(57)【要約】本発明は、多数の化合物を、遺伝子の発現を調節する能力についてスクリーニングする方法を提供する。本方法はジーントラップ技術を用い、ジーントラップベクターを用いて細胞集団をトランスフェクトし、その蛍光レベルに従って細胞を選別し、選別された細胞をプールに分配して、それぞれのトラップされた遺伝子を提示するのに十分な数の細胞が得られ、コントロールを上回る、試験化合物の作用の区別が可能となるようプールを増殖させ、細胞を試験化合物に曝して、ＦＡＣＳ解析を用いて細胞の蛍光分布パターンを変更する化合物を同定する工程を含んでなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種のトラップされた遺伝子の発現に影響を及ぼす１種以上の化合物を同定するために、複数の試験化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）蛍光レポータータンパク質をコードするジーントラップベクターを準備し（該蛍光レポータータンパク質は直接または間接的に蛍光を発する）、
ｂ）細胞集団を前記ジーントラップベクターを用いて安定にトランスフェクトし（前記レポータータンパク質の発現は前記トラップされた遺伝子の発現を示す）、
ｃ）安定にトランスフェクトされた前記細胞集団をＦＡＣＳによってレポータータンパク質の発現レベルに従って群別し、
ｄ）各群由来の細胞を１以上のプールに分配し（各プールは１種よりも多いトラップされた遺伝子を示す）、
ｅ）各プール由来の前記細胞を増殖させ（この増殖は、前記トラップされた遺伝子の発現に対するテスト化合物の作用について、コントロールを上回るものを識別できるようにするため、各トラップされた遺伝子を示すのに十分な数の細胞を生産するためである）、
ｆ）前記増殖させた細胞を個々のウェルに入れ、
ｇ）各プール由来の前記ウェルを複数の試験化合物の不在下、または存在下でインキュベートして、コントロールウェルおよび試験ウェルをそれぞれ作製し（該複数の試験化合物をうまく同一のウェルにまたは別個のウェルに加える）、
ｈ）前記試験ウェルおよびコントロールウェルについてＦＡＣＳ解析を実施して前記試験ウェルおよびコントロールウェル中の細胞の蛍光分布パターンを作製し、
ｉ）各試験ウェルと前記コントロールウェルの蛍光分布パターンを比較し、さらに
ｊ）前記蛍光分布パターンが前記コントロールウェルと異なる試験ウェルを同定する（異なる蛍光分布パターンの同定は、前記試験ウェルにおいて示される１種以上のトラップされた遺伝子の発現に影響を及ぼす試験化合物を示す）
という工程を含んでなる方法。
【請求項２】
前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レポータータンパク質が、増強された緑色蛍光タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記各群の細胞の数が、約５００のトラップされた遺伝子を示すものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
各プール由来の前記細胞を少なくとも５倍に増殖させる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
各プール由来の前記細胞を少なくとも１０倍に増殖させる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記トラップされた遺伝子をクローニングし、配列決定する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＦＡＣＳの選別パラメーターを、細胞周期による前記レポータータンパク質の蛍光の不均一性に適応するよう調節する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
フローサイトメーター中の細胞の細胞流動速度が、１秒当たり２５メートル未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記フローサイトメーター中の細胞の細胞流動速度が、１秒当たり１５メートル未満である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記フローサイトメーター中の細胞の細胞流動速度が、１秒当たり約５メートルである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
サンプルに白色光を当てることによって、バックグラウンドの蛍光を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１種のトラップされた遺伝子の発現に影響を及ぼす１種以上の化合物を同定するために、複数の試験化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）蛍光レポータータンパク質をコードするジーントラップベクターを準備し（該蛍光レポータータンパク質は直接または間接的に蛍光を発する）、
ｂ）細胞集団を前記ジーントラップベクターを用いて安定にトランスフェクトし（前記レポータータンパク質の発現は前記トラップされた遺伝子の発現を示す）、
ｃ）安定にトランスフェクトされた前記細胞集団をＦＡＣＳによってレポータータンパク質の発現レベルに従って群別し、
ｄ）各群由来の細胞を１以上のプールに分配し（各プールは１種よりも多いトラップされた遺伝子を示す）、
ｅ）各プール由来の前記細胞を増殖させ（この増殖は、前記トラップされた遺伝子の発現に対するテスト化合物の作用について、コントロールを上回るものを識別できるようにするため、各トラップされた遺伝子を示すのに十分な数の細胞を生産するためである）、
ｆ）前記増殖させた細胞を個々のウェルに入れ、
ｇ）各プール由来の前記ウェルを複数の試験化合物の不在下、または存在下でインキュベートして、コントロールウェルおよび試験ウェルをそれぞれ作製し（該複数の試験化合物をうまく同一のウェルにまたは別個のウェルに加える）、
ｈ）前記試験ウェルおよびコントロールウェルについてＦＡＣＳ解析を実施して前記試験ウェルおよびコントロールウェル中の細胞の蛍光分布パターンを作製し、
ｉ）各試験ウェルと前記コントロールウェルの蛍光分布パターンを比較し、さらに
ｊ）前記蛍光分布パターンが前記コントロールウェルと異なる試験ウェルを同定する（異なる蛍光分布パターンの同定は、前記試験ウェルにおいて示される１種以上のトラップされた遺伝子の発現に影響を及ぼす試験化合物を示す）
という工程を含むこと、及び
選別パラメーターは細胞周期による前記レポータータンパク質蛍光の不均一性を補正するよう調節され、かつ、ＦＡＣＳ解析の際の細胞流動速度は１秒当たり２５メートル未満であり、バックグラウンドの蛍光はサンプルに白色光を当てることによって減少させられる、ことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記レポータータンパク質が、増強された緑色蛍光タンパク質である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記各群の細胞数が、約５００のトラップされた遺伝子を示すものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
各プール由来の前記細胞を少なくとも５倍に増殖させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
各プール由来の前記細胞を少なくとも１０倍に増殖させる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記トラップされた遺伝子をクローニングし、配列決定する工程をさらに含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞流動速度が、１秒当たり１５メートル未満である、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞流動速度が、１秒当たり約５メートルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
既知のトラップされた遺伝子のマルチプル・モジュレータを同定する方法であって、
ａ）蛍光レポータータンパク質をコードするジーントラップベクターが挿入されることによって既知の遺伝子がトラップされている、安定にトランスフェクトされた細胞のクローンを得（該蛍光レポータータンパク質は直接または間接的に蛍光を発する）
ｂ）前記クローン由来の細胞を複数のウェルに入れ、
ｃ）前記ウェルを複数の試験化合物の不在下、または存在下でインキュベートして、コントロールウェルおよび試験ウェルをそれぞれ作製し（該複数の試験化合物をうまく同一のウェルにまたは別個のウェルに加える）、
ｄ）前記試験ウェルおよびコントロールウェルについてＦＡＣＳ解析を実施して前記試験ウェルおよびコントロールウェル中の細胞の蛍光分布パターンを作製し、
ｅ）各試験ウェルと前記コントロールウェルの蛍光分布パターンを比較し、さらに
ｆ）前記蛍光分布パターンが前記コントロールウェルと異なる試験ウェルを同定する、（異なる蛍光分布パターンの同定は、前記トラップされた遺伝子の発現に影響を及ぼす試験化合物を示す）
という工程を含むこと、及び
選別パラメーターは細胞周期による前記レポータータンパク質蛍光の不均一性を補正するよう調節され、かつ、ＦＡＣＳ解析の際の細胞流動速度は１秒当たり２５メートル未満であり、バックグラウンドの蛍光はサンプルに白色光を当てることによって減少させられる、ことを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記レポータータンパク質が、緑色蛍光タンパク質である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記レポータータンパク質が、増強された緑色蛍光タンパク質である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
各群の細胞数が、約５００のトラップされた遺伝子を示すものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
各プール由来の細胞を少なくとも５倍に増殖させる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記各プール由来の細胞を少なくとも１０倍に増殖させる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞流動速度が、１秒当たり１５メートル未満である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞流動速度が、１秒当たり約５メートルである、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は概して薬剤スクリーニングの分野に関し、より詳しくは、遺伝子発現に対する作用について、試験化合物をハイスループット・マルチプレックス化スクリーニングする方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
検出可能なレポーター（マーカー）を含むＤＮＡ配列のランダムな組み込みによって遺伝子を標識する技術は周知であり、ジーントラップと呼ばれている（Ｓｋａｒｎｅら，１９９２，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，６：９０３−１８；Ｄｕｒｉｃｋら，１９９９，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，９：１０１９−１０２５；Ｐｒｕｉｔｔら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９７，１２４：６１７−６２６）。ジーントラップ技術は典型的にはプロモーターを含まないベクターを準備する。代わりに、ジーントラップベクターは遺伝子に挿入されると融合ＲＮＡ転写物を生じる特定の配列を提供する。このことによりジーントラップは哺乳類細胞にとって特に魅力的なものとなっているが、これはこれらの細胞が大きなイントロンおよび小さなエキソンを含む複雑なゲノム機構を有しているからである。次いで、トラップされた遺伝子はｍＲＮＡ配列によって同定することができる。これらの技術を用いることにより、レポーター遺伝子の発現により、それが組み込まれている遺伝子（トラップされた遺伝子）の活性の尺度を表す、細胞のライブラリーを創ることが可能である。さらに、トラップされ得る遺伝子は細胞内の遺伝子の大部分に相当する。
【０００３】
技術は、トラップされた遺伝子の同定に利用できる。ジーントラップ法では、トラップされた遺伝子の同定はレポータータンパク質のｍＲＮＡを含む融合ｍＲＮＡの生成に基づいている。次いで、ｃＤＮＡの迅速増幅（ＲＡＣＥ）などの標準的な技術を用いてレポーター遺伝子が挿入されている遺伝子（トラップされた遺伝子）をクローニングすることができる。
【０００４】
トラップされた遺伝子の発現の測定には、レポーター遺伝子のための標準的な検出技術が用いられている。蛍光レポーターについては、かかる技術として蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０００５】
トラップされた遺伝子のライブラリーは特定の化合物に応答する遺伝子を同定するために用いられている（Ｐｒｕｉｔｔ，１９９２；Ｗｈｉｔｎｅｙ，１９９９，米国特許第５，９２８，８８８号）。Ｐｒｕｉｔｔはβ−ガラクトシダーゼ発現構築物を細胞中の真核細胞ゲノムへ挿入し、さらにその細胞を化学物質と接触させてβ−ガラクトシダーゼ活性の変化を検出することを教示している。Ｗｈｉｔｎｅｙはβ−ラクタマーゼ発現構築物を細胞中の真核細胞ゲノムへ挿入し、さらにその細胞を化学物質と接触させてβ−ラクタマーゼ活性の変化を検出することを開示している。先行技術はまた化合物の遺伝子発現を調節するその能力についてのスクリーニングを提供するが、Ｗｈｉｔｎｅｙの方法はＦＡＣＳの使用を伴うものである。しかしながら、先行技術の方法には特有の制限がある。まず、個々の化合物の複数の遺伝子に対する作用について同時にスクリーニングできるが、この方法は複数回の濃縮にわたって所定のモジュレータに応答する細胞を濃縮するためにＦＡＣＳの調整用スケールでの使用を必要とする。結果として、この方法はハイスループット化合物スクリーニングへの使用を考えると非常に費用がかかり、かつ、時間がかかる。第２に、Ｗｈｉｔｎｅｙの方法によれば、トラップされた遺伝子を含む細胞のライブラリーは高レベルの蛍光を示すものと低レベルの蛍光を示すもの、すなわち、本質的にオンまたはオフに分けられる。ＦＡＣＳはオフからオンに、またはオンからオフになることによって化合物に応答する細胞を濃縮するために用いる。前記で論じた濃縮のラウンドを反復した後、細胞を回収してトラップされた遺伝子を決定する。Ｗｈｉｔｎｅｙ法は細胞をオンからオフへ、またはオフからオンへ変化させるのに必要なものより小さな遺伝子発現の変化を明らかにすることはできないために、遺伝子発現の定性的変化は同定されない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、薬剤スクリーニングの分野には多数の化合物をその遺伝子発現に対する作用についてスクリーニングできる方法、およびかかる作用を定量的な手段で測定できる方法を開発する必要がある。
【発明を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、遺伝子の発現を調節する能力について、多数の化合物をスクリーニングする方法を提供する。本方法はジーントラップ技術を用い、細胞集団を、蛍光レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含んでなるジーントラップベクターでトランスフェクトし、その細胞集団をＦＡＣＳ解析に付して蛍光レベルを基に細胞をウィンドウに選別し、各ウィンドウ由来の細胞をプールし、発現変異の検出が可能となるようプールされた細胞を増殖させて各トラップされた遺伝子を含む細胞の十分な数のコピーを得、各プール由来の特定数の細胞を複数の化学物質に曝露し、曝露した細胞をＦＡＣＳ解析に付し、蛍光パターンがコントロール細胞に対して変更されているプールを同定し、さらに変更された蛍光パターンを特定の化学物質と関連づける工程を含んでなる。
【０００８】
本発明はさらに、試験化合物に曝露されるとその活性が変更されるトラップされた遺伝子を同定し、クローニングして配列決定する方法を提供する。
【０００９】
本発明では、ＦＡＣＳスクリーニングの精度、安定性および感度を改善し、ひいては化合物のマルチプレックス・スクリーニングを可能にする方法論が提供される。これらの方法論は１）蛍光測定の不正確さを生じる選別の際の所定の細胞内の蛍光の検出における不均一性；２）細胞周期の段階に依存する検出される蛍光の不均一性；および３）蛍光に基づくアッセイの感度を低下させる細胞の自己蛍光を減少させることに向けられる。精度は一様でない照明による検出の不均一性を減少させるようフローサイトメーター中の各細胞の滞留時間を延長することで改善されている。滞留時間は細胞流動速度を低下させることで延長されている。安定性はＦＡＣＳの際の細胞を選別するパラメーターを細胞周期による変化が最小となるよう調節することで改善されている。感度はサンプルに白色光を当てることでバックグラウンドを抑えることで改善されている。
【００１０】
従って、本発明の目的は、ジーントラップ細胞ライブラリー中のトラップされた遺伝子集団に対する作用について、スクリーニングできる化合物の数に対する制限を克服することである。いくつかの化合物の作用についてのジーントラップ細胞ライブラリーのサブセットの同時評価、すなわち、マルチプレックス化により評価できる遺伝子×化合物数の増大が可能となる。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、細胞周期による蛍光検出の不均一性を減少させることである。
【００１２】
本発明のさらなる目的はＦＡＣＳ解析の際の高速選別による蛍光検出の不均一性を減少させることである。
【００１３】
さらなる目的は細胞の自己蛍光を抑えることである。自己蛍光の抑制により最小レベルで発現される遺伝子によって生じる低いシグナルレベルを測定する能力が高まる。
【００１４】
ある実施形態では、約５００のトラップされた遺伝子を示す各群の細胞（ＦＡＣＳ解析由来の蛍光分布パターンのウィンドウ）からプールを作製する方法を提供し、蛍光タンパク質レポーターを増強された緑色蛍光タンパク質によってこれらの遺伝子からの発現を検出し、かつ、トラップされた遺伝子からのこのレポーターの発現は約３未満の因子によって（ＦＡＣＳにおいて２つの隣り合うウィンドウに分離する蛍光の範囲）変化し、かつ、約０．０２％〜０．０３％未満の細胞がこれらのパラメーターから逸脱する。
【００１５】
もう１つの実施形態では、用いる特定のレポーター遺伝子の安定性によって変動しうるアッセイ時間の間細胞が所望の特性を維持し、かつ、遺伝子発現におけるアップレギュレートまたはダウンレギュレート変化が好適な細胞集団を提供する。
【００１６】
もう１つの実施形態では、１０群の約２０００の化合物を、低または中レベルの蛍光に対してウィンドウ内に表示された約５０００−１００００個の細胞のプールを含み、かつ、約２０のトラップされた遺伝子を示す細胞を含むマイクロタイターウェルに適用し、マイクロタイターウェル当たり６０００個もの細胞由来の蛍光に対するこれらの化合物の作用を解析することにより、約２９８００の化合物の特定の遺伝子との相互作用を評価したアッセイを提供する。
【００１７】
もう１つの実施形態では、１０群の約２０００の化合物を、低または中レベルの蛍光に対してウィンドウ内に表示された約５０００−１００００個の細胞のプールを含み、かつ、約５００のトラップされた遺伝子を示す細胞を含むマイクロタイターウェルに適用し、マイクロタイターウェル当たり６０００個もの細胞由来の蛍光に対するこれらの化合物の作用を解析することにより、約８７５０００の化合物の特定の遺伝子との相互作用を評価したアッセイを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
定義：
本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、少なくとも１０個の塩基長のヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれか）またはいずれかの種類のヌクレオチドの改変型の重合形態を意味する。この用語には一本鎖または二本鎖型のＤＮＡが含まれる。
【００１９】
「レポータータンパク質」または「レポーター」は「マーカータンパク質」または「マーカー」と互換的に用いられ、本明細書ではジーントラップベクターに存在するＤＮＡの配列の転写によって生成し、内在性遺伝子のコード配列に依存しない、レポータータンパク質から発現を促進するアッセイによって検出可能であるタンパク質を意味する。
【００２０】
本明細書において「蛍光レポータータンパク質」とは、蛍光に基づいて検出可能であるレポータータンパク質を意味し、ここで蛍光は、レポータータンパク質に直接由来するものであっても、レポータータンパク質の蛍光基質の活性に由来するものであっても、蛍光タグをつけた化合物との結合親和性を有するタンパク質に由来するものであってもいずれでもよい。蛍光タンパク質の例としてはＧＦＰおよびＥＧＦＰが挙げられる。これらは細胞中のその存在がフローサイトメトリー法によって検出できる。
【００２１】
本明細書において「トラップされた遺伝子」とは、タンパク質をコードする細胞のゲノム中のポリヌクレオチド配列であって、その中にレポーター／マーカータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列が導入されているものを意味する。
【００２２】
本明細書において「ベクター」とは、プラスミド、ファージまたはコスミドなどのレプリコンを意味し、付着されたセグメントの複製がなされるようにそれにもう１つのＤＮＡセグメントを付着させてもよい。「ベクター」はさらに複製可能な核酸構築物、例えば、プラスミドまたはウイルスの核酸と定義してもよい。
【００２３】
本明細書において「ジーントラップベクター」とは、内在性遺伝子に組み込まれた際、内在性遺伝子プロモーターからレポーター遺伝子の発現が可能になる配列を含むベクター（プラスミドなどの）を意味する。ベクターはさらに、スプライシング、内在性遺伝子の翻訳終結、内部リボソーム侵入、転写終結、インスレーター配列エレメント、転写開始、選択培地での細胞の増殖、配列特異的組換えを可能にする配列エレメント、またはその他のエレメントを含んでもいてもよい。
【００２４】
本明細書において「滞留時間」とは、フローサイトメーター中で流れる時に粒子または細胞がレーザービームによって完全に照射される時間を意味する。滞留時間はＦＡＣＳ解析の際の細胞流動速度と反比例する。
【００２５】
本明細書において「蛍光分布パターン」とは、ＦＡＣＳ解析によって明確にされる特性に相関した特定の蛍光特性のパターンを意味し、これには蛍光および前方散乱、蛍光および側方散乱、ある規定されたチャンネルの蛍光および第２の規定されたチャンネルの蛍光またはその組み合わせなどが含まれる。
【００２６】
本発明は、多数の化合物を、細胞内で発現される遺伝子の１００００個から３００００個の大部分の発現に対する作用について、スクリーニングできる可能性を秘めている方法を提供する。特に、ジーントラップ技術は、ヒト細胞株内で発現される遺伝子の大部分を、増強された緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）などのレポータータンパク質を用いて個別にマークするのに用いられる。ハイスループット自動蛍光細胞選別技術による最初のスクリーニングにより、個々の化合物に応答する特定の遺伝子がマーク（トラップ）されている細胞が同定および単離される。マークされた遺伝子を同定し、さらに特定の化合物と関連付ける。従って、本発明は、ハイスループットスクリーニングに好適な、遺伝的にマークされた細胞株を提供し、細胞内で発現される遺伝子のレパートリーに対する作用を特徴とし得る特定のリード化合物を関連付ける。
【００２７】
本発明は、特定のマークされた遺伝子に対する化合物の作用をレポートするのに必要な細胞数を、統計的に信頼のおける同定に必要とされる最小値まで減少させる方法を提供する。ある実施形態では、この数は約１０まで減少している。最小数の細胞を評価することにより、化合物の作用をより高い効率で測定することが可能となる。
【００２８】
本方法はまた、特定の発現範囲内で遺伝子を発現する細胞を、遺伝子発現の変化について感度のいい測定を可能にするのに十分なレベルにまで精製する方法を提供する。この規模の生物学的作用は、目的が化合物をバイオプローブまたは薬剤開発リードのいずれかとして用いる細胞内シグナル伝達経路の調節である場合に、望ましい。
【００２９】
本発明は「ジーントラップ」技術を使用する（例えば、Ｓｋａｒｎｅｓら，１９９２，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ；Ｐｒｕｉｔｔ，１９９２，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）。この技術により、一度に１つの遺伝子を調べるのではなく多数の遺伝子および潜在的には全ゲノムのスクリーニングが可能となる。本方法は、ゲノム内の遺伝子を蛍光レポーターを用いて捕捉（トラップ）し、ＦＡＣＳによって測定されるトラップされた遺伝子の発現レベルに基づいて細胞を同定および選別し、選別された細胞を増殖させてトラップされた遺伝子を含む所望の数の細胞のコピーを得、選別され増殖させた細胞を複数の化合物に曝露し、トラップされた遺伝子の発現が変更する細胞群を同定し、影響を与える化合物を同定し、それをトラップされた遺伝子と関連付けることを含む。本発明に必要な工程の概観は図１に示されている。要約すれば、ジーントラップ細胞ライブラリーを構築し（パネル１）、細胞を特定の蛍光レベルのプールに選別し（パネル２）、化合物を適用し（パネル３）、個々のウェルを細胞のサブセットの蛍光レベルの変化について反応測定する(パネル４)。
【００３０】
本発明において遺伝子をトラップするには、指標活性、好ましくは蛍光活性を有するタンパク質（本明細書では蛍光レポータータンパク質と呼ぶ）をコードするポリヌクレオチドを用いる。例えば、原核生物および真核生物ではオワンクラゲＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａから単離した、緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＥＰ）がレポーター（マーカー）として利用できるようになっている。ｇｆｐ遺伝子は紫または青緑光によって励起されると蛍光を発するタンパク質をコードしている。ＧＦＰの変種もまた利用できる。このような特定の変種には増強されたＧＦＰすなわちＥＧＦＰがある（図１に例として示されている）。ＥＧＦＰをコードするポリヌクレオチドを標的細胞のゲノムにランダムに組み込む。ネオマイシン耐性遺伝子などの標準的な選択部位を用い、そして組み込み部位の３’の内在性ポリアデニル化シグナルの必要性に基づいて機能的遺伝子をコードするゲノム領域への組み込み事象を選択する。レポーター遺伝子からの発現は、それが組み込まれた内在性遺伝子プロモーターに依存しており、かつ、該遺伝子からの発現レベルを反映している。このことから、各トラップされた遺伝子からの発現をモニターできる迅速で重要な細胞マーカーが提供される。
【００３１】
本発明に有用なジーントラップベクターは当技術分野ではすでに周知である。本発明には種々のジーントラップ設計を用いることができる。レポータータンパク質の発現が、それをコードするポリヌクレオチドの、タンパク質をコードする遺伝子内への組み込みに依存することを確実にするように設計すべきである。典型的には、本発明に有用なジーントラップベクターは、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、５’末端にはスプライスアクセプター部位が、そして３’末端にはポリアデニル化シグナルが隣接している。かかるベクターは標的遺伝子のイントロンへの挿入後活性化される。本発明に好適なジーントラップベクターとしては米国特許第５，９２２，６０１号、同６，２４８，９３４号および同６，３０６，６００号に開示されるものが挙げられ、その開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【００３２】
レポーターである蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドの取り込みによってマークされた内在生遺伝子を保持する各細胞は、内在性のマークされた遺伝子からの発現に必要な経路に影響を及ぼす化合物の能力を、蛍光の変化として伝えることができる。この特性により複数の遺伝子に対する化合物の作用を同時に評価することが可能となるが、これは異なる内在性遺伝子がマークされている細胞集団がスコアされ得るからである。ハイスループット解析に適当な自動化形式でこれが達成され得る１つの方法は、ＦＡＣＳによるものである。従って、蛍光活性化細胞選別装置（ＦＡＣＳ）を用いて蛍光レポーターを発現する細胞を検出し、その結果タグがつけられた遺伝子を同定する。ＦＡＣＳの一般的な概観についてはＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇら，（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１９７６，Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．２３４：１０８）；Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ，（Ｍａｌａｍａｄ，ＭｕｌｌａｎｅｙおよびＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９）を参照。便宜的には、蛍光活性化細胞選別装置は細胞の懸濁液を取り込み、それらを一列に検出器近くに設置されるレーザーの光路に送る。レーザーは通常規定の波長を有する。検出器は各細胞が機器を通過するときの蛍光発光強度を測定し、細胞数対蛍光強度のヒストグラムプロットを作製する。ヒストグラムにゲート（ウィンドウ）または制限を設定することができ、従って、細胞の特定の集団を同定することができる。前記のように、予期しない発見に基づいて、技術の信頼性を高めるために標準ＦＡＣＳ技術の改変を実施した。
【００３３】
ＦＡＣＳには応答細胞の同時単離が可能であるというさらなる利点がある。ＦＡＣＳの本法への適用は図１、パネル２−４に例示されている。まず、マークされた細胞集団を蛍光に基づいて別個のウィンドウ内に収まる細胞のプールに選別する。ウィンドウ間の細胞の分布をスコアする。次いで、この分布を用いて、続く工程で評価される必要がある各ウィンドウ由来のプール数を決定する。好適な数の細胞（約５００など）のプールを増幅して一部を永久参照として凍結してもよい。各プールは化合物スクリーニングでの使用のために選択された数（５００など）の標的遺伝子を提示する。
【００３４】
蛍光細胞が高精度、高安定性および高感度で蛍光の特定のウィンドウに選別され得、ジーントラップ細胞株のプールのマルチプレックススクリーニングが可能となる３種の方法論を用いた。この３つの方法は１）蛍光の最初の測定における不正確さにつながり、その結果「蛍光不均一検出」（ＦＨＤ）と呼ばれる現象をもたらす、高速選別の際の所定の細胞内の蛍光の検出の不均一性；２）「細胞周期依存性レポーター不均一性」（ＣＤＲＨ）と呼ばれる現象をもたらすアッセイ期間の間の細胞周期と相関する検出可能な蛍光の不均一性；３）蛍光に基づくアッセイの感度の下方限界を制限する細胞の自己蛍光、に対応している。これらの問題により、化合物のレポーター遺伝子発現に対する作用についての小容量・一回通過アッセイという可能性、または化合物に応答するマークされた遺伝子を反映するこのようなアッセイからの細胞の単離という可能性が事実上妨げられている。本アッセイは、ある面では、ＦＨＤおよびＣＤＲＨ現象に関連する問題を解決する有効な方法に基づくハイスループット・マルチプレックスアッセイを考慮する。ＣＤＲＨ現象はすべてのレポーター遺伝子に共通のものであり、蛍光に基づくアッセイに限定されるものではない。低レベルで発現される遺伝子の検出におけるより優れた感度は、細胞の自己蛍光を軽減する方法によって提供される。
【００３５】
ＦＡＣＳ解析後、細胞集団を細胞のプレーティングおよび試験化合物のスクリーニングのために従来のウィンドウサイズに選別する。スクリーニング自体は、小容量の反復解析が可能ないずれの形式を適用してもよいがマイクロタイター形式で実施する。いずれの形式においても、所定のプール由来の選択された数の細胞を複数の試験化合物に曝露する。例えば、ある実施形態では、約５０００個の細胞（トラップされた遺伝子を示す各細胞を１０ずつコピーした、５００種のトラップされた遺伝子を示す細胞）を約１０種の異なる化学物質の混合物に曝露する。次いで、ＦＡＣＳ技術を再度用いて個々のウェルに対する化合物の作用を評価し、ウェル内の最小数の細胞（約１０個など）による最初のウィンドウからの蛍光のずれとして「ヒット」をスコアする。応答する細胞を選別して薬剤の不在下のマイクロタイターウェルに分離するが、これは非細胞傷害性化合物の場合にはそれらを直接回収することが可能であるからである。（不可逆的な細胞傷害性化合物を含有するウェル由来の細胞も予め凍結したアリコートから回収可能である）。この実施例におけるこのスクリーニングの最終結果は、ウェルあたり１０種の異なる化合物を含む９６ウェルを含む単一のマイクロタイタープレートにより、５００の異なる遺伝子の発現に対する約９６０の異なる化合物の作用を評価することが可能であるということである。
【００３６】
本方法は当業者によって実験室で作製されたか、または多数のその他の供給源から入手できる化学ライブラリーのスクリーニングに用いてもよい。化学ライブラリーの供給源のいくつかの例としては以下のものがあげられる。
【００３７】
１つの例は６０のヒト腫瘍細胞株のＮＣＩパネルにおいてスクリーニングされたＮＣＩ低分子サンプルコレクションである。この資源の利用により細胞培養において抗腫瘍作用を示した化合物の幅広いコレクションが提供される。近年、多くの化合物のライブラリーは市販されるようにもなった。これらのライブラリーのデータベースにまずフィルタをかけて化学的に反応性のもの、極めて高価なもの、高度に毒性のもの、そうではないが好適でない化合物を除外してもよい。残るライブラリーを（例えば、通常用いられる「５のＬｉｐｉｎｓｋｉ  Ｒｕｌｅ」を適用することによって）フィルタにかけそのＣＬｏｇＰ、イオン官能性の数およびｐＫａ、水素結合供与基および受容基の数、ならびに分子量などの特定の基準に基づいて細胞膜を透過しなさそうな化合物、またはｉｎ  ｖｉｖｏでの使用には好適でないであろう化合物を除外することができる。次いで、候補となる特製の合成ライブラリーを本発明を用いて評価することができる。
【００３８】
ひと度、その中のトラップされた遺伝子が特定の化学物質に応答すると認められる細胞が同定されれば、標準的な分子生物学の技術を用いてその遺伝子を同定することができる。この目的のために逆転写ＰＣＲまたはＲＡＣＥなどの技術を用いることができ、これらは当業者には十分に周知である。
【００３９】
ＰＣＲをベースとする技術は融合転写配列の既知部分を上手く利用している（Ｆｒｏｈｍａｎら，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ．，１９８８：８９９８−９００２）。典型的には、かかる配列は選択マーカー／レポーターを含む外来のエキソンによってコードされている。プロセスの第１の工程ではＰＣＲ増幅反応に用いられる一本鎖相補ＤＮＡを作製する。ｃＤＮＡ合成のためのＲＮＡ基質は全細胞ＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分のいずれであってもよいが、後者が好ましい。ｍＲＮＡを溶解した細胞から単離し、ｍＲＮＡをポリアデニル化テールの相補的な結合によって固体マトリックスが結合したポリチミジンと結合させる。結合したｍＲＮＡを数回洗浄し、逆転写反応（ＲＴ）の試薬を加える。ＲＴ反応でのｃＤＮＡ合成はランダム配列（ＲＳ）プライマーの結合によるメッセージに沿ってランダムな位置で開始される。このＲＳプライマーは３’末端に６〜９個のランダムなヌクレオチドを含み、ｍＲＮＡ中の部位と結合してｃＤＮＡ合成をプライムし、かつ、既知の組成物の５’テール配列を次の工程でＰＣＲ増幅のためのアンカーとして作用させる。従って、ＲＴ工程ではトラップされるメッセージには特異性はない。あるいは、ＰＣＲのために特定の配列に付加されたポリｄＴプライマーを用いてもよい。次いで、ｃＤＮＡの第１鎖の合成が各トラップされた遺伝子の末端で開始される。
【００４０】
次の工程では、ＰＣＲ増幅を用いる。この反応のためのプライマーはＲＳプライマーのアンカー配列および選択マーカーに相補的である。選択マーカー遺伝子中の固定点と付加された転写物配列中の下流の種々の点の間の二本鎖断片が増幅される。次いで、これらの断片がＤＮＡ配列決定反応の基質となる。
【００４１】
以下、本発明は以下に示す実施例によってさらに理解されるであろうが、例示として解釈されるべきものであり、多少とも制限的なものであると意図するものではない。
【実施例１】
【００４２】
この実施形態はジーントラップ細胞ライブラリーの確立を記載する。ジーントラップ細胞ライブラリーはジャーカット細胞、Ｐ１９ＥＣ細胞またはＳＦ２６８神経膠腫細胞で構築した。当技術分野で周知のいくつかのベクターを本発明に用いてよい。有用なジーントラップベクターの例は米国特許第６，２４８，９３４号、同６，０８０，５７６号、同６，１３６，５６６号、同５，９２２，６０１号に開示されている。これらのライブラリーに用いたベクターはジーントラップベクターの既知の特徴を組み入れており、一般的な構造は、５’から３’に向けてスプライスアクセプター、内在性タンパク質由来の３つのリーディングフレームすべての中で翻訳を終結させるトリプレット翻訳終結配列、内部リボソーム侵入部位、レポーター遺伝子（ＥＧＦＰなど）、ポリアデニル化シグナル、β−グロビン遺伝子由来のインスレーター配列、ＰＧＫプロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子およびスプライスドナーを含んでいる。前記のように構築されたベクターを本発明に用いた。前記の配列エレメントがアデノ随伴ウイルスの逆方向末端反復の間に組み込まれた第２のベクターも構築した。Ｐ１９ＥＣ細胞ジーントラップライブラリーの場合には、第１のベクターがエレクトロポレーションによって直線化された分子として導入された。
【００４３】
エレクトロポレーションは２００ボルトおよび５００μＦに設定されたバイオラッド・ジーン・パルサー（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）ＩＩを用いて実施し、これでは、１×１０７個の細胞を４０〜６０μｇのＤＮＡを含有する１ｍｌ容量中でエレクトロポレーションした。細胞をＧ４１８の存在下で１０日間増殖させ、生存しているコロニーをプールした。コロニー数は約１５００であった。コロニーを慣例の組織培養法を用いてトリプシン処理し、さらなる培養のために組織培養フラスコにプールした。細胞をトリプシン処理してさらなる培養フラスコに継代することによって増幅し、約５×１０７個の細胞が得られるまで得られた細胞のすべてを保持した。次いで、この集団をトリプシン処理し標準的なプロトコールを用いて濾過することによってＦＡＣＳ用に調製した。中でジーントラップベクターが遺伝子をよくトラップしている細胞を実施例１に記載のように処理し、ＦＡＣＳ解析に付し、蛍光分布パターン（図１のパネル２にあるようなもの）を作製した。従って、注目される特定の所望の集団の存在を測定するために、細胞をサイトメトリーによって評価する。図１はゲノムに組み込まれたＥＧＦＰ含有ベクターから緑色蛍光タンパク質を発現する細胞を示す例である。
【００４４】
次いで、細胞を蛍光レベルに基づいて選別する。次いで、選別した細胞を１以上のプールに分配する。ここで、各プールは１よりも多いトラップされた遺伝子を示す。好ましい実施形態では、少なくとも１つの群から選別された細胞数は約５００である。次いで、各トラップされた遺伝子を示す十分な数の細胞が得られて、コントロールを上回る、試験化合物のトラップされた遺伝子の発現に対する作用を区別できるよう、各プールの細胞を培養して増殖させる。次いで、増殖させた細胞を個々のウェルに入れて、複数の試験化合物の不在下または存在下でインキュベートしてそれぞれコントロールウェルおよび試験ウェルを作製する。複数の試験化合物はうまく同一のウェルに加えてもよいし、または個別のウェルに加えてもよい。試験化合物とともに好適な期間インキュベートした後、試験ウェルおよびコントロールウェルでＦＡＣＳ解析を実施して試験ウェルおよびコントロールウェル中の細胞の蛍光分布パターンを作製する。各試験ウェルの蛍光分布パターンをコントロールウェルと比較することにより、トラップされた遺伝子の発現を変更した化合物を含む試験ウェルの同定が可能となる。次いで、トラップされた遺伝子を標準的な既知の技術によってクローニングして配列決定すればよい。
【実施例２】
【００４５】
本実施形態は蛍光不均一性検出を軽減するプロセスを記載する。このプロセスは、トランスフェクトされた遺伝子由来の蛍光タンパク質を発現する、純粋な細胞集団を提供するよう設計されている。このプロセスは、限定されるものではないが、フローサイトメーターおよびイメージサイトメーターを含む。このプロセスはいずれかの特定の細胞集団によって発現される、あらゆるゲノムまたはプロテオミクス由来の蛍光マーカーにも適用される。
【００４６】
ひと度、細胞のマーカー特性、すなわち、単独または以下に記載するようなその他のパラメーターと相関する蛍光レベルが選択されれば、選別条件を規定して細胞を適当な回収容器に選別する。図２ａ（ＡおよびＢ）は２５メートル／秒の細胞流動速度を用いるＦＡＣＳ−バンテージ・フロー・ソーター（Ｖａｎｔａｇｅ  ｆｌｏｗ  ｓｏｒｔｅｒ）で従来の高速選別を用いて選別された細胞の例を、そして下部パネル（ＣおよびＤ）では選別された細胞の再評価を示す。２Ａおよび２Ｂは１回目の実施で選別した細胞のパターンを示し、図２ｂの２Ｃおよび２Ｄは２回目の実施についての細胞のパターンを示す。２Ｂおよび２Ｄの比較により、２Ｄ細胞は明らかに２Ａで選択された選別パラメーターの外側に存在しているため、従来のプロセスでは再現性のある結果が生じないということが示される。従って、当技術分野で現在用いられている従来のアプローチは、十分に精製された細胞を提供するという目標を達成するには効果がない。
【００４７】
この問題を軽減するため以下の成功プロセスを開発した。図３Ａおよび３Ｂに示されるように、励起レーザービームは蛍光発光検出から９０°にある。従来のサイトメーターのための現在の検出角はπ／６である。その結果、最大検出可能蛍光は４％である。これは改良した検出法、例えば、４π付近の検出器によって増加され得るが、常になされるわけではない。このことにより、細胞の空間分布および検出容量におけるそれらの蛍光の重要性が分かる。細胞は光量子に対して様々な不透過率を有するので、不均一な蛍光が不均一な検出をもたらす。従って、選別した細胞を再解析した場合に、ある通過で輝いて見え、選別規準を満たすよう方向付けられる場合がある同一の細胞が、その２回目の通過で薄暗く見える場合があり（またはその逆）、このことが所望の細胞を汚染し、かつ、所望の細胞を見失う好ましくない事象を引き起こす。これまではこの現象は認識されておらず、本明細書では蛍光検出不均一性と呼ぶ。
【００４８】
ＦＨＤ現象を捕らえ、かつ、正確な蛍光ウィンドウ機能を得るプロセスには均一な照明および検出が必要である。本発明では、ＦＨＤを軽減するための２つのプロセスを提供する。
【００４９】
一つは４π付近の検出を求めることによる。これは４π付近での細胞の照明および検出をもたらし、このことにより、ＦＨＤ検出に関する問題を解決し、スピードおよび感度の増加につながることが予想される。
【００５０】
第２のプロセスは、検出容量において延長した滞留時間中に、細胞に回転することを求めることによって、個々の細胞における蛍光の検出の精度を高めることに関する。各細胞の滞留時間は、細胞流動速度を、蛍光測定の精度に関して有益な作用が達成される速度である１秒あたり２５メートル未満にまで低下させることによって延長される。好ましい実施形態では、細胞流動速度は１秒当たり約２０メートル未満である。より好ましい実施形態では、細胞流動速度は１秒当たり約１０メートル未満であり、さらにより好ましい実施形態では、細胞流動速度は１秒あたり約５メートルである。このアプローチを例示するために、フローサイトメーターの検出容量中の細胞の滞留時間を延長して細胞が回転するのに十分な時間を可能にした（細胞流動速度を１秒当たり５メートルまで低下させることによって）点以外は従来法によって前に記載したように細胞を準備してサイトメーターによって評価した。結果を図４に示す。滞留時間を延長した結果は照射および蛍光検出の均一性の増大である。従って、図４に示すように、このプロセスは再評価後の選別された集団の純度を有意に改善した。
【実施例３】
【００５１】
この実施形態は細胞周期依存性レポーター不均一性を軽減する方法を記載する。実施例２に記載されるプロセスからは最初の選別の数時間以内の再解析によって実証されるようにきっちりとウィンドウ内に表示された細胞集団が得られるが、本発明者らは前記の方法論を用いる場合には、１８時間のさらなる増殖の間にウィンドウ内に表示された集団において相当な不均一性が再び生じることを発見した。このことが試験化合物の評価に問題を引き起こすであろうということは明らかである。この現象は図５に示されるように実証されている。左側のパネル（図５Ａ）は選別の少し後のきっちりとウィンドウ内に表示された細胞集団を示す。同一の細胞を２４時間培養して増殖させた後に再評価したところ、その時点ではその蛍光特性は左側に示されるの最初の解析と比較して不均一となっていた（図５Ｂ）。予期していなかったがこの不均一性の理由は細胞周期による細胞の進行に相関するものであると判断し、本明細書において細胞周期依存性レポーター不均一性（ＣＤＲＨ）と呼ぶ現象が認識されることとなった。この現象の結果は、短期間、一般には、レポーターによりマークされた遺伝子の発現に対する化合物の作用を評価するのに必要なものよりも短い期間内に、最初に蛍光の所定の範囲内で正確にウィンドウ内に表示された細胞がその蛍光において不均一になるということである。この現象の結果は正確に蛍光ウィンドウ内に表示された細胞であっても１回のアッセイにおいて遺伝子発現に対する化合物の作用を伝えるための好適な標的としては用いることができない場合があるということである。これまで用いられてきたこの問題に対するある解法は遺伝子発現が変化する細胞の濃縮を複数回実施するということである。しかしながら、このアプローチは多数の細胞を必要とし、実施できるアッセイ数を大幅に制限する。従って、１回のアッセイではたとえ正確に蛍光ウィンドウ内に表示された細胞でも化合物の遺伝子発現に対する作用を伝える標的として好適でない。これまで、このことが本特許に記載されるマルチプレックス化アッセイの考慮を妨げてきた。
【００５２】
化合物スクリーニングにおいて、ジーントラップ細胞のプールを用いる際のＣＤＲＨによって生じる問題を軽減するために、蛍光（またはその他のレポーター遺伝子測定値）が細胞周期パラメーターに基づいて補正され得る方法を本明細書において考慮する。本明細書に例示されるある特定の解法は細胞周期、細胞の大きさと細胞の大きさの指標を提供するＦＡＣＳにおける光の前方散乱能力の間の関係を上手く利用している。本方法論の範囲内にはまた細胞周期パラメーターの別の測定値の使用、内部参照遺伝子の使用（例えば、異なる色の蛍光タグをつけた遺伝子）または細胞同期化も含まれる。この目的のための前方散乱パラメーターの使用の利点はその容易さおよびこの測定は現在すべてのフローサイトメーターおよびソーターで慣例的になされているという事実にある。かかる方法は細胞スキャナーまたはその他のレポーター検出法とともに用いるのに有利であると予想される。
【００５３】
図６Ａ−Ｅに示されるように個々の細胞から検出される蛍光シグナルを細胞周期におけるそれらの位置に関して基準化するために前方散乱パラメーターを上手く利用することもできる。細胞周期とともに大きさが、分裂直後の初期Ｇ１期の間の相対的に小さいものから分裂の直前の後期Ｇ２期の相対的に大きなものへ変化する。細胞の増殖の間は、レポーターにトラップされたすべての遺伝子からの発現のために、細胞内には蛍光タンパク質が蓄積されており、これは時間と相関して生じる。細胞分裂時には、この蛍光タンパク質数が半分になる。さらに、細胞周期の間はほとんどの遺伝子の発現に変化が起こり、Ｍ期の染色体凝縮の間は発現は最小であり、分裂直後の小細胞と分裂直前の大細胞間の蛍光の相異を強調する。従って、細胞周期の間は個々の細胞からの蛍光シグナルの発光は２倍よりも大きな範囲を行き来する。さらに、この蛍光範囲は図６Ｂに示す前方散乱パラメーターとの関係を示す。ＣＤＲＨを捕らえる特定の蛍光レベルを有するウィンドウ内に表示された細胞についてのこのシフトの結果は上部パネルに示されている（図６Ａ−Ｃ）。選別の直後は、細胞はきっちりとウィンドウ内に表示されている。しかしながら、同調化されていない集団では、細胞周期の進行がシグナルに見かけの不均一性をもたらす。この不均一性によって従来の化合物スクリーニングアッセイ法によって選別された細胞の利用が制限されている。
【００５４】
本発明はＣＤＲＨによって生じる不均一性を補正する方法を提供する。詳しくは図６の下部（図６Ｄ−６Ｆ）に示すように、ＣＤＲＨを捕らえるウィンドウを用いて細胞を選別する。これらの選別パラメーターのもとでは、細胞は細胞周期を行き来しながらも最初の選別ウィンドウ内に留まり、見かけの不均一性は解消されている。
【００５５】
このプロセスの１つの実施形態を図７（Ａ−Ｄ）に示す。ここではある範囲の蛍光シグナルを示す細胞をＣＤＲＨを捕らえない水平ウィンドウまたはＣＤＲＨを考慮する傾斜ウィンドウのいずれかを用いて選別した。最初の選別ウィンドウは全出発集団の約４３％が水平または傾斜ウィンドウのいずれかに存在するように選択した。細胞を一度、あらゆる作用が選別ウィンドウの変化に起因し得るような、選別を改善するためのさらなる方法を加えないで選別した。選別された細胞を約１８時間培養し最初の選別ウィンドウに存在する割合を再評価した。水平ウィンドウの場合には、細胞のパーセンテージは４３％（図７Ａ）から４１％（図７Ｂ）へ実質的に減少した。コントロール的に最初の傾斜ウィンドウにおいて回収した細胞のパーセンテージは４３％（図７Ｃ）から５４％（図７Ｄ）へ増加した。この最初の実験により選別効率を改善するためのさらなる技術が全くない場合のＣＤＲＨ補正の有用性が証明される。
【００５６】
細胞の蛍光分布パターンに対する細胞周期の作用は、細胞、細胞のクローンまたは細胞群が細胞周期に沿って進行した後、その蛍光および前方散乱パラメーターまたは細胞周期特性を反映するその他のパラメーターを測定することによって、実験的に求めることができる。従って、細胞をグルーピングするためのウィンドウの形および傾斜の双方は経験による方法によって決定することができる。ＣＤＲＨ補正またはよりきっちりとウィンドウ内に表示された細胞集団の使用を具体化するさらなる例を以下の実施例４に示す。
【実施例４】
【００５７】
この実施形態は細胞の自己蛍光を低下させ蛍光検出の有用な範囲を拡大するためのフローサイトメトリーのプロセスを記載する。低レベルで発現されるトラップされた遺伝子は、蛍光タンパク質レポーターから相応に低いレベルの蛍光シグナルしか生じないであろう。これらの低レベルの蛍光では、細胞の自己蛍光が有用なシグナル範囲を分かりにくくする場合がある。本出願では、このことは遺伝子発現に対する化合物の作用の解析を妨げる作用がある。この問題に対応するために、蛍光タンパク質からの蛍光レベルに影響を及ぼさずに細胞の自己蛍光の多くを低下させることができるプロセスが提供される。このプロセスはいずれの目的であっても蛍光タンパク質発現に対する自己蛍光を低下させるために適用できる。
【００５８】
このプロセスの基本は、細胞の自己蛍光は通常白色光源から生じる広域スペクトルの可視光（本明細書では白色光と呼ぶ）によって迅速に消光するが、蛍光タンパク質レポーターからの発現は、かかる曝露によってあまり影響を受けないという、予期しない知見である。この知見をＦＡＣＳに適用するために、ＦＡＣＳの直前に細胞を、蛍光タンパク質レポーターからの蛍光以上に自己蛍光を優先的に消光する光源に曝露した。本実施形態では、これは高輝度光ファイバー白色光源をＦＡＣＳの流体の流れに設置することにより行う。
【００５９】
このプロセスの１つの実施形態を図８に示す。この実施形態では、ＦＡＣＳによって２つの細胞集団を解析した。一方は蛍光レポータータンパク質を保持せず（上部パネル）、もう一方（下部パネル）はレポーターを発現しない小集団を含む、ジーントラップによって生じる低レベルでＥＧＦＰを発現する細胞の混合物である。各場合において細胞を光曝露なしおよび光曝露ありで評価し、蛍光分布を表すヒストグラムを重ね合わせる。蛍光タンパク質レポーターを保持しない細胞の場合には（上部パネル）、細胞の全集団がより低レベルの蛍光にシフトし、このことは細胞の自己蛍光の減少を実証する。コントロール的に、蛍光タンパク質由来の低レベルの蛍光を示す細胞と発現しない細胞の双方を含む細胞集団では（下部パネル）、発現しない細胞のみが蛍光の下方へのシフトを示す。従って、このプロセスの使用は、蛍光レポータータンパク質が検出され得る下方限界を効果的に拡げる。
【実施例５】
【００６０】
本実施形態は本発明のマルチプレックス化合物スクリーニングを例示する。本明細書にはマルチプレックス化合物スクリーニングの２つの実施形態を示す。この実施例では、中レベルの蛍光としてウィンドウ内に表示された細胞について、蛍光レベルを増強するか低下するかいずれかの能力がある化合物を捜すために検査し、実施例６では低レベルの蛍光としてウィンドウ内に表示された細胞について、発現を増強する能力がある化合物を捜すために検査する。
【００６１】
化合物
各スクリーニングにおいて、テストした化合物は、国立がん研究所の多様性セットおよび検証セットである。多様性セットは、異なる可能性を持つ構造を多く提示することを基準に選抜された約２０００種の化合物を含む。検証セットは抗腫瘍活性が知られているがその作用機構は現在のところ分かっていない５４種の化合物のセットからなる。化合物を約１０種のセットにプールし２０８プールとした。得られたプールのうち、２００を本実施例に記載する実験に用い、実施例６に記載する実験には２０８すべてを用いた。
【００６２】
細胞のジーントラップライブラリーの蛍光ウィンドウ内への表示
実施例１に記載するＰ１９ＥＣ細胞の細胞ライブラリーを、トラップされたレポーター遺伝子から示される蛍光範囲（蛍光分布パターン）を最初に確定することによって、スクリーニングのために準備した。この解析を基に、２つの蛍光領域を選択した。一方は中程度の蛍光細胞に相当し、１５００という全集団の１．４％からなっていた。各細胞が単独の組み込み事象を表すと仮定すると、これは約２０の単独の組み込み事象を意味し、第２のものは極めて低いものおよび発現しない細胞に相当し、全集団の３４％、すなわち、約５１０の単独の組み込み事象からなる。
【００６３】
レポーター遺伝子発現に対して増強または抑制活性のいずれかを示す化合物の、複合性の低いマルチプレックス・スクリーニング
実施例２〜４において前記のプロセスを用いて中程度のレベルで発現する細胞をウィンドウ内に表示し、２００μｌの組織培養培地中の約５０００〜１００００個の細胞を２０８のマイクロタイターウェルの各々に播種した。化合物のプールは、多様性セットの場合には各化合物につき１μＭ、検証セットの場合には１０μＭの最終濃度で、担体のＤＭＳＯ２μｌ中に加えられた（２００のウェルに対し）。残りの８ウェルはコントロールとして２μｌのＤＭＳＯ担体単独で処理した。細胞を約４０時間インキュベートし、その時点で組織培養培地を各ウェルから取り除き、トリプシン処理することで細胞を蛍光スキャニング用に準備した。細胞をスキャンし、最初の選別ウィンドウよりも上または下のいずれかのレベルの蛍光強度を示す細胞についてスコアした。コントロール細胞の１つのウェル、１つの負のウェルおよび細胞が最初の蛍光値から逸脱している２つのウェルの結果を図９に示す。合計２０８のうち、５９ウェルが評価を妨げる１種以上の細胞傷害性化合物を含んでいた。示される２つの陽性ウェルは、蛍光細胞の正常な分布からの逸脱を示す唯一のウェルであり、このアッセイにおいて細胞のサブセットに由来する蛍光に影響を及ぼす１種以上の化合物の存在のために陽性であると考えられる。この複合性の低いマルチプレックスアッセイでは、標的遺伝子に対する作用について評価される化合物の総数は、約１４９０（１４９の読み取り可能ウェル中の）×ウェルあたり約２０の標的遺伝子＝２９８００であった。元のライブラリー中のトランスフェクタントの総数を容易に増加させることができ、５００の標的遺伝子という好ましい複合性に到達させることもできる。
【実施例６】
【００６４】
本実施形態では、本発明を化合物のマルチプレックス・スクリーニングに使用して、レポーター遺伝子発現に対して増強活性を示す化合物を同定することが可能であるということを証明する。前記の実施例２〜４のプロセスを用いて低レベルで発現する細胞をウィンドウ内に表示し、２００μｌの組織培養培地中の約５０００個の細胞を２１６のマイクロタイターウェルの各々に播種した。実施例５と同様に１μＭまたは１０μＭの最終濃度で化合物のプールを、各化合物について、担体のＤＭＳＯ２μｌ中に加えた（２０８のウェルに対して）。残る８ウェルはコントロールとして２μｌのＤＭＳＯ担体単独で処理した。細胞を約２４時間インキュベートし、その時点で各ウェルから組織培養培地を取り除き、トリプシン処理することで細胞を蛍光スキャニング用に準備した。細胞をスキャンして最初の選別ウィンドウよりも上のレベルで蛍光強度を示す細胞についてスコアした。コントロール細胞の１つのウェル、１つの負のウェルおよび細胞が最初の蛍光値から逸脱している２つのウェルの結果を図に示す。細胞のサブセットにおいて蛍光シグナルの減少または増加（または双方）をもたらす、蛍光細胞の正常な分布から逸脱している１４のウェルが得られ、このアッセイにおいて細胞のサブセットに由来する蛍光に影響を及ぼす１種以上の化合物の存在のために陽性であると考えられる。この複合性の高いマルチプレックスアッセイにおいて、標的遺伝子に対する作用について評価される化合物の総数は、約１７５０（１７５の読み取り可能なウェル中の）×ウェル当たり約５００の標的遺伝子＝８７５０００であった。
【００６５】
本明細書に記載される本発明により、トラップされた遺伝子の発現に対する試験化合物の作用についてのマルチプレックス・スクリーニングが可能となる。本発明を例示するために前記に種々の例を示した。しかしながら、本発明の軽度の改変は当業者には当然のことであり、かつ、本発明の範囲内に含まれるよう意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】
図１は、マルチプレックス化合物スクリーニングの図式的概観である。パネル１は蛍光標識細胞ライブラリーの構築を例示する。パネル２は蛍光マーカー発現に基づいた細胞の分画を例示する。パネル３はマイクロタイター形式の細胞のプールへの化学ライブラリーの適用を例示する。パネル４は個々のウェルの自動化ＦＡＣＳ解析および応答細胞の捕獲を例示する。
【図２ａ】
図２ａは、ＥＧＦＰ発現細胞の高速セル選別を表す。細胞は３０ミクロンの検出高度で１秒当たり２５メートルの細胞流動速度を用いて選別した。２ＡではＧＦＰ蛍光対前方散乱の最初のプロットが示されている。２Ｂでは細胞数が蛍光に対してプロットされている。
【図２ｂ】
２Ｃおよび２Ｄは、図２ａの２Ａおよび２ＢのウィンドウＷ中の選別された細胞の蛍光対前方散乱、および細胞数対蛍光のプロットである。選別された細胞の再解析はＧＦＰ蛍光においていくらかの改善を示すが、２５％よりも多くが所望の選別領域の外側に収まっている。
【図３】
３Ａおよび３Ｂは、ＦＡＣＳ検出による照度および細胞の蛍光シグナルの検出の図式的表示であって、検出器に対する蛍光細胞の提示の違いによるＡおよびＢ間の蛍光の検出における異質性を示す。
【図４】
図４は、低速選別後のＥＧＦＰ細胞蛍光を示す。細胞は３０ミクロンの検出高度で１秒当たり約５メートルの細胞流動速度を用いて選別した。選別した細胞の再解析は所望の細胞の純度において大きな改善を示している。最初の細胞集団は図２に示されるものと同一である。この場合には４Ａに４つの別個の選別領域が示され、個々の細胞由来の蛍光分布のヒストグラムをＲ２、Ｒ４、Ｒ６およびＦ８と名づけた。下部のパネル、すなわち、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄおよび４Ｅは前方散乱と相関させたそれぞれ選別された領域Ｒ２、Ｒ４、Ｒ６およびＲ８の蛍光のドット・プロットを示す。まれに例外はあるが、最初の選別ウィンドウから２以上のウィンドウによって分離される選別ウィンドウの混入レベルは．０２％未満である。さらに、例外的場合の多くでは、混入は２００未満の前方散乱値を示し、これはそれらが全細胞ではなく細胞細片であることを示す。
【図５】
細胞周期依存性レポーター不均一性。ＥＧＦＰを発現する細胞を蛍光ウィンドウに選別し、純度について再評価した（パネルＡ）。１８時間増殖させた後、細胞を蛍光強度について再評価した（パネルＢ）。この図は強度の範囲が最初の選別ウィンドウよりも広がったことを示す。
【図６】
図６は、細胞周期の間の蛍光と前方散乱の関係を図示する。６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、標準的な選別パラメーター（細胞周期の間、ＦＳＣを用いるレポーター遺伝子発現の検出における変化を補正しないもの）の使用結果を示す。この場合には、最初の選別後、細胞周期が細胞周期の異なる期に入ると（矢印で示される）その蛍光値が変化しその蛍光の見かけの変化を引き起こす。この結果は右のパネル（６Ｃ）に示されており、蛍光の別個のウィンドウに最初選別された細胞が今ではさらなるウィンドウに現れている。下部の図（６Ｄ、６Ｅおよび６Ｆ）は、細胞周期の間における、ＦＳＣと相関するレポーター遺伝子発現の検出における変化の補正結果を示す。この補正を用いれば、蛍光の特定のウィンドウに最初に選別された細胞は、細胞周期の異なる期へ入った後も最初の選別ウィンドウ内に留まる。
【図７】
図７は、細胞増殖後の蛍光ウィンドウ内に表示された細胞の回収に対する前方散乱軸のＣＤＲＨの補正作用を例示する。蛍光×前方散乱チャンネルの水平（上部左側パネル、Ａ）または傾斜した（下部左側パネル、Ｃ）選別ウィンドウの使用に基づいて一定の範囲の蛍光値を示す細胞を選別した。細胞を約２４時間増殖させて同一のウィンドウを用いて再評価した（上部右側パネル（Ｂ）；水平ウィンドウ；下部右側パネル（Ｄ）傾斜ウィンドウ）。
【図８】
図８は、自己蛍光およびＥＧＦＰ依存性蛍光に対する広域スペクトル照明の作用の例示である。上部パネルはＥＧＦＰを発現しないコントロール細胞集団に対する照明の作用を示し、すべての細胞の蛍光値が下方にシフトする。下部パネルはＥＧＦＰを発現しないものおよび低レベルのＥＧＦＰを発現するものからなる細胞の混合集団に対する照明の作用を示す。この場合には発現しない細胞のみが蛍光値の下方へのシフトを示す。このシフトの結果、バーによって示されるように、ＥＧＦＰ依存性蛍光を有する細胞とそれのない細胞間で顕著に分離される。
【図９】
試験化合物の作用のない１つのウェル（「負」と表示される）およびレポーター遺伝子発現が変更されている２つのウェル（「ヒット」と表示される）を示す、レポーター遺伝子発現に対して増強または抑制活性のいずれかを示す化合物の、複合性の低いマルチプレックス・スクリーニング。
【図１０】
試験化合物の作用のない１つのウェル（「負」と表示される）およびレポーター遺伝子発現が変更されている２つのウェル（「ヒット」と表示される）を示す、レポーター遺伝子発現に対して増強または抑制活性のいずれかを示す化合物の、複合性の高いマルチプレックス・スクリーニング。
【図１】
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【図３】
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【図６】
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【図８】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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