(57)【要約】本発明は、バニロイド受容体（ＶＲ１）アンタゴニスト活性を有する新規化合物、それらの製造方法、それらを含有する組成物、および種々の障害の治療におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004525127.tif 000011
［式中、
Ｐは、フェニルまたはナフチルであり；
Ｒ1は、ハロゲン、アルキル、ＣＦ3、ヒドロキシ、アルキルオキシ、ＣＮ、ＯＣＦ3、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、ニトロ、アミノ、モノ−もしくはジアルキルアミノ、またはＣ(Ｏ)アルキルであり；
ｐは、０、１、２または３であり；
ｎは、２、３、４、５または６であり；
Ｒ2は、ハロゲン、アルキル、ＣＦ3、アルコキシ、ＣＮ、ニトロ、アリール、ＯＣＦ3、Ｃ(Ｏ)アルキル、アミノ、またはモノ−もしくはジアルキルアミノであり；
ｑは、０、１、２または３であり；
Ｒ3は、水素、アルキルまたはアリールアルキルである］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩。
【請求項２】
Ｐがフェニルである請求項１記載の化合物。
【請求項３】
ｎが２である請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ3がエチルである請求項１〜３いずれか１項記載の化合物。
【請求項５】
Ｎ−[２−ブロモフェニル]−Ｎ'−[２−(Ｎ''−エチル−Ｎ''−(３−メチルフェニル)アミノ)エチル]尿素またはその医薬上許容される塩である請求項１記載の化合物。
【請求項６】
式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩の製造方法であって、式（ＩＩ）：
【化２】
2004525127.tif 000012
［式中、Ｒ1、Ｐおよびｐは式（Ｉ）における定義と同じである］
で示される化合物を式（ＩＩＩ）：
【化３】
2004525127.tif 000013
［式中、Ｒ2、Ｒ3、ｎおよびｑは式（Ｉ）における定義と同じであり、ＡおよびＢは、一緒に反応して尿素部分を形成することができる適当な官能基を含んでいる］
で示される化合物とカップリングさせ；その後、以下の任意の工程：
（１）いずれもの保護基を除去する工程；
（２）Ｒ1を別のＲ1に変換するか、または、Ｒ2を別のＲ2に変換するか、または、Ｒ3を別のＲ3に変換する工程；および
（３）式（Ｉ）で示される化合物の医薬上許容される塩を形成する工程
のうち１つまたはそれ以上を行うことを含む方法。
【請求項７】
治療に用いるための請求項１〜５いずれか１項記載の化合物。
【請求項８】
疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、術後疼痛、慢性関節リウマチ性疼痛、変形性関節炎性疼痛、背痛、内臓痛、癌性疼痛、痛覚過敏、神経痛、片頭痛、ニューロパシー、糖尿病性ニューロパシー、坐骨神経痛、ＨＩＶ関連ニューロパシー、ヘルペス後神経痛、線維筋痛、神経損傷、虚血、神経変性、発作、発作後疼痛、多発性硬化症、呼吸器系統疾患、喘息、咳、ＣＯＰＤ、炎症性障害、食道炎、胃食道逆流症（ＧＥＲＤ）、過敏性大腸症候群、炎症性腸疾患、骨盤過敏症、尿失禁、膀胱炎、火傷、乾癬、嘔吐および掻痒症からなる群から選択される障害の治療または予防に用いるための請求項１〜５いずれか１項記載の化合物。
【請求項９】
ヒトを含む哺乳類における疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、術後疼痛、慢性関節リウマチ性疼痛、骨関節炎性疼痛、背痛、内臓痛、癌性疼痛、痛覚過敏、神経痛、片頭痛、ニューロパシー、糖尿病性ニューロパシー、坐骨神経痛、ＨＩＶ関連ニューロパシー、ヘルペス後神経痛、線維筋痛、神経損傷、虚血、神経変性、発作、発作後疼痛、多発性硬化症、呼吸器系統疾患、喘息、咳、ＣＯＰＤ、炎症性障害、食道炎、胃食道逆流症(ＧＥＲＤ)、過敏性大腸症候群、炎症性腸疾患、骨盤過敏症、尿失禁、膀胱炎、火傷、乾癬、嘔吐および掻痒症からなる群から選択される障害の治療または予防方法であって、該患者に治療上有効量の請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩を投与することを含む方法。
【請求項１０】
請求項１〜５いずれか１項記載の化合物および医薬上許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規化合物、特に、薬理活性を有する新規尿素誘導体、それらの製造方法、それらを含む組成物、および種々の障害の治療におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
バニロイドは、バニリル（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェニル）基または機能上等価の基の存在によって特徴付けられる一群の天然化合物および合成化合物である。かかる化合物によって機能が調節されるバニロイド受容体（ＶＲ１）は広く研究されており、Szallasi and Blumberg（The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics, 1999, Vol. 51, No. 2）によって広範に概説されている。
【０００３】
異なる構造を有する広範囲に及ぶ種々のバニロイド化合物が当該技術分野で知られており、例えば、EP 347000、EP 401903、GB 2226313 および WO 92/09285 に開示されている化合物がある。バニロイド化合物またはバニロイド受容体モジュレーターの特に顕著な例は、トウガラシ類の植物であるから単離されたカプサイシン、すなわち、トランス−８−メチル−Ｎ−バニリル−６−ノネンアミド、カプサゼパイン（capsazepine）（Tetrahedron, Vol. 53, No. 13, pp. 4791-4814, 1997）およびオルバニル（olvanil） − Ｎ−(３−メトキシ−４−ヒドロキシ−ベンジル)オレアミド（J. Med. Chem. 1993, 36, 2595-2604）である。最近、ある種のバニロイド受容体アンタゴニストがWO02/08221 において開示された。
【０００４】
この度、バニロイド受容体（ＶＲ１）アンタゴニスト活性を有する構造上新規な一群の化合物が見出された。したがって、本発明は、第一の態様において、式（Ｉ）：
【化１】
2004525127.tif 000002
［式中、
Ｐは、フェニルまたはナフチルであり；
Ｒ1は、ハロゲン、アルキル、ＣＦ3、ヒドロキシ、アルキルオキシ、ＣＮ、ＯＣＦ3、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、ニトロ、アミノ、モノ−もしくはジアルキルアミノ、またはＣ(Ｏ)アルキルであり；
ｐは、０、１、２または３であり；
ｎは、２、３、４、５または６であり；
Ｒ2は、ハロゲン、アルキル、ＣＦ3、アルコキシ、ＣＮ、ニトロ、アリール、ＯＣＦ3、Ｃ(Ｏ)アルキル、アミノ、またはモノ−もしくはジアルキルアミノであり；
ｑは、０、１、２または３であり；
Ｒ3は、水素、アルキルまたはアリールアルキルである］
で示される化合物またはその医薬上許容される塩を提供する。
【０００５】
適当なアルキル基は、Ｃ1-6アルキル基である。
本明細書で使用する場合、「アルキル」は、単独で使用されようと別の基の一部として使用されようと、直鎖または分枝鎖アルキル基を表す。
【０００６】
「ハロゲン」なる用語は、本明細書において、他に記載されない限り、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素から選択される基を示すために用いられる。
【０００７】
「アリール」なる用語は、本明細書において、他に記載されない限り、フェニルまたはナフチルのような基を示すために用いられる。かかるアリール基は、１個またはそれ以上のＣ1-6アルキルまたはハロゲンによって置換されていてもよい。
【０００８】
「ナフチル」なる用語は、本明細書において、他に記載されない限り、ナフタレン−１−イルおよびナフタレン−２−イル基の両方を示すように用いられる。
Ｐがナフチルである場合、好ましい基は、ナフタレン−１−イルである。好ましくは、Ｐはフェニルである。
【０００９】
ｐが１またはそれ以上である場合、Ｒ1は、好ましくは、ハロゲン、Ｃ1-6アルキル（特に、メチル）、Ｃ1-6アルコキシ（特に、メトキシ）、Ｃ1-6アルキルチオ（特に、チオメチル）、Ｃ(Ｏ)Ｃ1-6アルキル（特に、アセチル）、ニトロ、ＣＦ3、ＣＮまたはＯＣＦ3である。
ｐが２または３である場合、基Ｒ1は、同一であっても異なっていてもよい。好ましくは、ｐは１または２である。
【００１０】
好ましくは、ｎは２または３であり、最も好ましくは、２である。
【００１１】
ｑが１またはそれ以上である場合、Ｒ2は、好ましくは、ハロゲン、Ｃ1-6アルキル（特に、メチル）、Ｃ1-6アルコキシ（特に、メトキシ）、ＣＦ3、ＣＮまたはアリール（特に、フェニル）である。
ｑが２または３である場合、基Ｒ2は、同一であっても異なっていてもよい。好ましくは、ｑは１または２である。最も好ましくは、ｑは１であり、Ｒ2はフェニル環の３位に置換されているメチル基である。
【００１２】
Ｒ3がアルキルである場合、特に好ましい基はエチルである。Ｒ3がアリールアルキルである場合、好ましい基としては、ベンジルまたは２−フェネチルが挙げられる。
【００１３】
本発明の特に好ましい化合物は、Ｎ−[２−ブロモフェニル]−Ｎ'−[２−(Ｎ''−エチル−Ｎ''−(３−メチルフェニル)アミノ)エチル]尿素またはその医薬上許容される塩である。本発明の他の好ましい化合物としては、実施例Ｅ１、Ｅ２、Ｅ５、Ｅ１３、Ｅ１４、Ｅ１６、Ｅ１７、Ｅ２１、Ｅ２８、Ｅ２９およびＥ３０（下記表１を参照）またはその医薬上許容される塩が挙げられる。
【００１４】
適当には、Ｒ1はハロゲンである。
適当には、Ｒ2はハロゲンまたはアルキル（例えば、メチル）である。
【００１５】
式（Ｉ）で示される化合物は、慣用的な医薬上許容される酸のような酸、例えば、マレイン酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、酢酸、フマル酸、サリチル酸、クエン酸、乳酸、マンデル酸、酒石酸およびメタンスルホン酸との酸付加塩を形成することができる。
【００１６】
式（Ｉ）で示される化合物は、また、水和物のような溶媒和物を形成することができ、本発明はまたこれらの形態に及ぶ。本明細書において言及される場合、「式（Ｉ）で示される化合物」なる用語は、これらの形態を包含すると理解される。
【００１７】
式（Ｉ）で示されるある種の化合物は、ジアステレオマーおよびエナンチオマーを含む立体異性体形態で存在することができ、本発明は、これらの立体異性体形態の各々、およびラセミ化合物を含むそれらの混合物に及ぶ。種々の立体異性体形態を常法によりお互いに分離することができるか、または、立体特異的合成または不斉合成によって所定の異性体を得ることができる。本発明はまた、互変異性体およびそれらの混合物にも及ぶ。
【００１８】
本発明はまた、さらなる態様において、式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩の製造方法であって、式（ＩＩ）：
【化２】
2004525127.tif 000003
［式中、Ｒ1、Ｐおよびｐは式（Ｉ）における定義と同じである］
で示される化合物を式（ＩＩＩ）：
【化３】
2004525127.tif 000004
［式中、Ｒ2、Ｒ3、ｎおよびｑは式（Ｉ）における定義と同じであり、ＡおよびＢは、一緒に反応して尿素部分を形成することができる適当な官能基を含んでいる］
で示される化合物とカップリングさせ；その後、以下の任意の工程：
（１）いずれもの保護基を除去する工程；
（２）Ｒ1を別のＲ1に変換するか、または、Ｒ2を別のＲ2に変換するか、または、Ｒ3を別のＲ3に変換する工程；および
（３）式（Ｉ）で示される化合物の医薬上許容される塩を形成する工程
のうち１つまたはそれ以上を行うことを含む方法を提供する。
【００１９】
適当なＡおよびＢ基の適当な例としては以下のものが挙げられる：
（ａ）Ａが−Ｎ＝Ｃ＝Ｏであり、ＢがＮＨ2であるか；または
（ｂ）ＡがＮＨ2であり、ＢがＮＨ2であるか；または
（ｃ）ＡがＮＨ2であり、ＢがＮ＝Ｃ＝Ｏである。
【００２０】
方法（ａ）または（ｃ）において、すなわち、Ａが−Ｎ＝Ｃ＝Ｏであり、ＢがＮＨ2であるか、またはその逆である場合、該反応は、ジクロロメタンまたはアセトニトリルのような不活性溶媒中にて行われる。
【００２１】
方法（ｂ）において、該反応は、好ましくは、トリエチルアミンまたはピリジンのような塩基の存在下であってもよく、周囲温度または高温にてジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、またはジクロロメタンのような不活性有機溶媒である適当な溶媒中、カルボニルジイミダゾールまたはホスゲンのような適当な尿素化剤の存在下にて行われる。
【００２２】
式（Ｉ）で示される非対称尿素化合物の別の合成方法は、ジアリールカーボネートから、対応するカルバメートを経由するものである。かかる方法は、Freer et al.（Synthetic Communications, 26(2), 331-349, 1996）によって開示されている。かかる方法が式（Ｉ）で示される化合物の製造用に容易に適応しうることは当業者によって理解されるであろう。
【００２３】
上記した任意の工程（１）、(２）または（３）は、適当な慣用の方法、例えば、Comprehensive Organic Transformations, R.C. Larock, Wiley-VCH (Chichester), 1999 のような標準的な参考書に開示されている方法を使用して行われる。
【００２４】
当業者は、ある種の基を保護する必要があり得るということを認識するであろう。適当な保護基ならびにそれらの結合および除去方法は、Greene T.W.‘Protective groups in organic synthesis’New York, Wiley (1981) に記載されている方法のように有機化学の技術分野において慣用的である。
【００２５】
式（ＩＩ）および（ＩＩＩ）で示される化合物は、商業的に入手可能であるか、または、公知の方法または公知の方法と類似している方法に従って製造され得る。
【００２６】
医薬上許容される塩は、適当な酸または酸誘導体との反応によって製造され得る。
【００２７】
式（Ｉ）で示される化合物およびそれらの医薬上許容される塩はバニロイド受容体アンタゴニスト（ＶＲ１）活性を有し、疼痛、慢性疼痛、神経因性疼痛、術後疼痛、慢性関節リウマチ性疼痛、骨関節炎性疼痛、背痛、内臓痛、癌性疼痛、痛覚過敏、神経痛、片頭痛、ニューロパシー、糖尿病性ニューロパシー、坐骨神経痛、ＨＩＶ関連ニューロパシー、ヘルペス後神経痛、線維筋痛、神経損傷、虚血、神経変性、発作、発作後疼痛、多発性硬化症、呼吸器系統疾患、喘息、咳、ＣＯＰＤ、炎症性障害、食道炎、胃食道逆流症(ＧＥＲＤ）、過敏性大腸症候群、炎症性腸疾患、骨盤過敏症、尿失禁、膀胱炎、火傷、乾癬、嘔吐および掻痒症のようなある種の障害の治療または予防に用いられる可能性のあるものであると考えられる。
【００２８】
かくして、本発明はまた、特に、上記障害の治療または予防における治療物質として用いるための式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩を提供する。特に、本発明は、慢性および急性疼痛ならびに尿失禁の治療または予防に用いるための式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩もしくはその溶媒和物を提供する。
【００２９】
本発明は、さらに、ヒトを含む哺乳類における上記障害の治療または予防方法であって、該患者に治療上有効量の式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩を投与することを含む方法を提供する。
【００３０】
本発明はまた、式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩および医薬上許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００３１】
適当には、周囲温度および大気圧で、混合することによって調製され得る本発明の医薬組成物は、通常、経口投与、非経口投与、直腸投与または膀胱への膀胱内投与用に適応し、そういうものとして、錠剤、カプセル剤、経口液体製剤、散剤、顆粒剤、ロゼンジ剤、復元用散剤、注射用もしくは注入用液剤、懸濁剤または坐剤の剤形であってよい。経口投与用組成物が一般に好ましい。
【００３２】
経口投与用の錠剤およびカプセル剤は、１回投与型剤形であってよく、結合剤、充填剤、錠剤化用滑沢剤、崩壊剤および許容される湿潤剤のような慣用的な賦形剤を含有し得る。該錠剤は、通常の製薬業務において周知の方法に従って被覆され得る。
【００３３】
経口液体製剤は、例えば、水性もしくは油性懸濁剤、液剤、乳剤、シロップ剤またはエリキシル剤の剤形であり得るか、または、使用前に水または他の適当なビヒクルで復元するための乾燥製剤の剤形であり得る。かかる液体製剤は、懸濁化剤、乳化剤、（食用油を包含し得る）非水性ビヒクル、保存剤、および所望により、慣用的なフレーバーまたは着色料のような慣用的な添加剤を含有し得る。
【００３４】
非経口投与については、本発明の化合物またはその医薬上許容される塩および滅菌ビヒクルを用いて流体単位投与剤形が調製される。当該化合物は、使用されるビヒクルおよび濃度に依存して、ビヒクルに懸濁または溶解され得る。液剤の調製において、当該化合物を注射用に溶解し、濾過滅菌した後に適当なバイアルまたはアンプルに充填し、密封することができる。有利には、局所麻酔薬、保存剤および緩衝剤のような補助剤をビヒクルに溶解させる。安定性を増強するために、該組成物をバイアルに充填した後、冷凍し、水分を真空除去することができる。非経口懸濁剤は、当該化合物をビヒクルに溶解させずに懸濁させること、および滅菌を濾過により行うことができないこと以外は、実質的に同一の方法で調製される。当該化合物を酸化エチレンに曝露させることにより滅菌した後、滅菌ビヒクルに懸濁させる。有利には、界面活性剤または湿潤剤を当該組成物に含ませて化合物の均一な分散を促進させることができる。
【００３５】
当該組成物は、投与方法に依存して、活性物質を０.１重量％〜９９重量％、好ましくは、１０〜６０重量％含有してよい。
【００３６】
上記障害の治療において使用される当該化合物の用量は、通常、障害の重篤度、患者の体重、および他の類似のファクターによって異なる。全身投与について、疼痛の治療には、体重１ｋｇにつき０.０１ｍｇ〜１００ｍｇの投与レベルが有用である。しかしながら、一般的な基準としては、適当な単位投与量は０.０５〜１０００ｍｇであり、より適当には、０.０５〜２０、２０〜２５０、または０.１〜５００.０ｍｇであり、例えば、０.２〜５および０.１〜２５０ｍｇである；かかる単位投与量を１日に１回よりも多く、例えば、１日２または３回投与して、合計日用量が約０.５〜１０００ｍｇの範囲となる；かかる治療は数週間または数ヶ月間に及ぶことができる。
【００３７】
本発明に従って投与した場合、本発明の化合物について許容されない毒物学的効果は考えられない。
【００３８】
以下の実施例は本発明の化合物の製造を例示する。
【００３９】
記載例１
Ｎ−エチル−Ｎ−(３−フルオロフェニル)エチレンジアミン
【化４】
2004525127.tif 000005
Ｎ−エチル−３−フルオロアニリン（９.２ｇ、６６ｍｍｏｌ）および２−ブロモエチルアミン・臭化水素酸塩（０.５当量）をトルエン（１００ｍｌ）中にて還流させながら２４時間加熱した。冷却後、溶媒を減圧除去し、残留物をジエチルエーテル（１００ｍｌ）に懸濁させ、炭酸カリウム水溶液（２０％溶液、２×１００ｍｌ）で洗浄した。エーテル層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧除去した。シリカゲルクロマトグラフィーに付してジクロロメタンおよびメタノール（勾配液、最大１０％）で溶離して油状物として標記化合物を得た（３.９ｇ）。ＭＨ+ １８３（１００％）。
【００４０】
記載例２
Ｎ−エチル−Ｎ−(３−フルオロ−４−メチルフェニル)エチレンジアミン
【化５】
2004525127.tif 000006
記載例１に概略記載した手順に従って、Ｎ−エチル−３−フルオロ−４−メチルアニリンおよび２−ブロモエチルアミン・臭化水素酸塩から標記化合物を製造した。ＭＨ+ １９７。
【００４１】
記載例３
Ｎ−エチル−Ｎ−(３,４−ジフルオロフェニル)エチレンジアミン
【化６】
2004525127.tif 000007
記載例１に概略記載した手順に従って、Ｎ−エチル−３,４−ジフルオロアニリンおよび１−ブロモエチルアミン・臭化水素酸塩から標記化合物を製造した。ＭＨ+ ２０１。
【００４２】
記載例４
Ｎ−エチル−Ｎ−(３−メチル−４−フルオロフェニル)エチレンジアミン
【化７】
2004525127.tif 000008
記載例１に概略記載した手順に従って、Ｎ−エチル−４−フルオロ−３−メチルアニリンおよび２−ブロモエチルアミン・臭化水素酸塩から標記化合物を製造した。ＭＨ+ １９７。
【００４３】
実施例１
Ｎ−[２−ブロモフェニル]−Ｎ'−[２−(Ｎ''−エチル−Ｎ''−(３−メチルフェニル)アミノ)エチル]尿素
【化８】
2004525127.tif 000009
Ｎ−エチル−Ｎ−(３−メチルフェニル)エチレンジアミン（ＴＣＩ、日本国）（０.５ｇ、２.８ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３ｍｌ）中溶液をＤＣＭ（２ｍｌ）中の２−ブロモフェニルイソシアネート（アルドリッチ（Aldrich））（０.５７ｇ、２.８ｍｍｏｌ）で処理した。該反応を室温で１時間撹拌した後、溶媒を減圧除去してオフホワイト色の固体として所望の生成物を得た（０.９１ｇ、８６％）。
1Ｈ ＮＭＲ（２５０ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ（ｐｐｍ）：８.００（ｄ，１Ｈ）、７.５０（ｄ，１Ｈ）、７.２６（ｍ，１Ｈ）、７.１０（ｍ，１Ｈ）、６.９２（ｍ，１Ｈ）、６.５５（ｍ，４Ｈ）、４.９５（ｂｒ，１Ｈ）、３.４７（ｍ，４Ｈ）、３.３７（ｑ，２Ｈ）、２.３０（ｓ，３Ｈ）、１.１４（ｔ，３Ｈ）。
【００４４】
実施例Ｅ１の手順と同様の手順に従って表１に示される化合物を製造した。これらの実施例の合成に用いられる全てのイソシアネートは商業的に入手可能である。
【００４５】
【表１】
2004525127.tif 000010
【００４６】
薬理データ
上記のとおり、本発明の化合物は、バニロイド受容体（ＶＲ１）アンタゴニストであり、有用な医薬特性を有する。バニロイド受容体（ＶＲ１）アンタゴニスト活性は、慣用の方法、例えば、D. Le Bars, M. Gozarin and S. W. Cadden, Pharmacological Reviews, 2001, 53(4), 597-652のような標準的な参考書または本明細書に記載するこのような他のテキストに開示されている方法によって特定の化合物について確認および証明され得る。本発明の化合物について用いられるスクリーンは、Smart et al.（British Journal of Pharmacology, 2000, 129, 227-230）によって記載されたものと同様の、ＦＬＩＰＲベースのカルシウムアッセイに由来した。
【００４７】
ヒトＶＲ１を安定に発現している形質移入された星細胞腫１３２１Ｎ１細胞を２５,０００細胞／ウェル（９６−ウェルプレート）でＦＬＩＰＲプレート中に播き、一夜培養した。次いで、暗所にて、４μＭ Ｆｌｕｏ−３ ＡＭ（モレキュラー・プローブス（Molecular Probes））を含有する培地中に該細胞を室温で２時間負荷した。次いで、プロベネシドを用いずに、１.５ｍＭカルシウムを含有するタイロード（Ｔｙｒｏｄｅ）で、該プレートを４回洗浄した。
【００４８】
該細胞を化合物またはバッファー対照と一緒に室温で３０分間プレインキュベートした。次いで、該細胞にカプサイシン（シグマ（Sigma））を加えた。化合物を含まないバッファー対照と比較したカプサイシンを添加した後に測定した場合の蛍光の差異を検出することによってヒトＶＲ１に対するアンタゴニスト活性を有する化合物を同定した。かくして、例えば、バッファー対照において、カプサイシン添加の結果、蛍光を生じる細胞内カルシウムの増加が生じた。アンタゴニスト活性を有する化合物はカプサイシンが該受容体に結合するのを遮断し、シグナリングはなく、したがって、細胞内カルシウムレベルが増加せず、その結果、蛍光が低下する。ｐＫＢ値は、Cheng-Prusoff方程式を用いてＩＣ50から得られる。
上記方法によって試験した全て化合物はｐＫｂ＞６を有し、好ましい化合物はｐＫｂ＞７.０を有していた。
【国際公開パンフレット】
2004525127.tif 000014
2004525127.tif 000015
2004525127.tif 000016
2004525127.tif 000017
2004525127.tif 000018
2004525127.tif 000019
2004525127.tif 000020
2004525127.tif 000021
2004525127.tif 000022
2004525127.tif 000023
2004525127.tif 000024
2004525127.tif 000025
2004525127.tif 000026
2004525127.tif 000027
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004525127.tif 000028
【国際調査報告】
2004525127.tif 000029
2004525127.tif 000030
2004525127.tif 000031
2004525127.tif 000032