(57)【要約】活性剤の送達のための化合物及び組成物を提供する。投与及び調製の方法もまた提供する。様々な生物学的、化学的、及び物理的バリアにも妨げられずに、広範な活性剤の標的への送達を可能にするための所定の化合物及び／またはその塩の形態の化合物及び組成物、これを用いる投与方法及びその調製方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式：
【化１】
2004521857.tif 000010
の化合物及びその塩。
【請求項２】
（Ａ）活性剤；及び
（Ｂ）下式：
【化２】
2004521857.tif 000011
を有する化合物、その塩、またはそれら混合物；
を含む組成物。
【請求項３】
前記活性剤が、生物学的活性剤、化学的活性剤、及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項２の組成物。
【請求項４】
前記生物学的活性剤が、少なくとも１つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ホルモン、多糖類、ムコ多糖類、炭水化物、または脂質を含む、請求項３の組成物。
【請求項５】
前記生物学的活性剤が、成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、組換えヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インターフェロン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インスリン、ブタインスリン、ウシインスリン、ヒトインスリン、ヒト組換えインスリン、インスリン様増殖因子、インスリン様増殖因子−ｌ、ヘパリン、未分画ヘパリン、ヘパリノイド、デルマタン、コンドロイチン、低分子量ヘパリン、極低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン、カルシトニン、サケカルシトニン、ウナギカルシトニン、ヒトカルシトニン、エリトロポエチン（ＥＰＯ）、心房性ナトリウム利尿因子、抗原、モノクローナル抗体、ソマトスタチン、プロテアーゼ阻害剤、アドレノコルチコトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモン、オキシトシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、卵胞刺激ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、トロンボポエチン、フィルグラスチム、プロスタグランジン、シクロスポリン、バソプレシン、クロモリンナトリウム、ナトリウムクロモグリカート、二ナトリウムクロモグリカート、バンコマイシン、デフェリオキサミン、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモンのフラグメント、抗菌剤、抗真菌剤、ビタミン；これらの化合物の類似物、フラグメント、擬剤、及びポリエチレングリコール変性誘導体；及びこれらのあらゆる組み合わせからなる群より選択される、請求項３の組成物。
【請求項６】
前記生物学的活性剤が、インスリン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、クロモリンナトリウム、またはこれらのあらゆる組み合わせを含む、請求項３の組成物。
【請求項７】
前記生物学的活性剤が、インスリンを含む、請求項３の組成物。
【請求項８】
前記生物学的活性剤が、インターフェロンを含む、請求項３の組成物。
【請求項９】
（Ａ）請求項２に記載の組成物；及び
（Ｂ）（ａ）賦形剤、
（ｂ）希釈剤、
（ｃ）崩壊剤、
（ｄ）潤滑剤、
（ｅ）可塑剤、
（ｆ）着色剤、
（ｇ）投薬媒体、または
（ｈ）これらのあらゆる組み合わせ；
を含む投薬単位形態。
【請求項１０】
前記活性剤が、生物学的活性剤、化学的活性剤、及びこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項９に記載の投薬単位形態。
【請求項１１】
前記生物学的活性剤が、少なくとも１つのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ホルモン、多糖類、ムコ多糖類、炭水化物、または脂質を含む、請求項１０に記載の投薬単位形態。
【請求項１２】
前記生物学的活性剤が、成長ホルモン、ヒト成長ホルモン、組換えヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、ブタ成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、インターフェロン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、インターロイキン−１、インターロイキン−２、インスリン、ブタインスリン、ウシインスリン、ヒトインスリン、ヒト組換えインスリン、インスリン様増殖因子、インスリン様増殖因子−ｌ、ヘパリン、未分画ヘパリン、ヘパリノイド、デルマタン、コンドロイチン、低分子量ヘパリン、極低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリン、カルシトニン、サケカルシトニン、ウナギカルシトニン、ヒトカルシトニン、エリトロポエチン、心房性ナトリウム利尿因子、抗原、モノクローナル抗体、ソマトスタチン、プロテアーゼ阻害剤、アドレノコルチコトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモン、オキシトシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、卵胞刺激ホルモン、グルコセレブロシダーゼ、トロンボポエチン、フィルグラスチム、プロスタグランジン、シクロスポリン、バソプレシン、クロモリンナトリウム、ナトリウムクロモグリカート、二ナトリウムクロモグリカート、バンコマイシン、デフェリオキサミン、副甲状腺ホルモン、副甲状腺ホルモンのフラグメント、抗菌剤、抗真菌剤、ビタミン、これらの化合物の類似物、フラグメント、擬剤、及びポリエチレングリコール変性誘導体、及びこれらのあらゆる組み合わせからなる群より選択される、請求項１０の投薬単位形態。
【請求項１３】
前記生物学的活性剤が、インスリン、ヒト成長ホルモン、インターフェロン、クロモリンナトリウム、またはこれらのあらゆる組み合わせを含む、請求項１０に記載の投薬単位形態。
【請求項１４】
前記活性剤がインスリンを含む、請求項９の投薬単位形態。
【請求項１５】
前記活性剤がインターフェロンを含む、請求項９の投薬単位形態。
【請求項１６】
錠剤、カプセル、粒子、粉末、薬包、または液体の形態である、請求項９の投薬単位形態。
【請求項１７】
前記投薬媒体が、水、２５％の水性ポリエチレングリコール、リン酸緩衝液、１，２−プロパンジオール、エタノール、及びこれらのあらゆる組み合わせから選択される液体である、請求項９に記載の投薬単位形態。
【請求項１８】
生物学的活性剤を、前記剤を必要とする動物に投与する方法であって、請求項３の組成物を、前記動物に経口投与する工程を含む方法。
【請求項１９】
以下：
（Ａ）少なくとも一つの活性剤；
（Ｂ）請求項１の化合物；及び
（Ｃ）任意の投薬媒体；
を混合する工程を含む組成物の調製方法。
【請求項２０】
請求項３の組成物を、これを必要とする患者に投与する工程を含む、疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、生物学的活性剤または化学的活性剤等の活性剤を標的に送達するための化合物に関する。これらの化合物は、経口、結腸内、肺から、あるいは別の経路からの動物への投与のための、活性剤との非共有結合混合物の生成に非常に好適である。こうした組成物の調製及び投与の方法もまた開示する。
【０００２】
【従来の技術】
活性剤の送達のための従来の手段は、生物学的、化学的、及び物理的バリアによってしばしば厳しく制限される。典型的には、これらのバリアは、送達が起きる環境、送達の標的の環境、及び／または標的自身によって負わされる。生物学的活性剤及び化学的活性剤は、特にこうしたバリアに対して脆弱である。
【０００３】
生物学的に活性または化学的に活性な薬理剤及び治療剤の動物への送達においては、バリアは身体によって課される。物理的バリアの例は、所定の活性剤にとっては比較的に非浸透性であるが、循環器系などの標的に到達する前には越えねばならない、皮膚、脂質二重層、及び様々な器管の膜である。化学的バリアには、これらに制限されるものではないが、胃腸（ＧＩ）管内におけるｐＨ変化及び分解酵素が含まれる。
【０００４】
これらのバリアは、経口送達システムの設計において、特に重要である。生物学的、化学的、及び物理的バリアがないとすれば、多くの生物学的または化学的活性剤の経口送達は、動物への投与のために選択すべき経路となるであろう。典型的に経口投与になじみにくい多数の剤の中には、生物学的または化学的に活性なペプチド、例えばカルシトニン及びインスリン；多糖類、特にこれに限定するものではないがヘパリンを含むムコ多糖類；ヘパリノイド；抗生物質；及び他の有機物質がある。これらの剤は、胃腸管内で、酸加水分解、酵素などによって、迅速に不活性化または破壊される。さらに、巨大分子薬剤のサイズ及び構造は、吸収を妨げうる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
脆弱な薬理剤の経口投与のための初期の方法は、腸壁の浸透性を人工的に増大させるための助剤（例えば、レゾルシノール及び非イオン性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテル）の共投与、並びに酵素による分解を抑制するための酵素阻害剤（例えば、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスファート（ＤＦＦ）及びトラシロール（ｔｒａｓｙｌｏｌ））の共投与に依存してきた。リポソームがまた、インスリン及びヘパリンのための薬剤送達システムとして開示されている。しかしながら、こうした薬剤送達システムの広範な使用は、不可能である。なぜなら、（１）該システムが、助剤または阻害剤の毒性量を要する；（２）好適な低分子量の貨物、すなわち活性剤が入手できない；（３）該システムが、安定性に乏しく、不適当な貯蔵寿命を示す；（４）該システムが、製造困難である；（５）該システムが、活性剤（貨物）を保護できない；（６）該システムが、活性剤を不利に変質させる；または（７）該システムが、活性剤を吸収させること、または活性剤の吸収を促進することができない；ためである。
【０００６】
近年、プロテイノイドミクロスフィアが、薬理剤の送達に使用されている。例えば、米国特許第５，４０１，５１６号；第５，４４３，８４１号；及び参照番号３５，８６２号を参照のこと。更に、所定の変性アミノ酸が、製薬品の送達に使用されている。例えば、米国特許第５，６２９，０２０号；第５，６４３，９５７号；第５，７６６，６３３号；第５，７７６，８８８号；及び第５，８６６，５３６号を参照のこと。
しかしながら、簡便且つ安価で、容易に調製され、広範な活性剤を多様な経路から送達可能な送達システムが、依然として望まれている。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、活性剤の送達を容易にする化合物及び組成物を提供する。本発明の送達剤化合物には、下式を有するもの及びその塩が含まれる。
【０００８】
【化３】
2004521857.tif 000002
【０００９】
本発明の組成物には、少なくとも１つの活性剤、好ましくは生物学的活性剤または化学的活性剤、及び少なくとも１つの本発明の化合物またはその塩が含まれる。こうした組成物の調製及び投与の方法も提供される。
【００１０】
さらに提供されるのは、前記組成物を含む投薬単位形態である。投薬単位は、固体（例えば錠剤、カプセルまたは粒子、例えば粉末または薬包）または液体の形態であってよい。
【００１１】
生物学的な活性剤を、前記剤を必要とする動物に投与する方法であって、特に経口、結腸内、または肺からの経路による方法もまた、本発明の組成物と共に提供され、更にこうした組成物を使用する治療方法も提供される。本発明の組成物を、前記組成物を必要とする動物に投与することを含む、疾患の治療方法が提供される。
【００１２】
【発明の実施の形態】
（化合物）
化合物は、カルボン酸またはその塩の形態であってよい。塩には、以下に制限されるものではないが、有機または無機の塩、例えばナトリウム、カリウム、及びリチウム等のアルカリ金属塩；マグネシウム、カルシウム、またはバリウム等のアルカリ土類金属塩；アンモニウム塩；塩基性アミノ酸、例えばリシンまたはアルギニン；及び有機アミン、例えばジメチルアミンまたはピリジンが含まれる。好ましくは、前記塩はナトリウム塩である。前記塩は、一価または多価の塩、例えば一ナトリウム塩及び二ナトリウム塩であってよい。前記塩はまた、エタノール溶媒和化合物を含む溶媒和化合物であってもよい。
【００１３】
更に、１つ以上のこれらの化合物を含む多価アミノ酸及びペプチドを使用しても良い。
【００１４】
アミノ酸とは、少なくとも１つの遊離アミン基を有するあらゆるカルボン酸であり、天然及び合成のアミノ酸が含まれる。ポリアミノ酸は、ペプチド（これはペプチド結合によって接合された２つ以上のアミノ酸である）であるか、例えばエステルまたは無水結合などによって結合可能な、別の基により形成された結合によって結合した、２つ以上のアミノ酸である。ペプチドは、２つのアミノ酸を有するジペプチドから数百のアミノ酸を有するポリペプチドまで、長さはさまざまに異なって良い。１つ以上のアミノ酸またはペプチドユニットは、アシル化またはスルホン化されていてよい。
【００１５】
ここに記載した１つ以上のアミノ酸は、本開示及びＷＯ９６／３００３６、ＷＯ９７／３６４８０、ＵＳ５，６４３，９５７、及びＵＳ５，６５０，３８６に記載された方法に基づいて、当業者の技術常識の範囲内である方法によって、アミノ酸から誘導して良く、アミノ酸から容易に調製可能である。例えば、該化合物は、単一のアミノ酸を、アミノ酸中に存在する遊離のアミノ部分と反応してアミドを形成する、適当なアシル化剤またはアミン変性剤と反応させることによって調製しても良い。当業者には既知であるように、望ましからぬ副反応を避けるために保護基を使用しても良い。保護基に関しては、参照のためにここに取り込むこととする、Ｔ．Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｗｉｌｅｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８１）が参照される。
【００１６】
本発明の化合物の塩は、当業界において既知の方法により製造して良い。例えば、ナトリウム塩は、当該化合物をエタノールに溶解させ、水性水酸化ナトリウムを加えることによって製造して良い。
【００１７】
該化合物は、再結晶、または単独もしくはタンデムに接合した１つ以上の固体クロマトグラフィー支持体上での分画によって精製可能である。好適な再結晶溶媒システムには、以下に制限されるものではないが、アセトニトリル、メタノール、及びテトラヒドロフランが含まれる。分画は、メタノール／ｎ−プロパノール混合物を溶離液として使用し、アルミナなどの適当なクロマトグラフィー支持体上にて；トリフルオロ酢酸／アセトニトリル混合物を溶離液として使用し、逆相クロマトグラフィーにて；さらに水または好適な緩衝液を溶離液として使用してイオン交換クロマトグラフィーにて；実行可能である。アニオン交換クロマトグラフィーを行う場合には、好ましくは０−５００ｍＭの塩化ナトリウム勾配を採用する。
１つの実施態様によれば、該化合物は、その無水形態で使用される。
【００１８】
（活性剤）
本発明における使用に好適な活性剤には、以下に制限されるものではないが、殺虫剤、薬理剤及び治療剤を含む、生物学的及び化学的な活性剤が含まれる。
例えば、本発明における使用に好適な生物学的または化学的な活性剤には、以下に制限されるものではないが、タンパク質；ポリペプチド；ペプチド；ホルモン；多糖類、特にムコ多糖類の混合物；炭水化物：脂質；他の有機化合物；及び、特に単独では胃腸粘膜を通過しない（または投与用量の一部のみが通過する）、及び／または胃腸管内で酸及び酵素により化学開裂しがちである化合物；またはこれらのあらゆる組み合わせが含まれる。
【００１９】
さらなる例には、以下に制限されるものではないが、これらの合成、天然または組換え源を含む以下のものが含まれる：ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、ウシ成長ホルモン、及びブタ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出ホルモン；α、β及びγを含むインターフェロン；インターロイキン−１；インターロイキン−２；ブタ、ウシ、ヒト、及びヒト組換えのものを含み、任意に亜鉛、ナトリウム、カルシウム及びアンモニウムを含むカウンターイオンを有するインスリン；ＩＧＦ−１を含むインスリン様増殖因子；未分画ヘパリン、ヘパリノイド、デルマタン、コンドロイチン、低分子量ヘパリン、極低分子量ヘパリン、超低分子量ヘパリンを含むヘパリン；サケ、ウナギ、ブタ、及びヒトのカルシトニン；エリトロポエチン；心房性ナトリウム利尿因子（ａｔｒｉａｌ ｎａｔｕｒｅｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ）；抗原；モノクローナル抗体；ソマトスタチン；プロテアーゼ阻害剤；アドレノコルチコトロピン；ゴナドトロピン放出ホルモン；オキシトシン；黄体形成ホルモン放出ホルモン；卵胞刺激ホルモン；グルコセレブロシダーゼ；トロンボポエチン；フィルグラスチム（ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）；プロスタグランジン；シクロスポリン；バソプレシン；クロモリンナトリウム（ナトリウムまたは二ナトリウムのクロモグリカート）；バンコマイシン；デフェリオキサミン（ＤＦＯ）；そのフラグメントを含む副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）；抗真菌剤を含む抗微生物剤；ビタミン；これらの化合物の類似物、フラグメント、擬剤及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）変性誘導体；またはこれらのあらゆる組み合わせ。以下に限定されるものではないが、インスリンの合成形態を含むインスリンの別の好ましい形態は、参照のためにそれぞれその全体をここに取り込むこととする、米国特許第４，４２１，６８５号、５，４７４，９７８号、及び５，５３４，４８８号に記載されている。
【００２０】
（送達システム）
本発明の組成物は、送達剤及び１つ以上の活性剤を含む。１つの実施態様においては、１つ以上の送達剤化合物、またはこれら化合物の塩、またはこれら化合物または塩がその１つ以上のユニットを成すポリアミノ酸またはペプチドを、投与の前に活性剤と混合することによって送達剤として使用して良い。
【００２１】
投与組成物は、液体の形態であってよい。投薬媒体は、水（例えば、サケカルシトニン、副甲状腺ホルモン、及びエリトロポエチン用）、２５％ポリエチレングリコール水溶液（例えばヘパリン用）、及びリン酸緩衝液（例えばｒｈＧＨ用）であってよい。別の投薬媒体には、ポリエチレングリコール、ソルビトール、マルチトール、及びスクロースが含まれる。投薬溶液は、送達剤化合物の溶液を活性剤の溶液と、投与の直前に混合することによって調製しても良い。あるいは、送達剤（または活性剤）の溶液を、活性剤（または送達剤）の固体形態と混合してもよい。送達剤化合物と活性剤とはまた、乾燥粉末として混合してもよい。送達剤化合物と活性剤とをまた、製造工程中に混合することも可能である。
【００２２】
投薬溶液は、リン酸緩衝液塩、クエン酸、グリコール、または他の分散剤などの添加剤を任意に含有可能である。安定化添加剤は、好ましくは約０．１乃至２０％（ｗ／ｖ）の濃度で該溶液に導入可能である。
【００２３】
あるいは、前記投与組成物は、錠剤等の固体、粉末もしくは薬包などのカプセルまたは粒剤の形態であってもよい。固体投与形態は、固体形態の化合物と固体形態の活性剤とを混合することによって調製しても良い。あるいはまた、当業界において既知の方法、例えばフリーズドライ、沈殿、結晶化、及び固体分散等により、化合物の溶液と活性剤とから得てもよい。
【００２４】
本発明の投与組成物はまた、１つ以上の酵素阻害剤を含有可能である。こうした酵素阻害剤には、以下に制限されるものではないが、アクチノニンまたはエピアクチノニン及びこれらの誘導体が含まれる。他の酵素阻害剤には、以下に制限されるものではないが、アプロチニン（Ｔｒａｓｙｌｏｌ）及びボーマン‐バークインヒビターが含まれる。
【００２５】
本発明の投与組成物に使用される活性剤の量は、標的とする適応症のための特定の活性剤の目的を達成するのに有効な量である。該組成物中の活性剤の量は、典型的には、薬理学的、生物学的、治療上、または化学的に有効な量である。しかしながら、この量は、該組成物が投薬単位形態で使用される場合には前記の量未満であっても良く、なぜなら、投薬単位形態は、複数の化合物／活性剤組成物を含有しても、または薬理学的、生物学的、治療上、または化学的に有効な量を分割して含有してもよい。全有効量を、総計で前記活性剤の有効量を含有する累積単位として投与することも可能である。
【００２６】
使用する活性剤の総量は、当業者に周知の方法によって決定可能である。しかしながら、該組成物は従来の組成物よりも有効に活性剤を送達可能であるため、従来の投薬単位形態において使用されるよりも低量の生物学的または化学的活性剤を被験者に投与する一方で、依然として同様の血中濃度及び／または治療効果を達成することが可能である。
【００２７】
本発明により開示される化合物は、特に経口、鼻腔、舌下、十二指腸内、皮下、口腔、結腸内、直腸、腟、粘膜、肺、経皮、真皮内、非経口、静脈内、筋内、及び視覚系から、並びに血液脳関門の通過により、生物学的または化学的活性剤を送達する。
【００２８】
投薬単位形態はまた、賦形剤、希釈剤、崩壊剤、潤滑剤、可塑剤、着色剤、香料、テイスト・マスキング剤、糖類、甘味料、塩、及び以下に限定されるものではないが、水、１，２−プロパンジオール、エタノール、オリーブオイル、またはこれらのあらゆる組み合わせを含む投薬媒体をいずれか一つあるいは組み合わせを含有可能である。
【００２９】
懸かる発明の化合物及び組成物は、以下に制限するものではないが、鶏等の鳥；齧歯類、ウシ、ブタ、犬、猫、霊長類、及び特に人間等のほ乳類；及び昆虫を含むあらゆる動物への、生物学的または化学的な活性剤の投与に有用である。
【００３０】
前記システムは、これによらなければ、標的領域（すなわち、送達組成物の活性剤が放出される領域）に達する前に及び投与された動物の身体内で遭遇する条件によって破壊されるか、または効力が低下するであろう、化学的または生物学的な活性剤の送達に特に有利である。特に本発明の化合物及び組成物は、経口経路によっては通常送達不可能であるもの、または改善された送達が所望されるもの等の活性剤の経口投与において有用である。
【００３１】
化合物及び活性剤を含有する組成物は、選択された生物学系への活性剤の送達において、及び送達剤を用いない活性剤の投与と比較した場合の活性剤の生物学的利用能の増大もしくは改善において、有用性を有する。送達は、一定期間に亘ってより大量の活性剤を送達することによって、または（例えばより迅速または遅延した送達を有効にするために）特定の期間内に、もしくは一定期間に亘って（例えば持続性送達）活性剤を送達することにおいて改善可能である。
【００３２】
投与に次いで、該組成物または投薬単位形態中に存在する活性剤は、循環中に取り込まれる。この剤の生物学的利用能は、血中の既知の薬理活性、例えばヘパリンによって引き起こされる血液凝固時間の増大またはカルシトニンによって引き起こされる循環カルシウム濃度の低下を測定することによって容易に評価される。あるいはまた、活性剤自体の循環濃度を直接測定することも可能である。
【００３３】
以下の実施例は、本発明を限定なしに詳説する。全ての部は、特記のない限り重量部として表した。データ中の分子量（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ）、融点（Ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）、燃焼分析（ｃｏｍｂｕｓｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）、及びＮＭＲ分析（ＮＭＲ ａｎａｌｙｓｉｓ）は原文のまま示した。
【００３４】
【実施例】
（実施例１：化合物調製）
（１ａ．化合物１の調製）
４−クロロサリチル酸（１０．０ｇ、０．０５７９ｍｏｌ）を、約５０ｍｌの塩化メチレンを収容する１つ口の２５０ｍｌの丸底フラスコに加えた。撹拌を開始し、反応の残り時間に亘って継続した。カップリング剤１，１−カルボニルジイミダゾール（９．３９ｇ、０．０５７９ｍｏｌ）を固体として少量ずつ前記フラスコに加えた。反応物を室温にて、カップリング剤全量を加え終えてからおよそ２０分間撹拌し、その後エチル−４−アミノブチレートヒドロクロライド（９．７ｇ、０．０５７９ｍｏｌ）を撹拌しつつ前記フラスコに加えた。トリエチルアミン（１０．４９ｍｌ、０．０７５２ｍｏｌ）を滴下漏斗から滴下した。滴下漏斗を塩化メチレンで濯いだ。反応物を室温にて一晩撹拌しておいた。
【００３５】
反応物を分液漏斗に注入し、２ＮのＨＣｌで洗ったところ、エマルジョンが生成した。前記エマルジョンを二日間静置した。該エマルジョンをセライトで濾過してフリットガラス漏斗（ｆｒｉｔｔｅｄ ｇｌａｓｓ ｆｕｎｎｅｌ）に入れた。濾液を分液漏斗に戻し、層分離させた。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、これを濾過して除き、濾液を回転エバポレータで濃縮した。得られた固体物質を２ＮのＮａＯＨで加水分解し、一晩冷蔵した後加水分解を再開した。該溶液を２ＮのＨＣｌで酸性化し、生成した固体を単離し、真空下で乾燥させ、メタノール／水を使用して二度再結晶させた。一晩で固体が析出し、これを単離して乾燥させた。該固体を２ＮのＮａＯＨに溶解させ、該試料のｐＨは２ＮのＨＣｌを使用してｐＨ５とした。固体を回収し、ＨＰＬＣではシングルピークが見られた。これらの固体をメタノール／水から再結晶し、単離した後、真空下で乾燥させ、４．９６ｇ（３３．０％）の４−（４クロロ−２−ヒドロキシベンゾイル）アミノ酪酸を得た。
【００３６】
【ＮＭＲ１】
2004521857.tif 000003
【００３７】
（１ｂ．化合物１の追加調製）
４−クロロサリチル酸（２５．０ｇ、０．１４４８ｍｏｌ）を、約７５−１００ｍｌの塩化メチレンを収容する１つ口の２５０ｍｌの丸底フラスコに加えた。撹拌を開始し、反応の残り時間に亘って継続した。カップリング剤１，１−カルボニルジイミダゾール（２３．５ｇ、０．１４４８ｍｏｌ）を固体として少量ずつ前記フラスコに加えた。反応物を室温にて、カップリング剤全量を加え終えてからおよそ２０分間撹拌し、その後エチル−４−アミノブチレートヒドロクロライド（２４．３ｇ、０．１４４８ｍｏｌ）を撹拌しつつ前記フラスコに加えた。トリエチルアミン（２６．０ｍｌ、０．１８８２４ｍｏｌ）を滴下漏斗から滴下した。滴下漏斗を塩化メチレンで濯いだ。反応物を室温にて一晩撹拌しておいた。
【００３８】
反応物を分液漏斗に注入し、２ＮのＨＣｌで洗ったところ、エマルジョンが生成した。前記エマルジョンをセライトで濾過してフリットガラス漏斗に入れた。濾液を分液漏斗に戻し、層分離させた。有機層を水及び塩水で洗い、硫酸ナトリウムで乾燥させ、これを濾過して除き、濾液を回転エバポレータで濃縮した。得られた固体物質を２ＮのＮａＯＨで一晩加水分解させた。該溶液を２ＮのＨＣｌで酸性化させたところ、生成した褐色固体をメタノール／水を使用して再結晶させ、不溶性の黒色物質を熱時濾過した。析出した白色固体を単離して乾燥させ、１１．６８ｇ（３７．０％）の４−（４クロロ−２−ヒドロキシベンゾイル）アミノ酪酸を得た。
【００３９】
【ＮＭＲ２】
2004521857.tif 000004
【００４０】
（１ｃ．化合物１の追加調製）
（４−［（４−クロロ−２−ヒドロキシベンゾイル）アミノ］酪酸）
２２Ｌの五つ口の丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、還流コンデンサー付きの１Ｌのディーン・スタークトラップ、熱電対温度目盛り、及び加熱マントルを装備した。以下の反応は乾燥窒素雰囲気下で行った。試薬ｎ−ブタノール（５０００ｍＬ）及び４−クロロサリチル酸（２０００ｇ、１１．５９ｍｏｌ）を前記反応フラスコに仕込んだ。ディーン・スタークトラップをｎ−ブタノール（１０００ｍＬ）で満たした。濃硫酸（５０ｇ）を加えた。反応混合物をおよそ１２０時間加熱還流した。およそ２０６ｍＬの水がこの時間中にトラップ内に回収された。加熱マントルを取り除き、反応混合物を常温にまで放冷した。ディーン・スタークトラップは排水させて取り除いた。脱塩水（１０００ｍＬ）を仕込んだ。二相混合物を１０分間撹拌した。撹拌を停止し、相分離させた。下部水相を吸い出して廃棄した。重炭酸ナトリウムの１０重量％水溶液（１０００ｍＬ）を前記反応混合物に加えた。該混合物を１０分間撹拌した。反応混合物をｐＨ試験紙で試験して、該溶液のｐＨが７より大であることを確認した。反応混合物に水（５００ｍＬ）を加えた。撹拌を停止し、相を分離させた。下部水相を吸い出して廃棄した。反応混合物をさらに５００ｍＬの脱塩水で洗った。常圧蒸留のために反応器を設置し、計量した５Ｌの受器を用意した。混合物を、容器温度が１４０乃至１５０℃に上昇するまで蒸留した。蒸留を常圧蒸留から減圧蒸留に切り替えた。蒸留装置中の圧力をゆっくりと１００ｍｍＨｇにまで低下させた。容器温度は低下し、残留ｎ−ブタノール及びｎ−ブチルエーテル（反応副生成物）が留去された。加熱を停止し、反応混合物を常温にまで放冷した。真空を乾燥窒素で解除した。粗製のブチルエステルを、減圧蒸留装置の５Ｌのポットフラスコに移した。粗製のブチルエステルを０．２乃至０．５ｍｍＨｇの圧力で蒸留した。４０℃未満のヘッド温度にて回収された先留出物（ｆｏｒｅｒｕｎ）を廃棄した。ブチル＝４−クロロ−２−ヒドロキシベンゾエートフラクションを、ヘッド温度１０４乃至１１２℃にて回収した。このフラクションは２５５９ｇの重量を有していた。収率は９６％であった。
【００４１】
２２Ｌの五つ口の丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、還流コンデンサー、熱電対温度目盛り、及び加熱マントルを装備した。反応器を窒素パージした。ブチル＝４−クロロ−２−ヒドロキシベンゾエート（２５５９ｇ、１１．２ｍｏｌｅｓ）及び試薬メタノール（１０，０００ｍＬ）を反応フラスコに仕込み、溶液が得られるまで内容物を撹拌した。反応混合物をブフナー漏斗で濾過して反応器に戻した。撹拌速度を上げ、気体アンモニアを反応器のヘッドスペースに迅速に加えた。アンモニア気体の添加を、反応器の温度が４５℃に達するまで継続した。アンモニアの添加をいったん取り止め、撹拌速度を低下させた。反応物を常温にまで放冷した。上述のようなアンモニア気体添加を、液体クロマトグラフィーによって反応の完了が示されるまで繰り返した。反応の完了までには、５日間に亘り７回のアンモニア添加が必要であった。溶媒のおよそ半量を、常圧蒸留によって除去した。反応混合物を常温に冷却し、５Ｌの脱塩水を加えた。濃塩酸（およそ５０００ｍＬ）を、反応混合物のｐＨが４乃至５になるまでゆっくりと反応器に加えた。生成する沈殿物を、大型の焼結ガラス漏斗を用いた減圧濾過によって回収した。生成物のフィルターケーキを２０００ｍＬの脱塩水で洗い、５０℃にて３２時間乾燥させたところ、１７９７ｇの４−クロロ−２−ヒドロキシベンズアミドが得られた。収率は９４％であった。
【００４２】
２２Ｌの五つ口の丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、還流コンデンサー、滴下漏斗、熱電対温度目盛り、及び加熱マントルを装備した。反応器を窒素パージした。アセトニトリル（４７００ｍＬ）及び４−クロロ−２−ヒドロキシベンズアミド（１７８２ｇ、１０．４ｍｏｌ）を反応フラスコに仕込み、撹拌を開始した。ピリジン（１１３３ｍＬ、１４．０ｍｏｌ）を反応器に仕込んだ。生成した反応スラリーを、アイスバスを用いて１０℃未満に冷却した。エチルクロロホルメート（１０９１ｍＬ、１２３７ｇ、１１．４ｍｏｌ）を滴下漏斗に入れて前記反応混合物を撹拌しつつゆっくりと滴下したが、該反応混合物の温度が添加の間に１５℃を越えないようにした。反応混合物の温度を、エチルクロロホルメートの添加完了後３０分間に亘り１０乃至１５℃に維持した。アイスバスを取り除き、反応混合物を常温に加温した。その後反応混合物をゆっくりと加熱還流させ、この温度に１８時間維持した。反応混合物の液体クロマトグラフィー分析により、該反応が８０％完了したのみであることが示された。常圧蒸留により、溶媒の約半量を除去した。反応混合物をまず常温に冷却し、その後アイスバスを用いて１０℃未満に冷却した。さらにピリジン（２１５ｍＬ、２．６５ｍｏｌ）を反応混合物に加えた。エチルクロロホルメート（２３５ｇ、２．１７ｍｏｌ）を滴下漏斗からゆっくりと冷温の反応混合物に加えた。反応混合物は、エチルクロロホルメート添加完了後３０分間に亘り１０乃至１５℃に維持した。アイスバスを取り除き、反応混合物を常温に加温した。その後反応混合物をゆっくりと加熱還流させ、この温度に１８時間維持し、この時間経過後、液体クロマトグラフィーにより反応が完了したことが示された。反応混合物をまず常温に冷却し、その後アイスバスを用いて１０℃未満に冷却した。水（１６００ｍＬ）を滴下漏斗からゆっくりと加え、得られたスラリーを９０分間に亘って１０℃未満に維持した。固体生成物を大型の焼成ガラス漏斗を用いた減圧濾過によって回収した。生成物フィルターケーキを脱塩水で洗い、５０℃にて１８時間減圧乾燥させて１９１４ｇの７−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオンを褐色固体として得た。収率は８３％であった。
【００４３】
２２Ｌの五つ口の丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、還流コンデンサー、熱電対温度目盛り、及び加熱マントルを装備した。以下の反応は乾燥窒素雰囲気下で行った。７−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾキサジン−２，４（３Ｈ）−ジオン（１９０４ｇ、９．６４ｍｏｌ）、エチル＝４−ブロモブチレート（１３１３ｍＬ、９．１８ｍｏｌ）、及びＮ，Ｎ−ジメチルアセタミド（４７００ｍＬ）を窒素パージ下で仕込んだ。反応混合物を７０℃に加熱した。炭酸ナトリウム（１１１９ｇ、１０．５５ｍｏｌ）を五等分した部分量ずつ、およそ４０分間かけて透明溶液に仕込んだ。反応混合物を一晩７０℃に維持した。反応物を５５℃に冷却した。無機固体を焼成ガラス漏斗を用いた減圧濾過により除去した。反応フラスコを２Ｂ−エタノール（２０００ｍＬ）で濯ぎ、この濯ぎ液をフィルターケーキを洗うために用いた。反応フラスコを脱塩水で洗浄した。濾液を清浄な反応フラスコに戻した。濾液をアイスバス中で冷却した。脱塩水（９４００ｍＬ）を滴下漏斗からゆっくりと加えた。冷却した混合物を一晩撹拌しておいた。生じる固体を焼成ガラス漏斗を用いる減圧濾過により回収した。生成物ケーキを脱塩水で洗った。エチル＝３−（４−ブタノエート）−７−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾキサジン−２，４−（３Ｈ）−ジオンは、２４７６．０ｇの重量を有していた。収率は８２．２％であった。
【００４４】
１２Ｌのステンレススチール反応器にオーバーヘッドスターラー、還流コンデンサー、熱電対温度目盛り、滴下漏斗、及び加熱マントルを装備した。以下の反応は乾燥窒素雰囲気下で行った。水（３Ｌ）及びエチル＝３−（４−ブタノエート）−７−クロロ−２Ｈ−１，３−ベンゾキサジン−２，４−（３Ｈ）−ジオン（１１１８ｇ、３．５８ｍｏｌ）を反応器に仕込み、撹拌を開始した。水（２Ｌ）中の水酸化ナトリウム（５７４ｇ、１４．３４ｍｏｌ）の溶液をゆっくりと反応スラリーに加えた。反応物を７０℃に６時間加熱した後、ゆっくりと常温に冷却した。反応混合物をブフナー漏斗で濾過した。
【００４５】
２２Ｌの五つ口の丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、還流コンデンサー、熱電対温度目盛り、及び滴下漏斗を装備した。脱塩水（１８８０ｍＬ）及び濃塩酸（１１９７ｇ、１２．０４ｍｏｌ）を反応器に仕込んだ。脱塩水（１８８０ｍＬ）及び濃塩酸（１１９７ｇ、１２．０４ｍｏｌ）を反応器に仕込んだ。上記からの加水分解産物を滴下漏斗からゆっくりと酸溶液に加えた。得られるスラリーのｐＨを、さらなる塩酸（１６０ｍＬ、１．６１ｍｏｌ）を添加することによって３に調整した。生成物固体を焼成ガラス漏斗を用いる濾過によって回収し、真空オーブン中において５０℃にて２４時間に亘り乾燥させ、１１０９．３ｇの４−［（４−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゾイル）アミノ］ブタン酸を白色固体として得た。収量は定量的であった。
【００４６】
（実施例１ｄ．  無水ナトリウム＝４−［（２−ヒドロキシベンゾイル）アミノ］ブタノエートの調製）
２２Ｌの五つ口の丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、還流コンデンサー、熱電対温度目盛り、及び加熱マントルを装備した。以下の反応は乾燥窒素雰囲気下で行った。試薬アセトン（１３０００ｍＬ）及び４−［（４−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゾイル）アミノ］ブタン酸（５００．０ｇ、１．９４ｍｏｌ）を反応器に仕込み撹拌を開始した。反応スラリーをかすみがかった褐色の溶液が得られるまで５０℃に加熱した。温めた溶液をＷｈａｔｍａｎ ＃１濾紙を付けた温めた加圧フィルターを通して清浄な２２Ｌの反応器中に注入した。黄色透明の濾液を撹拌しつつ５０℃に加熱した。水酸化ナトリウム溶液（５０％水性；１５５ｇ、１．９４ｍｏｌ）を反応器に仕込み、一方では激しく撹拌を継続した。塩基添加が完了した後、反応器を２．５時間に亘って加熱（６０℃）還流し、その後ゆっくりと常温に冷却した。生成物を焼成ガラス漏斗を用いる減圧濾過によって単離し、真空オーブン中において５０℃にて２４時間に亘り乾燥させ、５２７．３ｇの４−［（２−ヒドロキシベンゾイル）アミノ］ブタノエートを乳白色固体として得た。収率は９７．２％であった。
【００４７】
（実施例１ｅ．  ナトリウム＝４−［（２−ヒドロキシベンゾイル）アミノ］ブタノエート＝モノヒドレートの調製）
２２Ｌのフラスコに、オーバーヘッドスターラーを装備した。脱塩水（２０００ｍＬ）及び４−［（４−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゾイル）アミノ］ブタン酸（３８０．０ｇ、１．４７ｍｏｌ）を加えて撹拌を開始した。水（５００ｍＬ）中の水酸化ナトリウム（５９．０ｇ、１．４８ｍｏｌ）の溶液を反応器に加えた。水（１５００ｍＬ）を反応器に加え、生じたスラリーを完全な溶液が得られるまで加熱した。反応混合物を常温に冷却した後、減圧下で濃縮乾燥させた。得られた固体をフラスコから掻き取り、５０℃にて真空乾燥させて４０１．２ｇのナトリウム＝４−［（２−ヒドロキシベンゾイル）アミノ］ブタノエートを乳白色固体として得た。収率は９６．９％であった。
【００４８】
（実施例１ｆ．  イソプロパノール溶媒和化合物を経る、ナトリウム＝４−［（２−ヒドロキシベンゾイル）アミノ］ブタノエートの調製）
１Ｌの四つ口丸底フラスコに、オーバーヘッドスターラー、還流コンデンサー、熱電対温度目盛り、及び加熱マントルを装備した。以下の反応は乾燥窒素雰囲気下で行った。イソプロパノール（４００ｍＬ）及び４−［（４−クロロ−２−ヒドロキシ−ベンゾイル）アミノ］ブタン酸（２５．０ｇ、０．０９ｍｏｌ）を反応器に仕込み、撹拌を開始した。反応スラリーをかすみがかった褐色の溶液が得られるまで５０℃に加熱した。温めた溶液をＷｈａｔｍａｎ ＃１濾紙を付けた温めた加圧フィルターを通して清浄な１Ｌの反応器中に注入した。黄色透明の濾液を撹拌しつつ６２℃に加熱した。水酸化ナトリウム溶液（５０％水性；７．２ｇ、０．０９ｍｏｌ）を反応器に仕込み、一方では激しく撹拌を継続した。塩基添加が完了した後、反応器を加熱（７２℃）して還流させ、その後ゆっくりと常温に冷却した。生成物を焼成ガラス漏斗を用いる減圧濾過によって単離し、５０℃にて２４時間に亘り真空乾燥させて、２３．１６ｇのナトリウム＝４−［（２−ヒドロキシベンゾイル）アミノ］ブタノエートを乳白色固体として得た。収率は９２％であった。
【００４９】
（実施例１ｇ．  カプセル調製）
化合物１（実施例１ｄにおいて調製）の一ナトリウム塩及びインスリンを含む霊長類投与のためのカプセルを下記の通り調製した。化合物１の一ナトリウム塩及びヒト：プロインスリン由来（組換えＤＮＡ由来）のＱＡ３０７Ｘ亜鉛インスリン結晶（Ｅｌｉ−Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）より入手可能）を、まず３５メッシュＴｙｌｅｒ標準ふるいに通し、必要量を計量した。篩った化合物１の一ナトリウム塩及びインスリンを、形状ふるい法（ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ ｓｉｅｖｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）を使用して適切に寸法測定したガラス乳鉢中で混合した。乳鉢中の物質は、ガラス乳棒で十分混合した。乳鉢の側面から掻き取るためにスパチュラを使用した。得られた製剤を、カプセル充填のためのプラスチック計量ボートに移した。前記製剤を、サイズ＃０のＴｏｒｐａｃ硬質ゼラチンカプセル（Ｔｏｒｐａｃ， Ｉｎｃ．（Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ， ＮＪ）より入手可能）に手作業にて実装した。各カプセル充填重量は、個別の動物の体重による。化合物１のカプセル用量は、１００ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、及び５０ｍｇ／ｋｇ（一ナトリウム塩として）であった。インスリンのカプセル用量は、体重１ｋｇあたり０．２５乃至０．５ｍｇであった。
【００５０】
（実施例２  インスリン−経口送達）
Ａ．ラットの研究
送達剤化合物（下記の通り実施例１ａまたは１ｂのように調製）及び亜鉛ヒト組換えインスリン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐ．（Ｌａ Ｊｐｌｌａ， ＣＡ）より入手可能（カタログ＃４０７６９４）の経口投薬（ＰＯ）組成物を脱塩水中に調製した。典型的には、５００ｍｇの送達剤化合物を１．５ｍｌの水に加えた。得られた溶液を撹拌し、１等量の水酸化ナトリウムを添加することによって、送達剤化合物の遊離酸をナトリウム塩に変換した。該溶液を撹拌した後、加熱（約３７℃）し、音波処理した。ｐＨを、ＮａＯＨまたはＨＣｌで約７乃至８．５に調整した。必要に応じて更にＮａＯＨを添加して均一な溶解を達成し、ｐＨを再調整した（例えば、化合物１ａについては、合計２５８．５ｍｌの１０ＮのＮａＯＨを、１．５ｍｌの水中５０１ｍｇの化合物に加えた。最終的ｐＨは７．７３）。その後水を添加して全体積を約２．４ｍｌとして撹拌した。インスリンストック溶液（１５ｍｇ／ｍｌ、０．５４０９ｇのインスリンと１８ｍｌの脱塩水より調製し、ＨＣｌ及びＮａＯＨでｐＨ８．１５に調整し、４０ｍｌの濃ＨＣｌ、２５ｍｌの１０Ｎ ＮａＯＨ、及び５０ｍｌの１Ｎ ＮａＯＨを使用して透明な溶液を得た）からの約１．２５ｍｇのインスリンを、該溶液に添加してインバータで混合した。最終送達剤化合物用量、インスリン用量、及び投薬体積量を、以下の表１にまとめた。
【００５１】
典型的な投薬及び標本抽出プロトコルは、以下の通り。体重約２００−２５０ｇのオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、２４時間断食させ、投薬の１５分前にケタミン（４４ｍｇ／ｋｇ）及びクロルプロマジン（１．５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、必要に応じて麻酔を維持するために再度投与した。５匹の動物の投薬グループに、投薬溶液の一つを投与した。経口投与のためには、１１ｃｍ Ｒｕｓｃｈ ８ Ｆｒｅｎｃｈ ｃａｔｈｅｔｅｒにピペット先端を備えた１ｍｌのシリンジを取り付けた。カテーテルから該溶液を引き込んでシリンジを投薬溶液で満たし、カテーテルを拭って乾燥させた。該カテーテルを食道内に設置したが、切歯の外に管を１ｃｍ残した。シリンジプランジャーを押すことにより溶液を投与した。
【００５２】
血液試料を、典型的には、投与後１５、３０、６０、１２０、及び１８０分の時点にて、尾の動脈から順次採取した。血清インスリンレベルは、インスリンＥＬＩＳＡテストキット（Ｄｉａｇｏｓｔｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．（Ｗｅｂｓｔｅｒ， ＴＸ）製、Ｋｉｔ ＃ ＤＳＬ−１０−１６００）で測定し、現行のプロトコルにおいて使用される試料の体積及び濃度について、標準曲線の直線範囲と感受性とを最適化するために、標準プロトコルを調整した。血清ヒトインスリン濃度（μＵ／ｍｌ）を、各時点について、各投薬グループ中の５匹の動物それぞれについて測定した。各時点についての５つの値を平均し、結果を血清インスリン濃度として時間に対してプロットした。最大（ピーク）及び曲線の下の体積（ＡＵＣ）を以下の表１に示した。前述の実験は、ヒトインスリン単独での経口投薬の後、測定可能なレベルのヒトインスリンを示さなかった。
【００５３】
【表１】
2004521857.tif 000005
【００５４】
Ｂ．サルの研究
全ての動物プロトコルは「実験動物取り扱いの原則（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ）」を遵守し、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ （ＩＡＣＵＣ）に認可されている。
【００５５】
カプセルを各動物に投与するための投与プロトコルは下記の通り。基線血清試料を、投与の前に動物から得た。体重２−３ｋｇのオス２匹及びメス２匹の４匹のカニクイザルのグループを、投薬の前４時間及び投薬後２時間まで断食させた。投薬直前の１０ｍｇ／ｋｇの塩酸ケタミンの筋内注射によって、動物に麻酔をかけた。各動物に、化合物１（２５−１００ｍｇ／ｋｇ）の可変用量を、０．２５−０．５ｍｇ／ｋｇのインスリンのインスリン可変用量と組み合わせて１カプセルとして投与した。動物にとって、水を投薬期間全般に亘って入手可能なようにし、４００ｍｌのジュースを投薬前の一晩及び投薬期間全般及びに亘って入手可能なようにした。動物をスリング拘束で拘束した。カプセルを収容するためのコケットプランジャー（ｃｏｃｋｅｔ ｐｌｕｎｇｅｒ）及びスプリットラバーチップを備えたプラスチックの道具であるピルガンに、カプセルをいれた。ピルガンを、動物の食道に挿入した。ピルガンのプランジャーを押して、カプセルをラバーチップから食道内へ押し出した。その後ピルガンを引っ込めた。動物の口を閉じさせておき、およそ５ｍｌの逆浸透水を側部から口に投与してえん下反射を誘発した。動物の喉部をさらに摩擦してえん下反射を誘発した。
【００５６】
クエン酸塩加血清試料（各１ｍＬ）を、投薬の１時間前及び投薬の１０、２０、３０、４０、及び５０分後及び、１、１．５、２、３、４、及び６時間後に適当な静脈から静脈穿刺により採取した。収集した各血清試料を、２つに分けた。一方の部分は−８０℃にて凍結してインスリンアッセイのために別の位置に移した。他方の部分は血糖アッセイに用いた。４匹のサルは、皮下よりさらにインスリンを投与された（０．０２ｍｇ／ｋｇ）。血清試料を採取し、上述のように分析した。
【００５７】
（インスリンアッセイ）
血清インスリンレベルを、Ｉｎｓｌｉｎ ＥＬＩＳＡ Ｔｅｓｔ Ｋｉｔ （ＤＳＬ， Ｗｅｂｓｔｅｒ， ＴＸ）を使用して測定した。
（糖アッセイ）
血糖測定を、Ｌｉｖｅ Ｓｃａｎ Ｉｎｃ．（Ｎｅｗｔｏｎ， ＰＡ）製のＯＮＥＴＯＵＧＨ （登録商標）糖モニターシステムを使用して行った。
結果を下記の表２に示す。
【００５８】
【表２】
2004521857.tif 000006
【００５９】
（実施例３  クロモリン−経口送達）
送達剤化合物（実施例１において調製）及びクロモリンの二ナトリウム塩（ｃｒｏｍｏｌｙｎ）（Ｓｉｇｍａ （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ））を含有する投薬溶液を、脱塩水中に調製した。送達剤化合物の遊離酸を、１等量の水酸化ナトリウムでナトリウム塩に変換した。この混合物を撹拌し、ソニケーターにいれた（約３７℃）。ｐＨを、ＮａＯＨ水溶液で約７乃至７．５に調整した。必要に応じて更にＮａＯＨを添加して均一な溶解を達成し、ｐＨを再調整した。該混合物を撹拌し、必要に応じて音波処理及び熱も使用して均一な溶液を調製した。送達剤化合物溶液をストック溶液（脱塩水中、１７５ｍｇクロモリン／ｍｌ、必要に応じてＮａＯＨまたはＨＣｌでｐＨを約７．０に調製、ストック溶液はホイルに包んで凍結貯蔵した後、使用前に融解させて約３０℃に加熱した）からのクロモリンと混合した。該混合物を撹拌し、必要に応じて音波処理及び熱も使用して均一な溶液を調製した。ＮａＯＨ水溶液でｐＨを約７−７．５に調整した。該溶液を水で所望の体積（通常は２．０ｍｌ）に希釈し、濃縮して、使用前にはホイルにくるんで貯蔵した。最終送達剤化合物及びクロモリンの用量、及び投薬体積を、以下の表３にまとめた。
【００６０】
典型的な投薬及び標本抽出プロトコルは、以下の通り。体重２００−２５０ｇのオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、２４時間断食させ、投薬の１５分前にケタミン（４４ｍｇ／ｋｇ）及びクロルプロマジン（１．５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、必要に応じて麻酔を維持するために再度投与した。５匹の動物の投薬グループに、投薬溶液の一つを投与した。１１ｃｍ Ｒｕｓｃｈ ８ Ｆｒｅｎｃｈ ｃａｔｈｅｔｅｒにピペット先端を備えた１ｍｌのシリンジを取り付けた。カテーテルから該溶液を引き込んでシリンジを投薬溶液で満たし、カテーテルを拭って乾燥させた。該カテーテルを食道内に設置したが、切歯の外に管を１ｃｍ残した。シリンジプランジャーを押すことにより投薬溶液を投与した。
【００６１】
血液試料を、典型的には、投与後０．２５、０．５、１．０、及び１．５時間の時点にて、尾の動脈から採取した。血清クロモリン濃度は、ＨＰＬＣによって測定した。試料は以下のように調製した：１００μｌの血清を１００μｌの３Ｎ ＨＣｌ及び３００μｌの酢酸エチルとエッペンドルフ管内で混合した。管を１０分間振とうした後、１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心機にかけた。２００μｌの酢酸エチル層を、６７μｌの０．１Ｍリン酸緩衝液を入れたエッペンドルフ管に移した。管を１０分間振とうした後、１０，０００ｒｐｍにて１０分間遠心機にかけた。リン酸緩衝液層をＨＰＬＣバイアルに移し、ＨＰＬＣ（カラム＝Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｅｘｓｉｌ Ａｍｉｎｏ １５０×２ｍｍ ｉ．ｄ．， ５μｍ， １００Å（Ｋｅｙｓｔｏｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ．）；移動相＝３５％緩衝液（８５％のＨ３ＰＯ４でｐＨ３．０に調整した６８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）／６５％アセトニトリル；注入体積＝１０μｌ；流速＝０．３０ｍｌ／分；クロモリン保持時間＝５．５分；２４０ｎｍにて吸収検出）前述の実験は、約０の基線値を示した。
各グループ中の動物から得られた結果を、各時点について平均をとり、これら平均（すなわち平均ピーク血清クロモリン濃度）を以下の表３にまとめた。
【００６２】
【表３】
2004521857.tif 000007
【００６３】
（実施例４：組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）−経口送達）
リン酸緩衝液中に、送達剤化合物（実施例１ａまたは１ｂにおいて調製、表４に記載）及びｒｈＧＨの経口栄養（ＰＯ）投薬溶液を調製した。送達剤化合物の遊離酸は、１当量の水酸化ナトリウムでナトリウム塩に変換した。典型的には、該化合物の溶液は、リン酸緩衝液中に調製されて撹拌され、ナトリウム塩を製造する際に水酸化ナトリウム水溶液（１．０Ｎ）の１等量が添加される。必要であれば、さらにＮａＯＨが添加されて、均一な溶解が達成され、ｐＨが再調整される。最終投薬溶液は、化合物溶液をｒｈＧＨストック溶液（粉末状態で１５ｍｇのｒｈＧＨ、７５ｍｇのＤ−マンニトール、１５ｍｇのグリシン、及び３．３９ｍｇの二塩基リン酸ナトリウムを混合し、２％のグリセリンで希釈することによって製造、１５ｍｇ ｒｈＧＨ／ｍｌ）と混合し、所望の体積（通常は３．０ｍｌ）に希釈することによって調製した。化合物及びｒｈＧＨ用量及び用量体積は、下記の表４にまとめた。
【００６４】
典型的な投薬及び標本抽出のプロトコルは、以下の通り。体重２００−２５０ｇのオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、２４時間断食させ、投薬の１５分前にケタミン（４４ｍｇ／ｋｇ）及びクロルプロマジン（１．５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、必要に応じて麻酔を維持するために再度投与した。５匹の動物の投薬グループに、投薬溶液の一つを投与した。１１ｃｍ Ｒｕｓｃｈ ８ Ｆｒｅｎｃｈ ｃａｔｈｅｔｅｒにピペット先端を備えた１ｍｌのシリンジを取り付けた。カテーテルから該溶液を引き込んでシリンジを投薬溶液で満たし、カテーテルを拭って乾燥させた。該カテーテルを食道内に設置したが、切歯の外に管を１ｃｍ残した。シリンジプランジャーを押すことにより溶液を投与した。
【００６５】
血液試料を尾の動脈から、典型的には投与後の時間＝１５、３０、４５、及び６０分の時点に採取した。血清ｒｈＧＨ濃度は、ｒｈＧＨ免疫測定テストキット（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）製、Ｋｉｔ＃ Ｋ１Ｆ４０１５）によって定量化した。前述の実験により基線値は約０であることが示された。
【００６６】
各グループの動物による結果を各時点について平均した。これらの平均の最大値（すなわち、平均ピーク血清ｒｈＧＨ濃度）を以下の表４に報告する。（標準偏差（ＳＤ）または標準誤差（ＳＥ）が以下に記載されていない場合は、各時点の５つの試料はアッセイ前にプールされていた。）
【００６７】
【表４】
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【００６８】
（実施例５：インターフェロン−経口送達）
送達剤化合物（実施例１ｂにおいて調製）及びヒトインターフェロン（ＩＦＮ）の投薬溶液を脱塩水中に調製した。送達剤化合物の遊離酸を、１等量の水酸化ナトリウムを用いてナトリウム塩に変換した。典型的には、送達剤化合物の溶液は水中に調製し、撹拌し、ナトリウム塩を調製する場合には１等量の水酸化ナトリウム（１．０Ｎ）を添加した。この混合物を撹拌してソニケーターにいれた（約３７℃）。ｐＨを、ＮａＯＨ水溶液で約７．０乃至８．５に調整した。該混合物を撹拌して均一な懸濁液または溶液を調製したが、必要に応じてさらに音波処理と熱を用いた。必要に応じて更にＮａＯＨを添加して均一な溶解を達成し、ｐＨを再調整した。送達剤化合物溶液をＩＦＮストック溶液（リン酸緩衝液中に約２２．０乃至２７．５ｍｇ／ｍｌ）と混合し、所望の体積（通常３．０ｍｌ）に希釈した。最終送達剤化合物及びＩＦＮ用量、及び投薬体積は以下の表５にまとめた。
【００６９】
典型的な投薬及び標本抽出プロトコルは、以下の通り。体重２００−２５０ｇのオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、２４時間断食させ、投薬の１５分前にケタミン（４４ｍｇ／ｋｇ）及びクロルプロマジン（１．５ｍｇ／ｋｇ）を投与し、必要に応じて麻酔を維持するために再度投与した。５匹の動物の投薬グループに、投薬溶液の一つを投与した。１１ｃｍ Ｒｕｓｃｈ ８ Ｆｒｅｎｃｈ ｃａｔｈｅｔｅｒにピペット先端を備えた１ｍｌのシリンジを取り付けた。カテーテルから該溶液を引き込んでシリンジを投薬溶液で満たし、カテーテルを拭って乾燥させた。該カテーテルを食道内に設置したが、切歯の外に管を１ｃｍ残した。シリンジプランジャーを押すことにより投薬溶液を投与した。
【００７０】
血液試料を、典型的には、投与後の時間＝０、１５、３０、４５、６０、及び９０分の時点にて、尾の動脈から順次採取した。血清ＩＦＮ濃度は、ヒトのＩＦＮ−アルファについてＣｙｔｏｓｃｒｅｅｎ免疫測定キット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ， ＣＡ）製、カタログ＃ ＫＨＣ４０１２）を使用して定量化した。前述の実験は、約０の基線値を示した。各グループ中の動物から得られた結果を、各時点について平均した。これら平均の最大（すなわち、平均ピーク血清ＩＦＮ濃度）を以下の表５に示した。
【００７１】
【表５】
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【００７２】
上記の特許、特許出願、試験方法、及び文献は、参照のため、ここにその全体を取り込むこととする。
上記詳細な説明に鑑みれば、当業者には、本発明の多数の変形が自ずから示唆される。こうした明白な変形全てが、添付の請求の範囲に完全に包含されることを企図したものである。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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