(57)【要約】レチノイドを含み、かつ改良された安定性およびマイルドさを有する化粧品組成物。特に好ましい組成物はまた、レチノイドブースターおよび多価アルコール湿潤剤も含んでいる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）流動油中に可溶化されたレチノイドと、
（ｂ）ポリマー乳化剤と、を含む化粧品水中油エマルジョン組成物。
【請求項２】
この組成物がさらに、多価アルコール湿潤剤約１％から約９０％を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
この組成物がさらに、エラストマー約０％から約３０％を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
この組成物がさらに、揮発性シリコーン油を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
この組成物がさらに、結晶質脂肪酸を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
レチノイドの量が、この組成物の少なくとも約０．００１重量％である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
このレチノイドが、レチノイン酸、レチノール、レチニルエステル、およびレチナールから選ばれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
このレチノイドが、流動油中に、２５℃においてこの油約１００ｇあたり少なくとも約０．１ｇのレチノイドの量において可溶である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
この組成物中のレチノイドの半減期が、５０℃において少なくとも約２０日である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
さらにレチノイドブースターも含む、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、レチノイドを送り出し、改良されたレチノイド安定性を有し、同時に皮膚に対してマイルドでもある、皮膚および毛髪用化粧品組成物に関する。
【０００２】
レチノイドは、例えば皮膚を明るくすること、しわのトリートメント、オイル制御などの広範囲な皮膚への効果を与えることが知られている。残念ながらレチノイドは、特に水の存在下において不安定である。しかしながら化粧品組成物はほとんどいつも、美的に許容しうる外見および触感特性をもたらすために、かなり多量の水を含む。レチノイドの使用に伴なうもう１つの欠点は、特に比較的高い濃度で使用された時、および／または敏感肌に使用された時、刺激性になる可能性があることである。したがって改良された安定性を有するレチノイドを含み、かつ皮膚に対してマイルドでもある化粧品組成物が、商品として望ましい。
【０００３】
下記のものを含む化粧品水中油エマルジョン組成物：
（ａ）流動油中に可溶化されたレチノイド、
（ｂ）ポリマー乳化剤。
【０００４】
操作例および比較例以外、または明らかにほかの指摘がなされている場合以外、物質の量または反応条件、物質の物理的性質および／または使用を示す、この明細書におけるすべての数は、「約」という語によって修飾されていると理解すべきである。すべての量は、ほかに特定されていなければ、最終組成物の重量である。
【０００５】
本明細書において用いられている「皮膚」という用語は、顔、首、胸、背中、腕、手、脚、および頭皮の皮膚を含む。
【０００６】
流動油中に可溶化されたレチノイド
本発明の組成物はレチノイドを含む。適切なレチノイドには、レチニルエステル、レチノール、レチナール、およびレチノイン酸が含まれるが、これらに限定されるわけではなく、好ましくはレチノールまたはレチニルエステルである。「レチノール」という用語には、レチノールの下記異性体が含まれる。すなわち、オール−トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、１１−シス−レチノール、９−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール、３，４−ジデヒドロ−１３−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−１１−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−９−シス−レチノールである。好ましい異性体は、オール−トランス−レチノール、１３−シス−レチノール、３，４−ジデヒドロ−レチノール、９−シス−レチノールである。最も好ましいものは、その幅広い商業的入手性によって、オール−トランス−レチノールである。
【０００７】
レチニルエステルは、レチノールのエステルである。「レチノール」という用語は上で定義されている。本発明への使用に適したレチニルエステルは、レチノールのＣ１〜Ｃ３０エステル、好ましくはＣ２〜Ｃ２０エステル、最も好ましくは、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ１６エステルであるが、その理由は、これらがさらに普通に入手しうるからである。レチニルエステルの例には下記のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、レチニルパルミテート、レニチルホルメート、レチニルアセテート、レチニルプロピオネート、レチニルブチレート、レチニルバレレート、レチニルイソバレレート、レチニルヘキサノエート、レチニルヘプタノエート、レチニルオクタノエート、レチニルノナノエート、レチニルデカノエート、レチニルウンデカノエート、レチニルラウレート、レチニルトリデカノエート、レチニルミリステート、レチニルペンタデカノエート、レチニルヘプタデカノエート、レチニルステアレート、レチニルイソステアレート、レチニルノナデカノエート、レチニルアラキドネート、レチニルベヘネート、レチニルリノレエート、レチニルオレエートである。
【０００８】
本発明への使用に好ましいエステルは、レチニルパルミテート、レチニルアセテート、およびレチニルプロピオネートから選ばれるが、その理由は、これらが最も商業的入手性が高く、したがって最も安価であるからである。レチニルリノレエートおよびレチニルオレエートも、これらの有効性によって好ましい。
【０００９】
レチノイドは、少なくとも約０．００１％、好ましくは約０．００１％から約１０％の量で、より好ましくは約０．０１％から約１％の量で、最も好ましくは約０．０１％から約０．５％の量で本発明の組成物に用いられる。
【００１０】
本発明の組成物中に存在するレチノイドは、レチノイドの保存安定性を改良するために、流動油中に可溶化されている。適切な流動油は、レチノイドが、２５℃においてこの油１００グラムあたり少なくとも０．１グラムのレチノイドの量において可溶になるように選択される。好ましくはレチノイドは、この油１００グラムあたり少なくとも２グラムのレチノイド、最も好ましくはこの油１００グラムあたり２〜８０グラムのレチノイドの量において可溶である。
【００１１】
例証として、様々な油中のレチノール結晶の溶解度は次のとおりである：
油　　　　　　　　　　　　　　　　　溶解度、ｗｔ％
鉱油　　　　　　　　　　　　　　　　３４．２
セチオール　ＯＥ　　　　　　　　　　８０
イソステアリルパルミテート　　　　　４４
Ｃ１２〜１５アルキルベンゾエート　　　　８５
トリオレイン／スクアレン（６：１）　５６．４
シクロメチコーン　　　　　　　　　　２．７
ジメチコーン　　　　　　　　　　　　０．４９
【００１２】
油中のレチノイド溶解度は、下記手順によって測定される。油中の予測された溶解性限界を超えた純粋レチノイドの既知重量が、油中に添加される。すべてのレチノイド結晶を溶解するために、メタノールがこの混合物に添加される。すべてのメタノールがこの油から確実に蒸発されるように、窒素噴霧（ｓｐａｒｇｉｎｇ）が用いられる。レチノイドは一晩再結晶化させられる。サンプルは、０．４５ミクロンフィルターを通して濾過される。イソプロパノール中のこの濾過物の既知の希釈液は、適切な波長（レチノールについては３２５ｎｍ）においてＵＶ分光法によって測定され、レチノイドの濃度は、イソプロパノール中のレチノイドの較正標準に対して測定される。
【００１３】
適切な流動油には次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、脂肪酸またはアルコールのエステルおよび炭化水素、好ましくは、これらが本明細書に記載されている溶解度要件を満たすかぎり、脂肪酸またはアルコールのモノエステルである。最も好ましくは流動油は、イソステアリルパルミテート、トリデシルサリチレート、Ｃ１２〜１５オクタノエート、イソプロピルステアレート、イソプロピルミリステート、およびイソプロピルパルミテート、またはこれらの混合物から成る群から選ばれる。例えばセチオール（Ｃｅｔｉｏｌ）ＯＥという商品名を有するジカプリルエーテルも、最も好ましい油として含まれる。
【００１４】
シリコーン油もこれらの組成物中に含まれていてもよい。これらは好ましくは、約３個から約９個、好ましくは約４個から約５個のケイ素原子を含む環式または線状ポリジメチルシロキサンから選ばれる。その他のシリコーン油、例えばポリアルキルシロキサン、ポリアルキルアリールシロキサン、およびポリエーテルシロキサンコポリマー（例えばジメチコーンコポリオール）が含まれていてもよい。本明細書において有用なポリアルキルシロキサンには例えば、２５℃において約５センチストークスから約１００，０００センチストークスの粘度を有するポリジメチルシロキサン、好ましくは２５℃において約１０センチストークスから約４００センチストークスの粘度を有するポリジメチルシロキサンが含まれる。
【００１５】
これらの油は、単一で、または互いとの混合物として用いられてもよい。
【００１６】
この油は、レチノイドの選択量を溶解するが、本発明の組成物の快適な触感特性を犠牲にしないような量で用いられる。
【００１７】
ポリマー乳化剤
本発明の組成物は、これらの組成物中のレチノイドの安定性を改良するために、ポリマー乳化剤を用いる。ポリマー乳化剤は、油相中への水の拡散を最小限にし、したがってレチノイドの水への暴露を最小限にする。このことは、レチノイドの改良された安定性を生じる。
【００１８】
適切なポリマー湿潤剤は一般に、次の２つの種類に含まれる：
（ｂ１）両親媒性ブロックコポリマー；
（ｂ２）疎水基で修飾された親水性バックボーンを含むポリマー。
【００１９】
これらのブロックコポリマーは、ジブロック（ＡＢ構造）あるいはトリブロック（ＡＢＡまたはＢＡＢ構造）になりうる。例証として、Ａブロックは親水性であり、例えばポリ酸化エチレン、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、シロキサン、グアール、およびバイオポリマー（アラビアゴム、タンパク質、ゼラチン）である。Ｂブロックは疎水性であり、例えばポリ酸化プロピレン、ポリイソブタレン、およびポリスチレンである。
【００２０】
疎水的に修飾されたポリマーの場合、主要成分またはバックボーンは親水性である。このバックボーンに沿って、および／または末端部において、疎水基（例えばアルカン（Ｃ１２〜Ｃ３０））はグラフト化されている。これらのポリマーは、バスフ社（ＢＡＳＦ）、ローム・アンド・ハース社（Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ）、ＢＦグッドリッチ社（ＢＦ　Ｇｏｏｄｒｉｃｈ）等によって、ポリマー乳化剤のカテゴリー下に生産されている。例えば下記のものである：
・バスフ社（プルラケア（Ｐｌｕｒａｃａｒｅｓ））
・ＢＦグッドリッチ社（ペムレン（Ｐｅｍｕｌｅｎｓ）、カーボポル（Ｃａｒｂｏｐｏｌ）１３８２）
・ローム・アンド・ハース社（アクリン（Ａｃｕｌｙｎ）２２）
・ウイトコ社（Ｗｈｉｔｃｏ）（シルウエット（Ｓｉｌｗｅｔ））。
【００２１】
これらの分子は大部分親水性であり、極性溶媒（水、グリセロール）中に可溶化することができる。しかしながらこれらのポリマーはまた、ポリマーを非極性相または有機相、例えば油中に可溶化させる疎水性領域も含んでいる。
【００２２】
このポリマー乳化剤は、約０．０１％から約１０％、好ましくは約０．１％から２％、最も好ましくは使用量を最小限にするために、約０．１％から約０．５％の濃度で本発明の組成物中に含まれている。最も好ましいポリマー乳化剤は、ペムレンＴＲ１、ペムレンＴＲ２、アクリン２２、およびプルラケアであるが、その理由は、これらが化粧品として許容しうるものであり、効率的であるからである。
【００２３】
好ましくは本発明の組成物は、従来の乳化剤、例えばナトリウムステアロイルラクチレート、ＰＥＧ−１００ステアレート、およびセテアレトを実質的に含んでいない。一般に、本発明の組成物中の従来の乳化剤の量は２％未満であり、好ましくは１％未満であり、最も好ましくは０．５％未満である。用いられるとしても、好ましくは非イオン性乳化剤、例えばツイーンが用いられる。
【００２４】
これらの組成物の安定性
本発明の組成物は、この組成物中のレチノイドの実質的に改良された安定性を示す。具体的には、これらの組成物中のレチノイドの半減期は、好ましくは５０℃において少なくとも約２０日、より好ましくは５０℃において少なくとも約４０日、最も好ましくは５０℃において少なくとも約７０日である。
【００２５】
レチノイド半減期の測定
「半減期」は、レチノイドが、ある一定の温度においてそのもとの濃度の半分まで低下するのにかかる時間として定義される。
【００２６】
促進安定性調査のために、配合物を５０℃において炉に入れる。レチノイドは、下記ＨＰＬＣ方法による安定性評価のために、時間間隔に基づいて分析される。これらの調査は、レチノイドの劣化が、一次動力学によることを示した。したがって反応の半減期を測定するために、残留レチノイド濃度の自然対数が、保存時間に対してプロットされ、勾配ｋを有する直線が得られる。この勾配ｋは、逆時間単位におけるレチノイド酸化率である。ついでレチノールの半減期が、比１ｎ２／ｋによって決定される。
【００２７】
レチノイドＨＰＬＣ分析の手順
ＨＰＬＣデータを収集するために、ミレニアム（Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）３２ソフトウエアおよび光ダイオードアレイ検出器を備えたウオーターズミリポア（Ｗａｔｅｒｓ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）システムを用いた。クロマトグラフィー条件は、下記のとおりである：
カラム：フェノネネックスＩネルトシル（Ｐｈｅｎｏｎａｅｎｅｘ　Ｉ　ｎｅｒｔｓｉｌ）　５μ　ＯＤＳ　２　１５０×４．６０ｍｍ
流量：１．０ｍＬ／分
注入容積：３０μＬ
ＵＶ検出：光ダイオードアレイを用いて３２５ｎｍ
移動相：９０／１０　メタノール／水
運転時間：１５分
温度：４℃
保持時間：約８．７分
【００２８】
１０ｐｐｍ未満の標準曲線範囲内の最終レチノイド濃度を有するようにサンプル溶液を調製するために、０．２ｇクリームサンプルを、まず２．５ｇの水と混合し、渦巻き攪拌してスラリーを形成する。ついでメタノールをこのスラリーに添加し、５０ｍｌの最終総重量を得て、再び渦巻き攪拌する。その後このサンプルを、０．４５μｍフィルターが取り付けられた使い捨て注射器を用いてろ過する。すべてのサンプルは、ＨＰＬＣ分析のために３重複製として調製する。
【００２９】
湿潤剤
皮膚に保湿効果をもたらすために、本発明の組成物中に好ましくは湿潤剤が含まれている。適切な湿潤剤は多価アルコールであり、これにはグリセロール（別名グリセリン）が含まれるが、これに限定されるわけではなく、本発明において添加することができるグリセリン以外の湿潤剤には、ソルビトール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、ヘキシレングリコール、エトキシル化グルコース、およびヘキサントリオールが含まれる。湿潤剤は、本発明の組成物中に少なくとも１０％の濃度で含まれる。好ましくは少なくとも２％、一般に約２％から約９０％の範囲内にある濃度である。好ましくは約５％から約６０％、最も好ましくは保湿効果を最適化するために、約１０％から約３５％である。最も好ましい湿潤剤は、グリセロールおよびソルビトールであり、これらは化粧品として好ましく、低価格で、高い効力がある。
【００３０】
エラストマー
エラストマーは、本発明の組成物中に含めるのに好ましい任意成分である。エラストマーは絹のようなつややかさを与える。これらの物質は、高架橋シロキサンポリマーとシリコーン油とのブレンドである。供給業者源には、ＧＥシリコーンズ社（ＧＥ　Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ）（ニューヨーク州ウオーターフォード（Ｗａｔｅｒｆｏｒｄ、ＮＹ））、ダウ・コーニング社（Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ）（ミシガン州ミッドランド（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ））、ローディア・シリコーンズ社（Ｒｈｏｄｉａ　Ｓｉｌｉｃｏｎｅｓ）（ニュージャージー州クランベリー（Ｃｒａｎｂｕｒｙ，ＮＪ））が含まれる。エラストマーは好ましくは、０％から３０％、好ましくは１％から１５％、最も好ましくは１％から１０％の量で含まれる。最も好ましくはエラストマーの分散を助けるため、および皮膚の潤滑性のために、エラストマーは追加の揮発性シリコーン油（シクロメチコーンおよびジメチコーン）と組合わせて含まれる。その場合、この揮発性シリコーン油は、約０％から約２５％、好ましくは約１％から約１０％の量で含まれる。
【００３１】
【表１】
2004513959.tif 000002
【００３２】
レチノイドブースター
本発明による好ましい組成物は、レチノイドブースターを含む。
【００３３】
レチノールエステルおよびレチノールは、図１に示されているメカニズムにしたがって、皮膚の中でレチノイン酸に酵素的に転換されると考えられる。
【００３４】
あるいくつかの化合物は、ＡＲＡＴ／ＬＲＡＴ、レチナールレダクターゼ、ＣＲＡＢＰＩＩ、およびレチノイン酸酸化を阻害し（後者は、シトクロムＰ４５０系によって触媒される）、一方、あるいくつかのほかの化合物は、レチナールデヒドロゲナーゼを増強する。これらの化合物は本明細書において、集合的に「ブースター」と名づけられ、上記チャートではグループＢ１からＢ５としてコード化される。これらのブースターは、単独で、または互いに組合わせて、レチノイン酸への転換に有効なレチノールの量を増加させることによって、およびレチノイン酸の劣化を阻害することによって、レチノイドの作用を強化する。これらのブースターは、レチノイド（例えばレチノール、レチニルエステル、レチナール、レチノイン酸）とともに作用する。
【００３５】
本発明の組成物は好ましくは、ブースターまたはブースターの組合わせを、この組成物の約０．０００１重量％から約５０重量％、好ましくは約０．００１重量％から約１０重量％、最も好ましくは約０．００１重量％から約５重量％含んでいる。
【００３６】
本発明の組成物中に含まれているブースターまたはブースターの組合わせは、下記のものから成る群から選ばれる：
（ａ）Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ４、Ｂ５から成る群から選ばれるブースター；
（ｂ）Ｂ１／Ｂ２；Ｂ１／Ｂ３；Ｂ１／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３；Ｂ２／Ｂ４；Ｂ２／Ｂ５；Ｂ３／Ｂ４；Ｂ３／Ｂ５；Ｂ４／Ｂ５から成る群から選ばれるブースターの二元的組合わせ；
（ｃ）Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５から成る群から選ばれるブースターの三元的組合わせ；
（ｄ）Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ２／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ１／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５；Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５から成る群から選ばれるブースターの四元的組合わせ；
（ｅ）Ｂ１／Ｂ２／Ｂ３／Ｂ４／Ｂ５のブースターの５つのグループの組合わせ。
【００３７】
ブースターとして本発明の中に含まれる化合物は、このような化合物が、表Ａに挙げられたある濃度において、下記のセクション２．１から２．７に記載されているような特定酵素に対する試験管内ミクロソームアッセイに合格する能力に基づいて選ばれる。このようなブースターは、たとえ本明細書に明白に記載されていなくても、本発明の中に含まれる。別な言い方をすれば、化合物が下記アッセイにおいて酵素を十分に阻害または増強するならば、これはレチノイドと共に作用して、レチノイン酸のケラチン生成細胞（皮膚細胞）への作用を模す。したがってこれは本発明の範囲内に含まれる。
【００３８】
レチノイドおよび好ましくはレチノイドブースターを含めることによって、本発明の組成物は、乾燥肌、にきび、光損傷肌、シワの外見、加齢斑、老化肌の予防および治療、角質層柔軟性の増加、肌の色を明るくすること、皮脂分泌の制御、および一般に皮膚の質の向上において有用である。この組成物は、皮膚の落屑、および表皮の分化を改良するために用いられてもよい。
【００３９】
本発明の製品中のブースターの存在は、レチノイドの性能を実質的に改良する。
【００４０】
このブースターは、下記のセクション２．１から２．７に記載されている試験管内ミクロソームアッセイに合格する化合物である。本発明への使用に適した化合物は、表Ａに挙げられた濃度において、表Ａに挙げられた少なくとも幅広い％まで酵素を阻害または増強する。
【００４１】
【表２】
2004513959.tif 000003
【００４２】
本発明の組成物中にこの化合物を含めることの適切さを決定するために用いられた試験管内ミクロソームアッセイは、下記のとおりである：
１．材料
オール−トランス−レチノール、オール−トランス−レチノイン酸、パルミトイル−ＣｏＡ、ジラウロイルホスファチジルコリン、ＮＡＤ、およびＮＡＤＰＨは、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から購入された。これらのミクロソームアッセイ用のレチノイドの保存溶液は、ＨＰＬＣグレードアセトニトリル中で作られた。ＨＰＬＣ分析用のレチノイド標準保存溶液はすべてエタノール中で調製され、Ｎ２雰囲気下に−７０℃で保存され、保存から取り出された時、暗室灯下に氷上に維持された。その他の薬品および阻害剤は、化粧品材料供給業者、または化学会社、例えばオルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）またはインターナショナル・フレーバーズ・アンド・フレイグランシーズ社（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｆｌａｖｏｒｓ　ａｎｄ　Ｆｒａｇｒａｎｃｅｓ）から商品として入手しうるものであった。
【００４３】
２．方法
２．１　ＲＰＥミクロソームの単離（Ｊ．Ｃ．Ｓａａｒｉ　＆　Ｄ．Ｌ．Ｂｒｅｄｂｅｒｇ、「レチナール色素上皮におけるＣｏＡおよび非ＣｏＡ依存性レチノールエステル化（ＣｏＡ　ａｎｄ　Ｎｏｎ−ＣｏＡ　Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｒｅｔｉｎｏｌ　Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｒｅｔｉｎａｌ　Ｐｉｇｍｅｎｔ　Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）」、Ｊ．Ｂｉｌｌ．Ｃｈｅｍ．２６３、８０８４−８０９０（１９８８）から修正されたもの）。
【００４４】
網膜および房水が除去された５０個の凍結二等分ウシ眼球（ｅｙｅｃｕｐ）は、米国ネブラスカ州リンカーンのＷ．Ｌ．ローソン社（Ｗ．Ｌ．Ｌａｗｓｏｎ　Ｃｏ．，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）から入手した。これらの目を一晩解凍し、着色された虹彩膜を、ピンセットで剥がして除去した。黒く着色された細胞を、絵筆またはゴム冠ポリスマンでこすって、各々の眼球を２×０．５ｍＬ冷緩衝液（０．１Ｍ　ＰＯ４／１ｍＭ　ＤＴＴ／０．２５Ｍスクロース、ｐＨ７）で洗浄した。この細胞懸濁液を、虹彩膜に添加し、ビーカーにおいてテフロン攪拌棒で懸濁液を数分間攪拌した。この懸濁液を、粗いフィルター（スペクトラ（Ｓｐｅｃｔｒａ）／Ｐｏｒ９２５μｌ細孔サイズポリエチレンメッシュ）を通して濾過し、大きい粒子を除去し、結果として生じた暗い色の懸濁液を、モーター駆動テフロンホモジナイザーを備えたグラス−コル（Ｇｌａｓ−Ｃｏｌ）を用いて均質化した。この細胞ホモジェネートを、２０，０００ｇで３０分間遠心分離した（１４，０００ＲＰＭにおいて２．５×１０ｃｍ管中ＳＳ３４ローターを備えたソルバール（Ｓｏｒｖａａｌ）モデルＲＣ−５Ｂ遠心分離機）。その結果生じた上澄み液を、１５０，０００ｇで６０分間さらなる遠心分離に付した（４０，０００ＲＰＭにおいて１３×５１ｍｍ管中ＳＷ５０．１ローターを有するベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）モデルＬ８０超遠心分離機）。その結果生じたペレットを、ヒート・システムズ・ウルトラソニクス社（Ｈｅａｔ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．）モデルＷ１８５Ｄソニファイアー・セル・ディスラプター（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ）を用いて、約５ｍＬ　０．１Ｍ　ＰＯ４／５ｍＭ　ＤＴＴ、ｐＨ７中に分散し、その結果生じたミクロソーム分散液を、小さい管にアリコートし、−７０℃で保存した。これらのミクロソームのタンパク質濃度は、バイオラッド・ダイ（ＢｉｏＲａｄ　Ｄｙｅ）結合アッセイを用い、ＢＳＡを標準として用いて測定した。
【００４５】
２．２　ラットの肝臓ミクロソームの単離（Ｒ．Ｍａｒｔｉｎｉ　＆　Ｍ．Ｍｕｒｒａｙ、「ラットの肝臓ミクロソームレチノイン酸４−ヒドロキシル化におけるＰ４５０　３Ａ酵素の調製（Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ４５０　３Ａ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ｉｎ　Ｒａｔ　Ｈｅｐａｔｉｃ　Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ　Ｒｅｔｉｎｏｉｃ　Ａｃｉｄ　４−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ）」、Ａｒｃｈｉｖｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０３、５７−６６（１９９３））。
【００４６】
約６グラムの凍結ラット肝臓（アキュレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック社（Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏｒｐ．）からのハーラン・スプラーグ・ドーリー（Ｈａｒｌａｎ　Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ）ラットから入手したもの）を、ブリンクマン・ポリトロン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ　Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）を用いて、０．１Ｍトリス／０．１Ｍ　ＫＣｌ／１ｍＭ　ＥＤＴＡ／０．２５Ｍスクロース、ｐＨ７．４緩衝液３容積中に均質化した。その結果生じた組織の懸濁液を、前記モーター駆動テフロンホモジナイザーにおいてさらに均質化した。その結果生じたホモジェネートを、１０，０００ｇで３０分、２０，０００ｇで３０分、３０，０００ｇで１５分間連続的に遠心分離し、その結果生じた上澄み液を、１０５，０００ｇで８０分間超遠心分離した。このペレットを、前記のように０．１Ｍ　ＰＯ４／０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ／５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４緩衝液約５ｍＬ中で音波処理し、アリコートとして−７０℃で保存した。タンパク質濃度を、前記のように測定した。
【００４７】
２．３　ＡＲＡＴおよびＬＲＡＴ活性についてのアッセイ（Ｂ１を同定するため）
下記手順は、Ｊ．Ｃ．Ｓａａｒｉ　＆　Ｄ．Ｌ．Ｂｒｅｄｂｅｒｇ、「ウシレチナール色素上皮ミクロソームのＡＲＡＴおよびＬＲＡＴ活性（ＡＲＡＴ　＆　ＬＲＡＴ　Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｒｅｔｉｎａｌ　Ｐｉｇｍｅｎｔ　Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９０、１５６−１６３（１９９０）に記載されている方法の修正法である。下記の緩衝液を調製し、４℃で保存した：０．１Ｍ　ＰＯ４／５ｍＭ　ジチオトレイトール、ｐＨ７．０（ＰＯ４／ＤＴＴ）。アッセイ当日、緩衝液１ｍＬあたり２ｍｇのＢＳＡを添加して、ＰＯ４／ＤＴＴ／ＢＳＡ作業緩衝液を生じる。１ｍＭレチノール基質をアセトニトリル中で調製し、窒素ガス下−２０℃でアンバービンに保存した。作業緩衝液中４ｍＭパルミトイル−ＣｏＡ溶液（アリコートとして保存されたもの）およびエタノール中４ｍＭのジラウロイルホスファチジルコリンを調製し、−２０℃で保存した。阻害剤を、Ｈ２Ｏ、エタノール、アセトニトリル、またはＤＭＳＯ中の１０ｍＭ保存溶液として調製した。急冷溶液は、５０μｇ／ｍＬブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）を含む純粋エタノールを用いて調製し、５０μｇ／ｍＬ　ＢＨＴを含むヘキサン溶液を抽出のために用いた。
【００４８】
２ドラムガラスビンに、下記のものを順序よく添加する：５００μＬの総容積を生じるためのＰＯ４／ＤＴＴ／ＢＳＡ緩衝液、５μＬアシルドナー（４ｍＭパルミトイル−ＣｏＡおよび／またはジラウロイルホスファチジルコリン）、５μＬ阻害剤、または溶媒ブランク（１０ｍＭ保存液またはそれ以上の希釈液）、ついで約１５μｇのＲＰＥミクロソームタンパク質（約１ｍｇ／ｍＬミクロソームタンパク質アリコート約１５μＬ）。３７℃で５分間インキュベーションして、反応温度を平衡させ、ついで５μＬの１ｍＭレチノールを添加する。これらのビンに蓋をし、５秒間渦巻き攪拌し、３７℃で３０〜９０分間インキュベーションする。０．５ｍＬエタノール／ＢＨＴを添加して反応を急冷する。３ｍＬヘキサン／ＢＨＴを添加してレチノイドを抽出し、数秒間数回これらの管を渦巻き攪拌し、これらの管を低速で５分間遠心分離して、これらの層を素早く分離する。上部ヘキサン層をきれいなビンに取り出し、前記のように別の３ｍＬヘキサン／ＢＨＴで水性相を再抽出する。これらのヘキサン層を組合わせ、加熱アルミニウムブロック上で窒素ガス流下、３７℃での乾燥によってヘキサンを蒸発させる。ＨＰＬＣ分析まで、これらの乾燥残渣を−２０℃で保存する。下記のようにＨＰＬＣシグナルの統合によって、それぞれＡＲＡＴおよびＬＲＡＴ活性について、レチニルパルミテートおよびレチニルラウレートの量を定量化する。
【００４９】
このインキュベーション溶液が、４０μＭアシルドナー、１００μＭ以下の阻害剤、１０μＭレチノール、約３０μｇ／ｍＬミクロソームタンパク質、および約０．１Ｍ　ＰＯ４、ｐＨ７／５ｍＭ　ＤＴＴ／２ｍｇ／ｍＬ　ＢＳＡを含むことに注目のこと。レチノールの添加に続くすべての工程は、暗闇で、または暗室灯下で行なわれた。
【００５０】
２．４　レチノールデヒドロゲナーゼ活性についてのアッセイ（Ｂ２を同定するため）
下記の保存溶液を調製した：
５０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４緩衝液、滅菌濾過されたもの；
ＤＭＳＯ中１０ｍＭオールトランスレチノール（シグマＲ７６３２）；
滅菌水中の２００ｍＭニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、ナトリウム塩（ＮＡＤＰ）（シグマＮ０５０５）；
適切な溶媒（水、緩衝液、エタノール、クロロホルム、またはＤＭＳＯ）中４０ｍＭテスト化合物；
５０ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４緩衝液（４μｇ／μｌ）中ラット肝臓ミクロソームの１：１０希釈液。
【００５１】
ネジ蓋のついている２ドラムガラスビンの中に、次のものを順序よく添加する：
最終容積４００μｌを生じるための緩衝液；
２５μｌ希釈ミクロソーム（最終＝１００μｇ）−対照として沸騰ミクロソーム、テストサンプルとして通常のミクロソームを用いる；
４μｌの２００ｍＭ　ＮＡＤＰ（最終＝２ｍＭ）；
１μｌの４０ｍＭテスト化合物（最終＝１００μＭ）；
８μｌの１０ｍＭレチノール（最終＝２００μＭ）。
【００５２】
３７℃の振とう水浴においてガラスビンを４５分間インキュベーションする。反応を急冷するために、各々のガラスビンに５００μｌ氷冷エタノールを添加する。これらのレチノイドを氷冷ヘキサン（１抽出あたり２．７ｍｌ）で２回抽出する。各々のサンプルにおける抽出効率を監視する手段として、酢酸レチニル（９００μＭ保存溶液５μｌ）を、第一抽出の間に各々のガラスビンに添加する。サンプルを１０秒間渦巻き攪拌した後で、ベックマンＧＳ−６Ｒ遠心分離機において５℃、１０００ｒｐｍで５分間静かに遠心分離する。レチノイドを含む上部ヘキサン層は、きれいな２ドラムガラスビンへの各々の抽出後、水性層から除去する。静かな窒素ガス流下、ヘキサンを蒸発させて除去する。ＨＰＬＣ分析まで、乾燥残渣を−２０℃で保存する。
【００５３】
２．５　レチナールレダクターゼ活性についてのアッセイ（Ｂ３を同定するため）
すべての保存溶液を、下記の置換えを行なって前記のように調製した。
【００５４】
ＤＭＳＯ中１０ｍＭのオールトランスレチナルデヒド（シグマＲ２５００）−レチノールの代わりに；
２００ｍＭ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート、還元形態、滅菌水中テトラナトリウム塩（ＮＡＤＰＨ）（シグマＮ７５０５）−ＮＡＤＰの代わりに。
【００５５】
ネジ蓋のついている２ドラムガラスビンにおいて、下記のものを順序よく加える：
最終容積４００μｌを生じるための緩衝液；
２５μｌの希釈ミクロソーム（最終＝１００μｇ）−対照として沸騰ミクロソーム、テストサンプルとして通常のミクロソームを用いる；
４μｌの２００ｍＭ　ＮＡＤＰＨ（最終＝２ｍＭ）；
１μｌの４０ｍＭテスト化合物（最終＝１００μＭ）；
３μｌの１０ｍＭレチナルデヒド（最終＝７５μＭ）。
【００５６】
前記と同じインキュベーションおよび抽出手順にしたがう。
【００５７】
２．６　ＣＲＡＢＰＩＩアンタゴニストについてのアッセイ（Ｂ４を同定するため）
２．６．１．ＣＲＡＢＰＩＩの合成
ａ．発現系
遺伝子ＣＲＡＢＰＩＩを、ｐＥＴ２９ａ−ｃ（＋）プラスミド（ノバゲン社（Ｎｏｖａｇｅｎ））中にクローンした。このクローン遺伝子は、強力なバクテリオファージＴ７転写および翻訳シグナルの制御下にあった。Ｔ７ポリメラーゼ源は、ホスト細胞Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（ノバゲン社）によって供給された。後者は、ＩＰＴＧの存在によって誘発された、ｌａｃＵＶ５制御下のＴ７ポリメラーゼの染色体コピーを有する。
【００５８】
このプラスミドは、製造業者のプロトコル（ノバゲン社）による形質転換によって、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＢＬＲ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞中に転移される。
【００５９】
ｂ．誘発
これらの形質転換細胞の一晩培養物を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンと２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールとを含む２ｘＹＴ中に１：１００希釈した。これらの細胞は、６００ｎｍにおけるＯＤが０．６から０．８に達するまで、３７℃での振とう中に成長した。ついでＩＰＴＧを、最終濃度１ｍＭまで添加し、この培養物を、さらに２時間インキュベーションした。これらの細胞を、室温において５０００ｇで１０分間、遠心分離によって採集した。このペレットを−２０℃で保存した。
【００６０】
２．６．２．精製
Ｎｏｒｒｉｓ　ａｎｄ　Ｌｉ，１９９７に記載されている方法にしたがって、精製を実施した。
【００６１】
ａ．溶解
凍結ペレットをＲＴで解凍し、新たに調製された溶解緩衝液（５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０％（ｗ／ｖ）スクロース、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）ナトリウムアジド、０．５ｍＭ　ＤＴＴ、１０ｍＭ　ＭｎＣｌ２、２．５ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、２．５ｍＭベンズアミジン、６μｇ／ｍＬ　ＤＮａｓｅ）１から２ペレット容積中に再懸濁した。この溶解物を、３０分間室温でインキュベーションした。さらに、溶解を、音波処理（６回の１０，０００ｐｓｉにおける３０秒バーストと、５回の３０秒の氷上遅延とを交互に行なう）によって完成した。この溶解物の不溶フラクションを、１５０００ｒｐｍにおいて４℃で１時間、遠心分離によって除去し、上澄み液を−２０℃で保存する。
【００６２】
ｂ．セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ３００上のゲル濾過
工程ａからの上澄み液を、室温においてセファクリルＳ−３００（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））の２．５×１００ｃｍカラム上に載せた。溶離緩衝液は、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、０．５ｍＭＤＴＴ、０．０５％ナトリウムアジド（緩衝液Ａ）であった。流量は２ｍＬ／分であった。収集された２−ｍＬフラクションを、２８０ｎｍにおける紫外線吸光度についてチェックした。これらのピークを表わすフラクションは、ＣＲＡＢＰＩＩの存在についてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって調べた。
【００６３】
ｃ．アニオン交換クロマトグラフィー
ＣＲＡＢＰＩＩを含むゲル濾過フラクション２ｍＬを、第四アミンアニオン交換カラムＦＰＬＣ（高速タンパク質液体クロマトグラフィー）型モノＱ（ファルマシア社）上に載せた。ＣＲＡＢＰＩＩは、室温において２０分間にわたって１００％緩衝液Ａから３０％緩衝液Ｂまでの勾配緩衝液（１００％緩衝液Ｂ＝緩衝液Ａ＋２５０ｍＭ　ＮａＣｌ）を用いて溶離した。１ｍＬフラクションを１分毎に収集した。もう一度、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによってＣＲＡＢＰＩＩの存在をチェックした。ＣＲＡＢＰＩＩを、４℃において保存し、その後ガラスビンプラットホームアタッチメントの付いたマイクロモデュリロ（Ｍｉｃｒｏｍｏｄｕｌｙｏ）１．５Ｋ（エドワーズ・ハイ・バキューム・インターナショナル社（Ｅｄｗａｒｄｓ　Ｈｉｇｈ　Ｖａｃｕｕｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））を用いて凍結乾燥した。結合アッセイに使用するまで、これらの乾燥サンプルを室温で保存した。
【００６４】
ｄ．ＣＲＡＢＰＩＩの存在の検出
ＣＲＡＢＰＩＩの発現および精製は、７％から１５％ポリアクリルアミドゲル（バイオラッド社）上の変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いて確認した。１０μＬサンプルを、１０μＬの２×負荷緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、０．２％ＢＰＢ、２０％グリセロール、１ｍＭＤＴＴ）と混合し、加熱（８０℃において２分）によって変性した。これらのサンプルをゲル上に載せ、これを１×トリス−グリシン緩衝液（バイオラッド社）中に浸漬し、定電流（２５ｍＡ）を室温で１時間加えた。クーマシーブルー染色後、タンパク質を、ベンチマーク予備染色タンパク質ラダー（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ）を用いて測定されたその分子量にしたがって同定した。
【００６５】
ＣＲＡＢＰＩＩの存在を確認するために、ウエスタンブロットを用いた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離されたタンパク質を、バイオラッドカセットを用いて、イモビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）−Ｐ転移膜（ミリポア）上に転移した。この転移は、１×トリス−グリシン緩衝液（ビオラッド）＋１０％メタノール中で発生した。電流（６０ｍＡ）を３時間加えて、タンパク質を膜を通って移動させた。その後この膜を、室温で１時間１×ＴＢＳ中５％乾燥ミルクで遮断し、同じ緩衝液中で４℃で一晩、ＣＲＡＢＰＩＩへの第一抗体（マウスの抗クローナル５−ＣＲＡ−Ｂ３の１／１０００希釈液）でプローブした。翌日、この膜をＰＢＳで洗浄し（３×５分）、ついで第二抗体、ペルオキシダーゼ共役抗マウス抗体（ＥＣＬＭ、アマーシャム社）の１：２０００希釈液で室温で１時間インキュベーションした。この膜を１×ＰＢＳで洗浄し（３×５分）、ＥＣＬ検出キットを用いて製造業者の指示にしたがって（アマーシャム社）、タンパク質を検出した。
【００６６】
ＢＳＡキット（ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ））を用いて、精製ＣＲＡＢＰＩＩの濃度を測定した。
【００６７】
２．６．３．放射性結合アッセイ
２２０ｐモルのＣＲＡＢＰＩＩを、７０μＬの総容積中１５ｐモルの放射性オールトランスレチノイン酸（ＮＥＮ）で、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４中にインキュベーションした。競合アッセイのために、過剰なもう１つのリガンド（６６７０：１、６７０：１、または７０：１）を、このミックスに添加した。この反応は、暗闇で室温において１時間発生した。結合オールトランスレチノイン酸から未結合オールトランスレチノイン酸を分離するために、６ｋＤカットオフミニクロマトグラフィーカラム（バイオラッド社）を用いた。マイクロプレックス（Ｍｉｃｒｏｐｌｅｘ）マニホールドを用い、製造業者の指示（ファルマシア社）にしたがって、保存緩衝液を処分した。これらのサンプルをカラム上に載せると、分離が３０分にわたって重力によって発生した。ＣＲＡＢＰＩＩに結合したレチノイン酸（「ＲＡ」）が濾過物中に現われ、一方、遊離ＲＡはカラム中に残留した。濾過物の放射性を、シンチレーションカウンタによって測定した。
【００６８】
２．７　ＮＡＤＰＨ依存性レチノイン酸酸化についてのアッセイ（Ｂ５を同定するため）
下記手順は、Ｒ．ＭａｒｔｉｎｉおよびＭ．Ｍｕｒｒａｙの、「ラットの肝臓ミクロソームレチノイン酸４−ヒドロキシル化におけるＰ４５０　３Ａ酵素の参加（Ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐ４５０　３Ａ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　ｉｎ　Ｒａｔ　Ｈｅｐａｔｉｃ　Ｍｉｃｒｏｓｏｍａｌ　Ｒｅｔｉｎｏｉｃ　Ａｃｉｄ　４−Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ）」、Ａｒｃｈｉｖｅｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０３、５７−６６（１９９３）に記載されている方法の修正法である。下記アッセイ緩衝液を調製し、４℃で保存する：０．１Ｍ　ＰＯ４／０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ／５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４。アッセイ当日に、緩衝液中６０ｍＭ　ＮＡＤＰＨ溶液を調製する。阻害剤保存液、酸性化エタノール／ＢＨＴ急冷溶液、および前記のようなヘキサン／ＢＨＴを調製する。１ｍＭレチノイン酸作業溶液を、エタノールでの１５ｍＭ保存溶液（ＤＭＳＯ中）の希釈によって調製する。
【００６９】
２ドラムガラスビンに、下記のものを順序よく添加する：最終溶液５００μＬを生じるためのアッセイ緩衝液、２０μＬの６０ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、５μＬの阻害剤、または溶媒ブランク、ついで約２ｍｇのラット肝臓ミクロソームタンパク質。３７℃で５分間インキュベーションし、ついで５μＬの１ｍＭレチノイン酸作業溶液を添加する。
【００７０】
３７℃で６０分間インキュベーションを続行する。ガラスビンに蓋をしない。その理由は、この酸化プロセスが、ＮＡＤＰＨに加えて分子Ｏ２を必要とするからである。酸性化エタノール／ＢＨＴで急冷し、前記のようなヘキサン／ＢＨＴで抽出する。下記のように、ＨＰＬＣシグナルの統合によって、素早く溶離する極性レチノイン酸代謝産物（４−オキソレチノイン酸と推測される）を定量化する。
【００７１】
レチノイン酸の添加に続くすべての工程は、暗闇で、または暗室灯下で実施されることに留意のこと。最終インキュベーション溶液は、２．４ｍＭ　ＮＡＤＰＨ、１００μＭ以下の阻害剤、１０μＭレチノイン酸、約４ｍｇ／ｍＬラット肝臓ミクロソームタンパク質、および約０．１Ｍ　ＰＯ４／０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ／５ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む。
【００７２】
個々のレチノイドのＨＰＬＣ分析
ＨＰＬＣによるレチノイド定量化用のサンプルは、各ガラスビン中で残渣を１００μＬのメタノールで溶解して調製した。この溶液を、１ｍＬシェルガラスビンの中の１５０μＬガラス円錐管に移し替え、きっちりと蓋をし、ウオーターズ７１５オートサンプラー（Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ）の中に入れた。６０μＬのアリコートを直ちに注入し、レチノイド含量について分析した。
【００７３】
クロマトグラフィー機器類は、ウオーターズ６００勾配制御器／ポンプ、ウオーターズ９９６光ダイオードアレイ検出器、およびウオーターズ４７４走査蛍光検出器から成っていた。レチノイド分析のために、２つのＨＰＬＣプロトコルを使用した。ＡＲＡＴおよびＬＲＡＴアッセイのために、レチノールとレチノールエステルとの分離は、ウオーターズ３．９×３００ｍｍＣ１８ノバパック逆相分析カラム、および流量１ｍＬ／分に調節された８０：２０（ｖ／ｖ）メタノールＴＨＦ定組成移動相を有するウオーターズ・セントリー・ノバパックＣ１８ガードカラムを用いて実施した。この溶離物を、３２５ｎｍにおける吸光度および３２５ｅｘ／４８０ｅｍにおける蛍光について監視した。より短いウオーターズ３．９×１５０ｍｍＣ１８ノバパック逆相分析カラムおよびウオーターズ・セントリー・ノバパックＣ１８ガードカラムを用い、Ａ．Ｂ．Ｂａｒｕａ、「水溶性化合物のグルコノミドの分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｗａｔｅｒ−Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：Ｇｌｕｃｏｎｏｍｉｄｅｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８９、１３６−１４５（１９９０）によって記載されている勾配系の修正法を利用して、レチノールとレチノイン酸酸化アッセイのためにレチノイド酸とアルコールとを分離した。この系は、６８：３２（ｖ／ｖ）メタノール／１０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む水から、４：１（ｖ／ｖ）メタノール：ジクロロメタンまでの２０分の直線勾配、ついで流量１ｍＬ／分における５分間の保持から成っていた。このカラム溶離物は、３００ｎｍから４００ｎｍまで監視された。
【００７４】
これらのプロトコルは、各々のアッセイのために適切なレチノイド酸、アルコール、アルデヒド、および／またはエステルを明白に解明するこれらの能力、および分離の相対的迅速性に基づいて選ばれた。ＨＰＬＣによる個々のレチノイドの同定は、未知のピークの保持時間と有効な真正レチノイド標準の保持時間との正確なマッチ、および有効な真正レチノイドに対する未知のピークのＵＶスペクトル分析（３００ｎｍから４００ｎｍ）に基づいた。
【００７５】
本発明に用いるのに適したブースターには、下記表Ｂ１からＢ５に挙げられているブースターが含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００７６】
【表３】
2004513959.tif 000004
2004513959.tif 000005
2004513959.tif 000006
2004513959.tif 000007
【００７７】
【表４】
2004513959.tif 000008
【００７８】
【表５】
2004513959.tif 000009
【００７９】
【表６】
2004513959.tif 000010
【００８０】
【表７】
2004513959.tif 000011
【００８１】
好ましいブースターまたはこれらの組合わせは、下記トランスグルタミナーゼアッセイにおいて、１０ｍＭの濃度において少なくとも５０％までトランスグルタミナーゼ（以後「Ｔｇａｓｅ］）を阻害する。
【００８２】
【表８】
2004513959.tif 000012
【００８３】
トランスグルタミナーゼアッセイ
トランスグルタミナーゼアッセイおよびケラチン生成細胞分化
表皮における末端分化のプロセスの間、角質外皮（ＣＥ）として知られているタンパク質の１５ｎｍ厚さの層が、細胞周辺部の内側表面上に形成される。ＣＥは、表皮中に発現された少なくとも２つの異なるトランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅｓ）の作用によって触媒されたＮε−（Υ−グルタミル）リシンイソジペプチド結合の形成によって互いに架橋された多数の異なるタンパク質から成っている。ＴＧａｓｅ　Ｉは、表皮の分化層、特に顆粒層中に豊富に発現されるが、未分化基底表皮には存在しない。したがってＴＧａｓｅ　Ｉは、より分化された状態を示す、高いＴＧａｓｅ　Ｉレベルを有する表皮性ケラチン生成細胞分化の有用なマーカーである。ＴＧａｓｅ　Ｉ抗体を用いるＥＬＩＳＡベースのＴＧａｓｅ　Ｉアッセイを用いて、下記実施例における培養ケラチン生成細胞の分化の状態を評価した。
【００８４】
ケラチン生成細胞（前記のように培養されたもの）を、２００μ培地中１ウエルあたり４，０００から５，０００細胞の密度で、９６ウエルプレートにおいて培養した。２日間から３日間のインキュベーション後、または細胞が約５０％密集成長になるまで、この培地を、テスト化合物を含む培地に変えた（１テストあたり５重の複製）。これらの細胞をさらに９６時間培養し、その後この培地を吸引し、これらのプレートを−７０℃で保存した。プレートをフリーザーから取出し、これらの細胞を、２００μｌの１×ＰＢＳで２回洗浄した。これらの細胞を、室温（Ｒ／Ｔ）において１時間、ＴＢＳ／５％ＢＳＡ（洗浄緩衝液、ウシ血清アルブミン）でインキュベーションした。次にＴＧａｓｅ一次抗体を添加した：洗浄緩衝液中に１：２０００希釈された、５０μｌのモノクローナル抗−ＴＧａｓｅ　Ｉ　Ａｂ　Ｂ．Ｃ．。この一次抗体を、３７℃で２時間インキュベーションし、ついで洗浄緩衝液で６×濯ぎ洗いをした。ついで細胞を、３７℃で２時間、洗浄緩衝液中１：４，０００希釈された５０μｌの二次抗体（Ｆａｂ断片、アマーシャム社から得られるペルオキシダーゼ共役抗マウスＩｇＧ）でインキュベーションし、ついで洗浄緩衝液で３回濯ぎ洗いをした。洗浄緩衝液での濯ぎ洗い後、これらの細胞を３×ＰＢＳで濯ぎ洗いした。比色展開のために、これらの細胞を、Ｒ／Ｔ、暗闇で（アルミ箔下）正確に５分間、１００μｌの基質溶液（４ｍｇのｏ−フェニレンジアミンおよび１０ｍｌの０．１Ｍクエン酸塩緩衝液ｐＨ５．０中３．３μｌ３０％Ｈ２Ｏ２）でインキュベーションした。この反応を、５０μｌ４Ｎ　Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止した。サンプルの吸光度を、９６ウエルプレートＵＶ分光光度計で４９２ｎｍにおいて読取った。５つの複製のうち４つを両方の抗体で処理し、５つ目を、ＴＧａｓｅバックグラウンド対照として用いた。ＴＧａｓｅレベルを測定し、パーセント対照として表示した。
【００８５】
トランスグルタミナーゼレベルを測定し、上記表Ｂ１からＢ５において下記のもののどちらかとして表示した：
（ｉ）％（ブースター＋レチノール阻害／対照阻害）−％（ＲＯＨ阻害／対照阻害）、これは、レチノールのみに対して、ブースター＋レチノール誘発ＴＧａｓｅ阻害の追加効果を測定する。または
（ｉｉ）多ブースター濃度の阻害効果を調べた時のＩＣ５０値として。これは、１０−７Ｍの一定のレチノール濃度と組合わせてＴＧａｓｅを５０％阻害するブースターの濃度を生じる。
【００８６】
【表９】
2004513959.tif 000013
2004513959.tif 000014
【００８７】
その他の任意成分
結晶質脂肪酸
結晶質脂肪酸は任意成分である。好ましくはこの脂肪酸は、１２個から２２個の炭素原子を含むが、その理由は、このような酸は安価で、美的に最も許容しうるからである。最も好ましい脂肪酸はステアリン酸である。本明細書において用いられている「酸」という用語は、最終組成物のｐＨに応じて、脂肪酸の塩の存在を排除しない。例えばナトリウム、カリウム、またはアンモニウム塩が存在してもよい。この塩の量は、脂肪酸の量の中に含まれる。本発明の組成物は好ましくは、脂肪酸を少なくとも０％、最も好ましくは０．１％から１８％含む。
【００８８】
本発明の組成物は最も好ましくはさらに、レチノイドの安定性を改良するために、酸化防止剤、還元剤、キレート剤、およびこれらの混合物から成る群から選ばれる成分を含んでいる。これらの成分は、レチノイドの酸化に対して追加の保護レベルを与える。本発明の配合物のための酸化防止剤、還元剤、およびキレート剤の通常の例は、「ＣＴＦＡ国際化粧品成分辞典、第４版（ＣＴＦＡ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｓｍｅｔｉｃ　Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ　４ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）」，Ｔｈｅ　Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ，ａｎｄ　Ｆｒａｇｒａｎｃｅ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９１に見ることができる。
【００８９】
好ましい還元剤は、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、二亜硫酸ナトリウム、チオ亜硫酸ナトリウム、またはその他のチオール、例えばチオグリセロール、チオウレア、チオグリコール酸、システイン等である。好ましい酸化防止剤は、ｒａｃ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラ−メチルクロマン−２−カルボン酸（トロロックス）、プロピルガレート、ｎ−プロピルトリヒドロキシベンゾエート、ｔ−ブチルヒドロキノン、およびブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、トコフェリルアセテート、アスコルビルパルミテート、ヒドロキノン、ジブチルヒドロキノン等である。
【００９０】
キレート剤の適切な例には、次のものが含まれるがこれらに限定されるわけではない。すなわち、ＥＤＴＡ、クエン酸、酒石酸、有機アミノホスホン酸、および有機ホスホン酸成分であり、これにはモンサント社（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）によって販売されている、商品として入手しうるデクエスト（Ｄｅｑｕｅｓｔ）（商標）化合物のいくつかが含まれる。好ましくは、１−ヒドロキシエチレン、（１．１−ジホスホン酸）である。
【００９１】
有機アミノホスホン酸は、少なくとも１つのホスホン酸基と少なくとも１つのアミノ基とから成る有機化合物である。本発明に用いるのに適した有機アミノホスホン酸成分には、アミノアルキレンポリ（アルキレンホスホン酸）とニトリロトリメチレンホスホン酸とが含まれる。この種類の有機アミノホスホン酸成分の例には、モンサント社によって販売されている、商品として入手しうるデクエスト（商標）化合物のいくつかが含まれる。
【００９２】
好ましくは、アミノトリ（メチレンホスホン酸）（デクエスト２００６（登録商標））、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）、およびヘキサメチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）である。
【００９３】
本発明に用いるのに適したその他の追加の重金属イオン封鎖剤には、ニトリロトリ酢酸およびポリアミノカルボン酸、例えばエチレンジアミノテトラ酢酸、またはエチレントリアミンペンタ酢酸が含まれる。
【００９４】
本発明に用いるのに適したさらに他の追加重金属イオン封鎖剤は、イミノジ酢酸誘導体、例えば２−ヒドロキシエチルジ酢酸またはグリセリルイミノジ酢酸である。
【００９５】
酸化防止剤は、本発明の組成物中に、０．０１％から１０％、好ましくは０．１％から５％、最も好ましくは０．２％から４％の量で含まれている。還元剤は、本発明の組成物中に、０．０１％から１０％、好ましくは０．１％から５％、最も好ましくは０．２％から４％の量で含まれている。キレート剤は、本発明の組成物中に、０．０１％から１％、好ましくは０．０５％から０．５％、最も好ましくは０．０５％から０．３％の量で含まれている。
【００９６】
特に好ましい組成物は、０．１％亜硫酸塩、０．７％デクエスト２００６（登録商標）、および０．２％ＢＨＴを含んでいる。
【００９７】
様々な種類の活性成分が、本発明の化粧品組成物中に存在していてもよい。活性成分とは、エモリエント以外で、この組成物の物理的特徴を単に改良する成分以外の、皮膚または毛髪効果剤として定義される。このカテゴリーには限定されないが、一般的な例には、日焼け止め剤、美白剤、日焼け剤が含まれる。
【００９８】
日焼け止め剤には、紫外線を遮断するために通常用いられている物質が含まれる。これらの例証的化合物は、ＰＡＢＡの誘導体、シンナメート、およびサリチレートである。例えばオクチルメトキシシンナメートおよび２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（オキシベンゾンとしても知られている）を用いることができる。オクチルメトキシシンナメートおよび２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノンは、それぞれパーソル（Ｐａｒｓｏｌ）ＭＣＸおよびベンゾフェノン−３という商標の商品として入手しうる。
【００９９】
これらのエマルジョンに用いられる日焼け止め剤の正確な量は、太陽のＵＶ線からの望まれる保護の程度に応じて変えることができる。
【０１００】
もう１つの好ましい任意成分は、必須脂肪酸（ＥＦＡ）、すなわち、すべての細胞の原形質膜形成にとって必須の脂肪酸から選ばれる。ケラチン生成細胞においてＥＦＡ欠乏は、細胞を高増殖性にする。ＥＦＡの補足は、これを補正する。ＥＦＡはまた、表皮の脂質生合成を増強し、表皮のバリヤー形成のための脂質を供給する。必須脂肪酸は好ましくは、リノール酸、Υ−リノレン酸、ホモ−Υ−リノレン酸、コロンビン酸、エイコサ−（ｎ−６，９，１３）−トリエン酸、アラキドン酸、Υ−リノレン酸、チムノドン酸、ヘキサエン酸、およびこれらの混合物から選ばれる。
【０１０１】
その他の任意成分には、着色剤、乳白剤、および顔料（例えば二酸化チタン、シリカ）および香料を含めることができる。これらの物質の量は、この組成物の０．００１重量％から２０重量％のいずれかであってもよい。
【０１０２】
化粧品として許容しうるビヒクル
本発明による組成物はまた、この組成物が皮膚または毛髪に付けられた時に、これらの分散を容易にするように、この組成物中の活性成分用の希釈剤（ｄｉｌｕｔａｎｔ）、分散剤、またはキャリヤーとして作用するための、化粧品として許容しうるビヒクルも含んでいる。
【０１０３】
水以外の、または水に加えてのビヒクルには、液体または固体エモリエント、溶媒、湿潤剤、増粘剤、および粉末が含まれてもよい。特に好ましい非水性キャリヤーは、ポリジメチルシロキサン、および／またはポリジメチルフェニルシロキサンである。この発明のシリコーンは、２５℃において約１０センチストークスから０，０００，０００センチストークスのいずれかの粘度を有するシリコーンであってもよい。特に望ましくは、低粘度シリコーンと高粘度シリコーンとの混合物である。これらのシリコーンは、ジェネラル・エレクトリック社（Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｃｏｍｐａｎｙ）からビカシル（Ｖｉｃａｓｉｌ）、ＳＥおよびＳＦという商標で、ダウ・コーニング社から２００および５５０シリーズとして入手しうる。この発明の組成物に用いうるシリコーンの量は、この組成物の５％から９５％、好ましくは２５重量％から９０重量％のいずれかである。
【０１０４】
組成物の使用
本発明による組成物は主として、特に皮膚のコンディショニングおよび平滑化のため、およびシワの寄った肌または老化肌または乾燥した毛髪の外見を防ぐかまたは減らすための薬剤として、ヒトの皮膚または毛髪への局所使用のための製品として意図されている。
【０１０５】
使用の際、この組成物の少量、例えば１ｍｌから５ｍｌを、適切な容器またはアプリケーターから、皮膚または毛髪の暴露区域に付け、ついで必要であれば、手または指または適切な器具を用いてこれを皮膚または毛髪上に伸ばし、および／またはすり込む。
【０１０６】
製品形態および包装
この組成物は、その粘度および消費者によって意図された用途に合わせて、適切な容器に包装することができる。例えば組成物は単に、変形不能なビンまたは絞り容器、例えばチューブまたは蓋付きビンに保存することができる。
【０１０７】
本発明はしたがって、本明細書において定義されている化粧品として許容しうる組成物の入っている閉鎖容器も提供する。
【０１０８】
下記特定の実施例は、本発明をさらに例証するが、本発明はこれらに限定されるわけではない。
【０１０９】
実施例
１．すべての調製は、オーバーヘッドミキサー（１０００ｒｐｍから２０００ｒｐｍ）を用いて、室温（２０℃から２５℃）で実施される。
【０１１０】
２．水性成分（水、グリセロール、ペムレン、および保存料）を、ペムレンが完全に溶媒和されるまで、１０００ｒｐｍから１５００ｒｐｍにおいて互いに混合する。
【０１１１】
３．別個の容器において、油（シリコーン油および／またはその他の任意油）とエラストマーとを１０００ｒｐｍで混合する。
【０１１２】
４．工程３の油混合物にＢＨＴとレチノールとを添加する。１０００ｒｐｍで５分間から１０分間混合する。
【０１１３】
５．工程４からの油相に、工程２からの水性相を添加し、１０００ｒｐｍから１５００ｒｐｍにおいて５分間から１０分間混合する。
【０１１４】
６．最後にＴＥＡを添加し、よくブレンドされるまで１５００ｒｐｍから２０００ｒｐｍにおいて５分間から１０分間混合する。
【０１１５】
註：酸化防止剤、例えばデクエスト２０６６、亜硫酸ナトリウム、およびＮａ２ＣＯ３を、工程２の水相に添加する。トランスクトール（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）を、工程３の油相に添加する。
【０１１６】
Ｂ．レチノール安定性
試作品を、５０℃でアンバーガラスビンに保存した。レチノール安定性測定のために、０、１、２、３、４、６、８、および１２週目に同じビンからアリコートを取った。ＨＰＬＣを用いて、レチノール安定性を監視した。各サンプルを、３重複製において分析した。
【０１１７】
サンプル試作品をレチノール安定性データとともに、下記３つの表に示す。表１は、シリコーン油中のレチノールを有する配合物を詳細に示している。表２は、セチオール油中のレチノールを有する配合物を詳細に示している。表３は、その他の油中のレチノールを有する配合物を詳細に示している。
【０１１８】
【表１０】
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【０１１９】
【表１１】
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【０１２０】
【表１２】
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【０１２１】
本発明は、本明細書において幾分特定的に、およびあるいくつかの好ましいその実施形態を参照して記載されてはいるが、当業者であれば、実施することができ、かつ特許請求されている本発明の範囲内にある、記載されているものの多くの変形例、修正例、およびこれに代わるものを認めることができる。これらの修正例および変形例のすべては、本発明において記載され、かつ特許請求されている本発明の範囲内にあり、これらの発明は、クレームの範囲によってのみ限定され、このようなクレームは、合理的である程度に幅広く解釈されるものとする。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年2月18日(2003.2.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）流動油中に可溶化されたレチノイドと、
（ｂ）両親媒性ブロックコポリマー又は疎水基で修飾された親水性バックボーンを含むポリマーであるポリマー乳化剤と、
（ｃ）結晶質脂肪酸と、を含む化粧品水中油エマルジョン組成物。
【請求項２】
この組成物がさらに、多価アルコール湿潤剤約１％から約９０％を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
この組成物がさらに、エラストマー約０％から約３０％を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
この組成物がさらに、揮発性シリコーン油を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
このレチノイドが、レチノイン酸、レチノール、レチニルエステル、およびレチナールから選ばれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
このレチノイドが、流動油中に、２５℃においてこの油約１００ｇあたり少なくとも約０．１ｇのレチノイドの量において可溶である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
この組成物中のレチノイドの半減期が、５０℃において少なくとも約２０日である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
さらにレチノイドブースターも含む、請求項１に記載の組成物。
【国際調査報告】
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