(57)【要約】本発明は、ＡＦＴＩポリペプチド及びそれをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、ＡＦＴＩポリペプチドを生成するためのベクター、宿主細胞、選択結合物質、及び方法を提供する。また、ＡＦＴＩポリペプチドに関する疾患、特にＩＬ−１媒介の疾患、ＴＮＦ−α媒介の疾患、及び単球の活性化に関わる疾患の治療、診断、改善、又は予防のための方法を提供する。
2004500105.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１の残基７３から６０１に示すようなヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２の残基２５から１９４に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１の残基７３から４５１に示すようなヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２の残基２５から１４４に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１の残基４８５から８２０に示すようなヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号２の残基２５から１１３に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号２の残基７３から１１３に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列番号２の残基１５６から２６７に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）中又は高ストリンジェンシー条件下で（ａ）から（ｆ）までの少なくとも１つの補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つヌクレオチド配列；及び
（ｊ）（ａ）から（ｈ）の少なくとも１つに相補的なヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列から本質的に成る単離核酸分子。
【請求項２】
（ａ）基本的に、請求項１に記載のヌクレオチド配列と少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるヌクレオチド配列から成るヌクレオチド配列であって、配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）請求項１に記載のヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体又はスプライス変異体をコードするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５個のアミノ酸残基のポリペプチドをコードする（ａ）及び（ｂ）の少なくとも１つから選択されるヌクレオチド配列であって、ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つヌクレオチド配列；
（ｄ）少なくとも約１６個のヌクレオチドの断片を含む、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）の少なくとも１つから選択されるヌクレオチド配列；及び
（ｅ）（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列から本質的に成る単離核酸分子。
【請求項３】
請求項１又は請求項２の核酸分子を含むベクター。
【請求項４】
請求項３のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
真核細胞である、請求項４の宿主細胞。
【請求項６】
原核細胞である、請求項４の宿主細胞。
【請求項７】
アポ−Ａ−１フラグメントＴ細胞活性化阻害因子様ポリペプチドを生成する方法であって、請求項５の宿主細胞を適当な条件下で培養してポリペプチドを発現させ、培養からポリペプチドを単離することを含む方法。
【請求項８】
アポ−Ａ−１フラグメントＴ細胞活性化阻害因子様ポリペプチドを生成する方法であって、請求項６の宿主細胞を適当な条件下で培養してポリペプチドを発現させ、培養からポリペプチドを単離することを含む方法。
【請求項９】
請求項７の方法によって生成されるポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８の方法によって生成されるポリペプチド。
【請求項１１】
核酸分子が、ＡＦＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された天然アポＡ−１についてのプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
核酸分子が、ＡＦＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された天然アポＡ−１についてのプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムから成る群より選択されるコンピュータプログラムを用いてパーセント同一性を決定する、請求項２に記載の単離核酸分子。
【請求項１４】
化合物がＡＦＴＩポリペプチドの活性又は産生を阻害するかどうかを判定するための方法であって、請求項４に記載の細胞を化合物に暴露し、該細胞におけるＡＦＴＩ活性又は産生を測定することを含む方法。
【請求項１５】
基本的に、
（ａ）配列番号２の残基２５から１９４に示すようなアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２の残基２５から１４４に示すようなアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２の残基１５６から２６７に示すようなアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２の残基２５から１１３に示すようなアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２の残基７５から１１３に示すようなアミノ酸配列；
（ｆ）コードされるポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、配列番号２のオーソローグ（直系遺伝子）についてのアミノ酸配列；
（ｇ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも約７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるアミノ酸配列；
（ｈ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも約２５個のアミノ酸残基を含む（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）の少なくとも１つに示すアミノ酸配列の断片；
（ｉ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、（ａ）から（ｆ）の少なくとも１つの対立遺伝子変異体又はスプライス変異体についてのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列から成る単離ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項２の核酸分子にコードされる単離ポリペプチド。
【請求項１７】
ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、及びＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムから成る群より選択されるコンピュータプログラムを用いてパーセント同一性を決定する、請求項１５に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１５に記載のポリペプチドで動物を免疫することによって産生される抗体。
【請求項１９】
請求項１５に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体又はその断片。
【請求項２０】
モノクローナル抗体である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２１】
請求項２０に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項２２】
ヒト化抗体である、請求項１８に記載の抗体。
【請求項２３】
完全なヒト抗体又はその断片である、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２４】
キメラ抗体又はその断片である、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２５】
ＣＤＲ移植抗体又はその断片である、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２６】
抗イディオタイプ抗体又はその断片である、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２７】
検出可能な標識に結合している、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２８】
ファージディスプレイ抗体又はその断片である、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２９】
サンプル中のＡＦＴＩポリペプチドを検出する又はＡＦＴＩポリペプチドの量を測定する方法であって、サンプルを請求項１８に記載の抗体又は断片と接触させ、抗体−ポリペプチド相互作用を測定することを含む方法。
【請求項３０】
請求項１５に記載の少なくとも１つのポリペプチドに特異的に結合する選択結合物質又はその断片。
【請求項３１】
可変領域断片である、請求項３０に記載の選択結合物質。
【請求項３２】
可変領域断片がＦａｂ又はＦａｂ’断片である、請求項３１に記載の選択結合物質。
【請求項３３】
検出可能な標識に結合している、請求項３０に記載の選択結合物質。
【請求項３４】
ＡＦＴＩポリペプチドの生物活性に拮抗する、請求項３０に記載の選択結合物質。
【請求項３５】
請求項３０に記載の選択結合物質の有効量を患者に投与することを含む、疾患、状態、又は障害を治療する、予防する、又は改善するための方法。
【請求項３６】
請求項１５に記載のポリペプチドと製薬上許容される製剤物質を含む組成物。
【請求項３７】
請求項１６に記載のポリペプチドと製薬上許容される製剤物質を含む組成物。
【請求項３８】
製薬上許容される製剤物質が、担体、アジュバント、溶解補助剤、安定剤、又は抗酸化薬の少なくとも１つを含む、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３９】
製薬上許容される製剤物質が、担体、アジュバント、溶解補助剤、安定剤、又は抗酸化薬の少なくとも１つを含む、請求項３７に記載の組成物。
【請求項４０】
水溶性ポリマーで共有結合修飾された、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオル、及びポリビニルアルコールから選択される、請求項４０に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
水溶性ポリマーで共有結合修飾された、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオル、及びポリビニルアルコールから選択される、請求項４２に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
請求項１に記載の核酸分子を含むウイルスベクター。
【請求項４５】
請求項２に記載の核酸分子を含むウイルスベクター。
【請求項４６】
請求項１５に記載のポリペプチドと非相同アミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項４７】
非相同アミノ酸配列がＩｇＧ定常ドメイン又はその断片である、請求項４６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４８】
請求項１６に記載のポリペプチドと非相同アミノ酸配列を含む融合ポリペプチド。
【請求項４９】
非相同アミノ酸配列がＩｇＧ定常ドメイン又はその断片である、請求項４８に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５０】
対象者において炎症を軽減するための方法であって、請求項１５に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。
【請求項５１】
対象者において炎症を軽減するための方法であって、請求項１６に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。
【請求項５２】
対象者においてＩＬ−１βの分泌を低下させるための方法であって、請求項１５に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。
【請求項５３】
対象者においてＩＬ−１βの分泌を低下させるための方法であって、請求項１６に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。
【請求項５４】
対象者においてＴＮＦ−αの分泌を低下させるための方法であって、請求項１５に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。
【請求項５５】
対象者においてＴＮＦ−αの分泌を低下させるための方法であって、請求項１６に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。
【請求項５６】
ＩＬ−１が仲介する疾患を治療するための方法であって、請求項１５に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。
【請求項５７】
ＩＬ−１が仲介する疾患を治療するための方法であって、請求項１６に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。
【請求項５８】
ＴＮＦ−αが仲介する疾患を治療するための方法であって、請求項１５に記載のポリペプチドを該対象者に投与することを含む方法。
【請求項５９】
単球の活性化に関わる医学的状態を治療する、予防する、又は改善するための方法であって、（ａ）アポ−Ａ−１、（ｂ）アポ−Ａ−１フラグメントＴ細胞活性化阻害因子（ＡＦＴＩ）、及び（ｃ）配列番号２を含む融合タンパク質の少なくとも１つから選択される分子を対象者に投与することを含む方法。
【請求項６０】
ＡＦＴＩが請求項１５に記載のポリペプチドである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ＡＦＴＩが請求項１６に記載のポリペプチドである、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、いずれもその全体があらゆる目的のために参照してここに組み込まれる、２０００年３月１３日出願の米国特許仮出願第６０／１８９，００８号及び２０００年３月３１日出願の米国特許仮出願第６０／１９３，５５１号の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、アポリポタンパク質Ａ−１（アポ−Ａ−１）及びその断片と誘導体ならびにＴ細胞を介した単球の活性化を調節する上でのそれらの使用に関する。本発明はまた、そのようなアポ−Ａ−１関連分子を生成するためのベクター、宿主細胞、製薬組成物、選択結合物質及び方法に関する。また、Ｔ細胞を介した単球の活性化に関連する疾患の診断、治療、改善、及び／又は予防のための方法も提供する。
【０００３】
（発明の背景及び概要）
慢性炎症における腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及びインターロイキン−１（ＩＬ−１）の重要性は広く確立されている。インビボでのこれらのプロ炎症性サイトカインの遮断又は阻害は、慢性関節リウマチ、クローン病、及び多発性硬化症のような疾患のヒト又は動物モデルの治療において良好な結果を示した（Ｆｅｌｄｍａｎら、１９９８、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｐｒｏｃ．３０：４１２６−４１２７；Ａｒｅｎｄら、１９９８、Ｃ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：２７−５５；Ｂｒｅｓｎｉｈａｎ，Ｂ．，１９９９，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．５８補遺１：１９６−１９８；Ｂａｄｏｖｉｎａｃら、１９９８、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．８５：８７−９５；Ｗｉｅｍａｎｎら、１９９８、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１４９：４５５−４６３）。慢性炎症性疾患の病因においてＴリンパ球が中心的役割を果たすという概念に基づき、刺激されたＴリンパ球との直接の細胞−細胞接着こそが、単球が大量のＴＮＦ−αとＩＬ−１βを産生する引き金となる主な刺激であることが明らかにされた（Ｂｕｒｇｅｒ　Ｄ．とＤａｙｅｒ　Ｊ．Ｍ．，Ｔ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　１１１−１２８（１９９８））。
【０００４】
植物性血球凝集素（ＰＨＡ）とホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）の組合せのようなポリクローナルマイトジェン（Ｖｅｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２０４０−２０４６；Ｉｌｓｅｒら、１９９３、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｎｅｔｗ．４：１５−２３；Ｌａｃｒａｚら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２０２７−２２０３３；Ｌｉら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　８４：５７１−５７６）、共同刺激分子ＣＤ２８の架橋を伴う又は伴わない、固定化抗ＣＤ３ｍＡｂによるＣＤ３の架橋（Ｍｉｌｔｅｎｂｕｒｇら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２６５５−２６６７；Ｃｈｉｚｚｏｌｉｎｉら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１７１−１７７）及び抗原特異的Ｔ細胞クローン上での抗原認識（Ｃｈｉｚｚｏｌｉｎｉら、１９９７、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１７１−１７７）を含めて、様々な刺激がＴ細胞における単球活性能を誘導することができる。
【０００５】
発明者は、Ｔ細胞を刺激すればＴ細胞上の膜関連リガンドが、単球上の対リガンドに結合することによって単球−マクロファージシグナル伝達の引き金になると考える。しかしながら、これらのリガンド及び対リガンドの同一性は、明らかではなかった。ヒトの系では、シグナル伝達の一部はβ２−インテグリン、ＣＤ６９、ＣＤ２３、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ及びリンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）に帰せられるであろう（Ｖｅｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２０４０−２０４６；Ｉｌｓｅｒら、１９９３、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｎｅｔｗ．４：１５−２３；Ｌａｃｒａｚら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２０２７−２２０３３；Ｈｅｒｍａｎｎら、１９９９、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１４４：７６７−７７５；Ｓｔｏｕｔら、１９９６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：８−１１；Ｓｕｔｔｌｅｓら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：５８３５−５８４２；Ａｖｉｃｅら、１９９９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２７４８−２７５３；Ａｒｍａｎｔら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４８６８−４８７５；Ｒｅｚｚｏｎｉｃｏら（２０００、印刷中）、Ｂｌｏｏｄ）。膜関連ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βは、ヒト線維芽細胞／滑膜細胞又は微小血管内皮細胞での刺激されたＴ細胞によって誘導される刺激プロセスにおける重要な役割とは異なって、この細胞相互作用では決定的な役割を果たさない（Ｂｕｒｇｅｒら、１９９８、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．４１：１７４８−１７５９；Ｌｏｕら、１９９６、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：３１０７−３１１３；Ｂｕｒｇｅｒら、１９９８、Ｔ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　１１１−１２８）。
【０００６】
単球又は単球性細胞（ＴＨＰ−１細胞）のＴ細胞シグナル伝達によって誘導されるＴＮＦ−α及びＩＬ−１β産生へのヒト血清分画の阻害活性を評価する際に、発明者は、アポ−Ａ−１が血清阻害因子であることを認めた。この所見は、単球又は単球性細胞のＴ細胞シグナル伝達に関わる疾患及び状態の治療のための新しい組成物と方法の開発を促進する。
【０００７】
一部の実施形態に従えば、本発明は、Ｔ細胞を介した単球の活性化を調節するポリペプチド及びそれをコードする核酸分子を提供する。他の実施形態に従えば、本発明は、Ｔ細胞を介した単球の活性化に関わる疾患及び状態の治療と診断のための方法を提供する。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、アポ−Ａ−１（配列番号２）及びその断片と誘導体に関する組成物、工程及び使用方法、ならびにＴ細胞を介した単球の活性化を調節する上でのそれらの使用を提供する。一部の実施形態に従えば、本発明は、基本的に、
（ａ）配列番号１の残基７３から６０１に示すようなヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２の残基２５から１９４に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号１の残基７３から４５１に示すようなヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２の残基２５から１４４に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）配列番号１の残基４８５から８２０に示すようなヌクレオチド配列；
（ｆ）配列番号２の残基２５から１１３に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）配列番号２の残基７３から１１３に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｈ）配列番号２の残基１５６から２６７に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｉ）中又は高ストリンジェンシー条件下で（ａ）から（ｆ）までの少なくとも１つの補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、コードされるポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つヌクレオチド配列；及び
（ｊ）（ａ）から（ｈ）の少なくとも１つに相補的なヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列から成る単離核酸分子に関する。
【０００９】
他の一部の実施形態では、本発明は、基本的に、
（ａ）配列番号２の残基２５から１９４に示すようなアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２の残基２５から１４４に示すようなアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２の残基１５６から２６７に示すようなアミノ酸配列；
（ｄ）配列番号２の残基２５から１１３に示すようなアミノ酸配列；
（ｅ）配列番号２の残基７５から１１３に示すようなアミノ酸配列；
（ｆ）コードされるポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、配列番号２のオーソローグについてのアミノ酸配列；
（ｇ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）の少なくとも１つのアミノ酸配列と少なくとも約７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるアミノ酸配列；
（ｈ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも約２５個のアミノ酸残基を含む（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、又は（ｅ）の少なくとも１つに示すアミノ酸配列の断片；
（ｉ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、（ａ）から（ｆ）の少なくとも１つの対立遺伝子変異体又はスプライス変異体についてのアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列から成る単離ポリペプチドに関する。
【００１０】
本発明は、一部の実施形態では、アポ−Ａ−１フラグメントＴ細胞活性化因子（「ＡＦＴＩ」）である、配列番号２の残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７に示すポリペプチドフラグメント及び関連ポリペプチドに関する。一部の実施形態では、本発明のＡＦＴＩは、配列番号２の残基番号２５から始まり、配列番号２に示すポリペプチドの１３キロダルトン（ｋＤａ）又は１８ｋＤａのフラグメントを含む、アポ−Ａ−１のＮ末端フラグメントを含むが、これに限定されない。他の一部の実施形態では、本発明のＡＦＴＩは、配列番号２の最後のアミノ酸残基で終わり、配列番号２に示すポリペプチドの１３ｋＤａのフラグメントを含む、アポ−Ａ−１のＣ末端フラグメントを含むが、これに限定されない。
【００１１】
一部の実施形態では、本発明はさらに、
（ａ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を備えた、配列番号２に示すようなアミノ酸配列、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７；
（ｂ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも１個のアミノ酸挿入を備えた、配列番号２に示すようなアミノ酸配列、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７；
（ｃ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも１個のアミノ酸欠失を備えた、配列番号２に示すようなアミノ酸配列、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７；
（ｄ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、Ｃ及び／又はＮ末端トランケーションを有する、配列番号２、又は配列番号２の残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７に示すようなアミノ酸配列；及び
（ｅ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーション、及びＮ末端トランケーションから成る群より選択される少なくとも１つの修飾を備えた、配列番号２に示すようなアミノ酸配列、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７から選択されるアミノ酸配列を含む単離ポリペプチドを提供する。
【００１２】
一部の実施形態では、本発明は、
（ａ）配列番号２に示すようなポリペプチド、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも１個の保存的アミノ酸置換を備えた、配列番号２に示すようなポリペプチド、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも１個のアミノ酸挿入を備えた、配列番号２に示すようなポリペプチド、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７をコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、少なくとも１個のアミノ酸欠失を備えた、配列番号２に示すようなポリペプチド、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７をコードするヌクレオチド配列；
（ｅ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、Ｃ及び／又はＮ末端トランケーションを有する、配列番号２に示すようなポリペプチド、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７をコードするヌクレオチド配列；
（ｆ）ポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端トランケーション、及びＮ末端トランケーションから成る群より選択される少なくとも１つの修飾を備えた、配列番号２に示すようなポリペプチド、又は配列番号２に示すような残基２５から１１３、７３−１１３、２５−１９４、２５−１４４、又は１５６−２６７をコードするヌクレオチド配列；
（ｇ）少なくとも約１６個のヌクレオチドの断片を含む、（ａ）から（ｆ）のヌクレオチド配列；
（ｈ）コードされるポリペプチドが配列番号２に示すようなポリペプチドの活性を持つ、中又は高ストリンジェンシー条件下で（ａ）−（ｇ）のいずれかの補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）にハイブリダイズするヌクレオチド配列；及び
（ｉ）（ａ）から（ｆ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列
から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。
【００１３】
一部の実施形態では、本発明は、ここで述べるような単離核酸分子を含む発現ベクター、ここで述べるような組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、及び宿主細胞を培養し、任意にそのようにして生成したポリペプチドを単離することを含む、ＡＦＴＩポリペプチドを生成する方法を提供する。
【００１４】
ＡＦＴＩポリペプチドをコードする構築された核酸分子を含むヒト以外のトランスジェニック動物が本発明の一部の実施形態によって提供される。一部の実施形態では、動物（例えば血流）における高いレベルのＡＦＴＩポリペプチドを含みうる、ＡＦＴＩポリペプチドの発現、好ましくは高いレベルの発現を可能にするように、ＡＦＴＩ核酸分子を動物に導入する。一部の実施形態に従えば、ヒト以外のトランスジェニック動物は、哺乳類、例えばげっ歯類、ラット、マウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、イヌ、ネコ、等々でありうる。
【００１５】
また一部の実施形態では、本発明のＡＦＴＩポリペプチドの誘導体が提供される。
【００１６】
さらに一部の実施形態では、本発明のＡＦＴＩポリペプチドに特異的に結合することができる抗体及びペプチドのような選択結合物質が提供される。そのような抗体及びペプチドはアゴニストまたは、アンタゴニストでありうる。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、及び／又は選択結合物質と、１又はそれ以上の製薬上許容される製剤物質を含む製薬組成物も、本発明の一部の実施形態に包含される。一部の実施形態では、製薬組成物を使用して、治療上又は診断上有効な量の本発明のヌクレオチド又はポリペプチドを提供する。本発明は、一部の実施形態に従えば、ポリペプチド、核酸分子、及び選択結合物質を使用する方法に関する。
【００１８】
一部の実施形態に従えば、本発明のＡＦＴＩポリペプチド及び核酸分子は、ここで列挙するものを含めた疾患及び障害を治療し、予防し、改善し、及び／又は検出するために使用しうる。
【００１９】
一部の実施形態に従えば、本発明は、ＡＦＴＩポリペプチドに結合する試験分子を同定するために試験分子を評価する方法を提供する。一部の実施形態に従えば、該方法は、試験分子にＡＦＴＩポリペプチドを接触させ、試験分子がポリペプチドに結合する度合を測定することを含む。一部の実施形態に従えば、該方法は、そのような試験分子がＡＦＴＩポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストであるかどうかを測定することを含む。一部の実施形態に従えば、本発明はさらに、ＡＦＴＩポリペプチドの発現又はＡＦＴＩポリペプチドの活性への分子の影響を試験する方法を提供する。
【００２０】
ＡＦＴＩポリペプチドの発現を調節し、レベルを変化させる（すなわち上昇又は低下させる）方法も、本発明の一部の実施形態に包含される。一部の方法は、ＡＦＴＩポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与することを含む。もう１つの方法では、ＡＦＴＩポリペプチドの発現を調節する又は変化させる要素を含む核酸分子を投与することができる。これらの方法の例は、ここでさらに述べるような遺伝子治療、細胞療法、及びアンチセンス療法を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明の一部の実施形態では、ＡＦＴＩポリペプチドはＡＦＴＩレセプタを同定するために使用しうる。様々な形態の「発現クローニング」が、タンパク質リガンドについてのレセプタをクローニングするために広汎に使用されてきた。例えば、Ｈ．ＳｉｍｏｎｓｅｎとＨ．Ｆ．Ｌｏｄｉｓｈ，Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１５巻、４３７−４４１（１９９４）、及びＴａｒｔａｇｌｉａら、Ｃｅｌｌ，８３：１２６３−１２７１（１９９５）参照。一部の実施形態では、ＡＦＴＩレセプタの単離は、ＡＦＴＩポリペプチドシグナル伝達経路の新規アゴニスト及びアンタゴニストを同定する又は開発するために有用である。そのようなアゴニスト及びアンタゴニストは、可溶性ＡＦＴＩレセプタ、抗ＡＦＴＩレセプタ選択結合物質（抗体及びその誘導体など）、小分子、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むが、これらに限定されず、そのいずれもが、ここで列挙するものを含めた１又はそれ以上の疾患又は障害を治療するために使用できる。
【００２２】
（図面の簡単な説明）
図１：（Ａ）ヒトアポリポタンパク質Ａ−１のアミノ酸配列（配列番号２）とポリヌクレオチド配列（配列番号１）。アポ−Ａ−１ポリペプチドは、らせん脂質結合ドメイン（アミノ酸残基４４−６５及び２２０−２４１）、単球からのリポタンパク質媒介のコレステロール流出に関与するドメイン（アミノ酸残基７４−１１１）、レセプタ結合ドメイン（アミノ酸残基１４９−２１９）、主要抗原エピトープドメイン（アミノ酸残基９９−１２０）、ヒンジドメイン（アミノ酸残基９９−１４３）、系統発生的に保存されたドメイン（アミノ酸残基６６−１２０）、及びレクチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性に関与するドメイン（アミノ酸残基９０−１１１）を持つ。アポ−Ａ−１ポリペプチドは、８個の両親媒性らせん（アミノ酸残基４４−６５、６６−９８、９９−１２０、１２１−１４２、１４３−１６４、１６５−２０８、２０９−２１９、２２−２４１）、Ｎ末端ペプチド（アミノ酸残基１−４３）、及びＣ末端ペプチド（アミノ酸残基２４２−２４３）を備える。ＡＦＴＩのアミノ酸配列は、配列番号２のフラグメント、例えば（Ｂ）１８ｋＤａのＮ末端フラグメント（アミノ酸残基２５から１９４、ヌクレオチド９２−６０１）、（Ｃ）１３ｋＤａのＮ末端フラグメント（アミノ酸残基２５から１４４、ヌクレオチド９２−４５１）、及び（Ｄ）１３ｋＤａのＣ末端フラグメント（アミノ酸残基１５６から２６７、ヌクレオチド４８５−８２０）を含むが、これらに限定されない。
【００２３】
図２：ヒト血清は、ＰＨＡで刺激したＰＢＭＣにおいてＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの産生を阻害する。ＰＢＭＣ（４×１０５細胞／２００μｌ／穴）を、ＦＣＳ又はＨＳを含む培地中１μｇ／ｍｌのＰＨＡで刺激した。（Ａ）４８時間インキュベーションした後、上清中のＴＮＦ−αとＩＬ−１βを測定した；（Ｂ）７２時間後に増殖（３Ｈ−チミジンの組込み）を測定した。
【００２４】
図３：ＨＳによる単球及びＴＨＰ−１細胞のＴ細胞シグナル伝達の阻害。（Ａ）ＴＨＰ−１細胞を、漸増用量のＨＳ（ＨＳ、黒い記号）又はＦＣＳ（白い記号）の存在下に８Ｔリンパ球／ＴＨＰ−１細胞の細胞比で、固定して刺激したＴリンパ球によって４８時間活性化した。（Ｂ）ＴＨＰ−１細胞を、漸増用量のＨＳの存在下に８ＨＵＴ−７８細胞／ＴＨＰ−１細胞の細胞比で固定して刺激したＨＵＴ−７８細胞（黒い記号）又は１０μｇ／ｍｌのリポ多糖類（ＬＰＳ）と５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（白い記号）のいずれかによって４８時間活性化した。ＴＨＰ−１細胞（ＣとＤ）及び単球（ＥとＦ）を、１０％ＨＳの存在下又は不在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞から分離した漸増用量の膜によって４８時間活性化した。ＴＮＦ−α（ＣとＥ）及びＩＬ−１β（ＤとＦ）を培養上清で測定した。結果は平均±ＳＤで表しており、（Ｂ）を除いてｎ＝３であり、（Ｂ）ではｎ＝７である。ＡとＢでは、１００％は、阻害因子なしで４８時間培養した後のＩＬ−１βの産生を表わす。
【００２５】
図４：ＨＳの連続クロマトグラフィー分別のＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００溶出プロフィールとＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（Ａ）Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰから溶出した阻害性分画をプールし、濃縮して、ＰＢＳ中で平衡させたＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００でのゲルろ過に供した。カラムはゲルろ過クロマトグラフィー用分子量マーカーキット（Ｓｉｇｍａ）で検定した。分画をタンパク質含量（ＯＤ２８０ｍｍ、点線）及び阻害活性（黒丸）に関して試験した。（Ｂ）各段階後に阻害性分画をプールし、１０％ポリアクリルアミドゲル上のレーンごとに１０μｇのタンパク質アリコートを充填した；（ａ）ＨＳ；（ｂ）Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）の漏出点；（ｃ）Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）からの阻害性分画のプール；（ｄ）Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）　ＨＰからの阻害性分画のプール；（ｅ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）　２００からの阻害性分画のプール；ゲルはクマシーブルーで染色した。
【００２６】
図５：ＨＤＬのタンパク質分画における阻害活性の存在。ＨＳを高密度遠心分離によって分別し、ＨＤＬと血清タンパク質分画の阻害活性を分析した。単離したＨＤＬをさらに脱脂（脱脂ＨＤＬ）又はプロテイナーゼＫによるタンパク質分解消化（プロテイナーゼＫ処理ＨＤＬ）に供した。分画の阻害活性をＨＳ（全血清）と比較した。全血清と血清タンパク質についての最終タンパク質濃度は７ｍｇ／ｍｌ（黒い柱）、３．５ｍｇ／ｍｌ（灰色の柱）、及び０．７ｍｇ／ｍｌ（白い柱）であった。ＨＤＬと脱脂ＨＤＬの最終タンパク質濃度は０．２ｍｇ／ｍｌ（黒い柱）、０．１ｍｇ／ｍｌ（灰色の柱）、及び０．０２ｍｇ／ｍｌ（白い柱）であった。プロテイナーゼＫ処理ＨＤＬの量はタンパク質分解前のタンパク質濃度に従って評価し、未処理ＨＤＬと同様であった。結果は、阻害因子なしでのＩＬ−１又はβＴＮＦ−α酸性のパーセンテージを表わす（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【００２７】
図６：細胞へのＨＤＬ結合の分析。（Ａ）刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜へのＨＤＬの結合によるＴ細胞シグナル伝達の阻害；刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜（白い柱）、ＴＨＰ−１細胞（斜線の柱）、又は両方（黒い柱）を、ＦＣＳ（１０％）、ＨＳ（１０％）又はＨＤＬ（０．３２ｍｇ／ｍｌタンパク質）の不在下（−）又は存在下に氷上で４５分間プレインキュベートした；洗浄後、処理（斜線の柱と黒い柱）及び未処理（白い柱）ＴＨＰ−１細胞を、処理した（白い柱と黒い柱）又は処理していない（斜線の柱）刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜の存在下で培養した；４８時間培養した培養上清においてＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生を測定した。結果は、阻害因子なしで測定した産生を１００％としたパーセンテージで表しており、平均±ＳＤ、ｎ＝６である。（Ｂ−Ｆ）非複合ＦＩＴＣとＦＩＴＣ−ＨＤＬ（０．１ｍｇ／ｍｌ）の結合を、ＴＨＰ−１細胞（Ｂ）、単離したヒト単球（Ｃ）、刺激していないＨＵＴ−７８細胞（Ｄ）及び刺激したＨＵＴ−７８細胞（Ｅ）に関してフローサイトメトリーによって評価した。ＦＩＴＣを陰性対照として使用した。（Ｆ）精製抗アポ−Ａ−１抗体（１００μｇ／ｍｌ）（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ番号ＨＢ−９５７０）の存在下又は不在下でのＦＩＴＣ−ＨＤＬ（１０μｇ／ｍｌ）の刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜への結合。
【００２８】
図７：アポ−Ａ−１は、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化したＴＨＰ−１細胞においてＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生を阻害する。（Ａ）ＴＨＰ−１細胞を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した漸増濃度のアポ−Ａ−１の存在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化した；４８時間後、培養上清中でＴＮＦ−αとＩＬ−１βを測定した。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３を表している。（ＢとＣ）ＴＨＰ−１細胞を、脱脂ＨＤＬの分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥから電気溶出した漸増濃度のタンパク質の存在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化した：（Ｂ）（Ｍｒ＝２８，０００及び（Ｃ）（Ｍｒ＝１８，０００。（Ｄ）ＴＨＰ−１細胞を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　Ｓ７５でのゲルろ過によって分離した漸増濃度のアポ−Ａ−１（Ｍｒ＝２８，０００）の存在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化した。４８時間後、培養上清中でＴＮＦ−αとＩＬ−１βを測定した。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３を表し、１００％は阻害因子なしで産生されたサイトカインの量である。（Ｅ）阻害活性について試験した単離分画を、ウエスタンブロット法によってアポ−Ａ−１含量に関して分析した；（ａ）２８，０００の電気溶出したバンド、（ｂ）１８，０００の電気溶出バンド、及び（ｃ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）Ｓ７５ゲルろ過から回収された２８，０００タンパク質。
【００２９】
図８：アポ−Ａ−１はＴＮＦ−αとＩＬ−１β　ｍＲＮＡの定常状態レベルを低下させる。（ＡとＢ）ＲＮアーゼプロテクションアッセイのオートラジオグラム。（Ａ）未処理（ａ）又はＴＨＰ−１活性化の種々の時点で加えたアポ−Ａ−１（２００μｇ／ｍｌ）の存在下又は不在下に（ｃ−ｅ）、３時間、刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜（２００μｇタンパク質／ｍｌ）によって活性化した（ｂ−ｅ）、ＴＨＰ−１細胞（５×１０６細胞／ｍｌ）：ｃ（０時間）；ｄ（１時間）；及びｅ（２時間）。（Ｂ）未処理（ａ）又はＴＨＰ−１活性化の種々の時点で加えたアポ−Ａ−１（２００μｇ／ｍｌ）の存在下又は不在下に（ｃ−ｅ）、１時間、刺激Ｔリンパ球の膜（４０μｇタンパク質／ｍｌ）によって活性化した、（ｂ−ｅ）単球（１０×１０６細胞／ｍｌ）：ｃ（０分）；ｄ（１５分）；及びｅ（３０分）。（ＣとＤ）ＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡ＝１のデンシトメトリーで基準化し、阻害因子なしでの活性化ＴＨＰ−１細胞（Ｂ）又は単球（Ｃ）のｍＲＮＡレベルを１００％としたパーセンテージで表した、それぞれオートラジオグラフィーＡとＢのデンシトメトリー分析。結果は３つの異なる実験を代表している。
【００３０】
図９：アポ−Ａ−１は、ＰＨＡ又は破傷風トキソイド（ＴＴ）によって刺激したＰＢＭＣ中のＴＮＦ−αとＩＬ−１βを阻害する。ＰＢＭＣ　４×１０５細胞／２００μｇ／穴を、指示されている用量のアポ−Ａ−１とＨＤＬの存在下に１μｇ／ｍｌのＰＨＡ（ＡとＢ）又は１０μｇ／ｍｌのＴＴ（ＣとＤ）によって刺激した。
【００３１】
図１０：組換えヒトアポ−Ａ−１Ｍｉｌａｎｏは阻害作用を示す。ＴＨＰ−１細胞を、ヒト血清（ＨＳ）の連続希釈、Ｓｉｇｍａからのアポリポタンパク質Ａ−１（出発濃度＝２ｍｇ／ｍｌ）、及び組換えアポリポタンパク質Ａ−１Ｍｉｌａｎｏ（出発濃度＝２ｍｇ／ｍｌ）の存在下に、刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜で刺激した。両アポリポタンパク質（精製及び組み換え）は、阻害作用を表示する。
【００３２】
図１１：アポ−Ａ−ＩＩ及びアポ−Ａ−１のフラグメントによるＴＨＰ−１細胞の接触媒介活性化の阻害。ＴＨＰ−１細胞を、指示されている阻害因子の存在下に、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜（ＨＵＴ）によって活性化した。アポ−Ａ−１、アポ−Ａ−ＩＩ及びアポ−Ａ−１のドメインＩＩ及びＩＩＩを含むフラグメントによってＩＬ−１βとＴＮＦ−αの両方の産生が阻害された。
【００３３】
（発明の詳細な説明）
ここで使用する章の目次は単に構成上の目的だけのためであって、記述する主題を限定するものと解釈すべきではない。この出願の中で引用するすべての参考文献は、あらゆる目的のためにその全体が参照してここに明白に組み込まれるが、但しそのような組み込みがここで提供する意味とは異なる語を定義する場合を除く。
【００３４】
定義
「ＡＦＴＩ遺伝子」又は「ＡＦＴＩ核酸分子」又は「ＡＦＴＩポリヌクレオチド」の語は、配列番号１に示すようなヌクレオチド配列又はその何らかのセグメント、配列番号２に示すようなポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、又はその何らかのフラグメントを指す。
【００３５】
「ＡＦＴＩポリペプチド」の語は、配列番号２のアミノ酸配列を持つポリペプチド、又はその何らかのフラグメント、及び関連ポリペプチドを指す。関連ポリペプチドは、ＡＦＴＩポリペプチド対立遺伝子変異体、ＡＦＴＩポリペプチドオーソローグ、ＡＦＴＩポリペプチドスプライス変異体、ＡＦＴＩポリペプチド変異体、及びＡＦＴＩポリペプチド誘導体を含む。ＡＦＴＩポリペプチドはここで定義するような成熟ポリペプチドであってもよく、また調製する方法に依存して、アミノ末端のメチオニン残基を有しているか又は有していなくてもよい。
【００３６】
「ＡＦＴＩポリペプチド対立遺伝子変異体」の語は、生物又は生物個体群の染色体上の所与の座を占める遺伝子の、いくつかの又は多くの可能な天然に生じる代替形態の１つを指す。
【００３７】
「ＡＦＴＩポリペプチド誘導体」の語は、配列番号２に示すポリペプチドのポリペプチドフラグメント、ＡＦＴＩポリペプチド対立遺伝子変異体、ＡＦＴＩポリペプチドオーソローグ、ＡＦＴＩポリペプチドスプライス変異体、又は化学修飾された、ここで定義するようなＡＦＴＩポリペプチド変異体を指す。
【００３８】
「ＡＦＴＩポリペプチドフラグメント」の語は、ここで述べるＡＦＴＩポリペプチドのアミノ末端（リーダー配列を含む又は含まない）にトランケーション及び／又はカルボキシ末端にトランケーションを有するポリペプチド、ＡＦＴＩポリペプチド対立遺伝子変異体、ＡＦＴＩポリペプチドオーソローグ、ＡＦＴＩポリペプチドスプライス変異体及び／又はここで特定して述べるＡＦＴＩポリペプチドアミノ酸配列と比較して１又はそれ以上のアミノ酸付加又は置換又は内部欠失（生じるポリペプチドは少なくとも６個のアミノ酸の長さである）を有するＡＦＴＩポリペプチド変異体を指す。ＡＦＴＩポリペプチドフラグメントは、例えば代替的ＲＮＡスプライシングから又はインビボでのプロテアーゼ活性から生じうる。好ましい実施形態では、トランケーションは約１０個のアミノ酸、又は約２０個のアミノ酸、又は約５０個のアミノ酸、又は約７５個のアミノ酸、又は約１００個のアミノ酸、又は約１００個以上のアミノ酸を含む。そのようにして生成されるポリペプチドフラグメントは約２５個の隣接アミノ酸、又は約５０個のアミノ酸、又は約７５個のアミノ酸、又は約１００個のアミノ酸、又は約１５０個のアミノ酸、又は約２００個のアミノ酸を含むであろう。一部の実施形態では、本発明のＡＦＴＩポリペプチドフラグメントは、６個のアミノ酸の長さからここで述べるポリペプチドまで、又はそれらの大きさの間のいずれかの数のアミノ酸である。そのようなＡＦＴＩポリペプチドフラグメントは任意にアミノ末端のメチオニン残基を含みうる。そのようなフラグメントは、例えばＡＦＴＩポリペプチドに対する抗体を作製するために使用できることは認識されるであろう。
【００３９】
「ＡＦＴＩ融合ポリペプチド」の語は、ＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩポリペプチドフラグメントのアミノ又はカルボキシ末端での１又はそれ以上のアミノ酸の融合（非相同ペプチド又はポリペプチドのような）を指す。従って、この語はここで特定して述べるポリペプチド、ＡＦＴＩポリペプチド対立遺伝子変異体、ＡＦＴＩポリペプチドオーソローグ、ＡＦＴＩポリペプチドスプライス変異体、又はここで特定して述べるＡＦＴＩポリペプチドアミノ酸配列と比較して１又はそれ以上のアミノ酸欠失又は置換又は内部付加を有するＡＦＴＩポリペプチド変異体のいずれかの配列を持つ融合タンパク質を含む。
【００４０】
「ＡＦＴＩポリペプチドオーソローグ」の語は、ここで特定して述べるＡＦＴＩポリペプチドアミノ酸配列に対応するもう１つ別の種からのポリペプチドを指す。例えば、マウスとヒトのＡＦＴＩポリペプチドは互いのオーソローグとみなされる。
【００４１】
「ＡＦＴＩポリペプチドスプライス変異体」の語は、ここで特定して述べるＡＦＴＩポリペプチドに対応するＲＮＡ転写産物においてイントロン及び／又はエクソン配列の代替的プロセシング（例えば代替的スプライシング）によって生成される核酸分子、通常はＲＮＡによってコードされるＡＦＴＩポリペプチドを指す。
【００４２】
「ＡＦＴＩポリペプチド変異体」の語は、ここで特定して述べるＡＦＴＩポリペプチドアミノ酸配列（リーダー配列を含む又は含まない）と比較して１又はそれ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（例えば内部欠失及び／又はＡＦＴＩポリペプチドフラグメントのような）、及び／又は付加（例えば内部付加及び／又はＡＦＴＩ融合ポリペプチドのような）を有するアミノ酸配列を含むＡＦＴＩポリペプチドを指す。変異体は、天然に生じるか（例えばＡＦＴＩポリペプチド対立遺伝子変異体、ＡＦＴＩポリペプチドオーソローグ及びＡＦＴＩポリペプチドスプライス変異体）又は人工的に構築されてもよい。そのようなＡＦＴＩポリペプチド変異体は、対象とするＡＦＴＩをコードする配列番号１に示すようなＤＮＡ配列から、それに応じて変化するＤＮＡ配列を備えた対応核酸分子から調製しうる。好ましい実施形態では、変異体は１から１０、又は１から１５、又は１から２０、又は１から２５、又は１から５０、又は１から７５、又は１から１００、又は１００個以上のアミノ酸の置換、挿入、付加及び／又は欠失を持ち、置換は保存的、又は非保存的、又はその何らかの組合せでありうる。
【００４３】
「抗原」の語は、抗体のような選択結合物質によって結合することができ、さらにその抗原のエピトープに結合することができる抗体を作製するために動物において使用できる分子又は分子の部分を指す。抗原は１又はそれ以上のエピトープを有しうる。
【００４４】
「生物学的に活性なＡＦＴＩポリペプチド」の語は、配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチドの特徴を示す少なくとも１つの活性を備えたＡＦＴＩポリペプチドを指す。
【００４５】
「有効量」及び「治療上有効な量」の語は、各々ここで述べるようなＡＦＴＩポリペプチドの１又はそれ以上の生物活性の著明なレベルを支持するために使用されるＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩ核酸分子の量を指す。
【００４６】
「発現ベクター」の語は、宿主細胞での使用に適し、非相同核酸配列の発現を指令及び／又は制御する１又はそれ以上の核酸配列を含むベクターを指す。発現は、転写、翻訳、及びＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）のような１又はそれ以上のプロセスを含むが、これらに限定されない。
【００４７】
「宿主細胞」の語は、トランスフェクションした又は形質転換した細胞、あるいは対象とする核酸配列でトランスフェクション又は形質転換することができ、対象とする核酸（又は対象とする核酸のセグメント）を発現することができる細胞を指す。かかる語は、子孫が形態又は遺伝的性質に関して元の親と同じであるかどうかに関わらず、対象とする核酸が存在する限り、親細胞の子孫を含む。
【００４８】
当該技術において既知であるような「同一性」の語は、配列を比較することによって決定したときの、２又はそれ以上のポリペプチド分子あるいは２又はそれ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。当該技術では、「同一性」はまた、２又はそれ以上のヌクレオチド残基あるいは２又はそれ以上のアミノ酸残基のストリング間の対合の数によって決定したときの、場合に応じて核酸分子間又はポリペプチド間の配列関連性の度合を意味する。「同一性」は、特定の数理モデル又はコンピュータプログラム（すなわち「アルゴリズム」）によって取り上げたギャップ整列（存在する場合）による２又はそれ以上の配列の小さいほうの間の同一対合のパーセントを測定する。
【００４９】
「類似性」の語は関連する概念であるが、「同一性」と異なって、同一対合と保存的置換対合の両方を含む配列関係を指す。２個のポリペプチド配列が、例えば１０／２０の同一アミノ酸を持ち、残りがすべて非保存的置換である場合、パーセント同一性と類似性はいずれも５０％である。同じ例で、保存的置換が存在する位置がさらに５個ある場合には、パーセント同一性は５０％のままであるが、パーセント類似性は７５％となる（１５／２０）。それ故、保存的置換が存在する場合には、２個のポリペプチド間の類似性の度合はそれら２個のポリペプチド間のパーセント同一性よりも高くなる。
【００５０】
「単離核酸分子」の語は、（１）天然に結合しているタンパク質、脂質、炭水化物又は他の物質（すなわち夾雑物）の少なくとも約５０％から分離されている、（２）「単離核酸分子」が天然の状態では共有結合しているポリヌクレオチドの全部又は一部に共有結合していない、（３）天然の状態では結合していないポリヌクレオチドに作動可能に共有結合している、又は（４）天然の状態では、より大きなポリヌクレオチド配列の部分としては生じない、本発明の核酸分子を指す。好ましくは、本発明の単離核酸分子は、ポリペプチドの生産又はその治療、診断、予防又は研究用途における使用に干渉する、その天然環境において認められる他の何らかの夾雑核酸分子又は他の夾雑物から実質的にフリーである。
【００５１】
「単離ポリペプチド」の語は、（１）天然に結合しているポリヌクレオチド、脂質、炭水化物又は他の物質（すなわち夾雑物）の少なくとも約５０％から分離されている、（２）「単離ポリペプチド」が天然の状態で共有結合しているポリペプチドの全部又は一部に共有結合していない、（３）天然の状態出は結合していないポリペプチドに作動可能に共有結合している、又は（４）天然の状態出は生じない、本発明のポリペプチドを指す。好ましくは、単離ポリペプチドは、ポリペプチドの生産又はその治療、診断、予防又は研究用途に干渉する、その天然環境において認められる他の何らかの夾雑ポリペプチド又は他の夾雑物から実質的にフリーである。
【００５２】
「核酸配列」又は「核酸分子」の語は、少なくとも２個のヌクレオチドの重合体を指す。そのようなヌクレオチドは、天然に生じるすべてのヌクレオチド及びすべての合成ヌクレオチドを含む。そのようなヌクレオチドは、例えば、４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、及び２，６−ジアミノプリンを含むがこれらに限定されない、ＤＮＡ及びＲＮＡの既知の塩基類似体のいずれかから形成されうる。
【００５３】
核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞、等のような生物学的物質に関連して使用するとき「天然に生じる」又は「天然の」の語は、天然の状態で認められ、人間によって操作（すなわち設計又は構築）されていない物質を指す。同様に、ここで使用するとき「非天然に生じる」又は「非天然の」は、天然の状態では認められない、又は人間によって構造的に改変された又は合成された物質を指す。
【００５４】
「作動可能に連結された」の語は、ここでは、そのように記述されたフランキング配列がそれらの通常の機能を実施するように立体配置又は構築されているフランキング配列の配置を表わすために使用される。従って、コード配列に作動可能に連結されたフランキング配列は、コード配列の複製、転写及び／又は翻訳を生じさせることができる。例えば、プロモーターがコード配列の転写を指令することができるとき、コード配列はプロモーターに作動可能に連結されている。フランキング配列は、それが正しく機能する限り、コード配列に隣接する必要はない。それ故、例えば、まだ転写されていない介在非翻訳配列がプロモーター配列とコード配列の間に存在することが可能であり、それでもやはりプロモーター配列はコード配列に「作動可能に連結されている」とみなすことができる。
【００５５】
ここで使用するとき「製薬上許容される担体」又は「生理的に許容される担体」の語は、ＡＦＴＩポリペプチド、ＡＦＴＩ核酸分子又はＡＦＴＩ選択結合物質の製薬組成物としての供給送達を実現する又は促進するのに適した１又はそれ以上の製剤物質を指す。
【００５６】
「選択結合物質」の語は、ＡＦＴＩポリペプチドに特異性を持つ１又はそれ以上の分子を指す。ここで使用するとき、「特異的」及び「特異性」の語は、選択結合物質がヒトＡＦＴＩポリペプチドに結合し、ヒトの非ＡＦＴＩポリペプチドには結合しない能力を指す。しかし、選択結合物質はまた、配列番号２に示すようなポリペプチドのオーソローグ、すなわちマウスとラットのポリペプチドのような、その種間バージョンにも結合しうる。
【００５７】
「形質導入」の語は、通常はファージによる、１つの細菌から他の細菌への遺伝子の転移を指すために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核細胞配列の獲得と転移も表わす。
【００５８】
「トランスフェクション」の語は、細胞による異種又は外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用され、外来ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されたときに細胞は「トランスフェクションされた」ことになる。多くのトランスフェクション手法が当該技術において既知であり、ここで開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６（１９７３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら、「分子生物学における基本的方法（Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６；及びＣｈｕら、Ｇｅｎｅ、１３：１９７（１９８１）参照。そのような手法を使用して、１又はそれ以上の外来ＤＮＡ分子を適当な宿主細胞に導入することができる。
【００５９】
ここで使用するとき「形質転換」の語は細胞の遺伝的性質の変化を指し、細胞が新しいＤＮＡを含むように改変されたとき、その細胞は形質転換されたことになる。例えば、細胞がその天然の状態から遺伝的に修飾される場合、細胞は形質転換される。トランスフェクション又は形質導入後、形質転換ＤＮＡは、物理的に細胞の染色体に組み込むことによってその細胞のＤＮＡと組み換えるか、複製されることなくエピソーム要素として一過性に維持するか、又はプラスミドとして独立して複製することができる。ＤＮＡが細胞の分裂によって複製されるとき、細胞は安定に形質転換されたとみなされる。
【００６０】
「ベクター」の語は、コード情報を宿主細胞に転移するために使用される何らかの分子（例えば核酸、プラスミド、又はウイルス）を指すために使用される。
【００６１】
核酸分子及び／又はポリペプチドの関連性
関連核酸分子が配列番号１の核酸分子の対立遺伝子又はスプライス変異体又はその断片を含むこと、及び上記のヌクレオチド配列のいずれかに相補的な配列を含むことは明白である。関連核酸分子はまた、ここで述べるポリペプチド、例えば配列番号のポリペプチドと比較して１又はそれ以上のアミノ酸残基の置換、修飾、付加及び／又は欠失を含む、又は基本的にそれから成る、又はそれから成るポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００６２】
フラグメントは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも約２５個のアミノ酸残基、又は約５０個、又は約７５個、又は約１００個、又は約１００個以上のアミノ酸残基のポリペプチドをコードする分子を含む。
【００６３】
さらに、関連ＡＦＴＩ核酸分子は、ここで定義するような中ストリンジェンシー又は高ストリンジェンシー条件下で、配列番号１の核酸分子、又は配列番号２に示すようなアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする分子、又はここで定義するような核酸フラグメント、又はここで定義するようなポリペプチドをコードする核酸フラグメントに完全に相補的な配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子を包含する。ハイブリダイゼーションプローブは、関連配列に関してｃＤＮＡ、ゲノム又は合成ＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、ここで提供するＡＦＴＩ配列に基づいて調製しうる。ここで述べるような配列アラインメントアルゴリズムを用いて、既知の配列と有意の同一性を示すＡＦＴＩ　ＤＮＡの領域及び／又はＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列が容易に決定され、それらの領域はスクリーニングのためのプローブを設計するために使用しうる。
【００６４】
「高ストリンジェンシー条件」の語は、配列が高度に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、有意に不正対合ＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除するように設計された条件を指す。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主として温度、イオン強度、及びホルムアミドのような変性剤の濃度によって決定される。ハイブリダイゼーションと精製のための「高ストリンジェンシー条件」は、６５から６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、又は４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、及び５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ　＆　Ｍａｎｉａｔｉｓ、「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、「核酸ハイブリダイゼーション：実際的アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｃｈ．４，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）参照。
【００６５】
よりストリンジェントな条件（より高い温度、低いイオン強度、ホルムアミド又は他の変性剤の高い濃度）も使用しうるが、ハイブリダイゼーションの速度に影響する。非特異的及び／又はバックグラウンドハイブリダイゼーションを低減するために、ハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液中に他の物質を含めてもよい。その例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル−ピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４又はＳＤＳ）、フィコール、デンハルト溶液、音波破砕サケ精子ＤＮＡ（又は他の非相補的ＤＮＡ）、及び硫酸デキストランであるが、他の適当な物質も使用できる。これらの添加物の濃度と種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響することなく変化させることができる。ハイブリダイゼーション実験は通常ｐＨ６．８から７．４で実施されるが、典型的なイオン強度条件では、ハイブリダイゼーションの速度はｐＨとほとんど無関係である。Ａｎｄｅｒｓｏｎｎら、「核酸ハイブリダイゼーション：実際的アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｃｈ．４，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）参照。
【００６６】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を及ぼす因子は、塩基組成物、長さ、及び塩基対の不正対合の度合を含む。これらの変数を適応させて、様々な配列関連性のＤＮＡにハイブリッドを形成させるために、当業者はハイブリダイゼーション条件を調節することができる。完全に適正なＤＮＡ二重鎖の融解温度は次の等式によって算定することができる：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
［式中、Ｎは形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション又は洗浄液中のナトリウムイオンの盛る濃度であり、％Ｇ＋Ｃはハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）のパーセンテージである。不完全な対合のハイブリッドについては、各々１％の不正対合について融解温度が約１℃低下する。
【００６７】
「中ストリンジェンシー条件」の語は、「高ストリンジェンシー条件」下で形成されうるＤＮＡ二重鎖よりも大きな度合の塩基対不正対合を持つＤＮＡ二重鎖が形成されうる条件を指す。典型的な「中ストリンジェンシー条件」の例は、５０から６５℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、又は３７から５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、及び２０％ホルムアミドである。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中５０℃の「中ストリンジェンシー」条件は、約２１％の不正対合を許容する。
【００６８】
「高」ストリンジェンシーと「中」ストリンジェンシー条件の間に絶対的な区別がないことは当業者に認識されるであろう。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオンでは（ホルムアミドなし）、完全に適正な長いＤＮＡの融解温度は約７１℃である。６５℃で洗浄すると（同じイオン強度で）、これは約６％の不正対合を許容することになる。より関連性の低い配列を捕獲するためには、当業者は単に温度を下げるか又はイオン強度を上げればよい。
【００６９】
次の式により、約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについて１Ｍ　ＮａＣｌ＊中で融解温度の良好な算定が得られる：
Ｔｍ＝Ａ−Ｔ塩基対につき２℃＋Ｇ−Ｃ塩基対につき４℃
６Ｘ塩類クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中のナトリウムイオン濃度は１Ｍである。Ｓｕｇｇｓら、「精製遺伝子を用いた発生生物学（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇ　ｙ　Ｕｓｉｎｇ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｇｅｎｅｓ）」ｐ．６８３、Ｂｒｏｗｎ　ａｎｄ　Ｆｏｘ（編集）（１９８１）参照。
【００７０】
オリゴヌクレオチドについての高ストリンジェンシー精製条件は、通常、６ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中でオリゴヌクレオチドのＴｍより低い０−５℃の温度である。
【００７１】
もう１つの実施形態では、関連核酸分子は、配列番号１に示すようなヌクレオチド配列と約７０％同一であるヌクレオチド配列を含む、又は基本的にそれらから成る、又はそれらから成るか、若しくは配列番号２に示すようなポリペプチドと約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、又は基本的にそれから成る、又はそれから成る。一部の好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１に示すようなヌクレオチド配列と約７５％、又は約８０％、又は約８５％、又は約９０％、又は約９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるか、若しくはヌクレオチド配列は、配列番号２に示すようなポリペプチド配列と約７５％、又は約８０％、又は約８５％、又は約９０％、又は約９５、９６、９７、９８、又は９９％同一であるポリペプチドをコードする。
【００７２】
核酸配列の相違は、配列番号２のアミノ酸配列に比べてアミノ酸配列の保存的及び／又は非保存的修飾を生じうる。
【００７３】
配列番号２のアミノ酸配列への保存的修飾（及びそのコードするヌクレオチドへの対応する修飾）は、天然に生じるＡＦＴＩポリペプチドのものに類似した機能的及び化学的特性を持つＡＦＴＩポリペプチドを生じる。これに対し、ＡＦＴＩポリペプチドの機能的及び／又は化学的特性における実質的修飾は、（ａ）例えばシート又はらせん構造のような、置換領域における分子バックボーンの構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖のバルクを維持することへの影響が有意に異なる、配列番号２のアミノ酸配列内の置換を選択することによって達成しうる。
【００７４】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性又は電荷への影響がほとんどない若しくは全くないような、非天然残基による天然アミノ酸残基の置換を含みうる。さらに、ポリペプチド内のいずれかの天然残基はまた、「アラニン走査突然変異誘発」について以前に記述されたように（例えばアラニン走査突然変異誘発を論じている、ＭａｃＬｅｎｎａｎら、１９８８、Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５−６７；Ｓａｓａｋｉら、１９９８、Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１−２４参照）、アラニンで置換されうる。
【００７５】
所望するアミノ酸置換（保存的又は非保存的）は、そのような置換を所望する時点で当業者によって決定されうる。例えば、アミノ酸置換は、ＡＦＴＩポリペプチドの重要な残基を同定するため、又はここで述べるＡＦＴＩポリペプチドの親和性を高める又は低下させるために使用できる。例示的なアミノ酸置換を表Ｉに示す。
【００７６】
【表１】
2004500105.tif 000003
【００７７】
一部の実施形態では、保存的アミノ酸置換はまた、典型的には生物系における合成によってではなく化学的ペプチド合成によって組み込まれる、非天然に生じるアミノ酸残基を包含する。これらはペプチドミメティクス、及びアミノ酸部分の他の逆転（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）又は逆方向（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）形態を含む。
【００７８】
天然に生じる残基は、共通の側鎖特性に基づくクラスに分類することができる：
１）疎水性残基：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；　２）中性親水性残基：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性残基：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性残基：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び
６）芳香族残基：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００７９】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスの１つの成員を別のクラスからの成員と交換することを含みうる。そのような置換された残基は、非ヒトＡＦＴＩポリペプチドオーソローグと相同なヒトＡＦＴＩポリペプチドの領域内又は分子の非相同領域内に導入することができる。
【００８０】
そのような交換を行う際には、アミノ酸の疎水親水指数を考慮しうる。各々のアミノ酸はそれらの疎水性と電荷特性に基づいて疎水親水指数が割り当てられており、それらは次の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。
【００８１】
タンパク質に相互作用性の生物学的機能を付与する際のアミノ酸疎水親水指数の重要性は当該技術において理解されている。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）。一部のアミノ酸が同様の疎水親水指数又はスコアを有する他のアミノ酸に置き換わって、それでもなお同様の生物活性を保持しうることが知られている。疎水親水指数に基づいて変更を行う際には、疎水親水指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに一層好ましい。
【００８２】
また、同様のアミノ酸の置換は、特にそれによって創造される生物学的機能が等しいタンパク質又はペプチドが、本出願におけるように免疫学的実施形態における使用を意図されている場合は、親水性に基づいて有効に実施できることも当該技術において理解されている。タンパク質の最大局所平均親水性は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるので、その免疫原性及び抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と相関する。
【００８３】
次のような親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。同様の親水性値に基づいて変更を行う際には、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに一層好ましい。親水性に基づく一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域は「エピトープコア領域」という。
【００８４】
当業者は、既知の手法を用いて配列番号２に示すようなポリペプチドの適当な変異体を決定しうるであろう。活性を失わせずに変更しうる分子の適当な領域を同定するために、当業者は、活性にとって重要でないと考えられる領域を標的することができる。例えば、同じ種又は他の種からの同様の活性を持つ同様のポリペプチドが既知であるとき、当業者はＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をそのような同様のポリペプチドと比較することができる。そのような比較により、同様のポリペプチド間で保存される分子の残基及び部分を同定することができる。そのような同様のポリペプチドに比して保存されないＡＦＴＩポリペプチドの領域の変化は、ＡＦＴＩポリペプチドの生物活性及び／又は構造に有害な影響を及ぼす可能性が低いことは認識されるであろう。また、比較的保存された領域であっても、活性を保持しながら、天然に生じる残基を化学的に類似したアミノ酸に置換しうること（保存的アミノ酸残基置換）は当業者には既知であろう。それ故、生物活性又は構造にとって重要と考えられる領域であっても、生物活性を失わせずに、あるいはポリペプチド構造に有害な影響を及ぼさずに、保存的アミノ酸置換に供しうると考えられる。
【００８５】
さらに、当業者は、活性又は構造にとって重要な同様のポリペプチド中の残基を同定する構造−機能試験を検討することができる。そのように比較することで、同様のポリペプチド中の活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応する、ＡＦＴＩポリペプチド中のアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当業者は、ＡＦＴＩポリペプチドのそのような重要と予測されるアミノ酸残基の代わりに化学的に類似したアミノ酸置換基を選択することができる。
【００８６】
当業者はまた、同様のポリペプチドの構造について、三次元構造とアミノ酸配列を分析することができる。その情報により、当業者はその三次元構造に関するＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸残基の配列を予測しうる。当業者は、タンパク質の表面にあると予測されるアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関与すると考えられるので、そのような残基に対してラジカルに変化させないものを選択するであろう。さらに、当業者は、各々の所望するアミノ酸残基における１個のアミノ酸置換を含む試験変異体を作製しうる。次に当業者に既知の活性アッセイを使用してかかる変異体をスクリーニングすることができる。そのような変異体は適当な変異体についての情報を収集するために使用できるであろう。例えば、活性の失活、活性の望ましくない低下、又は不適当な活性に起因する特定のアミノ酸残基の変化をもたらすことが発見された場合には、そのように変化した変異体は回避されるであろう。言い換えると、そのような常用実験から収集された情報に基づいて、当業者は、単独の又は他の突然変異と組み合わせたさらなる置換を回避するべきであるアミノ酸を容易に決定することができる。
【００８７】
多くの学術公表文献が二次構造の予測を対象としてきた。Ｍｏｕｌｔ　Ｊ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７（４）：４２２−４２７（１９９６）；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７：２５１−２７６及びＣｈｏｕら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．，２６：３６７−３８４（１９７９）参照。さらに、現在、二次構造を予測するのにコンピュータプログラムが使用できる。二次構造を予測する１つの方法はホモロジーモデリングに基づく。例えば、３０％以上の配列同一性又は４０％以上の類似性を有する２個のポリペプチド又はタンパク質は、しばしば類似した構造的トポロジーを持つ。最近、タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）が発達したことにより、ポリペプチド又はタンパク質構造内の折りたたみの潜在的な数を含めて、二次構造の予測可能性が高まっている。Ｈｏｌｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４−２４７（１９９９）参照。所与のポリペプチド又はタンパク質内に限られた数の折りたたみが存在し、ひとたび重要な数の構造が解明されれば、構造予測の正確性が劇的に進歩するであろうと示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、７（３）：３６９−３７６（１９９７）。
【００８８】
二次構造を予測するさらなる方法は、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，４（１）：１５−９（１９９６））、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４（１３）：４３５５−４３５８（１９８７））、及び「進化的連鎖（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｍｅ、前出、及びＢｒｅｎｎｅｒ、前出参照）を含む。
【００８９】
関連核酸分子とポリペプチドの同一性及び類似性は既知の方法によって容易に算定できる。そのような方法は、「コンピュータ分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編集、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８８；「バイオコンピューティング：情報処理とゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９３；「配列データのコンピュータ解析、第一部（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ　１）」、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編集、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９８７；「配列分析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ）」、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９１；及びＣａｒｉｌｌｏら、ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．，４８：１９７３（１９８８）に述べられているものを含むが、これらに限定されない。
【００９０】
同一性及び／又は類似性を決定するための好ましい方法は、検討する配列間で最大の対合を生じるように設計する。同一性及び類似性を決定する方法は公的に入手可能なコンピュータプログラムの中で述べられている。２つの配列間の同一性及び類似性を決定する好ましいコンピュータプログラムの方法は、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を含めたＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０（１９９０））を含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他のソース（ＢＬＡＳＴ　Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ　２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前出）から公的に入手可能である。既知のＳｍｉｔｈ　Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用しうる。
【００９１】
２個のアミノ酸配列を整列するためのある種のアラインメントスキームは２個の配列の短い領域だけの対合を生じることがあり、この小さな整列領域は、２つの完全長配列間に有意の関係がない場合でも配列同一性が非常に高い場合がある。従って、好ましい実施形態では、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）は標的ポリペプチドの少なくとも５０個の隣接アミノ酸配列に及ぶアラインメントを生じる。
【００９２】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、配列同一性パーセントを決定すべき２個のポリペプチドをそれらのそれぞれのアミノ酸の至適対合についてアラインメントする（アルゴリズムによって決定されるような対合スパン）。ギャップ開放ペナルティー（３Ｘ平均ダイアゴナル（ａｖｅｒａｇｅ　ｄｉａｇｏｎａｌ）として算定される；「平均ダイアゴナル」は使用する比較マトリックスの対角線の平均値である；「ダイアゴナル」は個々の比較マトリックスによって各々の完全なアミノ酸対合に割り当てられるスコア又は数である）及びギャップ伸長ペナルティー（通常はギャップ開放ペナルティーの１／１０）、ならびにＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２のような比較マトリックスをアルゴリズムと共に使用する。標準比較マトリックス（ＰＡＭ２５０比較マトリックスについてはＤａｙｈｏｆｆら、「タンパク質配列及び構造アトラス（Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）」、第５巻、補遺３（１９７８）参照；ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスについてはＨｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）参照）もアルゴリズムによって使用される。
【００９３】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは次のものを含む：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＵＭ６２；
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長ペナルティー：４
類似性閾値：０
ＧＡＰプログラムは上記のパラメータに関して有用である。上述したパラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いたポリペプチド比較についてのデフォルトパラメータ（末端ギャップについてのペナルティーを伴わない）である。
【００９４】
核酸分子の配列比較のための好ましいパラメータは次のものを含む：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較マトリックス：対合＝＋１０、不正対＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長ペナルティー：３
ＧＡＰプログラムは上記のパラメータに関しても有用である。上述したパラメータは核酸分子比較についてのデフォルトパラメータである。
【００９５】
他の例示的なアルゴリズム、ギャップ開放ペナルティー、ギャップ伸長ペナルティー、比較マトリックス、類似性閾値、等々も、Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　９、１９９７年９月に示されているものを含めて、使用しうる。採用すべき個々の選択は当業者には明らかであり、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡなどの実施する特定の比較に依存し、またさらには、所与の配列対間での比較であるか（この場合は一般にＧＡＰ又はＢｅｓｔＦｉｔが好ましい）又は１個の配列と大きな配列データベースとの比較であるか（この場合はＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴＡが好ましい）にも依存するであろう。
【００９６】
好ましいＡＦＴＩポリペプチド変異体は、グリコシル化の数及び／又はタイプが配列番号２に示すアミノ酸配列に比べて変化しているグリコシル化変異体を含む。１つの実施形態では、ＡＦＴＩポリペプチド変異体は、配列番号２に示すアミノ酸配列よりも多い又は少ない数のＮ−結合グリコシル化部位を含む。Ｎ−結合グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒを特徴とし、式中、Ｘと称されるアミノ酸残基はプロリンを除くいずれのアミノ酸残基でもよい。この配列を創造するアミノ酸残基の置換は、Ｎ−結合糖鎖の付加のための潜在的な新しい部位を提供する。代替的に、この配列を除去する置換は存在するＮ−結合糖鎖を取り除くだろう。また、１又はそれ以上のＮ−結合グリコシル化部位（典型的には天然に生じるもの）が除去されて、１又はそれ以上の新しいＮ−結合部位が創造される、Ｎ−結合糖鎖の再配列も提供される。さらなる好ましいＡＦＴＩ変異体は、配列番号２に示すアミノ酸配列又はそのフラグメントと比較して１又はそれ以上のシステイン残基が欠失している又は別のアミノ酸（例えばセリン）に置き換わっている、システイン変異体を含む。システイン変異体は、不溶性封入体の単離後のようにＡＦＴＩポリペプチドを生物学的に活性なコンフォメーションに折りたたまなければならないときに有用である。システイン変異体は一般に天然タンパク質よりもシステイン残基の数が少なく、典型的には不対システインから生じる相互作用を最小限に抑えるため偶数の残基を持つ。
【００９７】
さらなるＡＦＴＩポリペプチド変異体は、ＡＦＴＩポリペプチド配列の修飾（例えば残基の挿入又は置換）によって脂質化部位が付加された脂質化変異体を含む。そのような分子については、配列番号２のタンパク質を、脂質化酵素によって認識されるアミノ酸又はモチーフ（例えばＣＡＡＸモチーフを含めて、ファルネシルトランスフェラーゼ及び／又はゲラニルゲラニルトランスフェラーゼによって認識されるモチーフ）を含むように突然変異させることができる。例えば、Ｆｕら、１９９９、Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．５４：３１５−３４２；Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３３：４９７−５０４；Ｋｈｏｓｒａｖｉ−Ｆａｒら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２４３６３−２４３６８参照。当該技術において既知の他の脂質化手法も、本発明のＡＦＴＩポリペプチドを修飾するために使用できる。
【００９８】
さらに、配列番号２又はＡＦＴＩポリペプチド変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドを相同なポリペプチドに融合してホモダイマーを形成する、又は非相同ポリペプチドに融合してヘテロダイマーを形成することができる。非相同ペプチド及びポリペプチドは次のものを含むが、これらに限定されない：ＡＦＴＩ融合ポリペプチドの検出及び／又は単離を可能にするエピトープ；細胞外ドメイン又は膜貫通及び細胞内ドメインのような、膜貫通レセプタタンパク質又はその部分；膜貫通レセプタタンパク質に結合するリガンド又はその部分；触媒的に活性な酵素又はその部分；ロイシンジッパードメインのようなオリゴマー化を促進するポリペプチド又はペプチド；免疫グロブリン定常領域のような安定性を高めるポリペプチド又はペプチド；及び配列番号２に示すようなアミノ酸配列又はＡＦＴＩポリペプチド変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドとは異なる治療作用を持つポリペプチド。
【００９９】
融合は配列番号２に示すアミノ酸配列又はＡＦＴＩポリペプチド変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドのアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかで行うことができる。融合は、リンカー又はアダプター分子なしに直接であるか、若しくはリンカー又はアダプター分子を使用して間接的であってもよい。リンカー又はアダプター分子は１個又はそれ以上のアミノ酸残基、典型的には約２０個から約５０個のアミノ酸残基でありうる。リンカー又はアダプター分子はまた、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼのための開裂部位又は融合部分を分離させるプロテアーゼのための開裂部位を含むように設計することもできる。ひとたび構築されれば、融合ポリペプチドがここで述べる方法に従って誘導体化できることは明白であろう。
【０１００】
本発明のさらなる実施形態では、配列番号２又はＡＦＴＩポリペプチド変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドをヒトＩｇＧのＦｃ領域の１又はそれ以上のドメインに融合する。抗体は２個の機能的に独立した部分、すなわち抗原に結合する、「Ｆａｂ」として知られる可変ドメインと、補体の活性化や食細胞作用などのエフェクター機能に関与する、「Ｆｃ」として知られる定常ドメインを含む。Ｆｃは長い血清半減期を持ち、一方Ｆａｂの半減期は短い。Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−３１（１９８９）。治療タンパク質と共に構築すると、Ｆｃドメインはより長い半減期を与える、又はＦｃレセプタ結合、プロテインＡ結合、補体の固定、そしておそらく胎盤輸送のような機能を組み込むことができる。表２は、当該技術で既知の特定のＦＣ融合の使用を要約する。
【０１０１】
【表２】
2004500105.tif 000004
【０１０２】
１つの例では、ヒトＩｇＧヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の全部又は一部を、当業者に既知の方法を用いてＡＦＴＩポリペプチドのＮ末端又はＣ末端のいずれかに融合することができる。生じたＡＦＴＩ融合ポリペプチドはプロテインＡアフィニティーカラムを使用して精製しうる。Ｆｃ領域に融合したペプチド及びタンパク質は、インビボで融合していない対応物よりも実質的に長い半減期を示すことが認められた。また、Ｆｃ領域への融合は融合ポリペプチドの二量体化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は天然に生じるＦｃ領域であるか、又は治療品質、循環時間、凝集低下、等々のようなある種の質を高めるように改変されていてもよい。
【０１０３】
合成
ここで述べる核酸及びポリペプチド分子が組換え及び他の方法によって産生しうることは当業者に認識されるであろう。
【０１０４】
核酸分子の合成
ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子は、限定されず、化学合成、ｃＤＮＡ又はゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニング及び／又はｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を含む様々な方法で容易に入手することができる。
【０１０５】
ここで使用する組換えＤＮＡ法は、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、及び／又はＡｕｓｕｂｅｌら編集、「分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ．及びＷｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）に示されているものである。本発明は、ここで述べるような核酸分子とかかる分子を得るための方法を提供する。
【０１０６】
ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が１つの種から同定された場合、その遺伝子の全部又は一部がオーソローグ又は同じ種からの関連遺伝子を同定するためのプローブとして使用できる。プローブ又はプライマーを使用して、ＡＦＴＩポリペプチドを発現すると考えられる様々な組織からのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。さらに、ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定し、単離するために、配列番号１に示すような配列を持つ核酸分子の一部又は全部を使用してゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。典型的には、スクリーニングから得られる偽陽性の数を最小限に抑えるため、中又は高ストリンジェンシーの条件がスクリーニングに使用される。
【０１０７】
ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子はまた、発現されるタンパク質の特性に基づく陽性クローンの検出を用いた発現クローニングによっても同定しうる。典型的には、宿主細胞表面で発現され、ディスプレイされるクローン化タンパク質への抗体又は他の結合パートナー（例えばレセプタ又はリガンド）の結合によって核酸ライブラリーをスクリーニングする。抗体又は結合パートナーは、所望するクローンを発現する細胞を同定するために検出可能な標識で修飾する。
【０１０８】
下記に述べる説明に従って実施する組換え発現手法は、これらのポリヌクレオチドを作製し、コードされるポリペプチドを発現するために使用しうる。例えば、ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することにより、当業者は大量の所望するヌクレオチド配列を容易に生産することができる。次のその配列を使用して検出プローブ又は増幅プライマーを作製することができる。その代わりに、ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入することもできる。発現ベクターを適切な宿主に挿入することにより、コードされるＡＦＴＩポリペプチドを大量に生産することができる。
【０１０９】
適当な核酸配列を得るためのもう１つの方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法では、逆転写酵素を用いてポリ（Ａ）＋ＲＮＡ又は全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する。次に、典型的にはＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）の２つの別々の領域に相補的な、２個のプライマーを、Ｔａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼと共にｃＤＮＡに加えると、ポリメラーゼは２個のプライマー間のｃＤＮＡ領域を増幅する。
【０１１０】
ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製するもう１つの手段は、Ｅｎｇｅｌｓら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．，２８：７１６−７３４（１９８９）に述べられているもののような当業者に既知の方法を用いた化学合成である。これらの方法は、中でも特に、核酸合成のためのホスホトリエステル、ホスホルアミダイト、及びＨ−ホスホネート法を含む。そのような化学合成のための好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を用いたポリマー支持合成である。
【０１１１】
典型的には、ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは数百ヌクレオチドの長さである。約１００ヌクレオチド以上の核酸は、これらの方法を用いていくつかのフラグメントとして合成することができる。その後フラグメントを一緒に連結して、ＡＦＴＩポリペプチドの完全長ヌクレオチド配列を形成することができる。通常、ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡ断片は、メチオニン残基をコードするＡＴＧを持つ。このメチオニンは、宿主細胞において産生されるポリペプチドがその細胞から分泌されるように設計されているか否かによって、ＡＦＴＩポリペプチドの成熟形態に存在しても、又は存在しなくてもよい。当業者には既知の他の方法が良く使用されうる。
【０１１２】
一部の実施形態では、核酸変異体は、所与の宿主細胞におけるＡＦＴＩポリペプチドの至適発現のために変化したコドンを含む。個々のコドン変化は発現のために選択されるＡＦＴＩポリペプチドと宿主細胞に依存する。そのような「コドンの至適化」は様々な方法によって、例えば所与の宿主細胞において高度に発現される遺伝子での使用のために好ましいコドンを選択することによって実施できる。高度に発現される細菌遺伝子のコドン選択性についての「Ｅｃｏｈｉｇｈ．ｃｏｄ」のようなコドン頻度表を組み込んだコンピュータアルゴリズムが使用でき、これはｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　９．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩによって提供されている。他の有用なコドン頻度表は「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、及び「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」を含む。
【０１１３】
ベクターと宿主細胞
ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は標準的なライゲーション手法を用いて適切な発現ベクターに挿入することができる。ベクターは、典型的には使用する個々の宿主細胞において機能性であるように選択される（すなわち遺伝子の増幅及び／又は遺伝子の発現が起こりうるようにベクターは宿主細胞機構と適合性である）。ＡＦＴＩポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）、及び／又は真核生物宿主細胞において増幅／発現されうる。宿主細胞の選択は、一部にはＡＦＴＩポリペプチドが翻訳後修飾（例えばグリコシル化及び／又はリン酸化）であるかどうかに依存する。そうである場合には、酵母、昆虫、又は哺乳類宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説については、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，ｖ．１８５，Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）参照。
【０１１４】
典型的には、いずれの宿主細胞で使用される発現ベクターも、プラスミドの維持のための配列及び外来ヌクレオチド配列のクローニングと発現のための配列を含む。一部の実施形態では集合的に「フランキング配列」と称されるそのような配列は、典型的には次のヌクレオチド配列の１個又はそれ以上を含む：プロモーター、１又はそれ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、スプライス供与部位と受容部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現すべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、及び選択可能なマーカー要素。これらの配列のそれぞれを下記で述べる。
【０１１５】
場合によっては、ベクターは「タグ」コード配列、すなわちＡＦＴＩポリペプチドの５’又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含みうる；オリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（ヘキサＨｉｓのような）、あるいはＦＬＡＧ，ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）又は市販の抗体が存在するｍｙｃのような他の「タグ」をコードする。このタグは、典型的にはポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からのＡＦＴＩポリペプチドのアフィニティー精製の手段として使用できる。アフィニティー精製は、例えばタグに対する抗体をアフィニティーマトリックスとして使用するカラムクロマトグラフィーによって実施できる。場合によっては、その後、開裂のためにある種のペプチダーゼを使用するなどの様々な手段によって精製ＡＦＴＩポリペプチドからタグを除去することができる。
【０１１６】
フランキング配列は相同（すなわち宿主細胞と同じ種及び／又は同じ系統から）、非相同（すなわち宿主細胞の種又は系統以外の種から）、ハイブリッド（すなわち２つ以上のソースからのフランキング配列の組合せ）又は合成であってもよく、あるいはフランキング配列はＡＦＴＩポリペプチド発現を調節するように正常に機能する天然配列であってもよい。それ自体で、フランキング配列のソースは、フランキング配列が宿主細胞機構において機能性であり、宿主細胞機構によって活性化されうることを条件として、いかなる原核又は真核生物、脊椎又は非脊椎生物、又は植物であってもよい。
【０１１７】
本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、当該技術において既知のいくつかの方法のいずれかによって入手しうる。典型的には、ＡＦＴＩ遺伝子フランキング配列以外のここで有用なフランキング配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によってこれまでに同定されており、従って適切な制限エンドヌクレアーゼを用いて適当な組織ソースから単離することができる。一部の霊ではフランキング配列の全ヌクレオチド配列は既知でありうる。ここでは、フランキング配列は、核酸合成又はクローニングについてここで述べる方法を用いて合成しうる。
【０１１８】
フランキング配列の全部又は一部だけが既知である場合、ＰＣＲ及び／又は適当なオリゴヌクレオチド及び／又は同じ又は別の種からのフランキング配列フラグメントでゲノムライブラリーをスクリーニングすることによってフランキング配列を入手することができる。フランキング配列が不明である場合には、フランキング配列を含むＤＮＡのフラグメントを、例えばコード配列又はさらに別の１又はそれ以上の遺伝子を含みうるＤＮＡのより大きな断片から単離しうる。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生じる制限エンドヌクレアーゼで消化し、その後アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）、又は当業者に既知の他の方法を用いて単離することによって実施しうる。この目的を達成するための適当な酵素の選択は当業者には容易に明らかであろう。
【０１１９】
複製起点は典型的には市販のものを購入した原核生物発現ベクターの一部であり、起点は宿主細胞におけるベクターの増幅を助ける。一定のコピー数へのベクターの増幅は、一部の場合には、ＡＦＴＩポリペプチドの至適発現にとって重要でありうる。選択するベクターが複製起点部位を含まない場合は、既知の配列に基づいて化学合成し、ベクターに連結することができる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（製品Ｎｏ．３０３−３ｓ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点は大部分のグラム陰性細菌に適しており、また様々な起点（例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）あるいはＨＰＶ又はＢＰＶのような乳頭腫ウイルス）が哺乳類細胞におけるクローニングベクターにとって有用である。一般に、哺乳類発現ベクターには複製起点成分は必要ない（例えば、ＳＶ４０起点は初期プロモーターを含むのでしばしば使用される）。
【０１２０】
転写終結配列は、典型的にはポリペプチドコード領域の末端の３’側に位置し、転写を終結する役割を果たす。通常、原核細胞における転写終結配列はＧ−Ｃに富むフラグメントで、ポリＴ配列がそれに続く。かかる配列はライブラリーから容易にクローン化され、あるいはベクターの一部として市販のものも購入されるが、ここで述べるような核酸合成のための方法を用いて容易に合成することもできる。
【０１２１】
選択可能マーカー遺伝子要素は、選択培地で成長する宿主細胞の生存と増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質又は他の毒素、例えば原核宿主細胞についてはアンピシリン、テトラサイクリン、又はカナマイシンに対する耐性を付与する、（ｂ）細胞の栄養欠損を補足する、又は（ｃ）複合培地からは得られない必須栄養素を供給するタンパク質をコードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子も原核及び真核宿主細胞での選択のために使用しうる。
【０１２２】
他の選択遺伝子を使用して発現する遺伝子を増幅することもできる。増幅は、成長にとって必須のタンパク質を産生するためにより必要とされる遺伝子が、組換え細胞の連続する世代の染色体内でタンデムに反復される過程である。哺乳類細胞のための適当な選択可能マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）及びチミジンキナーゼを含む。哺乳類細胞の形質転換体を、形質転換体だけがベクター内に存在する選択遺伝子によって独自に生存に適応する選択圧下に置く。媒質中の選択剤の濃度を連続的に変化させ、それによって選択遺伝子とＡＦＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡの両方の増幅を導く条件下で形質転換細胞を培養することによって選択圧を課する。その結果、増幅されたＤＮＡから高い量のＡＦＴＩポリペプチドが合成される。
【０１２３】
ｍＲＮＡの翻訳開始には通常リボゾーム結合部位が必要であり、リボソーム結合部位はシャイン−ダルガーノ配列（原核細胞）又はコザック配列（真核細胞）によって特定される。かかる要素は典型的にはプロモーターの３’側、発現されるＡＦＴＩポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。シャイン−ダルガーノ配列は多様であるが、典型的にはポリプリンである（すなわち高いＡ−Ｇ含量を有する）。多くのシャイン−ダルガーノ配列が同定されており、それらの各々がここで述べる方法を用いて容易に合成でき、原核細胞ベクターにおいて使用できる。
【０１２４】
リーダー又はシグナル配列を使用して宿主細胞からのＡＦＴＩポリペプチドを指令することができる。典型的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列をＡＦＴＩ核酸分子のコード領域に位置づけるか、又は直接ＡＦＴＩポリペプチドコード領域の５’末端に位置づける。多くのシグナル配列が同定されており、選択した宿主細胞において機能性であるいずれもがＡＦＴＩ核酸分子と共に使用できる。それ故、シグナル配列はＡＦＴＩ遺伝子又はｃＤＮＡに相同（天然に生じる）であるか又は非相同であってもよい。さらに、シグナル配列はここで述べる方法を用いて化学合成しうる。ほとんどの場合、シグナルペプチドの存在を通した宿主細胞からのＡＦＴＩポリペプチドの分泌は、分泌されたＡＦＴＩポリペプチドからのシグナルペプチドの除去をもたらす。シグナル配列はベクターの成分であるか、又はベクターに挿入されるＡＦＴＩ核酸分子の一部であってもよい。
【０１２５】
ＡＦＴＩポリペプチドコード領域に連結された天然ＡＦＴＩポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、又はＡＦＴＩポリペプチドコード領域に連結された非相同シグナル配列をコードするヌクレオチド配列の使用は本発明の範囲内に含まれる。選択される非相同シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる、すなわちシグナルペプチダーゼによって開裂されるものでなければならない。天然ＡＦＴＩポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核宿主細胞については、シグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、又は熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核細胞シグナル配列に置き換える。酵母分泌については、天然ＡＦＴＩポリペプチドシグナル配列を酵母インベルターゼ、α因子、又は酸性ホスファターゼリーダーによって置き換えることができる。哺乳類細胞の発現においては、天然シグナル配列は満足しうるものであるが、他の哺乳類シグナル配列が適当であると考えられる。
【０１２６】
真核宿主細胞発現系においてグリコシル化を所望する場合のように、一部の場合には、グリコシル化又は収率を改善するために様々なプレ配列を操作しうる。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ開裂部位を変化させる、又は同様にグリコシル化に影響を及ぼしうるプレ配列を付加することができる。最終的なタンパク質産物は、−１位に（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に比べて）、完全には除去されなかったと考えられる、発現に付随する１又はそれ以上の付加アミノ酸を持ちうる。例えば、最終タンパク質産物は、Ｎ末端に結合した、ペプチダーゼ開裂部位に認められる１個又は２個のアミノ酸残基を持ちうる。その代わりに、一部の酵素開裂部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内の該当領域で切断する場合、所望するＡＦＴＩポリペプチドのわずかにトランケートされた形態を生じることがある。
【０１２７】
多くの場合、ベクター内に１個又はそれ以上のイントロンが存在することによって核酸分子の転写が高められる；これは特に、ポリペプチドが真核宿主細胞、中でも哺乳類宿主細胞において産生される場合に当てはまる。使用するイントロンは、特に使用する遺伝子が完全長ゲノム配列又はそのフラグメントである場合、ＡＦＴＩ遺伝子内に天然に生じるものでありうる。イントロンが天然では遺伝子内に生じない場合（ほとんどのｃＤＮＡに関して）、別のソースからイントロンを入手することができる。イントロンが有効であるように転写されねばならないので、フランキング配列及びＡＦＴＩ遺伝子に対するイントロンの位置は概して重要である。それ故、ＡＦＴＩｃＤＮＡ分子が転写されるとき、イントロンの好ましい位置は転写開始部位の３’側、ポリＡ転写終結配列の５’側である。好ましくは、１個又はそれ以上のイントロンがコード配列を中断しないようにｃＤＮＡの一方の側又は他方の側（すなわち５’又は３’側）に位置する。ウイルス、原核及び真核（植物又は動物）生物を含めたいかなるソースからのいかなるイントロンも、それが挿入される宿主細胞と適合性であることを条件として、本発明を実施するために使用しうる。合成イントロンもここに含まれる。場合によっては、２個以上のイントロンをベクターにおいて使用することができる。
【０１２８】
本発明の発現及びクローニングベクターは、各々典型的には、宿主生物によって認識され、ＡＦＴＩポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する、構造遺伝子の開始コドンの上流（５’側）（一般に約１００−１０００ｂｐ以内）に位置する非転写配列である。プロモーターは、誘導型プロモーターと構成型プロモーターの２つのクラスに好都合に分類される。誘導型プロモーターは、栄養素の存在又は不在あるいは温度変化のような培養条件の変化に応答して、その制御下でＤＮＡからの高いレベルの転写を開始させる。構造型プロモーターは、他方で、連続的な遺伝子産物の産生を開始させる；すなわち遺伝子発現に対してはほとんどあるいは全く制御しない。様々な宿主細胞によって認識される多くのプロモーターが広く知られている。制限酵素消化によってソースＤＮＡからプロモーターを取り除き、所望するプロモーター配列をベクター内に挿入することにより、適当なプロモーターがＡＦＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。天然ＡＦＴＩ遺伝子プロモーター配列を使用して、ＡＦＴＩ核酸分子の増幅及び／又は発現を指令することができる。しかしながら、天然プロモーターと比較してより高い転写と発現タンパク質のより高い収率を可能にし、且つ使用のために選択した宿主細胞系と適合性であれば、異種プロモーターが好ましい。
【０１２９】
原核細胞宿主での使用に適するプロモーターは、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；及びｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターを含む。他の既知の細菌プロモーターも適する。それらの配列は公表されており、それによって当業者は、有用な制限部位を提供するため必要に応じてリンカー又はアダプターを使用して、所望するＤＮＡ配列にプロモーターをライゲートすることができる。
【０１３０】
酵母宿主に関する使用に適したプロモーターも当該技術において既知である。酵母エンハンサーが酵母プロモーターと共に好都合に使用される。哺乳類宿主細胞に関する使用に適したプロモーターは既知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２のような）、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、そして最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られるものを含むが、これらに限定されない。他の適当な哺乳類プロモーターは、異種哺乳類プロモーター、例えば熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターを含む。
【０１３１】
ＡＦＴＩ遺伝子の転写を制御する上で有用と考えられるさらなるプロモーターは次のものを含むが、これらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔとＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ，２９０：３０４−３１０、１９８１）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ、２２：７８７−７９７，１９８０）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１４４−１４４５、１９８１）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２９６：３９−４２、１９８２）；原核細胞発現ベクタオーについては、β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：３７２７−３７３１、１９７８）のようなプロモーター；あるいはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５、１９８３）。組織特異性を示し，トランスジェニック動物において使用されてきた、次のような動物転写制御領域も有用である：膵小胞体細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、Ｃｅｌｌ、３８：６３９−６４６，１９８４；Ｏｒｎｉｔｚら、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，７：４２５−５１５，１９８７）；膵β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，Ｎａｔｒｅ，３１５：１１５−１２２，１９８５）；リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、Ｃｅｌｌ，３８：６４７−６５８（１９８４）；Ａｄａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３１８：５３３−５３８（１９８５）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、７：１４３６−１４４４、１９８７）；精巣、乳房、リンパ系及び肥満細胞において活性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、Ｃｅｌｌ、４５：４８５−４９６，１９８６）；肝において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．、１：２６８−２７６，１９８７）；肝において活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：１６３９−１６４８、１９８５；Ｈａｍｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３５：５３−５８，１９８７）；肝において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．、１：１６１−１７１，１９８７）；骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、Ｎａｔｕｒｅ，３１５：３３８−３４０，１９８５；Ｋｏｌｌｉａｓら、Ｃｅｌｌ，４６：８９−９４，１９８６）；脳の希突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、Ｃｅｌｌ，４８：７０３−７１２，１９８７）；骨格金において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ，３１４：２８��−２８６，１９８５）；及び視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３４：１３７２−１３７８，１９８６）。
【０１３２】
高等真核生物による本発明のＡＦＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を高めるために、エンハンサー配列をベクターに挿入することができる。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を高める、通常約１０から３００ｂｐの長さの、ＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは比較的方向及び位置に依存しない。転写ユニットの５’側と３’側に認められている。哺乳類遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（例えばグロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。典型的には、しかしながら、ウイルスからのエンハンサーが使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーは、真核細胞プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーはＡＦＴＩ核酸分子の５’側と３’側の位置でベクター内にスプライシングされうるが、典型的にはプロモーターから５’側の部位に位置する。
【０１３３】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような出発ベクターから構築されうる。そのようなベクターは所望するフランキング配列の全部を含んでいてもよく、又は含んでいなくてもよい。１又はそれ以上の所望するフランキング配列が既にベクター内に存在しなていない場合には、それらを個々に入手して、ベクターにライゲートすることができる。各々のフランキング配列を得るために使用される方法は当業者には既知である。
【０１３４】
本発明を実施するための好ましいベクターは、細菌、昆虫、酵母、及び哺乳類宿主細胞と適合性であるものである。そのようなベクターは、中でも特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、及びｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１４３６３号）及びｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含む。
【０１３５】
さらなる適当なベクターは、コスミド、プラスミド又は修飾ウイルスを含むがこれらに限定されず、但し、ベクター系が選択した宿主細胞と適合性でなければならないことは明白であろう。そのようなベクターは、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高いコピー数のＣｏｌＥ１に基づくファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、Ｔａｑ増幅したＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えばＴＯＰＯ（商標）　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）　Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、のようなプラスミド、及び哺乳類、酵母、昆虫、又はバキュロウイルス発現系（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）のようなウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
【０１３６】
ベクターが構築され、ＡＦＴＩポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後、完成したベクターを増幅及び／又はポリペプチドの発現のために適当な宿主細胞に挿入することができる。選択した宿主細胞へのＡＦＴＩポリペプチドの発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション又はＤＥＡＥ−デキストラン法のような方法を含めた既知の方法、あるいは他の既知の手法によって実施しうる。選択する方法は、一部には使用する宿主細胞の種類に依存するであろう。これらの方法や他の適当な方法は当業者に既知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前出に述べられている。
【０１３７】
宿主細胞は原核宿主細胞（大腸菌など）又は真核宿主細胞（酵母細胞、昆虫細胞又は脊椎動物細胞など）でありうる。宿主細胞は、適切な条件下で培養したとき、ＡＦＴＩポリペプチドを合成し、その後それを培地から収集するか（宿主細胞がＡＦＴＩポリペプチドを培地中に分泌する場合）、又はそれを産生する宿主細胞から直接収集することができる。適切な宿主細胞の選択は、所望する発現レベル、グリコシル化又はリン酸化のような所望する又は活性に必要なポリペプチド修飾、及び生物活性分子への折りたたみの容易さのような様々な因子に依存するであろう。
【０１３８】
いくつもの適当な宿主細胞が当該技術において既知であり、多くはｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９から入手可能である。その例は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ　ＤＨＦＲ細胞（Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７：４２１６−４２２０（１９８０）、ヒト胚腎（ＨＥＫ）２９３又は２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ１５７３）、あるいは３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ９２）のような哺乳類細胞を含むが、これらに限定されない。適当な哺乳類宿主細胞の選択ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング及び生成物の生産と精製のための方法は当該技術において既知である。他の適当な哺乳類細胞系は、サルＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１６５０）及びＣＯＳ−７細胞系（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）、及びＣＶ−１細胞系（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＣＬ７０）である。さらなる例示的な哺乳類宿主細胞は、形質転換細胞系を含めた、霊長類細胞系及びげっ歯類細胞系を含む。正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養から誘導される細胞株、ならびに一次外植片も適する。候補細胞は、選択遺伝子に遺伝子型上の欠損があるか、又は優性に作用する選択遺伝子を含みうる。他の適当な哺乳類細胞系は、ＡＴＣＣから入手可能な、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃ又はＮＩＨマウスから誘導される３Ｔ３系統、ＢＨＫ又はＨａＫハムスター細胞系を含むが、これらに限定されない。これらの細胞系の各々がタンパク質発現の当業者に既知であり、入手可能である。
【０１３９】
細菌細胞も、本発明に適する宿主細胞として同様に有用である。例えば、大腸菌の種々の菌株（例えば、ＨＢ１０１、（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．３３６９４）ＤＨ５α、ＤＨ１０、及びＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．５３３３８））はバイオテクノロジーの分野において宿主細胞として既知である。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｐ．）、他のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｐ．）、等の種々の菌株もこの方法において使用しうる。
【０１４０】
当業者に既知の酵母細胞の多くの菌株も、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として使用しうる。好ましい酵母細胞は、例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｉｖｉｓａｅ及びＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓを含む。
【０１４１】
さらに、所望する場合には、昆虫細胞系も本発明の方法において使用しうる。そのような系は、例えばＫｉｔｔｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４：８１０−８１７（１９９３）；Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４：５６４−５７２（１９９３）；及びＬｕｃｋｌｏｗら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−４５９（１９９３））に述べられている。好ましい昆虫細胞はＳｆ−９及びＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。
【０１４２】
また、グリコシル化ＡＦＴＩポリペプチドを発現するためにトランスジェニック動物を使用することができる。例えば、トランスジェニック乳産生動物（例えばウシ又はヤギ）を使用して、動物乳において本発明のグリコシル化ポリペプチドを得ることができる。また、ＡＦＴＩポリペプチドを生成するために植物も使用しうるが、一般に、植物で起こるグリコシル化は哺乳類細胞で生じるものとは異なり、ヒト治療用途には適さないグリコシル化産物が生じうる。
【０１４３】
ポリペプチド産生
ＡＦＴＩポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に既知の標準培地を使用して培養しうる。培地は通常、細胞の増殖と生存に必要なすべての栄養素を含む。大腸菌細胞を培養するための適当な培地は、例えば、Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）及び／又はＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）を含む。真核細胞を培養するための適当な培地は、Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地１６４０（ＲＰＭＩ　１６４０）、最小必須培地（ＭＥＭ）及び／又はダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含み、それらすべてに、培養する特定細胞系によって指示されるように血清及び／又は成長因子を補足しうる。昆虫培養のための適当な培地は、必要に応じてイーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物及び／又はウシ胎児血清を補足したグレース培地である。
【０１４４】
典型的には、形質転換細胞の選択増殖のために有用な抗生物質又は他の化合物を補足物として培地に加える。使用すべき化合物は、宿主細胞が形質転換されたプラスミド上に存在する選択マーカーエレメントによって指定される。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培地に加える化合物はカナマイシンである。選択増殖のための他の化合物は、アンピシリン、テトラサイクリン、及びネオマイシンを含む。
【０１４５】
宿主細胞によって産生されるＡＦＴＩポリペプチドの量は、当該技術において既知の標準的方法によって評価できる。そのような方法は、限定を伴わずに、ウエスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降法、及び／又はＤＮＡ結合ゲルシフト分析のような活性アッセイを含む。
【０１４６】
ＡＦＴＩポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計した場合、ポリペプチドの大部分は細胞培地中に存在すると考えられる。しかし、ＡＦＴＩポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合には、それは細胞質及び／又は核（真核宿主細胞の場合）あるいは細胞質ゾル（細菌宿主細胞の場合）内に存在する。
【０１４７】
宿主細胞の細胞質及び／又は核（真核宿主細胞の場合）あるいは細胞質ゾル（細菌宿主細胞の場合）内に位置するＡＦＴＩポリペプチドに関して、当業者に既知の何らかの標準的手法を用いて宿主細胞から細胞内物質（グラム陰性菌についての封入体を含む）を抽出することができる。例えば、宿主細胞を溶解し、フレンチプレス、均質化、及び／又は音波破砕とそれに続く遠心分離によってペリプラズム／細胞質の内容物を放出させることができる。
【０１４８】
ＡＦＴＩポリペプチドが細胞質ゾル内で封入体を形成した場合、封入体はしばしば内細胞膜及び／又は外細胞膜に結合しており、それ故遠心分離後は主としてペレット物質として認められる。その後ペレット物質を極端なｐＨで処理するか、あるいはアルカリ性ｐＨでのジチオトレイトール又は酸性ｐＨでのトリスカルボキシエチルホスフィンのような還元剤の存在下に界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、又は尿素誘導体のようなカオトロピック試薬で処理して、封入体を放出し、破壊し、可溶化することができる。次に、可溶性形態となったＡＦＴＩポリペプチドをゲル電気泳動、免疫沈降法、等を用いて分析することができる。ＡＦＴＩポリペプチドを単離することを所望する場合には、ここで述べる方法及びＭａｒｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８２：２６４−２７５（１９９０）の方法のような標準的方法を用いて単離を実施することができる。
【０１４９】
一部の場合、ＡＦＴＩポリペプチドが単離後は生物活性でないことがある。ポリペプチドをその三次構造に「リフォールディング」又は変換して、ジスルフィド結合を形成するための様々な方法が、生物活性を回復するために使用できる。そのような方法は、可溶化したポリペプチドを特定の濃度のカオトロピック試薬の存在下で、通常は７以上のｐＨに暴露することを含む。カオトロピック試薬の選択は封入体可溶化のために使用する選択と非常に類似するが、通常カオトロピック試薬はより低い濃度で使用され、必ずしも可溶化のために使用するカオトロピック試薬と同じではない。ほとんどの場合、リフォールディング／酸化溶液はまた、還元剤、あるいはタンパク質のシステイン架橋の形成の際に起こるジスルフィドシャフリングを可能にする特定のレドックス電位を生じる特定比率での還元剤プラスその酸化形態を含む。一般的に使用されるレドックス対の一部は、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、及び２−２メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）を含む。リフォールディングの効率を高めるために共溶媒が使用でき、このために使用されるより一般的な試薬は、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコール、アルギニン、等を含む。
【０１５０】
ＡＦＴＩポリペプチドの発現時に有意の度合の封入体が形成されない場合には、細胞ホモジネートの遠心分離後、ポリペプチドは主として上清中に認められる。ここで述べるような方法を用いて上清からポリペプチドさらに単離することができる。
【０１５１】
溶液からのＡＦＴＩポリペプチドの精製は様々な手法を用いて実施できる。ポリペプチドがそのカルボキシ末端又はアミノ末端のいずれかにヘキサヒスチジン（ＡＦＴＩポリペプチド／ｈｅｘａＨｉｓ）、あるいはＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ．，Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）又はｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）などの他の小さなペプチドのようなタグを含むように合成された場合、カラムマトリックスがタグに高い親和性を持つアフィニティーカラムに溶液を通すことによって１段階で精製することができる。
【０１５２】
例えば、ポリヒスチジンは高い親和性と特異性でニッケルに結合し、それ故ニッケルのアフィニティーカラム（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラムのような）がＡＦＴＩポリペプチド／ポリＨｉｓの精製に使用できる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、「分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第１０．１１．８章、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９３）参照。
【０１５３】
さらに、ＡＦＴＩ様ポリペプチドは、ＡＦＴＩ様ポリペプチドを特異的に認識し、結合することができるモノクローナル抗体の使用を通して精製しうる。
【０１５４】
精製のための適当な手順は、それ故、限定を伴わずに、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動（未変性ゲル電気泳動を含む）とそれに続くゲル溶出、及び分取等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」装置／手法、Ｈｏｅｆｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を含むがこれらに限定されない。一部の場合には、高い純度を達成するために２又はそれ以上の精製手法を組み合わせてもよい。
【０１５５】
ＡＦＴＩポリペプチドはまた、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３）、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：５１３２（１９８５）、及びＳｔｅｗａｒｄとＹｏｕｎｇ，「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４）に述べられているような、当該技術において既知の手法を用いて化学合成法（固相ペプチド合成のような）によって調製することもできる。そのようなポリペプチドはアミノ末端にメチオニンを持つか又はメチオニンなしで合成しうる。化学合成したＡＦＴＩポリペプチドを、これらの参考文献に述べられている方法を用いて酸化し、ジスルフィド架橋を形成することができる。化学合成ＡＦＴＩポリペプチドは、組換え生産した又は天然ソースから精製した対応するＡＦＴＩポリペプチドと同等の生物活性を持つと予想され、それ故組換え又は天然ＡＦＴＩポリペプチドと交換可能に使用しうる。
【０１５６】
ＡＦＴＩポリペプチドを入手するもう１つの手段は、ＡＦＴＩポリペプチドが天然に存在するソース組織及び／又は液体のような生物学的サンプルからの精製によるものである。そのような精製は、ここで述べるようなタンパク質生成のための方法を用いて実施できる。精製の間ＡＦＴＩポリペプチドが存在することは、例えば組換え生産したＡＦＴＩポリペプチド又はそのペプチド断片に対して作製した抗体を用いてモニターしうる。
【０１５７】
核酸及びポリペプチドを生成するためのさらなるいくつかの方法が当該技術において知られており、ＡＦＴＩに特異性を持つポリペプチドを生成するために使用できる。例えば、ｍＲＮＡとそれがコードするペプチド間の融合タンパク質の産生を述べた、Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１２２９７−１２３０３（１９９７）参照。また、特定の生物学的機能を実施することができるオリゴヌクレオチドを得る方法を述べた米国特許第５，８２４，４６９号も参照のこと。その手順は、各々が５’ランダム配列、中央のあらかじめ選択された配列、及び３’ランダム配列を持つ、オリゴヌクレオチドの非相同プールを生成することを含む。生じた非相同プールを、所望する生物学的機能を示さない細胞個体群に導入する。次に細胞の小個体群をあらかじめ決定された生物学的機能を示すものに関してスクリーニングする。その小個体群から、所望する生物学的機能を実施することができるオリゴヌクレオチドを単離する。
【０１５８】
米国特許第５，７６３，１９２号、５，８１４，４７６号、５，７２３，３２３号、及び５，８１７，４８３号は、ペプチド又はポリペプチドを生成するための方法を述べている。これは、確率的遺伝子又はそのフラグメントを作製し、次に確率的遺伝子によってコードされる１又はそれ以上のタンパク質を産生する宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって実施される。その後宿主細胞をスクリーニングして、所望する活性を持つペプチド又はポリペプチドを産生するクローンを同定する。
【０１５９】
化学誘導体
ＡＦＴＩポリペプチドの化学修飾誘導体は、下記に述べる開示を考慮して、当業者によって調製されうる。ＡＦＴＩポリペプチド誘導体は、ポリペプチドに天然に結合している分子の種類又は位置を変化させるように修飾される。誘導体は１又はそれ以上の天然結合化学基の欠失によって形成される分子を含みうる。配列番号２又はＡＦＴＩポリペプチド変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドは、１又はそれ以上のポリマーの共有結合によって修飾されうる。例えば、選択されるポリマーは典型的には水溶性であるので、それに結合するタンパク質は生理環境のような水性環境において沈殿しない。ポリマーの混合物も適当なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終産物の治療用途のために、ポリマーは製薬上許容されうるものである。
【０１６０】
各々のポリマーはいかなる分子量であってもよく、分枝又は非分枝のいずれでもよい。ポリマーは典型的には約２ｋＤａから約１００ｋＤａ（「約」の語は、水溶性ポリマーの製剤中、一部の分子は示されている分子量よりも大きく、一部の分子はそれより小さい分子量を持つことを意味する）の平均分子量を持つ。各ポリマーの平均分子量は好ましくは約５ｋＤａから約５０ｋＤａ、より好ましくは約１２ｋＤａから約４０ｋＤａ、最も好ましくは約２０ｋＤａから約３５ｋＤａの間である。
【０１６１】
適当な水溶性ポリマー又はその混合物は、Ｎ結合又はＯ結合炭水化物、糖類、リン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ又はアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含めて、タンパク質を誘導体化するために使用されてきたＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば約６ｋＤａの低分子量デキストランなど）、セルロース、又は他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオル（例えばグリセロール）及びポリビニルアルコールを含むが、これらに限定されない。配列番号２又はＡＦＴＩポリペプチド変異体のアミノ酸配列を含むポリペプチドの共有結合多量体を調製するために使用しうる二官能性架橋分子も本発明に包含される。
【０１６２】
一般に、化学誘導体化は、タンパク質を活性化ポリマー分子と反応させるために使用される適当な条件下で実施しうる。ポリペプチドの化学誘導体を調製するための方法は、一般に（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はＡＦＴＩポリペプチド変異体が１又はそれ以上のポリマー分子に結合する条件下で、ポリペプチドを活性化ポリマー分子（ポリマー分子の反応性エステル又はアルデヒド誘導体など）と反応させ、そして（ｂ）反応産物を得る段階を含む。至適反応条件は既知のパラメータと所望する結果に基づいて決定されるであろう。例えば、ポリマー分子：タンパク質の比が大きいほど、結合ポリマー分子のパーセンテージが高くなる。１つの実施形態では、ＡＦＴＩポリペプチド誘導体はアミノ末端に１個のポリマー分子部分を持ちうる。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号参照。
【０１６３】
ポリペプチドのペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は特に、例えば次の参考文献に述べられているように、当該技術において既知のペギル化反応いずれかによって実施しうる：Ｆｒａｎｃｉｓら、「成長因子への注目（Ｆｏｃｕｓ　ｏｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ）」、３：４−１０（１９９２）；ＥＰ０１５４３１６号；ＥＰ０４０１３８４号；米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペギル化はここで述べるような反応性ポリエチレングリコール分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を通して実施しうる。アシル化反応については、選択するポリマーは１個の反応性エステル基を持たねばならない。還元的アルキル化については、選択するポリマーは１個の反応性アルデヒド基を持つべきである。反応性アルデヒドは、例えば水に安定なポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、又はそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシ又はアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号参照）。
【０１６４】
もう１つの実施形態では、ＡＦＴＩポリペプチドをビオチンに化学結合し、次に複合したビオチン／ＡＦＴＩポリペプチド分子をアビジンに結合して、四価のアビジン／ビオチン／ＡＦＴＩポリペプチド分子を生成する。ＡＦＴＩポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）又はトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合し、生じた複合体を抗ＤＮＰ又は抗ＴＮＰ−ＩｇＭで沈殿させて、１０の原子価を持つデカマー複合体を形成することもできる。
【０１６５】
一般に、本発明のＡＦＴＩポリペプチド誘導体の投与によって軽減又は緩和しうる状態は、ＡＦＴＩポリペプチドに関してここで述べたものを含む。しかし、ここで開示するＡＦＴＩポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子に比べて付加的な活性、高い又は低い生物活性、あるいは長い又は短い半減期のような他の特性を持ちうる。
【０１６６】
化学誘導体のもう１つの形態は脂質化ＡＦＴＩポリペプチドである。そのような分子については、１又はそれ以上の脂質を何らかの手段によって、例えば化学的手段によってＡＦＴＩポリペプチド又は配列番号１のポリペプチド又はその変異体に共有結合することができる。
【０１６７】
遺伝的に構築したヒト以外の動物
さらに、天然ＡＦＴＩポリペプチドをコードする１又はそれ以上の遺伝子が、この遺伝子の発現レベルが有意に低下する又は完全に排除されるように分断された（「ノックアウトされた」）、例えばマウス、ラット、又は他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ウシ、ブタ、又はヒツジのようなヒト以外の動物が本発明の範囲内に含まれる。そのような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に述べられているような手法と方法を用いて作製しうる。
【０１６８】
本発明はさらに、その動物についての天然形態のＡＦＴＩ遺伝子又は異種ＡＦＴＩ遺伝子のいずれかが該動物によって過剰発現され、それによって「トランスジェニック」動物が作製される、マウス、ラット、又は他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、又は他の家畜のようなヒト以外の動物を含む。そのようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号及びＰＣＴ特許願第ＷＯ９４／２８１２２号に述べられているもののような既知の方法を用いて作製しうる。
【０１６９】
本発明はさらに、本発明の１又はそれ以上のＡＦＴＩポリペプチドについてのプロモーターが活性化又は不活性化されて（例えば相同的組換え法を用いて）、１又はそれ以上の天然ＡＦＴＩポリペプチドの発現レベルを変化させるヒト以外の動物を含む。
【０１７０】
これらのヒト以外の動物は薬剤候補物質のスクリーニングに使用しうる。そのようなスクリーニングにおいては、薬剤候補物質の動物への影響を測定することができる。例えば、薬剤候補物質はＡＦＴＩ遺伝子の発現を低下又は上昇させうる。一部の実施形態では、薬剤候補物質に動物を暴露したあと、産生されるＡＦＴＩポリペプチドの量を測定することができる。さらに、一部の実施形態では、薬剤候補物質の動物への実際の影響を検出しうる。例えば、特定遺伝子の過剰発現は疾患又は病的状態をもたらす又はそれらに結びつくと考えられる。そのような場合、薬剤候補物質が該遺伝子の発現を低下させる能力、又は病的状態を予防又は阻害する能力を試験することができる。他の例では、ポリペプチドのフラグメントのような特定代謝産物の産生が疾患又は病的状態をもたらす又はそれらに結びつくと考えられる。そのような場合、薬剤候補物質がそのような代謝産物の産生を低下させる能力、又は病的状態を予防又は阻害する能力を試験することができる。
【０１７１】
マイクロアレイ
ＤＮＡマイクロアレイテクノロジーが本発明に従って利用できることは明白であろう。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラスのような保持体上に位置する核酸の微細で高密度のアレイである。アレイ内の各々の細胞又はエレメントは、そのコグネイトｍＲＮＡについてのハイブリダイゼーションの標的として働く単一種のＤＮＡの多数のコピーを持つ。一部の実施形態では、ＤＮＡマイクロアレイテクノロジーを用いた発現プロファイリングにおいて、最初にｍＲＮＡを細胞又は組織標本から抽出し、次に蛍光標識したｃＤＮＡに酵素的に変換する。この物質をマイクロアレイにハイブリダイズして、結合していないｃＤＮＡを洗浄によって除去する。その後、各々の標的ＤＮＡに特異的に結合した標識ｃＤＮＡの量を測定することによってアレイ上に存在する別々の遺伝子の発現を視覚化する。このようにして、生物学的物質の単一標本から数千の遺伝子の発現が高い流量で平行して定量できる。
【０１７２】
この高流量発現プロファイリングは、次のものを含むがそれらに限定されない、本発明のＡＦＴＩ様分子に関する幅広い適用を持つ：治療のための標的としてのＡＦＴＩ疾患関連遺伝子の同定と有効性確認；ＡＦＴＩ様分子及びその阻害因子の分子毒性学；臨床試験のための代理マーカーの個体群の層別と生成；ならびに高流量スクリーニング（ＨＴＳ）において選択化合物の同定を助けることによるＡＦＴＩ関連小分子薬剤送達の促進。
【０１７３】
選択結合物質
ここで、「選択結合物質」の語は、１又はそれ以上のＡＦＴＩポリペプチドに結合特異性を持つ分子を指す。適当な選択結合物質は、抗体及びその誘導体、ポリペプチド、及び小分子を含むが、これらに限定されない。適当な選択結合物質は当該技術において既知の方法を用いて調製しうる。本発明の例示的なＡＦＴＩポリペプチド選択結合物質はＡＦＴＩポリペプチドの特定の部分に結合することができ、それによってＡＦＴＩレセプタへのポリペプチドの結合を阻害する。
【０１７４】
ＡＦＴＩポリペプチドに結合する抗体及び抗体断片のような選択結合物質は本発明の範囲内である。抗体は、単一特異性ポリクローナルを含むポリクローナル、モノクローナル（ＭＡｂ）、組換え、キメラ、ＣＤＲ移植のようなヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）、ヒト、一本鎖、及び／又は二重特異性、ならびにそれらのフラグメント、変異体又は誘導体でありうる。抗体フラグメントは、ＡＦＴＩポリペプチドのエピトープに結合する抗体の部分を含む。そのようなフラグメントの例は、完全長抗体の酵素的開裂によって精製されるＦａｂ及びＦ（ａｂ’）フラグメントを含む。他の結合フラグメントは、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現のような、組換えＤＮＡ手法によって生成されるものを含む。
【０１７５】
ＡＦＴＩポリペプチドに対するポリクローナル抗体は一般に、ＡＦＴＩポリペプチドとアジュバントの多回皮下又は腹腔内注入により動物（例えばウサギ又はマウス）において産生される。キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン、又はダイズトリプシン阻害因子のような、免疫する種において免疫原性である担体タンパク質にＡＦＴＩポリペプチドを複合することは有用であると考えられる。また、免疫応答を高めるためにミョウバンのような凝集剤が使用される。免疫後、動物から採血し、血清を抗ＡＦＴＩポリペプチド抗体力価に関して検定する。
【０１７６】
ＡＦＴＩポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養において連続する細胞系統による抗体分子の産生を提供する何らかの方法を用いて作製される。モノクローナル抗体を作製するための適当な方法の例は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）のハイブリドーマ法、及びヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、「モノクローナル抗体作製の手法と応用（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、ｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８７）を含む。ＡＦＴＩポリペプチドと反応性のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も本発明によって提供される。
【０１７７】
本発明のモノクローナル抗体は治療薬として使用するために修飾しうる。１つの実施形態は、Ｈ及び／又はＬ鎖の一部が特定種から誘導される又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一又は相同であり、鎖の残りの部分がもう１つ別の種から誘導される又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一又は相同である、「キメラ」抗体である。そのような抗体のフラグメントも、それらが所望する生物活性を示す限り、包含される。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８１：６８５１−６８５５（１９８５）参照。
【０１７８】
もう１つの実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術において既知である。米国特許第５，５８５，０８９号及び５，６９３，７６２号参照。一般に、ヒト化抗体はヒト以外のソースから導入された１又はそれ以上のアミノ酸残基を持つ。ヒト化は、例えば、ヒト抗体の対応する領域をげっ歯類の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部に置き換えることにより、当該技術において記述されている方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４−１５３６（１９８８））を用いて実施できる。
【０１７９】
ＡＦＴＩポリペプチドに結合するヒト抗体も本発明に包含される。内因性免疫グロブリンの産生なしでヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）を使用して、任意に担体に複合したＡＦＴＩ抗原（すなわち少なくとも６個の隣接アミノ酸を持つ）で免疫することによってそのような抗体が産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら、Ｙｅａｒ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏ．，７：３３（１９９３）参照。そのようなテクノロジーは、Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．からのＨｕＭａｂ（商標）テクノロジー及びＡｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．からのＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）テクノロジーを含めて、市販のものが入手できる。１つの方法では、対象動物内の免疫グロブリンのＨ及びＬ鎖をコードする内因性遺伝子座を無効にし、ヒトＨ及びＬ鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノム内に挿入することにより、そのようなトランスジェニック動物を作製する。次に、部分改変された動物、すなわち完全でない改変を有する動物を交雑育種して、所望する免疫系修飾のすべてを有する動物を得る。免疫原を投与したとき、これらのトランスジェニック動物は、これらの抗原に免疫特異的な可変領域を含む、ヒト（例えばマウスではなく）アミノ酸配列を備えた抗体を産生する。ＰＣＴ特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８号及びＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６号参照。さらなる方法が米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５号及びＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７号、及びＥＰ５４６　０７３Ｂ１号及びＥＰ５４６　０７３Ａ１号に述べられている。ヒト抗体はまた、ここで述べるように宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によって又はハイブリドーマ細胞における発現によって作製することもできる。この項で述べるテクノロジーによって作製したヒト抗体を集合的に「完全ヒト抗体」と称する。
【０１８０】
代替的実施形態では、ファージディスプレイライブラリーからヒト抗体を生成することができる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））。これらの方法は、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーのディスプレイと、その後の選択抗原への結合によってファージを選択することを通して免疫選択を模倣する。そのような手法の１つがＰＣＴ特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４号に述べられており、そのようなアプローチを用いた、ＭＰＬ−及びｍｓｋ−レセプタに対して高い親和性を備え、且つ機能的に反発する抗体の単離を記述している。この項で述べる手法によって作製した抗体を「ファージディスプレイ抗体」と称する。
【０１８１】
キメラ、ＣＤＲ移植、及びヒト化抗体は典型的には組換え法によって作製される。抗体をコードする核酸を宿主細胞に導入し、ここで述べる材料と手順を用いて発現させる。好ましい実施形態では、ＣＨＯ細胞のような哺乳類宿主細胞において抗体を作製する。モノクローナル（例えばヒト）抗体はここで述べるような宿主細胞における組換えＤＮＡの発現又はハイブリドーマ細胞における発現によって生成されうる。
【０１８２】
本発明の抗ＡＦＴＩ抗体は、ＡＦＴＩポリペプチドの検出と定量のために、競合結合測定法、直接及び間接サンドイッチ測定法、ならびに免疫沈降法のようないかなる既知の検定法においても使用しうる（Ｓｏｌａ，「モノクローナル抗体：手法マニュアル（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、ｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）参照）。抗体は、使用する検定方法に適した親和性でＡＦＴＩポリペプチドに結合する。
【０１８３】
診断適用のために、一部の実施形態では、抗ＡＦＴＩ抗体を検出可能な成分で標識することができる。検出可能な成分は、直接又は間接的に、検出可能なシグナルを生成することができるものでありうる。例えば、検出可能成分は３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、又は１２５Ｉのような放射性同位元素、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、又はルシフェリンのような蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又は西洋わさびペルオキシダーゼのような酵素でありうる（Ｂａｙｅｒら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８４：１３８−１６３（１９９０））。
【０１８４】
競合結合測定法は、標識標準品（例えばＡＦＴＩポリペプチド、又はその免疫学的に活性な部分）が限られた量の抗ＡＦＴＩ抗体との結合に関して被験試料分析物（ＡＦＴＩポリペプチド）と競合する能力に基づく。被験試料中のＡＦＴＩポリペプチドの量は、抗体に結合する標準品の量に反比例する。結合している標準品の量の測定を容易にするため、典型的には競合の前又はあとに抗体を不溶化するので、抗体に結合している標準品と分析物を、結合しないままの標準品及び分析物から好都合に分離することができる。
【０１８５】
サンドイッチアッセイは典型的には２つの抗体の使用を含み、各々が、検出する及び／又は定量するタンパク質の異なる免疫原性部分、又はエピトープに結合することができる。サンドイッチアッセイでは、典型的には被験試料分析物は保持体に固定した第一抗体に結合され、その後第二抗体が分析物に結合して、不溶性の３つの部分から成る複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号参照。第二抗体自体が検出可能な成分で標識されているか（直接サンドイッチアッセイ）、又は検出可能成分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定することができる（間接サンドイッチアッセイ）。例えば、１つのタイプのサンドイッチアッセイは酵素結合イムノソルベント測定法（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合検出可能成分は酵素である。
【０１８６】
抗ＡＦＴＩ抗体を含めた選択結合物質はまた、インビボでの画像化にも有用である。検出可能成分で標識した抗体を動物に、好ましくは血流中に投与し、宿主における標識抗体の存在と位置を測定する。抗体は、核磁気共鳴、放射線、又は当該技術において既知の他の検出手段によって、動物において検出可能な何らかの成分で標識しうる。
【０１８７】
抗体を含めた本発明の選択結合物質は治療薬として使用しうる。これらの治療薬は一般に、それぞれＡＦＴＩポリペプチドの生物活性の少なくとも１つを高める又は低下させるという意味で、アゴニスト又はアンタゴニストである。１つの実施形態では、本発明のアンタゴニスト抗体は、インビボ又はインビトロで、ＡＦＴＩポリペプチドに特異的に結合することができ、且つＡＦＴＩポリペプチドの機能的活性を阻害する又は排除することができる抗体又はその結合フラグメントである。好ましい実施形態では、選択結合物質、例えばアンタゴニスト抗体は、ＡＦＴＩポリペプチドの機能的活性を少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも８０％阻害する。もう１つの実施形態では、選択結合物質は、ＡＦＴＩ結合パートナー（リガンド又はレセプタ）と相互作用することができ、それによってインビトロ又はインビボでＡＦＴＩ活性を阻害する又は排除することができる抗ＡＦＴＩポリペプチド抗体でありうる。アゴニスト及びアンタゴニスト抗ＡＦＴＩ抗体を含めた選択結合物質は、当該技術において既知のスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１８８】
本発明はまた、ＡＦＴＩ選択結合物質（抗体のような）及び生物学的試料においてＡＦＴＩポリペプチドレベルを検出するために有用な他の試薬を含むキットに関する。そのような試薬は、検出可能な標識、遮断血清、陽性及び陰性対照試料、ならびに検出試薬を含みうる。
【０１８９】
本発明のＡＦＴＩポリペプチドは、発現クローニング戦略を用いてＡＦＴＩレセプタをクローン化するために使用できる。放射標識（１２５−ヨウ素）ＡＦＴＩポリペプチド又は親和性／活性標識ＡＦＴＩポリペプチド（Ｆｃ融合又はアルカリホスファターゼ融合のような）を結合アッセイで使用して、ＡＦＴＩレセプタを発現する細胞型又は細胞系統又は組織を同定することができる。そのような細胞又は組織から単離したＲＮＡをｃＤＮＡに変換して、哺乳類発現ベクターにクローン化し、哺乳類細胞（ＣＯＳ又は２９３細胞のような）にトランスフェクションして発現ライブラリーを作製することができる。次に放射標識又はラベルＡＦＴＩポリペプチドを親和性リガンドとして使用して、その表面上にＡＦＴＩレセプタを発現する細胞のサブセットをこのライブラリーから同定し、単離することができる。その後これらの細胞からＤＮＡを単離し、哺乳類細胞にトランスフェクションして、ＡＦＴＩレセプタを発現する細胞の分画が元のライブラリーにおけるよりも何倍も高い二次発現ライブラリーを作製することができる。ＡＦＴＩレセプタを含む単一組換えクローンが単離されるまで、この濃縮プロセスを繰り返し反復することができる。ＡＦＴＩレセプタの単離は、ＡＦＴＩポリペプチドシグナル伝達経路の新規アゴニスト及びアンタゴニストを同定する又は開発するために有用である。そのようなアゴニスト及びアンタゴニストは、ＡＦＴＩレセプタ、抗ＡＦＴＩレセプタ抗体、小分子、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、それらはここで述べるものを含めた１又はそれ以上の疾患又は障害を治療する、予防する、又は診断するために使用しうる。
【０１９０】
ＡＦＴＩポリペプチド活性の他の調節因子の測定法
一部の状況では、ＡＦＴＩポリペプチドの活性のモジュレーター、すなわちアゴニスト又はアンタゴニストである分子を同定することが望ましいと考えられる。ＡＦＴＩポリペプチドを調節する天然又は合成分子は、ここで述べるもののような１又はそれ以上のスクリーニングアッセイを使用して同定しうる。そのような分子はエクスビボで、あるいは注入又は経口送達、移植装置、等によってインビボで投与することができる。
【０１９１】
「被験分子」は、ＡＦＴＩポリペプチドの活性を調節する（すなわち高める又は低下させる）能力に関して評価されている分子を指す。最も一般的には、被験分子はＡＦＴＩポリペプチドと直接相互作用する。しかし、被験分子はまた、ＡＦＴＩ遺伝子の発現に影響を及ぼすことによる、又はＡＦＴＩの結合パートナー（例えばレセプタ又はリガンド）に結合することによるような、ＡＦＴＩポリペプチド活性を間接的に調節しうることも考慮されるであろう。１つの実施形態では、被験分子は少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは約１０−８Ｍ、より好ましくは約１０−９Ｍ、さらに一層好ましくは約１０−１０Ｍの一定な親和性でＡＦＴＩポリペプチドに結合する。
【０１９２】
ＡＦＴＩポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は本発明に包含される。一部の実施形態では、被験分子とＡＦＴＩポリペプチドの相互作用を可能にする条件下でＡＦＴＩポリペプチドを被験分子と共にインキュベートし、相互作用の度合を測定することができる。被験分子は実質的に精製された形態で又は粗混合物としてスクリーニングすることができる。
【０１９３】
一部の実施形態では、ＡＦＴＩポリペプチドアゴニスト又はアンタゴニストは、ＡＦＴＩポリペプチドと相互作用してその活性を調節するタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、又は低分子量分子でありうる。ＡＦＴＩポリペプチドの発現を調節する分子は、ＡＦＴＩポリペプチドをコードする核酸に相補的であるか、又はＡＦＴＩポリペプチドの発現を指令する又は制御する核酸に相補的であって、発現のアンチセンス調節因子として働く核酸を含む。
【０１９４】
ひとたび一組の被験分子がＡＦＴＩポリペプチドと相互作用することが同定されれば、ＡＦＴＩポリペプチドの活性を高める又は低下させる能力に関して分子をさらに評価することができる。ＡＦＴＩポリペプチドと被験分子の相互作用の測定は、細胞ベースの結合測定法、膜結合測定法、溶液相測定法及び免疫測定法を含めて、いくつかの様式で実施しうる。一般に、被験分子を一定の期間ＡＦＴＩポリペプチドと共にインキュベートし、生物活性を測定するための１又はそれ以上のアッセイによってＡＦＴＩポリペプチド活性を測定する。
【０１９５】
被験分子とＡＦＴＩポリペプチドの相互作用はまた、免疫測定法においてポリクローナル又はモノクローナル抗体を使用して直接測定することもできる。その代わりに、ここで述べるようなエピトープ標識を含む修飾形態のＡＦＴＩポリペプチドを免疫測定法で使用してもよい。
【０１９６】
ＡＦＴＩポリペプチドが結合パートナー（例えばレセプタ又はリガンド）との相互作用を通して生物活性を表示する場合、対応する結合パートナー（選択結合物質、レセプタ、又はリガンドのような）へのＡＦＴＩポリペプチドの結合を測定するために様々なインビトロアッセイが使用できる。これらのアッセイは、結合パートナーへのＡＦＴＩポリペプチドの結合の速度及び／又は度合を高める又は低下させる能力に関して被験分子をスクリーニングするために使用しうる。１つのアッセイでは、ＡＦＴＩポリペプチドをマイクロタイタープレートのウエルに固定する。次に放射標識ＡＦＴＩポリペプチド結合パートナー（例えばヨウ素化ＡＦＴＩ結合パートナー）と被験分子を一度に１つずつ（いずれかの順序で）又は同時にウエルに加える。インキュベーション後、ウエルを洗浄し、シンチレーションカウンターを使用して放射能を測定して、結合パートナーがＡＦＴＩポリペプチドに結合している度合を決定することができる。典型的には、一定範囲の濃度にわたって分子を試験し、結果の評価の正確さのために被験アッセイの１又はそれ以上の要素を欠く一連の対照ウエルを使用することができる。この方法の代替法は、タンパク質の「位置」を逆にする、すなわちＡＦＴＩ結合パートナーをマイクロタイタープレートのウエルに固定し、被験分子と放射標識ＡＦＴＩポリペプチドをインキュベートして、ＡＦＴＩポリペプチドの結合の度合を測定することを含む。例えば、「分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、第１８章、Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９５）参照。
【０１９７】
放射標識に代わるものとして、ＡＦＴＩポリペプチド又はその結合パートナーをビオチンに複合し、その後比色定量によって検出できる西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）のような酵素に連結したストレプトアビジンを用いて、又はストレプトアビジンの蛍光標識によって、ビオチニル化タンパク質の存在を検出することができる。ビオチンに複合した、ＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩ結合パートナーに対する抗体も使用でき、ＡＰ又はＨＲＰに連結した酵素結合ストレプトアビジンとのインキュベーション後に検出することができる。
【０１９８】
ＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩ結合パートナーはまた、アガロースビーズ、アクリルビーズ又は他の種類のそのような不活性固相基質に結合することによって固定できる。基質−タンパク質複合体を、相補的タンパク質と被験化合物を含む溶液中に入れる。インキュベーション後、ビーズを遠心分離によって沈殿させ、ＡＦＴＩポリペプチドとその結合パートナー間の結合の量をここで述べる方法によって評価することができる。その代わりに、基質−タンパク質複合体をカラムに固定し、被験分子と相補的タンパク質をカラムに通す。その後ＡＦＴＩポリペプチドとその結合パートナー間の複合体の形成をここで述べる手法のいずれか、すなわち放射標識、抗体結合、等を用いて評価することができる。
【０１９９】
ＡＦＴＩ結合タンパク質とＡＦＴＩ結合パートナー間の複合体の形成を上昇させる又は低下させる被験分子を同定するために有用なもう１つのインビトロアッセイは、ビアコアアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）のような表面プラズモン共鳴検出システムである。ビアコアシステム（ＢＩＡ　ｃｏｒｅ　ｓｙｓｔｅｍ）は製造者のプロトコールに従って実施しうる。このアッセイは基本的に、検出器内に位置するデキストラン被覆センサーチップへのＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩ結合パートナーの共有結合を含む。被験化合物と他の相補的タンパク質をセンサーチップの入ったチェンバー内に同時に又は連続的に注入する。結合する相補的タンパク質の量を、センサーチップのデキストラン被覆側に物理的に関連する分子量の変化に基づいて評価することができる；分子量の変化は検出システムによって測定することができる。
【０２００】
一部の場合、２又はそれ以上の被験化合物を、ＡＦＴＩポリペプチドとＡＦＴＩ結合パートナー間の複合体の形成を上昇させる又は低下させる能力に関して一緒に評価することが望ましいと考えられる。これらの場合、そのような付加被験化合物を最初の被験化合物と同時に、又は最初の被験化合物に続いて加えることにより、ここで述べるアッセイを容易に修正することができる。本アッセイの工程の残りをここで述べる。
【０２０１】
ここで述べるようなインビトロアッセイは、ＡＦＴＩポリペプチドとＡＦＴＩ結合パートナーによる複合体形成への作用に関して多数の化合物をスクリーニングするために好都合に使用しうる。アッセイは、ファージディスプレイによって生成された化合物、合成ペプチド、及び化学合成ライブラリーをスクリーニングするために自動化することができる。
【０２０２】
ＡＦＴＩポリペプチドとＡＦＴＩ結合パートナー間の複合体の形成を上昇させる又は低下させる化合物はまた、ＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩ結合パートナーのいずれかを発現する細胞と細胞系を使用して、細胞培養においてスクリーニングすることもできる。細胞及び細胞系はいかなる哺乳類からも入手しうるが、好ましくはヒト又は霊長類、イヌ、又はげっ歯類由来のものである。表面にＡＦＴＩ結合パートナーを発現する細胞へのＡＦＴＩポリペプチドの結合を被験分子の存在下又は不在下で評価し、例えばＡＦＴＩ結合パートナーに対するビオチニル化抗体を使用したフローサイトメトリーによって、結合の度合を測定することができる。細胞培養アッセイは、ここで述べるタンパク質結合アッセイにおいて陽性と認められた化合物をさらに評価するために好適に使用することができる。
【０２０３】
細胞培養はまた、薬剤候補物質の影響をスクリーニングするためにも使用できる。例えば、薬剤候補物質はＡＦＴＩ遺伝子の発現を低下又は上昇させうる。一部の実施形態では、細胞培養を薬剤候補物質に暴露した後、産生されるＡＦＴＩポリペプチドの量を測定する。一部の実施形態では、細胞培養への薬剤候補物質の実際の影響を検出することができる。例えば、特定遺伝子の過剰発現は細胞培養に特定の影響を及ぼすと考えられる。そのような場合、薬剤候補物質の遺伝子発現上昇能又は低下能、あるいは細胞培養への特定の影響を予防する又は阻害する能力を試験することができる。他の例では、ポリペプチドのフラグメントのような特定代謝産物の産生は疾患又は病的状態をもたらす、又はそれらに結びつくと考えられる。そのような場合、候補薬剤が細胞培養においてそのような代謝産物の産生を低下させる能力を試験することができる。
【０２０４】
インターナリゼーションタンパク質
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶからの）を使用して、タンパク質を細胞内にインターナリゼーションすることができる。Ｆａｌｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：６６４−６６８（１９９４）参照。例えば、ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質の１１個のアミノ酸配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）（「タンパク質形質導入ドメイン」又はＴＡＴ　ＰＤＴと称する）は、細胞質膜及び細胞の核膜を越えた送達を媒介すると記述されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１５６９−１５７２（１９９９）；及びＮａｇａｈａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４：１４４９−１４５２（１９９８）参照。これらの手順においては、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって観察したとき細胞に結合するＦＩＴＣ−構築物（ＦＩＴＣ−ＧＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）を調製する。これらの構築物はｉ．ｐ．投与後組織に侵入する。次に、ｔａｔ−ｂｇａｌ融合タンパク質を構築する。この構築物で処理した細胞はｂ−ｇａｌ活性を示した。注入後、これらの手順を用いて肝、腎、肺、心臓、及び脳組織を含めた多くの組織が発現を示すことが認められた。これらの構築物は細胞に入り込むためにある程度変性を受けたと考えられる；そのために、細胞に入った後リフォールディングが必要であると考えられる。
【０２０５】
従って、所望するタンパク質又はポリペプチドを細胞にインターナリゼーションするためにｔａｔタンパク質配列を使用しうることは理解されるであろう。例えば、ｔａｔタンパク質配列を使用して、ＡＦＴＩアンタゴニスト（抗ＡＦＴＩ選択結合物質、小分子、可溶性レセプタ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドなど）を細胞内に投与して、ＡＦＴＩ分子の活性を阻害することができる。ここで使用するとき、「ＡＦＴＩ分子」の語は、ここで定義されるようなＡＦＴＩ核酸分子とＡＦＴＩポリペプチドの両方を指す。所望する場合には、ＡＦＴＩタンパク質自体もこれらの手法を用いて細胞に内在的に投与しうる。Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｅ．，「体細胞へのタンパク質の導入（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　Ｂｏｄｙ’ｓ　Ｃｅｌｌｓ）」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１４６６−１４６７（１９９９）も参照のこと。
【０２０６】
ＡＦＴＩポリペプチドを用いた細胞ソースの同定
本発明の一部の実施形態に従えば、ＡＦＴＩポリペプチドに関連する特定細胞型のソースを決定することは有用であると考えられる。例えば、適切な治療を選択する助けとして、疾患又は病的状態の由来を決定することは有用であろう。一部の実施形態では、ＡＦＴＩポリペプチドをコードする核酸をプローブとして使用して、細胞の核酸をそのようなプローブでスクリーニングすることにより、ＡＦＴＩポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する又は含む細胞を同定することができる。他の実施形態では、細胞におけるＡＦＴＩポリペプチドの存在を調べる、従ってそのような細胞がＡＦＴＩポリペプチドを発現するかどうか、又はそれらがＡＦＴＩポリペプチドを発現することが知られている細胞に由来するかどうかを決定するために、抗ＡＦＴＩポリペプチド抗体を使用しうる。　【０２０７】
治療用途
本発明のポリペプチド及び核酸で治療できる、診断できる、改善できる、又は予防できる急性及び慢性疾患の非排他的なリストは、ＩＬ−１及び／又はＴＮＦ活性の阻害によって治療しうる疾患を含む。
【０２０８】
ＩＬ−１の阻害
これまでに発見された最も強力な炎症性サイトカインの１つはインターロイキン−１（ＩＬ−１）である。ＩＬ−１は多くの疾患や医学的状態において鍵となるメディエイターであると思われる。ＩＬ−１はマクロファージ／単球直系の細胞によって（独占的にではないが）製造され、２つの形態で産生されると考えられる：ＩＬ−１アルファ（ＩＬ−１α及びＩＬ−１ベータ（ＩＬ−１β）。
【０２０９】
自発的又は実験的疾患又は医学的状態が体液中又は組織中のＩＬ−１の高いレベルに結びつく場合、又は身体から採取した細胞又は組織が培養中でＩＬ−１の高いレベルを生じる場合、疾患又は医学的状態は「インターロイキン−１媒介疾患」であるとみなされる。多くの場合、そのようなインターロイキン−１媒介疾患はまた、次の付加的な２つの条件によっても認識される：（１）疾患又は医学的状態に関連する病理学的所見がＩＬ−１の投与又はＩＬ−１の発現の上方調節により動物において実験的に模倣できる；（２）疾患又は医学的状態の実験動物モデルにおいて誘導される病理が、ＩＬ−１の作用を阻害する物質での治療によって阻害又は排除することができる。大部分のインターロイキン−１媒介疾患では３つの条件のうち少なくとも２つに合致し、多くのインターロイキン−１媒介疾患では３つの条件すべてに合致する。
【０２１０】
急性及び慢性インターロイキン−１（ＩＬ−１）媒介疾患の非排他的なリストは次のものを含むが、これらに限定されない：急性膵炎；
ＡＬＳ；
アルツハイマー病、
ＡＩＤＳ誘発の悪液質を含めた悪液質／食欲不振；
喘息及び他の肺疾患；アテローム性動脈硬化症；
自己免疫性血管炎；
慢性疲労症候群；
クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）関連の下痢を含めたクロストリジウム関連疾病；
うっ血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全（例えば敗血症に関連する）、及び冠状動脈バイパス移植を含めた、冠状動脈の状態及び適応症；
多発性骨髄腫及び骨髄性（例えばＡＭＬ及びＣＭＬ）その他の白血病のような癌、ならびに腫瘍転移；
糖尿病（例えばインスリン性糖尿病）；
子宮内膜症；
熱；
線維筋痛；
糸球体腎炎；
移植片対宿主病／移植拒絶反応；
出血性ショック；
痛覚過敏；
炎症性腸疾患；
変形性関節症、乾癬性関節炎及び慢性関節リウマチ（ＲＡ）を含めた関節の炎症状態；
例えば角膜移植に関連すると考えられる炎症性眼疾患；
脳虚血（例えば、各々が神経変性を導く可能性がある、外傷、てんかん、出血又は発作の結果としての脳損傷）を含めた虚血；
川崎病；
学習障害；
肺疾患（例えばＡＲＤＳ）；
多発性硬化症；
ミオパシー（例えば、特に敗血症における筋タンパク質代謝）；
神経毒性（例えばＨＩＶによって誘発されるような）；
骨粗しょう症；
癌に関連する疼痛を含めた痛み；
パーキンソン病；
歯周病；
早産；
乾癬；
再灌流損傷；
敗血症性ショック；
放射線療法からの副作用；
側頭下顎関節疾患；
睡眠障害；
ブドウ膜炎；
又は挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染又は他の疾患プロセスから生じる炎症状態。
【０２１１】
ＴＮＦ−αの阻害
多くの疾患や医学的状態がＴＮＦによって媒介され、通常は炎症性状態として分類される。「ＴＮＦ媒介疾患」は、体液中のＴＮＦの高いレベルに関連する自発的又は実験的疾患又は医学的状態である。多くの場合、そのようなＴＮＦ媒介疾患はまた、次の事柄によって特徴付けられる：（１）疾患又は医学的状態に関連する病理学的所見がＴＮＦの投与又は発現の上方調節により動物において実験的に模倣できる；（２）実験動物モデルにおいて疾病を誘発したとき、疾患又は医学的状態がＴＮＦの作用を阻害する物質での治療によって阻害又は排除されうる。
【０２１２】
急性及び慢性ＴＮＦ媒介疾患の非排他的なリストは次のものを含むが、これらに限定されない：
悪液質／食欲不振；
癌（例えば白血病）；
慢性疲労症候群；
うっ血性心不全、冠状動脈再狭窄、心筋梗塞、心筋機能不全（例えば敗血症に関連する）、及び冠状動脈バイパス移植を含めた、冠状動脈の状態及び適応症；
うつ病；
若年発症１型糖尿病及びインスリン抵抗性（例えば肥満に関連する）を含めた糖尿病；
子宮内膜症、子宮内膜炎、及び関連状態；
線維筋痛又は痛覚消失；
移植片対宿主拒絶反応；
痛覚過敏；
クローン病及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ関連の下痢を含めた炎症性腸疾患；
脳虚血（各々が神経変性を導く可能性がある、外傷、てんかん、出血又は発作の結果としての脳損傷）を含めた虚血；
肺疾患（例えば成人呼吸促進症候群、喘息、及び肺線維症）；
多発性硬化症；
神経炎症性疾患；
角膜移植、眼変性及びブドウ膜炎を含めた眼疾患及び状態；
眼に関連する疼痛を含めた痛み；
膵炎；
歯周病；
毛孔性紅色ひこう疹（ＰＲＰ）；
前立腺炎（細菌性又は非細菌性）及び関連状態；
乾癬及び関連状態；
肺線維症；
再灌流損傷；
慢性関節リウマチ、変形性関節症、若年性関節炎（関節リウマチ）、セロネガティブ多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群及び反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、腸疾患に基づく関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、血管炎（例えば川崎病）、脳脈管炎、ライム病、ブドウ球菌誘発性（敗血症性）関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎及びリウマチ性多発性筋痛及び巨細胞動脈炎を含めたリウマチ病；
敗血症性ショック；
放射線療法からの副作用；
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；
側頭下顎関節疾患；
甲状腺炎；
組織移植又は挫傷、捻挫、軟骨損傷、外傷、整形外科手術、感染（例えばＨＩＶ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ及び関連種）又は他の疾患プロセスから生じる炎症状態。
【０２１３】
ＡＦＴＩの阻害因子（例えば抗ＡＦＴＩ抗体）は、患者がＴＮＦ及び／又はＩＬ−１の上方調節から恩恵を受けるであろう治療適用において有用であると考えられる。そのような疾患及び適応症は、癌、移植片対宿主病を含むが、これらに限定されない。
【０２１４】
ＡＦＴＩ組成物及び投与
治療組成物は本発明の範囲内である。そのようなＡＦＴＩ製薬組成物は、投与様式との適合性によって選択される製薬上又は生理的に許容される製剤物質と混合して、治療上有効な量のＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩ核酸分子を含みうる。製薬組成物は、投与様式との適合性によって選択される製薬上又は生理的に許容される製剤物質と混合して、治療上有効な量の１又はそれ以上のＡＦＴＩ選択結合物質を含みうる。
許容される製剤物質は、好ましくは使用される用量及び濃度でレシピエントに対して無毒性である。
【０２１５】
製薬組成物は、例えば組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、等張性、におい、無菌性、安定性、溶解又は放出速度、吸着又は浸透を変化させる、維持する又は保存するための製剤物質を含みうる。適当な製剤物質は、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンなど）、抗菌剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸など）、充填剤（マンニトール又はグリシンなど）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）、増量剤、単糖類、ニ糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、又はデキストリンなど）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）、着色料、着香料及び希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）、沈殿防止剤、界面活性剤又は湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０のようなポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパルなど）、安定化促進剤（スクロース又はソルビトール）、張度増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは塩化ナトリウム又はカリウム）、マンニトール、ソルビトールなど）、送達賦形剤、希釈剤、賦形剤及び／又は製薬佐剤（「レミントンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編集、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］）を含むが、これらに限定されない。
【０２１６】
至適製薬組成物は、例えば意図する投与経路、送達形式、及び所望する用量に依存して当業者によって決定される。例えば、「レミントンの製薬科学」、前出参照。そのような組成物は、ＡＦＴＩ分子の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度、及びインビボでのクリアランス速度に影響を及ぼしうる。
【０２１７】
製薬組成物における主要賦形剤又は担体は、本来水性又は非水性のいずれかでありうる。例えば、適当な賦形剤又は担体は、おそらく非経口投与組成物において一般的な他の物質を補足した、注射用蒸留水、生理食塩水、又は人工脳脊髄液でありうる。中性緩衝食塩水又は血清アルブミンと混合した食塩水はさらなる例示的賦形剤である。他の例示的製薬組成物は、ソルビトール又はその適当な代用物をさらに含みうる、約ｐＨ７．０から８．５のトリス緩衝液、又は約ｐＨ４．０から５．５の酢酸緩衝液を含む。本発明の１つの実施形態では、ＡＦＴＩポリペプチド組成物は、所望する純度を備えた選択組成物を至適製剤物質（「レミントンの製薬科学」、前出）と混合することにより、凍結乾燥ケーク又は水溶液の形態で保存用に調製することができる。さらに、ＡＦＴＩポリペプチド製品はスクロースのような適切な賦形剤を用いて凍結乾燥品として製剤しうる。
【０２１８】
ＡＦＴＩ製薬組成物は非経口送達用に選択することができる。代替的には、吸入用又は経口のような消化管を通しての送達用に選択することもできる。そのような製薬上許容される組成物の調製は当該技術の範囲内である。
【０２１９】
製剤成分は投与部位に許容される濃度で存在する。例えば、緩衝液は組成物を生理的ｐＨ又はわずかに低いｐＨ、典型的には約５から約８のｐＨ範囲内に維持するために使用される。
【０２２０】
非経口投与を考慮するときには、本発明で使用するための治療組成物は、所望するＡＦＴＩ分子を製薬上許容される賦形剤中に含む、発熱物質不含の非経口的に許容される水溶液の形態をとりうる。非経口注入に特に適する賦形剤は、ＡＦＴＩ分子が無菌等張液として製剤され、適切に保存される無菌蒸留水である。さらにもう１つの製剤は、その後蓄積注射として送達されうる製品の制御又は持続放出を提供する、注射用ミクロスフェア、生物食用粒子、高分子化合物（ポリアクチン酸、ポリグリコール酸）、又はビーズ、又はリポソームのような物質と所望する分子との製剤を含みうる。ヒアルロン酸も使用でき、これは循環中に存在する期間を延長する作用を持つと考えられる。所望する分子の導入のための他の適当な手段は、移植可能な薬剤送達装置を含む。
【０２２１】
１つの実施形態では、製薬組成物は吸入用に製剤することができる。例えば、ＡＦＴＩ分子は吸入用乾燥粉末として製剤しうる。ＡＦＴＩポリペプチド又はＡＦＴＩ核酸分子の吸入溶液も、エーロゾル送達のための推進薬と共に製剤しうる。さらにもう１つの実施形態では、溶液を噴霧することができる。肺投与はさらに、化学修飾したタンパク質の肺送達を述べたＰＣＴ特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号に詳述されている。
【０２２２】
また、一部の製剤は経口的に投与しうると想定される。本発明の１つの実施形態では、そのように投与されるＡＦＴＩ分子は、錠剤及びカプセルのような固形投与形態の配合剤において慣例的に使用される担体と共に又は担体なしで製剤することができる。例えば、バイオアベイラビリティーを最大化し、プレシステミック分解を最小限に抑えるときには、製剤の活性部分を胃腸管内の部位で放出するようにカプセルを設計することができる。ＡＦＴＩ分子の吸収を促進するために付加的なアゴニストを含めることができる。希釈剤、着香剤、低融点のろう、植物油、潤滑剤、沈殿防止剤、錠剤崩壊剤、及び結合剤も使用しうる。
【０２２３】
もう１つの製薬組成物は、錠剤の製造に適した無毒性賦形剤との混合物中に有効量のＡＦＴＩ分子を含みうる。錠剤を滅菌水又は他の適切な賦形剤に溶解することにより、溶液を単位投与形態として調製することができる。適当な賦形剤は、炭酸カルシウム、炭酸又は重炭酸ナトリウム、ラクトース、又はリン酸カルシウムのような不活性希釈剤；あるいはデンプン、ゼラチン、又はアカシアのような結合剤；あるいはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、又は滑石のような潤滑剤を含むが、これらに限定されない。
【０２２４】
さらなるＡＦＴＩ製薬組成物は、持続又は制御送達製剤中にＡＦＴＩポリペプチドを含有する製剤を含めて、当業者には明らかであろう。リポソーム担体、生物食用微粒子又は多孔性ビーズ及び蓄積注射のような様々な他の持続又は制御送達手段を製剤するための手法も当業者には既知である。例えば、製薬組成物の送達のための多孔性高分子微粒子の制御放出を述べているＰＣＴ特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号参照。持続放出性製剤のさらなる例は、成形品、例えば薄膜、又はマイクロカプセルの形態の半透性高分子基質を含む。持続放出性基質は、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号及びＥＰ第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）及びＬｎａｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、前出）又はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ第１３３，９８８号）を含みうる。持続放出性組成物はまた、当該技術において既知のいくつかの方法のいずれかによって調製できるリポソームを含みうる。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８−３６９２（１９８５）；ＥＰ第３６，６７６号；ＥＰ第８８，０４６号；ＥＰ第１４３，９４９号参照。
【０２２５】
インビボ投与に使用するＡＦＴＩ製薬組成物は典型的には無菌でなければならない。これは無菌ろ過膜を通してろ過することによって達成しうる。組成物を凍結乾燥する場合には、これらの方法を用いた滅菌は凍結乾燥及び還元の前又は後のいずれかに実施しうる。非経口投与用組成物は凍結乾燥形態又は溶液として保存することができる。さらに、非経口用組成物は一般に、無菌アクセスポートを持つ容器、例えば皮下注射針によって貫通しうる栓を備えた静脈内溶液バッグ又はバイアルに納められる。
【０２２６】
ひとたび製薬組成物が製剤されれば、溶液、懸濁液、ゲル、乳剤、固体、あるいは脱水又は凍結乾燥粉末として無菌バイアル中で保存できる。そのような製剤は、即時使用形態又は投与前に還元を必要とする形態（例えば凍結乾燥）のいずれかで保存しうる。
【０２２７】
特定実施形態では、本発明は単回投与単位を生成するためのキットを対象とする。キットは各々、乾燥タンパク質が入った第一容器と水性製剤が入った第二容器を含みうる。単一又は多チェンバー予備充填注射器（例えば液体注射器及びリオシリンジ）を含むキットも本発明の範囲内に包含される。
【０２２８】
治療的に使用されるＡＦＴＩ製薬組成物の有効量は、例えば治療の背景と目的に依存するであろう。当業者は、それ故治療のための適切な用量レベルが、一部には、送達される分子、ＡＦＴＩ分子が使用される適応症、投与経路、及び患者のサイズ（体重、体表面積又は器官のサイズ）と状態（年齢及び全身の健康状態）に依存して変化することを認識するであろう。従って、臨床医は最大の治療効果を得るために用量を調節し、投与経路を変更することができる。典型的な用量は、上述した因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで又はそれ以上の範囲をとりうる。他の実施形態では、用量は０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；又は１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで；又は５μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲をとりうる。
【０２２９】
投与頻度は、使用する製剤中のＡＦＴＩ分子の薬物動態パラメータに依存する。典型的には、臨床医は所望する効果を達成する用量に達するまで組成物を投与する。組成物は、それ故、単回用量として、あるいは経時的に投与される２回又はそれ以上の用量（同じ量の所望する分子を含む又は含まない）として、あるいは移植装置又はカテーテルを通しての持続注入として投与しうる。適切な用量のさらなる改善が当業者によって常套的に行われており、当業者が常套的に実施する作業の範囲内である。適切な用量は、適切な用量−反応データの使用を通して確認できる。
【０２３０】
製薬組成物の投与経路は既知の方法、例えば経口、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、又は病巣内経路による注入、あるいは持続放出システム又は移植装置に一致する。所望する場合には、ボーラス注射によって又は注入によって持続的に、又は移植装置によって組成物を投与することができる。
【０２３１】
代替的又は付加的に、組成物は、所望する分子が吸収された又は被包された膜、スポンジ、又は他の適切な材料の移植を通して局所投与しうる。移植装置を使用する場合には、適当な組織又は器官内に装置を移植し、拡散、時間指定放出ボーラス（ｔｉｍｅｄ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｂｏｌｕｓ）、又は持続的投与によって所望する分子の送達が達成されうる。
【０２３２】
一部の場合には、エクスビボでＡＦＴＩ製薬組成物を使用することが望ましいと考えられる。そのような場合には、患者から切除した細胞、組織、又は器官をＡＦＴＩ製薬組成物に接触させ、その後細胞、組織及び／又は器官を患者の体内に移植して戻す。
また一部の場合には、ここで述べるような方法を使用して、遺伝的に構築した特定細胞を移植することによってＡＦＴＩポリペプチドを送達することができる。そのような細胞は動物又はヒト細胞であってもよく、また自己由来、異種、又は外因性でありうる。場合によっては、細胞を不朽化してもよい。免疫応答の可能性を低下させるため、周辺組織への浸潤を避けるように細胞を被包することができる。被包材料は、典型的には、タンパク質産物の放出を許容するが、患者の免疫系による又は周辺組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防ぐ、生体適合性の半透性高分子封入物（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅｓ）又は膜である。
【０２３３】
単離細胞個体群（Ｔ細胞など）を１又はそれ以上のＡＦＴＩポリペプチドで治療することは望ましいと考えられる。これは、ポリペプチドが細胞膜透過性の形態である場合には、直接単離細胞をポリペプチドに暴露することによって実施できる。
【０２３４】
本発明のさらなる実施形態は、治療用ポリペプチドのインビトロ生成のため、及び遺伝子治療又は細胞治療による治療用ポリペプチドの生成と送達のための細胞及び方法（例えば相同的組換え及び／又は他の組換え生産法）に関する。相同的及び他の組換え法を使用して、通常は転写サイレントのＡＦＴＩ遺伝子、又は過小発現遺伝子を含む細胞を修飾し、それによって治療上有効な量のＡＦＴＩポリペプチドを発現する細胞を産生することができる。
【０２３５】
相同的組換えはもともと、転写活性遺伝子における突然変異を誘発する又は矯正する遺伝子を標的するために開発された手法である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，Ｐｒｏｇ．ｉｎ　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．＆　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、３６：３０１、１９８９）。基礎手法は、特定の突然変異を哺乳類ゲノムの特定領域に導入するため（Ｔｈｏｍａｓら、Ｃｅｌｌ，４４：４１９−４２８，１９８６；ＴｈｏｍａｓとＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３−５１２，１９８７；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：８５８３−８５８７，１９８８）あるいは欠陥遺伝子内の特定突然変異を矯正するため（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６−５７８，１９８７）の方法として開発された。例示的な相同的組換え手法は米国特許第５，２７２，０７１号（ＥＰ第９１９３０５１号、ＥＰ公開第５０５５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２号、国際特許公開第ＷＯ９１／０９９５５号）に述べられている。
【０２３６】
相同的組換えを通して、ゲノム内に挿入するＤＮＡ配列は、標的ＤＮＡに結合することによって対象とする遺伝子の特定領域に指令することができる。標的ＤＮＡはゲノムＤＮＡの領域の相補的な（相同な）ヌクレオチド配列である。ゲノムの特定領域に相補的な標的ＤＮＡの小さな部分をＤＮＡ複製過程の間に親の鎖に接触させる。共有する相同領域を通して内因性ＤＮＡの他の部分とハイブリダイズし、それ故組み換わることは、細胞内に挿入されたＤＮＡの一般的特性である。この相補鎖が、突然変異又は異なる配列を含むオリゴヌクレオチドあるいは付加的なヌクレオチドに結合した場合、それもやはり組換えの結果として新たに合成された鎖に組み込まれる。校正機能の結果として、ＤＮＡの新しい配列は鋳型として働くことができる。従って、移入されたＤＮＡがゲノム内に組み込まれる。
【０２３７】
標的ＤＮＡのこれらの断片に結合するのは、ＡＦＴＩポリペプチドと相互作用しうる又はＡＦＴＩポリペプチドの発現を制御しうるＤＮＡの領域、例えばフランキング配列である。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサー、又は外因性転写調節エレメントを、所望するＡＦＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に影響を及ぼすのに十分な近接度と方向性で、意図する宿主細胞のゲノム内に挿入する。制御エレメントは、宿主細胞ゲノム内に存在するＤＮＡの部分を制御する。それ故、所望するＡＦＴＩポリペプチドの発現は、ＡＦＴＩ遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、内因性遺伝子配列にＡＦＴＩポリペプチドの転写のための認識可能なシグナルを与えるＤＮＡ調節セグメントと結合した標的ＤＮＡ（対象とする内因性遺伝子と相同性を持つ領域を含む）の使用によって達成されると考えられる。
【０２３８】
例示的な方法では、細胞における所望標的遺伝子（すなわち所望する内因性細胞遺伝子）の発現は、少なくとも調節配列、エクソン及びスプライス供与部位を含むＤＮＡの導入による、あらかじめ選択した部位での細胞ゲノム内への相同的組換えを通して変化する。これらの成分は、これが実際に、新しい転写単位（ＤＮＡ構築物中に存在する調節配列、エクソン及びスプライス供与部位が内因性遺伝子に作動可能に連結されている）の生成をもたらすように染色体（ゲノム）ＤＮＡに導入される。染色体ＤＮＡへのこれらの成分の導入の結果として、所望する内因性遺伝子の発現が変化する。
【０２３９】
ここで述べるような変化した遺伝子発現は、得られる細胞において通常はサイレントである（発現されない）遺伝子を活性化すること（又は発現を生じさせること）、ならびに得られる細胞中で生理的に有意のレベルでは発現されない遺伝子の発現を上昇させることを包含する。かかる実施形態は、得られる細胞において起こる調節又は誘導のパターンとは異なるように調節又は誘導のパターンを変化させること、及び得られる細胞において発現される遺伝子の発現を低下させること（排除することを含む）をさらに包含する。
【０２４０】
相同的組換えを使用して細胞の内因性ＡＦＴＩ遺伝子からのＡＦＴＩポリペプチド産生を生じさせる又は上昇させることができる１つの方法は、最初に、相同的組換えを使用して部位特異的組換え系からの組換え配列（例えばＣｒｅ／ＩｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５：５２１−５２７，１９９４；Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２５：８９０−９００，１９９３）を細胞の内因性ゲノムＡＦＴＩポリペプチドコード領域の上流（すなわち５’側）に置くことを含む。ゲノムＡＦＴＩポリペプチドコード領域のすぐ上流に置いた部位に相同な組換え部位を含むプラスミドを、適切なリコンビナーゼ酵素と共に修飾した細胞系に導入する。このリコンビナーゼは、プラスミドの組換え部位を通して、細胞系のゲノムＡＦＴＩポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置する組換え部位にプラスミドの組込みを生じさせる（ＢａｕｂｏｎｉｓとＳａｕｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２１：２０２５−２０２９，１９９３；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３５１−１３５５，１９９１）。転写を高めることが知られているフランキング配列（例えばエンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、もしこのプラスミド内に正しく位置していれば、細胞の内因性ＡＦＴＩ遺伝子からの新規の又は高いＡＦＴＩポリペプチド産生をもたらす新しい又は改変された転写単位を創造するように組込みを行う。
【０２４１】
部位特異的組換え配列を細胞の内因性ゲノムＡＦＴＩポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置づけた細胞系統を使用するさらなる方法は、細胞系のゲノムのどこか別の場所に第二の組換え部位を導入するために相同的組換えを使用することである。その後適切なリコンビナーゼ酵素を２組換え部位の細胞系に導入して、細胞の内因性ＡＦＴＩ遺伝子からの新規の又は高いＡＦＴＩポリペプチド産生をもたらす新しい又は改変された転写単位を創造する組換え事象（欠失、逆位、転位）（Ｓａｕｅｒら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、前出、１９９４；Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，前出、１９９３）を生じさせる。
【０２４２】
細胞の内因性ＡＦＴＩ遺伝子からＡＦＴＩポリペプチドの発現を、上昇させる又は生じさせるためのさらなるアプローチは、細胞の内因性ＡＦＴＩ遺伝子からの新規の又は高いＡＦＴＩポリペプチド産生をもたらすように、１又はそれ以上の遺伝子（例えば転写因子）の発現を上昇させる又は生じさせる、及び／又は１又はそれ以上の遺伝子（例えば転写リプレッサー）の発現を低下させることを含む。この方法は、非天然に生じるポリペプチド（例えば転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）を、細胞の内因性ＡＦＴＩ遺伝子から新規の又は高いＡＦＴＩポリペプチド産生が生じるように細胞内に導入することを含む。
【０２４３】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。一部の実施形態では、例示的なＤＮＡ構築物は次のものを含む：（ａ）１又はそれ以上の標的配列；（ｂ）調節配列；（ｃ）エクソン；及び（ｄ）不対スプライス供与部位。ＤＮＡ構築物中の標的配列は、（ｂ）から（ｄ）のエレメントが内因性標的遺伝子の配列に作動可能に連結されるように、（ａ）から（ｄ）のエレメントを細胞内の標的遺伝子に組み込むことを指令する。もう１つの実施形態では、ＤＮＡ構築物は次のものを含み：（ａ）１又はそれ以上の標的配列；（ｂ）調節配列；（ｃ）エクソン；（ｄ）スプライス供与部位；（ｅ）イントロン；及び（ｆ）スプライス受容部位、標的配列は、（ｂ）から（ｆ）のエレメントが内因性遺伝子に作動可能に連結されるように、（ａ）から（ｆ）のエレメントの組込みを指令する。標的配列は、相同的組換えが起こる細胞の染色体ＤＮＡ内のあらかじめ選択された部位と相同である。構築物においては、エクソンは一般に調節配列の３’側にあり、スプライス供与部位はエクソンの３’側にある。
【０２４４】
ここで提示するＡＦＴＩポリペプチドの核酸配列のような、特定遺伝子の配列が既知であれば、遺伝子の選択した領域に相補的であるＤＮＡの断片を合成する又は、対象領域と境界を接する特異的認識部位で天然ＤＮＡを適切に制限することなどによって入手することができる。この断片は細胞内への挿入の際の標的配列として使用でき、ゲノム内のその相同領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製の間に起こる場合、このＤＮＡ断片及びそれに結合している付加的な配列は岡崎フラグメントして働き、新たに合成される娘鎖のＤＮＡに組み込まれる。本発明は、それ故、標的配列として使用しうる、ＡＦＴＩポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む。
【０２４５】
ＡＦＴＩポリペプチド細胞治療、例えば、ＡＦＴＩポリペプチドを産生する細胞の移植も考慮される。この実施形態は、生物学的に活性な形態のＡＦＴＩポリペプチドを合成し、分泌することができる細胞を移植することを含む。そのようなＡＦＴＩポリペプチド産生細胞は、ＡＦＴＩポリペプチドの天然プロデューサーであるか、若しくは所望するＡＦＴＩポリペプチドをコードする遺伝子又はＡＦＴＩポリペプチドの発現を高める遺伝子での形質転換によってＡＦＴＩポリペプチドを産生する能力が高められた組換え細胞でありうる。そのような改変は、遺伝子を送達し、さらにその発現と分泌を促進するのに適したベクターによって達成されうる。外来種のポリペプチドの投与によって起こりうるような、ＡＦＴＩポリペプチドを投与する患者における潜在的免疫反応を最小限に抑えるため、ＡＦＴＩポリペプチドを産生する天然細胞はヒト由来であり、ヒトＡＦＴＩポリペプチドを産生することが好ましい。同様に、ＡＦＴＩポリペプチドを産生する組換え細胞は、ヒトＡＦＴＩポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換することが好ましい。
【０２４６】
移植細胞は、周辺組織の浸潤を避けるため被包してもよい。ＡＦＴＩポリペプチドの放出は許容するが、患者の免疫系による又は周辺組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防ぐ、生体適合性の半透性高分子封入物（ｅｎｃｌｏｓｕｒｅｓ）又は膜内で、ヒト又はヒト以外の動物細胞を患者に移植することができる。その代わりに、エクスビボでＡＦＴＩポリペプチドを産生するように形質転換した患者自身の細胞を、そのような被包を行わずに直接患者に移植してもよい。
【０２４７】
生存細胞の被包のための手法は当該技術において既知であり、被包細胞の調製及び患者への移植は常套的に実施されうる。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（ＷＯ９５／０５４５２号；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９号）は、生物活性分子の有効な送達のための遺伝的に構築した細胞を含む膜カプセルを記述している。カプセルは生体適合性であり、容易に回収されうる。カプセルは、哺乳類宿主への移植の際にインビボで下方調節を受けないプロモーターに作動可能に連結された、生物活性分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクションされた細胞を被包する。かかる装置はレシピエント内の特異的部位に生存細胞からの分子を送達することを提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号、５，０１１，４７２号、及び５，１０６，６２７号参照。生存細胞を被包するためのシステムは、ＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ特許願ＰＣＴ／ＵＳ９１／００１５７号に述べられている。また、ＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ特許願ＰＣＴ／ＵＳ９１／００１５５号；Ｗｉｎｎら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１３：３２２−３２９（１９９１）、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１１：２６９−２７５（１９９１）；及びＴｒｅｓｃｏら、ＡＳＡＩＯ、３８：１７−２３（１９９２）も参照のこと。
【０２４８】
ＡＦＴＩポリペプチドのインビボ及びインビトロでの遺伝子治療送達も想定される。遺伝子治療手法の１つの例は、構成的又は誘導的プロモーターに作動可能に連結されうる、ＡＦＴＩポリペプチドをコードするＡＦＴＩ遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、及び／又は合成ＤＮＡのいずれか）を使用して、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成することである。プロモーターは、構築物を挿入する細胞又は組織型において活性であることを条件として、内因性ＡＦＴＩ遺伝子に相同又は非相同のいずれでもよい。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、場合によっては、部位特異的組込み用に設計されたＤＮＡ分子（例えば相同的組換えのために有用な内因性配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサー又はサイレンサー、親細胞に比べて選択優位性を提供することができるＤＮＡ分子、形質転換細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、陰性選択システム、細胞特異的結合物質（例えば細胞ターゲティングのための）、細胞特異的インターナリゼーション因子、及びベクターによる発現を高める転写因子ならびにベクターの製造を可能にする因子を含みうる。
【０２４９】
次にウイルス又は非ウイルスベクターを使用して遺伝子治療ＤＮＡ構築物を細胞に導入することができる（エクスビボ又はインビボのいずれかで）。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの手段は、ここで述べるようなウイルスベクターによるものである。レトロウイルスベクターのような一部のベクターは、ＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、遺伝子を染色体ＤＮＡに組み込むことができる。他のベクターはエピソームとして機能し、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は細胞質内にとどまる。
【０２５０】
さらなる他の実施形態では、標的細胞におけるＡＦＴＩ遺伝子の制御された発現のために調節エレメントを含めることができる。そのようなエレメントは適切なエフェクターに応答して作動する。そのようにして、所望するときには治療的ポリペプチドを発現することができる。従来の制御手段の１つは、ＤＮＡ結合タンパク質又は転写活性化タンパク質のような、小分子結合ドメイン及び生物学的プロセスを開始させることができるドメインを含むキメラタンパク質を二量体化するために使用される、小分子ダイメライザー又はラパログ（ＷＯ９６４１８６５号（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９９４８６号）；ＷＯ９７３１８９８号（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３１３７号）及びＷＯ９７３１８９９号（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１５７号）に述べられているような）の使用を含む。タンパク質の二量体化を使用して、ＡＦＴＩ遺伝子の転写を開始することができる。
【０２５１】
他の適当な制御システム又は遺伝子スイッチは次のシステムを含むが、これらに限定されない。ミフェプリストン（ＲＵ４８６）はプロゲステロンアンタゴニストとして使用される。プロゲステロンアンタゴニストへの修飾プロゲステロンレセプタリガンド結合ドメインの結合は、２つの転写因子の二量体を形成することによって転写を活性化し、つぎにそれが核内へと通過してＤＮＡに結合する。リガンド結合ドメインは、天然リガンドに結合するレセプタの能力を排除するように修飾される。修飾ステロイドホルモンレセプタ系はさらに米国特許第５，３６４，７９１号；ＷＯ９６４０９１１号；及びＷＯ９７１０３３７号に述べられている。
【０２５２】
さらにもう１つの制御システムは、エクジソンレセプタ（細胞質レセプタ）に結合してそれを活性化するエクジソン（ショウジョウバエステロイドホルモン）を使用する。次にレセプタは核に転位して、特異的ＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子からのプロモーター）に結合する。エクジソンレセプタは、転写を開始させるトランス活性化ドメイン／ＤＮＡ結合ドメイン／リガンド結合ドメインを含む。エクジソン系は、さらに米国特許第５，５１４，５７８号；ＷＯ９７３８１１７号；ＷＯ８６３７６０９号；及びＷＯ９３０３１６２号において記述されている。
【０２５３】
もう１つの制御システムは、陽性テトラサイクリン制御可能トランス活性化因子を使用する。このシステムは、転写を活性化するポリペプチドに連結された突然変異ｔｅｔリプレッサータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節トランス活性化因子タンパク質を生じる突然変異ｔｅｔＲ−４アミノ酸変化、すなわちテトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する）を含む。そのような系は米国特許第５，４６４，７５８号；５，６５０，２９８号及び５，６５４，１６８号に述べられている。
【０２５４】
さらなる発現制御システム及び核酸構築物は、Ｉｎｎｏｖｉｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．への米国特許第５，７４１，６７９号及び５，８３４，１８６号に述べられている。
【０２５５】
インビボ遺伝子治療は、ＡＦＴＩ核酸分子の局所注入を通して、あるいは他の適切なウイルス又は非ウイルス送達ベクターにより、ＡＦＴＩポリペプチドをコードする遺伝子を細胞に導入することによって実施されうる。Ｈｅｆｔｉ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２５：１４１８−１４３５（１９９４）。例えば、標的細胞への送達のためにＡＦＴＩポリペプチドをコードする核酸分子をアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに組み込むことができる（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，国際特許公開第ＷＯ９５／３４６７０号；国際特許願第ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８号）。組換えＡＡＶゲノムは、典型的には、機能的プロモーター及びポリアデニル化配列に作動可能に連結されたＡＦＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接する、ＡＡＶ逆方向末端反復配列を含む。
【０２５６】
代替的な適当なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、及びパピローマウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含む、インビボでのウイルスを介した遺伝子導入システムを述べている。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するようにインビトロで処理したヒト細胞を送達することにより、患者に治療タンパク質を供給するための方法の例を提供している。遺伝子治療手法の実施のためのさらなる方法及び材料は、アデノウイルスベクターに関する米国特許第５，６３１，２３６号；レトロウイルスベクターに関する米国特許第５，６７２，５１０号；及びサイトカインを発現するレトロウイルスベクターに関する米国特許第５，６３５，３９９号に記述されている。
【０２５７】
ウイルス以外の送達方法は、リポソームを介した導入、裸のＤＮＡ送達（直接注入）、レセプタを介した導入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降法、及び微粒子衝撃（例えば遺伝子ガン）を含むが、これらに限定されない。遺伝子治療の材料及び方法はまた、誘導的プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組込みのための設計されたＤＮＡ配列、親細胞に比べて選択優位性を提供することができるＤＮＡ配列、形質転換細胞を同定するための標識、陰性選択システム及び発現制御システム（安全上の措置）、細胞特異的結合物質（細胞ターゲティングのため）、細胞特異的インターナリゼーション因子、及びベクターによる発現を高める転写因子ならびにベクター製造の方法の使用を含みうる。遺伝子治療手法の実施のためのそのような付加的な方法及び材料は、エレクトロポレーション手法に関する米国特許第４，９７０，１５４号；核リガンドに関するＷＯ９６／４０９５８号；遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を述べる米国特許第５，６７９，５５９号；リポソーム担体に関する米国特許第５，６７６，９５４号；リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法に関する米国特許第５，５９３，８７５号；及び生物活性粒子が細胞の表面を貫通し、細胞の内部に組み込まれる速度で、粒子を細胞において推進する、米国特許第４，９４５，０５０号に記述されている。
【０２５８】
また、ＡＦＴＩ遺伝子治療又は細胞治療がさらに、同じか又は異なる細胞中の１又はそれ以上の付加的なポリペプチドの送達を含みうることも考慮される。そのような細胞は、患者に別々に導入するか、若しくは上述した被包膜のような単一の移植可能な装置に組み込むか、あるいはウイルスベクターによって別々に改変することができる。
【０２５９】
遺伝子治療を通して細胞における内因性ＡＦＴＩポリペプチドの発現を上昇させる１つの方法は、エンハンサーエレメントがＡＦＴＩ遺伝子の転写活性を高める働きをすることができる場合には、１又はそれ以上のエンハンサーエレメントをＡＦＴＩポリペプチドプロモーターに挿入することである。使用するエンハンサーエレメントは、遺伝子を活性化することを所望する組織に基づいて選択し、その組織においてプロモーターの活性化をもたらすことが知られているエンハンサーエレメントを選択する。例えば、ＡＦＴＩポリペプチドをコードする遺伝子をＴ細胞において「作動させる」場合には、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用できる。ここでは、付加する転写エレメント機能的部分を、標準的なクローニング手法を用いてＡＦＴＩポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡのフラグメントに挿入することができる（そして場合によっては、ベクター及び／又は５’及び／又は３’フランキング配列、等々に挿入することができる）。「相同的組換え構築物」として知られるこの構築物を、次に、エクスビボ又はインビボのいずれかで所望する細胞に導入することができる。
【０２６０】
遺伝子治療はまた、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによってＡＦＴＩポリペプチドの発現を低下させるためにも使用できる。そのような改変は典型的には相同的組換え法によって実施される。例えば、不活性化のために選択したＡＦＴＩ遺伝子のプロモーターの全部又は一部を含むＤＮＡ分子を、転写を調節するプロモーターの断片を除去する及び／又は置換するように構築することができる。例えば、標準的な分子生物学手法を用いて、プロモーターの転写活性化因子のＴＡＴＡボックス及び／又は結合部位を欠失させることができる；そのような欠失はプロモーター活性を阻害することができ、それによって対応するＡＦＴＩ遺伝子の転写を抑制する。ＴＡＴＡボックス又はプロモーター内の転写活性化因子結合部位の欠失は、１又はそれ以上のＴＡＴＡボックス及び／又は転写活性化因子結合部位のヌクレオチドを１又はそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入によって突然変異させたＡＦＴＩポリペプチドプロモーター（調節するＡＦＴＩ遺伝子と同じか又は関連する種からの）の全部又は関連部分を含むＤＮＡ構築物を作製することによって達成されうる。その結果、ＴＡＴＡボックス及び／又は活性化因子結合部位は低い活性を持つか又は完全に不活性化される。構築物は典型的には、改変したプロモーターセグメントに隣接する天然の（内因性）５’及び３’ＤＮＡ配列に対応する、少なくとも約５００塩基のＤＮＡを含む。構築物は、ここで述べるように直接に又はウイルスベクターを通して適切な細胞に導入しうる（エクスビボ又はインビボのいずれかで）。典型的には、プロモーター構築物内の５’及び３’ＤＮＡ配列が、内因性染色体ＤＮＡへのハイブリダイゼーションを通して改変プロモーター領域の組み込みを助ける役割を果たすことができる場合には、細胞のゲノムＤＮＡへの構築物の組み込みは相同的組換えを通して行われる。
【０２６１】
ＡＦＴＩ核酸及びポリペプチドの使用
ＡＦＴＩ核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしないものを含む）は、哺乳類組織又は体液標本中のＡＦＴＩ又はアポ−Ａ−１　ＤＮＡあるいは対応するＲＮＡの存在を定性的又は定量的に調べる診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であると考えられる。
【０２６２】
ＡＦＴＩポリペプチドは、治療する適応症にとって適切であるときには、１又はそれ以上のサイトカイン、成長因子、抗生物質、抗炎症薬、及び／又は化学療法剤と組み合わせて使用しうる。
【０２６３】
１又はそれ以上のＡＦＴＩポリペプチドの活性を阻害することを所望する場合、他の方法も使用しうる。発現制御配列（三重らせん形成）又はＡＦＴＩ　ｍＲＮＡに相補的であり、ハイブリダイズする核酸分子によってそのような阻害を生じさせることができる。例えば、選択したＡＦＴＩ遺伝子の少なくとも一部に相補的な配列を持つアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡ分子を細胞に導入することができる。アンチセンスプローブは、ここで開示するＡＦＴＩポリペプチドをコードする配列を用いて、使用可能な手法によって設計しうる。典型的には、そのような各々のアンチセンス分子は選択した各ＡＦＴＩ遺伝子の開始部位（５’末端）に相補的である。その後アンチセンス分子を対応するＡＦＴＩ　ｍＲＮＡにハイブリダイズすると、このｍＲＮＡの翻訳が妨げられる又は低下する。アンチセンス阻害因子は、細胞又は生物におけるＡＦＴＩポリペプチドの低下又は不在に関する情報を提供する。
【０２６４】
代替的に、遺伝子治療を用いて１又はそれ以上のＡＦＴＩポリペプチドのドミナントネガティブ阻害因子を創造することができる。この場合には、各選択ＡＦＴＩポリペプチドの突然変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡを調製し、ここで述べるようなウイルス又は非ウイルス法を用いて患者の細胞に導入することができる。各々のそのような突然変異体は、典型的にはその生物学的役割に関して内因性ポリペプチドと競合するように設計される。
【０２６５】
さらに、ＡＦＴＩポリペプチドは、生物学的に活性であるか否かに関わらず、免疫原として使用しうる、すなわちポリペプチドは、それに対する抗体が惹起されうる少なくとも１個のエピトープを含む。ＡＦＴＩポリペプチド（ここで述べるような）に結合する選択結合物質は、体液又は細胞試料中のＡＦＴＩポリペプチドの存在を検出するための標識形態での使用を含むがこれに限定されない、インビボ及びインビトロでの診断目的に使用しうる。抗体はまた、ここで挙げるものを含めて、多くの疾患及び障害を予防する、治療する、又は診断するために使用しうる。抗体は、ＡＦＴＩポリペプチドの特徴的な少なくとも１つの活性を低下させる又は遮断するようにＡＦＴＩポリペプチドに結合しうる、又はＡＦＴＩポリペプチドの特徴的な少なくとも１つの活性を高めるようにポリペプチドに結合しうる（ＡＦＴＩポリペプチドの薬物動態を高めることによる場合を含めて）。
【０２６６】
単球によるＩＬ−１β及びＴＮＦ−α産生へのアポ−Ａ−１の作用
アポ−Ａ−１は、アポリポタンパク質と称される、脂質と種々の両親媒性ペプチドの高分子複合体であるＨＤＬの主要成分である。アポリポタンパク質は、ＨＤＬが種々の機能を果たすことを可能にする一連の活性を有しており（Ｂａｒｔｅｒら、１９９６、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ　１２１：１−１２）、それらの機能は最初、血液の脂質代謝へのそれらの作用によるものと考えられた。最近になって、ＨＤＬが単球上のＣＤ−１４レセプタを下方調節することを示した（Ｐａｊｋｒｔら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１６０１−１６０８）、ヒト志願者において例示されたような抗炎症機能を含めて、ＨＤＬが一連の活性を持つことが明らかになった（Ｃａｌａｂｒｅｓｉら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．８：２１９−２２４；Ｍｉｙａｚａｋｉら、１９９５、Ｊ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．２：３０−３６）。ＨＤＬはまた、リポ多糖類（ＬＰＳ）と競合することによって抗炎症機能を示し、それ故内毒素活性の低下に寄与する（Ｂａｕｍｂｅｒｇｅｒら、１９９１、Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ　５９：３７８−３８３）。ＨＤＬの抗炎症機能の機序と生理的関連性は明らかにされていないが、下記の実施例１で述べる結果は、この活性の少なくとも一部はアポ−Ａ−１による単球のＴ細胞シグナル伝達の阻害に帰せられるであろうことを示唆している。
【０２６７】
データは、ＨＤＬがアポ−Ａ−１の結合を通して刺激Ｔ細胞と相互作用することを明らかにしている。そのような相互作用は、アポ−Ａ−１をリガンドとして認識するヒトリンパ球上の特異的ＨＤＬ結合部位の存在を明らかにした試験において記述された（Ｊｕｒｇｅｎｓら、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８５４９−８５５６）。このＨＤＬレセプタは同定されなかったが、ＨＤＬを補足した無血清培地で培養したとき、Ｔリンパ球によるＨＤＬ脂質の利用がその責任を担うと主張された。より最近の試験に従えば（Ｈｉｄａｋａら、１９９９、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．４０：１１３１−１１３９）、下記の実施例１で述べる結果は、ＨＤＬが典型的には刺激されていないＴリンパ球には結合しないことを明らかにしている。これらの所見は、アポ−Ａ−１関連ＨＤＬが刺激されたＴ細胞と相互作用しうることを示している。この相互作用が単球のＴ細胞シグナル伝達の阻害に関与すると考えられる。さらに、フローサイトメトリー分析に従えば、ＨＤＬは単球に結合する。これは全ＰＢＭＣ中での単球へのＨＤＬ（ＨＤＬ３）の結合を示した公表データ（Ｈｉｄａｋａら、１９９９、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．４０：１１３１−１１３９）と一致する。それ故、ＨＤＬが、直接後者の細胞の活性化のレベルを調節することにより、単球の活性化にも影響を及ぼす可能性が非常に高い。これは図７に示す結果によって確認される。実際に、刺激後に加えたアポ−Ａ−１（刺激ＨＵＴ−７８細胞又はＴリンパ球の膜）がまだサイトカイン産生作用を阻害することができるという前提は、単球／ＴＨＰ−１細胞への阻害因子の直接作用を示唆する。休止ＴＨＰ−１細胞に関してはＨＤＬの結合又は機能活性は認められていないが、休止ＴＨＰ−１細胞は分化された（活性化された）ＨＤＬレセプタを発現しうる（Ｗｅｓｔｍａｎら、１９９５、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．５５：２３−３３）。それ故、下記の実施例１で述べる結果は、ＨＤＬ関連のアポ−Ａ−１が、一部の実施形態に従えば、２つの異なる経路を通して刺激Ｔ細胞と接触することにより、単球の活性化の際のプロ炎症性サイトカインの産生を阻害することを明らかにしている：主要経路は、Ｔ細胞上の活性化因子の単球上レセプタへの結合の遮断であり、従ってＴＮＦ−αとＩＬ−１βの両方の発現を阻害する。もう１つの経路は、レセプタへの結合を通した単球へのアポ−Ａ−１関連ＨＤＬの直接作用であると考えられ、従って直接サイトカインの産生を阻害する。後者の作用はまだ証明されていないが、これらの二元的な作用は、ＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦ−αとＩＬ−１β産生の阻害の程度の違いを説明すると考えられる。
【０２６８】
実施例１の結果は刺激Ｔ細胞表面のアポ−Ａ−１のリガンドを同定しなかったが、ＳＲ−Ｂ１又はＣＤ３６のようなＨＤＬレセプタタンパク質が関与する可能性は低い。これらのレセプタはＬＤＬと相互作用することができる特定のアポリポタンパク質に特異性を示さないからである（Ｋｒｉｅｇｅｒ，Ｍ．，１９９９、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８：５２３−５５８；Ｆｉｄｇｅ，Ｎ．Ｈ．，１９９９、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｄ．４０：１８７−２０１）。ＬＤＬは単球のＴ細胞シグナル伝達に対して検出可能な阻害活性を示さない（データは示していない）。他方で、ラット肝原形質膜及びヒト血液単球において発現される特異的ＨＤＬ結合タンパク質（ＨＢ１及びＨＢ２）が記述された（Ｈｉｄａｋａら、１９９９、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．４０：１１３１−１１３９）。ＨＢ２は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する細胞接着分子であるＡＬＣＡＭに相同である（Ｆｉｄｇｅ，Ｎ．Ｈ．，１９９９、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｄ．４０：１８７−２０１）。アポ−Ａ−１がＨＤＬのＨＢ２への結合に関したことから、刺激Ｔ細胞上のＨＤＬレセプタはＨＢ２タンパク質ファミリーと何らかの相同性を持つ可能性がある。最近、内性因子−ビタミンＢ１２複合体（すなわちキュビリン）の腸吸収のための高親和性レセプタとして知られるタンパク質が、ＨＤＬのエンドサイトーシス（Ｋｏｚｙｒａｋｉら、１９９９、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ５：６５６−６６１）を促進するアポ−Ａ−１に高い親和性を示すことが明らかにされた。後者の４６０ｋＤａタンパク質又はＨＢ２が刺激Ｔリンパ球において発現されるか否かはまだ測定されていない。刺激Ｔ細胞上のアポ−Ａ−１／ＨＤＬレセプタの同定は、単球のＴ細胞シグナル伝達阻害因子の作用機序の解明を可能にするであろう。
【０２６９】
単球のＴ細胞シグナル伝達の阻害は血流中で低いレベルの単球活性化を維持する上で重要であると考えられるが、この試験で使用した静的条件は血流によって加えられるずれ応力を反映しないと思われる。最近、若年性ＲＡにおける炎症状態が低ＨＤＬ血症（Ｔｓｅｌｅｐｉｓら、１９９９、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．４２：３７３−３８３）及びこの疾患を有する患者の血漿中のアポ−Ａ−１濃度の有意の低下に結びつくことが示された。ＲＡにおいては、アポ−Ａ−１（Ａｎａｎｔｈら、１９９３、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　４２：８０３−８０６；Ｌｏｒｂｅｒら、１９８５、Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２４：２５０−２５５；Ｄｏｈｅｒｔｙら、１９９８、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　１９：３５５−３６３）又はＨＤＬコレステロール（Ａｎａｎｔｈら、１９９３、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　４２：８０３−８０６；Ｌｏｒｂｅｒら、１９８５、Ｂｒ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２４：２５０−２５５；Ｊｏｖｅｎら、１９８４、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．２７：１１９９−１２００）の血漿レベルには変化がなかった又は低下したという議論の余地のある報告が為されている。しかしながら、アポ−Ａ−１の濃度は滑液中では血漿中よりも１０倍低いが、ＲＡ患者の滑液においてアポ−Ａ−１が増強されることは明らかである（Ａｎａｎｔｈら、１９９３、Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　４２：８０３−８０６）。ＲＡ患者の滑液中でのアポ−Ａ−１の上昇はコレステロールの上昇を伴い、炎症部位へのＨＤＬ粒子の浸潤を示唆した。
【０２７０】
実際に、サイトカイン（ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α）及びメタロプロテイナーゼのような炎症性因子の活性が特異的阻害因子によって打ち消されることは炎症においては一般的である。慢性炎症では、調節機序が炎症性因子に打ち負かされると思われる。発明者が仮定するように、単球のＴリンパ球シグナル伝達が重要なプロ炎症機序である場合には、この活性を制御する阻害因子が存在するはずである。ＨＤＬ関連のアポ−Ａ−１はこれらの調節因子の１つであることが明らかにされた。ＲＡ患者の滑液中にアポ−Ａ−１が存在することは、炎症反応を抑制しようとする生物の応答であると考えられる。アポ−Ａ−１濃度の変化は、もう１つの自己免疫性病因の炎症性疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）においても認められ（Ｌａｈｉｔａら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．３６：１５６６−１５７４）、この場合にはアポ−Ａ−１の血漿濃度が低下した。この低下は３２％の患者において抗アポ−Ａ−１抗体の存在に結びついていた（Ｄｉｎｕら、１９９８、Ｇ，Ｌｕｐｕｓ　７：３５５−３６０）。これもやはりアポ−Ａ−１の抗炎症性機能を示唆している。
【０２７１】
ＨＤＬの濃度とアテローム性動脈硬化症の発生率には広く確立された逆相関が存在する。炎症応答はアテローム性動脈硬化症の不可欠の部分であるという主張（Ｒｏｓｓ，Ｒ．，１９９９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０−１１５−１２６）を強力に裏付ける証拠が増えつつある。実際に、単球−マクロファージ及びＴリンパ球は病変発現のすべての時期に存在し、最も初期の病変（脂肪線条）は主としてマクロファージとＴリンパ球から成る（Ｓｔａｒｙら、１９９４、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８９：２４６２−２４７８）。それ故、この疾患においては単球のＴリンパ球シグナル伝達が起こると考えられる。活性化単球−マクロファージによるメタロプロテイナーゼの放出はプラーク基質を弱め、プラークの破壊と血栓形成の急性期を早めると思われる（Ｌｅｅら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｖａｓｃ．Ｂｉｏｌ．１７：１８５９−１８６７）ので、ＨＤＬは、Ｔリンパ球による単球活性化の低下を含めて、アテローム性動脈硬化症のいくつかのレベルで防護機能を及ぼすと考えられる。
【０２７２】
ここで述べる結果は、ＨＤＬ関連アポ−Ａ−１の抗炎症性機能を同定する。一部の実施形態に従えば、これは、血液循環中に刺激Ｔリンパ球が認められる炎症状態での単球−マクロファージの過剰活性化に対する一般的な防護機序ならびに血漿タンパク質が炎症組織内に漏洩したときの重要な対抗調節機序であると考えられる。今回の結果から生じた新しい概念は、アポ−Ａ−１のような「ネガティブな」急性期タンパク質の抗炎症性因子としての重要性である。
【０２７３】
下記の実施例は、例示目的だけを意図したものであり、いかなる意味においても本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【０２７４】
実施例１：Ｔリンパ球との接触を通して刺激したヒト単球においてＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生を阻害するためのアポ−Ａ−１の使用
実験材料及び方法
実験材料及び試薬。Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ（尋常性インゲンマメ）ロイコフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）（Ｅ−Ｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｍａｔｅｏ，ＣＡ）；酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）、パラホルムアルデヒド、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ペプスタチンＡ、ロイペプチン、ヨードアセトアミド、硫酸ポリミクシンＢ、ノイラミニダーゼ、及びウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；ＲＰＭＩ−１６４０、Ｃａ２＋及びＭｇ２＋を含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、胎児ウシ血清（ＦＣＳ）、ペニシリン、ストレプトマイシン及びＬ−グルタミン（Ｇｉｂｓｏ，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を指定供給業者から購入した。他の試薬はすべて分析グレード以上であった。
【０２７５】
ヒト血清。プールヒト血清（ＨＳ）をｔｈｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｖａから入手した。
【０２７６】
Ｔ細胞及びＴ細胞原形質膜の調製。ヒトＴ細胞系統（Ｇａｚｄａｒら、１９８０、Ｂｌｏｏｄ　５５：４０９−４１７）、ＨＵＴ−７８をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。細胞を、５％ＣＯ２−空気加湿大気中３７℃で、１０％熱不活化ＦＣＳ、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、５０ＩＵ／ｍｌペニシリン及び２ｍＭ　Ｌ−グルタミンを補足したＲＰＭＩ−１６４０培地（完全ＲＰＭＩ培地）中に保持した。ＨＵＴ−７８細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）をＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）及びＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）によって６時間刺激した。刺激したＨＵＴ−７８細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定するか（Ｖｅｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２０４０−２０４６；Ｉｓｌｅｒら、１９９３、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋａｉｎｅ　Ｎｅｔｗ．４：１５−２３）、若しくは以前に述べられているように（Ｂｕｒｇｅｒら、１９９８、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ．４１：１７４８−１７５９）それらの原形質膜を調製した。Ｔリンパ球を以前に述べられているように（Ｖｅｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２０４０−２０４６）健常ドナーの軟膜から得た。Ｔリンパ球は、フローサイトメトリーによって評価したとき、９４から９８％ＣＤ２＋、８３から９４％ＣＤ３＋、及び≦２％ＣＤ１４＋を含んだ。Ｔリンパ球をＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）及びＰＭＡ（５ｎｇ／ｍｌ）によって４８時間刺激し、十分に洗って、以前に述べられているように（Ｖｅｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２０４０−２０４６；Ｉｓｌｅｒら、１９９３、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋａｉｎｅ　Ｎｅｔｗ．４：１５−２３）１％パラホルムアルデヒドで固定した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）での密度遠心分離によって健常ドナーの軟膜から得た。
【０２７７】
単球及び単球性細胞。急性単球性白血病の患者に由来するヒト単球性細胞系統ＴＨＰ−１（Ｔｓｕｃｈｉｙａら、１９８０、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　２６：１７１−１７６）をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手した。末梢血単球を記述されているように入手した（Ａｒｍａｎｔら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４８６８−４８７５）。
【０２７８】
ＰＭＢＣ培養。ＰＭＢＣを９６穴培養プレートにおいて４×１０５細胞／２００μｌ／穴の密度で、指示された刺激の存在下に４８時間（サイトカイン産生）又は７２時間（増殖）培養した。増殖アッセイについては、細胞を採集する２４時間前に３Ｈ−チミジンを加えた。
【０２７９】
タンパク質濃度及びＮ末端マイクロシーケンス法。Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法によってタンパク質濃度を測定した。精製阻害分画を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に移して、クマシーブルー染色によって視覚化した。Ｍｒ２８ｋＤａのバンドを切り出し、Ｐｒｏｃｉｓｅ　４９４−ＨＴタンパク質シーケンサー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）でＮ末端配列分析を実施した。
ＴＨＰ−１細胞及び単球の活性化。ＴＨＰ−１細胞（５×１０４細胞／穴）又は単球（８×１０４細胞／穴）を９６穴培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＵＫ　Ｌｔｄ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＵＫ）に分配し、指示された阻害因子の存在下又は不在下に総容量２００μｌの完全ＲＰＭＩ培地中で指示された刺激によって活性化した。４８時間後、培養上清を、以前に述べられているように（Ｖｅｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２０４０−２０４６；Ｉｓｌｅｒら、１９９３、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋａｉｎｅ　Ｎｅｔｗ．４：１５−２３）ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの含量に関して分析した。
高密度超遠心分離による血清ＨＤＬの単離。Ｈａｖｅｌら、１９５５、Ｊ．Ｃｌｔｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４：１３４５−１３５３に従ってＨＳリポタンパク質を単離した。簡単に述べると、カイロミクロンを除去するため、Ｂｅｃｋｍａｎ　ＪＡ　２０．１ローターを使用して２０，０００ｒｐｍで４５分間ＨＳを遠心分離した。次にカイロミクロン不含血清を５０，０００ｒｐｍで２４時間３７分間遠心分離した。超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）を含む上部相を廃棄した。下部相を、固体ＮａＢｒを加えて１．０６３ｇ／ｍｌの密度に調整し、５０，０００ｒｐｍで２４時間３７分間遠心分離した。上部相で回収された低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を廃棄した。下部相を、固体ＮａＢｒを加えてｄ＝１．２３ｇ／ｍｌに調整し、４５，０００ｒｐｍで６０時間４７分間遠心分離した。上部相で高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）が回収され、下部層は残りの血清タンパク質を含んだ。超遠心分離はすべてＢｅｃｋｍａｎ　５０．２　Ｔｉローターを使用して４℃で実施した。
【０２８０】
回収したリポタンパク質とタンパク質分画をＰＢＳに透析し、それらの阻害活性を調べた。簡単に述べると、ＴＨＰ−１細胞（５×１０４細胞／穴）又は単球（８×１０４細胞／穴）を９６穴培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＵＫ　Ｌｔｄ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＵＫ）に分配し、種々の希釈の分画の存在下に総容量２００μｌの完全ＲＰＭＩ培地中で刺激Ｔ細胞から単離した膜によって活性化した。４８時間後、培養上清を、以前に述べられているように（Ｖｅｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２０４０−２０４６；Ｉｓｌｅｒら、１９９３、Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋａｉｎｅ　Ｎｅｔｗ．４：１５−２３）ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの含量に関して分析した。
【０２８１】
フローサイトメトリー。ＨＤＬを、記述されているように（Ｈｉｄａｋａら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓ．４０：１１３１−１１３９）フルオレセインチオシアネート（ＦＩＴＣ−ＨＤＬ）で標識した。ＦＩＴＣ−ＨＤＬの細胞への結合を、基本的に以前に述べられているようにして（Ｄｅａｇｅら、１９９８、Ｍ．Ｅｕｒ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｎｅｔｗ．９：６６３−６６８）フローサイトメーター（ＥＰＩＣＳ，Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）での直接フローサイトメトリーによって分析した。生存細胞のゲーティング時に平均蛍光強度を記録し、４×１０対数スケールの任意単位で表した。陽性細胞のパーセンテージは、非複合ＦＩＴＣ対照を越える蛍光事象のパーセンテージに基づいた。
【０２８２】
ＨＤＬの脱脂。記述されているように（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｊ．Ｃ．Ｊ．，１９８６、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２８：２１３−２２２）ＨＤＬアポリポタンパク質の抽出を行った。簡単に述べると、超遠心分離によって単離した１容のＨＤＬを、絶えず攪拌しながら１２容の氷冷メタノールにゆっくりと加えた。次に２８容の氷冷ジエチルエーテルを溶液に加えた。氷上で１０分間攪拌した後、混合物を５００×ｇで５分間遠心分離した。タンパク質ペレットを４０容のジエチルエーテルに再懸濁した。氷上で１０分間攪拌した後、混合物を上記のように遠心分離した。ペレットを回収し、窒素フラックス下で乾燥した。凝集を最小限に抑えるため、脱脂したＨＤＬリポタンパク質を、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＮａＮ３、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び２Ｍ塩化グアニジニウムを含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中、２ｍｇタンパク質／ｍｌで可溶化し、その後ＰＢＳで透析した。
【０２８３】
プロテイナーゼＫによるＨＤＬの処理。最終容量２００μｌのＰＢＳ中３７℃で１時間、アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に結合した１単位のプロテイナーゼＫの存在下又は不在下でＨＤＬ（１００μｇタンパク質）をインキュベートした。タンパク質分解反応を遠心分離によって停止し、その効果をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価した。
【０２８４】
ＨＤＬタンパク質の電気溶出。基本的に以前に記述されているようにして（Ｂｕｒｇｅｒら、１９９０、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５４：１５６９−１５７５）、ＨＤＬタンパク質をゲル切片から電気溶出によって分離した。簡単に述べると、脱脂ＨＤＬタンパク質１ｍｇを非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。ゲルを０．３Ｍ　ＣｕＣｌ２で染色した（Ｌｅｅら、１９８７、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６：３０８−３１２）。検出されたバンド（Ｍｒ＝５６，０００−６６，０００、５０，０００、２８，０００、及び１８，０００）を切り出し、脱染色して、５ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．１％ＳＤＳを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ及び３８４ｍＭグリシン（ｐＨ≡８．３）中で５時間電気溶出した。電気溶出したタンパク質をアセトン中で沈殿させることによってＳＤＳを除去した。タンパク質を凍結乾燥し、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＮａＮ３、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び２Ｍ塩化グアニジニウムを含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．３中に再懸濁して、その後ＰＢＳで透析した。代替的には、脱脂したＨＤＬからのタンパク質を、０．１Ｍ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＮａＮ３、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、及び２Ｍ塩化グアニジニウムを含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４中で可溶化し、同じ緩衝液中で平衡させたＳｕｐｅｒｄｅｘ　Ｓ７５（７５×１．６ｃｍ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でのゲルろ過に供した。Ｍｒ＝２８，０００に対応する分画をプールし、濃縮して、ＰＢＳ中で透析し、それらの阻害活性を調べた。Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ　Ｃｏｒｐ．（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、カタログ番号１７８４７２からのマウスモノクローナル抗体を使用して、分画をウエスタンブロットによってそれらのアポ−Ａ−１含量に関して分析した。
【０２８５】
ｍＲＮＡの定量。ＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造者の手順に従って全ＲＮＡをＴＨＰ−１細胞及び単球から単離した。ＴＮＦ−α用のアンチセンスリボプローブを加えた市販のｈｃｋ２鋳型セット付き「ＲＮアーゼプロテクションアッセイシステム」キット（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、単球とＴＨＰ−１細胞中のｍＲＮＡを定量するためにそれぞれ２μｇと１０μｇの全ＲＮＡを使用した。ＴＮＦ−αアンチセンスリボプローブは、Ｄｒ．Ｃ．Ｖ．Ｊｏｎｇｅｎｅｅｌ（Ｌｕｄｗｉｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌａｕｓａｎｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より提供されたｐＳＰ６５／ｈＴＮＦプラスミドを線形化した後、ＳＰ６　ＲＮＡポリメラーゼで調製したＴＮＦ−α　ｃＤＮＡ鋳型から得た。
【０２８６】
実験結果。
【０２８７】
ヒト血清は単球とＴＨＰ−１細胞の両方のＴ細胞シグナル伝達を阻害した。
ヒト血清（ＨＳ）がサイトカインの産生を阻害することによって抗炎症作用を示すかどうかを調べるため、１０％ＦＣＳ又はＨＳのいずれかを補足した培地中で分離していないＰＢＭＣをＰＨＡによって刺激した。ＦＣＳで培養したＰＢＭＣに比べてＨＳで培養したＰＢＭＣではＴＮＦ−αとＩＬ−１βの両方の産生が阻害された（図２Ａ）が、細胞増殖はＨＳとＦＣＳで同様であった（図２Ｂ）。単球中では刺激Ｔ細胞との直接接触によってＰＢＭＣのサイトカイン産生が上昇したと考えられるので、固定して刺激したＴリンパ球又はＨＵＴ−７８細胞あるいはＨＵＴ−７８細胞からの原形質膜のいずれかをＰＢＭＣ又はＴＨＰ−１単球性細胞に加えたいくつかの培養系において、ＨＳの阻害作用を検討した。誘導されたＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生を測定した（図３）。
【０２８８】
末梢血から分離したＴリンパ球をＰＨＡとＰＭＡで刺激し、固定して、ヒト血清（ＨＳ）又は胎児ウシ血清（ＦＣＳ）の存在下で、すなわち２０％の最終血清濃度でＴＨＰ−１細胞に加えた。これらの条件下で、ＴＨＰ−１細胞によるＩＬ−１βの産生はＨＳによって用量依存的に阻害されたが、ＦＣＳによっては阻害されなかった（図３Ａ）。これはＨＳにおける阻害活性の存在を明らかにしている。ヒト臍帯血清（ＣＢＳ）１０％濃度でごくわずかに阻害性であり（図２Ａ）、成人血清においてのみ阻害活性が存在することを示唆した。
【０２８９】
阻害が接触活性化された単球に特異的であることを確認するため、漸増濃度のＨＳの存在下でＴＨＰ−１細胞を固定して刺激したＨＵＴ−７８細胞又はＬＰＳとＰＭＡのいずれかによって刺激した。固定して刺激したＨＵＴ−７８細胞とＴＨＰ−１細胞の接触時に産生されるＩＬ−１βはＨＳによって用量依存的に阻害されたが、ＬＰＳとＰＭＡによって誘導されたＩＬ−１βは、ＨＳ濃度に依存して刺激されるか又は不変であった（図３Ｂ）。これは、ＨＳの阻害作用が、ＴＨＰ−１細胞及び新鮮単離したＴリンパ球のＴ細胞シグナル伝達を対象とすること、そしてＨＵＴ−７８細胞系統が刺激時に活性化因子を発現したことを明らかにしている（図３、Ａ及びＢ）。
【０２９０】
刺激したＴ細胞の原形質膜は、ＴＨＰ−１細胞及び新鮮単離した単球におけるＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生を誘導した（図３、Ｃ−Ｆ）。しかし、単球はＴＨＰ−１細胞よりも刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜との接触活性化に対してより感受性であり、ＴＨＰ−１細胞は活性化のために１０倍高い量の膜を必要とした。実際に、ＩＬ−１βとＴＮＦ−αの産生は、刺激Ｔ細胞／単球の０．１という低い細胞比に等しい量の単離した膜によって開始されたが、一方ＴＨＰ−１細胞では２の比率の刺激Ｔ細胞／ＴＨＰ−１細胞でサイトカイン産生が認められた（図３、Ｃ−Ｆ）。両方の細胞型で同様のレベルのＩＬ−１βが誘導された（ず３、Ｄ及びＦ）が、ＴＮＦ−αのレベルは単球よりもＴＨＰ−１細胞において２０倍低かった。
【０２９１】
それ故、種々のサイトカインに関する阻害の程度は標的細胞型に依存した。実際に、単球ではＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生が同じ程度に阻害され、０．２５から１．０のＴ細胞当量／単球の範囲の膜用量でそれぞれ約８５％と約９１％の阻害に達した。ＴＨＰ−１細胞では、ＴＮＦ−α産生の阻害はＩＬ−１βの阻害を下回り、２．５から１０のＴ細胞当量／単球の範囲の膜用量でそれぞれ約６９％と約８９％であった。これは、ＴＮＦ−αとＩＬ−１βが同程度に阻害される単球に比べて、ＴＨＰ−１細胞ではＴＮＦ−α産生の阻害がＩＬ−１βの阻害よりも効率的でないことを示唆する。これらのデータは、単球によるＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生の引き金となる上で、刺激Ｔ細胞との直接接触が高い効力を持つことを確認し、ＨＳにおいて阻害機序あるいは阻害因子が存在するという仮説を裏付けた。さらにＨＳの阻害成分と阻害機序を同定するため、ＴＨＰ−１細胞と刺激ＨＵＴ−７８細胞からの膜を使用した。
【０２９２】
単球のＴ細胞シグナル伝達を阻害するＨＳ因子の分離。阻害因子を同定するため、Ｂｌｕｅ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ファーストフロー、Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）ファーストフロー、フェニルＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）６ファーストフロー、及びＳｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）での連続クロマトグラフィーによってＨＳを分別した。分画２３−２６において（図４Ａ）、すなわちＭｒ＝１７９×１０３±４６×１０３（平均±ＳＤ、ｎ＝４阻害分画で阻害活性を回収した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析において、阻害活性は２８ｋＤａタンパク質バンドの濃縮と相関した（図４、表１）。Ｎ末端マイクロシーケンス法は、このバンドが高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）の主要タンパク質成分であるアポリポタンパク質、（アポ）Ａ−１であることを証明した。これは、それぞれＨＤＬとアポ−Ａ−１を分離するゲルろ過とＳＤＳ−ＰＡＧＥのＭｒ分析の違いを説明した（図４、Ａ及びＢ）。これらのデータは、ＨＤＬ粒子中に阻害因子が含まれることを明らかにした。
【０２９３】
ＨＤＬのタンパク質成分は単球のＴ細胞シグナル伝達を阻害した。いずれのＨＤＬ成分が阻害性であるかを調べるため、連続高密度遠心分離（Ｈａｖｅｌら、１９５５、Ｊ．Ｃｌｔｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．３４：１３４５−１３５３）によってＨＳを分別し、血清タンパク質からリポタンパク質を分離した。分離したリポタンパク質と血清タンパク質をＰＢＳで透析し、刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化したＴＨＰ−１細胞におけるそれらの阻害作用を調べた。ＨＤＬ分画では阻害活性が回収されたが、ＨＤＬと同じ超遠心分離（ｄ＝１．２３）を用いて回収したＬＤＬと血清タンパク質は阻害性ではなかった（図５）。ＨＤＬ分画を脱脂又はプロテイナーゼＫによるタンパク質分解処理に供して、ＨＤＬのいずれの成分が、すなわちタンパク質又は脂質のいずれが阻害因子であるかを決定した。ジエチルエーテル／メタノール処理によって得たＨＤＬタンパク質は高い阻害活性を示したが、プロテイナーゼＫによるタンパク質分解消化後に得たＨＤＬ脂質はもはや阻害性ではなかった（図５）。ＴＮＦ−αとＩＬ−１βの両方の産生がＨＤＬタンパク質によって阻害された（図５、Ａ及びＢ）。これは、ＨＳの阻害因子がＨＤＬのタンパク質成分であったことを確認している。
【０２９４】
アポ−Ａ−１は単球のＴ細胞シグナル伝達のＨＳ阻害因子である。アポ−Ａ−１が阻害作用を示すかどうかを調べるため、市販の精製アポ−Ａ−１（Ｓｉｇｍａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を試験した。アポ−Ａ−１は、ＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化したＴＨＰ−１細胞においてＴＮＦ−αとＩＬ−１βの両方の産生を用量依存的に阻害した（図６Ａ）。図３から既に明らかなように、ＴＮＦ−αの産生はＩＬ−１β産生ほどには阻害されなかった。アポ−Ａ−１製剤は３％の同定されない夾雑物を含む（供給業者に従えば）ので、阻害が実際にアポ−Ａ−１によるものであることを確認しなければならなかった。脱脂したＨＤＬからのタンパク質を分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。銅ろ過した後、バンド（Ｍｒ：５６，０００−６６，０００、５０，０００、２８，０００、及び１８，０００）を切り出して電気溶出した。Ｍｒ＝２８，０００及びＭｒ＝１８，０００のバンドにおいて阻害活性を回収した（図６、Ｂ及びＣ）。ウエスタンブロット分析によって評価したときアポ−Ａ−１凝集物を含んでいた、２倍のＭｒ＝５６，０００−６６，０００のバンドは有意の阻害活性を示さなかった（データは示していない）。ＴＮＦ−αとＩＬ−１βの両方の産生が電気溶出したタンパク質によって阻害された。ＴＮＦ−αはＩＬ−１βよりも低い度合で阻害され、図２からの結果を確認した。ウエスタンブロット分析によって明らかにされたようにすべての阻害分画がアポ−Ａ−１を含み（図６Ｅ）、アポ−Ａ−１が単球のＴ細胞シグナル伝達の阻害因子であることを示した。実際に、もう１つ別のＨＤＬアポリポタンパク質が、タンパク質及びタンパク質溶解断片の大きさに関してアポ−Ａ−１と同じ挙動を示すという可能性は極めて低い（図６Ｅ、レーンａ及びｂ）。代替的に、脱脂ＨＤＬからのタンパク質をＳｕｐｅｒｄｅｘ　Ｓ７５でのゲルろ過に供した。Ｍｒ＝２８，０００±１０，０００に対応するプール分画は阻害活性を示した（図６Ｄ）。これらの分画はウエスタンブロット分析によって測定したときアポ−Ａ−１を含んでおり（図６Ｅ、レーンｃ）、アポ−Ａ−１が阻害因子であることをさらに確認した。
【０２９５】
ＨＤＬはアポ−Ａ−１結合を通して刺激Ｔ細胞と相互作用する。ＨＤＬの阻害作用が刺激したＴ細胞膜又はＴＨＰ−１細胞へのその潜在的な結合によるものであるかどうかを調べるため、ＴＨＰ−１細胞又は刺激したＨＵＴ−７８細胞から分離した膜のいずれかをＦＣＳ、ＨＳ、又は単離ＨＤＬの存在下又は不在下でプレインキュベートした。洗浄後、刺激ＨＵＴ−７８細胞からの膜又はＴＨＰ−１細胞の残存活性化能力を評価した。刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜をＨＳ又はＨＤＬと共にインキュベートしたときのみ、ＩＬ−１β産生の阻害が認められた（図７Ａ）。ＦＣＳ、ＨＳ、又はＨＤＬのいずれかとのＴＨＰ−１細胞のインキュベーションはＩＬ−１βの産生を阻害しないと思われた（図７Ａ）。これらの結果は、ＨＳ及びＨＤＬの阻害作用は主として刺激されたＴ細胞の表面で発現される活性化因子が対象であったことを明らかにしている。
【０２９６】
阻害因子が刺激されたＴ細胞上の表面因子と相互作用したことをさらに確認するため、単離したＨＤＬをフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識し、種々の細胞型への結合をフローサイトメトリーによって評価した。ＴＨＰ−１細胞上ではＦＩＴＣ−ＨＤＬの結合は認められなかった（図７Ｂ）が、非複合ＦＩＴＣ対照と比較すると、ＦＩＴＣ−ＨＤＬと共にインキュベートしたときには単球の蛍光がわずかに増強された（図７Ｃ）。刺激していないＨＵＴ−７８細胞に対してはＦＩＴＣ−ＨＤＬの低いレベルの結合が認められたが、刺激したＨＵＴ−７８細胞はＦＩＴＣ−ＨＤＬに結合して、２つの蛍光ピークを示し、少なくとも２つの異なるＨＤＬ結合部位が存在することを示唆した（図７、Ｄ及びＥ）。より低いＦＩＴＣ−ＨＤＬ濃度では、１つの蛍光ピークだけが認められた。抗アポ−Ａ−１抗体の存在下では、より低い蛍光強度へのシフトが認められ、ＨＤＬがアポ−Ａ−１特異的結合を通して刺激Ｔ細胞と相互作用したことを明らかにした（図７Ｆ）。これらの結果は共に、ＨＤＬが刺激Ｔ細胞と選択的に相互作用することを示しており、アポ−Ａ−１に関わる阻害活性がＴ細胞上の表面因子を対象とすることを示唆している。
【０２９７】
定常状態のｍＲＮＡレベルの最大阻害は、刺激と同時に又は刺激直後にアポ−Ａ−１を加えた場合にだけ認められた。アポ−Ａ−１の機序をさらに解明するため、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１β　ｍＲＮＡの定常状態レベルへの単離アポ−Ａ−１の阻害作用を評価した。種々の時点で加えたアポ−Ａ−１の存在下に、刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜でＴＨＰ−１細胞を刺激した。アポ−Ａ−１は、刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜で活性化したＴＨＰ−１細胞においてＴＮＦ−α及びＩＬ−１β　ｍＲＮＡの定常状態レベルを低下させた（図８、Ａ及びＣ）。ＴＮＦ−α　ｍＲＮＡの阻害はＩＬ−１β　ｍＲＮＡの阻害ほど顕著ではなく、タンパク質産生レベルに関して得たデータと相関する。ＴＮＦ−α　ｍＲＮＡの阻害は、０の時点又はその直後にアポ−Ａ−１が存在したときにのみ認められ、ＴＮＦ−α産生の阻害が刺激ＨＵＴ−７８細胞上の活性化因子とアポ−Ａ−１の相互作用によるものであることを示唆した。刺激Ｔリンパ球の膜によって活性化したＰＢＭＣに関しても同様の結果が得られ（図８、Ｂ及びＤ）、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１β　ｍＲＮＡの両方の定常状態レベルがアポ−Ａ−１又はＨＳによって低下したが、ｍＲＮＡ誘導はＴＨＰ−１細胞よりも単球においてより速やかであった。単球では、定常状態のｍＲＮＡレベルの阻害は、やはり膜と一緒に又はその直後にアポ−Ａ−１を加えたときに最大であった（図８Ｄ）。活性化の３０分後にアポ−Ａ−１を加えた場合には阻害を認めなかった。後者の結果は、アポ−Ａ−１が細胞型に関わりなく接触を介した単球の活性化を阻害したことを示しており、図３のデータを確認している。
【０２９８】
アポ−Ａ−１は抗原活性化ＰＢＭＣにおけるＴＮＦ−α及びＩＬ−１β産生を阻害する。アポ−Ａ−１が、ＰＨＡによって刺激したＰＢＭＣにおけるサイトカイン産生の阻害の原因となる因子であることを確認するため、アポ−Ａ−１及び脱脂ＨＤＬの存在下又は不在下でＰＢＭＣをＰＨＡ又は破傷風トキソイド（ＴＴ）のいずれかによって刺激した。ＴＴ刺激ＰＢＭＣではＰＨＡ刺激ＰＢＭＣにおけるよりもサイトカイン産生が低かったが、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１β産生は刺激に関わりなくアポ−Ａ−１又は脱脂ＨＤＬによって阻害された（図９）。ＴＮＦ−α産生はＩＬ−１βよりも低い度合で阻害され、図２に示す結果を確認した。これは、（ｉ）図２に示す非分別ＨＳによるサイトカイン産生の阻害はアポ−Ａ−１によるものであったこと、そして（ｉｉ）アポ−Ａ−１はＴ細胞刺激に関わりなく単球の活性化を阻害することを明らかにしており、抗原特異的刺激及びマイトジェン刺激が、発現のレベルは異なるが、Ｔリンパ球上の同様の活性化因子を誘導することを示唆している。さらに、これらの結果は、単球が刺激されたＴ細胞と接触したときにのみＴＮＦ−α及びＩＬ−１βがＰＢＭＣにおいて誘導されたことを確認している。
【０２９９】
組換え突然変異体アポ−Ａ−１Ｍｉｌａｎｏは阻害活性を示す。アポ−Ａ−１と同様の物理化学特性を持つ少量の夾雑タンパク質が阻害因子でありうる可能性を排除するため、アポ−Ａ−１の組換え突然変異体（Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ　Ｇ．Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙの好意により提供された）の活性についても接触アッセイで試験した。突然変異体タンパク質、アポ−Ａ−１Ｍｉｌａｎｏ（アポ−Ａ−１Ｍ）は１個のＡｒｇ／Ｃｙｓ置換によって野生型アポ−Ａ−１とは異なり、ジスルフィド結合二量体の形成を導く（Ｃａｌａｂｒｅｚｉら、１９９４）。一般に、アポ−Ａ−１Ｍのインビトロ及びインビボ特性は野生型アポ−Ａ−１とごくわずかしか異ならない。Ａ−１Ｍ／Ａ−１Ｍを含むＨＤＬ粒子は、細胞からのコレステロール流出を促進する上ではアポ−Ａ−１を含むものよりも効率的であり、レシチンコレステロールアセチルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）酵素にとっては効率が低く、内皮細胞上の接着分子のサイトカイン誘導性発現を阻害する場合の効率は等しい（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉｎｉら、１９９８）。図１０に示すように、組換え突然変異体アポ−Ａ−１は、精製された市販のアポ−Ａ−１と等しい効率で接触活性化された単球におけるＩＬ−１βの産生を阻害し、やはりアポ−Ａ−１が阻害因子であることを確認した。
【０３００】
アポ−Ａ−１のドメインＩＩ及びＩＩＩを含むフラグメントは阻害活性を示す。ＴＨＰ−１細胞は、１０％ヒト血清、１００μｇ／ｍｌのアポ−Ａ−１、１００μｇ／ｍｌのアポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、又は５０μｇ／ｍｌのアポ−Ａ−１のドメインＩＩ及びＩＩＩを含むフラグメント（ＤＩＩ／ＤＩＩＩ）の存在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞（ＨＵＴｓ）の膜との接触によって活性化された。図１１に示すように、ＤＩＩ／ＤＩＩＩはＴＨＰ−１細胞によるＩＬ−１β及びＴＮＦ−αの産生を阻害した。
【０３０１】
結果は、アポ−Ａ−１、すなわち「陰性」急性期タンパク質によって誘発される抗炎症作用を示している（Ｇａｂａｙら、１９９９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０：５６２−５６９）。典型的には他の刺激（すなわちＬＰＳ及びＰＭＡ）による単球の活性化はＨＳ阻害因子、すなわちアポ−Ａ−１によって影響されなかったので、この作用は特異的に単球のＴ細胞シグナル伝達を対象とすると思われる。さらに、ＨＳ又はＨＤＬで処理した刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜は処理していない膜よりも低いサイトカイン誘導能力を示し、一方ＴＨＰ−１細胞のＨＤＬ処理は認められる作用を示さなかった。これは、阻害作用が主として刺激されたＴ細胞の表面で発現される活性化因子に向けられたことを明らかにしている。アポ−Ａ−１の作用機序は十分には解明されておらず、本発明はいかなる特定機序にも限定されないが、今回の結果は、一部の実施形態に従えば、アポ−Ａ−１が、Ｔ細胞の膜活性化因子と単球上のそれぞれのレセプタとの間の相互作用を特異的に妨げることによってその作用を及ぼしうることを示唆している。
【０３０２】
実施例２：ＡＦＴＩポリペプチドの産生
Ａ．細菌発現
ＰＣＲを用いて、配列の５’及び３’末端に対応するプライマーを使用してＡＦＴＩポリペプチドをコードする鋳型ＤＮＡ配列を増幅する。増幅したＤＮＡ産物は、発現ベクターへの挿入を可能にする制限酵素部位を含むように修飾してもよい。ＰＣＲ産物をゲル精製し、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて発現ベクターに挿入する。ｌｕｘプロモーターとカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含むｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ　Ｎｏ．９８１１３）のような例示的ベクターを、挿入したＤＮＡの方向指示クローニング（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ｃｌｏｎｉｎｇ）のためにＢａｍＨＩ及びＮｄｅｌで消化する。ライゲートした混合物をエレクトロポレーションによって大腸菌宿主菌株に形質転換し、形質転換体をカナマシン耐性に関して選択する。選択したコロニーからのプラスミドＤＮＡを分離し、ＤＮＡ塩基配列決定に供して、挿入物の存在を確認する。
【０３０３】
形質転換した宿主細胞を、誘導の前に３０ｍｇ／ｍｌカナマイシンを含む２×ＹＴ培地中３０℃でインキュベートする。Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ｄｌ−ホモセリンラクトンを３０ｎｇ／ｍｌの最終濃度まで加え、その後３０℃又は３７℃で６時間インキュベーションして遺伝子発現を誘導した。培養の遠心分離、細菌ペレットの再懸濁と溶解、及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による宿主細胞タンパク質の分析によってＡＦＴＩポリペプチドの発現を評価する。
【０３０４】
ＡＦＴＩポリペプチドを含む封入体を次のように精製する。細菌細胞を遠心分離によってペレット化し、水に再懸濁する。細胞懸濁液を音波破砕によって溶菌し、１９５，０００×ｇで５から１０分間遠心分離してペレット化する。上清を廃棄し、ペレットを洗ってホモジナイザーに移す。ペレットをＰｅｒｃｏｌｌ溶液（７５％液体Ｐｅｒｃｏｌｌ、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ）５ｍｌ中で均一に懸濁するまで均質化し、その後希釈して、２１，６００×ｇで３０分間遠心分離する。封入体を含む勾配分画を回収し、プールする。単離した封入体をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０３０５】
大腸菌産生ＡＦＴＩポリペプチドに対応するＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドをゲルから切り出し、基本的にＭａｔｓｕｄａｉｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：１０−３５（１９８７）が述べたようにしてＮ末端アミノ酸配列を決定する。
【０３０６】
Ｂ．哺乳類細胞の産生
ＰＣＲを用いて、配列の５’及び３’末端に対応するプライマーを使用してＡＦＴＩポリペプチドをコードする鋳型ＤＮＡ配列を増幅する。増幅したＤＮＡ産物は、発現ベクターへの挿入を可能にする制限酵素部位を含むように修飾してもよい。ＰＣＲ産物をゲル精製し、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて発現ベクターに挿入する。エプスタイン−バーウイルスの複製起点を含む例示的な発現ベクター、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が、２９３−ＥＢＮＡ−１（エプスタイン−バーウイルス核抗原）細胞におけるＡＦＴＩの発現のために使用しうる。増幅してゲル精製したＰＣＲ産物をｐＣＥＰ４ベクターにライゲートし、２９３−ＥＢＮＡ細胞にリポフェクションする。１００ｍｇ／ｍｌヒグロマイシン中でトランスフェクションした細胞を選択し、生じた薬剤耐性培養を集密まで増殖させる。次に細胞を無血清培地で７２時間培養する。順化培地を除去し、ＡＦＴＩポリペプチド発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０３０７】
ＡＦＴＩポリペプチドの発現は銀染色によって検出しうる。代替的には、ＡＦＴＩポリペプチドをＩｇＧ定常ドメイン又はＦＬＡＧエピトープのようなエピトープ標識との融合タンパク質として生成し、それを、標識ペプチドに対する抗体を用いてウエスタンブロット分析によって検出することができる。
【０３０８】
ＡＦＴＩポリペプチドをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出すか、又はＡＦＴＩ融合タンパク質をエピトープ標識に対するアフィニティークロマトグラフィーによって精製して、ここで述べるようなＮ末端アミノ酸配列分析に供する。
【０３０９】
実施例３：抗ＡＦＴＩポリペプチド抗体の作製
ＡＦＴＩポリペプチドに対する抗体は、生物学的合成又は化学合成によって生成した精製タンパク質又はＡＦＴＩペプチドで免疫することによって入手しうる。抗体を作製するための適当な手順は、ＨｕｄｓｏｎとＨａｙ、「実用免疫学（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、第２版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｈｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９８０）に述べられているものを含む。
【０３１０】
抗体作製のための１つの手順では、動物（典型的にはマウス又はウサギ）にＡＦＴＩ抗原（ＡＦＴＩポリペプチドのような）を注射し、ＥＬＩＳＡによって測定したとき十分な血清力価を持つものをハイブリドーマ産生のために選択する。免疫した動物の脾臓を採集し、単一細胞懸濁液として調製して、そこから脾細胞を回収する。脾細胞をマウス骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞のような；ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＣＲＬ−１５８１）に融合し、２００ＩＵ／ｍｌペニシリン、２００ｍｇ／ｍｌ硫酸ストレプトマイシン、及び４ｍＭ　Ｌ−グルタミンと共にＤＭＥＭ中でインキュベートして、その後ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン；アミノプテリン；チミジン）中でインキュベートする。選択後、各々の融合ウエルから組織培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡによって抗ＡＦＴＩ抗体産生に関して試験する。
【０３１１】
ヒト抗体の産生のためにヒトＩｇ遺伝子座を内包するトランスジェニックマウスの免疫、及び抗体可変ドメインの突然変異誘発によって生成されるもののような合成抗体ライブラリーのスクリーニングなどの、抗ＡＦＴＩ抗体を得るための代替的な手順も使用できる。
【０３１２】
本発明を好ましい実施形態の見地から説明してきたが、変法及び修正が生じることは当業者には明白である。それ故、付属の特許請求の範囲は、特許請求される本発明の範囲内に含まれるそのようなすべての等価変法をカバーすることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ヒトアポリポタンパク質Ａ−１のアミノ酸配列（配列番号２）とポリヌクレオチド配列（配列番号１）。アポ−Ａ−１ポリペプチドは、らせん脂質結合ドメイン（アミノ酸残基４４−６５及び２２０−２４１）、単球からのリポタンパク質媒介のコレステロール流出に関与するドメイン（アミノ酸残基７４−１１１）、レセプタ結合ドメイン（アミノ酸残基１４９−２１９）、主要抗原エピトープドメイン（アミノ酸残基９９−１２０）、ヒンジドメイン（アミノ酸残基９９−１４３）、系統発生的に保存されたドメイン（アミノ酸残基６６−１２０）、及びレクチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ活性に関与するドメイン（アミノ酸残基９０−１１１）を持つ。アポ−Ａ−１ポリペプチドは、８個の両親媒性らせん（アミノ酸残基４４−６５、６６−９８、９９−１２０、１２１−１４２、１４３−１６４、１６５−２０８、２０９−２１９、２２−２４１）、Ｎ末端ペプチド（アミノ酸残基１−４３）、及びＣ末端ペプチド（アミノ酸残基２４２−２４３）を備える。
【図１Ｂ】ＡＦＴＩのアミノ酸配列である配列番号２のフラグメントである、１８ｋＤａのＮ末端フラグメント（アミノ酸残基２５から１９４、ヌクレオチド９２−６０１）。
【図１Ｃ】ＡＦＴＩのアミノ酸配列である配列番号２のフラグメントである、１３ｋＤａのＮ末端フラグメント（アミノ酸残基２５から１４４、ヌクレオチド９２−４５１）。
【図１Ｄ】ＡＦＴＩのアミノ酸配列である配列番号２のフラグメントである、１３ｋＤａのＣ末端フラグメント（アミノ酸残基１５６から２６７、ヌクレオチド４８５−８２０）。
【図２】ヒト血清は、ＰＨＡで刺激したＰＢＭＣにおいてＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの産生を阻害する。ＰＢＭＣ（４×１０５細胞／２００μｌ／穴）を、ＦＣＳ又はＨＳを含む培地中１μｇ／ｍｌのＰＨＡで刺激した。（Ａ）４８時間インキュベーションした後、上清中のＴＮＦ−αとＩＬ−１βを測定した；（Ｂ）７２時間後に増殖（３Ｈ−チミジンの組込み）を測定した。
【図３】ＨＳによる単球及びＴＨＰ−１細胞のＴ細胞シグナル伝達の阻害。（Ａ）ＴＨＰ−１細胞を、漸増用量のＨＳ（ＨＳ、黒い記号）又はＦＣＳ（白い記号）の存在下に８Ｔリンパ球／ＴＨＰ−１細胞の細胞比で、固定して刺激したＴリンパ球によって４８時間活性化した。（Ｂ）ＴＨＰ−１細胞を、漸増用量のＨＳの存在下に８ＨＵＴ−７８細胞／ＴＨＰ−１細胞の細胞比で固定して刺激したＨＵＴ−７８細胞（黒い記号）又は１０μｇ／ｍｌのリポ多糖類（ＬＰＳ）と５ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（白い記号）のいずれかによって４８時間活性化した。ＴＨＰ−１細胞（ＣとＤ）及び単球（ＥとＦ）を、１０％ＨＳの存在下又は不在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞から分離した漸増用量の膜によって４８時間活性化した。ＴＮＦ−α（ＣとＥ）及びＩＬ−１β（ＤとＦ）を培養上清で測定した。結果は平均±ＳＤで表しており、（Ｂ）を除いてｎ＝３であり、（Ｂ）ではｎ＝７である。ＡとＢでは、１００％は、阻害因子なしで４８時間培養した後のＩＬ−１βの産生を表わす。
【図４】ＨＳの連続クロマトグラフィー分別のＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００溶出プロフィールとＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。（Ａ）Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰから溶出した阻害性分画をプールし、濃縮して、ＰＢＳ中で平衡させたＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００でのゲルろ過に供した。カラムはゲルろ過クロマトグラフィー用分子量マーカーキット（Ｓｉｇｍａ）で検定した。分画をタンパク質含量（ＯＤ２８０ｍｍ、点線）及び阻害活性（黒丸）に関して試験した。（Ｂ）各段階後に阻害性分画をプールし、１０％ポリアクリルアミドゲル上のレーンごとに１０μｇのタンパク質アリコートを充填した；（ａ）ＨＳ；（ｂ）Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）の漏出点；（ｃ）Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）からの阻害性分画のプール；（ｄ）Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）　ＨＰからの阻害性分画のプール；（ｅ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）　２００からの阻害性分画のプール；ゲルはクマシーブルーで染色した。
【図５】ＨＤＬのタンパク質分画における阻害活性の存在。ＨＳを高密度遠心分離によって分別し、ＨＤＬと血清タンパク質分画の阻害活性を分析した。単離したＨＤＬをさらに脱脂（脱脂ＨＤＬ）又はプロテイナーゼＫによるタンパク質分解消化（プロテイナーゼＫ処理ＨＤＬ）に供した。分画の阻害活性をＨＳ（全血清）と比較した。全血清と血清タンパク質についての最終タンパク質濃度は７ｍｇ／ｍｌ（黒い柱）、３．５ｍｇ／ｍｌ（灰色の柱）、及び０．７ｍｇ／ｍｌ（白い柱）であった。ＨＤＬと脱脂ＨＤＬの最終タンパク質濃度は０．２ｍｇ／ｍｌ（黒い柱）、０．１ｍｇ／ｍｌ（灰色の柱）、及び０．０２ｍｇ／ｍｌ（白い柱）であった。プロテイナーゼＫ処理ＨＤＬの量はタンパク質分解前のタンパク質濃度に従って評価し、未処理ＨＤＬと同様であった。結果は、阻害因子なしでのＩＬ−１又はβＴＮＦ−α産生のパーセンテージを表わす（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【図６】細胞へのＨＤＬ結合の分析。（Ａ）刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜へのＨＤＬの結合によるＴ細胞シグナル伝達の阻害；刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜（白い柱）、ＴＨＰ−１細胞（斜線の柱）、又は両方（黒い柱）を、ＦＣＳ（１０％）、ＨＳ（１０％）又はＨＤＬ（０．３２ｍｇ／ｍｌタンパク質）の不在下（−）又は存在下に氷上で４５分間プレインキュベートした；洗浄後、処理（斜線の柱と黒い柱）及び未処理（白い柱）ＴＨＰ−１細胞を、処理した（白い柱と黒い柱）又は処理していない（斜線の柱）刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜の存在下で培養した；４８時間培養した培養上清においてＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生を測定した。結果は、阻害因子なしで測定した産生を１００％としたパーセンテージで表しており、平均±ＳＤ、ｎ＝６である。（Ｂ−Ｆ）非複合ＦＩＴＣとＦＩＴＣ−ＨＤＬ（０．１ｍｇ／ｍｌ）の結合を、ＴＨＰ−１細胞（Ｂ）、単離したヒト単球（Ｃ）、刺激していないＨＵＴ−７８細胞（Ｄ）及び刺激したＨＵＴ−７８細胞（Ｅ）に関してフローサイトメトリーによって評価した。ＦＩＴＣを陰性対照として使用した。（Ｆ）精製抗アポ−Ａ−１抗体（１００μｇ／ｍｌ）（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ；カタログ番号ＨＢ−９５７０）の存在下又は不在下でのＦＩＴＣ−ＨＤＬ（１０μｇ／ｍｌ）の刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜への結合。
【図７】アポ−Ａ−１は、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化したＴＨＰ−１細胞においてＴＮＦ−αとＩＬ−１βの産生を阻害する。（Ａ）ＴＨＰ−１細胞を、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より購入した漸増濃度のアポ−Ａ−１の存在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化した；４８時間後、培養上清中でＴＮＦ−αとＩＬ−１βを測定した。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３を表している。（ＢとＣ）ＴＨＰ−１細胞を、脱脂ＨＤＬの分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥから電気溶出した漸増濃度のタンパク質の存在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化した：（Ｂ）（Ｍｒ＝２８，０００及び（Ｃ）（Ｍｒ＝１８，０００。（Ｄ）ＴＨＰ−１細胞を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　Ｓ７５でのゲルろ過によって分離した漸増濃度のアポ−Ａ−１（Ｍｒ＝２８，０００）の存在下で、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜によって活性化した。４８時間後、培養上清中でＴＮＦ−αとＩＬ−１βを測定した。結果は平均±ＳＤ、ｎ＝３を表し、１００％は阻害因子なしで産生されたサイトカインの量である。（Ｅ）阻害活性について試験した単離分画を、ウエスタンブロット法によってアポ−Ａ−１含量に関して分析した；（ａ）２８，０００の電気溶出したバンド、（ｂ）１８，０００の電気溶出バンド、及び（ｃ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）Ｓ７５ゲルろ過から回収された２８，０００タンパク質。
【図８】アポ−Ａ−１はＴＮＦ−αとＩＬ−１β　ｍＲＮＡの定常状態レベルを低下させる。（ＡとＢ）ＲＮアーゼプロテクションアッセイのオートラジオグラム。（Ａ）未処理（ａ）又はＴＨＰ−１活性化の種々の時点で加えたアポ−Ａ−１（２００μｇ／ｍｌ）の存在下又は不在下に（ｃ−ｅ）、３時間、刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜（２００μｇタンパク質／ｍｌ）によって活性化した（ｂ−ｅ）、ＴＨＰ−１細胞（５×１０６細胞／ｍｌ）：ｃ（０時間）；ｄ（１時間）；及びｅ（２時間）。（Ｂ）未処理（ａ）又はＴＨＰ−１活性化の種々の時点で加えたアポ−Ａ−１（２００μｇ／ｍｌ）の存在下又は不在下に（ｃ−ｅ）、１時間、刺激Ｔリンパ球の膜（４０μｇタンパク質／ｍｌ）によって活性化した、（ｂ−ｅ）単球（１０×１０６細胞／ｍｌ）：ｃ（０分）；ｄ（１５分）；及びｅ（３０分）。（ＣとＤ）ＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡ＝１のデンシトメトリーで基準化し、阻害因子なしでの活性化ＴＨＰ−１細胞（Ｂ）又は単球（Ｃ）のｍＲＮＡレベルを１００％としたパーセンテージで表した、それぞれオートラジオグラフィーＡとＢのデンシトメトリー分析。結果は３つの異なる実験を代表している。
【図９】アポ−Ａ−１は、ＰＨＡ又は破傷風トキソイド（ＴＴ）によって刺激したＰＢＭＣ中のＴＮＦ−αとＩＬ−１βを阻害する。ＰＢＭＣ　４×１０５細胞／２００μｇ／穴を、指示されている用量のアポ−Ａ−１とＨＤＬの存在下に１μｇ／ｍｌのＰＨＡ（ＡとＢ）又は１０μｇ／ｍｌのＴＴ（ＣとＤ）によって刺激した。
【図１０】組換えヒトアポ−Ａ−１Ｍｉｌａｎｏは阻害作用を示す。ＴＨＰ−１細胞を、ヒト血清（ＨＳ）の連続希釈、Ｓｉｇｍａからのアポリポタンパク質Ａ−１（出発濃度＝２ｍｇ／ｍｌ）、及び組換えアポリポタンパク質Ａ−１Ｍｉｌａｎｏ（出発濃度＝２ｍｇ／ｍｌ）の存在下に、刺激ＨＵＴ−７８細胞の膜で刺激した。両アポリポタンパク質（浄化及び組み換え）は、阻害作用を表示する。
【図１１】アポ−Ａ−ＩＩ及びアポ−Ａ−１のフラグメントによるＴＨＰ−１細胞の接触媒介活性化の阻害。ＴＨＰ−１細胞を、指示されている阻害因子の存在下に、刺激したＨＵＴ−７８細胞の膜（ＨＵＴ）によって活性化した。アポ−Ａ−１、アポ−Ａ−ＩＩ及びアポ−Ａ−１のドメインＩＩ及びＩＩＩを含むフラグメントによってＩＬ−１βとＴＮＦ−αの両方の産生が阻害された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500105.tif 000151
【国際調査報告】
2004500105.tif 000152
2004500105.tif 000153
2004500105.tif 000154
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