(57)【要約】本発明は、試料中のバイオマスを検出および／または測定する方法であって、ＮＡＤ（Ｐ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの合計プールを、試料中のＮＡＤ（Ｐ）のＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの転化により、バイオマスの存在についてのマーカーとして測定することを特徴とする、前記方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のバイオマスの存在を検出するための方法であって、ＮＡＤ（Ｐ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの合計プールを、試料中のＮＡＤ（Ｐ）のＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの転化により、バイオマスの存在についてのマーカーとして測定することを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
存在するバイオマスを検出し、測定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＮＡＤ（Ｐ）のＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの転化を、基質Ｓ１および酵素Ｅ１を用いて酵素的に行うことを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
検出を、蛍光定量的に行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
検出を、電極表面における電位または電圧の変化をもたらす、電極表面におけるＮＡＤ（Ｐ）ＨのＮＡＤ（Ｐ）への転化により行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
検出を、第２の酵素Ｅ２および第２の基質Ｓ２を加えることにより行い、これにより、以下の反応
【化１】
2004508833.tif 000008
が発生し、Ｓ２のＰ２への転化により、色の変化、蛍光の変化、ルミネセント反応または電極表面における電位の変化をもたらす電気化学的反応を含む、吸収スペクトルの変化であるシグナルが発生することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
基質Ｓ１およびＳ２を、試料に過剰に加えることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｅ１が、乳酸デヒドロゲナーゼであり、Ｅ２が、ジアホラーゼであり、Ｓ１が、乳酸リチウムであり、Ｓ２が、ニトロブルーテトラゾリウムであることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
Ｅ１が、グルコースデヒドロゲナーゼであり、Ｅ２が、ジアホラーゼであり、Ｓ１が、グルコースであり、Ｓ２が、ニトロブルーテトラゾリウムであることを特徴とする、請求項６または７に記載の方法。
【請求項１０】
試料を、２５〜４５℃の温度に加熱することを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
バイオマスの量を検出する前に、洗浄剤および随意にその後中和剤を、試料に適用することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法の、微生物または試料の衛生状態の定量および／または検出への使用。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法において用いるのに適する試験キットであって、少なくとも酵素Ｅ１およびＥ２並びに基質Ｓ１およびＳ２を、１つまたは２つ以上の容器中に含むことを特徴とする、前記試験キット。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法において用いるために適する試験ストリップであって、少なくとも酵素Ｅ１およびＥ２並びに基質Ｓ１およびＳ２を、１つまたは２つ以上の位置において、この上に乾燥して含むことを特徴とする、前記試験ストリップ。
【請求項１５】
請求項１〜１１のいずれかに記載の方法において用いるために適する側方流れ試験装置であって、液体を毛管現象により沿って輸送することができる乾燥マトリックス材料を含み、少なくとも試料を受けるための開始帯域および、少なくとも１種の酵素がこの中に固定化されている反応帯域を有する試験ストリップを含むことを特徴とする、前記側方流れ試験装置。
【請求項１６】
基質Ｓ１およびＳ２が上に乾燥された試薬帯域並びに、酵素Ｅ１およびＥ２が上に固定化されている反応帯域を含むことを特徴とする、請求項１５に記載の側方流れ試験装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド化合物の酵素的アッセイのための方法に基づく、バイオマスの検出および測定に関する。
【０００２】
発明の背景
試料中に存在する生物学的物質（「バイオマス」）のレベルの評価は、広範囲の用途において価値がある。いくつかの用途において、評価を、プロセスをモニタリングするために、例えば発酵プロセスにおける微生物および他の微生物学的培養物のレベルを決定するために、行う。他の用途において、バイオマスの測定により、環境的衛生状態および清浄性の間接的指標が得られる。これは、特に、食物製造および貯蔵に用いられる領域の清浄性およびまた臨床的環境内の領域の清浄性のチェックにおいて関連する。他の用途において、バイオマスの測定を用いて、このような汚染物を含まないことが期待される試料、例えば石油化学製品、潤滑油、食料品、工業プロセス水並びに他の水供給および給源における不所望な微生物または他の生物学的物質の存在を、直接的に検出および測定することができる。
【０００３】
バイオマスの検出および測定に有用である種々の手法がある。バイオマスは、例えばポテンシオスタットを用いる誘電または容量特性から計算された、細胞質膜内に包囲された溶液の容積比から評価された（ＧＢ ２ ２９８ ０４６）。第２の方法は、好適な電極を用いる溶液の酸素消費を測定する（ＧＢ ２ ２８０ ４３１）。バイオマスはまた、微生物の懸濁液の光学的（ＵＳ ４ ８９３ ９３５）または沈降（ＤＥ ３８ １９ ５４０）特性から、直接決定することができる。これらの方法はすべて、バイオマスのレベルが高い用途において、例えば工業的および市街地の流出流の分析においてのみ用いることができる。その理由は、これらが、比較的感受性が低いからである。これらの方法はまた、高価な計器装備に依存する。
【０００４】
発酵槽およびバイオリアクター中に成長する細菌、酵母および哺乳類細胞の成長は、培養物の直接的な蛍光から評価されており、この半分より多くは、細胞内ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨから生じる（Ｚａｂｒｉｓｋｉｅ， Ｄ．Ｗ． およびＨｕｍｐｈｒｅｙ， Ａ．Ｅ． 「培養蛍光の測定による発酵バイオマス濃度の評価」（１９７８） Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３５， ３３７−３４３）。この方法は、比較的感受性が低く、生存可能な細胞の数が極度に高い用途に好適であるに過ぎない。ＮＡＤ（Ｐ）ではなくＮＡＤ（Ｐ）Ｈが、蛍光シグナルを発生するため、この方法は、細胞変化の代謝状態としての細胞内ＮＡＤ（Ｐ）：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比率における変動により生じた人工物の傾向がある。また、細胞数の定量を、内部スクリーニング効果、培地組成の変化（特にｐＨ）および細胞外培地中の蛍光化合物により妥協させることができる。
【０００５】
バイオマスの検出および測定に有用な他の手法は、ＡＴＰを１種の基質として用いる酵素反応による、光の発生の測定である。その理由は、この分子は、細胞起源の生物学的物質中に存在する、遍在する成分であるからである（Ｈａｗｒｏｎｓｋｙｊ， Ｊ．Ｍ． およびＨｏｌａｈ， Ｊ． 「ＡＴＰ：普遍的な衛生モニター」（１９９７） Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８， ７９−８４）。ＡＴＰは、ホタルルシフェラーゼ（ＥＣ　１．１３．１２．７）および適切な物質の存在下で好適な光検出装置により測定可能な光を発生する。あるいはまた、細胞酵素アデニレートキナーゼを、バイオマスの検出および測定に、ホタルルシフェラーゼを用いることにより用いて、ＡＤＰを試料に加えた際のＡＴＰのこの生成を測定することができる（Ｓｑｕｉｒｒｅｌｌ， Ｄ．Ｊ． およびＭｕｒｐｈｙ， Ｍ．Ｊ． 「生物ルミネセンスおよび化学ルミネセンス：基本的および応用態様」、Ｃａｍｐｂｅｌｌ， Ａ．Ｋ．， Ｋｒｉｃｋａ， Ｌ．Ｊ． ａｎｄ Ｓｔａｎｌｅｙ編、Ｐ．Ｅ． ｐｕｂ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ ｓｏｎｓ， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ， ＵＫ．中の「生物ルミネセントアッセイにおける細胞マーカーとしてのアデニレートキナーゼ」（１９９４））。
【０００６】
ＡＴＰのルミネセンス測定を含む方法により、定量的結果を、数分以内に得ることができる。このことは、多くの用途について遅すぎる、生存可能な微生物のみを計数し、結果を得るのに何日も必要とする、微生物列挙、例えば微生物プレート計数を含む、伝統的な方法にまさる利点を示す。プレート計数方法はまた、培養条件および選択した手順に従って、生存可能な微生物選択性の集団を測定する。しかし、ＡＴＰのルミネセンス測定を含む方法は、比較的感受性があるが、高価な計器装備および試薬を必要とする。特に、これらの方法からのルミネセンス出力を、視覚的に評価することはできない。
【０００７】
あるいはまた、結果を視覚的に評価することができ、従って機器の使用を必要としない、バイオマスの測定のための試験方法が考えられる。機器を必要としない試験方法は、特に低容量の使用者について、ルミネセンス方法にまさって、費用効率性における潜在的な改善を示す。さらに、このような方法は、解釈の容易さ並びに訓練およびメンテナンスの必要性が低いという利点を有する。
【０００８】
タンパク質、デンプンまたは脂質のような分析物の存在下での色の変化をもたらす化学反応を生じる試薬が記載されている。これらの反応の根底にある化学は比較的単純であり、用いるために好都合である。これらの色染色反応は、例えば食物から由来する生物学的物質の評価においていくつかの用途を有するかもしれないが、これらは、染色が容易に微生物と反応しないため、特に感受性が低く、微生物が試料内に顕著なレベルで存在する環境におけるバイオマスの決定には特に不適である。
【０００９】
他の手法は、微生物のデヒドロゲナーゼ活性を用いて、試料中に存在するバイオマスを検出する（ＧＢ １ ６０３ １８３）。バイオリアクターからの試料または廃液試料を、酸化還元指示薬、例えば無色テトラゾリウム塩と共に、１５〜２０分にわたり、嫌気性条件下でプレインキュベートする。この指示薬は、微生物中に存在する種々のデヒドロゲナーゼ酵素により、不溶性の着色されたホルマザン生成物に転化される。このインキュベーションの終了時に、すべての酵素活性を停止し、ホルマザン生成物を抽出し、比色的に測定して、試料中のバイオマスの評価を得た。この方法は、関連する物質の増幅または再循環を含まず、従って、再び比較的感受性が低く、長期を要しかつ、不便であるため、発酵またはバイオマスが比較的高い工業廃液中の含量のモニタリングのために、限定的に設計される。
【００１０】
ナノモル未満のＡＴＰの濃度から、視覚可能な色変化（ＷＯ ９４／２５６１９）または蛍光シグナル（Ｈａｎｓｅｎ， Ｅ．Ｈ．， Ｇｕｎｄｓｔｒｕｐ， Ｍ． およびＭｉｋｋｅｌｓｅｎ， Ｈ．Ｓ． 「酵素増幅反応および蛍光検出を用いた流動注入分析による微小量のＡＴＰの決定」（１９９３） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３１， ３６９−３８０）を生じる、多酵素結合アッセイが記載されている。これらのアッセイは、２つの段階を必要とし、これらの両方が少なくとも２種の酵素成分を含む経路を含むために困難が生じる。
【００１１】
既存のバイオマスの比色決定法における改善は、良好な広範囲の感受性と簡便で強固な製剤の広範な使用と製造の容易さとを組合せ広範な形式に適合できるものであり、生物学的物質中に遍在する化合物の信頼し得る測定結果を与える場合には、顕著な利益を与えると考えられる。
【００１２】
発明の概説
本発明は、試料中のバイオマスの存在を検出するための方法であって、ＮＡＤ（Ｐ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの合計プールを、試料中のＮＡＤ（Ｐ）のＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの転化により、バイオマスの存在についてのマーカーとして測定することを特徴とする、前記方法に関する。
本発明の１つの好ましい態様において、バイオマスの存在が検出されるのみならず、バイオマスのレベルもまた測定される。
【００１３】
好ましい態様において、ＮＡＤ（Ｐ）のＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの転化は、基質Ｓ１および酵素Ｅ１を用いて、酵素的に行われる。好ましくは、酵素Ｅ１は、デヒドロゲナーゼである。
１つの態様において、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元された形態の検出を、蛍光的に行う。
【００１４】
本発明の他の好ましい態様において、検出または測定を、第２の酵素Ｅ２および第２の基質Ｓ２を加え、これにより以下の反応
【化２】
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が発生し、Ｓ２のＰ２への転化により、色の変化、蛍光の変化、ルミネセント反応または電極表面における電位または電流の変化をもたらす電気化学的反応を含む、吸収スペクトルの変化であるシグナルが発生する。好ましくは、シグナルは、視覚的に検出することができる色の変化である。
【００１５】
あるいはまた、他の好ましい態様において、ＮＡＤ（Ｐ）ＨのＮＡＤ（Ｐ）への転化は、好適な電極の表面において、第２の酵素Ｅ２または第２の基質Ｓ２を必要とせずに直接発生して、電極表面における電位または電流の変化をもたらすことができる。
本発明の他の好ましい態様において、基質Ｓ１およびＳ２を、試料に過剰に加える。従って、測定の感受性を増強する循環検出系を発生する。これは、試料の衛生状態の評価に特に適する。
【００１６】
他の好ましい態様において、Ｅ１は乳酸デヒドロゲナーゼであり、Ｅ２は、ジアホラーゼであり、Ｓ１は乳酸リチウムであり、Ｓ２はニトロブルーテトラゾリウムである。
極めて好ましい態様において、Ｅ１はグルコースデヒドロゲナーゼであり、Ｅ２はジアホラーゼであり、Ｓ１はグルコースであり、Ｓ２はニトロブルーテトラゾリウムである。
１つの好ましい態様においては、試料を２５〜４５℃、好ましくは３５〜４５℃の温度に加熱し、反応の速度を高め、検出時間を最小にする。
【００１７】
他の好ましい態様において、バイオマスの量を検出または測定する前に、洗浄剤および随意にその後中和剤を試料に適用する。さらに、１つの測定を、洗浄剤を適用せずに行い、そして１つの測定を洗浄剤を適用して行うことも可能である。これにより、細胞外および細胞内ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドプール間の区別が可能になる。
【００１８】
本発明はまた、前述の方法の、試料の微生物含量または衛生状態の評価への使用に関する。
本発明は、前述の方法において用いるのに適する試験キットであって、このキットが、少なくとも酵素Ｅ１およびＥ２並びに基質Ｓ１およびＳ２を、１つまたは２つ以上の容器中に含む、前記試験キットに関する。該キットはまた、他の補助材、例えば試料採取装置、容器、湿潤溶液などを含むことができる。
【００１９】
本発明は、さらに、本発明の方法において用いるのに適する試験ストリップであって、少なくとも酵素Ｅ１およびＥ２並びに基質Ｓ１およびＳ２を、１つまたは２つ以上の位置において、この上に乾燥して含む、前記試験ストリップに関する。
【００２０】
本発明は、さらに、本発明の方法において用いるために適する側方流動（ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ）試験デバイスにおいて、液体を毛管現象により沿って輸送することができる乾燥マトリックス材料を含み、少なくとも試料を受けるための開始帯域および、少なくとも１種の酵素がこの中に固定化される反応帯域を含む試験ストリップを含む、前記側方流動装置に関する。
【００２１】
好ましい態様において、側方流動試験ストリップは、酵素Ｅ１およびＥ２が上に固定化された反応帯域並びに基質Ｓ１およびＳ２が上に乾燥された追加の試薬帯域を含む。
【００２２】
図面、表および他の箇所において用いられる略語は、以下の意味を有する：
ＡＤＰ　アデノシン−５’−二リン酸
ＡＴＰ　アデノシン−５’−三リン酸
ＢＳＡ　ウシ血清アルブミン
ＤＴＡＢ　ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド
ＥＤＴＡ　エチレンジアミン四酢酸
Ｇ６Ｐ　グルコース−６−リン酸
【００２３】
Ｇ６ＰＤＨ　グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ
ＩＮＴ　ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット
ＮＡＤ　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（酸化された形態）
ＮＡＤ（Ｐ）　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびニコチンアミドアデニンリン酸（酸化された形態）
ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよびニコチンアミドアデニンリン酸（還元された形態）
【００２４】
ＮＡＤＨ　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（還元された形態）
ＮＡＤＰ　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（酸化された形態）
ＮＡＤＰＨ　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元された形態）
ＮＢＴ　ニトロブルーテトラゾリウム
ＴＶＣ　合計生存コロニー
【００２５】
発明の説明
本発明は、バイオマスの検出および測定のための、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、例えばＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨのアッセイに関する。これらの化合物は、細胞の成分として見出され、環境中で遊離している。
【００２６】
バイオマスの検出のためのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ単独の測定は、ＮＡＤ（Ｐ）／ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ比率の変化による人為的な影響を受ける。これらの問題は、試料中のすべてのＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに転化し、その後ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを、試料中のＮＡＤ（Ｐ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの合計プールのためのマーカーとして検出することによる、バイオマスの検出のための簡便かつ感受性を有する方法を提供することにより克服されることが見出された。
【００２７】
本発明に関連する利点は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、マーカー、例えばＡＴＰおよびＡＤＰの比色酵素的アッセイに必要な配合物よりもはるかに簡単な配合物を用いた比色酵素的アッセイにより、容易に検出および測定することができることである。極めて広い範囲の酵素および基質を用いることができる。さらなる利点として、これらの化合物の測定を、顕著なレベルの微生物を含む試料におけるバイオマスの決定に好首尾に適用することができ、従って、これらの測定は、タンパク質、脂質またはデンプンの測定のための化学的染色より、このような用途に適合する。
【００２８】
他の利点として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、現在のバイオマスのマーカー、例えばＡＴＰとは異なり、電気化学的および直接分光学的アッセイにより容易に測定することもできる。
【００２９】
反応スキームＩに示す本発明の好ましい形態において、試料中に存在する酸化された形態のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、例えばＮＡＤおよびＮＡＤＰを、還元された形態のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、例えばＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに、好適な酵素（Ｅ１）によって、この第２の基質（Ｓ１）を用いて転化することができる。
【化３】
2004508833.tif 000004
【００３０】
好適な酵素Ｅ１は、ＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに転化するすべての酵素である。好ましい態様において、この酵素は、デヒドロゲナーゼ、例えばグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。
試料中に存在するＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨはまた、このアッセイにより検出される。これにより、還元された形態のみが測定されるアッセイ、例えば細菌および細胞培養物のＵＶ蛍光と比較して、顕著な利点が得られる。その理由は、酸化されたニコチンアミド化合物：還元されたニコチンアミド化合物の比率が、細胞の代謝状態に依存して変化するからである。本発明は、酸化された形態、および還元された形態（スキームＩにおける（ｘ＋ｙ）ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ）を、共に検出することができるため、この潜在的な問題に左右されない。
【００３１】
検出を試料中のＮＡＤ（Ｐ）Ｈの蛍光を測定することにより、直接的に行うか、または例えば反応スキームＩＩに示されるように、追加の酵素的または化学的反応を用いて、検出可能なシグナルＰ２を発生させることにより間接的に行うことができる。
【化４】
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【００３２】
これらの反応からのシグナルは、色の変化、他のスペクトル特性、蛍光特性、ルミネセンスまたは電気化学的電位であることができる。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの決定により発生したシグナルの測定は、着色生成物が、可溶性形態であるか不溶性形態であるかにより、色シグナルで反射計または分光光度計を用いることにより、蛍光シグナルで蛍光計を用いることにより、ルミネセントシグナルでルミノメーターを用いることにより、または電気化学的電位もしくは電流測定的シグナルで電位差計を用いることにより、それぞれ行うことができる。
【００３３】
感受性を改善するために、本発明の他の好ましい態様において、試料中に存在するＮＡＤ（Ｐ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、共に再循環される。
【００３４】
反応スキームＩＩから明らかなように、検出の化学的または酵素的手段の意味において、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、好適な化学的介在物質により直接または酵素触媒反応により、好適なドナー分子Ｓ２との反応により、ＮＡＤまたはＮＡＤＰに再転化する。このドナー、デヒドロゲナーゼの第２の生成物または生成したニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの還元された形態の還元により、バイオマスの存在の指標として用いられるシグナルＰ２が得られる。
【００３５】
次に、この反応において発生したＮＡＤ（Ｐ）を、再びＮＡＤ（Ｐ）Ｈに、試料中に存在するＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに最初に転化するために用いた同一の酵素Ｅ１を用いることにより再循環する。この結果、アッセイの感受性を改善し、少量のバイオマスを検出するのに特に適する単純な循環系が発生する。この循環系を適切に作用させるために、過剰の酵素基質Ｓ１およびＳ２を提供することが必要である。
【００３６】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの酸化された形態と還元された形態との間で再循環することができる循環系のスキームを、図１に示す。酵素Ｅ１の作用により、ＮＡＤまたはＮＡＤＰは、過剰に存在する酵素の第２の基質Ｓ１の対応する酸化に伴って、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨに転化される。生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈは、過剰に存在する好適なドナー分子Ｓ２の対応する還元に伴って、ＮＡＤ（Ｐ）に再循環される。最初の試料中に存在するＮＡＤ（Ｐ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈの検出は、これが還元された際にこのドナー分子の特性における変化から行うか、またはこれが酸化された際に基質Ｓ１における変化から行うことができる。これは、電極表面における電位の変化をもたらす、色の変化、蛍光の変化、ルミネセント反応または電気化学的反応を含む吸収スペクトルにおける変化であることができる。ＮＡＤＨとＳ２との間の反応は、直接発生し得るか、または化学的中間体により媒介され得るか、または酵素Ｅ２により触媒され得る。
【００３７】
あるいはまた、試料中のＮＡＤＨを、適切なデテクターを用いて、デヒドロゲナーゼまたはＮＡＤを再循環する他の酵素を用いて、または単独で適切な酵素により触媒された電気化学的反応により直接検出して、必要な感受性を達成することができる。
【００３８】
本発明のより具体的な例を、図２に例示する。再循環を、目による検出に適するドナー分子の還元に際しての色変化に結び付いた２種の酵素により達成する。酵素Ｅ１は、Ｄ−グルコース−６−リン酸およびＮＡＤＰから６−ホスホグルコノ−δ−ラクトンおよびＮＡＤＰＨを生成する酵母グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．４９）である。酵素Ｅ２は、ＮＡＤＰＨおよびテトラゾリウム塩、例えばｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（ＩＮＴ）からホルマザン生成物およびＮＡＤＰを生成するジアホラーゼ（ＥＣ　１．８．１．４）である。最初の試料中のＮＡＤＰおよびＮＡＤＰＨの存在を示す反応の進行を、目により赤色として、または分光光度的に５００ｎｍにおいてモニタリングして、ホルマザンの生成に際しての色の変化によりモニタリングする。
【００３９】
多くのデヒドロゲナーゼおよび対応する基質を、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびＤ−グルコース−６−リン酸の代わりに、ＮＡＤ（Ｐ）の還元のための用いることができる。例えば、リューコノストク・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）（ＥＣ　１．１．１．４９、ＮＡＤおよびＮＡＤＰに特異的）、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．４７）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．２７）、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．２．４．１）、マレイン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．３７）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．２．１．５）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ　１．１．１．１）からのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼである。
【００４０】
同等の方法においては、多くの他の酵素およびこれらの対応する好適な基質を、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの酸化および検出可能なシグナルの発生のために、ジアホラーゼの代わりに用いることができる。
【００４１】
例えば、肝臓アルコールデヒドロゲナーゼおよびニトロサミン基質を用いて、ＮＡＤＨから色を発生することが可能であるが、基質が有毒であるため、これを例えば食物調製物または臨床的環境におけるバイオマスの検出に用いるべきではない。
さらに、ジアホラーゼを、化学的介在物質、例えば最初にＮＡＤＨにより還元され、次にＮＢＴにより再び酸化されて、着色したホルマザン塩を形成するメルドラブルーにより置換することができる。ＮＡＤＨは、ＮＢＴと直接反応して、着色されたホルマザンを生成するが、この反応は極めて低速である（〜時間）。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈと反応して色変化を生じることができる他の化合物は、ＤＩＰ（ジクロロフェノールインドフェノール）、メチレンブルーおよびチオニンである。
【００４２】
ＮＡＤＨのルミネセント検出は、酵素細菌ルシフェラーゼを用いて可能である。
ＮＡＤＰＨの特異的な検出のために、ＮＡＤＰＨを、ＮＡＤＰに、グルタチオンオキシダーゼにより、このＤＴＮＢ（５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸））との反応により検出することができるグルタチオンの還元を伴って転化することができる。
ＮＡＤＨを、電流測定的に検出する場合には、ＮＡＤ（Ｐ）ＨのＮＡＤ（Ｐ）への転化は、電極表面において直接発生することができるため、第２の酵素は、必要ではない。
【００４３】
例えばジアホラーゼとの反応のための好適な基質は、着色されたホルマザン生成物を生じるテトラゾリウム塩である。その例は、ＮＢＴまたはＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニル−２−テトラゾリウムブロミド）である。
酵素反応を、用いられる酵素と適合性であるすべての標準的な緩衝液中で行うことができる。好ましい緩衝液系の１つの例は、２００ｍＭのトリス、５０％のグリセロール、０．０１％のプロクリン、０．３％のトウィーン８０、ｐＨ８からなる緩衝液および１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６、０．０１％のプロクリンおよび２％（ｗ／ｖ）のアルファ−シクロデキストリンからなる基質配合物である。
【００４４】
不完全な色形成は、試料と混合されて反応を開始する２種の試薬予備混合物として配合物を調製することにより、防止することができる。
本発明のアッセイ配合物中の精製されたデヒドロゲナーゼの高い濃度を用いたＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの測定は、例えば酸化還元指示薬の還元による微生物の内因性デヒドロゲナーゼ活性のアッセイに基づく比色法に優れた感受性を与える（ＧＢ １ ６０３ １８３）。
【００４５】
本発明の他の態様
本発明内の他の態様として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、極めて広い範囲の試験形式を用いてバイオマスのためのマーカーとして検出し、測定することができる。適切な試験形式は、マイクロタイターウェルまたは試験管およびスワブ（ｓｗａｂ）、試験ストリップ、センサー、管およびまたフィルターおよび膜表面を含む。特に、流体試料中に存在するバイオマスを、アッセイ前に適切な膜の表面上に濾過により濃縮することができる。
【００４６】
例えば、表面を、上に適切な紙パッドを一方の端において付着させ、あるいはまた、試験ストリップを上に綿または合成材料を一方の端部においてきつく巻き付けて頭部を形成した、プラスチックシャフトを含む慣用のスワブで置換することができる、プラスチック支持体を含む試験ストリップ、あるいはまた同様の適切な試料採取装置を用いて試料採取することができる。試料採取装置を、所要に応じて試料採取前に、適切な湿潤溶液により湿潤させることができる。
【００４７】
本発明内の他の態様として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、反応化学の速度を、熱を適用することにより増強する手順を用いて、バイオマスについてのマーカーとして検出し測定することができる。酵素活性は、温度に比例すること、および酵素は熱を加えることにより破壊されることが知られているため、本発明の方法のための好ましい温度は２０〜４５℃である。反応の増強のための理想的な温度は、２５〜４５℃、好ましくは３５〜４５℃である。
【００４８】
本発明内の他の態様として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、生化学的反応を、定められた期間の後に好適な試薬を加えることにより停止する手法を用いて、バイオマスについてのマーカーとして検出し測定することができる。反応を化学的に、または試薬を試料採取装置から洗浄して除去することにより停止することができる。例えば、着色されたホルマザン生成物が、試験ストリップ上に発生し、試験ストリップを水で洗浄する場合には、不溶性ホルマザン生成物は試験ストリップに付着し、一方他の試薬（酵素など）は洗浄除去される。
【００４９】
本発明内の他の態様として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを細胞状物質に基づいた試料、例えば微生物からの適切な物理的または化学的処理、例えば洗浄剤抽出を用いた放出の後に決定することができる。好適な配合物中の抽出試薬、例えば洗浄剤を、他のアッセイ成分との混合物中に含有させるか、または害を伴わずにアッセイ生物化学／化学に個別に加えることができる。
【００５０】
特に、本発明において、細胞内ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、細菌および他の微生物細胞から、陽イオン性洗浄剤、例えば第四級アンモニウム化合物、例えばＤＴＡＢを用いて、続いて中和剤、例えばアルファまたはベータシクロデキストリンを用いて抽出して、洗浄剤を中和することが提案される。次に、放出されたニコチンアミドアデニンジヌクレオチドは、陽イオン性洗浄剤の潜在的な干渉を伴わずに、測定のために有用である（ＷＯ ９２／１２２５３）。また、非イオン性または両性イオン性洗浄剤を、哺乳類または他の真核細胞の溶解のために用いて、細胞内ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを抽出することができる。
【００５１】
本発明内の他の態様として、真核細胞からの、および試料中に遊離する背景ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）を、温和な手法、例えば非イオン性洗浄剤を用いることにより抽出し、次に、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）を微生物給源からより強い抽出用溶剤、例えば陽イオン性洗浄剤を用いることにより抽出する前に、好適なＮＡＤアーゼにより破壊させるプロトコルを考慮することができる。このようにして、微生物ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）を、背景または真核細胞給源からの高められたＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）の存在下で選択的に測定することができる。
【００５２】
本発明内の他の態様として、適切な測定および対照を用いることにより、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドのレベルの比較決定を受けることが可能である。例えば、試料中のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドのレベルの洗浄剤による抽出を伴うか、または伴わない比較決定を用いて、細胞材料、例えば細菌内に特異的に存在するニコチンアミドアデニンジヌクレオチドのレベルを定量し、従って細胞のおよその定量に用いることができる。他の例として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドのレベルの時間に伴う変化の決定を用いて成長を検出し、試料中の生存細胞の成長曲線を決定し、測定することができる［例４参照］。これは重要な態様であり、ここで取り扱いの良好さおよび感受性により、光学的方法にまさる利点が得られ、また時間は、プレート計数方法と比較して、顕著に有利である。また、比色シグナルを得て、例えば成長を目により視覚的に認識することが可能になる前に、細菌濾液培養物中での成長を検出することも可能である。
【００５３】
本発明の態様として、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを、極めて広い範囲の試料から、バイオマスについてのマーカーとして検出し、測定することができる。これには、以下のものが含まれる。
【００５４】
・食物製造、調製、取り扱い、貯蔵表面および液体試料並びに衛生試験のための他の試料
・食料品および食材（乳製品および飲料を含む）
・加工水、冷却塔および熱交換システム、配管および他の工業水試料
・油、鉱油、潤滑剤、石油化学的試料
・クリーニング試料および溶液
・シャワー、浴室、トイレ、スイミングプール試料
・病院および臨床／診療所／歯科的試料
【００５５】
・医学的および獣医学的試料
・空中試料全般；エアロゾル全般
・総体的に建物および家庭環境からの試料
・バイオフィルム（表面上に存在する／表面に接着する微生物のフィルム）
・空気で運ばれる微生物［細菌戦］
・環境的試料
・微生物学的濾液培養物
【００５６】
・微生物学的発酵物［ビール；ヨーグルト；など］
・細胞組織培養物
・発酵開始培養物
・バイオレメディエーションおよび水処理システムからの試料
・細胞成長または細菌成長の阻害を用いて汚染物または薬理学的活性または他の阻害化合物を評価するアッセイ
・淡水の川および湖中の細菌および藻類成長の測定
・バイオサイド処理の効率のために試験される試料。
【００５７】
本発明はまた、少なくともＮＡＤ（Ｐ）のＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの酵素的転化を行うために必要な試薬、好ましくはまたシグナルを発生することによりＮＡＤ（Ｐ）Ｈを検出するために必要な試薬を含む、試験キットに関する。これは、試薬が、酵素Ｅ１およびＥ２並びに基質Ｓ１およびＳ２を１つまたは２つ以上の容器中に含むことを意味する。
【００５８】
１つの好ましい態様において、試験キットは、湿潤溶液（例えば水または、水と、アルコール、例えばイソプロパノールとの混合物または水と、滅菌剤、例えば次亜塩素酸ナトリウムとの混合物）、基質溶液（例えば、ＮＢＴ、グルコース、好適な緩衝溶液などを含む）および酵素溶液（例えばジアホラーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼ、好適な緩衝溶液など）を含む。他の好ましい態様において、試験キットは、すべての酵素および基質を有する１つの容器を含む。
【００５９】
好ましくは、試験キットはまた、試験ストリップ、スワブ、固体支持体上の吸着材料などの形態の試料採取装置を含む。さらに、他の補助、例えば標準的な溶液、検出方法の文書のプロトコル、標準的な色チャートなどを、含めることができる。
【００６０】
本発明は、さらに、本発明の方法による試料中のバイオマスの存在を検出するための側方流動試験装置に関する。試験装置は、液体を毛管現象により沿って輸送することができる乾燥マトリックス材料を有し、少なくとも前述の試料を受けるための開始帯域および、少なくとも１種の酵素がこの中に固定化される反応帯域を有する試験ストリップを含む。
【００６１】
開始帯域は、好ましくは試験ストリップの一方の端部に位置する。分析するべき試料を開始帯域に適用する。好ましい態様において、開始帯域は、吸着紙で構成された試料パッドである。ガラス繊維材料、繊維状プラスチック材料、例えばポレックス（Ｐｏｒｅｘ）（登録商標）シート材料（Ｐｏｒｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）並びにビスコースおよびポリエステルなどの材料を含む不織布も用いることができる。好ましくは、このような材料は、単一のシートまたは層中になければならない。試料パッドの体積容量は、装置の初期試料採取を規定する。試料パッドはまた、不所望な粒状物質が反応帯域に到達するのを防止するのを補助するフィルターとして作用する。
【００６２】
開始帯域の材料は、アッセイのすべての含浸された可動性成分の、装置の残りへの放出を制御するのを補助するため、この目的に適合しなければならない。液体試料を、開始帯域に、単一の滴下として、例えばピペットを用いることにより、または開始帯域を液体試料中に浸漬することにより加えることができる。開始帯域は、この上に乾燥される成分、例えば酵素アッセイの成分および／または非特異的結合効果を反応帯域において防止（「遮断」）する化学物質および／または親水性特性、アッセイ成分の再水和および側方流動特性を高める化学物質および／または分析物放出剤および／または抽出用溶剤、好ましくは洗浄剤抽出用溶剤を含むことができる。
【００６３】
反応帯域を、開始帯域に直接隣接して、またはさらに試験ストリップの下に配置することができる。これは、安定な状態での酵素アッセイの１種または２種以上の成分、特に反応帯域に固定化された少なくとも１種の酵素を含む。追加の成分は、追加の固定化された酵素および／または固定化されたかまたは乾燥した酵素基質、共基質、共因子などであることができる。好ましい態様において、反応帯域は、変性を伴わない非共有的に、または共有的に固定化されたタンパク質への手順およびまた材料の側方流動特性に適するように選択されたパッドまたは膜である。
【００６４】
極めて好ましい態様において、反応帯域は、高いタンパク質結合能力を有するニトロセルロース膜から構成される。このような膜はまた、酢酸セルロースを含むことができる。パッドまたは膜を、酵素固定化の前および／または後に処理して、不所望な効果、例えば分析物および／またはアッセイ成分の非特異的結合を最小にし、および／または親水性特性および側方流動を増強することができる。アッセイを含む反応が生じ、最初の試料中の分析物の存在を示す生成物が生成するのは反応帯域においてである。
【００６５】
好ましい態様において、試験ストリップは、さらに代表的には試料パッドのために用いられる材料と類似した材料から構成され、好ましくは吸着紙もしくはガラス繊維またはポリエチレン繊維もしくはポリエステルから構成され、開始帯域と反応帯域との間に局在するか、またはこれらの帯域の一方または両方と部分的に重複する試薬帯域を含む。試薬帯域は、１種または２種以上の安定な状態で乾燥されるアッセイの成分、例えば酵素基質成分および／または非特異的結合効果を反応帯域において防止（「遮断」）する化学物質および／または親水性特性、アッセイ成分の再水和および側方流動特性を高める化学物質および／または分析物放出剤および／または抽出用溶剤、好ましくは洗浄剤抽出用溶剤を開始帯域の代わりに、またはこれに加えて含む。
【００６６】
他の好ましい態様において、試験ストリップは、ガーゼ（ｗｉｃｋ）または、液体試料を試験ストリップのマトリックスからデバイスを通して吸収し、従って毛管流動を試料パッドから駆動させる同等の手段を含む。ガーゼ中への溶液の流れにより、試料および試薬パッドからの、固定化された酵素の反応部位を交差しての持続された流れが確実になって、生成する生成物の量が最大になる。ガーゼは、代表的には、試料パッドのために用いられる材料と類似した材料から構成される。好ましい態様において、ガーゼは、吸着紙で構成される。アッセイは、吸着パッドの体積容量が満たされた場合にのみ終点に達するが試料体積は限定されないと推測される。
【００６７】
１つの態様において、試験ストリップは、さらに、プラスチックケースまたは他のハウジングを含んで、デバイスにさらなる強度および剛性を付与し、デバイスの取り扱いを、これを汚染せずに容易にする。好ましくは、試験ストリップはハウジングにより部分的に覆われているに過ぎない。開始帯域は、好ましくはハウジングにより覆われないで、試料の容易な適用を確実にする。
【００６８】
試験ストリップの種々の吸着帯域は、すべて同一平面中にあり、帯域間の液体試料の毛管流動を可能にする。本法において、試験ストリップ上で乾燥状態におかれたすべての１または２以上の成分、例えば、試料内のマトリックスから分析物を抽出するための洗浄剤を溶液中に再構成する。すべての帯域は、例えば酵素反応の成分の貯蔵を支持するかまたは、酵素反応に適する反応条件（例えばｐＨ）を提供する安定剤または緩衝液などの、他の試薬を含むことができる。いくつかの用途について、酵素反応を化学反応と組み合わせて、例えば検出可能なシグナルの発生を改善することが好ましい。この場合において、化学反応の成分は、試験ストリップの帯域中に乾燥状態でも含まれる。
【００６９】
本発明の好ましい態様において、酵素反応の基質を試薬パッド中に配置する。その理由は、これらは、典型的に低い分子量を有し、溶液中で可動であるからである。酵素は、反応パッド上に配置する。その理由は、これらは高い分子量を有し、比較的不動であるからである。極めて好ましい態様において、反応パッドを、酵素が効果的に固定化される程度に厳密に結合するニトロセルロース膜から構成する。
【００７０】
好ましい態様において、試験ストリップは、乾燥された洗浄剤抽出用溶剤を含む開始帯域、１種または２種以上の乾燥された酵素基質および／または共因子を含む試薬帯域および少なくとも１種の固定化された酵素を含む反応帯域を含む。
【００７１】
図５は、本発明において用いるための側方流動試験ストリップの概略説明図である。自己接着性プラスチックベース（６）の上に、開始帯域としての試料パッド（１）、開始帯域と部分的に重複している試薬帯域（２）、酵素（３）が上に固定化された反応帯域（４）が配置されている。反応帯域に隣接してガーゼ（５）がある。
【００７２】
この側方流動試験デバイスは、少なくとも、ＮＡＤ（Ｐ）のＮＡＤ（Ｐ）Ｈへの酵素的転化に必要な試薬、好ましくはまた少なくともシグナルを発生することによりＮＡＤ（Ｐ）Ｈを検出するために必要な試薬を含む。
【００７３】
ＮＡＤ（Ｈ）側方流動試験装置の１つの好ましい形式において、吸着紙で構成された開始帯域は乾燥された洗浄剤抽出用溶剤を保持し、また吸着紙またはガラス繊維で構成された試薬帯域はアッセイにおいて用いられる酵素についての基質を含み、一方酵素自体は、高いタンパク質結合能力を有するニトロセルロース膜から構成された反応帯域上に固定化されている。アッセイのための好ましい試薬は、開始帯域上の洗浄剤抽出用溶剤としてのＤＴＡＢ（ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド）であり、酵素グルコースデヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼは反応帯域において固定化されており、対応する基質ＮＢＴおよびグルコースは試薬帯域上で乾燥される。
【００７４】
あるいはまたＤＴＡＢを、試薬帯域上で乾燥された基質試薬中に導入することができる。
【００７５】
開始帯域に適用された液体試料は、毛管作用により試薬帯域中に移動し、ここで酵素基質は再水和し、試料と共に反応帯域において固定化された酵素に移動する。分析物ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰおよび／またはＮＡＤＰＨの存在下で、黄色のＮＢＴは酵素およびこれらの基質の作用により暗青色のホルマザン塩に転化し、目により視覚可能な色の変化を生じる。ホルマザン生成物の溶解度の低下によって、これが反応部位付近で濃縮され一層強い色を生じる作用が生じる。基質が、試薬帯域から供給される場合には、２種の酵素が、ＮＡＤ（Ｐ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを再循環し、試料中に存在する各々の分析物分子について多くの着色された分子を生成するため、高い感受性が達成される。
【００７６】
他の態様において、他のテトラゾリウム化合物またはジアホラーゼ基質を、ＮＢＴと置き換えて、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよびジアホラーゼを有する容易に検出可能な生成物を生成することができる。他の態様において、酵素ジアホラーゼを、適切な化学試薬、例えばメルドラブルーおよびＮＢＴにより置換することができ、これはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下で容易に検出可能な生成物を生成することができる。
【００７７】
他の好ましい態様において、試料パッドの容量は好適な湿潤溶液の単一の滴下が試料パッドを湿潤させるが、試験デバイスの他の成分を湿潤させない程度であり、パッドを用いて試験表面をシグナル形成反応を開始せずに試料採取することができる程度である。その後、湿潤溶液の第２の滴下は毛管流れを開始し、従って装置全体を湿潤させることによりアッセイ試薬を再水和させ、ＮＡＤ（Ｐ）またはＮＡＤ（Ｐ）Ｈの存在下でシグナル形成をもたらす。
【００７８】
例えば試料衛生を単一の装置により同一の試料中でモニタリングするための、２種の重要なパラメーターの測定を可能にするために、タンパク質との比色反応を生じる試薬を、反応ストリップ上でＮＡＤ（Ｐ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈを検出するために用いられる酵素および基質の個別の位置において固定化することができる。同一の試料中のタンパク質およびＮＡＤのアッセイにより、さらなる感受性および試料の組成に関する情報が得られる。
【００７９】
タンパク質を検出するための試薬として、種々のタンパク質検出方法、例えばビウレット反応方法、ローリー方法、クマジー染色方法、ＢＣＡ方法およびニンヒドリン反応方法による検出に必要な試薬が、本発明の方法において使用可能である。タンパク質を検出するための試薬は、好ましくは、八ハロゲン化されていないスルホフタレインの群から、望ましくはフェノールスルホンフタレインおよびクレゾールスルホンフタレインからなる群から選択される。好適な試薬は、例えば、ブロモフェノールブルー、ブロモクレゾールグリーン、ブロモクレゾールパープル、ブロモフェノールレッド、ブロモチモールブルーおよびブロモクロロフェノールである。
【００８０】
他の説明を加えなくても、当業者は前記記載を用いて、本発明をその完全な程度に用いることができると考えられる。従って、好ましい特定の態様および例は、単に例示的でありいかなる方法によっても残りの開示を限定するものではないと解釈するべきである。
本明細書中に引用したすべての出願、特許および刊行物並びに、２０００年９月１３日に出願の対応する出願ＥＰ ００ １１９ ４１８．２の開示内容全体を、本明細書中に参照として組み込む。
【００８１】
例
以下の例は、本発明の実際的な適用を示す。
例１：
食物残留物の実際的な検出への本発明の使用を、図３に例示する。１ｍｌの精製水中に均質化した種々の一般的な食物を、図１に記載したものと同様の比色アッセイにおいて、試料として用いた。テトラゾリウム塩のニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の還元を、酵素ジアホラーゼにより媒介した。ＮＡＤをＮＡＤＨに転化するために用いたデヒドロゲナーゼは、グルコースデヒドロゲナーゼであった。この例において、グルコース、ジアホラーゼおよび既知の濃度（１μＭ）のＮＡＤからなる試料または食物試料を、適切な緩衝液（７５ｍＭのトリス、２５ｍＭの塩化カリウム、５ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１％のトライトンＸ−１００、１．２５％（ｗ／ｖ）のアルファ−シクロデキストリン、ｐＨ７．７５）に加えた。比色反応を、グルコースデヒドロゲナーゼを加えることにより開始した。
【００８２】
５分後の着色されたホルマザン生成物の生成を、５４０ｎｍにおいて分光光度的に測定した。既知の濃度のＮＡＤ標準により同一の条件下で生成した色との比較により、最初の試料中でのＮＡＤ（Ｈ）濃度の計算が可能になる。本発明を実際の適用とし得ることを立証するために、これが在来の清浄性アッセイ、例えばＭｅｒｃｋ ＫＧａＡにより製造されたハイライト（ＨＹ−ＬｉＴＥ）（登録商標）ＡＴＰルミネセンスアッセイに相当することを示すことが必要である。正しい比較を得るために、ＤＴＡＢを、ハイライト（登録商標）アッセイにおいて除外した。ＡＴＰ濃度を、この生成物を用いて、最初に標準的なハイライト（登録商標）ペンの試料棒をホーム位置に押し込んで（ｐｕｓｈ ｈｏｍｅ）、凍結乾燥したホタル試薬を再水和させ、ハイライト（登録商標）ルミノメーターを用いて背景ルミネセンスを測定することにより測定した。
【００８３】
ペンのプラスチックキャップを取り外し、３０μｌの試料をペンの本体中の緩衝液に加え、プラスチックキャップを再び取り付けた。次に、ペンをルミノメーター中に再び配置し、得られた試料ルミネセンスを測定した。ルミネセンス測定を、ＡＴＰ濃度に、個別の測定中の既知の濃度のＡＴＰ標準を用いて校正することにより換算した。図３に例示した食物試料中に見出されたＮＡＤ（Ｈ）およびＡＴＰ濃度の比較は、ほとんどの場合において食物のＮＡＤ（Ｈ）含量が、少なくともＡＴＰの含量と等しいことを示している。従って、ＮＡＤ（Ｈ）アッセイによる食物残留物の検出は、ＡＴＰアッセイを用いた検出と同等に有効であると例証される。
【００８４】
図３において、頭文字は、以下の一般的な食物を意味する：
Ａ＝ゆで卵、Ｂ＝マスタード、Ｃ＝ニンジン、Ｄ＝チーズ、Ｅ＝パイナップル、Ｆ＝ポート（Ｐｏｒｔ）、Ｇ＝赤ワイン、Ｈ＝ヨーグルト、Ｉ＝肉。ｘ軸は、ＡＴＰまたはＮＡＤ（Ｈ）のｎＭ濃度を示す。
【００８５】
例２：
本発明を用いて、表面ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを測定することにより表面の清浄性を評価することが、表１に例証されている。上に、一方の端部において適切な紙パッドが付着したプラスチック支持体からなる試験ストリップを、先ず適切な溶液（蒸留水中の６％イソプロパノール）を用いて湿潤させた。次に、湿潤パッドを用いて、試験表面（代表的には３０ｃｍ２の面積）上をふき取り、試料を表面から試験ストリップに移動させた。試料中に存在するニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを試薬を試験ストリップに加え、目に視覚可能である着色した生成物を得ることにより測定した。先ず、適切な基質配合物（１０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ６、２ｍｇ／ｍｌのＮＢＴ、３００ｍＭの乳酸リチウム、０．０１％のプロクリン、２％（ｗ／ｖ）のアルファ−シクロデキストリン）の１滴（約４０μｌ）を試験ストリップに加え、続いて１滴の適切な酵素配合物（２００ｍＭのトリス、ｐＨ８、６ｍｇ／ｍｌのジアホラーゼ、３ｍｇ／ｍｌの乳酸デヒドロゲナーゼ、５０％のグリセロール、０．０１％のプロクリン、０．３％のトウィーン８０）を加えて、反応を開始した。この試験において用いられる試料をある家庭の台所から得た。
【００８６】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在は、目により容易に区別することができる試験ストリップ上の色の発色により示される。ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドがより多量に存在するに従って、色はより迅速に発色する。色の発色を、この例における反応の開始の５分後に評価した。この時間は、用途に応じて１〜１０分の間で変化させることができる。
【００８７】
表１は、この試験から得られた結果を例示する。「汚れた」表面を示す発色を、＋により示す。「清浄な」表面を示す発色なしを、−により示す。「極めて汚れた」表面を示す迅速な色の形成を、＋＋により示す。表１中の結果は、この試験において用いた形態の本発明が、視覚的な色の変化により、外見上清浄な表面上の残留物を検出することができることを示している。さらに、検出された清浄でない表面の数は、清浄にした後に顕著に減少し、この形態の本発明の感受性がこの適用について正確であることを示している。
【００８８】
【表１】
2004508833.tif 000006
【００８９】
例３：
微生物学的衛生モニタリングとの比較における表面の清浄性を検査するための本発明の使用を、表２に例示する。表面の清浄性の尺度としてのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド含量を、本発明により例２に記載したように測定した。表面上の細菌含量を、１０ｃｍ×１０ｃｍの領域を掃除し、スワブを１ｍｌの生理的食塩水中に洗浄することにより決定した。溶液の１００μｌのアリコートを、通常の寒天プレート上に配置し、３０℃での３日間のインキュベーションの後に存在するコロニーの数を、表面上の微生物の数の尺度として用いた（ＣＦＵ／スワブ）。本例における試料は、施設の食物調製環境において採取した。
【００９０】
表２は、本方法の相対的な利点を例示している。プレート計数法による測定は、好気性微生物による表面汚染とともに、存在する生物のタイプを同定する方法に拡張できる可能性を示す。表面ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの測定により、清浄性／衛生レベルに関する情報が得られる。言い換えると、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド分析は、生存可能な微生物の数よりもむしろ存在する有機「ソイル（ｓｏｉｌ）」（生物学的廃棄物質）のレベルを示す。ソイルの存在は表面が完全に洗浄されておらず、微生物汚染のための条件を提供する可能性を有することを示す。
【００９１】
【表２】
2004508833.tif 000007
【００９２】
データは、清浄性を評価するためにニコチンアミドアデニンジヌクレオチドを測定することの利点を強調している。３つの場合において、プレート計数法は生存している微生物を示唆せずに、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの存在を示唆し、清浄でない表面を示す。これは、本発明による生物学的廃棄物質を検出する性能を例証するものである。また、本例において測定されたすべての試料において、プレート計数により決定された微生物汚染は、例４において用いられる本発明の形態における微生物の検出限界より低いことに注意するべきである。このことは、乏しい表面清浄性についてのマーカーとしてのニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの大部分が、細菌細胞に対して細胞外に存在したことを示している。データはまた、本発明が視覚的評価により清浄であると判定される表面上のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドのレベルを検出する性能を有することを示す。
【００９３】
微生物学的方法、例えばプレート計数法は、完了するために数日を要し、従って表面汚染の過去の実態を提示することができるに過ぎない。ＡＴＰのルミノメーター的評価は、光測定のための機器の使用を必要とする。本発明は、数分を要するのみであり、計器装備を必要とせず、視覚的評価よりも主観的でない。本発明のこの適用は、リアルタイムで表面の清浄性を評価する性能を提供し、所要に応じて、即座に修正する行動を可能にする。
【００９４】
例４：
細菌培養物の成長曲線を決定し、細菌を検出するための本発明の使用を、図４に例示する。培養物中の大腸菌ＮＣＴＣ　９００１の成長は、細菌コロニーの試料を適切な成長培地、例えば栄養濾液に加えることにより開始する。培養物中の細菌成長を、試料を適切な時間に採取し、６００ｎｍにおける光学密度、本発明を用いてのニコチンアミドアデニンジヌクレオチド含量および、微生物プレート計数を用いての、合計生存可能コロニー（ＴＶＣ）の数を測定することにより評価する。本発明の本例において、適切な細胞溶解剤、例えばＤＴＡＢの１滴、続いて適切な中和剤、例えばアルファ−シクロデキストリンを含む適切な基質混合物の１滴、続いて反応を開始するための適切な酵素溶液の１滴を、試料に加え、色形成の速度を、分光光度計を用いて測定した。ＮＡＤをＮＡＤＨに、酵素である乳酸デヒドロゲナーゼおよびこの基質である乳酸リチウムにより転化した。色がＮＡＤＨから、酵素ジアホラーゼおよびＮＢＴにより発生した。既知のＮＡＤ濃度の試料の色形成の速度を用いて、試料の色形成の速度を絶対的なニコチンアミドアデニンジヌクレオチド濃度に相関させた。
【００９５】
図４は、本発明が、細菌群の成長動態をモニタリングすることが可能であり、光学密度および合計の生存コロニー測定、すなわち細菌含量をアッセイする、現在受け入れられているルーチンの方法と相関を有することを示している。
【００９６】
例５：
目により視覚可能な色変化を用いて細菌を検出するための本発明の使用は、プレート計数により決定して５×１０８ｃｆｕ／ｍｌのＴＶＣを有する大腸菌ＮＣＴＣ　９００１培養物中に、プラスチックストリップの端部に付着させた適切な紙パッドを浸漬させて、パッドが培養物により湿潤するようにすることによって例証し得る。パッドに、好適な細胞溶解試薬、例えばＤＴＡＢの１滴、中和化合物、例えばアルファ−シクロデキストリンを含む適切な基質、例えば乳酸リチウムおよびＮＢＴの１滴、並びに最後に適切な酵素配合物、例えば乳酸デヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼの１滴を連続的に加えた。５分後、顕著な色がパッド上に生じ、このことは本発明が視覚可能な色変化により細菌を検出することができることを示す。
【００９７】
例６：
細菌を濃縮するフィルターを用いた本発明の使用は、微生物検出の感受性を増強することができる。例として、６×１０５ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌ＮＣＴＣ　９００１を含む培養物２０ｍｌを、０．２μｍの孔の大きさを有するナイロンフィルターを通過させた。このフィルターに、細胞溶解剤（例えばＤＴＡＢ）の１滴（約４０μｌ）、適切な中和剤を含む基質溶液（例えば乳酸リチウム、ＮＢＴおよびアルファ−シクロデキストリン）の１滴および最後に酵素溶液（例えば乳酸デヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼ）の１滴を連続的に加えた。目により明瞭に視覚可能な色が、７分以内にフィルターの上に発色した。実験をフィルター上の試料として６×１０５ｃｆｕ／ｍｌを含む大腸菌培養物の単一の滴下のみを用いて繰り返した場合には、目により視覚可能な色は、細胞溶解試薬、基質および酵素溶液の添加に対して、３０分後にも形成しなかった。本例は、比色アッセイを行うことができるフィルター上の溶液の微生物含量を濃縮することにより、感受性の増大を得ることができることを例証している。
【００９８】
例７：
反応の速度を高め、読みとりに必要な時間を減少させるための加熱ブロックを用いた本発明の使用を、既知の濃度（即ち、１．２５μＭ溶液の約４０μｌ）のＮＡＤの１滴、続いて乳酸リチウムおよびＮＢＴからなる基質溶液の１滴および最後に乳酸デヒドロゲナーゼおよびジアホラーゼからなる酵素溶液の１滴を試験ストリップに加えたアッセイを行うことにより例示する。２０℃（周囲温度）において目により評価される「陽性の」結果に要する時間は、３．５分である。実験を専用のサーモスタット制御の加熱ブロック上にストリップを配置することにより４０℃で繰り返した際には、目により評価される「陽性の」結果に要する時間はわずか１分である。
【００９９】
第２の例においては、前述の既知の濃度のＮＡＤの試料、基質溶液および酵素溶液を、２つの適切なキュベット中に配置し、それぞれ１８℃および４３℃の温度においてインキュベートし、吸光度を５４０ｎｍにおいて５分後に測定した。１８℃における吸光度は１．０７２であり、一方４３℃における吸光度は、２．２５６であり、色形成の速度の上昇は２１０％であった。
これらの結果は、アッセイ感受性における顕著な改善が周囲温度よりも高い温度においてアッセイを行うことにより可能であり、特別の目的のための加熱ブロックまたはすべての適切なインキュベーターのいずれかを用いて達成されることを示している。
【０１００】
例８−側方流動試験装置：ＮＡＤ
ニトロセルロース反応ストリップ、紙試料パッド、試薬パッドおよびガーゼを含む側方流動試験装置を、図５に示すように構成した。試薬パッドを、４５０ｍＭのグルコース、２ｍｇ／ｍｌのＮＢＴ、１０ｍＭのクエン酸塩を含む基質配合物の溶液中に浸漬し、次に組み立てる前に乾燥した。装置は、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ＳＲ膜に基づいており、これは、不活性プラスチック支持体上のニトロセルロース膜を含む。プラスチック支持体上の自己接着性部分により、好適な紙ストリップの付着物が、試料パッド、試薬パッドおよびガーゼとして作用することが可能である。装置を幅２０ｃｍのストリップとして構成し、これを５ｍｍの幅を有する個別の装置に切断した。
【０１０１】
用いるためのストリップを製造するために、２００ｍＭのトリス、３ｍｇ／ｍｌのジアホラーゼ、８ｍｇ／ｍｌのグルコースデヒドロゲナーゼを含む酵素配合物１μｌをストリップのニトロセルロース部分に加え、２０℃で１０分間放置して乾燥した。この構成において、酵素および基質配合物を個別に保持し、装置の長期間安定性を改善する。さらに、各々の幅５ｍｍの試薬パッドは、約２０μｌの基質の相当物を含み、反応ストリップ上の固定化された酵素が反応の完全な時間経過に十分な基質を有するのを確実にする。
【０１０２】
アッセイは１５ｐｍｏｌのＮＡＤを含む溶液を試料パッドに加えることにより活性化した。試料は、試薬パッド中に移動し、ここで酵素基質は、再水和され、試料と共にニトロセルロース反応パッド中に輸送される。ここで、ＮＡＤ、アッセイ酵素および基質は反応して、２０℃で５分以内に目により視覚可能な紫色のホルマザン生成物を生成し、このデバイスが、溶液中のＮＡＤを検出することができることを示す。実験を試料としてＮＡＤ溶液の代わりに蒸留水対照を用いて繰り返した場合には、２０℃で１０分後に紫色は形成されなかった。
【０１０３】
例９−側方流動試験装置：バイオマス
側方流動試験装置を用いてバイオマスを検出することを例証するために、７．２×１０７コロニー形成単位／ｍｌ（合計好気性微生物プレート計数により決定した）を含む大腸菌ノバブルー（ＮｏｖａＢｌｕｅ）（Ｎｏｖａｇｅｎ，カタログ番号６９００９−３）の濾液培養物３０μｌを、例８に記載したように製造したストリップの試料パッドに加えた。装置を活性化するために、水中の０．３％ｗ／ｖのＤＴＡＢからなる抽出用溶剤溶液３０μｌを試料パッドに加え、液体試料が毛管作用により装置を通して移動するのに十分な容積を提供する。抽出用溶剤は、試料パッド上に存在する細菌を溶解し、細胞内ＮＡＤ（Ｐ）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈが反応パッドに、可動試料相を有する試薬パッドを介して移動するのを可能にする。衛生モニタリングアッセイにおける「汚れた」結果と同等のＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）の存在を示す紫色が５分以内に得られた。実験を細菌を含まない無菌の濾液を用いて繰り返した際には、色形成は観察されなかった。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において用いることができる、一般的な酵素反応のスキームを示す図である。
【図２】本発明において用いることができる、一般的な酵素反応のスキームを示す図である。
【図３】本発明により測定された食物残留物中に存在するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド化合物と、同一の食物残留物中に存在するハイライト（登録商標）衛生モニタリングシステムにより測定されたＡＴＰとの比較の図である。
【図４】細菌培養物の成長をモニタリングするために用いられる、本発明の例を示す図である。
【図５】本発明において用いるための側方流動試験ストリップの模式的説明図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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