(57)【要約】新規のＭＫ６１ポリペプチド分子およびこれらのタンパク質をコードする核酸分子。本発明はまた、ベクター、宿主、選択的因子、およびＭＫ６１ポリペプチドを産生するための方法を提供する。ＭＫ６１ポリペプチドを使用して、疾患の、処置、診断、改善または予防のための方法もまた、提供される。ＭＫ６１様ポリペプチドを調節する天然の分子または合成分子は、１つ以上のスクリーニングアッセイ（例えば、本明細書において記載されるアッセイ）を用いて同定され得る。このような分子は、エキソビボ様式、または注射によるインビボ様式、または経口送達、移植装置などのいずれかによって投与され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３または配列番号１５に示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３または配列番号１５のＭＫ６１コード部分；
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）または（ｂ）の相補体に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、そのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；および
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、
核酸分子。
【請求項２】
単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドに少なくとも約７０％同一性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３または配列番号１５に示されるヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列であって、そのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３もしくは配列番号１５、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列であって、そのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３または配列番号１５、あるいは（ａ）〜（ｃ）のヌクレオチド配列；
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；および
（ｆ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、
核酸分子。
【請求項３】
単離された核酸分子であって、該核酸分子は、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む（ａ）〜（ｅ）のヌクレオチド配列；
（ｇ）（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；および
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、
核酸分子。
【請求項４】
請求項１、２または３に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項６】
真核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
原核生物細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ＭＫ６１ポリペプチドを産生するプロセスであって、請求項５に記載の宿主細胞を、該ポリペプチドを発現するのに適切な条件下で培養する工程、および必要に応じて、該培養物から該ポリペプチドを単離する工程を包含する、プロセス。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスによって産生された、単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８に記載のプロセスであって、前記核酸分子は、該ＭＫ６１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、ネイティブなＭＫ６１ポリペプチドについてのプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターＤＮＡを含む、プロセス。
【請求項１１】
請求項２に記載の単離された核酸分子であって、ここで、前記同一性パーセントが、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを使用して決定される、核酸分子。
【請求項１２】
ＭＫ６１ポリペプチドの活性または産生の、候補インヒビターを同定するプロセスであって、該プロセスは、請求項５、６、または７に記載の細胞を該候補インヒビターに曝露する工程、該細胞におけるＭＫ６１ポリペプチドの活性または産生を測定する工程、および該候補インヒビターに曝露した細胞中のＭＫ６１の活性と、該候補インヒビターに曝露していない細胞中の活性とを比較する工程、を包含する、プロセス。
【請求項１３】
ＭＫ６１ポリペプチドの活性または産生の、候補刺激因子を同定するプロセスであって、該プロセスは、請求項５、６、または７に記載の細胞を候補刺激因子に曝露する工程、該細胞におけるＭＫ６１ポリペプチドの活性候補を測定する工程、および該候補刺激因子に曝露した細胞中のＭＫ６１の活性と該刺激因子に曝露していない細胞中の活性とを比較する工程を包含する、プロセス。
【請求項１４】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの成熟形態を含むアミノ酸配列であって、必要に応じてさらに、アミノ末端メチオニンを含む、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のオルソログのアミノ酸配列であって、ここで、このオルソログは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％同一性を示すアミノ酸配列であって、そのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、そのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、フラグメント；ならびに
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、もしくは配列番号１６または（ａ）〜（ｃ）の少なくとも１つに示されるアミノ酸配列のいずれかの対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列であって、そのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
ポリペプチド。
【請求項１６】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるアミノ酸配列であって、そのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるアミノ酸配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるアミノ酸配列であって、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する、配列番号２に示されるアミノ酸配列であって、ここで、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるアミノ酸配列であって、ここで、そのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１５または請求項１６に記載のアミノ酸を含むポリペプチドであって、ここで、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２の位置３８にあるアミノ酸は、システイン、セリンまたはアラニンである、ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１５または請求項１６に記載のアミノ酸を含むポリペプチドであって、ここで、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２の位置３９にあるアミノ酸は、システイン、セリンまたはアラニンである、ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１５または請求項１６に記載のアミノ酸を含むポリペプチドであって、ここで、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２の位置５１にあるアミノ酸は、システイン、セリンまたはアラニンである、ポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１５または請求項１６に記載のアミノ酸を含むポリペプチドであって、ここで、配列番号２、または配列番号６の位置６０にあるアミノ酸は、システイン、セリンまたはアラニンである、ポリペプチド。
【請求項２１】
請求項１５または請求項１６に記載のアミノ酸を含むポリペプチドであって、ここで、配列番号２または配列番号６の位置７６にあるアミノ酸は、システイン、セリンまたはアラニンである、ポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１５または請求項１６に記載のアミノ酸を含むポリペプチドであって、ここで、配列番号１４または配列番号１６の位置４１にあるアミノ酸は、システイン、セリンまたはアラニンである、ポリペプチド。
【請求項２３】
請求項１５または請求項１６に記載のアミノ酸を含むポリペプチドであって、ここで、配列番号１４または配列番号１６の位置４２にあるアミノ酸は、システイン、セリンまたはアラニンである、ポリペプチド。
【請求項２４】
請求項１５または請求項１６に記載のアミノ酸を含むポリペプチドであって、ここで、配列番号１４または配列番号１６の位置５４にあるアミノ酸は、システイン、セリンまたはアラニンである、ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１５または請求項１６に記載のアミノ酸を含むポリペプチドであって、ここで、配列番号１４または配列番号１６の位置６３にあるアミノ酸は、システイン、セリンまたはアラニンである、ポリペプチド。
【請求項２６】
請求項１５または請求項１６に記載のアミノ酸を含むポリペプチドであって、ここで、配列番号１４または配列番号１６の位置７９にあるアミノ酸は、システイン、セリンまたはアラニンである、ポリペプチド。
【請求項２７】
請求項１５または請求項１６に記載のアミノ酸を含むポリペプチドであって、ここで、配列番号２の位置１７１にあるアミノ酸は、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、アラニンまたはフェニルアラニンである、ポリペプチド。
【請求項２８】
請求項１５または請求項１６に記載のアミノ酸を含むポリペプチドであって、ここで、配列番号２の位置１７２にあるアミノ酸は、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、アラニンまたはフェニルアラニンである、ポリペプチド。
【請求項２９】
請求項１５または請求項１６に記載のアミノ酸を含むポリペプチドであって、ここで、配列番号１４または配列番号１６の位置１７８にあるアミノ酸は、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、アラニンまたはフェニルアラニンである、ポリペプチド。
【請求項３０】
請求項１５または請求項１６に記載のアミノ酸を含むポリペプチドであって、ここで、配列番号１４または配列番号１６の位置１８０にあるアミノ酸は、ロイシン、ノルロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、アラニンまたはフェニルアラニンである、ポリペプチド。
【請求項３１】
請求項１、２、または３に記載の核酸分子によって、コードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項３２】
請求項１５に記載の単離されたポリペプチドであって、ここで、前記同一性パーセントが、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを使用して決定される、ポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のアミノ酸配列を含むペプチドで動物を免疫することによって産生された、抗体。
【請求項３４】
請求１４、１５または１６のいずれか１項に記載のポリペプチドを特異的に結合する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項３５】
モノクローナル抗体である、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３６】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のアミノ酸配列を含むペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項３７】
サンプル中のＭＫ６１ポリペプチドの検出またはＭＫ６１ポリペプチドの定量を行う方法であって、該方法は、ＭＫ６１を含有すると推測されるサンプルと、抗ＭＫ６１抗体または請求項３３、３４もしくは３５のいずれかに記載の抗体フラグメントとを接触させる工程、および該抗体または該抗体フラグメントの結合を検出する工程を包含する、方法。
【請求項３８】
少なくとも１つのポリペプチドを特異的に結合する選択的結合因子またはそのフラグメントであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるアミノ酸配列；および
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６の少なくとも１つに示されるアミノ酸配列の、少なくとも約２５アミノ酸のフラグメント；ならびに
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の天然に存在する改変体
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、
選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項３９】
抗体またはそのフラグメントである、請求項３８に記載の選択的結合因子。
【請求項４０】
ヒト化抗体である、請求項３８に記載の選択的結合因子。
【請求項４１】
ヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項３８に記載の選択的結合因子。
【請求項４２】
ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項３８に記載の選択的結合因子。
【請求項４３】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項３８に記載の選択的結合因子。
【請求項４４】
キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項３８に記載の選択的結合因子。
【請求項４５】
相補性決定領域ＣＤＲ０グラフト化抗体またはそのフラグメントである、請求項３８に記載の選択的結合因子。
【請求項４６】
抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、請求項３８に記載の選択的結合因子。
【請求項４７】
抗体可変領域フラグメントである、請求項３８に記載の選択的結合因子。
【請求項４８】
ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フラグメントである、請求項３８に記載の可変領域フラグメント。
【請求項４９】
選択的結合因子またはそのフラグメントであって、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異性を有する、少なくとも１つの相補性決定領域を含む、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項５０】
検出可能な標識が結合されている、請求項３８に記載の選択的結合因子。
【請求項５１】
ＭＫ６１ポリペプチドの生物学的活性のアンタゴニストまたはアゴニストである、請求項３８に記載の選択的結合因子。
【請求項５２】
疾患、状態または障害を、処置、予防または改善するための方法であって、請求項３８に記載の選択的結合因子の有効量を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５３】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６からなる群より選択されたアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫することによって産生された、選択的結合因子。
【請求項５４】
請求項１、２または３に記載のポリペプチドを結合し得る選択的結合因子を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項５５】
請求項１４、１５、または１６に記載のポリペプチド、および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項５６】
前記薬学的に受容可能な処方剤が、キャリア、アジュバント、可溶化剤、安定剤、または抗酸化剤である、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
前記ポリペプチドが、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチドの成熟形態を含む、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５８】
請求項１４、１５、または１６に記載のポリペプチドの誘導体を含む、ポリペプチド。
【請求項５９】
水溶性ポリマーで共有結合的に改変されている、請求項５８に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
請求項５１に記載のポリペプチドであって、ここで、前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアルコールからなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項６１】
請求項１、２または３に記載の核酸分子、および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
【請求項６２】
前記核酸分子が、ウイルスベクター中に含まれる、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
請求項１、２または３のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ウイルスベクター。
【請求項６４】
異種アミノ酸配列に融合された、請求項１４、１５、または１６のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、ポリペプチド。
【請求項６５】
前記異種アミノ酸配列が、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメントである、請求項６４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６６】
配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む、融合ポリペプチド。
【請求項６７】
配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む、融合ポリペプチド。
【請求項６８】
ＭＫ６１ポリペプチドのレベルの増加により生じる哺乳動物の医学的状態を、処置、予防または改善するための方法であって、該方法は、該哺乳動物に治療有効量のアンタゴニストを投与する工程であって、該アンタゴニストが、選択的結合因子、低分子、ペプチド、ペプチド誘導体およびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択される、工程を包含する、方法。
【請求項６９】
ＭＫ６１ポリペプチドのレベルの減少により生じる哺乳動物の医学的状態を、処置、予防または改善するための方法であって、該方法は、該哺乳動物に治療有効量のポリペプチドを投与する工程であって、該ポリペプチドは、請求項１４、１５、もしくは１６のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１、２、または３のいずれに記載される核酸によってコードされるポリペプチドである、工程を包含する、方法。
【請求項７０】
ＭＫ６１ポリペプチドの異常なレベルによって引き起こされるか、またはＭＫ６１ポリペプチドの異常なレベルから生じる、被験体における病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下：
（ａ）サンプル中の請求項１４、１５もしくは１６のいずれか１項に記載のポリペプチド、または請求項１、２もしくは３のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現の存在または量を決定する工程；および
（ｂ）正常被験体または異なる時刻における該被験体由来の、生物学的サンプル、組織サンプルまたは細胞サンプル中のＭＫ６１ポリペプチドのレベルを比較する工程であって、ここで、病理学的状態に対する感受性が該ポリペプチドの発現の存在または量に基く、工程
を包含する、方法。
【請求項７１】
デバイスであって、以下：
（ａ）移植に適合性の膜；および
（ｂ）該膜内にカプセル化された細胞、
を備え、ここで、該細胞は、請求項１４、１５または１６のいずれか１項に記載のポリペプチドを分泌し、そして、ここで、該膜は、該ポリペプチドに対して透過性である、デバイス。
【請求項７２】
デバイスであって、以下：
（ａ）移植に適合性の膜；および
（ｂ）該膜内にカプセル化されたＭＫ６１ポリペプチド、
を備え、ここで、該該膜は、該ポリペプチドに対して透過性である、デバイス。
【請求項７３】
ポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、
該方法は、以下：
（ａ）請求項１４、１５、または１６のいずれか１項に記載のポリペプチドと化合物とを接触させる工程；および
（ｂ）該化合物に対する該ポリペプチドの結合の程度を決定する工程
を包含する、方法。
【請求項７４】
動物におけるポリペプチドのレベルを調節する方法であって、請求項１、２または３のいずれか１項に記載の核酸分子を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項７５】
哺乳動物におけるＭＫ６１レセプター活性を阻害する方法であって、該方法は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号３６および配列番号３９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項７６】
哺乳動物におけるＭＫ６１リガンド活性を阻害する方法であって、該方法は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号３６および配列番号３９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを投与する工程を包含する、方法。
【請求項７７】
ＭＫ６１レセプターシグナル伝達のネガティブ調節因子を投与する工程を包含する、哺乳動物における免疫応答を刺激する方法。
【請求項７８】
請求項７７に記載の方法であって、ここで、前記ネガティブ調節因子が、融合タンパク質、抗体、低分子、ペプチドおよびペプチド誘導体からなる群より選択される、方法。
【請求項７９】
請求項７８に記載の方法であって、ここで、前記融合タンパク質が配列番号１６、３６、または３９に記載のアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項８０】
ＭＫ６１レセプターのシグナル伝達のポジティブ調節因子を投与する工程を包含する、免疫応答を阻害する方法。
【請求項８１】
請求項８０に記載の方法であって、ここで、前記ポジティブ調節因子が、融合タンパク質、抗体、低分子、ペプチドおよびペプチド誘導体からなる群より選択される、方法。
【請求項８２】
細胞表面結合ＭＫ６１リガンドを介する逆シグナル伝達を刺激する方法であって、該方法が、ＭＫ６１リガンド逆シグナル伝達のポジティブ調節因子を投与する工程、包含する、方法。
【請求項８３】
請求項８４に記載の方法であって、ここで、前記ポジティブ調節因子が、融合タンパク質、抗体、低分子、ペプチドおよびペプチド誘導体からなる群より選択される、方法。
【請求項８４】
請求項８３に記載の方法であって、ここで、前記融合タンパク質が、配列番号１６、配列番号３６、または配列番号３９のアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項８５】
細胞表面結合ＭＫ６１リガンドを介する逆シグナル伝達を阻害する方法であって、該方法が、ＭＫ６１リガンド逆シグナル伝達のネガティブ調節因子を投与する工程、を包含する、方法。
【請求項８６】
請求項８７に記載の方法であって、ここで、前記ネガティブ調節因子が、融合タンパク質、抗体、低分子、ペプチドおよびペプチド誘導体からなる群より選択される、方法。
【請求項８７】
哺乳動物における、Ｂ細胞およびＴ細胞のリンパ増殖性障害を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＭＫ−６１抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＭＫ６１リガンド、または抗ＭＫ６１リガンド抗体を、該哺乳動物に投与する工程、を包含する、方法。
【請求項８８】
請求項８７に記載の方法であって、ここで、前記リンパ増殖性障害が、白血病、骨髄腫、Ｂリンパ腫、または非ホジキンリンパ腫である、方法。
【請求項８９】
自己免疫疾患を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＭＫ−６１抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＭＫ６１リガンド、または抗ＭＫ６１リガンド抗体を、該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項９０】
請求項８９に記載の方法であって、ここで前記自己免疫疾患が、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、腸管性腸疾患、またはクローン病である、方法。
【請求項９１】
炎症性疾患を処置する方法であって、該方法は、治療有効量の、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＭＫ−６１抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＭＫ６１リガンド、または抗ＭＫ６１リガンド抗体を、哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項９２】
請求項９１に記載の方法であって、ここで、前記炎症性疾患が、慢性関節リウマチ、敗血症、腸管性腸疾患、またはクローン病である、方法。
【請求項９３】
配列番号３６のシステインリッチドメインである残基２６〜６０を含むアミノ酸配列を有する、ポリペプチドフラグメント。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、２０００年９月５日付けで出願された米国仮特許出願番号第６０／２３０，１９１号（これは、本明細書中において、全体が参考として援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、新規なＴＮＦレセプター（ＴＮＦｒ）様ポリペプチド（本明細書中において、「ＭＫ６１」と呼称する）およびこれをコードする核酸分子に関する。
【０００３】
本発明はまた、ＭＫ６１ポリペプチドを産生するための、ベクター、宿主細胞、薬学的組成物、選択的結合因子、および方法に関する。ＭＫ６１ポリペプチドと関連する疾患の診断、処置、改善、および／または予防のための方法もまた提供される。
【０００４】
（発明の背景）
核酸分子の同定、クローニング、発現、および操作における技術進歩ならびにヒトゲノム解読は、ヒトゲノム解読に基く新規治療剤の発見を大きく加速した。現在、高速核酸配列決定技術は、前例のない速度で配列情報を作製し得、そしてコンピュータ解析と合わされて、ゲノムの一部および全体へと重複配列を構築（アセンブリ）すること、ならびにポリペプチドコード領域の同定を可能にする。既知のアミノ酸配列のデータベース編集物に対する推定アミノ酸配列の比較によって、以前に同定された配列および／または構造的な目印に対して相同性の程度を決定することが可能である。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングおよび発現によって、構造分析および機能分析のためのポリペプチド産物が提供される。核酸分子およびコードされるポリペプチドを操作して、その改変体および誘導体を作製することによって、治療剤としての用途のための生成物に有利な特性を与え得る。
【０００５】
過去１０年間にわたるゲノム研究における顕著な技術進歩にも関わらず、ヒトゲノムに基づく新規治療剤の開発に関する可能性は、未だほとんど実現されていない。潜在的に有利なポリペプチド治療剤をコードする多くの遺伝子または（治療分子に対して「標的」としてはたらき得る）ポリペプチドをコードする遺伝子は、未だ同定されていない。
【０００６】
従って、診断的な利点または治療的な利点を有する、新規ポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子を同定することが、本発明の目的である。
【０００７】
腫瘍の壊死に関する数年の研究の後、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αおよび腫瘍壊死因子βが、１９８４年に、ついにクローニングされた。これに続く数年間は、以下を含むＴＮＦサイトカインのスーパーファミリーの出現の場となった：ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ２７リガンド（ＣＤ２７Ｌ）、ＣＤ３０リガンド（ＣＤ３０Ｌ）、ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ，これはまた、ＡＧＰ−１として示される）、オステオプロテゲリン結合タンパク質（ＯＰＧ−ＢＰまたはＯＰＧリガンド）、４−１ＢＢリガンド、ＬＩＧＨＴ、ＡＰＲＩＬ、およびＴＡＬＬ−１（Ｓｍｉｔｈら（１９９４），Ｃｅｌｌ，７６：９５９−９６２；Ｌａｃｅｙら（１９９８），Ｃｅｌｌ，９３：１６５−１７６；Ｃｈｉｃｈｅｐｏｔｉｃｈｅら（１９９７），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：３２４０１−３２４１０；Ｍａｕｒｉら（１９９８），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，８：２１−３０；Ｈａｈｎｅら（１９９８），Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：１１８５−９０；Ｓｈｕら（１９９９），Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，６５：６８０−３）。このファミリーは、その構造、特にＣ末端における構造によって、１つにまとめられる。さらに、これまでに知られているほとんどのメンバーは、免疫画分において発現されるが、いくつかのメンバーはまた、他の組織または器官でも同様に発現される（Ｓｍｉｔｈら（１９９４），Ｃｅｌｌ　７６：９５９−６２）。全てのリガンドメンバー（ＬＴ−αは除外する）は、ＩＩ型膜貫通タンパク質であって、これらは、Ｃ末端細胞外ドメイン内の保存された１５０アミノ酸の領域によって特徴付けられる。わずか２０〜２５％の同一性に限定されていることが、この保存された１５０アミノ酸のドメインは、特徴的なβプリーツシートサンドイッチ（β−ｐｌｅａｔｅｄ　ｓｈｅｅｔ　ｓａｎｄｗｉｃｈ）に折り畳まれ、そして３量体化する。この保存された領域は、タンパク質分解によって放出され、これにより、可溶性の機能的形態を生じ得る（Ｂａｎｎｅｒら（１９９３），Ｃｅｌｌ，７３：４３１−４４５）。
【０００８】
このリガンドファミリーの中の多くのメンバーは、リンパの多い組織において発現され、そして免疫系の発達および調節において重要な役割を果たす（Ｓｍｉｔｈら（１９９４））。例えば、ＴＮＦαは、マクロファージによって主に合成され、そして、このＴＮＦαは、炎症性応答および免疫防御のための重要な伝達物質である（ＴｒａｃｅｙおよびＣｅｒａｍｉ（１９９４），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，４５：４９１−５０３）。Ｆａｓ−Ｌ（これは、活性化Ｔ細胞において優勢に発現している）は、胸腺細胞のＴＣＲ媒介性アポトーシスを調節する（Ｎａｇａｔａら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ，１６：３９−４３；Ｃａｓｔｒｉｍら（１９９６），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，５：６１７−２７）。ＣＤ４０Ｌは、Ｂ細胞の生存、増殖、および免疫グロブリンアイソタイプスイッチに必須のシグナルを提供する（Ｎｏｅｌｌｅ（１９９６），Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，４：４１５−９）。
【０００９】
ＴＮＦリガンドファミリーのメンバーの大部分についての同族（ｃｏｇｎａｔｅ）レセプターが同定された。これらのレセプターは、それらの細胞外ドメインにおいて特徴的な複数のシステインリッチ反復を共有し、そして細胞質領域内の触媒モチーフを有さない（Ｓｍｉｔｈら（１９９４））。ＴＮＦＲのホモログ（すなわち、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ１、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、およびＤＲ６）のうちの２つのサブグループは、細胞内デスドメイン（ｄｅａｔｈ　ｄｏｍａｉｎ）を含み、このドメインはＴＲＡＤまたはＦＡＤＤに結合する。この結合によって、カスパーゼ８の活性化およびアポトーシスを生じる（Ｌｏｃｋｓｌｅｙら（２００１）Ｃｅｌｌ　１０４：４８７−５０１）。しかし、デスレセプター（ｄｅａｔｈ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を介するシグナル伝達はまた、肝細胞およびＴ細胞の増殖のために必要とされ得る（Ｓｔｒａｓｓｅｒら（１９９９）Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．３１：５３３−５３７，Ｙａｍａｄａら（１９９７），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｏｆ　Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，９４：１４４１−６）。ＴＮＦＲ２、ＣＤ４０、またはＣＤ３０を含む他のグループは、これらの表面レセプターを下流のシグナル伝達カスケードにつなぐ分子アダプターであるＴＮＦレセプター結合因子（ＴＲＡＦ）（ＴＮＦ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　Ｆａｃｔｏｒ）に結合する。この結合によって、細胞増殖および細胞生存を促進し得る、ＪＮＫおよびＮＦＫＢに活性化を生じる。従って、これらのタンパク質は、形態形成、アポトーシスの制御、分化または、増殖において重大な役割を果たす。ＴＮＦ／ＴＮＦＲスーパーファミリーのタンパク質は、アテローム性動脈硬化症、同種移植拒絶、関節炎、および癌のような多くのヒト疾患に対する治療のための標的として、現在、広範に研究がなされている。Ｌｏｃｋｓｌｅｙら（２００１），Ｗｉｌｌｉａｍｓら（２０００），Ａｎｎ．Ｒｈｅｍ．Ｄｉｓ．５９：ｉ７５−８０。
【００１０】
上記の膜結合レセプター分子に加えて、ＴＮＦレセプタースーパー遺伝子ファミリーに属する多くのレセプターは、可溶性リガンド結合タンパク質として存在する。その後、膜貫通レセプターの可溶性形態の多くのものは、このレセプターの細胞外リガンド結合ドメインのみを含むとして同定された。例えば、可溶性形態のＴＮＦレセプターは、尿および血清において見出され（米国特許第５，８４３，７８９号およびＮｏｐｈａｒら，ＥＭＢＯ　Ｊ．，９（１０）：３２６９−３２７８，１９９０を参照のこと）、そして、この可溶性形態のＴＮＦレセプターは、細胞表面のＴＮＦレセプターのタンパク質分解性切断によって生じることが示された（Ｗａｌｌａｃｈら，Ａｇｅｎｔｓ　Ａｃｔｉｏｎｓ　Ｓｕｐｐｌ．，３５：５１−５７，１９９１）。これらの可溶性形態のレセプター分子は、レセプターへのＴＮＦ結合を阻害のみならず、このＴＮＦ構造を安定化し、そしてその活性を保持し、従ってその効果を延長することによって、ＴＮＦ活性の調節に関与する（Ａｄｅｒｋａら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　＆　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，７（３）：２３１−２４０，１９９６）。
【００１１】
この腫瘍壊死因子スーパーファミリーのリガンドおよび細胞表面レセプターのメンバーは、免疫機能を調節し、そしてほとんどのＴＮＦ／ＴＮＦＲスーパーファミリータンパク質（例えば、２〜３例挙げると、ＦＡＳＬ／ＦＡＳ、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ、またはＬＴβ／ＬＴβＲ）は、この免疫系協調的（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ）な免疫細胞のホメオスタシス、活性誘導性細胞死、Ｔ細胞初回免疫、樹状細胞の機能および生存、または胚中心およびリンパ器官（例えば、パイアー斑およびリンパ節）の形成の場）において発現される（Ｆｕら（１９９９），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：３９９−４３３，Ｇｒｅｗａｌら（１９９８），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：１１１−１３５）。最近、この大きなファミリーの新規のメンバーが、免疫における重要な機能を有し、そしてリンパ系細胞と他の器官系（例えば、妊娠時の骨形態形成および乳腺形成）とをつなぐことが同定された。
【００１２】
免疫系および種々の疾患プロセスにおける、このＴＮＦファミリーのリガンドおよびそれらのレセプター（膜結合型および可溶型）のメンバーが担う重要な役割に起因して、診断および治療を改善する用途のために、これらのファミリーの新規のメンバーを同定し、そして特徴付けるという必要性が存在する。
【００１３】
（発明の要旨）
本発明は、新規のＭＫ６１核酸分子およびコードされるポリペプチドに関する。
【００１４】
本発明に従って、以下の多くのヒトＭＫ６１アイソフォームが本明細書中に記載される：「ｈＭＫ６１Ｔ１」、「ｈＭＫ６１Ｔ２」、「ｈＭＫ６１Ｔ３」、「ｈＭＫ６１Ｔ４」、「ｈＭＫ６１Ｔ５」、および「ｈＭＫ６１Ｔ６」。さらに、マウスのアイソフォーム（「ｍＭＫ６１」）およびそのＦｃ融合ポリペプチド（「ｍＭＫ６１−Ｆｃ」および「ｈＭＫ６１−Ｆｃ」）が、本明細書中に記載される。
【００１５】
本発明は、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：）１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３または配列番号１５に記載のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）または（ｂ）の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここでこのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列。
【００１６】
本発明はまた、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドに対して、少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでこのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３または配列番号１５に記載のヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列であって、ここでこのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のいずれかに記載されるアミノ酸配列の中で、少なくとも１つのアミノ酸置換および／またはアミノ酸欠失を有する、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１または（ａ）〜（ｄ）のヌクレオチド配列；
（ｆ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｅ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここでこのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列。
【００１７】
本発明はさらに、以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでこのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでこのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでこのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端および／またはＮ末端の短縮を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでこのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮およびＮ末端短縮からなる群から選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここでそのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）のヌクレオチド配列；
（ｇ）中程度または高度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここでそのコードされるポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列。
【００１８】
本発明はまた、本明細書中に記載の単離された核酸分子を含む発現ベクター；このベクターを含む（真核生物および／または原核生物の）組換え宿主細胞；ｈ２５２０ポリペプチドを産生するプロセスであって、この宿主細胞を適切な条件下で培養して、このポリペプチドを発現させる工程および必要に応じてこの培養物からこのポリペプチドを単離する工程を包含する、プロセス；ならびにこのプロセスによって産生された単離されたポリペプチド、を提供する。このプロセスにおいて使用される核酸分子はまた、ＭＫ６１ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された、ネイティブＭＫ６１ポリペプチドのプロモーターＤＮＡ以外のプロモーターを含み得る。
【００１９】
本発明はまた、同一性パーセントが、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔおよびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを使用して決定される、上の段落に記載の核酸分子を提供する。
【００２０】
本発明は、ＭＫ６１ポリペプチドの活性または産生の候補インヒビターおよび／または候補刺激因子を同定するためのプロセスを提供し、このプロセスは、宿主細胞を候補インヒビターおよび／または候補刺激因子に曝露する工程、この宿主細胞中におけるＭＫ６１ポリペプチドの活性または産生を測定する工程、およびこの活性とコントロール細胞（すなわち、この候補インヒビターおよび／または候補刺激因子に曝露されていない細胞）とを比較する工程を包含する。関連する局面において、本発明は、前述の方法のいずれかによって同定される、インヒビターおよび／または刺激因子を提供する。
【００２１】
本発明はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００２２】
本発明はまた、以下からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載の成熟アミノ酸配列であって、必要に応じてアミノ末端メチオニンをさらに含む、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のオルソログのアミノ酸配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータプログラムを使用して決定される場合の、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一性を示すアミノ酸配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のアミノ酸配列のフラグメントであって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列のフラグメント；ならびに
（ｅ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、もしくは配列番号１６に記載のアミノ酸配列、または（ａ）〜（ｃ）のうちの少なくとも１つのいずれかの、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体についてのアミノ酸配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列。
【００２３】
本発明はさらに、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のアミノ酸配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のアミノ酸配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のアミノ酸配列であって、ここでこのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端および／またはＮ末端の短縮を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のアミノ酸配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮およびＮ末端短縮からなる群から選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のアミノ酸配列であって、ここでそのポリペプチドは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列。
【００２４】
ＭＫ６１のアナログを、本発明で提供する。これは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のＭＫ６１ポリペプチドの保存的および非保存的な置換によって生じる。このようなアナログには、以下が含まれる：配列番号２、４、６、８、１０、または１２の３８位、３９位、または５１位に対応しているアミノ酸がシステイン、セリン、またはアラニンである、ＭＫ６１ポリペプチド；配列番号２または６の６０位または７６位に対応しているアミノ酸が、システイン、セリン、またはアラニンである、ＭＫ６１ポリペプチド；配列番号１４または１６の４１位、４２位、５４位、６３位、または７９位に対応しているアミノ酸がシステイン、セリン、またはアラニンである、ＭＫ６１ポリペプチド；配列番号２の１７１位または１７２位に対応しているアミノ酸が、ロイシン、ノルロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、またはフェニルアラニンである、ＭＫ６１ポリペプチド；配列番号１４または１６の１７８位または１８０位に対応しているアミノ酸が、ロイシン、ノルロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、またはフェニルアラニンである、ＭＫ６１ポリペプチド；配列番号１４または１６の１４１位に対応しているアミノ酸が、グリシン、プロリン、またはアラニンである、ＭＫ６１ポリペプチド。
【００２５】
本発明はまた、哺乳動物中のＭＫ６１レセプターおよび／またはリガンド活性を阻害する方法を提供する。この方法は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されている少なくとも１つのポリペプチドを投与する工程を包含する。
【００２６】
上記の（ａ）〜（ｅ）のアミノ酸配列を含有している融合ポリペプチドもまた、提供される。さらに、本発明は、配列番号１６、配列番号３６、および配列番号３９のアミノ酸配列を含有している融合ポリペプチドを含む。
【００２７】
本発明はまた、本明細書中に示されている単離された核酸分子を含有している発現ベクター、本明細書中に示されている組換え核酸分子を含有している組換え宿主細胞、ならびに、宿主細胞を培養する工程、および必要に応じてそのように産生されたポリペプチドを単離する工程を包含する、ＭＫ６１ポリペプチドを産生する方法を提供する。
【００２８】
ＭＫ６１ポリペプチドをコードする核酸分子を含有している非ヒトトランスジェニック動物はまた、本発明に包含される。ＭＫ６１核酸分子は、ＭＫ６１ポリペプチドの発現およびそのレベルの増大（これは、循環レベルの増大を含み得る）を可能にする様式で動物中に導入される。非ヒトトランスジェニック動物は、好ましくは哺乳動物である。
【００２９】
本発明のＭＫ６１ポリペプチドの誘導体もまた、提供される。
【００３０】
本発明はさらに、本明細書中に示されているＭＫ６１ポリペプチドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメントを提供する。この抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、そして、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のアミノ酸配列を含有しているペプチドでの免疫によって産生され得る。
【００３１】
配列番号２のアミノ酸配列を含有しているペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマもまた、提供される。
【００３２】
本発明はまた、サンプル中のＭＫ６１ポリペプチドを検出するかまたはその量を定量する方法を提供する。この方法は、ＭＫ６１ポリペプチドを含有しているとの疑いのあるサンプルを、本明細書中に示されている抗ＭＫ６１抗体または抗体フラグメントと接触させる工程、および上記の抗体または抗体フラグメントの結合を検出する工程を包含する。
【００３３】
さらに、ＭＫ６１ポリペプチド、その誘導体、変異体、およびフラグメント（好ましくは、少なくとも約２５個のアミノ酸の配列を有している）に特異的に結合することができる、選択的結合試薬またはそのフラグメントが、本発明によって提供される。これらの選択的結合試薬は、ヒト化抗体、ヒト抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体。キメラ抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）を繋がれた抗体、抗イディオタイプ抗体ような抗体、およびそれらのフラグメントのであり得る。さらに、選択的結合試薬は、ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フラグメントのような抗体の可変領域のフラグメント、あるいはそれらのフラグメントであり得、そして本明細書中に示されているＭＫ６１ポリペプチドに対して特異性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む場合がある。選択的結合試薬はまた、検出可能な標識（例えば、放射性標識、蛍光標識、酵素標識、または当該分野で公知の任意の他の標識）に結合する場合がある。さらに、選択的結合試薬は、ＭＫ６１ポリペプチドの生物学的活性をアンタゴナイズし得、そして／または本明細書中に示されているようなＭＫ６１ポリペプチドでの動物の免疫化によって産生され得る。
【００３４】
本発明はまた、本明細書中に示されているＭＫ６１ポリペプチドに結合することができる選択的結合試薬を産生するハイブリドーマを提供する。
【００３５】
本明細書中に示されている選択的結合試薬の有効量を患者に投与する工程を包含する、疾患、症状、または障害を処置、予防、または緩和するための方法もまた、提供される。有効量または治療有効量は、疾患、症状、または障害の経過または大きさ（例えば、これらに関係している任意の徴候の存在の強さまたは期間）において検出可能な変化を生じるために十分な量である。
【００３６】
上記の核酸分子、ポリペプチド、または選択的結合試薬、および１つ以上の薬学的に受容可能な処方剤を含有している薬学的組成物もまた、本発明に含まれる。薬学的に受容可能な処方剤は、キャリア、アジュバント、可溶化剤、安定剤、または抗酸化剤であり得る。本発明の核酸分子は、ウイルスベクター中に含まれ得る。組成物は、本発明の核酸分子またはポリペプチドの治療有効量を提供するために、使用される。本発明はまた、ポリペプチド、核酸分子、および選択的結合試薬を使用する方法にも関する。
【００３７】
本発明のＭＫ６１ポリペプチドの誘導体もまた、提供される。これらのポリペプチドは、水溶性ポリマーを用いて共有的に改変され得る。ここでは、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、およびポリビニルアルコールからなる群より選択される。
【００３８】
本発明はまた、ＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメントであり得る異種アミノ酸配列に融合された、本明細書中で示されているポリペプチド配列を含有している融合ポリペプチドを提供する。
【００３９】
ＭＫ６１ポリペプチドのレベルの低下によって生じる哺乳動物中の医学的状態（例えば、癌）を処置、予防、または緩和するための方法もまた、本発明に含まれる。これらの方法は、選択的結合試薬、低分子、ペプチド、ペプチド誘導体、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群より選択されるアンタゴニストの治療有効量を患者に投与する工程を包含する。これらの医学的状態には、免疫システムの刺激によって特徴付けられる症状（例えば、自己免疫疾患および白血病およびリンパ腫）が含まれ得る。
【００４０】
ＭＫ６１ポリペプチドのレベルの増加によって生じる哺乳動物中の医学的状態を処置、予防、または緩和するための方法もまた、本発明に含まれる。これらの方法は、ＭＫ６１ポリペプチド；ＭＫ６１ポリペプチドをコードする核酸分子；またはＭＫ６１ポリペプチドの発現を調節するかもしくは調整するエレメントを含有している核酸分子の治療有効量を患者に投与する工程を包含する。これらの方法の例には、遺伝子治療および細胞療法が含まれ、そしてさらに、本明細書中に記載される。これらの医学的状態には、免疫システムの抑制によって特徴付けられる症状（例えば、ＡＩＤＳおよび癌）が含まれ得る。
【００４１】
本発明は、ＭＫ６１ポリペプチドの異常なレベルによって引き起こされるかまたはそれによって生じる被験体の病理学的症状を診断または病理学的症状に対するかかりやすさを診断する方法を含む。この方法は、生物学的組織または細胞サンプル中のＭＫ６１ポリペプチドの存在またはその発現量を決定する工程；および正常な被験体または異なる時間の被験体のいずれかに由来する生物学的組織または細胞サンプル中の上記のポリペプチドのレベルを比較する工程を包含する。ここでは、病理学的症状に対するかかりやすさは、ポリペプチドの存在またはその発現量に基づく。
【００４２】
本発明のＭＫ６１ポリペプチドおよび核酸分子は、本明細書中に記載されているものを含む、疾患および障害を処置、予防、緩和、および／または検出するために使用される場合がある。
【００４３】
本発明はまた、ＭＫ６１ポリペプチドに結合する化合物の同定方法を提供する。この方法は、ＭＫ６１ポリペプチドを試験分子と接触させる工程、そしてポリペプチドに対する試験分子の結合の程度を決定する工程を包含する。この方法はさらに、このような試験分子がＭＫ６１ポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストであるかどうかを決定する工程を包含する場合がある。本発明はさらに、ＭＫ６１ポリペプチドの発現、またはＭＫ６１ポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法を提供する。
【００４４】
ＭＫ６１ポリペプチドの発現を調節しそしてそのレベルを調節する（すなわち、増進させるかまたは低下させる）方法もまた、本発明に含まれる。１つの方法は、ＭＫ６１ポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与する工程を包含する。別の方法においては、ＭＫ６１ポリペプチドの発現を調節するかまたは調整するエレメントを含有している核酸分子が投与される場合がある。これらの方法の例には、本明細書中にさらに記載されているような、遺伝子治療、細胞療法、およびアンチセンス治療が含まれる。
【００４５】
本発明は、さらに、本明細書中に示されている核酸分子を動物に投与する工程を包含する、動物のＭＫ６１ポリペプチドのレベルを調節する方法を提供する。
【００４６】
ＭＫ６１ポリペプチドをコードする核酸分子を含有している非ヒトトランスジェニック動物もまた、本発明に含まれる。ＭＫ６１核酸分子は、ＭＫ６１ポリペプチドの発現およびそのレベルの増大（これは、循環レベルの増大を含み得る）を可能にする様式で動物中に導入される。非ヒトトランスジェニック動物は、好ましくは哺乳動物である。
【００４７】
本発明は、配列番号２に示されているアミノ酸配列、またはそのフラグメント、変異体、もしくはホモログ（その対立遺伝子変異体およびスプライシングされた変異体を含む）をコードする、検出可能に標識されたポリヌクレオチドを含有している診断試薬を提供する。検出可能に標識されたポリヌクレオチドは、第１鎖のｃＤＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡであり得る。
【００４８】
本発明はまた、以下の工程を包含する、生物学的サンプル中のＭＫ６１核酸分子の存在を検出するための方法を提供する：
（ａ）ＭＫ６１核酸分子を含有しているとの疑いのある生物学的サンプルを提供する工程；
（ｂ）診断薬が上記の生物学的サンプル中に含まれるＭＫ６１核酸分子とハイブリダイズする条件下で、生物学的サンプルを診断薬と接触させる工程：
（ｃ）生物学的サンプル中のＭＫ６１核酸分子と診断薬との間でのハイブリダイゼーションを検出する工程；および
（ｄ）生物学的サンプルと診断薬との間でのハイブリダイゼーションのレベルを、既知の濃度のＭＫ６１核酸分子と診断薬との間でのハイブリダイゼーションのレベルと比較する工程。
【００４９】
本発明はまた、以下の工程を包含する、組織または細胞サンプル中のＭＫ６１核酸分子の存在を検出するための方法を提供する：
（ａ）ＭＫ６１核酸分子を含有しているとの疑いのある組織または細胞サンプルを提供する工程；
（ｂ）診断薬がＭＫ６１核酸分子とハイブリダイズする条件下で、組織または細胞サンプルを診断薬と接触させる工程：
（ｃ）組織または細胞サンプル中のＭＫ６１核酸分子と診断薬との間でのハイブリダイゼーションを検出する工程；および
（ｄ）組織または細胞サンプルと診断薬との間でのハイブリダイゼーションのレベルを、既知の濃度のＭＫ６１核酸分子と診断薬との間でのハイブリダイゼーションのレベルと比較する工程。
【００５０】
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、３６、および３８から構成なる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つを投与する工程を包含する、哺乳動物のＭＫ６１レセプター活性を阻害する方法を提供する。
【００５１】
本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、３６、および３８から構成なる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つを投与する工程を包含する、哺乳動物のＭＫ６１リガンド活性を阻害する方法を提供する。
【００５２】
本発明は、ＭＫ６１レセプターのシグナル伝達のネガティブな調節因子を投与することによる、哺乳動物の免疫応答を刺激する方法を提供する。ネガティブな調節因子は、ＭＫ６１レセプターのシグナル伝達を阻害する分子である。ネガティブな調節因子には、配列番号１６、３６、および３９に示されているような融合タンパク質、抗体、低分子、ペプチド、およびペプチド誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
本発明はまた、ＭＫ６１レセプターのシグナル伝達のポジティブな調節因子を投与する工程を包含する、免疫応答を阻害する方法を提供する。ポジティブな調節因子は、ＭＫ６１レセプターのシグナル伝達を活性化する分子である。ポジティブな調節因子には、ＭＫ６１リガンドおよびアゴニスト抗体が含まれる。
【００５４】
本発明は、ＭＫ６１リガンドの逆シグナル伝達のポジティブな調節因子を含む、細胞表面に結合したＭＫ６１リガンドを通じる逆シグナル伝達を刺激する方法を提供する。ポジティブな調節因子には、ＭＫ６１融合タンパク質、抗体、低分子、およびペプチド誘導体が含まれるがこれらに限定されない。用語「逆シグナル伝達」は、リガンドのレセプターまたは抗リガンド抗体による結合のような細胞表面に結合したリガンドへの分子の結合によって誘導される、細胞性のシグナル伝達の活性化因子をいう。
【００５５】
本発明はまた、ＭＫ６１リガンドの逆シグナル伝達のネガティブな調節因子を含む、細胞表面に結合したＭＫ６１リガンドを通じる逆シグナル伝達を阻害する方法を提供する。ネガティブな調節因子には、ＭＫ６１融合タンパク質、抗体、低分子、およびペプチド誘導体が含まれるがこれらに限定されない。
【００５６】
本発明は、哺乳動物のＢ細胞性またはＴ細胞性リンパ増殖障害、自己免疫疾患、または炎症性疾患を処置する方法を提供する。これらの方法は、治療有効量のＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＭＫ６１抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＭＫ６１リガンド、または抗ＭＫ６１リガンド抗体を、上記の哺乳動物に投与する工程を包含する。処置され得るリンパ増殖性疾患には、骨髄腫、Ｂリンパ腫、白血病、および非ホジキンリンパ腫以外のリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。自己免疫疾患には、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、腸管疾患、およびクローン病が含まれるが、これらに限定されない。炎症性疾患には、慢性関節リウマチ、敗血症、腸管性腸疾患、およびクローン病が含まれるがこれらに限定されない。
【００５７】
本発明はまた、配列番号３６のシステインリッチドメインの残基２６〜６０を含有しているアミノ酸配列を有するポリペプチドフラグメントを含む。システインリッチドメインは、Ｍａｄｒｙら（Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：１６９３−１７０２、１９９８）および本明細書中の参考文献に定義されているような、ＴＮＦＲスーパーファミリーのシステインリッチ領域の記号と適合し、そしてＭＫ６１リガンド結合ドメインを含むと予想される。
【００５８】
ＭＫ６１ポリペプチドは、そのリガンド同定するために使用され得る。「発現クローニング」の種々の形態が、レセプターのリガンドをクローニングするために使用されている。例えば、Ｄａｖｉｓら、Ｃｅｌｌ，８７：１１６１−１１６９（１９９６）を参照のこと。これらおよび他のＭＫ６１リガンドクローニング実験は、本明細書中でさらに詳細に記載される。ＭＫ６１リガンドの単離は、ＭＫ６１シグナル伝達経路の新規のアゴニストおよび／またはアンタゴニストの同定および開発を可能にする。このようなアゴニストおよびアンタゴニストには、ＭＫ６１リガンド、抗ＭＫ６１リガンド抗体、およびそれらの誘導体、低分子、炭水化物、脂質、ポリヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む）が含まれる。これらのいずれかが、本明細書中に記載されているものを含む、１つ以上の疾患または障害を処置する可能性を秘めて使用され得る。
【００５９】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される見出しの節は、構成の目的だけのためであり、そして記載される発明事項を限定するようには解釈されない。本明細書中で引用されている全ての参考文献は、本明細書中で明白に参考として援用される。
【００６０】
ｈＭＫ６１Ｔ１アイソフォームは、シグナルペプチド、ＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）、システインリッチドメイン（ＣＲＤ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、および長くかつ高度に保存されている細胞内ドメインを有している細胞表面レセプターである。
【００６１】
残りの５個のヒトのアイソフォーム（ｈＭＫ６１Ｔ２、ｈＭＫ６１Ｔ３、ｈＭＫ６１Ｔ４、ｈＭＫ６１Ｔ５、およびｈＭＫ６１Ｔ６）は、ＭＫ６１の可溶性のレセプター形態であると考えられる。ｈＭＫ６１Ｔ３およびｈＭＫ６１Ｔ５はそれぞれ、完全なＴＮＦｒ　ＣＲＤを含み、そしておそらく、ｈＭＫ６１Ｔ１によって媒介されるシグナル伝達の天然に存在しているインヒビターである。ｈＭＫ６１Ｔ２アイソフォーム、ｈＭＫ６１Ｔ４アイソフォーム、およびｈＭＫ６１Ｔ６アイソフォームの各々は、部分的なＣＲＤを含む。
【００６２】
ｍＭＫ６１はマウスＭＫ６１のアイソフォームであり、そしてｍＭＫ６１−Ｆｃは、そのＦｃ融合ポリペプチドである。
【００６３】
（定義）
用語「ＭＫ６１遺伝子」または「ＭＫ６１核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号１５に示されているヌクレオチド配列、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および本明細書中で定義されている核酸分子を含むかまたはそれらから構成される核酸分子をいう。
【００６４】
用語「ＭＫ６１ポリペプチド」は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のアミノ酸配列、および関連するポリペプチドを含むポリペプチドをいう。関連するポリペプチドには、ＭＫ６１ポリペプチドの対立遺伝子変異体、ＭＫ６１ポリペプチドのオルトログ、ＭＫ６１ポリペプチドのスプライシング変異体、ＭＫ６１ポリペプチドの変異体、およびＭＫ６１ポリペプチドの誘導体が含まれる。ＭＫ６１ポリペプチドは、本明細書中で定義されているような成熟ポリペプチドである場合があり、そしてそれらが調製される方法に依存して、アミノ末端メチオニン残基を有するかまたはそれを有さない場合もある。
【００６５】
用語「ＭＫ６１ポリペプチドの対立遺伝子変異体」は、生物体または生物体の集団の染色体上の所定の遺伝子座を占有している遺伝子の、天然において生じる可能性のある別の形態のいくつかのうちの１つによってコードされるポリペプチドをいう。
【００６６】
用語「ＭＫ６１ポリペプチドの誘導体」は、化学的に改変されている、本明細書中で定義されているような、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されているアミノ酸配列を有しているポリペプチド、ＭＫ６１ポリペプチドの対立遺伝子変異体、ＭＫ６１ポリペプチドのオルトログ、ＭＫ６１ポリペプチドのスプライシング変異体、またはＭＫ６１ポリペプチドの変異体をいう。
【００６７】
用語「ＭＫ６１ポリペプチドフラグメント」は、ポリペプチドのアミノ末端での短縮（リーダー配列を含むかまたは含まない）、および／またはカルボキシ末端での短縮を含むポリペプチド（それらの配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されている）、ＭＫ６１ポリペプチドの対立遺伝子改変体、ＭＫ６１ポリペプチドのオルトログ、ＭＫ６１ポリペプチドのスプライス変異体、および／またはＭＫ６１ポリペプチドの変異体（配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されているＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列と比較した場合に１つ以上のアミノ酸の付加、または置換、または内部欠失を有している（ここでは、得られるポリペプチドは、少なくとも６アミノ酸またはそれ以上の長さである））をいう。ＭＫ６１ポリペプチドフラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシングまたはインビボでのプロテアーゼ活性によって生じ得る。ＭＫ６１ポリペプチドの膜貫通形態または膜に結合した形態については、好ましいフラグメントは、膜貫通ドメインまたは膜結合ドメインを欠失しているフラグメントのような、可溶性の形態を含む。
【００６８】
好ましい実施態様においては、短縮は、約１０個のアミノ酸、または約２０個のアミノ酸、または約５０個のアミノ酸、または約７５個のアミノ酸、または約１００個のアミノ酸、または１００個以上のアミノ酸を含む。このように産生されたポリペプチドフラグメントは、約２５個の連続するアミノ酸、または約５０個のアミノ酸、または約７５個のアミノ酸、または約１００個のアミノ酸、または約１５０個のアミノ酸、または約２００個のアミノ酸を含む。このようなＭＫ６１ポリペプチドフラグメントは、アミノ酸末端のメチオニン残基を必要に応じて含み得る。このようなフラグメントが、例えば、ＭＫ６１ポリペプチドに対する抗体を作成するために使用され得ることが理解される。
【００６９】
用語「ＭＫ６１融合ポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるポリペプチド、ＭＫ６１ポリペプチドの対立遺伝子改変体、ＭＫ６１ポリペプチドのオルソログ、ＭＫ６１ポリペプチドのスプライス改変体、または配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列と比べて、１つ以上のアミノ酸の欠失、置換、または内部付加を有する、ＭＫ６１ポリペプチド改変体の、アミノ末端またはカルボキシ末端での１つ以上のアミノ酸（例えば、異種ペプチドまたは異種ポリペプチド）の融合体をいう。
【００７０】
用語「ＭＫ６１ポリペプチドのオルソログ」とは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列に対応する、別の種由来のポリペプチドをいう。例えば、マウスおよびヒトのＭＫ６１ポリペプチドは、互いにオルソログであるとみなされる。
【００７１】
用語「ＭＫ６１ポリペプチドのスプライス改変体」とは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列の非連続的コード領域を含むＲＮＡ一次転写物中のイントロン配列の選択的プロセシングによって生成される、核酸分子（通常はＲＮＡ）をいう。
【００７２】
用語「ＭＫ６１ポリペプチドの改変体」とは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されるＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（例えば、内部欠失および／またはＭＫ６１ポリペプチドフラグメント）、および／または付加（例えば、内部付加および／またはＭＫ６１融合ポリペプチド）を有するアミノ酸配列（リーダー配列を有するかまたは有さない）を含むＭＫ６１ポリペプチドをいう。改変体は、天然に存在する（例えば、ＭＫ６１ポリペプチドの対立遺伝子改変体、ＭＫ６１ポリペプチドのオルソログ、およびＭＫ６１ポリペプチドスプライス改変体）か、または、人工的に構築され得る。このようなＭＫ６１ポリペプチドの改変体は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３または配列番号１５に示されるＤＮＡ配列から適切に変化させたＤＮＡ配列を有する、対応する核酸分子から調製され得る。好ましい実施形態において、この改変体は、１〜３、または１〜５、または１〜１０、または１〜１５、または１〜２０、または１〜２５、または１〜５０、または１〜７５、または１〜１００、または１００より多くのアミノ酸の置換、挿入、付加、および／または欠失を有し、ここで、この置換は、保存的、または非保存的、あるいはその任意の組み合わせであり得る。
【００７３】
用語「抗原」とは、選択的結合因子（例えば、抗体）により結合され得、そしてさらに動物において使用されて、各抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生し得る分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
【００７４】
用語「生物学的に活性なＭＫ６１ポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドに特徴的な少なくとも１つの活性を有するＭＫ６１ポリペプチドをいう。
【００７５】
用語「有効量」および「治療有効量」とは、各々、本明細書中に示されるＭＫ６１ポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するために使用されるＭＫ６１ポリペプチドまたはＭＫ６１核酸分子の量をいう。
【００７６】
用語「発現ベクター」とは、宿主細胞における使用に適切であり、かつ異種核酸配列の発現を、指示および／または制御する核酸配列を含むベクターをいう。発現としては、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）のようなプロセスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７７】
用語「宿主細胞」を用いて、核酸配列で形質転換されたか、または形質転換され得、次いで目的の選択された遺伝子を発現し得る細胞をいう。この用語は、選択された遺伝子が存在する限り、その子孫が形態学または遺伝子構造において本来の親と同一であろうとなかろうと、その親細胞の子孫を含む。
【００７８】
用語「同一性」とは、当該分野で公知のように、配列の比較によって決定されるような、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係をいう。当該分野において、「同一性」はまた、場合に応じて、２つ以上のヌクレオチドまたは２つ以上のアミノ酸配列のストリングの間の一致によって決定されるような、核酸分子間またはポリペプチド間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、２つ以上の配列のうち小さなものと、特定の数理的モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により取り扱われたギャップアラインメント（存在する場合）との間の同一的一致のパーセントを測定する。
【００７９】
用語「類似性」は、関連した概念であるが、「同一性」とは対照的に、同一的一致および保存的置換の一致の両方を含む類似性の尺度をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば１０／２０個同一のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換である場合、パーセント同一性および類似性は、どちらも５０％である。同じ例において、保存的置換であるさらに５つの位置が存在する場合、パーセント同一性は５０％のままであるが、パーセント類似性は７５％（１５／２０）である。従って、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド間のパーセント類似性の程度は、これらの２つのポリペプチド間のパーセント同一性よりも高い。
【００８０】
用語「単離された核酸分子」とは、（１）総ＤＮＡが供給源細胞から単離される場合に、これが天然で一緒に見出されるタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０パーセントから分離された本発明の核酸分子、（２）「単離された核酸分子」が天然で連結しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に連結していない本発明の核酸分子、（３）天然では連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結した本発明の核酸分子、あるいは（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然には存在しない本発明の核酸分子、をいう。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、任意の他の混入核酸分子、または天然の環境において見出される他の混入物（これらは、ポリペプチド産生におけるその使用、またはその治療的用途、診断的用途、予防的用途、または研究的用途を妨害する）を実質的に含まない。
【００８１】
用語「単離されたポリペプチド」とは、（１）供給源細胞から単離される場合に、天然で一緒に見出されるポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０％から分離された本発明のポリペプチド、（２）「単離されたポリペプチド」が天然で連結するポリペプチドの全てまたは一部に連結していない（共有結合的相互作用によってもまたは非共有結合的相互作用によっても）、本発明のポリペプチド、（３）天然には連結しないポリペプチドに作動可能に連結（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）する、本発明のポリペプチド、あるいは（４）天然では存在していない本発明のポリペプチドをいう。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、その治療的用途、診断用途、予防用途または研究用途を妨害する、その天然の環境において見出される任意の他の混入ポリペプチドまたは他の混入物を、実質的に含まない。
【００８２】
用語「成熟ＭＫ６１ポリペプチド」は、リーダー配列を欠失したＭＫ６１ポリペプチドをいう。成熟ＭＫ６１ポリペプチドはまた、他の改変（例えば、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）および／またはカルボキシル末端のタンパク質分解性プロセシング、より大きな前駆体からのより小さなポリペプチドの切断、Ｎ結合型および／またはＯ結合型グリコシル化など）を含み得る。
【００８３】
例示的な成熟ＭＫ６１ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基２４〜アミノ酸残基３５５；配列番号４のアミノ酸残基２４〜アミノ酸残基８５；配列番号６のアミノ酸残基２４〜アミノ酸残基１３６；配列番号８のアミノ酸残基２４〜アミノ酸残基１８７；配列番号１０のアミノ酸残基２４〜アミノ酸残基７１；配列番号１２のアミノ酸残基２４〜アミノ酸残基１６７；配列番号１４のアミノ酸残基２２〜アミノ酸残基３４５；および配列番号１６のアミノ酸残基２２〜アミノ酸残基４０４によって示される。
【００８４】
用語「核酸配列」または「核酸分子」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列をいう。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかから形成される分子を包含し、例えば、以下であるがこれらに限定されない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデニン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシ−メチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチル−グアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュエオシン（β−Ｄ−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン（ｏｘｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
【００８５】
用語「天然に存在する」または「ネイティブの」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的物質と関連して使用される場合、天然において見出され、かつヒトによって操作されていない物質をいう。同様に、「天然に存在しない」または「ネイティブではない」は、本明細書中で使用される場合、天然で見出されないか、またはヒトによって構造的に改変もしくは合成された物質をいう。
【００８６】
用語「作動可能に連結された」を用いて、本明細書中では、隣接配列の様式をいい、ここで、このように記載される隣接配列は、その通常の機能を行うように構成またはアセンブルされる。従って、コード配列に作動可能に連結した隣接配列は、このコード配列の複製、転写および／または翻訳を行うことが可能であり得る。例えば、コード配列は、プロモーターがコード配列の転写を指示し得る場合に、このプロモーターに作動可能に連結されている。隣接配列は、これが正確に機能する限り、コード配列と連続する必要はない。従って、例えば、非翻訳性であるが転写される介在配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列は、なおこのコード配列に「作動可能に連結」されているとみなされ得る。
【００８７】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理学的に受容可能なキャリア」は、本明細書中で使用される場合、薬学的組成物としてのＭＫ６１ポリペプチド、ＭＫ６１核酸分子、またはＭＫ６１選択的結合因子の送達の達成または増強に適切な１つ以上の処方物質をいう。
【００８８】
用語「選択的結合因子」とは、ＭＫ６１ポリペプチドに特異性を有する分子（単数または複数）をいう。本明細書中で使用される場合、用語「特異的」および「特異性」とは、選択的結合因子の、ヒトＭＫ６１ポリペプチドに結合し、かつヒトの非ＭＫ６１ポリペプチドに結合しない能力をいう。しかし、選択的結合因子がまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載されるようなポリペプチドのオルソログ（すなわち、その種間バージョン（例えば、マウスポリペプチドおよびラットポリペプチド））に結合し得ることが、理解される。
【００８９】
用語「形質導入」を用いて、１つの細菌から別のものへの核酸の移入（通常、ファージによる）をいう。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞の配列の獲得および移入をいう。
【００９０】
用語「トランスフェクション」を用いて、細胞による外来ＤＮＡまたは外因性ＤＮＡの取り込みをいう。そして、細胞は、その外因性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されている場合、「トランスフェクト」されている。多数のトランスフェクション技術が、当該分野で周知であり、そして、本明細書中に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６（１９７３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，（１９８９）；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，（１９８６）；およびＣｈｕら、Ｇｅｎｅ　１３：１９７（１９８１）を参照のこと。このような技術は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入するために使用され得る。
【００９１】
用語「形質転換」は、本明細書中で使用される場合、細胞の遺伝特徴における変化をいい、そして細胞は、新しいＤＮＡを含むように改変されている場合、形質転換されている。例えば、細胞は、そのネイティブな状態から遺伝的に改変された場合、形質転換されている。トランスフェクションまたは形質導入に続いて、その形質転換するＤＮＡは、細胞の染色体へ物理的に組み込むことによってその細胞のＤＮＡと組み換わり得るか、複製されないエピソームエレメントとして一過性に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製し得る。細胞は、そのＤＮＡが細胞の分裂と共に複製される場合、安定に形質転換されているとみなされる。
【００９２】
用語「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を移すために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）をいうために使用される。
【００９３】
（核酸分子および／またはポリペプチドの関連性）
関連した核酸分子が、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３または配列番号１５の核酸分子の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体を包含すること、そしてこの関連した核酸分子が上記のヌクレオチド配列のいずれかに相補的である配列を包含することが理解される。関連した核酸分子はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６におけるポリペプチドと比較して１以上のアミノ酸残基の置換、改変、付加および／もしくは欠失を含むかまたは本質的にこれからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。
【００９４】
フラグメントは、配列番号２のポリペプチドの少なくとも約２５個のアミノ酸残基、または約５０個、または約７５個、または約１００個、または約１００個より多くのアミノ酸残基のポリペプチドをコードする分子を包含する。
【００９５】
さらに、関連したＭＫ６１核酸分子は、本明細書中で定義したとおりの中程度または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３もしくは配列番号１５の核酸分子、または配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、もしくは配列番号１６に示されるようなアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする分子、または本明細書中に定義されるような核酸フラグメント、または本明細書に定義されるようなポリペプチドをコードする核酸フラグメントの完全に相補的な配列と、ハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子を包含する。ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリーまたは合成ＤＮＡライブラリーを、関連した配列についてスクリーニングするために、本明細書中に提供されるＭＫ６１配列を用いてハイブリダイゼーションプローブが調製され得る。ＭＫ６１ポリペプチドのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列のうちの、既知配列に対して顕著な同一性を示す領域は、本明細書中に記載される配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてこれらの領域を用いて、スクリーニングのためのプローブを設計し得る。
【００９６】
用語「高度にストリンジェントな条件」とは、配列が非常に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを許容し、かつ顕著に不一致のＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度および変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度によって主に決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての「高度にストリンジェントな条件」の例は、６５〜６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；ならびにＡｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　第４章、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ　Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８５））を参照のこと。
【００９７】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミドまたは他の変性剤）もまた用いられ得るが、ハイブリダイゼーションの程度が影響される。他の薬剤は、非特異的および／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少させる目的のために、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液中に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、ｆｉｃｏｌｌ、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた用いられ得る。これらの添加剤の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施される；しかし、代表的なイオン強度の条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨからほとんど独立する。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　第４章（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ（１９８５））を参照のこと。
【００９８】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基組成、長さおよび塩基対の不一致程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変動要因を適応させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために当業者によって調整され得る。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって評価され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、ヌクレオチド中に形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中でのナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中での（グアニン＋シトシン）塩基の百分率である。不完全に一致したハイブリッドについては、融解温度は、１％の不一致毎に約１℃低下する。
【００９９】
用語「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が形成され得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、５０〜６５℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、または３７〜５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび２０％ホルムアミドである。例示として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中で５０℃の「中程度にストリンジェントな条件」は、約２１％の不一致を可能にする。
【０１００】
「高度に」ストリンジェントな条件と「中程度に」ストリンジェントな条件との間に絶対的な区別が存在しないことが当業者によって認識される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）では、完全に一致した長さのＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃で（同じイオン強度で）の洗浄を用いると、このことは、約６％の不一致を可能にする。より遠い関連配列を捕獲するために、当業者は、単純に、温度を低くし得るかまたはイオン強度を高くし得る。
【０１０１】
約２０ヌクレオチド（ｎｔ）までのオリゴヌクレオチドプローブについての１Ｍ　ＮａＣｌ＊中での融解温度の良好な推定は、以下によって与えられる：
Ｔｍ＝Ａ−Ｔ塩基対あたり２℃　＋　Ｇ−Ｃ塩基対あたり４℃
＊６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）中でのナトリウムイオン濃度は、１Ｍである。Ｓｕｇｇｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｕｓｉｎｇ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｇｅｎｅｓ　６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ編、（１９８１）を参照のこと。
【０１０２】
オリゴヌクレオチドについての高度なストリンジェンシー洗浄条件は、通常、より長いオリゴヌクレオチドについて、そのオリゴヌクレオチドのＴｍよりも０℃〜５℃低い温度にて、６×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中である。
【０１０３】
別の実施形態では、関連した核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３もしくは配列番号１５に示されるとおりのヌクレオチド配列に対して約７０パーセント（７０％）同一であるヌクレオチド配列を含むかもしくはこれからなるか、または配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４もしくは配列番号１６に示されポリペプチドに対して約７０パーセント（７０％）同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくは本質的にこれからなる。好ましい実施形態では、このヌクレオチド配列は、配列番号１に示されるとおりのヌクレオチド配列に対して約７５パーセント、または約８０パーセント、または約８５パーセント、または約９０パーセント、または約９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセント、もしくは９９パーセント同一であるか、またはヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４もしくは配列番号１６に示されるとおりのポリペプチド配列に対して約７５パーセント、または約８０パーセント、または約８５パーセント、または約９０パーセント、または約９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パーセント、もしくは９９パーセント同一であるポリペプチドをコードする。
【０１０４】
核酸配列における相違は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列の保存的改変および／または非保存的改変をもたらし得る。
【０１０５】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４または配列番号１６のアミノ酸配列に対する保存的改変（およびコードするヌクレオチドに対応する改変）は、天然に存在するＭＫ６１ポリペプチドの機能的特徴および化学的特徴と類似の機能的特徴および化学的特徴を有するＭＫ６１ポリペプチドを生成する。対照的に、ＭＫ６１ポリペプチドの機能的特徴および／または化学的特徴における実質的な改変は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のアミノ酸配列における置換を選択することによって達成され得、以下を維持することに対するその効果が顕著に異なる：（ａ）例えば、シートコンホメーションもしくはヘリックスコンホメーションのような、置換領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルク。
【０１０６】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性にも電荷にもほとんど影響がないかまたは全く影響がないように、ネイティブではない残基でのネイティブなアミノ酸残基の置換を含み得る。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」について以前に記載されたように、アラニンで置換され得る。
【０１０７】
保存的アミノ酸置換はまた、生物学的系における合成によるよりむしろ、化学的なペプチド合成によって代表的に組み込まれる、天然には存在しないアミノ酸残基を含む。これらとしては、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転（ｒｅｖｅｒｓｅｄ）形態または反転（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）形態が挙げられる。
【０１０８】
天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいてクラスに分けられ得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性で親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１０９】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラス由来のメンバーへの交換を含み得る。このように置換された残基は、非ヒトＭＫ６１ポリペプチドオルソログと相同または類似するヒトＭＫ６１ポリペプチドの領域、あるいはこの分子の非相同性領域に導入され得る。
【０１１０】
このような変更を作製する際、アミノ酸の疎水性親水性指標（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ　ｉｎｄｅｘ）が、考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性特徴および荷電特徴に基づいて疎水性親水性指標が割り当てられている。これらは、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【０１１１】
タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を与える疎水性アミノ酸指標の重要性が、当該分野で理解される。Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３１（１９８２）。特定のアミノ酸が、類似した疎水性親水性の指標またはスコアを有する他のアミノ酸に置換され得、そしてなお、類似した生物学的活性を保持するということは公知である。疎水性親水性指標に基づいて変更を作製する際、疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして疎水性親水性指標が±０．５以内であるアミノ酸置換がなおより特に好ましい。
【０１１２】
類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得ることもまた当該分野で理解され、特に、それによって作製される生物学的に機能的で等価なタンパク質またはペプチドが一部本発明における場合と同様に、免疫学的な実施形態において使用されることが意図される。タンパク質の最大局所的平均親水性は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される場合、その免疫原性および抗原性（すなわち、そのタンパク質の生物学的特性）と相関する。
【０１１３】
以下の親水性値が、これらのアミノ酸残基に対して割りあてらている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）およびトリプトファン（−３．４）。類似した親水性値に基づいて変更を作製する際、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そして親水性値が±０．５以内であるアミノ酸置換がなおより特に好ましい。当業者はまた、親水性に基づいて、アミノ酸の一次配列からエピトープを同定し得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」ともいわれる。
【０１１４】
所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的にかかわらず）は、そのような置換が所望されるときに当業者によって決定され得る。例えば、アミノ酸置換は、ＭＫ６１ポリペプチドの重要な残基を決定するために使用され得るか、または本明細書中に記載されるＭＫ６１ポリペプチドのそれらの基質に対する親和性を増加もしくは減少させるために使用され得る。
【０１１５】
例示的なアミノ酸置換を、表Ｉに示す。
【０１１６】
【表１】
2004508043.tif 000002
2004508043.tif 000003
当業者は、周知技術を用いて、配列番号２に示されるポリペプチドの適切な改変体を決定し得る。活性を崩壊させることなく変化され得る分子の適切な領域を同定するため、当業者は、活性に重要であると考えられない領域を標的し得る。例えば、同じ種由来または他の種由来の、類似した活性を有する類似のポリペプチドが既知の場合、当業者は、ＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列をそのような類似したポリペプチドと比較し得る。そのような比較を用いて、当業者は、類似したポリペプチドの間で保存されているその分子の残基および部分を同定し得る。そのような類似したポリペプチドに対して保存されていないＭＫ６１ポリペプチドの領域における変化は、ＭＫ６１ポリペプチドの生物学的活性および／または構造に逆の影響をおそらくほとんど与えないことが理解される。当業者はまた、たとえ比較的保存された領域においても、活性を維持したままで、天然に存在する残基を化学的に類似したアミノ酸で置換し得る（保存的アミノ酸残基置換）ことを理解する。従って、生物学的活性または構造に対して重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を崩壊させることなく、またはポリペプチド構造に有害な影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
【０１１７】
さらに、類似したポリペプチドにおいて活性または構造に重要である残基を同定する構造−機能研究を、当業者は再検討し得る。そのような比較を考慮して、当業者は、類似したポリペプチドにおいて活性もしくは構造に重要であるアミノ酸残基に対応する、ＭＫ６１ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、ＭＫ６１ポリペプチドのそのような予測された重要なアミノ酸残基の代わりに、化学的に類似したアミノ酸置換を選択し得る。
【０１１８】
当業者はまた、類似したポリペプチドにおける三次元構造に関連して、三次元構造およびアミノ酸配列を分析し得る。そのような情報を考慮して、当業者は、その三次元構造についてＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸残基のアラインメントを推測し得る。当業者は、タンパク質の表面上であると推測されるアミノ酸残基に対して極端な変更を作製しないように選択し得る。なぜなら、そのような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、所望の各アミノ酸残基において単一アミノ酸置換を含む試験改変体を作製し得る。次いで、この改変体は、当業者に公知の活性アッセイを用いてスクリーニングされ得る。そのような改変体を使用して、適切な改変体に関する情報を集め得る。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変更が、崩壊された活性、好ましくなく減少された活性、または不適切な活性を生じることが発見された場合、そのような変更を有する改変体は、回避される。言い換えると、そのような慣用的な実験から集められた情報に基づいて、当業者は、単独でかまたは他の変異と組み合わせてのいずれかで、さらなる置換が回避されるべきであるアミノ酸を、容易に決定し得る。
【０１１９】
本発明のＭＫ６１ポリペプチドアナログは、ＭＫ１ポリペプチドのアミノ酸配列を、関連するファミリーメンバーとを比較することによって、決定され得る。例示的なＭＫ６１ポリペプチド関連ファミリーメンバーとしては、ＴＮＦレセプターファミリーメンバー（例えば、Ｍｒａｎｋ（配列番号１７））、Ｆａｓリガンドレセプターファミリーメンバー（例えば、Ｍｆａｓｒ（配列番号１８））、およびリンフォトキシンβレセプターファミリメンバー（例えば、ＴＮＦｒｃ（配列番号１９））が挙げられる、これらに限定されない。この比較は、Ｐｉｌｅｕｐ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（図１０、図１１および図１２に示されるような、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　ＧＣＧ　Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｐａｃｋａｇｅ，ｖｅｒ．８．１）または保存領域および非保存領域内で複数のファミリーメンバーを用いる等価（オーバーラップ（重複））比較を用いることによって、達成され得る。図１０〜図１２に示されるように、ｍＭＫ６１ポリペプチド（配列番号１４）の予測されたアミノ酸配列は、それぞれ、Ｍｒａｎｋ（配列番号１７）、Ｍｆａｓｒ（配列番号１８）およびＴｎｆｒｃ（配列番号１９）の公知のアミノ酸と共にアライメントされる。
【０１２０】
他のＭＫ６１ポリペプチドアナログは、当業者に公知の、これらまたは他の方法を使用して同定され得る。これらのオーバーラップ（重なり合わせた）配列は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換についての指針を与え、これによって、さらなるＭＫ６１アナログを生じる。これらのアミノ酸置換が天然に存在するアミノ酸または非天然のアミノ酸からなり得ることが理解される。例えば、図１０〜１２に示されるアライメントによって、潜在的なＭＫ６１アナログが、配列番号２、４、６、８、１０、および１２の３８位、３９位、または５１位においてＣｙｓ残基を有し、これらがＳｅｒ残基またはＡｌａ残基によって置換されること；このＭＫ６１アナログが、配列番号２および６の位置６０または７６においてＣｙｓ残基し、これらがＳｅｒ残基およびＡｌａ残基で置換されること；このＭＫ６１アナログが、配列番号１４または１６の４１位、４２位、５４位、６３位、または７９位においてＣｙｓ残基を有して、これらがＳｅｒ残基またはＡｌａ残基で置換されること；このＭＫ６１アナログが、配列番号２の１７１位および１７２位においてＬｅｕ残基を有して、これらがノルロイシン、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、またはＰｈｅで置換されること；このＭＫ６１アナログが、配列番号１４または配列番号１６の位置１７８位および１８０位においてＬｅｕ残基を有して、これらがノルロイシン、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、またはＰｈｅで置換されること；このＭＫ６１アナログが、配列番号１４または１６の１４１位においてＧｌｙ残基を有して、これらがＰｒｏ残基またはＡｌａ残基によって置換されることを示される。
【０１２１】
多数の科学刊行物が、二次構造の推測に向けられている。Ｍｏｕｌｔ　Ｊ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．７（４）：４２２−４２７（１９９６）、Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３（２）：２２２−２４５（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１１３（２）：２１１−２２２（１９７４）；Ｃｈｏｕら、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−１４８（１９７８）；Ｃｈｏｕら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６およびＣｈｏｕら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−３８４、（１９７９）を参照のこと。さらに、二次構造の予測を補助するコンピュータープログラムが、現在利用可能である。二次構造を予測する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％よりも高い配列同一性、または４０％よりも高い配列類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似した構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長により、二次構造の推測可能性（ポリペプチド構造またはタンパク質構造内の潜在的な折り畳みの数を含む）の増大がもたらされた。Ｈｏｌｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．２７（１）：２４４−２４７（１９９９）を参照のこと。所定のポリペプチドもしくはタンパク質において限定された数の折り畳みが存在すること、および一旦構造の臨界数が決定されると、構造予測が劇的により正確になること、が示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７（３）３６９−３７６（１９９７））。
【０１２２】
二次構造を予測するさらなる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７（３）：３７７−８７（１９９７）；Ｓｉｐｐｌら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、４（１）：１５−１９（１９９６））、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５３：１６４−１７０（１９９１）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１８３：１４６−１５９（１９９０）；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４（１３）４３５５−４３５８（１９８７））、および「進化的連鎖（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｌｉｎｋａｇｅ）」（Ｈｏｌｍ（前出）およびＢｒｅｎｎｅｒ（前出）を参照のこと）が、挙げられる。
【０１２３】
好ましいＭＫ６１ポリペプチド改変体としては、グリコシル化部位の数および／または型が配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のアミノ酸配列と比較して変化している、グリコシル化改変体が挙げられる。１つの実施形態において、ＭＫ６１ポリペプチド改変体は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のアミノ酸配列より多いかまたは少ない数のＮ結合型グリコシル化部位を含む。Ｎ結合型グリコシル化部位は、配列：Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘと印されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ結合型炭水化物鎖の付加のための潜在的な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、存在するＮ結合型炭水化物鎖を除去する。１つ以上のＮ結合型グリコシル化部位（代表的に、天然に存在するグリコシル化部位）が排除され、そして１つ以上の新たなＮ結合型部位が作製される、Ｎ結合型炭水化物鎖の再配列もまた、提供される。さらなる好ましいＭＫ６１改変体としては、１つ以上のシステイン残基が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に記載のアミノ酸配列と比較して欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されている、システイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、ＭＫ６１ポリペプチドが、例えば不溶性の封入体の単離の後に、生物学的に活性なコンフォメーションにリフォールディングされなければならない場合に、有用である。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン残基を有し、そして代表的には偶数のシステイン残基を有し、対合していないシステインから生じる相互作用を最小にする。
【０１２４】
本発明は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されたタンパク質のエピトープ結合部分を含むポリペプチドさらに提供する。用語「エピトープ」とは、抗体が結合し得るタンパク質の領域をいう。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら、ＰＮＡＳ，ＵＳＡ　８１：３９９８〜４００２（１９８４）を参照のこと。エピトープは、直鎖状またはコンフォメーション型であり得、この後者は、このタンパク質のフォールリング（折り畳み）の際にエピトープを形成するタンパク質の非連続的な領域からなる。直鎖状エピトープは、一般的に少なくとも６アミノ酸残基長である。タンパク質配列の部分を模倣する比較的短い合成ペプチドは、この部分的に模倣されたタンパク質と反応する抗血清を、慣用的に誘起し得る。Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２１９：６６０−６６６（１９８３）を参照のこと。短い、直鎖状エピトープを認識する抗体は、変性したタンパク質を使用する分析的用途および診断的用途（例えば、ウェスタンブロット）において特に有用である。例えば、Ｔｏｂｉｎ　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７６：４３５０−４３５６（１９７９）を参照のこと。短いペプチドに対する抗体はまた、ネイティブコンフォメーションのタンパク質を認識し得、従って、この抗体は、タンパク質発現およびタンパク質単離をモニターするため、および例えば、ＥＬＩＳＡまたは免疫沈降的研究によって溶液中のＭＫ６１タンパク質を検出するのに有用である。
【０１２５】
さらに、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはＭＫ６１ポリペプチド改変体は、相同なポリペプチドに融合されてホモダイマーを形成し得るか、または異種のポリペプチドに融合されてヘテロダイマーを形成し得る。異種のペプチドおよびポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＭＫ６１融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能するためのエピトープ；膜貫通レセプタータンパク質またはその一部分（例えば、細胞外ドメイン、または膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン）；膜貫通レセプタータンパク質に結合するリガンドまたはその一部分；触媒活性である酵素またはその一部分；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；安定性を増加するポリペプチドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）；ならびに配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、もしくは配列番号１６に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはＭＫ６１ポリペプチド改変体とは異なる治療活性を有するポリペプチド。
【０１２６】
融合は、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、もしくは配列番号１６に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはＭＫ６１ポリペプチド改変体のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかでなされ得る。融合は、リンカー分子またはアダプター分子なしで直接的であり得るか、あるいはリンカー分子またはアダプター分子を使用して間接的であり得る。リンカー分子またはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基、代表的には約２０〜約５０個までのアミノ酸残基であり得る。リンカー分子またはアダプター分子はまた、融合部分の分離を可能にするために、コードされるポリヌクレオチド中の、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼの切断部位、またはプロテアーゼの切断部位を有するように設計され得る。一旦構築されると、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載される方法に従って誘導され得ることが理解される。
【０１２７】
本発明のさらなる実施形態において、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４に記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはＭＫ６１ポリペプチド改変体は、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合される。抗体は、２つの機能的に独立した部分（抗原に結合する、「Ｆａｂ」として公知の可変ドメイン、および食細胞による攻撃および補体活性化のようなエフェクター機能に関係する、「Ｆｃ」として公知の定常ドメイン）を含む。Ｆｃは、長い血清半減期を有し、一方、Ｆａｂは短寿命である（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３７：５２５−３１（１９８９））。治療タンパク質と一緒に構築される場合、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはＦｃレセプター結合、プロテインＡ結合、補体固定およびおそらく胎盤輸送のような機能でさえ組込み得る（同書）。表ＩＩは、当該分野で公知の特定のＦｃ融合物の使用を要約する。
【０１２８】
【表２】
2004508043.tif 000004
2004508043.tif 000005
一例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域の全てまたは一部が、当業者に公知の方法を使用して、ＭＫ６１ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいて、融合され得る。得られるＭＫ６１融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって、精製され得る。Ｆｃ領域に融合したペプチドおよびタンパク質は、融合していない対応物よりもインビボにおいて実質的に長い半減期を示すことが見出された。また、Ｆｃ領域への融合により、融合ポリペプチドの二量化／多量体化が可能になる。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、または治療の質、循環時間、減少した凝集などのような特定の質を改善するよう変更され得る。
【０１２９】
関連する核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算され得る。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ　Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄａｔａ（Ｐａｒｔ　１，Ｇｒｉｆｆｉｎ　Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ　Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９１）；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、ＳＩＡＭ　Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３０】
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間での最大の適合を与えるように、設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公共に利用可能なコンピュータプログラムにおいて記載されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための、好ましいコンピュータプログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ　Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（前出）（１９９０））から公共に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ　Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【０１３１】
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアライメントスキームは、これら２つの配列の短い領域のみの適合を生じ得、そしてこの小さな整列領域は、その２つの全長配列間に有意な関連がない場合でさえも、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、好ましい実施形態において、選択されたアライメント方法（ＧＡＰプログラム）は、標的ポリペプチドの少なくとも５０個連続するアミノ酸にわたるアラインメントを生じる。
【０１３２】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一性の百分率が決定されるべき２つのポリペプチドが、それらのそれぞれのアミノ酸の最適な適合（アルゴリズムによって決定される「適合したスパン」）のために、整列される。ギャップオープニングペナルティー（ｇａｐ　ｏｐｅｎｉｎｇ　ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、平均対角の３倍として計算される：「平均対角」とは、使用される比較行列（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｍａｔｒｉｘ）の対角（ｄｉａｇｏｎａｌ）の平均である；「対角」とは、特定の比較行列によって各完全なアミノ酸一致に対して割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティー（ｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｐｅｎａｌｔｙ）（これは通常、キャップオープニングペナルティー１／１０倍である）、ならびにＰＡＭ　２５０またはＢＬＯＳＵＭ　６２のような比較行列が、このアルゴリズムと組み合わせて使用される。標準的な比較行列（ＰＡＭ２５０比較行列については、Ｄａｙｈｏｆｆら、Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　５（３）（１９７８））；ＢＬＯＳＵＭ　６２比較行列については、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８９：１０９１５−１０９１９を参照のこと）もまた、このアルゴリズムによって使用される。
【０１３３】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは、以下を含む：
アルゴリズム（Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較マトリクス（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｍａｔｒｉｘ）：ＢＬＯＳＵＭ　６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、（前出）；
ギャップペナルティー（Ｇａｐ　Ｐｅｎａｌｔｙ）：１２
ギャップレングスペネルティー（Ｇａｐ　Ｌｅｎｇｔｈ　Ｐｅｎａｌｔｙ）：４
類似性閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　ｏｆ　Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）：０。
【０１３４】
このＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較のためのデフォルトパラメータ（末端ギャップに対してはペナルティーがないこととともに）である。
【０１３５】
核酸分子配列比較についての好ましいパラメーターとしては、以下が挙げられる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら（前出）（１９７０）
比較マトリクス：一致＝＋１０、不一致＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップレングスペナルティー：３。
【０１３６】
ＧＡＰプログラムはまた、上記パラメーターを用いても有用である。上記パラメーターは、核酸分子比較についてのデフォルトパラメーターである。
【０１３７】
他の例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップエクステンションペナルティー、比較行列（マトリクス）、類似性閾値などが当業者により使用され得、これには、Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に記載されるものを含む。なされる特定の選択は、当業者に明らかであり、なされる特定の比較（例えば、ＤＮＡ−ＤＮＡ、タンパク質−タンパク質、タンパク質−ＤＮＡ）；さらに、比較が、所定の配列対の間である（この場合、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）か、または一つの配列と大きな配列のデータベースとの間（この場合、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるか）に依存する。
【０１３８】
（合成）
本明細書中に記載される核酸分子およびポリペプチド分子は組換え手段および他の手段によって産生され得ることが、当業者によって認識される。
【０１３９】
（核酸分子）
この核酸分子は、ＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、種々の方法（化学合成、ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニングおよび／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅を含むが、これらに限定されない）で容易に獲得され得る。
【０１４０】
本明細書中で使用される組換えＤＮＡ方法は、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））および／またはＡｕｓｕｂｅｌら編（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｉｎｃ．ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４））に記載される方法である。本発明は、本明細書中に記載される核酸分子およびこのような分子を得るための方法を提供する。
【０１４１】
ＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が一つの種から同定された場合、その遺伝子の全てまたは一部は、同じ種由来のオルソログ遺伝子または関連遺伝子を同定するためのプローブとして使用され得る。このプローブまたはプライマーは、ＭＫ６１ポリペプチドを発現すると考えられる種々の組織供給源由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。さらに、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３または配列番号１５に記載される配列を有する核酸分子の一部または全てを使用してゲノムライブラリーをスクリーニングし、ＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定および単離し得る。代表的には、中程度のストリンジェンシーの条件または高度なストリンジェンシーの条件をスクリーニングのために使用して、スクリーニングから得られる偽陽性の数を最小にする。
【０１４２】
ＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子はまた、発現クローニング（これは、発現されたタンパク質の性質に基づく陽性クローンの検出を使用する）によって同定され得る。代表的には、核酸ライブラリーは、宿主細胞表面において発現されそして提示されるクローン化タンパク質への抗体または他の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）の結合によってスクリーニングされる。抗体または結合パートナーは、所望のクローンを発現する細胞を同定するために、検出可能な標識を用いて修飾される。
【０１４３】
以下に記載される説明に従って行われる組換え発現技術に従って、これらのポリヌクレオチドを作製し、そしてコードされるポリペプチドを発現させ得る。例えば、ＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することによって、当業者は、大量の所望のヌクレオチド配列を容易に作製し得る。次いで、この配列を使用して検出プローブまたは増幅プライマーを作製し得る。あるいは、ＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターに挿入し得る。発現ベクターを適切な宿主に導入することによって、コードされるＭＫ６１ポリペプチドは、大量に産生され得る。
【０１４４】
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法において、ｃＤＮＡは、酵素である逆転写酵素を使用して、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製される。次いで、２つのオリゴヌクレオチドプライマー（代表的には、ＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ（オリゴヌクレオチド）の２つの別個の領域に対して相補的である）が、ＴａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにこのｃＤＮＡに添加され、そしてこのポリメラーゼが、これら２つのプライマー間のｃＤＮＡの領域を増幅する。
【０１４５】
ＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７１６−７３４（１９８９）によって記載されるもののような、当業者に周知の方法を使用する、化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのリン酸トリエステル法、ホスホロアミダイト法、およびＨ−ホスホネート法が挙げられる。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を使用する、ポリマーにより支持される合成である。代表的に、ＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用して、いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、これらのフラグメントが一緒に連結されて、ＭＫ６１ポリペプチドの全長ヌクレオチド配列を形成し得る。通常、このポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、ＡＴＧを有し、このＡＴＧは、メチオニン残基をコードする。このメチオニンは、宿主細胞において産生されたポリペプチドがその細胞から分泌されるよう設計されているか否かに依存して、ＭＫ６１ポリペプチドの成熟形態で存在してもそうでなくてもよい。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１４６】
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるＭＫ６１ポリペプチドの最適な発現のために変更されたコドンを含む。特定のコドン変更は、発現のために選択されるＭＫ６１ポリペプチドおよび宿主細胞に依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって（例えば、所定の宿主細胞において高度に発現される遺伝子における使用に好ましいコドンを選択することによって）実施され得る。高度に発現された細菌遺伝子のコドン優先度に関する「Ｅｃｏｈｉｇｈ．ｃｏｄ」のようなコドン頻度表を組み込むコンピューターアルゴリズムが使用され得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｖｅｒｓｉｏｎ　９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。他の有用なコドン頻度表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」が挙げられる。
【０１４７】
（ベクターおよび宿主細胞）
ＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入し得る。ベクターは、代表的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じ得るように、宿主細胞機構と適合性である）。ＭＫ６１ポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫（バキュロウイルス系）宿主細胞および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、ＭＫ６１ポリペプチドが翻訳後修飾（例えば、グリコシル化および／またはリン酸化）されるか否かに一部依存する。そうである場合、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説については、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８５巻、Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）を参照のこと。
【０１４８】
代表的に、上記の宿主細胞のいずれかに使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列ならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含む。このような配列（集合的に、「隣接配列」と呼ばれる）は、特定の実施形態において、代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナースプライス部位およびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論される。
【０１４９】
必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、ＭＫ６１ポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に配置されるオリゴヌクレオチド分子）を含み得；このオリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）、または他の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）またはｍｙｃ）（これらに関して市販の抗体が存在する）をコードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にそのポリペプチドに融合され、宿主細胞からの、ＭＫ６１ポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリクスとしてタグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、その後、タグは、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような種々の手段によって、精製されたＭＫ６１ポリペプチドから除去され得る。
【０１５０】
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統由来）であり得るか、異種（すなわち、宿主細胞種または宿主細胞系統以外の種由来）であり得るか、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）であり得るか、または合成であり得るか、あるいは隣接配列は、ＭＫ６１ポリペプチド発現を調節するために正常に機能するネイティブな配列であり得る。このように、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、あるいは任意の植物であり得、但し、隣接配列は、宿主細胞の機構において機能的であり、そして宿主細胞の機構によって活性化され得る。
【０１５１】
本発明のベクターにおいて有用な隣接配列は、当該分野において周知であるいくつかの方法のいずれかによって得られ得る。代表的には、内因性ＭＫ６１遺伝子隣接配列以外の、本明細書中で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は公知であり得る。ここで、隣接配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書中で記載される方法を使用して、合成され得る。
【０１５２】
隣接配列の全てまたは一部のみが公知である場合、ＰＣＲを使用して、そして／あるいは適切なオリゴヌクレオチドおよび／または同じ種もしくは別の種由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、隣接配列は得られ得る。隣接配列が公知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子（単数または複数）を含み得る大きなＤＮＡ断片から単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、続くアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、または当業者に公知の他の方法を使用する単離によって、達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
【０１５３】
複製起点は、代表的に、商業的に購入した原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞においてベクターの増幅に役立つ。特定のコピー数へのベクターの増幅は、いくつかの場合において、ＭＫ６１ポリペプチドの最適な発現に重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、複製起点部位は、公知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（製品番号３０３−３ｓ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢＰＶのようなパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターに必要とされない（例えば、ＳＶ４０起点は、ただそれが初期プロモーターを含むので、しばしば、使用される）。
【０１５４】
転写終結配列は、代表的にポリペプチドコード領域の末端の３’側に配置され、そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメント、およびそれに続くポリ−Ｔ配列である。この配列はライブラリーから容易にクローン化されるか、またはベクターの一部として商業的にさえ購入されるが、これはまた、本明細書中に記載されるような核酸合成のための方法を使用して容易に合成され得る。
【０１５５】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞について、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるタンパク質；（ｂ）細胞の栄養要求性の欠損を補うタンパク質；あるいは（ｃ）複合培地から入手可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質を、コードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
【０１５６】
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生により大きく要求される遺伝子が、連続する世代の組換え細胞の染色体において直列に反復される、プロセスである。哺乳動物細胞についての適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子によって生存するように唯一適合される、選択圧下に置かれる。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が連続的に変化する条件下で、形質転換された細胞を培養することによって課され、それによって選択遺伝子とＭＫ６１ポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く。結果として、増加した量のＭＫ６１ポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１５７】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてシャイン・ダルガルノ配列（原核性物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的に、発現されるＭＫ６１ポリペプチドのプロモーターの３’側かつコード配列の５’側に配置される。シャイン・ダルガルノ配列は、可変であるが、代表的には、ポリプリン（すなわち、高いＡ−Ｇ含有量を有する）である。多くのシャイン・ダルガルノ配列が、同定されており、そのそれぞれが、本明細書中に記載の方法を使用して容易に合成され得、そして原核生物ベクターにおいて使用され得る。
【０１５８】
リーダー配列、またはシグナル配列は、宿主細胞の外へとＭＫ６１ポリペプチドを指向させるために使用され得る。代表的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、ＭＫ６１核酸分子のコード領域に位置するか、または直接ＭＫ６１ポリペプチドコード領域の５’末端に位置する。多くのシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞において機能性である任意のシグナル配列が、ＭＫ６１核酸分子と組み合わせて使用され得る。従って、シグナル配列は、ＭＫ６１遺伝子またはＭＫ６１　ｃＤＮＡに対して同種（天然に存在する）または異種であり得る。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載される方法を使用して化学的に合成され得る。ほとんどの場合、シグナルペプチドの存在による宿主細胞からのＭＫ６１ポリペプチドの分泌は、分泌されたＭＫ６１ポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されたＭＫ６１核酸分子の一部であり得る。
【０１５９】
ＭＫ６１ポリペプチドコード領域に結合されたネイティブなＭＫ６１ポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列またはＭＫ６１ポリペプチドコード領域に結合された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかの使用が、本発明の範囲内に含まれる。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。ネイティブなＭＫ６１ポリペプチドシグナル配列を認識せずかつプロセシングしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼリーダー、ペニシリナーゼリーダー、または熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される、原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌のために、ネイティブなＭＫ６１ポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、ネイティブなシグナル配列が十分であるが、他の哺乳動物シグナル配列が使用され得る。
【０１６０】
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において望ましいような、いくつかの場合において、グリコシル化または収量を改善するために種々のプレ配列（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更し得るか、または、これもまた、グリコシル化に影響し得るプレ配列を付加し得る。最終タンパク質産物は、（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）−１位に、発現に付随して１つ以上のさらなるアミノ酸を有し得、これは、完全には除去されないかもしれない。例えば、最終タンパク質産物は、Ｎ末端に結合される、ペプチダーゼ切断部位において見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域を切断する場合、所望のＭＫ６１ポリペプチドの少し短縮した形態を生じ得る。
【０１６１】
多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の１つ以上のイントロンの存在によって増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺乳動物宿主細胞）において産生される場合、特に当てはまる。使用されるイントロンは、特に使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合、ＭＫ６１遺伝子内に天然に存在し得る。（大部分のｃＤＮＡについて）イントロンが遺伝子内に天然に存在しない場合、イントロンは、別の供給源から得られ得る。隣接配列およびＭＫ６１遺伝子に関するイントロンの位置は、イントロンが効果的に転写されなければならないので、一般的に重要である。従って、ＭＫ６１　ｃＤＮＡ分子が転写される場合、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の３’側でありかつ、ポリＡ転写終結配列の５’側である。好ましくは、イントロン（単数または複数）は、コード配列を妨害しないように、ｃＤＮＡの一方の側またはもう一方の側（すなわち、５’側または３’側）に配置される。イントロンが、挿入される宿主細胞に適合性である場合、任意の供給源（任意のウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む）由来の任意のイントロンを使用して本発明を実行し得る。合成イントロンもまた本明細書中に含まれる。必要に応じて、１つより多くのイントロンがベクター内で使用され得る。
【０１６２】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは各々、代表的には、宿主生物によって認識され、かつＭＫ６１ポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、代表的には構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子の開始コドンに対して上流（すなわち、５’側）（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ内）に配置される非転写配列である。プロモーターは、慣習的に、２つのクラス（誘導性プロモーターおよび構成性プロモーター）の１つにグループ化される。この状況で、誘導性プロモーターは、抑制性（ｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ）／抑圧性（ｄｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ）のプロモーターおよび従来の誘導性プロモーターである。誘導性プロモーターは、培養条件におけるいくらかの変化（例えば、栄養の存在または欠如、あるいは温度の変化）に応答して、その制御下にある、ＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始する。他方、構成性プロモーターは、連続的な遺伝子産物の産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対してほとんど制御しないかまたは全く制御しない。多数のプロモーター（種々の潜在的な宿主細胞によって認識される）が周知である。適切なプロモーターは、例えば、供給源のＤＮＡから制限酵素消化によってプロモーターを取り出し、そして所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、ＭＫ６１ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブなＭＫ６１遺伝子プロモーター配列は、ＭＫ６１核酸分子の増幅および／または発現を指向するために使用され得る。しかし、ネイティブなプロモーターと比較して多量の転写およびより高い発現タンパク質の産生が可能であり、そして使用のために選択された宿主細胞系と適合性である場合、異種プロモーターが好ましい。
【０１６３】
原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼプロモーター系、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；ならびにハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた、適切である。これらの配列は、公開されており、それによって、当業者は、任意の有用な制限部位を供給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを使用して、所望のＤＮＡ配列にそれらを連結し得る。
【０１６４】
酵母宿主との使用に適切なプロモーターもまた、当該分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、限定しないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られる、プロモーターが挙げられる。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
【０１６５】
ＭＫ６１遺伝子転写を制御する際に興味深くあり得るさらなるプロモーターとしては、限定しないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモータ領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ　２９０：３０４−３１０、１９８１）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’側の長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ　２２：７８７−７９７、１９８０）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：１４４−１４４５，１９８１）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ　２９６：３９−４２，１９８２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５：３７２７−３７３１，１９７８）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：２１−２５，１９８３）。組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている、以下の動物転写制御領域もまた関心が高い：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら，Ｃｅｌｌ　３８：６３９−６４６，１９８４；Ｏｒｎｉｔｚら，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　７：４２５−５１５，１９８７）；膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，Ｎａｔｕｒｅ　３１５：１１５−１２２，１９８５）；リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，Ｃｅｌｌ　３８：６４７−６５８（１９８４）；Ａｄａｍｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３１８：５３３−５３８（１９８５）；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−１４４４，１９８７）；精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞において活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，Ｃｅｌｌ　４５：４８５−４９５，１９８６）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６，１９８７）；肝臓において活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−１６４８，１９８５；Ｈａｍｍｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：５３−５８，１９８７）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１，１９８７）；骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，Ｎａｔｕｒｅ　３１５：３３８−３４０，１９８５；Ｋｏｌｌｉａｓら，Ｃｅｌｌ　４６：８９−９４，１９８６）；脳の稀突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，Ｃｅｌｌ　４８：７０３−７１２、１９８７）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ　３１４：２８３−２８６��１９８５）；ならびに視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３４：１３７２−１３７８，１９８６）。
【０１６６】
エンハンサー配列は、高等真核生物による本発明のＭＫ６１ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加するように、ベクターに挿入され得る。エンハンサーは、転写を増加させるようにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、比較的方向および位置に非依存性である。これらは、転写ユニットに対して５’側および３’側に見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）。しかし、代表的には、ウイルス由来のエンハンサーが、使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ＭＫ６１核酸分子に対して５’側または３’側の位置でベクターにスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから５’側の部位に配置される。
【０１６７】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような開始ベクターから構築され得る。このようなベクターは、所望な隣接配列を全て含んでも良いし、含まなくても良い。所望される隣接配列の１つ以上が予めベクター内に存在しない場合、これらは、個々に得られ得、ベクターに連結され得る。隣接配列のそれぞれを得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１６８】
本発明を実行するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞、および哺乳動物宿主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとしては、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５β（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ公開番号ＷＯ　９０／１４３６３）ならびにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が挙げられる。
【０１６９】
さらなる適切なベクターとしては、限定しないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスが挙げられるが、これらのベクター系は、選択された宿主細胞と適合性でなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、限定しないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（ＣｏｌＥｌ−ベースの高コピー数ファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭ　ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ならびに哺乳動物ベクター、酵母ベクター１またはバキュロウイルス発現系のようなウイルスベクター（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ、ＣＡ）のような、プラスミドが挙げられる。
【０１７０】
ベクターが構築され、そしてＭＫ６１ポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後に、完成したベクターが増幅および／またはポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入され得る。選択された宿主細胞へのＭＫ６１ポリペプチドについての発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム媒介性形質転換、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストラン法のような方法を含む周知の方法、あるいは他の公知の技術によって達成され得る。選択される方法は、部分的には使用される宿主細胞の種類の関数である。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載される。
【０１７１】
宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であり得る。宿主細胞は、適切な条件下で培養される場合にＭＫ６１ポリペプチドを合成し得、このＭＫ６１ポリペプチドは、続いて、（宿主細胞がそのポリペプチドを培地に分泌する場合）培養培地から収集され得るか、または（そのポリペプチドが分泌されない場合）直接そのポリペプチドを産生する宿主細胞から収集される。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性に望ましいかまたは必要なポリペプチド修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）、および生物学的に活性な分子へと折り畳まれる容易さなどの種々の因子に依存する。
【０１７２】
多くの適切な宿主細胞が当該分野において公知であり、多くが、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９から入手可能である。例としては、限定しないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ６１）、ＣＨＯ　ＤＨＦＲ−細胞（Ｕｒｌａｕｂら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：４２１６−４２２０（１９８０））、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞または２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１５７３）、あるいは３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ９２）のような哺乳動物細胞が挙げられる。適切な哺乳動物宿主細胞の選択、ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物生成、および精製のための方法は当該分野において公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルのＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１６５０）およびＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ１６５１）細胞株、およびＣＶ−１（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ７０）細胞株である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、霊長動物細胞株およびげっ歯類細胞株（形質転換細胞株を含む）が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物から誘導される細胞株、ならびに初代外植片もまた、適切である。候補細胞は、選択遺伝子を遺伝子型的に欠失し得るか、または優性に作用する選択遺伝子を含み得る。他の適切な哺乳動物細胞株としては、限定しないが、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓマウス、Ｂａｌｂ−ｃマウスまたはＮＩＨマウスから誘導された３Ｔ３株、ＢＨＫハムスター細胞株またはＨａｋハムスター細胞株が挙げられ、これらはＡＴＣＣより入手可能である。これらの細胞株のそれぞれは、タンパク質発現に関する分野の当業者にとって公知であり入手可能である。
【０１７３】
本発明に適切な宿主細胞として同様に、有用なのは細菌細胞である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの種々の菌株（例えば、ＨＢ１０１、（ＡＴＣＣ受託番号３３６９４）ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１（ＡＴＣＣ受託番号５３３３８））は、生物工学の分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐｐ．などの種々の菌株もまた、本方法において使用され得る。
【０１７４】
当業者に公知の酵母細胞の多くの菌株はまた、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１７５】
さらに、望ましい場合には、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−８１７（１９９３）；Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−５７２（１９９３）；およびＬｕｃｋｌｏｗら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−４５７９（１９９３）に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）である。
【０１７６】
グリコシル化ＭＫ６１ポリペプチドを発現するために、トランスジェニック動物もまた使用され得る。例えば、トランスジェニック乳汁産生動物（例えば、雌ウシまたはヤギ）を使用して、本発明のグルコシル化ポリペプチドを動物の乳汁中に得ることができる。ＭＫ６１ポリペプチドを産生するために、植物もまた使用し得るが、一般的に、植物において生じるグリコシル化は、哺乳動物細胞において生じるものとは異なり、ヒト治療の用途に適切ではないグリコシル化産物を生じ得る。
【０１７７】
（ポリペプチド産生）
ＭＫ６１ポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を使用して培養され得る。この培地は通常、細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養素を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するための適切な培地としては、例えば、Ｌｕｒｉａ　Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細胞を培養するための適切な培地としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｍｅｄｉｕｍ　１６４０（ＲＰＭＩ　１６４０）、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍａｌ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＥＭ）および／またはダルベット改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これらの全ては、培養される特定の細胞株に示されるように血清および／または増殖因子を補充され得る。昆虫培養物についての適切な培地は、必要に応じて、イーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物、および／またはウシ胎仔血清を補充した、グレース培地である。
【０１７８】
代表的に、形質転換された細胞の選択的な増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、培地に補充物質として添加される。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されるプラスミドに存在する選択マーカーエレメントによって指示される。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養培地に加えられる化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリン、およびネオマイシンが挙げられる。
【０１７９】
宿主細胞によって産生されるＭＫ６１ポリペプチドの量は、当該分野において公知の標準的な方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定しないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のようなクロマトグラフィー分離、免疫沈降のような免疫検出、および／またはＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイのような活性アッセイが挙げられる。
【０１８０】
ＭＫ６１ポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計される場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地中で見出され得る。しかし、ＭＫ６１ポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、このポリペプチドは、細胞質および／または核（真核宿主細胞について）に、あるいは、細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に存在する。
【０１８１】
宿主細胞の細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）あるいは細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に位置するＭＫ６１ポリペプチドについて、細胞内物質（グラム陰性細菌についての封入体を含む）は、当業者に公知の標準的技術のいずれかを用いて宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞は、浸透圧性ショック、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、および／または超音波破砕次いで遠心分離によって溶解され、ペリプラズム／細胞質の内容物を放出し得る。
【０１８２】
ＭＫ６１ポリペプチドが細胞質ゾル内に封入体を形成した場合、この封入体は、しばしば、細胞内膜および／または細胞外膜に結合され得、従って、主に、遠心分離後のペレット物質において見出される。次いで、ペレット物質は、極端なｐＨで、あるいはジチオトレイトールのような還元剤の存在下アルカリ性のｐＨで、またはトリスカルボキシエチルホスフィンの存在下酸性のｐＨで、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体のようなカオトロピック剤で処理されて、封入体を放出させ、分断させ、そして可溶化させ得る。次いで、可溶化形態のＭＫ６１ポリペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。ＭＫ６１ポリペプチドを単離することが望ましい場合、単離は、本明細書中およびＭａｒｓｔｏｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−２７５（１９９０）に記載される方法のような標準的な方法を使用して達成され得る。
【０１８３】
いくつかの場合、ＭＫ６１ポリペプチドは、単離の際に生物学的に活性でなくても良い。ポリペプチドをその三次構造に「リフォールディング」または変換し、そしてジスルフィド結合を生成するための種々の方法を使用して、生物学的活性を回復し得る。このような方法は、可溶化されたポリペプチドを、一定のｐＨ（通常は、７より上）および特定の濃度のカオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の存在に曝露する工程を包含する。カオトロピック剤の選択は、封入体可溶化に使用される選択肢に非常に類似するが、通常、カオトロピック剤はより低い濃度で使用され、可溶化に使用されるカオトロピック剤と必ずしも同一ではない。多くの場合、リフォールディング／酸化溶液はまた、還元剤、または特定の比の還元剤およびその酸化形態を含んで、特定の酸化還元電位を生成し、タンパク質のシステイン架橋の形成を生じるジスルフィドシャフリングを可能にする。通常使用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２−２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。共溶媒が、リフォールディングの効率を増加するのに使用され得、この目的のために使用されるより一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１８４】
封入体がＭＫ６１ポリペプチドの発現において有意な程度まで形成されない場合、ポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後の上清中に見出される。ポリペプチドは、さらに、本明細書中に記載されるかまたは当該分野で公知の方法を使用して上清から単離され得る。
【０１８５】
溶液からのＭＫ６１ポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成され得る。ポリペプチドが、ヘキサヒスチジン（ＭＫ６１ポリペプチド／ヘキサＨｉｓ（ｈｅｘａＨｉｓ））のようなタグまたは他の小さなペプチド（例えば、ＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ．，Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））をそのカルボキシル末端またはアミノ末端のいずれかにおいて含むように合成された場合、カラムマトリクスがそのタグに対して高い親和性を有するアフィニティーカラムに溶液を通すことによって一工程で精製され得る。
【０１８６】
例えば、ポリヒスチジンは、ニッケルに対して大きな親和性および特異性で結合する。従って、ニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）は、ＭＫ６１ポリペプチド／ポリＨｉｓの精製のために使用され得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　§　１０．１１．８，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照のこと。
【０１８７】
さらに、ＭＫ６１ポリペプチドは、ＭＫ６１ポリペプチドを特異的に認識し得かつ結合し得る、モノクローナル抗体の使用を介して精製され得る。
【０１８８】
精製のための適切な手段としては、限定しないが、アフィニティークロマトグラフィー、免疫アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｓｉｅｖｅ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、電気泳動（ネイティブゲル電気泳動を含む）、続くゲル溶出、および分取用等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」ｍａｃｈｉｎｅ／ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｈｏｅｆｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）が挙げられる。いくつかの場合において、増加した純度を達成するために２つ以上の精製技術を組み合わせ得る。
【０１８９】
ＭＫ６１ポリペプチドはまた、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９（１９６３）；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：５１３２（１９８５）；ならびに、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ（１９８４）に記載されるような当該分野で公知の技術を使用する、化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）によって調製され得る。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを有するかまたは有さずに合成され得る。化学的に合成されたＭＫ６１ポリペプチドは、これらの参考文献に記載される方法を使用して酸化されて、ジスルフィド結合を形成し得る。化学的に合成されたＭＫ６１ポリペプチドは、組換え的に産生されるかまたは天然の供給源から精製された対応のＭＫ６１ポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると期待され、従って、組換えまたは天然のＭＫ６１ポリペプチドと相互交換可能に使用され得る。
【０１９０】
ＭＫ６１ポリペプチドを得る別の手段は、生物学的サンプル（例えば、ＭＫ６１ポリペプチドが天然に見出される供給源の組織および／または流体）からの精製による。このような精製は、本明細書中に記載されるかまたは当該分野で公知のタンパク質精製のための方法を使用して行われ得る。精製の間、ＭＫ６１ポリペプチドの存在は、例えば、組換え的に産生されたＭＫ６１ポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して調製された抗体を使用してモニターされ得る。
【０１９１】
核酸およびポリペプチドを産生するための多くのさらなる方法は、当該分野において公知であり、この方法は、ＭＫ６１に対して特異性を有するポリペプチドを産生するために使用され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：１２２９７−１２３０３（１９９７）を参照のこと。これは、ｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．３：２６８−２７３（１９９９）もまた参照のこと。さらに、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドを得る方法を記載する。この手順は、異種プールのオリゴヌクレオチドを生成する工程を包含し、この異種プールのオリゴヌクレオチドは、それぞれが、５’ランダム化配列、中央部の予め選択された配列、および３’ランダム化配列を有する。得られる異種プールは、所望の生物学的機能を示さない細胞の集団に導入される。次いで、細胞の亜集団（小集団）を、予め決定された生物学的機能を示すものについてスクリーニングする。その亜集団から、所望の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドが単離される。
【０１９２】
米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２３，３２３号；および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチドを産生するためのプロセスを記載する。このプロセスは、確率論的な（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ）遺伝子またはそのフラグメントを産生し、次いで、宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって行われ、その宿主細胞がその確率論的な遺伝子によってコードされた１以上のタンパク質を産生する。次いで、この宿主細胞は、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生する、これらのクローンを同定するためにスクリーニングされる。
【０１９３】
ペプチドまたはポリペプチドを産生するための別の方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ，Ｉｎｃ．によって出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２００９４（ＷＯ９９／１５６５０に記載される。これは、「Ｒａｎｄｏｍ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）として知られており、このプロセスは、インサイチュ組換え方法による、内因性遺伝子の発現の活性化または遺伝子の過剰発現を含む。例えば、内因性遺伝子の発現は、標的細胞中に調節配列を組み込むことによって、活性化または増加され、その標的細胞は、非相同組換えまたは非正統的（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）組換えによって、その遺伝子の発現を活性化し得る。この標的ＤＮＡは、まず、照射に供せられ、そして遺伝子プロモーターが挿入される。このプロモーターは、遺伝子の５’末端前方に切れ目（ｂｒｅａｋ）をランダムに配置し、遺伝子の転写を開始する。これが、所望のペプチドまたはポリペプチドの発現を引き起こす。
【０１９４】
これらの方法はまた、包括的なＩＬ−１７様タンパク質発現ライブラリーを作製するために使用され得、これは、続いて、種々のアッセイ（例えば、生化学的アッセイ、細胞アッセイおよび生物全体のアッセイ（例えば、植物、マウスなど））において、ハイスループット表現型スクリーニングのために使用され得ることが理解される。
【０１９５】
（化学的誘導体）
ＭＫ６１ポリペプチドの化学的に改変された誘導体は、本明細書中以下に記載された開示を考慮して、当業者によって調製され得る。ＭＫ６１ポリペプチド誘導体は、このポリペプチドに天然で結合している分子の型または位置のいずれかにおいて異なる様式で改変される。誘導体は、１以上の天然で結合している化学基の欠失によって形成される分子を含み得る。配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４もしくは配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはＭＫ６１ポリペプチド改変体は、１以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、代表的に水溶性であり、その結果、それが結合するタンパク質は、水性環境（例えば、生理学的な環境）下で沈殿しない。ポリマーの混合物は、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終産物の調製物の治療学的用途のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
【０１９６】
これらのポリマーの各々は、任意の分子量を有し得、そして分枝または非分枝であり得る。これらのポリマーの各々は、代表的に、約２ｋＤａと約１００ｋＤａとの間の平均分子量を有する（この用語「約（およそ）」は、水溶性ポリマーの調製の際に、いくつかの分子が示された分子量より多く、いくつの分子は示された分子量より少ない分子量を有することを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約５０ｋＤａの間、より好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａとの間、そして最も好ましくは、約２０ｋＤａと約３５Ｄａとの間である。
【０１９７】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ−結合型またはＯ−結合型炭水化物、糖、ホスフェート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（これは、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−ポリエチレングリコール、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために使用されるＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤの低分子量デキストラン）、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコール。配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、またはＭＫ６１ポリペプチド改変体の共有結合したマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性架橋分子もまた、本発明に包含される。
【０１９８】
一般に、化学的誘導体化は、タンパク質と活性化されたポリマー分子とを反応させるために用いられる任意の適切な条件下で実施され得る。ポリペプチドの化学的誘導体を調製するための方法は、一般に、（ａ）ポリペプチドと活性化されたポリマー分子（例えば、そのポリマー分子の反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とを反応させる工程であって、この反応が、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいはＭＫ６１ポリペプチド改変体が、１つ以上のポリマー分子との結合を生じる条件下で行われる、工程、および（ｂ）反応産物を得る工程、を包含する。最適反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子：タンパク質の比がより大きくなればなるほど、結合されるポリマー分子の割合がより多くなる。１つの実施形態において、ＭＫ６１ポリペプチド誘導体は、アミノ末端に単一のポリマー分子の部分を有し得る。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと。
【０１９９】
ポリペプチドのペグ化は、特に、例えば、以下の参考文献に記載されるような、当該分野で公知のペグ化反応のいずれかによって実施され得る：Ｆｒａｎｃｉｓら，Ｆｏｃｕｓ　ｏｎ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０（１９９２）；ＥＰ　０１５４３１６；ＥＰ　０４０１３８４および米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペグ化は、本明細書において記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性の水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。アシル化反応について、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。還元アルキル化について、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（これは、水溶性である）であるか、またはそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシ誘導体もしくはそのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【０２００】
別の実施形態において、ＭＫ６１ポリペプチドは、ビオチンと化学的に結合し得、次いで、その結合体化されたビオチン／ＭＫ６１ポリペプチド分子は、アビジンへの結合が可能となり、その結果、四価のアビジン／ビオチン／ＭＫ６１ポリペプチド分子を生じる。ＭＫ６１ポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合され得、そして得られた結合体は、抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭとともに沈澱され、１０の結合価の十量体の結合体を形成し得る。
【０２０１】
一般に、本発明のＭＫ６１ポリペプチド誘導体の投与によって緩和され得るかまたは調節され得る状態は、ＭＫ６１ポリペプチドについて本明細書において記載される状態を含む。しかし、本明細書において開示されるＭＫ６１ポリペプチド誘導体は、誘導体化されていない分子と比較した場合、さらなる活性、増強した生物学的活性もしくは減少した生物学的活性、または他の特性（例えば、増加した半減期もしくは減少した半減期）を有し得る。
【０２０２】
（遺伝的に操作された非ヒト動物）
非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、または他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、もしくはヒツジ、または他の家畜動物）は、本発明の範囲内にさらに含まれ、ここで、ネイティブＭＫ６１ポリペプチドをコードする遺伝子は、破壊されており（「ノックアウト」）、その結果、この遺伝子の発現レベルは、有意に減少されるかまたは完全に消失する。このような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されるような技術および方法を用いて調製され得る。
【０２０３】
本発明はさらに、非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、または他のげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜動物）を含み、ここで、この動物についてのＭＫ６１遺伝子のネイティブな形態または異種ＭＫ６１遺伝子のいずれかは、この動物によって過剰に発現され、これによって、「トランスジェニック」動物を作製する。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２８１２２に記載されるような、周知の方法を用いて調製され得る。
【０２０４】
本発明はさらに、非ヒト動物を含み、ここで、本発明のＭＫ６１ポリペプチドの１つ以上についてのプロモーターが、１つ以上のネイティブＭＫ６１ポリペプチドの発現のレベルを変更するために、（例えば、相同組換え方法を用いることによって）活性化されているかまたは不活性化されている。
【０２０５】
これらの非ヒト動物は、薬物候補スクリーニングのために用いられ得る。このようなスクリーニングにおいて、動物に対する薬物候補の影響が測定され得る。例えば、薬物候補は、ＭＫ６１遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、産生されるＭＫ６１ポリペプチドの量は、薬物候補への動物の曝露後、測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物に対する薬物候補の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、疾患または病理学的状態を生じる得るか、または付随し得る。このような場合、遺伝子の発現を減少させる薬物候補の能力、あるいは病理学的状態を予防、抑制または排除する薬物候補の能力を試験し得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の産生は、疾患または病理学的状態を、生じ得るか、またはこれらに関連し得る。このような場合、薬物候補がこのような代謝産物の産生を減少させる能力、あるいは薬物候補が病理学的状態を予防、抑制または排除する能力を試験し得る。
【０２０６】
（マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、本発明に従って利用され得ることが理解される。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置される核酸の小型かつ高密度アレイである。アレイ内の各セルまたはエレメントは、単一種のＤＮＡの多数のコピーを有し、その同種ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーションのための標的として働く。ＤＮＡマイクロアレイ技術を用いた発現プロファイリングにおいて、ｍＲＮＡはまず、細胞または組織サンプルから抽出され、次いで、蛍光標識されたｃＤＮＡに酵素的に変換される。この物質は、このマイクロアレイにハイブリダイズされ、そして未結合のｃＤＮＡが洗浄によって除去される。次いで、このアレイ上に示された個々の遺伝子の発現が、各標的ＤＮＡに特異的に結合された標識ｃＤＮＡの量を定量化することによって可視化される。このように、幾千もの遺伝子の発現が、生物学的材料の単一サンプルから、ハイスループットかつ並列様式で定量化され得る。
【０２０７】
このハイスループット発現プロファイリングは、以下を含むがこれらに限定されない、本発明のＭＫ６１分子に関する、広い範囲の適用を有する：治療剤のための標的としてのＭＫ６１疾患関連遺伝子の同定および検証；ＭＫ６１分子およびそのインヒビターの分子毒物学；治験のための代理マーカーの集団および世代の階層化；ならびに、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）における選択的化合物の同定を補助することによるＭＫ６１関連低分子薬物発見の強化。
【０２０８】
（選択的結合剤）
本明細書で使用される場合、用語「選択的結合剤」とは、１つ以上のＭＫ６１ポリペプチドに対して特異性を有する分子をいう。適切な選択的結合剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに低分子。適切な選択的結合剤は、当該分野で公知の方法を用いて調製され得る。本発明の例示的なＭＫ６１ポリペプチド選択的結合剤は、ＭＫ６１ポリペプチドの特定の部分に結合し得、これによってＭＫ６１ポリペプチドレセプターへのこのポリペプチドの結合を阻害する。
【０２０９】
選択的結合剤（例えば、ＭＫ６１ポリペプチドに結合する抗体および抗体フラグメント）は、本発明の範囲内にある。抗体は、単一特異性ポリクローナルを含むポリクローナル抗体、モノクローナル（ＭＡｂ）抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体（例えば、ＣＤＲグラフト（ｇｒａｆｔｅｄ）抗体）、ヒト抗体、単鎖抗体および／または二重特異性抗体、ならびにそれらの、フラグメント、改変体または誘導体であり得る。抗体フラグメントは、ＭＫ６１ポリペプチド上のエピトープに結合するそれらの抗体の部分を含む。このようなフラグメントの例としては、全長抗体の酵素的切断によって生じるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む組換えプラスミドの発現）によって生じるものが挙げられる。
【０２１０】
ＭＫ６１ポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、一般に、動物（例えば、ウサギまたはマウス）において、ＭＫ６１ポリペプチドおよびアジュバントの複数回の皮下注射、筋内注射または腹腔内注射によって産生される。ＭＫ６１ポリペプチドを、免疫されるべき種において免疫原性であるキャリアタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシンインヒビター）と結合体化させることが有用であり得る。また、凝集剤（例えば、ミョウバン）は、免疫応答を増強するために用いられる。免疫後、これらの動物を、採血し、そして血清を、抗ＭＫ６１ポリペプチド抗体力価についてアッセイする。
【０２１１】
ＭＫ６１ポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、培養中の継代細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の方法を用いて産生される。モノクローナル抗体を調製するための適切な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４））；Ｂｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８７）が挙げられる。ＭＫ６１ポリペプチドと反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本発明によって提供される。
【０２１２】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤としての使用のために改変され得る。１つの実施形態は、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種由来の抗体または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同であり、その鎖の残部が、別の種由来の抗体または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは相同である、「キメラ」抗体である。このような抗体のフラグメントもまた、これらのフラグメントもまた、所望の生物学的活性を示す限り、含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８５）を参照のこと。
【０２１３】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源由来の抗体に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、当該分野で記載されている方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４−１５３６（１９８８））を用いて、ヒト抗体の対応する領域についてのげっ歯類相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部分を置換することによって実施され得る。
【０２１４】
ＭＫ６１ポリペプチドに結合するヒト抗体、フラグメント、改変体および／または誘導体もまた、本発明に包含される。内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を用いて、このような抗体は、ＭＫ６１抗原（すなわち、少なくとも６個連続するアミノ酸を有する）（必要に応じてキャリアと結合体化される）での免疫によって産生される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ　３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，Ｙｅａｒ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７：３３（１９９３）を参照のこと。１つの方法において、このようなトランスジェニック動物は、この動物における免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖をコードする内因性遺伝子座を無能化し、かつそのゲノム中に、ヒトの、重鎖および軽鎖のタンパク質をコードする遺伝子座を挿入することによって生成される。次いで、部分的に改変された動物（すなわち、完全未満の補体の改変を有する動物）を交雑育種して、所望の免疫系の改変の全てを有する動物を得る。免疫原を投与された場合、これらのトランスジェニック動物は、これらの抗原に対して免疫特異的である可変領域を含む、（例えば、マウスではなく）ヒトのアミノ酸配列を含む抗体を産生する。ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５、ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、ならびにＥＰ　５４６０７３Ｂ１およびＥＰ　５４６０７３Ａ１に記載される。ヒト抗体はまた、本明細書中に記載されるように、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によってか、またはハイブリドーマ細胞における発現によって産生され得る。
【０２１５】
別の実施形態において、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーから産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１（１９９１））。これらは、糸状バクテリオファージの表面上の抗体レパートリーの提示によって、免疫のプロセス識別子を模倣し、そしてその後、選りぬきの抗原に対するそれらの結合によってファージを選択する。このような技術の１つは、Ａｄａｍｓらによって出願された、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４に記載されており、これは、このようなアプローチを用いた、ＭＰＬ−レセプターおよびｍｓｋ−レセプターに対する高親和性かつ機能的アゴニスト抗体の単離を記載している。
【０２１６】
キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、およびヒト化抗体は、代表的には、組換え方法によって産生される。抗体をコードする核酸は、宿主細胞中に導入され、そして本明細書に記載されるか、または当該分野で公知の材料および手順を用いて発現される。好ましい実施形態において、抗体は、哺乳動物の宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）において産生される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、本明細書において記載されるように、宿主細胞における組換えＤＮＡの発現によってかまたはハイブリドーマ細胞における発現によって産生され得る。
【０２１７】
本発明の抗ＭＫ６１抗体は、ＭＫ６１ポリペプチドの検出および定量のための、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７））のような任意の公知のアッセイ方法において用いられ得る。これらの抗体は、用いられるアッセイ方法に適切な親和性で、ＭＫ６１ポリペプチドに結合する。
【０２１８】
診断適用について、特定の実施形態において、抗ＭＫ６１抗体は、検出可能な部分で標識され得る。検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルを生成し得る、任意の部分であり得る。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、もしくは１２５Ｉ）、蛍光化合物もしくは化学発光化合物（例えば、フルオロセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン）、または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｂａｙｅｒら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８４：１３８−１６３（１９９０）））であり得る。
【０２１９】
競合的結合アッセイは、標識された標準物（例えば、ＭＫ６１ポリペプチド、またはその免疫学的反応性部分）が、限られた量の抗ＭＫ６１抗体との結合について、試験サンプルの分析物（ＭＫ６１ポリペプチド）と競合する能力に依存する。試験サンプル中のＭＫ６１ポリペプチドの量は、抗体に結合する標準物の量に反比例する。結合する標準物の量を決定するのを容易にするため、これらの抗体は、代表的に、競合の前または後に不溶化され、その結果、これらの抗体に結合された標準物および分析物は、結合されていないままの標準物および分析物から、都合よく分離され得る。
【０２２０】
サンドイッチアッセイは、代表的に、検出および／または定量されるべきタンパク質の異なる免疫原性部分（またはエピトープ）に各々結合し得る、２つの抗体の使用を包含する。サンドイッチアッセイにおいて、試験サンプルの分析物は、代表的に、固体支持体上に固定化されている第１の抗体に結合し、その後、第２の抗体がこの分析物に結合し、従って、不溶性の３つの部分の複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第２の抗体は、それ自体に検出可能な部分で標識されてもよいし（直接的サンドイッチアッセイ）、検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定してもよい（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの型は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）であり、この場合、検出可能な部分は、酵素である。
【０２２１】
選択的結合剤（選択的結合因子）（抗ＭＫ６１抗体を含む）はまた、インビボでのイメージングに有用である。検出可能な部分で標識された抗体を、動物に、好ましくは、血流中に投与し得、そして宿主における標識された抗体の存在および位置を、アッセイする。抗体は、核磁気共鳴、放射線学、または当該分野で公知の他の検出手段のいずれかによって、動物において検出可能な任意の部分で標識され得る。
【０２２２】
本発明の選択的結合剤（抗体を含む）は、治療剤として用いられ得る。これらの治療剤は、一般に、これらが、ＭＫ６１ポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を、それぞれ、増強または減少させる点で、アゴニストまたはアンタゴニストである。１つの実施形態において、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＭＫ６１ポリペプチドに特異的に結合し得、そして、インビボまたはインビトロにおいてＭＫ６１ポリペプチドの機能的活性を阻害または排除し得る、抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、選択的結合剤（例えば、アンタゴニスト抗体）は、少なくとも約５０％、そして好ましくは、少なくとも約８０％、ＭＫ６１ポリペプチドの機能的活性を阻害する。別の実施形態において、選択的結合剤は、ＭＫ６１結合パートナー（リガンドまたはレセプター）と相互作用し得、これによって、インビボまたはインビトロにおいてＭＫ６１活性を阻害または排除する、抗体であり得る。選択的結合剤（アゴニストおよびアンタゴニスト抗ＭＫ６１抗体を含む）は、当該分野で周知のスクリーニングアッセイによって同定される。
【０２２３】
本発明はまた、ＭＫ６１選択的結合剤（例えば、抗体）および生物学的サンプルにおいてＭＫ６１ポリペプチドのレベルを検出するのに有用な他の試薬を備えるキットに関する。このような試薬は、検出可能な標識、ブロッキング血清、ポジティブおよびネガティブコントロールサンプル、ならびに検出試薬を含み得る。
【０２２４】
ＭＫ６１ポリペプチドは、「発現クローニング」ストラテジーを用いてＭＫ６１リガンドをクローニングするために使用され得る。放射線標識（１２５ヨウ素）されたＭＫ６１ポリペプチドまたは「親和性／活性−タグ化」ＭＫ６１ポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合体またはアルカリホスファターゼ融合体）を結合アッセイに用いて、ＭＫ６１リガンドを発現する細胞型または細胞株あるいは組織を同定し得る。次いで、このような細胞または組織から単離されたＲＮＡは、ｃＤＮＡに変換され、哺乳動物発現ベクターにクローニングされ、そして哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳ、または２９３）中にトランスフェクトされて、発現ライブラリーを生成し得る。次いで、放射線標識されたかまたはタグ化されたＭＫ６１ポリペプチドを親和性試薬として用いて、ＭＫ６１リガンドを発現するこのライブラリーにおける細胞のサブセットを同定し、そして単離し得る。次いで、ＤＮＡは、これらの細胞から単離され、次ぎに哺乳細胞中にトランスフェクトされて、ＭＫ６１リガンドを発現する細胞の画分が、元のライブラリーにおける発現よりも何倍も高い、２次発現ライブラリーを生成する。この富化プロセスは、ＭＫ６１リガンドを含む単一組換えクローンが単離されるまで、反復的に繰り返され得る。ＭＫ６１リガンドの単離は、ＭＫ６１シグナル伝達経路の新規のアゴニストおよびアンタゴニストを同定または開発するのに有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、ＭＫ６１リガンド、抗ＭＫ６１リガンド抗体、低分子、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらは、本明細書中に記載の疾患または障害を含む、１以上の疾患または障害を、処置、予防または診断するために使用され得る。
【０２２５】
（ＭＫ６１ポリペプチド活性の他のモジュレーターについてのアッセイ）
いくつかの状況において、ＭＫ６１ポリペプチドの活性のモジュレーターである分子（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）を同定することが所望され得る。ＭＫ６１様ポリペプチドを調節する天然の分子または合成分子は、１つ以上のスクリーニングアッセイ（例えば、本明細書において記載されるアッセイ）を用いて同定され得る。このような分子は、エキソビボ様式、または注射によるインビボ様式、または経口送達、移植装置などのいずれかによって投与され得る。
【０２２６】
「試験分子」とは、ＭＫ６１ポリペプチドの活性を調節（すなわち、増加または減少）する能力についての評価下にある分子をいう。最も通常には、試験分子は、ＭＫ６１ポリペプチドと直接相互作用する。しかし、試験分子はまた、ＭＫ６１ポリペプチド活性を（例えば、ＭＫ６１遺伝子発現に影響することによってか、またはＭＫ６１結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）に結合することによって）間接的に調節し得ることもまた考慮される。１つの実施形態において、試験分子は、少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは約１０−８Ｍ、より好ましくは約１０−９Ｍ、そしてなおより好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数で、ＭＫ６１ポリペプチドと結合する。
【０２２７】
ＭＫ６１ポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本発明によって包含される。特定の実施形態において、ＭＫ６１ポリペプチドは、試験分子とＭＫ６１ポリペプチドとの相互作用を可能にする条件下で試験分子とともにインキュベートされ、そして相互作用の程度が測定され得る。試験分子は、実質的に精製された形態においてかまたは粗混合物においてスクリーニングされ得る。
【０２２８】
特定の実施形態において、ＭＫ６１ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストは、ＭＫ６１ポリペプチドと相互作用し、その活性を調節する、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量の分子であり得る。ＭＫ６１ポリペプチド発現を調節する分子は、ＭＫ６１ポリペプチドをコードする核酸に相補的であるか、あるいはＭＫ６１ポリペプチドの発現を指向するかまたは制御する核酸配列に相補的である核酸を含み、そしてこれらの核酸は、発現のアンチセンス調節因子として作用する。
【０２２９】
一旦、試験分子のセットが、ＭＫ６１ポリペプチドと相互作用すると同定されると、この分子は、ＭＫ６１ポリペプチド活性を増加または減少させる能力についてさらに評価され得る。試験分子とＭＫ６１ポリペプチドとの相互作用の測定は、いくつかの形式で実施され得、これには、細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、液相アッセイ、および免疫アッセイが挙げられる。一般に、試験分子は、特定の期間、ＭＫ６１ポリペプチドと共にインキュベートされ、そしてＭＫ６１ポリペプチド活性が、生物学的活性を測定するための１以上のアッセイによって決定される。
【０２３０】
試験分子とＭＫ６１ポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにおいて、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して直接的にアッセイされ得る。あるいは、本明細書中に記載されるようなエピトープタグを含むＭＫ６１ポリペプチドの改変形態が、免疫アッセイ中で使用され得る。
【０２３１】
ＭＫ６１ポリペプチドが、結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）との相互作用を介して、生物学的活性を示す場合において、多様なインビトロアッセイが、対応する結合パートナー（選択的結合因子、レセプター、またはリガンド）へのＭＫ６１ポリペプチドの結合を測定するために使用され得る。これらのアッセイは、その結合パートナーに対するＭＫ６１ポリペプチドの結合の速度および／または程度を増加または減少させるその能力について、試験分子をスクリーニングするために使用され得る。１つのアッセイにおいて、ＭＫ６１ポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェル中に固定される。次いで、放射標識したＭＫ６１結合パートナー（例えば、ヨウ素化したＭＫ６１結合パートナー）および試験分子が、このウェルに、１つずつ（いずれかの順序で）または同時にのいずれかで添加され得る。インキュベーション後に、このウェルを洗浄し、そしてシンチレーション計数器を使用して）放射活性を計数し、結合パートナーがＭＫ６１ポリペプチドに結合した程度を決定する。代表的に、分子は、一定の濃度範囲にわたって試験され、そして試験アッセイの１以上の要素を欠く一連のコントロールウェルが、結果の評価の正確性のために使用され得る。この方法の代替法は、タンパク質の「位置」を逆にすること（すなわち、マイクロタイタープレートウェルに対してＭＫ６１結合パートナーを固定し、試験分子および放射標識したＭＫ６１ポリペプチドと共にインキュベートし、そしてＭＫ６１ポリペプチド結合の程度を決定する工程）を包含する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８章、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９５）を参照のこと。
【０２３２】
放射性標識に対する代替として、ＭＫ６１ポリペプチドまたはその結合パートナーは、ビオチンと結合体化され得、そしてビオチン化されたタンパク質の存在が、次いで、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））に結合したストレプトアビジン（これらは、比色定量的に検出されるかまたはストレプトアビジンの蛍光タグ化によって検出され得る）を使用して検出され得る。ＭＫ６１ポリペプチドまたはＭＫ６１結合パートナーに対する、ビオチンに結合体化されている抗体もまた用いられ得、ＡＰまたはＨＲＰに連結した酵素連結ストレプトアビジンとのインキュベーション後に、検出され得る。
【０２３３】
ＭＫ６１ポリペプチドまたはＭＫ６１結合パートナーはまた、アガロースビーズ、アクリルビーズ、または他の型のこのような不活性な固相基材への付着によって固定され得る。基材−タンパク質複合体は、相補タンパク質および試験化合物を含む溶液内に配置され得る。インキュベーション後、これらのビーズは、遠心分離によって沈澱され、そしてＭＫ６１ポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の量が、本明細書中に記載の方法を使用して評価され得る。あるいは、基材−タンパク質複合体は、カラムに固定され、そして試験分子および相補タンパク質をこのカラムに通過させる。ＭＫ６１ポリペプチドとその結合パートナーとの間の複合体の形成は、次いで、本明細書中に記載の技術（例えば、放射性標識または抗体結合など）のいずれかを使用して評価され得る。
【０２３４】
ＭＫ６１ポリペプチドとＭＫ６１結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる試験分子を同定するために有用な別のインビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴検出器システム（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））である。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、製造業者のプロトコールを用いて実行され得る。このアッセイは、本質的に、ＭＫ６１ポリペプチドまたはＭＫ６１結合パートナーのいずれかの、デキストランでコートされたセンサーチップ（これは、検出器に配置される）への共有結合を含む。次いで、この試験化合物および他の相補タンパク質が、同時にかまたは連続的にかのいずれかで、センサーチップを含むチャンバに注入され得る。結合する相補タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコートされた側面に物理的に会合する分子の質量の変化に基づいて評価され得、この分子の質量の変化は、検出器システムによって測定される。
【０２３５】
いくつかの場合において、２つ以上の試験化合物を、ＭＫ６１ポリペプチドとＭＫ６１結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させるそれらの能力について、一緒に評価することが所望され得る。これらの場合において、本明細書中に記載のアッセイは、第一の試験化合物と同時にか、またはそれに続いてのいずれかで、このようなさらなる試験化合物を添加することによって容易に改変され得る。このアッセイにおける工程の残りは、本明細書中に記載される通りである。
【０２３６】
インビトロアッセイ（例えば、本明細書中に記載されるアッセイ）は、ＭＫ６１ポリペプチドとＭＫ６１結合パートナーによる複合体の形成に対する効果について、多数の化合物をスクリーニングするために、有利に使用され得る。これらのアッセイは、ファージディスプレイライブラリー、合成ペプチドライブラリー、および化学合成ライブラリーにおいて生成された化合物をスクリーニングするために、自動化され得る。
【０２３７】
ＭＫ６１ポリペプチドとＭＫ６１結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少する化合物はまた、ＭＫ６１ポリペプチドまたはＭＫ６１結合パートナーのいずれかを発現する細胞および細胞株を使用して、細胞培養物においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞株は、任意の哺乳動物から得られ得るが、好ましくは、ヒト、または他の霊長類、イヌ類またはげっ歯類の供給源由来である。ＭＫ６１結合パートナーをその表面で発現する細胞へのＭＫ６１ポリペプチドの結合は、試験化合物の存在または非存在下で評価され、そして結合の程度が、例えば、ＭＫ６１結合パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る。細胞培養アッセイは、本明細書中に記載されるタンパク質結合アッセイにおいて陽性であるとスコア付けされる化合物をさらに評価するために有利に使用され得る。
【０２３８】
細胞培養物はまた、薬物候補の影響をスクリーニングするために使用され得る。例えば、薬物候補は、ＭＫ６１遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、生成されるＭＫ６１ポリペプチドの量は、薬物候補への細胞培養物の曝露の後に測定され得る。特定の実施形態において、細胞培養物への薬物候補の実際の影響が検出され得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物への特定の影響を有し得る。このような場合に、薬物候補が遺伝子の発現を増加または減少させる能力、またはその薬物候補が細胞培養物に対する特定の影響を予防または阻害する能力が試験され得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメント）の生成が、疾患または病理学的状態を生じ得るか、またはそれらと関連し得る。このような場合、薬物候補が細胞培養物におけるこのような代謝産物の生成を減少する能力が試験され得る。
【０２３９】
酵母ツーハイブリッド系（Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：９５７８〜９５８３（１９９１））を使用して、ＭＫ６１ポリペプチドに結合するかまたは相互作用する、新規なポリペプチドを同定し得る。例として、酵母ＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメインに融合したＭＫ６１ポリペプチドの細胞質ドメインをコードするＤＮＡを含むハイブリッド構築物が、ツーハイブリッドベイト（ｂａｉｔ）プラスミドとして使用され得る。スクリーニングから出現する陽性クローンはさらに特徴付けられ、相互作用タンパク質を同定し得る。
【０２４０】
（Ｐ３８インヒビター）
細胞外刺激と、細胞からの、ＩＬ−１およびＴＮＦαの分泌との間への介入のための新規のアプローチは、このシグナル伝達経路に存在するキナーゼの阻害を通じたシグナル伝達の遮断を含む。１つの例は、既知のｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼ（Ｈａｎら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ，１２６５：２２４−２２７（１９９５）に報告されたクローン）であるＰ−３８（「ＲＫ」または「ＳＡＰＫ−２」とも呼ばれる、Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３７２：７３９（１９９４））の阻害による。Ｐ−３８への競合結合アッセイにおける有効性について、直線的な関係が示されており、そして同じインヒビターは、ＬＰＳでの刺激後に、単球からのＩＬ−１の分泌のレベルを減少させる。単球のＬＰＳでの刺激後、ＴＮＦαについてのメッセンジャーＲＮＡのレベルは１００倍の増大を示したが、ＴＮＦαのタンパク質レベルは１０，０００倍に増大した。従って、ＴＮＦのシグナル伝達の相当の増幅が、翻訳レベルで生じる。Ｐ−３８インヒビターの存在下での単球のＬＰＳでの刺激後、ｍＲＮＡのレベルは影響を受けないが、最終的なＴＮＦタンパク質のレベルは劇的に（Ｐ−３８インヒビターの有効性に依存して、８０〜９０％まで）減少する。従って、上記の実験は、Ｐ−３８の阻害が翻訳効率の減少を導くという結論の強力な支持を導く。さらに、ＴＮＦαが翻訳制御下にあるという証拠が、Ｂｅｕｔｌｅｒら、およびＬｅｅの欠失実験において見出される。ここでは、３’非翻訳ｍＲＮＡ（３’ＵＴＲ）のセグメントが除去され、それによってＴＮＦαの高い翻訳効率を生じる。より重要なことは、Ｐ−３８インヒビターは、ＴＮＦα　ｍＲＮＡの適切なセグメントが欠失させられた場合には、ＴＮＦαのレベル（すなわち、翻訳効率）に対して作用を有さなかった。このように、Ｐ−３８に対するインヒビターの結合のレベルと、同じインヒビターでのＬＰＳでの刺激後のＩＬ−１およびＴＮＦαのレベルの低下との間での相関するデータ、ならびに、ＴＮＦαおよびＩＬ−１の両方の翻訳効率に対するＰ−３８インヒビターの作用に関する上記の生化学的な証拠が、相関関係の強力な原因でありそしてそれを達成する。細胞中でのＰ−３８の役割もさらに詳細に記載されている；従って、その阻害によって得られる炎症性疾患または他の疾患状態に関する他の有利な影響が、おそらくすぐに使用され得る。
【０２４１】
ＴＮＦαおよび／またはＩＬ−１のレベルの上昇は、以下を含むがこれらに限定されない多数の疾患状態の発症、病因、または悪化に寄与し得る：慢性関節リウマチ；変形性関節症；リウマチ様脊椎炎；通風性関節炎；炎症性腸疾患；成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）；乾癬；クローン病；アレルギー性鼻炎；潰瘍性大腸炎；過敏症；接触皮膚炎；喘息；ＴＮＦαの阻害に敏感なそのようなウイルス−ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、インフルエンザ、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、および帯状ヘルペスを含む）を含む、抗ウイルス治療；筋肉の萎縮；悪態症；ライター症候群；ＩＩ型糖尿病；骨再吸収疾患；移植片対宿主反応；虚血性再潅流損傷；アテローム性動脈硬化症；脳の外傷；アルツハイマー病；多発性硬化症；大脳マラリア；敗血症；敗血症性ショック；毒性ショック症候群；感染症に起因する発熱および筋肉痛。
【０２４２】
置換されたイミダゾール、ピロール、ピリジン、ピリミジン、および同様の化合物は、プロ炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ）の阻害による、サイトカインによって媒介される疾患の処置における使用について記載されている。サイトカインによって媒介される疾患の処置における使用のための置換されたイミダゾールは、米国特許第５，５９３，９９２号；ＷＯ９３／１４０８１；ＷＯ９７／１８６２６；ＷＯ９６／２１４５２；ＷＯ９６／２１６５４；ＷＯ９６／４０１４３；ＷＯ９７／０５８７５；およびＷＯ９７／０５８７８に記載されている。炎症の処置における使用のための置換されたイミダゾールは、米国特許第３，９２９、８０７号に記載されている。サイトカインによって媒介される疾患の処置における使用のための置換されたピロール化合物は、ＷＯ９７／０５８７７；ＷＯ９７／０５８７８号；ＷＯ９７／１６４２６；ＷＯ９７／１６４４１；およびＷＯ９７／１６４４２に記載されている。サイトカインによって媒介される疾患の処置における使用のための置換されたアリールおよびヘテロアリールが融合されたピロール化合物は、ＷＯ９８／２２４５７に記載されている。サイトカインによって媒介される疾患の処置における使用のための置換されたピリジン、ピリミジン、ピリミジノン、およびピリダジン化合物は、ＷＯ９８／２４７８０；ＷＯ９８／２４７８２；ＷＯ９９／２４４０４；およびＷＯ９９／３２４４８に記載されている。
【０２４３】
（内部移行タンパク質）
ＴＡＴタンパク質配列（ＨＩＶ由来）を、細胞膜の脂質二重層の成分へと標的化することによって、タンパク質を細胞内へ内向させるために使用することができる。例えば、Ｆａｌｗｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：６６４−６６８（１９９４）を参照のこと。例えば、ＨＩＶ　ｔａｔタンパク質の１１個のアミノ酸配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ；配列番号Ｘ）（「タンパク質形質導入ドメイン」またはＴＡＴ　ＰＤＴと呼ばれる）は、β−ガラクトシダーゼのような大きな生体活性タンパク質の送達、ならびにｐ２７Ｋｉｐの細胞の細胞質膜および核膜の通過を媒介することが示されている。Ｓｃｈｗａｎｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８５：１５６９−１５７２（１９９９）；およびＮａｇａｈａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４：１４４９−１４５２（１９９８）を参照のこと。Ｓｃｈｗａｒｚｅら、前出は、培養された細胞が、ＴＡＴ−ＰＤＴとβ−ガラクトシダーゼとの融合体に暴露された場合に、β−ガラクトシダーゼ活性を獲得したことを示した。ＴＡＴ−β−ｇａｌ融合タンパク質でのマウスの注射は、（肝臓、腎臓、肺、心臓、および脳組織を含む）多数の組織中でβ−ｇａｌの発現を生じた。
【０２４４】
従って、ＴＡＴタンパク質配列は、細胞中に所望されるタンパク質またはポリペプチドを内向させるために使用され得ることが理解される。本発明の状況では、ＴＡＴタンパク質配列は、ＭＫ６１アンタゴニスト（すなわち、抗ＭＫ６１選択的結合試薬、低分子、可溶性レセプター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）のような別の分子に融合され得、ＭＫ６１分子の活性を阻害するように細胞内に投与され得る。本明細書中で使用される場合には、用語「ＭＫ６１分子」は、本明細書中で定義されるように、ＭＫ６１核酸分子およびＭＫ６１ポリペプチドの両方をいう。所望される場合には、ＭＫ６１タンパク質自体、またはＭＫ６１のペプチドフラグメントもしくは改変された形態は、上記の手順を使用して、細胞への投与のためのそのようなタンパク質トランスデューサーに融合され得る。
【０２４５】
（ＭＫ６１ポリペプチドを使用する細胞供給源の同定）
本発明の特定の実施形態に従うと、ＭＫ６１ポリペプチドに関係している特定の細胞型の供給源を決定することが可能であることが、有用であり得る。例えば、適切な治療の選択の補助として、疾患または病理学的な状態の起源を決定することが有用であり得る。
【０２４６】
（治療的用途）
本発明のポリペプチドおよびアゴニストおよびアンタゴニストもまた、本明細書中に記載されているものを含む多数の疾患および障害の診断および処置に有用である。これらには、白血球および／または破骨細胞の増殖、分化、生存、および／またはアポトーシスに関係している疾患および障害が含まれるが、これらに限定されない。本発明のポリペプチドおよびアゴニストおよびアンタゴニストはまた、リンパ球、白血球、および他の癌細胞の増殖、生存性、および／またはアポトーシスを調節することにおいて有用である。
【０２４７】
ｈＭＫ６１Ｔ１は、ＰＭＡで処置された癌細胞株から同定された。従って、ｈＭＫ６１Ｔ１細胞表面レセプターの産生は、ＰＭＡおよび／またはＲＮＡスプライシングレベルでの他の増殖シグナルによって調節され得る。ｈＭＫ６１Ｔ１の細胞外ドメインの一部に対応しているペプチドが、ヒトの尿および血清中で、プロテオミックス（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）分析を通じて同定された。さらに、ｈＭＫ６１の選択的な発現は、ノーザンブロッティングによって決定されたように、脾臓、リンパ節、末梢血白血球、および胎児の肝臓中で観察された。従って、本発明のポリペプチドおよびアゴニストおよびアンタゴニストはまた、免疫システムの障害の診断および／または処置（本明細書中で記載されているように）において、ならびに肝臓の保護および再生においても、有用である。
【０２４８】
多くの疾患および医学的状態はＴＮＦに関係しており、そして炎症性の症状としてしばしば分類される。ＴＮＦに関係している疾患には、自然発生した疾患または病態モデル、あるいは、体液もしくは組織中のＴＮＦレベルの増大に関係しているか、または体から採取された細胞もしくは組織が培養物中でＴＮＦレベルの上昇を生じる場合の医学的な症状が含まれるが、これらに限定されない。多くの場合には、ＴＮＦに関係している疾患はまた、以下によっても認識され得る：（１）疾患または医学的な症状に関係している病理学的知見が、ＴＮＦの投与またはＴＮＦの発現のアップレギュレーションによって動物中で実験的に模倣され得る、あるいは（２）疾患または医学的な症状の実験用の動物モデルにおいて誘導される病理学が、ＴＮＦの作用を阻害する試薬での処置によって阻害され得るかまたは完全に廃止され得る。しかし、ＭＫ６１ポリペプチドの作用機構が、ＴＮＦの阻害を必ずしも必要としないことが理解される。
【０２４９】
急性および慢性的なＴＮＦに関係している疾患の排他的ではないリストには以下が含まれるが、これらに限定されない：悪態症／食欲低下；癌（例えば、白血病）；慢性疲労症候群；環状動脈の症状および適応症（うっ血性心不全、環状動脈の再狭窄、心筋梗塞、および環状動脈のバイパス移植を含む）；欝状態；糖尿病（例えば、若年性発症１型、および真性糖尿病）；子宮内膜症、子宮内膜炎および関連する症状；結合組織炎（ｆｉｂｒｏｍｙａｌｇｉａ）または痛覚脱失症；移植片対宿主拒絶；痛覚過敏症；炎症性腸疾患（クローン病、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに関係している下痢を含む）；虚血（大脳の虚血（外傷、癲癇、出血、または発作（これらのそれぞれが、神経変性を導き得る）の結果としての脳の損傷）を含む）；肺疾患（例えば、成人呼吸窮迫症候群、喘息、および肺繊維症）；多発性硬化症；神経炎症疾患；眼の疾患および症状（角膜移植、眼球の変性、およびブドウ膜炎を含む）；疼痛（癌に関係している痛みを含む）；膵炎；歯周疾患；前立腺炎（細菌性および非細菌性）および関連する症状；乾癬および関連する症状；肺繊維症；再潅流損傷；リウマチ病（例えば、慢性関節リウマチ、変形性関節症、若年性（リウマチ）関節炎、血清陰性の多発性関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群、および反応性関節炎、スティル病、乾癬性関節炎、腸性関節炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症、全身性硬化症、脈管炎（例えば、川崎病）、大脳脈管炎、ライム病、ブドウ球菌によって誘導される（「敗血症性の」）関節炎、シェーグレン症候群、リウマチ熱、多発性軟骨炎、および多発性筋痛リウマチ、ならびに巨大細胞動脈炎）；敗血症性ショック；放射線治療による副作用；全身性エリテマトーデス；一時的な下顎骨の関節疾患；甲状腺炎；緊張、捻挫、軟骨の損傷、外傷、整形外科手術、感染（例えば、ＨＩＶ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、および関連する種）によって生じる組織移植または炎症性の症状、あるいは他の疾患プロセス。
【０２５０】
ＴＮＦαインヒビターは、ＴＮＦの産生をダウンレギュレーションまたは阻害すること、ＴＮＦを結合させないこと、そのレセプターへのＴＮＦの結合を妨害すること、またはそのレセプターへの結合後のＴＮＦのシグナル伝達の調節を妨害することによって、作用し得る。従って、用語「ＴＮＦαインヒビター」は、可溶化されたＴＮＦレセプター、ＴＮＦに対する抗体、ＴＮＦレセプターに対する抗体、ＴＮＦα転換酵素（ＴＡＣＥ）のインヒビター、およびＴＮＦ活性に影響を与える他の分子を含む。
【０２５１】
種々の種のＴＮＦαのインヒビターは、以下の参考文献を含む当該分野で開示されている：
欧州特許出願番号第３０８３７８号；同第４２２３３９号；同第３９３４３８号；同第３９８３２７号；同第４１２４８６号；同第４１８０１４号；同第４１７５６３号；同第４３３９００号；同第４６４５３３号；同第５１２５２８号；同第５２６９０５号；同第５６８９２８号；同第６６３２１０号；同第５４２７９５号；同第８１８４３９号；同第６６４１２８号；同第５４２７９５号；同第７４１７０７号；同第８７４８１９号；同第８８２７１４号；同第８８０９７０号；同第６４８７８３号；同第７３１７９１号；同第８９５９８８号；同第５５０３７６号；同第８８２７１４号；同第８５３０８３号；同第５５０３７６号；同第９４３６１６号；
米国特許第５，１３６，０２１号；同第５，９２９，１１７号；同第５，９４８，６３８号；同第５，８０７，８６２号；同第５，６９５，９５３号；同第５，８３４，４３５号；同第５，８１７，８２２号；同第５８３０７４２号；同第５，８３４，４３５号；同第５，８５１，５５６号；同第５，８５３，９７７号；同第５，３５９，０３７号；同第５，５１２，５４４号；同第５，６９５，９５３号；同第５，８１１，２６１号；同第５，６３３，１４５号；同第５，８６３，９２６号；同第５，８６６，６１６号；同第５，６４１，６７３号；同第５，８６９，６７７号；同第５，８６９，５１１号；同第５，８７２，１４６号；同第５，８５４，００３号；同第５，８５６，１６１号；同第５，８７７，２２２号；同第５，８７７，２００号；同第５，８７７，１５１号；同第５，８８６，０１０号；同第５，８６９，６６０号；同第５，８５９，２０７号；同第５，８９１，８８３号；同第５，８７７，１８０号；同第５，９５５，４８０号；同第５，９５５，４７６号；同第５，９５５，４３５号；
国際（ＷＯ）特許出願番号第９０／１３５７５号、同第９１／０３５５３号、同第９２／０１００２号、同第９２／１３０９５号、同第９２／１６２２１号、同第９３／０７８６３号、同第９３／２１９４６号、同第９３／１９７７７号、同第９５／３４３２６号、同第９６／２８５４６号、同第９８／２７２９８号、同第９８／３０５４１号、同第９６／３８１５０号、同第９６／３８１５０号、同第９７／１８２０７号、同第９７／１５５６１号、同第９７／１２９０２号、同第９６／２５８６１号、同第９６／１２７３５号、同第９６／１１２０９号、同第９８／３９３２６号、同第９８／３９３１６号、同第９８／３８８５９号、同第９８／３９３１５号、同第９８／４２６５９号、同第９８／３９３２９号、同第９８／４３９５９号、同第９８／４５２６８号、同第９８／４７８６３号、同第９６／３３１７２号、同第９６／２０９２６号、同第９７／３７９７４号、同第９７／３７９７３号、同第９６／３５７１１号、同第９８／５１６６５号、同第９８／４３９４６号、同第９５／０４０４５号、同第９８／５６３７７号、同第９７／１２２４４号、同第９９／００３６４号、同第９９／００３６３号、同第９８／５７９３６号、同第９９／０１４４９号、同第９９／０１１３９号、同第９８／５６７８８号、同第９８／５６７５６号、同第９８／５３８４２号、同第９８／５２９４８号、同第９８／５２９３７号、同第９９／０２５１０号、同第９７／４３２５０号、同第９９／０６４１０号、同第９９／０６０４２号、同第９９／０９０２２号、同第９９／０８６８８号、同第９９／０７６７９号、同第９９／０９９６５号、同第９９／０７７０４号、同第９９／０６０４１号、同第９９／３７８１８号、同第９９／３７６２５号、同第９７／１１６６８号；
日本国（ＪＰ）特許出願番号第１０１４７５３１号、同第１０２３１２８５号、同第１０２５９１４０号、および同第１０１３０１４９号、同第１０３１６５７０号、同第１１００１４８１号、ならびに同第１２７，８００号／１９９１年；ドイツ（ＤＥ）特許出願番号第１９７３１５２１号；英国（ＧＢ）特許出願番号第２２１８１０１号、同第２３２６８８１号、同第２２４６５６９号。
【０２５２】
本発明の目的のために、これらの参考文献に開示されている分子、および参考文献（下記を参照のこと）に開示されている分子は、まとめて「ＴＮＦαインヒビター」と呼ばれる。
【０２５３】
例えば、ＥＰ３９３，４３８およびＥＰ４２２，３３９は、可溶性のＴＮＦレセプターＩ型（ｓＴＮＦＲ−Ｉまたは３０ｋＤａのＴＮＦインヒビターとしてもまた公知である）および可溶性のＴＮＦレセプターＩＩ型（ｓＴＮＦＲ−ＩＩまたは４０ｋＤａのＴＮＦインヒビターとしてもまた公知である）（これらはまとめて、「ｓＴＮＦＲ」と呼ばれる）のアミノ酸および核酸配列、ならびにそれらの改変型（例えば、フラグメント、機能的な誘導体、および変異体）を教示する。ＥＰ３９３，４３８およびＥＰ４２２，３３９はまた、インヒビターをコードする応答性の遺伝子の単離、適切なベクターおよび細胞型中への遺伝子のクローニング、およびインヒビターを産生させるための遺伝子の発現のための方法を開示する。
【０２５４】
ｓＴＮＦＲ−ＩおよびｓＴＮＦＲ−ＩＩは、神経成長因子レセプター（ＮＧＦ）、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０、４−１ＢＢ、ラットのＴ細胞抗原ＭＲＣ　ＯＸ４０、ｆａｓ抗原、ならびにＣＤ２７およびＣＤ３０抗原を含むレセプターの、神経成長因子／ＴＮＦレセプタースーパーファミリーのメンバーである（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１０１９−１０２３（１９９０））。細胞表面レセプターのこのグループの間で最も保存されている特徴は、システインリッチ細胞外リガンド結合ドメインである。これは、約４個のアミノ酸の４回の繰り返しモチーフに分けられ得、そしてこれは、良好に保存されている位置で４〜６個のシステイン残基を含み得る（Ｓｍｉｔｈら、（１９９０）、前出）。
【０２５５】
本発明によって企図されるように、ＭＫ６１ポリペプチドは、他の治療と共に、そしてまた処置される適応症に適切な他の薬学的処方物と共に投与され得る。ＭＫ６１ポリペプチドおよび１以上のさらなる治療または薬学的処方物のいずれかは、別々に、連続して、または同時に投与され得る。
【０２５６】
特定の実施形態では、本発明は、ＴＮＦ応答性疾患の処置のための１以上のインターロイキン−１（ＩＬ−１）インヒビターのうちのいずれかと組合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する。インターロイキン−１インヒビターのクラスとしては、以下が挙げられる：以下に記載されるような、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１に対する細胞レセプターの活性化を特異的に妨げ得る任意の化合物）（例えば、ＩＬ−１ｒａ）；抗ＩＬ−１レセプターモノクローナル抗体（例えば、ＥＰ　６２３，６７４）；ＩＬ−１結合タンパク質（例えば、可溶性ＩＬ−１レセプター（例えば、米国特許第５，４９２，８８８号、同第５，４８８，０３２号、同第５，４６４，９３７号、同第５，３１９，０７１号および同第５，１８０，８１２号）；抗ＩＬ−１モノクローナル抗体（例えば、ＷＯ　９５／０１９９７、ＷＯ　９４／０２６２７、ＷＯ　９０／０６３７１、米国特許第４，９３５，３４３号、ＥＰ　３６４，７７８、ＥＰ　２６７，６１１およびＥＰ　２２０，０６３）；ＩＬ−１レセプター補助タンパク質（例えば、ＷＯ　９６／２３０６７）ならびにＩＬ−１のインビボでの合成または細胞外放出をブロックする、他の化合物およびタンパク質。
【０２５７】
インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）は、インターロイキン−１の天然のインヒビターとして作用するヒトタンパク質である。インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト、ならびにそれらの作製方法および使用方法は、米国特許第５，０７５，２２２号；ＷＯ　９１／０８２８５；ＷＯ　９１／１７１８４；ＡＵ　９１７３６３６；ＷＯ　９２／１６２２１；ＷＯ　９３／２１９４６；ＷＯ　９４／０６４５７；ＷＯ　９４／２１２７５；ＦＲ　２７０６７７２；ＷＯ　９４／２１２３５；ＤＥ　４２１９６２６；ＷＯ　９４／２０５１７；ＷＯ　９６／２２７９３およびＷＯ　９７／２８８２８（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）に記載される。このタンパク質は、グリコシル化および非グリコシル化ＩＬ−１レセプターアンタゴニストを包含する。
【０２５８】
詳細には、３つの好ましい形態のＩＬ−１ｒａ（ＩＬ−１ｒａα、ＩＬ−１ｒａβおよびＩＬ−１ｒａｘ）（各々は、同じＤＮＡコード配列およびその改変体によりコードされる）が、米国特許第５，０７５，２２２号に開示および記載される。ＩＬ−１インヒビター（特に、ＩＬ−１ｒａｓ）を産生するための方法もまた、５，０７５，２２２号特許に開示される。
【０２５９】
さらなるクラスのインターロイキン−１インヒビターは、ＩＬ−１に対する細胞性レセプターの活性化を特異的に妨げ得る化合物を包含する。このような化合物としては、ＩＬ−１結合タンパク質（例えば、可溶性レセプターおよびモノクローナル抗体）が挙げられる。このような化合物はまた、このレセプターに対するモノクローナル抗体を包含する。
【０２６０】
さらなるクラスのインターロイキン−１インヒビターとしては、ＩＬ−１のインビボでの合成および／または細胞外放出をブロックする化合物およびタンパク質が挙げられる。このような化合物としては、ＩＬ−１遺伝子の転写またはＩＬ−１プレタンパク質のプロセシングに影響を与える因子が挙げられる。
【０２６１】
特定の実施形態において、本発明は、分泌または可溶性のヒトｆａｓ抗原またはその組換えバージョン（ＷＯ９６／２０２０６およびＭｏｕｎｔｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．、１５５：４８２９−４８３７；およびＥＰ５１０，６９１（これらの開示は本明細書中で参考として援用される））と組合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する。ＷＯ９６／２０２０６は、分泌ヒトｆａｓ抗原（ネイティブおよび組換え体（Ｉｇ融合タンパク質を含む））、可溶性組換えヒトｆａｓ抗原のコードの原因である遺伝子を単離するための方法、適切なベクターおよび細胞型にこの遺伝子をクローン化するための方法、およびこの遺伝子を発現させてインヒビターを産生するための方法を開示する。ＥＰ５１０，６９１は、ヒトｆａｓ抗原（可溶性ｆａｓ抗原を含む）をコードするＤＮＡ、このＤＮＡを発現するためのベクター、およびこのベクターでトランスフェクトされた形質転換体を教示する。非経口的に投与される場合、分泌または可溶性のｆａｓ抗原融合タンパク質の用量は、それぞれ一般的に、約１μｇ／ｋｇ〜約１００μｇ／ｋｇである。
【０２６２】
ＴＮＦ応答性疾患（リウマチ性疾患のような急性および慢性の炎症を含む）の現在の処置は、通常、疼痛および炎症の制御のための第一線の薬物の使用を含み；これらの薬物は、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）として分類される。二次的な処置は、コルチコステロイド、遅効性抗リウマチ薬（ＳＡＡＲＤ）または疾患改善（ＤＭ）薬を含む。以下の化合物に関する情報は、Ｔｈｅ　Ｍｅｒｃｋ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ、第１６版、Ｍｅｒｃｋ，Ｓｈａｒｐ　＆　Ｄｏｈｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ．，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ、Ｊ、（１９９２）およびＰｈａｒｍａｐｒｏｊｅｃｔｓ、ＰＪＢ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　Ｌｔｄ．に見出され得る。
【０２６３】
特定の実施形態において、本発明は、リウマチ性疾患のような急性および慢性の炎症；ならびに対宿主性移植片病を含むＴＮＦ応答性疾患の処置のためのＭＫ６１ポリペプチドおよび１以上のＮＳＡＩＤのうちのいずれかの使用に関する。ＮＳＡＩＤは、少なくとも部分的に、その抗炎症性作用がプロスタグランジン合成の阻害であることが認められている（ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、「Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、ＭａｃＭｉｌｌａｎ第７版（１９８５））。ＮＳＡＩＤは、以下の少なくとも９つのグループに特徴付けられ得る：（１）サリチル酸誘導体、（２）プロピオン酸誘導体、（３）酢酸誘導体、（４）フェナム酸誘導体、（５）カルボン酸誘導体、（６）酪酸誘導体、（７）オキシカム（ｏｘｉｃａｍ）、（８）ピラゾール、および（９）ピラゾロン。
【０２６４】
さらに特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のサリチル酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する。このようなサリチル酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩としては、以下が挙げられる：アセトアミノザロール、アロキシプリン、アスピリン、ベノリラート、ブロモサリゲニン、アセチルサリチル酸カルシウム、トリサリチル酸マグネシウムコリン、サリチル酸マグネシウム、サリチル酸コリン、ジフルシナル（ｄｉｆｌｕｓｉｎａｌ）、エテルサレート、フェンドサール、ゲンチジン酸、サリチル酸グリコール、サリチル酸イミダゾール、アセチルサリチル酸リジン、メサラミン、サリチル酸モルホリン、１−ナフチルサリチレート、オルサラジン、パルサルミド、アセチルサリチル酸フェニル、サリチル酸フェニル、サラセタミド、サリチルアミドＯ−酢酸、サルサラート、サリチル酸ナトリウムおよびスルファサラジン。同様の鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したサリチル酸誘導体もまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２６５】
さらなる具体的な実施形態において、本発明は、１つ以上のプロピオン酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する。プロピオン酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩としては、以下が挙げられる：アルミノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロクス酸、カルプロフェン、デキシンドプロフェン（ｄｅｘｉｎｄｏｐｒｏｆｅｎ）、フェノプロフェン、フルノキサプロフェン、フルプロフェン、フルルビプロフェン、フルクロプロフェン、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロキサム、インドプロフェン、イソプロフェン、ケトプロフェン、ロキソプロフェン（ｌｏｘｏｐｒｏｆｅｎ）、ミロプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、オキサプロジン、ピケトプロフェン、ピメプロフェン、ピルプロフェン、プラノプロフェン、プロチジン酸、ピリドキシプロフェン（ｐｙｒｉｄｏｘｉｐｒｏｆｅｎ）、スプロフェン、チアプロフェン酸およびチオキサプロフェン。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したプロピオン酸誘導体もまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２６６】
さらに具体的な実施形態において、本発明は、１つ以上の酢酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する。酢酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩としては、以下が挙げられる：アセメタシン、アルクロフェナク、アムフェナク、ブフェキサマック、シンメタシン、クロピラク、デルメタシン（ｄｅｌｍｅｔａｃｉｎ）、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、エトドラク、フェルビナク、フェンクロフェナク、フェンクロラク、フェンクロジン酸、フェンチアザク、フロフェナク、グルカメタシン、イブフェナック、インドメタシン、イソフェゾラク、イソキセパック、ロナゾラク、メチアジン酸、オキサメタシン、オキシピナク（ｏｘｐｉｎａｃ）、ピメタシン、プログルメタシン、スリンダク、タルメタシン、チアラミド、チオピナク、トルメチン、トルメチンナトリウム、ジドメタシンおよびゾメピラク。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連した酢酸誘導体もまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２６７】
さらに具体的な特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のフェナム酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する。フェナム酸誘導体、そのプロドラッグエステル、およびその薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：エンフェナム酸、エトフェナマート、フルフェナム酸、イソニキシン、メクロフェナム酸、メクロフェナム酸ナトリウム、メドフェナム酸（ｍｅｄｏｆｅｎａｍｉｃ　ａｃｉｄ）、メフェナム酸、ニフルム酸、タルニフルマート、テロフェナマート、トルフェナム酸およびウフェナマート。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したフェナム酸誘導体もまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２６８】
さらに別のより具体的な実施形態において、本発明は、１つ以上のカルボン酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する。使用され得るカルボン酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩としては以下が挙げられる：クリダナク、ジフルニサル、フルフェニサール、イノリジン（ｉｎｏｒｉｄｉｎｅ）、ケトロラクおよびチノリジン。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したカルボン酸誘導体もまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２６９】
より具体的な実施形態において、本発明は、１つ以上の酪酸誘導体、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する。酪酸誘導体、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：ブマジソン、ブチブフェン、フェンブフェンおよびキセンブシン。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連した酪酸誘導体もまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２７０】
より具体的な実施形態において、本発明は、１つ以上のオキシカム、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する。オキシカム、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：ドロキシカム、エノリカム、イソキシカム、ピロキシカム、スドキシカム、テノキシカムおよび４−ヒドロキシ−１，２−ベンゾチアジン１，１−ジオキシド４−（Ｎ−フェニル）−カルボキサミド。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したオキシカムもまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２７１】
より具体的な特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のピラゾール、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する。使用され得るピラゾール、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩は以下を含む：ジフェナミゾールおよびエピリゾール。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したピラゾールもまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２７２】
より具体的な特定の実施形態において、本発明は、１つ以上のピラゾロン（ｐｙｒａｚｏｌｏｎｅ）、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する。使用され得るピラゾロン、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：アパゾン、アザプロパゾン、ベンズピペリロン、フェプラゾン、モフェブタゾン、モラゾン、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピペブゾン、プロピルフェナゾン、ラミフェナゾン、スキシブゾンおよびチアゾリノブタゾン。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したピラゾロンもまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２７３】
より具体的な実施形態において、本発明は、以下の１つ以上のＮＳＡＩＤのいずれかと組み合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する：ε−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸、アミキセトリン、アニトラザフェン、アントラフェニン、ベンダザック、ベンダザックリジネート（ｂｅｎｄａｚａｃ　ｌｙｓｉｎａｔｅ）、ベンジダミン、ベプロジン（ｂｅｐｒｏｚｉｎ）、ブロペラモール、ブコローム、ブフェゾラク、シプロカゾン、クロキシメート、ダジダミン、デボキサメト、デトミジン、ジフェンピラミド（ｄｉｆｅｎｐｉｒａｍｉｄｅ）、ジフェンピラミド（ｄｉｆｅｎｐｙｒａｍｉｄｅ）、ジフィサラミン（ｄｉｆｉｓａｌａｍｉｎｅ）、ジタゾール、エモルファゾン、ファネチゾールメシレート、フェンフルミゾール、フロクタフェニン、フルミゾール、フルニキシン、フルプロカゾン、フォピルトリン（ｆｏｐｉｒｔｏｌｉｎｅ）、フォスフォサール、グアイメサール、グアイアゾレン（ｇｕａｉａｚｏｌｅｎｅ）、イソニキシン（ｉｓｏｎｉｘｉｒｎ）、レフェタミンＨＣｌ、レフルノミド、ロフェミゾール、ロチファゾール、リジンクロニキシネート（ｌｙｓｉｎ　ｃｌｏｎｉｘｉｎａｔｅ）、メセクラゾン、ナブメトン、ニクチンドール、ニメスリド、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサセプロール、オキサパドール、パラニリン（ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ）、ぺリソキサール、クエン酸ぺリソキサール、ピフォキシム、ピプロキセン（ｐｉｐｒｏｘｅｎ）、ピラゾラク、ピルフェニドン、プロカゾン、プロキサゾール、チエラビンＢ（ｔｈｉｅｌａｖｉｎ　Ｂ）、チフラミゾール、チメガジン、トレクチン、トルパドール、トリプトアミド（ｔｒｙｐｔａｍｉｄ）ならびに４８０１５６Ｓ、ＡＡ８６１、ＡＤ１５９０、ＡＦＰ８０２、ＡＦＰ８６０、ＡＩ７７Ｂ、ＡＰ５０４、ＡＵ８００１、ＢＰＰＣ、ＢＷ５４０Ｃ、ＣＨＩＮＯＩＮ　１２７、ＣＮ１００、ＥＢ３８２、ＥＬ５０８、Ｆ１０４４、ＦＫ−５０６、ＧＶ３６５８、ＩＴＦ１８２、ＫＣＮＴＥＩ６０９０、ＫＭＥ４、ＬＡ２８５１、ＭＲ７１４、ＭＲ８９７、ＭＹ３０９、ＯＮＯ３１４４、ＰＲ８２３、ＰＶ１０２、ＰＶ１０８、Ｒ８３０、ＲＳ２１３１、ＳＣＲ１５２、ＳＨ４４０、ＳＩＲ１３３、ＳＰＡＳ５１０、ＳＱ２７２３９、ＳＴ２８１、ＳＹ６００１、ＴＡ６０、ＴＡＩ−９０１（４−ベンゾイル−１−インダンカルボン酸）、ＴＶＸ２７０６、Ｕ６０２５７、ＵＲ２３０１およびＷＹ４１７７０のような会社コード番号によって命名されるようなＮＳＡＩＤ。ＮＳＡＩＤに類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したＮＳＡＩＤもまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２７４】
より具体的な実施形態において、本発明は、リウマチ性疾患、対宿主性移植片病、および多発性硬化症のような急性および慢性の炎症を含む、ＴＮＦ応答性疾患の処置のための、１つ以上のコルチコステロイド、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する。コルチコステロイド、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩は、ヒドロコルチゾンおよびヒドロコルチゾンに由来する化合物を含む：例えば、２１−アセトキシプレグネノロン、アルクロメラゾン、アルゲストン、アムシノニド、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、ベタメタゾンバレレート、ブデソニド、クロロプレドニゾン、クロベタゾール、クロベタゾールプロピオネート、クロベタゾン、クロベタゾンブチレート、クロコルトロン、クロプレドノール、コルチコステロン、コルチゾン、コルチバゾール、デフラザコン、デソニド、デスオキシメラゾン、デキサメタゾン、ジフロラゾン、ジフルコルトロン、ジフルプレドネート、エノキソロン、フルアザコート、フルクロロニド、フルメタゾン、フルメタゾンピバレート、フルシノロンアセトニド、フルニソリド、フルオシノニド、フルオロシノロン（ｆｌｕｏｒｏｃｉｎｏｌｏｎｅ）アセトニド、フルオコルチンブチル、フルオコルトロン、フルオコルトロンヘキサノエート、吉草酸ジフルコルトロン、フルオロメトロン、フルペロロンアセテート、フルプレドニデンアセテート、フルプレドニゾロン、フルランデノリド（ｆｌｕｒａｎｄｅｎｏｌｉｄｅ）、フォルモコルタール、ハルシノニド、ハロメタゾン、ハロプレドンアセテート、ヒドロコルタメート、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、リン酸ヒドロコルチゾン、コハク酸ヒドロコルチゾン２１−ナトリウム、ヒドロコルチゾンテブテート、マジプレドン、メドリゾン、メプレドニゾン、メチルプレドニソロン、モメタゾンフロエート、パラメタゾン、プレドニカルベート、プレドニゾロン、プレドニゾロン２１−ジエドリアミノアセテート、プレドニゾロンナトリウムホスフェート、プレドニゾロンナトリウムスクシネート、プレドニゾロンナトリウム２１−ｍ−スルホベンゾネート、プレドニゾロンナトリウム２１−ステアログリコレート、プレドニゾロンテブテート、プレドニゾロン２１−トリメチルアセテート、プレドニゾン、プレドニバル（ｐｒｅｄｎｉｖａｌ）、プレドニリデン、プレドニリデン２１−ジエチルアミノアセテート、チキソコルトール、トリアムシノロン、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンベネトニド、およびトリアムシノロンヘキサセトニド。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したコルチコステロイドもまた、このグループに含まれることが意図される。
【０２７５】
より具体的な実施形態において、本発明は、リウマチ性疾患、対宿主性移植片病、および多発性硬化症のような急性および慢性の炎症を含む、ＴＮＦ応答性疾患の処置のための、１つ以上の遅効性抗リウマチ薬（ＳＡＡＲＤ）または疾患改善抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤＳ）、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する。ＳＡＡＲＤまたはＤＭＡＲＤ、そのプロドラッグエステルおよび薬学的に受容可能な塩は、以下を含む：アロクプレイドナトリウム、オーラノフィン、金チオグルコース、金チオグリカニド、アザチオプリン、ブレキナルナトリウム、ブシラミン、カルシウム３−金チオ−２−プロパノール−１−スルホネート、クロラムブシル、クロロキン、クロブザリト、クプロキソリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、ダプソン、１５−デオキシスペルグアリン（１５−ｄｅｏｘｙｓｐｅｒｇｕａｌｉｎ）、ジアセレイン、グルコサミン、金塩（例えば、シクロキン金塩、金ナトリウムチオマレート、金ナトリウムチオスルフェート）、ヒドロキシクロロキン、硫酸ヒドロキシクロロキン、ヒドロキシ尿素、ケブゾン、レバミゾール、ロベンザリット、メリチン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、ミゾリビン、ミコフェノレートモフェチル（ｍｏｆｅｔｉｌ）、ミオラル（ｍｙｏｒａｌ）、ナイトロジェンマスタード、Ｄ−ペニシラミン、ピリジノール、イミダゾール（例えば、ＳＫＮＦ８６００２およびＳＢ２０３５８０）、ラパマイシン、チオール、サイモポエチンおよびビンクリスチン。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したＳＡＡＲＤまたはＤＭＡＲＤもまた、この群に含まれることが意図される。
【０２７６】
より具体的な特定の実施形態において、本発明は、急性および慢性の炎症を含む、ＴＮＦ応答性疾患の処置のための、１つ以上のＣＯＸ２インヒビター、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する。ＣＯＸ２インヒビター、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩の例としては、例えば、セレコキシブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）が挙げられる。類似した鎮痛特性および抗炎症特性を有する構造的に関連したＣＯＸ２インヒビターもまた、この群に含まれることが意図される。
【０２７７】
より具体的な特定の実施形態において、本発明は、急性および慢性の炎症を含む、ＴＮＦ応答性疾患の処置のための、１つ以上の抗菌剤、そのプロドラッグエステルまたは薬学的に受容可能な塩のいずれかと組み合わせたＭＫ６１ポリペプチドの使用（前処置、後処置または同時処置）に関する。抗菌剤としては、例えば、ペニシリン、セファロスポリンおよび他のβ−ラクタム、アミノ配糖体、アゾール、キロノン、マクロライド、リファマイシン、テトラサイクリン、スルホンアミド、リンコサミド（ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅ）およびポリミキシンの広範なクラスが挙げられる。ペニシリンは、以下を含むがこれらに限定されない：ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フロキサシリン、アンピシリン、アンピシリン／スルバクタム、アモキシリン、アモキシリン／クラブラン酸、ヘタシリン、シクラシリン（ｃｙｃｌａｃｉｌｌｉｎ）、バカンピシリン、カルベニシリン、カルベニシリンインダニル（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ　ｉｎｄａｎｙｌ）、チカルシリン、チカルシリン／クラブラン酸、アズロシリン、メズロシリン、ピペラシリン（ｐｅｐｅｒａｃｉｌｌｉｎ）、およびメシリナム。セファロスポリンおよび他のβ−ラクタムは、以下を含むがこれらに限定されない：セファロチン、セファピリン、セファレキシン、セフラジン、セファゾリン、セファドロキシル、セファクロール、セファマンドール、セフォテタン、セフォキシチン、セルロキシム（ｃｅｒｕｒｏｘｉｍｅ）、セフォニシド、セフォラジン（ｃｅｆｏｒａｄｉｎｅ）、セフィキシム、セフォタキシム、モキサラクタム、セフチゾキシム、セトリアキソン（ｃｅｔｒｉａｘｏｎｅ）、セフォペラゾン（ｃｅｐｈｏｐｅｒａｚｏｎｅ）、セフタジジム、イミペネムおよびアズトレオナム。アミノ配糖体は、以下を含むがこれらに限定されない：ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン、ネチルマイシン、カナマイシンおよびネオマイシン。アゾールは、フルコナゾールを含むがこれに限定されない。キノロンは、ナリジクス酸、ノルフロキサシン、エノキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、スパルフロキサシンおよびテマフロキサシンを含むがこれらに限定されない。マクロライドは、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｏｍｙｃｉｎ）、スピラマイシンおよびアジスロマイシンを含むがこれらに限定されない。リファマイシンは、リファンピンを含むがこれに限定されない。テトラサイクリンは、スピサイクリン（ｓｐｉｃｙｃｌｉｎｅ）、クロルテトラサイクリン、クロモサイクリン、デメクロサイクリン、デオキシサイクリン（ｄｅｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ）、グアメサイクリン（ｇｕａｍｅｃｙｃｌｉｎｅ）、リメサイクリン、メクロサイクリン、メタサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ぺニメピサイクリン、ピパサイクリン、ロリテトラサイクリン、サンサイクリン、セノサイクリン（ｓｅｎｏｃｉｃｌｉｎ）およびテトラサイクリンを含むがこれらに限定されない。スルホンアミドは、スルファニルアミド、スルファメトキサゾール、スルファセタミド、スルファジアジン、スルフイソキサゾールおよびコ��リモキサゾール（トリメトプリム／スルファメトキサゾール）を含むがこれらに限定されない。リンコサミドは、クリンダマイシンおよびリンコマイシンを含むがこれらに限定されない。ポリミキシン（ポリペプチド）は、ポリミキシンＢおよびコリスチンを含むがこれらに限定されない。
【０２７８】
（ＭＫ６１組成物および投与）
本発明の範囲内にある治療用組成物としては、ヒトまたは非ヒト動物（哺乳動物など）に投与する様式との適合性について選択された、薬学的または生理学的に受容可能な処方剤と混合した、ＭＫ６１ポリペプチドまたはＭＫ６１ヌクレオチド分子の治療有効量を含み得る、ＭＫ６１薬学的組成物を含む。薬学的組成物は、投与の様式との適合性について選択された、薬学的または生理学的に受容可能な処方剤と混合した、１以上のＭＫ６１の選択的結合因子の治療有効量を含み得る。
【０２７９】
受容可能な処方物質は、好ましくは、使用される投薬量および濃度で受容者（レシピエント）に対して好ましくは非毒性である。
【０２８０】
薬学的組成物は、例えば、ｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、等張性、匂、滅菌性、安定性、溶解または放出の速度、この組成物の吸収および透過を、改変、維持、または保存するための処方物質を含み得る。適切な処方物質としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）；抗菌剤；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝液（例えば、ホウ素酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸または他の有機酸）；充填剤（マンニトールまたはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）；フィラー；モノサッカリド（単糖類）；ジサッカリド（二糖類）；および他の糖質（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン；ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤；芳香剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピナルパラベン、クロロヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）；溶液（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニックス（ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン、コレステロール、チロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）））；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）；張性増強剤（例えば、アルカリ金属ハライド、好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または薬学的アジュバント（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０））。
【０２８１】
最適な薬学的組成物は、例えば、意図した投与経路、送達様式および所望の投薬量に依存して当業者によって決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（前出）を参照のこと。このような組成物は、ＭＫ６１分子の、物理学的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響を与え得る。
【０２８２】
薬学的組成物における主なビヒクルまたはキャリアは、天然において水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアは、注入のための水、薬学的生理的食塩水または人工脳脊髄液であり得、これらは、非経口投与のための組成物において共通する他の物質を補充し得る。中性緩衝化生理的食塩水または血清アルブミンを混合した生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、ｐＨが約７．０〜約８．５のＴｒｉｓ緩衝液、またはｐＨ約４．０〜約５．５の酢酸緩衝液を含み、この薬学的組成物は、ソルビトールまたはその適切な代用物であり得る。本発明の１つの実施形態において、ＭＫ６１ポリペプチド組成物は、凍結乾燥したケーキまたは水溶液の形態で適切な処方剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前出）と、共に所望の純度を有する選択された組成物とを混合することによって、保存のために調製され得る。さらに、このＭＫ６１ポリペプチド生成物を、スクロースのような適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として処方され得る。
【０２８３】
ＭＫ６１薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、この組成物は、吸入のため、または消化管を介した送達（例えば、経口）のため、または当該分野で公知の送達経路を介して、選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の投与は、当該分野の範囲である。
【０２８４】
この処方成分は、投与の部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液を使用して、生理学的ｐＨまたは僅かに低いｐＨ（代表的には、約５〜約８の範囲内のｐＨ）で組成物を維持する。
【０２８５】
非経口投与が企図される場合、本発明の用途のための治療組成物は、発熱物質を含有しない、非経口的に受容可能な水性溶液の形態であって、この水性溶液は、所望のＭＫ６１分子を薬学的に受容可能なビヒクル中に含有する。非経口注入のための特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、この滅菌蒸留水中に、ＭＫ６１分子が、無菌、等張溶液として処方され、そして適切に保存される。さらに別の調製物は、薬剤（例えば、注射可能なミクロスフェア、生体分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸、ビーズまたはリポソーム）を有する所望の分子の処方物に関し、この調製物は、蓄積注射を介して送達され得る生成物の制御された放出または徐放を提供する。ヒアルロン酸もまた使用され得、そしてこれは、循環における徐放持続時間を増進させる効果を有する。所望の分子を導入するための他の適切な手段として、移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
【０２８６】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例えば、ＭＫ６１分子は、吸入のための乾燥粉末として処方され得る。ＭＫ６１ポリペプチドまたはＭＫ６１核酸分子の吸入溶液はまた、エアゾール送達のためのプロペラントを用いて処方され得る。さらに別の実施形態において、溶液は、噴霧され得る。肺投与は、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５にさらに記載され、これは、化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
【０２８７】
特定の処方物は、経口投与され得ることもまた企図される。本発明の１つに実施形態において、この様式で投与されるＭＫ６１ポリペプチドは、錠剤およびカプセルのような固体投薬形態の処方において慣例的に使用されるそれらのキャリアとともにまたはそれを含まずに処方され得る。例えば、カプセルは、胃腸管において、バイオアベイラビリティーが最大化され、そして全身前分解が最小化される時点で処方物の活性部分が放出されるように設計され得る。さらなる薬剤が、ＭＫ６１分子の吸収を容易にするように含まれ得る。希釈剤、香料、低融点ろう、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた使用され得る。
【０２８８】
別の薬学的組成物は、ＭＫ６１分子の有効量を、錠剤の製造のために適切な非毒性賦形剤と混合して含み得る。滅菌水または別の適切なビヒクル中にその錠剤を溶解することによって、溶液が単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、ラクトース、またはリン酸カルシウム；あるいは結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン、またはアラビアゴム）；あるいは滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０２８９】
さらなるＭＫ６１薬学的組成物は、当業者に明らかであり、これには、徐放処方物または制御された送達処方物中のＭＫ６１ポリペプチドを含む処方物が包含される。種々の他の徐放手段または制御された送達手段（例えば、リポソームキャリア、生体分解性微粒子または多孔性ビーズおよび蓄積注射）を処方するための技術もまた、当業者に公知である。例えば、以下を参照のこと：ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９。これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー微粒子の制御された放出を記載する。徐放調製物のさらなる例としては、成型された物品の形態（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリクスを包含する。徐放マトリクスとしては以下が挙げられ得る：ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ　５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，前出）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ　１３３，９８８）。徐放組成物はまた、リポソームを含み得る。このリポソームは、当該分野において公知のいくつかの方法のいずれかにより調製され得る。例えば、以下を参照のこと：Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；ＥＰ　０３６，６７６；ＥＰ　０８８，０４６；ＥＰ　１４３，９４９。
【０２９０】
インビボ投与のために使用されるＭＫ６１の薬学的組成物は、代表的には、無菌でなければならない。このことは、滅菌濾過膜を介する濾過によって達成され得る。この組成物が、凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構築の前または後のいずれかで実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥された形態または溶液で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する、静脈内溶液バッグまたはバイアル）内に配置される。
【０２９１】
一旦、薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水和粉末もしくは凍結乾燥粉末として保存され得る。このような処方物は、即時使用型（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）の形態または投与の前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥された形態）のいずれかで保存され得る。
【０２９２】
特定の実施形態において、本発明は、単一用量投与単位を生成するためのキットに関する。このキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性処方物を有する第二の容器の両方を含み得る。また、本発明の範囲内には、単一および多チャンバーの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが包含される。
【０２９３】
治療的に使用されるＭＫ６１の薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存する。従って、当業者は、処置のための適切な投薬レベルが、従って、送達される分子、ＭＫ６１分子が使用されている指標、投与の経路、および患者のサイズ（体重、体表面積、または器官の大きさ）および状態（年齢および一般的な健康）に、部分的に依存して変化することを理解する。従って、臨床家は、最適な治療効果を得るために、投薬量を力価決定し（ｔｉｔｅｒ）、投与経路を改変し得る。代表的な投薬量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲であり得る。他の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。
【０２９４】
投薬の頻度は、使用される処方物中でのＭＫ６１分子の薬物動態学のパラメーターに依存する。典型的に、臨床家は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで組成物を投与する。従って、組成物は、単一用量として、もしくは経時的に２以上の用量（これは、同量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい）として、または移植デバイスもしくはカテーテルを介する連続的な注入として、投与され得る。適切な投薬量のさらなる改良は、当業者によって慣用的になされ、そしてそれらによって慣用的に実施される課題の範囲内である。適切な投薬量は、慣用的に得られる適切な用量−応答データの使用を介して確認され得る。
【０２９５】
薬学的組成物の投与の経路は、以下のような公知の方法と一致する：例えば、経口的投与、静脈内、腹腔内、脳内（実質内の）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内の経路による注入を介する投与；または徐放性の系もしくは移植デバイスによる投与。所望される場合、これらの組成物は、ボーラス注射によって投与され得るか、もしくは注入によって連続的に投与され得るか、または移植デバイスによって投与され得る。
【０２９６】
あるいはまたはさらに、組成物は、膜、スポンジ、または他の適切な材料（その上に所望の分子が吸収されるかまたはカプセル化される）の移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織または器官に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラスまたは連続的な投与を介し得る。
【０２９７】
いくつかの場合において、エキソビボ様式において、ＭＫ６１薬学的組成物を使用することが所望され得る。このような例において、患者から除去された細胞、組織、または器官は、これらの細胞、組織、および／または器官が引き続いて患者に移植し戻された後にＭＫ６１薬学的組成物に曝露される。
【０２９８】
他の場合において、ＭＫ６１ポリペプチドは、本明細書中に記載されるような方法を使用して、このポリペプチドを発現および分泌するように遺伝的に操作された特定の細胞を移植することによって、送達され得る。このような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であり得、そして自己、異種、または外因性の細胞であり得る。必要に応じて、細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少するために、細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために、カプセル化され得る。カプセル化材料は、典型的に、生体適合性の半浸透性ポリマー性包囲物または膜であり、これらは、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系による、または周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の破壊を防止する。
【０２９９】
本発明のさらなる実施形態は、遺伝子治療または細胞治療による、治療ポリペプチドのインビトロ産生と、治療ポリペプチドの産生および送達との両方のための、細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）に関する。相同組換えおよび他の組換えの方法を使用して、通常は転写に対してサイレントなＭＫ６１遺伝子、または過少発現される遺伝子を含む細胞を改変し得、これによって、治療有効量のＭＫ６１ポリペプチドを発現する細胞を産生し得る。
【０３００】
相同組換えは、もともとは、遺伝子を標的化して転写活性な遺伝子における変異を誘導するか、または修正するために開発された技術である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，Ｐｒｏｇ．ｉｎ　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．＆　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６：３０１、１９８９）。基本的な技術は、特定の変異を哺乳動物ゲノムの特定の領域に導入するための方法（Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ　４４：４１９−４２８（１９８６）；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ　Ｃｅｌｌ　５１：５０３−５１２（１９８７）；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８５８３−８５８７（１９８８））、または欠損遺伝子における特定の変異を修正するための方法（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３３０：５７６−５７８（１９８７））の方法として、開発された。例示的な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１号（欧州特許第９１９３０５１号、同第５０５５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、国際公開番号ＷＯ　９１／０９９５５）に記載されている。
【０３０１】
相同組換えによって、ゲノムに挿入されるべきＤＮＡ配列は、それを標的ＤＮＡに付着させることによって、目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。この標的ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同）であるヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に対して相補的な標的ＤＮＡの小さな断片は、ＤＮＡ複製プロセスの間に、親鎖と接触される。これは、細胞に挿入されてハイブリダイズしたＤＮＡの一般的な特性であり、そして従って、共有される相同領域を介して、内因性ＤＮＡの他の断片と組み換えられる。この相補鎖が、変異または異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに付着される場合には、これはまた、この組換えの結果として新たに合成された鎖に組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、ＤＮＡの新たな配列がテンプレートとして働くことが可能である。従って、移入されたＤＮＡは、ゲノムに組み込まれる。
【０３０２】
ＭＫ６１ポリペプチドと相互作用し得るかまたはその発現を制御し得るＤＮＡの領域（例えば、隣接配列）が、標的ＤＮＡのこれらの断片に付着する。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプレッサ、または外因性転写調節エレメントが、意図される宿主細胞のゲノムに、所望のＭＫ６１ポリペプチドをコードするＤＮＡの近位かつこのＤＮＡの転写に影響を与えるに十分な配向で、挿入される。制御エレメントは、この宿主細胞ゲノムに存在するＤＮＡの一部分を制御する。従って、所望のＭＫ６１ポリペプチドの発現は、ＭＫ６１遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろ、ＭＫ６１ポリペプチドの転写のための認識可能なシグナルを有する内因性遺伝子配列を提供するＤＮＡ調節セグメントと結合した標的ＤＮＡ（目的の内因性遺伝子と相同の領域を含む）の使用によって、達成され得る。
【０３０３】
例示的な方法において、細胞における所望の標的遺伝子（すなわち、所望の内因性細胞遺伝子）の発現は、予め選択された部位における細胞ゲノムへの相同組換えを介して、少なくとも調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位を含むＤＮＡの導入によって、変更される。これらの構成成分は、新たな転写ユニットの産生を実際に生じるような様式で、染色体（ゲノム）ＤＮＡに導入される（ここで、ＤＮＡ構築物に存在する調節配列、エキソン、およびスプライスドナー部位は、内因性遺伝子に作動可能に連結する）。染色体ＤＮＡへのこれらの構成成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変化する。
【０３０４】
本明細書中で記載されるように、変化された遺伝子発現は、通常は、得られた細胞においてサイレントな（発現されていない）遺伝子の活性化する（または発現させる）こと、ならびに得られた細胞において生理学的に有意なレベルでは発現されない遺伝子の発現の増加することを包含する。この実施形態はさらに、調節または誘導のパターンが、得られたままの細胞において生じる調節または誘導のパターンとは異なり、そして得られたままの細胞において発現される遺伝子の発現を減少（排除を含む）させるような、調節または誘導のパターンを変化させる工程を包含する。
【０３０５】
細胞の内在性ＭＫ６１遺伝子からのＭＫ６１ポリペプチドの産生を増加するかまたはこれを引き起こすために相同定組換えが使用され得る方法の１つは、最初に、相同性組換えを使用して、部位特異的組換え系由来の組換え配列（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，５：５２１−５２７，（１９９４）；Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２５：８９０−９００，（１９９３））を、細胞の内在性ゲノムＭＫ６１ポリペプチドコード領域の上流（すなわち、５’）に配置する工程を包含する。ゲノムＭＫ６１ポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された部位に対して相同性の組換え部位を含むプラスミドは、適切なリコンビナーゼ酵素と共に、改変された細胞株に導入される。このリコンビナーゼ酵素によって、プラスミドは、このプラスミドの組換え部位を介して、この細胞株のゲノムＭＫ６１ポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置する組換え部位に組込み得る（ＢａｕｂｏｎｉｓおよびＳａｕｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：２０２５−２０２９，１９９３；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５１：１３５１−１３５５（１９９１））。転写を増大させることが知られている任意の隣接配列（例えば、エンハンサー／プロモーター、イントロン、または翻訳エンハンサー）は、このプラスミド中に適切に配置される場合、細胞の内在性ＭＫ６１遺伝子からの新たなまたは増加したＭＫ６１ポリペプチド産生を生じる新たなまたは改変された転写単位を作製するような様式で組み込まれる。
【０３０６】
部位特異的組換え配列が細胞の内在性ゲノムＭＫ６１ポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された細胞株を使用するさらなる方法は、細胞株のゲノムの他のいずれかの位置に第２の組換え部位を導入するために相同性組換えを使用することである。次いで、適切なリコンビナーゼ酵素が、二組換え部位細胞株に導入され、組換え現象（欠失、転化、および転移）を生じ（Ｓａｕｅｒ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　Ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，前出、（１９９４）；Ｓａｕｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（前出）（１９９３））、これは、細胞の内在性ＭＫ６１遺伝子からの新規なまたは増加したＭＫ６１ポリペプチド産生を生じる、新しいかまたは改変された転写単位を作製する。
【０３０７】
細胞の内在性ＭＫ６１遺伝子からのＭＫ６１ポリペプチドの発現を増加するため、または引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内在性ＭＫ６１遺伝子からの新たなまたは増加したＭＫ６１ポリペプチドの産生を生じる様式で、遺伝子（例えば、転写因子）の発現を増加するかまたは引き起こし、そして／または遺伝子（例えば、転写リプレッサ）の発現を減少する工程を包含する。この方法は、天然に存在しないポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）を、細胞の内在性ＭＫ６１遺伝子からの新たなまたは増加したＭＫ６１ポリペプチドの産生が起こるように、細胞に導入する工程を包含する。
【０３０８】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。特定の実施形態において、例示的なＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的配列、（ｂ）制御配列、（ｃ）エキソン、および（ｄ）不対スプライスドナー部位。ＤＮＡ構築物中の標的配列は、エレメント（ａ）〜（ｄ）の細胞中の標的遺伝子への組込みを指向し、その結果、これらのエレメント（ｂ）〜（ｄ）は、内在性標的遺伝子の配列に作動可能に連結される。別の実施形態において、ＤＮＡ構築物は、以下を含む：（ａ）１つ以上の標的配列、（ｂ）制御配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライスドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター部位。ここで、標的配列は、エレメント（ａ）〜（ｆ）の組込みを指向し、その結果、これらのエレメント（ｂ）〜（ｆ）は、内在性遺伝子に作動可能に連結される。標的配列は、相同性組換えが生じる細胞染色体ＤＮＡの予め選択された部位に対して相同性である。この構築物において、エキソンは、一般的に、制御配列の３’側であり、そしてスプライスドナー部位は、このエキソンの３’側である。
【０３０９】
特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書中で記載されるＭＫ６１ポリペプチドの核酸配列）が公知である場合、遺伝子の選択された領域に対して相補的なＤＮＡの部分は、合成されるか、またはそうでなければ、例えば、目的の領域に結合している特定の認識部位におけるネイティブのＤＮＡの適切な制限等によって得られ得る。この部分は、細胞に挿入された際に、標的配列として働き、そしてそのゲノム内の相同性領域にハイブリダイズする。これまで、このハイブリダイゼーションが、ＤＮＡ複製の間に生じる場合、このＤＮＡの部分、およびそれに結合した任意のさらなる配列は、Ｏｋａｚａｋｉフラグメントとして作用し、そしてＤＮＡの新たに合成された娘鎖に組み込まれると考えられている。従って、本発明は、ＭＫ６１ポリペプチドをコードするヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、標的配列として使用され得る。
【０３１０】
ＭＫ６１ポリペプチド細胞治療（例えば、ＭＫ６１ポリペプチドを産生する細胞の移植）もまた企図される。この実施形態は、生物学的に活性な形態のＭＫ６１ポリペプチドを合成および分泌し得る細胞を移植する工程を包含する。このようなＭＫ６１ポリペプチド産生細胞は、ＭＫ６１ポリペプチドの天然産物である細胞であり得るか、または組換え細胞であって、ＭＫ６１ポリペプチドを産生するその能力が、所望のＭＫ６１ポリペプチドをコードする遺伝子またはＭＫ６１ポリペプチドの発現を増大する遺伝子で形質転換することによって増大された、組換え細胞であり得る。このような改変は、遺伝子を送達し、そしてその発現および分泌を促進するために適切なベクターによって達成され得る。ＭＫ６１ポリペプチドを投与されている患者における強力な免疫学的反応を最小化するために、異種のポリペプチドの投与と共に生じる得る場合、ＭＫ６１ポリペプチドを産生する天然の細胞が、ヒト起源であり、そしてヒトＭＫ６１ポリペプチドを産生することが好ましい。同様に、ＭＫ６１ポリペプチドを産生する組換え細胞が、ヒトＭＫ６１ポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが好ましい。
【０３１１】
移植された細胞は、周辺組織の浸透を回避するようにカプセル化され得る。ヒトまたは非ヒト動物細胞は、生体適合性の半透性ポリマー封入物または膜（これは、ＭＫ６１ポリペプチドの放出を可能にするが、患者の免疫系または周辺組織からの他の有害な因子による細胞の崩壊を防止する）の形態で患者に移植され得る。あるいは、ＭＫ６１ポリペプチドをエキソビボで産生するように形質転換された患者自身の細胞が、このようなカプセル化なしで、患者に直接移植され得る。
【０３１２】
生きた細胞をカプセル化するための技術は当該分野で公知であり、そしてカプセル化された細胞の調製およびそれらの患者への移植は、慣用的に達成され得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（ＷＯ９５／０５４５２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の効果的な送達のために遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。このカプセルは、生体適合性であり、そして容易に取り出し可能である。このカプセルは、哺乳動物宿主に移植された際に、インビボで下方制御に供されないプロモーターに作動可能に連結された生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化する。このデバイスは、レシピエント内の特定の部位への生きた細胞由来の分子の送達を提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号；同第５，０１１，４７２号；および同第５，１０６，６２７号を参照のこと。生きた細胞をカプセル化するためのシステムは、ＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／００１５７に記載される。ＡｅｂｉｓｃｈｅｒらのＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ／９１／００１５５；Ｗｉｎｎら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１３：３２２−３２９（１９９１）；Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１１１：２６９−２７５（１９９１）；およびＴｒｅｓｃｏら、ＡＳＡＩＯ　３８：１７−２３（１９９２）もまた参照のこと。
【０３１３】
ＭＫ６１ポリペプチドのインビボおよびインビトロの遺伝子治療送達もまた想定される。遺伝子治療技術の一例は、構成的または誘発性プロモーターに作動可能に連結され得るＭＫ６１ポリペプチドをコードするＭＫ６１遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡのいずれか）を使用して、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成することである。このプロモーターは、構築物が挿入される細胞または組織型において活性であるという条件下では、内在性ＭＫ６１遺伝子に対して同種であっても異種であってもよい。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて、部位特異的組込みのために設計されるＤＮＡ分子（例えば、相同性組換えのために有用な内在性配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、親細胞を越える選択的優性を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子（例えば、細胞標的化について）、細胞特異的内部移行因子、ベクターによる発現を増大する転写因子、およびベクターの産生を可能にする因子を含み得る。
【０３１４】
遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、次いで、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して細胞に（エキソビボまたはインビボのいずれかで）導入され得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの手段は、本明細書中に記載されるようなウイルスベクターの使用による。特定のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）は、ＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、そしてこの遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。他のベクターは、エピソームとして機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質に残る。
【０３１５】
さらに他の実施形態において、制御エレメントが、標的細胞におけるＭＫ６１遺伝子の制御された発現のために含まれ得る。このようなエレメントは、適切なエフェクターに応答して刺激される。このようにして、治療的ポリペプチドは、所望の場合に発現され得る。１つの従来の制御手段は、低分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始し得るドメイン（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性タンパク質）を含むキメラタンパク質を二量化するために用いられる低分子二量化剤またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）（ＷＯ９６４１８６５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／０９９４８６）；ＷＯ９７３１８９８（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０３１３７）およびＷＯ９７３１８９９（ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３１５７）に記載のような）の使用を包含する。タンパク質の二量化は、導入遺伝子の転写を開始するために使用され得る。
【０３１６】
代替の調節技術は、目的の遺伝子から発現されたタンパク質を、凝集体またはクラスターとして細胞の内側に貯蔵する方法を使用する。目的の遺伝子は、小胞体における凝集タンパク質の保持を生じる、条件的凝集ドメインを含む融合タンパク質として発現される。貯蔵されたタンパク質は安定であり、そして細胞の内側で不活性である。しかし、このタンパク質は、条件的凝集ドメインを除去する薬物（例えば、低分子リガンド）を投与することによって放出され得、それにより、凝集体またはクラスターを特異的に破壊し、その結果、このタンパク質は細胞から分泌され得る。Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８７：８１６−８１７および２８７：８２６−８３０（２０００）を参照のこと。
【０３１７】
他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、以下の系が挙げられるが、これらに限定されない。Ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ（ＲＵ４８６）は、プロゲステロンアンタゴニストとして使用される。改変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインのプロゲステロンアンタゴニストへの結合は、２つの転写因子のダイマー（次いで、核に至り、ＤＮＡに結合する）を形成することによって、転写を活性化する。このリガンド結合ドメインは、レセプターが天然のリガンドに結合する能力を排除するように改変される。改変されたステロイドホルモンレセプター系はさらに、米国特許第５，３６４，７９１号；ＷＯ９６４０９１１、およびＷＯ９７１０３３７に記載される。
【０３１８】
さらに別の制御系は、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合し、そしてこれを活性化するエクジソン（ショウジョウバエステロイドホルモン）を使用する。次いで、このレセプターは核に転移し、特定のＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子由来のプロモーター）に結合する。エクジソンレセプターは、転写を開始するための、トランス活性化ドメイン／ＤＮＡ結合ドメイン／リガンド結合ドメインを含む。エクジソン系はさらに、米国特許第５，５１４，５７８、ＷＯ９７３８１１７；ＷＯ９６３７６０９；およびＷＯ９３０３１６２に記載されている。
【０３１９】
別の制御手段は、陽性テトラサイクリン制御可能トランス活性化因子を使用する。この系は、転写を活性化するポリペプチドに連結された変異したｔｅｔレプレッサタンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節トランス活性化因子タンパク質を生じた変異したｔｅｔＲ−４アミノ酸の変化、すなわち、これは、テトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する）を含む。このような系は、米国特許第５，４６４，７５８号、同第５，６５０，２９８号、および同第５，６５４，１６８号に記載されている。
【０３２０】
さらなる発現制御系および核酸構築物は、米国特許第５，７４１，６７９号および同第５，８３４，１８６号（Ｉｎｎｏｖｉｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）に記載されている。
【０３２１】
インビボの遺伝子治療は、ＭＫ６１ポリペプチドをコードする遺伝子を、ＭＫ６１核酸分子の局所的な注射を介して、または他の適切なウイルスもしくは非ウイルス送達ベクターによって、細胞に導入することによって達成され得る。Ｈｅｆｔｉ、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２５：１４１８−１４３５（１９９４）。例えば、ＭＫ６１ポリペプチドをコードする核酸分子は、標的細胞への送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター中に含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、国際公開番号ＷＯ９５／３４６７０；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８）。組換えＡＡＶゲノムは、代表的には、機能的プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結したＭＫ６１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接する、ＡＡＶ逆方向末端反復を含む。
【０３２２】
代替の適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、およびパピローマウイルスのベクターが挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボのウイルス媒介遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療的タンパク質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するためにインビトロで処理されたヒト細胞の送達によって、治療的タンパク質を患者に提供するためのプロセスの例を提供する。遺伝子治療技術の実行のためのさらなる方法および材料は、アデノウイルスベクターに関する米国特許第５，６３１，２３６号；レトロウイルスベクターに関する米国特許第５，６７２，５１０号；およびサイトカインを発現するレトロウイルスベクターに関する米国特許第５，６３５，３９９号に記載されている。
【０３２３】
非ウイルス送達方法としては、リポソーム媒介移入、裸のＤＮＡの送達（直接注射）、レセプター媒介移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子治療の材料および方法としてはまた、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ配列、親細胞を超える選択的利点を提供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブ選択系および発現制御系（安全な測定）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のための）、細胞特異的内在化因子、ならびにベクター製造のための方法が挙げられ得る。遺伝子治療技術の実行のためのこのようなさらなる方法および材料は、エレクトロポレーション技術に関する米国特許第４，９７０，１５４号；核リガンドに関するＷＯ９６／４０９５８；遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載する米国特許第５，６７９，５５９号；リポソームキャリアに関する米国特許第５，６７９，９５４号；リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法に関する米国特許第５，５９３，８７５号；および米国特許第４，９４５，０５０号（ここで、生物学的に活性な粒子が、ある速度で細胞に噴射され、それによってこの粒子は細胞の表面を貫通し、そして細胞内部に取り込まれる）に記載される。
【０３２４】
ＭＫ６１遺伝子治療または細胞治療はさらに、同じ細胞または異なる細胞において１以上のさらなるポリペプチドの送達を含み得ることがまた、意図される。このような細胞は、患者に別々に導入され得るか、またはこれらの細胞は、単一の移植可能なデバイス（例えば、上記のようなカプセル化膜）中に含まれ得るか、またはこれらの細胞は、ウイルスベクターによって別々に改変され得る。
【０３２５】
遺伝子治療を介して、細胞における内在性のＭＫ６１ポリペプチド発現を増大させる手段は、ＭＫ６１ポリペプチドプロモーター中に１以上のエンハンサーエレメントを挿入することであり、ここで、このエンハンサーエレメントは、ＭＫ６１遺伝子の転写活性を増大するように作用し得る。使用されるエンハンサーエレメントは、遺伝子を活性化することが所望される組織に基づいて選択される；この組織においてプロモーターの活性化を与えることが公知のエンハンサーエレメントが、選択される。例えば、ＭＫ６１ポリペプチドをコードする遺伝子が、Ｔ細胞において「オンにされる」場合、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、添加されるべき転写エレメントの機能的部分は、標準的なクローニング技術を使用して、ＭＫ６１ポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡのフラグメント中に挿入され得る（そして必要に応じて、ベクターならびに／または５’隣接配列および／もしくは３’隣接配列などの中に挿入される）。次いで、「相同組換え構築物」として公知のこの構築物は、エキソビボまたはインビボのいずれかで所望の細胞に導入され得る。
【０３２６】
遺伝子治療はまた、内在性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによってＭＫ６１ポリペプチドの発現を減少させるために使用され得る。このような改変は、代表的には、相同組換え方法を介して達成される。例えば、不活化のために選択されたＭＫ６１遺伝子のプロモーターの全てまたは一部を含むＤＮＡ分子は、転写を調節するプロモーターの断片を除去および／または置換するように操作され得る。例えば、ＴＡＴＡボックスおよび／またはプロモーターの転写活性化因子の結合部位は、標準的な分子生物学的技術を使用して欠失され得る；このような欠失は、プロモーターの活性を阻害し得、それによって対応するＭＫ６１遺伝子の転写を抑制する。ＴＡＴＡボックスまたはプロモーターの転写活性化因子結合部位の欠失は、ＭＫ６１ポリペプチドプロモーター（調節されるべきＭＫ６１遺伝子と同種または関連の種由来の）の全てまたは関連部分を含むＤＮＡ構築物を生成することによって達成され得、ここで、ＴＡＴＡボックスおよび／または転写活性化因子結合部位のヌクレオチドの１以上は、１以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入を介して変異される。結果として、ＴＡＴＡボックスおよび／または活性化因子結合部位は、活性を減少させるかまたは完全に不活化される。この構築物は、代表的には、改変されたプロモーターセグメントに隣接するネイティブな（内在性の）５’および３’ＤＮＡ配列に対応するＤＮＡの少なくとも約５００塩基を含む。この構築物は、適切な細胞中に（エキソビボまたはインビボのいずれかで）、直接または本明細書中に記載のウイルスベクターを介してかのいずれかで導入され得る。代表的には、細胞のゲノムＤＮＡへの構築物の組み込みは、相同組換えを介してであり、ここで、プロモーター構築物の５’および３’ＤＮＡ配列は、内在性の染色体ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションを介して、改変されたプロモーター領域を組み込む際の補助として役立ち得る。
（ＭＫ６１核酸およびポリペプチドのさらなる使用）
本発明の核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）は、ＭＫ６１遺伝子および関連する遺伝子の染色体上の位置をマッピングするために使用され得る。マッピングは、当該分野で公知の技術（例えば、ＰＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション）によってなされ得る。
【０３２７】
ＭＫ６１核酸分子（それ自体が生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）は、定性的かまたは定量的にのいずれかで、哺乳動物の組織または体液のサンプル中の、ＭＫ６１　ＤＮＡまたは対応するＲＮＡの存在についての診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。
【０３２８】
従って、本発明は、診断適応における使用のための試薬を提供する。ヒトＭＫ６１遺伝子は、染色体バンド１９ｑ１３に配置されている。さらに詳細には、遺伝子は、１９ｑ１３．１の内部、またはそれに近い領域に配置されている。いくつかの他の興味深い遺伝子が、第１９染色体のこの領域に配置されている。これには、ヒト白血球レセプタークラスター（ＬＲＣ）（これは、イムノグロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーの白血球によって発現されるレセプターをコードする１９個の遺伝子を含むことが示されている）、ヒトＫｉｒ２．４内部調整カリウムチャンネル遺伝子（ｉｎｗａｒｄｌｙ　ｒｅｃｔｉｆｙｉｎｇ　ｐｏｔａｓｓｉｕｍ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｇｅｎｅ）（ＫＣＮＪ１４）、ヒトキラー細胞阻害レセプター遺伝子ＫＩＲ１０３、リボソームタンパク質Ｓ１９遺伝子、プロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）、およびセリン様プロテアーゼ１（Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｓｅｒｉｎｅ−Ｌｉｋｅ　１）が含まれる。ＭＫ６１は、以下を含む本明細書中に記載されている疾患および障害についての候補である：シスチン尿症、先天性ネフローゼ症候群、家族性ネフローゼ症候群、家族性焦点性体節性糸球体硬化症、家族性ウィルムス腫瘍ＦＷＴ２、Ｂ細胞リンパ腫に関連赤血球貪食症候群、エンゲルマン（Ｃａｍｕｒａｔｉ−Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ）病、進行性骨幹異常形成症、遺伝性痙性対麻痺、喘息、心臓の異常（ｈｅａｒｔ　ｄｅｆｅｃｔ）、眼の発達、全身性エリテマトーデス（ｈＳＬＥ１）、原発性小頭症（ＭＣＰＨ２）、常染色体劣性の脊椎骨形成不全症（ｓｐｏｎｄｙｌｏｃｏｓｔａｌ　ｄｙｓｏｓｔｏｓｉｓ）、胎便性イレウスの嚢胞性繊維症の改変因子の遺伝子座、急性骨髄形成性白血病、赤血球貪食症候群に関係しているＢ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、精巣の生殖細胞の腫瘍、悪性神経膠腫、家族性の良性の高カルシウム血症（ｈｙｐｅｒｃａｌｃｅｍｉｔｈｕｓ）。ＭＫ６１遺伝子、ＭＫ６１　ＤＮＡまたはＲＮＡを含有しているプローブは、ＭＫ６１遺伝子が第１９染色体上に存在するかどうか、または変異が生じているかどうかを決定するために使用され得る。ＭＫ６１遺伝子座での検出可能な染色体の異常には、異数性、遺伝子のコピー数の変化、挿入、欠失、制限部位の変化、および再配置が含まれるが、これらに限定されない。これらの異常性は、コード配列内で、イントロン内で、または隣接している配列（上流のプロモーターおよび調節領域を含む）内で生じ得、そしてコード配列内の物理的な変更、または遺伝子の発現レベルでの変化として明示され得る。分析用プローブは、一般的には、少なくとも２０ヌクレオチドの長さであるが、いくらか短いプローブ（１４〜１７ヌクレオチド）が使用され得る。ＰＣＲプライマーは、少なくとも５ヌクレオチドの長さであり、好ましくは、１５またはそれ以上のヌクレオチド、より好ましくは、２０〜３０ヌクレオチドの長さである。短いポリヌクレオチドは、遺伝子の小さい領域が分析のための標的化される場合に使用され得る。遺伝子の全体の分析のためには、ポリヌクレオチドプローブは、エキソン全体またはそれ以上を含み得る。プローブは、一般的には、放射標識ヌクレオチドのようなシグナルを生じる部分に連結されたポリヌクレオチドを含む。一般的には、これらの診断方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から遺伝子サンプルを得る工程；（ｂ）ポリヌクレオチドが相補的なポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする条件下で、遺伝子サンプルを上記に開示されているポリヌクレオチドプローブまたはプライマーとともにインキュベートして、第１の反応産物を生じる工程；および（ｃ）コントロールの反応産物に対して第１の反応産物を比較する工程。第１の反応産物とコントロールの反応産物との間での差異が、患者の遺伝子の異常性の指標である。本発明での使用のための遺伝子サンプルには、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドプローブまたはプライマーはＲＮＡまたはＤＮＡであり得、そして配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号１５の一部、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、または配列番号１５の相補体、あるいはそれらのＲＮＡ等価物を含む。これに関する適切なアッセイ方法には、以下のような当業者に公知の分子遺伝的技術が含まれる：制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）の分析、ＰＣＲ分析を使用する短いタンデムな反復の（ＳＴＲ）分析、鎖連結反応（Ｂａｒａｎｙ、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　１：５−１６（１９９１））、リボヌクレアーゼ保護アッセイ、および当該分野で公知の他の遺伝子連関分析。Ｓａｍｂｒｏｏｋら編；Ａｕｓｕｂｅｌら編、およびＡ．Ｊ．Ｍａｒｉａｎ，Ｃｈｅｓｔ　１０８：２５５−６５（１９９５）を参照のこと。リボヌクレアーゼ保護アッセイ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、第４章）は、患者のＲＮＡサンプルへのＲＮＡプローブのハイブリダイゼーションを含み、その後、反応産物（（ＲＮＡ−ＲＮＡ）ハイブリッド）がＲＮａｓｅに曝される。ＲＮＡのハイブリダイズした領域は、消化から保護される。ＰＣＲアッセイにおいては、患者の遺伝子サンプルはオリゴヌクレオチドプライマーの対とともにインキュベートされ、そしてプライマーの間の領域が増幅されそして得られる。得られた産物の大きさ、量、または配列の変化は、患者における変異の指標である。使用され得る別のＰＣＲに基づく技術は、一本鎖のコンフォメーション多型（Ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＳＣＰ）の分析である。Ｈａｙａｓｈｉ、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　１：３４−３８（１９９１）を参照のこと。
【０３２９】
血清中のＭＫ６１タンパク質のアッセイは、本明細書中に記載されている疾患および障害を検出するために使用され得る。当業者は、ＭＫ６１の過小発現または過剰発現に関係している症状が、ＭＫ６１タンパク質のレベルの治療的な操作による処置に敏感に反応し得ることを認識する。
【０３３０】
ＭＫ６１ポリペプチドは、処置される適応について適切である場合には、１つ以上のサイトカイン、成長因子、抗生物質、抗炎症薬、および／または化学療法薬との組合せで、（同時にまたは続いて）使用され得る。
【０３３１】
１つ以上のＭＫ６１ポリペプチドの活性を阻害することが所望される場合には、他の方法もまた、使用され得る。このような阻害は、コントロール配列に相補的であり、その発現物にハイブリダイズする（三重らせんの形成）かまたはＭＫ６１　ｍＲＮＡにハイブリダイズする核酸分子によって達成され得る。例えば、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子（これらは、選択されたＭＫ６１遺伝子の少なくとも一部に対して相補的である配列を有する）が、細胞中に導入され得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示されているＭＫ６１ポリペプチドの配列を使用して利用可能な技術によって設計され得る。典型的には、それぞれのこのようなアンチセンス分子は、それぞれの選択されたＭＫ６１遺伝子の開始部位（５’末端）に対して相補的である。次いで、アンチセンス分子が対応するＭＫ６１　ｍＲＮＡにハイブリダイズすると、このｍＲＮＡの翻訳が妨げられるかまたは減少させられる。アンチセンスインヒビターは、細胞または生物体中のＭＫ６１ポリペプチドの減少またはその非存在に関する情報を提供する。
【０３３２】
あるいは、遺伝子治療は、１つ以上のＭＫ６１ポリペプチドのドミナントネガティブインヒビターを作成するために使用され得る。この状況では、各々の選択されたＭＫ６１ポリペプチドの変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡが調製され得、そして本明細書中に記載されているウイルスまたは非ウイルス方法のいずれかを使用して患者の細胞中に導入され得る。このような変異体の各々は、典型的には、その生物学的役割において内因性のポリペプチドと競合するように設計される。
【０３３３】
さらに、ＭＫ６１ポリペプチド（生物学的に活性であるかどうかにはかかわらず）は、免疫原として使用され得る。すなわち、ポリペプチドは、抗体がそれに対して惹起され得る少なくとも１つのエピトープを含む。ＭＫ６１ポリペプチドに結合する選択的結合試薬（本明細書中に記載されているような）は、体液または細胞サンプル中のＭＫ６１ポリペプチドの存在を検出するための標識された形態での使用を含むがこれに限定されない、インビボおよびインビトロでの診断目的のために使用され得る。抗体はまた、本明細書中に記載されているものを含む多数の疾患および障害を予防、処置、または診断するためにも使用され得る。抗体は、ＭＫ６１ポリペプチドの特徴である少なくとも１つの活性を減少させるかまたは遮断するように、ＭＫ６１ポリペプチドに結合し得るか、あるいは、ＭＫ６１ポリペプチドの特徴である少なくとも１つの活性を増大させる（ＭＫ６１ポリペプチドの薬物動態を増大させることを含む）ようにポリペプチドに対して結合し得る。
【０３３４】
以下の実施例は、説明の目的だけのために意図され、そしていかなる方法においても本発明の範囲の限定とは解釈されるべきではない。
【０３３５】
（実施例１）
（ヒトＭＫ６１　ｃＤＮＡクローンの単離）
Ａｍｇｅｎ　ＥＳＴデータベースのＴＮＦレセプターファミリーのプロファイルファイルの検索を行った。１つのヒトＥＳＴ配列（Ｇ−００４２−Ｂ７）を、ＴＮＦレセプターファミリーの可能性のあるメンバーとして同定し、ＭＫ６１と命名した。全長のヒトクローンを、続いて、当該分野で公知の標準的な条件下で以下のプライマーを使用して、ヒトリンパ節ライブラリーからＰＣＲ増幅した：ヒトＭＫ６１センスプライマー（５’−ＧＧＴＧＡＣＣＡＣＣＴＣＧＴＧＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴ−３’；配列番号２１）、アンチセンスプライマー（５’−ＧＣＣＣＡＡＴＴＡＧＧＡＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＧ−３’；配列番号２２）。ヒトのリンパ節由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを逆転写し、そしてｃＤＮＡをＳｍａｒｔ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、製造業者の説明書に従って合成した。ヒトＭＫ６１遺伝子の全長のｃＤＮＡを、哺乳動物細胞での発現のためにｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にクローン化し、そして標準的な方法を使用して配列決定した。クローンの名称は、ｐｃｄｎａ３ｈｕＭＫ６１＃５であり、そしてこれは、ヒトＭＫ６１　Ｔ１アイソフォームｃＤＮＡを含む。
【０３３６】
ヒトＭＫ６１　ｃＤＮＡ配列は１６６８ヌクレオチド（配列番号１）であり、そして３５５アミノ酸のポリペプチド（配列番号２）をコードする。ポリペプチド（ｈＭＫ６１Ｔ１として本明細書中で記載される；図１を参照のこと）は、残基１〜２３にまたがるシグナルペプチド、ＴＮＦＲスーパーファミリーのシステインリッチ領域の記号に適合する残基２６〜６０にまたがるシステインリッチドメイン（Ｍａｄｒｙら、ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ．１０：１６９３−１７０２、１９９８、および本明細書中の参考文献）、残基１５７〜１８５にまたがる膜貫通ドメイン、および長い細胞内ドメインを含む。公のデータベース、Ａｍｇｅｎ内部データベース、およびＣｅｌｅｒａデータベースにおいて入手可能なｃＤＮＡおよびゲノム配列と適合している全ての入手可能なヒトＭＫ６１の慎重なアラインメントによって、５個のさらなる全長のヒトＭＫ６１のアイソフォームを同定した（本明細書中では、ヒトＭＫ６１Ｔ２、ＭＫ６１Ｔ３、ＭＫ６１Ｔ４、ＭＫ６１Ｔ５、およびＭＫ６１Ｔ６と記載する）。
【０３３７】
ｈＭＫ６１Ｔ２ポリヌクレオチド配列は１５２５ヌクレオチド（配列番号３）であり、そして８５アミノ酸のポリペプチド（配列番号４）をコードする。これは、シグナルペプチド（残基１〜２３）（しかし、推定される膜貫通ドメインではない）を含み、このアイソフォームが分泌されたポリペプチド（図２）をコードし得ることを示唆している。ｈＭＫ６１Ｔ２は、ＴＮＦＲスーパーファミリーのシステインリッチ領域の特徴に対して不完全な適合（６個のシステインのうちの５個が適合）を示す、残基２６〜５１にまたがるシステインリッチドメインを含む。ｈＭＫ６１Ｔ３ポリヌクレオチド配列は、１２８９ヌクレオチド（配列番号５）であり、そして１３６個のアミノ酸残基のポリペプチド（配列番号６）をコードする。これは、シグナルペプチド（残基１〜２３）（しかし、推定される膜貫通ドメインではない）を含み、このアイソフォームが分泌されたポリペプチド（図３）をコードし得ることを示唆している。ｈＭＫ６１Ｔ３は、ＴＮＦＲスーパーファミリーのシステインリッチ領域の記号に適合している、残基２６〜６０にまたがるシステインリッチドメインを含む。ｈＭＫ６１Ｔ４ポリヌクレオチド配列は、１１６４ヌクレオチド（配列番号７）であり、そして１８７個のアミノ酸残基を含有しているポリペプチド（配列番号８）をコードする。これは、シグナルペプチド（残基１〜２３）（しかし、推定される膜貫通ドメインではない）を含み、このアイソフォームが分泌されたポリペプチド（図４）をコードし得ることを示唆している。ｈＭＫ６１Ｔ４は、ＴＮＦＲスーパーファミリーのシステインリッチ領域の特徴に対して不完全な適合（６個のシステイン残基のうちの５個が適合）を示す、残基２６〜５１にまたがるシステインリッチドメインを含む。ｈＭＫ６１Ｔ５ポリヌクレオチド配列は、１４８３ヌクレオチド（配列番号９）であり、そして７１個のアミノ酸残基のポリペプチド（配列番号１０）をコードする。これは、シグナルペプチド（残基１〜２３）（しかし、推定される膜貫通ドメインではない）を有し、このアイソフォームが分泌されたポリペプチド（図５）をコードし得ることを示唆している。ｈＭＫ６１Ｔ５は、ＴＮＦＲスーパーファミリーのシステインリッチ領域の記号に適合しているが、ｈＭＫ６１Ｔ１とはわずかに異なる、残基２６〜５７にまたがるシステインリッチドメインを含む。ｈＭＫ６１Ｔ６ポリヌクレオチド配列は、１１０４ヌクレオチド（配列番号１１）であり、そして１６７個のアミノ酸残基のポリペプチド（配列番号１２）をコードする。これは、シグナルペプチド（残基１〜２３）（しかし、推定される膜貫通ドメインではない）を含み、このアイソフォームが分泌されたポリペプチド（図６）をコードし得ることを示唆している。ｈＭＫ６１Ｔ６は、ＴＮＦＲスーパーファミリーのシステインリッチ領域の記号に対して不完全な適合（６個のシステインのうちの５個が適合）を示す残基２６〜５１にまたがるシステインリッチドメインを含む。
【０３３８】
興味深いことに、全てのヒトＭＫ６１アイソフォームは、リガンド結合ドメインの一部を構成し得る、完全なまたは部分的なＴＮＦＲ型のシステインリッチドメインを含む。従って、ｈＭＫ６１Ｔ１は真の新規のＴＮＦＲファミリーのメンバーである細胞表面レセプターをコードするようであるが、ヒトのアイソフォームＭＫ６１Ｔ２〜Ｔ６は、分泌されたレセプターをコードするようである。分泌されたレセプターは、オステオプロテグリン（ＯＰＧ）について以前に実証されているように、未知のＭＫ６１リガンドをそのレセプターとの相互作用から妨げる、デコイレセプターとして作用し得る。オステオプロテグリンリガンドは、破骨細胞の分化および活性化を調節するサイトカインである（Ｌａｃｅｙら、Ｃｅｌｌ：９３：１６５−１７６、１９９８）。さらに、ＭＫ６１Ｔ１〜Ｔ６アイソフォームは、未知のＭＫ６１リガンドに結合し得、そしてそれを通じて逆シグナル伝達を調節する。
【０３３９】
（実施例２）
（マウスのＭＫ６１　ｃＤＮＡクローンの単離）
Ａｍｇｅｎ　ＥＳＴデータベースのＴＮＦレセプターファミリーのプロファイル検索を、実施例１において上記に記載するように行った。１つのヒトＥＳＴ配列（Ｇ−００４２−Ｂ７）を、ＴＮＦレセプターファミリーの可能性のあるメンバーとして同定し、ＭＫ６１と命名した。全長のマウスＭＫ６１クローンを、当該分野で公知の標準的な条件下で以下のプライマーを使用して、マウスＡ２０細胞ライブラリーからＰＣＲ増幅した：マウスセンスプライマー（５’−ＣＧＧＡＣＧＣＧＴＧＧＧＣＧＧＡＣＧＣＧＴＧＧＧ−３’；配列番号２３）、アンチセンスプライマー（５’−ＡＧＣＡＡＡＣＴＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＡＧＴＴ−３’；配列番号２４）。マウスのＢリンパ腫細胞株Ａ２０由来のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを逆転写し、そしてｃＤＮＡをＳｍａｒｔ　ＲＡＣＥ　ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して、製造業者の説明書に従って合成した。マウス遺伝子の全長のｃＤＮＡを、哺乳動物細胞での発現のためにｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にクローン化し、そして標準的な方法を使用して配列決定した。
【０３４０】
マウスＭＫ６１ポリヌクレオチド配列は、１２０２ヌクレオチド（配列番号１３）であり、そして３４５アミノ酸のポリペプチド（配列番号１４）をコードする。マウスＭＫ６１Ｔ１ポリペプチドは細胞表面レセプターであり、これは、残基１〜２１にまたがるシグナル配列、および膜貫通ドメインを有する（図７）。
【０３４１】
（実施例３）
（ｈＭＫ６１　ｍＲＮＡの組織分布）
ＭＫ６１　ｍＲＮＡの分布を、ノーザンブロット分析および定量的ＰＣＲによって決定した。ヒトの末梢血Ｔ細胞、Ｂ細胞、および単球を、Ｒｏｓｅｔｔｅ　Ｓｅｐ　ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ　ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって製造業者の説明書に従って精製した。ヒトバーキットリンパ腫細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｔリンパ腫細胞、Ｊｕｋａｔ細胞、Ｋ５６２細胞、およびＵ９３７細胞を、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から入手した。全ＲＮＡを、Ｒｎｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって製造業者の説明書に従って、これらの細胞から単離した。
【０３４２】
ノーザンブロット分析を、当該分野で公知の標準的な条件を使用して行った。多組織ノーザンブロットおよび多組織ｃＤＮＡを、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）から購入した。ノーザンブロットを、ランダムプライムしたヒトおよびマウスのＭＫ６１放射活性プローブで５５℃で３時間ハイブリダイズさせ、次いで２×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳで数回交換し、続いて０．１×ＳＳＣ／０．１％のＳＤＳで３０分間、洗浄した。
【０３４３】
ノーザンブロット分析は、ｈＭＫ６１が末梢のリンパ系器官、脾臓、リンパ節、胸腺、骨髄、末梢血白血球、ならびに胎児の肝臓中で優先的に発現されることを示した（図１３および１４を参照のこと）。いくつかの種々のＭＫ６１アイソフォームがこれらの器官中で発現されたが、主な転写物は１．６ｋｂｐであった。
【０３４４】
リアルタイム定量的ＰＣＲを、種々のヒト組織および細胞株について行った。このアッセイは、特異的なＰＣＲ産物の検出を可能にする色素原性プローブおよびＰＣＲプライマーを使用する。ＰＣＲプライマーおよびプローブを、ＰＥ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰｒｉｍｅｒ　Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して設計し、そして必要とされる場合には、Ａｍｇｅｎ　Ｂｏｕｌｄｅｒによって合成した。ヒトＭＫ６１に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ（プローブ＃２２８８−２３　ＥＴＴ　ＣＣＣ　ＡＧＴ　ＴＴＴ　ＴＣＡ　ＴＣＴ　ＧＣＡ　ＣＴＧ　ＣＣＡ　Ｘ（配列番号４０）；５’プライマー＃２２８８−２２　ＴＧＣ　ＴＧＧ　ＡＣＣ　ＣＡＡ　ＣＡＣ　ＡＡＡ　ＴＧ（配列番号４１）；３’プライマー＃２２８８−２４　ＴＧＣ　ＣＡＴ　ＣＣＡ　ＡＣＣ　ＡＣＴ　ＣＡＧ　ＴＣ（配列番号４２））、およびヒトシクロフィリン（プローブ＃２６６１−９２　ＥＣＴ　ＧＣＣ　ＴＧＣ　ＴＧＣ　ＣＴＧ　ＧＴＣ　ＣＡＣ　ＣＴＸ（配列番号４３）、５’プライマー＃２６６１−９０　ＡＣＡ　ＣＣＴ　ＧＧＣ　ＣＧＣ　ＡＡＧ　ＡＴＡ　ＴＧ（配列番号４４）；３’プライマー：＃２６６１−９１　ＧＡＣ　ＴＣＧ　ＧＣＣ　ＴＣＡ　ＧＣＧ　ＡＡＴ　ＡＧ（配列番号４５））を、ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの標準的なプロトコールに従ってＴａｑｍａｎのためのプライマーとして使用した。Ｔａｑｍａｎ　ＰＣＲ反応を、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ　７７００機器上で行い、そしてデータを、ＰＥ　ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳｅｑｕｅｎｃｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍソフトウェアによって分析した（図１５を参照のこと）。
【０３４５】
ヒトＭＫ６１　ｍＲＮＡの発現は、単球（ｍｏｎｏｚｙｔｉｃ　ｃｅｌｌ）、Ｂ細胞、リンパ節、脾臓、およびＴ細胞中で最も高かった。中程度のレベルのヒトＭＫ６１　ｍＲＮＡの発現が、肝臓、骨髄、胸腺、扁桃腺、および胎児の肝臓で検出された。低いレベルのヒトＭＫ６１　ｍＲＮＡが、肺、胎盤、およびＪｕｒｋａｔ細胞中で検出された。興味深いことに、ヒトＭＫ６１　ｍＲＮＡの発現は、対応している腫瘍細胞株Ｒａｊｉ、Ｋ５６２、およびＵ９３７よりも、初代Ｂ細胞、Ｔ細胞、および単球（ｍｏｎｏｚｙｔｉｃ　ｃｅｌｌ）中で高かった。この発現パターンは、ＭＫ６１の発現がリンパ腫特異的であり、そして腫瘍細胞中でダウンレギュレートされ得るという見解と一致した。
【０３４６】
（実施例４）
（ｍＭＫ６１−Ｆｃ融合構築物の調製）
Ｓｍｉ１２−０００５１−ｆ３の推定される１７５アミノ酸の細胞外部分を、ＰＥＦ−ＢＯＳベクター（ｐＥＦ−ＢＯＳ；強力な哺乳動物発現ベクター；Ｍｉｚｕｓｈｉｍａら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８：５３２２、１９９０）中にサブクローン化し、そしてＦｃ部分を遺伝子の末端に付着させた。ｍＭＫ６１−Ｆｃをコードするヌクレオチド配列を、配列番号１５に示す。トランスフェクションを、トランスフェクション試薬としてＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｃｙｔｏｆｅｃｔｅｎｅを使用して行った。トランスフェクションの４８時間後に馴化培地を回収し、そしてＣＭを、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）によって１０倍に濃縮した。レーン６、７、および８に充填したサンプルは、濃縮した馴化培地であった（図９を参照のこと）。
【０３４７】
ｍＭＫ６１　Ｆｃ融合タンパク質（配列番号１６）を、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｐｉｅｒｃｅ）によって、１：３０００稀釈で検出し、次いで化学発光の増強（ＥＣＬ）によって視覚化した。露光時間は、１５秒であった。２９３３個の細胞溶解物をポジティブコントロールとして使用し、そして以下のように調製した：２９３細胞（ＡＴＣＣ検索番号ＣＲＬ−１５７３のもとで入手可能）を、２００μｌの２×ＳＤＳ充填緩衝液中に懸濁し、そして加熱した。次いで、細胞溶解物（５μｌ）をそれぞれのレーンに充填した。ウェスタンブロット（図９）は、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質が分泌され、そして細胞の馴化培地中で検出可能であることを示す。
【０３４８】
（実施例５）
（組換えＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質の産生および精製）
Ａ．ヒトＭＫ６１−Ｆｃタンパク質のクローニングおよび細菌での発現：
以下に記載するプライマー対および鋳型を使用するＰＣＲ増幅を、種々の形態のヒトＭＫ６１タンパク質を作成するための使用した。それぞれの対の１つのプライマーに、遺伝子のカルボキシ末端の後に、終止コドン（ＴＡＡ）および特有のＸｈｏＩ部位を導入した。それぞれの対の他方のプライマーには、特有のＮｄｅＩ部位、Ｎ末端メチオニン、遺伝子のアミノ酸末端部分について最適なコドンを導入した。ＰＣＲおよびサーモサイクリング（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）を、標準的な組換えＤＮＡ方法論を使用して行った。ＰＣＲ産物を精製し、制限消化し、そしてベクターｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ検索番号第９８１１３号）の特有のＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ部位に挿入した。続いて、原栄養性Ｅ．ｃｏｌｉ株３９３または２５９６をベクターで形質転換した。他の一般的に使用されるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターおよび宿主細胞もまた、発現に適切である。形質転換後、クローンを選択し、プラスミドＤＮＡを単離し、そしてＭＫ６１タンパク質の挿入物の配列を確認した。
【０３４９】
１．ｐＡＭＧ２１−ヒトＭＫ６１　２１−１６０　Ｈｉｓ：
ｐＡＭＧ２１−ｈＭＫ６１　２１−１６０　Ｈｉｓ構築物を、１４７アミノ酸の長さでありそして以下のＮ末端およびＣ末端残基を有するように操作した：ＮＨ２−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−−−−−−−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−ＣＯＯＨ（配列番号２５）。以下のオリゴヌクレオチドプライマーの対（＃２６０９−８７および＃２６０９−８８）を、この遺伝子構築物のＰＣＲおよびクローニングに使用した（２６０９−８７：５’−ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＴＡＡ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＧＣＣ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＴＡＴ　ＴＧＣ　ＧＧＣ　ＣＧＣ−３’（配列番号２６）；２６０９−８８：５’−ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＡＴＣ　ＣＴＣ　ＧＡＧ　ＴＴＡ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＣＧＧ　ＣＣＡ　ＧＧＣ　ＣＴＧ　ＣＴＧ−３’（配列番号２７））。
【０３５０】
２．ｐＡＭＧ２１−ヒトＭＫ６１　２１−１６０　Ｆｃ（ヒトＩｇＧ１）
ｐＡＭＧ２１−ヒトＭＫ６１　２１−１６０　Ｆｃ構築物を、３７３アミノ酸の長さでありそして以下のＮ末端およびＣ末端残基を有するように操作した：ＮＨ２−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−−−−−−−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＣＯＯＨ（配列番号２８）。５個のグリシン残基から構成されるリンカーを、ＭＫ６１タンパク質のＣ末端とヒトＩｇＧ１　ＦｃのＮ末端の間に挿入した。ＭＫ６１−Ｆｃ連結分の配列は以下であった：Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ（配列番号２９）。この構築物のＰＣＲ増幅を、２段階で行った。最初の工程では、遺伝子のＭＫ６１およびＦｃ部分を増幅した。オリゴ＃２６０９−８７（５’−ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＴＡＡ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＧＣＣ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＴＡＴ　ＴＧＣ　ＧＧＣ　ＣＧＣ−３’　配列番号３０）；および＃２６０９−９７（５’−ＡＣＡ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＡＧＴ　ＴＴＴ　ＧＴＣ　ＡＣＣ　ＡＣＣ　ＡＣＣ　ＡＣＣ　ＡＣＣ　ＡＴＴ　ＣＧＧ　ＣＣＡ　ＧＧＣ　ＣＴＧ　ＣＴＧ−３’　配列番号３１）を、ＭＫ６１部分を増幅するために使用した。オリゴ＃２６０９−９８（５’−ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＧＣＣ　ＴＧＧ　ＣＣＧ　ＡＡＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＧＧＴ　ＧＡＣ　ＡＡＡ　ＡＣＴ　ＣＡＣ　ＡＣＡ　ＴＧＴ−３’　配列番号３２）および＃２２９３−１０（５’−ＣＣＧ　ＣＧＧ　ＡＴＣ　ＣＴＣ　ＧＡＧ　ＴＴＡ　ＴＴＴ　ＡＣＣ　ＣＧＧ　ＡＧＡ　ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡＧ−３’　配列番号３３）を、ヒトＩｇＧ１　ｆｃ部分を増幅するために使用した。第２の工程では、第１回目の増幅による反応産物をゲル精製し、そして最終的なＭＫ６１：：ｆｃ構築物を作成するための鋳型として使用した。オリゴ＃２６０９−８７（配列番号３０）および＃２２９３−１０（配列番号３３）を、この構築物のＰＣＲ増幅に使用した。
【０３５１】
ＤＮＡ配列の確認後、形質転換したＥ．ｃｏｌｉを対数期中期まで３７℃で増殖させ、そして２５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度のホモセリンラクトン（ＨＳＬ）で処理して、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質の発現を誘導した。誘導後、細胞を、３７℃で数時間増殖させ、続いて、遠心分離によって回収し、そして−８０℃で凍結させた。トランスフェクトしたＥ．Ｃｏｌｉの増殖、ＭＫ６１−Ｆｃタンパク質の発現の誘導、およびＭＫ６１−Ｆｃを含有している封入体の単離を、本明細書中で参考として援用されている、１９９５年１２月２２日に提出された米国特許出願番号第０８／５７７，７８８号に記載されている手順に従って行った。
【０３５２】
Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現させたＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質の精製およびリフォールディングを、以下の方法を使用して達成した。ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質を可溶化させるために、細菌細胞をマイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）中で壊し、そして１２，０００ｇで１時間遠心分離した。得られた封入体を水で洗浄し、そして１２，０００ｇで１時間遠心分離した。次いで、ペレットを、５０ｍＭのＴｒｉｓ、８ＭのＧｕＨＣｌ、および７ｍＭのＤＴＴ（ｐＨ８．５）中で１時間可溶化し、そして１２，０００ｇで１時間遠心分離した。
【０３５３】
ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質をリフォールディングするために、上清を５０ｍＭのＴｒｉｓ、２Ｍの尿素、０．２Ｍのアルギニン（ｐＨ８．５）で１：２０に稀釈し、そしてＥｌｍａｎ試験で遊離のチオールについてネガティブになるまで４℃でインキュベートした（約４日間）。次いで、上清を２０倍に濃縮し、４倍容量の５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）で透析した。稀釈した上清を、２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）の１０倍の溶液で稀釈し、そしてｐＨを５．０に下げることによって沈殿させた。次いで、稀釈した溶液を５分間攪拌し、そして１２，０００ｇで３０分間遠心分離した。
【０３５４】
精製のために、上清をＳＰ高速カラム上に充填し、そして０〜６００ｍＭのＮａＣｌ勾配上でＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）の存在下で６０倍以上のカラム容量で実行した。融合タンパク質は、５００ｍＭのＮａＣｌの周辺で溶出された。プールした画分をｐＨ７．０に滴定し、１Ｍの硫酸アンモニウム（ＡＳ）濃度にし、そして１２，０００ｇで３０分間遠心分離した。次いで、上清をブチル高速カラム上に充填し、そして１ＭのＡＳから０ＭのＡＳの勾配上で、１０ｍＭのＮａＰｉ（ｐＨ７．０）の存在下で５０倍以上のカラム容量で実行した。この融合タンパク質は、およそ３０ｍＭのＡＳで溶出された。プールした画分を、ＰＢＳに対して透析した。
Ｂ．哺乳動物細胞培養物中でのＭＫ６１−Ｆｃのクローニング、発現、および精製：
ヒトＭＫ６１−Ｆｃのアミノ酸１から１５３をコードするｃＤＮＡフラグメントを、鋳型としてのｐｃｄｎａ３ｈｕＭＫ６１＃５、ならびにプライマー＃２６２３−８１（ＣＡＧ　ＣＣＣ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＴＡＧ　ＡＣＣ　ＡＣＣ　ＡＴＧ　ＧＧＧ　ＣＣＴ　ＧＧＡ　ＣＧＡ　ＴＧＣ；配列番号３４）および２６２３−８３（ＣＡＧ　ＧＴＣ　ＧＡＣ　ＡＧＧ　ＣＴＣ　ＡＧＧ　ＧＧＴ　ＣＣＴ；配列番号３５）を使用してＰＣＲによって増幅した。これらのプライマーに、それぞれ遺伝子の５’および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌ１部位を挿入した。ＰＣＲ産物を精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌ１で消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌ１で消化しそして脱リン酸化したｈｕＯＰＧ１９４　ＦｃΔＣベクター（第ＷＯ０１／１８２０３号および第ＥＰ　１１２７１１７号に記載されている）中に連結した。連結産物を、ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に形質転換し、そしてＬＢ＋アンピシリンプレート上にプレートした。
【０３５５】
形質転換したＤＨ５αコンピテント細胞の８個のコロニーを、ミニプレップ技術（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを単離するために増殖させた。単離したＤＮＡを、Ｎｏｔ１およびＰｖｕ１での消化によってスクリーニングした。５個のクローンが、予想された１５１２塩基対のフラグメントを生じた。ポジティブクローンのクローン１および７を、５００ｍｌの調製物中で増幅し、ＤＮＡを単離し、そして標準的な方法を使用して配列決定した。
【０３５６】
クローン７から単離したＤＮＡは、正確な配列であった。ＭＫ６１−Ｆｃのアミノ酸配列を、配列番号３６として図２４に示す。クローン７のＤＮＡ（１５μｇ）を、Ｐｖｕ１で直鎖状にし、そしてＡＭ−１／Ｄ細胞中にトランスフェクトした。ＡＭ−１／Ｄは、血清を含まない条件に適合させられた、ＤＨＦＲを欠失しているチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ　１９８０　ＰＮＡＳ　第７７巻　４２１６−４２２０）（米国特許第６，２１０，９２４号に記載されている）である。安定なクローンを、選択マーカーＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）に基づいて作成した。９個の安定なクローンを、発現分析のために拡大させた。ＭＫ６１−Ｆｃの発現を、抗ヒトＩｇＧ１　Ｆｃ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してウェスタンブロッティングによって決定した。高発現クローンを選択し、そして標準的な方法を使用してローラーボトル中での細胞の増殖によって拡大させた。
【０３５７】
ヒトＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質を精製するために、馴化ＣＨＯ−ＭＫ６１−Ｆｃ培地を、ＰＢＳ中で平衡化したプロテインＧカラム上に充填した。このカラムを２０倍のカラム容量のＰＢＳで洗浄し、そして融合タンパク質を、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ２．６）で溶出し、そしてプールした画分を１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）で中和し、そしてＰＢＳ中に透析した。
【０３５８】
Ｃ．マウスＭＫ６１／ＦｃΔＣ融合タンパク質の産生：
タンパク質の細胞外ドメインをコードするマウスＭＫ６１　ｃＤＮＡを、全長のｍｕＭＫ６１　ｃＤＮＡ（配列番号１３）から、プライマー＃２６６４−８３（ＣＡＧ　ＣＣＣ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＴＡＧ　ＡＣＣ　ＡＣＣ　ＡＴＧ　ＧＧＧ　ＣＣＣ　ＡＧＣ　ＴＧＧ　ＣＴＴ；配列番号３７）および＃２６６４−８４（ＣＡＧ　ＧＴＣ　ＧＡＣ　ＣＴＣ　ＡＴＴ　ＣＴＴ　ＧＧＴ　ＴＧＴ；配列番号３８）を使用して増幅した。これらのプライマーには、それぞれ、遺伝子の５’および３’末端にＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌ１部位を挿入した。ＰＣＲ産物を精製し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌ１で消化し、そしてＨｉｎｄＩＩＩおよびＳａｌ１で消化しそして脱リン酸化したｈｕＯＰＧ１９４　ＦｃΔＣベクター中に連結した。連結産物を、ＤＨ５αコンピテント細胞中に形質転換し、そしてＬＢ＋アンピシリンプレート上にプレートした。
【０３５９】
形質転換したＤＨ５αコンピテント細胞の１６個のコロニーを、ミニプレップ技術によってそれらのＤＮＡを単離するために増殖させた。単離したＤＮＡを、ＭＳＣ１（ＭＫ６１に特有の酵素）およびＰｖｕ１（ｐＤＳＲαベクターに特有の酵素）での消化によってスクリーニングした。１５個のクローンが、予想された１５２３塩基対のフラグメントを生じた。これらのポジティブクローンのクローン２および４を、５００ｍｌのプレップ中で増幅し；ＤＮＡを単離し、そして標準的な方法を使用して配列決定した。
【０３６０】
クローン２および４の両方から単離したＤＮＡは、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質の発現のための正確な配列を有した（図２５；配列番号３９）。クローン２のＤＮＡ（１５μｇ）をＰｖｕ１で直鎖状にし、そしてチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株から誘導されたＡＭ−１／Ｄ細胞中にトランスフェクトした。安定なクローンを、選択マーカーＤＨＦＲに基づいて作成した。９個のクローンを、発現分析のために拡大させた。ＭＫ６１−Ｆｃの発現を、抗ヒト　Ｆｃ抗体を使用してウェスタンブロッティングによって決定した。
【０３６１】
（実施例６）
（ＦＡＣＳ分析によって決定したＭＫ６１−Ｆｃの結合）
ＭＫ６１−Ｆｃタンパク質の結合を、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）によってヒト細胞上で検出した。Ｒａｊｉ細胞、Ｍｏｌｔ−４細胞、Ｕ９３７細胞、Ｋ５６２細胞、Ａ２０細胞、およびＪｕｒｋａｔ細胞を、ＡＴＣＣから入手した。細胞を回収し、そして結合緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、２％のヤギ血清、５％のウサギ血清、１μｇ／ｍｌの抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２モノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を含有しているＤＭＥＭ培地）中の１μｇ／ｍｌのヒトＭＫ６１−Ｆｃとともに室温で３０分間インキュベートし、続いて、２％のＦＢＳを含有しているＰＢＳで３回洗浄した。ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質の細胞表面への結合を、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ　Ｆｃ二次抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して免疫蛍光染色によって評価した。蛍光を、ＦＡＣＳｔａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して検出した。
【０３６２】
ＭＫ６１−Ｆｃの結合を、Ｕ９３７細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞上で検出した（図１６を参照のこと）。ＭＫ６１−Ｆｃの結合を増強させるために、Ｕ９３７細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞を、分析の前に、ヒトインターフェロンγ（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間処理した。インターフェロンγでの事前処理によって、ＭＫ６１−Ｆｃの結合を増強させた（図１７を参照のこと）。ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質のこれらの細胞への結合は、ＭＫ６１リガンドが、単球（ｍｏｎｏｚｙｔｉｃ）（Ｕ９３７）およびＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）の細胞表面上に存在することを示す。
【０３６３】
免疫細胞の表面上の未知のＭＫ６１リガンドの存在は、ＭＫ６１（例えば、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質）のリガンドに結合する可溶性の形態が、ＭＫ６１レセプターのシグナル伝達経路を活性化する「ポジティブな試薬」として作用し得ることを示唆する。このことは、免疫細胞の表面上に存在する未だ未知のＭＫ６１リガンドに対するポジティブな結合試薬によって達成され得、そしてそれによってリガンドを通じる逆のシグナル伝達を誘発する。このようなシグナル伝達は、リンパ球の拡大および免疫グロブリンの産生を生じる免疫系を調節する事象である。
【０３６４】
（実施例７）
（初代脾臓細胞中での、ＭＫ６１−Ｆｃによって阻害されるイムノグロブリンの産生）
脾臓細胞の全てを、リンパ球分離培地（ＩＣＮ，Ａｕｒｏｒａ，ＯＨ）の遠心分離を使用してマウスの脾臓から単離した。脾臓細胞を、１５０ｎｇ／ｍｌのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）とともに７２〜９６時間の間、マウスまたはヒトのΔＣ　ＭＫ６１−ＦｃΔ融合タンパク質の存在下で、インビトロで培養した。続いて、処理した細胞に由来する培養上清を、種々のＩｇアイソフォームの産生を分析するために４日後に除去した（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，ＣＡ）。
【０３６５】
マウスおよびヒトの両方のＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質での処理は、マウスの脾臓細胞培養物中でのＩｇＡおよびＩｇＧの産生において用量依存性の減少を生じた（図１８を参照のこと）。最大の阻害は、ＭＫ６１−Ｆｃを１００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用した場合に達成された。このデータは、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質が、免疫システムの強力なインヒビターであることを示す。このデータはまた、ＭＫ６１レセプターが、可溶性のＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質のような「ネガティブな調節因子」によってアンタゴナイズされ得る免疫システムのシグナル伝達経路を活性化することを示唆する。
【０３６６】
免疫グロブリンの産生の阻害がＢ細胞の増殖のＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質によって誘導される阻害に起因するかどうかを決定するために、Ｂ細胞の増殖に対するＭＫ６１−Ｆｃの影響を測定した。マウスＢ細胞を、マウスＢ細胞回収カラム（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｈｏｒｎｂｙ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を使用してＣ５７Ｂ／６マウスの脾臓からネガティブ選択によって精製した。この方法によって単離された細胞は、ＦＡＣＳ分析によって決定すると、Ｂ２２０染色については９０％以上がポジティブであった。１×１０６個／ｍｌを、培地（ＲＰＭＩ−１６４０、５％のＦＢＳ、５×１０−５Ｍの２ＭＥ、２μｇ／ｍｌののアフィニティー精製したヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＭ）中の９６ウェル平底組織培養プレート中に播種した。次いで、Ｂ細胞を、漸増量のＣＤ４０Ｌ、ＡＰＲＩＬ、またはＴＡＬＬ−１の存在下またはその非存在下で、１００ｎｇ／ｍｌのヒトまたはマウスのＭＫ６１−Ｆｃタンパク質とともに７２時間インキュベートした。ＤＮＡ合成を、［３Ｈ］チミジンの取り込みの測定によって定量した。０．５μＣｉの［３Ｈ］チミジンを添加し、１８時間後に細胞を回収し、そして［３Ｈ］チミジンの取り込みを計数した。ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質での処理は、このアッセイではＢ細胞の増殖には影響を与えなかった。
【０３６７】
（実施例８）
（インビボでのＢ細胞応答に対するＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質での処理の影響）
ＭＫ６１ポリペプチドの機能的な重要性を特徴付けるために、融合タンパク質ＭＫ６１−ＦｃΔＣをマウスを処置するために使用した。
【０３６８】
最初に、Ｂａｌｂ／ｃマウス（８〜１２週齢の雌、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、０日目に開始して７日間連続して１日に１回、５ｍｇ／ＫｇのＭＫ６１−Ｆｃで腹膜内で処置した。コントロールのマウスを、上記と同様に、５ｍｇ／ＫｇのＩｇＧ１　Ｆｃまたは生理食塩水で処置した。マウスを、ＭＫ６１−Ｆｃの最後の注射の１日後（すなわち、７日目）に屠殺した、脾臓を組織学的試験、ＦＡＣＳ分析、および血清Ｉｇの測定のために切り出した。
【０３６９】
Ａ．組織学的分析：
組織学的試験のために、脾臓をホルマリン中に固定し、標準的な手順に従ってパラフィン中に包埋し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質での処置は、コントロールのＦｃタンパク質または生理食塩水と比較して、脾臓の重量を７５％増大させた（図１９、上段のパネル）。脾臓の重量の増大は、脾臓のリンパ球の数の匹敵する増大を反映する（図１９、下段のパネル）。脾臓細胞の総数を、Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ　Ｈ．Ｉ．Ｅ．Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂａｙｅｒ　Ｃｏ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｗｏｏｄ、ＭＤ）を使用して、製造業者によって推奨される標準的な手順に従って決定した。ＭＫ６１−Ｆｃで処置したマウス由来の脾臓の組織学的試験は、以下によって特徴付けられるリンパ球の過形成の存在を示した：（１）中程度から十分に発達した卵胞胚芽中心の数の増大、ならびに（２）白色パルプと赤色パルプとの間の界面での局所的な堆積に通常局在する血漿細胞の数の増大（図２０を参照のこと）。リンパ球の過形成は、Ｆｃタンパク質または生理食塩水で処置したコントロールマウス中では観察されなかった。
【０３７０】
Ｂ．ＦＡＣＳ分析
ＦＡＣＳ分析のために、脾臓を生理食塩水中に回収し、そして細胞懸濁物を生じるようにホモジナイズした。全リンパ球数を、細胞計数器を用いて得、一方で、リンパ球のサブセットの割合を、免疫蛍光二重染色およびフローサイトメトリーによって導いた。ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質は、コントロールのＦｃまたは生理食塩水と比較して、脾臓のリンパ球の総数を９０％増大させた（図２１、上段のパネル）。ＭＫ６１−Ｆｃは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および非Ｔ細胞、非Ｂ細胞を指数的に増加させた。実際、ＭＫ６１−Ｆｃは、ＣＤ３＋（Ｔ細胞）、ＣＤ３−／Ｂ２２０＋（Ｂ細胞）、およびＣＤ３−／Ｂ２２０−（非Ｔ細胞および非Ｂ細胞）細胞の絶対数を増加させたが、これらの細胞の割合には有意な影響を与えなかった（図２１、下段のパネル）。ＭＫ６１−Ｆｃは、Ｂ細胞のサブセットの割合を変化させた。実際、ＭＫ６１−Ｆｃは、ＣＤ１９＋／ＣＤ５＋（Ｂ）細胞の割合を減少させたが、それらの絶対数はなお増大した（図２１）。
【０３７１】
Ｃ．血清イムノグロブリンの測定：
血清免疫グロブリンを、以前に記載されたサンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｇｕｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：５５７８−８４，２００１）によって測定した。コントロールのＦｃと比較して、ＭＫ６１−Ｆｃは、全ＩｇＧ、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２ｂの血清濃度を増大させたが、他のＩｇ型およびサブタイプの濃度は有意には変化させなかった（図２２）。ＩｇＧ１の増大は、全てのＩｇＧサブタイプの中で最も顕著であった（約６倍）。
【０３７２】
（実施例８）
（インビボでのＴ細胞応答に対するＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質での処置のさらなる影響）
別のインビボでの実験では、マウスを、マウスのＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質またはＦＣタンパク質コントロールの最初の注射の前に、０日目に、フロイトの完全なアジュバント（ＣＦＡ）中のＴ細胞非依存性抗原Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ（１１５μｇ、Ｍｅｒｃｋ、Ｗｅｓｔ　Ｐｏｉｎｔ，ＰＡ）またはＴ細胞依存性抗原キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で免疫した。事前処置後、動物を、実施例７に上記に記載したように処置した。マウスを、抗原特異的抗体を測定するための血清を得るために、７日目および１４日目に放血させた。
【０３７３】
抗ＫＬＨおよび抗Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ　ＩｇＧおよびＩｇＭを、以前に記載されているようなＥＬＩＳＡ（Ｙｕら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：２５２−２５６，２０００）によって血清中で測定した。簡潔には、抗ＫＬＨの測定のために、プレートを、ＰＢＳ中のＫＬＨでコーティングし、ブロックし、そして種々の稀釈の標準サンプルおよび試験サンプルを添加した。捕捉された抗ＫＬＨ　ＩｇＧまたはＩｇＭを、抗ＩｇＧまたは抗ＩｇＭビオチニル化抗体およびニュートラアビジン結合ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）を使用して明らかにした。抗Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ　ＩｇＭの測定のために、プレートを、ポリ−Ｌ−リジンを使用してＰｎｅｕｍｏｖａｘでコーティングし、ブロックし、そして種々の稀釈の標準および試験サンプルを添加した。捕捉された抗Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ　ＩｇＭを、抗ＩｇＭビオチニル化抗体およびニュートラアビジン結合ＨＲＰを使用して明らかにした。
【０３７４】
コントロールのＦｃタンパク質と比較して、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質は、抗Ｐｎｅｕｍｏｖａｘ抗体（ＩｇＭ；データは示さない）の血清濃度を変化させなかった；しかし、特定のＩｇクラスおよびサブクラスの抗ＫＬＨ抗体の血清濃度を変化させた（図２３を参照のこと）。免疫化の７日目および／または１４日目に、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質は、抗ＫＬＨ　ＩｇＧ、全てのサブクラス、および抗ＩｇＥの血清濃度を増大させた（図２３）。
【０３７５】
実施例８および９のインビボでの研究は、免疫性を適合させるための特定の参照を用いて、ＭＫ６１ポリペプチドが免疫性を調節することを示す。分子の推定されるリガンドに結合する可溶性形態（ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質）を使用する、結合ＭＫ６１とその未だ未知のリガンドとの間での相互作用の破壊は、リンパ球の拡大とＩｇの産生を生じる。このことは、「ネガティブ試薬」（例えば、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質、同様のＭＫ６１由来の分子、またはＭＫ６１もしくはそのリガンドを指向するアンタゴニスト抗体）を使用するこの相互作用の破壊が、免疫刺激を導き得ることを示す。一方、「ポジティブな試薬」（例えば、ＭＫ６１リガンドのＭＫ６１に結合する可溶性形態、ＭＫ６１レセプターを活性化するＭＫ６１または他の分子に対するアゴニスト抗体）を使用するこの相互作用の人工的な作成は、免疫抑制を導き得る。
【０３７６】
以下の図面においては、シグナルペプチドをコードするこれらのヌクレオチドの５’ヌクレオチドが、５’−非翻訳（５’−ＵＴＲ）隣接配列の一部であることが理解される。さらに、終止コドンの３’ヌクレオチドは、３’−非翻訳（３’−ＵＴＲ）配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ヒトＭＫ６１Ｔ１（ｈＭＫ６１Ｔ１）をコードする核酸配列（配列番号１）を示す。ヒトｈＭＫ６１Ｔ１のアミノ酸配列（配列番号２）もまた示される。ｈＭＫ６１Ｔ１は細胞表面レセプターであり、シグナルペプチド（ＳＰ）、１つのＴＮＦｒ型のシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）、スペーサー、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、および種間で高度に保存されている２つの領域を有する長い細胞内ドメインを含む。推定のシグナルペプチドをこの図中に下線で示し、そして配列番号１の終止コドンには二重下線を付ける。
【図２】
図２は、可溶性のレセプターと考えられるヒトＭＫ６１Ｔ２（ｈＭＫ６１Ｔ２）をコードする核酸配列（配列番号３）を示す。ヒトｈＭＫ６１Ｔ２のアミノ酸もまた示される（配列番号４）。推定されるシグナルペプチドは、この図中に下線で示され、そして配列番号３の終止コドンには、二重下線を付ける。
【図３】
図３は、ヒトＭＫ６１Ｔ３（ｈＭＫ６１Ｔ３）をコードする核酸配列（配列番号５）を示す。ヒトｈＭＫ６１Ｔ３のアミノ酸もまた示される（配列番号６）。ｈＭＫ６１Ｔ３は、可溶性のレセプターと考えられ、シグナルペプチドおよびＴＮＦｒ型ＣＲＤを有している。推定されるシグナルペプチドは、この図中に下線で示され、そして配列番号５の終止コドンには、二重下線を付ける。
【図４】
図４は、可溶性のレセプターと考えられるヒトＭＫ６１Ｔ４（ｈＭＫ６１Ｔ４）をコードする核酸配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。推定されるシグナルペプチドは、この図中に下線で示され、そして配列番号７の終止コドンには、二重下線を付ける。
【図５】
図５は、可溶性のレセプターと考えられるヒトＭＫ６１Ｔ５（ｈＭＫ６１Ｔ５）をコードする核酸配列（配列番号９）およびアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。推定されるシグナルペプチドは、この図中に下線で示され、そして配列番号９の終止コドンには、二重下線を付ける。
【図６】
図６は、可溶性のレセプターと考えられるヒトＭＫ６１Ｔ６（ｈＭＫ６１Ｔ６）をコードする核酸配列（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。推定されるシグナルペプチドは、この図中に下線で示され、そして配列番号１１の終止コドンには、二重下線を付ける。
【図７】
図７は、「Ｓｍｉｌ２−０００５１−Ｆ３」または「Ｓｍｉｌ２−０００５１」とも呼ばれる、マウスＭＫ６１（ｍＭＫ６１）をコードする核酸配列（配列番号１３）およびアミノ酸配列（配列番号１４）を示す。この図中で、推定されるシグナルペプチドは下線で示され、そして配列番号１３の終止コドンには、二重下線を付ける。
【図８】
図８は、マウスｍＭＫ６１−Ｆｃ融合ポリペプチド（ｍＭＫ６１−Ｆｃ）をコードする核酸配列（配列番号１５）およびアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。この図中で、推定されるシグナルペプチドは下線で示され、そして配列のＦｃ部分には二重下線を付け、ＭＫ６１のＦｃへの連結のためのＮｏｔＩ制限部位は太字であり、そしてＫｏｚａｋコンセンサス配列（翻訳されない）は斜字である。
【図９】
図９は、ｍＭＫ６１　Ｆｃ融合タンパク質（ｍＭＫ６１−Ｆｃ）が哺乳動物細胞から分泌され得ることを示すウェスタンブロットを示す。
【図１０】
図１０は、ＯＰＧレセプター、Ｍｒａｎｋ（配列番号１７）、既知のＴＮＦｒファミリーのメンバーとの、ｍＭＫ６１（配列番号１４）のアミノ酸配列の比較を示す。Ｍｒａｎｋは、マウスＯＰＧ（オステオプロテゲリン）レセプター前駆体である。
【図１１】
図１１は、Ｆａｓリガンドレセプター（ｍｆａｓ）（配列番号１８）とのｍＭＫ６１（配列番号１４）のアミノ酸配列の比較を示す。ｍｆａｓは、アポトーシスを媒介する表面抗原レセプター前駆体である。
【図１２】
図１２は、既知のマウスのリンホトキシン−βレセプター（Ｔｎｆｒｃ）（配列番号１９）とのｍＭＫ６１（配列番号１４）のアミノ酸配列の比較を示す。Ｔｎｆｒｃは、リンホトキシン−βレセプター前駆体であり、そして「腫瘍壊死因子レセプター２関連タンパク質」または「腫瘍壊死因子−ｃレセプター前駆体」とも呼ばれる。
【図１３】
図１３は、ランダムプライムされたヒトＭＫ６１放射活性プローブでプローブした、他組織ノーザンブロットを示す。これらのブロットは、ヒトＭＫ６１　ｍＲＮＡがヒトリンパ組織中で発現されることを示す。
【図１４】
図１４は、ランダムプライムされたヒトＭＫ６１放射活性プローブでプローブした、他組織ノーザンブロットを示す。これらのブロットは、ヒトＭＫ６１　ｍＲＮＡがヒトリンパ組織中で発現されることを示す。
【図１５】
図１５は、定量ＰＣＲによって測定した、種々のヒト組織および細胞株中でのヒトＭＫ６１　ｍＲＮＡの発現を比較するヒストグラムを示す。
【図１６】
図１６は、ＦＡＣＳ分析によって測定した、ヒト細胞の表面上のＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質の結合を定量するヒストグラムを示す。ヒストグラムは、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質が、Ｕ９３７およびＪｕｒｋａｔ細胞の細胞表面に結合することを示す。
【図１７】
図１７は、インターフェロンγでの処理後の、ＪｕｒｋａｔおよびＵ９３７細胞の細胞表面上のＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質の結合の増大を示すヒストグラムを示す。
【図１８】
図１８は、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質での処理後の、マウスの脾臓細胞培養物中のＩｇＧ（上段のパネル）およびＩｇＡ（下段のパネル）の産生を定量するヒストグラムを示す。
【図１９】
図１９は、マウスの脾臓の重量（上段のパネル）および脾臓リンパ球（下段のパネル）に対するＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質の影響を定量するヒストグラムを示す。これらのヒストグラムは、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質での処理が、脾臓の重量および脾臓リンパ球数を増大させることを示す。
【図２０】
図２０は、ＭＫ６１−Ｆｃで処理したマウスの脾臓の組織学的分析を示す。組織学的分析は、リンパ球の過形成の存在を示した。
【図２１】
図２１は、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質で処置したマウスにおける、脾臓Ｂ細胞およびＴ細胞の数を定量するヒストグラムを示す。
【図２２】
図２２は、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質で処置したマウスにおける、血漿イムノグロブリンレベルを定量するヒストグラムを示す。
【図２３】
図２３は、ＭＫ６１−Ｆｃ融合タンパク質で処置したマウスにおける、抗−ＫＬＨ特異的抗体の作成を定量するヒストグラムを示す。
【図２４】
図２４は、ヒトＭＫ６１−ΔＦｃ　ＣＨＯのアミノ酸配列を示す（配列番号３６）。
【図２５】
図２５は、ヒトＭＫ６１−Ｆｃ　ＣＨＯのアミノ酸配列を示す（配列番号３９）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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