(57)【要約】本発明は、トランスジェニックマウス、ならびに遺伝子機能の特徴付けに関連する組成物および方法に関する。詳細には、本発明は、遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを提供し、これは、疾患のモデルならびに遺伝子の発現および遺伝子の機能を調節する因子を同定するためのモデルとして、ならびに種々の疾患状態および疾患条件の潜在的な処置として有用である。本発明のトランスジェニック細胞は、相同組換えを行い得る任意の細胞からなる。好ましくは、本発明の細胞は、幹細胞であり、そしてより好ましくは、胚性幹（ＥＳ）細胞、そして最も好ましくは、マウスＥＳ細胞である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
（ａ）標的遺伝子に相同な第１のポリヌクレオチド配列であって、ここで、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択される、第１のポリヌクレオチド配列；
（ｂ）該標的遺伝子に相同な第２のポリヌクレオチド配列；および
（ｃ）選択マーカー、
を包む、ターゲッティング構築物。
【請求項２】
前記ターゲッティング構築物がスクリーニングマーカーをさらに含む、請求項１に記載のターゲッティング構築物。
【請求項３】
標的遺伝子に対するターゲッティング構築物を生成する方法であって、ここで、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択され、該方法は以下：
（ａ）標的遺伝子に相同な第１のポリヌクレオチド配列を獲得する工程；
（ｂ）該標的遺伝子に相同な第２のポリヌクレオチド配列を獲得する工程；
（ｃ）選択マーカーを含むベクターを提供する工程；および
（ｄ）該ベクターに該第１および該第２の配列を挿入して、該ターゲッティング構築物を生成する工程、
を包含する、方法。
【請求項４】
標的遺伝子に対するターゲッティング構築物を生成する方法であって、ここで、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択され、該方法は、以下：
（ａ）該標的遺伝子に相同なポリヌクレオチド配列を提供する工程；
（ｂ）該ポリヌクレオチド配列の２つの異なるフラグメントを生成する工程；
（ｃ）選択マーカーをコードする遺伝子を有するベクターを提供する工程；および
（ｄ）該２つの異なるフラグメントを該ベクターに挿入して、該ターゲッティング構築物を形成する工程、
を包含する、方法。
【請求項５】
標的遺伝子における破壊を含む細胞であって、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択される、細胞。
【請求項６】
前記細胞がマウス細胞である、請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記マウス細胞が胚性幹細胞である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
標的遺伝子における破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物であって、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択される、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９】
請求項８に記載の非ヒトトランスジェニック動物に由来する、細胞。
【請求項１０】
標的遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１に記載のターゲッティング構築物を細胞に導入する工程；
（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）得られた該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスは、キメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）該キメラマウスを飼育して、該トランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
標的遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、ここで、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択され、該方法は、以下：
（ａ）該標的遺伝子における破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程；
（ｂ）該非ヒトトランスジェニック動物に因子を投与する工程；および
（ｃ）該非ヒトトランスジェニック動物における該破壊された標的遺伝子の発現が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２】
標的遺伝子の機能を調節する因子を同定する方法であって、ここで、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択され、該方法は、以下：
（ａ）該標的遺伝子における破壊を含む非ヒトトランスジェニック動物を提供する工程；
（ｂ）該非ヒトトランスジェニック動物に因子を投与する工程；および
（ｃ）該非ヒトトランスジェニック動物における該破壊された標的遺伝子の機能が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
標的遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、ここで、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択され、該方法は、以下：
（ａ）標的遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞と因子とを接触させる工程；および
（ｃ）該標的遺伝子の発現が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４】
標的遺伝子の機能を調節する因子を同定する方法であって、ここで、該標的遺伝子が、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子、またはスルホトランスフェラーゼ遺伝子からなる群より選択され、該方法は、以下：
（ａ）標的遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞と因子とを接触させる工程；および
（ｃ）該標的遺伝子の機能が調節されているか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５】
前記細胞が、請求項８に記載の非ヒトトランスジェニック動物に由来する、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１１、請求項１２、請求項１３、または請求項１４に記載の方法により同定される因子。
【請求項１７】
網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスが眼の異常を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項１８】
前記眼の異常が網膜の異常である、請求項１７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１９】
前記網膜の異常が網膜異形成症により特徴付けられる、請求項１８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２０】
前記トランスジェニックマウスが、以下の特徴：網膜におけるロゼット形成、網膜ひだ、網膜の外核層の断片菲薄化もしくは欠損、または網膜の欠損、の少なくとも１つを示す、請求項１９に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２１】
前記トランスジェニックマウスが、網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊に対してヘテロ接合性である、請求項１７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２２】
前記トランスジェニックマウスが、網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊に対してホモ接合性である、請求項１７に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項２３】
網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、ここで、該トランスジェニックマウスは眼の異常を示し、該方法は、以下：
（ａ）網膜特異的核レセプター遺伝子ターゲッティング構築物を細胞に導入する工程；
（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）得られる該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスはキメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）該キメラマウスを飼育して、網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含む該トランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスは、以下の表現型：胃腸管の異常；皮膚の異常；精巣または精巣上体の異常；または血液における異常、の少なくとも１つを示す、トランスジェニックマウス。
【請求項２５】
請求項１７、請求項２３、または請求項２４に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞であって、該細胞が、網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含む、細胞。
【請求項２６】
眼の異常を改善する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスの該眼の異常を改善するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記眼の異常が網膜の異常である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記網膜の異常が網膜異形成症により特徴付けられる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、ここで、前記トランスジェニックマウスが、以下の特徴：網膜におけるロゼット形成、網膜ひだ、網膜の外核層の断片菲薄化もしくは欠損、または網膜の欠損、の少なくとも１つを示す、方法。
【請求項３０】
網膜特異的核レセプター遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスにおける網膜特異的核レセプター遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３１】
前記表現型が、以下：眼の異常；胃腸管の異常；皮膚の異常；精巣または精巣上体の異常；あるいは血液における異常、のいずれか１つを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該表現型を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３３】
前記表現型が、以下：眼の異常；胃腸管の異常；皮膚の異常；精巣または精巣上体の異常；あるいは血液における異常、のいずれか１つを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
網膜特異的核レセプター遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程；（ｂ）該細胞と因子とを接触させる工程；および
（ｃ）該因子が網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する否かを決定するであって、ここで、該因子が網膜特異的核レセプター遺伝子の機能を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、ここで、前記表現型が以下：眼の異常；胃腸管の異常；皮膚の異常；精巣または精巣上体の異常；あるいは血液における異常、のいずれか１つを含む、方法。
【請求項３６】
網膜特異的核レセプター遺伝子の機能を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程；（ｂ）該細胞と該因子を接触させる工程；および
（ｂ）該因子が網膜特異的核レセプター遺伝子の機能を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項３７】
前記表現型が、以下：眼の異常；胃腸管の異常；皮膚の異常；精巣または精巣上体の異常；あるいは血液における異常、のいずれか１つを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項２６、請求項３０、請求項３２、請求項３４、または請求項３６に記載の方法により同定される、因子。
【請求項３９】
リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが細胞浸潤を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項４０】
前記細胞浸潤がリンパ球からなる、請求項３９に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４１】
前記細胞浸潤が、以下：肺、膵臓、胃、または肝臓、の器官のいずれか１つにおいて生じる、請求項４０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４２】
前記トランスジェニックマウスが、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊に対してヘテロ接合性である、請求項３９に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４３】
前記トランスジェニックマウスが、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊に対してホモ接合性である、請求項３９に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４４】
リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該トランスジェニックマウスは細胞浸潤を示し、該方法は、以下：
（ａ）リンパ系特異的ＧＰＣＲターゲッティング構築物を細胞に導入する工程；（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）得られる該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスはキメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）該キメラマウスを飼育して、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。
【請求項４５】
リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスが、以下：肺における細気管支周囲の細胞浸潤；膵臓における細気管支周囲の細胞浸潤；胃の深粘膜、粘膜下組織、または筋層における細胞浸潤；またあるいは肝臓の門脈三管における細胞浸潤、の表現型の少なくとも１つを示す、トランスジェニックマウス。
【請求項４６】
請求項３９、請求項４４、または請求項４５に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞であって、ここで、該細胞は、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊を含む、細胞。
【請求項４７】
細胞浸潤を改善する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスの該細胞浸潤を改善するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４８】
前記細胞浸潤がリンパ球からなる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞浸潤が、以下：肺、膵臓、胃、または肝臓、の器官のいずれか１つにおいて生じる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスにおけるリンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項５１】
前記表現型が、以下：肺、膵臓、胃、または肝臓、の器官のいずれか１つにおける細胞浸潤を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞浸潤がリンパ球からなる、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程；（ｂ）該細胞と因子とを接触させる工程；および
（ｃ）該因子がリンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項５４】
前記表現型が、以下：肺、膵臓、胃、または肝臓、の器官のいずれか１つにおける細胞浸潤を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記細胞浸潤がリンパ球からなる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子の機能を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程；（ｂ）該細胞と因子とを接触させる工程；および
（ｃ）該因子がリンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子の機能を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項５７】
前記表現型が、以下：肺、膵臓、胃、または肝臓、の器官のいずれか１つにおける細胞浸潤を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該表現型を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５９】
前記表現型が、以下：肺、膵臓、胃、または肝臓、の器官のいずれか１つにおける細胞浸潤を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
請求項４７、請求項５０、請求項５３、請求項５６、または請求項５８に記載の方法により同定される、因子。
【請求項６１】
メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが機能低下の挙動を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項６２】
前記トランスジェニックマウスが、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊に対してヘテロ接合性である、請求項６１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６３】
前記トランスジェニックマウスが、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊に対してホモ接合性である、請求項６１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項６４】
メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該トランスジェニックマウスは機能低下の挙動を示し、該方法は、以下：
（ａ）メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子ターゲッティング構築物を細胞に導入する工程；
（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）得られる該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスはキメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）網膜特異的核レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製するために該キメラマウスを飼育する工程、
を包含する、方法。
【請求項６５】
請求項６１または請求項６４に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞であって、ここで、該細胞は、メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊を含む、細胞。
【請求項６６】
機能低下の挙動を改善する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスの該機能低下の挙動を改善するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６７】
メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスにおけるメラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、該トランスジェニックマウスの機能低下の挙動に対する効果を有する、工程、
を包含する、方法。
【請求項６８】
メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊に関連する機能低下を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）メラニン形成細胞刺激ホルモンセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスの機能低下の挙動を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６９】
請求項６６、請求項６７、または請求項６８に記載の方法により同定される、因子。
【請求項７０】
マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが肺の異常または増加した白血球細胞数を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項７１】
前記肺の異常が肺の病変を含む、請求項７０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項７２】
前記肺の病変が肺炎と相反しない、請求項７１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項７３】
前記トランスジェニックマウスが、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊に対してヘテロ接合性である、請求項７０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項７４】
前記トランスジェニックマウスが、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊に対してホモ接合性である、請求項７０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項７５】
マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該トランスジェニックマウスは肺の異常または増加した白血球細胞数を示し、該方法は、以下：
（ａ）マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子ターゲッティング構築物を細胞に導入する工程；
（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）得られる該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスはキメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）該キメラマウスを飼育して、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。
【請求項７６】
請求項７０または請求項７５に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞であって、ここで、該細胞は、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含む、細胞。
【請求項７７】
肺の異常を改善する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスの肺の異常を改善するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項７８】
前記肺の異常が肺の病変を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記肺の病変が肺炎と相反しない、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
白血球細胞数を減少させる因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスの白血球細胞数を減少させる否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項８１】
マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスにおけるマグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項８２】
前記表現型が肺の異常または増加した白血球細胞数を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記肺の異常が肺の病変を含む、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記肺の病変が肺炎と相反しない、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該表現型を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項８６】
前記表現型が肺の異常または増加した白血球細胞数を含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記肺の異常が肺の病変を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記肺の病変が肺炎と相反しない、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞と因子とを接触させる工程；および
（ｃ）該因子がマグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項９０】
前記表現型が肺の異常または増加した白血球細胞数を含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記肺の異常が肺の病変を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記肺の病変が肺炎と相反しない、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子の機能を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞と因子とを接触させる工程；および
（ｃ）該因子がマグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子の機能を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項９４】
前記表現型が肺の異常または増加した白血球細胞数を含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記肺の異常が肺の病変を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記肺の病変が肺炎と相反しない、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
請求項７７、請求項８０、請求項８１、請求項８５、請求項８９、または請求項９３に記載の方法により同定される、因子。
【請求項９８】
ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが眼の異常を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項９９】
前記眼の異常が網膜の異常である、請求項９８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１００】
前記網膜の異常が、網膜変性または網膜異形成症により特徴付けられる、請求項９９に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１０１】
前記トランスジェニックマウスが光レセプター層の非存在を示す、請求項１００に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１０２】
前記眼の異常が視覚の問題または失明と相反しない、請求項９８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１０３】
前記網膜の異常が色素性網膜炎と相反しない、請求項９９に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１０４】
前記眼の異常が以下：該眼の内核層の菲薄化または空胞化；該眼の内網状層の菲薄化；神経節細胞核の喪失；神経線維層の神経膠症；または網膜脈管構造の減衰、の少なくとも１つを含む、請求項９８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１０５】
前記トランスジェニックマウスが、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に対してヘテロ接合性である、請求項９８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１０６】
前記トランスジェニックマウスが、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に対してホモ接合性である、請求項９８に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１０７】
ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該トランスジェニックマウスは眼の異常を示し、該方法は、以下：
（ａ）ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子ターゲッティング構築物を細胞に導入する工程；
（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）得られる該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスはキメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）該キメラマウスを飼育して、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。
【請求項１０８】
ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスが以下の表現型：大動脈の異常；腎臓の異常；肝臓の異常；リンパ節の異常；皮膚の異常；増加した体重および器官重量；あるいは上昇したレベルのＡＬＴ、リン、カリウム、またはビリルビン、の少なくとも１つを示す、トランスジェニックマウス。
【請求項１０９】
請求項９８、請求項１０４または請求項１０８に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞であって、ここで、該細胞は、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含む、細胞。
【請求項１１０】
眼の異常を改善する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスの眼の異常を改善するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１１】
前記眼の異常が網膜の異常を含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
前記網膜の異常が網膜退化または網膜異形成症により特徴付けられる、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記トランスジェニックマウスが光レセプター層の非存在を示す、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１４】
前記眼の異常が以下：該眼の内核層の菲薄化または空胞化；該眼の内網状層の菲薄化；神経節細胞核の喪失；神経線維層の神経膠症；または眼の網膜脈管構造の減衰、の少なくとも１つを含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１５】
ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスにおけるｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１１６】
前記表現型が以下：眼の異常；大動脈の異常；腎臓の異常；肝臓の異常；リンパ節の異常；皮膚の異常；増加した体重または器官重量；あるいは上昇したレベルのＡＬＴ、リン、カリウム、またはビリルビン、のいずれか１つを含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該表現型を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１８】
前記表現型が以下：眼の異常；大動脈の異常；腎臓の異常；肝臓の異常；リンパ節の異常；皮膚の異常；増加した体重または器官重量；あるいは上昇したレベルのＡＬＴ、リン、カリウム、またはビリルビン、のいずれか１つを含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞と因子とを接触させる工程；および
（ｃ）該因子がｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１２０】
前記表現型が以下：眼の異常；大動脈の異常；腎臓の異常；肝臓の異常；リンパ節の異常；皮膚の異常；増加した体重または器官重量；あるいは上昇したレベルのＡＬＴ、リン、カリウム、またはビリルビン、のいずれか１つを含む、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子の機能を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞と因子とを接触させる工程；および
（ｃ）該因子がｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子の機能を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１２２】
前記表現型が以下：眼の異常；大動脈の異常；腎臓の異常；肝臓の異常；リンパ節の異常；皮膚の異常；増加した体重または器官重量；あるいは上昇したレベルのＡＬＴ、リン、カリウム、またはビリルビン、のいずれか１つを含む、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
請求項１１０、請求項１１５、請求項１１７、請求項１１９、または請求項１２１に記載の方法により同定される因子。
【請求項１２４】
ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが減少した不安性挙動を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項１２５】
前記トランスジェニックマウスが、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に対してヘテロ接合性である、請求項１２４に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１２６】
前記トランスジェニックマウスが、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に対してホモ接合性である、請求項１２５に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１２７】
機能亢進性の挙動を改善する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスの機能亢進性挙動を改善するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１２８】
ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスにおけるｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子が該トランスジェニックマウスの機能亢進性挙動に対する効果を有する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１２９】
ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスの機能亢進性挙動を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３０】
請求項１２７、請求項１２８、または請求項１２９に記載の方法により同定される、因子。
【請求項１３１】
スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、該トランスジェニックマウスが以下の少なくとも１つを示す、トランスジェニックマウス：攻撃的な挙動、機能亢進性挙動、増加した活動性挙動、または減少した不安性挙動。
【請求項１３２】
前記トランスジェニックマウスが、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に対してヘテロ接合性である、請求項１３１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１３３】
前記トランスジェニックマウスが、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に対してホモ接合性である、請求項１３１に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１３４】
スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該トランスジェニックマウスは以下：攻撃的な挙動、機能亢進性挙動、増加した活動性挙動、または減少した不安性挙動、の少なくとも１つを示し、該方法は、以下：
（ａ）スルホトランスフェラーゼ遺伝子ターゲッティング構築物を細胞に導入する工程；
（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）得られる該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスはキメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）該キメラマウスを飼育して、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３５】
請求項１３１または請求項１３４に記載のトランスジェニックマウスに由来する細胞であって、ここで、該細胞は、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含む、細胞。
【請求項１３６】
スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に関連する挙動を改善する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスの攻撃的な挙動、機能亢進性挙動、増加した活動性挙動、または減少した不安性挙動を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３７】
スルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスにおけるスルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、該トランスジェニックマウスの攻撃的な挙動、機能亢進性挙動、増加した活動性挙動、または減少した不安性挙動に対する効果を有する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１３８】
スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に関連する挙動を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が、該トランスジェニックマウスの攻撃的な挙動、機能亢進性挙動、増加した活動性挙動、または減少した不安性挙動を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３９】
請求項１３６、請求項１３７、または請求項１３８に記載の方法により同定される、因子。
【請求項１４０】
スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスであって、ここで、該トランスジェニックマウスが以下：肝臓における異常または唾液腺における異常、の少なくとも１つを示す、トランスジェニックマウス。
【請求項１４１】
前記肝臓における異常が以下：肝細胞異常、赤血球大小不同、核の大小不同および肝臓における増加した有糸分裂細胞活性、の少なくとも１つにより特徴付けられる、請求項１４０に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項１４２】
唾液腺における異常が以下：該唾液腺における病巣の色素沈着、萎縮、または線維症、の少なくとも１つにより特徴付けられる、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウス。
【請求項１４３】
スルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が、該トランスジェニックマウスにおけるスルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１４４】
前記表現型が以下：肝臓における異常または唾液腺における異常、のいずれか１つを含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該表現型を調節するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１４６】
前記表現型が以下：肝臓における異常または唾液腺における異常、のいずれか１つを含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
スルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞と因子とを接触させる工程；および
（ｃ）該因子がスルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１４８】
前記表現型が以下：肝臓における異常または唾液腺における異常、のいずれか１つを含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
スルホトランスフェラーゼの機能を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含む細胞を提供する工程；
（ｂ）該細胞と因子とを接触させる工程；および
（ｃ）該因子がスルホトランスフェラーゼ遺伝子の機能を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子は、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１５０】
前記表現型が以下：肝臓における異常または唾液腺における異常、のいずれか１つを含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
スルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節する因子を同定する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスに因子を投与する工程；および
（ｂ）該因子が該トランスジェニックマウスにおけるスルホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を調節するか否かを決定する工程であって、ここで、該因子がホスファターゼ遺伝子における破壊に関連する表現型を調節する、工程、
を包含する、方法。
【請求項１５２】
前記表現型が以下：肝臓における異常または唾液腺における異常、のいずれか１つを含む、請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
請求項１４３、請求項１４５、請求項１４７、請求項１４９、または請求項１５１に記載の方法により同定される、因子。
【請求項１５４】
スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する方法であって、該トランスジェニックマウスは以下：肝臓における異常または唾液腺における異常、の少なくとも１つを示し、該方法は、以下：
（ａ）スルホトランスフェラーゼ遺伝子ターゲッティング構築物を細胞に導入する工程；
（ｂ）該細胞を胚盤胞に導入する工程；
（ｃ）得られる該胚盤胞を偽妊娠マウスに移植する工程であって、ここで、該偽妊娠マウスはキメラマウスを産む、工程；および
（ｄ）該キメラマウスを飼育して、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製する工程、
を包含する、方法。
【請求項１５５】
請求項１４０または請求項１５４に記載のトランスジェニックマウスに由来する、細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本願は、米国出願番号第６０／１９０，３４８号（２０００年３月１６日提出）、米国出願番号第６０／１９１，１２８号（２０００年３月２２日提出）、米国出願番号第６０／１９１，２３６号（２０００年３月２２日提出）、米国出願番号第６０／１９１，２３５号（２０００年３月２２日提出）、米国出願番号第６０／１９１，１２９号（２０００年３月２２日提出）、米国出願番号第６０／１９１，１４２号（２０００年３月２２日提出）、米国出願番号第６０／１９１，２４０号（２０００年３月２２日提出）、米国出願番号第６０／２０４，２２７号（２０００年５月１５日提出）、米国出願番号第６０／２０４，２３０号（２０００年５月１５日提出）、米国出願番号第６０／２１５，２１４号（２０００年６月２９日提出）、米国出願番号第６０／２１６，２４９号（２０００年７月６日提出）、米国出願番号第６０／２１６，２６４号（２０００年７月６日提出）、米国出願番号第６０／２１６，７６５号（２０００年７月６日提出）、米国出願番号第６０／２１８，０７５号（２０００年７月１２日提出）、米国出願番号第６０／２１９，１６７号（２０００年７月１９日提出）、米国出願番号第６０／２１９，１８２号（２０００年７月１９日提出）、米国出願番号第６０／２２１，４８５号（２０００年７月２７日提出）および米国出願番号第６０／２２３，１７３号（２０００年８月７日提出）の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、遺伝子機能の特性化に関するトランスジェニック動物、組成物および方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
実験動物モデルは、遺伝子の役割を理解するための重要な手段である。より詳細には、変更または不活性化された特定遺伝子を有する動物を開発する能力は、遺伝子機能の研究にとって計り知れないほど貴重であり、そしてヒトにおける同様な発現を有する疾患の原因となる遺伝子および／または機構の予期せぬ発見につながっている。これらの遺伝的に操作された動物はまた、種々の疾患および障害のための治療的処置を同定および試験するためにも有用である。
【０００４】
多くの遺伝子の機能を同定することは、疾患におけるその役割を確認することおいて有用である。ヒトとマウスとの間の高レベルな相同性のため、マウスの選択された遺伝子の標的生殖系列変異を行うことによって、個々のヒト遺伝子の機能を明確にすることが可能である。結果として得られる変異マウスの表現型は、ヒトにおける表現型を定義するのに役立てるために用いられ得る。
【０００５】
数種の興味ある遺伝子が最近、発見されている。これらの遺伝子およびその発現産物の役割を確認することは、疾患経路の決定ならびに診断上および治療上で有用な標的の同定を可能とし得る。
【０００６】
多くの医療上、有意義な生物学的プロセスは、Ｇ−タンパク質および／またはｃＡＭＰなどの第２メッセンジャーを含むシグナル伝達経路に関与するタンパク質によって仲介される。Ｇ−タンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）の膜タンパク質遺伝子スーパーファミリーは、ホルモン、ウイルス性、成長因子および神経レセプターなどの広範囲の生物学的活性レセプターを含む。ＧＰＣＲは、７種の推定膜貫通ドメイン（ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と称する）を有するとして特性化されている。これらは、細胞外または細胞質ループによって連結された膜貫通α−へリックスを表すと考えられている。ほとんどのＧ−タンパク質結合レセプターは、機能的タンパク質構造を安定化すると考えられているジスルフィド結合を形成する最初の２つの細胞外ループのそれぞれに１つの保存システイン残基を有する。Ｇ−タンパク質結合レセプターは、ヘテロ三量体Ｇ−タンパク質によって細胞内で種々の細胞内酵素、イオンチャネルおよび輸送体に結合され得る。異なったＧ−タンパク質α−サブユニットは、優先的に特定のエフェクターを刺激して、細胞内で種々の生物学的機能を調節する。
【０００７】
網膜疾患において潜在的に重要であり得る核レセプター遺伝子、特に網膜特異的核レセプター遺伝子が同定されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６：１５１４９）。網膜特異的核レセプターは、網膜色素上皮およびグリア細胞内で発現された細胞性レチンアルデヒド（ｒｅｔｉｎａｌｄｅｈｙｄｅ）結合タンパク質の潜在的調節因子であり得る。このような遺伝子は、細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質との相互作用により視覚サイクルを調節するとみなされている。
【０００８】
ＧＰＣＲファミリーのリンパ系特異的メンバーは、縮重オリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲによって同定されている（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２３（３），　６４３−５０　（１９９４））。エプスタイン−バー−誘導ｃＤＮＡ　ＥＢＩ１として報告されるこのレセプターは、正常なリンパ系組織中、および数種のＢ−およびＴ−リンパ球細胞系列中で発現される。この遺伝子は、ヒト染色体１７ｑ１２−ｑ２１．２にコードされる。他のＧ−タンパク質結合レセプターのいずれもこの領域にマップされていないが、Ｃ−Ｃケモカインファミリーは、１７ｑ１１−ｑ２１にマップされている。マウスＥＢＩ１ｃＤＮＡも単離されていて、そしてヒト相同体に８６％の同一性を有するタンパク質をコードする。マウスＥＢＩ１はＣ−Ｃケモカイン７型レセプター（ＣＣＲ−７、Ｃ−Ｃ　ＣＫＲ−７またはＣＣ−ＣＫＲ−７と様々に呼ばれる）である。その遺伝子構造は、公知であり得るが、その機能およびリガンドＥＢＩ１は、未知である。
【０００９】
メラニン形成細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）は、色素沈着機能を調節する。このペプチドもまた、脳、下垂体および免疫系を含む他の領域において種々の生物学的活性を有する。マウスメラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター（ＭＳＨ−Ｒ）ｍＲＮＡは、クローン化され（１２６０ｂｐ）、そしてカンナビノイドレセプターを含み得るグアニンヌクレオチド−結合タンパク質に結合されたレセプターのサブファミリーを定義することが見出されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７（５０７４），　１２４８−１２５１　（１９９２））。
【００１０】
ホスファターゼは、低分子阻害および薬理学的介入に対して特殊かつ誘引性の標的を表す。タンパク質リン酸化／脱リン酸化サイクルは、成長および分化、細胞間接触、細胞周期ならびに腫瘍形成を含む細胞活性を制御する真核生物細胞によって使用される主要な調節機構の１つである。典型的な哺乳動物細胞の１０％より多い活性タンパク質は、リン酸化されていると推定される。タンパク質リン酸化／脱リン酸化中、リン酸基は、タンパク質キナーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）分子からタンパク質へ移動され、そしてタンパク質ホスファターゼによってタンパク質から除去される。
【００１１】
ヒト新形成のほとんど全ての形態は、細胞周期制御を変更するので、細胞周期制御でのホスファターゼの役割は、これらの分子を薬学的介入の誘引性な標的にする。異常な細胞活性を妨害するホスファターゼインヒビターの能力は、実証されている。例えば、天然に存在するセリン／スレオニンホスファターゼインヒビター、オカダ酸は、骨髄性白血病細胞（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１５０，４８４（１９９２））、およびラット肝実質細胞、ラット下垂体腺腫細胞、ヒト乳癌細胞およびヒト神経芽腫細胞（Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．１９５，２３７（１９９１））中でアポトーシスを誘導することが示されている。
【００１２】
マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼは、ｃＡＭＰ−活性化タンパク質キナーゼ活性、Ｃａ２＋−依存性シグナル伝達、ｔＲＮＡスプライシング、および熱ショック反応に関連するシグナル伝達を調節することを含む広い種類の機能に関与するようである。最近、ＰＰ２Ｃ、αアイソフォーム（すなわちＰＰ２Ｃ−α）をコードする完全なｃＤＮＡ配列は、マウス脳からクローン化されたと報告された。ＰＰ２Ｃ−α（ＧＩまたはＮＩＤ番号：５３２６７８；受託番号：Ｄ２８１１７）は、計算された分子量４２，４３２Ｄａを有する３８２個のアミノ酸のタンパク質をコードする１３８７ｂｐの配列である（Ｇｅｎｅ　１４５（２），３１１−３１２（１９９４））。
【００１３】
別の重要なＧＰＣＲサブファミリーは、走化性サイトカインとして公知であるケモカインレセプターファミリーである。ケモカイン作用の機構は、標的細胞上の７種の膜貫通スパニングＧＰＣＲへの初期特異的結合を含む。炎症性反応におけるケモカインの中心的役割は、多くの研究で立証されている。皮下注射によるαケモカイン、例えばＩＬ−８の局所投与は、好中球浸潤により支配される急性炎症性反応となる。最近、ラットＣＸＣケモカインレセプター１（ＣＸＣＲ１）遺伝子のクローニングが報告されている（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７１（５１），　３２７７０−６　（１９９６））。このＣＸＣＲ１遺伝子（ＧＩまたはＮＩＤ番号：１５８９９３０；受託番号：Ｕ７１０８９）は、ヒトインターロイキン−８（ＩＬ−８）ＡおよびＢレセプターサブタイプと約７０〜８５％同一であるアミノ酸配列を有するヒトインターロイキン−８（ＩＬ−８）レセプターと相同であり、マウスＣＸＣＲ１遺伝子とも相同である。
【００１４】
ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）は、ホスホジエステル結合の分解の原因である１群の酵素である。特に環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣＮ−ＰＤＥ）は、プリン環状ヌクレオチド基質に対する特異性を示し、そして環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）および環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）を加水分解する（Ｐｈａｒｍａｃ．　Ｔｈｅｒ．　５１，　１３−３３　（１９９１））。ＣＮ−ＰＤＥは、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの定常レベルを調節し、そして環状ヌクレオチドシグナルの振幅および持続時間の両方を調節する。次に、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰは、シグナル伝達、すなわち細胞が細胞外シグナル（ホルモン、薬物、神経伝達物質、成長および分化因子、ならびに他の薬剤）に反応することによる一般的なプロセスにおいて重要な「第２メッセンジャー」分子である。シグナル伝達は、細胞増殖、分化および遺伝子転写を含む全ての型の細胞機能を調節する。少なくとも８種の異なっているが相同であるＣＮ−ＰＤＥの遺伝子サブファミリーは、哺乳動物組織に存在することが目下、公知である。
【００１５】
ＰＤＥの６型サブファミリー（ＰＤＥ６）のメンバーは、網膜光伝達に関係している（Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６６，　１０７１１−１４　（１９９１））。光伝達では、光レセプター細胞に衝突する光は、ＰＤＥ６によるｃＧＭＰの加水分解となる生化学的事象のカスケードを活性化することによって神経シグナルを誘発する。ＰＤＥ６は、触媒的アルファおよびベータ（αおよびβ）サブユニット、および２つの抑制ガンマ（γ）サブユニットから構成される四量体タンパク質である。酵素複合体からの抑制ガンマサブユニットの解離は、トランスデューシンと呼ばれる膜関連タンパク質によって誘導され、そして酵素を活性化する。ＰＤＥ６欠損は、網膜変性を特徴とする遺伝性網膜変性疾患に関与している。ホスホジエステラーゼ、特に網膜機能に関与するＰＤＥ（例えば、ＰＤＥ６）の重要性を考えると、機能不全または疾患、および網膜変性（ＲＤ）および特に網膜色素変性（ＲＰ）などの特に視覚関連機能不全および疾患を阻止、改善または矯正する役割を果たし得るホスホジエステラーゼの同定および特性化が明らかに必要である。
【００１６】
多くの薬物、生体異物、神経伝達物質およびホルモンの物質代謝は、硫酸（ＳＯ４）基の酵素的付加に関与する工程を含む。硫酸基の付加は、一般に硫酸結合体化、または単に硫酸化と呼ばれる。硫酸結合体化の原因となる酵素は、スルホトランスフェラーゼ（すなわちＳＴ）として公知であり、これは、当該酵素がスルホトランスフェラーゼ反応において１つの生物学的分子（硫酸ドナー）から別の生物学的分子（硫酸アクセプター）へ硫酸基を転移させることにより作用するためである。
【００１７】
ヒト肝臓中のサイトゾルのスルホトランスフェラーゼ酵素は、硫酸化がほとんどの化合物の水溶解性を増加し、したがってその腎排泄を増加するので、集中的に研究に供されている。硫酸化はまた、通常、生物学的活性の減少となる。しかしながら、いくつかの場合では、硫酸結合体化は、降圧薬ミノキシジルなどの薬物を活性化するために必要とされ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，３１，２９４９−２９５４（１９８２））、そしてまた、ヒドロキシルアリールアミンなどの前発癌物質の生物学的活性化において役割を果たし得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５，４０３（１９８２）；Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔ．１０９，２２１−３５（１９９８））。
【００１８】
現在まで、硫酸物質代謝の分野での遺伝的操作の努力から、数種のスルホトランスフェラーゼ酵素：ヒト肝臓ＤＨＥＡ　ＳＴ（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１，８６５−８７２（１９９２））、ＴＳ　ＰＳＴ（Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４３，７０−７７（１９９３））、ＴＬ　ＰＳＴ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９８，１１１９−１１２７（１９９４））および非ヒト哺乳動物種の数種の組織から単離された１群のエストロゲンスルホトランスフェラーゼ（Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．４１，５０７−５１６（１９８８）；Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．６，５８９−５９７（１９９２））に対するｃＤＮＡのクローニングおよび発現を生じている。
【００１９】
また、マウス肝臓フェノール／アリール形態のスルホトランスフェラーゼ（ｍＳＴｐ１）のｃＤＮＡ配列（１２６９ｂｐ）が決定されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１１７１（３），３１５−８（１９９３））。クローン化されたｃＤＮＡは、３４．７ｋＤである２９８個のアミノ酸のポリペプチドをコードする、ヌクレオチド６５で始まる８９７個のヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むと報告された。ｍＳＴｐ１遺伝子は、ＧＩまたはＮＩＤ番号２０１０６９および受託番号Ｌ０２３３１を有する。ヒトＳＴｐ１遺伝子は、広く特性化されている（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　６，４７３−４８７（１９９６）；Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２８，１３４−１４０（１９９６））。ＳＴｐ１遺伝子はまた、ＳＵＬＴ１Ａ１遺伝子とも呼ばれている。
【００２０】
実験動物モデルは、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター１−様タンパク質遺伝子、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子およびスルホトランスフェラーゼ遺伝子の役割を理解する重要な手段を提供する。このような役割の理解は、疾患経路の決定、診断上および治療上、有用な標的の同定、および潜在的治療処置の試験および研究を可能とし得る。
【００２１】
（発明の要旨）
本発明は、一般的にトランスジェニック動物、ならびに遺伝子機能の特性化に関する組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、種々の遺伝子およびそのインビボでの特性化および機能に関する。
【００２２】
本発明は、標的遺伝子における破壊を含むトランスジェニック細胞を提供する。本発明のトランスジェニック細胞は、相同組換えを行い得る任意の細胞からなる。好ましくは、本発明の細胞は、幹細胞であり、そしてより好ましくは、胚性幹（ＥＳ）細胞、そして最も好ましくは、マウスＥＳ細胞である。１つの実施形態に従って、トランスジェニック細胞は、幹細胞中に標的化構築物を導入し、標的遺伝子の突然変異をもたらす相同組換え体を生成することにより産生される。他の実施形態では、トランスジェニック細胞は、以下に記載するトランスジェニック動物由来である。トランスジェニック動物由来の細胞は、組織または器官、および任意の細胞系列またはその任意の子孫から単離されるか、あるいはそれらに存在する細胞を含む。
【００２３】
本発明はまた、標的化構築物、および幹細胞中に導入される場合、相同組換え体を産生する標的化構築物を産生する方法を提供する。１つの実施形態では、本発明の標的化構築物は、標的遺伝子に相同である第１および第２のポリヌクレオチド配列を含む。標的化構築物はまた、構築物中で２つの異なった相同ポリヌクレオチド配列間に位置することが好ましい選択可能マーカーをコードするポリヌクレオチド配列も含む。標的化構築物は、相同組換えを強化し得る他の調節因子も含み得る。
【００２４】
本発明はさらに、非ヒトトランスジェニック動物、および標的遺伝子に破壊を含むこのような非ヒトトランスジェニック動物を産生する方法を提供する。本発明のトランスジェニック動物は、標的遺伝子中の変異に対してヘテロ接合性およびホモ接合性であるトランスジェニック動物を含む。１つの局面では、本発明のトランスジェニック動物は、標的遺伝子の機能を欠損している。別の局面では、本発明のトランスジェニック動物は、標的遺伝子に変異を有することに関連した表現型を含む。
【００２５】
本発明はまた、トランスジェニック動物の表現型に影響を及ぼし得る薬剤を同定する方法も提供する。例えば、推定薬剤がトランスジェニック動物へ投与され、そして推定薬剤に対するトランスジェニック動物の反応が測定され、そして「正常」または野生型マウスの反応と比較されるか、あるいはトランスジェニック動物コントロール（薬剤投与されない）と比較される。本発明は、このような方法に従って同定された薬剤をさらに提供する。本発明はまた、標的遺伝子の破壊に関連した状態を処置するための治療薬剤として有用な薬剤を同定する方法を提供する。
【００２６】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現または機能に対してある効果を有する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、標的遺伝子に破壊を有するトランスジェニック動物、好ましくはマウスに有効量の薬剤を投与する工程を包含する。この方法は、例えば薬剤に対するトランスジェニック動物の反応を測定し、例えば野生型動物あるいはトランスジェニック動物制御とし得るコントロール動物とトランスジェニック動物の反応を比較する工程を包含する。遺伝子の発現または機能に対してある効果を有し得る化合物はまた、例えば、このような化合物を同定するために、細胞ベースアッセイで細胞に対してスクリーニングされ得る。
【００２７】
本発明はまた、標的遺伝子の核酸配列を含む細胞系列を提供する。このような細胞系列は、細胞系中で機能するプロモーターへの作動可能な連結によって、このような配列を発現することが可能であり得る。好ましくは、標的遺伝子配列の発現は、誘導性プロモーターの制御下にある。標的遺伝子を薬剤と接触させる工程および薬剤／標的遺伝子複合体を検出する工程を包含する、標的遺伝子に相互作用する薬剤を同定する方法も提供される。このような複合体は、例えば、作動可能に連結された検出可能なマーカーの発現を測定して検出され得る。
【００２８】
本発明はさらに、標的遺伝子における破壊、より詳細には標的遺伝子の発現または機能における破壊に関連した疾患または状態を処置する方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明の方法は、必要とする患者へ標的遺伝子の発現または機能をもたらす治療薬剤を投与する工程を包含する、標的遺伝子の発現または機能中の破壊に関連した疾患または状態を処置する工程を包含する。この実施形態に従って、この方法は、治療上、有効な量の天然、合成、半合成、または組換え標的遺伝子、標的遺伝子産物またはそのフラグメント、ならびに天然、合成、半合成または組換え類似体の投与を含む。
【００２９】
本発明はさらに、破壊された標的遺伝子の発現または機能に関連した疾患または状態を処置する方法を提供し、この方法は、変異された標的遺伝子を検出し、かつ遺伝子治療によって置換する工程を包含する。
【００３０】
（定義）
本明細書中で使用される場合、「遺伝子」とは、（ａ）本明細書に開示されるＤＮＡ配列の少なくとも１つを含む遺伝子；（ｂ）本明細書中に開示されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列をコードする任意のＤＮＡ配列、および／または；（ｃ）本明細書中に記載されるコード配列の補体にハイブリダイズする任意のＤＮＡ配列をいう。好ましくは、この用語は、コード領域ならびに非コード領域を含み、そして好ましくはプロモーター、エンハンサーおよび他の調節配列を含む正常な遺伝子発現に必要である全ての配列を含む。
【００３１】
用語「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」は、いかなる長さを有するヌクレオチドのポリマー形態を呼ぶために互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはその類似体を含み得る。ヌクレオチドは、いかなる３次元構造をも有し得、そして公知または未知であるいかなる機能をも発揮し得る。用語「ポリヌクレオチド」は、１本鎖、２本鎖および三重ヘリックス分子を含む。
【００３２】
「オリゴヌクレオチド」とは、５と約１００ヌクレオチドとの間の１本鎖または２本鎖ＤＮＡのポリヌクレオチドをいう。オリゴヌクレオチドはまた、オリゴマーまたはオリゴとして公知であり、そして遺伝子から単離され得るか、あるいは当該技術分野で公知である方法によって化学的に合成され得る。「プライマー」とは、酵素仲介核酸合成の開始に３’−ヒドロキシ末端を提供する、通常、１本鎖であるオリゴヌクレオチドをいう。
【００３３】
下記のもの：遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、すべての配列の単離ＤＮＡ、すべての配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマーは、ポリヌクレオチドの非限定的実施形態である。核酸分子はまた、メチル化核酸分子および核酸分子類似体などの改変核酸分子を含み得る。プリンおよびピリミジンの類似体は、当該技術分野で公知であり、アジリジニルシトシン（ａｚｉｒｉｄｉｎｙｃｙｔｏｓｉｎｅ）、４−アセチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチル−アミノメチルウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、シュードウラシル、５−ペンチニルウラシルおよび２，６−ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。デオキシリボ核酸におけるチミンの代替としてのウラシルの使用はまた、ピリミジンの類似形態と考えられる。
【００３４】
ポリヌクレオチドの「フラグメント」は、コード配列または非コード配列の少なくとも９個の連続したヌクレオチド、好ましくは少なくとも１５個の連続したヌクレオチド、そしてより好ましくは少なくとも４５個のヌクレオチドからなるポリヌクレオチドである。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「ｂｐ」とも表示される「塩基対」とは、相補的核酸分子をいう。ＤＮＡには、４「種」の塩基が存在する：プリン塩基アデニン（Ａ）は、ピリミジン塩基チミジン（Ｔ）と水素結合され、そしてプリン塩基グアニン（Ｇ）は、ピリミジン塩基シトシン（Ｃ）と水素結合される。各水素結合された塩基対セットはまた、ワトソン−クリック塩基対としても公知である。１０００塩基対は、しばしばキロベース対またはｋｂと呼ばれる。「塩基対ミスマッチ」とは、塩基が相補的ワトソン−クリック対でない核酸分子中の位置をいう。句「いかなる位置にも少なくとも１種の塩基を含まない」とは、いかなる位置にも４種の塩基のうちの１つを有しないヌクレオチド配列をいう。例えば、１つのヌクレオチドを欠く（すなわち１種の塩基を欠く）配列は、Ａ、Ｇ、Ｔ塩基対から構成され、そしてＣ残基を含まないものであり得る。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、「遺伝子標的化」は、ゲノムＤＮＡのフラグメントが哺乳動物細胞中に導入され、かつ、そのフラグメントが内因性相同配列の位置を定め、これと再び結合する場合に生じる１種の相同的組換えである。
【００３７】
用語「相同組換え」とは、相同ヌクレオチド配列の部位での２つのＤＮＡ分子または染色分体間のＤＮＡフラグメントの交換をいう。本明細書中で使用される場合、用語「相同」は、参照配列と比べて、少なくとも約７０％の配列同一性、典型的には、少なくとも約８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、そしてより好ましくは約９８％の配列同一性、そして最も好ましくは参照配列に比べて約１００％の配列同一性を有するＤＮＡ配列の特性を示す。相同性は、「ＢＬＡＳＴＮ」アルゴリズムを使用して決定され得る。相同配列は、ヌクレオチド配列中の挿入、欠失および置換に適応する（ａｃｃｏｍｍｏｄａｔｅ）ことが理解される。したがって、ヌクレオチドの線形配列は、たとえヌクレオチド残基のいくつかが正確に対応しないか、または整列しなくても、本質的に同一であり得る。参照配列とは、遺伝子またはフランキング配列の一部、または染色体の反復部分などのより大きな配列のサブセットであり得る。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「標的遺伝子」（または「標的遺伝子配列」または「標的ＤＮＡ配列」または「標的配列」と呼ぶ）とは、相同組換えによって改変される任意の遺伝子の任意の核酸分子またはポリヌクレオチドをいう。標的配列は、インタクト遺伝子、エキソンまたはイントロン、調節配列または遺伝子間の任意の領域を含む。１つの局面では、一般的集団中に１つの配列を有する核酸分子は、いずれの疾患または認識可能な表現型にも関連していない。一般的な集団中において、野生型遺伝子は、互いに関連した配列中の変化を含む複数の有力なバージョン（ｐｒｅｖａｌｅｎｔ　ｖｅｒｓｉｏｎ）を含み得るにも関わらず、認識可能な病理学的効果を引き起こさないことが注目される。これらの変異は、「多型性」または「対立遺伝子変異」と命名される。標的遺伝子は、個人のゲノムＤＮＡ中に特定遺伝子または遺伝子座の一部を含む。本明細書中に提供されるように、本発明の標的遺伝子は、網膜特異的核レセプター遺伝子、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子、メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、ケモカインレセプター１−様タンパク質遺伝子、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子およびスルホトランスフェラーゼ遺伝子、または天然に存在する対立遺伝子変異体またはその相同体からなる。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「網膜特異的核レセプター遺伝子」とは、配列番号１９を含む配列、または受託番号：ＡＦ１４８１２９；ＧＩ番号：６６５１２２６としてＧｅｎＢａｎｋで同定された網膜特異的核レセプター遺伝子をいう。１つの局面では、網膜特異的核レセプター遺伝子のコード配列は、配列番号１９、あるいは受託番号：ＡＦ１４８１２９；ＧＩ番号：６６５１２２６としてＧｅｎＢａｎｋで同定された配列を含む。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子」とは、配列番号２２を含む配列、または受託番号：Ｌ３１５８０；ＧＩ番号：４６８３４０であるＧｅｎＢａｎｋのリンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子をいう。１つの局面では、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子のコード配列は、配列番号２２、または受託番号：Ｌ３１５８０；ＧＩ番号：４６８３４０としてＧｅｎＢａｎｋで同定された配列を含む。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子」とは、配列番号２５を含む配列、または受託番号：Ｘ６５６３５；ＧＩ番号：５３２４４としてＧｅｎＢａｎｋで同定されたメラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子をいう。１つの局面では、メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子のコード配列は、配列番号２５または受託番号：Ｘ６５６３５；ＧＩ番号：５３２４４としてＧｅｎＢａｎｋで同定された配列を含む。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子」とは、配列番号２８を含む配列、または受託番号：Ｄ２８１１７；ＧＩ番号：５３２６７８としてＧｅｎＢａｎｋで同定されたマグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子をいう。１つの局面では、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子のコード配列は、配列番号２８または受託番号：Ｄ２８１１７；ＧＩ番号：５３２６７８としてＧｅｎＢａｎｋで同定された配列を含む。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「ケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子」とは、配列番号３１を含む配列、または受託番号：Ｕ７１０８９；ＧＩ番号：１５８９９３０としてＧｅｎＢａｎｋで同定されたケモカインレセプター１−様タンパク質遺伝子をいう。１つの局面では、ケモカインレセプター１−様タンパク質遺伝子のコード配列は、配列番号３１または受託番号：Ｕ７１０８９；ＧＩ番号：１５８９９３０としてＧｅｎＢａｎｋで同定された配列を含む。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子」とは、配列番号３４を含む配列、または受託番号：Ｘ６０６６４；ＧＩ番号：５３５８７としてＧｅｎＢａｎｋで同定されたｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子をいう。１つの局面では、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子のコード配列は、配列番号３４または受託番号：Ｘ６０６６４；ＧＩ番号：５３５８７としてＧｅｎＢａｎｋで同定された配列を含む。
【００４５】
本明細書中で使用される場合、用語「スルホトランスフェラーゼ遺伝子」とは、配列番号３７を含む配列、または受託番号：Ｌ０２３３１；ＧＩ番号：２０１０６９としてＧｅｎＢａｎｋで同定されたスルホトランスフェラーゼ遺伝子をいう。１つの局面では、スルホトランスフェラーゼ遺伝子のコード配列は、配列番号３７または受託番号：Ｌ０２３３１；ＧＩ番号：２０１０６９としてＧｅｎＢａｎｋで同定された配列を含む。
【００４６】
標的遺伝子の「破壊」は、ゲノムＤＮＡのフラグメントが内因性相同配列の位置を定め、そしてこれと再び結合する場合に生じる。これらの配列破壊または改変は、ＤＮＡ配列の挿入、ミスセンス、フレームシフト、欠失、または代替、または置換、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。挿入は、動物、植物、原核生物、またはウイルス起源のものであってもよい全遺伝子の挿入を含む。例えば、破壊は、標的遺伝子のプロモーター、エンハンサー、またはスプライシング部位を変更または置換し得、そして正常な遺伝子産物の産生を部分的に、または完全に阻止するか、あるいは正常遺伝子産物の活性を強化することによって、正常遺伝子産物を変更し得る。
【００４７】
用語「トランスジェニック細胞」とは、遺伝子標的化の方法で完全にまたは部分的に破壊、変性、変更または置換されている標的遺伝子をそのゲノム内に含む細胞をいう。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、「トランスジェニック動物」は、遺伝子標的化の方法で完全にまたは部分的に破壊、または不活性化されている特定遺伝子をそのゲノム内に含む動物である。トランスジェニック動物は、ヘテロ接合性動物（すなわち、１つの欠損対立遺伝子および１つの野生型対立遺伝子）ならびにホモ接合性動物（すなわち、２つの欠損対立遺伝子）の両方を含む。
【００４９】
本明細書中で使用される場合、用語「構築物」とは、標的組織、細胞系列またはヒトを含む動物中に移入されるべき人工的に組み立てられたＤＮＡセグメントをいう。典型的には、構築物は、遺伝子、または特別の目的の配列、マーカー遺伝子および適切な制御配列を含む。「プラスミド」との用語は、自律性自己複製染色体外ＤＮＡ分子をいう。好ましい実施形態では、本発明のプラスミド構築物は、目的の遺伝子の２つのフランキング領域間に位置されるポジティブ選択マーカーを含む。必要に応じて、この構築物はまた、スクリーニングマーカー、例えば緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）を含み得る。存在する場合、スクリー−ニングマーカーは、フランキング領域の外側で、かつある距離だけ離れて配置される。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「選択マーカー」または「ポジティブ選択マーカー」とは、遺伝子を保有する細胞のみがある条件下に生き残り、かつ／または成長し得る産物をコードする遺伝子をいう。例えば、導入されたネオマイシン抵抗性（Ｎｅｏｒ）遺伝子を発現する植物および動物細胞は、化合物Ｇ４１８に対して抵抗性である。Ｎｅｏｒ遺伝子マーカーを保有しない細胞は、Ｇ４１８によって死滅される。他のポジティブ選択マーカーは、当業者には公知である。
【００５１】
「ポジティブ−ネガティブ選択」は、特定の標的化された位置に組み込まれたＤＮＡ挿入物を保有する細胞を選択するプロセス（ポジティブ選択）、および非標的化された染色体部位に組み込まれたＤＮＡ挿入物を保有する細胞をまた選択する（ｓｅｌｅｃｔ　ａｇａｉｎｓｔ）（ネガティブ選択）をいう。ネガティブ選択挿入物の非限定的例としては、チミジンキナーゼ（ｔｋ）をコードする遺伝子が挙げられる。ポジティブ−ネガティブ選択に適した遺伝子は、当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第５，４６４，７６４号参照。
【００５２】
「スクリーニングマーカー」または「レポーター遺伝子」は、容易に分析され得る産物をコードする遺伝子をいう。例えば、レポーター遺伝子は、特定ＤＮＡ構築物が細胞、器官または組織中に首尾よく導入されたか否かを決定するために使用され得る。スクリーニングマーカーの非限定的例としては、緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子、または改変された蛍光性タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「ネガティブスクリーニングマーカー」は、ネガティブ選択マーカー；それを発現する細胞を典型的には死滅させるネガティブ選択マーカーとして解釈されるべきでない。
【００５３】
用語「ベクター」は、挿入されたＤＮＡを保有し得、宿主細胞中に不滅化され得るＤＮＡ分子をいう。ベクターはまた、クローニングベクター、クローニングビヒクルまたはビヒクルとして公知である。この用語は、細胞中に核酸分子を挿入するために主に機能するベクター、核酸の複製のために主に機能する複製ベクター、およびＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のために機能する発現ベクターを含む。上記の機能の１より多くをもたらすベクターもまた、含まれる。
【００５４】
「宿主細胞」は、ベクターのため、あるいは核酸分子および／またはタンパク質の導入のためのレセプターであり得るかまたはそうである、個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、１つの宿主細胞の子孫を含み、そしてその子孫は、天然の変異、偶発的な変異または故意の変異に起因して、必ずしも元の親と（形態学的にまたは全ＤＮＡ相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において）完全に同一でなくてもよい。宿主細胞は、本発明の構築物でトランスフェクトされた細胞を含む。
【００５５】
用語「ゲノムライブラリー」は、１セットのランダムに生成された重複する、生物体のゲノムを表現するＤＮＡフラグメントから作られたクローンの集合をいう。「ｃＤＮＡライブラリー」（相補的ＤＮＡライブラリー）は、酵素逆転写酵素でｃＤＮＡ分子に変換され、次いで、ベクター（外来ＤＮＡの添加後に複製し続けることができる他のＤＮＡ分子）中に挿入された、細胞、組織または生物体に存在するｍＲＮＡ分子の集合である。ライブラリーのためのベクターの例としては、バクテリオファージ（「ファージ」としても公知である）が挙げられる。これは、細菌を感染するウイルス（例えば、λファージ）である。次いで、ライブラリーは、目的の特定ｃＤＮＡ（従って、ｍＲＮＡ）のためにプローブされ得る。１つの実施形態では、高効率のファージベクター系をプラスミド系の便宜性と組み合わせるライブラリー系（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡからのＺＡＰ系）が本発明の実施に使用される。
【００５６】
用語「エキソヌクレアーゼ」は、線状核酸基質の自由端から連続してヌクレオチドを切断する酵素をいう。エキソヌクレアーゼは、２本鎖または１本鎖のヌクレオチドに特異的であり得、ならびに／あるいは、例えば３’−５’および／または５’−３’の方向に特異的であり得る。いくつかのエキソヌクレーゼは、他の酵素活性を示す。例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼおよび活性３’−５’エキソヌクレアーゼの両方である。他のエキソヌクレアーゼの例としては、リン酸化３’末端を有さない２重鎖ＤＮＡの５’末端から１つずつヌクレオチドを取り除くエキソヌクレアーゼＩＩＩ、１本鎖ＤＮＡの両端からヌクレオチドを切断することによってオリゴヌクレオチドを作るエキソヌクレアーゼＶＩ、および結合する５’リン酸基を有する２重鎖ＤＮＡの５’末端からヌクレオチドを取り除くエキソヌクレアーゼλが挙げられる。
【００５７】
用語「リコンビナーゼ」は、組換えを誘導、媒介または促進する酵素、および核酸配列の再配列、または第２の核酸配列から第１の核酸配列を切除または第２の核酸配列の中へ第１の核酸配列を挿入することを誘起、媒介または促進する酵素を改変する他の核酸を包含する。リコンビナーゼの「標的部位」は、リコンビナーゼによって認識（例えば、特異的に結合する）および／または作用される（組換えのための切除、切断または誘導）核酸配列または領域である。本明細書中で使用される場合、「酵素指向性部位特異的組換え」との表現は、次の事象を含むことが意図される：リコンビナーゼ標的部位が隣接する予め選択されたＤＮＡセグメントの欠失；リコンビナーゼ標的部位が隣接する予め選択されたＤＮＡセグメントのヌクレオチド配列の反転；および異なったＤＮＡ分子上に配置されたリコンビナーゼ標的部位に近接したＤＮＡセグメントの相互交換。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」は、標的遺伝子の機能、発現、または代替的に、標的遺伝子における破壊に関連した表現型の、阻止、低下または増強をいう。
【００５９】
用語「回復する」は状態、疾患、障害、または標的遺伝子における破壊に関連した異常性もしくは病徴を含む表現型を、減少、低下または除去することをいう。
【００６０】
用語「異常性」は、任意の疾患、障害、状態、または病理学的状態を含む標的遺伝子の破壊が関係する表現型をいう。
【００６１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、部分的に、遺伝子の発現および役割ならびに遺伝子発現産物の評価に基づく。とりわけ、本発明は、疾患経路の決定ならびに診断上および治療上有用な標的の同定を可能とする。例えば、疾患状態で変異あるいは下方制御される遺伝子は、疾患状態を生じるかまたは悪化させることに関与し得る。このような遺伝子の活性を上方制御することに指向された治療、または代替の経路に関与する治療は、疾患状態を改善させ得る。
【００６２】
当該技術分野で公知である技術はいずれも、動物中に標的遺伝子導入遺伝子を導入してトランスジェニック動物のファウンダー系（ｆｏｕｎｄｅｒ　ｌｉｎｅ）を生産するために使用され得る。このような技術としては、前核マイクロインジェクション（米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖系列中へのレトロウイルス仲介遺伝子導入（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８２：６１４８−６１５２（１９８５））；胚性幹細胞での遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，５６：３１３−３２１（１９８９））；胎児のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３：１８０３−１８１４（１９８３））：および精子仲介遺伝子移送（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ，５７：７１７−７２３（１９８９））；などが挙げられるが、これらに限定されない。このような技術の概説については、Ｇｏｒｄｏｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｎｉｍａｌｓ，Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．，１１５：１７１−２２９（１９８９）（本明細書中にその全体が参考として援用される）を参照のこと。
【００６３】
好ましい実施形態では、相同組換えは、本発明のノックアウトマウスを生成するために使用される。好ましくは、構築物は（１）標的配列に対して相同である配列を増幅する工程（例えば、長距離（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ）ＰＣＲを使用して）、および（２）相同配列が隣接するようにＰＣＲ産物中に別のポリヌクレオチド（例えば、選択マーカー）を挿入する工程による２工程で生成される。典型的には、ベクターは、プラスミドゲノムライブラリー由来のプラスミドである。完全な構築物はまた、典型的には、環状プラスミドである。従って、図１に示されるように、「外方向に向かう（ｐｏｉｎｔｉｎｇ）」オリゴヌクレオチドを用いる長距離ＰＣＲを使用すると、選択マーカーが容易に、好ましくは連結非依存性クローニングにより挿入され得るベクターが生じる。次いで、この構築物は、相同標的配列の機能を破壊し得るＥＳ細胞中に導入され得る。
【００６４】
相同組換えはまた、分化全能性の胚性幹細胞でない幹細胞および他の細胞型の遺伝子をノックアウトするために使用され得る。その例として、幹細胞には骨髄、リンパ、または神経前駆体および前駆細胞であり得る。このようなトランスジェニック細胞は特に、個々の発生経路の標的遺伝子機能の研究において有用であり得る。幹細胞は、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウサギ、ヒト、非ヒト霊長類などの全ての脊椎動物種から誘導され得る。
【００６５】
分化全能性でない細胞では、当該技術分野で公知である方法を使用して、標的の両コピーをノックアウトすることが望ましい場合がある。例えば、ポジティブ選択マーカー（例えば、Ｎｅｏｒ）の発現のために選択され、そして非ランダム組込みのためにスクリーニングされている標的遺伝子座での相同組換えを含む細胞は、高レベルの選択試薬（例えば、Ｇ４１８）に暴露されることによって、選択マーカー遺伝子の多数のコピーについてさらに選択され得る。次いで、これらの細胞は、標的遺伝子座でのホモ接合性について分析される。代替的に、第２の構築物は、異なったポジティブ選択マーカーを用いて２つの相同配列間に挿入して生成され得る。２つの構築物は、連続してかまたは同時にかのいずれかで細胞中に導入され、続いて、ポジティブマーカー遺伝子の各々について適切に選択され得る。最終細胞は標的の両対立遺伝子の相同組換えについてスクリーニングされる。
【００６６】
別の局面では、目的のクローンの２つの別々なフラグメントが増幅され、そして連結非依存性クローニング技術を使用してポジティブ選択マーカーを含むベクター中に挿入される。この実施形態では、目的のクローンは、一般的にはファージライブラリー由来であり、ＰＣＲ技術を使用して同定かつ単離される。連結非依存性クローニングは、２工程または１工程で実施され得る。
【００６７】
好ましい方法によれば、５’−３’　１本鎖領域が作製され得る場合、多数の部位を有する構築物が使用される。これらの構築物、好ましくはプラスミドは、指向性の四方向連結非依存性クローニングが可能なベクターを含む。
【００６８】
構築物は、典型的には、例えば、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子などの、ポジティブ選択マーカーをコードする配列；ポジティブ選択マーカーのいずれかの側部の制限酵素部位、および４塩基対の１つを含まない制限酵素部位に隣接する配列を含む。この配置によって、適切な制限酵素で構築物を消化し、そしてエキソヌクレアーゼ活性を有する化合物（例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ）でそのフラグメントを処理することによって、この配列中に１本鎖末端が生成され得る。
【００６９】
１つの好ましい実施形態では、標的化された変異をＥＳ細胞中に導入するために適した構築物は、プラスミドゲノムライブラリーから直接に調製される。特異的プライマーを用いる長距離ＰＣＲを使用して、目的の配列がプラスミドライブラリーから１工程で同定かつ単離される。この配列の単離に続いて、標的配列を破壊する第２のポリヌクレオチドは、目的の配列をコードする２つの領域の間に容易に挿入され得る。この直接的方法を使用して、標的化構築物は、７２時間ほどの短い時間で生成され得る。別の実施形態では、標的化構築物は、以下に詳細に記載されるように、ファージゲノムライブラリー中の目的のクローンの同定の後に調製される。
【００７０】
本明細書中に記載される方法は、ハイブリダイゼーション単離工程、制限酵素マッピング工程および多数クローニング工程を必要としない。さらに、いかなる遺伝子の機能も、これらの方法を使用して決定し得る。例えば、短い配列（例えば、ＥＳＴ）が、オリゴヌクレオチドプローブを設計するために使用され得る。これらのプローブは、構築物を作製する直接的増幅方法において使用されるか、またはより長い完全長の遺伝子のためのゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用され得る。従って、いかなる遺伝子もＥＳ細胞中での使用のために迅速かつ効率的に調製され得ることが意図される。
【００７１】
好ましい実施形態では、構築物は、プラスミドゲノムライブラリーから直接に調製される。このライブラリーは、当該技術分野で公知であるいかなる方法によっても生産され得る。好ましくは、マウスＥＳ細胞から得たＤＮＡは単離され、ＤＮＡをフラグメントに切断する制限エンドヌクレアーゼを使用して処理される。次いで、ＤＮＡフラグメントは、ベクター（例えば、バクテリオファージまたはファージミド（例えば、Ｌａｍｄａ　ＺＡＰＴＭ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）系）に挿入される。ライブラリーがＺＡＰＴＭ系で作製される場合、ＤＮＡフラグメントは、好ましくは約５〜約２０キロベースである。
【００７２】
好ましくは、ライブラリーが作られる生物は、識別可能な疾患または表現型効果を示さない。好ましくは、このライブラリーは、マウスライブラリーである。このＤＮＡは、いかなる細胞源または体液からも取得され得る。臨床業務で入手可能な細胞源の非限定的な例としては、ＥＳ細胞、肝臓、腎臓、血球、口腔内細胞、頸膣部細胞、尿からの上皮細胞、胎児性細胞、または組織診によって得られる組織中に存在する任意の細胞が挙げられる。体液としては、尿、血液脳脊髄液（ＣＳＦ）、および感染または炎症の部位の組織浸出液が挙げられる。ＤＮＡは、細胞または体液から、当該技術分野で公知である任意の方法を使用して抽出した。好ましくは、ＤＮＡは、胚性幹細胞のコンフルエントな１００ｍｍプレートに、５ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５％ＳＤＳおよび１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ）を添加して抽出される。次いで、これらの細胞は、約６０℃で数時間または完全に溶解されるまでインキュベートされる。ゲノムＤＮＡは、溶解された細胞からフェノール：クロロホルムによる穏やかな抽出を数回繰り返し、続いてエタノール沈殿によって精製される。便宜的には、ゲノムライブラリーは、プール中に配列される。
【００７３】
好ましい実施形態では、目的の配列は、オリゴヌクレオチドプライマーおよび長距離ＰＣＲを使用してプラスミドライブラリーから同定される。典型的には、プライマーは、部分的遺伝子配列（例えば、ｃＤＮＡまたはＥＳＴ配列）から得られた配列情報に基づいて設計される外方向に向かうプライマーである。例えば、図１に示されるように、生成物は、各プライマー間に配置される領域を除外した線状フラグメントである。
【００７４】
好適であると判断されたＰＣＲ条件は、以下の実施例中に記載される。最適なＰＣＲ条件は当業者によって容易に決定され得ることが理解される（例えば、ＰＣＲ２：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ；Ｙｕら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，５８：３３５−９（１９９６）；Ｍｕｎｒｏｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９２：２２０９−１３（１９９５）を参照のこと）。ライブラリーのＰＣＲスクリーニングは、ライブラリーが平板化され、フィルターが作られ、放射活性プローブが調製され、かつ、ハイブリダイゼーション条件が確定されなければならない、従来のハイブリダイゼーションスクリーニングに関連する問題および時間的遅延の多くを取り除く。ＰＣＲスクリーニングは、目的の配列（遺伝子）に対するオリゴヌクレオチドプライマーのみを必要とする。ＰＣＲ産物は、微量濾過、透析、ゲル電気泳動などを含むがこれらに限定されない種々の方法で精製され得る。新規なＤＮＡ合成が生じ得ないように、ＰＣＲに使用されるポリメラーゼを取り除くことが望ましい場合がある。好適な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、市販される（例えば、ＶｅｎｔＴＭ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｄｅｅｐ　ＶｅｎｔＴＭ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＨｏｔＴｕｂＴＭ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、Ｔｈｅｒｍｏ　ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ｒＢｓｔＴＭ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ）、ＰｆｕＴＭ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ａｍｐｌｉｔａｑ　ＧｏｌｄＴＭ　（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）、およびＥｘｐａｎｄＴＭ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ））。
【００７５】
完成された構築物を形成するために、標的配列を破壊する配列は、ＰＣＲ増幅産物中に挿入される。例えば、本明細書中に記載される場合、直接的方法は、長距離ＰＣＲ産物（すなわち、ベクター）および１つのフラグメント（すなわち、選択マーカーをコードする遺伝子）を連結することを含む。上記のように、ベクターは、標的ＤＮＡ配列に相同である２つの異なった配列領域を含む。好ましくは、ベクターはまた、選択マーカー（例えば、アンピシリン）をコードする配列を含む。ベクターおよびフラグメントは、１本鎖末端を形成するために処理される場合、フラグメントが標的遺伝子と実質的に相同である２つの異なった領域間に配置されるようにアニールするように設計される。
【００７６】
クローニングのいかなる方法も好適であるけれども、連結非依存性クローニング戦略が、選択マーカーに隣接する２つの異なった相同領域を含む構築物をアセンブリするために使用されることが好ましい。連結非依存性クローニング（ＬＩＣ）は、キナーゼまたはリガーゼを使用することなくポリヌクレオチドを指向性クローニングするための戦略である（例えば、Ａｓｌａｎｉｄｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１８：６０６９−７４（１９９０）；Ｒａｓｈｔｃｈｉａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，６：３０−３６（１９９５）を参照のこと）。１本鎖テール（ｔａｉｌ）（クローニング部位またはアニーリング配列とも呼ばれる）は、通常たった１つのｄＮＴＰの存在下にＴ４ＤＮＡポリメラーゼでベクターを（消化される制限酵素部位で）処理することによって、ＬＩＣベクター中に作製される。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性は、反応混合物中に存在する１つのｄＮＴＰに対応する残基に遭遇するまでヌクレオチドを除去する。この時点で、この酵素の５’−３’ポリメラーゼ活性は、さらなる切除を阻止するためにエキソヌクレアーゼ活性を相殺する。ベクターは、作製される１本鎖テールが非相補的であるように設計される。例えば、ｐＤＧ２ベクターでは、４つのアニーリング部位のうち１本鎖テールはいずれも互いに相補的でない。ＰＣＲ産物は、オリゴヌクレオチドプライマー中に適切な５’伸長を形成することによって作製される。ＰＣＲ産物は、ｄＮＴＰ（および（鋳型として使用される場合）元々のプラスミド）を取り除くために精製され、次いで、適切なｄＮＴＰの存在下にＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理されて、特異的ベクター適合性オーバーハングを生成する。クローニングは、適合性テールのアニーリングによって生じる。１本鎖テールは、例えば、化学的手段または酵素的手段を使用して、クローンフラグメントの末端で作製される。相補的テールは、ベクター上で作製されるが、挿入物を有さないベクターのアニーリングを阻止するために、ベクターテールは、互いに相補的でない。テールの長さは、少なくとも約５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１２ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【００７７】
１つの実施形態では、重複するベクターおよびフラグメントを同じ反応物中に置くことは、それらをアニールするには充分である。代替的に、相補的配列は、結合され、加熱され、そしてゆっくりと冷却され得る。好ましくは、加熱工程は、約６０℃〜約１００℃、より好ましくは約６０℃〜８０℃、さらにより好ましくは６０℃〜７０℃である。次いで、加熱反応物は、冷却され得る。一般的には、冷却は、かなりゆっくり生じる。例えば、この反応物は、約１時間後に徐々にほぼ室温となる。冷却は、アニーリングが可能となるように充分にゆっくりでなければならない。アニールされたフラグメント／ベクターは、直ちに使用され得るか、または使用まで−２０℃で冷凍保存され得る。
【００７８】
さらにアニーリングは、適切な条件を達成するために塩および温度を調節して実施され得る。ハイブリダイゼーション反応は、約１０ｍＭ　ＮａＣｌ〜約６００ｍＭ　ＮａＣｌの範囲の溶液中で約３７℃〜約６５℃の範囲の温度で実施され得る。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、塩濃度および温度の両方で決定されることが理解される。例えば、１０ｍＭの塩中にて３７℃で実施されるハイブリダイゼーションは、５００ｍＭの塩中にて６５℃で実施されるものと同様なストリンジェンシーであり得る。本発明については、相同的な相補性配列の間にハイブリッドを形成するいかなるハイブリダイゼーション条件も使用され得る。
【００７９】
図１に示されるように、１つの実施形態では、ベクター部分が（長距離ＰＣＲを使用して、プラスミドライブラリーから増幅された）標的遺伝子に対して実質的に相同である２つの異なった領域を含み、そして、フラグメントが選択マーカーをコードする遺伝子である場合、構築物は、これらの任意のアニーリング手順を使用した後に作成される。
【００８０】
アニーリング後、構築物は、当該技術分野で公知である方法によってコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞中へ形質転換され、構築物を増幅する。次いで、単離された構築物は、ＥＳ細胞中への導入のための準備が整う。
【００８１】
別の実施形態では、目的のクローンは、ＰＣＲを使用してプールされたゲノムライブラリー中で同定される。１つの実施形態では、ＰＣＲ条件は、選択マーカーをコードする遺伝子がポジティブに同定されたクローン中に直接的に挿入され得るようなものである。このマーカーは、標的ＤＮＡに対して実質的な相同性を有する２つの異なった配列の間に配置される。
【００８２】
ゲノムファージライブラリーは、当該技術分野で公知である任意の方法によって調製され得る。好ましくは、マウス肺性幹細胞ライブラリーは、λファージ中でゲノムＤＮＡを長さ約２０キロベースであるフラグメントに切断して調製される。次いで、これらのフラグメントは、任意の好適なλクローニングベクター（例えば、λＦｉｘ　ＩＩまたはλＤａｓｈ　ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａ））中に挿入される。
【００８３】
ライブラリーから多数のクローンを迅速に、かつ効率的にスクリーニングするために、プールは、平板培養されたライブラリーを作製し得る。好ましい実施形態では、ゲノムλファージライブラリーは、プレート当たり約１，０００クローン（プラーク）の密度で平板培養される。生物の全ゲノムを何度も表すに充分なプレートが、作製される。例えば、約１，０００，０００クローン（１０００プレート）は、約８個のゲノム等価物を生じる。次いで、プラークが、例えば、緩衝溶液でプレートを覆い、プレートをインキュベートし、そして緩衝液を再収集して回収される。使用される緩衝液の量は、プレートの大きさによって変化する。一般的に、直径１００ｍｍの１つのプレートは、約４ｍｌの緩衝液を使用して覆われ、約２ｍｌが回収される。
【００８４】
個々のプレート溶解物はこの手順のいずれの時点でもプールされ得、これらはいかなる組み合わせでもプールされ得ることが理解されるだろう。しかし、１つのクローンのその後の同定を容易にするには、各プレート溶解物を別個に保存し、次いでプールとすることが好ましい。例えば、各２ｍｌの溶解物は、９６穴ディープウェルプレートに置かれ得る。次いで、プールは、各ウェルからある量、好ましくは約１００μｌを取り出し、新規なプレートのウェル中でそれらを一緒にすることによって形成され得る。好ましくは、１２の個々のプレート溶解物１００μｌが１つのウェルで一緒にされ、１２，０００クローンのライブリラリーを表す１．２ｍｌのプールを形成する。
【００８５】
次いで各プールは、標的遺伝子を増幅することが公知である１セットのＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ増幅される。標的遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋまたはＥＭＢＬなどの公に入手可能である核酸配列データベースから得られる公知の全長遺伝子、またはより好ましくは、部分的ｃＤＮＡ配列であり得る。これらのデータベースは、発現配列タグ（ＥＳＴ）として公知である部分的ｃＤＮＡ配列を含む。オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーは、当該技術分野で公知である任意の方法でいかなる生物からも単離され得るか、あるいは好ましくは、化学的手段で合成され得る。
【００８６】
一旦、標的遺伝子のポジティブクローンがゲノムライブラリーで同定されると、標的遺伝子の別個の部分をコードする２つのフラグメントが、生成されなければならない。言い換えると、標的の小さな公知領域（例えばＥＳＴ）のフランキング領域が生成される。各フランキング領域のサイズは重大でなく、１００塩基対ほど少ないものから１００ｋｂほど多いものまでにわたり得るが、好ましくは、各フランキングフラグメントは、約１ｋｂ長より長く、より好ましくは約１〜約１０ｋｂ、さらにより好ましくは約１〜約５ｋｂである。当業者は、より大きなフラグメントがＥＳ細胞での相同組換え事象の数を増加し得るが、より大きなフラグメントはまた、クローニングするにはより困難であることを認識する。
【００８７】
１つの実施形態では、フランキングフラグメントを増幅するために使用されるオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーの１つは、ライブラリークローニングベクター（例えば、λファージ）に特異的である。従って、ライブラリーがλファージライブラリーである場合、λファージアームに特異的なプライマーは、長いフランキングフラグメントを生成するポジティブクローンに特異的なプライマーと組合わせて使用され得る。多数のＰＣＲ反応が、異なった組み合わせのプライマーを試験するためにセットアップされ得る。好ましくは、使用されるプライマーは、長さ約２〜約６ｋｂのフランキング配列を生成する。
【００８８】
好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、フラグメントがクローニングされるベクターに相補的な５’配列を有するように設計される。さらに、プライマーはまた、構築物がアセンブリされる場合、フランキング配列がベクターおよび互いに関して適切な３’−５’方向にあるように設計される。
【００８９】
従って、ＰＣＲに基づく方法を使用して、例えば、ポジティブクローンは、電気泳動ゲル上のバンドを可視化することにより同定され得る。
【００９０】
１つの局面では、クローニングは、ベクターおよび２つのフラグメントを含む。ベクターは、ポジティブ選択マーカー、好ましくはＮｅｏｒ、および標的遺伝子の２つの異なった領域のためのポジティブ選択マーカーの両側部上のクローニング部位を含む。必要に応じて、このベクターはまた、好ましくはポジティブ選択マーカーの反対に配置されるスクリーニングマーカー（レポーター遺伝子）をコードする配列を含む。スクリーニングマーカーは、相同配列のフランキング領域の外側に配置されるであろう。図３Ａは、ベクターの１つの側部に配置される、スクリーニングマーカーであるＧＦＰを有するベクターの１つの実施形態を示す。しかし、スクリーニングマーカーは、ポジティブ選択マーカーであるＮｅｏｒの反対の側部上のＮｏｔＩおよびＳｉｔｅ４の間のどこにでも配置され得る。　【００９１】
好適なベクターの１つの例は、配列番号１の配列を有する図２に示されるプラスミドベクターである。図１で「部位１、２、３または４」と呼ばれる特異的核酸連結非依存性クローニング部位（本明細書中ではアニーリング部位とも呼ぶ）は、本明細書中でも示される。一般的に、クローニング部位は、少なくとも１つの型の塩基、すなわちチミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）またはアデニン（Ａ）を欠く。従って、１つの欠失するヌクレオチドのみの存在下にポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼの両者として作用する酵素とベクターを反応させることは、オーバーハングを作製する。例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼの両者として作用する。従って、ポリメラーゼ活性に利用可能なヌクレオチドが不充分である場合、Ｔ４は、エキソヌクレアーゼとして作用する。従って、特異的オーバーハングは、ｄＴＴＰのみの存在下にＴ４ＤＮＡポリメラーゼとｐＤＧ２ベクターを反応させることによって作製され得る。本発明の実施において有用な他の酵素、例えばウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）（例えば、ＷＯ９３／１８１７５を参照のこと）は当業者には公知である。本明細書中に例示されるベクターは、２４ヌクレオチドのオーバーハングを有する。首尾よい連結非依存性クローニングには、５ヌクレオチドほどしか必要でないことは、当業者には公知である。
【００９２】
別の実施形態では、構築物は、２工程クローニング手順でアセンブリされる。第１工程で、相同な各クローニング領域は、ベクターのアニーリング部位の２つに別個にクローニングされる。例えば、相同な「上流」領域は、アニーリング部位１および２にクローニングされ、一方、別個のクローニングである相同な「下流」領域はアニーリング部位３および４中にクローニングされる。一旦、相同な１つの領域の各々を含むクローンが同定されると、制限酵素で各クローンを消化することによって、相同性を有する両領域を含むターゲティング構築物が作製され得る（ここで、１つの酵素はアニーリング部位１（例えば、図２ＡのＮｏｔＩ）の外側を消化し、別の酵素はポジティブ選択マーカーとアニーリング部位３（例えば、図２ＡのＳａｌＩ）との間を消化する）。それぞれの構築物から得たフランキング相同領域を含むフラグメントは、（例えば、ゲル電気泳動で）精製され、そして当該技術分野で公知である標準的連結技術を使用して結合されて、結果として得られるターゲティング構築物を生産する。
【００９３】
さらに別の実施形態では、本発明の１つの局面による構築物は単一工程、四方向連結手法で形成され得る。ベクターおよびフラグメントは上記のように処理される。簡単には、ベクターは処理されて２片を形成し、各片は各末端に特異的配列の１本鎖テイルを有する。同様に、ＰＣＲ増幅フランキングフラグメントも処理されて、ベクター片のテイルと相補的である１本鎖テイルを形成する。処理されたベクター片およびフラグメントは結合され、上記のようにアニールされる。１本鎖テイルの特異性ゆえに、最終構築物は適切な配向性を有するポジティブ選択マーカーによって分離されたフラグメントを含むであろう。
【００９４】
最終プラスミド構築物は細菌内で増幅され、精製され、次いでＥＳ細胞中に導入され得るか、あるいは使用まで−２０℃に冷凍貯蔵される。所望である場合には、ベクターは胚幹細胞株中に導入され（例えば、エレクトロポレーションで）、そして導入されたＤＮＡが内因性ＤＮＡと相同組換えされた細胞が選択される（例えば、Ｌｉ，ｅｔ．ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６９：９１５２６（１９９２）を参照のこと）。成功する組換えは、ＰＣＲおよび／またはサザン分析のような当該分野で公知である種々の技術を使用して立証され得る。代表的に、数百の個々のコロニーがＧ４１８（Ｎｅｏカセットについて）での薬剤選択により選択され、ＤＮＡ調製のために拡大され、そしてＰＣＲ分析によって相同組換えについてスクリーニングされる。ＰＣＲスクリーニング手順は、ターゲティングベクターに存在しない標的遺伝子特異的オリゴヌクレオチド、およびＮｅｏ（または他の選択可能マーカー）カセットに対応するオリゴヌクレオチドを使用する。ターゲティングベクターの外側にあるオリゴヌクレオチドの選択は、ターゲティングベクターのランダムな組込みから相同組換え体を区別するために使用される。一般的には、ターゲティングベクター上に存在しない４つの非依存性標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドは、Ｎｅｏの挿入部位に隣接する標的遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドと組み合わせた野生型ＥＳ細胞ＤＮＡ上で試験される（図９）。バックグラウンドのバンドを生成するか、あるいは予定された大きさの産物を生ずることができないオリゴヌクレオチドは除かれる。１つの標的遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは選択され、Ｎｅｏカセットに対応するオリゴヌクレオチドと対を形成する。このスクリーニングでＰＣＲポジティブであるＥＳ細胞は、もとのオリゴヌクレオチド対に隣接するがこれとは区別される異なった対の標的遺伝子特異的オリゴヌクレオチドおよびＮｅｏ遺伝子（または他の選択可能マーカー）特異的オリゴヌクレオチドを使用する第２のＰＣＲ実験によって確認される。さらに、この方法は、マーカー特異的オリゴヌクレオチドと結合した選択可能マーカーの反対側に配置される標的遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドを使用して繰り返され得る。この方法では、ターゲティングベクターの両相同配列の適切な組込みが立証される。
【００９５】
サザンブロットハイブリダイゼーションもまた、ターゲティングベクター上に含まれないが、相同組換えの予定されるクロスオーバー部位に隣接するプローブを使用して、ＥＳ細胞標的化事象を確認するために使用し得る。相同組換えについて試験するサザンブロット実験は、野生型染色体と変異体遺伝子標的対立遺伝子を表す２つの区別されるバンドを検出すべきである。高分子量ゲノムＤＮＡは、コントロールＥＳ細胞親株、および相同組換えに関してＰＣＲポジティブであるＥＳ細胞株から調製される。このＤＮＡは、標的遺伝子ＤＮＡ相同性のアーム内でターゲティングベクターを切断せず相同組換えの診断となることが制限酵素マッピングによって証明されている制限酵素（ＥｃｏＲＩ）で消化される。ＥｃｏＲＩ部位がＮｅｏ遺伝子中に存在するので、相同組換え事象は、Ｎｅｏカセットの挿入およびＥｃｏＲＩ部位の付加となるべきである。この部位の付加は、プローブにハイブリダイズするバンドの大きさの全体的低下となることが予測される。消化されたＤＮＡは１％ＴＡＥアガロースゲル上で分離され、ナイロン膜に移送され、紫外線（ＳｔｒａｔａＬｉｎｋｅｒ）で架橋され、そして３２−Ｐ標識ＤＮＡプローブでハイブリダイズされる。このプローブは、ターゲティングベクター上にあるＤＮＡ配列とハイブリダイズするのでなく、相同組込みの部位に隣接する位置にハイブリダイズする。
【００９６】
次いで、選択された細胞は動物（例えば、マウス）の胚盤胞（または例えば桑実胚などの生存可能な動物を作製する目的に適した発育の他の段階）中に注入されて、キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，．ｉｎ　Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ　ａｎｄ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，　１１３−１５２　（１９８７）（参照）。また、選択されたＥＳ細胞を、分離されたマウス胚性細胞と凝集させて、凝集キメラを形成し得る。次いで、キメラ胚は好適な偽妊娠したメスの里親動物中に移植され、胚は満期まで導かれ得る。相同的に組換えられたＤＮＡをその生殖細胞中に有するキメラ子孫が、動物の細胞の全てが相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させるために使用され得る。１つの実施形態では、キメラ子孫マウスは、標的遺伝子にヘテロ接合性破壊を有するマウスを生成するために使用される。次いで、ヘテロ接合性ノックアウトマウスは交尾され得る。通常、このような交尾の結果の１／４が標的遺伝子にホモ接合性破壊を有するであろうことは、当該技術分野で周知である。
【００９７】
次いで、ヘテロ接合性およびホモ接合性ノックアウトマウスは正常な野生型マウスと比較されて、標的遺伝子の破壊が表現型変化、特に病理学的変化を引き起こすか否かを決定し得る。例えば、ヘテロ接合性およびホモ接合性マウスは、物理的試験、検死、組織像、臨床化学、全血球数、体重、器官重量、および骨髄の細胞学的評価により、表現型変化について評価され得る。
【００９８】
１つの実施形態では、標的遺伝子の破壊に関連する表現型（または表現型変化）はデータベース中に入れるか、あるいは蓄えられる。好ましくは、データベースは、（ｉ）遺伝子型データ（例えば、破壊された遺伝子の同定）および（ｉｉ）遺伝子型データに関連する表現型データ（例えば、遺伝子破壊から生じる表現型）を含む。このデータベースは好ましくは、電子データベースである。さらに、このデータベースは検索可能であるように、好ましくは検索ツールと組み合わされる。
【００９９】
さらに、本発明は、組換え方法を使用して生産された動物などの条件ノックアウト動物を意図する。バクテリオファージＰ１Ｃｒｅリコンビナーゼ、および酵母プラスミドから得たｆｌｐリコンビナーゼは、特異的標的部位（ｃｒｅリコンビナーゼではｌｏｘＰ部位およびｆｌｐリコンビナーゼではｆｒｔ部位）でＤＮＡを切断し、第２の切断部位へこのＤＮＡの連結を触媒する部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼ酵素の２つの非制限的例である。多数の好適な別の部位特異的リコンビナーゼが記載されており、これらの遺伝子は本発明の方法に従って使用され得る。このようなリコンビナーゼとしては、バクテリオファージλのＩｎｔリコンビナーゼ（Ｘｉｓを有するか、あるいは有さない）（Ｗｅｉｓｂｅｒｇ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，ｉｎ　Ｌａｍｂｄａ　ＩＩ，（Ｈｅｎｄｒｉｘ，Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．編），Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２１１−５０頁（１９８３）（本明細書中に参考として導入される））；ＴｐｎＩおよびβ−ラクタマーゼ転移因子（Ｍｅｒｃｉｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：３７４５−５７（１９９０））；Ｔｎ３リソルバーゼ（Ｆｌａｎａｇａｎ　＆　Ｆｅｎｎｅｗａｌｄ　Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２０６：２９５−３０４（１９８９）；Ｓｔａｒｋ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５８：７７９−９０（１９８９））；酵母リコンビナーゼ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：６１０−１８（１９９０））；Ｂ．スブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＳｐｏＩＶＣリコンビナーゼ（Ｓａｔｏ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２：１０９２−９８　（１９９０））；Ｆｌｐリコンビナーゼ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ　＆　Ｓａｄｏｗｓｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２０５：６４７−６５８（１９８９）；Ｐａｒｓｏｎｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：４５２７−３３（１９９０）；Ｇｏｌｉｃ　＆　Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ，Ｃｅｌｌ，５９：４９９−５０
（１９８９）；Ａｍｉｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２１４：５５−７２（１９９０））；Ｈｉｎリコンビナーゼ（Ｇｌａｓｇｏｗ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１００７２−８２　（１９８９））；免疫グロブリンリコンビナーゼ（Ｍａｌｙｎｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ，５４：４５３−４６０（１９８８））；およびＣｉｎリコンビナーゼ（Ｈａｆｆｅｒ　＆　Ｂｉｃｋｌｅ，ＥＭＢＯ　Ｊ．，７：３９９１−３９９６（１９８８）；Ｈｕｂｎｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．，２０５：４９３−５００（１９８９））（全ては本明細書中に参考として導入される）が挙げられる。このようなシステムは、Ｅｃｈｏｌｓ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４６９７−１４７００（１９９０））：ｄｅ　Ｖｉｌｌａｒｔａｙ（Ｎａｔｕｒｅ，３３５：１７０−７４（１９９８）：Ｃｒａｉｇ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２２：７７−１０５（１９８８））；Ｐｏｙａｒｔ−Ｓａｌｍｅｒｏｎ，ｅｔ　ａｌ．，（ＥＭＢＯ　Ｊ．８：２４２５−３３（１９８９））；Ｈｕｎｇｅｒ−Ｂｅｒｔｌｉｎｇ，ｅｔ　ａｌ．，（Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９２：１０７−１６（１９９０））；およびＣｒｅｇｇ　＆　Ｍａｄｄｅｎ　（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１９：３２０−２３（１９８９））（全てが本明細書中に参考として導入される）によって議論されている。
【０１００】
Ｃｒｅは均質に精製され、ｌｏｘＰ部位との反応は広く特性化されている（Ａｂｒｅｍｓｋｉ　＆　Ｈｅｓｓ　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５９：１５０９−１４（１９８４）（本明細書中に参考として導入される））。Ｃｒｅタンパク質は分子量３５，０００を有し、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ／Ｄｕ　Ｐｏｎｔから市場で入手され得る。このｃｒｅ遺伝子（Ｃｒｅタンパク質をコードする）はクローン化され、発現されている（Ａｂｒｅｍｓｋｉ，ｅｔ　ａｌ．　Ｃｅｌｌ３２：１３０１−１１（１９８３）（本明細書中に参考として導入される）。Ｃｒｅタンパク質は、同じまたは異なったＤＮＡ分子上に存在し得る２つのｌｏｘＰ配列の間の組換えを仲介する（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４５：２９７−３０９（１９８１））。ｌｏｘＰ部位の内部スペーサー配列は非対称であるから、２つのｌｏｘＰ部位は互いに相対する方向性を示し得る（Ｈｏｅｓｓ　＆　Ａｂｒｅｍｓｋｉ　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：１０２６−２９（１９８４））。したがって、同じＤＮＡ分子上の２つの部位が直接的に繰り返された方向にある場合、Ｃｒｅは部位間のＤＮＡを切除するであろう（Ａｂｒｅｍｓｋｉ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ　３２：１３０１−１１（１９８３））。しかしながら、もしもこの部位が互いに反転されるなら、これらの間のＤＮＡは組換え後に切除されるのではなく単に反転される。したがって、直接方向に２つのｌｏｘＰ部位を有する環状ＤＮＡ分子が組換えられて、２つのより小さな環を生産する。これに対して、反転された方向に２つのｌｏｘＰ部位を有する環状分子は、ｌｏｘＰ部位が隣接するＤＮＡ配列を単に反転する。さらに、リコンビナーゼ作用は、標的が別個のＤＮＡ分子上に存在する場合、標的部位の遠位にある領域の相互交換を生じ得る。
【０１０１】
リコンビナーゼは、ノックアウトモデルの遺伝子機能を特性化する重要な用途を有する。本明細書中に記載される構築物が標的遺伝子を破壊するために使用される場合、ポジティブ選択マーカーの挿入が標的遺伝子の翻訳開始部位の下流（３’）に生じるとき融合転写物が生産され得る。融合転写物は未知の結果を伴うある程度のタンパク質発現を生じ得る。ポジティブ選択マーカー遺伝子の挿入がすぐ近くの遺伝子の発現に影響を与え得ることが示唆されている。所与の表現型が遺伝子の不活性化、あるいはすぐ近くの遺伝子の転写に関連しているか否かを識別し得ないので、これらの効果はノックアウト事象後に遺伝子機能を決定することを難しくする場合がある。両方の潜在的問題は、リコンビナーゼ活性を利用することによって解決される。ポジティブ選択マーカーに同じ方向のリコンビナーゼ部位が隣接する場合、対応するリコンビナーゼを加えると、ポジティブ選択マーカーが除去される。このようにして、ポジティブ選択マーカーにより生じる効果または融合転写物の発現は避けられる。
【０１０２】
１つの実施形態では、精製されたリコンビナーゼ酵素は直接微量注入法によって細胞へもたらされる。他の実施形態では、リコンビナーゼは、リコンビナーゼ遺伝子が機能的プロモーターに作動可能に連結される同時トランスフェクトされた構築物またはベクターから発現される。この実施形態の別な態様は、いつおよびどこで組換えが生じるかを選択することが可能である組織特異的または誘導性リコンビナーゼ構築物の使用である。誘導性形態のリコンビナーゼ仲介組換えを実行するための１つの方法は、誘導性であるかあるいは組織特異的なプロモーターまたは他の遺伝子調節因子を使用して所望のリコンビナーゼ活性を発現するベクターの使用に関する。誘導性発現要素は、好ましくは所望のリコンビナーゼ活性の発現の誘導性制御または活性化を可能とするように作動的に配置される。このような誘導性プロモーターまたは他の遺伝子調節因子の例としては、テトラサイクリン、メタロチオネイン、エクジソン、および他のステロイド反応性プロモーター、ラパマイシン反応性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない（Ｎｏ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−５１（１９９６）；Ｆｕｒｔｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：９３０２−６（１９９４））。使用することができるさらなる調節因子としては、ウイルス性プロモーターなどの特異的転写因子を必要とするプロモーターが挙げられる。このようなプロモーターを導入するベクターは、必要な転写因子を発現する細胞中でリコンビナーゼ活性のみを発現する。
【０１０３】
当該技術分野で公知である他の方法が、本発明のトランスジェニック細胞およびノックアウトマウスを生産するために使用され得る。例えば、米国特許第５，４６４，７６４号、米国特許第５，４８７，９９２号、米国特許第５，６２７，０５９号、米国特許第５，６３１，１５３号に記載される方法は、本発明によってもたらされる標的遺伝子の破壊を含むトランスジェニック細胞またはノックアウトマウスを生産するために使用され得る。
【０１０４】
（疾患のモデル）
本明細書中に記載される細胞および動物に基づいた系は、疾患のモデルとして使用され得る。マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロピッグ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギおよび非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジーを含むがこれらに限定されないあらゆる種の動物が、疾患動物モデルを生み出すために使用され得る。さらに、ヒトから得た細胞が使用され得る。これらの系は種々の用途において使用され得る。例えば、細胞および動物に基づいたモデル系は、標的遺伝子をさらに特性化するために使用され得る。このようなアッセイは、疾患症状を回復させることが可能である化合物を同定するように設計されたスクリーニング戦略の一部として使用される。したがって、動物系および細胞系モデルは、疾患治療に有効であり得る医薬品、製剤、治療および処置を同定するために使用され得る。
細胞に基づいた系は、疾患症状を回復させるように作用し得る化合物を同定するために使用され得る。例えば、このような細胞系は、疾患症状を回復させる能力を示すと推定される化合物に暴露され得る。これは、暴露された細胞中で疾患症状のこのような回復を誘導するに充分な濃度で、かつ充分な時間で行う。暴露された後、細胞は１つまたは複数の疾患細胞性表現型が、より正常な、あるいはより野生型の非疾患表現型に似ているように変化されているか否かを決定するために試験される。
さらに、本明細書中に記載されるものなどの動物系疾患系は、疾患症状を回復させることができる化合物を同定するために使用され得る。このような動物モデルは、疾患または動物の他の表現型特徴を治療することにおいて有効であり得る医薬品、製剤、治療および処置を同定するための試験物質として使用され得る。例えば、動物モデルは、疾患症状を回復させる能力を示すと推定される化合物または薬剤に暴露され得る。これは、暴露された動物の疾患症状のこのような回復を誘導するのに充分な濃度および充分な時間で行う。暴露に対する動物の反応は、疾患に関連する障害の逆転（ｒｅｖｅｒｓａｌ）を評価してモニターされ得る。暴露は、本明細書中に記載されるモデル動物の妊娠中に母動物を治療し、それによって疾患または表現型を阻止または回復させ得る化合物または薬剤に胚または胎児を暴露することを含み得る。新生児、若年および成人の動物もまた暴露され得る。
【０１０５】
より具体的には、本発明の動物モデルを使用して、薬剤および／または化合物を同定する方法が、好ましくは、標的遺伝子をコードする遺伝子中の破壊に関連する生理学的、組織学的または行動的表現型に影響を与える薬剤および／または化合物の能力に基づいて提供される。
【０１０６】
１つの実施形態では、本発明は、標的遺伝子の発現または機能を調節する能力を有する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は、標的遺伝子に破壊を有する、本発明の非ヒトトランスジェニック動物、好ましくはマウスに有効量の薬剤を投与することを含む。この方法は、例えば薬剤に対する動物の反応を測定し、このような動物の反応をコントロール動物と比較することを含む。「生理学的反応」とは、測定可能である動物のあらゆる生物学的または物理的パラメーターである。生理学的反応を評価するために、分子アッセイ（例えば、遺伝子転写、タンパク質生産および分解速度）、物理的パラメーター（例えば、運動生理学的試験、呼吸の種々のパラメーターの測定、心拍数または血圧の測定、出血時間の測定、ＰＴＴ．Ｔ、またはＴＴ）および細胞アッセイ（例えば、細胞表面マーカーの免疫組織化学アッセイ、または凝集または増殖する細胞の能力）が使用され得る。
【０１０７】
本発明の動物および細胞は、標的遺伝子の破壊に関係する表現型に関連する疾患、障害または症状のためのモデルとして使用され得る。
【０１０８】
本発明はまた、行動表現型に関係する新規な治療を試験および開発するための特殊な動物モデルを提供する。行動表現型の分析は、例えば、神経学的、神経心理学的、または精神病性疾病などのヒトの遺伝性疾患のために提案される遺伝的および薬理学的治療の有効性を試験するために有用な動物モデルの開発を可能とする。
【０１０９】
測定された種々の挙動の統計的分析は、当業者にとって日常的に使用される任意の従来の統計プログラム（例えば、「分散分析」またはＡＮＯＶＡなど）を使用して実施され得る。約０．０５以下の「ｐ」値が一般的に統計的に有意であると考えられるが、わずかに高いｐ値は統計的に有意な差をなおも示し得る。異常な挙動を統計的に分析するために、トランスジェニック動物（またはその群）の挙動と野生型マウス（またはその群）の挙動を、典型的にはある定められた条件下に比較を行う。本明細書中に使用されるように、「異常な行動」とは、標的遺伝子に破壊を有しない動物（例えば野生型マウス）と異なる、標的遺伝子に破壊を有する動物（例えばトランスジェニック動物）によって示される挙動を指す。異常な挙動は客観的に測定（または観察）および比較され得る任意数の標準的挙動からなる。比較する場合、ノックアウト動物と野生型コントロール動物との間に意義ある挙動の差が本当に存在することを確認するためには、その変化が統計的に有意であることが好ましい。測定または観察され得る挙動の例としては、運動失調、急速四肢運動、眼球運動、呼吸、運動活性、認識、情緒的挙動、社会的挙動、機能亢進、過敏症、不安、学習障害、異常報酬挙動および攻撃性などの異常社会的相互作用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
一連の試験は、異常な挙動を同定するための神経学的および神経心理学的試験を含む、本発明の動物モデルの挙動的表現型を測定するために使用され得る。これらの試験は例えば、学習および記憶、食事、疼痛、攻撃性、有性生殖、不安、抑うつ、精神分裂病、および薬物乱用に関する異常な挙動を測定するために使用され得る（例えば、ＣｒａｗｌｅｙおよびＰａｙｌｏｒ，Ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ａｎｄ　Ｂｅｈａｖｉｏｒ　３１：１９７−２１１（１９９７）を参照のこと）。
【０１１１】
社会的相互作用試験は種々の設定において他の動物へマウスを暴露することを含む。動物の社会的挙動（例えば、接触、登上、匂いかぎおよび交尾）が続いて評価される。次いで、挙動における差異は統計的に解析され、比較され得る（例えば、Ｓ．Ｅ．Ｆｉｌｅ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．２２：９４１−９４４（１９８５）；Ｒ．Ｒ．Ｈｏｌｓｏｎ，Ｐｈｙｓ．Ｂｅｈａｖ．３７：２３９−２４７（１９８６）参照）。挙動試験の例としては下記のものが挙げられる。
【０１１２】
マウス驚愕反応試験は、通常、動物を感覚（通常、聴覚性）刺激に暴露し、動物の驚愕反応を測定することを含む（例えば、Ｍ．Ａ．Ｇｅｙｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．２５：４８５−４９８（１９９０）；ＰａｙｌｏｒおよびＣｒａｗｌｅｙ，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　１３２：１６９−１８０（１９９７）参照）。（正常な驚愕反応からの）抑制パーセントは驚愕パルスに先立って短い低度の前パルスを使用して、まず動物に「合図を与える（ｃｕｅｉｎｇ）」ことによって測定される前パルス抑制試験もまた使用され得る。
【０１１３】
電気ショック試験は、通常、電気を流した表面への暴露および例えば、運動活性、学習、社会的挙動など、その後の挙動の測定を含む。挙動は測定され、標準的な統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｇ．Ｊ．Ｋａｎｔ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．２０：７９３−７９７（１９８４）；Ｎ．Ｊ．Ｌｅｉｄｅｎｈｅｉｍｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．３０：３５１−３５５（１９８８）参照）。
【０１１４】
テイルピンチまたは固定化試験は、動物の尾部に圧力を加え、かつ／または動物の運動を抑制することを含む。運動活性、社会的挙動および認識挙動が、測定される領域の例である（例えば、Ｍ．Ｂｅｒｔｏｌｕｃｃｉ　Ｄ’Ａｎｇｉｃ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．５５：１２０８−１２１４（１９９０）参照）。
【０１１５】
新規の試験は、通常、新奇な環境および／または新奇な対象への暴露を含む。新奇な環境および／または新奇な対象の周囲での動物の運動挙動は測定され、統計的に解析される（例えば、Ｄ．Ｋ．Ｒｅｉｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．１７：１９３−２０２（１９８２）；Ｂ．Ｐｏｕｃｅｔ，Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０３：１００９−１００１６（１９８９）；Ｒ．Ｒ．Ｈｏｌｓｏｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈｙｓ．Ｂｅｈａｖ．３７：２３１−２３８（１９８６）を参照のこと）。この試験は、視覚処理の欠乏または欠損を検出するために使用され得る。
【０１１６】
学習された無力（ｈｅｌｐｌｅｓｓｎｅｓｓ）試験は、動物の挙動によって影響をされ得ないストレス、例えば有害刺激への暴露を含む。動物の挙動は、種々の標準的統計試験を使用して統計的に解析され得る（例えば、Ａ．Ｌｅｓｈｎｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒａｌ　Ｂｉｏｌ．２６：４９７−５０１（１９７９）参照）。
【０１１７】
また、テイルによって「逆さまに」宙吊りされたときに、マウスの「不動」時間を測定するテイル宙吊り試験が使用される。これは、動物がもがくか否かの目安、すなわち抑うつの指標である。ヒトでは、抑うつはその生活または状況の制御欠如の感情から生じると信じられている。抑うつ状態は、動物が制御できない逆況に繰り返し付されることによって、動物に誘発され得ると信じられている。遂には「学習された無力」の状況が達成され、動物がその環境を変化しようとすることを停止し、そして単にその宿命を受け入れる。より早くもがきを停止する動物は、より抑うつ傾向にあると考えられる。試験に先たってある種の抗うつ剤を投与すると動物があきらめる前にもがく時間を増加させると研究が示している。
【０１１８】
モーリス水迷路試験（Ｍｏｒｒｉｓ　ｗａｔｅｒ−ｍａｚｅ　ｔｅｓｔ）は、水中での空間方向性を学習し、続いて、例えば、不正確な選択の数を計算することなどによって動物の挙動を測定することを含む。測定された挙動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｅ．Ｍ．Ｓｐｒｕｉｊｔ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．５２７：１９２−１９７（１９９０）を参照のこと）。
【０１１９】
また、Ｙ字型迷路が使用され得る（例えば、ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｄ．Ｊ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｅｈａｖｉｏｒ　３２：７２３−７２６（１９８９）；Ｄｅｌｌｕ，Ｆ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｌｅａｒｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｍｅｍｏｒｙ　７３：３１−４８（２０００）を参照のこと）。Ｙ迷路は、一般的に認識能力の試験であると考えられている。Ｙ迷路の各アームの大きさは、他の大きさも使用され得るけれども、例えば、約４０ｃｍ×８ｃｍ×２０ｃｍであり得る。各アームは例えばアーム内の運動を自動的に検出する等しく間隔をあけた１６のフォトビームも有することができる。少なくとも２種の異なった試験がこのようなＹ迷路を使用して実施され得る。連続Ｙ迷路パラダイムでは、マウスに例えば約１０分間、Ｙ迷路の３つのアーム全てを探索させる。動物は、フォトビーム検出グリッドを使用して連続的に追跡され、そのデータは自発的交替およびポジティブな偏り挙動を測定するために使用され得る。自発的交替とは迷路の最も馴染みのないアームを訪れる「正常な」動物の自然な傾向を呼ぶ。交替は動物が２回、連続して同じ方向に回転を行うときに記録され、したがって、最低頻度で入った迷路のアームへの連続した訪問を表す。位置の偏りは、一方の方向での回転を他方の方向よりも好む動物の傾向を測定して、自己中心的（ｅｇｏｃｅｎｔｒｉｃａｌｌｙ）に定義された反応を決定する。したがって、この試験は他人中心性または自己中心性機構に基づいて進む動物の能力の差異を検出し得る。２つの試験的Ｙ迷路記憶試験は、自由選択探索パラダイムに基づく新奇性および空間記憶に対する反応を測定する。第１の試験（取得）中、動物は、例えば約１５分間、自由にＹ迷路の２つのアームを訪問し得る。第３のアームはこの試験中、遮蔽されている。第２の試験（回復）は例えば約２時間の試験間間隔をおいてから実施される。回復試験中、遮蔽されたアームは開放され、動物は例えば、約５分間、３つのアーム全てに近づき得る。データは回復試験中に集められ、各アームへの訪問回数および時間について解析される。迷路の３つのアームはほとんど同一であるから、新規性と精通さとの区別は各アームの位置に関連する部屋周囲の「環境的」空間的手掛かり（ｃｕｅ）に依存している。トランスジェニック動物モデルのアームへの入場および新規のアームで過ごす持続時間における変化は、新規性および認識過程を仲介するその遺伝子の役割を示し得る。
【０１２０】
消極的回避またはシャトルボックス試験は、一般的には２つ以上の環境への暴露を含み、そのうちの１つは有害であって、動物により学習される選択をもたらす。挙動測定は例えば、反応の潜伏時間、正確な反応の回数および反応一貫性を含む（例えば、Ｒ．Ａｄｅｒ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｓｙｃｈｏｎ．Ｓｃｉ．２６：１２５−１２８（１９７２）；Ｒ．Ｒ．Ｈｏｌｓｏｎ，Ｐｈｙｓ．Ｂｅｈａｖ．３７：２２１−２３０（１９８６）参照）。また、ゼロ迷路が使用され得る。ゼロ迷路では、動物を例えば、２つの開放および２つの閉塞された四分円を有する高架環状プラットホームのうちの閉鎖された四分円中に置き、約５分間、探索させる。このパラダイムは、ゲッ歯類の正常な探索性活性と解放空間への嫌悪との間の接近−回避葛藤を利用する。この試験は不安の程度を測定し、抗不安剤の有効性を評価するために使用され得る。閉鎖四分円に対して開放四分円で過ごす時間は、例えば、各移行場所にフォトビームを配置して、自動的に記録され得る。
【０１２１】
食物回避試験は、新しい食物への暴露、および例えば食物摂取および摂取の潜伏時間を客観的に測定することを含む。測定された挙動は、標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｂ．Ａ．Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈｏｌ．６７：１５−２２（１９６９）を参照のこと）。
【０１２２】
高架式プラス迷路試験は、プラットホーム上で側部のない迷路に暴露することを含み、動物の挙動は、迷路侵入および迷路学習の回数を計算して客観的に測定される。この挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｈ．Ａ．Ｂａｌｄｗｉｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ，２０：６０３−６０６（１９８８）参照）。
【０１２３】
刺激誘導機能亢進試験は、刺激薬剤（例えば、アンフェタミン、コカイン、ＰＣＰなど）の注射、および例えば運動活性、社会的相互作用、認識挙動を客観的に測定することを含む。動物の挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｐ．Ｂ．Ｓ．Ｃｌａｒｋｅ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　９６：５１１−５２０（１９８８）；Ｐ．　Ｋｕｃｚｅｎｓｋｉ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ１１：２７０３−２７１２（１９９１）を参照のこと）。
【０１２４】
自己刺激試験は、一般的にはそれ自身の脳への電気的および／または化学的刺激を調節する機会をマウスに与えることを含む。挙動は自己刺激の頻度およびパターンによって測定される。このような挙動は標準的統計試験によって統計的に解析される（例えば、Ｓ．Ｎａｓｓｉｆ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．，３３２：２４７−２５７（１９８５）；Ｗ．Ｌ．Ｉｓａａｃ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０３：３４５−３５５（１９８９）参照）。
【０１２５】
報酬試験は、種々の挙動、例えば運動、認識および社会的挙動を具体化し、例えば挙動変化の敏捷さおよび信頼性を測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む（例えば、Ｌ．Ｅ．Ｊａｒｒａｒｄ，ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．６１：５１９−５３０（１９８６）参照）。
【０１２６】
ＤＲＬ（低反応率分化強化）実施試験は間欠的報酬パラダイムに暴露し、適切な反応、例えばレバー押しの回数を測定することを含む。このような挙動は標準的統計試験を使用して統計的に解析される（例えば、Ｊ．Ｄ．Ｓｉｎｄｅｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１００：３２０−３２９（１９８６）；Ｖ．Ｎａｌｗａ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．１７：７３−７６（１９８５）；およびＡ．Ｊ．Ｎｏｍｎｅｍａｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｓｙｃｈ．９５：５８８−６０２（１９８１）を参照のこと）。
【０１２７】
空間学習試験は、複雑で新奇の環境に暴露し、空間学習の速さおよび範囲を測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む（例えば、Ｎ．Ｐｉｔｓｉｋａｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｃｈ．Ｂｅｈａｖ．３８：９３１−９３４（１９９１）；Ｂ．ｐｏｕｃｅｔ，ｅｔａｌ．，Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．３７：２６９−２８０（１９９０）；Ｄ．Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，ｅｔａｌ．，Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．３７：２６３−２６８（１９９０）；およびＦ．Ｖａｎ　Ｈａａｒｅｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｅｈａｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０２：４８１−４８８（１９８８）を参照のこと）。また、所与の時間に動くより大きな距離が動物の活性度および不安の目安であるオープンフィールド（ｏｆ）試験が使用され得る。オープンフィールドが新規な環境である場合、これは動物が探索する欲動と自身を守る欲動との「板ばさみ」となる接近−回避状況を作り出すと考えられる。部屋が明るくされ、隅以外に隠れる場所がないから、「正常な」マウスは隠れる場所のない中心よりも隅および周辺でより長い時間を費やすであろうと予測される。しかしながら、「正常な」マウスは部屋をますます探索するにつれて中心領域へ出て行くであろう。次いで、特に心配性のマウスは中心領域の探索を比較的わずかしか、あるいは全くせずに隅でその時間のほとんどを費やす一方、大胆な（すなわち心配性でない）マウスは大きな距離を動き、中心領域に対して周辺をそれほど好まないことを示すことが推定される。
【０１２８】
視覚、体性感覚および聴覚失認試験は、一般的には感覚的刺激に暴露し、例えば環境に適応する（ｏｒｉｅｎｔｉｎｇ）反応を客観的に測定し、そして測定された挙動を統計的に解析することを含む（例えば、Ｊ．Ｍ．Ｖａｒｇｏ．ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．１０２：１９９−２０９（１９８８）を参照のこと）。
【０１２９】
完了行動試験は、一般的には餌と飲み物を与えること、および消費量を客観的に測定することを含む。測定された行動は、標準的統計試験（例えば、Ｐ．Ｊ．Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１０２：３０１−３０８（１９９０）；Ｍ．Ｇ．Ｃｏｒｄａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：２０７２−２０７６（１９８３）参照）を使用して統計的に解析される。
【０１３０】
視覚識別試験もまた、動物の視覚処理を評価するために使用され得る。１つまたは２つの同様な対象物がオープンフィールドに置かれ、動物は約５〜１０分間、探索させられる。各対象物を探索するために費やされた時間（対象物への接近、例えば約３〜５ｃｍ以内での動きが対象物の探索とみなされる）が記録される。次いで、動物はオープンフィールドから取り出され、そして対象物が同様な対象物および新奇な対象物に取り替えられる。動物はオープンフィールドへ戻され、古い対象物に対して新奇な対象物を探索することに費やす時間の割合（再び、約５〜１０分間の時間をかけて）が測定される。「正常な」動物は、代表的には、古い対象物よりもむしろ新奇な対象物を探索することにより高い割合の時間を費やす。サンプリングと試験との間に遅れが課せられる場合、記憶作業はより海馬依存性になる。遅れが課せられない場合、作業は単純な視覚識別により大きく基づく。この試験はまた、対象物（好ましくは単純なブロック）がスプレーされるか、さもなければ匂いを保持するために処理されて、嗅覚識別のためにも使用され得る。この試験はまた、動物が味覚識別ができるか否かを決定するために使用することができ、新奇な食物ではなく先に食べた食物にもどる動物は味覚新奇恐怖症（ｎｅｏｐｈｏｂｉａ）を示す。
【０１３１】
熱板痛覚脱失試験（ｈｏｔ　ｐｌａｔｅ　ａｎａｌｇｅｓｉａ　ｔｅｓｔ）は、熱または痛みによる刺激に対する動物の感受性を評価するために使用され得る。例えば、マウスは約５５℃の熱板上に置かれ得、そしてマウスの応答潜伏時間（例えば、後足を持ち上げて後足をなめる時間）が記録され得る。これらの反応は反射的でなく、むしろ皮質の関与を必要とする「高等な」応答である。この試験は、侵害受容障害を評価するために使用し得る。
【０１３２】
加速ロータロッド試験は、マウスの協調および平衡を測定するために使用され得る。動物は、例えば、回転トレッドミル（または回転丸太）のように作動するロッド上に置かれ得る。ロータロッドは最初はゆっくりと回転し、次いで、例えば約６０ｒｐｍの速度に達するまで次第に速く回転するようにすることができる。マウスは落下を避けるために連続して自分自身の位置を変えなければない。動物は好ましくは最低２０分間あけて少なくとも３回、試験される。もっとも長くロッド上に留まることができるマウスはより良好な協調および平衡を有すると考えられる。
【０１３３】
メトラゾール投与試験は、発作または同様な事象に対して変化する感受性について動物をスクリーニングするために使用され得る。例えば、メタゾール５ｍｇ／ｍｌ溶液は、例えば、約０．３７５ｍｌ／分の速度でマウスの尾静脈から注入され得る。この注入はマウス全てに発作を経験させ、続いて致死を引き起こす。最も早く発作段階に入ったマウスは発作をおこす傾向が高いと考えられる。４つの区別される生理学的段階が記録され得る：注入開始後、速やかに、マウスは著しい「痙攣」、続いて一連の発作を示し、「強直性伸展（ｔｏｎｉｃ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」として公知である体の最終緊張となり、続いて死に至る。
【０１３４】
（標的遺伝子産物）
本発明はさらに、標的遺伝子産物を生産するための標的遺伝子配列の使用を意図する。標的遺伝子産物は、機能的に等価な遺伝子産物を代表するタンパク質を含み得る。このような等価遺伝子産物は、本明細書中に記載される遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含み得るが、これはサイレント変化を生じ、したがって機能的に等価な標的遺伝子産物を生産する。アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて作製され得る。
【０１３５】
例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられ；極性の中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられ；正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられ；そして負に荷電した（酸性）アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。本明細書中に使用されるよ場合、「機能的に等価である」とは、標的遺伝子配列によってコードされる内因性遺伝子産物と実質的に同様なインビボ活性を示すことができるタンパク質をいう。あるいは、アッセイの一部として使用される場合、「機能的に等価である」とは、内因性遺伝子産物の対応する部分が行う方法と実質的に同様な方法で他の細胞内分子または細胞外分子と相互作用することができるペプチドをいう場合がある。
【０１３６】
本発明の方法により有用である他のタンパク質産物は、組換えまたは合成手段で生産された標的遺伝子から誘導されるか、あるいはこれに基づくペプチド（誘導ペプチド）である。
【０１３７】
標的遺伝子産物は、当該技術分野で周知である技術を使用して、組換えＤＮＡ技術によって生産され得る。したがって、遺伝子配列をコードする核酸を発現して本発明の遺伝子のポリペプチドおよびペプチドを調製する方法が本明細書中に記載される。当業者に周知である方法は、タンパク質コード遺伝子配列および適切な転写／翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために使用され得る。これらの方法には例えばインビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９（上掲）およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８９（上掲）参照）。あるいは、タンパク質の遺伝子配列をコードすることができるＲＮＡは、例えば自動合成器（例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）参照）を使用して化学的に合成され得る。
【０１３８】
種々の宿主発現ベクター系が、本発明の遺伝子コード配列を発現するために使用され得る。このような宿主発現系は、目的のコード配列が生産され、続いて精製され得る媒体を示すが、適切な配列をコードするヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた場合、インサイチュで本発明の遺伝子のタンパク質を示し得る細胞も示すことができる。これらには、タンパク質コード遺伝子配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物；タンパク質コード遺伝子配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ；タンパク質コード遺伝子配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で感染されるか、あるいはタンパク質コード遺伝子配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換される植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
細菌系では、多くの発現ベクターは、発現される遺伝子のタンパク質について意図される用途に応じて有利に選択され得る。例えば、多量のこのようなタンパク質が生産されるべき場合には、抗体の生成またはペプチドライブラリーのスクリーニングのために、たとえば容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指向するベクターが望ましい場合がある。このようなベクターとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（このベクターにおいて、タンパク質コード遺伝子配列は、融合タンパク質が生産されるように、ｌａｃＺコード領域とインフレームでベクター中に個々に連結される）（Ｒｕｔｈｅｒら、ＥＭＢＯ　Ｊ．、２：１７９１−９４（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ　＆　Ｉｎｏｕｙｅ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、１３：３１０１−０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４：５５０３−９（１９８９））などが挙げられるが、これらに限定されない。ｐＧＥＸベクターはまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用いて外来ポリペプチドを融合タンパク質として発現するために使用され得る。一般的には、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへの吸着と、これに続く遊離グルタチオンの存在下での溶出とによって溶解細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたはＸａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、結果として、クローン化された標的遺伝子タンパク質がＧＳＴ部分から放出され得る。
【０１４０】
好ましい実施形態では、完全長のｃＤＮＡ配列が、標準的ＰＣＲ方法論（Ｉｎｎｉｓら（編）、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  （１９９０））を使用してアミノ末端でインフレームＢａｍＨＩ部位に、そしてカルボキシ末端でインフレームＥｃｏＲＩ部位に付加され、ｐＧＥＸ−２ＴＫベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）中に連結される。得られたｃＤＮＡ構築物は、放射性標識のためにアミノ末端にキナーゼ認識部位を、そして親和性精製のためにカルボキシ末端にグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ配列を含む（Ｎｉｌｓｓｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、４：１０７５−８０（１９８５）；Ｚａｂｅａｕら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１：１２１７−２４（１９８２））。
【０１４１】
昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。このウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。遺伝子コード配列はウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）中に個々にクローン化され、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれ得る。遺伝子コード配列の首尾のよい挿入は、ポリヘドリン遺伝子の不活性化および非閉鎖性組換えウイルス（すなわち、ポリヘドリン遺伝子によりコードされるタンパク性被覆を欠くウイルス）の産生を生じる。次いで、これらの組換えウイルスは、挿入された遺伝子が発現されるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染するために使用される（例えば、Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４６：５８４−９３（１９８３）；米国特許第４，７４５，０５１号参照）。
【０１４２】
哺乳動物宿主細胞では、多くのウイルスに基づく発現系が使用される。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合には、対象の遺伝子コード配列はアデノウイルス転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび３つの部分からなるリーダー配列）に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子はインビトロまたはインビボでの組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）での挿入は、生存可能かつ感染宿主中の遺伝子のタンパク質発現が可能な組換えウイルスを生じる（例えば、Ｌｏｇａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３６５５−５９（１９８４）参照）。特異の開始シグナルもまた、挿入された遺伝子コード配列の効率的な翻訳のために必要であり得る。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む遺伝子全体が適切な発現ベクター中に挿入される場合には、さらなる翻訳制御シグナルは必要とされない場合がある。しかし、遺伝子コード配列の一部のみが挿入される場合、おそらくＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されなければならない。さらに、開始コドンは挿入物全体の翻訳を確実にするために所望コード配列のリーディングフレームを有する相（ｐｈａｓｅ）中になければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）のものであり得る。発現の効率は適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどの封入（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）によって増強される（Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６−４４（１９８７）参照）。
【０１４３】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望される特定の様式で遺伝子産物を改変およびプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のこのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）はタンパク質の機能に重要であり得る。異なった宿主細胞はタンパク質の翻訳後プロセシングおよび改変のための特徴的かつ特異的な機構を有する。適切な細胞株または宿主系が、発現された外来タンパク質の正確な改変およびプロセシングを確実にするために選択され得る。この目的には、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化およびリン酸化の適切なプロセシングのための細胞内機構を有する真核生物宿主細胞が使用され得る。このような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４４】
組換えタンパク質の高収量での長期の生産のためには安定な発現が好ましい。例えば、遺伝子タンパク質を安定して発現する細胞株が操作される。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、宿主細胞は適切な発現調節因子（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されるＤＮＡ、および選択可能マーカーで形質転換され得る。外来ＤＮＡの導入後に操作された細胞は富化培地中で１〜２日間、増殖させられ、次いで選択培地へ切り換えられ得る。組換えプラスミド中の選択可能マーカーは選択に対して耐性を与え、その染色体中にプラスミドを安定して組み込み、そして増殖する細胞が、次々にクローン化され、細胞株において広がり得る病巣を形成させる。この方法は遺伝子タンパク質を発現する細胞株を操作するために有利に使用され得る。このような操作された細胞株は、遺伝子タンパク質の内因性活性に影響を与える化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
【０１４５】
好ましい実施形態では、組換えタンパク質の発現の時期および／または量の制御は、誘導性の発現構築物を使用して制御され得る。組換えタンパク質の誘導性の発現のための誘導性の構築物および誘導性の系は当業者には周知である。このような誘導性プロモーターまたは他の遺伝子調節エレメントの例としては、テトラサイクリン、メタロチオネイン、エクジソンおよび他のステロイド応答性プロモーター、ラパマイシン応答性プロモーターなどが挙げられるがこれらに限定されない（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９３：３３４６−５１（１９９６）；Ｆｕｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：９３０２−６（１９９４））。使用され得るさらなる調節エレメントとしては、ウイルス性、特にＨＩＶプロモーターなどの特定転写因子を必要とするプロモーターが挙げられる。１つの実施形態では、Ｔｅｔ誘導性遺伝子発現系が使用される（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７−５１（１９９２）；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：１７６６−６９  （１９９５））。Ｔｅｔ発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉＴｎ１０トランスポゾンのテトラサイクリン耐性オペロン由来の２つの調節エレメント（テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）およびＴｅｔＲに結合するテトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ））に基づく。このような系を使用して、組換えタンパク質の発現はｔｅｔＯオペレーター配列の制御下に置かれ、宿主細胞中へトランスフェクトまたは形質転換される。宿主細胞中に同じにトランスフェクトされたＴｅｔＲの存在下で、組換えタンパク質の発現はｔｅｔＯ調節エレメントへのＴｅｔＲタンパク質の結合によって抑制される。次いで、高レベルで調節された遺伝子発現はＴｅｔＲに結合するためのｔｅｔＯエレメントと競合するテトラサイクリン（Ｔｃ）またはドキシサイクリン（Ｄｏｘ）などのＴｃ誘導体の濃度を変化させることに応答して誘導され得る。ｔｅｔ誘導性遺伝子発現のための構築物および材料は、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ．から市販されている。
【０１４６】
アッセイ系の一成分として使用される場合、この遺伝子タンパク質は直接的または間接的のいずれかで標識されて、遺伝子タンパク質と試験物質との間に形成される複合体の検出を容易にし得る。１２５Ｉなどの放射性同位元素；基質に暴露されたときに検出可能な発色性シグナルまたは光を発生する酵素標識系；および蛍光標識を含むがこれらに限定されない種々の適切な標識系のいずれかが使用され得る。組換えＤＮＡ技術がこのようなアッセイ系について遺伝子タンパク質を生産するために使用される場合、標識、固定化および／または検出を容易にすることができる融合タンパク質を操作することが有利であり得る。
【０１４７】
間接的標識は遺伝子産物に特異的に結合するタンパク質（標識抗体など）の使用を含む。このような抗体としてはポリクローナル、モノクローナル、キメラ、１本鎖、ＦａｂフラグメントおよびＦａｂ発現ライブラリーによって生産されたフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
（抗体の生成）
１つまたは複数のエピトープを特異的に認識可能な抗体の生成方法が本明細書に記載される。このような抗体としてはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化抗体またはキメラ抗体、１本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されたフラグメント、抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、および上記したもののいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体は、例えば生物学的試料中の標的遺伝子の検出に、あるいは、異常な標的遺伝子活性の阻害方法として使用され得る。したがって、このような抗体は疾患治療方法の一部として使用してもよく、そして／または診断技術の一部として使用してもよい。その際、患者は標的遺伝子タンパク質の異常なレベル、またはこのようなタンパク質の異常な形態の存在について試験され得る。
【０１４９】
抗体の生産について、種々の宿主動物は標的遺伝子、その発現産物またはその一部分を注射することにより免疫化され得る。このような宿主動物としては、ほんの数例として、ウサギ、マウスおよびラットが挙げられ得るが、これらに限定されない。種々のアジュバントは宿主の種に応じて免疫学的応答を増加させるために使用され、このようなアジュバンドとして、フロイント（完全または不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル（ｍｉｎｅｒａｌ  ｇｅｌ）、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳化液、キーホールリンペット・ヘモシアニン、ジニトロフェノールおよびＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）および（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
ポリクローナル抗体は標的遺伝子産物またはその抗原性機能的誘導体などの抗原で免疫された動物の血清由来抗体分子の異種の集団である。ポリクローナル抗体の生成のために、上記したような宿主動物は、上記したようなアジュバントを補充された遺伝子産物を注射することにより免疫化され得る。
【０１５１】
特定の抗原に対する抗体の同種の集団であるモノクローナル抗体は、培養物中の連続的な細胞株による抗体分子の生成を提供するための任意の技術によって得られ得る。これらは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５−７（１９７５）；および米国特許第４，３７６，１１０号のハイブリドーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２（１９８３）；Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２０２６−３０（１９８３））およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｉｔｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、７７−９６頁（１９８５））が挙げられるが、これらに限定されない。このような抗体はＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびこれらの任意サブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスのものであり得る。本発明のｍＡｂを生成するハイブリドーマはインビトロまたはインビボで培養され得る。インビボでの高力価のｍＡｂの生産が、これを現時点での好ましい生産方法とする。
【０１５２】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒に適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子をスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の生成について開発された技術（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４：４５２−５４（１９８５））が使用され得る。キメラ抗体は、異なった部分が異なった動物種に由来する分子（例えば、ネズミｍＡｂ由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有する分子）である。
【０１５３】
また、１本鎖抗体の生産について記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−２６（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９−８３（１９８８）；およびＷａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３３４：５４４−４６（１９８９））は、遺伝子１本鎖抗体を生成するために適用され得る。１本鎖抗体はアミノ酸架橋によってＦｖ領域の重鎖および軽鎖フラグメントを連結することによって形成され、１本鎖ポリペプチドを生じる。
【０１５４】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは公知技術によって生成され得る。このようなフラグメントとしては、例えば、抗体分子のペプシン消化によって生成され得るＦ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を低下させることによって生成され得るＦａｂフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築され得（Ｈｕｓｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６：  １２７５−８１  （１９８９））、所望な特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能とする。
【０１５５】
（治療薬剤のスクリーニング）
標的遺伝子配列を含み、かつ発現する細胞は、治療薬剤をスクリーニングするために使用され得る。このような細胞としては、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５９３）、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−２０２）、およびＰ３８８Ｄ１（ＡＴＣＣ＃ＴＩＢ−６３）などの非組換え単球細胞株、ＨＵＶＥＣなどの内皮細胞およびウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）；ならびにＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１６５１））などの一般的な哺乳動物細胞系が挙げられ得る。さらに、このような細胞としては組換えトランスジェニック細胞株が挙げられ得る。例えば、本発明のノックアウトマウスは疾患に関与する１以上の細胞型を含む細胞株を生成するために使用され得る。これはその障害の細胞培養モデルとして使用され得る。本発明の疾患トランスジェニック動物由来の細胞、組織、および一次培養物は使用され得るが、連続的な細胞株の生成が好ましい。トランスジェニック動物から連続的な細胞株を誘導するために使用され得る技術の例としては、Ｓｍａｌｌら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、５：６４２−４８（１９８５）を参照のこと。
【０１５６】
標的遺伝子配列は、目的の細胞のゲノム中に導入され得、そして過剰発現される。標的遺伝子配列を過剰発現するために、標的遺伝子配列のコード部分が、目的の細胞型の遺伝子発現を駆動し得る調節配列に連結され得る。このような調節領域は当業者には周知であり、過度の実験がなくても利用され得る。標的遺伝子配列はまた破壊されるかあるいは過少発現され得る。標的遺伝子破壊または過少発現された標的遺伝子配列を有する細胞は、例えば、破壊または過少発現に寄与する機能の任意の欠失を代償する代替経路に影響し得る薬剤をスクリーニングするために使用される。
【０１５７】
インビトロ系は標的遺伝子産物に結合可能な化合物を同定するために設計され得る。このような化合物としては、Ｄ−および／またはＬ−立体配置アミノ酸から作られたペプチド（例えば、ランダムペプチドライブラリーの形態；例えば、Ｌａｍら、Ｎａｔｕｒｅ、３５４：８２−４（１９９１）参照）、ホスホペプチド（例えば、無作為にまたは部分的に縮重した、指向されたホスホペプチドライブラリーの形態；例えば、Ｓｏｎｇｙａｎｇら、Ｃｅｌｌ、７２：７６７−７８  （１９９３）参照）、抗体、および有機または無機低分子が挙げられ得るが、これらに限定されない。同定された化合物は、例えば、標的遺伝子タンパク質、好ましくは変異標的遺伝子タンパク質の活性を調節すること；標的遺伝子タンパク質の生物学的機能を生成すること；または正常な標的遺伝子相互作用を破壊するか、もしくは、それ自身がこのような相互作用を破壊する化合物をスクリーニングすることにおいて有用であり得る。
【０１５８】
標的遺伝子タンパク質に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、２つの化合物が相互作用および結合することを可能にするために充分な条件下で十分な時間、標的遺伝子タンパクと試験化合物の反応混合物を調製し、反応混合物から取り除かれ、そして／または検出され得る複合体を形成する工程を包含する。これらのアッセイは種々の方法で行われ得る。例えば、このようなアッセイを行う１つの方法は、固相上に標的遺伝子タンパク質または試験物質を付着する工程、および反応の最後に固相上に付着させた標的タンパク質／試験物質複合体を検出する工程を包含する。このような方法の１つの実施形態では、標的遺伝子タンパク質は固体表面上に付着され得、そして付着されない試験化合物が直接的または間接的にのいずれかで標識され得る。
【０１５９】
実際には、マイクロタイタープレートが便宜的に使用される。付着された成分は非共有または共有結合によって固定化され得る。非共有結合は単にタンパク質溶液で固体表面を被覆し、乾燥することによって達成され得る。あるいは、固定化抗体、好ましくはタンパク質に特異的なモノクローナル抗体は、固体表面にタンパク質を付着するために使用され得る。その表面は予め調製され、かつ貯蔵されていてもよい。
【０１６０】
アッセイを実施するために、固定化されなかった成分は、付着された成分を含む被覆表面に添加される。反応が完了した後、未反応成分は、形成された全ての複合体が固体表面上に固定化されたまま残るような条件下に除去（例えば、水洗）される。固体表面上に付着された複合体の検出は多くの方法で達成され得る。既に固定化されていない成分が前もって標識されている場合には、表面上に固定化された標識の検出は複合体が形成されたことを示す。前に固体化されていない成分が予め標識されていない場合には、間接的標識が表面上に付着された複合体を検出するために、使用され得る；例えば、前に固定化されていない成分に特異的な標識抗体（順次、標識された抗−Ｉｇ抗体で直接的に標識されるか、または間接的に標識され得る抗体）を使用する。
【０１６１】
あるいは、反応は液相中で実施され得、反応生成物は未反応成分から分離され、複合体は、例えば、標的遺伝子産物に特異的な固定化抗体または溶液中に形成された任意の複合体を付着する試験化合物、および付着された複合体を検出するために可能性ある複合体の他の成分に特異的な標識抗体を使用して検出される。
【０１６２】
上記された方法の１つによって特定の標識遺伝子産物に結合することが示される化合物は、さらに標的遺伝子タンパク質から生化学的応答を惹起するその能力について試験され得る。発現産物のアゴニスト、アンタゴニストおよび／またはインヒビターは、当該分野で周知であるアッセイを使用して同定され得る。
【０１６３】
（アンチセンス、リボザイム、および抗体）
治療剤として使用され得る他の薬剤としては、標的遺伝子、その発現産物およびその機能的フラグメントが挙げられる。さらに、変異標的遺伝子活性を低下または阻害する薬剤は、疾患症状を回復させるために使用され得る。このような薬剤としては、アンチセンス、リボザイムおよび三重螺旋分子が挙げられる。このような分子の生成および使用のための技術は当業者には周知である。
【０１６４】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、標的ｍＲＮＡにハイブリダイズし、かつタンパク質翻訳を阻害することにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接的にブロックするように作用する。アンチセンスＤＮＡに関して、翻訳開始部位、例えば、目的の標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０領域と＋１０領域との間に由来するオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１６５】
リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することが可能な酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレオチド切断（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ）を含む。リボザイム分子の組成物は、標的遺伝子ｍＲＮＡに対して相補的な１以上の配列を含まなければならず、そしてｍＲＮＡ切断に起因する周知の触媒配列を含まなければならない。この配列としては、米国特許第５，０９３，２４６号を参照のこと（その全体が本明細書中に参考として援用される）。本発明の範囲内で、標的遺伝子タンパク質をコードするＲＮＡ配列のエンドヌクレオチド切断を特異的かつ有効に触媒するハンマーヘッド型モチーフリボザイム分子が操作される。
【０１６６】
任意の潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は最初、以下の配列、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位のための目的の分子をスキャニングすることにより同定される。一旦、同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド配列を所望のものでなくし得る、二次構造などの予想される構造的特徴について評価され得る。候補配列の適合性はまた、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用して、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのためのそれらの接触性を試験することにより評価され得る。
【０１６７】
転写の阻害のための三重螺旋形成に使用される核酸分子は１本鎖であり、デオキシリボヌクレオチドから構成されるべきである。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型塩基対の法則によって三重螺旋形成を促進するように設計されなければならない。これは、一般的には二重鎖のうちの一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きな伸長（ｓｔｒｅｔｃｈ）を必要とする。ヌクレオチド配列は、得られた三重螺旋の３本の関連した鎖にわたってＴＡＴおよびＣＧＣトリプレットを生じるピリミジンベースであり得る。ピリミジンに富む分子は、その鎖に平行に配向した二重鎖のうちの一本鎖のプリンに富む領域に相補的である塩基を提供する。さらに、例えばＧ残基の伸長を含む、プリンに富む核酸分子が選択され得る。これらの分子は、ＧＣ対に富むＤＮＡ二重鎖とともに三重螺旋を形成する。そこでは、大多数のプリン残基は、標的二重鎖のうちの一本鎖上に配置され、三重鎖の３本鎖にわたりＧＧＣトリプレットを生じる。
【０１６８】
あるいは、三重螺旋形成のために標的化することができる潜在的配列は、「スイッチバック」核酸分子と呼ばれるものを作製することによって増加され得る。スイッチバック分子は、二重鎖のうち、最初に一方の鎖、次いで他方の鎖と塩基対を作り、二重鎖のうちの一方の鎖に存在するプリンまたはピリミジンのいずれかのかなり大きな伸長の必要性を排除するように、交互５’−３’、３’−５’様式で合成される。
【０１６９】
本明細書に記載されるアンチセンス、リボザイムおよび／または三重螺旋分子は、正常および変異標的遺伝子対立遺伝子の両者によって生産されるｍＲＮＡの転写（三重螺旋）および／または翻訳（アンチセンス、リボザイム）を低減あるいは阻止し得る。標的遺伝子活性の十分に正常な程度が維持されることを確証するために、正常な活性を示す標的遺伝子ポリペプチドをコードおよび発現する核酸分子は、使用されるいなかなるアンチセンス、リボザイム、または三重螺旋処理にも感受性を有する配列を含まない細胞中へ導入され得る。また、細胞または組織の標的遺伝子活性の必須の程度を維持するために、細胞または組織中に正常な標的遺伝子タンパク質を共投与することが好ましい場合もある。
【０１７０】
本発明のアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ、リボザイム、および三重螺旋分子はＤＮＡおよびＲＮＡ分子の合成に関する当該技術分野で公知である任意の方法によって調製され得る。これらは、例えば固相ホスホロアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）化学合成法など、当該技術分野で周知であるオリゴデオシキリボヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する方法を含む。またはＲＮＡ分子はアンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写によって生成され得る。このようなＤＮＡ配列はＴ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む広範囲に多様なベクター中に導入される。また、使用されるプロモーターに応じて、構成的にまたは誘導可能にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物が、細胞系中に安定して導入され得る。
【０１７１】
ＤＮＡ分子の種々の周知である修飾は、細胞内安定性および半減期を増加させる手段として導入される。可能性ある修飾としては、分子の５’および３’末端にリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列を付加すること、またはオリゴデオキシリボヌクレオチドの主鎖内のホスホジエステラーゼ連結よりもむしろホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルを使用することが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７２】
標的遺伝子タンパク質、および特に変異遺伝子タンパク質の両方に特異的であり、その活性を干渉する抗体は、変異標的遺伝子機能を阻止するために使用され得る。このような抗体は、当該技術分野で公知であり、また本明細書中に記載されるような標準的技術を使用して、タンパク質自身に対して、またはタンパク質一部分に対応するペプチドに対して生成され得る。このような抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント、１本鎖抗体、キメラ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７３】
標的遺伝子タンパク質が細胞内にありかつ全抗体が使用される例では、抗体を内在化させることが好ましい場合がある。しかしながら、リポフェクチンリポソームは、細胞中へ標的遺伝子エピトープに結合する抗体またはＦａｂ領域のフラグメントを送達するために使用され得る。抗体のフラグメントが使用される場合、標的または広がった標的タンパク質の結合ドメインに結合する最小の阻害フラグメントが好ましい。例えば、標的遺伝子タンパク質に結合する抗体の可変領域のドメインに対応するアミノ酸配列を有するペプチドが使用され得る。このようなペプチドは当該技術分野で周知である方法を使用して、化学的に合成されるか、あるいは組換えＤＮＡ技術により生産され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  （１９８４）  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３，  前出；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、  １９８９，前出、参照）。また、細胞内標的遺伝子エピトープに結合する１本鎖中和抗体も投与され得る。このような１本鎖抗体は、例えばＭａｒａｓｃｏら、  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９０：  ７８８９−９３  （１９９３）に記載される技術などを使用することにより、例えば、標的細胞集団内の１本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を発現することで投与され得る。
【０１７４】
標的遺伝子タンパク質をコードするＲＮＡ配列は、疾患症状が改善されるような、ある程度の標的遺伝子タンパク質の生産に十分である濃度で、疾患症状を示す患者に直接に投与される。患者は遺伝子置換治療法で治療されてもよい。正常な標的遺伝子の１つまたは複数の複製物、または標的遺伝子機能を有する正常な標的遺伝子タンパク質の生産を指向する遺伝子の一部分は、ベクターを使用して細胞内へ挿入される。ベクターとしては、リポソームなどの細胞中にＤＮＡを導入する他の粒子のほかに、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、およびレトロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、上記したような技術が、ヒト細胞中へ正常な標的遺伝子配列を導入するために使用され得る。
【０１７５】
次いで、遺伝子配列を発現する正常な標的遺伝子を含む細胞、好ましくは自己細胞は、疾患症状の改善を可能とする位置で、患者の中に導入されるかあるいは再導入され得る。
【０１７６】
（薬学的組成物、有効量、および投与経路）
標的変異体遺伝子の発現、合成および／または活性を阻害する同定された化合物は、疾患を治療または改善するために治療的に有効な用量で患者に投与され得る。治療的に有効な用量とは、疾患の症状の改善をもたらすのに十分な化合物の量をいう。
【０１７７】
このような化合物の毒性および治療的有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％の致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％の治療的有効量）を測定することについて、細胞培養物または実験動物の標準的な薬学的方法により決定され得る。毒性と治療的効果との用量割合は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表現され得る。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用される間は、未感染細胞への潜在的損傷を最小限にし、それによって副作用を減少させるために、病気に冒された組織の部位へのこのような化合物を標的とする送達系を設計するように注意すべきである。
【０１７８】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を処方することに使用され得る。このような化合物の用量は、好ましくは、毒性がほとんどないかあるいは全くないＥＤ５０を含む循環濃度範囲内にある。この用量は使用される投与形態および使用される投与経路に応じて、この範囲内で変化し得る。本発明の方法に使用されるいかなる化合物についても、治療的に有効な用量が細胞培養アッセイから最初に推定され得る。用量は細胞培養で決定されたようなＩＣ５０（すなわち、症状の最大抑制の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成する動物モデルで処方される。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用され得る。血漿中のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより測定され得る。
【０１７９】
本発明により使用するための薬学的組成物は、１つまたは複数の生理学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤を使用して従来の方法で処方され得る。したがって、この化合物およびその生理学的に受容可能な塩および溶媒化合物は、吸入または通気（口または鼻のいずれかから）、または経口、頬側、非経口、局所、皮下、腹膜内、静脈内、胸膜内、眼球内、動脈内、または直腸投与による投与のために処方される。また、薬学的組成物が化合物の活性を増強する他の生成物とともに投与され、必要に応じて他の治療成分を含み得ることも考えられる。
【０１８０】
経口投与の場合、薬学的組成物は、例えば、結合剤（例えば、前糊化（ｐｒｅｇｅｌａｔｉｎｉｓｅｄ）トウモロコシデンブン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはグリコール酸塩ナトリウムスターチ（ｓｏｄｉｕｍ　ｓｔａｒｃｈ　ｇｌｙｃｏｌａｔｅ））；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に受容可能な賦形剤を使用する従来の手段によって調製される形態（例えば錠剤またはカプセル）をとり得る。錠剤は当該技術分野で周知である方法で被覆され得る。経口投与のための液体調製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の形態をとるか、あるいは使用前に水または他の適した媒体を用いて構成する乾燥製品として存在してもよい。このような液体調製剤は懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化可食性脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水溶性媒体（例えば、アーモンドオイル、油性エステル、エチルアルコールまたは分留植物油）；および保存剤（例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）などの薬学的に受容可能な添加剤を使用する従来の手段によって調製され得る。この調製剤はまた、適切に緩衝塩、香味剤、着色剤および甘味剤も含む。
【０１８１】
経口投与の場合の調製剤は、活性化合物を制御して放出させるように適切に処方され得る。
【０１８２】
頬側投与の場合には、この組成物は従来の方法で処方された錠剤またはトローチ剤の形態をとり得る。
【０１８３】
吸入による投与の場合には、本発明による使用のための化合物は適した噴霧剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適したガスを使用する加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレー形態で便宜的に送達される。加圧エアゾールの場合には、用量単位は、一定量を送達するバルブを備えることによって決定され得る。吸入または通気に使用するための、例えばゼラチンからなるカプセルまたはカートリッジが、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適した粉末基材との粉末状混合物を含むように処方され得る。
【０１８４】
この化合物は注射、例えば、一回大量注入（ｂｏｌｕｓ　ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）または連続注入による非経口投与のために処方され得る。注射のための処方剤は、単位用量形態、例えば添加された保存剤とともにアンプルまたは多用量容器に入れられ得る。この組成物は懸濁液、溶液、または油性または水性媒体中の乳化液のような形態をとることができ、懸濁、安定化および／または分散剤などの処方剤を含んでいてもよい。また、活性成分は使用前に適切な媒体、例えば無菌パイロジェンフリー水を用いて構成するための粉末形態であってもよい。
【０１８５】
この化合物はまた、例えば、ココア脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基材を含む座薬または保持性浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ　ｅｎｅｍａｓ）などの直腸用組成物として処方される。経口摂取はおそらく、いなかる投薬の中で最も容易な方法である。このような投与経路は一般的に単純で簡単であり、しばしば、患者の視点からみて不便さまたは不快さが最も少ない投与経路である。しかしながら、これはタンパク質および他の生物学的活性組成物を含む多くの物質には好ましくない環境である胃に物質を通すことを伴う。胃の酸性、加水分解性およびタンパク質分解性である環境が、続く同化作用のためにタンパク性物質をアミノ酸およびオリゴペプチドへ消化することを効率的に進めるので、単に経口から摂取した場合、広範囲に多様な生物学的活性タンパク性物質のうち、ほんのわずかのものが胃を通過して、小腸で体内に吸収されることは驚くべきことではない。その結果、多くのタンパク性薬剤はしばしば皮下、筋肉内または静脈内注射による非経口などの他の方法で摂取されなければならない。
【０１８６】
薬学的組成物はまた、薬剤活性を安定化するために、種々の緩衝液（例えば、トリス、酢酸塩、リン酸塩）、可溶化剤（例えば、ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）、ポリソルベート）、ヒト血清アルブミンなどのキャリア、保存剤（チメロサール、ベンジルアルコール）およびアスコルビン酸などの抗酸化剤を含み得る。安定化剤はＴｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０、ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎＸ−１００などの界面活性剤であり得る。ＥＢＰはまた、長期間にわたり、制御された送達を患者に行うための高分子化合物の微粒子調製物中に導入され得る。薬学的組成物中の成分のより大規模な検索は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　１８ｔｈ（編）、　Ａ．Ｒ．　Ｇｅｎｎａｒｏ（編）、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，　Ｅａｓｔｏｎ，　Ｐａ　（１９９０）に見られる。
【０１８７】
先に記載した処方剤のほかに、化合物はまたデポー製剤として処方され得る。このような長期作用処方剤は移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射により投与されてもよい。したがって、例えば、化合物は適切な高分子または疎水性物質（例えば、受容可能な油中の乳化剤として）またはイオン交換樹脂とともに処方されるか、または難溶解性誘導体として（例えば、難溶解性塩として）処方され得る。
【０１８８】
組成物は、所望であれば、活性成分を含む１つまたは複数の単位用量形態を含み得るパックまたはディスペンサー装置に入れられていてもよい。このパックは例えばブリスターパックなどの金属またはプラスチック箔を含んでもよい。このパックまたはディスペンサー装置は投与のための指示書が添付されていてもよい。
【０１８９】
（診断薬）
標的遺伝子に関連した疾患症状を診断するために、種々の方法が使用され得る。具体的に、試薬が、例えば標的遺伝子変異の存在を検出するために、あるいは標的遺伝子ｍＲＮＡの過剰発現（ｏｖｅｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）または不完全な発現（ｕｎｄｅｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）のいずれかを検出するために使用される。
【０１９０】
本発明の診断および予後判定（ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ）方法によれば、野生型標的遺伝子座の変化が検出される。さらに、この方法はまた、野生型標的遺伝子座を検出し、疾病素因または新形成の欠如を確認することによって実施され得る。「野生型遺伝子の変化」はコードまたは非コード領域の欠失、挿入および点変異を含む変異のすべての形態を包含する。欠失は全遺伝子または遺伝子の一部だけであってもよい。点変異は停止コドン、フレームシフト変異またはアミノ酸置換をもたらし得る。体細胞性変異はある組織（例えば腫瘍組織）にだけ生じるものであり、生殖系列に遺伝されない。生殖系列変異は、体組織のいずれにも見出され、遺伝され得る。ただ１つの対立遺伝子が体細胞で変異されると、初期新形成状態が示される。しかしながら、もしも両方の対立遺伝子が変異されるなら、そのときは、後期新形成状態が示される。したがって、遺伝子変異の発見は診断および予後の両方の情報を提供する。欠失されない標的遺伝子対立遺伝子（例えば、標的遺伝子欠失を有する染色体に対する姉妹染色体に見られる）は、挿入、小欠失および点変異などの他の変異のためにスクリーニングされ得る。腫瘍組織に見られる変異は、標的遺伝子産物の減少した発現に関連し得る。しかしながら、非機能的遺伝子産物をもたらす変異はまた、癌状態にも関連し得る。点変異事象は、ｍＲＮＡの発現の損失または減少をもたらす遺伝子のプロモーター中などの調節領域中で生じ得る。点変異はまた、標的遺伝子産物の発現の損失をもたらすか、あるいはｍＲＮＡの安定性または翻訳効率の減少をもたらす適切なＲＮＡプロセッシングを無効とする。
【０１９１】
候補遺伝子座中の変異を検出するために使用可能な１つの試験は、癌患者から得たゲノム標的配列をコントロール集団から得たものと直接に比較することである。また、例えばＰＣＲによって増幅後、メッセンジャーＲＮＡを配列決定し、それによって候補遺伝子のエクソン構造を決定する必要性を排除することができる。標的遺伝子のコード領域の外側に起こる（ｆａｌｌ）癌患者の変異は、標的遺伝子の近くまたはその中のイントロンおよび調節配列などの非コード領域を試験することにより検出され得る。非コード領域中の変異が重要であるとの初期指標は、コントロール個体と比較して癌患者の異常な大きさのまたは多量のメッセンジャーＲＮＡ分子を明らかにするノザンブロット実験から判明し得る。
【０１９２】
本明細書中に記載される方法は、例えば、本明細書に記載される少なくとも１つの特異的遺伝子核酸または抗遺伝子抗体試薬を含むプレパックされた診断キットを使用して実施され得る。これは、例えば、疾患症状を示すか、あるいは疾患が進展する危険性のある患者を診断する臨床設定において便宜的に使用される。
【０１９３】
遺伝子が発現されるいかなる細胞型または組織、好ましくは単球、内皮細胞または平滑筋細胞も、以下に記載される診断において使用される。
【０１９４】
分析される細胞型または組織から得たＤＮＡまたはＲＮＡは、当該技術分野で周知である方法を使用して容易に単離され得る。診断手法はまた、核酸精製が必要でないように、生検または切除から得た患者組織の組織切片（固定および／または凍結されている）上で、直接にインサイチュー（ｉｎ　ｓｉｔｕ）にて実施され得る。核酸試薬は、このようなインサイチュー手法のためのプローブおよび／またはプライマーとして使用され得る（例えば、Ｎｕｏｖｏ，　ＰＣＲ　Ｉｎ　Ｓｉｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎ．Ｙ．　（１９９２）を参照）。
【０１９５】
遺伝子ヌクレオチド配列、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかは、例えば、疾患関連遺伝子構造および発現を検出するために生物学的試料のハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイに使用され得る。このようなアッセイとしては、サザンまたはノーザン分析、制限断片長多型アッセイ、１本鎖配座多型分析、インサイチューハイブリダイゼーションアッセイ、およびポリメラーゼ連鎖反応分析が挙げられるが、これらに限定されない。このような分析は、遺伝子発現パターンの定量的態様、ならびに遺伝子発現および／または遺伝子組成物の定性的態様の両方を明らかにし得る。すなわち、このような態様としては、例えば、点変異、挿入、欠失、染色体再配列、および／または遺伝子発現の活性化または不活性化が挙げられ得る。
【０１９６】
遺伝子特異的核酸分子の検出のための好ましい診断方法は、例えば、１つまたは複数の標識された核酸試薬と、分析される細胞型または組織から誘導された核酸を、対象の核酸分子内のその相補的配列に、これらの試薬を特異的アニーリングするために好ましい条件下で、接触およびインキュベートすることを含む。好ましくは、これらの核酸試薬の長さは少なくとも９〜３０ヌクレオチドである。インキュベーション後、全てのアニールされない核酸は、核酸：フィンガープリント分子ハイブリッドから除去される。ハイブリダイズしたフィンガープリント組織から得た核酸の存在は、このような分子が存在する場合に検出される。このような検出スキームを使用して、対象の組織または細胞型から得た核酸は、例えば、膜などの固体支持体、またはマイクロタイタープレートまたはポリスチレンビーズなどのプラスチック表面などに固定化される。この場合、インキュベーション後、アニールされない標識核酸試薬は容易に除去される。残りのアニールされた標識核酸試薬の検出は、当該技術分野で周知である標準的技術を使用して達成される。
【０１９７】
遺伝子特異的核酸分子の検出に関する別の診断方法は、その増幅、例えばＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）に記載の実験の実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８８：　１８９−９３　（１９９１））、自己配列複製（ｓｅｌｆ　ｓｕｓｔａｉｎｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（Ｇｕａｔｅｌｌｉら、　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８７：　１８７４−７８　（１９９０））、転写増幅システム（Ｋｗｏｈら、　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，　８６：　１１７３−７７　（１９８９））、Ｑβレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　６：　１１９７　（１９８８））、または他の核酸増幅方法を含み、続いて、当業者に周知である技術を使用して増幅された分子の検出を行う。これらの検出スキームは、このような分子が非常に低い数で存在する場合に、核酸分子の検出のために特に有用である。
【０１９８】
このような検出スキームの１つの実施形態では、ｃＤＮＡ分子が対象のＲＮＡ分子から（例えば、ｃＤＮＡへのＲＮＡ分子の逆転写によって）得られる。このようなＲＮＡが単離され得る細胞型または組織は、野生型フィンガープリント遺伝子が発現されることが公知であるいかなる組織も含み、単球、内皮細胞、および／または平滑筋が挙げられるが、これらに限定されない。次いで、ｃＤＮＡ内の配列が、ＰＣＲ増幅反応などの核酸増幅反応のための鋳型として使用される。この方法の逆転写および核酸増幅工程で合成開始試薬（例えば、プライマー）として使用される核酸試薬は、本明細書中に記載される遺伝子核酸試薬の中から選択され得る。このような核酸試薬の好ましい長さは少なくとも１５〜３０ヌクレオチドである。増幅産物の検出には、核酸増幅が放射性または非放射性標識ヌクレオチドを使用して実施され得る。また、充分に増幅された産物は、この産物が標準的臭化エチジウム染色によって、または任意の他の適した核酸染色方法を使用することにより可視化され得る。
【０１９９】
野生型または変異遺伝子ペプチドに対する抗体はまた、疾患診断薬または予後判定薬としても使用され得る。このような診断方法は、遺伝子タンパク質発現の程度の異常、またはフィンガープリント遺伝子タンパク質の構造および／または組織、細胞内、または細胞下の位置における異常を検出するために使用され得る。構造的差異としては、例えば、正常なフィンガープリント遺伝子タンパク質に関連する変異体フィンガープリント遺伝子タンパク質の大きさ、電気陰性度、または抗原性の差異が挙げられる。
【０２００】
分析される組織または細胞型から得たタンパク質は、ウエスタンブロット分析を含むがこれに限定されない、当業者に周知である技術を使用して容易に検出または単離され得る。ウエスタンブロット分析を実施するための方法の詳細な説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、　（１９８９）前出、１８章を参照されたい。本明細書で使用されるタンパク質検出および単離方法はまた、例えばＨａｒｌｏｗ　および　Ｌａｎｅ（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８８））に記載されるものなどである。
【０２０１】
野生型または変異体遺伝子ペプチド分子の検出のための好ましい診断方法は、例えば、フィンガープリント遺伝子ペプチドが抗フィンガープリント遺伝子特異的ペプチド抗体とのその相互作用によって検出されるイムノアッセイを含み得る。
【０２０２】
例えば、本発明で有用な抗体、または抗体のフラグメントは、野生型または変異体遺伝子ペプチドの存在を定量的または定性的に検出するために使用される。これは、例えば光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光検出法と組み合わせて蛍光標識抗体（以下を参照）を使用する免疫蛍光技術によって達成され得る。このような技術は、フィンガープリント遺伝子ペプチドが細胞表面上で発現される場合に特に好ましい。
【０２０３】
本発明で有用である抗体（またはそのフラグメント）は、さらに、フィンガープリント遺伝子ペプチドのインサイチュー検出のための免疫蛍光法または免疫電子顕微鏡法で組織学的に使用され得る。インサイチュー検出は患者から組織学的検体を取り出し、その検体に本発明の標識抗体を適用することによって達成される。抗体（またはフラグメント）は、好ましくは生物学的試料上に標識抗体（またはフラグメント）を上に重ねることにより適用される。このような方法の使用によって、フィンガープリント遺伝子ペプチドの存在のみならず、試験された組織中のその分布を決定することも可能である。本発明を使用して、このようなインサイチュー検出を達成するために、当業者は、広範囲の組織学的方法（染色方法など）のいずれかが改変され得ることを容易に理解するであろう。
【０２０４】
野生型、変異体または広がったフィンガープリント遺伝子ペプチドのためのイムノアッセイは、代表的に、フィンガープリント遺伝子ペプチドを同定可能な検出可能に標識された抗体の存在下に、生物学的流体、組織抽出物、新鮮な収穫細胞、または組織培養物中でインキュベートされている細胞などの生物学的試料をインキュベートし、当該技術分野で周知である多くの技術のいずれかによって、結合された抗体を検出することを含む。
【０２０５】
生物学的試料が、細胞、細胞粒子または可溶性タンパク質を固定化可能なニトロセルロースなどの固相支持体またはキャリア、または他の固体支持体上に接触され、そして固定化され得る。次いで、この支持体を適した緩衝液で洗浄し、続いて、検出可能に標識された遺伝子特異的抗体を使用して処理し得る。次いで、固相支持体を２回目の緩衝液で洗浄して、未結合抗体を除去する。次いで、固相支持体上の結合標識の量を従来の手段で検出し得る。
【０２０６】
「固相支持体またはキャリア」とは、抗原または抗体を結合可能ないかなる支持体をも意図するものである。周知の支持体またはキャリアとしては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロプレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然または改変されたセルロース、ポリアクリルアミド、斑糲岩、磁鉄鉱が挙げられる。キャリアの性質は、本発明の目的において、ある程度可溶性であるか不溶性のいずれかであり得る。支持体物質は、結合された分子が抗原または抗体に結合可能なかぎり、実質的にいかなる可能性のある構造的立体配置を有していてもよい。したがって、支持体の立体配置は、ビーズのような球状、または試験管の内側表面のような円筒状、または棒状体の外表面であってもよい。また、その表面はシート、試験片などのように平らであってもよい。好ましい支持体としてはポリスチレンビーズが挙げられる。当業者は、抗体または抗原を結合するための多くの他の適したキャリアを知っているか、また、日常の実験を使用することによりこれを確証できるであろう。
【０２０７】
所定の多数の（ａ　ｇｉｖｅｎ　ｌｏｔ　ｏｆ）抗野生型または抗変異体フィンガープリント遺伝子ペプチド抗体の結合活性は、周知方法によって測定され得る。当業者は日常の実験を使用することにより各測定のための操作的および最適アッセイ条件を決定できるであろう。
【０２０８】
遺伝子ペプチド特異的抗体が検出可能に標識され得る方法の１つは、酵素にこれを連結し、そしてエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）にこれを使用することである（Ｖｏｌｌｅｒ，　Ｒｉｃ　Ｃｌｉｎ　Ｌａｂ，　８：　２８９−９８　（１９７８）［“Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ　（ＥＬＩＳＡ）”，　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｈｏｒｉｚｏｎｓ　２：　１−７，　１９７８，　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，　Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，　Ｍｄ．］；　Ｖｏｌｌｅｒら、　Ｊ．　Ｃｌｉｎ．　Ｐａｔｈｏｌ．，　３１：　５０７−２０　（１９７８）；　Ｂｕｔｌｅｒ，　Ｍｅｔｈ．　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　７３：　４８２−５２３　（１９８１）；　Ｍａｇｇｉｏ（編）、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，　ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ．　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，　Ｆｌａ．　（１９８０）；　Ｉｓｈｉｋａｗａら（編）、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，　Ｉｇａｋｕ−Ｓｈｏｉｎ，　Ｔｏｋｙｏ　（１９８１））。抗体に結合される酵素は、例えば、分光光度定量法、蛍光定量法によるか、あるいは可視的手段によって検出され得る化学部分（ｍｏｉｅｔｙ）を製造するような方法で、適切な基質、好ましくは発色基質と反応するであろう。抗体を検出可能に標識するために使用され得る酵素としては、マレートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカルヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェート、デヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、西洋ワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。検出は酵素の発色基質を使用する発色方法によって達成され得る。検出はまた、同様に調製された標準品と比較される基質の酵素反応の程度を可視的に比較して達成され得る。
【０２０９】
検出はまた、種々の他のイムノアッセイのいずれかを使用して達成され得る。例えば、抗体または抗体フラグメントを放射性標識することにより、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）の使用により、フィンガープリント遺伝子の野生型、変異体、または広がったペプチドを検出することができる（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，　Ｂ．，　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，　Ｓｅｖｅｎｔｈ　Ｔｒａｉｎｉｎｇ　Ｃｏｕｒｓｅ　ｏｎ　Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ　Ａｓｓａｙ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ｔｈｅ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｓｃｏｃｉｅｔｙ，　Ｍａｒｃｈ，　１９８６）。放射性同位元素はガンマカウンターまたはシンチレーションカウンターの使用のような手段、またはオートラジオグラフィーによって検出され得る。
【０２１０】
蛍光性化合物で抗体を標識することも可能である。蛍光標識された抗体は適切な波長の光に暴露されると、次いで、その存在が蛍光によって検出され得る。最も一般的に使用される蛍光標識化合物の中には、蛍光性イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒドおよびフルオレスカミンがある。
【０２１１】
抗体はまた、１５２Ｅｕなどの蛍光放出金属、またはランタニド系列の他のものを使用して検出可能に標識され得る。これらの金属は、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン−テトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のような金属キレート基を使用して抗体に結合され得る。
【０２１２】
抗体はまた、化学発光性化合物に結合することにより検出可能に標識され得る。次いで、化学発光でタグ化された抗体の存在が、化学反応の進行中に発生する発光の存在を検出することにより決定される。特に有用な化学発光性標識合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、テロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩および蓚酸エステルがある。
【０２１３】
同様に、生物発光性化合物が本発明の抗体を標識するために使用され得る。生物発光は、触媒性タンパク質が化学発光反応の効率を増加する生物学系において見出された化学発光の一種である。生物発光性タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより決定される。標識目的のために重要な生物発光性化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０２１４】
本願中、種々の刊行物、特許および公開特許公報は、確認する引例として参照される。本願で参照されるこれらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示は、ここで、本発明が関連する先行技術の状況をより完全に記載するために、本開示中に参考として援用される。
【０２１５】
以下の実施例は、本発明を説明することのみを意図され、主題である発明を限定するように解釈されるべきでない。
【０２１６】
（実施例）
（実施例１：プラスミドライブラリーからの直接構築物構築）
ラムダＺＡＰＴＭ系を使用するゲノムライブラリーは、以下のようにして調製された。胚性幹細胞は１００ｍｍ組織培養プレート中で成長させた。高分子量ゲノムＤＮＡは、胚性幹細胞の集密的な１００ｍｍプレートに５ｍｌの溶解緩衝液（トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１０ｍＭ、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０ｍＭ、ＮａＣｌ　１０ｍＭ、０．５％ＳＤＳ、および１ｍｇ／ｍｌプロティナーゼＫ）を添加してこれらのＥＳ細胞から単離した。次いで、これらの細胞を６０℃で数時間、または完全に可溶化されるまでイキュベートした。ゲノムＤＮＡは、穏やかなフェノール：クロロホルム抽出を数回行い、次いでエタノール沈殿を行って溶解細胞から精製した。
【０２１７】
ゲノムＤＮＡを、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを使用して部分的に消化して、約５〜２０ｋｂのフラグメントを生成した。これらのフラグメントの末端を、Ｋｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼの存在下にてｄＡＴＰおよびｄＧＴＰの添加によって部分的に充填して、ゲノムフラグメントに不適合性末端を作製した。次いで、５ｋｂと１０ｋｂとの間の大きさのフラグメントを、アガロースゲル電気泳動（１×ＴＡＥ、０．８％ゲル）によって精製した。次いで、このＤＮＡを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　ｇｅｌ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、切除されたアガロース片から単離した。
【０２１８】
ゲノムフラグメントを、ＸｈｏＩで切断され、かつｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびＫｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼを使用して部分的に充填されているλＺａｐＴＭＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中に連結させた。連結後、ＤＮＡは、λ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ　ｍｉｘ（Ｇｉｇａｐａｃｋ　ＩＩＩ　ｇｏｌｄ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用してパッケージングして、力価を測定した。
【０２１９】
環状ファージミドＤＮＡを、Ｍ１３ヘルパーファージである、ＥｘＡｓｓｉｓｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，）の存在下にて適切な細菌株（ＸＬ−１　Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）でλクローンを増殖させることによって、λライブラリーから誘導した。具体的には、約１００，０００個のλクローンを１０〜１００倍過剰の細菌およびヘルパーファージの両方とともに３７℃で２０分間、インキュベートした。１ｍｌのＬＢ培地と１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４を、各切除反応へ添加し、３７℃で一晩、攪拌下にてインキュベートした。通常、２４〜９６のこれらの反応を、９６ウェルのディープウェルブロックに同時に準備した。翌朝、このブロックを、６５℃まで１５分間加熱し、細菌およびλファージの両方を死滅させた。細菌残骸を、約３０００ｇで１５分間の遠心分離によって除去した。環状ファージミドＤＮＡを含む上清を残し、そして．プラスミドＰＣＲに直接使用した。
【０２２０】
上記されたファージミドＤＮＡのプールを、長距離（ｌｏｎｇ−ｒａｎｇｅ）ＰＣＲ、および公知配列（図１に示される）に基づき上記したように選択された「外方向に向かう（ｏｕｔｗａｒｄ  ｐｏｉｎｔｉｎｇ）」オリゴを使用して、目的の特定遺伝子についてスクリーニングした。ＰＣＲ反応液は、２μｌのプールファージミドＤＮＡサンプル、３μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液３（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、１．１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、５０ｎＭのプライマー、０．３μｌのＥＸＰＡＮＤ  Ｌｏｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  ＰＣＲ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および３０μｌのＨ２Ｏを含む。サイクリング条件は９４℃で２分間（１サイクル）、９４℃で１０秒間、６５℃で３０秒間、６８℃で１５秒間（１５サイクル）；９４℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、６８℃で１５秒間およびさらなる各サイクル（２５サイクル）毎に２０秒間の増加；６８℃で７分間（１サイクル）そして４℃で保持した。
【０２２１】
ＰＣＲ反応産物を、１×ＴＡＥ緩衝液を含むアガロースゲルを介する電気泳動により分離し、臭化エチジウムおよびＵＶ光で可視化した。首尾よい長距離ＰＣＲを示す大きなフラグメントをいずれもゲルから切除し、そしてＱＩＡｑｕｉｃｋ　ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。
【０２２２】
ＰＣＲフラグメントを制限マッピングする必要性を除くために、次の連結非依存性クローニング戦略を使用した。目的の長距離ＰＣＲフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒｉｔａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、「精製」した。ＰＣＲフラグメントの１本鎖末端を、０．１〜２μｇのフラグメント、２μｌのＮＥＢ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）緩衝液４；１μｌの２ｍＭ　ｄＴＴＰ、６単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、Ｈ２Ｏを混合して、全容量２０μｌとして、２５℃で３０分間、インキュベートすることにより生成した。ポリメラーゼを、７５℃で２０分間の加熱によって不活性化した。１本鎖末端をまた、独特な制限酵素部位で、ＳａｃＩおよびＳａｃＩＩを使用してプラスミドベクターｐＤＧ２（図２Ａに示されるｐＤＧ２）を消化し、上記のようにＴ４ＤＮＡポリメラーゼで各反応物を処理することによって、ＮｅＯｒ選択マーカーフラグメント上に作製した。図１に示されるベクターを、長距離ＰＣＲフラグメント上のものと相補的な１本鎖末端を使用して調製した。
【０２２３】
次いで、ベクターとフラグメントを、２工程クローニング戦略または四方向１工程プロトコールのいずれかを使用して構築物中へアセンブリした。簡単には、１０ｎｇのＴ４処理Ｎｅｏｒカセット、１μｌのＴ４処理ＰＣＲフラグメント、０．２μｌの０．５Ｍ　ＥＤＴＡ、０．３μｌの０．５Ｍ　ＮａＣｌおよび４μｌまでのＨ２Ｏを含む反応物を、６５℃まで加熱し、約４５分かけて室温にまで冷却させた。次いで、この混合物を、サブクローニングに効率的なＤＨ５−αコンピテント細胞中に形質転換した。
【０２２４】
（実施例２：ファージライブラリーからの構築物の生成）
マウス胚性幹細胞ライブラリーを、以下のようにλファージ中で調製した。ゲノムライブラリーを、Ｓａｕ３ＡＩ部位でのＤＮＡの部分的切断によってゲノムＤＮＡから構築し、長さ約２０ｋｂのゲノムフラグメントを得た。これらのＤＮＡフラグメントの末端配列を、ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰの存在下にてＫｌｅｎｏｗ酵素を使用して部分的に充填し、そのフラグメントを、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰの存在下にてＫｌｅｎｏｗを使用して部分的に充填されている適切なλクローニングベクター、例えばλＦｉｘＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）のＸｈｏＩ部位中にＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して連結させた。代替的に、部分的に消化させたゲノムＤＮＡを、蔗糖勾配および選択される約２０ｋｂの配列を使用してサイズ選択した。富化された画分を、ＢａｍＨＩ切断λベクター、例えば、λ　Ｄａｔｓｈ　ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中へクローン化した。
【０２２５】
このライブラリーを、各プレートが約１，０００個のクローンを含む１，１５２のプレート上に平板培養した。したがって、全部で１．１百万個のクローン（８ゲノムに等しい）を平板培養した。
【０２２６】
ファージを、各プレートへ４ｍｌのλ溶出緩衝液（１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０））を添加して、室温で３〜５時間インキュベートすることにより各プレートから溶出した。インキュベーション後、２ｍｌの緩衝液を各プレートから収集して、９６ディープウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｉｎ．）の１つのウェルの中に置いた。１２個の９６ウェルプレートを充填し、「サブプール（ｓｕｂ−ｐｏｏｌ）ライブラリー」と呼んだ。
【０２２７】
サブプールライブラリーを使用して、「プールライブラリー」を、新規な９６ウェルプレートの１つのウェルの中に１２の異なったサブプールウェルの１００μｌを置くことによって作製した。１２個のサブプールプレートを組み合わせて１つのプレートのプールライブラリーを形成した。
【０２２８】
目的の遺伝子をＰＣＲ増幅することが知られている１対のオリゴヌクレオチドを使用して、「大きなプール（ｌａｒｇｅ−ｐｏｏｌ）ライブラリー」の９６プールからの上清を増幅した。ＰＣＲはを、０．５単位のＡｍｐｌｉｔａｑ　ＧｏｌｄＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）、１μＭの各オリゴヌクレオチド、２００μＭ　ｄＮＴＰ、２μｌのプール（またはサブプール）上清の１〜５倍希釈物、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、および１．５ｍＭまたは１．２５ｍＭのいずれかのＭｇＣｌ２の存在下にて実施した。サイクリング条件は、９５℃で８分間（１サイクル）；９５℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で４５秒間（５５サイクル）、７２℃で７分間（１サイクル）そして４℃で保持した。遺伝子に依存して、実施例１に記載されるアガロースゲル上で同定した場合にポジティブシグナルが約３および１２プールの間で産生した。さらに精製が必要な場合（すなわち、明瞭なシグナルが増幅後に存在しない場合）、プールを作る１２のサブプールを、同じプライマーを使用する増幅に供し、１つのサブプール（１０００クローン）を同定した。
【０２２９】
（フランキングフラグメントの生成）
上記されたように、ノックアウト構築物は、ポジティブ選択マーカーに隣接する標的遺伝子に対して相同であるＤＮＡ配列の２つのブロックを含む。長距離ＰＣＲを、実施例２に上記したようにしてポジティブに同定されたλクローンのプールから実施した。各フラグメントを、１つの型の塩基を欠き、かつベクター上の所定の配列に相補的である所定の配列を有する１対のオリゴヌクレオチドを使用して生成した。得られたフラグメントは１ｋｂと５ｋｂとの間であった。５ｋｂより長い第３のフラグメントも、適切なオリゴヌクレオチドを使用して生成する。次いで、この第３のフラグメントを、ノックアウトされる遺伝子の近くであるが、ベクターの外側にあるＤＮＡ配列を得るために使用した。
【０２３０】
（実施例３：２工程クローニング−一般的方法）
ｐＤＧ２プラスミドベクター（図２Ａ）は、独特な制限部位ＳａｃＩＩおよびＳａｃＩを含む。適切な１本鎖アニーリング部位を、制限酵素ＳａｃＩＩまたはＳａｃＩのいずれかを使用してｐＤＧ２ベクターを消化し、そして上記したように各反応物をＴ４ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＴＴＰで処理することによって生成した。４つの反応物を、各ベクターについてマイクロタイタープレートに準備した。反応物は（１）Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理フラグメント；（２）Ｔ４処理フラグメント反応物の１：１０倍希釈物；（３）Ｔ４処理フラグメントの１：１００倍希釈物または（４）Ｈ２Ｏ（挿入物のないコントロール）のいずれかを１μｌ含む。マイクロタイタープレートを密封し、６５℃まで加熱された２つの温度ブロックの間に置き、室温で３０〜４５分間、ゆっくり冷却させた。
【０２３１】
次いで、マイクロタイタープレートを氷上に置き、２０〜２５μｌのサブクローニングに効率的なコンピテントな細胞を各ウェルに添加した。プレートを、氷上で２０〜３０分間インキュベートした。次いで、マイクロタイタープレートを、４２℃までに加熱された２つの温度ブロックの間に２分間置き、続いて氷上に２分間置いた。１００μｌのＬＢを各ウェルに添加し、プレートをパラフィルムで覆い、そして３７℃で３０〜６０分間インキュベートした。各ウェルの全内容物は１つのＬＢ−Ａｍｐプレート上に平板培養し、そして３７℃で一晩インキュベートした。
【０２３２】
約１２と２４との間のコロニーを、挿入物のないコントロールよりも少なくとも２〜４倍も多いコロニーを有するプレートからピックアップした。これらのコロニーを３７℃で一晩ディープウェルプレートで増殖させ、次いで、プラスミドＤＮＡをＱｉａｇｅｎミニプレップキットを使用して抽出した。
【０２３３】
プラスミドＤＮＡを、ＮｏｔＩ酵素およびＳａｌＩ酵素を使用して消化した。図２Ａに示されるように、ＮｏｔＩ／ＳａｌＩ消化は、クローニング部位３および４を含む大きなフラグメント、ならびにクローニング部位１および２およびＮｅｏｒ遺伝子を含む小さなフラグメントを生成する。消化後、反応物は、０．２μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含む０．８％アガロースゲル上にかけた。挿入物がない場合、２つのバンド、１９７５塩基対のものと２７９３塩基対のものが存在した。挿入フラグメントが存在する場合、これらのバンドの少なくとも１つは、より大きい。なぜなら、アニーリング部位１／２または部位３／４のいずれかでフラグメント（挿入物１または２）をも含むからである。挿入物バンドを切除し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットで処理した。１μｌの１０×リガーゼ緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭ　ＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）、１μｌ　Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、１〜２μｌフラグメント（部位３／４バンド）、５μｌの部位１／２バンドおよび１０μｌまでのＨ２Ｏを含む第２の連結反応を実施した。コントロールもまた、部位３／４フラグメントまたは部位１／２フラグメントのいずれかを水に代えて準備した。反応物を、室温で１〜２時間インキュベートし、そして２５μｌのコンピテント細胞で形質転換した。
【０２３４】
これらの実施例の文脈における「フランキングＤＮＡ」とは、欠失または変異されるべき標的遺伝子中の領域に隣接するゲノム配列を指す。「フランキングＤＮＡ」はまた、標的遺伝子と相同であるＤＮＡ配列のブロックとして上記される。Ｒ１ゲノムライブラリーは、Ｒ１　ＥＳ細胞株から調製されたゲノムライブラリーをいう。このようなライブラリーを、実施例１に記載されるように調製し得る。
【０２３５】
（実施例４：網膜特異的核内レセプター遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析）
網膜特異的核内レセプターの役割を研究するために、網膜特異的核内レセプター遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、網膜特異的核内レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より特定には、特に配列番号１９を含む網膜特異的核内レセプター遺伝子を破壊または改変する能力を有する網膜特異的ターゲティング構築物を、配列番号２０または配列番号２１として本明細書中で同定されるオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、１２９／Ｓｖ−＋Ｐ＋Ｍｇｆ−ＳＬＪ／Ｊマウス亜系統から誘導されたＥＳ細胞中に導入し、キメラマウスを生成した。Ｆ１マウスを、雌性Ｃ５７ＢＬ／６とともに交雑することによって生成した。Ｆ２ホモ接合性変異マウスを、Ｆ１ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。網膜特異的核内レセプター遺伝子における破壊を含むトランスジェニック動物を、表現型の変化および発現パターンについて分析した。網膜特異的核内レセプター遺伝子における破壊に関連する表現型は、以下のようにして決定した。
【０２３６】
（ホモ接合性マウス）
分析したホモ接合性マウスは、以下の表現型の少なくとも１つを示した。
【０２３７】
目：以下によって特徴付けられる重度の網膜異形成症を含む目の異常：大きなロゼット形成および網膜フォールディング；病巣を満たす棹状体および錐状体を有する網膜の外側核内層の分節菲薄化（ｓｅｇｍｅｎｔａｌ　ｔｈｉｎｎｉｎｇ）；ならびに、網膜の完全な片側欠如。さらに、網膜によって正常に占められる空間は、線維性結合組織、骨様骨棘およびいくつかの鉱質で充填されていた。ある範囲で、結合組織は後方水晶体包に付着していた。水晶体の前方面に付着する肥厚化した虹彩を有する後方癒着を検出した。網膜の着色された上皮層は肥厚化され、そしてその細胞は大きさおよび数が増加した。水晶体の内部構造は組織崩壊され、腫脹および変性した線維を含んだ。網膜が片側で欠損する例では、小さな病巣痕跡が存在していた。
【０２３８】
胃腸管：胃腸管の異常は、胃の深部粘膜および粘膜下組織に好中球の多巣性浸潤物を含んだ。
【０２３９】
皮膚：皮膚の異常は、真皮内に病巣リンパ性炎症を含んだ。
【０２４０】
精巣／副睾丸：精巣および副睾丸の異常は、低下した精子形成を含んだ。特に、輸精細管には変性または壊死性精子形成上皮細胞および多核性巨細胞が散らばっていた。副睾丸は精子細胞の数が低下し、変性細胞が細管内に存在した。いくつかの副睾丸細管の上皮細胞は、空胞化されていた。
【０２４１】
臨床化学／血液分析：異常は、野生型コントロール値に比べて、低いアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、およびクレアチニンキナーゼ（ＣＫ）値を含んだ。しかし、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性は上昇していた。血液学的評価は、より低い全白血球数を示した。
【０２４２】
（ヘテロ接合性マウス）
皮膚：異常は、局所的線維症およびリンパ系皮膚炎を含んだ。
【０２４３】
肝臓：異常は、胆管肥厚化および線維症を有する胆管周囲炎を含んだ。
【０２４４】
（実施例５：リンパ系特異的Ｇ−タンパク質結合レセプター遺伝子破壊を含むマウスの生成および分析）
リンパ系特異的Ｇ−タンパク質結合レセプターの役割を研究するために、リンパ系特異的Ｇ−タンパク質結合レセプター遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、リンパ系特異的Ｇ−タンパク質結合レセプター遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、特に配列番号２２を含むリンパ系特異的Ｇ−タンパク質結合レセプター遺伝子を破壊または改変する能力を有するリンパ系特異的ＧＰＣＲターゲティング構築物を、配列番号２３および配列番号２４として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、１２９／ＯｌａＨｓｄマウス亜系統から誘導されたＥＳ細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。Ｆ１マウスを、雌Ｃ５７ＢＬ／６と飼育して生成した。Ｆ２ホモ接合性変異体動物を、Ｆ１ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑して生成した。リンパ系特異的Ｇ−タンパク質結合レセプター遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを、表現型の変化および発現パターンについて分析した。リンパ系特異的ＧＰＣＲにおける破壊に関連した表現型を、以下のようにして決定した。
【０２４５】
（ホモ接合性マウス）
ホモ接合性マウスは、下記の表現型の少なくとも１つを示した：
肺：肺の異常は細気管支の周りに細胞性浸潤液を含んだ。様々な程度の斑状気管支周辺リンパ球性細胞性浸潤液を示す肺の変化が検出された。浸潤液は、主に小リンパ球から構成された。気管支周辺リンパ球性袖口様縁形成は、リンパ球の病巣胸膜下集合；血管壁のフィブリノイド壊死；および気管支上皮の肥厚化を含んだ。
【０２４６】
膵臓：膵臓の異常は、膵管および島の近くに膵臓細胞性浸潤液を含んだ。特に、管周辺細胞性浸潤液または島周辺細胞性浸潤液が存在し、主に小リンパ球から構成された。
【０２４７】
胃：胃の異常は、小リンパ球、顆粒球および血漿細胞から構成される胃液混合細胞性浸潤液を含んだ。浸潤液は、胃の深在粘膜、粘膜下組織および／または筋層を含んだ。
【０２４８】
肝臓：肝臓の異常は、細胞性浸潤液、主に門脈三管に関与するリンパ球を含んだ。
【０２４９】
（発現分析）
ＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）発現を、脾臓およびリンパ節で検出した。特に、リンパ節で、数種の細胞が強いＸ−Ｇａｌ染色を示した。脾臓では、強い染色を、赤脾髄のいくつかの細胞で検出した。
【０２５０】
（実施例６：メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析）
ＧＰＣＲメラニン形成細胞刺激ホルモンの役割を研究するために、ＧＰＣＲメラニン形成細胞刺激ホルモン遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、ＧＰＣＲメラニン形成細胞刺激ホルモン遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、特に配列番号２５を含むメラニン形成細胞刺激ホルモンレセプターをコードする遺伝子を破壊または改変する能力を有するメラニン形成細胞刺激ホルモンターゲティング構築物を、配列番号２６および配列番号２７として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、１２９／ＯｌａＨａｄマウス亜系統から誘導されたＥＳ細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。Ｆ１マウスを、雌Ｃ５７ＢＬ／６と交雑することによって生成した。Ｆ２ホモ接合性変異マウスを、Ｆ１ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。
【０２５１】
メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子に破壊を含むトランスジェニック動物を、表現型の変化および発現パターンについて分析した。メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子における破壊に関連した表現型を、以下のようにして決定した。
【０２５２】
挙動分析：ホモ接合性マウスは、オープンフィールド試験で移動した全体距離において野生型マウスとは有意に異なっていた。ホモ接合性マウスは、その野生型対応物よりも著しく（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ）動きまわり、かつオープンフィールドを探索するという点で、活動低下していた。オープンフィールド試験を、活動のレベルおよび不安における変化を証明するために使用した。したがって、オープンフィールドデータは、ホモ接合性マウスが野生型コントロールマウスよりも活動低下していることを示す。
【０２５３】
ＬａＺ発現分析：ＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）発現を、食道、皮膚および雄生殖系で検出した。
【０２５４】
（実施例７：マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析）
マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子の役割を研究するために、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子、特に配列番号２８を含む遺伝子を破壊および改変する能力を有するマグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子ターゲティング構築物を、配列番号２９および配列番号３０として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、１２９／ＯｌａＨｓｄマウス亜系統から誘導されたＥＳ細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。Ｆ１マウスを、雌Ｃ５７ＢＬ／６と交雑することによって生成した。Ｆ２ホモ接合性変異マウスを、Ｆ１ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。
【０２５５】
マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子に破壊を含むトランスジェニック動物を、表現型の変化および発現パターンについて分析した。マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子における破壊に関連した表現型を、以下のようにして決定した。
【０２５６】
（ホモ接合性マウス）
ホモ接合性マウスは、以下の表現型のうちの少なくとも１つを示した：
肺：肺の異常は、異物誤嚥性肺炎を示唆する肺損傷を含んだ。関連する肉芽腫瘍（おそらく異物）、泡沫肺胞マクロファージ、および肺胞マクロファージ内の好酸球増加性結晶を伴う斑状気管支周辺急性炎症が肺の中で見られた。肺の斑状黄赤色変色も検出された。
【０２５７】
血液学：血液中の異常は、上昇した白血球（ＷＢＣ）数を含んだ。
【０２５８】
剖検試験：斑状赤黄色肺変色。筋肉と骨は、野生型コントロールよりも軟らかった。
【０２５９】
（発現分析）
強いｌａｃＺ発現は、脳、脊髄、坐骨神経、眼、ハーダー腺、胸腺、脾臓、リンパ節、骨髄、大動脈、心臓、肺、肝臓、胆嚢、膵臓、腎臓、膀胱、気管、喉頭、食道、甲状腺、下垂体、副腎、唾液腺、舌、骨格筋、皮膚および雌雄生殖系を含む、試験された全ての組織または器官において検出可能であった。
【０２６０】
（実施例８：ケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析）
ケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子の役割を研究するために、ケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、ケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、特に配列番号３１を含むケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子を破壊および改変する能力を有するケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子ターゲティング構築物を、配列番号３２および配列番号３３として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、１２９／ＯｌａＨｓｄマウス亜系統から誘導されたＥＳ細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。Ｆ１マウスを、雌Ｃ５７ＢＬ／６と交雑することによって生成した。Ｆ２ホモ接合性変異マウスを、Ｆ１ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。
【０２６１】
（実施例９：ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析）
ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子の役割を研究するために、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、特に配列番号３４を含むｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子を破壊および改変する能力を有するｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子ターゲティング構築物を、配列番号３５および配列番号３６として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、１２９／ＯｌａＨｓｄマウス亜系統から誘導されたＥＳ細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。Ｆ１マウスを、雌Ｃ５７ＢＬ／６と交雑することによって生成した。Ｆ２ホモ接合性変異マウスを、Ｆ１ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。
【０２６２】
ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子に破壊を含むトランスジェニック動物を、表現型の変化および発現パターンについて分析した。ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子における破壊に関連した表現型を、以下のようにして決定した：
（ホモ接合性マウス）
ホモ接合性マウスは、以下の表現型の少なくとも１つを示した：
眼：ホモ接合性マウスは、特に網膜に関与する眼の異常、より具体的には光レセプター層（すなわち、棹状体と錐状体、外核層、外網状層）の完全な非存在を伴う重症の両側網膜変性または網膜異形成を含む網膜変性（ＲＤ）を示した。棹状体と錐状体は、光レセプター細胞の樹状突起であり、外核層は、光レセプター細胞の核を示し、そして外網状層は、光レセプター細胞の軸索線維を示す。このような眼の異常は、視覚障害または盲目を伴い得る。これらのマウスの眼の他の異常は、内核層の菲薄化および空胞化；内網状層の菲薄化；神経節細胞核、特に大きな神経節細胞の損失；神経線維層の神経膠症；ならびに網膜脈管構造の減弱を含んだ。マウスで観察されたＲＤは、ヒトの網膜色素変性症（ＲＰ）に類似している。
【０２６３】
大動脈：大動脈の異常は、大動脈の外膜または炎症を含んだ。
【０２６４】
腎臓：腎臓異常は、尿細管拡大または腎盂炎を含んだ。
【０２６５】
肝臓：検出された肝臓異常は、髄外造血を含んだ。
【０２６６】
リンパ節：リンパ節の異常は、リンパ球増殖症、リンパ球萎縮または出血を含んだ。
【０２６７】
皮膚：皮膚異常は、皮膚炎を含んだ。
【０２６８】
体重：異常は、増加した体重と体長を含んだ。特に、コントロールマウスに対して体重は雄で約１１％〜３７％増加し、体長は約１３％増加していた。体長に対する体重の比は、約２３％増加していた。
【０２６９】
器官重量：増加した器官重量が脾臓および胸腺、腎臓および肝臓で見られた。特に脾臓重量は、約１３％〜２８％の範囲で増加し、胸腺重量は、約１７％〜３０％の範囲で増加した。腎臓重量は約１６％増加し、肝臓重量は約３８％増加していた。
【０２７０】
臨床化学：上昇したレベルのＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）、リン、カリウム、またはビリルビンを検出した。
【０２７１】
挙動分析：ホモ接合性マウスは、オープンフィールド試験においてより大きな総距離を動き、オープンフィールドをより多く探索する有意に増加した活動を示した。この観察はホモ接合性マウスの多動を示した。
【０２７２】
（ヘテロ接合性マウス）
眼：眼の異常はピンクアイを含む変色を含んだ。
【０２７３】
（ＬａｃＺ発現分析）
ＬａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）発現を、胸腺、唾液腺プロパー、喉頭の唾液腺、気管の気管周腺および粘膜下腺および舌の粘液腺に検出した。
【０２７４】
（実施例１０：スルホトランスフェラーゼ遺伝子破壊を含むマウスの生成と分析）
スルホトランスフェラーゼ遺伝子の役割を研究するために、スルホトランスフェラーゼ遺伝子における破壊を、相同組換えによって生成した。具体的には、スルホトランスフェラーゼ遺伝子に破壊を含むトランスジェニックマウスを作製した。より具体的には、スルホトランスフェラーゼ遺伝子、特に配列番号３７を含む遺伝子を破壊または改変する能力を有するスルホトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティング構築物を、配列番号３８および配列番号３９として本明細書中で同定されたオリゴヌクレオチド配列を使用して作製した。ターゲティング構築物を、１２９／ＯｌａＨｓｄマウス亜系統から誘導されたＥＳ細胞中に挿入して、キメラマウスを生成した。Ｆ１マウスを、雌Ｃ５７ＢＬ／６と交雑することによって生成した。Ｆ２ホモ接合性変異マウスを、Ｆ１ヘテロ接合性の雄と雌とを交雑させることによって生成した。これらの動物を、表現型変化について評価した。スルホトランスフェラーゼ遺伝子の破壊に関連した表現型を、以下のようにして決定した：
（ホモ接合性マウス）
肝臓：ホモ接合性マウスは、野生型マウスに比べて肝臓で異常を示した。ホモ接合性マウスは以下の少なくとも１つを示した：斑状蒼白の腺房帯３肝実質細胞；肝実質細胞の細胞質内の核内陥入を有する様々な大きさの好酸性小球；または赤血球大小不同、核の大小不同および野生型マウスに比べて増加した有糸分裂細胞活性。
【０２７５】
唾液腺：ホモ接合性マウスは、ハーダー腺および唾液腺の異常を示した。特に、これらの腺に病巣の色素沈着が、そして顎下腺に萎縮症および線維症が存在した。
【０２７６】
挙動分析：ホモ接合性マウスは野生型マウスに比べて、積極的で、多動であり、かつ不安の少ない挙動を示した。特に、２週齢に始まってホモ接合性変異体雄マウスは、野生型同腹仔に比べて増大した攻撃性を示した。飼育室を観察中、これらの動物は正常な雄マウスよりもその部屋のマウスを攻撃し、そのような攻撃を阻止するために別の飼育室へ入れなければならなかった。さらに、ホモ接合性変異体マウスは、オープンフィールド試験において野生型マウスとは有意に異なっていた。変異体は動きまわり、かつ野生型マウスよりもより敏速にオープンフィールドを探索して多動であり、野生型マウスに比べて増加した活動および低下した不安を示した。
【０２７７】
ホモ接合性マウスは、オープンフィールドで野生型と有意に異なっていた（中央で過ごす時間の％）。ホモ接合性マウスは、野生型マウスに比べてオープンフィールドの中心部分でより長い割合の時間を過ごし、不安がより少なかった。
【０２７８】
当業者には明らかなように、上記実施形態の種々の改変は、本発明の精神および範囲から逸脱することなくなされ得る。これらの改変および変更は、本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明のターゲティングベクターを構築する１つの方法を示す概略図である。プラスミドＰＣＲ法は、実施例９および１０に記載される。
【図２】
図２Ａは、ｐＤＧ２ベクターを示す概略図である。このベクターは、アンピシリン耐性遺伝子およびネオマイシン（Ｎｅｏｒ）遺伝子を含む。Ｎｅｏｒ遺伝子の両側部は、制限部位とともに連結非依存性クローニングのための２つの部位である。ｐＤＧ２の配列は、図２Ｂおよび配列番号１に示される。
【図３】
図３Ａは、ｐＤＧ４ベクターを示す概略図である。このベクターは、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン（Ｎｅｏｒ）遺伝子および緑色蛍光性タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含む。Ｎｅｏｒ遺伝子の両側には、制限酵素認識部位とともに連結非依存性クローニングのための２つの部位である。ｐＤＧ４の配列は、図３Ｂおよび配列番号２に示される。
【図４】
図４（配列番号３〜配列番号１０）は、ＰＣＲ増幅されたゲノムＤＮＡの末端に含まれるアニーリング部位１〜４のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理の前および後の核酸配列を示す。
【図５】
図５（配列番号１１〜配列番号１８）は、ｐＤＧ２ベクター内に含まれるアニーリング部位１〜４のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ処理の前および後の核酸配列を示す。
【図６】
図６は、アニーリング反応中のｐＤＧ２ベクター内のアニーリング部位１、２、３および４に関連した５’および３’フランキングＤＮＡの配置を示す。
【図７】
図７は、アニーリング反応中のｐＤＧ４ベクター内のアニーリング部位１、２、３および４に関連した５’および３’フランキングＤＮＡならびにＧＦＰスクリーニングマーカーの配置を示す。
【図８】
図８は、配列番号１９として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図８はまた、配列番号２０および配列番号２１として同定された配列を示す。これらは、網膜特異的核内レセプター遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図９】
図９は、配列番号２２として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図９はまた、配列番号２３および配列番号２４として同定された配列を示す。これらは、リンパ系特異的ＧＰＣＲ遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図１０】
図１０は、配列番号２５として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図１０はまた、配列番号２６および配列番号２７として同定された配列を示す。これらは、メラニン形成細胞刺激ホルモンレセプター遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図１１】
図１１は、配列番号２８として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図１１はまた、配列番号２９および配列番号３０として同定された配列を示す。これらは、マグネシウム依存性タンパク質ホスファターゼ遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図１２】
図１２は、配列番号３１として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図１２はまた、配列番号３２および配列番号３３として同定された配列を示す。これらは、ケモカインレセプター１様タンパク質遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図１３】
図１３は、配列番号３４として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図１３Ｂは、配列番号３５および配列番号３６として同定された配列を示す。これらは、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図１４】
図１４は、配列番号３７として同定されたポリヌクレオチド配列を示す。図１４はまた、配列番号３６および配列番号３７として同定された配列を示す。これらは、スルホトランスフェラーゼ遺伝子ターゲティング構築物に使用された。
【図１】
2004500102.tif 000002
【図２】
2004500102.tif 000003
2004500102.tif 000004
【図３】
2004500102.tif 000005
2004500102.tif 000006
【図４】
2004500102.tif 000007
【図５】
2004500102.tif 000008
【図６】
2004500102.tif 000009
【図７】
2004500102.tif 000010
【図８】
2004500102.tif 000011
【図９】
2004500102.tif 000012
【図１０】
2004500102.tif 000013
【図１１】
2004500102.tif 000014
【図１２】
2004500102.tif 000015
【図１３】
2004500102.tif 000016
2004500102.tif 000017
【図１４】
2004500102.tif 000018
【国際公開パンフレット】
2004500102.tif 000019
2004500102.tif 000020
2004500102.tif 000021
2004500102.tif 000022
2004500102.tif 000023
2004500102.tif 000024
2004500102.tif 000025
2004500102.tif 000026
2004500102.tif 000027
2004500102.tif 000028
2004500102.tif 000029
2004500102.tif 000030
2004500102.tif 000031
2004500102.tif 000032
2004500102.tif 000033
2004500102.tif 000034
2004500102.tif 000035
2004500102.tif 000036
2004500102.tif 000037
2004500102.tif 000038
2004500102.tif 000039
2004500102.tif 000040
2004500102.tif 000041
2004500102.tif 000042
2004500102.tif 000043
2004500102.tif 000044
2004500102.tif 000045
2004500102.tif 000046
2004500102.tif 000047
2004500102.tif 000048
2004500102.tif 000049
2004500102.tif 000050
2004500102.tif 000051
2004500102.tif 000052
2004500102.tif 000053
2004500102.tif 000054
2004500102.tif 000055
2004500102.tif 000056
2004500102.tif 000057
2004500102.tif 000058
2004500102.tif 000059
2004500102.tif 000060
2004500102.tif 000061
2004500102.tif 000062
2004500102.tif 000063
2004500102.tif 000064
2004500102.tif 000065
2004500102.tif 000066
2004500102.tif 000067
2004500102.tif 000068
2004500102.tif 000069
2004500102.tif 000070
2004500102.tif 000071
2004500102.tif 000072
2004500102.tif 000073
2004500102.tif 000074
2004500102.tif 000075
2004500102.tif 000076
2004500102.tif 000077
2004500102.tif 000078
2004500102.tif 000079
2004500102.tif 000080
2004500102.tif 000081
2004500102.tif 000082
2004500102.tif 000083
2004500102.tif 000084
2004500102.tif 000085
2004500102.tif 000086
2004500102.tif 000087
2004500102.tif 000088
2004500102.tif 000089
2004500102.tif 000090
2004500102.tif 000091
2004500102.tif 000092
2004500102.tif 000093
2004500102.tif 000094
2004500102.tif 000095
2004500102.tif 000096
2004500102.tif 000097
2004500102.tif 000098
2004500102.tif 000099
2004500102.tif 000100
2004500102.tif 000101
2004500102.tif 000102
2004500102.tif 000103
2004500102.tif 000104
2004500102.tif 000105
2004500102.tif 000106
2004500102.tif 000107
2004500102.tif 000108
2004500102.tif 000109
2004500102.tif 000110
2004500102.tif 000111
2004500102.tif 000112
2004500102.tif 000113
2004500102.tif 000114
2004500102.tif 000115
2004500102.tif 000116
2004500102.tif 000117
2004500102.tif 000118
2004500102.tif 000119
2004500102.tif 000120
2004500102.tif 000121
2004500102.tif 000122
2004500102.tif 000123
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500102.tif 000124
2004500102.tif 000125
【国際調査報告】
2004500102.tif 000126
2004500102.tif 000127
2004500102.tif 000128
2004500102.tif 000129
2004500102.tif 000130
2004500102.tif 000131
2004500102.tif 000132
2004500102.tif 000133