(57)【要約】本発明は、未知の分子質量の化合物Ｙの分子質量を質量分析によって測定する方法を提供し、この方法は化合物Ｙのサンプルを用意するステップと、それぞれが化学式（Ｉ）Ｒ−Ｘの少なくとも２つの異なる化合物を用意するステップと（ここでＲはトリチル基であり、Ｘは開裂して質量分析のための荷電分子種を形成できる）、化合物Ｙと少なくとも２つの化学式（Ｉ）の化合物の分子質量を記録するステップを含み、少なくとも２つの化学式（Ｉ）の化合物は質量分析のための校正用化合物として用いることができる。また、これらは質量分析のための校正用化合物を生成するキットの形で利用することもでき、このキットは、（ａ）少なくとも１つの化学式（Ｉ）Ｒ−Ｘのベース反応物質（ここでＲはトリチル基であり、Ｘは開裂して質量分析のための荷電分子種を形成できる）、及び（ｂ）分子質量が異なりそれぞれが該ベース反応物質と反応することができる少なくとも２つの異なるアミン化合物とを含み、該ベース反応物質（ａ）はアミン化合物（ｂ）と別にパッケージされている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子質量が未知の化合物Ｙの分子質量を質量分析によって測定する方法であって：
化合物Ｙのサンプルを用意するステップ；
各々が化学式（Ｉ）Ｒ−Ｘ（式中、Ｒはトリチル基であり、Ｘは開裂して質量分析のための荷電分子種を形成できるものである。）の少なくとも２つの異なる化合物のサンプルを用意するステップ；及び
質量分析計において化合物Ｙ及び化学式（Ｉ）の該少なくとも２つの化合物の分子質量を記録するステップ；
を含む方法。
【請求項２】
ＲがＲ１Ｒ２Ｒ３Ｃ−であり、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は同じ又は異なるものであり、各々が置換された又は置換されない単環式又は縮合環芳香族グループであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の少なくとも１つが置換された又は置換されないＣ１−Ｃ２０アルコキシ又はヒドロカルビルから選択される置換基を含むことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該アルコキシ又はヒドロカルビルが、カルボン酸、スルホン酸、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、第１、第２、又は第３アミノ、第１，又は第２アミド、無水物、カルボニル・ハロゲン化物、又は活性エステルによって置換されていることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の各々がアリール、好ましくはフェニル、であることを特徴とする請求項２乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該トリチル基Ｒが２つ又は４つ以上のアミド置換基を含むことを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３が全体として少なくとも２つのアミド基及び／又は少なくとも２つの結合のための反応基、好ましくはＮ−ヒドロキシスクシンアミドエステル基、を含むことを特徴とする請求項２乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
Ｘがハロゲン化物又はトシラートであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも５つ、好ましくは少なくとも１０，の化学式（Ｉ）の化合物を用意するステップと、質量分析計においてそれらの分子質量を記録するステップを含むことを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
グループＸは光で開裂して質量分析のための荷電分子種を形成できることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、未知化合物Ｙの分子質量をＭｙと推定するステップと、Ｍｙより小さな既知の分子質量Ｍ１を有する少なくとも１つの化学式（Ｉ）の化合物とＭｙより大きな分子質量Ｍ２を有する少なくとも１つの化学式（Ｉ）の化合物とを用意するステップを含み、好ましくはＭｙとＭ１及びＭ２の各々との差が±５０％以内であることを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、少なくとも１つの分子質量が未知である別の化合物Ｚのサンプルを用意するステップと、化合物Ｚの分子質量を測定するステップを含む請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
化学式（Ｉ）Ｒ−Ｘにおいて、Ｒはトリチル基であり、Ｘは開裂して質量分析のための荷電分子種を形成できるものである化学式（Ｉ）の化合物の質量分析の校正用化合物としての利用。
【請求項１４】
質量分析の校正用化合物を生成するためのキットであって：
（ａ）化学式（Ｉ）Ｒ−Ｘの少なくとも１つのベース反応物質、ここでＲはトリチル基であり、Ｘは開裂して質量分析のための荷電分子種を形成できる；及び
（ｂ）異なる分子質量を有し、各々該ベース反応物質と反応できる少なくとも２つの異なるアミン化合物；
を含み、反応物質（ａ）がアミン化合物（ｂ）と別にパッケージされているキット。
【請求項１５】
さらに、校正用化合物に望ましい少なくとも２つの分子質量Ｍ１とＭ２を選択し、１つ又は２つ以上のアミンを選んで該ベース反応物質と反応させて予め定められた所望の分子質量Ｍ１とＭ２の化合物を得るための使用説明書、及び該化合物を質量分析に使用するための使用説明書を含むことを特徴とする請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
質量分析のための校正用化合物の組であって、少なくとも２つの別にパッケージされた混合物（ａ）と（ｂ）を含み、
混合物（ａ）は各々が化学式（Ｉ）Ｒ−Ｘである異なる分子質量の少なくとも２つの化合物を含み、
混合物（ｂ）は各々が化学式（Ｉ）Ｒ−Ｘである異なる分子質量を有する少なくとも２つのさらに別の化合物を含み、
Ｒはトリチル基であり、Ｘは開裂して質量分析のための荷電分子種を形成できることを特徴とする組。
【請求項１７】
混合物（ａ）における最小の分子質量が混合物（ｂ）における最小の分子質量よりも小さく、混合物（ａ）における最大の分子質量が混合物（ｂ）における最大の分子質量よりも小さいことを特徴とする請求項１６に記載の組。
【請求項１８】
混合物（ａ）と（ｂ）の各々が分子質量が異なる少なくとも５つの異なる化合物を含み、好ましくは分子質量が異なる少なくとも１０の異なる化合物を含むことを特徴とする請求項１６又は１７に記載の組。
【請求項１９】
少なくとも３つの別々にパッケージされた化合物の混合物を含み、好ましくは少なくとも５つの別々にパッケージされた化合物の混合物を含むことを特徴とする請求項１６乃至１８のいずれか１項に記載の組。
【請求項２０】
校正用化合物の組を生成するためのキットであって：
化学式（Ｉ）Ｒ−Ｘのベース反応物質を含む第１のパッケージ、ここでＲはトリチル基であり、Ｘは開裂して質量分析のための荷電分子種を形成できる；及び
各々が分子質量が異なりそれぞれ該ベース反応物質と反応できる少なくとも２つのアミン化合物を含む少なくとも２つの別々の第２のパッケージ（ａ）と（ｂ）；
を含むキット。
【請求項２１】
混合物（ａ）における最小の分子質量は混合物（ｂ）における最小の分子質量よりも小さく、混合物（ａ）における最大の分子質量は混合物（ｂ）における最大の分子質量よりも小さいことを特徴とする請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
混合物（ａ）と（ｂ）の各々が少なくとも５つの異なる分子質量の異なるアミン化合物を含み、好ましくは少なくとも１０の異なる分子質量の異なるアミン化合物を含むことを特徴とする請求項２０又は２１に記載のキット。
【請求項２３】
少なくとも３つのアミン化合物混合物を含み、好ましくは少なくとも５つのアミン化合物混合物を含むことを特徴とする請求項２０乃至２２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４】
分子質量が未知の化合物Ｙの分子質量を測定する方法であって：
化合物Ｙの予期される分子質量を推定するステップ；
該化合物Ｙの予期される分子量に近い分子量を有する少なくとも１つの化学式（Ｉ）Ｒ−Ｘの校正用化合物を選択するステップ、ここでＲはトリチル基であり、Ｘは開裂して質量分析のための荷電分子種を形成できる；及び
両化合物に対して同時に質量分析を行うステップ；
を含む方法。
【請求項２５】
校正用化合物が、ベース反応物質Ｒ−Ｘを選択し（ここでＲはＲと異なるトリチル基である）、適当な分子質量のアミン反応物質を選択して、該アミン反応物質を該ベース反応物質と反応させることによって得られることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、質量分析によって分子質量を測定する方法に関し、詳しくは質量分析計の精密な校正の方法、そして質量分析計の校正に使用されるキット及びシステムに関する。
【０００２】
近年、質量分析で得られる測定値に要求される精度が非常に高くなっている。質量分析データにおいて誤差が１乃至５ ｐｐｍ 以下でなければならないと要求されることが今では普通になった。したがって、質量分析計の正確な校正を実現することがますます重要になっている。
【０００３】
分子質量が知られている校正用化合物を分析されるサンプルの中に含めることによって質量分析計を校正するやり方は公知である。校正用化合物の理想的な組は、精密な質量を測定しようとしている物質の予期される分子質量よりも１つは上に１つは下に、両方共それに近い分子質量を有する少なくとも２つの異なる分子質量の化合物を含む組である。校正曲線は直線的ではないので、既知の質量の化合物が測定しようとする質量に近い質量を有するということが重要である。
【０００４】
いろいろなタイプの化合物が校正用化合物として使用できることが知られている。例えば、ある範囲の分子質量が提供される特定の糖誘導体がある。しかし、これは合成することが難しく、質量分析の過程で分解して副産物を生じ易く、それがスペクトルにかなりのバックグラウンド雑音を生ずる。また、これらは質量分析計の中であまり良い飛翔体（ｆｌｙｅｒ）ではない。
【０００５】
それに代わるシステムとして、ペプチドを用いるものがある。しかし、これも作成するのに高価である。さらに、これらは信号強度が異なることが多く、最終スペクトルの中にそれを見つけるのが難しいことがある。
【０００６】
質量分析計の校正のために、予め定められた正確な分子質量を有し、質量分析計の中で良く飛翔し、スペクトルにバックグラウンド雑音を生ずる分解産物を発生しない校正用化合物を含む方法及びシステムを提供することが望ましい。また、単純明快であり安価に作成できる校正用化合物を提供することが望ましい。
【０００７】
本発明によって、我々は、未知の分子質量を有する化合物Ｙの分子質量を質量分析によって測定する方法であって、
化合物Ｙのサンプルを用意するステップ；
各化学式（Ｉ）、Ｒ−Ｘ、の少なくとも２種の異なる化合物のサンプルを用意するステップ、ここでＲはトリチル基であり、Ｘは開裂して質量分析のための荷電分子種を形成することが可能であり；及び
質量分析計で化合物Ｙ及び少なくとも２つの化学式（Ｉ）の化合物の分子質量を記録するステップ；
を含む方法を提供する。
【０００８】
このように、本発明において我々は化学式（Ｉ）のトリチル化合物を質量分析の校正用化合物として用いる。我々は、トリチル基が校正用化合物として用いるのに特に適当であることを見出した。トリチル基は、質量分析計の中でレーザーで照射することによって化学式（Ｉ）の化合物から容易に開裂される。さらに、こうして生ずる正荷電のカルボニウムイオンは非常に安定であり、したがって検出感度が高くなる。また、これらは質量分析計の中で良く飛翔する。トリチル・マーカーは非常に低濃度でも検出可能であり、被分析物の脱離速度を低下させて被分析物を妨害する可能性も小さい。さらに、トリチル基のユニークな構造は、非常に広範囲の予め定められた分子質量から、測定しようとする化合物の推定される分子質量に応じて適当なものを選択してコントロールすることを可能にする。例えば３５０ 乃至８００ Ｄａ という分子質量に対して、例えば０．５ 乃至１ ｐｐｍ という精度が得られる。一般に、この方法において化合物Ｙは化学式Ｒ−Ｘという形ではない。
【０００９】
校正用化合物は化学式Ｒ−Ｘという形であり、ここでＲはトリチル基である。一般にＲはＲ１Ｒ２Ｒ３Ｃ−であり、ここでＲ１、Ｒ２、及びＲ３は、同じであっても異なっていてもよく、各々が置換された又は置換されない単環式又は縮合環芳香族グループである。好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は各々アリール基、好ましくはフェニル基である。
【００１０】
好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は少なくとも１つが、置換された又は置換されないＣ１−Ｃ２０アルコキシ又はヒドロカルビルから置換基を含む。置換基は芳香族リングのどの箇所にあってもよいが、パラ置換基が好適であり好ましい。
【００１１】
アルコキシ又はヒドロカルビルが置換される場合、置換基は好ましくは、カルボン酸、スルホン酸、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、チオール、第１、第２、又は第３アミノ、第１、又は第２アミド、無水物、カルボニル・ハロゲン化物、及び活性エステル、から成る群から選択される。これらの置換基で、水素原子は一部又は全部重水素又はハロゲン、例えばフッ素、によって置き換えることができる。これによって利用できる分子質量の範囲が改良される。例えば、非放射性同位元素の置換基を用いることによって、例えば１，２，又は３個の重水素原子を含む小さなアルキル基を用いることによって、分子質量を変えることができる。
【００１２】
トリチル基Ｒをアミド置換基によって置換することが好ましい。このタイプの置換されたトリチル基は特に生成することが容易であり、広範囲の分子質量が得られる。好ましくは、トリチル基Ｒは２つ又は４つ以上のアミド置換基を含む。さらに好ましくは、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３は全体で少なくとも２つのアミド基及び／又は少なくとも２つの結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）のための反応基を、好ましくはＮ−ヒドロキシヒドロキシスクシンイミドを含む。
【００１３】
グループＸは、開裂して質量分析のための荷電分子種を形成することができる。通常、それは光開裂可能であり、例えばレーザー照射によって開裂可能である。Ｘは、適当などんな離脱基であってもよく、例えばハロゲン化物又はトシラートであってもよい。
【００１４】
この方法では、化学式（Ｉ）の少なくとも２つの異なる化合物で、分子質量が異なるものが用いられる。好ましくは化学式（Ｉ）の化合物の数は、例えば少なくとも５より大きく，好ましくは少なくとも１０であり，さらに少なくとも２０であることが望ましい。一般に、化学式（Ｉ）の化合物は、化合物Ｙの推定される分子量の上下である範囲の分子質量を有するように選ばれる。化学式（Ｉ）の化合物の分子質量が化合物Ｙの分子質量に近いことが正確な校正のために望ましい。したがって、本発明によるある好ましい方法では、未知の化合物Ｙの分子質量がＭｙと推定され、Ｍｙよりも小さな既知の分子質量Ｍ１を有する少なくとも１つの化学式（Ｉ）の化合物が用意され、同様にＭｙよりも大きな分子質量Ｍ２を有する少なくとも１つの化学式（Ｉ）の別の化合物が用意される。好ましくは、Ｍ１とＭ２の各々はＭｙから±５０％ 以内の分子質量範囲にある。すなわち、Ｍ１はＭｙの５０％以上であり、Ｍ２はＭｙの１５０％以下である。好ましくはこの範囲は±２５％ であり、さらに好ましくは±１０％ である。
【００１５】
化学式（Ｉ）の少なくとも２つの化合物の調製された混合物を用意し、それを未知の分子質量のサンプルＹと混合して質量分析における校正用化合物として用いることができる。このような混合物は、化学式（Ｉ）の異なる化合物を少なくとも５つ、さらに好ましくは少なくとも１０、場合によっては少なくとも２０，含む。
【００１６】
したがって、本発明の第２の様態では、我々は未知の分子質量の化合物Ｙの分子質量を測定する方法であって、化合物Ｙの予期される分子質量を推定するステップと、化合物Ｙの予期される分子質量に近い分子質量を有する化学式（Ｉ）Ｒ−Ｘの少なくとも１つの校正用化合物を選ぶステップ（ここでＲはトリチル基であり、Ｘは開裂して質量分析のための荷電分子種を形成することができる）と、両化合物を同時に質量分析にかけるステップとを含む方法を提供する。
【００１７】
この様態では、化学式（Ｉ）の化合物は、上記本発明の第１の様態であげた好ましい特徴のいずれかを適宜含むことができる。
【００１８】
本発明の第３の様態によって、我々は質量分析において校正用化合物として使用するのに適した混合物を提供する。この様態によって、我々は少なくとも２つの別々にパッケージされた混合物（ａ）と（ｂ）を含む質量分析のための校正用化合物の組であって、
混合物（ａ）は、異なる分子質量を有する各々化学式（Ｉ）Ｒ−Ｘの少なくとも２つの異なる化合物を含み、
混合物（ｂ）は、異なる分子質量を有する化学式（Ｉ）Ｒ−Ｘの少なくとも２つのさらに別の化合物を含み、Ｒはトリチル基であり、Ｘは開裂して質量分析のための荷電分子種を形成することができることを特徴とする方法を提供する。
【００１９】
すなわち、この組は少なくとも２組の異なる校正用化合物の組を含む。好ましくは、各組は異なる範囲にわたって拡がる分子質量を有する。これらの範囲は重なっていてもよい。好ましくは、混合物（ａ）の最小の分子質量は混合物（ｂ）の最小の分子質量よりも小さく、混合物（ａ）の最大の分子質量は混合物（ｂ）の最大の分子質量よりも小さい。
【００２０】
さらに好ましくは、この組は少なくとも３つの別々にパッケージされた化合物混合物を含み、さらに好ましくは少なくとも５つの別々にパッケージされた化合物混合物を含む。別々の混合物の数が多いほど、分子質量がある範囲にある未知の化合物を校正できる可能性が大きくなる。
【００２１】
各組が異なる分子質量の少なくとも５つの化合物を含むことが好ましく、さらに好ましくは異なる分子質量の少なくとも１０の化合物を含む。場合によっては、異なる分子質量の少なくとも２０の化合物が望ましい。
【００２２】
本発明の校正用トリチル化合物を使用する１つの利点は、それが予め定められたどんな分子量を有するようにも容易に生成できるということである。特にトリチル化合物は化学式（Ｉ）Ｒ−Ｘのベース反応物質をアミンと反応させることによって生成することができる。これによってアミド置換トリチル化合物が生ずる。反応条件は当業者であれば選択できる。我々が以前に公開したＷＯ９９／６０００７パンフレットは、適当な反応条件を記載している。その公開文書で我々は、オリゴヌクレオチド又はオリゴペプチドなどの分子のタグ部分（ｔａｇ ｍｏｉｅｔｉｅｓ）としてのトリチル化合物の利用を記載している。そこに記載されているトリチル基の分子質量を変える方法は本発明にも適用できる。
【００２３】
本発明の第４の様態によって、我々は質量分析のための校正用化合物を生成するキットであって：
（ａ）化学式（Ｉ）Ｒ−Ｘの少なくとも１つのベース反応物質；ただし、Ｒはトリチル基であり、Ｘは開裂して質量分析のための荷電分子種を形成することができる：及び
（ｂ）分子質量が異なり、各々そのベース反応物質と反応することができる少なくとも２つの異なるアミン化合物；
を含み、ベース反応物質（ａ）がアミン化合物（ｂ）と別にパッケージされているキットを提供する。
【００２４】
このキットは、ベース反応物質（ａ）とアミン化合物（ｂ）を望むときに反応させて一群の異なる分子質量の化学式（Ｉ）の化合物を生成するためにエンドユーザーに供給することができる。本発明のこれまでの様態と同様に、このキットは異なる分子質量の異なるアミン化合物を好ましくは少なくとも５つ、さらに好ましくは少なくとも１０，場合によっては少なくとも２０含む。上で述べた他の好ましい特徴も適宜適用される。
【００２５】
このキットは、エンドユーザーが校正用化合物として少なくとも２つの所望の分子質量Ｍ１とＭ２を選択して反応のために１つ以上のアミン化合物を選んでベース反応物質と反応させて予め定められた所望の分子質量Ｍ１とＭ２を有する化学式（Ｉ）の化合物を得られるように使用説明書と共に供給することができる。次に、これらの化合物を質量分析に使用することができる。
【００２６】
本発明の第５の様態によって、我々は校正用化合物の組を生成するための別のキットであって、化学式（Ｉ）Ｒ−Ｘのベース反応物質（ここでＲはトリチル基でありＸは開裂して質量分析のための荷電分子種を形成できる）を含む第１のパッケージと、各々がベース反応物質と反応することができる異なる分子質量を有する少なくとも２つのアミン化合物を含む少なくとも２つの別々の第２のパッケージ（ａ）及び（ｂ）とを含むキットを提供する。
【００２７】
したがって、このキットは、本発明の第３の様態に係わる校正用化合物の組を生成するのに適している。その様態におけると同様に、混合物（ａ）の最小の分子質量は混合物（ｂ）の最小の分子質量よりも小さく、混合物（ａ）の最大の分子質量は混合物（ｂ）の最大の分子質量よりも小さいことが好ましい。このキットは、より多数の混合物を提供するように、少なくとも３つ、好ましくは少なくとも５つの混合物を含む。好ましくは、各混合物は少なくとも５つの異なるアミン化合物を含み、さらに好ましくは少なくとも１０の異なるアミン化合物を、場合によっては少なくとも２０の異なるアミン化合物を含む。
【００２８】
以下で、本発明を次の実施例によって例示する。
［実施例］
この実施例では、化学式がＣ２５Ｈ２０ＮＯ５という化合物の精密な質量が決定される。計算された精密な質量は４１４．１３４１５ である。Ｔｒ（ＮＨＳ） は、Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ ｅｔ ａｌ がＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ５６ （２０００） ２７１３−２７２４ で記述しているように生成される。この化合物がその論文に記載されているようにブチルアミンとアミルアミンで処理される。これによって計算された精密な質量が４０２．５０７８１ と４１６．５２０９６ である２つの校正用化合物が得られる。この２つの校正用化合物と被分析物が質量分析にかけられて、被分析物の単一同位体（ｍｏｎｏｉｓｏｔｏｐｉｃ）質量が４１４．１３６２１ であるということが誤差４．９ ｐｐｍ で決定された。
【国際公開パンフレット】
2004506897.tif 000002
2004506897.tif 000003
2004506897.tif 000004
2004506897.tif 000005
2004506897.tif 000006
2004506897.tif 000007
2004506897.tif 000008
2004506897.tif 000009
2004506897.tif 000010
2004506897.tif 000011
2004506897.tif 000012
2004506897.tif 000013
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004506897.tif 000014
【国際調査報告】
2004506897.tif 000015
2004506897.tif 000016
2004506897.tif 000017