(57)【要約】本発明は、非還元末端の位置に少なくとも１のフコース単位を含む、１３糖単位未満のオリゴ糖を含み、かつ、微生物種クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエから得られることができる多糖の分解のための少なくとも１のステップを含む方法を用いることで少なくともそれを得ることができることを特徴とする非硫酸化フコース・ベースのオリゴ糖混合物に関する。この新しい混合物は、皮膚の異なる構成要素に対し顕著な活性を示し、特に優れた皮膚の肥厚化により、はっきりと目に見える老化防止の効果を提供する。
2004507613.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非還元末端の位置に少なくとも１のフコース単位を含む１３糖単位未満のオリゴ糖を含み、かつ、微生物種クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエからの多糖の分解のための少なくとも１のステップを含む方法を用いて得られることを特徴とする非硫酸化フコース・ベースのオリゴ糖混合物。
【請求項２】
前記混合物の総重量に対して少なくとも１５重量％の、非還元末端の位置に少なくとも１のフコース単位を含む１３糖単位未満のオリゴ糖を含むことを特徴とする、請求項１に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項３】
前記混合物の総重量に対して２０〜５０重量％の、非還元末端の位置に少なくとも１のフコース単位を含む１３糖単位未満のオリゴ糖を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項４】
前記混合物の総重量に対して２５〜４５重量％の、非還元末端の位置に少なくとも１のフコース単位を含む１３〜２４糖単位を有するオリゴ糖をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項５】
前記混合物の総重量に対して１５〜３５重量％の、非還元末端の位置に少なくとも１のフコース単位を含む５４糖単位超のオリゴ糖をさらに含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項６】
前記オリゴ糖が、フコース−ガラクトース−ガラクツロン酸回収モチーフを少なくとも一部として含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項７】
以下のステップ：
ａ）　微生物種クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエを生じさせ、糖質の同化可能な源の好気性醗酵により水性の栄養培地中で培養し；
ｂ）　醗酵に必須なものから、形成された多糖を回収し；
ｃ）　上記形成された多糖を適度な加水分解に供し；
ｄ）　ステップｃ）の加水分解産物を酵素的加水分解に供し；そして
ｅ）　オリゴ糖混合物を回収した後に上記酵素を不活化することにより形成する、
を含む方法によりそれを得ることができることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項８】
前記微生物種クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエが、番号ｌ−１５０７の下にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに寄託された微生物又はそれらの突然変異体であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項９】
前記の適度な加水分解を、ガンマ線を用いた処理、プロトリシス処理、及びこれらの処理の組み合わせから成る群から選ばれる処理により実施することを特徴とする、請求項７又は８に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項１０】
前記酵素加水分解を、少なくとも１のエンドフコシダーゼを用いて実施することを特徴とする、請求項７〜９のいずれか１項に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項１１】
前記エンドフコシダーゼが、Ｆｅｒｍｉｚｙｍｅ ＨＣＰであることを特徴とする、請求項１０に記載のオリゴ糖混合物。
【請求項１２】
化粧用又は医薬として活性な物質として、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴ糖混合物の少なくとも１つ、及び化粧用又は医薬として許容される賦形剤の少なくとも１つを含むことを特徴とする化粧用又は医薬組成物。
【請求項１３】
皮膚病学的な組成物であることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記オリゴ糖混合物が、前記組成物の総重量に基づき、約０．００１〜約２０重量％の比率で存在することを特徴とする、請求項１２又は１３に記載の組成物。
【請求項１５】
皮膚の細胞間の細胞情報伝達を刺激することを意図した組成物の製造のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴ糖混合物の使用。
【請求項１６】
皮膚のケラチノサイトの細胞増殖を刺激することを意図した組成物の製造のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴ糖混合物の使用。
【請求項１７】
皮膚の線維芽細胞の細胞増殖を刺激することを意図した組成物の製造のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴ糖混合物の使用。
【請求項１８】
皮膚の線維芽細胞によるエラスターゼ型プロテアーゼの合成を抑制することを意図した組成物の製造のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴ糖混合物の使用。
【請求項１９】
ヒアルロナンによって誘発されたプロテアーゼ、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の過剰発現を抑制することを意図した組成物の製造のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴ糖混合物の使用。
【請求項２０】
前記組成物が、皮膚の線維芽細胞によるプロテアーゼ、ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の合成を抑制することを意図することを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記組成物が、刺激に対する皮膚の感受性を低下させることを意図することを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の使用。
【請求項２２】
真皮のコラーゲン線維の堆積を刺激することを意図した組成物の製造のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴ糖混合物の使用。
【請求項２３】
前記オリゴ糖混合物を、前記組成物の総重量に基づき、約０．００１〜約２０重量％の比率で使用することを特徴とする、請求項１５〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
製造された組成物が、化粧用又は医薬として許容される賦形剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１５〜２３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のオリゴ糖混合物の少なくとも１つを含む化粧用組成物を皮膚に適用することを特徴とする化粧による処置方法。
【請求項２６】
前記化粧用組成物が、化粧用として許容される賦形剤をさらに含むことを特徴とする、請求項２５に記載の化粧による処置方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、非硫酸化フコース・ベースのオリゴ糖の新しい混合物、並びに特に老化防止製品、例えば医薬品及び獣医薬、より特に、化粧用製品中で、上皮又は結合組織に対する活性が求められる、主に局所適用産物におけるその使用に関する。
【０００２】
老化の間に、皮膚は、平均で１０年ごとに約６％薄くなる（Ｓｋｉｎ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ａｇｉｎｇ ｓｋｉｎ， Ｂｒａｎ−ｃｈｅｔ ｅｔ ａｌ， Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ， １９９０， ３６： ２８−３５）。老化の根底にある機構は、内因性なもの、及び外因性なものである。内因性の機構は、細胞増殖の減少と皮膚細胞外マトリックス（ＣＥＭ）の顕著な喪失を含む。この喪失は、老化による、ＣＥＭ合成の低下、及び皮膚マトリックスを攻撃する可能性がある分解酵素の合成の増加の結果である（Ｄ．Ｌ．ＲＯＢＥＲＴ： ａｇｉｎｇ， ＣＮＲＳ， Ｂｅｌｉｎ， １９９４； Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｌ． ＲＯＢＥＲＴ： ａｇｉｎｇ， ｆａｃｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｏｒｉｅｓ， ＤＯＭＩＮＯＳ， Ｆｌａｍｍａｒｉｏｎ， １９９５）。原因であるプロテアーゼは、本質的にはマトリックス・メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）であり、多様なそれらの中のいくつか（例えば、セリン・プロテアーゼ）は、皮膚マトリックス、及び特に弾性線維の構成要素のほとんどを分解する。
【０００３】
ここ数年、皮膚の老化に特定の結果を防ぐ活性化合物を得る目的で、おびただしい数の調査研究が行われた。最初の目的の１つは、このプロセスをより遅くすることである。他の目的は、皮膚、主に真皮を厚くする効果を得ることである。
【０００４】
糖質及び多糖は、主にそれらの含水特性について、化粧品中で周知の化合物である。これは、例えば単糖フコース、及びそれを含んでいる多糖の場合である。
【０００５】
フコースは、ガラクトースに近いデオキシ−ヘキソースであり、立体配座を持つ。しかし、Ｃ６原子が第１級アルコール基（−ＣＨ２ＯＨ）でなくメチル基（−ＣＨ３）を持つという点で、フコースの構造は、本質的にガラクトースのそれと異なる。確かに、このメチル基が、フコースの分子に着目の部分的な疎水的性質を与え、この性質は、４つの炭素原子上の他の原子の水酸基によって償われている。
【０００６】
特定の藻類及び菌類のオリゴ糖であるフコースは、系統発生の間で早く現れ、上記の特定の藻類及び菌類は、単独で又は他の化合物との組み合わせで、比較的に大量にそれらを含んでいる。同様に、それはフカン（ｆｕｃａｎｅｓ）のような硫酸化形態で現われる。他方、フコースは、動物界の広範囲に存在し、そして特定のバクテリアで合成されもする。
【０００７】
しかし、フコース及びそれを含む多糖に関する相当の数の論文にもかかわらず、これまで成し遂げられた成果は、主に化粧用の製品における、産業規模の適用満足させるには程遠かった。
【０００８】
特に、単糖フコースの乏しいコスト／有効性の関係に加えて、フコースを含む既知の多糖は、先に記載のとおり、当業者が皮膚の老化と戦うことを可能にする顕著な活性を示さない。
【０００９】
こうして、例えば、フカンは、高分子量（＞２０ ｋＤ）を有する硫酸化重合体である。ＷＯ９９／３２０９９ （ＩＦＲＥＭＥＲ）は、結合組織の損傷の修復の範囲内でのフカンの新しい用途を説明している。しかし、フカンは、それらのサイズ及び荷電が原因で効果的に皮膚の細胞層の全体と相互作用できない。さらに、逆に、フカンは、ＭＭＰ−２を、つまり皮膚の正常な老化への化粧による処置（ｃｏｓｍｅｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）に関するレドヒビトリー（ｒｅｄｈｉｂｉｔｏｒｙ）特性を活性化することができる。
【００１０】
ＦＲ−２ ７５０ ８６３（Ｌ’ＯＲＥＡＬ）は、スケーリングを助ける、すなわち、表皮の角質層の表面にある「フライ（ｆｌｙ）」細胞の除去を助ける（３ページの６、及び７行目）、及び／又は表皮の再生を促進する、すなわち、表皮の再生を加速させる角質層の強制的な除去をもたらす（１ページの１３〜２３行目）、主に、フコースを含む多糖である、ポリホロシドの使用を記載し、これらの効果は、ＦＲ−２ ７５０ ８６３による皮膚の老化防止効果に類似した結果をもたらす。しかし、ＦＲ−２ ７５０ ８６３に記載の多糖は、その分子量及びその構造に関して、皮膚の種々の構成要素により満足な方法で当業者が統合することを許さない。
【００１１】
その後、全く予期しない、思いがけない方法により、皮膚の異なる構成要素に対して顕著な活性を示し、主に皮膚の優れた肥厚化によってはっきりと現れる真の老化防止の効果をもたらす、選ばれた微生物の特定の処置によって得ることができる、フコースを含むオリゴ糖の新しい混合物が発見された。
【００１２】
こうして、本発明は、非還元末端の位置に少なくとも１のフコース単位を含む１３糖単位未満のオリゴ糖を含み、そしてそれが微生物種クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ｓｕｂｓｐ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの多糖の少なくとも１ステップの分解を含むプロセスによって得ることができることを特徴とした非硫酸化にフコース・ベースのオリゴ糖混合物を提供する目的を持つ。
【００１３】
本発明による「非硫酸化フコース・ベースのオリゴ糖」に関して、当業者の一般的な知識に従って、当業者は、少なくとも１のフコース糖単位を含み、かつ、サルフェート基 −Ｏ（ＳＯ３）−を持たないオリゴ糖であると理解している。特に、フカンはこの定義から除外される。
【００１４】
本発明による「非還元末端の位置に少なくとも１のフコース単位を含むオリゴ糖」に関して、当業者の一般的な知識に従って、当業者は、上記オリゴ糖鎖の末端の位置に少なくとも１のフコース糖単位を含むオリゴ糖であると理解し、このフコース単位がアセタール型の結合によってオリゴ糖に続く次のオリゴ糖の次の糖単位と連結している。
【００１５】
以下の実施例に説明されるように、当業者に知られる技術を用いて、特にクロマトグラフィーＨＰＬＣ技術を用いることによって糖単位の数を計測する。
【００１６】
好ましくは、本発明のオリゴ糖混合物は、上記混合物の総重量に対して、少なくとも１５重量％、そしてより特に、及び好ましくは、２０〜５０重量％の、非還元の末端の位置に少なくとも１のフコース単位を含む１３糖単位未満のオリゴ糖鎖を含む。
【００１７】
より特に、本発明によるオリゴ糖混合物は、それが混合物の総重量に対して、２５〜４５重量％の、非還元末端の位置に少なくとも１のフコース単位を含む１３〜２４の糖単位を持つオリゴ糖をさらに含むことを特徴とする。
【００１８】
より特に、本発明のオリゴ糖混合物は、それが混合物の総重量に対して１５〜３５重量％の非還元末端の位置に少なくとも１のフコース単位を含む５４糖単位超を持つオリゴ糖をさらに含むことを特徴とする。
【００１９】
前記オリゴ糖混合物は、微生物種クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエからの多糖の分解のための少なくとも１のステップを含む方法を用いることにより得ることでき、好ましくは、上記オリゴ糖は、少なくとも一部にフコース−ガラクトース・ガラクツロン酸のモチーフを含む。
【００２０】
具体的には、上記オリゴ糖混合物は、以下のステップを含む方法によって得ることができる：
ａ）　微生物種クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエを生じさせ、糖質の同化可能な源の好気性醗酵により水性の栄養培地中で培養し；
ｂ）　醗酵に必須なもの（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｕｓｔ）から、形成された多糖を回収し；
ｃ）　形成された多糖を適度な加水分解に供し；
ｄ）　ステップｃ）の加水分解産物を酵素的加水分解に供し；そして
ｅ）　オリゴ糖混合物を回収した後に上記酵素を不活化することにより形成した。
【００２１】
より特に、これらのステップａ）〜ｅ）は、以下の方法で記載されうる：
ステップａ）
好ましくは、我々は、番号ｌ−１５０７の下でｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに寄託された微生物、クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエ、又はそれらの突然変異体を使用する。同時に、この微生物は、出願ＷＯ ９６／２３０５７に詳細に説明されている。
【００２２】
前記水性の栄養培地は、炭素、窒素、及び無機塩類の供給源を含む当業者に知られたあらゆる水性の培地であり、例えば出願ＷＯ ９６／２３０５７に説明されているものである。
【００２３】
前記醗酵は、およそ２５℃〜３５℃の温度で、約６．０〜７．５のｐＨで、好気的条件下で、かつ、撹拌しながら、２〜４日間実施する。
【００２４】
前記醗酵は、古典的な発酵槽中で、例えば約１２０℃の温度まで加熱することによるか、又はろ過滅菌することによって前もって滅菌された栄養培地への接種により行われる。
【００２５】
ステップｂ）
醗酵の期間の終わりに、醗酵に必須なものを回収し、そしてフコースに豊む多糖を以下の方法を用いてそこから単離する：
醗酵に必須なものを、特に約１００〜約１３０℃、好ましくは約１１５〜約１２５℃の範囲の温度での、約３０分〜約２時間、そして好ましくは約４０分〜約１時間の間、そして特に約２〜約５．５、好ましくは約３〜約５．５の範囲のｐＨでの熱処理に供した。
【００２６】
熱処理産物を、プレートを用いた加圧ろ過器のような古典的な手段によりろ過する。
【００２７】
この方法により、我々は、全く細胞を含まない透明で、粘性のある多糖を得る。
【００２８】
次に、沈殿を、アルコール溶剤、好ましくはエタノール、イソプロパノール、及びそれらの混合物から選ばれるアルコール溶剤中で実施する。特に、我々は、約１〜約３．０容量の溶剤対１容量の多糖、そして好ましくは、約１．３〜約２．０容量の溶剤対１容量の多糖を使用する。
【００２９】
次に、我々は、粉末が得られるまで、特に約２０〜約６０℃、そして好ましくは、約３０〜５０℃の範囲の温度で減圧下で乾燥を行う。
【００３０】
ステップｃ）及びｄ）：多糖の加水分解
これは、ステップの必要不可欠な組み合わせである。実際に、我々は、好ましくはガンマ線の照射及び／又はプロトライシス（ｐｒｏｔｏｌｙｓｉｓ）による適度な加水分解のステップの組み合わせであり、古典的な加水分解、例えば酸性加水分解に類似し、我々が加水分解の十分に全体的な出力を有利に得ることを可能にし、しかし酵素的加水分解の特定の切断の利点を持つ、驚異的で、思いがけない方法を発見した。特に、無作為な性質などは統計的にレドヒビトリーな切断の獲得を導くので、古典的な酸性加水分解は、我々が本発明による特定のオリゴ糖混合物を得ることを不可能にする。さらに、古典的な酸性加水分解から得られた化合物は、生物学的に不活性であることが分かる。
【００３１】
ステップｃ）：多糖の適度な加水分解
適度な加水分解は、ガンマ線による処理、プロトリシス処理、又はこれら２つの連続する処理により実施される。好ましくは、我々は、ガンマ線、次にプロトリシス処理による処理を連続的に実施する。
【００３２】
ガンマ線による処理は、フリーラジカルの作用に起因する限られた分解により、粘性の顕著な低下を引き起こすことが分かった。それは、当業者に知られた照射手段により実施されうる。
【００３３】
非常に貫通性がある光線であるガンマ線による処理は、さらに、多糖の滅菌、つまり炎症を誘発するか又は肉芽腫を引き起こしさえする、存在する細菌の殺傷の利益を与える。この方法で、我々は、最終産物の生物製剤活性に好ましくない方法で妨げる防腐剤を培地に添加することなく細菌の攻撃を防ぐ。
【００３４】
それ故に、ガンマ線の照射を受けた、ステップｂ）で得られた多糖粉末を、同様にプロトリシス処理に供する。この目的のために、それを、水溶液の総重量に対して、特に１〜２０重量％、好ましくは、２〜１０重量％の割合で水溶液にする。
【００３５】
前記水溶液を、陽子発生樹脂、例えば商業化され、そして当業者に知られているもの、つまり水分子の固定によりグルコシド結合の切断を引き起こす陽子を発生する樹脂の存在下、熱処理、つまり１〜６時間の間、特に約７５〜約１２０℃、好ましくは約９０℃〜約１００℃の温度で加熱する。
【００３６】
ステップｄ）：酵素加水分解
我々は、ステップｂ）で得られた加水分解物中に酸性緩衝物質、例えばクエン酸緩衝液（４．１５ ｇ／ｋｇ）−オリン酸水素二ナトリウム（約１０．７５ ｇ／ｋｇ）を導入する。我々は、前記溶液の温度を特に約２５〜約４５℃、そして好ましくは約３０〜約４０℃の温度に調節する。
【００３７】
我々は、利用した多糖粉末の最初の重量に対して、特に約２〜約２０重量％、そして好ましくは約５〜１５重量％の含量に従って、少なくとも１のエンドフコシダーゼ、好ましくはＧｉｓｔ Ｂｒｏｃａｄｅｓよって商業化されているＦｅｒｍｉｚｙｍｅ ＨＣＰを含む酵素製剤を導入する。
【００３８】
こうして得られた混合物を、緩衝混合物の存在により６にｐＨを調節し、特に約２５〜約４５℃、そして好ましくは約３０〜約４０℃の範囲の温度で、約８〜約２４時間、そして好ましくは約１０〜２０時間の範囲で撹拌しながら維持する。
【００３９】
ステップｅ）
ステップｄ）の後に得られた加水分解産物を、古典的な手段、例えばプレート加圧ろ過器によりろ過する。
【００４０】
次に、前記酵素を、そしてより特にこの特異的酵素のフコシダーゼ活性を不活化するために、回収した溶液を、特に約７５〜約１２０℃、そして好ましくは約９０〜約１０５℃の範囲の温度で、約１０〜約４５分間、そして好ましくは約２０〜３５分間の範囲で熱処理した。
【００４１】
我々は、特に約２０〜４０℃の範囲の温度までそれに冷却する。
【００４２】
冷却中、防腐剤が溶液に添加されるかもしれない。
【００４３】
次に、我々は、無菌条件下で全体をろ過し、そして包装を行なう。
【００４４】
本発明によるこうして得られたオリゴ糖混合物は、当業者に周知の技術、特にＨＰＬＣ、薄層、並びに他の方法及び化学物質用量のクロマトグラフィーを用いて特徴づけられうる。
【００４５】
この方法により、我々は、本発明によるオリゴ糖混合物が、フコースが主に非還元末端の位置で鎖の末端に存在することを調べることができる。
【００４６】
オリゴ糖混合物は、特に老化防止である化粧用の組成物中の、又は特に皮膚病学的（局所適用）である医薬医薬組成物中の活性混合物として特に好適である。特に、オリゴ糖のこの混合物で見つかった生物学的効果は、単糖フコースのそれに非常に類似し、そしてそれよりむしろ優れている。
【００４７】
こうして、本発明は、化粧用又は医薬として活性な物質として例えば前記の少なくとも１のオリゴ糖混合物、並びに化粧用又は医薬として許容される賦形剤を含むことを特徴とする化粧用又は医薬組成物を提供する目的を同様に有する。
【００４８】
前記組成物が医薬用である場合、それは、好ましくは局所適用のための皮膚病学的組成物であり、よってこの皮膚病学的適用にふさわしい少なくとも１の医薬用の賦形剤を有する。
【００４９】
前記化粧用又は医薬として許容される賦形剤は、化粧用又は医薬としての観点から組成物を改善するか、修飾するか、又は安定化させるために当業者に知られたさらなる他の成分を有する、クリーム、ローション剤、ゲル、軟膏などの形態、あるいはエマルジョンの形態において本発明による組成物を得る目的のために当業者に知られるいずれかのものである。
【００５０】
本発明によると、「医薬として許容される賦形剤」という表現は、組成物の獣医学の使用のために適合した賦形剤を含む。
【００５１】
本発明による組成物は、特に製剤への助けとしての他の添加剤、例えばフリーラジカルを防ぐための酸化防止剤を含むかもしれない。当業者は、特に純粋なビタミンＥ又はジ−アルファ−トコフェロールとその誘導体、そして２，６−ジ−テルト−ブチル−ｐ−クレゾール（ＢＨＴ）を引き合いに出すことができる。
【００５２】
有利には、本発明による組成物は、皮膚を構成する物質（例えば、スクアラン及びスフィンゴ脂質）、湿潤剤（例えば、グリセリン及びヒドロキシ・プロシランＣ）、皮膚軟化薬（例えば、ブチレン・グリコール及びセチル・ラクテート）、シリコン（例えば、シクロメチコン）、日焼け防止剤（例えば、Ｐａｒｓｏｌ １７８９及びＥｕｓｏｌｅｘ ６３００）、乳化剤（特にトリエタノールアミン及び大豆レシチンに関連するＣａｒｂｏｐｏｌ １３４２）、増粘剤（特にキサンタンゴム）、捕捉剤（特にＥＤＴＡ）、酸化防止剤（例えば、前記ＢＨＴ）、香料、保存剤、水、及びそれらの混合物から成る群から選ばれる少なくとも１の添加剤を特に含むかもしれない。
【００５３】
もちろん、本発明による化粧用又は医薬組成物を準備するための操作上の条件は、本技術分野の一般的な知識の一部である。
【００５４】
好ましくは、オリゴ糖混合物は、化粧用又は医薬組成物の総重量に対して、約０．００１〜約２０重量％、そしてより特に、及び好ましくは、約０．１〜約１０重量％の範囲の割合に従って存在する。
【００５５】
しかし、あらゆる見解にとらわれることなく、本発明によるオリゴ糖混合物の、以下に挙げられた実施例で説明されている有利な活性は、特に、フコースの高度に利用可能なメチル基の疎水性官能基を介した細胞膜との相互作用のその非常に大きな能力から、並びに皮膚細胞、マクロファージ、又はランゲルハンス細胞のマンノース−フコース受容体とのその相互作用からもたらされる（Ｃｏｎｄａｍｉｎｅｔ ｅｔ ａｌ： Ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓ ｔｈｅ ｍａｎｎｏｓｅ−ｆｕｃｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ． １９９８， ２８： ３５４１−３５５１）。一連のこれらの効果は、細胞の情報伝達を刺激する効果として特徴づけられうる。
【００５６】
こうして、本発明は、皮膚の細胞間の細胞の情報伝達を刺激することを意図した組成物の準備のために、先に記載のオリゴ糖混合物を使用する目的を有しもする。
【００５７】
他方では、本発明は、皮膚のケラチノサイトの細胞増殖を刺激することを意図した組成物の準備のために、先に記載のオリゴ糖混合物を使用する目的を有しもする。
【００５８】
さらに、本発明は、皮膚の繊維芽細胞の細胞増殖を刺激することを意図した組成物の準備のために、先に記載のオリゴ糖混合物を使用する目的を有する。
【００５９】
最後に、本発明は、先に記載のとおり、皮膚の繊維芽細胞によるエラスターゼ型のプロテアーゼの合成の抑制を意図した組成物の準備のためにオリゴ糖混合物を使用する目的を有する。
【００６０】
ヒトの皮膚の線維芽細胞は、様々なプロテアーゼを合成し、そのいくつかはエラスターゼ型の活性がある。これは、とりわけＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９、並びに膜ＭＭＰについて言えることである。
【００６１】
低濃度（１〜２ ｍｇ／ｍｌ）のヒアルロナン（ｈｙａｌｕｒｏｎａｎｅ）を添加した線維芽細胞は、エラスターゼ型の活性を大幅に増加させる。驚いたことに、そして意外にも、我々は、本発明によるオリゴ糖混合物がこの刺激を抑えることを発見することができた。ヒアルロナンが細胞周囲の環境に絶えず存在するので、この抑制活性は老化による皮膚マトリックスの分解を減らすことを当業者に可能にすると考えられる。
【００６２】
こうして、本発明は、ヒアルロナンによって誘発されるプロテアーゼＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の過剰発現の抑制を意図した組成物の準備のために、先に記載のオリゴ糖混合物を使用する目的を同様に有する。
【００６３】
より特に、本発明は、皮膚の繊維芽細胞によるプロテアーゼＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の合成の抑制を意図した組成物の準備のために、先に記載のオリゴ糖混合物を使用する目的をも有する。
【００６４】
他方では、ＭＭＰの活性が接触による感作の場合に極めて重要であることが最近示された（Ｍ．Ｃ． Ｌｅｂｒｅ ｅｔ ａｌ， Ａｒｃｇ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． Ｒｅｓ．， １９９９， ２９１： ４４７−４５２）。ＭＭＰ阻害剤の存在下、接触による感作の時点の場合であっても、表皮のランゲルハンス細胞は真皮を通して移動することができない。この方法で、本発明によるオリゴ糖混合物によるＭＭＰ活性の抑制作用は、刺激に対する皮膚の感受性を減少させる真の効果を提供する。
【００６５】
従って、刺激に対する皮膚の感受性を減少させることを意図した組成物の作製のための、先に記載のオリゴ糖混合物の使用は本発明の目的でもある。
【００６６】
本発明によるオリゴ糖混合物は、表皮及び真皮の厚さを増加させる効果を達成することを当業者に可能にさせる。統計的に、これらの２つの効果は、非常に顕著である。皮膚の厚さが老化により減少する時、本発明によるオリゴ糖混合物のこの栄養効果は、皮膚の老化の予防に非常に重要である。
【００６７】
より特に、当業者は、本発明によるオリゴ糖混合物により処置した皮膚の真皮のコラーゲンの線維束の補強を観察しうる。皮膚の安定におけるこれらのコラーゲン線維束の役割の重要性を考えると、これは大きな抗老化効果である。
【００６８】
その結果、本発明は、真皮におけるコラーゲン線維の蓄積を刺激することを意図した組成物の作製のために、先に記載のオリゴ糖混合物を使用する目的をも有する。
【００６９】
好ましくは、オリゴ糖混合物は、組成物の総重量に基づき、約０．００１〜約２０重量％、そしてより特に、及び好ましくは、約０．１〜約１０重量％の範囲の割合に従って先に記載のとおり使用される。
【００７０】
こうして準備された組成物は、さらに化粧用又は医薬として（特に皮膚病学的に）許容された賦形剤、例えば当業者に知られたものをさらに含む。
【００７１】
最後に、本発明は、先に記載のオリゴ糖混合物の少なくとも１つを含む化粧用組成物を皮膚に適用することを特徴とする、皮膚の化粧による処置を提供する目的をさらに有する。前記化粧用組成物は、化粧用に許容される賦形剤、例えば当業者に知られるものをさらに含む。
【００７２】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図するものであり、つまりその範囲を制限するものとして解釈されるべきでは全くない。
【００７３】
実施例１：本発明によるオリゴ糖混合物の準備
ａ）　醗酵
我々は、番号ｌ−１５０７の下でｔｈｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに寄託された微生物、クレブシエラ・ニューモニエ亜種ニューモニエを使用する。栄養培地及び他の醗酵条件は以下の通りである：
接種材料の準備：
培地：
Ｎｅｏｓｏｒｂ（登録商標） ７０−０７ （ソルビトール含量：７０％ Ｍ．Ｓ．；ＲＯＱＵＥＴＴＥ ＦＲＥＲＥＳ， Ｌｉｌｌｅ／Ｆｒａｎｃｅにより販売）：１７．９０ ｇ／ｌ （すなわち、１２．５ ｇ／ｌのソルビトール）
Ｐｅｐｔｏｎａ Ｂｉｏｋａｒ １０４００３ （タンパク質加水分解物、ＳＯＬＡＢＩＡＢＩＯＫＡＲ， Ｐａｎｔｉｎ， Ｆｒａｎｃｅにより販売）：− ４．５０ ｇ／ｌ
酵母エキス：０．０５ ｇ／ｌ
ＫＨ２ＰＯ４：１．５０ ｇ／ｌ
Ｋ２ＨＰＯ４：４．５０ ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４，７Ｈ２Ｏ：０．２０ ｇ／ｌ
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） ＰＥ ６１０００ （消泡剤）、ＢＡＳＦ、Ｄ−６７００ Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙにより販売：０．５０ ｇ／ｌ
水中で溶液状態にする
培養条件：
３０分間、１２１℃で滅菌
培養温度：３０℃
接種率：５〜１０％
エアレーション：１ ＶＶＭ
ｐＨ調整なし（ｐＨ約７．００）
培養継続時間：２４時間
培地の製造：
培地
Ｎｅｏｓｏｒｂ（登録商標） ７０−０７：５４．００ ｇ／ｌ （すなわち、３８ ｇ／ｌのソルビトール）
Ｐｅｐｔｏｎａ Ｂｉｏｋａｒ（登録商標） ｂ １０４００３：４．５０ ｇ／ｌ
酵母エキス：０．０５ ｇ／ｌ
ＫＨ２ＰＯ４：１．５０ ｇ／ｌ
ＭｇＳＯ４，７Ｈ２Ｏ：０．２０ ｇ／ｌ
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） ＰＥ ６１０００：０．５０ ｇ／ｌ
水中で溶液状態にする
培養条件（３５０リットルの有効容量を持つＣｈｅｍａｐ発酵槽）：
４５分間、１２０℃で滅菌
培養温度：３０℃
接種率：約５％
撹拌：３００ ｒｐｍ （Ｒｕｓｈｔｏｎ型撹拌機）
エアレーション：１ ＶＶＭ
ＮａＯＨ ７Ｎにより７．０に調節したｐＨ
圧力：１００〜２００ ｍｂａｒｓ
培養継続時間：６０〜６５時間
製造で達成された平均値：
サイクルの終わりの粘度：４００００ ＭＰａ．ｓ （粘度計：Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ ＤＶ−ＩＩ＋モデルＬＶ、可動ＳＰ３１、チャンバーＳＣ４−３４／１３Ｒ、３０℃）
Ｌ−フコースで計算した培地中の産生された多糖の濃度：
２ｇ／ｌ （Ｄｉｓｃｈｅ ａｎｄ Ｓｈｅｔｔｌｅｓ法）
ソルビトール消費：（ソルビトールで） ＞３５ ｇ／ｌ
２０重量％でのＮａＯＨの消費：１５リットル／ｍ３
ｐＨ調節の開始：発酵槽への接種後１６〜１７時間
醗酵培地の最終の乾燥抽出物 〜２０ ｇ／ｌ
ｂ）形成された多糖の回収
我々は、醗酵に必須なものを１２０℃の温度で４５分間、そして５．５のｐＨで熱処理に供する。熱処理産物を、ザイツ型プレートによる加圧ろ過器の助けによりろ過する。この方法で、我々は、全く細胞を含まない透明で、粘性の多糖を得る。次に、我々は１．５容量のエタノール対１容量の多糖の状態で沈殿を実施する。そして、粉末が得られるまで２５℃の温度で真空下、乾燥を行う。微生物を使用することを考ると、この多糖は三糖、フコース−ガラクトース−ガラクツロン酸の反復単位から構成され、よってそれは以下の構造体を示す：
【００７４】
【化１】
2004507613.tif 000003
【００７５】
ｃ）　多糖の適度な加水分解
多糖粉末を、水性溶液の総重量に基づいて５重量％の割合で水性溶液の状態にする。前記水性溶液を、陽子発生樹脂の存在下で熱処理、すなわち１００℃まで加熱し３時間に供する。
【００７６】
ｄ）　酵素加水分解
我々は、加水分解物中に緩衝物質混合物、クエン酸（４．１５ ｇ／ｋｇ）−オリン酸水素二ナトリウム（約１０．７５ ｇ／ｋｇ）を導入する。前記溶液の温度を３７℃に調節する。我々は、使用した多糖粉末の総質量に対して、２０重量％、すなわち、プロトリシスによる適度な加水分解について先に記載されたとおり、前記粉末を再び水中に入れた後の水溶液の総質量に対して０．０５重量％の含量に従って、Ｇｉｓｔ Ｂｒｏｃａｄｅｓよって商業化された酵素製剤Ｆｅｒｍｉｚｙｍｅ ＨＣＰを導入する。
【００７７】
こうして得られた混合物を、撹拌しながら、緩衝混合物の存在により６にｐＨを調節し、３７℃の範囲の温度で、１５時間維持する。
【００７８】
ｅ）　前記酵素の不活化及びオリゴ糖混合物の回収
加水分解産物を、ザイツ型プレートを用いた加圧ろ過器でろ過する。次に、回収した溶液を、１０℃で３０分間熱処理し、前記酵素を不活化する。我々は、２５℃の温度までこれを冷却する。それを冷却している間に、保存剤、フェノキシエタノール（１重量％）及びフェノニプ（ｐｈｅｎｏｎｉｐｅ）（０．３重量％）を溶液に添加する。次に、全体を無菌条件下でろ過する。
【００７９】
こうして得られたオリゴ糖混合物を「混合物−１」と呼ぶ。
【００８０】
実施例２：混合物−１の特徴づけＨＰＬＣ
実施例１で得られた混合物−１の分画を、その組成物のオリゴ糖及び多糖の割合を決定する目的のために実施した。
【００８１】
ａ）　カラム「ＸＫ ５０／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐｇｒａｄｅ」を用いた予備の排除クロマトグラフィーによる分画
我々は、５０ ｍｌの、５０ ｍｇ／ｍｌに濃縮された混合物−１を予備カラム「ＸＫ ５０／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐｇｒａｄｅ」（排除クロマトグラフィー）に通して、そして９５の画分を回収し、次にＨＰＬＣに通した。
【００８２】
【表１】
2004507613.tif 000004
【００８３】
カラム「ＸＫ ５０／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ｐｒｅｐｇｒａｄｅ」による混合物−１の分画の後に、９５のフラクションを回収し、その４５がオシド（ｏｓｉｄｅｓ）を含む。
【００８４】
ｂ）　ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ １２０及びｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ ２５０カラムによるＨＰＬＣ（排除クロマトグラフィー）によって得られた画分の特徴づけ
研究のこの第２部の目的は、これらの画分の構成要素の分子量と濃度を分析するためにＨＰＬＣ排除カラム（Ｕｌｔｒａｈｙｄｒｏｇｅｌ １２０及び２５０カラム）に混合物−１の全９５画分を通すことであった。
【００８５】
この研究のために、我々は、以下に記載のＷａｔｅｒｓＨＰＬＣシステムを用いて作業した。
【００８６】
【表２】
2004507613.tif 000005
【００８７】
【表３】
2004507613.tif 000006
【００８８】
ｃ）　結果
表３に記載のＦｌｕｋａの分子量の基準で得られた以下の方程式を用いることによって、調査した画分の構成要素の分子量が計算された：
成分の分子量＝５５２９００００＊１０＾（−０．１３９４２＊Ｘ）
Ｒ２＝０．９８２
Ｘ＝溶出時間（分）
混合物−１の構成要素を含む最初の画分は、画分Ｎｏ． ４４で、最後のものは画分Ｎｏ． ８９であり、それはわずかに高められた分子量の、同じ構成要素が８９の画分が回収された後（８９×１２．５ミリリットル＝１１１２．５ミリリットルの溶出後）に得られることを意味する。回収された画分は、モノ−、オリゴ−、及び約２１ｋＤａまでの１８４Ｄａ（単糖の混合物）の多糖を含む。従って、この画分は、平均１１７の単糖単位又は３９の三糖単位により形成された多糖を含む。
【００８９】
画分Ｎｏ． ７７、７８、７９、８１、８２、８３、８４、８５、及び８６を除いて、ほとんどの画分が、単糖のピークを含む（分離は適用した分離法の感受性によって制限される）。
【００９０】
異なる画分のおおよその濃度は、高めた濃度のフコース基準の評価範囲を使用することによって決定されうる。この種の「単一成分」評価レンジを、検出システム（屈折計による屈折指数の計測）のおかげで使用することができた。これらの結果によると、１ ｎｇ／ｍｌのフコースの溶液は、平均で、２９４０９ （システムの任意の単位）の外見的なピークを得る。分析された外見的なピークが既知であるので、それらの見掛け上の濃度を計算することが可能だった。
【００９１】
達成された結果は、混合物−１が約２６％の低分子オシド（２ ｋＤａまで、約４つの三糖単位）、約３６％のオリゴ糖（４ ｋＤａまで、８つの三糖単位）、及び約２３％の１０ ｋＤａより高い分子量の多糖 （１８の三糖単位）を含むことを示す。
【００９２】
混合物−１の準備のために使用される微生物及び特定の酵素（エンドフコシダーゼ）を考えると、混合物のオリゴ糖が非還元末端の位置にフコース単位を含むように思われる。
【００９３】
実施例３：ヒトの皮膚マトリックスのメタロプロテアーゼ活性に対するフコースの活性、及び混合物−１の活性
ここで、我々は、静止状態又はヒアルロナンによって刺激された状態の線維芽細胞のマトリックス・メタロプロテアーゼ（又はＭＭＰ）活性に対する前述の実施例１で作製された単糖フコース、及びオリゴ糖混合物「混合物−１」の効果を調査するために計画する。ヒト皮膚線維芽細胞の単層の細胞培養からだけでなく、皮膚のそれに最も近い細胞環境における異なる処理の効果を調べるために外植片の培養からも試験を実施した。実際、真皮の線維芽細胞は、インビボにおいて豊富な細胞外マトリックスにより囲まれており、従って、外植片の培養は上記細胞の天然環境を再構成する培養の種類であり、よって、我々が生理学的な条件に近い条件において線維芽細胞のＭＭＰ活性に対する処理効果を調査することを可能にする。
【００９４】
ａ）　方法
ａ．１）　皮膚外植片の培養
ａ．１．１）　不刺激皮膚の外植片のＭＭＰ活性
５４歳の女性の腹部の皮膚からの外植片を、フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ （ＧＩＢＣＯ）中、異なる処理を伴い４８時間の３７℃で撹拌しながら培養した。サンプルを１０μｇ／ｍｌの濃度で処理した。
【００９５】
サンプルの回収：
細胞外の媒体−１ ｍｌの培地
細胞内の媒体−１ ｍｌのＭＭＰ緩衝物質中でｕｌｔｒａｔｕｒａｘにより外植片を挽いたもの
ＭＭＰ緩衝液組成：
０．１ ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ７．５、０．１ ＭのＮａＣｌ、１０ ｍＭのＣａＣｌ２、１ ｍＭの酢酸亜鉛０．０１ ％のＢｒｉｊ ３５、０．０１％のＮａＮ３
ザイモグラフィー（ｚｙｍｏｇｒａｐｈｙ）
ＭＭＰ−ｓの基質であるゼラチンを、１ ｍｇ／ｍｌの終濃度で１０％のポリアクリルアミドのゲルと共同重合させた。皮膚外植片の培養からの細胞外培地を、ゲルの上部に堆積させ、１５０ボルトで電気泳動を実施した。次に、このゲルをＭＭＰ緩衝液中、撹拌しながら３７℃で２４時間インキュベートした。次に、このゲルをクーマシー・ブルーにより着色し、その後蒸留水で脱色した。ＭＭＰ活性に対応する範囲は、白く見え、一方、ゲルのバックグラウンドは青かった。タンパク質の移動距離の関数により、我々は、ゼラチンを消化している酵素の分子量を決定しうる。ＭＭＰ活性を、Ｖｉｓｉｏｌａｂコンピュータを用いた形態計測解析によって定量化した。
【００９６】
ａ．１．２）　１２ ｍｇ／ｍｌのヒアルロナンにより刺激した皮膚の外植片のＭＭＰ活性
調査のプロトコールは、不刺激皮膚外植片のＭＭＰ活性の調査のために使われたものと同じであるが、培地に添加した１２ ｍｇ／ｍｌの濃度のヒアルロナン、及び１０ μｇ／ｍｌの濃度のオリゴ糖サンプルを伴う。
【００９７】
ａ．２）　皮膚線維芽細胞の培養
ａ．２．１）　不刺激皮膚の線維芽細胞のＭＭＰ活性
４５歳の女性の腹部の皮膚からの皮膚線維芽細胞を、１％の抗生物質及び抗真菌薬、並びに１０％のウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ Ｇｌｕｔａｍａｘ （ＧＩＢＣＯ）中で７代目の細胞の継代まで培養し、そして実験に使用した。線維芽細胞を１ウェルにつき５．１０４細胞の密度で６ウェル・プレートに蒔いた。集密の時点で、前記培地を、０．１％のＢＳＡ、及び １０ μｇ／ｍｌの濃度で処理されるべき異なる物質を含むフェノールレッド不含ＤＭＥＭ培地と交換した。３７℃での２４時間の培養（５％ （ｖ／ｖ）のＣＯ２、９５％ （ｖ／ｖ）の空気）の後にサンプルを回収した。
【００９８】
細胞外の媒体−１ ｍｌの培地＋０．２５ ｍｌのＰＢＳによる２回のすすぎ液
細胞内の媒体−１ ｍｌのＭＭＰ緩衝物質により超音波処理した細胞層（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｐｅｔ）
ＭＭＰ緩衝液の組成：
０．１ ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ７．５、０．１ ＭのＮａＣｌ、１０ ｍＭのＣａＣｌ２、１ ｍＭの酢酸亜鉛０．０１ ％のＢｒｉｊ ３５、０．０１ ％のＮａＮ３
皮膚外植片の培養の場合のように、線維芽細胞の培地をザイモグラフィーにより調査した。
【００９９】
ａ．２．２）　１ ｍｇ／ｍｌのヒアルロナンにより刺激した皮膚の線維芽細胞のＭＭＰ活性
調査のプロトコールは、不刺激皮膚の外植片のＭＭＰ活性の調査のために使われたものと同じであるが、培地に添加した１ ｍｇ／ｍｌの濃度のヒアルロナン、及び１０ μｇ／ｍｌの濃度のオリゴ糖サンプルを伴う。
【０１００】
ｂ）　結果
ｂ．１）　皮膚外植片のＭＭＰ活性
ＭＭＰ−ｓは、酵素原、つまり不活性な形態で分泌された酵素である。それらの活性化はタンパク質分解による開裂によって達成され、そしてこの酵素の活性型は、細胞外マトリックスの化合物を分解する。従って、ＭＭＰ−ｓの発現レベルだけでなく、インビボにおいて細胞外マトリックス分解だけを可能にする、と同時に上記酵素が潜在型を活性化することができる、活性型で存在するＭＭＰの割合を知ることも重要である。従って、結果を、酵素の活性型／不活性型の関係の形で示し、そして証明に関係するパーセンテージを、ＭＭＰの活性割合を減少させる、あるいは不活性型の活性化を抑えるためのその能力についてのフコース及び混合物−１の有効性を示すために計算した。
【０１０１】
【表４】
2004507613.tif 000007
【０１０２】
これらの結果を、図１に棒グラフの形で同様に示した。
【０１０３】
フコースと混合物−１は、酵素の活性型／不活性型の関係を減少させることができる。この現象は、ＭＭＰ−２よりＭＭＰ−９に関してさらに重要である。この関係の減少は、その結果インビボにおいて細胞外マトリックスを分解しうる活性酵素の量が、皮膚外植片をフコース又は混合物−１の存在下で培養した場合、重要ではないことを示唆する。
【０１０４】
【表５】
2004507613.tif 000008
【０１０５】
これらの結果を、図２に棒グラフの形で同様に示した。
【０１０６】
皮膚外植片の培地中のヒアルロナンの存在は、ＭＭＰ−ｓの活性型の増加を引き起こす。フコース及び混合物−１は、この増加を減らして、その結果、活性酵素の放出の刺激を抑えることができる。
【０１０７】
ｂ．２）　線維芽細胞のＭＭＰ活性
線維芽細胞を単層で培養した場合、広く分泌されるＭＭＰ−２だけが目に見えるが、しかしながら存在する非常に少量のＭＭＰ−９を伴う。ＭＭＰ−２酵素の不活性型だけが放出される。
【０１０８】
【表６】
2004507613.tif 000009
【０１０９】
これらの結果を、図３の棒グラフに同様に示す。
【０１１０】
我々は、フコース及び混合物−１がＭＭＰ−２の発現を減少させることを観察しうる。混合物−１は、この表現の減少に関してフコースより有効であるように思われる。
【０１１１】
【表７】
2004507613.tif 000010
【０１１２】
ｃ）　結論
フコース及び混合物−１が、ヒト皮膚の線維芽細胞によるＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９の合成、並びに活性化を減少させうることがこれらの実験から裏付けられる。同様に、より効果的な様式で、フコース及び混合物−１は、ヒアルロナン存在下のメタロプロテアーゼの過剰発現を遮断することができる。老化の間の皮膚の細胞外マトリックスの分解におけるこれらのメタロ−エンドペプチダーゼの重要な役割を考慮すると、これは大きな老化防止の効果である。
【０１１３】
実施例４：ヒト皮膚線維芽細胞に対するフコース及び混合物−１の活性
この調査の目的は、細胞の情報伝達の独特の指標、及びヒト皮膚の線維芽細胞の老化を防ぐ作用の１つ、すなわち：ヒトの皮膚の線維芽細胞の細胞増殖の刺激に対する実施例１の混合物−１の作用を分析することであった。
【０１１４】
ａ）　方法論：細胞増殖の調査
この調査で使用したヒト皮膚の線維芽細胞は、２０歳の女性の切除した皮膚から生じる（２６回継代）。この細胞を、１２ウェル・プレートを用いて１０％のウシ胎仔血清（ＳＶＦ）、１％の抗生物質と抗真菌薬（ＰＳＦ）、及び１ μＣｉ／ｍｌの［３Ｈ］−チミジン（ＩＣＮ）を含むＤＭＥＭ培地中で７２時間、各々のサンプルについて２つの最終の濃度：１μｇ／ｍｌと１０ μｇ／ｍｌを有する試験すべき産物の存在下で培養した。
【０１１５】
サンプルの存在下、温室（ｓｔｏｖｅ） （５％ （ｖ／ｖ）のＣＯ２、９５％ （ｖ／ｖ）の空気）内における３７℃での７２時間の培養の後に、ＰＢＳにより細胞を４回洗い、そして細胞層を０．０５％のトリプシンで分離させた。次に、１点のサンプルにつき３ ｍｌのシンチレーション液体を加え、そして細胞中に取り込まれた放射活性を、シンチレーションを用いてコンピュータにより読み取った。
【０１１６】
ｂ）結果：細胞増殖に対する作用
試験された２点のサンプル（１ μｇ／ｍｌと１０ μｇ／ｍｌの濃度）を伴う線維芽細胞の７２時間のインキュベーションは、不刺激細胞（以下の表８を参照のこと）に比べて細胞増殖を顕著に促進した。
【０１１７】
【表８】
2004507613.tif 000011
【０１１８】
実施例５：老化防止クリーム
【０１１９】
【表９】
2004507613.tif 000012
【０１２０】
実施例６：老化防止クリーム
【０１２１】
【表１０】
2004507613.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【図１】
皮膚の外植片によって分泌されたＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９に関係する活性形態／不活性形態を減少させるための有効性のパーセンテージに関して、実施例３．ｂ．１において示された結果を報告する棒グラフである。
【図２】
ヒアルロナンによって刺激された皮膚の外植片によって分泌されたＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９に関係する活性形態／不活性形態を減少させるための有効性のパーセンテージに関して、実施例３．ｂ．１において示された結果を報告する棒グラフである。
【図３】
皮膚の外植片のＭＭＰ−２発現を減少させるための有効性のパーセンテージに関して、実施例３．ｂ．２において示された結果を報告する棒グラフである。
【図１】
2004507613.tif 000014
【図２】
2004507613.tif 000015
【図３】
2004507613.tif 000016
【国際公開パンフレット】
2004507613.tif 000017
2004507613.tif 000018
2004507613.tif 000019
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【国際調査報告】
2004507613.tif 000052
2004507613.tif 000053