(57)【要約】本発明は、植物内もしくは動物内の疾患を検出するため、または植物もしくは動物の特定の組織を画像化するために、光ファイバー（１０６）を通じて照射を行う方法に関する。さらに、そのように光ファイバー（１０６）を通じて照射を行うことによって、蛍光を被検者内で検出および位置特定することができる。照射は同時多光子励起を生じさせるのに有効である。光ファイバーは、単独で使用して組織の内部領域を検査し、光学生検針（１１４）と共に使用して表面下組織を評価し、または、内視鏡（１６）と共に使用して体腔内の組織を評価する。
2004500197.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の植物または動物の組織の内部で疾患を検出する方法であって、
該特定の植物または動物の組織に同時多光子励起を生じさせ且つ固有の蛍光特性を発生させるのに有効な条件下で、少なくとも１本の光ファイバーを通して照射を行うことによって該特定の植物または動物の組織を活性化させる段階；
該活性化の段階に用いられるのと同一の条件下で、該固有の蛍光特性を該特定の植物または動物の健常組織を励起させることによって放出される蛍光と比較する段階；および
該固有の蛍光特性が、該活性化の段階に用いられるのと同一の条件下で該特定の植物または動物の健常組織を励起させることによって放出される該蛍光と異なる場合に、該植物または動物の特定の組織を疾患の可能性があると同定する段階とを含む方法。
【請求項２】
照射が特定の植物または動物の組織に実質的に隣接して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
照射が特定の植物または動物の組織の内部で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
活性化の段階の前に特定の植物または動物の組織を少なくとも１種類の光活性物質で処理する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
照射がレーザーにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
照射がパルスである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
照射がパルス幅約１０−９秒〜１０−１５秒のパルスである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
レーザーがモードロックレーザーである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１本の光ファイバーが、植物または動物の組織の表面に接する終端を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１本の光ファイバーが、植物または動物の組織内に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１本の光ファイバーが、光学生検針で構成されるかまたは光学生検針に連結される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１本の光ファイバーが、植物または動物の体腔内に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１本の光ファイバーが内視鏡に連結される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
体腔が、結腸、食道、胃、腸、膀胱、子宮、膣、肺、卵巣、および咽喉からなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
１本または複数の収集光ファイバーを用いて、植物または動物の組織への照射を収集する段階をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
組織が照射光の第二高調波または第三高調波を生成する能力を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
植物または動物の特定の組織の内部領域の画像を生成する方法であって、
該植物または動物の該特定の組織の該内部領域に同時多光子励起を生じさせ且つ自己蛍光を発生させるのに有効な条件下で、光ファイバーを通して照射を行うことによって該特定の植物または動物の組織を活性化させる段階；および
該内部領域の画像を生成するために該自己蛍光を収集する段階
を含む方法。
【請求項１８】
少なくとも１本の光ファイバーが植物または動物の組織の表面に並置される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
活性化の段階の前に特定の植物または動物の組織を少なくとも１種類の光活性物質で処理する段階をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
照射がレーザーにより行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
照射がパルスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
照射がパルス幅約１０−１２秒〜１０−１５秒のパルスである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
レーザーがモードロックレーザーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１本の光ファイバーが、植物または動物の体腔内に配置される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１本の光ファイバーが内視鏡に連結される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
体腔が、結腸、食道、胃、腸、膀胱、子宮、膣、肺、卵巣、および咽喉からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１本の光ファイバーが光ファイバーの束である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
組織が照射光の第二高調波および第三高調波を生成する能力を有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
被検者内で蛍光を検出および位置特定する方法であって、
少なくとも１本の光ファイバーを通じて該被検者の内部表面に照射を行う段階であり、該光ファイバーはそれぞれ該内部表面に近接する先端で終結し、且つ、該内部表面内で蛍光体分子の同時多光子吸収を生じさせ、その結果少なくとも１本の光ファイバーの先端付近で蛍光励起を生じさせるのに有効な条件下で照射が行われる段階
を含む方法。
【請求項３０】
少なくとも１本の光ファイバーが、被検者の外部から到達可能な体腔を通じて該被検者に挿入される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１本の光ファイバーが内視鏡に連結される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
体腔が、結腸、食道、胃、腸、膀胱、子宮、膣、肺、卵巣、および咽喉からなる群より選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１本の光ファイバーが、体の貫通可能な表面を通じて被検者に挿入される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
照射の段階の後に被検者の内部表面を画像化する段階をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
照射の段階の後に被検者の内部表面の疾患を検出する段階をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
照射の段階の前に少なくとも１種類の光活性物質で被検者を処理する段階をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
照射がレーザーにより行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
照射がパルスである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
照射がパルス幅約１０−１２秒〜１０−１５秒のパルスである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
レーザーがモードロックレーザーである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
照射の段階の後に、被検者の内部表面の組織学的および臨床的組成、構造、代謝状態、ならびに活力度を検出する段階をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
照射の段階の後に、被検者の内部表面の生理的および薬理学的刺激に対する機能的反応と疾患状態とを検出する段階をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
照射の段階の後に、被検者の内部表面における組織または薬物の蛍光励起および発光スペクトルと、光度と、蛍光寿命と、時間的変動とを検出する段階をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項４４】
組織が照射光の第二高調波および第三高調波を生成する能力を有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４５】
貫通可能な物質の体の中で蛍光を検出および位置特定する方法であって、
少なくとも１本の光ファイバーを通じて該貫通可能な物質の体の内部領域に照射を行う段階であり、該光ファイバーはそれぞれ該内部領域に近接する先端で終結し、該内部領域内で蛍光体分子の同時多光子吸収を生じさせ、その結果少なくとも１本の光ファイバーの先端付近で蛍光励起を生じさせるのに有効な条件下で照射が行われる段階
を含む方法。
【請求項４６】
少なくとも１本の光ファイバーが、貫通可能な物質の体に挿入される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
照射の段階の後に被検者の領域を画像化する段階をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
照射がレーザーにより行われる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
照射がパルスである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
照射がパルス幅約１０−１２秒〜１０−１５秒のパルスである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
レーザーがモードロックレーザーである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
貫通可能な物質の体が照射光の第二高調波および第三高調波を生成する能力を有する、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願の特許請求の範囲は、２０００年２月８日に出願された米国仮出願第６０／１８１，０１２号の恩典を主張するものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、多光子励起を光学生検針および内視鏡と共に利用することに関する。
【０００３】
発明の背景
多くの重要な生物学的機能は、固有の蛍光性を有する生体分子および組織構造によって調整または達成される。したがって、スペクトルおよび組織蛍光発光を測定および位置特定することによって重要な生物学的事象を診断および検査できる可能性がある。ヒトおよび畜産動物などの大型生物の内部過程および内部構造をインビボで観察するためには、体腔または固形組織さえも貫通する内視鏡検査が必要と考えられる。
【０００４】
通常、体腔の内視鏡ビデオ画像には、内視鏡を通じて照射される後方散乱白色光が使用され、体腔の内部表面のカラー画像は解像度が低くなる。医師は、悪性腫瘍または炎症など、疾患の状態を判断するために形状の変化および局所の顕著な色の変化（主に血液分布の変化に起因する）を利用することが多い。残念ながら、これらの手掛かりは、特に疾患の初期徴候の検出には十分でないことが多い。光散乱および組織蛍光発光の量的測定によって、診断は改善されてきた。
【０００５】
通常、組織蛍光を励起するのに必要な光は、機械的な生検ワイヤを収容するため内視鏡管に設けられた小さなチューブを通じて挿入される光ファイバーまたはファイバー束を通じて伝達される。小さな光ファイバーまたはファイバー束は、この同じチューブに容易に通すことができる。この方法で通常見られる最も強い組織蛍光の中には、ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）およびコラーゲン構造に起因するものもある。それらの蛍光は、約３〜４ ｅＶの光子エネルギーに相当する波長約３００〜４００ ｎｍの紫外線、または、ときとしてこれよりやや波長が長い可視光線を吸収することによって励起される。
【０００６】
第１の問題は、この紫外線が蛍光性を持たない血液内のヘモグロビンおよびオキシヘモグロビンに多く吸収され、したがって組織中への照射光の透過がヘモグロビンおよびオキシヘモグロビンの濃度および分布により異なることである。
【０００７】
第２の問題は、光ファイバーを出て組織に入射する照射光が、光ファイバーの開口数（ＮＡ）によって決定される開先角度で扇型に広がることである。光がまず焦点に集束するように小さなレンズによってその広がりを集束することができるが、焦平面より先は、光は扇型に広がる（典型的に、ＮＡは約０．２、開先円錐角は〜１７°）。吸収によって減衰されるまで、ファイバー端から各距離の球面上ではほぼ同量の蛍光が励起されるため、この角度の広がりは問題となる。図１にこの効果を概略的に示す。蛍光励起も同様の広がりを生じる。散乱は、蛍光励起を減衰させないが、その分布をさらに広くする。その結果、血液の分布および光の散乱による実際的な制限も受けて、観察領域が誤って規定される。照射光をレンズで集束し、ならびに／または、プリズムおよび鏡で側視用に光を屈曲させても、これらの問題は依然として存在する可能性があることは注意を要する。
【０００８】
本発明は、当技術分野におけるこれらの欠陥を克服するものである。
【０００９】
発明の概要
本発明のひとつの局面は、植物または動物の特定の組織内の疾患を検出する方法に関する。この方法には、特定の植物または動物の組織の同時多光子励起を促進し、固有の蛍光特性を放出させる条件下で、少なくとも１本の光ファイバーを通じて照射を行うことによって特定の植物または動物の組織を活性化する段階を含む。この固有の蛍光特性を、活性化の段階を実施する際と同一の条件下で特定の植物または動物の健常組織を励起したときに放出される蛍光と比較する。植物または動物の特定の組織において、固有の蛍光特性が、そのような活性化を実施する際と同一の条件下で特定の植物または動物の健常組織を励起したときに放出される蛍光とは異なる場合、その組織は疾患の可能性があるものとして同定される。
【００１０】
本発明の別の局面は、植物または動物の特定の組織の内部表面の画像を生成する方法を含む。この方法では、植物または動物の特定の組織の内部表面の同時多光子励起および自己蛍光の惹起を促進する条件下で、光ファイバーを通じて照射を行うことによって、特定の植物または動物の組織を活性化する。この自己蛍光は内部表面の画像を生成するために収集される。
【００１１】
本発明はまた、少なくとも１本の光ファイバーを通じて被検者の内部領域に照射を行うことによって被検者内の蛍光を検出および位置特定する方法に関する。各ファイバーは内部領域に近接する先端で終結する。照射は、内部領域で蛍光体分子の同時多光子吸収を生じさせ、その結果少なくとも１本の光ファイバーの先端付近で蛍光励起を生じさせるのに有効な条件下で行われる。
【００１２】
本発明の別の態様は、貫通可能な物質の体の内部領域に少なくとも１本の光ファイバーを通じて照射を行うことによって、貫通可能な物質の体の内部で蛍光を検出および位置特定する方法に関する。各ファイバーは内部領域に近接する先端で終結する。照射は、内部領域で蛍光体分子の同時多光子吸収を生じさせ、その結果少なくとも１本の光ファイバーの先端付近で蛍光励起を生じさせるのに有効な条件下で行われる。
【００１３】
本発明は、自己蛍光分光法によって疾患を確認するため、組織の自己蛍光を高い空間分解能で励起する多光子吸収を利用する。この目的に最も有用な組織蛍光は、励起のために紫外線エネルギーの吸収を必要とする可能性が高い。多光子励起にはさらに、蛍光分子または蛍光構造による２つまたはそれ以上の光子の同時吸収によって必要な励起エネルギーを提供するという赤外線照射光の利点が提供される。
【００１４】
体腔または組織を貫通する光ファイバーを通じた蛍光分光法の内部多光子励起について前述した利点は、蛍光性を有するまたは蛍光性を持たせてもよい他の貫通可能な物質の探索にも有利に適用できる。例として、食料製品、高分子構造または多孔質媒質がある。
【００１５】
多光子励起のひとつの重要な利点は、照射光がヘモグロビンおよびミオグロビンに吸収されないこと、および、事実上他の一般的な組織構成要素にも多くは吸収されないことである。また、組織による赤外線の散乱も紫外線波長の散乱より有意に少ない。しかし、内視鏡蛍光分光法における多光子励起の最も重要な利点は、蛍光が強く励起される有効な集光量を良好に規定し高度に局在化できることである（図２）。この理由は、蛍光の２光子励起の割合が照度の２乗に比例していることにある。より高次の多光子プロセスについては、照度の指数法則が大きくなり、例えば３光子励起では３乗となる。多光子レーザー走査顕微鏡では、この高次指数法則の特徴によって、共焦点空間フィルタリングで除外する必要のある焦点外の蛍光を生成することなしに３次元の分解が可能となる。
【００１６】
これと同様の照射条件は、特定の適した組織における第二高調波および第三高調波の生成にも適している。第二高調波および第三高調波は、レーザー照射光波長の正確に２分の１および３分の１の波長でそれぞれ生成され、固有の蛍光性と共に利用して組織の特徴付けに役立てることができる。
【００１７】
類似の利点のひとつは、内視鏡組織蛍光に適用する場合のように、光ファイバーを通じて伝送されるレーザー光によって励起される蛍光多光子に関するものである。照度は、ファイバーの端または任意の集光レンズの焦平面からの各半径において、ほぼ同量の力を有する１光子の励起と同様に扇形に展開するが、励起蛍光はこの照射光の扇形展開に従わない。単一モードの光ファイバーを通じた２光子励起の場合、蛍光の分布は、ファイバーの先端を起点とするろうそくの炎に似た形状で、ファイバーの先端近くに局在化する。この有効な集光量は、２光子励起の照度の２乗の空間分布によって規定される。照度の２乗は、ファイバー端からの距離の４乗にほぼ反比例して急激に減少するため、蛍光励起は局在化する。図３に示すように、有意な蛍光は、励起強度の２乗が大きいこの制限された領域からのみ放出される。有効な集光量を光ファイバーの端より先方へずらすため、および／または多光子励起の利点を失うことなく側視を得るため、レンズ、プリズムなどを使用してもよい。
【００１８】
この効果によって、蛍光励起の集光量が良好に規定され、且つ、重要な解剖学的構造を分析するのに十分な鮮明さを持つ有用な空間分解能が得られる。例えば、結腸内では、約５つの異なる層が識別できると考えられる。内皮表面では、陰窩のアレイがその領域を覆い、このアレイは陰窩底部を閉じる細胞層で終結し、その後、平滑筋および結合組織を含む複数の層が合計約０．５ ｍｍにわたって続く。これらの層は層ごとに異なる固有の組織蛍光を励起する多光子レーザー走査顕微鏡によって容易に分析される。したがって、そのような層および表面付近の疾患による層の摂動は、組織蛍光の内視鏡分光法によって、多光子励起で得られる十分な空間分解能で無傷の組織内で識別することができる。
【００１９】
本発明の多光子励起によって精密な空間識別能が得られ、且つ、三次元で規定される小領域の蛍光の定量化が可能となる。これは特に、厚い細胞層を検査する際に重要となる。この場合、ファイバーは深い層の蛍光を励起する多光子を観察および確認するために組織を貫通させてもよく、これによりインサイチューの光学生検が可能となる。さらに、多光子励起では背景蛍光および散乱アーチファクトが大幅に低下する。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明のひとつの局面は、植物または動物の特定の組織内の疾患を検出する方法に関する。この方法には、植物または動物の特定の組織の同時多光子励起を促進し、固有の蛍光特性を放出させる条件下で、少なくとも１本の光ファイバーを通じて照射を行うことによって植物または動物の特定の組織を活性化する段階を含む。この固有の蛍光特性を、活性化の段階を実施する際と同一の条件下で特定の植物または動物の健常組織を励起したときに放出される蛍光と比較する。植物または動物の特定の組織において、固有の蛍光特性が、そのような活性化を実施する際と同一の条件下で特定の植物または動物の健常組織を励起したときに放出される蛍光とは異なる場合、その組織は疾患の可能性があるものとして同定される。
【００２１】
本発明の別の局面は、植物または動物の特定の組織の内部表面の画像を生成する方法を含む。この方法では、植物または動物の特定の組織の内部表面の同時多光子励起および自己蛍光の惹起を促進する条件下で、光ファイバーを通じて照射を行うことによって、特定の植物または動物の組織を活性化する。この自己蛍光は、１セットの隣接領域を記録することによって収集され、内部表面下の組織の画像が生成される。
【００２２】
本発明はまた、少なくとも１本の光ファイバーを通じて被検者の内部領域に照射を行うことによって被検者内の蛍光を検出および位置特定する方法に関する。各ファイバーは内部領域に近接する先端で終結する。照射は、内部領域で蛍光体分子の同時多光子吸収を生じさせ、その結果少なくとも１本の光ファイバーの先端付近で蛍光励起を生じさせるのに有効な条件下で行われる。
【００２３】
本発明の別の態様は、貫通可能な物質の体の内部領域に少なくとも１本の光ファイバーを通じて照射を行うことによって、貫通可能な物質の体の内部で蛍光を検出および位置特定する方法に関する。各ファイバーは内部領域に近接する先端で終結する。照射は、内部領域で蛍光体分子の同時多光子吸収を生じさせ、その結果少なくとも１本の光ファイバーの先端付近で蛍光励起を生じさせるのに有効な条件下で行われる。
【００２４】
本発明のひとつの形態は、生体体腔内の組織表面における多光子内視鏡自己蛍光分光法を利用するものである。内視鏡による低分解能での体腔内部表面の観察および画像化は、すでに標準的な医療手技として十分に確立されている。光ファイバーを通じた多光子内視鏡自己蛍光分光法によって、表面自己蛍光と組織下層の自己蛍光とを分離することができる。将来的な改善の可能性は数多くある。体腔の内視鏡観察では、対象とする組織領域の蛍光を検出するために制御器具を使用して進行方向を定め、観察部位を特定し、光ファイバーの焦点を合わせることは既に可能である。内視鏡観察に多光子蛍光励起の利点を生かすために類似の技術が適用できる。多光子固有蛍光の画像を得るために、ファイバーの走査、または、個々のファイバーもしくは束にしたクラスターの連続照射が使用できると予想される。本発明のこの局面は、結腸、食道、胃、腸、膀胱、子宮、膣、肺、卵巣、および咽喉などの体内の管で組織の蛍光を画像化するのに使用してもよい。その結果、紫外線励起エネルギーで励起された蛍光の差異を認識することによって悪性疾患が検出される。
【００２５】
図４に、本発明に係る内視鏡の構成を示す。本発明のこの態様では、レーザー２がレーザー照射光Ｌを生成し、ダイクロイックフィルタ４によって光ファイバーアセンブリ６に送られる。図４Ａに光ファイバーアセンブリ６をさらに詳しく示す。この図において、レーザー照射光Ｌはレンズ／集束アレイ８を通過し、光ファイバー１０ｄに入る。光ファイバー１０ａ〜１０ｇはケーブル１２に収められ、ケーブル１２は内視鏡ヘッドピース１４に接続される。内視鏡の遠位端は、患者Ｐの口腔に導入され、この場合は食道である腔Ｃに通される。内視鏡の遠位端は内視鏡端１６および励起／収集ユニット１８で終結している。図４Ｂに、励起／収集ユニット１８の詳細を示し、レーザー照射光Ｌは光ファイバー１０ｄを通過して組織Ｔに照射される。その結果、組織Ｔは光ファイバー１０ｄの先端部で蛍光を発し（図２参照）、このような蛍光Ｆは光ファイバー１０ａ〜１０ｇによって収集される。収集された蛍光Ｆは、内視鏡ヘッドピース１４、光ファイバーアセンブリ６（レンズ／集束アレイ８を含む）、ダイクロイックフィルタ４、バリアフィルタ２０を順に通過し、分光器および／または画像検出装置２２に入る。
【００２６】
本発明の別の形態は、光学生検針または少なくとも１本の従来の光ファイバーで組織自体を貫通することに基づく。この用途では、光ファイバーの末端部で組織の自己蛍光をサンプリングするために、光ファイバーまたは光学生検針を組織自体に挿入する。ファイバーは、必要に応じて組織に挿入できる皮下注射器のように機能してもよい。もしくは、光ファイバーの遠位端は、画像化する植物または動物の組織の表面に接触するよう構成してもよい。多光子励起においては、蛍光が励起されるファイバー先端部の量は原理的に良好に規定される。これは初めのファイバーを取り巻くファイバー束により実現できる。もしくは、より大きな量を照射するファイバーの束を使用してもよい。乳癌または肝癌など、高密度組織の癌の生検では、ファイバーの挿入経路に沿って蛍光を探索できる。一般的に、時間がかかる組織の固定および染色手順が必要とされる従来の生検とは対照的に、多光子励起蛍光分光法を使用した光学生検では、プローブを患者の体内に挿入し移動させる際に、即座に診断スペクトルデータが得られる。
【００２７】
図５に、本発明に係る光学生検針の構成を示す。本発明のこの態様では、レーザー１０２がレーザー照射光Ｌを生成し、ダイクロイックフィルタ１０４によって光ファイバーアセンブリ１０６に送られる。図５Ａに光ファイバーアセンブリ１０６をさらに詳しく示す。この図において、レーザー照射光Ｌはレンズ／集束アレイ１０８を通過し、光ファイバー１１０ｄに入る。光ファイバー１１０ａ〜１０ｇはケーブル１１２に収められ、ケーブル１１２は光学生検針のヘッドピース１１４に接続される。光学生検針（すなわち針１１６）の遠位端は、患者Ｐの皮膚を通して骨盤Ｅまで進められる。図５Ｂにより詳しく示すように、針１１６の内部ではレーザー照射光Ｌは光ファイバー１０ｄを通過して組織Ｔに照射される。その結果、組織Ｔは光ファイバー１０ｄの先端部で蛍光を発し（図２参照）、このような蛍光Ｆは光ファイバー１１０ａ〜１１０ｇによって収集される。収集された蛍光Ｆは、光学生検針ヘッドピース１１４、光ファイバーアセンブリ１０６（レンズ／集束アレイ１０８を含む）、ダイクロイックフィルタ１０４、バリアフィルタ１２０を順に通過し、分光器および／または画像検出装置１２２に入る。
【００２８】
本発明のこれらの形態は、ファイバーを体腔の内部表面に到達させるための経路を提供するため患者の体腔内に内視鏡を挿入するという組み合わせで使用してもよく、この場合、ファイバーは組織内に挿入されてその連続層をサンプリングしてもよい。例えば、結腸壁で腫瘍の発生を探索する場合、その組織には約５つの層があり、それぞれが特有の光学的性質および自己蛍光を有する。各層を連続して光学的に探索することによって、各層を識別でき、且つ確認できる。
【００２９】
多光子励起蛍光ならびに組織内で生じたレーザー励起の第二高調波および第三高調波の検出を、励起を生じさせる光ファイバーと、単一モード励起ファイバーの先端付近で励起した光を効率的に収集するための周囲を囲むファイバー束または太い光学チューブとを通じて、内視鏡観察および光学生検によって達成してもよい。多光子内視鏡組織蛍光では、発光は光収集光学部品に最も到達しやすいファイバー先端の付近に限局されるため、単一光子励起と比較して蛍光収集効率の面で大きな利点がある。この利点は光学生検でも同様である。本発明は、複数の光収集ファイバーで取り囲まれた単一励起ファイバーを含む複数の光ファイバーを用いて実施されることが望ましい。
【００３０】
本発明に係る効率的な多光子分子励起は、（ａ）非常に強く、局所的、且つ瞬間的な強度、および（ｂ）パルスされたレーザーの一時的な集中を組み合わせることによって可能となる。回折限界に集光できる高い強度の、長波長の単色光光源としては、各パルスの持続時間が約１００フェムト秒（１００ ｘ １０−１５）で反復速度約８０ ＭＨｚのチタンサファイア・モードロック固体レーザーなどがある。多光子励起および高調波生成に有効な他のレーザーを使用してもよい。これらの高速のパルスは、内視鏡または光学生検針を通じて生きた植物もしくは動物の標的組織、または組織標本に照射される。回折限界に集光される、持続時間が非常に短い強いパルスによって大きな瞬間的な力が供給されるため、標的に含まれ、通常は波長の短い高エネルギーの単一光子（典型的には紫外線）によって励起されうる蛍光体（蛍光色素）が、レーザー源から出た波長の長い光子を２つ同時に吸収する可能性が十分高くなる。この吸収によって蛍光体分子内で２つの光子のエネルギーが結合され、蛍光体が励起状態まで高められる。蛍光体が通常の状態に戻るときに光が放出され、この光が内視鏡または光学生検針を通じて適切な検出器まで戻る。
【００３１】
非常に強力な短パルスの光による蛍光体の多光子励起により、一般的な蛍光顕微鏡技術で、背景識別力がより良好で蛍光体の光退色がより少ない画像化が可能となる。これは、顕微鏡内で供給される集束照射光が、標本を通過する際に集束円錐を形成するためである。集束円錐の頂点で焦平面に到達するすべての光は、蛍光体で吸収されるごく一部を除いて、発散円錐を通って標本の反対側へと抜ける。照度は、集束円錐と発散円錐とで形成されるくびれ部分（ｗａｉｓｔ）にある対物面上の焦点部位でのみ標本発光体の多光子吸収を生じさせるのに十分な強さとなり、この照度依存性により、焦点周囲の小さな局所領域内でのみ長波長の励起を生じさせることが可能となる。この吸収は、高速、強力であり、標本内の焦点以外の部位で長波長光の適度な平均照度を維持する比較的波長の長いフェムト秒パルスの流れという手段によって実現される。その結果、焦平面以外の部位の蛍光体の光退色は事実上生じない。長波長光の１光子吸収は無視できる程度であり、また、実際には時間平均照度は標本の全深度にわたってほぼ均一であるものの、瞬間照度は焦平面以外の部位では低すぎるため、感知可能な２光子吸収および励起を生じさせない。この効果により、生細胞への傷害も大幅に低下する。
【００３２】
本発明では、３次元分解能を得るため、励起光の波長の２分の１と重複するかまたはこれを上回る波長に１光子吸収のピークをもつ蛍光体の２光子励起を利用してもよい。３光子励起の場合は、１光子吸収の波長が励起光の波長の３分の１と重複するようにする。これを実現するには、例えば赤外線領域の可視赤色など比較的波長が長く、高い瞬間出力をもつ非常に短いパルスのレーザー光を生成させる。この光を、通常は短波長領域（例：紫外線照射）の１光子で励起される蛍光体を含んだ標本に照射し、２つの低エネルギー（赤色）の光子がそのエネルギーを結合させなければ１つの高エネルギー（紫外線）の光子の場合と同じ励起が生じないようにする。標本中の励起率も、したがって蛍光率も、入射光強度の２乗に比例する。集光した励起レーザー光において、長波長の入射光は標本内の焦点領域でのみ蛍光体を励起するのに十分な強度となる。この焦点は、焦点周囲の選択した長円形量でのみ標本の蛍光および／または光分解が生じるよう、標本内で位置を調整してもよい。したがって、本発明においては、長波長の励起光のみが標本を通過する必要があり、この長波長の光は、非常に小さな領域内でのみ蛍光を励起するのに十分な強度をもつよう集光される。この蛍光は、通常は紫外線でしか吸収しない蛍光体でも発生する。焦点は標本内で選択的に位置決めすることができるため、走査蛍光顕微鏡観察、光分解のいずれにおいても３次元分解能が得られる。光分解には、光分解で放出されてもよい、光子により活性化される試薬の光分解も含まれる。
【００３３】
本発明において、必要な励起強度は、例えば、赤色領域のスペクトル（例えば約７００〜１０００ ｎｍ）の波長を有するか、もしくはパルス幅１０−９〜１０−１５秒で便宜的には反復速度が約８０ ＭＨｚであるパルス光を生成する、チタンサファイアモードロックレーザーであってもよい照射光源から供給される。他の高輝度パルスレーザーを使用して、例えば赤外または可視赤色領域の比較的長い異なる波長の光を生成し、これにより、総エネルギーが適切な吸収エネルギーバンドとなるよう必要な励起光子を生じさせてもよい。適切な吸収エネルギーバンドとは、通常はスペクトル領域がこの入射光の波長の約半分の波長を有する単一光子の吸収により励起されるスペクトルの蛍光体が必要とするエネルギーである。より短波長の励起が必要な場合は、外部の高調波発生によりレーザー波長を２、３、または４つに分割してもよい。したがって、例えば、７５０ ｎｍの可視赤色領域の２つの光子により、通常は３７５ ｎｍまたはそれ以上の紫外領域の光を吸収する蛍光体が励起され、例えば、１０７０ ｎｍの赤外領域の２つの光子により、５３５ ｎｍまたはそれ以上の可視光領域の光を吸収する蛍光体が励起される。
【００３４】
本発明のひとつの変更された形式においては、入射光が強い瞬間パワーと異なる波長とを有する２つの重ね合わせパルス光となるよう、単一波長の光源を２つの異なる波長のレーザー光源で置き換えてもよい。入射光の各波長は、短波長で吸収性を示す蛍光体を励起するよう選択され、これは以下の式で表される：
１／λａｂｓ＝ １／λ１＋ １λ２
式中、λａｂｓは吸収体の短い波長、λ１およびλ２はレーザー入射光の各波長である。
【００３５】
２光子励起において、２光子断面積δが典型的な次式
δ ＝ １０−５８ｍ４ｓ ／ 光子
で与えられ、パルスパラメータが前述のとおり（反復速度８０ ＭＨｚの１００ ｆｓｅｃパルス）であり、且つ開口数Ａ − １．４のレンズで光が集光される場合、平均パワー（Ｐ０）約 ５０ ｍＷの入射レーザー光により、１蛍光体１パルスにつき１吸収光子が限界である蛍光体の蛍光出力が飽和する。１パルス１蛍光体につき吸収される光子数ｎａは以下の関係に従う：
2004500197.tif 000003
式中、
τはパルス持続時間、
ｆは反復速度、
Ｐ０は入射レーザーの平均パワー、
δは光子吸収断面積、
ｈはプランク定数、
ｃは光速、
Ａは集光レンズの開口数
である。ただし、蛍光放出はパルス反復周波数を蛍光寿命の逆数まで増加することによって増強できる。これは典型的に次式で表される：
τｆ−１＝ １０９Ｓ−１
比較として、１光子の蛍光飽和は約３ ｍＷの入射光パワーで生じる。
【００３６】
多光子励起で固有組織蛍光を測定することに加えて、薬物の蛍光を利用して組織中の局在を検出することが可能である。こうした薬物はしばしば特定の組織構造または腫瘍などの疾患生成物の中に分離して存在する。これら薬物の同定に多光子励起を用いることができる。多くの重要な薬物は紫外光を吸収して蛍光性となる性質があり、したがって多光子励起により効率的に励起される。したがって、蛍光性薬物の選択的分離または結合により提供される標識付けの特徴とともに、固有組織蛍光の多光子励起の利点がすべて得られる。例えば、結腸炎治療に使用される主要な薬物である５−アミノサリチル酸は、生きた結腸組織の外植片において同薬物が代謝される際に結腸組織の全層内で画像化できる。コラーゲン、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、および他の構造による組織自己蛍光を画像化することにより、複雑な組織構造に対して位置特定することができる。このような薬物の多光子励起により、多光子内視鏡および／または多光子光学生検による組織内のインビボ観察も可能となる。
【００３７】
蛍光色素を含む光活性物質は、細胞および組織の特性を画像化するため多光子顕微鏡観察で一般的に用いられる。適切な光活性物質としては、例えばＣａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、またはＨ＋などの金属イオンに結合したときに蛍光特性が変化する有機分子など、多光子励起で励起される色素が含まれる。ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジヒドロクロライド）など、ＤＮＡ二重鎖に結合する色素は特に有用である。多くのこのような色素がインビボの適用において適している。
【００３８】
ヒトを含む生きた動物内で多光子吸収内視鏡分光観察により蛍光の分布を探索し、結腸炎などの炎症性疾患の識別およびその治療経過の観察を行うことができる。同様に、アミノレブリン酸の代謝産物であり、癌細胞に蓄積する蛍光性のプロトポルフィリンＩＸの分布も癌の検出に有用であると考えられる。ＮＡＤＨ蛍光は、多光子吸収内視鏡分光観察で検出できる、最も将来性のある癌シグナルである可能性があるが、隣接組織中で同様に蛍光性を有するコラーゲンと識別するには多光子吸収により空間的に位置特定する必要がある。特定の組織および組織構成物、特に、組織の重要な構造構成物であり多くの形体で存在するコラーゲンは、明るい干渉性の照射光の第二高調波を非常に高効率で生成することが以前から知られている。第二高調波の照射光は波長が基本照射光のちょうど半分であり、したがって基本照射光の２倍の光子エネルギーを有する。同様に、第三高調波の照射光は波長が基本照射光のちょうど３分の１であり、したがって光子エネルギーは３倍である。実際に、第二高調波光の生成は細胞の顕微鏡的な画像化に有用な現象であることが示されている。複雑な組織内で第二高調波および第三高調波を生じさせるのに必要な照射条件は多光子蛍光励起の必要条件と同様であるため、コラーゲンなどの組織において、第二高調波または第三高調波の生成を利用して固有組織蛍光の多光子励起を補うことができる。複雑な組織内では、第二高調波または第三高調波は広い角度から高頻度に照射されるため、多光子励起蛍光とともに検出することができる。本発明は種々の目的に利用可能である。例えば、被検者の当該領域における組織学的および臨床的な組成、構造、代謝状態、ならびに活力度を決定することができる。もしくは、被検者の当該領域における、生理的および薬理的な刺激に対する機能的反応、ならびに疾患状態を検出することができる。最後に、被検者の当該領域における、組織蛍光および薬物蛍光の励起スペクトルおよび発光スペクトル、光度、蛍光寿命、ならびに時間的変動を決定することができる。
【００３９】
本明細書において、好ましい態様を詳細に記述および説明してきたが、当業者には、本発明の精神から逸脱することなく種々の改変、追加、置換などが可能であり、これらは特許請求の範囲で規定される本発明の範囲内に入るとみなされることが理解されるものと思われる。
【図面の簡単な説明】
【図１】先行技術に基づいた、単一モードの光ファイバーから放出される紫外光の空間的分布、およびそれに対応する自己蛍光を示す斜視図である。ここで、照射の強度の減衰は光ファイバー先端からの距離の２乗に反比例する。
【図２】本発明に基づいた、単一モードの光ファイバーから放出される２光子励起蛍光の紫外光の空間的分布を示す斜視図である。ここで、照射光のパターンは１光子励起と同様である。しかし、２光子励起の割合がパルスされた照度の２乗に比例するため、蛍光強度はファイバー先端からの距離の４乗にほぼ反比例して減衰し、蛍光の励起が高度に局在化された有効な集光量が得られる。より高次の蛍光励起については、直径の大きな光ファイバーを使用する場合は有効な集光量の鮮明さが低下し得るものの、放出の指数法則はさらに強くなり、例えば、３光子励起の場合は６乗に反比例する。
【図３】ファイバー出力の２光子励起プロフィールをガウス強度プロフィール（Ｇａｕｓｓｉａｎ Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ Ｐｒｏｆｉｌｅ）で示したものである。この図は、光ファイバーの出口を起点として、光ファイバーの軸に沿った平面について、均一な蛍光体による２光子励起の蛍光放出の空間分布を示したものである。正規化された最大値は、軸に沿って約１０〜１５マイクロメートルで半分に減少し、また、典型的な単一モードのファイバー出口の半分の最大値半幅は約２μｍを有する。
【図４】本発明に係る内視鏡の構成を示す。
【図５】本発明に係る光学生検針の構成を示す。
【図１】
2004500197.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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