(57)【要約】被験者における、抗原成分に特異的な抗体の産物を増強し得るワクチンに使用される抗原成分であって、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するPidタンパク質に特異的に結合し得る抗原成分である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における、抗原成分に特異的な抗体産物を増強し得るワクチンに使用される抗原成分であって、
抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するPidタンパク質に特異的に結合し得る抗原成分。
【請求項２】
配列番号１のアミノ酸配列を有する前記Pidタンパク質、または実質的にその抗原性に作用しないそれらの変異体を含有する請求項１に記載の抗原成分。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列を有する前記Pidタンパク質のペプチド断片、または実質的にその抗原性に作用しないそれらの変異体を含有する請求項１に記載の抗原成分。
【請求項４】
胞子虫網（apicomplexan）の寄生虫から調製されるものである請求項２または３に記載の抗原成分。
【請求項５】
前記胞子虫網の寄生虫は、アメリア属（Eimeria）、イソスポラ属（Isospora）、トキソプラスマ（Toxoplasma）、ハモンディア（Hammondia）、シストイソスポラ（Cystoisospora）、肉胞子虫属（Sarcocystis）、ベスノイチア（Besnoitia）、フレンケリア（Frenkelia）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）、プラスモディウム属（Plasmodium）、バベシア属（Babesia）、及びタイレリア属（Theileria）よりなる群から選択される属である請求項４に記載の抗原成分。
【請求項６】
前記胞子虫網の寄生虫は、プラスモディウム属の一種である請求項５に記載の抗原成分。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗原成分を、免疫原成分に結合させた免疫原。
【請求項８】
請求項７に記載の免疫原、及びアジュバントを含有するワクチン。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗原成分をコードするポリ核酸を含有するワクチン。
【請求項１０】
前記ポリ核酸は更に、抗原成分をコードする配列の発現を制御する為の真核生物プロモーターを含有するものである請求項９に記載のワクチン。
【請求項１１】
ヒト被験者の使用に適したものである請求項８〜１０のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１２】
P. ファルシパルム（falciparum）、P. オバレ（ovale）、P. ビバックス（vivax）、及びP. マラリエ（malariae）から選択される寄生虫によって生じるヒトマラリアへの使用に適したものである請求項１１に記載のワクチン。
【請求項１３】
特異的結合アッセイにおいて、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質に競合し得る成分を含有する治療剤。
【請求項１４】
配列番号１のアミノ酸配列を有するPidタンパク質に特異的に結合し得る抗体を含有する診断剤。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれかに記載の抗原成分を含有する診断剤。
【請求項１６】
配列番号１のアミノ酸配列またはそのペプチド断片を含有する医薬用タンパク質。
【請求項１７】
配列番号１のアミノ酸配列またはその断片を有するPidタンパク質をコードする医薬用ポリ核酸。
【請求項１８】
配列番号１のアミノ酸配列を有するPidタンパク質に特異的に結合し得る医薬用抗体。
【請求項１９】
胞子虫網の寄生虫によって生じる疾病に有効な医薬を製造する為の、請求項１〜６のいずれかに記載の抗原成分の使用。
【請求項２０】
胞子虫網の寄生虫によって生じる疾病に有効な医薬を製造する為の、配列番号１のアミノ酸配列またはそのペプチド断片を有するタンパク質の使用。
【請求項２１】
胞子虫網の寄生虫によって生じる疾病に有効な医薬を製造する為の、配列番号１のアミノ酸配列またはその断片を有するPidタンパク質をコードするポリ核酸の使用。
【請求項２２】
胞子虫網の寄生虫によって生じる疾病を診断する診断剤を製造する為の、配列番号１のアミノ酸配列を有するPidタンパク質に特異的に結合し得る抗体の使用。
【請求項２３】
胞子虫網の寄生虫によって生じる疾病を診断する診断剤を製造する為の、請求項１〜６のいずれかに記載の抗原成分の使用。
【請求項２４】
胞子虫網の寄生虫によって生じる疾病を診断する方法における請求項１４または１５に記載の診断剤の使用。
【請求項２５】
胞子虫網の寄生虫によって生じる疾病を診断する診断剤を製造する為の、配列番号１のアミノ酸配列またはそのペプチド断片を含有するタンパク質の使用。
【請求項２６】
胞子虫網の寄生虫によって生じる疾病を診断する診断剤を製造する為の、配列番号１のアミノ酸配列またはその断片を有するPidタンパク質をコードするポリ核酸の使用。
【請求項２７】
胞子虫網の寄生虫によって生じる疾病に有効な医薬を製造する為のPidタンパク質Ｃｄｃ４２のインヒビターの使用。
【請求項２８】
前記胞子虫網（apicomplexan）寄生虫は、アメリア属（Eimeria）、イソスポラ属（Isospora）、トキソプラスマ（Toxoplasma）、ハモンディア（Hammondia）、シストイソスポラ（Cystoisospora）、肉胞子虫属（Sarcocystis）、ベスノイチア（Besnoitia）、フレンケリア（Frenkelia）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）、プラスモディウム属（Plasmodium）、バベシア属（Babesia）、及びタイレリア属（Theileria）よりなる群から選択される属である、請求項１９〜２７のいずれかに記載の使用。
【請求項２９】
前記疾病は、マラリア、コクシジウム症、タイレリア症、クリプトポリジウム症、イソスポーラ症、ブラストシストシス（blastocystosis）、バベシア症、アナプラスマ症、サルコスポリディオシス（sarcosporidiosis）、トキソプラスマ症、及び肉胞子虫症より選択されるものである請求項１９〜２８のいずれかに記載の使用。
【請求項３０】
前記胞子虫網の寄生虫は、プラスモディウム属の一種である請求項１９〜２９のいずれかに記載の使用。
【請求項３１】
前記胞子虫網の寄生虫は、プラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）、プラスモディウムビバックス（Plasmodium vivax）、プラスモディウムオバレ（Plasmodium ovale）、プラスモディウムマラリエ（Plasmodium malariae）から選択される一種である請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記疾病はマラリアである請求項１９〜３１のいずれかに記載の使用。
【請求項３３】
前記疾病は、ヒトマラリアである請求項３２に記載の使用。
【請求項３４】
被験者の胞子虫網による感染症を診断するin vitroの方法であって、
（ｉ）被験者から、核酸含有サンプルを得る工程、及び
（ii）該サンプルを用い、Pidの核酸配列特徴の有無をテストする工程
を包含する方法。
【請求項３５】
前記胞子虫網は、プラスモディウム属の一種である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
サンプルは、赤血球細胞を含有するものである請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記核酸サンプルは、テストの前に増幅されるものである請求項３４〜３６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明はワクチン用抗原成分に関し、特に、胞子虫網によって生じる疾病用の抗原成分に関するものである
【背景技術】
【０００２】
胞子虫網には、アメリア属（Eimeria）、イソスポラ属（Isospora）、トキソプラスマ（Toxoplasma）、ハモンディア（Hammondia）、シストイソスポラ（Cystoisospora）、肉胞子虫属（Sarcocystis）、ベスノイチア（Besnoitia）、フレンケリア（Frenkelia）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）、プラスモディウム属（Plasmodium）、バベシア属（Babesia）、及びタイレリア属（Theileria）といった属の寄生虫を始めとする様々な寄生虫が包含される。
【０００３】
上記胞子虫網に属する全ての属は、アピカル複合体と呼ばれる特別のオルガネラ（以下、この名前で呼ぶ）を有している。このオルガネラは、侵入中に標的細胞の表面に突出する分泌性の顆粒／タンパク質を含有している。この様なタンパク質の突出は、細胞の侵入よりも前に起こる。
【０００４】
これらの寄生虫は、広範囲の宿主生物体の疾病に関与している。例えばアメリア属（Eimeria）の種は、少なくとも鶏、七面鳥、雁、鴨、蓄牛、羊、豚、馬、ウサギ、ラット、及びマウスに対し、病原性を有することが知られている。ヒト、子犬、馬及び子羊におけるトキソプラスマ症は、トキソプラスマ（Toxoplasma）の種、特にT. ゴンディ（gondii）が関与している。クリプトスポリジウム種は、哺乳類、鳥及び爬虫類に感染する。特にC. ムリス（muris）及びC. パルバム（parvum）は、蓄牛、羊及びヒトに胃腸疾患をもたらすことが知られている。
【０００５】
更にバベシア種は、蓄牛、馬、羊、ヤギ、豚、猫及び犬を含む家畜動物に対し、致命的な疾患をもたらす。タイレリア種は、蓄牛、羊及びヤギに感染力があることが知られている。特にT. パルバ（parva）及びT. アンヌラタ（annulata）は、蓄牛における重篤な病原体であり、前者は、アフリカのタイレリア症または東海岸熱をもたらす。
【０００６】
最も鋭意研究されている胞子虫網由来疾病の一つがマラリアである。この疾病は、現代におけるヒトの罹患率及び死亡率が最も重篤な、単一原因よりなる疾病の一つであり、感染者は、一年間につき推定で３百万人、正確には約５００万人に近い（Butler, D. and J. Maurice, 1997）。
【０００７】
マラリアは、プラスモディウム種によって生じるが、これは、雌性蚊のベクターを介して脊髄動物の血液に侵入する。今日、４種類のプラスモディウム種、即ち、P. ファルシパルム（falciparum）、P. オバレ（ovale）、P. ビバックス（vivax）、及びP. マラリエ（malariae）がヒトマラリアに関与している。これらのうち主な感染源は、P. ファルシパルム（falciparum）であると広く認識されている。更にヒト以外の霊長類では、P. cynomolgi、P. knowlesi、P. brasilianum、P. inui、P. berghei、P. yoelii、P. vinckei、及びP. chabaudiを含め、少なくとも２０種類のプラスモディウムが関与していることが知られている。
【０００８】
プラスモディウム種のライフサイクルを図１に示す。
【０００９】
感染段階で、スポロゾイトは、蚊の唾液腺から血流中に直接侵入する。次に、スポロゾイトは肝細胞を攻撃し、過剰の赤血球シソゴニー（増殖生産）と呼ばれるプロセスを繰返す。このステージで、P. ビバックス（vivax）またはP. オバレ（ovale）といった或る種の寄生虫は、ヒプノゾイトへと進展し、休眠状態を保つが、復活して再発する恐れもある。
【００１０】
（種依存性の）期間経過後、メロゾイトと呼ばれる様になる寄生虫は、再び血流に侵入する。メロゾイトは赤血球に侵入した後、更に赤血球シソゴニーと呼ばれる繰返し期へと進む。感染した赤血球細胞が破裂した後、遊離したメロゾイトは順次、新しい赤血球細胞に侵入する。この感染サイクルは、何回も繰返される。
【００１１】
メロゾイトは、マラリア疾患の主原因であると考えられている。例えば上記寄生虫は、その作用が、様々なマラリアの兆候及び症状に関与していると考えられている腫瘍壊死因子の様なサイトカインの遊離を刺激する。更に大脳マラリアは、脳内毛血管に癒着した感染赤血球細胞によって生じることが知られている。
【００１２】
幾つかのメロゾイトは、生殖段階でガメトサイト（生殖母細胞）へと進展し得るが、雌性蚊が再び刺すと集結する。受精期間後、オーキネートが生成され、スポロゾイトへの進展準備ができると、蚊の消化管に侵入する。次にスポロゾイトは、次の刺傷に備えて、蚊の唾液腺を貫通する。
【００１３】
マラリア以外の胞子虫網寄生虫が関与する疾病に対する最近の治療は、成功例が限られている。この属の生物体に有用なワクチンは、トキソプラスマ症に対する弱毒生ワクチン一つしかなく、動物用に認可されているのみである。葉酸阻害剤及びマクロライドによる治療は、トキソプラスマ症には有効であるが、スルファジアジン及びピリメタミンは、妊娠中の使用は危険である為、妊娠中にも使用でき、最も有効に治療し得る新規な治療法の開発が必要である。スピラミシン等のマクロライドは安全性に劣り、血管−脳バリアを通過することができない為、脳内トキソプラスマ症の治療には適さない。クリプトスポリジウム症に有効な治療法またはワクチンは、今のところ無い。
【００１４】
マラリアへの抗疾病対策としては、蚊刺傷の予防、抗寄生虫薬及び予防治療法が広く含まれる。
【００１５】
1980年代から、P. ファルシパルム（falciparum）のタンパク質成分を用いて、宿主防御抗体を刺激するワクチンを開発する試みがなされている。しかしながら、供試ワクチンはいずれも、当該分野で免疫応答が有効であるといえる程、強い刺激は認められなかった。SPf66は、血液ステージをターゲットとする合成ワクチンであるが、実地試験では何らかの防御が認められたものの、現時点では、マラリアコントロール用の適切な候補物質とは考えられていない。
【００１６】
SPf66は免疫原を有しており、南アメリカの住民では、或る程度の防御（30〜35%）が認められたと報告されているが、高レベルの伝染力に曝されているアフリカの子供達には、殆ど無防備であった。このことは、上記ワクチンによる効力は、系統間の境界を超えられないことを意味している。ワクチン／薬物が有効である為には、疾病の流行地域にかかわらず、寄生虫−系統の境界を超えることが必要である。X線を照射したスポロゾイトは、チャレンジ試験では有効であると報告されているが、広範囲な使用は現実的でない。多くのスポロゾイトタンパク質を用いたワクチンCSPは、T細胞による応答を誘導しない為、長期間の免疫が得られなかった。メロゾイト表面タンパク質に基づく他のワクチンMSP-1は、サル臨床試験での防御が得られなかった。これらのワクチンが全て失敗した理由としては恐らく、誤った前提から直接導かれたワクチン候補物質を誤って選択したことが考えられる。可能性のある別の問題は、これらの抗原が、幾つかは重複しているが、或る地域から他の地域にわたって高度の多形を有するということ、即ち、これらは１個以上のコピー（MSP-1等）で生じるという点である。非常に重要なことであるが、ワクチン候補物質の選択に関する理論的根拠は、同種分子の生化学または生物学を考慮しておらず、どの様にしたら寄生虫伝染の全概要にフィットするのか考慮していない。例えば、過去20年間に亘って広範囲に研究されてきたMSP-1またはCSPの機能は、未だ解明されていない。分子機能の予備知識は、ワクチン設計における使用に欠くことのできない重要なものである。
【００１７】
最近、宿主における細胞免疫応答を顕在化させるワクチンを開発する試みがなされている。
【００１８】
その様な研究の一つとして、寄生虫に感染した肝細胞を破壊する宿主Ｔ細胞を刺激するワクチンを産生しようという試みがなされている。この研究は、所謂「プライムブースト（prime-boost）」技術を用いてなされたものであって、宿主免疫システムを一のワクチンで開始した後、他のワクチンでブーストし、細胞障害性Ｔ細胞のレベルを高めるというものである。プライムブーストワクチンの二つの成分は、同定した特定抗原に基づくDNAワクチン、及びそのDNAに挿入した同一抗原に対する遺伝子を有する、非複製ワクシニアウイルス（MVA）である。プライムブーストワクチンは、マウスの後期マラリア感染症を防御することが報告されている。現在、ヒトへの試みがなされているところである。
【００１９】
更なる例として、RTSSは、スポロゾイトタンパク質をベースとするウイルスワクチンでありるが現在、実地試験がなされている。
【００２０】
しかしながら、この様な明白な進展にもかかわらず、有効な抗哺乳類ワクチンは未だ見出されていない。この様な状況下、胞子虫網寄生虫由来のマラリア及び他の疾病に対し、治療及び予防が共に有効な、新しい治療法へのニーズは依然として残っている。
【発明の開示】
【００２１】
従って、この発明の第一の目的は、被験者における、抗原成分に特異的な抗体の産生を促進し得るワクチンに使用される抗原成分であって、抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有するPidタンパク質に特異的に結合し得る抗原成分を提供することにある。
【００２２】
本発明者らは、胞子虫網寄生虫によって生じる侵入付与遺伝子座としてpid（Plasmodium invasion determinant）座を同定した。寄生虫感染宿主は、感染マーカーとして、Pidタンパク質、及び当該タンパク質に対する抗体を有すると予想される。従って、Pidタンパク質は、これら寄生虫由来疾患に対する、ワクチン及び治療剤を含めた治療法における、新しいターゲットの可能性を提供するものである。
【００２３】
驚くべきことに、新たに同定したPidタンパク質は、pSaプラスミド（Kado, C.I. and S.M. Close, 1991; Chen, CY and C.I Kado, 1994）のosa遺伝子でコードしたOsa（oncogenic suppressive activity）タンパク質のアミノ酸配列と同じであることが分かった。上記osa座及びpid座もまた、同じヌクレオチド配列を有している。
【００２４】
植物病理学分野では、pSaプラスミドは、Agrobacterium tumefaciensによる植物腫瘍刺激能を完全に阻害することが知られている。関連研究によれば、Osa座のみが、この阻害発生に適していることが報告されている。A. tumefaciensによる腫瘍形成力は、細菌Tiプラスミドの特異的なセクター（T-DNA）が植物細胞へトランスファーすることによって仲介される。上述の研究は、Osaタンパク質が、細菌から植物へVirE2がトランスファーされるのをブロックすることにより、腫瘍形成力を抑制し得ることを示唆するものである。
【００２５】
本発明の第一の目的によれば、ワクチンに応答して被験者に生じた抗体に対する特異的ターゲットとなる、Pidタンパク質を提供するものである。
【００２６】
抗体は一般に、エピトープまたは抗原決定基として知られているタンパク質の一部分に結合している。タンパク質は、一以上のエピトープを有しており、一つのタンパク質に存在する様々なエピトープは、種々の抗体で認識されていると考えられる。同様に一つの抗体は、一以上のエピトープに結合し得る可能性がある。しかしながら、結合親和力、更には相互作用の特異性は、様々である。
【００２７】
ワクチンに応答して生じる抗体の結合特異性は、ワクチンの抗原成分によって決定される。要約すると、ワクチンを投与すると、抗原成分は、宿主免疫システムによって認識され、当該成分に特異的に結合し得る抗体が産生される。本明細書では、抗原成分と特異的な同起源の抗体との結合は、10-6〜10-7M、若しくはそれ以下の範囲の結合定数で起こると予測している。
【００２８】
本発明によれば、ワクチンに応答して生じた抗体は更に、感染宿主における標的Pidタンパク質を認識して結合することができる。ネイティブの宿主抗原との交叉反応を阻止する為、抗体はPidと、1〜10nMの範囲、好ましくは1nM以下の結合定数で、特異的に結合しなければならない。
【００２９】
一実施態様では、抗原成分は、アミノ酸配列番号１のPidタンパク質、またはその抗原性に実質的に影響しない変異体を含有し得る。この様に、抗原成分においてPidタンパク質のエピトープに特異的に結合して生じる抗体は、標的Pidタンパク質と同じエピトープに結合することができる。
【００３０】
変異体配列を有するPidタンパク質は、変異体が自然に発生し得るか、若しくはエンジニア（巧みに工作）され得る。上記変異体の配列は、配列番号１の配列と比較して、１以上のアミノ酸が付加、置換、または欠失されたものを含有し得る。同様に上記変異体は、アミノ酸配列の変異体が、タンパク質の抗原性に実質的に影響しないのであれば、一以上の修飾アミノ酸を含有し得る。例えば同類置換によるバリエーションの可能性が挙げられる。同類置換の組合わせとしては、アスパラギン及びグルタミン（NまたはQ）；バリンV、ロイシンL、イソロイシンI、及びメチオニンM；アスパラギン酸及びグルタミン酸（DまたはE）；リジンK、アルギニンR、及びヒスチジンH；アラニンA、及びグリシンG；セリンS、及びトレオニンT；フェニルアラニンF、チロシンY、及びトリプトファンWである。
【００３１】
変異体Pidタンパク質の使用は、特別な利点をもたらす。例えば上記変異体により、溶解性または安定性が改善され得、他のワクチン成分と一層適合し得る。例えば、チオレドキシン等の融合標識（タグ）は当該タンパク質と結合し、安定性及び／又は溶解性が改善される。
【００３２】
上述した様にタンパク質は、抗体結合エピトープを１個以上含有し得る。従って、Pidタンパク質のエピトープはいずれも、当該タンパク質の断片にのみ含まれ得る。従って、前述した様に上記抗原成分は、配列番号１のアミノ酸配列を有するPidタンパク質のペプチド断片、またはその変異体を含有し得る。
【００３３】
完全なタンパク質よりはペプチド断片を使用する方が、投与がより一層容易な、小さい抗原成分を提供することができる。小断片は、完全なタンパク質に比べ、より安価に且つ簡易に製造することができる。これらは、合成化学または組換え法により、簡単に合成することができる。
【００３４】
抗原成分における上記Pidタンパク質または当該Pidタンパク質のペプチド断片は、胞子虫網寄生虫由来のものであることが好ましい。上記タンパク質は、源寄生虫で発現され、単離され得る。或いは、Pid座は、寄生虫から単離され、標準クローニング技術及び発現技術によって発現され得る。好適な胞子虫網寄生虫は、アメリア属（Eimeria）、イソスポラ属（Isospora）、トキソプラスマ（Toxoplasma）、ハモンディア（Hammondia）、シストイソスポラ（Cystoisospora）、肉胞子虫属（Sarcocystis）、ベスノイチア（Besnoitia）、フレンケリア（Frenkelia）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）、プラスモディウム属（Plasmodium）、バベシア属（Babesia）、及びタイレリア属（Theileria）よりなる群から選択される属であり、好ましいのはプラスモディウム属（Plasmodium）である。
【００３５】
寄生虫源から精製されるタンパク質は、ネイティブに近い（ミリスチル化またはグリコシル化の様な、何らかの翻訳後修飾を有する）為、抗原成分源として推奨される。しかしながら、これらのタンパク質は、充分な量を精製することが困難である。細菌発現により、大量の組換えタンパク質が生じることは保証されるが、翻訳後修飾がなされ得るものではない。しかしながら、酵母（Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae またはSchizosaccharomyces pombe）、またはバキュロウイルス／昆虫の細胞システムにおける発現は、組換えタンパク質が適切に修飾されることを保証するものである。しかし、抗原成分の使用に適したPidタンパク質の合成模倣品が構築され得ることも認識されている。
【００３６】
抗体反応の顕在化を狙ったワクチンでは、免疫原性は、ワクチンの免疫原によって介在される。従って、本発明の第二の目的は、免疫原成分に結合する抗原成分を含有する免疫原を提供することにある。
【００３７】
抗原成分はそれ自体、免疫原性を有する為、抗原成分それ自体が免疫原性成分を含有している。しかしながら、抗原成分は非常に小さいので、例えば宿主に対する免疫原性を有することはできない。その様な場合、抗原成分を、適切な担体に結合することが必要である。従って、単離した抗原は、生物感染の間に顕在化するのと同様のレベルまで或る程度、刺激することが好ましい。抗原の提示及び免疫原性を増強する為に、ウシ血清アルブミン及びキーホール（keyhole）カサガイヘモシアニン等のハプテン；ウイルス粒子またはデンドリマーに結合させてもよい。生ワクチンとして、経口的にデリバーされるワクチンを運ぶことができる様に、弱毒化サルモネラ菌株をエンジニアすることも可能である。サルモネラは、抗体反応及び細胞性免疫応答の両方を高度に誘導する為、上記目的に適している。
【００３８】
本発明の更なる目的は、抗体反応を増強する免疫原及びアジュバントを含有するワクチンを提供することにある。例えば、非ヒトワクチンでは、フロイントの完全アジュバント及びフロイントの不完全アジュバントの使用が好ましい。ヒトでは、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムをアジュバントとして使用することが認可されている。更に好ましくは、アジュバントには、リポソーム、ＢＣＧ、リポ多糖類、ムラミルジペプチド誘導体、スクワラン、非イオン疎水性ブロック共重合体、プルロニック（pluronic）ポリオール、酢酸ビニルエチレン、シクロデキストリン及びポリシアル酸が含まれる。
【００３９】
本発明の更なる目的は、上述した抗原成分をコードするポリ核酸を含有するワクチンを提供することにある。上記ポリ核酸には、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、または合成核酸が含まれる。
【００４０】
一実施態様では、上記ポリ核酸は、配列番号２の配列を含有する。
【００４１】
代表的にはポリ核酸ワクチンは、被験者の細胞性免疫応答を促す為に用いられる。上記タイプのワクチンの特徴部分は、ポリ核酸のワクチンでコードした抗原成分は、被験者の細胞表面で発現され、提示されるということである。これらのワクチンは、抗原が細胞内にある自然状態を模倣する為、特に、細胞内に侵入する寄生虫由来の疾病に使用することができる。
【００４２】
本発明ワクチンのポリ核酸は更に、抗原成分を有効に発現する為の配列を含有する。この様な配列は例えば、プロモーター配列を含有し得るか、または分泌シグナルをコードし得る。
【００４３】
好都合なことに、本発明のワクチンは更に、ポリ核酸を被験者に運ぶデリバリー手段を有している。上記ワクチンは更に、被験者の細胞性免疫応答を増強するアジュバントを含有し得る。
【００４４】
本発明のポリ核酸ワクチンは、二つの主な形態、即ち、裸（naked）ワクチンまたは生ワクチンのいずれかをとることが好ましい。
【００４５】
裸ワクチンの場合、上記ポリ核酸は被験者に投与された後、様々な代替手段のうちのいずれかによって標的宿主細胞に運ばれる。次いで、ポリ核酸でコードした抗原成分は、宿主細胞で発現される。
【００４６】
例えば裸ワクチンのポリ核酸は、標的宿主細胞における抗原成分の有効発現を指示する真核細胞プロモーターを運ぶことができる、プラスミドを含有し得る。このプロモーターは例えば、CMVプロモーター属またはSV40プロモーター属で構成され得る。或いは、このプロモーターは、組織特異性を有していてもよい。一実施態様では、上記プロモーターは、MyoD、ミオシンまたはミオゲニンプロモーター等の筋肉特異的プロモーターである。筋肉特異的プロモーターが重要なのは、筋肉内注射で運ばれたポリ核酸ワクチンが、筋肉細胞によって直接発現され得る為である。
【００４７】
肝臓もまた、抗原発現の標的となり得る。アルブミンプロモーター等の肝特異的プロモーターは、発現及び分泌用の抗原読取り枠で標識された分泌シグナルと共に使用することができる。
【００４８】
上記ポリ核酸は更に、抗原成分の分泌シグナルをコードする配列を含有し得、発現の間、当該成分が、宿主細胞の外表面に分泌されることを保証する。例えば分泌シグナルには、細菌発現用のmalEシグナル、昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現用ミツバチのメリチンシグナル（Sf9、Sf21）、
【００４９】
【数１】
2004520277.tif 000002
及び哺乳類細胞での発現用Ig6シグナルが含まれる。
【００５０】
裸ワクチンのポリ核酸は更に、適切なアジュバントを提供する免疫刺激配列を含有し得る。例えば上記目的の為に、メチル化していないCpG配列を使用することができる。CpG免疫刺激配列はまた、上述した完全または不完全のフロイドアジュバントの様な、一以上の他のアジュバントと組合わせても良い。
【００５１】
被験者に運ぶ為に、裸ワクチンのポリ核酸は、例えば、リポソーム小胞またはウイルス粒子で複合化され得る。一実施態様では、上記ワクチンは、皮膚または筋肉内注射によって運ばれる。更なる態様では上記ワクチンは、噴霧によって運ばれる。リポソーム及びウイルス粒子は、担体として作用する。必須プロモーターが、デリバーされたDNA配列に含まれるといった、組織特異的発現が要求される場合を除き、特別な細胞タイプは、ターゲットとされない。
【００５２】
生ワクチンの場合はまず、ポリ核酸は、適切な細菌菌株に形質転換された後、当該細菌細胞は、その細胞表面に抗原成分を発現する。次に、発現した細菌菌株を被験者に投与することにより、上記細菌は、必要なデリバリー手段を提供する。
【００５３】
上記目的に好ましい細菌菌株としては、サルモネラ、リステリア及びコリネバクテリウム（Corynebacterium）pseudotuberculosisの弱毒化されたアロ（aro）／栄養要求株が挙げられる。弱毒化した単純ヘルペス、BCG及びアデノウイルス等のウイルスベクターも使用することができる。
【００５４】
生ワクチンのポリ核酸は、細菌における抗原成分の有効発現を指示する原核細胞プロモーターを運ぶことができる、発現ベクターを含有し得る。細菌の発現に好ましいプロモーターとしては、tac、trc、BAD、T7及びPL/trpプロモーターが挙げられる。このポリ核酸は更に、細菌細胞から上記成分の分泌を促す分泌シグナルをコードすることができ、これにより、宿主免疫系に当該成分を発現することができる。分泌シグナルの例としては、malE、ompT、pelB及びファージfd遺伝子IIIタンパク質シグナルが挙げられる。
【００５５】
更なる態様では、抗原成分をコードするポリ核酸は、細菌の染色体に組込まれ得る。組込みによって安定性が改善され、発現レベルが高められると予想される。抗原の発現は代表的には、上述した遺伝子プロモーターのいずれか一つによって誘導される。或いは、例えばサルモネラ遺伝子プロモーターを使用することも可能である。上記分泌シグナルは、標的組換えワクチンベクターの重要部分であると予想される為、細菌の染色体に安定して組込まれる。
【００５６】
生ワクチンの場合、アジュバントの使用は最適であり、例えば、サルモネラが使用される。サルモネラは分泌を促し、体液性免疫及び細胞性免疫を促進する。
【００５７】
好都合なことに、上述したワクチンは、ヒト被験者への使用に適している。例えばこれらのワクチンは、上記に例示した様な、ヒトへの使用に好適なアジュバントを含有する。代表的には上記ワクチンは、生物感染に対する防御作用を有するのみならず、発熱性がなく、非炎症性で、且つ、ネクレオタイズでない（non-necreotizing）。
【００５８】
一実施態様では、本発明のワクチンは、P. ファルシパルム（falciparum）、P. オバレ（ovale）、P. ビバックス（vivax）、またはP. マラリエ（malariae）由来のヒトマラリアへの使用に適している。
【００５９】
理論による裏付けは期待されないが、本発明のワクチンは、胞子虫網寄生虫のライフサイクルにおける一以上のステージで、Pidを標的とすることができる。プラスモディウム属寄生虫の場合、上記ワクチンは例えば、哺乳動物の肝細胞または赤血球細胞へ侵入するライフサイクルのステージをターゲットとする。標的となるライフサイクルのステージは、肝臓に侵入するスポロゾイト；赤血球細胞に侵入するメロゾイト、または吸血中若しくは吸血後に蚊の消化管壁に侵入してスポロゾイトへと進化するオーキネートである。
【００６０】
ワクチン用の新たなターゲットの提供に加えて、Pidタンパク質はまた、胞子虫網由来の疾患等の感染症に対し、新しい治療法の基礎を提供するものである。
【００６１】
更に本発明の他の目的は、特異的結合アッセイで、配列番号１のアミノ酸配列を有するタンパク質に競合し得る成分を含有する治療剤を提供するものである。
【００６２】
Pidタンパク質は、例えば胞子虫網の寄生虫による細胞への侵入に重要な役割を果たしていることが認識されている。理論による裏付けは期待されないが、これは、Pidとレセプターとの相互作用によって起こると考えられている。In vitroでの特異的結合アッセイにおいてPidに競合し得る成分は、レセプター結合により、in vivoでPidに競合し得ると考えられる。従って、上記成分は、Pid−レセプターの相互作用をブロックする治療剤に組み込むことができる。
【００６３】
一実施態様では、Pidは、ターゲットレセプターまたは相互作用に関する予備知識なしに、ランダムペプチド群からファージディスプレイを組合わせ選択して使用することができる。15アミノ酸に至るランダムペプチドライブラリーが構築され、ファージ表面に提示される。次に、組換えPidタンパク質をペトリ皿に固定し、BSAでブロックして非特異的部位を塞ぐ。ファージでコードしたペプチドはその後、Pidと共にインキュベートする。上記ステップの後、非特異的結合ペプチド／ファージを洗浄し、特異的ファージを溶出して、許容細菌宿主で増幅させた後、全てのパンニング（panning）サイクルが繰返される。４〜５回の選択後、ペプチド配列を決定する。結合親和性は、指定部位突然変異誘導によって更に最適化される。次にこれらのペプチドを合成し、結合アッセイに用いる。高親和結合とは、1〜10nMの範囲の解離定数を有するペプチドと定義され得る。IC50は、競・)LISAによって決定され得る。一般には10-6〜10-7の値であれば、競合結合であると考えられている。
【００６４】
一実施態様では、Pidタンパク質の模倣品を作製し、治療剤に組込むことができると考えられる。或いは、Pidのレセプターを同定し、Pid−レセプターの相互作用の阻害剤を治療剤成分として使用することができる。
【００６５】
レセプター抗体エピトープとPid結合部位が同じであると仮定すると、Pidレセプター抗体は、Pidとの相互作用をブロックし得るので、治療剤としても有用である。
【００６６】
本発明の更なる目的によれば、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を含有する医薬として有用なタンパク質、またはその断片を提供するものである。更に本発明は、上記タンパク質または当該タンパク質の断片をコードする、医薬として有用なポリ核酸を提供するものである。
【００６７】
本発明によれば、上記ワクチン及び治療剤は共に、胞子虫網の寄生虫由来の感染症に対する治療方法に、好適に使用することができる。
【００６８】
従って、本発明の目的は、胞子虫網の寄生虫由来の疾病に対して有効な医薬を製造する為に、上述した抗原成分の有効な使用を提供することにある。上記によれば、前述した疾病に有効な医薬の製造は、配列番号１のアミノ酸配列を含有するペプチドまたはそのペプチド断片を含有するタンパク質の使用、及び／又は上述したタンパク質またはペプチド断片をコードするポリ核酸の使用を包含し得る。
【００６９】
本発明によって有効に治療し得る疾病としては、以下に示す、胞子虫網の寄生虫由来の疾病が挙げられる。アメリア属（Eimeria）、イソスポラ属（Isospora）、トキソプラスマ（Toxoplasma）、ハモンディア（Hammondia）、シストイソスポラ（Cystoisospora）、肉胞子虫属（Sarcocystis）、ベスノイチア（Besnoitia）、フレンケリア（Frenkelia）、クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）、プラスモディウム属（Plasmodium）、バベシア属（Babesia）、及びタイレリア属（Theileria）。
【００７０】
好ましくは、上記疾病は、以下より選択されるものである。マラリア、コクシジウム症、タイレリア症、クリプトポリジウム症、イソスポーラ症、ブラストシストシス（blastocystosis）、バベシア症、アナプラスマ症、サルコスポリディオシス（sarcosporidiosis）、トキソプラスマ症、及び肉胞子虫症。
【００７１】
特に本発明は、プラスモディウム寄生虫に関連のマラリア疾病を予防・治療する手段を提供するものである。例えばP. ファルシパルム（falciparum）、P. オバレ（ovale）、P. ビバックス（vivax）、及びP. マラリエ（malariae）より選択される寄生虫由来のヒトマラリアは、特に重要なターゲットとなる。
【００７２】
上記に特記した通り、Pidタンパク質は、胞子虫網の寄生虫等といった、pid座を運ぶ微生物由来の感染症における適切なマーカーを提供するものである。従って、本発明の目的の一つは、配列番号1のアミノ酸配列を有するPidタンパク質に特異的に結合し得る抗体を含有する診断剤を提供することにある。
【００７３】
本明細書によれば、上記抗体は代表的には、10-6〜10-7の範囲の結合定数を有するPidタンパク質に結合することができる。上記診断剤は好ましくは、抗体−Pid複合体を検出する手段を包含する。上記抗体は例えば、発蛍光団、放射性同位元素、マーカー酵素、またはリガンドによる標準技術を使用して標識することができる。好適な発蛍光団は、フルオロレサミン、ローダミン、Cy3、TRITC及びフィコエリトリンである。好適なマーカー酵素は、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、及び西洋ワサビペルオキシダーゼである。好適なリガンドは、ビオチン及びジゴキシゲニン（DIG）である。
【００７４】
本発明の更なる目的は、胞子虫網の寄生虫由来の疾病を診断する方法における、診断剤としての使用を提供することにある。上記診断剤は、in vitroで、被験者から採取したサンプル中のPidタンパク質の有無を検出するのに使用される。
【００７５】
患者の血清／血漿中のPid抗体の検出をベースとした、in vitroにおける感染症の診断試験には、免疫蛍光顕微鏡で補完され得るELISAまたはEIAが包含され得る。Pidを含むいずれの診断剤も、陽性対照（精製Pidタンパク質及び同起源の反応性抗体）、及び関連の標識用基質［例えば、アルカリホスファターゼ（AP）で標識した第二抗体用ｐ−ニトロフェニルリン酸（NPP）］が含まれる。
【００７６】
感染症はまた、被験者血清中のPidタンパク質に対する抗体を検出することによって同定することができる。従って、本発明の更なる目的は、上述した抗原成分を含有する診断剤を提供することにある。上記抗原成分は、被験者の血清中に存在する任意のPid抗体に結合する。上記結合は、種々の標準標識技術の一つによって検出することができる。
【００７７】
更に本発明は、胞子虫網の寄生虫由来の疾病を診断する方法における、診断剤の使用を提供するものである。
【００７８】
一実施態様では、上記診断剤の抗原成分をELISAプレートに固定し、被験者の血清と共にインキュベートする。次に、上記血清中のPidに対する抗体は、陽性対照として使用されるPidに対するモノクローナル抗体を用いた、抗原捕獲によって検出され得る。
【００７９】
他の標識及び検出法として、染色体法［AP-NPPまたはニトロテトラゾリウムブル−及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（BCIP）］、蛍光遺伝子（fluorogenic）法［例えばビオチン及びフルオロレシンで標識したストレプタヴィジン（streptavidin）］またはルミネセンス（例えばAP及びCDP-スター）が挙げられる。ELISA法またはEIA法を用いる場合には、ウエスタンブロット法または蛍光in situハイブリダイゼーションを行なうことも可能である。或る場合には、蛍光遺伝子ヌクレオチドを用いたin situ PCRで法増強することができる。
【００８０】
固定した抗原成分は、フィールド診断のスポット分析またはディップスティック（dip-stick）法によって提供される。次いで、ハプテン結合した（FITC、アルカリホスファターゼ等）、Pidに対するモノクローナル抗体を寄生虫と共にインキュベートし、蛍光顕微鏡で直接視覚化する。
【００８１】
上述した様に本発明は、配列番号１のアミノ酸配列を有するPidタンパク質に特異的に結合し得る、医薬として有用な抗体を提供するものである。
【００８２】
本発明はまた、胞子虫網の寄生虫由来の疾病を診断する診断剤を製造する為の、その様な抗体の使用を提供するものである。
【００８３】
本発明の更なる目的は、胞子虫網の寄生虫由来の疾病の診断用診断剤を製造する為の、上述した抗原成分の使用を提供することにある。
【００８４】
上述した診断剤の製造には、配列番号１のアミノ酸配列またはその断片を含有するタンパク質の使用、または、上記タンパク質またはペプチド断片をコードするポリ核酸の使用が包含され得ると評価されている。
【００８５】
代表的には診断剤は、陽性対照（精製Pidタンパク質及び同起源の反応性抗体）、及び関連の標識用基質［例えばアルカリホスファターゼ（AP）で標識した第二抗体用ｐ−ニトロフェニルリン酸（NPP）］を含むキットとして提供され得る。詳細且つ完全な参照指示マニュアル、及び計算情報は通常、上記キットの重要部分として含まれている。
【００８６】
更なる目的は、被験者の胞子虫網感染症を診断する為の、in vitroでの方法を提供することにあり、以下の工程を包含する。
【００８７】
（i）被験者から、核酸含有サンプルを得る工程；及び
（ii）サンプル中における、Pid核酸配列の特徴の存在を試験する工程。Pid核酸配列の特徴部分は、Pidタンパク質をコードする、全部または一部分の配列であっても良いし、或いは、Pidコード配列の上流または下流の核酸配列であっても良い。核酸含有サンプルに、PCR法等の増幅手段を施したものは、Pid核酸配列に特異的であるので推奨される。これは、図５に示すプライマーセットの如く、適切なプライマー類を用いることによって達成することができる。標的核酸に特異的な他のプライマーも用いることができる。
【００８８】
前述した胞子虫網由来の感染症は、上記方法によって検出することができる。ヒトへの感染の場合、プラスモディウム感染の検出は特に、マラリアの診断に重要である。これは、核酸の供給源として赤血球細胞を用いることによって達成され得る。
【００８９】
本発明によって診断することのできる、胞子虫網由来の疾患としては、上述したものが挙げられる。
【００９０】
実施例
Plasmodium（プラスモディウム）yoeliからの、pid座の単離
上述した様にプラスモディウム種のライフサイクルには、オーキネート、スポロゾイト及びメロゾイトという、三つの侵入ステージが含まれる（図１）。各ステージでは、異なる標的細胞が選択される。例えばスポロゾイトは、宿主細胞の肝細胞に選択的に侵入するのに対し、メロゾイトは赤血球細胞に侵入する。
【００９１】
一般にプラスモディウムによる侵入は主に、認識、吸着、及び侵入という、三つの段階に分けられる。侵入工程に含まれる一または一以上の因子は、究極的には同定されていない。多くの潜在的な寄生虫特異的リガンドが、細胞侵入に関与しており、指定レセプターとして様々な細胞組織が示唆されている。しかしながら、これらの研究は、現実の細胞侵入ではなく、細胞結合に焦点が向けられている（Sim, B.K.L et al, 1994; Horuk, R et al, 1993; Breton, C. B et al, 1992; and Hadley, T J et al, 1986）。
【００９２】
本発明の発明者らは、組換えアッセイ（Isberg, R.R. and S. Falkow, 1985）を用いて、P. yoeliから、E. coli K12による上皮細胞侵入に必要且つ充分な座を単離した。
【００９３】
まず、P. yoeliゲノムのコスミドクローンセグメントをE.coliに形質導入した。このクローンが、COS-7培養細胞に結合し、侵入する能力があるかをスクリーニングした。スクリーニング工程における侵入または内面化の確認は主に、ゲンタマイシンの死滅によって行なった。ゲンタマイシンは細胞を殆ど通過しない為、細胞表面に結合した細菌を排除するのに使用することができる。
【００９４】
上記スクリーニング法に基づき、幾つかの侵入クローン（‘Inv’）を単離すると、クロス−ハイブリダイズすることが分かった。上記クローンの制限酵素地図によれば、これらは相互にオーバーラップすることが分かる。
【００９５】
同定したクローンが本当に侵入するかどうか確認する為に、コスミドクローンで形質転換したE.coli K12菌株を用いて、更に侵入アッセイを行なった。上記アッセイは、E.coli K12に特異的な一次ポリクローナル抗体による間接免疫蛍光法で細菌を追跡したこと以外は、上述した様に行なった。侵入細菌による点状の蛍光が観察された。上記アッセイは、対照菌株、非形質転換のE.coli、またはプラスミド若しくはコスミドベクターで形質転換した細菌で行なっても、侵入は認められなかった。
【００９６】
上記細菌細胞は、細胞の外ではなく内部に取込まれることを証明する為に、侵入細胞を、TRITC標識ファロイジンで対比染色した。細胞侵入の中心にアクチン重合が観察され、侵入細菌は、重合アクチンフィラメントの核形成でコロキャライズされた（colocalised）。
【００９７】
更に細胞侵入の証拠を得る為に、透過型電子顕微鏡を用いて侵入培養細胞を観察した。膜結合した小腔の内部に細菌が検出された。
【００９８】
更に、細胞侵入における上記座の役割を調査する為に、侵入性クローンInvcos18を、Tn1000gdでトランスボゾンに突然変異させた（Morris, G.E et al, 1995）。
【００９９】
トランスボゾン変異体の97％が細胞侵入によって深刻なダメージを被っており、細胞侵入におけるE. coliを捕捉できなかった。
【０１００】
６個の非相補的クローン
【０１０１】
【数２】
2004520277.tif 000003
の配列解析は、６例全部において、同じ部位でのトランスボゾン挿入を示している。このことは、侵入には、挿入座が不可欠であることを示唆している。図４Aに、配列中にトランスボゾン末端位をマークしたヌクレオチド配列領域を示す。
【０１０２】
トランスボゾン挿入部位は、約567のヌクレオチドの推定読取り枠に関係する位置にある。Pid座配列は、配列番号２のアミノ酸配列に示す通りであり、図４Aのヌクレオチド607から、ヌクレオチド1172に至る。
【０１０３】
図４Bに、Pid翻訳産物のアミノ酸予測配列を示し、配列番号１とする。これは、図４Aにも示している。Pid上流部分のDNA配列を配列番号３に示し、ORF3からコードしたアミノ酸配列をを配列番号４に示す。Pid下流部分の配列を配列番号５に示す。
【０１０４】
BLASTプログラムのGenBank、EMBL、DDBJ及びPDBデータベースを用いて、pid相同配列またはPid配列を探索した。
【０１０５】
上記Pid座は、寄生虫の染色体DNAに比べ、異常に高いGC量（55％）で特徴付けられる病原性島であることが判明した。侵入座に隣接するDNA配列はATに富み、伝播性TraC／プライマーゼ座と相同性を示す（約38％）が、これは、広範な宿主域プラスミドIncN及びIncW（Valentine, C.R.I. and C.I.Kado, 1989）の接合トランスファーに不可欠である。IncWプラスミドpSaでコードした、Anatol、A. Belogurovらの非制限タンパク質Ard（タイプC）は、乱交雑プラスミドRP4のTrac1プライマーゼのタンパク質輸送ドメインと非常に類似している（Journal of Molecular Biology, (2000), 296: 969-977）。
【０１０６】
理論による裏付けの期待はないが、このことは、寄生虫ゲノムに組込まれた潜在プラスミドDNA配列の存在を示唆している。Pid座は恐らく、病原性細菌または病原性ファージ由来の始原遺伝子が水平トランスファーして獲得されたものである。
【０１０７】
相同性研究により、Pidタンパク質のアミノ酸配列は、Shigella flexneriの病原性をもたらすプラスミドpSaがosa遺伝子でコードされたOsaタンパク質の配列と同じであることが判明した。
【０１０８】
上記Pidタンパク質も、リステリア菌のinlABオペロンにおけるインターナリンB座（InlB）産物と相同性を有しており、侵入に不可欠であることが分かる（Gaillard, J.L. et al, 1991; Parida, S.K. et al, 1998）。
【０１０９】
更に本発明者らは、Pidタンパク質配列における、推定CDC42/Racの相互結合（CRIB）モチーフ：PVLSRDEASAVMLAEHVGVAを同定した。このモチーフを配列番号65に示す。上記モチーフは、N-WASP、Ste20及びMSE55等といった低分子量GTPアーゼエフェクタータンパク質と関係している。Pidタンパク質配列と、他のCRIBタンパク質の配列を並べたものを、図４Bに示す。上記配列は、BLASTプログラムによって作製した。Pidにおける、推定CRIBドメインは、インターナリンB配列と整列しない。後者と、Rho GTPアーゼエフェクタータンパク質との相同性を、BLASTP探索によって同定した。Pid相同物のアクセス番号は以下の通りである。
2004520277.tif 000004
インターナリンを除く残りは全て、CRIBドメインを有している。
【０１１０】
WASP、Ste20及びMSE55のタンパク質は、アクチン細胞骨格の再編成に有効であることが知られている（Burbelo, P.D. et al, 1999; Hall, A et al, 1998; Burbelo, P.D et al, 1998）。例えばサルモネラ菌（Salmonella typhimurium）の場合、N-WASP及びSopEと、Rho GTPアーゼCDC42及びRac1との相互作用は、食細胞以外の細胞侵入に必要である（Hardt, W.D et al, 1998; Chen, L.M. et al 1996; Susuki,T et al, 1998; Masol, P et al, 1998）。従って、pidは、グアニンヌクレオチド交換因子またはGTPアーゼ活性タンパク質となり得る。
【０１１１】
Pidの単離及び発現
Pid遺伝子は、標準クローニング技術により、適切な寄生虫から配列番号1及び2の配列情報として単離することができる。この遺伝子断片は、標準方法によって得られる。
【０１１２】
上記pid遺伝子または当該遺伝子の断片は、通常の方法によって発現され、タンパク質産物が精製される。
【０１１３】
上記方法の詳細は、Riggs, P., in Ausubel, F.M. et al (eds)「分子生化学における近代プロトコール」、John Wiley & Sons, Inc., New York, pp 16.6.1-16.6.14 (1994)を参照すれば良い。
【０１１４】
ワクチンの調製
抗体由来ワクチン
抗原成分が得られた後は、当該抗原成分含有ワクチンは、通常の方法によって製造することができる。以下の文献を参照すれば良い：
Jane L. Holley, Mike Elmore, Margaret Mauchline, Nigel Minton and Richard W. Titball.「Clostridium botulinum系F毒素に対する組換えサブユニットワクチンのクローニング、発現及び評価」、［要約］［フルテキスト］、Vaccine 19 (2-3) 288-297 (2000)
Michael Theisen et al.「ヒト抗体由来寄生虫の死滅をターゲットとする、プラスモディウムファルシパルムのグルタミン酸塩に富むタンパク質(GLURP)の主要なB細胞エピトープの同定」、Vaccine 19 (2-3) 204-212 (2000)
JH Tian, S Kumar, DC Kaslow, and LH Miller、「Plasmodium yoeliiメロゾイト表面タンパク質1の様々な領域からの、組換えタンパク質による免疫化で誘導された防御の対比」、Infect. Immun. 1997 65: 3032-3036.
Bittle, J.L., Houghten, R.A., Alexander, H., Shinnick, T.M., Sutcliffe, J.G., Lerner, R.A., Rowlands, D.J. and Brown, F. 1982、「ウイルスヌクレオチド配列から予測される化学合成ペプチドでの免疫化による、口蹄疫に対する防御」、Nature 298:30-33.
Harlow, E. & Lane, D. 1988. Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York.
Holder, A.A. and Freeman, R.R. 1981、「精製された寄生虫抗原を用いた血流段階でのげっ歯類マラリアの免疫化」、Nature, 294:361-364.
Hollingdale, M.R., Nardin, E.H., Tharavanij, S., Schwartz, A.L. and Nussenzweig, R.S. 1984、「培養細胞への、プラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）及びプラスモディウムビバックス（Plasmodium vivax）のスポロゾイトの侵入阻害、防御抗体のin vitroアッセイ」、J. Immunol. 132:909-913.
Kaslow, D.C., Quakyi, I.A., Syin, C., Raum, M.G., Keister, D.B., Coligan, J.E., McCutchan, T.F. and Miller, L.H. 1988、「EGF様ドメインを含む、ヒトマラリア生殖段階からのワクチン候補物質」、Nature 333:74-76。
【０１１５】
上記ワクチンを被験者に投与し、当該ワクチンへの応答によって産生した抗体がPidに特異的に結合するかを、標準方法によって試験する。好適な方法は、以下の参照文献に例示されている：JH Tian, S Kumar, DC Kaslow, and LH Miller、「Plasmodium yoeliiメロゾイト表面タンパク質1の様々な領域からの、組換えタンパク質による免疫化で誘導された防御の対比」、Infect. Immun. 1997 65: 3032-3036.
Harlow, E. & Lane, D. 1988. Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York.
Holder, A.A. and Freeman, R.R. 1981、「精製された寄生虫抗原を用いた血流段階でのげっ歯類マラリアの免疫化」、Nature, 294:361-364.
Hollingdale, M.R., Nardin, E.H., Tharavanij, S., Schwartz, A.L. and Nussenzweig, R.S. 1984、「培養細胞への、プラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）及びプラスモディウムビバックス（Plasmodium vivax）のスポロゾイトの侵入阻害、防御抗体のin vitroアッセイ」、J. Immunol. 132:909-913.
Kaslow, D.C., Quakyi, I.A., Syin, C., Raum, M.G., Keister, D.B., Coligan, J.E., McCutchan, T.F. and Miller, L.H. 1988、「EGF様ドメインを含む、ヒトマラリア生殖段階からのワクチン候補物質」、Nature 333:74-76.
Armando Reyna-Bello, Axel Cloeckaert, Nieves Vizcaiino, Mary I. Gonzatti, Pedro M. Aso, Geerard Dubray, and Michel S. Zygmunt、「ベネズエラにおけるウシアナプラスマ症血清学診断の為の、組換え主要表面タンパク質5を用いた酵素結合免疫吸着検定法の評価」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998 5: 259-262.
M Theisen, J Vuust, A Gottschau, S Jepsen, and B Hogh、「Escherichia coliで発現したプラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）の組換えグルタミン酸塩リッチタンパク質の抗原性及び免疫原生」、Clin Diagn. Lab. Immunol. 1995 2: 30-34。
【０１１６】
同様に上記ワクチンは、標準実験プロトコールを用い、胞子虫網の寄生虫由来の疾病に有効かどうか試験することができる。例えばこれらは、以下の参考文献を参照すればよい：JH Tian, S Kumar, DC Kaslow, and LH Miller、「Plasmodium yoeliiメロゾイト表面タンパク質1の様々な領域からの、組換えタンパク質による免疫化で誘導された防御の対比」、Infect. Immun. 1997 65: 3032-3036.
Harlow, E. & Lane, D. 1988. Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York.
Holder, A.A. and Freeman, R.R. 1981、「精製された寄生虫抗原を用いた血流段階でのげっ歯類マラリアの免疫化」、Nature, 294:361-364.
Hollingdale, M.R., Nardin, E.H., Tharavanij, S., Schwartz, A.L. and Nussenzweig, R.S. 1984、「培養細胞への、プラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）及びプラスモディウムビバックス（Plasmodium vivax）のスポロゾイトの侵入阻害、防御抗体のin vitroアッセイ」、J. Immunol. 132:909-913.
Kaslow, D.C., Quakyi, I.A., Syin, C., Raum, M.G., Keister, D.B., Coligan, J.E., McCutchan, T.F. and Miller, L.H. 1988、「EGF様ドメインを含む、ヒトマラリア生殖段階からのワクチン候補物質」、Nature 333:74-76.
Armando Reyna-Bello, Axel Cloeckaert, Nieves Vizcaiino, Mary I. Gonzatti, Pedro M. Aso, Geerard Dubray, and Michel S. Zygmunt、「ベネズエラにおけるウシアナプラスマ症血清学診断の為の、組換え主要表面タンパク質5を用いた酵素結合免疫吸着検定法の評価」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998 5: 259-262.
M Theisen, J Vuust, A Gottschau, S Jepsen, and B Hogh、「Escherichia coliで発現したプラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）の組換えグルタミン酸塩に富むタンパク質の抗原性及び免疫原生」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1995 2: 30-34。
【０１１７】
ポリ核酸ワクチン
適切なポリ核酸を同定した後、当該ポリ核酸は、通常の方法により、ワクチンに組込むことができる。これに関しては、以下の文献を参照すれば良い：（Jones, T.R. et al, 1999; Chatfield, S.N. et al, 1989;） Ricardo S. Corral and Patricia B. Petray、「トリパノソーマ（Trypanosoma）cruziの免疫化における、Th1促進アジュバントとしてのCpG DNA」、Vaccine 19 (2-3) 234-242 (2000)
K.D. Song et、「保存アイメリア（Eimeria）タンパク質をコードするDNAワクチンは、生きたアイメリアacervulinaのチャレンジに対する防御免疫を誘導する」、Vaccine 19 (2-3) 243-252 (2000)
Rong Xiang, Holger N. Lode, Ta-Hsiang Chao, J. Michael Ruehlmann, Carrie S. Dolman, Fernando Rodriguez, J. Lindsay Whitton, Willem W. Overwijk, Nicholas P. Restifo, and Ralph A. Reisfeld、「マウスメラノーマに対する、自己経口DNAワクチンの防御」、PNAS 97: 5492-5497
Martha Sedegah, Trevor R. Jones, Manjit Kaur, Richard Hedstrom, Peter Hobart, John A. Tine, and Stephen L. Hoffman、「組換えワクチンの上昇は、マラリアDNAワクチンの免疫原生及び防御効率を増加させる」、PNAS 95: 7648-7653.
Donald L. Lodmell, Nancy B. Ray and Larry C. Ewalt、「プラスミドDNAの遺伝子ガン粒子介在ワクチン接種は、狂犬病ウイルス感染に対する防御免疫を付与する」、Vaccine 16 (2-3) 115-118 (1998)
Cynthia L. Brazolot Millan, Risini Weeratna, Arthur M. Krieg, Claire-Anne Siegrist, and Heather L. Davis、「CpG DNAは、若年マウスのB型肝炎表面抗原に対する、強力なTh1体液性及び細胞性免疫応答を誘導し得る」、PNAS 95: 15553-15558.
Wendy C. Brown, D. Mark Estes, Sue Ellen Chantler, Kimberly A. Kegerreis, and Carlos E. Suarez、「Babesia bovis由来のDNA及びCpGオリゴヌクレオチドは、ウシB細胞の分泌促進剤である」、Infect. Immun. 1998 66: 5423-5432.
Zina Moldoveanu, Laurie Love-Homan, Wen Qiang Huang and Arthur M. Krieg、「インフルエンザウイルスワクチンによる全身性及び粘膜免疫の為の、新規免疫エンハンサーCpG DNA」、16(11-12)1216-1224
上記ポリ核酸ワクチンを被験者に投与し、以下の参考文献に示す標準プロトコールを用いて治療効果を試験する：JH Tian, S Kumar, DC Kaslow, and LH Miller、「Plasmodium yoeliiの様々なメロゾイト表面タンパク質1領域からの組換えタンパク質による免疫化で誘導された防御の対比」、Infect. Immun. 1997 65: 3032-3036.
Bittle, J.L., Houghten, R.A., Alexander, H., Shinnick, T.M., Sutcliffe, J.G., Lerner, R.A., Rowlands, D.J. and Brown, F. 1982、「ウイルスヌクレオチド配列から予測される化学合成ペプチドでの免疫化による、口蹄疫に対する防御」、Nature 298:30-33.
Harlow, E. & Lane, D. 1988.「抗体：実験マニュアル」、Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York.
Holder, A.A. and Freeman, R.R. 1981、「精製された寄生虫抗原を用いた血流段階でのげっ歯類マラリアの免疫化」、Nature, 294:361-364.
Hollingdale, M.R., Nardin, E.H., Tharavanij, S., Schwartz, A.L. and Nussenzweig, R.S. 1984、「培養細胞への、プラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）及びプラスモディウムビバックス（Plasmodium vivax）のスポロゾイトの侵入阻害、防御抗体のin vitroアッセイ」、J. Immunol. 132:909-913.
Kaslow, D.C., Quakyi, I.A., Syin, C., Raum, M.G., Keister, D.B., Coligan, J.E., McCutchan, T.F. and Miller, L.H. 1988、「EGF様ドメインを含む、ヒトマラリア生殖段階からのワクチン候補物質」、Nature 333:74-76.
M Theisen, J Vuust, A Gottschau, S Jepsen, and B Hogh、「Escherichia coliで発現したプラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）の組換えグルタミン酸塩リッチタンパク質の抗原性及び免疫原生」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1995 2: 30-34。
【０１１８】
治療剤の設計及び作製
Pid遺伝子を単離した後、Pidタンパク質を発現させて精製し、通常の方法によって治療剤用成分を得ることができる。
【０１１９】
上記Pidタンパク質を例えば結晶化させ、以下に記載の方法：Alex M. Aronov, Stephen Suresh, Frederick S. Buckner, Wesley C. Van Voorhis, Christophe L. M. J. Verlinde, Fred R. Opperdoes, Wim G. J. Hol, and Michael H. Gelb、「トリパノソーマ類のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼのサブミクロモル生物学的活性阻害剤の、構造ベース設計」、PNAS 96: 4273-4278によって3-D構造を決定する。
【０１２０】
上記構造は、複合化学によるPid模倣品設計用鋳型として使用することができる。以下の方法を参照すればよい：(Aronov, A.M. et al, 1999;‘Combinatorial chemistry’ (1996) Methods in Enzymology vol 267 ed. John N Abelson; Academic Press Inc. New York;) Kirk McMillan, Marc Adler, Douglas S. Auld, John J. Baldwin, Eric Blasko, Leslie J. Browne, Daniel Chelsky, David Davey, Ronald E. Dolle, Keith A. Eagen, Shawn Erickson, Richard I. Feldman, Charles B. Glaser, Cornell Mallari, Michael M. Morrissey, Michael H. J. Ohlmeyer, Gonghua Pan, John F. Parkinson, Gary B. Phillips, Mark A. Polokoff, Nolan H. Sigal, Ronald Vergona, Marc Whitlow, Tish A. Young, and James J. Devlin、「複合化学を介して発見された誘導一酸化窒素シンターゼ二量体化のアロステリック阻害剤」、PNAS 97: 1506-1511
Dustin J. Maly, Ingrid C. Choong, and Jonathan A. Ellman、「複合ターゲットをガイドするリガンドアッセンブリー：潜在サブタイプ選択的c-Src阻害剤の同定」、PNAS 97: 2419-2424.
RAP Lutzke, NA Eppens, PA Weber, RA Houghten, and RHA Plasterk、「複合化学ライブラリーの使用による、ヒト免疫不全ウイルスインテグラーゼタンパク質のヘキサペプチド阻害剤の同定」、PNAS 92: 11456-11460
NF Sepetov, V Krchnak, M Stankova, S Wade, KS Lam, and M Lebl, Library of Libraries：「ファルマコフォアモチーフの合成複合ライブラリーデザイン及びスクリーニングへのアプローチ」、PNAS 92: 5426-5430
JJ Burbaum, MHJ Ohlmeyer, JC Reader, I Henderson, LW Dillard, G Li, TL Randle, NH Sigal, D Chelsky, and JJ Baldwin、「コード化複合化学による薬物発見のパラダイム」、PNAS 92: 6027-6031
D.T. O'Hagan et al. Microparticles in MF59、「HIV-1に対する組換えタンパク質ワクチン用の潜在アジュバントのコンビネーション」、Vaccine 18(17):1793-1801 (2000)
Jing Huang and Stuart L. Schreiber、「ナノドロップレットでのタンパク質−タンパク質相互作用の小分子阻害剤選択用酵母遺伝システム」、PNAS 94: 13396-13401.
Jay Parrish, Helen Metters, Lin Chen, and Ding Xue、「第二位サプレッサーの構造ベースデザインによる、in vivoでのキー細胞死滅調節剤の相互作用の証明」、PNAS 97: 11916-11921。
【０１２１】
上記模倣品は、Harlow, E. & Lane, D. 1988. Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New Yorkに記載の方法による特異的結合アッセイで、Pidに対する競合的結合を試験すれば良い。
【０１２２】
このファーマコフォア（pharmacophores）は、QSAR（定量的な構造−活性相関）によって評価される。これらの毒性をin vivoで試験し、治療剤としての有効性を、寄生虫による感染症から受ける防御レベルで評価する。好ましいプロトコールは、以下のものを参照すれば良い：Alex M. Aronov, Stephen Suresh, Frederick S. Buckner, Wesley C. Van Voorhis, Christophe L. M. J. Verlinde, Fred R. Opperdoes, Wim G. J. Hol, and Michael H. Gelb、「トリパノソーマ類のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼのサブミクロモル生物学的活性阻害剤の、構造ベース設計」、PNAS 96: 4273-4278.
NF Sepetov, V Krchnak, M Stankova, S Wade, KS Lam, and M Lebl, Library of Libraries：「ファルマコフォアモチーフの合成複合ライブラリーデザイン及びスクリーニングへのアプローチ」、PNAS 92: 5426-5430
Bittle, J.L., Houghten, R.A., Alexander, H., Shinnick, T.M., Sutcliffe, J.G., Lerner, R.A., Rowlands, D.J. and Brown, F. 1982、「ウイルスヌクレオチド配列から予測される化学合成ペプチドでの免疫化による、口蹄疫に対する防御」、Nature 298:30-33.
Harlow, E. & Lane, D. 1988. Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York.
Holder, A.A. and Freeman, R.R. 1981、「精製された寄生虫抗原を用いた血流段階でのげっ歯類マラリアの免疫化」、Nature, 294:361-364.
Hollingdale, M.R., Nardin, E.H., Tharavanij, S., Schwartz, A.L. and Nussenzweig, R.S. 1984、「培養細胞への、プラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）及びプラスモディウムビバックス（Plasmodium vivax）のスポロゾイトの侵入阻害、防御抗体のin vitroアッセイ」、J. Immunol. 132:909-913.
Kaslow, D.C., Quakyi, I.A., Syin, C., Raum, M.G., Keister, D.B., Coligan, J.E., McCutchan, T.F. and Miller, L.H. 1988、「EGF様ドメインを含む、ヒトマラリア生殖段階からのワクチン候補物質」、Nature 333:74-76。
【０１２３】
上記治療剤は、リポソーム形態で直接注射、または酢酸ビニルエチル等の疎水性コポリマー、シクロデキストリン、ポリシアル酸、若しくは界面活性剤システムからの調節放出によって、経口投与することができる。好適な方法は、以下：（Ron, E. et al, 1993）; PNAS 90:4176-4180.に記載されている。
【０１２４】
或いは、Pidレセプターは、（Chien, C-H. et al, 1991;）; PNAS 88;9578-9582に記載の酵母ツーハイブリッドシステム等といったタンパク質−タンパク質の相互作用トラップアッセイによって同定することができる。
【０１２５】
更に、上記相互作用の阻害剤を複合化学によって同定し、通常の方法を用いて、変異体による阻害を充分に最適化させる。好ましい方法は、以下の参考文献を参照すれば良い：Kirk McMillan, Marc Adler, Douglas S. Auld, John J. Baldwin, Eric Blasko, Leslie J. Browne, Daniel Chelsky, David Davey, Ronald E. Dolle, Keith A. Eagen, Shawn Erickson, Richard I. Feldman, Charles B. Glaser, Cornell Mallari, Michael M. Morrissey, Michael H. J. Ohlmeyer, Gonghua Pan, John F. Parkinson, Gary B. Phillips, Mark A. Polokoff, Nolan H. Sigal, Ronald Vergona, Marc Whitlow, Tish A. Young, and James J. Devlin、「複合化学を介して発見された誘導一酸化窒素シンターゼ二量体化のアロステリック阻害剤」、PNAS 97: 1506-1511
Dustin J. Maly, Ingrid C. Choong, and Jonathan A、「複合ターゲットをガイドするリガンドアッセンブリー：潜在サブタイプ選択的c-Src阻害剤の同定」、PNAS 97: 2419-2424.
RAP Lutzke, NA Eppens, PA Weber, RA Houghten, and RHA Plasterk、「複合化学ライブラリーの使用による、ヒト免疫不全ウイルスインテグラーゼタンパク質のヘキサペプチド阻害剤の同定」、PNAS 92: 11456-11460.
JJ Burbaum, MHJ Ohlmeyer, JC Reader, I Henderson, LW Dillard, G Li, TL Randle, NH Sigal, D Chelsky, and JJ Baldwin、「コード化複合化学による薬物発見のパラダイム」、PNAS 92: 6027-6031
D.T. O'Hagan et al. Microparticles in MF59、「HIV-1に対する組換えタンパク質ワクチンの為の、潜在アジュバントのコンビネーション」、Vaccine 18(17):1793-1801 (2000)
Jing Huang and Stuart L. Schreiber、「ナノドロップレットでのタンパク質−タンパク質相互作用の小分子阻害剤選択用酵母遺伝システム」、PNAS 94: 13396-13401.
Jay Parrish, Helen Metters, Lin Chen, and Ding Xue、「第二位サプレッサーの構造ベースデザインによる、in vivoでのキー細胞死滅調節剤の相互作用の証明」、PNAS 97: 11916-11921。
【０１２６】
次に上記阻害剤を、レセプター吸蔵用治療剤に組込ませた後、標準方法を用いて治療効果を試験すれば良い。
Bittle, J.L., Houghten, R.A., Alexander, H., Shinnick, T.M., Sutcliffe, J.G., Lerner, R.A., Rowlands, D.J. and Brown, F. 1982、「ウイルスヌクレオチド配列から予測される化学合成ペプチドでの免疫化による、口蹄疫に対する防御」、Nature 298:30-33.
Holder, A.A. and Freeman, R.R. 1981、「精製された寄生虫抗原を用いた血流段階でのげっ歯類マラリアの免疫化」、Nature, 294:361-364.
Kaslow, D.C., Quakyi, I.A., Syin, C., Raum, M.G., Keister, D.B., Coligan, J.E., McCutchan, T.F. and Miller, L.H. 1988、「EGF様ドメインを含む、ヒトマラリア生殖段階からのワクチン候補物質」、Nature 333:74-76.
診断剤の作製及び診断方法
抗体含有診断剤
Pidタンパク質またはその断片の発現に次いで、当該タンパク質に対する抗体を産生させる方法は、当業者間で熟知されている。好ましい方法は、以下の参考文献を参照すれば良い： Bittle, J.L., Houghten, R.A., Alexander, H., Shinnick, T.M., Sutcliffe, J.G., Lerner, R.A., Rowlands, D.J. and Brown, F. 1982、「ウイルスヌクレオチド配列から予測される化学合成ペプチドでの免疫化による、口蹄疫に対する防御」、Nature 298:30-33.
Harlow, E. & Lane, D. 1988.「抗体：実験マニュアル」、Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, New York.
Holder, A.A. and Freeman, R.R. 1981、「精製された寄生虫抗原による、血流段階でのげっ歯類マラリアの免疫化」、Nature, 294:361-364.
Hollingdale, M.R., Nardin, E.H., Tharavanij, S., Schwartz, A.L. and Nussenzweig, R.S. 1984、「培養細胞への、プラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）及びプラスモディウムビバックス（Plasmodium vivax）のスポロゾイトの侵入阻害、防御抗体のin vitroアッセイ」、J. Immunol. 132:909-913.
Kaslow, D.C., Quakyi, I.A., Syin, C., Raum, M.G., Keister, D.B., Coligan, J.E., McCutchan, T.F. and Miller, L.H. 1988、「EGF様ドメインを含む、ヒトマラリア生殖段階からのワクチン候補物質」、Nature 333:74-76.
これらの抗体は、診断剤に組込むことができ、常用の方法により診断に使用することができる。読者は、以下の文献を参照することができる： Shuli Li, Gina Galvan, Fausto G. Araujo, Yasuhiro Suzuki, Jack S. Remington, and Stephen Parmley、「組換え抗原を用いた酵素結合免疫吸着検定法による、最近の後天的トキソプラズマ（Toxoplasma）gondii感染症の血清学診断」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000 7: 781-787.
Kerstin Hubert, Abel Andriantsimahavandy, Alain Michault, Matthias Frosch, and FritzA. Muuhlschlegel、「カギサナダ（Taenia solium）Cysticerciからの組換え抗原の使用による、ヒト胞虫症の血清学診断」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1999 6: 479-482.
Byoung-Kuk Na and Chul-Yong Song、「カンジダアルビカンス（Candida albicans）由来のカンディダ症診断におけるモノクローナル抗体の使用：循環アスパラチルプロテイナーゼ抗原の検出」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1999 6: 924-929.
Felix Grimm, Friedrich E. Maly, Jian Luu, and Roberto Llano、「標準酵素結合免疫吸着検定法によるエキノコックス症の血清学診断の為の、特異的免疫グロブリンGサブクラス抗体の分析」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998 5: 613-616.
Armando Reyna-Bello, Axel Cloeckaert, Nieves Vizcaiino, Mary I. Gonzatti, Pedro M. Aso, Geerard Dubray, and Michel S. Zygmunt、「ベネズエラでのウシアナプラスマ症の血清学診断への、組換え主要表面タンパク質5を用いた酵素結合免疫吸着検定法の評価」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998 5: 259-262.
Franccois Simondon, Isabelle Iteman, Marie Pierre Preziosi, Abdoulaye Yam, and Nicole Guiso、「セネガルでの百日咳の診断における、百日咳毒素及び繊維状血球凝集素の為の、免疫グロブリンG酵素結合免疫吸着検定法の評価」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998 5: 130-134.
I Bjerkas, MC Jenkins, and JP Dubey、「neosporosis診断に有用な、Neospora caninum tachyzoite抗原の同定及び特性」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1994 1: 214-221.
M Theisen, J Vuust, A Gottschau, S Jepsen, and B Hogh、「Escherichia coliで発現したプラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）の組換えグルタミン酸塩リッチタンパク質の抗原性及び免疫原生」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1995 2: 30-34.
Laurens A. H. van Pinxteren, Pernille Ravn, Else Marie Agger, John Pollock, and Peter Andersen、「二種の特異的抗原ESAT-6及びCFP10に基づく結核の診断」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000 7: 155-160.
E. E. Zijlstra, N. S. Daifalla, P. A. Kager, E. A. G. Khalil, A. M. El-Hassan, S. G. Reed, and H. W. Ghalib、「リーシュマニア（Leishmania）donovani感染症診断用のrK39酵素結合免疫吸着検定法」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998 5: 717-720。
【０１２７】
抗原含有診断剤
有効な抗原成分は、上述した方法によって得ることができる。次に上記抗原成分を診断剤に組込み、標準方法を用いて診断に使用することができる。
【０１２８】
好ましい方法は、以下の文献に記載されている： (Mills, C. D. et al, 1999;); Bull WHO 77:553-559; Felix Grimm, Friedrich E. Maly, Jian Luu, and Roberto Llano、「標準酵素結合免疫吸着検定法によるエキノコックス症の血清学診断の為の、特異的免疫グロブリンGサブクラス抗体の分析」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998 5: 613-616.
Armando Reyna-Bello, Axel Cloeckaert, Nieves Vizcaiino, Mary I. Gonzatti, Pedro M. Aso, Geerard Dubray, and Michel S. Zygmunt、「ベネズエラでのウシアナプラスマ症の血清学診断への、組換え主要表面タンパク質5を用いた酵素結合免疫吸着検定法の評価」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998 5: 259-262.
Franccois Simondon, Isabelle Iteman, Marie Pierre Preziosi, Abdoulaye Yam, and Nicole Guiso、「セネガルでの百日咳の診断における、百日咳毒素及び繊維状血球凝集素の為の、免疫グロブリンG酵素結合免疫吸着検定法の評価」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998 5: 130-134.
I Bjerkas, MC Jenkins, and JP Dubey、「neosporosis診断に有用な、Neospora caninum tachyzoite抗原の同定及び特性」、Lab. Immunol. 1994 1: 214-221.
M Theisen, J Vuust, A Gottschau, S Jepsen, and B Hogh、「Escherichia coliで発現したプラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）組換えグルタミン酸塩リッチタンパク質の抗原性及び免疫原生」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1995 2: 30-34.
Laurens A. H. van Pinxteren, Pernille Ravn, Else Marie Agger, John Pollock, and Peter Andersen、「二種の特異的抗原ESAT-6及びCFP10に基づく結核の診断」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000 7: 155-160.
E. E. Zijlstra, N. S. Daifalla, P. A. Kager, E. A. G. Khalil, A. M. El-Hassan, S. G. Reed, and H. W. Ghalib、「リーシュマニア（Leishmania）donovani感染症診断用のrK39酵素結合免疫吸着検定法」、Clin. Diagn. Lab. Immunol. 1998 5: 717-720。
【０１２９】
材料及び方法
１．P. yoeliiゲノム遺伝子のコスミドライブラリーの構築
高分子量のゲノムDNAをP. yoeliiの非同期性培養物から単離した後、Sau3Aで部分切断し、30-50kbの断片を得た。これらをウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化させ、予めBamH1で消化したコスミドベクターSuperCos1（Stratagene）に連結した。この様にして連結した混合物のアリコットをGigapack III XLのパッケージ抽出物（Stratagene）でパッケージし、XL1-Blue MR（Stratagene）に形質導入させた。アンピリシリンで選抜した組換えコスミドを集め、一回、増幅させた。
【０１３０】
２．培養COS-7細胞の侵入に対するコスミドクローンの一次スクリーニング
侵入アッセイ用として、E. coli寄生コスミドの対数期培養物を、感染多重度10でCOS-7細胞に接種した後、上述した様に重要な侵入アッセイを行なった。５時間インキュベートした後、上記細胞を充分洗浄し、250μg/mlのゲンタマイシン含有新鮮培地を加え、非侵入性細菌を死滅させた。一晩インキュベートした後、この細胞をPBSで10回洗浄した。PBS/0.05%サポニンを用い、COS-7細胞を穏やかに溶菌させることによって侵入細菌を遊離させ、LBプレート上にてアンピシリン選抜で評価した。
【０１３１】
３．免疫蛍光及び電子顕微鏡による研究
上記方法によって侵入アッセイを行なった。次に上記細胞を充分洗浄し、3.7%パラホルムアルデヒドで固定した。この細胞を室温で30分間、PBS/0.05%サポニンに浸透させ、５％脱脂粉乳PBS溶液でインキュベートした。室温で１時間経過後、上記細胞をPBSで３回洗浄し、E. coli K-12菌株C600（Dako Ltd）に対するウサギポリクローナル抗体と共にインキュベートした。上記抗体を、他のK-12菌株と交叉反応させた。２時間インキュベートした後、当該細胞をPBSで洗浄し、ウサギFITC標識IgG（Sigma）で１時間インキュベートした後、PBSで充分洗浄し、Zeiss顕微鏡で蛍光顕微鏡用に固定した。この結果を図２A（陰性対照）、及び図２B（E.coli含有侵入コスミドクローンによる感染）に示す。
【０１３２】
更に細胞を、TRITCファロイジンで対比染色し、細菌及びアクチンポリマーのコロキャリゼーション（colocalisation）を測定した。
【０１３３】
形質転換E. coliが侵入したCOS-7細胞の電子顕微鏡写真を得る為に、上述した様な侵入アッセイを行なった後、COS-7細胞をPBSで充分洗浄し、4%グルタールアルデヒドで４℃にて一晩固定した。固定細胞を細断し、四酸化オスミウムで染色した後、透過型電子顕微鏡で観察した。この結果を図２Cに示す。
【０１３４】
４．同定した侵入クローンのトランスボゾン突然変異誘導及び配列解析
Tn1000γδを用い、以下の如くマイナーな改変をした以外は上述した方法により、トランスボゾン変異変異誘導を行なった。
【０１３５】
侵入クローンInvcos11及びInvcos18を、コンピテントMH1638ドナー細胞に形質転換させた。メチシリン１ml当たり１個のコロニーを、LB/（100mg/mlアンピシリン）/（50mg/mlメチシリン）で対数期まで増殖させた。レシピエント細胞のHB101をLBで増殖させた。ドナー培養物2mlをスピン（spin）し、Falcon製チューブにて、LB15mlで再懸濁させた。4500rpmで10分間遠心した後、細胞ペレットを、レシピエントのHB101培養物1mlに再懸濁させた。この交配混合物をLB寒天平板（抗体なし）に広げ、37℃で2時間インキュベートした。
【０１３６】
上記細胞をLBブロス15mlで洗浄し、上記の様に遠心分離した。２回目の遠心後、そのペレットをLBブロス1mlで再懸濁した。このうち100mlを、100μg/mlのアンピシリン、50μg/mlのメチシリン及び100μg/mlのストレプトマイシンを添加したLBプレートで培養した。37°Cで一晩培養した後、単離したコロニー50個を採取し、LB/アンピシリン/メチシリン/ストレプトマイシン（LB/amp/meth/strep）で増殖させた後、上述した侵入アッセイに用いた。
【０１３７】
サポニン溶解COS-7細胞をLB/amp/meth/strepで培養することにより、侵入クローンを評価した。図３aに、野生型及びTn1000γδ挿入クローンを用いた挿入アッセイ後のプレート評価で得られたプレートを示す。
【０１３８】
図３ｂは、Tn1000γδ挿入クローンのTM1及びTM5を用いた侵入アッセイ後における、プレート評価の結果を示す棒グラフである。野生型のInvcos11及びInvcos18を、侵入用陽性対照として使用し、一方、LB寒天またはLB/amp寒天で増殖させた、HB101またはpMAL-p2で形質転換したXL1 Blue（New England Biolabs）を、陰性対照として作用させた。
【０１３９】
上記アッセイで同定した非補足的クローンを精製し、以下のプライマーを用いて配列決定した。
γ  CCTGAAAAGGGACCTTTGTATACTG（配列番号１３）
δ  AGGGGAACTGAGAGCTCTA        （配列番号１４）
図４Aに示す挿入領域の配列は、トランスボゾン突然変異生成からの配列アッセンブリーをコントすることによって得た。
【０１４０】
Pidへの抗原応答
方法
１．pidのサブクローニング及びPid-Myc融合タンパク質の発現
pidは、その5’末端及び3’末端を夫々、HindIII及びBgl制限部位で処理したinvcos18からのPCRアンプライマー（amplimer）として調製した。
【０１４１】
このアンプライマーを、Mycエピトープ標識含有発現ベクターpROlar A122（Clontech）中でサブクローン化させた。コロニーを、LB/カナマイシンプレートにて37℃で維持した。一晩培養したブイヨン培養物のうち50μlを用い、5mlブイヨン中に接種した後、インキュベートし、0.4-0.6OD600の培養物に、100mM IPTGを5μl、及び15%アラビノースを53μl添加した。この培養物を37℃で3時間インキュベートした。
【０１４２】
２．Pidの調製
Pidの濃度を、c-Mycモノクローナル抗体アガロースビーズ（Clontech）を用いて高めた。誘導細胞を氷冷したPBSで洗浄した後、そのペレットを、溶解（lysis）バッファー中で再懸濁し、-70℃で凍結した。次いで、このサンプルを氷で解凍し、20μlのc-Myc Mabを加えた後、軽くボルテックスし、4℃で40分間、回転プラットフォーム（rotating platform）で混合した。次いで、上記調製物を冷却したPBSで３回洗浄し、1200gで1時間、微量遠心分離した。
【０１４３】
３．患者血清
Royal Free Hospitalにマラリアで入院している８名の患者から血清を採取した。プラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）の感染及び寄生虫血症の程度を調べた。出身国も記載した。
【０１４４】
４．ウエスタンブロット法
Pid調製物の多数のレーンを、12% SDS-PAGEで分離した後、Hybond-Cへの電気泳動によるトランスファー（AmershamPharmacia）を行なった。トランスファーは、10Vにて2時間行なった（Novablot, AmershamPharmacia）。1/100倍希釈した各患者血清について、得られたブロットを検査し、ECLウエスタンブロット用試薬（AmershamPharmacia）で視覚化させた。
【０１４５】
結果
試験した８名の患者血清のうち５名に、Pid-Myc融合産物で共遊走したタンパク質バンドが認められた。一方、無関係な非プラスモディウム配列を含むpROlarで形質転換した細胞を試験しても、これらの血清には、上記分子量のバンドは認められなかった。各患者の出身国及び寄生虫血症の程度を表１に示す。
【０１４６】
結論
Pid発現を誘導したE. coli細胞調製物には、試験血清の5/8で、予測分子量を有する抗原部分の存在が見られた。患者は全て、重篤な寄生虫血症を有しており、いずれもサハラ砂漠以南のアフリカ出身者であった。プラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）に感染した患者は、Pidへの免疫応答が上昇していることから、上記データは、当該感染症を検出する為の血清学的基礎を構築することを示唆している。
【０１４７】
【表１】
2004520277.tif 000005
患者血清中のpidのPCR増幅
方法
１．pidのPCR増幅：
プラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）T9-96からのゲノムDNAを用い、以下のプライマー類で一連の（nested）PCRプロトコールを最適化させた：第一ラウンドプライマー, pfpid1, 5’ ATG CTG ATG TTG CTA CGG 3’, pfpid2, 5’ ATC TTC CTG CAT TGC TCA CGC 3’ 及び第二ラウンドプライマー, pfpid3 5’ CTT GGA ATG AGG TTG TTT G 3’ 及びpfpid4 5’ AAT CCT CGA CGC CTA ACG 3’ （図１）。第一ラウンドPCR用に最適化された反応混合物は、1×NH4Cl2ストックバッファー（Biolline, UK）、5 mM MgCl2,、1μM pfpid1、1μM pfpid2、100μM dNTP、2.5 IU Taqポリメラーゼ（Bioline, UK）である。サイクル条件は、95℃で３分間；92℃で30秒間、50℃で30秒、72℃で30秒を45サイクル；72℃で5分を１サイクルとした。第一ラウンドPCRからのアンプライマー調製物のPCR群2μlに、以下の反応混合物を加えた：1×NH4Cl2ストックバッファー（Bioline, UK）、5 mM MgCl2、1μM pfpid3、1μM pfpid4、200μM dNTP、2.5 IU Taqポリメラーゼ（Bioline, UK）。サイクル条件は、95℃で3分；92℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒を45サイクル；72℃で5分を１サイクルである。
【０１４８】
２．患者血清
Royal Free Hospitalにマラリアで入院している８名の患者の全血を集めた。新鮮な全血を3,000 gで5分間遠心分離した。血清を除去し、赤血球を-20℃で保存した。プラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）による感染及び寄生虫血症の程度を調べた。出身国も記載した。
【０１４９】
３．患者サンプルからのpidのPCR増幅
Wizard（R）ゲノムDNA精製キット（Promega, UK）の製造指針に基づき、上記赤血球ペレットからDNAを抽出した。次に、項目１のPCRアンプライマーにおける最適プロトコールによって、得られたゲノムDNA5μlを増幅した。PCRアンプライマーを、臭化エチジウム含有2%アガロースゲルで視覚化させた。
【０１５０】
４．患者サンプルからのPCRアンプライマーの配列分析
Wizard（Ｒ）PCR精製キット（Promega, UK）を用いて、予測した分子量を有するPCRアンプライマーを精製した。次に、アンプライマーをCambridge Biosciencesのシーケンス（now Cytomyx, UK）にかけた。
【０１５１】
結果
図６に、患者血清からのpidをPCR増幅した結果を示す。17/20のサンプルが陽性結果を示し、試験患者の全てに陽性結果が見られた。３名の患者では、１例のみが陰性結果であった。患者の詳細及びPCRの結果を表２に示す。
【０１５２】
最も強い結果をもたらすPCR反応からのアンプライマーであるサンプル４、５及び１０のシーケンスを行なった。PILEUP（GCG, MRC-HGMP UK）を用い、pidに対する配列の類似性を分析した。サンプル４及び５は、同じ患者から供給されたもので、３つのサンプルは全て、pidとの類似性の程度が高かった（図７）。
【０１５３】
結論
上記データは、pidが、プラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）による感染が確認された患者から増幅され、診断試験用の適切なターゲットになり得るという証拠を提供するものである。Pidとの類似性について調べたPCRアンプライマーは、相同性の程度が高いことを示しており、pidとの同一性が確認された。
【０１５４】
【表２】
2004520277.tif 000006
ヒト赤血球細胞への、pid介在侵入
方法
１．細菌細胞株
invcos18, pROLAR-pidまたはネイティブのpROLARのいずれかで形質転換されたE. coli K12菌株のXL1-Blue MRを用いた。これらの構成は上述した通りである。
【０１５５】
２．ヒト赤血球細胞（rbc）
新鮮な血液10 mlを、リチウムヘパリン含有試験管にトランスファーした。血液ドナーは、何らかの手段でマラリア風土病地域へ旅行したという経験はなく、マラリア感染も知られていなかった。上記rbcを3,000gで5分間遠心して分離し、5000gの微量遠心分離により、DMEM/10%のウシ胎仔血清（FBS）で３回洗浄した。
【０１５６】
３．侵入アッセイ
形質転換したE. coliを、5% CO2にて37℃で3時間、赤血球と共に10:1の比率（85×105細菌：8.5×105rbcs）でインキュベートした。次にこの細胞を、5000gの微量遠心分離により、DMEM/10% FBSで３回洗浄した。洗浄した細胞をDMEM/FBSで再懸濁した後、200μg/mlのゲンタマイシンを添加し、得られた沈殿物を、5% CO2にて37℃で一晩、インキュベートした。インキュベート後、上記細胞を5000gの微量遠心分離により、DMEM/10% FBSで３回洗浄した後、rbcを滅菌蒸留水で再懸濁し、溶解した。この溶解液50μlを、カナマイシン含有LB寒天平板上に広げた後、溶解物を二重培養した。
【０１５７】
24時間後のプレートを調べ、コロニーの数を、二人の観察者が別々にカウントした。
【０１５８】
結果
カウントしたコロニーを表３に示す。
【０１５９】
結論
表３に示すデータは、E. coliによるヒト赤血球細胞の侵入は、pidのみの存在によって媒介され得るが、侵入は、完全コスミドの存在によって増強され得ることを示しており、これは、侵入プロセスに関与する更なる遺伝子の存在を示唆するものである。
【０１６０】
【表３】
2004520277.tif 000007
PIDとRHO GTPアーゼとの相互反応
ヒトCdc42、Rac1及びRhoAをコードするcDNAを、下記セットよりなるプライマー類を用いたPCR法で増幅させた。Cdc42：センス（cag gaa ttc cag aca att aag tgt gtt g）；アンチセンス（cag gtc gac tta gaa tat aca gca ctt cc）；Rac1: センス（cag gaa ttc cag gcc atc aag tgt gtg）；アンチセンス（cag gtc gac cta caa cag gca ttt tct c）. RhoA：センス（cag gaa ttc gct gcc atc cgg aag aaa ctg）；アンチセンス（cag cgt cga ctc aca aga caa ggc aac c）。３つのGTPアーゼ全てをEcoRI及びSalIで消化し、活性ドメインベクターpAD-GAL4（Stratagene）で同じ部位に連結した。更にPidを増幅させ（センス: cag gga att cat gct gat gtt gct ac）；アンチセンス（cag cgt cga cct aga tct tcc tgc）、上記酵素で消化した後、結合ドメインベクターpBD-GAL4（Stratagene）に連結した。４つのライゲーション全てを、
【０１６１】
【数３】
2004520277.tif 000008
を形質転換するのに使用し、LB寒天/アンピシリンプレート上で選別した。形質転換体をインサートする為にスクリーニングした後、これらのインサートを制限酵素地図にかけ、これらが、GAL4融合ドメインに正しく配向しているかどうか調べた。各タンパク質に対する新しいプラスミド夫々、AD-Cdc42、AD-Rac1、AD-RhoA及びBD-Pidと命名した。
【０１６２】
相互作用を調べる為に、コンピテント酵母細胞YRG-2（Stratagene）中にAD-GTPアーゼの構成物を、BD-Pidで同時形質転換した。次に、これらを合成デキストロース寒天平板（SD/-His-Leu-Trp）で培養した。上記培地は、アミノ酸のロイシン（活性ドメインのGTPアーゼ構成物用に選択される）、トリプトファン（結合ドメインPid用に選択される）、及びヒスチジン（HISレセプター遺伝子用に選択される）を欠失している。30℃で3〜7日間インキュベートした後、コロニーを単離し、SD液体培地にて30℃で3日間、振盪インキュベーターにて増殖した。
【０１６３】
観察：
PidとRhOA GTPアーゼの相互作用を、アミノ酸原栄養株及びHISレポーター遺伝子の両方に基づいて評価した。しかしながら、Cdc42のみがPidと限定的に相互作用していると考えられる。
【０１６４】
PIDの細胞成分局在
多くの場合、レポータータンパク質として緑色または赤色の蛍光を発するタンパク質を用い、培養条件下での細胞を用いてタンパク質の位置を追跡することが可能である。この為にPidを、以下のプライマー類でPCR増幅した：cag gga att cat gct gat gtt gct ac（センス）及びアンチセンス（cat gct cga gat ctt cct gca ttg ctc ac）後、EcoRI及びXhoIで消化した。次に、赤色の蛍光を発するタンパク質のN末端及びインフレーム（in-frame）にて、pDsRed-N1（Clontech）のEcoRI/SalI部位に連結した。
【０１６５】
【数４】
2004520277.tif 000009
細胞由来の形質転換体を、カナマイシンLB寒天平板上で選択した。プラスミドDNAを精製し、Pid挿入の有無及び配向を、制限酵素地図により決定した。このプラスミドをpPid-DsRedで消化した。
【０１６６】
HeLa細胞（〜104細胞）を、Permanoxチャンバースライドに播種した後、5% CO2下、37℃にて、10%ウシ胎仔血清、抗真菌剤及び抗体を補充したDulbeccos改変イーグル培地（DMEM）で増殖した。約80%の集密時点で、この細胞をリンスした後、新鮮培地で1〜２時間インキュベートしてトランスフェクトした。pPid-DsRed（5 :g）を、至適iMEM培地にて、最終容積が100 :l. 10 :l リポゾーム（DOSPER, Roche）となる様に希釈した後、更に同量で希釈した。プラスミドDNA及びリポゾームの希釈液の両者を混合した後、室温で30分間インキュベートし、複合体を得た。この混合物をピペットでHeLa細胞中に移した後、6-12時間、インキュベートした。新鮮なDMEMを添加した後、更に、上記細胞を30時間インキュベートした。その後、この細胞をPBSで２回洗浄し、室温にて30分間、3.7%パラホルムアルデヒドで固定した。これらを、核対比染色用のDAPIを備えたVectashield Mounting Medium（Vector Laboratories）に固定した後、Nikon Eclipse E800蛍光顕微鏡で観察した。Bio-Rad Radiance 2100共焦顕微鏡にて、２ミクロン切片からの画像を得た。
【０１６７】
観察：
pDsRed-N1でトランスフェクトしたHeLa細胞では、シトゾル及び核の内腔の両方に、細胞全体にわたって蛍光が観察された。これに対し、pPid-DsRedでトランスフェクトした細胞では、蛍光は、（恐らく分泌性の）顆粒または周辺小胞に限定されている様であった。
【０１６８】
アクチン脱重合は、Pid形質転換細菌による細胞侵入を妨げる
前述した実験では、FITC標識抗体とTRITCファロイジンの二重染色により、細胞入口の中心に、アクチンの核生成／重合を誘導する侵入コスミドで形質転換された細菌細胞が観察された。これは、侵入プロセスにおける細胞骨格の新たな補充を示唆するものである。更にこのステップを考慮すれば、アクチンの脱重合は侵入プロセスに何らかの影響を及ぼすのではと考えられる。これに目を向けて、104 HeLa細胞をThermanoxカバーガラスに播種し、上記の様にしてDMEMにて培養した。侵入アッセイの前に、HeLa細胞をPBSで２回洗浄した後、抗体無添加の新鮮培地でインキュベートした。阻害の為に、上記細胞に、0.5-1 :g/ml濃度のシトカラシンBを加え、2〜5分後に侵入アッセイを開始した。次に、HeLa細胞培養物に、pA15-Pid（pROLar.A122中にサブクローンしたPid）、pGEX-Pid（pGEX-5X1中にサブクローンしたPid）、Incos18（野生型侵入コスミド）、In18TM1（変異コスミド）または非形質転換体HB101を、感染多重度10の比率で加えた。侵入効率をコントロールする為に、形質転換細菌を加えたパラレルアッセイでは、シトカラシンBの添加を省略した。3〜5時間後、この細胞をPBSで５回洗浄した後、200 :g/mlのゲンタマイシンを補充したDMEMでインキュベートし、インキュベーター内で一晩放置した。この細胞をPBSで５回洗浄した後、3.7%パラホルムアルデヒドで固定し、室温で30分間、PBS/0.05%サポニンで処理して透過性を高めた。これらをPBS/5%脱脂粉乳と共に、室温で1時間インキュベートした後、PBS/5%脱脂粉乳で希釈した抗E. coli抗体でインキュベートした。これらをPBSで２回リンスした後、抗ウサギIgG-FITC接合体を単独で、またはTRITC-ファロイジンと共に、再びインキュベートした。この細胞をPBSで充分洗浄した後、蛍光顕微鏡用に固定した。
【０１６９】
観察：
シトカラシンBで処理したHeLa細胞は、pA15-Pid形質転換菌またはpGEX-Pid形質転換菌による侵入には反応しなかった。Incos18形質転換細胞では、シトカラシンBで処理したHeLa細胞の周囲で（当該細胞が存在する場合には）、細菌細胞が局在していた。これは、侵入工程からのHeLa細胞に付着した細菌細胞が脱共役することを示すものである。シトカラシンBで処理していないHeLa細胞は、Incos18、pGEX-Pid及びpA15-Pidによる侵入は有効に認められたが、In18TM1またはHB101による侵入は認められなかった。
【０１７０】
クリプトスポリジウム（Cryptosporidium）に対応するPid配列
Cryptosporidium parvumの接合子嚢（オーシスト）を、Moredun Scientific Ltd, Scotlandから得た。約100,000の接合子嚢を遠心分離し、50mM Tris-HCl pH 8.0、5mM EDTA、50mM NaCl、0.5% Sarkosyl、100μg/ml proteinase Kで再懸濁した。上記細胞を、PCR機にて60℃で2時間インキュベートした。次に、この溶菌液を、フェノール−クロロホルム−イソアミルアルコールで２回抽出した。ゲノムDNAを、3M酢酸ナトリウム0.1容積及び氷冷した95%エタノール2.5容積で沈殿した。-20℃で30分間の後、DNAを13,000rpmで30分間遠心分離にかけてペレット化した後、70%エタノールで洗浄し、風乾した。このDNAペレットを、100μlの10mM Tris/1mM EDTA pH 8.0で再懸濁した。PCR用に、以下のプライマーを用いた：センス, CGA GAA TTC ATG CTA ATG TTG CTA CGG；アンチセンス, CGA AGC TTC TAG ATC TTC CTG CAT TGC。上記サイクルのパラメーターは以下の通りである：最初の変性を94℃で3分間；次いで94℃で30秒間、55℃で30秒間、68℃で1分間を30サイクル。68℃での最終エクステンションは、10分間行なった。このPCR産物をT-vector pCR2.1（Invitrogen）に結合し、組換え体からプラスミドDNAを精製し、配列を決定した。
【０１７１】
観察：
配列決定を配列番号28に示すが、これは実質的に、plasmodium yoeliからのPidヌクレオチド配列と同じである。
【０１７２】
参考文献
Aronov, A.M., Suresh, S., Buckner, F.S., van Voorhis, W.C., Verlinde, C.L.M.J., Opperdoes, F.R., Hol, W.G. and M.H. Gelb. (1999)、「トリパノソーマ類のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼのサブミクロモル生物学的活性阻害剤の、構造ベース設計」、Proc. Natl. Acad. Sci. 96 4273-4278
Breton, C.B., Blisnick, T., Jouin, H., Barale, J.C., Rabilloud, T., Langsley, G. & Da Silva, L.H.P. (1992)、「マウス赤血球へのメロゾイト侵入に必要なPlasmodium chabaudi p68セリンプロテアーゼ活性」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,9647-9651
Burbelo, P.D., Drechel, D. & Hall, A. (1995)、「Cdc42及びRac GTPアーゼの為の、多数のターゲット候補タンパク質を決定する保存結合モチーフ」、J. Biol. Chem. 270, 29071-29074
Burbelo, P.D., Snow, D.M., Bahou, W. & Spiegel, S. (1999) MSE55、「繊維芽細胞の長細胞エクステンションを誘導するCdc42エフェクタータンパク質」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 9083-9088.
Butler, D. & Maurice, J. (1997)、「アゲンダ（agenda）に対するマラリアコントロールする時間」、Nature 386,535-541.
Chatfield, S.N., Strugnell, R.A., and G. Dougan. (1989)、「外来抗原決定因子のワクチン及びキャリアとしての生きたサルモネラ」、Vaccine, 7, 495-498.
Chen, C-Y. & Kado, C.I. (1994)、「pSaのosa遺伝子によるAgrobacterium tumefaciensの発ガン能阻害」、J. Bacteriol. 176,5697-5703.
Chen, L-M., Hobbie, S. & Galan, J.E. (1996)、「サルモネラ誘導細胞骨格及び核応答へのCDC42の要請」、Science 274, 2115-2118.
Chien, C-H., Bartel, P.L., Sternglanz, R. and S. Fields. (1991)、「関心のあるタンパク質と相互反応するタンパク質遺伝子を同定し、クローンするツーハイブリッドシステムの方法」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582
Combinatorial chemistry, (1996) Methods in Enzymology vol 267 ed. John N Abelson; Academic Press Inc. New York.
Gaillard, J.-L., Berche, P., Frehel, C., Gouin, E. & Cossart, P. (1991)、「L. monocytogenesの細胞への侵入はインターナリン、グラム陽性球菌からの表面抗原を暗示するリピートタンパク質で媒介される」、Cell 65, 1127-1141.
Hadley, T.J. (1986)、「マラリア寄生虫による赤血球侵入：細胞分子概観」、Annu. Rev. Microbiol. 40,451-477.
Hall, A. (1998)、「Rho GTPアーゼ及びアクチン細胞骨格」、Science 279, 509-514.
Hardt, W-D., Chen, L-M., Schuebel, K.E., Bustelo, X.R. & Galan, J.E. (1998)、「S. typhimuriumは、宿主細胞での膜浪打ち運動及び核応答を誘導するRho GTPアーゼのアクチベーターをコードする」、Cell 93, 815-826.
Horuk, R., Chitnis, C.E., Darbonne, W.C., Colby, T.J., Rybicki, A., Hadley, T.J. & Miller, L.H. (1993)、「マラリア寄生虫プラスモディウムビバックス（Plasmodium vivax）のレセプター：赤血球ケモカインレセプター」、Science 264,1182-1184.
Isberg, R.R. & Falkow, S. (1985)、「Escherichia coli K-12による培養動物細胞の侵入を許容するYersinia pseudotuberculosisでコードした単一遺伝子座」、Nature 317, 262-264.
Jones, T.R., Obaldia, N.III, Gramsinski, R.A., Charoenvit, Y., Kolodny, N., Kitov, S., Davis, H.L., Krieg, A.M. and S.L. Hoffman. (1999)、「Aotus monkeysのペプチドマラリアワクチンの免疫原生をエンハンスするCpGモチーフ含有合成オリゴヌクレオチド」、Vaccine, 17, 3065-3071;
Lu, P-J., Zhou, X. Z., Shen, M., & Lu, K.P. (1999)、「ホスホセリンまたはホスホスレオニン結合モジュールとしてのWWドメイン機能」、Science 283,1325-1328
Massol, P., Montcourrier, P., Guillemot, J-C. & Chavrier, P. (1998)、「Fcレセプター媒介食作用は、CDC42及びRac1を必要とする」、EMBO J. 17, 6219-6229.
Mills, C. D., Burgess, D.C., Taylor, H.J. and K.C.Kain. (1999)、「プラスモディウムファルシパルム（Plasmodium falciparum）によるマラリア診断の為の、急速及び安価なディップスティックアッセイの評価」、Bull. WHO. 77, 553-559
Morris, G.E., thi Man, N., & Sedgwick, S.G. (1995)、「トランスポゾン変異誘導による組換え抗原のエピトープマッピング」、Mol. Biotech. 4, 45-54.
Parida, S.K., Domann, E., Rohde, M., Muller, S., Darji, A., Hain, T., Wehland, J. & Chakraborty, T. (1998)、「インターナリンBは、接着に必要で、リステリア菌（Listeria monocytogenes）のヒト内皮細胞への侵入を媒介する」、Mol. Microbiol. 28, 81-93.
Ron, E., Turek, T. Mathiowitz, E., Chasin, M., MichaeL, H. and R. Langer (1993)、「ポリアンヒドリドからのポリペプチドの調整放出」、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4176-4180.
Sim, B.K.L., Chitnis, C.E., Wasniowska, K., Hadley, T.J., & Miller, L.H. (1994)、「Plasmodium falciparum（プラスモディウムファルシパルム）による赤血球侵入のレセプター及びリガンドドメイン」、Science 264,1941-1944.
Sudol, M., Chen, H.I., Bougeret, C., Einbond, A. & Bork, P. (1995)、「新規なタンパク質結合モジュールWWドメインの特性」、FEBS Lett 369, 67-71.
Susuki, T., Miki, H., Takenawa, T. & Sasakawa, C. (1998)、「天然ウイスコット−アルドリッチ症候群タンパク質は、Shigella flexneriのアクチンベース運動性に関与する」、EMBO J. 17, 2767-2776.
Valentine, C.R.I. & Kado, C.I. (1989)、「グラム陰性菌Promiscuousプラスミド」(ed Thomas, C.) 125-163 (Academic Press, London,).
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
以下、本発明を、添付図面を参照しつつ、より詳細に説明する。
【図１】図１は、プラスモディウム寄生虫のライフサイクルを図説したものである。
【図２ａ】図２ａは、P. yoeli DNAのコスミドクローンで形質転換したE. coli菌株に対する、免疫蛍光侵入アッセイの結果を示すものである。
【図２ｂ】図２ｂは、P. yoeli DNAのコスミドクローンで形質転換したE. coli菌株に対する、免疫蛍光侵入アッセイの結果を示すものである。
【図２ｃ】図２ｃは、P. yoeli DNAの‘Inv’コスミドクローンで形質転換したE. coli菌株が侵入した、COS-7細胞の透過型電子顕微鏡写真を示す。
【図３】図３は、侵入アッセイの後、COS-7細胞からレスキューした野生型コスミドクローン（Invcos11WT 及びInvcos18WT）、及びTn1000γδ挿入クローン（TM1及びTM5）のプレートスコアの結果を示す棒グラフである。
【図４ａ】図４ａは、本発明によるPIDヌクレオチド配列（配列番号２）を含むヌクレオチド配列、及び対応のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。
図４の説明  Ａ．Pidの核酸及び翻訳アミノ酸配列、及び隣接した配列。上流はORF3で、pSaのosaオペロンの一部分である。pidの下流は、アンチレストリクション遺伝子のArdCの5’UTRである。トランスボゾン挿入部位を
【０１７４】
【数５】2004520277.tif 000010
で示す。ターミネーションシグナルを星印で示す。トランスボゾン挿入部位上流の配列はγプライマー、下流配列はTn1000トランスボゾンのδプライマーで得た。介在配列は、トランスボゾン挿入部位を通過するプライマー−ウオーキング（primer-walking）で得た後、野生型コスミド構成物Invcos18を含む幾つかの他のクローンを配列決定することにより証明した。
【０１７５】
【図４ｂ】図４ｂは、PIDの概略表示及び隣接する配列を示す。
図４の説明  B．pidの概要発現量、並びに上流及び下流の配列  トランスボゾンの方向を矢印で示す。推定Cdc42/Rho GTPアーゼと相互作用する配列（the CRIBドメイン）の配列番号６は印字を太くしており、Ste20/S cerevisiae（Acc # L04655）；ヒトWASP（Acc # NM000377）； Cdc42エフェクタータンパク質MSE55（Acc # XM_001058.1）；p65PAK-α/ラット（Acc # NM017198）；C09B8.7/C.elegans（cc # U29612）及びSHK1/S.pombe（Acc # AL034433）の配列と対比できる。
【０１７６】
【図５】図５は、診断アッセイ用プライマー部位を同定するPidヌクレオチド配列部分を示す。
【０１７７】
【図６】図６は、患者サンプル中のPidをPCR増幅した結果を示す。
【０１７８】
【図７】図７は、患者から増幅させたPid配列を示す。
【図１】
2004520277.tif 000011
【図５】
2004520277.tif 000012
【図８】
2004520277.tif 000013
【図９】
2004520277.tif 000014
【図１０】
2004520277.tif 000015
【国際公開パンフレット】
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2004520277.tif 000017
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【国際調査報告】
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