(57)【要約】アセトニトリルの存在下で、固体担体に対するオリゴヌクレオチド結合をアセンブルする工程と、該固体担体からオリゴヌクレオチドを切断する前に、アセトニトリルを除去する工程と、該固体担体からオリゴヌクレオチドを切断する工程と、を含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成プロセスが提供される。本プロセスは、ヌクレオチドの大規模合成に特に適する。アセトニトリルは、乾燥及び溶媒洗浄の一方又は両者によって、固体担体から除去されてもよい。好ましい洗浄溶媒は、トリアルキルアミンを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）アセトニトリルの存在下で、固体担体に対するオリゴヌクレオチドの結合をアセンブルする工程と、
（ｂ）該固体担体からオリゴヌクレオチドを切断する工程と、
を含み、該固体担体からオリゴヌクレオチドを切断する前に、オリゴヌクレオチドと固体担体との合算質量の１０ｗｔ％未満までアセトニトリルの濃度を減少させることを特徴とするホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの大規模合成プロセス。
【請求項２】
（ａ）アセトニトリルの存在下で、固体担体に対するオリゴヌクレオチドの結合をアセンブルする工程と、
（ｂ）該固体担体からオリゴヌクレオチドを切断する前に、固体担体に対するオリゴヌクレオチドの結合を１以上の溶媒洗浄を用いる洗浄方式で洗浄する工程と、
（ｃ）該固体担体からオリゴヌクレオチドを切断する工程と、
を含み、該洗浄方式の最終洗浄は、アセトニトリル又はジオキサン以外の溶媒を用いることを特徴とするホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成プロセス。
【請求項３】
前記溶媒は、芳香族炭化水素、脂肪族炭化水素、ハロアルカン、エステル、アルコール、アミド、塩基性求核性溶媒、極性エーテル、スルホキシド、水、バッファ水溶液、水と水混和性有機溶媒との混合物からなる群より選択される請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
前記溶媒は、トルエン、シクロヘキサン、ジクロロメタン、酢酸エチル、プロピオン酸メチル、プロピオン酸エチル、Ｃ１―４アルキルアルコール、ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリジノン、ピリジン、トリ（Ｃ１―４−アルキル）アミン、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、酢酸ナトリウム水溶液からなる群より選択される請求項３に記載のプロセス。
【請求項５】
（ａ）アセトニトリルの存在下で、固体担体に対するオリゴヌクレオチドの結合をアセンブルする工程と、
（ｂ）該固体担体からオリゴヌクレオチドを切断する前に、固体担体に対するオリゴヌクレオチドの結合を１以上の溶剤洗浄を用いる洗浄方式で洗浄する工程と、
（ｃ）該固体担体からオリゴヌクレオチドを切断する工程と、
を含み、洗浄方式の最終洗浄は、トリアルキルアミンを含む溶液を溶媒洗浄として用いることを特徴とするホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成プロセス。
【請求項６】
前記溶媒は、トリエチルアミンである請求項４又は５に記載のプロセス。
【請求項７】
アセトニトリルの存在下で、固体担体に対するオリゴヌクレオチドの結合をアセンブルする工程と；担持されたオリゴヌクレオチドを空気乾燥させる工程と；オリゴヌクレオチドを脱保護化するに十分な時間、乾燥した担持オリゴヌクレオチドをトリアルキルアミン、好ましくはトリエチルアミンと接触させる工程と；該固体担体からオリゴヌクレオチドを連続的に切断する工程と、を含むホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成プロセス。
【請求項８】
オリゴヌクレオチド及び固体担体の合算質量の５ｗｔ％未満、特に約１ｗｔ％未満までアセトニトリル濃度を減少させる請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
１０ｍｍｏｌ以上のオリゴヌクレオチドのバッチサイズにて行われる請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
固体担体上に担持された遊離水酸基を含むヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと、ヌクレオシドホスホロアミド又はオリゴヌクレオチドホスホロアミドとをカップリングすることを含み、該固体担体は微孔性担体であることを特徴とするオリゴヌクレオチドの調製プロセス。
【請求項１１】
前記固体担体は、アクリロイル−サルコシンメチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド及びビス−アクリロイルエチレンジアミンの共重合により調製された担体から誘導されたアミン官能基化担体である請求項１〜１０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記アミン官能基化担体は、メチルエステル基とアルキルジアミン、好ましくはエチレンジアミンとの反応により誘導された１級アミン官能基を含む請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドは、ウレタンリンカー、オキサリルリンカー、スクシニルリンカー及びアミノ誘導リンカーからなる群より選択される切断可能なリンカーを介して前記固体担体に結合されている請求項１〜１２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドは、切断試薬と接触することにより、前記固体担体から切断される請求項１〜１３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記切断試薬は、メチルアミン、メチルアミン水溶液、液化アンモニア、気体状アンモニア又は濃アンモニア水溶液を含む請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
１〜１００のインターヌクレオシド結合を有するオリゴヌクレオチドを調製するために用いられる請求項１〜１５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１７】
インターヌクレオシド結合の少なくとも５０％がホスホロチオエート化されている化合物を調製するために用いられる請求項１〜１６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１８】
前記インターヌクレオシド結合の９０〜１００％がホスホロチオエート化されている請求項１７に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
過去１５年間くらい、オリゴデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡシーケンス）、オリゴリボヌクレチド（ＲＮＡシーケンス）及びこれらの類似体の合成の開発において、非常に大きな進歩がなされている。”ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０，ＰｒｏｔｏｃｏｏｌｆｏｒＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｓ”，Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．Ｅｄ．，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９３。研究の大半は、マイクロモル又はより小さなスケールで行われており、モノマー性ホスホロアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）形成ブロックを含む自動化された固相合成（Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．，１９８１，２２，１８５９―１８６２）が最も簡便なアプローチであることが証明されている。実際、今や、市販の合成装置で、高分子量ＤＮＡシーケンス及び比較的高分子量のＲＮＡシーケンスをルーチン的に調製することができる。これらの合成オリゴヌクレオチドは、バイオロジー及びバイオテクノロジーにおいて多数の非常に重要なニーズに合致している。
【０００３】
一方、ミリグラム量は、一般に、分子生物学的目的にとって十分であり、１００グラムよりも大きいグラム量は、臨床試験にとって必要とされる。潜在的なアンチセンスドラッグ（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｄｒｕｇｓ）であるオリゴヌクレオチド類似体の幾つかは、今や、臨床試験に進んでいる。非常に近い将来に、これらのシーケンスの一つがＡＩＤＳ又は一種の癌の治療に受け入れられるようになれば、特定のシーケンスのキログラム、マルチキログラム又はより大きな単位の量が必要になるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
薬品工業において、現在関心のあるオリゴヌクレオチドの多くは、ホスホロチオエート化−インターヌクレオシド結合（ｐｈｏｈｐｈｒｏｔｈｉｏａｔｅｄ―ｉｎｔｅｒｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｌｉｎｋａｇｅ）を含む天然のオリゴヌクレオチドの類似体である。ホスホロチオエート結合が存在する場合、特にこのような結合が結合の大半をなす場合及び特にこれらがインターヌクレオシド結合の１００％をなす場合には、最終製品中の不純な非ホスホロチオエート化結合の濃度は、薬理学的に許容されるレベルを維持することが強く望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
オリゴヌクレオチドの合成にとっての非常に多数のプロトコールは、用いられる試薬に対する溶媒としてアセトニトリルを用いる。アセトニトリルは、試薬及びオリゴヌクレオチド生成物に対して不活性であり、良好な溶媒特性を有し、環境的に許容され得るので、溶媒として魅力的である。一般に、大規模合成に対しては、オリゴヌクレオチド生成物を固体担体から切断するステージ中、高濃度のアセトニトリルが存在する。これまで、アセトニトリルの目に見える不活性特性ゆえに、高濃度のアセトニトリルは大規模合成に受け入れられてきた。しかし、本発明をなすに至った研究の間に、驚くべきことに、切断ステージ中に存在するアセトニトリルの濃度を減少させることにより、より高い純度のオリゴヌクレオチドを得ることができることを知見した。
【０００６】
本発明の一側面によれば、（ａ）アセトニトリルの存在下で、固体担体に対するオリゴヌクレオチド結合（ｂｏｕｎｄ）をアセンブルするステージと、（ｂ）該固体担体からオリゴヌクレオチドを切断するステージとを含み、該オリゴヌクレオチドを該固体担体から切断する前に、アセトニトリルの濃度をオリゴヌクレオチドと固体担体の合算質量の１０ｗｔ％未満にまで減少させることを特徴とするホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの大規模合成プロセスが提供される。
【０００７】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、固相合成に関する公知の技術により、例えばＨ−フォスフォネート又は特にホスホロアミダイト化学を用いることにより、アセンブルすることができる。一般に、ホスホロアミダイトアプローチに対して、用いられているシーケンスは、固体担体に対するヌクレオシド結合、特に５’−位における固体担体に対するヌクレオシドの結合の脱保護（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）；担持されたオリゴヌクレオチド（担持オリゴヌクレオチド）を形成するための好ましくは３’−位ホスホロアミダイトヌクレオシドのカップリング；担持ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの製造のための硫化剤との反応による担持オリゴヌクレオチドの硫化；キャッピング剤による未反応担持ヌクレオシドのキャッピングである。このサイクルは、オリゴヌクレオチドの所望のシーケンスをアセンブルするに必要なだけ何度も繰り返される。混合されたホスフェート／ホスホロチオエート生成物が所望である場合には、硫化ステージを、所望の位置にホスフェート結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を製造するための酸化工程に代えてもよい。アセンブリの完了時に、及び担体からの切断の前に、一般的に、痕跡量の未反応試薬を除去するために、担持オリゴヌクレオチドをアセトニトリルで洗浄する。
【０００８】
アセトニトリルは、担持オリゴヌクレオチドを乾燥することによって、場合によっては減圧下で乾燥することによって、除去することができる。アセトニトリルは、一般に、大気温度で、例えば１５〜３０℃で除去されるが、３０〜８０℃など、例えば４０〜６０℃の昇温された温度を用いることもできる。
【０００９】
本発明の第１の側面によるプロセスは、オリゴヌクレオチドの大規模合成に用いられる。オリゴヌクレオチドの大規模合成は、しばしば、オリゴヌクレオチドの１０ｍｍｏｌ以上のバッチサイズであると考えられ、一般には１５ｍｍｏｌ以上、しばしば２５ｍｍｏｌ以上、例えば５０ｍｍｏｌを越え、特に７５ｍｍｏｌを越えるオリゴヌクレオチドのバッチサイズであると考えられる。多くの実施形態において、本発明のプロセスは、１００〜５００ｍｍｏｌの範囲の規模でのオリゴヌクレオチド合成に対して用いられる。
【００１０】
所望の生成物のアセンブリの完了時に、生成物を固体担体から切断してもよい。用いられる切断方法は、与えられた固体担体に関する当該分野で公知の方法でよい。生成物が切断可能なリンカーを介して固体担体に結合している場合には、リンカーに対して適切な切断方法が用いられる。例えば、メチルアミン、メチルアミン水溶液、液化アンモニア、気体状アンモニアとの接触、特に濃アンモニア水溶液との接触などがある。切断に続いて、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及び適切な溶媒からの沈殿の１以上など当該分野で公知の技術を用いて、生成物を精製してもよい。例えば限外濾過による生成物のさらなる処理を用いてもよい。
【００１１】
本発明によるプロセスにおいて用いられる固体担体は、用いられる溶媒に実質的に不溶性であり、オリゴヌクレオチドの固相合成の分野で周知の担体を含む。例えば、シリカ、制御されたポアガラス、ポリスチレン、ポリスチレンを含むコポリマー、例えばポリスチレン−ポリ（エチレングリコール）コポリマー、及びポリビニルアセテートなどのポリマーを挙げることができる。さらに、所望であれば、微孔性又はソフトゲル担体、特にポリ（アクリルアミド）担体、ペプチドの固相合成に対して、より一般的に用いられるものなどを用いることもできる。好ましいポリ（アクリルアミド）担体は、アミン官能性化担体、特にアクリロイル−サルコシンメチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド及びビス−アクリロイルエチレンジアミンの共重合により調製された担体から誘導されたもの、例えばカタログ名称「ＰＬ―ＤＭＡ」（ＰｏｌｙｍｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で市販されている担体などである。担体の調製の手順は、Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．；Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．；ｉｎＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｕｂｌ．，ＩＲＬＰｒｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９８４）に記載されている。このような担体上の官能基は、メチルエステルであり、これはエチレンジアミンなどのアルキルジアミンとの反応により１級アミン官能基に最初に転換される。
【００１２】
本発明の第２の側面によれば、（ａ）アセトニトリルの存在下で、固体担体に対するオリゴヌクレオチド結合をアセンブルする工程と、（ｂ）該固体担体からオリゴヌクレオチドを切断する前に、１以上の溶媒洗浄を用いる洗浄方式で該固体担体に対するオリゴヌクレオチド結合を洗浄する工程と、（ｃ）該固体担体からオリゴヌクレオチドを切断する工程と、を含み、洗浄方式の最終洗浄には、アセトニトリル又はジオキサン以外の溶媒を用いることを特徴とするホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成プロセスが提供される。
【００１３】
洗浄方式は、１以上の溶媒洗浄を用いる。洗浄方式が１回の洗浄を用いる場合、用いられる溶媒はアセトニトリル及びジオキサンを含まない。１回よりも多い溶媒洗浄が用いられる場合、アセトニトリル及びジオキサンを最終洗浄ステージ以外の洗浄ステージで用いてもよい。しかし、洗浄方式のすべてのステージにおいて、アセトニトリル及びジオキサンを用いないことが好ましい。
【００１４】
用いることができる溶媒は、溶媒が用いられる条件下でオリゴヌクレオチドを分解しない不活性溶媒であることが好ましい。用いることができる不活性溶媒の例としては、不活性有機溶媒及び不活性水系溶媒を挙げることができる。
【００１５】
好ましくは、溶媒による洗浄が効果的であり、アセトニトリルの濃度がオリゴヌクレオチドと担体の合算質量の１０ｗｔ％未満にまで減少する。
用いることができる有機溶媒は、芳香族炭化水素、例えば、トルエン；脂肪族炭化水素、例えばシクロヘキサン；ハロアルカン、特にジクロロメタン；エステル、特に酢酸エチル、プロピオン酸メチル又はプロピオン酸エチルなどのアルキルエステル；アルコール、特にＣ１―４アルキルアルコールなどの脂肪族アルコール、例えばメタノール、エタノール又はイソプロパノール；アミド、例えばジメチルホルムアミド及びＮ−メチルピロリジノン；塩基性求核性溶媒、例えばピリジン又はアルキルアミンなど、特にトリ（Ｃ１―４−アルキル）アミンなどのトリ（アルキル）アミン；テトラヒドロフランなどの極性エーテル；例えばジメチルスルホキシドなどのスルホキシドを挙げることができる。
【００１６】
用いることができる水系溶媒としては、水、バッファ水溶液、水と水混和性不活性有機溶媒の混合物、特に上述の溶媒を挙げることができる。
用いることができる固体担体は、本発明の第１の側面に関して上述した通りである。多くの実施形態において、担体がポリ（スチレン）など疎水性である場合には、有機溶媒を用いることが好ましいかもしれない。他の実施形態において、担体が制御されたポアガラス又はシリカなど親水性である場合には、水系溶媒を用いることが好ましいかもしれない。さらなる実施形態において、担体が微孔性である場合には、担体を膨潤させる溶媒を用いることが好ましいかもしれない。
【００１７】
ある好ましい実施形態において、用いられる溶媒は、オリゴヌクレオチドから保護基を取り除くように、特にインターヌクレオシド結合からβシアノエチル保護基及び核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）保護基を取り除くように作用する。好ましい溶媒は、アルキルアミン、特に、トリ（Ｃ１―４）アミンなどのトリ（アルキル）アミンであり、最も好ましくトリエチルアミンである。
【００１８】
本発明の第２の側面によるプロセスは、小規模オリゴヌクレオチド合成（すなわち＜２５ｍｍｏｌ規模）及び本発明の第１の側面に関して上述したような大規模オリゴヌクレオチド合成の両者に用いることができる。
【００１９】
本発明の第１の側面に関して上述した方法により、オリゴヌクレオチドをアセンブルして、洗浄後、固体担体から切断することができる。
本発明の第１の側面及び第２の側面の両者において、アセトニトリルの濃度は、オリゴヌクレオチド及び固体担体の合算質量の好ましくは５ｗｔ％未満、しばしば３ｗｔ％未満、特に約２ｗｔ％未満、特に約１ｗｔ％未満まで減少する。
【００２０】
本発明の特に好ましい実施形態は、アセトニトリルの存在下で固体担体に対するオリゴヌクレオチドの結合をアセンブルする工程と、担持オリゴヌクレオチドを空気乾燥する工程と、乾燥した担持オリゴヌクレオチドをトリアルキルアミン、好ましくはトリエチルアミンと、オリゴヌクレオチドを脱保護するに十分な時間にわたり接触させる工程と、続いて固体担体からオリゴヌクレオチドを切断する工程と、を含む。
【００２１】
本発明の関連する実施形態において、（ａ）アセトニトリルの存在下で、固体担体に対するオリゴヌクレオチド結合をアセンブルする工程と、（ｂ）該固体担体からオリゴヌクレオチドを切断する前に、１以上の溶媒洗浄を用いる洗浄方式で、固体担体に対するオリゴヌクレオチド結合を洗浄する工程と、（ｃ）該固体担体からオリゴヌクレオチドを切断する工程と、を含み、該洗浄方式の最終洗浄は、溶媒洗浄として、アセトニトリルを実質的に含まないアルカリアミン、好ましくはトリエチルアミンなどのトリ（Ｃ１―４）アルキルアミンを用いることを特徴とするホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成プロセスが提供される。１回以上の溶媒洗浄が用いられてもよい。いかなる溶媒洗浄においても、アセトニトリルが用いられないことが好ましい。
【００２２】
オリゴヌクレオチドが微孔性担体上で合成され担持されるホスホロアミダイト化学を用いるオリゴヌクレオチドの合成は、新規であると考えられる。したがって、本発明の第３の側面において、ヌクレオシドホスホロアミダイト又はオリゴヌクレオチドホスホロアミダイトを、固体担体上に担持された遊離水酸基を含むヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドとカップリングして、オリゴヌクレオチド亜リン酸トリエステルを形成することを含み、該固体担体が微孔性担体であることを特徴とするオリゴヌクレオチドの調製プロセスが提供される。
【００２３】
微孔性担体は、好ましくはポリ（アクリルアミド）担体であり、所望であれば、ペプチドの固相合成に関してより一般的に用いられている担体を用いることができる。好ましいポリ（アクリルアミド）担体は、アミン官能基化担体、特にアクリロイルサルコシンメチルエステル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド及びビス−アクリロイルエチレンジアミンの共重合により調製された担体から誘導されたもの、例えばカタログ名「ＰＬ―ＤＭＡ」（ＰｏｌｙｍｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で市販されているものなどである。担体の調製の手順は、Ａｔｈｅｒｔｏｎ，Ｅ．；Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．；ｉｎＳｏｌｉｄＰｈａｓｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｕｂｌ．，ＩＲＬＰｒｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ（１９８４）に記載されている。この文献中の微孔性担体は、本願明細書に参照として組み込まれる。アミン官能基化担体上の官能基は、メチルエステルであり、これはエチレンジアミンなどのアルキルジアミンとの反応によって１級アミン官能基に最初に転換される。微孔性担体は、重合性ビーズの形態で用いられることが好ましい。
【００２４】
本発明の第３の側面によるプロセスは、好ましくは、微孔性担体を膨潤させる溶媒の存在下で行われる。このような溶媒の例としては、ハロアルカン、特にジクロロメタン；エステル、特に酢酸エチル、プロピオン酸メチル、又はプロピオン酸エチルなどのアルキルエステル；テトラヒドロフランなどのエーテル；好ましくはジメチルホルムアミド及びＮ−メチルピロリジノンなどのアミドを挙げることができる。最も好ましい溶媒は、ジメチルホルムアミドである。
【００２５】
用いられるヌクレオシドホスホロアミダイト又はオリゴヌクレオチドホスホロアミダイトは、３’−ホスホロアミダイト基又は５’−ホスホロアミダイト基、最も好ましくは３’−ホスホロアミダイト基を含み得る。一般的に、ホスホロアミダイトは、βシアノエチルオキシホスホロアミダイトである。ヌクレオシドホスホロアミダイト又はオリゴヌクレオチドホスホロアミダイトは、一般的に、保護水酸基を含み、３’−位又は５’−位のいずれかにおける保護水酸基がホスホロアミダイトではない。好ましくは、５’−位における基が保護水酸基である。好ましい保護基は、ピキシル基及びトリチル基であり、特にジメトキシトリチル基である。
【００２６】
用いられる遊離水酸基を含むヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドは、３’−水酸基又は５’−水酸基を含むものでよく、一般的に、３’−位又は５’−位のいずれか遊離水酸基ではない方を介して固体担体に結合されている。最も好ましくは、遊離水酸基を含むヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドは、３’−位を介して固体担体に結合されていて、遊離５’水酸基を含む。
【００２７】
遊離水酸基を含むヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドは、一般的に、切断可能なリンカーを介して固体担体に結合されている。
ヌクレオシドホスホロアミド又はオリゴヌクレオチドホスホロアミドと、遊離水酸基を含むヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドと、のカップリングは、適切な活性化剤の存在下で起こる。このような活性化剤の例は、慣用のホスホロアミドオリゴヌクレオチド合成に関して当該分野で公知の活性化剤であり、テトラゾール、チオエチルテトラゾール、ニトロフェニルテトラゾール及びジシアノイミダゾールを挙げることができる。一般的に、ヌクレオシドホスホロアミド又はオリゴヌクレオチドホスホロアミドは、微孔性担体を膨潤させるために用いられる溶媒中の溶液として用いられる。微孔性担体を膨潤させるために用いられる溶媒中の溶液として活性化剤の添加の前に、ホスホロアミド溶液と遊離水酸基を含む膨潤された担体とを混合することが有利である。
【００２８】
本発明の第３の側面のプロセスにおいて製造された亜リン酸オリゴヌクレオチドトリエステルは、一般的に、酸化又は硫化されて、リン酸オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドホスホロチオエートを形成する。用いられる酸化剤は、慣用のホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド合成に関して当該分野で公知の酸化剤であり、ヨーダイド、及びｔ−ブチルヒドロペルオキシドを挙げることができる。用いられる硫化剤は、慣用のホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド合成に関して当該分野で公知の硫化剤であり、キサンタンヒドライド（ｘａｎｔｈａｎｅｈｙｄｒｉｄｅ）、フェニルアセチルジサルファイド及びＢｅａｕｃａｇｅ試薬を挙げることができる。酸化剤又は硫化剤は、一般的に、微孔性担体を膨潤させるために用いられる溶媒中の溶液として用いられる。
【００２９】
当該分野において公知のキャッピング剤、例えばピリジン及び無水酢酸の混合物やピリジン及びＮ−メチルイミダゾールの混合物を用いるキャッピング処理を用いてもよい。キャッピング剤は、微孔性担体を膨潤させるために用いられる溶媒の存在下で用いられることが有利である。
【００３０】
固体担体に結合しているリン酸オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドホスホロチオエート中に、一般的に５’−位にて存在しているピキシル保護基又はトリチル保護基は、慣用の脱トリチル化技術、例えばジクロロ酢酸溶液での処理により除去することができる。好ましくは、ジクロロ酢酸は、例えばジクロロメタン又は有利にはアミド、特にジメチルホルムアミド又はＮ−メチルピロリジノンなど微孔性担体を膨潤させるために用いられる溶媒中の溶液として用いられる。ピキシル保護基又はトリチル保護基の除去は、さらなるカップリングの為に用いることができる遊離水酸基を生成させる。さらなるカップリングは、所望のシーケンスをアセンブルするために行うことができる。所望のシーケンスのアセンブリの完了時に、用いられたリンカーに対する適切な技術を用いて固体担体から生成物を切断することができる。
【００３１】
本発明によるプロセスは、ホスホロチオエート化されたデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを合成するために用いることができる。ヌクレオチドは、ヌクレオチド分野で公知の塩基、保護基及び他の修飾を含むものでもよい。例えば、存在してもよい塩基としては、プリン及びピリミジン、一般的にＡ、Ｇ、Ｔ、Ｃ及びＵを挙げることができる。存在してもよい他の塩基としては、ヒポキサンチン、イノシン及び２，６−ジアミノプリンを挙げることができる。存在してもよい保護基としては、ベンジル基、アセチル基、フェノキシアセチル基及びイソブチリル基などの塩基保護基や、ピキシル基、トリチル基、特にジメトキシトリチル基などのヒドロキシ保護基を挙げることができる。リブヌクレオチドは、２’−位にてメトキシ置換基又はメトキシエトキシ置換基などのアルコキシ置換基又はアルコキシアルキル置換基により修飾されていてもよく、あるいは２’−位にてターシャリブチルジメチルシリル、１−（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル（Ｆｐｍｐ）又は１−（２−クロロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル（Ｃｐｍｐ）などのヒドロキシ保護基により保護されていてもよい。逆位ヌクレオシド（ｉｎｖｅｒｔｅｄｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）、脱塩基ヌクレオシド（ａｂａｓｉｃｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ）及びＬ−ヌクレオシドを含む修飾剤が存在していてもよい。デオキシリボヌクレオチドは、２’−位で、２’−Ｃ−アルキル基により修飾されていてもよい。混合したデオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチド、及び／又は混合したリン酸ヌクレオチド／ホスホロチオエートヌクレオチドを含むキメラヌクレオチドを調製してもよい。
【００３２】
多くの実施形態において、本発明のプロセスを用いて、１〜１００のインターヌクレオシド結合、しばしば５〜７５のインターヌクレオシド結合、好ましくは８〜５０及び特に好ましくは１０〜３０のインターヌクレオシド結合を有するオリゴヌクレオチドを調製する。一般的に、本発明のプロセスは、インターヌクレオシド結合の少なくとも５０％がホスホチオエート化されている化合物、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは９０〜１００％がホスホチオエート化されている化合物を調製するために用いられる。
【００３３】
本発明のプロセスにおいて用いることができる切断可能なリンカーの例としては、オリゴヌクレオチドの固相合成の分野で周知のリンカー、例えばウレタンリンカー、オキサリルリンカー、スクシニルリンカー及びアミノ誘導リンカーなどを挙げることができる。スクシニルリンカーが好ましい。
【００３４】
さて、以下の実施例により本発明を制限することなく説明する。
［実施例１〜３及び比較例Ａ］
標準的なホスホロアミダイト化学を用いて、１７個のホスホロチオエート基を含む完全にホスホロチオエート化されたデオキシリボヌクレオチドのサンプルを調製した。生成物をポリスチレン担体上にトリチル−オン（ｔｒｉｔｙｌ―ｏｎ）で製造した。アセンブリ及び硫化の完了後に、担持ヌクレオチドをアセトニトリルで洗浄した。
【００３５】
担持オリゴヌクレオチドの３種のサンプルを以下のように処理した。実施例１として、担持オリゴヌクレオチドを濾過漏斗上で空気乾燥させた。実施例２として、サンプルをトリエチルアミンで洗浄した。実施例３として、サンプルを２．５Ｍ酢酸ナトリウム水溶液で洗浄した。実施例２及び実施例３の各々において、洗浄は、わずかに減圧した状態であるが、アセトニトリルの蒸発を最小にするような圧力下で濾過漏斗上で行った。サンプル中のアセトニトリル含量（％ｗ／ｗ）はＧＣによって測定した。濃アンモニア水を用いる標準的なアンモノリシス条件を用いて、実施例１〜３の生成物を切断して、オリゴヌクレオチド生成物を得た。比較例Ａとして、担持オリゴヌクレオチドのさらに別のサンプルを同じ条件下で、しかし乾燥又は洗浄処理を行わずに切断した。各場合において、イオン交換クロマトグラフィーを用いて、サンプル中のＰ＝Ｏ不純物の重量パーセンテージを決定した。結果を下記Ｔａｂｌｅ１に示す。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
Ｔａｂｌｅ１に示す結果は、本発明のプロセスにより製造されたオリゴヌクレオチド（実施例１〜３）が、切断の前にアセトニトリルの濃度を減少させなかった比較プロセスよりも、オリゴヌクレオチド生成物の純度を大幅に増加させたことを示す。
【００３８】
［実施例４−微孔性担体を用いるオリゴヌクレオチドの合成］
以下の反応は、窒素雰囲気下で行った。
商標「ＰＬ―ＤＭＡ」としてＰｏｌｙｍｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したアミン官能基化ポリ（アクリルアミド）樹脂（装填１ｍｍｏｌ／ｇ）を含むペプチド合成に一般的に用いられるタイプの４０ｍｌ固相ガラス焼結／バブラー反応器に、５’−ＤＭＴ−Ｔ−３’−サクシネートの３当量を添加した。十分なＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）を添加して、窒素撹拌に移る直前に樹脂を作り、４当量のジイソプロピリカルボジイミド及び３当量のジイソプロピルエチルアミンを添加した。Ｋａｉｓｅｒテストにより示されるように樹脂の装填が完了するまで、混合物を窒素で撹拌した。樹脂をＮＭＰ（５×床容積）及びジクロロメタン（ＤＣＭ、５×床容積）で洗浄した。ＤＣＭ湿潤樹脂に１０当量のピロールを添加して、ＤＣＭ（２×床容積）中の１５％ｖ／ｖ酢酸ジクロロ（ＤＣＡ）溶液を添加した。混合物を窒素で１時間撹拌し、次いでＤＣＭ（５×床容積）及びＮＭＰ（５×床容積）で洗浄して、５’―脱保護３’−担持Ｔを形成した。
【００３９】
３当量の５’−ＤＭＴ−Ｔ−３’−（βシアノエチルオキシジイソプロピルアミノ）ホスホロアミドを上記で調製した担持Ｔに添加した。十分なＮＭＰを添加して、窒素撹拌に移る直前に樹脂を作り、３．３当量のＳ−エチルテトラゾールを添加した。混合物を窒素で３０分間撹拌し、次いでＮＭＰ（１０×床容積）で洗浄した。Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬（５当量）を用いて、６０分間、十分なＮＭＰの存在下で硫化を達成し、窒素撹拌に移る直前に樹脂を作った。樹脂をＮＭＰ（５×床容積）及びＤＣＭ（５×床容積）で洗浄し、５’−ＤＭＴ保護担持ダイマーホスホロチオエートを形成した。脱トリチル化、カップリング及び硫化サイクルをさらに２回繰り返して、５’−ＤＭＴ担持テトラマーホスホロチオエートを形成した。これを上記条件を用いて脱トリチル化した。固体担体からの切断、及びβシアノエチル基の除去は、室温で、４８時間、濃アンモニア水で処理して達成した。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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