(57)【要約】本発明は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的に修飾されたゲノム配列と、この配列に向けられた腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子のシトシンメチル化状態を検出するオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマーと、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータを確認する方法とに関する。さらに、本発明は、シトシンメチル化パターンが腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断及び／又は治療に特に適していることを見出したことによるものである。【選択図】図１
2004507214.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号５３６のグループから取り出した配列の一つ及びこれの相補配列に従った、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡのセグメントの少なくとも１８塩基の長さである配列を含む核酸。
【請求項２】
遺伝子ＢＲＣＡ２（Ｕ４３７４６）、Ｅ２Ｆ１（Ｍ９６５７７）、ＥＬＥ１（Ｘ７１４１３）、ＭＮ／ＣＡ９（Ｚ５４３４９）、ＰＶＴ１（Ｍ２６７１４）、ＳＡＣ２（ＡＫ００１７２５）、ＴＥＭ８（ＡＫ０２５４２９）、ＴＭ４ＳＦ１（Ｘ０１３９４）、ＴＮＦＳＦ１１（ＡＦ０５３７１２）、ＡＸＬ（ＮＭ＿０２１９１３＆ＮＭ＿００１６９９）、ＣＣＮＤ３（ＮＭ＿００１７６０）、ＣＳＦＩＲ（ＮＭ＿００５２１１）、ＭＧＭＴ（ＮＭ＿００２４１２）、ＮＯＶ（ＮＭ＿００２５１４）、ＳＦＲＳ８（ＮＭ＿００４５９２）、ＴＮＦＲＳＦ６（ＮＭ＿００００４３）、ＴＰＤ５２（ＮＭ＿００５０７９）、ＡＫＴ１（ＮＭ＿００５１６３）、ＢＣＬ２（ＮＭ＿０００６３３＆ＮＭ＿０００６５７）、ＣＢＬ（ＮＭ＿００５１８８）、ＣＢＬＣ（ＮＭ＿０１２１１６）、ＣＲＫ（ＮＭ＿００５２０６＆ＮＭ＿０１６８２３）、ＤＣＣ（ＮＭ＿００５２１５）、ＥＰＨＡ１（ＮＭ＿００５２３２）、ＥＰＨＡ３（ＮＭ＿００５２３３）、ＥＴＳ１（ＮＭ＿００５２３８）、ＥＴＶ５（ＮＭ＿００４４５４）、ＥＴＶ６（ＮＭ＿００１９８７）、ＦＧＦ３（ＮＭ＿００５２４７）、ＦＧＦ４（ＮＭ＿００２００７）、ＦＨＩＴ（ＮＭ＿００２０１２）、ＧＬＴＳＣＲ１（ＮＭ　０１５７１１）、ＧＰＳ１（ＮＭ＿００４１２７）、ＧＲＯＳ１（ＮＭ＿０２２３５６）、ＨＩＣ１（ＮＭ＿００６４９７）、ＩＧＦＢＰ７（ＮＭ＿００１５５３）、ＫＩＳＳ１（ＮＭ＿００２２５６）、ＫＲＡＳ２（ＮＭ＿００４９８５）、ＬＡＴＳ１（ＮＭ＿００４６９０）、ＬＯＣ５１２１３（ＮＭ＿０１６３８３）、ＭＵＣ１（ＮＭ＿００２４５６）、ＭＵＣ２（ＮＭ＿００２４５７）、Ｎ３３（ＮＭ＿００６７６５）、ＰＴＴＧ１ＩＰ（ＮＭ＿００４３３９）、ＳＥ２０＿４（ＮＭ＿０２２１１７）、ＳＥ７０＿２（ＮＭ＿０２２１１８）、ＳＦＮ（ＮＭ＿００６１４２）、ＳＴ７（ＮＭ＿０１３４３７）、ＳＵＰＴ３Ｈ（ＮＭ＿００３５９９）、ＳＵＰＴ６Ｈ（ＮＭ＿００３１７０）、ＴＥＭ１（ＮＭ＿０２０４０４）、ＴＥＲＴ（ＮＭ＿００３２１９）、ＴＨＲＢ（ＮＭ＿０００４６１）、ＴＩＭＰ２（ＮＭ＿００３２５５）、ＴＭＥＦＦ１（ＮＭ＿００３６９２）、ＴＮＦＡＩＰ６（ＮＭ＿００７１１５）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ（ＮＭ＿００３８４４）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＮＭ＿００３８４２）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ（ＮＭ＿００３８４１）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ（ＮＭ＿００３８４０）、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＮＭ＿００１０６５）、ＴＮＦＳＦ１２（ＮＭ＿００３８０９）、ＴＮＦＳＦ１３（ＮＭ＿００３８０８）、ＴＮＦＳＦ１５（ＮＭ＿００５１１８）、ＴＮＦＳＦ１８（ＮＭ＿００５０９２）、ＴＰ６３（ＮＭ＿００３７２２）、ＴＳＳＣ１（ＮＭ＿００３３１０）、ＶＤＲ（ＮＭ＿０００３７６）、ＹＥＳ１（ＮＭ＿００５４３３）、ＦＯＸＧ１Ａ（ＮＭ＿００４４７１）、ＧＲＦ２（ＮＭ＿００５３１２）、ＨＳＰＣ０７０（ＮＭ＿０１４１６０）、ＲＡＢ３Ａ（ＮＭ＿００２８６６）、ＲＡＢ５Ａ（ＮＭ＿００４１６２）、ＡＰＣ（ＮＭ＿００００３８）、ＢＭＩ１（ＮＭ＿００５１８０）、ＣＨＥＳ１（ＮＭ＿００５１９７）、ＳＭＴ３Ｈ１（ＮＭ＿００６９３６）、ＴＩＡＭ１（ＮＭ＿００３２５３）、ＶＡＶ１（ＮＭ＿００５４２８）、ＭＣＦ２（ＮＭ＿００５３６９）、ＭＳＨ２（ＮＭ＿０００２５１）、ＥＲＢＢ４（ＮＭ＿００５２３５）、ＦＯＸＧ１Ｂ（ＮＭ＿００５２４９）、ＴＡＣＳＴＤ１（ＮＭ＿００２３５４）、ＴＲＡ１（ＮＭ＿００３２９９）、ＦＯＸＧ１Ｂ（ＮＭ＿００５２４９）、ＴＡＣＳＴＤ１（ＮＭ＿００２３５４）、ＦＬＩ１（ＮＭ＿００２０１７）のいずれか一つの遺伝子に従った配列の一つ及びこれの相補配列に従った、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡのセグメントの少なくとも１８塩基の長さである配列を含む核酸。
【請求項３】
オリゴマー、特にオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマーであって、配列ＩＤ番号１乃至５３６の一つに従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡ又はこれの相補配列とハイブリッド形成する又は同一である、少なくとも九個のヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列をいずれの場合でも含むオリゴマー。
【請求項４】
塩基配列が少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチドを含む、請求項３記載のオリゴマー。
【請求項５】
ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが、オリゴマーの三分の一のほぼ中央に位置することを特徴とする、請求項４記載のオリゴマー。
【請求項６】
請求項３乃至５のいずれか一項に記載の少なくとも二つのオリゴマを含む、オリゴマーのセット（ｓｅｔ）。
【請求項７】
配列ＩＤ番号１乃至５３６に従った又は請求項２に記載の遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡに従った配列の一つとこれの相補配列からのすべてのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を検出するオリゴマーを含む、請求項６記載のオリゴマーのセット（ｓｅｔ）。
【請求項８】
配列ＩＤ１乃至配列ＩＤ５３６の一つのＤＮＡ配列及びこれの相補配列、及び／又は請求項２に記載の遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡの配列、及びこれの相補配列、又はそのセグメントの増殖のためのプライマーオリゴヌクレオチドとして使用することが可能な、請求項３記載の少なくとも二つのオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）。
【請求項９】
少なくとも一つのオリゴヌクレオチドが固相に固定されていることを特徴とする、請求項８記載のオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）。
【請求項１０】
請求項１記載の化学的前処理されたゲノムＤＮＡ及び／又は請求項２に記載の遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡにおけるシトシンメチル化状態及び／又は単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出するための、オリゴマープローブのセット（ｓｅｔ）。
【請求項１１】
配列ＩＤ１乃至配列ＩＤ５３６の一つ及びこれの相補配列及び／又は請求項２記載の遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態に関連する疾患を分析する、キャリヤー材料に固定された様々なオリゴマーの配置（アレイ）を製造する方法であって、請求項３乃至５のいずれか一項に記載の少なくとも一つのオリゴマーが固相に結合されている方法。
【請求項１２】
請求項１１により得ることが可能な、様々なオリゴマーの配置（アレイ）。
【請求項１３】
長方格子又は六方格子の形態で平坦な固相上に配置されることを特徴とする、請求項１２記載の様々なオリゴヌクレオチド−及び／又はＰＮＡ−オリゴマーのアレイ。
【請求項１４】
固相表面が、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成されることを特徴とする、請求項１２又は１３記載のアレイ。
【請求項１５】
前記請求項のいずれか一項に記載の少なくとも一つの核酸を含む、遺伝子のメチル化状態に関連する疾患を分析するＤＮＡ−及び／又はＰＮＡ−アレイ。
【請求項１６】
シトシンメチル化を分析することで、既存の疾患或いは特定の疾患の素因に関する診断及び／又は治療のための遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータを確認する方法であって、
ａ）ゲノムＤＮＡ試料において、５位置においてメチル化されていないシトシン塩基を、化学処理によって、ウラシル又はハイブリッド形成行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換するステップと、
ｂ）化学的前処理されたゲノムＤＮＡの断片が、請求項８又は９記載のプライマーオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）及びポリメラーゼを使用して増幅され、増幅物が検出可能な標識を運ぶステップと、
ｃ）増幅物が、請求項６又は７記載のオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡプローブのセット（ｓｅｔ）、或いは請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載のアレイとハイブリッド形成するステップと、
ｄ）ハイブリッド形成された増幅物が、その後、検出されるステップと、
が実行されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
化学的処理が、重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、又は二亜流酸塩の水溶液を用いて実行されることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
１００乃至２０００塩基対の長さを有する１０より多くのの異なる断片が増幅されることを特徴とする、請求項１６又は１７の一方に記載の方法。
【請求項１９】
いくつかのＤＮＡセグメントの増幅が、一つの反応槽において実行されることを特徴とする、請求項１６乃至１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ポリメラーゼが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、請求項１６乃至１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を用いて実行されることを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
増幅の標識が、蛍光標識であることを特徴とする、請求項１６乃至２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
増幅の標識が、放射性核種であることを特徴とする、請求項１６乃至２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
増幅の標識が、質量分析計において検出される通常の質量を有する分離可能な分子断片であることを特徴とする、請求項１６乃至２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
増幅物又は増幅物の断片が、質量分析計において検出されることを特徴とする、請求項１６乃至２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
生成された断片が、質量分析計での検出可能性を高めるために、単一の正又は負の実効電荷を有することを特徴とする、請求項２４又は２５の一方に記載の方法。
【請求項２７】
検出が、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）を用いて、或いは電子スプレ質量分析法（ＥＳＩ）を使用して、実行及び視覚化されることを特徴とする、請求項２４乃至２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ゲノムＤＮＡが、ＤＮＡを含む細胞又は細胞構成要素から得られ、ＤＮＡのソースが例えば、細胞系と、バイオプシーと、血液と、唾液と、大便と、尿と、脳脊髄液と、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房、又は肝臓からの組織等のパラフィンに埋め込まれた組織と、ヒストロジックオブジェクトスライド（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ　ｏｂｊｅｃｔ　ｓｌｉｄｅｓ）と、又はこれらにおいて可能なあらゆる組み合わせとを含むことを特徴とする、請求項１６乃至２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）　（＝二亜流酸塩、亜硫酸水素塩）試薬と、請求項３乃至５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマーを含むキット。
【請求項３０】
充実性腫瘍と、癌との診断のための、請求項１に記載の核酸と、請求項３乃至５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はＰＮＡ−オリゴマーと、請求項２９に記載のキットと、請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載のアレイと、請求項６乃至９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）との使用。
【請求項３１】
充実性腫瘍と、癌との治療のための、請求項１に記載の核酸と、請求項３乃至５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はＰＮＡ−オリゴマーと、請求項２９記載のキットと、請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載のアレイと、請求項６乃至９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセットとの使用。
【請求項３２】
重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）　（＝二亜流酸塩、亜硫酸水素塩）試薬と、請求項３乃至５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマーを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
分子生物学における近年の方法論の発展を受けて、遺伝子自体と、こうした遺伝子のＲＮＡへの転換と、結果として生じるタンパク質との観察（治療）レベルにおいて広く研究が行われてきた。個体の成長過程のどの時点においてどの遺伝子のスイッチが入るかという問題、及び特定の細胞及び組織内の特定の遺伝子の活性化及び抑制がどのように制御されるかという問題は、遺伝子又はゲノムのメチル化の程度及び特徴と相関させることができる。この点において、発病条件は、個別の遺伝子又はゲノムの変化したメチル化パターンに現れる可能性がある。
本発明は、核酸と、オリゴヌクレオチドと、ＰＮＡオリゴマーとに関し、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子及び特にそのメチル化状態に関連する遺伝子の遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータとのつながりを有する疾患の診断及び／又は治療のための方法に関する。
【従来の技術】
【０００２】
ガン患者の治療及び診断の代替方法の発達が望まれている。現行の方法である、放射性治療、化学療法などは多くの場合に好ましくない副作用を伴い、ガンの多くの形では無効である。
【０００３】
ガンの遺伝的特質は、多数の優性である形質転換された状態（腫瘍遺伝子）の正の調節因子と同様に、多数の劣勢である（腫瘍抑制遺伝子）負の調節因子を含んでおり、複雑である。およそ１００の腫瘍遺伝子が同定されている。腫瘍遺伝子はいくつかのグループに分類されており、膜内外タンパク質から転写因子の範囲での活性の異なるタイプを表している。およそ１０の腫瘍抑制遺伝子が現在では知られている。腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子または細胞成長に通常のある制約を加えている遺伝子の機能の損失、すなわち、それらの制約の解放は、腫瘍化につながる。遺伝子上の異型（ヘテロ）接合性の損害又は自然（突然）変異に加えて、さらなる腫瘍形成を導く機構の可能性がある。遺伝子のはエピジェネティクスパラメータ誤調節は腫瘍形成をもたらすことがが確認されている。最も特徴的なはエピジェネティクスパラメータは、シトシンのＣ５位置の共有結合修飾である、遺伝子のメチル化である。ガンのメチル化異常は単位突然変異、グローバルハイポメチレーション（ｇｌｏｂａｌ　ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、個々の遺伝子のハイポメチレーション（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、ＣｐＧ島のハイパーアメチレーション（ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）又は刷り込みの失敗（ｌｏｓｓ）が含まれている。
【０００４】
ＣｐＧ島での突然変異の高い割合はガンを引き起こす可能性がある。メチル化シトシン塩基は自然に脱アミノ反応によりウラシルなることがある。ミスマッチの修復はそのうえＤＮＡ−ＭＴａｓｅにより阻害され、シトシンからチアミジン（ｔｈｉａｍｉｄｉｎｅ）トランジションが起こる可能性がる。この好適な例として、Ｐ５３遺伝子がある。この遺伝子の突然変異は、すべての腫瘍の５０％以上で存在し、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンからのチミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）トランジションの推定値は２４％である。
【０００５】
広範囲メチル化の低レベル化は、腫瘍の多くの形成において一般的である。個々の遺伝のハイポメチレーション（ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）もまた認められている。
メチル化と細胞増殖の逆相関はｂｃ１−２遺伝子（リンパ性白血病）と肺と結腸腫瘍のＫ−ｒａｓ　ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｅで認められる。
【０００６】
ｐ１６遺伝子は重要な腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子の調節遺伝子である。ｐ１６タンパク質は、Ｇ１／Ｓ境界で細胞周期の進行を停止させ、ｐ１６作用の欠如は、無秩序な細胞増殖を可能にすることで癌の進行につながる場合がある。高メチル化が仲介するｐ１６遺伝子の不活性化は、脳腫瘍と、乳癌と、結腸癌と、頭部及び頚部癌と、非小細胞肺ガンと、高度非ホジキンリンパ腫において実証されている。
【０００７】
腫瘍形成におけるメチル化の役割は、ＳｉｇｎａｌとＧｉｎｄｅｒの’ＤＮＡ　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ’Ｂｌｏｏｄ，　Ｖｏｌ．９３　Ｎｏ．　１２　（Ｊｕｎｅ　１５），　１９９９：ｐｐ．４０５９−４０７０；において概説されている。さらに腫瘍遺伝子に関連するメチル化の例には、以下が含まれている。
【０００８】
頭部及び頚部癌。Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｃｅｓｐｅｄｅｓ　Ｍ　ら、”Ｇｅｎｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｈｙｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｕｍｏｕｒｓ　ａｎｄ　ｓｅｒｕｍ　ｏｆ　ｈｅａｄ　ａｎｄ　ｎｅｃｋ　ｃａｎｃｅｒ　ｐａｔｉｅｎｔｓ”Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．２０００　Ｆｅｂ．１５；６０（４）：８９２−５
ホジキン病（悪性リンパ腫）。Ｇａｒｃｉａ　ＪＦ　ら、”Ｌｏｓｓ　ｏｆ　ｐ１６　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐ１６ＩＮＫ４Ａ　ｇｅｎｅ　ｉｓ　ａ　ｆｒｅｑｕｅｎｔ　ｆｉｎｄｉｎｇ　ｉｎ　Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ　ｄｉｓｅａｓｅ”Ｌａｂ　ｉｎｖｅｓｔ　１９９９　Ｄｅｃ；７９（１２）：１４５３−９
胃ガン。Ｙａｎａｇｉｓａｗａ　Ｙ　ら、”Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｈＭＬＨｌ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｉｎ　ｆａｍｉｌｉａｌ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ　ｗｉｔｈ　ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ”Ｉｎｔ　Ｊ　Ｃａｎｃｅｒ　２０００　Ｊａｎ　１；８５（１）：５０−３）
【０００９】
ガン遺伝子のメチル化依存調整の特定は、ガン治療及び診断の代替方法を開発する可能性を広げるものである。ＤＮＡメチル化阻害因子による治療は、重要な腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子ｐ１６の遺伝子発現を修復するものとして示されている。Ｂｅｎｄｅｒら、″Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｂｙ　５−ａｚａ−２’−ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ．″Ｃａｎｃｅｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　５８；９５−１０１（１９９８）。これにより、腫瘍細胞系の成長の抑制につながる遺伝的レベルの遺伝子発現が生じた。
【００１０】
メチル化ベースの治療は、化学療法、外科処置、及び放射線治療といった現行の治療方法に比べ、大きな利点を有する可能性がある。こうした治療は、従来の治療方法に対する耐性がある腫瘍を治療する手段を提供する可能性もあり、これは、Ｓｏｅｎｇａｓらの″Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ａｐａｆ−１　ｉｎ　ｍａｌｉｇｎａｎｔ　ｍｅｌａｎｏｍａ″Ｎａｔｕｒｅ　４０９；２０７−２１１（２００１）によって実証されている。加えて、メチル化特異的治療の開発に加え、Ｍｉｎマウスでの実験は、ＤＮＡメチル化の阻害が腫瘍の発生を抑制できることを示している。Ｌａｉｒｄら、″Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｎｅｏｐｌａｓｉａ　ｂｙ　ＤＮＡ　ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ″Ｃｅｌｌ　８１；１９７−２０５（１９９５）。更に、ＤＮＡメチル化分析は、癌診断の新しい手段を提供する可能性がある。
【００１１】
５−メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡにおいて最も多い共有塩基修飾である。これは、例えば、転写の調整と、遺伝子の刷り込みと、腫瘍形成とにおいて役割を果たす。そのため、遺伝情報の構成要素として５−メチルシトシンを特定することは、大きな関心に値する。しかしながら、５−メチルシトシンはシトシンと同じ塩基対合行動を有するため、５−メチルシトシンの位置は、配列決定では特定不可能である。更に、５−メチルシトシンが運ぶはエピジェネティク情報は、ＰＣＲ増幅中に完全に失われる。
【００１２】
５−メチルシトシンに関してＤＮＡを分析するために、比較的新しく、現在最も頻繁に使用される方法は、重亜硫酸塩のシトシンとの特定の反応に基づいており、結果として生じるアルカリ加水分解により、シトシンは塩基対合行動においてチミジンに対応するウラシルに転換される。しかしながら、５−メチルシトシンは、こうした条件下では修飾されないまま残る。その結果、元のＤＮＡは、ハイブリッド形成行動によって当初識別できなかったメチルシトシンを、例えば増幅及びハイブリッド形成又は配列決定等、「通常」の分子生物学的手法を使用して唯一残存するシトシンとして検出できる。こうしたすべての手法は、十分に利用することが可能となっている塩基対合に基づいている。感度の点において、従来技術は、分析されるＤＮＡをアガロースマトリックスで囲み、ＤＮＡの拡散及び復元を防ぎ（重亜硫酸塩は一本鎖ＤＮＡとのみ反応する）、すべての沈殿及び浄化ステップを高速透析に置き換える方法によって定められる（Ｏｌｅｋ　Ａ，　Ｏｓｗａｒｄ　Ｊ，Ｗａｌｔｅｒ　Ｊ．　Ａｍｏｄｉｆｉｅｄ　ａｎｄ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｂｉｓｕｌｐｈａｔｅ　ｂａｓｅｄ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９９６　Ｄｅｃ　１５；２４（２４）：５０６４−６）。この方法を使用することで、個々の細胞を分析することが可能となり、これらの方法のすなわち意義を示すものである。しかしながら、現在、約３０００塩基対までの長さの個別領域のみが分析されており、数千のメチル化事象の可能性に関する細胞の広範囲分析は不可能である。また、しかしながら、この方法は、小さな量の試料からの非常に小さな断片を高い信頼性で分析することはできない。これらは、拡散防止措置にもかかわらず、マトリックスを通じて失われてしまう。
【００１３】
５−メチルシトシンを検出する更なる既知の方法の概要は、次の総論から得ることができる。Ｔ．，　ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ，　Ｍ．Ｌ．，　Ｚｏｒｂａｓ，Ｈ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９８，２６，２２５５。
【００１４】
現在まで、僅かな例外を除き（例えば、Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ　Ｍ，　Ｌｉｃｈ　Ｃ，　Ｂｕｉｔｉｎｇ　Ｋ，　Ｄｏｅｒｆｌｅｒ　Ｗ，　Ｈｏｒｓｔｈｅｍｋｅ　Ｂ．　Ａ　ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ　ＰＣＲ　ｔｅｓｔ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｉｓ　ｏｆ　Ａｎｇｅｌｍａｎ　ａｎｄ　Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａｌｌｅｌｉｃ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ＳＮＲＰＮ　ｌｏｃｕｓ．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ．１９９７　Ｍａｒ−Ａｐｒ；５（２）：９４−８）、重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）手法は調査のみに使用されている。しかしながら、常に、既知である短い特定の断片は、重亜硫酸塩処理の後で増幅され、完全に配列決定されるか（Ｏｌｅｋ　Ａ，　Ｗａｌｔｅｒ　Ｊ．　Ｔｈｅ　ｐｒｅ−ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｎｔｏｇｅｎｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｈ１９　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｉｍｐｒｉｎｔ．Ｎａｔ　Ｇｅｎｅｔ．１９９７　Ｎｏｖ；１７（３）：２７５−６）、或いは、プライマ延長反応によって（Ｇｏｎｚａｌｇｏ　ＭＬ，　Ｊｏｎｅｓ　ＰＡ．　Ｒａｐｉｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ａｔ　ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｓｉｔｅｓ　ｕｓｉｎｇ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ｓｉｎｇｌｅ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｐｒｉｍｅｒ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ）．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９７　Ｊｕｎ　１５；２５（１２）：２５２９−３１，ＷＯ出願９５／００６６９）又は酵素的な消化によって（Ｘｉｏｎｇ　Ｚ，　Ｌａｉｒｄ　ＰＷ．　ＣＯＢＲＡ：　ａ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　ａｎｄ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　ｒｅｓ．１９９７　Ｊｕｎ　１５；２５（１２）：２５３２−４）、個々のシトシン位置が検出される。加えて、ハイブリッド形成による検出も述べられている（Ｏｌｅｋら、ＷＯ９９／２８４９８）。
【００１５】
個々の遺伝子でのメチル化検出に関する重亜硫酸塩手法の使用を扱っているその他の出版物は、次の通りである。Ｇｒｉｇｇ　Ｇ，　Ｃｌａｒｋ　Ｓ．　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｉｎ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ．Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．１９９４　Ｊｕｎ；１６（６）：４３１−６，４３１。Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ　Ｍ，　Ｓｃｈｍｉｔｚ　Ｂ，　Ｄｉｔｔｒｉｃｈ　Ｂ，　Ｂｕｉｔｉｎｇ　Ｋ，　Ｈｏｒｓｔｈｅｍｋｅ　Ｂ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ　Ｗ．　Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ　ｓｅｇｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｅ：　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ＤＮＡ　ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ／Ａｎｇｅｌｍａｎ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ　ｒｅｇｉｏｎ　ａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｈｕｍ　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔ．１９９７Ｍａｒ；６（３）：３８７−９５。Ｆｅｉｌ　Ｒ，　Ｃｈａｒｌｔｏｎ　Ｊ，　Ｂｉｒｄ　ＡＰ，　Ｗａｌｔｅｒ　Ｊ，　Ｒｅｉｋ　Ｗ．　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｐｒｏｔｏｃｏｌ　ｆｏｒ　ｂｉｓｕｌｐｈａｔｅ　ｇｅｎｏｍｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９４　Ｆｅｂ　２５；２２（４）：６９５−６。Ｍａｒｔｉｎ　Ｖ，　Ｒｉｂｉｅｒａｓ　Ｓ，　Ｓｏｎｇ−Ｗａｎｇ　Ｘ，　Ｒｉｏ　ＭＣ，　Ｄａｎｔｅ　Ｒ．　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ａ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＤＮＡ　ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　５’ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐＳ２　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ．Ｇｅｎｅ．１９９５　Ｍａｙ　１９；１５７（１−２）：２６１−４。ＷＯ　９７　４６７０５、ＷＯ　９５１５３７３、及びＷＯ　４５５６０。
【００１６】
オリゴマーアレイ製造における従来技術の概要は、１９９９年１月に刊行されたＮａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓの特別版（Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｖｏｌｕｍｅ　２１，Ｊａｎｕａｒｙ　１９９９）と、そこに引用された文献とから得ることができる。
【００１７】
蛍光標識プローブは、固定化ＤＮＡアレイのスキャニングに使用される場合が多い。特定のプローブの５’−ＯＨに対するＣｙ３及びＣｙ５色素の添加は、蛍光標識に特に適している。ハイブリッド形成されたプローブの蛍光の検出は、例えば、共焦点顕微鏡を介して実行することができる。Ｃｙ３及びＣｙ５色素は、他の多くの色素同様、市販されている。
【００１８】
マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、生体分子の分析に関する非常に効率的な成果である（Ｋａｒａｓ　Ｍ，　Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ　Ｆ．　Ｌａｓｅｒ　ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｉｔｈ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓｅｓ　ｅｘｃｅｅｄｉｎｇ　１０，０００　ｄａｌｔｏｎｓ．Ａｎａｌ　Ｃｈｅｍ．１９８８　Ｏｃｔ　１５；６０（２０）：２２９９−３０１）。検体は、ライト（ｌｉｇｈｔ）マトリックスに埋め込まれる。このマトリックスは、短レーザパルスによって蒸発するため、検体分子を断片化せずに気相へと移行させる。検体は、マトリックス分子との衝突によってイオン化する。給与電圧により、このイオンは、フィールドフリー飛行管へ加速される。質量の違いにより、このイオンは、異なる速度で加速される。小さなイオンは、大きなイオンよりも早く検出器に到達する。
【００１９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析法は、ペプチド及びタンパク質の分析に非常に適している。核酸の分析は、多少困難である（Ｇｕｔ　Ｉ　Ｇ，　Ｂｅｃｋ　Ｓ．　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｍａｔｒｉｘ　Ａｓｓｉｓｔｅｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ　Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ　Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｆｕｔｕｒｅ　Ｔｒｅｎｄｓ．１９９５，１：１４７−５７）。核酸に対する感度は、ペプチドに対する感度よりも約１００倍劣っており、断片のサイズの増加とは反比例して感度は減少する。多重負電荷バックボーンを有する核酸では、マトリックスを介したイオン化プロセスの効率は、大幅に低下する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析法において、マトリックスの選択は、非常に重要な役割を果たす。ペプチドの脱離に関しては、非常に微細な結晶体を生成する極めて効率的なマトリックスがいくつか発見されている。現在では、ＤＮＡに関する反応性マトリックスがいくつか存在するが、しかしながら、感度の格差は低減されていない。感度の格差は、ＤＮＡがペプチドに類似するような形でＤＮＡを化学的に修飾することで低減させることができる。バックボーンの通常のリン酸塩がチオリン酸塩に置換したホスホロチオエート核酸は、単純なアルキル化化学反応を使用して電荷中立ＤＮＡに転換することができる（Ｇｕｔ　Ｉ　Ｇ，　Ｂｅｃｋ　Ｓ．　Ａ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ＤＮＡ　ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９５　Ａｐｒ　２５；２３（８）：１３６７−７３）。この修飾済みＤＮＡに電荷タグを結合させることで、ペプチドに関してみられるものと同じレベルまで感度が増加する。電荷タグ付加の更なる利点は、未修飾の基質の検出を非常に困難にする不純物に対する分析の安定性を増加させることである。
【００２０】
ゲノムＤＮＡは、標準的な方法を使用して、細胞、組織、又はその他の試験試料のＤＮＡから取得される。この標準的な方法は、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ編のＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，１９８９といった参考文献に記載されている。
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の目的は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子のシトシンメチル化を検出するためのオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡオリゴマーと、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの診断及び／又は治療に特に適した方法とを提供することである。本発明は、シトシンメチル化パターンが腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断及び／又は治療に特に適しているということを見出したことに基づいている。
【００２２】
本発明の目的は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的に修飾されたＤＮＡと、シトシンメチル化を検出するためのオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡオリゴマーと、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの診断及び／又は治療に特に適した方法とを提供することである。本発明は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータを見出したことに基づいている、特にそのシトシンメチル化パターンが腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断及び／又は治療に特に適している点である
【００２３】
本発明による目的は、ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号５３６のうち一つ及びこれと相補配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡ及び／又は表１記載の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡの少なくとも１８塩基の長さの配列を含む核酸を使用することで、達成される。この表において、列挙された遺伝子の記号表示の後には、付随する遺伝子配列を固有のものとして定めるそれぞれのデータバンク番号（アクセッション番号）が指定されている。基盤となるデータバンクとして、国立保健研究所のＧｅｎＢａｎｋを使用しており、インターネツトアドレスはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖである。
【００２４】
化学的に修飾された核酸は、これまで、遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの確認とは関連付けられていない。
【００２５】
本発明の目的は、配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号５３６及びこれの相補配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡ及び／又は表１記載の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡとハイブリッド形成する少なくとも１３ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含む、化学的前処理されたＤＮＡにおけるシトシンメチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチド又はオリゴマーによって、更に達成される。本発明によるオリゴマープローブは、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータを確認することを初めて可能にする重要かつ効果的なツールを構成する。オリゴマーの塩基配列は、好ましくは、少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。このプローブは、特に好適な対合特性を有するＰＮＡ（ペプチド核酸）の形態で存在することもできる。本発明によるオリゴヌクレオチドで特に好適なものは、１３−ｍｅｒの５’末端からの五番目乃至九番目のＣｐＧジヌクレオチドであり、ＰＮＡ−オリゴマーの場合は、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが９−ｍｅｒの５’末端からの四番目及び六番目のヌクレオチドとなるのが好適である。
【００２６】
本発明によるオリゴマーは、配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号５３６の配列及びこれの相補配列及び／又は表１記載の遺伝子配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡのＣｐＧジヌクレオチドのそれぞれに関して少なくとも一つのオリゴマーを含むいわゆるセット（ｓｅｔ）において通常使用される。好適なものは、配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号５３６のうち一つ及びこれの相補配列及び／又は表１記載の遺伝子配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡのＣｐＧジヌクレオチドのそれぞれに関して少なくとも一つのオリゴマーを含むセットである。
【００２７】
更に、本発明は、配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号５３６の及びこれの相補配列及び／又は表１の遺伝子又はそのセグメントの配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡの配列とを増幅するいわゆる「プライマーオリゴヌクレオチド」として使用可能な少なくとも二つのオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）を利用可能にする。
【００２８】
本発明によるオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）の場合、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドが固相に固定されることが好適である。
【００２９】
本発明は、化学的前処理されたゲノムＤＮＡ（配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号５３６及びこれの相補配列及び／又は表１の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡ）におけるシトシンメチル化状態を検出するために使用される少なくとも１０ｎのセット（ｓｅｔ）（オリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマー）に更に関する。こうしたプローブにより、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの診断及び／又は治療が可能となる。このオリゴマーのセット（ｓｅｔ）は、配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号５３６のうち一つ及びこれの相補配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡ及び／又は表１の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡにおいて単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出するために使用することもできる。
【００３０】
本発明によれば、本発明によって利用可能となる、異なるオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマの配置（いわゆる「アレイ」）は、同様に固相に固定される形で存在することが好適である。この異なるオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマー配列のアレイは、長方格子又は六方格子の形態で固相上に配置されることによって特徴付けることができる。固相表面は、好ましくは、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成される。しかしながら、ニトロセルロースと、ペレットの形態又は樹脂基質として存在することが可能なナイロン等のプラスチックとも利用可能である。
【００３１】
そのため、本発明の主題は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患と関係する分析のためのキャリヤー材料に固定されたアレイを製造する方法であり、この方法においては、本発明に従った少なくとも一つのオリゴマーが固相に結合される。こうしたアレイを製造する方法は、例えば、固相化学反応及び光変性保護基を用いる米国特許第５，７４４，３０５号により知られている。
【００３２】
本発明の更なる主題は、本発明に従った少なくとも一つの核酸を含む腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の分析のためのＤＮＡチップに関する。ＤＮＡチップは、米国特許第５，８３７，８３２号により知られている。
【００３３】
更に、本発明の主題は、例えば、重亜硫酸塩（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）含有試薬と、いずれの場合にも、付録で指定する塩基配列（配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号５３６及びこれの相補配列及び／又は表１の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡの配列）の１８塩基の長さのセグメントに対応する配列又はこのセグメントの相補配列を有する少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）と、オリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマーと、説明された方法を実行及び評価するための指示書とによって構成されるキットである。しかしながら、本発明に沿ったキットは、上で述べた構成要素の一部のみを含むこともできる。
【００３４】
本発明により、シトシンメチル化及び単一ヌクレオチド多型を分析することで、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータを確認する方法も利用可能となり、これは以下のステップを含む。
【００３５】
この方法の第一のステップにおいて、ゲノムＤＮＡ試料は、５’−位置においてメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミン、又はハイブリッド形成行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換される形で、化学的に処理される。これは、以下において「化学的前処理」として理解されるものとする。
【００３６】
分析されるゲノムＤＮＡは、好ましくは、細胞又は細胞構成要素といったＤＮＡの通常のソースから取得され、これは例えば、細胞株と、バイオプシーと、血液と、唾液と、大便と、尿と、脳脊髄液と、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房、又は肝臓からの組織等のパラフィンに埋め込まれた組織と、ヒストロジックオブジェクトスライド（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ　ｏｂｊｅｃｔ　ｓｌｉｄｅｓ）と、又はその組み合わせとである。
【００３７】
上で説明したゲノムＤＮＡの処置は、好ましくは、重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）（亜硫酸水素塩、二亜流酸塩）と、続いてアルカリ加水分解によって実行され、このアルカリ加水分解によって、非メチル化シトシンはウラシル、或いは塩基対合行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換される。
【００３８】
化学的前処理されたＤＮＡの断片は、本発明に従ったプライマーオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔｓ）と、好ましくは、熱安定性ポリメラーゼとを使用して、増幅される。統計的及び実際的な考慮から、好ましくは、１００乃至２０００塩基対の長さを有する１０より多くの異なる断片を増幅する。いくつかのＤＮＡセグメントの増幅は、一つの同じ反応槽において、同時に実行することができる。通常、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を用いて実行される。
【００３９】
この方法の好適な実施形態において、プライマオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）は、付録において指定された塩基配列（配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号５３６及びこれの相補配列及び／又は表１の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡの配列）の少なくとも１８塩基対の長さのセグメントをそれぞれ逆相補配列又はこれと同一の配列を有する少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含む。このプライマオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ＣｐＧジヌクレオチドをまったく含まない点で特徴付けられる。
【００４０】
本発明によれば、少なくとも一つのプライマオリゴヌクレオチドは、増幅中に固相に接合されている。様々なオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマー配列を、長方格子又は六方格子の形態で、平坦な固相上に配置することが可能であり、固相表面は、好ましくは、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成され、ニトロセルロース又はプラスチック等の他の材料を使用することも可能である。
【００４１】
増幅を用いて得られる断片は、検出可能な標識を直接的又は間接的に伴なうことができる。好適なものは、蛍光標識、放射性核種、又は質量分析計において検出できる通常の質量を有する分離可能な分子断片の形態の標識であり、質量分析計での検出可能性を高めるために、生成される断片は単一の正又は負の実効電荷を有することが好適である。この検出は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）を用いて、或いは電子スプレ質量分析法（ＥＳＩ）を使用して、実行及び視覚化することができる。
【００４２】
この方法の第二のステップで得られた増幅物は、その後、オリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡプローブのアレイ又はセット（ｓｅｔ）とハイブリッド形成する。この状況において、ハイブリッド形成は、以下の説明の形で行われる。ハイブリッド形成中に使用されるプローブのセット（ｓｅｔ）は、好ましくは、少なくとも十個のオリゴヌクレオチド又はＰＮＡ−オリゴマーで構成される。このプロセスにおいて、増幅物は、既に固相と接合しているオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するプローブの役割を果たす。ハイブリッド形成しない断片は、その後、除去される。前記オリゴヌクレオチドは、付録において指定された塩基配列のセグメントを逆相補する又はこれと同一である１３ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含み、このセグメントは少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンは、１３−ｍｅｒの５’末端からの五番目乃至九番目のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドにはそれぞれＣｐＧジヌクレオチドが存在する。前記ＰＮＡ−オリゴマーは、付録において指定された塩基配列のセグメントを逆相補する又はこれと同一である９ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含み、このセグメントは少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンは、９−ｍｅｒの５’末端から見て四番目乃至六番目のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドにはそれぞれＣｐＧジヌクレオチドが存在する。
【００４３】
この方法の第四のステップにおいて、ハイブリッド形成されない増幅物は除去される。
【００４４】
この方法の最終ステップにおいて、ハイブリッド形成した増幅物が検出される。この状況において、増幅物に添加された標識は、各オリゴヌクレオチド配列が位置する固相の各位値を特定可能できることが好適である。
【００４５】
本発明によれば、増幅物の標識は、蛍光標識、放射性核種、又は質量分析計において検出できる通常の質量を有する分離可能な分子断片であることが好適である。質量分析計は、増幅物、増幅物の断片、又は増幅物を相補するプローブの検出に好適であり、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）を用いて、或いは電子スプレ質量分析法（ＥＳＩ）を使用して、検出を実行及び視覚化することができる。
【００４６】
生成た断片は、質量分析計での検出可能性を高めるために、単一の正又は負の実効電荷を有することができる。上述の方法は、好ましくは、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータを確認するために使用される。
【００４７】
本発明によるオリゴマー又はそのアレイと、本発明によるキットとは、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析することで、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断及び／又は治療に使用される。本発明によれば、この方法は、好ましくは、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子内の重要な遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータの診断及び／又は治療に使用される。
【００４８】
本発明による方法は、例えば、充実性腫瘍と、癌との診断及び／又は治療に使用される。配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号５３６及びこれの相補配列及び／又は表１の配列に従った腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡの本発明による核酸は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータの診断及び／又は治療に使用することができる。
【００４９】
本発明は、更に、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析することで腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断及び／又は治療を行うための診断剤及び／又は治療剤を製造する方法に関し、この診断剤及び／又は治療剤は、その製造において、おそらくは適切な添加剤及び助剤と共に、本発明による少なくとも一つの核酸が使用される点によって特徴付けられる。
【００５０】
本発明の更なる主題は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析する腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断剤及び／又は治療剤に関し、この診断剤及び／又は治療剤は、おそらくは適切な添加剤及び助剤と共に、本発明による少なくとも一つの核酸が含まれる。
【００５１】
本発明は、更に、患者又は個人にとって不利な事象の診断及び／又は予後診断に関し、これにおいて、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子内の重要な遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータは、本発明を用いて取得されるパラメータであり、遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータの他のセット（ｓｅｔ）と比較することが可能であり、その格差は患者又は個人にとって不利な事象の診断及び／又は予後診断の根拠の役割を果たす。
【００５２】
本発明における、「ハイブリッド形成」という用語は、オリゴヌクレオチドを、試料ＤＮＡにおいて、ワトソン・クリック塩基対合のラインに沿って、完全に相補配列に接合し、二重構造を形成することと理解される。「厳密なハイブリッド形成条件」は、６０℃の２．５×ＳＳＣ緩衝液でハイブリッド形成が実行され、その後、３７℃の低緩衝液濃度でのいくつかの洗浄ステップが行われ、安定状態が維持されるとして理解される。
【００５３】
「機能変異体」という用語は、ＤＮＡ配列を相補し、厳密な条件下で基準配列とハイブリッド形成を行い、本発明に従った対応するポリペプチドと類似する活動を有する、すべてのＤＮＡ配列を意味する。
【００５４】
本発明における、「遺伝的パラメータ」は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子及びその調整に更に必要な配列に関連する遺伝子の変異及び多型現象である。変異として指定されるものは、特に、挿入と、欠失と、点変異と、反転及び多型現象と、特に好適なものとしてＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）とである。
【００５５】
本発明における、「エピジェネティクスパラメータ」は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子及びその調整に更に必要な配列に関連する遺伝子のＤＮＡ塩基におけるシトシンメチル化及びその他の化学的修飾である。その他のエピジェネティクスパラメータには、例えば、ヒストンのアセチル化が含まれ、しかしながら、これは説明した方法を使用して直接的に分析することはできないが、同様に、ＤＮＡメチル化と相関する。
【発明の実施の形態】
【００５６】
以下では、本発明について、配列及び例と、添付の図とに基づいて参照し、これに限定されることなく、詳細に説明する。
以下の例は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する遺伝子の断片に関係し、この例では、ＭＹＣにおいて、特定のＣＧ位置がメチル化状態に関して分析される。
【実施例１】
【００５７】
腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連するＭＹＣ遺伝子におけるメチル化分析
以下の実施例は、ＭＹＣ遺伝子の断片に関係し、メチル化に関して特定のＣＧ位置が分析される。
【００５８】
第一のステップにおいて、ゲノム配列は、塩基の５位置においてメチル化していないすべてのシトシンが修飾され、それは５位置においてメチル化しているシトシンが変化しないまま、異なる塩基が塩基対合行動に関して置換されるように、重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、二亜流酸塩）を使用して処理される。
【００５９】
重亜硫酸（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）溶液が反応に使用される場合、非メチル化シトシン塩基において付加が発生する。更に、変性剤又は溶剤と、ラジカルインタセプターとが存在しなければいけない。その後のアルカリ加水分解により、非メチル化シトシン核酸塩基のウラシルへの転換が生じる。化学的に転換されたＤＮＡ（配列ＩＤ番号５３１）は、次に、メチル化シトシンの検出に使用される。第二の方法ステップにおいて、処理されたＤＮＡ試料は、水又は水溶液により希釈される。好ましくは、このＤＮＡは、その後、アルカリ性ｐＨ値で脱スルホン化される（１０乃至３０分、９０乃至１００℃）。この方法の第三のステップにおいて、このＤＮＡ試料は、好ましくは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅される。この例では、ＭＹＣ遺伝子のシトシンが分析される。このため、８３１ｂｐの長さを有する定められた断片は、特定のプライマオリゴヌクレオチド　ＴＴＴＴＧＴＧＴＧＧＡＧＧＧＴＡＧＴＴＧ（配列ＩＤ番号５３７）及びＣＣＣＣＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＡＡＣＣ（配列ＩＤ番号５３８）により増幅される。この増幅物は、既に固相に接合されているオリゴヌクレオチドと（これは例えばＴＡＡＧＧＡＴＧＣＧＧＴＴＴＧＴＴＡ（配列ＩＤ番号５３９））、ハイブリッド形成し、二重構造を形成し、増幅物の位置６０に位置するシトシンを検出する試料としての役割を果たす。ハイブリッド形成物の検出は、増幅に使用されたＣｙ３及びＣｙ５蛍光標識プライマーオリゴヌクレオチドに基づく。増幅ＤＮＡのオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成反応は、重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）処理されたＤＮＡのこの位置にメチル化シトシンが存在している場合のみ発生する。したがって、分析される特定のシトシンのメチル化状態は、ハイブリッド形成物から推測できる。
【００６０】
特定の位置のメチル化状態を検証するために、増幅物の試料は、既に固相に接合された別のオリゴヌクレオチドと更にハイブリッド形成される。前記オリゴヌクレオチドは、焦点となる位置を除き、試料のメチル化状態を分析するのに以前使用されたオリゴヌクレオチドと同一である。分析される位置において、前記オリゴヌクレオチドは、シトシン塩基ではなくチミン塩基を含み、これは例えばＴＡＡＧＧＡＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＡ（配列ＩＤ番号５４０）である。そのため、ハイブリッド形成反応は、分析される位置に非メチル化シトシンが存在する場合のみ発生する。
【００６１】
分析は、二種類の組織試料に関して実行され、試料１は毛様細胞性星状細胞腫（脳腫瘍）組織からであり、試料２は毛様細胞性星細胞種悪性度ＩＩ（脳腫瘍）組織からのものである。結果（図１）から、試料１は増幅物の位置６０においてメチル化していないのに対して、試料２は同じ位置にメチル化した細胞又は非メチル化細胞の両方の混合物を有することが確認できる。
【実施例２】
【００６２】
腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の診断
メチル化パターンを腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する疾患の一つに関係付けるために、最初に、疾患のある患者グループと健康な患者グループのＤＮＡメチル化パターンを分析する必要がある。こうした分析は、例えば、例１と同じように実行される。このようにして得られた結果は、データベースに保存され、二グループ間でメチル化が異なるＣｐＧジヌクレオチドが特定される。これは、個別のＣｐＧメチル化割合を決定することで実行可能であり、こうした決定は、例えば、配列決定による比較的不正確な方法、或いは、メチル化感受性「プライマ延長反応」による非常に正確な方法で行うことができる。更に、例えば、コンピュータ等により実行することが可能なクラスター分析により、全体のメチル化状態を同時に分析すること、及びパターンを比較することも可能である。
【００６３】
その後、検査した患者を特定の治療グループに割り当て、こうした患者を個別化した治療により選択的に治療することが可能である。
【００６４】
例２は、例えば、以下の疾患に関して実行することができる。
充実性腫瘍、及び癌。
【００６５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、蛍光標識増幅物による表面固定オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を示している。試料Ｉは、毛様細胞性星状細胞腫（脳腫瘍）組織からのものであり、試料ＩＩは、毛様細胞性星細胞種悪性度ＩＩ（脳腫瘍）組織からのものである。点の蛍光は、増幅物によるオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を示している。ＣＧオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、分析されるシトシン位置でのメチル化を意味し、ＴＧオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、分析されるシトシン位置での非メチル化を意味する。
【配列の説明】
配列ＩＤ番号１乃至５３６
配列ＩＤ番号１乃至５３６は、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連するな遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡの配列を示している。特に、奇数の配列番号（配列ＩＤ番号１、３、５、．．．）を有する配列は、いずれの場合にも、腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する様々な遺伝子の化学的前処理されたゲノムＤＮＡの配列を示す。偶数の配列番号（配列ＩＤ番号２、４、６、．．．）を有する配列は、いずれの場合にも、先行する配列の相補する腫瘍抑制遺伝子と腫瘍遺伝子に関連する様々な遺伝子の化学的前処理されたゲノムＤＮＡの配列を示す（例えば、配列ＩＤ番号１に対する相補配列は配列ＩＤ番号２であり、配列ＩＤ番号３に対する補完配列は配列ＩＤ番号４である）。
配列ＩＤ番号５３７乃至配列ＩＤ番号５４０は、実施例１において使用されるオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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