(57)【要約】標的タンパク質、特に、全ゲノム又はそのサブセットから発見された標的タンパク質の低分子相互作用物質の発見のための並行ハイスループット法及びキット。標的モジュールは、検出できるように修飾された標的タンパク質を、別個の検出可能なビーズに結合されたサロゲート・リガンドにより選択敵に結合させることにより調製される。複数セットの標的モジュールを、多チャンバー容器の各チャンバー内で一緒に混合する。テスト化合物、又はテスト化合物のコレクションを各チャンバーに添加し、そして化合物と各標的モジュールの相互作用を観察する。特定の標的タンパク質に特異的な化合物は、そのタンパク質をその標的モジュールから置き替える。そのように破壊された標的モジュールを、その置き替えられた標的タンパク質かそれに結合していた特定のビーズを検出することにより同定する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
ａ）複数の標的タンパク質を得；
ｂ）サロゲート・リガンドの第１セットを得、ここで、サロゲート・リガンドの上記セット内の各サロゲート・リガンドは第１標的タンパク質に選択的に結合し；
ｃ）サロゲート・リガンドの上記第１セットを第１の検出可能なビーズに結合させて、サロゲート・リガンド−ビーズ複合体の第１セットを形成し、ここで、上記第１の検出可能なビーズの全てが、上記第１の検出可能なビーズの光学特性により検出されることができ；
ｄ）サロゲート・リガンド−ビーズ複合体の上記第１セットを、検出のために標識された上記第１標的タンパク質と併合して、第１標的モジュールを形成し；
ｅ）同時に又は順番に、サロゲート・リガンドの異なるセットと検出可能なビーズを、そして上記第１標的タンパク質又は異なる標的タンパク質を用いて、ステップａ）、ｂ）、ｃ）、及びｄ）を繰り返して、標的モジュールの複数セットを形成し；
ｆ）標的モジュールの上記複数セットを、多チャンバー容器の各チャンバーに添加し；
ｇ）テスト化合物又はテスト化合物のコレクションを、上記多チャンバー容器の各チャンバーに添加し；
ｈ）テスト化合物による標的タンパク質の置き替えを検出し；そして
ｉ）テスト化合物により置き替えられた各標的タンパク質を同定する；
を含む方法。
【請求項２】
前記のサロゲート・リガンドのセットを得るステップが、以下のステップ：
ａ）ファージ・ライブラリーを得、ここで、上記ライブラリーの各ファージが、外来ペプチドを提示し；
ｂ）上記ファージ・ライブラリーを、前記複数の標的タンパク質の中の前記標的タンパク質の各々と混合し；
ｃ）前記標的タンパク質の各々に選択的に結合する上記外来ペプチドを提示するファージを単離し；
ｄ）前記標的タンパク質の各々に結合する上記外来ペプチドをコードするＤＮＡを単離し；
ｅ）上記ＤＮＡをシークエンシングし；そして
ｆ）上記シークエンシングに基づき、サロゲート・リガンドの前記セットを合成する；
を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的タンパク質のセットを、以下のステップ：
ａ）ゲノムから標的遺伝子を選択し；
ｂ）上記標的遺伝子の各々を発現させて、前記標的タンパク質のセットを作製し；そして
ｃ）前記標的タンパク質を精製する；
により得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｅ）における標的タンパク質が、前記第１標的タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｅ）における標的タンパク質が、前記第１標的タンパク質とは異なる標的タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
以下のステップ：
ａ）前記標的タンパク質をビオチニル化し；そして
ｂ）前記標的タンパク質をアビジン−フィコエリスリンと連結させる；
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
以下のステップ：
ａ）複数の標的タンパク質を得；
ｂ）サロゲート・リガンドの第１セットを得、ここで、サロゲート・リガンドの上記セット内の各サロゲート・リガンドは第１標的タンパク質に選択的に結合し；
ｃ）上記第１標的タンパク質を第１の検出可能なビーズに結合させて、標的タンパク質−ビーズ複合体の第１セットを形成し、ここで、上記第１の検出可能なビーズの全てが、上記第１の検出可能なビーズの光学特性により検出されることができ；
ｄ）標的タンパク質−ビーズ複合体の上記第１セットを、検出のために標識されたサロゲート・リガンドの上記第１セットと併合して、第１標的モジュールを形成し；
ｅ）同時に又は順番に、サロゲート・リガンドの異なるセットと検出可能なビーズを、そして上記第１標的タンパク質又は異なる標的タンパク質を用いて、ステップａ）、ｂ）、ｃ）、及びｄ）を繰り返して、標的モジュールの複数セットを形成し；
ｆ）標的モジュールの上記複数セットを、多チャンバー容器の各チャンバーに添加し；
ｇ）テスト化合物又はテスト化合物のコレクションを、上記多チャンバー容器の各チャンバーに添加し；
ｈ）テスト化合物によるサロゲート・リガンドの置き替えを検出し；そして
ｉ）テスト化合物により置き替えられた各サロゲート・リガンドを同定する；を含む方法。
【請求項８】
前記のサロゲート・リガンドの各セットを得るステップが、以下のステップ：
ａ）ファージ・ライブラリーを得、ここで、上記ライブラリーの各ファージが、外来ペプチドを提示し；
ｂ）上記ファージ・ライブラリーを、前記複数の標的タンパク質の中の前記標的タンパク質の各々と混合し；
ｃ）前記標的タンパク質の各々に結合する上記外来ペプチドを提示するファージを単離し；
ｄ）前記標的タンパク質の各々に選択的に結合する上記外来ペプチドをコードするＤＮＡを単離し；
ｅ）上記ＤＮＡをシークエンシングし；そして
ｆ）上記シークエンシングに基づき、サロゲート・リガンドの前記セットを合成する；
を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標的タンパク質のセットを、以下のステップ：
ａ）ゲノムから標的遺伝子を選択し；
ｂ）上記標的遺伝子の各々を発現させて、前記標的タンパク質のセットを作製し；そして
ｃ）前記標的タンパク質を精製する；
により得られる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ｅ）における標的タンパク質が、前記第１標的タンパク質である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｅ）における標的タンパク質が、前記第１標的タンパク質とは異なる標的タンパク質である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
以下のステップ：
ａ）前記標的タンパク質をビオチニル化し；そして
ｂ）前記標的タンパク質をアビジン−フィコエリスリンと連結させる；
を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記サロゲート・リガンドが、ペプチド、ＲＮＡアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）又はベーターペプチドである、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１４】
前記個々のビーズの各々を、２つの染料の所定のコンビネーションで、３つの染料の所定のコンビネーションで又は計量可能な点（ｑｕａｎｔｕｍ　ｄｏｔｓ）の所定の集団で、標識することを含む、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１５】
前記個々のビーズの各々を、２つの染料の所定のコンビネーションで標識することを含み、ここで、前記個々のビーズの数が、１００の標的タンパク質が前記各チャンバー内でスクリーニングされるように、１００である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記チャンバー当りに使用される前記化合物の量が、０．１〜１００ｎｇの範囲内にある、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数の標的タンパク質の前記各標的タンパク質の酵素又は調節機能が知られていない、請求項１又は７に記載の方法。
【請求項１８】
ゲノムから複数の標的タンパク質をスクリーニングするためのキットであって、以下の：
ａ）標的モジュールのセット、ここで、標的モジュールの上記セットの中の各セットは：
（１）個々に検出可能なビーズ；
（２）上記検出可能なビーズに結合されたサロゲート・リガンドのセット、ここで、サロゲート・リガンドの上記セットの中のサロゲート・リガンドは、前記複数の標的タンパク質の中の同一の又は異なる標的タンパク質に選択的に結合され；
（３）前記標的タンパク質は、検出のために標識されており；及び
ｂ）多チャンバー容器、ここで、標的モジュールの前記セットは、上記多チャンバー容器の各チャンバー内に保存される、
を含む前記キット。
【請求項１９】
前記複数の標的タンパク質が未知機能を有する、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
ゲノムから複数の標的タンパク質をスクリーニングするためのキットであって、以下の：
ａ）リガンド−ビーズ複合体のセット、ここで上記リガンド−ビーズ複合体の各々が：
（１）検出可能なビーズ；
（２）上記検出可能なビーズに結合されたサロゲート・リガンド；
ｂ）複数の標的タンパク質、ここで、上記複数の標的タンパク質の中の前記標的タンパク質の各々は、サロゲート・リガンドに選択的に結合することができ；及び
ｃ）多チャンバー容器、ここで、上記複数のリガンド−ビーズ複合体は、上記多チャンバー容器の各チャンバー内に保存され、上記標的タンパク質は、上記リガンド−ビーズ複合体から分離して保存される、
を含む前記キット。
【請求項２１】
前記標的タンパク質が、未知の機能を有する、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記標的タンパク質の数が５０より大きい、請求項１８又は２０に記載のキット。
【請求項２３】
前記標的タンパク質の数が５００より大きい、請求項１８又は２０に記載のキット。
【請求項２４】
個々に検出可能なビーズ、サロゲート・リガンド、及び複数の標的タンパク質を使用するハイスループット・スクリーニング方法において、その改良が、
ａ）多チャンバー容器の各チャンバー内で、標的分子の複数セットを混合し、
ｉ）ここで、標的分子の上記セットの中の各セットが、リガンド−ビーズ複合体と、検出のために標識された標的タンパク質を含み；
ｉｉ）ここで、上記リガンド−ビーズ複合体が、個々に検出可能なビーズに結合されたサロゲート・リガンドを含み；
ｉｉｉ） ここで、上記サロゲート・リガンドの各々が、上記標的タンパク質の中の１に選択的に結合し；
ｂ）上記多チャンバー容器の上記各チャンバーに、テスト化合物を添加し、それにより、上記化合物が、上記標的化合物がそれと相互作用するところの上記標的モジュールからの上記標的タンパク質に置き替わり；
ｃ）テスト化合物による標的タンパク質の置き替えを検出し；そして
ｄ）テスト化合物により置き替えられた各標的タンパク質を同定すること、
を含む前記ハイスループット・スクリーニング方法。
【請求項２５】
前記複数の標的タンパク質の機能が未知である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
サロゲート・リガンドの前記セットの各々を得るステップが、以下の：
ａ）ファージ・ライブラリーを得、ここで、上記ライブラリーの各ファージが外来ペプチドを提示し；
ｂ）上記ファージ・ライブラリーを、前記複数の標的タンパク質の前記標的タンパク質の各々と混合し；
ｃ）前記各標的タンパク質に選択的に結合する前記外来ペプチドを提示するファージを単離し；
ｄ）前記標的タンパク質の各々に結合する前記外来ペプチドをコードするＤＮＡを単離し；そして
ｅ）上記ＤＮＡをシークエンシングし；そして
ｆ）上記シークエンシングに基づき、サロゲート・リガンドの前記セットを合成する、
を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
標的タンパク質の前記セットが、以下のステップ：
ａ）ゲノムから標的遺伝子を選択し；
ｂ）上記標的遺伝子の各々を発現させて、標的タンパク質の前記セットを作製し；そして
ｃ）前記標的タンパク質を精製する；
により得られる、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、標的タンパク質の低分子相互作用物質の発見のためのハイスループット法及びキットに、特に、未知の機能を有する多数の標的タンパク質との低分子の相互作用の並列分析のためのハイスループット法及びキットに関する。
【０００２】
単一標的ハイスループット・スクリーン（Ｈｉｇｈ　Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　Ｓｃｒｅｅｎｓ（ＨＴＳ））は、農薬研究者と医薬研究者の両者における特定の標的タンパク質の低分子インヒビター、リガンド、アゴニスト又はアンタゴニストを発見するために選ばれる方法である。これらのスクリーンは、１つの標的タンパク質に対して１００，０００〜１，０００，０００超の化合物をテストすることができるロボットのプラットホーム上で行われる。放射標識されたトレーサーから複雑な蛍光マーカーにわたる、いくつかの検出方法が、現在使用されている。スクリーニングされるべき各標的タンパク質に関して、研究者は、適当な基質又はリガンドを同定し、そして調製するために、そして適当な実施可能な検出方法を開発するために、その特別な酵素又は調節機能を知らなければならない。有用な生理学的役割をもつことが知られているが、その酵素又は調節機能が知られていない遺伝子産物は、ＨＴＳにおける標的として使用されていない。したがって、上記アプローチは、アッセイの開発及び実施において多額の投資を要求し、ほんの制限された数の標的タンパク質のＨＴＳが、所定の時間期間に行われることを許容する。
【０００３】
全ゲノム配列決定プロジェクトは、伝統的なアプローチからＨＴＳ研究へのパラダイムにおけるシフトを後押ししている。上記配列決定努力の１の重要な結果は、確認された標的（ｖａｌｉｄａｔｅｄ　ｔａｒｇｅｔｓ）の大きなコレクションの同定である。しかしながら、低分子発見への最近のアプローチは、単一標的ＨＴＳモデルに基づいているので、科学者は、生成する多量のゲノム情報を効率的に使用し、かつ、利用することができない。したがって、高く確認された標的、すなわち、知られた機能をもつ標的のみが、ユニークなスクリーンの開発を保証する。さらに、新たに発見された確認された標的の大部の機能は知られていないので、上記の場合において単一標的ＨＴＳの開発は不可能である。明らかに、現在の単一標的ＨＴＳアプローチは、いくつかの経済的、実行可能性上、及び計画上の（ｌｏｇｉｓｔｉｃ）制限をもつ。したがって、各標的についてのユニークなスクリーンの開発を伴わずに、ほんの２〜３よりも多くの標的を分析することができるＨＴＳは、ゲノム分析の分野においてかなりの利点を提供するであろう。さらに、未知の機能をもつ多数の標的を分析することができるＨＴＳも、ゲノム分析の分野においてかなりの利点を提供するであろう。
【０００４】
本発明は、遺伝子クローニングと発現、タンパク質精製と修飾、リガンド同定と合成、及びアッセイ・プラットホーム技術を併合して、ゲノム基準上で、標的の並列な、大規模な、多岐にわたるスクリーニングを許容する新規スクリーン及び方法とする。本発明は、さらに、未知の機能をもつ多数の標的をＨＴＳのやり方で分析することができるスクリーン及び方法を提供する。未知の機能をもつタンパク質は、それに関して、当業者が、酵素、調節、構造又は受容体活性を関係づけることができないところのタンパク質である。
【０００５】
好ましい態様においては、本発明の方法及びキットは、生理学的プロセスに対するそれらの不可欠性についてのゲノム情報に基づき、本明細書中“標的タンパク質”ともいわれる、遺伝子産物のコレクション又は複数の遺伝子産物を使用する。しかしながら、本発明の方法及びキットは、標的タンパク質の酵素又は調節機能が知られていることを要求せず、又はそのためにそれらの不可欠性を要求しない。
【０００６】
本発明に従えば、各所望の標的タンパク質をコードする遺伝子が調製され、発現ベクター内に移入され、そして適当な宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バキュロウイルス、哺乳動物細胞又は酵母内に移される。この遺伝子産物又は標的タンパク質は発現され、そして次に精製される。
精製された標的タンパク質は、ビオチニル化され、そしてそれらの表面上に外来タンパク質を提示するファージを選別するために使用される。精製された標的タンパク質に選択的に結合するペプチド配列を含むファージは、別々に増幅され、そして上記ペプチドをコードするＤＮＡが配列決定される。このＤＮＡによりコードされるペプチド配列が合成され、そして本発明の方法及びキットにおいてサロゲート・リガンドとして使用される。
【０００７】
標的モジュールは、個々の検出可能なビーズに結合されたサロゲート・リガンドを用いて、その検出が可能となるように修飾された、標的タンパク質に選択的に結合させることに調製される。本発明の１の態様においては、１００の標的モジュールは、１００の着目標的タンパク質のために構築される。１００の標的モジュールは、多チャンバー容器の各チャンバー内で一緒に混合される。テストされるべき化合物又は化合物のコレクションは、各チャンバーに添加され、そして化合物と各標的モジュールの相互作用が観察される。好ましい態様においては、上記相互作用の分析は、フロー・サイトメトリーにより実施される。特定の標的タンパク質に特異的な化合物は、そのタンパク質をその標的モジュールから置き替えるであろう。そのように破壊された標的モジュールの同定は、上記サロゲート・リガンドがそれに結合するところの特定のビーズを同定することにより行われる。
【０００８】
より詳しくは、本発明の方法は、以下のステップ：複数の標的タンパク質を得；サロゲート・リガンドの第１セットを得、ここで、サロゲート・リガンドの上記セット内の各サロゲート・リガンドは第１標的タンパク質に選択的に結合し；サロゲート・リガンドの上記第１セットを第１の検出可能なビーズに結合させて、サロゲート・リガンド−ビーズ複合体の第１セットを形成し、ここで、上記第１の検出可能なビーズの全てが、上記第１の検出可能なビーズの光学特性により検出されることができ；サロゲート・リガンド−ビーズ複合体の上記第１セットを、検出のために標識された上記第１標的タンパク質と併合して、第１標的モジュールを形成し；同時に又は順番に、サロゲート・リガンドの異なるセットと検出可能なビーズを、そして上記第１標的タンパク質又は異なる標的タンパク質を用いて、上記ステップを繰り返して、標的モジュールの複数セットを形成し；標的モジュールの上記複数セットを、多チャンバー容器の各チャンバーに添加し；テスト化合物又はテスト化合物のコレクションを、上記多チャンバー容器の各チャンバーに添加し；テスト化合物による標的タンパク質の置き替えを検出し；そしてテスト化合物により置き替えられた各標的タンパク質を同定する；
を含む。
【０００９】
本発明の方法は、さらに、以下のステップ：ファージ・ライブラリーを得、ここで、上記ライブラリーの各ファージが、外来ペプチドを提示し；上記ファージ・ライブラリーを、前記複数の標的タンパク質の中の前記標的タンパク質の各々と混合し；前記標的タンパク質の各々に選択的に結合する上記外来ペプチドを提示するファージを単離し；前記標的タンパク質の各々に結合する上記外来ペプチドをコードするＤＮＡを単離し；上記ＤＮＡをシークエンシングし；そして上記シークエンシングに基づき、サロゲート・リガンドの前記セットを合成する；
により前記のサロゲート・リガンドのセットを得るステップをさらに含む。
【００１０】
本発明の方法は、以下のステップ：ゲノムから標的遺伝子を選択し；上記標的遺伝子の各々を発現させて、前記標的タンパク質のセットを作製し；そして前記標的タンパク質を精製する；
による、複数の標的タンパク質を得るステップをさらに含む。
【００１１】
本発明の方法は、以下のステップ：前記標的タンパク質をビオチニル化し；そして前記標的タンパク質をアビジン−フィコエリスリンと連結させる；
を含む。
【００１２】
本発明は、さらに、以下のステップ：ゲノムから標的遺伝子を選択し；上記標的遺伝子の各々を発現させて、前記標的タンパク質のセットを作製し；そして前記標的タンパク質を精製する；
により、標的タンパク質を提供する。
【００１３】
本発明は、さらに、ペプチド、ＲＮＡアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、及びβ−ペプチドを含む群から選ばれるサロゲート・リガンドを使用することを提供する。サロゲート・リガンドは、コンビナトリアル・ケミストリー又は天然化合物コレクションから得られる低分子から選択されることもできる。本発明は、未知の機能をもつ標的タンパク質をスクリーニングすることも提供する。
【００１４】
本発明は、さらに個々のビーズの各々を、２つの染料の所定のコンビネーションで、３つの染料の所定のコンビネーションで又は計量可能な点（ｑｕａｎｔｕｍ　ｄｏｔｓ）の所定の集団で、標識することを提供する。
本発明は、１００の標的タンパク質が多チャンバー容器の各チャンバー内でスクリーンされるように１００のビーズでスクリーンすること、又は、１０００の標的タンパク質が多チャンバー容器の各チャンバー内でスクリーニングされるように、１０００のビーズでスクリーンすることをも提供する。
【００１５】
本発明はさらに、０．１〜１００ｎｇの範囲内にあるチャンバー当りに使用される化合物の量でスクリーニングすることを提供する。
【００１６】
本発明は、ゲノムから複数の標的タンパク質をスクリーニングするためのキットであって、以下の：標的モジュールのセット、ここで、標的モジュールの上記セットの中の各セットは：個々に検出可能なビーズ；上記検出可能なビーズに結合されたサロゲート・リガンドのセット、ここで、サロゲート・リガンドの上記セットの中のサロゲート・リガンドは、前記複数の標的タンパク質の中の同一の又は異なる標的タンパク質に選択的に結合され；前記標的タンパク質は、検出のために標識されており；及び多チャンバー容器、ここで、標的モジュールの前記セットは、上記多チャンバー容器の各チャンバー内に保存される、
を含む前記キットをも、提供する。
【００１７】
本発明は、個々に検出可能なビーズ、サロゲート・リガンド、及び複数の標的タンパク質を使用するハイスループット・スクリーニング方法であって；多チャンバー容器の各チャンバー内で、標的分子の複数セットを混合し、ここで、標的分子の上記セットの中の各セットが、リガンド−ビーズ複合体と、検出のために標識された標的タンパク質を含み；ここで、上記リガンド−ビーズ複合体が、個々に検出可能なビーズに結合されたサロゲート・リガンドを含み；ここで、上記サロゲート・リガンドの各々が、上記標的タンパク質の中の１に選択的に結合することが知られているこのペプチド配列に従って上記方法において使用するために選択され；上記多チャンバー容器の上記各チャンバーに、テスト化合物を添加し、それにより、上記化合物が、上記標的化合物がそれと相互作用するところの上記標的モジュールからの上記標的タンパク質に置き替わり；テスト化合物による標的タンパク質の置き替えを検出し；そしてテスト化合物により置き替えられた各標的タンパク質を同定すること、
を含む、前記ハイスループット・スクリーニング方法をも提供する。
【００１８】
本発明の方法のステップの順番は決定的ではなく、他の順番も可能であると理解すべきである。
【００１９】
遺伝子クローニング及び標的の発現
表ＩＩ、Ａ部は、着目遺伝子のクローニングと、対応の標的タンパク質の発現及び精製の一般ステップを説明する。遺伝子産物又はタンパク質は、ノック−アウト、ｍｉｓ−発現、又は遺伝子破壊実験により決定されるように、農薬又は医薬デザイン研究のための標的として潜在的であることが示されているとき、標的タンパク質であると考えられる。本発明の好ましい態様においては、着目遺伝子のコレクションは、特定の生物の全ゲノムから成ることができる。有用なコレクションは、９６の着目遺伝子又はその倍数から成るかもしれない。なぜなら、それらは、マイクロタイター・プレートに基づく実験を用いて並行処理されることができるからである。
【００２０】
上記遺伝子の各々についての２つのＰＣＲプライマーのセットは、上記配列から得られ、そして対応のｃＤＮＡを増幅するために使用される。テンプレートは、ｍＲＮＡの集団の逆転写により得られた第１鎖ｃＤＮＡ又はプラスミド又はファージ・ライブラリーからＤＮＡを精製することにより調製された２本鎖ｃＤＮＡであることができる。増幅された材料は、多用途クローニング系、例えば、ユニバーサル・ドナー・ベクターからさまざまな発現ベクター内への方向性クローニングのためのＣｒｅリコンビナーゼを使用するＥｃｈｏ（商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、又はさまざまな発現ベクター内へのクローニングのためにバクテリオファージ・ラムダに基づく部位指定組換えを使用するＧＡＴＥＷＡＹ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）内で使用される（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏ． （１９９８）， ８ ： １３００ ； Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （１９８９）， ５８ ： ９１３ ； 及びＰｔａｓｈｅ， （１９９２） Ａ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｗｉｔｃｈ， Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）。正しい方向は、外部プライマーと内部プライマーを用いたＰＣＲによりチェックされる。
【００２１】
Ｅｃｈｏ（商標）Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍを使用して、着目遺伝子はＥ．ｃｏｌｉ、バキュロウイルス、哺乳動物細胞又は酵母発現ベクターに移入される。標的タンパク質の精製を容易にするためには、上記発現ベクターは、アフィニティー・タグ、例えば、ＧＳＨ−アガロース・クロマトグラフィー（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９８６） ＰＮＡＳ ８３ ： ８７０３−８７０７ ）による精製を可能にするＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）、金属キレート・クロマトグラフィー（Ｐｏｒａｔｈ ｅｔ ａｌ． （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５８ ： ５９８）上でのタンパク質精製を可能にする６×Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、又は他のアフィニティー・タグ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９５））を含むことができる。あるいは、上記発現ベクターは、タグを提供しなくともよく、そして上記タンパク質は、（封入体を用いた）分別遠心分離、疎水性相互作用、又はイオン交換クロマトグラフィーのいずれかにより精製される。上記プロセス全体は、９６ウェル・プレート内で並列して実施され、この９６ウェル・プレートは、プライマー調製、ＰＣＲ反応、Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換、及びＤＮＡテンプレート調製のために使用される。ロボット液体取扱い装置、例えば、Ｔｅｃａｎ　Ｇｅｎｅｓｉｓ（Ｔｅｃａｎ　ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）又はＱｉａｇｅｎ　Ｂｉｏｒｏｂｏｔ　９６００（Ｑｉａｇｅｎ　ＧｍｂＨ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が、ＰＣＲ反応のフォーマッティングのために使用される。コロニーの拾い上げは、Ｇｅｎｅｔｉｘ　Ｑ−ｂｏｔ（Ｇｅｎｅｔｉｙ　Ｌｔｄ，ＵＫ）の如きロボットにより、取扱われる。
【００２２】
本発明の１の態様においては、クローン化された標的タンパク質は、慣用の誘導プロモーター、例えば、ｔａｃプロモーター、アラビノース・プロモーター、又はＴ７プロモーター（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， １９９５ ）を使用してＥ．ｃｏｌｉ内で発現される。プロテアーゼの欠如は、発現レベルを改善するよく知られた方法であり（Ｍｅｓｓｉｎｇ （１９８３） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １０１ ： ２０−７８）、このシステムは、最低、ｌｏｎＡプロテアーゼ、バクテリアの細胞質内でタンパク質分解活性の大部分に責任を負うＡＴＰ依存性酵素の抑制により改良された（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ． （１９９３） Ｇｅｎｅ １３６ ： ２３７−２４２）。他の遺伝的特徴、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞質内でジスルフィド結合の形成を高く強化する（Ａｓｌｕｎｄ ｅｔ ａｌ． （１９９９） ｉｎ Ｎｏｖａｔｉｏｎｓ １０， １１−１２ ）チオレドキシン・レダクターゼ（ｔｒｘＢ）遺伝子とグルタチオン・レダクターゼ（ｇｏｒ）遺伝子の両者内に突然変異をもつ、いわゆる、“Ｏｒｉｇａｍｉ（商標）”内での特徴も有用である。クローン化された標的は、ガラクトース誘導プロモーターを用いて酵母内で（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ （１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４ ： １４４０−１４４８）、ポリヘドリン・プロモーターを用いてバキュロウイルス感染昆虫細胞内で（Ｍａｉｏｒｅｌｌａ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６ ： １４０６−１４１０）、又はＣＭＶプロモーターを用いて哺乳動物細胞内で（Ｋａｕｆｍａｎ （１９９０） Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８５ ： ４８７−５１１）、発現されることもできる。
【００２３】
各着目遺伝子によりコードされ、そして発現された標的タンパク質は、現存の並行１ステップ技術、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＩ）及びＱｉａｇｅｎにより提供された技術を用いて精製される。標的タンパク質の推定分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの如き質量分析法により確認される。本発明の方法は未知の機能をもつタンパク質にも適用できるので、タンパク質が正しく折り畳まれていることを示すいくつかの指標が必要である。計測するための活性の不存在下では、標的タンパク質の折り畳みの存在は、ＣＤスペクトロスコピーにより確認される。上記目的のために、高感度の装置、例えば、π＊ −１８０（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ，ＵＫ）が使用される。封入体が、タンパク質の精製のために使用されるとき、そのタンパク質は、６Ｍグアニジン−ＨＣｌとのインキュベーションにより完全に変性され、そして次に、グアニジン−ＨＣｌ不含バッファーに対する透析又はグアニジン−ＨＣｌの低下する濃度を含むバッファー中での順次希釈により、再折り畳みされる。再折り畳みの後に、ＣＤスペクトロスコピーが行われる。
【００２４】
本発明の他の態様においては、標的のＰＣＲ増幅が、着目生物の全長ｃＤＮＡライブラリーの使用により置き替えられる。ゲノミックスの進展に伴い、上記のユニバーサル・ベクター内の上記ライブラリーが利用可能となるであろう。このようなライブラリーは、各々所定のｃＤＮＡを含む、一連の９６ウェル・プレート内に配置される。例えば、６０００の酵母発現タンパク質の完全相補物が、本発明に従って、６５未満の９６ウェル・プレート内に配置されうる。
【００２５】
サロゲート・リガンドの調製
サロゲート・リガンドは、所定のタンパク質についてアフィニティーをもつものとして同定された、ペプチド、ＲＮＡ、ベーター・ペプチド又は他の分子である。サロゲート・リガンドは、置き替えアッセイにおいて生理学的に関連するリガンドの置き替え物として働き、それにより、生理学的なリガンドの正体を知ることなく、本発明のハイスループット置き替えアッセイのデザインを可能にする。
【００２６】
本発明において使用する、表ＩＩのＢ部に簡単に説明するリガンド調製手順は、Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９９６） Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ ＮＹ． ｅｄｓ． Ｋａｙ， Ｂ．， Ｗｉｎｔｅｒ， Ｊ．， ａｎｄ ＭｃＣａｆｆｅｒｙ ； Ｊ． ； Ｃｗｉｒｌａ， Ｓ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ８７ ： ６３７８−６３８２ ； 及びＢａｒｒｅｔｔ， Ｒ．Ｗ． ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０４ ： ３５７−３６４に基づき、これらの全てを本明細書中に援用する。上記手順においては、標的タンパク質のビオチニル化、ファージの選別、ファージの精製、標的タンパク質についてのペプチド−ファージ・アフィニティーの推定、及び配列決定のためのファージＤＮＡの調製及び精製は、９６ウェル・フォーマットにおいて行われる。
【００２７】
本発明の１の態様においては、溶液相選別、その後の、マイクロタイター・プレート上でのファージの捕獲が使用される。溶液相選別のためには、上記のように、そして表ＩＩのＡ部に説明するように得られ、そして精製された標的タンパク質は、製造者（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により推奨された手順に従って、スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンを用いてビオチニル化される。遊離のビオチンは、Ｄ−Ｓａｌｔポリアクリルアミド６０００カラム（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．）を用いたゲル濾過を通過させることにより除去される。標的タンパク質のビオチニル化の程度は、〔２−（４′−ヒドロキシアゾベンゼン）安息香酸〕（ＨＡＢＡ）法（Ｇｒｅｅｎ， Ｎ．Ｍ． （１９６５）， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ９４， ２３ｃ−２４ｃ）により推定されることができ、又はタンパク質は、ビオチニル化の計測を伴わずに使用されうる。Ｐｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により推奨された手順に従ってスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−ビオチンを用いて、標的タンパク質は、定常的には、標的タンパク質当り１〜１０ビオチン分子の程度まで、ビオチニル化される。多数のタンパク質が、ポリプロピレン・マイクロタイター皿内でビオチニル化される、そして９６ウェルＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ　Ｍｉｎｉｃｏｌｕｍｎ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）内に充填されたＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を通過させることにより、遊離ビオチンから分離されることができる。
【００２８】
表ＩＩ、Ｂ部を再び参照して、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（洗浄バッファーＡ）を含む、９０μｌの、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ　ＨＣｌ，ｐＨ７．５中のビオチニル化標的タンパク質（０．０５μｇ〜１．０μｇ）を、９６ウェル・ポリプロピレン・マイクロタイター・プレート内の（ウェル当り１タンパク質）、ペプチド・ファージ・ライブラリー、例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから入手可能なもの（例えば、Ｐｈ．Ｄ．−１２，Ｐｈ．Ｄ．−７、又はＰｈ．Ｄ．−ｃｙｃ７）からのファージ（１０１１ｐｆｕ ）に添加し、そして室温で１時間インキュベートする。ファージ・ライブラリーは、上記タンパク質に特異的なファージを除去するために、ストレプトアビジンに対して事前に選別されることができる。各タンパク質に対応する各溶液は、次に、９６ウェルの、ストレプトアビジン被覆プレート（ウェル当り１溶液）のウェルに移される。これらのストレプトアビジン被覆プレートは、Ｐｉｅｒｃｅから得られるか、又は１５０μｌの０．１Ｍ　ＮａＨ　ＣＯ３ ｐＨ８．６中で１５μｇのストレプトアビジンとともにＮｕｎｃ　Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを４℃で一夜インキュベートし、その後、ブロッキング剤とともにインキュベートすることにより調製される。調製されたＮｕｎｃ　Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートは、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ標識されたビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．）の結合により計測されるとき、０．０２５μｇのビオチニル化標的タンパク質に結合することができる。２０分間のインキュベーションの後、ビオチンは、０．１ｍＭの最終濃度まで各ウェルの溶液に添加され、そしてインキュベーションが５分間続けられる。プレートは、数容の洗浄バッファーＡで洗浄され、そしてタンパク質標的に結合したファージは、各ウェルに、１００μｌの０．２ＭグリシンＨＣｌ，ｐＨ２．２を添加し、そして１０分間インキュベートすることにより溶離される。放出されたファージを含む酸溶液を、各ウェルから取り出し、そして１５μｌの１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．１を含む９６ウェル・ポリプロピレン・マイクロタイター・プレートのウェルに移される。
【００２９】
あるいは、選別は、Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｌｉｂｒａｒｙ　ｋｉｔのために推奨されるＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓのプロトコールに本質的に従って、実施される。標的タンパク質（１５０μｌ　０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３ ，ｐＨ８．６中５μｇ）が、９６ウェル・マイクロタイター・プレート（Ｃｏｓｔａｒ　９０１７又はＮｕｎｃ　Ｍａｘｉｓｏｒｐ）の各ウェルに添加され、そして緩やかに振とうしながら４℃において一夜インキュベートされる。次に、タンパク質溶液が除去され、そしてウェルは、ブロッキング・バッファー（０．１Ｍ　ＮａＨＣＯ３ ，５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ，ｐＨ８．６）で満たされる。プレートは、４℃で３時間インキュベートされ、その後、ブロッキング・バッファーが除去され、そしてプレートは洗浄バッファーＡで洗浄される。次に、ペプチド・ファージ・ライブラリーからの１０１１プラーク形成単位（ｐｆｕ ）が、洗浄バッファーＡに懸濁され、そして室温で１時間インキュベートされる。マイクロタイター・プレートは洗浄バッファーＡで洗浄される。ファージを溶出するために、１００μｌの０．２ＭグリシンＨＣｌ，ｐＨ２．２を各ウェルに添加し、そして１０分間インキュベートする。酸溶液を、各ウェルから取り出し、そして１５μｌの１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．１を含む９６ウェル・ポリプロピレン・マイクロタイター・プレートのウェルに添加する。
【００３０】
上記９６ウェルの各々から、溶出されたファージ（今回は、合計容量１００μｌ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＥＲ２７３８（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）（又は他のＥ．ｃｏｌｉ株であってＦ−因子を含むもの）の一夜培養物の１：１００希釈物を含む２ｍｌのＬＢ培地中で増幅した。この増幅を、こぼれを防止するために、Ｑｉａｇｅｎ　Ａｉｒ　Ｐｏｒｅストリップ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて、８つの滅菌１２ウェル・プレート内で行う。４．５時間後、サンプルを、９６ウェルの深いウェル・プレート（ウェル当り１サンプル）に移し、そして３，０００×ｇで遠心分離して、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞をペレット化した。上記ファージを含む９６の上清を、９６の深いウェル・プレート（ウェル当り１の上清）に移し、そして１／６容のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％ｗ／ｖポリエチレン・グリコール８０００，２．５Ｍ　ＮａＣｌ）を添加する。この溶液を、４℃で一夜インキュベートする。４℃で一夜沈殿させた後、サンプルを、Ｑｉａｇｅｎ　４〜１５℃遠心分離機内で５６００×ｇにおいて３０分間回転させて、上記ファージをペレット化した。９６上清の各々を除去し、そしてファージを、１００μｌの洗浄バッファーＡに再懸濁させた。２ｍｌの細胞培養物中で溶出したファージを増幅することにより１０１０〜１０１１ｐｆｕ のファージ収量が定常的に得られ、これは、数ラウンドの選別のための適当な数のファージを提供する。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が取り出され、そして上記ファージを含む上清が、本分野において知られているような遠心分離に代わる濾過により、回収される。
【００３１】
増幅されたファージは、第２及び第３ラウンドの選別において使用され、そして１００μｌの各増幅されたファージ（典型的には１０１０〜１０１１ｐｆｕ ）が、先に記載したように、その対応の標的タンパク質に添加される。選別は、同じやり方で実施される。但し、洗浄バッファーは、０．５％（ｖ／ｖ）までのＴｗｅｅｎ−２０（商標）濃度を含むことができる。ファージは、以下に記載するように滴定されることができ、又は、増幅されたファージの全１００μｌが、ファージ力価の推定を伴わずに選別のために使用されることができる。
第３ラウンドのアフィニティー選別の後に、ファージは滴定されうる。
【００３２】
ファージ・ストックの力価は、上記各増幅ステップの後に推定されることができ、又は溶出されたファージの力価は、選別後に推定されることもできる。ファージ力価を推定するために、ファージは、ポリプロピレン・マイクロタイター・プレート内で順次希釈され、そして細胞芝（ｃｅｌｌ　ｌａｗｎ）上にスポットされることができる。マイクロタイター・プレートのウェルは、９０μｌ　ＴＢＳ（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ，ｐＨ７．５，０．１５Ｍ　ＮａＣｌ）で満たされる。１０マイクロリッターのファージが、マイクロタイター・ピペッターにより、上記プレートの第１列に移され、そして多数回、ピペットにより上下されることにより混合される。この列から、１０μｌを、最後の列に達するまで、次の列に移す。ファージを、１０８ 倍超のレンジまで、このように希釈する。
この方法で、９６ファージのサンプルを、８マイクロタイター・プレートを用いて滴定のために希釈することができる。多チャンネル・ピペッターを用いて、２μｌの溶液を、上記マイクロタイター・プレート内のウェルのカラムから取り出し、そしてＩＰＴＧ（２００μＭ）とＸｇａｌ（１９０μＭ）を含み、そしてＥ．ｃｏｌｉ　ＥＲ２７３８（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）、又は他のＥ．ｃｏｌｉであってＦ因子を含むものの飽和培養物と混合された上部アガーにより重層されたＬＢ寒天プレート上にスポットした。
【００３３】
１６のこのような寒天プレートが、上記９６のファージ・サンプルの力価を推定するために必要である。寒天プレートを、３７℃で約１６時間インキュベートし、そしてファージを、青いプラークとして可視化して、上記ファージ・ストックの力価を推定する。ファージ力価は、上記寒天プレート上で個々のファージ・プラークを作り出した最大ファージ希釈を観察することにより計算される。３ラウンドのアフィニティー選別の後、個々のプラークを、上記ファージ力価に基づき、第３ラウンドのアフィニティー選別からの溶出ファージの適当な希釈物を、上記のＬＢ／ＩＰＴＧ／Ｘ−ｇａｌ寒天プレート上にピペットで移すことにより、単離される。１の寒天プレートが、溶出されたファージ・サンプルの各々のために必要とされる（すなわち、９６の寒天プレートが、９６の標的に対する選別から個々のファージを得るために必要とされる）。プレートを３７℃で一夜インキュベートして、青色のプラークを作り出す。各プレートからの１２の個々のプラークを、９６の深いウェル・プレート内で希釈したＥ．ｃｏｌｉ　ＥＲ２７３８の１：１００飽和培養物５００μｌに別々に移し、そして４．５時間激しく振とうしながら３７℃で増幅する。１２の９６ウェルの深いプレートが、上記９６標的のために必要とされる。ファージは、先に記載したようにＵｎｉｐｌａｔｅフィルター・プレートを用いて細胞から分離されることができる。無細胞培地中のファージは、先に記載したように滴定され、そしてファージＥＬＩＳＡのために使用されることができる。
【００３４】
どの個々のファージが最も強く標的タンパク質に結合するかどうかを測定するために、ファージＥＬＩＳＡを使用する。ＥＬＩＳＡは、ＮＥＢプロトコールと本質的に同じ方法で実施する。但し、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）基質として、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用する。ＥＬＩＳＡシグナルを、マイクロタイター・プレート・リーダー、例えば、Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ（Ｔｅｃａｎ）内で６００ｎｍにおいて読む。全てのファージ・サンプルが、等しい濃度にあるように個々のファージを希釈する（典型的には、５０μｌの洗浄バッファーＡ中、２×１０８ 〜２×１０９ｐｆｕ）。個々のファージを、先に記載した直接選別法において記載したように、標的タンパク質で被覆したウェルに移す。溶液相選別の場合には、ビオチニル化標的タンパク質を、ストレプトアビジン・プレートに添加し、そして次にファージを、マイクロタイター・プレートに添加する。ファージを、先の選別ステップにおいて記載したように結合させる。但し、上記プレートから未結合ファージを洗浄した後に、ＨＲＰ標識抗−Ｍ１３抗体（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）の１：５０００希釈物１５０μｌを、各ウェルに添加し、そしてインキュベートし、その後に取り出し、そして上記ウェルを洗浄する。ＨＲＰ基質ＴＭＢ（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を添加し、そして６００ｎｍにおける吸光度をモニターする。好ましくは、最高のアフィニティーを示すファージだけを、本発明の方法及びキットにおいて使用する。それらの対応の標的タンパク質について最高のアフィニティーをもつ個々のファージを、９６ウェルの深いウェルプレート内で上記ファージを、増殖させることにより、配列決定し、それによりファージＤＮＡを、製造者の推奨手順に従って、現存キット（Ｑｉａｐｒｅｐ　９６　Ｍ１３キット；Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｉｃａ，ＣＡ）を用いて、９６ウェル・フォーマットにおいて調製する。ＮＥＢファージ・ライブラリーの場合には、ファージＤＮＡは、Ｐｈ．Ｄ．Ｐｈａｇｅ　Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｋｉｔｓにより供給されたプライマーを用いて配列決定される。
【００３５】
表Ｉ
表Ｉは、先に記載した選別プロトコールに従って得られるサロゲート・リガンドの配列例を示す。使用したライブラリーは、Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｖｉｓｔａ．ＣＡ．から得られる、ＨｙＢである。５μｇ標的タンパク質、及び１０９ｐｆｕの個々のファージによるマイクロタイター・ウェルの直接コーティングを使用して行われるファージＥＬＩＳＡは、２つの標的タンパク質についての（標的タンパク質を全く含まない）バックグラウンド・ウェルを上廻るＥＬＩＳＡシグナルをもたらす。
【００３６】
【表１】
2004507739.tif 000002
【００３７】
表Ｉの上記２つの実施例は、サロゲート・リガンドが、どのようにコンセンサス配列（標的タンパク質＃１に関してＧＲＫＬＥ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）、標的タンパク質＃２に関してＡＸＧＧ／Ｌ　ＲＤ（配列番号１３））の周りにクラスターを形成するかを示す。それらは、生理学的意味をもたないアウトサイダーが、どのようにしてコンセンサス配列（標的＃１においてファージＩＤ　１ａ３）の欠如により同定されるのかということをも示す。
【００３８】
本発明の方法を使用して、サロゲート・リガンドの複数セットが得られ、ここで、サロゲート・リガンドの各セット内の各サロゲート・リガンドは、所望の標的タンパク質の中の１に選択的に結合する。したがって、１セットのサロゲート・リガンドは、所望標的タンパク質の各々について作製される。本発明の１の態様においては、サロゲート・リガンドは、未知の機能をもつ複数の標的タンパク質に選択的に結合する。
【００３９】
サロゲート・リガンドは、その結合が、他の標的へのその結合から容易に区別されることができるような方法でその標的に結合するとき、“選択的に結合”する。なぜなら、ａ）生成されたシグナルはバックグラウンド・シグナルよりも高く、そしてｂ）その結合は、それが非特異的な標的についてよりも特異的な標的についてより高いアフィニティーを有するからである（非特異的標的への結合から得られるシグナルは弱いか又は存在しない）。
【００４０】
単一ファージ上でペプチドの多コピーを提示するファージ・ライブラリーの代替物として、１の又は１より小さなペプチド／ファージを提示する１価ファージが、本発明の方法により使用されうる。１価ファージの使用は、より高いアフィニティー・ファージをもたらすことができる。Ｌｏｗｍａｎ， Ｈ．Ｂ． （１９９７）， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ２６ ： ４０１−２４。１のこのようなファージ・ライブラリー、ＨｙＢは、Ｄｉｓｐｌａｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｖｉｓｔａ．ＣＡから得られうる。ＨｙＢライブラリーを使用して、ファージは、上記のように選別され、そして増幅される。但し、ヘルパー・ファージＭ１３ＫＯ７は、ファージの産生のためのファージ増幅の間に添加されなければならない。このファージミド系においては、提示されたペプチドは、ヒト分泌性トリプシン・インヒビター（ＰＳＴＩ）に結合され、これは、その後、線維状ウイルスのｇ３タンパク質上に提示される。Ｒｏｔｔｇｅｎ， Ｐ．， ａｎｄ Ｃｏｌｌｉｎｓ， Ｊ． （１９９５） Ｇｅｎｅ １６４ ： ２４３−２５０。
【００４１】
このような系は、多価ディスプレイよりもより高いアフィニティーをもつペプチド・ファージをもたらすことができる。Ｇｒｅｅｎ， Ｎ．Ｍ． （１９６５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ９４ ： ２３ｃ−２４ｃ。この系においても、選択されたペプチドを提示するＰＳＴＩタンパク質は、発現ベクターに移され、そして１リッター細胞培養物からミリグラム量で精製されることができる（Ｍａｙｗａｌｄ， Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｇｅｎｅ ６８ ： ３５７−３６９）。
【００４２】
本発明の他の態様においては、ペプチド・サロゲート・リガンドは、ＲＮＡアプタマーにより置き替えられることができる。このようなＲＮＡアプタマーの選択及び調製方法は、公表されている（レビューのためには：Ｆａｍｕｌｏｋ， Ｍ （１９９９） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ９ ： ３２４ ； Ｈｅｒｍａｎ， Ｔ ａｎｄ Ｐａｔｅｌ， Ｄ．Ｊ． Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０００）， ２８７ ： ８２０−８２５）； Ｋｅｌｌｙ， ＪＡ， Ｆｅｉｇｏｎ， Ｊ， Ｙｅａｔｅｓ， （１９９６） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５６ ： ４１７ ； 及びＦｅｉｇｏｎ， Ｊ， Ｄｉｅｃｋｍａｎ， Ｔ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ， Ｆ．Ｗ． （１９９６） Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ３ ： ６１１を参照のこと）。ペプチド・サロゲート・リガンドは、ベータ−ペプチドにより置き替えられることもできる。ベータ−ペプチドは、ベータ−アミノ酸から作られ、ベータ−アミノ酸は、ペプチド骨格内に追加のメチレン基を含む（Ｓｅｅｂａｃｈ， Ｄ ａｎｄ Ｍａｔｔｈｅｗｓ， Ｊ．Ｌ． （１９９７） Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍ． ２０１５−２０２２ ； Ｇｅｌｌｍａｎ， Ｓ （１９９８） Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ３１ ： １７３−１８０）。ベータ−ペプチド対天然ペプチドの予想される高められた安定性に因り、このように作製されたサロゲート・リガンドは、天然ペプチド・サロゲート・リガンドよりもより短いものであると推定され、そしてそれゆえ、標的タンパク質の各々のためのリガンドを同定するためにスクリーンされる必要があるサロゲート・リガンドのプールの複雑さを単純にするかもしれない。各標的タンパク質にとって適当なベータ−ペプチド・サロゲート・リガンドの選択は、天然ペプチドのいくつかのコレクションのために使用されたプロトコール、例えば、Ｙａｆｆｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｃｅｌｌ， ９１ ： ９６１−９７１に基づくことができる。上記プロトコールは、タンパク質標的にリガンドのコレクシュンを提示し、そしてその後、ゲル濾過によりその複合体を分離することにより、特異的リガンドを選択する。選択されたリガンドは、次に、質量分析により同定される。
【００４３】
ハイスループット複合置換アッセイ（Ｈｉｇｈ　Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）
本発明の複合ＨＴＳ置換アッセイは、Ｌｕｍｉｎｅｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ　ＴＸにより開発された技術を取り込む。この技術は、２つの染料の所定のコンビネーションにより個々に標識された１００の５μｍ微小球（“ビーズ”又は“粒子”）のコレクションを提供する。上記ビーズの表面は、上記ビーズへのアナライト（核酸、タンパク質、又は他のこのような材料）のカップリングを許容するように修飾される。また、アナライトは、好ましくは、蛍光分子（核酸、タンパク質、又は他のこのような材料）により標識される。ビーズの同一性、そしてそれゆえ、それにカップリングするアナライトの同一性は、フロー・サイトメトリーにより測定される。１００の異なるビーズが利用可能であるので、１００の異なるアナライトとそれらの対応の蛍光標識の相互作用は、同時に計測されることができる。Ｌｕｍｉｎｅｘ複合アッセイは、米国特許第５，９８１，１８０号中に記載されており、これを本明細書中に援用する。現在のＬｕｍｉｎｅｘビーズは、１００のビーズのコーディングを許容する２つの塗料を担持するけれども、３つの染料も可能であり、そして１０００のビーズ及び対応の標的タンパク質の同時コーディングを可能にするであろう。
【００４４】
一旦、サロゲート・リガンドが、上記のように本発明の方法により同定され、そして配列決定されれば、それらは、商業的なペプチド供給者により合成され、そして得られる。本発明の好ましい態様においては、サロゲート・リガンドはＮ又はＣ末端システイン残基をもつ。コストを抑えるために、Ｎ末端よりもむしろＣ末端としてシステインをもつことが好ましい。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄペプチド合成手順は、Ｃ末端から出発し、そして多量のＣｙｓ残基が調製され、そして全てのペプチド合成研究のために使用される。１ｍｇ量のペプチドは、本発明の方法による使用のために十分なものである。
【００４５】
本発明の方法に従えば、本発明のサロゲート・リガンドの各々は、本明細書中リガンド−ビーズ複合体というものを形成するために、個々に標識され、かつ、検出可能なビーズに結合される。用語“複合体”とは、リガンドがビーズに結合する間に形成される構造物をいう。標的タンパク質は、本発明の標的モジュールの複数セットを形成するために、それらの対応のリガンド−ビーズ複合体に選択的に結合する。例えば、特定の標的タンパク質が、特定のリガンド−ビーズ複合体に選択的に結合して、第１標的モジュールを形成する。他の標的タンパク質は、他の（又は同一の）リガンド−ビーズ複合体に選択的に結合して、第２標的モジュールを形成し、以下、同様である。
【００４６】
本発明の方法の１の態様は、標的タンパク質を標識するために、アビジン結合フィコエリスリンを使用する。記号λｅｘ１ 、λｅｍ１ は、ビーズ同定のための励起及び発光波長を示す。記号λｅｘ２ 、λｅｍ２ は、上記ビーズ関連した蛍光を計測するための波長を示す。あるいは、標的タンパク質は、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術に適合した蛍光基により標識されることもできる。このような基の例は、Ａｌｅｘａ　５３２染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）又はＣｙ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）である。
【００４７】
本発明のアッセイは、マイクロタイター・プレート（９６又は３８４ウェル形式）の各ウェル内で標的モジュールの複数セットをインキュベートすることにより行われる。反応容量は、１０〜１００μｌの間であることができる。使用されるバッファーは、各場合に適したものとされうるが、典型的には、ＰＢＳ又は０．１Ｍ　ＮａＣｌを含むｐＨ７．５における１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌである。１の態様においては、１０００〜５０００ビーズが、特異的、標的モジュールの各セットを占め、そしてマイクロタイター・プレートの各ウェル内で、０．１〜１００ｎＭの標的タンパク質、及び０．１〜１００ｐＭのアビジン−フィコエリスリンとともに存在する。さらに、ウェルは、１〜５％の最終濃度のＤＭＳＯにおいて１〜１０μＭのテスト化合物を含む。したがって、１の態様においては、（標的モジュールの複数セットを表す）１００，０００〜５００，０００ビーズが、１０〜１００μｌの同一最終容量において存在する。反応混合物は、１〜３０分間室温においてインキュベートされ、そしてＬｕｍｉｎｅｘ検出装置を使用して、分析した。
【００４８】
本発明は、本発明により分析され、そして計測された物理的存在物が、標的タンパク質の、その対応のサロゲート・リガンドへの選択的結合であることを認識する。この物理的存在が生化学的に意味のあることを保証するためのステップが採られる。例として、そのＫ１ により定義され、そして酵素アッセイにより計測されるような、サロゲート・リガンドの阻害能力は、そのＫＤ として定義され、そしてＬｕｍｉｎｅｘビーズ・アッセイ設定において計測されるような、標的タンパク質についてのそのアフィニティーに対して比較された。図１Ａと図１Ｂに示すこの比較は、上記２つの値が本質的に同じであることを証明する。
【００４９】
本発明は、標的タンパク質がしばしば２以上の関連の結合部位を提示するであろうことをも認識する。例えば、キナーゼは、基質とＡＴＰが結合する触媒部位、及びシグナル伝達経路内の直上流のタンパク質と相互作用するタンパク質相互作用部位をもつ。サロゲート・リガンドは、上記部位の各々について同定される。異なるビーズへの上記サロゲート・リガンドの各々の結合により、異なる部位が同時にプローブされる。
【００５０】
いくつかの適用においては、本発明は、ビーズに結合するサロゲート・リガンドよりもむしろ標的タンパク質をもつことが有利であることをも認識する。この場合、標的タンパク質は、ビーズ表面上に存在する反応性基との共有結合の形成により又はアビジン被覆されたビーズとの相互作用により、ビーズに連結される。サロゲート・リガンドは、溶液中で遊離しており、そしてアビジン−フィコエリスリンを介した検出のために、ビオチンにより、又は直接検出のために、蛍光染料、例えば、Ａｌｅｘａ　５３２又はＣｙ３により、標識される。
【００５１】
本発明は、Ｌｕｍｉｎｅｘ技術が、同じく特異的マーカーによりビーズを同定する技術により置き替えられることができるということも認識する。例えば、１のこのようなマーカー系は、Ｑｕａｎｔｕｍ　Ｄｏｔ（商標）（Ｑｕａｎｔｕｍ　Ｄｏｔ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）ともいわれる。Ｑｕａｎｔｕｍ　Ｄｏｔ（商標）は、そのサイズに依存して、ＵＶ光で励起されたとき、紫外〜赤外にわたる単一波長光を発光する２〜１０ｎｍ　ＣｄＳｅ結晶である（Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｎｉｅ （１９９８）， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１ ： ｐ ２０１６−２０１８）。このアプローチにおいては、ポリマー・ビーズであるかガラス・ビーズであるかを問わず、各ビーズは、測定可能なドット（ｑｕａｎｔｕｍ　ｄｏｔｓ）の所定の集団により同定される。測定可能なドットの集団の複雑さは、記録されることができる別個のビーズの合計数を定める。与えられた測定可能なドットの不存在の存在により定められるセット−アップの複雑さは、以下の式：
複雑さ＝２（ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ） −１
により計算される。
【００５２】
例えば、５つの測定可能なドットが使用される場合、３１のビーズがコードされることができる。与えられた測定可能なドットの不存在、低い量又は高い量により定められるセット−アップの複雑さは、以下の式：
複雑さ＝３（ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ） −１
により計算される。例えば、５つの測定可能なドットが使用される場合、２４２のビーズがコードされることができる。少数の測定可能なドットを使用する場合でさえも、ビーズのより大きなコレクションがコードされることができるということが分かる。これは、よく分離された発光をもつ測定可能なドットの使用を許容し、これは今度は、そのビーズの検出及び同定が、低コストのイメージング・システムにより行なわれることができるようにする。このようなシステムは、ＵＶ光源、コンピューター制御による９６ウェル・プレートを保持する機械ステージ、及びカラー・ディジタル・カメラ、例えば、コンピューター研究のために使用されるものを備えた顕微鏡であることができる。各ウェル内の反応は、Ｌｕｍｉｎｅｘアプローチのためのものと同じ要素から作られるが、Ｌｕｍｉｎｅｘビーズを置き替える測定可能なドット・コーディング・ビーズを用いたものである。ビーズがウェルの底に沈んだ後、９６ウェル−プレートを上記顕微鏡上で走査し、画像をキャプチャーし、そしてコンピューターで分析する。このセット−アップは、上記５つの測定可能なドットの色と、結合した蛍光リガンドに因るビーズに関連した蛍光のための６つ目の色の間を区別することだけが必要とされる。この最後の蛍光源は、ビーズ・コーディングとは異なる色をもつ６つ目の測定可能なドットであることもできる。
【００５３】
あるいは、マイクロフルイディクス（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）のセット−アップ、例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｌｉｐｅｒ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ）から入手可能なものが、本発明により使用されうる。この場合には、サロゲート・リガンドと標的タンパク質の両者は溶液中で遊離している。サロゲート・リガンドは、蛍光、例えば、フルオレセイン、テトラメチルローダミンその他により標識される。相互作用の検出は、本分野において知られているように蛍光分極（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）により行われることができる。蛍光分極法は、感度の欠如、及び多量の標的タンパク質の必要性を欠点とする。このようなタンパク質の典型的な濃度は、１０〜５０μＭである。２５μｌアッセイ容量においてアッセイされる５０ｋＤａ タンパク質の場合には、１００，０００の化合物をアッセイするために、１．２５〜６．２５グラムのタンパク質が必要とされる。これらの多量は、ＧｅｎｏｍｉｃｓベースのＨＴＳとは適合しない。マイクロフルイディクス・セット−アップを使用することにより、反応容量は、１０ｎｌ以下に減少され、５００μｇ以下の標的タンパク質を要求することになる。この場合、各化合物は、順番に、各標的に対してサンプリングされる。
【００５４】
本発明は、所定の生物内で発現されるタンパク質の、又はそのサブセット、例えば、特定の代謝又はシグナリング経路に関係するタンパク質のための全相補物を表す標的モジュールのセットを含むスクリーニング・キットをも含む。リガンド−ビーズ複合体は、４℃において滅菌して安定して保存される。対応の複数のタンパク質標的は、−８０℃において滅菌されてアリコートとして保存される。あるいは、標的モジュールの複数セットが構築され、そして多チャンバー容器の個々のチャンバー内で保存される。本発明のキットは、一部、潜在的に有用なタンパク質標的をテスト化合物と会合させるために、使用される。
【００５５】
本発明の１の利点は、本発明が、標的タンパク質の伝統的なＨＴＳに比較して、１日当りに採取されたデータ点のかなりの増加を提供するということである。本発明の方法及びキットは９６又は３８４ウェル・プレートのためにフォーマットされるので、本法は、例えば、上記反応をアセンブルするためのＴｏｍ　Ｔｅｃ　Ｑｕａｄｒａ　９６ｐｌｕｓ（ＴｏｍＴｅｃ，Ｈａｍｄｅｎ，ＣＴ）、及びそのアセンブルされたプレートをＬｕｍｉｎｅｘ／ＨＴＳ検出装置に搬送するためのＨｕｄｓｏｎ　Ｐｌａｔｅ　Ｃｒａｎｅ（Ｈｕｄｓｏｎ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）から成るロボット・プラットホームに適したものとされる。したがって、本発明の方法とキットは、２０分毎に１の３８４ウェル・プレートを分析する。１００の標的が併合され、そして単一の低分子がウェル当りに存在するとき、本発明の産出量は１時間当り１１５，２００データ点である。１０時間の１日サイクルにおいて２４プレートがアッセイされるとき、本発明の方法及びキットは、１日当り１１０万のデータ点を収集する。比較として、ＨＴＳに関係する４３のＬｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ企業の調査は、推定データ点の収集は、１９９９年について１ヶ月当り１３５，０００〜１７５，０００であり、そして２００２年においては、１ヶ月当り４９０，０００〜６１５，０００まで上昇すると予測されている（Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ： １９９９−２０００ Ｍａｒｋｅｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｍａｎｕｆａ ｃｔｕｒｅｒｓ， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ Ｃｏｎｓｕｌｔａｎｔｓ， Ｂｏｕｌｄｅｒ， ＣＯ）。同じ調査において、これらの企業は、研究からの標的のゲノム・サイズのコレクションについてのデータの収集を経済的にする、データ点当りの価格の低下を期待していない。
【００５６】
さらに、本発明の方法は、スクリーニングされるべき化合物をひじょうに効率的に利用する：ひじょうに少量の各化合物だけが、多数の標的をテストするために消費される。本発明の方法及びキットの１例として、１００μｌアッセイ容量は１００の標的を含み、そして５００の平均分子量をもつ化合物コレクションが２μＭにおいてテストされ、１００の標的テストは、１００ｎｇの化合物を要求するであろう（又は標的当り１ｎｇ）。上述の調査に基づけば、典型的なアッセイは、ウェル当り５０μｌ容量を使用する３８４ウェルのフォーマットを使用する。ウェル当りたった１の標的がアッセイされるので、伝統的なＨＴＳフォーマットにおいて１００の標的を実行するために必要とされるであろう化合物の当量は、５μｇである（又は標的当り５０ｎｇ）。
【００５７】
本発明の他の利点は、本発明が、未知の機能をもつタンパク質をスクリーンするＨＴＳ法及びキットを提供するということである。
先に開示した態様は例示的である。本発明の開示は、当業者をして本発明の多くの変更を成さしめるであろう。このような自明かつ予測しうる変更は全て、添付の請求の範囲により包含されると意図される。
【００５８】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】図１Ａは、酵素阻害により計測された、標的タンパク質について同定されたサロゲート・リガンドの阻害定数を示すグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、リガンドがビーズに結合しているＬｕｍｉｎｅｘ（商標）ビーズ・セット−アップにおいて計測された、Ｆｉｇ．１Ａにおいて示したものと同じサロゲート・リガンドとタンパク質についてのアフィニティー定数を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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