(57)【要約】本発明は、シトクロムＰ４５０クラスの酵素、これらの酵素をコードするヌクレオチド配列、及び病原体抵抗性植物の作製方法におけるそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するアレン酸化物シンターゼ又はそのイソ酵素。
【請求項２】
配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するジビニルエーテルシンターゼ又はそのイソ酵素。
【請求項３】
基質として９−ＨＰＯＤ／ＴＥ及び１３−ＨＰＯＤ／ＴＥの両者を変換する請求項１又は２に記載の酵素。
【請求項４】
コケ又は高等植物に由来する請求項１〜３のいずれかに記載の酵素。
【請求項５】
ヒメツリガネゴケに由来する請求項１〜４のいずれかに記載の酵素。
【請求項６】
多価不飽和脂肪酸の生合成に関与する請求項１に記載のアレン酸化物シンターゼをコードする、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される単離されたヌクレオチド配列：
ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）ａ）又はｂ）に対し相補的なヌクレオチド配列
【請求項７】
多価不飽和脂肪酸の生合成に関与する請求項２に記載のジビニルエーテルシンターゼをコードする、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される単離されたヌクレオチド配列：
ａ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）ａ）又はｂ）に対し相補的なヌクレオチド配列
【請求項８】
コケ又は高等植物に由来する請求項６又は７に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項９】
ヒメツリガネゴケに由来する請求項６〜８のいずれかに記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれかに記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つ、その対立遺伝子、誘導体又は部分、並びにそれと機能しうる形で連結された調節ヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物。
【請求項１１】
請求項６〜９のいずれかに記載の単離されたヌクレオチド配列の少なくとも１つ、その対立遺伝子、誘導体及び／若しくは部分、並びに／又は請求項１０に記載の遺伝子構築物、並びに宿主細胞における選択及び／若しくは複製のため、及び／又は宿主細胞のゲノム内への組込みのための別のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１２】
請求項６〜９のいずれかに記載の単離されたヌクレオチド配列の少なくとも１つ、その対立遺伝子、誘導体及び／若しくは部分、及び／又は請求項１０に記載の遺伝子構築物、及び／又は請求項１１に記載のベクターを複製可能な形態で含むトランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫であって、内因性遺伝子発現と比較してアレン酸化物シンターゼをコードするヌクレオチド配列及び／又はジビニルエーテルシンターゼをコードするヌクレオチド配列の発現の増大を示し、該発現が植物の病原体抵抗性の増強をもたらす、上記トランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫。
【請求項１３】
請求項６〜９のいずれかに記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つ、その対立遺伝子、誘導体及び／若しくは部分、及び／又は請求項１０に記載の遺伝子構築物、及び／又は請求項１１に記載のベクターが、染色体外の形態で存在する、及び／又は宿主植物ゲノム内に安定的に組込まれている、請求項１２に記載のトランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫。
【請求項１４】
請求項１に記載のアレン酸化物シンターゼ、そのイソ酵素、誘導体及び／若しくは部分、及び／又は請求項２に記載のジビニルエーテルシンターゼ、そのイソ酵素、誘導体及び／若しくは部分を含み、植物細胞において対応する内因性酵素比活性と比較して比活性の増大を示すものである、請求項１２又は１３に記載のトランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫。
【請求項１５】
有用植物又はその細胞であり、好ましくはナス科又は穀物科の植物、特に好ましくはジャガイモ、オオムギ又はコムギである、請求項１２〜１４のいずれかに記載のトランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫。
【請求項１６】
請求項６〜９のいずれかに記載のヌクレオチド配列の単独若しくは組み合わせ、及び／又は請求項１０に記載の遺伝子構築物、及び／又は請求項１１に記載のベクターを、複製可能な形態で植物細胞に移入し、こうして形質転換された植物細胞から植物個体を再生させることを含む、植物の病原体抵抗性の増強方法。
【請求項１７】
使用される植物細胞が、有用植物に由来する細胞、好ましくはナス科又は穀物科の植物、特に好ましくはジャガイモ、オオムギ又はコムギに由来する細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫の病原体抵抗性を増強するための、請求項６〜９のいずれかに記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つの使用。
【請求項１９】
植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫の病原体抵抗性を増強するための、請求項１〜８のいずれかに記載の酵素の少なくとも１つの使用。
【請求項２０】
少なくとも１つの酵素の比活性の増大が、対応する内因性酵素比活性と比較して２０〜９０％、好ましくは３０〜８０％、特に好ましくは４０〜７０％増強された植物細胞又は植物の病原体抵抗性を生じさせる、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
少なくとも１つの酵素が、ウドンコ病菌、好ましくはオオムギウドンコ病菌（ブルメリア・グラミニスｆ．ｓｐ．ホルデイ）若しくはコムギウドンコ病菌（ｆ．ｓｐ．トリチシ）、及び／又は疫病菌（フィトフトラ・インフェスタンス）に対する抵抗性の増強を生じさせる、請求項１９又は２０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトクロムＰ４５０クラスに由来する酵素、対応するコード化ヌクレオチド配列の単離、並びに病原体抵抗性植物細胞及びそれらの子孫の作製方法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
シトクロムＰ４５０酵素クラスは、酵素であるアレン酸化物シンターゼ（ＡＯＳ）、ヒドロペルオキシドリアーゼ（ＨＰＬ）及びジビニルエーテルシンターゼ（ＤＥＳ）を包含する。それらはＣＹＰ７４と呼ばれる別のサブファミリーを形成する。
【０００３】
多様なシトクロムＰ４５０酵素があるために、このクラスの各タンパク質にその一次構造に基づいて特定のファミリー及びサブファミリーを割り当てる命名法が開発された。従って、ＡＯＳの全てはそれら独自のサブファミリーＣＹＰ７４Ａを形成する一方で、ＣＹＰ７４Ｂは１３−ＨＰＬ類を含み、ＣＹＰ７４Ｃは９／１３−ＨＰＬ類を含み、そしてＣＹＰ７４Ｄは９−ＤＥＳ類を含む（Ｆｅｕｓｓｎｅｒら；２００１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．６，２６８−２７３）。同じサブファミリーに由来するタンパク質には年代順に番号が付与される。
【０００４】
ＣＹＰ７４酵素は、補欠分子族の血球分子を有するモノオキシゲナーゼである。それらは補欠分子族として結合したプロトポルフィリンＩＸ型（ヘムｂ）も有するが、それらはＣＯに対して極めて低い親和性を有する（Ｍａｔｓｕｉ，１９９８，Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ．１３１，５０−６２）。
【０００５】
それらは、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）経路として知られているポリエン脂肪酸の代謝において重要な酵素を構成する（Ｆｅｕｓｓｎｅｒ及びＷａｓｔｅｒｎａｃｋ，１９９８，Ｆｅｔｔ／Ｌｉｐｉｄ．１００，１４６−１５２）。
【０００６】
ＬＯＸは、触媒中心の鉄がアミノ酸側鎖に結合したジオキシゲナーゼである（Ｂｒａｓｈ，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２３６７９−２３６８２）。それらは、多価不飽和脂肪酸の（１Ｚ，４Ｚ）−ペンタジエン系内への分子状酸素の導入を触媒する。植物において、これらは主としてリノール酸及びα−リノレン酸である。採用されるＬＯＸの部位選択性（regioselectivity）に応じて、生成物として、ヒドロペルオキシダーゼの２つの異なる位置異性体、すなわち（９Ｓ）異性体又は（１３Ｓ）異性体が生成しうる。例えば、α−リノレン酸は、（１３Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ，１５Ｚ）−１３−ヒドロペルオキシ−９，１１，１５−オクタデカトリエン酸（１３Ｓ−ＨＰＯＴＥ）を生じ、そしてリノール酸は、（１３Ｓ，９Ｚ，１１Ｅ）−１３−ヒドロペルオキシ−９，１１−オクタデカジエン酸（１３Ｓ−ＨＰＯＤＥ）を生じる。
【０００７】
植物において、これらのヒドロペルオキシドは、多数の酵素によって急速にさらに反応する。現在、ヒドロペルオキシドを変換し、そしてＬＯＸ生成物と競合する７種の異なる酵素ファミリーが植物界において知られている。すなわち、アレン酸化物シンターゼ（ＡＯＳ）反応、ヒドロペルオキシドリアーゼ（ＨＰＬ）反応、ジビニルエーテルシンターゼ（ＤＥＳ）反応、レダクターゼ反応、ペルオキシゲナーゼ反応、エポキシアルコールシンターゼ（ＥＡＳ）反応及びＬＯＸ反応それ自体（Ｆｅｕｓｓｎｅｒら；２００１，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．６，２６８−２７３）。
【０００８】
酵素アレン酸化物シクラーゼ（ＡＯＣ）の存在下において１３−ＨＰＯＴＥが反応する場合には、１２−オキソフィトジエン酸（１２−ｏｘｏ−ＰＤＡ）を与える環化反応が起こり（Ｚｉｅｇｌｅｒら；２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，１９１３２−８）、これ自身はジャスモン酸（ここでは植物ホルモンと考えられる）の前駆体である。
【０００９】
ＡＯＳ（ＥＣ４．２．１．９２；ＣＹＰ７４Ａ）は、記載された最初のＣＹＰ７４酵素であった。均質なタンパク質は亜麻から初めて単離された（Ｓｏｎｇ及びＢｒａｓｈ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２５３，７８１−７８４）。それは不安定なアレン酸化物を与える反応を触媒し、該酸化物は水の存在下で対応するα−及びγ−ケトールに分解しうる。ＡＯＳはジャスモン酸の生合成に関与する（Ｖｉｃｋ及びＺｉｍｍｅｒｍａｎ，１９８３，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１１，４７０−７）。ジャスモン酸それ自体は、特定のｍＲＮＡの転写の誘導、及びジャスモネート誘導タンパク質（ＪＩＰ）、例えばＬＯＸ、ＡＯＳ及びプロテイナーゼ阻害剤の翻訳の調節に関与する。これにより、ジャスモン酸は植物ストレス応答における重要なシグナル物質となっている（Ｗａｓｔｅｒｎａｃｋ及びＰａｒｔｈｉｅｒ，  １９９７，  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．２，３０２−３０７）。成長調節プロセス及び老化促進における関与も同様に記載されている（Ｓｅｍｂｄｎｅｒ及びＰａｒｔｈｉｅｒ，１９９３，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４４，５６９−５８９）。
【００１０】
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、トマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｕｍ）及びオオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）のＡＯＳを含む多数のＡＯＳが既にクローニングされており、かつ大腸菌において機能的に発現されている。オオムギＡＯＳは別として、今日までにクローニングされた全てのＡＯＳは、（１３Ｓ）−ヒドロペルオキシドに対して基質特異性を示す（Ｍａｕｃｈｅｒら；２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２１，１９９−２１３）。
【００１１】
ＨＰＬ（ＣＹＰ７４Ｂ及びＣ）は、ヒドロペルオキシドを切断して（３Ｚ）−アルデヒド及びω−オキソ酸にする（Ｍａｔｓｕｉ，１９９８，Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｔａｎｙ．１３１，５０−６２）。この酵素自体が発見される以前でさえも、ＨＰＬ反応生成物は、植物および果実の特徴的な臭いに寄与する「葉アルデヒド」として知られていた（Ｈａｔａｎａｋａ，１９９６，Ｆｏｏｄ  Ｒｅｖ．Ｉｎｔ．１２，３０３−３５０）。基質が１３−ＨＰＯＴＥである場合には、（３Ｚ）−ヘキサナール及び（９Ｚ）−１２−オキソ−９−ドデセン酸が生成され、そのうち後者は異性化して（１０Ｅ）−１２−オキソ−１０−ドデセン酸（トラウマチン）を与え、これは傷害ホルモンとして論じられている。植物メッセンジャー物質としての機能も論じられている（Ｂａｔｅ及びＲｏｔｈｓｔｅｉｎ，１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１６，５６１−５６９）。トラウマチンはさらに酸化されて外傷酸を与えることができ、これも同様に植物傷害応答に関与するようである（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ及びＶｉｃｋ，１９７０，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４６，４４５−４５３）。クローニングされ、そして大腸菌において活性タンパク質として発現されたＨＰＬは、特にシロイヌナズナ、キュウリ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）、アルファルファ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  ｓａｔｉｖｕｓ）及びトマトのＨＰＬであった。ここでもまた、これらの酵素の大部分は（１３Ｓ）−ヒドロペルオキシドに対して基質特異性を示す。キュウリ由来のＨＰＬのうち１つのみ及びメロン由来の１つは基質特異性を示さず、それ故に９／１３−ＨＰＬと呼ばれる（ＭｃＩｎｔｙｒｅら；１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２５１８９−２５１９２；Ｍａｔｓｕｉら；２０００，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４８１，１８３−１８８）。ＣＹＰ７４ファミリーの他のメンバーを用いた両者の配列の関係についての研究は、ＡＯＳとの相同性が１３−ＨＰＬよりも高程度であることを示した。これは、これらの酵素が別のサブファミリーＣＹＰ７４Ｃとして分類される理由である（Ｍａｔｓｕｉら；２０００，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４８１，１８３−１８８）。アラビドプシスＨＰＬが傷害によって誘導されることが実証されている。
【００１２】
ＤＥＳ（ＣＹＰ７４Ｄ）は、殺真菌活性を有するジビニルエーテルの生成を触媒する（Ｗｅｂｅｒら，１９９９）。病原性真菌及び細菌に対する防御にジビニルエーテルが関与することも、ＨＰＬ生成物の場合のアルデヒドと同様に論じられている（Ｗｅｂｅｒら；１９９９，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ．１１，４８５−４９３；Ｇｏｅｂｅｌら；２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７２６，６２６７−６２７３）。最初のトマトＤＥＳは、２００１年にＩｔｏｈ及びＨｏｗｅによってクローニングされた。それにより配列についてＡＯＳ及びＨＰＬと高い程度の相同性を有することが明らかになった。それ故に、それはシトクロムＰ４５０クラス、サブファミリーＣＹＰ７４Ｄに属するとも考えられる。さらに、ＤＥＳが９Ｓ−ヒドロペルオキシドに対して高度に特異的である唯一の酵素である限りにおいて、ＤＥＳはＣＹＰ７４群で独特である（Ｉｔｏｈ及びＨｏｗｅ，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，３６２０−３６２７）。
【００１３】
本質的に、Ｐ４５０酵素は多数の内因性物質の生合成及び代謝に多くの様式で関与する。それらが生体異物の解毒に関与することは特に重要である。さらに、植物Ｐ４５０酵素は傷害シグナル（ジャスモン酸、サリチル酸、トラウマチン）及びホルモン（ジベレリン、ブラシノステロイド）の生合成に関与する。
【００１４】
植物における傷害シグナル及びその後のシグナル伝達カスケードを引き起こす物質は多くの形態で生じる。それらは植物への損傷又は外傷によって引き起こされうるが、外部の化学物質によっても（人工的に）誘導されうる。
【００１５】
しかしながら、そのうえに、それは特に、植物病の発生及び中でもこのような病原体に対する植物の防御反応の促進であり、これらは農業経済学的に莫大な関連がある。病原体に対する植物の応答は、植物がそれ自体を外傷によるストレスに対して防御する場合とは著しく異なった経路を伴うであろう。例えば、ウイルス、細菌又は真菌によって引き起こされる植物病の発生は、農作物の劇的な量的又は質的減少と一緒になって、植物全体の相当な損傷又は実際にその死を一般的にもたらす。
【００１６】
収率損失が経済的に許容できる程度に限定されるならば、植物保護対策を行うことが肝要である。特に、土壌、地下水及び使用者にとって追加の汚染物となる化学薬品を用いることなく、病原体及び／又は有害寄生物に対する植物の防御反応を改善することが望ましいであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って、本発明の課題は、増強された病原体抵抗性を示すトランスジェニック植物細胞、植物及びそれらの子孫、並びに対応する改善されたそれらの作製方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記課題は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するアレン酸化物シンターゼ若しくはそのイソ酵素、及び／又は配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するジビニルエーテルシンターゼ若しくはそのイソ酵素によって達成される。
【００１９】
上記の２つの酵素はＣＹＰ７４酵素ファミリーに属する。これらのＣＹＰ７４酵素の比活性の増大は、単独で又は組み合わせて、植物細胞におけるこれらの酵素の内因性比活性に関して、植物細胞における病原体抵抗性の増強をもたらす。
【００２０】
ここで、本発明により増大されるＣＹＰ酵素比活性は、植物細胞又は植物における内因性酵素比活性に対して２０〜９０％、好ましくは３０〜８０％、特に好ましくは４０〜７０％増強されている植物細胞又は植物の病原体抵抗性を生じさせる。植物の抵抗性は、侵入頻度の低下によって決定される。
【００２１】
本発明の目的のために、侵入頻度とは、首尾よく侵入された表皮細胞を有する感染部位の数を感染部位の総数で除した値を意味するものと理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明に係るＣＹＰ７４酵素は、単独で又は組み合わせて、例えば、生物栄養真菌のような病原体に対する植物の抵抗性の増強を有利に生じさせる。本発明に係るＣＹＰ７４タンパク質の濃度上昇（比活性上昇）は、ウドンコ病（ベト病）菌、特に好ましくはオオムギウドンコ病菌（ブルメリア・グラミニスｆ．ｓｐ．ホルデイ）又はコムギウドンコ病菌（ｆ．ｓｐ．トリチシ）に対する抵抗性の増強を生じさせる。しかしながら、これは他の植物病原体に対する抵抗性の増強を排除するものではない。
【００２３】
このような植物病原体のさらなる例は、ピチウム（Ｐｙｔｈｉｕｍ）属の種、アルブゴ（Ａｌｂｕｇｏ）属の種、ツノ担子菌（リゾクトニア・ソラニ；Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎｉ）、ベト菌（ペロノスポラ・パラシティカ；Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐａｒａｓｉｔｉｃａ）、ウドンコ菌（エリシフェ・クルシフェラウム；Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｒｕｃｉｆｅａｒｕｍ）、ウドンコ菌（Ｅ．シコレアセアルム；Ｅ．ｃｉｃｈｏｒｅａｃｅａｒｕｍ）、黒斑病菌（アルテルナリア・ブラッシコーラ；Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ  ｂｒａｓｓｉｃｉｃｏｌａ）、灰色かび病菌（ボトリチス・シネレア；Ｂｏｔｒｙｔｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、白絹病菌（スクレロチウム・ロルフシイ；Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ  ｒｏｌｆｓｉｉ）、菌核病菌（スクレロチニア・スクレロチウム；Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ）、萎ちょう病菌（フザリウム・オキシスポルム；Ｆｕｚａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、赤かび病菌（Ｆ．クルモルム；Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ、Ｆ．グラミネアルム；Ｆ．ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、ムギ赤かび病菌（Ｆ．ニバレ；Ｆ．ｎｉｖａｌｅ）、疫病菌（フィトフトラ・インフェスタンス；ｐｈｙｔｏｐｈｔｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）又はつる枯細菌（シュードモナス・シリンガエ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）である。
【００２４】
本発明に係る上記のＣＹＰ７４酵素は、このクラスに由来する従来公知のＣＹＰ酵素よりも著しく広い基質スペクトルを示すことに注目すべきである。本発明に係るＣＹＰ７４酵素は、基質として９−ＨＰＯＤ／ＴＥだけでなく１３−ＨＰＯＤ／ＴＥも変換することができる。
【００２５】
本発明によれば、本発明のＣＹＰ７４酵素はコケ又は高等植物に由来するものである。好ましくは、本発明に係るＣＹＰ７４酵素はヒメツリガネゴケ（フィスコミトレラ・パテンス）に由来するものである。
【００２６】
本発明はまた、植物細胞又は植物の病原体抵抗性を増強するための多価不飽和脂肪酸の生合成に関与する上記種類のアレン酸化物シンターゼをコードする、以下から選択される単離されたヌクレオチド配列に関する：
ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）ａ）又はｂ）に対し相補的なヌクレオチド配列
【００２７】
本発明はまた、ａ）又はｂ）とハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含する。
【００２８】
同様に、本発明は、植物細胞又は植物の病原体抵抗性を増強するための多価不飽和脂肪酸の生合成に関与する上記種類のジビニルエーテルシンターゼをコードする、以下から選択される単離されたヌクレオチド配列に関する：
ａ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）ａ）又はｂ）に対し相補的なヌクレオチド配列
【００２９】
本発明はまた、ａ）又はｂ）とハイブリダイズするヌクレオチド配列を包含する。
【００３０】
本発明によれば、単離された核酸又は単離された核酸断片は、一本鎖又は二本鎖であってよく、そして場合により天然の、化学的に合成された、改変された又は人工のヌクレオチドを含んでいてもよいＲＮＡ又はＤＮＡポリマーを意味するものと理解される。これに関して、ＤＮＡポリマーという用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はこれらの混合物をも包含する。
【００３１】
本発明の目的のために、ハイブリダイズするヌクレオチド配列は、ＣＹＰ７４酵素をコードする本発明に係る対応するヌクレオチド配列と標準的なハイブリダイゼーション条件下で結合するオリゴ−又はポリヌクレオチドを意味するとものと理解される。標準的なハイブリダイゼーション条件という用語は、広義に解釈すべきであり、そしてストリンジェントな又はより低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を指す。このような条件は、特にＳａｍｂｒｏｏｋらによって記載されている（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。本発明によれば、ハイブリダイズするヌクレオチド配列という用語は、本来公知の標準的ハイブリダイゼーション条件下で本発明に係るヌクレオチド配列と特異的な相互作用（結合）を行うＤＮＡ又はＲＮＡ群に由来する実質的に類似のヌクレオチド配列を包含する。これらはまた、例えば１０〜３０、好ましくは１２〜１５のヌクレオチド長を有する短鎖ヌクレオチド配列も包含する。本発明によれば、これはまた、特にプライマー又はプローブとして知られているものも包含する。
【００３２】
本発明によれば、相補的ヌクレオチド配列は、塩基対合規則による問題の出発配列の転写の構成要素となるＤＮＡ又はＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列を意味するものと理解される。
【００３３】
本発明によれば、アレン類は機能的に同等のヌクレオチド配列、すなわち、本質的に同じタイプの作用を有するヌクレオチド配列であるものと理解される。機能的同等配列は、例えば、遺伝子暗号の縮重のためにヌクレオチド配列が異なるにもかかわらず、所望の機能を保持している配列である。従って、機能的同等物は、本明細書に記載した配列の天然の変種、並びに人工ヌクレオチド配列、例えば化学的合成によって得られ、かつ適切ならば宿主生物のコドン用法に適合化されているヌクレオチド配列を包含する。加えて、機能的に同等の配列は、例えば、阻害剤に対する脱感作性又は抵抗性をタンパク質に与える改変されたヌクレオチド配列を有するものを包含する。
【００３４】
機能的同等物はまた、特に、所望の機能を保持している最初に単離された配列の自然の又は人工的な突然変異を意味するものと理解される。突然変異は、１以上のヌクレオチド残基の置換、付加、欠失、転換又は挿入を包含する。
【００３５】
ここで同様に包含されるのは、センス変異として知られているものであり、これらはタンパク質レベルで、例えば、保存されたアミノ酸の置換に導きうるがタンパク質の機能性の根本的変化に導かないもの、すなわち、機能的に中性の変異である。これはまた、タンパク質レベルで、タンパク質のＮ又はＣ末端に関連するがタンパク質の機能に実質的には有害な影響を及ぼすことのないヌクレオチド配列の改変を包含する。実際に、これらの改変はタンパク質構造に対して安定化させる影響を有することができる。機能的同等物はまた、その活性が元の遺伝子又は遺伝子断片と比較して弱化又は強化されている変種を包含する。
【００３６】
人工ＤＮＡ配列もまた、それらが上記のように所望の特性を与える限り、本発明に含まれる。このような人工ＤＮＡ配列は、例えば、分子モデリングによって作成されたタンパク質の逆翻訳によるか、又はインビトロ選択により決定することができる。特に好適なＤＮＡ配列は、宿主−生物−特異的コドン用法に従ってポリペプチド配列を逆翻訳することによって得られるコード化ＤＮＡ配列である。特異的なコドン用法は、分子遺伝学的方法に精通した当業者によって、形質転換すべき生物の他の既知遺伝子のコンピュータ評価により容易に決定することができる。
【００３７】
「機能的に同等な」という用語はまた、問題のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を指す。この場合、「機能的に同等な」という用語は、そのアミノ酸配列が基準タンパク質（この場合はＣＹＰ７４酵素）のアミノ酸配列と一定のパーセンテージの相同性を示すことを説明するものである。このパーセンテージは少なくとも７５％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０〜９５％、特に９９．９％である。
【００３８】
さらに、本発明はまた、例えば、対応する誘導体を生じさせるヌクレオチド配列の改変によって得られるヌクレオチド配列を包含する。このような改変の目的は、例えば、それに存在するコード化配列のさらなる限定、又はそのほかに、例えば、さらなる制限酵素切断部位の挿入でありうる。
【００３９】
さらに、本発明に係るヌクレオチド配列は、それらがコケ又は高等植物に由来するという事実によって区別される。好ましくは、それらはヒメツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）に由来するものである。
【００４０】
用語を明確にするために、配列番号１によりコードされるタンパク質はクラスＣＹＰ７４ＡシトクロムＰ４５０酵素（アレン酸化物シンターゼ；ＡＯＳ）であることを指摘すべきである。その基質特異性により、特に配列番号３によりコードされる酵素はＣＹＰ７４Ｅクラス（ジビニルエーテルシンターゼ；ＤＥＳ）に割り当てられる。
【００４１】
本発明はさらに、配列番号１に示されるヌクレオチド配列及び／又は配列番号３に示されるヌクレオチド配列、並びにそれらと機能しうる形で連結された調節ヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物に関する。
【００４２】
本発明に係る遺伝子構築物はまた、配列番号１及び／若しくは配列番号３に示されるヌクレオチド配列の誘導体、対立遺伝子又は部分を包含する。これに関して、コード領域は単独で又は組み合わせて（結合して）、同じ調節配列または種々の別々の調節配列の制御下にある。
【００４３】
機能的連結は、例えば、プロモーター、コード配列、ターミネーター、及び適切ならば、コード配列が発現されるときに調節エレメントの各々が、その意図される機能を果たしうるような他の調節エレメントの連続的配置を意味するものと理解される。これらの調節ヌクレオチド配列は、天然起源のもの又は化学的合成により得られるものであってよい。好適なプロモーターは、原則として、問題の宿主生物において遺伝子発現を調節可能な全てのプロモーターである。本発明によれば、このようなプロモーターは、それによって支配される遺伝子の発現が宿主細胞において特定の時点で制御されうる、天然の又は合成的に生成された化学的に誘導可能なプロモーターの形態をとることもできる。これらはまた、組織特異的プロモーターを包含する。遺伝子構造物は、例えば、Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＪ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に記載された慣用の組換え及びクローニング技術を使用して、好適なプロモーターを本発明に係るヌクレオチド配列の少なくとも１つに融合させることによって構築される。ＤＮＡ断片を相互に結合させるために、アダプターまたはリンカーを断片に付加することができる。
【００４４】
本発明によって同様に包含されるものは、コード領域の上流に存在する配列領域（構造遺伝子；５’又は上流配列領域）及び／又はそれらの下流に存在する配列領域（３’又は下流配列領域）である。同様に包含されるものは、特に、調節機能を有する配列領域である。それらは転写、ＲＮＡ安定性又はＲＮＡプロセッシング及び翻訳に影響を与えることができる。調節配列の例は、特に、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、ターミネーター又は翻訳エンハンサーである。
【００４５】
本発明によって同様に包含されるものは、配列番号１に示される単離されたヌクレオチド配列、その対立遺伝子、誘導体若しくは部分、及び／又は配列番号３に示される単離されたヌクレオチド配列、その対立遺伝子、誘導体若しくは部分、及び／又は上記種類の遺伝子構築物、並びに宿主細胞において選択及び／若しくは複製するための、及び／又は宿主細胞のゲノム内へ組込むのための別のヌクレオチド配列を含むベクターである。
【００４６】
一般的に、本発明により好適な宿主細胞は、高等植物の細胞でありうる。好ましい細胞は、有用植物、好ましくは単子葉有用植物、特に好ましくは穀類、特にオオムギ及び／又はコムギの細胞である。双子葉有用植物の好ましい細胞は、ナス科に由来するものである。
【００４７】
従って、本発明はまた、配列番号１に示される単離されたヌクレオチド配列、その対立遺伝子、誘導体及び／又は部分、及び／又は配列番号３に示される単離されたヌクレオチド配列、その対立遺伝子、誘導体及び／又は部分、及び／又は上記種類の遺伝子構築物、及び／又は上記種類のベクターを複製可能な形態で含むトランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫の少なくとも１つであって、内因性遺伝子発現（すなわち、例えば非形質転換植物又は植物細胞において見出される天然遺伝子発現）と比較して、アレン酸化物シンターゼをコードするヌクレオチド配列及び／又はジビニルエーテルシンターゼをコードするヌクレオチド配列の発現の増大を示し、該発現が植物の病原体抵抗性の増強をもたらす、上記トランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫を包含する。
【００４８】
遺伝子発現の増大の理由は、問題のヌクレオチド配列のコピー数が増加するためであろう。あるいは、それは、例えば、ヌクレオチド配列のコード領域が、遺伝子発現の開始の増強をもたらす１以上の調節配列と機能しうる形で連結されているという事実に基づいている。これは、例えば、強い及び／又は誘導性のプロモーター及び／又はエンハンサー及び／又は他の調節配列によって生じさせることができる。
【００４９】
コピー数に関しては、上記のヌクレオチド配列の一方又は双方は、本発明の種々の形態において、２〜１００、好ましくは５〜５０、特に好ましくは２〜１５のコピーとして存在しうる。
【００５０】
本発明に係る上記のトランスジェニック植物細胞、植物及び／又はそれらの子孫において、本発明に係るヌクレオチド配列（単独で又は組み合わせて）、その対立遺伝子、誘導体若しくは部分、及び／又は上記種類の遺伝子構築物、及び／又はベクターは、染色体外に存在していてもよく、及び／又は植物ゲノム内に安定的に組込まれていてもよい。
【００５１】
ヌクレオチド配列を植物ゲノム内に組込むために好適な手法及び補助物質、例えば遺伝子構築物又はベクター及び好適な使用生物は当業者に公知であり、さらに詳述されない。
【００５２】
配列番号２に示されるアレン酸化物シンターゼ及び／又は配列番号４に示されるジビニルエーテルシンターゼ、及び／又はそれらの相当するイソ酵素、誘導体及び／又は部分を有するトランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫であって、トランスジェニック宿主細胞系における酵素の相対比活性が、相対内因性酵素活性（例えば、野生型細胞におけるもの）と比較して増大されているものも、同様に本発明に包含される。
【００５３】
イソ酵素は、同一又は類似の基質特異性及び作用特異性を有するが、一次構造が異なる酵素を意味するものと理解される。
【００５４】
本発明によれば、誘導体は、配列内に、例えばポリペプチドのＮ及び／若しくはＣ末端で、又は保存されたアミノ酸領域内に改変を有するが、しかし酵素の機能に有害作用を及ぼすことのない酵素を意味するものと理解される。これらの改変は、本来公知の方法によりアミノ酸置換の形で行うことができる。
【００５５】
本発明の特定の実施形態は、その活性がアミノ酸置換によって、問題の出発タンパク質と比較して低下又は増大した酵素の変種を包含する。同じことは、本発明に係る酵素の安定性にも適用され、これらの細胞においては、例えばプロテアーゼによる分解に対する感受性が上昇又は低下している。
【００５６】
さらに、本発明は、アレン酸化物シンターゼ又はジビニルエーテルシンターゼの機能を有する酵素であって、それらのアミノ酸配列が調節化合物、例えばそれらの活性を調節する異化代謝産物に対して脱感受性（フィードバック脱感受性）を有するように修飾されている酵素に関する。
【００５７】
本発明によれば、上記のトランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫は、有用植物又はその細胞、好ましくはナス科又は穀物科、特に好ましくはジャガイモ、オオムギ又はコムギの形態をとる。
【００５８】
本発明はまた、配列番号１に示されるヌクレオチド配列及び／又は配列番号３に示されるヌクレオチド配列、及び／又は上記で詳述した種類の遺伝子構築物、及び／又はベクターを、複製可能な形態で植物細胞に移入し、こうして形質転換された植物細胞から植物個体を再生させることを含む、植物細胞又は植物の病原体抵抗性を増強する方法を包含する。
【００５９】
本発明に係るこのようなトランスジェニック植物の再生方法は、標準的な実験室の慣用手法である。本発明の有利な変法において、ヌクレオチド配列及び／又は遺伝子構築物及び／又はベクターは、「粒子ボンバードメント」として知られている方法及び／又はアグロバクテリウム媒介形質転換によって植物又は植物の部分若しくは細胞に移入される。
【００６０】
本発明によって得られるトランスジェニック植物及びその子孫の特別な利点は、本発明に係るヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピー数の増加、又は同様に、対応してコードされたタンパク質の少なくとも１つが高められた濃度で存在することが、実質的に増強された疾病抵抗性に導くことである。これは、本発明に係る遺伝子及び／又はコードされたタンパク質が病原性寄生物に対する抵抗性の発生の原因となることを意味する。
【００６１】
病原性寄生物の例は、特に、オオムギウドンコ病菌（ブルメリア・グラミニスｆ．ｓｐ．ホルデイ）若しくはコムギウドンコ病菌（ｆ．ｓｐ．トリチシ）、ピチウム属の種、アルブゴ属の種、ツノ担子菌（リゾクトニア・ソラニ）、ベト菌（ペロノスポラ・パラシティカ）、ウドンコ菌（エリシフェ・クルシフェラウム）、ウドンコ菌（Ｅ．シコレアセアルム）、黒斑病菌（アルテルナリア・ブラッシコーラ）、灰色かび病菌（ボトリチス・シネレア）、白絹病菌（スクレロチウム・ロルフシイ）、菌核病菌（スクレロチニア・スクレロチウム）、萎ちょう病菌（フザリウム・オキシスポルム）、赤かび病菌（Ｆ．クルモルム、Ｆ．グラミネアルム）、ムギ赤かび病菌（Ｆ．ニバレ）、疫病菌（フィトフトラ・インフェスタンス）又はつる枯細菌（シュードモナス・シリンガエ）である。
【００６２】
本発明に係る方法の好ましい変法において、使用される植物細胞は有用植物の細胞、好ましくはナス科又は穀物科、特に好ましくはジャガイモ、オオムギ又はコムギに由来する細胞である。
【００６３】
本発明はさらに、トランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫の病原体抵抗性を増強するための、配列番号１に示されるヌクレオチド配列及び／又は配列番号３に示されるヌクレオチド配列及び／又はそれらの対立遺伝子、それらの誘導体および／または部分の使用に関する。
【００６４】
本発明はまた、トランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫の病原体抵抗性を増強するための、配列番号２に示されるポリペプチド及び／又は配列番号３に示されるポリペプチド及び／又はそれらのイソ酵素及び／又は誘導体のうち少なくとも１つの使用に関する。
【００６５】
本発明により同様に包含されるのは、少なくとも１つの酵素の比活性の増大が、対応する内因性酵素比活性と比較して２０〜９０％、好ましくは３０〜８０％、特に好ましくは４０〜７０％増強された植物細胞又は植物の病原体抵抗性をもたらす、上記酵素の少なくとも１つの使用である。
【００６６】
これに関して、本発明に係る酵素の少なくとも１つの使用は、例えば、ウドンコ病菌、好ましくはオオムギウドンコ病菌（ブルメリア・グラミニスｆ．ｓｐ．ホルデイ）若しくはコムギウドンコ病菌（ｆ．ｓｐ．トリチシ）及び／又は疫病菌（フィトフトラ・インフェスタンス）に対する抵抗性の増強を生じさせる。
【実施例】
【００６７】
以下の実施例は本発明の説明を意図するものであって、限定的なものではない。
【００６８】
一般的方法：
一般的なＤＮＡ及びクローニング技術、ゲル電気泳動、配列決定、ＰＣＲ、ノーザンブロット法、組換えタンパク質の発現及び精製、ウェスタンブロット法、ＨＰＬＣ及びＧＣ分析、並びに微生物の培養は、従来の実験室方法であり、特にＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されている。
【００６９】
コケ及び植物材料の処理も同様に実験室の慣用手法であり、特にＧｅｌｖｉｎら（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９９５，Ｄｏｖｄｒｅｃｈｔ／Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌ．）に記載されている。
【００７０】
ＣＹＰ７４酵素をコードする遺伝子のＰＣＲによるクローニング
ヒメツリガネゴケ（フィスコミトレラ・パテンス）の２つのλＺａｐＩＩ  ｃＤＮＡライブラリー（１つは糸状体組織に由来し、１つは配偶体組織に由来する）をＲＡＣＥ−ＰＣＲのために利用した。Ｔ７−ｌａｎｇプライマー（５’−ＧＴＡ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＣＴＣ  ＡＣＴ  ＡＴＡ  ＧＧＧ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＧＧＧ−３’）を５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲのためのベクタープライマーとして作用させた。標準的方法を用いた。
【００７１】
ネステッドＲＡＣＥ−ＰＣＲのために、Ｍ１３ｒｅｖプライマー（５’−ＧＧＡ  ＡＡＣ  ＡＧＣ  ＴＡＴ  ＧＡＣ  ＣＡＴ  Ｇ−３’）及びＲＡＣＥプライマーを用いて第一ＰＣＲを行った。この混合物を鋳型として、Ｔ７−ｌａｎｇプライマー及び以下のプライマーから選択された（遺伝子特異的）ネステッド−ＲＡＣＥプライマーを用いる第二ＰＣＲのために作用させた：
2004533849.tif 000002
【００７２】
完全な断片をクローニングするために、後者をＥｘｐａｎｄＴＭＰＣＲ系により増幅させた。Ｔａｇポリメラーゼに加えて、この系はプルーフリーディング活性を有するＰｗｏポリメラーゼを含有する。この第二ポリメラーゼの目的は、クローニングすべきＤＮＡにおいて可能な限り少ない突然変異体を得るために、リーディングの誤差率を低く保つことである。鋳型として次のｃＤＮＡライブラリーを用いた：糸状体ヒメツリガネゴケｃＤＮＡλＺａｐＩＩ及び配偶体ヒメツリガネゴケｃＤＮＡλＺａｐＩＩ。下記のプライマーを使用した：
2004533849.tif 000003
【００７３】
ＲＡＣＥ及び完全なｃＤＮＡのクローニング中にクローンを調べるために、これに関しては誤差率は重要でなかったので、Ｔｆ１ポリメラーゼによる「コロニー」ＰＣＲとして知られている方法を行った。プライマーを保持し、そして標準的設定を用いてプログラムを実行した。
【００７４】
ＣＹＰ７４酵素の単離
ＣＹＰ７４をコードする２つの遺伝子を、２つのヒメツリガネゴケλＺａｐＩＩ  ｃＤＮＡライブラリーから単離した。
【００７５】
クローンＰｐ２９１
単離されたクローンＰｐ２９１は、３２２アミノ酸のオープンリーディングフレームを有していた。このタンパク質はグアユール（Ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ  ａｒｇｅｎｔａｔｕｍ）ＡＯＳと４８％の同一性を有していた（Ｐａｎら；１９９５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，８４８７−８４９４）。しかしながら、そのヌクレオチド配列を他の公知のＡＯＳと比較したところ、５’末端に約５００〜６５０ｂｐが依然として失われていたことが明らかになった。これは、糸状体組織由来のλＺａｐＩＩ  ｃＤＮＡライブラリー及び配偶体組織由来のλＺａｐＩＩ  ｃＤＮＡライブラリーを用いて５’−ＲＡＣＥ−ＰＣＲを行ったためである。ＲＡＣＥプライマーＰＰ２９１ＡＯＳ５Ｒ（上記参照）及び６０℃のアニーリング温度を用いて、糸状体ライブラリーから３つの異なる長さの断片を首尾よく増幅させた。断片長の評価は、アガロースゲルに導入されたサイズ標準物との比較によって可能であった。断片長は６００ｂｐ、７００ｂｐ及び８００ｂｐであった。２つの長い方の断片をベクターｐＧＥＭ−Ｔ内にクローニングし、そして配列決定した。生成した配列の両方は、出発クローンの５’末端を延長するものであった。停止コドンを両方の配列における最初の開始コドン（ＡＴＧ）の１５ｂｐ上流に配置させた。完全なｃＤＮＡをクローニングするために、ＳｐｈＩ及びＰｓｔＩに対する制限切断部位を有する発現プライマー（ＰＰ２９１／５’ＳｐｈＩ及びＰＰ２９１／３’ＰｓｔＩ、上記参照）を、ＲＡＣＥ−ＰＣＲのｃＤＮＡ配列から誘導した。得られた完全なｃＤＮＡ配列は配列番号１に示されており、そして４７５アミノ酸を有するタンパク質（配列番号２）をコードする。
【００７６】
クローンＰｐ３６４
第二のｃＤＮＡクローンは４８９アミノ酸を有するタンパク質をコードしたオープンリーディングフレームを含有していた。このタンパク質はシロイヌナズナＡＯＳと４２％の同一性（Ｌａｕｄｅｒｔら；１９９６，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３１，  ３２３−３３５）、及びアマＡＯＳと４１％の同一性（両者ともアミノ酸レベルで）を有していた。この長さにもかかわらず、このクローンは出発コドンを含有していなかった。ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩに対する制限切断部位を有する発現プライマーＰＰ３６４／５’ＢａｍＨＩ及びＰＰ３６４／３’ＨｉｎｄＩＩＩを、公知のクローン配列から誘導した。完全なｃＤＮＡ配列をＲＡＣＥ−ＰＣＲ及び逆ＰＣＲによって得た。完全なｃＤＮＡ配列は配列番号３に示されており、そして５３２アミノ酸を有するタンパク質（配列番号４）をコードする。
【００７７】
組換えタンパク質の発現及び精製
単離されたｃＤＮＡを発現させるために、それらを発現ベクターに連結する必要があった。Ｎ−末端Ｈｉｓ６−Ｔａｇを有するタンパク質を発現させるために、ベクターｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ）を用いた。Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを用いて、切断前のｐＱＥ３０及びドナーＤＮＡ（比率は約１：３）の間の連結を行った。
【００７８】
組換えタンパク質を大腸菌株ＳＧ１３００９において発現させた（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎｎら；１９８１，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１４８，２６５−７３）。最初に、発現クローンをＬＢ培地（カルベニシリン及びカナマイシンを含む）中３７℃で、ＯＤ６００が０．６〜０．８に達するまでインキュベートした。ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を用いて誘導したのち、細菌を１０℃でさらに２〜３日間増殖させた。
【００７９】
精製は可能な限り氷上で行い、遠心段階は４℃で行った。４０００×ｇで１５分間の遠心によって細胞を沈降させた。
【００８０】
この細胞沈降物を５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８に完全に再懸濁させ、そして５０％強度及び５０％パルスで５×１分間、音波処理した（Ｓｏｎｏｐｕｌｓ  ＧＭ７０，Ｂａｎｄｅｌｉｎ，Ｂｅｒｌｉｎ）。４０００×ｇで１５分間の遠心によって細胞破片を除去し、そしてさらなる遠心（１０００００×ｇで１時間）によって細胞膜を上清から沈降させた。
【００８１】
両方のクローンＰｐ２９１及びＰｐ３６４の場合、組換え産生されたタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。これに続いて、ｐＨ勾配（図１Ａ）、及びその代わりにイミダゾール勾配（図１Ｂ）を用いて溶出させた。全ての洗浄及び溶出ステップにおいて、同一体積（１ｍｌ）を沈殿させ、そしてゲルにアプライした。
【００８２】
図１Ａから分かるように、純粋なＰｐ２９１タンパク質はｐＨ４でカラムから溶出された。イミダゾール勾配の場合には、１００ｍＭ以上のイミダゾール濃度でタンパク質が比較的に純粋な形態で溶出した。両方の方法を比較すると、相違は認められなかった。このために、以下ではｐＨ勾配だけを用いてタンパク質を精製した。
【００８３】
活性アッセイ
配列アラインメントは触媒活性に関する結論を考慮しないので、光度計測法活性アッセイ並びにＨＰＬＣ及びＧＣ分析（これらは全て標準的方法で行った）によって、酵素の触媒作用中に生成した生成物を分析した。
【００８４】
光度計測法活性アッセイにおいて、吸収の低下を２３４ｎｍで測定する。この低下は、ＣＹＰ７４酵素との反応中にヒドロペルオキシドの共役ジエン系の分解に基づくものである。この目的のために、それぞれの基質を（純粋な活性アッセイの目的では、一般的に２０μＭの１３−ＨＰＯＴＥ又は９−ＨＰＯＤＥの最終濃度となるように）リン酸緩衝液（ｐＨは酵素の最適ｐＨに依存する）に溶解し、そして酵素の添加により反応を開始させた。基質濃度を２３４ｎｍでの吸収による光度計測法でモニターした。モル吸収係数（λ２３４ｎｍ）は２５０００Ｍ−１ｃｍ−１である。
【００８５】
両方の基質（１３−ＨＰＯＴＥ又は９−ＨＰＯＤＥ）は、クローンＰｐ２９１でコードされる酵素、及びＰｐ３６４でコードされる酵素の両者によって変換された。グラフを図２に示す。
【００８６】
ヒドロペルオキシドとＤＥＳとの反応はジビニルエーテルを生じさせ、これは酸性環境で加水分解してアルデヒドを与える。これらのアルデヒドは揮発性である。生成したこれらのアルデヒドを同定するために、それらをＤＮＰＨで誘導体化することができる（Ｋｏｈｌｍａｎｎら；１９９９，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６０，８８５−８９５）。こうして生成したヒドラゾンは、もはや揮発性でなく、そしてＨＰＬＣ分析によってそれらの保持時間から同定することができる。図３に示すように、ジビニルエーテルは誘導体化試薬で処理すると、アルデヒドに分解することもでき、次いでこれらをＤＮＰＨ誘導体の形態で検出することができる。
【００８７】
この方法を用いて、Ｐｐ３６４でコードされる酵素、並びに基質１３−ＨＰＯＴＥ及び９−ＨＰＯＤＥの反応混合物中でアルデヒドが生成することを示すことができる（図４）。これらのアルデヒドは、それらの保持時間から（２Ｅ）−ヘキサナール及び（２Ｅ）−ノネナールであると同定された。それらは、アルデヒド−ＤＮＰＨ誘導体に典型的なＵＶスペクトルを示した。Ｐｐ２９１の場合には、アルデヒドは検出されなかった（データは示さない）。
【００８８】
不揮発性化合物のＨＰＬＣ分析においては、１−１４Ｃ−標識ヒドロペルオキシドを反応させる。ＵＶ検出器の代わりに放射能検出器により可視化できる標識生成物が生成する。このようにして、典型的なＵＶ極大を有しない物質でさえも、それらの保持時間から同定することができる。もう一つの利点は、この種の検出がＵＶ検出よりも感度が高いという事実である。［１−１４Ｃ−１３−ＨＰＯＴＥを酵素反応における基質として使用すれば、図５に示したクロマトグラムは、オオムギ９／１３−ＡＯＳ１と同じＰｐ２９１の溶出プロフィールを示し（Ｍａｕｃｈｅｒら；２０００，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．２１，１９９−２１３）、これを参照として用いた。他のＡＯＳについては、アレン酸化物シクラーゼが存在しない場合の主反応生成物はα−ケトールであることが既に示されている。
【００８９】
Ｐｐ３６４の発現及び後続の変換のクロマトグラムは、約３０分でシグナルを示した（図６）。このシグナルはキュウリ９／１３−ＨＰＬ又はオオムギ９／１３−ＡＯＳ１のいずれにも認められなかった。Ｐｐ３６４はさらに、キュウリ９／１３−ＨＰＬの生成物と同じ保持時間を有する他のシグナルを示した。
【００９０】
放射性ＨＰＬＣにおいてはカラム溶出物に液体シンチレーターが添加されるので、生成物を採取し、それらをさらに分析するために、未標識基質を用いて同じＨＰＬＣ試験を行った。α−ケトールは典型的なＵＶ極大を有しないので、この場合は２１０ｎｍで検出を行った（Ｇａｒｄｎｅｒ，１９９７，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ−ｆｏｕｒ（Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｗ．Ｗ．偏）ｐｐ．１−４３，Ｔｈｅ  Ｏｉｌｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｄｕｎｄｅｅ）。
【００９１】
Ｐｐ２９１の場合には、１３−ＨＰＯＴＥから生成したα−ケトールに対する標準物と同じ保持時間を有する基質を採取し、誘導体化し、そしてＧＣ／ＭＳにより研究した。（図７に）示したクロマトグラムが得られた。質量スペクトルは対応するα−ケトール標準物のものと同一である。
【００９２】
酵素特性の決定
最適ｐＨ
クローンＰｐ２９１のための最適ｐＨを光度測定法で決定した。この目的で、１３−ＨＰＯＴＥを基質として用いた（適切なｐＨを有する５０ｍＭリン酸ナトリウム中約２５μＭ）。最高活性は５．０〜６．６．０のｐＨ範囲の酵素によって示される。これを図８に示す。
【００９３】
酵素動力学的パラメーター
Ｐｐ２９１をその基質特異性、特にアラキドン酸のヒドロペルオキシド（ＨＰＥＴＥ）に関して研究した。なぜならば、これがこの生物の主要な脂肪酸だからである（Ｇｉｒｋｅら；１９９８，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．１５，３９−４８）。図９に示す変換速度比が見出された。これに関して研究したヒドロペルオキシドの中で、８−ＨＰＥＴＥが最も速く変換される基質であることを明らかである。これに続き、１３−ＨＰＯＴＥ、９−ＨＰＯＤＥ及び１１−ＨＰＥＴＥであり、８−ＨＰＥＴＥ：１３−ＨＰＯＴＥ：９−ＨＰＯＤＥ：１１−ＨＰＥＴＥの比は１００：７０：６０：５７である。
【００９４】
増強された病原体抵抗性を生じさせるための過剰発現
Ｐｐ２９１及びＰｐ３６４ ｃＤＮＡをバイナリーベクターにクローニングするために、それらをＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩで制限し、そしてＢａｍＨＩ−及びＮｏｔＩで切断されたｐＣＲＳｃｒｉｐｔベクターに移入した。次いでＳａｌＩを用いてそれらをこのベクターから切り出し、そして適切にＳａｌＩで切断されたｐＢｉｎＡＲベクターに連結した。遺伝子がセンス方向にあるクローンを、ＢａｍＨＩによるコントロール切り出し及び配列決定によって決定した。
【００９５】
シロイヌナズナへの形質転換
各実験でセンス方向のＰｐ２９１及びＰｐ３６４ ｃＤＮＡを含むこれらのｐＢｉｎＡＲベクターを用いて、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（Ｃ５８Ｃ１  ｐＭＰ９０）を形質転換する。そののち、野生型シロイヌナズナ植物（ｃｖ．  Ｃｏｌｕｍｂｉａ）を、Ｃｌｏｕｇｈ及びＢｅｎｔ（Ｃｌｏｕｇｈ  Ｓ．及びＢｅｎｔ  Ａ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ  １９９８，１６（６）：７３５−４３）及びＢｅｃｈｔｏｌｄら（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ  Ｎ．ら，ＣＲＡｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｐａｒｉｓ  １９９３，１１４４（２）：２０４−２１２）の真空浸潤方法の改変法に基づいて、それぞれ形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス株を用いて形質転換する。
【００９６】
カナマイシン含有ＭＳプレート（４０ｍｇ／ｌのカナマイシン、１０ｍｇ／ｌのベノミル及び１００ｍｇ／ｌのチメチンを添加したＭＳ培地（Ｓｉｇｍａ））上での種子の栽培によるカナマイシン耐性に基づいて、一次形質転換物の種子をスクリーニングした。２週間ののち、カナマイシン耐性実生を土壌に移し、それらが完全に発達した植物に成長したとき、それらを用いて表現型分析及び分子分析を行った。
【００９７】
センス方向のＰｐ２９１及びＰｐ３６４で形質転換されたトランスジェニック植物のうち、共抑制効果が観察されなかったものを選択した。この目的で、全ＲＮＡを植物から単離し、そしてメッセンジャーの存在をリアルタイムＰＣＲ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）により検出する。こうして同定されたトランスジェニック植物を種々の病原体に感染させた。これらにはオオムギウドンコ病菌（ブルメリア・グラミニスｆ．ｓｐ．ホルデイ）若しくはコムギウドンコ病菌（ｆ．ｓｐ．トリチシ）、ピチウム属の種、アルブゴ属の種、ツノ担子菌（リゾクトニア・ソラニ）、ベト菌（ペロノスポラ・パラシティカ）、ウドンコ菌（エリシフェ・クルシフェラウム）、ウドンコ菌（Ｅ．シコレアセアルム）、黒斑病菌（アルテルナリア・ブラッシコーラ）、灰色かび病菌（ボトリチス・シネレア）、白絹病菌（スクレロチウム・ロルフシイ）、菌核病菌（スクレロチニア・スクレロチウム）、萎ちょう病菌（フザリウム・オキシスポルム）、赤かび病菌（Ｆ．クルモルム、Ｆ．グラミネアルム）、ムギ赤かび病菌（Ｆ．ニバレ）、又はつる枯細菌（シュードモナス・シリンガエ）が含まれた。
【００９８】
結果、すなわち植物の病原性真菌又は細菌抵抗性の肉眼観察度を、特に蛍光及び光学顕微鏡により分析した。それにより、Ｐｐ２９１−及びＰｐ３６４−トランスジェニックアラビドプシス植物が野生型と比較して増強された上記病原体抵抗性を示したことが明らかとなった。
【００９９】
オオムギへの形質転換
オオムギｃｖ．パラス（Ｐａｌｌａｓ）の葉の切片を、ＧＦＰ発現ベクター（緑色蛍光タンパク質）に存在するＰｐ２９１又はＰｐ３６４のｃＤＮＡで形質転換した。次いで葉を病原性真菌オオムギウドンコ病菌（ブルメリア・グラミニスｆ．ｓｐ．ホルデイ）に感染させ、そして結果を４８時間後に光学顕微鏡及び蛍光顕微鏡により分析した。ＧＦＰ発現性細胞内への侵入を、生細胞の吸収管の検出及びまさにそれらの細胞における真菌の発育の評価によって評価した。６つの実験全てにおいて、Ｐｐ２９１又はＰｐ３６４によるオオムギｃｖ．パラスのボンバードメントによって、外来コントロールｃＤＮＡ（ヒト甲状腺ホルモン受容体ｄｓＲＮＡ、ＴＲ）でボンバードメントを行った細胞と比較して、オオムギウドンコ病菌が首尾よく侵入した細胞数が減少した。Ｐｐ２９１及びＰｐ３６４ ｃＤＮＡの抵抗性誘導効果は、オオムギウドンコ病菌による侵入効率を平均で４４％低下した。
【０１００】
オオムギの葉の表皮細胞内へのｃＤＮＡの加速（biloistic）導入について既に記載されている方法（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ  Ｐら（１９９９）Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  １２：６４７−５４；Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ  Ｐら（２０００）Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ２０００  ２４：８９５−９０３）を用いて、オオムギの一過性形質転換を行った。形質転換マーカーとして、ベクターｐＧＦＰ（ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターの制御下のＧＦＰ）のプラスミドＤＮＡと一緒にｃＤＮＡを用いて、直径１．１ｍｍのタングステン粒子（粒子密度２５ｍｇ／ｍｌ）を被覆した。この目的で、以下の量のｃＤＮＡ及びリポータープラスミドを各ボンバードメントのために被覆目的に用いた：１ｍｇのｐＧＦＰ及び２ｍｇのｃＤＮＡ。これらのマイクロキャリアを調製するために、５５ｍｇのタングステン粒子（Ｍ１７，直径１．１ｍｍ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍｕｎｉｃｈ）を１ｍｌのオートクレーブ蒸留水で２回、及び１ｍｌの無水エタノールで１回洗浄し、乾燥し、そして１ｍｌの５０％濃度グリセロール（約５０ｍｇ／ｍｌのストック溶液）に吸収させた。この溶液を５０％濃度グリセロールで２５ｍｇ／ｍｌに希釈し、使用前によく混合し、そして超音波浴中で懸濁させた。マイクロキャリアを被覆するために、ボンバードメント当たり１ｍｇのプラスミド、２ｍｇのｃＤＮＡ（１ｍＬ）、１２．５ｍｌのタングステン粒子懸濁液（２５ｍｇ／ｍｌ）１２．５ｍｌの１Ｍ  Ｃａ（ＮＯ３）２溶液（ｐＨ１０）を、絶えず混合しながら滴下して混合し、室温で１０分間放置し、簡単に遠心し、そして２０ｍｌの上清を分離した。タングステン粒子を含む残余を再懸濁させ（超音波浴）、そして実験に使用した。
【０１０１】
約４ｃｍ長さのオオムギの本葉切片を用いた。ペトリ皿（直径６．５ｃｍ）に入れた２０ｍｇ／ｍｌのベンズイミダゾールを添加した０．５％Ｐｈｙｔａｇａｒ（ＧｉｂｃｏＢＲＬｔ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｔ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）の上に組織を置き、粒子ボンバードメントの直前に、大きさ２．２ｃｍ×２．３ｃｍの長方形スロットを有するステンシルでその端を覆った。真空チャンバ（その上には、粒子凝集物の拡散及び粒子流の減速のための拡散器として機能する有孔ボード（底の上５ｃｍ、マクロキャリアの上１１ｃｍ、以下参照）にナイロンメッシュ（メッシュサイズ０．２ｍｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｅｓｃｈｂｏｒｎ）が挿入されている）の底に、皿を次々に置いた（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ  Ｐら（１９９９）Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  １２：６４７−５４）。各ボンバードメントのために、チャンバの上部に取り付けたマクロキャリア（プラスチック製無菌フィルターホルダー１３ｍｍ、Ｇｅｌｍａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｗｉｎｎｅｙ，ＵＫ）に、５．８ｍｌのＤＮＡ被覆タングステン粒子（マイクロキャリア、以下参照）を負荷した。膜真空ポンプ（Ｖａｃｕｕｂｒａｎｄ，Ｗｅｒｔｈｅｉｍ）を用いてチャンバ内の圧力を０．９ｂａｒだけ低下させ、そして植物組織の表面に対しタングステン粒子で９バールのヘリウムガス圧においてボンバードメントを行った。その直後にチャンバを換気した。
【０１０２】
形質転換された細胞を標識するために、葉をプラスミドでボンバードメントした（ｐＧＦＰ；ｐＵＣ１８系ベクター、挿入されたＧＦＰ遺伝子を有するＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター／ターミネーターカセット；Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ  Ｐら（１９９９）Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  １２：６４７−５４；Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，Ｐ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ＩＰＫ，Ｇａｔｅｒｓｌｅｂｅｎ，ＧｅｒｍａｎｙのＤｒ  Ｐ．Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒから提供を受けた）。別のプラスミドでボンバードメントを行う前に、それぞれの実験でマクロキャリアを水でよく洗浄した。ボンバードメント後に、日光中でペトリ皿を僅かにあけたままにして、葉を４時間室温でインキュベートしたのち、それらに１００分生胞子器／ｍｍのオオムギ真菌のウドンコ病菌を（系統Ａ６）接種し、そして同一条件下でさらに４０〜４８時間インキュベートした。
【０１０３】
粒子流入銃を用いて葉の切片に被覆粒子をボンバードメントした。各ボンバードメントのために、３１２ｍｇのタングステン粒子を適用した。ボンバードメントの４時間後に、葉にブルメリア・グラミニスウドンコ病菌（系統Ａ６）を接種し、そしてさらに４０時間後に感染症状について評価した。結果（例えば、成熟した吸収管及び二次的延長菌糸を形成する、攻撃された細胞のパーセンテージとして定義される侵入効率；計算：以下参照）を、蛍光顕微鏡及び光学顕微鏡により分析した。１００分生胞子器／ｍｍ２の接種により、形質転換細胞の約５０％の攻撃頻度を生じた。最小１００の相互作用部位を各実験それぞれについて評価した。形質転換（ＧＦＰ発現）細胞を、青色光で励起して同定した。形質転換細胞の３つの異なるカテゴリーが識別された：
１．  容易に認識できる吸収管を含む侵入された細胞。１以上の吸収管を含む細胞を１細胞と評価した
２．  真菌の付着器によって攻撃されるが、吸収管を含まない細胞。オオムギウドンコ病菌によって繰り返し攻撃されているが、吸収管を含まない細胞を１細胞と評価した
３．  オオムギウドンコ病菌によって攻撃されない細胞。
【０１０４】
評価には細孔細胞及び副細胞を含めなかった。オオムギウドンコ病菌の表面構造を、光学顕微鏡及び０．１％カルコフルオル（Calcofluor）（水中のｗ／ｖ）による真菌の３０秒間の蛍光染色によって分析した。真菌の発育は、カルコフルオル染色後に蛍光顕微鏡で容易に評価することができる。真菌は、Ｐｐ２９１−又はＰｐ３６４−ｄｓＲＮＡ形質転換細胞の一次及び付着器胚管を発生するが、吸収管の発育は起こらない。吸収管の発生は二次菌糸が発育するための条件である。
【０１０５】
相対侵入効率（ＲＰＥ）は、形質転換細胞（Ｐｐ２９１又はＰｐ３６４ ｃＤＮＡで形質転換）の侵入効率と非形質転換細胞の侵入効率（この場合：平均侵入効率５７％）との差として計算される。パーセントで表したＲＰＥ（％ＲＰＥ）は、ＲＰＥから１を引いた値に１００を乗じることによって計算される：
ＲＰＥ＝［形質転換細胞のＰＥ］
［非形質転換細胞のＰＥ］
％ＲＰＥ＝１００×（ＲＰＥ−１）
【０１０６】
％ＲＰＥ値（コントロールの平均侵入効率からの偏差）は、Ｐｐ２９１又はＰｐ３６４ ｃＤＮＡで形質転換された細胞の感受性の決定に役立つ。
【０１０７】
５つの独立した実験において、コントロールｃＤＮＡは、オオムギウドンコ病菌の侵入効率に関して、コントロールｃＤＮＡでの形質転換と水での形質転換との間で差異がないことを明らかにした。
【０１０８】
攻撃された細胞の形質転換率又は生存率に対するｃＤＮＡの効果を除外するために、コントロールｃＤＮＡと、Ｐｐ２９１又はＰｐ３６４ ｃＤＮＡとの実験間でＧＦＰ発現性細胞の数を比較した。Ｐｐ２９１及びＰｐ３６４ ｃＤＮＡは、ＧＦＰ発現細胞の総数又は攻撃されたＧＦＰ発現細胞の数に対して影響を及ぼさなかった。
【０１０９】
Ｐｐ２９１及びＰｐ３６４によるトランスフェクション率は、オオムギウドンコ病菌の侵入頻度の劇的な低下を生じさせた（平均％ＲＰＥ値＝−３０％）。
【０１１０】
図面の説明
図１：クローンＰｐ２９１のアフィニティー精製
（Ａ）；ｐＨ勾配で溶出：Ｍ＝マーカー；１＝ブランクベクターｐＱＥ３０（非誘導）；２＝ｐＱＥ３０（ＩＰＴＧ誘導）；３＝非誘導Ｐｐ２９１；４＝誘導Ｐｐ２９１；５＝１の超遠心後の上清；６＝２の超遠心後の上清；７＝溶出液；８、９、１０＝洗浄ステップｐＨ８、ｐＨ７、ｐＨ６；１１、１２＝溶出ステップｐＨ５、ｐＨ４；
（Ｂ）；イミダゾール勾配で溶出；Ｍ＝マーカー；１〜１１＝上昇するイミダゾール濃度（ｍＭ）：０、２０、４０、６０、８０、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００。
【０１１１】
図２：光度測定活性アッセイ：クローンＰｐ２９１の細胞溶解物（Ｃ）、この細胞溶解物の１：５０希釈物（Ｂ）及びブランクベクターｐＱＥ３０（Ａ）を添加した後のヒドロペルオキシド溶液の２３４ｎｍにおける吸収の低下が示される。
【０１１２】
図３：ヒドロペルオキシドとジビニルエーテルシンターゼとの反応中に生成した揮発性アルデヒドの誘導体としてのヒドラゾンのＨＰＬＣ分析の溶出プロフィール：コルネレイック（ｃｏｌｎｅｌｅｉｃ）（ジビニルエーテルの１種）をアルデヒド誘導体化試薬で処理したのちの（２Ｅ）−ノネナールの検出。
【０１１３】
図４：基質１３−ＨＰＯＴＥ及び９−ＨＰＯＤＥを用いた、クローンＰｐ３６４によってコードされるＤＥＳ酵素の触媒作用生成物（アルデヒド）のＨＰＬＣ分析の溶出プロフィール。それらは、それらの保持時間に基づいて（２Ｅ）−ヘキサナール及び（２Ｅ）−ノネナールと同定された。
【０１１４】
図５：クローンＰｐ２９１によってコードされるＡＯＳ酵素によるヒドロペルオキシドの変換の不揮発性生成物のＨＰＬＣ分析の溶出プロフィール。
【０１１５】
図６：クローンＰｐ３６４によってコードされるＤＥＳ酵素によるヒドロペルオキシドの変換の不揮発性生成物のＨＰＬＣ分析の溶出プロフィール；
ａ＝細胞溶解物；ｂ＝精製酵素。
【０１１６】
図７：クローンＰｐ２９１によってコードされるＣＹＰ７４酵素の触媒作用による生成物のＧＣ／ＭＳクロマトグラムが作成される。１８．２分におけるシグナルは枠内に示す質量スペクトルを有する。
【０１１７】
図８：ｐＨの関数としての、クローンＰｐ２９１によってコードされるＣＹＰ７４酵素の相対酵素活性。
【０１１８】
図９：クローンＰｐ２９１によってコードされるＣＹＰ７４酵素による種々の基質の相対変換速度（基質特異性）；各実験の基質濃度２０μＭ；測定は光度測定法で行った；ｎ．ｄ．＝検出できず。
【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】クローンＰｐ２９１のアフィニティー精製（Ａ）；ｐＨ勾配で溶出；（Ｂ）；イミダゾール勾配で溶出。
【図２】光度測定活性アッセイ：クローンＰｐ２９１の細胞溶解物（Ｃ）、この細胞溶解物の１：５０希釈物（Ｂ）及びブランクベクターｐＱＥ３０（Ａ）を添加した後のヒドロペルオキシド溶液の２３４ｎｍにおける吸収の低下。
【図３】ヒドロペルオキシドとジビニルエーテルシンターゼとの反応中に生成した揮発性アルデヒドの誘導体としてのヒドラゾンのＨＰＬＣ分析の溶出プロフィール。
【図４】基質１３−ＨＰＯＴＥ及び９−ＨＰＯＤＥを用いた、クローンＰｐ３６４によってコードされるＤＥＳ酵素の触媒作用生成物（アルデヒド）のＨＰＬＣ分析の溶出プロフィール。
【図５】クローンＰｐ２９１によってコードされるＡＯＳ酵素によるヒドロペルオキシドの変換の不揮発性生成物のＨＰＬＣ分析の溶出プロフィール。
【図６】クローンＰｐ３６４によってコードされるＤＥＳ酵素によるヒドロペルオキシドの変換の不揮発性生成物のＨＰＬＣ分析の溶出プロフィール。
【図７】クローンＰｐ２９１によってコードされるＣＹＰ７４酵素の触媒作用による生成物のＧＣ／ＭＳクロマトグラム。
【図８】ｐＨの関数としての、クローンＰｐ２９１によってコードされるＣＹＰ７４酵素の相対酵素活性。
【図９】クローンＰｐ２９１によってコードされるＣＹＰ７４酵素による種々の基質の相対変換速度（基質特異性）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月19日(2003.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するアレン酸化物シンターゼ。
【請求項２】
配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するジビニルエーテルシンターゼ。
【請求項３】
基質として９−ＨＰＯＤ／ＴＥ及び１３−ＨＰＯＤ／ＴＥの両者を変換する請求項１又は２に記載の酵素。
【請求項４】
多価不飽和脂肪酸の生合成に関与する請求項１に記載のアレン酸化物シンターゼをコードする、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される単離されたヌクレオチド配列：
ａ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）ａ）又はｂ）に対し相補的なヌクレオチド配列
【請求項５】
多価不飽和脂肪酸の生合成に関与する請求項２に記載のジビニルエーテルシンターゼをコードする、以下の（ａ）〜（ｃ）から選択される単離されたヌクレオチド配列：
ａ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号３に示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｃ）ａ）又はｂ）に対し相補的なヌクレオチド配列
【請求項６】
コケ又は高等植物に由来する請求項４又は５に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項７】
ヒメツリガネゴケに由来する請求項４〜６のいずれかに記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれかに記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つ、その対立遺伝子、誘導体又は部分、並びにそれと機能しうる形で連結された調節ヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物。
【請求項９】
請求項４〜７のいずれかに記載の単離されたヌクレオチド配列の少なくとも１つ、その対立遺伝子、誘導体及び／若しくは部分、並びに／又は請求項８に記載の遺伝子構築物、並びに宿主細胞における選択及び／若しくは複製のため、及び／又は宿主細胞のゲノム内への組込みのための別のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１０】
請求項４〜７のいずれかに記載の単離されたヌクレオチド配列の少なくとも１つ、その対立遺伝子、誘導体及び／若しくは部分、及び／又は請求項８に記載の遺伝子構築物、及び／又は請求項９に記載のベクターを複製可能な形態で含むトランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫であって、内因性遺伝子発現と比較してアレン酸化物シンターゼをコードするヌクレオチド配列及び／又はジビニルエーテルシンターゼをコードするヌクレオチド配列の発現の増大を示し、該発現が植物の病原体抵抗性の増強をもたらす、上記トランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫。
【請求項１１】
請求項４〜７のいずれかに記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つ、その対立遺伝子、誘導体及び／若しくは部分、及び／又は請求項８に記載の遺伝子構築物、及び／又は請求項９に記載のベクターが、染色体外の形態で存在する、及び／又は宿主植物ゲノム内に安定的に組込まれている、請求項１０に記載のトランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫。
【請求項１２】
請求項１に記載のアレン酸化物シンターゼ、その誘導体及び／若しくは部分、及び／又は請求項２に記載のジビニルエーテルシンターゼ、そのイソ酵素、誘導体及び／若しくは部分を含み、植物細胞において対応する内因性酵素比活性と比較して比活性の増大を示すものである、請求項１０又は１１に記載のトランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫。
【請求項１３】
有用植物又はその細胞であり、好ましくはナス科又は穀物科の植物、特に好ましくはジャガイモ、オオムギ又はコムギである、請求項１０〜１２のいずれかに記載のトランスジェニック植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫。
【請求項１４】
請求項４〜７のいずれかに記載のヌクレオチド配列の単独若しくは組み合わせ、及び／又は請求項８に記載の遺伝子構築物、及び／又は請求項９に記載のベクターを、複製可能な形態で植物細胞に移入し、こうして形質転換された植物細胞から植物個体を再生させることを含む、植物の病原体抵抗性の増強方法。
【請求項１５】
使用される植物細胞が、有用植物に由来する細胞、好ましくはナス科又は穀物科の植物、特に好ましくはジャガイモ、オオムギ又はコムギに由来する細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫の病原体抵抗性を増強するための、請求項４〜７のいずれかに記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つの使用。
【請求項１７】
植物細胞、植物個体及び／又はそれらの子孫の病原体抵抗性を増強するための、請求項１〜６のいずれかに記載の酵素の少なくとも１つの使用。
【請求項１８】
少なくとも１つの酵素の比活性の増大が、対応する内因性酵素比活性と比較して２０〜９０％、好ましくは３０〜８０％、特に好ましくは４０〜７０％増強された植物細胞又は植物の病原体抵抗性を生じさせる、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
少なくとも１つの酵素が、ウドンコ病菌、好ましくはオオムギウドンコ病菌（ブルメリア・グラミニスｆ．ｓｐ．ホルデイ）若しくはコムギウドンコ病菌（ｆ．ｓｐ．トリチシ）、及び／又は疫病菌（フィトフトラ・インフェスタンス）に対する抵抗性の増強を生じさせる、請求項１７又は１８に記載の使用。
【国際調査報告】
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