(57)【要約】Ｃ１  ｍｙｂ転写因子および Ｒタイプのｍｙｃ転写因子を用いてイソフラボノイド産生植物における全ゲニステインに対する全ダイゼインの比を変化させるための方法について説明する。また、ゲノムにこれらの転写因子を含む植物ならびに、これらの植物の種子から作られるイソフラボノイド含有生成物についても説明する。このような生成物では、対照の全ダイゼイン対全ゲニステイン比と比較した場合に全ゲニステインに対する全ダイゼインの比が高められている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）（ｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む第１の組換え発現コンストラクトおよびＲ  ｍｙｃタイプの転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え発現コンストラクト、（ｉｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターとＲ  ｍｙｃタイプの転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターとを含む第２の組換え発現コンストラクト、あるいは（ｉｉｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子の全体または一部とＲ  ｍｙｃタイプの全体または一部とをコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含み、Ｃ１  ｍｙｂ転写因子およびＲ  ｍｙｃタイプの転写因子の両方として機能できる組換え発現コンストラクトを用いて植物を形質転換し、そして
（ｂ）形質転換植物を単数または複数の組換え発現コンストラクトの発現に適した条件下で成長させることを含み、
単数または複数のコンストラクトの発現によって対照の全ダイゼイン対全ゲニステイン比よりも全ダイゼイン対全ゲニステイン比を高くすることで形質転換植物のイソフラボノイド特性を変化させる、イソフラボノイド産生植物のイソフラボノイド特性を変化させる方法。
【請求項２】
Ｃ１  ＤＮＡ結合ドメインとＣ１活性化ドメインとの間に座位するメイズＲコード領域を含むキメラ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え発現コンストラクトを用いて植物を形質転換する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
イソフラボノイド産生植物が、ダイズと、クローバーと、リョクトウと、レンズマメと、ヘアリーベッチと、アルファルファと、ルピナスと、シュガービートと、サヤエンドウと、からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記植物の全ダイゼイン対全ゲニステイン比が対照の全ダイゼイン対全ゲニステイン比よりも高い、請求項１または２に記載の方法によって作出されるイソフラボノイド産生植物。
【請求項６】
前記植物が、ダイズと、クローバーと、リョクトウと、レンズマメと、ヘアリーベッチと、アルファルファと、ルピナスと、シュガービートと、サヤエンドウと、からなる群から選択される、請求項５に記載のイソフラボノイド産生植物。
【請求項７】
請求項５に記載の植物の種子または植物の一部。
【請求項８】
請求項６に記載の植物の種子または植物の一部。
【請求項９】
請求項７に記載の種子または植物の一部から得られる、全ゲニステインに対する全ダイゼインの比が高められたイソフラボノイド含有生成物。
【請求項１０】
請求項８に記載の種子または植物の一部から得られる、全ゲニステインに対する全ダイゼインの比が高められたイソフラボノイド含有生成物。
【請求項１１】
イソフラボノイド生成物が、タンパク質単離物と、タンパク質濃縮物と、ミールと、グリッツと、全脂および脱脂フラワーと、組織状タンパク質と、組織状フラワーと、組織状濃縮物と、組織状単離物と、からなる群から選択される、請求項９に記載のイソフラボノイド含有生成物。
【請求項１２】
イソフラボノイド含有生成物が、タンパク質単離物と、タンパク質濃縮物と、ミールと、グリッツと、全脂および脱脂フラワーと、組織状タンパク質と、組織状フラワーと、組織状濃縮物と、組織状単離物と、からなる群から選択される、請求項１０に記載の生成物。
【請求項１３】
全ゲニステインに対する全ダイゼインの比が高められた抽出イソフラボノイド含有生成物であって、前記生成物が請求項７に記載の種子または植物の一部から抽出される、抽出イソフラボノイド含有生成物。
【請求項１４】
全ゲニステインに対する全ダイゼインの比が高められた抽出イソフラボノイド含有生成物であって、前記生成物が請求項８に記載の種子または植物の一部から抽出される、抽出イソフラボノイド含有生成物。
【請求項１５】
請求項９に記載の生成物が配合された食品。
【請求項１６】
請求項１０に記載の生成物が配合された食品。
【請求項１７】
請求項９に記載の生成物が配合された飲料。
【請求項１８】
請求項１０に記載の生成物が配合された飲料。
【請求項１９】
請求項８に記載の種子から得られる、全ゲニステインに対する全ダイゼインの比が高められたイソフラボノイド含有ダイズタンパク生成物であって、種子がダイズ種子である、イソフラボノイド含有ダイズタンパク生成物。
【請求項２０】
イソフラボノイド生成物が、タンパク質単離物と、タンパク質濃縮物と、ミールと、グリッツと、全脂および脱脂フラワーと、組織状タンパク質と、組織状フラワーと、組織状濃縮物と、組織状単離物と、豆乳と、豆腐と、発酵大豆製品と、全粒大豆製品と、からなる群から選択される、請求項１９に記載の生成物。
【請求項２１】
全ゲニステインに対する全ダイゼインの比が高められた抽出イソフラボノイド含有ダイズタンパク生成物であって、前記生成物が請求項８に記載の種子から抽出され、この種子がダイズ種子である、抽出イソフラボノイド含有ダイズタンパク生成物。
【請求項２２】
請求項１９に記載の生成物が配合された食品。
【請求項２３】
請求項１９に記載の生成物が配合された飲料。
【請求項２４】
（ａ）請求項７に記載の種子を破って外皮から種実を取り除き、そして
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた種実を、所望のフレーク厚が得られるようにフレーク状にすることを含む、イソフラボノイド含有生成物の製造方法。
【請求項２５】
（ａ）請求項８に記載の種子を破って外皮から種実を取り除き、そして
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた種実を、所望のフレーク厚が得られるようにフレーク状にすることを含む、イソフラボノイド含有生成物の製造方法。
【請求項２６】
種子がダイズ種子である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（ｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む第１の組換え発現コンストラクトおよびＲ  ｍｙｃタイプの転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え発現コンストラクト、
（ｉｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターとＲ  ｍｙｃタイプの転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターとを含む第２の組換え発現コンストラクト、あるいは
（ｉｉｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子の全体または一部とＲ  ｍｙｃタイプの全体または一部とをコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含み、Ｃ１  ｍｙｂ転写因子およびＲ  ｍｙｃタイプの転写因子の両方として機能できる組換え発現コンストラクトをゲノム中に含む、イソフラボノイド産生植物であって、
対照の全ダイゼイン対全ゲニステイン比と比較した場合に前記植物の全ダイゼイン対全ゲニステイン比が高められている、イソフラボノイド産生植物。
【請求項２８】
組換え発現コンストラクト（ｉｉｉ）が、Ｃ１  ＤＮＡ結合ドメインとＣ１活性化ドメインとの間に座位するメイズＲコード領域を含むキメラ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む、請求項２７に記載のイソフラボノイド産生植物。
【請求項２９】
プロモーターが種子特異的プロモーターである、請求項２７または２８に記載のイソフラボノイド産生植物。
【請求項３０】
イソフラボノイド産生植物が、ダイズと、クローバーと、リョクトウと、レンズマメと、ヘアリーベッチと、アルファルファと、ルピナスと、シュガービートと、サヤエンドウと、からなる群から選択される、請求項２７または２８に記載のイソフラボノイド産生植物。
【請求項３１】
前記植物の全ダイゼイン対全ゲニステイン比が対照の全ダイゼイン対全ゲニステイン比よりも高い、請求項２７または２８に記載のイソフラボノイド産生植物。
【請求項３２】
前記植物が、ダイズと、クローバーと、リョクトウと、レンズマメと、ヘアリーベッチと、アルファルファと、ルピナスと、シュガービートと、サヤエンドウと、からなる群から選択される、請求項３１に記載のイソフラボノイド産生植物。
【請求項３３】
請求項３１に記載の植物の種子または植物の一部。
【請求項３４】
請求項３２に記載の植物の種子または植物の一部。
【請求項３５】
請求項３３に記載の種子または植物の一部から得られる、全ゲニステインに対する全ダイゼインの比が高められたイソフラボノイド含有生成物。
【請求項３６】
請求項３４に記載の種子または植物の一部から得られる、全ゲニステインに対する全ダイゼインの比が高められたイソフラボノイド含有生成物。
【請求項３７】
イソフラボノイド生成物が、タンパク質単離物と、タンパク質濃縮物と、ミールと、グリッツと、全脂および脱脂フラワーと、組織状タンパク質と、組織状フラワーと、組織状濃縮物と、組織状単離物と、からなる群から選択される、請求項３５に記載の生成物。
【請求項３８】
イソフラボノイド含有生成物が、タンパク質単離物と、タンパク質濃縮物と、ミールと、グリッツと、全脂および脱脂フラワーと、組織状タンパク質と、組織状フラワーと、組織状濃縮物と、組織状単離物と、からなる群から選択される、請求項３６に記載の生成物。
【請求項３９】
全ゲニステインに対する全ダイゼインの比が高められた抽出イソフラボノイド含有生成物であって、前記生成物が請求項３３に記載の種子または植物の一部から抽出される、抽出イソフラボノイド含有生成物。
【請求項４０】
全ゲニステインに対する全ダイゼインの比が高められた抽出イソフラボノイド含有生成物であって、前記生成物が請求項３４に記載の種子または植物の一部から抽出される、抽出イソフラボノイド含有生成物。
【請求項４１】
請求項３５に記載の生成物が配合された食品。
【請求項４２】
請求項３６に記載の生成物が配合された食品。
【請求項４３】
請求項３５に記載の生成物が配合された飲料。
【請求項４４】
請求項３６に記載の生成物が配合された飲料。
【請求項４５】
請求項３４に記載の種子から得られる、全ゲニステインに対する全ダイゼインの比が高められたイソフラボノイド含有ダイズタンパク生成物であって、種子がダイズ種子である、イソフラボノイド含有ダイズタンパク生成物。
【請求項４６】
イソフラボノイド生成物が、タンパク質単離物と、タンパク質濃縮物と、ミールと、グリッツと、全脂および脱脂フラワーと、組織状タンパク質と、組織状フラワーと、組織状濃縮物と、組織状単離物と、豆乳と、豆腐と、発酵大豆製品と、全粒大豆製品と、からなる群から選択される、請求項４４に記載の生成物。
【請求項４７】
全ゲニステインに対する全ダイゼインの比が高められた抽出イソフラボノイド含有ダイズタンパク生成物であって、前記生成物が請求項３４に記載の種子から抽出され、この種子がダイズ種子である、抽出イソフラボノイド含有ダイズタンパク生成物。
【請求項４８】
請求項４０に記載の生成物が配合された食品。
【請求項４９】
請求項４０に記載の生成物が配合された飲料。
【請求項５０】
（ａ）請求項３３に記載の種子を破って外皮から種実を取り除き、そして
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた種実を、所望のフレーク厚が得られるようにフレーク状にすることを含む、イソフラボノイド含有生成物の製造方法。
【請求項５１】
（ａ）請求項３４に記載の種子を破って外皮から種実を取り除き、そして
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた種実を、所望のフレーク厚が得られるようにフレーク状にすることを含む、イソフラボノイド含有生成物の製造方法。
【請求項５２】
種子がダイズ種子である、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本件出願は２００１年６月１３日出願の米国仮特許出願第６０／２９７，９８１号の優先権の利益を主張するものであり、その内容全体を本願明細書に援用する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、フェニルプロパノイド経路における遺伝子の発現を調節するＣ１  ｍｙｂ転写因子とＲタイプのｍｙｃ転写因子とを利用してイソフラボノイド産生植物中の各イソフラボノイドの比を変化させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
イソフラボノイドとは、マメ科の植物においてフェニルプロパノイド経路から派生して得られる一群の二次代謝産物を示し、イソフラボン、イソフラバノン、ロテノイド、プテロカルパン、イソフラバン、キノン誘導体、３−アリール−４−ヒドロキシクマリン、３−アリールクマリン、イソフラブ−３−エン、クメスタン、α−メチルデオキシベンゾイン、２−アリールベンゾフラン、イソフラバノール、クマロノクロモンなどの化合物がこれに含まれる。植物では、これらの化合物は他の生物体との間の相互作用に関与し、植物病原微生物に対するマメ科植物の防御応答に加わることが知られている（非特許文献１）。イソフラボノイド由来の化合物は、最終的に根粒形成および窒素固定につながる根株と根粒菌との共生にも関与し（非特許文献２）、全般的にいえば抗生物質や防虫剤、誘引物質、シグナル化合物として機能することが明らかになっている（非特許文献３）。
【０００４】
また、イソフラボノイドは、動物およびヒトでの研究で生理活性を持つことも報告されている。たとえば、ダイズ種子に見られるイソフラボンに、抗溶血作用（非特許文献４）、抗真菌作用（非特許文献５）、発情促進作用（非特許文献６）、腫瘍抑制作用（非特許文献７、非特許文献８）、脂質低下作用（非特許文献９）、血清コレステロール低下作用（非特許文献１０）があることが報告されている。これらの研究から、ダイズタンパク生成物に含まれるイソフラボンが健康面からみて重要な多くの効用を生み出すのではないかということが分かる。
【０００５】
遊離イソフラボンがダイズ中に高濃度で蓄積されることはほとんどなく、通常は炭水化物または有機酸と結合している。ダイズ種子には、アグリコン型のダイゼイン、ゲニステインおよびグリシテイン、グルコシド型のダイジン、ゲニスチンおよびグリシチン、マロニルグルコシド型の６’’−Ｏ−マロニルダイジン、６’’−Ｏ−マロニルゲニスチンおよび６’’−Ｏ−マロニルグリシチンと、３つのタイプのイソフラボンが３通りの形で含まれる。加工処理時に、６’−Ｏ−アセチルダイジン、６’−Ｏ−アセチルゲニスチン、６’−Ｏ−アセチルグリシチンといったアセチルグルコシドの形が生成される。ダイズ種子中のイソフラボノイド含有量は極めて多様であり、遺伝的特徴と育成場所や登熟期の温度などの環境条件の両方に影響される（非特許文献１１、非特許文献１２）。また、マメ科植物のイソフラボノイド含有量は、病原体による攻撃、創傷、強いＵＶ光線への曝露、汚染によってストレス誘発される可能性がある（非特許文献１３）。ゲニステインの形でのイソフラボノイドがダイズ種子や大半の食品に最も豊富に含まれるグループをなし、一方、ダイゼインおよびグリシテインの形で存在する濃度は低い（非特許文献１４）。
【０００６】
ダイズにおけるイソフラボノイドの生合成経路ならびにいくつかの他のクラスのフェニルプロパノイドとの関係を図１Ａおよび図１Ｂに示す。
【０００７】
イソフラボンシンターゼの作用によってイソフラボノイドが合成される分岐経路が見られるのは主にマメ科の植物に限られるが、フェニルプロパノイド経路や他の派生はマメ科以外の植物種においても起こる。メイズでは、フェニルプロパノイド経路とこれよりも下流のアントシアニン分岐経路の遺伝子が、Ｒタイプの因子との組み合わせで転写因子Ｃ１によって調節される。Ｃ１およびＲタイプの因子は、メイズ細胞でのアントシアニンの合成および蓄積につながる一連の遺伝子の発現を活性化する（非特許文献１５）。
【０００８】
メイズのＣ１は、メイズ細胞でのアントシアニンの産生と蓄積とに関与する遺伝子の発現を調節するｍｙｂタイプの転写因子である。しかしながら、Ｃ１単独では遺伝子発現を活性化することができず、標的遺伝子プロモーターを活性化するにはＲタイプのｍｙｃ転写因子との相互作用が必要になる。Ｒタイプの因子としては、特に、Ｒのアレル、メイズのＢ相同遺伝子のアレル、Ｌｃ相同遺伝子のアレルがあげられる。これらの遺伝子は同じように機能し、Ｒ／Ｂ遺伝子ファミリを構成する（非特許文献１６）。Ｒ／Ｂ遺伝子ファミリのさまざまな遺伝子は、各々プロモーターが違うことからトウモロコシ茎葉内での発現パターンを変動させる異なるアレルとして見られることがある。このファミリのメンバは極めて似通ったアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするため、アントシアニン経路の構造遺伝子に対して共通の作用を持つ。これらの異なるプロモーターの特異性からアントシアニン生合成の組織特異性が生じる（非特許文献１７、非特許文献１８）。所望の組織または発達段階においてＲ遺伝子の機能を得るにあたって、最適なプロモーターとの併用でこの大きなファミリの機能的遺伝子のコード領域のうちのどれを使ってもよいことは当業者であれば分かるであろう。Ｒ／Ｂファミリ遺伝子およびアレルの例としては、Ｌｃ、Ｒ、Ｒ−Ｓ、Ｒ−Ｐ、Ｓｎ、Ｂ−Ｐｅｒｕ、Ｂ−Ｉがあげられるが、これに限定されるものではない。Ｃ１に関しての実験では、Ｌｃ遺伝子またはＢ遺伝子の特定のアレル、特にＢ−Ｐｅｒｕアレルのコード領域が最もよく使用されている。
【０００９】
エストラジオールを添加した後、Ｃ１とＲとの融合のエストラジオール誘導バージョン（ＣＲＣ）を持つメイズ自殖ブラックメキシカンスウィート（Ｂｌａｃｋ  Ｍｅｘｉｃａｎ  Ｓｗｅｅｔ）（ＢＭＳ）の懸濁細胞株を分析した。カルコンイソメラーゼ以外の既知のフラボノイド遺伝子から得られるｃＤＮＡ断片をホルモン誘導後にＣＲＣ発現株で誘導した（非特許文献１９）。メイズのＣ１およびＲタイプの因子が一緒になると、本来はアントシアニンが発現されないＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓの組織（非特許文献２０）およびペチュニアの葉（非特許文献２１）でアントシアニンの合成を促進することができる。
【００１０】
１９９９年７月２９日公開の特許文献１には、ＲのＬｃアレルとメイズＣ１をトマト果実で発現させたところ、フラボノールケンフェロールの濃度が上昇したことが開示されている。このように、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、ペチュニア、トマト、メイズをはじめとする植物において、Ｃ１およびＲタイプの因子によってフェニルプロパノイド経路の個々の遺伝子の発現を調節し、アントシアニンまたはフラボノールを産生できることが周知である。これらの植物はいずれもイソフラボンが産生されない植物である。イソフラボンが産生されるのはマメ科の植物だけにほぼ限られている。イソフラボンが産生されるマメ科以外の植物のごく限られた例のひとつにシュガービートがある。
【００１１】
マメ科の植物であるシロツメクサとエンドウマメにおいてＣ１とＢ−Ｐｅｒｕとを一過的に発現させ（非特許文献２２）、目視による検査でアントシアニン濃度を調べた。Ｃ１およびＢ−Ｐｅｒｕが一過的に発現することで、シロツメクサとエンドウマメのいくつかの組織でのアントシアニンが産生される結果となった。Ｃ１およびＢ−Ｐｅｒｕがイソフラボノイド濃度に対しておよぼす作用を判定するためのアッセイについては実施されなかった。このため、イソフラボノイド産生植物でＣ１およびＲタイプのｍｙｃがイソフラボノイド濃度に対してどのような影響をおよぼすのかは教示されていない。
【００１２】
２０００年８月３日公開の特許文献２には、イソフラボンシンターゼ遺伝子の過発現に関連してメイズのＣ１およびＲ（ＣＲＣキメラとして）でダイズを形質転換することについて開示されている。ＣＲＣ単独の場合にイソフラボノイドの濃度にどのような影響がおよぶのかについては何ら報告されていない。このように、イソフラボンシンターゼのない状態で、Ｃ１およびＲタイプの因子を単独で導入するとイソフラボノイド産生植物でのイソフラボノイドの合成と蓄積とに何らかの影響がおよび得るのか否かは明らかになっていない。
【００１３】
植物と人間のどちらにおいてもイソフラボノイドに関連した生理学的な利点があることから、作物でその含有量を操作することが極めて望ましくなっている。たとえば、ダイズ種子中のイソフラボノイド濃度を高めれば、血清コレステロールの低減用またはエストロゲン補充療法用として今日販売されているイソフラボン関連生成物の抽出効率を高め、これにかかるコストを低減することができよう。
【００１４】
【特許文献１】
ＷＯ９９／３７７９４号明細書
【特許文献２】
ＷＯ００／４４９０９号明細書
【非特許文献１】
Ｄｅｗｉｃｋ，Ｐ．Ｍ．（１９９３）、Ｔｈｅ  Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｉｎｃｅ  １９８６，Ｈａｒｂｏｒｎｅ，Ｊ．Ｂ．編、第１１７〜２３８頁、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ、Ｌｏｎｄｏｎ。
【非特許文献２】
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｄ．Ａ．（１９９２）、Ｒｅｃｅｎｔ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．、第２６巻、第２０１〜２３１頁、Ｓｔａｆｆｏｒｄ，Ｈ．Ａ．およびＩｂｒａｈｉｍ，Ｒ．Ｋ．編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【非特許文献３】
Ｂａｒｚ，Ｗ．およびＷｅｌｌｅ，Ｒ．（１９９２）、Ｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ、第１３９〜１６４頁、Ｈ．Ａ．ＳｔａｆｆｏｒｄおよびＲ．Ｋ．Ｉｂｒａｈｉｍ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【非特許文献４】
Ｎａｉｍ，Ｍ．ら（１９７６）、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２４：１１７４〜１１７７。
【非特許文献５】
Ｎａｉｍ，Ｍ．ら（１９７４）、Ｊ．Ａｇｒ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．２２：８０６〜８１０。
【非特許文献６】
Ｐｒｉｃｅ，Ｋ．Ｒ．およびＦｅｎｗｉｃｋ，Ｇ．Ｒ．（１９８５）、Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔ．Ｃｏｎｔａｍ．２：７３〜１０６。
【非特許文献７】
Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｍ．およびＢａｒｎｅｓ，Ｓ．（１９９１）、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８３：５４１〜５４６。
【非特許文献８】
Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｇ．ら（１９９１）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：６６１〜６６７。
【非特許文献９】
Ｍａｔｈｕｒ，Ｋ．ら（１９６４）、Ｊ．Ｎｕｔｒ．８４：２０１〜２０４。
【非特許文献１０】
Ｓｈａｒｍａ，Ｒ．Ｄ．（１９７９）、Ｌｉｐｉｄｓ  １４：５３５〜５４０。
【非特許文献１１】
塚本知玄ら（１９９５）、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４３：１１８４〜１１９２。
【非特許文献１２】
Ｗａｎｇ，Ｈ．およびＭｕｒｐｈｙ，Ｐ．Ａ．（１９９４）、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４２：１６７４〜１６７７。
【非特許文献１３】
Ｄｉｘｏｎ，Ｒ．Ａ．およびＰａｉｖａ，Ｎ．Ｌ．（１９９５）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ７：１０８５〜１０９７。
【非特許文献１４】
Ｍｕｒｐｈｙ，Ｐ．Ａ．（１９９９）、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４７：２６９７〜２７０４。
【非特許文献１５】
Ｇｒｏｔｅｗｏｌｄ，Ｅ．ら（１９９８）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １０：７２１〜７４０。
【非特許文献１６】
Ｇｏｆｆ，Ｓ．Ａ．ら（１９９２）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：８６４〜８７５。
【非特許文献１７】
Ｒａｄｉｃｅｌｌａ，Ｊ．Ｐ．ら（１９９２）、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：２１５２〜２１６４。
【非特許文献１８】
Ｗａｌｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．（１９９５）、ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：２３５０〜２３６３。
【非特許文献１９】
Ｂｒｕｃｅら（２０００）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １２：６５〜８０。
【非特許文献２０】
Ｌｌｏｙｄ，Ａ．Ｍ．ら（１９９２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１７７３〜１７７５。
【非特許文献２１】
Ｑｕａｔｔｒｏｃｃｈｉｏ，Ｆ．ら（１９９３）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ５：１４９７〜１５１２。
【非特許文献２２】
Ｍａｊｎｉｋら（１９９８）、Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓ．２５：３３５〜３４３。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
イソフラボノイド全体の濃度を変化させるだけでなく、個々のイソフラボノイド成分の比率を変化させることも対象とする。ゲニステインおよびダイゼインがそれぞれ植物の病気に対する応答に影響し、さらには人間の健康に何らかの影響をおよぼすという指摘もいくつかある。ダイゼインがダイズの主要なフィトアレキシンすなわちグリセオリンの前駆体であるのに対し、ゲニステインはグリセオリンが合成されるように病原体の攻撃に対する細胞応答の成立に関与している（グラハム（Ｇｒａｈａｍ）およびグラハム（Ｇｒａｈａｍ）（２０００）Ｍｏｌ．  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．  ５：１８１〜２１９）。人間の健康という点では、ダイゼインは人間の血液中におけるＬＤＬコレステロール濃度を抑え、ＨＤＬコレステロール濃度を高める上で効果がある（米国特許第５，８５５，８９２号）。また、ダイゼインは高血圧や冠状動脈アテローム性硬化心臓疾患の治療にも効果がある（リュウ（Ｌｉｕ），Ｙ．ら（１９９０）、Ｓｈｅｎｙａｎｇ  Ｙａｏｘｕｅｙｕａｎ  Ｘｕｅｂａｏ  ７：１２３〜１２５）。このように、イソフラボノイド全体のうちのダイゼイン成分を増やすと有意な可能性がある。
【００１６】
したがって、イソフラボノイドの濃度を高め、イソフラボノイド産生植物中のイソフラボノイド成分の比率を変化させることには需要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、（ａ）（ｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む第１の組換え発現コンストラクトおよびＲ  ｍｙｃタイプの転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む第２の組換え発現コンストラクト、（ｉｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターとＲ  ｍｙｃタイプの転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターとを含む組換え発現コンストラクト、あるいは（ｉｉｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子の全体または一部とＲ  ｍｙｃタイプの転写因子の全体または一部とをコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含み、Ｃ１  ｍｙｂ転写因子およびＲ  ｍｙｃタイプの転写因子の両方として機能できる組換え発現コンストラクトを用いて植物を形質転換し、そして
（ｂ）形質転換植物を単数または複数の組換え発現コンストラクトの発現に適した条件下で成長させることを含み、単数または複数のコンストラクトの発現によって対照の全ダイゼイン対全ゲニステイン比よりも全ダイゼイン対全ゲニステイン比を高くすることで形質転換植物のイソフラボノイド特性を変化させる、イソフラボノイド産生植物のイソフラボノイド特性を変化させる方法に関するものである。
【００１８】
第２の実施形態では、上述した組換え発現コンストラクトが、Ｃ１  ＤＮＡ結合ドメインとＣ１活性化ドメインとの間に座位するメイズのＲ  ｍｙｃタイプのコード領域を含むキメラ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む。
【００１９】
第３の実施形態では、イソフラボノイド産生植物が、ダイズと、クローバーと、リョクトウと、レンズマメと、ヘアリーベッチと、アルファルファと、ルピナスと、シュガービートと、サヤエンドウと、からなる群から選択される。また、イソフラボノイド含有生成物を得るまたは抽出することのできる、本発明の組換え発現コンストラクトを用いて形質転換された植物の種子または植物の一部も対象となる。
【００２０】
第４の実施形態では、本発明はこれらのイソフラボノイド含有生成物が配合された食品または飲料に関するものである。
【００２１】
第５の実施形態では、本発明は、（ａ）本発明のいずれかの組換え発現コンストラクトを用いて形質転換された植物から得られる種子を破って外皮から種実を取り除き、そして（ｂ）ステップ（ａ）で得られた種実を、所望のフレーク厚が得られるようにフレーク状にすることを含む、イソフラボノイド含有生成物の製造方法に関するものである。
【００２２】
第６の実施形態では、本発明は、（ｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む第１の組換え発現コンストラクトおよびＲ  ｍｙｃタイプの転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む第２の組換え発現コンストラクト、
（ｉｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターとＲ  ｍｙｃタイプの転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターとを含む組換え発現コンストラクト、あるいは
（ｉｉｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子の全体または一部とＲ  ｍｙｃタイプの全体または一部とをコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含み、Ｃ１  ｍｙｂ転写因子およびＲ  ｍｙｃタイプの転写因子の両方として機能できる組換え発現コンストラクトをゲノム中に含む、イソフラボノイド産生植物であって、
対照の全ダイゼイン対全ゲニステイン比と比較した場合に前記植物の全ダイゼイン対全ゲニステイン比が高められている、イソフラボノイド産生植物に関するものである。
【００２３】
微生物の寄託
ブダペスト条約の定めにより、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９の米国菌株保存機関（ＡＴＣＣ）に、以下のプラスミドの寄託を行い、以下の表示、受入番号および寄託日を得ている。
【００２４】
【表１】
2004533831.tif 000002
【００２５】
本願の一部をなす以下の詳細な説明および添付の配列表から本発明をなお一層理解することができる。
【００２６】
以下の配列の説明ならびに本願明細書に添付の配列表は、米国特許施行規則第１．８２１〜１．８２５に記載の特許出願におけるヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の開示に関する規則を遵守している。この配列表では、本願明細書に援用するＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １３：３０２１〜３０３０（１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２１９（Ｎｏ．２）：３４５〜３７３（１９８４）に記載のＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ標準に従って定義されるように、ヌクレオチド配列文字の表記については１文字コードを、アミノ酸については３文字コードを採用している。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データに用いる記号および形式は米国特許施行規則第１．８２２に記載の規則に準拠している。
【００２７】
配列表の配列番号１はＣＲＣ組換えＤＮＡ断片の検出に用いられるプライマー１のヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列表の配列番号２はＣＲＣ組換えＤＮＡ断片の検出に用いられるプライマー２のヌクレオチド配列である。
【００２９】
配列表の配列番号３はゲノムおよびキメライソフラボンシンターゼ遺伝子の検出に用いられるプライマー３のヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列表の配列番号４はゲノムおよびキメライソフラボンシンターゼ遺伝子の検出に用いられるプライマー４のヌクレオチド配列である。
【００３１】
配列表の配列番号５はダイズのフェニルアラニンアンモニアリアーゼの少なくとも一部をコードするクローンｓｄｐ３ｃ．ｐｋ００２．ｃ２２へのｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列表の配列番号６はダイズケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼの少なくとも一部をコードするクローンｓｒｃ３ｃ．ｐｋ０１４．ｅ１７へのｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列である。
【００３３】
配列表の配列番号７はダイズのカルコンイソメラーゼの少なくとも一部をコードするクローンｓｓｍ．ｐｋ００１３．ｅ３へのｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列表の配列番号８はダイズのカルコンレダクターゼの少なくとも一部をコードするクローンｓｒｃ３ｃ．ｐｋ００９．ｅ４へのｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列である。
【００３５】
配列表の配列番号９はダイズのイソフラボンシンターゼの少なくとも一部をコードするクローンｐＯＹ２０４へのｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列表の配列番号１０はダイズのフラバノン３−ヒドロキシラーゼの少なくとも一部をコードするクローンｓｆｌ１．ｐｋ００４０．ｇ１１へのｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列である。
【００３７】
配列表の配列番号１１はダイズのジヒドロフラボノールレダクターゼの一部をコードするクローンｓｆｌ１．ｐｋ１３１．ｇ５へのｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列表の配列番号１２はダイズのジヒドロフラボノールレダクターゼの少なくとも一部をコードするクローンｓｒｃ．ｐｋ００４３．ｄ１１へのｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列である。
【００３９】
配列表の配列番号１３はダイズのフラボノールシンターゼの少なくとも一部をコードするクローンｓｓｌ．ｐｋ００５７．ｄ１２へのｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列表の配列番号１４はダイズのイソフラボンレダクターゼの少なくとも一部をコードするクローンｓｒｒ１ｃ．ｐｋ００１．ｋ４へのｃＤＮＡインサートのヌクレオチド配列である。
【００４１】
配列表の配列番号１５はクローンｐＯＹ２０４からの増幅によるイソフラボンシンターゼ配列の調製に用いられるプライマー５のヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列表の配列番号１６はクローンｐＯＹ２０４からの増幅によるイソフラボンシンターゼ配列の調製に用いられるプライマー６のヌクレオチド配列である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
ここに引用の特許、特許出願および公開公報についてはいずれもその内容全体を本願明細書に援用する。
【００４４】
本願の開示内容においては多数の専門用語を使用しなければならない。
【００４５】
「イソフラボノイド（単数または複数）」という用語は、植物に自然に生じる、共通のジフェニルプロパン骨格を基本とするポリフェノール化合物からなる大きな群を意味する。本願明細書において使用する場合、この用語は、３つのタイプのイソフラボンを３通りの形ですなわちアグリコン型のダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、グルコシド型のダイジン、ゲニスチン、グリシチン、マロニルグルコシド型の６’’−Ｏ−マロニルダイジン、６’’−Ｏ−マロニルゲニスチン、６’’−Ｏ−マロニルグリシチンを含み、さらには加工処理時に生成されるアセチルグルコシド型の６’−Ｏ−アセチルダイジン、６’−Ｏ−アセチルゲニスチン、６’−Ｏ−アセチルグリシチンを含むがこれに限定されるものではない。
【００４６】
本願明細書において使用する「全ゲニステイン」とは型に関係なくこのイソフラボノイドの総量を意味する。よって、「全ゲニステイン」には、アグリコン型、グルコシド型、マロニルグルコシド型、他のゲニステイン型を含む。同様に「全ダイゼイン」とは型に関係なくこのイソフラボノイドの総量を意味する。よって、「全ダイゼイン」には、アグリコン型、グルコシド型、マロニルグルコシド型、他のダイゼイン型を含み、「全グリシテイン」は、アグリコン型、グルコシド型、マロニルグルコシド型、他のグリシテイン型を含む。
【００４７】
「イソフラボノイド産生植物」という用語はイソフラボノイドが普通に生じる植物を意味する。
【００４８】
「対照」という用語は比較の根拠として用いられる、種子などの植物または植物の一部を意味する。本願明細書にて記載の種子などの対照の植物または植物の一部は、イソフラボン特性が変化していない植物または植物の一部である。適切な対照の例として、野生型の植物または野生型の植物から得られる植物の一部、ボンバードメントを施して、このような形質転換植物から得られる、核酸断片または該当する断片または植物の一部すなわち単数または複数の種子などの含有が認められなかった植物があげられ、対照の植物または植物の一部は、該当する単数または複数の核酸断片を含有する形質転換植物由来のものであってもよいが、ここでは有性生殖（これは野生型分離個体と呼ぶことができる）時の断片（単数または複数）の分離によって該当する単数または複数の核酸断片を含まない、あるいは対照の植物はイソフラボン特性を変化させることもない核酸断片で形質転換された植物、たとえばリジン表現型が多い種子を産生するように形質転換されたがイソフラボン特性は変化しない植物であってもよいが、これに限定されるものではない。たとえば、該当する植物がダイズ植物である場合、好ましい対照は上述した植物のうちのひとつから得られる種子であろう。該当する植物がクローバーである場合、好ましい対照は上述した植物のうちのひとつから得られる葉であろう。それぞれの対照が該当する植物に応じて決まるものであることは当業者であれば理解できよう。
【００４９】
「Ｃ１  ｍｙｂ転写因子」という用語は、メイズＣ１遺伝子によってコードされるタンパク質ならびにＣ１  ｍｙｂ転写因子と機能的に等価なあらゆるタンパク質を意味する。
【００５０】
「Ｒ  ｍｙｃタイプの転写因子」という用語は、Ｒ／Ｂ遺伝子ファミリのメンバによってコードされる塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックスドメインを有するタンパク質ならびにＲ  ｍｙｃタイプの転写因子と機能的に等価なあらゆるタンパク質を意味する。
【００５１】
本願明細書において使用する場合、「単離された核酸断片」は、合成、非天然または変化したヌクレオチド塩基を含有していてもよい一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーである。ＤＮＡのポリマーの形での単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１以上のセグメントで構成されるものであってもよい。ヌクレオチド（通常はその５’−モノリン酸の形態で見られる）は、（それぞれＲＮＡまたはＤＮＡについて）アデニル酸またはデオキシアデニル酸に「Ａ」、シチジル酸またはデオキシシチジル酸に「Ｃ」、グアニル酸またはデオキシグアニル酸に「Ｇ」、ウリジル酸に「Ｕ」、デオキシチミジル酸に「Ｔ」、プリン（ＡまたはＧ）に「Ｒ」、ピリミジン（ＣまたはＴ）に「Ｙ」、ＧまたはＴに「Ｋ」、ＡまたＣまたはＴに「Ｈ」、イノシンに「Ｉ」、すべてのヌクレオチドについて「Ｎ」という一文字で表される。
【００５２】
本願明細書では「機能的に等価な細断片（ｓｕｂｆｒａｇｍｅｎｔ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」および「機能的に等価な細断片（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ  ｓｕｂｆｒａｇｍｅｎｔ）」という表現を同義に用いる。これらの表現は、断片または細断片が活性酵素をコードするか否かを問わず、遺伝子発現を変化させるまたは特定の表現型を生じる機能が保持されている単離された核酸断片の一部または部分配列を意味する。たとえば、断片または細断片を組換えＤＮＡ断片またはキメラ遺伝子の設計に利用して、形質転換植物で所望の表現型を得ることができる。
【００５３】
本願明細書では、「相同性」、「相同的」、「実質的に類似の」および「実質的に相当する」を同義に用いる。これらの表現は、１以上のヌクレオチド塩基が変わっても核酸断片の持つ遺伝子発現を媒介する機能または特定の表現型を生じる機能に影響がない核酸断片を意味する。また、これらの表現は、最初の未修飾の断片に対して得られる核酸断片の機能的な特性を実質的に変化させない１以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本発明の核酸断片の修飾も意味する。したがって、当業者であれば分かるように、本発明にはここに例示する特定の配列以外の配列も包含されることは理解できよう。
【００５４】
さらに、本発明に包含される実質的に類似の核酸配列も、本願明細書に例示する配列と適度にストリンジェントな条件（たとえば、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃）下でハイブリダイズする機能によって、あるいは本願明細書に開示の核酸配列と機能的に等価である、本願明細書に開示のヌクレオチド配列のいずれかの部分で定義されることは、当業者であれば分かるであろう。ストリンジェンシー条件については、遠縁の生物体から得られる相同配列などの適度な類似性のある断片から、近縁の生物体から得られる機能的酵素を複製する遺伝子などの極めて類似性の高い断片に至るまで、スクリーニングできるように調節することが可能である。ハイブリダイゼーション後の洗浄でストリンジェンシー条件を判定する。好ましい条件一組には、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで室温にて１５分間に続いて、２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを４５℃にて３０分間行い、さらに０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを５０℃にて３０分間ずつ２回繰り返す一連の洗浄が含まれる。さらに好ましいストリンジェントな条件の組では上記よりも高い温度を使用する。この場合、最後に行う０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳでの３０分ずつ２回の洗浄時の温度を６０℃に上げること以外は上記と同じである。極めてストリンジェントな条件のもうひとつの好ましい組として、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの最後の２回の洗浄を６５℃にする形がある。
【００５５】
配列アライメントと類似率の計算値については、ＬＡＳＡＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングパッケージ（ウィスコンシン州マディソン、ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを含むがこれに限定されるものではない、相同配列を検出するように設計されたさまざまな比較方法を利用して求めることができる。また、Ｃｌｕｓｔａｌ法のアライメント（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３）をデフォルトのパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で利用して配列のマルチプルアライメントを行う。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いてのペアワイズアライメントのデフォルトのパラメータおよびタンパク質配列の同一性の割合の計算値は、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸では、これらのパラメータはＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。
【００５６】
「遺伝子」とは、コード配列に先行（５’非コード配列）および後続（３’非コード配列）する制御配列をはじめとする特定のタンパク質を発現する核酸断片を意味する。「天然遺伝子」とは、それぞれに制御配列を持つ自然界に見られるような遺伝子を意味する。「キメラ遺伝子」とは、天然遺伝子ではなく、自然界では一緒に見られることのない制御配列とコード配列とを含むあらゆる遺伝子を意味する。したがって、キメラ遺伝子は、異なる起源に由来する制御配列とコード配列とを含むものであってもよいし、同一起源由来であるが自然界で見られる形とは違った形に配列された制御配列およびコード配列を含むものであってもよい。「外来遺伝子」とは、宿主生物には通常は見られないが、遺伝子移行によって宿主生物に導入された遺伝子を意味する。外来遺伝子は、未変性ではない生物体に挿入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含むことができる。「トランスジーン」とは、形質転換法によってゲノムに導入された遺伝子のことである。「アレル」とは、染色体上の同じ座位に座乗する形態の異なるいくつかの遺伝子のうちのひとつである。染色体上の同じ座位に存在するアレルがすべて同じである場合、その植物はその座位でホモ接合性である。染色体上の同じ座位に存在するアレル同士が異なっている場合は、その植物はその座位でヘテロ接合性である。
【００５７】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列内またはコード配列の下流（３’非コード配列）に位置し、関連のコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるいは翻訳に影響するヌクレオチド配列を意味する。制御配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００５８】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御できるＤＮＡ配列を意味する。プロモーター配列は、近位の要素とこれよりも遠位にある上流の要素とからなるものであり、後者の要素はエンハンサーと呼ばれることも多い。したがって、「エンハンサー」とは、プロモーター活性を刺激できるＤＮＡ配列であり、プロモーターにもともとある要素であってもよいし、あるいはプロモーターのレベルまたは組織特異性を高めるために挿入される異種要素であってもよい。プロモーターは、全体が天然遺伝子由来のものであってもよいし、自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素からなるものであってもよく、あるいは、合成ＤＮＡセグメントを含むものであってもよい。プロモーターが変われば、異なる組織または細胞型の遺伝子の発現、異なる発達段階での遺伝子の発現、あるいは異なる環境条件に応答しての遺伝子の発現が指示される場合があることは、当業者であれば理解できよう。ほとんどの細胞型でほぼ常に遺伝子を発現させるプロモーターは一般に「構成的プロモーター」と呼ばれている。植物細胞において有用なさまざまなタイプの新たなプロモーターが常に発見されつづけており、オカムロ（Ｏｋａｍｕｒｏ），Ｊ．Ｋ．およびゴールドバーグ（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ），Ｒ．Ｂ．が編纂したＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ  １５：１〜８２（１９８９）に多くの例が見られる。さらに、多くの場合は制御配列の正確な境界が完全に画定されていないため、若干異なるＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を持つこともあると言われている。
【００５９】
「翻訳リーダー配列」とは、遺伝子のプロモーター配列とコード配列との間に位置するポリヌクレオチド配列を意味する。翻訳リーダー配列は翻訳開始配列の完全に（ｆｕｌｌｙ）プロセシングされたｍＲＮＡ上流に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写物のプロセシング、ｍＲＮＡの安定性または翻訳効率に影響する場合がある。翻訳リーダー配列の例については過去に記載がある（ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ），Ｒ．およびフォスター（Ｆｏｓｔｅｒ），Ｇ．Ｄ．（１９９５）、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３：２２５〜２３６）。
【００６０】
「３’非コード配列」とは、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を意味し、ポリアデニル化認識配列ならびにｍＲＮＡのプロセシングまたは遺伝子発現に影響をおよぼすことのできる調節シグナルをコードする他の配列を含む。ポリアデニル化シグナルは通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸領域の付加に影響することが特徴である。さまざまな３’非コード配列の使用例が、インゲルブレヒト（Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔ），Ｉ．Ｌ．ら（１９８９）、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：６７１〜６８０に記載されている。
【００６１】
「ＲＮＡ転写物」とはＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写によって生じる産物を意味する。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全に相補的なコピーである場合、これを一次転写物と呼び、一次転写物の転写後プロセシングで得られるＲＮＡ配列であれば成熟ＲＮＡと呼ぶ。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」とは、イントロンを持たず、細胞によってタンパク質への翻訳が可能なＲＮＡを意味する。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡ鋳型と相補であり、かつ酵素の逆転写酵素を用いてｍＲＮＡ鋳型から合成されるＤＮＡを意味する。ｃＤＮＡは一本鎖であってもよいし、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を用いて二本鎖形態に変換したものであってもよい。「センス」ＲＮＡとは、ｍＲＮＡを含み、細胞内またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにてタンパク質への翻訳が可能なＲＮＡ転写物を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的の一次転写物またはｍＲＮＡの全体または一部に対して相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を意味する（米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、５’非コード配列、３’非コード配列、イントロンまたはコード配列など、特定の遺伝子転写物のどの部分に対するものであってもよい。「機能的ＲＮＡ」とは、翻訳はされないが、それでもなお細胞プロセスに対する影響力を持つ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡまたは他のＲＮＡを意味する。本願明細書では「相補体」および「逆相補体」という用語をｍＲＮＡ転写物に関して同義に使用し、メッセージのアンチセンスＲＮＡを定義するものとする。
【００６２】
「作動的に結合された」という表現は、一方の機能が他方に影響するような形で１つの核酸断片上に核酸配列が会合した状態を意味する。たとえばプロモーターであれば、コード配列の発現を調節できる（すなわちそのコード配列がプロモーターの転写制御下にある）ときに、そのコード配列と作動的に結合されると言う。コード配列は、センスまたはアンチセンスの向きで制御配列への作動的な結合が可能である。もうひとつ例をあげると、本発明の相補ＲＮＡ領域を、標的ｍＲＮＡの５’または標的ｍＲＮＡの３’あるいは標的ｍＲＮＡ内に直接または間接的に作動的に結合することが可能である。あるいは、第１の相補的な領域が５’であり、その相補体が標的ｍＲＮＡの３’である。
【００６３】
本願明細書において使用する場合、「発現」という用語は、ｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体または成熟）などの機能的な最終産物が生成されることを意味する。
【００６４】
「成熟」タンパク質とは、翻訳後プロセシングを受けたポリペプチドすなわち、翻訳産物中に含まれるプレペプチドまたはプロペプチドがすべて除去されたポリペプチドを意味する。「前駆体」タンパク質とは、ｍＲＮＡ翻訳の一次産物すなわち、プレペプチドおよびプロペプチドが残ったままの一次産物を意味する。プレペプチドおよびプロペプチドとしては細胞内局在シグナルがあり得るが、これに限定されるものではない。
【００６５】
「安定した形質転換」とは、核ゲノムとオルガネラゲノムの両方を含む宿主生物のゲノムに核酸断片が移行し、遺伝的に安定した遺伝が起こることを意味する。これとは対照的に、「一過性の形質転換」とは、宿主生物の核またはＤＮＡ含有オルガネラに核酸断片が移行し、統合または安定した遺伝のない遺伝子発現が起こることを意味する。形質転換された核酸断片を含む宿主生物を「トランスジェニックな」生物と呼ぶ。コメ、トウモロコシ、他の単子葉植物の細胞形質転換の好ましい方法としては、粒子加速または「遺伝子銃」での形質転換技術（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ（ロンドン）３２７：７０〜７３、米国特許第４，９４５，０５０号）を利用するか、あるいはトランスジーンを含む適当なＴｉプラスミドを用いるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる方法（石田祐二ら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：７４５〜７５０）があげられる。
【００６６】
本願明細書にて使用する標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニングの技法は従来技術において周知であり、さらに詳細については、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッツ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９（以下「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）に記載されている。
【００６７】
「組換え」という用語は、たとえば遺伝子工学の技法により単離された核酸セグメントを操作または化学合成することで、組換えを行わなければ別々である２つの配列セグメントの人工的な組み合わせを意味する。
【００６８】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」とは、特定のＤＮＡセグメントを大量に合成するための手法のことであり、一連の繰り返しサイクルで構成される（コネチカット州ノーウォーク、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。一般に、二本鎖ＤＮＡを熱変性させ、標的セグメントの３’境界と相補な２つのプライマーを低温でアニールした後、中間温度で伸展させる。この連続した３工程をまとめてサイクルと呼ぶ。
【００６９】
「組換えＤＮＡ断片」とは、コード配列と非制御配列などの自然界では一緒に見られることのない核酸断片同士の人工的な組み合わせを意味する。よって、「組換えＤＮＡ断片」と以下で定義する「組換えコンストラクト」との違いは、核酸配列の人工的な組み合わせにおける制御配列の有無に左右される。制御配列が組み合わせの一部であれば、これは「組換えコンストラクト」である。組み合わせの中に制御配列がなければ、これは「組換えＤＮＡ断片」である。
【００７０】
本願明細書では、「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、「組換え発現コンストラクト」という用語を同義に使用する。組換えコンストラクトは、自然界では一緒に見られることのない、制御配列とコード配列などの核酸断片の人工的な組み合わせを含む。たとえば、キメラコンストラクトは、異なる起源に由来する制御配列を少なくとも１つとコード配列を少なくとも１つとを含むこともあれば、同一起源由来の制御配列とコード配列とを含むこともあるが、いずれにしても自然界で見られるものとは異なった形に配置されている。このようなコンストラクトは、それ自体でも使用できるしベクターと併用することもできるものである。ベクターを用いるのであれば、どのベクターを選択するかは当業者間で周知のように宿主細胞の形質転換にどの方法を使うかに左右される。たとえばプラスミドベクターを用いることが可能である。当業者であれば、本発明の単離された核酸断片のうちのいずれかを含む宿主細胞の形質転換し、選択し、増殖させる過程を成功させるには、ベクター上にどの遺伝因子を存在させなければならないかについて十分に認識している。また、当業者であれば、互いに独立した異なる形質転換イベントでは得られる発現のレベルやパターンが異なる（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、（１９８５）、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２４１１〜２４１８、ドゥ・アルメイダ（Ｄｅ  Ａｌｍｅｉｄａ）ら、（１９８９）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２１８：７８〜８６）ことから、所望の発現レベルとパターンとを呈する系統を得るには複数のイベントをスクリーニングしなければならないことも理解できよう。このようなスクリーニングについては特に、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のイムノブロッティング分析あるいは表現型の分析によって行うことができる。
【００７１】
本発明は、（ａ）（ｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む第１の組換え発現コンストラクトおよびＲ  ｍｙｃタイプの転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む第２の組換え発現コンストラクト、（ｉｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターとＲ  ｍｙｃタイプの転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターとを含む組換え発現コンストラクト、あるいは（ｉｉｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子の全体または一部とＲ  ｍｙｃタイプの転写因子の全体または一部とをコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含み、Ｃ１  ｍｙｂ転写因子およびＲ  ｍｙｃタイプの転写因子の両方として機能できる組換え発現コンストラクトを用いて植物を形質転換し、そして
（ｂ）形質転換植物を単数または複数の組換え発現コンストラクトの発現に適した条件下で成長させることを含み、単数または複数のコンストラクトの発現によって対照の全ダイゼイン対全ゲニステイン比よりも全ダイゼイン対全ゲニステイン比を高くすることで形質転換植物のイソフラボノイド特性を変化させる、イソフラボノイド産生植物のイソフラボノイド特性を変化させる方法に関するものである。
【００７２】
また、（ｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む第１の組換え発現コンストラクトおよびＲ  ｍｙｃタイプの転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む第２の組換え発現コンストラクト、
（ｉｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターとＲ  ｍｙｃタイプの転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターとを含む組換え発現コンストラクト、あるいは
（ｉｉｉ）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子の全体または一部とＲ  ｍｙｃタイプの全体または一部とをコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含み、Ｃ１  ｍｙｂ転写因子およびＲ  ｍｙｃタイプの転写因子の両方として機能できる組換え発現コンストラクトをゲノム中に含む、イソフラボノイド産生植物であって、
対照の全ダイゼイン対全ゲニステイン比と比較した場合に前記植物の全ダイゼイン対全ゲニステイン比が高められている、イソフラボノイド産生植物も対象となる。
【００７３】
イソフラボノイド産生植物の例としては、ダイズ、クローバー、リョクトウ、レンズマメ、ヘアリーベッチ、アルファルファ、ルピナス、シュガービート、サヤエンドウがあげられるが、これに限定されるものではない。さらに好ましい実施形態では、好ましいイソフラボノイド産生植物はダイズであろう。他のイソフラボノイド産生植物の例については１９９３年１１月２５日公開のＷＯ９３／２３０６９号に見出すことができ、その開示内容を本願明細書に援用する。
【００７４】
形質転換方法は当業者間で周知であり、上述したとおりである。
【００７５】
イソフラボノイド産生植物を形質転換するのに利用できる組換え発現コンストラクトは、
（１）たとえば、１つのコンストラクトがＣ１  ｍｙｂ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含み得るものであり、もう１つの別のコンストラクトがＲ−ｍｙｃタイプの転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含み得るなど、複数のコンストラクトを完全に別のものとすることが可能である。
（２）Ｃ１  ｍｙｂ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターとＲ−ｍｙｃタイプの転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターとを含む単一のコンストラクト、あるいは
（３）２つのコードされるタンパク質を組み合わせる融合タンパク質が生成されるように、Ｃ１  ｍｙｂ転写因子の全体または一部をコードする単離された核酸断片と、Ｒ−ｍｙｃタイプの転写因子の全体または一部をコードする単離された核酸断片と、に作動的に結合されたプロモーターを含む単一のコンストラクト
という３つのカテゴリに分類される。
【００７６】
次に、単数または複数の組換え発現コンストラクトの発現に適した条件下で形質転換植物を栽培する。単数または複数の組換え発現コンストラクトが発現することで、形質転換を行っていない植物または植物の一部の全ダイゼイン対全ゲニステイン比よりも全ダイゼイン対全ゲニステイン比が高くなり、形質転換植物または植物の一部のイソフラボノイド特性が変化する。たとえば、場合によっては、形質転換植物から得られる種子を形質転換を行っていない植物から得られる種子と比較して組換え発現コンストラクトの発現を検討し、全ダイゼイン対全ゲニステイン比が増えているか否かを判断すると好ましいことがある。
【００７７】
さらに好ましい実施形態では、メイズＲコード領域がＣ１  ＤＮＡ結合ドメインとＣ１活性化ドメインの間に位置するキメラ転写因子をコードする単離された核酸断片に作動的に結合されたプロモーターを含む組換え発現コンストラクトでイソフラボノイド産生植物を形質転換することができる。
【００７８】
単一の植物プロトプラスト形質転換体またはさまざまな形質転換外植体から得られた植物の再分化、発達および培養は従来技術において周知である（ＷｅｉｓｓｂａｃｈおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ（１９８８））。この再分化と成長の過程には一般に、形質転換された細胞を選択し、根のある小植物体段階への通常の胚芽発達段階でこれらの個々の細胞を培養するステップが含まれる。トランスジェニックな胚芽および種子についても同様に再分化させる。後に、このようにして得られる根のあるトランスジェニックな苗条を土壌などの適当な植物栽培用の培地に植え付ける。
【００７９】
該当するタンパク質をコードする外因性の外来遺伝子を含む植物の発達または再分化は従来技術において周知である。このような再分化植物が自家受粉してホモ接合性トランスジェニック植物が得られると好ましい。そうでなければ、再分化植物から得た花粉を農学的に重要な系統の種子栽培植物に交雑させる。逆に、これらの重要な系統の植物から得た花粉を使って再分化植物を受粉させる。当業者間で周知の方法を利用して、所望のポリペプチドを含む本発明のトランスジェニック植物を培養する。
【００８０】
植物組織から植物を再分化させる方法にはさまざまなものがある。どの再分化方法を使うかは、開始植物組織と再分化させる具体的な植物種とに左右される。
【００８１】
主にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを利用して双子葉植物を形質転換し、トランスジェニック植物を得るための方法が、綿（米国特許第５，００４，８６３号、米国特許第５，１５９，１３５号、米国特許第５，５１８，９０８号）、ダイズ（米国特許第５，５６９，８３４号、米国特許第５，４１６，０１１号、マカベ（ＭｃＣａｂｅ）ら、ＢｉｏｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：９２３（１９８８）、クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．８７：６７１〜６７４（１９８８））、Ｂｒａｓｓｉｃａ（米国特許第５，４６３，１７４号）、ピーナッツ（チェン（Ｃｈｅｎｇ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１５：６５３〜６５７（１９９６）、マッケントリー（ＭｃＫｅｎｔｌｙ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１４：６９９〜７０３（１９９５））、パパイヤ、ナシ（グラント（Ｇｒａｎｔ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１５：２５４〜２５８（１９９５））について公開されている。
【００８２】
ポリエチレングリコール処理、電気穿孔または微粒子銃によって植物細胞に核酸分子を導入することで、クローニングした核酸コンストラクトの一過性発現に基づく遺伝子発現をアッセイする方法が開発されている（マルコッテ（Ｍａｒｃｏｔｔｅ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３５：４５４〜４５７（１９８８）、マルコッテ（Ｍａｒｃｏｔｔｅ）ら、Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １：５２３〜５３２（１９８９）、マッカーティ（ＭｃＣａｒｔｙ）ら、Ｃｅｌｌ  ６６：８９５〜９０５（１９９１）、服部ら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：６０９〜６１８（１９９２）、ゴフ（Ｇｏｆｆ）ら、ＥＭＢＯ  Ｊ．９：２５１７〜２５２２（１９９０））。
【００８３】
一過性発現系を利用して遺伝子コンストラクトを機能的に精査することもできる（概要については、マリーガ（Ｍａｌｉｇａ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）を参照のこと）。本発明の核酸分子はいずれも、ベクター、プロモーター、エンハンサーなどの他の遺伝因子と組み合わせて、永久的または一過的に植物細胞に導入可能なものであることは理解できよう。
【００８４】
上述した手法に加えて、専門家であれば、巨大分子（ＤＮＡ分子、プラスミドなど）の構築、操作、単離、組換えＤＮＡ断片および組換え発現コンストラクトの生成、クローンのスクリーニングおよび単離の具体的な条件ならびに手法について解説した標準的な資料に馴染みがある（たとえば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、マリーガ（Ｍａｌｉｇａ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５）、ビレン（Ｂｉｒｒｅｎ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｅｎｅｓ，１、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）、ビレン（Ｂｉｒｒｅｎ）ら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ＤＮＡ，２、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９８）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ編、Ｃｌａｒｋ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９７））。
【００８５】
本発明の方法では、どのようなプロモーターでも利用可能である。よって、所望の宿主組織で所望のタンパク質遺伝子について翻訳可能なｍＲＮＡを発現することで本発明を達成できるだけの十分な転写活性を持つ限り、コード配列の発現をドライブするのに選択したプロモーターをどこから入手するかは重要ではない。好ましい実施形態では、プロモーターは種子特異的プロモーターである。種子特異的プロモーターの例としては、β−コングリシニンのプロモーター（チェン（Ｃｈｅｎ）ら（１９８９）、Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１０：１１２〜１２２）、ナピンプロモーターおよびファゼオリンプロモーターがあげられるが、これに限定されるものではない。２０００年４月６日公開のＷＯ００／１８９６３号には、極めて多数のプロモーターが記載されており、その開示内容を本願明細書に援用する。
【００８６】
また、本発明の範囲内に包含されるものに、このような形質転換植物から得られる種子または植物の一部がある。植物の一部としては、根株、茎、芽、葉、花粉、種子、腫瘍組織ならびに、単細胞、プロトプラスト、胚芽、カルス組織などのさまざまな形態の細胞および培養物を含むがこれに限定されるものではない、分化した組織および未分化の組織があげられる。植物組織は、植物におけるものであってもよいし、器官、組織または細胞培養におけるものであってもよい。
【００８７】
もうひとつの態様では、本発明は、本願明細書に記載の形質転換植物に由来する種子または植物の一部から得られる、全ダイゼインが高く全ゲニステインが低いイソフラボノイド含有生成物に関するものである。このようなイソフラボノイド含有生成物の例としては、タンパク質単離物、タンパク質濃縮物、ミール、グリッツ、全脂および脱脂フラワー、組織状タンパク質、組織状フラワー、組織状濃縮物、組織状単離物があげられるが、これに限定されるものではない。さらに別の態様では、本発明は、本願明細書に記載の形質転換植物に由来する種子または植物の一部から抽出される、全ダイゼインが高く全ゲニステインが低いイソフラボノイド含有生成物に関するものである。抽出された生成物を、イソフラボンを高濃度で含むように作られるピル、錠剤、カプセルまたは他の同様の剤形の製造に用いることが可能であろう。
【００８８】
このような生成物を得るための方法は当業者間で周知である。たとえば、ダイズの場合、このような生成物をさまざまな方法で得ることができる。ダイズタンパク質単離物の調製に一般に用いられる条件については、［Ｃｈｏら（１９８１）、米国特許第４，２７８，５９７号、Ｇｏｏｄｎｉｇｈｔら（１９７８）、米国特許第４，０７２，６７０号］に記載されている。ダイズタンパク質濃縮物は、（ｐＨ約４．５での）酸浸出、アルコールでの抽出（約５５〜８０％）、高圧蒸気を用いてのタンパク質の変性後に水で抽出するという３つの基本プロセスで製造される。ダイズタンパク質濃縮物の調製に一般に用いられる条件については、パス（Ｐａｓｓ）［（１９７５）米国特許第３，８９７，５７４号］およびキャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）ら［（１９８５）、Ｎｅｗ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｏｄｓ、ＡｌｔｓｃｈｕｌおよびＷｉｌｃｋｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、第５巻、第１０章、Ｓｅｅｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第３０２〜３３８頁］に説明されている。
【００８９】
「イソフラボン含有タンパク質生成物」は、食餌、食品および／または飲料に用いられる適当な植物の種子から生成される品目として定義できる。たとえば、「ダイズタンパク生成物」には、表１「ダイズタンパク生成物」に列挙した品目を含み得るが、これに限定されるものではない。
【００９０】
【表２】
2004533831.tif 000003
【００９１】
「プロセシング」とは、表１に列挙した生成物（製品）を得るのに用いるあらゆる物理的方法および化学的方法を意味し、全粒種子または砕粒種子の熱調質、フレーク化および粉砕、押出、溶媒抽出、水浸漬および抽出を含むがこれに限定されるものではない。さらに、「プロセシング」には、全粒種子または砕粒種子からダイズタンパク質を濃縮して分離するのに用いられる方法ならびに、東洋で発酵大豆食品の製造に伝統的に用いられているさまざまな方法を含む。これらの生成物（製品）の多くについては取引規準と仕様とが確立されている（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｉｌｓｅｅｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｙｅａｒｂｏｏｋ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｉｎｇ  Ｒｕｌｅｓ  １９９１〜１９９２を参照のこと）。「高タンパク質」または「低タンパク質」であると呼ばれる生成物はこれらの標準仕様に説明されている通りである。「ＮＳＩ」はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’  Ｓｏｃｉｅｔｙの方法Ａｃ４  ４１によって定義されるような水溶性窒素指数である。大豆ミールの品質を示すインジケータに「ＫＯＨ窒素溶解性（ＫＯＨ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）」があるが、これはＡｒａｂａおよびＤａｌｅ［（１９９０）Ｐｏｕｌｔ．  Ｓｃｉ．  ６９：７６−８３］に記載の条件下で０．０３６ＭのＫＯＨに溶解する窒素の量を意味している。「白色」フレークとは、外皮を取り除いた子葉を脱脂し、制御された高圧蒸気で処理してＮＳＩが約８５から９０になるようにフレーク化したものを意味する。この用語は、米国標準の篩でＮｏ．１００のサイズを通るように粉砕された、同等のＮＳＩのフラワーも意味し得る。「調理済み」とは、ＮＳＩが約２０から６０の一般にはフラワーであるダイズタンパク生成物を意味する。「トーストした」とは、ＮＳＩが２０未満で一般にはフラワーであるダイズタンパク生成物を意味する。「グリッツ」とは、米国標準の篩でＮｏ．１０から８０の間にある、脱脂し、外皮を取り除いた子葉を意味する。「ダイズタンパク質濃縮物」とは、（ｐＨ約４．５での）基本的に酸浸出、アルコールでの抽出（約５５〜８０％）、高圧蒸気を用いてのタンパク質の変性後に水で抽出するという３つの工程で外皮を取り除いて脱脂したダイズ生成物を意味する。ダイズタンパク質濃縮物の調製に一般に用いられる条件については、パス（Ｐａｓｓ）［（１９７５）米国特許第３，８９７，５７４号およびキャンベル（Ｃａｍｐｂｅｌｌ）ら、（１９８５）、Ｎｅｗ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｏｄｓ、ＡｌｔｓｃｈｕｌおよびＷｉｌｃｋｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、第５巻、第１０章、Ｓｅｅｄ  Ｓｔｏｒａｇｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、第３０２〜３３８頁］に説明されている。「押出」とは、材料（グリッツ、フラワーまたは濃縮物）を、材料の組織を変化させるための手段としてのジャケット付きのオージェ（ｊａｃｋｅｔｅｄ  ａｕｇｅｒ）に高温高圧下で通すプロセスを意味する。「組織化」および「構造化」とは、材料の物性を調節するのに用いられる押出プロセスを意味する。熱可塑性押出を含むこれらのプロセスの特徴については過去に説明がなされている［アトキンソン（Ａｔｋｉｎｓｏｎ）（１９７０）、米国特許第３，４８８，���７０号、Ｈｏｒａｎ（１９８５）、Ｎｅｗ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｏｄｓ、アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）およびウィルケ（Ｗｉｌｃｋｅ）編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、第１Ａ巻、第８章、第３６７〜４１４頁］。さらに、ダイズタンパク生成物を含む複合食材混合物の押出処理の間に用いられる条件が、［ロキー（Ｒｏｋｅｙ）（１９８３）、Ｆｅｅｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩＩＩ、２２２〜２３７、マッカローチ（ＭｃＣｕｌｌｏｃｈ）、米国特許第４，４５４，８０４号］において過去に説明がなされている。
【００９２】
また、本発明のイソフラボノイド含有生成物が配合された食品および飲料も本発明の範囲内である。
【００９３】
飲料は液体であっても乾燥粉末状であってもよい。
【００９４】
本発明のイソフラボノイド含有生成物を配合／添加可能な食品には、ほぼすべての食品／飲料が含まれる。たとえば、挽肉、乳化させた肉、マリネにした肉、本発明のイソフラボノイド含有生成物と一緒に導入される肉類、栄養補給剤、栄養補助飲料、スポーツ飲料、タンパク質補助飲料、ジュース、乳、代替乳、ダイエット飲料などの飲料類、ハードチーズおよびソフトチーズ、クリームチーズ、カテージチーズなどのチーズ、アイスクリーム、アイスミルク、低脂肪氷菓、乳を使っていない氷菓などの氷菓、ヨーグルト、スープ、プディング、ベーカリー製品、サラダドレッシング、マヨネーズなどのディップおよびスプレッド、チップディップ、フードバーをあげることができる。このイソフラボノイド含有生成物を、食品および／または飲料の摂取者に所望の用量を送達すべく選択した量で添加可能である。さらに別の態様では、本発明は、（ａ）本発明の形質転換植物から得られる種子を割って外皮から種実を取り除き、そして（ｂ）ステップ（ａ）で得られた種実を、所望のフレーク厚が得られるようにフレーク化することを含む、イソフラボノイド含有生成物の製造方法に関するものである。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例において本発明をさらに定義する。実施例中、特に明記しない限り部およびパーセンテージはいずれも重量基準であり、度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示してこそいるが、単なる例示にすぎないことを理解されたい。当業者であれば上記の説明とこれらの実施例から本発明の本質的な特徴を把握することができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明にさまざまな変更および改変を施して多様な使用法や条件に適合させることができる。よって、当業者には本願明細書に図示および説明する以外の本発明のさまざまな改変例も明らかであろう。このような改変例も添付の特許請求の範囲に記載の内容に包含されるものとする。
【００９６】
実施例１
Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘの形質転換用プラスミドの構築
Ｃ１およびＲのＬｃアレルをコードするメイズヌクレオチド配列を含有する組換えＤＮＡ断片によってコードされるタンパク質がダイズのイソフラボノイド特性にたいしてどのような影響をおよぼすのかを試験した。この目的で、ＣＲＣ組換え発現コンストラクトをダイズ胚芽に導入するためのプラスミドｐＯＹ２０３を構築した。プラスミドｐＯＹ２０３については、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ００／４４０９０号（２０００年８月３日公開）で簡単に説明したが、細菌系と植物系の両方でハイグロマイシンの存在下で成長の選択を可能にする発現系を含むベクターのファゼオリンプロモーターおよび終結シグナルの制御下でＣＲＣ組換えＤＮＡ断片が含有されている。
【００９７】
プラスミドｐＯＹ２０３については中間プラスミドｐＯＹ１３５を介して作製した。プラスミドｐＯＹ１３５には、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位に隣接して、ファゼオリンプロモーターとポリアデニル化シグナル配列との間にＣＲＣ組換えＤＮＡ断片が挿入されている。ＣＲＣ組換えＤＮＡ断片には、
（ａ）１２５位アミノ酸までのＣ１  ｍｙｂドメインと、
（ｂ）ＲのＬｃアレルの全コード領域（１位アミノ酸から１６０位アミノ酸）と、
（ｃ）Ｃ１転写活性化ドメイン（１２６位アミノ酸からＣ１のＣ末端まで）と、をコードするメイズヌクレオチド配列がＳｍａ  Ｉ部位間に５’から３’への方向で含まれる。
【００９８】
プラスミドｐＤＰ７９５１（２０００年８月３日公開のＰＣＴ出願公開第ＷＯ００／４４０９０号に記載、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ３７１）からＣＲＣ組換えＤＮＡ断片を単離し、ベクターｐＣＷ１０８Ｎに挿入した。ベクターｐＣＷ１０８Ｎは市販のベクターｐＵＣ１８（ギブコ−ＢＲＬ）由来のものであり、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位間に、
（ａ）転写開始部位に対して−４１０から＋７７までのファゼオリン遺伝子プロモーターのＤＮＡ断片（Ｓｌｉｇｈｔｏｍら（１９９１）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｎ．Ｂ１６：１）と、
（ｂ）同じファゼオリン遺伝子のポリアデニル化シグナル配列領域を含む１１７５ｂｐのＤＮＡ断片（ドイル（Ｄｏｙｌｅ）ら（１９８６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８〜９２３８およびスライトム（Ｓｌｉｇｈｔｏｍ）ら（１９８３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：１８９７〜１９０１の配列の説明を参照のこと）と、が含有されている。
【００９９】
ファゼオリンプロモーターとポリアデニル化シグナル配列との間を切断するＡｓｐ  ７１８でプラスミドｐＣＷ１０８Ｎを消化し、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの存在下でＴ４  ＤＮＡポリメラーゼと一緒にインキュベーションして突出末端を埋めた。ＣＲＣ組換えＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片を、Ｓｍａ  Ｉでの消化によってｐＤＰ７９５１から単離し、アガロースゲル電気泳動を用いて精製し、平滑末端化したｐＣＷ１０８Ｎに挿入してｐＯＹ１３５を形成した。
【０１００】
ｐＯＹ２０３を形成するために、ファゼオリンプロモーター／ＣＲＣ組換えＤＮＡ断片／ファゼオリンポリアデニル化シグナル配列を含むカセット（以下、ＣＲＣ組換え発現コンストラクトと呼ぶ）をＨｉｎｄ  ＩＩＩでの消化によってｐＯＹ１３５から遊離させ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ消化ｐＺＢＬ１０２に導入した。プラスミドｐＺＢＬ１０２には、細菌系と植物系の両方でプラスミドＤＮＡ配列を含む細胞を同定する手段として用いられるハイグロマイシンの存在下で成長の選択を可能にする発現系を含み、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ００／４４０９０号に記載されている。
【０１０１】
本発明を実施するにあたって必要なことではないが、最初の実験では、プラスミドｐＯＹ２０３を同じくＰＣＴ出願公開第ＷＯ００／４４０９０号に記載されているプラスミドｐＷＳＪ００１と一緒にボンバードメント法でダイズ胚芽に導入した。プラスミドｐＷＳＪ００１には、細菌系と植物系の両方でハイグロマイシンの存在下で成長の選択を可能にする発現系を含むベクターのα’β−コングリシニンプロモーターおよびファゼオリンポリアデニル化シグナル配列の制御下でイソフラボンシンターゼコード領域が含有されている。４時間発芽させた種子で作製したダイズｃＤＮＡライブラリから得られるクローン（ｓｇｓ１ｃ．ｐｋ００６．ｏ２０）をＰＣＲ増幅し、イソフラボンシンターゼコード領域（ＮＣＢＩの汎用識別子Ｎｏ．６９７９５２０に見られる）を得た。増幅にはＰｆｕポリメラーゼ（ストラタジーン）を使用し、プライマー５（配列表の配列番号１５に示す）とプライマー６（配列表の配列番号１６に示す）とを用いてＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍにて標準的なＰＣＲ反応で行った。
【０１０２】
５’−ＴＴＧＣＴＧＧＡＡＣＴＴＧＣＡＣＴＴＧＧＴ−３’［配列表の配列番号１５］
５’−ＧＴＡＴＡＴＧＡＴＧＧＧＴＡＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＡＡＧＧＡＧ−３’［配列表の配列番号１６］
【０１０３】
まず、ベクターｐＣＷ１０９のα’β−コングリシニンプロモーターとファゼオリンポリアデニル化シグナル配列との間にイソフラボンシンターゼコード領域を挿入した。ベクターｐＣＷ１０９には、α’β−コングリシニンプロモーターの５５０ｂｐの断片（Ｓｌｉｇｈｔｏｍら（１９９１）、Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｎ．Ｂ１６：１）と、ｐＣＷ１０８Ｎについて上述したものと同じファゼオリンポリアデニル化シグナル配列とが含まれている。プラスミドｐＣＷ１０９のプロモーターとポリアデニル化シグナル配列断片との間にあるＮｃｏ  Ｉ部位をＮｃｏ  Ｉでの消化によって除去した後、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの存在下にてＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで埋めた。このようにして得られたＤＮＡを、埋められたＮｃｏ  Ｉ部位の３’を切断するＫｐｎ  Ｉで消化し、イソフラボンシンターゼ断片を導入した。ＩＦＳキメラ遺伝子（α’β−コングリシニンプロモーター／イソフラボンシンターゼ／ファゼオリン３’ポリアデニル化配列）を含むカセットをＨｉｎｄ  ＩＩＩで消化してこのプラスミドから遊離させ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−消化ｐＺＢＬ１０２に導入してｐＷＳＪ００１を形成した。
【０１０４】
実施例２
ダイズ体細胞胚培養物の形質転換とダイズ植物の再分化
プラスミドｐＯＹ２０３およびｐＷＳＪ００１でダイズ不定胚培養物を形質転換し、ＣＲＣ組換え発現コンストラクトのみを発現している形質転換体をスクリーニングし、植物を再生させ、生成されたイソフラボンの濃度を測定することで、ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを発現しているトランスジェニックなダイズ植物でイソフラボン濃度を変化させる機能を試験した。本発明ではプラスミドｐＷＳＪ００１は必要ない。ＰＣＲ増幅を利用してトランスジーンの有無についてのスクリーニングを行い、イソフラボンシンターゼ組換え発現コンストラクトを含有する植物を本研究から排除した。
【０１０５】
粒子銃でのボンバードメント法によってｐＷＳＪ００１と併せてｐＯＹ２０３でダイズの胚形成懸濁培養物を形質転換し、ｐＯＹ２０３にＣＲＣ組換え発現コンストラクトを持つがｐＷＳＪ００１にＩＦＳ組換え発現コンストラクトを持たない形質転換体を同定した。
【０１０６】
ダイズ植物の形質転換と再分化には以下のストック溶液と培地とを利用した。
【０１０７】
ストック溶液（１リットルあたり）
ＭＳスルフェート１００×ストック溶液：ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏを３７．０ｇ、ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏを１．６９ｇ、ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏを０．８６ｇ、ＣｕＳＯ４．５Ｈ２Ｏを０．００２５ｇ。
ＭＳハライド１００×ストック溶液：ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏを４４．０ｇ、ＫＩを０．０８３ｇ、ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏを０．００１２５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４を１７．０ｇ、Ｈ３ＢＯ３を０．６２ｇ、Ｎａ２ＭｏＯ４．２Ｈ２Ｏを０．０２５ｇ、Ｎａ２ＥＤＴＡを３．７２４ｇ、ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏを２．７８４ｇ。
Ｂ５ビタミンストック溶液：ｍｙｏ−イノシトールを１００．０ｇ、ニコチン酸を１．０ｇ、ピリドキシンＨＣｌを１．０ｇ、チアミンを１０．０ｇ。
２，４−Ｄストック溶液：１０ｍｇ／ｍＬ
【０１０８】
培地（１リットルあたり）
ＳＢ５５：各ＭＳストック溶液を１０ｍＬ、Ｂ５ビタミンストック溶液を１ｍＬ、ＮＨ４ＮＯ３を０．８ｇ、ＫＮＯ３を３．０３３ｇ、２，４−Ｄストック溶液を１ｍＬ、アスパラギンを０．６６７ｇ、ｐＨ５．７。
ＳＢ１０３：ムラシゲ＆スクーグ塩混合物（ギブコＢＲＬ）を１パック、マルトースを６０ｇ、ジェランガム２ｇ、ｐＨ５．７。
ＳＢ７１−１：Ｂ５塩、Ｂ５ビタミンストック溶液を１ｍＬ、スクロースを３０ｇ、ＭｇＣｌ２を７５０ｍｇ、ジェランガムを２ｇ、ｐＨ５．７。
【０１０９】
蛍光と白熱光との混合光線を用いて、日中１６時間で夜間８時間のサイクルにて、（ジャック変種（Ｊａｃｋ  ｖａｒｉｅｔｙ）の）ダイズ胚形成懸濁培養物を、回転振盪機（１５０ｒｐｍ）で２８℃にてＳＢ５５液体培地３５ｍＬ中に保持した。新鮮な液体培地３５ｍＬに組織約３５ｍｇを接種して培養物を２から３週間ごとに継代培養した。
【０１１０】
ダイズ胚芽懸濁培養物を、デュポンのＢｉｏｌｉｓｔｉｃ  ＰＤＳ１０００／Ｈｅ装置を用いて粒子銃によるボンバードメント法（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら（１９８７）、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０〜７３を参照）で形質転換した。胚芽をプラスミドｐＯＹ２０３（ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを含有）およびプラスミドｐＷＳＪ００１（ＩＦＳ組換え発現コンストラクトを含有）と一緒にボンバードメントした。ＰＣＲを用いてＣＲＣ組換え発現コンストラクトを単独で含む形質転換体を同定した。これを本願明細書に記載する。ＩＦＳ組換え発現コンストラクトを含む形質転換体については他の目的で利用し、本発明の一部をなしてはいない。
【０１１１】
ボンバードメントにあたっては、ｐＯＹ２０３（０．５μｇ／μＬ）とｐＷＳＪ００１（１μｇ／μＬ）プラスミドＤＮＡとの１：２混合物５μＬと、ＣａＣｌ２（２．５Ｍ）５０μＬと、スペルミジン（０．１Ｍ）２０μＬとを、０．６μｍ金粒子の６０ｍｇ／ｍＬの懸濁液５０μＬに加えた。粒子調製物を３分間攪拌し、微量遠心管にて１０秒間スピンし、上清を除去した。続いて、ＤＮＡをコーティングした金粒子を１００％エタノール４００μＬで１回洗浄し、無水エタノール４０μＬ中に再懸濁させ、１秒ずつ３回超音波処理した。次に、それぞれのマイクロキャリアディスクにＤＮＡをコーティングした金粒子を５μＬずつ仕込んだ。
【０１１２】
２週間培養した懸濁培養物約３００から４００ｍｇを６０ｍｍ×１５ｍｍの空のペトリ皿に入れ、ピペットを使って組織から残った液体を除去した。この組織を保持用スクリーンから約３．５インチ離して配置し、ボンバードメントを２回行った。メンブレン破断圧を１１００ｐｓｉに設定し、およびチャンバを−２８インチＨｇまで脱気した。それぞれの実験で２枚のプレートをボンバードメントし、ボンバードメント後、組織を半分に割り、液体培地に戻し、上述したようにして培養した。
【０１１３】
ボンバードメントの１１日後、液体培地をハイグロマイシン５０ｍｇ／ｍＬを含有する新鮮なＳＢ５５培地と交換した。選択培地を毎週リフレッシュした。ボンバードメントの７週間後、形質転換した緑色の組織が形質転換されなかった壊死胚形成クラスタから成長しているのが観察された。緑色の単離組織を取り出し、個々のフラスコに接種して、クローン繁殖させた新たな形質転換胚形成懸濁培養物を生成した。このように、新たな系統を各々独立した形質転換イベントとして処理した。ダイズ懸濁培養については、継代培養によって未熟な発達段階でクラスター形成された胚芽の懸濁液として保持するか、あるいは個々の不定胚の成熟と発芽によって再生して植物全体にすることが可能である。
【０１１４】
形質転換された胚形成クラスタを液体培養物から取り出し、ホルモンまたは抗生物質を含有しないＳＢ１０３固体寒天培地にのせた。蛍光と白熱光との混合光線を用いて、日中１６時間、夜間８時間のスケジュールで、胚芽を２６℃にて８週間培養した。この期間に、クラスタから個々の胚芽を取り出し、さまざまな胚芽発達段階で分析した。選択した系統にＣＲＣ組換え発現コンストラクトおよび／またはＩＦＳ組換え発現コンストラクトがあるか否かをＰＣＲ増幅によって分析した。
【０１１５】
５’−  ＡＧＧＣＧＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＡＣＧ  −３’［配列表の配列番号１］
５’−  ＡＧＧＴＣＣＡＴＴＴＣＧＴＣＧＣＡＧＡＧＧＣ  −３’［配列表の配列番号２］
５’−ＡＴＧＴＴＴＧＧＣＡＡＧＴＡＧＧＡＡＧＧＧＡＣＣ  −３’［配列表の配列番号３］
５’−ＧＣＡＴＴＣＣＡＴＡＡＧＣＣＧＴＣＡＣＧＡＴＴＣ  −３’［配列表の配列番号４］
【０１１６】
野生型のダイズ胚芽には存在しない断片を産生するプライマー１およびプライマー２（それぞれ配列表の配列番号１および配列表の配列番号２に示す）を用いてＣＲＣ組換え発現コンストラクトの有無を判断した。また、プライマー３およびプライマー４（それぞれ配列表の配列番号３および配列表の配列番号４に示す）を用いてＩＦＳ組換え発現コンストラクトの有無を判断した。このプライマー対を用いて得られた増幅生成物をアガロースゲル上で分離したところ、すべての試料で内在性のＩＦＳ遺伝子を示す（すなわちイントロンを含む）１０６２ｂｐの断片が得られ、同じくＩＦＳ組換え発現コンストラクトを含む８４５ｂｐの断片が胚芽で得られた。ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを含み、ＩＦＳ組換え発現コンストラクトを含まない胚芽を、さらに研究する目的で選択した。
【０１１７】
不定胚は８週間後に発芽に適したものとなったため、成熟培地から取り出し、空のペトリ皿で１から５日かけて乾燥させた。この乾燥胚芽をＳＢ７１−１培地に蒔き、ここで上記にて説明したものと同じ光線および発芽条件で発芽させた。発芽した胚芽を滅菌土壌に移し、熟すまで栽培した。種子を収穫した。
【０１１８】
実施例３
ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを含む形質転換体のＲ１種子中のイソフラボンの分析
ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを含み、ＩＦＳ組換え発現コンストラクトを含まないダイズ一次形質転換体（Ｒ１種子）から得られる種子で、イソフラボン濃度を分析した。以下のようにして抽出物を調製し、ＨＰＬＣで分析した。各種子を秤量し、１／４インチ円柱ビーズとフラボン２０ｍｇ（内部標準）の入った２ｍＬ容のねじ蓋付きのチューブに入れた。次に、ビーズ破砕装置を用いて４２００ｒｐｍで３０秒間の間隔で微粉末になるまで種子をひき割った。８０％水性メタノール８００μＬを加えて試料を溶液に均質化し、さらにビーズ破砕をほどこした。各試料を６０℃の振盪水浴中に４時間放置した後、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心処理した。上清のアリコート１００μＬを取り出し、脱イオン水１００μＬを加え、ボルテックスし、遠心処理し、ＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣ分析には、ダイオードアレイ検出器とＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ製のＬｕｎａ  ３  Ｃ１８（２）、４．６ｍｍ×１５０ｍｍカラムとを取り付けたＨＰ１１００装置を利用した。カラム温度を２２℃とし、溶媒流量を１ｍＬ／分とし、２６０ｎｍで検出を行った。溶媒溶出は５％メタノール／９５％０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の水溶液から１００％メタノールまでの勾配で１６分間とし、続いて３分間の後洗浄を行った。これによって、ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステイン、その複合誘導体のクロマトグラムが得られた。それぞれの分析について標準曲線を作成し、個々の化合物を測定した。複合体はすべて標準の変換係数を用いてアグリコン当量値に変換した。各アグリコンの総濃度に加えて、全イソフラボン含有量も算出した。
【０１１９】
おおむね、各形質転換イベントで得られた１から３つの植物それぞれから種子個体を５つ採取して分析を行った。合計で１３の形質転換イベントで得られた一次形質転換植物の種子にはそれぞれＣＲＣ組換え発現コンストラクトしか含まれず、これについてもトランスジーンを持たない一次形質転換植物の種子と同様に分析した。ＣＲＣイベントのサブセットから、対照とは異なるイソフラボノイド組成物が認められた。トランスジェニック植物の一部における表現型の観察結果については、独立した形質転換イベントで発生するトランスジーンの発現の通常のバリエーションで説明がつく。
【０１２０】
対照の植物から得た種子のイソフラボン成分の特性を図１０に種子番号１〜５で示す。この対照の植物は形質転換実験で得られたものであるが、ＣＲＣ組換え発現コンストラクトについてはＰＣＲ陰性であった。この典型的な対照特性では、ゲニステインが最も豊富なイソフラボンである。ダイゼインはおおむね次に濃度の高い成分で、グリシテインが最低であるが、種子によってはダイゼインとグリシテインの濃度が近くなる場合もある。また、この例では、個々のイソフラボンの濃度ならびにイソフラボン総濃度の合計には、同じ植物から得たものであっても種子ごとに相当な量のばらつきがあることがわかる。４つの独立した形質転換イベントを示す植物から得た種子でイソフラボン成分の特性の明らかな変化が見て取れた（図１０）。半接合性一次形質転換体から得たＲ１種子はトランスジーンで分離されるものと思われた。１−１、１−２および１−３５のイベントの植物から分析した種子の中には、特性が変化した種子もあれば上述した対照の特性を持つ種子もある。１−２５のイベントで得た種子ではいずれも特性が変化していたことから、５つの種子がすべてトランスジーンを持っていることが分かる。これは、分離遺伝子座が複数あることによるものか、あるいはそれぞれが単一の座を含む５つの種子が１つずつ偶然に選択されたことによる可能性がある。
【０１２１】
これらのイソフラボン成分が変化した種子では、グリシテイン濃度への影響が最も少なかった。しかしながら、種子によっては、特に１−１イベントの種子では、グリシテイン濃度が同じ形質転換体の野生型の分離個体種子の場合よりも約２倍高くなった（図１０、種子番号６、１０、１３）。グリシテイン合成経路は定義されていないが、ゲニステインよりもダイゼインの方がグリシテインの構造に近いため、ダイゼイン分岐経路の一部ではないかと思われる。グリシテイン合成に関与している可能性のあるＣＹＰ７１Ｄ９  Ｐ４５０でコードされる酵素が最近になって特徴付けられた（ラチュンデ−ダダ（Ｌａｔｕｎｄｅ−Ｄａｄａ）ら（２００１）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：１６８８〜１６９５）。ダイゼインとグリシテインが密接に関連しているとすれば、ＣＲＣトランスジーンにイソフラボン合成のダイゼイン／グリシテイン分岐経路を活性化する作用がある。ダイゼイン濃度の高いＣＲＣ形質転換体から得られた種子個体のなかには、イソフラボンの総濃度が高くなったものがあった。イソフラボン特性が変化した１６個の種子（図１０に示す）のうち、１４個の種子でイソフラボンの総濃度が対照の植物から得られた種子よりも高くなった。このため、種子個体におけるイソフラボンの総濃度には極めて幅があるが、場合によってはＣＲＣが原因でその濃度がさらに高くなり得るという結論を導きだせる。この作用には矛盾があることから、最終的なイソフラボンの総濃度を決めることになる何らかの要因が他にもまだあるに違いないと考えられる。
【０１２２】
これらの４つのイベントにおいて種子のイソフラボン特性が変化していることは全ダイゼインの濃度が著しく高くなることで見分けることができ、対照および野生型の分離種子（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｎｇ  ｓｅｅｄ）（種子番号１０および１７）のダイゼイン濃度と比較すると濃度が最も高くなるときで約４倍まで上昇する。ダイゼイン濃度が高い同じ種子個体でもゲニステイン濃度は著しく低下し、場合によってはほとんど検出できないレベルにまで低くなった（種子番号６、１１、１３など）。これらの変化によって、対照および野生型の分離種子でダイゼインは全体の２０％から３５％であるのが普通なのに対し、表現型が変化した種子で全イソフラボンの６０％から８０％がダイゼイン成分によるものとなる（図１１）。表現型が変化した種子では、ゲニステイン成分はほぼ０％という低い値から１４％までの範囲であるが、対照および野生型の分離種子ではこの範囲が全イソフラボンの４３％から６０％である（図１２）。ゲニステイン濃度の低下は形質転換イベントによってまちまちであり、イベント１−２がゲニステインの低下率が最も高く、ほぼゼロまで達した。イベント１−２５では、ゲニステインは全イソフラボンの６％から１４％までしか低下しなかったが、これでもまだ対照の濃度よりはかなり低い。
【０１２３】
図２は、１−１、１−２、１−２５、１−３５の各形質転換イベントの植物から得られた全ダイゼイン対全ゲニステイン比が高められた種子個体ならびに対照の種子の全ダイゼイン対全ゲニステイン比を示している。対照の種子については、ＰＣＲ増幅の際にＣＲＣ組換え発現コンストラクトが陰性である形質転換実験で得られた植物、あるいはイソフラボノイド特性を変化させない組換えＤＮＡ発現コンストラクトで形質転換された植物のうちのいずれかから得る。１−２のイベントで得た２つの種子での比は高すぎて（７８４．０および８０１．０）同じチャートの中にプロットすることができないため、ここでは図示していない。対照の種子での全ダイゼイン対全ゲニステイン比は０．３から１．６の範囲であったが、新規な高い全ダイゼイン表現型を持つ４つの形質転換イベントの種子での比は４．７から８０１．０の範囲であった。全ゲニステインに対する全ダイゼインの正確な比は、単一の形質転換イベントの中ですら種子個体によってまちまちであった。しかしながら、ダイズ種子においてＣＲＣ組換え発現コンストラクトを発現させると全ダイゼイン対全ゲニステイン比が２未満から４．５を超える値まで変化することは明らかである。
【０１２４】
４つの形質転換イベントで得られた全ダイゼイン対全ゲニステイン比が高められた種子の大半では、全イソフラボンの濃度も上昇した。図３は、図２に示す全ダイゼイン対全ゲニステイン比の場合と同じ種子についての全イソフラボン濃度を示すグラフである。分析の対象となった、全ダイゼイン対全ゲニステイン比が高められた２４個の種子のうち、１８個で全イソフラボン濃度が対照の全イソフラボンの最高値よりも高くなった。対照の種子では全イソフラボン濃度が種子重量１ｇあたり１９９から１８３３μｇの範囲であった。全ダイゼイン対全ゲニステイン比が高められた１８個の種子では全イソフラボン濃度が２００３から４７３７の間であったのに対し、全ダイゼイン対全ゲニステイン比が高められた残りの６個の種子の全イソフラボン濃度は３４８から１８０８の間であった。このように、ダイズ種子でＣＲＣ組換え発現コンストラクトが発現すると、全ダイゼイン対全ゲニステイン比が高い種子の大多数で全イソフラボンの濃度が高くなる。
【０１２５】
実施例４
ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを含む形質転換体のＲ２種子中のイソフラボンの分析
上述した１−１、１−２、１−２５、１−３５のイベントで得られたＲ１種子をデラウェア州ニューアークのスティーネ（Ｓｔｉｎｅ）敷地にある圃場に蒔き、１−１のイベントで得られたＲ１種子をポットに蒔いて栽培室で栽培した。種子を収穫し（Ｒ２種子）、イソフラボン濃度を分析した。単一の種子抽出物を調製し、実施例３で説明した手順を以下のように変更して分析した。まず、内部標準を加えなかった。試料を８０％メタノール中で２７℃にて１時間かけて抽出した。遠心分離後、上清５００μＬを新しい２ｍＬ容のチューブに移した。チューブに残った破砕後の種子に８０％メタノールを別途５００μＬ加え、この混合物をＳｐｅｘ  ２０００  Ｇｅｎｏ−グラインダで１６２０ストローク／分にて３０秒間再懸濁させ、遠心処理を繰り返した。別に５００μＬの上清を新しいチューブ内の５００μＬと混合し、試料をボルテックスし、再度遠心処理し、３００μＬを脱イオン水３００μＬに加えてボルテックスした。カラムの温度を２５℃とし、検出を２６２ｎｍで行ったこと以外は実施例３の条件下で、試料をＨＰＬＣでアッセイした。実施例３で説明したようにしてデータの計算を行った。
【０１２６】
全ダイゼイン対全ゲニステイン比の高い種子個体には種子の中線に沿って茶色の縞があったことにも注意した。これらの種子には、対照の表現型を持つ種子が全体的に明るい黄褐色であったのに対して、子葉軸に平行にへそとは反対側の中線のまわりに暗褐色の縞があった。茶色の縞のある種子の中には、対照の種子よりも小さいものがあり、わずかに皺がよっているものもあった。種子を切ったところ、茶色の着色は外側の皮にしかなく、子葉にまでは達していないことが分かった。
【０１２７】
目に見える表現型とイソフラボン特性との間に考えられる相関についてさらに調査検討するために、１−１、１−２、１−２５のイベントで得られた黄褐色または茶色の縞のあるＲ１種子を用いて栽培チャンバで植物を栽培し、目に留まったＲ２種子を収穫した。黄褐色の種子から栽培した植物ではいずれも黄褐色の種子しか得られなかった。茶色の縞のある種子から栽培した１−２５の植物には茶色の縞のある種子が１７個でき、この系統には複数の遺伝子座があるという点と整合していた。茶色の縞のある種子から栽培した１−１および１−２の植物ではいずれも茶色の縞のある分離種子と黄褐色の分離種子とが得られた。１−２の系統では分離が茶色の縞対黄褐色で３：１であったことから、優性の形質が明らかになった。１−１の系統では分離比が２：１であったことから、この形質の割合が低かったか劣性種子致死表現型との間に何らかの関連性があるのではないかと考えられた。１−１および１−２のイベントで得られた茶色の縞の種子個体と黄褐色の種子個体ならびに、１−２５のイベントで得られた茶色の縞の種子個体でイソフラボン濃度を分析した。いずれの場合も、茶色の縞のある種子ではダイゼインが高くゲニステインは低かったのに対し、黄褐色の種子ではゲニステインの対照特性が高かった（それぞれ図１３および図１４）。このように、茶色の縞がＣＲＣ形質転換体から得られた種子におけるイソフラボン表現型の変化を伴って同時分離されている。この目に見える表現型は、ＣＲＣホモ接合体ならびに野生型の分離個体を同定する上での手段となる。
【０１２８】
このように、分析を行う前に全ダイゼイン対全ゲニステイン形質が高い種子を目視で特定することができた。これらの植物には茶色の縞がない種子しかできないため、ＣＲＣ形質転換イベント系統から得られた野生型の分離個体である植物を同定し、これらの植物から圃場栽培のＲ２種子の対照を得た。
【０１２９】
茶色の縞のある種子ができない植物（野生型の分離個体）または茶色の縞で分離される種子ができる植物のいずれかである圃場栽培植物から得られる単一のＲ２種子の全ダイゼイン対全ゲニステイン比を図４に示す。ＣＲＣ組換えＤＮＡコンストラクトを発現しているトランスジェニック植物は表現型で分離されるが、茶色の縞のある種子のデータのみを示してある。野生型の分離個体における全ダイゼイン対全ゲニステイン比は０．６から０．７であったのに対し、種子の中線に沿って茶色の縞のある種子の全ダイゼイン対全ゲニステイン比は２．９から１２８．０の範囲であった。分析対象とした、中線に沿って茶色の縞のある１８個の種子のうち１６個で全ダイゼイン対全ゲニステイン比が２０以上になったのに対し、他の２つの種子では比が２．９および４．５であった。Ｒ２の圃場栽培種子におけるイソフラボン成分濃度から分かるように、全ダイゼイン対全ゲニステインの高い比が、１−１、１−２、１−２５のイベントの第二世代の植物に遺伝しているのは明らかであった。
【０１３０】
栽培室で栽培した植物の対照の種子は、中線に沿って茶色の縞のない種子であり、種子の中線に沿って茶色の縞のある種子と同じ植物から収穫されたものである。栽培室の植物から得られたＲ２種子の全ダイゼイン対全ゲニステイン比を求めた。これを図５に示す。栽培室で育った１−１のイベントの植物から得られたＲ２種子では、全ダイゼイン対全ゲニステイン比が対照の種子での比に比べてかなり高かった。対照の種子では全ダイゼイン対全ゲニステイン比が０．５から０．６の間であったのに対し、中線の下に向かって茶色の縞がある種子では全ダイゼイン対全ゲニステイン比が１３．６から６４．４の間であった。
【０１３１】
圃場栽培植物から得られたＲ２種子の全イソフラボン濃度を測定した。これを図６にまとめておく。中線に沿って茶色の縞のある種子の中には全イソフラボン濃度が茶色の縞のない種子の約２倍になったものもあるが、この茶色の縞のある種子の中には全イソフラボン濃度が茶色の縞のない野生型の分離個体種子よりも低いものもあった。１−１の形質転換イベントに由来する植物から得られた種子では、中線に沿って茶色の縞のあるすべての種子で全イソフラボン濃度が野生型の分離個体種子よりも高かった。１−２５の形質転換イベントに由来する植物から得られた種子では、中線に沿って茶色の縞のある種子の全イソフラボン濃度が、分析対象となった１つを除くすべての種子で野生型の分離個体よりも高かった。１−２の形質転換イベントに由来する植物から得られた種子では、野生型の分離個体種子のうちのひとつの全イソフラボン濃度が通常の対照範囲よりも高かった。この種子の全イソフラボン濃度は、１−２の形質転換イベントに由来する中線に沿って茶色の縞のあるどの種子の全イソフラボン濃度よりも高かった。しかしながら、１−２の形質転換イベントに由来し、中線に沿って茶色の縞のある１つを除くすべての種子で、全イソフラボン濃度が（１−１、１−２５および１−２のイベントについて）残りの野生型の分離個体種子よりも高かった。
【０１３２】
栽培室で栽培した１−１の形質転換イベントの植物から得られたＲ２種子の全イソフラボン濃度を図７に示す。中線に沿って茶色の縞のある種子は、対照の種子よりも全イソフラボン（ｉｓｏｆｌａｖｏｎｗ）濃度が高かった。
【０１３３】
図１５に示すように、３つのイベントからの圃場栽培した茶色の縞のあるＲ２種子はいずれもダイゼイン濃度が高く、おおむねゲニステインが２％程度の濃度までかなり低減した。Ｒ１種子でのゲニステインの低下率が最も少なかった１−２５のイベントですら、圃場栽培種子よりもゲニステインの低下率が大きかった（図１６）。このように、世代や環境によってゲニステインが低減される度合いのばらつきがみられた。１−１のイベントから得られたものと１−２５のイベントから得られたものの２つの種子個体が、約１５％〜１７％のゲニステインを持つ点で注目すべきである。このことから、同じ植物から得られる種子個体ですらゲニステイン濃度に影響するばらつきがあることが分かる。しかしながら、ＣＲＣトランスジーンを持つＲ２種子では全体としてダイゼイン濃度の上昇とゲニステイン濃度の低下が見られ続けた。また、種子によっては全イソフラボン濃度が上昇した種子が、ここでも一貫性はなかった（図１７）。
【０１３４】
要するに、第二世代の種子の全イソフラボン濃度は、中線に沿って茶色の縞のある種子のほとんどの例で対照の野生型分離個体種子よりも高くなった（全ダイゼイン対全ゲニステイン比が高くなり、ＣＲＣ組換え発現コンストラクトが存在することで分かる）。
【０１３５】
実施例５
ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを含む形質転換体のＲ３種子中のイソフラボンの分析
１−１、１−２、１−２５の形質転換イベントに由来する栽培室栽培の植物から収穫したＲ２種子を使って栽培室で植物を栽培し、種子を収穫（Ｒ３）してイソフラボン含有量を分析した。以下のようにして抽出物を調製し、バルク試料で分析した。それぞれの植物から採取した８個の種子を混合し、市販されていない粉砕装置で粉砕した。試料２００ｍｇを秤量し、２ｍＬ容のバイアルに移した。この試料を実施例４で説明したようにして調製してアッセイした。この実験での対照は茶色の縞のない種子しかできない野生型の分離個体から採取したＲ３種子とした。各形質転換イベントごとに、対照の植物１つとＣＲＣ組換え発現コンストラクトを含む植物３つの各々から１つずつ試料を分析した。結果を図８に示す。野生型の分離個体のバルク種子試料における全ダイゼイン対全ゲニステイン比は０．７から０．８の範囲であった。ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを有する植物から採取した試料の全ダイゼイン対全ゲニステイン比は５．３から７１．８の範囲であった。Ｒ３種子のイソフラボン成分濃度から分かるように、全ダイゼイン対全ゲニステインの高い比が、１−１、１−２、１−２５のイベントの第三世代の植物に遺伝しているのは明らかであった。
【０１３６】
バルクＲ３試料の全イソフラボン濃度を図９に示す。Ｒ３種子では、ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを有する植物から得られたすべてのバルク種子試料で全イソフラボン濃度が対照の植物種子試料のいずれよりも高くなった。
【０１３７】
実施例６
ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを含む形質転換体のＲ４種子におけるフェニルプロパノイド経路の遺伝子の発現の分析
ノーザンブロットおよびイムノブロット分析を行い、ＣＲＣ組換え発現コンストラクトの発現に影響されるフェニルプロパノイド経路の遺伝子を求めた。フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）、ケイ皮酸４−ヒドロキシラーゼ（Ｃ４Ｈ）、カルコンイソメラーゼ（ＣＨＩ）、カルコンレダクターゼ（ＣＨＲ）、イソフラボンシンターゼ（ＩＦＳ）、フラバノン３−ヒドロキシラーゼ（Ｆ３Ｈ）、ジヒドロフラボノールレダクターゼ（ＤＦＲ）、フラボノールシンターゼ（ＦＳ）、イソフラボンレダクターゼ（ＩＦＲ）から、ｍＲＮＡを検出するためのプローブを作製した。ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを含むＲ３植物の種子または対照からＲＮＡを調製し、メンブレンにトランスファーし、上述したプローブとハイブリダイズさせた。これらのノーザンブロット分析によって、ＰＡＬ、Ｃ４Ｈ、ＣＨＩ、ＣＨＲ、Ｆ３Ｈ、ＤＦＲ、ＦＳのそれぞれの濃度が、ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを発現しているトランスジェニック植物の種子で対照よりも高くなることが分かった。抗ＣＨＳ、抗ＣＨＲまたは抗ＩＦＳ抗血清を用いて、同じ植物の種子に由来するタンパク質試料のイムノブロット分析を行った。ＣＨＲ遺伝子およびＩＦＳ遺伝子のタンパク質発現特性をそのＲＮＡ発現特性と相関させた。ＣＲＣトランスジェニック植物の種子でＣＨＳタンパク質が増加したことから、ＣＨＳ遺伝子の発現量が高くなったのではないかと思われた。
【０１３８】
ノーザンブロット分析
１−１のイベントのＲ３世代の植物を栽培チャンバで栽培した。茶色の縞のある種子しかできないＣＲＣ組換え発現コンストラクトとホモ接合性の植物と、黄褐色の種子しかできない野生型の分離個体とを栽培した。開花約１０日後と開花２０日後の２つの発達段階で、それぞれ重量が約１５０ｍｇおよび２５０ｍｇの未熟な種子を収穫した。これらの物質から得られる全ＲＮＡおよびタンパク質を別々に抽出した。ＲＮＡ抽出では、Ｔｒｉｚｏｌ法（メリーランド州ロックビルのギブコＢＲＬ、ライフテクノロジーズ）に手を加えたものを適用した。各試料について約５個の種子を液体窒素中でまとめて粉砕し、粉末５００ｍｇをＴｒｉｚｏｌ試薬７．５ｍＬで５分間かけて抽出した。クロロホルム３ｍＬを加え、混合し、水相４ｍｌを回収した。イソアミルアルコール４ｍＬを加えてＲＮＡを沈殿させた。遠心処理および液相の除去後、ＲＮＡ沈殿物を７５％エタノールで洗浄し、２０分間風乾させた。ＲＮＡを水４００μＬ中に再懸濁させ、各試料から、３０μｇのＲＮＡに相当する量をプレキャストＲｉｌａｎｔ  ＲＮＡ  Ｇｅｌ（メーン州ロックランドのＦＭＣ）の各レーンにローディングした。ＲＮＡ分離とノーザンブロッティングの標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）に従ってＲＮＡ成分を電気泳動で分離し、メンブレンにトランスファーした。
【０１３９】
デュポンＥＳＴの独自データベースで所望の遺伝子をコードすると特定したクローンからプローブを作製した。選択した各々のクローン（ｓｒｒ１ｃ．ｐｋ００１．ｋ４以外）のｃＤＮＡインサート全体の配列を得て、この挿入物が正しい遺伝子を表していることを確認した。プローブの作製に利用したクローンを、コードされるポリペプチドならびに添付の配列表で使用する対応の識別子（配列表の配列番号）と一緒に表２に示す。
【０１４０】
【表３】
2004533831.tif 000004
【０１４１】
プローブについては、ギブコ−ＢＲＬ、ライフテクノロジーズから入手したランダムプライマーＤＮＡラベリングシステムを利用して、製造業者のプロトコールに従ってランダムプライマー法で作製した。ＩＦＳコード領域を含むＰＣＲ産物を鋳型にしたＩＦＳ以外のすべてのプローブでプラスミド全体を鋳型として利用した。このＰＣＲ増幅産物は、ＷＳＪ００１の調製について上記の実施例１で説明したようにして得たものである。
【０１４２】
ランダムプライマー反応混合物全体を、精製せずにハイブリダイゼーションに利用した。ハイブリダイゼーション条件はＰｅｒｆｅｃｔＨｙｂ  Ｂｕｆｆｅｒ（ミズーリ州セントルイスのシグマ−アルドリッチ）のプロトコールに従った。このハイブリダイゼーションについては、６８℃にて一晩で実施した。次に、２×ＳＳＣ緩衝液（ギブコＢＲＬ、ライフテクノロジーズ）で２回、０．１×ＳＳＣで１回、６８℃にてそれぞれ１５分ずつメンブレンを洗浄した。
【０１４３】
イムノブロット分析
ＣＨＳまたはＣＨＲコード領域を発現しているＥ．  ｃｏｌｉから精製したタンパク質に対するＣＨＳ抗体およびＣＨＲ抗体を、常法でＣｏｖａｎｃｅ（カリフォルニア州リッチモンド）によって調製した。また、ＷＯ００／４４，９０９号に記載されているように、ＩＦＳタンパク質の合成ペプチドに対するＩＦＳ抗体を調製した。イムノブロット分析には、抗ＣＨＳ、抗ＣＨＲまたは抗ＩＦＳ抗血清を用いる標準的なプロトコールを利用した。スーパーシグナルＷｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（イリノイ州ロックフォードのピアース社）を用いてＣＨＳおよびＣＨＲの結合抗体を可視化し、一方、ＩＦＳにはＦｅｍｔｏ化学発光基質（イリノイ州ロックフォードのピアース社）を用いた。
【０１４４】
１５０ｍｇまたは２５０ｍｇのいずれかで収穫した、野生型の分離個体である対照の植物から得られた種子またはＣＲＣ組換え発現コンストラクト植物から得られた種子でのイソフラボノイド経路における異なる遺伝子のＲＮＡおよび／またはタンパク質の相対的な検出結果を表３に示す。プラス記号（＋）１つはＲＮＡまたはタンパク質が明確に検出されたことを示す。＋／−はＲＮＡまたはタンパク質が辛うじて検出されたことを示す。２つ以上のプラス記号は特定のＲＮＡ濃度またはタンパク質濃度の検出量がほぼ増えたことを示す。
【０１４５】
【表４】
2004533831.tif 000005
【０１４６】
これらの結果から、ダイズ種子でＣＲＣ組換え発現コンストラクトを発現させると、上記にて列挙したようなフェニルプロパノイド経路の特定のダイズ遺伝子の発現量が増えたことが分かる。上流のフェニルプロパノイド経路では、ＰＡＬ遺伝子およびＣＨＳ遺伝子の発現量に最も劇的な変化が観察された。Ｃ４Ｈ、ＣＨＩ、ＣＨＲの発現量も有意に増加した。
【０１４７】
ＩＦＳの発現量は増えなかった。ダイゼインからのグリセオリンの合成に関与する酵素であるＩＦＲは、若い種子では増えず、月日を経た種子では若干増えた。
【０１４８】
フェニルプロパノイド経路のフラボノール／アントシアニン分岐経路に関与する酵素をコードするいくつかの遺伝子の発現量がＣＲＣの発現によって増えた。これには、Ｆ３Ｈ、ＤＦＲ、ＦＳが含まれる。
【０１４９】
ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを発現しているダイズ種子には中線に沿って茶色の縞があるため、これを簡単に特定できることが分かった。Ｒ１種子、Ｒ２種子、Ｒ３種子の分析結果から、対照の種子とＣＲＣ組換え発現コンストラクトを含む種子のどちらでも全イソフラボンの濃度および全ダイゼイン対全ゲニステイン比が変化することが分かった。
【０１５０】
全体的にみて、ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを含む種子の全ダイゼイン対全ゲニステイン比は２．９から８０１．０の範囲であり、対照の種子から得られた試料ではこれが０．３から１．６の範囲であった。これらの範囲に重複する部分はない。
【０１５１】
検討対象とした種子のうち、ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを発現していない植物よりもＣＲＣ組換え発現コンストラクトを発現している植物から得られたＲ１種子の方が全イソフラボン濃度が高かった。２つの例外を除き、圃場栽培植物から得られたＲ２種子の全イソフラボン濃度は、組換え発現コンストラクトを発現していない植物から得られた種子と比較してＣＲＣ組換え発現コンストラクトを発現している植物から得られた種子の方が高かった。この場合、上記の結果に当てはまらなかった種子が２つあった。すなわち、ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを含む１−２５の形質転換イベントから得られた１つの種子で全イソフラボン濃度が野生型の分離個体から得られた種子よりも低く、１−２の形質転換イベントから得られた野生型の分離個体の１つの種子で全イソフラボン濃度が並外れて高かった。中線に沿って茶色の縞を持つ検討対象としたＲ３種子ではいずれも全イソフラボン濃度が野生型の分離個体から得られた種子よりも高かった。
【０１５２】
実施例７
ＣＲＣ組換え発現コンストラクトを含む形質転換体に蓄積されるフェニルプロパノイド経路の中間体の同定
質量分析法を利用して、ＣＲＣ組換えＤＮＡ断片を発現しているダイズ種子と対照の種子とのＨＰＬＣ特性の違いを求めた。質量分析法を利用して、野生型の種子ではほとんど検出できないがＣＲＣ組換え発現コンストラクトを発現している種子には存在する３種類の化合物を特定した。この後から特定した化合物はいずれもｍ／ｚが５０５であるが、保持時間が１５．４６分、２１．２９分、２１．７５分と異なる（野生型の種子についての図１８とＣＲＣ組換え発現コンストラクトを発現している種子についての図１９とを比較のこと）。ＭＳ２分析によって、各化合物についてｍ／ｚが２５７の主断片を１つ得た。この質量から、質量２４８の断片が失われたことが分かるが、これは複合化合物からのマロニル−グルコースのフラグメンテーションの結果と一致している。
【０１５３】
ダイゼイン合成の中間体であるリキリチゲニンおよびイソリキリチゲニンはいずれも質量が２５６であり、未知のピークそれぞれについて検出されたｍ／ｚの２５７に一致する。未知のものについては、まずインソースフラグメンテーション（ソース衝突誘導解離）を利用して２４８ｍ／ｚの断片を除去して２５７ｍ／ｚの種を残し、続いてＭＳ２によってさらに分析した。最初のフラグメンテーションについては、マロニル−グルコース部分をダイゼインおよびゲニステインのマロニル−グルコース誘導体から除去するのに理想的であると判断された条件下で行った。ＭＳ２では、３つの未知のものそれぞれについて、２３９、１４７および１３７の同じ断片が生成された。リキリチゲニンおよびイソリキリチゲニン標準を分析したところ、各化合物について主なピークがｍ／ｚ２５７にあるＭＳ１スペクトルと、２３９、１４７および１３７のＭＳ２断片とが認められた。これらの結果から、３つの未知のものが、リキリチゲニンおよび／またはイソリキリチゲニンのマロニル−グルコース誘導体ではないかと考えられる。
【０１５４】
リキリチゲニンおよびイソリキリチゲニン標準をさらにキャラクタリゼーションしたところ、これらの２つの化合物を区別するのにＵＶスペクトルおよび保持時間を利用できることが明らかになった。リキリチゲニンのＵＶスペクトルは保持時間１５．５で未知のものと一致し、未知のものの２１．３および２１．８でのスペクトルがイソリキリチゲニンのＵＶスペクトルに近い（データ図示せず）。未知のものの保持時間を、リキリチゲニンおよびイソリキリチゲニンそれぞれの保持時間１８．３および２７．１と比較すると、フラボノイドアグリコンとその対応するマロニル−グルコース複合体との保持時間の差に基づく予想と一致する。この結果ならびに上記のデータから、１５．５の未知のものはリキリチゲニンのマロニル−グルコース複合体であり、２１．３および２１．８の未知のものはイソリキリチゲニンのマロニル−グルコース複合体であるという結論に至る。２つの異なる位置でイソキリチゲニンの複合が起こるのは、おそらく後ろの２つのピークによるものであろう。これらの中間体がＣＲＣ種子に蓄積されることから、イソフラボンシンターゼ触媒反応が制限されているのではないか（図１）と思われるが、複合に関与している酵素をコードする遺伝子の活性化が高まることで中間体の捕促が増えることも可能性のひとつである。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１Ａ】ダイズのイソフラボノイド生合成経路ならびに他のいくつかのフェニルプロパノイド類との関係を示す図であり、フェニルアラニンからダイゼイン、ゲニステイン、ジヒドロフラボノールまでの経路を示している。
【図１Ｂ】ダイズのイソフラボノイド生合成経路ならびに他のいくつかのフェニルプロパノイド類との関係を示す図であり、ダイゼイン、ゲニステイン、ジヒドロフラボノールから、グリセオリン、キエビトン（ｋｉｅｖｉｔｏｎｅ）、アントシアニン、フラボノールまでの経路を示している。
【図２】新規な全ダイゼイン対全ゲニステイン比を示す４通りの独立した形質転換イベントから得られる植物に由来するＲ１種子個体ならびに対照の種子で観察された全ダイゼイン対全ゲニステイン比を示している。バーの上の表示は各群の種子の起源（すなわちＣＲＣ形質転換イベント番号または対照）である。対照の種子については、ボンバードメントを施して該当する核酸断片の含有が認められなかった植物または形質転換植物のイソフラボノイド特性を変化させない組換えＤＮＡ発現コンストラクトで形質転換した植物から入手する。種子１、２、５、６、７、８、９、１０、１１、１４、１５、１６、１７、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３１、３５、３６、３７、３９、４０、４３は、ＰＣＲ増幅の際にＣＲＣ組換え発現コンストラクト陰性であった、形質転換実験から得られた植物に由来するものである。仮特許出願の図２の種子番号１〜７は本図の番号３、２０、８、４１、１３、３０および３８に相当する。
【図３】新規な全ダイゼイン対全ゲニステイン比を示す４通りの独立した形質転換イベントでの植物で得られるＲ１種子個体ならびに対照の種子のイソフラボンの全濃度を示している。本図の種子は図２の種子と同一である。バーの上の表示は各群の種子の起源（すなわち対照またはイベント番号）である。
【図４】ＣＲＣ組換え発現コンストラクト株および野生型分離個体（図中、アスタリスク［＊］で示す）由来の圃場栽培トランスジェニック植物から得られる単一のＲ２種子で観察された全ダイゼイン対全ゲニステイン比を示している。全ダイゼイン対全ゲニステイン比が新規な種子も中線に沿って茶色の縞を示していた。バーの上の表示は各群の種子の起源（ＣＲＣ形質転換イベント番号）である。
【図５】１−１形質転換イベントに由来し、栽培室にて栽培された植物から得られる単一のＲ２種子で観察された全ダイゼイン対全ゲニステイン比を示している。バーの上にポンド記号（＃）を付してあるのは中線に沿った茶色の縞がない種子であり、マークのないバーは中線に沿って茶色の縞がある種子を示している。
【図６】ＣＲＣ組換え発現コンストラクト株および野生型分離個体（図中、アスタリスク［＊］で示す）由来の圃場栽培トランスジェニック植物から得られる単一のＲ２種子で観察されたイソフラボンの全濃度を示している。バーの上の表示は各群の種子の起源（ＣＲＣ形質転換イベント番号）である。
【図７】栽培室で栽培され、１−１形質転換イベントに由来する植物から得られる単一のＲ２種子中のイソフラボンの全濃度を示している。バーの上にポンド記号（＃）を付してあるのは中線に沿った茶色の縞がない種子であり、その他のマークがないバーは茶色の縞がある種子を示している。種子個体は図５の種子と同一である。
【図８】栽培室で栽培された植物から収穫したバルク分析したＲ３種子の全ダイゼイン対全ゲニステイン比を示している。各バルク種子試料は異なる植物から得たものである。各種子試料のＣＲＣ組換え発現コンストラクト株（すなわちＣＲＣ形質転換イベント番号）をバーの上に表示してある。ＣＲＣ組換え発現コンストラクト株由来の野生型分離個体から得られる種子試料についてはバーの上にアスタリスク［＊］を付して示してある。
【図９】栽培室で栽培された植物から収穫したバルク分析したＲ３種子のイソフラボンの全濃度を示している。各バルク種子試料は異なる植物から得たものである。各種子試料のＣＲＣ組換え発現コンストラクト株（すなわちＣＲＣ形質転換イベント番号）をバーの上に表示してある。ＣＲＣ組換え発現コンストラクト株由来の野生型分離個体から得られる種子試料については図中アスタリスク［＊］を付して示してある。これらの種子は図８で分析したものと同一である。
【図１０】ＣＲＣ組換えＤＮＡ発現コンストラクトで形質転換した植物から得られるＲ１種子個体から調製される抽出物のＨＰＬＣ分析で得られた個々のイソフラボン（ダイゼイン、グリシテイン、ゲニステイン）総量ならびにイソフラボン総量を示している。それぞれの植物について３から５個の種子を分析した。対照種子については、ＣＲＣ組換えＤＮＡ発現コンストラクトが陰性の形質転換体から得る。ＣＲＣ組換えＤＮＡ発現コンストラクトが陽性の植物から得られる種子は、各形質転換イベント１−１、１−２、１−２５、１−３５からのものである。バーの上の表示は各群の種子の起源（形質転換イベントの後ろに植物の番号）である。
【図１１】ＣＲＣ組換えＤＮＡ発現コンストラクトで形質転換し、図１０で分析したものと同じＲ１種子で得られたイソフラボン総量に対する全ダイゼインの比を示している。
【図１２】ＣＲＣ組換えＤＮＡ発現コンストラクトで形質転換し、図１０で分析したものと同じＲ１種子で得られたイソフラボン総量に対する全ゲニステインの比を示している。
【図１３】栽培室で栽培され、３通りの形質転換イベント（１−１、１−２、１−２５）に由来する植物から得られるＲ２種子個体でのイソフラボン総量に対する全ダイゼインの比を示している。各植物ごとに６個の種子で得られた比を示してある。種子の収穫元となった個々の植物を数字と文字との組み合わせで特定し、バーの上に表示してある。最初の２つの数字は形質転換イベント番号を示し、３つ目の数字はＲ０植物を示し、文字はＲ２種子が得られたＲ１植物を示している。中線に沿った茶色の縞がない種子についてはバーの上にポンド記号（＃）を付して示してある。
【図１４】栽培室で栽培され、３通りの形質転換イベント（１−１、１−２、１−２５）に由来する植物から得られるＲ２種子個体での全ゲニステインとすべてのイソフラボンの合計との比を示している。図示の比は図１３に示した種子と同じ種子についてのものである。
【図１５】圃場で栽培され、３通りの形質転換イベント（１−１、１−２、１−２５）に由来する植物から得られるＲ２種子個体での全ダイゼインとイソフラボン総量との比を示している。バーの上にアスタリスク（＊）を付した２つの種子の各組は、黄褐色の種子しかできない分離個体から得られた黄褐色の種子であるため、隣接する植物の形質転換イベントの野生型の分離個体として特定した。３つの形質転換イベントからの２つのＣＲＣ組換えＤＮＡ発現コンストラクト含有植物各々から得られた、いずれも茶色の縞がある３つの種子をアッセイした。種子を収穫した個々のＣＲＣ組換えＤＮＡ発現コンストラクト含有植物を３つの数字で特定する。最初の２つの数字は形質転換イベント番号を示し、３つ目の数字はＲ２種子を得たＲ０植物を示す。
【図１６】圃場で栽培され、３通りの形質転換イベント（１−１、１−２、１−２５）に由来する植物から得られたＲ２種子個体について、全ゲニステインと全イソフラボンの合計との比を示している。図示の比は図１５に示す種子と同じ種子についてのものである。
【図１７】圃場で栽培され、３通りの形質転換イベント（１−１、１−２、１−２５）に由来する植物から得られたＲ２種子個体について、イソフラボンの総量を示している。これらの種子は図１１で分析した種子と同じである。
【図１８】ＣＲＣ組換えＤＮＡ発現コンストラクトを含まない対照の野生型の分離個体種子からの抽出物で得られたｍ／ｚ５０４．６から５０５．６のＬＣ−ＭＳ２質量クロマトグラムを示している。
【図１９】１−１の形質転換イベントに由来する茶色の縞のあるＲ３種子からの抽出物で得られたｍ／ｚ５０４．６から５０５．６のＬＣ−ＭＳ２質量クロマトグラムを示している。１４．３８、１５．４６、２１．２９および２１．７５分間の時点に別のピークが認められる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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