(57)【要約】本発明は、２つ以上の相同性を有する二本鎖ポリヌクレオチドから一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片のプール（ｐｏｏｌ）を製造する段階、前記一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片を鋳型とし、特定のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて複数周期の延長反応を含む重合反応を行うことにより組換えポリヌクレオチドを得る段階、および少なくとも一つのプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより前記組換えポリヌクレオチドを増幅させる段階を含む組換えポリヌクレオチドの製造方法；および前記方法で製造した組換えポリヌクレオチドをベクターに挿入する段階、および組換えポリヌクレオチドを含む前記ベクターで発現細胞を形質転換して多数の変異体クローンを製造する段階を含む組換えＤＮＡライブラリーの製造方法に関する。本発明の方法は、相同性ポリヌクレオチドのインビトロ組換えおよび意図された分子的進化のために使用できる。
2004513633.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記段階を含む組換えポリヌクレオチドの製造方法：
（ａ）相互類似性のある領域を有する、組換えようとする少なくとも１つの出発ポリヌクレオチドから様々な長さを有する一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片のプールを生成する段階；
（ｂ）複数周期の延長反応を含む重合過程を行う段階であって、
段階（ａ）で製造された一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片が順次に鋳型として作用し、特定のオリゴヌクレオチドがプライマーとして反応混合物に添加され、このプライマーが鋳型交換を通じて延長されて少なくとも一つの組換えポリヌクレオチドを生産し、生成した組換えポリヌクレオチドは出発ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なることを特徴とする段階；および
（ｃ）少なくとも一つの特定のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、（ｂ）段階で製造された組換えポリヌクレオチドを増幅させる段階。
【請求項２】
（ａ）段階が、（ｉ）少なくとも一つの出発ポリヌクレオチドからＲＮＡを製造するために転写過程を行い、（ｉｉ）無作為プライマーをプライマーとして用い、前記（ｉ）段階のＲＮＡ転写物を鋳型として用いて逆転写反応を行うことを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記（ａ）段階が、
（ｉ）出発二本鎖ポリヌクレオチドを少なくとも一つの制限酵素で切断して一方の末端に３’−突出構造を生成し、
（ｉｉ）（ｉ）段階の反応混合物をエクソヌクレアーゼＩＩＩで処理し、一定の時間間隔で反応混合物の一部を取った後、エクソヌクレアーゼＩＩＩの活性を中止させることにより、一方向に順次に切断された二本鎖ポリヌクレオチドのプールを製造し、
（ｉｉｉ）５’−突出構造を有する生成された二本鎖ポリヌクレオチドをＳ１ヌクレアーゼおよびＤＮＡ重合酵素で処理して平滑末端を形成し；
（ｉｖ）（ｉ）段階で３’−突出構造を有する同一の末端に新たな３’−突出構造を生成させ；
（ｖ）（ｉｖ）段階のポリヌクレオチドをエクソヌクレアーゼＩＩＩで処理して一本鎖ポリヌクレオチド切片を製作すること
を含む請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記（ａ）段階が、
（ｉ）出発二本鎖ポリヌクレオチドを少なくとも一つの制限酵素で切断して一方の末端に３’−突出構造を生成し、
（ｉｉ）（ｉ）段階のポリヌクレオチドをエクソヌクレアーゼＩＩＩで処理して一本鎖ポリヌクレオチドを生成し；
（ｉｉｉ）無作為プライマーを用いて（ｉｉ）段階の一本鎖ポリヌクレオチドに対して重合反応を行うこと
を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記（ａ）段階が、
（ｉ）出発二本鎖ポリヌクレオチドを少なくとも一つの制限酵素で切断して一方の末端に３’−突出構造を生成し；
（ｉｉ）（ｉ）段階のポリヌクレオチドをエクソヌクレアーゼＩＩＩで処理して一本鎖ポリヌクレオチドを生成し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）段階の一本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖特異的５’→３’エクソヌクレアーゼで処理し、一定の時間間隔で反応混合物の一部を取った後、エクソヌクレアーゼの活性を中止させることにより、一方の方向に順次に切断された一本鎖ポリヌクレオチドのプールを製造すること
を含む請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記（ａ）段階が、
（ｉ）正方向および逆方向プライマーのうち一種のオリゴヌクレオチドのみを用いて出発二本鎖ポリヌクレオチドに対してポリメラーゼ連鎖反応を行い；
（ｉｉ）生成した一本鎖ポリヌクレオチドを出発二本鎖ポリヌクレオチドから分離し；
（ｉｉｉ）無作為プライマーを用いて（ｉｉ）段階の一本鎖ポリヌクレオチドに対して重合反応を行うこと
を含む請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記（ａ）段階が、
（ｉ）正方向および逆方向プライマーのうち一種のオリゴヌクレオチドのみを用いて出発二本鎖ポリヌクレオチドに対してポリメラーゼ連鎖反応を行い；
（ｉｉ）生成した一本鎖ポリヌクレオチドを出発二本鎖ポリヌクレオチドから分離し；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）段階の一本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖特異的５’→３’エクソヌクレアーゼで処理し、一定の時間間隔で反応混合物の一部を取った後、エクソヌクレアーゼの活性を中止させることにより、一方向に順次に切断された一本鎖ポリヌクレオチドのプールを製造すること
を含む請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記（ａ）段階が、
（ｉ）少なくとも一つの出発ポリヌクレオチド挿入体を有するウイルスベクターまたはプラスミドベクターから一本鎖ポリヌクレオチドを分離し；
（ｉｉ）無作為プライマーを用いて（ｉ）段階の一本鎖ポリヌクレオチドに対して重合反応を行うこと
を含む請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記（ｂ）段階が、
（ｉ）プライマーが鋳型として用いられた一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片の端まで伸長される少なくとも一周期を行い；
（ｉｉ）（ｉ）段階で生成された伸長されたポリヌクレオチドの各々が鋳型交換を通じて（ｉ）段階で用いられた一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片とは異なる一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片の端までさらに伸長される少なくとも一つの後続周期を行い；
（ｉｉｉ）目的とする長さの組換えポリヌクレオチドが得られるまで（ｉｉ）段階を繰り返すこと
を含む請求項１記載の方法。
【請求項１０】
（ｂ）段階の特定のオリゴヌクレオチドが、少なくとも一つの出発ポリヌクレオチドとハイブリダイズできる特定のヌクレオチド配列を有する請求項１記載の方法。
【請求項１１】
出発ポリヌクレオチドが、酵素、抗体、抗原、結合タンパク質、ホルモン、成長因子および血漿タンパク質からなる群から選ばれるいずれか一つのタンパク質をコードする遺伝子またはその一部である請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記酵素が、加水分解酵素、分解酵素、伝達酵素、酸化還元酵素、連結酵素および異性化酵素からなる群から選ばれる請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
出発ポリヌクレオチドが、野生型ＤＮＡまたはそれから得られた変異型ＤＮＡである請求項１記載の方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項の方法によって製造された組換えポリヌクレオチドをベクターに挿入する段階、および組換えポリヌクレオチドを含む前記ベクターで発現細胞を形質転換して複数の突然変異クローンを得る段階を含む組換えＤＮＡライブラリーの製造方法。
【請求項１５】
前記ベクターが、ファージ、プラスミド、ファージミド、ウイルスベクターおよび人工染色体からなる群から選ばれる請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
発現細胞が、細菌、カビ、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞からなる群から選ばれる請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
請求項１４の方法によって製造された組換えＤＮＡライブラリーから目的とする機能的特性を有する組換えポリヌクレオチドをスクリーニングすることを含む、ポリヌクレオチドを目的とする性質を有するように進化させる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、突然変異タンパク質をコードする組換えＤＮＡのプール（ｐｏｏｌ）を製造する方法およびそれを含む組換えＤＮＡライブラリーに関し、それを用いると、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）組換えによるタンパク質の意図的進化が可能である。
【０００２】
（背景技術）
遺伝情報は、究極的に生体内で大部分の生命維持機能を果すタンパク質に解読される。重要な生物学的巨大分子の一つとして、タンパク質は細胞の構成成分だけでなく、高度の特異性を持ってすべての生化学反応に参与する。
【０００３】
２０種類のアミノ酸から構成されたタンパク質の機能は、１次、２次、３次および４次構造という４段階に分けられる構造によって決定される。タンパク質の１次構造、すなわち、アミノ酸配列は特にタンパク質の形態と機能に関する情報を含んでいるので、タンパク質の全体的構造または機能はただ一つのアミノ酸残基の変異によっても変化し得る（Ｓｈａｏ， Ｚ． ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ Ｆ． Ｈ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｕｒｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ６：５１３−５１８， １９９６）。
【０００４】
生物体の多様性はＤＮＡまたはＲＮＡにコードされた遺伝情報の多様性を反映する。自然界において、遺伝情報は突然変異、有性生殖および自然選択を含む自然的進化過程によって徐々に、そして持続的に変化する。たとえば、有性生殖の際、減数分裂（ｍｅｉｏｓｉｓ）の間、２つの個体から由来する相同染色体（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）は相同性組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を通じて遺伝物質を交換するか、再組み立てすることができる。このようなＤＮＡの再組立ては、生物が速く進化する機会をさらに多く提供する。しかし、自然界におけるこのような形態の進化は、部分的にそれが偶然に起こるため、長時間にわたって進行される。したがって、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）突然変異の誘発を適切なスクリーニング技法とともに用いて所望する目的に進化された遺伝子および変異タンパク質を短期間で得るために多くの努力が注がれている（Ｅｉｇｅｎ， Ｍ．， Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ， ５８： ４６５−５２３， １９７１； Ｂｒａｄｙ， Ｒ．Ｍ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３１７：８０４−８０６ （１９８５）；およびＰａｌ， Ｋ．Ｆ．， Ｂｉｏ． Ｃｙｂｅｒｎ．， ６９：５３９−５４６， １９９３）。
【０００５】
変異タンパク質を製造するために現在最も多く利用される方法は、部位特異的突然変異誘発法（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）である。前記方法は、目的とする部位のヌクレオチドを合成によって変異されたオリゴヌクレオチドに置換する。しかし、この方法は、タンパク質において置換しようとする部位のアミノ酸配列および機能に対する正確な情報を必要とするという限界がある。組換えＤＮＡライブラリーの形式で突然変異タンパク質を製造する他の方法としては、エラー誘発性ポリメラーゼ連鎖反応（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ ＰＣＲ）（Ｌｅｕｎｇ， Ｄ． Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， １：１１−１５， １９８９；およびＣａｌｄｗｅｌｌ， Ｒ．Ｃ． ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ， Ｇ．Ｆ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ２：２８−３３， １９９２）が広く利用されている。エラー誘発性ＰＣＲは、重合反応時に反応条件を調節することにより、重合酵素の充実性を減少させて遺伝子の突然変異ＤＮＡライブラリーを構築するのに使用できる。しかし、エラー誘発性ＰＣＲは、重合酵素の低い進行性（ｌｏｗ ｐｒｏｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）が問題となり、これは、平均サイズの遺伝子に対するこの方法の実質的な適用を制限する。エラー誘発性ＰＣＲの他の制限点は、短い長さのＤＮＡ領域内で多数の突然変異がともに起こる頻度が非常に低く、多重突然変異（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が導入されることが難しいということである。
【０００６】
これらの方法の短所を解消するために、相同性ポリヌクレオチドの混合物から突然変異ＤＮＡライブラリーを構築する様々な方法が開発されている。このような方法は、マキシジェン社（Ｍａｘｙｇｅｎ， Ｉｎｃ．）のＤＮＡシャフリング（ＤＮＡ Ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）方法（米国特許第５，６０５，７９３号、第６，１１７，６７９号、第６，１３２，９７０号）とダイバーサ社（Ｄｉｖｅｒｓａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の遺伝子再組立て（Ｇｅｎｅ Ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ）方法（米国特許第５，９６５，４０８号）、アーノルド（Ｆｒａｎｃｅｓ Ｈ． Ａｒｎｏｌｄ）の組換え方法（米国特許第６，１５３，４１０号）である。
【０００７】
マキシジェン社のＤＮＡシャフリング方法（米国特許第５，６０５，７９３号、第６，１１７，６７９号および第６，１３２，９７０号；Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｗ． Ｐ． Ｃ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３７０：３８９−３９１， １９９４；およびＳｔｅｍｍｅｒ， Ｗ． Ｐ． Ｃ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：１０７４７−１０７５１， １９９４）は、組換えようとする１種以上の二本鎖ＤＮＡの切片を製作し、これらの切片を集めてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う段階を含むが、ここでは異なる母ＤＮＡから由来する相同性切片が互いに接合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）して部分的に重複するＤＮＡ切片（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔｓ）を形成し、各々のＤＮＡ切片を互いに対する鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）およびプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）として用いてＤＮＡ合成が起こることにより、無作為的な組換えＤＮＡライブラリーが生成する。しかし、この方法は、ＤＮＡ切片を製作するために比較的多量のＤＮＡが必要であり、切断工程に用いられたＤＮａｓｅ　Ｉは生成したＤＮＡ切片の後続重合工程を妨げるので十分に除去しなければならない。また、前記方法は、ＤＮａｓｅ　Ｉの特性によって適用が制限される。たとえば、前記目的で広く用いられるＤＮａｓｅ　Ｉは、末端にプリン塩基よりはピリミジン塩基を有する３’−ホスホジエステル結合を切断しやすいため、完全に無作為化されたＤＮＡ切片プールを得ることが難しい（Ｓｈａｏ， Ｚ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２６：６８１−６８３ （１９９８））。
【０００８】
ダイバーサ社の遺伝子再組立て方法（米国特許第５，９６５，４０８号）は、組換えようとする一種以上の二本鎖ＤＮＡを鋳型として用いた重合工程によってＤＮＡ切片を合成し、切片を集めてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、無作為的な組換えＤＮＡライブラリーを製作する段階を含む。前記方法は、ＵＶ処理または鋳型ＤＮＡ上の付加生成物（ａｄｄｕｃｔ）の形成によって生成した部分合成された切片を用いるので、鋳型ＤＮＡ上で完全な重合が行われない。構築されたＤＮＡライブラリーの無作為性にもかかわらず、ダイバーサ社の方法は用いられた試薬の突然変異誘発の可能性および所望するサイズの切片を得るために重合反応停止試薬の処理のための反応条件を最適化しなければならない煩わしさなどの問題がある。また、ＤＮＡストランドにピリミジン塩基が連続的に存在する場合、ＵＶ処理によってチミジン二量体（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ ｄｉｍｅｒ）のようなピリミジン二量体（ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ ｄｉｍｅｒ）が生成して鋳型ＤＮＡが歪み、ストランドに沿って重合酵素が進行することを妨げる。その結果、重合反応がピリミジン二量体部位で終りやすいので、得られたＤＮＡ切片は不十分な無作為性を有する。
【０００９】
ＤＮＡシャフリングおよび遺伝子再組立て法は、部分的に重複するＤＮＡ断片（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔｓ）の形成が必須段階であり、組換えられる出発ＤＮＡから由来する各ＤＮＡ切片が鋳型およびプライマーとして作用することを特徴とする。
【００１０】
アーノルド（Ａｒｎｏｌｄ）によって提案された他の方法、すなわち、ＳｔＥＰ（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ）（米国特許第６，１５３，４１０号；Ｚｈａｏ， Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １６：２５８−２６１， １９９８；およびＥｎｃｅｌｌ， Ｌ． Ｐ． ａｎｄ Ｌｏｅｂ， Ｌ． Ａ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １６：２３４−２３５， １９９８）は、鋳型二本鎖ポリヌクレオチドに無作為または特定のプライマーを結合させた後、反応条件を調節しながら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って各反応サイクルごとに鋳型から部分伸長された短いＤＮＡ切片を生成させ、ＰＣＲを反復的に行うことにより、鋳型交換（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）によって遺伝子間の組換えを完成することを含む。重合酵素反応時、各ターゲットＤＮＡには、特定な配列−特異的重合遅延部位 （ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｕｓｅ ｓｉｔｅｓ）が存在する。したがって、ＳｔＥＰ方法は、異なる鋳型ＤＮＡの同一領域にプライマーが接合しても、プライマーから始まって伸長されるＤＮＡ切片の伸長速度が互いに異なるため、組換えＤＮＡライブラリーが無作為的に製造されないという問題がある（Ｅｎｃｅｌｌ， Ｌ． Ｐ． ａｎｄ Ｌｏｅｂ， Ｌ． Ａ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １６：２３４−２３５， １９９８）。ＳｔＥＰ方法では、プライマーの部分伸長から短いＤＮＡ切片を製作するために、重合時間を減らし、反応温度を低めることにより、ＰＣＲ条件を厳しく調節しなければならない。ＳｔＥＰ方法では、ＰＣＲ工程中に温度を好ましい範囲に維持できない場合（たとえば、低すぎる温度）は、非特異的接合（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｎｅａｌｉｎｇ）が起こり、好ましくない組換え体が生成し得る。
【００１１】
前記通常の方法における問題を克服した組換えＤＮＡライブラリーの構築方法は、改善された特性を有する突然変異タンパク質の生産のために非常に有用である。本明細書に記述された本発明は、異種ＤＮＡストランドのインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）組換え方法に関するものであって、一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片を製造し、このＤＮＡ切片を特定のプライマーと混合した後重合反応を行い、さらに前記段階を繰り返すことにより、組換えＤＮＡライブラリーを製造することを含む。本発明の他の利点は、添付の図面を参考して下記の発明の詳細な説明から明らかになる。
【００１２】
（発明の開示）
したがって、本発明の目的は、２つ以上の相同性を有する二本鎖ポリヌクレオチド間の無作為的な組換えを通じて様々な組換えポリヌクレオチドを製造する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、前記組換えポリヌクレオチドをベクターに挿入し、生成したベクターで発現細胞を形質転換して複数の突然変異クローンを得る段階を含む、組換えＤＮＡライブラリーの製造方法を提供することである。
【００１４】
本発明のまた他の目的は、前記組換えＤＮＡライブラリーから目的とする機能的特性を有する組換えポリヌクレオチドをスクリーニングすることにより、改善された突然変異遺伝子を同定する方法を提供することである。
【００１５】
本発明の一実施態様に従って、本発明では下記の段階を含む換えＤＮＡライブラリーの製造方法が提供される：
（ａ）相互類似性のある領域を有する、組換えようとする２つ以上の出発ポリヌクレオチドから様々な長さを有する一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片のプール（ｐｏｏｌ）を生成する段階；
（ｂ）複数周期の延長反応を含む重合過程を行う段階であって、段階（ａ）で製造された一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片が鋳型としてのみ作用し、特定のオリゴヌクレオチドがプライマーとして反応混合物に添加され、これらのプライマーが鋳型交換（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）を通じて方向性をもって順次に延長されて少なくとも一つの組換えポリヌクレオチドを生産し、生成した組換えポリヌクレオチドは出発ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なることを特徴とする段階；および
（ｃ）少なくとも一つの特定のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、（ｂ）段階で製造された組換えポリヌクレオチドを増幅させる段階。
【００１６】
本発明の他の実施態様に従って、本発明では、前記方法によって製造された組換えポリヌクレオチドをベクターに挿入し、組換えポリヌクレオチドを含む前記ベクターで発現細胞を形質転換して複数の突然変異クローンを製造する段階を含む組換えＤＮＡライブラリーの製造方法が提供される。
【００１７】
また、本発明のさらに他の実施態様に従って、本発明では前記方法によって製造された組換えＤＮＡライブラリーから目的とする機能的特性を有する組換えポリヌクレオチドをスクリーニングする過程を含む、ポリヌクレオチドを目的とする特性を有するように進化させる方法が提供される。
【００１８】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明者らは、従来技術の問題を解決するための新たな方法を開発するために鋭意努力した結果、従来の技術とは異なる新たな原理によって導入された、増加された無作為性によって様々な組換えＤＮＡのプール（ｐｏｏｌ）をより容易に得られる、組換えＤＮＡライブラリーの新たな製造方法を確立することにより、本発明を完成した。
【００１９】
前記マキシジェン社のＤＮＡシャフリング方法（米国特許第５，６０５，７９３号；第６，１１７，６７９号；および第６，１３２，９７０号）とダイバーサ社の遺伝子再組立て方法（米国特許第５，９６５，４０８号）は、共通して組換えようとする２つ以上のポリヌクレオチドから得られた二本鎖ＤＮＡ切片が一本鎖に変換された後、互いに接合して部分的に重複するＤＮＡ切片（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔｓ）を形成し、したがって、これらがポリメラーゼ連鎖反応（米国特許第４，６８３，２０２号および第４，６８３，１９５号）においてヌクレオチド延長のための鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）およびプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）として用いられ、同一の複数周期の重合反応を繰り返すことにより長さを伸長されるという特徴がある。対照的に、本発明の方法では、組換えようとする２つ以上のポリヌクレオチドから由来する一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片が用いられるので、一本鎖ポリヌクレオチド切片のプール内で部分的に重複するＤＮＡ切片（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔｓ）が形成されず、一本鎖ポリヌクレオチド切片は専ら鋳型としてのみ用いられること；プライマーとして添加されたオリゴヌクレオチドのみが一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片を鋳型として方向性をもって順次に伸長されること；および前記ＰＣＲ過程において鋳型交換（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）によって組換えが導入されること等の点において従来の技術とは根本的に異なる。また、鋳型として用いられた二本鎖ターゲットＤＮＡから部分的に伸長されたＤＮＡ切片を製造するために、温度および反応時間を調節する厳しい条件を用いるアーノルドのＳｔＥＰ方法（米国特許第６，１５３，４１０号）とは異なり、本発明の方法は、ＤＮＡ切片を鋳型として用いるので、通常の重合反応条件を用いて鋳型ＤＮＡ切片の長さだけ伸長されたＤＮＡ切片が得られる。また、配列−特異的重合遅延部位（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐａｕｓｅ ｓｉｔｅｓ）で重合酵素の伸長速度が落ちることに影響されないので、組換えの無作為性を著しく向上できる。
【００２０】
本発明の突然変異組換えポリヌクレオチドの製造方法は、２つ以上の相同性を有する遺伝子の一部を相互交換することにより、一群の様々な組換え遺伝子を製造する方法を提供し、下記のような段階を含む：
（ａ）相互類似性のある領域を有する、組換えようとする２つ以上の出発ポリヌクレオチドから様々な長さを有する一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片のプール（ｐｏｏｌ）を生成する段階；
（ｂ）複数周期の延長反応を含む重合過程を行う段階であって、
段階（ａ）で製造された一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片が鋳型としてのみ作用し、特定のオリゴヌクレオチドがプライマーとして反応混合物に添加され、これらのプライマーが鋳型交換（ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）を通じて方向性をもって順次に延長されて少なくとも一つの組換えポリヌクレオチドを生産し、生成した組換えポリヌクレオチドは出発ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なることを特徴とする段階；および
（ｃ）少なくとも一つの特定のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより、（ｂ）段階で製造された組換えポリヌクレオチドを増幅する段階。
【００２１】
前記（ｂ）段階の重合反応において、特定のプライマーから部分的に伸長されたＤＮＡ切片が次の周期で他の出発二本鎖ポリヌクレオチドから由来する鋳型ＤＮＡ切片と接合して重合反応が行われると、２つの相同性ポリヌクレオチドから由来する配列を一つのポリヌクレオチド内に含む組換えポリヌクレオチドが生成する。このようなＰＣＲ周期を繰り返すことにより、図１に示すようにＡおよびＢ遺伝子の間で無作為的に組換えられた配列を有する様々な突然変異組換えポリヌクレオチドが得られる。
【００２２】
また、本発明は、前記のように製造された組換えポリヌクレオチドをベクターに挿入し、組換えポリヌクレオチドを含む前記ベクターで発現細胞を形質転換して複数の突然変異クローンを得る段階を含む、組換えＤＮＡライブラリーの製造方法を提供する。
【００２３】
本発明の方法で構築された組換えＤＮＡライブラリーから有用な遺伝子をスクリーニングできる。
【００２４】
したがって、本発明はまた、前記方法によって構築された組換えＤＮＡライブラリーから目的とする機能的特性を有する組換えポリヌクレオチドをスクリーニングすることを含む、改善された突然変異遺伝子を同定する方法を提供する。
【００２５】
本発明は、２つ以上の遺伝物質の間で無作為的な組換えによって組換えＤＮＡライブラリーを製造する方法に関する。本発明によれば、インビトロ無作為的組換えによって様々な種類の組換え遺伝子を合成でき、この組換え遺伝子を適当な発現ベクターおよび宿主細胞とともに用いて製作した組換えＤＮＡライブラリーから目的とするクローンをスクリーニングし、それからポリペプチドを発現させることにより、目的とする特性を有する新規なポリペプチドを製造できる。
【００２６】
本明細書で用いられる用語の「一方向性の一本鎖ＤＮＡまたはポリヌクレオチド切片（ｕｎｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｏｒ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」は、一本鎖ＤＮＡまたはポリヌクレオチド切片が互いに逆平衡（ａｎｔｉ−ｐａｒａｌｌｅｌ）関係ではなく、平衡（ｐａｒａｌｌｅｌ）関係にあるので、これらを互いに混合しても相補的水素結合を通じて互いに接合できないことを意味する。たとえば、二本鎖ＤＮＡの全体ヌクレオチド配列が下記の通りであるとき、
５’−ＡＧＧＴＣＣＡＧＴＴＡＧＣＡＴＴＣＧＧＡＡＡＧＧＣＣＧＴＴＴＧＡＧＡＧＡＧ−３’（配列番号：１７）
３’−ＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＣＧＴＡＡＧＣＣＴＴＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＴＣＴＣＴＣ−５’（配列番号：１８）
それから由来する３’−ＴＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＣＧＴＡＡＧ−５’（配列番号：１９）、３’−ＡＡＡＣＴＣＴＣＴＣ−５’（配列番号：２０）、３’−ＴＴＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＴＣＴＣＴＣ−５’（配列番号：２１）、３’−ＣＣＴＴＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＴＣＴＣＴＣ−５’（配列番号：２２）および３’−ＴＣＡＡＴＣＧＴＡＡＧＣＣＴＴＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＴＣＴＣＴ　Ｃ−５’（配列番号：２３）などの一本鎖ＤＮＡは一方向性であるとみなされる。本発明の方法において、ポリメラーゼ連鎖反応の鋳型としてのみ用いられるそのような一方向性の一本鎖ＤＮＡまたはポリヌクレオチド切片は組換えようとするポリヌクレオチドのサイズによって様々な長さに製造できる。
【００２７】
本明細書で用いられる用語の「組換えＤＮＡ」は同一ではないが、実質的に相同性のあるヌクレオチド配列を有する２つ以上のポリヌクレオチドから由来するヌクレオチド配列を一分子内に含む、ヌクレオチド配列モザイクを有するキメラＤＮＡ」を意味する。キメラＤＮＡは本来のヌクレオチド配列領域および突然変異されたヌクレオチド配列領域を含む。図５および６は、本発明の方法による無作為的なインビトロＤＮＡ組換え（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって合成されたこのような組換えＤＮＡを例示している。有性生殖中の減数分裂過程において相同染色体間の交差による遺伝子交換によって自然的に生成する組換えＤＮＡとは異なり、本発明の方法の組換えＤＮＡは相同性ＤＮＡストランド間のインビトロ無作為的組換えによって短期間で様々なヌクレオチド配列を有するように製造され、これらはベクターに挿入され、このベクターで形質転換された宿主細胞で発現され得る。様々な組換えＤＮＡを含むクローンから構成された組換えＤＮＡライブラリーを構築し、それから目的とする特性を有する組換えＤＮＡをスクリーニングできる。前記で論議されたように、２つ以上の相同性ポリヌクレオチド間の無作為的な組換えＤＮＡライブラリーのインビトロ製造および自然選択を模倣したスクリーニング技法に組入れると、目的とする特性を有する改善された遺伝子または突然変異タンパク質を短時間で得られる。
【００２８】
本明細書で用いられる用語の「相同性のある（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」とは、一つの一本鎖核酸配列が相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイゼーション（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）できることを意味する。この際、ハイブリダイゼーションの程度は、核酸配列間の同一性程度、および温度および塩の濃度のようなハイブリダイゼーション条件を含む多数の因子によって変化する。
【００２９】
本明細書で用いられる用語の「突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」とは、天然型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）核酸配列またはそれから発現されるペプチドの配列が変化したことを意味する。
【００３０】
本明細書で用いられる用語の「ＤＮＡライブラリー（ＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ）」は、２つ以上のポリヌクレオチドからなり、無作為的な組換えによって製造されたポリヌクレオチドまたは組換えＤＮＡ切片の集合を意味する。ＤＮＡライブラリーは、様々なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの集合；様々なヌクレオチド配列を有するＤＮＡまたはクローニングされたＤＮＡの総合；または、広義的には、これらのＤＮＡを含むクローンの集合を含む。このようなＤＮＡライブラリーから目的とする特性を有するタンパク質をコードする組換えＤＮＡをスクリーニングしてタンパク質の発現に使用できる。
【００３１】
より具体的に、本発明は次のような段階によって自然界に存在するか、人為的に製造された２種以上の相同性ポリヌクレオチドから無作為的および人為的に突然変異された様々なヌクレオチド配列を有する組換えポリヌクレオチドを製造する方法を提供する。図１は、このようなインビトロＤＮＡ組換え方法を示す。
【００３２】
第１段階：互いに類似した領域を有する、組換えようとする２つ以上の出発ポリヌクレオチドから様々な長さを有する一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片を製造する（図１の段階１）。本発明の方法に用いるための出発ポリヌクレオチドは互いに５０％以上の相同性を有してもよく、８０％以上の相同性を有する出発ポリヌクレオチドを用いることが好ましい。
【００３３】
２つ以上の相同性のあるポリヌクレオチドから生産されたすべての一本鎖ポリヌクレオチド切片は同一な一方向性を有する。したがって、これらは、互いに対して平衡（ｐａｒａｌｌｅｌ）であるため、これらを互いに混合しても相補的水素結合を通じたこれらの間の相補的な接合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）は起こらない。
【００３４】
一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片は、通常の方法のいずれ、たとえば、ＲＮＡから逆転写反応を用いて一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片を製造する方法、ヌクレオチドの順次的な一方向性切断によって一本鎖ポリヌクレオチドを製造する方法、および相補的な一本鎖ポリヌクレオチドから一本鎖ポリヌクレオチド切片を製造する方法などによって製造できる。一方向性のポリヌクレオチド切片はＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡから無作為性プライマー（Ｆｅｉｎｂｅｒｇ， Ａ． Ｐ． ａｎｄ Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ， Ｂ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １３２：６−１３（１９８３））から始めて逆転写酵素（Ｇｅｒａｒｄ， Ｇ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ８：６１−７７（１９９７））、バクテリオファージＴ４　ＤＮＡ重合酵素（Ｎｏｓｓａｌ， Ｎ． Ｇ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４９：５６６８−５６７６（１９７４））、バクテリオファージＴ７　ＤＮＡ重合酵素（Ｔａｂｏｒ， Ｓ． ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ， Ｃ． Ｃ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４：６４４７−６４５８（１９８９））、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）酵素（Ｋｌｅｎｏｗ， Ｈ． ａｎｄ Ｈｅｎｎｉｎｇｓｅｎ， Ｉ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ６５：１６８ （１９７０））を用いて製造できる。この際、無作為性プライマーの濃度を調節するか、反応混合物に適切な濃度のジデオキシヌクレオチド（２’，３’−ジデオキシアデノシン５’−トリホスフェート、２’，３’−ジデオキシグアノシン５’−トリホスフェート、２’，３’−ジデオキシシチジン５’−トリホスフェート、２’，３’−ジデオキシチミジン５’−トリホスフェート）を加えて無作為性プライマーから順次に長さが伸長された一本鎖ポリヌクレオチド切片を得ることにより、一本鎖ポリヌクレオチド切片のサイズを調節できる。順次に一つの方向が切断された一本鎖ポリヌクレオチド切片は一本鎖ポリヌクレオチドの５’末端から順次にヌクレオチドを切断できるエクソヌクレアーゼを用いて得られる。
【００３５】
より具体的に、一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片は次の方法のいずれか一つによって製造できる：
（ｉ）少なくとも一つの出発ポリヌクレオチドからＲＮＡを製造するために転写過程を行う段階、および（ｉｉ）無作為オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、前記（ｉ）段階のＲＮＡ転写物を鋳型として用いる逆転写反応（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を行う段階を含む方法；
（ｉ）出発二本鎖ポリヌクレオチドを少なくとも一つの制限酵素で切断して一方の末端に３’−突出構造（３’−ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生成する段階、（ｉｉ）（ｉ）段階の反応混合物をエクソヌクレアーゼ−ＩＩＩで処理し、一定の時間間隔で反応混合物の一部を取った後、エクソヌクレアーゼＩＩＩの活性を中止させることにより、一方向に順次に切断された二本鎖ポリヌクレオチドのプールを製造する段階、（ｉｉｉ）５’−突出構造を有する生成された二本鎖ポリヌクレオチドをＳ１ヌクレアーゼおよびＤＮＡ重合酵素で処理して平滑（ｂｌｕｎｔ）末端を形成する段階、（ｉｖ）（ｉ）段階で３’−突出構造を有する同一の末端に新たな３’−突出構造を生成させる段階、および（ｖ）前記（ｉｖ）段階のポリヌクレオチドをエクソヌクレアーゼＩＩＩで処理して一本鎖ポリヌクレオチドを製造する段階を含む方法；
（ｉ）出発二本鎖ポリヌクレオチドを少なくとも一つの制限酵素で切断して一方の末端に３’−突出構造を生成する段階、（ｉｉ）（ｉ）段階のポリヌクレオチドをエクソヌクレアーゼＩＩＩで処理して一本鎖ポリヌクレオチドを生成する段階、および（ｉｉｉ）無作為プライマーを用いて（ｉｉ）段階の一本鎖ポリヌクレオチドに対して重合反応を行う段階を含む方法；
（ｉ）出発二本鎖ポリヌクレオチドを少なくとも一つの制限酵素で切断して一方の末端に３’−突出構造を生成する段階、（ｉｉ）（ｉ）段階のポリヌクレオチドをエクソヌクレアーゼＩＩＩで処理して一本鎖ポリヌクレオチドを生成する段階、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）段階の一本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖特異的５’→３’エクソヌクレアーゼで処理し、一定の時間間隔で反応混合物の一部を取った後、エクソヌクレアーゼの活性を中止させることにより、一方の方向に順次に切断された一本鎖ポリヌクレオチドのプールを製造する段階を含む方法；
（ｉ）正方向（ｆｏｒｗａｒｄ）および逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーのうち一種のオリゴヌクレオチドのみを用いて出発二本鎖ポリヌクレオチドに対してポリメラーゼ連鎖反応を行う段階、（ｉｉ）生成した一本鎖ポリヌクレオチドを出発二本鎖ポリヌクレオチドから分離する段階、および（ｉｉｉ）無作為プライマーを用いて（ｉｉ）段階の一本鎖ポリヌクレオチドに対して重合反応を行う段階を含む方法；
（ｉ）正方向（ｆｏｒｗａｒｄ）および逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）プライマーのうち一種のオリゴヌクレオチドのみを用いて出発二本鎖ポリヌクレオチドに対してポリメラーゼ連鎖反応を行う段階、（ｉｉ）生成した一本鎖ポリヌクレオチドを出発二本鎖ポリヌクレオチドから分離する段階、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）段階の一本鎖ポリヌクレオチドを一本鎖特異的５’→３’エクソヌクレアーゼで処理し、一定の時間間隔で反応混合物の一部を取った後、エクソヌクレアーゼの活性を中止させる段階を含む方法；および
（ｉ）少なくとも一つの出発ポリヌクレオチド挿入体を有するウイルスベクターまたはプラスミドベクターから一本鎖ポリヌクレオチドを分離する段階、および（ｉｉ）無作為プライマーを用いて（ｉ）段階の一本鎖ポリヌクレオチドに対して重合反応を行う段階を含む方法。
【００３６】
第２段階：本発明の方法の二番目の段階は、（ｉ）プライマーが鋳型として用いられた一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片の端まで伸長される少なくとも一周期を行う段階；（ｉｉ）（ｉ）段階で生成された伸長されたポリヌクレオチドの各々が鋳型交換を通じて（ｉ）段階で用いられた一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片とは異なる一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片の端までさらに伸長される少なくとも一つの後続周期を行う段階；および（ｉｉｉ）目的とする長さの組換えポリヌクレオチドが得られるまで（ｉｉ）段階を繰り返す段階を含み得る。
【００３７】
具体的に、第１段階で製造された様々な長さの一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片をともに混合した後、これに前記一本鎖ポリヌクレオチド断片に相補的なヌクレオチド配列を有する特定のオリゴヌクレオチドを加えた後、適当な制御性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を維持しながら、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行う。そうすると、前記特定のオリゴヌクレオチドがポリメラーゼ連鎖反応のプライマーとして作用し、毎回の反応で一方向（５’→３’）に次第に伸長されることにより組換え反応が起こる。合成されたポリヌクレオチドは変性過程によって一本鎖に分離され、再接合（ｒｅ−ａｎｎｅａｌｉｎｇ）される。この際、合成されたポリヌクレオチドは相同性配列を含む他のポリヌクレオチド断片と接合できる。
【００３８】
より具体的に、二本鎖ポリヌクレオチドの混合物は熱によって変性でき、以降のポリメラーゼ連鎖反応は次の３段階からなる。まず、二本鎖鋳型ＤＮＡを９０℃〜９８℃で１０秒〜５分間処理して一本鎖に分離する（変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ））。その後、温度を下げることにより、事前に添加したプライマーが相補的な一本鎖鋳型ＤＮＡと接合する（接合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ））。この段階は、４０〜７２℃で１０秒〜２分間行う。その後、温度を７０℃〜７８℃範囲に調節すると、反応混合物のうち４種のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）が反応し始め、鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡが合成および伸長される。反応時間は合成されるＤＮＡの長さによって変化する。
【００３９】
このような方式で相同性ヌクレオチド配列を有する２つ以上のポリヌクレオチドから様々な組換えＤＮＡを生成する場合、一つの合成周期でポリヌクレオチドは少なくとも一つの出発ポリヌクレオチドとハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドプライマーから鋳型として用いられる一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片の５’末端まで伸長でき、生成したポリヌクレオチドは次の周期で鋳型交換によって他の出発ポリヌクレオチドから由来する他の一方向性の一本鎖ポリヌクレオチドの端までさらに伸長できる。この際、異なる出発ポリヌクレオチドから由来した一方向性の一本鎖ポリヌクレオチドを鋳型として用いて生成されたオリゴヌクレオチドの間に組換え境界が形成される。
【００４０】
ポリヌクレオチドの延長のための第２段階において、第１段階で製造された一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片は組換えＤＮＡを生成するための鋳型としてのみ用いられるので、最初に添加したプライマーは反復的なＰＣＲを通じてこれらを鋳型として用いて一方向（５’→３’）に長さが次第に伸長して組換えポリヌクレオチドを生成する。
【００４１】
第２段階において、ＤＮＡ組換えはＤＮＡ重合酵素の存在下で変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）、接合（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）および伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）段階を所望する期間の間周期的に繰り返すことにより行われる。組換えの程度は異なる出発ポリヌクレオチドから由来する一本鎖ポリヌクレオチド群間の相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）によって変化する。
【００４２】
第３段階：前記第２段階のＰＣＲ周期を十分に繰り返し、生成した突然変異組換えポリヌクレオチドを正常のＰＣＲ方法を通じて増幅させることにより組換え二本鎖ＤＮＡライブラリーを製造する。このように得られた組換えＤＮＡライブラリーは出発二本鎖ポリヌクレオチドのうちいずれか一つの相応する領域と比較して同一（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）領域および異質的（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｏｕｓ）領域を一分子内に含む様々な種類の突然変異二本鎖ポリヌクレオチドから構成される。組換えＤＮＡのヌクレオチド配列は通常の方法、たとえば、マクザム−クルバート法（Ｍａｘａｍ， Ａ． Ｍ． ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ， Ｗ．， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．（Ｍｏｓｋ） ２０：５８１−６３８ （１９８６））、ジデオキシ法（Ｍｅｓｓｉｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２４：３０９−３２１（１９８１））、またはＤＮＡ蛍光標識および自動化されたＤＮＡヌクレオチド配列分析機を用いた方法によって決定できる。
【００４３】
また、本発明では、前記方法で得られた組換えＤＮＡを用いて目的とする遺伝子を選別するための組換えＤＮＡライブラリーを製造する方法を提供する。具体的に、この方法は、第３段階で得られた突然変異組換え二本鎖ＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、生成した発現ベクターを発現細胞に導入して複数のクローンを含むライブラリーを得た後、これらのクローンから目的とするポリヌクレオチドをスクリーニングし、通常の方法によってポリヌクレオチドからタンパク質を発現させる段階を含む。適当な発現方法は、細胞内で遺伝子生成物を製造および蓄積すること；遺伝子生成物を細胞から分泌させ、これらを培地に蓄積させること；遺伝子生成物をペリプラズム内に分泌させることなどの方法を含む。組換えＤＮＡライブラリーから目的とする遺伝子産物をスクリーニングするために、当業界に公知の方法、たとえば、免疫化学法、放射線化学法、表面発現システムを用いた方法、および遺伝子チップスクリーニング方法を選択または組合せて利用できる。組換えＤＮＡライブラリーを製造するに当たり、選択された宿主細胞内で作用する任意の発現ベクターを使用できるが、例示的なベクターは当業界に公知の通常のベクターであるファージ（ｐｈａｇｅ）、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）、ファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）、ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）および人工染色体（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）などを含む。発現ベクターを構築する方法は当業界に公知であり、たとえば、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， （１９８９） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．）に開示されている。生成した発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換する。組換えＤＮＡを発現させるのに適当な宿主細胞は、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・ブレジス（Ｂ． ｂｒｅｖｉｓ）などのような細菌；ストレプトマイセスリビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）のような放線菌類；エス．セルビシエ（Ｓ． ｓｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような酵母；アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニダランス（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ）およびアスペルギルス・ニーガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）のようなカビ；ＣＯＳ−７、ＣＨＯ、ＶｅｒｏおよびマウスＬ細胞のような動物細胞；昆虫細胞；および植物細胞を含む。
【００４４】
本発明は短期間で様々な無作為突然変異組換えＤＮＡを製造する方法を提供する。具体的に、突然変異組換えポリヌクレオチドのライブラリーは、２つ以上の相同性核酸配列またはポリヌクレオチドから由来する一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片の混合物にオリゴヌクレオチドプライマーを添加し、反復的なＰＣＲを行って一本鎖ヌクレオチド切片のヌクレオチド配列の間に無作為的な組換えが発生した突然変異組換えポリヌクレオチドのライブラリーを得ることにより得られる。
【００４５】
本発明の方法によって製造された組換えＤＮＡは、たとえば、酵素、抗体、ワクチン（抗原）、ホルモン、成長因子、結合タンパク質および血漿タンパク質のようなタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。たとえば、前記組換えＤＮＡは酵素を暗号化してもよく、前記酵素は加水分解酵素（ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、分解酵素（ｌｙａｓｅ）、伝達酵素（ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、酸化還元酵素（ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、連結酵素（ｌｉｇａｓｅ）および異性化酵素（ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）からなる群から選ばれてもよい。本発明の好ましい一実施態様は、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）キチナーゼ遺伝子（配列番号：１；以下、「ｍ−ｃｈｉ」という）とセラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）キチナーゼ遺伝子（配列番号：２；以下、「ｌ−ｃｈｉ」という）の間に無作為的な突然変異を有する組換え遺伝子（組換えＤＮＡ）を製造し、この組換え遺伝子をクローニングすることにより組換えＤＮＡライブラリーを製造する方法を提供する。本発明の方法によって約１０，０００個のクローンを製造し、そのうち、１０個のクローンを無作為選別してこれらのヌクレオチド配列を決定した。これらのヌクレオチド配列を２つの野生型遺伝子と比較した結果、組換えクローン３、４および１０においては１回の組換え；組換えクローン１、２、７および８においては２回の組換え；組換えクローン６および９においては３回の組換え；そして、組換えクローン５においては４回の組換えが２つの遺伝子の間で起こったことを確認した。このような結果は、本発明の方法が２つ以上のポリヌクレオチドの間で無作為的な組換えを有する組換えＤＮＡライブラリーを製造するのに効果的であることを立証する。
【００４６】
本発明の組換えＤＮＡライブラリーの製造方法は広い応用可能性を有している。このようなインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）突然変異誘発方法は実験室で生化学的研究のための手段として使用してもよい。この方法は、生命の維持および調節に関与するタンパク質のメカニズムを分子水準で理解することを可能にするため、酵素、抗体、ワクチン（抗原）、ホルモン、結合タンパク質または血漿タンパク質のようなタンパク質を生産およびスクリーニングするための手段として用いられて気質特異性の変化、反応特異性の変化、活性の増進、抗原性の変化、タンパク質の安全性の変化などを誘導できる。したがって、この方法は、医薬の開発、食品の品質改善および増進、エネルギー転換率の改善、畜産および漁業における育種および品質改良、新たな化学製品の開発および生産などのために様々な産業分野に究極的に適用され得る（Ｃｈａｒｔｒａｉｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １１：２０９−２１４ （２０００）； Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２９７：１０１５−１０２６ （２０００）； Ｇｉｖｅｒ， Ｌ． ａｎｄ Ａｒｎｏｌｄ， Ｆ． Ｈ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ２：３３５−３３８ （１９９８）； Ｋｕｍａｍａｒｕ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １６：６６３−６６６ （１９９８）およびＰａｔｔｅｎ， Ｐ． Ａ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ８：７２４−７３３（１９９７））。
【００４７】
本発明は下記実施例によってさらに明確になる。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示すが、例示のためにのみ与えられていると理解されなければならない。前記論議および本実施例から、当分野の熟練家は本発明の必須的な特徴を確認でき、本発明を様々な用途および条件に適応させるためにその真意および範疇を外れないながら多様に変化および変更できる。
【００４８】
実施例１：一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片の製造
互いに類似した領域を有する一対の二本鎖ポリヌクレオチドから様々な長さを有する一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片のプール（ｐｏｏｌ）を次のように製造した。
【００４９】
１−１）逆転写反応による一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片の製造
本発明の一態様では、セラチア・マルセセンスおよびセラチア・リクファシエンスのキチナーゼをコードする遺伝子（以下、各々「ｍ−ｃｈｉ」および「ｌ−ｃｈｉ」という）を再組立のための出発ポリヌクレオチドとして選択し、これらのヌクレオチド配列を図２に示す。
【００５０】
ｍ−ｃｈｉおよびｌ−ｃｈｉ遺伝子を各々含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ切片をｐＵＣ１９にクローニングしてプラスミドｐＵＣ１９−ｍ−ｃｈｉおよびｐＵＣ１９−ｌ−ｃｈｉを製造した。このプラスミドをＮｄｅＩで切断し、クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）でギャップフィリング（ｇａｐ−ｆｉｌｌｉｎｇ）した後、ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。得られた約２ｋｂのＤＮＡ挿入体をｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＶ骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）に入れて５ｋｂ組換えプラスミドを得た。継いで、生成したプラスミドｐＢＳＫ−ｍ−ｃｈｉおよびｐＢＳＫ−ｌ−ｃｈｉをＳｐｅＩで線形化（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）した。
【００５１】
線形化されたプラスミド２００ｎｇを０．５ｍＭ各ｒＮＴＰ、４０単位のＲＮａｓｉｎおよび１７単位のＴ３　ＲＮＡ重合酵素が添加された転写緩衝溶液［４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．９）、６ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２ｍＭスペルミジン（ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ）、１０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＤＴＴ］に総体積が２０μｌになるように加え、３７℃で１時間反応させた。前記インビトロ転写（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）によって得られたｍ−ｃｈｉおよびｌ−ｃｈｉ遺伝子のＲＮＡ転写物を１％アガロースゲル上の電気泳動で分析した。図３（ａ）のレーン２および３から５ｋｂプラスミドおよびＲＮＡ転写物のバンドが検出された。これらをＲＮＡｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した後、２つのキチナーゼ遺伝子から転写された各ＲＮＡを２００ｎｇずつ混合した。ＲＮＡ混合物を６μｇの無作為ヘクサマー（ｒａｎｄｏｍ ｈｅｘａｍｅｒ； Ｇｅｎｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．）、０．２ｍＭ相当の各ｄＮＴＰ、４０単位のＲＮａｓｉｎおよび５０単位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素が添加された反応緩衝液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭ　ＫＣｌ、０．６ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　ＤＴＴ］と総体積が５０μｌになるように混合し、３７℃で１時間逆転写反応を行った。逆転写反応後、反応混合物を２０ｎｇのＲＮａｓｅ　Ｉとともに３７℃で１時間反応させてＲＮＡ鋳型を除去した。
【００５２】
無作為ヘクサマーは鋳型ＲＮＡといずれの位置でも偶然ハイブリダイズできるので、無作為ヘクサマーからのヌクレオチド伸長によって様々な長さの一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片が製造される。
【００５３】
逆転写生成物を１％アガロースゲルで電気泳動し（図３（ｂ）のレーン２）、一本鎖ＤＮＡ切片を切取ってジーンクリーンキット（Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ｋｉｔ， Ｂｉｏ １０１）で精製した。
【００５４】
１−２）順次に５’末端が切断された一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片の製造
この方法は、エクソヌクレアーゼＩＩＩ（Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ ＩＩＩ）の２つの有用な特性、すなわち、（ｉ）非常に均一な速度で順次に切断し、（ｉｉ）４−塩基の３’−突出末端を有するＤＮＡでは切断を開始できない特性（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｓ．， Ｇｅｎｅ， ２８， ３５１−３５９（１９８４））に基づいたものである。
【００５５】
ｍ−ｃｈｉ遺伝子を含むプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）３０μｇを一対の制限酵素ＳｐｈＩおよびＮｃｏＩで線形化させたが、ＳｐｈＩはエクソヌクレアーゼＩＩＩで切断されない４−塩基３’−突出末端を生成させる反面、ＮｃｏＩは４−塩基５’−突出末端を生成させる。ｌ−ｃｈｉ遺伝子に対して、前記手続を同様に行った。エクソヌクレアーゼＩＩＩ反応緩衝溶液［６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．６６ｍＭ　ＭｇＣｌ２］に総体積６０μｌになるように溶解した線形化されたポリヌクレオチドを２単位のエクソヌクレアーゼＩＩＩで切断した。２０秒間隔で２．５μｌずつ分取して酵素反応を停止させた。得られた分画を７．５μｌのＳ１核酸加水分解酵素（Ｓ１ ｎｕｃｌｅａｓｅ）混合物［Ｓ１核酸加水分解酵素反応緩衝液（３００ｎＭ酢酸カリウム、ｐＨ４．６、２．５Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＺｎＳＯ４、５０％グリセロール）および５０単位のＳ１核酸加水分解酵素］と混合した後室温で１５分間静置した。
【００５６】
Ｓ１停止溶液［３００ｍＭトリス塩基、５０ｍＭ　ＥＤＴＡ］でＳ１核酸加水分解酵素を失活させた後、クレノウを入れ、３７℃で３０分間重合反応を行った後、この産物をＳａｃＩで切断した。前記で生成された、順次に無作為的に欠失された二本鎖ＤＮＡ切片を１％アガロースゲル上で電気泳動によって分析した。ＤＮＡ切片をゲルから抽出し、２単位のエクソヌクレアーゼＩＩＩとともに１時間反応させて一方向に切断された一組の一本鎖ＤＮＡ切片を生産した。
【００５７】
１−３）一本鎖ＤＮＡを鋳型として用いた一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片の製造
ｍ−ｃｈｉおよびｌ−ｃｈｉ遺伝子各々を含むプラスミドｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）５μｇずつを一対の制限酵素ＳｐｈＩおよびＮｃｏＩで線形化させた。エクソヌクレアーゼＩＩＩ反応緩衝溶液［６６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．６６ｍＭ　ＭｇＣｌ２］に総６０μｌになるように溶解した線形化されたポリヌクレオチドを２単位のエクソヌクレアーゼＩＩＩで３７℃で３０分間切断した。
【００５８】
生成した線形化された一本鎖ポリヌクレオチドを鋳型として用いて重合反応混合物［１０単位のクレノウ、６μｇの無作為ヘクサマー、０．１ｍＭ各ｄＮＴＰ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、７．５ｍＭ　ＤＴＴ］中で３７℃で一本鎖ＤＮＡ切片を製造した。
【００５９】
生成した一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片を１％アガロースゲル上の電気泳動で分析した後、ジーンクリーンキット（Ｂｉｏ１０１）で精製した。
【００６０】
実施例２：一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片を鋳型として用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるポリヌクレオチドの再組立て
前記で得られた一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片をポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用いた。総体積５０μｌの反応混合物は２０ｎｇの一本鎖ＤＮＡ切片、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、２単位のベント（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡ重合酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ）および２５ｐｍｏｌｅのプライマーを含み、ここでプライマーはｍ−ｃｈｉおよびｌ−ｃｈｉ遺伝子の５’末端と同一なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド（配列番号：２４）であった。ポリメラーゼ連鎖反応は９４℃で３分；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒（３０周期）；および７２℃で５分の条件でＭＪリサーチ熱循環器（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ）を用いて行った。全長ＤＮＡを増幅させるために、２５ｐｍｏｌｅの３’−特異的オリゴヌクレオチド（配列番号：２５）をプライマーとして用いて前記ＰＣＲ産物に対して２次ＰＣＲを行った。ＰＣＲはＭＪリサーチ熱循環器（ＰＴＣ−１０１）上で９４℃で３分；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒（３０周期）；および７２℃で５分の条件で行った。生成した約１．７ｋｂのＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動によって分析した（レーン２、図３（ｃ））。
【００６１】
実施例３：配列分析およびスクリーニング
実施例２のＰＣＲ産物をジーンクリーンキット（Ｂｉｏ１０１）によってゲルから抽出した後、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで切断した後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳベクターのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ骨格に連結した。前記組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ８３菌株に形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンが補充されたＬＢ−アガープレート上で形質転換体を選別した。無作為に選別した１４個のコロニーからキアゲンスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ））によってプラスミドＤＮＡを分離し、制限　酵素ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｃＩＩで切断した。
【００６２】
図４は１％アガロースゲル上の通常の電気泳動によって分離した様々なサイズのＤＮＡを示す。同一な３つの制限酵素で切断されたｌ−ｃｈｉ遺伝子のＤＮＡ切片のバンドパターンがレーン５に示されており、ｍ−ｃｈｉ遺伝子のバンドパターンはレーン８および１３に示されている。残りのレーンはｍ−ｃｈｉおよびｌ−ｃｈｉ遺伝子から組換えられた無作為組換えＤＮＡのパターンを示し、このパターンは野生型ＤＮＡ切片のものとは異なる。このような結果は、無作為に選別した１４個のクローンのうち少なくとも１１個のクローンが一対の野生型ＤＮＡから再組立てられた組換えＤＮＡを含んでいることを意味する。
【００６３】
生成した組換えＤＮＡを同定するために、１０個のプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ断片を配列をＡＢＩ ＰＲＩＳＭ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析し、この配列を野生型ｍ−ｃｈｉおよびｌ−ｃｈｉ遺伝子の配列と比較し、整列して図５に示し、また、図６の模式図に示す。
【００６４】
図６に示すように、２つの野生型遺伝子の間の組換えが組換えＤＮＡクローン３、４および１０においては１回；クローン１、２、７および８においては２回；クローン６および９においては３回；そしてクローン５においては４回起こった。このような結果は、一方向性の一本鎖ポリヌクレオチドを用いる本発明の方法が２種以上の出発ポリヌクレオチドから無作為的な組換えＤＮＡライブラリーを効果的に製造できることを意味する。
【００６５】
野生型酵素より比活性度（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）がさらに高いキチナーゼをコードする組換えポリヌクレオチドをスクリーニングするために、コロニーをレプリカプレート法（ｒｅｐｌｉｃａ ｐｌａｔｉｎｇ）によって１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．５％膨潤されたキチン（ｓｗｏｌｌｅｎ ｃｈｉｔｉｎ）を含有するＬＢ−アガー培地に移し、透明なプラークが生じるまで３７℃で一晩培養した。約８００個余りのコロニーを透明度によってスクリーニングした。図７は、組換えキチナーゼを発現するコロニーによってこれらの異なるキチン分解活性によって形成された透明環（ｃｌｅａｒ ｚｏｎｅ）のサイズの変化を示す。野生型よりさらに大きい透明環を形成する一つのコロニーによって生産されたキチナーゼをＲ−２４キチナーゼと命名した。このクローンからキアプレップスピンミニプレップ法（Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｍｅｔｈｏｄ （Ｑｉａｇｅｎ））によってプラスミドＤＮＡを抽出し、Ｒ−２４キチナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を分析した。図８は、Ｒ−２４キチナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：１３）を２つの野生型遺伝子、すなわち、ｌ−ｃｈｉ遺伝子（配列番号：１）およびｍ−ｃｈｉ遺伝子（配列番号：２）の配列と比較したものである。図９は、Ｒ−２４キチナーゼ遺伝子の構成を２つの野生型遺伝子と比較して示した模式図である。図９から、Ｒ−２４キチナーゼの遺伝子は２つの野生型遺伝子の間に４回の組換えによって生産されたことが分かる。
【００６６】
表１は、Ｒ−２４キチナーゼの比活性度を２つの野生型キチナーゼの比活性度と比較した結果を示す。
【表１】
2004513633.tif 000003
【００６７】
表１から分かるように、Ｒ−２４キチナーゼの比活性度はセラチア・マルセセンスキチナーゼおよびセラチア・リクファシエンスキチナーゼより各々１．５倍および１．１倍高かった。
【００６８】
実施例４：熱安定性の増進のためのキトサナーゼの意図的進化
４−１）エラー誘発性ＰＣＲによるキトサナーゼ変異体の製造
ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＶ／ＳａｌＩ二重切断によって得られた約０．５ｋｂのＤＮＡ切片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫのＥｃｏＲＶ／ＳａｌＩ切断部位に挿入した。生成したベクター構造物をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで切断した後、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．（ＫＣＴＣ ０３７７ＢＰ））を同一な酵素で切断して得た約１．４ｋｂのキトサナーゼ遺伝子と連結してキトサナーゼ遺伝子を含む組換えベクター構造物ｐＢＳＫ−ｃｓｎ−３２２を製造した。
【００６９】
ｐＢＳＫ−ｃｓｎ−３２２をエラー誘発性ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマーとして用いた。各５０ｐｍｏｌｅのｃｓｎ−ＸｂａＩ（配列番号：２６）およびｃｓｎ−ｃ１（配列番号：２７）をプライマーとして用い、ポリメラーゼ連鎖反応は１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、４ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　ｄＡＴＰ、０．２ｍＭ　ｄＧＴＰ、１ｍＭ　ｄＣＴＰ、１ｍＭ　ｄＴＴＰ、０．１５ｍＭ　ＭｎＣｌ２、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡおよび５単位のＴａｑ重合酵素を含む１００μｌの反応液中でＭＪリサーチサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ−２００））を用いて行った。ＰＣＲ条件は次の通りである：９４℃で３分；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒（３０周期）；および７２℃で５分。
【００７０】
生成した約１．４ｋｂ　ＤＮＡ切片をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで切断した後、ｐＢＳＫ−ｃｓｎ−３２２のＸｂａＩ／ＥｃｏＲ１骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）に連結した。生成した組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ８３に形質転換し、これらを１００μｇ／ｍｌアンピシリンが補充されたＬＢ−アガープレート上で３７℃で１８時間培養することにより、陽性形質転換体を選別した。プレートに形成されたコロニーを新たなプレートにレプリカプレーティングによって移した後、３７℃で２０時間培養した。コロニーを含むペトリディッシュを７０℃の水浴で１５分間加熱した後、０．１％のキトサンと１％のアガロースを含む５０ｍＭ　Ｎａ−アセテート緩衝溶液をＬＢ−アガープレート上に注いだ。プレートを３７℃で２４時間静置した後、０．２％コンゴレッド（Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄ）染色試薬を用いてキトサナーゼ活性を依然として保有して透明プラークを生成するコロニーを選別した。前記過程の結果として、１２，０００個のクローンから改善された熱安定性を有する９個の陽性クローンを分離した。このクローンからキアプレップスピンミニプレップ法（Ｑｉａｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｍｅｔｈｏｄ（Ｑｉａｇｅｎ））によってプラスミドＤＮＡを抽出し、これに含まれたキトサナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を分析した。表２は、エラー誘発性ＰＣＲによって製造した熱安定性キトサナーゼ変異体のアミノ酸置換部位を野生型キトサナーゼと比較した結果を示す。
【００７１】
【表２】
2004513633.tif 000004
【００７２】
４−２）１次組換えＤＮＡライブラリーの生成およびスクリーニング
４−１）で選別された９個のキトサナーゼ変異体遺伝子を出発ポリヌクレオチドとして用いて本発明のＤＮＡ組換え方法を行った。
【００７３】
前記９個のクローンから抽出したプラスミドを５００ｎｇずつ混ぜた後、ＸｈｏＩで切断して約４．９ｋｂサイズの線形化されたＤＮＡ切片を得た。線形化された断片２００ｎｇを０．５ｍＭ各ｒＮＴＰ、４０単位のＲＮａｓｉｎおよび１７単位のＴ３　ＲＮＡ重合酵素を含む２０μｌの転写緩衝溶液［４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．８、６ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２ｍＭ　Ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、１０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＤＴＴ］中で３７℃で１時間転写させた。キトサナーゼ変異体遺伝子の生成したＲＮＡ転写物をＲＮＡｅａｓｙカラム（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。
【００７４】
２００ｎｇのＲＮＡに対して６μｇランダムヘクサマー、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、４０単位のＲＮａｓｉｎおよび５０単位のＭ−ＭＬＶ逆転写酵素を含む５０μｌの反応溶液［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、１５ｍＭ　ＫＣｌ、０．６ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ　ＤＴＴ］中で３７℃で１時間逆転写反応を行った。その後、ＲＮａｓｅ　Ｉによって３７℃で１時間鋳型ＲＮＡを除去した。前記逆転写反応を通じて、鋳型ＲＮＡと接合された無作為ヘクサマーから様々なサイズの一方向性の一本鎖ＤＮＡが合成された。生成した一本鎖ＤＮＡを１％アガロースゲル電気泳動によって分析し、ジーンクリーンキット（Ｂｉｏ１０１）を用いてゲルから抽出した。
【００７５】
前記で得られた一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片をポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用いた。総５０μｌの反応混合物は１０ｎｇの一本鎖ＤＮＡ切片、０．２ｍＭ各ｄＮＴＰ、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、２単位ベント（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡ重合酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．）および２５ｐｍｏｌｅのｃｓｎ−ＸｂａＩプライマー（配列番号：２６）を含んでいた。ＰＣＲは９４℃で３分；９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒（３０周期）；および７２℃で５分の条件でＭＪリサーチサーマルサイクラー（ＰＴＣ−１００）を用いて行った。その後、約１．４ｋｂサイズの全長ＤＮＡを２５ｐｍｏｌｅのｃｓｎ−ｃ１プライマー（配列番号：２７）を用いて前記と同一な条件でＰＣＲを行って増幅した。生成した１．４ｋｂ　ＤＮＡをＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで切断した後ｐＢＳＫ−ｃｓｎ−３２２のＸｂａＩ／ＥｃｏＲ１骨格に連結した。製造されたプラスミドを大腸菌ＪＭ８３菌株に形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが補充されたＬＢ−アガープレートで３７℃で２０時間培養して陽性形質転換体を選別した。成長したコロニーをレプリカプレーティング法によって新たなプレートに移した後、３７℃で２０時間培養した。このプレートを７５℃の水浴で２０分間加熱した後、０．１％のキトサンと１％のアガロースを含む５０ｍＭのＮａ−アセテート溶液をＬＢ−アガープレートに注いだ。３７℃で一晩培養した後、０．２％コンゴレッド上で熱処理したにもかかわらず、キトサナーゼ活性を維持して周辺に透明環を形成したコロニーを選別した。
【００７６】
前記のような過程を通じて、約１２，０００個のクローンからエラー誘発性ＰＣＲによって得られた８個のクローンに比べて耐熱性が改善された２３個のクローンを選別した。
【００７７】
４−３）２次組換えＤＮＡライブラリーの生成およびスクリーニング
１次組換えＤＮＡライブラリーの選別によって得られた２３個の突然変異キトサナーゼ遺伝子から４−２）に記述された方法と同様な方法を通じて２次組換えＤＮＡライブラリーを製作した。８０℃で３０分間熱処理した後、生成した１６，０００個余りのコロニーを出発物質である２３個のキトサナーゼ変異体より改善された熱安定性を有するキトサナーゼ変異体に対してスクリーニングした。２個の変異体を選別し、これらによってコードされるポリペプチドを各々Ｍ−１３およびＭ−２０と命名した。
【００７８】
４−４）Ｍ−１３およびＭ−２０のアミノ酸置換部位の決定および熱安定性分析
キトサナーゼ変異体Ｍ−１３およびＭ−２０を発現するコロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、キトサナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列を分析した。図１０は野生型キトサナーゼの配列とＭ−１３およびＭ−２０を各々コードする遺伝子の配列を比較して示したものである。また、野生型キトサナーゼと熱安定性Ｍ−１３およびＭ−２０変異体の類推されたアミノ酸配列を分析し、野生型キトサナーゼと異なるアミノ酸を有する変異体キトサナーゼのアミノ酸置換部位を表３に示す。
【００７９】
【表３】
2004513633.tif 000005
【００８０】
表３から分かるように、表２に示すようなエラー誘発性ＰＣＲによって製造された変異体に存在する置換部位と比較すると、Ｍ−１３キトサナーゼには７つの突然変異体に存在する置換部位、すなわち、Ｅ１０７Ｄ、Ｑ１５９Ｒ、Ｄ３０５Ｇ、Ｅ３０８Ｇ、Ｎ３６８Ｄ、Ｓ３７６ＰおよびＩ３８９Ｍが組換えを通じて蓄積され；Ｍ−２０キトサナーゼには６個の突然変異体に存在する置換部位、すなわち、Ｓ２４Ｐ、Ｅ１０７Ｄ、Ｑ１５９Ｒ、Ｄ３０５Ｇ、Ｅ３０８ＧおよびＮ３６８Ｄが組換えを通じて蓄積されたことが確認された。このような結果は、本発明の方法が組換えポリヌクレオチドの効率的な製造のために有用であることを立証する。一方、出発突然変異体の間の組換えから始まった置換部位の以外に、本発明の方法の過程中に各々４個と３個の新たな変異部位がＭ−１３およびＭ−２０キトサナーゼ変異体に導入されたことが分かる。
【００８１】
キトサナーゼ変異体の熱安定性を確認するために、野生型キトサナーゼ、Ｍ−１３変異体およびＭ−２０変異体を６０℃で処理した後、時間による残存活性を測定した。図１１は、野生型キトサナーゼ、Ｍ−１３変異体およびＭ−２０変異体の熱安定性の差異を示す。図１１において、酵素の活性が最初活性の５０％に減少する期間を意味する半減期（Ｔ１／２）は野生型が５．１分、Ｍ−１３突然変異体が６．９時間、Ｍ−２０突然変異体が１１．６時間である。この結果は、Ｍ−１３とＭ−２０突然変異体の６０℃における熱安定性が野生型キトサナーゼに比べて各々約８１倍と１３６倍増加したことを示す。
【００８２】
前記の記載および実施例から分かるように、本発明の方法は相同的ポリヌクレオチドのインビトロ組換えおよび目的特性のためのタンパク質の意図的な分子的進化のために使用できる。また、本発明の方法は、通常の方法に比べてポリヌクレオチドの無作為的な多様性が短期間で達成できるという利点がある。
【００８３】
本発明を具体的な実施態様と関連させて記述したが、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形および変化させ得ると理解されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、一方向性の一本鎖ポリヌクレオチド切片をポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として用いる本発明の組換えＤＮＡライブラリーの製造方法を説明する模式図である。
【図２】図２は、セラチア・リクファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のキチナーゼ遺伝子（ｌ−ｃｈｉ）（配列番号：１）とセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）のキチナーゼ遺伝子（ｍ−ｃｈｉ）（配列番号：２）のヌクレオチド配列を互いに比較したものである。２つの遺伝子の対応塩基のうち異なるものは小文字で表わした。
【図３】図３は、１％アガロースゲル電気泳動結果であって、（ａ）のレーン１は、標準ＤＮＡサイズマーカー（上から２３、９．４、６．６、４．４、２．３、２．０および０．５６ｋｂ）、（ａ）のレーン２はセラチア・マルセセンスのキチナーゼ遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物、（ａ）のレーン３はセラチア・リクファシエンスのキチナーゼ遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物；（ｂ）のレーン１は、標準ＤＮＡサイズマーカー（上から２３、９．４、６．６、４．４、２．３、２．０および０．５６ｋｂ）、（ｂ）のレーン２は逆転写反応を通じて製作された一本鎖ＤＮＡ切片；（ｃ）のレーン１は標準ＤＮＡサイズマーカー（上から２３、９．４、６．６、４．４、２．３、２．０および０．５６ｋｂ）、（ｃ）のレーン２は一方向性の一本鎖ＤＮＡ切片を鋳型として用いたＰＣＲ産物である。
【図４】図４は、本発明の方法によって製造された組換えＤＮＡライブラリーから無作為的に選択された１４個のクローンからプラスミドＤＮＡを抽出し、このプラスミドＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｃＩＩで分解して得られた分解産物の１％アガロースゲル電気泳動の結果である。レーン１は標準ＤＮＡサイズマーカーであり、レーン２〜１５は無作為的に選択した１４個のクローンからのプラスミドＤＮＡの制限酵素分解産物である。
【図５】図５は、本発明の方法によって製造された組換えＤＮＡライブラリーから無作為的に選択された１０個の組換えＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３〜１２）を２つの野生型遺伝子、すなわち、ｌ−ｃｈｉ遺伝子（配列番号：１）およびｍ−ｃｈｉ遺伝子（配列番号：２）の塩基配列と比較したものである。
【図６】図６は、図５の突然変異組換えＤＮＡの構成を２つの野生型遺伝子と比較して示す模式図である。
【図７】図７は、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび０．５％膨潤されたキチン（ｓｗｏｌｌｅｎ ｃｈｉｔｉｎ）を含有するＬＢ−アガー（ａｇａｒ）培地上で組換えキチナーゼ組換え遺伝子を発現するコロニーによって製作されたキチン分解能の差異による透明環（ｃｌｅａｒ ｚｏｎｅ）のサイズの差異を示す。
【図８】図８は、Ｒ−２４キチナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：１３）を２つの野生型遺伝子、すなわち、ｌ−ｃｈｉ遺伝子（配列番号：１）およびｍ−ｃｈｉ遺伝子（配列番号：２）のヌクレオチド配列と比較したものである。
【図９】図９は、Ｒ−２４キチナーゼ遺伝子の構成を２つの野生型遺伝子と比較して示す模式図である。
【図１０】図１０は、Ｍ−１３変異体（配列番号：１５）およびＭ−２０変異体（配列番号：１６）のヌクレオチド配列を野生型キトサナーゼ遺伝子の塩基配列（配列番号：１４）と比較したものである。
【図１１】図１１は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＣＴＣ　０３７７ＢＰから由来する野生型キトサナーゼ、変異体Ｍ−１３および変異体Ｍ−２０の熱安定性の差異を示す。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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