(57)【要約】細菌リポサッカリドに複合体化された細菌外膜タンパク質プロテオソームから構成されるアジュバント複合体が、種々の条件下で成分部分を含むように調製される。この複合体は、抗原性材料とともに処方されて、免疫原性組成物、ワクチンおよび免疫治療剤を形成しうる。誘導された免疫応答は、種々のプロトコルについて示される防御抗体および／または１型サイトカインを含む。本発明（ＩＶＸ−９０８）は、抗原に対するアジュバントであり、かつ本発明と抗原とが単純に合わされた場合にアジュバントワクチンまたは免疫治療剤を生じる新規処方物の組成物およびそのような新規処方物の産生のためのプロセスを記載し、そのアジュバントワクチンまたは免疫治療剤は、非経口経路または粘膜経路によって送達される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のグラム陰性細菌から調製された外膜タンパク質プロテオソーム調製物および第２のグラム陰性細菌由来のリポサッカリド調製物を含むアジュバント組成物であって、該外膜タンパク質プロテオソームおよびリポサッカリド調製物は、安定な非共有結合アジュバント複合体を形成し、総プロテオソームタンパク質の重量％としての最終リポサッカリド含有量は、少なくとも約１３％である、アジュバント組成物。
【請求項２】
請求項１に記載のアジュバント組成物であって、前記第１および第２のグラム陰性細菌が同じである、アジュバント組成物。
【請求項３】
請求項１に記載のアジュバント組成物であって、前記第１および第２のグラム陰性細菌が異なる、アジュバント組成物。
【請求項４】
請求項１に記載のアジュバント組成物であって、前記第１のグラム陰性細菌がＮｅｉｓｓｅｒｉａ属から選択される、アジュバント組成物。
【請求項５】
請求項４に記載のアジュバント組成物であって、前記Ｎｅｉｓｓｅｒｉａが、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓである、アジュバント組成物。
【請求項６】
請求項１に記載のアジュバント組成物であって、前記第２のグラム陰性細菌が、以下の属：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａから選択される、アジュバント組成物。
【請求項７】
請求項６に記載のアジュバント組成物であって、前記第２のグラム陰性細菌が、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｐ．ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ、またはＳ．ｅｓｓｅｎｓから選択される、アジュバント組成物。
【請求項８】
請求項１に記載のアジュバント組成物であって、前記総プロテオソームタンパク質の重量％としての最終リポサッカリド含有量が、１５％〜３００％である、アジュバント組成物。
【請求項９】
請求項１に記載のアジュバント組成物であって、前記総プロテオソームタンパク質の重量％としての最終リポサッカリド含有量が、２０％〜２００％である、アジュバント組成物。
【請求項１０】
請求項１に記載のアジュバント組成物であって、前記総プロテオソームタンパク質の重量％としての最終リポサッカリド含有量が、３０％〜１５０％である、アジュバント組成物。
【請求項１１】
請求項１に記載のアジュバント組成物であって、前記プロテオソーム調製物が、総タンパク質の約０．５％〜約５％のリポサッカリド含有量を有する、アジュバント組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載のアジュバント組成物であって、前記プロテオソーム調製物が、総タンパク質の約１２％〜約２５％のリポサッカリド含有量を有する、アジュバント組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載のアジュバント組成物であって、前記プロテオソーム調製物が、総タンパク質の約１５％〜約２０％のリポサッカリド含有量を有する、アジュバント組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載のアジュバント組成物であって、前記第１のグラム陰性細菌がＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓであり、前記第２のグラム陰性細菌がＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉであり、最終リポサッカリド含有量が５０％〜１５０％である、アジュバント組成物。
【請求項１５】
請求項１に記載のアジュバント組成物であって、前記第１のグラム陰性細菌がＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓであり、前記第２のグラム陰性細菌がＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓであり、最終リポサッカリド含有量が５０％〜１５０％である、アジュバント組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアジュバント複合体および抗原を含む免疫原性組成物。
【請求項１７】
請求項１６に記載の免疫原性組成物であって、前記抗原は、ペプチド、タンパク質、トキソイド、糖タンパク質、糖脂質、脂質、糖質、および／またはポリサッカリドから選択される、免疫原性組成物。
【請求項１８】
請求項１６に記載の免疫原性組成物であって、前記抗原が、動物界または植物界の生物または感染生物由来であるか、アレルゲンであるか、または化学的に改変されたアレルゲンもしくは生物学的に改変されたアレルゲンであるか、または化学物質である、免疫原性組成物。
【請求項１９】
請求項１６に記載の免疫原性組成物であって、前記抗原が、弱毒化されたおよび／または不活化された、ウイルス、細菌または寄生生物を含む完全な微生物または破壊された微生物である、免疫原性組成物。
【請求項２０】
請求項１６に記載の免疫原性組成物であって、前記抗原が、合成手順または組換え分子手順により生成される、免疫原性組成物。
【請求項２１】
請求項１６に記載の免疫原性組成物であって、前記抗原が、Ｂｅｔ  ｖ  １ａである、免疫原性組成物。
【請求項２２】
請求項１６に記載の免疫原性組成物であって、前記抗原が、ｒＢｅｔ  ｖ  １ａである、免疫原性組成物。
【請求項２３】
請求項１６に記載の免疫原性組成物であって、前記抗原が、組換えインフルエンザ抗原である、免疫原性組成物。
【請求項２４】
請求項１６に記載の免疫原性組成物であって、前記抗原が、インフルエンザスプリット抗原である、免疫原性組成物。
【請求項２５】
請求項１６に記載の免疫原性組成物であって、前記抗原が、カバノキ花粉抽出物である、免疫原性組成物。
【請求項２６】
請求項１６に記載の免疫原性組成物であって、前記抗原が、免疫原抽出物である、免疫原性抽出組成物。
【請求項２７】
請求項１６に記載の免疫原性組成物であって、該組成物が、特定の免疫治療剤、アジュバント混合予防ワクチンまたは治療ワクチンである、免疫原性組成物。
【請求項２８】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、第１のグラム陰性細菌から調製された外膜タンパク質プロテオソームと第２のグラム陰性細菌由来のリポサッカリド調製物とを混合して、該成分の複合体化をもたらして、該アジュバント組成物を形成する工程を包含する、プロセス。
【請求項２９】
請求項２８に記載のプロセスであって、前記プロテオソーム調製物および前記リポサッカリド調製物が界面活性剤溶液中で混合される、プロセス。
【請求項３０】
請求項２９に記載のプロセスであって、前記界面活性剤溶液が、Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢ、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｍｅｇａ−１０である、プロセス。
【請求項３１】
請求項２９に記載のプロセスであって、透析法、ダイアフィルトレーション法、もしくは限外濾過法またはこれらの組み合わせにより界面活性剤を除去する工程をさらに包含する、プロセス。
【請求項３２】
請求項２９に記載のプロセスであって、前記除去工程が、ダイアフィルトレーション法、限外濾過法またはこれらの組み合わせを包含する、プロセス。
【請求項３３】
請求項２８に記載のプロセスであって、前記混合工程が、両調製物の共沈降および／または凍結乾燥を包含する、プロセス。
【請求項３４】
免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、該プロセスは、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアジュバント複合体と抗原とを混合して、該組成物を形成する工程を包含する、プロセス。
【請求項３５】
請求項３４に記載のプロセスであって、前記抗原が、ペプチド、タンパク質、トキソイド、糖タンパク質、糖脂質、脂質、糖質、および／またはポリサッカリドから選択される、プロセス。
【請求項３６】
請求項３４に記載のプロセスであって、前記抗原が、動物界または植物界の生物または感染生物由来であるか、アレルゲンであるか、または化学的に改変されたアレルゲンもしくは生物学的に改変されたアレルゲンであるか、または化学物質である、プロセス。
【請求項３７】
請求項３４に記載のプロセスであって、前記抗原が、弱毒化されたおよび／または不活化された、ウイルス、細菌または寄生生物を含む完全な微生物または破壊された微生物である、プロセス。
【請求項３８】
請求項３４に記載のプロセスであって、前記抗原が、合成手順または組換え分子手順により生成される、プロセス。
【請求項３９】
請求項３４に記載のプロセスであって、前記抗原が、Ｂｅｔ  ｖ  １ａである、免疫原性組成物。
【請求項４０】
請求項３４に記載の免疫原性組成物であって、前記抗原が、ｒＢｅｔ  ｖ  １ａである、プロセス。
【請求項４１】
請求項３４に記載の免疫原性組成物であって、前記抗原が、組換えインフルエンザ抗原である、プロセス。
【請求項４２】
請求項３４に記載のプロセスであって、前記抗原が、インフルエンザスプリット抗原である、プロセス。
【請求項４３】
請求項３４に記載の免疫原性組成物であって、前記抗原が、カバノキ花粉抽出物である、プロセス。
【請求項４４】
請求項３４に記載のプロセスであって、前記抗原が、免疫原抽出物である、プロセス。
【請求項４５】
免疫応答を誘導するためのプロセスであって、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の組成物を被験体に投与する工程を包含する、プロセス。
【請求項４６】
請求項４５に記載のプロセスであって、前記組成物が、粘膜経路、経腸的経路、非経口経路、経皮経路／経粘膜経路、および吸入からなる群より選択される経路により投与されて、抗原に対する血清または粘膜抗体または１型細胞性免疫応答を誘導する、プロセス。
【請求項４７】
請求項４６に記載のプロセスであって、前記粘膜経路が、鼻粘膜、口腔咽頭粘膜、眼の粘膜または尿生殖器粘膜を介する経路である、プロセス。
【請求項４８】
請求項４６に記載のプロセスであって、前記経腸的経路が、経口経路、直腸経路または舌下経路である、プロセス。
【請求項４９】
請求項４６に記載のプロセスであって、前記非経口経路が、動脈内注射または注入、皮内注射または注入、筋肉内注射または注入、腹腔内注射または注入、静脈内注射または注入、皮下注射または注入、および粘膜下注射または注入のいずれか１つである、プロセス。
【請求項５０】
請求項４６に記載のプロセスであって、前記経皮／経粘膜経路が、局所的経路である、プロセス。
【請求項５１】
請求項４６に記載のプロセスであって、前記吸入経路が、鼻腔内経路、口腔咽頭経路、気道内経路、肺内経路または経肺経路である、プロセス。
【請求項５２】
請求項４５に記載のプロセスであって、前記投与される量が、免疫応答を増強する、プロセス。
【請求項５３】
請求項４５に記載のプロセスであって、前記増強される免疫応答が、ａ）機能的アッセイにおいて測定される血清ＩｇＧ抗体または血清抗体；ｂ）気道、胃腸管、または尿生殖器管から回収される粘膜分泌物中のＩｇＡを含む粘膜抗体；およびｃ）細胞アッセイまたは抗体アッセイまたはＩＦＮ−γのような１型サイトカインアッセイにより測定される、より高いまたは優性な２型応答から混合した、均衡のとれた、増加した、または優性な１型応答へのシフトを含む細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）の、維持された、減少した、または存在しないＩＬ−５のような２型サイトカインとの相関の１以上を含む、プロセス。
【請求項５４】
請求項４５に記載のプロセスであって、投与が、一連の投与工程を包含する、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、免疫原性の増強のため、および抗原に対する免疫応答の改善のためのアジュバント、ならびにそれらを調製および使用するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
宿主において防御免疫応答を誘導するための抗原の能力は、その抗原を免疫刺激剤またはアジュバントと合わせることによって増強され得る。ミョウバンベースのアジュバントは、認可された注射可能なヒトワクチンのためにほぼ排他的に使用され、ミョウバンは、特定の型の血清抗体応答（２型）を増強するが、他の型の抗体応答（１型）の増強は弱く、そして細胞内病原に対する防御のためならびに癌およびアレルギーに対する治療ワクチンのために重要である細胞性免疫応答の弱い活性化因子である。さらに、ミョウバンは、ＩｇＥの防御に起因して、アレルギー反応を増強する。多数の物質が、動物モデルにおいて試験され、そして抗体および細胞性（１型）免疫応答に対する潜在的なアジュバントであることが示されているが、そのほとんどが、容認できないレベルの反応生成性（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）および／または期待外れの免疫増強能に起因して、ヒトでの使用に対して適切でないことが証明されている。さらに、現在、多数の感染性因子が宿主に進入する粘膜表面において免疫応答を増強し得る認可されたアジュバントは、存在しない。実際、ほとんどの有望な鼻腔送達される粘膜アジュバント（細菌性エンテロトキシン（例えば、変異コレラ毒素および熱不安定性毒素））の開発は、げっ歯類のＣＮＳの嗅球領域に輸送され、そしてその嗅球領域において炎症を引き起こすその能力が原因で、北アメリカで中止されている。ヒトにおいて安全であり、かつ防御的な全身性免疫応答および粘膜体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘導し得る潜在的なアジュバントの必要性がある。
【０００３】
グラム陰性細菌由来のリポポリサッカリド（ＬＰＳ）は、潜在的なアジュバントである。ＬＰＳは、炎症性サイトカイン（例えば、マクロファージおよび樹状細胞からのＩＬ−１、ＴＮＦ−  、ＩＬ−１０およびＩＬ−１２；内皮細胞由来のＩＬ−１、ＩＬ−６およびＩＬ−８ならびに上皮細胞由来のＩＬ−８）の産生を引き起こす生得免疫系を活性化する。さらに、ＬＰＳは、Ｂ細胞有糸分裂誘発性およびポリクローナル抗体分泌の刺激によって証明されるように、マウスおよびある範囲でヒトにおいてＢ細胞活性化因子である。ＬＰＳは、ＣＤ１４分子への結合および抗原提示細胞の表面上のｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）の活性化によってその効果を媒介し、炎症誘発性分子の転写カスケード、遺伝子発現および分泌を開始する。
【０００４】
ＬＰＳのアジュバントの潜在性にもかかわらず、ヒトにおけるその使用は、その分子の脂質Ａ部分によって媒介される関連内毒性が原因で、制限されている。ＬＰＳの脂質Ａ領域の化学改変が、特定のアジュバント特性を維持しながら、脂質Ａを実質的に解毒することが示されている（例えば、モノホスホリル脂質ＡもしくはＭＰＬ−Ａ、または例えば、特定の脂肪酸を除去するためのアルカリ解毒）（Ｑｕｒｅｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９８２；２５７：１１８０８−１５を参照のこと）。ＭＰＬ−Ａは、動物において潜在的なアジュバント活性を示すが、ヒトにおける経験では相反し、いくつかの抗原との弱いアジュバント活性、および多くの状況における容認できない全体的な反応生成性を示す。
【０００５】
非共有結合性のプロテオソーム−ＬＰＳ複合体（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のプロテオソームおよびＳｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉまたはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ由来の精製されたＬＰＳを含む）が、単独型ワクチンの状況で、フェーズ１臨床試験およびフェーズ２臨床試験においてヒトに鼻腔内投与または経口投与された。これらのワクチンは、鼻腔内経路を介して提供された場合、それぞれ、動物（Ｍａｌｌｅｔら、Ｉｎｆｅｃｔ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎ  １９９５；６３：２３８２−８６）およびヒト（Ｆｒｉｅｓら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００１；６９：４５４５−５３）において、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ感染またはＳ．ｓｏｎｎｅｉ感染に対して防御免疫応答を誘導する。さらに、これらの複合体は、非常に高い用量においてヒトに鼻腔経路または経口経路を介して十分に寛容され（匹敵する量のＬＰＳと共に１．５ｍｇまでのプロテオソームを鼻腔内で提供、およびプロテオソームおよびＬＰＳ成分の各々２ｍｇを経口で提供）（Ｆｒｉｅｓら、２０００）、そして小動物毒性研究において、嗅球毒性または他のＣＮＳ関連毒性は示されなかった。プロテオソームは、主に、ポーリン（ｐｏｒｉｎ）タンパク質および他の外膜タンパク質からなる。ポーリンプロテオソームもまた、樹状細胞からＩＬ−１２を誘導し得ること、ならびに、ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導（Ｊｅａｎｎｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０００；１：５０２−５０９）およびＩＬ−８を生成するＨｅｌａ細胞の活性化（Ｐｒｉｄｍｏｒｅら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ  ２０００；１０：１８３）の証拠が示されている。プロテオソームポーリンはまた、ｔｏｌｌ様レセプター２の活性化を介して、抗原提示細胞上でＢ７．２（ＣＤ２８）同時刺激分子をアップレギュレートする（Ｍａｓｓａｒｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２，１６８：１５３３−１５３７）。
【０００６】
Ｄａｌｓｅｇら（Ｖａｃｃｉｎｅｓ、９６、ｐｐ．１７７−１８２（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６））は、不活性化されたインフルエンザウイルス全体に対する粘膜アジュバントとして、髄膜炎菌外膜小胞（ＯＭＶ）の使用を報告している。Ｄａｌｓｅｇおよび彼の同僚および共同研究者らは、彼らが調製したＯＭＶは、総ＯＭＶタンパク質の量（重量）と比較して、６％〜９％の内因性リポオリゴサッカリド（ＬＯＳ）残存を保持するプロセスを使用したことを報告した。これらのＯＭＶ調製物はまた、そのＯＭＶ中に１６％の界面活性剤（デオキシコレート）（この量は、毒性研究またはヒトにおいて身体に悪いかまたは毒性であり得る量である）を特異的に保持することを報告している。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の簡単な説明）
本発明（ＩＶＸ−９０８）は、抗原に対するアジュバントであり、かつ本発明と抗原とが単純に合わされた場合にアジュバントワクチンまたは免疫治療剤を生じる新規処方物の組成物およびそのような新規処方物の産生のためのプロセスを記載し、そのアジュバントワクチンまたは免疫治療剤は、非経口経路または粘膜経路によって送達される。このアジュバントは、２つの主要な成分からなる。第１の成分は、グラム陰性細菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓが挙げられるが、これに限定されない）から調製したプロテオソームの外膜タンパク質調製物である。第２の成分は、リポサッカリドの調製物である。リポサッカリドとしては、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉまたはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓまたは他のグラム陰性細菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種、またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が挙げられるが、これらに限定されない）由来の、ネイティブリポポリサッカリド（ＬＰＳ）もしくは改変リポポリサッカリド、およびネイティブリポオリゴサッカリドもしくは改変リポオリゴサッカリドが挙げられる。これら２つの成分は、成分間の相互作用を最適化して、互いの成分の安定な非共有結合複合体を生じるように、記載されるプロセスによって特定の初期比率で処方され得る。このプロセスは、一般的に、選択された界面活性剤溶液（例えば、Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および／またはＭｅｇａ−１０）中でこれらの成分を混合すること、次いで、透析によって（好ましくは、ダイアフィルトレーション方法論／限外濾過方法論によって）界面活性剤を除去しながら、これらの成分を複合体化することを含む。これら２つの成分の混合、共沈および／または凍結乾燥もまた使用して、適切な複合体化または会合を実施し得る。
【０００８】
このプロセスの最終結果は、抗原と共に投与された場合に、粘膜経路（例えば、鼻腔、経口、口腔咽頭、目、膣を含む生殖粘膜、舌下、肺内、気管内、または直腸）、または非経口経路（例えば、筋内、皮下、静脈内、腹腔内、粘膜下、皮内）または経皮経路、局所経路または経粘膜経路によって送達されて、同じ経路によって単独で提供された抗原と比較して、その抗原に対する増強したレベルの血清抗体および／または粘膜抗体および／またはＩ型細胞性免疫応答を誘導し得る、アジュバントワクチンまたは免疫治療剤を形成するアジュバンドの生成である。以下の実施例において、プロテオソーム−ＬＰＳ（ＳｈｉｇｅｌｌａまたはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａのいずれか由来のＬＰＳを使用）ならびに一価または多価スプリット（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ  ｓｐｌｉｔ）または精製組換えのインフルエンザ抗原を含み、液体もしくはスプレーによって、またはアジュバントインフルエンザワクチンとしての注射によって送達される混合物は、特定の抗インフルエンザ免疫応答を誘導し、この特定の抗インフルエンザ免疫応答としては、例えば、以下のうちの１つ以上の応答が挙げられる：ａ）血清ＩｇＧ抗体、または赤血球凝集抑制（ＨＡＩ）抗体を含む（これに限定されない）機能アッセイにおいて測定される血清抗体；ＨＡＩ応答は、その誘導がヒトにおいてインフルエンザに対する防御と相関することが知られているので、重要であることに注意される；ｂ）呼吸管、胃腸管または尿生殖路（鼻咽頭、肺、および膣が挙げられるが、これらに限定されない）から回収される粘膜分泌物中の、ＩｇＡを含む粘膜抗体、ならびにｃ）細胞媒介性免疫（ＣＭＩ）の相関性（特定の２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−５であって、そのレベルは、例えば、維持されるか、減少されるかまたは無くなり得る）の誘導における匹敵する増大を伴なわない、ＩＦＮ−γのようなサイトカインの産生によって測定されるような、混合１型応答、均衡のとれた１型応答、増大した１型応答または優勢的な１型応答を生じる、より高い２型応答または優勢的な２型応答のスイッチまたは減少を含む）。このような１型応答は、他のＣＭＩ関連応答の誘導に対して予測的である（例えば、Ｔｈ１免疫を示す細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の発生）。鼻腔または筋内で提供されたアジュバントの、抗原に対してこのような３つの型の応答を誘発する能力は、そのワクチンが、感染性疾患に対して免疫を提供し得ることを示す。なぜなら、機能的血清抗体（ＨＡＩ抗体を含む）およびウイルス特異的肺抗体が生成されるからである。さらに、本発明のアジュバントを用いて粘膜投与されるアジュバントワクチンに対する膣ＩｇＡの誘導は、免疫部位（例えば、胃腸管または尿生殖路）から遠位の粘膜感染またはアレルギーに対する利用を支持する。さらに、１型応答の誘導は、残留または細胞内のウイルス、寄生虫または特定の細菌病原体の排除を補助する。さらに、抗原に対して１型免疫応答を産生するアジュバントの能力は、例えば、ＣＴＬおよびＴｈ１サイトカイン応答が重要である癌、自己免疫疾患およびアレルギーに対する有効な治療ワクチンの産生に有益である。
【０００９】
例えば、アレルギー性鼻炎は、しばしば、免疫治療（その個体がアレルギー性である物質の用量を増大しながらの一連の注射）によって効果的に制御され得る。アレルギー性鼻炎は、古典的免疫治療を受けている個体の約５０％が治癒し得る。好首尾な免疫治療は、以下のうちの１つ以上と関連する：２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−５およびＩＬ−４）の産生を生じるＴ細胞応答からの、１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）の産生を生じる応答へのスイッチ、ならびに／またはその抗原に対して特異的なＩｇＧの増加および／もしくはＩｇＥの減少。しかし、これらの結果を達成するためには、３年までの反復した免疫が必要とされる。１型免疫応答を促進するアジュバントと組合わせたアレルゲンの使用は、そのような免疫治療の有効性を増強し得、そして必要とされる免疫の回数を減少させ得る。
【００１０】
以下の実施例において、本発明者らは、カバノキ花粉またはカバノキ花粉抽出物の主要なアレルゲンに相当する組換えタンパク質としてのｒＢｅｔ  ｖ  １ａと組合わせたＩＶＸ−９０８を用いて、鼻腔免疫したマウスにおける研究の結果を示す。組換えタンパク質およびアレルゲン抽出物の両方についての結果が、ＩＶＸ−９０８は、Ｂｅｔ  ｖ  １ａに対するＴ細胞サイトカイン産生を２型から優勢的に１型表現型に変換するということを実証する。さらに、１型応答は、アレルゲン単独と比較したアレルゲン特異的血清ＩｇＧの増大した産生、ならびにリン酸アルミニウム、デポー、およびアレルゲンに対するアレルギー応答に対してマウスを感作することが公知の２型アジュバントで投与したアレルゲンと比較したＢｅｔ  ｖ  １ａ特異的血清ＩｇＥの減少と関連する。重要なことに、１型サイトカイン（ＩＦＮγ）の増加はまた、ＩＶＸ−９０８と共に同じアレルゲンを用いてアレルギー性マウスを免疫した後に、観察された。マウスのアレルギーの前状態は、アレルギー性のヒトの状況を模倣し、このことは、ＩＶＸ−９０８／アレルゲン処方物が、治療的アレルギー性ワクチンの候補であり得ることを示唆する。
【００１１】
本発明は、感染性生物であり得るか、あるいは単細胞生物または多細胞生物から獲得されたアレルギー源の抽出物または精製もしくは化学修飾された抽出物であり得るか、あるいは化学物質であり得る動物界または植物界の生物（例えば、寄生生物、ウイルス、および細菌）から単離された、単一抗原、一価抗原、または多成分抗原（例えば、ペプチド、タンパク質、トキソイド、糖タンパク質、糖脂質、糖質、および／または多糖）を含むワクチンを容易に増強し得ることに注意されたい。弱毒または不活性化されたウイルス、細菌、または寄生生物を含む微生物全体または分裂された微生物が抗原として使用され得ることもまた想定される。これらの材料はまた、いくつかの系の特定の生物もしくは複数の生物または疾患を引き起こす薬剤あるいはアレルギー、癌、または自己免疫疾患に対する免疫を誘導し、そして保護するための合成分子手順または組換え分子手順により生成され得る。ヒトおよび獣医学分野における使用が提案される。さらに、本発明は、増強されたワクチンとしての抗原または本発明を用いずにその抗原を投与（粘膜経路または非経口経路による）する前または後の免疫のプライミングまたはブーストとしての免疫治療剤と共に与えられる場合に免疫を増強するために使用され得る。
【００１２】
非経口使用、鼻使用、経口使用、または坐剤使用について、アジュバントは、当該分野で慣習的な希釈剤または媒体として種々の量の賦形剤または他のアジュバント（油、エマルジョン、ナノエマルジョン、脂肪、ワックス、緩衝液、または糖が挙げられる）と共に与えられ得、所望の送達形式の製品の安定な送達を提供する。
【００１３】
特に注目されることは、アジュバントとして本発明を使用することが、特に新規であることが強調されることである。なぜならば、好ましい実施形態において、本発明は、プロテオソームのアジュバント効果とＬＰＳの免疫刺激能力を組み合わせ得るからである。この複合体は、先行技術よりも有効であることが予想されていなかった。なぜならば、この複合体は、単独で与えられた場合に通常毒性である全長ＬＰＳを含むからである。安定なプロテオソーム複合体ＬＰＳは、臨床前安定性、免疫原性、および毒性の両方により立証される所定の実施例において、ならびにＦＤＡ承認のフェーズＩおよびフェーズＩＩ臨床試験における臨床研究において、鼻経路および非経口経路によって非毒性である。
【００１４】
本発明は、グラム陰性細菌種（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株が挙げられるがこれに限定されない）由来の精製または組換え細菌外膜タンパク質で構成され得る。ＬＰＳは、グラム陰性細菌（例えば、ＳｈｉｇｅｌｌａまたはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓまたはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａまたはサルモネラ種であるがこれらに限定されない）から獲得され得、そして外膜タンパク質プロテオソームを提供するために使用される細菌の同一種または異なる種由来であり得る。好ましい実施形態において、総プロテオソームタンパク質の割合としての最終のリポ多糖またはＬＰＳ含量（重量）は、約１３％と３００％との間であり得、そして投与の適用および経路の特異性に依存して、２０％〜１００％のリポ多糖またはＬＰＳの割合での使用のために有効かつ実用的であり得るか、または３０％〜１５０％の間のリポ多糖の割合での特定の用途においてさらに区別され得る。本発明は抗原と共に、（粘膜経路（例えば、そして詳細には、吸入、または摂取もしくは性的な伝達）によって獲得されようと、非経口経路（例えば、経皮経路、皮内経路、または皮下経路または筋肉内経路）によって獲得されようと）癌、自己免疫、ウイルス疾患もしくは微生物疾患または特定の毒素もしくは生物学的脅威薬剤またはアレルギーの予防または処置において使用するために、粘膜経路（鼻経路、舌下経路、経口経路、または直腸経路）または非経口経路（筋肉内経路、皮下経路、皮内経路、または経皮経路）により増強されたワクチンが送達されるよう設計される。
【００１５】
本発明の１つの実施形態は、総タンパク質の０．５％〜約５％の間の内因性リポオリゴ糖（ＬＯＳ）含量を有するプロテオソームを調製するためのプロセスである。本発明の別の実施形態は、総タンパク質の約１２％〜約２５％、好ましい実施形態において、１５％と２０％との間の内因性リポ糖を有するプロテオソームを調製するためのプロセスを特徴とする。
【００１６】
本発明は、任意のグラム陰性細菌種由来のリポ糖を含有する組成物を特徴とする。任意のグラム陰性細菌種は、好ましくは、天然にまたは組換えにより異なる形態であるか、または本発明におけるタンパク質の供給源であるグラム陰性細菌種と同一であり得る。本発明の組成物は最適化され、詳細には、処方物により特徴付けられ、そして自由に変更されて、得られる本発明の組成物が、総プロテオソームタンパク質の少なくとも約１３重量％の量のリポ糖を含むような量のプロテオソームおよびリポ糖を含み得る（好ましい実施形態において、１５％〜３００％であり得、そして用途に依存して、総タンパク質の２０％〜２００％（重量：重量基準）との間または総タンパク質の３０％と１５０％との間でさえあることがさらに好ましくあり得る）。
【００１７】
本発明の最も好ましい実施形態は、アジュバント組成物である。ここで、プロテオソームは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから調製され、そしてリポ糖は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉまたはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ  ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓから調製され、そしてリポ糖の最終含量は、総プロテオソームタンパク質の５０％〜１５０％の間（重量）である。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
結果は、インフルエンザウイルス由来の組換えおよびスプリット抗原と混合された場合の、以下のＩＶＸ−９０８アジュバント活性を示す。
【００１９】
（Ａ．注射可能な経路による）
１．注射可能なスプリットｆｌｕインフルエンザワクチン単独と比較して、血清ＨＡＩおよびＩｇＧの８倍までの増加を誘導する
２．スプリットｆｌｕインフルエンザワクチン単独と比較して、１型（ＣＭＩ）応答へと惹起された免疫応答をシフトさせる。
【００２０】
（Ｂ．経鼻経路による）
１．経鼻経路により投与されたスプリットｆｌｕインフルエンザ抗原単独と比較して、血清ＨＡＩおよびＩｇＧ応答の１００倍の増加を誘導する
２．注射により与えられたスプリットｆｌｕと比較して１０倍高く特異的な、血清ＨＡＩおよびＩｇＧを誘導する
３．経鼻投与または注射により投与されたスプリットｆｌｕインフルエンザ抗原単独と比較して１００倍〜１０００倍よりも高く特異的な、ＩｇＡを肺および／または鼻において誘導する
４．経鼻投与または注射により投与されたスプリットｆｌｕインフルエンザ抗原単独と比較して１６０倍まで高く特異的な、ＩｇＡを生殖管において誘導する
５．スプリットｆｌｕ単独と比較して、１型（ＣＭＩ）応答へとシフトさせる
６．０．３μｇ〜１μｇ程度の少ない量のＩＶＸ−９０８は、スプリットｆｌｕ  ＨＡに対する血清ＩｇＧ応答の最適な増強を達成するに十分である
７．ＩＶＸ−９０８と同時投与される組換えインフルエンザＨＡは、死亡率および罹病率に対して防御し、かつこの抗原単独の注射または鼻内投与により誘導される応答よりも優れた、応答を誘導する
８．Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種由来のＬＰＳを使用してタンパク質：ＬＰＳ比３：１〜１：３で調製したＩＶＸ−９０８が、有効であった。
【００２１】
これらの結果は、本発明のインフルエンザスプリットｆｌｕ抗原による呼吸免疫または非経口免疫が、アジュバントを含まないこのインフルエンザスプリット産物による免疫と比較して、血清生物サンプルおよび粘膜生物サンプルの各々における増強された特異的インフルエンザＨＡ抗体形成を誘導することを、示す。
【００２２】
結果は、ｒＢｅｔ  ｖ  １ａ（カバノキ花粉由来の主要アレルゲン）を組換えアレルゲンまたはカバノキ花粉アレルゲン抽出物のいずれかとして混合し、そして経鼻経路を介して投与した場合の、以下のＩＶＸ−９０８アジュバント活性を示す。
【００２３】
１．経鼻ＩＶＸ−９０８およびｒ  Ｂｅｔ  ｖ  １ａ混合物は、１型サイトカインであるＩＦＮ−γの誘導を、Ｂｅｔ  ｖ  １ａ単独およびリン酸アルミニウム中に処方したＢｅｔ  ｖ  １ａと比較して、それぞれ５０倍および７４倍増強した。経鼻ＩＶＸ−９０８およびカバノキ花粉抽出物（ＢＰＥｘ）混合物は、１型サイトカインであるＩＦＮ−γの誘導を、Ｂｅｔ  ｖ  １ａ単独およびリン酸アルミニウム中に処方したＢｅｔ  ｖ  １ａと比較して、それぞれ４４倍より大きく、および３倍増強した。
【００２４】
２．このＩＶＸ−９０８／Ｂｅｔ  ｖ  １ａ混合物およびＩＶＸ−９０８／ＢＰＥｘ混合物によるＩＦＮ−  生成の増加は、ＩＬ−５分泌の増加と関連がなかった。このことは、ＩＶＸ−９０８が、Ｂｅｔ  ｖ  １ａに対する免疫応答を、１型に偏ったＴ細胞応答へと向けたことを示す。
【００２５】
３．ＩＶＸ−９０８／Ｂｅｔ  ｖ  １ａ混合物およびＩＶＸ−９０８／ＢＰＥｘ混合物により誘導される血清ＩｇＥは、リン酸アルミニウムとともに投与されたそれらアレルゲンにより誘導される血清ＩｇＥの、それぞれ、約３７分の１および４４分の１であった。
【００２６】
４．アレルゲン特異的血清ＩｇＧは、Ｂｅｔ  ｖ  １ａ単独およびＢＰＥｘ単独と比較して、ＩＶＸ−９０８／Ｂｅｔ  ｖ  １ａ混合物およびＩＶＸ−９０８／ＢＰＥｘ混合物により免疫したマウスについて、それぞれ、４００倍より大きく、および２２倍増加された。
【００２７】
５．Ｂｅｔ  ｖ  １ａ＋ミョウバンで感作されたマウスにおいて、１型サイトカインであるＩＦＮ−γの生成は、ＩＶＸ−９０８／ｒＢｅｔ  ｖ  １ａおよびＩＶＸ−９０８／ＢＰＥｘによる免疫後に、対応するアレルゲン単独と比較して、それぞれ、４．７倍および３３倍増加された。これらのマウスにおいて、２型サイトカインであるＩＬ−５は、対応するアレルゲン単独と比較して減少された。
【００２８】
６．ＩＶＸ−９０８／アレルゲン混合物で経鼻免疫されその後Ｂｅｔ  ｖ  １ａ＋ミョウバンによる感作注射を投与されたマウスにおいて、１型サイトカインであるＩＦＮ−γが、カバノキ花粉抽出物単独と比較して１０倍増加された。これらのマウスにおいて、２型サイトカインであるＩＬ−５のレベルは、同様には上昇せず、実際には、カバノキ花粉抽出物単独と比較していくらか減少された。
【００２９】
これらの結果は、ＩＶＸ−９０８／アレルゲン処方物が、アレルゲン未処理マウスおよびアレルゲン感作マウスにおいて、強力な１型サイトカイン応答を誘導することを示し、このことは、アレルゲンの精製タンパク質もしくは組換えタンパク質または抽出物を用いて調製されたこれらの処方物が、アレルギー性疾患について特異的な免疫療法のためのワクチンまたは治療剤として使用され得ることを示唆する。
【００３０】
これらの結果は、オボアルブミン（ＯＶＡ）（公知の貧弱な免疫原）と混合されそして経鼻経路または注射可能経路により投与された場合の、以下のＩＶＸ−９０８アジュバント活性を示す。
【００３１】
１．抗原単独と比較して、経鼻経路および注射可能経路を介して、それぞれ６０倍および７５倍よりも大きく、ＯＶＡ特異的血清ＩｇＧ力価を増強する。
【００３２】
２．平衡型の免疫応答を生じる抗原単独と比較して、再刺激された脾細胞からのＯＶＡ特異的ＩＦＮ−γおよびＩＬ−５の分泌を増強する。
【実施例】
【００３３】
（実施例）
（実施例１：プロテオソームの生成）
外膜タンパク質プロテオソーム調製物の２つの例を示す。これらの調製物を、フェノール殺傷した細菌ペーストを、１Ｍ塩化カルシウム中の６％  Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢ（ＥＢＢ）（ＡｌｂｒｉｇｈｔおよびＷｉｌｓｏｎ，Ｗｈｉｔｈａｖｅｎ，ＵＫ）溶液で抽出し、その後、エタノールで沈殿させ、１％  ＥＢＢ−Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ−生理食塩水中で可溶化し、その後、硫酸アンモニウムで沈殿させることによって、２型Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓから精製した。この沈殿物を、１％  ＥＢＢ緩衝液中で再可溶化し、ダイアフィルトレーションし、そして−７０℃にてＥＢＢ緩衝液中で貯蔵した。このプロセスのフローチャートを、後の頁のフローチャート１Ａ（図１Ａ）に示す。このプロセスは、０．５％と５％との間のリポサッカリド含量を有するプロテオソームを生じた。プロテオソームをまた、望ましい場合はこのプロセスを短くするために硫酸アンモニウム沈殿工程を省略することによっても調製し得、生じるプロテオソームは、１２％と２５％との間のリポサッカリド含量を有し、このリポサッカリド含量は、材料に依存して、フローチャート１Ｂ（図１Ｂ）に示されるように、１５％と２５％との間であり得る。
【００３４】
（実施例２：リポサッカリドの生成）
フローチャート２（図２）における例は、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ細菌またはＰ．ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ細菌からのＬＰＳの単離および精製のためのプロセスを示す。このプロセスは、他のグラム陰性細菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ種、Ｐｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ種、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が挙げられるが、これらに限定されない）からＬＰＳを調製するために、同様に使用され得る。発酵によるその細菌の増殖後、その細胞ペーストを、３ｍＬの０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．００５Ｍ  ＥＤＴＡ／ペースト１ｇで再水和した。１０ｍｇリゾチーム／ペースト１ｇもまた、添加した。リゾチーム消化を、室温で１時間進行させた。その後、５０Ｕ／ｍＬベンゾナーゼ（ＤＮアーゼ）を、０．０２５Ｍ  ＭｇＣｌ２とともに添加した。ＤＮアーゼ消化を、室温で３０分間進行させた。その後、その懸濁物を、１４，０００〜１９，０００ｐｓｉでマイクロフルイダイザーに通すことによって、破砕した。新しいＤＮアーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）を添加し、そしてその懸濁物を、室温でさらに３０分間消化した。消化した細胞懸濁物を、水浴中で６８℃に加熱した。等容量の９０％フェノールを（同じ温度で）添加し、そしてその混合物を、６８℃で３０分間、振盪しながらインキュベートした。その混合物を、４℃にて遠心分離して、水相と有機相とを分離した。その水相を採集し、そしてその有機相を、ＷＦＩ（注射用水）を用いて６８℃にて３０分間再抽出した。その混合物を、４℃にて遠心分離して、水相と有機相とを分離し、これらの水相を合わせた。２０％エタノールおよび１０ｍＭ  ＣａＣｌ２をこの合わせた水相に添加して、核酸を沈殿させた。この混合物を４℃で一晩攪拌した。その後、沈殿した核酸を、１０，０００×Ｇで３０分間の遠心分離によってペレットにし、そしてその上清を収集した。
【００３５】
その上清を濃縮し、そして３０，０００ＭＷ中空繊維カートリッジを使用して、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡおよび０．１％  Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢ（ｐＨ８．０）中にダイアフィルトレーションした。最後に、そのＬＰＳを、０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐａｋ  ６０フィルター単位を使用して滅菌濾過し、滅菌貯蔵容器中に分注し、そして−８０℃にて凍結した。
【００３６】
（実施例３：プロテオソーム−リポサッカリドアジュバント複合体の調製および特徴づけ）
このアジュバントを、プロテオソームをＬＰＳに非共有結合体化することによって製造した。このＬＰＳは、多数のグラム陰性細菌（フローチャート３に記載されるような、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種またはＰｌｅｓｉｏｍｏｎａｓ種またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種またはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種が挙げられるが、これらに限定されない）のいずれかに由来し得る。手短に述べると、プロテオソームおよびＬＰＳを、４℃にて一晩融解させ、そしてＴＥＥＮ緩衝液中で１％  Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢに調整した。プロテオソームを一晩融解させ、そしてＴＥＥＮ緩衝液中で１％  Ｅｍｐｉｇｅｎ  ＢＢに調整した。この２つの成分を、１０：１と１：３との間の最終プロテオソーム：ＬＰＳ重量／重量比を生じる量で混合し、そして室温で１５分間攪拌した。このＬＰＳ−プロテオソーム混合物を、適切なサイズ（例えば、Ｓｉｚｅ９の）１０，０００ＭＷＣＯ中空繊維カートリッジにて、ＴＮＳ緩衝液（０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）中にダイアフィルトレーションした。このダイアフィルトレーションを、その透過物中のＥｍｐｉｇｅｎ含量が（Ｅｍｐｉｇｅｎ濁度アッセイまたはＢｒａｄｆｏｒｄ試薬アッセイによって）５０ｐｐｍ未満であった場合に停止した。この大量のアジュバントＩＶＸ−９０８を濃縮し、そして（Ｌｏｗｒｙアッセイによって）５ｍｇ／ｍＬタンパク質に調整した。最後に、このアジュバントを、０．２２μｍ  Ｍｉｌｌｉｐａｋ２０フィルター単位を使用して滅菌濾過した。この大量のアジュバントを、滅菌貯蔵容器中に分注し、そして凍結した。
【００３７】
このプロテオソーム−ＬＰＳ複合体を、逆相ＨＰＬＣを使用してＥｍｐｉｇｅｎ（４００ｐｐｍ）について試験し、Ｌｏｗｒｙによってタンパク質含量について試験し、２−ケト−３−デオキシオクトネート（ＫＤＯ）アッセイの測定によってＬＰＳ含量について試験した。本発明は、粒子サイズ選別器（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓモデル９０＋または同様の機器）（１０〜１００ｎｍ）を使用する定量的数加重分析（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｗｅｉｇｈｔｅｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によって決定した場合、粒子サイズ分布についてさらに特徴付けられた。しかし、この複合体についての粒子サイズは、プロテオソーム対ＬＰＳ比が高くなるにつれて増加する。この複合体処方物の安定性は、以前に示されたＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＬＰＳワクチンと一致するはずである。これらのデータは、冷蔵温度および加速温度（２５℃および３７℃）の両方での複合体の安定性を示す。
【００３８】
（実施例４：ＩＶＸ−９０８インフルエンザ抗原またはカバノキ花粉アレルギーもしくはオボアルブミン混合物の調製）
本発明を、ＩＶＸ−９０８プロテオソーム−ＬＰＳアジュバント（実施例３）を、安定性および免疫学的結果について最適な処方を促進する比率で抗原と混合によって調製した。
【００３９】
（実施例５：インフルエンザ抗原研究のためのマウス免疫プロトコル）
ＢＡＬＢ／Ｃマウスを、１日目および２１日目に、２５または１００μｌの容量で抗原を用いて、それぞれ、単独か、または０．３〜３ｕｇのＩＶＸ−９０８アジュバント（種々のプロテオソーム：ＬＰＳ  ｗｔ／ｗｔ比でＬＰＳを含む）と混合してかのいずれかで、鼻内免疫または筋肉内免疫した。この抗原は、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６５／９５またはＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５およびＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７二価界面活性剤スプリット抗原（ｂｉｖａｌｅｎｔ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｓｐｌｉｔ  ａｎｔｉｇｅｎ）（ＧＭＰ市販許可抗原）として、０．３と３ｕｇの間のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）を含む。コントロールマウスを、リン酸緩衝化生理食塩水での鼻内免疫に供した。動物を、３５日目に、伏在静脈を介してか、または心臓穿刺によって採血した。鼻洗浄もしくは肺洗浄、または膣洗浄を、３５日目に行った。各マウスの肺を、外科的に露出させ、そして器官にカニューレを挿入した。０．１％ウシ血清アルブミンおよびプロテアーゼインヒビター（０．２ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、１μｇ／ｍｌアプロチン、３．２５ｕＭ  ベスタチン、および１０ｕＭロイペプチド）を補充したリン酸緩衝化生理食塩水を含むシリンジを用いて、１鼻洗浄サンプル（約１ｍｌ）および２肺洗浄サンプル（２×１ｍｌ）を収集した。個々の動物から肺洗浄液を合わせ、ボルテックスし、そして遠心分離して、細胞片を取り除き、そして上清を、ＥＬＩＳＡによりアッセイされるまで、−７０℃で保存した。膣洗浄液を、（上記のような）２５ｕｌの補充リン酸緩衝化生理食塩水で湿らせた綿球を、マウスの膣へと３０秒間挿入することにより行った。綿球を取り除いた後、この手順を、綿球の反対端で繰り返した。この綿球を、−７０℃で凍結保存し、そしてアッセイ時にＥＬＩＳＡブロッキング緩衝液（実施例８を参照のこと）中で再構成した。
【００４０】
（実施例６：血清凝集抑制アッセイ（ＨＡＩ））
ＨＡＩ活性の決定の前に、マウス血清を５６℃で加熱して、補体を不活化した。非特異的凝集反応の排除を、マウス血清をレセプター破壊酵素（ＲＤＥ）を用いて処理することにより達成した。０．１ｍｌの血清に、０．４ｍｌのＲＤＥ（１００単位／ｍｌ）を、３７℃にて１２〜１８時間添加した。０．３ｍｌのクエン酸ナトリウム（２．５％）を、ＲＤＥを不活化するために、５６℃にて３０分間添加した。サンプル容量を、（１：１０の最終サンプル希釈を得るために）ＰＢＳを用いて１ｍｌにした。各サンプルの倍数連続希釈物を、標準的なＨＡＩアッセイにおいて完全インフルエンザウイルスによる０．５％ヒヨコ赤血球の凝集反応を阻害する能力について試験した。
【００４１】
（実施例７：血清、肺液、鼻液および膣液における特異的な抗ｆｌｕ抗体の測定）
血清を、各免疫の後に収集した；肺腔洗浄液および鼻腔洗浄液および膣洗浄液を、最後の免疫の後に収集した。ＥＬＩＳＡを、完全なウイルスまたは検出抗原として界面活性剤スプリット抗原を用いて行った。簡単には、９６ウェル丸底マイクロタイタープレート（例えば、Ｃｏｓｔｅｒ  ＥＩＡ／ＲＩＡ９６ウェルＥａｓｙｗａｓｈ  Ｐｌａｔｅｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）を、抗原でコーティングし、そして一晩インキュベートした。プレート洗浄器を用いる抗原の吸引の後、プレートを、もう一度、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄し、そしてＰＢＳ−Ｔおよび２％粉乳を含むブロッキング緩衝液と共にインキュベートした。このブロッキング緩衝液を吸引し、そしてＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ブロッキング溶液中で倍数希釈した、血清、肺腔洗浄液もしくは鼻腔洗浄液、または膣洗浄液のサンプルを、添加し、そしてプレートを３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔで洗浄後、アフィニティー精製した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−標識ヤギ抗マウスＩｇＧまたはＩｇＡを、添加し、そしてプレートを、３７℃にて３０分間インキュベートした。吸引し、そしてＰＢＳ−Ｔで２回洗浄した後、発色液を添加し、そしてプレートを室温で３０分間インキュベートし、そしてＨ２ＳＯ４の添加により停止した後、マイクロタイターＥＬＩＳＡプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて吸光度値を決定した。表における抗体力価は、アフィニティー精製したマウスＩｇＧ標準（Ｓｉｇｍａ）およびＩｇＡ標準（Ｓｉｇｍａ）を用いるＥＬＩＳＡ捕捉アッセイを用いて作成した標準曲線から決定した、特異的なＩｇＧまたはＩｇＡのｎｇ／ｍｌとして表す。
【００４２】
（実施例８：ＩＶＸ−９０８アジュバントを用いるインフルエンザワクチンにより惹起された、増大した免疫源性および免疫）
この実験は、ＩＶＸ−９０８アジュバントの有りまたは無しで得た、一価（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５）抗原での鼻免疫、あるいは二価（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５およびＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７）抗原での鼻免疫または筋肉内免疫の後に誘導された血清抗体応答および粘膜抗体応答を示す。用いたインフルエンザ抗原の１株あたり０．３ｕｇＨＡおよびＩＶＸ−９０８（ＩＶＸ−９０８は、全ての０．３ｕｇのＨＡについて１．２ｕｇのプロテオソームタンパク質を有する、１：１ｗｔ／ｗｔのプロテオソーム：ＬＰＳ比からなる）を含む、２用量の抗原をマウスに与えた。血清中の抗インフルエンザＩｇＧ抗体を、ＨＡＩにより分析した；血清中のＩｇＧおよび肺腔液および鼻腔液中のＩｇＡ抗体を、ＥＬＩＳＡにより分析した。結果を表１〜３に示しかつ要約する。簡単には：
鼻に与えたＩＶＸ−９０８アジュバントを用いるインフルエンザワクチンは：
１．  鼻に与えたスプリット（ｓｐｌｉｔ）インフルエンザ抗原のみよりも、５０〜２５０倍の間の高い血清ＩｇＧ応答、および注射（ｉ．ｍ．）により与えたインフルエンザワクチンよりも、１０倍までより高い応答を惹起した（表１〜３）、
２．  鼻に与えたスプリット（ｓｐｌｉｔ）Ｆｌｕ単独よりも、１６〜１００倍高い血清ＨＡＩ応答、および注射によりスプリット生成物インフルエンザワクチンのみを与えることにより惹起するよりも、８倍より高い応答を惹起した（表１〜３）、
３．  鼻または注射（ｉ．ｍ．）により与えたスプリットＦｌｕインフルエンザワクチンのみよりも、鼻腔において２０〜１２０倍の間のより高いＩｇＡ応答を惹起した（表１）、
４．  鼻または注射（ｉ．ｍ．）により与えたスプリットインフルエンザワクチンのみよりも、肺において５０〜６００倍を超える、より高い特異的ＩｇＡ応答を惹起した（表１〜３）、
５．  鼻または注射により与えたスプリットＦｌｕインフルエンザワクチンのみと比較して、特異的な膣ＩｇＡにおいて、３０〜１６０倍を超える増大を誘導した（表２）。
【００４３】
筋肉内に与えたＩＶＸ−９０８アジュバントを用いるインフルエンザワクチンは：
１．  注射により与えたスプリットＦｌｕインフルエンザワクチンのみと比較して、特異的な血清ＩｇＧにおける５倍までの増加、および血清ＨＡＩにおける８倍までの増加を誘導した（表４）。
【００４４】
データは、インフルエンザスプリット抗原と混合した場合に、Ｐ．ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ（表１および３）か、またはＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ（表２）のいずれかに由来するＬＰＳを用いて調製されたＩＶＸ−９０８が、血清抗原特異的免疫応答および粘膜抗原特異的免疫応答の両方を増大することを実証する。さらに、一価調製物として与えた場合に、ＩＶＸ−９０８は、個々の一価ＨＡ抗原の各々に対するＨＡ−特異的免疫応答を補助した（表２および３）。
【００４５】
表１．一価抗原を用いる鼻内経路を介するＩＶＸ−９０８のアジュバント効果。ＩＶＸ−９０８アジュバント（４：１のＩＶＸ−９０８：ＨＡ比で１用量あたり３ｕｇ  ＨＡ）と混合し、次いで鼻免疫した、スプリットｆｌｕ抗原（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５）により誘導されたマウス血清ＨＡＩ、ＩｇＧおよび粘膜ＩｇＡ。
【００４６】
【表１】
2004521925.tif 000002
全てのサンプルを、２回目の免疫の１４日後に得た。
ＩＶＸ−９０８を、Ｐ．Ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ  ＬＰＳを用いて調製した。
＊は、１０マウス／群についての相乗平均であり、＊＊は、１０マウス／群からプールした血清についてのＨＡＩである。
【００４７】
表２．二価抗原を用いる鼻経路を介するアジュバント効果。ＩＶＸ−９０８アジュバント（４：１のＩＶＸ−９０８：ＨＡ比で１用量あたり０．３ｕｇ  ＨＡ／株）と混合し、鼻に与えた、二価スプリットｆｌｕ抗原（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５  Ｈ１およびＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７（Ｈ３））により誘導された、マウス抗Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５（Ｈ１）血清ＨＡＩ、ＩｇＧおよび粘膜ＩｇＡ。
【００４８】
【表２】
2004521925.tif 000003
2004521925.tif 000004
全てのサンプルを、２回目の免疫の１４日後に得た。
ＩＶＸ−９０８を、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＬＰＳを用いて調製した。
・は、１０マウス／群についての相乗平均である。
・＊＊は、１０マウス／群からプールした血清についてのＨＡＩである。
【００４９】
表３．鼻経路または筋肉内経路を介するアジュバント効果。ＩＶＸ−９０８アジュバント（４：１のＩＶＸ−９０８：ＨＡ比で１用量あたり０．３ｕｇ  ＨＡ／株）と混合し、鼻または筋肉内に与えた、二価スプリットｆｌｕ抗原（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５  Ｈ１およびＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７（Ｈ３））により誘導されたマウス抗Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５（Ｈ１）血清ＨＡＩ、ＩｇＧ、および粘膜ＩｇＡ。
【００５０】
【表３】
2004521925.tif 000005
2004521925.tif 000006
全てのサンプルを、２回目の免疫の１４日後に得た。
アジュバントを、Ｐ．Ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ  ＬＰＳを用いて調製した。
・は、１０マウス／群についての相乗平均である。
・＊＊は、１０マウス／群からプールした血清についてのＨＡＩである。
【００５１】
（実施例９：鼻プロテオソームインフルエンザワクチンによる、２型から１型への免疫応答のシフト）
プロテオソーム−ＬＰＳでアジュバント化されたインフルエンザスプリット抗原およびアジュバント化されていないインフルエンザスプリット抗原で免疫されたマウス由来の脾細胞培養物を、Ｔ細胞サイトカインインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）およびＩＬ−５の産生について、それぞれＴｈ１型またはＴｈ２型の免疫応答の誘導の指標として分析した。簡単には、実施例６に記載されるように経鼻または経筋肉のいずれかで、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、２４μｇ  ＩＶＸ−９０８  プロテオソーム−ＬＰＳありまたはなしで、３μｇ  Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５およびＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７由来のインフルエンザＨＡを含む二価処方物で免疫した。２回目の免疫の１４日後に、マウスを安楽死させ、そして各群からの５匹のマウス由来の脾臓を回収し、１００μｍナイロン細胞濾過器（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＮＪ）を使用して、細胞を、単一細胞懸濁物に裂いた。脾細胞を、ＵＶ照射され、精製されたＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザウイルスおよびＩＶＲ−１０８再集合体（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザウイルス（ＮＩＢＳＣ，Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫ）ありまたはなしで、以下を含有するＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＯＮ）中で２．０×１０６細胞／ｍｌ（２００μｌ／ウェル）にて９６ウェル細胞培養クラスター（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）中で培養した：８％  ウシ胎仔血清（５６℃で１時間の熱非働化；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、２ｍＭグルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および５０μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）。細胞を、３７℃で７２時間インキュベートし、上清を回収し、そして−８０℃で凍結させた。サンドイッチＥＬＩＳＡキット（ＯｐｔＥＩＡセット、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡより購入した）を、製造業者の指示書に従って、マウスサイトカインレベルを測定した。組換えサイトカインを、標準として使用した。
【００５２】
簡単には、表４の結果は、アジュバント化インフルエンザワクチンを形成するために多価二価スプリットｆｌｕ抗原と一緒に経鼻または経筋肉のいずれかで与えられたＩＶＸ−９０８が、検出可能なＩＬ−５（２型サイトカイン）を伴うことなく、１型サイトカイン（ＩＮＦ  ）を独特に誘導することを実証する。逆に、経鼻または経筋肉で与えられた二価インフルエンザ抗原単独は、ＩＮＦ−γおよびＩＬ−５の両方の産生によって証拠付けられるような、１型および２型混合の免疫応答を誘導する。これらの結果は、ＩＶＸ−９０８が、増強された抗原特異的血清学的応答を誘導し、そして抗原に対するＴ細胞応答を１型免疫に向けて偏向させる。１型免疫応答は、細胞内の病原体のクリアランス、抗腫瘍応答の発達、およびアレルギー性応答の制御、に重要である。
【００５３】
表４．脾細胞からのマウスサイトカイン誘導。二価スプリットｆｌｕ抗原（Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５  Ｈ１およびＡ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７  Ｈ３）およびＩＶＸ−９０８アジュバント（ＩＶＸ−９０８：ＨＡの比が４：１での投与量当たり３μｇ  ＨＡ／株）で、マウスを、経鼻または経筋肉で免疫した。Ｐ．ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｅｓ  ＬＰＳを用いてＩＶＸ−９０８アジュバントを調製した。不活化したＡ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５（Ｈ１）またはＳｙｄｎｅｙ（Ｈ３）再集合体全体で、脾細胞を再刺激した。
【００５４】
（Ａ．Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５（Ｈ１）免疫および再刺激）
【００５５】
【表４Ａ】
2004521925.tif 000007
（Ｂ．Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７（Ｈ３）免疫および再刺激）
【００５６】
【表４Ｂ】
2004521925.tif 000008
実施例１０に記載されるように不活化全ウイルス（１．２５μｇ／ｍＬ）で再刺激したマウス脾細胞の上清中のＩＮＦ−γおよびＩＬ−５を決定し、ｐｇ／ｍＬ培養上清で表した。結果は、３連の培養物の平均であり、そしてＰＢＳ免疫したマウスの脾細胞由来のＩＦＮ−γおよびＩＬ−５（ｐｇ／ｍＬ）を既に差し引いた値を有した。
【００５７】
（実施例１０：アジュバント化（ａｄｊｕｖａｎｔａｔｉｏｎ）を最大化するために、ＩＶＸ−９０８およびヘマグルチニン抗原の最適な量および比を規定する）
１０μｇ〜０．０３μｇの漸減量のＩＶＸ−９０８（プロテオソームタンパク質：Ｓ．ｆｌｅｘ  ＬＰＳ、１：１）と混合した１μｇのＨＡ（Ｈ３Ｎ２株、Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ／５／９７）で、マウスを０日目および１４日目にｉ．ｎ．にて免疫した。次の研究では、ＨＡの量が３〜０．３μｇに変化したが、ＩＶＸ−９０８の量は１μｇまたは０．３μｇで一定を維持した。両方の研究において、血液、肺洗浄液、鼻洗浄液および脾臓を、２１日目の安楽死時に回収し、ＩｇＧまたはＩｇＡの含量について分析したか、または適切なように（上記の実施例９に記載されるように）インビトロ刺激のための脾細胞を調製するために使用した。Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ対比較を使用するＡＮＯＶＡ分析によって、データの有意性を評価した。
【００５８】
図４ａ）およびｂ）は、０．３〜１μｇのＩＶＸ−９０８での閾値を超えて、誘導した免疫応答レベルがレベルオフし、そしてこの閾値を下回って、誘発した応答が顕著に減少するを示す。この閾値でＩＶＸ−９０８の量を維持して、ＨＡの量を３μｇと０．３μｇとの間で変化させながら第２の研究を行った。図４ｃ）およびｄ）の結果は、ＨＡを１〜３μｇのＨＡの閾値を超えるＩＶＸ−９０８と混合した場合に、最大の全身性免疫応答および粘膜免疫応答を得たことを示す（０．３μｇまたは１μｇのいずれかのＩＶＸ−９０８でｉ．ｎ．投与した）。この結果は、マウスにおいて最適な免疫応答を誘発するために、１〜３μｇのＨＡが０．３〜１μｇのＩＶＸ−９０８と混合されるべきであることを示す。
【００５９】
他の研究におけるように、インビトロ刺激した脾細胞から放出されるサイトカインの分析は、ＩＶＸ−９０８とともにＨＡをｉ．ｎ．投与することにより、１型表現型の応答が主に誘発されたことを示した。
【００６０】
（実施例１１：ＩＶＸ−９０８と混合した組換えヘマグルチニンの鼻投与によって誘発された、全身性免疫応答および粘膜免疫応答の増強、ならびに生ウイルスチャレンジに対する防護）
全長非切断タンパク質（ＨＡ０）として供給された、バキュロウイルス誘導組換えインフルエンザヘマグルチニン（ｒＨＡ；Ｈ１Ｎ１株  Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１）を、市販の供給源より購入した。ｒＨＡの免疫原性を、６〜８週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスの１５の群の免疫によって評価した。鼻内（ｉ．ｎ．）免疫について、マウスを軽く麻酔し、２５μｌのワクチン（ＩＶＸ−９０８（８μｇプロテオソームタンパク質および８μｇ  Ｓ．ｆｌｅｘ  ＬＰＳ）ありまたはなしで２μｇのｒＨＡを含む）またはＰＢＳを外鼻孔に適用し（１２．５μｌ／外鼻孔）、そしてマウスに飛沫を吸入させた。筋肉内（ｉ．ｍ．）免疫を、後肢への２５μｌ（２μｇ  ｒＨＡ）の注射によって達成した。全てのマウスを、０日目および２１日目に免疫した。各群からの１０匹の動物を、４８日目に８  ＬＤ５０のマウス適応同型改変体インフルエンザウイルス（Ａ／Ｔａｉｗａｎ／１／８６）ｉ．ｎ．滴注でチャレンジして防護を評価した。任意の死を記録し、そして体重減少を、病的状態の代理として使用した；チャレンジ直前および２日毎に、マウスを秤量した。チャレンジ前の体重の３０％以上を喪失したマウス、あるいは窮迫および／または病的状態の他の臨床的徴候（例えば、毛髪起立（ｐｉｌｏ−ｅｒｅｃｔｉｏｎ）、湾曲した姿勢、低減した移動性）とともにより軽い体重喪失（２０％以上）を示すマウスを、実験終了点基準に達したとみなし、そして安楽死させた。各群からの５匹のチャレンジしていないマウスを、５１日目に安楽死させ、心臓穿刺によって放血させた。血清を血餅から分離し、アッセイまで−７０℃で保存した。脾臓を無菌的に取り出し、（上記の実施例９に記載されるように）インビトロでの再刺激に処理した。鼻洗浄および肺洗浄を、以前に記載したように行った。
【００６１】
表５ａは、５１日目に回収したサンプルにおける全身性応答および粘膜応答を示し、表５ｂは、特定のインビトロ刺激に続く、脾細胞から放出されたＩＦＮ−γおよびＩＬ−５の量を示す。表５ａ）は、免疫したマウスまたはコントロールマウスにおける、体輻をなす改変体であるマウス適応生ウイルスでのチャレンジに続く死に対する防護を示し、ｂ）は、免疫したマウスまたはコントロールマウスにおける、体輻をなす改変体であるマウス適応生ウイルスでのチャレンジに続く病的状態に対する防護を示す。
【００６２】
これらの結果は、以下を示す：
１．ＩＶＸ−９０８＋ｒＨＡによって誘発された血清応答は、ｉ．ｍ．またはｉ．ｎ．で与えられたｒＨＡ単独によって誘導された応答より、それぞれ４倍および１００倍高い。
２．ＩＶＸ−９０８とともにｉ．ｎ．で投与されたｒＨＡのみが、検出可能な粘膜ＩｇＡ応答を誘発した。
３．ＩＶＸ−９０８＋ｒＨＡでのｉ．ｎ．免疫は、２型表現型の応答を誘導したｉ．ｍ．ｒＨＡ単独とは対照的に、１型表現型の応答を誘導した。
４．ｒＨＡで免疫したマウスまたはコントロールマウスとは対照的に、ＩＶＸ−９０８＋ｒＨＡでｉ．ｎ．免疫した全てのマウス（１０／１０）は、生ウイルスチャレンジにもなお生存する。ｉ．ｍ．またはｉ．ｎ．にてｒＨＡ単独で免疫した８／１０のマウスおよび１／１０のマウスは生存したが、コントロールマウスが生存しなかった。
５．ＩＶＸ−９０８＋ｒＨＡでのｉ．ｎ．免疫したマウスは、チャレンジ後の体重喪失を受けなかった。この生存するマウスを、チャレンジ後にｉ．ｎ．経路またはｉ．ｍ．経路のいずれかにてｒＨＡ単独で免疫し、チャレンジに続く感染の結果として、全てのマウスが、顕著な量の体重を喪失し、病的状態を示した。よって、ｉ．ｎ．のＩＶＸ−９０８＋ｒｒＨＡは、マウスをチャレンジ後の死および病的状態から防護する。
【００６３】
表５ａは、実施例１１に記載されるように、ＩＶＸ−９０８ありまたはなしで、２μｇのｒＨＡでのマウスの免疫によって誘発された全身性応答および粘膜応答を示す。ＨＩ力価は、血球凝集を阻害する血清の最大希釈の逆数であり、そして免疫グロブリン（ＩｇＧまたはＩｇＡ）レベルは、括弧内の９５％信頼限界を有する相乗平均濃度として表される。ＮＤ＝検出されなかった。
【００６４】
【表５Ａ】
2004521925.tif 000009
表５ｂは、２μｇのワクチンまたはコントロール材料で免疫したマウス由来の脾臓Ｔ細胞のインビトロ刺激後、培養上清中に放出されたＩＦＮ−γおよびＩＬ−５の量（ｐｇ／ｍｌ；３連で行った決定）を示す。脾細胞を、不活化されたマウス適応Ａ／Ｔａｉｗａｎインフルエンザウイルスで再刺激した。
【００６５】
【表５Ｂ】
2004521925.tif 000010
（実施例１２：ＩＶＸ−９０８／Ｂｅｔ  ｖ  １ａアレルゲンの鼻処方による、血清抗体および粘膜抗体の誘導ならびに２型から１型への免疫応答のシフト）
Ｈｉｓ−Ｔａｇ（Ｈｉｓ）をアミノ末端に付加した組換えＢｅｔ  ｖ  １ａタンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉに発現させ、ニッケルカラムでのアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、２８μｌ（表６）または３６μｌ（表７）の容量で、精製組換えタンパク質としての１０μｇ  Ｂｅｔ  ｖ  １ａ（ｒＢｅｔ  ｖ  １ａ）またはカバノキ花粉抽出物（ＢＰＥｘ）（Ｇｒｅｅｒ  Ｌａｂｓ．Ｉｎｃ．）を単独でか、または１０μｇ  ｒＢｅｔ  ｖ  １ａもしくはＢＰＥｘ＋１０μｇのＩＶＸ−９０８（表６および７）の混合物として、のいずれかで、２週間（表７）または３週間（表６）後に３回経鼻免疫した。コントロールマウスに、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）での鼻内免疫を与えた。他のマウスに、腹腔内に１５０μｌの容量で、２ｍｇ  リン酸アルミニウム中１０μｇ  Ｂｅｔ  ｖ  １ａを０日目および２１日目に（表６）、または１ｍｇリン酸アルミニウム中３μｇ  カバノキ花粉抽出物（ＢＰＥｘ）（Ｇｒｅｅｒ  Ｌａｂｓ．Ｉｎｃ．）を０日目に（表７）与えた。最終免疫の１週間後（表６）または３週間後（表７）、心臓穿刺によって動物から採決し、続いて肺洗浄液を得た。血清中のＢｅｔ  ｖ  １ａ特異的ＩｇＥ（ＯｐｔＥＩＡ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＥ  Ｓｅｔ；ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）、ＩｇＧ、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ、ならびに気管支−肺胞洗浄中のＩｇＡおよび総ＩｇＡを、ＥＬＩＳＡによって測定した。分泌したＩＦＮ−γおよびＩＬ−５のレベルを、１０μｇ／ｍｌ  Ｂｅｔ  ｖ  １ａでインビトロ再刺激したそれぞれ２日後および３日後の脾細胞培養物（１０×１０６脾細胞／ｍＬ）からの上清において決定した。サイトカインを、ＥＬＩＳＡ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ；Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）によって検出した。表８において、例は、０日目、１７日目および２９日目に１０μｇカバノキ花粉抽出物（ＢＰＥｘ）（Ｇｒｅｅｒ  Ｌａｂｓ．Ｉｎｃ．）単独または１０μｇのＩＶＸ−９０８との混合物として３回鼻免疫した後に、２ｍｇのリン酸アルミニウム中１０μｇ  ｒＢｅｔ  ｖ  １ａの単回用量で７１日目に腹腔内注入したマウスにおけるサイトカイン誘導について示す。表９において、例は、２ｍｇのリン酸アルミニウム中１０μｇ  Ｂｅｔ  ｖ  １ａの単回用量で腹腔内にて以前に感作させたマウスにおける、ＩＶＸ−９０８ありまたはなしでｒＢｅｔ  ｖ  １ａまたはＢＰＥｘの３回の免疫後のサイトカイン誘導について示す。
【００６６】
ＩＶＸ−９０８／ｒＢｅｔ  ｖ  １ａまたはＩＶＸ−９０８／ＢＰＥｘ混合物を用いた鼻内免疫後のＴ細胞サイトカイン応答ならびに血清免疫グロブリン応答および粘膜免疫グロブリン応答についての結果を、表６、７、８および９に示す。
【００６７】
未投薬マウスに鼻腔投与されたＩＶＸ−９０８アジュバントｒＢｅｔ  ｖ  １ａまたはＩＶＸ−９０８アジュバントＢＰＥｘ（表６および７）は：
１．Ｂｅｔ  ｖ  １ａアレルゲンにより誘導されるＴ細胞応答を、２型表現型に偏っていたものをより高度なまたは大部分の１型表現型へと指向させた。これは、ＩＬ−５の産生の低下（ＩＶＸ−９０８／ＢＰＥｘについて）または維持（ＩＶＸ−９０８／ｒＢｅｔ  ｖ  １ａについて）を伴う、ｒＢｅｔ  ｖ  １ａまたはＢＰＥｘ単独またはリン酸アルミニウムを有するｒＢｅｔ  ｖ  １ａまたはＢＰＥｘ処方アレルゲンを投与されたマウスと比較して、増強されたＩＶＸ−９０８処方アレルゲンを投与されたマウス由来の脾臓細胞によるＩＦＮ−γの産生に起因した、
２．単独で投与されるｒＢｅｔ  ｖ  １ａまたはＢＰＥｘと比較して、Ｂｅｔ  ｖ  １ａ特異的血清ＩｇＧの産生を増強した、そして
３．リン酸アルミニウム中のｒＢｅｔ  ｖ  １ａにより誘導されるレベルと比較して、レベルが３７〜４３倍減少した血清ＩｇＥレベルを生じ、免疫レジメンは、抗原を用いるその後のチャレンジの際のアレルギー応答のために動物を感作することが知られている。
【００６８】
（表６．鼻経路を介する、１０μｇのｒＢｅｔ  ｖ  １ａ単独かもしくはＩＶＸ−９０８（１０μｇ  １：１  タンパク質：ＬＰＳ）を用いて処方された１０μｇのｒＢｅｔ  ｖ  １ａ、または実施例１０に記載される腹腔内経路による２ｍｇのリン酸アルミニウムを伴う１０μｇのｒＢｅｔ  ｖ  １ａによる、マウスサイトカインならびに血清抗体および粘膜抗体の誘導）
【００６９】
【表６】
2004521925.tif 000011
ＩＦＮ−γおよびＩＬ−５についての結果は、１群あたり５匹のマウスからプールされた脾臓由来の３連の培養物についての中間ｐｇ／ｍＬとして表される。血清ＩｇＧは、ＩｇＧ１力価およびＩｇＧ２ａ力価の合計として表される。肺ＩｇＡは、％全ＩｇＡとして表される特異的ＩｇＡとして示される。全ての免疫グロブリン力価を、１群あたり７〜１０匹のマウス（ＩｇＧおよびＩｇＥ）または１群あたり５匹のマウス（ＩｇＡ）由来のサンプルについての相乗平均力価を使用して計算した。ＩＶＸ−９０８を、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＬＰＳを用いて調製した。
【００７０】
（表７．実施例１２に記載のように鼻経路を介する、１０μｇのカバノキ花粉抽出物単独または１０μｇのＩＶＸ−９０８で処方された１０μｇのカバノキ花粉抽出物（ＢＰＥｘ）による、マウスサイトカインおよび血清ＩｇＧの誘導。ＢＰＥｘ＋ａｌｕｍについて、マウスに１ｍｇのリン酸アルミニウムと一緒に、３μｇのカバノキ花粉抽出物の単回胃腸内注射の免疫をした。）
【００７１】
【表７】
2004521925.tif 000012
ＩＦＮ−γおよびＩＬ−５についての結果は、１群あたり４〜５匹のマウスからプールされた脾臓由来の３連の培養物についての中間ｐｇ／ｍＬとして表される。血清ＩｇＧは、ＢＰＥｘ＋ＩＶＸ−９０８群を除いて１５匹のマウスからプールされた血清についてのものであり、ここで１５匹の個々のマウスからの結果の相乗平均を計算した。ＢＰＥｘ＋ＩＶＸ−９０８群についての血清ＩｇＥは、１５匹の個々のマウス由来の血清からの相乗平均を表し、一方ＢＰＥｘ＋Ａｌｕｍの結果は、８６匹の個々のマウスについての相乗平均である。ＢＰＥｘおよびＰＢＳについての血清ＩｇＥレベルは、１５匹の動物からプールされた血清において測定された。ＩＶＸ−９０８を、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＬＰＳを用いて調製した。
【００７２】
ｒＢｅｔ  ｖ  １ａおよびａｌｕｍを注射する前にマウスの鼻腔に投与されたＩＶＸ−９０８アジュバントＢＰＥｘ（表８）は：
１．単独で投与されたＢＰＥｘと比較して、１型サイトカインＩＦＮ−γの産生を１０倍増加し、
２．そして、２型サイトカインＩＬ−５のレベルをわずかに低下させた。
【００７３】
（表８．実施例１２に記載のように、１０μｇのカバノキ花粉抽出物単独またはＩＶＸ−９０８（１０μｇタンパク質：ＬＰＳ）と１：１で処方された１０μｇのカバノキ花粉抽出物を用いた３回の鼻腔免疫後に、ｒＢｅｔ  ｖ１ａおよびａｌｕｍを腹腔内注射されたマウスにおけるサイトカインの誘導）
【００７４】
【表８】
2004521925.tif 000013
ＩＦＮ−γおよびＩＬ−５についての結果は、１群あたり８〜１０匹の個々のマウス由来の脾臓培養物からの相乗平均（ｐｇ／ｍＬ）として表される。ＩＶＸ−９０８を、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＬＰＳを用いて調製した。
【００７５】
ｒＢｅｔ  ｖ  １ａで感作されたマウスの鼻腔に投与されたＩＶＸ−９０８アジュバントｒＢｅｔ  ｖ  １ａまたはＢＰＥｘ（表９）は：
１．それぞれ対応する単独のアレルゲン比較して、ＩＶＸ９０８／ｒＢｅｔ  ｖ  １ａおよびＩＶＸ−９０８／ＢＰＥｘに対してそれぞれ、４．７倍および３３倍の１型サイトカイン（ＩＦＮ−γ）の産生を増加し、そして
２．２型サイトカイン（ＩＬ−５）のレベルを低下させた。
【００７６】
（表９．実施例１２に記載される、ｒＢｅｔ  ｖ  １ａで感作されたマウスにおいて、１０μｇのｒＢｅｔ  ｖ  １ａまたはカバノキ花粉抽出物単独または１０μｇのＩＶＸ−９０８と共に鼻に投与された１０μｇのｒＢｅｔ  ｖ  １ａまたはカバノキ花粉抽出物によるマウスサイトカインの誘導）：
【００７７】
【表９Ａ】
2004521925.tif 000014
ＩＦＮ−γおよびＩＬ−５についての結果は、１群あたり４〜５匹のマウス由来の脾臓培養物からの相乗平均（ｐｇ／ｍＬ）として表される。ＩＶＸ−９０８をＳ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ＬＰＳを用いて調製した。
【００７８】
表６、７、８および９におけるデータは、ＩＶＸ−９０８と共に処方されたアレルゲン（精製された組換えタンパク質または抽出物）が、マウスにおいて１型免疫応答を誘導することを実証する。これらの処方物は、その後にｒＢｅｔ  ｖ  １ａおよびａｌｕｍの感作注射を腹腔内に注射されたマウスにおいて１型サイトカインの産生を維持した。重要なことに、これらの処方物はまた、前もって感作されるかまたはアレルゲンに対してアレルギー性にされたマウスにおける１型サイトカインの産生を増強した。これらの結果は、アレルギー性疾患のための治療的ワクチンとしてのＩＶＸ−９０８／アレルゲン処方物の潜在的な有用性を示唆する。
【００７９】
（実施例１３：弱免疫原に対する免疫応答の増強）
鼻腔内（ｉ．ｎ．）経路または粘膜内（ｉ．ｍ．）経路のいずれかにより、オボアルブミン（ＯＶＡ、弱い免疫原性の可溶性たんぱく質）を１００μｇ〜５μｇの減少する量で用いて、１μｇのＩＶＸ−９０８（プロテオソームタンパク質：ＬＰＳ  １：１、Ｐ．ｓｈｉｇ  ＬＰＳを使用）を用いてまたは用いずに、上記のようにマウスを免疫した。０日目および１４日目に免疫した後、２１日目にマウスを安楽死させ、そして血清、肺洗浄液および脾臓を分析用に収集した。血清ＧＭＣを図６に示す。
【００８０】
このデータは、非アジュバントＯＶＡが、鼻腔内経路または粘膜内経路のいずれかにより１００μｇのＯＶＡでマウスを免疫した場合でさえ、弱い免疫原性であり、そして検出可能な血清ＩｇＧ力価をほとんど惹起しないということを確認する。しかし、ＩＶＸ−９０８と混合される場合、より高濃度（２５μｇ以上）のＯＶＡにもかかわらず、両方の免疫経路で６０倍を超える力価の上昇が観察された。免疫マウスのいずれにおいても、粘膜応答は、検出されない。ＯＶＡまたはＯＶＡ＋ＩＶＸ−９０８により惹起されるサイトカインプロフィールの分析は、鼻腔内で免疫された場合に、ＩＶＸ−９０８の同時投与が、脾臓細胞由来の上昇したレベルのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＩＬ−５の分泌を誘導することを示した。従って、ＨＡがＩＶＸ−９０８と共に投与された場合に１型表現型へ切り替わる、２型表現型応答を示すサイトカインの放出を誘導したＨＡとは異なり、弱い免疫原性の可溶性ＯＶＡのアジュバント調整（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）は、バランスのとれた１型／２型表現型応答の誘導と関連するようであった。
【００８１】
（実施例１４：惹起された免疫性に対するＩＶＸ−９０８中のＬＰＳの量を変化させる効果）
惹起された免疫性に対するＩＶＸ−９０８中のＬＰＳに対するプロテオソームの比率を変えることの効果を決定するために、上記のように鼻腔内で１μｇ（ＬＰＳとして）のＩＶＸ−９０８（１：１または１：２のプロテオソームおよびＰ．ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｓ  ＬＰＳの複合体）と混合された３μｇのＨＡ（Ｈ３Ｎ２株Ａ／Ｓｙｄｎｅｙ）を用いてマウスを免疫する研究を行った。安楽死の際に、血液および肺洗浄液を収集し、そしてそれぞれ特異的ＩｇＧまたはＩｇＡについてＥＬＩＳＡで分析した。結果を表９に示す。これらの結果は、両方のＩＶＸ−９０８が実質的に同一レベルの特異的血清ＩｇＧを惹起するが、異なるＩＶＸ−９０８により惹起された粘膜ＩｇＡの間には非常に有意な差（Ｐ≦０．００１）が存在することを示す。明らかに、Ｐ．ｓｈｉｇｅｌｌｏｉｄｓ  ＬＰＳと１：１で複合体化されたプロテオソームを含むＩＶＸ−９０８は、肺洗浄液においてより高い力価の特異的粘膜ＩｇＡを惹起した。従って、１：２のプロテオソームタンパク質：ＬＰＳ複合体よりも高い粘膜アジュバント活性を有する。
【００８２】
表９は、ＨＡ＋ＩＶＸ−９０８（Ｐｒ：ＬＰＳ  １：１または１：２）を用いて鼻腔内で免疫されたマウス由来の血清および肺洗浄液における、相乗平均濃度（カッコ内は９５％信頼限界）として表される免疫グロブリンレベル（ＩｇＧまたはＩｇＡ）を示す。
【００８３】
【表９Ｂ】
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（実施例１５：異なる生物由来のＬＰＳを用いて調製されたＩＶＸ−９０８のアジュバント効果）
新規生物由来のＬＰＳに対してプロテオソームを複合体化することにより作製されたＩＶＸ−９０８のアジュバント活性（ａｄｊｕｖａｎｔｉｃｉｔｙ）を決定するために、非病原性のＥ．ｃｏｌｉ（０１７）由来のＬＰＳおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｓｓｅｎ由来のＬＰＳを使用してＩＶＸ−９０８調製物を作製した。ＩＶＸ−９０８調製物を、プロテオソームおよびＬＰＳを３：１、１：１および１：３（ｗ／ｗ）の比でＥｍｐｉｇｅｎの存在下で混合し、そして透析カセットでの透析により洗浄剤を除去することにより作製した。３μｇまたは０．３μｇ（ＬＰＳとして）のＩＶＸ−９０８と混合された３μｇのＨＡ（Ｂ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ）を用いて０日目および１４日目にマウスを鼻腔内免疫した。コントロールマウスは、３μｇのＨＡを鼻腔内に受容した。２１日目の安楽死の際に、血液を収集し、そして特異的ＩｇＧについてＥＬＩＳＡで分析した。結果を表１０に示す。これらの結果は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種以外の病原体由来のＬＰＳで作製したＩＶＸ−９０８調製物が、ワクチン抗原に対する免疫応答を増強し得るということを示す。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＰＳを用いて調製されたＩＶＸ−９０８については、０．３μｇのＬＰＳの用量におけるＬＰＳに対して１：１および１：３の比のプロテオソームが、鼻腔内に単独で投与されたＨＡと比較して、抗ＨＡ血清ＩｇＧ応答の有意な（Ｐ≦０．００１）増強を与えた。試験された両方の用量におけるＰｒ：ＬＰＳ（Ｓ．ｅｓｓｅｎ）の全ての比率が、単独で鼻腔内に投与されたＨＡに対して血清抗ＨＡ応答の有意な（Ｐ≦０．００１）増強を惹起した。Ｓ．ｅｓｓｅｎを用いて作製されたＩＶＸ−９０８についての結果は、Ｓｈｉｇｅｌｌａ種由来のＬＰＳを用いて作製されたＩＶＸ−９０８について得られた結果に匹敵した。
【００８４】
表１０は、異なるグラム陰性菌由来のＬＰＳを異なるＰｒ：ＬＰＳ比で含有するＨＡ＋ＩＶＸ−９０８調製物で鼻腔内免疫された、１群あたり８匹のマウスについての相乗平均濃度（μｇ／ｍＬ）（括弧内９５％信頼限界）として表された血清抗ＨＡ  ＩｇＧ力価を示す。
【００８５】
【表１０】
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本発明の開示を理解するかまたは完成するのに必要な程度まで、本明細書中で言及される全ての刊行物、特許および特許出願は、各々が個々に援用される程度と同じ程度まで本明細書中に参考として明白に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１Ａ】図１Ａは、プロテオソームバルク材料の製造の実施形態（フローチャート１Ａ）を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、プロテオソームバルク材料の製造の実施形態（フローチャート１Ｂ）を示す。
【図２】図２は、Ｓ．ｆｌｅｘｎｅｒｉ  ２ａ  ＬＰＳの製造スキームを示す（フローチャート２）。
【図３】図３は、ＩＶＸ−９０８プロテオソーム−ＬＰＳアジュバントの製造スキームを示す（フローチャート３）。
【図４Ａ】図４Ａは、一定量のＨＡを異なる量のＩＶＸ−９０８と混合し、そしてマウスの鼻内を免疫するために使用した場合に誘発された特定の血清ＩｇＧのレベルを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、一定量のＨＡを異なる量のＩＶＸ−９０８と混合し、そしてマウスの鼻内を免疫するために使用した場合に誘発された特定の肺洗浄ＩｇＡのレベルを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、一定量のＩＶＸ−９０８（１μｇまたは０．３μｇのいずれか）を異なる量のＨＡと混合し、そしてマウスの鼻内を免疫するために使用した場合に誘発された特定の血清ＩｇＧのレベルを示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、一定量のＩＶＸ−９０８（１μｇまたは０．３μｇのいずれか）を異なる量のＨＡと混合し、そしてマウスの鼻内を免疫するために使用した場合に誘発された特定の肺洗浄ＩｇＡのレベルを示す。
【図５】図５Ａは、生存している、マウスに適合された、ホモ型の改変インフルエンザウイルスを用いた、免疫マウス（ｎ＝１０）またはコントロールマウス（ｎ＝９）の生存チャレンジの数を示す。図５Ｂは、各群における生存の平均重量損失（インフルエンザウイルスによる感染に関連する死亡率の測定）を示す。誤差のバーは、平均に対する標準誤差を示す。
【図６】図６は、ＩＶＸ−９０８を用いた場合と用いない場合の、オボアルブミンによりｉ．ｎ．またはｉ．ｍ．免疫したマウスの血清における特定の抗体応答を示す。力価は、特定のＩｇＧ（μｇ／ｍｌ）の濃度の幾何学的平均として表され、９５％の信頼限界が誤差のバーにより示される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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