(57)【要約】本発明は以下のステップを含むマイクロアレイを得る方法に関する：−　固体支持体の表面上にアルデヒド官能基を形成させるために前記固体支持体の表面を前記表面上に存在するオレフィン基の酸化に供し、−　関心のある相補的標的生物又は化学分子の検出、同定、定量及び／又は回収のために設計された捕獲分子を前記アルデヒド官能基上に共有結合させる（ただし、前記共有結合は固体支持体表面１ｃｍ２当たり少なくとも４個の分離領域の密度を含むアレイを生じ、前記分離表面領域の各々は一種類の捕獲分子と結合されている）。【選択図】図２
2004506922.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップを含むマイクロアレイを得る方法：
−　固体支持体の表面上にアルデヒド官能基を形成させるために前記固体支持体の表面を前記表面上に存在するオレフィン基の酸化に供し、
−　関心のある相補的標的生物又は化学分子の検出、同定、定量及び／又は回収のために設計された捕獲分子を前記アルデヒド官能基上に共有結合させる（ただし、前記共有結合は固体支持体表面１ｃｍ２当たり少なくとも４個の分離領域の密度を含むアレイを生じ、前記分離表面領域の各々は一種類の捕獲分子と結合されている）。
【請求項２】
前記酸化が水溶液中で、好ましくは過マンガン酸塩及び／又は過ヨウ素酸塩水溶液中で行われることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
固体支持体表面が前記表面上へのオレフィン基の付加によって予め変性されたものであることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
固体支持体表面がガラス層から作られていることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項５】
ガラス層の表面がオレフィンシランの付加によって変性されることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
捕獲分子が生物捕獲分子であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
生物捕獲分子が抗体（又はその超可変部）／抗原（又はハプテン）、受容体／リガンド、及びヌクレオチド配列の相補鎖からなる群から選択される結合対の第一メンバーからなる群から選択されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
捕獲分子が組合せ化学によって得られる標的化学分子に特異的に結合することができる化学分子であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
関心のある相補的標的生物又は化学分子の結合検出、同定、定量及び／又は回収のために設計された捕獲分子を結合するのに好適なアルデヒド官能基を酸化後形成することができるオレフィン基を担持する少なくとも一つの表面を有するマイクロアレイであって、前記共有結合が固体支持体表面１ｃｍ２当たり少なくとも４個の分離領域の密度を含むアレイを生じ、前記分離表面領域の各々は一種類の捕獲分子と結合されているマイクロアレイ。
【請求項１０】
請求項１−８のいずれか一項記載の方法によって得られる請求項９記載のマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はマイクロアレイの構築を改良するために固体支持体表面の官能基化によって分子（捕獲ヌクレオチド配列、捕獲抗体、受容体等）を結合することができる固体支持体の表面活性化を得る方法に関する。
【０００２】
従来技術
マイクロアレイはサンプル中、好ましくはヌクレオチド配列、リガンド、抗体の如き生物分子中に存在する多数の異なる標的分子を同時検出するための強力なツールである。ＤＮＡバイオチップについては、アレイ上に存在する分子の結合特性は捕獲ヌクレオチド配列の数、配列及び長さ並びにそれらが支持体に固定される方法に主に依存する。ＤＮＡバイオチップ技術は固体支持体上に固定されたＤＮＡ分子の顕微鏡スケールでのアレイを利用する。バイオチップマイクロアレイの適用は多数であり、遺伝子発現分析、多型又は突然変異の検出、分子診断、ＤＮＡ配列決定及び遺伝子探索の如き生物医学的分析のために用いられる（Ｒａｍｓａｙ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６， ｐ．４０（１９９８））。
【０００３】
かかるＤＮＡマイクロアレイは様々な方法によって製造される。ＤＮＡは組合せ化学を用いることによってガラス表面上にその場で合成されることができる（Ｐｅａｓｅ等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ｐ．５０２２（１９９４））。この方法は１０−２５塩基の大きさのオリゴヌクレオチドの群からなるＤＮＡマイクロアレイを作り出す。一方、ロボットを用いたマイクロ付着によって製造されるＤＮＡマイクロアレイは小オリゴヌクレオチドから例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅後に得られる０．５−２ｋｂのヌクレオチド配列までのいかなる長さであることができる（Ｚａｍｍａｔｔｅｏ等、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５３， ｐ．１８０（１９９７））。機械的なマイクロスポッティングは少量のＤＮＡを既知の領域に送り出すために受動的（ピン）又は能動的（インクジェットノズル）装置を用いる。
【０００４】
ガラスは主にその低い蛍光、透明度、低コスト及び高温及び多くの化学試薬に対する耐性のため、ＤＮＡバイオチップ用の一般的な支持体である（Ｃｈｅｕｎｇ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１， ｐ．１５（１９９９））。それは多孔質膜及びゲルパッドに比べて多数の実用上の利点をも有する。液体は支持体の表面を貫通できないので、標的ヌクレオチド配列は孔中に拡散することなしに対応する捕獲ヌクレオチド配列に直接接近する（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ ２１， ｐ．５（１９９９））。顕微鏡スライドは取扱いが容易で自動読み取り機に適合しやすいので研究室で現在用いられている。
【０００５】
ガラス表面特性の変性（ポリリジンの付加による（Ｓｃｈｅｎａ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０， ｐ．４６７（１９９５））又は疎水性被覆による（Ａｌｌｅｍａｎｄ等、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７３， ｐ．２０６４（１９９７））はＤＮＡヌクレオチド配列の直接結合を得るために提案されている。しかし、これらの場合においてはＤＮＡ鎖は高塩又は高温条件下で表面から除去されやすい。従って、共有結合方法が好まれる。ＤＮＡは紫外線照射によって架橋されてＤＮＡ配列中のチミジン残基と官能基化されたスライド上に付加された正に帯電したアミン基との間に共有結合を形成することができる（Ｄｕｇｇａｎ等、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ２１， ｐ．１０（１９９９））。しかし、ＤＮＡ分子の付着点の位置及び数はよく規定されておらず、従ってハイブリダイゼーションに利用できる長さ及び配列は固定条件によって異なることがあり得る。代替法はＤＮＡ分子をその末端の一つによって固定することである。かくしてカルボン酸化されたＤＮＡ（Ｊｏｏｓ等、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４７， ｐ．９６（１９９７））又はリン酸化されたＤＮＡ（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ等、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８， ｐ．１３８（１９９１））はアミノ化された支持体上にそれぞれ結合されることができる（Ｇｈｏｓｈ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５， ｐ．５３５３（１９８７））。他の代替法は、アミノ末端オリゴヌクレオチドをイソチオシアネート活性化されたガラスに（Ｇｕｏ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２， ｐ．５４５６（１９９９））、アルデヒド活性化されたガラスに（Ｓｃｈｅｎａ等、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３， ｐ．１０６１４（１９９６））又はエポキシドで変性された表面に（Ｌａｍｔｕｒｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２， ｐ．２１２１（１９９４））結合している。チオール変性された又はジスルフィド変性されたオリゴヌクレオチドはヘテロ二官能性架橋剤を介してアミノシラン上に（Ｃｈｒｉｓｅｙ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４， ｐ．３０３１（１９９６））又は３−メルカプトプロピルシラン上に（Ｒｏｇｅｒｓ等、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６６， ｐ．２３（１９９９））結合された。しかし、これらの場合においては結合は高温では不安定であった。最近、一層手の込んだ化学がＤＮＡが付着できるガラス上につながれた分子の構築のために提案されている（Ｂｅｉｅｒ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７， ｐ．１９７０（１９９９））。
【０００６】
表面に共有結合的に付着されたつながれた一本鎖ヌクレオチド配列の接近しやすさが長いヌクレオチド配列の特異性と組合わせられる状況は、ＤＮＡバイオチップの分野においてかなりの改良を与えるだろう。
【０００７】
最近、Ｚａｍｍａｔｔｅｏ等（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８０， ｐ．１４３（２０００））はガラス表面上にＤＮＡを共有結合するのに現在用いられているいくつかの結合方法を比較した。彼らはカルボン酸又はアミン変性されたガラス支持体上のアミノ化された、カルボン酸化された及びリン酸化されたＤＮＡのカルボジイミドによって媒介される結合をテストした。これらの方法はアルデヒドで活性化されたガラスへのアミノ化されたＤＮＡの結合と比較された。彼らは、アルデヒド変性された表面へのアミノ化されたＤＮＡの固定は、結合効率、結合剤の不在下での反応速度の観点でＤＮＡマイクロアレイを構築するための最良の結合手順を与えると結論した。ガラス以外にポリマーも微小流体工学技術及び「チップ上の研究室」という概念の発達により生物学的アッセイの微小化のために及びマイクロアレイのために用いられることが増大している。アッセイを行うためには生物又はリガンド分子はポリマーの表面上に固定されなければならず、ポリマー活性化の簡単な方法の要求は価値があるであろう。
【０００８】
発明の目的
本発明は固体支持体の表面活性化（官能基化又は変性）を得る新規の方法を提供することを目的とする。前記方法は生物又は化学分子の共有結合のために及び改良されたバイオチップ又はケモチップマイクロアレイの構築のために好適な前記固体支持体上の官能基を導入するのが容易かつ迅速である。
【０００９】
本発明の好ましい目的は、前記方法による改良されたチップマイクロアレイを提供することである。これは前記チップのマイクロアレイ上の標的分子の検出感度を増大させ（増大した結合率、反応速度等）、それらの同定及び／又は定量及び／又は回収を可能にする。
【００１０】
発明の概要
本発明は固体支持体表面に存在する化学基の酸化によって固体支持体の表面にアルデヒド官能基を形成させることによる固体支持体表面の活性化（変性又は官能基化）方法に関する。前記アルデヒド官能基は生物又は化学分子との共有結合用に好適である。
【００１１】
本発明による固体支持体は検出、定量及び／又はサンプルから回収される相補分子（標的ヌクレオチド配列、標的抗体又は抗原構造、標的受容体又はリガンド等）に特異的な捕獲分子（捕獲ヌクレオチド配列、捕獲抗原又は抗体、捕獲リガンド又は受容体等）を特定位置で含むマイクロアレイ、特に「バイオチップ」又は「ケモチップ」用の好適な固体支持体である。
【００１２】
マイクロアレイは組合せ化学によって得られる分子の如き特定化学分子の検出、定量及び／又は回収用の同一原理に基づくケモチップの製造用にも好適である。
【００１３】
従って、本発明は以下のステップを含むマイクロアレイを得る方法に関する：
−　固体支持体の表面上にアルデヒド官能基を形成させるために前記固体支持体の表面を前記表面上に存在する化学基の酸化に供し、そして
−　関心のある相補的標的生物又は化学分子の検出、同定、定量及び／又は回収のために設計された捕獲分子を前記アルデヒド官能基上に共有結合させる（ただし、前記共有結合は固体支持体表面１ｃｍ２当たり少なくとも４個、１０個、１６個、２０個又はそれ以上の分離領域の密度を含むアレイを生じ（得るために形成させる）、前記分離表面領域の各々は一種類の捕獲分子と結合されている。
【００１４】
分離領域（又はスポット）の位置は好ましくは１０〜５００μｍの直径を有し、同様の大きさの距離によって分離されているので、固体支持体のアレイは１ｃｍ２の表面上に１０〜２５００００の分離領域（好ましくは１ｃｍ２の表面上に１０〜１０００スポット）を含む。
【００１５】
しかし、１μｍ以下の小ささの分離領域又はスポットを製造することも可能であり、その上に特定の「捕獲分子」が固定される。
【００１６】
好ましくは、本発明による方法においてはガラス固体支持体を用いてもよく、その上に酸化に先立ってオレフィンシランがガラス固体支持体の表面上に存在するヒドロキシル官能基上にまず結合される。
【００１７】
本発明の他の実施態様によれば、固体支持体はオレフィン基を含むポリカーボネート、ポリエチレン又はＰＰＭＡポリマーの如き（好ましくは透明の）プラスチックポリマーであるか又は例えばクロロシラン誘導体の付加による、オレフィン分子を担持する層又は樹状化合物の物理的付着によって又は化学（結合）反応によってオレフィン基が上に組入れられている固体支持体である。
【００１８】
好ましくはアルデヒド官能基の形成を可能にする固体支持体表面の酸化ステップは緩衝された水溶液中で低濃度の過マンガン酸塩及び過ヨウ素酸塩の存在下で得られる。
【００１９】
しかし、当業者によって選択される他の穏和な酸化剤であって同様のアルデヒド酸化生成物を与える酸化剤も本発明による方法で用いることができる。アルデヒド官能基は実施例１０に記載の通りＸＰＳ技術又はトレンステストによって固体支持体上で同定される。
【００２０】
本発明によれば、標的分子は血液、尿、脈管、だ液、膿、血清、組織、発酵溶液又は培養培地から抽出された臨床サンプルの如きサンプル（生物サンプル）中に存在することができる。前記標的化合物は本発明によるマイクロアレイ上でのそれらの検出及び／又は定量前に当業者によって公知の方法によって単離、開裂、精製及び／又は（もし必要ならば）増幅されることが好ましい。
【００２１】
それ故、マイクロアレイ上に存在する前記捕獲分子は前記相補的標的分子に対して特異的であり、結合対の部分であることが好ましい。この例としては、ヌクレオチド配列の相補鎖、抗体又は抗体の活性超可変性部分／抗原構造又はハプテン、受容体／リガンド、ビオチン／ストレプトアビジン分子（これは所望により他の化学又は生物分子に結合されている）又は分子の生物又は化学ライブラリーの同定、特性決定、スクリーニング及び回収のために好適な、遺伝子発現分析、多型又は突然変異検出、分子診断、ＤＮＡ配列決定及び遺伝子特性決定の如き生物医学分析のために好適ないかなる一対の結合システムである。
【００２２】
本発明は本発明による方法に従って得られるマイクロアレイ固体支持体、及び当業者には周知の方法による、好ましくは国際特許出願ＰＣＴ／ＢＥ００／０００５４に記載の方法による関心のある標的生物又は化学分子の検出、定量及び／又は回収のためのそれらの使用にも関する。
【００２３】
本発明は添付の図面を参照して以下の非限定的実施例において詳細に説明される。
【００２４】
図面の簡単な説明
図１はガラス表面についての官能基化反応の模式図である。
【００２５】
図２はアミノ化されたＤＮＡヌクレオチド配列に対する官能基化されたガラスの固定能力を示す。
【００２６】
図３はタンパク質Ａと反応させられた、官能基化されたガラスに滴下された後の捕獲された抗体の固定率を示す。
【００２７】
発明の詳細な記述
バイオチップの制約の一つは、前記バイオチップ上の生物分子の検出が比色又は蛍光方法によって行われるということである。透明又は蛍光のようなプラスチックポリマーの物理特性は、有機溶媒を用いることによって容易に変更される。この欠点はコンパクトディスク支持体（ＣＤｓ）に用いられるポリカーボネートプラスチックにも存在し、有機溶媒によって容易に変更される。
【００２８】
本発明によれば、前記固体支持体表面上に存在するオレフィン基は緩衝水溶液中の低濃度の過マンガン酸塩及び過ヨウ素酸塩の存在下でアルデヒドへと酸化される。これはポリマーの化学又は物理特性を損なうことなしに大部分のプラスチックポリマーに有利に適用されることができる。
【００２９】
ＰＭＭＡ又はポリエチレンの如き他の透明ポリマーも本発明の方法による官能基化に極めて適している。
【００３０】
本発明は支持体材料がオレフィン基を含むか又は支持体表面でのかかるオレフィン担持分子の化学反応又は物理的付着によって支持体表面にこれらのオレフィン基を最初に組入れられるならば、大部分の支持体材料に容易に適用することができる。
【００３１】
本発明の一つの好ましい実施態様においては、ガラスはクロロシラン誘導体を用いたオレフィン基の付着及び次にこれらのオレフィン基のアルデヒドへの酸化によってバイオチップマイクロアレイを構築するための支持体として用いられる（図１）。好ましくは、オレフィン基は少なくとも２原子のスペーサーによって固体支持体から距離を置かれている。実施例４は四又は六つの炭素原子鎖の末端に存在するオレフィン基がガラスのヒドロキシルからスペーサーとして一つの炭素しか有しないオレフィン基よりもずっと良好なハイブリダイゼーション率を与えるということを示す。
【００３２】
本発明の他の実施態様においては、アクリル−ポリアクリル樹脂は同一の方法によって酸化される。これらのアクリル−ポリアクリル樹脂はＣＤのポリカーボネートの如き他の支持体上に存在する場合、成功裏に酸化された。有機溶媒を用いないという事実は、この方法をポリカーボネートの如き支持体用に十分適合させる。本発明は長い分子又は樹状分子の末端に存在するオレフィン基の酸化に特に適している。何故なら、表面からのスペーサーの存在はＤＮＡハイブリダイゼーション率にとって極めて好適であることが見出されたからである（実施例４も参照）。
【００３３】
オレフィン基のアルデヒドへの穏和な酸化は、オゾン分解の如き酸化方法を用いても行うことができる。しかし、得られた結果はあまり定量的でなく、約２０％の減少があった。しかし、かかる方法を工業規模での製造に移行すると、過マンガン酸塩／過ヨウ素酸塩での実施よりもオゾン分解法での実施の方がずっと複雑である。その主要な理由は、酸化が有機溶媒中で行われる必要があり、良く調節された低温が過マンガン酸塩／過ヨウ素酸塩酸化を用いた場合よりもオゾン分解処理を用いた場合において観察されたという事実にある。本発明の好ましい実施態様においては、アルデヒド担持表面はＤＮＡアミノ化捕獲ヌクレオチド配列を付着するために用いることができる。アミノ基とアルデヒドの反応は迅速な反応であり、本発明を少量の溶液を用いて室温で行われ蒸発に供されることによるマイクロアレイ構築に良く適したものにする。０．０５〜０．５ｍｍのスポットを持つマイクロアレイ構築は０．１〜５ｎｌの範囲の小滴又はピン付着小滴を用いた。他の実施態様においては、イミン形成された結合は次に結合を安定化するため及び過剰の遊離アルデヒドを不活性化するためにホウ水素ナトリウム又は他の還元剤と共にインキュベートされることによって還元された。
【００３４】
本発明の他の実施態様においては、分子はアルデヒド表面に結合されており、結合対の第一メンバーである。第二メンバーは生物又は化学サンプル中で検出又は同定又は定量される分子である。
【００３５】
好ましくは、第一メンバーは抗原（ハプテン）又は抗体、リガンド又は受容体、ビオチン又はストレプトアビジンであるが、相補的な又は他の結合分子によって認識されるペプチド、タンパク質又はＤＮＡであることもできる。例えば、支持体に付着されたＤＮＡ特異的配列はＤＮＡ結合タンパク質を検出するために用いることができる。一つの特異的適用は転写因子の検出である。
【００３６】
本発明は同一表面上での多数の結合分子の構築及びその自動化に特に良く適合している。従って、化学物質、ペプチド、リガンド、抗原のライブラリーはロボットによる分子付着が容易であればかかる支持体上に容易に構築される。固体支持体は次に生物学的に構築された分子（クローン、プラスミドバンク又はファージディスプレイ分子）又は化学的に構築された分子のライブラリーをスクリーニングするために容易に用いられる。化学的ライブラリーは分子の組合せ又は平行合成の進歩のために今や容易に構築される。
【００３７】
実施例
材料
エタノール、マレイン酸、ＮａＣｌ及びＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）はＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＮａＢＨ４，Ｔｗｅｅｎ ２０，ストレプトアビジン−Ｃｙ３及びストレプトアビジン−金はＳｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＵＳＡ）から購入した。［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰはＤｕｐｏｎｔ ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ（Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ， ＵＳＡ）から購入した。オリゴヌクレオチドはＥｕｒｏｇｅｎｅｔｅｃ（Ｓｅｒａｉｎｇ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入した。６５μｌのハイブリダイゼーションチャンバーはＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩＮＣ（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ， Ｍａ， ＵＳＡ）から購入した。オリゴｄＴヌクレオチド配列、逆転写酵素Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐ ＩＩ及びＲｎａｓｅ ＨはＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）から購入した。Ｒｎａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤はＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｓｏｎ， ＵＳＡ）から購入した。シリル化（アルデヒド）スライドはＣｅｌｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ， ＵＳＡ）から購入した。
【００３８】
整列機及び比色マイクロアレイ読み取り機はＧｅｎｅｔｉｘ（ＵＫ）からの２５０μｍのピンを用いてＷＯＷ（Ｎａｎｉｎｎｅ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入された。液体シンチレーション分析機ＬＳ ６０００１ＣはＢｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ， ＵＳＡ）から購入された；ＡｑｕａｌｕｍａはＬｕｍａｃ ＬＳＣ（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から購入した。Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ、ｄＮＴＰ、ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ及びビオチン−１６−ｄＵＴＰはＢｏｅｒｈｉｎｇｅｒ（Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入された。ハイブリダイゼーション溶液及び銀青透明溶液はＡＡＴ（Ｎａｍｕｒ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入された。Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼはＢｉｏｔｏｏｌｓ（Ｓｐａｉｎ）から購入された。９６００サーモサイクラーはＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ＵＳＡ）から購入された。マイクロアレイ蛍光読み取り機はＧｅｎｅｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ（Ｗｏｂｕｒｎ ＭＡ， ＵＳＡ）からのアレイスキャナーＧＳＭ　４１８である。アリトリクロロシラン、５−ヘキセニルトリクロロシラン及び７−オクテニルトリクロロシランはＡＢＣＲ（Ｇｅｒｍａｎｙ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）から購入された。過マンガン酸カリウム、過ヨウ素酸ナトリウム及びトルエンはＡｌｄｒｉｃｈ ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗｏｕｋａ， Ｗｉ， ＵＳＡ）から購入された。非処理のガラススライドはＫｎｉｔｔｅｌ ｇｌａｓｅｒ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入された。
【００３９】
実施例１：ガラスの活性化
シラノール官能基を担持するガラスはこの表面をオレフィン基で被覆するためにオレフィンシランカップリング剤とまず結合された。ガラススライドは７−オクテニルトリクロロシランの１０−３Ｍの無水トルエン溶液中に１時間浸漬された。サンプルは次に激しく撹拌された新鮮なトルエン中に浸漬されることによって洗浄されて過剰の物理吸着された分子が除去され、次に１２０℃のオーブン中で１０分間乾燥された。
【００４０】
実施例２：オレフィン酸化
ガラス又はポリマー上に存在するオレフィン官能基は以下のようにして酸化された。スライドは穏和な撹拌下で１時間、２０ｍＭのＮａＩＯ４及び０．５ｎＭのＫＭｎＯ４を含む０．１Ｍのリン酸緩衝液ｐＨ７．５の溶液中に浸漬され、水で２回洗浄され、窒素流下で乾燥され、減圧下で保存された。ガラススライドはこのようにして活性化され、Ｄｉａｇｌａｓｓスライドと称された。
【００４１】
実施例３：Ｄｉａｇｌａｓｓスライドのアミノ化されたＤＮＡヌクレオチド配列の固定能力
サイトメガロウィルスＤＮＡ配列は捕獲ヌクレオチド配列調製用の鋳型として用いられる。捕獲ヌクレオチド配列はプライマー及び他の場所で記載されている方法（Ｚａｍｍａｔｔｅｏ等、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５３， ｐｐ．１８０−１８９（１９９７））を用いたＰＣＲによって合成された。ＭＩＥ４プライマーはその５′末端にアミン基を担持しており、増幅単位の長さは２５７ｂｐである。
【００４２】
放射能活性標識はＰＣＲ増幅中［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰの取り込みによって行われる。増幅されたＤＮＡは未取り込みのヌクレオチド及びプライマーからＨｉｇｈ Ｐｕｒｅ ＰＣＲ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ上のクロマトグラフィーによって分離された。ＤＮＡ濃度は次に２６０ｎｍでのその吸光度によって測定される。断片の純度はアガロースゲル電気泳動によってチェックされる。
【００４３】
アミノ化された捕獲ヌクレオチド配列はＳＳＣ３×緩衝液ｐＨ５、０．０１％ＳＤＳ又はＳＳＣ３×緩衝液ｐＨ５中に３００ｎＭ及び１５０ｎＭの濃度に希釈される。ヌクレオチド配列は整列機を用いて活性化されたガラススライド上に付着される。ガラスは実施例２に記載のようにして得るか又はＴｅｌｅｃｈｅｍ（Ｃｅｌｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｈｏｕｓｔｏｎ， ＴＸ， ＵＳＡ）から購入された。各アレイは１００個のスポット（１０×１０）からなる。スポットは直径が４００μｍであり、二つの隣接スポット間の距離は５００μｍである。２３℃で１時間のインキュベーション後、ガラスサンプルは０．１％ＳＤＳで１回、水で２回洗浄され、次に５分間ホウ水素ナトリウムでインキュベートされ、水で１回洗浄され、最後に沸とう水で３分間洗浄されて一本鎖ヌクレオチド配列をその表面に得る。
【００４４】
コントロールアレイ（１００％固定）はこの洗浄ステップを含まない。アレイを含むガラスサンプルは切断され、結合の定量は液体シンチレーションカウンターを用いてガラス支持体に結合された３２Ｐ−ＤＮＡの量を計測することによって行われる。
【００４５】
各アレイ中の結合ＤＮＡの量（モルでの）は１００％固定コントロールに参照して計算される。スポット直径は０．４ｍｍであり、１ｃｍ２当たりの固定されたＤＮＡヌクレオチド配列の量が計算された；２２０及び２３０ｆモル／ｃｍ２の値が得られた。これらはそれぞれスポッティングが捕獲ヌクレオチド配列中１５０又は３００ｎＭでの溶液を用いて行われた場合の値である。比較により、値はＴｅｌｅｃｈｅｍスライドについて２０及び３０であった。
【００４６】
実施例４：ＤＮＡ付着率に対するω−オレフィンシランカップリング剤の鎖長の影響
官能基化の第一ステップは異なる鎖長を有する３種のω−オレフィンシランカップリング剤のガラススライド上への結合である。これらはアリトリクロロシラン（Ｃ３）、５−ヘキセニルトリクロロシラン（Ｃ６）及び７−オクテニルトリクロロシラン（Ｃ８）であった。
【００４７】
ガラスのシラン基上のそれらの固定についての実験手順及びアルデヒドにおけるそれらの酸化は実施例１及び２に記載されている。
【００４８】
捕獲ヌクレオチド配列合成のプロトコール及びガラススライド上での固定は実施例３に記載されている。唯一の差異は捕獲ヌクレオチド配列が多重にビオチン化されており、放射能標識されておらず、２００ｎＭでスポットされたということである。
【００４９】
スライドは４５分間室温で８００μｌのストレプトアビジン−Ｃｙ５コンジュゲートと共にインキュベートされる。インキュベート後、スライドは緩衝液１で１分間５回洗浄され、次に水で２回リンスされる。検出はアレイスキャナーＧＳＭ　４１８を用いて行われる。各スポットは次に自家製の定量ソフトウェアによって定量される。結果はＣ３　ω−オレフィンシラン結合剤について２、Ｃ６　ω−オレフィンシラン結合剤について２３４、Ｃ８　ω−オレフィンシラン結合剤について２４２の蛍光値を与えた。
【００５０】
実施例５：ガラススライド上に固定された長い捕獲ヌクレオチド配列上の標的ヌクレオチド増幅単位の検出
捕獲ヌクレオチド配列の合成及びガラススライド上での固定についてのプロトコールは実施例３に記載されたものである。捕獲ヌクレオチド配列は２００ｎＭ溶液からスポッティングされた。
【００５１】
サイトメガロウィルスＤＮＡ配列は標的ＤＮＡ製造用の鋳型として用いられる。標的は他の場所で記載されたプライマー及び方法（Ｚａｍｍａｔｔｅｏ等、（１９９７）， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５３， １８０−１８９）を用いたＰＣＲによって合成される。標的は４３７ｐｂの長さである。標識化はＰＣＲ増幅中に１：１のｄＴＴＰに対するビオチン−１６−ｄＵＴＰの比でビオチン−１６−ｄＵＴＰの組込みによって得られる。ＤＮＡ濃度は次に２６０ｎｍでの吸光度によって測定される。断片の純度はアガロースゲル電気泳動によってチェックされる。
【００５２】
ハイブリダイゼーション溶液は２×ＳＳＣ　ｐＨ７、４％のＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡ及び１０ｎＭの４３７ｂｐのビオチン化標的ＣＭＶを含む最終容量７０μｌからなる。この溶液はハイブリダイゼーションチャンバーによって作られたアレイ上に添加され、次にカバーストリップによって封止される。スライドは次に加熱ブロック上に９８℃で５分間配置されて標的増幅単位を変性する。ハイブリダイゼーションは５０℃で２時間行われる。スライドは次に４回洗浄され、蛍光は実施例４と同様に測定される。結果はＤｉａｇｌａｓｓ上で行われたハイブリダイゼーションについて２１７の値を与え、Ｔｅｌｅｃｈｅｍについて４６の値を与えた。
【００５３】
実施例６：ガラススライド上に固定された長い捕獲ヌクレオチド配列上のｃＤＮＡ標的の検出に対する捕獲ヌクレオチド配列濃度の影響
逆転写は以下の手順を用いて一次培地中で肝細胞から抽出された２μｇのｍＲＮＡで行われる。
【００５４】
滅菌されたヌクレアーゼを含まないマイクロチューブ中で１μｇのオリゴｄＴヌクレオチド配列がラットの肝臓から抽出されたｍＲＮＡに添加される。ヌクレアーゼを含まない水が１０μｌの最終容量を得るために添加される。この混合物は１０分間７０℃で変性され、次に氷上で５分間冷却される。逆転写はアニールしたヌクレオチド配列／鋳型に以下の成分を添加することによって行われる：逆転写酵素を添加された４μｌのＦｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ（２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８．３、３７５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ２）、２μｌのＤＴＴ　０．１Ｍ、４０単位のＲｎａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤、５００μＭのｄＡＴＰ、５００μＭのｄＣＴＰ、５００μＭのｄＧＴＰ、１３０μＭのｄＴＴＰ、７０μＭのビオチンｄＵＴＰ。反応混合物はチューブをはじくことによって穏和に混合され、４２℃で２分間インキュベートされる。３００単位の逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩが混合物に添加され、チューブは４２℃で１時間インキュベートされる。反応は７０℃で１５分間加熱することによって停止される。ｃＤＮＡに相補的なＲＮＡを除去するため、Ｒｎａｓｅ Ｈを用いた処理が３７℃で２０分間行われる。
【００５５】
ガラススライド上の捕獲ヌクレオチド配列の固定についてのプロトコールは実施例３に記載されている。アミノ化された捕獲ヌクレオチド配列は４００塩基長であり、チトクロームＰ４５０　３ａｌ遺伝子に特異的であった。
【００５６】
ハイブリダイゼーションプロトコールは実施例５に記載されており、標的としてのトータル逆転写生成物及びポジティブコントロールとしての２ｎＭのビオチン化ＣＭＶ増幅単位を用いる。ポジティブコントロールに対応する捕獲ヌクレオチド配列はアレイ上に含まれている。ハイブリダイゼーションは６０℃で１６時間行われる。結果は蛍光スキャニングで得られ、図２に示されている。最大のハイブリダイゼーションはＴｅｌｅｃｈｅｍについての捕獲ヌクレオチド配列濃度よりも６倍も小さいＤｉａｇｌａｓｓについての捕獲ヌクレオチド配列濃度を用いて得られた。
【００５７】
実施例７：ガラススライド上に固定された短い捕獲ヌクレオチド配列上の標的ヌクレオチド増幅単位の検出−捕獲ヌクレオチド配列の固定
ガラススライド上への捕獲ヌクレオチド配列の固定プロトコールは実施例３で記載されている。アミノ化捕獲ヌクレオチド配列は３０００ｎＭの濃度でスポッティングされる。
【００５８】
標的ＤＮＡはエス・アウレウス（Ｓ． ａｕｒｅｕｓ）からのｆｅｍＡ遺伝子配列の断片（５８７ｂｐ）であり、以下の縮重プライマーを用いたＰＣＲによって得られる：
【外１】
2004506922.tif 000003
ただし、ＹはＣ又はＴであり、ＲはＡ又はＧであり、ＭはＡ又はＣであり、ＮはＡ，Ｇ，Ｃ又はＴである。
【００５９】
ＰＣＲは以下のものを含む５０μｌの最終容量で行われる：２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、７５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ９．０、５０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．５μＭの　　、０．１μＭのプライマー、２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄＣＴＰ、２００μＭのｄＧＴＰ、１５０μＭのｄＴＴＰ、５０μＭのビオチン−１６−ｄＵＴＰ、０．５Ｕのウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ、１．２５ＵのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ、５ｎｇのｆｅｍＡ遺伝子含有プラスミド。反応混合液はまず９４℃で５分間変性され、次に以下の温度及びサイクル時間を用いたＤＮＡ９６００サーモサイクラーで４０回のサイクルに供される：９４℃で３０秒間、４９℃で４５秒間、７２℃で３０秒間。７２℃で１０分間の最終伸長ステップが行われる。ＰＣＲ生成物は直接用いられるか又は凍結される。水のコントロールは増幅のネガティブコントロールとして用いられる。
【００６０】
ハイブリダイゼーションプロトコールは実施例５に記載されている。スライドは緩衝液２中に１０００倍に希釈されたコロイド金で標識された８００μｌのストレプトアビジンと共に室温で４５分間インキュベートされる。インキュベート後、スライドは緩衝液１で１分間５回洗浄され、次に水で１回リンスされる。金は銀青透明化溶液（ＡＡＴ；Ｎａｍｕｒ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いた銀沈殿を触媒する。スライドは８００μｌの透明化混合物と共に１０分間３回インキュベートされ、次に水でリンスされ、乾燥され、マイクロアレイ読み取り機を用いて分析される。各スポットは次に手製の定量ソフトウェアによって定量される。結果はＤｉａｇｌａｓｓスライドについては１８１のハイブリダイゼーション値を与え、Ｔｅｌｅｃｈｅｍについては１１１のハイブリダイゼーション値を与えた。
【００６１】
実施例８：ガラススライド上に固定された相補的捕獲ヌクレオチド上の短い標的ヌクレオチドの検出
ガラススライド上への捕獲ヌクレオチド配列の固定についてのプロトコールは実施例３に記載されている。２７塩基のアミノ化捕獲ヌクレオチド配列は１６００ｎＭの濃度でスポッティングされる。
【００６２】
ハイブリダイゼーションプロトコールは実施例５に記載されている。２７塩基のビオチン化標的ＤＮＡ　３０ｎＭは５０℃で３０分間アレイ上でハイブリダイズされ、検出は実施例７に記載のように行われた。結果はＤｉａｇｌａｓｓスライドについては２３８のハイブリダイゼーション値を与え、Ｔｅｌｅｃｈｅｍについては６１のハイブリダイゼーション値を与えた。
【００６３】
実施例９：ガラススライド上に固定された抗体の検出
プロテインＡの存在は抗体／抗原認識を容易にする抗体のＦｃ断片によって抗体を固定する。共有結合による固定はプロテインＡの遊離アミンとガラススライドのアルデヒド官能基の間で起こる。
【００６４】
被覆溶液は１００μｇ／ｍｌのプロテインＡ含有ＰＢＳ、及びＤｉａｇｌａｓｓスライド用の０．０１％のＳＤＳ（これはＴｅｌｅｃｈｅｍスライドの場合はなし）からなる。スライドは次にこの混合物（１５ｍｌ／スライド）で１時間室温でインキュベートされ、次にＰＢＳ／０．０２％　Ｔｗｅｅｎ ２０で２分間３回洗浄され、水で２分間２回リンスされる。この処理の後、スライドはＰＢＳ／１０％ミルク粉末中で室温で２時間飽和される。最後に、スライドはＰＢＳで１分間５回洗浄され、水でリンスされる。
【００６５】
抗体は整列機を用いてガラススライド上にプリントされる。増大する濃度の抗ストレプトアビジン抗体が３×ＳＳＣ（ナトリウム塩クエン酸）ｐＨ５及びＤｉａｇｌａｓｓスライド用の０．０１％のＳＤＳ（これはＴｅｌｅｃｈｅｍスライドの場合はなし）からなる溶液中に１．５μｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌまでの範囲でスポッティングされる。スポッティングされたスライドは室温で１時間インキュベートされ、その後１× ＰＢＳ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０で１分間２回洗浄され、水で１分間３回リンスされる。検出は実施例４と同様にＣｙ５−ストレプトアビジンを用いて行われた。飽和曲線が０．４ｍｇ／ｍｌの抗体溶液についての最大固定で得られる（図３）。
実施例１０：変性されたガラス表面の特性決定
ガラス表面の官能基化の異なるステップはＸ線光電子分光分析法（ＸＰＳ）及び接触角測定によって特性決定された。Ｄｉａｇｌａｓｓ及びＴｅｌｅｃｈｅｍスライドについてのＣ　 ｌｓ線は二つの成分に分解されることができ、一つは脂肪族環境（ＣＨｘ）における炭素に対応する２８５．０ｅＶに存在し、もう一つはアルデヒド官能基からのカルボニルの特徴であり２８８．７ｅＶに存在する。更に、Ｄｉａｇｌａｓｓスライドはトレンステスト（脂肪族アルデヒドの特性テスト）に対してポジティブに反応し、銀鏡を与える。他方、ガラススライド単独又はカルボン酸又はアルコール官能基を有するガラススライドはこのテストにおいてポジティブな結果を与えない。
【００６６】
トレンス試薬は以下のようにして調製された：３０ｍｌの水に３ｇの硝酸銀を溶解し（溶液Ａ）、３０ｍｌの水に３ｇの水酸化ナトリウムを溶解する（溶液Ｂ）。試薬が必要なときに、二つの溶液２ｍｌを清潔な試験管中で混合し、酸化銀がちょうど溶解するまで希釈アンモニア溶液を一滴ずつ添加する。
【００６７】
トレンステスト：Ｄｉａｇｌａｓｓスライドの小片を２ｍｌのトレンス試薬を含む試験管に浸し、次に試験管を水浴中で６０℃で数分間加熱する。銀鏡がＤｉａｇｌａｓｓの表面に出現するであろう。
【００６８】
表面上のアルデヒドレベルはチップに結合される捕獲プローブの収率に影響を与える。これは実施例３に示されている。スポッティング状況での捕獲ＤＮＡプローブのこの固定率はガラスのアルデヒド含有量の良好な特性決定方法である。何故なら、それはこれらのガラスの用途に期待される最終結果の正確な推定を与えるからである。６７％の固定率がこれらの作業状況で１５０ｎＭの捕獲プローブ溶液のスポッティングを用いて現在得られている。これに対し、Ｔｅｌｅｃｈｅｍガラススライドについては１０％の固定率しか得られていない。
【図面の簡単な説明】
【図１】ガラス表面についての官能基化反応の模式図である。
【図２】アミノ化されたＤＮＡヌクレオチド配列に対する官能基化されたガラスの固定能力を示す。
【図３】タンパク質Ａと反応させられた、官能基化されたガラスに滴下された後の捕獲された抗体の固定率を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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