(57)【要約】滑膜ＣＲＨは、慢性関節リウマチおよび乾癬性関節炎滑膜の両方の炎症細胞において豊富に発現される、核転写因子ＮＵＲＲ１を誘導するパラクリン様式で機能する。この融合は、グルココルチコイドによって抑制される。本発明は、ＣＲＨ−レセプターサブタイプＲ１αを介した、末梢のＣＲＨおよびＣＲＨ媒介シグナル伝達の調節において（特に、ヒトの関節炎における炎症プロセスにおいて）ＮＵＲＲサブファミリーの転写因子が果たす中心的役割に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核レセプターポリペプチドの転写活性を阻害するためのアンタゴニストであって、該ポリペプチドは、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列を含む、アンタゴニスト。
【請求項２】
前記ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列が、配列番号３３、配列番号６４および配列番号９１からなる群より選択される、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
前記アンタゴニストが、関節炎を阻害する、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項４】
前記アンタゴニストが、関節の炎症を阻害する、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項５】
核レセプターポリペプチドの転写活性を阻害するのためのアンタゴニストであって、該ポリペプチドは、ＮＵＲＲ１アミノ酸配列を含む、アンタゴニスト。
【請求項６】
前記ＮＵＲＲ１アミノ酸配列が、配列番号３３である、請求項５に記載のアンタゴニスト。
【請求項７】
前記アンタゴニストが、関節炎を阻害する、請求項５に記載のアンタゴニスト。
【請求項８】
前記アンタゴニストが、関節の炎症を阻害する、請求項５に記載のアンタゴニスト。
【請求項９】
炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法であって、ＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列の発現を減少させる工程を包含する、方法。
【請求項１０】
前記ＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列が、配列番号１、配列番号４７および配列番号７６からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法であって、配列番号１のＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列の発現を減少させる工程を包含する、方法。
【請求項１２】
前記炎症性免疫疾患が、慢性炎症性関節疾患、潰瘍性大腸炎および甲状腺炎からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記慢性炎症性関節疾患が、関節炎である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記関節炎が、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎およびサルコイド関節炎からなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法であって、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列を含むポリペプチドのレベルを低下させる工程を包含する、方法。
【請求項１６】
前記ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列が、配列番号３３、配列番号６４および配列番号９１からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列が、配列番号３３である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドを低下させる工程が、配列番号３３を含む配列のアミノ酸合成を阻害することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記炎症性免疫疾患が、慢性炎症性関節疾患、潰瘍性大腸炎および甲状腺炎からなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記慢性炎症性関節疾患が、関節炎である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記関節炎が、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎およびサルコイド関節炎からなる群より選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法であって、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの転写活性を阻害する工程を包含する、方法。
【請求項２３】
前記ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのアミノ酸配列が、配列番号３３、配列番号６４および配列番号９１からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのアミノ酸配列が、配列番号３３である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記炎症性免疫疾患が、慢性炎症性関節疾患、潰瘍性大腸炎および甲状腺炎からなる群より選択される、請求項２２に記載方法。
【請求項２６】
前記慢性炎症性関節疾患が、関節炎である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記関節炎が、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎およびサルコイド関節炎からなる群より選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＮＵＲＲサブファミリーポリペプチドとリガンドとの相互作用を妨害する化合物についてスクリーニングする方法であって、以下の工程：
細胞に試験因子を導入する工程であって、ここで、該細胞は、マーカー配列を含み、該マーカー配列の発現は、該ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーによって調節される、工程；および
該マーカー配列の発現レベルを測定する工程であって、ここで、該マーカー配列の該発現が、該導入後に減少した場合、該試験因子は、該ＮＵＲＲサブファミリーポリペプチドと該リガンドとの相互作用を妨害する化合物である、工程
を包含する、方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法によって得られた化合物を含む、組成物。
【請求項３０】
前記ＮＵＲＲサブファミリーポリペプチドが、配列番号３３、配列番号６４および配列番号９１からなる群より選択される配列である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＮＵＲＲサブファミリーポリペプチドが、配列番号３３の配列である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
炎症性免疫疾患の処置のための化合物を同定する方法であって、以下の工程：
細胞に試験因子を導入する工程であって、ここで、該細胞は、マーカー配列を含み、該マーカー配列の発現は、該ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーによって調節される、工程；および
該マーカー配列の発現レベルを測定する工程であって、ここで、該マーカー配列の該発現が、該導入後に減少した場合、該試験因子は、該炎症性免疫疾患の処置のための化合物である、工程
を包含する、方法。
【請求項３３】
薬学的に受容可能な組成物であって、
請求項３２に記載の方法によって得られた化合物；および
薬学的キャリア
を含む、組成物。
【請求項３４】
前記化合物を薬学的キャリア中に分散させる工程；および
該キャリア中の治療有効量の該化合物を、前記炎症性免疫疾患を有する個体に投与する工程
をさらに包含する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記前記炎症性免疫疾患が、関節中に存在する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法であって、コルチコトロピン放出ホルモンレセプターの核酸配列の発現を減少させる工程を包含する、方法。
【請求項３７】
前記コルチコトロピン放出ホルモンレセプターの発現を減少させる工程が、配列番号１０４の核酸配列の合成を阻害することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法であって、コルチコトロピン放出ホルモンレセプターのアミノ酸配列のレベルを低下させる工程を包含する、方法。
【請求項３９】
前記コルチコトロピン放出ホルモンレセプターのアミノ酸レベルを低下させる工程が、配列番号１２４を含む配列のアミノ酸合成を阻害することを包含する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
炎症性免疫疾患について生物体を処置するための方法であって、配列番号１２４の配列の転写活性を阻害する工程を包含する、方法。
【請求項４１】
ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの発現を減少させるためのアンタゴニスト。
【請求項４２】
前記アンタゴニストが、デキサメタゾンである、請求項４１に記載のアンタゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般に、複数の炎症性シグナルを媒介する際の、ＮＵＲＲサブファミリーの転写因子の中心的役割に関する。より詳細には、本発明は、核レセプターＮＵＲＲ１、ＮＵＲ７７およびＮＯＲ１、ならびに末梢のＣＲＨおよびＣＲＨ媒介性シグナル伝達（これは、例えば、ヒトの関節炎において、炎症プロセスの重要な成分である）の調節におけるそれらの役割に関する。
【０００２】
（発明の背景）
脊椎動物の発生、分化およびホメオスタシスの多くの局面は、核レセプターへの結合を介したリガンド依存性様式で遺伝子の発現を制御する、低分子ホルモンおよびシグナル伝達分子によって調節される。これらの分子としては、性ステロイド、コルチコステロイド、甲状腺ホルモンおよびビタミンＤ３が挙げられ、これらの多くはクローニングされている。リガンドおよび生物学的機能における多様性にもかかわらず、これらのレセプターは、構造的および遺伝的に関連した核レセプタースーパーファミリーに属する。このスーパーファミリーの共通の構造的特徴は、以下からなる三部構成のドメイン構造である：トランス活性化機能に寄与する超可変Ｎ末端；ＤＮＡ認識および二量体形成を担う、高度に保存されたＤＮＡ結合ドメイン；ならびに保存されたＣ末端（これは、サブドメインＩＩおよびＩＩＩを含み、核局在化、リガンド結合、レセプター二量体形成、サイレンシングおよびトランス活性化に関与する）（例えば、Ｅｖａｎｓ，１９８８；Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ，１９９０；Ｂｅａｔｏ，１９９１；ならびにＴｓａｉおよびＯ’Ｍａｌｌｅｙ，１９９４を参照のこと）。このスーパーファミリーの最も保存された特徴は、６５〜６８アミノ酸残基を含むＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）である。９つの非可変システインのうちの８つは、２つのＩＩ型ジンクモジュールを形成する。ＤＢＤの任意のメンバーにおける、残りのファミリーに対する配列同一性は、４０％〜９９％の範囲に及ぶ。このセグメントが高度に保存されることによって、より構造的に関連した多くのレセプターが近年見出され、これらは、リガンドの正体および生理学的機能が未知であるので、オーファンレセプターと称される（例えば、Ｏ’Ｍａｌｌｅ，１９８８；Ｂｅａｔｏ，１９９１；Ｌａｕｄｅｔら，１９９２；Ｏ’ＭａｌｌｅｙおよびＣｏｎｎｅｅｌｙ，１９９２を参照のこと）。
【０００３】
オーファンレセプターは、人工的に分類されたとはいえ、核スーパーファミリーの重要なサブファミリーを形成する。これらの大多数は、既にクローニングされたメンバーに対する、ＤＢＤ領域における相同性に基づいて同定された。ＤＢＤ全体をプローブとして使用して、低下したストリンジェンシーでｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすること（Ｇｉｇｕｅｒｅら，１９８８；およびＬａｗら，１９９２）またはＤＢＤ中で最も保存された領域をコードする縮重プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ増幅（Ｓｃｈｍｉｄｔら，１９９２；Ａｎｄｒｅら，１９９３）またはＤＢＤコンセンサス配列に対応する縮重オリゴヌクレオチドを用いてライブラリーをスクリーニングすること（ＩｓｓｅｍａｎｎおよびＧｒｅｅｎ，１９９０；ＣｈａｎｇおよびＫｏｋｏｎｔｉｓ，１９８８）を含む、いくつかのストラテジーを適用して、新規なメンバーについて検索した。
【０００４】
いくつかの系統の証拠は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーが、ＨＰＡ軸の全てのレベルで重要な座標調節役割を果たすことを示す（Ｗｉｌｓｏｎら，１９９３；ＭｕｒｐｈｙおよびＣｏｎｎｅｅｌｙ　１９９７；Ｐｈｉｌｉｐｓら，１９９７）。ＮＵＲＲサブファミリーは、種々の発生プロセスおよび生理学的プロセスを制御する、構造的に関連した転写因子のスーパーファミリーに属する。このファミリーは、ステロイドホルモン、ビタミンおよび甲状腺ホルモンについてのレセプター、ならびに同族リガンド（存在する場合）が未だ同定されていないオーファンレセプターを含む（Ｅｖａｎｓ，１９９８；Ｏ’ＭａｌｌｅｙおよびＣｏｎｎｅｅｌｙ，１９９２）。ＮＵＲＲ１（Ｎｕｒ関連因子１；ＲＮＲ−１およびＮＯＴとも呼ばれる）は、中枢神経系で主に発現される、このスーパーファミリーのオーファンメンバーである（Ｌａｗら，１９９２；Ｓｃｅａｒｃｅら，１９９３；Ｍａｇｅｓら，１９９４）。このタンパク質は、オーファンレセプターＮＵＲ７７（ＮＧＦＩ−β／Ｎ１０／ＮＡＫとも呼ばれる）（Ｈａｚｅｌら，１９８８；Ｍｉｌｂｒａｎｔ，１９９８；Ｒｙｓｅｃｋら，１９８９；Ｎａｋａｉら，１９９０）およびＮＯＲ−１（ＭＩＮＯＲ／−ＴＥＣとも呼ばれる）（Ｏｈｋｕｒａら，１９９４；Ｍａｒｕｙａｍａら，１９９５；ＨｅｄｖａｔおよびＩｒｖｉｎｇ，１９９５）に対する密接な構造的関連を示す。これらの３つのタンパク質は、同じシス作用性コンセンサス配列（ＮＢＲＥ）に結合して標的遺伝子発現を調節する、ＮＵＲＲサブファミリーを構成する（Ｏｈｋｕｒａら，１９９４，Ｗｉｌｓｏｎら，１９９１；Ｍｕｒｐｈｙら，１９９５）。大部分の核レセプターとは異なり、ＮＵＲＲサブファミリーは、種々の細胞外刺激（増殖因子（Ｈａｚｅｌら，１９９８；Ｍｉｌｂｒａｎｄｔ，１９９８）、神経伝達物質（ＷａｔｓｏｎおよびＭｉｌｂｒａｎｄｔ，１９８９）およびポリペプチドホルモン（Ｗｉｌｓｏｎら，１９９３；ＭｕｒｐｈｙおよびＣｏｎｎｅｅｌｙ，１９９７；ＤａｖｉｓおよびＬａｕ，１９９４）を含む）に応じて発現が示差的に誘導され得る、前初期遺伝子の産物である。ＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７は、それらの近位プロモーター領域において特異的シス作用性配列と相互作用することによって、ＣＲＨ遺伝子およびＰＯＭＣ遺伝子の発現を調節し得る。ＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７は、初代下垂体細胞においてＣＲＨによって迅速に誘導されて、ＰＯＭＣの合成の増加をもたらす（ＭｕｒｐｈｙおよびＣｏｎｎｅｅｌｙ，１９９７）。ＰＯＭＣ遺伝子のグルココルチコイド抑制は、ＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７によるＰＯＭＣ遺伝子の活性化のグルココルチコイドレセプター依存性阻害によって媒介される（Ｅｖａｎｓ，１９９８；Ｐｈｉｌｉｐｓら，１９９７）。ＮＯＲ−１は、同一のＤＮＡ結合ドメインを保有し、そしてオーファンレセプターをＮＵＲＲサブファミリーに構造的に分類する同じシス作用性コンセンサス配列を結合し得る。それゆえ、ＮＵＲＲサブファミリーの転写因子の異なるメンバーの密接な構造的関係、同一のシス作用性コンセンサス配列およびＮＵＲＲサブファミリーの転写因子の異なるメンバーが互いに機能的に補完する能力は、Ｎ���ＲＲサブファミリーのメンバーが機能の重複性を有するという強い指標である。
【０００５】
コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）（視床下部下垂体軸（ＨＰＡ）の主な調節因子）は、主にグルココルチコイドの免疫抑制作用を介して顕著な抗炎症効果を発揮する（Ｖａｌｅら　１９８９；ＣａｔｏおよびＷａｄｅ，１９９６）。活性化された免疫系の産物（ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦαを含む）は、直接的および間接的に作用して、視床下部ＣＲＨの合成および分泌を刺激する（ＴｕｒｎｂａｌｌおよびＲｉｖｉｅｒ，１９９９）。ＣＲＨは、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）経路（これは、プロオピオメラノコルチコトロピン（ｐｒｏ−ｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ；ＰＯＭＣ）の合成を強く刺激する）のレセプター媒介活性化を介してその機能を発揮する（Ａｇｕｉｌｅｒａら，１９８２）。ＰＯＭＣは、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）（これは、下垂体から放出され、そして副腎グルココルチコイドの合成を調節する）を含むいくつかの神経ペプチドの前駆体分子である。ホメオスタシスを維持するために、グルココルチコイドは、ＣＲＨおよびＰＯＭＣの合成および分泌を視床下部および下垂体のレベルで阻害する。
【０００６】
一連のデータが増えつつあるので、現在、免疫応答の調節における視床下部外ＣＲＨまたは免疫ＣＲＨの直接的関与を支持する。局在化した炎症応答の媒介における免疫ＣＲＨについての役割は、ＣＲＨが産生されかつ局所的に活性である、急性炎症のインビボラットモデルにおいて支持されている（Ｋａｒａｌｉｓら，１９９１）。このラットモデルでは、末梢ＣＲＨは、その間接的免疫抑制効果とは対照的に、局所炎症誘発性（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）オートクライン／パラクリン役割と関連する。抗ＣＲＨ抗体を用いたこの局在化ＣＲＨ合成の免疫中和（ｉｍｍｕｎｏｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、炎症応答の特異的抑制を引き起こす（Ｋａｒａｌｉｓら，１９９１）。最も重要なことに、ＣＲＨを欠くマウスの構築は、末梢ＣＲＨがインビボでの炎症応答の誘導のために必要とされることを確証する（Ｋａｒａｌｉｓら，１９９９）。しかし、ＣＲＨが、全身的免疫系活性化の間の炎症反応の重要なメディエーターであるという証拠にもかかわらず、末梢ＣＲＨの作用調節および作用形態は確立されていない。増大した免疫反応性ＣＲＨがＲＡ滑膜組織（Ｃｒｏｆｆｏｒｄら，１９９３；Ｎｉｓｈｉｏｋａら，１９９６）および炎症性関節疾患のいくつかの動物モデル（Ｃｒｏｆｆｏｒｄら，１９９２；Ｗｅｂｓｔｅｒら，１９９８）において見出されるという知見は、炎症性関節炎の病因における末梢ＣＲＨの潜在的関与を強調する。視床下部ＣＲＨの機能を媒介する際のＮＵＲＲ転写因子の重要性（Ｍｕｒｐｈｙら，１９９３）を考慮すると、ＣＲＨならびに炎症誘発性メディエーターおよび抗炎症性メディエーターに応じた、滑膜外植片におけるＮＵＲＲ１、ＮＵＲ７７およびＮＯＲ１の遺伝子発現の調節は、本明細書中で実証される。
【０００７】
オーファンレセプターの研究は、本発明者らのスーパーファミリーの見解を広げた。この研究は、新たなリガンドの発見を容易にし、例えば、９−シス−レチノイン酸（９−ｃｉｓ−ｒｅｔｉｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）は、ＲＸＲ（レチノイド−ｘレセプター）についてのリガンドとして同定された（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら，１９９０；Ｌｅｖｉｎら，１９９２；Ｈｅｙｍａｎら，１９９２）。オーファンレセプターＮＵＲ７７およびＣＯＵＰ−ＴＦについての膜レセプター活性化リン酸化経路を含む、代替のリガンド依存性活性化経路が見出されている（Ｈａｚｅｌら，１９９１；Ｐｏｗｅｒら，１９９１）。個々のホルモン機能に対して多様性を付加するレセプターアイソフォームが、このスーパーファミリーにおいて非常に普通に見出されている（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら，１９９０；Ｌｅｖｉｎら，１９９２；Ｈｅｙｍａｎら，１９９２；Ｈａｚｅｌら，１９９１；Ｐｏｗｅｒら，１９９１；Ｃｈｅｎら，１９９３）。オーファンレセプターはまた、不飽和脂肪酸に応じたペルオキシソームの脂肪酸β酸化系の重要な酵素であるアシル−ＣｏＡオキシダーゼ遺伝子を調節することによって、代謝機能（例えば、ＰＰＡＲ（ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプター（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）サブファミリー）に対して寄与し得る（Ｄｒｅｙｅｒら，１９９２）。それゆえ、オーファンレセプターのクローニングおよび特徴付けは、新たなシグナル伝達経路およびトランス活性化機構の発見において重要な役割を果たしてきた。
【０００８】
ＩＬ−１βおよびＴＮＦαは、ＮＦ−κＢを介して転写カップリングを媒介し、一方、ＰＧＥ２は、ＣＲＥＢ依存性経路の活性化によってシグナルを伝達することが充分に立証されている。さらに、ＣＲＨは、ＣＲＥＢ依存性経路の活性化によってシグナル伝達することが充分に立証されている。しかし、ＣＲＥＢ依存性経路およびＮＦ−κＢ経路の媒介においてＣＲＨレセプターが果たす役割は、規定されていない。ＣＲＨレセプターの２つの異なるサブタイプＣＲＨ−Ｒ１およびＣＲＨ−Ｒ２が単離され、そして特徴付けられており（Ａｇｕｉｌｅｒａら，１９８７；Ｐｅｒｒｉｎら，１９９５）、そして両方とも、薬理学的に異なっており、脳および末梢組織におけるそれらの発現パターンが独特である。健常マウスでは、ＣＲＨ−Ｒ１は、脳幹、小脳、大脳皮質、ならびに内側中隔（ｍｅｄｉａｌ　ｓｅｐｔｕｍ）および下垂体を含む、脳の領域に主に制限される。この局在化のため、ＣＲＨ−Ｒ１が欠損したマウスが構築され、ＣＲＨ−Ｒ１が出生後の発達において果たす特異的役割を研究するために用いられた（２０００年１１月１４日発行の米国特許６，１４７，２７５号）。ＣＲＨ−Ｒ１の５’非翻訳領域における開始コドンの存在が、ｍＲＮＡ翻訳の阻害と関連しており、そして上流の開始コドンが、ＣＲＨ−Ｒ１レセプターの翻訳を調節する際に役割を果たすことを示唆する（Ｘｕら，２００１）。ＣＲＨ−Ｒ２は、心臓、骨格筋、胃腸管および精巣上体を含め、いくつかの末梢組織において発現され、そして脳における発現は、外側中隔領域および視床下部領域に集中している。ＣＲＨ−Ｒ１の部分的アゴニストは、ストレス関連障害の処置について記載されている（２０００年１０月３日に発行された米国特許第６，１２７，３９９号）。
【０００９】
炎症性免疫疾患に関与する詳細な生化学的プロセスを解明する情報は増加し続けており、そしてこのような疾患の病理的結果は充分に証明されている。リウマチは、複数の関節における腫脹および疼痛、ならびに他の身体器官における倦怠感、虚弱、体重減少、微熱および食欲不振を引き起こす、慢性の全身性炎症性自己免疫疾患である。リウマチの分類についての診断基準としては、朝のこわばり、３以上の関節領域の関節炎、手の関節の関節炎、全身性関節炎、Ｘ線写真的変化、血清リウマチ因子およびリウマチ小節が挙げられる。当該分野では、患者がこれらの７つの診断基準のうちの少なくとも４つ満たした場合、この患者はリウマチを有すると考えられる。コルチコステロイドは、非常に重要な抗炎症剤であり、炎症のいくつかのメディエーターおよび関節軟骨分解酵素の形成を抑制し、そのようにして、外傷性関節疾患に関連した炎症および疼痛を効果的に減少させる。慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、一種の関節炎であり、そして障害の通常の原因である。１２年間の疾患の後では、ＲＡを有する８０％より多くの患者は、部分的に不能になり、そして１６％は完全に不能になり、そして平均余命は、男性で平均７年および女性で平均３年短縮される（Ｍａｔｔｅｓｏｎ，２０００）。ＲＡに関連した、平均余命の減少の最も一般的な原因は、脈管炎、血管の炎症；薬物の副作用（例えば、胃潰瘍からの出血）；および必要とされる薬物による免疫系抑制の結果である、感染の危険性の増大である。治療目標は、疼痛を軽減し、炎症を制御し、そして関節破壊を予防することであり、そして疾患改変抗リウマチ薬物（ＤＭＡＲＤ）（例えば、金、メトトレキサートまたは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アンタゴニスト）を含む。近年、Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　ＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎおよびＥｕｒｏｐｅａｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　Ａｇｅｎｃｙは、可溶性ＴＮＦα　ＩＩ型レセプター−ＩｇＧ１融合タンパク質であるエタナールセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）およびＴＮＦαに対するキメラモノクローナル抗体であるインフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）承認した。これらの薬物の開発は、炎症誘発性メディエーターが慢性関節リウマチにおいて果たす役割の理解の増大からもたらされた。しかし、これらの複雑な細胞性相互作用の詳細な機構は、未知のままである。さらに、遺伝子治療による炎症誘発性メディエーターのアンタゴニストの送達は、慢性関節リウマチについての潜在的な治療ツールを提示する（Ｃｈｏｙら，２００１）。
【００１０】
滑膜の炎症および過形成は、慢性関節リウマチの顕著な特徴である。正常な滑膜は、関節包の内側を覆う繊細な組織である；しかし、ＲＡでは、滑膜は、パンヌスと呼ばれる攻撃的な腫瘍様構造体へとトランスフォームされる。滑膜内の滑膜細胞（線維芽細胞）およびマクロファージは、サイトカイン（すなわち、ＩＬ１β、ＴＮＦαおよびＩＬ６）のオートクライン作用／パラクリン作用を介して自己永続化炎症性応答を組み合わせる。罹患した軟骨近傍の増殖中の滑膜細胞は、マトリックス分解分子（マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を含む）を産生し、そして増殖因子および接着分子を発現する。関節の侵食を最終的にもたらすのは、持続性の侵襲性かつ破壊性の滑膜組織の増殖である。ＲＡに関連している炎症性サイトカインおよびＭＭＰの多くは、誘導性転写因子によって調節される。転写因子（例えば、ＮＦｋＢ、ＡＰ１およびＣＲＥＢ）は、炎症性応答の中枢的な調節因子である。いくつかの独立研究は、ＲＡ滑膜における細胞増殖、サイトカイン産生およびＭＭＰ産生を調節することが公知の遺伝子発現の調節におけるこれらの転写因子の異常発現に関連した。
【００１１】
活性な炎症性パンヌスの形成は、関節の破壊をもたらすびらん性疾患の中心となると考えられる。新たな血管の形成である血管新生は、慢性関節リウマチにおける最も早期の組織病理学的知見の一つであり、そしてパンヌスの発達のために必要とされるようである。新たな結果は、サイトカインおよびプロテアーゼ活性の主な供給源として、関節炎疾患の開始および維持において重要な要因であると考えられる。
【００１２】
（発明の要旨）
本発明の１つの実施形態では、配列番号１、配列番号４７および配列番号７６からなる群より選択されるＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列の発現を減少させる工程を包含する、炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法が存在する。特定の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列の発現を減少させる工程は、配列番号１の核酸配列の合成を阻害することを含む。別の特定の実施形態では、この炎症性免疫疾患は、慢性炎症性関節疾患、潰瘍性大腸炎および甲状腺炎からなる群より選択される。さらなる特定の実施形態では、この炎症性関節疾患は関節炎である。さらなる特定の実施形態では、この関節炎は、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎およびサルコイド関節炎からなる群より選択される。
【００１３】
本発明の１つの実施形態では、配列番号３３、配列番号６４および配列番号９１からなる群より選択されるＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列を含むポリペプチドのレベルを低下させる工程を包含する、炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法が存在する。特定の実施形態では、ポリペプチドを低下させる工程は、配列番号３３を含む配列のアミノ酸合成を阻害することを含む。別の特定の実施形態では、この炎症性免疫疾患は、慢性炎症性関節疾患、潰瘍性大腸炎および甲状腺炎からなる群より選択される。さらなる特定の実施形態では、この炎症性関節疾患は関節炎である。さらなる特定の実施形態では、この関節炎は、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎およびサルコイド関節炎からなる群より選択される。
【００１４】
本発明の別の実施形態では、配列番号３３、配列番号６４および配列番号９１からなる群より選択される配列の転写活性を阻害する工程を包含する、炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法が存在する。特定の実施形態では、この配列は配列番号３３である。別の特定の実施形態では、この炎症性免疫疾患は、慢性炎症性関節疾患、潰瘍性大腸炎および甲状腺炎からなる群より選択される。さらなる特定の実施形態では、この炎症性関節疾患は関節炎である。さらなる特定の実施形態では、この関節炎は、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎およびサルコイド関節炎からなる群より選択される。
【００１５】
本発明のさらなる実施形態では、ポリペプチドの転写活性を阻害するためのアンタゴニストが存在し、ここで、このポリペプチドは、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列（例えば、配列番号３３、配列番号６４および配列番号９１からなる群より選択されるアミノ酸配列）を含み、ここで、このポリペプチドは核レセプターである。特定の実施形態では、このポリペプチドはステロイドレセプターである。特定の実施形態では、このポリペプチドはホルモンレセプターである。特定の実施形態では、このポリペプチドはビタミンレセプターである。特定の実施形態では、このアンタゴニストは関節炎を阻害する。別の特定の実施形態では、このアンタゴニストは関節の炎症を阻害する。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態では、ポリペプチドの転写活性を阻害するためのアンタゴニストが存在し、ここで、このポリペプチドは、配列番号３３のＮＵＲＲ１アミノ酸配列を含み、ここで、このポリペプチドは核レセプターである。特定の実施形態では、このアンタゴニストは関節炎を阻害する。別の特定の実施形態では、このアンタゴニストは関節の炎症を阻害する。
【００１７】
別の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーポリペプチドとリガンドとの相互作用を妨害する化合物についてスクリーニングする方法が存在し、この方法は、細胞に試験因子を導入する工程であって、ここで、この細胞は、マーカー配列を含み、このマーカー配列の発現は、このＮＵＲＲサブファミリーのメンバーによって調節される、工程；およびこのマーカー配列の発現レベルを測定する工程であって、ここで、このマーカー配列のこの発現が、この導入後に減少した場合、この試験因子は、このＮＵＲＲサブファミリーポリペプチドとリガンドとの相互作用を妨害する化合物である、工程を包含する。特定の実施形態は、組成物としての、ＮＵＲＲサブファミリーポリペプチドとリガンドとの相互作用を妨害する化合物についてのスクリーニングによって同定された化合物である。さらなる特定の実施形態では、このＮＵＲＲサブファミリーポリペプチドは、配列番号３３、配列番号６４および配列番号９１からなる群より選択される配列である。別の特定の実施形態では、このＮＵＲＲサブファミリーポリペプチドは、配列番号３３の配列である。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、炎症性免疫疾患の処置のための化合物を同定する方法が存在し、この方法は、細胞に試験因子を導入する工程であって、ここで、この細胞は、マーカー配列を含み、このマーカー配列の発現は、このＮＵＲＲサブファミリーのメンバーによって調節される、工程；およびこのマーカー配列の発現レベルを測定する工程であって、ここで、このマーカー配列の発現が、この試験因子の導入後に減少した場合、この試験因子は、この炎症性免疫疾患の処置のための化合物である、工程を包含する。特定の実施形態では、この炎症性免疫疾患は、関節内に存在する。
【００１９】
本発明の別の実施形態では、薬理学的に受容可能な組成物が存在し、この組成物は、炎症性免疫疾患の処置のために同定された化合物および薬学的キャリアを含む。特定の実施形態では、炎症性疾患の処置のための化合物は、薬学的キャリア中に分散され、そしてキャリア中、この化合物の治療有効量で、炎症性免疫疾患を有する個体へと投与される。
【００２０】
本発明の別の実施形態では、ポリペプチドの転写活性のアゴニストが存在し、ここで、このポリペプチドは、配列番号３３、配列番号６４および配列番号９１からなる群より選択されるＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列を含み、ここで、このポリペプチドは核レセプターである。特定の実施形態では、このアゴニストはステロイドレセプターである。特定の実施形態では、このアゴニストはホルモンレセプターである。特定の実施形態では、このアゴニストはビタミンレセプターである。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態では、ポリペプチドの転写活性のアゴニストが存在し、ここで、このポリペプチドは、配列番号３３のＮＵＲＲ１アミノ酸配列を含み、ここで、このポリペプチドは核レセプターである。
【００２２】
本発明の特定の実施形態では、ＣＲＨレセプターの核酸配列の発現を減少させる工程を包含する、炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法が存在する。さらなる特定の実施形態では、ＣＲＨレセプターの発現を減少させる工程は、配列番号１０４の核酸配列の合成を阻害することを含む。本発明の別の特定の実施形態では、ＣＲＨレセプターのアミノ酸配列のレベルを低下させる工程を包含する、炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法が存在する。さらなる特定の実施形態では、ＣＲＨレセプターのアミノ酸レベルを低下させる工程は、アミノ酸合成を阻害すること、ＣＲＨレセプターのアミノ酸分解を増加させることを含むか、または治療有効レベルの、配列番号１２４を含む配列のＣＲＨレセプターポリペプチドに対する抗体を投与することを含む。特定の実施形態では、この炎症性免疫疾患は、慢性炎症性関節疾患、関節炎、慢性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎および甲状腺炎からなる群より選択される。別の特定の実施形態では、この炎症性関節疾患は関節炎である。さらなる特定の実施形態では、この関節炎は、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎およびサルコイド関節炎からなる群より選択される。
【００２３】
他の目的、特徴および利点、ならびにさらなる目的、特徴および利点は、以下の明細書を読むことによって、および明細書の一部を形成する添付の図面を参照することによって、明らかであり、そして最終的により容易に理解されるか、または本発明の現在好ましい実施形態の任意の例は、開示の目的のために与えられる。
【００２４】
（発明の説明）
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかである。しかし、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示しているとはいえ、例示のためにのみ与えられており、なぜなら、本発明の趣旨および範囲内の種々の変更および改変は、この詳細な説明から当業者には明らかであることが理解されるべきである。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１以上を意味し得る。特許請求の範囲で使用される場合、用語「を含む」に関連して使用される場合、用語「ａ」または「ａｎ」は、１または１より多くを意味し得る。本明細書中で使用される場合、「別の」は、少なくとも二番目以上を意味する。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、用語「アゴニスト」は、別の生物学的実体の活性または機能を促進する、促す、または増強する因子と定義される。特定の実施形態では、これは、ＮＵＲＲサブファミリーポリペプチドの転写活性のアゴニストである。別の特定の実施形態では、これは、ＮＵＲＲアミノ酸配列をコードするポリペプチドのアゴニストであり、ここで、このポリペプチドは核レセプターである。このアゴニストは、アミノ酸配列、核酸配列、脂質、糖、糖質またはそれらの組合せであり得る。特定の実施形態では、このアゴニストは、炎症に関連する。例としては、ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＰＧＥ２が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中で使用される同じ因子についての他の用語は、メディエーターおよびサイトカインである。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「アンタゴニスト」は、別の生物学的実体の活性、機能または効果を妨害する、中和するまたは妨害する因子と規定される。特定の実施形態では、このアンタゴニストは、ＮＵＲＲサブファミリーポリペプチドの転写活性を阻害する。別の特定の実施形態では、これは、ＮＵＲＲ１アミノ酸配列をコードするポリペプチドのアンタゴニストであり、ここで、このポリペプチドは核レセプターである。このアンタゴニストは、アミノ酸配列、核酸配列、脂質、糖、合成化学分子、ハプテン、糖質またはそれらの組合せであり得る。この因子は、ＮＵＲＲ１活性を部分的または完全に妨害し得る。特定の実施形態では、このアンタゴニストリガンドはＮＵＲＲ１転写活性を阻害する。
【００２８】
本明細書中で使用される場合、用語「抗サイトカイン」は、サイトカインの合成、活性または機能を妨害する生物学的因子と定義される。この生物学的因子は、アミノ酸、核酸、脂質、糖、糖質またはそれらの組合せであり得る。サイトカインの妨害は、直接的相互作用または間接的相互作用を含み得る。抗サイトカインは、内因性または合成によって誘導され得る。
【００２９】
本明細書中で使用される場合、用語「関節炎」は、関節の炎症と定義される。特定の実施形態では、関節は、肩、膝、肘、中手指節関節、指（ｆｉｎｅｒ）、膝距腿関節部、頸部または股関節部の関節である。別の特定の実施形態では、複数の関節が罹患している。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、用語「サイトカイン」は、標的細胞に対してリンホカインと同じ効果（炎症を引き起こすことを含む）を引き起こす能力を有する、リンパ系細胞または非リンパ系細胞によって産生される可溶性の物質と定義される。リンホカインは、抗原侵襲に応じてリンパ芽球によって放出される、生物学的に活性な可溶性因子と本明細書中で定義される。サイトカインの例としては、ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＰＧＥ２が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、用語「細胞」、「細胞株」および「細胞培養」は、交換可能に使用され得る。これらの用語の全てはまた、任意の全てのその後の世代である、それらの子孫を含む。すべての子孫が、意図的な変異または偶然の変異に起因して、同一というわけではないかもしれないことが理解される。異種核酸配列を発現する状況では、「宿主細胞」は、原核生物細胞または真核生物細胞をいい、宿主細胞は、ベクターを複製し得るおよび／またはベクターによってコードされる異種遺伝子を発現し得る、任意の形質転換可能な生物体を含む。宿主細胞は、ベクターについてのレシピエントとして使用され得、そして使用されている。宿主細胞は、「トランスフェクト」または「形質転換」され得、トランスフェクトまたは形質転換とは、外因性核酸が宿主細胞へと移入または導入されるプロセスをいう。形質転換細胞としては、初代の対象細胞およびその子孫が挙げられる。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「炎症性免疫疾患」は、生物体の免疫系に罹り、身体の特定領域の炎症を引き起こす疾患と定義される。特定の実施形態では、炎症の領域としては、関節、結腸および甲状腺の滑液が挙げられる。炎症は、この疾患の原発症状であり得るか、またはこの疾患に間接的に関連し得る。特定の実施形態では、この炎症は、低いレベルのグレードの炎症（例えば、変形性関節症を含め、変性形態の関節炎に伴う炎症）であり得る。炎症性免疫疾患の例としては、関節炎（例えば、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎およびサルコイド関節炎）、変形性関節症、潰瘍性大腸炎および甲状腺炎が挙げられる。
【００３３】
本明細書中で使用される場合、用語「妨害する」は、作用を遅延させるか、緩慢にするかまたは妨げて、望ましくない結果を予防することとして定義される。妨害は、完全であってもよく、または部分的であってもよい。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「阻害する」は、作用をブロックするか、遅延させるか、または妨げて、所望でない結果を予防することと定義される。阻害は、完全であってもよく、または部分的であってもよい。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、用語「リガンド」は、別の分子に結合する分子と定義される。特定の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーに結合するリガンドが好ましい。当業者は、リガンドが、リガンド全体、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーに結合し得るままである、その任意の部分および任意の変異体を含むことを認識する。
【００３６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＮＵＲＲサブファミリー」は、構成的に活性な転写因子として機能し、かつＮＵＲＲ１（Ｎｕｒ関連因子Ｉ）に関連する（ここで、この関係は構造的および機能的である）、核に局在する転写因子のグループと定義される。特定の実施形態では、このサブファミリーは、異なるメンバーが互いに機能的に補完する能力によって特徴付けられる。別の特定の実施形態では、このサブファミリーは、ＤＮＡ結合ドメインの同一の配列を有し、ここで、この配列同一性は、約４０％である。さらに別の特定の実施形態では、この配列同一性は約４５％である。さらに別の特定の実施形態では、この配列同一性は約５０％である。さらに別の特定の実施形態では、この配列同一性は約５５％である。さらに別の特定の実施形態では、この配列同一性は約６０％である。さらに別の特定の実施形態では、この配列同一性は約６５％である。さらに別の特定の実施形態では、この配列同一性は約７０％である。さらに別の特定の実施形態では、この配列同一性は約７５％である。さらに別の特定の実施形態では、この配列同一性は約８０％である。さらに別の特定の実施形態では、この配列同一性は約８５％である。さらに別の特定の実施形態では、この配列同一性は約９０％である。さらに別の特定の実施形態では、この配列同一性は約９５％である。さらに別の特定の実施形態では、この配列同一性は約９９％である。このファミリーは、ＮＵＲＲ１、ＮＯＲ１（ニューロン由来オーファンレセプター）およびＮＵＲ７７を含む。このサブファミリーの考察については、本明細書中に参考として援用される、Ｍａｒｕｙａｍａら，１９９５および各メンバーの別名に関するその中の表１を参照のこと。当業者は、このグループが核レセプタースーパーファミリーのＮＧＦＩ−Ｂサブファミリーともいわれ得ることを認識する。特徴としては、２つの高度に保存されたジンクフィンガーモチーフ（Ｂｅｒｇ，１９８９；ＫｌｕｇおよびＳｃｈｗａｂｅ，１９９５）を含む中心のＤＮＡ結合ドメイン、カルボキシル末端における８〜９個の疎水性アミノ酸のヘプタッド反復を含むリガンド結合ドメインおよび可変アミノ末端領域が挙げられ得る。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「オーファンレセプター」は、既知のレセプターに構造的に関連している分子であって、ここで、リガンドの正体および生理学的機能が未知である分子をいう。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、１より多くのアミノ酸サブユニットを含む、分子と定義される。ポリペプチドは、タンパク質全体であってもよく、またはポリペプチドは、タンパク質のフラグメント（例えば、ペプチドまたはオリゴペプチド）であってもよい。ポリペプチドはまた、アミノ酸サブユニットに対する変更（例えば、メチル化またはアセチル化）を含み得る。特定の実施形態では、ポリペプチドは、核局在化配列を有する。
【００３９】
本明細書中で使用される場合、用語「レセプター」は、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列と会合するかまたはＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列である、生物学的実体と定義される。レセプターは、アミノ酸配列、核酸配列、脂質、糖、糖質またはそれらの組合せであり得る。特定の実施形態では、レセプターはアミノ酸配列である。レセプターは、膜、核または細胞質に位置し得る。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、用語「治療的に有効」は、疾患に関連した何らかの症状を改善するために必要な化合物量と定義される。例えば、炎症性免疫疾患（例えば、関節炎）の処置において、この疾患の任意の症状を減少、妨害、遅延または停止させる化合物は、治療的に有効である。治療有効量の化合物は、疾患を治癒させるために必要とされるわけではなく、疾患についての処置を提供する。投与される量が生理学的に重要である場合、化合物は、治療有効量で投与される。化合物の存在が、レシピエント生物体の生理機能における技術的変化をもたらす場合、その化合物は、生理学的に有意である。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「転写される」は、デオキシリボ核酸テンプレートからのリボ核酸の作製をいう。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「処置」は、医学的手段または外科的手段を介した患者の管理と定義される。処置は、医学的状態または医学的疾患の少なくとも１つの症状を改善または緩和し、そして治癒を提供するためには必要とされない。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「血管疾患」は、血管（動脈、静脈および毛細管）の直径が制限される、任意の疾患と定義される。血管疾患は、血管透過性または血管拡張における変化（例えば、血管新生）を含み得る。制限された血管は、疾患または医学的状態（例えば、心臓病）の主症状であり得る。
【００４４】
本発明の１つの実施形態では、配列番号２のＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列を含むポリペプチドのレベルを低下させる工程を包含する、炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法が存在する。特定の実施形態では、レベルを低下させる工程は、このポリペプチドに対する、治療的に有効なレベルのアンタゴニストを投与することを含む。別の特定の実施形態では、このアンタゴニストは、アミノ酸、核酸、脂質、有機合成分子、ハプテン、糖、糖質またはそれらの組合せからなる群より選択される。さらなる特定の実施形態では、このアンタゴニストはアミノ酸である。
【００４５】
本発明の別の実施形態では、ポリペプチドのレベルを低下させる工程は、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸合成を阻害すること、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸分解を増大させることを含むか、または治療的に有効なレベルの、ＮＵＲＲサブファミリーポリペプチドに対する抗体を投与することを含む。特定の実施形態では、この炎症性免疫疾患は、慢性炎症性関節疾患、関節炎、慢性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎および甲状腺炎からなる群より選択される。別の特定の実施形態では、この炎症性関節疾患は関節炎である。さらなる特定の実施形態では、この関節炎は、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎およびサルコイド関節炎からなる群より選択される。別の実施形態では、抗サイトカインを投与する工程を包含する、炎症性免疫疾患を処置するための方法が存在する。特定の実施形態では、この抗サイトカインは、ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６またはＰＧＥ２を妨害する。特定の実施形態では、この抗サイトカインは、グルココルチコイドである。さらなる実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのポリペプチドのレベルを低下させる工程は、コルチコトロピン放出ホルモン、プロオピオメラノコルチコトロピン、コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）、血清アミロイドＡおよびＰＧＥ２のアミノ酸またはリボ核酸のレベルを低下させることを含む。
【００４６】
本発明のさらなる実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリー（例えば、配列番号１のＮＵＲＲ１核酸配列）から転写されるＮＵＲＲサブファミリーのリボ核酸配列のレベルを低下させる工程を包含する、炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法が存在する。特定の実施形態では、この低下させる工程は、ＮＵＲＲサブファミリーの核酸合成を阻害すること、ＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列の治療的に有効なレベルのアンチセンス配列を投与すること、または治療的に有効なレベルの抗サイトカインを投与することを含む。別の特定の実施形態では、この抗サイトカインは、ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＰＧＥ２からなる群より選択されるサイトカインを妨害する。特定の実施形態では、この抗サイトカインはグルココルチコイドである。さらなる実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列のレベルを低下させる工程は、コルチコトロピン放出ホルモン、プロオピオメラノコルチコトロピン、コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）および血清アミロイドＡのアミノ酸またはリボ核酸のレベルを低下させることを含む。特定の実施形態では、この炎症性免疫疾患は、慢性炎症性関節疾患、関節炎、慢性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎および甲状腺炎からなる群より選択される。別の特定の実施形態では、この炎症性免疫疾患は関節炎である。さらなる特定の実施形態では、この関節炎は、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎およびサルコイド関節炎からなる群より選択される。
【００４７】
本発明の別の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリー（例えば、配列番号３３のアミノ酸配列）を含むポリペプチドの、核酸への結合を妨害する工程を包含する、炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法が存在する。特定の実施形態では、この妨害する工程は、ＮＵＲＲサブファミリーのポリペプチドに対するアンタゴニストの治療的に有効なレベルを投与すること、ＮＵＲＲサブファミリーのポリペプチドに対する抗体の治療的に有効なレベルを投与すること、またはＮＵＲＲサブファミリーのメンバーを結合する、レセプターもしくは核酸のレベルを治療有効量まで増大させることを含む。別の特定の実施形態では、このアンタゴニストは、アミノ酸、核酸、脂質、糖、糖質またはそれらの組合せからなる群より選択される。さらなる特定の実施形態では、このアンタゴニストはアミノ酸である。特定の実施形態では、この炎症性免疫疾患は、慢性炎症性関節疾患、関節炎、慢性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎および甲状腺炎からなる群より選択される。別の特定の実施形態では、この炎症性免疫疾患は関節炎である。さらなる特定の実施形態では、この関節炎は、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎およびサルコイド関節炎からなる群より選択される。
【００４８】
本発明のさらなる実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの治療有効量の核酸配列を生物体に投与する工程を包含する、血管疾患について生物体を処置する方法が存在する。特定の実施形態では、投与する工程は、ベクターを含む。さらなる特定の実施形態では、このベクターは、核酸、アミノ酸、脂質、リポソーム、糖、糖質またはそれらの組合せである。別の特定の実施形態では、この核酸ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレトロウイルスである。
【００４９】
特定の実施形態では、配列番号１のＮＵＲＲ１核酸配列から転写されるリボ核酸のレベルを低下させる工程を包含し、ここで、このＮＵＲＲ１核酸配列が血管拡張剤をコードする、炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法が存在する。特定の実施形態では、ＮＵＲＲ１のリボ核酸のレベルを低下させる工程は、ＮＵＲＲ１核酸配列のアンチセンス配列の治療的に有効なレベルを投与することを含む。さらなる特定の実施形態では、この核酸配列はベクターを含む。別の特定の実施形態では、このベクターは、核酸、アミノ酸、脂質、リポソーム、糖、糖質およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。さらなる特定の実施形態では、この核酸ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスである。
【００５０】
本発明の別の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列を含むポリペプチドのレベルを低下させる工程を包含し、ここで、このＮＵＲＲサブファミリーポリペプチドが血管拡張剤として作用する、炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法が存在する。特定の実施形態では、配列番号３３のＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列を含むポリペプチドの治療的に有効なレベルを、生物体に投与する工程を包含する、血管疾患について生物体を処置する方法が存在する。さらなる実施形態では、アミノ酸配列を投与する工程は、タンパク質形質導入ドメインを含む。さらなる特定の実施形態では、このタンパク質形質導入ドメインは、ＨＩＶ　ＴＡＴタンパク質形質導入ドメインである。
【００５１】
本発明の別の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列（例えば、配列番号１を含む配列）から転写されるリボ核酸のレベルを低下させる工程を包含する、生物体における炎症性免疫疾患を予防する方法が存在する。
【００５２】
本発明のさらなる実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列（例えば、配列番号３３を含む配列）を含むポリペプチドのレベルを低下させる工程を包含する、生物体における炎症性免疫疾患を予防する方法が存在する。
【００５３】
本発明のさらなる実施形態では、ポリペプチドのアンタゴニストが存在し、ここで、このポリペプチドは、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列（例えば、配列番号３３の配列）を含み、ここで、このポリペプチドは、核レセプターである。特定の実施形態では、このアンタゴニストはアミノ酸である。他の特定の実施形態では、このポリペプチドは、ステロイドレセプター、ホルモンレセプターまたはビタミンレセプターである。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態では、ポリペプチドのアゴニストが存在し、ここで、このポリペプチドはＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列（例えば、配列番号３３を含むＮＵＲＲ１配列）を含み、ここで、このポリペプチドは核レセプターである。特定の実施形態では、このアゴニストはアミノ酸である。他の特定の実施形態では、このポリペプチドは、ステロイドレセプター、ホルモンレセプターまたはビタミンレセプターである。
【００５５】
本発明の１つの実施形態では、生物体における炎症性免疫疾患の処置のための化合物が存在し、ここで、この化合物は、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列（例えば、配列番号３３を含む配列）を含むポリペプチドのアンタゴニストであり、ここで、このポリペプチドは核レセプターである。特定の実施形態では、この炎症性免疫疾患は、慢性炎症性関節疾患、関節炎、慢性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎および甲状腺炎からなる群より選択される。別の特定の実施形態では、この炎症性免疫疾患は関節炎である。
【００５６】
本発明のさらなる実施形態では、生物体における炎症性免疫疾患の処置のための化合物が存在し、ここで、この化合物は、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列（例えば、配列番号３３を含むＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列）を含むポリペプチドのアゴニストであり、そしてここで、このポリペプチドは核レセプターである。特定の実施形態では、この炎症性免疫疾患は、慢性炎症性関節疾患、関節炎、慢性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎および甲状腺炎からなる群より選択される。別の特定の実施形態では、この炎症性免疫疾患は関節炎である。
【００５７】
本発明の特定の実施形態では、ＣＲＨレセプターの核酸配列の発現を減少させる工程を包含する、炎症性免疫疾患についての生物体を処置する方法が存在する。さらなる特定の実施形態では、ＣＲＨレセプターの発現を低下させる工程は、配列番号１０４の核酸配列の合成を阻害することを含む。本発明の別の特定の実施形態では、ＣＲＨレセプターのアミノ酸配列のレベルを減少させる工程を包含する、炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法が存在する。さらなる特定の実施形態では、ＣＲＨレセプターのアミノ酸のレベルを低下させる工程は、アミノ酸合成を阻害すること、ＣＲＨレセプターのアミノ酸分解を増大させることを含むか、または配列番号１２４を含む配列のＣＲＨレセプターのポリペプチドに対する抗体の治療的に有効なレベルを投与することを含む。特定の実施形態では、この炎症性免疫疾患は、慢性炎症性関節疾患、関節炎、慢性関節リウマチ、潰瘍性大腸炎および甲状腺炎からなる群より選択される。別の特定の実施形態では、この炎症性関節疾患は関節炎である。さらなる特定の実施形態では、この関節炎は、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎およびサルコイド関節炎からなる群より選択される。
【００５８】
本発明の目的は、核レセプタースーパーファミリーのメンバー（上記の通りのＮＵＲＲ１、ＮＯＲ１およびＮＵＲ７７を含む）は構造的および遺伝的に顕著な関連した冗長性があるので、ＮＵＲＲサブファミリーの全てのメンバーに対する、処置方法、予防方法、アンタゴニスト、アゴニストおよび化合物に関する。当業者は、本発明の範囲内でＮＵＲＲ１配列が利用されることを認識する。核酸ＮＵＲＲ１配列、続いてＧｅｎｂａｎｋ登録番号の例としては、以下が挙げられる：配列番号１（ＡＢ０１７５８６）、配列番号２（ＮＴ００５１５１）、配列番号３（ＡＪ２７８７００）、配列番号４（ＮＭ０１３６１３）、配列番号５（ＮＭ００６１８６）、配列番号６（ＢＢ５３９５８７）、配列番号７（ＢＢ５３６２２５）、配列番号８（ＢＢ４３２１６８）、配列番号９（ＢＢ４２４２６９）、配列番号１０（ＢＢ３４５７４５）、配列番号１１（ＢＢ３２２９４１）、配列番号１２（ＢＢ０２３３９１）、配列番号１３（ＢＢ０２３３５５）、配列番号１４（ＡＢ０１９４３３）、配列番号１５（ＸＭ００２４４１）、配列番号１６（ＡＶ３５６６５１９）、配列番号１７（ＡＶ３５６５１２）、配列番号１８（ＡＶ３８２２３４）、配列番号１９（ＡＶ３６８０３５）、配列番号２０（ＡＶ３５２１２７）、配列番号２１（ＡＶ３４１５５３）、配列番号２２（ＡＶ２４５７２４）、配列番号２３（ＡＶ２２１６６５）、配列番号２４（ＡＢ０１４８８９）、配列番号２５（Ｕ７２３４５）、配列番号２６（Ｕ８６７８３）、配列番号２７（Ｕ６７７３８）、配列番号２８（Ｕ９３４７１）、配列番号２９（Ｕ９３４２９）、配列番号３０（Ｓ５３７４４）、配列番号３１（Ｒ３５９２８）および配列番号３２（Ｒ２５９０８）。アミノ酸ＮＵＲＲ１配列の例としては、以下が挙げられる：配列番号３３（５４８３９０）、配列番号３４（ＸＰ００２４４１）、配列番号３５（ＣＡＣ２７７８３）、配列番号３６（Ａ４６２２５）、配列番号３７（ＮＰ０３８６４１）、配列番号３８（ＮＰ００６１７７）、配列番号３９（ＢＡＡ７７３２８）、配列番号４０（ＢＡＡ７５６６６）、配列番号４１（Ｑ０７９１７）、配列番号４２（Ｐ４３３５４）、配列番号４３（Ｑ０４９１３）、配列番号４４（ＡＡＢ６８７４８）、配列番号４５（ＡＡＢ６８７０６）および配列番号４６（ＡＡＢ２５１３８）。当業者は、本発明の範囲内でＮＯＲ−１配列が利用されることを認識する。核酸ＮＯＲ−１配列の例としては、以下が挙げられる：配列番号４７（１６５１１９０）、配列番号４８（Ｄ３８５３０）、配列番号４９（ＡＦ０５０２２３）、配列番号５０（Ｘ７５８７１）、配列番号５１（Ｌ２７８１）、配列番号５２（ＢＧ２３５９６５）、配列番号５３（ＢＥ６５６７１１）、配列番号５４（ＢＥ１８８０９５）、配列番号５５（ＢＥ１８７９３１）、配列番号５６（ＡＪ０１１７６８）、配列番号５７（Ｅ１４９６５）、配列番号５８（ＡＪ０１１７６７）、配列番号５９（Ｄ８５２４４）、配列番号６０（Ｄ８５２４３）、配列番号６１（Ｄ８５２４２）、配列番号６２（Ｄ８５２４１）および配列番号６３（ＮＭ０１５７４３）。アミノ酸ＮＯＲ１配列の例としては、配列番号６４（７４４１７７１）、配列番号６５（Ｑ９２５７０）、配列番号６６（ＢＡＡ１１４１９）、配列番号６７（ＪＣ２４９３）、配列番号６８（ＮＰ０５６５５８）、配列番号６９（Ｐ５１１７９）、配列番号７０（ＣＡＡ０９７６４）、配列番号７１（ＣＡＡ０９７６３）、配列番号７２（ＢＡＡ３１２２１）、配列番号７３（ＢＡＡ２８６０８）、配列番号７４（ＢＡＡ０７５３５）および配列番号７５（ＡＡＡ３２６８５）が挙げられる。当業者は、本発明の範囲内でＮＵＲ７７配列が利用されることを理解する。核酸ＮＵＲ７７配列の例としては、以下が挙げられる：配列番号７６（１３３９９１７）、配列番号７６（１２６６２５４８）、配列番号７７（ＢＦ９３７３８２）、配列番号７８（ＮＭ００６９８１）、配列番号７９（ＡＲ０８５６５５）、配列番号８０（ＡＲ０８５６５４）、配列番号８１（ＡＲ０８５６５３）、配列番号８２（ＡＲ０８５６５４）、配列番号８３（ＡＲ０８５６５２）、配列番号８４（ＢＥ１９８４６０）、配列番号８５（ＢＥ０４７６５６）、配列番号８６（ＢＥ０４７６５１）、配列番号８７（ＡＷ９８８８２７）、配列番号８８（ＡＡ４６１４２２）、配列番号８９（Ｄ４９７２８）および配列番号９０（Ｓ７７１５４）。アミノ酸ＮＵＲ７７配列の例としては、以下が挙げられる：配列番号７６（１２７８１９）、配列番号９１（１２８９１１）、配列番号９２（Ｐ２２８２９）、配列番号９３（ＮＰ０３４５７４）、配列番号９４（ＡＡＢ３３９９９）、配列番号９５（ＮＰ００８９１２）、配列番号９６（ＡＡＡ４２０５８）および配列番号９７（Ａ３７２５１）。当業者は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｇｅｎｂａｎｋデータベースまたは市販のデータベース（例えば、Ｃｅｌｅｒａによる遺伝子データベース）から配列をどのようにして検索するかがわかる。
【００５９】
本発明では、この方法は、炎症性免疫疾患（例えば、関節炎）を処置するため、またはこのような疾患を予防するためのいずれかに使用される。処置における使用の例は、その発症後の炎症性免疫疾患の改善のための使用、またはその症状を軽減するのを助ける際の使用である。この炎症性免疫疾患は、少なくとも１つの症状が緩和された場合、改善されたと考えられ、ここで、緩和は、部分的または完全であり得る。予防のための処置についての使用の例は、滑膜または滑液の炎症を予防するための、従って、関節炎の発症を予防または遅延させるための、関節炎の発症前の使用である。
【００６０】
本発明の１つの特定の実施形態は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの核酸レベルを低下させる工程を包含する、関節炎を処置する方法である。特定の実施形態では、ＮＵＲＲ１核酸が低下される。本発明の別の特定の実施形態は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのアミノ酸レベルを低下させる工程を包含する、関節炎を処置する方法を含む。特定の実施形態では、ＮＵＲＲ１アミノ酸のレベルが低下される。当業者は、ＮＵＲＲ１の核酸レベルまたはアミノ酸レベルを低下させる種々の方法が存在することを認識する。
【００６１】
（スクリーニングアッセイ−アミノ酸アンタゴニスト）
本発明の特定の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列に対するアンタゴニストを投与する方法が存在する。別の実施形態では、ＣＲＨレセプターのアミノ酸配列に対するアンタゴニストを投与する本発明の方法が存在する。当業者は、１つの実施形態におけるアンタゴニストが、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーへと結合することによって、ＮＵＲＲ転写活性を妨害することを認識する。別の実施形態では、このアンタゴニストの作用は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの発現の減少をもたらす。当業者は、標準的な方法を利用して、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列またはＣＲＨレセプターのアミノ酸配列に対するアンタゴニストとして阻害または作用する化合物についてスクリーニングすることを知っている。化合物バンクまたはオリゴペプチドライブラリーは、特定の実施形態で、当該分野で周知の方法によってスクリーニングされる。このアンタゴニストは、アミノ酸、核酸、脂質、リポソーム、糖質、糖またはそれらの組合せであり得る。好ましい実施形態では、このアンタゴニストはアミノ酸である。
【００６２】
本発明の別の実施形態は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーに対する抗体を投与して、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのアミノ酸配列を、入手可能なプールから隔離することによって、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのレベルを低下させることを含む。本発明の別のさらなる実施形態は、ＣＲＨレセプターに対する抗体を投与して、ＣＲＨレセプターのアミノ酸配列を、入手可能なプールから隔離することによって、ＣＲＨレセプターのレベルを低下させることを含む。抗体誘導のためのＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列およびＣＲＨレセプターのアミノ酸配列は、生物学的活性を必要としない；しかし、タンパク質フラグメントまたはオリゴペプチドは、抗原性でなければならない。特異抗体を誘導するために用いられるペプチドは、少なくとも約４アミノ酸、好ましくは少なくとも約１０アミノ酸からなるアミノ酸配列を有し得る。これらは、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部分を模倣すべきであり、そして天然に存在する低分子のアミノ酸配列全体を含み得る。当該分野で周知の手順は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのアミノ酸配列に対する抗体の産生のために、またはＣＲＨレセプターのアミノ酸配列に対する抗体の産生のために用いられ得る。
【００６３】
抗体の産生について、種々の宿主（ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなどを含む）は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのタンパク質もしくはＣＲＨレセプターのタンパク質、または免疫原性特性を保持する、それらの任意の部分、フラグメントもしくはオリゴペプチドを用いた注射によって免疫され得る。宿主の種に依存して、種々のアジュバントを用いて、免疫学的応答を増大させ得る。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｆｒｅｕｎｄアジュバント、鉱物ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）および界面活性剤（例えば、リゾレシチン）、プルーロニックポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ　ｐｏｌｙｏｌ）、ポリアニオン、ペプチド、油乳濁物、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノール。ＢＣＧ（カルメットゲラン桿菌）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍは、潜在的に有用なヒトアジュバントである。ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターに対するモノクローナル抗体は、培養中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて調製される。抗原結合部位を保持する、抗体およびフラグメントの誘導体もまた、本発明に含まれる。
【００６４】
特定の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのアミノ酸配列またはＣＲＨレセプターのアミノ酸配列のレベルは、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのアミノ酸合成またはＣＲＨレセプターのアミノ酸合成を阻害することによって低下される。これは、ＮＵＲＲ１配列またはＣＲＨレセプター配列の翻訳の妨害または停止だけでなく、翻訳後プロセシングおよび適切な細胞内（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）局在への輸送をも含む。
【００６５】
別の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列またはＣＲＨレセプターのアミノ酸配列のレベルは、それぞれ、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸分解またはＣＲＨレセプター分解を増大させることによって低下される。これは、アミノ酸配列を分解についての標的とする、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸配列またはＣＲＨレセプターのアミノ酸配列に対する改変（ユビキチン付加（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ））を含む。
【００６６】
さらなる実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのアミノ酸のレベルは、ＣＲＨの核酸またはアミノ酸のレベルを低下させることによって低下される。実施例において実証されるように、ＣＲＨは、ＮＵＲＲ１の発現を誘導する。それゆえ、特定の実施形態で、ＮＵＲＲ１抑制について類似の意味で本明細書中で記載される、レベルを低下させることはまた、ＮＵＲＲ１のアミノ酸レベルを低下させる。類似の方法で、他のＮＵＲＲサブファミリーのメンバーは、ＣＲＨレベルを低下させることによって低減される。
【００６７】
好ましい実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのアミノ酸配列のアミノ酸レベルを低下させることは、コラゲナーゼまたは血清アミロイドＡ（ＲＡ炎症機構および関節破壊と関連付けられている、その調節領域にＮＵＲＲ１コンセンサス結合部位を有する遺伝子の２つの例）の核酸またはアミノ酸の配列を減少させることをさらに含む。ＮＵＲＲ１によって調節され、かつ免疫疾患に関連した炎症に関連している他の核酸配列は、本発明の範囲内にある。コラゲナーゼの核酸配列は、本明細書中で配列番号１４１（１３６３９６７１）によって表され、そしてコラゲナーゼのアミノ酸配列は本明細書中で配列番号１４２（１３６３９６７２）によって表される。血清アミロイドＡの核酸配列は本明細書中で配列番号９８（１７８８６８）によって表され、そして血清アミロイドＡのアミノ酸配列は配列番号９９（１３５４０４７５）である。コンセンサス結合部位をその調節領域に含む遺伝子の他の例は、コルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）およびプロオピオメラノコルチコトロピン（ＰＯＭＣ）である。ＣＲＨの核酸は配列番号１００（１２８０３５３８）を含み、そしてＣＲＨのアミノ酸配列は配列番号１０１（ＡＡＨ０２５９９）を含む。ＰＯＭＣの核酸配列は配列番号１０２（１１４２９７８０）によって表され、そしてＰＯＭＣのアミノ酸配列は配列番号１０３（１３６３７２５３）によって表される。
【００６８】
好ましい実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのアミノ酸配列のアミノ酸レベルを低下させることは、ＣＲＨレセプターサブタイプＲ１の核酸またはアミノ酸の配列を低下させることをさらに含む。当業者は、本発明の範囲内でＣＲＨ−Ｒ１配列が利用されることを認識する。核酸ＣＲＨ−Ｒ１配列の例として、以下が挙げられる：配列番号１０４（５８１５４７２）、配列番号１０５（登録番号ＮＭ０３０９９９）、配列番号１０６（登録番号ＡＢ０５５４３４）、配列番号１０７（登録番号ＮＭ００７７６２）、配列番号１０８（登録番号ＮＭ００４３８２）、配列番号１０９（登録番号ＢＢ５２３３９９）、配列番号１１０（登録番号ＢＢ５２０２９０）、配列番号１１１（登録番号ＢＢ５１７６８９）、配列番号１１２（登録番号ＢＢ４７７３８８）、配列番号１１３（登録番号ＢＢ４７５６８７）、配列番号１１４（登録番号ＡＦ１８０３０１）、配列番号１１５（登録番号ＢＢ２３９４８６）、配列番号１１６（登録番号ＢＢ２３７７６１）、配列番号１１７（登録番号ＢＢ１６９１１４）、配列番号１１８（登録番号ＡＶ３３２１６４）、配列番号１１９（登録番号ＡＩ５６１８５６）、配列番号１２０（登録番号Ｕ１９９３９）、配列番号１２１（登録番号ＡＦ０７７１８５）、配列番号１２２（登録番号ＡＡ５４３２９９）および配列番号１２３（登録番号ＢＢ００９７４５）。ＣＲＨ−Ｒ１のアミノ酸配列の例として、以下が挙げられる：配列番号１２４（５８１５４７３）、配列番号１２５（登録番号０６２７７２）、０４２６０２）、配列番号１２６（登録番号Ｑ９０８１２）、配列番号１２７（登録番号Ｐ３５３５３）、配列番号１２８（登録番号Ｐ３５３４７）、配列番号１２９（登録番号Ｐ３４９９８）、配列番号１３０（登録番号ＮＰ１１２２６１）、配列番号１３１（登録番号ＢＡＢ２１８６４）、配列番号１３２（登録番号Ｉ３８８７９）、配列番号１３３（登録番号Ａ４８２６０）、配列番号１３４（登録番号Ｓ３９５３５）、配列番号１３５（登録番号ＮＰ００３１７８８）、配列番号１３６（登録番号ＡＡＤ５２６８８）、配列番号１３７（登録番号ＡＡＣ５２２４３）、配列番号１３８（登録番号ＡＡＣ５００７３）、配列番号１３９（登録番号ＡＡＣ２７３２０）および配列番号１４０（登録番号ＮＰ００４３７３）。
【００６９】
さらなる実施形態では、抗サイトカインの投与をさらに包含する、炎症性免疫疾患についての処置が存在する。この抗サイトカインは、サイトカインを、直接的または間接的のいずれかで妨害する。特定の実施形態では、妨害の標的であるサイトカインは、ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６またはＰＧＥ２である。
【００７０】
本発明の１つの実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列またはＣＲＨレセプターの核酸配列のレベルを低下させる工程を包含する、炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法が存在する。ＮＵＲＲサブファミリーまたはＣＲＨレセプターの核酸配列のレベルを低下させる工程は、当該分野で標準的な方法によって行われ得る。これは、機能的核酸配列のレベルを低下させることを含み、そして転写後プロセシング、５’ｍＲＮＡキャップの適用、スプライシングおよびポリアデニル化に影響を与えることを含み得る。特定の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列は、適切な細胞内位置にもはや局在しない。別の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列またはＣＲＨレセプターの核酸配列のレベルは、上流の因子（例えば、ＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列の発現を調節する転写因子）に影響を与えることによって低下される。さらなる実施形態では、ＣＲＨレセプターの核酸配列のレベルは、上流の因子（例えば、ＣＲＨレセプターの核酸配列の発現を調節する転写因子）に影響を与えることによって低下される。
【００７１】
（スクリーニングアッセイ−核酸アンタゴニスト）
本発明の１つの実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの核酸レベルを低下させる方法が存在する。本明細書中に提示される例は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーが低下したレベルの発現を有する条件下でのみ現れる、容易に検出可能な表現型をその組換え宿主に付与するためにレポーター遺伝子が用いられる、細胞全体アッセイ、インビボ分析または形質転換細胞株もしくは不死細胞株に基づく候補物質のスクリーニング方法を提供する。一例として、レポーター遺伝子は、分析（例えば、色素形成分析、蛍光比色分析、放射性同位体分析または分光光度分析）によって検出可能である、他の場合にはその宿主細胞によって産生されないポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、このアミノ酸配列をコードするＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列は、β−ガラクトシダーゼで置換されている。
【００７２】
本発明のスクリーニングアッセイの別の例は、本明細書中に提示される。ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーを発現する細胞は、マイクロタイターウェル中で増殖され、その後、一連のウェルに連続モル濃度比率の候補が添加され、そして化合物を再懸濁または溶解するために用いられたビヒクルと共に単独でインキュベートしたコントロールにおける発現を実証するに充分であるインキュベーション期間後にシグナルレベルが決定される。次いで、種々の比率の候補を含有するウェルは、シグナル活性化について評価される。次いで、レポーター遺伝子の転写または発現の用量関連減少を実証する候補は、臨床治療剤としてのさらなる評価のために選択される。
【００７３】
代替の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの配列（例えば、配列番号１）のアンチセンス配列で細胞をトランスフェクトすることによって、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの核酸レベルを低下させるための方法が存在する。細胞への核酸のトランスフェクションについての送達系は、ウイルス法または非ウイルス法のいずれかを利用し得る。非ウイルス形態のＤＮＡまたはＲＮＡについての標的化系は、以下の４つの成分を必要とする：１）目的のＤＮＡまたはＲＮＡ；２）細胞表面レセプターまたは抗原を認識しかつ結合する部分；３）ＤＮＡ結合部分；ならびに４）細胞表面から細胞質への複合体の輸送を可能にする溶解部分。さらに、リポソームおよびカチオン性脂質を用いて、治療遺伝子の組合せを送達して、同じ効果を達成し得る。潜在的ウイルスベクターとしては、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルスおよびウシパピローマウイルス）から誘導される発現ベクターが挙げられる。さらに、エピソーム性ベクターが用いられ得る。他のＤＮＡベクターおよび輸送体系は、当該分野で公知である。
【００７４】
当業者は、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスもしくはワクシニアウイルス、または種々の細菌性プラスミドから誘導された発現ベクターが、標的とされた器官、組織または細胞集団へのヌクレオチド配列の送達のために用いられ得ることを認識する。当業者に周知である方法を用いて、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターをコードする遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを発現する組換えベクターを構築し得る。この遺伝子は、高レベルの所望の遺伝子コードフラグメントを発現する発現ベクターで細胞または組織をトランスフェクトすることによって、オフにされ得る。このような構築物は、翻訳できないセンス配列またはアンチセンス配列を細胞にあふれさせ得る。ＤＮＡの組込みの非存在下でさえ、このようなベクターは、全てのコピーが内因性ヌクレアーゼによって無効にされるまで、ＲＮＡ分子を転写するのに寄与し得る。一過性発現は、非複製性ベクターについて一ヶ月以上、そして適切な複製エレメントがこのベクター系の一部である場合はさらに長く、持続し得る。
【００７５】
さらに、当業者は、遺伝子発現の改変が、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの核酸配列の制御領域（すなわち、プロモーター、エンハンサーおよびイントロン）に対するアンチセンス分子を設計することによって得られ得ることを認識する。転写開始部位（例えば、リーダー配列の−１０領域と＋１０領域との間）から誘導されるオリゴヌクレオチドが好ましい。アンチセンス分子はまた、転写産物がリボソームに結合するのを妨害することによってｍＲＮＡの翻訳をブロックするためにも、設計され得る。同様に、阻害は、「三重らせん」塩基対合方法論を用いることによって達成され得る。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために充分に開く能力を損なう。
【００７６】
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒し得る酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、続いてヌクレオチド内分解性（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）切断を含む。本発明の範囲内には、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーをコードする配列のヌクレオチド内分解性切断を特異的かつ効率的に触媒し得る、操作されたハンマーヘッド型モチーフのリボザイム分子が存在する。別の実施形態では、リボザイムは、Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ型リボザイムである。
【００７７】
本発明のアンチセンス分子およびリボザイムは、ＲＮＡ分子の合成について当該分野で公知の任意の方法（オリゴヌクレオチドを化学的に合成するための技術を含む）によって調製され得る。あるいは、ＲＮＡ分子は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのレセプターをコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボでの転写によって作製され得る。このようなＤＮＡ配列は、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）を有する広範な種々のベクター中に組み込まれ得る。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物は、細胞株、細胞または組織に導入され得る。
【００７８】
特定の実施形態では、核酸のトランスフェクションは、Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎら（１９９９）に記載されるように、輸送タンパク質によって促進される。手短には、ペプチドＭ９は、キャリア分子としてカチオン性ペプチドに化学的に結合される。カチオン性複合体は、負に荷電した目的の核酸を結合し、続いて核輸送タンパク質（例えば、トランスポルチン（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｉｎ））へとＭ９が結合する。
【００７９】
本発明の１つの実施形態は、遊離のＮＵＲＲサブファミリーのメンバーに結合する、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのレセプターの合成を増大させることによって、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのレベルを低下させることである。
【００８０】
本発明の１つの実施形態では、治療的に有効なレベルの抗サイトカインを投与する工程を包含する、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの核酸レベルを低下させる方法が存在する。特定の実施形態では、この抗サイトカインは、例えば、ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６またはＰＧＥ２を妨害する。
【００８１】
本発明のさらなる実施形態では、炎症性免疫疾患に関連した核酸配列（例えば、コラゲナーゼ、血清アミロイドＡ、ＣＲＨまたはＰＯＭＣ）の核酸レベルを低下させる工程をさらに包含する、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバー（例えば、ＮＵＲＲ１）の核酸レベルにおける低下が存在する。特定の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの核酸レベルにおける低下は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの結合部位を調節領域に有する核酸配列を減少させる。
【００８２】
本発明の１つの特定の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのアミノ酸配列を結合して、その生物学的活性または免疫学的活性をブロック、妨害または調節し、それによって、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのレセプターに対する作用をそのアミノ酸配列が生じることができないようにする因子を投与するための方法である。このアンタゴニストとしては、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのレセプターに結合する、タンパク質、ペプチド、可溶性レセプター、核酸、糖質、脂質、糖または他の分子が挙げられ得る。
【００８３】
本発明の１つの実施形態は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーに対する抗体を投与して、それによって、このメンバーがＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのレセプターに結合するのを妨害する方法である。
【００８４】
特定の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのレセプターのレベルを治療有効量まで増大させることによって、レセプターへのＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの結合を妨害する方法が存在する。当該分野で公知であり、そして本明細書中に考察される遺伝子治療によって、または当該分野で標準的であり、そしてまた本明細書中に考察されるＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのレセプターのアミノ酸レベルを投与することによって、このような方法は達成され得る。
【００８５】
本発明の１つの実施形態は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのレセプター構造に影響を与える化合物を投与する方法である。このような化合物は、結合したらＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのレセプター構造を変更させ、それによってこのレセプター構造をその活性に無効にする、タンパク質、ペプチド、核酸、糖質または他の分子を含み得るがこれらに限定されない。
【００８６】
本発明の１つの実施形態は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのレセプター機能に影響を与える化合物を投与する方法である。このような化合物は、結合したらＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのレセプターの機能を阻害または抑制する、タンパク質、核酸、糖質または他の分子を含み得るがこれらに限定されない。
【００８７】
特定の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのアミノ酸または核酸配列の治療的に有効なレベルを生物体に投与する工程を包含する、血管疾患を有する生物体を処置する方法が存在する。
【００８８】
特定の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの核酸のレベルを低下させる工程を包含する、炎症性免疫疾患について生物体を処置する方法が存在し、ここで、このＮＵＲＲサブファミリーのメンバーは、血管拡張剤として作用する。慢性関節リウマチでは、血管は、重要な役割を果たし、そして実施例において示した、血管系におけるＮＵＲＲ１とＣＲＨとの会合は、この疾患についての最初の引き金であると考えられる。それゆえ、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーおよびＣＲＨのレベルをこの疾患プロセスの初期段階で低下させることは、処置のための明らかでかつ有益なストラテジーである。特定の実施形態では、アンチセンスＮＵＲＲサブファミリーのメンバー（例えば、ＮＵＲＲ１）は、生物体に、血管収縮を促進するために投与される。
【００８９】
別の実施形態では、生物体における炎症性免疫疾患についての処置は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのアミノ酸レベルを低下させる工程を包含し、ここで、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーは血管拡張剤である。
【００９０】
別の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの核酸配列またはアミノ酸配列のレベルを低下させる工程を包含する、生物体における炎症性免疫疾患を予防する方法が存在する。投与は、この炎症性免疫疾患の発症の徴候を示さないかまたはこの疾患の初期の徴候を有する生物体に対してであり得る。好ましい実施形態では、この生物体は、この炎症性免疫疾患に対して感受性であるか、またはこの疾患を有することへの遺伝的素因を示す。
【００９１】
特定の実施形態では、本明細書中に記載される方法および処置は、他の抗炎症性治療（当該分野で公知の抗サイトカイン処置を含む）と共に用いられる。
【００９２】
好ましい実施形態では、処置されるまたは予防方法に供されると本明細書中に記載される生物体はヒトである。
【００９３】
本明細書中に記載される方法および処置は、炎症性疾患に関する。特定の実施形態では、この疾患は全身性であり、そして治療は、患者に対して全身的に投与される。しかし、代替的な実施形態では、この治療は、直接適用によって（例えば、注射によって）、炎症を起こした身体領域（例えば、関節）へと投与され得る。
【００９４】
（投薬量および処方）
本発明の化合物（活性成分）は、炎症性免疫疾患を処置するために処方され、そして脊椎動物の身体中での活性成分と薬剤作用部位との接触を生じる任意の手段によって、投与され得る。本発明の化合物は、個々の治療活性成分として、または治療活性成分の組合せでのいずれかで薬剤と関連して使用するために利用可能な任意の従来の手段によって投与され得る。本発明の化合物は、単独で投与され得るが、一般には、選択された投与経路および標準的な薬学的手法に基づいて選択された薬学的キャリアと共に投与される。
【００９５】
投与される投薬量は、治療有効量の活性成分であり、そしてもちろん、既知の要因（例えば、特定の活性成分ならびにその投与形態および投与経路の薬力学的特徴；レシピエントの年齢、性別、健康および体重；症状の性質および程度；併存処置の種類、処置頻度ならびに所望の効果）に依存して変動する。
【００９６】
活性成分は、固体投薬形態（例えば、カプセル剤、錠剤および散剤）において、または液体投薬形態（例えば、エリキシル剤、シロップ剤、乳剤および懸濁剤）において、経口投与され得る。活性成分はまた、注射、迅速な注入、鼻咽頭吸収または皮膚吸収による非経口投与のために処方され得る。この薬剤は、筋肉内に、静脈内に、皮下に、経皮に投与されるかまたは坐剤として投与され得る。化合物を投与する際に、この化合物は、全身的に与えられ得る。全身的な効果を回避する必要がある化合物については、好ましい実施形態は、髄腔内投与である。本発明の好ましい実施形態では、この化合物は、関節炎の処置のために関節間に投与される。
【００９７】
ゼラチンカプセルは、活性成分および粉末化キャリア（例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、デンプン、セルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸など）を含む。同様の希釈剤は、圧縮錠剤を作製するために使用され得る。錠剤およびカプセルは両方とも、長期にわたる薬物の連続放出を提供するために、持続放出製品として製造され得る。圧縮錠剤は、任意の不愉快な味をマスクし、かつ錠剤を空気から保護するために糖衣またはフィルムコーティングされ得るか、または胃腸管中での選択的崩壊のために腸溶性コーティングされ得る。
【００９８】
経口投与のための液体投薬量形態は、患者の容認を増すために着色剤および矯味矯臭剤を含み得る。
【００９９】
一般に、水、適切なオイル、生理食塩水、デキストロース（グルコース）水溶液、および関連の糖溶液、ならびにグリコール（例えば、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）は、非経口溶液のために適切なキャリアである。非経口投与のための溶液は好ましくは、活性成分の水溶性塩、適切な安定剤、および必要に応じて緩衝物質を含む。単独かまたは組み合わされたかのいずれかの、抗酸化剤（例えば、重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムまたはアスコルビン酸）は、適切な安定剤である。クエン酸およびその塩、ならびにエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ナトリウムもまた使用される。さらに、非経口溶液は、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、メチル−またはプロピル−パラベンおよびクロロブタノール）を含み得る。適切な薬学的キャリアは、この分野における標準的な参考書であるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載される。
【０１００】
さらに、標準的な薬学的方法を用いて、作用の持続時間を制御し得る。これらは、当該分野で周知であり、そして制御放出調製物を含み、そして適切な高分子（例えば、ポリマー、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミン）を含み得る。高分子の濃度ならびに取り込みの方法は、放出を制御するために調整され得る。さらに、この薬剤は、ポリマー材料（例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテートコポリマー）の粒子中に取り込まれ得る。取り込まれることに加えて、これらの薬剤を用いて、マイクロカプセル中に化合物を捕捉し得る。
【０１０１】
本発明の化合物の投与のために有用な薬学的投薬量形態は、以下の通りに例示され得る。活性成分についての薬理学的範囲は、当該分野で周知の方法を用いて、当業者によって決定され得る。活性成分についての例示の範囲は、以下の通りである：４００μｇ／日と４ｍｇ／日との間のフォレートの範囲；２５０ｍｇ（合計）と２ｇ〜３ｇまでの毎日１００ｍｇ／ｋｇ／日という高い値との間のメチオニンの範囲；１００ｍｇと２ｇとの間のコリン範囲；１ヶ月あたり経口で約１００ｍｇまたは筋肉内で１ｍｇのビタミンＢ１２；１日当たり６ｇまでのベタインの範囲；２５ｍｇと５０ｍｇとの間の亜鉛の範囲；および１日あたり２０ｇまでのフェニル酪酸ナトリウムの範囲。
【０１０２】
カプセル剤：カプセル剤は、標準的なツーピース式硬質ゼラチンカプセル剤の各々に、粉末化活性成分、１７５ｍｇのラクトース、２４ｍｇのタルクおよび６ｍｇステアリン酸マグネシウムを充填することによって調製される。
【０１０３】
軟質ゼラチンカプセル剤：ダイズ油中の活性成分の混合物を調製し、そして容量型ポンプ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ｐｕｍｐ）によってゼラチン中に注入して、活性成分を含有する軟質ゼラチンカプセル剤を形成する。次いで、このカプセル剤は、洗浄および乾燥される。
【０１０４】
錠剤：錠剤は、投薬量単位が、示唆される量の活性成分、０．２ｍｇのコロイド状二酸化ケイ素、５ｍｇのステアリン酸マグネシウム、２７５ｍｇの微結晶性セルロース、１１ｍｇのトウモロコシデンプンおよび９８．８ｍｇのラクトースを含むように、従来の手順によって調製される。適切なコーティングは、嗜好性を増大させるためまたは吸収を遅延させるために適用され得る。
【０１０５】
注射可能物：注射のために投与のために適切な非経口組成物は、１．５重量％の活性成分を１０容量％のプロピレングリコールおよび水中に攪拌することによって調製される。溶液は、塩化ナトリウムを用いて等張性にされ、そして滅菌される。
【０１０６】
懸濁物：水性懸濁物は、各々５ｍｌが、示唆される量の、微細分割活性成分、２００ｍｇのカルボキシメチルセルロースナトリウム、５ｍｇの安息香酸ナトリウム、１．０ｇのソルビトール溶液（Ｕ．Ｓ．Ｐ．）および０．０２５ｍｇのバニリンを含むように、経口投与のために調製される。
【０１０７】
従って、本発明の薬学的組成物は、種々の経路を介して、そして身体中の種々の部位へと送達されて、特定の効果を達成し得る。当業者は、１より多くの経路が投与のために用いられ得るが、特定の経路は、別の経路よりもより即座でかつより有効な反応を提供し得ることを認識する。局所送達または全身性送達は、体腔への処方物の適用もしくは点滴注入、エアゾールの吸入もしくはガス注入を含む投与によって、または筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、ならびに局所投与を含む非経口導入によって達成され得る。
【０１０８】
本発明の組成物は、単位投薬量形態で提供され得、ここで、各単位投薬量単位（例えば、茶匙１杯、錠剤、液剤または坐剤）は、所定量の組成物を、単独で、または他の活性薬剤との適切な組合せで含む。本明細書中で使用される場合、用語「単位投薬量形態」は、ヒト被験体および動物被験体の単位投薬量として適切な、物理的に別個の単位であって、各単位が、所望の効果を生じるに充分な量に算出された所定量の本発明の組成物を、単独でまたは他の活性な薬剤との組合せで、適切な場合は、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアまたはビヒクルと関連して含む単位をいう。本発明の単位投薬量形態についての詳細は、達成されるべき特定の効果および特定の宿主における薬学的組成物と関連した特定の薬力学依存する。
【０１０９】
本明細書中に記載されるこれらの方法は、決して包括的ではなく、そしてさらに特定の適用に適切にする方法は、当業者に明らかである。さらに、組成物の有効量は、所望の効果を発揮することが既知の化合物に対する類似性を通してさらに概算され得る。
【０１１０】
特定の実施形態では、薬物は、Ｋｅｈａｙｏｖａら，１９９９に記載されるように、極性基（例えば、カルボキシル基）を含むカルボニックアンヒドラーゼインヒビター（ＣＡＩ）を利用することによって、標的へと輸送され得る。このカルボキシル基は、この組成物を水溶性にするが、しかし、光に暴露されると、ＣＡＩをカルボキシルマスクへと連結している結合が切断され、残りの部分が疎水性環境中で可溶性になるようにする。
【０１１１】
特定の実施形態では、脂質処方物および／またはナノカプセルの使用は、アンタゴニスト、アゴニスト、配列番号３３のＮＵＲＲ１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号１のＮＵＲＲ１の核酸配列を含む核酸、配列番号６４のＮＯＲ１のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号４７のＮＯＲ１の核酸配列を含む核酸、配列番号９１のＮＵＲ７７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７６のＮＵＲ７７の核酸配列を含む核酸、またはそれらの薬学的に受容可能な塩、ポリペプチド、ペプチドおよび／または因子、および／または遺伝子治療ベクター（野生型ベクターおよび／またはアンチセンスベクターの両方を含む）の、宿主細胞への導入のために意図される。
【０１１２】
ナノカプセルは一般に、安定した方法および／または再現可能な方法において化合物を封入し得る。細胞内ポリマー過剰負荷に起因する副作用を回避するために、インビボで分解され得るポリマーを用いてこのような超微細粒子（約０．１μｍの大きさ）が設計されるべきである。これらの必要要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子は、本発明における使用が意図され、そして／またはこのような粒子は、容易に作製され得る。
【０１１３】
本発明の好ましい実施形態では、この薬学的組成物は、脂質と会合し得る。脂質と会合した薬学的組成物は、リポソームの水性内部にカプセル化され得、リポソームの脂質二重層内に散在し得、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方に会合した連結分子を介してリポソームへと結合し得、リポソーム内に封入され得、リポソームと複合体化され得、脂質を含有する溶液中に散在し得、脂質と混合され得、脂質と合わされ得、脂質中の懸濁物として含まれ得、ミセル中に含まれ得もしくはミセルと複合体化され得、さもなければ脂質と会合し得る。本発明の脂質または脂質／薬学的組成物関連組成物は、溶液中の任意の特定の構造に限定されない。例えば、これらは、二重層構造で、ミセルとして、または「折り畳まれた」構造を伴って、存在し得る。これらはまた、大きさまたは形状のいずれかが均質でない凝集物をおそらく形成して、溶液中に単に散在し得る。
【０１１４】
脂質は、天然に存在する脂質であっても合成脂質であってもよい、脂肪物質である。例えば、脂質としては、細胞質中に天然に存在する脂肪滴ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体（例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒド）を含む、当業者に周知である化合物のクラスが挙げられる。
【０１１５】
リン脂質は、本発明に従ってリポソームを調製するために用いられ得、そして正味の正電荷、負電荷または中性電荷を保有し得る。ジアセチルホスフェートはリポソームに負電荷を付与するために用いられ得、そしてステアリルアミン（ｓｔｅａｒｙｌａｍｉｎｅ）はリポソームに正電荷を付与するために用いられ得る。リポソームは、１以上のリン脂質から作製され得る。
【０１１６】
中性荷電脂質は、電荷のない脂質、実質的に非荷電の脂質、または等しい数の正電荷および負電荷を有する脂質混合物を含み得る。適切なリン脂質としては、ホスファチジルコリンおよび当業者に周知である他のリン脂質が挙げられる。
【０１１７】
本発明に従った使用のために適切な脂質は、商業的供給源から入手され得る。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）　は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．から入手され得、ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）は、Ｋ　＆　Ｋ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から入手され；コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇから入手され；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏｌａｒ　Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）から入手され得る。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質のストック溶液は、約−２０℃で保存され得る。好ましくは、クロロホルムは、唯一の溶媒として使用される。なぜなら、クロロホルムはメタノールよりも容易にエバポレートされるからである。
【０１１８】
天然の供給源由来のリン脂質（例えば、卵またはダイズのホスファチジルコリン、脳のホスファチジン酸、脳または植物のホスファチジルイノシトール、心臓のカルジオリピンおよび植物または細菌のホスファチジルエタノールアミン）は好ましくは、主な（すなわち、ホスファチド組成物全体の５０％以上を構成する）ホスファチドとしては使用されない。なぜなら、得られるリポソームが不安定かつ漏出性であるからである。
【０１１９】
「リポソーム」は、閉じた脂質二重層または凝集物の作製によって形成される、種々の一層脂質ビヒクルおよび多層脂質ビヒクルを包含する包括的用語である。リポソームは、リン脂質二重層膜および内部の水性媒体を有する小胞構造を有すると特徴付けられ得る。多層リポソームは、水性媒体によって隔てられた複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質を過剰の水溶液中に懸濁した場合に自然に形成する。脂質成分は、閉じた構造の形成前に再配置を経て、そして水および溶解した溶質を脂質二重層の間に捕獲する（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ，１９９１）。しかし、本発明はまた、溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物を包含する。例えば、この脂質は、ミセル構造をとり得るか、または単に脂質分子の不均質凝集物として存在し得る。リポフェクトアミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）−核酸複合体もまた意図される。
【０１２０】
リン脂質は、脂質の水に対するモル比に依存して、水中に分散された場合、リポソーム以外の種々の構造を形成し得る。低い比では、リポソームが好ましい構造である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度および／または二価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性物質および／または極性物質に対して低透過性を示し得るが、高温では、相転移を経て、これは、その透過性を顕著に変更する。相転移は、ゲル状態として公知の、びっしり詰まった規則正しい構造から、流体状態として公知の、ゆるく詰まった、それほど規則的でない構造への変化を含む。これは、特有の相転移温度で生じ、そして／またはイオン、糖および／または薬物に対する透過性の増大をもたらす。
【０１２１】
リポソームは、以下の４つの異なる機構を介して細胞と相互作用する：細網内皮系の食作用細胞（例えば、マクロファージおよび／または好中球）によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性および／もしくは静電力、ならびに／または細胞表面成分との特異的相互作用のいずれかによる、細胞表面への吸着；リポソーム内容物の細胞質への同時放出を伴う、原形質膜へのリポソームの脂質二重層の挿入による、形質細胞膜との融合；ならびに／あるいはリポソーム内容物の何の会合も伴わない、細胞膜および／もしくは細胞内膜および／またはその逆の、リポソーム脂質の移入。リポソーム処方を変動させることは、どの機構が作動するかを変更し得るが、１より多くが同時に作動し得る。
【０１２２】
インビトロでの外来ＤＮＡのリポソーム媒介オリゴヌクレオチド送達および発現は、非常に好結果であった。Ｗｏｎｇら（１９８０）は、培養したニワトリ胚、ＨｅＬａ細胞および肝細胞癌細胞における外来ＤＮＡのリポソーム媒介送達および発現の実行可能性を実証した。Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）は、静脈内注射後のラットにおける好首尾のリポソーム媒介遺伝子移入を達成した。
【０１２３】
本発明の特定の実施形態では、脂質は、血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）と会合し得る。このことは、細胞膜との融合を容易にし、そしてリポソームカプセル化ＤＮＡの細胞侵入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａら，１９８９）。他の実施形態では、脂質は、核の非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と共に複合体化または使用され得る（Ｋａｔｏら，１９９１）。なおさらなる実施形態では、脂質は、ＨＶＪおよびＨＭＧ−１の両方と共に複合体化または使用され得る。インビトロおよびインビボでのオリゴヌクレオチドの移入および発現においてこのような発現ベクターは好首尾に用いられているので、これらは本発明に適用可能である。細菌性プロモーターはＤＮＡ構築物において用いられる場合、適切な細菌性ポリメラーゼをリポソーム内に含むこともまた望ましい。
【０１２４】
本発明に従って用いられるリポソームは、異なる方法によって作製され得る。リポソームの大きさは、合成方法に依存して変動し得る。水溶液中に懸濁されたリポソームは一般に、脂質二重層分子の１以上の同心円状層を有する球状小胞の形状である。各層は、式ＸＹによって表される分子の平行アレイからなり、ここで、Ｘは親水性部分であり、そしてＹは疎水性部分である。水性懸濁物では、この同心円状の層は、親水性部分が水相と接触したままである傾向があり、疎水性領域が自己会合する傾向があるように配置される。例えば、水相が、リポソーム内およびリポソーム外の両方に存在する場合、脂質分子は、配置ＸＹ−ＹＸの、ラメラとして公知の二重層を形成し得る。１より多くの脂質分子の親水性部分および疎水性部分が互いに会合した場合、脂質の凝集物が形成され得る。これらの凝集物の大きさおよび形状は、多くの異なる変動要因（例えば、溶媒の性質および溶液中の他の化合物の存在）に依存する。
【０１２５】
本発明の範囲内のリポソームは、既知の実験室技術に従って調製され得る。１つの好ましい実施形態では、リポソームは、リポソーム脂質を、容器（例えば、ガラス製のナシ型フラスコ）中の溶媒中で混合することによって調製される。この容器は、期待されるリポソーム懸濁物溶液の容積よりも１０倍大きな容積を有するはずである。ロータリーエバポレーターを用いて、この溶媒は、陰圧下で約４０℃にて除去される。溶媒は通常、リポソームの所望の溶液に依存して、約５分〜２時間以内に除去される。この組成物は、デシケーター中で減圧下でさらに乾燥され得る。乾燥した脂質は一般に、時間経過に伴って劣化する傾向があるので、約１週間後に廃棄される。
【０１２６】
乾燥させた脂質は、全ての脂質膜が再懸濁されるまで振盪することによって、発熱物質を含まない滅菌水中で約２５ｍＭ〜約５０ｍＭリン脂質にて水和され得る。次いで、水性リポソームは、アリコートに分けられ得、アリコートの各々は、バイアル中に配置され、凍結乾燥され得、そして減圧下でシールされ得る。
【０１２７】
代替物において、リポソームは、以下の他の公知の実験室手順に従って調製され得る：その内容が本明細書中に参考として援用される、Ｂａｎｇｈａｍら（１９６５）の方法；その内容が本明細書中に参考として援用される、ＤＲＵＧ　ＣＡＲＲＩＥＲＳ　ＩＮ　ＢＩＯＬＯＧＹ　ＡＮＤ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ，Ｇ．Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編（１９７９）２８７−３４１頁に記載される通りの、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓの方法；その内容が本明細書中に参考として援用される、ＤｅａｍｅｒおよびＵｓｔｅｒ（１９８３）の方法；ならびにＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９７８）によって記載される通りの逆相エバポレーション法。上記の方法は、水性物質を捕捉するそれらのそれぞれの能力、およびそれらのそれぞれの水性空間の、脂質に対する比が異なる。
【０１２８】
上記の通りに調製された、乾燥した脂質または凍結乾燥したリポソームは、阻害性ペプチドの溶液中で水和および再構成され得、そして適切な溶媒（例えば、ＤＰＢＳ）で適切な濃度へと希釈され得る。次いで、この混合物は、ボルテックスミキサー中で激しく振盪される。カプセル化されていない核酸は、２９，０００×ｇでの遠心分離によって除去され、そしてリポソームペレットは洗浄される。洗浄されたリポソームは、適切な総リン脂質濃度（例えば、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭ）で再懸濁される。カプセル化された核酸の量は、標準的な方法に従って決定され得る。リポソーム調製物中にカプセル化された核酸の量の決定後、このリポソームは、適切な濃度へと希釈され得、そして使用するまで４℃で保存され得る。
【０１２９】
このリポソームを含む薬学的組成物は通常、無菌の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、水または生理食塩水溶液）を含む。
【０１３０】
（遺伝子治療の施術）
遺伝子治療に関して、当業者は、利用されるべきベクターが、プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子を含まなければならないことを認識する。アンチセンス遺伝子治療に関して、目的の遺伝子のアンチセンス配列は、プロモーターに作動可能に連結される。当業者は、特定の例において、目的の遺伝子を発現する際に、他の配列（例えば、３’ＵＴＲ調節配列）が有用であることを認識する。適切な場合、遺伝子治療ベクターは、固体、半固体、液体またはガスの形態の調製物へと、それらのそれぞれの投与経路について当該分野で公知の方法において処方され得る。当該分野で公知の手段を利用して、この組成物が標的器官に到達するまでこの組成物の放出および吸収を妨害し得るか、またはこの組成物の徐放性（ｔｉｍｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ）を確実にし得る。本発明の組成物を無効にしない、薬学的に受容可能な形態が用いられるべきである。薬学的投薬形態では、この組成物は、単独で、または適切に会合して、ならびに薬学的に活性な他の化合物と組み合わせて用いられ得る。治療核酸配列を含む充分な量のベクターは、薬理学的に有効な用量の遺伝子産物を提供するように投与されなければならない。
【０１３１】
当業者は、細胞中にベクターを投与するために種々の送達方法が利用され得ることを認識する。例としては以下が挙げられる：（１）物理的手段（例えば、エレクトロポレーション（電気）、遺伝子銃（物理的力）を利用する方法または大きな体積の液体（圧力）を適用する方法；ならびに（２）ベクターが別の実体（例えば、リポソームまたは輸送体分子）へと複合体化する方法。
【０１３２】
従って、本発明は、治療遺伝子を宿主へと移入する方法を提供し、この方法は、本発明のベクターを、上記の投与経路のいずれかまたは当業者に公知でかつ特定の適用について適切である代替的な経路を用いて、好ましくは組成物の一部として投与する工程を包含する。宿主細胞への、本発明による宿主細胞へのベクターの有効な遺伝子移入は、治療効果（例えば、処置されるべき特定の疾患に関連したいくつかの症状の緩和）に関して、またはさらに、宿主中の移入された遺伝子もしくは遺伝子の発現の証拠（例えば、配列決定、ノーザンハイブリダイゼーションもしくはサザンハイブリダイゼーション、または宿主細胞中の核酸を検出する転写アッセイと共にポリメラーゼ連鎖反応を用いて、あるいは免疫ブロット分析、抗体媒介検出、ｍＲＮＡもしくはタンパク質の半減期の研究、または移入された核酸によってコードされるタンパク質もしくはポリペプチド、またはこのような移入に起因してレベルもしくは機能において影響を受けたタンパク質もしくはポリペプチドを検出するために特化されたアッセイを用いる）によって、モニタリングされ得る。
【０１３３】
本明細書中に記載されるこれらの方法は、決して包括的というわけではなく、そしてさらに特定の適用に適切にする方法は、当業者に明らかである。さらに、組成物の有効量は、所望の効果を発揮することが既知の化合物に対する類似性を通してさらに概算され得る。
【０１３４】
さらに、実際の用量およびスケジュールは、組成物が他の薬学的組成物と組み合わせて投与されるか否かに依存して、または薬物動態学、薬物の性質および代謝における個体間の相違に依存して、変動し得る。同様に、量は、利用される特定の細胞株に依存してインビトロでの適用において変動し得る（例えば、細胞表面に存在するベクターレセプターの数または遺伝子移入のために用いられた特定のベクターがその細胞株において複製する能力に基づく）。さらに、１細胞あたりに添加されるベクターの量は、ベクター中に挿入された治療遺伝子の長さおよび安定性ならびにまた、アミノ酸の性質に伴って変動するようであり、そして特に、経験的に決定される必要があるパラメーターであり、そして本発明の方法に固有ではない要因（例えば、合成に関連するコスト）に起因して変更され得る。当業者は、特定の状況の緊急性に従って任意の必要な調整を容易に行い得る。
【０１３５】
治療遺伝子を含む細胞がまた、自殺遺伝子（すなわち、細胞を破壊するために用いられ得る産物（例えば、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ）をコードする遺伝子を含み得ることは可能である。多くの遺伝子治療状況では、宿主細胞中で治療目的のための遺伝子を発現し得るが、一旦治療が完了したら、または、制御不能になるか、または予測可能な結果も望ましい結果ももたらさなくなったら、宿主細胞を破壊する能力をも有することが望ましい。従って、宿主細胞中での治療遺伝子の発現は、プロモーターによって駆動され得るが、自殺遺伝子の産物は、プロドラッグの非存在下では無害なままである。一旦治療が完了したら、またはもはや所望されず必要ともされなくなったら、プロドラッグの投与は、自殺遺伝子産物を引き起こし、細胞に対して致死的となる。使用され得る自殺遺伝子／プロドラッグの組合せの例は、以下である：単純疱疹ウイルス−チミジンチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）およびガンシクロビル、アシクロビルまたはＦＩＡＵ；オキシドレダクターゼおよびシクロヘキシミド；シトシンデアミナーゼおよび５−フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジレートキナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）およびＡＺＴ；ならびにデオキシシチジンキナーゼおよびシトシンアラビノシド。
【０１３６】
細胞治療の方法は、当該分野で公知の方法によって用いられ得、ここで、ＮＵＲＲ１タンパク質をコードする非欠損ＮＵＲＲ１核酸配列を含む培養細胞が導入される。
【０１３７】
別の実施形態では、生物学的に活性な分子（例えば、遺伝子治療についてのベクター）は、脂質ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＰＧＡ）複合体の「ピンチ（ｐｉｎｃｈｅｄ）」領域の間の大きな水和ドメインに組み込まれ、ここで、ＰＧＡおよびカチオン性脂質ジドデシルジメチルアンモニウムブロミドは会合して、送達適用のための局在化されたピンチ領域を形成する（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍら，２０００）。
【０１３８】
代替の実施形態では、アミノ酸配列は、小胞体において凝集物として蓄積させるように設計され、続いて、組成物が投与されてタンパク質の脱凝集が誘導され、迅速かつ一過性の分泌がもたらされる（Ｒｉｖｅｒａら，２０００）。
【０１３９】
ＨＩＶ由来のペプチド（１１アミノ酸配列）は、全長タンパク質に融合され、そしてマウスに注射された場合に、身体の全ての細胞の核への迅速な分散を可能にすることが近年記載された（Ｓｃｈｗａｒｚｅら，１９９９）。Ｓｃｈｗａｒｚｅらは、１５ｋＤａ〜１２０ｋＤａの大きさの範囲の、Ｔａｔに対する融合タンパク質を作製した。かれらは、動物全体の細胞の核への融合タンパク質の迅速な取り込みを実証し、そしてこのタンパク質の機能的活性は維持された。
【０１４０】
本発明の１つの実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列に作動可能に連結された、ＴａｔまたはＴａｔ−ＨＡの核酸配列を含む構築物が存在する。このベクターは、細菌培養物において発現され、そして融合タンパク質は精製される。この精製されたＴａｔ−ＨＡ−ＮＵＲＲサブファミリーのタンパク質またはＴａｔ−ＮＵＲＲサブファミリーのタンパク質は、炎症部位、関節へのＴａｔ送達系の効率を決定するために、または融合タンパク質を全身的に送達することによって、動物へと注射される。分析は、炎症の減少または任意の関節炎症状の緩和におけるＴａｔ−ＨＡ−ＮＵＲＲサブファミリーのタンパク質またはＴａｔ−ＮＵＲＲサブファミリーのタンパク質の能力を決定するために行われる。これは、独立してまたは他の方法、処置または遺伝子と関連して実行可能な治療アプローチである。
【０１４１】
（ウイルス性ベクターを用いるＤＮＡ送達）
特定のウイルスがレセプター媒介エンドサイトーシスを介して細胞に感染してウイルス遺伝子を安定かつ効率的に宿主細胞ゲノム中へ組み込み、そして発現する能力によって、これらは、哺乳動物細胞への外来遺伝子の移入についての魅力的な候補になっている。本発明の好ましい遺伝子治療ベクターは一般に、ウイルス性ベクターである。
【０１４２】
外来遺伝物質を受け入れ得るいくつかのウイルスは、収容し得るヌクレオチド数および感染する細胞の範囲が制限されているが、これらのウイルスは、遺伝子発現を好首尾にもたらすことが実証されている。しかし、アデノウイルスは、それらの遺伝物質を宿主ゲノム中に組み込まず、それゆえ、遺伝子発現のために宿主の複製を必要とせず、これらを、迅速で効率的な異種遺伝子発現に理想的に適切にしている。複製欠損感染性ウイルスの調製のための技術は、当該分野で周知である。
【０１４３】
もちろん、ウイルス送達系を用いる際には、ビリオンを充分に精製して、ベクター構築物を受ける細胞、動物または個体に何の不都合な反応も引き起こさないように、望ましくない夾雑物（例えば、欠損性の妨害ウイルス粒子、エンドトキシンおよび他の発熱物質）を本質的に含まないようにすることを所望する。ベクターを精製する好ましい手段は、浮遊密度勾配（例えば、塩化セシウム勾配遠心分離）の使用を含む。
【０１４４】
（ａ．アデノウイルスベクター）
発現構築物の特定の送達方法は、アデノウイルス発現ベクターの使用を含む。アデノウイルスベクターはゲノムＤＮＡへの低い取り込み能力を有することが公知であるが、この特徴は、これらのベクターによって得られる高い遺伝子移入効率によって相殺される。「アデノウイルスベクター」は、（ａ）構築物のパッケージングの支持のために充分でかつ（ｂ）その中にクローニングされた組織または細胞に特異的な構築物を最終的に発現するに充分な、アデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。
【０１４５】
この発現ベクターは、遺伝子操作された形態のアデノウイルスを含む。アデノウイルスの遺伝的構成（３６ｋｂの直鎖状二本鎖ＤＮＡウイルス）の知識は、アデノウイルスＤＮＡの大きな片の、７ｋｂまでの外来配列での置換を可能にする（Ｇｒｕｎｈａｕｓおよび／またはＨｏｒｗｉｔｚ，１９９２）。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組込みをもたらさない。なぜなら、アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝毒性（ｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を伴わずにエピソーム様式で複製し得るからである。また、アデノウイルスは、構造的に安定であり、そして多数の増幅後、ゲノムの再配置は検出されなかった。
【０１４６】
アデノウイルスは、その中間の大きさのゲノム、操作の容易性、高い力価、広範な標的細胞域および高い感染性により、遺伝子移入ベクターとしての使用のために特に適切である。このウイルスのゲノムの両方の末端は、１００〜２００塩基対の逆方向反復（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲは、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングのために必要なシスエレメントである。ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分けられる、異なる転写単位を含む。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムの転写調節を担うタンパク質およびいくつかの細胞性遺伝子をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質合成をもたらす。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現および宿主細胞遮断に関与する（Ｒｅｎａｎ，１９９０）。この後期遺伝子の産物（ウイルスキャプシドタンパク質の大多数を含む）は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じる、単一の一次転写産物の顕著なプロセシングの後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８ｍ．ｕ．に位置する）は、感染後期の間に特に効率的であり、そしてこのプロモーターから生じた全てのｍＲＮＡは、これらを翻訳のために好ましいｍＲＮＡとする５’−三部構成のリーダー（ＴＰＬ）配列を保有する。
【０１４７】
現在の系では、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えから作製される。２つのプロウイルスベクターの間でのあり得る組換えに起因して、野生型アデノウイルスがこのプロセスから作製され得る。それゆえ、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離し、そしてそのゲノム構造を調べることは重要である。
【０１４８】
複製欠損である現行のアデノウイルスベクターの作製および／または増殖は、Ａｄ５　ＤＮＡフラグメントによって胚性腎臓細胞から形質転換された、そしてＥ１タンパク質（Ｅ１Ａおよび／またはＥ１Ｂ；Ｇｒａｈａｍら，１９７７）を構成的に発現する、２９３と称される独特の細胞株に依存する。Ｅ３領域はアデノウイルスゲノムには必要でない（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ，１９７８）ので、２９３細胞の助けを借りた現行のアデノウイルスベクターは、外来ＤＮＡをＥ１領域、Ｄ３領域または両方の領域のいずれかに保有する（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ，１９９１）。近年、Ｅ４領域に欠損を含むアデノウイルスベクターが記載されている（本明細書中に参考として援用される、米国特許５，６７０，４８８）。
【０１４９】
天然では、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージングし得（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら，１９８７）、約２ｋｂ余分なＤＮＡについての収容力を提供する。Ｅ１領域および／またはＥ３領域中の置換可能である約５．５ｋｂのＤＮＡと合わせて、現行のアデノウイルスベクターの最大収容力は７．５ｋｂ未満であり、そして／またはこのベクターの全長の約１５％未満である。デノウイルスのウイルスゲノムの８０％より多くが、このベクター骨格中に残っている。
【０１５０】
ヘルパー細胞株は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト胚性腎臓細胞、筋細胞、造血細胞および他のヒト胚性間葉細胞または上皮細胞）から誘導され得る。あるいは、ヘルパー細胞は、アデノウイルスについて許容性である他の哺乳動物種の細胞から誘導され得る。このような細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞ならびに／または他のサル胚性間葉細胞および／もしくは上皮が挙げられる。上記で述べたように、好ましいヘルパー細胞株は２９３である。
【０１５１】
近年、Ｒａｃｈｅｒら（１９９５）は、アデノウイルスを増殖させる改善された方法を開示した。１つの形式では、天然の細胞凝集物は、１００ｍｌ〜２００ｍｌの培地を含む１リットルのシリコン処理スピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）中に個々の細胞を接種することによって増殖される。４０ｒｐｍでの攪拌後、細胞生存率は、トリパンブルーを用いて評価される。別の形式では、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ　Ｓｔｅｒｌｉｎ，Ｓｔｏｎｅ，ＵＫ）（５ｇ／ｌ）は、以下の通りに用いられる。５ｍｌの培地中に再懸濁された細胞接種物は、２５０ｍｌの三角フラスコ中のキャリア（５０ｍｌ）に添加され、そして／または時々攪拌しながら１〜４時間にわたって静置される。次いで、この培地は５０ｍｌの新鮮培地で置換され、そして／または振盪が開始される。ウイルス産生に関して、細胞は、約８０％コンフルエンスになるまで増殖され、その後、培地が（最終容積の２５％まで）置換されるか、および／またはアデノウイルスが０．０５のＭＯＩで添加される。培養物は、一晩静置され、その後、その容積は１００％まで増加され、そして／または振盪がさらに７２時間にわたって開始される。
【０１５２】
アデノウイルスベクターが複製欠損であるかまたは少なくとも条件的に欠損であるという必要条件以外に、アデノウイルスベクターの性質は、本発明の好首尾の実施に対して重大であるとは考えられない。このアデノウイルスは、４２の異なる既知の血清型およびサブグループＡ〜Ｆのうちの任意のアデノウイルスであり得る。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発明における使用のための条件的複製欠損アデノウイルスベクターを得るために好ましい出発材料である。これは、アデノウイルス５型が、たくさんの生化学的および遺伝的情報が既知であるアデノウイルスであり、そしてこれがアデノウイルスをベクターとして用いる大部分の構築のために歴史的に用いられているからである。
【０１５３】
上記で言及したように、本発明による代表的なベクターは、複製欠損であり、そしてアデノウイルスＥ１領域を有さない。従って、これは、形質転換構築物を、Ｅ１コード配列が除去された位置で導入するために最も便利である。しかし、アデノウイルス配列中での構築物の挿入位置は、本発明に重要ではない。ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーをコードするポリヌクレオチドもまた、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６）によって記載されたように、Ｅ３置換ベクター中の欠失したＥ３領域の代わりに、またはＥ４領域（ここで、ヘルパー細胞株またはヘルパーウイルスはＥ４欠損を補完する）中に挿入され得る。
【０１５４】
アデノウイルスの増殖および操作は、当業者に公知であり、そしてインビトロおよびインビボで広範な宿主域を示す。このグループのウイルスは、高い力価（例えば、１ｍｌあたり１０９〜１０１１プラーク形成単位）で入手され得、そしてこれらは高度に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子はエピソーム性であり、それゆえ、宿主細胞に対して低い遺伝子毒性を有する。野生型アデノウイルスを用いたワクチン接種の研究において副作用は報告されておらず（Ｃｏｕｃｈら，１９６３；Ｔｏｐら，１９７１）、このことは、インビボでの遺伝子移入ベクターとしてのこれらの安全性および治療可能性を実証する。
【０１５５】
アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら，１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら，１９９２）およびワクチン開発（Ｇｒｕｎｈａｕｓおよび／またはＨｏｒｗｉｔｚ，１９９２；Ｇｒａｈａｍおよび／またはＰｒｅｖｅｃ，１９９２）において用いられている。近年、動物研究は、組換えアデノウイルスが遺伝子治療のために使用され得ることを示唆した（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよび／またはＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ，１９９１ａ；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら，１９９１ｂ；Ｒｉｃｈら，１９９３）。組換えアデノウイルスを異なる組織に投与する際の研究としては、気管点滴注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら，１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら，１９９３）、末梢静脈内注射（Ｈｅｒｚおよび／またはＧｅｒａｒｄ，１９９３）および脳への定位接種（Ｌｅ　Ｇａｌ　Ｌａ　Ｓａｌｌｅら，１９９３）が挙げられる。組換えアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（以下を参照のこと）は、分裂していない哺乳動物初代細胞を感染および形質導入し得る。
【０１５６】
（ｂ．アデノ随伴ウイルスベクター）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、本発明の細胞形質導入において使用するための魅力的なベクター系である。なぜなら、ＡＡＶは、高い組込み頻度を有し、そしてＡＡＶは分裂していない細胞を感染し得、それゆえ、ＡＡＶを、例えば、組織培養中（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）およびインビボでの、哺乳動物細胞への遺伝子の送達のために有用にしているからである。ＡＡＶは、感染性についての広い宿主域を有する（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，１９８４；Ｌａｕｇｈｌｉｎら，１９８６；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら，１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら，１９８８）。ｒＡＡＶベクターの作製および使用に関する詳細は、各々本明細書中に参考として援用される、米国特許第５，１３９，９４１号および米国特許第４，７９７，３６８号に記載される。
【０１５７】
遺伝子送達におけるＡＡＶの使用を実証する研究としては、ＬａＦａｃｅら（１９８８）；Ｚｈｏｕら（１９９３）；Ｆｌｏｔｔｅら（１９９３）；およびＷａｌｓｈら（１９９４）が挙げられる。組換えＡＡＶベクターは、マーカー遺伝子（Ｋａｐｌｉｔｔら，１９９４；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら，１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉら，１９８９；Ｙｏｄｅｒら，１９９４；Ｚｈｏｕら，１９９４；Ｈｅｒｍｏｎａｔおよび／またはＭｕｚｙｃｚｋａ，１９８４；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら，１９８５；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら，１９８８）または哺乳動物疾患に関与する遺伝子（Ｆｌｏｔｔｅら，１９９２；Ｌｕｏら，１９９４；Ｏｈｉら，１９９０；Ｗａｌｓｈら，１９９４；Ｗｅｉら，１９９４）のインビトロおよびインビボでの形質導入に好首尾に用いられている。近年、ＡＡＶベクターは、嚢胞性線維症の処置について第Ｉ相試験が承認された。
【０１５８】
ＡＡＶは、培養細胞において生産的感染を経るために別のウイルス（アデノウイルスまたはヘルペスウイルスファミリーのメンバーのいずれか）との同時感染を必要とする（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）という点で、依存性パルボウイルスである。ヘルパーウイルスでの同時感染が無ければ、野生型ＡＡＶゲノムは、その末端を介して第１９染色体へと組み込まれ、ここで、このゲノムは、プロウイルスとして潜伏状態で存在する（Ｋｏｔｉｎら，１９９０；Ｓａｍｕｌｓｋｉら，１９９１）。しかし、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ　Ｒｅｐタンパク質もまた発現されるのでなければ、組込みは第１９染色体に制限されない（ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ，１９９４）。ＡＡＶプロウイルスを保有する細胞にヘルパーウイルスを重感染させた場合、ＡＡＶゲノムは、この染色体または組換えプラスミドから「レスキュー」され、そして正常な生産性感染が確立される（Ｓａｍｕｌｓｋｉら，１９８９；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら，１９８８；Ｋｏｔｉｎら，１９９０；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）。
【０１５９】
代表的に、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスは、２つのＡＡＶ末端反復配列が隣接している目的の遺伝子を含むプラスミド（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら，１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉら，１９８９；各々本明細書中に参考として援用される）および末端反復配列を含まない野生型ＡＡＶコード配列を含む発現プラスミド（例えば、ｐＩＭ４５（ＭｃＣａｒｔｙら，１９９１；本明細書中に参考として援用される））を同時トランスフェクトすることによって作製される。これらの細胞はまた、アデノウイルスまたはＡＡＶヘルパー機能に必要とされるアデノウイルス遺伝子を保有するプラスミドでトランスフェクトされる。このような様式で作製されるｒＡＡＶウイルスストックは、ｒＡＡＶ粒子から（例えば、塩化セシウム密度勾配遠心によって）物理的に分離されなければならないアデノウイルスで汚染される。あるいは、ＡＡＶコード領域を含むアデノウイルスベクター、またはＡＡＶコード領域およびアデノウイルスヘルパー遺伝子のいくつかもしくは全てを含む細胞株が使用され得る（Ｙａｎｇら，１９９４；Ｃｌａｒｋら，１９９５）。組み込まれたプロウイルスとしてｒＡＡＶ　ＤＮＡを保有する細胞株もまた使用され得る（Ｆｌｏｔｔｅら，１９９５）。
【０１６０】
（ｃ．レトロウイルスベクター）
レトロウイルスは、その遺伝子を宿主ゲノム中に組み込み、大量の外来遺伝物質を移入し、広範な範囲の種および細胞型に感染し、そして特別な細胞株にパッケージングされる能力に起因して、遺伝子送達ベクターとしての見込みがある（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２）。
【０１６１】
レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染細胞においてそのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡへと変換する能力によって特徴付けられる、一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。次いで、得られたＤＮＡは、細胞の染色体にプロウイルスとして安定に組み込まれ、そしてウイルスタンパク質の合成を指向する。この組込みは、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列の保持をもたらす。このレトロウイルスゲノムは、キャプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素およびエンベロープ成分をそれぞれコードする３つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。ｇａｇ遺伝子の上流に見出される配列は、ビリオンへのゲノムのパッケージングのためのシグナルを含む。２つの長末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’末端および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、そしてまた、宿主細胞ゲノムへの組込みのために必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。
【０１６２】
レトロウイルスベクターを構築するために、目的の遺伝子をコードする核酸は、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて、複製欠損であるウイルスが得られる。ビリオンを産生するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子およびｅｎｖ遺伝子を含むがＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される（Ｍａｎｎら，１９８３）。レトロウイルスのＬＴＲ配列およびパッケージング配列と一緒にｃＤＮＡを含む組換えプラスミドは、この細胞株に（例えば、リン酸カルシウム沈澱によって）導入され、このパッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写産物がウイルス粒子中にパッケージングされるのを可能にし、次いでこのウイルス粒子は、培養培地中に分泌される（Ｎｉｃｏｌａｓおよび／またはＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎら，１９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含む培地が収集され、必要に応じて濃縮され、そして遺伝子移入のために用いられる。レトロウイルスベクターは、広範な種々の細胞型に感染し得る。しかし、組込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら，１９７５）。
【０１６３】
欠損レトロウイルスベクターの使用に関する懸念は、パッケージング細胞における、複製能力のある野生型ウイルスの出現の可能性である。これは、組換えウイルス由来のインタクトな配列が、宿主細胞のゲノムに組み込まれているｇａｇ配列、ｐｏｌ配列およびｅｎｖ配列の上流に挿入される組換え事象から生じ得る。しかし、組換えの確率を大いに減少させるはずである、新たなパッケージング細胞株は現在入手可能である（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら，１９８８；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒら，１９９０）。
【０１６４】
第二世代のレトロウイルスベクターを用いた遺伝子送達が報告されている。Ｋａｓａｈａｒａら（１９９４）は、ウイルスが、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）レセプターを保有する哺乳動物細胞に特異的に結合し、そして感染するようにエンベロープタンパク質を改変した、モロニーマウス白血病ウイルス（これは通常、マウス細胞にのみ感染する）の操作された改変体を調製した。これは、ＥＰＯ配列の一部をエンベロープタンパク質に挿入して、新たな結合特異性を有するキメラタンパク質を作製することによって達成された。
【０１６５】
（ｄ．他のウイルスベクター）
他のウイルスベクターは、本発明において発現構築物として用いられ得る。ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌおよび／またはＳｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒら，１９８８）、シンドビスウイルス、サイトメガロウイルスおよび　単純疱疹ウイルス）由来のベクターが用いられ得る。これらは、種々の哺乳動物細胞についてのいくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｂａｉｃｈｗａｌおよび／またはＳｕｇｄｅｎ，１９８６；Ｃｏｕｐａｒら，１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら，１９９０）。
【０１６６】
欠損Ｂ型肝炎ウイルスの認識に関して、異なるウイルス配列の構造−機能の関係についての新たな洞察が得られた。インビトロ研究は、ウイルスは、そのゲノムの８０％までの欠失にもかかわらず、ヘルパー依存性パッケージングおよび逆転写についての能力を保持し得ることを示した（Ｈｏｒｗｉｃｈら，１９９０）。これは、このゲノムの大きな部分が、外来遺伝物質で置換され得ることを示唆した。Ｃｈａｎｇらは近年、アヒルＢ型肝炎ウイルスゲノム中で、ポリメラーゼコード配列、表面コード配列およびプレ表面（ｐｒｅ−ｓｕｒｆａｃｅ）コード配列の場所に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を導入した。これを、野生型ウイルスと共にトリ肝細胞癌細胞株中に同時トランスフェクトした。高力価の組換えウイルスを含む培養培地を用いて、初代仔アヒル肝細胞に感染させた。安定なＣＡＴ遺伝子発現が、トランスフェクション後少なくとも２４日間にわたって検出された（Ｃｈａｎｇら，１９９１）。
【０１６７】
特定のさらなる実施形態では、この遺伝子治療ベクターは、ＨＳＶである。ＨＳＶを魅力的なベクターとする要因は、大きさおよびゲノム構成である。ＨＳＶは大きいので、複数の遺伝子または発現カセットの取り込みは、より小さな他のウイルス系においてよりも、問題が少ない。さらに、種々の性能（時間的、強度など）を有する異なるウイルス制御配列の入手可能性は、他の系においてよりも高い程度に発現を制御することを可能にする。このウイルスが比較的少ないスプライスメッセージを有し、遺伝子操作をさらに容易にすることもまた有利である。ＨＳＶはまた、操作するのが比較的容易であり、そしてより高い力価まで増殖され得る。従って、送達は、充分なＭＯＩを得るために必要な容積および反復投薬の必要性の低下の両方に関して問題がより少ない。
【０１６８】
（ｅ．改変ウイルス）
本発明のなおさらなる実施形態では、送達されるべき核酸は、特異的結合リガンドを発現するように操作された感染性ウイルス内に収容される。従って、このウイルス粒子は、標的細胞の同族レセプターに特異的に結合し、そしてその内容物をその細胞へと送達する。レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするように設計された新規なアプローチは、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学的改変に基づいて近年開発された。この改変は、シアロ糖タンパク質レセプターを介した肝細胞の特異的感染を可能にし得る。
【０１６９】
レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体または特異的細胞レセプターに対するビオチン化抗体が用いられる、組換えレトロウイルスの標的化に対する別のアプローチが設計された。この抗体は、ストレプトアビジンを用いることによって、ビオチン成分を介してカップリングされた（Ｒｏｕｘら，１９８９）。主要組織適合遺伝子複合体のクラスＩ抗原およびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いて、彼らは、インビトロでエコトロピックウイルスでの、これらの表面抗原を保有する種々の哺乳動物細胞の感染を実証した（Ｒｏｕｘら，１９８９）。
【０１７０】
（抗体調製）
本発明の特定の局面では、発現されたＮＵＲＲサブファミリーのメンバーおよびＣＲＨレセプターに対する１以上の抗体が、産生され得る。これらの抗体は、本明細書中以下に記載される、種々の診断適用または治療適用において用いられ得る。
【０１７１】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、任意の免疫学的結合因子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）を広範にいうことを意図する。一般に、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭが好ましい。なぜなら、これらは生理学的状況において最も普通の抗体であり、そしてこれらは実験室環境において最も容易に作製されるからである。
【０１７２】
用語「抗体」は、抗原結合領域を有する任意の抗体様分子をいうように用いられ、そして抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖Ｆｖ）などを含む。種々の抗体ベースの構築物およびフラグメントを調製および使用するための技術は、当該分野で周知である。抗体を調製および特徴付けするための手段もまた、当該分野で周知である（例えば、本明細書中に参考として援用される、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと）。
【０１７３】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、特定の利点（例えば、再現性および大規模）産生を有すると認識され、そしてそれらの使用は一般に好ましい。従って、本発明は、ヒト、マウス、サル、ラット、ハムスター、ウサギおよびさらにニワトリ起源のモノクローナル抗体を提供する。調製の容易さおよび試薬の入手し易さに起因して、マウスモノクローナル抗体はしばしば好ましい。
【０１７４】
しかし、「ヒト化」抗体もまた意図され、ヒトの定常領域ドメインおよび／または可変領域ドメインを保有する、マウス、ラットまたは他の種由来のキメラ抗体、二重特異性抗体、組換えおよび操作された抗体、ならびにそれらのフラグメントも同様である。
【０１７５】
（ａ．ポリクローナル抗体）
ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーに対するポリクローナル抗体およびＣＲＨレセプターに対するポリクローナル抗体は一般に、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターおよびアジュバントの複数の皮下（ｓｃ）注射または腹腔内（ｉｐ）注射によって、動物において惹起される。二官能性因子または誘導体化因子（例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（シスチン残基を通した結合体化）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を通す）、グルタルアルデヒド（ｇｌｙｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ここで、ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を用いて、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーもしくはＣＲＨレセプター、または標的アミノ酸配列を含むフラグメントを、免疫されるべき種において免疫原性であるタンパク質（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロブリンまたはダイズトリプシンインヒビター）に対して結合体化することは有用であり得る。
【０１７６】
動物は、１ｍｇまたは１μｇの結合体（それぞれ、ウサギまたはマウスについて）を３容量のＦｒｅｕｄ完全アジュバントと合わせ、そしてこの溶液を複数部位で皮内注射することによって、免疫原性結合体または免疫原性誘導体に対して免疫される。１ヵ月後、この動物は、複数部位での皮下注射によってＦｒｅｕｄ完全アジュバント中の結合体（元の量の１／５〜１／１０）でブーストされる。７日後〜１４日後、この動物は採血され、そして血清は、抗ＮＵＲＲ抗ＣＲＨレセプター抗体力価についてアッセイされる。動物は、力価がプラトーに達するまでブーストされる。好ましくは、この動物は、同じＮＵＲＲサブファミリーのメンバーの結合体または同じＣＲＨレセプターの結合体であるが、異なるタンパク質へと、または異なる架橋連結試薬を通して結合体化されている結合体でブーストされる。結合体はまた、組換え細胞培養においてタンパク質融合体として作製され得る。また、凝集剤（例えば、ミョウバン）は、免疫応答を増強するために用いられる。
【０１７７】
（ｂ．モノクローナル抗体）
モノクローナル抗体は、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、集団を構成する個々の抗体が、微量に存在し得る、あり得る天然に存在する変異以外は同一である）から入手される。従って、修飾語「モノクローナル」は、別個の抗体の混合物ではないという抗体の特徴を示す。例えば、本発明の抗ＮＵＲＲモノクローナル抗体または抗ＣＲＨレセプターモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５によって最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法（Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。ハイブリドーマ法では、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えば、ハムスター）が、本明細書中上記のように免疫されて、免疫のために用いられたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたはこの抗体を産生し得るリンパ球が惹起される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。次いで、リンパ球は、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を用いてミエローマ細胞と融合されて、ハイブリドーマ細胞が形成される（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。このようにして調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合していない親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１以上の物質を含む適切な培養培地中に播種され、そして増殖される。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマについての培養培地は代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン（ＨＡＴ培地）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する。
【０１７８】
好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支持し、そしてＨＡＴ培地のような培地に感受性である、ミエローマ細胞である。とりわけ、好ましいミエローマ細胞株は、マウスミエローマ株（例えば、Ｓａｌｋ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＵＳＡから入手可能な、ＭＯＰＣ−２１マウス腫瘍およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍から誘導されたミエローマ細胞、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２細胞）である。ハイブリドーマ細胞が増殖される培養培地は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターに対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイされる。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定される。このモノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，１９８０のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって決定され得る。所望の特異性、親和性および活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンは限界希釈手順によってサブクローニングされ得、そして標準的な方法によって増殖され得る。この目的のために適切な培養培地としては、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ＭｅｄｉｕｍまたはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物中の腹水腫瘍としてインビボで増殖され得る。
【０１７９】
サブクローンによって分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地、腹水または血清から、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなど）によって適切に分離される。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）容易に単離および配列決定される。本発明のハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一旦単離されると、このＤＮＡは、発現ベクター中に配置され得、次いでこの発現ベクターは、他の場合には免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞（例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはミエローマ細胞）中にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成が得られる。このＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりに、ヒトの重鎖および軽鎖の定常ドメインについてのコード配列で置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，１９８４）、または免疫グロブリンコード配列に対して、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全てもしくは一部を共有結合的に連結することによって、改変され得る。このような様式で、本明細書中の抗ＮＵＲＲレセプターモノクローナル抗体または抗ＣＲＨレセプターモノクローナル抗体の結合特異性を有する、「キメラ」抗体または「ハイブリッド」抗体が調製される。代表的に、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインを置換するか、またはこれらは、本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインを置換して、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターについての特異性を有する１つの抗原結合部位、および異なる抗原についての特異性を有する別の抗原結合部位を含む、キメラ二価抗体を作製する。
【０１８０】
キメラ抗体またはハイブリッド抗体もまた、合成タンパク質化学において公知の方法（架橋剤を含む方法を含む）を用いて、インビトロで調製され得る。例えば、免疫毒素（ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ）は、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって、構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレート（ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｔｅ）およびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。診断適用については、本発明の抗体は代表的に、検出可能な部分で標識される。この検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで、検出可能なシグナルを産生し得る、任意の部分であり得る。例えば、この検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉ）、蛍光化合物もしくは化学発光化合物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミンまたはルシフェリン）；ビオチン；放射性同位体標識（例えば、例えば、１２５Ｉ、３２Ｐ、１４Ｃまたは３Ｈ）または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る。抗体を検出可能な部分に対して別々に結合体化するための当該分野で公知の任意の方法（Ｈｕｎｔｅｒら，１９６２；Ｄａｖｉｄら，１９７４；Ｐａｉｎら，１９８１；およびＮｙｇｒｅｎ，１９８２によって記載される方法を含む）が用いられ得る。
【０１８１】
本発明の抗体は、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的および間接的なサンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイ）において用いられ得る。Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４７−１５８頁（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）。競合結合アッセイは、標識された標準物質（これは、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーもしくはＣＲＨレセプターまたはこれらの免疫学的反応性部分であり得る）が、制限された量の抗体との結合について試験サンプル分析物（ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプター）と競合する能力に頼る。試験サンプルにおけるＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターの量は、この抗体と結合した標準物質の量と逆に比例する。結合した標準物質の量を決定することを容易にするために、この抗体は一般的に、この抗体に結合した標準的物質および分析物が、結合していないままの標準物質および分析物から便利に分離され得るように、競合の前または後で不溶化される。サンドイッチアッセイは、２つの抗体（各々、検出されるべきタンパク質の異なる免疫原性部分（すなわち、エピトープ）に結合し得る）の使用を含む。サンドイッチアッセイでは、試験サンプル分析物は、固体支持体上に固定化された第一抗体によって結合されており、その後、第二抗体が分析物を結合し、従って、不溶性の三部複合体を形成する。ＤａｖｉｄおよびＧｒｅｅｎｅ，米国特許第４，３７６，１１０号。第二抗体は、検出可能な部分でそれ自体標識され得る（直接的サンドイッチアッセイ）か、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を用いて測定され得る（間接的サンドイッチアッセイ）。例えば、１つの型のサンドイッチアッセイはＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分は酵素である。
【０１８２】
（（ｉｉｉ）ヒト化抗体）
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば、「輸入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基といわれ、輸入残基は代表的に、「輸入」可変ドメインから採取される。ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同実験者ら（Ｊｏｎｅｓら，１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，１９８８；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，１９８８の方法に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することによって、本質的に行われ得る。従って、このような「ヒト化」抗体は、キメラ抗体（Ｃａｂｉｌｌｙ，前出）であり、ここで、インタクトなヒト可変ドメインよりも実質的に小さいドメインが、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。実際問題として、ヒト化抗体は代表的に、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が、齧歯類抗体における類似の部位由来の残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１８３】
抗体が、抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しながらヒト化されることが重要である。この目的を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析プロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、当業者にとって通常入手可能であり、そして当業者はこれに精通している。選択された候補免疫グロブリン配列のありそうな三次元コンホメーション構造を例示および提示する、コンピュータプログラムが入手可能である。これらのディスプレーの検査は、候補免疫グロブリンアミノ酸の機能における残基の、ありそうな役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このようにして、ＦＲ残基は、所望の抗体特徴（例えば、標的抗原についての親和性の増大）が達成されるように、コンセンサス配列および輸入配列から選択され得、そして組み合わされ得る。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接的かつ最も実質的に関与する。さらなる詳細については、１９９８年１０月１３日に出願された米国特許５，８２１，３３７を参照のこと。
【０１８４】
（ｄ．ヒト抗体）
ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒトミエローマ株およびマウス−ヒトへテロミエローマ細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８４）およびＢｒｏｄｅｕｒら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，５１−６３頁（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９８７）によって記載されている。現在、免疫されると、内在性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが可能である。例えば、キメラでおよび生殖系列変異体マウスにおける抗体の重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失は、内在性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジされると、ヒト抗体の産生をもたらす。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３を参照のこと。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，１９９０）を用いて、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体および抗体フラグメントをインビトロで産生し得る。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３またはｆｄ）の主要コートタンパク質遺伝子またはマイナーコートタンパク質のいずれかに対してインフレームでクローニングされ、そしてファージ粒子の表面上で機能的抗体フラグメントとして提示される。糸状粒子はこのファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能的特性に基づく選択もまた、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。従って、このファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレーは、種々の形式で行われ得る；これらの概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ　Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ　Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３，５６４−５７１（１９９３）を参照のこと。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源は、ファージディスプレイのために用いられ得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ　３５２，６２４−６２８（１９９１）は、免疫したマウスの脾臓由来のＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン（ｏｘａｚｏｌｏｎｅ）抗体の多様なアレイを単離した。免疫していないヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーが構築され得、そして多様なアレイの抗原（自己抗原を含む）に対する抗体は、Ｍａｒｋｓら，１９９１またはＧｒｉｆｆｉｔｈら，１９９３に記載される技術に本質的に従って単離され得る。
【０１８５】
天然の免疫応答では、抗体遺伝子は、変異を高い割合で蓄積する（体細胞超変異）。導入された変化のいくつかは、高い親和性を与え、そして高親和性表面免疫グロブリンを提示するＢ細胞は、その後の抗原チャレンジの間に優先的に複製され、そして分化する。この天然のプロセスは、「鎖シャッフリング」（Ｍａｒｋｓら，１９９２）として公知の技術を用いることによって模倣され得る。この方法では、ファージディスプレーによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖のＶ領域の遺伝子を、免疫していないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に存在する改変体（レパートリー）のレパートリーで順次置換することによって改善され得る。この技術は、ｎＭの範囲の親和性を有する抗体および抗体フラグメントの産生を可能にする。非常に大きなファージ抗体レパートリー（「全てのライブラリーの母（ｍｏｔｈｅｒ−ｏｆ−ａｌｌ　ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）」としても公知）を作製するためのストラテジーは、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら，１９９３によって記載されており、そして高親和性ヒト抗体は、既に報告されたような大きなファージライブラリーから直接単離され得る。遺伝子シャッフリングをまた用いて、齧歯類抗体からヒト抗体を誘導し得、ここで、ヒト抗体は、出発齧歯類抗体に対して類似の親和性および特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法に従って、ファージディスプレイ技術によって得られる齧歯類抗体の重鎖または軽鎖のＶドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換されて、齧歯類−ヒトキメラが作製される。抗原についての選択は、機能的抗原結合部位を保有し得る、すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配する（インプリントする）、ヒト可変部の単離をもたらす。残りの齧歯類Ｖドメインを置換するためにこのプロセスが繰り返される場合、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に公開されたＰＣＴ特許出願ＷＯ　９３／０６２１３を参照のこと）。ＣＤＲグラフト化による齧歯類抗体の伝統的なヒト化とは異なり、この技術は、齧歯類起源のフレームワーク残基もＣＤＲ残基も有さない、ヒト抗体を完全に提供する。
【０１８６】
（ｅ．二重特異性抗体）
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原についての特異性を有する、モノクローナル（好ましくはヒトまたはヒト化）抗体である。本発明の場合、結合特異性のうちの一方は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーについてまたはＣＲＨレセプターについてであり、他方は任意の他の抗原についてであり、そして好ましくは別のレセプターまたはレセプターサブユニットについてである。例えば、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターおよび神経栄養因子を特異的に結合するか、または２つの異なるＮＵＲＲサブファミリーのメンバーもしくは２つの異なるＣＲＨレセプターを特異的に結合する二重特異性抗体は、本発明の範囲内にある。二重特異性抗体を作製するための方法は当該分野で公知である。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリンの重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、ここで、２つの重鎖は、異なる特異性を有する（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ，１９８３）。免疫グロブリンのランダムな一組の重鎖および軽鎖に起因して、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の潜在的混合物を産生し、このうち、１つのみが正確な二重特異性構造を有する。正確な分子の精製（これは通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって行われる）はかなり扱いにくく、そして産物の収率は低い。同様の手順は、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ　９３／０８８２９（１９９３年５月１３日公開）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら，１９９１に開示される。
【０１８７】
異なりかつより好ましいアプローチに従って、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリンの定常ドメイン配列に融合される。融合は好ましくは、ヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリンの重鎖定常ドメインとである。融合物の少なくとも１つに存在する、軽鎖の結合のために必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリンの重鎖融合物をコードするＤＮＡおよび所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクター中に挿入され、そして適切な宿主生物体へと同時トランスフェクトされる。これは、構築において用いられる等しくない比の３つのポリペプチド鎖が最適な収率を提供する実施形態において、３つのポリペプチドフラグメントの相互の比率を調整する際に大きな融通性を提供する。しかし、等しい比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらす場合、またはこの比が何の特別な重要性も無い場合、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖についてのコード配列を、１つの発現ベクター中に挿入することが可能である。このアプローチの好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアームにおいて第一の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアームにおけるハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第二の結合特異性を提供する）から構成される。この非対称構造が、所望の二重特異性化合物の、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの分離を容易にすることが見出された。二重特異性分子の一方のみにおける免疫グロブリン軽鎖の存在が、容易な分離方法を提供する。このアプローチは、１９９２年８月１７日に出願した同時係属中の出願第０７／９３１，８１１号に開示される。二重特異性抗体を作製するさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら，１９８６を参照のこと。
【０１８８】
（ｆ．ヘテロ結合体抗体）
ヘテロ結合体抗体もまた、本発明の範囲内にある。ヘテロ結合体抗体は、共有結合的に連結された２つの抗体から構成される。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞に対して免疫系細胞を標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置について（ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ　９１／００３６０および同ＷＯ　９２／２００３７３；ＥＰ　０３０８９）提唱されている。ヘテロ結合体抗体は、任意の便利な架橋方法を用いて作製され得る。適切な架橋剤は当該分野で周知であり、そして多数の架橋技術と共に米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１８９】
（免疫検出方法）
なおさらなる実施形態では、本発明は、生物学的成分（例えば、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーおよびＣＲＨレセプターサブタイプのタンパク質成分）を結合、精製、除去、定量およびさもなければ一般的に検出するための、免疫検出方法に関する。本発明に従って調製される、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーおよびＣＲＨレセプターサブタイプの抗体を用いて、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターのタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドが検出され得る。本出願を通して記載されるように、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーおよびＣＲＨレセプターサブタイプに特異的な抗体の使用が意図される。いくつかの免疫検出方法としては、いくつか言及すると、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫アッセイ、化学発光アッセイ、生物発光アッセイおよびウェスタンブロットが挙げられる。種々の有用な免疫検出方法の工程は、科学文献（各々本明細書中に参考として援用される、例えば、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ　ＭＥおよびＢｅｎ−Ｚｅｅｖ　Ｏ，１９９９；Ｇｕｌｂｉｓ　ＢおよびＧａｌａｎｄ　Ｐ，１９９３；Ｄｅ　Ｊａｇｅｒ　Ｒら，１９９３；ならびにＮａｋａｍｕｒａら，１９８７）に記載されている。
【０１９０】
一般に、免疫結合方法は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含む疑いのあるサンプルを得る工程、およびこのサンプルを、本発明に従って、第一の抗ＮＵＲＲ抗体または抗ＣＲＨ抗体と、場合によっては条件下で、免疫複合体の形成を可能にするに有効な条件下で接触させる工程を含む。
【０１９１】
これらの方法としては、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーおよびＣＲＨレセプターのタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを患者のサンプルから精製する際に用いられ得るように、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーおよびＣＲＨレセプターのタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを精製するための方法、ならびに組換え発現されたＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターのタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドを精製するための方法が挙げられる。これらの例では、この抗体は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターサブタイプのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドの抗原性成分をサンプルから除去する。この抗体は好ましくは、固体支持体（例えば、カラムマトリックスの形態で）連結され、そしてＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターのタンパク質の抗原性成分を含む疑いのあるサンプルは、固定された抗体に適用される。望ましくない成分はカラムから洗浄され、固定された抗体に免疫複合体化した抗原が残され、次いで、このＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターのタンパク質抗原は、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターのタンパク質またはペプチドをカラムから取り出すことによって収集される。
【０１９２】
免疫結合方法はまた、サンプル中の、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターのタンパク質と反応性の成分の量を検出および定量するための方法、ならびに結合プロセスの間に形成された任意の免疫複合体の検出および定量を包含する。ここで、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターサブタイプのタンパク質またはペプチドを含む疑いのあるサンプルを得、そしてこのサンプルを、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターサブタイプに対する抗体と接触させ、次いで、特定の条件下で形成された免疫複合体の量を検出および定量する。
【０１９３】
抗原検出に関して、分析される生物学的サンプルは、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーおよび／またはＣＲＨレセプターサブタイプのタンパク質に特異的な抗原を含む疑いのある任意のサンプル（例えば、炎症性滑膜組織の切片または標本、ホモジナイズした炎症性滑膜組織抽出物、炎症性滑膜の細胞、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターのタンパク質を含有する組成物の上記のいずれかの分離および精製された形態またはさらには炎症性滑膜組織と接触する任意の生物学的流体（例えば、滑液）であり得るが、組織サンプルまたは抽出物が好ましい。ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターのタンパク質に特異的な抗原を含む疑いのあり得る炎症性免疫疾患としては、慢性炎症性関節疾患、潰瘍性大腸炎、甲状腺炎、関節炎、慢性関節リウマチ、乾癬性関節炎およびサルコイド関節炎として分類される状態のコレクションが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１９４】
選択された生物学的サンプルを、免疫複合体（一次免疫複合体）の形成を可能にするに有効な条件下でかつそれに充分な期間にわたって抗体と接触させることは一般に、抗体組成物をサンプルに単に添加し、そして抗体が、存在する任意のＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプタータンパク質抗原と免疫複合体を形成する、すなわち、結合するに充分に長い期間にわたって混合物をインキュベートする問題である。この時間の後、サンプル−抗体組成物（例えば、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロットまたはウェスタンブロット）は一般に洗浄されて、あらゆる非特異的に結合した抗体種が除去され、一次免疫複合体中に特異的に結合された抗体のみが検出されるのを可能にする。
【０１９５】
一般に、免疫複合体形成の検出は、当該分野で周知であり、そして多数のアプローチの適用を通して達成され得る。これらの方法は一般に、標識またはマーカー（例えば、放射性タグ、蛍光タグ、生物学的タグおよび酵素的タグのいずれか）の検出に基づく。このような標識の使用に関する米国特許としては、各々本明細書中に参考として援用される、３，８１７，８３７；３，８５０，７５２；３，９３９，３５０；３，９９６，３４５；４，２７７，４３７；４，２７５，１４９および４，３６６，２４１が挙げられる。もちろん、当該分野で公知であるように、二次結合リガンド（例えば、第二の抗体またはビオチン／アビジンリガンド結合配置）の使用を通してさらなる利点を見出し得る。
【０１９６】
検出において用いられるＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターの抗体は、それ自体、検出可能な標識に連結され得、次いで、この標識を単に検出し、それによって組成物中の一次免疫複合体の量が決定されるのを可能にする。あるいは、一次免疫複合体中に結合された第一の抗体は、この抗体についての結合親和性を有する二次結合リガンドによって検出され得る。これらの場合、第二の結合リガンドは、検出可能な標識に対して連結され得る。第二の結合リガンドはしばしば、それ自体抗体であり、従ってこのリガンドは、「二次」抗体と呼ばれ得る。一次免疫複合体を、標識された二次結合リガンド（すなわち、抗体）と、二次免疫複合体の形成を可能にするに有効な条件下でかつそれに充分な期間にわたって接触させる。次いで、二次免疫複合体は一般に洗浄されて、非特異的に結合したあらゆる標識二次抗体またはリガンドが除去され、次いで、二次免疫複合体中の残りの標識が検出される。
【０１９７】
さらなる方法は、二工程アプローチによる一次免疫複合体の検出を含む。抗体についての結合親和性を有する第二の結合リガンド（例えば、抗体）は、上記のような、二次免疫複合体を形成するために用いられる。洗浄後、二次免疫複合体を、第二の抗体についての結合親和性を有する第三のリガンドまたは抗体と、再度、免疫複合体（三次免疫複合体）の形成を可能にするに有効な条件下でかつそれに充分な期間にわたって接触させる。第三のリガンドまたは抗体は、検出可能な標識へと連結されて、このようにして形成された三次免疫複合体の検出を可能にする。この系は、シグナル増幅が所望される場合、シグナル増幅を提供し得る。
【０１９８】
Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｃａｎｔｏｒによって設計された免疫検出の１つの方法は、２つの異なる抗体を使用する。第一の工程のビオチン化モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いて標的抗原が検出され、次いで第二工程の抗体を用いて、複合体化したビオチンに結合したビオチンが検出される。この方法では、試験されるべきサンプルは、第一工程抗体を含む溶液中で最初にインキュベートされる。標的抗原が存在する場合、抗体のうちのいくつかは抗原に結合して、ビオチン化抗体／抗原複合体を形成する。次いで、抗体／抗原複合体は、ストレプトアビジン（またはアビジン）、ビオチン化ＤＮＡおよび相補的ビオチン化ＤＮＡの連続溶液中でのインキュベーションによって増幅され、各工程は、さらなるビオチン部位を抗体／抗原複合体に添加する。この増幅工程は、適切な増幅レベルが達成されるまで繰り返され、これが達成された時点で、サンプルは、ビオチンに対する第二工程抗体を含む溶液中でインキュベートされる。この第二工程抗体は、例えば、色素原基質を用いた組織酵素学によって抗体／抗原複合体の存在を検出するために用いられ得る酵素を用いてのように、標識される。適切な増幅を用いて、巨視的に見える結合体が産生され得る。
【０１９９】
別の公知の免疫検出方法は、免疫−ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）方法論を利用する。このＰＣＲ方法は、ビオチン化ＤＮＡとのインキュベーションまではＣａｎｔｏｒ法に類似するが、複数回のストレプトアビジンおよびビオチン化ＤＮＡインキュベーションを用いる代わりに、ＤＮＡ／ビオチン／ストレプトアビジン／抗体複合体は、この抗体を放出させる低いｐＨまたは高塩緩衝液を用いて洗浄される。次いで、得られた洗浄溶液は、適切なコントロールと共に適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応を実施するために用いられる。少なくとも理論的には、ＰＣＲの莫大な増幅能力および特異性を利用して、単一抗原分子を検出し得る。
【０２００】
本発明の免疫検出方法は、種々の形態の炎症性免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ）のような状態の診断および予後において明らかな有用性を有する。ここで、野生型または変異体のＮＵＲＲサブファミリーのメンバーまたはＣＲＨレセプターのタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたは変異体を含む疑いのある生物学的サンプルまたは臨床的サンプルが用いられる。しかし、これらの実施形態はまた、（例えば、例えば、ハイブリドーマの選択において、抗原または抗体のサンプルの力価測定において）非臨床サンプルに対する適用を有する。
【０２０１】
種々の形態の炎症性免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ）を有する患者の臨床診断および／またはモニタリングにおいて、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーおよびＣＲＨレセプターのタンパク質、ポリペプチド、ペプチドもしくは変異体の検出、または正常被験体由来の、対応する生物学的サンプルにおいて観察されたレベルと比較した、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーおよびＣＲＨレセプターのレベルにおける変更は、特定の実施形態では、炎症性免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ）を有する患者の指標である。しかし、当業者に公知のように、このような臨床診断は、かならずしも、孤立してこの方法に基づいてなされるわけではない。当業者は、生体マーカーの種類および量における顕著な差を識別することに非常に精通しており、これは、正の同定を表すか、または生体マーカーの低レベルおよびバックグラウンドの変化を表す。実際、バックグラウンドの発現レベルはしばしば、「カットオフ」を形成するために用いられ、カットオフよりも上の増大した検出は、顕著でかつポジティブとスコア付けされる。
【０２０２】
（ａ．免疫組織化学）
本発明の抗体はまた、免疫組織化学（ＩＨＣ）による研究のために調製された、新鮮に凍結されたパラフィン包埋された組織ブロック、およびホルマリン固定されパラフィン包埋された組織ブロックの両方に関連して用いられ得る。標本から組織ブロックを調製する方法は、種々の予後因子の以前のＩＨＣ研究において好首尾に用いられており、そして当業者に周知である（Ｂｒｏｗｎら，１９９０；Ａｂｂｏｎｄａｎｚｏら，１９９０；Ａｌｌｒｅｄら，１９９０）。
【０２０３】
手短に述べると、凍結切片は、５０ｎｇの凍結した「粉末化」組織を、小さなプラスチックカプセル中のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で室温で再水和し；遠心分離によって粒子をペレット化し；粘着性の包埋媒体（ＯＣＴ）中にこれらを再懸濁し；カプセルを反転し、そして遠心分離によって再度ペレット化し；−７０℃のイソペンタン中で急速凍結し；プラスチックカプセルを切断し、そして組織の凍結円柱を除去し；組織円柱をクリスタットミクロトームチャック上に固定し；そして２５〜５０個の連続切片を切断することによって調製され得る。
【０２０４】
永続切片は、プラスチック製の微量遠心管中での５０ｍｇのサンプルを再水和し；ペレット化し；４時間の固定のために１０％ホルマリン中で再懸濁し；洗浄／ペレット化し；温めた２．５％寒天中に再懸濁し；ペレット化し；氷水中で冷却して寒天を固くし；組織／寒天ブロックをこの管から取り出し；このブロックをパラフィン中に浸潤または包埋し；そして５０個までの連続永久切片を切断することを含む類似の方法によって調製され得る。
【０２０５】
（非タンパク質発現配列）
特定の実施形態では、ＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列またはＣＲＨレセプターは、翻訳されないメッセージを発現し得る。ＤＮＡは、表現型に影響を与えるように作用するがタンパク質には翻訳されないＲＮＡ転写産物を発現する目的のために生物体中に導入され得る。２つの例は、アンチセンスＲＮＡおよびリボザイム活性を有するＲＮＡである。両方とも、ネイティブな遺伝子または導入された遺伝子の発現を低減または排除する際に、可能な機能を果たし得る。しかし、以下に詳述されるように、ＤＮＡは、生物体の表現型をもたらすために発現される必要がない。
【０２０６】
（ａ．アンチセンスＲＮＡ）
特定の局面では、ＮＵＲＲサブファミリーの核酸配列またはＣＲＨレセプターは、アンチセンスメッセージを発現し得る。転写された場合に、標的とされるメッセンジャーＲＮＡの全てまたは一部に相補的であるアンチセンスＲＮＡを産生する核酸（特に、遺伝子由来の核酸）が構築または単離され得る。このアンチセンスＲＮＡは、このメッセンジャーＲＮＡのポリペプチド産物の産生を低減する。このポリペプチド産物は、細胞のゲノムによってコードされる任意のタンパク質であり得る。上記の遺伝子は、アンチセンス遺伝子と呼ばれる。従って、アンチセンス遺伝子は、形質転換方法によって細胞へと導入されて、選択された目的のタンパク質の発現が低減した新規なトランスジェニック細胞または生物体が産生され得る。例えば、このタンパク質は、細胞または生物体中の反応を触媒する酵素であり得る。酵素活性の低減は、細胞または生物体中で任意の酵素的に合成された化合物（例えば、脂肪酸、アミノ酸、糖質、核酸など）を含む反応の産物を低減または排除し得る。
【０２０７】
以下の実施例は、例示として提供され、本発明の範囲をどのようにも限定することは意図されない。
【０２０８】
（実施例１：ヒト炎症性滑膜組織におけるＣＲＨ　ｍＲＮＡの産生）
ＣＲＨ　ｍＲＮＡがヒト炎症性滑膜において末梢的に発現されるか否かを調べるために、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＲＡを有する患者の関節（ｎ＝６、１．８０＋／−０．８７）、ＰｓＡを有する患者の関節（ｎ＝６、０．８１＋／−０．６）、ＳＡを有する患者の関節（ｎ＝２、１．２０＋／−０．４）から得た滑膜組織および正常滑膜（ｎ＝２）中のＣＲＨ　ｍＲＮＡレベルを比較した。全ての疾患群は、正常滑膜と比較した場合、有意に上昇したＣＲＨ　ｍＲＮＡレベル（Ｐ＜０．０１）を有していた（図１Ａおよび図１Ｂ）。ハウスキーピング遺伝子であるグルタルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現レベルは、全ての患者において類似していた。
【０２０９】
総ＲＮＡを、ヒトＣＲＨおよびＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲによって分析した。（図１Ａ）正常ヒト滑膜（Ｎｏｒ）、乾癬性関節炎と診断された患者（ＰｓＡ）、慢性関節リウマチと診断された患者（ＲＡ）およびサルコイド関節炎と診断された患者（ＳＡ）。（図１Ｂ）示した値は、平均＋／−ＳＥである。＊は、正常滑膜と比較してＰ＜０．０１を示す。
【０２１０】
（実施例２：初代ヒト滑膜細胞におけるＣＲＨの発現）
ＣＲＨを発現する細胞の起源を同定するために、単離された初代ヒト滑膜細胞におけるＣＲＨ　ｍＲＮＡの発現を調査した。滑膜細胞は、炎症性滑膜組織中のＩＬ−１β、ＴＮＦαおよびＰＧＥ２の作用についての重要な供給源かつ標的細胞である（Ｂｕｃａｌａら，１９９１）。さらに、これらの炎症誘発性因子は、ヒト滑膜の過形成および軟骨破壊の病因における重要なメディエーターである（ＭａｃＮａｕｌら，１９９０）。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＣＲＨ　ｍＲＮＡがＲＡおよびＰｓＡの両方の初代滑膜細胞において構成的に発現されることを実証した。（図１Ｃ）炎症誘発性メディエーターによって刺激された後の初代滑膜細胞を図１Ｄに示す。正常条件下で維持された（Ｃｏｎ）、または１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、１μＭのＰＧＥ２、ＭｏＣＭまたは２５μＭのフォルスコリン（ＦＯＲ）に６時間にわたって暴露された滑膜細胞を用いて作製されたＰＣＲ産物の代表例。結果は、ＲＡ細胞株およびＰｓＡ細胞株の両方を用いて、３つの別々の実験から得られた。示した値は、平均＋／−ＳＥである。記号＊は、コントロールと比較してＰ＜０．０１を示す。作製されたＰＣＲ産物を、ヒトＣＲＨおよびＧＡＰＤＨについてのｃＤＮＡプローブを用いたサザンブロット分析によって確認した。
【０２１１】
（実施例３：ＣＲＨ発現に対するフォルスコリンおよび炎症誘発性アゴニストの効果）
アデニル酸シクラーゼ／プロテインキナーゼＡシグナル伝達経路の活性化による視床下部ＣＲＨ遺伝子の発現調節は既に確証されている（Ｇｕａｒｄｉｏｌａ−ｄｉａｚら，１９９４）。アデニル酸シクラーゼ活性化因子であるフォルスコリン（ＦＯＲ）の能力を、初代滑膜細胞におけるＣＲＨ遺伝子発現に対する刺激効果について試験した。フォルスコリンは、刺激の２時間後という早期に内在性ＣＲＨ　ｍＲＮＡレベルを誘導し、レベルは６時間後にピークに達した（図１Ｃおよび図１Ｄ）。末梢ＣＲＨ発現の調節シグナルを決定するために、炎症誘発性アゴニストの内在性ＣＲＨ　ｍＲＮＡ調節能力を試験した。インビボサイトカイン濃度を正確に反映することが報告された（Ｕｈｌａｒら，１９９７）炎症性メディエーターの複雑な組合せである単球馴化培地（ＭｏＣＭ）で刺激した滑膜細胞は、フォルスコリン処理に匹敵するレベルまで、ＣＲＨ　ｍＲＮＡ発現を強力に（４．６４＋／−２．５倍）刺激した。次いで、個々の炎症誘発性メディエーターがＣＲＨ　ｍＲＮＡを誘導する能力の比較を行った。ＴＮＦα（３．６＋／−２．０倍）、ＩＬ−１β（２．３＋／−１．０倍）およびＰＧＥ２（３．８５＋／−１．５倍）はＣＲＨ　ｍＲＮＡを有意にアップレギュレートした（Ｐ＜０．０１）が、ＩＬ−６は、試験したどの濃度でも、これらの細胞におけるＣＲＨ　ｍＲＮＡレベルに対して効果をほとんど有さなかった（１．５＋／−１．２倍）。ＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡのレベルは、試験した全ての条件下で比較的一定のままであった（図１Ｄ）。
【０２１２】
（実施例４：炎症性メディエーターは、初代滑膜細胞におけるヒトＣＲＨプロモーターの転写活性を増強する）
炎症性メディエーターがヒトＣＲＨプロモーターの発現を調節し得るか否かを決定するために、ヒトＣＲＨ遺伝子の近位プロモーター領域（−６６６／＋１１１）（配列番号１４３）を、プロモーターのないｐＢＬ３−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）プラスミド中へクローニングして、ｈＣＲＨ−ＣＡＴを作製することによってレポーター構築物を作製した。ｈＣＲＨプロモーターの転写調節を、初代ヒト滑膜細胞における一過性トランスフェクションによって測定した。β−ガラクトシダーゼ活性についてトランスフェクトした細胞のインサイチュ染色は、９５％を超える高いトランスフェクション効率を示した（図２Ａ）。３つの個々のＲＡ滑膜細胞株およびＰｓＡ滑膜細胞株を、ＣＲＨプロモーター活性をモニタリングするために３μｇの−６６６／＋１１１ｈＣＲＨ−ＣＡＴレポータープラスミドで一過性トランスフェクトし、正常条件下で維持した（Ｃｏｎ）か、または１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、１μＭのＰＧＥ２、ＭｏＣＭもしくは２５μＭのＦＯＲに１２時間暴露した。ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果と一貫して、ＴＮＦα（１５．６＋／−１．９倍）、ＩＬ−１β（１７．１＋／−３．１倍）、ＰＧＥ２（２８．８＋／−１．７倍）およびＭｏＣＭ（４０．８＋／−２．１倍）は、ｈＣＲＨプロモーターの転写活性を有意に（Ｐ＜０．０１）増強した。ＩＬ−６処理（１０〜１００ｎｇ／ｍｌ）のトランスフェクトした細胞は、ＣＡＴ産生を有意には増大させなかった（３．２＋／−１．９倍）。このことは、ＩＬ−６が、これらの細胞におけるＣＲＨプロモーター活性に対してほとんど効果を有さないことを示唆する。炎症誘発性アゴニストでの処理に対する個々のＰｓＡ滑膜細胞株およびＲＡ滑膜細胞株の応答は、有意差を示さなかった。トランスフェクトされた細胞によって産生される代表的なＣＡＴレベルを、図２Ｂに例示する。
【０２１３】
図２Ａおよび図２Ｂに示す結果は、ＲＡおよびＰｓＡの個々の３つの細胞株からの結果の代表である。各データバーは、２つのデータ点を表す。
【０２１４】
（実施例５：ＣＲＨレセプターは、炎症性滑膜において発現される）
炎症性ヒト滑膜におけるＣＲＨについての末梢での生物学的役割をさらに確証するために、ＣＲＨレセプターの存在を分析した。ＣＲＨレセプターについての特異的免疫組織化学的染色は、試験した全てのＲＡ組織（ｎ＝６）およびＰｓＡ組織（ｎ＝６）において見られた。ＣＲＨレセプターは、滑膜の血管系（血管の内皮細胞および平滑筋層を含む）に存在した（図３）。レセプター染色は、ＲＡの滑膜の血管系（図３Ａ）と比較して、ＰｓＡの滑膜の血管系（図３Ｂおよび図３Ｃ）において一貫してより濃かった。ポジティブ細胞は、褐色がかった黒色の染色によって示される。ＬＬは滑膜の管壁層（ｌｉｎｉｎｇ　ｌａｙｅｒ）を示し、一方、ＳＬは管壁下（ｓｕｂｌｉｎｉｎｇ）の滑膜支質を示す。もともとの倍率は以下の通りである：×２００（Ａ、Ｂ）；×４５０（Ｃ、Ｄ）。対照的に、いくつかの指定されたていない単核細胞がポジティブに染色させて出現しているが、滑膜の管壁層、滑膜下滑膜細胞および炎症性浸潤は、主にＣＲＨレセプター陰性であった。染色の特異性を、過剰の抗原と共に予めインキュベートした、ＣＲＨレセプター抗体で処理した連続切片に染色が見られないことによって確認した（図３Ｄ）。
【０２１５】
ポジティブ細胞は、褐色がかった黒色の染色によって示される。滑膜の管壁層（ＬＬ）および管壁下滑膜支質（ＳＬ）が示される。元々の倍率：×２００（Ａ、Ｂ）；×４５０（Ｃ、Ｄ）。ＲＡ（Ａ）およびＰｓＡ（Ｂ、ＣおよびＤ）の滑膜組織を、ＣＲＨレセプター１型および２型に対する抗体（Ｃ−２０）で染色した。ＰｓＡ滑膜組織（Ｄ）（Ｃにおける切片に対する連続切片）を、Ｃ−２０特異的ブロッキングペプチドで予め吸収したＣ−２０で染色した。
【０２１６】
（実施例６：滑膜組織におけるＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７のｍＲＮＡの発現）
ＮＵＲＲサブファミリーが病理的状況におけるＣＲＨシグナル伝達に寄与するか否かを決定するために、新たに切り出したＲＡ（図４Ａ）およびＰｓＡの滑膜外植片を、ＣＲＨ（１０−８Ｍ）と共にインキュベートし、そしてＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７の転写産物の発現を誘導する能力について調べた。ノーザンブロット分析によって、ＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７の両方が、ＣＲＨによって１時間以内に迅速に誘導され、そして３時間以内に基底レベルまで減少することが確認された（図４Ａ）。さらに、滑膜外植片の分析は、ＮＵＲ７７転写産物のレベルと比較してより高い、内在性およびＣＲＨ誘導性のＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡを示す。
【０２１７】
プロテインキナーゼＡ経路およびプロテインキナーゼＣ経路による遺伝子発現の調節は、ＲＡ滑膜細胞における重要なシグナル伝達事象を表す（Ｂｅｎ−Ａｖら，１９９５；Ｃｒｏｆｆｏｒｄら，１９９４；ＦｉｒｅｓｔｅｉｎおよびＭａｎｎｉｎｇ，１９９９）。ＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７のｍＲＮＡレベルにおける迅速な上昇は、これらの細胞においてプロテインキナーゼＡ経路のフォルスコリン活性化後に観察された（図４Ｂ）。ＮＵＲＲ調節におけるプロテインキナーゼＣシグナル伝達経路の関与を調査するために、滑膜細胞を、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）で処理した。ＰＭＡは、ＮＵＲ７７　ｍＲＮＡを中程度にアップレギュレートしたが、ＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡレベルに対しては何の刺激効果も有さなかった。グルココルチコイド（デキサメタゾン１０−８Ｍ）での滑膜細胞の前処理は、フォルスコリン誘導性ＮＵＲＲ１発現を劇的に抑制した（図４Ｂ）。対照的に、デキサメタゾンは、フォルスコリン誘導性ＮＵＲ７７レベルにもＰＭＡ誘導性ＮＵＲ７７レベルにも、効果をほとんど有さなかった。滑膜細胞が膜ＣＲＨレセプターを発現しないことを示唆する本発明者らの免疫組織化学的データと一貫して、ＣＲＨによるＮＵＲＲ１またはＮＵＲ７７の誘導は、初代滑膜細胞株において観察されなかった。この観察は、ＣＲＨレセプターの存在が、ＮＵＲＲ１発現に対する、観察されたＣＲＨ誘導性応答にとって重要であることを示す。
【０２１８】
図４では、総ＲＮＡを抽出し、そしてノーザンブロット分析を行った。フィルターを、ＮＵＲＲ１またはＮＵＲ７７についてのｃＤＮＡと、そしてまたローディングおよび転写を制御するためにＧＡＰＤＨとハイブリダイズさせた。滑膜の外植片を未処理のままにしたか［Ｃ］または示された時間にわたって１０−８ＭのＣＲＨと共にインキュベートした（図４Ａ）。初代滑膜細胞のコンフルエントな単層を未処理のままにした［Ｃ］かまたは１０−８Ｍのデキサメタゾン（ＤＥＸ）で２時間前処理し、その後、２５μＭのフォルスコリン（ＦＯＲ）または２０ｎｇ／ｍｌの酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）を添加した（図４Ｂ）。
【０２１９】
（実施例７：ヒト滑膜組織におけるＮＵＲＲ１の免疫組織化学的局在化）
滑膜のＮＵＲＲ発現を誘導するというＣＲＨの実証された能力は、ヒト炎症性関節炎におけるＮＵＲＲ転写因子についての調節役割を示唆する。この仮説を試験するために、ＮＵＲＲ１発現を、ＲＡおよびＰｓＡの両方の滑膜組織において免疫組織化学的染色によって調べた。ＮＵＲＲ１についての特異的染色は、ＲＡ（ｎ＝５）およびＰｓＡ（ｎ＝５）の試験した全ての組織において見られた。ポジティブなＮＵＲＲ１染色は、主に核に存在し、そして褐色がかった黒色の染色によって示された。
【０２２０】
染色は、主に核局在を示し、滑膜細胞およびマクロファージ細胞から主に構成される領域である、滑膜管壁細胞および滑膜下領域の細胞におけるいくらかの細胞質ＮＵＲＲ１局在を示した（図５Ａ）。同様に、ＲＡ滑液における顕著な単核細胞浸潤はＮＵＲＲ１ポジティブであった。滑膜の血管系（内皮細胞を含む）もまた、ＮＵＲＲ１発現についての部位であり、より強い染色が、ＰｓＡ滑膜血管において観察された（図５Ｃ）。ＲＡおよびＰｓＡの培養された初代滑膜細胞におけるＮＵＲＲ１発現の免疫組織化学研究は、インビボで見られた染色パターンと類似の染色パターンを示した（図５Ｄ）。ＮＵＲＲ１染色の特異性は、ＮＵＲＲ１抗体を過剰の抗原と共にプレインキュベートした場合に見られる染色が存在しないことによって確認された（図５Ｂ）。
【０２２１】
滑膜組織切片は、ＲＡ滑膜管壁層および管壁下層（図５Ａおよび図５Ｂ）、ならびにＰｓＡ滑膜の血管系（図５Ｃ）および培養したＰｓＡ滑膜細胞（図５Ｄ）を表す。ＲＡ滑膜組織（Ｂ）（Ａにおける切片の連続切片）を、ＮＵＲＲ１特異的ブロッキングペプチドで予め吸収させた抗ＮＵＲＲ１免疫血清で染色した。滑膜管壁層（ＬＬ）、管壁下滑膜支質（ＳＬ）および炎症性浸潤（ＩＩ）を示す。元々の倍率は、以下の通りである：×２００（図５Ａおよび図５Ｂ）；×１０００（図Ｃおよび図Ｄ）。
【０２２２】
（実施例８：炎症性アゴニストおよび炎症性アンタゴニストによるＮＵＲＲ１遺伝子の発現調節）
ＲＡおよびＰｓＡの滑膜組織、ならびにＣＲＨレセプターを発現しない細胞において観察された広範囲にわたるＮＵＲＲ１染色は、メディエーターもまた、ＮＵＲＲ１発現の調節に関与することを示唆する。それゆえ、炎症性関節疾患におけるＮＵＲＲ転写因子の病理的重要性を、炎症誘発性アゴニストが初代滑膜細胞および滑膜外植片組織におけるＮＵＲＲの転写産物のレベルを調節する能力を決定することによってさらに調べた（図６）。ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＰＧＥ２での処理は、内在性ＮＵＲＲ１のｍＲＮＡレベルにおける迅速かつ顕著な上昇を誘導した（図６Ａ〜図６Ｄ）。一貫して、ＰＧＥ２（図６Ｄ）は、これらの細胞においてＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡを刺激する際に最も強力かつ持続した効果を有した。単離された滑膜外植片におけるＮＵＲＲ１発現に対するＩＬ−６の刺激効果とは対照的に、滑膜細胞のＩＬ−６処理は、ＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡを顕著には誘導しなかった（図６Ｃ）。
【０２２３】
デキサメタゾン（１０−８Ｍ）は、滑膜細胞におけるＴＮＦα、ＩＬ−１β（図６Ａおよび図６Ｂ）ならびにＰＧＥ２刺激性ＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡ、ならびに滑膜外植片におけるＣＲＨ誘導性ＮＵＲＲ１発現を阻害した。対照的に、デキサメタゾンは、基底ＮＵＲＲ１発現（図６Ａ）に対して何の効果も有さなかった。ＩＬ−１β誘導性ＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡは、シクロオキシゲナーゼインヒビターインドメタシンによってブロックされず、オートクラインＰＧＥ２作用の改善を妨げた（図６Ｂ）（Ｂｅｎ−Ａｖら，１９９４）。シクロヘキシミドは、内在性ＮＵＲＲ１の転写産物のレベルを上昇させ、そしてフォルスコリン、ＰＧＥ２（図６Ｅ）、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαのＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡ刺激を強く増強した。このことは、デノボタンパク質合成が、ヒト滑膜細胞におけるＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡのサイトカイン媒介性誘導に必要でないことを意味する。図６に示す各ノーザンブロットについて、ＮＵＲ７７　ｍＲＮＡレベルもまた分析した。しかし、ＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡレベルにおける有意な変更とは対照的に、ＮＵＲ７７転写産物レベルは、試験した炎症性アゴニストおよび／または炎症性アンタゴニストの各々によって中程度にしか調節されなかった。著しいことに、滑膜のＮＵＲＲ１、ＮＵＲ７７およびＮＯＲ−１の示差的遺伝子発現が観察され、その結果、内在性ｍＲＮＡの相対的レベルはＮＵＲＲ１＞＞＞ＮＵＲ７７＞＞ＮＯＲ−１であった。
【０２２４】
図６について、各メンブレンを、ＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡを用いて再度プロービングして、ローディングおよび転写について制御した。ＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡレベルを、以下から抽出した総ＲＮＡを用いてノーザン分析によって測定した：（Ａ）１０−８Ｍデキサメタゾン（ＤＥＸ）での前処理の存在下または非存在下での、未処理のままの滑膜細胞［Ｃ］または示した時間にわたってＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に培養した滑膜細胞；（Ｂ）２μＭインドメタシン（ＩＮＤＯ）または１０−８Ｍ　ＤＥＸの前処理の存在下または非存在下での、未処理のままの滑膜細胞［Ｃ］または示した時間にわたってＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に培養した滑膜細胞；（Ｃ）未処理のままの滑膜細胞［Ｃ］またはＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌ）と共に培養した滑膜細胞もしくは滑膜の外植片；（Ｄ）１μＭ　ＰＧＥ２；（Ｅ）５μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（ＣＨＸ）の非存在下または存在下での、未処理のままの滑膜細胞［Ｃ］または１時間にわたって２５μＭフォルスコリン（ＦＯＲ）もしくは１μＭ　ＰＧＥ２と共に培養した滑膜細胞。
【０２２５】
（実施例９：サイトカイン処理後のＣＲＨ　ＮＢＲＥに対する増加した核ＮＵＲＲ１結合）
ＮＵＲＲ１遺伝子発現に対する炎症誘発性サイトカインの刺激効果は、この転写因子の調節におけるサイトカインの重要な役割を実証する。ＮＵＲＲ１のＤＮＡ結合能に対するサイトカインの効果を分析するために、ＥＭＳＡを行って、ヒトＣＲＨプロモーターにおけるコンセンサス配列（ＮＢＲＥ）に対するＮＵＲＲ１の結合特性を調べた。２５μＭフォルスコリン、１０ｎｇ／ｍｌ　ＴＮＦα（図７）、ＩＬ−１βまたはＰＧＥ２での滑膜細胞の刺激は、ＣＲＨ　ＮＢＲＥとの２つのタンパク質複合体の有意に増加した結合をもたらした。より大きなタンパク質複合体の結合は、５０倍モル過剰（複合体がより小さくなるほどより低い程度まで）の非標識相同オリゴヌクレオチドによって阻害された。より大きなタンパク質複合体は、ＮＵＲＲ１によるＤＮＡ結合を阻害することが既に示されている（ＭｕｒｐｈｙおよびＣｏｎｎｅｅｌｙ，１９９７）ＮＵＲＲ１特異的抗血清によって選択的にブロックされた。このことは、ＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡにおけるサイトカイン誘導性増加が、ＣＲＨ　ＮＢＲＥコンセンサス配列に対するＮＵＲＲ１タンパク質の特異的結合と相関することを確認する（図７）。
【０２２６】
未処理の滑膜細胞由来の核抽出物、２５μＭフォルスコリン（ＦＯＲ）処理（１時間）滑膜細胞由来の核抽出物、または１０ｎｇ／ｍｌ　ＴＮＦα処理（１時間）滑膜細胞由来の核抽出物を、α３２　Ｐ標識ＣＲＨ　ＮＢＲＥに対する増加した結合について比較した。ＤＮＡ−タンパク質相互作用を、５０倍モル過剰の相同オリゴヌクレオチドまたはＮＵＲＲ１特異的抗血清（ＮＵＲＲ１　Ａｂ）の存在下でアッセイした。
【０２２７】
（実施例１０：炎症プロセスにおける滑膜ＣＲＨの役割）
これらの実施例は、滑膜のＣＲＨ産生の調節が、ヒト炎症性関節疾患と関連した炎症プロセスの重要な要素であるという結論を支持する実質的な証拠を提供した。このデータは、最近発症したＲＡおよび他の慢性の炎症性関節症（ＰｓＡおよびＳＡを含む）を有する患者由来の滑膜組織におけるＣＲＨ　ｍＲＮＡの増加を実証する。末梢ＣＲＨ遺伝子発現の基礎となる調節機構を解明するために、関節の炎症および破壊と関連した炎症誘発性メディエーターが滑膜のＣＲＨ合成を刺激する能力を試験した。ＣＲＨ　ｍＲＮＡの内在性発現を、ＲＡおよびＰｓＡの培養滑膜細胞のインビトロでの研究によって確認した。これらの細胞は、ヒト炎症性関節炎において観察される軟骨破壊となる、滑膜過形成特性および滑膜の腫瘍様侵襲特性に関連している（Ｂｕｃａｌａら，１９９１；ＭａｃＮａｕｌら，１９９０）。初代滑膜細胞における定常状態のＣＲＨ　ｍＲＮＡ発現がＩＬ１β、ＴＮＦαおよびＰＧＥ２によって増大することおよびこのヒトＣＲＨプロモーターがこれらの同じ免疫学的刺激に内在性ＣＲＨ発現の応答と類似の様式で応答することもまた本明細書中で実証される。１より多くの細胞型がＣＲＨ　ｍＲＮＡを滑液中で産生することが可能である。ラットの脾臓および胸腺の免疫細胞、マウスＴリンパ球およびヒト末梢血リンパ球は、ＣＲＨ　ｍＲＮＡを産生することが報告されており（Ｗｅｂｓｔｅｒら，１９９８）、従って、炎症性滑液中の浸潤性マクロファージおよびリンパ球もまたＣＲＨ　ｍＲＮＡを発現する。しかし、滑膜細胞によるＣＲＨ　ｍＲＮＡ発現の顕著な誘導の観察は、滑膜細胞がＣＲＨ　ｍＲＮＡ発現の主な供給源であるという仮説を支持する。滑膜におけるＣＲＨレセプターの免疫組織化学局在は、滑膜ＣＲＨがパラクリンレセプター媒介応答において局所的に機能することを示す。さらに、ＣＲＨが核転写因子ＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７を滑膜外植片組織において誘導するという実証は、滑膜ＣＲＨの細胞内効果を媒介する際のＮＵＲＲサブファミリーについての顕著な役割を支持する。まとめて考えると、これらのデータは、炎症性滑膜における末梢ＣＲＨについての局所的な生理学的役割を支持する証拠を提供する。
【０２２８】
（実施例１１：複数の炎症シグナルを媒介する際のＮＵＲＲ１の重要性）
いくつかの独立した研究は、ＲＡ滑膜において細胞性増殖を調節する（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎら，１９９９）ことが公知の遺伝子発現の調節における核前初期遺伝子（例えば、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ）の異常な発現に関連していた。本明細書中で提示される実施例は、炎症性滑膜組織におけるＮＵＲＲ発現を初めて実証し、そしてこれらの転写因子がこの疾患の病理的プロセスに寄与することを示唆する。ＲＡ滑膜、ＰｓＡ滑膜および増殖中の滑膜細胞において、内在性ＮＵＲＲ１の遺伝子およびタンパク質の発現が検出された。前初期応答遺伝子の特徴である、ＩＬ−１β、ＴＮＦα、ＩＬ−６およびＰＧＥ２によるＮＵＲＲ１の誘導は、デノボのタンパク質合成とは独立した迅速な代謝回転速度を示した。ＣＲＨがＮＵＲＲ１を調節する能力は、確立された炎症誘発性メディエーターによるＮＵＲＲ１誘導と類似し、ＣＲＨについての末梢的役割をさらに強調する。滑膜由来ＣＲＨは、ＣＲＨレセプター保有細胞におけるＮＵＲＲ１発現を誘導する。しかし、ＣＲＨレセプターを発現しない、いくつかの滑膜細胞集団における豊富なＮＵＲＲ１発現は、炎症性関節に存在する炎症性メディエーターの環境によるこの転写因子の調節についての実質的な役割をさらに支持する。ヒトＮＵＲＲ１近位プロモーターにおけるＮＦ−κＢおよびＣＲＥＢの結合についてのコンセンサス配列は、本明細書で研究した免疫学的刺激による滑膜におけるＮＵＲＲ１発現の誘導と一貫する。初代滑膜細胞におけるＮＵＲＲ発現の調査は、ＩＬ−１β誘導性誘導性ＮＵＲＲ１転写およびＴＮＦα誘導性ＮＵＲＲ１転写の両方を媒介する際のＮＦκＢについての役割を示す。ＣＲＨおよびＰＧＥ２がｃＡＭＰ／ＣＲＥＢ依存性経路の活性化によってシグナル伝達をするという以前の証明（Ｌａｂｒｉｅ　Ｆ．ら，１９８２；Ｍｕｒｐｈｙ　ａｎｄ　Ｃｏｎｎｅｅｌｙ，１９９７；Ｂｅｎ−Ａｖら，１９９５）と共に、これらの観察は、ＮＵＲＲ１誘導が、少なくとも２つの異なる炎症誘発性シグナル伝達経路の収束点および複数の炎症シグナルを媒介する際のＮＵＲＲ１についての重要な共通の役割を表すことを示唆する。
【０２２９】
（実施例１２：炎症性関節疾患におけるＮＵＲＲ転写因子の病理的重要性）
炎症性関節疾患におけるＮＵＲＲ転写因子の病理的重要性を、ＲＡにおいて局所的に産生される炎症誘発性アゴニストが、初代ヒト滑膜細胞および滑膜外植片組織におけるＮＵＲＲ転写産物レベルを調節する能力を決定することによって調べた。本明細書中に実証されるように、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＰＧＥ２での処理は、内在性ＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡレベルにおける迅速かつ顕著な上昇を誘導した。一貫して、ＰＧＥ２は、これらの細胞においてＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡを刺激する際に最も強力および持続した効果を有した。ＩＬ−１βおよびＴＮＦαがＮＦ−κＢを介して転写カップリングを媒介し、一方、ＰＧＥ２がＣＲＥＢ依存性経路の活性化によってシグナル伝達することが充分に確立される（５）。ヒトＮＵＲＲ１近位プロモーターにおけるＮＦ−κＢおよびＣＲＥＢの両方の結合についての潜在的コンセンサス配列が同定された（図９Ａ）。電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）を実施して、ＮＦκＢタンパク質がＮＵＲＲ１プロモーターのサイトカイン誘導性複合体中に存在することを確認した（図９Ｂおよび９Ｄ）。ＮＵＲＲ１　ＮＦκＢコンセンサス部位に結合するタンパク質複合体の正体を確認するために、ＮＦκＢメンバーに特異的な抗体（ｐ５０およびｐ６５）を用いてスーパーシフトアッセイを行った（図９Ｂ）。同様に、ＮＵＲＲ１コンセンサス部位に結合するタンパク質複合体の正体を確認するために、ＣＲＥＢメンバーに特異的な抗体（ＣＲＥＢ−１およびＡＴＦ−２）を用いてスーパーシフトアッセイを行った（図９Ｄ）。これらのデータは、炎症促進性誘導性ＮＵＲＲ１転写産物を媒介する際のＮＦκＢおよびＣＲＥＢについての新規な役割を示唆する。初代ＲＡ滑膜細胞をＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼレポーターでトランスフェクトし、そしてβ−ガラクトシダーゼ活性について染色して、トランスフェクション効率を決定した（図９Ｃ）。
【０２３０】
未処理の培養滑膜細胞（ｃ）、１０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαもしくはＩＬ１βで１時間にわたって処理された培養滑膜細胞、またはＣＲＨで１．５時間にわたって処理された培養滑膜細胞由来の核抽出物（図９）を調製し、そしてＮＵＲＲ１プロモーターのＮＦκＢ結合配列に対応するオリゴヌクレオチド（図９Ｂ）またはＮＵＲＲ１プロモーターのＣＲＥＢ結合配列に対応するオリゴヌクレオチド（図９Ｄ）を用いるＥＭＳＡにおいて用いた。ＤＮＡ−タンパク質相互作用を、ＮＦκＢサブユニットｐ５０およびｐ６５に対する特異抗体（図９Ｂ）またはＣＲＥＢ−１およびＡＴＦ−２に対する特異抗体（図９Ｄ）の存在下でアッセイした。
【０２３１】
（実施例１３：ＮＵＲＲ転写活性は、滑膜過形成に寄与する）
証拠は、ＲＡ滑膜細胞の部分的形質転換が、変形性関節症（ＯＡ）と比較してＲＡ滑膜の侵襲性の可能性を増大させることを示唆する。この独特のリウマチ様表現型は、転写因子の機能および下流の標的遺伝子発現におけるサイトカイン調節性変化に起因する。以前の研究は、滑膜細胞による吸収性因子（例えば、ＭＭＰおよびＰＧＥ２）のサイトカイン刺激性放出が、線維芽細胞様形態から星状形態への変化と関連して生じることを報告した。本発明者らの分析は、ＮＵＲＲ１のサイトカイン誘導もまた、線維芽細胞様形状から星状形状への滑膜細胞のトランスフォーメーションと並行して生じることを示す（図１０Ａおよび図１０Ｂ）。免疫組織化学的染色は、未処理のままの初代ＰｓＡ滑膜細胞（Ａ）またはＴＮＦαで刺激された初代ＰｓＡ滑膜細胞（Ｂ）においてもたらされ、線維芽細胞様形状（Ａ）から星状形状（Ｂ）へのトランスフォーメーションおよび関連したＮＵＲＲ１核局在化が例示された。図１０Ｃおよび図１０Ｄは、ＮＵＲＲの優勢な核局在化もまた示す、抗ＮＵＲＲ１免疫血清を用いた正常な滑膜（Ｃ）およびＰｓＡ滑膜組織（Ｄ）の類似した染色を例示する。まとめて考えると、これらの結果は、ＮＵＲＲ１の重要なインビボでの転写調節役割を強調する。滑膜細胞によるＩＬ６、ＭＭＰおよびＰＧＥ２のサイトカイン刺激放出を阻害する因子であるデキサメタゾンもまた、ＮＵＲＲ１誘導およびサイトカイン刺激性形態学的トランスフォーメーションを阻害する。これらの知見は、ＮＵＲＲ１遺伝子発現の増加が、滑膜細胞が活性化されて骨吸収の誘導性炎症誘発性メディエーターを分泌する場合に生じる、遺伝子発現におけるプログラムされた変化の要因であることを示唆する。
【０２３２】
（実施例１４：ＣＲＨレセプター）
慢性滑膜炎における重要なプロセスは、局所的に産生されたサイトカインが、滑膜血管内皮における変化を活性化して、血管新生、血管拡張および血漿溢出の増大をもたらす能力である。レセプター媒介応答におけるＣＲＨは、局所血管新生を増強することに関連しており（Ａｒｂｉｓｅｒら，１９９９）、そして炎症部位の血管透過性を増大させて強力な血管拡張剤として作用する（Ｔｈｅｏｈａｒｉｄｅｓら，１９９８）。ＣＲＨレセプターが滑膜の血管内皮および血管平滑筋の両方に存在するという本明細書中に提示される知見は、ＣＲＨが炎症性滑液に関連した血管プロセスに関与することを示唆する。２つの別個のサブタイプのＣＲＨレセプター（ＣＲＨ−Ｒ１およびＣＲＨ−Ｒ２）が単離され、そして特徴付けられている（Ａｇｕｉｌｅｒａ　Ｇ．ら，１９８７；Ｐｅｒｒｉｎら，１９９５）。本明細書中の観察は、滑膜におけるＣＲＨ　Ｒ１発現の優位性を実証し、このことは、ＣＲＨ　Ｒ１が、滑膜ＣＲＨの効果を媒介する際にＣＲＨ　Ｒ２よりも重要であることを示す。内皮血管系におけるＣＲＨレセプターとＮＵＲＲ１との共存は、滑膜ＣＲＨ応答を媒介する際のこの転写因子についての役割をさらに例示する。ＣＲＨレセプターおよびＮＵＲＲ１の発現は、ＰｓＡ滑膜の血管系において一貫してより高く、このことは、血管の変化が、ＰｓＡにおいて、ＲＡと比較してより明白であるという理論を支持する（Ｖｅａｌｅら　１９９３）。
【０２３３】
（実施例１５：炎症性関節炎の媒介におけるＣＲＨ　Ｒ１αの役割）
ＣＲＨレセプターは、推定の７回膜貫通ドメインを含み、そしてカルシトニン／血管作用性腸成長ホルモン放出ホルモンサブファミリーのＧタンパク質共役レセプターに属する（Ａｇｕｉｌｅｒａら，１９８７）。２つの別個のサブタイプのＣＲＨレセプター（ＣＲＨ−Ｒ１およびＣＲＨ−Ｒ２）がヒト中枢神経系において単離されており、そして特徴付けられており、そして６８％相同である。各サブタイプは、薬理学的かつ機能的に別個のアイソフォーム（αおよびβ）を提示する、選択的にスプライシングされた２つの改変体を示し、そして別個の中枢組織特異的発現パターンおよび末梢組織特異的発現パターンを示す。本明細書中で報告されたデータは、ＣＲＨレセプター媒介効果が炎症性疾患の病因に寄与することを示す。それにもかかわらず、病理的炎症性病巣におけるＣＲＨレセプターの状態に関する情報はほとんど利用可能でない。ＣＲＨレセプター媒介応答が、初期ヒト関節炎における炎症の病態生理に寄与するか否かを決定するために、ＲＡ滑膜組織（ｎ＝５）およびＰｓＡ滑膜組織（ｎ＝９）におけるＣＲＨレセプターの発現および局在を調べた（図１１）。
【０２３４】
免疫組織化学分析を、ＣＲＨレセプターサブタイプＣＲＨ−Ｒ１およびＣＲＨ−Ｒ２の両方と反応する免疫血清を用いて行った（図１１）。ＣＲＨレセプターのかなり増強された発現は、全ての炎症性関節炎患者由来の内皮細胞を含む滑膜血管系において観察され、そして中程度の発現は、全ての炎症性関節炎患者由来の血管周囲領域において観察された（図１１Ａおよび図１１Ｂ）。滑膜管壁層、滑膜下滑膜細胞および炎症性浸潤は、一貫してＣＲＨレセプターネガティブであった。ＣＲＨレセプター発現は一貫して、ＲＡの滑膜血管系と比較して、ＰｓＡの滑膜血管系においてより強かった。正常な滑膜は、いずれのレセプターサブタイプも発現しなかった。
【０２３５】
（実施例１６：ヒト滑膜組織におけるＣＲＨレセプターサブタイプの発現の免疫組織化学）
初期炎症性関節炎患者コホート（ＲＡ、ｎ＝５およびＰｓＡ、ｎ＝９）由来の滑膜生検サンプルをさらに評価して、観察されたレセプター発現がＣＲＨ−Ｒ１レセプターサブタイプまたはＣＲＨ−Ｒ２レセプターサブタイプに起因するか否かを決定した。全体的なＣＲＨ−Ｒ１およびＣＲＨ−Ｒ２の発現パターン（図１１Ａおよび図１１Ｂ）と同様に、明確なＣＲＨ−Ｒ１染色が、血管内皮および他の別個の血管周囲細胞に観察された（図１１Ｄ）。対照的に、特異的ＣＲＨ−Ｒ２免疫血清は、ＣＲＨ−Ｒ１についてポジティブである同じ患者コホートの滑膜組織においてＣＲＨ−Ｒ２発現を検出できなかった（図１１Ｅ）。ＣＲＨレセプター染色の特異性は、過剰の特異的抗原と共に予めインキュベートされたＣＲＨレセプター抗体で処理された連続切片に見出された染色が顕著に存在しないことによって確実にされた（図１１Ｆ）。アイソタイプが一致した非免疫ヤギＩｇＧを用いた免疫染色は、調べた全てのＲＡ滑膜組織およびＰｓＡ滑膜組織においてネガティブであった。組織学的に正常な滑膜組織は、ＣＲＨ−Ｒ１レセプターサブタイプまたはＣＲＨ−Ｒ２レセプターサブタイプのいずれも発現しなかった（ｎ＝２）。
【０２３６】
（実施例１７：肥満細胞トリプターゼ（ｔｒｙｐｔａｓｅ）およびＣＲＨ−Ｒ１の二重免疫局在決定）
免疫反応性ＣＲＨ−Ｒ１を発現する血管周囲細胞を同定するために、滑膜の生検切片を、二重抗体染色法を用いて抗肥満細胞トリプターゼ抗体および抗ＣＲＨ−Ｒ１抗体で免疫染色した（図１２）。抗ＣＲＨ−Ｒ１抗体での染色は、血管内皮および別個の血管周囲細胞で検出された強い赤色蛍光を示した（図１２Ａ）。同じ切片を抗肥満細胞トリプターゼ抗体で染色することにより、明確な緑色蛍光が示された（図１２Ｂ）。図１２Ｃは、炎症性ＰｓＡ滑膜組織中の血管周囲細胞上のＣＲＨ−Ｒ１レセプターを用いたＭＣトリプターゼの二重免疫局在決定を例示し、これによって、ＣＲＨ−Ｒ１が炎症性滑膜組織中の血管周囲の肥満細胞に局在することが確立される。同様の発現パターンが、ＲＡ滑膜において検出された。
【０２３７】
（実施例１８：滑膜組織におけるＣＲＨレセプターサブタイプｍＲＮＡ発現の特徴付け）
ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて、ヒト炎症性関節症のコホート（ＲＡ、ｎ＝５およびＰｓＡ、ｎ＝８）において、ＣＲＨレセプターサブタイプｍＲＮＡの発現を特徴付けした（図１３）。ＣＲＨ−Ｒ１レセプターサブタイプおよびＣＲＨ−Ｒ２レセプターサブタイプの両方ならびにそれらのそれぞれのアイソフォームの発現を調べた。ＣＲＨ−Ｒ１プライマーでのｃＤＮＡの増幅によって、ＣＲＨ−Ｒ１αを表す３３３塩基対長のフラグメントおよびＣＲＨ−Ｒ１βアイソフォームを表す４２０塩基対長のフラグメントが予測された。ＣＲＨ−Ｒ１αは、逆転写されたｍＲＮＡの増幅後に炎症性滑膜組織において、全ての炎症性関節炎患者において検出された。対照的に、これらのプライマーは、同じ患者コホート由来の滑膜組織においてＣＲＨ−Ｒ１βアイソフォームを検出しなかった。ＲＡおよびＰｓＡの全ての滑膜組織サンプルは、正常滑膜と比較した場合、上昇したＣＲＨ−Ｒ１α　ｍＲＮＡレベルを有した（ｐ＜０．０５）（図１３Ａ）。免疫組織化学分析に従って、ＣＲＨ−Ｒ１　ｍＲＮＡレベルは一般に、ＲＡを有する患者と比較して、ＰｓＡを有する患者においてより高く、そしてより広範に分布していた。図１３Ｂは、２人のＲＡ患者および２人のＰｓＡ患者由来の滑膜組織を用いて、ＣＲＨ−Ｒ１αレセプターｍＲＮＡについて作製された代表的なＲＴ−ＰＣＲ産物を示す。組織学的に正常な滑膜は、どちらのＣＲＨ−Ｒ１レセプターアイソフォームをも発現しなかった。
【０２３８】
ＣＲＨ−Ｒ２サブタイプ発現を、関節炎を有する患者の同じコホート（ＲＡ、ｎ＝５およびＰｓＡ、ｎ＝８）において調査した。特異的ＣＲＨ−Ｒ２プライマーは、炎症性滑膜組織および正常滑膜組織の両方においてＣＲＨ−Ｒ２　ｍＲＮＡを増幅できなかった。ＣＲＨ−Ｒ２プライマー対の効力を確実にするために、ヒト大脳皮質ｃＤＮＡをポジティブコントロールとして役立てた。ヒト大脳皮質ｍＲＮＡの逆転写後、予測された７８１ｂｐのｃＤＮＡ産物が、特異的ＣＲＨ−Ｒ２プライマーを用いて増幅された（図１３Ｂ）。ハウスキーピング遺伝子であるグルタルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現レベルは、全ての患者において同様であった（図１３Ｂ）。
【０２３９】
単離された滑膜細胞集団におけるＣＲＨレセプターサブタイプ発現は、インビボで見られた染色パターンと同様の染色パターンを示した。豊富なＣＲＨ−Ｒ１タンパク質は、初代滑膜内皮細胞中に局在した（図１３Ｃ）。対照的に、いずれのＣＲＨレセプターサブタイプも、ＲＡ滑膜細胞またはＰｓＡ滑膜細胞の初代培養物で発現されなかった。免疫局在決定データと一貫して、初代滑膜内皮細胞（ＳＭＥＣ）において高レベルのＣＲＨ−Ｒ１α　ｍＲＮＡが存在したが、ＲＡおよびＰｓＡの初代滑膜細胞（ｎ＝３）でも正常なヒト微小血管内皮細胞でも検出不可能であった（図１３Ｄ）。ＣＲＨ　Ｒ２　ｍＲＮＡの発現は、調査した全ての細胞型において検出不可能であった。
【０２４０】
滑膜内皮細胞によるＣＲＨ−Ｒ１α（ｍＲＮＡおよびタンパク質）発現の顕著な誘導の観察は、血管内皮がＣＲＨ作用の主な標的であるという仮説を支持し、そしてＣＲＨが、ＲＡにおける滑膜の炎症と関連した血管の変化に関与することをさらに示唆する。ヒトＲＡ滑膜組織からの微小血管内皮細胞（ＳＭＥＣ）の単離のための迅速かつ効率的なプロトコルは、実施例２５に記載される。初代ＳＭＥＣは、１つの微小血管プロセスである血管新生についての研究についてこれらを理想的にする微小血管内皮細胞である。初代ＳＭＥＣにおけるＣＲＨレセプターサブタイプの発現の最初の研究は、インビボで見られる染色パターンと同様の染色パターンを示す。
【０２４１】
（実施例１９：転写因子としてのＮＵＲＲ１の役割）
インビボでの滑膜ＮＵＲＲ１の優勢な核局在化は、ＮＵＲＲ１の重要な転写調節役割を強調する。局所産生されたサイトカインによって直接的に調節される滑膜のＮＵＲＲ１は、滑膜ＣＲＨ発現を増大させることによって炎症応答を増幅するために役立つ、オートクライン調節炎症性カスケードの一般的メディエーターである（図８）。滑膜管壁層、滑膜下滑膜細胞および浸潤性単核細胞におけるＮＵＲＲ１の免疫組織化学的局在化は、ＮＵＲＲ１が、免疫反応性ＣＲＨを発現することが以前に示されたのと同じ滑膜部位で産生されることを確認する（Ｃｒｏｆｆｏｒｄら，１９９３）。ＣＲＨ遺伝子の近位プロモーターは、ＮＢＲＥコンセンサス配列を含み、そしてインビトロでの結果は、サイトカインによって刺激されたＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡレベルが、このコンセンサス配列に対するＮＵＲＲ１タンパク質の核結合の増大と相関することを確認する。Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｔｈａｔ　ＰＯＭＣ切断産物およびＰＯＭＣ切断産物（ＡＣＴＨおよびβ−エンドルフィン）が、ＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７を産生する同じ細胞において炎症性滑液中に発現されるという証拠は、ＮＵＲＲサブファミリーが滑液におけるＰＯＭＣ発現を調節するようであるということを示唆する（Ｆｅａｒｏｎら，１９９８）。これらの観察は、下垂体ＰＯＭＣのＣＲＨ誘導がＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７の転写活性を通して媒介されるという、以前の知見と一貫している（ＭｕｒｐｈｙおよびＣｏｎｎｅｅｌｙ，１９９７）。さらに、サイトカイン応答性遺伝子であるコラゲナーゼ（Ａｎｇｅｌ　Ｐ．，Ｂａｕｍａｎｎ　Ｉ．，Ｓｔｅｉｎ　Ｂ．Ｄｅｌｉｕｓら，１９８７）および血清アミロイドＡ（Ｕｈｌａｒら，１９９７）は、ヒト滑膜細胞において発現され、そしてＲＡ炎症機構および関節破壊に関連付けられており、ＮＢＲＥコンセンサス部位をその近位プロモーター領域に含む。これらの知見は、ＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７が、炎症性関節疾患の病因におけるＣＲＨおよび炎症誘発性サイトカイン応答の両方の重要な転写メディエーターであるという理論に対するさらなる支持を導く。しかし、滑膜のＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７の示差的遺伝子発現は、個々のＮＵＲＲタンパク質の転写の役割を詳細に分析するさらなる研究についての必要性を明らかにする（Ｍｕｒｐｈｙら，１９９５）。
【０２４２】
ＲＡの炎症は、グルココルチコイドに極めて感受性であり、グルココルチコイドは、リウマチ様滑膜炎の処置において有効に用いられる。従って、デキサメタゾンがサイトカイン誘導性ＮＵＲＲ１発現を阻害するという、本明細書中に報告された知見は、デキサメタゾンが、誘導された関節炎の動物モデルにおける、増大した末梢ＣＲＨの免疫反応性レベルを顕著に低減させたという以前に報告された証明（Ｃｒｏｆｆｏｒｄら，１９９２）とともに、滑膜組織におけるこれらのタンパク質の病理的重要性をさらに強調する。ＣＲＨが局所的にシグナル伝達する能力は、滑膜ＣＲＨがパラクリン調節ループに関与して、滑膜細胞、内皮細胞および単核細胞の間の連絡を容易にすることを示唆する。インビボでの末梢の炎症性部位でのＣＲＨの免疫中和は、炎症を顕著に阻害し、そしてＴＮＦα抗体を用いて観察された抗炎症性効果に類似する（Ｋａｒａｌｉｓら，１９９１）。炎症性関節炎疾患活性の処置における、ＴＮＦブロッキングストラテジーおよび他の抗サイトカイン因子の可能性を評価する、臨床試験および動物研究は、サイトカインカスケード内の複数の因子を標的化して、疾患の進行および関節の破壊が予防されることを示唆する。本明細書中に提示されるデータは、ＣＲＨ誘導がＴＮＦαおよびＩＬ−１βに対して下流で生じ、それゆえ、ヒト炎症性関節炎における抗サイトカイン治療についてのさらなる標的であることを実証する。ＣＲＨ　Ｒ１アンタゴニストであるアンタラルミン（ａｎｔａｌａｒｍｉｎ）のインビボでの評価は、これが臨床的に有効なＣＲＨアンタゴニストを炎症部位で提供し、そして炎症性関節炎のような、病態生理がＣＲＨの過剰分泌を含む疾患において局所炎症を制御する際に治療的見込みを有することを示す（Ｗｅｂｓｔｅｒら，１９９８）。
【０２４３】
（実施例２０：炎症性関節炎におけるＣＲＨおよびＮＵＲＲ１の役割のまとめ）
まとめると、本研究において提供されるデータは、局所産生されたＣＲＨの調節が、ヒト炎症性関節炎におけるサイトカインネットワークの重要な要素であることを示す。炎症性関節炎の重要なメディエーターは、ＣＲＨプロモーター転写活性を増強し、そして軟骨および骨を直接的に侵す滑膜細胞におけるＣＲＨ遺伝子発現の増大した産生を刺激する。炎症性滑膜におけるＣＲＨレセプターの存在は、末梢ＣＲＨ機能を局所的に示す。核レセプターＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７は、ヒト滑膜組織における末梢ＣＲＨシグナル伝達に寄与する。炎症部位での末梢のＣＲＨ媒介経路およびＣＲＨ媒介経路についての潜在的な病態生理学的役割は、ヒト炎症性関節炎における治療因子としてのＣＲＨのアンタゴニスト性アナログの調査をさらに支持する。
【０２４４】
さらに、ＮＵＲＲサブファミリーの調節は、炎症性関節疾患に関連した経路を調節する重要な機構であり、そして観察は、複数の炎症応答を媒介する際のＮＵＲＲ１についての中心的役割を示唆する。炎症および細胞トランスフォーメーションに関与するシグナル伝達経路、ならびにリウマチ病に対するそれらの関係は、比較的調査されていない研究領域である。転写因子活性の異常な機能は、正常な炎症性応答または免疫応答を慢性状態へと変換するのを助ける。ＲＡでは、炎症はより多くの炎症へと増殖し、そして永続化を妨害する治療アプローチは、ホメオスタシスを再度確立する機会を提供し得る。ＮＵＲＲサブファミリーによって調節される分子シグナル伝達経路の同定は、この転写因子を薬物治療の分子標的として用いた介入のための新たなアプローチを提供する。医療における薬物標的としてのＮＵＲＲ１ファミリーのメンバーの大きな可能性は、エストロゲンレセプターおよびアンドロゲンレセプターの場合、既に証明されている。炎症性関節炎の疾患活性の処置におけるＴＮＦαブロッキングストラテジーおよび他の抗サイトカイン因子の可能性を評価する、臨床試験および動物での研究は、サイトカインカスケード中の複数の因子が、疾患の進行および関節の破壊を予防するために標的化される必要があることを示唆する。これらのデータは、本明細書中で、ＮＵＲＲ１誘導がＴＮＦαおよびＩＬ−１βに対して下流で生じ、それゆえ、ヒト炎症性関節炎における抗サイトカイン治療にとってより効果的な標的であることを実証した。
【０２４５】
（実施例２１：ＮＵＲＲ１プロモーターに結合している、ＮＦκＢおよびＣＲＥＢ）
未処理の初代滑膜細胞またはＰＧＥ２処理初代滑膜細胞由来の核抽出物を用いて行われる、ＮＵＲＲ１　ＣＲＥＢコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｕｓ）部位を用いる、同様のＥＭＳＡおよびスーパーシフトアッセイを行う。さらに、変形性関節症（ＯＡ）滑膜と比較した、ＲＡ滑膜およびＰｓＡ滑膜の両方の由来の核抽出物におけるＮＵＲＲ１プロモーターに結合するＮＦκＢおよびＣＲＥＢのインビボでのレベルを測定する。ＮＵＲＲ１プロモーターに結合しているＮＦκＢおよびＣＲＥＢが疾患活性と関連するか否かを決定するために、滑膜組織におけるＥＭＳＡ　ＮＦｋＢ活性およびＣＲＥＢ活性の相対密度と、疾患活性の臨床的尺度との間の関係を評価する。
【０２４６】
サイトカイン媒介性ＮＵＲＲ１転写カップリングに対するコンセンサス部位の相対的寄与を分析するため、およびさらにこれらの伝達経路に関与する機構を解明するために、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子に融合された６００ｂｐの近位ヒトＮＵＲＲ１プロモーター領域を含む標的遺伝子構築物を作製した（図９Ａ）。用いられたＮＵＲＲ−１プロモーターフラグメントは、トランスジェニック動物において発現される場合にβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子の正確な発現に必要であることが公知の全ての配列を含む。ＮＵＲＲ１プロモーター中のＮＦκＢおよびＣＲＥＢのコンセンサス部位の個々の変異分析は、これらのコンセンサス部位がＮＵＲＲ１発現において果たす役割の評価を可能にする。野生型および変異型のプロモーター構築物を、ＲＡおよびＰｓＡの初代滑膜細胞に個々にトランスフェクトし、そして適切なサイトカインで刺激して、ＮＵＲＲ１転写活性をモニタリングする。実施例１１に記載されるデータは、抗炎症剤（例えば、デキサメタゾン）がサイトカイン誘導性ＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡのレベルを劇的に抑制し得ることを示す。従って、転写調節研究は、デキサメタゾンがＮＵＲＲ１転写のサイトカイン誘導を抑制する能力を試験することまで広げられる。このトランスフェクションアッセイ系は、ＥＭＳＡと共に、ＲＡの処置において用いられるこのような薬物の作用機構を同定する際に必須である。
【０２４７】
（実施例２２：ＮＵＲＲ１は、滑膜細胞の増殖を媒介する）
滑膜細胞の増殖のＮＵＲＲ１媒介を、ＲＡおよびＰｓＡの初代滑膜細胞におけるＮＵＲＲ１の一過性過剰発現の結果を観察し、そしてヒト滑膜細胞Ｋ４１細胞株を用いて安定なＮＵＲＲ１発現トランスフェクタントを確立することによって評価する。全長ＮＵＲＲ１タンパク質をコードするヒトＮＵＲＲ１　ｃＤＮＡを、哺乳動物細胞における組換えタンパク質の過剰産生のために設計されたｐＵＶ６／Ｖ５−Ｈｉｓ　Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にサブクローニングする。ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓベクターは、安定な細胞株の選択を可能にするためのブラスチシジン耐性遺伝子を含む。滑膜細胞の増殖を、標準的なＣｅｌｌＴｉｔｅｒ　Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定する。
【０２４８】
実験アプローチはＮＵＲＲ１の遺伝子調節役割を扱い、そして滑膜組織においてこの転写因子によって調節される標的遺伝子を同定する。サイトカイン応答性遺伝子であるＭＭＰ−１および血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）は、ＲＡ炎症性および破壊機構に関連付けられており、推定のＮＵＲＲ１コンセンサス結合部位（ＮＢＲＥ）をそれらの近位プロモーター領域に含む。これらの知見は、ＮＵＲＲ１が、炎症性関節疾患の病因に関与する炎症誘発性サイトカイン応答の重要な転写メディエーターであるという理論に対してさらなる支持を与える。ＥＭＳＡおよび細胞ベースのトランス活性化アッセイを用いた同様の実験アプローチを調べて、特異的ＮＢＲＥ配列と相互作用することによる、ＭＭＰ−１およびＳＡＡの滑膜発現のＮＵＲＲ１調節を決定する。
【０２４９】
証拠は、ＮＵＲＲ１がオートクライン様式で作用して、炎症誘発性メディエーターの産生を刺激することを示唆する。ＮＵＲＲ１転写活性によって調節される病態生理学的経路をさらに同定するために、細胞ベースのＮＵＲＲ１トランスフェクションアッセイ系を用いて、炎症性メディエーター（ＩＬ１αおよびＴＮＦβ）および骨破壊のエフェクターメディエーター（ＰＧＥ２、ＩＬ６およびＭＭＰ）の誘導におけるＮＵＲＲ１の関与を決定する。ＮＵＲＲ１トランスフェクト一次滑膜細胞によって産生されるこれらのメディエーターのレベルを、ＰｓＡおよびＲＡの個々の滑膜細胞株を用いて測定する。このようなデータは、類似するが臨床的に異なるこれらの慢性炎症性関節症についてさらなる洞察を提供する。
【０２５０】
（実施例２３：炎症誘発性メディエーターによって誘導されるＮＯＲ１発現）　炎症性関節疾患におけるＮＵＲＲ転写因子の病理的重要性を、炎症誘発性アゴニストが、初代滑膜細胞におけるＮＯＲ１転写産物のレベルを調節する能力を決定することによって、さらに調べた（図１４）。ＮＯＲ１およびＮＵＲＲ１のｍＲＮＡの発現レベルは、ＴＮＦαでの処理されると、未処理の滑膜細胞と比較して上昇した。しかし、ＰＧＥ２は、ＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡをこれらの細胞において刺激する際に最も強力かつ持続した効果を有したが、ＮＯＲ１は、ｍＲＮＡ発現レベルにおいて中程度の上昇しか提示しなかった。
【０２５１】
未処理（レーン１）またはＴＮＦα（レーン２）、ＩＬ−１β（レーン３）およびＰＧＥ２（レーン４）で１時間処理した初代ＲＡ滑膜細胞のノーザン分析。ＴＮＦαおよびＩＬ−１βを１０ｎｇ／ｍＬの濃度で用い、そしてＰＧＥ２を１０−６Ｍの濃度で用いた。
【０２５２】
（実施例２４：組織収集のための方法）
滑膜を、ＲＡ、乾癬性関節炎（ＰｓＡ）またはサルコイド関節炎（ＳＡ）と診断された患者からのインフォームドコンセントに従って関節鏡検査によって膝から得た。生検時に、全ての患者は、最近（＜１２ヶ月）発症した活動性疾患を有していた。全ての患者は、Ｓｔ．Ｖｉｎｃｅｎｔ’ｓ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＩｒｅｌａｎｄのＥａｒｌｙ　Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｃｌｉｎｉｃにかかっていた。患者が疾患改変薬物で処置されていた場合または患者が疾患改変薬物をこれまでに摂取したことがある場合、その患者を排除した。組織学的に正常な滑膜を、下肢切断を受ける患者から得た。ＣＲＨ−Ｒ１　ｍＲＮＡを発現するヒト子宮筋層組織を子宮摘出を受ける閉経前患者から獲得し、一方、正常なヒト大脳皮質ｃＤＮＡ（Ｇｅｎｅプール、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）をＣＲＨ−Ｒ２についてのコントロールとして役立てた。
【０２５３】
（実施例２５：滑膜細胞の培養および一過性トランスフェクションのための方法）
滑膜組織を、３７℃で５％　ＣＯ２中、ＲＰＭＩ中１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（Ｉ型；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｆｒｅｅｈｏｌｄ，ＮＪ）で４時間にわたって処理した。解離した細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）およびフンギゾン（０．２５μｇ／ｍｌ）を補充したＲＰＭＩ中にプレーティングした。滑膜細胞は形態学的に均質な線維芽細胞様細胞であることが見いだされ、そしてこれらを、３回目の継代と７回目の継代との間で用いた（Ｂｅｎ−Ａｖら，１９９５）。トランスフェクションの２４時間前に、１×１０６個の滑膜細胞を２５ｃｍ２ディッシュにプレーティングし、そして付着させた。内毒素を含まないＤＮＡ（３μｇ　ＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼまたは３μｇ　−６６６／＋１１１　ｈＣＲＨ　ＣＡＴ（ＭｕｒｐｈｙおよびＣｏｎｎｅｅｌｙ，１９９７）を９００μｌの容量のＲＰＭＩ（無血清）中の３５μｌのリポタキシ（ｌｉｐｏｔａｘｉ）試薬（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。ＲＰＭＩ（１．５ｍｌ）をこのトランスフェクション混合物に添加し、細胞上に移し、そして６時間にわたって３７℃で５％　ＣＯ２中でインキュベートした。等しい容量の培地を添加し、そして細胞を一晩、３７℃で５％　ＣＯ２中でインキュベートした。ＤＮＡ−リポタキシ含有培地を交換し、そして細胞を未処理のままにしたか、または１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、１μＭのＰＧＥ２もしくはＭｏＣＭで処理し、そしてさらに２４時間インキュベートした。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レベルを、ＣＡＴ　ＥＬＩＳＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）によって決定した。β−ガラクトシダーゼアッセイについては、細胞を、冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、冷０．５％グルタルアルデヒドで固定し、そしてＰＢＳで２回洗浄し、その後、染色溶液（１Ｍ　ＭｇＣｌ２、５Ｍ　ＮａＣｌ、０．５Ｍ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）、３０ｍＭフェリシアン化カリウム、３０ｍＭフェロシアン化カリウムおよび２％　５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガラクトピラノシド）と共に１２時間にわたって３７℃でインキュベートした。
【０２５４】
（実施例２６：滑膜内皮細胞（ＳＭＥＣ）の単離および培養）
初代ＳＭＥＣは、微小血管内皮細胞であり、これは、これらを、１つの微小血管プロセスである血管新生についての研究のために理想的にする。膝滑膜全体を関節形成術時に得て、そして上記の通りに処理した。罹患した組織を５０メッシュの細胞解離篩（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に通過させ、そして５００μｌの冷ＰＢＳ／０．１％　ＢＳＡ中に再懸濁した。１×１０７個のＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１：９Ｇ１１）でコーティングしたＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ　Ａ．Ｓ．Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒｗａｙ）を、このサンプルに４５分間にわたって添加し、そして磁性粒子濃縮器中に配置した。単離された内皮細胞を改変ＥＢＭ−２ＭＶ培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｉｎｃ．Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）中で直接培養した。内皮細胞を、形態学的に、ならびに第ＶＩＩＩ因子およびＣＤ３１の発現によって同定した。
【０２５５】
（実施例２７：逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））
総ＲＮＡを、新たに得られた滑膜生検または培養した滑膜細胞から単離した（ＲＮｅａｓｙ，Ｑｉａｇｅｎ，ＵＫ）。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、２００Ｕ　Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＫ）、１００ｍＭジチオトレイトール、４０Ｕ　ＲＮａｓｉｎ、各々１．２５ｍＭのｄＮＴＰおよび１２０ｎｇランダムヘキサマーを３７℃で１時間にわたって用いた１μｇの各ＲＮＡサンプルの逆転写によって調製した。ＰＣＲを、２μｌのｃＤＮＡ反応混合物、各々１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、各々１００ｎｇのプライマー、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２および２．５Ｕ　ＡｍｐｌｉＴａｑ−Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｂｒａｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）を含む５０μｌの容量で行った。ＰＣＲ増幅について、プライマー対（センス５’−ＣＡＡＴＣＧＡＧＣＴＧＴＣＡＡＧＡＧＡＧＣ−３’（配列番号１４４）およびアンチセンス５’−ＧＧＡＡＧＡＡＡＴＣＣＡＡＧＧＧＣＴＧＡＧ−３’（配列番号１４５））を用いて、ヒトＣＲＨを増幅した。プライマー対（センス５’−ＣＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’（配列番号１４６）およびアンチセンス５’−ＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣ−３’（配列番号１４７））を用いてＧＡＰＤＨを増幅した。両方のプライマー対は、介在配列に隣接していた。増幅のための条件は、９７℃で１分間、６０℃で１分間および７２℃で１分間であった。ＣＲＨについて３５サイクルおよびＧＡＰＤＨプライマー対について２５サイクルが、ＰＣＲ反応が増幅のプラトー期に達していないことを確実にすることが確認された。ＰＣＲ産物は、サザン分析によって確認された。オートラジオグラフィーの強度を、イメージング濃度計を用いて定量した。
【０２５６】
ヒトＣＲＨ−Ｒ１についてのプライマーを設計して、αアイソフォームとβアイソフォームとを区別した。ＣＲＨ−Ｒ１βは、８７塩基対の挿入物を５’領域に含み、ＣＲＨ−Ｒ１αについての３３３ｂｐ産物またはＣＲＨ−Ｒ１βに対応する４２０ｂｐ産物を生じるプライマーをもたらす。プライマー対は介在配列に隣接し、そして以下の通りに設計した：ＣＲＨ−Ｒ１αについて、それぞれ、２３５位〜２５５位および５４９位〜５６８位に対応するか、またはＣＲＨ−Ｒ１βについて、それぞれ１９８位〜２１９位および５９９位〜６１８位に対応する、センスプライマー５’−ＧＣＣ　ＣＴＧ　ＣＣＣ　ＴＧＣ　ＣＴＴ　ＴＴＴ　ＣＴＡ−３’（配列番号１４８）およびアンチセンスプライマー５’−ＧＣＴ　ＣＡＴ　ＧＧＴ　ＴＡＧ　ＣＴＧ　ＧＡＣ　ＣＡ−３’（配列番号１４９）。以下のヒトＣＲＨ−Ｒ２についてのプライマーを用いて、レセプターアイソフォームαおよびβを同定する７８１ｂｐの産物を増幅した：それぞれ、１４９位〜１６９位および９１１位〜９３０位に対応する、センスプライマー５’−ＧＣＴ　ＧＧＣ　ＣＣＣ　ＧＣＡ　ＧＣＧ　ＣＴＧ　ＣＣ−３’（配列番号１５０）およびアンチセンスプライマー５’−ＣＣＴ　ＣＡＣ　ＴＧＣ　ＣＴＴ　ＣＣＴ　ＧＴＡ　ＣＴ−３’（配列番号１５１）。ＧＡＰＤＨプライマーを設計して、６３５ｂｐの産物を産生した：センスプライマー５’−ＣＣＡＣＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡ−３’（配列番号１４６）およびアンチセンスプライマー５’−ＴＣＴＡＧＡＣＧＧＣＡＧＧＴＣＡＧＧＴＣＣＡＣＣ−３’（配列番号１４７）。ＰＣＲを、２μｌのｃＤＮＡ、各々１．２５ｍＭのｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩを伴う２．５Ｕ　ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｂｒａｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）、１．０ｍＭ　ＭｇＣｌ２（ＣＲＨ−Ｒ１，ＧＡＰＤＨ）、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２（ＣＲＨ−Ｒ２）、２００ｎｇのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー（ＣＲＨ−Ｒ１）、ならびに１００ｎｇのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー（ＣＲＨ−Ｒ２、ＧＡＰＤＨ）を含む、５０μｌ容積において行った。増幅についての条件は、９４℃にて１分間の変性、６２℃〜５８℃で１分間（ＣＲＨ−Ｒ１αおよびＧＡＰＤＨ）および６４℃〜６０℃で１分間（ＣＲＨ−Ｒ２）のプライマーアニーリング、ならびに７２℃で１分間の伸長であった。各ＰＣＲサンプルは、反応が増幅のプラトー期に達していないことが確実にされた、３５サイクルの増幅を受けた。作製されたＰＣＲ産物を１．５％アガロースゲルで電気泳動し、そして可視化した。ＰＣＲ産物の正体を、配列決定によって確認した。
【０２５７】
（実施例２８：ノーザンブロット分析のための方法）
総ＲＮＡを、培養した初代滑膜細胞または滑膜の外植片から単離した。ＲＮＡをＵＶ吸収によって定量し、そして１０μｇの総ＲＮＡを標準的なノーザンゲルで電気泳動し、そしてナイロンメンブレン（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）に転写した。クロスハイブリダイゼーションを回避するためのアミノ末端領域にわたるＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７のｃＤＮＡプローブ（ＭｕｒｐｈｙおよびＣｏｎｎｅｅｌｙ，１９９７）を、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰおよびランダムプライマー標識系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて高い比活性になるまで放射標識した。ブロットを、増感スクリーンを用いて−８０℃でフィルムに暴露し、そしてオートラジオグラフィーの強度を、イメージング濃度計を用いて定量した。
【０２５８】
（実施例２９：免疫組織化学のための方法）
滑膜組織切片（６μｍ）を、２％アミノプロピル−トリエトキシ−シランまたは１％パラホルムアルデヒドでコーティングしたスライドグラスに配置した。無発熱性ガラスカバースリップ上で増殖させた滑膜細胞を、メタノールで１５分間処理した後、染色した。ＮＵＲＲ１についての一次抗体（１：１００希釈）（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を、ヒトおよびラットのＮＵＲＲ１のアミノ末端にマッピングされるウサギポリクローナル抗体であった。ＣＲＨレセプターＩについての一次抗体（１：７５希釈）（Ｃ−２０）は、ヒトＣＲＨ−レセプター１型（ＣＲＨ−Ｒ１）のカルボキシ末端にマッピングされるペプチドに対して惹起されたヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＣＡ）であった。Ｃ−２０は、ＣＲＨ−Ｒ１およびＣＲＨ−Ｒ２と称される第二のＣＲＨレセプターサブタイプの両方と反応する。抗体を過剰のＣＲＨ−Ｒ２特異的合成ペプチド（Ｎ−２０−Ｐ、１００μｇ／０．５ｍｌ；Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で予め吸収させることによってＣ−２０のＣＲＨ−Ｒ２活性を排除することによって特異的ＣＲＨ−Ｒ１染色が達成された。ＣＲＨ−Ｒ２（Ｎ−２０）についての一次抗体は、ＣＲＨ−Ｒ２のアミノ末端に対応するペプチドに対して惹起されたポリクローナル抗体（２００μｇ／ｍｌ，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＣＡ）であった。一次抗体を０．６Ｍ　ＮａＣｌ中に１：１００希釈し、そして切片上で３７℃でインキュベートした。一次抗体との２時間のインキュベーション後、ビオチン化二次抗体（１：５００；Ｖｅｃｔｏｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を切片上にスポッティングし、続いてアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣキット，Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）をスポッティングした。ネガティブコントロールについて、各一次抗体を、その特異的合成ペプチド（２００μｇ／ｍｌ；Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で予め吸収した。
【０２５９】
（実施例３０：核抽出物の調製および電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ））
核タンパク質抽出物を、既に（ＭｕｒｐｈｙおよびＣｏｎｎｅｅｌｙ，１９９７）記載された通りに調製した。ＥＭＳＡについて、１μｇの核抽出物を、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．９）、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０％グリセロール、１００ｍＭ　ＫＣｌ、０．２ｍＭ　ＥＤＴＡ、８％　Ｆｉｃｏｌｌ、６００ｍＭ　ＫＣｌ、５００ｎｇ／μｌポリ（デオキシイノシン酸−デオキシシチジン酸）、５０ｍＭ　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）および［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ標識二本鎖オリゴヌクレオチドの存在下で２０分間インキュベートした。スーパーシフト実験のために、ＮＵＲＲ１に対する抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を、最初の２０分間のインキュベーション後に添加し、次いでさらに２０分間インキュベートした。サンプルを、０．５×Ｔｒｉｓ−Ｂｏｒａｔｅ−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝液中で５．５％非変性ポリアクリルアミドゲルを通して電気泳動した。競合研究のために、反応を、示された濃度の非標識プローブを用いて、記載される通りに行った。オリゴヌクレオチドＣＲＨ　ＮＢＲＥ　５’−ＧＡＴＧＧＴＡＡＧＡＡＧＧＴＣＡＡＣＧＧ−３’（配列番号１５２）を、移動度シフトアッセイにおいて用いた。
【０２６０】
（実施例３１：統計分析のための方法）
データを、平均値＋／−ＳＥとして表す。正常な滑膜と、ＲＡ、ＰｓＡまたはＳＡと診断された患者から得られた滑膜との間の比較を、独立した値についてＳｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定を用いて行った。処理の間の比較を、対の値についてＳｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定を用いて行った。
【０２６１】
（実施例３２：二重標識免疫蛍光のための方法）
組織切片または単離された細胞培養物を、希釈した正常なウサギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）中でインキュベートした。ＣＲＨ−Ｒ１（Ｃ−２０）ポリクローナル抗体を、１０％正常なヒト血清中で１：１０希釈し、続いてビオチン化抗ヤギ二次抗体（１：５００、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を添加した。切片を、希釈した正常なヤギ血清中でインキュベートし、そして第二の一次抗体であるモノクローナル肥満細胞マーカー：マウス抗ヒトトリプターゼ（ＡＡ１，Ａｃｃｕｒａｔｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｃｏｒｐ．Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ，ＵＳＡ）の１：１０希釈物中でインキュベートした。ヤギ抗マウスＩｇＧ１　ＦＩＴＣ結合体化抗体（１：５０、１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ　ＡＬ，ＵＳＡ）を添加し、続いてＣｙ３蛍光色素結合体化モノクローナルマウスである抗ビオチン抗体（ＢＮ−３４、１：１００、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を添加した。スライドを、ＤＡＫＯ（登録商標）蛍光マウント媒体（Ｄａｋｏ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）中にマウントした。アイソタイプが一致した非免疫ＩｇＧを、各々の一次抗体についてのコントロールとして含め、そして一次抗体を順次省略して、各々についての特異的染色を確実にした。類似のプロトコルを、単離したＳＭＥＣの第ＶＩＩＩ因子（１：５０、Ｆ８／８６、Ｄａｋｏ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ）染色について用いた。
【０２６２】
（実施例３３：ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのアンタゴニストについてスクリーニングするための方法）
転写アッセイを、試験因子の存在下および非存在下で実施する。プロモーターに作動可能に連結されたＮＵＲＲサブファミリーのメンバーおよびマーカー配列を保有する細胞（ここで、このプロモーターは、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバーによって直接的または間接的に調節される）を試験因子に投与する。この因子の非存在下でのマーカー配列の発現と比較した、この因子の存在下でのマーカー配列の発現における減少は、この因子が、ＮＵＲＲサブファミリーのメンバー／リガンドの相互作用を妨害することを示す。この妨害は、直接的または間接的であり得る。当業者は、このマーカー配列が、その発現レベルを間接的または直接的に反映する任意のマーカー配列であることを認識する。さらに、このマーカー配列の発現によって産生される転写産物またはこの発現の遺伝子産物が検出される。マーカー配列の例は、当該分野で周知であり、そしてクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼなどを含む。本明細書中の実施例に提供されるように、デキサメタゾンは、ＮＵＲＲ１の炎症誘発性メディエーターの発現を低減させ、従って、炎症誘発性メディエーターの存在下でＮＵＲＲサブファミリーのメンバーのアンタゴニストとして作用する。
【０２６３】
従って、ＮＵＲＲサブファミリーポリペプチドとリガンドとの相互作用を妨害する化合物についてのスクリーニングの方法が存在し、この方法は、細胞に試験因子を導入する工程（ここで、この細胞は、マーカー配列を含み、ここで、このマーカー配列の発現は、このＮＵＲＲサブファミリーのメンバーによって調節される）；およびこのマーカー配列の発現レベルを測定する工程（ここで、このマーカー配列の発現がこの導入後に低減した場合、この試験因子は、ＮＵＲＲサブファミリーポリペプチドとこのリガンドとの相互作用を妨害する化合物である）を包含する。
【０２６４】
別の特定の実施形態では、この方法は、炎症性免疫疾患の処置についての化合物を同定し、この方法は、細胞に試験因子を導入する工程（ここで、この細胞は、マーカー配列を含み、ここで、このマーカー配列の発現は、このＮＵＲＲサブファミリーのメンバーによって調節される）；およびこのマーカー配列の発現レベルを測定する工程（ここで、このマーカー配列の発現がこの導入後に低減された場合、この試験因子はこの炎症性免疫疾患の処置についての化合物である）を包含する。
【０２６５】
（特許）
米国３，８１７，８３７
米国３，８５０，７５２
米国３，９３９，３５０
米国３，９９６，３４５
米国特許４，２７７，４３７
米国特許４，２７５，１４９
米国特許４，３６６，２４１
米国特許３，３７６，１１０
米国特許４，６７６，９８０
米国特許４，７９７，３６８
米国特許４，８１６，５６７
米国特許５，１３９，９４１
米国特許５，６６２，２９８
米国特許５，６６２，２９９
米国特許５，６７０，４８８
米国特許６，１４７，２７５
米国特許６，１２７，３９９
米国特許５，８２１，３３７
ＷＯ　９１／００３６０
ＷＯ　９２／２００３７３
ＥＰ　０３０８９。
【０２６６】
（刊行物）
明細書において言及した全ての特許および刊行物は、本発明が関連する分野の当業者の技術水準を示す。全ての特許および刊行物は、各々の個々の刊行物が具体的かつ個々に、参考として援用されると示されたのと同じ程度に、本明細書中に参考として援用される。
【０２６７】
【表１】
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当業者は、目的を実行するため、そして上記の結果および利点ならびにその固有の結果および利点を得るために本発明が充分に適合されることを容易に認識する。本明細書中に記載される配列、方法、処理、薬学的組成物、手順および技術は、好ましい実施形態の現在の代表であり、例示であることが意図され、そして範囲を限定するとは意図されない。本発明の趣旨に包含されるかまたは係属中の特許請求の範囲によって規定される、これらにおける変更および他の用途は、当業者に考え付く。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、ヒトの滑膜組織および初代滑膜細胞におけるＣＲＨ　ｍＲＮＡ発現を説明する。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、ヒトの滑膜組織および初代滑膜細胞におけるＣＲＨ　ｍＲＮＡ発現を説明する。
【図１Ｃ】
図１Ｃは、ヒトの滑膜組織および初代滑膜細胞におけるＣＲＨ　ｍＲＮＡ発現を説明する。
【図１Ｄ】
図１Ｄは、ヒトの滑膜組織および初代滑膜細胞におけるＣＲＨ　ｍＲＮＡ発現を説明する。
【図２Ａ】
図２Ａは、炎症誘発性メディエーターが、培養滑膜細胞中でｈＣＲＨプロモーターからの転写を活性化することを説明する。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、炎症誘発性メディエーターが、培養滑膜細胞中でｈＣＲＨプロモーターからの転写を活性化することを説明する。
【図３Ａ】
図３Ａは、炎症性滑膜中でのＣＲＨレセプターについての免疫組織化学的染色を示す。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、炎症性滑膜中でのＣＲＨレセプターについての免疫組織化学的染色を示す。
【図３Ｃ】
図３Ｃは、炎症性滑膜中でのＣＲＨレセプターについての免疫組織化学的染色を示す。
【図３Ｄ】
図３Ｄは、炎症性滑膜中でのＣＲＨレセプターについての免疫組織化学的染色を示す。
【図４Ａ】
図４Ａは、ＲＡ滑膜外植片および培養初代滑膜細胞中でのＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７のｍＲＮＡのノーザン分析を説明する。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、ＲＡ滑膜外植片および培養初代滑膜細胞中でのＮＵＲＲ１およびＮＵＲ７７のｍＲＮＡのノーザン分析を説明する。
【図５Ａ】
図５Ａは、抗ＮＵＲＲ１免疫血清を用いた滑膜組織および培養滑膜細胞の免疫組織化学的染色を示す。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、抗ＮＵＲＲ１免疫血清を用いた滑膜組織および培養滑膜細胞の免疫組織化学的染色を示す。
【図５Ｃ】
図５Ｃは、抗ＮＵＲＲ１免疫血清を用いた滑膜組織および培養滑膜細胞の免疫組織化学的染色を示す。
【図５Ｄ】
図５Ｄは、抗ＮＵＲＲ１免疫血清を用いた滑膜組織および培養滑膜細胞の免疫組織化学的染色を示す。
【図６Ａ】
図６Ａは、滑膜細胞中のＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡ発現に対する、炎症誘発性メディエーターであるデキサメタゾン、インドメタシンおよびシクロヘキシミドの効果を示す。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、滑膜細胞中のＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡ発現に対する、炎症誘発性メディエーターであるデキサメタゾン、インドメタシンおよびシクロヘキシミドの効果を示す。
【図６Ｃ】
図６Ｃは、滑膜細胞中のＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡ発現に対する、炎症誘発性メディエーターであるデキサメタゾン、インドメタシンおよびシクロヘキシミドの効果を示す。
【図６Ｄ】
図６Ｄは、滑膜細胞中のＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡ発現に対する、炎症誘発性メディエーターであるデキサメタゾン、インドメタシンおよびシクロヘキシミドの効果を示す。
【図６Ｅ】
図６Ｅは、滑膜細胞中のＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡ発現に対する、炎症誘発性メディエーターであるデキサメタゾン、インドメタシンおよびシクロヘキシミドの効果を示す。
【図７】
図７は、初代滑膜細胞由来の核抽出物の電気泳動移動度シフト分析（ＥＭＳＡ）を説明する。
【図８】
図８は、局所産生されたＣＲＨ（これは、ヒト炎症性関節炎におけるサイトカインネットワークの成分である）の調節を例示する。炎症性関節炎に関連した炎症誘発性メディエーターは、滑膜のＣＲＨ産生を増大させる。滑膜のＣＲＨは、ＣＲＨレセプターを保有する内皮細胞およびいくつかの単核細胞において核転写因子ＮＵＲＲ１を誘導する。ＮＵＲＲ１は、サイトカイン媒介シグナル伝達に寄与し、そしてオートクライン炎症性カスケードの一般的なメディエーターであり、これはさらに、ＣＲＨ発現を増大させることによって炎症応答を増幅するために役立つ。デキサメタゾン（ＤＥＸ）は、サイトカイン誘導性ＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡ発現およびＣＲＨ誘導性ＮＵＲＲ１　ｍＲＮＡ発現の両方を阻害することによって機能する。
【図９Ａ】
図９Ａは、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子に融合されたヒトＮＵＲＲ１プロモーターの、ＮＦκＢ結合配列に対応するオリゴヌクレオチドへの、結合を説明する。
【図９Ｂ】
図９Ｂは、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子に融合されたヒトＮＵＲＲ１プロモーターの、ＮＦκＢ結合配列に対応するオリゴヌクレオチドへの、結合を説明する。
【図９Ｃ】
図９Ｃは、このレポーターでトランスフェクトされた初代ＲＡ滑膜細胞および滑膜組織におけるβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。
【図９Ｄ】
図９Ｄは、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子に融合されたヒトＮＵＲＲ１プロモーターの、ＣＲＥＢ結合配列に対応するオリゴヌクレオチドへの結合を説明する。
【図１０Ａ】
図１０Ａは、抗ＮＵＲＲ１免疫血清を用いた、培養滑膜細胞の免疫組織化学的染色を例示する。
【図１０Ｂ】
図１０Ｂは、抗ＮＵＲＲ１免疫血清を用いた、培養滑膜細胞の免疫組織化学的染色を例示する。
【図１０Ｃ】
図１０Ｃは、抗ＮＵＲＲ１免疫血清を用いた、培養滑膜細胞の免疫組織化学的染色を例示する。
【図１０Ｄ】
図１０Ｄは、抗ＮＵＲＲ１免疫血清を用いた、培養滑膜細胞の免疫組織化学的染色を例示する。
【図１１Ａ】
図１１Ａは、ＣＲＨ−Ｒ１レセプターサブタイプおよびＣＲＨ−Ｒ２レセプターサブタイプの発現を決定するための、滑膜組織の免疫組織化学的染色を示す。
【図１１Ｂ】
図１１Ｂは、ＣＲＨ−Ｒ１レセプターサブタイプおよびＣＲＨ−Ｒ２レセプターサブタイプの発現を決定するための、滑膜組織の免疫組織化学的染色を示す。
【図１１Ｃ】
図１１Ｃは、ＣＲＨ−Ｒ１レセプターサブタイプおよびＣＲＨ−Ｒ２レセプターサブタイプの発現を決定するための、滑膜組織の免疫組織化学的染色を示す。
【図１１Ｄ】
図１１Ｄは、ＣＲＨ−Ｒ１レセプターサブタイプおよびＣＲＨ−Ｒ２レセプターサブタイプの発現を決定するための、滑膜組織の免疫組織化学的染色を示す。
【図１１Ｅ】
図１１Ｅは、ＣＲＨ−Ｒ１レセプターサブタイプおよびＣＲＨ−Ｒ２レセプターサブタイプの発現を決定するための、滑膜組織の免疫組織化学的染色を示す。
【図１１Ｆ】
図１１Ｆは、ＣＲＨ−Ｒ１レセプターサブタイプおよびＣＲＨ−Ｒ２レセプターサブタイプの発現を決定するための、滑膜組織の免疫組織化学的染色を示す。
【図１２Ａ】
図１２Ａは、二重抗体染色法を用いた、肥満細胞トリプターゼおよびＣＲＨ−Ｒ１の免疫局在決定（ｉｍｍｕｎｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を示す。
【図１２Ｂ】
図１２Ｂは、二重抗体染色法を用いた、肥満細胞トリプターゼおよびＣＲＨ−Ｒ１の免疫局在決定を示す。
【図１２Ｃ】
図１２Ｃは、二重抗体染色法を用いた、肥満細胞トリプターゼおよびＣＲＨ−Ｒ１の免疫局在決定を示す。
【図１３Ａ】
図１３Ａは、滑膜組織におけるＣＲＨレセプターサブタイプｍＲＮＡの発現を特徴付ける。
【図１３Ｂ】
図１３Ｂは、滑膜組織におけるＣＲＨレセプターサブタイプｍＲＮＡの発現を特徴付ける。
【図１３Ｃ】
図１３Ｃは、滑膜組織におけるＣＲＨレセプターサブタイプｍＲＮＡの発現を特徴付ける。
【図１３Ｄ】
図１３Ｄは、滑膜組織におけるＣＲＨレセプターサブタイプｍＲＮＡの発現を特徴付ける。
【図１４】
図１４は、ノーザン分析による、初代ＲＡ滑膜細胞におけるＮＯＲ１およびＮＵＲＲ１の発現を例示する。
【図２Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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2004514649.tif 000135
2004514649.tif 000136
【国際調査報告】
2004514649.tif 000137
2004514649.tif 000138
2004514649.tif 000139