(57)【要約】本発明は分子上に位置する特定のエピトープの位置を確認して同定する方法に関する。対象の分子は細胞又は試験管中に位置されることができる。本発明は例えば抗体によるエピトープの特異的な標識付けと組合わせた電子顕微鏡法の使用に基づく。電子顕微鏡法は極めて低い電子線の線量を使用して行われ、これは標識付けする分子をそれらのエピトープに結合させたまま維持することを可能にする。さらに、方法は生物学的文脈における分子の研究を可能にする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の分子上に位置する特定のエピトープの位置を確認して同定する方法であって、下記のステップを含む方法：
（ａ）アフィニティ試薬又は１又は２以上のこのようなアフィニティ試薬の複合体を、前記試料中の前記分子に結合させることによってアフィニティ標識付けを行い；
（ｂ）試料中の前記分子と他の要素の間の空間関係を固定し；
（ｃ）試料を電子顕微鏡法のグリッド上に配置し、
（ｄ）試料を、透過型電子顕微鏡の低線量電子線に露出させ；
（ｅ）データをティルトシリーズから収集し；
（ｆ）収集したデータを利用して、個々の分子の構造を三次元で再構成し；
（ｇ）ＣＯＭＥＴを使用して、前記再構成物を改善し、前記試料中の個々の分子を目視可能にする。
【請求項２】
前記分子上の２以上のエピトープに対する前記アフィニティ試薬を、アフィニティ標識付けのために使用する請求項１の方法。
【請求項３】
前記アフィニティ試薬が高電子密度のマーカーで標識付けされている請求項１又は２の方法。
【請求項４】
第二アフィニティ試薬が、前記分子に結合される前記アフィニティ試薬に結合される請求項１〜３のいずれか一つの方法。
【請求項５】
前記アフィニティ試薬を、前記分子が位置している細胞又は組織中に注入する請求項１〜４のいずれか一つの方法。
【請求項６】
前記アフィニティ試薬を含有する前記細胞又は組織を、厚さが２５ｎｍ〜１μｍの範囲内の薄い切片にスライスする請求項５の方法。
【請求項７】
前記試料を、アフィニティ標識付けする前に、厚さが２５ｎｍ〜１μｍの範囲内の切片にスライスする請求項１の方法。
【請求項８】
試料を、アフィニティ標識付けを行った後に凍結し、次に前記試料を、前記低線量の電子線に露出する請求項１〜７のいずれか一つの方法。
【請求項９】
試料をスライスした後、埋包する請求項８の方法。
【請求項１０】
試料の要素間の空間関係を化学固定法で固定した後、凍結及び／又は埋包を行う請求項１〜９のいずれか一つの方法。
【請求項１１】
試料の要素間の空間関係を埋包及び／又は凍結によって固定した後、スライスする請求項１〜１０のいずれか一つの方法。
【請求項１２】
試料を、前記電子顕微鏡法のグリット上に配置した後に凍結し、次に前記低線量の電子線に露出する請求項１〜１１のいずれか一つの方法。
【請求項１３】
データを集める前に、試料を重原子で染色する請求項１〜１２のいずれか一つの方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、巨大分子及び多分子複合体の生体外及び原位置での三次元構造を分析する方法並びにその生理的環境内での構造を分析する方法に関する。
【０００２】
背景
分子の機能を機械論的観点から理解するため、その構造について知識を得ることは極めて重要である。この２０年間で、タンパク質、タンパク質の複合体及び核酸の多数の構造が、主としてＮＭＲ及びＸ線結晶構造解析法で測定されてきた。一般に、典型的なタンパク質分子を測定する場合、これらの方法で提供されるデータは、通常３Åより優れた分解能を提供する。分子が大型分子及びその集合体になると、その分解能が大きく低下し、多くの場合、これらの大型構造を測定することが不可能になる。これらの方法を使用して構造を測定するには、被検物体を、その生物環境（例えば細胞）から取り出すことも必要である。
【０００３】
透過型電子顕微鏡法を利用して、リボソーム類又はスプライソソームなどの超分子集合体を、二次元で目視可能にすることができる。電子顕微鏡の一変形すなわち電子顕微鏡断層撮影法（Ａｕｅｒの２０００年の文献：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７８巻１９１〜２０２頁２０００年）を使用して物体の三次元画像をつくることができる。物体の詳細な三次元再構成（ｔｈｒｅｅ  ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を行うことは、高い電子線（一般に約２０００ｅ−／Å２／データセット）が必要なため、達成することが実際には不可能であった。３Ｄ再構成を行うとき達成される分解能が低いので、構造の諸部分を特定の機能と関連づけることは困難である。
【０００４】
透過型電子顕微鏡法は、分類した後、平均することによって、単一物体を２Ｄ及び／又は３Ｄで再構成するのに利用できる。この方法は約１ｎｍの分解能を提供することができる。この種の方法は、バクテリオファージφ２９のコネクタタンパク質（ｃｏｎｎｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の特定の領域の地図を、約３ｎｍの分解能で２ＤにてつくるためＶａｌｌｅら（１９９９年の文献）が利用している。この方法にはいくつもの限界がある。第一に、分析される分子は、その分子の構造特性を変化させかねない表面に直接、結合される。第二に、その単一粒子を再構成する方法は、１００ｋＤａより小さい物体を解像する（ｒｅｓｏｌｖｅ）ことができない（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎの１９９５年の文献）。第三に、この方法は、平均の構造を提供するので、原位置での構造の分析又は個々の超分子複合体の分析を行うのに有効でない。抗体認識の画像を形成する別の方法を、Ｒａａｂら（１９９９年の文献）が提案している。この場合も、被検試料が表面に結合される。Ｒａａｂらによると、動的力顕微鏡法（ｄｙｎａｍｉｃ  ｆｏｒｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を利用することによって、ナノメートルのスケールでエピトープの地図作成を達成できるはずである。しかし、このような結果を達成できる方法の詳細は提供されていない。
【０００５】
最近、ＥＭ−実験で、信号対雑音比を劇的に増大するアルゴリズムが報告された（ＳＥ  Ｃ  ５１１７３７）。そのアルゴリズムはコンピュータプログラムのＣＯＭＥＴに利用されている。これは、低線量の電子線を使って試験することができるので、試料は、放射線による影響が非常に少ないから実験によってかき乱されることが少ない状態にある。なお、この方法で得られる分解能は低すぎるので、物体の特定部分の明確な同定を行うことができない。
【０００６】
発明の要約
本発明の目的は、巨大分子の物体の詳細な３次元再構成物をつくる方法を提供しそして特定のエピトープがこの物体のどこに位置しているかを決定することである。本願に記述されている発明は、エピトープに原位置で標識をつけることによって、その生理的環境内で、エピトープ類を同定するのに使用することができ、又はそれらエピトープは生体外で同定できる。エピトープを同定するには、アフィニティ試薬、すなわち一般に、対象の分子の一部に対して特異的な抗体であって、小さい高電子密度のマーカーを接合されているか又は接合されていなくてもよい抗体を、電子断層撮影法及びＣＯＭＥＴアルゴリズムとともに使用する必要がある。ＣＯＭＥＴを使用すると、ＥＭＴ画像をとるとき電子線量は低くてよい。いささか予想外のことであるが、このような低い線量は、前記アフィニティ試薬とそのエピトープの間の相互作用を妨げない。本発明の方法は、個々の分子又は超分子複合体の３Ｄ再構成物におけるエピトープの位置確認と同定を正確に行うことができるので、長年にわたって必要と感じていたことを満足させた。特定のエピトープの位置を正確に決定する方法の性能は図１Ｃに例示してある。
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、タンパク質、核酸又はこれらの１又は２以上の複合体もしくは集合体（ａｓｓｅｍｂｌｙ）などの巨大分子構造体の構造を決定する方法に関する。
【０００８】
四つの重要な側面は以下のように区分できる。
１）低線量の電子線を使用すること。
２）被検物体に、アフィニティ試薬で標識を付けること。
３）多数の画像の平均ではなくて個々の物体を分析すること。
４）原位置で物体を分析すること。
【０００９】
被検物体の調整は下記の手順のうちのいずれかに基づいて行われる。
１）生体外の場合、分析される物体は、溶液（例えば緩衝液）中の分子又は多分子複合体である。アフィニティ試薬（ＡＲ）を上記溶液に添加して、標的分子に結合させる。試料（この場合、被検物体とＡＲを含有している溶液）を、グリッド上に塗布し次に氷結晶が生成しない条件下（例えば液体エタン中に浸すことによるガラス化）で凍結する。次に、その凍結試料をデータを集めるために準備する。
【００１０】
２）原位置の場合、被検物体は、機能上、関連が深い環境内（例えば細胞内）の分子又は多分子複合体である。その被検物体は、ＡＲで標識を付けて２５ｎｍ〜１μｍ（好ましくは７０〜９０ｎｍ）の厚さになるようにスライスしなければならない。この標識付けとスライシングは、順序を変えて実施することも考えられる。一つの場合、標識付けはスライスを行う前に行われる。こうすることによって、研究者は、生細胞内又はかき乱されていない試料中の物体に標識を付けた後、スライスすることができる。もう一つの場合、スライシングを行った後、標識付けを行う。この場合、そのスライスはＡＲで標識をつける。
【００１１】
標識付けを実施した後、スライスを行う場合（例えばアフィニティ試薬を細胞中に注射することによって）、次のステップは、その試料を疎水性もしくは好ましくは親水性の物質中で固定し埋包するステップでもよく、又は代わりに試料を固定し凍結してもよい。その埋包したか又は凍結した細胞を、次に、ウルトラミクロトミーと呼ばれる方法でスライスして、厚さが一般に２０〜１００ｎｍのいわゆる薄い切片を得る。凍結した細胞の場合、スライシング法は低温ミクロトミーと呼ばれそして得られる切片は低温切片と呼ばれる。その低温ミクロトミーは、試料中の水が無定形に保たれて氷の結晶を生じることができないような条件下で行われる。この低温ミクロトミーは、試料を冷凍防止剤、一般にスクロースの存在下で凍結させることによって達成できる。
【００１２】
上記試料を次に電子ビームにかける。データを収集している間、試料のいくつもの画像（各画像は角度を少しずつ変えてとった画像である）を記録した。これら画像はいわゆるティルトシリーズ（ｔｉｌｔ−ｓｅｒｉｅｓ）を形成している。生体外の場合、データ収集は、試料を無定形状態に維持するため低温で行わねばならない。原位置の場合、データ収集は低温又は室温で実施できる。このようにして収集したデータは、次に、標準のソフトウェアを利用して加工する（Ｓｋｏｇｌｕｎｄらの１９９６年の文献ｂ）。これらの方法は、当業技術者にとって周知の方法である。
【００１３】
本発明の一実施態様で、試料中の分子上に位置する特定のエピトープの位置を確認して同定する方法が提供され、その方法は下記のステップを含んでいる。すなわち、
（ａ）アフィニティ試薬又は１又は２以上のこのようなアフィニティ試薬の複合体を、前記試料中の前記分子に結合させることによってアフィニティ標識付けを行い；
（ｂ）上記試料中の前記分子と他の要素の間の空間関係を固定し；
（ｃ）上記試料を電子顕微鏡法のグリッド上に配置し；
（ｄ）その試料を、透過型電子顕微鏡の低線量電子線に露出させ；
（ｅ）データをティルトシリーズから収集し；
（ｆ）その収集したデータを利用して、個々の分子の構造を三次元で再構成し；
（ｇ）ＣＯＭＥＴを使用して、前記再構成物（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を改善し、前記試料中の個々の分子を目視可能にする；
ステップを含んでいる。
【００１４】
別の実施態様で、前記分子上の２以上のエピトープに対する前記アフィニティ試薬を、アフィニティ標識付けのために使用する上記方法が提供される。
【００１５】
さらに別の実施態様で、前記アフィニティ試薬が高電子密度のマーカーで標識付けされている上記方法が提供される。
【００１６】
さらに別の実施態様で、第二アフィニティ試薬が、前記分子に結合される前記アフィニティ試薬に結合される上記方法が提供される。
【００１７】
さらに別の実施態様で、前記アフィニティ試薬を、前記分子が位置している細胞又は組織中に注入する上記方法が提供される。
【００１８】
さらに別の実施態様で、前記アフィニティ試薬を含有する前記細胞又は組織を、厚さが２５ｎｍ〜１μｍの範囲内の薄い切片にスライスする上記方法が提供される。
【００１９】
さらに別の実施態様で、前記試料が、アフィニティ標識付けする前に、厚さが２５ｎｍ〜１μｍの範囲内の切片にスライスする上記方法が提供される。
【００２０】
さらに別の実施態様で、試料を、アフィニティ標識付けを行った後に凍結し、次にその試料を、前記低線量の電子線に露出する上記方法が提供される。
【００２１】
さらに別の実施態様で、試料をスライスした後、埋包する上記方法が提供される。
【００２２】
さらに別の実施態様で、試料の要素間の空間関係を化学固定法で固定した後、凍結及び／又は埋包を行う上記方法が提供される。
【００２３】
さらに別の実施態様で、試料の要素間の空間関係を埋包及び／又は凍結によって固定した後、スライスする上記方法が提供される。
【００２４】
さらに別の実施態様で、試料を、前記電子顕微鏡法のグリット上に配置した後に凍結し、次に前記低線量の電子線に露出する上記方法が提供される。
【００２５】
上記諸実施態様の方法は、溶液内又は試料の生物学上の生体内環境内の分子の試料を試験できることに留意すべきである。
【００２６】
本発明の一実施態様で、アフィニティ試薬が被検物体に結合される。これらのアフィニティ試薬は電子顕微鏡法を使用して可視化することができそして抗体が向かうエピトープの位置決定を行うことができる。低線量放射線を使用する利点は、非共有結合で結合されるアフィニティ試薬でさえ、そのエピトープとともに可視化することができることである。これらアフィニティ試薬は、対象のエピトープに直接向ける（直接標識付けと呼ばれる）か、又は対象のエピトープにすでに結合されている一次アフィニティ試薬に向けることができ、この場合は間接標識付けと呼ばれる。
【００２７】
アフィニティ試薬の種類は、薬剤もしくは薬剤様分子及び炭水化物などの小分子から、ペプチド、ヌクレオチド、ポリペプチド及びポリヌクレオチドを経て、タンパク質、ホルモン及び抗体に至るまでの範囲で広く変えることができ、唯一の条件は、そのアフィニティ試薬が、データを収集する前又はデータ収集中に、電子線量によって、そのエピトープから放出されないということである。しかし、アフィニティ試薬が小分子である場合、例えば、高電子密度のマーカー又は電子顕微鏡で可視化できる何らかの他の分子で、アフィニティ試薬に標識をつける必要があることがある。
【００２８】
本発明の別の実施態様では、高電子密度のマーカーで標識付けした抗体がアフィニティ試薬として使用される。その高電子密度のマーカーは、電子顕微鏡によって容易に可視化することができる。
【００２９】
別の実施態様では、その抗体の大きさは、その抗体を、高電子密度のマーカーなしでも検出できる大きさである。
【００３０】
本発明のさらに別の実施態様では、薬剤候補物などの小分子（一般に２００〜６００Ｄａの大きさ）は、高電子密度のマーカーで標識付けされる。これは、その小分子が巨大分子のどこに結合できるか位置を確認するのに利用できる。
【００３１】
本発明の別の実施態様では、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質を、アフィニティ試薬として使用して、研究者は、プローブ（アフィニティ試薬）と被検物体が相互に作用する部位の位置を確認して同定することができる。
【００３２】
本発明の別の実施態様では、２種以上のプローブが、被検物体上の異なるエピトープに対するプローブとして利用される。これによって、研究者は、一実験によって、別個のエピトープの相対的位置を測定することができる。
【００３３】
本発明の一実施態様で、画像のコントラストを増大することは好都合なことである。これは、データを集める前に、試料を重原子で染色する（ｓｔａｉｎ）ことによって実施できる。
本発明を使用する実施例
下記実施例は、本発明を使用することによって達成される結果を示すために提供するものである。またこの実施例は、本願で特許請求されている本発明の範囲を限定するものではない。この実施例は、当業技術者が実験を繰り返すことができるように、使用される方法を提供しかつ参考文献を含んでいる。この実施例は、組織を原位置で試験する場合に使用される発明を例示している。
【００３４】
緒言
プレメンセンジャーＲＮＡ（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）のスプライシングは、いわゆるスプライソソームによって実行される複雑な工程である。生体外で組立てられたスプライソソームは、酵母内で（Ｃｌａｒｋらの１９８８年の文献）及び哺乳動物中で（Ｒｅｅｄらの１９８８年の文献）、電子顕微鏡法によって研究されている。そのスプライソソームは、順序を付けた段階的な方式で組立てられ、多数のタンパク質と核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）で構成されている。スプライソソームの生体内での組立て工程と構造は余りよく分かっていない。スプライシングは、主として、活性遺伝子において又はその近くで起こるようである。スプライシング要素は、光学顕微鏡法（例えば、Ａｍｅｒｏらの１９９２年の文献；Ｗｕらの１９９３年の文献；Ｚｈａｎｇらの１９９４年の文献；Ｂａｕｒｅｎらの１９９６年の文献；ＮｅｕｇｅｂａｕｅｒとＲｏｔｈの１９９７年の文献ａ）及び電子顕微鏡法（Ｋｉｓｅｌｅｖａらの１９９４年の文献；ＰｕｖｉｏｎとＰｕｖｉｏｎ−Ｄｕｔｉｌｌｅｕｔの１９９６年の文献；Ｃｍａｒｋｏらの１９９９年の文献）の両者によって、活性遺伝子に位置が決定されている。
【００３５】
いくつもの報告が、ＲＮＡポリメラーゼＩＩがキャッピング、スプライシング及びポリアデニル化に関与していることを立証している（Ｓｈｕｍａｎの１９９７年の文献；ＣｏｒｄｅｎとＰａｔｔｕｒａｊａｎの１９９７年の文献；Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚの１９９７年の文献，ＮｅｕｇｅｂａｕｅｒとＲｏｔｈの１９９７年の文献ｂ；Ｂｅｎｔｌｙの１９９９年の文献に概説されている）。組合わせた利用可能なデータは、転写及びプレ−ｍＲＮＡプロセシングが細胞核内で密接に連結しており、かつ延長しているＲＮＡポリメラーゼＩＩが、新生転写物及び異なるＲＮＡのプロセシング因子も含む分子複合体中に存在しているはずであることを示している。
【００３６】
同時転写ＲＮＡプロセシングのモデルにおいて、スプライシング因子を含むプロセシング要素は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合している（ＮｅｕｇｅｂａｕｅｒとＲｏｔｈの１９９７年の文献ｂ及びＢｅｎｔｌｅｙの１９９９年の文献参照）。しかし、このモデルのいくつもの側面は不明瞭であり、まだ生体内で分析されていない。このモデルでは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩがスプライシング因子をどこでピックアップするのか及びその延長ＲＮＡポリメラーゼが、特に多重イントロン遺伝子（ｍｕｌｔｉ−ｉｎｔｒｏｎ  ｇｅｎｅ）を転写中、スプライシング因子をどんな程度まで保持しているか明らかでない。協調している転写とスプライシングの構造ベースについてもっと知って上記質問に答えるには、活性遺伝子の生体内の構造を研究することが非常に重要である。この点について、キロノムス・テンタンス（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ  ｔｅｎｔａｎｓ）の唾液腺細胞中の活性バルビアニ環３（ＢＲ３）遺伝子は可視化されており、そして構造が決定されている。そのＢＲ３遺伝子は長さが１０．９ｋｂであり分泌タンパク質をコードしている。３８個のイントロンが、全遺伝子全体にわたってほぼ同じ間隔で配置されており（Ｐａｕｌｓｓｏｎらの１９９９年の文献）そして、これらイントロンの１／２以上が転写時に同時に切除されることが分かっている（Ｗｅｔｔｅｒｂｅｒｇらの１９９６年の文献）。この系では、形態が損なわれていない細胞核内の顆粒と呼ばれている複合体の中の活発に転写するＢＲ３遺伝子を同定することができる。これによって、活性ＢＲ３遺伝子の３次元（３Ｄ）構造を再構成するため電子断層撮影法を使用できるようになる。スプライシングが、特定のしかし動的な超分子複合体内で起こることが確認された。
【００３７】
本発明について、さらに一層重要なことであるが、ＲＮＡポリメラーゼとＵ２ｓｎＲＮＰが、スプライソソームのどこに位置しているか位置をつきとめることができる。これらの結果は、研究者が、本発明によって、特定のエピトープが分子上のどこに位置しているかを電子断層撮影法によって正確に示すことができるようになることを明確に実証している。
【００３８】
構造のデータと免疫学のデータは、各顆粒が、関連する転写とスプライシングの要素を有する成長プレ−ｍＲＮＡ転写産物（ｇｒｏｗｉｎｇ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）であることを示している。このような顆粒は各々、「新生の転写産物とスプライシングの複合体（ｎａｓｃｅｎｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ａｎｄ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」すなわちＮＴＳ複合体と呼称する。
【００３９】
本発明を添付図面を参照して説明する。
図１は、ＮＴＳ複合体中のＵ２ｓｎＲＮＰＢ″とＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤの免疫学的位置確認法を示す。
（Ａ）活性ＢＲ３遺伝子座を通る断面の一部。６ｎｍの金粒子（矢印）は抗−Ｕ２ｓｎＲＮＰＢ″抗体による標識付けを示す。活発に転写するＢＲ３遺伝子セグメントのみ標識付けされる。写真の右半分の不活性のコンパクトなクロマチン（Ｃｈｒ）の上には、金粒子が全く見えないか又はごく少数見える。４個の大きい金粒子も見える。これらの金粒子は、３Ｄの再構成を行うため使用され、プレパラート上に堆積させて、ティルトシリーズの写真を整列させるために使用するマーカーである。バーは長さ１００ｎｍである。
【００４０】
（Ｂ）抗Ｕ２ｓｎＲＮＰＢ″抗体で標識付けした活性ＢＲ３遺伝子セグメントを含む領域の３Ｄ再構成物の投影図である。その再構成物は、約０．５電子／Å２／画像を有する低線量データからつくった。矢印は、上記二次抗体に結合した６ｎｍ金粒子をいくつか指摘している。３Ｄ再構成を行うために使用される一つの大きい金粒子も見られる（左上部）。バーの長さは５０ｎｍである。
【００４１】
（Ｃ）５ｎｍの分解能で表面を表すように示した、Ｂに示す金粒子（大矢印）及び標識を付けたＮＴＳ複合体の３Ｄ再構成。金粒子（黄色）とＮＴＳ複合体（青色）の間の抗体接続部は赤色で示してある。破線はクロマチンの軸（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ａｘｉｓ）を示す。６ｎｍ金粒子は不透明物体であるから、再構成の後、いくぶん大きく見える。バーの長さは１０ｎｍである。
【００４２】
（Ｄ）抗−ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤ抗体で標識を付けた活性ＢＲ３遺伝子セグメントを含む領域の３Ｄ再構成物の投影図。その再構成物は、約０．５電子／Å２／画像を有する低線量データから作った。その矢印は上記二次抗体に結合された６ｎｍ金粒子を指摘している。３Ｄ再構成を行うために使用される二つの大きい金粒子も見える。バーの長さは５０ｎｍである。
【００４３】
（Ｅ）５ｎｍの分解能で表面を表すように示した、Ｄに示す金粒子（大矢印）及び標識を付けたＮＴＳ複合体の３Ｄ再構成。色のつけ方はＣと同じである。破線はクロマチンの軸を示す。バーの長さは１０ｎｍである。
【００４４】
図２は、比較実施例で得た結果を示す。この図は文献（Ｍｉｒａｌｌｅｓらの２０００年の文献）中の図１である。これらの図には、前記唾液腺細胞の核細胞質内のＢＲ粒子に関連する繊維が画かれている。（ｂ）唾液腺の薄い凍結切片中の核細胞質ＢＲ粒子の２例を酢酸ウラニルで染色してＥＭで観察した。そのＢＲ粒子は直径約５０ｎｍの高密度顆粒として見える。矢印は、ＢＲ粒子と接触し周囲の核細胞質に延びていると考えられる繊維を指摘している。（ｃ）前記繊維内に位置するタンパク質に対するモノクローナル抗体及び金を接合された二次抗体で免疫標識された繊維の２例を示している。上のパネルは、核細胞質内に位置し、ＢＲ遺伝子と核膜の両者から離れて位置しているＢＲ粒子を示す。バーの長さは５０ｎｍである。
【００４５】
図３は比較実施例で得た結果を示す。この図は、文献（Ｍｉｒａｌｌｅｓらの２０００年の文献）の６図である。繊維中のｈｒｐ６５の位置確認（ａ）唾液腺の薄い凍結切片上のｈｒｐ６５の免疫ＥＭ位置確認。その切片をｈｒｐ６５に対する抗体とともにインキュベートし、次に金接合二次抗体とともにインキュベートした。繊維の３例（ｂとｃ）、唾液腺の薄い凍結切片上のｈｒｐ２３とｈｒｐ３６それぞれの免疫−ＥＭ位置確認。バーの長さは５０ｎｍである。これらの図（図２と３）は、二次元の表示であり、そして金のマーカーによって示されている抗原は、金のまわりの半径が約１５ｎｍの円内のどこかに存在しているが、高い正確さで位置を確認できないことに留意すべきである。
【００４６】
図４ｄは比較実施例で得た結果を示す。この図は文献（Ｍｉｒａｌｌｅｓらの２０００年の文献）の図２ｄである。この図では、３次元の再構成物が作られた。図Ｉ−Ｖは高分解能でＢＲ粒子を示す。しかし、粒子の特定の要素は、同定の基準がないので位置を正確に示すことができないことに留意すべきである。バーの長さは２０ｎｍである。
【００４７】
定義と略語
ＡＲ−アフィニティ試薬
ＰＶＡ−ポリビニルアルコール
ＥＭ−電子顕微鏡法
ＴＥＭ−透過型電子顕微鏡法
ＥＭＴ−電子顕微鏡断層撮影法
ＣＯＭＥＴ−拘束最大エントロピー断層撮影法（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｅｎｔｒｏｐｙ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）
３Ｄ−三次元の
【００４８】
用語「試料」は、本願に開示されている場合、細胞、組織又は任意の種類の容器もしくは試験管内に入っている試料などの生物学的試料又は化学的試料を意味する。
【００４９】
用語「アフィニティ試薬」は、本願に開示されている場合、特定のエピトープに特異的に結合する分子を意味する。このようなアフィニティ試薬としては一般に、抗体、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、薬剤、候補薬剤、炭水化物、脂肪酸、タンパク質またはホルモンがある。
【００５０】
用語「プローブ」は、本願に開示されている場合、「アフィニティ試薬」と同じ意味で使うことができる。
【００５１】
用語「直接標識付け」は、本願に開示されている場合、アフィニティ試薬をマーカーで標識付けする方法を意味する。
【００５２】
用語「高電子密度の」は、本願に開示されている場合、高密度の電子を有する物体の特性を意味する。このような物体の例としては一般に、ヨウ素、フェリチン及び金、ウランもしくはタングステートのような重原子がある。
【００５３】
用語「エピトープ」は、本願に開示されている場合、アフィニティ試薬が認識する、分子上の特異的結合部位を意味する。
【００５４】
用語「間接標識付け」は、本願に開示されている場合、対象のエピトープに結合した一次アフィニティ試薬に結合する二次アフィニティ試薬にマーカーを結合する方法を意味する。
【００５５】
用語「低線量」は、本願に開示されている場合、３５ｅ−／Å２／データセット以下の電子線量を意味する。
【００５６】
用語「３Ｄ再構成」は、本願に開示されている場合、三次元画像をいくつかの二次元画像から再構成する方法を意味する。
【００５７】
用語「データ収集」は、本願に開示されている場合、試料を電子に露出し、生成した画像を記録する方法を意味する。
【００５８】
用語「ティルトシリーズ」は、本願に開示されている場合、電子断層撮影試験から収集した一組のデータを意味する。ティルトシリーズは、順にとった多数の連続画像である。各画像について、カメラは、物体に対して異なる角度で配置される。
【００５９】
用語「プロセシングデータ」は、本願に開示されている場合、Ｓｋｏｇｌｕｎｄらの１９９６年の文献ｂに記述されているような、収集したデータを整列させ、再構成し次いで改善することを含んでいる。
【００６０】
用語「化学固定」は、本願に開示されている場合、タンパク質及び／又は核酸を架橋する化合物、一般にグルタルアルデヒド又はホルムアルデヒドで処理する方法を意味する。
【００６１】
用語「凍結」は、氷結晶が大きく形成されるのを防止する低温条件を意味する。この意味は、当業技術者にとって周知のことである。このような条件の一例は、圧力が１気圧で温度が−１７０℃より低いか、又は２．３Ｍのスクロースの存在下温度が−１００℃より低い条件である。
【００６２】
用語「超凍結切片法」又は「凍結切片法」は、試料を、凍結条件で、薄いスライス（２０〜９０ｎｍ）に切断する方法を意味する。
【００６３】
材料と方法
唾液腺の分離と化学固定
第四齢のシー・テンタンス（Ｃ．ｔｅｎｔａｎｓ）の唾液腺を、０．０５Ｍスクロース含有０．１Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）に２％のグルタルアルデヒドを添加した液で４℃にて２ｈｒ固定し、次に、グルタルアルデヒドなしの同じ緩衝液内で１５分間ずつ４回洗浄した。
【００６４】
クロモソームの分離と抗体の標識付け
唾液腺を、ＴＫＭ（１０ｍＭ  トリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＫＣｌ、及び１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に２％のパラホルムアルデヒドを添加した液で４℃にて２分間固定した後、小ガラスピペットで採取することによってクロモソームＩＶを分離した（Ｂｊｏｅｋｒｏｔｈらの１９８８年の文献；Ｋｉｓｅｌｅｖａらの１９９４年の文献）。次にクロモソームＩＶをシリコーン処理したスライドガラスに移し、室温の４％パラホルムアルデヒド含有ＴＫＭで３０分間固定した後、Ｓｕｎらの１９９８年の文献に記述されているようにして免疫反応を実施した。そのクロモソームを２％グルタルアルデヒド含有ＴＫＭで１ｈｒ、後固定を行った。免疫標識されていないクロモソームを、分離した後、グルタルアルデヒド含有ＴＫＭで直接固定した。我々が試験することができたＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤとすべてのｈｎＲＮＰとスプライシング因子（２種のＳＲタンパク質、２種のｈｎＲＮＰタンパク質、Ｕ１ｓｎＲＮＰ及びＵ２ｓｎＲＮＰ）は、これらの条件中、活性ＢＲ３遺伝子セグメントに結合したままである。
【００６５】
ヤギ抗−ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ＲＮＡポリメラーゼＩＩｏ抗体（すなわちＲＮＡポリメラーゼＩＩの大サブユニットの過リン酸化ＣＴＤ）、「ｇＡＰα−ＰＣＴＤ」は、Ａｒｎｏ  Ｌ．Ｇｒｅｅｎｌｅａｆ博士（米国Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）からの親切な寄贈品である。マウスの抗−Ｕ２ｓｎＲＮＰＢ″抗体は、ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から購入した。両方の抗体は、ウエスタンブロット法に特有のものである。６ｎｍの金粒子を接合された二次ＩｇＧ抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から購入した。
【００６６】
埋包、染色及び切片作製
試料（無傷の腺と分離したクロモソーム）はすべて、グルタルアルデヒドで固定した後、同じ方式（Ｂｊｏｅｒｋｒｏｔｈらの１９８８年の文献）で脱水し次に埋包した。その分離したクロモソームは、シリコーン処理をしたスライドガラスの上面で埋包した。その分離したクロモソームを含有するプラスチックを、液体窒素で冷却した後、かみそりで、スライドガラスから取り外した。対象の領域を切り離し、台にのせて６０ｎｍ又は１００ｎｍの切片をつくった。これらの切片をＥＭのグリッドの上に置き（一連の切片を配列した）、次に２％の酢酸ウラニル含有エタノールで５分間染色した。上記配列のマーカーとして使用されるコロイドの１０ｎｍ金マーカー（Ａｕｒｏｐｒｏｂｅ  ＥＭ  ＧＡＤ  ＩｇＧ  Ｇ１９、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、前記切片の上面に添加した。その金マーカーを１：３の比率で希釈し、グリッドとともに８〜１０分間インキュベートした。そのグリッドは最終的に水で３回洗浄してから風乾した。
【００６７】
データの収集
切片にした核の中のクロモソームのティルトシリーズ（データセット）は、前記標本を、前照射（ｐｒｅ−ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）して、前記ティルトシリーズ中、ビーム方向に２０％初期収縮させてそれ以上収縮するのを防止した後、非弾性散乱フィルターを使って８０ｋＶの加速電圧でＺｅｉｓｓＥＭ９０２透過型電子顕微鏡に手動で記録した。３２０００倍の倍率を利用し、＋６０°から−６０°まで５°毎に記録して、合計２５個の投影図を得た。試料が放射線で損傷するのを抑制するため、二つのエキストラゼロデグリーティルト（ｅｘｔｒａ  ｚｅｒｏ−ｄｅｇｒｅｅ  ｔｉｌｔ）を、前記ティルトシリーズの前後に記録した。改善されたティルトシリーズだけをその後、処理し、次に、そのネガティブを、ラスターサイズ（ｒａｓｔｅｒ  ｓｉｚｅ）が２５μｍのＯｐｔｒｏｎｉｃｓ  Ｐ−１０００ドラムスキャナーで走査した。免疫標識されたクロモソームを含む分離されたクロモソームのティルトシリーズは、ＴＶＩＰＳ（ドイツ、Ｇａｕｔｉｎｇ所在のＴＶＩＰＳ  ＧｍｂＨ）検出システムとＥｍｍｅｎｕソフトウェアを使用して、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＥＭ  ２００ＦＥＧ透過型電子顕微鏡に、自動的に記録した。このソフトウェアは、ティルティング、焦点調節、トラッキング及びデータ収集を制御する。上記加速電圧は２００ｋＶであり、倍率は２６７００倍であり、そして写真は、ラスターサイズ１４μｍの２０４８×２０４８画素のＣＣＤチップに直接記録した。＋６０°から−６０°までの間２°毎に、６１枚の写真を記録した。完全なティルトシリーズに対する全線量は、３０電子／Å２未満であった。これらの条件中、収縮は全く検出できなかった（Ｍｉｒａｌｌｅｓらの２０００年の文献）。原位置でのクロモソームのティルトシリーズは画素サイズ７．８Åでディジタル化し、そして分離されたクロモソームのティルトシリーズは画素サイズ５．２Åでディジタル化した。切片にした核の中のクロモソームのティルトシリーズのディジタル化領域の全体の大きさは１．２５μｍ×１．２５μｍであり、そして分離されたクロモソームの場合は１．０７μｍ×１．０７μｍであった。
【００６８】
３Ｄ再構成
データは、ＥＴソフトウェアパッケージバージョン３．４（Ｓｋｏｇｌｕｎｄらの１９９６年の文献ｂ）を使って処理した（整列させ、再構成し次いで改善した）。画像プロセシングはすべて、Ｃｏｍｐａｑワークステーション（５００ａ）とＧＳ６０サーバーで行った。１０ｎｍのコロイド金マーカーを、異なる投影図を並べるために使用した。平均の配列誤差は５Å未満であった。ディジタル化された原位置の領域全体を、フィルターされたバックプロジェクションの原理（ｆｉｌｔｅｒｅｄ  ｂａｃｋ−ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）を使用して再構成した。個々の再構成物をＣＯＭＥＴ（Ｓｋｏｇｌｕｎｄらの１９９６年の文献ａ）を利用してさらに改善して、実験データに良好に適合させ、信号／雑音比を改善し、そして重要な密度だけを保持させた。最終的に、その再構成された密度は、低域フィルターされて、均一な分解能になった。
【００６９】
約３００×３００×１００ｎｍの領域を第一に、７．５μｍの分解能で分析した。選択された構造体をさらに再構成し次いで５ｎｍで分析した。Ｂｏｂ（Ｋｅｎ  Ｃｈｉｎ−Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｃ．フリーウェア）を容積レンダリングのために使用し、そして、ＸＴＶ（Ｓｋｏｇｌｕｎｄらの１９９６年の文献ｂ）及びＡＶＳ／Ｅｘｐｒｅｓｓバージョン４．０（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ）はともに表面レンダリングのために使用した。個々のＮＴＳ複合体の容積は、あつらえのエンベロープ内にボクセルを加えることによって測定した（対象の密度だけをＸＩＶソフトウェアを使って切り離した）。密度のしきい値すなわち一般に平均密度＋２標準偏差を超えたボクセルだけを加えた。原位置の切片に比べて埋包して分離したクロモソーム由来の遺伝子セグメントの線形伸長部分は、分離されたクロモソームの場合、約２０％の収縮率を示したが、これは試料の処理が異なることが原因である可能性が最も高い。この線収縮率は、原位置の切片と比べて、約５０％の容積の等方性収縮率に相当する。
従来技術の比較実施例
Ｍｉｒａｌｌｅｓらの２０００年の文献：Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４８巻２７１〜２８２頁には、本発明の前に得られた情報の実施例が示されている。図１と６は、ＣＯＭＥＴを使用せずに達成された低分解能画像の典型的な実施例を示している。この実施例で使用した抗体は、画像を３Ｄ再構成する場合には使用されず、低分解能である。図２ｄには、画像を３Ｄ再構成する場合にＣＯＭＥＴを使用したき達成された結果が示されている。図２ｄでは、エピトープを同定するのに抗体が全く使用されなかったので、物体の特定要素を同定することは不可能である。
【００７０】
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤ及びＵ２ｓｎＲＮＰＢ″タンパク質の免疫学的位置確認
ＲＮＡポリメラーゼＩＩのＣＴＤ及びＢＲ３遺伝子セグメント中のＵ２ｓｎＲＮＰ特異的Ｂ″タンパク質の位置を、免疫学的標識付けで決定した。
【００７１】
これらの実験には、分離したクロモソームＩＶを使用した。というのは、そのクロモソームが唾液腺の切片と比べて、抗体反応が一層効率的だからである。活性ＢＲ３遺伝子セグメントの特異的な金による標識付けは、抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤ抗体と抗Ｕ２ｓｎＲＮＰＢ″抗体の両者の場合に達成された。金粒子の９９％以上（抗Ｕ２ｓｎＲＮＰＢ″抗体の場合）及び９７％以上（抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤ抗体の場合）が活性遺伝子セグメントと結合しており、非常に少数の粒子だけが他の領域に見られた（図１Ａ参照）。セクション内に完全に位置している金粒子を３Ｄ再構成する場合、８３％以上（ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤ抗体の場合）及び９７％以上（抗Ｕ２ｓｎＲＮＰＢ″抗体の場合）がＮＴＳ複合体に特異的に接合していた（下記参照）。非特異的抗体を使用したところ（データは記載していない）、ごく少数の金粒子（抗Ｕ２ｓｎＲＮＰＢ″抗体と抗ＲＮＡポリメラーゼＣＴＤ抗体それぞれとともに見られる数は１％未満と３％未満）が見られ、しかも、これらの金粒子は、クロモソームの他の部分に対してランダムに分布していた。
【００７２】
免疫金標識付けは、転写ＢＲ３遺伝子セグメントに対して明らかに特異的であった（図１Ａ）が、二次元では、活性遺伝子セグメントのどの部分が標識付けされているのか正確に決定することは不可能であった（図１ＢとＤ）。免疫染色した活性ＢＲ３遺伝子を３Ｄ再構成することによって、その抗原のＮＴＳ複合体における位置決定を高い正確さでできるようになる。一般に、免疫染色及び３Ｄ再構成を組み合わせると、エピトープの地図をつくることができ、超分子構造中の個々の要素の位置を決定する可能性が有意に改善され、こうしてこのような構造の組成が細かく調べられる。
【００７３】
大部分の金粒子からの明らかな細い高電子密度の接続部が３Ｄ再構成物中に見られた。この接続部は金粒子から１０〜２０ｎｍ延び、そして、ＮＴＳ複合体だけがＵ２ｓｎＲＮＰＢ″抗体で標識付けされていることが観察された。この場合、大部分の接続部が、ＮＴＳ複合体の一部に接続しクロマチン軸に対し反対の方向に向いている（図１Ｃ）。さらに、抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤ抗体による、前記遺伝子セグメントのＮＴＳ複合体の標識付けだけが観察された。ＮＴＳ複合体間のクロマチン軸は標識付けされていなかった。このことは、各ＮＴＳ複合体が新生転写産物を含んでいるので、ＲＮＡポリメラーゼＩＩは各ＮＴＳ複合体中に存在していることになるという活性遺伝子セグメントの構造からの解釈を支持している。抗ＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤ抗体とＮＴＳ複合体に結合されている金粒子間の大部分の接続部は、クロマチン軸に最も近いＮＴＳ複合体の領域に観察された（図１Ｅ）。
【００７４】
これらの免疫標識実験は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの大きいサブユニットのＣＴＤ及びＵ２ｓｎＲＮＰＢ″がともに、クロマチン軸にそってＮＴＳ複合体に位置を確認できることを示している。さらに、本発明に関連するデータは、ＮＴＳ複合体内の上記二つの要素の異なる位置、すなわちクロマチン軸に最も近いＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤ及びＮＴＳ複合体のさらに内部のＵ２ｓｎＲＮＰを指摘するのに充分に高い分解能のデータである。
【参考文献】
【００７５】
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【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】ＮＴＳ複合体中のＵ２ｓｎＲＮＰＢ″とＲＮＡポリメラーゼＩＩＣＴＤの免疫学的位置確認法を示す。
【図２】比較実験で得た結果を示す。
【図３】比較実験で得た結果を示す。
【図４】比較実験で得た結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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