(57)【要約】本発明は、主に粒子凝集体の測定を改良することにより、高度の特異性、精度および感度で、広範囲の被検体のいずれかの濃度を決定する改良された粒子増感アッセイ法を提供する。被検体濃度は、アッセイ培養液中で粒子増感アッセイ反応を実行すること、および、偏光散乱強度差計測により前記反応混合液中の異なる粒度で凝集した粒子の分布を測定することによって、決定される。粒子の粒度分布は、前記サンプル中の被検体濃度を決定するために、標準曲線と比較される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の被検体の濃度を決定する方法であって、
（ａ）関心のある前記被検体か、該被検体に対する結合パートナーかのいずれかを固定した担体粒子を含む既知量の感作された粒子と、未知の濃度の前記被検体を含むサンプルとをアッセイ培養液中で混合して、反応混合液を形成するステップと、
（ｂ）前記個々の感作された粒子および異なる粒度の凝集体を含む凝集反応混合液の形成を可能にする条件下で、前記反応混合液のインキュベーションをするステップと、
（ｃ）偏光散乱強度差計測法により、前記反応混合液中の前記個々の感作された粒子および異なる粒度の凝集体の粒度分布を決定するステップと、
（ｄ）前記サンプル中の前記被検体の濃度を決定するステップとを含む、サンプル中の被検体の濃度を決定する方法。
【請求項２】
前記決定するステップは、（ｃ）のステップで得られる前記粒子の粒度分布を較正曲線と比較することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記決定するステップは、前記粒度分布を時間の関数として測定することを含み、
前記凝集体の粒度分布の時間の関数としての変化は、前記サンプル中の被検体の量を決定するために利用される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記偏光散乱強度差計測法は、
（ａ）軸に沿って、（ｉ）該軸に対して測定された第１の角度での直線偏波面を有する少なくとも第１の成分と、
（ｉｉ）前記軸に対して測定された第２の角度での直線偏波面を有する第２の成分とを含む選択された波長によりそれぞれが特徴付けられた１または２以上の光ビームを用いて、前記反応混合液を照射するステップと、
（ｂ）（ｉ）第１の成分からの散乱光の強度を表す第１の強度信号を発生させる手段と、
（ｉｉ）第２の成分からの散乱光の強度を表す第２の強度信号とを発生させる手段とを含み、前記反応混合液中の前記さまざまな粒度の粒子によって散乱された光を検出する光検出器手段を提供するステップと、
（ｃ）少なくとも１つの選択された波長についての前記反応セル中の粒度分布を表す信号を発生させる、前記光検出器手段に結合された強度差分処理手段を提供するステップとを含み、
前記第１および第２の角度は、散乱面に直交または平行な面に対して対称的でない位置にあるが、前記軸とは交わり、
前記強度差分処理は、第１および第２の強度信号の差を表す差分信号を発生させる手段を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
サンプル中の関心のある被検体の濃度を決定する方法であって、
（ａ）前記関心のある被検体か、該被検体と特異的に結合する結合パートナーかのいずれかを固定した不溶性の担体粒子を含む、選択量の感作された粒子を提供するステップと、
（ｂ）反応混合液を形成するために、前記サンプルを前記感作された粒子とアッセイ培養液中で混合するステップと、
（ｃ）前記個々の感作された粒子および異なる粒度の凝集体を含む凝集反応混合液の形成を可能にする条件下で、前記反応混合液のインキュベーションをするステップと、
（ｄ）第１の偏光成分と第２の偏光成分とを含む光の柱を前記反応混合液を貫通するように導くステップと、
（ｅ）偏光散乱強度差計測法によって、前記個々の感作された粒子および異なる粒度の凝集体の前記反応混合液中の粒度分布を測定するステップと、
（ｆ）前記サンプル中の前記被検体の濃度を決定するステップとを含み、
前記分布は前記サンプル中の被検体の量に相関関係がある、サンプル中の関心のある被検体の濃度を決定する方法。
【請求項６】
サンプル中の被検体の濃度を測定する方法であって、
（ａ）関心のある前記被検体か、該被検体と特異的に結合する結合パートナーかのいずれかを固定した不溶性の粒子を含む感作された粒子の選択量を提供するステップと、
（ｂ）反応混合液を形成するために、前記サンプルを前記感作された粒子とアッセイ培養液中で混合するステップと、
（ｃ）前記個々の感作された粒子および異なる粒度の凝集体を含む凝集反応混合液の形成を可能にする条件下で、前記反応混合液のインキュベーションをするステップと、
（ｄ）前記反応混合液を貫通する軸に沿って、該軸に対して垂直および水平面での偏波についてフィルタ処理された複数の波長の光を照射するステップと、
（ｅ）前記垂直面の偏波光により散乱された光の平均強度を測定して、第１の強度信号を発生させるステップと、
（ｆ）前記水平面の偏波光により散乱された光の平均強度を測定して、第２の強度信号を発生させるステップと、
（ｇ）前記第１および第２の強度信号の差を表す差分信号を発生させるステップと、
（ｈ）前記反応混合液中の前記個々の感作された粒子および異なる粒度の凝集体の分布を表す合成信号を発生させるために、前記差分信号を処理するステップと、
（ｉ）前記サンプル中の前記被検体の濃度が測定されるように、前記合成信号を標準曲線と比較するステップとを含む、サンプル中の被検体の濃度を測定する方法。
【請求項７】
前記決定するステップは、前記関心のある被検体の濃度を表す標準曲線と前記粒度分布とを比較することを含み、該比較することは、前記サンプル中の前記関心のある被検体の濃度の定量的な測定値を提供する、請求項１、５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記感作された粒子は、被検体に特異的な結合パートナーを固定した不溶性の粒子を含む、請求項１、５または６に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプル中の前記被検体の存在は粒子凝集を促進する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記感作された粒子は前記被検体を固定した不溶性の粒子を含み、前記反応混合液に既知量の被検体に特異的な結合パートナーを添加するステップを含む、請求項１、５または６に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプル中の前記被検体の存在は粒子凝集を阻害する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合パートナーまたは被検体は、共有結合または非共有結合によって前記不溶性の粒子に固定されている、請求項１、５または６に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルは、血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、尿、細胞および組織からなるグループから選択される、請求項１、５または６に記載の方法。
【請求項１４】
前記被検体は、抗原、ハプテン、抗体、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、癌細胞マーカー、組織細胞、ウイルス、ビタミン、薬剤、代謝産物、核酸および殺虫剤からなるグループから選択される、請求項１、５または６に記載の方法。
【請求項１５】
前記結合パートナーは、抗原、抗原断片、レセプター、核酸、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体および抗体断片からなるグループから選択される、請求項１、５または６に記載の方法。
【請求項１６】
前記不溶性の粒子は、ポリスチレン、アクリロニトリル、ポリブタジエン、アクリルアミド、メタクリルアミド、ナイロン、金属、金属の酸化物および誘導体、ガラス、デキストラン、セルロース、赤血球、花粉、リポソームおよび細菌からなるグループから選択される、請求項１、５または６に記載の方法。
【請求項１７】
前記粒子がポリスチレンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記散乱した光は、該光の光路方向に対して約９０度に位置する複数の検出器によって測定され、該検出器は垂直面および水平面の偏波の散乱光の間の差分強度を測定する、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断法の分野、より具体的には、サンプル中の関心のある被検体の濃度測定用の敏感な粒子増感アッセイ法に関する。反応混合液の粒子解析は、偏光散乱強度差計測（Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、以下「ＰＩＤＳ」という。）法を用いて決定される。それから、粒度（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ）分布が前記サンプル中の被検体の濃度に関係付けられる。
【背景技術】
【０００２】
多数の慣用される臨床化学アッセイ法は、免疫複合体の形成を起こす免疫学的反応を通じて、生理的な液体のような試験サンプル中に存在するさまざまな物質の検出および定量をする。免疫複合体が形成されるのは、互いに相手方に対する特異的結合親和性がある２つの反応パートナーが適当なアッセイ培養液中で組み合わされるときである。前記反応パートナーは、抗原と、抗体のような該抗原に対する特異的結合パートナーとの場合がある。一般に、被検体として知られる前記反応パートナーの一方が前記試験サンプル中に未知の量存在する。粒子増感免疫アッセイ法では、前記反応パートナーの一方はラテックス粒子のような不溶性の粒子上に固定される。前記粒子増感免疫アッセイ法は、いったん開始されると、粒子の凝集体の形成、例えばアッセイ用培養液中で不溶性の抗原抗体複合体の形成につながる。直接的粒子増感アッセイ法では、粒子凝集の程度は、前記サンプル中の被検体の濃度に直接比例する。
【０００３】
粒子凝集体はさまざまな方法のいずれでも検出することができる。例えば、粒子凝集体が十分大きい場合には、光を散乱することができ、散乱された光は測光免疫アッセイ法によって検出することができる。前記アッセイ培養液中の粒子凝集体の存在は、入射光のエネルギーを減衰させることにより、前記アッセイ培養液の光散乱特性および吸光特性のような、光学特性を変化させることができる。これらの変化は、さまざまな光散乱法により検出することができる。静的あるいは「古典的」な光散乱法は、前記粒子を含むサンプルを照射して、数個の予め定められた角度での散乱光の強度を測定することに基づく。１個の粒子からの散乱光の強度は、前記粒子の粒度と、入射光の波長と、前記入射光に対して前記散乱光を受光する角度との関数である。散乱光強度の角度依存性に基づくこの粒度測定法は、一群の粒子の粒度分布を決定するために用いることができる。これらの変化は、適当な光度計によって検出することができる。該光度計は前記被検体の検出および定量ができるように較正することができる。較正は、アッセイ培養液中で関心のある被検体の既知量で粒子増感反応を実行して、標準曲線または較正曲線を得ることが典型的である。前記較正極性は、アッセイ培養液に対して培養液の単位体積当たり存在する被検体の量による光の減衰、例えば、吸光のレベルを示すことができる。（Ｃｏｈｅｎらに付与された以下の特許文献１および２と、Ｐ．Ｌ．Ｍａｓｓｏｎらの以下の非特許文献１と、Ｔ．Ａ．Ｗｉｌｋｉｎｓらの以下の非特許文献２とを参照せよ。）
【特許文献１】
米国特許第４，０８０，２６４号明細書
【特許文献２】
米国特許第４，８５１，３２９号明細書
【非特許文献１】
「粒子測定免疫アッセイ（Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ,ＰＡＣＩＡ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７４巻、１０６−１３９頁、１９８１年、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ刊、Ｓ．Ｐ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｏ．Ｋａｐｌａｎ編。
【非特許文献２】
「粒子測定による免疫アッセイ」、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、２２７−２４０頁、１９８８年、Ｗ．Ｐ．編。
【０００４】
粒子凝集体による光散乱を測定する測光技術の例は、ネフェロメトリー（ｎｅｐｈｅｌｏｍｅｔｒｙ）およびタービジメトリー（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙ）を含む。ネフェロメトリー法は、粒子の懸濁液により散乱された光、あるいは、光路に直接置かれるのではない検出器に向かって反射された光を測定する。これに対し、タービジメトリー法は、粒子懸濁液を透過して伝搬する光の減少を測定し、光検出器は光路に置かれる。前記減少は、粒子による光の反射、散乱および吸収によって生じる。しかし、大きな免疫複合体を作るという要件は、ネフェロメトリーおよびタービジメトリー法の免疫アッセイの適用可能性を、数個のエピトープ（すなわち、抗体結合部位）を有するタンパク質のような高分子量の分子に限定してきた。特に、治療剤のような多くのハプテンは、単一のエピトープを有しており、かかる免疫アッセイに必要な大きな免疫複合体を形成することができない。
【０００５】
上述のＣｏｈｅｎらに付与された特許文献１は、光子相関分光法を用いて試験サンプル中の関心のある抗体または抗原の濃度を決定するための粒子を用いる免疫アッセイ法を開示する。培養液中の標的被検体の存在は、凝集と、被検体濃度に相関する粒度の増加とにつながる。粒子の平均拡散係数の直接測定は、アインシュタインおよびストークスの式を通じて粒度と関係付けることができる。しかし、光子相関分光法は、解像度が低いことが知られており、少量の粒子凝集体を正確に検出することができない。そこで、この方法は実質的に感度が欠けている。
【０００６】
Ｃａｎｎｅｌｌに付与された以下の特許文献３は、２つの異なる角度での散乱光の強度の比、いわゆる異方性比を用いて粒度分布を測定する、粒子を用いる免疫アッセイ法を開示する。この方法は、低レベルの凝集状態での異方性比の変化を検出するために、単分散粒子試薬を最初に使用する必要がある。しかし、この方法は、異方性比のほんのわずかな変化しか観察されないために、凝集体の検出感度は低い。同様に、この方法は、異方性比の変化速度が大きい凝集の初期の間で主に有用である。
【特許文献３】
米国特許第４，１７４，９５２号明細書
【０００７】
Ａｂｂｏｔｔらに付与された以下の特許文献４は、不均一な粒度のラテックス粒子試薬の懸濁液を用いることを可能にする、選択的粒子計測免疫アッセイ法を開示する。この方法は、光散乱法と選択的粒子計測法を組み合わせる。具体的には、凝集反応混合液の流れが光学的に定義された観察ゾーン（ｖｉｅｗｉｎｇ  ｚｏｎｅ）を通過する。集光されたレーザ放射が前記観察ゾーンを通過する。前記流れの各粒子によって散乱された放射の強度を担当する検出器は、前記粒子の粒度に関する電気信号を発生する。前記検出器に動作的に連携したカウンタのネットワークが、予め定められた粒度の範囲内にある前記流れの粒子数の測定値を記録する。
【特許文献４】
米国特許第４，５２１，５２１号明細書
【０００８】
Ｓａｗａｉらに付与された以下の特許文献５、６および７は、平均粒径が１．６ミクロン以下の抗体または抗原で増感したラテックス粒子を用いる凝集免疫アッセイ法を記載する。反応混合液は、０．６から２．４ミクロンまでの範囲の波長を有し、担体粒子の平均直径の少なくとも１．５倍よりも長い光を照射される。反応が起こるとともに、前記反応混合液の吸光度が測定される。前記反応混合液が適当な波長を有する多色光線を含む光を照射されるとき、前記反応混合液の吸光度または吸光度の百分率は、ラテックスの凝集の進行に付随して増大する。
【特許文献５】
米国特許第４，１１８，１９２号明細書
【特許文献６】
米国特許第４，２０３，７２４号明細書
【特許文献７】
米国特許第４，２０８，１８５号明細書
【０００９】
Ｍｉｙａｓｈｉｔａらに付与された以下の特許文献８は、反応混合液をレーザビームで照射すること、３０度から６０度までの散乱角範囲（テータ）で前記反応混合液からの散乱光の強度を選択的に検出するすることを含む、生物学的な凝集反応を測定する測光法を開示する。しかし、この方法は、粒度分布をサンプル中の被検体濃度に関係付けることはしない。
【特許文献８】
米国特許第４，７６６，０８３号明細書
【００１０】
Ｂｏｔｔらに付与された以下の特許文献９は、偏光散乱強度差計測（ＰＩＤＳ）法を用いる粒度測定の新規な方法を開示する。この解析法は、ある直線偏波面を有する第１の成分と、別の直線偏波面を有する第２の成分とを含む、選択された波長の呼びかけビームを用意することを含み、前記成分の直線偏波面は直交する。１または２以上の散乱面の測光アレイは、少なくとも２つの散乱角で前記粒子によって散乱された光を検出する。しかし、Ｂｏｔｔらの前記方法は、この方法をサンプル中の被検体濃度を検出または定量するために用いることについては教示しない。
【特許文献９】
米国特許第５，１０４，２２１号明細書
【００１１】
敏感で、迅速で、自動化することができる粒子を用いる免疫アッセイ法を用いて、サンプル中の被検体濃度を定量する改良された方法の必要性はまだある。
【００１２】
発明の概要
本発明は、サンプル中の被検体濃度を特異的に検出し、定量的に決定するための改良された粒子増感アッセイ法を提供する。本発明の方法は、アッセイ反応混合液の粒子解析法を改良することによる、被検体濃度を測定する従来の粒子増感アッセイ法の改善を提供する。前記方法は、偏光散乱強度差計測（ＰＩＤＳ）法を用いて、前記アッセイ反応混合液中に存在するさまざまな粒度（例えば、個々の粒子単量体および粒子単量体のさまざまなクラスター）の相対的または絶対的な分布を計測することにより、サンプル中の被検体濃度を決定することを伴う。ＰＩＤＳは、同様な粒度のミクロン以下の粒子を容易に識別することを効果的に可能にする非常に敏感な方法である。これは、さまざまな粒度の粒子が異なる波長の水平および垂直に偏波した光で照射されるときの散乱パターンの変化を利用することにより達成される。そして、粒度の実際の分布の測定は、前記試験サンプル中に存在する被検体の量と関係付けられる。
【００１３】
したがって本発明の一面は、サンプル中の被検体の量を決定する直接的アッセイ法であって、
ａ）前記被検体に対する特異的な結合パートナーが固定されている不溶性の担体粒子を含む感作された粒子を用意すること、
ｂ）反応混合液を形成するために、アッセイ培養液中で前記サンプルを前記感作された粒子と混合すること、
ｃ）前記感作された粒子およびその粒度の異なる凝集体を含む凝集反応混合液を形成することを可能にする条件下で、前記反応混合液をインキュベーションすること、
ｄ）第１の偏波成分および第２の偏波成分を含む光の柱（ｃｏｌｕｎｍ）を前記反応混合液を貫通するように導くこと、
ｅ）偏光散乱強度差計測法により、前記サンプル中の被検体の量に比例する、前記反応混合液中の前記不溶性の感作された粒子および異なる粒度の凝集体の分布を測定すること、および
ｆ）前記サンプル中の被検体濃度を決定することを含む、アッセイ法を提供することである。
【００１４】
前記粒度分布の測定は偏光散乱強度差計測（ＰＩＤＳ）法を用いて行われるが、これは、垂直面および水平面に偏波させるためにフィルター処理されたさまざまなな波長および偏波の光を前記反応混合液を貫通するように逐次的に照射すること、および、選択された光の状態のそれぞれによる散乱光の平均強度を測定することを伴う。前記散乱光は検出され、前記サンプル中の関心のある被検体濃度と関係付けられるデータに変換される。複数の波長と２つの偏波面の組合せは、異なる粒度のミクロン以下の粒子を弁別する情報を提供し、粒度分布の測定、そして、被検体濃度の測定の分解能および感度を向上させる。
【００１５】
本発明の方法は、直接的アッセイ法および競合的アッセイ法を含む、サンプル中の被検体濃度を決定するためのいかなる粒子増感アッセイ法での使用にも適する。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、サンプル中の被検体濃度を測定する改良された粒子増感アッセイ法に関する。簡潔には、本発明の一面は、反応混合液を形成するために、前記被検体に対する複数の結合パートナーを固定した不溶性の担体粒子を含む感作された既知量の粒子とアッセイ培養液中で混合された前記サンプル中の関心のある被検体の直接的粒子増感アッセイ法を提供する。前記反応混合液は、前記個々の感作された粒子および異なる粒度の凝集体を含む凝集反応混合液の形成を可能にする条件下でインキュベーションされる。前記個々の感作された粒子および異なる粒度の凝集体の分布は、前記サンプル中にもともと存在している被検体濃度と関係付けられる。
【００１７】
本発明の新規な特徴は、偏光散乱強度差計測（ＰＩＤＳ）法を用いて、個々の感作された粒子および異なる粒度の凝集体の分布を測定する改善された方法を含む。粒度分布を決定するために前記ＰＩＤＳ法を用いて得られるデータは、サンプル中の被検体濃度のより正確な決定を可能にする。したがって本発明の方法は、主にアッセイ反応混合液の粒子解析法を改良することにより、被検体濃度測定のための従来の粒子増感アッセイ法の改良を提供する。本発明の方法は、粒子増感アッセイ反応混合液中のさまざまな粒度（すなわち、単量体粒子と、２量体、３量体およびＮ量体と）の分布を測定し、同様の粒度の粒子を弁別することができ、極めて敏感なアッセイ法を提供する。
【００１８】
「凝集」という用語は、被検体およびその特異的結合パートナーの間で一方が粒子に固定されて結合する結果として、２または３以上の個々の感作された粒子が互いに連結されて、２量体粒子、３量体粒子およびより高次の凝集した粒子のネットワークを形成する過程をいう。
【００１９】
本発明の目的のためには、「粒度」という用語は、個々の感作された粒子の単量体と、２量体凝集体と、３量体凝集体と、Ｎ量体凝集体とを含むが、ここで、「Ｎ」とは前記凝集体中の感作された粒子の数をさす。「粒子の単量体」とは、個々の（すなわち、凝集していない）感作された粒子、すなわち、別の感作された粒子と連結されていない感作された粒子をいう。
【００２０】
ここで用いるところの「粒度分布」という用語は、粒子増感アッセイ反応混合液中でのさまざまな粒子の粒度分布を指す。「相対的分布」という用語は、単量体、２量体、３量体等の量の分布の相対比を指す。
【００２１】
ここで用いるところの「粒子解析」という用語は、粒子増感アッセイ反応混合液中での粒度分布の測定を指し、（サンプル体積または表面積に関する）異なる粒度の相対的な百分率または絶対的な量か、粒度分布の時間変化（すなわち凝集速度または凝集速度の時間変化）か、粒度分布に関連する他のパラメーターの変化（例えば、ピークの高さ、ピークの幅、ピークのスロープまたは数理モデル化またはアルゴリズムの操作の前か後かのいずれかでのアナログまたはデジタル応答）かを含む。この測定値は前記サンプル中の被検体濃度と相関関係がある。
【００２２】
ここで用いられるところの「感作された粒子」とは、固定された関心のある被検体か、被検体に特異的な結合パートナーかのいずれかの１または２以上の層を有する不溶性の担体粒子を指し、ここで前記結合パートナーは共有（化学的）結合または非共有（物理的吸着）結合によって前記粒子に付着している。前記担体粒子は、結合パートナーまたは被検体を固定することができるいかなる天然物質または合成物質でもかまわない。前記担体粒子は、粒度が均一である必要はない。担体粒子の例は、ポリスチレン（「ラテックス」ともいう。）、アクリロニトリル、ポリブタジエンのようなオレフィン不飽和単量体の重合体または共重合体と、これらの誘導体および共重合体（Ｂａｎｇｓ、Ｌ．Ｂ．、「均一ラテックス粒子（Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｌａｔｅｘ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」、１９８４年、および米国特許第４，３０５，９２５号明細書）、ガラス、アクリルアミド、メタクリルアミド、ナイロン、金属、金属酸化物およびこれらの誘導体、デキストラン、セルロース、赤血球、花粉、リポソームおよび細菌のような天然の粒子状物質を含む。
【００２３】
「結合パートナー」という用語は、関心のある被検体を特異的に認識して結合し、他の物質との交差反応性は無視できる分子または物質を指す。被検体とその特異的結合パートナーとの結合は化学的な手段でも物理的な手段でもかまわない。典型的な結合パートナーは、抗原、抗原断片、レセプター、核酸、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、これらの断片、誘導体および複合体を含む。ある被検体に特異的なかかる結合パートナーは、商業的な供給源から取得しても、あるいは、当業者に周知の標準的な手順に従って調製してもかまわない。
【００２４】
本発明は、粒子増感アッセイ反応混合液の粒度分布または凝集の変化率を測定する新規な方法を提供し、さらに、試験サンプル中の関心のある被検体の定量法の改良を可能にする。本発明の方法は、粒子増感アッセイ反応混合液の粒子解析を実行するために、ＰＩＤＳ法を用いる。前記解析で検出される散乱光は、適当なモデル化およびデータ解析アルゴリズムを通じて、前記サンプル中の被検体濃度に関係付けられるデータに変換される。
【００２５】
ＰＩＤＳ法、または偏光散乱強度差計測法は、０．０４μｍまでのミクロン以下の粒子の特徴付けのための増感されたアンサンブル光散乱法である。ＰＩＤＳは、引用によりここに具体的に取り込まれる米国特許第５，１０４，２２１号明細書に記載されている。ＰＩＤＳ法は、異なる偏波面の光の散乱を伴う現象に基づいており、小さな粒子の高い散乱角での高分解能測定法を提供する。したがってＰＩＤＳは、異なる粒度のミクロン以下の粒子の弁別を、前記粒子が異なる波長の水平および垂直に偏波した光で照射されるときの散乱パターンの相違を利用して、効果的に可能にする。ＰＩＤＳ解析は、ベックマン・コールターＬＳ２３０のような適当な光散乱装置を用いて実行することができる。
【００２６】
簡潔には、典型的なＰＩＤＳ光学システムでは、白色光源からの光が数個の波長と２つの偏波面のフィルターを通して処理される。サンプル・セルを通過する平行化された光は、ビーム・モニタで監視される。前記サンプルが前記サンプル・セルに導入されると、前記サンプル中の粒子が前記セルを通過する光を光軸に沿った直接の光路から散乱させ、これにより、ビーム・モニタにより検出される信号は減少する。散乱光は典型的には６０度から１４５度までの広範囲の角度にわたって位置する複数の検出器により検出される。前記検出器のそれぞれからの検出された信号は専用の増幅回路により増幅され、測定時間中平均化される。
【００２７】
凝集した反応混合液を通過する光ビームが垂直（Ｖ）方向または水平（Ｖ）方向のいずれかに配向されるとき、ある角度で検出された散乱強度ＩＶおよびＩＨは異なる。ＩＶおよびＩＨの差分強度（ＩＶ−ＩＨ）がＩＶのかわりに用いられるとき、さまざまな粒度の粒子についての散乱強度の角度の変位（ａｎｇｕｌａｒ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は強調される。ＩＶおよびＩＨの差（ＩＶ−ＩＨ）は「ＰＩＤＳ信号」と定義される。ＰＩＤＳ信号は光の波長に対して粒度に依存するため、複数の波長でのＰＩＤＳ信号の測定は粒子解析を洗練させるのに利用できる追加の散乱情報を提供する。
【００２８】
粒子増感アッセイでは、さまざまな粒度の粒子によって散乱された光の強度は、ある時点でのアッセイ反応混合液中の特定の粒度の粒子の数に比例する。アッセイの最初に、前記反応混合液は前記感作された粒子の単量体を主に含む。しかし反応が進行するにつれて、前記単量体は一緒になって、２量体、３量体およびＮ量体のような、前記粒子の単量体より粒度が大きい粒子のクラスターまたは凝集体を形成する。これらのより大きな凝集体は、個々の感作された粒子（単量体）よりも大きい粒径の粒子のように事実上ふるまうために、散乱強度の角度分布を変化させる。前記強度は前記粒子増感アッセイ反応混合液中での粒度分布に比例し、それゆえ、前記試験サンプル中の関心のある被検体濃度と相関関係がある。
【００２９】
前記測定が完了するとき、それぞれの波長および偏波で得られた平均値は逐次的にデータファイルに書き込まれる。ＰＩＤＳ法を用いる本発明の方法による散乱実験についてのデータ解析手順は、ＰＩＤＳ情報を含むマトリックスを用いる。粒度分布データは前記サンプル中の被検体濃度を表す。
【００３０】
上述のとおり、ＰＩＤＳ法は４０ｎｍまでの小さい粒度を測定できる。前記感作された粒子を調製するために用いられる担体粒子は、典型的には、約４０ｎｍと１０００ｎｍとの間である。したがって、粒度分布を測定するためにＰＩＤＳ法を用いる本発明の方法は、従来の方法よりも向上した感度を提供する。向上した感度が、高角度での光散乱を測定するＰＩＤＳ法の結果として得られ、粒子凝集体粒度弁別のより高い解像度を提供する。さらに、前記凝集体が、同じタイプおよび粒度の粒子単量体からなる２量体、３量体等である必要はない。
【００３１】
本発明のアッセイ法を実行するためには、最初に感作された粒子を用意する必要がある。上述のとおり、前記感作された粒子は関心のある被検体か、該被検体に対する特異的な結合パートナーかのいずれかに結合された担体粒子を含む。前記被検体または結合パートナーは、物理的（受動的）吸着、促進された（強制的）吸着および共有結合のような、当業者に周知の標準的技術に従って前記粒子上に固定される場合がある。例えば、前記被検体または結合パートナーは、前記結合パートナーを前記粒子に付着させることができる化学的な官能基の修飾によって前記粒子の表面に共有結合により付着させられる場合がある。例えば、引用によりここに具体的に取り込まれる米国特許第４，０６４，０８０号、４，１８１，６３６号、４，２１０，７２３号、４，２６４，７６６号、４，５２１，５２１号および４，３０５，９２５号明細書を参照せよ。これらの特許明細書に開示された技術は、前記粒子に被検体または結合パートナーを付着させるために利用される場合がある。引用によりここに具体的に取り込まれるＳｅａｍａｎ  Ｇ．Ｖ．Ｆ．編、「診断法におけるラテックスに基づく技術（Ｌａｔｅｘ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）」、Ｈｅａｌｔｈ  ＆  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ刊、ワシントンＤ．Ｃ．２０００５、１９９０年、を参照せよ。所望の特性および特徴を有する感作された粒子は商業的に取得できる場合がある。
【００３２】
本発明の１の実施態様では、標準曲線（すなわち較正曲線）が関心のある被検体についてサンプルを解析する前に最初に確立される。すなわち、既知濃度の感作された粒子を用いて検定される被検体の濃度の関数として前記粒子増感アッセイ反応混合液の相対的な粒度分布の標準的な定量的な関係が確立される。当業者に周知のいずれかの方法を前記標準曲線の作成に利用してもかまわない（上記ＭａｓｓｏｎらおよびＷｉｌｋｉｎｓらを参照せよ。）
【００３３】
例えば、直接的粒子増感アッセイ法では、既知量の被検体を含む複数のサンプルが、不溶性の担体粒子上に固定された特異的な結合パートナーと接触させられる。前記サンプル中の被検体の存在は、個々の粒子の交差連結（クロスリンキング）と、さまざまな粒度の粒子の凝集体の形成とにつながる。前記被検体の濃度が増大するにつれて、凝集の程度も増大する（すなわち、特定の粒度の凝集体の数の増加および／またはより大きな粒度の凝集体の生成が起こる）。例示として、ある被検体の４つの既知濃度（０ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬおよび１０ｎｇ／ｍＬ）が既知量の感作された粒子を含む最適化されたアッセイ培養液に添加され、凝集した反応混合液の形成を可能にするように混合液がインキュベーションされる。異なる被検体濃度は、それぞれ１００％（ｘ）、［５０％（ｘ）−５０％（２ｘ）］、［１００％（２ｘ）］および「１００％（３ｘ）］の粒度分布に対応するが、ここで、ｘは前記サンプル中の粒子単量体の粒度（直径）をナノメーター（ｎｍ）で表したものである。こうして、被検体濃度対粒子分布の容量−応答曲線は前記既知量の被検体に基づいて確立される。そして、サンプル中の未知量の被検体が同一の反応条件で処理される。その後粒度分布について得られた結果が、前記サンプル中の被検体濃度を決定するために、前記標準曲線と比較される。
【００３４】
標準曲線を生成する目的のためには、相対的な粒度分布は、単位体積のサンプルあたりの粒子単量体、２量体、３量体等の比を測定することのような複数の方法で特徴付けることができる。前記標準曲線は、関心のある被検体の未知量を含むサンプルについて粒子増感アッセイを実行するときに標準として用いることができる。
【００３５】
本発明の直接的粒子増感アッセイを実行するためには、固定された被検体特異的な結合パートナーを含む感作された粒子が用意される。関心のある被検体を含むことが疑われるサンプルは、反応混合液を形成するために、アッセイ培養液中で既知量の前記感作された粒子と組み合わされる。前記反応混合液は、前記サンプル中に存在する被検体と前記固定化された結合パートナーとの間で結合が起こることを可能にし、そして、凝集した反応混合液を形成することを可能にする条件下でインキュベーションをされる。かかる反応混合液を調製しインキュベーションをする方法は、当業者に周知でありさらに詳細に説明する必要はない。いったん測定可能な反応が進行すると、前記反応混合液中の粒度分布がＰＩＤＳ法により測定される。１の実施態様では、前記反応混合液は反応フロー・セルを通るように流され、該反応フロー・セルは散乱面に対して水平および垂直な面に偏波した光のビームを通過するように前記反応混合液を流す。この実施態様では、ＰＩＤＳ測定は、粒子を含むサンプルの全て、あるいは、実質的な部分が散乱光測定が行われる反応セルを通過するような速度で反応フロー・セルを反応混合液が流れるように連続的にポンプを運転することによって、実行される。代替的には、前記サンプル、感作された粒子およびアッセイ培養液が組み合わされて、反応セル中でインキュベーションをされて、ＰＩＤＳ測定は前記反応セル中に含まれる反応混合液で行われる。
【００３６】
ＰＩＤＳ測定は、引用により具体的にここに取り込まれる米国特許第５，１０４，２２１号明細書に開示される方法に従って行われる。一般に、ＰＩＤＳ測定は、複数の波長および偏波面の組合せの光のビームを前記反応セルを通るように逐次的に照射すること、および、前記ビームの軸に対してさまざまな角度で散乱される光の平均強度を測定することにより行われる。散乱光の振幅および角度は部分的には粒度の関数である。前記反応混合液中の粒子によって散乱された光の一部は、集光レンズを通って前記さまざまな検出器の焦点表面に到達する。その結果、前記検出器の焦点表面上のそれぞれの位置が、前記反応セル中のビームの入射軸に対して単一の独自の角度で散乱された光を受け取る。前記焦点表面の小さな別々の位置での光の強度を測定することによって、前記反応セル中の粒子により散乱された光の強度／角度のプロフィールが決定できる。１の実施態様では、光は２つの偏波の組合せをそれぞれが含む３つの異なる波長を含み、散乱光は１０秒と３０秒との間の時間測定される。したがって、サンプルシステム中の大抵の粒子は照射された光のそれぞれの組合せについて感知される。
【００３７】
測定が完了するとき、それぞれの波長および偏波面で得られた平均値は逐次的にデータファイルに書き込まれる。その後、前記平均値は適当なモデル化およびデータ解析アルゴリズムを通して粒度分布を表すデータに変換される。前記粒度分布のデータは、試験サンプル中の被検体のもともとの濃度を決定するために、標準曲線と比較される。
【００３８】
粒度分布を測定するためにＰＩＤＳ法を利用することにより、本発明の方法は、非常に敏感で、１ミリリットルあたり１０−１１から１０−８グラムのような極めて低濃度のサンプル中の被検体を正確に測定するうえで効果的な改良された粒子増感アッセイ法を提供する。
【００３９】
一般に、本発明の一面は、関心のある被検体を含むかもしれないサンプルを被検体特異的な結合パートナーと接触させて反応混合液を形成すること、該被検体と粒子に結合した結合パートナーとの間の結合であって、前記粒子間の凝集を起こす結合を可能にする条件下で前記反応混合液のインキュベーションをすること、および、ＰＩＤＳ法を用いて粒度分布を測定することを含む、直接的アッセイ法を提供する。凝集した粒子の形成を可能にするいかなる条件を本発明の方法で用いてもかまわないし、かかる条件は当業者に周知である。粒子凝集の程度は、サンプル中の被検体濃度に直接比例する。
【００４０】
本発明の別の一面は、サンプル中の被検体の決定のための競合的アッセイ法を提供する。このアッセイ法では、既知量の結合パートナーが関心のある被検体を含む試験サンプルに添加される。それから、この混合液は、被検体が結合している担体粒子を含む感作された粒子と混合される。前記試験サンプル中に存在する被検体と、固定された被検体とは、前記結合パートナーと競合して反応する。前記試験サンプル中に存在する被検体の量が多いほど、感作された粒子を連結させて凝集を誘導するために利用可能な結合パートナーは少なく、粒子凝集の阻害は大きい。前記結合パートナーが前記感作された粒子凝集を阻害する程度が、前記サンプル中に存在する被検体濃度を示す。このアッセイ法では、粒子凝集の程度は前記サンプル中の被検体濃度と逆に比例する。
【００４１】
本発明は、特異的な結合パートナーが存在するか、あるいは、特異的な結合パートナーが用意できる場合がある関心のある被検体のいずれかの検出および測定に適用することができる。ここで用いられるところの「被検体」とは、サンプル中の存在および／または濃度が決定されうる物質を指す。「被検体」という用語は、特異的な結合パートナーが存在するか、あるいは、特異的な結合パートナーを用意することが可能で、前記結合パートナーとアッセイ中で結合する、いずれかの物質を指す。代表的な被検体は、抗原、ハプテン、抗体、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ホルモン、ステロイド、癌細胞マーカー、組織細胞、ウイルス、ビタミン、薬剤、代謝産物、核酸および殺虫剤を含むが、これらに限定されない。本発明に従って測定される場合がある関心のある被検体は、不溶性の粒子上に固定された結合パートナーとの接触または反応の際に、粒子増感反応を促進または阻害することができるいずれかの被検体を含む。
【００４２】
ここで用いられるところの「抗体」という用語は、外来物質の検出に反応して産生される免疫グロブリンを指し、無傷の分子とともに、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖのような機能的な断片をも含む。これらの抗体断片は、その抗原またはレセプターと選択的に結合するなんらかの能力を保持している。
【００４３】
ここで用いられるところの「サンプル」という用語は、血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、尿およびその他のタイプの液体のような生物学的な液体、細胞、組織、または関心のある被検体を含むことが疑われる物質を含むが、これらに限定されない。「細胞」とは、身体の器官その他の組織、例えば、腫瘍から得られ、細胞の懸濁液を調製することができる、いずれかのサンプルを意味する。前記サンプルは、当業者に周知な方法に従って、希釈される場合も希釈されない場合もあり、処理されない場合も処理される場合もある。かかる処理には、ｐＨ調整、分離（ろ過、遠心等）、酵素および／またはその他の化学物質での化学的な処理、物理的な処理（ホモジナイズ処理、超音波処理等）を含む。
【００４４】
１の実施態様では、本発明に有用な装置は、
（ａ）感作された粒子と関心のある被検体を含むサンプルとを反応させることにより得られる反応混合液を保持するためのサンプル・セルと、
（ｂ）第１の軸に沿って、（ｉ）該軸に対して測定された第１の角度での直線偏波面を有する少なくとも第１の成分と、
（ｉｉ）前記軸に対して測定された第２の角度での直線偏波面を有する第２の呼びかけ（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｎｇ）成分とを含む選択された波長によりそれぞれが特徴付けられた１または２以上の光ビームを用いて、前記サンプル・セルを照射する手段と、
（ｃ）前記反応混合液中の前記さまざまな粒度の粒子によって散乱された光を検出する光検出器手段と、
（ｄ）少なくとも１つの選択された波長についての前記サンプル・セル中の粒度分布を表す信号を発生させる、前記光検出器手段に結合された強度差分処理手段とを含み、
前記第１および第２の角度は、散乱面に直交または平行な面に対して対称的でない位置にあるが、前記軸とは交わり、
前記光検出器は、第１の成分からの散乱光の強度を表す第１の強度信号を発生させる手段と、第２の成分からの散乱光の強度を表す第２の強度信号とを発生させる手段とを含み、
前記強度差分処理は、第１および第２の強度信号の差を表す差分信号を発生させる手段を含む。
【００４５】
本発明の方法は、従来の光散乱法を利用する免疫アッセイ法に比べて重要な利点がある。例えば、粒子増感アッセイ反応の進行中に、感作された粒子の凝集体が大きくなり、粒子の単量体より粒度が大きい、２量体、３量体およびＮ量体を形成する。これらのより大きな複合体は、実際にもともとの感作された粒子（単量体）よりも大きい直径の粒子のようにふるまうため、散乱光の角度分布を変化させる。しかし大きい粒子は光を小さい角度で散乱し、粒度の比較的大きな変化はほんの少ししか散乱パターンを変化させない。本発明の方法は、高い角度で散乱された光を測定するＰＩＤＳ法が従来技術と比べて小さい散乱パターンの変化を検出するより敏感な手段を提供するために、先行技術のこの欠点を克服する。したがって、粒度分布を測定するためにＰＩＤＳ法を用いることは、サンプル中の関心のある被検体の量を測定するより敏感な手段を提供する。
【００４６】
本発明は、その本質的な特徴から逸脱することなく他の具体的な形態で実施される場合がある。説明された前記実施態様は、全ての点で例示としてのみ考慮されるべきであり、制限的として考慮されるべきではない。実際当業者は、過度の実験を行うことなく、ここで示された説明に基づいて更なる実施態様を思いつき、作ることができる。したがって、本発明の範囲は、上述の説明よりもむしろ添付する特許請求の範囲によって示される。前記特許請求の範囲の意味および均等の範囲内に属する全ての変更は、特許請求の範囲内に含まれる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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