(57)【要約】本発明は、天然反復タンパク質ファミリーの一つまたは複数の反復単位に由来する反復モジュールを含む反復タンパク質の集合体、上記の反復タンパク質をコードする核酸分子の集合体、そのような集合体の構築および適用方法、ならびにそのような集合体の個々のメンバーに関する。
2004508033.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各反復（ｒｅｐｅａｔ）タンパク質が、連続した反復モジュールの組（ｓｅｔ）を含む反復ドメインを含み、各反復モジュールのそれぞれが、天然反復タンパク質ファミリーの一つまたは複数の反復単位に由来し、反復単位が骨格残基および標的相互作用残基を含み、反復タンパク質が少なくとも一つの位置で異なる、反復タンパク質の集合体（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）をコードする核酸分子の集合体。
【請求項２】
反復モジュールのそれぞれがアミノ酸配列を有し、少なくとも７０％のアミノ酸残基が、
（ｉ）少なくとも二つの天然反復単位の対応する位置に見出されるアミノ酸残基から推定されるコンセンサスアミノ酸残基；または
（ｉｉ）天然反復単位内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基
のいずれかに対応する、請求項１記載の集合体。
【請求項３】
組が２個〜約３０個の反復モジュールからなる、請求項１または２記載の集合体。
【請求項４】
反復モジュールが直接結合している、請求項１から３のいずれか一項記載の集合体。
【請求項５】
反復モジュールが（ポリ）ペプチドリンカーによって結合している、請求項１から３のいずれか一項記載の集合体。
【請求項６】
反復ドメインが、反復モジュールのいずれか一つと異なるアミノ酸配列を有するＮ末端および／またはＣ末端キャッピングモジュールをさらに含む、請求項１から５のいずれか一項記載の集合体。
【請求項７】
反復単位がアンキリン反復である、請求項１から６のいずれか一項記載の集合体。
【請求項８】
反復モジュールのそれぞれが以下のアンキリン反復配列モチーフを含む、請求項７記載の集合体：
2004508033.tif 000033
式中、「ｘ」は任意のアミノ酸を意味し、「±」は任意のアミノ酸または欠失を意味し、「ａ」は無極性の側鎖を有するアミノ酸を意味し、および「ｐ」は極性側鎖を有する残基を意味する。
【請求項９】
反復モジュールのそれぞれが以下のアンキリン反復配列モチーフを含む、請求項７記載の集合体：
2004508033.tif 000034
式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸を意味する。
【請求項１０】
反復モジュールのそれぞれが以下のアンキリン反復配列モチーフを含む、請求項７記載の多様な集合体：
2004508033.tif 000035
式中、「ｘ」は任意のアミノ酸を意味する。
【請求項１１】
「ｘ」で示される一つまたは複数の位置が無作為化されている（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ）、請求項８から１０のいずれか一項記載の集合体。
【請求項１２】
反復モジュールのそれぞれがアンキリン反復配列モチーフを含む、請求項７記載の多様な集合体：
2004508033.tif 000036
式中、１はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
２はＨ、ＮおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表す。
【請求項１３】
反復単位がロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）である、請求項１から６のいずれか一項記載の集合体。
【請求項１４】
モジュールのそれぞれが以下のＬＲＲ配列モチーフを含む、請求項１３記載の集合体：
2004508033.tif 000037
式中、「ｘ」は任意のアミノ酸を意味し、「ａ」は脂肪族アミノ酸を意味し、かつ「±」は任意のアミノ酸または欠失を意味する。
【請求項１５】
モジュールの少なくとも一つが以下のＬＲＲ配列モチーフを含む、請求項１３記載の集合体：
2004508033.tif 000038
式中、「ｘ」は任意のアミノ酸を意味し、「ａ」は脂肪族アミノ酸（Ａ型ＬＲＲ）を意味する。
【請求項１６】
モジュールの少なくとも一つが以下のＬＲＲ配列モチーフを含む、請求項１３記載の集合体：
2004508033.tif 000039
式中、「ｘ」は任意のアミノ酸を意味し、「ａ」は脂肪族アミノ酸（Ｂ型ＬＲＲ）を意味する。
【請求項１７】
「ｘ」および／または「±」によって示される一つまたは複数の位置が無作為化されている、請求項１４から１６のいずれか一項記載の集合体。
【請求項１８】
Ａ型ＬＲＲコンセンサス配列における１０位のシステイン残基が親水性アミノ酸残基に置換され、かつ１７位のシステイン残基が疎水性アミノ酸残基に置換されている、請求項１５記載の集合体。
【請求項１９】
コンセンサス配列における一つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然反復単位内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基に置換されている、請求項８から１２、または１４から１８のいずれか一項記載の集合体。
【請求項２０】
組が一種類の反復モジュールからなる、請求項１から１９のいずれか一項記載の集合体。
【請求項２１】
組が二つの異なる種類の反復モジュールからなる、請求項１から１９のいずれか一項記載の集合体。
【請求項２２】
組が、反復ドメインにおける対として二つの異なる種類の連続した反復モジュールを含む、請求項２０記載の集合体。
【請求項２３】
二つの異なる種類のモジュールがＡ型ＬＲＲおよびＢ型ＬＲＲに基づく、請求項２１または２２記載の集合体。
【請求項２４】
組に含まれる反復モジュールのアミノ酸配列が、無作為化残基を除く各種類に関して同一である、請求項２０から２３のいずれか一項記載の集合体。
【請求項２５】
それぞれの種類のコピーをコードする核酸配列が、無作為化された位置におけるアミノ酸残基をコードするコドンを除いて同一である、請求項２４記載の集合体。
【請求項２６】
核酸分子が、反復モジュールのあいだに少なくとも９ヌクレオチドの同一の核酸配列を含む、請求項１から２５のいずれか一項記載の集合体。
【請求項２７】
核酸分子が、対のあいだに少なくとも９ヌクレオチドの同一核酸配列を含む、請求項２２または２３記載の集合体。
【請求項２８】
モジュールまたは対のあいだの核酸配列のそれぞれが制限酵素認識配列を含む、請求項１から２６のいずれか一項記載の集合体。
【請求項２９】
モジュールまたは対のあいだの核酸配列のそれぞれが、二つの互換的制限酵素によって作製された付着末端から形成された核酸配列を含む、請求項１から２７のいずれか一項記載の集合体。
【請求項３０】
同一の核酸配列によって、ＰＣＲに基づく核酸分子の構築（ａｓｓｅｍｂｌｙ）を行うことができる、請求項２６または２７記載の集合体。
【請求項３１】
反復ドメインが、Ａ型ＬＲＲまたはＢ型ＬＲＲに基づく一つまたは複数のモジュール対を含み、対のそれぞれが以下の配列を有する、請求項２４記載の集合体：
2004508033.tif 000040
式中、１は、群
Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、ＷおよびＹから選択されるアミノ酸残基を表し；
式中、２は、群
Ｎ、ＳおよびＴから選択されるアミノ酸残基を表し；
式中、３は、群
Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、ＨおよびＴから選択されるアミノ酸残基を表し；かつ
式中、４は、群
Ｌ、ＶおよびＭから選択されるアミノ酸残基を表す。
【請求項３２】
モジュール対のそれぞれが以下の核酸分子によってコードされる、請求項３１記載の集合体：
2004508033.tif 000041
式中、１１１は、群
Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、ＷおよびＹから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；
式中、２２２は、群
Ｎ、ＳおよびＴから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；
式中、３３３は群
Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、ＨおよびＴから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；かつ
式中、４４４は群
Ｌ、ＶおよびＭから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表す。
【請求項３３】
少なくとも一つのモジュール対における一つまたは複数のアミノ酸残基が、天然ＬＲＲ内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基に置換されている、請求項３１記載の集合体。
【請求項３４】
少なくとも一つのモジュール対における一つまたは複数のアミノ酸コドンが、天然ＬＲＲ内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基をコードするコドンに置換されている、請求項３２記載の集合体。
【請求項３５】
請求項１から３４のいずれか一項記載の核酸分子の集合体を含む組み換え型核酸分子の集合体。
【請求項３６】
請求項１から３４のいずれか一項記載の核酸分子の集合体、または請求項３５記載の組み換え型核酸分子の集合体を含むベクターの集合体。
【請求項３７】
請求項１から３４のいずれか一項記載の核酸分子の集合体、請求項３５記載の組み換え型核酸分子の集合体、または請求項３６記載のベクターの集合体を含む、宿主細胞の集合体。
【請求項３８】
請求項１から３４のいずれか一項記載の核酸分子の集合体、請求項３５記載の組み換え型核酸分子の集合体、請求項３６記載のベクターの集合体によってコードされる、または請求項３７記載の宿主細胞の集合体によって産生される、反復タンパク質の集合体。
【請求項３９】
請求項１から３４のいずれか一項記載の核酸分子の集合体を構築する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）　反復タンパク質ファミリー由来の反復単位を同定する段階；
（ｂ）　反復単位において骨格残基および標的相互作用残基を同定する段階；
（ｃ）　反復タンパク質ファミリーの少なくとも一つのメンバーからの骨格残基および無作為化標的相互作用残基を含む、少なくとも一種類の反復モジュールを推定する段階；ならびに
（ｄ）　段階（ｃ）において推定された少なくとも一種類の反復モジュールの二つまたはそれ以上のコピーを含む反復タンパク質をそれぞれがコードする核酸分子を構築する段階。
【請求項４０】
段階（ｃ）において推定された少なくとも一つの反復モジュールがアミノ酸配列を有し、少なくとも７０％のアミノ酸残基が、
（ｉ）少なくとも二つの天然反復単位の対応する位置に見出されるアミノ酸残基から推定されるコンセンサスアミノ酸残基；または
（ｉｉ）天然反復単位内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基
のいずれかに対応する、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
請求項３８記載の反復タンパク質の集合体を作製する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）請求項３７記載の宿主細胞の集合体を提供する段階；および
（ｂ）宿主細胞に含まれる核酸分子の集合体を発現させる段階。
【請求項４２】
既定の特性を有する反復タンパク質を得る方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）　請求項３８もしくは３９記載の、または請求項４１に従って産生された、反復タンパク質の集合体を提供する段階；ならびに
（ｂ）　既定の特性を有する少なくとも一つの反復タンパク質を得るために、集合体をスクリーニングする段階および／または集合体から選択する段階。
【請求項４３】
既定の特性が、標的に対する結合である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
請求項２４から３４のいずれか一項記載の集合体からの反復タンパク質。
【請求項４５】
請求項４４記載の反復タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項４６】
請求項４５記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４７】
請求項４４記載の反復タンパク質または請求項４５記載の核酸分子、ならびに選択的に、薬学的に許容される担体および／もしくは希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項４８】
核酸分子が
2004508033.tif 000042
である、請求項３１または３２記載の集合体を構築するための反復モジュール対をコードする核酸分子：
式中、１１１は群
Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、ＷおよびＹから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；
式中、２２２は群
Ｎ、ＳおよびＴから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；
式中、３３３は群
Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、ＨおよびＴから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；かつ
式中、４４４は群
Ｌ、ＶおよびＭから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、天然反復タンパク質の一つのファミリーの一つまたは複数の反復単位に由来する反復モジュールを含む反復タンパク質の集合体、上記の反復タンパク質をコードする核酸分子の集合体、そのような集合体の構築および適用方法、ならびにそのような集合体の個々のメンバーに関する。
【０００２】
本明細書において多くの文献を引用する。これらの文献の開示内容は、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００３】
タンパク質−タンパク質相互作用、またはより一般的に、タンパク質−リガンド相互作用は、全ての生物において重要な役割を果たしており、認識および結合の重要な特徴を理解することは、現在の生化学研究の一つの焦点となっている。現在まで、作製された任意の抗体および誘導体が、この研究領域において主に用いられている。しかし、抗体技術は周知の欠点を有する。例えば、抗体は細胞質が還元的環境であるために細胞内にほとんど適用できない。このように、抗体の制限を克服する特徴を有する高親和性結合分子が必要である。そのような分子は、医学、バイオテクノロジー、および研究において新しい解決策となる可能性が最も高く、細胞内結合剤も同様に、ゲノム学においてますます重要になりつつある。
【０００４】
新規結合タンパク質を構築するための様々な活動が報告されている（ＮｙｇｒｅｎおよびＵｈｌｅｎ、１９９７）。最も有望な戦略は、限定されたライブラリ作製と、所望の特性のスクリーニングまたは選択との組み合わせであるように思われる。通常、結晶構造の分析後いくつかの露出したアミノ酸残基を無作為化するために、既存の足場構造が加えられた。しかし、安定性および発現性に関する進歩にもかかわらず、これまで報告されている親和性は抗体の親和性よりかなり低い（ＫｕおよびＳｃｈｕｌｔｚ、１９９５）。拘束は、それに対する結晶構造が既知である（Ｋｉｒｋｈａｍら、１９９９）標的、または当初の標的分子と相同である標的に対する制限である可能性があるため、結合のための普遍的な足場はこれまで同定されていない。スクリーニング後に結合物質の見かけの親和性を増加させるために、いくつかのアプローチは、結合活性効果を利用するために単一の結合剤の多量体化を用いた。
【０００５】
したがって、本発明の基礎となる技術的問題は、結合タンパク質の集合体を構築するための新規アプローチを同定することである。この技術的問題の解決は、請求の範囲に特徴を示す態様を提供することによって得られる。したがって、本発明によって、反復モジュールを含む反復タンパク質の集合体を構築することができる。本発明の技術的アプローチ、すなわち、天然反復タンパク質の反復単位から上記のモジュールを誘導することは、先行技術において提供されておらず、示唆もされていない。
【０００６】
したがって、本発明は、それぞれの反復タンパク質が連続した反復モジュールの組を含む反復ドメインを含み、反復モジュールのそれぞれが天然反復タンパク質の一つのファミリーの一つまたは複数の反復単位に由来し、上記の反復単位が骨格残基および標的相互作用残基を含み、上記の反復タンパク質が、上記の標的相互作用残基の一つに対応する少なくとも一つの位置で異なる、反復タンパク質の集合体をコードする核酸分子の集合体に関する。
【０００７】
本発明の意味において、「集合体」という用語は、少なくとも二つの異なる実体またはメンバーを含む集団を意味する。好ましくは、そのような集合体は、少なくとも１０５個、より好ましくは１０７個、および最も好ましくは１０９個以上の異なるメンバーを含む。「集合体」は、「ライブラリ」または「複数（ｐｌｕｒａｒｉｔｙ）」と呼んでもよい。
【０００８】
「核酸分子」という用語は、一本鎖または二本鎖のいずれかであるリボ核酸（ＲＮＡ）、またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子であるポリヌクレオチド分子を意味する。核酸分子は、単離型で存在してもよく、または組み換え型核酸分子もしくはベクターに含まれてもよい。
【０００９】
「反復タンパク質」という用語は、一つまたは複数の反復ドメインを含む（ポリ）ペプチド／タンパク質を意味する（図１）。好ましくは、上記の反復タンパク質のそれぞれは、最大４個の反復ドメインを含む。より好ましくは、上記の反復タンパク質のそれぞれは、最大２個の反復ドメインを含む。しかし、最も好ましくは、反復タンパク質のそれぞれは、一つの反復ドメインを含む。さらに、上記の反復タンパク質は、さらに非反復タンパク質ドメイン（図２ａおよび図２ｂ）、（ポリ）ペプチドタグおよび／または（ポリ）ペプチドリンカー配列（図１）を含んでもよい。「（ポリ）ペプチドタグ」という用語は、上記アミノ酸配列が、上記の（ポリ）ペプチド／タンパク質の精製、検出、もしくはターゲティングのために利用できる、または上記のアミノ酸配列が上記の（ポリ）ペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善する、または上記のアミノ酸配列がエフェクター機能を有する、（ポリ）ペプチド／タンパク質に結合したアミノ酸配列を意味する。そのような（ポリ）ペプチドタグは、小さいポリペプチド配列、例えばＨｉｓｎ（Ｈｏｃｈｕｌｉら、１９８８；Ｌｉｎｄｎｅｒら、１９９２）、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ（Ｈｏｐｐら、１９８８；ＫｎａｐｐｉｋおよびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ、１９９４）、またはストレップ（Ｓｔｒｅｐ）タグ（ＳｃｈｍｉｄｔおよびＳｋｅｒｒａ、１９９３；ＳｃｈｍｉｄｔおよびＳｋｅｒｒａ、１９９４；Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９６）であってもよい。これらの（ポリ）ペプチドタグは全て、当技術分野で周知であり、当業者に十分に利用可能である。さらなる非反復ドメインはさらに、上記の反復タンパク質の検出を可能にする酵素（例えば、アルカリホスファターゼのような酵素）のような部分、またはターゲティングのためおよび／またはエフェクター分子として用いることができる（免疫グロブリンまたはその断片）部分であってもよい。反復タンパク質の個々のポリペプチドタグ、部分および／またはドメインは、互いに直接または（ポリ）ペプチドリンカーを通して結合してもよい。「（ポリ）ペプチドリンカー」という用語は、例えば、二つのタンパク質ドメイン、（ポリ）ペプチドタグとタンパク質ドメインまたは二つの配列タグを結合することができるアミノ酸配列を意味する。そのようなリンカー、例えば多様な長さのグリシン−セリンリンカー（例えば、ＦｏｒｒｅｒおよびＪａｕｓｓｉ、１９９８）は、関連する技術分野の当業者に既知である。
【００１０】
本発明の意味において、「（ポリ）ペプチド」という用語は、多数、すなわちペプチド結合によって結合した二つまたはそれ以上のアミノ酸の一つまたは複数の鎖からなる分子を意味する。
【００１１】
「タンパク質」という用語は、（ポリ）ペプチドの少なくとも一部がその（ポリ）ペプチド鎖（複数）の内部、および／またはあいだで二次構造、三次構造、または四次構造を形成することによって既定の三次元配置を有する、または獲得することができる（ポリ）ペプチドを意味する。タンパク質が二つまたはそれ以上の（ポリ）ペプチドを含む場合、個々の（ポリ）ペプチド鎖は、非共有結合または共有結合によって、例えば二つの（ポリ）ペプチド間のジスルフィド結合によって結合してもよい。二次または三次構造を形成することによって、既定の三次元配置を個々に有するまたは獲得することができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、関連技術分野の当業者に周知である。
【００１２】
「天然反復タンパク質ファミリー」という用語は、上記の群のメンバーが類似の反復単位を含む、天然タンパク質の群を意味する。タンパク質ファミリーは、当業者に周知である。
【００１３】
「反復ドメイン」という用語は、上記の構造単位が同じ折り畳みを有し、きちんと積み重ねられてジョイント疎水性コアを有する高次らせん構造を作製する、構造単位として二つまたはそれ以上の連続した反復単位（モジュール）を含むタンパク質ドメインを意味する（概説として、ＫｏｂｅおよびＫａｊａｖａ、２０００を参照のこと）（図１）。「構造単位」という用語は、（ポリ）ペプチド鎖に沿って互いに近位である二次構造の二つまたはそれ以上のセグメント間の三次元相互作用によって形成された（ポリ）ペプチドの局所的に構築された部分を意味する。そのような構造単位は構造モチーフを含む。「構造モチーフ」という用語は、少なくとも一つの構造単位に存在する二次構造エレメントの三次元配置を意味する。例えば、ＬＲＲタンパク質に繰り返し存在する構造モチーフは、β鎖と、ループによって結合した反対の逆平行らせんセグメントとで構成される（図４ａ）。構造モチーフは、関連技術分野の当業者に周知である。上記の構造単位のみでは、既定の三次元配置を獲得できないが、反復ドメインにおいて反復モジュールとしてそれらが連続して配置されると、隣接単位の相互安定化が起こり、上記の高次らせん構造が得られる。
【００１４】
「反復モジュール」という用語は、天然タンパク質の反復単位（図３）に由来する、本発明の集合体の核酸分子によってコードされる反復タンパク質の反復アミノ酸配列を意味する。反復ドメインに含まれるそれぞれの反復モジュールは、天然反復タンパク質の一つのファミリーの一つまたは複数の反復単位に由来する。
【００１５】
そのような「反復モジュール」は、アミノ酸残基が反復モジュールの全てのコピーに存在する位置（「固定位置」）、およびアミノ酸残基が異なるまたは「無作為化された」位置（無作為位置）を含んでもよい。
【００１６】
「反復モジュールの組」という用語は、反復ドメインに存在する反復モジュールの総数を意味する。反復ドメインに存在するそのような「反復モジュールの組」は、二つまたはそれ以上の連続した反復モジュールを含み、二つもしくはそれ以上のコピーにおいて反復モジュールの一種類のみ、またはそれぞれが一つもしくはそれ以上のコピーに存在する二つもしくはそれ以上の異なる種類のモジュールを含んでもよい。本発明による反復タンパク質の集合体は、対応する反復ドメイン１個あたり同数の反復モジュールを有する反復ドメインを含んでもよく（すなわち、反復モジュールの固定数を有する一つのセット）、または対応する反復ドメイン１個あたりの反復モジュールの数が異なる（すなわち、反復モジュールの異なる数を含む二つまたはそれ以上の組）反復ドメインを含んでもよい。
【００１７】
好ましくは、組に含まれる反復モジュールは、相同な反復モジュールである。本発明の意味において、「相同な反復モジュール」という用語は、７０％を上回る上記の反復モジュールの骨格残基が相同である反復モジュールを意味する。好ましくは、８０％を上回る上記の反復モジュールの骨格残基が相同である。最も好ましくは、９０％を上回る上記の反復モジュールの骨格残基が相同である。Ｆａｓｔａ、ＢｌａｓｔまたはＧａｐのようなポリペプチド間の相同性の百分率を決定するためのコンピュータープログラムは、関連技術分野の当業者に既知である。
【００１８】
好ましくは、本発明の反復モジュールは一つの反復単位に由来する。これは、それぞれの分子が本発明の反復ドメインをコードする核酸分子の集合体が、天然反復ドメインをコードする核酸分子のランダム変異誘発によって得られる状況を意味してもよい。このように、本発明の上記の反復ドメインは、上記のモジュールのそれぞれが上記の天然反復ドメインの対応する反復単位に由来する、反復モジュールの組を含む。エラープローン（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ（ＷｉｌｓｏｎおよびＫｅｅｆｅ、２０００）またはＤＮＡシャッフリング（ＶｏｌｋｏｖおよびＡｒｎｏｌｄ、２０００）のような核酸分子のランダム変異誘発のための方法は、関連技術分野の当業者に周知である。もう一つの状況において、単一の天然反復単位を用いて、本発明の反復配列モチーフを誘導してもよい。
【００１９】
より好ましくは、本発明の反復モジュールは、一つまたは複数の反復単位に由来する。これは、それぞれが天然反復ドメインをコードする二つまたはそれ以上の相同な核酸分子に、ＤＮＡ組み換えまたはランダムキメラ誘発を行う状況を意味してもよい（ＶｏｌｋｏｖおよびＡｒｎｏｌｄ、２０００）。このように、本発明の上記の反復ドメインは、上記のモジュールのそれぞれが上記の相同な天然反復ドメインの一つまたは複数の対応する反復単位に由来する、反復モジュールの組を含む。好ましくは、上記の相同な核酸分子は、少なくとも７５％のＤＮＡ配列同一性を有する。より好ましくは、上記の配列同一性は少なくとも８５％である。
【００２０】
最も好ましくは、本発明の反復モジュールは、二つまたはそれ以上の反復単位を用いて本発明の反復配列モチーフを誘導する、二つまたはそれ以上の反復単位に由来する。そのような誘導プロセスを実施例に示す。
【００２１】
「一つまたは複数の反復単位に由来する反復モジュール」という用語は、以下を意味する：
（ｉ）ランダム変異誘発、例えば、反復単位をコードする核酸分子のエラープローンＰＣＲによって、反復モジュールをコードする核酸分子を作製する段階を含むプロセス；
または
（ｉｉ）それぞれが反復単位をコードする二つもしくはそれ以上の相同な核酸分子のランダムキメラ誘発によって、反復モジュールをコードする核酸分子を作製する段階を含むプロセス；
または
（ｉｉｉ）天然反復タンパク質の一つもしくは複数の反復単位の分析と、反復モジュールの推定とを含むプロセス。このプロセスは以下の段階を含んでもよい：
（ａ）天然反復単位を同定する段階；
（ｂ）配列アラインメントによって最初の反復配列モチーフを決定する段階；
（ｃ）上記の反復単位の配列分析および構造分析によって、反復配列モチーフを精密化する段階；
（ｄ）（ｃ）の反復配列モチーフに従って反復モジュールを構築する段階；
または
（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、もしくは（ｉｉｉ）のプロセスの後にランダム変異誘発もしくはランダムキメラ誘発によって反復モジュールのさらなる考案を含むプロセス。
【００２２】
「反復単位」という用語は、上記の「反復単位」が多数のコピーで存在し、タンパク質の折り畳みを決定する上記のモチーフ全てに対して共通の既定の折り畳み位相学を示す、一つまたは複数の天然タンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を意味する。そのような反復単位は、骨格残基（図４ｄ）と相互作用残基（図４ｅ）とを含む。そのような反復単位の例には、ロイシンリッチ反復単位、アンキリン反復単位、アルマジロ反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、ＨＥＡＴ反復単位、およびロイシンリッチ変種反復単位（ＫｏｂｅおよびＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９９４；ＧｒｏｖｅｓおよびＢａｒｆｏｒｄ、１９９９；Ｍａｒｉｎｏら、２０００；Ｋｏｂｅ、１９９６に論評されている）が含まれる。二つまたはそれ以上のそのような反復単位を含む天然タンパク質は、「天然反復タンパク質」と呼ばれる。反復タンパク質の個々の反復単位のアミノ酸配列は、互いに比較した場合に有意な数の変異、置換、付加、および／または欠失を有してもよいが、反復単位の一般的パターン、またはモチーフをなおも実質的に保持している。
【００２３】
好ましくは、反復配列モチーフを推定するために用いられる反復単位は、反復単位が同じ構造モチーフを含み、７０％を上回る上記の反復単位の骨格残基が相同である、相同的反復単位である。好ましくは、８０％を上回る上記の反復単位の骨格残基が相同である。最も好ましくは、９０％を上回る上記の反復単位の骨格残基が相同である。
【００２４】
「反復配列モチーフ」という用語は、一つまたは複数の反復配列から推定されたアミノ酸配列を意味する。そのような反復配列は骨格残基の位置および標的相互作用残基の位置を含む。上記の骨格残基は、上記の反復単位の骨格残基の位置に対応する。上記の標的相互作用残基の位置は、上記の反復配列の標的相互作用残基の位置に対応する。そのような反復配列モチーフは、固定位置と無作為化位置とを含む。「固定位置」という用語は、上記の位置が特定のアミノ酸に設定される、反復配列モチーフにおけるアミノ酸の位置を意味する。そのような固定位置は、骨格残基の位置に対応することが最も多い。「無作為化位置」という用語は、二つまたはそれ以上のアミノ酸が上記のアミノ酸位置で容認される反復配列モチーフにおけるアミノ酸位置を意味する。そのような無作為化位置は、標的相互作用残基の位置に対応することが最も多い。しかし、骨格残基のいくつかの位置も同様に無作為化してもよい。アミノ酸配列モチーフは関連技術分野の当業者に周知である。
【００２５】
「折り畳み位相学」という用語は、上記の反復単位の三次元構造を意味する。折り畳み位相学は、αヘリックスもしくはβシートの少なくとも一部を形成するアミノ酸の枝、直鎖ポリペプチドもしくはループを形成するアミノ酸の枝、またはαヘリックス、βシート、および／もしくは直鎖状のポリペプチド／ループの任意の組み合わせによって決定されうる。
【００２６】
「連続」という用語は、上記のモジュールが縦列に配置される配置を意味する。
【００２７】
反復タンパク質において、少なくとも２個、通常は約２個〜６個、より通常は少なくとも約６個、しばしば２０個またはそれ以上の反復単位が存在する。たいていの場合、反復タンパク質は、原核細胞ならびに脊椎動物および無脊椎動物を含む真核細胞に存在する構造タンパク質および／または接着タンパク質である。アンキリンタンパク質が抗体に類似していることが示唆されている（ＪａｃｏｂｓおよびＨａｒｒｉｓｏｎ、１９９８）。
【００２８】
ほとんどの場合、上記の反復単位は、高度の配列同一性（対応する位置に同じアミノ酸残基）または配列類似性（アミノ酸残基が異なるが類似の物理化学特性を有する）を示し、アミノ酸残基のいくつかは、天然タンパク質に認められる異なる反復単位において強く保存されている重要な残基である可能性がある。
【００２９】
しかし、天然タンパク質に認められる異なる反復配列単位におけるアミノ酸の挿入および／または欠失、および／または置換による高度の配列多様性は、共通の折り畳み位相学が維持される限り可能であると考えられる。
【００３０】
Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、ＣＤ分光法のような物理化学的手段によって反復タンパク質の折り畳み位相学を直接決定する方法は、関連技術分野の当業者に周知である。反復単位もしくは反復配列モチーフを同定して決定する方法、または相同性検索（ＢＬＡＳＴ等）のような、そのような反復単位もしくはモチーフを含む関連タンパク質のファミリーを同定する方法は、生体情報学の分野において十分に確立されており、そのような技術分野の当業者に周知である。最初の反復配列モチーフを精密化する段階は、反復プロセスを含んでもよい。
【００３１】
アンキリン型反復（Ｂｏｒｋ、１９９３；Ｈｕｘｆｏｒｄら、１９９８、図２ｇおよび図２ｈを参照のこと）の結晶構造、ロイシンリッチ反復配列（ＬＲＲ）スーパーファミリー（ＫｏｂｅおよびＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９９３、図２ｃを参照のこと）および他のＬＲＲタンパク質（図２ｄ〜図２ｆを参照のこと）のリボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩ）の結晶構造が報告されている。これらの構造を詳しく調べたところ、アンキリン反復の場合には伸張した形状、またはロイシンリッチ反復の場合には馬蹄形であり、極めて大きい表面を生じることが判明した。
【００３２】
「骨格残基」という用語は、折り畳み位相学に関与する、すなわち上記の反復単位（もしくはモジュール）の折り畳みに関与する、または隣接する単位（もしくはモジュール）の相互作用に関与する、反復単位のアミノ酸残基または対応する反復モジュールの対応するアミノ酸残基を意味する。そのような関与は、反復単位（モジュール）における他の残基との相互作用（４ｄ）であってもよく、またはαヘリックスもしくはβシート、または直鎖状のポリペプチドもしくはループを形成するアミノ酸の枝に認められるポリペプチド骨格配座に及ぼす影響であってもよい。「標的相互作用残基」という用語は、標的物質との相互作用に関与する反復単位のアミノ酸残基または反復モジュールの対応するアミノ酸残基を意味する。そのような関与は、標的物質との直接相互作用であってもよく（図４ｅ）、または例えば、上記の直接相互作用残基と上記の標的との相互作用を可能にするまたは増強するために、上記の反復単位（モジュール）の（ポリ）ペプチドの配座を安定化させることによる他の直接相互作用残基に対する影響であってもよい。そのような骨格および標的相互作用残基は、先に述べた物理化学的方法によって得られる構造データの分析によって、または構造生物学および／または生体情報学における当業者に周知の既知の関連構造情報と比較することによって同定してもよい。
【００３３】
「上記の標的物質との相互作用」という用語は、標的に対する結合、上記の標的の構造変化もしくは化学反応への関与、または上記の標的の活性化であってもよいがこれらに限定されない。
【００３４】
「標的」は、核酸分子、（ポリ）ペプチドタンパク質、糖質、または他の天然分子の任意の一部、またはそのような分子の二つもしくはそれ以上の複合体を含む、そのような個々の分子であってよい。標的は、細胞全体もしくは組織試料であってもよく、または天然に存在しない分子もしくは部分であってもよい。
【００３５】
「少なくとも一つの位置で異なる」という用語は、一つ以上のアミノ酸が認められる少なくとも一つの位置を有する反復タンパク質の集合体を意味する。好ましくは、そのような位置は無作為化される。「無作為化」という用語は、集合体内で可変であり、集合体において一つ以上のアミノ酸残基によって占有される反復モジュールの位置を意味する。好ましくは、無作為化位置は、一つの反復ドメイン内の反復モジュール間でさらに変化する。好ましくは、そのような位置は完全に無作為化してもよい、すなわち天然タンパク質を形成するアミノ酸残基の完全な組によって占有されてもよい。より好ましくは、そのような位置は部分的に無作為化してもよく、すなわち天然タンパク質を形成するアミノ酸残基の完全な組のサブセットによって占有されてもよい。アミノ酸残基のサブセットは、疎水性、親水性、酸性、塩基性、芳香族、もしくは脂肪族アミノ酸の組のような共通の物理化学的特性を有するアミノ酸残基の組、システインもしくはプロリンを含まない組のような特定の望ましくないアミノ酸残基を除き全てを含むサブセット、または天然反復タンパク質における対応する位置で認められる全てのアミノ酸残基を含むサブセットであってもよい。無作為化は、標的相互作用残基のいくつか、好ましくは全てに適用してもよい。上記の反復タンパク質をコードする核酸配列のオリゴヌクレオチド特異的変異誘発を用いることによる（例えば、モノヌクレオチドまたはトリヌクレオチドの混合物を用いることによって）（Ｖｉｒｎｅｋａｓら、１９９４）ような、または上記の核酸配列の合成の際のエラープローンＰＣＲを用いることによるような、「無作為化」反復タンパク質を作製する方法は当業者に周知である。
【００３６】
好ましい態様において、上記の反復モジュールのそれぞれがアミノ酸配列を有し、少なくとも７０％のアミノ酸残基が
（ｉ）少なくとも二つの天然反復単位の対応する位置に見出されるアミノ酸残基から推定されるコンセンサスアミノ酸残基；
または
（ｉｉ）天然反復単位内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基
のいずれかに対応する。
【００３７】
「コンセンサスアミノ酸残基」は、先に定義したように決定された構造および／または配列相同性に基づいて、二つまたはそれ以上の反復単位を整列化することによって、および上記の単位におけるそれぞれの位置に関して最も頻繁なアミノ酸残基の一つを同定することによって（例を図５ａおよび図５ｂに示す）発見してもよい。上記の二つもしくはそれ以上の反復単位は、単一の反復タンパク質に含まれる反復単位から得てもよく、または二つもしくはそれ以上の反復タンパク質から得られうる。二つまたはそれ以上のアミノ酸残基が上記の二つまたはそれ以上の反復単位において類似の確率で認められれば、コンセンサスアミノ酸は、最も頻繁に認められるアミノ酸の一つ、または上記の二つもしくはそれ以上のアミノ酸残基の組み合わせであるかも知れない。
【００３８】
上記の組が２個〜約３０個の反復モジュールからなる集合体が、さらに好ましい。
【００３９】
６個〜約１５個の反復モジュールからなる組が、より好ましい。
【００４０】
本発明のさらにより好ましい態様において、上記の反復モジュールは直接結合している。
【００４１】
本発明の意味において、「直接結合する」という用語は、介在アミノ酸が存在しない反復タンパク質における直接の反復として配置される反復モジュールを意味する。
【００４２】
さらにより好ましい態様において、上記の反復モジュールは（ポリ）ペプチドリンカーによって結合される。
【００４３】
したがって、反復モジュールは、個々のモジュールを分離する介在配列としての（ポリ）ペプチドリンカーによって間接的に結合してもよい。「介在配列」は、折り畳み位相学またはモジュールの積み重ねを妨害しない個々のモジュールに結合させる任意のアミノ酸配列であってよい。選択的に、上記の介在配列は、アミノ酸残基１０個未満、さらにより好ましくは５個未満の短い（ポリ）ペプチドリンカーである。
【００４４】
本発明の集合体のさらにより好ましい態様において、各反復タンパク質のそれぞれは、上記の反復モジュールのいずれか一つと異なるアミノ酸配列を有するＮ末端および／またはＣ末端キャッピングモジュール（図１）をさらに含む。
【００４５】
「キャッピングモジュール」という用語は、上記のキャッピングモジュールが上記の反復モジュールと堅固な三次相互作用を形成して、それによって連続する反復モジュールに接していない側の上記の反復モジュールの疎水性コアを溶媒から保護するキャップを提供する、反復ドメインのＮ末端またはＣ末端反復モジュールに融合したポリペプチドを意味する（図１）。
【００４６】
上記のＮ末端および／またはＣ末端キャッピングモジュールは、キャッピング単位（図３）、または天然反復タンパク質において反復単位に隣接して認められる他のドメインであってもよく、またはそれらに由来してもよい。「キャッピング単位」という用語は、上記の（ポリ）ペプチドが反復単位にＮ末端またはＣ末端で融合する特定の構造単位を定義する、上記の（ポリ）ペプチドが上記の反復単位と堅固な三次相互作用を形成して、それによって、上記の反復単位の一つの側の疎水性コアを溶媒から保護するキャップを提供する、天然の折り畳まれた（ポリ）ペプチドを意味する。そのようなキャッピング単位は、上記の反復配列モチーフに対して配列類似性を有してもよい。
【００４７】
好ましい態様において、本発明は、上記の反復単位がアンキリン反復単位である、核酸分子の集合体に関する。
【００４８】
アンキリン反復タンパク質の特徴は論評されており（ＳｅｄｇｗｉｃｋおよびＳｍｅｒｄｏｎ、１９９９）、一つの最小の折り畳み単位が調べられている（ＺｈａｎｇおよびＰｅｎｇ、２０００）。アンキリン反復タンパク質は、ある程度詳細に調べられており、このデータを用いて本発明による反復タンパク質の構築を例示することができる。
【００４９】
アンキリン反復タンパク質は、酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、および線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）におけるそのような四つのタンパク質のあいだの配列比較によって１９８７年に同定された。ブリーデン（Ｂｒｅｅｄｅｎ）およびナスミス（Ｎａｓｍｙｔｈ）は、ｓｗｉ６ｐ、ｃｄｃ１０ｐ、ｎｏｔｃｈおよびｌｉｎ−１２の配列においておよそ３３残基の反復単位の多数のコピーを報告した（ＢｒｅｅｄｅｎおよびＮａｓｍｙｔｈ、１９８７）。アンキリンタンパク質におけるこの反復単位の２４コピーがその後発見されたことによって、この反復単位の名称はアンキリン反復となった（Ｌｕｘら、１９９０）。後に、この反復単位は、異なる生物およびウイルスの数百ものタンパク質において同定された（Ｂｏｒｋ、１９９３；ＳＭＡＲＴデータベース、Ｓｃｈｕｌｔｚら、２０００）。これらのタンパク質は核、細胞質、または細胞外間隙に存在する。このことは、これらのタンパク質のアンキリン反復ドメインがジスルフィド架橋とは無関係であること、そしてこのように環境の酸化状態とは無関係であるという事実と一致する。タンパク質当たりの反復単位の数は、２個〜２０個を上回る（ＳＭＡＲＴデータベース、Ｓｃｈｕｌｔｚら、２０００）。安定な折り畳まれたドメインを形成するために、最小数の反復単位が必要であるように思われる（ＺｈａｎｇおよびＰｅｎｇ、２０００）。一方、一つの折り畳まれたドメインに存在する６個の反復単位の上限に関しても何らかの証拠がある（ＭｉｃｈａｅｌｙおよびＢｅｎｎｅｔ、１９９３）。
【００５０】
これまでに決定されたアンキリン反復単位の三次構造は、二つの逆平行αヘリックスが続き、反復単位を次の反復単位に結合するループで終わるβ−ヘアピンからなる共通の折り畳み構造（ＳｅｄｇｗｉｃｋおよびＳｍｅｒｄｏｎ、１９９９）を共有する（図４ｃ）。アンキリン反復単位で構築されるドメインは、反復単位を積み重ねて、より伸張した湾曲した構造を形成することによって形成される。これは、図２ｈにおけるマウスＧＡ結合タンパク質β１サブユニットの構造によって説明される。
【００５１】
アンキリン反復ドメインを含むタンパク質は、しばしばさらなるドメインを含む（ＳＭＡＲＴデータベース、Ｓｃｈｕｌｔｚら、２０００）。後者のドメインは、多様な機能を有するが、アンキリン反復タンパク質ドメインの機能は、いくつかの例が示すように最もしばしば他のタンパク質との結合である（Ｂａｔｃｈｅｌｏｒら、１９９８；ＧｏｒｉｎａおよびＰａｖｌｅｔｉｃｈ、１９９６；Ｈｕｘｆｏｒｄら、１９９９；ＪａｃｏｂｓおよびＨａｒｒｉｓｏｎ、１９９９；Ｊｅｆｆｒｅｙら、２０００）。これらのタンパク質の反復単位を分析する場合、標的相互作用残基は主にβヘアピンおよび第一のαヘリックスの露出した一部において認められる（図４ｃ）。したがって、これらの標的相互作用残基は、アンキリン反復ドメイン上で大きい接触表面を形成する。この接触表面は、αヘリックス１、αヘリックス２およびループの積み重ね単位の骨格構築上で露出している（図４ｃ）。反復単位５個からなるアンキリン反復タンパク質に関して、他のタンパク質に接触するこの相互作用表面は、約１２００Å２である。そのような大きい相互作用表面は、標的分子に対する高親和性を得るために都合がよい。例えば、ＩｋＢａ（アンキリン反復単位６個のドメインを含む）のＮＦ−κＢヘテロダイマーに対する親和性は、ＫＤ＝３ｎＭ（Ｍａｌｅｋら、１９９８）であるのに対し、ヒトＧＡ結合タンパク質β１の、そのα単位に対する解離定数はＫＤ＝０．７８ ｎＭである（Ｓｕｚｕｋｉら、１９９８）。広く用いられている抗体と比較して、本発明によるアンキリン反復タンパク質を用いる長所は、それらが可溶性の、単量体で安定な分子として大量に組み換え型で発現できるという点である（実施例２）。
【００５２】
上記の反復モジュールのそれぞれが、以下のアンキリン反復コンセンサス配列を含む集合体がさらに好ましい：
2004508033.tif 000003
式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸を意味し、「±」は任意のアミノ酸または欠失を意味し、「ａ」は、無極性側鎖を有するアミノ酸を意味し、および「ｐ」は、極性側鎖を有する残基を意味する。「ｘ」で示される一つまたは複数の位置が無作為化されている集合体が最も好ましい。
【００５３】
上記の反復モジュールのそれぞれが以下のアンキリン反復コンセンサス配列を含む集合体が特に好ましい：
2004508033.tif 000004
式中、「ｘ」は任意のアミノ酸を意味する。
【００５４】
上記の反復モジュールのそれぞれが以下のアンキリン反復配列モチーフを含む多様な集合体がさらにより好ましい：
2004508033.tif 000005
式中、「ｘ」は任意のアミノ酸を意味する。
【００５５】
上記の反復モジュールのそれぞれが以下のアンキリン反復配列モチーフを含む、多様な集合体がさらにより好ましい：
2004508033.tif 000006
式中、１は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
式中、２は、Ｈ、ＮおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表す。
【００５６】
さらに好ましい態様において、本発明は、上記の反復単位がロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）である核酸分子の集合体に関する。
【００５７】
ＬＲＲ反復の特徴および特性は論評されている（ＫｏｂｅおよびＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９９４）。ＬＲＲタンパク質はある程度詳細に研究されており、そのデータを用いて反復タンパク質の挙動を例示することができる。
【００５８】
ＬＲＲタンパク質は、２位、５位、７位または１２位でロイシンまたは他の疎水性残基の高度に保存されたコンセンサスによって同定されている（図４ｂ）。しかし、このアミノ酸分布パターンの重要性は、ＬＲＲの最初の構造であるリボヌクレアーゼ阻害剤タンパク質が溶解している場合に限って理解されていた（図２ｃ）。最近、さらなるＬＲＲ結晶構造が解明されている（図２ｄ〜図２ｆ）。典型的なアンキリン反復ドメインタンパク質の構造を比較のために示す（図２ｇ）。単一のＬＲＲは常に、ロイシンまたは他の脂肪族残基のみからなるコアを取り巻く（Ｋａｊａｖａ、１９９８）β鎖および逆平行αヘリックス（独自のα／β襞、図４ａ）に対応すると仮定されている。リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩ）であるＬＲＲタンパク質の全体的な形状は、Ａ型（アミノ酸２９個）とＢ型（アミノ酸２８個）が厳密に交互する縦列の相同な反復１５個によって形成された馬蹄形である（図２ｃ）と記述されうる。タンパク質の交互の特性は、配列が分析された時期に既に認識されていた（図５ａ（Ｌｅｅら、１９８８））。
【００５９】
興味深いことに、哺乳類のＲＩはその標的タンパク質に対する極端な親和性を特徴とする。ヒトＲＩに対するＲＮａｓｅＡの結合に関して、Ｋｉ＝５．９×１０−１４ Ｍ（ＫｏｂｅおよびＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９９６）が報告されているが、アンジオゲニンは、ブタＲＩによってＫｉ＝７．１×１０−１６ Ｍで阻害され、このように、これはタンパク質間で既知の最も強力な相互作用の一つとなることが判明した。最もよく結合する抗体でさえも、親和性の特徴は１．５×１０−１１ Ｍまでである（Ｙａｎｇら、１９９５）。顕著な親和性をよりよく理解するために、二つのＲＩをその標的タンパク質と共に同時結晶した。結晶構造のその後の分析によって、相互作用が主に静電気的であり（ＫｏｂｅおよびＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９９６）、関係するアミノ酸は主に内側のβシートおよび各単位をそのαヘリックスに結合させるループから出ていることが主に認められた（図４ｂ、ＫｏｂｅおよびＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９９５）。その上、馬蹄形の襞の幅は、標的タンパク質に適応するようにわずかに変化することができる（ＫｏｂｅおよびＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９９４）。標的と阻害剤との界面は、相互作用の「パッチワーク」からなり、堅固な会合は、標的タンパク質が馬蹄形内部に結合している場合、形状の相補性よりむしろ埋もれた大きい表面積（約２５５０Ａ２）に由来する（ＫｏｂｅおよびＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９９６）。
【００６０】
ＲＩに対するＲＮａｓｅＡとアンジオゲニン（わずか３０％の配列同一性を有する二つの分子）の詳細な結合を比較すると、有意な差が明らかとなった（ＣｈｅｎおよびＳｈａｐｉｒｏ、１９９７）。ＲＩの側ではほぼ同じ残基が関係しているが、標的タンパク質の残基は、相同ではないか、または異なる種類の結合を用いた（Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕら、１９９７）。言い換えれば、ＲＩは、残基の最適な相補性よりむしろ正しい幾何学的方向に提示される多数の接触に基づいて、異なる標的分子にそれを結合させて、それを阻害させるように進化した。これは、新しい結合特異性を有する新しい結合分子を設計するための基礎である。形状は大きい表面を認識するように予め運命が決まっているように思われ、それによって抗体の比較的小さい「可変の」ドメインと比較して、はるかに多様なランダムアミノ酸にライブラリを作製させることができる。しかし、抗体のループは、小さいハプテンまたは深い溝を認識しなければならない場合には、優れているように思われる。さらに、反復そのものを変化させることができるのみならず、その数も標的分子に依存しうる。
【００６１】
上記のモジュールのそれぞれが以下のＬＲＲコンセンサス配列を含む集合体が、さらに好ましい：
2004508033.tif 000007
式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸を意味し、「ａ」は脂肪族アミノ酸、および「±」
は任意のアミノ酸または欠失を意味する。
【００６２】
「脂肪族アミノ酸」という用語は、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、およびバリンの一覧から得られるアミノ酸を意味する。
【００６３】
上記のモジュールの少なくとも一つが以下のＬＲＲコンセンサス配列を含む集合体が、特に好ましい：
2004508033.tif 000008
式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸を意味し、「ａ」は脂肪族アミノ酸（Ａ型ＬＲＲ）を意味する。
【００６４】
さらに、上記のモジュールの少なくとも一つがＬＲＲコンセンサス配列を含む集合体が特に好ましい：
2004508033.tif 000009
式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸を意味し、「ａ」は脂肪族アミノ酸（Ｂ型ＬＲＲ）を意味する。
【００６５】
「ｘ」および／または「±」で示される一つまたは複数の位置が無作為化されている集合体が最も好ましい。
【００６６】
Ａ型ＬＲＲコンセンサス配列における１０位のシステイン残基が親水性のアミノ酸残基に置換され、１７位のシステイン残基が疎水性アミノ酸残基に置換されている集合体がさらに好ましい。
【００６７】
親水性アミノ酸残基は、セリン、トレオニン、チロシン、グルタミン、およびアスパラギンのリストから得られうる。
【００６８】
疎水性アミノ酸残基は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのリストから得られうる。
【００６９】
一本鎖Ｆｖまたは従来の抗体と比較すると、いくつかの長所を列挙することができる。ジスルフィド架橋は、ほとんどの抗体の安定性のために必須であるが（Ｐｒｏｂａら、１９９７）、ＬＲＲタンパク質ではジスルフィド結合は必要でなく、このため細胞内への適用が可能となる。
【００７０】
したがって、還元環境において適用するために新しい結合分子を作製することができる。これは、サイトゾルにおける直接阻害によって、ゲノムシークエンシングプロジェクトによって同定された多数のタンパク質の機能を解明するための極めて強力なツールとなりうる。バイオテクノロジーでは多くの適用に関して、発現されたおよび正確に折り畳まれたタンパク質の大量が必要であり、大腸菌における産生は好ましいが、酸化的細胞外環境において放出された抗体にとって非常に難しい。対照的に、ＲＩ変種の折り畳みまたはひだの再形成は、それらが本来サイトゾルにおいて認められるためにより効率的である（実施例１を参照のこと）。
【００７１】
本発明による集合体のさらに好ましい態様において、上記のアンキリンまたはＬＲＲ反復モジュールにおけるアミノ酸残基の一つまたは複数が、対応する天然反復単位の対応する位置に見出されるアミノ酸残基に置換されている。
【００７２】
好ましくは、３０％までのアミノ酸残基、より好ましくは２０％まで、および最も好ましくは１０％までのアミノ酸残基が置換される。
【００７３】
上記の組が反復モジュールの一種類からなる集合体が特に好ましい。
【００７４】
「反復モジュールの種類」という用語は、モジュールの長さ、その「固定位置」のみならずその「無作為化位置」の数および組成によって決定されたモジュールの特徴を意味する。「異なる種類のモジュール」は、上記の特徴の一つまたは複数が異なっていてもよい。
【００７５】
上記の組が二つの異なる種類の反復モジュールからなる集合体が、さらに好ましい。
【００７６】
さらにより好ましい態様において、本発明は、上記の組が上記の反復タンパク質における対として連続した反復モジュールの二つの異なる型を含む集合体に関する。
【００７７】
上記の二つの異なる種類のモジュールが上記のＡ型ＬＲＲおよびＢ型ＬＲＲに基づく集合体が最も好ましい。
【００７８】
上記の組に含まれる反復モジュールのアミノ酸配列が無作為化残基を除いてそれぞれの上記の種類に関して同一である集合体がさらに好ましい。
【００７９】
それぞれの上記の種類のコピーをコードする核酸配列が、無作為化された位置におけるアミノ酸残基をコードするコドンを除いて同一である集合体がさらにより好ましい。
【００８０】
上記の反復タンパク質をコードする核酸分子が上記の反復モジュールのあいだに少なくとも９ヌクレオチドの同一の核酸配列を含む集合体が特に好ましい。
【００８１】
上記の「少なくとも９ヌクレオチドの同一の核酸配列」は、一つのみの反復モジュールの末端の一部であってもよく、隣接する二つの反復モジュールの両端によって形成されてもよく、または二つの反復モジュールを結合する（ポリ）ペプチドリンカーの一部であってもよい。
【００８２】
本発明によるさらに好ましい集合体において、上記の反復タンパク質をコードする核酸分子は、対のあいだに少なくとも９ヌクレオチドの同一の核酸配列を含む。
【００８３】
上記の「少なくとも９ヌクレオチドの同一の核酸配列」は、反復モジュールの唯一の対の末端の一部であってもよく、反復モジュールの二つの隣接する対の両端によって形成されてもよく、または反復モジュールの二つの対を結合する（ポリ）ペプチドリンカーの一部であってもよい。
【００８４】
上記のモジュールまたは上記の対のあいだの核酸配列のそれぞれが制限酵素認識配列を含む集合体が最も好ましい。
【００８５】
「制限酵素認識配列」という用語は、制限エンドヌクレアーゼによって認識されて切断される核酸配列を意味する。上記の制限酵素認識配列は、３’末端および５’末端のあいだで対称的に分割されてもよく（例えば、両末端に６塩基対認識配列の３ヌクレオチド）、または非対称的であってもよい（一方の末端に２ヌクレオチド、もう一方の末端に４ヌクレオチド）。
【００８６】
上記のモジュールまたは上記の対のあいだの核酸配列のそれぞれが、二つの互換的制限酵素によって作製された付着末端から形成される核酸配列を含む集合体が特に好ましい。
【００８７】
「互換的制限酵素」という用語は、異なる認識配列を有するが、二本鎖ＤＮＡを切断する場合に互換的付着末端を形成する制限酵素を意味する。二つの互換的制限酵素から生じた付着末端二本鎖ＤＮＡ断片の再ライゲーション後、産物ＤＮＡは、もはや双方の制限酵素の認識配列を示さない。
【００８８】
本発明の集合体のさらに最も好ましい態様において、上記の同一の核酸配列によって、上記の反復タンパク質をコードする核酸分子のＰＣＲに基づく構築が可能となる。
【００８９】
本発明による集合体の最も好ましい態様において、上記の反復タンパク質は、上記の対のそれぞれが以下の配列を有する、上記のＡ型ＬＲＲおよびＢ型ＬＲＲに基づく一つまたは複数のモジュール対を含む：
2004508033.tif 000010
式中、１は、群
Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、ＷおよびＹから選択されるアミノ酸残基を表し；
式中、２は群
Ｎ、ＳおよびＴから選択されるアミノ酸残基を表し；
式中、３は、群
Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、ＨおよびＴから選択されるアミノ酸残基を表し；かつ
式中、４は、群
Ｌ、ＶおよびＭから選択されるアミノ酸残基を表す。
【００９０】
最も好ましくは、上記のモジュール対のそれぞれは、以下の核酸分子によってコードされる：
2004508033.tif 000011
式中、１１１は群
Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、ＷおよびＹから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；
式中、２２２は群
Ｎ、ＳおよびＴから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；
式中、３３３は群
Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、ＨおよびＴから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し
；かつ
式中、４４４は群
Ｌ、ＶおよびＭから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表す。
【００９１】
もう一つの好ましい態様において、上記の少なくとも一つのモジュール対におけるアミノ酸残基の一つまたは複数は、天然ＬＲＲ内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基によって置換されている。
【００９２】
さらにもう一つの好ましい態様において、上記の少なくとも一つのモジュール対におけるアミノ酸コドンの一つまたは複数は、天然ＬＲＲ内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換されている。好ましくは、アミノ酸残基またはアミノ酸コドンがそれぞれ３０％まで、より好ましくは２０％まで、および最も好ましくは１０％まで置換されている。
【００９３】
さらにもう一つの好ましい態様において、上記の少なくとも一つのモジュール対におけるアミノ酸コドンの一つまたは複数は、天然ＬＲＲ内の対応する位置において認められるアミノ酸残基をコードするコドンによって置換されている。
【００９４】
さらに好ましい態様において、本発明は、本発明による核酸分子の集合体を含む組み換え型核酸分子の集合体に関する。
【００９５】
本発明の意味において、「組み換え型核酸分子」という用語は、上記の反復タンパク質をコードする核酸配列およびさらに核酸配列、例えば非コード配列を含むＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を意味する。
【００９６】
さらにより好ましい態様において、本発明は、本発明による核酸分子の集合体、または本発明による組み換え型核酸分子の集合体を含むベクターの集合体に関する。
【００９７】
本発明によるベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、またはウイルスもしくはバクテリオファージに基づくベクターであってもよく、およびクローニングまたはシークエンシングベクターであってもよく、または好ましくは原核もしくは真核細胞発現系のいずれかにおいて上記のベクターから核酸分子の発現にとって必要な全ての要素を含む発現ベクターであってもよい。核酸分子をクローニング、シークエンシング、および発現するためのベクターは、当業者に周知である。本発明の核酸分子を含むベクターは、細胞宿主の種類に応じて変化する周知の方法によって宿主細胞に移入することができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションは、原核細胞に一般的に用いられるが、例えばリン酸カルシウムもしくはＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクションまたはエレクトロポレーションは、他の細胞宿主のために用いてもよい；例えば、サムブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、１９８９）を参照のこと。
【００９８】
そのようなベクターは、適した宿主細胞および適した条件下において上記のベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子のようなさらなる遺伝子を含んでもよい。好ましくは、本発明の核酸分子は、原核または真核細胞における発現を可能にする発現制御配列に機能的に結合する。上記の核酸分子の発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへのポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳類細胞における発現を確実にする調節エレメントは、当業者に周知である。それらは通常、転写の開始を確実にする調節配列、ならびに選択的に転写の終了および転写物の安定化を確実にするポリＡシグナル、および／または上記の核酸分子の発現をさらに増強するイントロンを含む。さらなる調節エレメントには、転写と共に翻訳エンハンサー、および／または天然に会合するまたは異種プロモーター領域が含まれてもよい。原核宿主細胞における発現を可能にする可能性がある調節エレメントは、例えば、大腸菌におけるｐＬ、ｌａｃ、ｔｒｐ、またはｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞における発現を可能にする調節エレメントの例は、ＡＯＸ１または酵母のＧＡＬ１プロモーター、またはＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー、または哺乳類および他の動物細胞におけるグロビンイントロンである。転写の開始に関与するエレメントの他に、そのような調節エレメントはまた、ＳＶ４０−ポリＡ部位またはｔｋ−ポリＡ部位のような転写終了シグナルを、核酸分子の下流に含んでもよい。さらに、用いられる発現系に応じて、（ポリ）ペプチドを細胞区画に向けて、それを培地に分泌させることができるリーダー配列を、本発明の核酸分子のコード配列に加えてもよく、それらは当技術分野で周知である。リーダー配列（複数）は、翻訳、開始および終了配列、ならびに好ましくは翻訳されたタンパク質またはその一部のペリプラスム間隙または細胞外培地への分泌を指示することができるリーダー配列と共に適当な相で構築される。選択的に、異種配列は、所望の特徴、例えば発現された組み換え産物の安定化または精製の単純化を付与するＣ末端またはＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードすることができる。この意味において、オカヤマ−ベルグｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（ファルマシア社）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン社）、ｐＳＰＯＲＴ１（ギブコＢＲＬ社）、もしくはｐＣＩ（プロメガ社）、またはより好ましくはｐＴＦＴ７４（Ｇｅら、１９９５）もしくはｐＱＥシリーズ（キアゲン社）のメンバーのような適した発現ベクターは、当技術分野において既知である。さらに、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子操作において従来用いられているベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、およびバクテリオファージに関する。好ましくは、上記のベクターは発現ベクターである。当業者に周知の方法を用いて、組み換え型ウイルスベクターを構築することができる；例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）、Ｎ．Ｙ．）、およびアウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（「分子生物学の現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））に記載される技術を参照のこと。
【００９９】
さらに、本発明は、本発明による核酸分子の集合体を含む宿主細胞の集合体、本発明による組み換え型核酸分子の集合体、または本発明によるベクターの集合体に関する。
【０１００】
本発明の意味において、「宿主細胞」という用語は、大腸菌（Ｇｅら、１９９５）または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（Ｗｕら、１９９３ａ）のような細菌、酵母のような真菌（Ｈｏｒｗｉｔｚら、１９８８；Ｒｉｄｄｅｒら、１９９５）、または糸状菌（Ｎｙｙｓｓｏｎｅｎら、１９９３）、植物細胞（Ｈｉａｔｔ、１９９０；ＨｉａｔｔおよびＭａ、１９９３；Ｗｈｉｔｅｌａｍら、１９９４）、昆虫細胞（Ｐｏｔｔｅｒら、１９９３；Ｗａｒｄら、１９９５）、または哺乳類細胞（Ｔｒｉｌｌら、１９９５）を含むがこれらに限定されない、異種タンパク質を産生するために一般的に用いられる任意のものであってもよい。
【０１０１】
もう一つの態様において、本発明は、本発明による核酸分子の集合体、本発明によるベクターの集合体によってコードされる、または本発明による宿主細胞の集合体によって産生された反復タンパク質の集合体に関する。
【０１０２】
さらに、本発明は、本発明による核酸分子の集合体の構築方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）反復タンパク質ファミリー由来の反復単位を同定する段階；
（ｂ）上記の反復単位において骨格残基および標的相互作用残基を同定する段階；
（ｃ）上記の反復タンパク質ファミリーの少なくとも一つのメンバーからの骨格残基および無作為化標的相互作用残基を含む少なくとも一種類の反復モジュールを推定する段階；ならびに
（ｄ）それぞれが、段階（ｃ）において推定された反復モジュールの上記の少なくとも一種類の二つまたはそれ以上のコピーを含む反復タンパク質をコードする核酸分子を構築する段階。
【０１０３】
本発明の方法を行う様式を、本発明の核酸分子の集合体の態様に関連して上記に説明する。そのような二つの様式の説明を実施例において説明する。
【０１０４】
本発明の方法の好ましい態様において、段階（ｃ）において推定された上記の少なくとも一つの反復モジュールがアミノ酸配列を有し、少なくとも７０％のアミノ酸残基が、
（ｉ）少なくとも二つの天然反復単位の対応する位置に見出されるアミノ酸残基から推定したコンセンサスアミノ酸残基、または
（ｉｉ）天然反復単位内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基
のいずれかに対応する。
【０１０５】
本発明による（ポリ）ペプチド／タンパク質の集合体の産生方法であり、以下の段階を含む方法がさらに好ましい：
（ａ）本発明による宿主細胞の集合体を提供する段階；および
（ｂ）上記の宿主細胞に含まれる核酸分子の集合体を発現させる段階。
【０１０６】
以下の段階を含む既定の特性を有する反復タンパク質を得る方法が特に好ましい：
（ａ）本発明による反復タンパク質の集合体を提供する段階、および
（ｂ）上記の既定の特性を有する少なくとも一つの反復タンパク質を得るために、上記の集合体をスクリーニングする段階および／または上記の集合体から選択する段階。
【０１０７】
反復タンパク質の多様な集合体は、用いられるスクリーニングおよび／または選択系に従っていくつかの方法によって提供してもよく、バクテリオファージ（国際公開公報第９０／０２８０９号；Ｓｍｉｔｈ、１９８５；Ｋａｙら、１９９６；Ｄｕｎｎ、１９９６）、または細菌細胞（国際公開公報第９３／１０２１４号）の表面上でのディスプレイ、リボソームディスプレイ（国際公開公報第９１／０５０５８号；国際公開公報第９８／４８００８号；Ｈａｎｅｓら、１９９８）、プラスミド上のディスプレイ（国際公開公報第９３／０８２７８号）などの方法を用いること、または共有結合ＲＮＡ−反復タンパク質ハイブリッド構築物を用いることによって（国際公開公報第００／３２８２３号）、タンパク質相補性アッセイ（国際公開公報第９８／３４１１２０号；Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、１９９８）によるような細胞内発現および選択／スクリーニングのような方法を用いることを含んでもよい。これらの全ての方法において、反復タンパク質は、核酸分子の対応する集合体の発現の後に反復タンパク質のスクリーニングを行い、その後反復タンパク質に関連した遺伝情報によって所望の特性を有する一つまたは複数の反復タンパク質を同定することによって提供される。
【０１０８】
本発明の意味において、「既定の特性」という用語は、反復タンパク質の集合体からの反復タンパク質の一つが有する特性、および集合体のスクリーニングおよび／または選択のための基礎を形成する特性を意味する。そのような特性は、標的に対する結合、標的の阻害、標的媒介反応の活性化、酵素活性のような特性、および当業者に既知のさらなる特性を含む。所望の特性の種類に応じて、当業者は、フォーマット、およびスクリーニングおよび／または選択を行うための必要な段階を同定することができると考えられる。
【０１０９】
最も好ましくは、本発明は、上記の既定の特性が標的に対する結合である方法に関する。
【０１１０】
もう一つの態様において、本発明は、本発明による集合体からの反復タンパク質に関する。
【０１１１】
好ましくは上記の反復タンパク質は、上記の方法によって得られ、既定の特性の一つを有する。
【０１１２】
さらに、本発明は、本発明による反復タンパク質をコードする核酸分子に関する。
【０１１３】
さらにもう一つの態様において、本発明は、本発明による核酸分子を含むベクターに関する。
【０１１４】
本発明は、本発明の集合体からの反復タンパク質、または上記の反復タンパク質をコードする核酸分子、および選択的に薬学的に許容される担体および／または希釈剤を含む薬学的組成物にも関する。
【０１１５】
適した薬学的担体の例は、当技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩液、水、油／水乳剤のような乳剤、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液等が含まれる。そのような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって調製することができる。これらの薬学的組成物は、適した用量で被験者に投与することができる。適した組成物の投与は、異なる方法で、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、鼻腔内、または気管支内投与によって行ってもよい。投与レジメは主治医および臨床要因によって決定されると考えられる。医学の技術分野において周知であるように、患者への任意の用量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与すべき特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、全身健康状態、および同時投与される他の薬剤を含む多くの要因に依存する。典型的な用量は例えば、０．００１〜１０００μｇ（またはこの範囲の発現または発現の阻害に関して核酸の）となりうるが、特に上記の要因を考慮してこの例となる範囲より下または上の用量が想定される。一般的に、薬学的組成物の定期的な投与としての療法は、１μｇ〜１０ ｍｇ単位／日の範囲でありうる。療法が持続的注入の場合、同様に１μｇ〜１０ ｍｇ単位／ｋｇ体重／分の範囲でありうる。定期的な評価によって進行をモニターすることができる。用量は変更するが、ＤＮＡの静脈内投与の好ましい用量は、ＤＮＡ分子約１０６コピー〜１０１２コピーである。本発明の組成物は、局所または全身投与してもよい。投与は、一般的に非経口投与、例えば静脈内投与でありうる。ＤＮＡはまた、例えば内部もしくは外部標的に対するバイオリスティック輸送によって、または動脈内の部位にカテーテルによって、標的部位に直接投与してもよい。非経口投与のための調製物には、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルである。水性担体には、生理食塩液および緩衝培地を含む、水、アルコール／水性溶液、乳液、または懸濁液が含まれる。非経口媒体には、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、または固定油が含まれる。静脈内媒体には、液体および栄養補給剤、電解質補給剤（リンゲルデキストロースに基づく補給剤のような）等が含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス等のような保存剤および他の添加剤も同様に存在してもよい。さらに、本発明の薬学的組成物は、薬学的組成物の意図する用途に応じて、インターロイキン、またはインターフェロンのような物質をさらに含んでもよい。
【０１１６】
本発明の薬学的組成物に含まれる反復タンパク質は、共有または非共有結合によって結合されるさらなるドメインを含みうる。結合は、当技術分野で既知の方法および上記の方法に従って、遺伝的融合に基づくことができ、例えば、国際公開公報第９４／０４６８６号に記載されるような例えば化学的クロスリンクによって行うことができる。本発明に従って用いられるペプチド、ポリペプチド、または抗体を含む融合タンパク質に存在するさらなるドメインを、好ましくは、ポリペプチドリンカーが上記のさらなるドメインのＣ末端と反復タンパク質のＮ末端とのあいだ、またはその逆の距離に及ぶほど十分な長さの複数の疎水性のペプチド結合アミノ酸を含む、柔軟なリンカー、都合がよいのはポリペプチドリンカーによって結合してもよい。上記の融合タンパク質はさらに、切断可能なリンカーまたはプロテナーゼの切断部位を含んでもよい。
【０１１７】
さらに、上記のさらなるドメインは、既定の特異性または機能を有するドメインであってもよい。この意味において、本発明による薬学的組成物に存在する反復タンパク質は、当技術分野で既知の従来の方法によってさらに改変してもよい。これによって、本発明の反復タンパク質と、他の機能的アミノ酸配列、例えば異種タンパク質に由来してもよい核局在シグナル、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ホルモン結合ドメイン、タンパク質タグ（ＧＳＴ、ＧＦＰ、ｈ−ｍｙｃペプチド、ＦＬＡＧ、ＨＡペプチド）とを含む融合タンパク質を構築することができる。このように、本発明の組成物の投与は、標識のみならず非標識（ポリ）ペプチドまたは抗体を利用することができる。
【０１１８】
上記の核酸分子が
2004508033.tif 000012
である、本発明による集合体を構築するために反復モジュール対をコードする核酸分子がさらに好ましい：
式中、１１１は群
Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、ＷおよびＹから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；
式中、２２２は群
Ｎ、ＳおよびＴから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；
式中、３３３は群
Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、ＨおよびＴから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し
；かつ
式中、４４４は群
Ｌ、ＶおよびＭから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表す。
【０１１９】
これらおよび他の態様は、本発明の説明および実施例によって開示され、含まれる。本発明に従って用いられる任意の方法、用途、および化合物に関するさらなる文献を、例えば電子装置を用いて公共のライブラリから検索してもよい。例えば、インターネット上で利用できるデータベース「ＰｕｂＭｅｄ」（Ｓｅｑｕｅｉｒａら、２００１）を利用してもよい。
【０１２０】
バイオテクノロジーにおける特許情報の概要、ならびにレトロスペクティブ検索にとっておよび現在の認識にとって有用な特許情報の調査または関連起源は、バークス（Ｂｅｒｋｓ、１９９４）に示される。
【０１２１】
実施例は本発明を例示するものである。
【０１２２】
実施例
実施例において特記しない限り、全ての組み換えＤＮＡ技術を、記載のプロトコールに従って行う（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、またはＡｕｓｕｂｅｌら、１９９４）。用いたデータベースは以下の通りであった：
ＧｅｎＢａｎｋ
国立バイオテクノロジー情報センター、国立医学図書館、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、アメリカ（ＵＳＡ）；
Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ
スイス生体情報学研究所、ジュネーブ（Ｇｅｎｅｖａ）、スイス（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；タンパク質データベース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｓｅ）
ラトガーズ大学分子生物物理および生物物理化学センター、ニュージャージー州（Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、アメリカ（ＵＳＡ）；ならびに
単純モジュール構築研究ツール（ＳＭＡＲＴ）
ＥＭＢＬ、ハイデルベルグ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、ドイツ（Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【０１２３】
１．哺乳類リボヌクレアーゼ阻害剤の反復単位に由来する反復モジュールを含む反復タンパク質の集合体
本実施例は、哺乳類のリボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩ）に由来するロイシンリッチ反復タンパク質の集合体の構築を説明する。この足場構造は、ＲＩ（Ｌｅｅら、１９８９）によるアンジオゲニンおよびＲＩによるＲＮａｓｅＡ（ＫｏｂｅおよびＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９９６）の結合に関して、フェントモル範囲での極めて堅固な相互作用が報告されていることから選択した。
【０１２４】
ＲＩアミノ酸配列は、Ａ型およびＢ型ＬＲＲ反復単位（ＫｏｂｅおよびＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９９４）と呼ばれる、二つの交互の異なるが相同な反復単位の特徴的なパターンを示したことから、２つの反復モチーフを誘導してこれを用いて反復ドメインを構築した。Ａ型のＬＲＲ反復モチーフとＢ型のＬＲＲ反復モチーフとの構築物を、本明細書においてＲＩ反復モチーフ対と呼ぶ。ＲＩ反復モチーフ対を含む反復モジュール対のモデルを示す（図４ｆ）。本実施例は、反復ドメインを構築するために一つ以上の反復モチーフを用いることを示し、これは一つのみのモチーフを用いる実施例２とは対照的である。
【０１２５】
１）哺乳類ＲＩの予備的な反復配列モチーフの誘導
ヒトＲＩ（アクセッション番号Ｐ１３４８９、Ｌｅｅら、１９８８）およびブタＲＩ（Ｐ１０７７５、Ｈｏｆｓｔｅｅｎｇｅら、１９８８）のタンパク質配列を用いて相同配列を検索した。ラットＲＩ（Ｐ２９３１５、Ｋａｗａｎｏｍｏｔｏら、１９９２）およびマウスＲＩタンパク質の完全なタンパク質配列が判明した（ＡＡＫ６８８５９、非公表）。
【０１２６】
得られたＲＩタンパク質配列の反復単位は、ＧＣＧ（商標）Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ（登録商標）において実行される「ＦａｓｔＡ」（アクセルリス、アメリカ）を用いて整列化した。ヒトＲＩのタンパク質配列を示し（図５ａ）、２位、５位、７位、１２位、２０位、および２４位でのロイシンまたは他の脂肪族残基を特徴とするＬＲＲパターン（ＫｏｂｅおよびＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９９４）を強調して示す。それぞれの位置に関して最も豊富なアミノ酸をヒト、マウス、ブタ、およびラットＲＩ配列に関して計算した（図５ｃおよび図５ｄ）。最初のＲＩ反復モチーフ対は、所定の位置での場合の５０％（図５ｃおよび図５ｄを参照のこと）またはそれ以上に存在するアミノ酸によって定義された。
2004508033.tif 000013
【０１２７】
所定の位置での同一アミノ酸の閾値が４０％またはそれ以上である場合、ＲＩ反復モチーフ対は、以下のアミノ酸配列によって定義された。
2004508033.tif 000014
【０１２８】
同様に、所定の位置での同一アミノ酸の閾値が３０％またはそれ以上である場合、ＲＩ反復モチーフ対は、以下のアミノ酸配列によって定義された。
2004508033.tif 000015
【０１２９】
最後に、所定の位置での同一アミノ酸の閾値が２５％またはそれ以上である場合、ＲＩ反復モチーフ対は、位置一つあたりアミノ酸一つのみによってほぼ完全に定義された。
2004508033.tif 000016
【０１３０】
これは、配列モチーフを配列情報およびアラインメントのみからどのようにして誘導できるかを説明するためのものである。しかし、好ましくは、構造情報を考慮に入れるべきである。
【０１３１】
２）骨格と標的相互作用残基の位置を決定する
Ａ型とＢ型ＬＲＲ単位双方の分析によって、２位、５位、７位、１０位、１２位、１７位、２０位、および２４位でのアミノ酸の側鎖が常に疎水性コアに向いていること（ＫｏｂｅおよびＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９９４、ならびに図４ｂおよび図４ｄ）、そしてこれらのアミノ酸が骨格残基のサブセットを構成することが判明した。他の骨格残基は、それらがそれぞれのＬＲＲ単位のαヘリックスを開始させて終了させることから、１６位のグリシンならびにＡ型残基では２８位（Ａ２８と省略）およびＢ型ＬＲＲ単位では２７位（Ｂ２７位と省略）のプロリンである。さらに、位置Ａ１、Ａ３、Ａ１３、Ａ１８、Ａ１９、Ａ２２、Ａ２５、Ａ２７、ならびにＢ１、Ｂ３、Ｂ１１、Ｂ１４、Ｂ１８、Ｂ２２、およびＢ２６は、周辺溶媒の方向を向いた親水性アミノ酸残基を有することが最も多く、骨格位置として処理された。同様に、位置Ａ１４、Ａ１５、Ａ２１、Ａ２３、Ａ２６、ならびにＢ１５、Ｂ１９、Ｂ２１、Ｂ２５、およびＢ２９は通常、反復モジュールの界面を安定化させる疎水性アミノ酸残基によって占有され、このように、同様に骨格位置として処理される。さらに、位置Ａ１１、Ｂ１３、Ｂ２３およびＢ２８は、他のアミノ酸残基より柔軟性を可能にするグリシンを特徴とし、したがって骨格にとって同様に重要である。対照的に位置４、６、８および９は、ＲＩ反復モチーフ対における標的相互作用の位置であると定義された。
【０１３２】
３）不都合なアミノ酸の置換
ＲＩコンセンサスはまた、位置Ａ１０およびＡ１７ならびにＢ２１およびＢ２９において極めてよく保存されたシステインを特徴とする。しかし、遊離のシステインは酸化されて、合併症を引き起こす可能性があるため、システインを含まないモジュールを設計することが望ましい。したがって、適当な置換を調べた。三次元構造（ＭＴＳ＃１）を調べると、Ａ１０位のシステインは水素結合を形成することが判明した。さらに、より遠位のＬＲＲ分子とのアラインメントにより、ほとんどの場合アスパラギン、セリン、またはトレオニンのいずれかが存在することが判明した。したがって、ＬＲＲモジュールにおける位置Ａ１０は、これらの三つのアミノ酸が存在するように設計された。同様に、位置Ａ１７は疎水性コアの一部であることが判明し、これがＬＲＲモジュールにおいてメチオニン、ロイシン、またはバリンを用いる理由である。同時に、これらの二つの位置Ａ１０およびＡ１７は、骨格位置が無作為化される場合を構成する。位置Ｂ２１において、分析された全てのＲＩ配列における最初と最後の反復のシステインは、常にロイシンによって置換され（バリンを一つの例外として）、このように、最終的なＬＲＲモジュールにおいてロイシンであると定義された。位置Ｂ２９の場合、したがって、選択はセリンとトレオニンのあいだであり、この場合、ＢｓｓＨＩＩとＭｌｕＩの制限エンドヌクレアーゼ部位との構築を可能にするように、トレオニンを選択した（詳しい説明に関しては、図６を参照のこと）。
【０１３３】
分析された位置Ａ２１の３６％に生じる最後まで残っているシステイン（図５ｃ）は、これが所定の位置での次に最も頻繁なアミノ酸であり、同様に疎水性環境に一致するように思われることからアラニンと設定した。Ｂ２１位でロイシンが認められたほとんどの場合において、Ａ２１位にアラニンが存在することが認められたために、この決定が促進された。言い換えれば、Ｂ２１位でのロイシンは、Ａ２１位でのアラニンを好むように思われる。このように、積み重ねは、ＬＲＲモジュールにおけるこの選択によって最もよく支持されると考えられた。
【０１３４】
Ａ１位に関しては、もう一つの決定が必要であった。二つの可能性がある陽性荷電アミノ酸であるリジンとアルギニンのうち、上記の制限エンドヌクレアーゼ部位に一致するように後者が選択された。
【０１３５】
このように、精密化された反復配列モチーフは、以下の配列によって記述することができる。
2004508033.tif 000017
【０１３６】
４）標的相互作用残基の定義
標的相互作用位置の定義に関して、ヒトＲＩ−アンジオゲニン（Ｐａｐａｇｅｏｒｇｉｏｕら、１９９７）およびブタＲＩ−ＲＮａｓｅＡ（ＫｏｂｅおよびＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９９５）複合体の双方を分析した。Ｎ末端およびＣ末端キャッピング単位の双方における広い相互作用を別にして、反復単位の相互作用は、Ａ型ＬＲＲ単位の６位、８位、および９位を含むことが最も多く、一方Ｂ型ＬＲＲ単位では、４位、６位および９位を用いることが最も多かった。これらの位置は全てＬＲＲ単位のβ鎖から生じた側鎖を特徴とし（図４ｅ）、したがって、標的相互作用に適している。しかし、Ｂ型ＬＲＲ単位の４位のグルタメートは例外なく存在し、さらなる構造上の重要性を無視することができないため、本発明者らはこの位置を無作為化しなかった。このように、この位置は、標的相互作用の位置が無作為化されていない場合を構成する。対照的に、位置Ａ４は、３０％未満の保存を示したために、無作為化されていると定義した。したがって、ＬＲＲモジュールにおいてＡ４、Ａ６、Ａ８、およびＡ９ならびにＢ６およびＢ９を無作為化した。無作為化位置でのアミノ酸の選択されたサブセットは、天然アミノ酸の物理化学特性を大きく反映し、したがって、多くの場合において結合を支持することが知られている全ての荷電アミノ酸、いくつかの水素結合形成アミノ酸、および芳香族アミノ酸を選択した。同時に、Ａ型ＬＲＲ単位の位置に限ってより大きいアミノ酸が許容されるように、そしてＢ型ＬＲＲ単位の位置では交互の状態において立体妨害を最小限にするより小さいアミノ酸のみが許容されるように決定した。このように、この段階で得られた反復配列モチーフは、以下のように記述することができる。
2004508033.tif 000018
【０１３７】
このように、８個の位置での無作為化によって、２．８×１０５個の独立したＲＩ反復モジュール対が得られた。言い換えれば、上記の反復配列モチーフを満足する分子の合成は、約３００，０００個のしかし非常に相同なメンバーを作製すると考えられる。
【０１３８】
詳細に分析したもう一つの位置は、双方のＬＲＲ反復単位の上部のループ領域、すなわち１１位である。Ａ型およびＢ型ＬＲＲ単位の双方におけるコンセンサスはそれぞれ、３６％および２５％であったため、アミノ酸の対の発生をチェックした。Ｂ型ＬＲＲ単位において、荷電アミノ酸が１１位ではわずかに好ましく、リジンはＡ型ＬＲＲ単位においてアスパラギン酸塩と共にしばしば生じた。この推定の塩架橋は、設計されたＬＲＲモジュールの安定性および溶解度を増加させると考えられ、したがってこれらを選択した。もう一つの可能性（Ａ１１でのグリシンおよびＢ１１でのグルタミン酸）は柔軟性が高すぎるために却下した。
【０１３９】
Ａ１４位での選択は、アラニンとグルタミン酸のいずれかであり、この場合も溶解度および疎水性の外皮の正しい方向を増強するために後者を選択した。同様に、Ｂ２２位は、グルタミン酸またはグルタミンのいずれかを示唆し、この場合後者は、先に定義したＡ２２でセリンによりよく一致するように思われたため、後者を選択した。
【０１４０】
最後に、２６位を精査に供した。この場合、選択はＢ２６位でのグルタミンと共にＡ２６位のアラニン、およびＢ２６位でのアスパラギン酸塩と共にＡ２６位でのセリンのいずれかであった。ＬＲＲモジュールの溶解度を増強するために、この場合も後者の変種を用いた。
【０１４１】
したがって、ＲＩ反復モチーフ対は以下と考えられる（変更を太字で印刷する）。
2004508033.tif 000019
【０１４２】
５）哺乳類ＲＩのＬＲＲに由来する反復ドメインの設計
多数の反復モジュールをドメインに構築することは簡単である。ここに、本発明者らは、互換的オーバーハングを作製する２つの異なる制限酵素を含むアプローチを行った（図６を参照のこと）。このように、ライゲーションの方向は、ライゲーション産物を再度消化することによって単純に制御することができ、この場合、正しくライゲーションした分子は切断されない。
【０１４３】
さらに、本発明者らは、反復ドメインの推定の結合疎水性コアを周辺の溶媒から保護するように設計されたＮ末端およびＣ末端キャッピングモジュールによって、構築されたＬＲＲモジュールを補則することを選択した。哺乳類ＲＩタンパク質の分析から、最初と最後のＬＲＲ単位が上記のコンセンサスとは有意に異なることが判明した（図５ｃおよび図５ｄ）。単純にするために、ヒトＲＩの対応するキャッピング単位をわずかに改変してクローニングし、以降これをキャッピングモジュールと呼ぶ。このように、Ｎ末端キャッピングモジュールに関してアミノ酸１位〜２８位およびＣ末端モジュールに関してヒトＲＩのアミノ酸４２７位〜４６０位を用いて、アミノ酸残基ＰＹＡＲをコードする短いリンカーをＮ末端キャッピングモジュールとＲＩ反復モジュール対とのあいだに導入して、長さの必要条件を一致させた。
【０１４４】
改訂したアミノ酸コンセンサスをＤＮＡ配列に逆翻訳する場合、以下のパラメータを考慮した。望ましくない制限酵素認識配列は、反復モジュール対内に容認されず、コドンの使用は大腸菌での発現に関して最適化された。
【０１４５】
６）発現プラスミドの調製
適当な制限消化部位が隣接するＮ末端モジュールを得るために、ｐＴＲＰ−ＰＲＩ（ＬｅｅおよびＶａｌｌｅｅ、１９８９）をオリゴヌクレオチドＭＴＳ２およびＭＴＳ４によって増幅して（表１）、ＰＣＲ断片Ｎを得た。このように、５’末端において、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩを導入し、３’末端はＢｓｓＨＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を特徴とした。得られたＤＮＡ断片は、正確なフレームで翻訳されたアミノ酸を示す（図８における四角で囲まれた部分の上）。
【０１４６】
ＰＣＲ断片Ｎを、ｐＴＦＴ７４のＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲーションして（Ｇｅら、１９９５）、プラスミドｐＴＦＴ＿Ｎ（図９ａ）を得た。同時に、Ｎ末端のＦｌａｇタグおよび６×Ｈｉｓタグを導入した。上記の反復モジュールを挿入するために、いくつかのベクターをｐＴＦＴ＿Ｎから誘導した。ｐＴＦＴ＿ＮのＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入物を同じ制限消化酵素によって調製したｐＱＥ６０（キアゲン社、ヒルデン、ドイツ）にクローニングした（プラスミドｐＱＥ＿Ｎを生じる）。ｐＴＦＴ＿ＮのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入物（Ｎ末端Ｆｌａｇタグおよび６×Ｈｉｓタグを含まない）を、λファージタンパク質Ｄ遺伝子挿入物の下流のｐＱＥ６０誘導体にインフレームでクローニングしてＣ末端融合反復ドメインを得た（プラスミドｐＱＥ−ｐＤ＿Ｎを生じる）。
【０１４７】
ｐＴＦＴ誘導体は、ｌａｃオペレータの下でＴ７ポリメラーゼプロモーターを特徴とするのに対し、ｐＱＥ誘導体は、同じ制御系においてＴ５ポリメラーゼプロモーターを提供する。溶解度および発現を増加させるためにＮ末端融合パートナーとしてλファージタンパク質Ｄを選択した（ＦｏｒｒｅｒおよびＪａｕｓｓｉ、１９９８）。
【０１４８】
７）反復モジュールライブラリの合成
オリゴヌクレオチドＭＴＳ７およびＭＴＳ９を、トリヌクレオチドから部分的に構築して（Ｖｉｒｎｅｋａｓら、１９９４）、他の全てのオリゴヌクレオチドを標準的な技術によって合成した。
【０１４９】
下記に示す戦略により、パリンドローム制限酵素およびライゲーションを用いて、既定の方向にＤＮＡ断片のポリマーを得る方法を説明する。そのような一つの可能性は、互換的オーバーハングを生じる制限酵素ＢｓｓＨＩＩおよびＭｌｕＩ（図６）を用いることである。同じオーバーハングを有するが当初の認識部位が異なるＤＮＡ断片を再度ライゲーションすると、当初の酵素のいずれによっても消化できない新しい複合部位（図６および図７ａ〜図７ｃにおいて＊で示される）が形成されうる（図６）。しかし、同一の末端がライゲーションされると、当初の認識部位が形成され、したがってこれらの分子は、制限消化によって区別することができない。互換的オーバーハングを有する制限酵素の他の対は、当業者に周知である。
【０１５０】
以下の段階の番号は、図７ａ〜図７ｃにおいて用いた番号を意味する。
【０１５１】
（段階Ｉ）
反復モジュールの第一のライブラリを作製するために、部分的無作為化オリゴヌクレオチドＭＴＳ７、ＭＴＳ８、ＭＴＳ９、およびＭＴＳ１０をＰＣＲによって構築して、ＭＴＳ１１ｂおよびＭＴＳ１４ｂの１０倍モル過剰量によって一段階で増幅した（９５℃で２分間；次に９５℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および７２℃で２０秒間を２０サイクル行った後に、７２℃で１分間）。本明細書に記載するＬＲＲライブラリの場合、最初のＰＣＲは上記のＡ／Ｂ対を一つのモジュールに構築する。得られたＤＮＡ断片は正しいフレームで翻訳されたアミノ酸を示す（図８における四角で囲った部分、オリゴヌクレオチドを矢印として示す）。
【０１５２】
（段階ＩＩ）
ＢａｍＨＩおよびＭｌｕＩまたはＢｓｓＨＩＩのいずれかによる個々の広範囲の制限消化の後に、Ｔ４リガーゼによるライゲーションを行った（室温で１時間および酵素の熱不活化）。得られたライゲーション産物は、低融点アガロースゲル電気泳動によって精製した。二量体反復モジュールに対応するバンドを単離して、エタノール沈殿によるβアガロース消化後にＤＮＡを回収した。
【０１５３】
（段階ＩＩＩ）
反復モジュールの二量体を増幅するために、プライマーＴ７ｐｒｏおよびｓｒｐＴＦＴ１（９５℃で２分間；次に９５℃で１５秒間、５０℃で１５秒間、７２℃で４０秒間を１５サイクル行った後に、７２℃で１分間）による第二のＰＣＲ反応を行った。ＬＲＲライブラリの場合、この段階は四つのロイシンリッチ反復である二つのＡ／Ｂ対を生じた。分子約１０１２個に対応する鋳型１μｇをＬＲＲライブラリのために用いると、全体の理論的多様性はなおこの段階で含まれた。
【０１５４】
（段階ＩＶ）
四量体に関して、得られたＤＮＡを再度ＢａｍＨＩおよびＭｌｕＩまたはＢｓｓＨＩＩによって消化した。より長いポリマーに関して、単消化および二重消化ＤＮＡ断片の混合物を調製した。
【０１５５】
（段階Ｖ）
ライゲーション、制限消化、および精製は反復モジュールの所望の数が得られるまで繰り返すことができる。
【０１５６】
（段階ＶＩ）
定方向のおよび効率的なプラスミドへのクローニングのために両末端で二つの異なる非互換的制限消化部位を有するＤＮＡ断片を得るために、以下の「キャッピング」戦略を改訂した。ヒトＲＩのＣ末端反復単位も同様に、ＰＣＲによってプラスミドｐＴＲＰ−ＰＲＩから増幅し、それによって、ＢｓｓＨＩＩ制限部位を５’末端に、そしてＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を３’末端に導入した。得られたＤＮＡ断片は正しい枠内に翻訳されたアミノ酸を示す（図８における四角で囲まれた部分の下）。
【０１５７】
プライマーＭＴＳ５ａおよびＭＴＳ３を、このＰＣＲ反応（９５℃で２分、次に、９５℃で１５秒間、４５℃で１５秒間、および７２℃で１０秒間を２０サイクル行った後に７２℃で１分間）において用い、産物をＱＩＡｑｕｉｃｋによって精製してＢｓｓＨＩＩによって制限消化した。
【０１５８】
（段階ＶＩＩ）
ＢｓｓＨＩＩ消化Ｃ末端反復モジュールを、Ｔ４リガーゼによってＭｌｕＩ消化ポリマーにライゲーションした（室温で１時間および酵素の熱不活化）。ＢｓｓＨＩＩ、ＭｌｕＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによるその後の十分な制限消化によって、モジュールの方向が正しいことを確認した。混合物は、低融点アガロースゲル電気泳動によって分離して、所望のバンドを上記のように回収した。最後に、回収された断片をＢｓｓＨＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ消化プラスミドｐＴＦＴ＿Ｎ、ｐＴＦＴ−ｐＤ＿Ｎ、ｐＱＥ＿Ｎ、またはｐＱＥ−ｐＤ＿Ｎのいずれかにライゲーションした。得られたライゲーション混合物をＱＩＡｑｕｉｃｋによって精製して、シンデュら（Ｓｉｎｄｈｕ、２０００）に従って調製したＸＬ１０Ｇｏｌｄ細胞のエレクトロポレーションに用いた。
【０１５９】
上記のプロトコールによって、異なるプラスミドライブラリが得られ、そのようなプラスミドの二つの代表的なダイヤグラムを示す（図９ｂおよび図９ｃ）。
【０１６０】
８）反復モジュールタンパク質ライブラリの特徴付け
標準的なＤＮＡシークエンシング技術を用いて、発現プラスミドのＤＮＡ配列を決定した。例として、クローンＤ１７（図１１ｃ、図１１ｄ、および図１２ｄにおける発現と比較）のＤＮＡ配列を示す（図１０ａおよび図１０ｂ）。Ｃ末端モジュールと共にＮ末端モジュールおよび四つの反復モジュールを示す。発現は本質的に記述通りに行って（キアゲン社、「ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ」）、超音波処理後の単一のクローンおよび／またはクローンのプールの可溶性および不溶性タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって分離して、クーマシーブルー染色を施した（図１１ａ〜図ｄ）。ウェスタンブロット分析は、製造元が提供したプロトコールに従って実施した。抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（シグマ社）を、Ｎ末端タンパク質Ｄを含まない構築物のために用い、抗ＲＧＳ−Ｈｉｓ（キアゲン社）を、Ｎ末端タンパク質Ｄを有する構築物のために用いた（図１２ａ〜図ｄ）。
【０１６１】
精製（図１３および図１４）、ＣＤ分光法（図１５）、およびサイズ排除クロマトグラフィー（図１６）を、実施例２に記載のように実施した。
【０１６２】
９）細菌毒素を阻害する（ポリ）ペプチド／タンパク質の選択
中等度のレベルの毒素でも単独では細菌において認容できないため、様々な細菌毒素が対応する抗毒素と共に存在することが知られている。したがって、ＣｃｄＢの遺伝子（Ｊｅｎｓｅｎら、１９９５）を、ＤＨ５□Ｚ１（ＬｕｔｚおよびＢｕｊａｒｄ、１９９７）、ＸＬ１０Ｇｏｌｄ、またはＸＬ１Ｂｌｕｅのようなテトラサイクリン抑制株において堅固に抑制されたテトラサイクリンプロモーターと共にｐＺシリーズの低コピープラスミドにクローニングした。これと同時に、０．１％活性を有する野生型バーナーゼ（ｂａｒｎａｓｅ）（Ｈａｒｔｌｅｙ、１９８８）およびＨ１０２Ｋ変異体（ＪｕｃｏｖｉｃおよびＨａｒｔｌｅｙ、１９９６）をクローニングした。これらの毒素プラスミドの一つを有する化学的コンピテント細胞を記述のように調製して（Ｉｎｏｕｅら、１９９０）、これらの毒素プラスミドの一つを有するエレクトロポレーションコンピテント細胞を記述のように調製した（Ｓｉｎｄｈｕら、２０００）。毒素阻害剤をコードするプラスミドを選択するために、細胞をＬＲＲに基づくライブラリによって形質転換して、選択プレート（５０ ｍｇ／Ｌアンピシリン、２０ ｍｇ／Ｌカナマイシン、４０ μＭ ＩＰＴＧ、および３０ μｇ／Ｌアンヒドロテトラサイクリンを添加したＬＢ培地）上に播種して、２５℃または３７℃のいずれかで増殖させた。阻害特性がプラスミドに連鎖していることを確認するために、ｐＱＥ誘導体を再度単離して、再度形質転換した。
【０１６３】
効率よく折り畳まれた構築物のスクリーニング
ＧＦＰは、標的タンパク質のＣ末端に融合させた場合に折り畳みレポーターとして首尾よく用いられてきた（Ｗａｌｄｏら、１９９９）。急速に凝集する標的は、Ｃ末端融合ＧＦＰを折り畳ませず、コロニーをＵＶ光においてスクリーニングすることができる。ＧＦＰの蛍光は、正しく折り畳まれたタンパク質の量に相関した。本発明者らの戦略において、ＧＦＰを、ＭＴＳ５ａおよびＭＴＳ６、ならびに再度ｐＴＲＰ−ＰＲＩを鋳型として用いて、ＰＣＲ増幅によって得られたＣ末端に設計されたＮｈｅＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。それによって、アミノ酸１２個のリンカー、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦを導入した。得られたＤＮＡ断片は、正しいフレームに翻訳されたアミノ酸を有することが示された（図８の底部）。
【０１６４】
停止コドンを含まない構築物の選択
ライブラリの構築後のフレームシフトおよび停止コドンの数を減少させるために、構築物を、クロラムフェニコール耐性遺伝子に結合するリンカーの上流でクローニングして、プレート上で生存クローンを選択した。
【０１６５】
ディスプレイ技術を用いた結合標的の選択
インビトロでの結合パートナーを同定するために、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓら、１９９８）およびファージディスプレイ（Ｄｕｎｎ、１９９６）の双方を用いた。結合パートナーは、ＲＮａｓｅスーパーファミリーのＲＮａｓｅＡおよびオンコナーゼ（Ｗｕら、１９９３ｂ）ならびに無関係な小さいポリペプチドであるタンパク質Ｄ（ＦｏｒｒｅｒおよびＪａｕｓｓｉ、１９９８）であった。
【０１６６】
タンパク質相補性アッセイを用いる結合標的の選択
結合パートナーを同定するために、大腸菌ゲノムライブラリをＤＨＦＲ１断片（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、１９９８）に融合したが、ＬＲＲに基づくライブラリは、ＤＨＦＲ２の隣に融合した。トリメトプリムを含むＭ９プレート上での選択によって、相互作用分子が得られた。
【０１６７】
得られた構築物を改善するためのＤＮＡモジュールシャッフリング
さらなる発展的改善のために、得られた構築物にＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４）および戻し交配を行った。これにより、改善を高めることができ、作用を有しない変異は失われた。
【０１６８】
実施例２
アンキリン反復単位に由来する反復モジュールを含む（ポリ）ペプチド／タンパク質の集合体
本発明に従って設計されたアンキリン反復タンパク質を作製する方法を記述する。この方法によって、Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュール、二つまたはいくつかのアンキリン反復モジュールおよびＣ末端アンキリンキャッピングモジュールを用いて様々な長さのアンキリン反復タンパク質を構築することが可能である。
【０１６９】
実施例１におけるアンキリン反復モジュールの集合体を作製するための基礎であったアンキリン反復モチーフの定義を下記に説明する。アンキリン反復モチーフに至った分析には、既知の三次元構造を有するアンキリン反復タンパク質の構造分析に関すると共に天然アンキリン反復タンパク質に関する公共のデータベースの検索が含まれた。この分析のために、アンキリン反復モジュールの配列モチーフを誘導してアンキリンキャッピングモジュールを誘導した。さらに、アンキリン反復モチーフに関して骨格と標的相互作用残基の位置を決定した。アンキリン反復モジュールのライブラリを作製するために、天然のアミノ酸２０個中１７個が、アンキリン反復モチーフにおける標的相互作用残基の位置で許容された。骨格残基の位置は、それぞれ特定のアミノ酸に指定された。得られたペプチド配列を、コドンの使用が大腸菌において最適であるが望ましくない制限部位を作製しないように逆翻訳した。オリゴヌクレオチドは、アンキリン反復モジュールのアセンブリＰＣＲを行うことができるように設計した。従来のオリゴヌクレオチドと共にトリヌクレオチドオリゴヌクレオチド（Ｖｉｒｎｅｋａｓら、１９９４）を用いた（表２および表３）。同様に、Ｎ末端およびＣ末端アンキリンキャッピングモジュールは、従来のオリゴヌクレオチドを用いてアセンブリＰＣＲによって作製した（表２）。得られたＰＣＲ産物は全て、それらの末端でＩＩｓ型制限酵素認識部位（図１７）を含み、その末端でその後次の／前の反復（またはキャッピング）モジュールのＤＮＡに結合されると考えられる（図１８）。それぞれの制限酵素によって切断すると、得られた互換的モジュール末端は、いずれの方向にもインフレームでライゲーションすることができると考えられる。したがって、Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュールは一つまたはいくつかのアンキリン反復モジュールにライゲーションすることができ、ライゲーション産物は、Ｃ末端アンキリンキャッピングモジュールにライゲーションすることができる。ＤＮＡが既定の位置で異なるために、この方法によって、アンキリン反復タンパク質の集合体をコードするＤＮＡ分子の多様な組を同時に構築することが可能であった。アンキリン反復タンパク質の得られた集合体の特徴は、結晶化と共に、発現、精製、円偏光二色性分光法、変性実験、サイズ排除クロマトグラフィーによって調べた。実験によって、このアンキリン反復タンパク質ライブラリの非選択メンバーを、可溶性および折り畳まれた配座で、細胞質の還元的環境において高レベルで発現させることができることが示された。
【０１７０】
アンキリン反復モチーフ配列の定義
技法および結果：
本発明の実施例として用いたアンキリン反復モチーフは、既知の三次元構造を有するアンキリン反復タンパク質の構造分析と共にアンキリン反復タンパク質配列分析に由来した（日時：２０００年８月）。
【０１７１】
アンキリン反復単位のアミノ酸配列に関してまず、ＳＭＡＲＴデータベース（Ｓｃｈｕｌｔｚら、２０００）を検索した。２２９アンキリン反復単位のＣｌｕｓｔａｌ−Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９９４）アラインメントを、アンキリン反復単位のコンセンサス「Ａ」を決定するための鋳型として用いた（図１９）。コンセンサス「Ａ」は、アンキリン反復単位のアラインメントのそれぞれの位置に関する残基頻度発生率を計算することによって決定した。考慮した２２９アンキリン反復単位は、これまでに述べた一般的なアンキリン反復単位コンセンサス配列と比較して、挿入または欠失を含まなかった（ＳｅｄｇｗｉｃｋおよびＳｍｅｒｄｏｎ、１９９９）。しかし、コンセンサス「Ａ」には、セドウィック（Ｓｅｄｇｗｉｃｋ）およびスマードン（Ｓｍｅｒｄｏｎ）（１９９９）の長さアミノ酸３３個のコンセンサス配列の残基３個〜３２個のみが含まれた（図１９）。コンセンサスをさらに精密化して、欠損する位置を定義するために、ＧｅｎＢａｎｋ（Ｂｅｎｓｏｎら、２０００）に対するＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０）検索をデフォルトパラメータを用いて行った。この検索に関して、コンセンサス「Ａ」は、最初のアミノ酸として２０位で環状入れ替え型として提出された（図１９）。欠失または曖昧な位置に、既知の三次元構造を有するアンキリン反復タンパク質のアンキリン反復単位のコンセンサスにおいて最高の頻度を有する残基を当てはめた（手動で整列化、上記の統計学）。得られたＢＬＡＳＴヒットの最初の２００個を手動で配列させて、アンキリン反復単位コンセンサス「Ａ」を上記のように残基頻度分析によって精密化して、コンセンサス「Ｂ」を得た（図１９）。「コンセンサス「Ｂ」は、ｐｆａｍデータベースの同一の分析によって確認した（Ｂａｔｅｍａｎら、１９９９；データは示していない）。
【０１７２】
最後のアンキリン反復単位コンセンサス「Ｃ」（図１９）を、この段落において言及した方法を組み入れることによって得た。アンキリン反復タンパク質の公表された三次元構造を肉眼で検分して、どのアミノ酸が特定の位置で最適であるかをさらに決定した。アンキリン反復単位コンセンサス「Ｂ」に対して最高の相同性を示す三次元構造である、マウスＧＡ結合タンパク質β１サブユニット（ＡＣ：２９８１７２６、ｐｄｂ）；１ＡＷＣ；Ｂａｔｃｈｅｌｏｒら、１９９８）は、ほとんどの場合の指標基準であったが、ヒトｐ１８（ＡＣ：４１３９８３０，ｐｄｂ；１ＩＨＢ；Ｖｅｎｋａｔａｍａｒａｎｉら、１９９８）のような他の構造も同様に検討した。天然アンキリン反復単位配列におけるアミノ酸の対、三重項および四重項の相互依存性も同様に、コンセンサス「Ｂ」をさらに開発または確認するために用いた。さらに、相同性モデリングおよびエネルギー最小化を含むモデリングアプローチ（インサイトＩＩパッケージ；インフォマックスインク、アメリカ）を行って、最適な空洞回避および充填最適化に向けてコンセンサス配列を作製した。コンセンサスのそれぞれの残基の二次構造傾向（Ｏ’ＮｅｉｌおよびＤｅＧｒａｄｏ、１９９０；ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、１９７８）は、天然のアンキリン反復単位内の対応する位置で二次構造に一致することをさらに確認した。さらに、ＰｈＤ−予測を用いて（Ｒｏｓｔ Ｂ．、１９９６）二次構造を分析して確認した。タンパク質の安定性およびコンセンサスのプロテアーゼ抵抗性は、ＰＥＳＴ（Ｒｏｇｅｒｓら、１９８６；スイス生物情報研究所、スイス）およびＧＣＧのペプチドソート（アクセルリス社、アメリカ；Ｗｏｍｂｌｅ， Ｄ．Ｄ．、２０００）を用いて分析して、コンセンサスは十分に安定であると予想された。
【０１７３】
コンセンサス「Ｃ」（図１９）に対するアンキリン反復単位コンセンサス「Ｂ」（図１９）の定義の際の重要な残基は１６位、１７位、１８位、１９位、２１位、２２位、２５位、および２６位であった。１６位は、その位置から前の反復と隠れた水素結合を作製することから、最終的にヒスチジンであると決定された。１７位のロイシンは、最終的にこれが二つの反復モジュールの界面を安定化させることから他のアミノ酸より好ましかった。１８位のグルタミン酸は、ヒトｐ１８においてこの位置でグルタミン酸とアスパラギン酸塩の反復を生じるために選択した。同様に、２１位のグルタミン酸は、マウスＧＡ結合タンパク質における多数の連続コピーに存在する。２５位のリジンは、マウスＧＡ結合タンパク質において塩基性残基であるアルギニンとリジンが繰り返し存在することから、他のアミノ酸より好ましかった。２６位に関して、三つのアミノ酸、ヒスチジン、チロシン、またはアスパラギンは全てこの位置の要件を満たすために、これらのアミノ酸のいずれも用いる折衷案を選択した。したがって、１９位および２２位には、これらの残基が等しく十分に適合することから、イソロイシンまたはバリン、およびバリンまたはロイシンをそれぞれ当てはめた。
【０１７４】
最終的に決定されたアンキリン反復単位コンセンサス「Ｃ」（図１９）は、アンキリン反復モジュールの基礎として役立った。アンキリン反復モチーフの配列を図２０に示す。クローニングの理由から、モチーフは、環状入れ替え型コンセンサス「Ｃ」に基づく。図１９において用いたコンセンサス番号付けスキームを一致させるために、そしてセドウィック（Ｓｅｄｇｗｉｃｋ）およびスマードン（Ｓｍｅｒｄｏｎ）（１９９９）によって用いられるように、アンキリン反復モチーフにおける位置の数字はアミノ酸配列に平行して環状に入れ替えた。アンキリン反復モチーフはアミノ酸３３個の長さであり、そのうち２７個の位置は骨格残基であると定義され、位置６個は標的相互作用残基であると定義された。骨格残基の位置は、アンキリン反復単位コンセンサス「Ｃ」を用いて定義した。三次元構造の分によっては、アンキリン反復単位の２位、３位、５位、１３位、１４位、および３３位がタンパク質−タンパク質相互作用に関係し、したがって、標的相互作用残基を構成することが示された。これはまた、アンキリン反復単位コンセンサスの定義の際に示されたこれらの位置の高い多様性によっても示唆された。アンキリン反復モジュールに関して、これらの残基は、１７個のアミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹのいかなるものであると定義された。
【０１７５】
したがって、アンキリン反復モジュールの集合体の独立したメンバーの数は、３・１７６＝７２’４１２’７０７個であると計算することができる。
【０１７６】
アンキリンキャッピングモジュールの定義
技法および結果：
誘導したアンキリン反復モチーフはマウスＧＡ結合タンパク質のβ１サブユニット（ＧＡＢＰβ１；ＡＣ：２９８１７２６；Ｂａｔｃｈｅｌｏｒら、１９９８）と高い相同性を示したために、後者のタンパク質のＮ末端およびＣ末端アンキリン反復キャッピング単位（Ｂａｔｃｈｅｌｏｒら、１９９８）に従う反復１および反復５）を、Ｎ末端およびＣ末端キャッピングモジュールの基礎として選択した。Ｎ末端およびＣ末端アンキリンキャッピングモジュールはいずれもマウスＧＡ結合タンパク質β１キャッピング単位と比較して変更しなければならなかった。Ｎ末端ＧＡ結合タンパク質β１キャッピング単位は、アンキリン反復モチーフの設計に立体的に適合するようにそのループを改変した。Ｃ末端ＧＡ結合タンパク質β１キャッピング単位を、いくつかの位置で改変した。ＧＡ結合タンパク質β１の反復４のループの一部ならびに反復４および５と結合するβヘアピン（Ｂａｔｃｈｅｌｏｒら、１９９８）は、クローニングの理由のためにＣ末端キャッピングモジュールに含めなければならなかった。それによって、ループおよびβヘアピンは、アンキリン反復モチーフの設計に立体的に適合するように改変された。改変は、ＧＡＢＰβ１を、本発明によるタンパク質ライブラリのメンバーであるＥ３−５と整列化させた図２１において示すことができる（下記参照）。
【０１７７】
実験技法
実施例Ａにおける全ての章に関して、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）， Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）， Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）， Ｔ．、（１９８９；「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、またはアウスユベール（Ａｕｓｕｂｅｌ）， Ｆ．Ｍ．、ブレント（Ｂｒｅｎｔ）， Ｒ．、キングストン（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ）， Ｒ．Ｅ．、ムーア（Ｍｏｏｒｅ）， Ｄ．Ｄ．、セイドマン（Ｓｅｉｄｍａｎ）， Ｊ．Ｇ．、スミス（Ｓｍｉｔｈ）， Ｊ．Ａ．およびストルール（Ｓｔｒｕｈｌ）， Ｋ．、（１９９４；「分子生物学の現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）の第１〜４巻、またはコリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ， Ｊ．Ｅ．）、ダン（Ｄｕｎｎ， Ｂ．Ｍ．）、プロー（Ｐｌｏｅｇｈ， Ｈ．Ｌ．）、スペイチャー（Ｓｐｅｉｃｈｅｒ， Ｄ．Ｗ．）およびウィングフィールド（Ｗｉｎｇｆｉｅｌｄ， Ｐ．Ｔ．、（１９９５；「タンパク質科学の現行プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｃｉｅｎｃｅ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）の第１巻および第２巻に記載されるプロトコールに従って実施した。
【０１７８】
本発明によるアンキリン反復タンパク質をコードするＤＮＡの合成
技法および結果：
オリゴヌクレオチドＩＮＴ１およびＩＮＴ２はトリヌクレオチドから部分的に構築して（Ｖｉｒｎｅｋａｓら、１９９４）、モルフォシス（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）（ドイツ）から得た。他のオリゴヌクレオチドは全て、標準的な技術によって合成して、マイクロシンスから得た（スイス、表２および表３を参照のこと）。ＤＮＡを増幅するためのオリゴヌクレオチドは、１００ μＭ保存液濃度で用い、鋳型として用いるオリゴヌクレオチドは、１０ μＭ保存液として用いた。酵素および緩衝液はニューイングランドバイオラブス（アメリカ）またはファーメンタス（リトアニア）社から得た。クローニング株は大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社）であった。
【０１７９】
アンキリン反復モジュールは、３．５ ｍＭ ＭｇＳＯ４を追加的に添加した標準的な緩衝液中で、オリゴヌクレオチド（それぞれ１μｌ）ＩＮＴ１、ＩＮＴ２、ＩＮＴ３、ＩＮＴ４、ＩＮＴ５、およびＩＮＴ６ａ［９５℃５分間、２０×（９５℃３０秒間、５０℃１分間、７２℃３０秒間）、７２℃５分間］ならびにＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いるアセンブリＰＣＲによって、最終容積５０ μｌで作製した。
【０１８０】
Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュールは、オリゴヌクレオチド（それぞれ１μｌ）ＥＷＴ１、ＥＷＴ２、ＴＥＮ３、およびＩＮＴ６［９５℃５分間、３０×（９５℃３０秒間、４０℃１分間、７２℃３０秒間）、７２℃５分間］ならびにＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いるアセンブリＰＣＲによって反応容積５０ μｌで調製した。得られたＤＮＡはＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによってｐＱＥ３０（キアゲン社、ドイツ）にクローニングした。ＤＮＡ配列は標準的な技術を用いて確認した、Ｃ末端アンキリン反復モジュールはそれに従って、しかし、オリゴヌクレオチドＷＴＣ１、ＷＴＣ２、ＷＴＣ３およびＩＮＴ５を用いて調製した。
【０１８１】
単一のアンキリン反復モジュールからのアンキリン反復タンパク質をコードするＤＮＡと、アンキリン反復キャッピングモジュールとのライゲーションを図１８に略図で示す。アンキリン反復タンパク質を構築するために、クローニングしたＮ末端アンキリンキャッピングモジュールをオリゴヌクレオチドＴＥＮ３およびＩＮＴ６ａを用いてＰＣＲ増幅した（Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュールに関して上記の通り）。ＤＮＡは、ＱＩＡｑｕｉｃｋＤＮＡ精製キット（キアゲン社、ドイツ）を用いて精製して、ＢｓａＩによって切断して、同じキットを用いて再度精製した。次に、Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュールをＢｐｉＩ切断物および精製アンキリン反復モジュールにライゲーションした。この定方向クローニングは、切断配列とは異なるＤＮＡ配列を認識する（図１７）二つの種類のＩＩｓ制限酵素であるＢｐｉＩおよびＢｓａＩの切断配列を、非対称性であるが互いに互換的であるように選択したために可能であった。Ｎ１と呼ばれるライゲーション産物をゲル精製して（ＬＭＰ−アガロース、β−アガラーゼ、酢酸ナトリウム／エタノール沈殿）、オリゴヌクレオチド（それぞれ１μｌ）ＥＷＴ３およびＩＮＴ６ｂ［９５℃５分間、２０×（９５℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃３０秒間）、７２℃５分間］ならびにＶｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼを用いるアセンブリＰＣＲによって反応容積５０ μｌの標準的な緩衝液においてＰＣＲ増幅した。増幅産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋを用いて精製し、ＢｓａＩを用いて切断して再度精製した。次に、ＢｐｉＩ切断アンキリン反復モジュールにライゲーションすると、新しいサイクルの伸張を開始し、これを所望の数のアンキリン反復モジュールがＮ末端アンキリンキャッピングモジュール（Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４などと呼ばれる）に付加されるまで繰り返した。ＰＣＲ増幅Ｎ２、Ｎ３、およびＮ４に対応するＤＮＡ種をＢｓａＩによって切断して、これを、クローニングしたＣ末端アンキリンキャッピングモジュールの予めＢｐｉＩによって切断したＰＣＲ産物にライゲーションした。これによって、Ｎ２Ｃ、Ｎ３Ｃ、およびＮ４Ｃアンキリン反復タンパク質ライブラリをコードするＤＮＡ分子が得られた。最終産物を、ＥＷＴ３およびＷＴＣ３それぞれ１μｌ［９５℃５分間、２５×（９５℃３０秒間、５０℃３０秒間、７２℃１分間）、７２℃５分間］を用いてＰＣＲ増幅して、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩによってｐＱＥ３０（キアゲン社）にクローニングした。
【０１８２】
タンパク質発現と精製
技法：
大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社）を、異なる長さのアンキリン反復タンパク質を発現させるための株として用いた。Ｎ２Ｃに対応する二つのクローン（Ｅ２−５およびＥ２−１７と呼ぶ）、Ｎ３Ｃに対応する二つのクローン（Ｅ３−５およびＥ３−１９）、ならびにＮ４Ｃに対応する二つのクローン（Ｅ４−２およびＥ４−８）を無作為に選択してさらに分析した。これらのクローンの静止期一晩培養物（ＬＢ、１％グルコース、１００ ｍｇ／Ｌアンピシリン；３７℃）２５ ｍｌを、培養物１リットルに接種した（前培養と同じ培地）。ＯＤ６００＝０．７になった時に、培養物を３００ μＭ ＩＰＴＧによって誘導して４時間インキュベートした。様々な時点で試料を採取して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した（図２２を参照のこと）。培養物を遠心分離して、得られた沈降物をＴＢＳ５００ ４０ ｍｌに溶解して（５０ ｍＭトリス塩酸、ｐＨ ８．０、５００ ｍＭ ＮａＣｌ）、超音波処理した。次に、溶解物に１０％グリセロールおよび２０ ｍＭイミダゾールを加えて、再度遠心分離した。得られた上清を、製造元に従って（キアゲン社、ドイツ）Ｈｉｓタグカラム（カラム容積２．５ ｃｌ）上での精製のために用いた。
【０１８３】
結果：
細胞分画実験から、全てのアンキリン反復タンパク質が、２００ ｍｇ／Ｌ培養物の収率で可溶性型で発現されることが示された（図２２）。Ｈｉｓタグ精製によって、１回の精製段階で純粋なタンパク質が得られた（図２３）。タンパク質の完全性はさらに、質量分析によって確認した（示していない）。可溶性型での発現は、設計された反復タンパク質の適切な折り畳みを示している。
【０１８４】
サイズ排除クロマトグラフィー
技法：
上記の精製試料６個を、ファルマシアＳＭＡＲＴシステムを用いて流速６０ μｌ／分で、ＴＢＳ １５０（５０ ｍＭトリス塩酸、ｐＨ ７．５；１５０ ｍＭ ＮａＣｌ）を実施緩衝液としてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（アマシャムファルマシアバイオテク、ＵＳＡ）上で分析した。標準物質は、□−アミラーゼ（シグマ社）およびファージタンパク質ｐＤおよびＳＨＰであった（Ｙａｎｇら、２０００）。例として、Ｎ３Ｃ−ライブラリメンバーであるＥ３−５の溶出プロフィールを図２４に示す。
【０１８５】
結果：
溶出プロフィールから、調べたタンパク質がほとんどの場合単量体のみであることが示されたが、タンパク質試料の少量（Ｅ２−１７およびＥ４−８）は、単量体の他に多量体であったが可溶性である種を示した。ゲル濾過によって測定した保持から、調べたタンパク質が折り畳まれておりランダムコイルではないことが示された。
【０１８６】
ＣＤ分光法
技法：
本発明に従って作製した無作為に選択したアンキリン反復タンパク質（Ｅ３−５、Ｎ３Ｃ分子）の円偏光二色性スペクトルは、ｐＨ ６．５の１０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（天然）またはｐＨ ６．５の２０ ｍＭリン酸緩衝液および６Ｍ塩酸グアニジニウム（変性）のいずれかにおいて、Ｊａｓｃｏ Ｊ−７１５機器［ジャスコ、日本；１０ ｎｍ／ｓ、８秒反応、０．２ ｎｍデータピッチ、２ｎｍバンド幅、１９５ ｎｍ〜２５０ ｎｍ（天然）、または２１２ ｎｍ〜２５０ ｎｍ（変性）、３回蓄積、１試料あたり３回測定、１ｍｍキュベット］を用いて記録した。ＣＤシグナルは、変性条件で２８０ ｎｍで分光測光法によって決定した試料の濃度を用いて平均残基楕円率に変換した。
【０１８７】
結果：
Ｅ３−５は最小で２０８ ｎｍおよび２２２ ｎｍにおいて天然条件下でαヘリックススペクトルを示した。二次構造は６Ｍ塩酸グアニジニウム中で失われる（図２５）。このことは、Ｅ３−５における二次構造要素が適切に形成されていることを示している。
【０１８８】
変性挙動
技法：
本発明に従って作製した無作為に選択したアンキリン反復タンパク質（Ｅ２−５、Ｅ３−５、およびＥ４−８、図２２）の変性挙動を、基本的に図２５に示す円偏光二色性によってしかし異なる緩衝液を用いて測定した。塩酸グアニジニウム変性曲線は、２０ ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ ６．５、１００ ｍＭ ＮａＣｌ中で塩酸グアニジニウムの異なる濃度でインキュベートした異なるタンパク質を用いて２２０ ｎｍでＣＤ分光測光法によって、室温で一晩測定した。２２０ ｎｍでの円偏光二色性シグナルは、各試料において１試料あたり３本ずつ測定した。
【０１８９】
結果：
塩酸グアニジニウムの異なる濃度に対するＥ２−５、Ｅ３−５、およびＥ４−８の変性曲線を図２６に示す。変性の中央点は、２．５ Ｍ〜３．８ Ｍ塩酸グアニジニウムの範囲内である。したがって、二次構造は、変性剤の高濃度に限って失われ、このことは調べた分子の安定性が比較的高いことを示す。
【０１９０】
結晶化
技法および結果：
本発明によるＮ３Ｃライブラリメンバーであるアンキリン反復タンパク質Ｅ３−５を、２０％ＰＥＧ ６０００、１００ ｍＭ ＭＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ ６．０中で９ｍｇタンパク質／ｍｌのＴＢＳ ５０（５０ ｍＭトリス塩酸、ｐＨ ８．０、５０ ｍＭ ＮａＣｌ、図２７を参照のこと）溶液から懸滴（２μｌタンパク質および２μｌ緩衝液を混合；５００μｌ緩衝液を貯蔵）によって２０℃で５日間結晶化した。結晶は、予備的なＸ線実験において３Åに屈折した（示していない）。
【０１９１】
表
表１：ヒトＲＩに由来するライブラリのクローニングのために用いられるオリゴヌクレオチド；
表２：実施例２によるアンキリン反復モジュールの作製のために用いられるオリゴヌクレオチド；
表３：本発明による一つ以上のアンキリン反復モジュールを含むアンキリン反復タンパク質をクローニングするためと共にＮ末端およびＣ末端アンキリンキャッピングモジュールを作製するために用いられるオリゴヌクレオチド。
【０１９２】
【表１】ヒトＲＩに由来するライブラリのクローニングのために用いられるオリゴヌクレオチド
2004508033.tif 000020
2004508033.tif 000021
１小文字はアニーリングのための領域を示す。
２略語：ｆｗｄ−フォワード；ｒｅｖ−リバース。
３ＮＮＮはトリヌクレオチドの混合物を意味する。
【０１９３】
【表２】実施例２によるアンキリン反復モジュールを作製するために用いられるオリゴヌクレオチド
2004508033.tif 000022
１ＮＮＮは、アミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹ（Ｖｉｒｎｅｋａｓら、１９９４）をコードするトリヌクレオチドの混合物を意味する。
２Ｄは、Ａ、Ｔ、またはＧを表す。
【０１９４】
【表３】一つ以上のアンキリン反復モジュールを含むアンキリン反復タンパク質をクローニングするためと共にＮ末端およびＣ末端アンキリンキャッピングモジュールを作製するために用いられるオリゴヌクレオチド
2004508033.tif 000023
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【０１９５】
参照
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【図面の簡単な説明】
【図１】「反復タンパク質」、「反復ドメイン」、「非反復ドメイン」、「反復モジュール」、「キャッピングモジュール」、および「リンカー」という用語の略図。
【図２ａ】反復ドメイン（１Ａ４Ｙ）のみ、または反復ドメインおよび非反復ドメイン（１Ｄ０Ｂ）の双方を特徴とするロイシンリッチ反復タンパク質の例。
【図２ｂ】反復ドメイン（１ＡＷＣ）のみ、または反復ドメインおよび非反復ドメイン（１ＤＣＱ）の双方を特徴とするアンキリン反復タンパク質の例。
【図２ｃ】ブタ肝臓リボヌクレアーゼ阻害剤の結晶構造（ＫｏｂｅおよびＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ、１９９３）。
【図２ｄ】酵母のｒｎａ１ｐ ＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質の結晶構造（Ｈｉｌｌｉｇら、１９９９）。
【図２ｅ】リステリアＩｎＩＢタンパク質の結晶構造（Ｍａｒｉｎｏら、１９９９）。
【図２ｆ】ヒトスプライセオソームタンパク質Ｕ２Ａ’の結晶構造（Ｐｒｉｃｅら、１９９８）。
【図２ｇ】ヒト転写因子阻害剤ＩκＢαの結晶構造（Ｈｕｘｆｏｒｄら、１９９８）。
【図２ｈ】マウスＧＡ結合タンパク質β１サブユニットのアンキリン反復ドメインのＸ線構造［ｐｄｂエントリー１ＡＷＣ（Ｂａｔｃｈｅｌｏｒら、１９９８）］。ドメインのＮ末端およびＣ末端を標識する。この像はＭＯＬＭＯＬを用いて作製した（Ｋｏｒａｄｉら、１９９６）。
【図３】天然反復単位およびキャッピング単位の例。ロイシンリッチ反復タンパク質（１Ａ４Ｙ）およびアンキリン反復タンパク質（１ＡＷＣ）を示す。
【図４ａ】ブタリボヌクレアーゼ阻害剤（残基４２３位〜４５０位）由来のＬＲＲ単位のβ／α折り畳み。
【図４ｂ】ブタリボヌクレアーゼ阻害剤（残基８６位〜１１２位）由来のＬＲＲ単位のβ鎖から生じたロイシンおよびアミノ酸の位置。
【図４ｃ】アンキリン反復単位の構造の説明。Ａ：側面図。Ｂ：上面図。相互作用残基は、「球と棒」として示す。これらの図は、ＭＯＬＭＯＬ（Ｋｏｒａｄｉら、１９９６）によって示されたＧＡ結合タンパク質（ｐｄｂエントリー１ＡＷＣ（Ｂａｔｃｈｅｌｏｒら、１９９８））の第三の反復を用いて作製した。
【図４ｄ】ＬＲＲ単位の骨格残基のサブセットを「球と棒」として示す。番号は、ＬＲＲ単位内の位置を示す。
【図４ｅ】ＬＲＲ単位の標的相互作用残基のサブセットを「球と棒」として示す。番号は、ＬＲＲ単位内の位置を示す。
【図４ｆ】ＬＲＲ反復モジュール対のモデルを示す。番号は、由来するＬＲＲ反復モチーフ対内の位置を示す。
【図５ａ】ヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害剤の内部アミノ酸アラインメント。
【図５ｂ】全てのリボヌクレアーゼ阻害剤配列に基づいて定義されたコンセンサス。
【図５ｃ】哺乳類ＲＩのＡ型反復単位における一つの位置で最も頻繁なアミノ酸の統計分析。
【図５ｄ】哺乳類ＲＩのＢ型反復単位における一つの位置で最も頻繁なアミノ酸の統計分析。
【図６】制限酵素認識部位およびコードされるアミノ酸。ＢｓｓＨＩＩによって認識されるＤＮＡは、第一の読みとり枠においてアラニンおよびアルギニン（ＡおよびＲ）をコードする。したがって、ＭｌｕＩは、第一の読みとり枠においてトレオニンおよびアルギニン（ＴおよびＲ）をコードする。ＢｓｓＨＩＩおよびＭｌｕＩによって切断されるＤＮＡ分子を組み合わせると、いずれかの制限酵素によっても認識されず、アラニンおよびアルギニン（ＡおよびＲ）をコードする、新しい複合部位が得られる。
【図７ａから図７ｃ】反復モジュールのライブラリのクローニング。
【図８】プラスミドｐＴＦＴ＿Ｎ１ＣＬにおけるＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入物のＤＮＡ配列および翻訳アミノ酸。ｐＴＦＴという略語は、ｐＴＦＴ７４に由来する全てのプラスミドを意味する（Ｇｅら、１９９５）。Ｎ１ＣＬという略語は、Ｎ末端モジュール、１反復モジュール、Ｃ末端モジュール、およびリンカー配列を含む挿入物を意味する。
【図９ａから図９ｃ】プラスミドｐＴＦＴ＿Ｎ、ｐＱＥ＿Ｎ１Ｃ、およびｐＱＥ−ｐＤ＿Ｎ２Ｃの図。命名法は、図８の説明に記載した。ｐＱＥ３０（キアゲン社）に由来するプラスミドの名称は常にｐＱＥで始まる。ｐＤという略語はλファージタンパク質Ｄを意味する（ＦｏｒｒｅｒおよびＪａｕｓｓｉ、１９９８）。
【図１０ａおよび図１０ｂ】プラスミドｐＱＥ＿Ｎ４ＣクローンＤ１７のＮｃｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入物のＤＮＡ配列。
【図１１ａ】ｐＤ＿Ｎ２Ｃライブラリ（Ａ２、Ａ１０、．．．）の無作為に選択したメンバーの高レベル発現。ライブラリ発現プラスミドｐＱＥ−ｐＤ＿Ｎ２Ｃの一つを含むＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を、３７℃でＯＤ６００＝１となるまで増殖させて、１ｍＭ ＩＰＴＧによって１時間誘導した。回収した細胞をＴＢＳ５００に再懸濁し、超音波処理して遠心分離した。細胞培養物４０マイクロリットルの上清（Ｓ）または沈降物（Ｐ）試料に対応する試料を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離して、クーマシーブルーによって染色した。クローンをＡ２、Ａ１０等と命名する。Ａｐ１およびＡｐ２は、１０個の別々のクローンのプールである；Ｙ：切断型ｐＤ＿Ｎ２Ｃ（２６ ｋＤａ）、Ｘ：ｐＤ＿Ｎ２Ｃ（３３ ｋＤａ）。
【図１１ｂ】図１１ａに記載したＮ２Ｃ（Ｃ１、Ｃ２、．．．）およびｐＤ＿Ｎ４Ｃ（Ｂ９、Ｂ２１）ライブラリの無作為に選択したメンバーの高レベル発現；＊：Ｎ２Ｃ（２２ ｋＤａ）、＃：ｐＤ＿Ｎ４Ｃ（４５ ｋＤａ）。
【図１１ｃ】図１１ａに記載したＮ４Ｃ（Ｄ１１、Ｄ１５、．．．）ライブラリの無作為に選択したメンバーの高レベル発現；Ｚ：Ｎ４Ｃ（３４ ｋＤａ）。
【図１１ｄ】図１１ａに記載した通りであるが、２５℃で増殖させたＮ４Ｃ（Ｄ１１、Ｄ１５、．．．）ライブラリの無作為に選択したメンバーの高レベル発現；Ｚ：Ｎ４Ｃ（３４ ｋＤａ）。
【図１２ａ】２５℃または３０℃のいずれかで発現させた後のｐＤ＿Ｎ２Ｃライブラリメンバー（Ａ２、Ａ１０、Ａ１５）の高レベル発現のウェスタンブロット分析。タンパク質を、図１１ａに記載したように調製した。抗ＲＧＳ−Ｈｉｓ抗体は、製造元（キアゲン社）のプロトコールに従って５０００倍希釈で用いた；Ｙ：切断型ｐＤ＿Ｎ２Ｃ（２６ ｋＤａ）、Ｘ：ｐＤ＿Ｎ２Ｃ（３３ ｋＤａ）。
【図１２ｂ】３７℃または２５℃のいずれかで発現させた後のｐＤ＿Ｎ４Ｃライブラリの無作為に選択したメンバー（Ｂ９、Ｂ２１、プールであるＢＰ）の高レベル発現のウェスタンブロット分析；＃：ｐＤ＿Ｎ４Ｃ（４５ ｋＤａ）。
【図１２ｃ】３７℃または２５℃のいずれかで発現させた後のＮ２Ｃライブラリメンバーのいくつか（Ｃ１、Ｃ３、Ｃ７）の高レベル発現のウェスタンブロット分析。タンパク質を図１１ａに記載したように調製した。抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体は、製造元（シグマ社）のプロトコールに従って１０００倍希釈で用いた；＊：Ｎ２Ｃ（２２ ｋＤａ）。
【図１２ｄ】３７℃または２５℃のいずれかで発現させた後のＮ４Ｃライブラリメンバーのいくつか（Ｄ１７、Ｄ１９、Ｄ２２）の高レベル発現のウェスタンブロット分析；Ｚ：Ｎ４Ｃ（３４ ｋＤａ）。
【図１３】本発明による無作為に選択したロイシンリッチ反復タンパク質の天然条件でのＨｉｓタグ精製。レーンＭは分子量マーカー（ｋＤａ）を示し、レーンＦＴは、未結合画分を示し、かつレーン０〜６は、異なる溶出画分を示す。矢印は予想されるタンパク質の位置を示す。
【図１４】精製カラムにおける反復タンパク質の再折り畳みを含む変性条件でのＨｉｓタグ精製。レーン１〜６は、本発明による６個のロイシンリッチ反復タンパク質の未結合画分を示す。レーン７〜１２は、同じ６個のタンパク質のピーク溶出画分を示す。矢印は予想されるタンパク質の位置を示す。
【図１５】本発明による無作為に選択したロイシンリッチ反復タンパク質の円偏光二色性分光法。
【図１６】本発明による無作為に選択したロイシンリッチ反復タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー。試料をＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラム上で分析した。
【図１７】本発明によるアンキリン反復タンパク質のクローニングに用いられる制限酵素のＤＮＡ認識配列。ＩＩ型制限酵素は、パリンドローム認識部位内でＤＮＡを切断するが、ＩＩｓ型制限酵素は、非パリンドローム認識部位の外側を切断する。２つのＩＩｓ型制限酵素（ＢｐｉＩおよびＢｓａＩ）を用いて、アンキリン反復モジュールを、その互換的突出末端の利点を利用した定方向的様式で互いにライゲーションして（図１８、表２、および表３を参照のこと）、アンキリン反復モジュールと次のモジュールとの継ぎ目のない結合を作製した。これらのＩＩｓ型制限酵素を用いて、Ｎ末端およびＣ末端アンキリンキャッピングモジュールを、それらを分離させているアンキリン反復モジュールに結合させることも可能である。ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを、本発明に従って構築されたアンキリン反復タンパク質（Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュール、二つまたはそれ以上のアンキリン反復モジュール、およびＣ末端アンキリンキャッピングモジュールを含む）をプラスミドｐＱＥ３０（キアゲン社、ドイツ）にクローニングするために用いた。それぞれの酵素に関する制限酵素パターンを実線で示す。
【図１８】ＤＮＡレベルでのアンキリン反復モジュールによるＮ末端アンキリンキャッピングモジュールの段階的伸張の概略図。Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュールを、アンキリン反復モジュールによって必要な長さまで伸張させ、その後Ｃ末端アンキリンキャッピングモジュールの付加によって終結させる。
【図１９】コンセンサス「Ａ」（ＳＭＡＲＴ分析後に得られた）、ＢＬＡＳＴ検索のために用いられるコンセンサス（欠失残基が既知の三次元構造を有するアンキリン反復タンパク質のアンキリン反復単位のコンセンサスから得られる、環状入れ替え型コンセンサス「Ａ」）、コンセンサス「Ｂ」（ＢＬＡＳＴ検索後に誘導）と共に、コンセンサス「Ｃ」（実施例２において言及した様々なパラメータを考慮して最終的に得られる）を、アンキリン反復単位コンセンサスの段階的定義を説明するために列挙する。コンセンサス「Ａ」および「Ｂ」では、所定の位置での頻度が２０％に達する残基を示す。コンセンサス「Ｃ」では、後者のアミノ酸が等しく十分に適合する位置においていくつかのアミノ酸を示す。
【図２０】アンキリン反復モチーフの配列（すなわち、実施例２の全てのアンキリン反復モジュールの基礎）、およびアミノ酸のそれぞれの位置の数を示す。さらに、予想される二次構造（αはαヘリックス、βはβシートを意味する）を示す。「ｘ」で示される６個の位置は、任意のアミノ酸Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹが容認される標的相互作用残基として定義された。残りの位置は、コンセンサス「Ｃ」によって定義された骨格残基であると定義された（図１９を参照のこと）。２６位では、ヒスチジン、チロシン、またはアスパラギンの３つのアミノ酸のいずれも容認されなかった。クローニングの理屈から、アンキリン反復モチーフは環状入れ替え型コンセンサス「Ｃ」に基づく（図１９を参照のこと）。図１９において用いられ、かつセドウィック（Ｓｅｄｇｗｉｃｋ）およびスマードン（Ｓｍｅｒｄｏｎ）（１９９９）によって用いられるコンセンサス番号付けスキームに一致させるために、番号をコンセンサス配列と平行して環状に入れ替えた。
【図２１】本発明に従って構築した無作為に選択したクローン「Ｅ３−５」のアラインメント。Ｎ末端およびＣ末端アンキリンキャッピングモジュールのあいだに３個のアンキリン反復モジュール（図２０）を有するタンパク質である、Ｅ３−５のアミノ酸配列を、マウスＧＡ結合タンパク質β１と整列化する。後者は、既知のアンキリン反復タンパク質の中でＥ３−５に対して最高の相同性を示すタンパク質である。配列を、ＧＣＧのコマンド「ギャップ（ｇａｐ）」（Ｗｏｍｂｌｅ， Ｄ．Ｄ．、２０００）を用いて、デフォルト値と配列比較行列Ｂｌｏｓｕｍ６２により整列化させた。全体として、二つの分子が６７％残基同一性および７１％残基相同性を示した。反復モチーフ（図２０を参照のこと）における無作為化位置に対応する位置に、上記の星印をつける。Ｎ末端およびＣ末端アンキリンキャッピングモジュールをオーバーラインで示し、３つのアンキリン反復モジュールを下線で示す。
【図２２】本発明に従って作製された異なる大きさのアンキリン反復タンパク質の高レベル発現［ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩをプラスミドｐＱＥ３０（キアゲン社）にクローニングし、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社）中で発現させた］。Ｎ２Ｃ、Ｎ３Ｃ、およびＮ４Ｃのそれぞれのライブラリの中で、二つの無作為に選択したクローンを調べた。Ｎ２Ｃという略語は、図１７および図１８に示すクローニング戦略を用いて結合した、Ｎ末端のアンキリンキャッピングモジュール、二つのアンキリン反復モジュールおよびＣ末端アンキリンキャッピングモジュールを意味する。Ｎ３ＣおよびＮ４Ｃは、そのＮ末端とＣ末端アンキリンキャッピングモジュールとのあいだの３個または４個のアンキリン反復モジュールの含量に従って命名される。発現は実施例２に記載するように実施した。培養物３０ μｌに対応する試料を様々な時点で採取して、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した（クーマシー染色）。レーン１：分子量マーカー（大きさはｋＤａで示す）；レーン２〜７：誘導直前の２個のＮ２Ｃ、２個のＮ３Ｃおよび２個のＮ４Ｃクローン；レーン８〜１３：レーン２〜７と同じであるが、２．５時間の誘導後；レーン１４〜１９：レーン２〜７と同じであるが、４時間の誘導後。
【図２３】本発明に従って作製された無作為に選択したアンキリン反復タンパク質のＨｉｓタグ精製。精製技法の異なる画分を示す１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを図示する。Ｎ３ＣクローンであるＥ３−５を、実施例２に記載するように発現および精製した。レーン１は、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに結合していない回収した細胞溶解物流出物０．６ μｌを示す。レーン２は、カラム洗浄分画の最初の８００ μｌの０．６ μｌを表す。レーン３は、最後の８００ □ｌ洗浄分画の０．６ μｌを表す。レーン４、５、６、７、８、および９は、アンキリン反復タンパク質のその後の溶出段階（それぞれ８００ μｌ）の０．６ μｌを表す。レーン１０は、分子量マーカーを示す（大きさはｋＤａで表す）。
【図２４】本発明に従って作製した無作為に選択したアンキリン反復タンパク質（Ｅ３−５、Ｎ３Ｃ分子；図２２を参照のこと）のサイズ排除クロマトグラフィー。試料を、流速６０ μｌ／分のファルマシアＳＭＡＲＴシステムおよびＴＢＳ １５０（５０ ｍＭトリス塩酸、ｐＨ ７．５；１５０ ｍＭ ＮａＣｌ）を用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（アマシャムファルマシアバイオテック社、アメリカ）上で分析した。標準物質は□−アミラーゼおよびファージ２１のファージタンパク質ＳＨＰ、ならびに□のｐＤであった。標準物質の見かけの分子量を図に示す。タンパク質が空隙容積に溶出されたため、□−アミラーゼに関する見かけの分子量２００ ｋＤａは示されない。
【図２５】本発明に従って作製された無作為に選択したアンキリン反復タンパク質（Ｅ３−５、Ｎ３Ｃ分子）の円偏光二色性。スペクトルを、ＪａｓｃｏＪ−７１５機器［Ｊａｓｃｏ、日本；１０ ｎｍ／ｓ、８秒の反応、０．２ ｎｍデータピッチ、２ｎｍバンド幅、１９５ ｎｍ〜２５０ ｎｍ（天然）、または２１２ ｎｍ〜２５０ ｎｍ（変性）、３回蓄積、１試料あたり３回測定、１ｍｍキュベット］を用いて、１０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ６．５（天然）または２０ ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ ６．５、および６Ｍ塩酸グアニジニウム（変性）のいずれかにおいて記録した。ＣＤシグナルを、変性条件で２８０ ｎｍで分光光度法によって測定した試料濃度を用いて平均残基楕円率に変換した。Ｅ３−５は、最小で２０８ ｎｍおよび２２２ ｎｍにおいて天然条件下でαヘリックススペクトルを示す。二次構造は、６Ｍ塩酸グアニジニウムにおいて失われる。
【図２６】本発明に従って作製した無作為に選択したアンキリン反復タンパク質の変性挙動（図２２を参照のこと）。２２０ ｎｍでのＣＤ値を、異なるタンパク質に関する塩酸グアニジニウム濃度に対して示す。異なるタンパク質を、２０ ｍＭ ＮａＰＯ４、ｐＨ ６．５、１００ ｍＭ ＮａＣｌ中の異なる濃度の塩酸グアニジニウムにおいて室温で一晩インキュベートした。２２０ ｎｍでの円偏光二色性シグナルは、それぞれの試料に関して３本ずつ測定した（実施例２において示された条件）。二次構造は、変性剤が高濃度である場合に限って失われ、調べたタンパク質安定性の高さを示している。
【図２７】本発明に従って作製された無作為に選択したアンキリン反復タンパク質の結晶（Ｅ３−５、図２２のＮ３Ｃライブラリメンバー）。結晶を、２０％ＰＥＧ ６０００、１００ ｍＭ ＭＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ６．０において、９ｍｇタンパク質／ｍｌのＴＢＳ ５０（５０ ｍＭトリス塩酸、ｐＨ ８．０、５０ ｍＭ ＮａＣｌ）溶液から懸滴（タンパク質２μｌ、および緩衝液２μｌを混合する；５００ μｌ緩衝液リザーバー）によって２０℃で５日間成長させた。
【図１】
2004508033.tif 000043
【図２ａ】
2004508033.tif 000044
【図２ｂ】
2004508033.tif 000045
【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
2004508033.tif 000049
【図２ｇ】
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【図２ｈ】
2004508033.tif 000051
【図３】
2004508033.tif 000052
【図４ａ】
2004508033.tif 000053
【図４ｂ】
2004508033.tif 000054
【図４ｃ】
2004508033.tif 000055
【図４ｄ】
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【図４ｅ】
2004508033.tif 000057
【図４ｆ】
2004508033.tif 000058
【図５ａ】
2004508033.tif 000059
【図５ｂ】
2004508033.tif 000060
【図５ｃ】
2004508033.tif 000061
【図５ｄ】
2004508033.tif 000062
【図６】
2004508033.tif 000063
【図７ａ】
2004508033.tif 000064
【図７ｂ】
2004508033.tif 000065
【図７ｃ】
2004508033.tif 000066
【図８】
2004508033.tif 000067
【図９ａ】
2004508033.tif 000068
【図９ｂ】
2004508033.tif 000069
【図９ｃ】
2004508033.tif 000070
【図１０ａ】
2004508033.tif 000071
【図１０ｂ】
2004508033.tif 000072
【図１１ａ】
2004508033.tif 000073
【図１１ｂ】
2004508033.tif 000074
【図１１ｃ】
2004508033.tif 000075
【図１１ｄ】
2004508033.tif 000076
【図１２ａ】
2004508033.tif 000077
【図１２ｂ】
2004508033.tif 000078
【図１２ｃ】
2004508033.tif 000079
【図１２ｄ】
2004508033.tif 000080
【図１３】
2004508033.tif 000081
【図１４】
2004508033.tif 000082
【図１５】
2004508033.tif 000083
【図１６】
2004508033.tif 000084
【図１７】
2004508033.tif 000085
【図１８】
2004508033.tif 000086
【図１９】
2004508033.tif 000087
【図２０】
2004508033.tif 000088
【図２１】
2004508033.tif 000089
【図２２】
2004508033.tif 000090
【図２３】
2004508033.tif 000091
【図２４】
2004508033.tif 000092
【図２５】
2004508033.tif 000093
【図２６】
2004508033.tif 000094
【図２７】
2004508033.tif 000095
【国際公開パンフレット】
2004508033.tif 000096
2004508033.tif 000097
2004508033.tif 000098
2004508033.tif 000099
2004508033.tif 000100
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508033.tif 000226
2004508033.tif 000227
【手続補正書】
【提出日】平成14年12月11日(2002.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各反復（ｒｅｐｅａｔ）タンパク質が、連続した反復モジュールの組（ｓｅｔ）を含む反復ドメインを含み、各反復モジュールのそれぞれが、天然反復タンパク質ファミリーの一つまたは複数の反復単位に由来し、反復単位が骨格残基および標的相互作用残基を含み、反復タンパク質が反復モジュールの少なくとも一つの位置で異なり、各反復モジュールの誘導が以下の段階からなるプロセスによって行われる、反復タンパク質の集合体（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）をコードする核酸分子の集合体：
（ａ）反復単位を同定する段階；
（ｂ）反復単位の骨格残基および標的相互作用残基の同定が分析に含まれる、反復単位の構造分析および配列分析によって、反復配列モチーフを決定する段階；ならびに
（ｃ）（ｂ）の反復配列モチーフを含むように反復モジュールを構築する段階。
【請求項２】
段階（ｂ）における反復モチーフが、反復単位の標的相互作用残基の位置に対応する少なくとも一つの無作為化位置を含む、請求項１記載の集合体。
【請求項３】
段階（ｂ）における配列分析が、反復単位のアミノ酸配列の整列化によるコンセンサス配列の提供を含む、請求項１または２記載の集合体。
【請求項４】
反復モジュールのそれぞれがアミノ酸配列を有し、少なくとも７０％のアミノ酸残基が、
（ｉ）少なくとも二つの天然反復単位の対応する位置に見出されるアミノ酸残基から推定されるコンセンサスアミノ酸残基；または
（ｉｉ）天然反復単位内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基
のいずれかに対応する、請求項１から３のいずれか一項記載の集合体。
【請求項５】
組が２個〜約３０個の反復モジュールからなる、請求項１から４のいずれか一項記載の集合体。
【請求項６】
反復モジュールが直接結合している、請求項１から５のいずれか一項記載の集合体。
【請求項７】
反復モジュールが（ポリ）ペプチドリンカーによって結合している、請求項１から６のいずれか一項記載の集合体。
【請求項８】
反復ドメインが、反復モジュールのいずれか一つと異なるアミノ酸配列を有するＮ末端および／またはＣ末端キャッピングモジュールをさらに含む、請求項１から７のいずれか一項記載の集合体。
【請求項９】
反復単位がアンキリン反復である、請求項１から８のいずれか一項記載の集合体。
【請求項１０】
反復モジュールのそれぞれが以下のアンキリン反復配列モチーフを含む、請求項９記載の集合体：
2004508033.tif 000228
式中、「ｘ」は任意のアミノ酸を意味し、「±」は任意のアミノ酸または欠失を意味し、「ａ」は無極性の側鎖を有するアミノ酸を意味し、および「ｐ」は極性側鎖を有する残基を意味する。
【請求項１１】
反復モジュールのそれぞれが以下のアンキリン反復配列モチーフを含む、請求項９記載の集合体：
2004508033.tif 000229
式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸を意味する。
【請求項１２】
反復モジュールのそれぞれが以下のアンキリン反復配列モチーフを含む、請求項９記載の集合体：
2004508033.tif 000230
式中、「ｘ」は任意のアミノ酸を意味する。
【請求項１３】
「ｘ」で示される一つまたは複数の位置が無作為化されている（ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ）、請求項１０から１２のいずれか一項記載の集合体。
【請求項１４】
反復モジュールのそれぞれがアンキリン反復配列モチーフを含む、請求項９記載の集合体：
2004508033.tif 000231
式中、１はＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、ＷおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表し；
２はＨ、ＮおよびＹからなる群より選択されるアミノ酸残基を表す。
【請求項１５】
反復単位がロイシンリッチ反復（ＬＲＲ）である、請求項１から８のいずれか一項記載の集合体。
【請求項１６】
モジュールのそれぞれが以下のＬＲＲ配列モチーフを含む、請求項１５記載の集合体：
2004508033.tif 000232
式中、「ｘ」は任意のアミノ酸を意味し、「ａ」は脂肪族アミノ酸を意味し、かつ「±」は任意のアミノ酸または欠失を意味する。
【請求項１７】
モジュールの少なくとも一つが以下のＬＲＲ配列モチーフを含む、請求項１５記載の集合体：
2004508033.tif 000233
式中、「ｘ」は任意のアミノ酸を意味し、「ａ」は脂肪族アミノ酸（Ａ型ＬＲＲ）を意味する。
【請求項１８】
モジュールの少なくとも一つが以下のＬＲＲ配列モチーフを含む、請求項１５記載の集合体：
2004508033.tif 000234
式中、「ｘ」は任意のアミノ酸を意味し、「ａ」は脂肪族アミノ酸（Ｂ型ＬＲＲ）を意味する。
【請求項１９】
「ｘ」および／または「±」によって示される一つまたは複数の位置が無作為化されている、請求項１６から１８のいずれか一項記載の集合体。
【請求項２０】
Ａ型ＬＲＲコンセンサス配列における１０位のシステイン残基が親水性アミノ酸残基に置換され、かつ１７位のシステイン残基が疎水性アミノ酸残基に置換されている、請求項１７記載の集合体。
【請求項２１】
コンセンサス配列における一つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然反復単位内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基に置換されている、請求項１０から１４、または１６から２０のいずれか一項記載の集合体。
【請求項２２】
組が一種類の反復モジュールからなる、請求項１から２１のいずれか一項記載の集合体。
【請求項２３】
組が二つの異なる種類の反復モジュールからなる、請求項１から２１のいずれか一項記載の集合体。
【請求項２４】
組が、反復ドメインにおける対として二つの異なる種類の連続した反復モジュールを含む、請求項２２記載の集合体。
【請求項２５】
二つの異なる種類のモジュールがＡ型ＬＲＲおよびＢ型ＬＲＲに基づく、請求項２３または２４記載の集合体。
【請求項２６】
組に含まれる反復モジュールのアミノ酸配列が、無作為化残基を除く各種類に関して同一である、請求項２２から２５のいずれか一項記載の集合体。
【請求項２７】
それぞれの種類のコピーをコードする核酸配列が、無作為化された位置におけるアミノ酸残基をコードするコドンを除いて同一である、請求項２６記載の集合体。
【請求項２８】
核酸分子が、反復モジュールのあいだに少なくとも９ヌクレオチドの同一の核酸配列を含む、請求項１から２７のいずれか一項記載の集合体。
【請求項２９】
核酸分子が、対のあいだに少なくとも９ヌクレオチドの同一核酸配列を含む、請求項２４または２５記載の集合体。
【請求項３０】
モジュールまたは対のあいだの核酸配列のそれぞれが制限酵素認識配列を含む、請求項１から２８のいずれか一項記載の集合体。
【請求項３１】
モジュールまたは対のあいだの核酸配列のそれぞれが、二つの互換的制限酵素によって作製された付着末端から形成された核酸配列を含む、請求項１から２９のいずれか一項記載の集合体。
【請求項３２】
同一の核酸配列によって、ＰＣＲに基づく核酸分子の構築（ａｓｓｅｍｂｌｙ）を行うことができる、請求項２８または２９記載の集合体。
【請求項３３】
反復ドメインが、Ａ型ＬＲＲまたはＢ型ＬＲＲに基づく一つまたは複数のモジュール対を含み、対のそれぞれが以下の配列を有する、請求項２６記載の集合体：
2004508033.tif 000235
式中、１は、群
Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、ＷおよびＹから選択されるアミノ酸残基を表し；
式中、２は、群
Ｎ、ＳおよびＴから選択されるアミノ酸残基を表し；
式中、３は、群
Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、ＨおよびＴから選択されるアミノ酸残基を表し；かつ
式中、４は、群
Ｌ、ＶおよびＭから選択されるアミノ酸残基を表す。
【請求項３４】
モジュール対のそれぞれが以下の核酸分子によってコードされる、請求項３３記載の集合体：
2004508033.tif 000236
式中、１１１は、群
Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、ＷおよびＹから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；
式中、２２２は、群
Ｎ、ＳおよびＴから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；
式中、３３３は群
Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、ＨおよびＴから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；かつ
式中、４４４は群
Ｌ、ＶおよびＭから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表す。
【請求項３５】
少なくとも一つのモジュール対における一つまたは複数のアミノ酸残基が、天然ＬＲＲ内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基に置換されている、請求項３３記載の集合体。
【請求項３６】
少なくとも一つのモジュール対における一つまたは複数のアミノ酸コドンが、天然ＬＲＲ内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基をコードするコドンに置換されている、請求項３４記載の集合体。
【請求項３７】
請求項１から３６のいずれか一項記載の核酸分子の集合体を含む組み換え型核酸分子の集合体。
【請求項３８】
請求項１から３６のいずれか一項記載の核酸分子の集合体、または請求項３７記載の組み換え型核酸分子の集合体を含むベクターの集合体。
【請求項３９】
請求項１から３６のいずれか一項記載の核酸分子の集合体、請求項３７記載の組み換え型核酸分子の集合体、または請求項３８記載のベクターの集合体を含む、宿主細胞の集合体。
【請求項４０】
請求項１から３６のいずれか一項記載の核酸分子の集合体、請求項３７記載の組み換え型核酸分子の集合体、請求項３８記載のベクターの集合体によってコードされる、または請求項３９記載の宿主細胞の集合体によって産生される、反復タンパク質の集合体。
【請求項４１】
請求項１から３６のいずれか一項記載の核酸分子の集合体を構築する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）　反復タンパク質ファミリー由来の反復単位を同定する段階；
（ｂ）　反復単位において骨格残基および標的相互作用残基を同定する段階；
（ｃ）　反復タンパク質ファミリーの少なくとも一つのメンバーからの骨格残基および無作為化標的相互作用残基を含む、少なくとも一種類の反復モジュールを推定する段階；ならびに
（ｄ）　段階（ｃ）において推定された少なくとも一種類の反復モジュールの二つまたはそれ以上のコピーを含む反復タンパク質をそれぞれがコードする核酸分子を構築する段階。
【請求項４２】
段階（ｃ）において推定された少なくとも一つの反復モジュールがアミノ酸配列を有し、少なくとも７０％のアミノ酸残基が、
（ｉ）少なくとも二つの天然反復単位の対応する位置に見出されるアミノ酸残基から推定されるコンセンサスアミノ酸残基；または
（ｉｉ）天然反復単位内の対応する位置に見出されるアミノ酸残基
のいずれかに対応する、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
請求項４０記載の反復タンパク質の集合体を作製する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）請求項３９記載の宿主細胞の集合体を提供する段階；および
（ｂ）宿主細胞に含まれる核酸分子の集合体を発現させる段階。
【請求項４４】
既定の特性を有する反復タンパク質を得る方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）　請求項４０もしくは４１記載の、または請求項４３に従って産生された、反復タンパク質の集合体を提供する段階；ならびに
（ｂ）　既定の特性を有する少なくとも一つの反復タンパク質を得るために、集合体をスクリーニングする段階および／または集合体から選択する段階。
【請求項４５】
既定の特性が、標的に対する結合である、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
請求項２６から３６のいずれか一項記載の集合体からの反復タンパク質。
【請求項４７】
請求項４６記載の反復タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項４８】
請求項４７記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４９】
請求項４６記載の反復タンパク質または請求項４７記載の核酸分子、ならびに選択的に、薬学的に許容される担体および／もしくは希釈剤を含む、薬学的組成物。
【請求項５０】
核酸分子が
2004508033.tif 000237
2004508033.tif 000238
である、請求項３３または３４記載の集合体を構築するための反復モジュール対をコードする核酸分子：
式中、１１１は群
Ｄ、Ｅ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｒ、Ｋ、ＷおよびＹから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；
式中、２２２は群
Ｎ、ＳおよびＴから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；
式中、３３３は群
Ｇ、Ｓ、Ｄ、Ｎ、ＨおよびＴから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表し；かつ
式中、４４４は群
Ｌ、ＶおよびＭから選択されるアミノ酸残基をコードするコドンを表す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
「一つまたは複数の反復単位に由来する反復モジュール」という用語は、以下を意味する：
（ｉ）天然反復タンパク質の一つもしくは複数の反復単位の分析と、反復モジュールの推定とを含むプロセス。このプロセスは以下の段階を含んでもよい：
（ａ）天然反復単位を同定する段階；
（ｂ）配列アラインメントによって最初の反復配列モチーフを決定する段階；
（ｃ）上記の反復単位の配列分析および構造分析によって、反復配列モチーフを精密化する段階；
（ｄ）（ｃ）の反復配列モチーフに従って反復モジュールを構築する段階；
または
（ｉｉ）（ｉ）のプロセスの後にランダム変異誘発もしくはランダムキメラ誘発によって反復モジュールのさらなる考案を含むプロセス。




【国際調査報告】
2004508033.tif 000239
2004508033.tif 000240
2004508033.tif 000241
2004508033.tif 000242
2004508033.tif 000243
2004508033.tif 000244