(57)【要約】本発明は、オレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする単離された核酸フラグメントに関する。本発明はまた、センスもしくはアンチセンスの向きのオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼの全部もしくは一部分をコードするキメラ遺伝子の構築にも関し、ここで、該キメラ遺伝子の発現は、形質転換された宿主細胞中での変えられたレベルのオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼの産生をもたらす。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
最低１６６アミノ酸の第一のポリペプチド（該ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１６より成る群から選択される第二のポリペプチドと比較した場合にＣｌｕｓｔａｌ整列法に基づき最低９０％の配列の同一性を有する）、もしくは好ましくは最低３６３アミノ酸の第三のポリペプチド（該ポリペプチドは、配列番号１４から選択される第四のポリペプチドに比較される場合にＣｌｕｓｔａｌ整列法に基づき最低９２％の同一性の配列の同一性を有する）をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列の同一性が最低９３％である、請求項１記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項３】
配列の同一性が最低９６％である、請求項１記載のポリヌクレオチド配列。
【請求項４】
第一のポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および１６より成る群から選択される、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５より成る群から選択されるヌクレオチド配列を含んで成る、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
第一のポリペプチドがオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼである、請求項１記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
（ａ）相補物および該ポリヌクレオチドが同一の数のヌクレオチドより成り、かつ、（ｂ）相補物および該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が１００％の相補性を有する、請求項１記載のポリヌクレオチドの単離された相補物。
【請求項８】
（ａ）相補物および該ポリヌクレオチドが同一の数のヌクレオチドより成り、かつ、（ｂ）相補物および該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が１００％の相補性を有する、請求項５記載のポリヌクレオチドの単離された相補物。
【請求項９】
（１）最低４００ヌクレオチドを含んで成り、かつ、（２）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳおよび６５℃の洗浄条件下で請求項１記載の単離されたポリヌクレオチドとハイブリダイズされたまま留まる、単離された核酸分子。
【請求項１０】
（１）最低４００ヌクレオチドを含んで成り、かつ、（２）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳおよび６５℃の洗浄条件下で請求項５記載の単離されたポリヌクレオチドとハイブリダイズされたまま留まる、単離された核酸分子。
【請求項１１】
請求項１記載のポリヌクレオチドを含んで成る細胞。
【請求項１２】
細胞が、酵母細胞、細菌細胞および植物細胞より成る群から選択される、請求項１１記載の細胞。
【請求項１３】
請求項１のポリヌクレオチドを含んで成るトランスジェニック植物。
【請求項１４】
細胞中に請求項１記載のポリヌクレオチドを導入することを含んで成る、細胞の形質転換方法。
【請求項１５】
（ａ）請求項１記載のポリヌクレオチドで植物細胞を形質転換すること、および（ｂ）形質転換された植物細胞から植物を再生させること、を含んで成る、トランスジェニック植物の製造方法。
【請求項１６】
（ａ）請求項１記載のポリヌクレオチドにより含まれるヌクレオチド配列を選択すること、および（ｂ）該ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドフラグメントを合成すること、を含んで成る、ポリヌクレオチドフラグメントの製造方法。
【請求項１７】
フラグメントがインビボで製造される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）最低１６６アミノ酸、ならびに（ｂ）配列番号２、４、６、８、１０、１２および１６より成る群から選択されるアミノ酸配列に比較されるＣｌｕｓｔａｌ法に基づき最低９０％の配列の同一性を有する、もしくは、好ましくは（ｃ）最低３６３アミノ酸、および（ｄ）配列番号１４より成る群から選択されるアミノ酸配列と比較してＣｌｕｓｔａｌ法に基づき最低９２％の配列の同一性を有する、を含んで成る、単離されたポリペプチド。
【請求項１９】
配列の同一性が最低９３％である、請求項１８記載のポリペプチド。
【請求項２０】
配列の同一性が最低９６％である、請求項１８記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ポリペプチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および１６より成る群から選択される配列を有する、請求項１８記載のポリペプチド。
【請求項２２】
ポリペプチドがオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼである、請求項１８記載のポリペプチド。
【請求項２３】
最低１個の適する調節配列に操作可能に連結される請求項１記載のポリヌクレオチドを含んで成るキメラ遺伝子。
【請求項２４】
（ａ）請求項２３記載のキメラ遺伝子で宿主細胞を形質転換すること；および
（ｂ）段階（ａ）の形質転換された細胞を、該キメラ遺伝子の発現に適する条件下で成長させること、
を含んで成る、宿主細胞中でのオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼ発現のレベルを変える方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、１９９９年１１月２４日に出願された米国仮出願第６０／１６７５１０号明細書の利益を特許請求する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は植物分子生物学の分野にある。より具体的には、本発明は、植物および種子中のオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする核酸フラグメントに関する。
【０００３】
（発明の背景）
植物脂質の組成が主として膜の機能および種の気候上の適応を決定する。結果として、多様な特性および組成を表す多くの天然に存在する植物油が存在する。これは、特定の産業上および栄養の機能を果たす多様な植物油の選択につながっている。脂質組成は、アシル担体タンパク質（ＡＣＰ）上での脂肪酸の合成、およびチオエステラーゼによるＡＣＰからのそれらの除去により決定される。ＡＣＰから除去された脂肪酸鎖はもはや伸長もしくは脱飽和の基質でなく、そして、頭部基に自由に結合されて、油の主成分であるより高次のトリアシル化合物を形成する。
【０００４】
植物脂質は、トリアシルグリセロールの形態で可食性油としてのそれらの主要な使用を見出している。可食性油の特定の性能および健康への属性は、主としてそれらの脂肪酸組成により決定される。商業的植物の種類由来の大部分の植物油は、主として、パルミチン酸（１６：０）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）およびリノレン酸（１８：３）より構成される。パルミチン酸およびステアリン酸はそれぞれ１６および１８個の炭素長さの飽和脂肪酸である。オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸は、それぞれ１、２、および３個の二重結合を含有する１８個の炭素長さの不飽和脂肪酸である。オレイン酸は一不飽和脂肪酸と称される一方、リノール酸およびリノレン酸は多不飽和脂肪酸と称される。
【０００５】
植物中での油の生合成は十分に研究されている［Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｖｏｌ．８（１）：１−４３中のＨａｒｗｏｏｄ（１９８９）を参照されたい］。パルミチン酸、ステアリン酸およびオレイン酸の生合成は、「ＡＣＰ経路（ｔｒａｃｋ）」の３種の重要な酵素、すなわちパルミトイル−ＡＣＰ伸長酵素（ｅｌｏｎｇａｓｅ）、ステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼおよびアシル−ＡＣＰチオエステラーゼの相互作用によりプラスチド中で発生する。これら３種の酵素型のうち、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、担体タンパク質（ＡＣＰ）から、そして従って代謝経路からアシル鎖を除去するよう機能する。オレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼは、オレオイル−ＡＣＰチオエステルの加水分解を高速で、ならびにパルミトイル−ＡＣＰおよびステアロイル−ＡＣＰの加水分解をずっとより低速で触媒する。この基質特異性を表さない他のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼが同定されている。ＡＣＰに結合された基質の同一のプール上で作用する、全部の形態のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ、パルミトイル−ＡＣＰ伸長酵素およびステアロイル−ＡＣＰデサチュラーゼの間の競争が、植物油のトリアシルグリセリド中で見出されるパルミチン酸、ステアリン酸および多不飽和酸の比を最終的に決定する。
【０００６】
最近の研究の努力は、冠動脈心疾患の危険の低下において一不飽和脂肪酸が演じる役割を検査した。過去において、一不飽和物（ｍｏｎｏｓａｔｕｒａｔｅ）は、飽和物および多不飽和物と対照的に、血清コレステロールおよび冠動脈心疾患の危険に対する影響を有しないと考えられた。いくつかの最近のヒト臨床試験は、一不飽和脂肪の豊富な食餌が、「善玉」（高密度リポタンパク質）コレステロールを維持する一方で「悪玉」（低密度リポタンパク質）コレステロールを低下させるかもしれないことを示唆している（Ｍａｔｔｓｏｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｉｐｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９８５）２６：１９４−２０２を参照されたい）。食餌中の一不飽和脂肪の意義は、１９８７年に国立心・肺・血液研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ　ａｎｄ　Ｂｌｏｏｄ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ）により後援された第２回一不飽和脂肪に関する討論会（ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｃｏｌｌｏｑｕｉｕｍ　ｏｎ　Ｍｏｎｏｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ　Ｆａｔｓ）での７ヶ国からの国際的な研究者らにより確認された。従って、高レベルのオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼ活性は、植物油中の一不飽和オレイン酸の濃度の増大で有利であるかもしれない。
【０００７】
植物および細菌中で見出されるクラスＩチオエステラーゼは、アシル−ＡＣＰチオエステルの加水分解を触媒する単機能タンパク質である。クラスＩＩチオエステラーゼ活性は、通常、多機能ポリペプチドの成分として見出され、また、鳥類（ＲｏｇｅｒｓとＫｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ（１９８４）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：４４４−４４８）およびラット（Ｎａｇｇｅｒｔら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１１４６−１１５０）からの酵素により例示される。
【０００８】
Ｐｅｒｃｈｏｒｏｗｉｃｚらに発行された米国特許第５，１４７，７９２号明細書は、チオエステラーゼＩＩおよびアシル担体タンパク質を使用することによる、プラスチド中の脂肪酸分布のより短い鎖にされた種への移動方法を記述する。Ｐｅｒｃｈｏｒｏｗｉｃｚらは単離されたプラスチド中の脂肪酸分布を変える方法を教示する一方、彼らは、植物細胞全体でのこうした変えられた脂肪酸プロフィルを生じさせる方法を教示しない。彼らは、さらに、変えられた脂肪酸プロフィルを生じさせる有性生殖植物の産生方法を教示しない。従って、該方法は、新たな脂肪酸組成をもつ、使用に適した植物油の大スケール生産のための手段を提供しない。
【０００９】
Ｄａｖｉｅｓらに発行された米国特許第５，２９８，４２１号明細書は、植物の中鎖を好むアシル−ＡＣＰチオエステラーゼおよび関係する方法を記述する。Ｄａｖｉｅｓらにより教示される方法は、実質的な量の長さが１６個未満の炭素原子の脂肪酸を含む種子油組成をもつ植物を生じさせる。これらの油は、この特徴において、通常の穏やかな（ｔｅｍｐｅｒａｔｅ）脂肪種子により産生される種子油と異なる。本発明で教示される種子油の脂肪酸組成は、より短い（１６個未満の炭素原子）脂肪酸が正常の油に比較して上昇されていない。本発明で生じられる脂肪酸プロフィルは、それらが上昇されたレベルの長さが１６および１８個の炭素原子の完全に飽和の脂肪酸を含有するために、普遍的な穏やかな脂肪種子、およびＤａｖｉｅｓらの発明と異なる。
【００１０】
１９９６年６月２５日にＨｉｔｚらに発行された米国特許第５，５３０，１８６号明細書は、変えられた脂肪酸組成を有するトランスジェニック植物における（それぞれ）アシル−ＡＣＰおよびパルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする単離された核酸フラグメントの使用を記述する。アシル−ＡＣＰチオエステラーゼは、Ｄａｖｉｅｓにより記述されたものに類似の中鎖を好む酵素をコードする。パルミトイル−ＡＣＰチオエステラーゼは、１６個の炭素の不飽和パルミチン酸に対する特異性を表す。６種の異なる植物種からの、オレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする３個の完全長ｃＤＮＡおよび３個の部分的ｃＤＮＡの証拠を、本明細書に提示する。
【００１１】
（発明の要約）
本発明は：（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２および１６より成る群から選択されるポリペプチドに比較される場合にＣｌｕｓｔａｌ整列法に基づき最低９０％の同一性を有する最低１６６アミノ酸のポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列、もしくは配列番号１４からのポリペプチドに比較される場合にＣｌｕｓｔａｌ整列法に基づき最低９２％の同一性を有する最低３６３アミノ酸のポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、ならびに（ｂ）第一もしくは第二のヌクレオチド配列の相補物を含んで成る第三のヌクレオチド配列、より成る群から選択されるヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００１２】
第二の態様において、本発明の単離されたポリヌクレオチドが、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および１６より成る群から選択されるポリペプチドをコードする、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５より成る群から選択される核酸配列を含んで成る第一のヌクレオチド配列を含んで成ることが好ましい。
【００１３】
第三の態様において、本発明は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５より成る群から選択されるヌクレオチド配列由来の６０の連続するヌクレオチドの最低１種（好ましくは４０の最低１種、最も好ましくは３０の最低１種）のヌクレオチド配列、ならびにこうしたヌクレオチド配列の相補物を含んで成る単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００１４】
第四の態様において、本発明は、最低１種の適する調節配列に操作可能に連結される本発明の単離されたポリヌクレオチドを含んで成るキメラ遺伝子に関する。
【００１５】
第五の態様において、本発明は、本発明のキメラ遺伝子もしくは本発明の単離されたポリヌクレオチドを含んで成る単離された宿主細胞に関する。該宿主細胞は、酵母もしくは植物細胞のような真核生物、または細菌細胞のような原核生物であってよい。本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドもしくは本発明のキメラ遺伝子を含んで成るウイルス、好ましくはバキュロウイルスにも関する。
【００１６】
第六の態様において、本発明はまた、本発明のキメラ遺伝子もしくは本発明の単離されたポリヌクレオチドを含んで成る単離された宿主細胞の製造方法にも関し、該方法は、単離された適する宿主細胞を、本発明のキメラ遺伝子もしくは単離されたポリヌクレオチドで形質転換もしくはトランスフェクションのいずれかをすることを含んで成る。
【００１７】
第七の態様において、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２および１６より成る群から選択されるポリペプチドに比較されるＣｌｕｓｔａｌ整列法に基づき最低９０％の同一性を含んで成る最低１６６アミノ酸のオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼポリペプチド、もしくは、配列番号１４からのポリペプチドに比較されるＣｌｕｓｔａｌ整列法に基づき最低９２％の同一性を含んで成る最低３６３アミノ酸のポリペプチドに関する。
【００１８】
第八の態様において、本発明は、宿主細胞、好ましくは植物細胞におけるオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼポリペプチドの発現もしくは酵素活性のレベルに影響を及ぼす単離されたポリヌクレオチドの選択方法に関し、該方法は：（ａ）本発明の単離されたポリヌクレオチドもしくは本発明の単離されたキメラ遺伝子を構築すること；（ｂ）単離されたポリヌクレオチドもしくは単離されたキメラ遺伝子を宿主細胞に導入すること；（ｃ）該単離されたポリヌクレオチドを含有する宿主細胞中でのオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼポリペプチドもしくは酵素活性のレベルを測定すること；および（ｄ）単離されたポリヌクレオチドを含有する宿主細胞中でのオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼポリペプチドもしくは酵素活性のレベルを、単離されたポリヌクレオチドを含有しない宿主細胞中でのオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼポリペプチドもしくは酵素活性のレベルと比較すること、の段階を含んで成る。
【００１９】
第九の態様において、本発明は：配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５より成る群から選択されるヌクレオチド配列由来の３０の連続するヌクレオチドの最低１種（好ましくは４０の最低１種、最も好ましくは６０の最低１種）のヌクレオチド配列、およびこうしたヌクレオチド配列の相補物を含んで成るオリゴヌクレオチドプライマーを合成すること；ならびに、該オリゴヌクレオチドプライマーを使用して核酸フラグメント（好ましくはクローニングベクター中に挿入されたｃＤＮＡ）を増幅すること、の段階を含んで成る、オレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼポリペプチド、好ましくは植物のオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼポリペプチドの実質的な一部分をコードする核酸フラグメントを得る方法に関する。増幅された核酸フラグメントは、好ましくはオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列の実質的な一部分をコードすることができる。
【００２０】
第十の態様において、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドでｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーをプロービングすること；本発明の単離されたポリヌクレオチドとハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定すること；同定されたＤＮＡクローンを単離すること；および単離されたＤＮＡクローンを含んで成るｃＤＮＡもしくはゲノムフラグメントを配列決定すること、の段階を含んで成る、オレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全部もしくは実質的な一部分をコードする核酸フラグメントを得る方法に関する。
【００２１】
第十一の態様において、本発明は、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含んで成る、ハイブリダイゼーション混合物のような組成物に関する。
【００２２】
第十二の態様において、本発明は：（ａ）本発明のキメラ遺伝子もしくは本発明の発現カセットで宿主細胞を形質転換すること；および（ｂ）形質転換された宿主細胞、好ましくは単子葉植物もしくは双子葉植物のような植物細胞を、ヌル突然変異体を補完するのに十分な量のオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で成長させて正の選択手段（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｍｅａｎｓ）を提供すること、を含んで成る、形質転換された細胞の正の選択方法に関する。
【００２３】
第十三の態様において、本発明は：（ａ）本発明のキメラ遺伝子で宿主細胞を形質転換すること；および（ｂ）キメラ遺伝子の発現に適する条件下で、形質転換された宿主細胞を成長させること、を含んで成る、宿主細胞中でのオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼの発現のレベルを変える方法に関し、ここで、キメラ遺伝子の発現が、形質転換された宿主細胞中でのオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼの変えられたレベルの産生をもたらす。
【００２４】
（図面および配列表の簡単な説明）
本発明は、以下の詳述された記述、ならびに本出願の一部を形成する付随する図面および配列表からより十分に理解することができる。
【００２５】
図１
発明にかかる、アフリカンデージー（Ｄｉｍｏｒｐｈｏｔｈｅｃａ　ｓｉｎｕａｔａ、［ＳＩＮ２］として示される配列番号２）、トウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ、［ＳＩＮ６］として示される配列番号６）、コメ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ、［ＳＩＮ８］として示される配列番号８）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ、配列番号１７、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　４０４０２８）、ゴーファーアップル（Ｌｉｃａｎｉａ　ｍｉｃｈａｕｘｉｉ、［ＳＩＮ４］として示される配列番号４）、マンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ　ｍａｎｇｏｓｔａｎａ、配列番号１８、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　１９３００７７）、ベルノニア（Ｖｅｒｎｏｎｉａ　ｍｅｓｐｉｌｉｆｏｌｉａ、［ＳＩＮ１０］として示される配列番号１０）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ、配列番号１９、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　４０４０２６）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ、［ＳＩＮ１２］として示される配列番号１２）、アフリカパーム油（Ｅｌａｅｉｓ　ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ、配列番号２０、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　４７０４６４０）、トウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ、［ＳＩＮ１４］として示される配列番号１４）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ、［ＳＩＮ１６］として示される配列番号１６）、ならびに２種のアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のタンパク質（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）、それぞれ配列番号２１および２２、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　７４８７９８３およびｇｉ　１０７６３６１）からのオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列の比較を示す。
【００２６】
表１は、本明細書に記述されるポリペプチド、これらのポリペプチドの全部もしくは実質的な一部分を表すポリペプチドをコードする核酸フラグメントを含んで成るｃＤＮＡクローンの呼称、および添付される配列表で使用されるところの対応する識別名（配列番号）を列挙する。配列の記述およびそれに添付される配列表は、Ｃ．Ｆ．Ｒ．第３７条§１．８２１−１．８２５に示されるところの特許出願におけるヌクレオチドおよび／もしくはアミノ酸配列の開示の基準となる規則に従う。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
配列表は、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１３：３０２１−３０３０（１９８５）およびＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊ．２１９（Ｎｏ．２）：３４５−３７３（１９８４）（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるＩＵＰＡＣ−ＩＵＢＭＢ基準に一致して定義されるところのヌクレオチド配列記号についての一文字記号およびアミノ酸の三文字記号を含有する。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列データに使用される記号および形式は、Ｃ．Ｆ．Ｒ．第３７条§１．８２２の要件に従う。
【００２９】
（発明の詳細な記述）
本開示の情況において、多数の用語を利用する。「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「核酸配列」および「核酸フラグメント」／「単離された核酸フラグメント」という用語は互換性に使用する。これらの用語はヌクレオチド配列および同様のものを包含する。ポリヌクレオチドは、合成、非天然もしくは変えられたヌクレオチド塩基を場合によっては含有する、一本鎖もしくは二本鎖であるＲＮＡもしくはＤＮＡであってよい。ＤＮＡのポリマーの形態のポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡの１種もしくはそれ以上のセグメント、またはそれらの混合物より構成されてよい。本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５由来の１２００の連続するヌクレオチドの最低１種、好ましくは８００の連続するヌクレオチドの最低１種、最も好ましくは最低４００の連続するヌクレオチドの１種、もしくはこうした配列の相補物を包含してよい。
【００３０】
「単離された」ポリヌクレオチドという用語は、限定されるものでないが、その天然に存在する環境で見出されるところのそれに通常付随するもしくはそれと相互作用する他の染色体および染色体外のＤＮＡならびにＲＮＡのような他の核酸配列を実質的に含まないポリヌクレオチドを指す。単離されたポリヌクレオチドは、それらが天然に存在する宿主細胞から精製してよい。当業者に既知の慣習的核酸精製方法を使用して、単離されたポリヌクレオチドを得てよい。該用語はまた、組換えポリヌクレオチドおよび化学的に合成されたポリヌクレオチドも包含する。
【００３１】
「組換え」という用語は、例えば、核酸配列が、例えば化学合成、もしくは遺伝子工学技術による単離された核酸の操作により、配列の２個の別の方法で分離されたセグメントの人工的結合により作成されることを意味する。
【００３２】
本明細書で使用されるところの「ｃｏｎｔｉｇ」は、共通もしくは重なり合いを共有する２種もしくはそれ以上の構成要素のヌクレオチド配列から集成される１個のヌクレオチド配列を指す。例えば、共通もしくは重なり合う配列を同定するために、２個もしくはそれ以上の核酸フラグメントのヌクレオチド配列を比較かつ整列することができる。２個もしくはそれ以上の核酸フラグメントの間に共通もしくは重なり合う配列が存在する場合、該配列（および従ってそれらの対応する核酸フラグメント）を単一の連続するヌクレオチド配列に集成して、「ｃｏｎｔｉｇ」を形成することができる。
【００３３】
本明細書で使用されるところの核酸フラグメントの場合の「実質的に類似の」は、１個もしくはそれ以上のアミノ酸の置換をもたらすがしかし該ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの機能的特性に影響を及ぼさない１個もしくはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化を指す。「実質的に類似の」はまた、１個もしくはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が、例えばアンチセンスもしくは共抑制技術による遺伝子抑制により遺伝子発現パターンを変える核酸フラグメントの能力に影響を及ぼさない、核酸フラグメントを指す。「実質的に類似の」はまた、遺伝子抑制もしくは生じるタンパク質分子の機能的特性の変更を媒介する能力に関して生じる転写物の機能的特性に実質的に影響を及ぼさない１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの欠失もしくは挿入のような本発明の核酸フラグメントの改変も指す。従って、本発明は、特定の例示的ヌクレオチドもしくはアミノ酸の配列以上を包含しかつそれらの機能的同等物を包含することが理解される。「実質的に類似の」および「実質的に対応する」という用語は、本明細書で互換性に使用する。
【００３４】
一態様において、実質的に類似の核酸フラグメントは、本発明の核酸フラグメントの下位フラグメントもしくは改変を表す核酸フラグメントをスクリーニングすることにより得ることができ、ここで、１個もしくはそれ以上のヌクレオチドが、植物もしくは植物細胞中での改変されない核酸フラグメントによりコードされるポリペプチドのレベルに影響を及ぼすそれらの能力のために置換、欠失および／もしくは挿入される。例えば、本核酸フラグメント由来の４００の連続するヌクレオチドの最低１種を表す実質的に類似の核酸フラグメントを構築しかつ植物もしくは植物細胞に導入することができる。実質的に類似の核フラグメントに曝露される植物もしくは植物細胞中に存在する改変されない核酸フラグメントによりコードされるポリペプチドのレベルを、その後、実質的に類似の核酸フラグメントに曝露されない植物もしくは植物細胞中での該ポリペプチドのレベルと比較することができる。
【００３５】
例えば、遺伝子発現のアンチセンス抑制および共抑制を、ある遺伝子のコーディング領域全体未満を表す核酸フラグメントを使用して、および抑制されるべき遺伝子と１００％の配列の同一性を共有しない核酸フラグメントを使用することにより、達成してよいことが、当該技術分野で公知である。さらに、所定の部位での化学的に同等なアミノ酸の産生をもたらすがしかしコードされるポリペプチドの機能的特性に影響しない核酸フラグメント中の変化が、当該技術分野で公知である。従って、アミノ酸アラニン（疎水性アミノ酸）のコドンを、グリシンのような別のより少なく疎水性の残基、またはバリン、ロイシンもしくはイソロイシンのようなより疎水性の残基をコードするコドンにより置き換えてよい。同様に、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸のような１個の負に荷電した残基の代わりに別のもの、もしくは、アルギニンの代わりにリシンのような１個の正に荷電した残基の代わりに別のものの置換をもたらす変化もまた、機能的に同等な産物を産生すると期待することができる。ポリペプチド分子のＮ末端およびＣ末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変化もまた、該ポリペプチドの活性を変えると期待されないことができる。提案された改変のそれぞれは、コードされる産物の生物学的活性の保持の決定がそうであるように、当該技術分野の慣例の熟練内に十分にある。結果として、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５より成る群から選択されるヌクレオチド配列由来の６０の連続するヌクレオチドの最低１種（好ましくは４０の最低１種、最も好ましくは３０の最低１種）のヌクレオチド配列、ならびにこうしたヌクレオチド配列の相補物を含んで成る単離されたポリヌクレオチドを、宿主細胞中でのオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼポリペプチドの発現に影響を及ぼす単離されたポリヌクレオチドの選択方法で使用してよい。ウイルスもしくは宿主細胞（植物細胞もしくは酵母細胞のような真核生物、または細菌細胞のような原核生物）中でのポリペプチドの発現のレベルに影響を及ぼす単離されたポリヌクレオチドの一選択方法は：本発明の単離されたポリヌクレオチドもしくは本発明の単離されたキメラ遺伝子を構築すること：該単離されたポリヌクレオチドもしくは単離されたキメラ遺伝子を宿主細胞に導入すること；該単離されたポリヌクレオチドを含有する宿主細胞中でのポリペプチドもしくは酵素活性のレベルを測定すること：および、該単離されたポリヌクレオチドを含有する宿主細胞中でのポリペプチドもしくは酵素活性のレベルを、該単離されたポリヌクレオチドを含有しない宿主細胞中でのポリペプチドもしくは酵素活性のレベルと比較すること、の段階を含んでよい。
【００３６】
さらに、実質的に類似の核酸フラグメントはまた、ハイブリダイズするそれらの能力も特徴としてよい。こうした相同性の推定は、当業者により十分に理解されるとおり、ストリンジェンシーの条件下でのＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡのいずれかのハイブリダイゼーションにより提供される（ＨａｍｅｓとＨｉｇｇｉｎｓ、編（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ、ＩＲＬ　プレス（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）、英国オックスフォード）。ストリンジェンシーの条件は、遠く関係した生物体からの相同的配列のような中程度に類似のフラグメントについて、緊密に関係した生物体からの機能的酵素を再現する遺伝子のような高度に類似したフラグメントまでスクリーニングするよう調節することができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄がストリンジェンシーの条件を決定する。一組の好ましい条件は、室温で１５分間の６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで開始し、その後４５℃で３０分間の２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで反復され、そしてその後５０℃で３０分間の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで２回反復される一連の洗浄を使用する。より好ましい一組のストリンジェントの条件はより高温を使用し、ここでは、洗浄は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での最後の２回の３０分の洗浄の温度が６０℃に増大されたことを除いて上のものに同一である。別の好ましい組の高度にストリンジェントな条件は、６５℃での０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の最後の洗浄を使用する。
【００３７】
本発明の実質的に類似の核酸フラグメントはまた、当業者により普遍的に使用されるアルゴリズムにより決定されるとおり、それらがコードするアミノ酸配列の、本明細書に開示されるアミノ酸配列への同一性のパーセントも特徴としてよい。
【００３８】
適する核酸フラグメント（本発明の単離されたポリヌクレオチド）は、本明細書に報告されるアミノ酸配列に最低約７０％同一、好ましくは最低約８０％、より好ましくは最低約８５％、なおより好ましくは最低約９０％、および最も好ましくは最低約９５％同一であるポリペプチドをコードする。好ましい核酸フラグメントは、本明細書に報告されるアミノ酸配列に約９２％同一であるアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸フラグメントは、本明細書に報告されるアミノ酸配列に最低約９３％同一であるアミノ酸配列をコードする。本明細書に報告されるアミノ酸配列に最低約９６％同一であるアミノ酸配列をコードする核酸フラグメントが最も好ましい。
【００３９】
適する核酸フラグメントは、上の同一性を有するのみならず、しかし典型的には、最低１０、好ましくは２０、より好ましくは３０、なおより好ましくは５０、より好ましくは最低１００、より好ましくは最低１５０アミノ酸、好ましくは最低１６６アミノ酸、より好ましくは最低２００アミノ酸、なおより好ましくは最低２５０アミノ酸、および最も好ましくは最低３００アミノ酸を有するポリペプチドをコードする。配列の整列および同一性のパーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティックスコンピュータ計算ソフトウェアパッケージのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡスター　インク（ＤＮＡＳＴＡＲ　Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン）を使用して実施した。配列の複数の整列は、デフォルトのパラメータ（ギャップ　ペナルティ（ＧＡＰ　ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０、ギャップ長ペナルティ（ＧＡＰ　ＬＥＮＧＴＨ　ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０）を用いてＣｌｕｓｔａｌ整列法（ＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を使用して実施した。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用する対にした整列のためのデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ　１、ギャップ　ペナルティ（ＧＡＰ　ＰＥＮＡＬＴＹ）＝３、ウィンドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびダイアゴナルズ　セイブド（ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ　ＳＡＶＥＤ）＝５であった。
【００４０】
アミノ酸もしくはヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、該アミノ酸もしくはヌクレオチド配列が含んで成るタンパク質もしくは遺伝子の推定の同定を提供するのに十分であるアミノ酸もしくはヌクレオチド配列を含んで成る。アミノ酸およびヌクレオチド配列は、当業者により人的に、もしくはＢＬＡＳＴ（基本的局所整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／もまた参照されたい）のようなアルゴリズムを使用するコンピュータに基づく配列の比較および同定ツールを使用することによるかのいずれかで評価することができる。一般に、１０もしくはそれ以上の連続するアミノ酸、または３０もしくはそれ以上の連続するヌクレオチドの配列が、ポリペプチドもしくは核酸配列を既知のタンパク質もしくは遺伝子に相同と推定で同定するために必要である。さらに、ヌクレオチド配列に関して、３０もしくはそれ以上の連続するヌクレオチドを含んで成る遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブを、配列に依存する遺伝子の同定（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば、細菌コロニーもしくはバクテリオファージプラークのインシトゥハイブリダイゼーション）方法で使用してよい。加えて、１２もしくはそれ以上のヌクレオチドの短いオリゴヌクレオチドを、プライマーを含んで成る特定の核酸フラグメントを得るためのＰＣＲで増幅プライマーとして使用してよい。従って、ヌクレオチド配列の「実質的な部分」は、該配列を含んで成る核酸フラグメントの特異的な同定および／もしくは単離を提供することができるヌクレオチド配列を含んで成る。本明細は、１種もしくはそれ以上の特定の植物タンパク質を含んで成るポリペプチドをコードするアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。本明細書に報告されるところの配列の利益を有する当業者は、今や、当業者に既知の目的上、開示される配列の全部もしくは実質的な一部分を使用してよい。従って、本発明は、付随する配列表に報告されるところの完全な配列、ならびに上で定義されたところのそれらの配列の実質的な部分を含んで成る。
【００４１】
「コドン縮重」は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響を及ぼすことなくヌクレオチド配列の変動を許容する遺伝暗号中の相違を指す。従って、本発明は、本明細書に示されるアミノ酸配列の全部もしくは実質的な一部分をコードするヌクレオチド配列を含んで成るいかなる核酸フラグメントにも関する。当業者は、所定のアミノ酸を特定するヌクレオチドコドンの使用頻度の、特定の宿主細胞により表される「コドンの偏り」を十分に知っている。従って、宿主細胞中での向上された発現のため核酸フラグメントを合成する場合、コドン使用頻度のその頻度が、宿主細胞の好ましいコドン使用頻度の頻度に近づくような核酸フラグメントを設計することが望ましい。
【００４２】
「合成核酸フラグメント」は、当業者に既知の手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から集成することができる。これらの構成単位を連結かつアニーリングしてより大きな核酸フラグメントを形成させ、それをその後酵素的に集成して所望の核酸フラグメント全体を構築してよい。核酸フラグメントに関するところの「化学的に合成される」は、成分のヌクレオチドがインビトロで集成されたことを意味する。核酸フラグメントの人的化学合成は、十分に確立した手順を使用して達成してよいか、もしくは、多数の商業的に入手可能な機械の１つを使用して、自動化化学合成を実施することができる。従って、核酸フラグメントを、宿主細胞のコドンの偏りを反映するヌクレオチド配列の至適化に基づく至適の遺伝子発現のため特別に作ることができる。当業者は、コドン使用頻度が宿主により好まれるそれらのコドンに向かって偏らされる場合に成功裏の遺伝子発現の見込みを認識する。好ましいコドンの決定は、配列情報が入手可能である宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づくことができる。
【００４３】
「遺伝子」は、コーディング配列に先行する（５’非コーディング配列）および後に続く（３’非コーディング配列）調節配列を包含する、特定のタンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。「天然の遺伝子」は、それ自身の調節配列とともに天然に見出されるところの遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」は、天然に一緒に見出されない調節およびコーディング配列を含んで成る天然の遺伝子でないいかなる遺伝子も指す。従って、キメラ遺伝子は、異なる供給源由来である調節配列およびコーディング配列、もしくは、同一の供給源由来のしかし天然に見出されるものと異なる様式で配置された調節配列およびコーディング配列を含んでよい。「内在性遺伝子」は、生物体のゲノム中のその天然の位置にある天然の遺伝子を指す。「外来遺伝子」は、宿主生物体中で通常は見出されないがしかし遺伝子移入により宿主生物体に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然の生物体に挿入された天然の遺伝子もしくはキメラ遺伝子を含むことができる。「トランスジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、形質転換手順によりゲノム中に導入された遺伝子である。
【００４４】
「コーディング配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を指す。「調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内もしくは下流（３’非コーディング配列）に配置され、かつ、転写、ＲＮＡのプロセシングもしくは安定性、または関連するコーディング配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロンおよびポリアデニル酸化認識配列を包含してよい。
【００４５】
「プロモーター」は、コーディング配列もしくは機能的ＲＮＡの発現を制御することが可能なヌクレオチド配列を指す。一般に、コーディング配列はプロモーター配列に対し３’に配置される。プロモーター配列は近位およびより遠位の上流の要素より成り、後者の要素はしばしばエンハンサーと称される。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるヌクレオチド配列であり、かつ、プロモーターの生来の要素、またはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を高めるように挿入された異種要素であってよい。プロモーターは本来の遺伝子にそっくりそのまま由来してよいか、もしくは天然に見出される異なるプロモーター由来の異なる要素から構成されてよいか、もしくは合成ヌクレオチドセグメントさえ含んでよい。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型中で、または発生の異なる段階で、または異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を指図することができることが、当業者により理解される。大部分の時点で大部分の細胞型中である核酸フラグメントを発現させるプロモーターは、普遍的に「構成プロモーター」と称される。植物細胞中で有用な多様な型の新たなプロモーターが絶えず発見されており；多数の例を、ＯｋａｍｕｒｏとＧｏｌｄｂｅｒｇ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ　１５：１−８２による編集物に見出すことができる。大部分の場合で調節配列の正確な境界が完全に定義されていないため、異なる長さの核酸フラグメントが同一のプロモーター活性を有するかもしれないことがさらに認識される。
【００４６】
「翻訳リーダー配列」は、遺伝子のプロモーター配列とコーディング配列との間に配置されるヌクレオチド配列を指す。翻訳リーダー配列は、完全にプロセシングされたｍＲＮＡ中に翻訳開始配列の上流に存在する。翻訳リーダー配列は、一次転写物のｍＲＮＡへのプロセシング、ｍＲＮＡの安定性もしくは翻訳効率に影響を及ぼすかもしれない。翻訳リーダー配列の例は記述されている（ＴｕｒｎｅｒとＦｏｓｔｅｒ（１９９５）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２２５−２３６）。
【００４７】
「３’非コーディング配列」は、コーディング配列の下流に配置されるヌクレオチド配列を指し、そして、ポリアデニル酸化認識配列、およびｍＲＮＡプロセシングもしくは遺伝子発現に影響を及ぼすことが可能な調節シグナルをコードする他の配列を包含する。ポリアデニル酸化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリアデニル酸領域の付加に影響を及ぼすことを特徴とする。多様な３’非コーディング配列の使用は、Ｉｎｇｅｌｂｒｅｃｈｔら（１９８９）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　１：６７１−６８０により例示される。
【００４８】
「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼに触媒される転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称されるか、もしくは、それは一次転写物の転写後プロセシング由来のＲＮＡ配列であることができ、そして成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」は、イントロンを含まずかつ細胞によりポリペプチドに翻訳される可能性のあるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」はｍＲＮＡ鋳型に相補的でありかつそれ由来であるＤＮＡを指す。ｃＤＮＡは一本鎖であることができるか、もしくは例えばＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントを使用して二本鎖の形態に転化することができる。「センスＲＮＡ」は、ｍＲＮＡを包含しかつ従って細胞によりポリペプチドに翻訳される可能性のあるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的の一次転写物もしくはｍＲＮＡの全部もしくは一部に相補的でありかつ標的遺伝子の発現を封鎖するＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定のヌクレオチド配列のいずれの部分と、すなわち５’非コーディング配列、３’非コーディング配列、イントロンもしくはコーディング配列でであってもよい。「機能的ＲＮＡ」は、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、もしくは翻訳されないかもしれないがしかしそれでもなお細胞の過程に対する影響を有する他のＲＮＡを指す。
【００４９】
「操作可能に連結される」という用語は、一方の機能が他方により影響を及ぼされるような単一のポリヌクレオチド上での２種もしくはそれ以上の核酸フラグメントの会合を指す。例えば、プロモーターは、それがあるコーディング配列の発現に影響を及ぼすことが可能である場合に、そのコーディング配列と操作可能に連結される（すなわち、該コーディング配列は該プロモーターの転写制御下にある）。コーディング配列は、センスもしくはアンチセンスの向きで調節配列に操作可能に連結することができる。
【００５０】
本明細書で使用されるところの「発現」という用語は、本発明の核酸フラグメント由来のセンス（ｍＲＮＡ）もしくはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を指す。発現はｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもまたよい。「アンチセンス阻害」は、標的タンパク質の発現を抑制することが可能なアンチセンスＲＮＡ転写物の産生を指す。「過剰発現」は、正常のもしくは形質転換されない生物体中での産生のレベルを越えるトランスジェニック生物体中での遺伝子産物の産生を指す。「共抑制」は、同一のもしくは実質的に類似の外来もしくは内在性の遺伝子の発現を抑制することが可能なセンスＲＮＡ転写物の産生を指す（米国特許第５，２３１，０２０号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる））。
【００５１】
「タンパク質」もしくは「ポリペプチド」は、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド中のコーディング配列により決定される、特定の順序で配置されたアミノ酸の鎖である。各タンパク質もしくはポリペプチドは独特の機能を有する。
【００５２】
「変えられたレベル」もしくは「変えられた発現」は、正常のもしくは形質転換されない生物体のものと異なる量もしくは比率でのトランスジェニック生物体中での遺伝子産物（１種もしくは複数）の産生を指す。
【００５３】
「ヌル突然変異体」は、ここでは、ある種のポリペプチドの発現を欠くか、または、不活性であるかもしくはいずれかの検出可能な期待された酵素機能を有しないポリペプチドを発現するかのいずれかの宿主細胞を指す。
【００５４】
タンパク質の記述において使用される場合の「成熟タンパク質」もしくは「成熟」という用語は、翻訳後にプロセシングされたポリペプチド、すなわちそれから一次翻訳産物中に存在するいかなるプレもしくはプロペプチドも除去されているものを指す。タンパク質の記述において使用される場合の「前駆体タンパク質」もしくは「前駆体」という用語は、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物（すなわちプレおよびプロペプチドがなお存在する）を指す。プレおよびプロペプチドは、限定されるものでないが細胞内局在化シグナルであってよい。
【００５５】
「葉緑体輸送ペプチド」は、タンパク質とともに翻訳されそして葉緑体もしくは該タンパク質が作成される細胞中に存在する他のプラスチド型に該タンパク質を向けるアミノ酸配列である。「葉緑体輸送配列」は葉緑体輸送ペプチドをコードするヌクレオチド配列を指す。「シグナルペプチド」は、タンパク質とともに翻訳されかつ該タンパク質を分泌系に向けるアミノ酸配列である（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１−５３）。タンパク質が液胞に向けられるべきである場合、液胞ターゲッティングシグナル（上記）がさらに付加される可能性があるか、もしくは、小胞体にである場合、小胞体保持シグナル（上記）が付加されてよい。タンパク質が核に向けられるべきである場合、存在するいかなるシグナルペプチドも除去されかつ代わりに核局在化シグナルが包含されるべきである（Ｒａｉｋｈｅｌ（１９９２）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ．１００：１６２７−１６３２）。
【００５６】
「形質転換」は、遺伝子的に安定な遺伝をもたらす、宿主生物体のゲノムへの核酸フラグメントの移入を指す。形質転換された核酸フラグメントを含有する宿主生物体は「トランスジェニック」生物体と称される。植物形質転換法の例は、アグロバクテリウム属（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）に媒介される形質転換（Ｄｅ　Ｂｌａｅｒｅら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４３：２７７）および粒子加速型もしくは「ジーンガン（ｇｅｎｅ　ｇｕｎ）」形質転換技術（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３；米国特許第４，９４５，０５０号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる））を包含する。従って、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、宿主細胞中への導入およびその中での複製が可能な組換え構築物、典型的にはＤＮＡ構築物に組込むことができる。こうした構築物は、複製系ならびに所定の宿主細胞中でポリペプチドをコードする配列の転写および翻訳が可能である配列を包含するベクターであることができる。植物細胞の安定なトランスフェクション、もしくはトランスジェニック植物の樹立に適する多数のベクターが、例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら、Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、１９８５、増補１９８７；ＷｅｉｓｓｂａｃｈとＷｅｉｓｓｂａｃｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、アカデミック　プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、１９８９；およびＦｌｅｖｉｎら、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ、クラワー　アカデミック　パブリッシャーズ（Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、１９９０に記述されている。典型的には、植物発現ベクターは、例えば、５’および３’調節配列の転写制御下の１個もしくはそれ以上のクローン化された植物遺伝子、ならびに優勢な選択可能なマーカーを包含する。こうした植物発現ベクターはまた、プロモーター調節領域（例えば、誘導可能なもしくは構成的な、環境的にもしくは発生的に調節される、または細胞もしくは組織特異的な発現を制御する調節領域）、転写開始の開始部位、リボソーム結合部位、ＲＮＡプロセシングシグナル、転写終止部位および／あるいはポリアデニル酸化シグナルも含有することができる。
【００５７】
本明細書で使用される標準的な組換えＤＮＡおよび分子クローニングの技術は当該技術分野で公知であり、かつ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ；コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー　プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）：コールドスプリングハーバー、１９８９（下で「Ｍａｎｉａｔｉｓ」）中に、より完全に記述される。
【００５８】
「ＰＣＲ」もしくは「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡセグメントの増幅に使用される技術として当業者により公知である（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，８００，１５９号明細書）。
【００５９】
本発明は：（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、１２および１６より成る群から選択されるポリペプチドに比較される場合にＣｌｕｓｔａｌ整列法に基づき最低９０％の同一性を有する最低１６６アミノ酸のポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列、もしくは配列番号１４からのポリペプチドに比較される場合にＣｌｕｓｔａｌ整列法に基づき最低９２％の同一性を有する最低３６３アミノ酸のポリペプチドをコードする第二のヌクレオチド配列、または（ｂ）第一もしくは第二のヌクレオチド配列の相補物を含んで成る第三のヌクレオチド配列、より成る群から選択されるヌクレオチド配列を含んで成る単離されたポリヌクレオチドに関する。
【００６０】
好ましくは、第一のヌクレオチド配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および１６より成る群から選択されるポリペプチドをコードする、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５より成る群から選択される核酸配列を含んで成る。
【００６１】
数種のオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼの少なくとも一部分をコードする核酸フラグメントが単離され、かつ、当業者に公知のＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用するヌクレオチドおよびタンパク質配列を含有する公的データベースとの無作為の植物ｃＤＮＡ配列の比較により同定されている。本発明の核酸フラグメントを、同一もしくは他の植物種からの相同なタンパク質をコードするｃＤＮＡおよび遺伝子を単離するのに使用してよい。配列に依存するプロトコルを使用する相同な遺伝子の単離は当該技術分野で公知である。配列に依存するプロトコルの例は、限定されるものでないが、核酸ハイブリダイゼーションの方法、ならびに核酸増幅技術（例えばポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応）の多様な用途により例示されるところのＤＮＡおよびＲＮＡ増幅の方法を挙げることができる。
【００６２】
例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡのいずれかとして他のオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして本核酸フラグメントの全部もしくは一部分を使用して、当業者に公知の方法論を使用していずれかの所望の植物からのライブラリーをスクリーニングすることにより、直接単離することができた。本核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブを、当該技術分野で既知の方法により設計かつ合成することができる（Ｍａｎｉａｔｉｓ）。さらに、配列全体を使用して、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーション、末端標識技術のような当業者に既知の方法によりＤＮＡプローブを、もしくは利用可能なインビトロ転写系を使用してＲＮＡプローブを直接合成することができる。加えて、特定のプライマーを設計し、そして本配列の一部もしくは全部を増幅するのに使用することができる。生じる増幅産物は、増幅反応の間に直接標識することができるか、もしくは増幅反応後に標識することができ、そして適切なストリンジェンシーの条件下で完全長のｃＤＮＡもしくはゲノムフラグメントを単離するためのプローブとして使用することができる。
【００６３】
加えて、本核酸フラグメントの２個の短いセグメントを、相同な遺伝子をコードするより長い核酸フラグメントをＤＮＡもしくはＲＮＡから増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応プロトコルで使用してよい。ポリメラーゼ連鎖反応はまた、一方のプライマーの配列が本核酸フラグメント由来でありかつ他方のプライマーの配列が植物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆体の３’端へのポリアデニル酸領域の存在を利用する、クローン化された核酸フラグメントのライブラリーで実施してもよい。あるいは、第二のプライマー配列はクローニングベクター由来の配列に基づいてよい。例えば、当業者は、転写物中の単一点と３’もしくは５’端との間の領域のコピーを増幅するためにＰＣＲを使用することによりｃＤＮＡを生成させるＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：８９９８−９００２）に従うことができる。３’および５’の方向に向けられたプライマーを本配列から設計することができる。商業的に入手可能な３’ＲＡＣＥもしくは５’ＲＡＣＥ系（ＢＲＬ）を使用して、特定の３’もしくは５’ｃＤＮＡフラグメントを単離することができる（Ｏｈａｒａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：５６７３−５６７７；Ｌｏｈら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４３：２１７−２２０）。３’および５’ＲＡＣＥ手順により生成された産物を組み合わせて完全長のｃＤＮＡを生成させることができる（ＦｒｏｈｍａｎとＭａｒｔｉｎ（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１：１６５）。結果として、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５より成る群から選択されるヌクレオチド配列由来の６０の連続するヌクレオチドの最低１種（好ましくは最低４０の１種、最も好ましくは最低３０の１種）のヌクレオチド配列、およびこうしたヌクレオチド配列の相補物を含んで成るポリヌクレオチドを、こうした方法で使用して、あるポリペプチドのアミノ酸配列の実質的な一部分をコードする核酸フラグメントを得てよい。
【００６４】
本発明は：配列番号１、３、５、７、９、１１、１３および１５より成る群から選択されるヌクレオチド配列由来の６０の連続するヌクレオチドの最低１種（好ましくは４０の最低１種、最も好ましくは３０の最低１種）のヌクレオチド配列、およびこうしたヌクレオチド配列の相補物を含んで成るオリゴヌクレオチドプライマーを合成すること；ならびに、該オリゴヌクレオチドプライマーを使用して核酸フラグメント（好ましくはクローニングベクターに挿入されたｃＤＮＡ）を増幅すること、の段階を含んで成る、オレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼポリペプチドの実質的な一部分、好ましくは植物のオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼポリペプチドの実質的な一部分をコードする核酸フラグメントを得る方法に関する。増幅された核酸フラグメントは、好ましくは、オレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼポリペプチドの一部分をコードすることができる。
【００６５】
本ヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列の利用可能性は、ｃＤＮＡ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングを助長する。本アミノ酸配列の部分を表す合成ペプチドを合成してよい。これらのペプチドを使用して動物を免疫化して、該アミノ酸配列を含んで成るペプチドもしくはタンパク質に対する特異性をもつポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を産生させることができる。その後、これらの抗体を使用して、ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングして目的の完全長ｃＤＮＡクローンを単離することができる（Ｌｅｒｎｅｒ（１９８４）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１−３４；Ｍａｎｉａｔｉｓ）。
【００６６】
別の態様において、本発明は、本明細書に記述されるところの本発明のキメラ遺伝子、もしくは本明細書に記述されるところの本発明の単離されたポリヌクレオチドのいずれかを含んで成るウイルスおよび宿主細胞に関する。本発明を実施するのに使用することができる宿主細胞の例は、限定されるものでないが酵母細胞、細菌細胞および植物細胞を挙げることができる。
【００６７】
本発明の核酸フラグメントは、開示されるポリペプチドが過剰発現されるかもしくはそれらの発現が抑制される、またはそれらが通常見出されない細胞型もしくは発生段階のトランスジェニック植物を創製するのに使用してよい。これはそれらの細胞中での脂肪酸のレベルを変えるという効果を有するとみられる。チオエステラーゼはそれらの基質を油生合成経路から除去する。従って、オレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼの活性を阻害することは、遊離される１８：１アシル鎖の低下をもたらすとみられる。これは、より長い鎖の多飽和（１８および２０個の炭素）脂肪酸の正味の増大をもたらすとみられる。パルミトイル−アシル−ＡＣＰチオエステラーゼを過剰発現することは、より長くかつ多飽和の脂肪酸を犠牲にして、油中の１８：１脂肪酸ならびに１６：０および１８：０不飽和鎖の遊離を増大させるとみられる。植物中の油組成を変えることは、成長および発生の変化につながるかもしれず、そして、その油の消費からのヒトへの健康の影響もまた有害な影響を与えられることができる。
【００６８】
本発明のタンパク質の過剰発現は、最初に、所望の発生段階で所望の組織中で遺伝子の発現を指図することが可能なプロモーターにコーディング領域が操作可能に連結されるキメラ遺伝子を構築することにより達成してよい。該キメラ遺伝子は、同一遺伝子由来のプロモーター配列および翻訳リーダー配列を含んでよい。転写終止シグナルをコードする３’非コーディング配列もまた提供してよい。本キメラ遺伝子はまた、遺伝子発現を助長するために１個もしくはそれ以上のイントロンも含んでよい。
【００６９】
本単離されたポリヌクレオチド（もしくはキメラ遺伝子）を含んで成るプラスミドベクターを構築してよい。当業者は、プラスミドベクターの選択は、該ベクターがタンパク質発現のためであるか、遺伝子の過剰発現のためであるか、もしくは抑制のためであるか、およびどの宿主細胞型中で該ベクターが繁殖されるかのような多くの因子に依存することを容易に認識する。プラスミドベクターの選択はまた、宿主植物を形質転換するのに使用することができる方法にも依存する。当業者は、キメラ遺伝子を含有する宿主細胞を成功裏に形質転換し、選択しかつ繁殖させるために該プラスミドベクター上に存在しなければならない遺伝子要素を十分に知っている。当業者はまた、多様な独立の形質転換事象が多様なレベルおよびパターンの発現をもたらすことができること（Ｊｏｎｅｓら（１９８５）ＥＭＢＯ　Ｊ．４：２４１１−２４１８；Ｄｅ　Ａｌｍｅｉｄａら（１９８９）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２１８：７８−８６）、ならびに従って、所望の発現レベルおよびパターンを表す系統を得るために複数の事象をスクリーニングしなければならないことも認識するであろう。こうしたスクリーニングは、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウェスタンパク質分析もしくは表現型分析により達成してよい。
【００７０】
いくつかの応用のためには、本ポリペプチドを多様な細胞区画に向けること、もしくは細胞からのその分泌を助長することが有用であるかもしれない。従って、上述されたキメラ遺伝子は、既に存在するターゲッティング配列を除去することを伴いもしくは伴わずに、輸送配列（Ｋｅｅｇｓｔｒａ（１９８９）Ｃｅｌｌ　５６：２４７−２５３）、シグナル配列、または小胞体局在化（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ．Ｐｌａｎｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２：２１−５３）もしくは核局在化シグナル（Ｒａｉｋｈｅｌ（１９９２）Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓ．１００：１６２７−１６３２）をコードする配列のような適切な細胞内ターゲッティング配列を用いて、本ポリペプチドをコードするようにコーディング配列を指図することによりさらに補完されてよいことが予見される。引用される参考文献はこれらのそれぞれの例を与える一方、該一覧は網羅的でなくかつ有用なより多くのターゲッティングシグナルが将来、発見されるかもしれない。
【００７１】
いくつかの応用については、植物中の本ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を低下もしくは排除することもまた望ましいかもしれない。これを達成するために、本ポリペプチドの共抑制のため設計されたキメラ遺伝子を、そのポリペプチドをコードする遺伝子もしくは遺伝子フラグメントを植物のプロモーター配列に連結することにより構築することができる。あるいは、本核酸フラグメントの全部もしくは部分のアンチセンスＲＮＡを発現するよう設計されたキメラ遺伝子を、該遺伝子もしくは遺伝子フラグメントを逆の向きで植物のプロモーター配列に連結することにより構築することができる。共抑制もしくはアンチセンスのいずれかのキメラ遺伝子を形質転換を介して植物に導入することができ、ここで、対応する内在性の遺伝子の発現が低下もしくは排除される。
【００７２】
変えられた遺伝子発現をもつ植物の生成への分子遺伝学的解決策は、より伝統的な植物育種のアプローチを上回る決定的な利点を有する。植物の表現型の変化は、アンチセンス阻害もしくは共抑制により１種もしくはそれ以上の遺伝子の発現を特異的に阻害することにより生じさせることができる（米国特許第５，１９０，９３１号、同第５，１０７，０６５号および同第５，２８３，３２３号明細書）。アンチセンスもしくは共抑制構築物は、遺伝子活性の優性の負の調節物質として作用するとみられる。慣習的な突然変異は遺伝子活性の負の調節を生じさせる可能性がある一方、これらの影響は、最もありそうには劣性である。トランスジェニックのアプローチとともに利用可能な優性の負の調節は、育種の観点から有利であるかもしれない。加えて、組織特異的プロモーターの使用により特定の表現型の発現を植物の生殖組織に限定する能力は、突然変異体の遺伝子が通常発現される全部の組織中で影響を有するかもしれない慣習的突然変異に関して作物学上の利点を与えるかもしれない。
【００７３】
当業者は、特別の考慮が、特定の遺伝子の発現を低下させるためにアンチセンスもしくは共抑制の技術の使用を伴うことを知っているであろう。例えば、センスもしくはアンチセンス遺伝子の適正なレベルの発現は、当業者に既知の多様な調節要素を利用する多様なキメラ遺伝子の使用を必要とするかもしれない。トランスジェニック植物を上述された方法の１つにより得れば、所望の表現型を最も効果的に表すものについて個々のトランスジェニック体をスクリーニングすることが必要であろう。従って、当業者は、多数の形質転換体のスクリーニング法を開発することができる。これらのスクリーニングの性質は、一般に実務的根拠で選ぶことができる。例えば、抑制されている遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的な抗体を使用することにより遺伝子発現の変化を探すことによってスクリーニングすることができるか、もしくは、酵素活性を特異的に測定するアッセイを確立することができる。好ましい一方法は、多数のサンプルを迅速に処理させるものであることができる。多数の形質転換体が所望の表現型について陰性であろうことが期待されるであろうからである。
【００７４】
別の態様において、本発明は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４および１６より成る群から選択されるポリペプチドに比較される場合にＣｌｕｓｔａｌ整列法に基づき最低９０％の同一性を有する最低１６６アミノ酸のポリペプチドに関する。
【００７５】
本ポリペプチド（もしくはその部分）は、異種宿主細胞、とりわけ微生物宿主の細胞中で産生されてよく、そして、当業者に公知の方法によりこれらのタンパク質に対する抗体を調製するのに使用することができる。該抗体は、インシトゥで細胞中で、もしくはインビトロで細胞抽出物中で、本発明のポリペプチドを検出するのに有用である。本ポリペプチドの産生に好ましい異種宿主細胞は微生物宿主である。微生物の発現系、および外来タンパク質の高レベル発現を指図する調節配列を含有する発現ベクターは当業者に公知である。これらのいずれも、本ポリペプチドの産生のためのキメラ遺伝子を構築するのに使用することができる。本キメラ遺伝子をその後、形質転換を介して適切な微生物に導入して、コードされるオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼの高レベル発現を提供することができる。細菌宿主中での本ポリペプチドの高レベル発現のためのベクターの一例を提供する（実施例６）。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチドの全部もしくは実質的な一部分はまた、それらが一部である遺伝子を遺伝子的にかつ物理的にマッピングするためのプローブとして使用してよく、また、それらの遺伝子に結びつけられる特質のマーカーとして使用してよい。こうした情報は、所望の表現型をもつ系統を開発するための植物育種で有用であるかもしれない。例えば、本核酸フラグメントを、制限断片長多形（ＲＦＬＰ）マーカーとして使用してよい。制限消化された植物のゲノムＤＮＡのサザンブロット（Ｍａｎｉａｔｉｓ）を、本発明の核酸フラグメントでプロービングしてよい。生じるバンド形成パターンをその後、遺伝子地図を構築するために、ＭａｐＭａｋｅｒ（Ｌａｎｄｅｒら（１９８７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１：１７４−１８１）のようなコンピュータプログラムを使用する遺伝子分析にかけてよい。加えて、本発明の核酸フラグメントを、定義された遺伝子交雑の親および子孫を表す一組の個体の制限エンドヌクレアーゼ処理されたゲノムＤＮＡを含有するサザンブロットをプロービングするのに使用してよい。ＤＮＡ多形の分離が示され、そして、この集団を使用して既に得られた遺伝子地図中の本核酸配列の位置を計算するのに使用される（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら（１９８０）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３２：３１４−３３１）。
【００７７】
遺伝子マッピングでの使用のための植物遺伝子由来のプローブの製造および使用は、ＢｅｒｎａｔｚｋｙとＴａｎｋｓｌｅｙ（１９８６）Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　４：３７−４１に記述される。多数の刊行物が、上に概説された方法論もしくはその変形物を使用する特定のｃＤＮＡクローンの遺伝子マッピングを記述する。例えば、Ｆ２交雑集団、戻し交配集団、無作為に交配された集団、準同質遺伝子系統、および他の組の個体を、マッピングに使用してよい。こうした方法論は当業者に公知である。
【００７８】
本核酸配列由来の核酸プローブはまた、物理的マッピングにも使用してよい（すなわち、物理的地図上の配列の配置；Ｎｏｎｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ、アカデミック　プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒｅｓｓ）１９９６中、Ｈｏｈｅｉｓｅｌら、ｐｐ．３１９−３４６、およびその中で引用される参考文献を参照されたい）。
【００７９】
別の態様において、本核酸配列由来の核酸プローブを、直接蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）マッピング（Ｔｒａｓｋ（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．７：１４９−１５４）で使用してよい。現在のＦＩＳＨマッピング法は大型のクローン（数ないし数百ＫＢ；Ｌａａｎら（１９９５）Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．５：１３−２０を参照されたい）の使用を好むとは言え、感受性の向上はより短いプローブを使用するＦＩＳＨマッピングの実施を可能にするかもしれない。
【００８０】
多様な核酸増幅に基づく遺伝子および物理的マッピング法を、本核酸配列を使用して実施してよい。例は、アレル特異的増幅（Ｋａｚａｚｉａｎ（１９８９）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１１：９５−９６）、ＰＣＲ増幅されたフラグメントの多形（ＣＡＰＳ；Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら（１９９３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　１６：３２５−３３２）、アレル特異的ライゲーション（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０７７−１０８０）、ヌクレオチド伸長反応（Ｓｏｋｏｌｏｖ（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１８：３６７１）、放射ハイブリッドマッピング（Ｗａｌｔｅｒら（１９９７）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７：２２−２８）およびハッピーマッピング（Ｈａｐｐｙ　Ｍａｐｐｉｎｇ）（ＤｅａｒとＣｏｏｋ（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１７：６７９５−６８０７）を包含する。これらの方法には、核酸フラグメントの配列を使用して、増幅反応もしくはプライマー伸長反応での使用のためのプライマー対を設計および製造する。こうしたプライマーの設計は当業者に公知である。ＰＣＲに基づく遺伝子マッピングを使用する方法においては、本核酸配列に対応する領域中のマッピング交雑の親の間のＤＮＡ配列の差異を同定することが必要であるかもしれない。しかしながら、これは一般にマッピング法に必要でない。
【００８１】
機能喪失突然変異体の表現型は、標的を定められた遺伝子混乱プロトコル、もしくは全部の可能な遺伝子中に突然変異を担持するトウモロコシ集団に含有されるこれらの遺伝子に特異的な突然変異体を同定することのいずれかにより、本ｃＤＮＡクローンについて同定してよい（ＢａｌｌｉｎｇｅｒとＢｅｎｚｅｒ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８６：９４０２−９４０６；Ｋｏｅｓら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９２：８１４９−８１５３；Ｂｅｎｓｅｎら（１９９５）Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　７：７５−８４）。後者のアプローチは２方法で達成してよい。第一に、本核酸フラグメントの短いセグメントを、突然変異誘発遺伝子トランスポゾンもしくはなんらかの他の突然変異を引き起こすＤＮＡ要素が導入されている植物の集団から調製されたＤＮＡ上での突然変異標識配列プライマーとともにのポリメラーゼ連鎖反応プロトコルで使用してよい（Ｂｅｎｓｅｎ、上記を参照されたい）。これらのプライマーでの特異的ＤＮＡフラグメントの増幅は、本ポリペプチドをコードする植物遺伝子中もしくはその近くへの突然変異標識要素の挿入を示す。あるいは、本核酸フラグメントを、制限酵素部位に固定された合成アダプターのもののような自由裁量のゲノム部位プライマーとともに突然変異標識配列プライマーを使用して突然変異集団から生成されたＰＣＲ増幅産物に対するハイブリダイゼーションプローブとして使用してよい。いずれかの方法を用いて、本ポリペプチドをコードする内在性の遺伝子中に突然変異を含有する植物を同定しかつ得ることができる。その後、本突然変異体植物を使用して、本明細書に開示される本ポリペプチドの天然の機能を決定もしくは確認することができる。
【００８２】
実施例
本発明は以下の実施例においてさらに定義され、ここで、別に述べられない限り、部分およびパーセントは重量でありかつ度は摂氏である。これらの実施例は本発明の好ましい態様を示す一方、具体的説明のみとして示されることが理解されるべきである。上の論考およびこれらの実施例から、当業者は本発明の不可欠の特徴を確かめることができ、そして、その技術思想および範囲から離れることなく、本発明を多様な使用法および条件に適応させるようにその多様な変更および改変をなすことができる。従って、本明細書に示されかつ記述されるものに加えての本発明の多様な改変が、前述の記述から当業者に明らかであろう。こうした改変もまた、付属として付けられる請求の範囲の範囲内にあることを意図している。
【００８３】
本明細書に示される各参考文献の開示は、引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる。
【００８４】
実施例１
ｃＤＮＡライブラリーの組成；ｃＤＮＡクローンの単離および配列決定
多様なアフリカンデージー（Ｄｉｍｏｒｐｈｏｔｈｅｃａ　ｓｉｎｕａｔａ）、ゴーファーアップル（Ｌｉｃａｎｉａ　ｍｉｃｈａｕｘｉｉ）、トウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）、コメ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ）、ベルノニア（Ｖｅｒｎｏｎｉａ　ｍｅｓｐｉｌｉｆｏｌｉａ）およびコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）組織からのｍＲＮＡを表すｃＤＮＡライブラリーを調製した。該ライブラリーの特徴を下述する。
【００８５】
【表２】
2004508802.tif 000004
【００８６】
＊これらのライブラリーは、本質的に米国特許第５，４８２，８４５号明細書（引用することにより本明細書に組み込まれる）に記述されるとおり正規化した。
【００８７】
ｃＤＮＡライブラリーは、利用可能な多くの方法のいずれか１つにより調製してよい。例えば、ｃＤＮＡは、最初に、製造元のプロトコル（ストラタジーン　クローニング　システムズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州ラホヤ）に従って、ユニザップ［Ｕｎｉ−ＺＡＰ］（商標）ＸＲベクター中で該ｃＤＮＡライブラリーを調製することにより、プラスミドベクター中に導入してよい。ユニザップ［Ｕｎｉ−ＺＡＰ］（商標）ＸＲライブラリーを、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により提供されるプロトコルに従ってプラスミドライブラリーに変換する。変換に際して、ｃＤＮＡ挿入物はプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に含有されることができる。加えて、該ｃＤＮＡは、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（ニュー　イングランド　バイオラブス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ））を使用して、予め切断されたＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（＋）ベクター（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に直接導入してよく、次いで、製造元のプロトコル（ギブコ　ＢＲＬ　プロダクツ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））に従ってＤＨ１０Ｂ細胞にトランスフェクションする。ｃＤＮＡ挿入物がプラスミドベクター中にあれば、組換えｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドを含有する無作為に拾われた細菌コロニーからプラスミドＤＮＡを調製するか、もしくは、挿入物のｃＤＮＡ配列を、挿入されたｃＤＮＡ配列に隣接するベクター配列に特異的なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応を介して増幅する。増幅された挿入物ＤＮＡもしくはプラスミドＤＮＡを、色素プライマー配列決定反応で配列決定して、部分的ｃＤＮＡ配列を生成させる（発現された配列標識（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｔａｇ）もしくは「ＥＳＴ」；Ａｄａｍｓら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：１６５１−１６５６を参照されたい）。生じるＥＳＴを、パーキン　エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）モデル３７７蛍光シークェンサーを使用して分析する。
【００８８】
完全な挿入物の配列（ＦＩＳ）データを、改変された転位プロトコルを利用して生成させる。ＦＩＳについて同定されたクローンを、保管されたグリセロールストックから単一コロニーとして回収し、そして、アルカリ溶解を介してプラスミドＤＮＡを単離する。単離されたＤＮＡ鋳型を、ＰＣＲに基づく配列決定反応において、ベクターでプライミングされた（ｖｅｃｔｏｒ　ｐｒｉｍｅｄ）Ｍ１３順および逆オリゴヌクレオチドと反応させ、そして自動化シークェンサーに負荷する。クローンの同定の確認を、それからＦＩＳの要求がなされる元のＥＳＴ配列への配列の整列により実施する。
【００８９】
確認された鋳型を、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｙ１転位可能要素（ＤｅｖｉｎｅとＢｏｅｋｅ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：３７６５−３７７２）に基づくプライマー　アイランド（Ｐｒｉｍｅｒ　Ｉｓｌａｎｄ）転位キット（ＰＥ　アプライド　バイオシステムズ（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、カリフォルニア州フォスターシティ）を介して転位させる。インビトロ転位系は、大型ＤＮＡ分子の集団全体に独特の結合部位を無作為に置く。その後、転位されたＤＮＡを使用して、ＤＨ１０Ｂ電気コンピテント細胞（ギブコ　ＢＲＬ／ライフ　テクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ／Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、メリーランド州ロックビル）を、電気穿孔法を介して形質転換する。転位可能要素は、組込まれたトランスポゾンを含有するサブクローンのみのアガープレート上での二重選択を見込む、付加的な選択可能なマーカー（ＤＨＦＲと命名される；ＦｌｉｎｇとＲｉｃｈａｒｄｓ（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１１：５１４７−５１５８）を含有する。複数のサブクローンを各転位反応から無作為に選択し、プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解を介して調製し、そして、鋳型を、トランスポゾン内の結合部位に特異的な独特のプライマーを利用して、転位事象の部位から外側に配列決定する（ＡＢＩ　プリズム（ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ）ダイターミネーターレディリアクション（ＲｅａｄｙＲｅａｃｔｉｏｎ）混合物）。
【００９０】
配列のデータを収集し（ＡＢＩ　プリズム　コレクションズ（ＡＢＩ　Ｐｒｉｓｍ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ））、そしてＰｈｒｅｄ／Ｐｈｒａｐ（Ｐ．Ｇｒｅｅｎ、ワシントン大学、シアトル）を使用してアセンブルする。Ｐｈｒｅｐ／Ｐｈｒａｐは、ＡＢＩの配列データを再読込み、塩基を再読出し、特性値（ｑｕａｌｉｔｙ　ｖａｌｕｅ）を割り当て、そして塩基の読出しおよび特性値をエディット可能な出力ファイルに書き込む、公的ドメインのソフトウェアプログラムである。Ｐｈｒａｐ配列アセンブリープログラムは、これらの特性値を使用してアセンブルされた配列のｃｏｎｔｉｇの正確さを増大させる。アセンブリは、Ｃｏｎｓｅｄ配列エディタ（Ｄ．Ｇｏｒｄｏｎ、ワシントン大学、シアトル）により見られる。
【００９１】
実施例２
ｃＤＮＡクローンの同定
オレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするｃＤＮＡクローンを、ＢＬＡＳＴ（基本的局所整列検索ツール（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／もまた参照されたい）「ｎｒ」データベース（全部の非冗長ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＣＤＳ翻訳、３次元構造のブルックヘイヴン（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ）タンパク質データバンク由来の配列、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベースの最新の主な発表、ＥＭＢＬ、およびＤＤＢＪデータベースを含んで成る）中に含有される配列に対する類似性についてのＢＬＡＳＴ検索を実施することにより同定した。実施例１で得られたｃＤＮＡ配列を、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）により提供されたＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、「ｎｒ」データベース中に含有される全部の公的に利用可能なＤＮＡ配列に対する類似性について分析した。ＤＮＡ配列を全部の読み枠で翻訳し、そして、ＮＣＢＩにより提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ＧｉｓｈとＳｔａｔｅｓ（１９９３）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２）を使用して、「ｎｒ」データベース中に含有される全部の公的に利用可能なタンパク質配列に対する類似性について比較した。便宜性のため、ＢＬＡＳＴにより計算されるところの単に偶然により検索されたデータベース中に含有される配列とのあるｃＤＮＡ配列の一致を観察するＰ値（確率）を、本明細書で「ｐＬｏｇ」値として報告し、これは報告されたＰ値の対数の負の数を表す。従って、ｐＬｏｇ値が大きくなるほど、ｃＤＮＡ配列およびＢＬＡＳＴの「ヒット」が相同なタンパク質を表すという見込みが大きくなる。
【００９２】
分析に提出されたＥＳＴを、上述されたところのジェンバンクのデータベースと比較する。より多くの５’もしくは３’の配列を含有するＥＳＴは、配列の相同な共通のもしくは重なり合う領域を共有するヌクレオチド配列を比較するデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）の専有のデータベースに対してＢＬＡＳＴｎアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を使用することにより見出すことができる。２種もしくはそれ以上の核酸フラグメントの間に共通のもしくは重なり合う配列が存在する場合、該配列を単一の連続するヌクレオチド配列に集成して、従って元のフラグメントを５’もしくは３’いずれかの方向に伸長することができる。大部分の５’のＥＳＴを同定すれば、その完全な配列を、実施例１に記述されるところの完全な挿入物の配列決定（Ｆｕｌｌ　Ｉｎｓｅｒｔ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により決定することができる。異なる種に属する相同な遺伝子は、ｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムを使用してＥＳＴデータベースに対して既知の遺伝子（専有の供給源もしくは公的なデータベースのいずれかから）のアミノ酸配列を比較することにより見出すことができる。ｔＢＬＡＳＴｎアルゴリズムは、全６個の読み枠で翻訳されるヌクレオチドデータベースに対してアミノ酸のクエリを検索する。この検索は、異なる種の間のヌクレオチドコドン使用頻度中の差異、およびコドンの縮重を見込む。
【００９３】
実施例３
オレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードするｃＤＮＡクローンの特徴づけ　表３に列挙されるクローンからのＥＳＴ配列を使用するＢＬＡＳＴＸ検索は、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ、配列番号１３、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　４０４０２８）、マンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ　ｍａｎｇｏｓｔａｎａ、配列番号１４、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　１９３００７７）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ、配列番号１５、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　４０４０２６）、およびアフリカパーム油（Ｅｌａｅｉｓ　ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ、配列番号１６、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　４７０４６４０）からのオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼに対する類似性を示した。個々のＥＳＴ（「ＥＳＴ」）、示されたｃＤＮＡクローンを含んで成るｃＤＮＡ挿入物全体の配列（「ＦＩＳ」）、２種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたｃｏｎｔｉｇの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ」）、ＦＩＳおよび１種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたｃｏｎｔｉｇの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ＊」）、または、ＦＩＳ、ｃｏｎｔｉｇもしくはＦＩＳおよびＰＣＲ由来のタンパク質全体をコードする配列（「ＣＧＳ」）についてのＢＬＡＳＴの結果を表３に示す：
【００９４】
【表３】
2004508802.tif 000005
【００９５】
表３に列挙されるクローン中のｃＤＮＡ挿入物全体の配列を決定した。さらなる配列決定およびデュポン（ＤｕＰｏｎｔ）の専有のデータベースの検索は、オレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする他のトウモロコシおよびコムギのクローンの同定を可能にした。表４に列挙されるクローンからのＥＳＴ配列を使用するＢＬＡＳＴＸ検索は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）（ＮＣＢＩ一般識別名番号ｇｉ　１０７６３６１およびｇｉ　７４８７９８３）からのオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼに対する、該ｃＤＮＡによりコードされるポリペプチドの類似性を示した。個々のＥＳＴ（「ＥＳＴ」）、示されたｃＤＮＡクローンを含んで成るｃＤＮＡ挿入物全体の配列（「ＦＩＳ」）、２種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたｃｏｎｔｉｇの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ」）、ＦＩＳおよび１種もしくはそれ以上のＥＳＴから集成されたｃｏｎｔｉｇの配列（「Ｃｏｎｔｉｇ＊」）、または、ＦＩＳ、ｃｏｎｔｉｇもしくはＦＩＳおよびＰＣＲ由来のタンパク質全体をコードする配列（「ＣＧＳ」）についてのＢＬＡＳＴの結果を表４に示す：
【００９６】
【表４】
2004508802.tif 000006
【００９７】
図１は、アフリカンデージー（Ｄｉｍｏｒｐｈｏｔｈｅｃａ　ｓｉｎｕａｔａ、［ＳＩＮ２］として示される配列番号２）、トウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ、［ＳＩＮ６］として示される配列番号６）、コメ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ、［ＳＩＮ８］として示される配列番号８）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ、配列番号１７、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　４０４０２８）、ゴーファーアップル（Ｌｉｃａｎｉａ　ｍｉｃｈａｕｘｉｉ、［ＳＩＮ４］として示される配列番号４）、マンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ　ｍａｎｇｏｓｔａｎａ、配列番号１８、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　１９３００７７）、ベルノニア（Ｖｅｒｎｏｎｉａ　ｍｅｓｐｉｌｉｆｏｌｉａ、［ＳＩＮ１０］として示される配列番号１０）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ、配列番号１９、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　４０４０２６）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ、［ＳＩＮ１２］として示される配列番号１２）、アフリカパーム油（Ｅｌａｅｉｓ　ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ、配列番号２０、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　４７０４６４０）、トウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ、［ＳＩＮ１４］として示される配列番号１４）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ、［ＳＩＮ１６］として示される配列番号１６）、ならびに２種のアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のタンパク質（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）、それぞれ、配列番号２１および２２、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　７４８７９８３およびｇｉ　１０７６３６１）からのオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列の比較を示す。
【００９８】
【表５】
2004508802.tif 000007
【００９９】
配列の整列および同一性パーセントの計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティックスコンピュータ計算ソフトウェアパッケージのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡスター　インク（ＤＮＡＳＴＡＲ　Ｉｎｃ．）、ウィスコンシン州マディソン）を使用して実施した。配列の複数の整列は、デフォルトのパラメータ（ギャップ　ペナルティ（ＧＡＰ　ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０、ギャップ長ペナルティ（ＧＡＰ　ＬＥＮＧＴＨ　ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０）を用いてＣｌｕｓｔａｌ整列法（ＨｉｇｇｉｎｓとＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３）を使用して実施した。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用する対にした整列のためのデフォルトのパラメータは、ＫＴＵＰＬＥ　１、ギャップ　ペナルティ（ＧＡＰ　ＰＥＮＡＬＴＹ）＝３、ウィンドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびダイアゴナルズ　セイブド（ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ　ＳＡＶＥＤ）＝５であった。配列の整列、ならびにＢＬＡＳＴスコアおよび確率は、本ｃＤＮＡクローンを含んで成る核酸フラグメントがオレオリル−ＡＣＰチオエステラーゼの実質的な一部分をコードすることを示す。これらの配列は、発明者に既知のオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼをコードする最初のジモルフォテカ属（Ｄｉｍｏｒｐｈｏｔｈｅｃａ）、リカニア属（Ｌｉｃａｎｉａ）およびベルノニア属（Ｖｅｒｎｏｎｉａ）の配列を表す。
【０１００】
実施例４
単子葉植物細胞中でのキメラ遺伝子の発現
該ｃＤＮＡフラグメントに対し５’に配置されるトウモロコシの２７ｋＤのゼインプロモーター、および該ｃＤＮＡに対し３’に配置される１０ｋＤのゼインの３’端に関して、センスの向きで本ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを含んで成るキメラ遺伝子を構築することができる。本遺伝子のｃＤＮＡフラグメントは、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用する該ｃＤＮＡクローンのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成してよい。クローニング部位（ＮｃｏＩもしくはＳｍａＩ）を、オリゴヌクレオチドに組込んで、下述されるところの消化されたベクターｐＭＬ１０３に挿入される場合にＤＮＡフラグメントの適正な向きを提供することができる。その後、標準的ＰＣＲで増幅を実施する。その後、増幅されたＤＮＡを制限酵素ＮｃｏＩおよびＳｍａＩで消化し、そしてアガロースゲル上で分画する。適切なバンドをゲルから単離し、そしてプラスミドｐＭＬ１０３の４．９ｋｂのＮｃｏＩ−ＳｍａＩフラグメントと結合することができる。プラスミドｐＭＬ１０３は、ブダペスト条約の約定のもとにＡＴＣＣ（アメリカン　タイプ　カルチャー　コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９）に寄託されており、そして受託番号ＡＴＣＣ　９７３６６をもつ。ｐＭＬ１０３からのＤＮＡセグメントは、トウモロコシの２７ｋＤのゼイン遺伝子の１．０５ｋｂのＳａｌＩ−ＮｃｏＩプロモーターフラグメント、およびベクターｐＧｅｍ９Ｚｆ（＋）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））中のトウモロコシの１０ｋＤのゼイン遺伝子の３’端からの０．９６ｋｂのＳｍａＩ−ＳａｌＩフラグメントを含有する。ベクターおよび挿入物ＤＮＡを、本質的には記述されたとおり（Ｍａｎｉａｔｉｓ）１５℃で一夜連結することができる。その後、連結されたＤＮＡを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（エピキュリアン　コライＸＬ−１　Ｂｌｕｅ［Ｅｐｉｃｕｒｉａｎ　Ｃｏｌｉ　ＸＬ−１　Ｂｌｕｅ］（商標）；ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））を形質転換してよい。細菌の形質転換体を、プラスミドＤＮＡの制限酵素消化、およびチェーンターミネーター法（シークェナーゼ［Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ］（商標）ＤＮＡ配列決定キット；Ｕ．Ｓ．バイオケミカル（Ｕ．Ｓ．　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ））を使用する限定されたヌクレオチド配列分析によりスクリーニングすることができる。生じるプラスミド構築物は、５’から３’の向きに、トウモロコシの２７ｋＤのゼインプロモーター、本ポリペプチドをコードするｃＤＮＡフラグメント、および１０ｋＤのゼインの３’領域をコードするキメラ遺伝子を含むとみられる。
【０１０１】
上述されたキメラ遺伝子をその後、以下の手順によりトウモロコシ細胞に導入することができる。未熟なトウモロコシ胚を、近交系トウモロコシＨ９９およびＬＨ１３２の交雑由来の発生中の穎果から切開することができる。胚を、受粉後１０ないし１１日にそれらが１．０ないし１．５ｍｍ長さである場合に単離する。胚をその後、軸側を下に面してかつアガロース固化されたＮ６培地（Ｃｈｕら（１９７５）Ｓｃｉ．Ｓｉｎ．Ｐｅｋｉｎｇ　１８：６５９−６６８）に接触させて置く。胚を暗所で２７℃に保つ。胚柄構造上に運ばれる体性の前胚様体および胚様体を伴う細胞の未分化の塊より成る砕けやすい胚形成カルスが、これらの未熟な胚の胚盤から増殖する。一次外植体から単離された胚形成カルスを、Ｎ６培地上で培養しかつ２ないし３週間ごとにこの培地上で継代することができる。
【０１０２】
プラスミドｐ３５Ｓ／Ａｃ（Ｐｅｔｅｒ　Ｅｃｋｅｓ博士、ヘキスト株式会社（Ｈｏｅｃｈｓｔ　Ａｇ）、ドイツ・フランクフルトから得られた）を、選択可能なマーカーを提供するために形質転換実験で使用してよい。本プラスミドは、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードするＰａｔ遺伝子（欧州特許公開第０　２４２　２３６号明細書を参照されたい）を含有する。酵素ＰＡＴは、ホスフィノトリシンのような除草性のグルタミン合成酵素阻害剤に対する抵抗性を与える。ｐ３５Ｓ／Ａｃ中のｐａｔ遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１３：８１０−８１２）およびアグロバクテリウム　ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡからのノパリン合成酵素遺伝子の３’領域の制御下にある。
【０１０３】
粒子砲撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２７：７０−７３）を、遺伝子をカルス培養細胞に移すのに使用してよい。本方法により、金粒子（直径１　ｍ）を、以下の技術を使用してＤＮＡで被覆する。１０μｇのプラスミドＤＮＡを、５０μＬの金粒子の懸濁液（１ｍＬあたり６０ｍｇ）に添加する。塩化カルシウム（２．５Ｍ溶液を５０μＬ）およびスペルミジンを含まない塩基（１．０Ｍ溶液を２０μＬ）を粒子に添加する。懸濁液は、これらの溶液の添加の間、ボルテックス攪拌する。１０分後、チューブを短く遠心分離（１５，０００ｒｐｍで５秒）し、そして上清を除去する。粒子を２００μＬの無水エタノールに再懸濁し、再度遠心分離し、そして上清を除去する。エタノールすすぎを再度実施し、そして粒子を３０μＬの最終容量のエタノールに再懸濁する。ＤＮＡ被覆された金粒子のアリコート（５μＬ）を、カプトン［Ｋａｐｔｏｎ］（商標）飛行円盤（バイオラッド　ラブス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｓ））の中央に置くことができる。その後、粒子を、１０００ｐｓｉのヘリウム圧、０．５ｃｍのギャップ距離および１．０ｃｍの飛行距離を使用して、バイオリスティック［Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ］（商標）ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（バイオラッド　インストゥルメンツ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて、トウモロコシ組織中に加速する。
【０１０４】
砲撃のためには、胚形成組織を、アガロース固化されたＮ６培地上の濾紙上に置く。組織を薄い芝のように配置し、そして直径約５ｃｍの円形領域を覆う。該組織を含有するペトリ皿を、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅのチャンバー中、停止スクリーンからおよそ８ｃｍに置くことができる。チャンバー中の空気をその後、２８インチのＨｇの真空まで排気する。マクロキャリアーを、衝撃管中のＨｅ圧が１０００ｐｓｉに達する場合に破裂する破裂膜を使用して、ヘリウム衝撃波で加速する。
【０１０５】
砲撃後７日に、組織を、グルホシネート（１リットルあたり２ｍｇ）を含有しかつカゼインもしくはプロリンを欠くＮ６培地に移すことができる。組織はこの培地上でゆっくりと成長し続ける。追加の２週間後に、組織を、グルホシネートを含有する新鮮なＮ６培地に移すことができる。６週間後に、活発に成長しているカルスの直径約１ｃｍの領域を、グルホシネートを補充された培地を含有するプレートのいくつか上で同定することができる。これらのカルスは選択培地上で継代される場合に成長し続けることができる。
【０１０６】
最初に、１リットルあたり０．２ｍｇの２，４−Ｄを補充されたＮ６培地に組織のクラスターを移すことにより、トランスジェニックカルスから植物を再生することができる。２週間後に、組織を再生培地（Ｆｒｏｍｍら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：８３３−８３９）に移すことができる。
【０１０７】
実施例５
双子葉植物細胞中でのキメラ遺伝子の発現
マメ、インゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）からの種子貯蔵タンパク質ファセオリンのβサブユニットをコードする遺伝子からのプロモーターおよび転写ターミネーターより構成される種子特異的発現カセット（Ｄｏｙｌｅら（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９２２８−９２３８）を、形質転換されたダイズでの本ポリペプチドの発現に使用することができる。該ファセオリンカセットは、翻訳開始コドンから上流（５’）の約５００ヌクレオチドおよびファセオリンの翻訳終止コドンから下流（３’）の約１６５０ヌクレオチドを包含する。５’および３’領域の間に、唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位Ｎｃｏ　Ｉ（ＡＴＧ翻訳開始コドンを包含する）、Ｓｍａ　Ｉ、Ｋｐｎ　ＩおよびＸｂａ　Ｉがある。カセット全体はＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位により隣接される。
【０１０８】
本遺伝子のｃＤＮＡフラグメントは、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用するｃＤＮＡクローンのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により生成させてよい。クローニング部位をオリゴヌクレオチド中に組込んで、発現ベクターに挿入される場合に該ＤＮＡフラグメントの適正な向きを提供することができる。その後、上述されたとおり増幅を実施し、そして、単離されたフラグメントを、種子発現カセットを担持するｐＵＣ１８ベクターに挿入する。
【０１０９】
ダイズ胚をその後、本ポリペプチドをコードする配列を含んで成る発現ベクターで形質転換してよい。体性胚を誘導するために、ダイズ栽培変種Ａ２８７２の表面滅菌された未熟な種子から切開された長さ３〜５ｍｍの子葉を、適切なアガー培地上、明もしくは暗所で２６℃で６〜１０週間培養することができる。二次胚を生じさせる体性胚をその後摘出し、そして適する液体培地中に入れる。早期の球形状態の（ｓｔａｇｅｄ）胚として繁殖した体性胚のクラスターについての反復された選択後に、懸濁液を下述されるとおり維持する。
【０１１０】
ダイズ胚形成懸濁培養物を、回転振とう機（１５０ｒｐｍ）上の３５ｍＬ液体培地中で、１６：８時間の昼／夜の計画で蛍光灯を用いて、２６℃で維持することができる。培養物は、およそ３５ｍｇの組織を３５ｍＬの液体培地に接種することにより２週間ごとに継代する。
【０１１１】
ダイズ胚形成懸濁培養物をその後、粒子銃砲撃法（Ｋｌｅｉｎら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２７：７０−７３、米国特許第４，９４５，０５０号明細書）により形質転換してよい。デュポン（ＤｕＰｏｎｔ）のバイオリスティック［Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ］（商標）ＰＤＳ１０００／ＨＥ装置（ヘリウム改装部品（ｒｅｔｒｏｆｉｔ））を、これらの形質転換に使用することができる。
【０１１２】
ダイズの形質転換を助長するのに使用することができる選択可能なマーカー遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルスからの３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ　３１３：８１０−８１２）、プラスミドｐＪＲ２２５からのヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から；Ｇｒｉｔｚら（１９８３）Ｇｅｎｅ　２５：１７９−１８８）、およびアグロバクテリウム　ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡからのノパリン合成酵素遺伝子の３’領域より構成されるキメラ遺伝子である。ファセオリンの５’領域、本ポリペプチドをコードするフラグメントおよびファセオリンの３’領域を含んで成る種子発現カセットを、制限フラグメントとして単離することができる。このフラグメントをその後、マーカー遺伝子を担持するベクターの唯一の制限部位に挿入することができる。
【０１１３】
６０ｍｇ／ｍＬの１μｍ金粒子懸濁液５０μＬに：５μＬのＤＮＡ（１μｇ／μＬ）、２０μＬのスペルミジン（０．１Ｍ）、および５０μＬのＣａＣｌ２（２．５Ｍ）を（順序よく）添加する。粒子調製物をその後３分間攪拌し、微小遠心器中で１０秒間回転し、そして上清を除去する。その後、ＤＮＡ被覆された粒子を４００μＬの７０％エタノールで１回洗浄し、そして４０μＬの無水エタノールに再懸濁する。ＤＮＡ／粒子懸濁物を、各１秒間３回超音波処理することができる。５μＬのＤＮＡ被覆された金粒子をその後、各マクロキャリアー円盤上に負荷する。
【０１１４】
およそ３００〜４００ｍｇの２週齢懸濁培養物を、空の６０×１５ｍｍペトリ皿中に入れ、そして残余の液体を、ピペットを用いて組織から除去する。各形質転換実験について、通常、組織のおよそ５〜１０枚のプレートを砲撃する。膜破裂圧を１１００ｐｓｉに設定し、そしてチャンバーを２８インチ水銀の真空まで排気する。組織を、保持スクリーンからおよそ３．５インチ離して置き、そして３回砲撃する。砲撃後に、組織を半分に分割しかつ液体中に戻し入れ、そして上述されたとおり培養することができる。
【０１１５】
砲撃後５ないし７日に、液体培地を新鮮な培地で、そして砲撃後１１ないし１２日に、５０ｍｇ／ｍＬのヒグロマイシンを含有する新鮮な培地で交換してよい。この選択培地は毎週更新することができる。砲撃後７ないし８週で、形質転換されない壊死性の胚形成クラスターから成長する緑色の形質転換された組織を観察するかもしれない。単離された緑色組織を取り出し、そして別個のフラスコに接種して、新たな、クローン的に繁殖される形質転換された胚形成懸濁培養物を生成させる。各新たな系統を独立の形質転換事象として処理してよい。これらの懸濁物をその後継代しかつ未熟な胚のクラスターとして維持することができるか、もしくは、個々の体性胚の成熟および発芽により植物全体に再生させることができる。
【０１１６】
実施例６
微生物細胞中でのキメラ遺伝子の発現
本ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、Ｔ７大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＢＴ４３０に挿入することができる。本ベクターは、バクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ／Ｔ７プロモーター系を使用するｐＥＴ−３ａ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８７）Ｇｅｎｅ　５６：１２５−１３５）の誘導体である。プラスミドｐＢＴ４３０を、最初にそれらの元の位置のｐＥＴ−３ａ中のＥｃｏＲ　ＩおよびＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位を破壊することにより構築した。ＥｃｏＲ　ＩおよびＨｉｎｄ　ＩＩＩ部位を含有するオリゴヌクレオチドアダプターを、ｐＥＴ−３ａのＢａｍＨ　Ｉ部位に挿入した。これは該発現ベクターへの遺伝子の挿入のための付加的な独特のクローニング部位をもつｐＥＴ−３ａＭを創製した。その後、翻訳開始の位置のＮｄｅ　Ｉ部位を、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用してＮｃｏ　Ｉ部位に転化した。この領域のｐＥＴ−３ａＭのＤＮＡ配列（５’−ＣＡＴＡＴＧＧ）を、ｐＢＴ４３０中の５’−ＣＣＣＡＴＧＧに転化した。
【０１１７】
ｃＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡを適切に消化して、タンパク質をコードする核酸フラグメントを遊離させてよい。このフラグメントをその後、１％低溶融アガロースゲル上で精製してよい。緩衝液およびアガロースは、ＤＮＡフラグメントの可視化のため、１０μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する。フラグメントをその後、製造元の説明書に従ってゲルアーゼ［ＧＥＬａｓｅ］（商標）（エピセンター　テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウィスコンシン州マディソン）での消化によりアガロースゲルから精製し、エタノール沈殿し、乾燥しかつ２０μＬの水に再懸濁することができる。適切なオリゴヌクレオチドアダプターを、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（ニュー　イングランド　バイオラブス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）（ＮＥＢ）、マサチューセッツ州ビバリー）を使用して該フラグメントに連結してよい。連結されたアダプターを含有するフラグメントを、上述されたところの低溶融アガロースを使用して過剰のアダプターから精製することができる。ベクターｐＢＴ４３０を消化し、アルカリホスファターゼ（ＮＥＢ）で脱リン酸化し、そして上述されたとおりフェノール／クロロホルムで除タンパクする。調製されたベクターｐＢＴ４３０およびフラグメントをその後、１６℃で１５時間連結することができ、次いでＤＨ５電気コンピテント細胞（ギブコ　ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ））に形質転換する。形質転換体を、ＬＢ培地および１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するアガープレート上で選択することができる。本ポリペプチドをコードする遺伝子を含有する形質転換体をその後、制限酵素分析により、Ｔ７プロモーターに関して正しい向きについてスクリーニングする。
【０１１８】
高レベル発現のために、ｃＤＮＡ挿入物をＴ７プロモーターに関して正しい向きでもつプラスミドクローンを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９８６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８９：１１３−１３０）に形質転換することができる。培養物を、アンピシリン（１００ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢ培地中２５℃で成長させる。およそ１の６００ｎｍでの光学密度で、ＩＰＴＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトシド、誘導物質）を、０．４ｍＭの最終濃度まで添加することができ、そして、インキュベーションを２５°で３時間継続することができる。その後、細胞を遠心分離により収穫し、そして、０．１ｍＭ　ＤＴＴおよび０．２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含有するｐＨ８．０の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　５０μＬに再懸濁する。少量の１ｍｍガラスビーズを添加することができ、そして、混合物を、微小プローブ超音波処理装置を用いて各回約５秒間３回超音波処理することができる。混合物を遠心分離し、そして上清のタンパク質濃度を測定する。培養物の可溶性画分からの１μｇのタンパク質を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離することができる。期待された分子量で移動するタンパク質のバンドについてゲルを観察することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
発明にかかる、アフリカンデージー（Ｄｉｍｏｒｐｈｏｔｈｅｃａ　ｓｉｎｕａｔａ、［ＳＩＮ２］として示される配列番号２）、トウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ、［ＳＩＮ６］として示される配列番号６）、コメ（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ、［ＳＩＮ８］として示される配列番号８）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ、配列番号１７、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　４０４０２８）、ゴーファーアップル（Ｌｉｃａｎｉａ　ｍｉｃｈａｕｘｉｉ、［ＳＩＮ４］として示される配列番号４）、マンゴスチン（Ｇａｒｃｉｎｉａ　ｍａｎｇｏｓｔａｎａ、配列番号１８、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　１９３００７７）、ベルノニア（Ｖｅｒｎｏｎｉａ　ｍｅｓｐｉｌｉｆｏｌｉａ、［ＳＩＮ１０］として示される配列番号１０）、ベニバナ（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ　ｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ、配列番号１９、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　４０４０２６）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ、［ＳＩＮ１２］として示される配列番号１２）、アフリカパーム油（Ｅｌａｅｉｓ　ｇｕｉｎｅｅｎｓｉｓ、配列番号２０、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　４７０４６４０）、トウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ、［ＳＩＮ１４］として示される配列番号１４）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ、［ＳＩＮ１６］として示される配列番号１６）、ならびに２種のアラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のタンパク質（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）、それぞれ配列番号２１および２２、ＮＣＢＩ受託番号：ｇｉ　７４８７９８３およびｇｉ　１０７６３６１）からのオレオイル−ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列の比較を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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