(57)【要約】ＨＩＦ−１αの転写活性化（Ｎ−ＴＡＤ）ドメインの変化はこのドメインが低酸素誘導性転写活性化、酸素依存性分解およびＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用のために必要な構造を含んでいることを証明している。Ｎ−ＴＡＤドメインに変化を有する、ＨＩＦ−１α配列、そのフラグメントおよびアナログは生物実体（ｂｉｏｅｎｔｉｔｙ）の活性を修飾または調節する際に有用である。ＨＩＦ−１αのＮ−ＴＡＤドメインのアゴニストおよびアンタゴニストもまた生物実体の活性を修飾または調節する際に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＰＹＩモチーフを含む、単離ポリペプチド。
【請求項２】
残基５６４−５６６がＤＤＤによって置換された請求項１記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
残基５６４−５６６がＡＡＡによって置換された請求項１記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＰ５６４残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項５】
残基５６４がＡによって置換された請求項４記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
残基５６４がＨによって置換された請求項４記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＹＩ６５６−５６６残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項８】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＰＭ５６７−５６８残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＤＤＤ５６９−５７１残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＫ５４７残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１１】
位置５４７でアミノ酸がＲによって置換された請求項１０記載の単離ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＹ５６５残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１３】
位置５６５でアミノ酸がＧによって置換された請求項１２記載の単離ポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＩ５６６残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１５】
位置５６６でアミノ酸がＧによって置換された請求項１４記載の単離ポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＦＱＬ５７２−５７４残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１７】
位置５７２−５７４でアミノ酸がＡＱＡによって置換された請求項１６記載の単離ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１−１７いずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を備える単離核酸分子。
【請求項１９】
少なくとも１種のプロモーターと作動的に連結している請求項１８記載の核酸分子を備えるベクター。
【請求項２０】
請求項１９記載のベクターを用いてトランスフォームまたはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１−１７のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドおよび少なくとも１種の医薬用担体もしくはアジュバンドを備える医薬組成物。
【請求項２２】
該ベクターがプラスミドである請求項１９記載のベクター。
【請求項２３】
該ベクターがウイルスベクターである請求項１９記載のベクター。
【請求項２４】
該ベクターがレトロウイルスベクターである請求項１９記載のベクター。
【請求項２５】
該宿主細胞が原核細胞である請求項２５記載の宿主細胞。
【請求項２６】
該宿主細胞が細菌細胞である請求項２５記載の宿主細胞。
【請求項２７】
該宿主細胞が真核細胞である請求項２５記載の宿主細胞。
【請求項２８】
該宿主細胞が哺乳類細胞である請求項２５記載の宿主細胞。
【請求項２９】
タンパク質またはその機能的フラグメントを作製する、下記のステップを備える方法：
請求項１８の核酸を宿主細胞または細胞抽出物内に導入するステップ；
前記宿主細胞または細胞抽出物を、前記核酸が転写物として発現し、前記転写物が前記タンパク質を備える翻訳産物として発現するような条件下でインキュベートするステップ；および
前記翻訳産物を単離するステップ。
【請求項３０】
請求項２９記載の方法によって作製される単離タンパク質またはその機能的フラグメント。
【請求項３１】
単離分解ボックスタンパク質を産生する、下記のステップを備える方法：
配列番号２の核酸を備える発現ベクターにより宿主細胞を感染する、トランスフォームする、またはトランスフェクトするステップ；
前記宿主細胞を培養するステップ；および
前記宿主細胞から単離タンパク質を除去するステップ。
【請求項３２】
請求項３１記載の方法によって作製される単離タンパク質またはその機能的フラグメント。
【請求項３３】
Ｎ−ＴＡＤ機能を調節する物質についてスクリーニングする、下記のステップを備える方法：
下記を備える混合物：
請求項２９記載の単離タンパク質；
標的タンパク質；および
候補物質
を前記物質の存在がなければそれによって前記単離タンパク質がレポーター遺伝子を特異的に転写活性化する、またはＶＨＬ依存性分解を媒介する、または基準親和力でＶＨＬと物理的に相互作用する条件下でインキュベートするステップ；
物質偏向親和力を確かめるために前記単離タンパク質の前記標的タンパク質に対する結合親和力を検出するステップ；
このとき、前記基準親和力と前記物質偏向親和力間の相違は、前記物質が前記標的タンパク質に対する前記単離タンパク質の機能的活性を調節することを示している。
【請求項３４】
標的タンパク質がＶＨＬまたはそのフラグメントである請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
インキュベーションが正常酸素条件で行われる請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
インキュベーションが低酸素条件で行われる請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
ＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用調節効力についてＰＹＩモチーフまたはＰ５６４にまたがるタンパク質もしくはその機能的フラグメントの潜在的アナログを評価する、下記のステップを備える方法：
細胞、細胞群または生物体における正常ＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用を確かめるステップ；
前記潜在的アナログを同等の試験細胞、細胞群または生物体へ投与するステップ；
前記試験細胞、細胞群または生物体におけるＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用のレベルを測定するステップ；および
ＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用の測定された試験レベルがＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用の正常レベル以上であるときに前記潜在的アナログが有効であることを確かめるステップ。
【請求項３８】
前記試験細胞、細胞群または生物体が正常酸素条件下にある請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記試験細胞、細胞群または生物体が低酸素条件下にある請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
ＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用阻害効力についてＰＹＩモチーフまたはＰ５６４にまたがるタンパク質もしくはその機能的フラグメントのアンタゴニストを評価する、下記のステップを備える方法：
細胞、細胞群または生物体におけるＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用の正常レベルを測定するステップ；
前記アンタゴニストを同等の試験細胞、細胞群または生物体へ投与するステップ；
前記試験細胞、細胞群または生物体におけるＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用のレベルを測定するステップ；および
ＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用の測定された試験レベルがＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用の正常レベル未満であるときに前記アンタゴニストが有効であることを確かめるステップ。
【請求項４１】
前記試験細胞、細胞群または生物体が正常酸素条件下にある請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記試験細胞、細胞群または生物体が低酸素条件下にある請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
細胞、細胞群および生きている生物体からなる群から選択されるバイオエンティティ（生物実体）のＨＩＦ−１αシグナル伝達経路を調節するため方法であって、ＰＹＩモチーフ、ＰＹＩモチーフの機能的フラグメント、ＰＹＩモチーフのアナログ、Ｐ５６４にまたがるタンパク質、Ｐ５６４にまたがるタンパク質の機能的フラグメント、Ｐ５６４にまたがるタンパク質のアナログからなる群から選択される物質を前記試験細胞、細胞群または生きている生物体への投与するステップを備える方法。
【請求項４４】
細胞、細胞群および生きている生物体からなる群から選択されるバイオエンティティ（生物実体）のＨＩＦ−１αシグナル伝達経路を調節するための、ＰＹＩモチーフのアンタゴニストまたはＰ５６４にまたがるタンパク質のアンタゴニストからなる群から選択される物質を前記試験細胞、細胞群または生きている生物体へ投与するステップを備える方法。
【請求項４５】
全長ＨＩＦ−１αもしくはそのアナログ、ＰＹＩモチーフの少なくとも１つの突然変異もしくは改変を有する前記全長ＨＩＦ−１αもしくはアナログを、細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える、疾患を治療する方法。
【請求項４６】
前記疾患が虚血性状態である請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記虚血性状態が脳梗塞、心筋梗塞および循環器障害からなる群から選択される請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
癌、高血圧、脱髄性疾患、びまん性増殖性糸球体腎炎、トキソプラズマ症誘発性網脈絡膜炎、ＨＩＶ誘発性Ｔａｔ血管新生、ＨＩＶ誘発性カポジ［Ｋａｐｏｓｉ］肉腫、肝炎誘発性炎症、肝炎誘発性血管新生、慢性潰瘍形成、増殖性網膜症、網膜血管芽細胞腫、新血管形成、動脈過血管形成、サルコイドーシス、水泡性皮膚疾患、血管新生を伴う脈管炎、血管新生を伴う皮膚筋炎、血管新生関節リウマチを伴う多発性筋炎、若年性変形性関節症、多発性関節炎、動脈瘤およびアテローム（粥腫）からなる群から選択される疾患を治療する、ＰＹＩモチーフまたはＰ５６４にまたがるタンパク質もしくはその機能的フラグメントのアンタゴニストを細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える方法。
【請求項４９】
ＰＹＩモチーフまたはＰ５６４にまたがるタンパク質もしくはそれの機能的フラグメントのアゴニストを細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える疾患を治療する方法。
【請求項５０】
前記疾患が虚血症、脳梗塞、心筋梗塞、および循環器障害からなる群から選択される請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
構成的に活性なＨＩＦ−１α変異体、構成的に活性なＨＩＦ−１α変異体の機能的フラグメント、ＰＹＩモチーフのアゴニスト、およびＰ５６４にまたがるタンパク質のアゴニストからなる群から選択される物質を培養への添加することを備えるｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中の状態を促進する方法。
【請求項５２】
培養物が神経幹細胞を維持もしくは増殖させるために使用される請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
ＰＹＩモチーフ、ＰＹＩモチーフの機能的フラグメント、ＰＹＩモチーフのアナログ、Ｐ５６４にまたがるタンパク質およびＰ５６４にまたがるタンパク質の機能的フラグメント、およびＰ５６４にまたがるタンパク質のアナログからなる群から選択される物質、および少なくとも１種の医薬用担体もしくはアジュバンドを備える医薬組成物。
【請求項５４】
ＰＹＩモチーフのアントゴニストまたはＰ５６４にまたがるタンパク質のアンタゴニストおよび少なくとも１種の医薬用担体もしくはアジュバンドを備える医薬組成物。
【請求項５５】
細胞、細胞群または生物体におけるＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ、およびＨＩＦ−３αからなる群から選択される分子の機能を調節する方法であって、前記細胞、細胞群または生物体へＰＹＩモチーフ、ＰＹＩモチーフの機能的フラグメントもしくはＰＹＩモチーフのアナログ、Ｐ５６４にまたがるタンパク質、Ｐ５６４にまたがるタンパク質の機能的フラグメント、およびＰ５６４にまたがるタンパク質のアナログからなる群から選択される物質を前記細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える方法。
【請求項５６】
細胞、細胞群または生物体におけるＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ、およびＨＩＦ−３αからなる群から選択される分子の機能を調節する方法であって、ＰＹＩモチーフに対するアンタゴニストまたはＰ５６４にまたがるタンパク質に対するアンタゴニストを前記細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える方法。
【請求項５７】
細胞、細胞群または生物体におけるＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ、およびＨＩＦ−３αからなる群から選択される分子の分解をもたらす方法であって、前記細胞、細胞群または生物体へＰＹＩモチーフもしくはＰＹＩモチーフの機能的フラグメント、ＰＹＩモチーフのアナログ、Ｐ５６４にまたがるタンパク質、Ｐ５６４にまたがるタンパク質の機能的フラグメントおよびＰ５６４にまたがるタンパク質のアナログからなる群から選択される物質を前記細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える方法。
【請求項５８】
Ｋ５４７、Ｐ５６４、Ｙ５６５、Ｉ５６６、Ｄ５６９、Ｄ５７０、およびＤ５７１からなる群から選択される少なくとも１個の残基の変化を有するＨＩＦ−１α変異体を細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える血管新生を増加させる方法。
【請求項５９】
Ｋ５４７、Ｐ５６４、Ｙ５６５、Ｉ５６６、Ｄ５６９、Ｄ５７０、およびＤ５７１からなる群から選択される少なくとも１個の残基の変化を有するＨＩＦ−１α変異体を細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える血管新生を調節する方法。
【請求項６０】
Ｋ５４７、Ｐ５６４、Ｙ５６５、Ｉ５６６、Ｄ５６９、Ｄ５７０、およびＤ５７１からなる群から選択される少なくとも１個の残基の変化を有するＨＩＦ−１α変異体を細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える赤血球生成を増加させる方法。
【請求項６１】
Ｋ５４７、Ｐ５６４、Ｙ５６５、Ｉ５６６、Ｄ５６９、Ｄ５７０、およびＤ５７１からなる群から選択される少なくとも１個の残基の変化を有するＨＩＦ−１α変異体を細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える赤血球生成を調節する方法。
【請求項６２】
細胞タンパク質中に配列番号５の配列を組み込むことを備えるタンパク質の酸素依存性分解を制御する方法。
【請求項６３】
前記タンパク質がＧＡＬ−４である請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
残基５３２−５８５のいずれか１つへの変化についてサンプル配列を評価することを備える、酸素非依存性分解性ＨＩＦ−１α変異体をコードするＨＩＦ−１α配列を検出する方法。
【請求項６５】
Ｋ５４７、Ｐ５６４、Ｙ５６５、Ｉ５６６、Ｐ５６７、Ｍ５６８、Ｄ５６９、Ｄ５７０、Ｄ５７１、Ｆ５７２、Ｑ５７３およびＬ５７４からなる群から選択される残基に前記変化が発生する請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
前記評価が、オリゴヌクレオチドプローブ、ＰＣＲに基づく診断および抗体からなる群から選択される手段によって実行される請求項６４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
フォン・ヒッペル・リンドウ（ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ、ＶＨＬ）病はＶＨＬ感受性遺伝子の生殖細胞系突然変異によって引き起こされる。これらの突然変異は、腎臓明細胞癌、褐色細胞腫および中枢神経系や網膜の血管腫瘍を含む多種多様な腫瘍の発生を引き起こす（マハー，イー・アール（Ｍａｈｅｒ，Ｅ．Ｒ．）ら，Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７６：３８１−３９１，１９９７；ケリン，ダブリュ・ジー（Ｋａｅｌｉｎ，Ｗ．Ｇ．）ら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．，１４：４２３−４２６， １９９８）。両方のＶＨＬ対立遺伝子の機能的不活化は多数の散発性腎臓明細胞癌において証明されている（グナッラ，ジェイ・アール（Ｇｎａｒｒａ，Ｊ．Ｒ．）ら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，７：８５−９０，  １９９４）。さらに、ヌードマウス異種移植片アッセイにおいて、ＶＨＬ（−／−）腎癌細胞内への変異型ＶＨＬ  ｃＤＮＡの再導入ではなく、野生型ＶＨＬ  ｃＤＮＡの再導入は、腫瘍を形成する能力を抑制する（イリオポーロス，オー（Ｉｌｉｏｐｏｕｌｏｓ，Ｏ．）ら，  Ｎａｔ．Ｍｅｄ，，１：８２２−８２６，１９９５；グナッラ，ジェイ・アール（Ｇｎａｒｒａ，Ｊ．Ｒ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，９３：１０５８９−１０５９４，１９９６）。ＶＨＬ関連腫瘍（ｎｅｏｐｌａｓｍ）は、典型的にはハイパーバスキュラー（ｈｙｐｅｒｖａｓｃｕｌａｒ）であり、例えば血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような血管新生因子を過剰産生する（タカハシ，エイ（Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ａ．）ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５４：４２３３−４２３７，１９９４；ウィツィッグマン−ヴォース，エス（Ｗｉｚｉｇｍａｎｎ−Ｖｏｏｓ，Ｓ．）およびプレート，ケイ・エイチ（Ｐｌａｔｅ，  Ｋ．Ｈ．），Ｈｉｓｔｏｌ．Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．，１１：１０４９−１０６１，１９９６）。さらに、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡを含む低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）誘導性ｍＲＮＡｓはＶＨＬ欠損細胞において正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）状態で構成的に発現することが証明されている（グナッラ，ジェイ・アール（Ｇｎａｒｒａ，Ｊ．Ｒ．）ら，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３：１０５８９−１０５９４，１９９６；イリオポーロス，オー（Ｉｌｉｏｐｏｕｌｏｓ，Ｏ．）ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ，，１：８２２−８２６，１９９５；シーマイスター，ジー（Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒ，Ｇ．）ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：２２９９−２３０１，１９９６）。ＶＨＬ（−／−）腎癌細胞内へのＶＨＬの再導入は、それが転写後機序（グナッラ，ジェイ・アール（Ｇｎａｒｒａ，Ｊ．Ｒ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３：１０５８９−１０５９４，１９９６；イリオポーロス，オー（Ｉｌｉｏｐｏｕｌｏｓ，Ｏ．）ら，Ｎａｔ．Ｍｅｄ，，１：８２２−８２６，１９９５；シーマイスター，ジー（Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒ，Ｇ．）ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６：２２９９−２３０１，１９９６）および／または転写機序（ムコパディイェイ，ディ（Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ，  Ｄ．）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１７：５６２９−５６３９，  １９９７）のどちらかによってＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルの負の調節因子として機能することを示している。
【０００２】
ＶＨＬタンパク質は３個のエクソンによってコードされ、２１３アミノ酸を含有している（配列番号２）（ラティフ，エフ（Ｌａｔｉｆ，Ｆ．）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，６０：１３１７−１３２０，１９９３）。ＶＨＬタンパク質をコードするヌクレオチドは配列番号１で提供される。ＶＨＬ分子は、αドメイン（残基１５５−１９２）と７連鎖βサンドイッチから構成させるβドメイン（残基６３−１５４）およびαヘリックス（残基１９３−２０４）を有している。配列類似性が欠如しているためＶＨＬの機能についての手掛かりは得られない。
【０００３】
生化学的研究において、ＶＨＬがＶＨＬ−ＢＣ−Ｃｕｌ−２複合体を形成するエロンガン（ｅｌｏｎｇｉｎ）ＢおよびＣ（デュアン，ディ・アール（Ｄｕａｎ，Ｄ．Ｒ．）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９；１４０２−１４０６，１９９５；キベル，エイ（Ｋｉｂｅｌ，Ａ．）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６９：１４４４−１４４６，１９９５：タカギ，ワイ（Ｔａｋａｇｉ，Ｙ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：２７４４４−２７４４９，１９９７）、および、カリン（ｃｕｌｌｉｎ）−２（Ｃｕｌ−２）（ポーズ，エイ（Ｐａｕｓｅ，Ａ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：２１５６−２１６１，１９９７；ロナーガン，ケイ・エム（Ｌｏｎｅｒｇａｎ，Ｋ．Ｍ．）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８：７３２−７４１，１９９８）を含む多数の細胞タンパク質と関連していることが証明されている。ＶＨＬ−ＢＣ三元複合体の結晶構造は、１つはＶＨＬとエロンガンＣとの間およびもう１つはエロンガンＢとＣとの間で２つの界面を示す（ステッビンス，シー・イー（Ｓｔｅｂｂｉｎｓ，Ｃ．Ｅ．）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：４５５−４６１，１９９９）。αドメインはエロンガンＣとの主要な接点を形成する。このＶＨＬのエロンガンＣ結合ドメインは腫瘍における突然変異多発領域の１つを表しており（グナッラ，ジェイ・アール（Ｇｎａｒｒａ，Ｊ．Ｒ．）ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２４２：２０１−２１０，１９９６）、ＶＨＬ−ＢＣ複合体形成が腫瘍抑制の機能にとって極めて重要であることを示唆している。さらに、また別のドメインであるＶＨＬのβドメイン上には突然変異多発領域があり（グナッラ，ジェイ・アール（Ｇｎａｒｒａ，Ｊ．Ｒ．）ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２４２：２０１−２１０，１９９６）、これはＶＨＬ−ＢＣ結晶構造内で同定された推定高分子結合部位と重複している（ステッビンス，シー・イー（Ｓｔｅｂｂｉｎｓ，Ｃ．Ｅ．）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：４５５−４６１，１９９９）。ＶＨＬの結合パートナーであるエロンガンＢおよびＣ並びにＣｕｌ−２は、ユビキチン媒介性タンパク質分解に関して細胞周期制御タンパク質を標的とするＳＣＦ（Ｓｋｐｌ−Ｃｕｌ−１−Ｆ−ボックスタンパク質）のマルチタンパク質複合体のコンポーネントに対するホモロジーを共有する（シーチャノヴァー，エイ（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．），ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：７１５１−７１６０，１９９８）。もっと重要なことに、ＶＨＬ−ＢＣ複合体の構造はＳＣＦ複合体構造に対するこれらの類似性を拡張させるが（ステッビンス，シー・イー（Ｓｔｅｂｂｉｎｓ，Ｃ．Ｅ．）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：４５５−４６１，１９９９）、これはＶＨＬ−ＢＣ−Ｃｕｌ−２およびＳＣＦ複合体が類似の機能を有する可能性があることを示している。このモデルと素晴らしく一致して、ＶＨＬは近年、哺乳類細胞抽出物中におけるＥ３ユビキチンリガーゼ活性と関連していることが証明されている（リスツワン，ジェイ（Ｌｉｓｚｔｗａｎ，Ｊ．）ら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１３：１８２２−１８３３，  １９９９；イワイ，ケイ（Ｉｗａｉ，Ｋ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ���ｉ．９６：１２４３６−１２４４１，１９９９）。
【０００４】
ユビキチン系によるタンパク質の分解は２つの極めて重要なステップを含んでいる：標的タンパク質への複数のユビキチン分子の共有結合、および２６Ｓプロテアソームによるユビキチン標識基質の分解（シーチャノヴァー，エイ（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．）による論評，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：７１５１−７１６０，１９９８）。ユビキチンのそれの基質への結合を媒介する酵素経路のカスケードは相当明確に特徴付けられてきたが（シーチャノヴァー，エイ（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．），ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：７１５１−７１６０，１９９８；および近年の論評についてはハーシュコ，エイ（Ｈｅｒｓｈｋｏ，Ａ．）およびシーチャノヴァー，エイ（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，Ａ．），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６７：４２５−４７９，１９９８を参照）、分解のためのタンパク質がどのように選択されるのかという核心的問題の１つが未解明のままである（ラニー，ジェイ・ディ（Ｌａｎｅｙ，Ｊ．Ｄ．）およびホッホシュトラーサー，エム（Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ，Ｍ．），による論評，Ｃｅｌｌ，９７：４２７−４３０，１９９９）。明白に、短命タンパク質を同定して細胞内のより安定性タンパク質とは識別する必要があるので、このプロセスは高度に特異的でなければならない。
【０００５】
上記のように、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ｍＲＮＡを含む低酸素誘導性ｍＲＮＡは、ＶＨＬ欠損細胞中では正常酸素条件で構成的に発現する。転写因子である低酸素誘導性因子１（ＨＩＦ−１）はＶＥＧＦ、エリスロポエチン、チロシンヒドロキシラーゼ、誘導性一酸化窒素合成酵素および解糖系酵素類をコードする遺伝子を含む低酸素応答性遺伝子を調節することが分かっている（セメンツァ，ジー・エル（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１５：５５１−５７８，１９９９）。このように、ＨＩＦ−１は血管新生、赤血球生成、エネルギー代謝、鉄代謝、血管運動制御、炎症、組織マトリックス代謝および細胞生存決定を含む遺伝子の調節に関係している（セメンツァ，ジー・エル（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｇ．Ｌ．），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，１５：５５１−５７８，１９９９）。ＨＩＦ−１は、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスＰＡＳ（Ｐｅｒ／Ａｒｎｔ／Ｓｉｎ）タンパク質のヘテロダイマー、ＨＩＦ−１αとアリール炭化水素受容体核移行因子（ＡＲＮＴ）と同等であるタンパク質、である（ワン，ジー・エル（Ｗａｎｇ，Ｇ．Ｌ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：５５１０−５５１４，１９９５）。
【０００６】
ＨＩＦ−１複合体のＨＩＦ−１αタンパク質は、現在判明している中で特に短命のタンパク質である。低酸素条件へ細胞を曝露させ、引き続いて正常酸素条件へ復帰させた後のＨＩＦ−１αの半減期は数分間の範囲内にあり（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、例えばｃ−Ｊｕｎ（半減期 ・９０分間；（ムスティ，エイ・エム（Ｍｕｓｔｉ，Ａ．Ｍ．）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：４００−４０２，１９９７）、またはｐ５３（半減期 ・７−８時間；（クッブタット，エム・エイチ（Ｋｕｂｂｕｔａｔ，Ｍ．Ｈ．）ら，Ｎａｔｕｒｅ，３８７：２２９−３０３，１９９７；およびその中に記載の参考文献）のような他のストレス活性化転写因子と比較して顕著に短い。ＨＩＦ−１α機能の活性化機序を特性付けの結果、低酸素条件によってＨＩＦ−１αタンパク質レベルの大量のアップレギュレーションが生じることが観察された（カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：５６６７−５６７２，１９９７；フアン，エル・イー（Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｅ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：７９８７−７９９２，１９９８）。ＨＩＦ−１αは正常酸素細胞からの抽出後にマルチユビキチン化されることが証明された（フアン，エル・イー（Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｅ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：７９８７−７９９２，１９９８；カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：６５１９−６５２５，１９９９）。けれども、ＨＩＦ−１αｍＲＮＡは多数の哺乳類細胞中で構成的に発現し、低酸素による影響を受けない（カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：５６６７−５６７２，１９９７）。
【０００７】
ＨＩＦ−１αは８２６アミノ酸残基（配列番号４）を含有し、配列番号３のヌクレオチド配列によってコードされる。ＨＩＦ−１αは、Ｎ末端で塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）ドメイン、その後に２つのＰＡＳ（Ｐｅｒ／Ａｒｎｔ／Ｓｉｍ）ドメインを含んでいる。１つはポリペプチドのＣ末端（Ｃ−ＴＡＤ）およびもう１つは中央（Ｎ−ＴＡＤ）で２つの転写活性化ドメインが同定されている（ジアン，ビー・エイチ（Ｊｉａｎｇ，Ｂ．Ｈ．）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１９２５３−１９２６０，１９９７；プー，シー・ダブリュ（Ｐｕｇｈ，Ｃ．Ｗ．）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２，１１２０５−１１２１４，１９９７）。Ｃ−ＴＡＤは以前に転写コアクチベーターＣＢＰ／ｐ３００による調節のために特異的に標的とされると報告されていたが（アラニー，ゼット（Ａｒａｎｙ，Ｚ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３：１２９６９−１２９７３，１９９６）、近年になってＮ−ＴＡＤおよびＣ−ＴＡＤ両方の機能が低酸素条件への細胞の曝露後にＣＢＰ／ｐ３００によって調節されることが観察された（エマ，エム（Ｅｍａ，Ｍ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８：１９０５−１９１４，１９９９；キャッレロ，ピー（Ｃａｒｒｅｒｏ，Ｐ．）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２０：４０２−４１５，２０００）。
【０００８】
以前の実験は、プロテアソーム経路によるＨＩＦ−１αタンパク質レベルの調節がＰＥＳＴ配列モチーフにまたがるＨＩＦ−１αの構造によって媒介されることを示している（フアン，エル・イー（Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｅ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：７９８７−７９９２，１９９８；カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：６５１９−６５２５，１９９９）。この構造は酸素依存性分解（ＯＤＤ）ドメインと呼ばれており（フアン，エル・イー（Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｅ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：７９８７−７９９２，１９９８）、さらに際立って、この領域はＨＩＦ−１αの転写活性化ドメインＮ−ＴＡＤを有している（ジアン，ビー・エイチ（Ｊｉａｎｇ，Ｂ．Ｈ．）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１９２５３−１９２６０，１９９７；プー，シー・ダブリュ（Ｐｕｇｈ，Ｃ．Ｗ．）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，２７２，１１２０５−１１２１４，１９９７）。これらのデータは、ＨＩＦ−１αのＣ−末端の極めて複雑な機能的構造を証明している。酸素依存性分解ドメインおよびＮ−ＴＡＤの近傍には、低酸素細胞におけるＨＩＦ−１αの核内輸送を媒介する低酸素誘導性核局在化シグナルがある（カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：６５７３−６５８６，１９９８）。
【０００９】
ＨＩＦ−１αの安定化は、標的プロモーターの同族低酸素応答要素と相互作用するため、その後の転写コアクチベーターの漸増によって、ＨＩＦ−１αの低酸素依存性核内移行およびＡｒｎｔを用いての二量体化、およびＨＩＦ−１αの活性化の、多段階式経路を惹起する（ウェンガー，アール・エイチ（Ｗｅｎｇｅｒ，Ｒ．Ｈ．）およびガスマン，エム（Ｇａｓｓｍａｎｎ，Ｍ．），Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３７８：６０９−６１６，１９９７；カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：６５７３−６５８６，１９９８；Ｅｍａ，Ｍ．Ｓ  ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８：１９０５−１９１４，１９９９）。近年、２つの研究がＨＩＦ−１機能の調節におけるＶＨＬの明確な役割を示している：ＨＩＦ−１α機能の負の調節を生じさせるＶＨＬ−欠損細胞における天然型ＨＩＦ−１αアンチセンス転写の誘導（スラッシュ−ビンガム，シー・エイ（Ｔｈｒａｓｈ−Ｂｉｎｇｈａｍ，Ｃ．Ａ．）およびタートフ，ケイ・ディ（Ｔａｒｔｏｆ，Ｋ．Ｄ．），Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９１：１４３−１５１，１９９９）。他方、ＶＨＬは近年、ＨＩＦ−１と物理的に相互作用すると報告されている（コックマン，エム・イー（Ｃｏｃｋｍａｎ，Ｍ．Ｅ．）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｍａｙ  ２２，２０００）。ｐＶＨＬはＨＩＦ−１αタンパク質分解をユビキチンリガーゼ複合体の認識コンポーネントとして作用することによって調節することが発見された（コックマン，エム・イー（Ｃｏｃｋｍａｎ，Ｍ．Ｅ．）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，Ｍａｙ  ２２，２０００）。ＶＨＬのβドメインがＨＩＦ−１αと直接的または間接的に相互作用する界面を形成すること、およびＨＩＦ−１αの残基５４９−５７２がこの相互作用のために不可欠であったことが証明された（コックマン，エム・イー（Ｃｏｃｋｍａｎ，Ｍ．Ｅ．）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，Ｍａｙ  ２２，  ２０００）。
【００１０】
発明の概要
本発明は、概論的に、配列番号４のアミノ酸配列を有するポリペプチドとそのフラグメントであって、そのポリペプチドの安定性に影響を及ぼす改変された残基を有する、を提供する。
【００１１】
第１態様に従うと、実質的に精製かつ単離された本発明のポリペプチドは、残基５６４−５６６で改変されたＰＹＩモチーフを有する、配列番号４のアミノ酸配列（ＨＩＦ−１α）およびそのフラグメントを備える。
【００１２】
第２態様に従うと、実質的に精製かつ単離された本発明のポリペプチドは、改変されたＰ５６４残基を有する、配列番号４のアミノ酸配列（ＨＩＦ−１α）を備える。
【００１３】
第３態様に従うと、実質的に精製かつ単離された本発明のポリペプチドは、改変されたＹＩ５６５−５６６残基を有する、配列番号４のアミノ酸配列（ＨＩＦ−１α）を備える。
【００１４】
第４態様に従うと、実質的に精製かつ単離された本発明のポリペプチドは、改変されたＹ５６５残基を有する、配列番号４のアミノ酸配列（ＨＩＦ−１α）を備える。
【００１５】
第５態様に従うと、実質的に精製かつ単離された本発明のポリペプチドは、改変されたＤＤＤ５６９−５７１残基を有する、配列番号４のアミノ酸配列（ＨＩＦ−１α）を備える。
【００１６】
第６態様に従うと、実質的に精製かつ単離された本発明のポリペプチドは、改変されたＩ５６６残基を有する、配列番号４のアミノ酸配列（ＨＩＦ−１α）を備える。
【００１７】
第７態様に従うと、実質的に精製かつ単離された本発明のポリペプチドは、改変されたＦＱＬ５７２−５７４残基を有する、配列番号４のアミノ酸配列（ＨＩＦ−１α）を備える。
【００１８】
第８態様に従うと、実質的に精製かつ単離された本発明のポリペプチドは、改変されたＤＤＤ５６９−５７１残基を有する、配列番号４のアミノ酸配列（ＨＩＦ−１α）を備える。
【００１９】
第９態様に従うと、実質的に精製かつ単離された本発明のポリペプチドは改変されたＫ５４７残基を有する、配列番号４のアミノ酸配列（ＨＩＦ−１α）を備える。
【００２０】
上記９つの態様のＨＩＦ−１αポリペプチドおよびそのフラグメントは野生型より安定性である。上記９つの態様のＨＩＦ−１αポリペプチドは正常酸素条件下ではＶＨＬ媒介性分解を解して分解されない。
【００２１】
上記９つの態様のＨＩＦ−１αポリペプチドおよびそのフラグメントの特定アミノ酸残基の改変は例えば、部位特異的突然変異誘発によって生じさせることができる。その結果として生じる変異体分子はその後、正常酸素条件下においてＶＨＬの存在下で安定性について試験することができる。
【００２２】
第１０態様によれば、本発明は上記に定義した本発明のポリペプチド又はポリペプチドのフラグメントをコードする精製かつ単離された核酸を提供する。核酸はＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、さらに一本鎖もしくは二本鎖であってもよい。核酸は細胞源もしくは組織源から単離されても、または組換えもしくは合成を起源としてもよい。遺伝暗号の縮重を理由として、当業者は各配列が、上記に提供した特定の改変を有する、配列番号４に示されたアミノ酸配列またはそのフラグメントをコードするような多数のコード配列があり得ることを理解するであろう。
【００２３】
本発明の第１１態様は、本発明のｃＤＮＡもしくは本発明に従った核酸分子を備えるベクター、および本発明の核酸分子もしくはベクターによりトランスフォームもしくはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。これらは起源が真核もしくは原核細胞であってよい。これらの細胞は特に本発明のポリペプチドの発現のために適しており、例えばバキュロウイルスベクターを用いてトランスフォームされた、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できるＳｆ９細胞（ＡＴＣＣ  ＳＲＬ−１７１）のような昆虫細胞、および適切な発現プラスミドによってトランスフェクトされたヒト胎児腎細胞系２９３−ＥＢＮＡを含んでいる。本発明の好ましいベクターは、ベクターでトランスファームもしくはトランスフェクトされた適切な宿主細胞が本発明のポリペプチドを発現することができるように本発明に従った核酸が１もしくは２種以上の適切なプロモーターおよび／または他の制御配列へ作動的に結合された発現ベクターである。他の好ましいベクターは、例えばアデノウイルス、ワクシニアウイルスもしくはレトロウイルスに基づくベクターもしくはリポソームのような、哺乳類細胞のトランスフェクションのために、または、遺伝子療法のために適切なベクターである。多くのそのようなベクターは当分野において知られている。
【００２４】
本発明は、さらにまた上記のような１もしくは２種以上の適切なプロモーターおよび／または他の制御配列へ核酸を作動的に結合するステップを備える、本発明による核酸によってコードされるポリペプチドを発現することのできるベクターを作製する方法である。
【００２５】
本発明はさらに、宿主細胞中で核酸もしくはベクターを発現するステップ、および宿主細胞もしくは宿主細胞の増殖培地からポリペプチドを単離するステップを備える、本発明によるポリペプチドを作製する方法を提供する。
【００２６】
本発明は、ＨＩＦ−１αの分解／転写活性化に影響を及ぼす物質を同定するためのスクリーニングシステムを提供する。スクリーニングシステムは、配列番号５（最小Ｎ−ＴＡＤ）の少なくとも１つのアミノ酸を有するポリペプチド、もしくはその小フラグメント（配列番号６（残基５４７−５７５；図２８））または上記のその変異体の実質的に精製された調製物を調製して被験物質と混合するステップ；およびそれによってＨＩＦ−１αの転写活性の阻害がＨＩＦ−１αアンタゴニストを同定する、何らかの適切な手段によってＨＩＦ−１αの転写活性化の阻害をモニターするステップを備える。このスクリーニングシステムは、さらにまたＨＩＦ−１αの転写活性を活性化する物質を同定するためにも使用できる。
【００２７】
配列番号５（最小Ｎ−ＴＡＤ）の少なくとも１つのアミノ酸を有するポリペプチドもしくはその小フラグメント（配列番号６（残基５４７−５７５；図２８））または上記のその変異体およびＶＨＬタンパク質（配列番号２）の哺乳類細胞における実質的な過剰発現に基づいて、スクリーンシステムは、被験物質による、配列番号５もしくは６に記載されたドメインの転写活性化能力、または、それらのタンパク質の安定性（分解）の変化をモニターするために正常酸素条件で機能する。
【００２８】
このスクリーンシステムの使用は、ＨＩＦ−１αの転写活性化／分解を変化させることのできる物質／化合物を決定するための手段を提供する。このスクリーニング法は、潜在的治療薬の効率的な高容量スクリーニングを可能にする、パンデックス（ＰＡＮＤＥＸ（登録商標））（バクスターデイド・ディアグノスティクス〔Ｂａｘｔｅｒ−Ｄａｄｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ〕）システムのような大規模の自動化手法に適合させることができる。
【００２９】
このスクリーニングシステムのためには、最小Ｎ−ＴＡＤ配列もしくは残基５４７−５７５フラグメントが、好ましくは組換えＤＮＡ技術を用いてここに記載するように調製される。例えば化合物もしくはタンパク質のような被験物質は、最小Ｎ−ＴＡＤもしくは残基５４７−５７５配列を含有する反応容器内に導入させる。最小タンパク質フラグメントへの被験物質の結合は、非限定的に、レセプター遺伝子系を有する、適切な手段によって同定される。このようなレポーター遺伝子系は、非限定的に、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子を含む。
【００３０】
本発明によるポリペプチドは、その活性もしくは機能に影響を及ぼす、または調節する分子をスクリーニングする際に使用できる。このような分子は、治療的（もしかすると予防的）状況において有用な可能性がある。
【００３１】
新薬の同定を導く製薬学的研究には、リード化合物が発見される前および発見された後でさえ、極めて多数の候補物質のスクリーニングが関わることがよく知られている。これは、製薬学的研究が極めて多額の費用と多大な時間を要する１つの因子である。スクリーニングプロセスを支援するための手段は、相当に大きな商業的重要性および有用性を有することがある。癌を治療もしくは予防する際に潜在的な有用性を有する物質をスクリーニングするためのそのような手段は、本発明によるポリペプチドによって提供される。ポリペプチドのモジュレーターとして同定された物質は癌に対する闘争における前進を表しているが、それはそれらがｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）使用するための治療薬の設計および検討のための基礎を提供するからである。
【００３２】
ポリペプチドの活性を調節する物質をスクリーニングする方法は、１もしくは２種以上の被験物質を適切な反応媒体中でポリペプチドと接触させるステップ、処理されたポリペプチドの活性を試験するステップおよびその活性を試験物質で処理されていない比較される反応媒体中でのポリペプチドの活性と比較するステップを含むことができる。処理されたポリペプチドと処理されていないポリペプチドの活性における差は関係試験物質の調節作用の指標である。
【００３３】
コンビナトリアル・ライブラリー・テクノロジーは、ポリペプチドの活性を調節する能力について潜在的に膨大な数の種々の物質を試験するための効率的方法である。このようなライブラリーおよびそれらの使用は当分野において知られている。ペプチド・ライブラリーの使用が好ましい。
【００３４】
活性の調節をスクリーニング前、または同時に、試験物質は、例えば酵母ツーハイブリッドシステム（ポリペプチドと試験物質の両方がコードされる核酸から酵母中で発現できることを必要とする）で、ポリペプチドと相互作用する能力についてスクリーニングすることができる。これは、ポリペプチドの活性を調節する実測的な能力について物質を試験する前の粗野なスクリーンとして使用できる。あるいはまた、このスクリーンは試験物質が例えば治療薬として試験するため、ＰＹＩモチーフもしくはＰ５６４にまたがるポリペプチド（残基５４７−５７５）またはその部分へ結合することについてスクリーニングするのに、又は、ＰＹＩモチーフ又はＰ５６４にまたがるペプチド又はその部分のミメティックを発見するために使用できよう。
【００３５】
ＰＹＩモチーフもしくはＰ５６４にまたがるポリペプチド（残基５４７−５７５）またはその部分の生物学的活性、例えばＶＨＬへの結合を、ミミックすることができる物質の同定に続いて、この物質を詳細に調査することができる。さらに、薬剤、医薬組成物もしくは薬物のような組成物の調製、即ち製造もしくは処方における製造および／または使用することができる。これらは個体に投与することができる。
【００３６】
ポリペプチド機能の調節因子として同定された物質は、性質においてペプチドもしくは非ペプチドであってよい。非ペプチド「小分子」は、数々のｉｎ  ｖｉｖｏ医薬的使用においてしばしば好ましい。従って、医薬的使用のためにこの物質（特にペプチドである場合）のミメティックもしくはミミックを設計することができる。
【００３７】
ミメティックを公知の製薬学的活性化合物へ設計することは、「リード」化合物に基づく医薬品を開発するためのよく知られているアプローチである。これは、活性化合物を合成するのが困難である、もしくは費用が高くつく場合、または、ペプチドが消化器官においてプロテアーゼによって急速に分解される傾向を示すため経口組成物としては不適切な活性剤である等、特定投与方法には適合しない場合に望ましいことがある。ミメティック設計、合成および試験は一般には、標的とされる特性について莫大な数の分子を無作為にスクリーニングするのを回避するために使用されている。
【００３８】
所定の標的特性を有する化合物からミメティックの設計を行うには、一般に幾つかのステップが用意される。第１に、標的特性を決定する際に重大および／または重要である化合物の特定部分が同定される。ペプチドの場合は、これは例えば各残基を順に置換させることによって、ペプチド内のアミノ酸残基を体系的に変化させることによって実施できる。一般にはこのようなペプチドモチーフを精製するためには、ペプチドのアラニンスキャン（Ａｌａｎｉｎｅ  ｓｃａｎ）が使用される。化合物の活性領域を構成するこれらの部分もしくは残基は「ファルマコフォア［ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ］」として知られている。
【００３９】
ファルマコフォアがいったん発見されると、その構造は例えば立体化学、結合、サイズおよび／または電荷のような物理的特性に従って、例えば分光法、Ｘ線回折データおよびＮＭＲのような源泉の範囲からのデータを使用してモデリングされる。このモデリングプロセスでは、コンピュータ利用解析、類似性マッピング（原子間の結合よりむしろファルマコフォアの電荷および／または質量をモデリングする）およびその他の技術を使用できる。
【００４０】
このアプローチの変形においては、リガンドおよびその結合パートナーの三次元構造がモデリングされる。これは、リガンドおよび／または結合パートナーが結合すると高次構造を変化させる場合には、モデルがミメティックの設計においてこれを考慮に入れることを許容するので、特に有用な可能性がある。この場合、リガンドはＰＹＩモチーフもしくはＰ５６４にまたがるポリペプチド（例、５４７−５７５残基）または機能的フラグメントもしくはその部分であってよい。結合パートナーはＶＨＬもしくはその機能的部分、例えばＨＩＦ−１α相互作用ドメインであってよい。
【００４１】
その後、ファルマコフォアをミミックする化学基をグラフトすることのできる鋳型分子が選択される。鋳型分子およびその上にグラフトされた化学基は、リード化合物の生物学的活性を保持しながらそのミメティックを容易に合成でき、おそらく薬理学的に許容可能であり、さらにｉｎ  ｖｉｖｏで分解しないように便宜的に選択することができる。あるいはまた、ミメティックがペプチドを基礎とする場合は、その強剛性を増加させるためにペプチドを環化させることによってより高度の安定性を達成できる。このアプローチによって発見されるミメティックもしくはミメティックはその後、それらが標的特性を有しているかどうか、またはそれらが標的特性をどの程度示すのかを調べるためにスクリーニングすることができる。その後、ｉｎ  ｖｉｖｏもしくは臨床試験のための１もしくは２つ以上の最終ミメティックに到達するために、よりいっそうの最適化もしくは改変を実施できる。
【００４２】
従って、本発明の第９態様では、ＰＹＩモチーフもしくはＰ５６４にまたがるポリペプチド（例、５４７−５７５残基）もしくはその部分の活性をミミックする物質をスクリーニングする方法が提供され、その方法は試験物質を例えばＶＨＬもしくはその１部分のようなＨＩＦ−１α特異的結合パートナーと接触させるステップと、試験物質がその特異的結合パートナーに結合するかどうかを判定するステップを備える。
【００４３】
本発明のポリペプチドを治療目的で使用する場合は、投与量および投与経路は治療される患者の性質および状態に左右され、さらに担当医もしくは獣医の裁量の範囲内であろう。適切な投与経路には、経口、皮下、筋肉内、腹腔内もしくは静脈内注射、非経口、局所投与、インプラント等が含まれる。
【００４４】
本発明のポリペプチドは適切な医薬用担体と組み合わせて使用できる。結果として生じる組成物は、本発明のポリペプチドまたは医薬上許容されるその無害の塩、および医薬上許容される固形もしくは液状担体もしくはアジュバント（補助薬）を備える。そのような賦形剤もしくはアジュバントの例には、生理食塩液、緩衝食塩液、リンゲル液、鉱油、タルク、コーンスターチ、ゼラチン、乳糖、蔗糖、微結晶性セルーロス、カオリン、マンニトール、リン酸カルシウム、塩化ナトリウム、アルギン酸、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、増粘剤、安定剤、懸濁剤およびそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。このような組成物は液剤、懸濁剤、錠剤、カプセル剤、クリーム剤、軟膏剤（ｓａｌｖｅｓ）、エリキシル剤、シロップ剤、ウェハース剤、軟膏剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔｓ）の形態もしくはその他の従来型形態であってよい。処方は投与様式に適合しなければならない。本発明のポリペプチドを備える組成物は、活性化合物を重量で約０．１％−９０％、および最も一般的には約１０％−３０％を含有するであろう。
【００４５】
本発明のまた別の態様は、例えばＰＹＩモチーフ、ＰＹＩモチーフの機能的フラグメント、ＰＹＩモチーフのアナログ、ＰＹＩモチーフのアナログ、Ｐ５６４にまたがるタンパク質、またはＰ５６４にまたがるタンパク質のアナログのような物質を細胞、細胞群または生物体へ投与することによってＨＩＦ−１αシグナル伝達経路を調節する方法を提供する。
【００４６】
本発明のまた別の態様は、ＰＹＩモチーフにおける改変を有する、ＨＩＦ−１αの全長もしくはフラグメント、ＰＹＩモチーフのアナログ、またはＰＹＩモチーフのアンタゴニストを細胞、細胞群または生物体へ投与することを備える疾患を治療する方法を提供する。
【００４７】
本発明のさらにまた別の態様は、構成的に活性なＨＩＦ−１α変異体、構成的に活性なＨＩＦ−１α変異体の機能的フラグメント、ＰＹＩモチーフのアゴニストおよびＰ５６４にまたがるタンパク質のアゴニストから構成される群から選択される物質を培地に添加することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養における状態の促進もしくは安定化を証明する。
【００４８】
本発明のまた別の態様は、例えばＰＹＩモチーフ、ＰＹＩモチーフの機能的フラグメント、ＰＹＩモチーフのアナログ、Ｐ５６４にまたがるタンパク質、Ｐ５６４にまたがるタンパク質の機能的フラグメント、またはＰ５６４にまたがるタンパク質のアナログのような物質を前記細胞、細胞群または生物体へ前記細胞、細胞群または生物体へ投与することを備える、細胞、細胞群または生物体における例えばＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ、もしくはＨＩＦ−３αのような分子の調節を示す。
【００４９】
本発明のまた別の態様は、ＰＹＩモチーフへのアンタゴニストもしくはＰ５６４にまたがるタンパク質へのアンタゴニストを細胞、細胞群または生物体へ投与することを備える、細胞、細胞群または生物体における例えばＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ、もしくはＨＩＦ−３αのような分子の調節を示す。
【００５０】
本発明のまた別の態様は、例えばＰＹＩモチーフ、ＰＹＩモチーフの機能的フラグメント、ＰＹＩモチーフのアナログ、Ｐ５６４にまたがるタンパク質、Ｐ５６４にまたがるタンパク質の機能的フラグメント、またはＰ５６４にまたがるタンパク質のアナログを細胞、細胞群または生物体へ投与することを備える、細胞、細胞群または生物体における、例えばＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ、もしくはＨＩＦ−３αのような分子の分解に影響をもたらす方法を教示する。
【００５１】
本発明のさらにまた別の方法は、Ｋ５４７、Ｐ５６４、Ｙ５６５、Ｉ５６６、Ｄ５６９、Ｄ５７０、およびＤ５７１から構成される群から選択される少なくとも１つの残基の変化を有するＨＩＦ−１α変異体を細胞、細胞群または生物体へ投与することによって、血管新生を増加もしくは調節させる、または赤血球産生を増加もしくは調節する方法である。
【００５２】
好適な実施形態の詳細な説明
実施例１  ＶＨＬ腫瘍抑制タンパク質によるＨＩＦ−１αタンパク質安定性の調節
ＨＩＦ−１αは通常、正常酸素条件下ではＨＩＦ−１αタンパク質が著しく不安定であるために正常酸素条件での細胞抽出物の免疫ブロット法による分析によって検出することができない。そこで、現在のところＶＨＬ発現が内因性のＨＩＦ−１αタンパク質レベルへ及ぼす影響を研究することは不可能である。
【００５３】
Ａ．正常酸素条件下でＶＨＬがＨＩＦ−１αタンパク質安定性へ及ぼす影響を試験するための実験条件を確立するために、６ｃｍ径プラスチック製培養皿内で０．２、０．５もしくは１．０μｇのＦＬＡＧエピトープタグされたＨＩＦ−１α発現プラスミドによりＣＯＳ７細胞を一過的にトランスフェクトした。ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２／ＨＩＦ−１α（１−８２６）発現プラスミドはカッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：５６６７−５６７２，１９９７に記載された通りに構築した。ＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣから入手）は、１０％ウシ胎児血清＋ペニシリン（５０ＩＵ／ｍＬ）＋ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）が補充されたダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の最小必須培地内で規定通りに維持した。これらのプラスミドを２容量のＦｕＧｅｎｅ６（ベーリンガー・マンハイム［Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｎ］社製）と混合し、培養培地へ添加した。１２時間に渡るインキュベーション後、細胞を１２時間に渡り正常酸素（２１％  Ｏ２）または低酸素（１．０％  Ｏ２）条件下で処理した。ＨＩＦ−１α融合タンパク質発現を検出するために、全細胞抽出物は基本的にカッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：５６６７−５６７２，１９９７に記載された通りに調製した。
【００５４】
手短には、細胞をＴＥＮバッファー（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で収集し、細胞ペレットを２０μＬの細胞溶解用バッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  ＮＰ４０、０．５％デオキシコール酸塩、０．１％  ＳＤＳ、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０）中で懸濁させ、その後１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心した。抽出物のタンパク質濃度はバイオラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社製タンパク質アッセイ試薬を使用して測定した。５０μｇの全細胞タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後にニトロセルロースフィルター上にブロットし、Ｔｒｉｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）中で５％脱脂乳と一緒に一晩ブロッキングした。一次抗体として使用した抗ＦＬＡＧ  Ｍ２（コダック［Ｋｏｄａｋ］社製）抗体は、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳ−Ｔ）および１％脱脂乳を含有するＴＢＳ中で１：５００で希釈し、サンプルと一緒に１時間インキュベートした。数回洗浄した後、二次抗体として使用した抗マウスＩｇ−ホースラディッシュペルオキシダーゼ抱合体（アマーシャム・ライフ・サイエンス［Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ］社製）を、１％脱脂乳を含有するＴＢＳ−Ｔバッファー中で１：１０００で希釈し、室温で１時間サンプルと一緒にインキュベートした。ＴＢＳ−Ｔバッファーを用いてしっかりと洗浄した後、製造業者の取扱説明書に従って強化化学発光（アマーシャム・ファルマシア・バイオテック「Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ」社製）を使用して可視化した。
【００５５】
図１は、正常酸素（２１％  Ｏ２、レーン１、３および５）または低酸素（１．０％  Ｏ２、レーン２、４および６）条件下で量を増加させながらＨＩＦ−１αタンパク質（０．２μｇ（レーン１および２）、０．５μｇ（レーン３および４）、１．０μｇ（レーン５および６））を使用した結果を示している。分子量マーカーの移動度はブロットの右側に示されている。
【００５６】
発現ベクターの濃度が最低のとき、ＨＩＦ−１αは正常酸素条件下では検出されなかったが低酸素条件下では検出された（図１、レーン１および２）。しかし、発現ベクターの濃度が高いときには、正常酸素条件でＨＩＦ−１αタンパク質発現を検出することができた（図１、レーン３）。試験した発現ベクターの最高濃度では、正常酸素および低酸素条件のどちらでも顕著なＨＩＦ−１α発現レベルが観察された（図１、レーン５および６）。従って、これらの実験は、正常酸素条件下でのＨＩＦ−１の分解機序がこれらの条件下で飽和するようになったこと、および分解機構の１もしくは複数のコンポーネントが限定的であったことを示している。
【００５７】
Ｂ．ＶＨＬ腫瘍抑制タンパク質の存在下でのＨＩＦ−１αたんぱく質の分解の作用を測定するために、２．０μｇの空ベクターもしくは野生型ＶＨＬ発現ベクター（ｐＣＭＸ／ＶＨＬ）のどちらかと共に、１．０μｇのｐＦＬＡＧ  ＣＭＶ２／ＨＩＦ−１αをＣＯＳ７細胞内へコトランスフェクトした。ｐＣＭＸ／ＶＨＬプラスミドは、ｐＣＩ／ＶＨＬ野生型（寛容にも米国ハワード・ヒューズ医学研究所［Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ］のジョアン・Ｗ・コナウェイ［Ｊｏａｎ  Ｗ．  Ｃｏｎａｗａｙ］博士から提供された）のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ（クレノウ［Ｋｌｅｎｏｗ］・ポリメラーゼを用いて両部位を末端平滑化させた後に）フラグメントをＥｃｏＲＶ−消化ｐＣＭＸベクター内へ挿入することによって構築した。プラスミド混合液を２容量のＦｕＧｅｎｅ６（ベーリンガー・マンハイム社製）と混合し、６ｃｍ径の培養皿内の培地へ添加した。１２時間のインキュベーション後、細胞を低酸素（１．０％  Ｏ２）または正常酸素（２１％  Ｏ２）条件下で１２時間に渡り処理した。全細胞抽出物を上記の通りに調製し、一次抗体としての抗ＦＬＡＧ  Ｍ２（コダック［Ｋｏｄａｋ］社製）もしくは抗ＶＨＬ（ファーミンゲン［Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ］社製）抗体を使用して上記で実施した通りに免疫ブロット法により分析した。
【００５８】
図２から明らかなように、ＦＬＡＧ／ＨＩＦ−１αおよびＶＨＬ発現プラスミドによる細胞のコトランスフェクションは正常酸素条件（上方パネル、レーン１および３を比較せよ）下ではＨＩＦ−１αタンパク質シグナルの顕著な減少を生じさせ、これはＶＨＬがＨＩＦ−１α単独の過剰発現の条件下では制限されている可能性があることを示唆している。興味深いことに、一過性に発現したＶＨＬは低酸素条件下ではＨＩＦ−１αタンパク質レベルの減少を誘導できなかった（レーン２および４を比較せよ）。対照実験では、類似レベルのＶＨＬ発現は抽出物中で正常酸素または低酸素細胞の両方から検出された（下方パネル、レーン３および４を比較せよ）。分子量マーカーの移動度はブロットの右側に示されている。
【００５９】
Ｃ．ＶＨＬがＨＩＦ−１のプロテアソーム分解を媒介するかどうかを確認するために、収集前に６時間に渡り５μＭのプロテアソームインヒビターＭＧ−１３２の不在下もしくは存在下でコトランスフェクトした細胞をインキュベートしたことを除いて上記の実験を繰り返した。細胞抽出物を調製し、実施例１Ｂと同様に分析した。
【００６０】
図３から明らかなように、正常酸素条件下でのＨＩＦ−１αタンパク質レベルのＶＨＬ誘導性減少はプロテアソームインヒビターＭＧ−１３２を用いた細胞の処理によって阻害された（レーン１−３を比較せよ）。上記の実験をまとめて考察すると、これらの結果はＶＨＬがＨＩＦ−１αのプロテアソーム分解を媒介することを示している。
【００６１】
Ｄ．ＶＨＬがＨＩＦ−１αに対して特異的であるかどうかを確かめるために、ＶＨＬの過剰発現がジオキシンレセプター（ＤＲ）タンパク質レベルに影響を及ぼすかどうかを確かめるための実験を実施した。ジオキシンレセプターは、ＨＩＦ−１と同一クラスの転写因子に属する塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス／ＰＡＳ（Ｐｅｒ／Ａｒｎｔ／Ｓｉｍ）タンパク質である。２．０μｇの空のベクターもしくは野生型ＶＨＬ発現ベクター（ｐＣＭＸ／ＶＨＬ）のどちらかと共に、１μｇのＦＬＡＧタグされたジオキシンレセプター発現ベクター（ｐＣＭＶ／ＤＲ／ＦＬＡＧ）をＣＯＳ７細胞内へコトランスフェクトした。ＦＬＡＧタグされたジオキシンレセプター発現プラスミドであるｐＣＭＶ／ＤＲ／ＦＬＡＧはジェイ・マグアイア博士（Ｊ．ＭｃＧｕｉｒｅ、カロリンスカ研究所［Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔ］、スウェーデン）から提供された。コトランスフェクション、インキュベーションおよび分析は実施例１Ｂと同様に実施した。
【００６２】
図４から明らかなように、一過性に発現したＶＨＬはＦＬＡＧタグされたジオキシンレセプターのタンパク質レベルに影響を及ぼさなかった。これは、ＶＨＬの作用がＨＩＦ−１αに対して特異的であることを示している。
【００６３】
実施例２  ＨＩＦ−１のタンパク質分解を誘導するためにはＶＨＬの２つのドメインが必要とされる
ＶＨＬが物理的にＨＩＦ−１αと相互作用するかどうかを確かめるために、免疫沈降アッセイを実施する前に、３５Ｓ標識ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳ＨＩＦ−１αを野生型もしくは変異型ＧＡＬ４−ＶＨＬ融合タンパク質または最小ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）単独と一緒にインキュベートした。図５は、ＶＨＬのＧＡＬ４融合野生型（１−２１３）および欠失もしくは単一アミノ酸点変異型（ｐｍｔ）の略図を示している。ＶＨＬの野生型もしくは変異型およびＧＡＬ４  ＤＢＤ融合ＶＨＬは、ｐＣＩ／ＶＨＬ野生型もしくは変異型／ＦＬＡＧ（寛容にも米国ハワード・ヒューズ医学研究所［Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ］のジョアン・ダブリュ・コナウェイ［Ｊｏａｎ  Ｗ．  Ｃｏｎａｗａｙ］博士から提供された）のＮｈｅＩ−ＥｃｏＲＩ（クレノウ・ポリメラーゼを用いて両部位を末端平滑化させた後に）フラグメントをＥｃｏＲＶ消化ｐＣＭＸ−ＧＡＬ４内へ挿入することによって組み立てた。
【００６４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫沈降アッセイにおいて、全長ＨＩＦ−１を含有するＧＡＬ４融合タンパク質をウサギ網状赤血球ライセート中での［３５Ｓ］メチオニン（プロメガ［Ｐｒｏｍｅｇａ］社製）の存在下で翻訳させた。［３５Ｓ］メチオニン標識翻訳産物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、取り込まれた［３５Ｓ］メチオニンに基づいてタンパク質濃度を計算するためにホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ、フジ［Ｆｕｊｉ］社製）によって分析した。免疫沈降実験は、グラディン，ケイ（Ｇｒａｄｉｎ，Ｋ）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１６：５２２１−５２３１，１９９６で記述された通りに実施した。手短には、放射標識ＨＩＦ−１αを室温で１時間、等濃度の非標識ＧＡＬ４−ＶＨＬもしくはＶＨＬ変異体と一緒にインキュベートした。細胞は５μＭ  ＭＧ−１３２を用いて６時間かけて処理し、その後ＴＥＮバッファー中で収集した。抽出物のタンパク質濃度はＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬を使用して測定した。５μＬの抗ＧＡＬ４（アップステート・バイオテック［Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ］）または免疫前ウサギ血清をタンパク質混合液に添加し、さらに１時間室温でインキュベートした。その後１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％トリトンＸ−１００を含有するＴＥＧバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ）中のプロテインＧ−セファロースの５０％スラリー３０μｌを反応混合液に添加し、回転させながら４℃で１２時間インキュベートした。急速の遠心分離後、結果として生じたセファロースペレットを補充したＴＥＧバッファーで３回洗浄し、さらに免疫共沈降タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび引き続いてのオートラジオグラフィーによって分析した。等濃度のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳３５Ｓ標識全長ＨＩＦ−１αをｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳野生型ＧＡＬ４／ＶＨＬ（図６、レーン２）またはＶＨＬ欠失変異体（図６、レーン３−５）またはＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインにまたがるＧＡＬ４−ＤＢＤ単独（図６、レーン６）とともに、インキュベートした。ローディング・コントロールのために、１０％のインプット３５Ｓ標識ＨＩＦ−１αを添加した（図６、レーン１）。抗ＧＡＬ４抗体を用いての免疫共沈降は図６の上方パネルに示されており、コントール用免疫前血清は下方パネルに示されている。
【００６５】
図６から明らかなように、３５Ｓ標識ＨＩＦ−１αはＧＡＬ４／ＶＨＬの存在下でＧＡＬ４−特異的抗体によって免疫共沈降されるが、ＨＩＦ−１αと最小ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインとの間の相互作用は観察されなかった（上方パネル、レーン２および６を比較せよ）。非特異的免疫前ウサギ抗血清はＶＨＬもしくはＧＡＬ４単独のいずれの存在下でもＨＩＦ−１αタンパク質を沈降させず（図６、下方パネル）、これは野生型ＶＨＬがＨＩＦ−１αとｉｎ  ｖｉｔｒｏで特異的に相互作用したことを指摘していた。
【００６６】
欠失変異体に関して、ＶＨＬ  Δ１１４−１５４欠失変異体はＨＩＦ−１αとの相互作用を示したが、ＶＨＬ１１４−１５４フラグメントはそのような作用を示すことができなかった（図６、レーン３および４を比較せよ）。しかし、ＶＨＬ  ９１−１５４欠失変異体はＨＩＦ−１αと相互作用することができた（図６、レーン４および５を比較せよ）。従って、ＶＨＬの残基９１と１１３との間に位置する構造はＨＩＦ−１αとの相互作用のために極めて重要であると思われた。興味深いことに、ＶＨＬのこの領域はＶＨＬ−ＢＣ複合体の結晶構造で観察される推定高分子結合内に含まれている（ステッビンス，シー・イー（Ｓｔｅｂｂｉｎｓ，Ｃ．Ｅ．）ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４：４５５−４６１，１９９９）だけではなく、腫瘍内の突然変異多発領域の１つを表している（グナッラ，ジェイ・アール（Ｇｎａｒｒａ，Ｊ．Ｒ．）ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１２４２：２０１−２１０，１９９６）。
【００６７】
腫瘍に由来する、ＶＨＬの変異がＨＩＦ−１αと相互作用するか、および／またはＨＩＦ−１α分解を誘導する能力に影響を及ぼすかどうかを確かめるために、Ｙ９８Ｎ（この領域において最も頻回な腫瘍変異）またはＣ１６２Ｆ単一アミノ酸変異（ＶＨＬの単一アミノ酸点変異型（ｐｍｔ）の略図については図５を参照）のいずれかを含有するＧＡＬ４−ＶＨＬ融合タンパク質を使用して実験を実施した。Ｃ１６２Ｆ変異はＶＨＬをエロンガンＢ−Ｃ複合体へ結合（ロナーガン，ケイ・エム（Ｌｏｎｅｒｇａｎ，Ｋ．Ｍ．）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１８：７３２−７４１，１９９８；リスツワン，ジェイ（Ｌｉｓｚｔｗａｎ，Ｊ．）ら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１３：１８２２−１８３３，１９９９）、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでユビキチンリガーゼ活性を阻害（リスツワン，ジェイ（Ｌｉｓｚｔｗａｎ，Ｊ．）ら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１３：１８２２−１８３３，１９９９）できないようにさせることが証明されてきた。これらの免疫共沈降実験では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳ＧＡＬ４融合野生型ＶＨＬ（図７、レーン３）もしくは変異ＶＨＬ  Ｙ９８Ｎ（図７、レーン４）、Ｃ１６２Ｆ（図７、レーン５）もしくはＧＡＬ４−ＤＢＤ単独（図７、レーン２）と一緒に等濃度のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳３５Ｓ標識全長ＨＩＦ−１αをインキュベートした。免疫共沈降法の結果は図７の上方パネルに示されているが、コントロール免疫前血清は下方パネルに示されている。これらの免疫共沈降実験は図６に示した実験と同様に実施して分析した。
【００６８】
図７の上方パネルから明らかなように、ＶＨＬ  Ｙ９８ＮはＨＩＦ−１と相互作用することができなかったが、他方ＶＨＬ  Ｃ１６２ＦはＨＩＦ−１αとの野生型レベルの相互作用を示した（レーン３−５を比較せよ）。これらの結果は、βドメインにおける腫瘍由来点変異はＨＩＦ−１αとＶＨＬとの相互作用を損なわれることを示している。
【００６９】
次に細胞分解アッセイを実施した。ｐＦＬＡＧ  ＣＭＶ２／ＨＩＦ−１αを図８に示したようにＧＡＬ４融合ＶＨＬ野生型もしくは変異型の不在下もしくは存在下でＣＯＳ７細胞中で一過的に共発現させた。細胞は２４時間に渡り正常酸素条件でインキュベートした。全細胞抽出物を調製し、免疫ブロット法によって分析した。ブロットは抗ＦＬＡＧ（上方パネル）または抗ＶＨＬ（下方パネル）抗体を用いて展開させた。
【００７０】
図８から明らかなように、免疫ブロット法による分析は、野生型ＶＨＬとは対照的に、ＶＨＬ  Ｙ９８ＮおよびＶＨＬ  Ｃ１６２Ｆ変異体の両方が正常酸素条件下ではＨＩＦ−１αの分解を誘導できないことを証明した（図８、レーン２−４を比較せよ）。従って、これらの結果は、ＨＩＦ−１の分解を媒介するためにＶＨＬのＨＩＦ−１α相互作用ドメインおよびエロンガンＣ結合ドメインの両方が必要であること、そしてＨＩＦ−１αの調節はおそらくＶＨＬの腫瘍抑制機能に関与している可能性があることを証明している。
【００７１】
実施例３  ＨＩＦ−１αの酸素依存性分解ドメインはＶＨＬによる調節の標的とされる
正常酸素条件でのプロテアソーム分解を媒介するため、ＶＨＬによって標的とされるＨＩＦ−１αのドメインを同定するために、野生型ＦＬＡＧ／ＨＩＦ−１αまたは一連のＦＬＡＧタグされたＨＩＦ−１α欠失変異体のいずれかをＶＨＬの存在下もしくは不在下で正常酸素条件下において、ＣＯＳ７細胞中で一過的に発現させた。図９Ａは、一連のＦＬＡＧタグされたＨＩＦ−１α欠失変異体の略図を提供する。図９Ａでは、ｂＨＬＨは塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスドメインに対する頭字語である；ＰＡＳはＰｅｒ／Ａｒｎｔ／Ｓｉｍドメインに対する頭字語である；ＯＤＤは酸素依存性分解ドメインに対する頭字語である；Ｎ−ＴＡＤはＮ−末端転写活性化ドメインに対する頭字語である；およびＣ−ＴＡＤはＣ−末端転写活性化ドメインに対する頭字語である。Ｎ−末端転写活性化ドメインは、アミノ酸５３１−５７５（ジアン，ビー・エイチ（Ｊｉａｎｇ，Ｂ．Ｈ．）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１９２５３−１９２６０，１９９７）、または５４９−５８２（プー，シー・ダブリュ（Ｐｕｇｈ，Ｃ．Ｗ．）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１１２０５−１１２１４，１９９７）の間に属することがマッピングされている。
【００７２】
ＦＬＡＧエピトープタグされた欠失変異型ＨＩＦ−１α（１−６５２）は、ｐＧＦＰ／ＨＩＦ−１（１−６５２）のＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩフラグメント（ＳｐｅＩ部位がクレノウ・ポリメラーゼでｆｉｌｌ  ｉｎされた）をＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ消化ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２（コダック［Ｋｏｄａｋ］社製）内へ挿入することによって作製した。ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２／ＨＩＦ−１（１−３３０）は、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２／ＨＩＦ−１（１−８２６）のＥｃｏＲＩフラグメントをＥｃｏＲＩ消化ｐＦＬＡＧ／ＣＭＶ２内へ挿入することによって構築した。ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２／ＨＩＦ−１（５２６−８２６）はｐＣＭＸ−ＧＡＬ４／ＨＩＦ−１（５２６−８２６）のＳａｌＩ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ（ＨｉｎｄＩＩＩ部位がクレノウ・ポリメラーゼでｆｉｌｌ  ｉｎされた）フラグメントをＳａｌＩ−ＢａｍＨ  Ｉ（ＢａｍＨ  Ｉ部位がクレノウ・ポリメラーゼでｆｉｌｌ  ｉｎされた）消化ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２内へ挿入することによって組み立てた。全細胞抽出物は、実施例１Ｂで記載された通りに免疫ブロット法による分析のために調製して使用した。
【００７３】
図９Ｂから明らかなように、ＧＡＬ４／ＨＩＦ−１α １−６５２およびＨＩＦ−１α ５２６−８２６フラグメントは正常酸素細胞においてＶＨＬ媒介性分解を示す。しかし、欠失変異型ＨＩＦ−１α １−３３０は正常酸素条件下ではＣＯＳ７細胞中でＶＨＬの過剰発現により分解されなかった。
【００７４】
ＶＨＬと相互作用するために必要なＨＩＦ−１αのドメインをマッピングするために、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインへ融合した全長ＨＩＦ−１αもしくはＨＩＦ−１α欠失変異体のセットを発現させ、３５Ｓ標識ＶＨＬとのインキュベーション後に免疫共沈降アッセイを実施した。３５Ｓ標識ＶＨＬはウサギ網状赤血球ライセート（プロメガ［Ｐｒｏｍｅｇａ］社製）中で３５Ｓメチオニンの存在下で翻訳させた。３５Ｓメチオニン標識翻訳産物はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させ、取り込まれた３５Ｓメチオニンに基づいたタンパク質濃度を計算するためにホスホイメージャー（フジ［Ｆｕｊｉ］社製）によって分析した。等濃度のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳３５Ｓ標識全長ＶＨＬを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳ＧＡＬ４−融合された、表示されたＨＩＦ−１α欠失変異体にまたがるタンパク質（図１０、レーン２−７）、ＧＡＬ４−ＤＢＤ単独（図１０、レーン８）と共に、インキュベートした。ローディング・コントロールのために、１０％のインプット３５Ｓ標識ＶＨＬが示されている（図１０、レーン１）。沈降した物質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析した。抗ＧＡＬ４抗体を用いて実施した免疫共沈降アッセイの結果は図１０の上方パネルに示されている。コントロール非特異的ウサギ抗血清を用いて実施したアッセイは、図１０の下方パネルに示されている。
【００７５】
図１０から明らかなように、ＧＡＬ４／ＨＩＦ−１α  １−３３０は３５Ｓ標識ＶＨＬとｉｎ  ｖｉｔｒｏでは物理的に相互作用することができなかった（上方パネル、レーン２）。さらに、ＨＩＦ−１αのＣ−末端転写活性化ドメインにまたがるＧＡＬ４／ＨＩＦ−１α  ７７８−８２６はＶＨＬとの相互作用を示さなかった（上方パネル、レーン７）。これとは対照的に、ＧＡＬ４／ＨＩＦ−１α  １−６５２、ＧＡＬ４／ＨＩＦ−１α  ３３１−６４１、ＧＡＬ４／ＨＩＦ−１α  ５２６−６４１およびＨＩＦ−１α  ５２６−８２６フラグメントはＶＨＬと明白に相互作用した（上方パネル、レーン３−６）。実際に、全長ＨＩＦ−１と比較したときに、後者のＨＩＦ−１αのフラグメントはＶＨＬと極めて類似の効率で相互作用した。コントロール沈降反応では、非特異的免疫前ウサギ抗血清は使用したＧＡＬ４／ＨＩＦ−１αフラグメントのいずれかもしくはＧＡＬ４単独の存在下でＶＨＬタンパク質を沈降させなかった（下方パネル）。
【００７６】
ひとまとめにして考察すると、これらの結果は残基５２６−６４１にまたがるＨＩＦ−１αの領域がＶＨＬとの物理的相互作用のために必須であることを示している。興味深いことに、この領域は以前に正常酸素細胞中のＨＩＦ−１αのプロテアソーム分解を媒介することが証明されており、さらにｈＨＩＦ−１αのアミノ酸残基４０１から６０３の間に位置すると大ざっぱに定義されているＨＩＦ−１αの酸素／酸化還元依存性分解ドメイン（ｏｘｙｇｅｎ／ｒｅｄｏｘ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）を含んでいる（フアン，エル・イー（Ｈｕａｎｇ，Ｌ．Ｅ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：７９８７−７９９２，１９９８；カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４：６５１９−６５２５，１９９９）。
【００７７】
実施例４  ＨＩＦ−１αの最小Ｎ−末端転写活性化ドメインはＶＨＬによるユビキチン化およびプロテアソーム分解の標的である
ＶＨＬ相互作用フラグメントであるＧＡＬ４／ＨＩＦ−１α  ５２６−６４１は、ＨＩＦ−１αの酸素依存性分解ドメインのコアだけではなくＮ−末端転写活性化ドメインであるＮ−ＴＡＤも含んでいる（図９Ａ参照）。ＨＩＦ−１αのＮ−ＴＡＤ内では、約１９アミノ酸残基の配列モチーフ（ヒトＨＩＦ−１αのアミノ酸５５６−５７４の間に位置する）は最も強力な種間の保存を示し、さらに関連低酸素誘導性因子ＥＰＡＳ−１／ＨＬＦにおいても保存されている。関連低酸素誘導性因子ＥＰＡＳ−１／ＨＬＦはより組織限定様式で発現する（エマ，エム（Ｅｍａ，Ｍ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：４２７３−４２７８，１９９７；ティアン，エイチ（Ｔｉａｎ，Ｈ．）ら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１１：７２−８２，１９９７）。このモチーフは低酸素応答性ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）類似タンパク質中でも高度に保存されている（テイラー，ビー・エル（Ｔａｙｌｏｒ，Ｂ．Ｌ．）ら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，６３：４７９−５０６，１９９９）。この配列モチーフは、このドメイン内のアラニン置換が低酸素依存性タンパク質安定化を損なわせ、正常酸素条件下ではタンパク質を安定化させることから、近年、ＨＩＦ−１αの酸素依存性分解ドメインの機能のために重要であると報告されている（ストリニヴァス，ヴィ（Ｓｔｒｉｎｉｖａｓ，Ｖ．）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２６０：５５７−５６１，１９９９）。図１１はヒト（ｈ）およびマウス（ｍ）ＨＩＦ−１αおよびＥＰＡＳ−１のＮ−ＴＡＤ配列の保存コアモチーフの配置を示している。
【００７８】
ＶＨＬがＨＩＦ−１αのＮ−ＴＡＤの保存コアモチーフと直接相互作用できるかどうかを確かめるために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳３５Ｓ標識ＶＨＬタンパク質およびＦＬＡＧタグされた野生型もしくは変異型Ｎ−ＴＡＤフラグメントを使用して免疫共沈降法を実施した。
【００７９】
ｐＦＬＡＧ／ＨＩＦ−１／ＮＴＡＤ（ＨＩＦ−１αのアミノ酸５３２−５８５）はＰＣＲによって作成したＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ消化ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２内へ挿入することによって構築した。次にＮ−ＴＡＤドメインを含む中心ＰＹＩトリプレットが３個のアスパラギン酸残基と置換された場所で変異型Ｎ−ＴＡＤを作成した。ＦＬＡＧ／ＨＩＦ−１／ＮＴＡＤ内でのアミノ酸置換はＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（ストラタジン［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ］社製）を使用して生じさせた。アミノ酸置換の位置は図１１に示されている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳３５Ｓ標識ＶＨＬタンパク質は等濃度のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳ＦＬＡＧタグされた野生型（図１２、レーン３）もしくは変異型（図１２、レーン４）Ｎ−ＴＡＤもしくはＦＬＡＧエピトープ単独（図１２、レーン２）と一緒にインキュベートした。抗ＦＬＡＧ抗体を使用して免疫共沈降法を実施し、さらに結果として生じた沈降物をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィーによって分析した。ローディング・コントロールには、１０％のインプット３５Ｓ標識ＶＨＬを使用した（図１２、レーン１）。
【００８０】
図１２から明らかなように、ＦＬＡＧ抗体はＨＩＦ−１αのＦＬＡＧエピトープタグされた最小野生型Ｎ−ＴＡＤの存在下で３５Ｓ標識ＶＨＬを沈降させることができた（レーン３）。これは、ＶＨＬとの相互作用を媒介するためにＨＩＦ−１αの領域が十分であることを証明している。中心ＰＹＩトリプレットのアスパラギン酸との置換がＶＨＬとＮ−ＴＡＤの間の相互作用を完全に破壊した（レーン３および４を比較せよ）。これらの実験は、ＶＨＬとの相互作用のためにはＮ−ＴＡＤの高度に保存されたコアモチーフが極めて重要であることを示している。
【００８１】
この配列部分は中心的役割を果たすために、位置５６４−５６６を変化させる何らかのアミノ酸置換はＶＨＬタンパク質との相互作用を効率的に抑止するであろう。これは、ＶＨＬ媒介性分解に対する安定化を作り出し、タンパク質の転写活性化機能を低酸素非依存性にさせる。
【００８２】
ＰＹＩトリプレット内またはその近傍の残基のより詳細な変異分析は、残基ＹＩ５６４−５６５からＧＧ、およびＤＤＤ５６９−５７１からＡＡＡへの変異はＶＨＬとＮ−ＴＡＤ間の相互作用を完全に破壊するが、他方残基ＰＭ５６７−５６８の変異はＶＨＬとＮ−ＴＡＤ間の相互作用の部分的阻害が生じることが証明された（図２７）。
【００８３】
Ｙ５６５でのアミノ酸置換はＶＨＬとの相互作用を抑止することができる。Ｙ５６５をＧと置換するとＶＨＬ媒介性分解に対する安定化が生じた。しかし、Ｆに置換されたＹ５６５は同一作用を生じさせない。Ｆ５６５は分解ボックスの特性を変化させないが、しかしその代わりにＶＨＬ相互作用を維持し、正常酸素条件下では分解を媒介し、さらに低酸素依存性転写活性化を許容する。このため、Ｙ５６５での置換は残基の疎水性成熟を変化させるはずであるので、従って親水性もしくは中性アミノ酸との置換はＶＨＬ結合を損なわせるであろうが、しかしＹ５６５での疎水性アミノ酸との置換はＶＨＬ結合を損なわされない。
【００８４】
Ｉ５６６でのアミノ酸置換もまたＶＨＬとの相互作用を抑止することができる。例えば、Ｉ５６６のＧとの置換はＶＨＬ媒介性分解に対するタンパク質を安定化させる。ＹＩ５６５−５６６は置換アミノ酸と置換することができる。例えば、ＹＩ５６５−５６６はＶＨＬとの相互作用を抑止するため、ＶＨＬ媒介性分解に対してタンパク質を安定化させるため、および転写活性化の低酸素依存性を除去するためにＧＧと置換することができる。Ｙ５６５での中性もしくは親水性アミノ酸置換はこの作用を生じさせると思われるので、同様にＹＩ５６５−５６６での中性もしくは親水性置換もまたこの作用を発生させるはずである。
【００８５】
アミノ酸ＤＤＤ５６９−５７１のＡＡＡへの置換はＶＨＬとの相互作用を抑止させた。ＤＤＤ５６９−５７１での全アミノ酸置換はこの作用を有していると予想される。ＦＱＬ５７２−５７４でのＡＱＡへの置換もまたＶＨＬとの相互作用を抑止させた。この置換はＶＨＬ媒介性分解に対するタンパク質を安定化させ、タンパク質の転写活性化機能を構成的に、またはもはや非低酸素依存性にさせた。ＦＱＬ５７２−５７４に対するその他の置換もこの作用を有しているはずである。
【００８６】
ＶＨＬの不在下または濃度を増加させながらの存在下での野生型もしくは変異型Ｎ−ＴＡＤに及ぼす影響を確かめるために次の免疫ブロットアッセイを実施した。表示したとおりに、６ｃｍ径培養皿当たり１μｇのＦＬＡＧ（図１３、レーン１）またはＦＬＡＧタグされた野生型（図１３、レーン２−４）もしくは変異型（図１３、レーン５−７）Ｎ−ＴＡＤを、ＶＨＬの不在下（−）または存在下（＋、１．０μｇ；＋＋、２．０μｇ／６ｃｍ径培養皿）でＣＯＳ７細胞中で一過的に共発現させた。細胞は正常酸素条件で２４時間インキュベートした。全細胞抽出物は実施例１Ａと同様に調製し、免疫ブロット法によって分析した。ブロットは抗ＦＬＡＧ（図１３、上方パネル）または抗ＶＨＬ（図１３、下方パネル）抗体を用いて展開させた。
【００８７】
図１３から明らかなように、野生型Ｎ−ＴＡＤタンパク質はＶＨＬによって用量依存性様式で分解した（レーン２−４を比較せよ）。これとは対照的に、変異型Ｎ−ＴＡＤの安定性は同一濃度のＶＨＬによって影響を受けなかった（レーン５−７を比較せよ）。
【００８８】
ＨＩＦ−１αのＶＨＬ媒介性分解の機序を調査するために、ＦＬＡＧタグされた野生型もしくは変異型Ｎ−ＴＡＤを使用してｉｎ  ｖｉｖｏユビキチン化実験を実施した。ＦＬＡＧエピトープ単独（図１４、レーン１）、ＦＬＡＧタグされた野生型Ｎ−ＴＡＤ（図１４、レーン２および３）もしくは変異型Ｎ−ＴＡＤ（図１４、レーン４および５）およびＨＡタグされたユビキチンは６時間に渡るプロテアソームインヒビターＭＧ１３２とのインキュベーションと組み合わせた正常酸素条件下でのＶＨＬの存在下（図１４、レーン１、３、５）または不在下（図１４、レーン２、４、６）でＣＯＳ７細胞において一過的に共発現させた。全細胞抽出物の抗ＦＬＡＧ免疫沈降後、抗ＨＡ免疫ブロット法による分析によってユビキチン化−ＴＡＤ型を検出した。
【００８９】
図１４が示すように、野生型Ｎ−ＴＡＤのユビキチン化はＶＨＬの共発現によって強度に強化された（上方パネル、レーン２および３を比較せよ）。他方、変異型Ｎ−ＴＡＤはＶＨＬの存在下においてさえ極めて低レベルのユビキチン化しか示めさなかった（上方パネル、レーン５−７）。１０％のインプット全細胞抽出物は下方パネルに示されている。重要なことに、これらの結果はＶＨＬが最小Ｎ−ＴＡＤモチーフとの物理的相互作用を通してＨＩＦ−１αのユビキチン化を媒介することを明白に証明している。
【００９０】
最小Ｎ−ＴＡＤモチーフのユビキチン化を前提として、Ｎ−ＴＡＤの３種のリシンのいずれがＶＨＬによる調節に対する標的であるのかを確かめた。Ｎ−ＴＡＤのＦＬＡＧタグされた野生型もしくは単一リシン変異型（各々、Ｋ５３２Ｒ、Ｋ５３８Ｒ、およびＫ５４７Ｒ）を２９３細胞中で一過的に発現させた。細胞を正常酸素もしくは低酸素条件下で１２時間インキュベートし、全細胞抽出物を実施例１Ａに記載された通りに調製し、免疫ブロット法により分析した。全長ＨＩＦ−１αと同様に、最小野生型ＧＡＬ４／Ｎ−ＴＡＤ融合タンパク質は正常酸素条件で顕著な分解を示し、低酸素条件によって安定化された。興味深いことに、Ｋ５４７の変異は正常酸素条件でタンパク質を安定化させたが、他方他の２種のリシン変異体の発現は正常酸素条件下ではほとんど検出できなかった（図１５）。これらの結果は、リシン５４７がＨＩＦ−１αの分解にとって重要であることを示している。
【００９１】
実施例５  正常酸素および低酸素条件でのＶＨＬの細胞内局在
以前に、低酸素がＨＩＦ−１αの核移行を誘導することは証明された（カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：６５７３−６５８６，１９９８）。ＶＨＬの場合、ＶＨＬ機能のためには核−細胞質輸送が必要とされることが示唆されている（リー（Ｌｅｅ）ら，１９９９）。正常酸素対低酸素細胞中でのその機能に関連してＶＨＬの細胞内局在化を試験するために、ＶＨＬをＣＯＳ７細胞中で一過的に発現させた。カバーグラス上で増殖させたＣＯＳ７細胞をＦＬＡＧ−ＶＨＬ発現プラスミド（ｐＣＭＸ／ＶＨＬ）を用いて一過的にトランスフェクトし、２４時間インキュベートした。低酸素（１％  Ｏ２）または正常酸素（２１％  Ｏ２）条件下で６時間インキュベートした後、細胞を３０分間に渡って室温においてＰＢＳ中で４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドを用いて固定し、その後に４℃で９時間かけて０．１％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ中で抗ＶＨＬモノクローナル抗体と一緒にインキュベートした。ＰＢＳおよび０．１％トリトンＸ−１００中のビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体およびＦＩＴＣ抱合ストレプトアビジン（アマーシャム［Ａｍｅｒｓｈａｍ］社製）を使用して間接的免疫蛍光を得た。定量目的で、１５０−２００蛍光細胞を分画化を目的として分析し、カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：６５７３−６５８６，１９９８に記載されている通りに４つのカテゴリーに細分した。
【００９２】
図１６から明らかなように、正常酸素条件下では、抗ＶＨＬ抗体による免疫蛍光が、細胞の細胞質分画における局在化に対する優先度を示めすものの、細胞全体で検出された。ＶＨＬ免疫反応性の極めて類似の分布は低酸素条件で観察された。正常酸素条件でのカッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：６５７３−６５８６，１９９８に開示された方法に引き続いてＶＨＬ免疫応答性細胞内局在化の半定量的分析は、トランスフェクトされた細胞の４７％が細胞質および核（カテゴリーＮ＝Ｃ）における等しい蛍光の分布を有していることを明らかにしているが、他方トランスフェクトされた細胞の４５％では細胞質蛍光が核内で検出された蛍光より優勢であった（カテゴリーＮ＜Ｃ）。細胞質信号より優勢である核蛍光を示したのはトランスフェクトされた細胞の３％だけであり（カテゴリーＮ＞Ｃ）、トランスフェクトされた細胞は排他的な核染色を示さなかった（カテゴリーＮ）。細胞の低酸素処理はＶＨＬの細胞内分布に何の影響も有していなかった。というのは、これはこれらの条件下でトランスフェクトされた細胞の４７％、５１％および６％が各々Ｎ＝Ｃ、Ｎ＜Ｃ、およびＮ＞Ｃのカテゴリーに分類されたからである。正常酸素条件で入手された結果と一致して、排他的な核蛍光は低酸素条件でも観察されなかった。従って、低酸素誘導性核内輸送を示すＨＩＦ−１（カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：６５７３−６５８６，１９９８）とは対照的に、ＶＨＬの細胞内局在は低酸素への曝露後に変化しなかった。
【００９３】
実施例６  ＶＨＬ依存性プロテアソーム分解からのＨＩＦ−１αの保護はＨＩＦ−１αの低酸素誘導性核移行および低酸素誘導性活性化シグナルを必要とする多段階経路である
次に野生型ＨＩＦ−１αの細胞内局在をＨＩＦ−１α変異体、ＨＩＦ−１αＫ７１９ＴおよびＨＩＦ−１α  Δ１７８−３９０変異体の細胞内局在と比較した。ＨＩＦ−１αＫ７１９Ｔ変異体は低酸素条件下では核に進入できないので、従って細胞質内で構成的に局在している（カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：６５７３−６５８６，１９９８）。ＨＩＦ−１α  Δ１７８−３９０変異体はＰＡＳドメインの１部分を欠如しており、構成的な核内局在化を示している（カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：６５７３−６５８６，１９９８）。
【００９４】
野生型全長ＨＩＦ−１αへ融合した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のための発現プラスミドをＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩフラグメント（ＮｏｔＩ部位がクレノウ・ポリメラーゼをｆｉｌｌ  ｉｎされた）としてのｐＧＥＸ−４Ｔ３−ＨＩＦ−１αからのＨＩＦ−１αコード領域を切断し、インフレームのこれをＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ消化ｐＣＭＸ−ＳＡＨ−Ｙ１４５Ｆ内にライゲート（結合）することによって産生した（カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：６５７３−６５８６，１９９８）。ｐＣＭＸ−ＳＡＨ−Ｙ１４５Ｆ発現ベクターは、タンパク質へ波長シフトおよび温度抵抗性を授けるＳ６５Ａ変異並びにＧＦＰの細胞内安定性を増加させるＹ１４５Ｆ置換を含む、ＣＭＶ最初期プロモーターの制御下で、ＧＦＰの改変された高度の発色団形態をコードする。ＧＦＰ−ＨＩＦ−１α（Ｋ７１９Ｔ）は、オースベル，エフ・エム（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊ．  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４に記載された通りにオーバーラップＰＣＲによるＣ末端核内局在化シグナルの部位特異的突然変異誘発によって構築した。所望の変異体（コドン７１９  ＡＧＧからＡＣＡ）をＰＣＲ産物内へ導入し、その後ＥｃｏＲＩ−ＰｓｔＩ細断片としてｐＧＦＰ−ＨＩＦ−１α（５２６−８２６）内へ挿入した。Ｋ７１９Ｔ変異を有している全長ＨＩＦ−１αのＧＦＰ融合物はその後ＨＩＦ−１αのＮ−末端ＢａｍＨＩ−ＳｐｅＩフラグメントをｐＧＦＰ−ＨＩＦ−１α（５２６−８２６  Ｋ７１９Ｔ）内へ挿入することによって組み立てた（カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：６５７３−６５８６，１９９８）。プラスミドはＣＯＳ７細胞中で一過的に発現させた。カバーガラス上で増殖させたＣＯＳ７細胞は各ＧＦＰ融合発現プラスミドにより一過的にトランスフェクトし、２４時間に渡ってインキュベートした。２４時間に渡る発現後、トランスフェクトした細胞をその後正常酸素（２１％  Ｏ２）または低酸素（１％  Ｏ２）状態のどちらかでさらに６時間インキュベートして観察した。蛍光活性の細胞内分布を調査し、ＦＩＴＣ−フィルターセットを備えたツァイス（Ｚｅｉｓｓ）社製アキシオバート（Ａｘｉｏｖｅｒｔ）１３５顕微鏡、およびギキセノン（Ｇｉｘｅｎｏｎ）バーナー（カール・ツァイス・イエナ［Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｊｅｎａ］社製、イエナ、ドイツ）からの照明によるエピフロオレセンス（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を使用して写真を撮影した。
【００９５】
予想された通り、ＨＩＦ−１α  Δ１７８−３９０は正常酸素および低酸素常態下の両方で構成的核局在化を示す；他方、ＨＩＦ−１α  Ｋ７１９Ｔは低酸素条件下では核内に進入することができず、従って細胞質内に構成的に局在している（図１７）。
【００９６】
図１８では、野生型ＨＩＦ−１α全長タンパク質の安定性にＶＨＬが及ぼす作用をＨＩＦ−１α  Ｋ７１９Ｔ変異体の安定性と比較した。ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２／ＨＩＦ−１α  Ｋ７１９ＴはｐＧＦＰ／ＨＩＦ−１α  Ｋ７１９ＴのＢａｍＨＩ−ＮｈｅＩ（ＮｈｅＩ部位がクレノウ・ポリメラーゼをｆｉｌｌ  ｉｎされた）フラグメントをＢａｍＨＩ−ＳｍａＩ消化ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２内へ挿入することによって作製した。２４時間の発現後、トランスフェクトした細胞をその後正常酸素（２１％  Ｏ２、図１８、レーン１、２）または低酸素（１％  Ｏ２、図１８、レーン３、４）条件下のどちらかでさらに１２時間インキュベートして観察した。全細胞抽出物は、実施例１Ａで記載された通りに調製し、実施例１Ｂで記載された通りに免疫ブロット法による分析によって分析した。
【００９７】
正常酸素条件で、野生型ＨＩＦ−１αおよびＨＩＦ−１α  Ｋ７１９Ｔは過剰発現ＶＨＬの存在下で分解した（図１８、レーン２）。興味深いことに、野生型ＨＩＦ−１αは低酸素条件でＶＨＬへの顕著な（全面的ではないが）抵抗性を示したが、ＨＩＦ−１α  Ｋ７１９Ｔ変異体は低酸素細胞中でのＶＨＬへの曝露後に強力に分解した（図１８、レーン４）。これらの結果は、ＨＩＦ−１αの低酸素誘導性核移行がＶＨＬ媒介性プロテアソーム分解からのＨＩＦ−１αを保護することを示している。
【００９８】
核局在化がＶＨＬ媒介性プロテアソーム分解からＨＩＦ−１αを保護するために十分であるかどうかを試験するために、ＶＨＬがＨＩＦ−１α  Δ１７８−３９０変異体の安定性に及ぼす作用を試験した。ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２／ＨＩＦ−１α（Δ１７８−３９０）は、ｐＣＭＸ−ＧＡＬ４／ＨＩＦ−１α（Δ１７８−３９０）のＳａｌＩフラグメントをＳａｌＩ消化ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ２内へ挿入することによって構築した。２４時間の発現後、トランスフェクトした細胞をその後、正常酸素（２１％  Ｏ２、図１８、レーン１、２）または低酸素（１％  Ｏ２、図１８、レーン３、４）条件下のどちらかでさらに１２時間インキュベートして観察した。全細胞抽出物は、実施例１Ａで記載された通りに調製し、実施例１Ｂで記載された通りに免疫ブロット法による分析によって分析した。
【００９９】
図１８から明らかなように、ＨＩＦ−１α  Δ１７８−３９０変異体をＶＨＬへの曝露後に正常酸素条件で分解した（レーン１および２を比較せよ）。従って、核内局在化それ自体ではＶＨＬによる分解に対するＨＩＦ−１αの保護を説明することができない。しかし、この変異体は低酸素細胞中のＶＨＬ媒介性分解に対する顕著な抵抗性を示した（レーン２および４を比較せよ）。これらの結果は、核移行に加えて、ＶＨＬ媒介性タンパク質分解に対するＨＩＦ−１αの保護のためには別個の核内現象もしくはシグナルが必要であることを示している。酸素依存性分解、ＶＨＬとの物理的相互作用および低酸素誘導性転写活性化を媒介する構造間でのＨＩＦ−１αのＮ−ＴＡＤの著しいオーバーラップを前提とすると、この推定細胞内安定化シグナルがタンパク質の転写活性化機能に連結している可能性がある。
【０１００】
実施例７  ＶＨＬは低酸素細胞中のＨＩＦ−１αから遊離されない
ＶＨＬ媒介性分解からＨＩＦ−１αを保護するためにはＨＩＦ−１αの核移行および低酸素誘導性活性化シグナルの両方が不可欠であることを考えて、次にＶＨＬが低酸素条件でＨＩＦ−１αから遊離するかどうかという機構的に重要な疑問を試験した。ＶＨＬが低酸素条件でＨＩＦ−１αから遊離するかどうかを試験するために、ＧＡＬ４  ＤＢＤ（４μｇ）（図１９、レーン１）もしくはＧＡＬ４／ＨＩＦ−１α（４μｇ）（図１９、レーン２−６）を１０ｃｍ径のプラスチック製培養皿内でＶＨＬの不在下（図１９、レーン２）または存在下（図１９、レーン３−６）でＣＯＳ７細胞中で一過的に発現させた。１２時間のインキュベーション後、細胞を正常酸素（図１９、各々レーン１−３）または低酸素（図１９、各々レーン４−６）条件下で１、３もしくは６時間処理した。細胞は５μＭ  ＭＧ−１３２プロテアソームインヒビター（カルビオケム［Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ］社製）と一緒に６時間インキュベートし、その後ＴＥＮバッファー中で細胞を収集した。細胞ペレットは、２０μＭのＮ−エチルマレイミドを添加した２００μＬの全細胞抽出物バッファー（２５ｍＭ  ヘペス［Ｈｅｐｅｓ］、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  βグリセロリン酸、２０ｍＭ  パラ−ニトロフェニル−リン酸、０．５％  トリトンＸ−１００、１００Ｍ  オルトバナジン酸ナトリウム）中に再懸濁させ、その後１４，０００ｒｐｍで３０分間遠心した。抽出物のタンパク質濃度はＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬を使用して測定した。免疫共沈降タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、その後免疫ブロット法を実施した。全細胞抽出物の抗ＧＡＬ４抗体（図１９、上方パネル）もしくはコントロール抗血清（図１９、中央パネル）媒介性免疫沈降の後に、ＶＨＬ抗体を使用した免疫ブロット法によってＶＨＬを検出した。コントロールとして１０％のインプット全細胞抽出物を使用した（図１９、下方パネル）。
【０１０１】
予想された通り、ＶＨＬは正常酸素条件でＧＡＬ４／ＨＩＦ−１と共に特異的に免疫共沈降した（図１９、レーン１−３）。しかし、ＶＨＬはさらに正常酸素条件で観察されたレベルに類似するレベルで低酸素条件でも免疫共沈降した（図１９、レーン４−６）。これらの結果は、ＶＨＬ媒介性分解からのＨＩＦ−１αの保護のためにＨＩＦ−１α−ＶＨＬ複合体の解離が必要ではないこと、およびＨＩＦ−１との結び付きを残しながらＶＨＬ機能の低酸素依存性不活化のための機序が存在することを示している。
【０１０２】
次に、ＡｒｎｔがＨＩＦ−１α−ＶＨＬ複合体と関連しているかどうかを確かめた。ＧＡＬ４／ＨＩＦ−１αまたは最小ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインは正常酸素または低酸素条件でＶＨＬおよび／またはＡｒｎｔの不在下もしくは存在下でＣＯＳ７細胞中で一過的に発現した。予想通りに、ＡｒｎｔはＶＨＬの不在下の低酸素条件でＧＡＬ４／ＨＩＦ−１αと共に特異的に免疫共沈降した（図２０）。さらに、ＶＨＬの存在下では、ＡｒｎｔおよびＧＡＬ４／ＨＩＦ−１αは低酸素依存性様式でも免疫共沈降したが（図２０）、これはこれらのタンパク質が低酸素細胞中で三元複合体を形成することを証明した。
【０１０３】
実施例８  ＨＩＦ−１α  Ｎ−ＴＡＤドメインの低酸素依存性転写活性化機能の調節におけるタンパク質安定化の役割
低酸素細胞中のＨＩＦ−１αによる転写活性化は２つの別個の転写活性化ドメインＮ−ＴＡＤおよびＣ−ＴＡＤによって媒介される（アラニー，ゼット（Ａｒａｎｙ，Ｚ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３：１２９６９−１２９７３，１９９６；カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：６５７３−６５８６，１９９８；エマ，エム（Ｅｍａ，Ｍ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８：１９０５−１９１４，１９９９；キャッレロ，ピー（Ｃａｒｒｅｒｏ，Ｐ．）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２０：４０２−４１５，２０００）。ＶＨＬが最小Ｎ−ＴＡＤ構造と相互作用するという事実を前提に、正常酸素および低酸素条件で野生型もしくはＰＹＩ変異型Ｎ−ＴＡＤモチーフのどちらかをふくむＧＡＬ４融合タンパク質の安定性および転写活性化機能の両方の比較（図１１）を行った。
【０１０４】
４μｇのＦＬＡＧタグされた野生型もしくはＰＹＩ変異型Ｎ−ＴＡＤを正常酸素（図２１、レーン１、３）もしくは低酸素（図２１、レーン２、４）条件下で１２時間１０ｃｍ径プラスチック製培養皿内のＣＯＳ７細胞中で一過的に発現させた。全細胞抽出物は、実施例１Ａで記載された通りに調製し、実施例１Ｂで記載された通りに免疫ブロット法による分析によって分析した。
【０１０５】
全長ＨＩＦ−１と類似して、最小野生型ＧＡＬ４／Ｎ−ＴＡＤ融合タンパク質は正常酸素条件で顕著な分解を示し、低酸素条件（図２１、レーン１−２）下で安定化した。ＰＹＩ変異型ＧＡＬ４／Ｎ−ＴＡＤタンパク質レベルは、正常酸素細胞からの抽出物の免疫ブロット法による分析によって容易に検出可能であり、さらに低酸素への細胞の曝露後に顕著には増加しなかった（図２１、レーン３−４）。
【０１０６】
残基５４７−５７５を備える最小Ｎ−ＴＡＤフラグメントはＮ−ＴＡＤドメインと同様に挙動した：これは正常酸素条件で顕著な分解を示し、低酸素によって安定化させられた（図３０）。これとは対照的に、単一Ｐ５６４の変異はタンパク質フラグメントの正常酸素依存性分解に対する顕著な保護作用を生じさせたが、これは細胞の低酸素処理によってはそれ以上安定化させられなかった（図３１）。従って、免疫共沈降実験によって評価されたように（図１２；図２７）、これらの変異体がＶＨＬと相互作用できないことは、低酸素条件での野生型ＧＡＬ４／Ｎ−ＴＡＤによって発生したレベルに類似した構成的に安定したタンパク質発現レベルと相関していた。
【０１０７】
野生型もしくはＰＹＩ変異型ＧＡＬ４／Ｎ−ＴＡＤ（０．２μｇ／３０ｍｍ径培養皿）の転写活性をチミジンキナーゼ最小プロモーターおよびＧＡＬ４−応答性エレメントの５のタンデムコピー（ＧＡＬ４−ｌｕｃ）（０．５μｇ／３０ｍｍ径培養皿）および内部コントロールとしてのβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミド（０．５μｇ／３０ｍｍ径培養皿）の制御下でのルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いたコトランスフェクション・アッセイにおいてＣＯＳ７細胞中で分析した。６時間のトランスフェクション後、細胞をレポーター遺伝子活性の分析前の低酸素（１％  Ｏ２）もしくは正常酸素（２１％  Ｏ２）条件下で３６時間インキュベートした。レポーター遺伝子活性は、正常酸素条件下ではＧＡＬ４−ＤＮＡ結合ドメイン単独の存在下での活性に関連して発現する。数値は、３回の個別実験の平均値±ＳＤを表している。図２２および３０で観察されるように、ＧＡＬ４駆動ルシフェラーゼレポーター遺伝子を使用したレポーター遺伝子転写活性化アッセイにおいて低酸素による最小野生型ＧＡＬ４／Ｎ−ＴＡＤの機能の幾分穏当な（約３倍）の活性化が見られる。この結果は、キャッレロ，ピー（Ｃａｒｒｅｒｏ，Ｐ．）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２０：４０２−４１５，  ２０００に開示された結果を考えると予想された。
【０１０８】
全長ＨＩＦ−１αとの関連において、ＰＹＩモチーフの変異はタンパク質を正常酸素条件で安定化させ、ＶＨＬ媒介性分解に対して抵抗性にしたが（図２３）、これはこのモチーフがＨＩＦ−１αのＶＨＬ依存性分解のために極めて重要な決定要因であることを証明している。変異型タンパク質は野生型ＨＩＦ−１αと比較して構成的転写活性の上昇を示したが、それはまだ低酸素誘導性であった（図２４）。最小Ｎ−ＴＡＤドメイン内で、ＰＹＩモチーフの突然変異は正常酸素および低酸素条件で観察される両方の活性に関して転写活性化機能を減少させた（図２２）。これらの結果は、突然変異が概して転写活性化のために重要な構造を変化させ、おそらく完全活性化応答のために必要である可能性があるタンパク質接触の一部を損なわせることを示している。それでもなお、この突然変異したコンストラクトは低酸素によって誘導され、転写活性において約２倍の増加を生じさせた（図２２）。これらのデータは、ＶＨＬによる分解に抵抗性である安定化タンパク質がまだ低酸素依存性活性化反応を媒介することができること、およびタンパク質安定化自体が転写活性化のための低酸素シグナルのニーズを回避することができないことを示している。
【０１０９】
上述した広範囲のＰＹＩ−ＡＡＡ突然変異と対照的に、単一Ｐ５６４Ａ突然変異を含有するＧＡＬ４−Ｎ−ＴＡＤの転写活性化機能はタンパク質による転写活性化機能における劇的な増加を生じさせた。実際に、これは野生型コンストラクトの最大限の低酸素誘導性機能の活性と匹敵していた（図３０）。重要なことに、Ｐ５６４Ａ変異型コンストラクトの活性は、低酸素処理によってそれ以上は強化されず、この単一点変異によって高レベルで構成的に活性にされることを証明している（図３０）。同様の方法で、突然変異ＹＩ５６５−５６６、およびＤＤＤ−ＡＡＡは、２９３細胞中で上述のように実施したレポーター遺伝子アッセイにおいて評価されたように、ＶＨＬ−Ｎ−ＴＡＤ相互作用を抑止するだけではなく（図２７）、ＧＡＬ４−Ｎ−ＴＡＤ融合タンパク質コンストラクトの突然変異体を構成的に活性にさせた（図２８）。
【０１１０】
Ｐ５６４Ａ変異型コンストラクトの活性に加えて、Ｐ５６４でのいずれかのアミノ酸のさらなる置換は同様に活性な変異型コンストラクトを産生するであろう。例えば、Ｐ５６４ＨもまたＶＨＬとの相互作用を抑止させ、ＶＨＬ媒介性分解に対してタンパク質を安定化させ、さらにタンパク質の転写活性化機能を構成的にさせる。つまり、タンパク質はもはや低酸素依存性ではなくなる。
【０１１１】
分解ボックスの機能を破壊する特異的突然変異は、本発明の適用において有用である。さらに、ＨＩＦ−１α以外のタンパク質への正常の分解ボックスの融合によるタンパク質分解を管理することはすべての細胞タンパク質に関して有用性を有している。
【０１１２】
実施例９  正常酸素および低酸素条件でのＨＩＦ−１α機能の条件付き調節のモデル
ここに提示したデータは、正常酸素条件でＶＨＬがＶＨＬ−ＢＣ−Ｃｕｌ−２複合体へＨＩＦ−１αを補充することによってＨＩＦ−１αをユビキチン−プロテアソーム分解に対する標的とすることによって機能することを示している。２種のタンパク質間の相互作用はＶＨＬのβドメインおよびＨＩＦ−１の最小Ｎ−ＴＡＤを介して生じる。低酸素条件は、パートナーＤＮＡ結合因子、Ａｒｎｔ、転写コアクチベーターおよび／またはレドックス制御因子Ｒｅｆ−１の補充と関連している可能性がある核移行および調節シグナルの誘導によってＨＩＦ−１αの分解の阻害をもたらす。
【０１１３】
図２５におけるＶＨＬ中の斜線付領域は、ＶＨＬのβドメインもしくはまたはエロンガンＣ結合ドメイン（ＣＢＤ）各々に一致する腫瘍における突然変異多発領域を示している。これら２つのドメインいずれかにおける突然変異はＨＩＦ−１αタンパク質を安定化させる。
【０１１４】
点変異誘発実験は、ＨＩＦ−１αのＮ−ＴＡＤの高度に保存された中心ＰＹＩモチーフ、特に、Ｐ５６４およびＹ５６５残基がＶＨＬとの相互作用およびＶＨＬ誘導性プロテアソーム分解のために極めて重要であることを指示した。実際に、最小ＨＩＦ−１α  Ｎ−ＴＡＤ構造がＶＨＬによって特異的にユビキチン化されたこと、およびこのプロセスが保存された中心ＰＹＩモチーフを必要とすることを証明した。ＨＩＦ−１αと関連する組織限定性低酸素誘導性因子ＥＰＡＳ−１／ＨＬＦとの間でのこのコアモチーフの保存を前提とすると（エマ，エム（Ｅｍａ，Ｍ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：４２７３−４２７８，１９９７；ティアン，エイチ（Ｔｉａｎ，Ｈ．）ら，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖ．，１１：７２−８２，１９９７）、両方の因子が類似の様式でＶＨＬ媒介性ユビキチン化によって調節されると思われる。これを支持して、ＥＰＡＳ−１／ＨＬＦは近年、さらにＮ−ＴＡＤとオーバーラップする酸素依存性分解ドメインを含んでおり（エマ，エム（Ｅｍａ，Ｍ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８：１９０５−１９１４，  １９９９）、さらにｉｎ  ｖｉｔｒｏでＶＨＬと相互作用すると報告されてきた（マックスウェル，ピー・エイチ（Ｍａｘｗｅｌｌ，Ｐ．Ｈ．）ら，Ｎａｔｕｒｅ，３９９：２７１−２７５，１９９９）。
【０１１５】
リシン残基Ｋ５４７である２点の突然変異もまた極めて重要な役割を果たすことが証明されてきた。このリシン残基は、ＨＩＦ−１αタンパク質安定化のために極めて重要であることが証明されている。
【０１１６】
図２５において略図で示されているＶＨＬによる調節に対するＨＩＦ−１αの低酸素誘導性保護は２つの別個の連続するステップを含んでいる：ＶＨＬ誘導性タンパク質分解に対してＨＩＦ−１αを保護するために必要とされたＨＩＦ−１αの核移行および核内現象もしくはシグナル。このモデルは、核内に進入できないＨＩＦ−１αの変異体が低酸素細胞中でさえＶＨＬ誘導性分解を示すという観察に基づいている。他方、構成的な核内局在化を示すＨＩＦ−１αの変異形は正常酸素細胞中では分解したが、ＶＨＬの存在下では低酸素誘導性安定化を示した。これらのデータは、核区分がＶＨＬ機能に対してＨＩＦ−１αを保護するためには十分ではないが、ＨＩＦ−１αが分解に対する抵抗性のためには低酸素シグナルを必要とすることを示している。酸素依存性分解、ＶＨＬとの物理的相互作用、および低酸素誘導性転写活性化を媒介する構造間のＨＩＦ−１α内での顕著なオーバーラップを前提とすると、推定核内安定化シグナルがタンパク質の転写活性化機能に連結している可能性があると考えられる。
【０１１７】
以前に、Ｎ−ＴＡＤおよびＣ−ＴＡＤ両方の低酸素誘導性機能が転写コアクチベーターＣＢＰ／ｐ３００およびＳＲＣ−１／ｐ１６０の補充に決定的に依存していることが観察されている（アラニー，ゼット（Ａｒａｎｙ，Ｚ．）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３：１２９６９−１２９７３，１９９６；カッリオ，ピー・ジェイ（Ｋａｌｌｉｏ，Ｐ．Ｊ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１７：６５７３−６５８６，１９９８；エマ，エム（Ｅｍａ，Ｍ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８：１９０５−１９１４，１９９９；キャッレロ，ピー（Ｃａｒｒｅｒｏ，Ｐ．）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２０：４０２−４１５，２０００）。この補充は、レドックス制御因子Ｒｅｆ−１によって促進されると思われる（エマ，エム（Ｅｍａ，Ｍ．）ら，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８：１９０５−１９１４，１９９９；キャッレロ，ピー（Ｃａｒｒｅｒｏ，Ｐ．）ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２０：４０２−４１５，２０００）。従って、Ｎ−ＴＡＤの機能的構造は２種の機能を有する重複構造を含んでいる。実際に、これらの機能は対立している、即ちタンパク質分解対遺伝子転写の活性化。これはＨＩＦ−１αタンパク質機能の調節における重要な「スイッチ」を作り出す。図２５に示したモデルにおいて略述したように、保護の低酸素依存性細胞内機序はＡｒｎｔとの二量化、コアクチベーターの補充、および／またはＲｅｆ−１の補充を含む可能性がある。重要なことに、今回のデータはタンパク質安定化自体はＨＩＦ−１αを転写的に活性にさせるための唯一の根拠を提供しないことを示している。Ｎ−ＴＡＤタンパク質が点変異によって構成的に安定性かつＶＨＬへ抵抗性に作製された場合でさえ、それでもその転写活性化機能に関連した低酸素誘導性を必要とした。ＨＩＦ−１αのＣ末端の共有結合改変がこの調節作用を決定する際に重要な役割を果たす可能性があることは考えられる。ステロイドレセプター系に類似して（シュー，エル（Ｘｕ，Ｌ．）ら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，９：１４０−１４７，１９９９）、これは低酸素シグナルがコアクチベーターの補充を促進してＶＨＬ機能を不活化するＨＩＦ−１αにおける高次構造の変化を決定するという魅力的なシナリオでもある。
【０１１８】
上記の説明および実施例は、単に本発明を例示するためにだけ記載されており、本発明を限定することは意図されていない。当業者であれば本発明の精神および本質を組み込んでいるここに開示した実施形態を変更することができるので、本発明は添付の請求項およびその同等物の範囲内に含まれるすべての変形を広範に含むと解釈しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
正常酸素（２１％  Ｏ２）または低酸素（１．０％  Ｏ２）条件下で量を増加させながらＨＩＦ−１αタンパク質を使用した免疫ブロット法の結果を示す図である。
【図２】
ＶＨＬ腫瘍抑制タンパク質の存在下でのＨＩＦ−１αタンパク質の免疫ブロット法の結果を示す図である。
【図３】
ＶＨＬ腫瘍抑制タンパク質およびプロテアソームインヒビターＭＧ−１３２の存在下でのＨＩＦ−１αタンパク質の免疫ブロット法の結果を示す図である。
【図４】
ＶＨＬタンパク質の存在下でのジオキシンレセプターの免疫ブロット法の結果を示す図である。
【図５】
ＶＨＬのＧＡＬ４融合野生型および欠失または単一アミノ酸点変異型の略図である。
【図６】
野生型ＶＨＬもしくはＶＨＬ欠失変異体の存在下でＨＩＦ−１αのＧＡＬ４抗体（上方パネル）またはコントール用免疫前血清（下方パネル）での免疫共沈降法の結果を示す図である。
【図７】
野生型ＶＨＬもしくはＶＨＬ単一アミノ酸点変異体の存在下でＨＩＦ−１αのＧＡＬ４抗体（上方パネル）またはコントール用免疫前血清（下方パネル）との免疫共沈降法の結果を示す図である。
【図８】
ＶＨＬの野生型または変異型へ曝露させた後のＨＩＦ−１αタンパク質レベルの免疫ブロット法による分析結果を示す図である。
【図９Ａ】
一連のＦＬＡＧタグされたＨＩＦ−１α欠失変異体の略図である。
【図９Ｂ】
一連のＦＬＡＧタグされたＨＩＦ−１α欠失変異体の略図である。
【図１０】
野生型ＨＩＦ−１αまたはＨＩＦ−１α欠失変異体の存在下でＶＨＬのＧＡＬ４抗体（上方パネル）またはコントール用免疫前血清（下方パネル）との免疫共沈降法の結果を示す図である。
【図１１】
マウス（ｍ）およびヒト（ｈ）ＥＰＡＳ−１およびＨＩＦ−１αのＮ−ＴＡＤ配列の保存コアモチーフのアラインメントを示す図である。
【図１２】
野生型（ｗｔ）または変異型（ｍｔ）Ｎ−ＴＡＤの存在下でＶＨＬのＦＬＡＧ抗体を使用した免疫共沈降法の結果を示す図である。
【図１３】
ＶＨＬへ曝露させた後の野生型（ｗｔ）または変異型（ｍｔ）Ｎ−ＴＡＤタンパク質レベルの免疫ブロット法による分析結果を示す図である。
【図１４】
ＶＨＬの存在下で野生型（ｗｔ）または変異型（ｍｔ）Ｎ−ＴＡＤタンパク質のユビキチン化についての免疫ブロット法による分析結果を示す図である。
【図１５】
ＶＨＬの存在下でＮ−ＴＡＤの野生型（ｗｔ）または単一リシン変異体のユビキチン化についての免疫ブロット法による分析結果を示す図である。
【図１６】
正常酸素および低酸素条件でのＶＨＬの細胞内局在化を示す図である。
【図１７】
正常酸素および低酸素条件でのＧＦＰ−ＨＩＦ−１αキメラタンパク質の細胞内分布を示す図である。
【図１８】
正常酸素および低酸素条件下でのＶＨＬの不在下または存在下で野生型ＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−１αＫ７１９Ｔ、またはＨＩＦ−１αΔ１７８−３９０変異体の安定性についての免疫ブロット法による分析結果を示す図である。
【図１９】
正常酸素および低酸素条件下での野生型ＨＩＦ−１αの免疫沈降法後のＶＨＬの免疫ブロット法による分析結果を示す図である。
【図２０】
ＶＨＬの存在または不在下で正常酸素および低酸素条件下での野生型ＨＩＦ−１αの免疫沈降法後のＡｒｎｔの免疫ブロット法による分析結果を示す図である。
【図２１】
正常酸素および低酸素条件下での野生型（ｗｔ）およびＰＹＩ変異型（ｍｔ）Ｎ−ＴＡＤの免疫ブロット法による分析結果を示す図である。
【図２２】
正常酸素および低酸素条件下での野生型（ｗｔ）およびＰＹＩ変異型（ｍｔ）Ｎ−ＴＡＤの転写活性の結果を示す図である。
【図２３】
ＶＨＬの不在または存在下で正常酸素および低酸素条件下での野生型（ｗｔ）およびＰＹＩ変異型（ｍｔ）Ｎ−ＴＡＤの免疫ブロット法による分析結果を示す図である。
【図２４】
野生型（ｗｔ）およびＰＹＩ変異型（ｍｔ）Ｎ−ＴＡＤの転写活性の結果を示す図である。
【図２５】
正常酸素および低酸素条件下でのＨＩＦ−１α機能の条件付き調節を略図で示したモデルの図である。
【図２６】
ＨＩＦ−１ファミリーのメンバーによって共有される保存アミノ酸配列およびＮＴＡＤ内に導入された点変異を示す図である。
【図２７】
３５Ｓ−メチオニン標識ＶＨＬおよびＦＬＡＧ−ＧＡＬ４−ＮＴＡＤ変異体の免疫沈降を示す図である。
【図２８】
正常酸素および低酸素条件下での２９３細胞中のＧＡＬ４−ＮＴＡＤ変異体のルシフェラーゼ活性を示す図である。
【図２９】
野生型（ｗｔ）およびＰ５６４（Ｐ−Ａ）変異体に対するＮＴＡＤ配列を示す図である。
【図３０】
正常酸素および低酸素条件下での最小野生型ＧＡＬ４−ＮＴＡＤ機能の相対的ルシフェラーゼ活性を示す図である。
【図３１】
野生型（ｗｔ）細胞と比較したＰ５６４変異体（Ｐ−Ａ）におけるタンパク質フラグメントの分解に対する低酸素非依存性保護作用
を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図５】
2004536552.tif 000004
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
2004536552.tif 000009
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004536552.tif 000107
【手続補正書】
【提出日】平成14年12月27日(2002.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、位置５６４−５６６での残基の１つがＡ以外である、単離ポリペプチド。
【請求項２】
残基５６４−５６６がＤＤＤによって置換された請求項１記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＰ５６４残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項４】
残基５６４がＡによって置換された請求項３記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
残基５６４がＨによって置換された請求項３記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＹＩ５６５−５６６残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項７】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＰＭ５６７−５６８残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項８】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＤＤＤ５６９−５７１残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項９】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＫ５４７残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１０】
位置５４７でアミノ酸がＲによって置換された請求項９記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＹ５６５残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１２】
位置５６５でアミノ酸がＧによって置換された請求項１１記載の単離ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＩ５６６残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１４】
位置５６６でアミノ酸がＧによって置換された請求項１３記載の単離ポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号４のアミノ酸配列およびそのフラグメントを備え、改変されたＦＱＬ５７２−５７４残基を含む、単離ポリペプチド。
【請求項１６】
位置５７２−５７４でアミノ酸がＡＱＡによって置換された請求項１５記載の単離ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１−１６いずれか１項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を備える単離核酸分子。
【請求項１８】
少なくとも１種のプロモーターと作動的に連結している請求項１７記載の核酸分子を備えるベクター。
【請求項１９】
請求項１８記載のベクターを用いてトランスフォームまたはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２０】
請求項１−１６のいずれか１項に記載の単離ポリペプチドおよび少なくとも１種の医薬用担体もしくはアジュバンドを備える医薬組成物。
【請求項２１】
該ベクターがプラスミドである請求項１８記載のベクター。
【請求項２２】
該ベクターがウイルスベクターである請求項１８記載のベクター。
【請求項２３】
該ベクターがレトロウイルスベクターである請求項１８記載のベクター。
【請求項２４】
該宿主細胞が原核細胞である請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２５】
該宿主細胞が細菌細胞である請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２６】
該宿主細胞が真核細胞である請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２７】
該宿主細胞が哺乳類細胞である請求項１９記載の宿主細胞。
【請求項２８】
タンパク質またはその機能的フラグメントを作製する、下記のステップを備える方法：
請求項１８に記載の核酸を宿主細胞または細胞抽出物内に導入するステップ；  前記宿主細胞または細胞抽出物を、前記核酸が転写物として発現し、前記転写物が前記タンパク質を備える翻訳産物として発現するような条件下でインキュベートするステップ；および
前記翻訳産物を単離するステップ。
【請求項２９】
請求項２８記載の方法によって作製される単離タンパク質またはその機能的フラグメント。
【請求項３０】
単離分解ボックスタンパク質を産生する、下記のステップを備える方法：
配列番号２の核酸ベクターを備える発現ベクターにより宿主細胞を感染する、トランスフォームする、または形質導入するステップ；
前記宿主細胞を培養するステップ；および
前記宿主細胞から単離タンパク質を除去するステップ。
【請求項３１】
請求項３０記載の方法によって作製される単離タンパク質もしくはその機能的フラグメント。
【請求項３２】
Ｎ−ＴＡＤ機能を調節する物質についてスクリーニングする、下記のステップを備える方法：
下記を備える混合物：
請求項２８記載の単離タンパク質；
標的タンパク質；および
候補物質
を前記物質の存在がなければそれによって前記単離タンパク質がレポーター遺伝子を特異的に転写活性化する、またはＶＨＬ依存性分解を媒介する、または基準親和力でＶＨＬと物理的に相互作用する条件下でインキュベートするステップ；
物質偏向親和力を確かめるために前記単離タンパク質の前記標的タンパク質に対する結合親和力を検出するステップ；
このとき、前記基準親和力と前記物質偏向親和力間の相違は、前記物質が前記標的タンパク質に対する前記単離タンパク質の機能的活性を調節することを示している。
【請求項３３】
標的タンパク質がＶＨＬまたはそのフラグメントである請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
インキュベーションが正常酸素条件で行われる請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
インキュベーションが低酸素条件で行われる請求項３２記載の方法。
【請求項３６】
ＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用調節効力についてＰＹＩモチーフまたはＰ５６４にまたがるタンパク質もしくはその機能的フラグメントの潜在的なアナログを評価する、下記のステップを備える方法：
細胞、細胞群または生物体における正常ＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用を確かめるステップ；
前記潜在的アナログを同等の試験細胞、細胞群または生物体へ投与するステップ；
前記試験細胞、細胞群または生物体におけるＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用のレベルを測定するステップ；および
ＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用の測定された試験レベルがＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用の正常レベル以上であるときに前記潜在的アナログが有効であることを確かめるステップ。
【請求項３７】
前記試験細胞、細胞群または生物体が正常酸素条件下にある請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記試験細胞、細胞群または生物体が低酸素条件下にある請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
ＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用阻害有効性についてＰＹＩモチーフまたはＰ５６４にまたがるタンパク質もしくはその機能的フラグメントのアンタゴニストを評価する、下記のステップを備える方法：
細胞、細胞群または生物体におけるＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用の正常レベルを確かめるステップ；
前記アンタゴニストを同等の試験細胞、細胞群または生物体へ投与するステップ；
前記試験細胞、細胞群または生物体におけるＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用のレベルを測定するステップ；および
ＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用の測定された試験レベルがＶＨＬ−ＨＩＦ−１α相互作用の正常レベル未満であるときに前記アンタゴニストが有効であることを確かめるステップ。
【請求項４０】
前記試験細胞、細胞群または生物体が正常酸素条件下にある請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
前記試験細胞、細胞群または生物体が低酸素条件下にある請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
細胞、細胞群および生きている生物体からなる群から選択されるバイオエンティティ（生物実体）のＨＩＦ−１αシグナル伝達経路を調節するための方法であって、ＰＹＩモチーフ、ＰＹＩモチーフの機能的フラグメント、ＰＹＩモチーフのアナログ、Ｐ５６４にまたがるタンパク質、Ｐ５６４にまたがるタンパク質の機能的フラグメント、Ｐ５６４にまたがるタンパク質のアナログからなる群から選択される物質を、前記試験細胞、細胞群または生きている生物体への投与するステップを備える方法。
【請求項４３】
細胞、細胞群および生きている生物体からなる群から選択されるバイオエンティティのＨＩＦ−１αシグナル伝達経路を調節する、ＰＹＩモチーフのアンタゴニストまたはＰ５６４にまたがるタンパク質のアンタゴニストを前記試験細胞、細胞群または生きている生物体へ投与するステップを備える方法。
【請求項４４】
全長ＨＩＦ−１αもしくはそのアナログ、ＰＹＩモチーフの少なくとも１つの突然変異もしくは改変を含有する前記全長ＨＩＦ−１αもしくはアナログを細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える、疾患を治療する方法。
【請求項４５】
前記疾患が虚血状態である請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
前記虚血性状態が脳梗塞、心筋梗塞および循環器障害からなる群から選択される請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
癌、高血圧、脱髄性疾患、びまん性増殖性糸球体腎炎、トキソプラズマ症誘発性網脈絡膜炎、ＨＩＶ誘発性Ｔａｔ血管新生、ＨＩＶ誘発性カポジ［Ｋａｐｏｓｉ］肉腫、肝炎誘発性炎症、肝炎誘発性血管新生、慢性潰瘍形成、増殖性網膜症、網膜血管芽細胞腫、新血管形成、動脈過血管新生、サルコイドーシス、水泡性皮膚疾患、血管新生を伴う脈管炎、血管新生を伴う皮膚筋炎、血管新生関節リウマチを伴う多発性筋炎、若年性変形性関節症、多発性関節炎、動脈瘤およびアテローム（粥腫）からなる群から選択される疾患を治療する、ＰＹＩモチーフまたはＰ５６４にまたがるタンパク質もしくはその機能的フラグメントのアンタゴニストを細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える方法。
【請求項４８】
ＰＹＩモチーフまたはＰ５６４にまたがるタンパク質もしくはその機能的フラグメントのアゴニストを細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える疾患を治療する方法。
【請求項４９】
前記疾患が虚血症、脳梗塞、心筋梗塞および循環器障害からなる群から選択される請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
構成的に活性なＨＩＦ−１α変異体、構成的に活性なＨＩＦ−１α変異体の機能的フラグメント、ＰＹＩモチーフのアゴニスト、およびＰ５６４にまたがるタンパク質のアゴニストからなる群から選択される物質を、培養へ添加することを備えるｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養中の状態を促進する方法。
【請求項５１】
培養物が神経幹細胞を維持もしくは増殖させるために使用される請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
ＰＹＩモチーフ、ＰＹＩモチーフの機能的フラグメント、ＰＹＩモチーフのアナログ、Ｐ５６４にまたがるタンパク質およびＰ５６４にまたがるタンパク質の機能的フラグメント、およびＰ５６４にまたがるタンパク質のアナログからなる群から選択される物質、および少なくとも１種の医薬用担体もしくはアジュバンドを備える医薬組成物。
【請求項５３】
ＰＹＩモチーフのアンタゴニストまたはＰ５６４にまたがるタンパク質のアンタゴニストおよび少なくとも１種の医薬用担体もしくはアジュバンドを備える医薬組成物。
【請求項５４】
細胞、細胞群または生物体におけるＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ、およびＨＩＦ−３αからなる群から選択される分子の機能を調節する方法であって、前記細胞、細胞群または生物体へＰＹＩモチーフ、ＰＹＩモチーフの機能的フラグメント、ＰＹＩモチーフのアナログ、Ｐ５６４にまたがるタンパク質、Ｐ５６４にまたがるタンパク質の機能的フラグメント、およびＰ５６４にまたがるタンパク質のアナログからなる群から選択される物質を前記細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える方法。
【請求項５５】
細胞、細胞群または生物体におけるＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ、およびＨＩＦ−３αからなる群から選択される１分子の機能を調節する方法であって、ＰＹＩモチーフに対するアンタゴニストまたはＰ５６４にまたがるタンパク質に対するアンタゴニストを前記細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える方法。
【請求項５６】
細胞、細胞群または生物体におけるＨＩＦ−１α、ＥＰＡＳ、およびＨＩＦ−３αからなる群から選択される分子の分解をもたらす方法であって、前記細胞、細胞群または生物体へＰＹＩモチーフ、ＰＹＩモチーフの機能的フラグメント、ＰＹＩモチーフのアナログ、Ｐ５６４にまたがるタンパク質、Ｐ５６４にまたがるタンパク質の機能的フラグメント、およびＰ５６４にまたがるタンパク質のアナログからなる群から選択される物質を前記細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える方法。
【請求項５７】
Ｋ５４７、Ｐ５６４、Ｙ５６５、Ｉ５６６、Ｄ５６９、Ｄ５７０、およびＤ５７１からなる群から選択される少なくとも１個の残基の変化を有するＨＩＦ−１α変異体を細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える血管新生を増加させる方法。
【請求項５８】
Ｋ５４７、Ｐ５６４、Ｙ５６５、Ｉ５６６、Ｄ５６９、Ｄ５７０、およびＤ５７１からなる群から選択される少なくとも１個の残基の変化を有するＨＩＦ−１α変異体を細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える血管新生を調節する方法。
【請求項５９】
Ｋ５４７、Ｐ５６４、Ｙ５６５、Ｉ５６６、Ｄ５６９、Ｄ５７０、およびＤ５７１からなる群から選択される少なくとも１個の残基の変化を有するＨＩＦ−１α変異体を細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える赤血球生成を増加させる方法。
【請求項６０】
Ｋ５４７、Ｐ５６４、Ｙ５６５、Ｉ５６６、Ｄ５６９、Ｄ５７０、およびＤ５７１からなる群から選択される少なくとも１個の残基の変化を有するＨＩＦ−１α変異体を細胞、細胞群または生物体へ投与するステップを備える赤血球生成を調節する方法。
【請求項６１】
細胞タンパク質中に配列番号５の配列を組み込むことを備えるタンパク質の酸素依存性分解を制御する方法。
【請求項６２】
前記タンパク質がＧＡＬ−４である請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
残基５３２−５８５のいずれか１つへの変化についてサンプル配列を評価することを備える、酸素非依存性分解性ＨＩＦ−１α変異体をコードするＨＩＦ−１α配列を検出する方法。
【請求項６４】
Ｋ５４７、Ｐ５６４、Ｙ５６５、Ｉ５６６、Ｐ５６７、Ｍ５６８、Ｄ５６９、Ｄ５７０、Ｄ５７１、Ｆ５７２、Ｑ５７３およびＬ５７４からなる群から選択される残基に前記変化が発生する請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記評価が、オリゴヌクレオチドプローブ、ＰＣＲに基づく診断および抗体からなる群から選択される手段によって実行される請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
タンパク質を作製する、下記のステップを備える方法：
配列番号３を備える単離核酸分子を宿主細胞もしくは細胞抽出物中に導入するステップ；
前記宿主細胞もしくは細胞抽出物を、前記核酸が転写物として発現し、前記転写物が前記タンパク質を備える翻訳産物として発現するような条件下でインキュベートするステップ；および
前記翻訳産物を単離するステップ。
【請求項６７】
請求項６６の方法によって作製された単離タンパク質。
【請求項６８】
タンパク質結合を調節する物質をスクリーニングする、下記のステップを備える方法：
下記を備える混合物：
配列番号３の核酸分子によってコードされたタンパク質；
前記タンパク質が結合する標的タンパク質；および
候補物質
を前記物質の存在がなければそれによって前記タンパク質が基準結合親和力で前記標的タンパク質と相互作用する条件下でインキュベートするステップ；
物質偏向親和力を確かめるために前記薬剤の存在下で前記タンパク質の前記標的タンパク質に対する結合親和力を検出するステップ；
このとき、前記基準親和力と前記物質偏向親和力間の相違は、前記物質が前記標的タンパク質に対する前記タンパク質の結合を調節することを示している。
【請求項６９】
標的タンパク質がＶＨＬである請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
インキュベーションが正常酸素条件で行われる請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
インキュベーションが低酸素条件で行われる請求項６８記載の方法。
【国際調査報告】
2004536552.tif 000108
2004536552.tif 000109
2004536552.tif 000110
2004536552.tif 000111
2004536552.tif 000112
2004536552.tif 000113
2004536552.tif 000114