(57)【要約】本発明は、レトロウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のプライマーを用いてレトロウイルスの濃度を測定する方法を提供する。本発明の方法は、標的細胞のゲノム内に導入されたレトロウイルスＤＮＡまたはウイルスを含む溶液中のレトロウイルスゲノムＲＮＡを迅速に定量できるので、遺伝子治療用レトロウイルスベクターの濃度測定、遺伝子治療を受けた患者の血清内自己複製可能なレトロウイルス（ＲＣＲ）の存在有無の検出、または野生型レトロウイルスによる感染を診断するのに非常に有用である。
2004520075.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応のプライマーとして用いる、レトロウイルスのゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを測定する定量方法。
【請求項２】
前記レトロウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドが、レトロウイルスゲノムの末端反復配列（ＬＴＲ）の一部領域を特異的に認識し、配列番号６および配列番号１１の塩基配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記レトロウイルス特異的なオリゴヌクレオチドが、マウス白血病レトロウイルス（ＭＬＶ）ゲノムのパッケージングシグナルの一部領域を特異的に認識し、配列番号１６および配列番号１７の塩基配列を有する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記ＰＣＲが、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＱＣ−ＰＣＲ（定量的競合的ＰＣＲ）および実時間定量ＰＣＲからなる群から選ばれる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
１）レトロウイルスを標的細胞に感染させる工程；
２）ウイルス感染した前記標的細胞からゲノムＤＮＡを精製する工程；
３）前記精製されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列番号６および配列番号１１のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて実時間定量ＰＣＲを行う工程；および
４）単位標的細胞ゲノムＤＮＡ当りのウイルスゲノムＤＮＡの量を測定してレトロウイルスの濃度を決定する工程
を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
１）ウイルス培養溶液またはウイルス含有溶液からウイルスのゲノムＲＮＡを精製する工程；
２）逆転写酵素反応を用いて前記ゲノムＲＮＡからＤＮＡを合成する工程；
３）前記合成されたＤＮＡを鋳型とし、配列番号１６および配列番号１７のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて実時間定量ＰＣＲを行う工程；および
４）増幅されたＰＣＲ産物を定量する、試料溶液中のウイルスゲノムＲＮＡの相対的な量を決定する工程
を含む、請求項４記載の方法。
【請求項７】
前記工程３）において、５’末端にはレポーター染料（Ｒ）が、３’末端には吸光染料（Ｑ）が二重に標識されているプローブをさらに用いる、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
前記レポーター染料が、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）および２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−６−カルボキシローダミン（ＪＯＥ）およびＶＩＣＴＭからなる群から選ばれ、吸光染料が６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）および（４−ジメチルアミン）アゾベンゼンスルホン酸（ＤＡＢＳＹＬ）からなる群から選ばれる、請求項７記載の方法。
【請求項９】
レトロウイルスのゲノムに保存的なＬＴＲの一部領域を特異的に認識する配列番号６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
レトロウイルスのゲノムに保存的なＬＴＲの一部領域を特異的に認識する配列番号１１の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
マウス白血病レトロウイルスのゲノムに保存的なパッケージングシグナルの一部領域を特異的に認識する配列番号１６の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
マウス白血病レトロウイルスのゲノムに保存的なパッケージングシグナルの一部領域を特異的に認識する配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、レトロウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）のプライマーとして用いてレトロウイルスの濃度を測定する方法に関する。
【０００２】
背景技術
レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）は、種々の遺伝子治療用ベクターの中で最も多く使用されている遺伝子伝達体であって、世界的に許可を受けた臨床試験の約４０％においてレトロウイルスベクターが使用されている（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：７９７−８０４， ２０００）。遺伝子治療のためには、一定水準（１０５〜１０６／ｍｌ）以上のウイルス濃度が要求されるため、レトロウイルスベクターを遺伝子治療に使用するに当たって最も重要な要素の一つは、レトロウイルスの濃度（ｔｉｔｅｒ）を測定することである。もし、ウイルスの濃度が一定の水準に至らないと、遺伝子伝達効率があまりにも低いため適切な治療効果が期待できない。したがって、遺伝子治療用レトロウイルスを生産する細胞株を評価するか、または互いに異なる種類のレトロウイルスベクターを比較する場合、ウイルスの濃度測定は必須である。
【０００３】
また、レトロウイルスの濃度を測定する方法は、遺伝子治療用レトロウイルス中に汚染物質として存在する可能性のある自己複製可能なレトロウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ：ＲＣＲ）の検出において非常に有効に使用できる。ＲＣＲで汚染されている場合はパッケージング細胞株（ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）からはもちろん標的細胞からもウイルスが生産され得、したがって、ＲＣＲが存在するか否かを調査するためにレトロウイルスの濃度を定量的に測定することは非常に重要である。
【０００４】
種々の方法がレトロウイルスの濃度を測定するために開発されており、これらの方法は以下の三つに分類され得る。
【０００５】
第１の方法は、逆転写酵素活性度、ドットブロットハイブリダイゼーション（ｄｏｔ ｂｌｏｔ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応または半定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）方法を用いてウイルスのゲノムＲＮＡ量を決定することにより、細胞培養上澄液中のウイルスの濃度を測定する方法である。しかし、前記方法は、標的細胞に治療遺伝子を伝達できるレトロウイルスの数の測定ではなく、欠損ウイルス（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｖｉｒｕｓ）を含む総ウイルスの数の測定なので、精密性および正確性が低いという問題点がある。
【０００６】
第２の方法は、レトロウイルスによって標的細胞に導入された遺伝子の発現レベルを測定して間接的にウイルスの濃度を測定する方法である。前記方法は、遺伝子が導入された細胞とそうでない細胞を区別できる種々のマーカー遺伝子を用いる。前記方法は、特定薬物を含む培養液で標的細胞を選択的に培養してコロニーの数を数えるか、標的細胞を染色して感染細胞の数を決定することにより、ウイルスの濃度を測定する。前記方法に使用され得るマーカー遺伝子としては、ネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏｍｙｃｉｎ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；Ｎｅｏ）、ハイグロマイシンβ耐性遺伝子（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；Ｈｙｇｒｏ）、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ；ＬａｃＺ）、β−グルクロニダーゼ遺伝子（β−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ；ＧＵＳ）などがある。しかし、このようなマーカー遺伝子の産物が動物モデルまたは臨床試験において免疫反応を起こし得る可能性が提起されるにつれ、最近はマーカー遺伝子なしに治療遺伝子のみを有するレトロウイルスベクターが主に使用されている。したがって、前記第２の方法は治療目的の遺伝子のみを有するレトロウイルスの濃度を測定するのには使用できない。
【０００７】
第３の方法は、標的細胞のゲノム内に挿入されたレトロウイルスゲノムＤＮＡの量を測定してレトロウイルスの濃度を測定する方法である。このため、一般的にサザンブロット分析法が幅広く用いられている。前記方法は、ハイブリダイズに用いるプローブを使用することにより、挿入された遺伝子にかかわらず一般的なレトロウイルスの濃度を測定するのに適用できる。しかし、サザンブロット分析法は正確な測定のための定量的な手法ではなく、長時間かかり煩わしい。
【０００８】
このような問題を解決するために、実時間定量ＰＣＲ方法（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）を前記第１および第３の方法に適用しようとする試みがいくつかあった（Ｋｌｅｉｎ， Ｄ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ４５８−４６３， ２０００； Ｓａｎｂｕｒｎ， Ｎ ａｎｄ Ｃｏｒｎｅｔｔａ， Ｋ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， １３４０−１３４５， １９９９）。このような試みは、ただマーカー遺伝子として用いられたＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）またはＮｅｏ遺伝子に対する特異的なプライマーを用いて実時間定量ＰＣＲを行うことによってレトロウイルスの濃度を測定する方法の可能性のみを模索したものである。しかし、実時間定量ＰＣＲをレトロウイルスの濃度測定に用いるためには、標的細胞として用いられたヒトゲノムとの相互作用なしにウイルスゲノムにのみ特異的なプライマーを開発することが必要であり、また、このようなプライマーのための適切なＰＣＲ反応条件の確立が必要である。
【０００９】
最近は、組換えを通じてパッケージング細胞株内における自己複製可能なレトロウイルス（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ：ＲＣＲ）の生成を抑制するために、レトロウイルスベクターは、ベクターとしての機能に必要な最小限の塩基配列以外は大部分のウイルス由来配列を除去して製作されている。したがって、このようなレトロウイルスベクターを含む種々の類型のレトロウイルスが用いられる場合はレトロウイルスに共通に存在するウイルス塩基配列に対して特異的なプライマーを開発する必要がある。そうでなければ、宿主細胞のゲノムＤＮＡあるいはＲＮＡに対する非特異的な反応によってウイルスの濃度を正確に測定することは不可能である。
【００１０】
また、最近実時間定量ＰＣＲを行う機器（ＡＢＩ７７００， ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＵＳＡ）が開発され、鋳型ＤＮＡの量を定量的に分析することが可能になった。しかし、このような機器を用いたウイルスの濃度分析にはレトロウイルスに特異的なプライマーの開発が必要である。
【００１１】
そこで、本発明者らは、前記要求を満たすために努力した結果、宿主細胞のゲノム内に挿入されているレトロウイルスゲノムＤＮＡを定量的に分析するか、あるいはレトロウイルスを含む溶液中のレトロウイルスゲノムＲＮＡを定量的に分析するのに使用できるレトロウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドを開発した。本発明のレトロウイルスに特異的なオリゴヌクレオチドはレトロウイルスの濃度を迅速かつ定量的に測定するのに有用である。
【００１２】
発明の開示
したがって、本発明の目的は、レトロウイルスのゲノムＤＮＡあるいはＲＮＡを定量的かつ迅速に測定するのにプライマーとして使用され得るレトロウイルス特異的オリゴヌクレオチドを提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、前記レトロウイルス特異的オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてレトロウイルスの濃度を迅速かつ定量的に測定できる方法を提供することである。
【００１４】
本発明の一実施態様によって、配列番号６、配列番号１１、配列番号１６および配列番号１７の塩基配列を有する、レトロウイルス特異的オリゴヌクレオチドが提供される。
【００１５】
また、本発明の他の実施態様によって、前記レトロウイルス特異的オリゴヌクレオチドを実時間定量ＰＣＲのプライマーとして用いてレトロウイルスゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの量を決定することによりレトロウイルス濃度を測定する方法が提供される。
【００１６】
本発明のレトロウイルス特異的オリゴヌクレオチドは、ヒトゲノムＤＮＡには反応せず、レトロウイルスゲノムＤＮＡまたはＲＮＡにのみ特異的に反応するため、種々の種類のレトロウイルスを検出できるプライマーとして使用できる。
【００１７】
発明を実施するための最良の形態
本発明において、レトロウイルス特異的プライマーとは、ヒトゲノムＤＮＡとは反応せず、レトロウイルスゲノムＤＮＡまたはＲＮＡにのみ特異的に反応するオリゴヌクレオチドを意味するものであって、これらはレトロウイルスを含む宿主細胞ゲノムとハイブリダイズさせる場合レトロウイルスゲノムのみを選択的に増幅させるためのＰＣＲプライマーとして効果的に使用できる。
【００１８】
本発明で提供される配列番号６のオリゴヌクレオチドは配列番号１のレトロウイルス３’ＬＴＲ付近の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｊ０２２５５； Ｓｈｉｎｎｉｃｋ， Ｔ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ２９３： ５４３−５４８， １９８１）においてＵ３領域の上流部分である８１−１００番目の塩基を特異的に認識し、配列番号１１のオリゴヌクレオチドはＲ領域とＵ５領域の境界部分である５５０−５７０番目の塩基を特異的に認識する（図１参照）。
【００１９】
また、配列番号１６および配列番号１７のオリゴヌクレオチドはすべてのマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）のＲＮＡに共通して存在し、配列番号２のＭＬＶパッケージングシグナルの塩基配列のうち１９−４３番目の塩基および７２−８９番目の塩基をそれぞれ特異的に認識する（図２参照）。
【００２０】
好ましくは、本発明のオリゴヌクレオチドを用いたレトロウイルス濃度測定方法は、これに限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）、半定量的（ｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）ＲＴ−ＰＣＲ、ＱＣ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＰＣＲ）または実時間定量ＰＣＲ（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ）などの方法を用いて行ってもよく、より好ましくは、増幅工程中に形成されたＰＣＲ産物の量を実時間で測定できる実時間定量ＰＣＲ方法である。
【００２１】
好ましい態様では、本発明のレトロウイルス濃度測定方法は本発明のオリゴヌクレオチドを実時間定量ＰＣＲのプライマーとして用いて宿主細胞のゲノム内に導入されたレトロウイルスゲノムＤＮＡを定量的に測定できる。また、本発明の方法は、ウイルスを含む溶液中に存在するレトロウイルスゲノムＲＮＡから逆転写酵素反応を通じてＤＮＡを合成した後、合成されたＤＮＡを鋳型とし、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて実時間定量ＰＣＲを通じて溶液中のレトロウイルスゲノムを定量的に分析できる。
【００２２】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いて実時間定量ＰＣＲ方法としてレトロウイルスゲノムＤＮＡを定量する方法は、
１）レトロウイルスを標的細胞に感染させる工程；
２）ウイルスが感染された標的細胞からゲノムＤＮＡを分離する工程；
３）前記分離されたゲノムＤＮＡを鋳型とし、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて実時間定量ＰＣＲを行う工程；および
４）単位標的細胞ゲノムＤＮＡ当りのウイルスゲノムＤＮＡの量を測定してレトロウイルスの濃度を決定する工程を含む。
【００２３】
また、本発明のオリゴヌクレオチドを用いて実時間定量ＰＣＲ方法でレトロウイルスゲノムＲＮＡを定量する方法は、
１）ウイルスを含む溶液からウイルスのゲノムＲＮＡを分離する工程；
２）逆転写酵素反応を通じて前記精製されたゲノムＲＮＡからＤＮＡを合成する工程；
３）前記合成されたＤＮＡを鋳型とし、本発明のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて実時間定量ＰＣＲを行う工程；および
４）増幅されたＰＣＲ産物を定量して、ＰＣＲ鋳型として使用されたウイルスを含む溶液中のウイルスゲノムＲＮＡの相対的な量を決定する工程を含む。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いてレトロウイルスの濃度を測定する方法は、標的細胞のゲノム内に導入されたレトロウイルスゲノムＤＮＡ量またはレトロウイルス培養液中のレトロウイルスゲノムＲＮＡ量を定量的かつ迅速に測定できる。したがって、本発明の測定方法は遺伝子治療用レトロウイルスベクターの濃度を測定し、遺伝子治療用レトロウイルス組成物から汚染された自己複製可能なレトロウイルス（ＲＣＲ）を検出するか、野生型レトロウイルスを検出するのに効果的に使用できる。
【００２５】
基本的に、ＲＣＲ測定のための本発明の方法はＢＡＧ移動性測定方法（ＢＡＧ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）に適用してもよい（Ｐｅａｒ， Ｗ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８３９２−８３９６， １９９３）。簡略に述べると、前記方法は試験しようとするレトロウイルスベクター溶液を野生型レトロウイルスを複製できる細胞株に感染させる工程；これを数回継代培養する工程；鋳型として細胞培養液を、プライマーとして本発明のオリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを行う工程；およびレトロウイルスゲノムＲＮＡを検出する工程を含む。前述のように、遺伝子治療に用いられるレトロウイルスベクターは大部分のウイルス遺伝子コード配列を欠損しているため、野生型レトロウイルスが複製できる細胞株で成長できない。したがって、このような工程によって検出されたレトロウイルスはＲＣＲとみなすことができない。また、本発明の方法は、遺伝子治療を受けた患者、または動物から得られた血液試料から野生型レトロウイルスを検出するのに用いられる。
【００２６】
以下、本発明のレトロウイルス特異的オリゴヌクレオチドを実時間定量ＰＣＲのプライマーとして用いてレトロウイルスの濃度を測定する方法を詳しく説明する。
【００２７】
１．実時間定量ＰＣＲ
実時間定量ＰＣＲは、増幅されたＰＣＲ産物を実時間で検出するために二重に染色標識されたプローブ（ｄｏｕｂｌｅ ｄｙｅ−ｌａｂｅｌｅｄ ｐｒｏｂｅ）を用い、ハイドら（Ｈｅｉｄ， Ｃ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， ９８６−９９４， １９９６）に記載の方法および原理に従って行うことができる。
【００２８】
前記プローブは増幅されるフラグメントに結合させた後増幅工程の伸張期（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｈａｓｅ）の間変形し、増幅されたＰＣＲ産物の量を間接的に示す検出可能な信号を形成する。この方法は、前記信号を測定することにより、ＰＣＲ産物の形成を実時間で検出できる。本発明で用いられるプローブは増幅しようとする鋳型ＤＮＡの５’および３’ＰＣＲプライマー結合部位にハイブリダイズされ得る。ハイブリダイズしたプローブは伸張期の間５’→３’ヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡ重合酵素の作用によって分解し、構造的または形態的変形を受ける。このような変形は吸光度の変化を伴い、これから検出可能な信号が形成される。
【００２９】
前記プローブは二つの標識を含むが、その一つは５’末端に標識されるレポーター染料（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｄｙｅ：Ｒ）であり、もう一つは３’末端に標識される吸光染料（ｑｕｅｎｃｈｅｒ ｄｙｅ：Ｑ）である。本発明に使用され得るレポーター染料としては、６−カルボキシフルオレセイン（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ：ＦＡＭ）、２’，４’，５’，７’−テトラクロロ−４，７−ジクロロフルオレセイン（２’，４’，５’，７’−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｏ−４−７−ｄｉｃｈｌｏｒｏ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ：ＴＥＴ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−６−カルボキシローダミン（２’，７’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−４’，５’−６−ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ、ＪＯＥ）またはＶＩＣＴＭ（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、ＵＳＡ）などが挙げられ、吸光染料としては６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ ｒｈｏｄａｍｉｎｅ：ＴＡＭＲＡ）または（４−ジメチルアミン）アゾベンゼンスルホン酸（［４−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ］ａｚｏｂｅｎｚｅｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ：ＤＡＢＳＹＬ）などが使用できる。
【００３０】
実時間定量ＰＣＲの好ましい態様として、本発明ではレポーター染料としての６−カルボキシフルオルセイン（ＦＡＭ）および吸光染料としての６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）で二重標識され、レトロウイルスの３’ＬＴＲ部分に相補的な塩基配列を有するヌクレオチド配列、ＦＡＭ−配列番号１３−ＴＡＭＲＡを有するプローブ；またはレポーター染料としてのＶＩＣＴＭおよび吸光染料としてのＴＡＭＲＡで二重標識され、レトロウイルスのパッケージングシグナルに相補的な塩基配列を有するヌクレオチド配列、ＶＩＣＴＭ−配列番号１９−ＴＡＭＲＡを有するプローブを使用する。
【００３１】
前記２群の化合物が溶液中に共存する場合、これらは互いにハイブリダイズしてヘアピンループを形成することにより、吸光染料がレポーター染料の放出スペクトル（ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａ）を吸光できるほど十分に近づくようになる。すなわち、吸光染料がレポーター染料に対する吸光体として作用する。
【００３２】
しかし、前記プローブがＰＣＲの鋳型として用いられた標的遺伝子断片とハイブリダイズすると、プローブは直線化された形態で存在する。この際、ＤＮＡ重合酵素が重合反応によって上流プライマーの伸張を行いながら、ハイブリダイズしたプローブと接触するようになると、ＤＮＡ重合酵素の５’エキソヌクレアーゼ活性によってプローブの５’末端部位に標識された吸光染料が分解してレポーター染料に対する吸光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）機能が失われることにより、蛍光の量が増加するようになる。したがって、反応液中の蛍光の強度は反応液中の標的ＰＣＲ産物の量に比例する。
【００３３】
ここで、Ｃｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値は蛍光が閾値に達するために必要な反応回数を指し、閾値は反応回数１から１５の間で観察される基底放出（ｂａｓｅｌｉｎｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ）の平均値の標準偏差に１０倍を乗じた値である。
【００３４】
既存のＰＣＲ産物を定量するための方法とは異なり、前記の原理に基づく実時間定量ＰＣＲは理論上では指数関数的（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ）に起こる反応回数領域を検出して反応回数と鋳型ＤＮＡ量の相関関係の２ΔＣｔを通じて定量的に決定できるという長所がある（Ｈｅｉｄ， Ｃ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， ９８６−９９４， １９９６）。
【００３５】
２．宿主細胞ゲノム内に挿入されたレトロウイルスの濃度を測定する方法
実時間定量ＰＣＲを用いてレトロウイルス濃度を測定するためには、ゲノム内に挿入されたレトロウイルスの１コピーを有する標的細胞株が必要である。まず、パッケージング細胞をレトロウイルスで感染させて無細胞ウイルス培養液を調製した後、前記無細胞ウイルス培養液をＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：感染効率）が０．１、好ましくは０．０５以下になるようにして宿主細胞に形質導入する。２４時間後制限稀釈法を用いてプレート上に単一細胞クローンを形成させる。レトロウイルスが感染したクローンを選別して培養し、これからゲノムＤＮＡを純粋に分離する。サザンブロット分析を行ってレトロウイルスの１コピーが標的細胞株のゲノムに挿入されたかを確認する。このように選別された細胞株を１００％感染細胞として選択し、対照群として用いる。
【００３６】
１００％感染細胞のゲノムＤＮＡと正常の宿主細胞ゲノムＤＮＡを適当な比率で混合して種々の感染比率を示すように製造した後宿主細胞の感染水準を前記対照群を用いて測定する。具体的に、レトロウイルスの１コピーが挿入された宿主細胞ゲノムＤＮＡと正常な宿主細胞ゲノムＤＮＡを各々純粋に分離した後、制限酵素処理してＤＮＡ量を定量する。前記二つのＤＮＡを種々の比率で混合して１００、５０、２５、１０、５、１、０．５および０％の感染比率を示す基準ゲノムＤＮＡを製造する。次いで、基準ゲノムＤＮＡに対して実時間定量ＰＣＲを行って種々の感染比率におけるＣｔ値を得、感染比率によるＣｔ値をプロッティングして基準曲線を作成する。
【００３７】
濃度を測定しようとする実験群細胞株のゲノムＤＮＡを前述の方法と同様に分離し、実時間定量ＰＣＲ反応を行ってＣｔ値を得る。このように得られたＣｔ値を基準曲線と比較することによって標的細胞の感染比率を決定することができる。このような結果は、レトロウイルスの遺伝子伝達効率とウイルスの濃度を計算するのに使用できる。
【００３８】
用いられたＰＣＲ反応溶液はゲノムＤＮＡ５μｌ、配列番号６および配列番号１１のヌクレオチド配列を有するプライマー対各１μｌ、および二重染色標識プローブ２μｌを含み、最終反応容量を蒸留水２５μｌを用いて調整する。ＰＣＲ反応は５０℃で２分、９５℃で１０分間反応させた後［９５℃で１５秒→６０℃で１分３０秒］の反応を４０回〜４５回繰り返すことが好ましい。
【００３９】
好ましい態様として、本発明はＭＴ５−ＩＤＵＡレトロウイルスの１コピーが感染しているヒトＨＴ１０８０細胞株を用いた。ＭＴ５−ＩＤＵＡレトロウイルスは本発明者らによって特許出願されたＭＴ５レトロウイルスベクター（韓国特許公開第１９９８−２４８４７号；ＫＣＣＭ−１０２０５）にヒトイズロニダーゼ遺伝子を挿入して製造したベクターである。感染比率が増加するにつれてＣｔ値が一定割合で減少し、感染比率とＣｔ値との間に高い相関関係（ｒ２＝０．９９８）があることを確認した。
【００４０】
３．レトロウイルスを含む溶液中のレトロウイルス濃度の測定方法
本発明の標的細胞内に導入されたレトロウイルスゲノムＤＮＡを測定する方法は実際に感染したウイルスを測定できるという長所はあるが、形質導入工程を経なければならないという煩わしさがある。ウイルス濃度を測定するこのような方法をより単純化するために溶液中の総レトロウイルスゲノムＲＮＡを測定する方法が開発された。この方法においては、配列番号１６および配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが実時間定量ＰＣＲのためのプライマーとして用いられる。
【００４１】
まず、レトロウイルスを含む溶液またはこれから分離されたレトロウイルスゲノムＲＮＡを逆転写酵素反応を行ってＤＮＡを合成した。ここで、ウイルスを含む溶液自体を用いる場合は、レトロウイルスゲノムＲＮＡが逆転写酵素反応の初期に高温変性化工程中に溶液に溶出するので、別途のＲＮＡ抽出工程を省略することができるため、実験の効率性を高め、費用を節減できる。また、レトロウイルスゲノムＲＮＡは当業界に知られた通常の方法のいずれかを用いてレトロウイルスを含む細胞培養液または他の溶液から抽出でき、これを逆転写反応に使用できる。
【００４２】
逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡは前述の方法と同様に実時間定量ＰＣＲの鋳型として用いられ、この際、ＭＬＶゲノムのパッケージングシグナル領域を特異的に認識し、プライマーとして配列番号１６および配列番号１７の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが用いられる。
【００４３】
本発明の他の実施態様では、ＭＴ５−ＩＤＵＡレトロウイルスベクターを含む溶液のウイルス濃度を本発明の方法を用いて測定した。観察されたＣｔ値は溶液中のレトロウイルスの量と優れた相関関係（ｒ２＝０．９９９３）を示し、実時間定量ＰＣＲを通じて測定されたＣｔ値からｃＤＮＡの相対的な量を測定できることが確認された。
【００４４】
以下、本発明を実施例によってさらに詳細に説明するが、下記実施例は本発明を例示するためのみであり、本発明の範囲はこれらに限定されない。
【００４５】
実施例１：レトロウイルスの１コピーが感染したヒト細胞株の製造
（１−１）ＭＴ５−ＩＤＵＡレトロウイルスベクターの製造
種々の種類のレトロウイルスをすべて検出できるプライマーを製造するためにはすべての種類のレトロウイルスに共通して存在する塩基配列のみを有するレトロウイルスベクターを使用することが好ましい。本発明者らによって開発されたＭＴ５ベクター（韓国特許公開第１９９８−２４８４７号；ＫＣＣＭ−１０２０５）は遺伝子伝達として働くのに必要な最小限の塩基配列以外のレトロウイルス由来のすべての配列を除去することによって製造した。本発明においては、ＭＴ５ベクターにヒトイズロニダーゼ遺伝子を挿入してＭＴ５−ＩＤＵＡベクターを製造した。
【００４６】
まず、ヒト包茎包皮線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｆｏｒｅｓｋｉｎ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ； ＨＦＦ）からトライゾール（Ｔｒｙｚｏｌ； Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， ＵＳＡ）方法を用いてＲＮＡを抽出し、抽出したＲＮＡから逆転写酵素重合反応にかけてｃＤＮＡを合成した。前記で合成されたｃＤＮＡをＰＣＲ鋳型とし、配列番号３および配列番号４の合成オリゴヌクレオチド（ヒトイズロニダーゼ遺伝子塩基配列［ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｍ７４７１５］の７６−９６番および２０４１−２０６１番塩基配列部分を各々認識）をプライマーとして用いたＰＣＲを通じてヒトイズロニダーゼ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントを得た。ＰＣＲ反応溶液は鋳型ＤＮＡ  １μｌ、１０ｐｍｏｌ／μｌプライマー各１μｌずつ、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  １０μｌ、拡張高性能酵素（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｅｎｚｙｍｅ； Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ＵＳＡ）３．５ユニットおよび酵素用緩衝溶液１０μｌを混合して最終容量を１００μｌに調整した。ＰＣＲ反応条件は９４℃で１分、５５℃で１分、７２℃で１分３０秒の反応で３０回繰り返した。その結果、約２，０００ｂｐサイズのＰＣＲ産物が増幅され、これをｐＧＥＭ  Ｔ  ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、ＵＳＡ）に挿入してｐＧＥＭ  Ｔ  ｅａｓｙ−ＩＤＵＡベクターを製造した。その後、前記ｐＧＥＭ  Ｔ  ｅａｓｙ−ＩＤＵＡベクターをＢａｍＨＩ制限酵素で処理して１，９８６ｂｐサイズのヒトイズロニダーゼ遺伝子切片を得、これをＭＴ５（ＫＣＣＭ−１０２０５）ベクターのＢａｍＨＩ制限酵素部位に挿入してＭＴ５−ＩＤＵＡベクターを製造した。
【００４７】
（１−２）レトロウイルスの１コピーが感染したヒト細胞株の製造
レトロウイルスの１コピーが感染した細胞株を製造するためにＭＴ５−ＩＤＵＡベクターを含むレトロウイルスを以下のようにして製造した。
まず、前記実施例（１−１）で製造されたＭＴ５−ＩＤＵＡベクターＤＮＡをマウス白血病ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ； ＭＬＶ）のｇａｇ−ｐｏｌ遺伝子を発現するｐＶＭ−ｇｐプラスミドＤＮＡ（ＴＡＫＡＲＡ ＳＨＵＺＯ， Ｊａｐａｎ）およびＶＳＶ−Ｇ（Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ−Ｇ）タンパク質を発現するｐＲＶ６７プラスミドＤＮＡ（Ｍｉｔｒｏｐｈａｎｏｕｓ、Ｋ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ６：１８０８−１８１８， １９９９）とともに２９３Ｔ細胞（Ｙｕ、Ｓ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ７： ７９７−８０４， ２０００）に形質移入し、８時間後新たな培地に移した。形質移入細胞をさらに４８時間培養し、０．４５μｍろ紙で濾過して無細胞ウイルスを得た。
【００４８】
前記で得られたＭＴ５−ＩＤＵＡ無細胞レトロウイルスをＨＴ１０８０細胞株（ＡＴＣＣ  ＃ＣＣＬ−１２１）にＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：感染効率）０．０５以下の条件で形質導入した。２４時間後、標的細胞を９６ウェルプレートにウェル当り０．３個の細胞が入るように稀釈して一つの細胞で構成されたクローンを得た後レトロウイルスが導入された単一クローンを１４日間Ｇ４１８（１μｇ／μｌ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ＵＳＡ）を処理して選択的に培養した。選別されたクローンからゲノムＤＮＡを分離した後パッケージングシグナルの塩基配列部位をプローブとして用いたサザンブロットハイブリダイズ分析を行った。その結果、レトロウイルスの１コピーが標的細胞株のゲノムに挿入されていることを確認した。
【００４９】
前記の１コピーのレトロウイルスベクターＭＴ５−ＩＤＵＡが挿入された細胞株クローンをＨＴ１０８０：ＭＴ５−ＩＤＵＡと称した。
【００５０】
実施例２：宿主細胞のゲノムに挿入されたレトロウイルスゲノムＤＮＡに特異的なプライマーの開発
ヒト細胞のゲノムＤＮＡには反応せず、かつレトロウイルスゲノムＤＮＡにのみ特異的に反応するプライマー対を開発するために、種々のオリゴヌクレオチドを製造し、前記実施例１で製造されたＨＴ１０８０：ＭＴ５−ＩＤＵＡ細胞株と野生型ＨＴ１０８０細胞株から得られたゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲ反応を行った。
【００５１】
ＨＴ１０８０細胞株から全体ゲノムＤＮＡを分離するために、ＨＴ１０８０細胞沈澱物にＴＥＳ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ；０．７％  ＳＤＳ）緩衝溶液を加えた後タンパク質分解酵素Ｋ（ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ）４００ｇ／ｍｌを５０℃で２時間処理した。その後、フェノール／クロロホルム抽出とエタノール沈澱によってＨＴ１０８０細胞株から総ゲノムＤＮＡを分離した。前記のように分離したゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ制限酵素で処理して定量した後ゲノムＤＮＡ１μｇに対してＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応溶液はゲノムＤＮＡ  １μｇ、２００ｎＭプライマー各１μｌずつ、および酵素用緩衝溶液５μｌを混合して最終容量を総５０μｌに調整した。ＰＣＲ反応条件は９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で１分３０秒の反応を３０回繰り返した。
【００５２】
前記ＰＣＲ反応条件下で本発明者によって設計された数対のオリゴヌクレオチドプライマーの反応特異性を検討した結果、配列番号６および配列番号１１のプライマー対がヒト細胞のゲノムＤＮＡには反応せず、かつレトロウイルスゲノムＤＮＡにのみ特異的な反応を示した（図１）。本発明で製作した種々のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲ反応結果を下記表１に示す。
【００５３】
【表１】
2004520075.tif 000003
（註）＋：反応が誘発された。−：反応が誘発されなかった。
【００５４】
表１に示すように、本発明の配列番号６および配列番号１１のプライマー対は宿主細胞のゲノムに導入されたレトロウイルスゲノムＤＮＡの保存的なＬＴＲ配列を特異的に認識するので、ＬＴＲ構造を有するすべてのレトロウイルスを検出するのに有用である。
【００５５】
実施例３：実時間定量ＰＣＲを用いたレトロウイルスゲノムＤＮＡの定量
前記実施例２で開発されたプライマー対を実時間定量ＰＣＲに適用して宿主細胞に挿入されたレトロウイルスゲノムＤＮＡを定量できるかどうかを検討するために以下のような実験を行った。
【００５６】
まず、前記実施例（１−２）で得られたＨＴ１０８０：ＭＴ５−ＩＤＵＡ細胞株と対照群ＨＴ１０８０細胞株から各々ゲノムＤＮＡを分離した後ＥｃｏＲＩ制限酵素で処理して定量した。その後、分離したＤＮＡを１００、５０、２５、１０、５、１、０．５、０．１、０％などの感染比率を反映する基準ゲノムＤＮＡを作るために種々の比率で混合し、実時間定量ＰＣＲ分析が前記感染比率を正確に反映するかどうかを試験した。
【００５７】
実時間定量ＰＣＲはＴａｑＭａｎＴＭ分析方法（Ｈｅｉｄ Ｃ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．， ９８６−９９４， １９９６）に従って、実時間定量ＰＣＲ機器（ＡＢＩ７７００， ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＵＳ）を用いて行った。前記実施例２の本発明のプライマー対とともに、５’末端には蛍光レポーター染料（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｄｙｅ：Ｒ）として６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）が、３’末端には吸光染料（ｑｕｅｎｃｈｅｒ ｄｙｅ：Ｑ）として６−カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）が二重に標識されており、レトロウイルスのＬＴＲ部分に相補的な塩基配列を有するＦＡＭ−配列番号１３−ＴＡＭＲＡのプローブを使用した。
【００５８】
ＰＣＲ反応溶液はゲノムＤＮＡ５μｌ、ＴａｑＭａｎＴＭ緩衝溶液２５μｌ（２×）、前記プローブ１μｌ（２μＭ）、前記プライマー各々１μｌずつ（２００ｎＭ）および蒸留水１７μｌを混合し、最終容量を総５０μｌに調整した。ＰＣＲ反応条件は、５０℃で２分、９５℃で１０分間反応させた後９５℃で１５秒、６０℃で１分３０秒間の反応の４５回の繰り返しである。同量のゲノムＤＮＡが使用されたかどうかを確認するために、対照群としてヒトβアクチン遺伝子を特異的に認識する配列番号１４および配列番号１５のプライマー対とβアクチン遺伝子に特異的なＶＩＣＴＭ−配列番号１８−ＴＡＭＲＡの塩基配列を有するプローブを用いてＰＣＲ反応を行った。
【００５９】
その結果、感染比率が０、０．１、０．５、１、５、１０、２５、５０および１００％の順に増加するにつれて蛍光が閾値に達する反応回数を示すＣｔ値が一定割合で減少した。このような結果は、感染比率とＣｔ値との間に優れた相関関係（ｒ２＝０．９９８）があることを示す（図３）。したがって、前記実施例２で開発された本発明のプライマー対は実時間−定量ＰＣＲを用いたレトロウイルスゲノムＤＮＡ検出に効果的に用い得る。
【００６０】
実施例４：実時間定量ＰＣＲを用いたレトロウイルス濃度測定方法とＭＤＲ選択マーカー遺伝子を用いたレトロウイルス濃度測定方法の比較
（４−１）ＭＴＭ−ＧＣレトロウイルスを産生するＰＧ１３細胞株の製造
前記実施例３で行った実時間定量ＰＣＲを用いたレトロウイルス濃度測定方法を既存のＭＤＲ（Ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）選別マーカー遺伝子を用いたレトロウイルス濃度測定方法と比較するために、まずＭＤＲ遺伝子を発現するレトロウイルスを生産する細胞株を以下のように製造した。
【００６１】
マルチクローニング部位の下流にＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｉｔｅ）と融合したＭＤＲ遺伝子塩基配列を含んでいるため、標的遺伝子とともにＭＤＲ遺伝子を発現できるＭＴＭベクター（韓国特許公開第１９９８−２４８４７号）のマルチクローニング部位にヒトグルコセルブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｂｒｏｓｉｄａｓｅ）遺伝子を挿入してＭＴＭ−ＧＣレトロウイルスベクターを製造した。
【００６２】
ＭＴＭ−ＧＣレトロウイルスを生産するＰＧ１３細胞株を製造するために、前記実施例（１−２）と同様の方法でＭＴＭ−ＧＣベクターＤＮＡをｐＶＭ−ｇｐプラスミドＤＮＡおよびｐＲＶ６７プラスミドＤＮＡとともに２９３Ｔ細胞に形質移入して培養した後、細胞培養液を濾過して無細胞ウイルスを得た。
【００６３】
前記で生産されたＭＴＭ−ＧＣレトロウイルスをＰＧ１３細胞株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１０６８６， ＭＤ， ＵＳＡ）に形質導入した。２４時間後、細胞を９６ウェルプレートに制限稀釈法を行って一つの細胞で構成された単一クローンを得た。これをビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ；２５ｎｇ／ｍｌ）で１４日間処理してレトロウイルスが導入された細胞株クローンのみを選別した。
【００６４】
以上のように選別培養された細胞株クローンのうちウイルス濃度が高い一つを選択し、これをＰＧ１３：ＭＴＭ−ＧＣ細胞株と称した。
【００６５】
（４−２）実時間定量ＰＣＲを用いたレトロウイルス濃度測定方法とＭＤＲ遺伝子を用いたレトロウイルス濃度測定方法の比較
前記実施例（４−１）で製造されたＰＧ１３：ＭＴＭ−ＧＣ細胞株から無細胞ウイルスを得た後これをＨＴ１０８０標的細胞に各々異なる濃度で形質導入した。２４時間後、前記形質導入された標的細胞を３つのグループ（ＧｒｏｕｐＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）に分けて培養した。レトロウイルス濃度を測定するための本発明の実時間定量ＰＣＲ方法とＭＤＲ選別マーカー遺伝子を用いた方法の効率を比較するために形質導入された標的細胞の３グループに対して以下の実験を行った。
【００６６】
グループＩは４８時間さらに培養した後、そのゲノムＤＮＡを分離し、前記実施例３と同様の方法で実時間定量ＰＣＲ方法を用いてＭＴＭ−ＧＣレトロウイルスが感染した標的細胞の感染比率を試験した。グループＩＩは２４時間さらに培養した後、ＭＤＲタンパク質に対して特異的な抗体（ＫＡＭＩＹＡ ＢＩＯＭＥＤＩＣＡＬ ＣＯＭＰＡＮＹ、ＵＳＡ）を用いたＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）分析（Ａｒａｎ， Ｊ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， １９５−２０６， １９９８）を行って何％の標的細胞がＭＤＲ遺伝子を発現するかを試験した。グループＩＩＩは標的細胞を１／１００、１／５００、１／１０００、１／５０００に稀釈し、ビンクリスチンで処理した後ＭＴＭ−ＧＣレトロウイルスに感染したコロニー数を調査した。その結果を表２に示す。
【００６７】
【表２】
2004520075.tif 000004
【００６８】
前記結果から、本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた実時間定量ＰＣＲ方法とＦＡＣＳ方法、ビンクリスチン抵抗性コロニー測定方法の間に高い相関関係があることが確認された。
【００６９】
実施例５：実時間定量ＰＣＲを用いてレトロウイルスのゲノムＲＮＡを測定する方法
前記実施例３および４で述べた本発明の方法は、標的細胞のゲノムに導入されたレトロウイルスゲノムＤＮＡを測定する。このような方法は実際に標的細胞に感染したレトロウイルスを測定できるという長所があるが、形質導入工程を要するため煩わしい。このような問題を解決するために、レトロウイルスゲノムＤＮＡでなく総レトロウイルスゲノムＲＮＡを測定する方法を開発した。前記方法は感染性のあるレトロウイルスＤＮＡでなく総レトロウイルスＲＮＡを測定するという短所があるが、レトロウイルスゲノムＤＮＡを測定する方法より簡便であるという長所を有する。
【００７０】
具体的には、鋳型として約１×１０６ウイルス／ｍｌ濃度のＭＴ５−ＩＤＵＡレトロウイルスベクターを含む溶液から１、０．１、０．０１、０．００１および０．０００１μｌを取ってワンステップ逆転写重合−ＰＣＲキット（ＴａｑＭａｎ Ｇｏｌｄ Ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ， ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＵＳＡ）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことによってｃＤＮＡを合成した。ＲＴ−ＰＣＲ反応は別途のＲＮＡ抽出工程なしにウイルス含有溶液を直接用いて行った。これは前記ＲＴ−ＰＣＲ反応の初期段階で高温変性化工程によってレトロウイルスが変性するからレトロウイルスゲノムＲＮＡが溶液中に流出するため可能である。
【００７１】
種々の濃度でレトロウイルスを含んでいる溶液中のレトロウイルスゲノム配列を増幅させるために、前記で合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＩＣＴＭ−配列番号１９−ＴＡＭＲＡの塩基配列を有するプローブと配列番号１６および配列番号１７の合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてＰＣＲを行った。逆転写反応とＰＣＲ反応が一つのチューブ内で連続的に起こる前記ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応はＡＢＩ７７００ＰＣＲ機器を用いて行われた。ＲＴ−ＰＣＲ反応溶液はレトロウイルス溶液１μｌ、ＴａｑＭａｎＴＭマスター混合（ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ）緩衝溶液１２．５μｌ（２×）、前記プローブ２μｌ（２μＭ）、前記プライマー各々２μｌずつ（１０ｐｍｏｌ／μｌ）、４０×マルチスクライブ０．５μｌおよびＲＮａｓｅ抑制剤混合物（ＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ ａｎｄ ＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｍｉｘ）、蒸留水５μｌを混合した後最終容量を総２５μｌに調整した。ＰＣＲ条件は９５℃で１５秒、６０℃で１分間の反応の４０回の繰り返しである。
【００７２】
その結果、レトロウイルスを含む溶液中の相対的なウイルス濃度が増加するにつれて蛍光が閾値に達する反応回数を示すＣｔ値が一定割合で減少し、溶液中のレトロウイルス量とＣｔ値の間に高い相関関係（ｒ２＝０．９９９３）があることが確認された（図４）。図４において、Ｘ軸のｌｏｇ［相対的なウイルス量］は１×１０６ウイルス／ｍｌ濃度のレトロウイルス含有溶液を基準とし、基準溶液の１、０．１、０．０１、０．００１および０．０００１μｌを採取した試料の蛍光を測定して得られたものであって、測定された蛍光はウイルスの相対的な量とみなされた。このように得られたＣｔ値は鋳型ｃＤＮＡの相対的な量を反映する。このような結果は本発明の配列番号１６および配列番号１７のプライマー対が実時間定量ＰＣＲを用いてレトロウイルスゲノムＲＮＡを検出するのに非常に効果的に適用できることを示す。
【００７３】
本発明を前記特定実施態様と関連して記述したが、添付した特許請求範囲によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形および変化させ得ることは勿論である。
【図面の簡単な説明】
【図１】レトロウイルス３’ＬＴＲ領域付近の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｊ０２２５５；配列番号１）と前記塩基配列に特異的な本発明のオリゴヌクレオチドの認識部位である。
【図２】マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）のゲノムに存在するパッケージングシグナルの塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋ ＃Ｊ０２２５５；４５１−６００）と前記塩基配列に特異的な本発明のオリゴヌクレオチドの認識部位である。
【図３】本発明の配列番号６および配列番号１１のオリゴヌクレオチドプライマー対を用いた実時間定量ＰＣＲによって宿主細胞内に導入されたレトロウイルスゲノムＤＮＡを定量分析した結果である。
【図４】本発明の配列番号１６および配列番号１７のオリゴヌクレオチドプライマー対を用いた実時間定量ＰＣＲによってウイルス試料溶液中に存在するレトロウイルスゲノムＲＮＡを定量分析した結果である。
【図１】
2004520075.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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