(57)【要約】本発明は、ヒト末梢血単核細胞からＩＮＦ―γを誘導する方法に関する。前記方法は、以下のステップを含む。キンマ葉の水性抽出物を調製するステップ。ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を調製するステップ。ｈＰＢＭＣをキンマ葉抽出物と１８〜４８時間インキュベーションするステップ。サイトカイン特異的ＲＴ―ＰＣＲのために、または、細胞内サイトカインタンパク質を検出するフローサイトメトリーのためにＲＮＡを抽出するステップ。ＲＮＡを用いてＲＴ―ＰＣＲを行い、ＩＦＮ―γ特異的既知プライマーを使用してＰＣＲ産物を得るステップ。ＩＦＮ―γ特異的バンドに反映される、ＩＦＮ―γの増加のステップ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト末梢血単核細胞からＩＦＮγを誘導する方法であって、下記（ａ）から（ｆ）のステップを含む方法。
（ａ）キンマ葉（ｂｅｔｅｌｌｅａｆ）を調製するステップ。
（ｂ）ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を調製するステップ。
（ｃ）ｈＰＢＭＣをキンマ葉抽出物と１８〜４８時間インキュベーションするステップ。
（ｄ）サイトカイン特異的ＲＴ―ＰＣＲのため、または、細胞内サイトカインタンパク質を検出するフローサイトメトリーのため、ＲＮＡを抽出するステップ。
（ｅ）ＲＮＡを使用してＲＴ―ＰＣＲを行い、ＩＦＮγ特異的既知プライマーを使用してＰＣＲ産物を得るステップ。
（ｆ）ＩＦＮγ特異的バンドに反映される、ＩＦＮγの増加のステップ。
【請求項２】
ヒト末梢血単核細胞からＩＦＮγを誘導する方法であって、さらに、下記（ａ）から（ｃ）の代替ステップを含む方法。
（ａ）ＩＦＮγの細胞内染色のために細胞をインキュベートするステップ。
（ｂ）フローサイトメーターで、染色した細胞を解析するステップ。
（ｃ）ＩＦＮγ陽性細胞の少なくとも７倍の増加のステップ。
【請求項３】
下記（ａ）から（ｃ）を含むキンマ葉抽出物をＴｈ１型免疫調整剤として使用する方法。
（ａ）被検者に、少なくとも、５〜１０ｍｇ／ｍｌ／ｋｇ体重のキンマ葉抽出物のジュースを投与すること。
（ｂ）抽出物を、少なくとも一日一回、少なくとも一ヶ月間投与すること。
（ｃ）前記抽出物を、経口または筋肉内経路で投与すること。
【請求項４】
Ｔｈ１型免疫調整剤として有用な医薬組成物であって、添加剤とともに、もしくは、添加剤と結合して、有効量のキンマ葉水性抽出物または凍結乾燥キンマ葉抽出物を含む組成物。
【請求項５】
前記凍結乾燥抽出物が、従来の方法で、前記水性抽出物をフリーズドライして得られる請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記添加剤が、キンマ葉抽出物の活性を妨げないように選択される請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記添加剤が、例えば、タンパク質、炭水化物、糖、タルク、ステアリン酸ナトリウム、セルロース、炭酸カルシウム、デンプン由来ゼラチンペースト等の栄養素、および／または、薬学上許容される担体、賦形剤、希釈剤もしくは溶剤から選択される請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記水溶性抽出物、凍結乾燥産物または前記組成物が、経口または筋肉内注射で投与される請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
経口経路が、カプセル、シロップ、濃縮物、パウダーまたは顆粒の剤形をとる請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
キンマ葉抽出物の前記添加剤に対する割合が、１０―１：１―１０の範囲である請求項４に記載の組成物。
【請求項１１】
キンマ葉抽出物、凍結乾燥抽出物、または前記キンマ葉抽出物を含む組成物が、５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルで、少なくとも一日一回、一ヶ月間投与される請求項４に記載の組成物。
【請求項１２】
前記凍結乾燥キンマ葉抽出物が、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特性を有する請求項４に記載の組成物。
（ｉ）乾燥試料が、黒ずんだ色の物質であり、水およびジメチルスルフォキシドに可溶である。
（ｉｉ）前記活性物質の薄層クロマトグラフィーが、ｎ―ブタノール、酢酸、水が、それぞれ、９：５：７の割合である溶媒系において、Ｒｆが、０．７５、０．６４、０．５０、０．４０、および０．３３である５つのスポットを示す。
（ｉｉｉ）ＩｎｔｅｒｓｉｌＯＤＳ―３（４．６ｘ２５０ｍｍ）分析カラムを使用したＨＰＬＣで、前記活性物質を解析すると、メタノールと水の割合が、４：１である溶媒系、流速１．０ｍｌ／分、検出が２１７ｎｍという条件下において、リテンション時間が、２．６９、４．２７、５．９５、６．９７、７．４９、９．３９、１１．２０、１２．４０、１５．５３、１８．９０、および２１．４９分である１１のピークが観測される。
【請求項１３】
キンマ葉抽出物もしくはその凍結乾燥抽出物、または有効量のキンマ葉抽出物を含む組成物の、ヒト末梢血単核細胞からＩＦＮγを誘導するための、または、Ｔｈ１型免疫調整剤としての使用。
【請求項１４】
前記組成物が、薬学上許容される添加剤と結合した、または組み合さったキンマ葉抽出物を含む請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記添加剤が、凍結乾燥キンマ葉抽出物の活性を妨げないように選択される請求項１３に記載の使用。
【請求項１６】
前記添加剤が、例えば、タンパク質、炭水化物、糖、タルク、ステアリン酸ナトリウム、セルロース、炭酸カルシウム、デンプン由来ゼラチンペースト等の栄養素、および／または、薬学上許容される担体、賦形剤、希釈剤もしくは溶剤から選択される請求項１３に記載の使用。
【請求項１７】
前記水溶性抽出物、凍結乾燥産物または前記組成物が、経口または筋肉内注射で投与される請求項１３に記載の使用。
【請求項１８】
経口経路が、カプセル、シロップ、濃縮物、パウダーまたは顆粒の剤形をとる請求項１３に記載の使用。
【請求項１９】
キンマ葉抽出物の前記添加剤に対する割合が、１０―１：１―１０の範囲である請求項１３に記載の使用。
【請求項２０】
前記キンマ葉抽出物、凍結乾燥抽出物、または前記キンマ葉抽出物を含む組成物が、５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルで、少なくとも一日一回、一ヶ月間投与される請求項１３に記載の使用。
【請求項２１】
Ｔｈ１型の免疫調整を付与するための被検者の処置方法であって、薬学上有効量のキンマ葉抽出物、凍結乾燥抽出物、または前記キンマ葉抽出物を含む組成物を、前記被検者に投与することを含む方法。
【請求項２２】
前記組成物が、薬学上許容される添加剤と結合した、または組み合さったキンマ葉抽出物を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記添加剤が、凍結乾燥キンマ葉抽出物の活性を妨げないように選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記添加剤が、例えば、タンパク質、炭水化物、糖、タルク、ステアリン酸ナトリウム、セルロース、炭酸カルシウム、デンプン由来ゼラチンペースト等の栄養素、および／または、薬学上許容される担体、賦形剤、希釈剤もしくは溶剤から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記水溶性抽出物、凍結乾燥産物または前記組成物が、経口または筋肉内注射で投与される請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記経口経路が、カプセル、シロップ、濃縮物、パウダーまたは顆粒の剤形をとる請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
キンマ葉抽出物の前記添加剤に対する割合が、１０―１：１―１０の範囲である請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記キンマ葉抽出物、凍結乾燥抽出物、または前記キンマ葉抽出物を含む組成物が、５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルで、少なくとも一日一回、一ヶ月間投与される請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト末梢血Ｔ細胞からＩＮＦ―γ（インターフェロンγ）産生を誘導するキンマ葉（ｂｅｔｅｌｌｅａｆ）抽出物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドイツでは、イラクサ（ｓｔｉｎｇｉｎｇｎｅｔｔｌｅ）の葉の抽出物は、リウマチ性疾患のアジュバント療法として登録されている。全血培養系において、イラクサ抽出物ＩＤＳ２３（商品名：Ｒｈｅｕｍａ―Ｈｅｋ）は、リポポリサッカライドに刺激された単球サイトカイン発現を抑制し、免疫調整効果（ＩＤＳ２３（イラクサ葉抽出物）の、インビトロにおけるＴヘルパーサイトカインの発現に対する抗リウマチ効果）を示す。
【０００３】
本願出願人は、インビトロにおけるキンマ葉（ｂｅｔｅｌｌｅａｆ）抽出物の、フィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）に刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対する影響を調べた。キンマの葉は、強い刺激の芳香性の風味を有し、広く咀嚼剤（ｍａｓｔｉｃａｔｏｒｙ）として使用される。一般に、成長は止まったがまだもろくなっていない、成熟期のまたは成熟期を過ぎたキンマの葉は、咀嚼（ｃｈｅｗｉｎｇ）に用いられる。咀嚼目的の基礎的な調製品は、消石灰とカテキューが塗られたキンマの葉と、そこに加えられるビンロウの実を削り落としたもの（ｓｃｒａｐｉｎｇｓｏｆａｒｅｃａｎｕｔ）を含み、お好みで、例えば、ココナッツシェービング（ｓｈａｖｉｎｇｓ）、クローブ、カルダモン、フェンネル、粉化甘草、ナツメグ、さらにタバコ等のフレーバリング（ｆｌａｖｏｒｉｎｇｓ）が使用される。ところによっては、調製されたパン（ｐａｎ）は、銀箔や金箔で覆われる。前記調製品は、咀嚼剤として、多くの特性について効果がある、すなわち、芳香性であり、消化を助け、刺激性であり、駆風を助ける、と考えられる。医薬としては、前記調整品は、カタルや肺疾患において有効であり、湿布としても使用できる。キンマをビンロウの実およびその他の添加剤と咀嚼することによる効果は、唾液腺の興奮（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）と口の粘膜の刺激（ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ）である。産生される赤の着色は、ビンロウの実の色素であり、それ自身が消石灰とカテキューにおけるアルカリ作用下にあることを明らかに示す。軽度の刺激が産生されると、心地よい香りを与えるとともに、温かみや安らぎを知覚させることとなる。前記（キンマの）葉の芳香性の評価を決定付ける最も重要な因子は、存在するエッセンシャルオイルの量と、とりわけ、前記エッセンシャルオイルの性質である。異なる地方からのキンマの葉は、匂いの点でも味の点でも異なる。最も刺激があるのは、サーンチー（Ｓａｎｃｈｉ）型であるが、最もまろやかで甘味があるのはマドラス産である。キンマの葉は、エッセンシャルオイルを含み、その含有量は、葉の多様性に応じて、０．７％〜２．６％の範囲で変化する。前記オイルは、フェノールやテルペンを含む。フェノールオイルの割合が高いほど、その品質は向上する。オイゲノールの異性体で、シャビベトール（ｃｈａｖｉｂｅｔｏｌ；キンマフェノール；４―ａｌｌｙｌ―２―ｈｙｄｒｏｘｙ―１―ｍｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｅｎｅ）と名づけられたものは、キンマオイルの特徴的な構成成分と考えられる。しかしながら、インド産の試料には、前記シャビベトールが含まれていない。インド型のキンマオイルは、フェノール類を大部分を占める構成成分として含む。キンマオイルは、ジフテリアにおけるうがい薬または吸入による局所適用として、さまざまな呼吸性カタルの治療に使用されてきた。キンマオイルは、駆風特性を有し、哺乳類の中枢神経系にさまざまな作用を及ぼす。致死量のキンマオイルは、深い昏睡を引き起こし、数時間内に死に至らしめる。前記キンマの葉のエッセンシャルオイルや抽出物は、いくつかのグラム陽性およびグラム陰性バクテリアに対して活性を有する。前記バクテリアとしては、例えば、ミクロコッカスピオジェネスバーアルバス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓｖａｒ．ａｌｂｕｓ）、ミクロコッカスピオジェネスバーアウレウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓｖａｒ．ａｕｒｅｕ）、バシルスサブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルスメガテリウム（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、デプロコッカスニューモニア（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ストレプトコッカスピオジェネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）、エセリシアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、サルモネラチホーザ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｏｓａ）、ビブリオコーマ（Ｖｉｂｒｉｏｃｏｍｍａ）、シゲラデセントリア（Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、プロテウスブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ）、シュードモナスソラナサエラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｏｌａｎａｃａｅｒｕｍ）、サルシナルーテ（Ｓａｒｃｉｎａｌｕｔｅａ）、エルウィニアカロトボーラ（Ｅｒｗｉｎｉａｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）等があげられる。前記オイルは、原虫パラマエシウムサウダタム（Ｐａｒａｍａｅｃｉｕｍｃａｕｄａｔｕｍ）に対して約５分で致死となることが知られている（ＷｅａｌｔｈｏｆＩｎｄｉａ，Ｖｏｌ．８ｐｐ．８４―９４）。前記オイルは、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒａｅ）、サルモネラチホサム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｏｓｕｍ）、シゲラフレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａｆｌｅｘｎｅｒｉ）、エセリシアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）の生育を阻害する。前記キンマの葉の蒸気蒸留は、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に対して活性を示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の主要な目的は、ヒト末梢血単核細胞からインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を誘導する方法を提供することである。
【０００５】
本発明のその他の目的は、キンマの葉（ｂｅｔｅｌｌｅａｆ）の抽出物を、ヒト末梢血Ｔ細胞からＩＦＮγ産生を誘導するために使用することに関する。
【０００６】
本発明のその他の目的は、Ｔｈ１型の免疫調整剤として有用なキンマ葉抽出物を含む組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、ヒト末梢血単核細胞からＩＦＮγを誘導する方法を提供する。本発明は、また、ヒト末梢血Ｔ細胞からＩＦＮγ産生を誘導するための、キンマの葉（ｂｅｔｅｌｌｅａｆ）の抽出物の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
したがって、本発明は、ヒト末梢血単核細胞からＩＮＦγを誘導する方法であって、前記方法が、キンマ葉の水抽出物を調製し、ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を調製し、前記ｈＰＢＭＣを前記キンマ葉抽出物とともに１８〜４８時間インキュベートし、サイトカインに特異的なＲＴ―ＰＣＲ用または細胞内サイトカインタンパク質を検出するためのフローサイトメトリー用のＲＮＡを抽出し、既知のＩＦＮγ特異的プライマーを使用して前記ＲＮＡのＲＴ―ＰＣＲを行いＰＣＲ産物を得て、ＩＦＮγ特異的バンドに反映されるようにＩＦＮγを増量することを含む方法である。
【０００９】
もう一方の、ヒト末梢血単核細胞から産生されるＩＦＮγを誘導する方法は、前記インキュベートした細胞を、細胞内ＩＦＮγ染色に供し、フローサイトメーターで染色された細胞を解析し、ＩＦＮγ陽性細胞を少なくとも７倍増加することを含む方法である。
【００１０】
キンマ葉抽出物をＴｈ１型の免疫調整剤として使用する方法は、下記（ａ）および（ｂ）を含む。
（ａ）被検者に、少なくとも、５〜１０ｍｇ／ｍｌ／ｋｇ体重のキンマ葉抽出物を投与すること。
（ｂ）前記抽出物を、経口または筋肉内経路で、一日一回、少なくとも一ヶ月間投与すること。
【００１１】
本発明の一実施態様として、本発明は、Ｔｈ１型の免疫調整剤として有用な医薬組成物を提供し、前記組成物は、添加剤とともに、もしくは、添加剤と結合させて、有効量の水性または凍結乾燥したキンマ葉抽出物を含む。
【００１２】
本発明のその他の実施態様として、前記添加剤は、キンマ葉抽出物の活性を妨げないように選択される。
【００１３】
本発明のさらにその他の実施態様として、前記添加剤は、例えば、タンパク質、炭水化物、糖、タルク、ステアリン酸ナトリウム、セルロース、炭酸カルシウム、デンプン由来ゼラチンペースト等の栄養素、および／または、薬学上許容される担体、賦形剤、希釈剤もしくは溶剤から選択される。
【００１４】
本発明のさらにその他の実施態様として、前記水溶性抽出物、凍結乾燥産物または前記組成物は、経口または筋肉内注射で投与される。
【００１５】
本発明のさらにその他の実施態様として、前記経口経路は、カプセル、シロップ、濃縮物、パウダーまたは顆粒の剤形をとる。
【００１６】
本発明のさらにその他の実施態様として、キンマ葉抽出物の前記添加剤に対する割合は、１０―１：１―１０の範囲である。
【００１７】
本発明のさらにその他の実施態様として、キンマ葉抽出物、凍結乾燥抽出物、または前記キンマ葉抽出物を含む組成物は、５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルで、少なくとも一日一回、一ヶ月間投与される。
【００１８】
本発明は、さらなる実施態様として、Ｔｈ１型の免疫調整を付与するため被検者を処置する方法であって、薬学上有効量のキンマ葉抽出物、凍結乾燥抽出物、または前記キンマ葉抽出物を含む組成物を、前記被検者に投与することを含む方法である。
【００１９】
本発明のさらにその他の実施態様として、添加剤は、凍結乾燥キンマ葉抽出物の活性を妨げないように選択される。
【００２０】
本発明のさらにその他の実施態様として、前記添加剤は、例えば、タンパク質、炭水化物、糖、タルク、ステアリン酸ナトリウム、セルロース、炭酸カルシウム、デンプン由来ゼラチンペースト等の栄養素、および／または、薬学上許容される担体、賦形剤、希釈剤もしくは溶剤から選択される。
【００２１】
本発明のさらにその他の実施態様として、前記水溶性抽出物、凍結乾燥産物または前記組成物は、経口または筋肉内注射で投与される。
【００２２】
本発明のさらにその他の実施態様として、前記経口経路は、カプセル、シロップ、濃縮物、パウダーまたは顆粒の剤形をとる。
【００２３】
本発明のさらにその他の実施態様として、キンマ葉抽出物の前記添加剤に対する割合は、１０―１：１―１０の範囲である。
【００２４】
本発明のさらにその他の実施態様として、キンマ葉抽出物、凍結乾燥抽出物、または前記キンマ葉抽出物を含む組成物は、５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルで、少なくとも一日一回、一ヶ月間投与される。
【００２５】
本発明は、さらなる実施態様として、適切な担体／添加剤と共同したキンマ葉抽出物を、Ｔｈ１型免疫調整剤として利用する。
【００２６】
本発明のさらにその他の実施態様として、前記添加剤は、凍結乾燥キンマ葉抽出物の活性を妨げないように選択される。
【００２７】
本発明のさらにその他の実施態様として、前記添加剤は、例えば、タンパク質、炭水化物、糖、タルク、ステアリン酸ナトリウム、セルロース、炭酸カルシウム、デンプン由来ゼラチンペースト等の栄養素、および／または、薬学上許容される担体、賦形剤、希釈剤もしくは溶剤から選択される。
【００２８】
本発明のさらにその他の実施態様として、前記水溶性抽出物、凍結乾燥産物または前記組成物は、経口または筋肉内注射で投与される。
【００２９】
本発明のさらにその他の実施態様として、前記経口経路は、カプセル、シロップ、濃縮物、パウダーまたは顆粒の剤形をとる。
【００３０】
本発明のさらにその他の実施態様として、キンマ葉抽出物の前記添加剤に対する割合は、１０―１：１―１０の範囲である。
【００３１】
本発明のさらにその他の実施態様として、キンマ葉抽出物、凍結乾燥抽出物、または前記キンマ葉抽出物を含む組成物は、５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルで、少なくとも一日一回、一ヶ月間投与される。
【００３２】
本発明は、さらなる実施態様として、キンマ葉抽出物の調製に関し、下記（１）〜（３）のステップを含む。
（１）新鮮なキンマの葉を洗浄し、混合ブレンダーでホモジェナイズするステップ。
（２）超音波槽内で、それぞれ１５分間の２〜３バーストにより、超音波破砕を行い、その抽出物をフィルターに通し、必要に応じて、少なくとも一回以上、抽出を繰り返し、そして、乾燥するステップ。
（３）前記抽出物を、凍結乾燥し、半固体の塊を得るステップ。
【００３３】
本発明のさらなる実施態様として、前記凍結乾燥抽出物は、従来公知の方法により、前記含水抽出物をフリーズドライすることで得られる。
【００３４】
その他の実施態様として、前記水性抽出物は、以下の型のキンマ葉（Ｐｉｐｅｒｂｅｔｅｌ）から調製される。すなわち、野生型、クライマー（Ｃｌｉｍｂｅｒ）型、バングラ（Ｂａｎｇｌａ）型、およびスイート（Ｓｗｅｅｔ）型である。
【００３５】
以下、実施例により、さらに、本発明を説明するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例１】
【００３６】
キンマ（Ｐｉｐｅｒｂｅｔｌｅ）の新鮮な葉３４．１４ｇを、滅菌水で十分に洗浄し、混合ブレンダーを用いて、１００ｍｌのガラス蒸留水とともにホモジェナイズし、そして、超音波槽内で、それぞれ１５分間のバーストを３バーストして、超音波破砕した。その抽出物をフィルター（商品名：ワットマンＮｏ．１フィルター紙）でろ過し、そのろ液を回収した。この抽出の工程を３回繰り返した。それらをまとめた抽出物を、凍結乾燥し、重量１．１７ｇの半固体塊を得た。これは、次に、生物活性テストに使用した。
【実施例２】
【００３７】
キンマ（Ｐｉｐｅｒｂｅｔｌｅ）の新鮮な葉２１．６８ｇを、混合ブレンダーを用いて、６０ｍｌの蒸留水とともにホモジェナイズし、そして、超音波槽内で、それぞれ１５分間のバーストを２バーストして、超音波破砕した。抽出は、オーバーナイトまたは１６時間行い、フィルター（商品名：ワットマンＮｏ．１フィルター紙）でろ過するこどで、水中に抽出された物質を分離した。この抽出処理方法は、３回繰り返した。それらをまとめた抽出物を、瞬間蒸発器を用いて、減圧下４５℃の条件で乾燥し、その残存物質を、高真空下のデシケーター内でさらに乾燥し、重量０．５９ｇの半固体塊を得た。これは、次に、生物活性テストに使用した。
【００３８】
（物質の特性）
実施例１および２で得られた生物学的に活性な物質は、以下の（１）〜（３）の特性を有する。
（１）上述のようにしてえら得た乾燥半固体は、黒ずんだ色の物質であり、水およびジメチルスルフォキシドに可溶であった。
（２）前記活性物質の薄層クロマトグラフィーは、ｎ―ブタノール、酢酸、水が、それぞれ、９：５：７の割合である溶媒系において、Ｒｆが、０．７５、０．６４、０．５０、０．４０、および０．３３である５つのスポットを示す。
（３）前記活性物質を、ＩｎｔｅｒｓｉｌＯＤＳ―３（４．６ｘ２５０ｍｍ）分析カラムを使用したＨＰＬＣで解析したところ、メタノールと水の割合が、４：１である溶媒系、流速１．０ｍｌ／分、検出が２１７ｎｍという条件下において、１１のピークが観測された。そのリテンション時間は、２．６９、４．２７、５．９５、６．９７、７．４９、９．３９、１１．２０、１２．４０、１５．５３、１８．９０、および２１．４９分である。
【実施例３】
【００３９】
１．ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の調製
へパリン添加全血（正常個体より採取）を、フィコールハイパック（ＦｉｃｏｌｌＨｙｐａｑｕｅ）濃度勾配遠心分離にかけ、境界面の細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補給したＲＰＭＩ―１６４０培地にリサスペンドした。
【００４０】
２．ヒトＰＢＭＣとキンマ葉抽出物とのインキュベーション
最終濃度１２．５ｍｇ／ｍｌのキンマ葉抽出物が存在するまたは存在しない２４ウェルプレート中で、５μｇ／ｍｌのフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）を含むトータル２ｍｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ培地を使用して、５．０×１０６細胞のＰＢＭＣを、３７℃、５％ＣＯ２下で一晩（１８時間）培養した。インキュベーション時間の最後に、ＰＢＭＣをＰＢＳで２回洗浄し、サイトカイン特異的ＲＴ―ＰＣＲに使用するトータルＲＮＡの抽出、または、単一細胞レベルの細胞内サイトカインを測定するためのフローサイトメトリーに使用した。
【００４１】
３．ＲＮＡ調製とＲＴ―ＰＣＲ
培養したＰＢＭＣ由来のトータル細胞ＲＮＡを、商品名Ｔｒｉｚｏｌ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）により抽出した。５×１０６の細胞を上述のように１８時間培養し、回収し、１ｍｌＴｒｉｚｏｌにリサスペンドした。ｃＤＮＡの合成とＰＣＲは、２μｇのＲＮＡと１０μＭの各プライマーを使用して、トータル容量２５μｌの登録商標ＯｎｅｓｔｅｐＲＴ―ＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）を用いて、一本のチューブで行った。ヒトＩＦＮγおよびヒトＩＬ―４のプライマー配列は、以下のとおりである。
ＩＦＮγセンス      ：５´ＴＣＴＧＣＡＴＣＧＴＴＴＴＧＧＧＴＴＣＴ３´      （配列番号１）
ＩＦＮγアンチセンス：５´ＣＡＧＣＴＴＴＴＣＧＡＡＧＴＣＡＴＣＴＣ３´      （配列番号２）
ＩＬ−４センス      ：５´ＣＣＴＣＴＧＴＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＡＧＣ３´      （配列番号３）
ＩＬ−４アンチセンス：５´ＣＣＧＴＴＴＣＡＧＧＡＡＴＣＧＧＡＴＣＡ３´      （配列番号４）
増幅とｃＤＮＡ合成は、製造業者のプロトコールに記載のとおり行った。ＰＣＲ産物は、エチヂウムブロマイドを含む１．２％アガロースゲルを使用して、電気泳動を行い、紫外線照射装置下で写真を撮影した。分子量マーカー（１２３ｂｐラダー：ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）は、全てのゲルのに含ませた（Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．１９９９：２６：２５１７―２５２２）。
【００４２】
４．フローサイトメトリー
細胞を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１０分処理して透過性を付与し、続けて、０．１％サポニンとともに１０分間インキュベーションした。その後、細胞を、洗浄バッファー（１％アルブミン、０．１％サポニン、および０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）で洗浄し、その透過性が向上した細胞に対し、ＦＩＴＣもしくはＰＥ標識のコントロールモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＩＦＮγ抗体、またはＰＥ標識抗ヒトＩＬ―４抗体を用いて、暗闇、室温で、２０分間処理した。細胞は、その後、洗浄バッファーで一度、そしてＰＢＳで一度洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳにリサスペンドして、フローサイトメトリー解析を行った。
【００４３】
（結果：キンマ葉抽出物のＴｈ１サイトカイン発現への影響）
ＲＴ―ＰＣＲで測定された結果を図１に示す。図１に示すように、キンマ葉抽出物が、正常ヒト個体の末梢血単核細胞において、ＩＦＮγのｍＲＮＡ発現を増加するが、ＩＬ―４のｍＲＮＡ発現には影響を及ぼさないことは、明らかである。いいかえると、図１に示される出願人のデータは、キンマ葉抽出物が、ＩＦＮγ特異的ｍＲＮＡの合成を著しく増加させ、ＩＬ―４ｍＲＮＡ合成には、ほとんど影響を及ぼさないことを示す。
【００４４】
ＰＢＭＣによるＩＦＮγ合成は、図２に示すフローサイトメトリーのドットプロットからも明らかなように、タンパク質レベルでも検出可能である。ＰＢＭＣをＰＨＡとインキュベーションした場合、ＩＦＮγ陽性のＰＢＭＣは、たった０．９％であった（図２Ａ）。それに対して、ＰＢＭＣをＰＨＡおよびキンマ葉抽出物とインキュベートした場合、７．１％のＰＢＭＣが、細胞内ＩＦＮγを示した（図２Ｂ）。対照的に、ＩＬ―４産生細胞のパーセントは、ＰＢＭＣをキンマ葉抽出物とインキュベートしても、認め得るほどの変化はなかった（図２ＣおよびＤ）。
【００４５】
（考察）
Ｔ細胞は、そのサイトカインのパターンによって、Ｔｈ１表現型とＴｈ２表現型とに、さらに細かく分類され、細胞媒介性および体液性免疫応答を制御する（Ｍｏｓｓｍａｎｎ，Ｔ．Ｒ．，Ｃｏｆｆｍａｎ，ＲＬ．「Ｔｈ１とＴｈ２細胞：異なるパターンのリンホカイン分泌が、異なる機能特性を導く（Ｔｈ１ａｎｄＴｈ２：ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐａｔｔｅｒｎｓｏｆｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓｌｅａｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．）」ＡｎｎｕａｌＲｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９８９，７；１４５―７３）。炎症性免疫応答は、本質的には、Ｔｈ１細胞集団が、ＩＬ２およびＩＦＮ―γの産生を通して、細胞性免疫を向上させることに媒介される（ＴｒｉｎｃｈｉｅｒｉＧ．「Ｔｈ１細胞の発生におけるインターロイキン―１２およびその役割（Ｉｎｔｅｒｌｅｎｋｉｎ―１２ａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆＴｈ１ｃｅｌｌｓ）」ＩｍｍｕｎｏｌＴｏｄａｙ１９９３；１４：３３５―８；Ｇｅｒｍａｎｎ，Ｔ．，Ｓｚｅｌｉｇａ，Ｊ．，Ｈｅｓｓ，Ｈ．ｅｔａｌ．「ＤＢＡ／１マウスにインターロイキン―１２をＩＩ型コラーゲンと組合せて投与すると重篤な関節炎を誘導する（Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｉｎｔｅｒｌｅｎｋｉｎ―１２ｉｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｙｐｅ―ＩＩｃｏｌｌａｇｅｎｉｎｄｕｃｅｓｓｅｖｅｒｅａｒｔｈｒｉｔｉｓｉｎＤＢＡ／１ｍｉｃｅ）」ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ１９９５；９２：４８２３―７）。
【００４６】
したがって、我々の結果は、キンマ葉抽出物が、Ｔｈ１型応答を向上させ、細胞性免疫を向上させることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図１は、キンマ葉抽出物が、正常個体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）において発現するＩＦＮ―γｍＲＮＡを増加させることを示すＲＴ―ＰＣＲの結果の一例を示す。
【図２】図２は、キンマ葉抽出物が、正常個体のＰＢＭＣにおけるＩＦＮ―γ発現をタンパク質レベルで増加させることを示すフローサイトメトリー測定の結果の一例を示す。
【配列表フリーテキスト】
【００４８】
配列番号１  ＲＴ―ＰＣＲ用プライマー  ＩＮＦ―γ  センス
配列番号２  ＲＴ―ＰＣＲ用プライマー  ＩＮＦ―γ  アンチセンス
配列番号３  ＲＴ―ＰＣＲ用プライマー  ＩＬ―４  センス
配列番号４  ＲＴ―ＰＣＲ用プライマー  ＩＬ―４  アンチセンス
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年7月24日(2003.7.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト末梢血単核細胞からＩＦＮγを誘導する方法であって、下記（ａ）から（ｆ）のステップを含む方法。
（ａ）キンマ葉を調製するステップ。
（ｂ）ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）を調製するステップ。
（ｃ）ｈＰＢＭＣをキンマ葉抽出物と１８〜４８時間インキュベーションするステップ。
（ｄ）サイトカイン特異的ＲＴ―ＰＣＲのため、または、細胞内サイトカインタンパク質を検出するフローサイトメトリーのため、ＲＮＡを抽出するステップ。
（ｅ）ＲＮＡを使用してＲＴ―ＰＣＲを行い、ＩＦＮγ特異的既知プライマーを使用してＰＣＲ産物を得るステップ。
（ｆ）ＩＦＮγ特異的バンドに反映される、ＩＦＮγの増加のステップ。
【請求項２】
さらに、下記（ａ）から（ｃ）の代替ステップを含む請求項１に記載の方法。
（ａ）ＩＦＮγの細胞内染色のために細胞をインキュベートするステップ。
（ｂ）フローサイトメーターで、染色した細胞を解析するステップ。
（ｃ）ＩＦＮγ陽性細胞の少なくとも７倍の増加のステップ。
【請求項３】
下記（ａ）から（ｃ）を含むキンマ葉抽出物をＴｈ１型免疫調整剤として使用する方法。
（ａ）被検者に、少なくとも、５〜１０ｍｇ／ｍｌ／ｋｇ体重のキンマ葉抽出物のジュースを投与すること。
（ｂ）抽出物を、少なくとも一日一回、少なくとも一ヶ月間投与すること。
（ｃ）前記抽出物を、経口または筋肉内経路で投与すること。
【請求項４】
Ｔｈ１型免疫調整剤として有用な医薬組成物であって、添加剤とともに、もしくは、添加剤と結合して、有効量の凍結乾燥キンマ葉抽出物を含む組成物。
【請求項５】
前記凍結乾燥抽出物が、従来の方法で、前記水性抽出物をフリーズドライして得られる請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記添加剤が、キンマ葉抽出物の活性を妨げないように選択される請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記添加剤が、例えば、タンパク質、炭水化物、糖、タルク、ステアリン酸ナトリウム、セルロース、炭酸カルシウム、デンプン由来ゼラチンペースト等の栄養素、および／または、薬学上許容される担体、賦形剤、希釈剤もしくは溶剤から選択される請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記水溶性抽出物、凍結乾燥産物または前記組成物が、経口または筋肉内注射で投与される請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
経口経路が、カプセル、シロップ、濃縮物、パウダーまたは顆粒の剤形をとる請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
キンマ葉抽出物の前記添加剤に対する割合が、１０―１：１―１０の範囲である請求項４に記載の組成物。
【請求項１１】
キンマ葉抽出物、凍結乾燥抽出物、または前記キンマ葉抽出物を含む組成物が、５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルで、少なくとも一日一回、一ヶ月間投与される請求項４に記載の組成物。
【請求項１２】
前記凍結乾燥キンマ葉抽出物が、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の特性を有する請求項４に記載の組成物。
（ｉ）乾燥試料が、黒ずんだ色の物質であり、水およびジメチルスルフォキシドに可溶である。
（ｉｉ）前記活性物質の薄層クロマトグラフィーが、ｎ―ブタノール、酢酸、水が、それぞれ、９：５：７の割合である溶媒系において、Ｒｆが、０．７５、０．６４、０．５０、０．４０、および０．３３である５つのスポットを示す。
（ｉｉｉ）ＩｎｔｅｒｓｉｌＯＤＳ―３（４．６ｘ２５０ｍｍ）分析カラムを使用したＨＰＬＣで、前記活性物質を解析すると、メタノールと水の割合が、４：１である溶媒系、流速１．０ｍｌ／分、検出が２１７ｎｍという条件下において、リテンション時間が、２．６９、４．２７、５．９５、６．９７、７．４９、９．３９、１１．２０、１２．４０、１５．５３、１８．９０、および２１．４９分である１１のピークが観測される。
【請求項１３】
キンマ葉抽出物もしくはその凍結乾燥抽出物、または有効量のキンマ葉抽出物を含む組成物の使用であって、前記細胞を前記抽出物または前記組成物に触れさせることによる、ヒト末梢血単核細胞からのＩＦＮγ誘導のための、または、Ｔｈ１型免疫調整剤としての使用。
【請求項１４】
前記組成物が、薬学上許容される添加剤と結合した、または組合わさったキンマ葉抽出物を含む請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記添加剤が、凍結乾燥キンマ葉抽出物の活性を妨げないように選択される請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記添加剤が、例えば、タンパク質、炭水化物、糖、タルク、ステアリン酸ナトリウム、セルロース、炭酸カルシウム、デンプン由来ゼラチンペースト等の栄養素、および／または、薬学上許容される担体、賦形剤、希釈剤もしくは溶剤から選択される請求項１４に記載の使用。
【請求項１７】
前記水溶性抽出物、凍結乾燥産物または前記組成物が、経口または筋肉内注射で投与される請求項１３に記載の使用。
【請求項１８】
経口経路が、カプセル、シロップ、濃縮物、パウダーまたは顆粒の剤形をとる請求項１３に記載の使用。
【請求項１９】
キンマ葉抽出物の前記添加剤に対する割合が、１０―１：１―１０の範囲である請求項１３に記載の使用。
【請求項２０】
前記キンマ葉抽出物、凍結乾燥抽出物、または前記キンマ葉抽出物を含む組成物が、５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルで、少なくとも一日一回、一ヶ月間投与される請求項１３に記載の使用。
【請求項２１】
Ｔｈ１型の免疫調整を提供するための被検者の処置方法であって、薬学上有効量のキンマ葉抽出物、凍結乾燥抽出物、または前記キンマ葉抽出物を含む組成物を、前記被検者に投与することを含む方法。
【請求項２２】
前記組成物が、薬学上許容される添加剤と結合した、または組合さったキンマ葉抽出物を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記添加剤が、凍結乾燥キンマ葉抽出物の活性を妨げないように選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記添加剤が、例えば、タンパク質、炭水化物、糖、タルク、ステアリン酸ナトリウム、セルロース、炭酸カルシウム、デンプン由来ゼラチンペースト等の栄養素、および／または、薬学上許容される担体、賦形剤、希釈剤もしくは溶剤から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記水溶性抽出物、凍結乾燥産物または前記組成物が、経口または筋肉内注射で投与される請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記経口経路が、カプセル、シロップ、濃縮物、パウダーまたは顆粒の剤形をとる請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
キンマ葉抽出物の前記添加剤に対する割合が、１０―１：１―１０の範囲である請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記キンマ葉抽出物、凍結乾燥抽出物、または前記キンマ葉抽出物を含む組成物が、５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量レベルで、少なくとも一日一回、一ヶ月間投与される請求項２１に記載の方法。
【国際調査報告】
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