(57)【要約】ヒト患者の癌を診断する方法であって、（ｉ）核酸および／またはタンパク質を含むサンプルを患者から得る工程、および（ｉｉ）癌と関連するあるレベルのｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの核酸またはタンパク質をサンプルが含むかどうかを判定する工程を含む方法。癌を治療する方法であって、ｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの機能を選択的に妨げる薬剤を患者に投与する工程を含む方法。細胞中で発現されるｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの機能を妨げることができる分子をコードする核酸を含む遺伝子構築体。これらの方法および組成物は、前立腺癌に特に適している。
2004507254.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト患者の癌に対する感受性を判定する方法であって、（ｉ）核酸および／またはタンパク質を含むサンプルを患者から得る工程、および（ｉｉ）癌と関連するあるレベルのｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの核酸またはタンパク質をサンプルが含むかどうかを判定する工程を含む方法。
【請求項２】
ヒト患者の癌を診断する方法であって、（ｉ）核酸および／またはタンパク質を含むサンプルを患者から得る工程、および（ｉｉ）癌と関連するあるレベルのｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの核酸またはタンパク質をサンプルが含むかどうかを判定する工程を含む方法。
【請求項３】
ヒト患者の癌の特定の結果の相対的見通しを予測する方法であって、（ｉ）核酸および／またはタンパク質を含むサンプルを患者から得る工程、および（ｉｉ）癌と関連するあるレベルのｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの核酸またはタンパク質をサンプルが含むかどうかを判定する工程を含む方法。
【請求項４】
癌が前立腺癌である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
癌が転移性である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
サンプルが核酸を含み、前記核酸をｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの核酸に選択的にハイブリダイズする核酸と接触させることによって、ｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの核酸のレベルを測定する、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
サンプルがｍＲＮＡを含み、前記核酸がｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルのｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ハイブリダイズする前記核酸を検出可能に標識する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
選択的にハイブリダイズする前記核酸が一本鎖である、請求項６から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
選択的にハイブリダイズする前記核酸が核酸の増幅反応において使用するのに適している、請求項６から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
サンプルがタンパク質を含んでおり、ｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルのタンパク質のレベルを測定する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質のレベルを、タンパク質をｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルのタンパク質に選択的に結合する分子と接触させることによって測定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
選択的結合分子が抗体、またはその断片もしくは誘導体、または抗体様の分子である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
選択的結合分子が検出可能な標識を含む、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルが、癌が疑われる組織、または癌が発見される可能性があるかもしくは既に発見されている組織のサンプルであるか、あるいは前記組織からの細胞を含んでいる、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
組織が前立腺であり、癌が前立腺癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
サンプルが尿、精液、血液またはリンパ循環液のうちのいずれか１つであり、癌が前立腺癌である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
サンプル中のｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルのタンパク質または核酸のレベルを判定する際に使用することができる薬剤の、癌を診断するための試薬の製造における使用。
【請求項１９】
薬剤がｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの核酸に選択的にハイブリダイズする核酸である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
薬剤がｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルのタンパク質に選択的に結合する分子である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
癌を診断する方法における、請求項１８から２０のいずれか一項で定義した薬剤の使用。
【請求項２２】
癌を診断するための、請求項１８から２０のいずれか一項で定義した薬剤の使用。
【請求項２３】
癌を診断するのに有用なパーツのキットであって、サンプル中のｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣのタンパク質または核酸のレベルを判定する際に使用することができる薬剤を含むキット。
【請求項２４】
陰性コントロールおよび／または陽性コントロールをさらに含む、請求項２３に記載のパーツのキット。
【請求項２５】
サンプルから前立腺の上皮細胞を分離する手段をさらに含む、請求項２３または２４のいずれか一項に記載のパーツのキット。
【請求項２６】
癌を治療する方法であって、ｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの機能を選択的に妨げる薬剤を患者に投与する工程を含む方法。
【請求項２７】
薬剤がｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの発現を妨げる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
薬剤がｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの活性を阻害する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
薬剤がアンチセンス分子である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
薬剤がリボザイムである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
癌を治療するための薬剤の製造における、ｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの機能を選択的に妨げる薬剤の使用。
【請求項３２】
細胞中で発現され、ｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの機能を妨げることができる分子をコードする核酸を含む遺伝子構築体。
【請求項３３】
ヒト細胞への送達用に適合させた、請求項３２に記載の遺伝子構築体。
【請求項３４】
該適合によって癌細胞への送達が可能である、請求項３３に記載の遺伝子構築体。
【請求項３５】
核酸を癌細胞に選択的に送達するための手段を含む、請求項３３または３４に記載の遺伝子構築体。
【請求項３６】
癌細胞中で前記分子をコードする核酸を選択的に発現させるための手段を含む、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の遺伝子構築体。
【請求項３７】
医療において使用するための、請求項３２から３６のいずれか一項に記載の遺伝子構築体。
【請求項３８】
請求項３２から３６のいずれか一項に記載の遺伝子構築体、および製薬上許容される担体を含む薬剤組成物。
【請求項３９】
ｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルを選択的に阻害する化合物を同定する方法であって、（ａ）試験化合物を前記電位依存性Ｎａ＋チャネルのいずれか１つと接触させ、前記化合物が阻害的であるかどうかを判定すること、（ｂ）試験化合物を他の電位依存性Ｎａ＋チャネルと接触させ、前記化合物が阻害的であるかどうかを判定すること、および（ｃ）（ａ）では実質的に阻害的であるが（ｂ）では実質的に阻害的でない化合物を選択することを含む方法。
【請求項４０】
ｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルのタンパク質に選択的に結合する部分、および他の部分を含む化合物。
【請求項４１】
他の部分が直接的または間接的に細胞毒性部分である、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４２】
他の部分が容易に検出可能な部分である、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４３】
ｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルのタンパク質に選択的に結合する部分および他の部分が融合したポリペプチドである、請求項４０に記載の化合物。
【請求項４４】
請求項４３に記載の化合物をコードする核酸分子。
【請求項４５】
請求項４４に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項４６】
医療において使用するための、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項４７】
請求項４０から４３のいずれか一項に記載の化合物および製薬上許容される担体を含む薬剤組成物。
【請求項４８】
癌を有しているかあるいは癌の危険があるヒト患者を治療および／または診断するための薬剤の製造における、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項４９】
癌を治療する方法であって、請求項４０、４１または４３のいずれか一項に記載の化合物をヒト患者に有効量投与することを含み、かつ該化合物の他の部分が患者に対して直接的または間接的に治療上有益な部分である方法。
【請求項５０】
ヒト患者中の癌を画像化する方法であって、有効量の請求項４２に記載の化合物を患者に投与することを含む方法。
【請求項５１】
（１）請求項４１に記載の化合物であって、該他の部分が比較的毒性のないプロドラッグを細胞毒性の薬物に変換することができる細胞毒性部分である化合物、および（２）比較的毒性のないプロドラッグを含むパーツのキット。
【請求項５２】
（１）請求項４０に記載の化合物であって、該他の部分が直接的または間接的細胞毒性部分または容易に検出可能な部分に選択的に結合することができる化合物、および（２）該化合物の該他の部分が結合することができる、直接的または間接的細胞毒性部分または容易に検出可能な部分のいずれか１つを含むパーツのキット。
【請求項５３】
本明細書で開示した、癌を治療あるいは診断するいずれかの新規な方法。
【請求項５４】
本明細書で開示した、癌を治療あるいは診断する際に使用するための、いずれかの新規な化合物または組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、患者が癌を有しているかどうか、さらにその癌が転移する可能性があるかどうかを判定する方法に関するものであり、さらに本発明は、癌、特に前立腺癌を治療する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌は重大な疾患であり、主たる死因である。近年、いくつかの癌の診断および治療においては進展があるが、診断および治療を改善する必要性が依然として存在する。
【０００３】
癌は遺伝性疾患であり、たいていの場合、１つまたは複数の遺伝子の突然変異と関係がある。ヒト・ゲノム中には約６０，０００個の遺伝子が存在すると考えられているが、これらの遺伝子の一握りのみが癌と関係があることが示されている。現在同定されている遺伝子よりも多くの遺伝子が、癌と関係があることが発見されるであろうことが推量されるが、分子の分析技法が利用可能であるにもかかわらず、この分野の進歩は依然として遅い。これは、今日までに同定されている遺伝子のさまざまな構造および機能のためであり、このことは、癌遺伝子が多くの形をとり、多くの異なる機能を有することができることを示唆している。
【０００４】
前立腺の癌腫は多くの国々で最も重大な疾患となっており、癌腫は西側の世界の男性において最も一般的に診断される悪性物であり、その発生率は年齢と共に大幅に増大する。この２０年でその死亡率は倍になっており、現在ではこれが、西側の世界において男性の癌による死亡の２番目に一般的な原因である（Ｗｉｎｇｏ他（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．Ｃｌｉｎ．４５、８−３０；Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：Ｃａｕｓｅ Ｅｎｇｌａｎｄ ａｎｄ Ｗａｌｅｓ．ＯＰＣＳ ＤＨ２ １９、１９９３、Ｈｅｒ Ｍａｊｅｓｔｙ’ｓ Ｓｔａｔｉｏｎｅｒｙ Ｏｆｆｉｃｅ）。前立腺癌の有病率はこの１０年で２８％増大しており、この疾患は現在イングランドおよびウェールズにおける男性の癌全体の１２％を占めている（Ｃａｎｃｅｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ：Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎｓ Ｅｎｇｌａｎｄ ａｎｄ Ｗａｌｅｓ．ＯＰＣＳ ＭＢＩ Ｎｏ２２、１９９４、Ｈｅｒ Ｍａｊｅｓｔｙ’ｓ Ｓｔａｔｉｏｎｅｒｙ Ｏｆｆｉｃｅ；Ｆｏｓｔｅｒ他（１９９９）Ｂｒ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．８３、１７１−１９４）。２０１８年までには前立腺癌が、その患者の男性群の５０％を占める最大の死因となることが予想される（８０才まででは８０％）。最近の物証によって、前立腺癌は若い男性の間でも増大していることも示唆されている（Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ（１９９９）７９、１３−１７）。これらの増大、および前立腺癌による近年の多くの有名人の死が作用して、この癌に対して何かを行う必要性が強調されている。スクリーニングが広範囲で利用可能であることによって、前立腺癌による死亡率が制限される可能性があることが示唆されている。
【０００５】
前立腺のスクリーニングは現在、直腸内診および前立腺に特異的な抗原（ＰＳＡ）レベルの測定からなっている。これらの方法には特異性が欠けている。なぜなら、直腸指診は試験者の間で大幅に異なるからである（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｃａｔａｌｏｎａ（１９９５）Ｕｒｏｌｏｇｙ ４５、７０−７４）。前立腺の房および管の上皮細胞によって合成され、精液の正常な部分として分泌される、漿液の前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）の測定値は、現在最も一般に適用されている癌の診断指標である（たとえば、Ｇａｏ他（１９９７）Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ３１、２６４−２８１）。しかしながら、ＰＳＡ測定によって矛盾した情報が与えられ、その結果前立腺癌を有する何人かの患者はＰＳＡのレベルが低いが、一方でＰＳＡのレベルを、非悪性の前立腺疾患、たとえば良性前立腺肥大症（ＢＨＰ）、前立腺炎症および他の病状の存在下で評価することができる（たとえば、Ｍａｎｄｅｌｓｏｎ他（１９９５）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ １６、２８３−３０６；Ｆｏｏｄ他（１９９６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１、３４２−３４９；Ｍｏｒｇａｎ他（１９９６）Ｔｈｅ Ｐｒｏｓｔａｔｅ ５７、５８−６３；Ｃｈａｎ ａｎｄ Ｓｕｌｍａｓｙ（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１０８、２２６−２７４）。診断試験時のＰＳＡの相対的な不具合が前立腺癌が進行している３６６人の男性において見られ、一方これは２２，０００人を超える男性の前向き研究、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｔｕｄｙ中に含まれている。研究の開始時に保存された漿液中のＰＳＡのレベルが測定され、評価されたレベルは、以後４年以内に前立腺癌が進行する男性のわずか４７％で発見された（Ｇａｎｎ他（１９９５）ＪＡＭＡ２７３、２８９−２９４）。
【０００６】
現在のスクリーニング法はしたがって満足なものではない。癌を診断するための、あるいは癌の考えられる転移の広がりを予想または予防するための信頼できる方法は存在せず、このことが大部分の患者の死の主な原因となっている。
【０００７】
Ｇｒｉｍｅｓ他（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３６９、２９０−２９４は、２つの前立腺腫瘍の細胞系における電位活性型であるＮａ＋の流れの差次的発現を記載しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるその侵襲性への貢献を論じている。研究された細胞系はラットの細胞系であり、どの特定のＮａ＋チャネルが関係しているかは示されていない。
【０００８】
Ｌａｎｉａｄｏ他（１９９７）Ａｍ Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０、１２１３−１２２１は、ヒト前立腺癌の細胞系における電位活性型Ｎａ＋チャネルの発現および機能分析を記載しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるその侵襲性への貢献を論じている。どの特定のＮａ＋チャネルが関係しているかは示されていない。
【０００９】
Ｓｍｉｔｈ他（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２３、１９−２４は、Ｎａ＋チャネルのタンパク質の発現によって、ラットおよびヒトの前立腺腫瘍の細胞系の侵襲性が高まることを示唆している。
【００１０】
Ｇｒｉｍｅｓ ａｎｄ Ｄｊａｍｇｏｚ（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７５、５０−５８は、転移性が高いラットの前立腺癌のＭａｔ−ＬｙＬｕ細胞系において発現される、電位依存性であるＮａ＋の流れの電気生理学的特性および薬理学的特性を記載している。
【００１１】
Ｄａｗｅｓ他（１９９５）Ｖｉｓｕａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２、１００１−１００５は、培養した網膜色素の上皮細胞中で誘導されるＮａ＋チャネルのサブタイプを同定したことを記載している。
【００１２】
Ｎａ＋チャネルの概説は、たとえばＢｌａｃｋ ａｎｄ Ｗａｘｍａｎ（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８、１３９−１５２；ＦｏｚｚａｒｄａｎｄＨａｎｃｋ（１９９６）、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７６、８８７−９２６；Ｂｕｌｌｍａｎ（１９９７）Ｈｕｍ．−Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６、１６７９−１６８５；Ｃａｎｎｏｎ、（１９９９）；およびＭａｒｂａｎ他（１９９８）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５０８、６４７−６５７中において発見することができる。Ｂｕｌｌｍａｎ（１９９７）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６、１６７９−１６８５；Ｂｕｒｇｅｓｓ他（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ．１０、４６１−４６５；およびＣａｎｎｏｎ、（１９９８）Ｍｏｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ（ＪＢ Ｍａｒｔｉｎ，Ｅｄ）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉｎｃ．、ＮＹ中に記載されたように、いくつかのＮａ＋および他のイオン・チャネルが、いくつかの遺伝的欠陥の根底にあることはよく知られている。しかしながら、診断目的で現在使用されているＮａ＋チャネルの配列は、現在存在しない。
【００１３】
したがって、このように以前の研究では、細胞系の働きに基づいて、前立腺癌およびその転移における電位依存性Ｎａ＋チャネル（ＶＧＳＣｓ）に関するいくつかの一般的な役割が示唆されていた可能性があるが、この情報を効果的に利用することは現在までできていない。なぜなら、ｉｎ ｖｉｖｏでの前立腺癌におけるＶＧＳＣの関与は実証されておらず、ヒトの前立腺癌と関係がある特定のＶＧＳＣは同定されていないからである。
【００１４】
驚くべきことに、我々は現在、ＶＧＳＣの発現は病気の進行と相関関係があり、ヒトの癌、特に前立腺癌およびその転移と関連があるＶＧＳＣは、ｈＮｅ−Ｎａ（Ｎａｖ１．７とも呼ばれる）であることを発見している。前述のように、これは知られているＶＧＳＣであり（ただし、ヒトの癌または癌細胞系、特にヒトの前立腺癌と関連があることは以前には知られていない）、タンパク質、およびそれをコードしているｍＲＮＡのｃＤＮＡのアミノ酸配列は報告されている（Ｋｌｕｇｂａｕｅｒ他（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４、１０８４−１０９０）。実施例１で論じたように、ｈＮｅ−Ｎａ（ヒト）およびＰＮ１（ラット）はＳＣＮ９Ａ遺伝子と対応した。近年では、新しいＶＧＳＣの命名法が採用されている（Ｇｏｌｄｉｎ他（２０００）Ｎｅｕｒｏｎ ２８（２）、３６５−３６８）。この系では、ｈＮｅ−ＮａおよびＰＮ１はそれぞれ、Ｎａｖ１．７のヒトおよびラットのオーソロガス遺伝子（オーソログ）である。
【００１５】
ｈＮｅ−Ｎａの染色体の位置は、いまだに決定されていない。しかしながら、マウスの相当物は、マウス染色体２上の電位依存性Ｎａ＋チャネル群に位置することは特定されている（Ｂｅｃｋｅｒｓ他（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３６、２０２−２４５）。ｈＮｅ−Ｎａが同様に存在する可能性があるヒト染色体２にも、この群は存在する（Ｍａｌｏ他（１９９４）Ｃｙｔｏｇｅｎ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．６７、１７８−１８６；Ｍａｌｏ他（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１、２９７５−２９７９；Ｇｅｏｒｇｅ他（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９、３９５−３９７）。ｈＮｅ−Ｎａ遺伝子（ヒトＳＣＮ９Ａ）イントロン／エクソンの編成はいまだに決定されていないが、他の知られている保存型のＶＧＳＣイントロンの位置から推測することも可能であろう（Ｌｏｕｇｈｅｙ他（１９８９）Ｃｅｌｌ５８、１１４３−１１５４；Ｇｅｏｒｇｅ他（１９９３）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１５、５９８−６０６Ｗａｎｇ他（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ３４、９−１６；およびＳｏｎｓｌｏｖａ他（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４１、２０１−２０９）。
【００１６】
ｈＮｅ−Ｎａと最も類似な脳タイプのＮａ＋チャネル（ラットの脳Ｉ−ＩＩＩ（Ｎｏｄａ他（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２２、８２６−８２８；Ｋａｙａｎｏ他（１９８８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２８、１８７−１９４）は、全体の配列と２０％異なる（ヒト骨格は３０％；心臓は３４％異なる）。しかしながら、（ｉ）特定の構造／機能ドメイン内で配列の比較を行う場合、この相同性は大幅に低くなる（たとえば最初に、ＤＩＩ−ＤＩＩＩ細胞質連結領域の３分の１は、大部分の類似のチャネル（ＲＢＩＩ／ＨＢＩＩ）とわずか４５％の相同性しかなく、（ｉｉ）ｈＮｅ−Ｎａは、特異的な抗体を作成するための充分異なる領域（たとえば、残基４４６−４６０：ＥＹＴＳＩＲＲＳＲＩＭＧＬＳＥ）を有している（たとえばＴｏｌｅｄｏ−Ａｒａｌ他（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４、１５２７−１５３２を参照のこと）。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、癌、特に前立腺癌の診断および予後治療を行う際に有用であり、癌、特に前立腺癌を処理する際に臨床医を手助けするための方法を提供することである。詳細には、本発明の目的は、癌、特に前立腺癌の転移の可能性を評価する方法を提供することである。
【００１８】
本発明の他の目的は、癌、特に前立腺癌を治療する方法、およびヒトの癌、特に前立腺癌と関連があるＶＧＳＣを選択的に抑制する化合物を同定する方法を提供することを含む。なぜなら、これらの方法は癌を治療する際に有用である可能性があるからである。
【００１９】
【課題を解決するための手段】
本発明の第１の態様では、ヒト患者の癌に対する感受性を判定する方法であって、（ｉ）核酸および／またはタンパク質を含むサンプルを患者から得る工程、および（ｉｉ）癌と関連がある一定レベルのｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの核酸またはタンパク質を、サンプルが含むかどうかを判定する工程を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明の第２の態様では、ヒト患者の癌を診断する方法であって、（ｉ）核酸および／またはタンパク質を含むサンプルを患者から得る工程、および（ｉｉ）癌と関連がある一定レベルのｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの核酸またはタンパク質を、サンプルが含むかどうかを判定する工程を含む方法を提供する。
【００２１】
サンプルが癌と関連がある一定レベルのｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣの核酸またはタンパク質が含むかどうかを判定することは、それ自体が癌の診断となる可能性があり、あるいは診断にいたる際の補助として、その判定を臨床医によって使用することができることは理解されるであろう。
【００２２】
たとえば、前立腺癌に関しては、臨床医が生験組織の病理組織学的試験を行う、あるいは漿液のＰＳＡレベルを測定する、あるいは外部指診を行う、あるいは画像化を行う場合、それが有用である。最近では、血液のＩＧＦ−１レベルを使用する可能性も示唆されている（Ｃｈａｎ他（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７９、５６３−５６６）。診断を行う前に、臨床医がこれらおよび他の要因を考慮に入れ、さらに前記ＶＧＳＣのレベルを考慮すること望むことは理解されるであろう。
【００２３】
本発明の第３の態様では、ヒト患者の癌の個々の結果の関連のある見通しを予測する方法であって、（ｉ）核酸および／またはタンパク質を含むサンプルを患者から得る工程、および（ｉｉ）癌と関連がある一定レベルのｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの核酸またはタンパク質を、サンプルが含むかどうかを判定する工程を含む方法を提供する。
【００２４】
したがって、本発明の第３の態様の方法は、予後あるいは予後を助成する際に有用である可能性がある。この方法は、生験組織の病理組織学的試験、あるいは漿液のＰＳＡレベルの測定、外部指診または画像化などの、知られている予後法の付属物として使用することができる。
【００２５】
【発明の実施の形態】
サンプル中の前記ＶＧＳＣのレベルを判定することは、患者の癌の取り扱い方を決定する際には、臨床医にとって有用であろうことは理解されるであろう。たとえば、高レベルの前記ＶＧＳＣは特に前立腺癌の転移の可能性と関連があり、アンドロゲン不感受性と関連がある可能性があるので、臨床医は前記ＶＧＳＣのレベルに関する情報を使用して、患者の治療に関する意思決定を容易にすることができる。したがって、前記ＶＧＳＣのレベルが前記前立腺癌の転移の可能性が低いことを示す場合、不要な根治手術は回避することができる。同様に、前記ＶＧＳＣのレベルが前記前立腺癌の転移の可能性が高いことを示す場合、根治手術（すなわち、前立腺切除術）が好ましい治療である可能性がある。
【００２６】
前述の事項、および以下の実施例から、前記ＶＧＳＣのレベルを判定することを診断上で利用して、所定の癌、特に前立腺の癌が転移するかどうかを予測することができることは理解されるであろう。なぜなら前記ＶＧＳＣの発現は、癌の考えられる将来的な広がりと対応すると考えられているからである。
【００２７】
考慮する癌が前立腺癌である場合は、それが特に好ましい。
【００２８】
本発明の方法を使用して、所定の前立腺の癌が転移するかどうかを予測する場合も、それが特に好ましい。
【００２９】
癌または転移の可能性を示す前記ＶＧＳＣのレベルは、知られている非癌性または非転移性前立腺細胞を超える、知られている癌性または転移性前立腺細胞中に存在する高いレベルとして定義することができる。前記ＶＧＳＣタンパク質のレベルは、たとえば癌性細胞または転移性細胞中では少なくとも１．５倍高く、あるいはそのレベルは少なくとも２倍または３倍高い可能性がある。免疫組織化学的に加工した組織部分のミクロ濃度測定による定量分析によって、前立腺管の癌性領域でのＶＧＳＣの発現は、対応する良性領域の３倍高いことが示されている（実施例３を参照のこと）。使用する抗体はすべてのＶＧＳＣと反応すると考えられているが、実施例１の我々の発見によって、ｈＮｅ−Ｎａ Ｎａ＋チャネルはヒト前立腺癌細胞中の主要形である可能性があり、したがって認識されるのは主にｈＮｅ−Ｎａ Ｎａ＋チャネルであろうことが示される。前記ＶＧＳＣをコードしているｍＲＮＡのレベルは、たとえば癌性細胞または転移性細胞中では少なくとも１．５倍高く、あるいはそのレベルは少なくとも２倍または３倍高く、あるいは少なくとも１０、５０、１００、５００または１０００倍高い可能性がある。半定量的なＰＣＲによる測定によって、実施例中に記載したように、ｍＲＮＡのレベルは、転移性の高い細胞系では、転移性の低い細胞系よりも約１０００倍高いことが示される。
【００３０】
本発明の１つの好ましい実施形態では、前記ＶＧＳＣの核酸、特にｍＲＮＡのレベルが癌と関連があるレベルであるかどうかを判定する。ｍＲＮＡなどの核酸を含むサンプル、および前記ＶＧＳＣのレベルは、前記核酸を前記ＶＧＳＣ核酸に選択的にハイブリダイズする核酸と接触させることによって、測定することが好ましい。
【００３１】
「選択的にハイブリダイズする」によって、核酸が前記ヒト核酸と充分なヌクレオチド配列類似性があり、したがってこの核酸は、適度あるいは非常に厳密な条件下でハイブリダイズすることができることが意味される。当分野でよく知られているように、核酸のハイブリダイゼーションの厳密度は、ハイブリダイゼーションが起こる核酸の長さ、ハイブリダイズする配列の同一性の程度などの要因、および温度、イオン強度、および配列のＣＧまたはＡＴ含有率などの要因に依存している。したがって、前記選択的にハイブリダイズすることができる任意の核酸が、本発明を実施する際に有用である。
【００３２】
前記ヒト核酸に選択的にハイブリダイズすることができる核酸には、核酸の少なくとも一部および前記ヒト核酸について、９５％を超える配列同一性、好ましくは９８％を超える配列同一性、より好ましくは９９％を超える配列同一性を有する核酸がある。よく知られているように、ヒト遺伝子は通常はイントロンを含み、したがって、たとえば遺伝子に由来するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡは、その全長は前記ヒト・ゲノムＤＮＡとは完全には一致しないと思われるが、それでもこれは前記ヒトＤＮＡと選択的にハイブリダイズすることができる核酸であると思われる。したがって、具体的には本発明は、前記ＶＧＳＣ ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズするが、前記ＶＧＳＣ遺伝子にはハイブリダイズすることができない核酸を含む。たとえば、前記ＶＧＳＣ遺伝子のイントロン−エクソン境界に広がる核酸は、前記ＶＧＳＣのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに選択的にハイブリダイズすることができない。
【００３３】
選択的なハイブリダイゼーションをもたらす、典型的な適度あるいは非常に厳密なハイブリダイゼーション条件は当分野でよく知られており、たとえば、参照により本明細書に組み込んである、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（ｅｄｓ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、ＵＳＡ中に記載された条件がある。
【００３４】
核酸がナイロン膜上に固定され、プローブの核酸が５００以上の塩基または塩基対であるときの、典型的なハイブリダイゼーション溶液の一例は以下のものである：
６ｘＳＳＣ（生理的食塩水、クエン酸ナトリウム）
０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）
１００μｇ／ｍｌの変性、分画したサケ精液のＤＮＡ
【００３５】
ハイブリダイゼーションは６８℃で行う。核酸を固定したナイロン膜は６８℃において１ｘＳＳＣで、あるいはさらに高い厳密度のために０．１ｘＳＳＣで洗浄することができる。
【００３６】
２０ｘＳＳＣは、以下の方法で調製することができる。１７５．３ｇのＮａＣｌおよび８８．２ｇのクエン酸ナトリウムを８００ｍｌのＨ２Ｏに溶かす。ＮａＯＨの１０Ｎ溶液数滴を用いて、ｐＨを７．０に調節する。Ｈ２Ｏを用いて、体積を１リットルに調節する。アリコートに分配する。オートクレーブ処理によって滅菌する。
【００３７】
核酸がナイロン膜上に固定され、プローブが１５個と５０個の間の塩基のオリゴヌクレオチドであるときの、典型的なハイブリダイゼーション溶液の一例は以下のものである：
３．０Ｍ塩化トリメチルアンモニウム（ＴＭＡＣｌ）
０．０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ ６．８）
１ｍｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ ７．６）
０．５％ＳＤＳ
１００μｇ／ｍｌの変性、分画したサケ精液のＤＮＡ
０．１脱脂粉乳
【００３８】
ハイブリダイゼーションの最適温度は、通常は所定の鎖長のＴｉより５℃低い温度を選択する。Ｔｉとは、プローブとその標的配列の間で形成されるハイブリッドの、不可逆的な融解温度である。Ｊａｃｏｂｓ他（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６、４６３７は、Ｔｉの決定を論じている。３Ｍ ＴＭＡＣｌ中の１７量体について奨励されているハイブリダイゼーション温度は４８−５０℃であり、１９量体については、それは５５−５７℃であり、２０量体については、それは５８−６６℃である。
【００３９】
「選択的にハイブリダイズする核酸」によって、以下でより詳細に記載するシステム、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの、よく知られている任意の増幅システムにより、前記ＶＧＳＣのｍＲＮＡからＤＮＡを増幅する核酸も含まれる。ＰＣＲ増幅に関する適切な条件は、以下の適切な１ｘ増幅用緩衝液中での増幅を含む：
１０ｘ増幅用緩衝液は５００ｍＭのＫＣＩである；１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．Ｃｌ（室温でｐＨ ８．３）；１５ｍＭ Ｍｇ Ｃｌ２；０．１％ゼラチン。
【００４０】
適切な変性剤または手順（９５℃に加熱するなど）を使用して、二本鎖ＤＮＡの鎖を分離する。
【００４１】
適切には、増幅のアニーリング部分は３７℃と６０℃の間、好ましくは５０℃である。
【００４２】
本発明の方法において有用である核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであってよいが、ＤＮＡが好ましい。本発明の方法において有用である核酸は二本鎖または一本鎖であってよいが、核酸の増幅反応などのいくつかの条件下では、一本鎖の核酸が好ましい。
【００４３】
本発明の方法において有用である核酸は、任意の適切なサイズであってよい。しかしながら、核酸が１００００個より少ない、より好ましくは１０００個より少ない、さらに好ましくは１０個から１００個、さらに好ましくは１５個から３０個の塩基対（核酸が二本鎖である場合）または塩基（核酸が一本鎖である場合）である場合、いくつかの診断、プローブまたは増幅目的には、その核酸が好ましい。以下により詳細に記載するように、ポリメラーゼ連鎖反応において使用するのに適した、一本鎖ＤＮＡのプライマーが特に好ましい。
【００４４】
本発明の方法において使用するための核酸は、前記ＶＧＳＣのｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸である。前記ＶＧＳＣ遺伝子の断片、および前記ＶＧＳＣ遺伝子によってコードされているｍＲＮＡから誘導可能なｃＤＮＡも、本発明の方法において使用するための好ましい核酸である。
【００４５】
本発明の方法において使用するための核酸がオリゴヌクレオチド・プライマーであり、これを使用して前記ＶＧＳＣ核酸、特にＶＧＳＣのｍＲＮＡの一部分増幅することができる場合、そのような核酸が特に好ましい。
【００４６】
ｈＮｅ−ＮａのｍＲＮＡは他のＶＧＳＣのｍＲＮＡと類似しているが、これらとは異なる。本発明において使用するための核酸は、２つ以上、たとえばＶＧＳＣのｍＲＮＡのすべて、ほぼすべて、または特定のサブセットにハイブリダイズすることができる。このことは、実施例１および２でさらに論じる。したがって、本発明において使用するための核酸は、ＶＧＳＣ間で保存されており、たとえばＶＧＳＣのすべて、ほぼすべて、または特定のサブセット中に同じアミノ酸配列を有するＶＧＳＣポリペプチドの領域をコードしている、ＶＧＳＣのｍＲＮＡの一部分にハイブリダイズすることができる。本発明において使用するのに好ましい核酸は、ｈＮｅ−ＮａのｍＲＮＡには選択的にハイブリダイズするが、他のＶＧＳＣのｍＲＮＡにはハイブリダイズしない核酸である。たとえば、核酸が前記ＶＧＳＣのｍＲＮＡにハイブリダイズし、他のＶＧＳＣのｍＲＮＡにはハイブリダイズしないかどうかを参照することによって、このような選択的にハイブリダイズする核酸を容易に得ることができる。
【００４７】
たとえば実施例１に記載した、方法および核酸を使用することができる。詳細には、たとえば実施例１に記載した、半定量的なＰＣＲ技法を使用することができる。
【００４８】
これらの方法は任意の癌に関して適切であるが、癌が前立腺の癌である場合は、その方法が好ましい。
【００４９】
癌が疑われる、すなわち癌が発見される可能性があるかあるいは発見されている組織のサンプルに核酸が由来する場合は、本発明の方法が好ましい。たとえば、癌が疑われる、すなわち癌が発見される可能性があるかあるいは発見されている組織が前立腺である場合、核酸を含むサンプルが患者の前立腺に由来する場合は、本発明の方法が好ましい。前立腺のサンプルは、手術による切除、腹腔鏡検査および生体組織検査、内視鏡検査および生体組織検査、および画像誘導生体組織検査によって得ることができる。超音波、テクネチウム−９９−標識した抗体、または前立腺に選択的に結合するかあるいはその位置を特定する抗体断片によって、画像を生み出すことができる。
【００５０】
患者に由来する核酸を含む任意のサンプルが本発明の方法において有用であるが、サンプルが前立腺組織、血液、尿または精液からなる群から選択される場合は、そのサンプルが好ましい。前立腺組織は、標準的な外科手術技法を使用して患者から得ることができる。前立腺に由来する細胞は、尿中および血液中で少数見られる。患者からの核酸を含むサンプルは、前立腺細胞などの患者の細胞であるか、あるいは患者の細胞に直接的に由来することが好ましいが、培養において増殖した細胞などの、患者に間接的に由来するサンプルも本発明中に含まれる。同様に、患者に由来する核酸は物理的に患者の内部に存在していた可能性があるが、あるいはその核酸は、患者の内部に物理的に存在していた核酸からコピーされた可能性がある。腫瘍組織は原発性の腫瘍から、あるいは転移物から取り出すことができ、詳細には腫瘍の縁から取り出すことができる。
【００５１】
癌に関する危険がある群の患者の前駆症状のスクリーニング用に、前述の方法を使用することができることは理解されるであろう。たとえば、約６０才を超える男性は、３５才未満の男性よりも前立腺癌の危険が高い可能性がある。同様に、本発明の方法を、前立腺腫瘍などの腫瘍を病理学的に分類するために使用することができる。
【００５２】
血液、精液、リンパ管循環物または尿が、患者に由来する核酸を含む前記サンプルの源である場合、そのサンプルを前立腺由来の組織または細胞用に富化することが好ましい。前立腺細胞用の富化は、前立腺に特異的な抗原（ＰＳＡ）を対象とする抗体などの前立腺選択的な抗体を使用する、たとえば蛍光活性型細胞の選別（ＦＡＣＳ）などの細胞選別法を使用して行うことができる。あるいは、磁気ビーズまたは他の固形担体、たとえばこのような前立腺に特異的な抗体、たとえば抗ＰＳＡ抗体で覆われたカラムを使用して、富化を行うことができる。前記サンプルの源はバイオプシー材料および腫瘍サンプルも含み、固定パラフィン封入標本、および新鮮であるかあるいは凍結された組織も含む。
【００５３】
好都合には、ｍＲＮＡなどの前記ヒト核酸に選択的にハイブリダイズすることができ、本発明の方法において使用する核酸は、検出可能な標識体をさらに含む。
【００５４】
「検出可能な標識体」によって、よく知られている方法を使用して核酸分子中に容易に取り込ませることができる、３２Ｐ、３３Ｐまたは３５Ｓなどの任意の好都合な放射性標識体が含まれる；核酸中に容易に取り込ませることができる、任意の好都合な蛍光または化学発光標識体も含まれる。さらに、「検出可能な標識体」という語は、他の部分（ストレプトアビジンとの結合によって検出することができるビオチンなど）との結合によって検出することができる部分；無色の化合物を有色の化合物に転換する能力、あるいはこの逆の能力によって検出することができる（たとえば、アルカリホスファターゼは無色のｏ−ニトロフェニルホスフェートを有色のｏ−ニトロフェノールに転換することができる）、酵素などの部分も含む。好都合には、核酸プローブは固定配列中のある位置を占めていてよく、核酸が前記ＶＧＳＣの核酸にハイブリダイズするかどうかは、固定配列中のハイブリダイゼーションの位置を参照することによって判定することができる。
【００５５】
ポリメラーゼ連鎖反応において使用するのに適したプライマー（ＰＣＲ；Ｓａｉｋｉ他（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９、４８７−４９１）が好ましい。適切なＰＣＲプライマーは、以下の諸性質を有していてよい：
【００５６】
オリゴヌクレオチドの５’端の配列は、増幅させる標的配列と一致している必要は無いことはよく知られている。
【００５７】
ＰＣＲプライマーは、特にその３’端には、２塩基より長い任意の互いに相補的な構造を含まないことが普通である。なぜならこの特徴は、「プライマー二量体」と呼ばれる人工的産物の形成を促進する可能性があるからである。２つのプライマーの３’端がハイブリダイズすると、これらは「プライマー化された鋳型」複合体を形成し、プライマーの伸張によって、「プライマー二量体」と呼ばれる短い重複産物がもたらされる。
【００５８】
プライマー中の内部二次構造は、回避すべきである。対称性ＰＣＲに関しては、いずれの塩基も長い伸張部を有していない両方のプライマーについて、４０−６０％のＧ＋Ｃ含有率がしばしば勧められる。ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションの研究に関して使用される、古典的な融解温度の計算によって、所定のプライマーは特定の温度でアニールするはずであり、あるいは７２℃という伸張温度によってプライマー／鋳型ハイブリッドが時期尚早に解離するであろうことがしばしば予測される。実際ハイブリッドは、単純なＴｍ計算によって一般的に予測するよりも、ＰＣＲ法において効果的である。
【００５９】
最適なアニーリング温度は経験的に決定することができ、予測した温度よりも高くてよい。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは３７−５５℃の領域で活性があり、したがってプライマーの伸張がアニーリング・工程中に起こり、ハイブリッドが安定化するであろう。プライマーの濃度は、従来の（対称性）ＰＣＲでは等しく、典型的には０．１−１μＭの範囲である。
【００６０】
ポリメラーゼ連鎖反応、ＱＢレプリカーゼおよびリガーゼ連鎖反応を含めた、任意の核酸増幅プロトコルを、本発明の方法において使用することができる。さらに、３ＳＲとも呼ばれるＮＡＳＢＡ（増幅に基づく核酸配列）をＣｏｍｐｔｏｎ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５０、９１−９２およびＡＩＤＳ（１９９３）、Ｖｏｌ ７（Ｓｕｐｐｌ，２）に記載されたように使用することができ、Ｓ１０８またはＳＤＡ（鎖置換増幅）をＷａｌｋｅｒ他（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０、１６９１−１６９６に記載されたように使用することができる。その簡潔性のために、ポリメラーゼ連鎖反応が特に好ましい。
【００６１】
本発明の１対の適切な核酸をＰＣＲにおいて使用するとき、ゲル電気泳動および臭化エチジウム染色によって、その産物を検出することが好都合である。ＤＮＡのアガロース・ゲル電気泳動および臭化エチジウム染色を使用し、ＤＮＡ増幅の産物を検出するための代替方法として、増幅させたＤＮＡにプローブとしてハイブリダイズすることができる、標識したオリゴヌクレオチド使用することが好都合である。増幅がＰＣＲによるものであるとき、オリゴヌクレオチド・プローブは、２つのプライマーによって定義される内部プライマー配列にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチド・プローブは、１０個と５０個の間のヌクレオチド長、より好ましくは１５個と３０個の間のヌクレオチド長である。プローブは、標準的な技法を使用して、３２Ｐ、３３Ｐおよび３５Ｓなどの放射性核種で標識することができ、あるいは蛍光染料で標識することができる。オリゴヌクレオチド・プローブを蛍光的に標識するとき、増幅させたＤＮＡ産物は溶液中で検出することができる（たとえば、Ｂａｌａｇｕｅｒ他（１９９１）「Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ａ ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｄｓｏｒｂｅｎｔ」Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９５、１０５−１１０およびＤｉｌｅｓａｒｅ他（１９９３）「Ａ ｈｉｇｈ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ」ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１５、１５２−１５７を参照のこと）。
【００６２】
ＰＣＲ産物は、プローブを使用して検出することもでき、プローブは蛍光体と抑制物質の対を有していてよく、または固形担体に結合してよく、またはビオチン・タグを有していてよく、あるいは捕獲プローブと検出プローブの組み合わせを使用して、ＰＣＲ産物を検出することができる。
【００６３】
蛍光体と抑制物質の対は、ＰＣＲ反応（たとえばＲＴ−ＰＣＲ）の定量測定に特に適している。適切なプローブを使用する蛍光性の分極化を使用して、ＰＣＲ産物を検出することもできる。
【００６４】
他の好ましい実施形態では、前記ＶＧＳＣタンパク質のレベルを測定する。前記タンパク質のレベルは、ｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣに選択的に結合する分子とタンパク質を接触させることによって、測定することが好ましい。
【００６５】
患者に由来するタンパク質を含むサンプルは、サンプル組織であることが好都合である。
【００６６】
患者に由来するタンパク質を含むサンプルは、癌が疑われる、すなわち癌が発見される可能性があるかあるいは発見されている組織のサンプルであることが好都合である。これらの方法は任意の癌に使用することができるが、これらは前立腺の癌に関して特に適切である。適切なサンプルを得る方法は、初期の方法に関して記載されている。
【００６７】
前記ＶＧＳＣタンパク質を検出することを含む本発明の方法は、腫瘍サンプルのパラフィン包埋切片を含むサンプルなどの歴史的なサンプルに関して特に有用である。
【００６８】
サンプル中の前記ＶＧＳＣタンパク質のレベルは、任意の適切な方法で判定することができる。実施例２には、ヒト前立腺の組織切片中での、ｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣのタンパク質を含めたＶＧＳＣタンパク質の検出を記載する。
【００６９】
ｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣに選択的に結合する分子が抗体である場合、それが特に好ましい。
【００７０】
ＶＧＳＣ、または特定の１つまたは複数の形のＶＧＳＣに選択的に結合することができる抗体は、たとえばペプチドを使用して作成することができ、これらのペプチドはすべてのＶＧＳＣ中あるいは特定のＶＧＳＣ中にそれぞれ保存されており、すなわち１つの形のＶＧＳＣと他の形のＶＧＳＣの間の相違点を含んでいる。
【００７１】
抗体はモノクローナルまたはポリクローナルであってよい。適切なモノクローナル抗体は、たとえばいずれも参照により本明細書に組み込んである、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ｈ Ｚｏｌａ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８８）および「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｊ Ｇ Ｒ Ｈｕｒｒｅｌｌ（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、１９８２）中に開示された、知られている技法によって作製することができる。
【００７２】
癌または転移の可能性を示す前記ＶＧＳＣのレベルは、知られている非癌性または非転移性前立腺細胞を超える、知られている癌性または転移性前立腺細胞中に存在する高いレベルとして定義することができる。そのレベルは、たとえば癌性細胞または転移性細胞中では少なくとも１．５倍高く、あるいはそのレベルは少なくとも２倍または３倍高い可能性がある。
【００７３】
「前記ＶＧＳＣタンパク質の相対量」によって、知られている正常な組織の単位質量当たり、あるいは正常な細胞の単位数当たりの前記ＶＧＳＣタンパク質の量と比較した、サンプル組織の単位質量当たり、あるいはサンプル細胞の単位数当たりの前記ＶＧＳＣタンパク質の量が意味される。この相対量は、任意の適切なタンパク質定量法を使用して決定することができる。詳細には、抗体を使用する場合は、定量的ウエスタン・ブロット法、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）または定量的免疫組織化学法を含めた方法を使用して、前記ＶＧＳＣタンパク質の量を決定することが好ましい。
【００７４】
抗体を生み出し精製するための他の技法は当分野ではよく知られており、任意のこのような技法を選択して、本発明で特許請求する方法において有用な調製物を得ることができる。本発明の好ましい実施形態では、抗体は溶液から前記ＶＧＳＣタンパク質を免疫沈降させ、さらにポリアクリルアミド・ゲルのウエスタン・ブロット法または免疫ブロット法で前記ＶＧＳＣタンパク質と反応する。他の好ましい実施形態では、免疫細胞化学的な技法を使用することによって、抗体がパラフィンまたは凍結組織切片中の前記ＶＧＳＣタンパク質を検出する。
【００７５】
前記ＶＧＳＣタンパク質を検出するための方法に関する好ましい実施形態には、モノクローナルおよび／またはポリクローナル抗体を使用するサンドウィッチ定量法を含めて、酵素結合免疫吸着定量法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫定量法（ＲＩＡ）、免疫放射定量法（ＩＲＭＡ）および免疫酵素定量法（ＩＥＭＡ）がある。代表的なサンドウィッチ定量法は、参照によりここに組み込んである米国特許第４，３７６，１１０号および４，４８６，５３０号中にＤａｖｉｄ他によって記載されている。
【００７６】
たとえば、抗原結合部位を有している抗体の断片または誘導体、一本鎖Ｆｖ断片（ＳｃＦｖ）およびドメイン抗体（ｄＡｂｓ）などの合成型の抗体様の分子、および抗体様の抗原結合モチーフを有する他の分子を含めた他の抗体様の分子を、本発明の方法において使用することができることは理解されるであろう。
【００７７】
他の実施形態では、サンプル中でのその活性を選択的に定量することによって、ｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣのレベルを測定する。サンプル中でのＶＧＳＣ、たとえばｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣの活性はバイオプシーを単細胞に解離させ、培養中に（ｉ）細胞の死亡率に対するＮａ＋チャネル遮断物質の影響を定量し、（ｉｉ）電気生理学的な記録によってＮａ＋チャネル活性を検出することによって定量することができる。
【００７８】
本発明の好ましい診断法には、「侵襲性の」方法および「非侵襲性の」方法として広義に記載することができる方法がある。たとえば侵襲性の方法には、たとえば（ａ）配列特異的な抗体を免疫組織化学的に適用すること、（ｂ）組織切片上でのｉｎ ｓｉｔｕのＰＣＲ、または（ｃ）バイオプシーから上皮細胞を分離した後の上皮細胞の逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲによる、Ｎａ＋チャネルの発現を検出するためのバイオプシーの採取がある。非侵襲性の方法は、尿、精液または血液から前立腺由来の細胞を得ることを含み、これらの細胞はＰＳＡに対する親和性によって分離することができ、ＰＣＲによりＮａ＋チャネルの発現について定量することができる。
【００７９】
本発明の他の態様では、癌を診断するための試薬の製造における、サンプル中のｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルのタンパク質または核酸のレベルを判定する際に使用することができる薬剤の使用を提供する。この薬剤は適切には、ｈＮｅ−ＮａのＶＧＳＣ核酸に選択的にハイブリダイズする核酸であってよく、あるいはこの薬剤はｈＮｅ−ＮａのＶＧＳＣタンパク質に選択的に結合する分子であってよく、あるいはこの薬剤はｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣの活性を選択的に定量する際に有用な薬剤であってよい。
【００８０】
したがって定義する薬剤は、癌を診断する方法において有用である。
【００８１】
本発明の他の態様は、癌、特に前立腺癌を診断するのに有用なパーツのキットであって、サンプル中のｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣのタンパク質または核酸のレベルを判定する際に使用することができる薬剤を含むキットを含む。この薬剤は、ｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣの核酸に選択的にハイブリダイズする核酸であってよく、あるいはこの薬剤はｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣのタンパク質に選択的に結合する分子であってよく、あるいはこの薬剤はｈｅＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣの活性を選択的に定量する際に有用な薬剤であってよい。
【００８２】
このキットは、ｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣの核酸またはタンパク質を含むコントロール・サンプルをさらに含むことが好ましく、そのコントロール・サンプルは陰性コントロール（癌または癌が転移する可能性が高いこととは関連がない、一定レベルのＶＧＳＣタンパク質または核酸を含む）であってよく、あるいはサンプルは陽性コントロール（癌または癌が転移する可能性が高いこと関連がある、一定レベルのＶＧＳＣタンパク質または核酸を含む）であってよい。キットは陰性コントロールと陽性コントロールの両方を含んでよい。有用なことにキットは、異なる量に対応するｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣのタンパク質または核酸を含むことができ、したがって、検量線を作成することができる。
【００８３】
キットは、サンプルから前立腺の上皮細胞を分離して前記ＶＧＳＣの定量法を行うための、手段を含むことが適切である。前立腺の上皮細胞を分離するための手段は、抗ＰＳＡ抗体で覆われたミクロのビーズまたはカラムを含むことが好ましい。
【００８４】
本発明の他の態様は、癌を治療するための方法であって、ｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの機能を選択的に妨げる薬剤を患者に投与する工程を含む方法を提供する。
【００８５】
当業者には明らかであるように、「妨げる」という語は、機能を部分的に妨げること、すなわち機能を低下させることを含む。したがって薬剤の影響は、観察する機能の低下、好ましくは著しい低下として現れてよい。
【００８６】
「ｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣの機能を選択的に妨げる薬剤」によって、（ａ）前記ＶＧＳＣの発現を阻害するか、あるいは（ｂ）前記ＶＧＳＣの活性を阻害する薬剤を含むものとする。
【００８７】
ｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣの機能を妨げる薬剤は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）のアンタゴニスト（そのアンタゴニストは、ＥＧＦまたはその受容体（ＥＧＦＲ）と反応性がある抗体であってよい）、および他の増殖因子（たとえば神経増殖因子）、およびホルモン（アンドロゲンを含めて）のアンタゴニスト（そのアンタゴニストも同様に抗体であってよい）を含んでよい。したがって、実施例４で論じるように、ＥＧＦ受容体キナーゼ阻害物質またはＥＧＦ受容体の抗体は、前立腺癌の細胞系のＶＧＳＣの機能（それは主にｈＮｅ−Ｎａ）を阻害することができる。これらの薬剤は、ｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣの発現を妨げる薬剤として働くことができる。
【００８８】
ＥＧＦのアンタゴニストは、ＥＧＦ受容体の細胞外結合ドメインを対象とするモノクローナル抗体（たとえばｃｅｔｕｘｉｍａａｂ［［ＩＭＣ−Ｃ２２５］］；Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ（ＨＥＲ２受容体（ヒトＥＧＦ受容体２）に結合するモノクローナル抗体；ＥＧＦ受容体キナーゼ阻害物質、たとえばＯＳＩ−７７４、ＰＤ１８２９０５、ＰＫＩ−１６６、ＣＩ−１０３３またはＺＤ１８３９を含んでよい。
【００８９】
前記ＶＧＳＣの発現を妨げる薬剤には、アンチセンス薬剤およびリボザイムがあるが、これらだけには限られない。
【００９０】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドは一本鎖の核酸であり、相補的な核酸配列に特異的に結合することができる。適切な標的配列に結合することによって、ＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡ、またはＲＮＡ−ＤＮＡ二量体が形成される。これらの核酸は、しばしば「アンチセンス」と呼ばれる。なぜなら、これらの核酸は、遺伝子のセンスまたはコード鎖と相補的だからである。近年、オリゴヌクレオチドがＤＮＡ二量体に結合する、三重らせんの形成が可能であることが証明されている。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ二重らせんの主要な溝中の配列を認識できることが発見された。したがって三重らせんが形成された。このことは、主要な溝、水素結合部位を認識することによって二本鎖ＤＮＡに特異的に結合する、配列特異的な分子を合成することが可能であることを示唆している。
【００９１】
標的核酸に結合することによって、前述のオリゴヌクレオチドは、その標的核酸の機能を阻害することができる。このことは、たとえば転写、プロセッシング、ポリ（Ａ）付加、複製、翻訳を遮断し、あるいはＲＮＡの分解を促進するなど、細胞を阻害する機構を促進する結果となる可能性がある。
【００９２】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドを研究室で作製し、次いでたとえばマイクロ・インジェクション、または細胞培養基から細胞への取り込みによって細胞中に導入し、あるいはプラスミドまたはアンチセンス遺伝子を運ぶ他のベクターを用いたトランスフェクション後に、細胞中で発現させる。アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ラオス肉腫ウイルス、水疱性口炎ウイルス、単純ヘルペス・ウイルスのタイプ１、シミアン・ウイルスおよびインフルエンザ・ウイルスに関しては、細胞培養中にウイルスの複製または発現を阻害することが最初に発見された。その時以来、アンチセンス・オリゴヌクレオチドによるｍＲＮＡ転写の阻害が、ウサギ網状赤血球の溶解産物および小麦麦芽抽出物を含めた、細胞が入り込んでいない系において、詳細にわたって研究されている。アンチセンス・オリゴヌクレオチドによるウイルス機能の阻害は、ＡＩＤＳ ＨＩＶレトロウイルスのＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチドを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実証されている（Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｊ．１９８８「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８５（１５）、５５０７−１１）。Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄの研究によって、最も有効であったオリゴヌクレオチドはポリ（Ａ）シグナルと相補的であり、ＲＮＡの５’端、特にプライマー結合部位の隣のキャップおよび５’非翻訳領域、およびプライマー結合部位で標的化された、オリゴヌクレオチドも有効であったことが示された。キャップ、５’非翻訳領域、およびポリ（Ａ）シグナルは、レトロウイルスＲＮＡ（Ｒ領域）の端部で繰り返される配列中に存在し、これらと相補的であるオリゴヌクレオチドはＲＮＡに二回結合することができる。
【００９３】
オリゴヌクレオチドは、細胞内生ヌクレアーゼによって分解作用を施されるか、あるいは不活性化させられる。この問題に対抗するために、たとえば内部ヌクレオチド結合が変わっており、元来存在するリン酸ジエステル結合が他の結合で置換されている修飾オリゴヌクレオチドを使用することが考えられる。たとえば、Ａｇｒａｗａｌ他（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５、７０７９−７０８３は、アミドリン酸オリゴヌクレオチドおよびチオリン酸オリゴヌクレオチドを使用して、ＨＩＶ−１の組織培養の阻害が増大することを示した。Ｓａｒｉｎ他（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５、７４４８−７４５１は、メチルリン酸オリゴヌクレオチドを使用して、ＨＩＶ−１の阻害が増大することを実証した。
【００９４】
Ａｇｒａｗａｌ他（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６、７７９０−７７９４は、ヌクレオチド配列に特異的なチオリン酸オリゴヌクレオチドを使用して、初期感染および慢性的に感染した細胞培養物において、ＨＩＶ−１の複製が阻害されることを示した。Ｌｅｉｔｈｅｒ他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７、３４３０−３４３４は、チオリン酸オリゴヌクレオチドによる組織培養物中のインフルエンザ・ウイルスの複製の阻害を報告している。
【００９５】
人工的な結合を有するオリゴヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｖｏでの分解に耐性があることが示されている。たとえば、Ｓｈａｗ他（１９９１）は、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９、７４７−７５０は、これ以外の非修飾型オリゴヌクレオチドが、あるキャップ構造によって３’端で遮断されるとき、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてヌクレアーゼに対してより耐性になり、非キャップ構造のチオリン酸オリゴヌクレオチドはｉｎ ｖｉｖｏでは分解されないことを報告している。
【００９６】
チオリン酸オリゴヌクレオチドを合成するためのＨ−ホスホン酸（塩）手法の詳細な記載は、参照によりその教示を本明細書に組み込んである、ＡｇｒａｗａｌおよびＴａｎｇ（１９９０）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３１、７５４１−７５４４中に提供されている。メチルリン酸オリゴヌクレオチド、ジチオリン酸（塩）、アミドリン酸（塩）、リン酸エステル、架橋アミドリン酸（塩）および架橋チオリン酸（塩）の合成は、当分野で知られている。たとえば、参照によりその教示を本明細書に組み込んである、ＡｇｒａｗａｌおよびＧｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８、３５３９；Ｎｉｅｌｓｅｎ他（１９８８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２９、２９１１；Ｊａｇｅｒ他（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７、７２３７；Ｕｚｎａｎｓｋｉ他（１９８７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２８、３４０１；Ｂａｎｎｗａｒｔｈ（１９８８）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．７１、１５１７；ＣｒｏｓｓｔｉｃｋおよびＶｙｌｅ（１９８９）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０、４６９３；Ａｇｒａｗａｌ他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７、１４０１−１４０５を参照のこと。合成または生成のための他の方法も考えられる。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であるが、リボ核酸（ＲＮＡ）配列も合成かつ適用することができる。
【００９７】
本発明において有用なオリゴヌクレオチドは、内生の仁の酵素による分解に耐性があるように設計することが好ましい。ｉｎ ｖｉｖｏでのオリゴヌクレオチドの分解によって、長さが減少したオリゴヌクレオチド分解産物が生成する。このような分解産物は、その完全長の相対物と比べて、非特異的なハイブリダイゼーションに携わる可能性が高く、有効である可能性は低い。したがって、身体中での分解に耐性があり、標的細胞に達することができるオリゴヌクレオチドを使用することが望ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の内部の人工的な内部ヌクレオチド結合を本来のリン酸ジエステル結合に置換することによって、たとえば結合中のリン酸をイオウで置き換えることによって、ｉｎ ｖｉｖｏでの分解により耐性があるようにすることができる。使用することができる結合体の例には、チオリン酸（塩）、メチルリン酸（塩）、スルホン、硫酸（塩）、ケチル、ジチオリン酸（塩）、さまざまなアミドリン酸（塩）、リン酸エステル、架橋チオリン酸（塩）および架橋アミドリン酸（塩）がある。これらの例は例示的なものであり、制限的なものではない。なぜなら、他の内部ヌクレオチド結合が当分野で知られているからである。たとえば、Ｃｏｈｅｎ、（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを参照のこと。リン酸ジエステル内部ヌクレオチド結合に置換された、１つまたは複数のこれらの結合を有するオリゴヌクレオチドの合成は、混合型の内部ヌクレオチド結合を有するオリゴヌクレオチドを生成するための合成経路を含めて、当分野でよく知られている。
【００９８】
オリゴヌクレオチドは、「キャップ化」、すなわち類似の基を５’または３’末端のヌクレオチドに取り込ませることによって、内生酵素による伸張に耐性があるようにすることができる。キャップ化用の試薬は、Ａｍｉｎｏ−Ｌｉｎｋ ＩＩ（商標）としてＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡから市販されている。キャップ化するための方法は、たとえば、参照によりその教示を本明細書に組み込んである、Ｓｈａｗ他（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９、７４７−７５０およびＡｇｒａｗａｌ他（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８（１７）、７５９５−７５９９によって記載されている。
【００９９】
オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼの攻撃に耐性があるようにする他の方法は、参照により本明細書に組み込んであるＴａｎｇ他（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１、２７２９−２７３５によって記載されたように、オリゴヌクレオチドを「自己安定型」にすることである。自己安定型のオリゴヌクレオチドは、その３’端にヘアピン・ループ構造を有しており、ヘビ毒のホスホジエステラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびウシ胎児血清による分解に対してより高い耐性を示す。オリゴヌクレオチドの自己安定型の領域は、ハイブリダイゼーション中に相補的な核酸を害することはなく、マウスにおける薬物動態および安定性の研究によって、自己安定型のオリゴヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏでのより高い残存率が、その線状の相対物に対して示されている。
【０１００】
本発明にしたがって、塩基対に特徴的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドの固有の結合特異性を、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてアンチセンス化合物をその目的とする遺伝子座へ利用することを制限することによって高めることができ、これによって使用する用量を少なくすることができ、全身性の影響を最小限にする。したがって、オリゴヌクレオチドを局所的に施用して、望ましい効果を得る。所望の遺伝子座におけるオリゴヌクレオチドの濃度は、オリゴヌクレオチドを全身に投与する場合はより高くなり、非常に少ない合計量を使用して治療効果を得ることができる。オリゴヌクレオチドの局所的な高濃度によって標的細胞の侵入性が高まり、標的核酸配列の翻訳を効果的に遮断する。
【０１０１】
薬剤を局所的に投与するのに適した任意の手段によって、オリゴヌクレオチドを遺伝子座に送達することができる。たとえば、オリゴヌクレオチドの溶液を部位に直接注射することができるか、あるいは注入ポンプを使用する注入によって送達することができる。オリゴヌクレオチドを植え込み用デバイス中に取り込ませることもでき、これを所望の部位に置くと、オリゴヌクレオチドが周囲の遺伝子座に放出される。
【０１０２】
オリゴヌクレオチドは、ヒドロゲル材料を介して投与することができる。ヒドロゲルは不燃性かつ生物分解性である。天然および合成ポリマーから作成された材料を含めた、多くのこのような材料が現在知られている。好ましい実施形態では本発明の方法は、体温未満では液体であるが、体温付近では形状保持されている半固体ヒドロゲルを形成するためのゲルである、ヒドロゲルを利用する。好ましいヒドロゲルは、エチレンオキシド−プロピレンオキシド繰り返し単位のポリマーである。ポリマーの性質は、ポリマーの分子量、およびポリマー中のポリエチレンオキシドとポリプロピレンオキシドの相対的なパーセンテージに依存する。好ましいヒドロゲルは、約１０〜約８０重量％のエチレンオキシド、および約２０〜約９０重量％のプロピレンオキシドを含む。特に好ましいヒドロゲルは、約７０％のポリエチレンオキシド、および３０％のポリプロピレンオキシドを含む。使用することができるヒドロゲルは、たとえばＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪからＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）の商用名で入手可能である。
【０１０３】
この実施形態では、ヒドロゲルは液体状態に冷却し、オリゴヌクレオチドをこの液体に混合し、ヒドロゲル１グラム当たり約１ｍｇのオリゴヌクレオチド濃度にする。次いで生成した混合物を、たとえばカテーテルまたは内視鏡による手順を使用し、手術中にスプレーまたは塗布することによって、処理する表面に施用する。ポリマーが暖まると、それは凝固してゲルを形成し、ゲルそのものの組成によって定義される一定の時間で、オリゴヌクレオチドはゲルから周囲の細胞に拡散する。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドは、リポソーム、マイクロ・カプセルおよび植え込み用デバイスを含めた、市販されているかあるいは科学文献中に記載されている他のインプラントによって投与することができる。たとえば、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリグリコール酸およびこれらのコポリマー、コラーゲン、およびタンパク質ポリマーなどの生物分解性材料、またはエチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）、ポリ酢酸ビニル、エチレンビニルアルコール、およびこれらの誘導体などの非生物分解性材料でできているインプラントを使用して、オリゴヌクレオチドを局所的に送達することができる。オリゴヌクレオチドは、材料中に取り込ませることができる。なぜならそれは、溶融体または溶媒の蒸発技法を使用して重合または凝固し、材料と機械的に混合することができるからである。一実施形態では、デキストランでコーティングされたシリカ・ビーズ、ステント、またはカテーテルなどの植え込み用デバイスのコーティングに、オリゴヌクレオチドを混合あるいは施用する。ポリマー状のナノ粒子／生物分解性薬剤の担体を使用することもできる（Ｍａｄｅｒ（１９９８）Ｒａｄｉｏｌ、Ｏｎｃｏｌ．３２、８９−９４）。
【０１０５】
オリゴヌクレオチドの用量は、オリゴヌクレオチドのサイズ、およびそれを投与する目的に依存する。一般にその範囲は、治療する組織の表面積に基づいて計算する。オリゴヌクレオチドの有効な用量は、オリゴヌクレオチドの長さおよび化学的組成にある程度は依存するが、一般には組織表面積の１平方センチメートル当たり約３０〜３０００μｇの範囲である。
【０１０６】
オリゴヌクレオチドは、治療および予防の両方の目的で、患者に全身的に投与することができる。オリゴヌクレオチドは、たとえば非経口的な（たとえば静脈内、皮下、筋肉内に）任意の有効な方法、あるいは経口的、鼻用または他の手段によって投与することができ、このことによってオリゴヌクレオチドが患者の血液流に接近し、その中で循環することができる。全身に投与されるオリゴヌクレオチド、および局所投与しなくても有用性がある局所的に投与されるオリゴヌクレオチドが与えられることが好ましい。一般に、ヒト成人への１回の投与当たり約０．１〜約１０グラムの範囲の用量が、この目的のためには有効であろう。
【０１０７】
アンチセンス・オリゴヌクレオチドを前立腺に向けることが望ましいであろうことは理解されるであろう。このことは、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを前立腺に投与することによって行うことができるか、あるいはアンチセンス・オリゴヌクレオチドを前立腺に選択的に向ける分子と関連がある、アンチセンス・オリゴヌクレオチドを使用して行うことができる。たとえば、アンチセンス・オリゴヌクレオチドは、ＰＳＡなどの前立腺関連の抗原に選択的に結合する、抗体または抗体様の分子と関連があってよい。「関連がある」によって、アンチセンス・オリゴヌクレオチドと前立腺を対象とする物体は非常に関連があり、前立腺を対象とする物体はアンチセンス・オリゴヌクレオチドを前立腺細胞に向かわせることができることを意味する。
【０１０８】
アンチセンス薬剤は、より大きな分子、たとえば前記ＶＧＳＣのｍＲＮＡまたは遺伝子に結合し、前記ＶＧＳＣのｍＲＮＡまたは遺伝子の発現を実質的に妨げ、前記ＶＧＳＣタンパク質の発現を実質的に妨げる、約百個から数百個の塩基も含むことは理解されるであろう。したがって、前記ＶＧＳＣのｍＲＮＡと実質的に相補的であるアンチセンス分子の発現は、本発明の一部として想定される。
【０１０９】
したがって、この手法では一般に、（ｉ）ｈＮｅ−Ｎａチャネルまたは（ｉｉ）ＶＧＳＣの特異敵領域に対するアンチセンス配列を有する合成オリゴヌクレオチドを投与して、チャネルの活性を遮断する。個々の合成オリゴヌクレオチドの詳細は、実施例２で与える。アンチセンス・オリゴヌクレオチド技術が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでカリウム・チャネルを操作するため（Ｒｏｙ他（１９９６）Ｇｌｉａ １８、１７４−１８８）、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでＶＧＳＣを操作するため（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ（１９９７）２３４、２３５−２４１）、さらに神経の痛みを遮断する際に（Ｌａｉ他（１９９９）「Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｎｅｕｒｏｐａｔｈｉｃ ｐａｉｎ ｂｙ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｓｏｄｉｕｍ ｃｈａｎｎｅｌｓ ｉｎ ｓｅｎｓｏｒｙ ｎｅｕｒｏｎｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ３１４、２０１−２１３）既に使用されていることは注目すべきことである。
【０１１０】
前記ＶＧＳＣの活性を遮断するための他の方法には、優勢ネガティブ抑制法がある。この技法では、突然変異したＶＧＳＣ遺伝子の産物は、対応する正常な遺伝子の産物の活性を、これら２つが同時に発現するとき抑制するか失わせる。４つのαサブユニットを含む電位依存性カリウム・チャネル（ＶＧＰＣ）の場合、充分に切断された遺伝子の産物を利用するこのような手法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＶＧＰＣの機能的発現（Ｔｕ他（１９９５）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．６８、１４７−１５６）、およびｉｎ ｖｉｖｏでの発現（Ｌｏｎｄｏｎ他（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５、２９２６−２９３１）を抑制するために、首尾よく使用されている。切断されたサブユニットは、他のＶＧＰＣサブユニットに結合することができるが、チャネル機能に必要とされる残基は含んでいない。したがって、「組み合わさった」ＶＧＰＣの活性は遮断される。天然に存在し他の方法で接合しているチャネル・サブユニットのいくつかが検出されており、これらはｉｎ ｖｉｖｏでの類似の機構によって、ＶＧＰＣの活性を抑制するために機能することができる（Ｂａｕｍａｎｎ他（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６、３４１９−３４２９；Ｋａｍｂ他（１９８８）Ｎｅｕｒｏｎ １、４２１−４３０；およびＰａｎｇｓ他（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ、７、１０８７−１０９６）。機能性チャネルの形成を害することによって、ＶＧＳＣを同様に抑制することができると考えられる。ＶＧＳＣは１つのαサブユニット（４つの機能性ドメインを含む）から形成されるが、近年の研究によって、優勢ネガティブ方式で働いてＶＧＳＣの活性を調節する可能性があるわずか２つのドメインを有する、切断型ＶＧＳＣタンパク質が特異的な発現をすること（ヒト、マウスおよび魚類の発生中に）が実証されている（Ｐｌｕｍｍｅｒ他（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２、２４００８−２４０１５；およびＯｈ ａｎｄ Ｗａｘｍａｎ（１９９８）ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ９、１２６７−１２７１）。
【０１１１】
より大きな分子は、以下に記載するように任意の適切な遺伝子構築体から発現させ、患者に送達することができる。典型的には、アンチセンス分子を発現する遺伝子構築体は、前記ＶＧＳＣのｃＤＮＡの少なくとも一部分、または癌性であるかあるいは癌性になる可能性がある細胞中、好ましくは前立腺癌中で、アンチセンス分子を発現させることができるプロモーターに動作可能に連結した遺伝子を含む。
【０１１２】
遺伝子構築体はＤＮＡまたはＲＮＡであってよいが、構築体がＤＮＡである場合はそれが好ましい。
【０１１３】
遺伝子構築体は、ヒト細胞への送達用に適合させることが好ましい。
【０１１４】
遺伝子構築体を動物の身体の細胞中に導入する手段および方法は、当分野で知られている。たとえば本発明の構築体は、任意の好都合な方法、たとえばレトロウイルスに関する方法によって腫瘍細胞中に導入することができ、その結果、構築体が腫瘍細胞のゲノム中に挿入される。たとえばＫｕｒｉｙａｍａ他（１９９１）Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｕｃ．ａｎｄＦｕｎｃ．１６、５０３−５１０では、精製したレトロウイルスを投与している。レトロウイルスによって、癌細胞を選択的に感染する可能性のある手段がもたらされる。なぜなら、レトロウイルスは分裂している細胞のゲノムにのみ組み込むことができ、癌の周囲の大部分の正常な細胞は細胞増殖の静止、非受容段階にあるか、あるいは少なくとも腫瘍細胞よりはるかに遅く分裂しているからである。前記アンチセンス薬剤をコードするレトロウイルスのＤＮＡ構築体は、当分野でよく知られている方法を使用して作成することができる。このような構築体から活性のあるレトロウイルスを生成するためには、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコの改質型イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させた、エコトロンｐｓｉ２パッケージング細胞系を使用することが普通である。細胞系のトランスフェクションは、リン酸カルシウムの共沈殿によることが好都合であり、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度までＧ４１８を加えることによって、安定性のある形質転換体を選択する（レトロウイルスの構築体がｎｅｏ（登録商標）を含むと仮定する）。独立したコロニーを単離し広げ、培養物の上澄みを除去し、０．４５μｍの孔サイズのフィルタを通して濾過し、−７０°で保存する。レトロウイルスを腫瘍細胞中に導入するためには、１０μｇ／ｍｌのポリブレンを加えたレトロウイルス上澄み液を直接注射することが好都合である。直径が１０ｍｍを超える腫瘍については、０．１ｍｌと１ｍｌの間、好ましくは０．５ｍｌのレトロウイルス上澄み液を注射することが適切である。
【０１１５】
あるいは、Ｃｕｌｖｅｒ他（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６、１５５０−１５５２中に記載されたように、レトロウイルスを生成する細胞を、腫瘍に注射する。このように導入したレトロウイルス生成細胞を工学処理して、レトロウイルスのベクターの粒子を活発に生成させ、その結果ベクターの連続的な生成が、腫瘍塊中においてｉｎ ｓｉｔｕで起こった。このように、増殖している腫瘍細胞は、レトロウイルスのベクターを生成する細胞と混合する場合、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて首尾よく形質導入することができる。
【０１１６】
標的レトロウイルスは、本発明で使用するために利用することもできる。たとえば、特異的な結合親和性を与える配列は、先在するウイルスのｅｎｖ遺伝子中において工学処理することができる（遺伝子治療用のこのベクターおよび他の標的ベクターの概要に関する、Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｖｉｌｅ（１９９５）、Ｆａｓｅｂ Ｊ．９、１９０−１９９を参照のこと）。
【０１１７】
他の方法は、細胞中で限られた時間発現させるため、あるいはさらに長い時間をかけたその後のゲノムへの組み込みのための、構築体の細胞への単純な送達を含む。後者の手法の一例は、リポソーム（腫瘍細胞を標的とすることが好ましい）を含む（Ｎａｓｓａｎｄｅｒ他（１９９２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２、６４６−６５３）。
【０１１８】
免疫リポソーム（抗体に向けられるリポソーム）は、癌細胞タイプを標的化する際に特に有用であり、免疫リポソームは細胞表面のタンパク質を過剰発現させ、そのために抗体が利用可能である。たとえば、以下でさらに論じるように、前記ＶＧＳＣに結合する抗体によって、免疫リポソームを標的化することができる。免疫リポソームを作製するために、ＭＰＢ−ＰＥ（Ｎ−［４（ｐ−マレイミドフェニル）ブチリル］−ホスファチジルエタノールアミン）を、Ｍａｒｔｉａｎ ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７、２８６−２８８の方法に従って合成する。ＭＰＢ−ＰＥをリポソームの二重層中に取り込ませて、抗体、またはその断片をリポソーム表面に共有結合させる。リポソームは、標的細胞に送達するため、本発明のＤＮＡまたは他の遺伝子構築体と共に装入することが好都合であり、たとえばこれは、ＤＮＡまたは他の遺伝子構築体の溶液中で前記リポソームを形成し、次に０．８Ｍｐａまでの窒素圧の下で０．６μｍおよび０．２μｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜フィルタを介した一連の押し出しによる。押し出し後、８００００ｘｇで４５分間の超遠心分離によって、遊離ＤＮＡ構築体から捕捉ＤＮＡ構築体を分離する。酸素除去した緩衝液中で新たに作製したＭＰＢ−ＰＥ−リポソームを、新たに作製した抗体（またはその断片）と混合させ、一定に際限なく一晩攪拌しながら、４℃において窒素雰囲気中で結合反応を行う。８００００ｘｇで４５分間の超遠心分離によって、結合していない抗体から免疫リポソームを分離する。免疫リポソームは腹膜内に、あるいは腫瘍に直接注射することができる。
【０１１９】
他の送達の方法には、抗体−ポリリシン架橋を介して外部ＤＮＡを運ぶアデノウイルス（Ｃｕｒｉｅｌ Ｐｒｏｇ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．４０、１−１８を参照のこと）、および担体としてのトランスフェリン−ポリカチオン結合体（Ｗａｇｎｅｒ他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｌ．ＵＳＡ ８７、３４１０−３４１４）がある。これらの第１の方法では、本発明のＤＮＡ構築体または他の遺伝子構築体と共にポリカチオン−抗体の複合体が形成され、この抗体は野生型アデノウイルスまたは変異体アデノウイルスのいずれかに特異的であり、抗体に結合する新しいエピトープが導入されている。ポリカチオン部分は、リン酸バックボーンとの静電的相互作用によってＤＮＡに結合する。アデノウイルスは不変の繊維およびペントン・タンパク質を含んでいるため、細胞に内在化し、それを有する細胞中に本発明のＤＮＡ構築体を運ぶ。ポリカチオンがポリリシンである場合は、それが好ましい。
【０１２０】
ＤＮＡはアデノウイルスによって送達することができ、たとえば以下に記載するように、ＤＮＡはアデノウイルス粒子中に存在する。
【０１２１】
これらの第２の方法では、受容体仲介型のエンドサイトーシスを使用してＤＮＡの巨大分子を細胞中に運ぶ、非常に効率の良い核酸送達系を使用する。この方法は、イオン輸送タンパク質、トランスフェリンを核酸に結合するポリカチオンに結合させることによって行う。ヒトのトランスフェリン、またはニワトリの相同体コンアルブミン、またはこれらの組み合わせは、ジスルフィド結合を介して、小さなＤＮＡ結合タンパク質であるプロタミン、またはさまざまなサイズのポリリシンに共有結合する。これらの改変型トランスフェリン分子は、それらの同族の受容体に結合し、細胞中への効率の良いイオン輸送を仲介する、その能力を維持している。トランスフェリン−ポリカチオン分子は、核酸のサイズ（短いオリゴヌクレオチドから２１キロベース対のＤＮＡまで）に関係なく、本発明のＤＮＡ構築体または他の遺伝子構築体と共に電気泳動的に安定した複合体を形成する。トランスフェリン−ポリカチオンと本発明のＤＮＡ構築体または他の遺伝子構築体の複合体を腫瘍細胞に供給すると、細胞中の構築体からの高レベルの発現が予想される。
【０１２２】
Ｃｏｔｔｅｎ他（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９、６０９４−６０９８の方法によって生成された、欠陥性または化学的に不活性化されたアデノウイルス粒子のエンドゾーム破壊活性を使用する、本発明のＤＮＡ構築体または他の遺伝子構築体の、非常に効率の良い受容体仲介型の送達を使用することもできる。この手法は、アデノウイルスを適合させて、リソソームを通過させずにエンドゾームからそれらのＤＮＡを切り離すことができ、たとえば本発明のＤＮＡ構築体または他の遺伝子構築体に連結したトランスフェリンの存在下では、アデノウイルス粒子と同様の経路で、細胞により構築体が取り込まれるという事実を利用するものであるようである。
【０１２３】
この手法には、複合レトロウイルス構築体を使用する必要がない、レトロウイルス感染と共に起こるゲノムの恒久的改変がない、さらに標的発現系が標的送達系と結びつき、これによって他の細胞タイプに対する毒性が低下するという利点がある。
【０１２４】
遺伝子構築体を含む適切な送達媒体を、一定時間で腫瘍に局所的にまき散らすことが望ましい可能性がある。追加的あるいは代替的に、送達媒体または遺伝子構築体を、接近可能な腫瘍に直接注射することができる。
【０１２５】
「裸のＤＮＡ」およびカチオン性および中性脂質と複合体形成したＤＮＡも、本発明のＤＮＡを治療する患者の細胞中に導入する際に、有用である可能性があることは理解されるであろう。遺伝子治療のための非ウイルス的な手法は、Ｌｅｄｌｅｙ（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６、１１２９−１１４４中に記載されている。
【０１２６】
ＷＯ９４／１０３２３中に記載された改変型アデノウイルス系などの、代替的な標的送達系も知られており、典型的にはＤＮＡは、アデノウイルス、またはアデノウイルス用の粒子内に運ばれる。Ｍｉｃｈａｅｌ他（１９９５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２、６６０−６６８は、細胞選択的な部分を繊維タンパク質に加えるためのアデノウイルスの改変を記載している。Ｂｉｓｃｈｏｆｆ他（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４、３７３−３７６中に記載されたアデノウイルスなどの、ｐ５３欠失型ヒト腫瘍細胞中で選択的に複製する突然変異体アデノウイルスも、本発明の遺伝子構築体を細胞に送達するために有用である。したがって、本発明の他の態様が、本発明の遺伝子構築体を含むウイルス、またはウイルス用の粒子を提供することは理解されるであろう。他の適切なウイルス、またはウイルス用の粒子にはＨＳＶ、ＡＡＶ、ワクシニアウイルスおよびパルボウイルスがある。
【０１２７】
他の実施形態では、ｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣの機能を選択的に妨げる薬剤は、標的とするＶＧＳＣ ＲＮＡまたはＤＮＡを切断することができるリボザイムである。前記リボザイムを発現する遺伝子は、アンチセンス分子の場合とほぼ同じ方法で、ほぼ同じ媒体を使用して投与することができる。
【０１２８】
本明細書で開示した、ウイルスまたはウイルス様の粒子のゲノム中にコードすることができるリボザイムは、Ｃｅｃｈ ａｎｄ Ｈｅｒｓｃｈｌａｇ「Ｓｉｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ」米国特許第５，１８０，８１８号、Ａｌｔｍａｎ他「Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ｔａｒｇｅｔｅｄ ＲＮＡ ｂｙ ＲＮＡｓｅ Ｐ」米国特許第５，１６８，０５３号、Ｃａｎｔｉｎ他「Ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ ＨＩＶ−１ ＲＮＡ」米国特許第５，１４９，７９６号、Ｃｅｃｈ他「ＲＮＡ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ」米国特許第５，１１６，７４２号、Ｂｅｅｎ他「ＲＮＡ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ，ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅｓ，ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ」米国特許第５，０９３，２４６号、およびＢｅｅｎ他「ＲＮＡ ｒｉｂｏｚｙｍｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ，ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅｓ，ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｄｏｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ；ｃｌｅａｖｅｓ ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｔｅ ｂｙ ｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」米国特許第４，９８７，０７１号中に記載されており、これらはすべて参照により本明細書に組み込んである。
【０１２９】
アンチセンス分子またはリボザイムは、前立腺細胞に特異的なプロモーター要素から発現されることが望ましいであろうことは理解されるであろう。前立腺に特異的な抗原（ＰＳＡ）は、ヒト前立腺分泌物の主要なタンパク質部分の１つである。ＰＳＡは、前立腺癌を検出し調べるための有用なマーカーとなっている。ＰＳＡをコードしている遺伝子、およびＰＳＡの前立腺に特異的な発現を指示するそのプロモーター領域は記載されている（Ｌｕｎｄｗａｌｌ（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１６１、１１５１−１１５９；Ｒｉｅｇｍａｎ他（１９８９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１５９、９５−１０２；Ｂｒａｗｅｒ（１９９１）Ａｃｔａ Ｏｎｃｏｌ．３０、１６１−１６８）。したがって、プロモーターはＰＳＡのプロモーターであることが適切である。
【０１３０】
本発明の遺伝子構築体は、当分野でよく知られている方法を使用して作製することができる。
【０１３１】
相補的な粘着末端を介してＤＮＡをベクターに動作可能に連結させるための、さまざまな方法が開発されている。たとえば、相補的なホモポリマー領域を、ベクターのＤＮＡに挿入するＤＮＡ切片に加えることができる。次いでベクターとＤＮＡ切片を、相補的なホモポリマー尾部間の水素結合によって結合させて、組み換えＤＮＡ分子を形成する。
【０１３２】
１つまたは複数の制限部位を含む合成リンカーによって、ＤＮＡ切片をベクターに結合させる代替的な方法がもたらされる。初期に記載されたようにエンドヌクレアーゼの制限的消化によって生み出されるＤＮＡ切片を、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、３’−５’−外ヌクレアーゼ鎖分解活性を有する突出した３’一本鎖末端を除去し、および重合活性を有するくぼんだ３’端中を充填する酵素で処理する。
【０１３３】
したがって、これらの活性を組み合わせることによって、平滑末端型のＤＮＡ切片が生成する。次いで平滑末端型切片を、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼなどの、平滑末端型ＤＮＡ分子の連結を触媒することができる酵素の存在下で、充分モル過剰のリンカー分子と共に培養する。したがって、この反応の生成物は、その端にポリマー・リンカー配列を有するＤＮＡ切片である。次いでこれらのＤＮＡ切片を適切な制限酵素を用いて切断し、ＤＮＡ切片の末端と適合性がある末端を生成する酵素を用いて切断した発現ベクターに連結させる。
【０１３４】
さまざまな制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ、ＣＮ、ＵＳＡを含めた、いくつかの源から市販されている。
【０１３５】
本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡを改変するための望ましい方法は、Ｓａｉｋｉ他（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９、４８７−４９１によって開示されたような、ポリメラーゼ連鎖反応を使用することである。
【０１３６】
この方法では、酵素によって増幅されるＤＮＡは、それら自体が増幅されたＤＮＡ中に取り込まれる、２つの特異的なオリゴヌクレオチド・プライマーの側面に位置している。前記特異的なプライマーは、当分野で知られている方法を使用して発現ベクターへのクローニング用に使用することができる、制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでよい。
【０１３７】
本発明は、本発明の遺伝子構築体（好ましくはＤＮＡ構築体）を用いて形質転換した宿主細胞にも関する。宿主細胞は原核性または真核性のいずれかであってよい。細菌細胞は好ましい原核性宿主細胞であり、典型的には、たとえばＢｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＵＳＡから入手可能な大腸菌の菌株ＤＨ５、およびＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）ｏｆ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ（Ｎｏ ＡＴＣＣ ３１３４３）から入手可能なＲＲ１などの大腸菌の菌株である。好ましい真核性宿主細胞には酵母菌および哺乳動物細胞、好ましくはマウス、ラット、サルまたはヒト繊維芽細胞系からの細胞などの脊椎動物細胞がある。酵母菌宿主細胞には、ＹＰＨ４９９、ＹＰＨ５００およびＹＰＨ５０１があり、これらは一般にＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ ９２０３７、ＵＳＡから入手可能である。好ましい哺乳動物宿主細胞には、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可能なチャイニーズ・ハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６５８として入手可能なＮＩＨスイス・マウスの胚細胞ＮＩＨ／３Ｔ３、およびＡＴＣＣからＣＲＬ１６５０として入手可能なサルの腎臓由来のＣＯＳ−１細胞がある。
【０１３８】
本発明のＤＮＡ構築体を用いた適切な細胞宿主の形質転換は、典型的には使用するベクターのタイプに依存する、よく知られている方法によって行う。原核性宿主細胞の形質転換に関しては、たとえばＣｏｈｅｎ他（１９７２）．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６９、２１１０およびＳａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹを参照のこと。酵母菌細胞の形質転換は、Ｓｈｅｒｍａｎ他（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ中に記載されている。Ｂｅｇｇｓ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ２７５、１０４−１０９の方法も有用である。脊椎動物細胞に関しては、このような細胞をトランスフェクトする際に有用な試薬、たとえばリン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストランまたはリポソーム調合物は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、またはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ ２０８７７、ＵＳＡから入手可能である。
【０１３９】
エレクトロポレーションも細胞を形質転換するためには有用であり、酵母菌細胞、細菌細胞および脊椎動物細胞を形質転換するために、当分野ではよく知られている。
【０１４０】
たとえば多くの細菌種は、参照により本明細書に組み込んだＬｕｃｈａｎｓｋｙ他（１９８８）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２、６３７−６４６中に記載された方法によって、形質転換することができる。２５μＦＤで１ｃｍ当たり６２５０Ｖを使用する、２．５Ｘ ＰＥＢ中に懸濁したＤＮＡ−細胞混合物のエレクトロポレーションに従って、最大数の形質転換体が一貫して回収される。
【０１４１】
エレクトロポレーションにより酵母菌を形質転換するための方法は、Ｂｅｃｋｅｒ ａｎｄ Ｇｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４、１８２中に開示されている。
【０１４２】
首尾よく形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築体を含む細胞は、よく知られている技法によって同定することができる。たとえば、本発明の発現構築体を導入した結果生じる細胞を増殖させて、本発明において定義する分子を生成することができる。細胞を採取し溶解させることができ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８、５０３またはＢｅｒｅｎｔ他（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３、２０８によって記載された方法などの方法を使用して、ＤＮＡの存在についてそのＤＮＡ含有量を調べる。あるいは、上澄み中の分子、たとえばタンパク質の存在を、以下に記載したように抗体を使用して検出することができる。
【０１４３】
組み換えＤＮＡの存在を直接分析することに加えて、組み換えＤＮＡがタンパク質の発現を指示することができるときは、よく知られている免疫学的方法によって首尾の良い形質転換を確認することができる。たとえば、発現ベクターを用いて首尾よく形質転換された細胞は、適切な抗原性を示すタンパク質を生成する。形質転換された疑いがある細胞のサンプルを採取し、適切な抗体を使用してタンパク質について分析する。
【０１４４】
したがって、形質転換された宿主細胞そのもの以外に、本発明は、栄養培地中のこれらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に相同である）培養物、またはモノクローナル培養物由来の培養物も企図する。
【０１４５】
遺伝子構築体がプラスミドＤＮＡ構築体であるときは、それを精製することができる。本発明のＤＮＡ構築体は、よく知られている方法を使用して宿主細胞から精製する。
【０１４６】
たとえばプラスミド・ベクターのＤＮＡは、Ｃｌｅｗｅｌｌ ａｎｄ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ（１９７０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ９、４４２８−４４４０およびＣｌｅｗｅｌｌ（１９７２）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１１０、６６７−６７６の方法に従って、ＣｓＣｌ勾配中でバンド化することにより、切断された溶解産物から大規模で作製することができる。このようにして抽出したプラスミドのＤＮＡは、Ｖｉｓｋｉｎｇチューブを介した滅菌され発熱性物質を含まない緩衝液に対する透析によって、あるいはサイズ除去クロマトグラフィによって、ＣｓＣｌから遊離させることができる。
【０１４７】
あるいはプラスミドのＤＮＡは、たとえばＱｉａｇｅｎによって供給されるイオン交換クロマトグラフィを使用して、透明な溶解産物から精製することができる。ヒドロキシアパタイト・カラム・クロマトグラフィを使用することもできる。
【０１４８】
本発明の他の態様は、癌を治療するための薬剤の製造における、ｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの機能を選択的に妨げる薬剤の使用を提供する。
【０１４９】
本発明の他の態様は、細胞内で発現するｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルの機能を妨げることができる分子をコードしている核酸を含む遺伝子構築体を提供する。
【０１５０】
前述のように、遺伝子構築体はＲＮＡまたはＤＮＡであってよい。ｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣの機能を妨げることができる分子は、前に開示したようにアンチセンス分子またはリボザイムであることが好都合である。
【０１５１】
遺伝子構築体は、ヒト細胞、特に癌性であるか癌が発生する可能性がある細胞への送達用に適合させてあり、より詳細には遺伝子構築体は、前立腺細胞に送達させるために適合させてある。本発明のこの態様の遺伝子構築体は、前に記載したウイルス性および非ウイルス性の送達系を含む。
【０１５２】
適切には、リボザイムまたはアンチセンス分子などの分子は、ＶＧＳＣ、たとえばｈＮｅ−Ｎａ ＶＧＳＣの機能を妨げることができ、癌細胞中で選択的に発現される。たとえば、遺伝子構築体による前記分子の発現は、癌細胞または組織選択的プロモーターを介して行うことができ、前立腺癌の場合は、ＰＳＡプロモーターまたは任意の他の前立腺癌選択的プロモーターであってよい。
【０１５３】
本発明の他の態様は、医療において使用するための遺伝子構築体を提供する。したがって、遺伝子構築体は、医療において使用するためにパッケージングされており提示される。
【０１５４】
本発明の他の態様は、本発明の遺伝子構築体および製薬上許容される担体を含む薬剤組成物を提供する。本発明の遺伝子構築体と適合性があり、そのレシピエントに害がないという意味で、担体は「許容される」ものでなければならない。典型的には担体は、滅菌されており発熱性物質を含まない、水または生理食塩水であろう。
【０１５５】
不確かさを避けるために、本発明の遺伝子構築体は、具体的にはウイルスまたはウイルス様の粒子を含む。
【０１５６】
本発明の他の態様は、ｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルを選択的に阻害する化合物を同定するための方法であって、（ａ）試験化合物を前記電位依存性Ｎａ＋チャネルのいずれか１つと接触させ、前記化合物が阻害的であるかどうかを判定すること、（ｂ）試験化合物を他の電位依存性Ｎａ＋チャネルと接触させ、前記化合物が阻害的であるかどうかを判定すること、および（ｃ）（ａ）では実質的に阻害的であるが（ｂ）では実質的に阻害的でない化合物を選択することを含む方法を提供する。
【０１５７】
典型的には、Ｎａ＋チャネルに対して知られている影響がある薬理学的薬剤（たとえばテロドトキシンと類似の影響がある化合物）、または生理学的薬剤（たとえば増殖因子またはホルモン、たとえば上皮増殖因子またはアンドロゲン）を含めたある範囲の化合物を、いくつかの定量法においてその有効性を調べる。適切な定量法の型には、細胞系としての長期培養中の細胞から、およびバイオプシーから解離した細胞の短期培養中の電気生理学的な記録（たとえばＧｒｉｍｅｓ ａｎｄ Ｄｊａｍｇｏｚ（１９９８）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１７５、５０−５８を参照のこと）、組み換え前記ＶＧＳＣを機能的に発現する卵母細胞からの電気生理学的な記録、その後のｃＲＮＡの注射（たとえばＦｒａｓｅｒ他（１９９３）Ｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｗｉｌｌｉｓ，ｅｄ）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓを参照のこと）、およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの（Ｂｏｙｄｅｎチャンバ）侵襲性の定量法（たとえばＧｒｉｍｅｓ他（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ３６９、２９０−２９４；およびＳｍｉｔｈ他（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４２３、１９−２４を参照のこと）がある。適切な定量法は、たとえばＡｂｄｕｌ ａｎｄ Ｈｏｏｓｅｉｎ（２００１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ２１、２０４５−２０４８中に記載されたような、前立腺癌細胞系からのＰＳＡ分泌の影響の測定も含んでよい。
【０１５８】
本発明は、前記ＶＧＳＣを発現している細胞を標的化することによって、治療が癌細胞を標的とする方法も提供し、この方法は前述のように、遺伝子構築体をこのような細胞に向けることに関する。たとえば、染料物質と結合する抗−前記ＶＧＳＣ抗体（ＶＧＳＣ−Ａｂ）は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて前立腺に施すことができる（たとえばＹａｓｍｕｃｈ他（１９９３）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｐｈｏｔｏｌｙｓｉｓ」Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｒｅｖｕｅ Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ １０、１９７−２５２；Ｐｏｇｒｅｂｎｉａｋ他（１９９３）「Ｔａｒｇｅｔｔｅｄ ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ−ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ａｎｄ ｌｉｇｈｔ」Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｏｃｌｏｇｙ ２、３１−４２）。したがって前立腺を、「付着した」染料の吸収ピークに一致する光線／レーザーの波長で、局所的に照射する。染料による光エネルギーの吸収によって、局所的な加熱および細胞の死がもたらされる。このようにして、標識された（すなわち転移性である）細胞のみが除去されるであろう。以下の染料で標識されたＶＧＳＣ−Ａｂを使用することができる：フルオロセン（Ｐｅｌｅｇｒｉｎ他（１９９１）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｐｈｏｔｏｉｍｍｕｎｏｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ−ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｎｕｄｅ−ｍｉｃｅ」Ｃａｎｃｅｒ ６７、２５２９−２５３７）、ローダミン（Ｈａｇｈｉｇｈａｔ他（１９９２）「Ｌａｓｅｒ−ｄｙｅｓ ｆｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｐｈｏｔｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ−ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ３ ｒｈｏｄａｍｉｎｅｓ」Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ１０２、８１−８７）、シアニン（Ｆｏｌｌｉ他（１９９４）「Ａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｄｏｃｙａｎｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｐｈｏｔｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｓｑｕａｍｏｕｓ−ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｎｕｄｅ−ｍｉｃｅ」Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５４、２６４３−２６４９；Ｌｉｐｓｈｕｔｚ他（１９９４）「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ４ ｎｅｗ ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎｅ ｄｙｅｓ ｆｏｒ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｌａｓｅｒｓ」Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ １０４、９９６−１００２；Ｈａｄｄａｄ他（１９９８）「Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｎ ｍａｒｉｎｅ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ」Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ５、２４１−２４７）。
【０１５９】
したがって本発明の他の態様は、ｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルのタンパク質に選択的に結合する部分、および他の部分を含む化合物を提供する。
【０１６０】
「ｈＮｅ−Ｎａ電位依存性Ｎａ＋チャネルのタンパク質に選択的に結合する部分」によって、前記ＶＧＳＣには結合するが、他の分子、たとえば他のＶＧＳＣには実質的に結合しない、任意の適切なこのような部分を意味する。結合部分を含む化合物は、使用時に癌性細胞、特に転移性癌細胞の領域に局在することができるが、癌性細胞が存在しない他の領域は実質的に局在することができない化合物であることが好ましい。
【０１６１】
結合部分は、高い親和性で前記ＶＧＳＣに結合することができることが好ましい。たとえば、結合部分の前記ＶＧＳＣへの結合に関する結合定数は、１０−７と１０−１０Ｍの間であることが好ましい。典型的には、結合部分は抗ｈＮｅ−Ｎａ抗体である。このような抗体および適切な抗体を作製する方法は、前で論じている。
【０１６２】
他の部分は、癌の治療または画像化または診断に関する有用な性質を化合物に与える、任意の他の部分であってよい。詳細には他の部分は、癌細胞、特に転移性癌細胞を殺傷または画像化する際に有用な部分である。他の部分は、化合物が標的とする癌細胞を、殺傷することができる部分であることが好ましい。
【０１６３】
本発明の好ましい実施形態では、他の部分は直接的あるいは間接的に細胞毒性である。詳細には他の部分は、癌細胞、特に転移性癌細胞に対して直接的あるいは間接的に毒性であることが好ましい。
【０１６４】
「直接的に細胞毒性である」によって、その部分はそれ自体が毒性である部分であるという意味を含む。「間接的に細胞毒性である」によって、その部分はそれ自体は毒性ではないが、たとえば他の分子に対する作用によって、あるいは他の分子に対する他の作用によって、細胞毒性を誘導する可能性がある部分であるという意味を含む。
【０１６５】
一実施形態では、細胞毒性部分は細胞毒性の化学療法剤である。細胞毒性の化学療法剤は、当分野においてよく知られている。
【０１６６】
抗癌剤などの細胞毒性の化学療法剤には以下のものがある；メクロレタミン（ＨＮ２）、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）およびクロラムブチルなどの窒素マスタードを含むアルキル化剤；ヘキサメチルメラミン、チオラパなどのエチレンイミンおよびメチルメラミン；ブスルファンなどのスルホン酸アルキル；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）およびストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）などのニトロソ尿素；デカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾール−カルボキサミド）などのトリアゼン；メトトレキサート（アメトプテリン）などの葉酸類似体を含めた代謝拮抗物質；フルオロウラシル（５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、フロクスリジン（フルオロデオキシウリジン；ＦＵｄＲ）およびシタラビン（シトシンアラビノシド）などのピリミジン類似体；およびメルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン；ＴＧ）およびペントスタイン（２□−デオキシコフォルマイシン）などのプリン類似体および関連阻害物質。ビンブラスチン（ＶＬＢ）およびビンクリスチンなどのビンカアルカノイドを含めた天然産物；エトポシドおよびテニポシドなどのエピポドフィロトキシン；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビノマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）およびマイトマイシン（マイトマイシンＣ）などの抗生物質；Ｌ−アスパラギナーゼなどの酵素；およびインターフェロン・アルフェノム（ａｌｐｈｅｎｏｍｅ）などの生物学的応答の改変剤。シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）およびカルボプラチンなどのプラチナ配位複合体を含めた混合剤；ミトキサントロンおよびアントラサイクリンなどのアントラセンジオン；ヒドロキシ尿素などの置換尿素；プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン、ＭＩＨ）などのメチルヒドラジン誘導体；およびミトタン（ｏ，ｐ□−ＤＤＤ）およびアミノグルテチミドなどの副腎皮質抑制物質；タキソールおよび類似体／誘導体；およびフルタミドおよびタモフェキシンなどのホルモンのアゴニスト／アンタゴニスト。
【０１６７】
さまざまなこれらの薬剤は、以前から抗体および他の標的部位送達用の薬剤に結合させており、したがって、これらの薬剤を含む本発明の化合物は、当業者によって容易に作成することができる。たとえば、カルボジイミド結合を使用して、ドキソルビシンを含めたさまざまな薬剤を抗体またはペプチドに結合させることができる（参照により本明細書に組み込んである、ＢａｕｍｉｎｇｅｒおよびＷｉｌｃｈｅｋ（１９８０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．７０、１５１−１５９）。
【０１６８】
カルボジイミドは、一般式Ｒ−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’を有する化合物であって、ＲおよびＲ’が脂肪族または芳香族であってよく、ペプチド結合を合成するために使用される化合物のグループを含む。その調製手順は簡潔で、比較的迅速であり、穏やかな条件下で行われる。カルボジイミド化合物は、カルボキシル基を攻撃して、これらの基を遊離アミノ基と反応性のある部位に変える。
【０１６９】
水溶性カルボジイミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）は、機能的部分を結合部分に結合させる際に非常に有用であり、これを使用して、腫瘍が宿るペプチドにドキソルビシンを結合させることができる。ドキソルビシンと結合部分の結合には、ドキソルビシンによって提供されるアミノ基、抗体またはペプチドなどの結合部分によって提供されるカルボキシル基の存在が必要とされる。
【０１７０】
ペプチド結合を直接形成するためにカルボジイミドを使用することに加えて、ＥＤＣを使用して、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド（ＮＨＳ）エステルなどの活性エステルを調製することもできる。したがって、アミノ基にのみ結合するＮＨＳエステルを使用して、ドキソルビシンの１つのアミノ基を有するアミド結合の形成を誘導することができる。ＥＤＣとＮＨＳを組み合わせた使用は、結合体が形成される収率を高めるための結合用に一般的に使用されている（Ｂａｕｍｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｌｃｈｅｋ、上記、１９８０）。
【０１７１】
機能的部分を結合部分に結合させるための他の方法も使用することができる。たとえば、グルタルアルデヒドの架橋に使用することができるのと同様に、過ヨウ酸ナトリウムの酸化、次いで適切な反応物の還元アルキル化を使用することができる。しかしながら、本発明の結合体を生成する方法のどれを選択するかに関係なく、結合部分がその標的化能力を維持していること、機能的部分がその関連機能を維持していることを判定しなければならないことが認められる。
【０１７２】
本発明の他の実施形態では、細胞毒性部分は細胞毒性ペプチドまたはポリペプチド部分であり、これによって細胞の死をもたらす任意の部分が含まれる。細胞毒性ペプチドまたはポリペプチド部分は当分野でよく知られており、これにはたとえばリシン、アブリン、シュードモナスの外毒素、組織因子などがある。これらを抗体などの標的部分に連結させるための方法も、当分野では知られている。細胞毒性剤としてのリシンの使用は、参照により本明細書に組み込んである、Ｂｕｒｒｏｗｓ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０、８９９６−９０００中に記載されており、局所的な血液凝固および腫瘍の梗塞形成をもたらす組織因子の使用は、Ｒａｎ他（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８、４６４６−４６５３およびＨｕａｎｇ他（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５、５４７−５５０によって記載されている。Ｔｓａｉ他（１９９５）Ｄｉｓ．Ｃｏｌｏｎ Ｒｅｃｔｕｍ ３８、１０６７−１０７４は、モノクローナル抗体に結合したアブリンＡ鎖を記載しており、これは参照により本明細書に組み込んである。細胞毒性剤としての他のリボゾーム不活性化タンパク質は、ＷＯ９６／０６６４１中に記載されている。シュードモナスの外毒素は、細胞毒性ポリペプチド部分として使用することもできる（たとえば参照により本明細書に組み込んである、Ａｉｅｌｌｏ他（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２、１０４５７−１０４６１を参照のこと）。
【０１７３】
ＴＮＦαおよびＩＬ−２などのいくつかのサイトカインも、細胞毒性剤として有用である可能性がある。
【０１７４】
いくつかの放射性原子も、充分な用量で送達される場合は細胞毒性である可能性がある。したがって細胞毒性部分は、使用の際に充分な量の放射活性を標的部位に送達して細胞毒性にする放射性原子を含むことができる。適切な放射性原子にはリン−３２、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、レニウム−１８６、レニウム−１８８、またはイットリウム−９０、または近隣の細胞、細胞器官または核酸を破壊するための充分なエネルギーを発する任意の他のアイソトープがある。本発明の化合物中の放射性原子のアイソトープおよび濃度は、４０００ｃＧｙを超える（少なくとも６０００、８０００または１００００ｃＧｙであることが好ましい）線量が標的部位、好ましくは標的部位の細胞、および細胞器官、特に核に送達されるようなものであることが好ましい。
【０１７５】
放射性原子は、知られている方法で結合部分に結合させることができる。たとえば、ＦＤＴＡまたは他のキレート剤を結合部分に結合させることができ、１１１Ｉｎまたは９０Ｙを結合させるためにこれらを使用することができる。チロシン残基は、１２５Ｉまたは１３１Ｉで標識することができる。
【０１７６】
細胞毒性部分は、適切な間接的に細胞毒性であるポリペプチドであってよい。特に好ましい実施形態では、間接的に細胞毒性であるポリペプチドは、酵素の能力を有しており、比較的毒性のないプロドラッグを細胞毒性の薬剤に転換することができるポリペプチドである。標的部分が抗体であるとき、このタイプの系はＡＤＥＰＴ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙ）と呼ばれることが多い。この系では、標的部分が酵素部分を患者の身体の所望の部位（すなわち前記ＶＧＳＣを発現する部位、転移性癌細胞など）に向け、その後酵素をその部位に局在化させる時間を与え、酵素の基質であるプロドラッグを投与することが必要であり、触媒作用の最終産物は細胞毒性化合物である。この手法の目的は、所望の部位における薬剤の濃度を最大にし、正常な組織中の薬剤の濃度を最小にすることである（Ｓｅｎｔｅｒ，Ｐ．Ｄ．他（１９８８）「Ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５、４８４２−４８４６；Ｂａｇｓｈａｗｅ（１９８７）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５６、５３１−２；およびＢａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．他（１９８８）「Ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ ｃａｎ ｂｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｔ ｃａｎｃｅｒ ｓｉｔｅｓ」Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．５８、７００−７０３を参照のこと）。
【０１７７】
任意の前記ＶＧＳＣ結合部分を、このタイプの定方向酵素プロドラッグ療法系において、抗ｈＮｅ−Ｎａ抗体の代わりに使用することができることは明らかである。
【０１７８】
本明細書に記載した前記ＶＧＳＣ標的酵素を使用する系の酵素およびプロドラッグは、前に示した任意のものであってよい。細胞毒性物質は、アルキル化剤などの任意の既存の抗癌薬剤、ＤＮＡ中に挿入される薬剤、チミジンシンテターゼ、リボヌクレオチドリダクターゼ、ヌクレオシドキナーゼまたはトポイソメラーゼなどの任意の重要な酵素を阻害する薬剤、任意の他の細胞部分と相互作用することによって細胞の死に影響を与える薬剤であってよい。エトポシドは、トポイソメラーゼ阻害剤の一例である。
【０１７９】
報告されているプロドラッグ系には、大腸菌β−グルクロニダーゼによって活性化されるフェノールマスタード・プロドラッグ（Ｗａｎｇ他、１９９２およびＲｏｆｆｌｅｒ他、１９９１）、ヒトβ−グルクロニダーゼによって活性化されるドキソルビシン・プロドラッグ（Ｂｏｓｓｌｅｔ他、１９９４）、コーヒー豆α−ガラクトシダーゼによって活性化される他のドキソルビシン・プロドラッグ（Ａｚｏｕｌａｙ他、１９９５）、コーヒー豆α−Ｄ−ガラクトシダーゼによって活性化されるダウノルビシン・プロドラッグ（Ｇｅｓｓｏｎ他、１９９４）、大腸菌β−Ｄ−ガラクトシダーゼによって活性化される５−フルオロウリジン・プロドラッグ（Ａｂｒａｈａｍ他、１９９４）、カルボキシペプチダーゼＡによって活性化されるメトトレキセート・プロドラッグ（たとえばメトトレキセート−アラニン）（Ｋｕｅｆｎｅｒ他、１９９０、Ｖｉｔｏｌｓ他、１９９２およびＶｉｔｏｌｓ他、１９９５）がある。これらおよび他のものは、以下の表中に含まれる。
【表１】
2004507254.tif 000003
【０１８０】
本発明の酵素部分の一部を形成する適切な酵素には、カルボキシペプチダーゼＧ、Ｇ１およびＧ２などのエキソペプチダーゼ（グルタミン化マスタード・プロドラッグ用）、カルボキシペプチダーゼＡおよびＢ（ＭＴＶベースのプロドラッグ用）、およびアミノペプチダーゼ（２−α−アミノシルＭＴＣプロドラッグ用）、たとえばトロンボリシンなどのエンドペプチダーゼ（トロンビン・プロドラッグ用）、ホスファターゼ（たとえばアルカリホスファターゼ）などのヒドロラーゼまたはスルファターゼ（たとえばアリールスルファターゼ）（リン酸化または硫化プロドラッグ用）、ペニシリンアミダーゼおよびアリールアシルアミダーゼなどのアミダーゼ、β−ラクタマーゼなどのラクタマーゼ、β−グルクロニダーゼ（β−グルクロノミドアントラサイクリン用）、α−ガラクトシダーゼ（アミグダリン用）およびβ−ガラクトシダーゼ（β−ガラクトースアントラサイクリン用）などのグリコシダーゼ、シトシンデアミナーゼ（５ＦＣ用）などのデアミナーゼ、ウロキナーゼおよびチミジンキナーゼ（ガンシクロフィア用）などのキナーゼ、ニトロリダクターゼなどのリダクターゼ（ＣＢ１９５４および類似体用）、アゾリダクターゼ（アゾベンゼンマスタード用）、およびＤＴ−ジアホラーゼ（ＣＢ１９５４用）、グルコースオキシダーゼ（グルコース用）、キサンチンオキシダーゼ（キサンチン用）およびラクトペルオキシダーゼなどのオキシダーゼ、ＤＬ−ラセマーゼ、触媒的抗体およびシクロデキストリンがある。
【０１８１】
プロドラッグは、細胞毒性の薬剤と比べると比較的毒性がない。典型的には、プロドラッグは、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞毒性試験において測定される毒性の１０％未満の毒性、好ましくは１％未満の毒性を有する。
【０１８２】
プロドラッグを細胞毒性の薬剤に転換することができる部分は、化合物の残り部分から単離する際には活性がある可能性があるが、その部分は（ａ）化合物の残り部分と組み合わさっている、（ｂ）化合物が標的細胞に結合しているか、隣接しているか、あるいは標的細胞中に内在化しているときにのみ活性である必要がある。
【０１８３】
化合物のそれぞれの部分がポリペプチドであるとき、その２つの部分を、Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎ他（１９７９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１００、１００−１０８中に概略的に記載された方法などの、ポリペプチドを架橋させる任意の従来的な方法で１つに結合させることができる。たとえば前記ＶＧＳＣ結合部分は、チオール基およびこれらのチオール基と反応することができる二機能性の薬剤と反応する他の部分、たとえばヨード酢酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＩＡ）またはＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を用いて富化させることができる。たとえば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと共に得られる、アミドまたはチオエーテル結合は、ジスルフィド結合よりもｉｎ ｖｉｖｏにおいて一般的に安定性がある。
【０１８４】
あるいは化合物は、組み換えＤＮＡ技法によって融合化合物として生成させることができ、ＤＮＡの長さ部分は、互いに隣接しているかあるいは化合物の所望の性質を害さないリンカー・ペプチドをコードしている領域によって分離されている、本発明の化合物の２つの部分をコードしている個々の領域を含んでいる。化合物の２つの部分は、完全あるいは部分的に重複している可能性があると考えられる。
【０１８５】
したがって、ＤＮＡは適切な宿主中で発現して、本発明の化合物を含むポリペプチドを生成する。
【０１８６】
細胞毒性部分は、放射線感受性増強物質であってよい。放射線感受性増強物質には、フルオロピリミジン、チミジン類似体、ヒドロキシ尿素、ゲムシタビン、フルダラビン、ニコチンアミド、ハロゲン化ピリミジン、３−アミノベンズアミド、３−アミノベンゾジアミド、エタニキサドール、ピリモニダゾールおよびミソニダゾールがある（たとえばＭｃＧｉｎｎ他（１９９６）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８８、１１９３−１１２０３；Ｓｈｅｗａｃｈ ａｎｄ Ｌａｗｒｅｎｃｅ（１９９６）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ １４、２５７−２６３；Ｈｏｒｓｍａｎ（１９９５）Ａｃｔａ ＯｎｃｏＬ ３４、５７１−５８７；Ｓｈｅｎｏｙ ａｎｄ Ｓｉｎｇｈ（１９９２）Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０、５３３−５５１；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ他（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．５６、８２７−８３６；Ｉｌｉａｋｉｓ ａｎｄ Ｋｕｒｔｚｍａｎ（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１６、１２３５−１２４１；Ｂｒｏｗｎ（１９８９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．１６、９８７−９９３；Ｂｒｏｗｎ（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ ５５、２２２２−２２２８を参照のこと）。
【０１８７】
さらに、細胞への遺伝子の送達、たとえばｐ５３遺伝子またはサイクリンＤの送達によって、細胞の放射線感受性を増強させることができる（Ｌａｎｇ他（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．８９、１２５−１３２；Ｃｏｃｏ Ｍａｒｔｉｎ他（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９、１１３４−１１４０）。
【０１８８】
他の部分は、照射時に細胞毒性になるか、あるいは細胞毒性部分を放出する部分であってよい。たとえば、ホウ素−１０アイソトープは、適切に照射されると、細胞毒性であるα粒子を放出する（たとえば、Ｇｏｌｄｅｂｅｒｇへの米国特許第４，３４８，３７６号；Ｐｒｉｍｕｓ他（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．７、５３２−５３５を参照のこと）。
【０１８９】
同様に、細胞毒性部分は、フォトフリンなどの光力学的療法において有用な部分であってよい。（たとえば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ他（１９９８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．９０、８８９−９０５を参照のこと）。
【０１９０】
他の部分は、直接的あるいは間接的に細胞毒性である核酸分子を含んでよい。たとえば核酸分子は、標的部位に局在すると、細胞に侵入し細胞の死をもたらすアンチセンス・オリゴヌクレオチドであってよい。したがってオリゴヌクレオチドは、必須遺伝子の発現を妨げるオリゴヌクレオチド、またはアポトーシスを引き起こす遺伝子発現の変化をもたらすオリゴヌクレオチドであってよい。
【０１９１】
適切なオリゴヌクレオチドの例には、ｂｃｌ−２（Ｚｉｅｇｌｅｒ他（１９９７）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８９、１０２７−１０３６）、およびＤＮＡポリメラーゼαおよびトポイソメラーゼＩＩα（Ｌｅｅ他（１９９６）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６、１８０５−１８１１．を対象とするオリゴヌクレオチドがある。
【０１９２】
ペプチド核酸は、従来の核酸の代わりに有用である可能性がある（Ｋｎｕｄｓｅｎ ａｎｄ Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ８、１１３−１１８を参照のこと）。
【０１９３】
他の実施形態では結合部分は、標的に核酸、たとえば本発明の前述の態様に関連して論じた核酸を送達するための、送達媒体中に含まれていてよい。送達媒体は任意の適切な送達媒体であってよい。たとえば送達媒体は核酸を含むリポソームであるか、あるいはそれは、核酸を送達することができるウイルスまたはウイルス様の粒子であってよい。これらの場合、前記ＶＧＳＣに選択的に結合する部分は、典型的には送達媒体の表面に存在する。たとえば、適切な抗体断片などの、前記ＶＧＳＣに選択的に結合する部分は、リポソームの外側表面に存在する可能性があり、送達される核酸はリポソームの内側に存在する可能性がある。他の例として、レトロウイルスまたはアデノウイルス・ベクターなどのウイルス・ベクターを工学処理し、その結果、前記ＶＧＳＣに選択的に結合する部分が、ウイルス粒子の表面に結合するかあるいはそこに局在し、これによってウイルス粒子を所望の部位に向けることができる。前で論じた改変型アデノウイルス系などの、標的送達系も知られている。
【０１９４】
前記ＶＧＳＣに選択的に結合する部分が抗体である、免疫リポソーム（抗体に向けられるリポソーム）を使用することができる。免疫リポソームの調製は、前に記載したとおりである。
【０１９５】
標的部位に送達される核酸は、直接的あるいは間接的に細胞毒性をもたらす任意の適切なＤＮＡであってよい。たとえば、核酸は細胞に対して細胞毒性であるリボザイムをコードすることができ、あるいは核酸は、ほとんど毒性のないプロドラッグを細胞毒性の薬剤に転換することができる酵素をコードすることができる（この後者の系はＧＤＥＰＴ：Ｇｅｎｅ Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐｒｏｄｒｕｇ Ｔｈｅｒａｐｙと呼ばれることもある）。
【０１９６】
標的に送達される核酸中にコードすることができるリボザイムは、前に引用した参照文献中に記載されている。リボザイム用の適切な標的には、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｍｙｃ、およびｂｃｌ−２などの転写因子がある。Ｄｕｒａｉ他（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７、３３０７−３３１２は、ｂｃｌ−２に対するハンマーヘッド型のリボザイムを記載している。
【０１９７】
ＥＰ０４１５７３１はＧＤＥＰＴ系を記載している。酵素およびプロドラッグの選択に関する同様の考察が、前に記載したＡＤＥＰＴ系へと同じくＧＤＥＰＴ系へ適用される。
【０１９８】
標的部位に送達される核酸は、直接的に細胞毒性であるポリペプチドをコードすることができる。
【０１９９】
本発明の他の実施形態では、本発明の化合物中に含まれる他の部分は、容易に検出可能な部分である。
【０２００】
「容易に検出可能な部分」によって、この部分は、患者に本発明の化合物を投与した後に標的部位に位置するとき、身体および標的が位置する部位の外側から非侵襲的に検出することができる部分であるという意味が含まれる。したがって、本発明のこの実施形態の化合物は、画像化および診断において有用である。
【０２０１】
典型的には、容易に検出可能な部分は、画像化において有用な放射活性原子であるか、あるいはこれを含む。適切な放射活性原子には、シンチグラフ研究用のテクネチウム−９９ｍまたはヨウ素−１２３がある。他の容易に検出可能な部分には、たとえばここでもヨウ素−１２３、およびヨウ素−１３１、インジウム１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、カドリニウム、マンガンまたは鉄などの磁気共鳴像（ＭＲＩ）用のスピン標識体がある。本発明の化合物は、分子が容易に検出可能であるために、充分な適切な原子のアイソトープを有していなければならないことは明らかである。
【０２０２】
放射性または他の標識体は、知られている方法で本発明の化合物中に取り込ませることができる。たとえば結合部分がポリペプチドである場合、それを生合成することができるか、あるいはたとえば水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用して、化学的なアミノ酸合成によって合成することができる。９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈおよび１１１Ｉｎなどの標識体は、たとえば結合部分中のシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム−９０は、リシン残基を介して結合することができる。ＩＯＤＯＧＥＮ法（Ｆｒａｋｅｒ他（１９７８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．８０、４９−５７）を使用して、ヨウ素−１２３を取り込ませることができる。参照文献（「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」Ｊ−Ｆ Ｃｈａｔａｌ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ．、１９８９）は、他の方法を詳細に記載している。
【０２０３】
本発明の他の実施形態では、他の部分は、直接的あるいは間接的に細胞毒性である部分、または容易に検出可能な部分に選択的に結合することができる。したがって、この実施形態では他の部分は、細胞毒性あるいは容易に検出可能である他の化合物または部分に結合する任意の部分であってよい。
【０２０４】
したがって他の部分は、他の化合物または部分に選択的に結合する抗体であるか、あるいはそれは、ストレプトアビジンまたはビオチンなどの、何か他の結合部分であってよい。以下の例では、本発明中に含まれる分子のタイプを例示し、他のこのような分子は、本明細書の教示から容易に明らかである。
【０２０５】
二重特異性抗体であって、１つの結合部位が前記ＶＧＳＣに選択的に結合する部分を含み、第２の結合部位が、たとえばほとんど毒性のないプロドラッグを細胞毒性の薬剤に転換することができる酵素に結合する部分を含む抗体。
【０２０６】
化合物は、ビオチンが結合する前記ＶＧＳＣに選択的に結合する抗体であってよい。容易に検出可能な標識体で標識されているアビジンまたはストレプトアビジンは、二相画像系においてビオチン標識された抗体と共に使用することができ、最初にビオチン標識された抗体を患者中の標的部位に局在させ、次いで標識されたアビジンまたはストレプトアビジンを患者に投与する。二重特異性抗体およびビオチン／ストレプトアビジン（アビジン）系は、Ｒｏｓｅｂｒｏｕｇｈ（１９９６）Ｑ Ｊ Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４４、２３４−２５１によって概説されている。
【０２０７】
本発明の好ましい実施形態では、前記ＶＧＳＣに選択的に結合する部分および他の部分は、縮重したポリペプチドである。
【０２０８】
本発明の他の態様は、本発明の前述の態様の化合物をコードしている核酸分子を含む。
【０２０９】
本発明の他の態様では、医療において使用するための本発明の化合物を提供する。典型的には化合物は、患者に使用するための薬剤として、または画像化剤として、あるいは診断剤として、パッケージングおよび提示される。
【０２１０】
本発明の他の態様では、本発明の化合物および製薬上許容される担体を含む薬剤組成物を提供する。
【０２１１】
典型的には、本発明の薬剤組成物または調合物は非経口投与用、より詳細には静脈内投与用のものである。
【０２１２】
非経口投与に適した調合物には、調合物を目的とするレシピエントの血液と等張にする、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬および溶質を含むことができる水性および非水性の滅菌した注射用溶液、懸濁剤および増粘剤を含むことができる水性および非水性の滅菌した懸濁溶液がある。
【０２１３】
本発明の他の態様では、癌を有しているかあるいは癌の危険があるヒト患者を治療および／または診断するための薬剤の製造における、本発明の化合物の使用を提供する。
【０２１４】
本発明の他の態様は、癌を治療する方法であって、本発明の化合物をヒト患者に有効量投与することを含み、かつ化合物の他の部分が患者に対して直接的または間接的に治療上有益である部分であることを含む方法を含む。
【０２１５】
本発明の他の態様は、ヒト患者中の癌を画像化するための方法（この方法はヒト患者の癌に対する感受性を判定する際に、あるいはヒト患者の癌を診断するのに、あるいは癌の個々の結果の関連のある見通しを予測するのに有用である可能性がある）であって、本発明の化合物を患者に有効量投与することを含み、かつ化合物の他の部分が容易に検出可能な部分であることを含む方法を含む。
【０２１６】
治療、画像化または診断において使用する個々の化合物に応じて、投与の時間が変わる可能性があり、本明細書で開示する療法系において使用する他の部分の数が変わる可能性があることは容易に理解されるだろう。
【０２１７】
たとえば、本発明の化合物が容易に検出可能な部分または直接的に細胞毒性である部分を含む場合、適切な調合の化合物のみを、患者に投与することが可能である。当然ながら、免疫抑制剤などの他の薬剤を投与することができる。
【０２１８】
検出可能に標識した化合物に関しては、ひとたび化合物が標的部位に局在化した後に、画像化が起こる。
【０２１９】
しかしながら化合物が、治療、画像化または診断に有用であるために他の部分を必要とする化合物である場合は、本発明の化合物を投与し、標的部位に局在化させ、次いで他の部分をその後の適切な時間に投与することができる。
【０２２０】
たとえば、前述のＡＤＥＰＴおよびＡＤＥＰＴ様の系に関しては、結合部分−酵素部分の化合物を投与し、標的部位に局在化させる。ひとたびこれが行われた後に、プロドラッグを投与する。
【０２２１】
同様に、たとえば化合物中に含まれる他の部分がその他の部分と結合する部分である化合物に関しては、最初にこの化合物を投与し、標的部位に局在化させ、その後他の部分を投与する。
【０２２２】
したがって一実施形態では、ビオチン標識した抗ｈＮｅ−Ｎａ抗体を患者に投与し、適切な時間の後、検出可能に標識したストレプトアビジンを投与する。ひとたびストレプトアビジンが抗体が局在化した部位（すなわち標的部位）に局在化した後に、画像化が起こる。
【０２２３】
他の部分が容易に検出可能な部分である本発明の化合物は、癌細胞の転移状態を決定する際に有用である可能性があると考えられる。これは、将来の療法の性質および結果に影響を与える、重要な因子である可能性がある。
【０２２４】
本発明の他の態様では、（１）本発明の化合物であって、他の部分が比較的毒性のないプロドラッグを細胞毒性の薬剤に転換することができる細胞毒性部分である化合物、および（２）比較的毒性のないプロドラッグを含むパーツのキット（すなわち療法系）を提供する。このパーツのキットは、本明細書に記載した任意の本発明の化合物および適切なプロドラッグを含んでよい。
【０２２５】
本発明の他の態様では、（１）本発明の化合物であって、他の部分が直接的または間接的細胞毒性部分または容易に検出可能な部分に選択的に結合することができる部分である化合物、および（２）化合物の他の部分が結合することができる、直接的または間接的細胞毒性部分または容易に検出可能な部分のいずれか１つを含むパーツのキット（すなわち療法系）を提供する。
【０２２６】
たとえば、このパーツのキットは、前に定義したビオチンで標識した抗ｈＮｅ−Ｎａ抗体、および容易に検出可能な標識体で標識したストレプトアビジンを含んでよい。
【０２２７】
【実施例】
実施例１：ラットおよびヒトの前立腺癌細胞系における、電位依存性Ｎａ＋チャネルのα−サブユニットの遺伝子の発現の概略：転移性が高いラットおよびヒトの前立腺癌細胞系における、ＰＮ１／ｈＮｅ−Ｎａタイプの電位依存性Ｎａ＋チャネルおよびサブユニットの優性発現
電位依存性Ｎａ＋チャネル（ＶＧＳＣ）はさまざまな細胞活動を制御しており、それらの機能不全は、前立腺癌の転移を含めたいくつかの病体生理学的条件と関係している。ＶＧＳＣは多様なサブユニットの集合体として生じる可能性があるが、α−サブユニット（ＶＧＳＣα）のみが機能的チャネルをコードすることができる。我々は、２つの新しい逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法、縮重プライマー・スクリーニング法および新規の半定量ＰＣＲ技法を開発した。これらの方法によって、転移の可能性が著しく異なるラット（ＭＡＴ−ＬｙＬｕ／ＡＴ−２）およびヒト（ＰＣ−３／ＬＮＣａＰ）前立腺癌細胞中の、ＶＧＳＣαのｍＲＮＡ発現の詳細な定性および定量調査が可能になり、非常に首尾一貫した結果を生み出した。転移性の高い細胞（ＭＡＴ−ＬｙＬｕおよびＰＣ−３）のみが、機能的ＶＧＳＣ活性を有することは以前に示された。ＶＧＳＣα縮重プライマーＰＣＲスクリーニング法によって、８個の異なるＶＧＳＣα遺伝子：ＳＣＮ１Ａ−４Ａ、ＳＣＮ７Ａ−９ＡおよびＳＣＮ１１Ａを同定した。特異的なプライマーのＰＣＲによって、大部分のＶＧＳＣαは、機能的および非機能的（充分に切断された）タンパク質をコードしていると思われる、多様な接合変異体として発現されることを実証した。半定量ＰＣＲ（ＳＱＴ−ＰＣＲ）の結果は、転移性の低い細胞（ＡＴ−２／ＬＮＣａＰ）中で起こるＶＧＳＣαのｍＲＮＡ発現の基礎レベルと一致し、このレベルは転移の可能性が高い細胞（ＭＡＴ−ＬｙＬｕ／ＰＣ−３）中では非常に高かった。ＳＣＮ９Ａ遺伝子（ＰＮ１／ｈＮｅ−Ｎａとも呼ばれる）の発現の特異的な著しい増大は、ラットおよびヒト細胞中のＶＧＳＣαのｍＲＮＡのレベルの、この上昇が主たる原因であった。したがってＳＣＮ９Ａは、検出される機能的ＶＧＳＣの主な源である可能性が高い。
【０２２８】
略語：ＶＧＳＣ、電位依存性Ｎａ＋チャネル；ＶＧＳＣα、電位依存性Ｎａ＋チャネルα−サブユニット；ＶＧＳＣβ、電位依存性Ｎａ＋チャネルβ−サブユニット；ＤＲＧ、背根神経節；ＲＴ−ＰＣＲ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応；Ｓ、膜内外断片；Ｄ、膜内外ドメイン；ＩＤ、内部ドメイン；ＴＴＸ、テトロドトキシン；ｓｓｃＤＮＡ、一本鎖ｃＤＮＡ；Ｒ６、ランダム・ヘキサマー・プライマー；ｎｔ、ヌクレオチド；ＳＱＴ−ＦＣＲ、半定量ポリメラーゼ連鎖反応；ＴＢＥ、トリズマ−ホウ酸（塩）−ＥＤＴＡ緩衝液；Ｃｙｔｂ５Ｒ、ＮＡＤＨ−シトクロームｂ５リダクターゼ；ＮＧＦ、神経増殖因子。
【０２２９】
背景
電位依存性Ｎａ＋チャネル（ＶＧＳＣ）１は、大きな（２４０ｋＤ以上）４つの膜内外ドメインのα−サブユニット（ＶＧＳＣα）、および２つまでの異なる補助β−サブユニット（ＶＧＳＣβ）から構成される、大きな膜に広がる糖タンパク質である（ｌ）。ＶＧＳＣα単独の発現は、機能的チャネルを形成するのに充分である（２）。ＶＧＳＣβは、機能的チャネルの利用性を容易にする（３）、チャネルの動態を制御する（４、５）、およびおそらく薬理学的特性さえ変える（６）などの、いくつかの支持的役割を果たす。
【０２３０】
ＶＧＳＣαは、ＳＣＮ１ＡからＳＣＮ１１Ａで示される、高等脊椎動物（７）中の少なくとも１１個の異なる遺伝子のファミリーを構成する。これらの産物は、さまざまな興奮性の細胞タイプからクローン化している。ＶＧＳＣα遺伝子の少なくとも２つのサブファミリー、ＮａＶ１およびＮａＶ２が、配列データに基づいて記載されている（８）。まだ実験的によって決定されたわけではないが、これらのサブファミリーは、著しく異なる電気生理学的性質を有するＶＧＳＣαであると一般的に考えられる（９）。実際、ＮａＶ２ＶＧＳＣα中の境界のＶＧＳＣα配列が保存されていないことによって、これらは電位依存性あるいはＮａ＋選択的でない可能性があることが暗示される（９、１０）。第３のサブファミリー、ＮａＶ３の存在、およびラットの背根神経節（ＤＲＧ）細胞からのｃＤＮＡ（ＮａＮ／ＳＮＳ２）のクローン化が、最近明示されている。ＮａＮ／ＳＮＳ２は他のＶＧＳＣαと５０％未満の配列相同性を共有しており、その演繹アミノ酸配列は、ＮａＶ１ ＶＧＳＣαのすべての特徴的な配列を有している（１１）。
【０２３１】
ＲＴ−ＰＣＲおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を使用することによって、いくつかの研究は、多様な細胞タイプ中での多様なＶＧＳＣαの同時発現を文書化している（１２−１４）。特定のＶＧＳＣαが、異なるレベルで発現されること、および動的制御下（たとえば、発生または損傷中）での発現が分かっている。たとえば、少なくとも８個の異なるＶＧＳＣαのｍＲＮＡが成体ラットのＤＲＧ細胞中で見られ、その発現レベルは広範囲でありＲＢ１、Ｎａ６、ＮａＮ／ＳＮＳ２およびＳＣＬ−１１のｍＲＮＡｓは非常に高いレベルで発現され、ＰＮ１およびＳＮＳ／ＰＮ３は中間レベルであり、ＲＢ２およびＲＢ３は非常に低いレベルであった（１１、１５、１６）。軸策損傷後に、ＳＮＳおよびＮａＮ／ＳＮＳ２のｍＲＮＡは劇的に下方制御され、一方ＲＢ１、ＲＢ２およびＲＢ３の発現は上方制御された（１７、１８）。
【０２３２】
ＶＧＳＣαの遺伝子は、いくつかの可変スプライシングされたイソ形として生じる可能性があり、その発現も動的制御下にある。第１の膜内外ドメイン（Ｄ１）の第３の断片（Ｓ３）をコードしているエクソンの可変スプライシングは、ＳＣＮ２ＡおよびＳＣＮ３Ａについては発生的に調節されており（１９、２０）、これによって「新生児」および「成体」形が生み出される。これらは、１つのアミノ酸のみが異なるタンパク質をコードしており、Ｓ３の最も細胞外の端に位置している。ＶＧＳＣαの機能に対するこの変化の影響は、現在明らかではない。類似の可変スプライシングされたエクソンが、ＳＣＮ８ＡおよびＳＣＮ９Ａ（２１、２２）中の対応する位置に存在するが、ＳＣＮ４Ａ、ＳＣＮ５Ａ、ＳＣＮ１０ＡおよびＳＣＮ１１Ａ（２３−２６）中には存在しない。今日まで、このような可変スプライシングの物証は、ＳＣＮ１ＡまたはＳＣＮ７Ａについては発見されていない。
【０２３３】
可変スプライシングは、ＶＧＳＣαの他の領域、特に内部ドメイン（ＩＤ）１−２およびＤ３中でも起こる。
【０２３４】
利用可能なＶＧＳＣαのｍＲＮＡプール中で、異なる組織のタイプ間で、さらに発生またはその後の損傷中に、多様なＶＧＳＣαの遺伝子および接合産物の発現を厳格に調節することにより（たとえば１７、１８、２７）、異なるＶＧＳＣαの遺伝子産物およびそれらのイソ形が大幅に異なる機能的役割を有している可能性があることが示唆されると思われるが、現在このことは大部分が知られていない。
【０２３５】
ＶＧＳＣαの機能的役割は、ＶＧＳＣの活動が標的特異的な軸策を通した移動および局所のシナプス結合（２８−３０）を含めて、基本的な衝撃の生成および伝導だけでなく指向的でパターン化された増殖も調節する、中央神経系において最もよく理解される。ＶＧＳＣｓは、興奮性組織（７、３１）のいくつかの遺伝性疾患、および慢性的な痛みの症候群（３２）、てんかん（３３）、虚血による発作（３４）およびアルツハイマー病（３５）を含めた、より複雑な病的障害とも関係している。ＶＧＳＣの発現は、前立腺癌のラット（ＭＡＴ−ＬｙＬｕ）およびヒト（ＰＣ−３）モデル中（３６−３８）で転移の可能性が高いこととも関連している、ますます多くの物証が存在している。実際、機能的ＶＧＳＣの発現は、転移プロセスに対して直接的でポジティブな影響を与える可能性がある。したがって、テトロドトキシン（ＴＴＸ）を多量に（３０％まで）施用することによって、これらの転移性の高い細胞系中でのＶＧＳの電流を遮断することによって、細胞の侵襲の可能性が下がった。ラット中の電流の電気生理学および薬理学的性質は、神経性で、ＴＴＸ感受性（ＮａＶ１）タイプ（３９）のチャネルと一致した。ＳＣＮ４Ａ遺伝子の発現は、ヒトおよびラットの転移性の高い細胞系と転移性の低い細胞系の両方において見られた（４０）。しかしながら、ラットＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞中のＶＧＳの電流の薬理学的性質は、このＶＧＳＣαについて報告された性質と一致しなかった。このことは、（１）ＭＡＴ−ＬｙＬｕ／ＡＴ−２ ｒＳｋＭｌの主要配列で決定された多数の相違点、（２）これらの細胞中の転写後機構の違い（たとえば、補助サブユニットとの結合、チャネルのグリコシル化／リン酸化）、または（３）記録されるＶＧＳの電流を生み出すＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞中の他のＶＧＳＣαの存在に原因がある可能性がある。
【０２３６】
本研究では、比較定量的なＲＴ−ＰＣＲ手法を使用して、転移性の高い前立腺癌細胞（ＭＡＴ−ＬｙＬｕおよびＰＣ−３）および転移性の低い前立腺癌細胞（ＡＴ−２およびＬＮＣａＰ）中での、他のＶＧＳＣαのｍＲＮＡの発現を決定するために、我々は作業を拡大している。
【０２３７】
実験手順
細胞の培養　ＭＡＴ−ＬｙＬｕ、ＡＴ−２、ＬＮＣａＰおよびＰＣ−３細胞系を、前に記載したように培養し採取した（３６、３７）。
【０２３８】
ＲＮＡの抽出　これは（４１）と同様に、あるいは以下に記載したように行った。簡潔には、組織０．１ｇ当たり溶液１ｍｌを使用するように、ＩＫＡホモジェナーザーを使用して、細胞を溶液（「Ａ」）中で均質にした。溶液Ａは、４Ｍのグアニジニウムチオシアン酸塩、２５ｍＭのクエン酸Ｎａ＋（ｐＨ７．０）、０．５％のサルコシルおよび０．７２％（ｖ／ｖ）のβ−メルカプトエタノールを含んでいた。次いで以下のもの、２Ｍの酢酸Ｎａ＋、ｐＨ ４．０（溶液Ａの１０％の体積）、フェノール（溶液Ａと同体積）およびクロロホルム（溶液Ａの２０％の体積）を加え、１０秒間激しく攪拌した。４℃において２０分間１０，０００ｘｇで、遠心分離を行った。その上澄みを採取し、イソプロパノールを用いて沈殿させた。次いで、前と同様にサンプルを遠心分離し、溶液Ａの最初の体積の約３０％中に、ペレットを再懸濁させた。第２回目のイソプロパノール沈殿を行い、ペレットを７５％エタノールで洗浄し、滅菌した蒸留水中で再懸濁させた。
【０２３９】
３つの異なるＲＮＡ抽出物を、それぞれのラット細胞系の３つの異なる細胞バッチから得て（ＭＬＬ．１、ＭＬＬ．２、ＭＬＬ．３、ＡＴ．１、ＡＴ．２、ＡＴ．４と名づけた）、ヒト細胞系の２つの異なる細胞バッチから２つの抽出物を得た（ＰＣ．１、ＰＣ．２、ＬＮ．１、ＬＮ．２と名づけた）。
【０２４０】
ＶＧＳＣαの縮重プライマーのスクリーニング　知られているすべてのＶＧＳＣαを増幅することができるＰＣＲ戦略を、増幅するため、さらにその後クローン化および配列決定によって、前立腺癌細胞系中で発現されているすべてのＶＧＳＣαを同定するために使用した。最初の配列決定の結果に従って、特異的なＶＧＳＣαのプライマーを使用して、それぞれの細胞系に由来する多数のＶＧＳＣαクローンの迅速なＰＣＲスクリーニングを可能にした。
【０２４１】
簡潔には、ＤＮａｓｅ Ｉを用いた消化によって抽出物からＤＮＡを除去し、合計５μｇＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ）合成用の鋳型として使用した。（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）。最終体積２０μｌ中でランダムなヘキサマー混合体（Ｒ６）を用いて、ｓｓｃＤＮＡ合成を刺激した。次いでＶＧＳＣαのｃＤＮＡを、成体ラットの網膜色素上皮細胞（４２）からＮａＶ１およびＮａＶ２のＶＧＳＣα、および原索動物であるホヤ類（４３）から新規のＶＧＳＣαを増幅させるために、前に使用した縮重ＰＣＲプライマー（ＹＪＩおよびＹＪ２Ｃ）を使用し、ＰＣＲ（Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によってＲ６−ｓｓｃＤＮＡのプールから増幅した。ＰＣＲ反応は、最終体積２０μｌ中で２００μＭのそれぞれのｄＮＴＰ、１単位のＴａｑ、１ｘＴａｑ緩衝液、および１μＭのそれぞれのプライマーを使用して、４μｌのＲ６−ｓｓｃＤＮＡ鋳型に行った。増幅は（ｉ）最初に９４℃で５分間変性させること、（ｉｉ）１Ｕの酵素を加えること、（ｉｉｉ）９４℃で１分間３３−３５サイクルの変性を行い、４０℃で１分間アニーリングを行い、７２℃で１分間延長を行い、さらに（ｉｖ）７２℃で１０分間延長を行うことによって行った。このＰＣＲおよび行ったすべてのＰＣＲについて、他のＤＮＡ源からの交差汚染を制御するためにｓｓｃＤＮＡを加えない反応も行った。
【０２４２】
ｐＧＥＭ−Ｔベクター（ｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）への連結の前に、電気泳動および精製したゲルによってＰＣＲ産物を分析した。次いでこれらを使用して、大腸菌を形質転換した（ｐＭｏｓＢｌｕｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）。プラスミドＤＮＡを、Ｖｉｓｔｒａ Ｌａｂｓｔａｔｉｏｎの６２５分調製手順（Ｖｉｓｔｒａ ＤＮＡ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）の改変型を使用して、細菌の培養物から回収した。５Ｏ個のクローンおよび「挿入体」を、それぞれの１０個のＲＮＡ抽出物をゲル電気泳動することによって明確に選択した。Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅの蛍光サイクル配列決定キットおよびＶｉｓｔｒａ ＤＮＡ ７２５自動型配列決定装置（Ａｍｅｒｓｈａｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して行った、それぞれのスクリーニングからの約１０個のクローンのサブセットのＤＮＡを配列決定した後に、スクリーニング中に発見され、一般的なベクター・プライマーと共に使用される最も多量のＶＧＳＣα用に、特異的なＰＣＲプライマーを設計し、広範囲の配列決定を必要としないクローンの迅速なＰＣスクリーニングを可能にした。これらのプライマーは、それぞれＰＮ１（５８℃）、ＳＣＬ−１１（５０℃）、ＲＢ１（４６℃）、ｒＳｋＭ１（６４℃）、ｈＮｅ−Ｎａ（５４℃）、ＨＢ２（５６℃）およびｈＮａ６（５４℃）ＶＧＳＣαの、ヌクレオチド（ｎｔ）４１１８−４１３７、３４０６−３４２５、４４４１−４４６０、４０６６−４０８５、４１３９−４１５８、４２６５−４２８４および４３２５−４３４４に対応した（番号付けはＧｅｎＢａｎｋに従うものであり、使用した反応のアニーリング温度は丸括弧中に示した）。これらのプライマーを、配列決定したクローンで試験して、これらが特異的な産物のみを生成することを確認した。これらのＶＧＳＣαについての試験で明確ではなかったクローンは、配列決定によって同定した。所定のＶＧＳＣαを表すクローンのパーセンテージを（それぞれのスクリーニングにおける５０個のクローンから）平均化した。データは、平均値±標準誤差で表した。
【０２４３】
ＶＧＳＣα特異的なＰＣＲ試験　２つの縮重プライマー間の領域は、研究したＶＧＳＣαの遺伝子（２２−２５）中に保存されたイントロン部位を含んでいない。したがって、保存されたＶＧＳＣαの遺伝子のイントロン部位中でＰＣＲを行って、スクリーニング中に発見されたＶＧＳＣαが、汚染しているゲノムＤＮＡから増幅しなかったことを確認した。さらに、縮重プライマーのスクリーニング中に発見されたいくつかのＶＧＳＣαは（特にＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３Ａ、ＳＣＮ８ＡおよびＳＣＮ９Ａ）、多数の接合形で存在することが発見されている。したがって、特異的な２０量体プライマーを設計して、Ｄ１：Ｓ２とＤ１：Ｓ５／Ｓ６の間の保存されたイントロンに広がる産物を増幅させ、ＳＣＮ２Ａ（ラットおよびヒト）、ＳＣＮ３Ａ（ヒト）、およびＳＣＮ９Ａ（ラットおよびヒト）の発現した接合形の同定を可能にし、ゲノムＤＮの汚染を制御する。ｈＮａ６（ＳＣＮ８Ａ）およびＮａＮ／ＳＮＳ２（ＳＣＮ１１Ａ）のプライマーをＤ３のために設計したが、しかしながらこの場合、Ｄ１：Ｓ３用のプライマーの同様の可変スプライシングがｈＮａ６ ＶＧＳＣα中で起こる（２２、４４）。反応によって、それぞれＰＮｌ（６０℃）、ＳＣＬ−１１（５８℃）、ＲＢ１（５８℃）、ＲＢ２（５９℃）、ｒＳｋＭ１（５８℃）、ＮａＮ／ＳＮＳ２（５８℃）、ｈＮｅ−Ｎａ（５９℃）、ｈＮａ６（６０℃）、ＨＢ２（５８℃）およびＨＢ３（６０℃）の、４２４−８４７、３８６−８７９、６８４−１１６０、６３２−１１２９、８７０−１３４７、３３５３−３６７４、４７４−８６２、３８５５−４３７０、５１２−１０２４、４９３−８９７に対応するヌクレオチドを増幅させた。
【０２４４】
２．５μｌのＲ６−ｓｓｃＤＮＡ混合物および０．５μＭのそれぞれのプライマーを使用して、３０−３５回のサイクルで、前述のように反応を行った。これらのＶＧＳＣαが以前にスクリーニング中に発見されたかどうかに関係なく、転移性の高い細胞系と転移性の低い細胞系の両方に、ＰＣＲを行った。観察した産物をクローン化および配列決定し、それぞれの細胞系中のそれぞれのＶＧＳＣαのコンセンサス配列を次いで生成させた（それぞれ異なるＲＮＡ抽出物に由来する少なくとも３つのクローンを使用した）。ＲＢ２、ＨＢ２、ＨＢ３、ＰＮ１およびｈＮｅ−Ｎａについては、それぞれの細胞系の抽出物からの少なくとも４つのクローンを、それぞれ４９８ｎｔ、５１３ｎｔ、４０５ｎｔ、４２４ｎｔおよび３８９ｎｔのＰＣＲ産物について、配列決定した（図２に示した）。
【０２４５】
半定量ＰＣＲ（ＳＱＴ−ＰＣＲ）　８つのＤＮａｓｅｄ ＲＮＡ抽出物（それぞれの細胞系の２つの抽出物）を使用して、それぞれの抽出物について３組のＲ６−ｓｓｃＤＮＡｓを生成させた。２．４μｌのこれらのＲ６−ｓｓｃＤＮＡｓを、６０μｌの最終体積中で、ＶＧＳＣα特異的ＰＣＲ（前と同様に行った）用の鋳型として使用した。転移性の高い細胞系と転移性の低い細胞系から得た結果を直接比較することを可能にするために、すべての比較可能なＲ６−ｓｓｃＤＮＡｓの反応およびＰＣＲ反応を同時に行った。
【０２４６】
動態観察手法（４５；Ｈｏｏｆ他（１９９１）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６、１６１−１６９Ｗｉｅｓｎｅｒ他（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８３、５５３−５５９）を採用して、６０μｌからの５μｌの反応混合物のアリコートをそれぞれの増幅サイクル、１１サイクルの終期に採取し、一方で反応混合物は７２℃に保った。アリコートを最初に採取した増幅サイクルは、研究対象のＶＧＳＣαに応じて変えた。次いでこれらのアリコートを、知られている濃度のＤＮＡマーカーを用いて、電気泳動（０．８％アガロース・ゲル）にかけた。ゲルを１５分間後染色し（臭化エチジウム０．８μｇ／ｍｌを含むＴＢＥ緩衝液）、デジタル方式で画像化した（ＧＤＳ７５００ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｇｅｌ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｕｌｔｒａ−Ｖｉｏｌｅｔ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）。それぞれのアリコートの生成物の合計質量（ナノグラム）を、画像分析（１Ｄ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｋｏｄａｋ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ）によって決定した。それぞれのＰＣＲ反応の２つの特徴的な段階を定量化した：
（１）画像解析ソフトウェア（デフォルト設定）を使用することによって、所定のＰＣＲ産物をちょうど検出することができた、閾値ＰＣＲサイクル数（ＣＮｔ）。
（２）反応の対数増殖期が終了したＰＣＲサイクル数（ＣＮｅ）。
【０２４７】
ＰＣＲサイクル数の増加による反応生成物の累積は、Ｓ字曲線（４５）をたどる。しかしながら、ＳＱＴ−ＰＣＲデータに関するこの曲線の２つの極値は、知られておらず決定されていない（すなわち、ゼロ・サイクルでのｃＤＮＡの最初の質量が知られておらず、ＰＣＲの終期の最終生成物の質量が決定されていない）。したがって、Ｓ字曲線をデータに適合させることができなかった。その代わりに、これもまたただ１つの変曲の予想点（ここではＰＣＲの対数増殖期の終期に対応する）を有する、三次の多項式を使用して、Ｓ字曲線を近似した。曲線の適合化はＳＴＡＴＩＳＴＩＣＡ（ＳｏｆｔＳｔａｔ Ｉｎｃ．、Ｔｕｌｓａ、ＯＫ）を使用して行い、次いで二次微分係数を計算して、ＣＮｅを得た。この手順は首尾よく行うことができ、ＣＮｅの計算値は実験によって得られたデータ・ポイントの範囲内であった（図１）。データは、それぞれの細胞系について平均値＋標準誤差で表した（それぞれのＶＧＳＣαの２つの抽出物に３回繰り返した）。ＣＮｔおよびＣＮｅの値を直接使用して、転移性の高い細胞系と転移性の低い細胞系における、それぞれのＶＧＳＣαの発現のレベルを比較した。
【０２４８】
多数の組織タイプ（４６、４７）に由来する、正常な細胞、癌性細胞および転移性の高い細胞において非常に似たレベルで発現される、ＮＡＤＨ−シトクロームｂ５リダクターゼ（Ｃｙｔｂ５Ｒ）は、ラットおよびヒトの縮重プライマーのスクリーニングで、発見された非特異的産物（非ＶＧＳＣαクローン）の主部分として存在した。したがってこれを、ＳＱＴ−ＰＣＲにおけるコントロールの増幅産物として使用した。Ｃｙｔｂ５Ｒ ２０量体プライマーによって、ラットおよびヒト相同体のヌクレオチド３８５−８０９および２９９−７９０がそれぞれ増幅された（両方共にアニーリング温度は６０℃）。
【０２４９】
ＰＮ１、ｈＮｅ−Ｎａ、ＲＢ２、ＨＢ２、ｈＮａ６およびＨＢ３の特異的ＰＣＲによって多様なＶＧＳＣα産物を生成し、可変スプライシングのために、ＶＧＳＣαの発現のレベルを決定することがより難しくなった。これらのＶＧＳＣαの単独の産物を得るために、新しい２０量体プライマーを使用して異なるＰＣＲを行い、これによって、それぞれＰＮ１（６０℃）、ＲＢ２（６０℃）、ｈＮｅ−Ｎａ（５６℃）、ｈＮａ６（６０℃）、ＨＢ２（５８℃）およびＨＢ３（５９℃）のヌクレオチド２０−３４５、１７２−５４４、５９４１−６３０８、３８２７−４３４４、５９１４−６２７０、１５９４−１８７５を増幅させた。ｈＮｅ−Ｎａ、ｈＮａ６、ＨＢ２およびＨＢ３の産物は保存されたイントロン部位には広がらず、したがって、逆転写酵素を加えていない逆転写反応からのアリコートでｓｓｃＤＮＡの鋳型を置換した、コントロールのＰＣＲ反応を行った。産物はすべて、クローン化および配列決定した。
【０２５０】
２つの追加的な２０量体プライマー（「新生児の」：ｎｔ５００−５１９、ＧｅｎＢａｎｋ番号および「成体」：ｎｔ３９９６−４０１５）を使用して、前立腺癌細胞中におけるｈＮａ６の新生児および成体接合形の相対的な発現のレベルを決定した。ＶＧＳＣα特異的ＰＣＲ試験用に使用する３’ｈＮａ６特異的プライマーと共に、ＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞のただ１つのＲＮＡ抽出物に、反応を行った（「新生児の」アニーリング温度、５８℃、「成体」ＰＣＲ、５７℃）。
【０２５１】
ＧｅｎＢａｎｋの配列ヌクレオチド番号　ヌクレオチド番号は、ＰＮ１、ＳＣＬ−１１、ＲＢ１、ＲＢ２、ｒＳｋＭ１、ＮａＮ／ＳＮＳ２、ｈＮｅ−Ｎａ、ｈＮａ６、ｈＮａ６「新生児」、ＨＢ２、ＨＢ３、ｒＣｙｔｂ５ＲおよびｈＣｙｔｂ５Ｒについてそれぞれ、受託番号Ｕ７９５６８、Ｙ０３６３９、Ｘ０３６３８、Ｘ０３６３９、Ｙ１７１５３、ＡＦ０５９０３０、Ｘ８２８３５、ＡＢ０２７５６７、ＡＦ０５０７３０、Ｍ９４０５５、ＡＦ０３５６８５、Ｄ００６３６、Ｙ０９５０１に従った。
【０２５２】
結果
ＶＧＳＣαの縮重プライマーのスクリーニング　異なる細胞系のｍｉｎｉｐｒｅｐ調製したクローンの、ＰＣＲと配列決定スクリーニングを併せた結果を表１に示す。８個の異なるＶＧＳＣαタイプをスクリーニング中に発見し、これらはＳＣＮ１Ａ−４Ａ、ＳＣＮ７Ａ−９ＡおよびＳＣＮ１１Ａ遺伝子からの産物であった。これらのうちでは、６つの異なるＶＧＳＣαがラット中で見られ、４つがヒト中で見られ、ヒトのスクリーニングで発見された２つのＶＧＳＣαの相同体は、ラット細胞中にも存在した（ＳＣＮ９Ａに由来するＰＮ１、およびＳＣＮ２Ａに由来するＲＢ２）。発見されたすべてのＶＧＳＣαは、増幅した領域（縮重プライマーによって表される）中のそれぞれの発表されている配列と同一であった。
【０２５３】
表１　ＶＧＳＣαの縮重プライマーによるスクリーニングの結果の概要
結果は、試験したクローンのパーセンテージとして示す（いずれの場合もｎ＝５０）。それぞれのスクリーニングは、それぞれの細胞系からの２−３の抽出物の結果である。誤差は標準誤差を示す。破線（−）は、実施したスクリーニングにおいて、特定のＶＧＳＣαと同一性を有するクローンが存在しなかったことを示す。
【表２】
2004507254.tif 000004
【０２５４】
縮重プライマーを設計して、好ましくは今までクローン化および配列決定したすべてのＮａＶ１ ＶＧＳＣα（ＹＪ１＝ＦＷＬＩＦＳＩＭ；ＹＪ２Ｃ＝ＱＶＡＴＦＫＧＷ）中で保存されている、２つのアミノ酸配列モチーフをコードすることができる、考えられるすべてのｃＤＮＡの組み合わせを増幅し、２２５−２３７ｂｐｓの産物を生成させた。したがって（少なくともＮａＶ１チャネルについては）、それぞれのＶＧＳＣαのタイプを表すクローンの比率は、細胞のＶＧＳＣαのｍＲＮＡプール中における、このＶＧＳＣαの実際の比率をおおまかに反映している可能性があった。
【０２５５】
２つの充分に保存されているプライマー結合領域間の配列は、すべてのＶＧＳＣαにおいて非常に異なっており、ＤＮＡの配列決定、またはＰＣＲによる（１つのＶＧＳＣαタイプのみの産物を増幅すると思われるＶＧＳＣα特異的なプライマーを使用する）、ＶＧＳＣαタイプ間の区別が可能になる。
【０２５６】
唯一のＮａＶ１タイプのＶＧＳＣα遺伝子、ＳＣＮ９Ａ（ＰＮｌ／ｈＮｅ−Ｎａ）の産物は、すべての転移性が高い抽出物（ラットおよびヒトに由来する）のスクリーニングにおいて豊富：ＭＡＴ−ＬｙＬｕおよびＰＣ−３細胞について、それぞれ３７．３±８．７％および４５．０±３．０％であったことが分かった。対照的に、対応する転移性が低い細胞では、実施したスクリーニングにおいてＳＣＮ９Ａの遺伝子産物は発見されなかった。ＡＴ−２細胞と比較して（１０．７±７．７％）、ｎＳＣＬ−１１もＭＡＴ−ＬｙＬｕのスクリーニングにおいてより多く存在した（５５．３±７．３％）。
【０２５７】
多数の非ＶＧＳＣαクローンを同定した。当業者に明らかであるように、クローンがＶＧＳＣαをコードしていない知られているＧｅｎＢａｎｋのＤＮＡ配列の登録物と一致する可能性がある場合、あるいはクローンが、縮重プライマーによって表される領域に保存されたＶＧＳＣα配列のモチーフを有する配列を有していない、以前に発表されていないｃＤＮＡを表す場合、非ＶＧＳＣαとしてクローンを分類した。非ＶＧＳＣαと同一性があるクローンのパーセンテージは、転移性が高い細胞と比べて、転移性が低い細胞で大きかった（ラットとヒトの両方で）。さらに全体的なレベルは、ラットのスクリーニングと比べてヒト中で高かった。ｈＣｙｔｂ５Ｒは、ヒト細胞のスクリーニングにおいて最もよく見られた非ＶＧＳＣαであった（ＰＣ−３中では１００％の非ＶＧＳＣαクローン、およびＬＮＣａＰ中では６１％）。
【０２５８】
ＶＧＳＣα特異的なＰＣＲ試験　これらの試験によって、縮重スクリーニングで発見したすべてのＶＧＳＣαの産物を生成し（ＭＡＴ−ＬｙＬｕ由来のｓｓｃＤＮＡのＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ７ＡおよびＳＣＮ９Ａ；ＡＴ−２由来のｓｓｃＤＮＡのＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ４Ａ、ＳＣＮ７Ａ、ＳＣＮ１１Ａ）、実際これらすべてがｍＲＮＡ転写物として発現したこと（およびゲノムＤＮＡに由来しないこと）が示された。さらに、ＡＴ−２のスクリーニングにおいてのみ発見されたラットのＶＧＳＣαは、ＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞（ＲＢ２（ＳＣＮ２Ａ）、ｒＳｋＭ１（ＳＣＮ４Ａ）およびＮａＮ（ＳＣＮ１１Ａ））中で発現することが分かった。転移性が高い細胞のスクリーニング（ＭＡＴ−ＬｙＬｕおよびＰＣ−３）においてのみ発見されたＶＧＳＣα（ＳＣＮ９Ａ）は、いくつかまたはすべての転移性が低い細胞抽出物において発現した。（３つのＡＴ−２抽出物の１つで検出されたＰＮ１；両方のＬＮＣａＰ抽出物中のｈＮｅ−Ｎａ）。
【０２５９】
配列分析によって、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３Ａ、ＳＣＮ８ＡおよびＳＣＮ９Ａのいくつかの接合形が、転移性が低い細胞と転移性が高い細胞の両方で発現していたことが示された（図２）。これらの接合形は、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３Ａ、およびＳＣＮ８Ａの新生児形および成体形からなっていたが、ＳＣＮ９Ａについては新生児形のみであった（ラットおよびヒト細胞について、それぞれ１０個と１２個のクローンを配列決定した）。興味深いことに、ＳＣＮ２ＡおよびＳＣＮ３Ａについては、転移性が低いヒト細胞系と転移性が高いヒト細胞系の両方で、新生児形は成体形よりも明らかに豊富に存在した。（両方のＶＧＳＣαについて８個と１個のクローン）。対照的に、ＳＣＮ２Ａの成体形は、ＭＡＴ−ＬｙＬｕおよびＡＴ−２細胞の両方で、より豊富に存在した（１３個と２個のクローン）。
【０２６０】
ｍＲＮＡ転写物からの成体および新生児のエクソンから接合したためにエクソン全体が欠けている、切断型の接合形（△で示す）も、ＳＣＮ２Ａ（ＡＴ−２細胞中の）、ＳＣＮ８ＡおよびＳＣＮ９Ａから増幅させ、配列決定した（図２）。△ＳＣＮ９Ａは、転移性が高い細胞（ラットおよびヒト）においてのみ発見された。公表されているオープン・リーディングフレームを想定すると、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３Ａ、およびＳＣＮ９Ａの転写物は、Ｄ１：Ｓ３で切断されたＶＧＳＣαのタンパク質をコードしていると思われる。対照的に、（ＳＣＮ８Ａからの）△ｈＮａ６は、前に記載したように、Ｄ３：Ｓ３の半分とＤ３：Ｓ４の全部のみが欠けている、ＶＧＳＣαのタンパク質をコードしていると思われる（４８）。さらに、新生児および成体のエクソンを含むＲＢ２（ＳＣＮ２Ａ）の接合形を配列決定し（ＡＴ−２抽出物から）、部分的に接合されたＲＢ２転写物を表した。これはＲＢ２タンパク質に翻訳され、新生児のＤ１：Ｓ３の直後で切断されると思われる（図２）。
【０２６１】
４つのＶＧＳＣαタイプ（ＳＣＬ−１１、ＲＢ２、ＨＢ３およびｈＮａ６）は、クローン化した領域中の個々の発表されている配列とは若干異なっていた。部分的な配列分析によって、（ＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞中の）ｈＮｅ−Ｎａは、３’非コード領域の一部が対応するＧｅｎＢａｎｋの配列と異なることも明らかになった。これらの変化を表ＩＩ中に概略する。他の変化も、特に非コード領域中に存在する可能性があることが予想される。
【０２６２】
表ＩＩ　ＧｅｎＢａｎｋの配列と比べた、部分的に配列決定したＶＧＳＣαのヌクレオチド（ｎｔ）の違い
他のＶＧＳＣα中の演繹アミノ酸の変化、および変化した残基の保存の相対的な度合いを示す。
【表３】
2004507254.tif 000005
【０２６３】
ＳＱＴ−ＰＣＲそれぞれラットおよびヒトのＶＧＳＣαの、典型的な電気泳動の結果を図３および４に示す。転移性が高い細胞と転移性が低い細胞のＲＮＡ抽出物に行ったＰＣＲ反応の効率が同様であったと仮定すると、計算したＣＮｔおよびＣＮｅ値の違い（ゲル画像から誘導した）は、真の発現レベルの違いを表す。この仮定と一致して、コントロールの増幅産物（Ｃｙｔｂ５Ｒ）は、ラット細胞の抽出物（ＣＮｔ＝１８．３±０．２および１７．３±０．４、ＣＮｅ＝２３．１±０．４および２２．１±０．２）またはヒト細胞の抽出物（ＣＮｔ＝１９．２±０．３および１９．５±０．４、ＣＮｅ＝２３．５±０．２および２３．４±０．３）において、ほとんどあるいはまったく違いを示さなかった。
【０２６４】
さらに、誘導したＣＮｔおよびＣＮｅ値を使用して、ＶＧＳＣαの発現レベルのおおよその絶対的な違いを計算することも可能である（８０％のＰＣＲ効率を仮定する（Ｂｉｓｈｏｐ他（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７５、１４２−１４７））、表ＩＩＩ（ａおよびｂ）に示す）
【０２６５】
ＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞とＡＴ−２細胞では、検出可能な産物を生成しＣＮｅに達するために、２つのＶＧＳＣα（ＰＮ１およびＳＣＬ−１１）のみが非常に少ない増幅を必要とし、このことによってＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞中の発現が高レベルであることが示された。重要なことに、ＰＮ１について最も著しい違いが見られた：ＣＮｔ＝２５．２±０．５、ＣＮｅ＝２９．２±０．４（図３ａ）。実際ＰＮ１は、４５サイクル後でさえも、広範囲に研究した２つのＡＴ−２細胞抽出物中では決して検出されなかった。明らかに低レベルのＰＮ１が、第３のＡＴ−２抽出物中に存在した（ＣＮｔ＝３５．７±０．３）。
【０２６６】
１つの他のＶＧＳＣα（ＲＢ２）は、有意な細胞依存性の増幅プロファイルの違いを示した（図３ｅ）。しかしながら、その結果は、全体的に低レベルの発現を示した：ＣＮｔ＝３５．４±０．４（ＭＡＴ−ＬｙＬｕ）および２９．８±０．８（ＡＴ−２）。わずかな細胞依存性の違いは、ｒＳｋＭ１（図３ｄ）およびＮａＮ／ＳＮＳ２（図３ｆ）についても見られ、ここでも転移性の低い細胞中で明らかに高レベルの発現が起こっていた。あるＶＧＳＣα、ＲＢ１は、２つの細胞系の間の発現レベルに明らかな違いは示さなかった（図３ｃ）。
【０２６７】
ＰＣ−３およびＬＮＣａＰ抽出物では、ｈＮｅ−Ｎａについて最も有意な細胞依存性の違いがあり（図４ａ）、ＰＮ１のオーソロガス遺伝子はＣＮｔ＝２５．７±０．８（ＰＣ−３）および３７．７±０．３（ＬＮＣａＰ）であった。２つの細胞系中のｈＮａ６、ＨＢ２およびＨＢ３の発現レベル間にも違いがあり（それぞれ、ＣＮｔ＝２２．６±０．５および２６．８±０．２；２６．８±０．５および３０．７±０．５；３４．０±０．７および３９．７±０．９）、ここでもＰＣ−３細胞のレベルは高かったが、これらの違いはｈＮｅ−Ｎａに関する違いよりもはるかに少なかった。
【０２６８】
ｈＮａ６の新生児（ｈＮａ６Ｎ）および成体（ｈＮａ６Ａ）イソ形を増幅した、ＳＱＴ−ＰＣＲの結果（図４ｆおよび４ｇ）によって、両方の形は転移性の低い細胞中よりも、転移性の高い細胞中において高レベルで発現されたことが示された：それぞれ、新生児形についてはＣＮｔ＝２５．３±０．３および２８．０±０、ＣＮｅ＝２８．１±０．２および３１．８±０．３、および成体形についてはＣＮｔ＝３６．７±０．３および＞４５．０。これらのＣＮｔ値は、両方の細胞系において、新生児形が成体形よりもはるかに高いレベルで発現していたことも示唆すると思われる。
【０２６９】
多様な産物を生成した、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３Ａ、ＳＣＮ８ＡおよびＳＣＮ９Ａの最初のＳＱＴ−ＰＣＲを図２に示す。したがって、決定した相対的な発現レベルのｓｃｎ２ａ、ｓｃｎ３ａ、ｓｅｎ８ａおよびｓｃｎ９ａ ＶＧＳＣαは、異なる形のこれらのＶＧＳＣαを含む。多様な産物を生成したＳＱＴ−ＰＣＲは、単一の産物を生成するＳＱＴ−ＰＣＲの結果と一般的に一致し、重要なことに、たとえばＶＧＳＣαの発現レベルは、ＬＮＣａＰよりもＰＣ−３中で高かった。新生児／成体のイソ形は、一貫して優性に発現したＲＢ２、ＨＢ３、ＰＮ１およびｈＮｅ−Ｎａの接合変異体であったようであり、生成物は少ないサイクル数では他のイソ形よりも顕著であった。しかしながら、ＨＢ２については、△および新生児／成体のイソ形は、明らかに同等なレベルで発現した（図２ａ）。対照的に、ｈＮａ６の発現は、ＬＮＣａＰ細胞中では新生児形によって、ＰＣ−３細胞中では新生児および△形によって支配されていたようである（図２ｃ）。
【０２７０】
考察
この研究では、我々は新規のＲＴ−ＰＣＲ法を開発して、前立腺癌細胞系における多様なＶＧＳＣα遺伝子の発現を調べ、（ｉ）多様なＶＧＳＣαおよびそれらの接合変異体が、ラットおよびヒトの源に由来する、転移性の高い前立腺癌細胞系および転移性の低い前立腺癌細胞系の両方で発現されたこと、（ｉｉ）ＶＧＳＣα発現の全体的なレベルは、転移性の低い細胞と比べて、転移性の高い細胞中で大幅に高かったこと、および（ｉｉｉ）特定の機能的ＶＧＳＣαタイプ、ＳＣＮ９Ａ（ＰＮ１／ｈＮｅ−Ｎａ）の産物の発現が優性であり、前立腺癌であるラットおよびヒト・モデルの転移性の高い細胞中で大幅に上方制御されていたことを示した。
【０２７１】
使用した細胞系は、それらの転移能力が非常に異なるために、研究用に選択した。ラットのＡＴ−２細胞は、コペンハーゲン・ラットの皮下に注射すると、転移性が低かった（１０％未満の動物で肺およびリンパ節転移が進行する（Ｉｓａａｃｓ他（１９８６）Ｐｒｏｓｔａｔｅ ９、２６１−２８１）。対照的に、ＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞は転移性が高く（８０％を超える動物で肺およびリンパ節転移が進行する（Ｉｓａａｃｓ他（１９８６））。同様に、ヒトＰＣ−３細胞は、無胸腺ヌード・マウスの皮下に注射すると容易に転移し、５６％の動物で腋窩リンパ節での転移が生じるが（Ｓｈｅｖｒｉｎ他（１９８９）Ｐｒｏｓｔａｔｅ１５、１８７−１９４；Ｗａｔｅｒｓ他（１９９５）Ｐｒｏｓｔａｔｅ ２６、２２７−２３４）、ＬＮＣａＰ細胞は無胸腺マウス中では転移しなかった（Ｌｅｅ他（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｔｓｉｓ Ｒｅｖ １２、２１−２８）。さらに、レシピエントであるヌード・マウスの前立腺に、転移性である変異体ＰＣ−３細胞を正所注射することによって、９０％の動物でリンパ節転移が起こり、一方ＬＮＣａＰ細胞も腫瘍形成性を示したが、明らかなリンパ節転移は起こらなかった（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ他（１９９２）Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ ８４、９５１−９５７）。
【０２７２】
方法の態様−縮重プライマーＰＣＲスクリーニング技法によって、これらの細胞中で発現されているＶＧＳＣαを決定することを最初に可能にした。縮重プライマー−制限酵素消化技法（Ｆｊｆｅｌｌ，Ｊ他（１９９７）Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５０、１９７−２０４）、および一般的なＶＧＳＣαプローブを使用するノーザン・ブロッティング（Ｂｅｃｋｈ，Ｓ．（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．２６２、３１７−３２２）を含めた他の技法が、ＶＧＳＣαの発現をサンプル化するために同様に使用されている。しかしながら、このような方法とは別に、縮重スクリーニングも定量的な情報を与える。我々の縮重ＰＣＲプライマーは、発表されているすべてのＶＧＳＣαの（Ｄ３：Ｓ５およびＤ３：Ｓ５／Ｓ６中）の２つの充分に保存された領域用に設計したので、ＮａＶ１サブファミリーのすべてのＶＧＳＣαはほぼ同じ効率で増幅された、すなわち、スクリーニングにおけるＶＧＳＣαの相対的な比率は、広義には細胞のｍＲＮＡ中におけるその相対的な豊富さを表す可能性がある。このことは、転移性の高い細胞と転移性の低い細胞の間で見積もられるＶＧＳＣαの発現レベルの違いを比較するときは特に、スクリーニングの結果と非常に一致したＳＱＴ−ＰＣＲデータによって支持される（表ＩＩＩａおよびＩＩＩｂ）。したがって、スクリーニングおよびＳＱＴ−ＰＣＲの結果を直接使用して、ＶＧＳＣαの発現の絶対的なレベル、ＶＧＳＣαに関する情報を決定することはできないが、互いに比べたｍＲＮＡレベルは、スクリーニング中のそれぞれのタイプのクローンのパーセンテージによって表した。
【０２７３】
重要なことに、最も顕著な違いは、転移性の高い細胞中において少なくとも１０００倍発現されたＳＣＮ９Ａに関するものである。ＳＣＮ９Ａも転移性の高い細胞系中の優性なＶＧＳＣαであり、ＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞およびＰＣ−３細胞中の約８０％の「機能的ＶＧＳＣα」のｍＲＮＡ群である。
【０２７４】
定量分析に関するＰＣＲの有用性は、増幅のある段階で定量化ができなくなることによって制限され、その段階を超えると、反応は指数関数的に増幅することを止め、最終的には安定状態に達する（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｃ．ａｎｄ Ｇａｎｎｏｎ，Ｆ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ１２１９、４９３−４９８）。したがって、一般的に使用されている「定量的」ＰＣＲ技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ａｎｄ Ｇａｎｎｏｎ（１９９４）中に概説された）の大部分は、この非指数関数的な増幅の開始に注意することが必要である。本研究中に導入した新規のＳＱＴ−ＰＣＲデータ分析法によって、このポイントは容易に決定した。三次の多項データ分析を、動態観察に基づいて、簡潔で時間を節約するＳＱＴ−ＰＣＲ技法に適用して、指数関数的な増幅が停止するＰＣＲの段階（サイクル数ＣＮｅとして表す）を決定した。したがってＣＮｅは、ＣＮｔの比較と同様の方法で、異なる細胞系のＶＧＳＣαのｍＲＮＡレベルを容易に直接的に比較するための、参照値として使用することができた。しかしながら、ＣＮｅはＣＮｔよりも信頼できるパラメータである可能性がある。なぜなら、（１）ＣＮｅは１つのＣＮｔ読み取り値ではなく数個のデータ・ポイントから誘導され、さらに（２）ＣＮｅは離散値ではなく連続値であり、したがってより正確だからである。
【０２７５】
結論としては、我々の新規な縮重スクリーニングおよびＳＱＴ−ＰＣＲ技法によって、これらの細胞中におけるＶＧＳＣα発現の、一貫性のある定量概略が生み出された。この分析の信頼度のレベルは、異なる細胞系から得られるＣｙｔｂ５Ｒのコントロール・データの確かさによって、さらに高まる。したがって、この２つの方法は、特に組み合わせると、ＶＧＳＣαのｍＲＮＡ発現の迅速で信頼できる定性／定量分析の強力な新しい手段となり、異なる表現型の細胞を、あるいは異なる条件下で同じ細胞タイプを比較するときに特に有用である。
【０２７６】
表ＩＩＩ　（ａ）ラットおよび（ｂ）ヒトの、転移性の高い細胞系と転移性の低い細胞系間で計算した、それぞれのＶＧＳＣαの発現レベルの違い
ＣＮｔ値、ＣＮｅ値（ＳＱＴ−ＰＣＰからのもの）、およびスクリーニングのデータの違いを示し、これらを増殖の要因として述べる。陽性および陰性値は、それぞれ転移性の高い細胞と転移性の低い細胞における、高い発現レベルと低い発現レベルを示す。ＣＮｔとＣＮｅの違いは、いずれの場合も８０％のＰＣＲ効率を仮定して（Ｂｉｓｈｏｐ他（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｃｅｌｌ ＢＩＯｌ ７５、１４２−１４７中で報告されたものと同等）、以下の等式：１．８［ＭＡＴ−ＬｙＬｕ値−ＡＴ−２値］にしたがって計算した（４５）。縮重スクリーニングの違いは、転移性の高い細胞と転移性の低い細胞中で、「ｓｔｄ」で示した指定の標準体（ラットのスクリーニングではＲＢ１、ヒトのスクリーニングではｈＣｙｔｂ５Ｒ）の発現のレベルが同等であると仮定して計算した。「ＮＤ」は、違いを決定することができなかったことを示す。
【表４】
2004507254.tif 000006
【表５】
2004507254.tif 000007
【０２７７】
スクリーニングの結果は、転移性の高い細胞と転移性の低い細胞の間で非常に異なる、ＶＧＳＣαのｍＲＮＡの合計レベルと一致した。ＳＱＴ−ＰＣＲデータによって、転移の可能性が異なる細胞（ラットとヒトの両方）中での、Ｃｙｔｂ５Ｒの発現のレベルが非常に似ていたことが示唆された。したがって、転移性の低いＬＮＣａＰ細胞とＡＴ−２細胞の縮重スクリーニングにおいて、この非ＶＧＳＣαクローンの発生が増大したことによって（表Ｉ）、これらの細胞中のＶＧＳＣαの標的とノイズの比が、転移性の高い細胞と比べて、小さくなったことが示された（したがって、ＶＧＳＣαの発現レベルが低下した）。
【０２７８】
したがってこの研究の結果は、基礎レベルのＶＧＳＣαのｍＲＮＡ発現は転移性の低い細胞中で起こり、この発現は転移性の高い表現型のものでは大幅に上方制御されることを示す。このような、転移性の低い細胞中での基礎レベルのＶＧＳＣαのｍＲＮＡ発現は、前のフロー・サイトメトリーの結果（３８）と一致し、これによって、電気生理学的に検出可能なＶＧＳの電流が存在しないにもかかわらず、ＬＮＣａＰ細胞およびＡＴ−２細胞中でのＶＧＳＣαタンパク質のレベルが低いことが明らかになった。非癌性前立腺上皮細胞中のＶＧＳＣαの発現は、本実施例では調べていない。基礎的なＶＧＳＣαの発現が新生物と関連があるかどうか、あるいはこの発現が正常な癌の上皮細胞に特徴的であるかどうかを決定するために、さらなる作業が必要とされる。
【０２７９】
スクリーニングおよびＳＱＴ−ＰＣＲの結果を直接使用して、ＶＧＳＣαの発現の絶対的なレベルを決定することはできない。しかしながら、縮重スクリーニング・ＰＣＲは、ほぼ同じＰＣＲ効率で、所定のサブファミリー（たとえばＮａＶ１）のすべてのＶＧＳＣαを増幅させ、これによって細胞のｍＲＮＡ中で互いに比べたＶＧＳＣαの発現レベルの情報が維持されると思われる。したがって、スクリーニングにおいてこれらの相対的な豊富さを比較し、これらの豊富さを細胞のｍＲＮＡ中の特定のＶＧＳＣαの相対的な比率と関連付けることができるはずである。利用可能なデータは、図５に示すＶＧＳＣαの相対的な発現の概略と一致する。この評価では、ＳＣＮ９Ａ遺伝子の産物は、ＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞およびＰＣ−３細胞中の「機能的ＶＧＳＣα」ｍＲＮＡ群の約８０％である。
【０２８０】
ＶＧＳＣαの発現の多様性　ＶＧＳＣαのｍＲＮＡの発現のレベルは、転移性の高いＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞中では非常に高く、大部分のＶＧＳＣαタイプは転移性の高い細胞および転移性の低い細胞中において高レベルで発現したが、３つの低度に発現したＶＧＳＣα遺伝子（ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ４ＡおよびＳＣＮ１１Ａ）は、転移性の低いＡＴ−２細胞中ではわずかに高いレベルで存在したことが分かった。これによって、これらのＶＧＳＣαは正常ではＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞中で検出されるＶＧＳの電流には貢献しておらず、存在する場合は生理学的重要性に貢献しているが、発現のこの下方制御を調節する機構は今だに決定されていないことが強く示される。対照的に、ヒトの細胞系では、検出したすべてのＶＧＳＣαは、転移性の高いＰＣ−３細胞中では高いレベルで発現した。
【０２８１】
ＤＲＧ細胞（１４）、ＰＣ１２細胞（４９）、および培養した脊髄星状細胞（１２）中での、多様なＶＧＳＣαの発現は、成体ラットで以前から実証されている。ここで研究した前立腺癌上皮細胞系は、その中で多様なＶＧＳＣαの同時発現が起こることが示されている、他の細胞タイプである。これらの場合はたいてい、広範囲のＶＧＳＣαのｍＲＮＡ発現のレベルが、細胞中に存在することが分かった。現在、単細胞タイプ中でのこの多様な発現の機能的な重要性は明らかではない。これらの細胞中でのＶＧＳＣαの発現は、増殖因子および軸策切断（１４、１７、４９）などの多数の刺激に応答して、サブタイプに特異的な方法で、劇的かつ迅速に上方または下方制御することができる。これは、異なるＶＧＳＣαは異なる機能を有しており、その相対的な重要性は異なる条件下では急速に変わる可能性があることを強く暗示していると思われる。発現の微調整が即座に起こって、細胞のＶＧＳＣαの発現の概略と、必要とされる機能的応答とを一致させることができる。機能的ＶＧＳＣの概略のこのような変化は、既に発現されている異なるＶＧＳＣαを制御することによってのみ得ることができ、ＶＧＳＣα遺伝子を「スイッチ・オンする」より緩慢なプロセスによっては得ることができない可能性が高い。したがって、多様な低レベルのＶＧＳＣαの発現によって、細胞のミクロ環境の動的変化によって必要となる機能的要件を、細胞に満たさせることができる可能性がある。
【０２８２】
ＶＧＳＣは、網膜色素、レンズおよび角膜上皮組織などの上皮タイプを含めた、多数の「非興奮性」組織中で検出されており、これらの機能的役割は大部分は知られていない（４２、５０、５１）。活動電位の生成に関係がないＶＧＳＣの機能的役割は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの脊髄星状細胞において決定されている（５２）。これらの細胞中では、ＶＧＳＣが代わりに、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ活性を維持しながら、Ｎａ＋の復帰経路を提供する。非興奮性細胞中のＶＧＳＣの他の役割には、細胞内のＣａ２＋の恒常性と関係がある段階電位の生成、またはさまざまな細胞内のシグナル経路の活性化が含まれてよい（５２）。
【０２８３】
前立腺癌細胞中の「非機能的ＶＧＳＣα」の高い発現レベル
ＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞およびＰＣ−３細胞中で見られるＳＣＮ７ＡおよびＳＣＮ８ＡのｍＲＮＡ転写物の、機能的ＶＧＳＣを作製する能力は疑わしい。ＳＣＮ７Ａは、明らかになっているチャネル形成能力は有していない、ＮａＶ２のＶＧＳＣαをコードしている。ＳＣＮ８Ａ遺伝子は機能的ＶＧＳＣタンパク質を生成することができることは知られているが、ヒト前立腺癌細胞中で発現される特異的なＳＣＮ８Ａ遺伝子の産物が、これらの細胞中で実用的なチャネルとして機能することができるかどうかは疑わしい。ｈＮａ６Ｎは、Ｄ１およびＤ２のみを有する、充分に切断されたＶＧＳＣαタンパク質（４４）をコードしている。この変異体は非神経および新生児組織中で発見されており、機能的ＶＧＳＣを形成すること、「絶対確実な」機構として代わりに作用して、完全長であるｈＮａ６ ＶＧＳＣαタンパク質（４４）の成体合成を妨げることができないことが示されている。実際、充分に切断された電位依存性Ｋ＋チャネルのαサブユニットを首尾よく使用して、ラット下垂体前葉細胞（５３）中の内生のＫ＋の電流を人工的に抑制している。ｈＮａ６の成体イソ形も、転移性の高いヒト細胞と転移性の低いヒト細胞中において非常に低いレベルで発現していることが分かっているが、新生児のイソ形の存在がｈＮａ６Ａの機能的発現を妨げている可能性がある。Ｄ３中の電位感受性Ｓ４断片を効果的に失った△ｈＮａ６変異体は、特異的ＰＣＲ試験で発見された△ｈＮｅ−Ｎａ、△ＰＮ１、△ＨＢ２および△ＲＢ２接合形と類似である。これらの転写物は、ミス・スプライシングされた非実用的な形のＳＣＮ８Ａ、ＳＣＮ９ＡおよびＳＣＮ２Ａ ＶＧＳＣα遺伝子（４８）を表している可能性がある。明らかに非機能的ＶＧＳＣαを発生させることが、前立腺癌細胞中の効果的なＶＧＳＣ発現を制御する追加的な手段となる可能性がある。
【０２８４】
転移性の高い細胞中でのＰＮ１／ｈＮｅ−Ｎａの優性発現　縮重スクリーニングおよびＳＱＴ−ＰＣＲの結果によって、ＰＮ１／ｈＮｅ−Ｎａは転移性の高い細胞中で発現される優性ＶＧＳＣαであることが一貫して実証された。さらに配列データによって、大部分のＳＣＮ９Ａ転写物は新生児形であったことが示された。実際、成体の接合形は今日まで、新生児のウサギＳｃｈｗａｎｎ細胞（２１）非常に低いレベルでのみ発見されており、したがってＳＣＮ９Ａ遺伝子のＤ１：Ｓ３可変スプライシングが発生的に制御されているかどうかは現在明らかではない。前立腺癌細胞中のＤ１：Ｓ３で可変スプライシングされたことが分かったすべてのＶＧＳＣαも、ＲＢ２を除いて、新生児形で主に発現されたことは注目に値するであろう。
【０２８５】
本研究によって、癌腫中におけるＳＣＮ９Ａ遺伝子の発現の一例が提供されており、ＳＣＮ９Ａ遺伝子の発現の上方制御は、一般的な癌腫関連の現象である可能性があることが示されている。ｈＮｅ−Ｎａは本来、ヒト髄質甲状腺癌腫（ｈＭＴＣ細胞）のクローンＣ−細胞系からクローン化および配列決定され、ヒトＣ−細胞の癌腫組織（５４）中で発現することが分かっている。ＰＮ１のクローンは、ラット副腎髄質（４９）のクロム親和性細胞腫に由来するＰＣ１２細胞から得た。これらの研究において、ｈＮｅ−ＮａまたはＰＮ１の発現と癌腫の間の関連を示唆するものはない。
【０２８６】
ＳＣＮ９Ａの産物は、末梢神経系では高レベルで、脳、脊髄、Ｓｃｈｗａｎｎ細胞、心臓、副腎および甲状腺（４９、５４−５６）、特に神経内分泌細胞（５４、５５）中でははるかに低いレベルで以前に発見されている。神経内分泌細胞は前立腺にも存在する。近年の研究により、神経内分泌細胞の増殖および分化によって前立腺癌の進行を予測することができることが示唆されている。（Ｃｏｈｅｎ他（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ ７４、１８９９−１９０３；Ａｎｔｈｏｎｙ ｄｉ Ｓａｎｔ’Ａｇｎｅｓｅ，Ｐ．（１９９８）Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｕｐｐｌ．８、７４−７９；Ｂｏｎｋｈｏｆｆ，Ｈ．（１９９８）Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｓｕｐｐｌ．８、１８−２２）。前立腺の神経内分泌細胞は、検出可能な核アンドロゲン受容体を欠いており（Ｂｏｎｋｈｏｆｆ，Ｈ他（１９９３）Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ．Ａ．Ｐａｔｈｏｌ．Ａｎａｔ．４２３、２９１−２９４；Ｋｒｉｊｎｅｎ，Ｊ他（１９９３）Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １００、３９３−３９８）、これらの細胞がアンドロゲン無感性であることが示唆される。この神経内分泌細胞の無感性は、前立腺癌をアンドロゲン無感性に進行させることを担う機構において役割を果たしている可能性がある。興味深いことに、アンドロゲンはＶＧＳＣの活性を阻害することができ（Ｔａｂｂ，Ｊ．Ｓ他（１９９４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４、７６３−７７３）、ＶＧＳＣαのｍＲＮＡ発現を低下させることもでき、他のステロイド・ホルモンが発現を低下させることも分かっている（Ｒｉｃｈ，Ｍ．Ｍ．、Ｋｒａｎｅｒ，Ｓ．Ｄ．およびＢａｒｃｈｉ，Ｒ．Ｌ．（１９９９）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．６、５１５−５２２）。したがって、高レベルのＶＧＳＣαのｍＲＮＡ発現が、アンドロゲン無感性が変化しながら、前立腺上皮細胞中で起こる可能性がある。
【０２８７】
比較を行うことができる場合、ＰＮ１およびｈＮｅ−ＮａタイプのＶＧＳＣの電気生理学的および薬理学的性質は、転移性の高いラットおよびヒトの前立腺癌細胞（３６、３７、３９、４９、５４、５６）中で観察されるＶＧＳの電流の性質と非常に似ている。これは、具体的にはこれらの細胞中で記録されるＶＧＳの電流の源であるＳＣＮ９Ａの産物と一致する。このＶＧＳＣαは侵襲プロセス（３６−３８）を増強することが示されているので、これが特定の亜細胞の分布パターン、細胞骨格との相互作用および／またはこの活性を助長する特化した電気生理学的性質を有していることは予想することができる。実際、近年の電気生理学の研究は、ｈＮｅ−Ｎａの１つの明らかに独特な性質、閉じた状態での不活性化の速度が非常に遅いことに焦点を当てている。この性質によって、ゆっくりではあるが徐々に増大する閾値未満の刺激に応じて、「ランプの電流」を生み出すことができる（Ｃｕｍｍｉｎｓ他（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８、９６０７−９６１９）。閉じた状態での不活性化の速度が速いＶＧＳＣαは、このような刺激に応答することができない。
【０２８８】
ＰＮ１タンパク質も、神経増殖因子（ＮＧＦ）、分化したＰＣ１２細胞および培養したラットＤＲＧニューロン中において特異的な亜細胞の局在性があり、神経突起の末端中、成長円錐（４９）の最先端に特異的に存在する。ＮＧＦはＰＣ１２細胞中のＰＮ１発現を上方制御し、これに丸形から非常に枝分かれした形への形態分化が続き、細胞の形態を向上させる際のこのＶＧＳＣαの役割が示される（５７）。これと一致して、ＴＴＸ処理はＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞の形態に対して正反対の影響を与え、細胞の突起を収縮させ細胞をコンパクトにした（５８）。
【０２８９】
疾患状態であるラットおよびヒトのモデルの転移性の高い前立腺癌細胞中において、ＶＧＳＣの機能的発現の源として、ＳＣＮ９Ａ遺伝子産物を具体的に決定することにより、より特異的な実験器具を使用して、転移性機構のあらゆる態様、（１）この遺伝子の発現の増大に特異的に影響を与える、ＳＣＮ９Ａ遺伝子の上流の要素、たとえばホルモン、増殖因子および転写因子／抑制物質、（２）ＣＮ９Ａを発現させて侵襲性／転移性を高める下流の要素をさらに解明することが現在は可能である。
【０２９０】
前立腺癌細胞中の他のＶＧＳＣサブユニットの考えられる発現　本研究では、転移性の高い細胞および転移性の低い細胞中のＶＧＳＣαのｍＲＮＡ発現を特徴付けすることのみを試みた。なぜなら、ＶＧＳＣαのみが機能的ＶＧＳＣをコードするのに充分であるからである。前立腺細胞について決定したＶＧＳＣの発現の多様性は、さらに低レベルでの他のＶＧＳＣαの転写物の考えられる発現によって、およびＶＧＳＣβの発現によって、さらに複雑になる可能性がある。ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ３Ａ、ＳＣＮ４ＡおよびＳＣＮ８Ａ遺伝子の産物は、一般に１つまたは複数のＶＧＳＣβと関連していることが分かっており、したがっていくつかのＶＧＳＣβの発現は、これらの細胞中で起こる可能性がある。しかしながら、ＳＣＮ９Ａ遺伝子の産物はＶＧＳＣβ（５４；５５）とは関係がないようであり（５４；５５）、したがって、これらの補助的なサブユニットが、転移性細胞中の高レベルの機能的ＶＧＳＣの発現を担う機構に、大きく貢献するであろう可能性はない。
【０２９１】
これらの細胞中で発現することがわかっているＶＧＳＣα遺伝子のすべてが、実際にタンパク質に翻訳されるかは確かではない。発現されるＶＧＳＣα遺伝子のすべてを翻訳することができる可能性がある場合、細胞のこのような多様性によって、サブタイプ特異的な方法で、増殖因子および損傷などのさまざまな刺激に対する細胞の応答において、ＶＧＳＣαを迅速に上方制御または下方制御することが可能であると思われる（おそらくＶＧＳＣα遺伝子の「スイッチ・オン」転写よりも速い）（Ｆｊｅｌｌ他（１９９９）Ｍｏｌｅｃ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ６７、２６７−２８２；Ｄｉｂ−Ｈａｊｊ他（１９９６）ＰＮＡＳ ９３、１４９５０−１４９５４；Ｔｏｌｅｄｏ−Ａｒａｌ他（１９９７）ＰＮＡＳ ９４、１５２７−１５３２）。このことは、異なるＶＧＳＣαは異なる機能を助長することを暗示していると思われ、その相対的な重要性は多様な条件下ですぐに変わる可能性がある。したがって、多様な低レベルのＶＧＳＣαの発現によって、細胞のミクロ環境の動的変化によって必要となる機能的要件を、細胞に満たさせることができる可能性がある。
【０２９２】
最終的な所見
本研究には、２つの広義の含意がある。第１に、機能的に異なる前立腺上皮細胞のＶＧＳＣαのｍＲＮＡ発現の概略を特徴付けることによって、（ｉ）非興奮性の細胞中でのＶＧＳＣの発現、および（ｉｉ）単細胞タイプ中でのＶＧＳＣの発現の多様性、すなわち多様なＶＧＳＣサブユニット、およびこれらのサブユニットの多様な接合形の発現の新しい概念のパターン、制御および機能的重要性を研究するための好都合なモデルとして、これらの細胞を現在確立させている。第２に、前立腺癌そのものに関して、現在の管理法の堅い制約は、転移性の表現型用の入手可能なマーカー（前立腺に特異的な抗原など）は信頼性がないことである（５９、６０）。したがって臨床的に重要な癌を、臨床的に重要ではなく激しい治療を必要としない癌（患者の高い死亡率と関連がある）と、容易に区別することができない。前立腺癌であるラットおよびヒトのモデルにおける優性なＶＧＳＣαとして、ＳＣＮ９Ａ遺伝子の産物を同定することによって、転移性の高い前立腺癌細胞系においてＶＧＳＣαの発現が保たれていることに焦点が当てられる。したがって本研究は、この疾患の考えられる診断および治療における、これらのイオン・チャネルの潜在的な価値をさらに支持するものである。
【参考文献】
2004507254.tif 000008
2004507254.tif 000009
2004507254.tif 000010
2004507254.tif 000011
【表６】
2004507254.tif 000012
【０２９３】
実施例２：ヒト前立腺癌中のＶＧＳＣ発現を抑制するための、アンチセンス・オリゴヌクレオチドの設計
１．ＶＧＳＣサブタイプに特異的なアンチセンス・オリゴヌクレオチドを設計するために、可能性のある部位を同定するための、現在知られているすべてのＶＧＳＣタイプの配列。
Ｃｏｎｓ　　　　　　 ａｇｔｇａｇｔｇｔｇａａａｇｔｃｔｔａｔｇｇａｇａｇｃａａｃａａａａｃｔｇ−−−ｔｃｃｇａｔｇｇａａａ
ｈＮａｖ２．１　　　　　ａｇｔｃｇｇｔｇｔｇａａａｇｃｃｔｔｃｔｇｔ−−−ｔｔａａｃｇａａｔｃｃａ−−−ｔｇｃｔａｔｇｇｇａａ
ｈＮｅ−Ｎａ　　　　　 ｔｃｃｇａａｔｇｔｔｔｔｇｃｃｃｔｔａｔｇａＡＴＧＴＴＡＧＴＣＡＡＡＡＴＧ−−−ＴＧＣＧＡｔｇｇａａａ
ヒトの脳１　　　　ａｃｔｇａｔｔｇｃｃｔａａａａｃｔａａｔａｇａａａｇａａａｔｇａｇａｃｔｇ−−−ｃｔｃｇａｔｇｇａａａ
ヒトの脳２　　　　ａｇｔｇａｇｔｇｃａＡＡＧＣＴＣＴＣＡＴＴＧＡＧＡＧＣＡＡＴｃａａａｃｔｇ−−−ｃｃａｇｇｔｇｇａａａ
ヒトの脳３　　　　ａｇｔｇａｃｔｇｔｃ−−ａｇｇｃｔｃｔｔｇｇｃａａｇｃａａ−−−−−ｇ−−ｃｔｃｇｇｔｇｇａａａ
Ｎａ６（ヒト）　　　　 ａｃｔｇａａｔｇｔｇａａａａｇｃｔｔａｔｇｇａｇｇｇｇＡＡＣＡＡＴＡＣＡＧＡＧＡＴＣＡＧＡＴＧｇａａｇ
ｈＳｋＭ１　　　　　 ａａｃａａｇｔｃｔｇａｇｔｇｃｇａｇａｇＣＣＴＣＡＴＧＣＡＣＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧｔｃｃｇｃｔｇｇｃｔｃ
ヒトの心臓１　　　ａａｃａａｇａｇｃｃａｇｔｇｔｇａｇｔｃｃｔｔｇａａｃｔｔｇａｃｃｇｇａｇａａｔｔｇｔａｃｔｇｇａｃｃ
ＰＮ３／ＳＮＳ（ラット）　ａａｃａａｇｔｃｃｇａｇｔｇｔｃａｃａａｔｃａａａａｃａｇｃａｃｃｇｇｃｃａｃｔｔｃｔｔｃｔｇｇｇｔｃ
【０２９４】
上の配列では、可能な場合、ヒトＶＧＳＣの相当物が使用されている。この配列は、ダッシュによって示される配列ギャップを挿入することによって最適化されているが、実際の配列または任意のオリゴヌクレオチド設計体中に、ギャップが実際に存在するわけではない。最も一般的に存在するヌクレオチドは、共通の線（Ｃｏｎｓ）で示す。２０量体のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを設計するための、可能性のある部位は太字で示し、ＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞系の縮重スクリーニングと特異的ＰＣＲ試験の両方で発見された、４つのヒトＶＧＳＣタイプには下線を引く。縮重スクリーニングによって生成した断片の、最も保存されていなかった領域を使用して、ここに一覧したものを生成した。
【０２９５】
いくつかのＶＧＳＣタイプを同時に「接合する」ことが個別にできる２０量体のアンチセンス・オリゴヌクレオチドを、３／４細胞質リンカー中で設計することも可能であると思われる（ＶＧＳＣ配列がすべてのタイプで充分に保存されている場合）。たとえば、３つのＶＧＳＣタイプからの３／４リンカーの２０未満のヌクレオチド切片は、一直線に並ぶことが示される。この切片中では、ｈＮｅ−Ｎａとヒトの脳２の配列は同一であり、ｈＳｋＭ１配列は２個所のヌクレオチド位置でのみ異なる。したがってこの領域では、少なくとも３つのチャネルをノック・アウトするであろう、２つのアンチセンス・オリゴヌクレオチドを設計することが可能である（Ｎａ６（ヒト）配列がこの領域で確認されているときは４つであることも考えられる）。
ｈＮｅ−Ｎａｑ　 ＴＴＡＴＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＡＡＧ
ヒトの脳２　ＴＴＡＴＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＡＡＧ
ｈＳｋＭ１　　 ＴＴＡＴＧＡＣｇＧＡｇＧＡＡＣＡＧＡＡＧ
【０２９６】
表２．試験したクラインのパーセンテージとして表した、（ａ）ラット由来のＭＡＴ−ＬｙＬｕおよびＡＴ−２、および（ｂ）ヒト由来のＰＣ−３およびＬＮＣａＰ細胞系の、ＶＧＳＣαの縮重プライマーによるスクリーニングの結果。
【表７】
2004507254.tif 000013
【表８】
2004507254.tif 000014
【０２９７】
表３．今日までに転移性の高い前立腺癌細胞系および転移性の低い前立腺癌細胞系で発見された、ＶＧＳＣαの接合変異体。ＶＧＳＣαのタイプの成体形および新生児形が記載されている場合、前立腺癌細胞中で発見されたその形は特定される。△は、Ｓ４断片Ｄ１またはＤ３をコードしているエクソンが欠けている、接合変異体を示す（セクション４．３を参照のこと）。
【表９】
2004507254.tif 000015
【０２９８】
実施例３：ヒト前立腺癌の病的進行と相関関係がある電位依存性Ｎａ＋チャネルの発現
以前の電気生理学的研究によって、機能的電位依存性Ｎａ＋チャネル（ＶＧＳＣ）は、ラット（ＭＡＴ−ＬｙＬｕ）およびヒト（ＰＣ−３）前立腺癌の転移性の高い細胞系によって選択的に発現されていることが示されている。さらに、テトロドトキシンを用いてこれらのチャネルを遮断することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞の侵襲性が大幅に低下した（Ｇｒｉｍｅｓ他（１９９５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．３６９、２９０−２９４；Ｌａｎｉａｄｏ他（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５０ １２１３−１２２１。いくつかの異なるラットおよびヒト前立腺癌細胞系による、直接的で侵襲性とＮａ＋チャネルのタンパク質発現の間のポジティブな相関関係が、Ｓｍｉｔｈ他（１９９８）ＦＥＢＳ Ｌｅｎｓ．４２３、１９−２４によってその後実証された。しかしながら、ＶＧＳＣの発現がｉｎ ｖｉｖｏにおいてヒト前立腺癌中で起こるかどうか、さらにそのような場合、その発現のレベルが構成要素である悪性上皮細胞の転移性の概略と関係があるかどうかは知られていない。
【０２９９】
ｉｎ ｓｉｔｕおよび侵襲性癌細胞を含めた、転移性がさまざまである上皮管を含むヒト前立腺の、組織切片中におけるＶＧＳＣタンパク質の免疫組織化学的な局在化を図６に示す。上皮細胞の病的性質が正常から侵襲性の新生物に進行するにつれて、染色の強度の強く漸増的な増加を観察した（図６ＡからＥ）。良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）では、構成要素である上皮細胞によるＶＧＳＣ発現のレベルは非常に低く、主に基底細胞に限られていた（図６Ａ）。低級な前立腺の内部上皮細胞の新生物（低級ＰＩＮ）では、全体の発現のレベルは、基底細胞の免疫組織化学的な染色によって増大し、わずかに強く現れた（図６Ｂ）。ＢＰＨと低級ＰＩＮについてひとまとめに考えると、先端と基部の光学濃度の比は０．７４±０．０５（ｎ＝４５０管、３０切片、１０患者）であった。ＶＧＳＣ発現の顕著で段階的な増大は、多層の特徴的な構造および細胞的特徴、重度の核異常および仁の拡大によって認識された、高級ＰＩＮの出現と関連があった（図６Ｃ）。この傾向はｉｎ ｓｉｔｕの悪性腫瘍（ＩｎｓＭ）を含む管および小胞中で保たれており、ここには基底細胞は存在せず（図６Ｄ）、侵襲性癌（ＩｎｖＣ）細胞も存在しなかった（図６Ｅ）。ＩｎｓＭの段階では、管腔の上皮細胞の先端の原形質膜全体で、ＶＧＳＣの発現が顕著であった（図６Ｄ）。ＩｎｖＣ中でも、細胞の原形質膜全体で、染色が強かった（図６Ｅ）。高級ＰＩＮとＩｎｓＭ上皮細胞についてひとまとめに考えると、ＶＧＳＣ染色の先端と基部の光学濃度の比は、１．５７±０．１９（ｎ＝７５０管、３０切片、１０患者）であった。低級ＰＩＮ管のそれと比較すると、この比は非常に大きかった（Ｐ＜０．０１）。
【０３００】
結論として、ｉｎ ｖｉｔｒｏで前立腺癌細胞の転移性の表現型と関連があるとして我々が以前に同定した高レベルのＶＧＳＣ発現が、ｉｎ ｖｉｖｏで起こることが現在確認されている。したがって、機能的ＶＧＳＣ発現の上方制御は、高い転移能力の不可欠な要素として起こると思われる。ＶＧＳＣの活性は、細胞プロセスの延長を促進すること（Ｆｒａｓｅｒ他（１９９９）Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．２９５．５０５−５１２）、運動性を高めること（Ｆｒａｓｅｒ他（１９９８）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５１３．Ｐ、１３１Ｐ）、侵襲性を高めること（Ｃｒｉｍｅｓ他、１９９５；Ｌａｎｉａｄｏ他、１９９７；Ｓｍｉｔｈ他、１９９８）、または細胞内の恒常性を高めること（Ｆｏｓｔｅｒ他（１９９９）Ｂｒ．Ｊ．Ｕｒｏｌ．８３、１７１−１９４）によって転移に貢献している可能性がある。したがって、ＶＧＳＣの上方制御による細胞極性（先端および基部）によって、隣接組織を指向的に侵襲性にすることができる可能性がある。本観察によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏのクローン由来の細胞系のモデル系で以前に得られた基本的な情報が、選択されなかった非クローン性の原発性のヒト組織に転換される。これらの結果によって、ＶＧＳＣが発現することは転移性である前立腺癌細胞の表現型の要件であり、したがって、原発性組織の診断時に転移性である可能性がある疾患を同定するための、貴重で新規の指標となる可能性があることが示唆される。
【０３０１】
実施例４：前立腺癌細胞系におけるＶＧＳＣの機能の制御
げっ歯類ＭＡＴ−ＬｙＬｕ細胞中でのＶＧＳＣの機能的発現を調べた。上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、ＶＧＳＣの機能的発現を上方制御する。図９に示すように、外性ＥＧＦは機能的なＶＧＳＣの発現を高める。ＥＧＦ受容体キナーゼ阻害物質を同時に施用することによって、この効果は遮断される（ＡＧ１４７８；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）。ＥＧＦ受容体の抗体（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、ＵＳＡ）を施用することによっても、基部のＶＧＳＣの電流は低下し、この現象が内生的に起こっていることを示す。
【０３０２】
他の増殖因子（たとえば神経増殖因子）およびホルモン（アンドロゲンを含めて）に、同様の効果がある可能性がある。
【０３０３】
ここで本発明を、以下の非制限的な実施例および図面を参照することにより記載する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＰＮ１ ＶＧＳＣαの画像分析データへの三次の多様な適合性を示す図である。第１のＭＡＴ−ＬｙＬｕ抽出物に行った三回の繰り返しの適合性を示す。ＰＣＲ産物の質量（ナノグラム）を、ＰＣＲのサイクル数に対してプロットする。上部の挿入写真は、データを誘導したゲル画像を示す。所定のバンドに関する代表的なＰＣＲのサイクル数を、ゲルの上部に示す。
【図２Ａ】
前立腺癌細胞中で見られるＶＧＳＣαの接合変異体の詳細を示す図である。特異的なＰＣＲ試験から決定した、ラット（ＲＢ２およびＰＮ１）およびヒト（ＨＢ２、ＨＢ３、ｈＮａ６およびｈＮｅ−Ｎａ）細胞系中で見られる、（ａ）ＳＣＮ２Ａ、（ｂ）ＳＣＮ３Ａ遺伝子産物の接合変異体を示す。典型的なＳＱＴ−ＰＣＲゲル画像を左側に示し、それぞれＰＣＲ産物を表す理想的なバンドをその側に示す。それぞれの産物に対応する構造的特徴の概略図は右側に示し、産物のサイズ（ヌクレオチド中）を示す。ＶＧＳＣαの正常なドメイン構造に関する、イントロンの位置（異なる影がついた領域は異なるエクソンを表す）およびＰＣＲプライマーの位置（矢印）の配置も示す。所定のバンドの代表的なＰＣＲのサイクル数を、ゲルの上に示す。ＮおよびＡは、新生児および成体の可変スプライシングしたエクソンをそれぞれ示す。△は、可変スプライシングしたエクソンの両方が欠けている産物を示す。
【図２Ｂ】
前立腺癌細胞中で見られるＶＧＳＣαの接合変異体の詳細を示す図である。特異的なＰＣＲ試験から決定した、ラット（ＲＢ２およびＰＮ１）およびヒト（ＨＢ２、ＨＢ３、ｈＮａ６およびｈＮｅ−Ｎａ）細胞系中で見られる、（ｃ）ＳＣＮ８Ａおよび（ｄ）ＳＣＮ９Ａ遺伝子産物の接合変異体を示す。典型的なＳＱＴ−ＰＣＲゲル画像を左側に示し、それぞれＰＣＲ産物を表す理想的なバンドをその側に示す。それぞれの産物に対応する構造的特徴の概略図は右側に示し、産物のサイズ（ヌクレオチド中）を示す。ＶＧＳＣαの正常なドメイン構造に関する、イントロンの位置（異なる影がついた領域は異なるエクソンを表す）およびＰＣＲプライマーの位置（矢印）の配置も示す。所定のバンドの代表的なＰＣＲのサイクル数を、ゲルの上に示す。ＮおよびＡは、新生児および成体の可変スプライシングしたエクソンをそれぞれ示す。△は、可変スプライシングしたエクソンの両方が欠けている産物を示す。
【図３】
ラットＶＧＳＣαのＳＱＴ−ＰＣＲゲル画像を示す図である。（ａ）ＰＮ１、（ｂ）ＳＣＬ−１１、（ｃ）ＲＢ１、（ｄ）ｒＳｋＭ１、（ｅ）ＲＢ２および（ｆ）ＮａＮ／ＳＮＳ２のＳＱＴ−ＰＣＲ産物、および（ｇ）ｒＣｙｔｂ５Ｒコントロールを示す。所定のバンドの代表的なＰＣＲのサイクル数を、ゲルの上に示す。それぞれのパネルでは、上部の画像がＭＡＴ−ＬｙＬｕの細胞抽出物に由来し、下部の画像はＡＴ−２の抽出物に由来した。
【図４】
ヒトＶＧＳＣαのＳＱＴ−ＰＣＲゲル画像を示す図である。（ａ）ｈＮｅ−Ｎａ、（ｂ）ｈＮａ６、（ｃ）ＨＢ２および（ｄ）ＨＢ３のＳＱＴ−ＰＣＲ産物、および（ｅ）ｈＣｙｔｂ５Ｒコントロール、およびｈＮａ６（ｆ）新生児および（ｇ）成体の接合変異体を示す。所定のバンドの代表的なＰＣＲのサイクル数を、ゲルの上に示す。それぞれのパネルでは、上部の画像がＰＣ−３細胞の抽出物に由来し、下部の画像はＬＮＣａＰ細胞の抽出物に由来した。
【図５】
転移性が強い前立腺癌細胞系（白いバー）および転移性が弱い前立腺癌細胞系（黒いバー）中における、さまざまな「機能的ＶＧＳＣα」のｍＲＮＡが示した発現レベルを示す図である。いずれの場合も垂直軸は、転移性が強い相当物中の機能的ＶＧＳＣαのレベルに関する、発現のおおよそのレベルを示す（それぞれラットおよびヒト細胞のＭＡＴ−ＬｙＬｕおよびＰＣ−３）。ＲＢ１（ラット）およびｈＣｙｔｂ５Ｒ（ヒト）を基準として使用し、縮重スクリーニングから、発現レベルを決定した。比較的多量の機能的ＶＧＳＣαのｍＲＮＡが、多様な接合型で発現されているＶＧＳＣαに関して、若干過剰に評価することができる（最も顕著なのはＨＢ２、その大部分は△ＨＢ２形で存在する）。
【図６】
免疫組織化学的に染色したさまざまな病的段階のヒト前立腺の切片およびＶＧＳＣ抗体を示す図である。Ａは良性前立腺肥大症である。Ｂは低級ＰＩＮ．ｌ、管腔、ストロマである。Ｃは高級ＰＩＮである。Ｄはｉｎ ｓｉｔｕでの悪性腫瘍ＩｎｓＭである。Ｅは侵襲性癌細胞ＩｎｖＣｓである（矢印によって示されるいくつかの例を示す）。免疫組織化学的方法を１０％ホルマリン中に固定しパラフィンに包埋した臨床用組織に適用した。年齢およびＧｌｅａｓｏｎ等級が異なる１０の異なる患者からの切片を使用した。抗原を回収するために電子レンジ中で処理した後の組織を、任意のタイプの脊椎動物のＶＧＳＣを認識するペプチド抗体（Ｅｎｇｌａｎｄ他（１９９１）Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．５４８、３３４−３３７）である、Ｎａ＋チャネルの抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）と共に培養した。最初に切片を、４℃において一晩、この抗体を用いて処理した（２μｇ／ｍｌ）。シグナルを検出するために、ビオチン化二次抗体、アビジン−ビオチン複合体、および色原体としてジアミノベンジジンを使用した。二次結合部位を遮断するために、二次抗体の宿主の漿液を施用した。２つの異なるタイプの陰性コントロールを行った（１）一次抗体をスキップし、（２）一次抗体を免疫ペプチドを用いて予め吸収させた。いずれの場合も、ＶＧＳＣ染色が見られなかった。定量分析用に、Ｎｉｋｏｎ顕微鏡およびＡｐｐｌｅ Ｍａｃコンピュータを使用し、３色コードのデジタル・カメラ（Ｐｉｘｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｏｓ Ｇａｔｏｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて画像を得た。画像分析プログラム（ＯＰＴＩＭＡＳ、ｖｅｒｓｉｏｎ ５．２（Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、光学濃度測定を行った。測定バーは１３．５μｍであった。
【図７】
脊椎動物ＶＧＳＣαのＹＪ１／ＹＪ２Ｃ領域の、アミノ酸配列のアラインメントを示す図である。ＬａｓｅｒｇｅｎｅのＭＥＧＡＬＩＧＮソフトウェアを使用して、このアラインメントを生成した。ＰＡＭ２５０重量表を用いるＣｌｕｓｔａｌ法を使用して、すべての配列を整列させた。保存されている残基は箱で囲み影を付けた。配列の受託番号は以下の通りである。ＰＮｌ（ＧＢ：Ｕ７９５６８）、ウサギＳｃｈｗａｎｎ細胞（ＧＢ：Ｕ３５２３８）、ｈＮｅ−Ｎａ（ＰＩＲ：Ｓ５４７７１）、Ｅｅｌ（ＧＢ：Ｘ０１１１９）、ウマＳｋＭ１（ＧＢ：Ｕ２５９９０）、ｈＳｋＭ１（ＧＢ：Ｍ８１７５８）、ｒＳｋＭ１（ＧＢ：Ｍ２６６４３）、マウスｍＮａｖ２．３（ＰＩＲ：Ａ５５１３８）、ＳＣＬ−１１（ＧＢ：Ｙ０９１６４）、ｈＮａｖ２．１（ＧＢ：Ｍ９１５５６）、ＲＢ１（ＳＷ：Ｐ０４７７４）、ＨＢ１（ＧＢ：５７１４４６）、ＲＢ３（ＳＷ：Ｐ０８１０４）、ＨＢ３（ＧＢ：Ｓ６９８８７）、ＲＢ２（ＰＩＲ：Ｂ２５０１９）、ＨＢ２（ＧＢ：Ｍ９４０５５）、マウスＳＣＮ８ａ（ＧＢ：Ｕ２６７０７）、ｒＮａ６（ＧＢ：Ｌ３９０１８）、フグ（ＧＢ：Ｄ３７９７７）、マウスＳＮＳ（ＧＢ：Ｙ０９１０８）、ラットＳＮＳ／ＰＮ３（ＧＢ：Ｘ９２１８４）、ヒト心臓（ＰＩＲ：Ａ３８１９５）、ラット心臓（ＳＷ：Ｐ１５３８９）、ＮａＮ（ＧＢ：ＡＦ０５９０３０）。
【図８】
特異的プライマーＰＣＲから決定した、ラットおよびヒト前立腺癌細胞系中で発現される（Ａ）ｈＮａ６および（Ｂ）ＰＮ１、ｈＮｅ−ＮａおよびＩＩＢ２の、接合変異体の予想される形態を示す図である。暗色のバー（■）は、ＶＧＳＣα遺伝子中で保存されているイントロンの位置を示す。Ｏｈ ａｎｄ Ｗａｘｍａｎ（１９９８）から適合させた。
【図９】
図９Ａは、ＭＡＴ−ＬｙＬｕラット前立腺癌細胞系からの電流の記録を示す図である。この電流は、膜を−１００ｍＶの保持電流から０ｍＶに減極し、次に０％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦおよびｌμＭのＡＧ１４７８中で２４時間培養することによって誘導される。電位依存性Ｎａ＋チャネルの発現は、ＥＧＦの存在下で上方制御された。
図９Ｂは、０％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍｌのＥＧＦおよびｌμＭのＡＧ１４７８およびＥＧＦ受容体の抗体（ｌμｇ／ｍｌ）中で２４時間培養した後の、平均したピークのＮａ＋の電流密度±標準誤差を示すヒストグラムである。統計上の有意性は、それぞれ＊＊＝ｐ＜０．０１および＊＊＊＝ｐ＜０．００１として示す。
【図１】
2004507254.tif 000016
【図２Ａ】
2004507254.tif 000017
【図２Ｂ】
2004507254.tif 000018
【図５】
2004507254.tif 000019
【図７】
2004507254.tif 000020
【図８】
2004507254.tif 000021
【図９】
2004507254.tif 000022
【国際公開パンフレット】
2004507254.tif 000023
2004507254.tif 000024
2004507254.tif 000025
2004507254.tif 000026
2004507254.tif 000027
2004507254.tif 000028
2004507254.tif 000029
2004507254.tif 000030
2004507254.tif 000031
2004507254.tif 000032
2004507254.tif 000033
2004507254.tif 000034
2004507254.tif 000035
2004507254.tif 000036
2004507254.tif 000037
2004507254.tif 000038
2004507254.tif 000039
2004507254.tif 000040
2004507254.tif 000041
2004507254.tif 000042
2004507254.tif 000043
2004507254.tif 000044
2004507254.tif 000045
2004507254.tif 000046
2004507254.tif 000047
2004507254.tif 000048
2004507254.tif 000049
2004507254.tif 000050
2004507254.tif 000051
2004507254.tif 000052
2004507254.tif 000053
2004507254.tif 000054
2004507254.tif 000055
2004507254.tif 000056
2004507254.tif 000057
2004507254.tif 000058
2004507254.tif 000059
2004507254.tif 000060
2004507254.tif 000061
2004507254.tif 000062
2004507254.tif 000063
2004507254.tif 000064
2004507254.tif 000065
2004507254.tif 000066
2004507254.tif 000067
2004507254.tif 000068
2004507254.tif 000069
2004507254.tif 000070
2004507254.tif 000071
2004507254.tif 000072
2004507254.tif 000073
2004507254.tif 000074
2004507254.tif 000075
2004507254.tif 000076
2004507254.tif 000077
2004507254.tif 000078
2004507254.tif 000079
2004507254.tif 000080
2004507254.tif 000081
2004507254.tif 000082
2004507254.tif 000083
2004507254.tif 000084
2004507254.tif 000085
2004507254.tif 000086
2004507254.tif 000087
2004507254.tif 000088
2004507254.tif 000089
2004507254.tif 000090
2004507254.tif 000091
2004507254.tif 000092
2004507254.tif 000093
2004507254.tif 000094
2004507254.tif 000095
2004507254.tif 000096
2004507254.tif 000097
2004507254.tif 000098
2004507254.tif 000099
2004507254.tif 000100
2004507254.tif 000101
2004507254.tif 000102
2004507254.tif 000103
2004507254.tif 000104
2004507254.tif 000105
2004507254.tif 000106
2004507254.tif 000107
2004507254.tif 000108
2004507254.tif 000109
2004507254.tif 000110
2004507254.tif 000111
2004507254.tif 000112
2004507254.tif 000113
2004507254.tif 000114
2004507254.tif 000115
2004507254.tif 000116
2004507254.tif 000117
2004507254.tif 000118
2004507254.tif 000119
2004507254.tif 000120
2004507254.tif 000121
2004507254.tif 000122
2004507254.tif 000123
2004507254.tif 000124
2004507254.tif 000125
2004507254.tif 000126
2004507254.tif 000127
2004507254.tif 000128
2004507254.tif 000129
2004507254.tif 000130
2004507254.tif 000131
2004507254.tif 000132
2004507254.tif 000133
2004507254.tif 000134
2004507254.tif 000135
2004507254.tif 000136
2004507254.tif 000137
2004507254.tif 000138
2004507254.tif 000139
2004507254.tif 000140
2004507254.tif 000141
2004507254.tif 000142
2004507254.tif 000143
2004507254.tif 000144
2004507254.tif 000145
2004507254.tif 000146
2004507254.tif 000147
2004507254.tif 000148
2004507254.tif 000149
2004507254.tif 000150
2004507254.tif 000151
2004507254.tif 000152
2004507254.tif 000153
2004507254.tif 000154
2004507254.tif 000155
2004507254.tif 000156
2004507254.tif 000157
2004507254.tif 000158
2004507254.tif 000159
2004507254.tif 000160
2004507254.tif 000161
2004507254.tif 000162
2004507254.tif 000163
2004507254.tif 000164
2004507254.tif 000165
2004507254.tif 000166
2004507254.tif 000167
2004507254.tif 000168
2004507254.tif 000169
2004507254.tif 000170
2004507254.tif 000171
2004507254.tif 000172
2004507254.tif 000173
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004507254.tif 000174
2004507254.tif 000175
【国際調査報告】
2004507254.tif 000176
2004507254.tif 000177
2004507254.tif 000178
2004507254.tif 000179
2004507254.tif 000180