(57)【要約】プトレッシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼプロモーター、特にタバコから単離されるプロモーターが、前記プロモーターを含む組み換え核酸、前記核酸を含む発現ベクター、前記発現ベクターにより生産されるトランスジェニック植物と共に開示されている。それらの利用方法も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物細胞において下流の異種ＤＮＡ断片の根特異的な転写を指示する単離ＤＮＡ分子であって、
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１と、
（ｂ）０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、６０℃の洗浄ストリンジェンシーにより示される条件で、上記（ａ）の配列を有する単離ＤＮＡまたは上記（ａ）の配列を有する単離ＤＮＡの相補物とハイブリダイゼーションし、植物細胞において下流の異種ＤＮＡ断片の根特異的な転写を指示するＤＮＡ配列と
から成るグループから選択される配列を有する単離ＤＮＡ分子。
【請求項２】
タバコプトレッシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）プロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し、前記プロモーターと作動可能に連結している異種ＤＮＡ断片とを、５’から３’方向に含むＤＮＡ構築物であって、前記プロモーターは異種ＤＮＡ断片の根特異的な発現を指示することを特徴とするＤＮＡ構築物。
【請求項３】
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１と、
（ｂ）０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、６０℃の洗浄ストリンジェンシーにより示される条件で、上記（ａ）の配列を有する単離ＤＮＡの相補物とハイブリダイゼーションし、植物細胞において下流の異種ＤＮＡ断片の根特異的な転写を指示するＤＮＡ配列と
から成るグループから選択される配列を有する根特異的プロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し、前記プロモーターと作動可能に連結している異種ＤＮＡ断片とを、５’から３’方向に含むＤＮＡ構築物。
【請求項４】
前記構築物がプラスミドである請求項３に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項５】
前記異種ＤＮＡ断片が、殺虫タンパク質をコードする遺伝子である請求項３に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項６】
前記異種ＤＮＡ断片が、昆虫に対して毒性を有するバシラス・チューリンゲンシスの結晶タンパク質をコードする遺伝子である請求項４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項７】
請求項３に記載のＤＮＡ構築物により形質転換された植物細胞。
【請求項８】
請求項７に記載の植物細胞から植物を再生することを含む形質転換植物の作製方法。
【請求項９】
ＤＮＡ構築物がＴｉプラスミドをさらに含む、請求項３に記載のＤＮＡ構築物を含む細胞。
【請求項１０】
請求項９に記載の構築物により植物細胞を感染して形質転換植物細胞を生産し、次に前記形質転換植物細胞から植物を再生することを含む形質転換植物の作製方法。
【請求項１１】
植物細胞の衝撃による形質転換(ballistic transformation)に適した、請求項３に記載のＤＮＡ構築物を有する微小粒子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の微小粒子を植物細胞内に発射して形質転換植物細胞を生産し、次に前記形質転換植物細胞から植物を再生することを含む形質転換植物の作製方法。
【請求項１３】
請求項３に記載のＤＮＡ構築物を含む植物細胞プロトプラスト。
【請求項１４】
請求項１３に記載の植物細胞プロトプラストから植物を再生することを含む形質転換植物の作製方法。
【請求項１５】
プトレッシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）根特異的プロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し、前記プロモーターと作動可能に連結している異種ＤＮＡ断片とを、５’から３’方向に含む異種ＤＮＡ構築物を含む、形質転換植物細胞を含んでなる形質転換植物であって、前記プロモーターは異種ＤＮＡ断片の根特異的な発現を指示することを特徴とする形質転換植物。
【請求項１６】
前記プロモーターが、
（ａ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１と、
（ｂ）０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、６０℃の洗浄ストリンジェンシーにより示される条件で、上記（ａ）の配列を有する単離ＤＮＡまたは上記（ａ）の配列を有する単離ＤＮＡの相補物とハイブリダイゼーションし、植物細胞において下流の異種ＤＮＡ断片の根特異的な転写を指示するＤＮＡ配列と
から成るグループから選択される配列を有する、請求項１５に記載の形質転換植物。
【請求項１７】
前記植物が双子葉植物である請求項１５記載の形質転換植物。
【請求項１８】
前記植物が単子葉植物である請求項１５記載の形質転換植物。
【請求項１９】
前記植物がタバコである請求項１５記載の形質転換植物。
【請求項２０】
植物において下流の異種ＤＮＡ断片の根特異的な転写を指示するプロモーターを本質的に含み、配列番号１〜１１から成るグループから選択される配列を有する単離ＤＮＡ分子。
【請求項２１】
請求項２０のプロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し、前記プロモーターと作動可能に連結している異種ＤＮＡ断片とを含む、発現カセットを含むＤＮＡ構築物。
【請求項２２】
請求項２１記載のＤＮＡ構築物を含む形質転換植物細胞を含む形質転換植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２０００年１１月７日提出の米国仮特許出願連続番号６０／２４６，４８８の利益を請求するものである。この出願は、引用することよりその明細全体を本明細書の一部をなすこととする。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、植物において有用な根特異的プロモーター、その利用方法、前記プロモーターを含む構築物、およびその様なプロモーターにより生産されるトランスジェニック植物に関する。
【背景技術】
【０００３】
プロモーターは一般に、転写される遺伝子の上流または下流の核酸配列として定義され、ＲＮＡポリメラーゼがフランキング遺伝子をメッセンジャーＲＮＡに転写する場合には、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーターに結合しなくてはならない。プロモーターは、種々の方法でプロモーターと作動可能に連結している構造遺伝子に影響を及ぼす多くの多様な調節要素を含む。例えば、調節要素は、関連構造遺伝子の発現を増強または抑制し、その遺伝子を発生調節の対象とさせ、あるいはその遺伝子の組織特異的調節に寄与することができる。プロモーターの修飾により、組み換えＤＮＡ技術を用いて、遺伝子発現の可能な任意のパターンを作製できる。例えば、Ｏｌｄ  ａｎｄ  Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ（第４版，１９８９）参照。
【０００４】
特定の害虫または病原体を抑制または死滅させるペプチドを発現するトランスジェニック植物は、作物の損傷および喪失を減少させる方法を提供する。例えば、トランスジェニックトウモロコシにおけるバシラス・チューリンゲンシスタンパク質の発現は、アワノメイガ（European corn borer）に対する抵抗性を供給する。しかし、植物の全組織における導入遺伝子の発現（構成的発現）は、非標的生物にトランスジェニックタンパク質を曝露する可能性があり、トランスジェニックタンパク質に対し抵抗性を有する病原体および害虫の発生に関する選択圧を増大する可能性があるため、不利な場合がある。植物全体にわたる高レベルの導入遺伝子発現は、植物の成長と収穫高にも悪影響を及ぼす可能性がある。これに代わる方法は、特定の害虫または病原体に冒された器官または組織においてのみ、毒性ペプチドを発現する方法である。植物の根を攻撃する害虫および病原体に対し、この方法を実行することは、特徴が明らかにされた根特異的プロモーターが無いため阻まれていた。
【０００５】
遺伝子の転写は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素と遺伝子プロモーターの間に、安定な複合体が形成された時点で開始される。プロモーターは一般に、全ての転写単位の初期段階に出現し、典型的には、長さ約１００塩基対で、一般的に転写開始部位のすぐ上流に位置する。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３８（１９８７）参照。プロモーターは、その「強度」、すなわち転写を正確かつ効率的に開始する能力に差がある。ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素は、転写領域の上流に隣接する約５０塩基の領域を担当すると考えられている。幾つかの例において、転写開始強度は、転写されるＤＮＡの上流に隣接するプロモーター領域に隣接して結合する補助タンパク質により増強される。例えば、Ｓｉｎｇｅｒ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，１４０−１４５．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，ミルバレー、カリフォルニア州（１９９１）参照。
【０００６】
Ｃｏｎｋｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｙａｍａｍｏｔｏの米国特許第５，４５９，２５２号に、ＲＢ７根プロモーターが説明されている。
【０００７】
Ｍｅｎｄｕ  ａｎｄ  Ｓｏｎｇの米国特許Ｎｏ．５，８３７，８７６に、ＮｔＱＰＴ１プロモーターとしても知られるＲＤ２根皮層特異的プロモーターが説明されている。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の第一の点は、植物細胞において下流異種ＤＮＡ断片の根特異的転写を指示する単離ＤＮＡ分子である。プロモーターは、タバコプトレッシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）プロモーターまたはＮｔＰＭＴ１プロモーターの様なプトレッシン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）プロモーターである。本発明のプロモーターの例として、（ａ）本明細書に提供されている配列番号１〜１１、および（ｂ）配列番号１〜１１のいずれか、またはその相補物と（好ましくはストリンジェントな条件において）ハイブリダイゼーションし、植物細胞において下流に位置する異種ＤＮＡ断片の根特異的な転写を指示するＤＮＡから成るグループから選択される単離ＤＮＡ分子が挙げられる。
【０００９】
本発明の更なる点は、タバコＰＭＴプロモーターとプロモーターの下流に位置し、プロモーターと作動可能に連結している異種ＤＮＡ断片を含む発現カセットである。
【００１０】
本発明の更なる点は、根特異的プロモーターの配列が本明細書に記述されている根特異的プロモーターと異種ＤＮＡ断片を含む発現カセットである。
【００１１】
本発明の更なる点は、上記に説明されている発現カセットを含む植物細胞、その様な植物細胞から形質転換植物を作製する方法、そのような形質転換植物細胞を含む形質転換植物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本明細書において、ヌクレオチドは、一本鎖のみにより、左から右に５’から３’方向に表示されている。本明細書において、ヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ−ＩＣＢ（国際純正応用化学連合−国際生化学連合）生化学命名委員会の推奨法により表示されている。
【００１３】
本発明の根特異的プロモーターの具体例は、配列番号１〜１１に示す配列のいずれか１つに対応する配列を持つＤＮＡ分子であり、配列の全ては下記により詳細に論じられている。ＴｏｂＰＭＴ根特異的プロモーターを同様に含む、前記配列より長いまたは短い、あるいはそれらに対するわずかな付加、削除または置換が行われたタバコＰＭＴ５’フランキング領域由来のその他の配列断片を調製できることは明らかであり、それらは全て本発明の範囲に含まれる。本発明の更なる点は、タバコ遺伝子から単離されるプロモーター、あるいはタバコＰＭＴプロモーターと相同で、植物細胞において下流の異種ＤＮＡ断片の根特異的な転写を指示できる下記のタバコ以外の植物から単離されるプロモーターを含む。
【００１４】
本明細書に使用されているＴｏｂＰＭＴプロモーターは、タバコＰＭＴ遺伝子の転写される領域の５’に見いだされるＤＮＡの連続断片と同一、または実質的に相同の配列を持つＤＮＡ分子を指す。本明細書に示す配列番号１は、ＴｏｂＰＭＴ遺伝子の転写開始部位の５’に隣接して見いだされる領域の配列を提供する。ＴｏｂＰＭＴプロモーターは、ＴｏｂＰＭＴの転写される領域の５’に隣接する少なくとも１００塩基対領域、１５０塩基対領域、好ましくは２００塩基対領域を含み、根特異的な発現を指示する。本明細書に使用されている「実質的に相同な」領域とは、核酸配列と少なくとも７５％、より好ましくは８０％、８５％、９０％、更に９５％相同である。
【００１５】
本明細書に使用されている根特異的プロモーターは、植物の葉または茎の組織、またはその他の組織の発現と比較して、根の組織における作動可能に連結しているＤＮＡ、核酸または遺伝子の発現を優先的に指示するプロモーターである。
【００１６】
その他の植物由来の根特異的プロモーター配列には、転写されるＤＮＡ領域上流に隣接するタバコＰＭＴプロモーターの約１００塩基断片に少なくとも７５％相同であり（より好ましくは８０％、８５％、９０％、更に９５％相同であり）、また植物細胞において下流の異種ＤＮＡ断片の根特異的転写を指示できる配列が含まれる。その他の植物由来の根特異的プロモーターには、本明細書において配列番号１〜１１により定義されるＴｏｂＰＭＴプロモーターの連続部分に少なくとも７５％相同であり（より好ましくは８０％、８５％、９０％、更に９５％相同であり）、また植物細胞において下流の異種ＤＮＡ断片の根特異的な転写を指示できるプロモーターが含まれる。相同性のパーセンテージは、適切な比較アルゴリズムを使用することにより、あるいは目視検査により、配列番号１〜１１の様な基準配列をもう一方の試験配列と比較することにより決定できる。一実施例において、少なくとも約２０残基から５０残基の長さの配列の領域にわたり、実質的な同一性が存在する。配列比較に関して、典型的には１つの配列が基準配列の役割を果たし、それに対して比較配列が比較される。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列と基準配列をコンピューターに入力し、必要な場合には下位配列座標が指定され、配列アルゴリズムプログラムパラメータが指定される。次に、配列比較アルゴリズムが、指定されたプログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列の配列同一性のパーセンテージを計算する。比較のための配列の最適アラインメントを、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムにより、これらのアルゴリズムのコンピューター化処理により（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，マディソン、ウィスコンシン州のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査により（一般的にＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記参照）により実施できる。有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、配列同一性の関係とパーセンテージを示すために、順次対整列を用いて、一群の関連配列から多重配列アラインメントを作成する。ＰＩＬＥＵＰはまた、アラインメントの作成に使用されるクラスタリング関係を示すツリーまたはデンドグラムもプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０（１９８７）の順次アラインメント法の簡素化を使用している。使用される方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３（１９８９）により説明された方法と類似している。プログラムは、それぞれの最大の長さが５，０００ヌクレオチドまたはアミノ酸の３００までの配列を整列できる。多重アラインメント手順は、２つの最も類似している配列のペアのアラインメントから始まり、２つのアラインされた配列のクラスタを生じる。次に、このクラスタを、次の最も相関する配列またはアラインされた配列のクラスタに整列する。配列の２つのクラスタは、２つの個々の配列のペアのアラインメントの単純延長により整列される。最終アラインメントは、一連の順次ペアアラインメントにより達成される。プログラムは、配列比較の領域に関する特定の配列およびそれらのアミノ酸またはヌクレオチド座標を指定することにより、またプログラムパラメータを指定することにより実行される。例えば、以下のパラメータ、デフォルトギャップ重み（３．００）、デフォルトギャップ長さ重み（０．１０）、加重されたエンドギャップを用いて、配列同一性関係のパーセンテージを決定するために、基準配列を別の試験配列と比較することができる。配列同一性のパーセンテージと配列類似性の決定に適したアルゴリズムのもう１つの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）に説明されている。ＢＬＡＳＴ分析を実行するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から一般利用が可能である。このアルゴリズムは、データベース配列の同じ長さのワードとアラインされると、幾つかの正に評価された閾値スコアＴに適合するか、それを満足する質問配列の短いワード長Ｗを識別することにより高得点配列対（ＨＳＰ）をまず識別することが含まれる。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記）。これらの初期近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰを発見するための探索を開始するためのシードの役割を果たす。次に、累積整列スコアを増大させることができる限り、ワードヒットは各配列に沿って両方向に延長される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメータＭ（合っている残基対に関するリワードスコア；常に＞０）およびＮ（合っていない残基対に関するペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列に関しては、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。両方向のワードヒットの延長は、累積アラインメントスコアが、その最大達成値から数量Ｘ低下した場合；１つ以上の負のスコアリング残基の累積により、累積スコアが０以下となった場合；または、どちらかの配列の末端に到達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、Ｘが、アラインメントの感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴＩＮプログラム（ヌクレオチド配列に関する）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、予測（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列に関して、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとしてワード長（Ｗ）３、予測（Ｅ）１０、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９８９）。
【００１７】
相同ＤＮＡ配列の、本明細書に示されているＤＮＡ配列へのハイブリダイゼーションを可能にする高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、本技術において公知である。例えば、このような配列の、本明細書に開示されているＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、２５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハート溶液において、４２℃で１００μｇ／ｍｌの一本鎖ＤＮＡと５％硫酸デキストランを用いて、２５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃で１５分間の洗浄条件で実施でき、約６０％の相同性で配列のハイブリダイゼーションが可能となる。よりストリンジェントな条件は、標準ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイを用いる０．３ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍのクエン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、４２℃または更に７０℃の洗浄ストリンジェンシーにより示される。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ参照）。一般的に、根特異的プロモーターをコードし、本明細書に開示されているタバコＰＭＴ根特異的プロモーターをコードするＤＮＡ配列とハイブリダイゼーションする植物のＤＮＡ配列は、本明細書に開示されているタバコＰＭＴ根特異的プロモーターをコードするＤＮＡの配列と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、更に９５％以上相同である。
【００１８】
本発明の根特異的プロモーターは、形質転換植物における導入遺伝子の組織特異的発現を指示するのに有用である。このような組織特異的導入遺伝子発現は、植物の根を攻撃する害虫および病原体により引き起こされる損傷に対する抵抗性を提供するのに有用である。更に、根は、光合成産物を貯蔵するための大きなシンク器官であるため、貯蔵された炭水化物を変更する様にデザインされた導入遺伝子の発現は、このようなプロモーターにより指示される。根特異的発現のための特定の目的の外来遺伝子には、重金属（例えば、メタロチオネイン）を結合するタンパク質；土壌伝播性害虫および病原体に対する抵抗性を提供するタンパク質；熱、塩（塩分）および干ばつに対する抵抗性を賦与するタンパク質；脱塩のためのタンパク質；および植物貯蔵化合物を他の好ましい産物または形態に代謝するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。
【００１９】
本発明の根特異的プロモーターは、「分子農業」適用例においてタンパク質またはペプチドを発現するために利用できる。このようなタンパク質またはペプチドには、工業用酵素、構造物、治療物質、栄養産物が含まれるが、これらに限定されない。植物が甜菜の様な根菜植物である場合には、このような根特異的発現が特に有用である。
【００２０】
本発明の根特異的プロモーターは、植物中の天然遺伝子の発現を減少または阻害するオリゴヌクレオチドの発現にも有用である。このようなオリゴヌクレオチドは、４、６または８ヌクレオチド長から４０、８０または１００ヌクレオチド長、あるいはそれ以上であり、天然遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、センス抑制物質またはその他の産物をコードできる。
【００２１】
組織特異的プロモーターは、選択された組織部位において、殺虫剤前駆体を活性型に転換するためにも利用できる。Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｓｔｉｃ．Ｓｃｉ．，４４，９（１９９５）は、根において殺虫剤前駆体を活性型に優先的に転換するために、根特異的プロモーターＴｏｂＲＢ７とβ−グルクロニダーゼ酵素を含むキメラ遺伝子の利用を報告している。不活性の殺虫剤前駆体（ヒドロキシメチルオキサミルのグルクロニド）は、観葉植物に塗布され、次に植物の篩部を通って根に輸送され、そこでグルクロニダーゼにより活性殺線虫剤型に転換された。
【００２２】
更に、根の皮層に特異的なプロモーターは、組織学的目的に有用であり、β−グルコニダーゼのようなリポーター遺伝子を用いて、根の皮層組織を同定または染色する。
【００２３】
本明細書に使用されている「作動可能に連結している」という言葉は、一方の機能が、もう一方により影響される様に結合されている一本鎖ＤＮＡ内部に含まれるＤＮＡ配列を意味する。従って、あるプロモーターがある遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる場合、プロモーターはその遺伝子と作動可能に連結している（すなわち、遺伝子はプロモーターにより転写調節される。）。プロモーターは、遺伝子の「上流」にあると言われ、遺伝子は逆にプロモーターの「下流」にあると言われる。
【００２４】
本発明のＤＮＡ構築物、または「発現カセット」は、５’−３’の転写方向に、本発明のプロモーター、プロモーターに作動可能に連結している異種ＤＮＡ断片、および任意選択により、終結シグナルおよび／またはポリアデニル化領域の様な転写および翻訳終結領域を含む。これらの調節領域は、好ましい形質転換細胞において機能できる。３’終結領域は、転写開始領域と同じ遺伝子または異なる遺伝子から得ることができる。
【００２５】
植物は、クロロフィルを持たない植物（例えば、真菌）とクロロフィルを含む植物（緑藻類、セン類）に分けられ、更にクロロフィルを含み、導管組織を持つ植物に分けられる（例えば、シダ、裸子植物、針葉樹、単子葉植物、双子葉植物）。後者の植物群は、根、茎、葉が存在する植物が含まれる。本明細書に使用されている「植物」という言葉は、上記に説明されている生物体全てを包含する。本明細書に使用されている「天然植物ＤＮＡ」という言葉は、遺伝子が変更されていない、あるいは非形質転換植物（例えば、選抜育種により生産される植物変種）から単離されるＤＮＡを意味する。
【００２６】
本明細書に使用されている異種遺伝子または異種ＤＮＡ断片という言葉は、遺伝子工学技術により細胞を形質転換するために使用される、細胞に本来存在しない遺伝子（またはＤＮＡ断片）を意味する。構造遺伝子は、タンパク質、ポリペプチド、またはその一部をコードするＤＮＡ断片を含む遺伝子の部分で、恐らくリボソーム結合部位および／または翻訳開始コドンを含むが、プロモーターは欠失している。この言葉は、人工的に導入されたのではなく、細胞内に本来見いだせる構造遺伝子のコピーも意味する場合がある。構造遺伝子は、その遺伝子が導入される、あるいはその遺伝子に作動可能に結合されたプロモーターと組み合わせて導入される、植物細胞には通常は見いだせないタンパク質をコードできる。植物種における発現のために、本発明のプロモーターに操作により結合される遺伝子は、染色体遺伝子、ｃＤＮＡ、合成遺伝子またはそれらの組み合わせから得られる。本明細書に使用されている異種ＤＮＡ断片という言葉は、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡの様な非タンパク質産物をコードするＤＮＡ断片も含む。アンチセンスＲＮＡは公知である（例えば、米国特許Ｎｏ．４，８０１，５４０（Ｃａｌｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）参照）。
【００２７】
本発明と共に使用する目的の遺伝子には、多様な表現型および非表現型特性に栄養を及ぼす遺伝子が含まれる。表現型には、（熱、塩分または干ばつから生じる）乾燥、除草剤、毒性金属、微量元素、害虫、病原体を含むがこれらに限定されない種々の環境ストレスに対する抵抗性を提供する酵素の様なタンパク質がある。抵抗性は、標的部位における変化、宿主細胞における標的タンパク質量の増大、ストレスから宿主を保護する産物の生合成経路に関わる１種類以上の酵素量の増加などに基づくものと思われる。構造遺伝子は、（例えば、酵母、ウィルス、植物、哺乳動物のような）原核生物または真核生物、細菌、真菌から得られ、あるいは全体または一部を合成できる。遺伝子の例として、グリホスフェート抵抗性３−エノールピルビルホスホロチオエートシキミ酸シンターゼ遺伝子、ニトリラーゼ、プロリンおよびグルタミン生合成経路の遺伝子、およびメタロチオネインが含まれる。
【００２８】
本発明のプロモーターに操作により結合される構造遺伝子は、バシラス・チューリンゲンシス結晶タンパク質の様な昆虫に対し有毒なタンパク質をコードするタンパク質が可能である。甲虫に有毒なバシラス・チューリンゲンシス毒素をコードするＤＮＡ配列、および毒性が保持されたこの配列のバリエーションは、米国特許第４，８５３，３３１号（米国特許第４，９１８，００６号および４，９１０，１３６号も参照）に開示されている（本明細書に引用されている米国特許文献は全て、引用することによりその全体が本明細書の一部を成すものとする）。鱗翅目に対する毒性を植物に賦与するバシラス・チューリンゲンシス由来の遺伝子配列は、ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０２８０３に開示されている。ＰＣＴ出願ＷＯ  ８９／０４８６８は、その配列が本発明と関連づけて使用できるバシラス・チューリンゲンシス結晶タンパク質の発現を促進するベクターにより形質転換されたトランスジェニック植物を開示している。ＰＣＴ出願ＷＯ  ９０／０６９９９は、鱗翅目に対して活性なバシラス・チューリンゲンシス結晶タンパク質毒素をコードするＤＮＡを開示している。その他の昆虫毒素をコードする遺伝子配列の例は、米国特許第４，９４０，８４０号およびＰＣＴ出願ＷＯ  ９０／０７００１に開示されている様にキチナーゼをコードする遺伝子配列（例えば、ＥＣ−３．２．１．１４）である。線虫に対して活性なポリペプチド毒素を生産するバシラス・チューリンゲンシスの菌株は、米国特許第４，９４８，７３４号および５，０９３，１２０号に開示されている。
【００２９】
遺伝子の発現産物が細胞質以外の細胞区画に配置される場合、構造遺伝子は、細胞原形質膜の様な特定部位への発現産物の移動、あるいは細胞周辺腔内または細胞の外部環境への分泌を引き起こす特定のアミノ酸配列をコードする領域を含む様に作成できる。ペプチド発現産物を特定部位に向けるための種々の分泌リーダー、膜組み込み配列、転位置配列が、文献に説明されている。例えば、Ｃａｓｈｍｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８５）３：８０３−８０８，Ｗｉｃｋｎｅｒ  Ｌｏｄｉｓｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２３０：４００−４０７参照。
【００３０】
発現カセットは、少なくとも１つの複製系をも有するＤＮＡ構築物の中に供給できる。好都合には、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４等の大腸菌において機能する複製系を持つのが一般的である。この方法においては、各操作後の各ステップにおいて、生じた構築物は、クローニングされ、配列決定され、操作が適正であることが決定される。更に、あるいは大腸菌複製系の代わりに、Ｐ−１不和合プライマーの複製系、例えば、ｐＲＫ２９０の様な広範にわたる複製系を利用できる。複製系に加えて、少なくとも１種類のマーカーを含めることも可能で、これは１種類以上の宿主で有用な場合もあり、あるいは個々の宿主にそれぞれ別のマーカーが有用な場合もある。すなわち、あるマーカーは原核生物宿主において選択のために利用でき、一方別のマーカーは真核生物宿主、特に植物宿主において選択のために利用できる。マーカーは、抗生物質、毒素、重金属等の殺生物剤に対する防御作用を提供でき、栄養要求宿主に原栄養性を賦与することにより補完でき、あるいは植物において新しい化合物を生産することにより肉眼で観察できる表現型を提供できる。利用できる遺伝子の具体例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ニトラーゼ、ゲンタマイシン耐性遺伝子が含まれる。植物宿主の選択に関しては、適切なマーカーの限定的ではない具体例として、β−グルクルニダーゼ（ＧＵＳ）（インジゴを生産する）、ルシフェラーゼ（可視光線を生じる）、ＮＰＴＩＩ（カナマイシン耐性またはＧ４１８耐性を提供する）、ＨＰＴ（ヒグロマイシン耐性を提供する）、突然変異アロＡ遺伝子（グリホセート耐性を提供する）がある。
【００３１】
種々の構築物、発現カセット、マーカーなどを含む種々の断片を、適切な複製系の制限酵素切断と特定の構築物または断片の利用可能部位への挿入により導入することができる。結合とクローニングの後、ＤＮＡ構築物を更なる操作のために単離することができる。これらの技術全てが、文献に十分に例示されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈｏｒｂｏｒ、ニューヨーク州参照。
【００３２】
ベクターは複製可能なＤＮＡ構築物である。本発明のＤＮＡ構築物により植物組織を形質転換するために利用できるベクターに、アグロバクテリウムベクターおよび弾道ベクター(ballistic vector)の両者と、ＤＮＡを介する形質転換に適したベクターが含まれる。Ｔｉプラスミドを含む本発明のＤＮＡ構築物を含有するアグロバクテリウム・ツメファシエンス細胞は、形質転換植物の作製方法に有用である。植物細胞は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスにより感染し、形質転換植物細胞が生産され、次に形質転換植物細胞から植物が再生される。
【００３３】
本発明の実施に有用な多くのアグロバクテリウムベクター系が公知である。例えば、米国特許第４，４５９，３５５号は、Ｔｉプラスミドを含むアグロバクテリウム株により、双子葉植物を含む形質転換し易い植物を開示している。アグロバクテリウムベクターによる木本の形質転換は、米国特許第４，７９５，８５５に開示されている。更に、Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許合４，９４０，８３８号は、バイナリーアグロバクテリウムベクター（すなわち、その中で、アグロバクテリウムは、Ｔｉプラスミドのｖｉｒ領域を持つが、Ｔ−ＤＮＡ領域は持たない１つのプラスミドと、Ｔ−ＤＮＡ領域を持つが、ｖｉｒ領域は持たない第二のプラスミドを含むもの）が、本発明の実施に有用であることを開示している。
【００３４】
本発明のＤＮＡ構築物を有する微小粒子は、植物細胞の衝撃による形質転換(ballistic transformation)に適しているが、本発明の形質転換植物の作製にも有用である。微小粒子は、植物細胞の中に発射され、形質転換植物細胞が生産され、形質転換植物細胞から植物が再生される。あらゆる適切な衝撃による細胞形質転換方法および装置が、本発明の実施に利用できる。装置および手法の具体例が、Ｓａｎｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｗｏｌｆ，米国特許第４，９４５，０５０号およびＡｇｒａｃｅｔｕｓ欧州特許出願第０２７０３５６号、表題「Ｐｏｌｌｅｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」に開示されている。衝撃による形質転換手法を用いる場合、発現カセットは、形質転換される細胞において複製可能なプラスミドの中に組み込むことができる。このような系における利用に適した微小粒子の例として、１から５μｍの金の球が挙げられる。ＤＮＡ構築物は、沈殿の様なあらゆる適切な技術により、微小粒子に蓄積できる。
【００３５】
形質転換宿主細胞は、組み換えＤＮＡ技術を用いて、本明細書に開示されているＤＮＡ配列を含む構築物により形質転換またはトランスフェクションされた細胞である。植物種は、本技術において公知の手順に従って、植物細胞プロトプラストのＤＮＡを介する形質転換と、その後の形質転換プロトプラストからの植物の再生により、本発明のＤＮＡ構築物を用いて形質転換できる。
【００３６】
本明細書に開示されているプロモーター配列は、プロモーターを利用できる全ての植物種（すなわち、そのＲＮＡポリメラーゼが、本明細書に開示されているプロモーター配列に結合する全ての植物種）において異種ＤＮＡ配列を発現するために使用できる。本発明のＤＮＡ構築物を用いる形質転換に適した植物種の例には、単子葉植物と双子葉植物の両者が含まれ、タバコ、ダイズ、ジャガイモ、ワタ、テンサイ、ヒマワリ、ニンジン、セロリ、アマ、キャベツ、その他のアブラナ科植物、コショウ、トマト、柑橘類、豆、イチゴ、レタス、トウモロコシ、カラス麦、小麦、米、大麦、サトウモロコシ、キャノーラが含まれるが、これらに限定されない。従って、本発明のＤＮＡ構築物により形質転換できる植物の具体例のカテゴリーは、双子葉植物であり、本発明のＤＮＡ構築物を用いて形質転換できる植物のより特定のカテゴリーは、ナス科の植物である。
【００３７】
器官形成によっても、胚形成によっても、その後のクローン増殖が可能なあらゆる植物組織は、本発明のベクターを用いて形質転換できる。本明細書に使用されている「器官形成」という言葉は、分裂組織中心から苗条と根が逐次発生する過程を意味し、本明細書に使用されている「胚形成」という言葉は、体細胞または生殖細胞から、一斉同時に（逐次ではなく）発生する過程を意味する。選択される特定の組織は、形質転換される特定の種にとって利用可能で、最も適したクローン増殖形質転換によって異なる。組織標的の例として、葉盤、花粉、胚、子葉、胚軸、大配偶体、カルス組織、既存分裂組織（例えば、頂端分裂組織、腋芽、根端分裂組織）、誘導分裂組織（例えば、子葉分裂組織、胚軸分裂組織）が含まれる。
【００３８】
以下の具体例は、本発明の種々の特別な実施例を説明するために提供されており、本発明を制限することを意図するものではない。
【実施例１】
【００３９】
［具体例１］
＜ＮｔＰＭＴプロモーターのクローニング＞
Ｎ．Ｈｉｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ６，７２３−７２５（１９９４）により発表されたＰＭＴ  ｃＤＮＡ配列を用いて、我々は、インバース−ＰＣＲのためのネストされた多岐ＰＣＲプライマー（nested divergent PCR）をデザインした。タバコゲノムＤＮＡを、種々の制限エンドヌクレアーゼを用いて切断し、低濃度ＤＮＡにおいて連結させ（環状化を促進するために）、次にインバースＰＣＲの鋳型として使用した。最も長い増幅産物を、ＮｄｅＩを用いて消化されたゲノムＤＮＡから得た。この断片をクローニングし、配列決定した。ＰＭＴ  ｃＤＮＡとの配列比較により、既知領域における配列同一性が明らかにされ、事実増幅されたＤＮＡが、ＰＭＴ  遺伝子の５’フランキング領域であることを示していた。ＮｔＰＰＴプロモーターのＤＮＡ配列を以下に示す。
【００４０】
【化１】
2004533807.tif 000002
【００４１】
Ｈｉｂｉ  ｅｔ  ａｌ．上記により発表されたＰＭＴ  ｃＤＮＡに対応する配列を下線で示す。開始ＡＴＧは太字で示す。インバースＰＣＲのプライマーとして使用される配列はイタリック体で示す。
【実施例２】
【００４２】
［具体例２］
＜トランスジェニック植物＞
標準技術に従って、具体例１に示されているＮｔＰＭＴ１プロモーターを（配列番号１）を、ｐＢ１１０１のＧＵＳ遺伝子と融合し、タバコの中に形質転換した。例えば、米国特許第５，８３７，８７６号の具体例４〜６参照。トランスジェニック根をＧＵＳ活性に関して染色した。
【実施例３】
【００４３】
［具体例３］
＜欠失変異体＞
本発明のＰＭＴプロモーターの更なる例として、上記配列番号１に示すプロモーターの欠失変異体が挙げられる。これらは、下記配列番号２〜６に示す様に５’領域が欠失した突然変異を含む。
【００４４】
配列番号２
【化２】
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【００４５】
配列番号３
【化３】
2004533807.tif 000004
【００４６】
配列番号４
【化４】
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【００４７】
配列番号５
【化５】
2004533807.tif 000006
【００４８】
配列番号６
【化６】
2004533807.tif 000007
【００４９】
本発明のＰＭＴプロモーターの更なる具体例は、３’領域が欠失した上記配列番号１に示す配列の欠失変異体が挙げられる。具体例として下記の配列番号７〜９が挙げられる。
【００５０】
配列番号７
【化７】
2004533807.tif 000008
【００５１】
配列番号８
【化８】
2004533807.tif 000009
【００５２】
配列番号９
【化９】
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【００５３】
本発明のＰＭＴプロモーターの更なる例として、３’領域と５’領域の両者が欠失した上記配列番号１に示すプロモーターの欠失変異体が挙げられる。具体例として、下記配列番号１０〜１１が挙げられる。
【００５４】
配列番号１０
【化１０】
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【００５５】
配列番号１１
【化１１】
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【００５６】
前記配列番号２〜１１は全て、上記に説明されている様に、目的の異種核酸またはＤＮＡと作動可能に結合でき、上記に説明されている様に、ベクターに挿入でき、植物細胞に導入でき、トランスジェニック植物とすることができる組換え核酸を生産でき、植物における異種核酸またはＤＮＡの発現を引き起こす。
【実施例４】
【００５７】
［具体例４］
＜発現分析＞
図１は、ＰＭＴプロモーターにより指示される葉（１列目）、茎（２列目）、根（３列目）の平均ＧＵＳ発現レベルを示す。データは、我々が検討した独立した形質転換体４８例全てに関するものである。ＧＵＳレベルには、形質転換体間に著明な変動が認められた。平均ＧＵＳ活性レベル（ｐｍｏｌ  ＭＵ／ｍｇタンパク質／分）が、根では５４４．８２、茎では１３．２４（根において〜４０倍増強）、葉では０．２６（根において〜２０００倍増強）であることは言及すべき重要な点である。大部分の葉（４４／４８）と茎（４０／４８）にＧＵＳ活性が認められなかったことも留意すべき点である。
【００５８】
前記は、本発明の説明であり、それらを限定することを意図するものではない。本発明は、以下の請求項により定義され、請求項の同等物は、請求項に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ＰＭＴプロモーターにより指示される葉（１列目）、茎（２列目）、根（３列目）の平均ＧＵＳ発現レベルを示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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