(57)【要約】胃腸炎で調整される遺伝子特性に関連するポリヌクレオチド、ポリペプチド、キット及び方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離核酸分子で、その分子が、
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４，ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７，ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５０，ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：５１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５３，ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：５４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６２
から構成される群から選択されるポリヌクレオチドからなることを特徴とする単離核酸分子。
【請求項２】
単離ポリペプチドで、そのポリペプチドが、
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４，ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７，ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５０，ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：５１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５３，ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：５４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６２
から構成される群から選択されるポリヌクレオチドによりコードされることを特徴とする単離ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１の単離核酸分子と少なくとも９５％同一のポリヌクレオチドからなる単離核酸分子。
【請求項４】
ストリンジェントな条件下で請求項１の単離核酸分子とハイブリッド形成できる少なくとも１０個の塩基の単離核酸分子。
【請求項５】
請求項２のポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項６】
請求項２のポリペプチドのフラグメントをコードする単離核酸分子。
【請求項７】
請求項２のポリペプチドのポリペプチドエピトープをコードする単離核酸分子。
【請求項８】
請求項２のポリペプチドにおいて、ポリペプチドが生物活性をもつことを特徴とするポリペプチド。
【請求項９】
請求項２のポリペプチドの種の相同体をコードする単離核酸。
【請求項１０】
請求項１の単離核酸分子において、ヌクレオチド配列がＣ末端又はＮ末端のいずれかから連続的なヌクレオチドの欠失を有することを特徴とする単離核酸分子。
【請求項１１】
請求項１の単離核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項１２】
請求項１の単離核酸分子を含む組換え宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２の組換え宿主細胞を作成する方法。
【請求項１４】
ベクター配列を含む請求項１２の組換え宿主細胞。
【請求項１５】
請求項２の単離ポリペプチドにおいて、単離ポリペプチドがＣ末端又はＮ末端のいずれかから連続的なアミノ酸欠失を有することを特徴とする単離ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項２の単離ポリペプチドに特異的に結合する単離抗体。
【請求項１７】
請求項１６の単離抗体において、抗体が単一クローン性抗体であることを特徴とする単離抗体。
【請求項１８】
請求項１６の単離抗体において、抗体が多クローン性抗体であることを特徴とする単離抗体。
【請求項１９】
請求項２の単離ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞。
【請求項２０】
単離ポリペプチドで、そのポリペプチドが、
（ａ）前記ポリペプチドが発現されるような条件で請求項１４の組換え宿主細胞を培養する工程、および
（ｂ）ポリペプチドを分離する工程、
により製造されることを特徴とする単離ポリペプチド。
【請求項２１】
医学的状態を予防、治療又は改善するための方法で、その方法が請求項２のポリペプチド又は請求項１のポリヌクレオチドの治療効果のある量を哺乳動物の患者に投与する工程からなることを特徴とする方法。
【請求項２２】
患者の病理的状態又は病理的状態への感受性を診断するための方法で、その方法が、
（ａ）請求項１のポリヌクレオチドの変異の有無を判断する工程と、
（ｂ）前記変異の有無に基づいて病理的状態又は病理的状態への感受性を診断する工程と、
からなることを特徴とする診断方法。
【請求項２３】
患者の病理的状態又は病理的状態への感受性を診断するための方法で、その方法が、
（ａ）生物サンプルにおいて請求項２のポリペプチドの存在又は発現の量を判断する工程と、
（ｂ）ポリペプチドの存在又は発現の量に基づいて、病理学的状態又は病理学的状態への感受性を診断する工程と、
からなることを特徴とする診断方法。
【請求項２４】
請求項２のポリペプチドの結合パートナーを同定するための方法で、その方法が、
（ａ）請求項２のポリペプチドと結合パートナーを接触する工程と、
（ｂ）結合パートナーがポリペプチドの活性に影響を与えるかどうかを判断する工程と、
からなることを特徴とする同定方法。
【請求項２５】
請求項１の単離核酸分子のｃＤＮＡ配列に対応する遺伝子。
【請求項２６】
生物学的検定法によって、発現したポリペプチドの活性を同定するための方法で、その方法が、
（ａ）細胞において請求項２のポリペプチドを発現させるための工程と、
（ｂ）発現したポリペプチドを分離する工程と、
（ｃ）発現したポリペプチドの活性を生物学的検定法で試験する工程と、
（ｄ）試験結果に基づいて発現したポリペプチドの活性を同定する工程と、
からなることを特徴とする同定方法。
【請求項２７】
表１に特定するＤＮＡ分子からなる群から選択され、デジタルアドレスに記載した５’側の部分的ヌクレオチド配列および長さをもち、胃腸炎に特徴的な調節パターンをもつ、胃腸炎において調節される遺伝子のプローブとして用いるのに適した実質的に純粋な単離ＤＮＡ分子。
【請求項２８】
哺乳動物の組織サンプルにおいて請求項２のポリヌクレオチドの存在を検出するのに適したキットで、そのキットが、請求項１のポリヌクレオチドに対応する遺伝子がコードする哺乳動物の蛋白又は請求項２のポリペプチドと免疫反応する第１の抗体の少なくとも１回の検定に十分な量と、使用マニュアルと、適切な梱包材料とを含むことを特徴とするキット。
【請求項２９】
請求項２８のキットがさらに第１の抗体と結合する第２の抗体を含むことを特徴とするキット。
【請求項３０】
請求項２９のキットにおいて、第２の抗体が標識されていることを特徴とするキット。
【請求項３１】
請求項３０のキットにおいて、標識が、酵素、放射性同位体、蛍光成分、コロイド金属、化学発光成分、りん光性成分、又は生物発光成分からなることを特徴とするキット。
【請求項３２】
胃腸炎において調節される遺伝子の存在を検出するのに適したキットで、そのキットが、
少なくとも１回の検定に十分な量の、請求項１又は４の少なくとも１つのポリヌクレオチドあるいは少なくとも１０の連続塩基を有するそのフラグメントと、
標識手段と、
使用マニュアルと、
適切な梱包材料と、
を含むことを特徴とするキット。
【請求項３３】
単離ポリペプチドで、そのポリペプチドがＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１２９からなることを特徴とする単離ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
関連出願の参照
本出願は、参考により本発明に組込まれる、１９９９年６月１０に提出された米国仮出願　Ｓ．Ｎ．　６０／１３８，４８７の優先権を主張する。
発明の背景
慢性的な炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は医学的に頑固な問題の一つである。ＩＢＤの主要な２つのタイプは、口から肛門まで消化管全体に影響する可能性を持つクローン病（ＣＤ）と大腸のみに影響する潰瘍性大腸炎（ＵＣ）である。
【０００１】
ＣＤとＵＣはともに腸管炎症から発生する大きい原腸管損傷により特徴付けられるが、これらの病気はまったく別である。肉眼的検査では、これらの病気を区別する最善の特徴はＵＣが１）連続的な炎症性異常、２）主として結腸と直腸の粘膜に限定される、３）通常主として血管に関し、また４）通常結腸の著しい短縮を伴うのに対して、ＣＤの炎症はほぼ常に不連続であり、また大腸や小腸の何処にでも発生する可能性がある。ＣＤでは粘膜は通常“丸石”のように見え、また内腔の狭窄と狭縮を伴う腸壁の亀裂と腫上りがある。
【０００２】
顕微鏡的には、ＵＣは基本的に粘膜の表面的炎症であり、また慢性疾患でもｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ  ｐｒｏｐｒｉａと漿膜は炎症性浸潤から免れる。逆に、ＣＤは顕微鏡的には、粘膜と粘膜下組織を通じて筋肉層内に広がる経壁的炎症を呈する。ＵＣでは、小窩（ｃｒｙｐｔ）膿傷と上皮の破壊がよく起こるのに対して、ＣＤでは有益な診断特徴は類肉腫タイプの肉芽腫の存在である。
【０００３】
これらの病気の療法の組織学特徴はＩＢＤにはリンパ球様組織の調節異常（ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）がある。免疫学的調節異常がＩＢＤの一次原因であるかどうか又は炎症性応答が上皮障壁内の裂け目など別の粘膜発作に二次的であるかどうかは不明のままである。
【０００４】
ここ数年の発達にもかかわらず、ＣＤとＵＣの正確な病因と病原は未定義にとどまる。ＩＢＤの機械論的基礎を試み且つよりよく理解するため、多大の努力が炎症性腸疾患の種々の動物モデルの発見と開発の方向で行われている。腸の炎症を研究するための最善の特徴的システムはデキシトラン・ナトリウム硫酸（ＤＳＳ）誘導大腸炎のマウス・モデルである（Ｉ．  Ｏｋａｙａｓｕ等、胃腸病学９８：６９４７０２、１９９０年；Ｈ．Ｓ．  Ｃｏｏｐｅｒ等、実験室研究  ６９：２３８−２４９、１９９３年；Ｌ．Ａ．  Ｄｉｅｌｍａｎ等、胃腸病学  １０７：１６４３−１６５２、１９９４年；Ｃ．Ｏ．  Ｅｌｓｏｎ等、胃腸病学１０９：１３４４−１３６７、１９９５年）。
【０００５】
ＤＳＳは上皮の密着結合内に裂け目を引起すと考えられ（Ｊ．  Ｎｉ等、腸３９：２３４−２４１、１９９６年）、よって腸内腔の膨大な抗原性負荷がその下にある組織と直接接触するのを可能にする。その一つの結果として、腸内腔に位置付けられた抗原に向けられた活発な免疫応答がＤＳＳ処置されたマウス達の中で開始される。腸炎症は一次的には大腸に限定される。
【０００６】
ＤＳＳ誘導の大腸炎モデル・システムは以下を検査するのに使用される（ｉ）  上皮損傷への初期応答の性質、（ｉｉ）  炎症部位への細胞の動員に責任のあるメカニズム、（ｉｉｉ）  腸炎症の高さでの保護免疫応答の性質及び（ｉｖ）  回復を誘導しまた損傷した組織の修復を起動するメカニズム。このモデル・システムはＩＢＤの誘導と回復のメカニズムを検査するのに使用できまた腸損傷を修飾又は防止するか又は粘膜の回復を刺激することのできる遺伝子／タンパク質の識別を助けるはずである。
【０００７】
これらのプロセスに寄与する要因の多様性に鑑み、ＩＢＤの諸段階で関与する新しいタンパク質の役割の発見、識別及び解明が必要なことは明らかである。
ＤＳＳ誘導大腸炎の特徴
ＤＳＳ誘導大腸炎モデル・システムでは、４日目からマウス達の体重損失が明白になる。腸の組織学的分析は上皮細胞とさかずき細胞の欠失により識別可能な初期の不規則な病変の存在を示す。８日目には、体重損失が顕著になり（約２０％の減少）、マウス達は瀕死状態に陥る。組織学的には、腸上皮はこの段階でほぼ完全に破壊される。固有層と粘膜下組織内への大きな混合炎症性細胞浸潤の証拠がある。炎症性細胞浸潤物は主としてＴ細胞、Ｂ細胞及び顆粒球で構成されるように思われる。１２日目には、マウス達が回復するにつれて体重増加が明らかになる。この後の段階では、小窩（ｃｒｙｐｔ）回復と上皮再生は、修復プロセスの開始の組織学的証拠を提供する。
ＤＳＳ誘導大腸炎と人間のＩＢＤ
ＤＳＳ誘導大腸炎での一次的事象は上皮細胞の損傷であり、二次的事象としての免疫の活性化を伴う炎症である。上皮細胞の損傷又は免疫の調節異常が人間のＩＢＤでの開始事象であるかどうかは明白でない。ＤＳＳ誘導大腸炎モデルは従って、両プロセスの発達と結果を研究する機会を提供することに於いて有益である。
発明の概要
ＤＳＳ処置により調節される遺伝子に相当する分子が識別された。斯かる分子はＩＢＤ及びその他の腸の病理学の処置での治療、予後及び診断使用に於いて有益である。本発明は新しいポリヌクレオチドと暗号化されたポリペプチドを提供する。その上、本発明は、それらのポリヌクレオチドやポリペプチドを生成するためのベクター、宿主細胞、抗体、及び、組換え方法に関係する。又、ポリペプチドとそれらを暗号化するポリヌクレオチドに関連した疾患を検出するための診断方法、及び斯かる疾患を処置するための治療方法もまた提供される。発明はさらにポリペプチドの結合相手を識別するためのスクリーニング方法にも関係する。
【０００８】
本発明は新しいポリヌクレオチドと暗号化されたポリペプチドを提供する。その上、本発明はそれらのポリヌクレオチドとポリペプチドを生成するためのベクター、宿主細胞、抗体、及び組換え方法に関係する。それらのポリペプチドとそれらを暗号化するポリヌクレオチドに関係する疾患を検出するための診断方法、及び斯かる疾患を処置するための治療方法も提供される。発明はさらにポリペプチドの結合相手を識別するためのスクリーニング方法にも関係する。
【０００９】
一つの実施態様では、発明は以下で構成されるグループから選択されたポリヌクレオチド１個を含む分離された核酸分子を提供する：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１．　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４，　ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：１５，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８．　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０，　Ｓ　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３５，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，　ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：３８，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４１，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４４，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４７，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４８，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５０，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５３，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，　ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：５６，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５９，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６０，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６２。もう一つの実施態様はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１−６２の核酸分子に少なくとも９５％同一の分離された核酸分子１個を含む。さらなる実施態様は厳格な条件下でＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１−６２の分離された核酸分子に雑種形成される分離された核酸分子１個を少なくとも１０個の塩基の長さの中に含む。
【００１０】
もう一つの実施態様は、以下で構成されるグループから選択されたポリヌクレオチドにより暗号化された分離されたポリペプチドを提供する：ＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１．　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３，　ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：４，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８．　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４，　ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：２５，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２６，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２９，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０，　Ｓ　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３２，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３５，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３８，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４１，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４４，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４５，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４７，　ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：４８，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５０，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５３，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５６，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５９，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６０，　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１とＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６２。もう一つの実施態様では、発明は本発明のポリペプチドを暗号化する分離された核酸分子を提供する。
【００１１】
さらなる実施態様では、発明はそれらのデジタル・アドレスにより記述された５’部分ヌクレオチド配列と長さを持ち、且つ消化管炎症中に特徴的な調節パターンを持つ第１表に識別されたＤＮＡ分子で構成されるグループから選択された、消化管炎症中の調節された遺伝子用のプローブとして使用するのに適した実質的に純粋な分離されたＤＮＡ分子を提供する。
【００１２】
本発明はまた、消化管炎症中に調節された遺伝子の存在を検出するためのシステムと方法も提供する。一つの実施態様では、本発明は少なくとも１回の効力検定用に充分量で本発明のポリヌクレオチドを少なくとも１個、又は少なくとも１０個の隣接塩基を有するその断片；標識手段；使用のための指示；及び適切なパッケージ材料を含んでいる、消化管炎症中に調節された遺伝子の存在を検出するのに適したキットを提供する。ひとつの実施態様では、ポリヌクレオチドは以下で構成されるグループから選択される：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２，  ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：２３，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０，  Ｓ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５，  ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：４６，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０，  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２。もう一つの実施態様はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２の分離された核酸分子に少なくとも９５％同一なポリヌクレオチドを含む。さらなる実施態様は厳格な条件下でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２の分離された核酸分子に雑種形成される少なくとも１０個の塩基の長さのポリヌクレオチドを含む。さらにもう一つの実施態様では、ポリヌクレオチドはそれらのデジタル・アドレスにより記述された５’部分ヌクレオチド配列と長さを持ち、且つ消化管炎症中に特徴的な調節パターンを持つ第１表に識別されたＤＮＡ分子で構成されるグループから選択される。
望ましい態様の詳細な説明
定義
以下の定義は本仕様を通じて使用されている特定の語句の理解を助けるために提供される。
【００１３】
本発明に於いて、“分離された”はその本来の環境（例：それが自然に発生する場合の自然環境）から取除かれた材料を言い、よってまたその自然な状態から“人間”の手で変更されている。例えば、分離されたポリヌクレオチドはベクター又は物質組成の一部であり得、あるいは細胞内に含まれることがあり、またそのベクター、物質組成や特定細胞がそのポリヌクレオチドの本来の環境でないゆえにさらに“分離される”こともあり得る。
【００１４】
本発明に於いて、“分泌された”タンパク質とはＥＲ、分泌小胞、又は信号配列の結果としての細胞外空間に導かれる可能性があるこれらのタンパク質を言う。ならびにこれらのタンパク質は、必ずしも信号配列を含む必要のない細胞外空間に放出される。分泌されたタンパク質が細胞外空間に放出される場合、分泌されたタンパク質は“成熟した”タンパク質を生成するため細胞外処理を受ける可能性がある。細胞外空間への放出は細胞外排出作用やタンパク分解分割を含む多くのメカニズムにより起こり得る。
【００１５】
本発明で使用するとき、“ポリヌクレオチド”はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２に含まれる核酸配列を持つ分子を言う。例えば、ポリヌクレオチドは、５’と３’不翻訳配列、信号配列付き又はなしのコード領域、分泌されたタンパク質コード領域、ならびに断片、エピトープ、ドメイン、及び変種の核酸配列を含む、全長ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド配列の全部又は一部を含むことができる。その上、本発明で使用するとき、“ポリペプチド”は広義のポリヌクレオチドから生成された翻訳済みのアミノ酸配列をもつ分子を言う。
【００１６】
本発明の“ポリヌクレオチド”はまた、厳格な雑種形成条件での、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２、又はその補体、あるいはｃＤＮＡに含まれる配列に雑種形成可能であるようなポリヌクレオチドを含む。“厳格な雑種形成条件”とは５０％のホルムアミド、５  ｘ  ＳＳＣ（７５０  ｍＭのＮａＣｌ、７５  ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０  ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ  ７．６）、５  ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、１０％のデキシトラン硫酸、及び２０  μｇ／ｍｌの変性しせん断したサケの精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃で一夜培養してから、約６５℃で０．１  ｘ  ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することを言う。
【００１７】
より低い厳格さの雑種形成条件で本発明のポリヌクレオチドに雑種形成する核酸分子もまた意図される。雑種形成と信号検出の厳格さの変更は主としてホルムアミド濃度（ホルムアミド・パーセントの低下は厳格さの低下を引起す）；塩条件、又は温度の操作を通じて行われる。例えば、より低い厳格さの条件は、６Ｘ  ＳＳＰＥ（２０Ｘ  ＳＳＰＥ＝３Ｍ  ＮａＣｌ；０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４；０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ  ７．４）、０．５％のＳＤＳ、３０％のホルムアミド、１００ｕｇ／ｍｌのサケの精子遮断ＤＮＡを含む溶液中で３７℃での一夜の培養に続いて、１ｘ  ＳＳＰＥ、０．１  ＳＤＳで５０℃での洗浄を含む。加えて、さらに低い厳格さを達成するには、厳格な雑種形成に続いて行う洗浄をより高い濃度の塩（例：５ｘ  ＳＳＣ）で行うことができる。
【００１８】
上述の条件の変化は雑種形成実験に於いて背景を抑制するのに使用される別の遮断試薬の包含及び／又は置換を通じて行えることに注意する。代表的な遮断試薬にはＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性されたサケの精子ＤＮＡ、及び市販の特許製品が含まれる。特定の遮断試薬の包含は適合性の問題に起因して、上述の雑種形成条件の変更を要する可能性がある。
【００１９】
勿論、ポリＡ＋配列（任意の３’末端のポリＡ  ＋  配列リンスティングに示された１個のｃＤＮＡの道）、又はＴ（又はＵ）残基の補完的伸張にのみ雑種形成するポリヌクレオチドは“ポリヌクレオチド”の定義に含まれないであろう。何故なら、斯かるポリヌクレオチドはポリ（Ａ）伸張やその補体（例：実質的に任意の二本鎖ｃＤＮＡクローン）を含む任意の核酸分子に雑種形成するからである。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは無修飾のＲＮＡやＤＮＡ又は修飾されたＲＮＡやＤＮＡであり得る任意のポリリボヌクレオチドやポリデオキシリボ核酸で構成され得る。例えば、ポリヌクレオチドは単鎖と二本鎖ＤＮＡ、単鎖と二本鎖領域の混合であるＤＮＡ、単鎖と二本鎖ＲＮＡ、及び単鎖と二本鎖領域の混合であるＲＮＡ、単鎖又はより代表的には二本鎖又は単鎖と二本鎖領域の混合であるＤＮＡとＲＮＡを含んでいる雑種分子で構成され得る。加えて、そのポリヌクレオチドはＲＮＡかＤＮＡ又はＲＮＡとＤＮＡの両方を含んでいる三本鎖領域で構成され得る。ポリヌクレオチドはまた、１個又は複数の修飾された塩基、又は安定のためか他の理由により修飾されたＤＮＡかＲＮＡバックボーンを含むこともできる。“修飾された”塩基には、例えば、イノシンなどのトリチル化された塩基及びイノシンなどの特殊な塩基が含まれる。ＤＮＡとＲＮＡには多様な修飾を行うことができ；このようにして、“ポリヌクレオチド”は化学的に、酵素又は代謝につき修飾された形を包含する。
【００２１】
本発明のポリペプチドはペプチド結合又は修飾ペプチド結合、即ちペプチド同配体、により互いに結合されたアミノ酸で構成され、また２０‐遺伝子暗号化されたアミノ酸以外のアミノ酸を含むことができる。そのポリペプチドは翻訳後処理などの自然のプロセスか、又は従来技術で良く知られている化学的修飾かのいずれかにより修飾することができる。斯かる修飾は、基本的文献及びより詳細な学術論文、ならびに大量の研究文献に充分説明されている。修飾はペプチドバックボーン、アミノ酸側鎖及びアミノ‐やカルボキシル‐末端を含め、ポリペプチドの何処に於いても起こり得る。与えられたポリペプチドの中で同じタイプの修飾が同じ又は異なる度合いで複数の部位に存在し得ることが理解されよう。また、一つの与えられたポリペプチドは多数のタイプの修飾を含み得る。ポリペプチドは、例えば、ユビキチン化の結果として分枝され得、また分枝付き又は分枝なしの環状であり得る。環状、分枝付き、及び分枝付き環状のポリペプチドは翻訳後の自然プロセスの結果として生じるか又は合成方法により作ることができる。修飾にはアセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有付加、ヘム成分の共有付加、ヌクレオチドやヌクレオチド派生物の共有付加、脂質や脂質派生物の共有付加、ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｎｏｓｉｔｏｌの共有付加、架橋結合、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸の形成、処方、ガンマ・カルボキシル化、グルコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ、タンパク質分解処理、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ、硫酸化、アルギニル化などタンパク質へのアミノ酸の転移ＲＮＡ仲介添加、及びユビキチン化が含まれる。（例えば、タンパク質‐構造と分子特性、第２版、Ｔ．Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク（１９９３年）；
タンパク質の翻訳後の共有付加修飾、Ｂ．Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１〜１２ページ（１９８３年）；Ｓｅｉｆｔｅｒ等、Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８２：  ６２６‐６４６  （１９９０年）；Ｒａｔｔａｎ等、Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ６３３：  ４８‐６２  （１９９２年）を参照）。
【００２２】
“生物学的活動度を有するポリペプチド”は、用量に依存して又は依存せずに、特定の生物学的検定で測定された成熟形を含む本発明のポリペプチドの活動度に、必ずしも同一である必要はないが、同様の活動度を示すポリペプチドを言う。用量依存性が存在する場合、それはポリペプチドのそれと同一である必要はないが、むしろ本発明のポリペプチドと比較して与えられた活動度での用量依存に実質的に同様である必要がある（即ち、候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドに比較してより大きい活動度か又は約２５倍少ない活動度以下、また望ましくは、約１０倍少ない活動度以下、またより望ましくは、３倍少ない活動度以下を示すであろう）。
【００２３】
既知の分子生物学技術を使用して他の読み枠もまた簡単に翻訳できるけれども、メチオニンに始まる翻訳されたアミノ酸配列が識別される。それらの代用の開放読み枠の翻訳により生成されたポリペプチドが本発明により特異的に意図される。
【００２４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２の翻訳は従来技術でよく知られた以下に詳述される様々の使用にとって充分正確であり、またさもなければ適している。これらのプローブはまた生物学的試料内で核酸分子に雑種形成し、それにより発明の様々の法的及び診断方法を可能にする。同様に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２の翻訳から識別されるポリペプチドは、識別されたｃＤＮＡクローンにより暗号化された分泌タンパク質に特異的に結合する抗体を生成する。
【００２５】
しかしながら、ＤＮＡ配列決定反応により生成されるＤＮＡ配列は配列決定エラーを含む可能性がある。エラーは識別間違いのヌクレオチドとして、あるいは生成されたＤＮＡ配列へのヌクレオチドの挿入又は欠失として存在する。間違って挿入又は欠失されたヌクレオチドは予想のアミノ酸配列の読み枠内にフレームシフトを引起す。これらの場合、たとえ生成されたＤＮＡ配列が実際のＤＮＡ配列に９９．９％以上同一であるとしても、予想のアミノ酸配列は実際のアミノ酸配列から相違する（例えば、１０００塩基以上の開放読み枠内での１個の塩基の挿入や欠失）。
【００２６】
本発明はまたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２、及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２の翻訳に対応する遺伝子にも関係する。対応する遺伝子は本発明で開示される配列情報を使用して既知の方法に従って分離することができる。斯かる方法は開示された配列からのプローブやプライマーの作成、及びゲノム物質の適切な発生源からの対応する遺伝子の識別や増殖を含む。
【００２７】
本発明に於いては同族の種も提供される。同族の種は本発明で提供される配列から適切なプローブやプライマーを調整して、希望する同族の適切な核酸発生源をスクリーニングすることにより分離及び識別することができる。
【００２８】
発明のポリペプチドは任意の適切な方法で調整することができる。斯かるポリペプチドは分離された自然発生のポリペプチド、組換えにより生成されたポリペプチド、合成により生成されたポリペプチド、又はこれらの方法の組合せにより生成されたポリペプチドを含む。斯かるポリペプチドを調整する手段は技術で十分理解されている。
【００２９】
ポリペプチドは成熟した形を含む分泌されたタンパク質の形、あるいは融合タンパク質（下記を参照）などのより大きなタンパク質の一部であり得る。分泌又はリーダー配列、前駆配列、ヒスチジン残基などの精製を助ける配列を含む追加のアミノ酸配列、又は組換え生成中の安定化用の追加の配列を含めると有利であることがよくある。
【００３０】
本発明のポリペプチドは望ましくは分離された形で提供され、また望ましくは実質的に精製される。分泌タンパク質を含むポリペプチドの組換え生成バージョンは、ＳｍｉｔｈとＪｏｈｎｓｏｎの遺伝子６７  ：３１−４０（１９８８年）で説明されているワン・ステップ方法により実質的に精製することができる。発明のポリペプチドはまた、従来技術でよく知られた方法に於いて分泌タンパク質に対して作られる本発明の抗体を使用して自然の又は組換えの発生源から精製することもできる。
【００３１】
信号配列
タンパク質が信号配列を持つかどうか、ならびに開裂点を予想する方法は存在する。例えば、ＭｃＧｅｏｃｈの方法、ウィルス研究３　：２７１−２８６（１９８５年）は、完全な（未開裂の）タンパク質の短いＮ端末を電荷された領域とそれに続く電荷なしの領域からの情報を使用する。ｖｏｎ　Ｈｅｉｎｊｅの方法、核酸研究１４　：４６８３−４６９０（１９８６年）は開裂部位周辺の残基、代表的には−１３から＋２の残基からの情報を使用し、ここで＋１は分泌されたタンパク質のアミノ末端を意味する。従って、推論されたアミノ酸配列から信号配列と成熟配列を識別することができる。
【００３２】
ポリヌクレオチドとポリペプチドの変種
“変種”とは、本発明のポリヌクレオチドやポリペプチドとは異なるがその基本的特性を保持しているポリヌクレオチドやポリペプチドを言う。一般的に、変種は全体として極めて同様であり、且つ、多くの領域に於いて、本発明のポリヌクレオチドやポリペプチドと同一である。
【００３３】
“同一性”はそれ自体、技術で認知された意味を持ち、また公表された技術で計算可能である。（例として、計算分子生物学、Ｌｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．、ｅｄ．オックスフォード大学出版、ニューヨーク（１９８８年）；生物計算：情報科学とゲノム・プロジェクト、Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｗ．  ｅｄ．  アカデミック出版、ニューヨーク（１９９３年）；配列データのコンピュータ分析、第１部、  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．Ｍ．とＧｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．Ｇ．、ｅｄｓ．  ヒューマナ出版、ニュージャージー（１９９４年）；分子生物学に於ける配列分析、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．、アカデミック出版（１９８７年）；及び配列分析プライマー、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．とＤｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．、ｅｄｓ．、Ｍストックトン出版、ニューヨーク（１９９１年）を参照）。２つのポリヌクレオチドやポリペプチド配列の間の同一性を測定する多数の方法が存在する一方、“同一性”の語句は熟練した技術者にはよく知られている。（Ｃａｒｉｌｌｏ，  Ｈ．とＬｉｐｔｏｎ，  Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ応用数学４８：１０７３（１９８８年））
二つの配列の間の同一性又は同類性を決定するのに普通採用される方法は、“大型コンピュータへのガイド”Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．  Ｂｉｓｈｏｐ、ｅｄ．アカデミック出版、サンディエゴ（１９９４年）、及びＣａｒｉｌｌｏ  Ｈ．とＬｉｐｔｏｎ，  Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ応用数学４８：１０７３（１９８８年）で開示されたものを含むがこれに制限されない。ポリヌクレオチドやポリペプチドをアラインメントするための方法は以下を含むコンピュータ・プログラムで暗号化されている：ＧＣＧプログラム・パッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．等、核酸研究（１９８４年）  １２（１）：３８７（１９８４年））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＩＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．等、分子生物学ジャーナル２１５：４０３  （１９９０年））、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（ウィスコンシン配列分析パッケージ、Ｕｎｉｘ用バージョン８、遺伝子コンピュータ・グループ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ、マディソン、ＷＩ  ５３７１１  （ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎの局所的相同アルゴリズムを使用）、応用数学の進歩２：４８２−４８９  （１９８１年））。
【００３４】
ある配列が、例えば、基準配列に９５％同一であるかどうか決定するため何らかの配列アラインメント・プログラムを使用するとき、同一性のパーセントが基準配列の全長にわたって計算されるように且つ基準配列のヌクレオチド総数の５％までの同一性のギャップが許容されるようにパラメータが設定される。
【００３５】
大域配列アラインメント（ｇｌｏｂａｌ  ｓｅｑｕｅｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）とも言われる、疑問のある配列（ｑｕｅｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（本発明の配列）と主配列（ｓｕｂｊｅｃｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の間の最善の全体的一致を決定するための望ましい方法は、Ｂｔｕｔｌａｇ等のアルゴリズム（コンピュータ応用生物科学６：２３７−２４５（１９９０年））に基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータ・プログラムを使用して決定できる。“配列”の語句はヌクレオチドとアミノ酸の配列を含む。配列のアラインメントに於いて、疑問のある配列と主配列は両方ともヌクレオチド配列か又は両方ともアミノ酸配列かのいずれでも良い。前述の大域配列アラインメント（ｇｌｏｂａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の結果は同一性のパーセントである。同一性パーセントを計算するためのＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ探索で使用される望ましいパラメータは以下である：Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、及びＣｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ０．０５、及びＷｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００か又はヌクレオチド塩基中の疑問のある配列長さのいずれか短い方。アミノ酸アラインメントの同一性と相似性パーセントを計算するのに採用される望ましいパラメータは以下である：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ  １５０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｅｎｇｔｈ＝０、及びＣｕｔｏｆｆ  Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ  Ｓｉｚｅ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、及びＷｉｎｄｏｗ  Ｓｉｚｅ＝５００か又はアミノ酸残基中の疑問のある配列長さのいずれか短い方。
【００３６】
説明として、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２に含まれる１配列に少なくとも９５％の“同一性”のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドとは、そのポリヌクレオチド配列が全長の各１００ヌクレオチド当り（与えられた１００ヌクレオチド伸張内だけではない）５ポイントの突然変異までを含む可能性のあることを除きＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１−６２に含まれる配列又はｃＤＮＡに同一であることを意味する。換言すれば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを得るには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２に含まれる配列又はｃＤＮＡ中のヌクレオチドの５％までを欠失、挿入、又は他のヌクレオチドで置換することができる。これらの変更はそのポリヌクレオチドの何処でも起こり得る。
【００３７】
本発明のさらなる実施態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２に含まれる配列に少なくとも８０％の同一性、より望ましくは少なくとも９０％の同一性、また処理望ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性をもつポリヌクレオチドを含む。勿論、遺伝子コードの縮退のゆえに、従来技術の普通の熟練度の人は少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を持つ数多くのポリヌクレオチドがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２の翻訳に含まれるアミノ酸配列に同一のポリヌクレオチドを暗号化することを直ちに認めるであろう。
【００３８】
同様に、基準ポリペプチドに少なくとも、例えば、９５％の“同一性”を持つアミノ酸配列を持つポリペプチドにより、そのポリペプチドのアミノ酸配列が、ポリペプチド配列が基準ポリペプチド全長の各１００アミノ酸当り５アミノ酸の変質までを含む可能性のあることを除き、基準ポリペプチドに同一であることが意図されている。換言すれば、基準アミノ酸配列に少なくとも９５％同一のアミノ酸配列をもつポリペプチドを得るには、基準配列中のアミノ酸残基の５％までを欠失又は他のアミノ酸で置換できるか、又は基準配列中の総アミノ酸残基の５％までの数のアミノ酸を基準配列中に挿入できる。基準配列のこれらの変質は基準アミノ酸配列のアミノ及びカルボキシル末端位置か、又は基準配列中の残基間に個別にあるいは基準配列内に一つ又はそれ以上の連続グループかのいずれかで点在するこれら末端位置の何処にでも起こり得る。
【００３９】
本発明のさらなる実施態様は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２の翻訳に含まれるアミノ酸配列に少なくとも８０％同一、より望ましくは少なくとも８５％同一、より望ましくは少なくとも９０％同一及び最も望ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を持つポリペプチドを含む。望ましくは、上述のポリペプチドはタンパク質の少なくとも１生物学的活動度を示すべきである。
【００４０】
望ましい実施態様では、本発明のポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２の翻訳に含まれるアミノ酸配列に少なくとも９０％の相似性、より望ましくは少なくとも９５％の相似性、またさらにより望ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、又は９９％の相似性をもつポリペプチドを含む。
【００４１】
変種はコード領域、ノンコーディング領域、又は両方に変質を含み得る。特に望ましいのは、サイレントな置換、付加、又は欠失を生成するが、暗号化されたポリペプチドの特性や活動度を変更しない変質を含んでいるポリヌクレオチド変種である。遺伝暗号の縮退のゆえにサイレントな置換により生成されたヌクレオチド変種が望ましい。その上、５−１０、１−５又は１−２アミノ酸が任意の組合せで置換、欠失又は付加される変種もまた望ましい。ポリヌクレオチド変種は、例えば、特定の宿主のためにコドン発現を最適化するため（人間のｍＲＮＡ内のコドンをＥ．  ｃｏｌｉなどの最近宿主に好まれるものに変更する）など、様々の理由で生成される可能性がある。
【００４２】
自然発生の変種は“対立変種”と呼ばれ、また生体の染色体上の与えられた座を占拠する遺伝子のいくつかの代案の形の一つを言う。（遺伝子ＩＩ、Ｌｅｗｉｎ，  Ｂ．、ｅｄ．、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９８５年））。これらの対立変種はポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドのレベルのいずれでも変化し得る。代案として、非自然発生の変種は突然変異生成技術や直接合成により生成することができる。
【００４３】
タンパク質工学と組換えＤＮＡテクノロジーの既知の方法を使用して、本発明のポリペプチドの特性を改善又は変更するために変種を生成することができる。例えば、１個又はそれ以上のアミノ酸を生物学的機能の実質的な欠失なしに分泌されたタンパク質のＮ−末端やＣ−末端から欠失することができる。Ｒｏｎ等、生物化学ジャーナル２６８：２９８４−２９８８  （１９９３年）の著者らは、３、８又は２７アミノ末端アミノ酸残基の欠失後でさえ、ヘパリン結合活動度を有するＫＧＦ変種タンパク質を報告している。同様に、ガンマ・インターフェロンはこのタンパク質のカルボキシ末端から８−１０アミノ酸残基を欠失後に１０倍高い活動度までを示した（Ｄｏｂｅｌｉ等、生物工学ジャーナル７：１９９−２１６  （１９８８年））。
【００４４】
その上、変種は自然発生タンパク質のそれと同様の生物学的活動度を保持することを示す多くの証拠が存在する。例えば、Ｇａｙｌｅと共同研究者ら（生物化学ジャーナル２６８：２２１０５−２２１１１  （１９９３年））は、人間のシトキンＩＬ−１ａの詳細な変異分析を行った。彼等はランダムな突然変異生成を使用して、分子の全長にわたって変種当り平均２．５アミノ酸が変化する３，５００個体以上のＩＬ−１ａ突然変異体を生成した。可能なそれぞれのアミノ酸位置で複数の突然変異が検証された。研究者らは“［ほ］とんどの分子が［結合又は生物学的活動度］のいずれにもほとんど影響なく変更され得る”ことを発見した。（Ｇａｙｌｅ等、（１９９３年）、要約を参照）。事実、検証された３，５００以上のヌクレオチド配列のうちユニークな２３のアミノ酸配列のみが野生タイプからの活動度に有意的変化を起こすタンパク質を生成した。
【００４５】
さらに、ポリペプチドのＮ−末端やＣ−末端から１個又はそれ以上のアミノ酸の欠失が、１個又はそれ以上の生物学的機能の修正や欠失を起こす結果となるにしても、他の生物学的活動度は依然として保持される。例えば、分泌された形を認知する抗体を誘導又は結合する欠失変種の能力は、分泌された形の残基の過半数未満がＮ−末端又はＣ−末端から取除かれるときは保持される可能性が高い。タンパク質のＮ−又はＣ−末端残基を欠失している特定ポリペプチドが斯かる免疫原性活動度を保持するかどうかは本発明で説明され、且つ別途従来技術で知られた通常の方法により容易に決定することができる。
【００４６】
よって、発明はさらに実質的な生物学的活動度を示すポリペプチド変種を含む。斯かる変種には、活動度に対してほとんど影響がないとして従来技術で知られた一般的規則に従って選定された欠失、挿入、逆位、反復、及び置換が含まれる。例えば、形質的にサイレントなアミノ酸置換をどのように行うかの指針がＢｏｗｉｅ，  Ｊ．  Ｕ．等、科学２４７：１３０６−１３１０  （１９９０年）に提供されており、そこで著者らはアミノ酸配列の寛容度の変化の研究について二つの主要な戦略が存在すると指摘する。
【００４７】
最初の戦略は変化プロセス中の自然選択によるアミノ酸置換の寛容度を利用する。諸種に於けるアミノ酸配列の比較により、保存されるアミノ酸を識別することができる。これらの保存されたアミノ酸はタンパク質機能にとって重要な可能性が高い。逆に、自然選択で置換が許容されたアミノ酸位置はこれらの位置がタンパク質機能にとって決定的に重要ではないことを指摘する。よって、寛容なアミノ酸置換はタンパク質の生物学的活動度を依然として維持しながら修飾され得ることになろう。
【００４８】
第２の戦略はタンパク質機能の決定的に重要な領域を識別するのにクローン化された遺伝子の特定の位置にアミノ酸の変化を導入するため遺伝子工学を使用する。例えば、部位特異的突然変異誘発法やアラニン走査突然変異誘発法（分子の各残基に単一アラニン突然変異の導入）を使用できる。（ＣｕｍｍｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ、科学２４４：１０８１−１０８５  （１９８９年））。次いで、その結果生じる突然変異分子をその生物学的活動度についてテストできる。
【００４９】
著者らが述べているように、これら二つの戦略でタンパク質がアミノ酸置換に驚くほど寛容であることが判明した。著者らはさらに、アミノ酸の変化はタンパク質中の特定のアミノ酸位置で容認される可能性の高いことを指摘する。例えば、ほとんどの埋没された（タンパク質の三次構造内に）アミノ酸残基は無極側連鎖を必要とするのに、表面側連鎖の特徴は一般的に少ししか保存されない。その上、許容された保存性のアミノ酸置換は脂質又は疎水性アミノ酸Ａｌａ，  Ｖａｌ，  Ｌｅｕ及びＩｌｅの置換え；ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｈｒの置換え；酸性残基ＡｓｐとＧｌｕの置換え；アミド残基ＡｓｎとＧｌｎの置換え；塩基性残基Ｌｙｓ，  Ａｒｇ，及びＨｉｓの置換え；芳香性残基Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，及びＴｒｐの置換え及び小型アミノ酸Ａｌａ，  Ｓｅｒ，  Ｔｈｒ，  Ｍｅｔ，及びＧｌｙの置換えを含む。
【００５０】
保存性アミノ酸置換のほかに、本発明の変種には以下が含まれる：（ｉ）  非保存アミノ酸残基１個又はそれ以上との置換、この場合、置換されたアミノ酸残基は遺伝暗号でコード化されることもされないこともある、又は（ｉｉ）  置換基を持つアミノ酸残基の１個又はそれ以上との置換、又は（ｉｉｉ）  ポリペプチドの安定性及び／又は溶解性を増加させる化合物（例：ポリエチレン・グリコール）他の化合物との成熟ポリペプチドの融合、又は（ｉｖ）  ＩｇＧ  Ｆｃ融合領域ペプチド、又はリーダーや分泌配列、又は配列促進精製など、追加アミノ酸とのポリペプチドの融合。斯かる変種ポリペプチドは本発明の技術から従来技術に習熟した人達の範囲に入ると見なされる。
【００５１】
例えば、荷電アミノ酸の他の荷電又は中性アミノ酸でのアミノ酸置換を含むポリペプチド変種は、より少ない凝集など改善された特徴を持つタンパク質を生成することができる。薬学的処方の凝集は活動度を低下させるとともに、凝集物の免疫原性活動度のゆえにクリアランスを増加する。（Ｐｉｎｃｋａｒｄ等、臨床実験免疫学２：３３１−３４０（１９６７年）；Ｒｏｂｂｉｎ等、糖尿病３６：８３８−８４５  （１９８７年）；Ｃｌｅｌａｎｄ等、Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．治療薬輸送システム１０：３０７−３７７  （１９９３年））。
【００５２】
ポリヌクレオチドとポリペプチドの断片
本発明に於いて、“ポリヌクレオチド断片”とはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２に示されたものに含まれる核酸配列を有する短いポリヌクレオチドを言う。短いヌクレオチド断片は望ましくは少なくとも約１５  ｎｔ、またより望ましくは少なくとも約２０  ｎｔ、さらに望ましくは少なくとも約３０  ｎｔ、さらになお望ましくは少なくとも約４０  ｎｔの長さを持つ。例えば“少なくとも２０ｎｔの長さ”の断片はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２に示されたものに含まれるｃＤＮＡ配列から２０又はそれ以上の隣接する塩基を含むことが意図される。これらのヌクレオチド断片は本発明で論じたように診断プローブとプライマーとして有益である。勿論、より大きい断片（例：５０、１５０、及びそれ以上のヌクレオチド）が望ましい。
【００５３】
その上、発明のポリヌクレオチド断片の代表的な例には、およそヌクレオチド番号１−５０、５１−１００、１０１−１５０、１５１−２００、２０１−２５０、２５１−３００、３０１−３５０、３５１−４００、４０１−４５０からＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２の最後までの１配列を持つ断片が含まれる。この文脈に於いて“およそ”とは、いずれかの末端又は両端で、いくつかの（５、４、３、２又は１）ヌクレオチドでより大きくか又はより小さく、特別に列挙された範囲を含む。望ましくは、これらの断片は生物学的活動度を持つポリペプチドをコード化する。
【００５４】
本発明に於いて、“ポリペプチド断片”とはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２の翻訳に含まれる短いアミノ酸配列を言う。たんぱく質断片は“自律（ｆｒｅｅ−ｓｔａｎｄｉｎｇ）”であるか又はその断片が一部又は領域を形成するより大きいポリペプチド内に、より望ましくは単一隣接領域として含まれることができる。発明の代表的なポリペプチド断片の例には、例えば、およそアミノ酸番号１−２０、２１−４０、４１−６０、又は６１からコーディング領域の最後までの断片が含まれる。その上、ポリペプチド断片はおよそ２０、３０、４０、５０又は６０のアミノ酸長さであり得る。この場合“およそ”は、いずれかの末端又は両端でいくつかの（５、４、３、２又は１）アミノ酸でより大きいか又はより小さい特に列挙された範囲を含む。
【００５５】
望ましいポリペプチド断片には分泌されたタンパク質並びにその成熟形が含まれる。さらに望ましいポリペプチド断片にはアミノ又はカルボキシ末端、あるいは両方からの欠失残基の連続シリーズを有する分泌されたたんぱく質又はその成熟形が含まれる。例えば、１−６０の範囲の任意の数のアミノ酸は分泌されたポリペプチドか又はその成熟形のいずれかのアミノ末端から欠失される可能性がある。同様に、１−３０の範囲の任意の数のアミノ酸は分泌されたたんぱく質かまたは成熟形のカルボキシ末端から欠失される可能性がある。さらには、上記のアミノ及びカルボキシ末端欠失の任意の組合せが望ましい。同様に、これらのポリペプチド断片をコード化するポリヌクレオチド断片も望ましい。
【００５６】
また望ましいのは、αへリックスとαへリックス形成領域、βシートとβシート形成領域、ｔｕｒｎとｔｕｒｎ形成領域、コイルとコイル形成領域、親水性領域、疎水性領域、α両親媒性領域、β両親媒性領域、可とう性領域、表面形成領域、基質結合領域、及び高抗原指数領域を含んでいる断片など、構造的または機能的ドメインにより特徴付けられるポリペプチドとポリヌクレオチドの断片である。保存されるドメイン内に入るＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２の翻訳のポリペプチド断片は本発明により特に意図される。その上、これらのドメインをコード化するポリヌクレオチド断片もまた意図される。
【００５７】
その他の望ましい断片は生物学的に活性な断片である。生物学的に活性な断片は本発明のポリペプチドの活動度に同一ではなくとも相似の活動度を示すものである。これらの断片の生物学的活動度は改善された望ましい活動度や減少した望ましくない活動度を含むことができる。
【００５８】
エピトープと抗体
本発明に於いて“エピトープ”とは、動物で、特に人間に於いて抗原性や免疫原性活動度を有するポリペプチド断片を言う。本発明の望ましい実施態様は、エピトープならびにこの断片をコード化するポリペプチドを含んでいるポリペプチド断片に関係する。抗体が結合できるタンパク質分子の領域は“抗原性エピトープ”と定義される。これに対して、“免疫原性エピトープ”は抗体反応を引出すタンパク質の一部と定義される。（例えば、Ｇｅｙｓｅｎ等、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．米国８１：３９９８−４００２  （１９８３）を参照）。
【００５９】
エピトープとして機能する断片は従来の手段のいずれによっても生成することができる。（例として、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，  Ｒ．Ａ．、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．米国  ８２：５１３１−５１３５  （１９８５年）及び米国特許Ｎｏ．  ４，６３１，２１１の説明を参照）。
【００６０】
本発明では、抗原性エピトープは望ましくは少なくとも７個、より望ましくは少なくとも９個、またさらにより望ましくは約１５から約３０個のアミノ酸の配列を含む。抗原性エピトープは、エピトープを特異的に結合するモノクローナル抗体を含め、抗体をつくるのに有益である。（例として、Ｗｉｌｓｏｎ等、細胞  ３７：７６７−７７８  （１９８４年）；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，  Ｊ．Ｇ．等、科学  ２１９：６６０−６６６（１９８３年）を参照）。
【００６１】
同様に、免疫原性エピトープは従来技術で良く知られた方法に従って抗体を誘発するのに使用することができる。（例として、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ等、前記；Ｗｉｌｓｏｎ等、前記；Ｃｈｏｗ，  Ｍ．等、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．米国８２：９１０−９１４；及びＢｉｔｔｌｅ，  Ｆ．Ｊ．等、遺伝ウィルス学ジャーナル６６：２３４７−２３５４  （１９８５年）を参照）。望ましい免疫原性エピトープには分泌されたタンパク質が含まれる。免疫原性エピトープは動物系（ウサギやマウスなど）に対してアルブミンなどの輸送タンパク質と一緒に、あるいは充分な長さを持つ場合は単体なしで、提出することができる。しかしながら、免疫原性エピトープは８〜１０など少ないアミノ酸しか含まない免疫原性エピトープが、最低でも、変質したポリペプチド（例：ウェスタン・ブロット法）内の線形エピトープに結合可能な抗体を作るのに充分であることが示されている。
【００６２】
本発明で使用するとき、“抗体”（Ａｂ）又は“モノクローナル抗体”（Ｍａｂ）の語句はタンパク質に特異的に結合可能な完全な分子ならびに抗体断片（例えば、ＦａｂとＦ（ａｂ’）２断片など）を含むことを意味する。ＦａｂとＦ（ａｂ’）２断片は完全な抗体のＦｃ断片を欠いており、循環からより速く消滅し、完全な抗体より非特異的組織結合が少ない可能性がある。（Ｗａｈｌ等、核医学２４：３１６−３２５  （１９８３年））。よって、これらの断片はＦＡＢやその他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物とともに望ましい。その上、本発明の抗体はキメラ、単鎖及び人化抗体を含む。
【００６３】
追加の実施態様は、例えば、ネズミ科モノクローナル抗体の人化バージョンなど、キメラ抗体を含む。斯かる人化抗体は既知の技術により調整でき、また抗体を人間に投与する場合に免疫原性が少ないという利点を有する。一つの実施態様では、人化モノクローナル抗体はネズミ抗体の変動領域（又は単にその抗体結合部位）と人間抗体から誘導された恒常領域とを含んでいる。代案として、人化抗体断片はネズミのモノクローナル抗体の抗体結合部位と人間抗体から誘導された変動領域断片（抗体結合部位を欠如）とを含むことができる。キメラ抗体とさらには工学的モノクローナル抗体の生産手続きにはＲｉｅｃｈｍａｎｎ等により記述されたものが含まれる（自然  ３３２：３２３、１９８８年）、Ｌｉｕ等（ＰＮＡＳ  ８４：３４３９、１９８７年）、Ｌａｒｒｉｃｋ等（生物／工学  ７：９３４、１９８９年）、及びＷｉｎｔｅｒとＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ  １４：１３９、１９９３年５月）。
【００６４】
抗体を生成する一つの方法はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から選択されたヌクレオチド配列から翻訳されたポリペプチドで、形質転換したマウスなど、人間以外の動物の免疫化を含み、この場合、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から選択されたヌクレオチド配列から翻訳されたポリペプチドに対して向けられる抗体が当該の動物に生成される。この手続きは人間以外の動物に人間抗体を生成するために開発された。抗体は部分的に人間のもの、あるいは望ましくは完全に人間のものである。一つ又はそれ以上の人間の免疫グロブリン鎖をコード化する遺伝物質を導入した人間以外の動物（形質転換したマウス達など）を採用できる。斯かる形質転換したマウス達は様々の方法で遺伝学的に変質させることができる。遺伝子操作は免疫化時に動物により生成された少なくとも数個（望ましくは全部）の抗体内で内在的免疫グロブリン鎖を置換える人間の免疫グロブリン・ポリペプチド鎖を結果として生じることができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から選択されたヌクレオチド配列から翻訳されたポリペプチドで免疫化する形質転換された動物により生成される抗体が本発明で提供される。
【００６５】
一つ又はそれ以上の内在的免疫グロブリン遺伝子が種々の手段で不活性化されるマウス達が準備された。人間の免疫グロブリン遺伝子が不活性化されたマウス遺伝子を置換えるためにマウス達に導入された。動物内に生成される抗体は動物内に導入された人間の遺伝物質によりコード化された人間の免疫グロブリン・ポリペプチド鎖を組込む。斯かる形質転換動物の生成と使用に関する技術の例は米国特許５，８１４，３１８、５，５６９，８２５及び５，５４５，８０６に説明されており、これらは参考として本発明に組込まれている。
【００６６】
モノクローナル抗体は従来の手続き、例えば、免疫化スケジュール完了後の形質転換した動物から採取した不死化脾臓細胞により生成できる。脾臓細胞は、従来の手続きにより、融合細胞腫を生成するために骨髄腫細胞と融合することができる。
【００６７】
ハイブリドーマ細胞系を生成する方法は以下を含む：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から選択したヌクレオチド配列から翻訳されたポリペプチドの少なくとも７個の隣接アミノ酸残基を含んでいる免疫原でもって形質転換した動物を免疫化すること；免疫化した動物から脾臓細胞を採取すること；採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞系に融合し、それによってハイブリドーマ細胞を生成すること；及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から選択したヌクレオチド配列から翻訳されたポリペプチドを結合するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマ細胞系を識別すること。斯かるハイブリドーマ細胞系、及びそれらから生成されたモノクローナル交代は本発明に含まれる。ハイブリドーマ細胞系により分泌されるモノクローナル抗体は従来の技術により精製される。
【００６８】
抗体は生体外手続きで採用するか、又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から選択したヌクレオチド配列から翻訳されたポリペプチドにより誘発される生物学的活動度を抑制するため生体内で投与することができる。このようにして、細胞表面受容体と本発明の斯かるポリペプチドとの相互作用により引起されるか又は激化された（直接又は間接的に）疾患を処置することができる。一つの治療方法にはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から選択したヌクレオチド配列から翻訳されたポリペプチドにより誘発される生物学的活動度を低減するのに有効量での哺乳動物への遮断抗体の生体内投与が含まれる。
【００６９】
また、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から選択したヌクレオチド配列から翻訳されたポリペプチドに対して向けられる抗体に結合される検出可能な（例：診断）治療因子を含んでいる結合体も本発明で含まれる。斯かる因子の例は良く知られており、診断放射性核種、治療放射性核種、及び細胞毒薬を含むがこれに制限されない。結合体は生体外又は生体内の手続きで使用できる。
【００７０】
融合タンパク質
本発明の任意のポリペプチドが融合タンパク質を生成するのに使用できる。例えば、本発明のポリペプチドは、第２タンパク質に融合されるとき、抗原タグとして使用することができる。本発明のポリペプチドに対して作られる抗体はそのポリペプチドに結合することによって第２タンパク質を間接的に検出するのに使用できる。その上、分泌されたタンパク質は交流信号（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ　ｓｉｇｎａｌｓ）に基づいて細胞位置を標的とするので、本発明のポリペプチドは他のタンパク質に一旦融合すると標的分子として試用することができる。
【００７１】
本発明のポリペプチドに融合できるドメインの例には、異種信号配列のみならず、異種機能領域も含まれる。融合は必ずしも直接的である必要はなく、リンカー配列を通じても起こり得る。
【００７２】
その上、融合タンパク質は本発明のポリペプチドの性質を改善するためにも加工できる。例えば、追加アミノ酸の領域、特に荷電したアミノ酸はをポリペプチドのＮ−末端に追加して、宿主細胞からの精製中の又はその後の取扱いや保存中の安定性と耐性を改善できる。また、ペプチド成分をポリペプチドに追加して精製を促進することもできる。斯かる領域はポリペプチドの最終調整の前に除去することが可能である。ポリペプチドの取扱いを容易にするためのペプチド成分の追加は従来技術では良く知られた日常的な技術である。
【００７３】
その上、断片を含め本発明のポリペプチド、特にエピトープは免疫グロブリン（ＩｇＧ）の恒常ドメイン部分と組合せることができ、結果としてキメラ・ポリペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は精製を促進しまた生体内での半減期の増加を示す。一つの報告例では、人間のＣＤ４−ポリペプチドの最初の２ドメインと哺乳類の免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の恒常領域の種々のドメインとを説明している。（ＥＰ　Ａ　３９４，８２７；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ等、自然３３１：８４−８６（１９８８年））。ジスルフィド結合の二量体構造（ＩｇＧによる）を有する融合タンパク質もまた、単量体の分泌タンパク質やタンパク質断片のみよりも、他の分子の結合及び中性化に於いてより効果的である。（Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ等、生化学ジャーナル２７０：３９５８−３９６４　（１９９４年））。
【００７４】
同様に、ＥＰ−Ａ−０　４６４　５３３（カナダの対応物２０４５８６９）は他の人間タンパク質やその部分と一緒に免疫グロブリンの恒常領域の諸部分を含んでいる融合タンパク質を開示している。多くの場合、融合タンパク質のＦｃ部分は治療と診断に有益であり、よってまた、例えば、改善された薬物動態特性を与える。（ＥＰ−Ａ　０　２３２　２６２）。別案として、融合タンパク質が発現、検出、及び精製されたあとでのＦｃ部分の欠失が望ましいと思われる。例えば、融合タンパク質が免疫化のための抗原として使用されると、Ｆｃ部分は治療及び診断を遅らせる可能性がある。例えば薬の発見に於いて、ｈＩＬ−５などの人間タンパク質はｈＩＬ−５の拮抗薬を識別するため高い処理能力のスクリーニング検定目的でＦｃ部分と融合された。（Ｄ．　Ｂｅｎｎｅｔｔ等、分子認知法８：５２−５８　（１９９５年）；Ｋ．　Ｊｏｈａｎｓｏｎ等、２７０：９４５９−９４７１　（１９９５年）を参照）。
【００７５】
その上、本発明のポリペプチドは、融合されたポリペプチドの精製を促進するペプチドなど、マーカー配列に融合することができる。望ましい実施態様では、マーカー・アミノ酸配列は、例えばｐＱＥベクター（ＱＬＡＧＥＮ社、９１３１１カリフォルニア州チャッツワース、エトン・アベニュー９２５９番地）中に提供されるタグなど、その多くが市販で入手可能なヘキサ・ヒスチジン・ペプチドである。例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の便利な生成方法を提供している（グランツ等、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８６：　８２１−８２４（１９８９年））。精製用に有益な他のペプチド・タグ、“ＨＡ”タグはインフルエンザ血球凝集素タンパク質から誘導されたエピトープに相当する。（Ｗｉｌｓｏｎ等、細胞  ３７：７６７  （１９８４年））。
このように、上記の融合のいずれも本発明のポリヌクレオチドやポリペプチドを使用して加工することができる。
【００７６】
ベクター、宿主細胞及びタンパク質の生成
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、及び組換え技術によるポリペプチドの生成にも関係する。ベクターは、例えば、相、プラスミド、ウィルス性、又はレトロウィルス・ベクターであり得る。レトロウィルス・ベクターは複製可能又は複製不能であり得る。後者の場合、ウィルス伝播は一般的に相補宿主細胞内で起こるであろう。
【００７７】
ポリヌクレオチドは宿主内で伝播するため選択可能なマーカーを含んでいるベクターに結合され得る。一般的に、プラスミド・ベクターは燐酸カルシウム沈殿などの沈殿物中に、あるいは荷電した脂質との複合体中に導入される。ベクターがウィルスである場合、適当なパッケージ細胞系を使用して生体外でパッケージしてから宿主細胞内に形質導入することができる。
【００７８】
ポリヌクレオチド挿入は、λ相ＰＬ促進因子、Ｅ．　ｃｏｌｉラクトース（ｌａｃ）、ｔｒｐ、ｐホＡ及びｔａｃ促進因子、ＳＶ４０早期及び後期促進因子及びレトロウィルスＬＴＲｓの促進因子など多数のうち適切な促進因子に有効に結合するべきである。他の適切な促進因子は熟練した技術者には知られている。発現構造はさらに遷移開始、終了のための部位、及び転写された領域に、翻訳用のリボソーム結合部位を含む。構造により発現される転写のコーディング部分は望ましくは翻訳されるポリペプチドの最初に翻訳開始コドンと及び最後に適切に位置付けられた終了コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ又はＵＡＧ）を含む。
【００７９】
指摘されているように、発現ベクターは望ましくは少なくとも１個の選択可能マーカーを含む。斯かるマーカーは真核細胞培養のためのジヒドロホレート還元酵素、Ｇ４１８又はネオマイシン抵抗、及びＥ．　ｃｏｌｉとその他のバクテリアで培養するためのテトラサイクリン、カナマイシン又はアンピリシン抵抗遺伝子を含む。適切な宿主の代表的な例には、Ｅ．　ｃｏｌｉ、ストレプトマイセス及びサルモネラ・ネズミチフス菌細胞などのバクテリア細胞；酵母細胞などの真菌細胞；ドロソフィラＳ２とＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、Ｂｏｗｅの黒色腫細胞などの動物細胞及び植物細胞が含まれるが、これに制限されない。上述の宿主細胞に関する適切な培地と条件は従来の技術で知られている。
【００８０】
バクテリアで使用するのに望ましいベクターの中には、ＱＬＡＧＥＮ社から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社から入手可能なｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｓｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ＰＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；及びＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が含まれる。望ましい真核ベクターの中には、Ｓｔｒｑｔｑｇｅｎｅ社から入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩ及びｐＳＧ；及びＰｈａｒｍａｃｉａ社から入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬがある。その他の適切なベクターは熟練した技術者には容易に分かる。
宿主細胞への構造の導入は、燐酸カルシウム移入、ＤＥＡＥ−デキシトラン仲介移入、陽イオン脂質仲介移入、電気穿孔法、形質導入、感染、またはその他の方法で実施できる。斯かる方法は、Ｄａｖｉｓ等、分子生物学の基本的方法（１９８６年）などの多くの標準的な実験マニュアルで説明されている。本発明のポリペプチドは事実上組換えベクターを欠如した宿主細胞により発現されることが特異的に意図される。
【００８１】
本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムやエタノール沈殿、酸抽出、陽イオン又は陰イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロース・クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィー及び植物凝集素クロマトグラフィーを含む既知の組換え細胞培養から回収及び精製することができる。最も望ましくは、高性能液体クロマトグラフィー（“ＨＰＬＣ”）が精製用に使用される。
【００８２】
本発明のポリペプチド、及び望ましくはその分泌された形もまた以下から回収できる：直接分離されたか又は培養された身体の流体、組織及び細胞を含む自然発生源から精製された産物；合成方法；及び例えば、バクテリア、酵母、高木、昆虫、及び哺乳類の細胞を含めた原核又は真核宿主から組換え技術により生成された産物。組換え生成方法で採用された宿主によって、本発明のポリペプチドはグリコシル化されるか又はグリコシル化されない。加えて、本発明のポリペプチドは、場合によっては宿主仲介プロセスの結果として、初期メチオニン残基を含むこともあり得る。このように、翻訳開始コドンによりコード化されたＮ−末端メチオニンが一般的に、すべての真核細胞内の翻訳後に如何なるタンパク質からも高効率で除去されることは良く知られている。ほとんどのタンパク質上のＮ−末端メチオニンもまたほとんどの原核生物で効率的に除去されるのに対して、いくつかのタンパク質では、Ｎ−末端メチオニンが共有的に結合されるアミノ酸の性質によって、この原核除去プロセスが不充分である。
【００８３】
ポリヌクレオチドの使用法
本発明で識別されるポリヌクレオチドのそれぞれは試薬として数多くの用途に使用できる。以下の説明は代表的なものであり且つ基地の技術を使用している。
本発明のポリヌクレオチドは染色体の識別に有益である。実際の配列データ（反復多形性）に基づく染色体マーキング試薬が現在少ししか入手できないことから、新しい染色体マーカーを識別する必要性が現存する。本発明の各ポリヌクレオチドは染色体マーカーとして使用可能である。
【００８４】
簡単に説明すると、配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１−６２に示された配列からＰＣＲプライマー（望ましくは１５−２５　ｂｐ）を調整することにより作図できる。プライマーはゲノムＤＮＡ内の予想される１エクソン以上に広がらないように、コンピュータ分析を使用して選択される。次いでこれらのプライマーは個々の人間染色体を含んでいる身体細胞の雑種のＰＣＲスクリーニングのために使用される。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１−６２に相当する人間の遺伝子を含んでいる雑種のみが増幅された断片を発生する。
【００８５】
同様に、身体の雑種はポリヌクレオチドを特定の染色体にＰＣＲ作図する迅速な方法を提供する。単一の熱循環装置（ｃｙｃｌｅｒ）を使用して、１日当り３個又はそれ以上のクローンを割当てることができる。その上、ポリヌクレオチドのｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎは特異的染色体断片パネルで行うことができる。使用可能な他の遺伝子作図戦略には、自然位での雑種形成、標識付きフロー選別（ｆｌｏｗ−ｓｏｒｔｅｄ）染色体でのプレスクリーニング、及び染色体特異的−ｃＤＮＡライブラリーを構成するための雑種形性による事前選択が含まれる。
【００８６】
ポリヌクレオチドの正確な染色体の位置付けもまた、中期染色体波及の蛍光自然位雑種形成（ＦＩＳＨ）を使用して行うことができる。この技術は５００又は６００塩基と短いポリヌクレオチドを使うが、但し、２，０００〜４，０００ｂｐのポリヌクレオチドが望ましい。この技術を確認するには、Ｖｅｒｍａ等、“人間の染色体：基本的技術マニュアル”Ｐｅｒｇａｍｏｎ出版、ニューヨーク（１９８８年）を参照。
【００８７】
染色体の地図作製では、ポリヌクレオチドは個別に（単一染色体又はその染色体上の単一部位をマークするため）又はパネルで（複数の部位及び／又は複数の染色体をマークするため）を使用することができる。望ましいポリヌクレオチドは、コーディング配列が遺伝子族内でより保存されやすく、よって染色体地図作製中の雑種交配のチャンスを増加させることから、ｃＤＮＡのノンコーディング領域に相当する。
【００８８】
ポリヌクレオチドが正確な染色体位置に作図されると、そのポリヌクレオチドの物理的位置を結合分析で使用することができる。結合分析は染色体の位置と特定疾患の提示との間の共同遺伝（ｃｏｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ）を確立する。（疾患地図作製データは、例えば、Ｖ．  ＭｃＫｕｓｉｃｋ、人間に於けるメンデル遺伝（ジョーン・ホプキンズ大学ウェルチ医学図書館を通じてオンラインで入手可能）にある）。１メガベースの地図作製解像度と２０  ｋｂ当り１遺伝子を仮定すると、疾患と結び付いた染色体領域に正確に位置付けられるｃＤＮＡは５０−５００の潜在的原因遺伝子のうちの一つであり得る。
【００８９】
よって、共有遺伝が確立されると、病気の個体と病気でない個体の間のポリヌクレオチドと相当遺伝子の差を検査することができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２のポリヌクレオチドは個々の人間のこの分析用に使用できる。
【００９０】
まず、欠失や転座などの染色体の視覚的構造変化を染色体波及内に又はＰＣＲにより検査することができる。構造変化が起こっていなければ、ポイント突然変異の存在を確認する。正常な個体以外の病気の個体の幾つか又は全部に観察された突然変異は疾患を引き起こす可能性がある。しかしながら、多形現象から突然変異を区別するには、幾人かの正常な個体からのポリペプチドと相当する遺伝子の完全な配列決定が必要になる。新しい多形現象が識別されると、この多形ポリペプチドをその後の結合分析に利用できる。
【００９１】
さらに、病気でない個体と比較して病気の個体内の遺伝子発現の増加又は減少は、本発明のポリヌクレオチドを使用して評価することができる。これらの変化（発現の変化、染色体の配列替え、又は突然変異）はいずれも診断や予断マーカーとして使うことができる。
【００９２】
上述に加えて、ポリヌクレオチドは３重螺旋形成又はアンチセンスＤＮＡやＲＮＡを通じて対照遺伝子発現に使用できる。両方法ともＤＮＡやＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に依拠する。これらの技術に関して、望ましいポリヌクレオチドは、通常、２０から４０塩基の長さであり、また転写に関与する遺伝子の領域か（３重螺旋‐Ｌｅｅ等、核酸研究６：３０７３  （１９７９年）；Ｃｏｏｎｅｙ等、科学２４１：４５６  （１９８８年）；及びＤｅｒｖａｎ等、科学２５１：１３６０  （１９９１年）を参照）又はｍＲＮＡ自体（アンチセンス‐Ｏｋａｎｏ、核化学ジャーナル５６：５６０  （１９９１年）；遺伝子発現のアンチセンス抑制剤としてのＯｌｉｇｏｄｅｏｘｙ−ヌクレオチド、ＣＲＣ出版、ＢｉｃａＲａｔｏｎ、フロリダ（１９８８年））のいずれかに相補的である。３重螺旋形成は最適には結果としてＤＮＡからのＲＮＡ転写の停止（ｓｈｕｔ−ｏｆｆ）を起こすのに対して、アンチセンスＲＮＡ雑種形成はｍＲＮＡ分子のポリペプチドへの翻訳を遮断する。両方の技術ともモデル・システムで有効であり、また本発明で開示される情報は疾患の処置の努力に於いてアンチセンスや３重螺旋ポリヌクレオチドを設計するのに使用できる。
【００９３】
本発明のポリヌクレオチドはまた遺伝子治療でも有益である。遺伝子治療の一つの目的は遺伝的欠損症を正す努力に於いて、正常な遺伝子を欠陥遺伝子を持つ器官に挿入することである。本発明で開示するポリヌクレオチドは非常に精密に斯かる遺伝的欠損症を標的にする手段を提供する。もう一つの目的は宿主ゲノムに存在しない新しい遺伝子を挿入して、宿主細胞に新しい特徴を生成することである。
【００９４】
ポリヌクレオチドはまた、微小な生物学的試料から個体を識別するのにも有益である。例えば、米国軍隊はその人員の識別に制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の使用を考慮している。この技術では、個人のゲノムＤＮＡが１個又はそれ以上の制限酵素とともに消化され、それからサザン・ブロット上で精査されて人の識別のため唯一のバンドを発生する。この方法は紛失、変更又は盗難の可能性があって肯定的識別を困難にしている“鑑札”の現在の制限を受けない。本発明のポリヌクレオチドはＲＦＬＰ用の追加のＤＮＡマーカーとして使用できる。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチドはまた、個人のゲノムの選択された部分の実際の塩基ごとのＤＮＡ配列を決定することにより、ＲＦＬＰの代案としても使用できる。これらの配列は、そのあとで配列決定される、斯かる選択されたＤＮＡを増幅及び分離するためのＰＣＲプライマーを調整するのに使用できる。この技術を使用して、各個人は唯一のＤＮＡ配列集合を持つことから、個人を識別することができる。唯一のＩＤデータベースがある人について確立されれば、生存中でも死亡後でも、その人の肯定的識別が非常に小さい組織試料から行えるようになる。
【００９６】
法廷生物学もまた本発明で開示するＤＮＡベースの識別技術の使用の恩恵を受ける。毛髪や皮膚などの組織、あるいは血液、唾液、精液などの体液など、非常に小さい生物学的試料から取られたＤＮＡ配列はＰＣＲを使用して増幅することができる。一つの先駆的技術では、ＤＱａクラスＩＩ  ＨＬＡ遺伝子など、多形性遺伝子座から増幅された遺伝子配列が個人を識別するために法廷生物学で使用されている。（Ｅｒｌｉｓｈ，  Ｈ．、ＰＣＲテクノロジー、Ｆｒｅｍａｎ社（１９９０年））。これらの特異的な多形性遺伝子座が増幅されると、１個又はそれ以上の制限酵素とともに消化され、ＤＱａクラスＨ  ＨＬＡ遺伝子に相当するＤＮＡで精査されたサザン・ブロット上に識別バンド集合を発生する。同様に、本発明のポリヌクレオチドは法廷目的での多形性マーカーとして使用できる。
【００９７】
特定の組織の発生源を識別できる試薬についても必要性が存在する。斯かる必要性は、例えば、未知の起源の組織を提示されたときの法廷で発生する。適切な試薬には、例えば、本発明の配列から調整された特定の組織に特異的なＤＮＡプローブやプライマーを含むことができる。斯かる試薬パネルは種により及び／又は器官タイプにより組織を識別できる。同様に、これらの試薬は汚染に関して組織培養をスクリーニングするのに使用できる。
【００９８】
最小限、本発明のポリヌクレオチドは、サザン・ゲル上の分子量マーカーとして、特定の細胞タイプの特異的ｍＲＮＡの存在に関する診断プローブとして、新規のポリヌクレオチド発見プロセス中に既知の配列を“引出す”ためのプローブとして、“遺伝子細片”やその他の支持体に付加するためのオリゴマーの選択又は作成のため、ＤＮＡ免疫化技術を使用してアンチＤＮＡ抗体を作るため、及び免疫応答を引出すための抗原として使用できる。
【００９９】
ポリペプチドの使用
ここで識別される各ポリペプチドは、様々な方法で使用し得る。以下の説明は、例証として考慮されるべきであり、既知の技法を利用するものである。
【０１００】
本発明におけるポリペプチドは、抗体をベースとする技法を用いる、生物学的サンプルにおける蛋白質レベルのアッセイにおいて使用し得る。例えば、組織内における蛋白質の発現については、古典的な免疫組織学的方法により研究を行い得る（Ｍ・ジャルカネン他、Ｊ．セル・バイオロジー誌１０１号、９７６〜９８５頁（１９８５年）、Ｍ・ジャルカネン他、Ｊ．セル・バイオロジー誌１０５号、３０８７〜３０９６頁（１９８７年））。蛋白質遺伝子の発現を検出するうえで有益なその他の抗体をベースとする方法には、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）や放射性免疫測定法（ＲＩＡ）などの免疫測定法が含まれる。適切な抗体測定標識は、本分野において既知であり、ブドウ糖酸化物などの酵素標識や、ヨー素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）およびテクニチウム（９９ｍＴＣ）などの放射性同位元素、ならびにフルオレセインやローダミンなどの蛍光標識、およびビオチンが含まれる。
生物学的サンプルにおける分泌蛋白質レベルのアッセイに加えて、蛋白質は、また、造影によりインビボにおいて検出され得る。蛋白質のインビボ造影用抗体標識またはマーカには、Ｘ線撮影法、ＮＭＲまたはＥＳＲにより検出可能な標識またはマーカが含まれる。Ｘ線撮影法の場合、妥当な標識には、検出可能な放射線を放射するが、被験者にとって明白に有害ではないバリウムやセシウムなどの放射性同位元素が含まれる。ＮＭＲおよびＥＳＲにおいて適切なマーカには、関連するハイブリドーマを得るために、栄養素の標識付けを行うことで抗体内に組み込み得る、ジューテリウムなどの検出可能な特性スピンを有するものが含まれる。
【０１０１】
妥当な検出可能な造影部を用いて標識付けが行われている蛋白質特定抗体または蛋白質特定抗体断片、例えば、放射性同位元素（例えば１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴＣ）陽性造影基質、または核磁気共鳴により検出可能な材料を、哺乳動物に導入する（例えば、部分的に、被かに、あるいは腹膜内に）。本技術分野において、被験者の大きさならびに使用される造影システムが、診断画像を作り出すために必要な造影部の量を決定することになることが理解されるであろう。ヒトが被験者の場合で、放射性同位元素部の場合、注入される放射能の量は、通常、９９ｍＴｃであれば、約５〜２０ミリキュリーとなる。標識付けが行われている抗体または抗体断片は、その後、選択的に、特定蛋白質を含む細胞の位置において蓄積されることになる。インビボ腫瘍造影については、Ｓ・Ｗ・バーカイル他「放射性同位元素を使って標識付けされる抗体およびその断片の免疫薬物動力学」（『腫瘍造影：癌の放射化学検出』第１３章、Ｓ・Ｗ・バーカイル、Ｂ・Ａ・ロズ編集、メイソン出版会社（１９８２年））において述べられる。
【０１０２】
このため、本発明によりは、（ａ）個人の細胞または体液内に発現する本発明によるポリペプチドのアッセイと、（ｂ）遺伝子発現レベルと標準的遺伝子発現レベルとの比較が含まれる、障害診断法が提供されるが、すなわちアッセイされるポリペプチド遺伝子発現レベルと標準的発現レベルとの比較における増減により、障害が示されることになる。
【０１０３】
さらに、本発明におけるポリペプチドは、病気の治療においても使用し得る。例えば、ポリペプチドの欠落または減少レベルに取って代わるために（例えばインスリン）、異なるポリペプチドの欠落または減少レベルを補給するために（例えばヘモグロビンＢに対しヘモグロビンＳ）、ポリペプチドの活動を抑制するために（例えば腫瘍形成遺伝子）、ポリペプチドの活動を活性化させるために（例えばレセプタに結合させることにより）、遊離配位子を得るために膜結合レセプタと競争させることによりその活動を軽減するために（例えば炎症を軽減する際に使用される可溶性のＴＮＦレセプタ）、または望ましい応答を得るために（例えば血管の成長）、患者に、本発明におけるポリペプチドを投与し得る。
【０１０４】
同様に、本発明におけるポリペプチドに振り向けられる抗体についても、病気の治療において使用し得る。例えば、本発明におけるポリペプチドに振り向けられる抗体を投与することにより、その抗体はポリペプチドに結合し、ポリペプチドの過剰生成が軽減される。同様に、抗体を投与することにより、膜（レセプタ）に結合されているポリペプチドに結合させるなどの方法において、ポリペプチドを活性化し得る。
【０１０５】
少なくとも、絶対的に、本発明におけるポリペプチドは、当業者にとっては良く知られる方法を用いる、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲル透過カラムにおける分子量マーカとして使用し得る。ポリペプチドは、また、次に、宿主細胞の形質転換をアッセイする方法として、組換え細胞における蛋白質の発現を測定するために使用される抗体を作り出す際に使用し得る。さらに、本発明におけるポリペプチドは、以下の生物学的活動について試験を行う際にも使用し得る。
【０１０６】
生物学的活動
本発明におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、一つ以上の生物学的活動を試験するためのアッセイにおいて使用し得る。これらのポリヌクレオチドまたはポリペプチドがあるアッセイにおける活動を抑圧する場合、これらの分子は、その生物学的活動を付随する病気に関連し得ると考えられる。このため、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、付随する病気の治療において使用し得る。
【０１０７】
免疫活動
本発明におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、免疫細胞の増殖、分化または移動（走化）を活性化あるいは抑制することにより、免疫システムの欠損または障害の治療において有益となり得る。免責細胞は、造血と呼ばれる工程を介して展開され、骨髄（血小板、赤血球、好中球およびマクロファージ）やリンパ（ＢおよびＴリンパ球）細胞を多能性幹細胞から生成する。これらの免疫欠損または免疫障害の原因については、癌や、何らかの（例えば化学療法や毒素により）取得される自己免疫障害あるいは感染などの、肉体における発生学的な原因であり得る。さらに、本発明におけるポリヌクレオチドかたはポリペプチドは、特定の免疫システムの病気または障害のマーカもしくは検出子として使用し得る。
【０１０８】
本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、造血細胞の欠損あるいは障害の治療または検出において有益となり得る。本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、ある種（あるいは多種）の造血細胞の減少を伴うこれらの障害を治療する際に、多能性幹細胞を含む造血細胞の分化および増殖を促進するために使用し得る。免疫学的欠損症候群の例として、血液蛋白質障害（例えば無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症）や、毛細管拡張性運動失調、一般的な可変免疫不全、ディジョージ症候群、ＨＩＶ感染、ＨＴＬＶ−ＢＬＴ感染、白血球付着不全症候群、リンパ球減少症、食細胞殺菌機能不全、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、ウィスコット−アルドリッチ症候群、貧血症、血小板減少症またはヘモグロビン尿症が含まれるが、これらに限られるものではない。
【０１０９】
さらに、本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、また、止血（出血を止める）作用や血栓溶解作用（血塊形成）を柔ら月ために使用し得る。例えば、止血あるいは血栓溶解作用を増強することにより、本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用して、血液凝固障害（例えば無線維素原血症、因子欠損症）、血小板障害（例えば血小板減少症）または外傷や手術またはその他の原因により発生した傷を治療し得る。あるいは、止血または血栓溶解作用を軽減し得る、本発明におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、凝固の抑制または溶解において使用し得る。これらの分子は、心臓発作（梗塞）、脳卒中または瘢痕の治療において重要となり得る。
【０１１０】
本発明におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、また、自己免疫障害の治療または検出において有益となり得る。多くの自己免疫障害は、免疫細胞による自己の異物としての不適切な認識によりもたらされ、この不適切な認識により、宿主組織の破壊につながる免疫応答が発生する。このため、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化を抑制する、本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与することは、自己免疫傷害を防止するうえで有効な治療法となり得る。
【０１１１】
本発明により治療または検出し得る自己免疫障害の例とし、アジソン病、溶血性貧血、抗リン脂質抗体症候群、慢性関節リウマチ、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、バセドウ病、多発硬化症、重症筋無力症、神経炎、眼炎、水泡性類疱瘡、天疱瘡、多発性内分泌障害、紫斑病、ライター病、スティフ−マン症候群、自己免疫甲状腺炎、全身性紅斑性狼瘡、自己免疫肺炎、ギラン−バレー症候群、インスリン依存糖尿病、頬炎および自己免疫炎症性眼病が含まれるが、これらに限られるものではない。
【０１１２】
同様に、喘息（特にアレルギー性喘息）またはその他の呼吸不全などのアレルギー反応やアレルギー状態も、また、本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにより治療し得る。さらに、これらの分子は、抗原性分子あるいは血液型の不一致に対するアナフィラキシーまたは過敏症の治療において使用し得る。
【０１１３】
本発明におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、また、臓器の拒絶または移植片−被移植体病（ＧＶＨＤ）の治療および／または防止においても使用し得る。臓器の拒絶は、移植された組織の被移植体免疫細胞が免疫応答により破壊されることにより発生する。同様に、免疫応答も、また、ＧＶＨＤにおいて関連するが、この場合、異物移植免疫細胞は、被移植体組織を破壊する。免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または走化を抑制する、本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを投与することは、ＧＶＨＤにおける臓器拒絶を防止する際に有効な治療法となり得る。
【０１１４】
同様に、本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、また、炎症の緩和において使用し得る。例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、炎症応答にかかわる細胞の増殖および分化を抑制し得る。これらの分子は、感染症を伴う炎症（例えば敗血症によるショック、セプシスまたは全身性の炎症応答症候群（ＳＩＲＳ））を含む、慢性および急性の両方の炎症状態の治療や、虚血再潅流障害、内毒素致死症、関節炎、超急性補体媒介拒絶、腎炎、細胞分裂または化学運動誘発肺創傷、炎症性腸病、クローン病、あるいは分裂細胞（例えばＴＮＦまたはＩＬ−１）が過剰に生成されるために発生する症状の治療において使用し得る。
【０１１５】
過剰増殖障害
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、腫瘍を含み、過剰増殖障害の治療あるいは検出において使用し得る。本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、障害の増殖を、直接的または間接的な相互作用を介して抑制し得る。あるいは、本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、過剰増殖障害を抑制し得る別の細胞を増殖し得る。
【０１１６】
例えば、免疫応答、特に過剰増殖障害の抗原質を高めることにより、またはＴ細胞を増殖、分化あるいは移動することにより、過剰増殖障害は治療し得る。この免疫応答は、存在する免疫応答を高めるか、あるいは新しい免疫応答を作り出すかのいずれかの方法により強化し得る。もしくは、免疫応答を軽減する方法も、また、化学療法薬などの、過剰増殖障害の治療法となり得る。
【０１１７】
本発明におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより治療または検出し得る過剰増殖障害の例として、腹部、骨、胸部、消化系統、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、上皮小体、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部または首、神経（中枢および抹消）、リンパ系、骨盤、皮膚、柔組織、脾臓、胸、尿生殖部に位置する腫瘍が含まれるが、これに限られるものではない。
【０１１８】
同様に、その他の過剰増殖障害についても、また、本発明におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより治療または検出し得る。このような過剰増殖障害の例として、ガンマグロブリン過剰血症、ガンマグロブリン血症リンパ増殖障害、パラプロテイン血症、紫斑症、類肉腫症、セザリー症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球症、およびあらゆるその他の、上記で列挙される臓器システム内に位置する、腫瘍形成以外の過剰増殖病が含まれるが、これらに限られるものではない。
【０１１９】
感染症
本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、病原菌の処理または検出において使用し得る。例えば、免疫応答を高めること、特にＢ細胞および・またはＴ細胞の増殖力ならびに分化を高めることにより、感染症は治療され得る。免疫応答は、存在する免疫応答を向上させるか、あるいは新しい免疫応答を提起させるかのいずれかにより高められ得る。または、本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、また、免疫応答を必然的に顕在化させることなく、直接、病原菌を抑制し得る。
【０１２０】
ウイルスは、本発明におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより処理または検出し得る病気または症状の原因となり得る病原菌の一例である。ウイルスの例として、アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、バルナウイルス科、バンヤウイルス科、カリチウイルス科、サーコウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、帯状疱疹など）、モノネガウイルス（例えばパラミクソウイルス科、麻疹ウイルス属、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えばインフルエンザ）、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（天然痘やワクシニアなど）、レオウイルス科（例えばロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）およびトガウイルス科（例えばルビウイルス属）などのＤＮＡおよびＲＮＡウイルス系統群が含まれるが、これに限られるものではない。これらの系統群に入るウイルスは、関節炎や細気管支炎、脳炎、眼の感染症（例えば結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、慢性活動性、デルタ）、髄膜炎、日和見感染（例えばエイズ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水痘、出血熱、麻疹、耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性交感染症、皮膚病（例えばカポジ肉腫、いぼ）およびウイルス血症などを含み、これらに限られることはない様々な病気または症状の原因となり得る。本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、これらの症状または病気のいずれかを治療または検出するために使用し得る。
【０１２１】
同様に、病気や症状の原因となり得る、また本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにより処理または検出し得る細菌または真菌には、放射菌類（例えばコリネバテリウム、ミコバクテリウム、ノカルジア）、アスペルギルス症、バシラス科（例えば炭そ、クロストリジウム）、バクテロイデス科、ブラストミセス症、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ症、カンジタ症、カンピロバクター菌、コクシジオイデス症、クリプトコックス症、皮膚糸状菌症、腸内細菌科（クレブシェラ属、サルモネラ属、セラシア属、エルジニア属）、エリジペロスリックス属、ヘリコバクター、レジオネラ症、レプトルピラ属、リステリア属、マイコプラズマ目、ナイセリア科（例えばアシネトバクター属、淋病、髄膜炎菌）、パスツレラ科感染症（例えばアクチノバチルス属、ヘルノフィラス、パスツレラ属）、シュードモナス、リケッチア科、クラミジア科、梅毒およびブドウ球菌など、これに限られることのない、グラム陰性およびグラム陽性細菌系統群ならびに細菌が含まれる。これらの細菌または真菌系統群は、菌血症、心内膜炎、眼の感染症（例えば結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染（例えばエイズ関連感染症）、爪囲炎、プロテーゼ関連感染症、ライター症候群、百日咳や蓄膿症などの呼吸管感染症、敗血症、ライム病、猫ひっかき病、赤痢、パラチフス、食中毒、腸チフス、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、濡不テリア、ハンセン病、パラ結核症、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性交感染症、皮膚病（例えばフレグモーネ、皮膚糸状菌症）、妊娠中毒症、尿管感染症、傷感染症を含むが、これらに限られることのない病気や症状の原因となり得る。本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、これらの症状または病気のいずれかを治療または検出するために使用し得る。
【０１２２】
さらに、本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにより処理または検出し得る、病気や症状の原因である規制菌には、アメーバ症、ピロプラズマ病、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症、媾疫、外部寄生虫、ランブル鞭毛虫症、蠕虫病、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ症およびトリコモナス症が含まれるが、これに限られるものではない。これらの寄生体は、疥癬、ツツガムシ病、眼の感染症、腸の病気（例えば赤痢、ランブル鞭毛虫症）、肝臓病、肺病、日和見感染症（例えばエイズ関連）、マラリア、妊娠合併症およびトキソプラズマ症を含むが、これらに限られることのない様々な病気や症状の原因となり得る。本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、これらの症状または病気のいずれかを治療または検出するために使用し得る。
【０１２３】
好ましくは、本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用する治療においては、患者に有効量のポリペプチドを投与するか、あるいは患者から細胞を取り出し、その細胞に本発明におけるポリヌクレオチドを補給し、患者に処理が施された細胞を戻す方法（半ビボ療法）のいずれかにより可能である。さらに、本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、感染病に対する免疫応答を高めるためのワクチンに含まれる抗原として使用し得る。
【０１２４】
再生
本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、組織の再生につながる、細胞の分化、増殖および誘引において使用し得る（サイエンス誌第２７６号、５９〜８７頁（１９９７年）参照）。組織の再生は、先天性欠損、外相（傷や火傷、切り口または潰瘍）、加齢、病気（例えば骨粗しょう症、骨関節症、歯周病、肝臓疾患）、美容整形手術を含む手術、繊維症、再潅流傷害または体シトキン損傷により損傷を受けた組織を修復、交換または保護するために使用され得る。
【０１２５】
本発明を使用することで再生可能な組織には、臓器（例えば膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋または心筋）、管（脈管内皮を含む）、神経、血液生成および骨格（骨、軟骨、腱および靭帯）組織が含まれる。好ましくは、再生は、傷を残すことなく、または僅かに傷が残る程度において発生する。
【０１２６】
さらに、本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、治癒が難しい組織の再生力を向上し得る。例えば、腱や靭帯の再生力が高められることにより、損傷を受けた後の回復時間が短縮される。本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、また、損傷を回避する努力において予防的に使用され得る。治療可能な特定の病気には、腱炎、手根管症候群およびその他の腱または靭帯欠陥が含まれる。更なる非治癒傷の組織再生例として、圧力潰瘍、血管の機能不全に関連する潰瘍、手術痕及び外傷痕が含まれる。
【０１２７】
同様に、本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを使用して神経細胞を増殖し、分化することにより、神経および脳組織も再生し得る。この方法により治療可能な病気には、中枢および抹消神経系の病気や、神経病患者または機能障害および外傷障害（例えば脊髄の障害、頭部外傷、脳血管病および脳卒中）が含まれる。特に、抹消神経疾患や末梢神経障害（例えば化学療法やその他の医療法の結果発生する障害）、局所神経障害、中枢神経系の病気（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症およびシャイ・ドレーガー症候群）に付随する病気は、全て、本発明におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使用することにより治療し得る。
【０１２８】
走化性
本発明におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、走化機能を有し得る。走化分子が、細胞（例えば単核細胞、繊維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、マスト細胞、エオシン好性細胞および／または内皮細胞）を、炎症や感染症などの体内における特定部位あるいは超増殖部位に誘引または移動させる。移動した細胞は、次に、特定の外傷または異常と戦い、さらに／または治癒し得る。
【０１２９】
本発明におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、特定細胞の走化機能を向上し得る。これらの走化分子は、結果的に、体内の特定局所に対しターゲットとなっている細胞数を増やすことにより、炎症や感染症、超増殖障害またはあらゆる免疫システム障害の治療において使用し得る。例えば、走化分子は、免疫細胞を疾病局所に誘引することにより、傷やその他の組織に対する外傷の治療において使用し得る。本発明における走化分子は、また、傷を治療するために使用し得る繊維芽細胞を誘引し得る。
【０１３０】
また、本発明におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおいては、走化機能の阻止が企図される。これらの分子は、また、障害を治療するために使用し得る。このため、本発明におけるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、走化抑制体として使用し得る。
【０１３１】
結合機能
本発明におけるポリペプチドは、ポリペプチドに結合する分子またはポリペプチドが結合する分子のふるい分けにおいて使用し得る。ポリペプチドと分子が結合することにより、結合されたポリペプチドまたは分子の活動を活性化（作用）、増強、抑制（拮抗）あるいは減少し得る。このような分子の例として、抗体やオリゴヌクレオチド、蛋白質（例えばレセプタ）または小分子が含まれる。
【０１３２】
好ましくは、当分子は、例えば配位子の断片または自然基質などのポリペプチドの自然配位子、配位子、構造あるいは機能的模倣に密接に関係する（コリギャン他「免疫学における最新実験記録第１（２）巻第５章（１９９１年）参照」。同様に、当分子は、ポリペプチドが結合するレセプタまたは少なくともポリペプチドにより結合される可能性があるレセプタの断片（例えば活性部位）に密接に関係し得る。何れの場合も、当分子は、既知の技法を用いることで、合理的に設計され得る。
【０１３３】
好ましくは、これらの分子のふるい分けにおいて、ポリペプチドを分泌蛋白質としてあるいは細胞膜上に発現させる適切な細胞の生成が関連する。好ましい細胞には、哺乳動物、酵母、キロショウジョウバエ属または大腸菌が含まれる。ポリペプチドを発言させる細胞（または発現されたポリペプチドを含む細胞膜）は、次に、好ましくは、ポリペプチドまたは分子のいずれかの活動の結合、刺激または抑制を観察するために、潜在的に分子を含む試験化合物に接触される。
【０１３４】
アッセイでは、単に、結合がラベルにより、または標識付けされた競争相手との競争が含まれるアッセイにおいて検出される、ポリペプチドに結合する化合物候補を試験し得る。さらに、アッセイでは、化合物候補がポリペプチドに対する結合により発生する信号となるか否かについても試験し得る。
【０１３５】
あるいは、アッセイは、無細胞調整法や、固体担体添付されるポリペプチド／分子、化学ライブラリまたは自然生産物混合物を用いて実行し得る。アッセイは、また、化合物候補とポリペプチドを含む溶液との混合工程や、ポリペプチド／分子活動または結合を測定する工程、ならびにポリペプチド／分子活動または結合を基準と比較する工程から構成され得る。
【０１３６】
好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイでは、単クローン抗体または多クローン抗体を用いて、サンプル（例えば生物学的サンプル）内におけるポリペプチドのレベルまたは活動を測定し得る。抗体は、ポリペプチドに直接または間接的に結合するか、基質を得るためにポリペプチドと競争するかのいずれかにより、ポリペプチドのレベルまたは活動を測定し得る。
【０１３７】
これらの上記の全アッセイは、診断マーカあるいは予後マーカとして使用し得る。これらのアッセイにより発見された分子は、ポリペプチド／分子を活性化させるか、または抑制することにより、病気の治療において、または患者に特定の結果（例えば血管の発育）をもたらすために使用し得る。さらに、アッセイでは、妥当に処理された細胞または組織からポリペプチドを生成する作用を抑制または増長し得る因子を発見し得る。
【０１３８】
このため、本発明には、本発明におけるポリペプチドに結合する化合物を識別するための、（ａ）本発明におけるポリペプチドを用いて結合化合物候補を培養する工程と、（ｂ）結合が発生しているかについて決定を行う工程とから構成される方法が含まれる。さらに、本発明には、作用・拮抗を識別するための、（ａ）本発明におけるポリペプチドを用いて化合物候補を培養する工程と、（ｂ）生物活性をアッセイする工程と、（ｃ）ポリペプチドの生物活性に変化が見られるかを決定するための工程とから構成される方法が含まれる。
【０１３９】
その他の機能
本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、また、上記で考察される造血系列のほかに、胚幹細胞の分化または増殖を促進あるいは減退し得る。
本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、また、身長、体重、紙の色、目の色、肌、脂肪組織の比率、色素形成、大きさおよび形状（例えば美容手術）などの哺乳類の特性を調製し得る。同様に、本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、エネルギーの異化、同化、処理、利用および保存に影響を及ぼす哺乳類の代謝を調整し得る。
【０１４０】
本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、バイオリズムや概日リズム、憂鬱（抑鬱障害を含む）、暴力傾向、痛みに対する許容性、再生能力（好ましくはアクチビンまたはインヒビンのような活動）、ホルモンまたは内分泌レベル、食欲、性的衝動、記憶、ストレスまたはその他の認識品質に影響を与えることにより、哺乳類の精神的状態あるいは肉体的状態を変化するために使用し得る。
【０１４１】
本発明におけるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、また、保存能力や脂肪含有量、脂質、蛋白質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、共同因子またはその他の栄養成分を増大または減少させるなど、食物添加物または保存剤として使用し得る。
その他の好ましい実施態様
請求を行う発明のその他の好ましい実施態様には、少なくとも８０％の、好ましくは少なくとも８５％において、より好ましくは少なくとも９０％において、最も好ましくは少なくとも９５％において、ヌクレオチド配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１−６２内で隣接する少なくとも５０個以上のヌクレオチドの配列と同一のヌクレオチド配列から構成される遊離ヌクレイン酸分子が含まれる。
【０１４２】
また、好ましいヌクレイン酸分子の場合、上記隣接ヌクレオチド配列は、クローン配列の５’ヌクレオチド位置あたりのヌクレオチドから、クローン配列の３’ヌクレオチド位置あたりのヌクレオチドまでの位置範囲において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２のヌクレオチド配列内に存在する。
【０１４３】
また、好ましいヌクレイン酸分子の場合、上記隣接ヌクレオチド配列は、スタートコドンの５’ヌクレオチド位置あたりのヌクレオチドから、ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１−６２に対し規定されるクローン配列の３’ヌクレオチド位置あたりのヌクレオチドまでの位置範囲において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２のヌクレオチド配列内に存在する。
【０１４４】
同様に、好ましいヌクレイン酸分子の場合、上記隣接ヌクレオチド配列は、シグナル・ペプチドの第一アミノ酸の５’ヌクレオチド位置あたりのヌクレオチドから、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２に対し規定されるクローン配列の３’ヌクレオチド位置あたりのヌクレオチドまでの位置範囲において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２のヌクレオチド配列内に存在する。
【０１４５】
また、好ましい遊離ヌクレイン酸分子の場合、少なくとも９５％において、ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２内の隣接する少なくとも１５０個以上のヌクレオチドの配列と同一のヌクレオチド配列から構成される。
【０１４６】
さらに、好ましい遊離ヌクレイン酸分子の場合、少なくとも９５％において、ヌクレオチド配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２内の隣接する少なくとも５００個以上のヌクレオチドの配列と同一のヌクレオチド配列から構成される。
【０１４７】
さらに好ましい実施態様は、少なくとも９５％において、シグナル・ペプチドの第一アミノ酸の５’ヌクレオチド位置あたりのヌクレオチドから、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２に対し規定されるクローン配列の３’ヌクレオチド位置あたりのヌクレオチドまでの、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列から構成されるヌクレイン酸分子である。
【０１４８】
さらに好ましい実施態様は、少なくとも９５％において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２の完全ヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列から構成される遊離ヌクレイン酸分子である。
【０１４９】
また、ヌクレイン酸分子への厳しい交雑条件下において交雑が行われる遊離ヌクレイン酸分子が好ましいが、交雑を行う上記ヌクレイン酸分子は、Ａ残基のみまたはＴ残基のみから構成されるヌクレオチド配列を有するヌクレイン酸分子に厳しい交雑条件下において交雑されないことを特徴とする。
【０１５０】
さらに好ましい実施態様として、生物学的サンプル内に存在する、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から構成されるグループから選択される配列内における少なくとも５０個の隣接するヌクレオチドの配列に少なくとも９５％において同一のヌクレオチド配列から構成されるヌクレイン酸分子を検出する方法があり、この方法は、前記サンプル内における少なくとも一つのヌクレイン酸分子を有するヌクレオチド配列と、前記グループから選択される配列とを比較し、前記サンプル内における前記ヌクレイン酸分子が少なくとも９５％において前記選択配列と同一であるかを決定する工程から構成される。
【０１５１】
また上記の方法について、好ましくは、前記配列比較工程には、前記サンプル内におけるヌクレイン酸分子と、前記グループから選択される前記配列から構成されるヌクレイン酸分子間におけるヌクレイン酸交雑程度を決定する工程が含まれる。同様に、また上記方法について、好ましくは、前記配列比較工程は、上記サンプル内におけるヌクレイン酸分子から決定されるヌクレオチド配列と、前記グループから選択される前記配列とを比較することで実行され、ヌクレイン酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子から構成し得るものである。
【０１５２】
さらに好ましい実施態様として、生物学的サンプルの種、組織または細胞形式を識別するための方法があり、この方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から構成されるグループから選択される配列内において少なくとも５０個の隣接するヌクレオチドの配列と少なくとも９５％において同一のヌクレオチド配列から構成されるヌクレイン酸分子が、前記サンプル内に存在する場合、その分子を検出する工程から構成される。  また、好ましくは、被験者に内在する、遺伝子の異常構造または異常表現に付随する病理学的状態を診断する方法があり、この方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２ヌクレオチド配列から構成されるグループから選択される配列内において少なくとも５０個の隣接するヌクレオチドの配列と少なくとも９５％において同一のヌクレオチド配列から構成されるヌクレイン酸分子が、上記被験者から入手される生物学的サンプル内に存在する場合、その分子を検出す工程から構成される。
【０１５３】
病理学的状態を診断するための方法は、少なくとも２本のヌクレオチド配列を有するパネル内にあるヌクレオチド配列から構成されるヌクレイン酸分子を検出する工程から構成され、ここでは、前記パネル内の一本の配列は、前記グループから選択される配列内にある少なくとも５０個の隣接するヌクレオチドの配列と少なくとも９５％において同一である。
【０１５４】
また好ましくは、遊離ヌクレイン酸分子から構成される組成が重要であり、前記ヌクレイン酸分子のヌクレオチド配列は、少なくとも２本のヌクレオチド配列を有するパネルから構成され、前記パネル内の少なくとも一本配列は、ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：１−６２ヌクレオチド配列から構成されるグループから選択される配列内において少なくとも５０個の隣接するヌクレオチドの配列と少なくとも９５％において同一であり、ヌクレイン酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子から構成し得るものである。
【０１５５】
また、好ましくは、遊離ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から書き換えられるアミノ酸配列内の少なくとも約１０個の隣接するアミノ酸の配列と少なくとも９０％において同一のアミノ酸配列から構成される。
【０１５６】
また、好ましいポリペプチドは、前記の隣接するアミノ酸の配列が、分泌蛋白質の第一アミノ酸位置あたりの残基から転写解読枠の第一アミノ酸あたりの残基までの位置範囲において、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から書き換えられるアミノ酸配列内の酸内に含まれる。
【０１５７】
また、好ましくは、遊離ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から書き換えられるアミノ酸配列内の少なくとも約３０個の隣接するアミノ酸の配列に少なくとも９５％において同一のアミノ酸配列から構成される。
【０１５８】
さらに好ましくは、遊離ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から書き換えられるアミノ酸配列内の少なくとも約１００個の隣接するアミノ酸の配列に少なくとも９５％において同一のアミノ酸配列から構成される。
【０１５９】
さらに好ましくは、遊離ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から書き換えられるアミノ酸配列内の酸に少なくとも９５％において同一のアミノ酸配列から構成される。
【０１６０】
さらに好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から書き換えられるアミノ酸配列から構成されるグループから選択される配列内の少なくとも１０個の隣接するアミノ酸の配列に少なくとも９０％において同一のアミノ酸配列から構成されるポリペプチドを生物学的サンプルから検出する方法であり、この方法は、前記サンプル内に１個以上のポリペプチド分子を有するアミノ酸配列と、前記グループから選択される配列とを比較し、前記サンプル内の前記ポリペプチド分子を有する配列、が少なくとも９０％において、１０個以上の隣接するアミノ酸を有する前記配列と同一であるかを決定する工程から構成される。
【０１６１】
また、好ましくは、上記の方法において、前記サンプル内に１個以上のポリペプチド分子を有するアミノ酸配列と、前記グループから選択される配列とを比較する工程が、前記サンプル内のポリペプチドの、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から書き換えられるアミノ酸配列から構成されるグループから選択される配列内の１０個以上の隣接するアミノ酸の配列に少なくとも９０％において同一のアミノ酸配列から構成されるポリペプチドと特に結合する抗体に対する固有結合範囲を決定する工程から構成される。
【０１６２】
また、好ましくは、上記の方法において、前記配列比較工程が前記サンプル内のポリペプチド分子から決定されるアミノ酸配列と、前記グループから選択される前記配列とを比較することにより実行される。
【０１６３】
また、好ましくは、生物学的サンプルの種、組織または細胞形式を識別するための方法があり、この方法は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から書き換えられるアミノ酸配列から構成されるグループから選択される配列内の１０個以上の隣接するヌクレオチドの配列と少なくとも９０％において同一のアミノ酸配列から構成されるポリペプチド分子が、前記サンプル内に存在する場合、その分子を検出する工程から構成される。
【０１６４】
また好ましくは、上記の、生物学的サンプルの種、組織または細胞形式を識別するための方法は、少なくとも２本のアミノ酸配列を有するパネル内にあるアミノ酸配列から構成されるポリペプチド分子を検出する工程から構成され、ここでは、前記パネル内の少なくとも一本の配列は、前記グループから選択される配列内の１０個以上の隣接するヌクレオチドの配列と少なくとも９０％において同一である。
【０１６５】
また、好ましくは、被験者に内在する、遺伝子の異常構造または異常表現に付随する病理学的状態を診断する方法があり、この方法は、前記被験者から入手される生物学的サンプル内に存在する、少なくとも２本のアミノ酸配列を有するパネル内にあるアミノ酸配列から構成されるポリペプチド分子を検出する工程から構成され、ここでは、前記パネル内の少なくとも一本の配列は、ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１−６２から書き換えられるアミノ酸配列から構成されるグループから選択される配列内の１０個以上の隣接するヌクレオチドの配列と少なくとも９０％において同一である。
【０１６６】
これらの方法の何れにおいても、前記ポリペプチド分子の検出工程では、抗体の使用が含まれる。
また、好ましくは、ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列に少なくとも９５％において同一のヌクレオチド配列から構成される遊離ヌクレイン酸分子であり、ここでは、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から書き換えられるアミノ酸配列から構成されるグループから選択される配列内の１０個以上の隣接するヌクレオチドの配列と少なくとも９０％において同一であるアミノ酸配列から構成される。
【０１６７】
また、好ましくは、遊離ヌクレイン酸分子であり、ここでは、前記のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列が、原核生物宿主内の前記ポリペプチドの表現に対し最適化されている。
【０１６８】
また、好ましくは、遊離ヌクレイン酸分子であり、ここでは、前記ヌクレオチド配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から書き換えられるアミノ酸配列から構成されるグループから選択される配列から構成されるポリペプチドのコード化を行う。
【０１６９】
さらに好ましくは、上記遊離ヌクレイン酸分子のいずれかをベクター内に挿入する構成の、組換えベクター生成方法がある。また、この方法により作り出される組換えベクターも好ましい。また、好ましくは、ベクターを宿主細胞に導入する構成の、組換え宿主細胞生成方法があり、この方法により生成される組換え宿主細胞が好ましい。
【０１７０】
また、好ましくは、前記ポリペプチドが表現される条件下においてこの組換え宿主細胞を培養し、前記ポリペプチドを回復させる構成の、遊離ポリペプチド生成方法がある。また、好ましくは、この遊離ポリペプチド生成方法において、前記組換え宿主細胞が真核細胞であり、前記ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２から書き換えられるアミノ酸配列から構成されるグループから選択される配列から構成されるヒトが分泌する蛋白質の分泌部である。この方法により作り出される遊離ポリペプチドも、また、好ましい。
【０１７１】
また、好ましくは、分泌蛋白質の活動レベルを強化する必要のある個人を治療する方法であり、この方法は、このような個人に、遊離ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、または前記個人における前記蛋白質活動レベルを強化するのに有効な、請求を行う本発明による抗体のある量から構成される製薬剤を投与する構成となる。
【０１７２】
当発明を総括的に説明してきたが、以下に示される、但しこれらに制限されることない例証を参照することにより、さらに容易に理解されることになる。
実施例１：インビボＤＳＳ処理により調整されるポリヌクレオチドの識別および特性付け
大腸炎を誘発するため、ＤＳＳ（ＭＷ  ４０，０００）を飲料水に溶解し、７日間にわたり、任意値にマウスに与え、その後ＤＳＳ水を普通の飲料水と取り替えることにより、マウスの個別系統において、ＤＳＳ大腸炎に対する異なる感受性が立証される。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに急性大腸炎を誘発させるためには、３％ＤＳＳで十分であり、ＢＡＬＢ／ｃマウスに急性大腸炎を誘発させるためには、５％ＤＳＳが必要である。
【０１７３】
本研究の目的において、腸のサンプルは、３％ＤＳＳを使って処置が行われたＣ５７ＢＬ／６マウス群から採取された。組織は、０日目、４日目、８日目または１２日目に採取したが、この日程は、回復に抗して腸の損傷を完全に誘発するための日程取りとした。
【０１７４】
腸組織に対する損傷は、ＩＢＤの顕著な特徴であり、ＤＳＳ誘発大腸炎マウスモデルは、腸組織に損傷を起こしており、それ自体、ＩＢＤの研究においてより有益なモデルのうちの一つである。
【０１７５】
マウスは、上述のように、飲み水にＤＳＳを混ぜる方法により処置が行われた。ＤＳＳ処置中の様々な時点において、マウス群は、解剖により腸が取り出された。解剖により取り出された新鮮な腸組織は、直ちに、ＧＴ緩衝液（４．５Ｍグアニジニウム・イソチオシアン酸塩、５０ｍＭクエン酸塩ナトリウム、０．５％ｗ／ｖサルコシルナトリウム、２％２−ベータメルカプトエタノール）に入れられ、均質化が行われた。均質溶解物は、短くスピンさせ、ＣｓＣｌ勾配に層状に積重ねる前に、大きめの砕片を取り除いた。ＲＮＡは、従来法により抽出し、その後ＴＯＧＡ分析において使用した。
ＤＳＳ誘発大腸炎の特徴
４日目から、マウスの体重の減少が明白になる。腸の組織分析により、上皮細胞および杯状細胞の損失により識別される初期寄せ集め病変の存在が明らかになる。８日目までに体重の減少はかなり深刻になり（約２０％の減少）、マウスは瀕死状態を呈する。組織学的に、腸の上皮は、この段階で、ほとんど、全体として破壊され、大きな混合炎症細胞の基底膜および粘膜下組織への浸潤が認められる。炎症細胞の浸潤は、主に、Ｔ細胞、Ｂ細胞および顆粒球から構成されるように思われる。１２日目までに、マウスが回復するため、体重の増加が明らかであり、この最後の段階において、地下回復および上皮再生により、修復工程の開始について、組織学的に証拠立てられる。
【０１７６】
遊離ＲＮＡは、Ｊ・Ｇサトクリフ他、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　２０００、２月２９日、９７（５）、１９７６〜１９８１、国際公開出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／２３６５５、米国特許第５，４５９，０３７号、同第５，８０７，６８０号、同第６，０３０，７８４号で述べられる、これにより参照により本書に組み入れる、ＴＯＧＡ（全遺伝子発現分析）として知られるｍＲＮＡの同時配列特定識別法を用いて、分析を行った。好ましくは、ＴＯＧＡ法またはその他の方法を応用する前に、遊離ＲＮＡは、当分野で既知の方法により開始ポリＡ含有ｍＲＮＡ固体群を形成するために濃縮が行われた。このような好ましい実施態様では、ＴＯＧＡ法は、さらに、４個の５’プライマーのうちの一つと、相補的なアンチセンスＲＮＡ（「ｃＲＮＡ」）個体群から作製されるｃＤＮＡテンプレートを用いて実施される追加複製連鎖反応（「ＰＣＲ」）から構成される。使用可能な２５６個の５’ＰＣＲプライマーおよび３ＰＣＲプライマーのうちの一つを用いるＰＣＲ最終段階において、ＰＣＲ生成物として、開始ｍＲＮＡ個体群の３’領域に対応するｃＤＮＡ断片が生成され、生成されたＰＣＲは、次に、ａ）５’の７つ以上の塩基対を有する配列、好ましくは全断片を有する配列により、またｂ）断片長さにより識別を行った。これらの二つのパラメータ、すなわち配列と断片長さは、取得されたＰＣＲ生成物と既知のポリヌクレオチド配列のデータベースとの比較において使用した。
【０１７７】
当方法により、デジタル配列タグ（ＤＳＴ）、すなわち、ｍＲＮＡの３末端の発現配列タグであるポリヌクレオチドをもたらす。ＤＳＳ処置後の相対レベルにおいて変化が見られたＤＳＴを、今後の研究のために選択し、標識付けされたＰＣＲ生成物のレーザ誘発蛍光強度を、処置後の異なる時間間隔において分離されたサンプルにおいて比較した。
【０１７８】
一般に、二本鎖ｃＤＮＡは、逆転写を始動するための４８個すべての５’ビオチン化アンカープライマー一式から構成される等モル混合物を用いて、関連する組織サンプルから抽出するポリ（Ａ）濃縮細胞質ＲＮＡから作られる。このような妥当な一式とは、Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３）であり、個々では、Ｖは、Ａ、ＣまたはＧであり、Ｎは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴである。４８個のアンカープライマーから構成されるこの混合物の一部員により、サンプル内の各ｍＲＮＡ種の全コピーの３末端である固定位置において合成が開始されるため、各種の３終末点が画定され、結果的にビオチン化された二本鎖ｃＤＮＡになる。
【０１７９】
各ビオチン化された二本鎖ｃＤＮＡサンプルは、ＣＣＧＧ配列を認識する制限エンドヌクレアーゼＭｓｐＩにより、割れ目を作った。ｃＤＮＡの３断片は、次に、ストレプトアビジンがコーティングされている基質上において、ビオチン化されたｃＤＮＡ断片を捕獲することにより分離した。妥当なストレプトアビジン塗装基質には、マイクロタイタープレート、ＰＣＲチューブ、ポリスチレンビーズ、常磁性ポリマービーズおよび常磁性多孔ガラス粒子が含まれる。好ましいストレプトアビジン塗装基質は、常磁性ポリマービーズの懸濁液である（ニューヨーク州レイクサクセスのダイナル社）。
【０１８０】
ストレプトアビジン塗装基質および捕獲ストレプトアビジンｃＤＮＡ断片を洗浄した後で、アンカープライマー内であるが、まれにｃＤＮＡのｍＲＮＡ誘導部内の８ヌクレオチド配列部に割れ目がつけられているＮｏｔＩを用いて、消化により、ｃＤＮＡ断片生成物を解き開き、各ｍＲＮＡ種に対して均一の長さである３’ＭｓｐＩ−ＮｏｔＩ断片を、ベクターＴ３プロモーターに関するアンチセンス配向において、ＣｌａＩ−、ＮｏｔＩ−き裂プラスミドｐＢＣ  ＳＫ＋（カリフォルニア州ラホーヤのストラタジーン社）と、大腸菌ＳＵＲＥ細胞を変形させるために使用される生成物（ストラタジーン）内に、指向的に、縛り付けた。この結紮により、ＮｏｔＩ部位が再生されるが、ＭｓｐＩ部位は再生されない。各ライブラリには、濃度が０．００１％以上の全ｍＲＮＡの３末端が多様に表現される可能性を高めるために、５ｘ１０５回以上の組換え行われた。プラスミド準備処置（キアゲン社）は、研究中の各サンプルのｃＤＮＡライブラリから行った。
【０１８１】
各ライブラリの約数は、３’のｃＤＮＡ挿入部およびその側面に位置する配列を離れながら、親ベクター内の幾つかの部位における裂け目により線形化に影響を及ぼすＭｓｐＩにより消化された。生成物は、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ（アンビオン社製のメガスクリプトキット）を用いて培養することにより、元々のｃＤＮＡからＭｓｐＩおよびＮｏｔＩ部位に隣接する既知のベクター配列を有するクローン挿入部のアンチセンスｃＲＮＡを生成した。
【０１８２】
この段階において、各ｃＲＮＡ調整は、３段階方式において行われた。最初のステップでは、５’のＲＴプライマー（Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）を用いて、２５９ｎｇのｃＲＮＡを第一鎖ｃＤＮＡに変換した。第二ステップでは、４００  ｐｇのｃＤＮＡ生成物を、それぞれ「万能」３’ ＰＣＲプライマーＧ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）と組み合される、Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５）形式の４つの５’のプライマーの各々との別個の４種類の反応におけるＰＣＲテンプレートとして使用した。
【０１８３】
３番目のステップにおいて、格差部プールにおける生成物を、さらに、各々１０ｎｇのフルオレセイン化「万能」３’ ＰＣＲプライマー、６−ＦＡＭに結合するオリゴヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ならびにＣ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７）形式の適切な５’ ＰＣＲプライマーを用い、人工的なミスプライミングを最小限に抑え、忠実度の高いコピーを促進するために、各５’ ＰＣＲプライマーのＴｍより僅かに高い温度Ｘにおいてアニーリングを行う工程が含まれるプログラムを使って、二番目のＰＣＲ反応に対し、６４個のサブサブプール（２０μｌ中２ｎｇ）に分割した。各ポリメラーゼ連鎖反応工程は、ＴａｑＳｔａｒｔ抗体（クロンテック社）の面前で行われた。
【０１８４】
各組織サンプルにおける最後のポリメラーゼ連鎖反応工程から生成される生成物は、自動化ＡＢＩ  Ｐｒｉｚｍ  ３７７シーケンサを使って、一連の変性ＤＮＡ配列決定ゲル上において分析し、ＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェアパッケージ（ＡＢＩ社）を使って、データの収集を行い、増幅および移動を行うために標準化を行った。この一連の反応を完全に実行することにより、最初のＰＣＲ反応における５’ ＰＣＲプライマーにより確立される４つのプールのそれぞれに対し６４個の生成物サブプールが作られ、２番目のＰＣＲ反応の全５’ ＰＣＲプライマーセットについては、合計で２５６個の生成物サブプールが作られた。
【０１８５】
上記で説明したＤＳＳ処置後の各時点において採取したｍＲＮＡサンプルの分析を行った。表１は、ｃＤＮＡから決定される４１４個のｍＲＮＡの発現レベルの概要である。これらのｃＤＮＡ分子は、そのデジタルアドレス、すなわち、分子の長さとカップリングされる部分５’終点ヌクレオチド配列とともに、処置後の異なる時間間隔において生成される分子の相対量により識別され、５’終点部分ヌクレオチド配列は、ＭｓｐＩを認識するための認識部位と、最後のＰＣＲ工程で使用される５’ ＰＣＲプライマーの解析塩基を有するヌクレオチド配列とにより決定される。断片のデジタルアドレス長さは、鎖曲線上の補間により決定したが、それ自体、配列決定により決定される実際の長さに対し、±１〜２ｂ．ｐ．の間で変化し得る。
【０１８６】
例えば、表１に記入のある、デジタルアドレスＭｓｐＩ  ＡＧＴＧ２４４により識別されるＤＮＡ分子の記述において、さらに、ＣＧＧＡＧＴＧ形式の、デジタルアドレス長さが２４４  ｂ．ｐ．の５’終点部分ヌクレオチド配列を有しているとして特徴付けられる。ＭｓＰＩ  ＡＧＴＧ２４４として識別されるＤＮＡ分子については、さらに、０日目、４日目および８日目において増加するレベルで発現することが分かり、１２日目では緩やかに下降している。但し、本処置では、０日目に見られる比較的高いレベルから４日目と８日目には減退するが、１２日目には増加するＭｓｐＩ  ＡＧＴＡ１８７発現パターンとは異なるパターンとなっている。
【０１８７】
同様に、表１においてそのＭｓｐＩデジタルアドレスにより識別される他の４１２ＤＮＡ分子は、さらに、ＤＳＳ処置終了後の０日目、４日目、８日目および１２日目における遺伝子発現レベルのパターンにより特徴付けられる。数多くの分離クローンについて、表２および表３で特徴づけを行っているが、そのヌクレオチド配列は、下記の配列リストにおけるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１−６２として規定される。
【０１８８】
図１で示されるデータは、５’終点において６−カルボキシフルオレセイン（ＡＢＩ社製６ＦＡＭ）により標識付けされる「万能」３’プライマー（ＳＥＱＩＤ  ＮＯ：６６）と組み合わされる５’ ＰＣＲプライマー（Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）により作成した。ＰＣＲ反応生成物は、４．５％アクリルアミドゲル上においてゲル電気泳動により溶解し、ＡＢＩ３７７により取得した蛍光データにより、シーケンサの自動化を行った。またデータ分析は、ＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェア（パーキン・エルメア社）を使って行った。
【０１８９】
パーシング塩基ＣＧＣＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８）を用いる５’ ＰＣＲプライマーを使ったＴＯＧＡ分析結果を、図１に示すが、ここでは、ＤＳＳを用いる７日間のコース終了後の０日目（図１Ａ）、４日目（図１Ｂ）、８日目（図１Ｃ）または１２日目（図１Ｄ）のマウスから分離した腸から（上下パネル）抽出したｍＲＮＡから生成されるＰＣＲ生成物を示す、パーシング塩基ＣＧＣＧを用いる５’ ＰＣＲプライマーを使ったＴＯＧＡ分析について述べられている。縦方向の指標線は、０日目に現れ、４日目には減少し、８日目には大きく増加し、１２日目にはその発現は総体的に減少するが、それでも上昇傾向を示す約４５８ｂ．ｐ．のＰＣＲ生成物を示している。
【０１９０】
区別的に提供されている幾つかの生成物は、その生成物が、ＧｅｎＢａｎｋから抽出したデータとの比較に基づき、新規性が示唆された位置において移動しているように思われた。これらの場合、ＰＣＲ生成物は、分離し、ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社）内にクローン化し、両方の鎖上において配列を決定した。下記の表４に、その例を示す。分離されたクローンが同じピークのものであることを立証するために、基質として最初のＰＣＲ反応において生成されたｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲを行った。例えば、上記で開示される４５８  ｂ．ｐ．生成物の場合、オリゴヌクレオチドは、万能３’ ＰＣＲプライマーと、３末端において延在する、クローン配列３’からパーシング塩基（この場合ＣＧＣＧ）に追加されるヌクレオチドを有する、第二ＰＣＲ工程における５’ ＰＣＲプライマーに相当する５’ ＰＣＲプライマーとを使って合成した。この延在５’プライマーの配列は、ＧＡＴＣＧＡＡＴＣＣＧＧＣＧＣＧＣＡＣＧＧＧＧＡＣＣＡＧＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）であった。
【０１９１】
当生成物は、電気泳動により分離し、クローンの長さを、図２で示される原初ＰＣＲ生成物の長さと比較した。図２Ａでは、上記で述べられるように誘導されたＰＣＲ生成物の長さ（ピークい値としての）を示す。図２Ｂでは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６の原初ＰＣＲプライマーを用いて生成したＰＣＲ生成物を示す（図１Ａと比較する）。図２Ｃでは、上部および中央パネルからの痕跡が重ね描きされており、分離クローンの配列を用いたＰＣＲ生成物の長さは、原初ＰＣＲ性セ物の長さと同じであることが立証される。
【０１９２】
同じ手順を使用して、データベース内のデータとの一致性について検証を行った。下記の図４に、その結果を示す。各事例において、オリゴヌクレオチドは、万能３’ ＰＣＲプライマーと、３末端において延在する、識別され一致するＧｅｎＢａｎｋ配列における終端ＭｓｐＩ部位に近接する配列から追加されるヌクレオチドを有する、第二ＰＣＲ工程における５’ ＰＣＲプライマーに相当する５’ ＰＣＲプライマーとを使って合成した。３つの事例において（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のＩＭＸ２−３３と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１のＩＭＸ２−３４と、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２のＩＭＸ２−７０）、列挙されるＤＳＴ配列が、ＧｅｎＢａｎｋの検証済みデータベース一致配列から取得された。
【０１９３】
図３は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のＩＭＸ２−４６クローンのノーザンブロット分析結果をグラフで表したものであり、４つの実験サンプル（処置後０日目、４日目、８日目または１２日目）から抽出されたポリＡ濃縮ｍＲＮＡ含有アガロースゲルとサイズ標準を、電気泳動後にブロットし、放射性同位元素を使って識別されるＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のＩＭＸ  ２−４６を用いて精査し、ホスフォイメージャーを使って造影し、定量化を行った。１．６ｋｂ写しの相対発現レベルを示す定量結果は、０日目が６４、４日目が５３、８日目が２２３、１２日目が２６９であった。ゲル上に搬入されるＲＮＡの量は、シクロフィリン（「シク」）に対し精査により決定した。
【０１９４】
【表１】
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【０１９５】
【表１】
2004500028.tif 000003
【０１９６】
【表１】
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【０１９７】
【表１】
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【０１９８】
【表１】
2004500028.tif 000006
【０１９９】
【表１】
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【０２００】
【表１】
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【０２０１】
【表１】
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【０２０２】
【表１】
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【０２０３】
【表２】
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【０２０４】
【表２】
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【０２０５】
ＥＳＴ＝エクスプレスト・シークエンス・タグ；
ＮＡ＝ノット・アプリカブル；
Ｒ＝リバース・トランスクリプターゼ−・ポリメラーゼ・チェーン反応；
Ｎ＝ノーザンブロット分析；
＊相対ＤＳＴ量＝ノーザンブロット分析の相対ＤＳＴ量は、バックグランドに対して補正し、そしてシクロフィリンのハイブリダイゼーションシグナルに対して基準化した。数値はノーザンブロットをホスホールイメージングスクリーンに暴露して得、ホスホールイメージャーＳＩを用いて定量化した。
【０２０６】
【表３】
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【０２０７】
【表３】
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【０２０８】
【表３】
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【０２０９】
【表４】
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【０２１０】
【表４】
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【０２１１】
ＥＳＴ＝エクスプレスト・シークエンス・タグ
【０２１２】
【表５】
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【０２１３】
実施例２
ＲＴ−ＰＣＲバリデーション
クローン化したＤＳＴのＲＴ−ＰＣＲバリデーションを実施し、結果を表２に示す。テンプレートの開始量を、所定のクローン化したＤＳＴの増幅の直線範囲を正確に定義するために作成した対照曲線に基づいて選択した。ＴＯＧＡＴＭパネルからクローン化したピークの強度に基づいて、以下の量のテンプレートを選択した。
ＴＯＧＡピーク強度　　低［ｃＤＮＡ］　　　高［ｃＤＮＡ］
０−４００　　　　　　２０００ｐｇ　　　　　５０００ｐｇ
３００−１０００　　　　４００ｐｇ　　　　　２０００ｐｇ
＞１０００　　　　　　　　５０ｐｇ　　　　　　２５０ｐｇ
クローン化したＤＳＴのバリデーションで用いたＰＣＲプライマーを表５に列挙する。最も強いＴＯＧＡＴＭ信号を示すタイムポイントサンプルから選択した適当な低濃度及び高濃度のｃＤＮＡテンプレートを用いて、重複反応混合物をアセンブルした。反応混合物を、２３、２６、２９、３２、３５及び３８のサイクルで反復した。重複反応から得た増幅産物を定量化し、サイクル数に対してプロット化して、標準曲線を作成した。これらデータから、様々なタイムポイント全体のＰＴ−ＰＣＲバリデーションのために、増幅の直線範囲内で許容可能なレベルのＰＣＲ産物を産生したサイクル数とｃＤＮＡ濃度を選択した。
【０２１４】
ＲＴ−ＰＣＲバリデーションは、定義したサイクル数で反復される選択的な濃度のｃＤＮＡを用いて三重複反応をアセンブルする工程からなる。例えば、表２でＩＭＸ２−５５（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）のデータは、５０ｐｇのｃＤＮＡテンプレートと２９サイクルを用いて得られた。同じ条件下で内部対照プライマー対も増幅を行って、ｃＤＮＡテンプレート間の相違を正規化するための根拠を求めた。
【０２１５】
実施例３
蛍光分析を用いたＲＴ−ＰＣＲ解析
２つのＤＳＴを代替プロトコルを用いてバリデーションした。ＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーを表５に列挙する。検証した各ＤＳＴについて、予備実験から得た結果に基づいた対応するセットのプライマー（表５を参照）について、最適なアニーリング温度と試薬の条件を決定した。８回の個別の反応において、プライマーの濃度、ｄＮＴＰの濃度、ＭｇＣｌ２の濃度、及びＴａｑポリメラーゼの４つのパラメータを調整して、各プライマーのセットを検定して最適な条件を見つけた。一旦最適な条件が決定されば、各ＤＳＴを、通常テンプレートの少なくとも４つの希釈が含まれる重複の複数同時反応と、テンプレートのない対照反応、サイクル数の６連続データ点で行った。
【０２１６】
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＴａｑＳｔａｒｔ抗体システム（カタログ番号５４００−１）で「温態開始」ＰＣＲを用いて反応を行った。各反応にはテンプレートとして１μｌのｃＤＮＡライブラリー希釈、決定した量のＡｍｐｌｉＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（カタログ番号８０８−０１５６）、ＭｇＣｌ２、ｄＮＴＰ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ  カタログ番号１０２９７−０１８）、プライマー、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＴａｑＳｔａｒｔ抗体を、１０％Ｔａｑ緩衝剤（ＭｇＣｌ２含まず）を用いた２０μｌの反応量に入れた。典型的には、テンプレート以外すべての成分を含有するマスターミックスを調製して、アリコートした。次に様々なテンプレートをこれらマスターミックスのサンプルに添加し、さらに個々の反応管に２０μｌの量を調合した。ＰＣＲの実行中、サイクルの「窓」を超える標的ＤＳＴの発現を定量化するために、予め決めたスケジュールに従って次々に管を除去した。増幅後、サンプルを蛍光分析で定量化した。
【０２１７】
ＰＣＲは、次のプログラムに従って各プライマー対の最低溶解温度よりも約５度高いアニーリング温度で実施した。１）摂氏９５度、３分、２）摂氏９５度、３０秒、３）ＴＭ＋摂氏５度、３０秒、４）摂氏７２度、１６ｂｐ／秒で標的の長さに従った時間、５）２〜４の工程を３３サイクル以上繰り返す、６）摂氏７２度、３分、７）摂氏１４度、繰返し。
【０２１８】
温度循環した後、９６ウェルのＣｏｓｔｅｒ  ＵＶマイクロタイタープレート（Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号０７−２００６２３）でＴＥ  ｐＨ７．５の１４０μｌの１：２８０の希釈のＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号ｐ−１１４９５（１０×１００ミクロンｌ）に、２μｌのＰＣＲ反応を加えた。このサンプルを１．５分間ゆっくりと混合して、１５分間暗所で室温で平衡状態にさせた。ＰＣＲ産物の濃度を、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＣｙｔｏＦｌｕｏｒシリーズ４０００マルチウェルプレートリーダーを用いた蛍光分析により定量化した。
【０２１９】
バックグランド蛍光を、テンプレート以外のすべての反応成分で反復した重複対照サンプルを用いて決定した。これら重複バックグランド対照サンプルからの平均値を、分析結果前の対応する実験値から減じた。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ検定の感度は、これら測定で使用したような蛍光マイクロプレートリーダーを用いて２５０ｐｇ／ｍｌ（２００μｌの検定量中に５０ｐｇ  ｄｓＤＮＡ）と報告されている。
【０２２０】
１：２０００のライブラリーの希釈について定量化したＩＭＸ２−４８のＲＴ−ＰＣＲの結果を、図４（任意蛍光単位で）と表６（各タイムポイントで対照値に正規化した）に示す。１：５００のライブラリーの希釈について定量化したＩＭＸ２−７４のＲＴ−ＰＣＲの結果を、図５（任意蛍光単位で）と表６（各タイムポイントで対照値に正規化した）に示す。
【０２２１】
【表６】
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【０２２２】
【表７】
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【０２２３】
【表７】
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【０２２４】
実施例４
ＩＭＸ２−４の伸長配列クローン
Ｅｄｇｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＣｌｏｎｅｃａｐｔｕｒｅ手順を用いて、Ｄ４／Ｄ８  ＤＳＳ結腸ライブラリーからクローンを分離した。ライブラリーは、Ｉｍｍｕｎｅｘ社用のＥｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより、ＤＳＳ治療したＣ５７ＢＬ／６マウスのＤ４及びＤ８の炎症性結腸から分離したＲＮＡから構成した。クローンはＥｄｇｅベクターｐＥＡＫ１２にある。
【０２２５】
ＩＭＸ２−０４  ＤＳＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は塩基６８８から９５７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）までＩＭＸ２−０４の伸長配列と対応している（上記表７を参照）。部分的に遺伝子産物をコード化できる塩基１で始まるオープンリーディングフレームがある。コード化された部分的な蛋白のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２９に与えられる。
【０２２６】
伸長配列をＮＣＢＩ  ｎｒデータベースｗ／ＢＬＡＳＴと比較したとき、塩基１−９３６のヌクレオチド配列の直線セグメントが、ヒト染色体１９、ＡＣ００７５６５．１から得たコスミドクローンのヌクレオチド配列のセグメントと約７０％同一であることを示した（上記表７を参照）。このことは、ヒトのＩＭＸ２−４の相同体は、少なくとも部分的には、コスミドで発見されるということを表す。しかし、コスミドで予測されるいくつかのエキソン（ＧＲＡＩＬプログラム又はマウスＥＳＴへのある程度の相同性により）はＩＭＸ２−４−Ｅ１０．ｓｅｑの直線配列によりスキップされる。スキップされるエキソンを除いて予測されるものが、ＤＥＲＷＥＮＴデータベースで完全な対応が見られる現実であると思われる。Ｄｅｒｗｅｎｔ登録は、コスミドで発見されないアミノ酸配列を含む１個のペプチドであるＤｅｒｗｅｎｔ蛋白登録（又はヌクレオチドＤｅｒｗｅｎｔ登録）に蛋白のフラグメントをもつ「分泌性」分子のためである。しかし、Ｄｅｒｗｅｎｔヌクレオチド登録も、７５％の同一レベルでＩＭＸ２−４−Ｅ１０．ｓｅｑの５末端との対応を示すコスミドのさらに別の５セグメントとの対応ももつ。これら様式が分泌性蛋白の様々なスプライス変異体を表すことがある。
【０２２７】
実施例５
ＩＭＸ２−３６の伸長配列クローン
ＩＭＸ２−３６．ＥＸＴ配列情報を、ＩＭＡＧＥコンソーシアムから入手したＦＶＢ／Ｎマウスの最も近い結腸由来のＥＳＴクローンであるクローンＩＭＸ２−３６ｐＴ７Ｔ３−２．ｓｅｑから導いた。ＥＳＴの登録番号はＡＡ５２９８５０で、クローンＩＤはＩＭＡＧＥ：９２１６０８である。ＥＳＴはｐＴ７Ｔ３ベクターにある。ＩＭＸ２−３６  ＤＳＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）は、塩基２９３から４２７までＩＭＸ２−３６．ＥＸＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）の伸長配列に対応する（上記表７を参照）。ＥＳＴをＧｅｎＢａｎｋで検索すると、「マウスＫＡＲ（キラー活性受容体）」と「ＤＡＰ１２蛋白」にヒットする（上記表７を参照）。
実施例６
ＩＭＸ２−４３の伸長配列クローン
Ｅｄｇｅ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＣｌｏｎｅｃａｐｔｕｒｅ手順を用いて、クローンをＤ４／Ｄ８  ＤＳＳ結腸ライブラリーから分離した。ライブラリーは、Ｉｍｍｕｎｅｘ社用のＥｄｇｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓにより、ＤＳＳ治療したＣ５７ＢＬ／６マウスからプールされるＤ４及びＤ８炎症性結腸から分離したＲＮＡから構成した。クローンはＥｄｇｅベクターｐＥＡＫ１２にある。ＩＭＸ２−４３  ＤＳＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）は、塩基１０７９から１２９８までＩＭＸ２−４３伸長配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）に対応する（上記表７を参照）。
【０２２８】
実施例７
ＩＭＸ２−４６の伸長配列クローン
ＩＭＸ２−４６．ＥＸＴ配列情報を、ＩＭＡＧＥコンソーシアムから入手したｐＴ７Ｔ３ベクターのＥＳＴクローンであるＩＭＸ２−４６ｐＴ７Ｔ３−６．ｓｅｑとＩＭＸ２−４６ｐＴ７Ｔ３−７．ｓｅｑの２つのクローンから導いた。ＩＭＸ２−４６ｐＴ７Ｔ３−６．ｓｅｑ  （登録番号ＡＡ２９０１９４、クローンＩＤ  ＩＭＡＧＥ：７５０８４７）はＣ５７ＢＬ／６マウスのリンパ節由来であった。ＩＭＸ２−４６ｐＴ７Ｔ３−７．ｓｅｑ  （登録番号ＡＡ１７４９６８、クローンＩＤ  ＩＭＡＧＥ：６１７７１７）はＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓由来であった。ＩＭＸ２−４６  ＤＳＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）は、塩基１５７から５６１までＩＭＸ２−４６．ＥＸＴの伸長配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）と並んでいる（上記表７を参照）。
【０２２９】
ＥＳＴを  ＧｅｎＢａｎｋで検索すると、ヒトＴＯＳＯ：ｆａｓ誘導アポトーシスの調節因子にヒットする（上記表７を参照）。
実施例８
ＩＭＸ２−５５の伸長配列クローン
ＩＭＸ２−５５．ＥＸＴ伸張配列情報を、ＩＭＡＧＥコンソーシアムから入手したＥＳＴクローンであるＩＭＸ２−５５ｐＴ７Ｔ３−８．ｓｅｑとＩＭＸ２−５５ｐＴ７Ｔ３−２４．ｓｅｑの２つの結腸から導いた。ＩＭＸ２−５５ｐＴ７Ｔ３−８．ｓｅｑ  （登録番号ＡＡ８２３５７３、クローンＩＤ  ＩＭＡＧＥ：１０７９１８９）はＦＶＢ照射したマウスの結腸由来であった。ＩＭＸ２−５５ｐＴ７Ｔ３−２４．ｓｅｑ  （登録番号ＡＡ６９０３７２、クローンＩＤ  ＩＭＡＧＥ：１１６４６９２）はＦＶＢマウスの最も近い結腸由来であった。
【０２３０】
ＩＭＸ２−５５ｐＴ７Ｔ３−８．ｓｅｑのＥＳＴの登録番号はＡＡ８２３５７３で、クローンＩＤはＩＭＡＧＥ：１０７９１８９である。ＩＭＸ２−５５ｐＴ７Ｔ３−２４．ｓｅｑのＥＳＴの登録番号はＡＡ６９０３７２で、クローンＩＤはＩＭＡＧＥ：１１６４６９２である。両ＥＳＴともにｐＴ７Ｔ３ベクターにあり、ＩＭＡＧＥコンソーシアムから入手した。ＩＭＸ２−５５ｐＴ７Ｔ３−８．ｓｅｑクローンはＦＶＢ照射したマウスの結腸由来であり、ＩＭＸ２−５５ｐＴ７Ｔ３−２４．ｓｅｑクローンはＦＶＢマウスの最も近い結腸由来であった。ＩＭＸ２−５５  ＤＳＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）は、３２２から７４４までの塩基を伸長配列ＩＭＸ２−５５．ＥＸＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）と並んでいる（上記表７を参照）。
【０２３１】
伸長したＩＭＸ２−５５配列をＧｅｎＢａｎｋで検索すると、Ｃ反応性蛋白に相同性をもつＥＳＴが明らかになる。
実施例９
ＩＭＸ２−５７の伸長配列クローン
ＰＣＲプライマーを、市販されていない２つのＥＳＴクローンの配列から得た配列情報に基づいたＩＭＸ２−５７のためにデザインした。由来する配列情報に用いるＥＳＴクローンは、（１）マウスの肝臓由来の登録番号ＡＡ２４０１７７でクローンＩＤ  ＩＭＡＧＥ：６７９２６４であるＥＳＴと、（２）Ｃ５７ＢＬ／６脾臓由来の登録番号ＡＶ００５２２７でクローンＩＤが０９１０００１Ｇ０８であるＥＳＴであった。
【０２３２】
用いるプライマーはＤＳＴとＥＳＴ  ＡＶ００５２２７を電子的にアセンブルすることから得た配列を伸長したフォワードプライマーＩＭＸ２−５７−ＦＰとリバースプライマーＩＭＸ２−５７−ＲＰであった。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの結腸から調製したＲＮＡ由来のｃＤＮＡで、ＰＣＲ反応を実施した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭベクターにクローン化して、クローンＩＭＸ２−５７ＰＣＲ１を得た。ＩＭＸ２−５７  ＤＳＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）は、伸長配列ＩＭＸ２−５７．ＥＸＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）の塩基２８３から４０８までと並んでいる（上記表７を参照）。
【０２３３】
アセンブルされたＥＳＴをＧｅｎＢａｎｋで検索すると、「ヒトキモトリプシン様（ＣＴＲＬ）ｍＲＮＡ」と「ヒトプロテオゾーム様サブユニット（ＭＥＣＬ−１）、キモトリプシン様プロテアーゼ（ＣＴＲＬ−１）及びプロテイン−セリンキナーゼ（ＰＳＫ−Ｈ１）の最後のエキソンにヒットする（上記表７を参照）。
【０２３４】
実施例１０
ＩＭＸ２−６１の伸長配列クローン
ＩＭＸ２−６１伸長配列情報を、ＩＭＡＧＥコンソーシアムから入手したＥＳＴクローンである、ＥＳＴクローンＩＭＸ２−６１ｐＢＳ−４７．ｓｅｑから導いた。ＩＭＸ２−６１ｐＢＳ−４７．ｓｅｑのＥＳＴの登録番号はＡＡ９８１０９２で、クローンＩＤはＩＭＡＧＥ：１２７９２８７である。ＩＭＸ２−６１ｐＢＳ−４７．ｓｅｑクローンはＷＥＨＩ３マウスの大食細胞由来であった。ＩＭＸ２−６１  ＤＳＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）は、ＩＭＸ２−６１伸長配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）の塩基２０４から４２５まで並んでいる（上記表７を参照）。
【０２３５】
実施例１１
ＩＭＸ２−１７の伸長配列クローン
陰窩ｄｕｃｔｉｎアルファスカベンジャー受容体（ＣＲＰ−ｄｕｃｔｉｎ）
ＴＯＧＡ分析で、ＩＭＸ２−１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）はハツカネズミのＣＲＰ−ｄｕｃｔｉｎ−アルファｍＲＮＡ、登録番号Ｕ３７４３８に対応することが分かった（表３）。ＣＲＰ−ｄｕｃｔｉｎは、小腸の陰窩細胞の先端部分に局在する。結腸では、主に表面の上皮細胞（ＥＣ）に見られる。また、ＥＣの内膵管と大きな肝管の先端部分にも見られる。ＣＲＰ−ｄｕｃｔｉｎ−アルファ配列は、多くの反復からなる短い細胞質領域、膜貫通領域、及び大きな細胞外領域をもつモザイク蛋白を予測する。細胞外領域には、蛋白のＣ末端半分の２１潜在Ｎ糖化部位を含む。また細胞質ドメインにも２つの潜在リン酸化部位がある。
フォワードプライマーｍＣＲＰ．５１７９−ＦＰとリバースプライマーｍＣＲＰ．６１０６−ＲＰを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６結腸から分離したＲＮＡ由来のｃＤＮＡテンプレートから得た９３６ｂｐの産物をＰＣＲした。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭベクターにサブクローン化して、ノザンブロット分析のプローブとして使用する前に配列を検証した。
【０２３６】
図６には、クローンＩＭＸ２−１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のノザンブロット分析の結果を表しているが、ここでは実験サンプルのポリＡ豊富なｍＲＮＡを含み標準サイズのアガロースゲルを電気泳動後にブロット化し、Ｕ３７４３８塩基５１７９−６１０６に対応する標識プローブで精査し、ホスフォイメージャーを用いて撮像して、定量化した。図６Ａには、治療から０、４、８又は１２日後のＤＳＳ大腸炎のＣ５７ＢＬ／６マウス、治療から０、６、３０又は７２時間後のαＣＤ３回腸炎のＣ５７ＢＬ／６マウスから得た結果と、ＦＶＢ、大腸炎のないｍｄｒノックアウトマウス、大腸炎のあるｍｄｒノックアウトマウスそれぞれの大腸からのサンプルを示す。図６Ｂには、治療後０、４、８又は１２日後のＤＳＳ大腸炎のＢａｌｂ／ｃマウス、０％、５％及び８％ＤＳＳで治療したＢａｌｂ／ｃマウス、治療後０、６、３０又は７２時間後のαＣＤ３回腸炎のＢａｌｂ／ｃマウスから得た結果を示す。ＩＭＸ２−１７  ＣＲＰ−ｄｕｃｔｉｎの予測転写サイズは６．６Ｋｂである。本研究で分かった実際の転写サイズは約６．５Ｋｂであった。
【０２３７】
ＩＢＤのいくつかのモデルから得たｍＲＮＡサンプルにノザンブロットを行った。ＤＳＳ大腸炎があるＣ５７ＢＬ／６マウスから得たサンプルの分析では、最初のＴＯＧＡ分析の結果（表１）と一致して、大腸で高レベルの構成的な発現を示し、８日でＤＳＳ大腸炎は最大となった（図６Ａ）。ＤＳＳ大腸炎のあるＢａｌｂ／ｃマウスから得たサンプルの分析は類似の結果を示した（図６Ｂ）。
【０２３８】
αＣＤ３回腸炎をもつＣ５７ＢＬ／６マウスから得たサンプルの分析では、小腸で低レベルの構成的な発現を示し、早期に炎症は増大し（図６Ａ）、６時間後に最大に達した後、低下している。αＣＤ３回腸炎をもつＢａｌｂ／ｃマウスから得たサンプルの分析では、強度は低かったが、類似の結果を示した（図６Ｂ）。
【０２３９】
構成的な発現が、ＦＶＢ大腸のサンプルで見られた（図６Ａ）。大腸炎の徴候のない健康なｍｄｒノックアウトマウスでの発現は多く、活性大腸炎をもつｍｄｒノックアウトマウスでの発現はほとんど増加しなかった（図６Ａ）。
【０２４０】
図６のノザンブロットで示された発現を定量化して、各列でＧ３ＰＤＨの量に
正規化した。正規化した結果を以下の表８に示す。
【０２４１】
【表８】
2004500028.tif 000022
【０２４２】
実施例１２
ＩＭＸ２−２２の伸長配列クローン
ＩＭＸ２−２２の造血幹細胞キナーゼＨＰＫ１
ＴＯＧＡ分析では、ＩＭＸ２−２２は、セリン／スレオニンキナーゼのハツカネズミのｍＲＮＡ、登録番号Ｙ０９０１０に対応することが分かった（表３）。ＨＰＫ１はＳＡＰＫ／ＪＮＫ経路を活性化する造血プロテインキナーゼである。
フォワードプライマーｍＨＰＫ１．１６４０−ＦＰとリバースプライマーｍＨＰＫ１．２４２０−ＲＰを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６結腸から分離したＲＮＡ由来のｃＤＮＡテンプレートから得た７８０ｂｐの産物をＰＣＲした。ＰＣＲ産物をｐＧＥＮにサブクローン化して、ノザンブロット分析のプローブとして使用する前に配列検証した。ＩＭＸ２−２２ＨＰＫ１の予測転写サイズは２．７Ｋｂで、公表されている転写サイズは２．８Ｋｂと３．６Ｋｂである。本研究で分かった実際の転写サイズは２．８Ｋｂであった。
【０２４３】
図７には、クローンＩＭＸ２−２２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のノザンブロット分析の結果を表す。ここでは、実験サンプルとサイズ標準から得たポリＡ豊富なｍＲＮＡを含むアガロースゲルを電気泳動後ブロット化し、Ｙ０９０１０の塩基１６４０から２４２０に対応する標識プローブとして精査し、ｐｈｏｓｐｈｒｉｍａｇｅｒを使用して撮像して定量化した。図７Ａには、治療から０、４、８又は１２日後のＤＳＳ大腸炎のＣ５７ＢＬ／６マウス、治療から０、６、３０又は７２時間後のαＣＤ３回腸炎のＣ５７ＢＬ／６マウスからの結果と、大腸炎のないＦＶＢ、ｍｄｒノックアウトマウス、大腸炎のあるｍｄｒノックアウトマウス、及びＣ５７ＢＬ／６の脾臓から得た大腸からのサンプルを示す。図７Ｂには、治療から０、４、８又は１２日後のＤＳＳ大腸炎のＢａｌｂ／ｃマウス、治療から０、６、３０又は７２時間後のαＣＤ３回腸炎のＢａｌｂ／ｃマウスからの結果と、Ｃ５７ＢＬ／６の正常なリンパ組織のサンプル（ＭＬＭ、ＰＰ、脾臓、及び胸腺）を示す。
【０２４４】
ＩＢＤのいくつかのモデルから得たｍＲＮＡサンプルにノザンブロットを実施した。ＤＳＳ大腸炎のあるＣ５７ＢＬ／６マウスから得たサンプルを分析すると、最初のＴＯＧＡ分析の結果（表１）とほとんど一致せず、大腸で低レベルの構成的な発現を示し、ＤＳＳ大腸炎は１２日目に最大となることが分かった（図７Ａ）。ＤＳＳ大腸炎のあるＢａｌｂ／ｃから得たサンプルを分析すると、８日目に最大となって、類似の結果を示した（図７Ｂ）。
【０２４５】
αＣＤ３回腸炎のあるＣ５７ＢＬ／６マウスから得たサンプルを分析すると、小腸で構成的な発現を示したが、６時間で低下した（図７Ａ）。αＣＤ３回腸炎のあるＢａｌｂ／ｃマウスから得たサンプルを分析すると類似の結果を示した（図７Ｂ）。
【０２４６】
対応するＴＯＧＡ分析ではほとんど変化がなかったのに対し（データは図示せず）、活性大腸炎をもつｍｄｒノックアウトマウスでの発現は増加した（図７Ａ）。
【０２４７】
ＭＬＮ、ＰＰ、胸腺のリンパ組織、特に脾臓では、強力な発現が見られた（図７Ａ＆Ｂ）。
図７のノザンブロットで示された発現を定量化して、各列のＧ３ＰＤＨの量に正規化した。正規化した結果を以下の表９に示す。
【０２４８】
【表９】
2004500028.tif 000023
【０２４９】
実施例１３
ＩＭＸ２−２８の伸長配列クローン
ダウンレギュレーションしたアデノーマ蛋白（ＤＲＡ）
ＴＯＧＡ分析では、ＩＭＸ２−２８がハツカネズミのダウンレギュレーションしたアデノーマ蛋白、登録番号ＡＦ１３６７５１に対応することが分かった（表３）。
【０２５０】
フォワードプライマーＤｒａ．１５５１−ＦＰとリバースプライマーＤｒａ．２３９０−ＲＰを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６クローンから分離したＲＮＡ由来のｃＤＮＡテンプレートから得た８４０ｂｐの産物をＰＣＲした。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭにベクターにサブクローンして、ノザンブロット分析のプローブとして使用する前に配列を検証した。ＩＭＸ２−２８  ＤＲＡの予測転写サイズは２．６Ｋｂである。本研究で分かった実際の転写サイズは約３Ｋｂであった。
【０２５１】
図８には、クローンＩＭＸ２−２８、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のノザンブロット分析の結果を表す。ここでは、実験サンプルとサイズ標準から得たポリＡ豊富なｍＲＮＡを含むアガロースゲルを電気泳動後にブロット化し、ＡＦ１３６７５１の塩基１５５１から２３９０に対応する標識プローブを精査して、ホスフォイメージャーを用いて撮像して定量化した。図８Ａには、治療から０、４、８又は１２日後のＤＳＳ大腸炎のＣ５７ＢＬ／６マウス、治療から０、６、３０又は７２時間後のαＣＤ３回腸炎のＣ５７ＢＬ／６マウスからの結果と、ＦＶＢ、大腸炎のないｍｄｒノックアウトマウス、大腸炎のあるｍｄｒノックアウトマウスから得た大腸からのサンプルを示す。図８Ｂには、治療から０、４、８又は１２日後のＤＳＳ大腸炎のＢａｌｂ／ｃマウス、０％、５％及び８％ＤＳＳで治療したＢａｌｂ／ｃマウス、及び治療から０、６、３０又は７２時間後のαＣＤ３回腸炎のＢａｌｂ／ｃマウスからの結果を示す。
【０２５２】
ＩＢＤのいくつかのモデルから得たｍＲＮＡサンプルにノザンブロットを実施した。ＤＳＳ大腸炎のあるＣ５７ＢＬ／６マウスから得たサンプルを分析すると、最初のＴＯＧＡ分析の結果（表１）と一致して、大腸で高レベルの構成的な発現を示したが、炎症とともに低下して、ＤＳＳ大腸炎は８日目に最低となることが分かった（図８Ａ）。ＤＳＳ大腸炎のあるＢａｌｂ／ｃマウスから得たサンプルを分析すると、同じパターンを示した（図８Ｂ）。
【０２５３】
αＣＤ３回腸炎のあるＣ５７ＢＬ／６マウスから得たサンプルを分析すると、ＤＳＳ大腸炎について大腸で見られたものよりも、小腸で構成的な発現のレベルは低いことが分かった。６時間までに炎症とともに発現は急速に低下し、その後低いままであった（図８Ａ）。αＣＤ３回腸炎のあるＢａｌｂ／ｃマウスから得たサンプルを分析すると同じパターンを示した（図８Ｂ）。このモデルのＴＯＧＡ分析（データは図示せず）では、対応するピークは示さなかった。
【０２５４】
ＦＶＢ大腸のサンプルで構成的な発現が見られた（図８Ａ）。大腸炎の徴候のない健康なｍｄｒノックアウトマウスでは構成的な発現が見られず、活性大腸炎のあるｍｄｒノックアウトマウスでは発現が劇的に低下した（図８Ａ）。このモデルのＴＯＧＡ分析（データは図示せず）では、対応するピークを示さなかった。
【０２５５】
図８のノザンブロットで示された発現を定量化して、各列のＧ３ＰＤＨの量に正規化した。正規化した結果を以下の表１０に示す。
【０２５６】
【表１０】
2004500028.tif 000024
【０２５７】
実施例１４
ＩＭＸ２−３３の伸長配列クローン
分泌性白血球プロテアーゼ抑制因子（ＳＬＰＴ）
ＴＯＧＡ分析では、ＩＭＸ２−３３がハツカネズミの分泌性白血球プロテアーゼ抑制因子、登録番号Ｕ７３００４に対応することが分かった（表３）。分泌性白血球プロテアーゼ抑制因子は、白血球セリンプロテアーゼの上皮細胞と大食細胞由来の抑制因子である。ＳＬＰＩの発現はガンマ−ＩＦＮにより抑制され、ＳＬＰＩはＬＰＳ反応を抑制する働きをするＬＰＳ誘導のガンマ−ＩＦＮ抑制可能な食細胞産物である。
【０２５８】
フォワードプライマーｍＳＬＰＩ．４４７−ＦＰとリバースプライマーｍＳＬＰＩ．８００−ＲＰを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６クローンから分離したＲＮＡ由来のｃＤＮＡテンプレートから得た３５０ｂｐの産物をＰＣＲした。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭベクターにサブクローンして、ノザンブロット分析のプローブとして使用する前に配列を検証した。用いるブローブはＵ７３００４の塩基４４７から８００に対応する。ＩＭＸ２−３３  ＳＬＰＩの予測転写サイズは１．１Ｋｂである。本研究で分かった実際の転写サイズは１．１Ｋｂであった。
【０２５９】
図９には、クローンＩＭＸ２−３３、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１のノザンブロット分析の結果を表し、ここでは、実験サンプルとサイズ標準から得たポリＡ豊富なｍＲＮＡを含むアガロースゲルを電気泳動後にブロット化し、精査して、ホスフォイメージャーを用いて撮像して定量化した。図９Ａには、治療から０、４、８又は１２日後のＤＳＳ大腸炎のＣ５７ＢＬ／６マウス、治療から０、６、３０又は７２時間後のαＣＤ３回腸炎のＣ５７ＢＬ／６マウスからの結果と、ＦＶＢ、大腸炎のないｍｄｒノックアウトマウス、大腸炎のあるｍｄｒノックアウトマウスの大腸から得たサンプルを示す。図９Ｂには、治療から０、４、８又は１２日後のＤＳＳ大腸炎のＢａｌｂ／ｃマウス、０％、５％及び８％ＤＳＳで治療したＢａｌｂ／ｃマウス、及びαＣＤ３回腸炎のＢａｌｂ／ｃマウス（０、６、３０又は７２時間後）のからの結果を示す。
【０２６０】
ＩＢＤのいくつかのモデルから得たｍＲＮＡサンプルにノザンブロットを実施した。ＤＳＳ大腸炎のあるＣ５７ＢＬ／６マウスから得たサンプルを分析すると、最初のＴＯＧＡ分析の結果（表１）と一致して、大腸で最小限の構成的な発現を示したが、炎症とともに著しく増加して、ＤＳＳ大腸炎は８日後には最大となり、１２日後にはさらに高くなることが分かった（図９Ａ）。ＤＳＳ大腸炎のあるＢａｌｂ／ｃマウスから得たサンプルを分析すると、同じパターンを示した（図９Ｂ）。
【０２６１】
αＣＤ３回腸炎のあるＣ５７ＢＬ／６マウスから得たサンプルを分析すると、ＤＳＳ大腸炎について大腸で見られたほどの調整はなく、小腸で低レベルから中レベルの構成的な発現を示した。３０時間後に炎症が最大となるとともに顕著な増加が見られたが、その後低下した（図９Ａ）。αＣＤ３回腸炎のあるＢａｌｂ／ｃマウスから得たサンプルを分析すると同じパターンを示した（図９Ｂ）。このパターンは、このモデルのＴＯＧＡ分析で見られたもの（データは図示せず）と一致した。
【０２６２】
大腸炎の徴候のない健康なｍｄｒノックアウトマウスでは最低限の構成的な発現が見られ、活性大腸炎のあるｍｄｒノックアウトマウスでは発現が増加した（図９Ａ）。このパターンは、このモデルのＴＯＧＡ分析で見られるもの（データは図示せず）と一致した。
【０２６３】
図９のノザンブロットで示された発現を定量化して、各列のＧ３ＰＤＨの量に正規化した。正規化した結果を以下の表１１に示す。
【０２６４】
【表１１】
2004500028.tif 000025
【０２６５】
実施例１５
ＩＭＸ２−４８の伸長配列クローン
ＩＭＸ２−４８の大食細胞の炎症性蛋白２（ＭＩＰ２）
ＴＯＧＡ分析では、ＩＭＸ２−４８がハツカネズミの大食細胞の炎症性蛋白２、登録番号Ｘ５３７９８に対応することが分かった（表３）。
【０２６６】
フォワードプライマーＭＩＰ２．６１−ＦＰとリバースプライマーＭＩＰ２．３４５−ＲＰを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６結腸から分離したＲＮＡ由来のｃＤＮＡテンプレートから得た２８４ｂｐの産物をＰＣＲした。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭベクターにサブクローンして、配列を検証した。ＩＭＸ２−４８  ＭＩＰ２の予測転写サイズは１．１Ｋｂである。
【０２６７】
本発明のこれら及びその他の特徴、側面、及び利点は以下の説明、添付の請求、及び以下の図面を参照することによりより良く理解されよう：
【図面の簡単な説明】
【図１】第１図は、未処置のマウス達（第１Ａ図、“０日後”）から分離したコロンから抽出されたｍＲＮＡ、４日間のＤＳＳを受けるマウス達（第１Ｂ図、“４日後”）から分離したコロンから抽出されたｍＲＮＡ、８日間のＤＳＳを受けるマウス達（第１Ｃ図、“８日後”）から分離したコロンから抽出されたｍＲＮＡ、及び１２日間のＤＳＳを受けるマウス達（第１Ｄ図、“１２日後”）から分離したコロンから抽出されたｍＲＮＡから生成されたＰＣＲ産物を示す、構文解析ベース（ｐａｒｓｉｎｇ  ｂａｓｅｓ）ＣＧＣＧで５’ ＰＣＲプライマーを使用したＴＯＧＡ分析（総遺伝子発現分析）の結果の図解であり、ここで垂直インデックス・ラインは最大８日間で到達するＤＳＳ処置により上昇調節される約４５８  ｂ．ｐ．のＰＣＲ産物を示し、縦座標は蛍光強度の任意の単位また横座標はヌクレオチドでのＰＣＲ産物の長さである。
【図２】第２図は第１図に示した４５８  ｂ．ｐ．  ＰＣＲ産物のより詳細な分析の図解であり；第２Ａ図は文章中に説明されているような延長５’プライマーを使用して得られたＰＣＲ産物を示し；第２Ｂ図は元々のＰＣＲプライマーを使用して得られたＰＣＲ産物を示し、また第２Ｃ図では分離され配列されたクローンのＰＣＲ産物が元々のＰＣＲ産物と同じ長さであることを示すように第２Ａ図と第２Ｂ図からのトレースがオーバーレイされており、ここで縦座標は蛍光強度の任意の単位また横座標はヌクレオチドでのＰＣＲ産物の長さである。
【図３】第３図は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０、クローンＩＭＸ  ２−４６のノーザン・ブロット分析結果の図解であり、この場合４つの実験試料（０、４、８又は１２日間ＤＳＳ処置）からのポリＡ濃縮されたｍＲＮＡならびにサイズ標準を含むアガロース・ゲルが電気泳動後にブロットされまたＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１０、放射標識付けしたＩＭＸ  ２−４６で精査され、燐光撮像装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を使用して撮像してから定量される。１．６  ｋｂ転写の相対的発現レベルを示す定量結果は：０日後６４、４日後５３、８日後２２３及び１２日後２６９であった。ゲル上に負荷されたＲＮＡ量はｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ（“ｃｙｃ”）についての精査により決定された。
【図４】第４図はクローンＩＭＸ２−４８のＲＴ−ＰＣＲの結果の図解である。
【図５】第５図はクローンＩＭＸ２−７４のＲＴ−ＰＣＲの結果の図解である。
【図６】第６図はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、クローンＩＭＸ  ２−１７のノーザン・ブロット分析結果の図解であり、この場合、実験試料からのポリＡ濃縮されたｍＲＮＡとサイズ標準を含むアガロース・ゲルは電気泳動後にブロットされ、精査され、燐光撮像装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）で撮像されてから定量される。第６Ａ図は処置から０、４、８及び１２日後のＤＳＳ大腸炎のＣ５７ＢＬ／６マウス達、処置後０、６、３０又は７２時間後のαＣＤ３回腸炎のＣ５７ＢＬ／６マウス達、ならびにＦＶＢからの大腸からの試料、大腸炎なしのｍｄｒノックアウト・マウス達及び大腸炎をもつｍｄｒノックアウト・マウス達からの結果を示す。第６Ｂ図は処置から０、４、８又は１２日後のＤＳＳ大腸炎のＢａｌｂ／ｃマウス達、０％、５％及び８％ＤＳＳで処置されたＢａｌｂ／ｃマウス達、及び処置から０、６、３０又は７２時間後のαＣＤ３回腸炎のＢａｌｂ／ｃマウス達からの結果を示す。ＩＭＸ２−１７  ＣＲＰ−ｄｕｃｔｉｎについての予想転写サイズは６．６  Ｋｂ、本研究で見出された実際の転写サイズは約６．５  Ｋｂであった。
【図７】第７図はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、クローンＩＭＸ２−２２のノザーン・ブロット分析結果の図解であり、この場合、実験試料からのポリＡ濃縮されたｍＲＮＡとサイズ標準を含むアガロース・ゲルが電気泳動後にブロットされ、精査され、燐光撮像装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を使用して撮像されてから定量される。第７Ａ図は処置から０、４、８又は１２日後のＤＳＳ大腸炎のＣ５７ＢＬ／６マウス達、処置後０、６、３０又は７２時間後のαＣＤ３回腸炎のＣ５７ＢＬ／６マウス達、ならびにＦＶＢからの大腸からの試料、大腸炎なしのｍｄｒノックアウト・マウス達、大腸炎のあるｍｄｒノックアウト・マウス達及びＣ５７ＢＬ／６膵臓からの結果を示す。第７Ｂ図は処置から０、４、８又は１２日後のＤＳＳ大腸炎のあるＢａｌｂ／ｃマウス達、処置から０、６、３０又は７２時間後のαＣＤ３回腸炎のあるＢａｌｂ／ｃマウス達、及びＣ５７ＢＬ／６の正常なリンパ球様組織試料（ＭＬＭ、ＰＰ、膵臓及び胸腺）からの結果を示す。ＩＭＸ２−２２  ＨＰＫ１についての予想転写サイズは２．７  Ｋｂ、本研究で見出された実際の転写サイズは約２．８  Ｋｂであった。
【図８】第８図はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、クローンＩＭＸ２−２８のノザーン・ブロット分析結果の図解であり、この場合、実験試料からのポリＡ濃縮されたｍＲＮＡとサイズ標準を含むアガロース・ゲルが電気泳動後にブロットされ、精査され、燐光撮像装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を使用して撮像されてから定量される。第８Ａ図は処置から０、４、８又は１２日後のＤＳＳ大腸炎のＣ５７ＢＬ／６マウス達、処置から０、６、３０又は７２時間後のαＣＤ３回腸炎のあるＣ５７ＢＬ／６マウス達、ならびにＦＶＢからの大腸からの試料、大腸炎なしのｍｄｒノックアウト・マウス達、大腸炎のあるｍｄｒノックアウト・マウス達からの結果を示す。第８Ｂ図は処置から０、４、８又は１２日後のＤＳＳ大腸炎のあるＢａｌｂ／ｃマウス達、０％、５％及び８％ＤＳＳ処置されたＢａｌｂ／ｃマウス達、及び処置から０、６、３０又は７２時間後のαＣＤ３回腸炎のあるＢａｌｂ／ｃマウス達からの結果を示す。ＩＭＸ２−２８  ＤＲＡについての予想転写サイズは２．６  Ｋｂ；本研究で見出された実際の転写サイズは約３  Ｋｂであった。
【図９】第９図はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、クローンＩＭＸ２−３３のノザーン・ブロット分析結果の図解であり、この場合、実験試料からのポリＡ濃縮されたｍＲＮＡとサイズ標準を含むアガロース・ゲルが電気泳動後にブロットされ、精査され、燐光撮像装置（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）を使用して撮像されてから定量される。第９Ａ図は処置から０、４、８又は１２日後のＤＳＳ大腸炎のＣ５７ＢＬ／６マウス達、処置から０、６、３０又は７２時間後のαＣＤ３回腸炎のあるＣ５７ＢＬ／６マウス達、ならびにＦＶＢからの大腸からの試料、大腸炎なしのｍｄｒノックアウト・マウス達、大腸炎のあるｍｄｒノックアウト・マウス達からの結果を示す。第９Ｂ図は処置から０、４、８又は１２日後のＤＳＳ大腸炎のあるＢａｌｂ／ｃマウス達、０％、５％及び８％ＤＳＳ処置されたＢａｌｂ／ｃマウス達、及び処置から０、６、３０又は７２時間後のαＣＤ３回腸炎のあるＢａｌｂ／ｃマウス達からの結果を示す。ＩＭＸ２−３３  ＳＬＰＩについての予想転写サイズは１．１  Ｋｂ；本研究で見出された実際の転写サイズは約１．１  Ｋｂであった。
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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