(57)【要約】１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物を含有する乳牛のための飼料。ビタミンＤ化合物は、規定食のリンの改良された利用を起こし、そして雌牛の規定食中の無機リンの補充的量の必要性を排除することができる。特に、乳牛の牛乳生産は、低Ｐ規定食を給餌した場合でさえ比較的高い収率を維持することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳牛に、約０．３重量％又はそれより少ない無機リン補充物を含有する飼料を給餌し；そして
前記飼料と共に、有効な量の１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物を、雌牛の腸におけるリンの取り込みを増加させるために給餌すること；
の段階を含んでなる、低リン規定食を給餌された乳牛の牛乳の生産を維持する方法。
【請求項２】
前記１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物が、前記飼料のトップドレッシング（ｔｏｐ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ）として給餌される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記有効な量の１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物が、約０．１μｇ／ｋｇないし約１００μｇ／ｋｇ規定食、を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記飼料が、０重量％の無機リン補充物を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物が、以下の一般構造：
【化１】
2004520063.tif 000010
によって特徴付けられ、ここで、Ｘ１は、水素又はヒドロキシ保護基であることができ、Ｘ２は、ヒドロキシ、又は保護されたヒドロキシであることができ、Ｘ３は、水素又はメチルであることができ、Ｘ４及びＸ５は、それぞれ水素を表すか又はいっしょに選択されて、Ｘ４及びＸ５がメチレン基を表し、そしてここでＺは、Ｙ、−ＯＹ、−ＣＨ２ＯＹ、−Ｃ≡ＣＹ及び−ＣＨ＝ＣＨＹから選択され、ここで二重結合は、ｃｉｓ又はｔｒａｎｓ立体化学配置を有することができ、そしてここでＹは、水素、メチル、−ＣＲ５Ｏ及び以下の式：
【化２】
2004520063.tif 000011
の構造のラジカルから選択され、ここでｍ及びｎは、独立に０ないし５の整数を表し、ここでＲ１は、水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、及び直鎖又は分枝鎖であることができ、そして所望によりヒドロキシ又は保護されたヒドロキシ置換基を保有するＣ１−５−アルキルから選択され、そしてここでそれぞれのＲ２、Ｒ３及びＲ４は、独立に水素、フルオロ、トロフルオロメチル、及び直鎖又は分枝鎖であることができ、そして所望によりヒドロキシ又は保護されたヒドロキシ置換基を保有するＣ１−５アルキルから選択され、そしてここでＲ１及びＲ２は、いっしょに選択されて、オキソ基、或いはアルキリデン基、＝ＣＲ２Ｒ３又は−（ＣＨ２）ｐ−基を表し、ここでｐは、２ないし５の整数であり、そしてここでＲ３及びＲ４は、いっしょに選択されて、オキソ基、又は−（ＣＨ２）ｑ−基を表し、ここでｑは、２ないし５の整数であり、そしてここでＲ５は、水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、又はＣ１−５アルキルを表す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ビタミンＤ化合物が、１α−ヒドロキシビタミンＤ３である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ビタミンＤ化合物が、１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
動物は、骨及び歯の形成、リン脂質（細胞膜構造）、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ）合成、ＡＴＰ及び他の高エネルギーＰ化合物の合成、並びに適切な酸／塩基バランスのためにリン（Ｐ）を必要とする。特に、乳汁を分泌する乳牛は、充分な牛乳の産出を維持するためにその規定食中に充分なＰを必要とする。
【背景技術】
【０００２】
植物性食料及び飼料中に存在するＰの８０％までは、本明細書中で以下フィチン酸塩と呼ばれる、フィチン酸（ミオイノシトール六リン酸）の錯体として存在する。フィチン酸塩は、構造的に以下の式：
【０００３】
【化１】
2004520063.tif 000002
【０００４】
によって例示することができる。フィチン酸塩中のＰは、ヒトを含む単純胃の動物にはたいてい利用不可能であり、そして従って、これは、ＧＩ管を通過し、そして糞中で排出される。ブタ及び家禽の栄養においては、動物の最低のＰ要求量に合致するために１．５−２．０％の無機リン酸塩源を補充することによる規定食の処方が源泉である。
【０００５】
補充的な無機Ｐは、三つ：リン酸二カルシウム（１８．５％Ｐ）、リン酸一カルシウム（２１．５％Ｐ）又は二フッ化リン酸（１８．０％Ｐ）の飼料級の形態の一つによって動物の規定食に与えられる。これらの産物の組み合わせた合計の市場は、米国、カナダ、メキシコ、西欧及び日本において年間６７５百万ドルと推定される。南米、東欧、アジア、アフリカ、中国、インド、及び東南アジア（ここでは、市場データを得ることが困難である）を含めた場合、飼料級リン酸塩の合計の市場が、年間１０億ドルを超えることを容易に予想することができる。従って、補充的無機Ｐは、動物の規定食中の比較的高価な成分である。Ｐが、エネルギー及びタンパク質に次ぐ３番目に最も高価な規定食成分であることがしばしば言われている。結果として、その減少及び／又は排除は、経費の観点から好ましいものである。好ましくは、補充的量又は無機Ｐの必要性におけるこの減少は、動物の飼料中に本来存在する有機Ｐの利用を増加することによって達成されるべきである。然しながら、乳牛において、このような無機Ｐの減少を、牛乳の産出を犠牲にして行うことはできない。
【０００６】
規定食の無機Ｐを減少することは、更に肥料のＰ含有率をも減少するものである。動物性肥料、並びにヒトの廃棄物は、一般的に農業用地に散布され、ここでＰの一部は、表面の流去水に、そして次いで池、小川、河、湖、そして大洋に入る。水中の多すぎるＰは、藻類の増殖を刺激し、そして藻類は相当な酸素を取り込む。これは、海洋生物から、これらが成長し、生殖し、そして繁栄するために必要な酸素を奪う。欧州及びアジアの多くの部分において、Ｐ汚染は、このような問題となり、そして厳しい財務上の罰金の形態の刑罰が、多すぎるＰ保持肥料を土壌に散布した家畜製造業者に課せられることへの関心となっている。多くの米国の土壌は、“Ｐ飽和”として記載され、従って土壌浸出液及び表面流去水中のＰのより大きい濃度となっている。チェサピーク湾のような地域の高Ｐの水の浸出液は、過剰の藻類の増殖及び湾の水中の魚類の死の増加のために非難されている（Ｗａｒｄ，１９９３）。欧州において、飼料工業グループＦＥＦＡＮＡは、“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ”と題するポジションペーパーを１９８１年に発行した。このグループは、家畜製造からの肥料中のＰが、３０％減少されるべきであることを提案している（Ｗａｒｄ，１９９３）。欧州の土壌に適用することができるＰの制限は、Ｓｃｈｗａｒｚ（１９９４）によって検討されている。従って、動物性廃棄物産物のＰ含有率を減少するものである方法及び／又は飼料組成物を提供することが好ましい。
【０００７】
正常な規定食の状況下で、規定食に加えられたコレカルシフェロール（ビタミンＤ３）は、胃腸（ＧＩ）管から吸収され、そして血液によって肝臓に運搬され、ここで肝臓の酵素２５−ヒドロキシラーゼが、この化合物に作用して、２５−ＯＨＤ３の形成を起こす。この化合物は、コレカルシフェロールの正常な血液代謝産物である。２５−ＯＨＤ３の小部分は、腎臓中で１−α位において更なるヒドロキシル化の段階を受け、カルシウム指向ホルモン１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３の合成を起こす。
【０００８】
Ｅｄｗａｒｄの米国特許第５，３６６，７３６号は、ブタ及びトリのような単胃動物において、化合物１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３が、フィチン酸塩に結合したＰからのＰの利用を改良することにおいて有効であることを示し、そしてＢｉｅｈｌ等（１９９５）は、Ｅｄｗａｒｄの結果を確認した。更に両方の研究は、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３が、規定食のフィチン酸錯体からＰを放出することにおいて微生物のフィチン酸塩と付加的に働くことを示した。然しながら、両方の参考文献とも、無機Ｐへの影響又は可能性のある乳汁を分泌する乳牛への影響について検討していない。１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３は、その効果を、二つの方法：（ａ）１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３化合物は、腸内フィターゼ又はフィチン酸塩を加水分解するホスファターゼの活性を増加する可能性があること（Ｐｉｌｅｇｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｍａｄｄａｉａｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９６４）及び（ｂ）１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３化合物が、リン酸塩の運搬を刺激し（Ｔａｎｋａ  ａｎｄ  ＤｅＬｕｃａ，１９７４）、ＧＩ管からＰを血漿へ、そして従って骨への運搬を促進することが知られていること、によって発揮する可能性があるように見受けられる。
【０００９】
植物性食料及び飼料（例えば、穀類穀粒及びマメ）中のフィチン酸錯体は、更に亜鉛、鉄、及びマンガンのようなカチオンをも結合する（Ｅｒｄｍａｎ，１９７９）。これは、略図的に以下の式：
【００１０】
【化２】
2004520063.tif 000003
【００１１】
のように例示される。更に、これらの三つの微量元素は、反芻動物の規定食に補充物の形態で、飼料級のＺｎＯ又はＺｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、ＦｅＳＯ４・Ｈ２Ｏ、ＭｎＯ又はＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏとして常に加えられる。再び、経費の観点から、並びに環境的観点から、動物の規定食中の補充的量のこのような無機物の必要性も更に減少するように、これらの元素の利用を増加する方法及び／又は飼料組成物を提供することが好ましいものである。
【００１２】
乳牛のような反芻動物において、４室の胃の第１室中の微生物及び原虫類の大きな集団はフィターゼを生成し、そして反芻動物が、規定食中のフィチン酸塩のＰの大部分を利用していることが一般的に受け入れられている。本発明において、１−α−ＯＨビタミンＤが、主として腸の膜を通るリン酸塩の運搬を刺激することによって反芻からのＰの取り込みを増加する可能性がある。腸のフィターゼ又はホスホターゼの作用による腸からの増加されたＰの取り込みに対する１−α−ＯＨビタミンＤの影響力は、２番目に重要である可能性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
発明の概要
本発明の目的は、雌牛の規定食中の補充的無機リンに対する必要性を排除又は少なくとも実質的に減少する乳牛のための飼料補充物を提供することにある。
【００１４】
本発明のもう一つの目的は、フィチン酸塩からのＰの利用を増加する生体作用性の飼料添加物を提供することにある。
本発明のなおもう一つの目的は、乳牛の牛乳の生産を維持し、一方同時に、補充的無機Ｐに対する必要性を最小化し、そして雌牛の規定食中のフィチン酸塩のＰの利用を増加する方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の更なる目的は、フィチン酸塩からのＺｎ、Ｍｎ、及びＦｅのような他の無機物の利用をも更に増加する生体作用性飼料添加物を提供することにある。
上記の本発明の目的によれば、乳牛のための飼料補充物は、有効な量の１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物を含む。好ましいビタミンＤ化合物は、１α−ヒドロキシビタミンＤ３又は１α，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３である。１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物は、約０．１μｇ／ｋｇないし約１００μｇ／雌牛の規定食中の飼料ｋｇ、を与えるように飼料添加物中に組み込まれる。１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物を乳牛の規定食中に組み込むことによって、飼料は、約０．３重量％又はそれより少ない無機Ｐ補充物のみと共に、そして好ましくは無機Ｐ補充物を含まずに処方することができる。
【００１６】
従って、本発明は、約０．３重量％又はそれより少ない無機リン補充物を含有する乳牛のための飼料補充物を与え；前記の飼料補充物と共に有効な量の１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物を組み込んで、飼料混合物を形成し；そして前記の飼料混合物を分離した形状に形成することの段階を含んでなる、乳牛のための飼料を配合する方法を提供する。
【００１７】
本発明は、更に約０．３重量％又はそれより少ない無機リン補充物；及び雌牛の腸内のリンの取り込みを増加するために有効な量の１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物を含有する飼料補充物を含んでなる乳牛のための動物の飼料組成物を提供する。
【００１８】
更に、本発明は、乳牛の規定食のリンに対する必要量を最小化する方法、更に特定的には、約０．３重量％又はそれより少ない無機リン補充物を含有する飼料を乳牛に給餌し；そして前記の飼料と共に、雌牛の腸のリンの取り込みを増加するために有効な量の１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物を給餌すること、の段階を含んでなる低Ｐ規定食を給餌された乳用牛の正常の産出で牛乳の生産を維持する方法を提供する。
【００１９】
乳用牛に対する補充物として規定食中で通常供給される微量無機物（例えばＺｎ、Ｍｎ及びＦｅ）、並びに無機リンの一部又は全てを置き換えることによって、残りの規定食は、より多い使用可能なエネルギーを含有するものである。従って、穀物−脂肪種子粉餌規定食は、一般的に規定食のキログラム当たり約３，２００ｋｃａｌの代謝可能エネルギーを含有し、そして無機塩は代謝可能なエネルギーを供給しない。従って必要ない無機物の除去及び穀物による置換は、規定食中の使用可能なエネルギーを増加するものである。
【００２０】
概要として、本発明の潜在的利益は：（ａ）乳用牛の規定食の無機Ｐ補充物に対する必要性の実質的な減少及び／又は排除；（ｂ）低Ｐ規定食を給餌した場合でさえ乳用牛の正常な牛乳の生産を維持すること；環境のＰ汚染の減少；及び（ｄ）乳用牛規定食中の補充物Ｚｎ、Ｍｎ、及びＦｅに対する必要性の可能な減少を含む。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
好ましい態様の詳細な説明
本説明及び特許請求項において使用される用語、ヒドロキシ保護基は、例えばアルコキシカルボニル、アシル、アルキルシリル、及びアルコキシアルキル基のようなヒドロキシ機能の一時的保護のために普通に使用されるいずれもの基を意味し、そして保護されたヒドロキシ基は、このような保護基によって誘導されたヒドロキシ機能である。アルコキシカルボニル保護基は、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、プロポキシカルボニル、イソプロポキシカルボニル、ブトキシカルボニル、イソブトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル又はアリルオキシカルボニルのような群である。用語“アシル”は、その全ての異性体の形態の１ないし６個の炭素のアルカノイル基、又はオキサリル、アムロニル（ａｍｌｏｎｙｌ）、スクシニル、グルタリル基のような１ないし６個の炭素のカルボキシアルカノイル基、或いはベンゾイル又はハロ、ニトロ若しくはアルキル置換ベンゾイル基のような芳香族アシル基を意味する。本説明又は特許請求項において使用される単語“アルキル”は、全てのその異性体の形態の、１ないし１０個の炭素の直鎖又は分枝鎖のアルキルラジカルを意味する。アルコキシアルキル保護基は、メトキシメチル、エトキシエチル、メトキシエトキシメチル、又はテトラヒドロフラニル及びテトラヒドロピラニルのような群である。好ましいアルキルシリル保護基は、トリメチルシリル、トリエチルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、及び類似のアルキル化シリルラジカルである。
【００２２】
本発明の処置において有用なビタミンＤ化合物は、１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物、好ましくは１α−ヒドロキシコレカルシフェロールである。この型のビタミンＤ化合物は、以下の式：
【００２３】
【化３】
2004520063.tif 000004
【００２４】
の一般構造によって特徴付けられ、ここで、Ｘ１は、水素又はヒドロキシ保護基であることができ、Ｘ２は、ヒドロキシ、又は保護されたヒドロキシであることができ、Ｘ３は、水素又はメチルであることができ、Ｘ４及びＸ５は、それぞれ水素を表すか又はいっしょに選択されて、Ｘ４及びＸ５がメチレン基を表し、そしてここでＺは、Ｙ、−ＯＹ、−ＣＨ２ＯＹ、−Ｃ≡ＣＹ及び−ＣＨ＝ＣＨＹから選択され、ここで二重結合は、ｃｉｓ又はｔｒａｎｓ立体化学配置を有することができ、そしてここでＹは、水素、メチル、−ＣＲ５Ｏ及び以下の式：
【００２５】
【化４】
2004520063.tif 000005
【００２６】
の構造のラジカルから選択され、ここでｍ及びｎは、独立に０ないし５の整数を表し、ここでＲ１は、水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、フルオロ、トリフルオロメチル、及び直鎖又は分枝鎖であることができ、そして所望によりヒドロキシ又は保護されたヒドロキシ置換基を保有するＣ１−５−アルキルから選択され、そしてここでそれぞれのＲ２、Ｒ３及びＲ４は、独立に水素、フルオロ、トロフルオロメチル、及び直鎖又は分枝鎖であることができ、そして所望によりヒドロキシ又は保護されたヒドロキシ置換基を保有するＣ１−５アルキルから選択され、そしてここでＲ１及びＲ２は、いっしょに選択されて、オキソ基、或いはアルキリデン基、＝ＣＲ２Ｒ３又は−（ＣＨ２）ｐ−基を表し、ここでｐは、２ないし５の整数であり、そしてここでＲ３及びＲ４は、いっしょに選択されて、オキソ基、又は−（ＣＨ２）ｑ−基を表し、ここでｑは、２ないし５の整数であり、そしてここでＲ５は、水素、ヒドロキシ、保護されたヒドロキシ、又はＣ１−５アルキルを表す。
【００２７】
上記の化合物は、単独で又は他の飼料添加剤との組み合わせで投与することができる。上記のビタミンＤ化合物又はその組み合わせは、０．１μｇ／ｋｇないし１００μｇ／飼料のｋｇ、の量で、これらを動物の飼料に直接混合し、又はこれらを飼料補充物若しくは添加物中に混合するかのいずれかによって容易に投与することができ、これを今度は動物の飼料に直接混合するか又は飼料と別個に動物に給餌することができる。更に、化合物は、別個に経口投与、注射又は経皮的手段によって、或いは他の１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物との組み合わせで投与することができ、取り組まれる特定の問題及び所望する反応の程度に依存する組み合わせ中の、それぞれの化合物の比率は、一般的に本発明の実施に対して有効である。乳牛において、好ましい投与量は、一日当たり７５μｇの１α−ヒドロキシビタミンＤ３である。一日当たり約１００マイクログラムを越える量、又はこの化合物と他の１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物との組み合わせは、一般的に所望する結果を達成するために必要なく、高カルシウム血症となり得ることができ、そして経済的に堅実な実施ではあり得ない。いずれもの一定の動物に対して投与される特定の投与量は、当業者にとって公知であるように、投与される特定の化合物、処置される問題、動物の状態、及び化合物の活性又は動物の反応を改変することができる他の関連する事実によって調節されるものであることは了解されるべきである。一般的に、当技術において公知であるように、単一投与又は分割された毎日の投与量のいずれかを使用することができる。
【００２８】
動物の飼料と別個に投与される場合、これらを、非毒性の医薬的に受容可能な担体と混合して、当技術において公知であるように、即時放出又は遅延放出製剤のいずれかを製造することによって各種の化合物の投与剤形を調製することができる。このような担体は、例えばトウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、落花生油、オリーブ油、ゴマ油及びプロピレングリコールのような固体又は液体のいずれかであることができる。固体の担体が使用される場合、化合物の投与剤形は、錠剤、カプセル、散薬、トローチ又はロゼンジ或いはミクロ分散性の剤形のトップドレッシング（ｔｏｐ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ）であることができる。液体の担体が使用される場合、投与剤形は、軟質ゼラチンカプセル、或いはシロップ又は液体懸濁液、乳液若しくは溶液である。投与剤形は、更に保存剤、安定剤、湿潤又は乳化剤、溶液促進剤、等のようなアジュバントを含有することもできる。これらは、更に他の療法的に価値のある物質を含有することもできる。
【００２９】
本発明は、更に乳牛のための動物の飼料組成物及び雌牛の飼料中のリンの規定食の必要量を低下するための、１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物を利用した動物の飼料を配合する方法に関する。この使用のために適した１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物は、本明細書中で先に記載されている。典型的に飼料と共に組み込まれる無機リン補充物（１８．５％Ｐ）の量は、０．３重量％又はそれより少なくまで減少することができるか、或いは雌牛の規定食から完全に排除することができる。この利益のあるリンの減少は、１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物の動物の飼料中への組み込みの直接の結果である。
【００３０】
動物の飼料は、乳牛の規定食の要求に合致するために通常使用されるいずれものタンパク質含有有機粉餌であることができる。多くのこのようなタンパク質含有粉餌は、典型的には主としてトウモロコシ、ダイズ粉餌又はトウモロコシ／ダイズ粉餌混合物で構成される。例えば、乳牛に給餌される典型的な商業的に入手可能な規定食を表１に示す。表１の規定食は、動物の飼料の典型的な例であり、これと共に本発明の１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物を組み込んで、肥料中のリンの排出物の量を減少することができる。従って、典型的に乳牛に給餌されるいずれもの型のタンパク質含有有機粉餌は、本発明の１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物を組み込むことができる、基本混合物として利用することができる。
【００３１】
本発明は、多くの反芻動物の規定食に適用することができ、これは、本明細書においては、複合した２又は４室胃を有する多胃哺乳類を含むとして定義される。特に、規定食は、乳牛のような商業的に有意な牛乳生産反芻動物に使用することができる。
【００３２】
本発明による乳牛のための飼料を配合する方法において、利用される１α−ヒドロキシル化ビタミンＤ化合物は、動物の飼料と、動物に一日当たり約５μｇないし約１００μｇの化合物が与えられるような量で組み込まれる。好ましい量は乳牛に対して一日当たり７５μｇであり、そして好ましい化合物は、１α−ヒドロキシビタミンＤ３である。次いで飼料混合物はすりつぶしたものとして給餌されるか、又は更なる加工及び包装のために所望する分離した形状に成型される。一般的に、これらの分離した形状は、既知の押し出し及び／又は圧縮技術によって成型されたペレット、ブロック又はブリケットであることができる。利用される特定の加工技術は、動物の飼料混合物中の１α−ヒドロキシル化ビタミンＤの性能に影響しない。
【００３３】
本発明は、以下の実施例によって更に特定的に記載され、これは、例示のみであることを意味する。
【実施例１】
【００３４】
乳牛の効力試験
Ａ．目的
毎日７５μｇの１−α−ＯＨビタミンＤ３を、乳汁を分泌する乳牛に給餌することにより、腸からのリン（Ｐ）の取り込みが、その後の血液血清中のＰの増加及び糞中のＰの排出の減少によって証明されるように、増加することを証明すること。
【００３５】
Ｂ．手順
８頭の経産の乳汁を分泌する乳牛（実験開始時において約１５０日乳を出している）を、牛乳の産出量により二つの群にブロック分けした。それぞれのブロックの雌牛は、四つの異なった処置に対して無作為に指定した。実験の構想は４×４のラテン方格であった。それぞれの期間は４週間の長さであった。最初の３週間は適合期間として使用し、そして測定はそれぞれの期間の最後の週中に行った。
【００３６】
四つの処置は：
１）高Ｐ規定食。規定食のＰ、０．４７％（ＤＭ基準）
２）規定食１及び１−α−ＯＨＤ３（７５μｇ／雌牛／日）
３）低Ｐ規定食。規定食のＰ、０．３５％（ＤＭ基準）
４）規定食３及び１−α−ＯＨＤ３（７５μｇ／雌牛／日）
であった。
【００３７】
規定食（表１）を、全混合食として一日一回無制限に給餌した。雌牛は個別の拘束牛舎に収容した。提供した及び拒否された毎日の飼料を、個々の雌牛に対して記録した。飼料の拒否物は、給餌したもの基準で摂取の１０％に制限した。サイレージ及び拒否物の毎日の試料を、化学分析のために週毎に合成した。個々の飼料の成分の試料を週に一回収集した。飼料の成分の乾燥物含有率を６０℃で４８時間のオーブンによる乾燥によって決定した。規定食の処方を、規定食の乾燥物含有率の変化に応じて必要な場合週毎に調節した。全ての飼料の成分を化学組成に対して分析した。アルファルファ及びトウモロコシサイレージを週毎に、中性洗剤性繊維（ＮＤＦ）、酸性洗剤性繊維（ＡＤＦ）、及び粗タンパク質（ＣＰ）に対して分析した。高水分穂トウモロコシ（ＨＭＥＣ）、ダイズ粉餌（ＳＢＭ）、炒りダイズ粉餌（ＲＳＢ）、及び血液粉餌（ＢＭ）を、４週毎に合成し（期間当たり１試料）、そしてＣＰに対して分析した。
【００３８】
雌牛を試験開始の前２日続けて計量し、そして終了時に２日続けて計量した。毎日の牛乳の重量を記録した。全ての雌牛にウシのソマトトロピン（Ｐｏｓｉｌａｃ（登録商標））を注射した。血液の試料を、それぞれの期間の１、２及び３週目の最後の日に収集した。４週目中に、血液試料をそれぞれの最後の３日間得た。血液は、給餌の５時間後、尾骨静脈又は動脈からゲル及び凝結補助活性化剤のヴァキュテーナー中に得た。試料を翌日遠心して、血清を分離した。無機リン及びカルシウム分析は、血清試料に対してＭａｒｓｈｆｉｅｌｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍａｒｓｈｆｉｅｌｄ，ＷＩによって行った。
【００３９】
それぞれの期間の最後の２日間中に、６個の尿の試料を、１日目の午前８時、午後４時、及び午後１１時、そして２日目の正午１２時、午後８時、及び午前６時に収集した。次いで尿の試料をリン、カルシウム、及びクレアチニン分析のために合成した。クレアチニンは、尿の量の推定を可能にするために測定した。牛乳の試料は、それぞれの期間の４日間中に得た。牛乳の試料は分割され；半分は保存剤と混合し、そして他の半分は保存剤なしで凍結した。保存剤を含む試料は、牛乳の組成を、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｇ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｍｉｌｋ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｍｅｎｏｍｏｎｉｅ，ＷＩ）によって分析し、そして保存剤を含まない試料は、牛乳の収率によって合成し、そして無機成分に対して、Ｓｏｉｌ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｏｉｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａｄｉｓｏｎにおいて分析した。
【００４０】
全ての飼料成分を、それぞれの期間中数回試料採取し、そして期間当たりそれぞれの成分に対して一つの合成試料を作り出した。合成試料を無機物組成に対して先に引用したＳｏｉｌ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで分析した。
【００４１】
試料のＤＭ消化率を、Ｙｂを外部マーカーとして使用して決定した。２．２４ｇのＹｂＣｌ３（１ｇのＹｂ）を３０ｍｌの水に溶解することによって調製したＹｂ溶液を、５００ｇのアルファルファサイレージ（ＤＭ基準）に噴霧した。Ｙｂ標識アルファルファサイレージを、全混合食に混合して、４０ｍｇのＹｂ／ｋｇの規定食ＤＭ、を得た。Ｙｂで標識した全混合食を９日間給餌した。Ｙｂ給餌の最後の２日間（それぞれの期間の最後の２日）中に、それぞれの雌牛から８個の糞の無作為試料を、１日目の午前７時、正午１２時、午後６時、及び午後１１時、そして２日目の午前９時、午後３時、午後９時、及び午前５時に収集した。糞の試料を６０℃で７２時間乾燥し、そして２ｍｍのＷｉｌｅｙ粉砕篩を通して粉砕した。糞の試料を二重に乾燥灰化した（Ｃｏｍｂ  ａｎｄ  Ｓａｔｔｅｒ，１９９２）。それぞれの期間の最後の４日間中に、それぞれの雌牛の試料拒否物を収集し、そして期間当たり、雌牛当たり１試料を合成した。これらの試料を糞と同様な方法で乾燥灰化し、そしてＹｂに対して分析した。飼料、飼料の拒否物、及び糞の試料中のＹｂの濃度（ｐｐｍ）を、直流プラズマ分光分析［（Ｃｏｍｂｓ  ａｎｄ  Ｓａｔｔｅｒ，１９９２）；Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍｅｔｒｉｃｓ，Ｉｎｃ．，ｓｕｂｓｉｄｉａｒｙ  ｏｆ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ］によって決定した。個々の雌牛のＤＭ消化率（パーセント）は、次のように計算した：ＤＭ消化率（％）＝（１−消費されたＤＭ中のＹｂ濃度）／（それぞれの雌牛の糞の試料中のＹｂの平均濃度）１００。異なった処置における規定食のリンの消化率は、Ｐ給餌−排出データを使用して計算した。
【００４２】
Ｃ．結果
乳牛によるＰの利用に対する１−α−ＯＨビタミンＤ３の影響を表２に示す。飼料の消費（ＤＭ摂取）は、規定食のＰ濃度又は１−α−ＯＨビタミンＤ３の存在のいずれによっても影響されなかった。糞のＰの排出は、雌牛の規定食中に７５μｇの１−α−ＯＨビタミンＤ３を毎日含めることによって減少した。
【００４３】
肥料中のリンの排出は、高及び低Ｐ処置の両方において一日当たり約１０ｇ減少した。これは、１−α−ＯＨビタミンＤ３の補充による糞中のＰの排出の、１４％の減少に等しい。牛乳の生産は、７５μｇの１−α−ＯＨビタミンＤ３の補充によって影響されなかった。
【００４４】
慣用的な規定食を給餌した場合、乳牛は通常、そして典型的には、約３５ないし４５ｋｇの牛乳／日、を生産することが予想されるものである。表２のデータは、明らかなように、１α−ＯＨ−Ｄ３補充を伴う又は伴わない０．４７％のＰを含有する規定食を給餌された乳牛が、それぞれ牛乳３６．９ｋｇ／日及び牛乳３７．８ｋｇの通常の産出量で生産したことがこれを確認する。１α−ＯＨ−Ｄ３補充を伴う又は伴わない０．３５％のＰを含有する規定食を給餌された乳牛が、これらの通常の産出量で、即ちそれぞれ牛乳３７．６ｋｇ／日、及び牛乳３７．３ｋｇ／日、を生産して、牛乳の生産を維持した。
【００４５】
牛乳の組成を表３に示す。牛乳の組成は、全ての処置において同様であったが、しかし統計的に有意か又は近接して有意である１−α−ＯＨビタミンＤ３処置に関する三つの小さい変化があった。牛乳のラクトースが１−α−ＯＨビタミンＤ３処置により僅かに増加し、そしてカリウムは同じ処置により減少した。牛乳のタンパク質は、１−α−ＯＨビタミンＤ３の処置により僅かに減少することができたが、しかし変化は非常に小さかった。
【００４６】
１−α−ＯＨビタミンＤ３の、血液血漿及び尿中の、Ｐ及びカルシウム（Ｃａ）の濃度に対する影響を表４に示す。１−α−ＯＨビタミンＤ３の影響は、血液血漿中のＰ及びＣａの両方の濃度を増加することであった。これは、高度に有意な影響であり、そして高及び低Ｐ処置の両方で起こった。Ｐ及びＣａの両方の尿中の排出は低かった。ある乳用牛において、Ｐが必要量の過剰で給餌された場合、尿中に僅かに多いＰが排出される傾向があり、そしてこれは、高Ｐ処置の場合に尿中のＰの増加となることがこの実験において証明された。然しながら、これは、尿ｄｌ当たり５．１５ｍｇのＰの濃度でさえ、規定食のＰの摂取の約２％のみを表す。尿を経由するカルシウムの排出は、１−α−ＯＨビタミンＤ３の補充により増加した。
【００４７】
Ｄ．要約
１−α−ＯＨビタミンＤ３の補充は、糞中のＰの排出の減少及び血液血漿中のＰ濃度の増加によって証明されるように、腸からのＰの取り込みを増加した。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
【表２】
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【００５０】
【表３】
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【００５１】
【表４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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