(57)【要約】ＰＢＮ（α−フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン）、およびその誘導体であるニトロンを基本とするフリーラジカル捕捉剤は、新生物発生前の結節の発達を有意に減少させ、そして非常に低いレベルで肝細胞癌（ＨＣＣ）の形成を阻害する。活性酸素種（ＲＯＳ）の癌発達における関与は、長年強く関連付けられてきた。ラットへのコリン欠乏（ＣＤ）食餌の給餌が肝細胞癌（ＨＣＣ）の発達を生じるモデルシステムでの癌の発達において、このＲＯＳの関与は、強く関連付けられてきた。ＰＢＮの飲料水中への投与は、ＨＣＣの形成を阻害する。肝臓における新生物発生前の結節の成長は、食事中のＰＢＮまたはその天然の代謝産物のいくらかの投与によって有意に抑制される。ＣＤ肝臓モデルにおけるＨＣＣの発達の防止におけるこのＰＢＮの効果は、標的細胞が遺伝的に腫瘍細胞に変化した後の、腫瘍の発達の防止に起因すると考えられる。
2004500411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の開始または発達を阻害するための方法であって、被験体に有効用量のニトロンフリーラジカル捕捉剤を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
腫瘍の発達を阻害するための方法であって、被験体に有効用量のアリールＮ−アルキルニトロンフリーラジカル捕捉剤を経腸的に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３】
癌の開始または発達を阻害するための方法であって、被験体に有効用量のニトロンフリーラジカル捕捉剤を食餌投与する工程を包含する、方法。
【請求項４】
前記薬剤が、フェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン、３−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン、２−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン、２−スルホキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンまたは４−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンである、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体が、癌の家族歴を有し、または発癌性の環境に曝された、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍の発達を阻害するための方法であって、有効用量の３−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンまたは４−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンを経腸的に投与する工程を包含する、方法。
【請求項７】
前記有効用量が、１日当たり体重１ｋｇにつき約５〜約６０ｍｇである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
肝癌形成を阻害するための方法であって、被験体に有効用量のフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン、３−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンまたは４−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンの少なくとも１つを食餌投与する工程を包含する、方法。
【請求項９】
前記食餌投与が、食物成分の補充による、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体が、Ｂ型肝炎ウイルスまたはＣ型肝炎ウイルスに曝されたかまたは感染した、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記有効用量が、投与される食餌の約０．００５ｗ／ｗ％〜約０．１ｗ／ｗ％である、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
抗発癌性食餌の調製に使用するためのニトロンフリーラジカル捕捉剤。
【請求項１３】
抗発癌性食餌の調製に使用するためのアリールＮ−アルキルニトロンフリーラジカル捕捉剤。
【請求項１４】
抗発癌性食餌の調製に使用するための３−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンまたは４−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン。
【請求項１５】
抗発癌性食餌の調製に使用するためのフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン、３−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン、２−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン、２−スルホキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンまたは４−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンの少なくとも１つ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
２０００年３月３０日に提出された米国仮出願第６０／１９３，５７２号からの優先権を主張し、そして本明細書で参考として援用する。
【０００２】
（連邦に資金援助された研究または開発に関する記述）
米国連邦政府は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｇｒａｎｔｓ　ＮＳ３５７４７、ＰＯ１−ＡＧ０５１１９、５Ｐ５０−ＡＧ０５１４４およびＲ０１　ＣＡ８２５０６によって部分的に支持される範囲で、本発明において権利を有する。
【０００３】
（背景）
発癌物質を含まないコリン−欠乏−Ｌ−アミノ酸−限定（ＣＤＡＡ）食餌の長期の給餌は、ラットにおいて、肝細胞の死および再生の繰り返しならびに線維症が背景に存在する、明らかに新生物発生前の局所的病変の発達を通じて強い肝臓癌誘発性を及ぼす。酸化的ストレスは、種々のシグナル分子の状態の改変と関連するその元にある機構において、主な役割を果たすと考えられる。ラジカル捕捉剤のフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＰＢＮ）は、この食餌の肝臓癌発癌の初期において、シクロオキシゲナーゼ活性および線維発生を誘導し得る酸化的ストレスを明らかに阻害することによって、新生物発生前の病変の発達を阻害することが示された（Ｆｌｏｙｄら、１９９８）。
【０００４】
活性酸素種（ＲＯＳ）は、何年もの間、癌の発達に関係すると考えられている。ＲＯＳが強く関連するとされた第一の例は、ラットへコリン欠乏（ＣＤ）食餌を給餌することが、任意の外因性の公知の発癌物質に全く曝すことなく、肝細胞癌（ＨＣＣ）の発達を生じるモデル系である。このモデルを使用して、本発明は、癌の開始および発達において重要であることが示された、鍵となるシグナル伝達経路とＲＯＳを関連付けることを可能にする新規の所見に関する。本発明者らは、ＣＤ肝臓からのミトコンドリアが変化し、その結果Ｈ２Ｏ２生成の有意に高い収量をもたらすことを示した。さらに、本発明者らは、初めてＰＢＮ（α−フェニル−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン）およびその誘導体がニトロンを基本とするフリーラジカル捕捉剤でありそして、化合物のとても低いレベルでの新生物発生前の結節の発達を有意に減少させそして肝細胞癌（ＨＣＣ）の形成を阻害することを示した。ＰＢＮ等は、これまでこのモデル中で研究された最も強力な抗発癌物質である。これらの所見を理解するために、本発明者らは、ＣＤ処置が、ミトコンドリア膜における変化を仲介してその結果Ｈ２Ｏ２の増強されたレベルを生成し、そしてＰＢＮ等が、複合体Ｉにて作用することによって過剰なＨ２Ｏ２の生成を有意に阻害することを前提とする。本発明者らはさらに、そのホスファターゼ活性の喪失を生じ、それによってアポトーシス仲介プロセスにおける減少を生じるが腫瘍形成事象における増加を生じるＡＫＴキナーゼ経路の、活性化へのシフトを仲介するＰＴＥＮ腫瘍抑制タンパク質の増強された不活性化を、過剰なＨ２Ｏ２が、引き起こすことを前提とする。本発明者らはまた、ＣＤ肝臓において発達する新生物発生前の結節中の細胞が、過剰なＨ２Ｏ２および特定の増殖因子（ＴＧＦβ１が最もあり得る）の作用の結果、腫瘍形成（アポトーシスとは逆に）へ傾き、そして過剰のＨ２Ｏ２の生成の阻害を通じて、およびまた増強されたシグナル伝達プロセスの抑制によっての両方で、ＰＢＮ等がこれらのプロセスを改変すると提案する。本発明者らは、ＰＢＮ等が新生物発生前の結節の細胞に作用して、腫瘍の発達の阻害を生じるアポトーシスプロセスに傾くようにすると考える。
【０００５】
（ＰＢＮの薬理的作用の研究）化合物ＰＢＮは、１９５０年代に最初に合成されたが、１９６８年に化学反応においてフリーラジカルを捕捉しかつ安定化するために非常に有用であることが発見され、それによってスピントラップ（ｓｐｉｎ−ｔｒａｐ）と命名された（Ｊａｎｚｅｎ　１９７１）。ＰＢＮは、プロトタイプのスピントラップであるが、他のいくつかのニトロンが合成され、化学反応においてフリーラジカルを捕捉しかつ特徴付けるために有用であることが見出された。これらのスピントラップは、最初化学反応において使用されたが、１９７０年代中期に生化学的系および生物学的系においてフリーラジカルを捕捉するために使用され始めた（例えば、Ｆｌｏｙｄら　１９７８；およびＰｏｙｅｒら　１９７８）。薬物動態研究は、ＰＢＮが容易かつ迅速に全ての組織にほぼ同等に分散され、約１３２分のラットにおける半減期を有し、そして大部分が尿中に排泄されることを示した。比較的少数の代謝研究がなされたが、化合物のいくつかの環の水酸化（主にパラの位置における）が肝臓中で生じることが公知である。Ｎｏｖｅｌｌｉは、ＰＢＮを使用して敗血性ショックから実験動物を保護し得ることを最初に示し（Ｎｏｖｅｌｌｉら　１９８６）、そして確かにこれが他のグループによって後に確認された（Ｐｏｇｒｅｂｎｉａｋら、１９９２）。薬物動態薬剤としてのＰＢＮおよび誘導体の使用は、１９８８年の発見の後に開始され、ＰＢＮが実験的脳卒中モデルにおいて神経保護的活性を有することが示された（Ｆｌｏｙｄ　１９９０；Ｆｌｏｙｄら　１９９６；およびＣａｒｎｅｙら　１９９１）。これらの結果は、繰り返されそして展開された（すなわち、例えば、参照Ｃｌｏｕｇｈら　１９９１；Ｃａｏら　１９９４；Ｆｏｌｂｅｒｇｒｏｖａら　１９９５；Ｐａｈｌｍａｒｋら　１９９６を参照のこと）。本発明者らは、ＰＢＮおよび誘導体に関する広範囲の神経保護的薬理学研究を要約する（Ｆｌｏｙｄ　１９９７；Ｈｅｎｓｌｅｙら　１９９６）。神経変性疾患に加えて、ＰＢＮは、糖尿病および他の多くの状態を含むＲＯＳ媒介プロセスが関与する他の病理学的状態において保護することが示された。ＰＢＮおよびその誘導体のいくつかが実験的卒中および他のいくつかの神経変性モデルにおいて非常に神経保護的である理由の機構的基礎は、いまだ完全には解明されていない。しかし、その作用は、そのフリーラジカルを捕捉する能力によって簡単に説明され得ないことは明らかである。実際、ＰＢＮの作用の機構的基礎に関する本発明者らの研究は今、ＰＢＮが遺伝子の誘導を抑制することによって（Ｆｌｏｙｄ　１９９７；Ｈｅｎｓｌｅｙら　１９９６；Ｍｉｙａｊｉｍａら　１９９５；Ｔａｂａｔａｂａｉｅら　１９９６；およびＨｅｎｓｌｅｙら　１９９７）、最もおそらくは酸化感受性シグナル伝達プロセスに作用することによって（Ｒｏｂｉｎｓｏｎら　１９９９）、作用することを示した。実際、ＰＢＮは、ミトコンドリアによるシグナル伝達増強ＲＯＳ形成を抑制することによって作用すると考えられる（Ｈｅｎｓｌｅｙら　１９９８）。これらの発見および考えは、神経変性プロセスの研究から持ち上がった。しかし、ＰＢＮのＣＤ発癌を防ぐ作用は、この神経変性疾患モデルにおいて見出されるものとは異なり得ることが強調される。作用の特定の機構は、本発明を限定しない。
【０００６】
（ＰＢＮは、コリン欠乏モデルにおいて保護的である）
初期の研究は、飲料水中に投与されたＰＢＮが、ＣＤモデルにおいて非常に保護的であったことを示した。この結果は、処置の１２週間後に評価された（Ｎａｋａｅら　１９９８）。この研究は、いくつかの重要な点を引き出した。（１）ＰＢＮは、最も低いレベルでさえ、新生物の結節の大きさを大幅に減少させた（それぞれ６、３０および６０ｍｇ／ｋｇ−日のＣＤＡＡ＋ＰＢＮ処理に対して、ＣＤＡＡのみにおける１．９２ｍｍ３から０．３３、０．１７および０．１０ｍｍ３へ、Ｎａｋａｅら　１９９８の表１を参照のこと）。
【０００７】
ＰＢＮの、結節の数への影響はあまりなかった、すなわち、それぞれ６、３０および６０ｍｇ／ｋｇ−日に対して、ＣＤＡＡのみの１ｍｍ３当たり１９０から、１７０、１４９および１４２へ（Ｎａｋａｅら、１９９８の表１を参照のこと）。（２）ＰＢＮは、結合組織の増殖を有意に減少させた。（３）ＰＢＮの濃度の増大は、８−ＯＨｄＧ量（ＤＮＡの酸化のマーカー）をＣＤ肝臓において減少させた。（４）ＰＢＮは、ＣＤ肝臓中のＰＧＥ２の量を、最も高い投与量で約５０％減少させたが、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルのどちらでもＣＯＸ−ＩＩの発現に影響しなかった。次に要約すると、非常に低いレベルのＰＢＮが、結節の大きさを８３％減少させるが、結節の数は１１％しか減少させないという事実は、本発明者らに結節の大きさがＰＢＮ処理に対して最も感受性のパラメーターであることを示す。ＰＢＮの最も高いレベルでのみＰＧＥ２レベルにいくぶんか影響したが、これはおそらく、酵素それ自体の触媒的阻害剤としての作用に関係がある。
【０００８】
ＣＤＡＡモデルにおいて試験された他の化学物質と比較してＰＢＮの効力を強調するために、Ｎａｋａｅ−Ｋｏｎｉｓｈｉグループによって得られた結果を比較することが有益である（Ｍｉｚｕｍｏｔｏら　１９９４；Ｅｎｄｏｈら　１９９６；およびＮａｋａｅ　１９９９）。このデータは、ＰＢＮが、新生物発生前の結節の大きさを減少させ、そして８−ＯＨｄＧ量における増加を妨げる点において、ＣＤＡＡ処置において試験された最も効果的な化合物であることを明らかに示す。このＰＢＮの結節の大きさに対する効果は、その多くがフリーラジカルの除去剤である他の阻害剤の匹敵する量よりはるかに強力である。高いレベルではあるが、いくぶんかの影響を有すると考えられる他の化合物は、ノルジヒドログアイアル酸（ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｉｃ　ａｃｉｄ）（ＮＧＤＡ）およびＣＶ３６１１だけである。ＣＶ３６１１は、アスコルビン酸の脂肪酸エステルである。ＮＧＤＡは、０．１％のレベルで結節の大きさを３９％低下させ、そしてＣＶ３６１１は、０．０５％のレベルで４４％の低下を生じた。対照的に、最も低いレベルの量でのＰＢＮ（６ｍｇ／ｋｇ）は、８３％減少した；そして最も高いレベルで９５％減少した結節の大きさを生じた。ＮＧＤＡは、その既知のリポキシゲナーゼ活性の阻害のために試験されたが、これはまた、チロシンキナーゼに拮抗することが最近示された（Ｈｅｎｓｌｅｙ　１９９８）。ＢＰＢ（ｐ−ブロモフェノシブロミド（ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｃｙｂｒｏｍｉｄｅ））は、ホスホリパーゼＡ２活性の阻害剤として使用されたが、データが示すように、この化合物は、結節の大きさの抑制における活性がほとんどない（Ｅｎｄｏｈ　１９９６）。アセチルサリチル酸は、結節の大きさおよび結節の数ならびに８−ＯＨｄＧ量に対していくぶんかの効果を有した（しかしＰＢＮの効力には遠く及ばない）（Ｅｎｄｏｈ　１９９９）。彼らによって研究されたαトコフェロールおよびアスコルビン酸ならびにトロロックス（ｔｒｏｌｏｘ）が研究され、どのパラメーターに対してもほとんど効果を有しなかった（Ｍｉｚｕｍｏｔｏら、１９９４）。脂肪肝の発達に対して任意の効果を有する阻害剤は、たとえあるとしても、なかったこともまた留意されるべきである。このモデルにおける種々の抗酸化剤の効果の広範な多様性および脂肪肝の発達に対する影響の欠如は、一貫性のある発見であると考えられる。適切な特筆すべき点としては、ＣＤＡＡモデルにおけるその作用と対比してラット肝臓ミクロソームにおける脂質の過酸化を阻害する化合物の抗酸化効果が挙げられる。Ｊａｎｚｅｎら　１９９４によって収集されたデータは、トロロックスおよびＢＨＴがラットの肝臓ミクロソームの過酸化を阻害する能力において、全く特筆すべき活性を示した（それぞれ４０μＭおよび６μＭのＩＣ５０）、一方、ＰＢＮは、約１／１０００効果的であった（ＩＣ５０＝５ｍＭ）ことを実証する。しかし、ＰＢＮは、ＣＤＡＡモデルにおいて非常に効果的である（Ｎａｋａｅら　１９９８）が、ＢＨＴおよびトロロックスはそうではない（Ｇｈｏｓｈａｌら　１９９０；Ｍｉｚｕｍｏｔｏら　１９９４）。この比較は、ＣＤＡＡモデルにおける阻害剤の作用が、その抗酸化またはラジカル除去特性のみによって簡単に説明され得ないという点を十分に例示する。
【０００９】
初期の研究は、新生物発生前の結節の病変の出現とＣＤＡＡ食餌のラットにおけるＰＢＮの存在または不在との間の関連の可能性を示してきたが、当業者は、これらの新生物発生前の結節の病変は、依存的に隣接する癌の発達を予測可能にしないと理解する。本発明は、ＰＢＮおよびその誘導体のようなニトロン還元剤が、実際の癌性病変の発達の阻害に実際に効果的であることを確立する。当業者は、この発見が今日の主要な健康問題のひとつに対する重大な意味を有することを理解する。
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、癌の開始または発達、あるいは腫瘍の発達を阻害するための方法を含む。この方法は、有効用量のニトロンフリーラジカル捕捉剤を経腸的に投与することを包含する。この投与は、好ましくは食物または飲料の供給によって経腸的である。好ましいニトロンは、アリールＮ−アルキルニトロンである。このアルキルは、第三級（ｔｅｒｔ）ブチルであるが、他のアルキル、シクロアルキル等も使用され得る。好ましいアリールは、フェニル、３−ヒドロキシフェニルおよび４−ヒドロキシフェニル等である。新規アリールおよびアルキルの両方は、一旦当業者が、効果的なニトロンを同定し、最適な用量送達ならびにタイミングスケジュールを見出すために、本明細書中に記載されたように試験を実施すると、使用され得る。被験体に対するニトロンフリーラジカル捕捉剤の有効用量を投与する食餌は、他の経路が特定の状況において効果的であることが見出され得るが、好ましい投与経路である。
【００１１】
本発明は、より好ましくは、癌を予防するかまたは阻害するのに有効な用量の３−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンまたは４−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンを経腸的に投与することを包含する方法を含む。ほとんどの場合、有効用量は、１日当たり体重１ｋｇにつき約０．５ｍｇから約６０ｍｇである。ひとつの好ましい実施形態において、本発明は、肝臓癌形成を阻害するための方法、フェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン、３−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンまたは４−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンの少なくともひとつの有効用量を被験体に食餌で投与することを包含する方法を含む。処置される被験体は、前立腺癌、乳癌、肝臓癌または他の癌のような癌の家族歴を有する被験体を含み、そして例えば、過剰の紫外線照射、放射線、食物への発癌物質の混入などの発癌性の環境に曝されたと考えられる被験体を含む。食餌投与が食物成分の補充による場合、有効なニトロン含有量は、投与される食餌の約０．００５ｗ／ｗ％から約０．１ｗ／ｗ％であり得る。
【００１２】
ＰＢＮおよびその化学的誘導体がおそらく活性である他の腫瘍モデルとしては、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスからの感染によって引き起こされたＨＣＣの発達が挙げられる。ヒトを悩ませる多くの腫瘍は、新生物発生前の結節の段階を通じて進行し、そして証拠は、ＲＯＳまたはＲＯＳ形成を悪化させる状態が、腫瘍の発達において重要であることを示す。従って、本発明者らは、多くのヒト腫瘍の発達はおそらく、ＰＢＮまたはその効果的な化学的誘導体のひとつを非常に低いレベルで（おそらく１日当たり１ｍｇ以下で）毎日投与することによって抑え得ると考える。
【００１３】
本発明はまた、抗発癌性食餌の調製およびこのような補助食餌の調製に使用するためのニトロンフリーラジカル捕捉剤を含む。アリールＮ−アルキルニトロンフリーラジカル捕捉剤はまた、抗発癌性食餌の調製における使用のために好ましい。最も好ましいニトロンは、抗発癌性食餌の調製における使用のために別個にまたは組み合わされる、３−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンおよび４−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンである。
【００１４】
初期の研究は、ＣＤＡＡ食餌に対するラットにおける新生物発生前の結節性病変の出現とＰＢＮの存在または不在との間に関連がある可能性を示したが、当業者は、これらの新生物発生前の結節性病変は、明らかな癌の発達を依存的に予測可能ではないと理解した。本発明は、ＰＢＮおよびその誘導体のようなニトロン還元剤が、実際の癌性病変の発達の阻害に実際に効果的であることを確立する。当業者は、この発見が今日の主要な健康問題のひとつに対する重大な含蓄を有することを理解する。
【００１５】
ＰＢＮ（またはその強力な誘導体）が、明らかな腫瘍の発達の防止に活性であると予測される例は、肝臓における腫瘍に加えて、胃、結腸、胸部、脾臓、前立腺、皮膚、頭頚部ならびに血流を含むほとんどの器官において発達する腫瘍を含んだ。
【００１６】
本発明はまた、抗発癌性食餌の調製およびこのような補助食餌の調製に使用するためのニトロンフリーラジカル捕捉剤を含む。アリールＮ−アルキルニトロンフリーラジカル捕捉剤はまた、抗発癌性食餌の調製における使用のために好ましい。より好ましいニトロンは、抗発癌性食餌の調製における使用のために別個にまたは組み合わされる、３−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン、２−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン、２−スルホキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンおよび４−ヒドロキシフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロンである。
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、例えば、ＣＤＡＡ食餌を給餌された動物における、肝細胞癌（ＨＣＣ）の発達に対するＰＢＮおよびその誘導体のインヒビターに関する。本発明はまた、ＰＢＮおよびその誘導体がＣＤＡＡ食餌の長期の給餌によって誘導されるＨＣＣの発達を効果的に阻害することの提示に関する。ＰＢＮおよびその誘導体のこの化学予防作用は、食餌による肝癌形成の、早期におけるＨＣＡを含む新生物発生前の病変の発達の妨害、および後期におけるＨＣＣへの病変の進行の防止の両方の結果であると示唆される。
【００１８】
ＣＤモデルにおけるＰＢＮの効果（飲料水中の場合）の長期（７０週間）の研究から最近収集されたデータは、ＰＢＮが明らかなＨＣＣ形成を完全に阻害し、そしてＰＢＮ自体は発癌性ではないことを実証した。ＰＢＮは、この特定のモデルにおいてこのようにこれまでに試験された最も効果的な抗発癌性化合物である。追試の研究において、本発明者らは、４−ヒドロキシＰＢＮ（４−ＯＨ−ＰＢＮ）が食餌中に投与された場合、親の化合物よりもさらにより効果的な抗発癌物質であることを見出した。従って、ＰＢＮ、ならびに４−ＯＨ−ＰＢＮ、３−ＯＨ−ＰＢＮ、２−ＯＨ−ＰＢＮおよび２−ＳＰＢＮ（２スルホキシＰＢＮ）は、食餌中に投与された場合、ラットにおけるＣＤ仲介性の肝細胞癌の発達を阻害する。
【００１９】
本明細書中に使用される略語は、以下のようである：ＰＢＮ、フェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン；ｉＮＯＳ、誘導性一酸化窒素シンターゼ；ＮＦ−κＢ、核因子−κＢ；ＣＯＸ２、誘導性シクロオキシゲナーゼ；ＣＤＡＡ食餌、コリン欠乏のＬ−アミノ酸限定食餌；ＧＳＴ−Ｐ、胎盤型グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；ＨＣＣ、肝細胞癌；ＨＣＡ、肝細胞線腫；ＣＳＡＡ食餌、コリン補給のＬ−アミノ酸限定食餌；ｉＮＯＳ、誘導性一酸化窒素シンターゼ；ＣＯＸ、シクロオキシゲナーゼ。
【００２０】
以下の実施例はさらに、好ましいバージョンおよびこれを作製する方法を含む本発明のモデル実施形態を例示する；しかし、これらの実施例は、本発明の制限として解釈されるべきではない。
【００２１】
（実施例１）
本実施例は、７０週間、コリン欠乏のＬ−アミノ酸限定（ＣＤＡＡ）食餌を給餌された雄性Ｗｉｓｔａｒラットにおける肝発癌に対する、ラジカル捕捉剤のフェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＰＢＮ）の効果を示す。肝細胞線腫（ＨＣＡ）および肝細胞癌（ＨＣＣ）は、７０週間の連続したＣＤＡＡ食餌の給餌によって、５７．１％の発生率で誘導された。実験期間を通じてＣＤＡＡ食餌とともに０．０６５％の濃度で飲料水中に投与されたＰＢＮで、ＨＣＡ発生率およびＨＣＣ発生率の両方が２５．０％に減少した。最初の２６週間のＰＢＮ、次に４４週間のビヒクル飲料水がＣＤＡＡ食餌と共に投与された場合、ＨＣＡ発生率およびＨＣＣ発生率の両方が、それぞれ２８．６％および０％に減少した。対照的に、２６週間のビヒクル飲料水、次に最後の４４週間のＰＢＮがＣＤＡＡ食餌と共に投与された場合、ＨＣＣ発生率は０％に減少したが、ＨＣＡ発生率は６２．５％と高いままであった。これらの結果は、ＰＢＮがＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットにおいて、肝発癌を阻害することを示した。後期におけるＨＣＡからＨＣＣへの変換のＰＢＮによるこの阻害は、ＨＣＣの発達の防止において特に重要である。
【００２２】
ＰＢＮは、強力な抗酸化活性を有するニトロンを基本とするラジカル捕捉剤である（Ｋｏｔａｋｅ　１９９９）。さらに、ＰＢＮは、インビボおよび／またはインビトロの場合に、ｉＮＯＳの誘導の阻害によって抗ニトロソ化効果を発揮し、そして種々のシグナル伝達分子（例えば、ＮＦ−κＢ、前炎症性サイトカイン、ＣＯＸ２ならびに前アポトーシス遺伝子産物）の状態に対する改変を防止することが示された（Ｋｏｔａｋｅ　１９９９）。これらの特性を反映して、ＰＢＮは、動物の種々の障害（例えば、酸化的ストレスおよびニトロソ化的ストレスによって媒介され、そしてシグナル伝達を変更する、内毒素性ショック、虚血−再灌流損傷、神経変性疾患および糖尿病）に対して予防的である（Ｋｏｔａｋｅ　１９９９）。
【００２３】
ＣＤＡＡ食餌の長期の給餌は、その内因性の機構に起因して、（任意の公知の発癌物質なしで）１年以内にＨＣＣの高い発生率を誘導する（Ｎａｋａｅら　１９９２；Ｎａｋａｅ　１９９９；Ｎａｋａｅ　２０００）。このモデルにおいて、ＨＣＣは、ＧＳＴ−Ｐ陽性の細胞が変化した病巣（ｆｏｃｉ　ｏｆ　ｃａｌｌｕｌａｒ　ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）、そして次に肝細胞の連続する死および増殖、ならびに肝硬変を生じる線維症が存在する背景下でのＨＣＡを通じて誘導される（Ｎａｋａｅ　１９９９）。
【００２４】
以前の報告において、本発明者らは、ＰＢＮが、肝細胞の核ＤＮＡに対する酸化的損傷の阻害および触媒レベルでのＣＯＸ２活性の阻害に起因して、ＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットの肝臓における細胞が変化したＧＳＴ−Ｐ陽性病巣の誘導および増殖を阻害することを実証した（Ｎａｋａｅら　１９９８）。これらの発見を展開して、本研究は、ＨＣＣを終点マーカーとして使用して、ＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットにおける肝発癌全体に対するＰＢＮの効果を評価する。
【００２５】
（材料および方法）
（動物、食餌および化学物質）このプロトコールは、実験に先立って、日本政府の動物の保護および管理に関する法律第１０５号および日本政府の実験動物の飼育および補完に関する告示第６号に従った動物実験に関するガイドラインに従い、奈良大学の動物実験委員会によって承認された。６週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラットは、ＪａｐａｎＳＬＣ、Ｉｎｃ．、（日本国静岡県浜松市）から購入した。ラットは、５匹ごとにプラスチックのケージに入れ、白色フレーク床敷き（Ｋａｎｓａｉ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｏｒｐ．、日本国京都府京都市）と共に、空調室で飼育した（温度２５±３℃、相対湿度５５±８％、１０〜１２／時間の換気および１２時間の暗／明サイクル）。ラットを、基本的な食餌（ＣＥ−１、Ｃｌｅａ　Ｊａｐａｎ、日本国東京都目黒区）に対する１週間の順応後、実験に使用し、そして順応期間および実験期間の間中、食物および飲み水は、自由に与えた。体重、食物消費および水の摂取を毎週モニターした。ＣＤＡＡ食餌およびコントロールのＣＳＡＡ食餌は、Ｄｙｅｔｓ　Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡから取得した。ＰＢＮを、本発明者らの研究室のＪａｎｚｅｎおよびＨａｉｒｅ（Ｊａｎｚｅｎら　１９９０）の方法に従って合成し、９９．９９７％の純度まで精製した。
【００２６】
（予備研究）予備研究を、ＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットにおいて肝発癌の後期が開始する時点を決定するために実施した。２０匹のラットの群に、１６週間ＣＤＡＡ食餌を給餌し、そして１０匹の動物を屠殺した。次いで残りの１０匹のラットに５４週間ＣＳＡＡ食餌を給餌し、そして開始後７０週間で軽いエーテル麻酔下での全採血によって屠殺した。２０匹のラットの他の群に、２６週間ＣＤＡＡ食餌を給餌し、そして１０匹の動物を屠殺した。次いで、残りの１０匹のラットに、４４週間ＣＳＡＡ食餌を給餌し、そして開始後７０週間で屠殺した。この屠殺に際し、肝臓を採取し、そして４μｍの厚さの、１０％中性緩衝化ホルマリン固定（２４時間）し、パラフィン包埋した検体を調製し、そしてＨ＆Ｅ手順によって慣用的に染色した。この肝臓検体を、文献に記載された基準に従って組織学的に試験した（Ｍａｒｏｎｐｏｔら　１９９６）。
【００２７】
（主研究）合計６０匹のラットを、６群に均等に分配した。第１群は、ＣＤＡＡ食餌を７０週間受けた。第２群は、飲料水中の０．０６５％の濃度のＰＢＮと共に７０週間ＣＤＡＡ食餌を受けた。第３群は、２６週間ＰＢＮと共にＣＤＡＡ食餌を受け、次いで４４週間ＣＤＡＡ食餌のみを受けた。第４群は、２６週間ＣＤＡＡ食餌のみ受け、次いで４４週間ＰＢＮと共にＣＤＡＡを受けた。第５群および第６群は、それぞれＣＳＡＡ食餌のみおよびＰＢＮとＣＳＡＡ食餌を７０週間受けた。このＰＢＮ用量は、本発明者らの先の報告に基づいて決定した（Ｎａｋａｅら　１９９８）。第３群および第４群において処置が変更される、開始後２６週間目の時点は、予備研究の結果に従って決定した（以下の結果および考察の節を参照のこと）。生存する全てのラットを、開始後７０週間目に屠殺し、そして肝臓を採取した。２つの連続した４μｍの厚さの、１０％中性緩衝化ホルマリン固定（２４時間）し、パラフィン包埋した肝臓検体を調製し、そして慣用的なＨ＆Ｅ手順およびマッソン三色手順によって染色した。このＨ＆Ｅ染色した肝臓検体を、前述の基準（Ｍａｒｏｎｐｏｔら　１９８６）に従って組織学的に試験し、そしてＨＣＡおよびＨＣＣの発生率を決定した。線維症の度合いは、マッソン三色染色された肝臓検体におけるコラーゲン線維によって占有される面積の百分率を、ＩＰＡＰ画像分析システム（Ｓｕｍｉｋａ　Ｔｅｃｈｎｏｓｅｒｖｉｃｅ、Ｃｏｒｐ．、日本国大阪府大阪市）を使用して分析することによって評価した。
【００２８】
（統計的分析）統計的分析を、ＩｎＳｔａｔソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して実行した。フィッシャーの直接確率検定を使用して、群の間の病変発生率の差異の統計的有意性を評価した。Ｓｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓの複数比較検定を、群の平均値間の偏差を決定する一方向（ｏｎｅ−ｗａｙ）のＡＮＯＶＯの後に群の間の平均値の差異の統計的有意性を評価するために使用し、続いて分散の均等性を決定するためにＢａｒｔｌｅｔｔ’ｓ検定を使用した。
【００２９】
予備研究において、細胞が変化した病巣は、１６週間ＣＤＡＡ食餌で給餌された全てのラットの肝臓において誘導され、そしてこれらの病変は続く５４週間のＣＳＡＡ食餌の給餌の後でさえも持続した。ＨＣＡまたはＨＣＣは、これらのいずれのラットにおいても観察されなかった。雄性Ｆｉｓｃｈｅｒ　３４４ラットを使用して、細胞が変化した病巣は２４週間のＣＤＡＡ食餌の給餌、そして２８週間のＣＳＡＡ食餌の給餌によって誘導されるが、ＨＣＡまたはＨＣＣは誘導されないことが、同様に示された（Ｎａｋａｅら　１９９２）。１６〜２４週間の期間は、ＨＣＡまたはＨＣＣを誘導するために十分ではないが、それ自体を持続性に維持するが追加的発癌性刺激がない下では進行した形態に変換する能力を有さない細胞が変化した病巣を誘導するためには十分であることが示唆される。対照的に、ＨＣＡは、２６週間のＣＤＡＡ食餌の給餌の後、１０匹のラットのうち２匹において誘導された（発生率２０％）。２６週間のＣＤＡＡ食餌次いで４４週間のＣＳＡＡ食餌が給餌された場合、ＨＣＡを、１０匹のラットのうち２匹において観察した（発生率２０％）。これらの結果は、少なくとも２６週間のＣＤＡＡ食餌の長期の給餌がＨＣＡを誘導し、そしてＨＣＣが追加的発癌性刺激がなくても後に誘導されることを実証する。予備研究のこれらの結果は、ラット肝発癌の後期が、ＣＤＡＡ食餌の給餌の開始後２６週間で開始し得ることを示唆する。
【００３０】
主研究のこの結果を、図１の表中に要約する。３匹、２匹、３匹および２匹のラットが、それぞれ、第１、２、３および４群において死亡した。第５および６群においては、全てのラットが生存した。食物消費または水の摂取の点では、群の間に差異はなかった。第５群の最終体重および相対的な肝臓の重量は、それぞれ、第１群のものよりも高くそして低かった。ＰＢＮのこの投与は、第２、３、４および６群においては、最終体重または相対的な肝臓の重量に影響しなかった。第１群において、これらの肝臓は、巨視的には黄色がかった白色であり、そして濁りかつ暗い色の数個の大きい腫瘍と関連して硬変を呈した。組織学的には、ＨＣＡおよびＨＣＣは、どちらも７匹のラットのうち４匹において観察されたが（発生率５７．１％）、全てのラットが脂肪肝および肝硬変を示し、肝臓検体の１３．３２％はコラーゲン線維によって占有された。第２群において、これらの肝臓は、巨視的には茶色がかった紫色であり、そして比較的滑らかな表面を有した。組織学的には、ＨＣＡおよびＨＣＣは、両方とも第２群の８匹のラットのうち２匹においてのみ観察されたが（発生率２５．０％）、これらの発生率は、第１群の値よりも有意に小さかった。脂肪肝は、なお明白であったが、線維症は大幅に減少し、線維によって占有された肝臓検体はほんの９．９５％であった。これは、第１群の値より有意に小さかった。第３群において、これらの肝臓の巨視的および組織学的特徴は、第２群の特徴に類似であった。ＨＣＡおよびＨＣＣは、それぞれ、７匹のラットのうち２匹（発生率２８．６％）および０匹（発生率０％）において観察され、そして肝臓検体の８．７１％が線維によって占有された。これらの発生率および線維症の度合いは全て、第１群の値よりも有意に小さかった。第４群において、これらの肝臓は、巨視的にはほとんど第１群のものに類似のように見えたが、大きな腫瘍を欠いていた。組織学的には、ＨＣＡは８匹のラットのうち５匹において（発生率６２．５％）脂肪肝および肝硬変を伴って観察され、肝臓検体の１２．８６％が線維によって占有された。これらは全て第１群と同じ範囲内であった。しかし、ＨＣＣは、組織学的には観察されず（発生率０％）、この発生率は、第１群の値よりも有意に小さかった。顕著な巨視的または組織学的変化は、第５または６群の肝臓中には検出されず、そしてＨＣＡおよびＨＣＣの発生率（どちらも０％）および線維症の度合い（１．６１％）は全て、第１群の値より有意に小さかった。これらの結果は、ＰＢＮがＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットの肝臓におけるＨＣＣの誘導を阻害することを明らかに示す。ＰＢＮのこのような阻害効果は、ＨＣＡ発達の防止（最初の２６週間のみ投与されたＰＢＮによってＨＣＡの発達は減少しＨＣＣは発達しないので）、およびＨＣＡのＨＣＣへの変換の防止（ＨＣＡ発生率の変更を伴わずにＨＣＣが発達しないので）の両方に起因すると示唆される。
【００３１】
本発明者らの以前の報告は、ＰＢＮが、１２週間のＣＤＡＡ食餌の給餌による細胞変化のＧＳＴ−Ｐ陽性病巣の誘導および、より顕著には、増殖を阻害し、これが酸化的ストレスおよびＣＯＸ２活性の阻害に寄与することを実証する（Ｎａｋａｅら　１９９８）。活性酸素種およびＣＯＸ２の役割は、ＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットにおける肝癌形成の早期において十分に示されたが、種々の他の因子もまた、関与すると示唆された（Ｎａｋａｅ　１９９９；およびＮａｋａｅ　２０００）。ｉＮＯＳ誘導およびＮＦ−κＢ活性化の両方の阻害剤である１’−アセトキシカビコールアセテートおよびＰＢＮ（Ｋｏｔａｋｅ　１９９９；Ｏｈａｔａら　１９９８）が、ＧＳＴ−Ｐ陽性細胞変化の病巣の誘導を阻害するので、活性窒素種、およびＮＦ−κＢのような転写因子が関与し得る（Ｎａｋａｅ　１９９９；Ｎａｋａｅ　２０００；およびＮａｋａｅ　１９９８）。一方、種々のシグナル伝達の変化は、半精製コリン欠乏食餌（Ｚｅｉｓｅｌ）を給餌されたラットの肝臓において誘導される。本発明者らは、１２週間のＣＤＡＡ食餌の給餌の間、ラットの肝臓においてＮＦ−κＢ、カスパーゼ−１および種々のサイトカインの蓄積または変化した状態をも示した（Ｎａｋａｅ　１９９９）。このような変化もまた、ＰＢＮがこれらの変化を正常化し得るので、この肝癌形成の早期において関与し得る（Ｋｏｔａｋｅ　１９９９）。線維症に関連するシグナルもまた、関与し得る。なぜなら、活性酸素種および種々のシグナル伝達分子が、ＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットの肝臓における線維症ならびに細胞変化のＧＳＴ−Ｐ陽性病巣の両方の誘導を阻害する、肝臓星状細胞の活性化、増殖および機能に関与するからである（Ｓａｋａｉｄａら　１９９６；Ｓａｋａｉｄａら　１９９８）。非ステロイド性抗炎症薬剤のＮ−（４−ヒドロキシフェニル）レチナミド（ｒｅｔｉｎａｍｉｄｅ）およびＰＢＮは、細胞変化のＧＳＴ−Ｐ陽性病巣の誘導および増殖の阻害と共に、線維症の誘導を阻害する（Ｎａｋａｅ　１９９９；Ｎａｋａｅ　２０００；およびＮａｋａｅら　１９９８）。本結果は、線維性のプロセスもまた、早期のＨＣＡの誘導に関与し、そしてＰＢＮによって阻害され得るが、肝硬変自体の存在が、後期におけるＨＣＣへのＨＣＡの変換に影響しないかもしれないことを示唆する。考え合わせると、ＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットにおける肝癌形成の早期におけるＰＢＮの阻害的効果は、広範囲のシグナル伝達経路の調節から生じることが示唆される。
【００３２】
ＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットにおける肝癌形成の後期の下にある機構に関してはほとんど解明されていないが、癌遺伝子の低メチル化は、コリンおよび複数のメチル基給与体（リポトロープ（ｌｉｐｏｔｒｏｐｅ））の欠乏した食餌に起因するラットの肝癌形成における重要な因子の１つであると、長く考えられてきた（Ｐｏｉｒｉｅｒら　１９９４；およびＣｈｒｉｓｍａｎ　１９９５）。本発明者らは最近、ｃ−ｍｙｃ遺伝子の５’隣接領域が低メチル化され、これが、ＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットにおいて、ＨＣＣ（ＨＣＡではなく）におけるｃ−ｍｙｃ遺伝子のｍＲＮＡの過剰発現を生じることを示した（Ｔｓｕｊｉａｃｈｉら　１９９５）。ｃ−ｍｙｃ遺伝子の低メチル化は、ＨＣＡから変換したＨＣＣによる悪性腫瘍の獲得において役割を果たすことが考えられる。活性酸素種は、転写因子介入下のＤＮＡメチル化パターンにおける後成的な変化を生じる（Ｃｈｒｉｓｍａｎ　１９９５；およびＣｅｒｄｒａら　１９９７）。ＰＢＮは、酸化的ストレスおよび転写因子の活性化に対する阻害能によって、異常なＤＮＡメチル化パターンの形成を妨げ得（Ｋｏｔａｋｅ　１９９９）、そして次にＨＣＣへのＨＣＡの変換を予防する。さらに、トランスフォーミング増殖因子−βシグナル伝達経路は、ＣＤＡＡ食餌の給餌によって誘導されたＨＣＣにおいて変化される（Ｓａｓａｋｉら　２００１）。これは、ＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットにおける肝癌形成の後期の機構に関与する別の因子であり得、そしてＰＢＮは、変化されたシグナル伝達を正常化する能力によってこのプロセスに影響し得る（Ｋｏｔａｋｅ　１９９９）。
【００３３】
結論として、ＰＢＮは、ＨＣＡ誘導だけでなく、ＨＣＡからＨＣＣへの変換もまた阻害することによって、ＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットの肝臓におけるＨＣＣの誘導に対して化学防御的である。さらなる研究は、広範な発癌発生に対するＰＢＮの化学防御的効果を評価し、そしてＰＢＮの癌化学防御的効果の下にある機構を解明するために、明らかに所望される。
【００３４】
（実施例２）
本実施例は、ラジカル捕捉剤フェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＰＢＮ）の抗肝癌形成効果を示す以前の結果（Ｎａｋａｅ、Ｄ．ら　（１９９８））を拡張する。これは、コリン欠乏性の、Ｌ−アミノ酸限定（ＣＤＡＡ）食餌を給餌されたラットにおける肝癌形成の早期に対するその誘導体の効果を試験することによる。６週齢の雄性Ｗｉｓｔａｒラットを、ＣＤＡＡ食餌単独または０．００９％、０．０４５％または０．０９０％の濃度のＰＢＮ誘導体を含むＣＤＡＡ食餌で、１６週間給餌した。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ胎盤型（ＧＳＴ−Ｐ）陽性の推定前新生物性病変の数は、最も高い用量のＰＢＮによってのみ減少された。しかし、前新生物性病変の大きさおよび肝細胞の核外成分に対する酸化的損傷は、全ての用量の４−ヒドロキシ−ＰＢＮならびに最も高い用量のＰＢＮおよび３−ヒドロキシ−ＰＢＮによって減少された。４−ヒドロキシ−ＰＢＮおよび３−ヒドロキシ−ＰＢＮは、周辺組織におけるその阻害なしに、ＧＳＴ−Ｐ陽性病変において細胞のアポトーシスを増強した。４−ヒドロキシ−ＰＢＮだけが、ＧＳＴ−Ｐ陽性病変および周辺組織の両方において肝細胞の増殖を阻害した。２−ヒドロキシ−ＰＢＮも２−スルホキシ−ＰＢＮも、いかなるこれらの効果も及ぼさなかった。本結果は、ＰＢＮ、４−ヒドロキシ−ＰＢＮおよび３−ヒドロキシ−ＰＢＮが前新生物性病変の増殖を阻害することを実証する。４−ヒドロキシ−ＰＢＮは、ＰＢＮおよび３−ヒドロキシ−ＰＢＮより効果的であった。ＰＢＮの４−ヒドロキシ−ＰＢＮへの代謝的変換がＰＢＮの抗肝癌形成効果において重要な役割を果たすこと、および、ＰＢＮ、４−ヒドロキシ−ＰＢＮおよび３−ヒドロキシ−ＰＢＮが有用な癌の化学防御剤として役割を果たし得ることを示唆する。
【００３５】
天然または合成の化学物質による化学防御は、発癌を遅延させるかまたは停止させることによる癌の潜在的制御において魅力的な注目点を有する（Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　Ｗｏｒｋｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐ　１９９９；およびＨｕｒｓｔｉｎｇら　１９９９）。発癌は、複数の工程のプロセスであり、そして従って、各工程において生じる事象が化学防御的化学物質についての標的であり得ることが提案された。有望な結果が、適切なインビボ動物モデルを使用する調査によって主に得られている（Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　Ｗｏｒｋｉｎｇ　Ｇｒｏｕｐ　１９９９；およびＨｕｒｓｔｉｎｇら　１９９９）。
【００３６】
フェニルＮ−ｔｅｒｔ−ブチルニトロン（ＰＢＮ）は、スピントラッピング技術によるラジカル種の検出に使用されている、ニトロンベースのフリーラジカル捕捉剤である。ＰＢＮは、酸化的ストレスおよびニトロソ化ストレスならびにシグナル伝達異常のインビトロおよびインビボでの阻害において、強力に効果的であることが示された（Ｋｏｔａｋｅ　１９９９）。ラットへのＰＢＮの投与は、単一の優勢な代謝産物として４−ヒドロキシ−ＰＢＮ（４−ＯＨＰＢＮ）を生じる（Ｒｅｉｎｋｅ　２０００）。ＰＢＮがインビボでラットに投与される場合、４−ＯＨＰＢＮの遊離形態および結合形態が、肝臓組織において、ならびに胆汁、尿および血漿中において検出される（Ｒｅｉｎｋｅ　２０００）。従って、４−ＯＨＰＢＮは、肝臓のミクロソームシステムにおいて形成される、ＰＢＮの主要な代謝産物であると考えられ、そしてその親化合物の薬理学的作用において重大な役割を果たすと考えられる（Ｋｏｔａｋｅ　１９９９；Ｒｅｉｎｋｅ　２０００）。しかし、４−ＯＨＰＢＮの生物学的効果についてはほとんど知られていない。
【００３７】
本発明者らは、ＰＢＮが、コリン欠乏性の、Ｌ−アミノ酸限定（ＣＤＡＡ）食餌を給餌されたラットの肝臓において、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ胎盤型（ＧＳＴ−Ｐ）陽性の推定前新生物性病変の誘導、より顕著には、増殖を阻害することを以前に実証した。ＰＢＮは、肝細胞核ＤＮＡに対する酸化的損傷を阻害し、そして誘導性シクロオキシゲナーゼ活性を抑制する（Ｎａｋａｅら　１９９８）。しかし、ＰＢＮの抗肝癌形成機構の特定の作用は、いまだおおむね不明瞭なままである。本研究は、ＣＤＡＡ食餌中にＰＢＮおよびその誘導体を長期に給餌することによる、ラット肝癌形成の早期に対する４−ＯＨＰＢＮおよび他の誘導体の効果を試験することによって、本発明者らのＰＢＮの抗肝癌形成効果に対する初期の知見を拡張するために実施した。
【００３８】
（材料および方法）
（動物）合計１１０匹の雄性Ｗｉｓｔａｒラットを、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｊａｐａｎ、Ｉｎｃ．、Ａｔｕｇｉ、Ｋａｎａｇａｗａ、Ｊａｐａｎから、５週齢で得た。実験を、基本食餌（ＣＥ−２食餌、Ｃｌｅａ　Ｊａｐａｎ、Ｍｅｇｕｒｏ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）に対する１週間の順化後に開始した。ラットを、標準雰囲気下（温度２５±３℃；相対湿度５５±８％；１０〜１５回／時間の換気；および１２時間の暗／明サイクル）の、白色フレーク床敷き（Ｋａｎｓａｉ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｏｒｐ．、Ｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｋｙｏｔｏ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を有するプラスチックケージに５匹ずつ置いた。食物および飲み水への自由な接触を、順化期間中および実験期間中、許容した。
【００３９】
（食餌および化学物質）このＣＤＡＡ食餌およびそのコントロールであるコリンを補充したＬ−アミノ酸限定（ＣＳＡＡ）食餌（Ｎａｋａｅら　１９９２；Ｎａｋａｅら　１９９０）を、Ｄｙｅｔｓ　Ｉｎｃ．、Ｂｅｔｈｌｅｈｅｍ、ＰＡから得た。ＰＢＮ、４−ＯＨＰＢＮ、３−ヒドロキシ−ＰＢＮ（３−ＯＨＰＢＮ）および２−ヒドロキシ−ＰＢＮ（２−ＯＨＰＢＮ）を、本発明者らの研究室で合成し、そして９９．９９７％の純度に精製した（Ｊａｎｚｅｎら　１９９０）。２−スルホキシ−ＰＢＮ（２−ＳＰＢＮ）を、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）から購入した。
【００４０】
（動物実験）順化後、ラットを、各５動物からなる２２群に均等に分配した。第１群の動物は、ＣＤＡＡ食餌のみを受容した。第２、３および４群は、０．００９％、０．０４５％および０．０９０％の濃度（本明細書中以降、それぞれ、低用量、中用量および高用量という）でＰＢＮを含むＣＤＡＡ食餌を受容した。第５〜７、８〜１０、１１〜１３および１４〜１６群は、それぞれ、４−ＯＨＰＢＮ、３−ＯＨＰＢＮ、２−ＯＨＰＢＮおよび２−ＳＰＢＮの低用量、中用量および高用量を含む、ＣＤＡＡ食餌を受容した。第１７群は、ＣＳＡＡ食餌のみを受容した。第１８、１９、２０、２１および２２群は、それぞれ、ＰＢＮ、４−ＯＨＰＢＮ、３−ＯＨＰＢＮ、２−ＯＨＰＢＮおよび２−ＰＢＮの高用量を含む、ＣＳＡＡ食餌を受容した。これらの化合物の用量を、ＰＢＮを飲料水中に投与した、本発明者らの以前の報告（Ｎａｋａｅら　１９９８）に従って決定した。しかし、本実験においては、本発明者らは、ＰＢＮのヒドロキシ誘導体の限定された溶解性に起因して、食餌中にこれらの化合物を投与した。全ての動物を、開始後１６週目で軽いエーテル麻酔下での瀉血によって屠殺し、そして肝臓を摘出した。肝臓の左葉、中葉および右葉から５ｍｍ厚のスライスを採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで２４時間固定し、次いで、パラフィンに包埋した。５つの連続する４μｍ厚の切片を、各固定した肝臓スライスから調製し、そして以下に記載のような組織学的および免疫組織学的な評価のために使用した。これらの肝臓の残りの部分を、直ぐに液体窒素下で凍結し、使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【００４１】
体重ならびに食物および水の摂取を、毎週モニターし、次いで、ＰＢＮおよびその誘導体の平均投与量を計算した。
【００４２】
（組織学的および免疫組織学的評価）組織学的評価を、ヘマトキシリン／エオシン手順およびマッソン三色染色手順によって慣用的に染色した切片を使用して実施した。線維症の度合いを、第１、４、７、１０、１３、１６および１７群において、定量的に評価した。これは、ＩＰＡＰ画像分析システム（Ｓｕｍｉｋａ　Ｔｅｃｈｎｏｓｅｒｖｉｃｅ、Ｃｏｒｐ．、Ｃｉｔｙ　ｏｆ　Ｏｓａｋａ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を使用して、マッソン三色法によって青色に染色されたコラーゲン線維によって占有される面積の百分率を計算することによる。ＧＳＴ−Ｐ陽性病変を、免疫組織学的に可視化した。６より多い細胞からなる病変を、他に記載のように（Ｋｉｓｈｉｄａら　２０００）、ＩＰＡＰシステムを使用して定量化した。アポトーシスおよび細胞増殖活性の量を、それぞれ、第１、４、７、１０、１３、１６および１７群において、上述のＧＳＴ−Ｐ免疫組織化学とインサイチュ末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰビオチンニックエンドラベリング法（Ｇｏｌｄら　１９９４）を組み合わせた二重染色技術、および増殖中の細胞の核抗原に対する増強ポリマー一工程染色（ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｐｏｌｙｍｅｒ　ｏｎｅ−ｓｔｅｐ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）法（Ｔｓｕｔｓｕｍｉら　１９９５）を使用して決定した。ＧＳＴ−Ｐ陽性病変における１０００〜５０００個の肝細胞および周辺組織における５０００個の肝細胞中のアポトーシス性のおよび増殖中の肝細胞の数を、光学顕微鏡下で計算してパーセンテージを得、これらを、それぞれ、本明細書中以降アポトーシス指標および増殖指標という。
【００４３】
（酸化的肝細胞損傷の決定）肝細胞に対する酸化的損傷のレベルを、凍結肝臓サンプルについて決定した。核ＤＮＡに対する酸化的損傷を、１０６のデオキシグアノシン（ｄＧ）に対する８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ＯＨｄＧ）の量の比をパラメーターとして使用して、上述のように評価した（Ｎａｋａｅら　１９９５）。核外成分に対する酸化的損傷を、タンパク質１ミリグラム当たりの２−チオバルビツール酸反応基質（ＴＢＡＲＳ）のピコモルマロンジアルデヒド等価物（ＭＤＡ　ｅｑ．）レベルを決定することによって、他に記載のように評価した（Ｎａｋａｅら　１９９０）。
【００４４】
（統計）群の平均間の偏差を決定するための分散の一方向分析、それに続く、分散の等質性を決定するためのバートレットの検定後に使用した、ダネット（Ｄｕｎｅｔｔ）多重比較検定によって、０．０５未満のｐ価が得られた場合、複数の群に対する定量化データにおける群の間の差異は、有意であると認めた。データがガウスベル型分布または非ガウス分布を示した場合に、それぞれ、スチューデントｔ検定またはウェルチ（Ｗｅｌｃｈ）ｔ検定によって０．０５未満のｐ価が得られた場合、特定の群の対に対するデータにおける群の間の差異を、有意であると見なした。
【００４５】
（結果）
（一般的発見）全てのラットが、実験期間を通じて生存した。最終体重または平均食物摂取の点においては、群の間に差異はなかった（図２の表）。コントロールの食餌を与えられたラット、すなわち、第１７群の相対的な肝臓の重量は、ＣＤＡＡ食餌のラット（第１群）より低かった；しかし、ＰＢＮもその誘導体のいずれも、コントロールの食餌を受容した動物における肝臓の重量の有意な変更を生じなかった（図２の表）。ＰＢＮおよびその誘導体の平均投与量は、化学物質間で差異を示さない投与の投与量と密接に相関した（図２の表）。
【００４６】
（ＰＢＮおよびその誘導体のＧＳＴ−Ｐ陽性病変の数および大きさに対する効果）新生物発生前の病変の数および大きさを、図３の表に要約した。ＧＳＴ−Ｐ陽性病変を、第１〜１６群において観察した。第１７〜２２群においては、病変は存在せず、従って、第１群のものより有意に低かった。ＰＢＮは、最も高い投与量でのみ、病変の数を第１群の値の５２％にまで有意に減少させた。ＰＢＮおよびその誘導体は、２つの最も低いレベルでは、病変の数に対する影響を示さない。対照的に、病変の大きさを、高投与量のＰＢＮ、３−ＯＨＰＢＮおよび４−ＯＨＰＢＮによって、第１群の値の１９％および９％にまで有意に減少した。４−ＯＨＰＢＮは、最大の効果を及ぼした。低、中、および高投与量の４−ＯＨＰＢＮは、それぞれ、病変の大きさを第１群の値の２４、１９および１８％にまで減少させた。最も低い投与量の４−ＯＨＰＢＮは、より高いその投与量と同様に効果的であり、そしてまた、ＰＢＮおよび３−ＯＨＰＢＮの最も高い投与量と同様に効果的であった。２−ＯＨＰＢＮも２−ＳＰＢＮも、病変の数および大きさに対していかなる影響も有しなかった。
【００４７】
（ＰＢＮおよびその誘導体の酸化的肝細胞損傷のレベルに対する効果）８−ＯＨｄＧおよびＴＢＡＲＳのデータをまた、図３の表に示す。第１７群の８−ＯＨｄＧの核ＤＮＡ含有量は、第１群のものより有意に低かった。ＰＢＮ、４−ＯＨＰＢＮおよび３−ＯＨＰＢＮの全ての投与量は、ＣＤＡＡ食餌の給餌によって生じた、増大した８−ＯＨｄＧ含有量を有意に阻害した。これらの効果は、投与量依存性を欠き、そして３つの化学物質間の強度は、異ならなかった。２−ＯＨＰＢＮも２−ＳＰＢＮも、第１群のものから８−ＯＨｄＧのレベルを減少させなかった。どの化学物質も、コントロールの食餌の動物の８−ＯＨｄＧ含有量に対していかなる影響も有さなかった。
【００４８】
第１７群のＴＢＡＲＳのレベルは、第１群のものよりも有意に低かった。ＰＢＮおよび３−ＯＨＰＢＮの高投与量のみがＣＤＡＡ給餌によって生じた、増強されたレベルを有意に阻害したが、４−ＯＨＰＢＮの３つ全ての投与量は、有意に効果を及ぼした。４−ＯＨＰＢＮの低い投与量は、より高いその投与量ならびにＰＢＮおよび３−ＯＨＰＢＮの高投与量同様に効果的であった。２−ＯＨＰＢＮも２−ＳＰＢＮも、ＴＢＡＲＳレベルに影響しなかった。ＣＳＡＡコントロール食餌が与えられた場合、どの化学物質も、いかなる影響も有さなかった。
【００４９】
（ＧＳＴ−Ｐ陽性病変および周辺組織における、ＰＢＮおよびその誘導体の、肝細胞のアポトーシスおよび増殖に対する効果）ＧＳＴ−Ｐ陽性病変およびその周辺組織におけるアポトーシス指標および増殖指標を、図４の表に要約する。第１７群の周辺組織におけるアポトーシス指標は、第１群のものより有意に低かった。このアポトーシス指標は、第１群の周辺組織においてよりも病変部において有意に低かった。ＰＢＮ、４−ＯＨＰＢＮおよび３−ＯＨＰＢＮの高投与量は、病変部におけるアポトーシス指標を、第１群の値を約３〜４倍上回って有意に増大させたが、周辺組織におけるこの指標を約４０％にまで有意に減少させた。結果として、アポトーシス指標は、これらの群の周辺組織においてよりも病変部において有意に高くなった。効果の強度は、３つの化学物質間で有意には異ならなかった。２−ＯＨＰＢＮも２−ＳＰＢＮも、アポトーシス指標を変更しなかった。
【００５０】
第１７群の周辺組織における増殖指標は、第１群のものより有意に低かった。この増殖指標は、第１群の周辺組織においてよりも病変部において有意に高かった。高投与量の４−ＯＨＰＢＮのみが、増殖指標を病変部において第１群の値の約３１％にまで、周辺組織において第１群の値の約４９％にまで、両方とも有意に減少させた。結果として、病変部における増殖指標は、第１７群の周辺組織における増殖指標よりなお有意に高いが、これに近づいた。コントロールの群においては、他のどの化学物質も、増殖指標にいかなる影響も有さなかった。
【００５１】
（ＰＢＮおよびその誘導体の組織学的肝臓損傷に対する効果）第１群において、広範囲な線維症を、脂肪肝に関連して組織学的に観察した。どの化学物質も、脂肪肝にいかなる影響も有さなかった。ＰＢＮ、４−ＯＨＰＢＮおよび３−ＯＨＰＢＮは、線維症を阻害したが、２−ＯＨＰＢＮも２−ＳＰＢＮも、阻害しなかった。第１、４、７、１０、１３、１６および１７群における線維症の度合いを、図４の表に要約する。第１７群の値は、第１群の値より有意に低かった。ＰＢＮ、４−ＯＨＰＢＮおよび３−ＯＨＰＢＮの高投与量は、線維症の度合いにおいて第１群の値から有意に低かった。この効果の強度は、３つの化学物質間で異ならなかった。高投与量の２−ＯＨＰＢＮも２−ＳＰＢＮも両方とも、線維症の度合いに影響を有しなかった。第１７〜２２群においては、特別な組織学的変化は、注目されなかった。
【００５２】
（議論）
本結果は、ＰＢＮ、４−ＯＨＰＢＮおよび３−ＯＨＰＢＮがＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットにおける早期の肝癌形成を阻害するが、２−ＯＨＰＢＮまたは２−ＳＰＢＮが阻害しないことを実証し、そして４−ＯＨＰＢＮがＰＢＮおよび３−ＯＨＰＢＮより大きな効果を及ぼすことを実証する。ＧＳＴ−Ｐ陽性病変の数は高投与量のＰＢＮによって陽性コントロールレベルの約半分に減少したが、その大きさは、ＰＢＮ、４−ＯＨＰＢＮおよび３−ＯＨＰＢＮによって約２０％以下に減少した。酵素変更肝臓病変の大きさおよび数は新生物発生前の肝細胞集団の誘導および増殖を反映すると考えられることから（Ｐｉｔｏｔら　１９８９）、従って、４−ＯＨＰＢＮおよび３−ＯＨＰＢＮは新生物発生前の肝臓の病変の誘導を阻害するよりも顕著にその増殖を阻害することが、示唆される。本発明者らはすでに、ＰＢＮについての結果を記述した（Ｎａｋａｅら　１９９８）。核ＤＮＡおよび核外成分の両方に対する酸化的肝細胞損傷は、ＰＢＮ、４−ＯＨＰＢＮおよび３−ＯＨＰＢＮによって阻害されるが、２−ＯＨＰＢＮまたは２−ＳＰＢＮによっては阻害されなかった。ＴＢＡＲＳについての阻害プロファイルは、ＧＳＴ−Ｐ陽性病変の大きさに対するプロファイルと同等であった。核ＤＮＡおよび核外成分に対する酸化的肝細胞損傷はそれぞれＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットにおける新生物発生前の肝細胞集団の誘導および増殖に関与することから（Ｎａｋａｅら　１９９４；およびＫｏｂａｙａｓｈｉら　１９９８）、酸化的ストレスの阻害は、ＰＢＮ、４−ＯＨＰＢＮおよび３−ＯＨＰＢＮの抗発癌効果に重要な構成要素であると考えられる。
【００５３】
ＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットの肝臓において、給餌の３日目から、肝細胞のアポトーシスは誘導され、そして肝細胞の核外成分に対する酸化的損傷に密接に関与して蓄積する（Ｙｏｓｈｉｊｉら　１９９２）．これは、肝細胞ミトコンドリアによって過酸化水素の過剰産生が生じる時点である（Ｈｅｎｓｌｙ　２０００）。これは、ＴＢＡＲＳレベルの増大と密接に関連する（Ｙｏｓｈｉｊｉら　１９９２）。本結果は、周辺組織における状況と比較した場合、アポトーシスがＧＳＴ−Ｐ陽性病変において抑制されることを示す。酸化的ストレスはアポトーシスを誘導するシグナル伝達を影響し（Ｎｏｓｅ　２０００）、変更された肝細胞を除去するが（Ｌｏｗｅら　２０００；およびＷｙｌｌｉｅら　１９９９）、アポトーシスのシグナル伝達がいくつかの新生物発生前の肝細胞においては調節されず（Ｒｅｅｄ　１９９９）、その結果、これらの細胞が新生物発生前の病変中に成長し得ることを可能にする、アポトーシスに対する抵抗性を獲得するらしいということが示唆される。いくつかの新生物発生前の細胞におけるアポトーシスのシグナル伝達の変化は、外因性の肝癌形成の間に化学的毒性に対する抵抗性の獲得に類似する（Ｆａｒｂｅｒ　１００６）。この文脈において、ＰＢＮ、４−ＯＨＰＢＮおよび３−ＯＨＰＢＮは、新生物発生前および非新生物発生前の肝細胞における酸化的ストレス仲介アポトーシス事象に対して異なる効果を及ぼして、前者の除去および後者の維持の増強を導き得ると考えられる。ＧＳＴ−Ｐ陽性病変の周辺組織におけるアポトーシスの阻害は、例えば、腫瘍壊死因子−α、インターロイキン−１αおよび１−β、インターフェロン−γ、ｃ−ｆｏｓ、カスパーゼ−３ならびにｆａｓ−Ａの過剰発現といった、プロアポトーシスのシグナル伝達因子に対するＰＢＮの阻害効果に起因し得る（Ｐｏｇｒｅｂｎｉａｋら　１９９１；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ　１９９９；Ｓａｎｇら　１９９９；およびＳｔｅｗａｒｔ　１９９９）。対照的に、ＰＢＮおよびその活性な誘導体によってＧＳＴ−Ｐ陽性病変においてアポトーシスが増強される理由については未知であり、そして本発明者らの研究室において活発な調査下にある。可能性のある標的分子の１つは、核因子−κＢである。なぜなら、その活性化がＰＢＮによって阻害されるからである（Ｋｏｔａｋｅら　１９９８）。（前）新生物発生細胞における自己増殖は、細胞増殖についての調節システムの種々の改変の結果である。このシステムは、化学防御の最も重要な標的の１つであると考えられてきた（Ｋｒｕｐｐら　２０００；およびＭｏｒｉら　１９９９）。ＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットの肝臓において、ｃ−ｍｙｃおよびｃ−Ｈａ−ｒａｓは、２日以内に過剰発現し（Ｔｓｕｊｉｕｃｈｉら　１９９５）、次いで肝細胞の増殖は、３日目からＴＢＡＲＳの増大に密接に関連して誘導される（Ｙｏｓｈｉｊｉら　１９９２）。本発明者らが実証したように、肝細胞の増殖活性は、周辺細胞においてよりもＧＳＴ−Ｐ陽性病変において高い。本研究において、４−ＯＨＰＢＮのみが、肝細胞の増殖を阻害した。この阻害は、周辺細胞においてよりもＧＳＴ−Ｐ陽性病変においてより顕著であった。これはおそらく、４−ＯＨＰＢＮの化学��御的有効性がＰＢＮまたは３−ＯＨＰＢＮよりも大きいことの主要な理由の１つである。
【００５４】
ＰＢＮの水酸基誘導体の生物学的な効果については、ほとんど知られていない。本発明者らは、少なくとも本モデルにおいて、４−ＯＨＰＢＮ、３−ＯＨＰＢＮおよび２−ＯＨＰＢＮが、ＰＢＮよりもそれぞれ、より効果的、同等、またはより効果が低いことを実証した。明らかに、水酸基の位置は、これらのＰＢＮ誘導体の効果において重要である。４−ＯＨＰＢＮへの代謝的変換がＰＢＮの抗肝癌形成効果において重要な役割を果たし得る可能性は高い。対照的に、２−ＳＰＢＮの化学防御的効果の欠如は、その親水性の性質に起因し得る（Ｋｏｔａｋｅ　１９９９）。２−ＳＰＢＮの遊離基捕捉の有効性は、ＰＢＮと同等に強力であるか、または水性の環境においてはＰＢＮよりまさに強い（Ｋｏｔａｋｅ　１９９９）。さらに、２−ＳＰＢＮは、親水性の層において誘導される酸化的ストレスによって媒介される種々の障害に対する阻害効果を示す（Ｆａｌｌｏｎら　１９９７；Ｈａｒｋｉｎｓら　１９９７；およびＳｃｈｕｌｚら　１９９５）。親油性抗酸化剤のＮ，Ｎ’−ジフェニル−ｐ−フェニレンジアミンは、ＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットの肝臓において、ＧＳＴ−Ｐ陽性病変の数を影響することなくその大きさを減少させる（Ｎａｋａｅら　１９９４）。この様式において、これは４−ＯＨＰＢＮおよび３−ＯＨＰＢＮに類似する。親油性ビタミンＣ誘導体の２−Ｏ−オクタデシルアスコルビン酸は、ＣＤＡＡ食餌の長期の給餌によるラットの肝癌形成を、その親水性の親であるＬ−アスコルビン酸より大きく阻害する（Ｍｉｚｕｍｏｔｏら　１９９４）。本結果は、親油性の層において誘導される酸化的ストレスがＣＤＡＡ食餌を給餌されたラットにおける肝癌形成にて重要な機構的因子および化学防御的標的の両方であることを示唆する。
【００５５】
結論として、ＰＢＮ、４−ＯＨＰＢＮ、２−ＯＨＢＰＮ、２−ＳＯＢＰＮおよび３−ＯＨＰＢＮは、新生物発生前の細胞におけるアポトーシスの選択的誘導および酸化的ストレスの阻害によって、おそらく有用な癌化学防御剤として働く。さらに、ＰＢＮの主要な代謝産物の４−ＯＨＰＢＮは、新生物発生前の細胞の増殖を阻害するそのさらなる能力に起因して、特に効果的であり得る。
【００５６】
（参考文献）
以下の引用文献は、本出願の詳細な補充のために本明細書中に参考として援用される：
【００５７】
【化１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＣＤＡＡ食餌を７０週間給餌したラットにおける、ＨＣＡ、ＨＣＣおよび線維症の誘導に対するＰＢＮの効果を示す表である。
【図２】図２は、ＣＤＡＡ±種々の量のニトロンの結果を示す表である。
【図３】図３は、ラットのＧＳＴ−Ｐ陽性の肝臓病変の数および大きさならびに酸化的な肝細胞の損傷のレベルの結果を示す表である。
【図４】図４は、ラットの肝臓におけるアポトーシス指標および線維症の度合いの結果を示す表である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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