(57)【要約】生物活性ペプチドが野生型修飾ペプチドと比較して高い溶解度、すなわち低い凝集傾向を有するように修飾されている。特に、修飾ヒトカルシトニンは、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有し且つ修飾ペプチドの凝集傾向が非修飾ヒトカルシトニンと比較して低くなるように修飾されているペプチドからなる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有し且つ修飾ペプチドの凝集傾向が非修飾ヒトカルシトニンと比較して低くなるように修飾されているペプチドからなることを特徴とする修飾ヒトカルシトニン。
【請求項２】
ペプチドと配列番号１の違いが６アミノ酸残基以下であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の修飾カルシトニン。
【請求項３】
ペプチドと配列番号１の違いが５アミノ酸残基以下であることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の修飾カルシトニン。
【請求項４】
ペプチドが５Ｎ−末端アミノ酸内ではヒトカルシトニンと比較して非修飾であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載の修飾カルシトニン。
【請求項５】
ペプチドが１０Ｎ−末端アミノ酸内ではヒトカルシトニンと比較して非修飾であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載の修飾カルシトニン。
【請求項６】
ペプチドが５Ｃ−末端アミノ酸内ではヒトカルシトニンと比較して非修飾であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の修飾カルシトニン。
【請求項７】
ペプチドが１０Ｃ−末端アミノ酸内ではヒトカルシトニンと比較して非修飾であることを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の修飾カルシトニン。
【請求項８】
配列番号１中の置換のためのアミノ酸が１１、１２、１５、１６、１７、１９、２０及び２４から選択されることを特徴とする請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の修飾カルシトニン。
【請求項９】
Ｎｏ．１１、１２、１５、１６、１７、１９、２０及び２４の２個以上のアミノ酸が野生型ヒトカルシトニンと比較して置換されていることを特徴とする請求の範囲第８項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ペプチドが
【化１】
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から選択されることを特徴とする請求の範囲第１項〜第９項のいずれか１項に記載の修飾カルシトニン。
【請求項１１】
請求の範囲第１項〜第１０項のいずれか１項に記載の修飾ペプチド及び医薬的に許容され得る担体を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
パジェット病、高カルシウム血症または骨粗しょう症の治療に使用するための請求の範囲第１項〜第１１項のいずれか１項に記載の医薬組成物または修飾ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、野生型非修飾ペプチドと比較して高い溶解度または低い凝集傾向を有する修飾ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、各種症状の治療において使用するために多数の生物活性ペプチド及びタンパク質が提案されている。前記ペプチドの使用は、患者に投与した後または貯蔵時にペプチドが凝集物を形成する傾向があるために制限されていることが多い。凝集ペプチドの活性は非凝集ペプチドより弱いことがある。場合により、このヒト野生型ペプチドまたはタンパク質の凝集傾向により、患者への投与時または貯蔵中の凝集傾向が低い他の種のペプチドが使用されるようになった。代替ソース由来のペプチドを使用するときの欠点は耐性が生じ、そのため非ヒト形態のペプチドに対して免疫応答が生ずるためにペプチドの有効性が低下する可能性があることである。
【０００３】
前記ペプチドの１例がカルシトニンである。カルシトニンは、カルシウム及びリン酸イオンの骨への取り込みを促進することにより前記イオンの血中レベルを迅速に一時的に低下させる。カルシトニンは哺乳動物の甲状腺のＣ細胞において産生される３２残基長のポリペプチドホルモンであり、カルシウム調節及び骨動力学に関与している（Ｓ．Ｌ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．，３１３：１３−１６（１９９７））。
【０００４】
現在、サケカルシトニンが骨粗しょう症やパジェット病を治療するための薬物としてヒトカルシトニンの代わりに使用されている。これは、ヒトカルシトニンが低濃度であってもインビボ及びインビトロで高い凝集傾向を有しているからである（Ｋ．Ｓｌｅｔｔｅｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１４３：９９３−９９８（１９７６）；Ｍ．Ｍ．Ｓｉｌｖｅｒら，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３６：１０３１−１０３６（１９８８）；Ｐ．Ｓｉｅｂｅｌら，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，５３：２１３５−２１５０（１９７０）；Ｔ．Ａｒｖｉｎｔｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：６４１５−６４２２（１９９３））。このことは、凝集したときに他の治療用ペプチドについて報告されているように（Ａ．Ｂｒａｕｎら，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，１４：１４７２−８（１９９７）；Ｌ．Ｃｕｒａｔｏｌｏら，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，９：７３４−９（１９９７）；Ｊ．Ｂｒａｎｇｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８６：５１７−５２５（１９９７））、凝集カルシトニンはその生理学的機能を発揮できず、望ましくない免疫応答を発生させたり細胞毒性を発生させる恐れがあるので薬物の製造、加工及び投与中に重大な問題となる。
【０００５】
しかしながら、サケカルシトニンの凝集傾向は弱い。ただし、その活性は（凝集を防止したときの）ヒトカルシトニンと比較して低い（Ａ．Ｃｕｄｄら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，８４：７１７−７１９（１９９５））。サケカルシトニンのヒトカルシトニンとの配列同一性は低い（３２残基中１６残基が異なる、すなわち５０％の配列同一性）。このために、サケカルシトニンを用いて長期間治療すると、患者が薬物に対する抗体を産生するために耐性またはアレルギーを生じ易い（Ｆ．Ｌｅｖｙら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．＆  Ｍｅｔａｂｏｌ．，６７：５４１−５４５（１９８８）；Ｒ．Ｍｕｆｆら，Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ  Ｉｎｔ．，１：７２−７５（１９９１）；Ａ．Ｇｒａｕｅｒら，Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｄｉａｂｅｔｓ，１０３：３４５−３５１（１９９５））。こうなると、投与する薬物の用量を増加させなければならず、最後には治療が総合的に無効となり得る。
【発明の開示】
【０００６】
本発明の目的は、溶解度が上昇する、すなわち凝集傾向が低下した野性型生物活性ペプチドの修飾形態を設計することである。前記した生物活性ペプチドはサケカルシトニンと比較してヒト形態のペプチドと高い配列同一性を示すが、ヒト形態よりも低い凝集傾向を示す、すなわちより可溶性である。野生型配列と比較して低い凝集傾向を有する前記ペプチドを提供すれば、ペフチドの産生及び操作がより簡単となる。また、凝集が防止されると、同一効果を得るのに使用する薬物の用量を減らすことができ、患者が該ペプチドに対して耐性を示す可能性が少なくなる。更に、ヒトカルシトニンと高い配列同一性を維持することにより、修飾ペプチドはヒト配列とほぼ同様の生理学的活性を有することができ、よって副作用及び望ましくない応答の発現が最小限に抑えられる。
【０００７】
本発明によれば、配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有し且つ修飾ペプチドの凝集傾向が非修飾ヒトカルシトニンと比較して低くなるように修飾されているペプチドからなる修飾ヒトカルシトニンが提供される。
【０００８】
本明細書に記載されているカルシトニンに対する修飾は関連ペプチド（例えば、カルシトニン関連ペプチドＩ）及び他の生物活性ペフチド及びタンパク質（例えば、ＩＡＰＰ）にも適用され得る。よって、他の態様で、本発明によれば、天然の生物活性ペプチドと少なくとも７０％の同一性を有し、非修飾ペプチドと比較して凝集傾向が低くなる、すなわち溶解度が上昇するようにペプチドが修飾されている修飾生物活性ペプチドが提供される。種間で多形性であるアミノ酸残基が変異のために選択されるように修飾が選択されることが好ましい。
【０００９】
（配列の説明）
配列番号１は配列ＣＧＮＬＳＴＣＭＬＧＴＹＴＱＤＦＮＫＦＨＴＦＰＱＴＡＩＧＶＧＡＰを有するヒトカルシトニンである。
【００１０】
配列番号２はマウスカルシトニンのアミノ酸配列である。
【００１１】
配列番号３はラットカルシトニンのアミノ酸配列である。
【００１２】
配列番号４はウシカルシトニンのアミノ酸配列である。
【００１３】
配列番号５はイヌカルシトニンのアミノ酸配列である。
【００１４】
配列番号６はブタカルシトニンのアミノ酸配列である。
【００１５】
配列番号７はヒツジカルシトニンのアミノ酸配列である。
【００１６】
配列番号８はサケ−３カルシトニンのアミノ酸配列である。
【００１７】
配列番号９はサケ−２カルシトニンのアミノ酸配列である。
【００１８】
配列番号１０はサケ−１カルシトニンのアミノ酸配列である。
【００１９】
配列番号１１はウナギカルシトニンのアミノ酸配列である。
【００２０】
配列番号１２はトリカルシトニンのアミノ酸配列である。
【００２１】
配列番号１３〜１８は本発明の修飾ポリペプチドである。
【００２２】
配列番号１９はヒトアドレノメジュリンのアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号２０はヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド−１のアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号２１はヒトカルシトニン遺伝子関連ペプチド−２のアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号２２はヒトＩＡＰＰ（アミリン）のアミノ酸配列である。
【００２６】
（発明の詳細説明）
本発明は、天然の生物活性ペプチドと少なくとも７０％の同一性を有し、非修飾ペプチドと比較して凝集傾向が低くなる、すなわち溶解度が上昇するようにペプチドが修飾されている修飾生物活性ペプチドを提供する。１態様で、本発明は配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有し、非修飾ヒトカルシトニンと比較して凝集傾向を低下させる、すなわち溶解度を上昇させるように修飾されている修飾ヒトカルシトニンを提供する。
【００２７】
本発明に従って修飾される生物活性ペプチドは治療または診断において用いられるペプチドである。特に、凝集傾向により有用性が限定されているペプチドが本発明に包含される。カルシトニンがそのようなペプチドの１例である。本発明に従って修飾される生物活性ペプチドは治療を要するヒトに投与するためにヒトペプチドが好ましい。
【００２８】
本発明によれば、生物活性ペプチドは該ペプチドの凝集傾向を低下させる、すなわち該ペプチドの溶解度を上昇させるべく修飾されている。好ましくは、修飾ペプチドは非修飾ペプチドに対して少なくとも７０％の同一性、好ましくは非修飾ペプチドに対して少なくとも８０％、８４％、８７％、最高９０％の同一性を保持している。好ましくは、本発明のペプチドに対する修飾は置換によりなされる。よって、同一性（％）は、配列間にギャップを挿入することなく非修飾ペプチドと最良の考えられるアラインメントを得、野生型配列と比較したアミノ酸置換の数を計算することにより計算され得る。
【００２９】
本発明によれば、修飾ペプチドは１，２，４，５，６，７，８または９〜１０，１５，１７，２０，３０または４０アミノ酸修飾を有し得、長さが２０，３０または４０アミノ酸残基を有するような短ペプチドの場合には特に２，４，５，６，７または８のような少数の修飾が好ましい。例えば、３２アミノ酸ペプチドのカルシトニンの場合には、ペプチドが配列番号１と比較して８以下、好ましくは７以下のアミノ酸変化を有し、最も好ましくは野生型配列と比較して６乃至５、またはより少ない修飾アミノ酸を有する。好ましくは、修飾ペプチドが非修飾ペプチドの活性の全部でなくとも一部を保持するように修飾を最低限に保つ。
【００３０】
修飾のための好ましいアミノ酸は多数の方法で同定され得る。ペプチドの活性部位以外の領域を修飾することが好ましい。修飾のための好ましい領域には、異なる種の中でペプチドが多形性である領域が含まれる。例えば、カルシトニンの場合、ヒト形態はカルシトニンのサケ形態とアラインされ得る。多形性残基はカルシトニンのヒト形態中の考えられる修飾のために同定され、標的とされ得る。修飾は、生物活性ペプチドのヒト形態中のアミノ酸が他の種由来のペプチド中のその位置に存在するものに修飾されるようになされ得る。
【００３１】
好ましくは、α−ヘリカルタイプの局部相互作用を形成するポリペプチドの性質を向上させるアミノ酸置換を選択する。各種ポリペプチドのヘリカル性は半経験的ａｇａｄｉｒアルゴリズム（Ｍｕｎｏｚ及びＳｅｒｒａｎｏ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１：３９９−４０９（１９９４）；Ｍｕｎｏｚ及びＳｅｒｒａｎｏ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４５：２９７−３０８（１９９４）；Ｍｕｎｏｚ及びＳｅｒｒａｎｏ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，４１：４９５−５０９（１９９７）；及びＬａｃｒｏｉｘら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８４：１７３−１９１（１９９８））、並びにＰＨＤ（Ｂ．Ｒｏｓｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３２：５８４−５９９（１９９３））、ＰＲＯＦ（Ｂ．Ｒｏｓｔら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：５２５−５３９（１９９６））及びＧＯＲ４（Ｊ．Ｇａｒｎｉｅｒら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２０：９７−２０（１９７８）；Ｇａｒｎｉｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：５４０−５５３（１９９６））を含めた他の利用可能なアルゴリズムを用いて予測され得る。構造データーベース、構造選択データーベース及び回転異性体選択データーベースに基づく別のアルゴリズムをこの目的のために使用及び／または設計することもできる。
【００３２】
ペプチド修飾は、疎水性残基の数を減らしたりペプチドの実効電荷を増加させるように実施される。よって、生物活性ペプチドのヒト形態が疎水性アミノ酸を含んでいる場合や非ヒト形態が同じ位置に極性または乏疎水性残基を有している場合には、前記残基は非ヒト形態のアミノ酸残基または別の極性または乏疎水性残基に修飾するために選択される。アミノ酸疎水性は公知のスケールを用いて確定され得る（Ｊ．Ｋｙｔｅ，Ｒ．Ｆ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５−１３２（１９８２）；Ｓ．Ｄ．Ｂｌａｃｋら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９３：７２−８２（１９９１）；Ｗ．Ｃ．Ｗｉｍｅｙ及びＳ．Ｈ．Ｗｈｉｔｅ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，３：８４２−８４８（１９９６）；Ｗ．Ｃ．Ｗｉｍｌｅｙら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：５１０９−５１２４（１９９６））。更に、実効電荷を増加させるためにアミノ酸置換を導入すると、異なるペプチド鎖間で反発を形成することにより設計配列を助け、よってペプチドの溶解度を高め、その凝集を減らす方向に向かう。置換の電荷効果が低ｐＨ値で操作されるので塩基性残基の導入が特に好ましいことがある。保存アミノ酸置換下表に示す。
【００３３】
【表１】
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【００３４】
実効電荷を増加させたいときには、前記置換は非保存的であってもよいが、ポリペプチドの電荷を増加させるかまたは疎水性を低下させるという所望効果を有するように選択される。
【００３５】
以下、特にカルシトニンを参照して本発明を更に説明する。カルシトニンは３２アミノ酸ペプチドである。修飾のために適当なアミノ酸を同定するために他の種由来のカルシトニンとの比較を行った。ヘリカル相互作用を高めるための修飾はより高いヘリカル性を有するペプチドの領域において優先的に位置する。好ましくは、各残基のα−ヘリカル性をＡｇａｄｉｒ、ＰＤＦ、ＰＲＯＦまたはＧＯＲ−４のような予測アルゴリズムまたはタンパク質及びペプチド構造データーベースに基づく他のアルゴリズムを用いて推定する。本発明の好ましい実施態様では、アミノ酸変化を活性部位以外の場所で生ずるように選択する。特に、Ｎｏｓ．１及び７のシステインがジスルフィド橋を形成している環状Ｎ末端ドメインに影響を及ぼさないように修飾を選択する。本発明の１実施態様では、改変または置換はより高いα−ヘリカルであると予測されるペプチドの中間部分内にある。Ｎ末端内、例えば５Ｎ末端アミノ酸内、好ましくは１０Ｎ末端アミノ酸内を置換しないことが特に好ましい。上記の代わりにまたはそれに加えて、５Ｃ末端アミノ酸内、好ましくは１０Ｃ末端アミノ酸内を修飾しないことが好ましい。好ましい修飾は、ヒトカルシトニンのＮ末端アミノ酸を残基１とナンバリングし、１文字アミノ酸コード：Ｎｏ．１１のＴ、Ｎｏ．１２のＹ、Ｎｏ．１５のＤ、Ｎｏ．１６のＦ、Ｎｏ．１７のＮ、Ｎｏ．１９のＦ、Ｎｏ．２０のＨ及びＮｏ．２４のＱを用いるとして、下記した通りである。
【００３６】
好ましい置換は、アミノ酸残基の疎水性を低下させるかまたはペプチドの凝集傾向を低下させるものである。好ましい置換は、別の種由来のカルシトニン中の同等位置に存在するアミノ酸残基を取り込んだものまたは他の種に存在する電荷と同じ電荷を持つものである。特に好ましい置換には、Ｎｏ．１１のＴ→Ｋ、Ｎｏ．１２のＹ→Ｌ、Ｎｏ．１５のＤ→Ｅ、Ｎｏ．１６のＦ→Ｌ、Ｎｏ．１７のＮ→ＬまたはＲ、Ｎｏ．１９のＦ→Ｌ、Ｎｏ．２０のＨ→Ｌ、Ｎｏ．２４のＱ→Ｒが含まれる。
【００３７】
本発明の特に好ましい実施態様では、ポリペプチドはＮｏｓ．１１、１２、１５、１６、１７、１９、２０及び２４の１つ以上の位置に修飾を有する配列番号１からなる。本発明の特に好ましい実施態様では、ポリペプチドは前記位置の修飾を少なくとも２つ含む。本発明の好ましい実施態様では、変異カルシトニンはＮｏｓ．１１、１２、１５、１６、１７、１９、２０または２４の修飾以外に追加の修飾を含まない。本発明の好ましい実施態様では、修飾ポリペプチドは配列番号２または配列番号３ではない。本発明のポリペプチドは、例えば同定または精製を助けるためにヒスチジン残基を付加することにより修飾され得る。この追加残基は使用前に開裂され得る。或いは、ポリペプチドを組換えにより産生しようとする細胞からの分泌を促進すべくシグナル配列を付加してもよい。環状Ｎ末端及び／またはＣ末端アミド化のような他の慣用されている修飾を含めてもよい。
【００３８】
本発明の修飾ペプチドは、非修飾ペプチドと比較して低い凝集傾向、すなわち高い溶解度を有する。修飾ペプチドが非修飾ペプチドの活性の一部または全部を維持していることが好ましい。前記活性は、例えばインビトロ細胞アッセイにより、または関係するペプチドに応じて適当な動物モデルを用いて容易にモニターされ得る。
【００３９】
凝集特性は適当な方法によりモニターされ得る。コンピューターモデリングにより、修飾ペプチドを設計し、その凝集性をモニターし得る。或いは、ペプチドをインビトロでインキュベートすることにより調べることもできる。インキュベートしたペプチド溶液の濁度を数時間、数日間または数週間モニターしてもよい。非修飾ペプチドの濁度との比較をコントロールとして採用して、ペプチドの凝集性及び溶解度に対する修飾の影響を評価し得る。
【００４０】
上記した修飾を含むように設計されるポリペプチドは当業界で公知のポリペプチド合成方法により作成され得る。通常、本発明のポリペプチドは化学合成、または組換えインビトロまたはインビボ発現により産生される。
【００４１】
ポリペプチドは各種固相技術（例えば、Ｒｏｂｅｒｇｅら，１９９５）を用いて化学的に合成され得、自動合成は例えばＡＢＩ  ４６１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて実施され得る。
【００４２】
ポリペプチドの組換えインビトロまたはインビボ産生は本発明のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを発現することにより達成され得る。
【００４３】
更なる態様で、本発明は本発明のポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチド配列は遺伝コードの縮重及びポリヌクレオチドを発現させる特定生物にとって好ましいコドンの使用にてらして設計され得る。ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡであり得、本発明のポリヌクレオチド及びその相補体を含む一本鎖または二本鎖であり得る。よって、ポリヌクレオチドは本質的に本発明のアミノ酸配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡから構成される。
【００４４】
ポリヌクレオチドの範囲に合成または修飾ヌクレオチドが含まれ得る。ポリヌクレオチドに対する多種多様の修飾が当業界で公知である。本発明では、本明細書に記載されているポリヌクレオチドは当業界で利用可能な方法により修飾され得ると理解されたい。前記修飾は、例えば本発明のポリヌクレオチドのインビトロ活性または寿命を変化させるために実施され得る。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドは、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）または別の増幅反応（例えば、増幅または部位特異的突然変異を促進するために）において使用するためのプライマーを作成するために使用可能である。前記プライマー及び他の断片は少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド、例えば少なくとも２５、３０または４０ヌクレオチドの長さを有し、本明細書中に使用される用語「本発明のポリヌクレオチド」に包含される。
【００４６】
本発明のＤＮＡポリヌクレオチド及びプライマーのようなポリヌクレオチド及びその非修飾形態は、組換え方法、合成方法または当業者が利用可能な手段を用いて産生され得る。これらを一般的技術を用いてクローン化してもよい。よって、ポリヌクレオドは当業界で入手可能なベクターにクローン化され得る。ポリヌクレオチドは通常単離及び／または精製形態で提供される。
【００４７】
一般的に、本発明の短ポリヌクレオチド（例えば、プライマー）は所望の核酸配列の段階的製造を含む合成方法により作成される。自動化技術を用いてこれを達成する方法は当業者に自明である。
【００４８】
本発明の長ポリヌクレオチド及びその非修飾形態は、短ポリヌクレオチドを一般的技術を用いて組み合せることにより、例えばライゲーションにより産生され得る。これらは組換え方法、例えばＰＣＲクローン化方法を用いても産生され得る。この方法は、クローン化したい遺伝子領域に（例えば、約１５−３０ヌクレオチドを有する）１対のプライマーを作成し、前記プライマーを標的ポリヌクレオチドと接触させることを含む。非修飾形態の場合、使用される標的ポリヌクレオチドは通常ゲノムＤＮＡ（全遺伝子をクローン化し得る、通常イントロン及びプロモーター領域を含む）、ｍＲＮＡまたはそこから作成されるｃＤＮＡの形態で細胞から得られる。本発明のポリヌクレオチドを産生するためには、任意の手段で作成される少量のポリヌクレオチドをＰＣＲ増幅反応において標的ポリヌクレオチドとして使用し得る。増幅は選択的増幅に適した条件下で実施される。所望領域を増幅後、増幅した断片を（例えば、反応混合物をアガロースゲル上で精製することにより）単離し、回収し得る。プライマーは、増幅したＤＮＡが好適なクローン化ベクターにクローン化し得るべく適当な酵素認識部位を含むように設計され得る。
【００４９】
通常本明細書に記載されている方法は当業界で公知であるが、特にＳａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，「分子クローニング  実験マニュアル(Molecular Cloning, a laboratory manual)」，第３版，ニューヨークに所在のＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００１年）発行及びそれ以前の版（例えば、１９８９年発行のもの））を参照してもよい。
【００５０】
本発明のポリヌクレオチドは、非修飾配列を含むポリヌクレオチドを部位特異的突然変異にかけて得ることができる。この方法は任意の方法で実施され得る。通常、この方法はＰＣＲにより実施され得る。前記方法には通常、所望の改変をもたらすのに適したヌクレオチド残基での変化以外の突然変異を所望する非修飾配列の領域とほぼ同一のヌクレオチド配列を含むプライマーの使用が含まれる。その後このプライマーをＰＣＲ増幅反応で使用するとＰＣＲ産物のヌクレンチド配列に所望の変化が導入される。部位特異的突然変異の所望部位は通常遺伝子のコード配列内にあり、従ってＰＣＲ産物は標的ポリヌクレオチドの切断形態であり得る。本発明の完全長修飾ポリヌクレオチドは、増幅産物を（任意の方法で作成した）非修飾または修飾配列を有する他のポリヌクレオチドと組み合せることにより作成され得る。組合せは当業界で公知の方法、例えばライゲーションにより実施され得る。この方法は、ポリヌクレオチド配列を発現させる特定宿主細胞のコドン選択を最適にするためにサイレントコドン変化が必要であるような場合にも有用であり得る。制限酵素認識部位を導入するため、またはポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの特性または機能を更に改変または修飾するために他の配列変化が所望されることもある。
【００５１】
作成した修飾ポリヌクレオチドは配列決定することにより所望配列について調べる。これは、例えば標的として推定修飾ポリヌクレオチドを含むサンプルと本発明のポリヌクレオチドを含むプローブまたはプライマーをハイブリダイズ条件で接触させ、配列を例えばＳａｎｇｅｒジデオキシ鎖終結方法（上掲のＳａｎｂｒｏｏｋら，２００１または１９８９参照）により決定することにより実施され得る。
【００５２】
前記方法は通常、標的ポリヌクレオチドに相補性の鎖を合成することによりプライマーを好適な試薬の存在下で延長し、延長反応物をＡ、Ｃ、ＧまたはＴ／Ｕ残基の１つ以上で選択的に終結させ、鎖延長及び終結反応を実施し、サイズに従って延長産物を分離して選択的終結が生じたヌクレオチド配列を決定することを含む。好適な試薬には、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、緩衝液及びＡＴＰが含まれる。選択的終結のためにジデオキシヌクレオチドが使用される。
【００５３】
本発明のポリヌクレオチドは当業界で入手可能なベクターに組み込まれ得る。本発明のベクターは本質的に本発明のポリヌクレオチドから構成される。通常、ベクターは組換え複製可能なベクターである。ベクターは適合性宿主細胞において核酸を複製するために使用され得る。よって、更なる態様で、本発明は本発明のポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入し、前記ベクターを適合性宿主細胞に導入し、前記宿主細胞をベクターを複製し得る条件下で増殖させることによる本発明のポリヌクレオチドの作成方法を提供する。ベクターは宿主細胞から回収される。好適な宿主細胞については発現ベクターと関連して以下に記載する。
【００５４】
ベクター中の本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞によりコード配列を発現させ得る調節配列に作動的に連結されていることが好ましい。ここで、ベクターは発現ベクターである。前記発現ベクターは本発明のポリペプチドを発現させるために使用され得る。
【００５５】
「作動的に連結」は、成分が意図するように機能し得る関係にある近位を指す。コード配列に「作動的に連結」した調節配列は、コード配列が調節配列に適合する条件下で発現するように連結されている。
【００５６】
前記ベクターを上記した好適な宿主細胞に形質転換すると、本発明のポリペプチドまたはその断片が発現する。よって、更なる態様で、本発明は上記した発現ベクターを形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞をポリペプチドを発現させる条件下で培養し、発現したペプチドを回収することを含む本発明のポリペプチドの産生方法を提供する。
【００５７】
ベクターは、例えば複製起源と場合によりポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター及びプロモーターのレギュレーターとを含むプラスミド、ウイルスまたはファージベクターであり得る。ベクターに１つ以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子、哺乳動物ベクターに対してはネオマシイン耐性遺伝子、または植物ベクターに対してはカノマイシン耐性遺伝子を含めてもよい。ベクターはインビトロで、例えばＲＮＡの産生のためまたは宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換するために使用され得る。ベクターはインビトロでも、例えば遺伝子治療方法において使用されるように適応され得る。
【００５８】
更なる態様で、本発明は本発明のポリヌクレオチドの複製及び発現のためにベクターを形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を提供する。前記細胞は前記ベクターと適合性であるように選択され、例えば細菌、酵母、植物、昆虫または哺乳動物であり得る。
【００５９】
本発明の発現ベクターは、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、粒子衝撃またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介技術を含めた慣用方法を用いて宿主細胞に導入され得る。宿主細胞からの発現は一過性であり得る。好適な宿主細胞の形質転換は、本発明のポリヌクレオチドまたはその断片を宿主細胞のゲノムに組み込むことにより実施され得る。通常、形質転換ゲノムは核であるが、他のゲノム、例えば真核細胞のミトコンドリアゲノムまたは植物細胞の色素体ゲノムの形質転換が望ましいことがある。或いは、複製可能な自律性ベクターを用いて形質転換を実施してもよい。発現ベクターは選択マーカーを含み得、及び／または前記選択マーカーを発現ベクターと共にトランスフェクトしてもよく、好適なトランスフェクト細胞を選択し得る。
【００６０】
好適な細胞には、上記ベクターを発現させ得る細胞が含まれる。これらの細胞には、微生物細胞（例えば、大腸菌のようなバクテリア）、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ７細胞、Ｐ３８８細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＫＢ細胞、ＥＬ４細胞またはＨｅｌａ細胞）、昆虫細胞、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、または植物、典型的には小麦、トウモロコシまたは菜種のような穀物植物の細胞が含まれる。バキュロウイルスまたはワクシニア発現系を使用してもよい。
【００６１】
細胞培養は標準条件下で実施する。細胞培養のために市販されている培地は広く利用可能であり、製造業者の指示に従って使用され得る。
【００６２】
宿主細胞で発現させた本発明のペプチドは当業界で公知の方法により回収され得る。こうすると、ポリペプチドが単離、精製され得る。典型的には、単離または精製したポリペプチドはサンプル中に存在するポリペプチドの少なくとも１０％〜１００％乾燥重量、より好ましくは少なくとも４０％または５０％、更に好ましくは少なくとも６０％または７０％、更に好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％を占める。最も好ましくは、精製ポリペプチドはサンプル中に存在するポリペプチドの少なくとも９９％乾燥重量を占める。
【００６３】
本発明は、ヒトカルシトニンのような特定の天然ポリペプチドを採取し、アミノ酸配列を分析してポリペプチドの凝集傾向を評価し、ヒトカルシトニン配列に基づいて野生型形態と比較して凝集傾向の低い修飾ポリペプチドを設計し、前記修飾ポリペプチドを作成することを含み得る。
【００６４】
任意の形態であるかまたは上記した他の物質と組み合わせたペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞は以下の用語「物質」の範疇に含まれる。有効で非毒性量の前記物質を必要なヒトまたは非ヒト患者に投与し得る。従って、前記物質を投与することにより病気を患っている患者の状態が改善され得る。前記物質を、病気の発症を予防するために患者でないものに予防的に投与してもよい。
【００６５】
従って、本発明はヒトまたは他の動物身体の治療方法に使用するための物質を提供する。本発明は病気治療用医薬品の製造における前記物質の使用を提供する。
【００６６】
前記物質は通常投与のために使用される標準方法により、例えば注射または鼻内スプレーにより投与される。
【００６７】
典型的には、まず前記物質を投与した後本発明と同一または異なる物質を投与し得る。１実施態様では、被験者に対して１回以上、少なくとも６時間、１２時間、１日、２日、７日、１４日、１ヶ月以上あけて別々に投与する。
【００６８】
前記物質は該物質及び医薬的に許容され得る担体または希釈剤を含む医薬組成物の形態をとり得る。好適な担体及び希釈剤には、等張性食塩液（例えば、リン酸緩衝食塩液）が含まれる。通常、組成物は非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、皮内、経口、膣内または経腸投与用に処方される。
【００６９】
投与量は各種パラメーターに従って、特に使用する物質；治療対象の患者の年令、体重及び状態；投与ルート；及び必要なレジメに従って決定され得る。担当医が特定患者に対して必要な投与ルート及び用量を決定できる。しかしながら、前記物質の好適用量は１０μｇ〜１０ｇ、例えば１００μｇ〜１ｇであり得る。この値は完全治療レジメにおいて投与される総量を表し、またはレジメにおける別々の投与を表し得る。
【００７０】
物質がポリヌクレオチドである場合には、ポリヌクレオチドの細胞による摂取を強化するためにトランスフェクション剤を投与してもよい。好適なトランスフェクション剤の例には、カチオン性物質（例えば、リン酸カルシウム及びＤＥＡＥ−デキストラン）及びリポフェクタン（例えば、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍ（商標）及びｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標））が含まれる。
【００７１】
前記物質がウイルスベクターの形態のポリヌクレオチドの場合、投与されるウイルスの量は１０４〜１０１２ｐｆｕ、好ましくは１０７〜１０１０ｐｆｕ（例えば、アデノウイルスベクターの場合）、ヘルペスウイルスベクターの場合にはより好ましくは約１０８ｐｆｕである。ポックスウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス）も通常上記した用量で使用し得る。注射する場合、医薬的に許容され得る好適な担体または希釈剤中通常１〜２ｍｌのウイルスを投与する。本発明の好ましい実施態様では、ペプチドは修飾ヒトカルシトニンである。修飾カルシトニンはパジェット病、高カルシアム血症または骨粗しょう症、特に乳癌、肺癌、腎臓癌や他の悪性疾患に付随する腫瘍性骨破壊、ミエローマ、原発性副甲状腺機能亢進症、骨のパジェット病（変形性骨炎）により生ずる骨破壊に起因する高カルシウム血症の治療において、特に骨痛、神経学的合併症、高いアルカリホスファターゼ及びヒドロキシプロリン分泌で示される高い骨ターンオーバー、骨病巣の段階的拡大、不完全または繰り返される骨折；進行した転移性骨癌または他の癌に関連する痛み；従来の治療に対して耐性の他の形態の痛み；閉経後骨粗しょう症及びヒト、サケまたはブタカルシトニンまたは他の治療形態のカルシトニンについて記載した他の治療または生理学的活性に関連する他の治療における短期間使用において使用される。
【００７２】
下記実施例を参照して本発明を更に詳細に説明する。
【００７３】
天然カルシトニン配列は以下の通りである：
【００７４】
【化２】
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【００７５】
新しい変異体を工学処理するために以下の点を考慮した：第１に、種間の多形性を構成する残基のみを修飾のために選択した。こうすると、カルシトニンの少なくとも幾つかの生理学的機能は維持され得る。このことは、システイン１及び７が受容体活性化のために特異的であると認められるジスルフィド橋を形成する環状Ｎ末端において特に重要である。
【００７６】
変化の数を最小に維持した。ヒト形態と比較した配列同一性が高ければ、患者が耐性を示す可能性は低くなる。
【００７７】
ペプチド配列を以下のように設計した：
【００７８】
【化３】
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【００７９】
Ａｇａｄｉｒ予測は標準条件（１００ｍＭイオン強度，ｐＨ７．０）及びアミド化Ｃ末端で実施した。ＧＯＲ−４予測は標準パラメーターを用いて実施する。
【００８０】
更なる研究のために変異体６ｃｈＲを選択した。この変異体は初めヒト配列に対してたった６個の変化を有する（＞８１％配列同一性）。後の段階で、変化の数を５個の変化（＞８４％同一性）に減らして、高い凝集傾向を持たないヒト形態により近い産物を得る。６ｃｈＬの代わりに、過剰濃度の疎水性残基を防止し、ペプチド溶解度を改良し得る追加の電荷を与えるために６ｃｈＲを選択する（酸性ｐＨ値で塩基性残基もこうなる）。サケカルシトニンはその位置にヒスチジン残基（これも塩基性である）を有するとして塩基性残基を選択した。
【００８１】
ペプチドを環状Ｎ末端及びＣ末端アミド化により合成した。
【００８２】
【化４】
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【００８３】
凝集研究
凝集分析を、既報（Ｔ．Ａｒｖｉｎｔｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：６４１５〜６４２２（１９９３））されているようにＰＢＳ、５ｍＭ  リン酸ナトリウム、１４５ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２（リン酸ナトリウム緩衝食塩液，ｐＨ７．２）を用い、細菌増殖を防ぐために微量（０．１％）のアジ化ナトリウムを添加して実施した。サンプルを常に３７℃でインキュベートした。３４０ｎｍで濁度を測定することにより凝集をモニターした。各種濃度のペプチドを試験した。サンプルを表１に記載されているように処理した（場合により濾過）。
【００８４】
【表２】
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【００８５】
図１は、３５ｍｇ／ｍｌのペプチド濃度で溶解させ、溶液を濾過しなかった場合のヒトカルシトニン及び６ｃｈＲ変異体の凝集挙動を示す。変異体がヒト形態よりも非常にゆっくり凝集することは明らかである。１０ｍｇ／ｍｌ以下の濃度では、非濾過及び濾過溶液中のいずれでも６ｃｈＲは＞１０ヶ月の実験終了時でも検出可能な凝集を示さなかった。表１は、異なる溶液条件下でのヒト及び６ｃｈＲカルシトニンの凝集時間を示している。溶液を濾過するとヒト変異体の凝集カイネティックは遅くなったが、いずれの場合も６ｃｈＲ変異体は凝集しにくい。濁りを呈するサンプルをアミロイドフィブリルについて電子顕微鏡によりチェックした。いずれの場合も濁りがサンプル中に存在した後でのみサンプルは類似のフィブリル構造を示した。６ｃｈＲ変異体が凝集するのに要する時間はヒトペプチドが必要とする時間よりも少なくとも２倍長かった。
【００８６】
構造研究
ヒト（ｈＣＴ）、サケ（ｓＣＴ）及び６ｃｈＲ（６ｃｈＲ）カルシトニンの構造特性を特徴づけるために円二色性及び核磁気共鳴を使用した。アミノ酸分析によりペプチド濃度を推定した。図２は、ｓＣＴ（２２．５％）が従来観察されている中性ｐＨでも低いｐＨ値でもｈＣＴ（１１．３％）よりも高いヘリカル含量を有することを示す。ｈＣＴと比較したとき、６ｃｈＲ（２１．１％）は中性ｐＨでも低いｐＨでも高いヘリカル含量を示し、これは予測された通りである。この高いヘリカル含量はＮＭＲ（データ示さず）を用いる化学シフト分析によっても検出される。従って、これらの試験から、ヘリカル局部相互作用の安定化及び凝集に関する６ｃｈＲペプチドの安定化の点で設計手順が成功したことが示唆される。
【００８７】
生理学的活性
実験の次ステップは、野生型ヒト形態と比較してかなり凝集しにくい工学処理ペプチドがカルシトニン様活性を示し、よって治療薬として使用し得るか否かを確認することであった。活性試験はトリまたはマウスのような適当な実験動物を用いて実施し得る。活性はインビトロで、例えば細胞培養物においてモニターされ得る。カルシトニンがアルカリホスファターゼ活性及びｃＡＭＰレベルを増加させると報告されている（Ａ．Ｗｏｈｌｗｅｎｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｏｍｍｅｎ．，１３１：５３７−５４２（１９８５）；Ｋ．Ｉ．Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７６：１９３−１９８（１９９８））ＬＬＣ−ＰＫＩ腎細胞を使用し得る。各種カルシトニン形態が示す活性を比較するために実験条件をより良くコントロールし得る細胞系で下記活性テストを実施した。幾つかの改変を加えた既報の２つの系の組合せを使用した（Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１５５：４２３−４３１（１９９７）；Ｋ．Ｉ．Ｍｉｙａｍｏｔｏら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，７６：１９３−１９８（１９９８））。上記アッセイのためにヒト導管癌Ｔ４７Ｄ（ＨＴＢ  １３３９）細胞を使用した。
【００８８】
（細胞培養）
Ｔ４７Ｄ（ＨＴＢ１３３）細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から購入し、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌ  グルコース及び１．５ｇ／Ｌ  重炭酸ナトリウムを含有するＲＰＭＩ−１６４０改変培地（ＡＴＣＣ）において増殖させた。この培地に１０％  熱不活化ウシ胎仔血清、２５μｇ／ｍｌ  ゲンタマイシン、及びカルシトニン受容体の発現を高めるために１００ｎＭ  デキサメタゾンを補充した。細胞を９５％  空気−５％  ＣＯ２の湿潤雰囲気中３７℃で増殖させた。
【００８９】
（環状ＡＭＰ細胞内蓄積の測定によるカルシトニン活性の計測）
各種カルシトニンペプチドの存在下でのインキュベーション時の刺激度を調べるために環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）蓄積を使用した。通常、細胞をマルチウエルプレートにおいて集密増殖させた後、予熱したＤＰＢＳ−グルコース（Ｇｉｂｃｏ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて洗浄して、微量の胎仔血清を除去した。０．１％  ＢＳＡ及び１ｍＭ  ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）を補充したＤＰＢＳ−グルコース中に異なる量のｈＣＴ、ｓＣＴ及び６ｃｈＲ（６ＣＴ）を溶解してサンプル溶液を調製した。洗浄後、細胞をペプチド溶液の存在下３７℃において１５分間インキュベートした。次いで、吸引して培地を除去し、細胞をドライアイス上で迅速に凍結させ、その後ｃＡＭＰ計測を実施するまで−８０℃で保持した。
【００９０】
各サンプルの環状ＡＭＰ含量を製造業者の仕様書に従って市販のＡＭＰ酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）システム（Ｂｉｏｔｒａｋ，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて測定した。カルシトニンインキュベーションにより生ずる全範囲の刺激をカバーするために異なる希釈度の細胞抽出物を測定した。結果を図３に示す。各種配列のそれぞれについて最大刺激キャパシティーを確立するために飽和濃度（１×１０−６Ｍ）の３種のペプチド（ｈＣＴ、ｒＣＴ及び６ｃｈＲ）を使用した。いずれの場合も、観察された刺激は基底レベルの３倍に近い。３種のペプチドはすべて明らかな刺激効果を示し、工学処理した６ｃｈＲ（６ＣＴ）ペプチドのカルシトニン活性が確認される。更に、６ｃｈＲとインキュベーションして得た刺激効果はｈＣＴ及びｓＣＴペプチド（現在の主要な治療用形態）の効果よりも明らかに高い。
【００９１】
上記結果は、追跡した設計方法は、ヒト形態に対して高い配列同一性を維持しながら凝集の劇的な低下を示し、活性を維持乃至向上させる新しい形態のカルシトニンを得るために確実で非常に有力であることを示している。この方法により、「ヒト化」設計は現在の治療用形態のカルシトニンに補充するかまたは代わる治療剤として使用するのに適する候補物質となる。更に、使用する方法の普遍性を前提とすると、上記研究から、ＣＧＲＰ−１、ＣＧＲＰ−２、アミリンまたはアドレノメジュリン（カルシトニン科の一部）のような他の治療用または生物活性ペプチド、またはこれらに関連していない配列の改良形態を設計し得る可能性が開ける。
【００９２】
カルシトニンに関連する他の生物活性ペプチド（保存鎖内ジスルフィド橋に関与するシステインに下線をつける）
【００９３】
【化５】
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【００９４】
ＡＭ（アドレノメジュリン）は有力な降圧剤及び血管拡張剤である。流体及び電解質ホメオスタシスの生理学的コントロールにかなり関連している多数の作用が報告されている。腎臓では、ＡＭは利尿及びナトリウム排泄作用を有し、ＡＭは直接副腎作用によりアルドステロン分泌を抑制する。甲状腺では、生理学的に適切な用量で両ペプチドは基底ＡＣＴＨ分泌を抑制する。ＡＭは脳及び甲状腺において作用して、血漿容量の損失を促進し、この作用は血管における降圧効果を補う。
【００９５】
ＣＧＲＰ（カルシトニン遺伝子関連ペプチド）は血管拡張を引き起こす。ＣＧＲＰは冠状、脳及び全身血管系を含めた各種血管を拡張する。大量のＣＧＲＰがＣＮＳ中に存在すると、神経伝達または神経調節役割をも発揮する。また、ＣＧＲＰは血小板ｃＡＭＰも上昇させる。ＣＧＲＰには、１（カルシトニン）、（ＣＧＲＰ−１）及び（ＣＧＲＰ−３）の３つのイソフォームが存在し、これらは同一遺伝子の選択的スプライシングにより産生される。カルシトニンファミリーに属する。
【００９６】
ＩＡＰＰ（アミリン）はインスリン刺激グルコース利用及び筋肉中のグリコーゲン沈着を選択的に抑制するが、脂肪細胞グルコース代謝に影響を与えない。ＩＡＰＰは２型糖尿病患者の膵島及びインスリノーマ中に存在するアミロイドのペプチドサブユニットである。カルシトニンファミリーに属する。
【００９７】
カルシトニンについて上記したと同様の設計方法は、低い凝集性を示す改良種を生成するためにこれらの４つのペプチドまたは他の類似ペプチドでも実施され得る。
【００９８】
図４は、各種カルシトニン関連ペプチドについてのヘリカル性予測プロフィールを示す。いずれの場合も、高いヘリカル性を有する中央領域が局在し得る。この領域は、既にカルシトニンで報告されているようにα−ヘリカル相互作用を高めるように修飾されやすい。これらの設計可能領域は、アドレノメジュリン（ＡＤＭ）の場合２０−３２及び３５−４１、ＣＧＲＰ−１，ＣＧＲＰ−２及びＩＡＰＰ（アミリン）の場合８−２０である（図４参照）。修飾ペプチドが生理学的活性にとって重要であると見られる保存鎖内ジスルフィド橋中またはその前を修飾しないことが好ましい。好ましくは、ヘリカル接点を形成する傾向の高い残基を修飾し（図４及び上記参照）、末端５及び末端１０アミノ酸のようなペプチドのＣ末端部分を修飾しないことが好ましい。よって、アドレノメジュリンの２０−３２及び／または３５−４１の１つ以上の残基、ＣＧＲＰ−１、ＣＧＲＰ−２及びＩＡＰＰ（アミリン）の８−２０の１つ以上の残基を修飾することが好ましい。種間で多形性を構成するアミノ酸における工学処理置換が好ましく、α−ヘリカル相互作用を安定化するように試みることが好ましい。更なる置換により、他の極性または低い疎水性の代わりに疎水性アミノ酸を使用する。反発を生成し、可溶性形態のペプチドを安定化するために電荷を導入してもよく、塩基性残基に対して電荷を導入することが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１】ペプチドの凝集度を示すために野生型ヒトカルシトニンと本発明の修飾カルシトニンの濁度を比較する。
【図２】円二色性で測定したカルシトニンペプチドの二次構造を示す。実験はｐＨ７．０及び３．０におけるペプチドの熱変性プロフィールを反映している。楕円率は２２２ｎｍで測定し、ペプチドのα−ヘリカル含量を反映している。ヘリカル含量はＣｈｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１３：３３５０−５９（１９７４）に従ってＣＤスペクトル計算（２５℃）に基づいている。
【図３】Ｔ４７Ｄ細胞の細胞内ｃＡＭＰレベルに対する異なるカルシトニンペプチドの影響を示す。
【図４】数種のヒトカルシトニン関連ペプチド（ＣＧＲＰ−１、ＣＧＲＰ−２、ＩＡＰＰ及びアドレノメジュリン）について計算した固有α−ヘリカル性を示す。予測アルゴリズムＡｇａｄｉｒを用いて予測した。ＰＤＨ及びＧＯＲ−４アルゴリズムを用いて同様のプロフィールを得た。グラフはα−ヘリカル構造を形成するための単一残基の予測％を表す。値の高い領域は高いα−ヘリカル含量を有するようにペプチド変異体を工学処理するための好ましい部分を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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