(57)【要約】本発明は、ＰＤＺ相互作用ポリペプチドを同定する方法、前記ポリペプチド、及び前記ポリペプチドの使用に関する。
2004533840.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
そのカルボキシル末端を介して、場合によってはペプチドリンカーを介して、３〜２０個のアミノ酸残基を含む、ＰＤＺドメイン結合ペプチドと結合したファージコートタンパク質の少なくとも一部を含んでなる融合タンパク質。
【請求項２】
ファージが繊維状ファージである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
コートタンパク質がｇ８タンパク質である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ＰＤＺドメイン結合ペプチドが３〜２０個のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ファージコートタンパク質が成熟ファージコートタンパク質を含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする融合遺伝子。
【請求項７】
請求項６に記載の融合遺伝子を含んでなるベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを含んでなるウイルス粒子。
【請求項９】
ライブラリー中の融合タンパク質が複数のＰＤＺドメイン結合ペプチドを含んでなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質のライブラリー。
【請求項１０】
融合遺伝子が複数のＰＤＺドメイン結合ペプチドを含んでなる融合タンパク質をコードする、請求項７に記載のベクターのライブラリー。
【請求項１１】
融合遺伝子が複数のＰＤＺドメイン結合ペプチドを含んでなる融合タンパク質をコードする、請求項８に記載のウイルス粒子のライブラリー。
【請求項１２】
ＰＤＺドメイン結合ペプチドライブラリーを作製する方法であって、組換え宿主細胞において請求項９に記載の融合タンパク質変異体のライブラリーを発現させて、その表面に複数のＰＤＺ結合ペプチドを提示する組換えファージ粒子のライブラリーを形成することを含んでなる方法。
【請求項１３】
ＰＤＺドメイン結合ペプチドを選択する方法であって、（ａ）組換え宿主細胞において請求項９に記載の融合タンパク質変異体のライブラリーを発現させて、その表面に複数のＰＤＺ結合ペプチドを提示する組換えファージ粒子のライブラリーを形成し；（ｂ）組換えファージ粒子をＰＤＺドメインを含む標的と接触させ、その結果、ファージ粒子の少なくとも一部が標的と結合し；さらに（ｃ）標的と結合するファージ粒子を結合しないものから分離することを含んでなる方法。
【請求項１４】
ファージ粒子が融合タンパク質をコードする融合遺伝子を含み、さらに、選択されたファージ粒子の融合遺伝子の少なくとも一部を配列決定してＰＤＺドメイン結合ペプチドのアミノ酸配列を決定し、所望により、ＰＤＺドメイン結合ペプチドを合成することをさらに含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＤＺドメイン結合タンパク質を同定する方法であって、（ａ）請求項１３に記載の方法を用いてＰＤＺドメイン結合ペプチドを選択して、選択されたＰＤＺドメイン結合ペプチドをコードする融合遺伝子を含有するファージ粒子を得、融合遺伝子の一部を配列決定して少なくとも１つの選択されたＰＤＺドメイン結合ペプチドのアミノ酸配列を同定し；（ｂ）ＰＤＺドメイン結合ペプチド配列をタンパク質群のカルボキシル末端アミノ酸配列と比較し、ＰＤＺドメイン結合ペプチド配列と同一または類似のカルボキシル末端配列を有する細胞内タンパク質を選択することを含んでなる方法。
【請求項１６】
選択された細胞内タンパク質のカルボキシル末端配列がＰＤＺドメイン結合ペプチド配列と同一であるか、または１、２もしくは３位で異なっている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
選択されたＰＤＺドメイン結合ペプチドの、および選択された細胞内タンパク質またはそのカルボキシル末端配列の、ＰＤＺドメインとの結合を比較することをさらに含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＤＺドメイン結合化合物のアッセイであって、ポリペプチドを含有するＰＤＺドメインを候補ＰＤＺドメイン結合化合物と接触させ、ポリペプチドと化合物の結合を検出することを含んでなるアッセイ。
【請求項１９】
請求項７に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項２０】
配列番号１４〜１８１、２０９〜２１３および２４１〜２４７からなる群から選択されるメンバーの配列を含むカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項２１】
本質的に、配列番号１４〜１８１、２０９〜２１３および２４１〜２４７からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号１４〜１８１、２０９〜２１３および２４１〜２４７からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号１〜１２からなる群から選択されるメンバーの配列を有するカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項２４】
本質的に、配列番号１〜１２からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
配列番号１〜１２からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号１３および５１２〜５７５からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項２７】
本質的に、配列番号１３および５１２〜５７５からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号１３および５１２〜５７５からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号２４８〜２８４からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
本質的に、配列番号２４８〜２８４からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号２４８〜２８４からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
配列番号２８５〜２９２からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項３３】
本質的に、配列番号２８５〜２９２からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号２８５〜２９２からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項３２に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号２９３〜３０３からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項３６】
本質的に、配列番号２９３〜３０３からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
配列番号２９３〜３０３からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項３５に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号３０４〜３１５からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項３９】
本質的に、配列番号３０４〜３１５からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項３８に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
配列番号３０４〜３１５からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項３８に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
配列番号３１６〜３３６からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
本質的に、配列番号３１６〜３３６からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号３１６〜３３６からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号３３７〜３７４からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項４５】
本質的に、配列番号３３７〜３７４からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
配列番号３３７〜３７４からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項４４に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
配列番号３７５〜３９１からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項４８】
本質的に、配列番号３７５〜３９１からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
配列番号３７５〜３９１からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
配列番号３９２〜４０１からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項５１】
本質的に、配列番号３９２〜４０１からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
配列番号３９２〜４０１からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項５０に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
配列番号４０２〜４１３からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項５４】
本質的に、配列番号４０２〜４１３からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項５３に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
配列番号４０２〜４１３からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項５３に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
配列番号４１４〜４１９からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項５７】
本質的に、配列番号４１４〜４１９からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項５６に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
配列番号４１４〜４１９からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項５６に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
配列番号４２０〜４２６からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項６０】
本質的に、配列番号４２０〜４２６からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
配列番号４２０〜４２６からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項５９に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
配列番号４２７〜４３２からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項６３】
本質的に、配列番号４２７〜４３２からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
配列番号４２７〜４３２からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
配列番号４３３〜４６３からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項６６】
本質的に、配列番号４３３〜４６３からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項６５に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
配列番号４３３〜４６３からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項６５に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
配列番号４６４〜５１１からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項６９】
本質的に、配列番号４６４〜５１１からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項６８に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
配列番号４６４〜５１１からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項６８に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
配列番号５７６〜５８２からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項７２】
本質的に、配列番号５７６〜５８２からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項７１に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
配列番号５７６〜５８２からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項７１に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
配列番号５８３〜６０１からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
【請求項７５】
本質的に、配列番号５８３〜６０１からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項７４に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
配列番号５８３〜６０１からなる群から選択されるメンバーからなる、請求項７４に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
請求項２０〜７６のいずれかに記載のポリペプチドと同一のエピトープと結合するポリペプチド。
【請求項７８】
ＰＤＺドメインとの結合について請求項２０〜７７のいずれかのポリペプチドと競合するポリペプチド。
【請求項７９】
請求項２０〜７８のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項８０】
ポリペプチド−ポリペプチド相互作用を阻害する方法であって、第１および第２のポリペプチドを含んでなる混合物をＰＤＺドメインとそのリガンド間の相互作用のインヒビターと接触させることを含んでなり、ここで、第１のポリペプチドは前記ＰＤＺドメインを含んでなり、かつ、第２のポリペプチドは前記リガンドを含んでなる方法。
【請求項８１】
第１のポリペプチドがＰＤＺドメインを含んでなる融合ポリペプチドであり、かつ、第２のポリペプチドが前記ＰＤＺドメインのリガンドを含んでなり、かつ、第１のポリペプチドが基質（固体支持体など）に付着されている、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
第１のポリペプチドがＰＤＺドメインを含んでなる融合ポリペプチドであり、かつ、第２のポリペプチドが前記ＰＤＺドメインのリガンドを含んでなり、かつ、第２のポリペプチドが基質に付着されている、請求項８０に記載の方法。
【請求項８３】
ＰＤＺドメインポリペプチドと前記ポリペプチドのＰＤＺドメインと結合すると知られている分子間の相互作用を調節する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドおよび分子を含有するサンプルを候補物質と接触させ；
（ｂ）前記候補物質の存在下での前記分子の前記ポリペプチドとの結合量を測定し；
（ｃ）ステップ（ｂ）の結合量を前記候補物質の不在下で同様の条件下での前記分子と前記ポリペプチドの結合量と比較することを含んでなり、；
それによって（ｃ）で求めた結合量の差が前記候補物質が前記相互作用を調節する物質であるということを示す方法。
【請求項８４】
ＰＤＺドメインポリペプチドと前記ポリペプチドのＰＤＺドメインと結合すると知られている分子の結合を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドおよび分子を含有するサンプルを候補物質と接触させ；
（ｂ）前記候補物質の存在下での前記分子の前記ポリペプチドとの結合量を測定し；
（ｃ）ステップ（ｂ）の結合量を候補物質の不在下で同様の条件下での前記分子と前記ポリペプチドの結合量と比較することを含んでなり；
それによって、ステップ（ｃ）で求めた、前記候補物質の不在下での結合量と比べた、候補物質の存在下でのポリペプチドと前記分子の結合量の減少が、前記候補物質がＰＤＺドメインポリペプチドと前記ポリペプチドのＰＤＺドメインと結合すると知られている分子との結合を阻害する物質であるということを示す方法。
【請求項８５】
ＰＤＺドメインポリペプチドと前記ポリペプチドのＰＤＺドメインと結合すると知られている分子との結合を増加させる物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドおよび分子を含有するサンプルを候補物質と接触させ；
（ｂ）候補物質の存在下での前記分子の前記ポリペプチドとの結合量を測定し；
（ｃ）ステップ（ｂ）の結合量を候補物質の不在下で同様の条件下での前記分子と前記ポリペプチドの結合量と比較することを含んでなり；
それによって、ステップ（ｃ）で求めた、前記候補物質の不在下での結合量と比べた、候補物質の存在下でのポリペプチドと前記分子の結合量の増加が、前記候補物質がＰＤＺドメインポリペプチドと前記ポリペプチドのＰＤＺドメインと結合すると知られている分子との結合を増加させる物質であるということを示す方法。
【請求項８６】
ＰＤＺドメインポリペプチドとリガンドの異常な結合相互作用と関連している症状を有する被験者に物質を投与することを含んでなる方法であって、前記物質が前記結合相互作用のモジュレーターである方法。
【請求項８７】
ＰＤＺドメインポリペプチドがＥＲＢＩＮのＰＤＺドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がδ−カテニン、ＡＲＶＣＦまたはｐ００７１である、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項８８】
ＰＤＺドメインポリペプチドがＤＥＮＳＩＮのＰＤＺドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がＡＲＶＣＦ、ｐ００７１またはδ−カテニンである、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項８９】
ＰＤＺドメインポリペプチドがＰＤＺ１および／または３のＳＣＲＩＢＢＬＥを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がＺＯ２（タイトジャンクションタンパク質２）、ＫＶ１．５、ＧＰＲ８７、ＡＣＴＩＮＩＮ、β−カテニンまたはＣＤ３４である、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項９０】
ＰＤＺドメインポリペプチドがＳＣＲＩＢＢＬＥのＰＤＺ２ドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がδ−カテニン、ＡＲＶＣＦまたはｐ００７１である、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項９１】
ＰＤＺドメインポリペプチドがＭＵＰＰのＰＤＺ７ドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がＨＴＲ２Ｂ、ＰＤＧＦＲｂ、δ−カテニン、ＳＧＫまたはＳＳＴＲ３である、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項９２】
ＰＤＺドメインポリペプチドがヒトＩＮＡＤＬのＰＤＺ６ドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がＨＴＲ２Ｂ、ＰＤＧＦＲｂ、δ−カテニン、ＳＧＫまたはＳＳＴＲ３である、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項９３】
ＰＤＺドメインポリペプチドがヒトＺＯ１のＰＤＺドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がクローディン−１７、クローディン−１、クローディン−３、クローディン−７、クローディン−９、クローディン−１８、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、δ−カテニン、ＡＲＶＣＦまたはＳＧＫである、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項９４】
ＰＤＺドメインポリペプチドがＡＦ６（ＭＬＬＴ４）のＰＤＺドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がＦＹＣＯ１、ＢＬＴＲ２、ＴＭ７ＳＦ３、ＯＲ１０Ｃ１、ＣＮＴＮＡＰ２、ネクチン３、ＳＨ３Ｄ５またはウトロフィンである、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項９５】
ＰＤＺドメインがＭＵＰＰのＰＤＺ３ドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がショウジョウバエＮＵＭＢ相同体、ＴＧＦＢＲ１、ＩＧＦＢＰ７またはＣＤ３６ｌ１である、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項９６】
ＰＤＺドメインポリペプチドがＭＡＧＩ１のＰＤＺ３ドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がＳＤＯＬＦ、ＰＬＥＫＨＡ１、ＰＥＰＰ２、ＭＵＣ１２、ＳＬＩＴ１、ＰＡＲＫ２、ＨＴＲ２ＡまたはＰＩＴＰＮＢである、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項９７】
ＰＤＺドメインポリペプチドがＭＡＧＩ３のＰＤＺ３ドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がＪＡＭ１、ＪＡＭ２、ＬＬＴ１、ＰＴＴＧ３、ＣＤ８３抗原、δ様相同体（ショウジョウバエ）、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＲＧＳ２０、ＴＭ４ＳＦ６、ＰＡＲＫ２、ＧＰＲ１０またはＩＬ２ＲＢである、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項９８】
ＰＤＺドメインポリペプチドがＩＮＡＤＬのＰＤＺ３ドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がＢＬＴＲ２、ＪＡＭ１、ＪＡＭ２、ＫＶ８．１、ＰＴＴＧ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＮＲＸＮ１、ＮＲＸＮ２、ＮＲＸＮ３、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＰＴＴＧ１、ＰＡＲＫ２、ＧＡＢＲＧ２、ＣＮＴＦＲ、ＣＣＲ２、ＧＡＢＲＧ３またはＧＡＢＲＰである、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項９９】
ＰＤＺドメインポリペプチドがヒトＩＮＡＤＬのＰＤＺ２ドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がＰＩＷＩ１、マウスＰＩＷＩ様相同体１の相同分子種、ＮＲＸＮ１、ＮＲＸＮ２、ＰＰＰ２ＣＡまたはＰＰＰ２ＣＢである、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項１００】
ＰＤＺドメインポリペプチドがヒトＰＡＲＤ３のＰＤＺ３ドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がＨＲＫ、ＤＯＣ１、ＰＩＷＩまたはＰＰＰ１Ｒ３Ｄである、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項１０１】
ＰＤＺドメインポリペプチドがＳＮＴＡ１のＰＤＺドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がＭＲＧＸ２、ＮＬＧＮ１、ＮＬＧＮ３、ＳＥＥＫ１、クローディン−１７、ＧＰＲ５６、ＳＳＴＲ５、ＳＣＴＲ、ＧＲＭ１、ＧＲＭ２、ＧＲＭ３またはＧＲＭ５である、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項１０２】
ＰＤＺドメインポリペプチドがＭＡＧＩ３のＰＤＺ０ドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がＬＡＮＯ、ＳＳＴＲ３、ＮＲＣＡＭ、ＧＰＲ１９、ＧＮＧ５またはＨＴＲ２Ｂである、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項１０３】
ＰＤＺドメインポリペプチドがＭＵＰＰのＰＤＺ１３ドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチと結合すると知られている分子がＮＬＧＮ３、ＮＬＧＮ１、クローディン−１６、ＧＰＲ５６、ＥＮＩＧＭＡ、ＦＺＤ９、ＳＳＴＲ５、ＶＣＡＭ１またはＧＰＲＫ６である、請求項８３または８６に記載の方法。
【請求項１０４】
ＰＤＺドメインポリペプチドがＭＡＧＩ３のＰＤＺ２ドメインを含んでなり、かつ、該ポリペプチドと結合すると知られている分子がＰＴＥＮ／ＭＭＡＣである、請求項８３または８６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が引用することにより本明細書の一部とされる、２００１年７月６日に出願された米国仮出願第６０／３０３，６３４号の優先利益を主張する。
【０００２】
本発明はファージディスプレイを用いて、ＰＤＺドメインによって媒介されるタンパク質−タンパク質相互作用を同定する方法に関する。本発明はまた、ＰＤＺドメインと相互作用し、かつ、結合するものと同定されるポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞の正常な機能は細胞下局在ならびにその成分およびプロセスの区画化に依存している。病的物質、遺伝子変異または環境による外傷によって引き起こされ得る、異常な細胞機構の結果は適切な機能の欠如となる。タンパク質間の配列特異的相互作用が細胞内の構造的および機能的機構の基礎を提供する。ＰＤＺドメインなどの、短いペプチドモチーフの変化を認識する、構造的に保存されたタンパク質ドメインがこれらの相互作用のいくつかを媒介する。
【０００４】
ＰＤＺ（ＰＳＤ−９５／Ｄｉｓｃｓ  ｌａｒｇｅ／ＺＯ−１）ドメインは、９５ｋＤａのシナプス後肥厚部タンパク質（ＰＳＤ−９５）、ショウジョウバエ腫瘍サプレッサーｄｉｓｃｓ−ｌａｒｇｅ、およびタイトジャンクションタンパク質ｚｏｎｕｌａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ−１（ＺＯ−１）の保存された構造エレメントとして最初に記載され、タンパク質の多種多様なセットに含まれている（CravenおよびBredt, 1998; Fanning及びAnderson, 1999; Tsunodaら, 1998）。一般に、ＰＤＺドメイン含有タンパク質は、上皮細胞タイトジャンクション、神経筋接合部およびニューロンのシナプス後肥厚部などの分化した細胞下部位で、イオンチャンネルおよびその他の膜貫通レセプターをはじめとする種々の機能的実体を集めるようである。これらのクラスター形成および局在作用には重要な生物学的意味がある。例えば、膜会合型グアニレートキナーゼ、ＰＳＤ−９５はＮ−メチルＤ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）レセプターおよびシェーカー型カリウムチャンネルをニューロンのシナプス後肥厚部へ分離する（Tejedorら, 1997）。もう１つの例では、種々のマルチＰＤＺタンパク質ＩＮＡＤによるショウジョウバエ視覚系の種々の構成要素の集合はこのシグナル伝達カスケードの効率を大幅に高める（Tsunodaら, 1997）。もう１つの有力な事例は、線虫のＬＥＴ−２３レセプターチロシンキナーゼの適切な側底局在化におけるいくつかのＰＤＺドメイン含有タンパク質の使用である（Kaechら, 1998）。このキナーゼは産卵口発達に必要であり、これらＰＤＺドメイン含有タンパク質の変異はＬＥＴ−２３タンパク質の細胞内の誤った局在化をもたらし産卵口分化がなくなる。多くのその他の例とあわせて、これらの研究はＰＤＺドメインが多様なシグナル伝達経路における重要な細胞内集合および局在化補助因子であるということを示唆する。
【０００５】
ＰＤＺドメインは３種の異なるタイプのリガンドを認識し、これらの相互作用のうちの２種はタンパク質のカルボキシル最末端のペプチドに対して特異性を示す（CowburnおよびRiddihough, 1997; Harrison, 1996; Oschkinat, 1999）。タイプＩおよびタイプＩＩ  ＰＤＺドメインはそれぞれ、コンセンサス配列Ｔｈｒ／Ｓｅｒ−  Ｘ−Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ａｌａ−ＣＯＯＨまたはＰｈｅ／Ｔｙｒ−Ｘ−Ｐｈｅ／Ｖａｌ／Ａｌａ−ＣＯＯＨを含むカルボキシル末端ペプチドを認識する。興味深いことに、第３のタイプのＰＤＺドメイン−リガンド相互作用は内部ペプチド配列の認識を含む。これら３種のＰＤＺ  相互作用の構造解析によりリガンド認識のメカニズムが解明されている。例えば、ＰＳＤ−９５由来のタイプＩ  ＰＤＺドメインの結晶構造は４残基のカルボキシル末端ペプチドがβストランドとの逆平行主鎖会合によってタンパク質と相互作用し、末端カルボキシル基が保存された「カルボキシル基結合ループ」に挿入されるということを示した（Doyleら, 1996;Morais Cabralら, 1996）。ヒトＣＡＳＫ由来のＰＤＺドメインの結晶構造からタイプＩＩモチーフによって媒介される相互作用の性質を明らかとした（Danielsら, 1998）。両タイプのドメインにおいて、ペプチドはＰＤＺドメイン構造に新規逆平行βストランドを形成し、２種の相互作用の全体的なコンホメーションは類似していた。しかしながら、側鎖接触にはかなりの相違があり、このことにより２種のドメインタイプの異なるリガンド特異性を説明できよう。最後に、シントロフィンのＰＤＺドメインとニューロン性一酸化窒素シンターゼのＰＤＺドメインの間の相互作用がＸ線およびＮＭＲ解析によって調べられている（Hillierら, 1999; Tochioら, 1999）。この事例では、タイプＩおよびＩＩドメインのカルボキシル末端リガンドを模倣するように、ニューロン性一酸化窒素シンターゼＰＤＺドメインの伸びたループがシントロフィンＰＤＺドメインのβストランドと結合するβフィンガーを形成する。総合して、これらのデータはこれら３種のＰＤＺドメインは類似ではあるが高度に分化した領域を用いて多様なカルボキシル末端および内部ペプチドリガンドを認識するということを示唆する。
【０００６】
ＰＤＺドメインリガンド特異性への最初の取りかかりは遊離ペプチド（Songyangら, 1997）または大腸菌Ｌａｃレプレッサーのカルボキシル末端に融合したペプチド（Strickerら, 1997）のいずれかからなるコンビナトリアル・ライブラリーを用いて実施された。コンビナトリアル・ペプチド・ライブラリーを提示するにはファージディスプレイが最も一般的に用いられる方法であるが、今日までに報告されたファージによって提示されるペプチド・ライブラリーは、メジャーコートタンパク質（タンパク質−８、Ｐ８）または遺伝子３マイナーコートタンパク質のいずれかのアミノ末端との融合物として提示されており、これは主として、いずれのコートタンパク質もカルボキシル末端融合物を支持できないと考えられているためである（Palzkillら, 1998; Strickerら, 1997）。したがって、ファージディスプレイは遊離カルボキシル末端を含むペプチドの提示には用いられてこず、この技術はＰＤＺドメインカルボキシル末端結合特異性の解析を受け入れられなかった（Geeら, 1998; Strickerら, 1997）。
【０００７】
バクテリオファージ（ファージ）ディスプレイは種々のポリペプチドがバクテリオファージ粒子の表面のコートタンパク質との融合タンパク質として提示される技術である（ScottおよびSmith, 1990）。ファージディスプレイの有用性は選択的にランダム化したタンパク質変異体（またはランダムにクローニングしたｃＤＮＡ）の大きなライブラリーを迅速かつ効率的に、標的分子と高い親和性で結合する配列について選別できるという事実にある。ファージでのペプチド（Cwirlaら, 1990）またはタンパク質（Clacksonら,1991 ; Kangら,1991 ;Lowmanら, 1991; Marksら, 1991a ; Smith, 1991）ライブラリーのディスプレイは無数のポリペプチドの特異的結合特性を有するものについてのスクリーニングに用いられてきた（Smith, 1991）。ランダム突然変異体のファージライブラリーを選別するには多数の変異体を構築して増殖させる戦略、標的レセプターを用いるアフィニティー精製のための手順、および結合濃縮結果を評価する手段が必要である（米国特許第５，２２３，４０９号；同５，４０３，４８４号；同５，５７１，６８９号；同５，６６３，１４３号）。
【０００８】
一般的には、変異体ポリペプチドは遺伝子−３タンパク質（Ｐ３）と融合されて、これがウイルス粒子のある末端で提示される。あるいは、変異体ポリペプチドをウイルス粒子のメジャーコートタンパク質、遺伝子−８タンパク質（Ｐ８）と融合させてもよい。かかる多価ディスプレイライブラリーはファージ遺伝子−３を、遺伝子−３タンパク質のアミノ末端と融合している外来配列をコードするｃＤＮＡで置換することで構築する。かかる融合は、結合力作用のために；すなわち、ファージが複数接着点を介して標的と結合できるので、高親和性変異体をライブラリーから選別する試みを複雑にし得る。さらに、遺伝子−３タンパク質は宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるファージの接着および増殖に必要であるために、かかる融合タンパク質は子孫のファージ粒子の感染性を著しく低下させ得る。
【０００９】
このような困難を克服するために、一価のファージディスプレイが開発された。このアプローチでは、タンパク質またはペプチド配列は遺伝子−３タンパク質の一部と融合され、野生型遺伝子−３タンパク質の存在下で低レベルで発現され、その結果、粒子が提示するのはほとんどが野生型遺伝子−３タンパク質で、融合タンパク質は１コピーを提示するかまたは提示しない（Bassら, 1990; LowmanおよびWells, 1991）。多価ファージディスプレイに優る一価の重大な利点としては（１）子孫のファージミドが完全感染力を保持する、（２）結合力作用が減少し、したがって、選別が内因性リガンド親和性によって媒介される、および（３）ＤＮＡ操作を簡素化するファージミドベクターが用いられる、が挙げられる。米国特許第５，７５０，３７３号および同５，７８０，２７９号も参照。その他のものもタンパク質、特に抗体を提示するのにファージミドを用いている（米国特許第５，６６７，９８８号；同５，７５９，８１７号；同５，７７０，３５６号；および同５，６５８，７２７号）。
【００１０】
Ｍ１３ファージに提示されるペプチドライブラリーから高親和性リガンドを選択するためには二段法アプローチが用いられている。まず、低親和性リードを、メジャーコートタンパク質、Ｐ８で提示された、未処置の多価ライブラリーから選択する。次いで、低親和性選択物を遺伝子−３マイナーコートタンパク質に移し、一価形式で高親和性に成熟させる。残念ながら、この方法論のペプチドからタンパク質への拡張はＰ８でのディスプレイレベルが融合物の長さおよび配列によって異なる（一般に、融合物の大きさが大きくなるほどディスプレイが減少する）ために困難であった。したがって、一価ファージディスプレイは多数の種々のタンパク質の親和性について用いられてきたが、Ｐ８の多価ディスプレイはほとんどのタンパク質足場に適用可能でなかった。
【００１１】
ほとんどのファージディスプレイ法は繊維状ファージを用いてきたが、ラムダファージディスプレイ系（ＷＯ  ９５／３４６８３；米国特許第５，６２７，０２４号）、Ｔ４ファージディスプレイ系（Efimovら, 1995; Jiang, 1997; RenおよびBlack, 1998; Renら, 1996; Ren, 1997; Zhu, 1997）およびＴ７ファージディスプレイ系（SmithおよびScott, 1993）；（米国特許第５，７６６，９０５号）も公知である。
【００１２】
ファージディスプレイのその他の改善および変法も開発されている。これらの改善はディスプレイ系のペプチドライブラリーを選択された標的分子との結合についてスクリーニングし、これらのタンパク質を所望の特性についてスクリーニングできる機能的タンパク質を提示する能力を高めるものである。ファージディスプレイ反応のためのコンビナトリアル反応装置も開発されており（ＷＯ９８／１４２７７）、ファージディスプレイライブラリーを用いて二分子の相互作用（ＷＯ９８／２０１６９；ＷＯ９８／２０１５９）、および強制したヘリックスペプチドの特性（ＷＯ  ９８／２００３６）が解析および制御されている。結合リガンドを選択的に単離するには、例えば、ファージディスプレイライブラリーをリガンドが標的分子と結合するある種の溶液、および親和性リガンドが標的分子と結合しない第２の溶液と接触させる、親和性リガンドを単離する方法を用いればよい（ＷＯ９７／３５１９６）。ＷＯ９７／４６２５１はアフィニティー精製した抗体を用いてランダムファージディスプレイライブラリーをピックアップし、次いで結合ファージを単離する方法とその後の高親和性結合ファージを単離するためのマイクロプレートウェルを用いるピックアッププロセスを記載している。黄色ブドウ球菌タンパク質Ａ（「タンパク質Ａ」）のアフィニティータグとしての使用も報告されている（Liら, 1998）。ＷＯ９７／４７３１４はファージディスプレイライブラリーであってもよいコンビナトリアルライブラリーを用いる、酵素特異性を区別するための基質サブトラクションライブラリーの使用を記載している。ファージディスプレイを用いて洗浄剤に用いるのに適した酵素を選択する方法がＷＯ９７／０９４４６に記載されている。特異的結合タンパク質を選択するさらなる方法も記載されている（米国特許第５，４９８，５３８号；同５，４３２，０１８号；およびＷＯ９８／１５８３３）。
【００１３】
ペプチドライブラリーを作製してこれらのライブラリーをスクリーニングする方法も米国特許第５，７２３，２８６号；同５，４３２，０１８号；同５，５８０，７１７号；同５，４２７，９０８号；および同５，４９８，５３０号に開示されている。米国特許第５，７７０，４３４号；同５，７３４，０１８号；同５，６９８，４２６号；同５，７６３，１９２号；および同５，７２３，３２３号も参照。
【００１４】
ファージの感染力を変更する方法も公知である。ＷＯ９５／３４６４８および米国特許第５，５１６，６３７号は標的タンパク質を宿主細胞のピリンタンパク質を含む融合タンパク質として提示し、ピリンタンパク質が好ましくはディスプレイファージのレセプターである方法を記載する。米国特許第５，７１２，０８９号は細菌にリガンドを発現するファージミドを感染させ、次いで、細菌に野生型Ｐ３をを含有するがＰ３をコードする遺伝子は含まないヘルパーファージを重感染させ、次いでＰ３−第２リガンドを添加し、第２リガンドが産生されたファージに提示された第１のリガンドと結合することを記載する。ＷＯ９６／２２３９３も参照。非感染ファージおよび感染性媒介複合体を用いる選択的感染性ファージ系も公知である（米国特許第５，５１４，５４８号）。
【００１５】
リガンドを提示するファージ系を用いてサンプルにおいて（ＷＯ／９７４４４９１）、動物において（米国特許第５，６２２，６９９号）リガンドと結合するポリペプチドの存在が検出されている。哺乳類細胞の表面に選択的に結合するファージを用いる遺伝子治療法（ＷＯ  ９８／０５３４４）および薬剤送達（ＷＯ９７／１２０４８）も提案されている。
【００１６】
さらなる改善によりファージディスプレイ系が抗体および抗体断片をバクテリオファージ表面に発現することが可能となり、これによって特異的特性、すなわち、特異的リガンドとの結合（ＥＰ  ８４４３０６；米国特許第５，７０２，８９２号；同５，６５８，７２７号）および抗体ポリペプチド鎖の組換え（ＷＯ９７／０９４３６）を選択することが可能となった。特異的ペプチド−ＭＨＣ複合体を認識する抗体を作製する方法も開発されている（ＷＯ９７／０２３４２）。米国特許第５，７２３，２８７号；同５，５６５，３３２号；および同５，７３３，７４３号も参照。
【００１７】
米国特許第５，５３４，２５７号は約３０残基までの外来エピトープがＭＳ−２ファージのキャプシドタンパク質に組み込まれている発現系を記載する。このファージは適した細菌宿主においてキメラタンパク質を発現することができ、ファージＲＮＡおよびその他の核酸混入物を含まない空のファージ粒子を生じる。空のファージはワクチンとして有用である。
【００１８】
バクテリオファージ粒子の表面での融合タンパク質の発現は可変性であって、幾分かは、ポリペプチドの大きさによって異なる。従来のファージディスプレイ系は野生型ファージコートタンパク質を用い、異種ポリペプチドと野生型アミノ酸配列のアミノ末端または野生型コートタンパク質配列の末端切断の結果生じるアミノ末端とを融合する。また、選択および標的結合を改善するために、リンカーアミノ酸のセグメントも、野生型コートタンパク質配列のアミノ末端に加えられている。
【００１９】
特許出願および出版物などの本明細書に記載されたすべての参照文献は全文を引用することにより本明細書の一部とされる。
【００２０】
（概要）
ある態様では、本発明はカルボキシル末端ファージディスプレイ法を用いて細胞内タンパク質のＰＤＺドメインと結合するペプチドを同定する方法を提供する。これらのペプチドは本発明の方法を用いてＰＤＺドメインの同族タンパク質リガンドを同定するのに有用である。かかるペプチドの構造解析はＰＤＺドメイン構造および機能を理解するのに、ならびにまたこれらのモチーフおよびこれらを含むタンパク質の細胞内生物学的機能を同定するのに有用である。ペプチドはさらに、例えば、ＰＤＺドメインインヒビターとしてそれ自体有用であり、またＰＤＺドメイン含有タンパク質とその同族リガンド間の結合相互作用の小分子インヒビター／アゴニストの設計における構造モデルとしても有用である。
【００２１】
本発明の方法を用いて、いくつかのタンパク質のＰＤＺドメインと結合する同族リガンドおよび合成ペプチドが発見することができ、また発見されている。これらとしては、以下にペプチド配列に基づいて同定された各ＰＤＺドメイン／タンパク質の対応する同族リガンドとともに列記されるタンパク質のＰＤＺドメインと結合するペプチドが挙げられる：
（１）ＥＲＢＩＮ：δ−カテニン；口蓋・心・顔面症候群（ｖｅｌｏｃａｒｄｉｏｆａｃｉａｌ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）において欠失しているアルマジロ反復遺伝子（ＡＲＶＣＦ）；ｐ００７１（２）Ｄｅｎｓｉｎ：ＡＲＶＣＦ；δ−カテニン；ｐ００７１
（３）Ｓｃｒｉｂｂｌｅ  ＰＤＺ１＆３：タイトジャンクションタンパク質２（ＺＯ２）；電位開口型カリウムチャンネル（シェーカー関連サブファミリー１）メンバー５（Ｋｖｌ．５）；Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）のロドプシンファミリーのメンバー（ＧＰＲ８７）；アクチニン；β−カテニン；ＣＤ３４
（４）Ｓｃｒｉｂｂｌｅ  ＰＤＺ２：δ−カテニン；ＡＲＶＣＦ；ｐ００７１
（５）ＭＵＰＰ  ＰＤＺ７：５−ヒドロキシトリプタミン２Ｂ（セロニン）レセプター（ＨＴＲ２Ｂ）；血小板由来増殖因子レセプターβ鎖（ＰＤＧＦＲｂ）；δ−カテニン；血清グルココルチコイド調節性キナーゼ（ＳＧＫ）；ソマトスタチンレセプター３（ＳＳＴＲ３）
（６）ヒトＩＮＡＤＬ  ＰＤＺ６：５−ヒドロキシトリプタミン２Ｂ（セロニン）レセプター（ＨＴＲ２Ｂ）；血小板由来増殖因子レセプターβ鎖（ＰＤＧＦＲｂ）；δ−カテニン  ；血清グルココルチコイド調節性キナーゼ（ＳＧＫ）；ソマトスタチンレセプター３（ＳＳＴＲ３）
（７）ヒトＺＯ１：クローディン−１７；クローディン１；クローディン３；クローディン７；クローディン９；クローディン１８；ＰＤＧＦＲＡ；ＰＤＧＦＲＢ；δ−カテニン；ＡＲＶＣＦ；ＳＧＫ
（８）ＡＦ６（ＭＬＬＴ４）：ＦＹＣＯ１；ＢＬＴＲ２；ＴＭ７ＳＦ３；ＯＲ１０Ｃ１；ＣＮＴＮＡＰ２（コンタクチン関連タンパク質様２）；ネクチン３；ＳＨ３Ｄ５；ウトロフィン
（９）ＭＵＰＰ  ＰＤＺ３：ショウジョウバエＮＵＭＢ相同体；ＴＧＦＢＲ１；ＩＧＦＢＰ７；ＣＤ３６ｌ１
（１０）ＭＡＧＩ１  ＰＤＺ３：ＳＤＯＬＦ（嗅覚レセプターｓｄｏｌｆ）；ＰＬＥＫＨＡ１；ＰＥＰＰ２；ＭＵＣ１２；ＳＬＩＴ１；ＰＡＲＫ２；ＨＴＲ２Ａ；ＰＩＴＰＮＢ
（１１）ＭＡＧＩ３  ＰＤＺ３：ＪＡＭ１；ＪＡＭ２；ＬＬＴ１；ＰＴＴＧ３；ＣＤ８３抗原；δ様相同体（ショウジョウバエ）  （また、前脂肪細胞因子（胎児抗原１）；ＴＮＦＲＳＦ１８；ＲＧＳ２０；ＴＭ４ＳＦ６；ＰＡＲＫ２；ＧＰＲ１０；ＩＬ２ＲＢ
（１２）ＩＮＡＤＬＰＤＺ３：ＢＬＴＲ２；ＪＡＭ１；ＪＡＭ２；ＫＶ８．１；ＰＴＴＧ３；ＣＮＴＮＡＰ２；ＮＲＸＮ１；ＮＲＸＮ２；ＮＲＸＮ３；ＴＮＦＲＳＦ１８；ＰＴＴＧ１；ＰＡＲＫ２；ＧＡＢＲＧ２；ＣＮＴＦＲ；ＣＣＲ３；ＧＡＢＲＧ３；ＧＡＢＲＰ
（１３）ヒトＩＮＡＤＬ  ＰＤＺ２：ＰＩＷＩ１（Ｐｉｗｉ（ショウジョウバエ）様１）；おそらくはマウスｐｉｗｉ様相同体の相同分子種；ＮＲＸＮ１；ＮＲＸＮ２；ＰＰＰ２ＣＡ；ＰＰＰ２ＣＢ
（１４）ヒトＰＡＲＤ３ＰＤＺ３：ｈａｒａ−ｋｉｒｉ（ＨＲＫ）；卵巣癌１（ＤＯＣ１）ではダウンレギュレートされている；ＰＩＷＩ；ＰＰＰ１Ｒ３Ｄ
（１５）ＳＮＴＡ１  ＰＤＺ：ＭＲＧＸ２；ＮＬＧＮ１；ＮＬＧＮ３；ＳＥＥＫ１；クローディン１７；ＧＰＲ５６；ＳＳＴＲ５；ＳＣＴＲ；ＧＲＭ１；ＧＲＭ２；ＧＲＭ３；ＧＲＭ５
（１６）ＭＡＧＩ３ＰＤＺ０：ＬＡＮＯ；ＳＳＴＲ３；ＮＲＣＡＭ；ＧＰＲ１９；ＧＮＧ５；ＨＴＲ２Ｂ
（１７）ＭＵＰＰ  ＰＤＺ１３：ＮＬＧＮ３；ＮＬＧＮ１；クローディン１６；ＧＰＲ５６；不明；ＦＺＤ９；ＳＳＴＲ５；ＶＣＡＭ１；ＧＰＲＫ６
（１８）ＭＡＧＩ３  ＰＤＺ２：ＰＴＥＮ／ＭＭＡＣ。
【００２２】
種々の態様では、本発明は以下を提供する：
１．  そのカルボキシル末端を介して、場合によっては、ペプチドリンカーを介して、好ましくは３〜２０個の、より好ましくは４〜１２個の、より好ましくは４〜７個のアミノ酸残基を含む、ＰＤＺドメイン結合ペプチドと結合したファージコートタンパク質の少なくとも一部を含んでなる融合タンパク質。
２．  ファージが繊維状ファージである、態様１の融合タンパク質。
３．  コートタンパク質がｇ３、ｇ６またはｇ８タンパク質である、態様２の融合タンパク質。
４．  ＰＤＺドメイン結合ペプチドが３〜２０個の、好ましくは４〜１２個の、より好ましくは４〜７個のアミノ酸残基を含む、態様１の融合タンパク質。
５．  ファージコートタンパク質が成熟ファージコートタンパク質を含んでなる、態様１〜４のいずれかの融合タンパク質。
６．  態様１〜５のいずれか１項の融合タンパク質をコードする融合遺伝子。
７．  態様６の融合遺伝子を含んでなるベクター、好ましくはファージまたはファージミドベクター。
８．  態様７のベクターを含んでなるウイルス粒子。
９．  ライブラリー中の融合タンパク質が複数のＰＤＺドメイン結合ペプチドを含んでなる、態様１〜５のいずれか１項の融合タンパク質のライブラリー。
１０．  融合遺伝子が複数のＰＤＺドメイン結合ペプチドを含んでなる融合タンパク質をコードする、態様７のベクターのライブラリー。
１１．  融合遺伝子が複数のＰＤＺドメイン結合ペプチドを含んでなる融合タンパク質をコードする、態様８のウイルス粒子のライブラリー。
１２．  ＰＤＺドメイン結合ペプチドライブラリーを作製する方法であって、組換え宿主細胞において態様９の融合タンパク質変異体のライブラリーを発現させて、その表面に複数のＰＤＺ結合ペプチドを提示する組換えファージ粒子のライブラリーを形成することを含んでなる方法。
１３．  ＰＤＺドメイン結合ペプチドを選択する方法であって、（ａ）組換え宿主細胞において態様９の融合タンパク質変異体のライブラリーを発現させて、その表面に複数のＰＤＺ結合ペプチドを提示する組換えファージ粒子のライブラリーを形成し；（ｂ）組換えファージ粒子をＰＤＺドメインを含む標的と接触させ、その結果、ファージ粒子の少なくとも一部が標的と結合し；さらに（ｃ）標的と結合するファージ粒子を結合しないものから分離することを含んでなる方法。
１４．  ファージ粒子が融合タンパク質をコードする融合遺伝子を含み、さらに、選択されたファージ粒子の融合遺伝子の少なくとも一部を配列決定してＰＤＺドメイン結合ペプチドのアミノ酸配列を決定し、所望により、ＰＤＺドメイン結合ペプチドを合成することをさらに含んでなる、態様１３の方法。
１５．  ＰＤＺドメイン結合タンパク質を同定する方法であって、（ａ）態様１３の方法を用いてＰＤＺドメイン結合ペプチドを選択して、選択されたＰＤＺドメイン結合ペプチドをコードする融合遺伝子を含有するファージ粒子を得、融合遺伝子の一部を配列決定して少なくとも１つの選択されたＰＤＺドメイン結合ペプチドのアミノ酸配列を同定し；（ｂ）ＰＤＺドメイン結合ペプチド配列をタンパク質群のカルボキシル末端アミノ酸配列と比較し、ＰＤＺドメイン結合ペプチド配列と同一または類似の（好ましくは、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％または９５％同一の）カルボキシル末端配列を有する細胞内タンパク質を選択することを含んでなる方法。
１６．  選択された細胞内タンパク質のカルボキシル末端配列がＰＤＺドメイン結合ペプチド配列と同一であるか、または１、２もしくは３位で異なっている、態様１５の方法。
１７．  選択されたＰＤＺドメイン結合ペプチドの、および選択された細胞内タンパク質またはそのカルボキシル末端配列の、ＰＤＺドメインとの結合を比較することをさらに含んでなる、態様１５の方法。
１８．  ＰＤＺドメイン結合化合物のアッセイであって、好ましくは、ＰＤＺドメインと結合すると知られているＰＤＺドメイン結合ペプチドの存在下で、ポリペプチドを含有するＰＤＺドメインを候補ＰＤＺドメイン結合化合物と接触させ、ポリペプチドと化合物の結合を検出することを含んでなるアッセイ。
１９．  態様７のベクターを含有する宿主細胞。
２０．  配列番号１４〜１８１、２０９〜２１３および２４１〜２４７からなる群から選択されるメンバーの配列を含むカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号６８８〜７０５のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。いくつかの実施形態では、本発明は配列番号１４〜１８１、２０９〜２１３および２４１〜２４７からなる群から選択されるメンバーの配列と少なくとも好ましくは８５％、好ましくは８０％、好ましくは７０％、好ましくは６０％の同一性を有するカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチドを提供する。
２１．  本質的に、配列番号１４〜１８１、２０９〜２１３および２４１〜２４７からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
２２．  配列番号１４〜１８１、２０９〜２１３および２４１〜２４７からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
２３．  配列番号１〜１２からなる群から選択されるメンバーの配列を有するカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７９７のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。いくつかの実施形態では、本発明は配列番号ｌ〜１２からなる群から選択されるメンバーの配列と少なくとも好ましくは８５％、好ましくは８０％、好ましくは７０％、好ましくは６０％の同一性を有するカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチドを提供する。
２４．  本質的に、配列番号１〜１２からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
２５．  配列番号１〜１２からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
２６．  配列番号１３および５１２〜５７５からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７４４および７４７〜７５７のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
２７．  本質的に、配列番号１３および５１２〜５７５からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
２８．  配列番号１３および５１２〜５７５からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
２９．  配列番号２４８〜２８４からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７０６〜７０８のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
３０．  本質的に、配列番号２４８〜２８４からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
３１．  配列番号２４８〜２８４からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
３２．  配列番号２８５〜２９２からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号６８８〜７０５のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
３３．  本質的に、配列番号２８５〜２９２からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
３４．  配列番号２８５〜２９２からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
３５．  配列番号２９３〜３０３からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７０７および７１５〜７１８のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
３６．  本質的に、配列番号２９３〜３０３からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
３７．  配列番号２９３〜３０３からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
３８．  配列番号３０４〜３１５からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７０７および７１５〜７１８のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
３９．  本質的に、配列番号３０４〜３１５からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
４０．  配列番号３０４〜３１５からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
４１．  配列番号３１６〜３３６からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７０６〜７０７、７１７および７１９〜７２６のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
４２．  本質的に、配列番号３１６〜３３６からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
４３．  配列番号３１６〜３３６からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
４４．  配列番号３３７〜３７４からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
４５．  本質的に、配列番号３３７〜３７４からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
４６．  配列番号３３７〜３７４からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
４７．  配列番号３７５〜３９１からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７０９〜７１４のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
４８本質的に、配列番号３７５〜３９１からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
４９．  配列番号３７５〜３９１からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
５０．  配列番号３９２〜４０１からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７０９〜７１４のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
５１．  本質的に、配列番号３９２〜４０１からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
５２．  配列番号３９２〜４０１からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
５３．  配列番号４０２〜４１３からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７７６〜７７７、７７９および７９１〜７９６のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
５４．  本質的に、配列番号４０２〜４１３からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
５５．  配列番号４０２〜４１３からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
５６．  配列番号４１４〜４１９からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７１９および７７５〜７８５のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
５７．  本質的に、配列番号４１４〜４１９からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
５８．  配列番号４１４〜４１９からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
５９．  配列番号４２０〜４２６からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７６８および７７２〜７７４のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
６０．  本質的に、配列番号４２０〜４２６からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
６１．  配列番号４２０〜４２６からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
６２．  配列番号４２７〜４３２からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７５９〜７６０および７６８〜７７１のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
６３．  本質的に、配列番号４２７〜４３２からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
６４．  配列番号４２７〜４３２からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
６５．  配列番号４３３〜４６３からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７２８、７３１、７４４、７４７〜７４８、７５０、７５３および７５８〜７６７のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
６６．  本質的に、配列番号４３３〜４６３からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
６７．  配列番号４３３〜４６３からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
６８．  配列番号４６４〜５１１からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７３９〜７４６のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
６９．  本質的に、配列番号４６４〜５１１からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
７０．  配列番号４６４〜５１１からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
７１．  配列番号５７６〜５８２からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７３５〜７３８のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
７２．  本質的に、配列番号５７６〜５８２からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
７３．  配列番号５７６〜５８２からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
７４．  配列番号５８３〜６０１からなる群から選択されるメンバーのカルボキシ末端アミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。該ポリペプチドは配列番号７２７〜７３４のいずれか１つと同一のアミノ酸配列を含まないことが好ましい。
７５．  本質的に、配列番号５８３〜６０１からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
７６．  配列番号５８３〜６０１からなる群から選択されるメンバーからなる、態様２０のポリペプチド。
７７．  本発明のポリペプチドと同一のエピトープと結合するポリペプチド。本発明のポリペプチドと同一のエピトープと結合するポリペプチドは約３〜約２０、約４〜約１２、または約４〜約７個のアミノ酸長のペプチドであることが好ましい。
７８．  ＰＤＺドメインとの結合について本発明のポリペプチドと競合するポリペプチド。ＰＤＺドメインとの結合について本発明のポリペプチドと競合するポリペプチドは約３〜約２０、約４〜約１２または約４〜約７個のアミノ酸長のペプチドであることが好ましい。いくつかの実施形態では、本発明はＰＤＺドメインとの結合について該ＰＤＺドメインと結合すると知られているポリペプチドと競合するポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態では、該ＰＤＺドメインと結合すると知られているポリペプチドは、ＧＧＷＲＷＴＴＷＬ、ＧＧＥＲＩＷＷＶ、ＧＧＷＦＬＤＶまたはＧＧＷＥＴＷＶを含んでなる、本質的にＧＧＷＲＷＴＴＷＬ、ＧＧＥＲＩＷＷＶ、ＧＧＷＦＬＤＶまたはＧＧＷＥＴＷＶからなる、またはＧＧＷＲＷＴＴＷＬ、ＧＧＥＲＩＷＷＶ、ＧＧＷＦＬＤＶまたはＧＧＷＥＴＷＶからなる。例えば、ＰＤＺドメインとの結合についてＧＧＷＲＷＴＴＷＬと競合するポリペプチドには、ＷＲＷＴＴＷＬ、ＹＲＷＴＴＷＬ、ＷＲＨＴＴＷＬ、ＷＧＷＴＴＷＬまたはＷＲＷＴＴＷＶがあり、該ポリペプチドのＮ末端残基は（必ずしもそうではないが）アセチル化されていてもよい。
７９．  もう１つの態様では、本発明は本発明のいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（組換えベクターおよび発現ベクターを含む）を提供する。
８０．  ポリペプチド−ポリペプチド相互作用を阻害する方法であって、第１および第２のポリペプチドを含んでなる混合物をＰＤＺドメインとそのリガンド間の相互作用のインヒビターと接触させることを含んでなり、ここで、第１のポリペプチドは該ＰＤＺドメインを含んでなり、かつ、第２のポリペプチドは該リガンドを含んでなる方法。
８１．  第１のポリペプチドがＰＤＺドメインを含んでなる融合ポリペプチドであり、かつ、第２のポリペプチドが該ＰＤＺドメインのリガンドを含んでなり、かつ、第１のポリペプチドが基質（固体支持体など）に付着されている、態様８０に記載の方法。
８２．  第１のポリペプチドがＰＤＺドメインを含んでなる融合ポリペプチドであり、かつ、第２のポリペプチドが該ＰＤＺドメインのリガンドを含んでなり、かつ、第２のポリペプチドが基質に付着されている、態様８０に記載の方法。
８３．  ＰＤＺドメインポリペプチドと該ポリペプチドのＰＤＺドメインと結合すると知られている分子（例えば、同族リガンドとの）間の相互作用（好ましくは結合）を調節する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該ポリペプチドおよび分子を含有するサンプルを候補物質と接触させ；
（ｂ）該候補物質の存在下での該分子の該ポリペプチドとの結合量を測定し；
（ｃ）ステップ（ｂ）の結合量を該候補物質の不在下で同様の条件下での該分子と該ポリペプチドの結合量と比較することを含んでなり、；
それによって（ｃ）で求めた結合量の差が該候補物質が該相互作用を調節する物質であるということを示す方法。
８４．  ＰＤＺドメインポリペプチドと該ポリペプチドのＰＤＺドメインと結合すると知られている分子との結合を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該ポリペプチドおよび分子を含有するサンプルを候補物質と接触させ；
（ｂ）候補物質の存在下での該分子の該ポリペプチドとの結合量を測定し；
（ｃ）ステップ（ｂ）の結合量を候補物質の不在下で同様の条件下での該分子と該ポリペプチドの結合量と比較することを含んでなり；
それによって、ステップ（ｃ）で求めた、該候補物質の不在下での結合量と比べた、候補物質の存在下でのポリペプチドと該分子の結合量の減少が、該候補物質がＰＤＺドメインポリペプチドと該ポリペプチドのＰＤＺドメインと結合すると知られている分子との結合を阻害する物質であるということを示す方法。
８５．  ＰＤＺドメインポリペプチドと該ポリペプチドのＰＤＺドメインと結合すると知られている分子との結合を増加させる物質をスクリーニングする方法であって、
（ａ）該ポリペプチドおよび分子を含有するサンプルを候補物質と接触させ；
（ｂ）候補物質の存在下での該分子の該ポリペプチドとの結合量を測定し；
（ｃ）ステップ（ｂ）の結合量を候補物質の不在下で同様の条件下での該分子と該ポリペプチドの結合量と比較することを含んでなり；
それによって、ステップ（ｃ）で求めた、該候補物質の不在下での結合量と比べた、候補物質の存在下でのポリペプチドと該分子の結合量の増加が、該候補物質がＰＤＺドメインポリペプチドと該ポリペプチドのＰＤＺドメインと結合すると知られている分子との結合を増加させる物質であるということを示す方法。
８６．  ＰＤＺドメインポリペプチドとリガンドの異常な結合相互作用と関連している症状を有する被験者に物質を投与することを含んでなる方法であって、該物質が該結合相互作用のモジュレーターである方法。モジュレーターはリガンドとＰＤＺドメインの結合相互作用の親和性に影響を及ぼすと知られている物質であることが好ましい。いくつかの実施形態では、モジュレーターは該相互作用を阻害する（例えば、細胞におけるＰＤＺドメインポリペプチド−リガンド複合体量の減少によって示されるように）。いくつかの実施形態ではモジュレーターは該相互作用を増強する（例えば、細胞におけるＰＤＺドメインポリペプチド−リガンド複合体量の増加によって示されるように）。ＰＤＺドメインポリペプチドとリガンド間の異常な相互作用と関連している症状は、ＰＤＺドメインポリペプチドおよびリガンドの生物学的機能、役割および／または活性の点から当業者には明らかであろう。例えば、本明細書ではＤＥＮＳＩＮ−１８０およびＥＲＢＩＮのＰＤＺドメインのリガンドとして示されているＡＲＶＣＦはその欠失が口蓋・心・顔面症候群と関連していると示されており、その遺伝子産物がカドヘリンに対して結合親和性を有し、したがって、接着結合での細胞接着において役割を果たす可能性がある遺伝子である。したがって、ＤＥＮＳＩＮまたはＥＲＢＩＮとＡＲＶＣＦ間の異常な相互作用は既知の症状、すなわち口蓋・心・顔面症候群、およびカドヘリン関連細胞接着機能の変化と関連しているいずれかの症状と関連している。ＰＤＺドメインポリペプチドとそのリガンドの異常な相互作用と関連している症状のその他の例としては、限定されるものではないが、パーキンソン病（例えば、ＰＡＲＫ２と関与している）；腫瘍形成（例えば、ＰＴＥＮ／ＭＭＡＣ、ＰＴＴＧ３、ＤＯＣ１と関与している）；細胞骨格機能／調節における異常と関連している症状（例えば、アクチニン、カテニン、ウトロフィンと関与しているもの）；シグナル伝達（例えば、膜会合型グアニレートキナーゼシグナル伝達、血清グルココルチコイド調節性キナーゼ（ＳＧＫ）、ＦＹＣＯ１、ＴＭ７ＳＦ３、ＳＨ３Ｄ５、ショウジョウバエＮＵＭＢ相同体、ＰＬＥＫＨＡ１、ＰＥＰＰ２、ＰＩＴＰＮＢ、ＪＡＭ１、ＪＡＭ２、ＬＬＴ１、ＲＧＳ２０、ＩＬ２ＲＢ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＰＰ１Ｒ３Ｄ、ＳＳＴＲ５、ＳＣＴＲ、ＧＲＭ１、ＧＲＭ２、ＧＲＭ３、ＧＲＭ５と関与しているもの）；レセプター機能（Ｇタンパク質共役レセプター（例えば、ＧＰＲ１０）、イオンチャンネル（例えば、ＫＶ８．１、ＫＶ１．５）、ＣＤ３４、セロトニンレセプター、ＰＤＧＦレセプター、ソマトスタチンレセプター３（ＳＳＴＲ３）、ＢＬＴＲ２、ＯＲ１０Ｃ１、ＣＮＴＮＡＰ２、ネクチン３、ＴＧＦＢＲ１、ＣＤ３６ｌ１、ＳＤＯＬＦ、ＨＴＲ２Ａ、ＮＲＸＮ１−３、ＧＡＢＲＧ２、ＣＮＴＦＲ、ＣＣＲ３、ＧＡＢＲＧ３、ＧＡＢＲＰ、ＭＲＧＸ２、ＧＰＲ１９、ＧＮＧ５、ＧＰＲＫ６と関与しているものなど）；細胞間結合／細胞接着（タイトジャンクションなど）（クローディン、ＪＡＭ１、ＪＡＭ２、ＴＭ４ＳＦ６、ＮＲＣＡＭ、ＶＣＡＭ１と関与しているものなど）；細胞増殖／生存／発達（ＩＧＦＢＰ７、ＭＵＣ���２、ＣＤ８３抗原、δ様相同体（ショウジョウバエ）、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＭ４ＳＦ６、ＰＩＷＩ１、マウスＰＩＷＩ様相同体１の可能性ある相同分子種、ＨＡＲＡＫＩＲＩ、ＬＡＮＯ、ＥＮＩＧＭＡと関与しているものなど）；ニューロン機能／発達（ＮＬＧＮ１、ＮＬＧＮ３、ＮＲＣＡＭと関与しているものなど））；乾癬（ＳＥＥＫ１と関与しているものなど）；低マグネシウム血症高カルシウム尿症症候群（クローディン１６（パラセリン−１）と関与しているものなど）；ウィリアムズ・ビューレン症候群（ＦＺＤ９と関与しているものなど）が挙げられる。
８７．  ＰＤＺドメインポリペプチドがＥＲＢＩＮのＰＤＺドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がδ−カテニン、ＡＲＶＣＦまたはｐ００７１である、本明細書に記載の方法。
８８．  ＰＤＺドメインポリペプチドがＤＥＮＳＩＮのＰＤＺドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がＡＲＶＣＦ、ｐ００７１またはδ−カテニンである、本明細書に記載の方法。
８９．  ＰＤＺドメインポリペプチドがＰＤＺ１および／または３のＳＣＲＩＢＢＬＥを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がＺＯ２（タイトジャンクションタンパク質２）、ＫＶ１．５、ＧＰＲ８７、ＡＣＴＩＮＩＮ、β−カテニンまたはＣＤ３４である、本明細書に記載の方法。
９０．  ＰＤＺドメインポリペプチドがＳＣＲＩＢＢＬＥのＰＤＺ２ドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がδ−カテニン、ＡＲＶＣＦまたはｐ００７１である、本明細書に記載の方法。
９１．  ＰＤＺドメインポリペプチドがＭＵＰＰのＰＤＺ７ドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がＨＴＲ２Ｂ、ＰＤＧＦＲｂ、δ−カテニン、ＳＧＫまたはＳＳＴＲ３である、本明細書に記載の方法。
９２．  ＰＤＺドメインポリペプチドがヒトＩＮＡＤＬのＰＤＺ６ドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がＨＴＲ２Ｂ、ＰＤＧＦＲｂ、δ−カテニン、ＳＧＫまたはＳＳＴＲ３である、本明細書に記載の方法。
９３．  ＰＤＺドメインポリペプチドがヒトＺＯ１のＰＤＺドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がクローディン−１７、クローディン−１、クローディン−３、クローディン−７、クローディン−９、クローディン−１８、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、δ−カテニン、ＡＲＶＣＦまたはＳＧＫである、本明細書に記載の方法。
９４．  ＰＤＺドメインポリペプチドがＡＦ６（ＭＬＬＴ４）のＰＤＺドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がＦＹＣＯ１、ＢＬＴＲ２、ＴＭ７ＳＦ３、ＯＲ１０Ｃ１、ＣＮＴＮＡＰ２、ネクチン３、ＳＨ３Ｄ５またはウトロフィンである、本明細書に記載の方法。
９５．  ＰＤＺドメインがＭＵＰＰのＰＤＺ３ドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がショウジョウバエＮＵＭＢ相同体、ＴＧＦＢＲ１、ＩＧＦＢＰ７またはＣＤ３６ｌ１である、本明細書に記載の方法。
９６．  ＰＤＺドメインポリペプチドがＭＡＧＩ１のＰＤＺ３ドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がＳＤＯＬＦ、ＰＬＥＫＨＡ１、ＰＥＰＰ２、ＭＵＣ１２、ＳＬＩＴ１、ＰＡＲＫ２、ＨＴＲ２ＡまたはＰＩＴＰＮＢである、本明細書に記載の方法。
９７．  ＰＤＺドメインポリペプチドがＭＡＧＩ３のＰＤＺ３ドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がＪＡＭ１、ＪＡＭ２、ＬＬＴ１、ＰＴＴＧ３、ＣＤ８３抗原、δ様相同体（ショウジョウバエ）、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＲＧＳ２０、ＴＭ４ＳＦ６、ＰＡＲＫ２、ＧＰＲ１０またはＩＬ２ＲＢである、本明細書に記載の方法。
９８．  ＰＤＺドメインポリペプチドがＩＮＡＤＬのＰＤＺ３ドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がＢＬＴＲ２、ＪＡＭ１、ＪＡＭ２、ＫＶ８．１、ＰＴＴＧ３、ＣＮＴＮＡＰ２、ＮＲＸＮ１、ＮＲＸＮ２、ＮＲＸＮ３、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＰＴＴＧ１、ＰＡＲＫ２、ＧＡＢＲＧ２、ＣＮＴＦＲ、ＣＣＲ２、ＧＡＢＲＧ３またはＧＡＢＲＰである、本明細書に記載の方法。
９９．  ＰＤＺドメインポリペプチドがヒトＩＮＡＤＬのＰＤＺ２ドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がＰＩＷＩ１、マウスＰＩＷＩ様相同体１の相同分子種、ＮＲＸＮ１、ＮＲＸＮ２、ＰＰＰ２ＣＡまたはＰＰＰ２ＣＢである、本明細書に記載の方法。
１００．  ＰＤＺドメインポリペプチドがヒトＰＡＲＤ３のＰＤＺ３ドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がＨＲＫ、ＤＯＣ１、ＰＩＷＩまたはＰＰＰ１Ｒ３Ｄである、本明細書に記載の方法。
１０１．  ＰＤＺドメインポリペプチドがＳＮＴＡ１のＰＤＺドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がＭＲＧＸ２、ＮＬＧＮ１、ＮＬＧＮ３、ＳＥＥＫ１、クローディン−１７、ＧＰＲ５６、ＳＳＴＲ５、ＳＣＴＲ、ＧＲＭ１、ＧＲＭ２、ＧＲＭ３またはＧＲＭ５である、本明細書に記載の方法。
１０２．  ＰＤＺドメインポリペプチドがＭＡＧＩ３のＰＤＺ０ドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がＬＡＮＯ、ＳＳＴＲ３、ＮＲＣＡＭ、ＧＰＲ１９、ＧＮＧ５またはＨＴＲ２Ｂである、本明細書に記載の方法。
１０３．  ＰＤＺドメインポリペプチドがＭＵＰＰのＰＤＺ１３ドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がＮＬＧＮ３、ＮＬＧＮ１、クローディン−１６、ＧＰＲ５６、ＥＮＩＧＭＡ、ＦＺＤ９、ＳＳＴＲ５、ＶＣＡＭ１またはＧＰＲＫ６である、本明細書に記載の方法。
１０４．  ＰＤＺドメインポリペプチドがＭＡＧＩ３のＰＤＺ２ドメインを含んでなり、かつ、このポリペプチドと結合すると知られている分子（例えば、リガンド）がＰＴＥＮ／ＭＭＡＣである、本明細書に記載の方法。
【００２３】
本発明の実施または試験に本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を用いてもよいが、適した方法および材料を以下に記載する。矛盾がある場合には、定義をはじめとする本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであって、限定しようとするものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
Ｉ．  ＰＤＺ結合ファージペプチドを同定する方法。
Ａ．  概要
本発明はカルボキシル末端ファージディスプレイ法を用いて細胞内タンパク質のＰＤＺドメインと結合するペプチドを同定する方法を提供する。本発明は各融合遺伝子が候補ＰＤＺ結合ペプチド遺伝子とファージコートタンパク質の少なくとも一部をコードする遺伝子とを含んでなる、融合遺伝子を提供し、ここで、融合遺伝子は各々、所望によりペプチドリンカーを介してファージコートタンパク質のカルボキシル末端アミノ酸残基に融合された候補ＰＤＺ結合ペプチドをコードする。ファージディスプレイでは、融合タンパク質はファージ粒子に組み込まれ、その結果、粒子が候補ＰＤＺ結合ペプチドをファージ粒子の表面に提示する。好ましい実施形態では、候補ＰＤＺ結合ペプチドを含んでなるカルボキシル末端融合タンパク質のライブラリーがファージ粒子に提示され、次いで、ライブラリーからＰＤＺドメイン標的をピックアップして特定のＰＤＺドメインと結合する候補ペプチドを同定する。次いで、ＰＤＺドメイン結合ペプチドを提示するファージを単離して、提示されたペプチドの配列を、例えば、融合遺伝子を配列決定することによって調べる。次いで、１以上の結合ペプチドの配列を既知のタンパク質のカルボキシル末端配列と比較して、どの既知の細胞内タンパク質がＰＤＺドメイン結合ペプチドと同一のまたは類似のカルボキシル末端配列を含むかを調べるＰＤＺドメイン含有タンパク質の同族タンパク質リガンドが同定できる。
【００２５】
好ましい態様では、繊維状バクテリオファージのＰ８タンパク質を用いてカルボキシル末端融合タンパク質を形成し、ＰＤＺドメイン結合特異性の解析のための本発明の好ましい方法はこのディスプレイ形式を用いる。例えば、膜会合型グアニレートキナーゼ由来の２種の異なるＰＤＺドメインによりＰ８のカルボキシル末端と融合された多種多様なペプチドライブラリーからコンセンサス配列が選択されたということを以下に示した。選択された配列に相当する合成ペプチドはＰＤＺドメインと高度の親和性および特異性をもって結合し、この合成ペプチドを用いて個々のペプチド側鎖の結合寄与を調べた（実施例参照）。もう１つの実施例では、ＥＲＢＩＮタンパク質由来のＰＤＺドメインを本発明の方法に適用し、これまでに記載されたリガンドよりも高度の親和性を有するファージペプチドおよび同族タンパク質リガンドを見出した。
【００２６】
Ｂ．  定義
１．  タンパク質、ポリペプチドおよびペプチド
タンパク質、ペプチドおよびポリペプチドは当技術分野では十分に公知である。タンパク質はペプチドよりも長いアミノ酸配列を含む。ペプチドは２〜約５０個のアミノ酸残基を含む。ポリペプチドにはタンパク質およびペプチドが含まれる。タンパク質の例としては、抗体、酵素、レクチンおよびレセプター；リポタンパク質およびリポポリペプチド；ならびに糖タンパク質および糖ポリペプチドが挙げられる。ポリペプチドの例としては、神経ペプチド、タンパク質の機能性ドメイン（例えば、ＰＤＺドメイン）、ファージディスプレイライブラリーから得られた３〜２０個の残基を含むペプチドなどが挙げられる。
【００２７】
２．  ＰＤＺドメイン（ＰＤＺＤ）
ＰＤＺドメイン（ＤＨＲ（ＤＬＧ相同体領域）またはＧＬＧＦリピートとしても知られている）は、９５ｋＤａのシナプス後肥厚部タンパク質（ＰＳＤ−９５）、ショウジョウバエ腫瘍サプレッサーｄｉｓｃｓ−ｌａｒｇｅおよびタイトジャンクションタンパク質ｚｏｎｕｌａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ−１（ＺＯ−１）の保存された構造エレメントとして最初に記載され、タンパク質の多種多様なセットに含まれている。一般に、ＰＤＺドメイン含有タンパク質は、上皮細胞タイトジャンクション、神経筋接合部およびニューロンのシナプス後肥厚部などの分化した細胞下部位で、イオンチャンネルおよびその他の膜貫通レセプターをはじめとする種々の機能的実体を集めるようである。
【００２８】
一般に、ＰＤＺドメインは相互作用するタンパク質のカルボキシル末端に位置する短いカルボキシル末端ペプチド配列と結合する。通常、ＰＤＺドメインは２つのαへリックスと６つのβシートを含んでなる。ＰＤＺＤの例としては配列番号２０１の残基１２１７〜１３７１、ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインがある。
ＰＤＺＤはＰＤＺＤ核酸（ＰＤＺＤ）によってコードされ得る。
【００２９】
３．  ＰＤＺタンパク質（ＰＤＺＰ）
ＰＤＺタンパク質は少なくとも１つのＰＤＺドメインを含む。ＰＤＺＰは天然タンパク質、または少なくとも１つのＰＤＺドメインを含むよう改変されたタンパク質であり得る。ＰＤＺＰはＰＤＺＰ核酸（ＰＤＺＰ）によってコードされ得る。ＰＤＺの例としてはＭＡＧＩ３およびＥＲＢＩＮが挙げられる。表Ｂも参照。
【００３０】
４．  ＰＤＺドメインリガンド（ＰＤＬ）
リガンドとはタンパク質またはその他の分子の特定の部位と結合する分子または部分を指し；ＰＤＺドメインリガンドとは、少なくとも１つのＰＤＺドメインと結合する分子または部分である。タンパク質、ペプチド、小さな有機および無機分子および核酸がＰＤＬの例として挙げられる。
【００３１】
５．  ＰＤＺドメイン結合ペプチド（ＰＤＢＰ）
物理的にではあるが、非共有結合的にＰＤＺドメインと相互作用する（「結合する」）、天然またはファージディスプレイ由来のペプチドなどのペプチド。ＰＤＢＰが相互作用し得るＰＤＺドメインは単離されていてもよいし、またはＰＤＺタンパク質もしくはその断片もしくは誘導体内に含まれていてもよい。ＰＤＢＰはＰＤＺドメインと結合するのに必要なアミノ酸残基のみを含んでいる場合もあるし、または全部で約５０個までのアミノ酸残基を含んでいる場合もある。ＰＤＺドメインと相互作用する、５０個のアミノ酸よりも長いペプチド（タンパク質）としてはＰＩＰがある（以下参照）。ＰＤＢＰはＰＤＢＰ核酸（ＰＤＢＰ）によってコードされ得る。ＰＤＢＰの例としてはＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインと結合するペプチド、配列番号１４〜１８１、２０９〜２１３および２４１〜２４７が挙げられる。
【００３２】
６．  ＰＤＺ相互作用タンパク質（ＰＩＰ）
ＰＤＺドメインを介してＰＤＺタンパク質と物理的にではあるが、非共有結合的に相互作用する（「結合する」）、少なくとも１つのＰＤＢＰを含んでなるタンパク質。ＰＩＰとしては天然に認められるタンパク質、その変異体、ならびに少なくとも１つのＰＤＢＰを含むよう改変されているタンパク質が挙げられる。ＰＩＰはＰＩＰ核酸（ＰＩＰ）によってコードされ得る。ＰＩＰの例としては、ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインと結合するＰＤＢＰを含むδカテニンが挙げられる。
【００３３】
７．  アフィニティー精製
アフィニティー精製とは、分子が化学または結合パートナーへ特異的誘引または結合されて、結合または複合体が形成され、それによって、パートナー部分へ結合されるか、または誘引されている間に分子が不純物から分離されることが可能となることに基づく分子の単離を意味する。
【００３４】
８．  細胞、細胞株、細胞培養物
細胞、細胞株、細胞培養物は同じ意味で用いられ、かかる表記には細胞または細胞株のすべての子孫が含まれる。子孫は意図的なおよび偶発的な変異のためにＤＮＡ内容が正確に同一でない場合もある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされた同一の機能または生物活性を有する変異子孫も含まれる。
【００３５】
９．  コートタンパク質（ファージとの関連において）
ファージコートタンパク質はファージウイルス粒子の表面の少なくとも一部を含んでなる。機能的には、コートタンパク質は宿主細胞におけるウイルスの構築プロセスの間にウイルス粒子と会合しており、感染まで構築されたウイルスと依然として会合しているいずれかのタンパク質である。メジャーコートタンパク質とはコートを主に含んでなるものであり、１０以上のコピー／粒子で存在し；マイナーコートタンパク質はあまり大量ではない。
【００３６】
１０．  融合タンパク質
融合タンパク質とはともに共有結合によって結合された２つの部分を含み、各部分が異なるタンパク質に由来するポリペプチドである。２つの部分は単一のペプチド結合によって直接、または１個以上のアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを介して結合している場合もある。一般に、２つの部分およびリンカーは互いにリーディングフレームにあり、組換え技術を用いて産生される。
【００３７】
１１．  異種ＤＮＡ
異種ＤＮＡとは宿主細胞に導入されているいずれかのＤＮＡである。このＤＮＡはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡおよび融合物をはじめとする種々の供給源由来のものであってよい。
【００３８】
１２．  ファージディスプレイ
ファージディスプレイとはそれによって変異体ポリペプチドがコートタンパク質との融合タンパク質として、繊維状ファージなどのファージ粒子の表面に提示される技術である。コートタンパク質、一般に、繊維状ファージのタンパク質３またはタンパク質８との融合を介して小さなランダムペプチドおよび小さなタンパク質を提示するためには、多価ファージディスプレイ法が用いられてきた（WellsおよびLowman, 1992）。一価ファージディスプレイでは、タンパク質またはペプチドライブラリーをコードする遺伝子をファージコートタンパク質遺伝子またはその一部と融合し、対応するタンパク質融合物が野生型コートタンパク質の存在下で低レベルで発現され、その結果、微量のファージ粒子のみが１コピーより多い融合タンパク質を提示する。多価ファージと比べて結合力作用が低く、その結果、選別が内因性リガンド親和性に基づくものとなる。ファージミドベクターを用いる場合には、ＤＮＡ操作が単純化される（LowmanおよびWells, 1991）。
【００３９】
１３．  ファージミドベクター
ファージミドとはファージ複製起点、細菌複製起点、例えば、ＣｏｌＥｌおよびバクテリオファージの遺伝子間領域のコピーを含むプラスミドベクターである。ファージミドは繊維状およびラムダバクテリオファージをはじめとするいずれかの既知のバクテリオファージを基にしたものであり得る。プラスミドはまた、選択マーカーも含む。これらのベクターにクローニングされたＤＮＡのセグメントはプラスミドとして増殖され得る。これらのベクターを含有する細胞がファージ粒子の産生に必要なすべての遺伝子とともに提供される場合に、プラスミドの複製様式がローリングサークル複製へと変化し、一本鎖のプラスミドＤＮＡのコピーが生じてファージ粒子がパッケージングされる。ファージミドは感染性または非感染性ファージ粒子を形成し得る。この用語は異種ポリペプチド遺伝子と結合したファージコートタンパク質遺伝子またはその断片を遺伝子融合物として含み、その結果、異種ポリペプチドがファージ粒子の表面に提示されるファージミドを含む（Sambrook, 1989）。
【００４０】
１４．  ファージベクター
ファージベクターとは、異種遺伝子を含有し、かつ、複製可能な、バクテリオファージＤＮＡの二本鎖核酸複製型である。ファージベクターはファージ複製起点を含み、これによりファージ複製およびファージ粒子形成が可能となる。好ましくは、ファージはＭ１３、ｆｌ、ｆｄ、Ｐｆ３ファージなどの繊維状バクテリオファージもしくはその誘導体またはラムダ２１、ｐｈｉ８０、ｐｈｉ８１、８２、４２４、４３４等といった、ラムダファージもしくはその誘導体である。
【００４１】
１５．  ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ＰＣＲとは、米国特許第４，６８３，１９５号に記載のように核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの微量の特定の断片を増幅する技術を指す。ＰＣＲは全ゲノムＤＮＡおよび全細胞性ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミド配列などから特定のＲＮＡ配列、特定のＤＮＡ配列を増幅するために使用できる（Ehrlich, 1992; Mullisら,米国特許第４，６８３，１９５号， 1987）。
【００４２】
１６．  野生型
野生型配列またはコートタンパク質などの野生型タンパク質の配列とは、それから変異体ポリペプチドが変異の導入によって誘導される対照配列である。一般に、任意のタンパク質の野生型配列とは天然において最も一般的な配列である。同様に、野生型遺伝子配列とは、天然において最も一般的に認められる遺伝子の配列である。野生型配列に導入された変異により本来の野生型タンパク質または遺伝子の「変異体」または「突然変異体」型が生じる。
【００４３】
Ｃ．  カルボキシル末端ファージディスプレイ
ＰＤＺファージペプチドを同定する第１のステップでは、タンパク質３または８を含む融合タンパク質を用いて、ファージ、好ましくは繊維状ファージの表面に異種ペプチドのカルボキシル末端（Ｃ末端）ディスプレイライブラリーを調製する。Ｃ末端ディスプレイはＭ１３のタンパク質６で報告されており（Jespersら, 1995）；ペプチドおよびタンパク質のＣ末端ディスプレイの方法は、概ねＷＯ００／０６７１７に開示されている。これらの方法は本発明の融合遺伝子、融合タンパク質、ベクター、組換えファージ粒子、宿主細胞およびそれらのライブラリーを調製するために用いてもよい。異種ペプチドまたはペプチドのライブラリーのＣ末端ディスプレイはファージコートタンパク質のＮ末端（Ｎ末端ディスプレイ）でのディスプレイと同様の方法で達成すればよい。Ｃ末端ディスプレイは野生型コートタンパク質またはＷＯ００／０６７１７に示される突然変異コートタンパク質を用いて達成すればよい。
【００４４】
コートタンパク質変異体および異種ペプチドを含むタンパク質融合物、かかる変異体およびタンパク質融合物のライブラリー、変異体および融合タンパク質をコードする発現ベクター、ベクターのライブラリー、ベクターを含有する宿主細胞のライブラリーを作製する、ファージまたはファージミドディスプレイの十分に公知の実験法のいずれか、同一物を調製してピックアップして結合ペプチドを得る方法もＣ末端ディスプレイのための本発明の本態様に用いてもよい。これらの方法を記載する参照文献は前記に記載されている。
【００４５】
変異体タンパク質融合タンパク質は野生型コートタンパク質配列と比べて置換、付加または欠失をはじめとする１以上の変更を含む。多数の変更があり得、ファージ表面にペプチドをディスプレイする能力を保持する間はファージに受け入れられる。残基の化学的性質が変更されていてもよく、すなわち、疎水性残基が親水性残基に、またはその逆に変更されていてもよい。２〜５０、好ましくは５〜４０、より好ましくは７〜２０個の変更された残基を含有する変異体があり得る。コートタンパク質またはその一部の野生型配列とは異なる、いずれかの成熟コートタンパク質配列またはその一部を含有する融合タンパク質も本発明の範囲内にある。２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０個の変異体残基を含有するコートタンパク質変異体が考慮されるが、最も好ましくは４〜１０個の変異体残基である。異種ペプチドの表面ディスプレイができない変異体はファージディスプレイの際に、ピックアップおよび選抜プロセスで不可として選択される。
【００４６】
Ｎ末端ディスプレイと同様に、コートタンパク質の所望のセグメント内のアミノ酸残基が様々であるライブラリーを作製して、コートタンパク質の所定の領域内にアミノ酸付加、置換または欠失を含むコートタンパク質変異体のライブラリーを得てもよい。例として、コートタンパク質を任意の数のゾーン、一般には２〜１０個のゾーンに分割して、ライブラリーが１以上のゾーン内の変異体から構築されていてもよい。Ｍ１３、ｆｌおよびｆｄファージの成熟コートタンパク質は、例えば、５０個のアミノ酸を含むが、各々５個のアミノ酸残基をからなる１０ゾーン、または各ゾーンに等しくない数の残基を含むゾーン、例えば、１５、１０、９および８残基を含むゾーンに分割してもよい。コートタンパク質の細胞質、膜貫通および周辺質領域に相当するゾーンを用いてもよい。アミノ酸変更が望まれる、各ゾーンの個別のライブラリーを構築してもよい。コートタンパク質変異体がゾーン１にアミノ酸変更を含む、融合タンパク質が望まれる場合には、例えば、ゾーン１内の１以上のアミノ酸残基が変化した、単一のライブラリーを構築すればよい。あるいは、２つのゾーンがアミノ酸変更を含む、融合タンパク質の作製を所望する場合もある。各ライブラリーが２つのゾーンの一方内に変更を含む、２つのライブラリーを調製すればよい。
【００４７】
好ましくは、異種ペプチドはコートタンパク質またはその変異体にリンカーペプチドを介して付着させる。リンカーはＣ末端ディスプレイが可能ないずれの数の残基を含んでいてもよいが、一般には約４〜約３０、好ましくは約８〜約２０個のアミノ酸残基を含む。リンカーはいずれかの天然の残基を含んでいてもよいが、主に（５０％より多く）グリシンおよび／またはセリンを含有するリンカーが好ましい。特定のペプチドのディスプレイに最適なリンカー組成および長さは前記のファージディスプレイを用いて選択すればよく、実施例において証明され得る。例えば、各々異なるリンカー長を含むファージライブラリーを構築し、ファージ選抜およびピックアップを用いて、異種ペプチドの発現およびディスプレイを最適にするいずれかの長さのリンカーのアミノ酸組成物を単離してもよい。効率的なリンカーの例については実施例を参照。
【００４８】
異種ペプチドのファージ粒子表面でのディスプレイを改善する変異体コートタンパク質が野生型と比べて複数の突然変異を含む場合には、異種ペプチドを新規変異体と野生型コートタンパク質を用いて得られるレベルの間の中間のレベルで提示する変異体を得ることも可能である。このことは変異体の各突然変異したアミノ酸を野生型配列または別の変更された残基に個別に復帰突然変異することで達成され得る。これらの復帰突然変異は一般に、異種ペプチドのディスプレイレベルを、変異体と野生型コートタンパク質を用いて得られたディスプレイレベルの間で変動するレベルに低下させる。復帰突然変異を組み合わせることによって、ディスプレイを、変異体と野生型コートタンパク質を用いて得られたものの間である所望のレベルに合わせてもよい。
【００４９】
同様のプロセスを用いて野生型コートタンパク質のレベルよりも低いレベルで提示する変異体を作製してもよい。例えば、突然変異を１以上のゾーンに作製して、得られたライブラリーから弱くしか結合しない（野生型融合物を提示するファージよりも弱く）ファージをピックアップしてもよい。より弱く結合するファージを野生型コートタンパク質融合物を提示するファージで置換して、既知の方法を用いて単離および配列決定してもよい。
【００５０】
ウイルスコートへの組み込みについて機能低下しており（野生型よりも機能的でない）、したがって、野生型コートタンパク質と比べて融合タンパク質ディスプレイを減少させる、突然変異コートタンパク質を得てもよい。この場合には、突然変異を野生型として保存される傾向にある残基に作製する。次いで、これらの部位での突然変異によって得られた変異体を、野生型コートタンパク質ディスプレイレベルと比べて所定の融合タンパク質を提示するその能力についてスクリーニングすればよい。次いで、融合物を野生型と比べて所望の低いレベルで提示する機能低下変異体をファージディスプレイ目的の融合タンパク質のライブラリーの構築に用いればよい。機能低下変異体の作製に好ましい残基は保存されているものであり、コートタンパク質のいずれかの残基を突然変異させて、得られた変異体を融合タンパク質のディスプレイを可能にするその能力について調べてもよい。野生型よりも低いディスプレイレベルは適当な機能低下突然変異体を用いることで達成される。機能低下変異体の選抜には選抜ではなくスクリーニングが必要であるが、タンパク質中のほとんどの突然変異が活性の増加ではなくむしろ低下を引き起こし、また、好適なスクリーニング手順は公知であるので、この方法は比較的単純である。
【００５１】
前記のＣ末端ディスプレイはＤＮＡライブラリー（候補ＰＤＺ結合ペプチドをコードする核酸を含む）によってコードされるペプチドをファージ粒子の表面に提示するのに有用である。オープンリーディングフレームを含有するファージミドまたはファージベクターを組換えによって構築し、ＤＮＡをコートタンパク質遺伝子の３'末端でベクターに連結する。次いで、宿主細胞をベクターのライブラリーを用いて形質転換し、ＤＮＡライブラリーのメンバーに相当する異種ペプチドを提示するファージ粒子を得る（ファージミドベクターのヘルパーファージの重感染を用いて）。得られたＣ末端ファージディスプレイライブラリーをピックアップして従来のファージディスプレイ技術を用いて解析すればよい。
【００５２】
Ｃ末端ディスプレイは、特に、ほとんどのＰＤＺドメインがＰＤＺドメイン結合リガンドのＣ末端部分を認識し結合するのでＰＤＺ結合ペプチド同定に特に有用である。
【００５３】
Ｃ末端ファージディスプレイライブラリーはファージミドベクターを用いて調製し、組換え技術を用いて複数の融合遺伝子を含有するベクターのライブラリーを構築するのが好ましい。融合遺伝子は、好ましくは、繊維状ファージの遺伝子８またはその変異体を含むペプチドライブラリー遺伝子の３'融合物として調製し、その結果、それによってコードされるタンパク質融合物が、カルボキシル末端候補結合ペプチドがそれに融合されているファージタンパク質８として発現される。さらに、融合遺伝子はまた、ファージコートタンパク質と候補結合ペプチドの間にペプチドリンカーをコードする核酸部分を含んでいてもよい。ペプチドリンカーの配列は前記の既知のファージディスプレイ法を用いて最適化すればよい。リンカーの長さは候補結合ペプチドの最適なディスプレイを提供するためには異なり得るが、一般に、２〜５０個の残基、好ましくは４〜２５個の残基、より好ましくは５〜２０個の残基である。したがって、長さおよびアミノ酸残基双方において異なるリンカーにより、異なる長さのディスプレイペプチドのより効率的なディスプレイが可能となり得る。ペプチドライブラリー遺伝子は一般に４〜２０、好ましくは４〜１０個のアミノ酸残基を含むランダムペプチドをコードする。各ライブラリー位置で、２０種すべての天然アミノ酸をコードする縮重コドンが用いられているのが好ましいが、１以上の位置が単一のアミノ酸残基として固定されていてもよく、または必要に応じて限定された残基セットをコードする縮重コドンを用いてもよい。ライブラリーはまた、短いペプチドのディスプレイが望まれる場合には、アンバー、オーカーまたはウンバー（ｕｍｂｅｒ）停止コドンなどの停止コドンをコードしていてもよい。ひと度調製すれば、ライブラリーを調製したＰＤＺドメインを用いる結合選抜に１、２または数ラウンド繰り返して付す。
【００５４】
Ｄ．  ＰＤＺドメインの調製
１．  一般的なアプローチ
ＰＤＺドメインは従来のようにドメインを含有するタンパク質断片として、または従来の合成もしくは組換え技術を用いて融合ポリペプチドとして得ればよい。融合ポリペプチドは発現研究、細胞局在化、バイオアッセイおよびＰＤＺドメイン精製に有用である。ＰＤＺドメイン「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は非ＰＤＺドメインポリペプチドと融合しているＰＤＺドメインを含んでなる。非ＰＤＺドメインポリペプチドはＰＤＺドメインと実質的に相同でない（相同性は以下に定義する）。ＰＤＺドメイン融合タンパク質はいずれかの数の生物活性部分をはじめとする全ＰＤＺドメインのいずれの部分を含んでいてもよい。次いで、融合タンパク質はアフィニティークロマトグラフィーおよび非ＰＤＺドメインポリペプチドと結合する捕獲試薬を用いて既知の方法に従って精製すればよい。ＰＤＺドメインは、例えば、ＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端と融合していてもよい。かかる融合タンパク質により固体支持体と結合しているグルタチオンを用いる組換えＰＤＺドメインの精製が容易になる。さらなる例示的融合物を、かかる融合物のいくつかの一般的な用途を含めて表Ａに示す。
【００５５】
融合タンパク質は組換え法を用いて容易に作製できる。ＰＤＺドメインをコードする核酸はインフレームで核酸をコードする非ＰＤＺドメインをＰＤＺドメインＮ末端、Ｃ末端または内部に融合すればよいが、ＰＤＺ融合物はＮ末端で融合されているのが好ましい。融合遺伝子はまた、自動化ＤＮＡシンセサイザーをはじめとする従来技術によって合成してもよい。２つの連続する遺伝子断片の間に、相補的なオーバーハングが生じ、続いて、これらをアニーリングして再増幅しキメラ遺伝子配列を得ることができる、アンカープライマーを用いるＰＣＲ増幅も有用である（Ausubelら, 1987）。ＰＤＺドメインを融合タンパク質にインフレームでサブクローニングするのを容易にする、多数のベクターが市販されている。
【００５６】
2004533840.tif 000003
【００５７】
ＰＤＺドメイン融合物の例として、ＧＳＴ−ＰＤＺ融合物を注目する遺伝子から調製してもよい。注目する全長遺伝子を鋳型として、ＰＣＲを用い、サブクローニングを容易にするため便宜な制限エンドヌクレアーゼ部位を導入するプライマーを用いてＰＤＺドメインをコードするＤＮＡ断片を増幅する。各増幅断片を適当な制限酵素で消化し、同様に消化した、ＧＳＴを含み、かつ、サブクローニングされた断片がＧＳＴとインフレームであるように設計され、かつ、プロモーターと機能し得る形で連結されているｐＧＥＸ−４Ｔ−３などのプラスミドにクローニングしてＧＳＴ−ＰＤＺ融合タンパク質をコードするプラスミドを得る。
【００５８】
融合タンパク質を生産するには、通常、適当な発現プラスミドを保持する大腸菌培養物を好ましくは約３７℃にてＬＢブロスで対数期の中間部（Ａ６００＝１．０）まで増殖させ、ＩＰＴＧで誘導すればよい。細菌を遠心分離によってペレットとし、ＰＢＳに再懸濁して超音波処理によって溶解する。懸濁液を遠心分離し、ＧＳＴ−ＰＤＺ融合タンパク質を上清から０．５ｍｌのグルタチオン−セファロースでのアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。
【００５９】
しかしながら、多数の変法によっても単離されたＰＤＺドメインタンパク質という目標に到達し、これらは本発明に用いてもよいということは当業者には明らかである。例えば、ＰＤＺドメインとエピトープタグの融合物は前記のように構築し、このタグをＰＤＺドメインをアフィニティー精製するために用いてもよい。エピトープタグは以下により十分に記載する。ＰＤＺドメインタンパク質／ペプチドはまた、いずれかの融合を用いずに、さらに、代わりにタンパク質を生産するための微生物ベクターを用いて調製してもよく、インビトロ化学合成を代わりに用いてもよい。その他の細菌、哺乳類細胞（ＣＯＳなど）といったその他の細胞、またはバキュロウイルス系を用いてＰＤＺドメインタンパク質／ペプチドを生産してもよい。種々の融合物を生じる広範なポリヌクレオチドベクターも利用できる。ＰＤＺドメイン融合タンパク質の最終精製は融合パートナーによって異なることは明らかであり、例えば、ポリヒスチジンタグ融合物はニッケルカラムで精製すればよい。
【００６０】
２．  ＰＤＺドメイン
ＰＤＺドメインはタンパク質複合体を、通常、細胞原形質膜に集めるという特徴を有する。これまでに、多数のＰＤＺドメイン含有タンパク質が知られている。いずれのＰＤＺドメインおよびいずれのＰＤＺドメイン含有タンパク質を本発明の方法に用いてもよい。表Ｂには既知のＰＤＺドメイン含有ヒトタンパク質のサブセットが列挙されている。これらおよび他のＰＤＺドメイン、ならびに、その非ヒト相同体が本発明の方法の標的として考慮される。
【００６１】
2004533840.tif 000004
2004533840.tif 000005
2004533840.tif 000006
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【００６２】
Ｅ．  注目するＰＤＺドメインと高親和性結合するファージの単離
次いで、候補ＰＤＺ結合ペプチドをカルボキシル末端提示するファージディスプレイライブラリーを、インビトロでＰＤＺドメインタンパク質またはＰＤＺドメイン融合タンパク質と接触させて、ＰＤＺドメイン標的と結合するライブラリーのメンバーを調べる。当業者に公知のいずれかの方法を用いてインビトロタンパク質結合をアッセイしてもよい。
【００６３】
例えば、１、２、３または４ラウンド以上の結合選抜を実施し、その後、個々のファージを単離し、所望によりファージＥＬＩＳＡで解析してもよい。ペプチドを提示するファージ粒子の固定化されたＰＤＺ標的タンパク質との結合親和性はファージＥＬＩＳＡを用いて求めればよい（Barrettら, 1992）。
【００６４】
Ｆ．  提示されたペプチドの配列の決定
標的ＰＤＺまたはＰＤＺ融合物と結合し、場合によっては、関連のないＰＤＺドメインとは結合しないファージを配列解析に付す。候補ＰＤＺ結合ペプチドを提示するファージ粒子を宿主細胞において増幅し、ＤＮＡを単離し、ゲノムの適当な部分（融合遺伝子）をいずれかの適当な既知の配列決定技術を用いて配列決定する。
【００６５】
Ｇ．  ＰＤＺ  結合ペプチドコンセンサス配列の決定
次いで、注目するＰＤＺドメインのＰＤＺ結合ペプチドコンセンサス配列を個々の結合ペプチドの配列から決定してもよい。コンセンサス配列とは類似の配列のファミリーに相当する導かれたアミノ酸配列である。コンセンサス配列中の各残基はその位置で最も高頻度で出現する残基に相当する。コンセンサス配列は検査によって配列のファミリーから手作業で求めることができる。
【００６６】
あるいは、市販のコンピューターソフトウェア、例えば、Ｅｙｅｂａｌｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｅｄｉｔｏｒソフトウェア（CabotおよびBeckenbach, 1989）を用いてアミノ酸配列をアラインしてもよい。相同性を最大とするようギャップを手作業で導入する。アミノ酸コンセンサス配列はアラインメントから手作業で導き：共通残基は所定の位置で最も高頻度に生じる。不変と同定される残基がすべての全長配列に存在する。明らかな共通を示さない位置はコンセンサス配列中では「Ｘ」と表す場合があり、他方、配列の少なくとも５０パーセントに存在しなかった位置は通常コンセンサス配列には含まれない。
【００６７】
Ｈ．  カルボキシ末端にＰＤＺ結合ペプチドコンセンサス配列または特定の結合配列を含むタンパク質の同定
注目するＰＤＺドメインの可能性ある結合パートナーを同定するために、Ｃ末端にＰＤＺ結合性コンセンサス配列または特定のＰＤＺ結合配列を含むタンパク質を同定する。この同定はインシリコでＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔ、ＤａｙｈｏｆｆまたはＧｅｎｂａｎｋなどの公開配列データベースをクエリーすることによって実施すればよい。この配列はアミノ酸配列のみによって検索してもよいし、またはＰＤＺ結合性コンセンサス配列をコードするであろう適当な一連の核酸配列を、遺伝暗号の縮重を考慮しながら作製することによって核酸配列を検索してもよい。
【００６８】
例えば、注目するＰＤＺドメインに対してファージ選択されたペプチドと類似するＣ末端残基を含むタンパク質をいずれかの利用可能なモチーフ検索アルゴリズムを用いて、または検査によって同定してもよい。好ましくは、複数の、例えば、１０〜２０または１０〜５０または１００より多いような、注目するＰＤＺドメインに対して選択されたファージペプチドをアラインさせて、注目するＰＤＺドメインに対して密着結合するコンセンサス配列を確定してもよい。次いで、コンセンサス配列を用い、データベース内のタンパク質のＣ末端アミノ酸に対する検索基準を限定しながら、利用可能なタンパク質データベースを検索して類似のＣ末端配列を同定する。基準におけるＣ末端アミノ酸数は、適したまたは所望の数のマッチするデータベースタンパク質を得るために必要に応じて変更すればよいが、好ましくは、約４〜約１０である。
【００６９】
当業者には明らかであるが、アラインされるファージ数、モチーフ検索アルゴリズム、クエリーされるデータベース、およびデータベースにおいてクエリーするＣ末端残基数などの種々の基準を調整すればよい。
【００７０】
Ｉ．  見込みのない候補の排除
注目するＰＤＺドメインと結合／相互作用する候補タンパク質を決定するために、タンパク質データベースをクエリーし（前記のように）、ファージディスプレイによって求められた、共通または特定の結合配列と類似のＣ末端配列を含むタンパク質のリストを同定する。所望により、細胞内タンパク質でないタンパク質（ＰＤＺドメインは細胞質タンパク質に認められる）をリストから除外する。重複するデータベースエントリーおよび相同分子種も排除してリストを所望のように単純なものとしてもよい。必要に応じて、ＰＤＺドメインが得られた生物と関連のないタンパク質を除外するようリストをさらに選抜してもよい。
【００７１】
例えば、相同分子種または同一遺伝子産物の単に別個のデータベースエントリーが認められ場合があり、これを減らして１つの例示的エントリーとしてもよい。タンパク質の細胞内局在化が未知である、かつ／または、配列相同性（特に既知の細胞内ターゲッティングドメインの相同性について）から予測できない場合には、かかるタンパク質は注目する候補タンパク質として維持してもよい。
【００７２】
Ｊ．  インビトロおよびインビボでの、ＰＤＺドメインと相互作用する注目する候補タンパク質およびＰＤＺドメイン含有タンパク質の生物学のアッセイ
ひと度、候補ＰＤＺドメイン結合タンパク質のリストが同定されれば、この候補をインビトロおよび／またはインビボで注目するＰＤＺドメインとの相互作用についてスクリーニングすればよい。適したスクリーニングアッセイには調製したＰＤＺドメイン（前記参照）または注目するＰＤＺドメインを含有する全タンパク質を用いればよい。例えば、アッセイはＰＤＺドメインまたはＰＤＺドメイン含有タンパク質をファージディスプレイによって決定された候補結合ペプチド（またはこの配列を含むより長いペプチド）と接触させ、あれば、結合を調べることを含んでなり得る。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイなどの標準的なアッセイ形式を用いればよい。
【００７３】
細胞生物学および生化学の当業者ならば適当なアッセイを容易に選択できよう。一般的なアッセイとしては、ＰＤＺ含有タンパク質を、通常、非変性条件下で細胞から抽出し、特異的抗体を用いて沈降させる免疫共沈降実験が挙げられる。ＰＤＺ含有タンパク質に特異的な共沈降するタンパク質（例えば、免疫沈降を実施するのに用いた薬剤で非特異的に沈降したのではない）を可視化して解析してもよい。さらなる解析としてはウェスタンブロッティング（下記参照）およびＰＤＺ結合ペプチドを認識する抗体、共沈降したペプチドのミクロシークエンシング、質量−分光光度法によるシークエンシングなどのアッセイが挙げられる。
【００７４】
ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティング法は当業者には十分に公知である。一般に、細胞または組織抽出物などのタンパク質サンプルを、サンプル内でタンパク質の適当な分離が生じるような条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥに付す。次いで、タンパク質を、タンパク質相互の相対的位置を維持するような方法でメンブラン（例えば、ニトロセルロース、ナイロンなど）にトランスファーする。
【００７５】
目に見えるように標識した、分子量が既知のタンパク質をゲルのレーンの中に含める。これらのタンパク質はタンパク質のメンブランへの適切なトランスファーが起こったということを保証する方法として、およびブロット上のその他のタンパク質の相対的分子量を求めるための分子量マーカーとして役立つ。
【００７６】
タンパク質のメンブランへのトランスファーに続いて、一次抗体の非特異的結合を防ぐためにメンブランをブロッキング溶液に浸漬する。
【００７７】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを認識する一次抗体を標識してもよく、また、メンブラン上の特定の位置の標識を検出することによって、抗原の存在および分子量を調べてもよい。しかしながら、一次抗体を標識しなくともよく、ブロットを標識した二次抗体とさらに反応させてもよい。この二次抗体が一次抗体と免疫反応性であり、例えば、二次抗体はウサギ免疫グロブリンの１種であり、アルカリ性ホスファターゼで標識されていてもよい。ウェスタンブロットを実施する装置および方法は米国特許第５，５６７，５９５号に記載されている。
【００７８】
免疫沈降
タンパク質発現は免疫沈降によって抗原を単離することで測定および定量することができる。免疫沈降法は米国特許第５，６２９，１９７号に記載されている。免疫沈降は複合体混合物からの標的抗原成分の分離を含み、微量のタンパク質を識別または単離するために用いられる。細胞表面に局在するタンパク質の単離には、非イオン性塩類が好ましいが、これは胆汁酸塩類などのその他の薬剤が酸性ｐＨで、または二価の陽イオンの存在下で沈降するからである。
【００７９】
免疫蛍光／免疫組織化学
細胞または組織によるタンパク質発現は抗原の免疫局在性によって確認することができる。一般に、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰなどの注目するエピトープを認識する抗体に曝された細胞または組織を、固定することで保存し、結合した抗体を可視化する。共存実験はタンパク質相互作用を示唆し、このアプローチでは、注目する２種の抗原をローダミンおよびフルオレセインなどの２種の異なるマーカーで標識する。ローダミン（赤）およびフルオレセイン（緑）が共存する場合には、黄色のシグナルが生じる。超微細構造的には、標識はサイズの異なる金粒子であってもよく、サイズの異なる粒子間の実際の距離をタンパク質−タンパク質相互作用の尤度について評価してもよい。
【００８０】
いずれの細胞、細胞株、組織または生物全体でさえも固定するのに適当である。細胞は一次培養物、細胞株としてインビトロ培養されていても、組織から回収されて機械的にまたは酵素的に分離されていてもよい。組織はいずれの器官、植物または動物由来のものであってもよく、また、固定後に、または好ましくはその前に回収されていてもよい。生物全体を調べてもよい。固定は当技術分野で公知のいずれの手段によってもよく、必要なことは、検出されるタンパク質が結合剤、ほとんどの場合抗体によって認識されないようになっていないことである。適当な固定液としては過ヨウ素酸−リジン−パラホルムアルデヒド、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、メタノール、酢酸−メタノール、グルタルアルデヒド、アセトンなどが挙げられ、当業者ならば適当な濃度はわかり、注目するタンパク質、特定の検出試薬（抗体など）の特性、および検出法（蛍光による、酵素による）および観察法（落射蛍光、共焦点顕微鏡、光学顕微鏡、超微細構造解析など）などの変数によって異なる適切な固定液を経験的に決定するであろう。サンプルを、ほとんどの場合生物学的バッファーで洗浄した後固定するのが好ましい。固定液は水溶液で、または生物学的バッファーで調製し、多数の固定液はサンプルに適用するために調製するのが好ましい。好適な生物学的バッファーとしては生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、Ｎ−（カルバモイルメチル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ−２−アセトアミド−２−イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、ビシン（ｂｉｃｉｎｅ）、ビス−ｔｒｉｓ、３−シクロヘキシルアミノ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、エタノールアミン、グリシン、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ'−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２−Ｎ−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−Ｎ−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３−Ｎ−モルホリノ−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ'−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、トリシン、トリエタノールアミンなどが挙げられる。当業者ならば解析されているサンプル、適当なｐＨ、および検出法の必要条件に従って適当なバッファーを選択するであろう。バッファーはＰＢＳであるのが好ましい。
【００８１】
５分〜１週間固定した後、サンプルの大きさ、サンプルの厚み、および固定液の粘性に従って、サンプルをバッファーで洗浄する。サンプルが厚く、切片が望まれる場合には、サンプルを適したマトリックスに包埋してもよい。凍結切片作製のためには、スクロースを注入して、ＯＣＴ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ  （Ａｎｄｗｉｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；  Ｃａｎｏｇａ  Ｐａｒｋ，  ＣＡ）またはゼラチンなどのマトリックスに包埋する。サンプルはまたパラフィンワックス、またはエポキシベースのもの（Ａｒａｌｄｉｔｅ、Ｐｏｌｙｂｅｄ８１２、Ｄｕｒｃｕｐａｎ  ＡＣＭ、Ｑｕｅｔｏｌ、Ｓｐｕｒｒ'ｓまたはそれらの混合物；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，  ＰＡ）、アクリレート（Ｌｏｎｄｏｎ  Ｒｅｓｉｎｓ  （ＬＲ  Ｗｈｉｔｅ，  ＬＲ  ｇｏｌｄ）Ｌｏｗｉｃｒｙｌｓ，  Ｕｎｉｃｒｙｌ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）、メチルアクリレート（ＪＢ−４，  ＯｓｔｅｏＢｅｄ；  Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）、メラミン（Ｎａｎｏｐｌａｓｔ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）などの電子顕微鏡に適した樹脂およびＤＧＤ、Ｉｍｍｕｎｏ−Ｂｅｄ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）などのその他の媒質に包埋して、次いで重合してもよい。ワックスまたは樹脂に包埋する場合には、サンプルを一連の濃エタノールまたはメタノールに通して脱水する。酸化ポリプロピレンなどのその他の溶媒を用いてもよい場合もある。好ましい樹脂は親水性のものであるが、これはこれらが重合の際に注目するタンパク質をあまり変性しないと思われ、また抗体溶液（Ｌｏｗｉｃｒｙｌｓ、Ｌｏｎｄｏｎ  Ｒｅｓｉｎｓ、水溶性Ｄｕｒｃｕｐａｎなど）をはじかないからである。包埋はサンプルを検出試薬と反応させた後で実施してもよいし、またはサンプルをまず包埋し、切片を作製し（ミクロトーム、クリオトームまたはウルトラミクロトームによって）、次いで、切片を検出試薬と反応させてもよい。
【００８２】
特に、免疫蛍光または酵素による産物に基づく検出の場合には、例えば、水酸化アンモニウムまたは水素化ホウ素ナトリウムまたはペルオキシダーゼに作用する過酸化水素などの混乱を招く内在酵素を不活化または枯渇させる物質を用いて、残存する固定液、タンパク質架橋、タンパク質沈殿または内在酵素によるバックグラウンドシグナルをクエンチしてもよい。切片にされていないサンプル中の細胞内タンパク質を検出するには、サンプルを透過処理してもよい。透過処理剤としてはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール、ポリオキシエチレンソルビタンなどの界面活性剤およびリジン、プロテアーゼ等といったその他の薬剤が挙げられる。
【００８３】
非特異的結合部位はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；変性したまたは未変性の）、ミルクタンパク質、または検出試薬が抗体である場合には、好ましくは、種が検出する抗体のものと同一である、非免疫化宿主動物由来の正常血清またはＩｇＧなどのタンパク質溶液を適用することでブロックする。例えば、ヤギで作製された二次抗体を用いる手順に正常ヤギ血清を用いる。
【００８４】
次いで、タンパク質を検出剤、好ましくは抗体と反応させる。抗体を用いる場合には、Ｆａｂ断片およびその誘導体、精製された抗体（アフィニティー、沈殿など）、ハイブリドーマ培養物由来の上清、腹水および血清など、どんな形態で適用してもよい。抗体は非特異的結合部位をブロックするのに用いた溶液など、好ましくはタンパク質担体を含むバッファーまたは培地で希釈してもよい。抗体は希釈してもよく、通常、経験的に決定する。一般に、ポリクローナル血清、精製された抗体および腹水は１：５０〜１：２００，０００に希釈してもよく、より多くは１：２００〜１：５００である。ハイブリドーマ上清は１：０〜１：１０に希釈してもよいし、または透析または硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮し、必要に応じて希釈してもよい。抗体とのインキュベーションは３７℃にてわずか２０分、室温（約２２℃）で２〜６時間、または４℃にて８時間以上実施すればよい。インキュベーション時間は当業者ならば経験的に容易に決定することができる。
【００８５】
抗体の、グロビンと結合するものなどの注目するタンパク質との結合を検出するためには、標識を用いる。標識は結合抗体、または第１の抗体を認識する二次抗体に結合してもよく、これを一次抗体インキュベーションおよび徹底的な洗浄の後にサンプルとともにインキュベートする。適した標識としては、蛍光イソチオシアネート、蛍光ジクロロトリアジン（およびフルオレセインのフッ化類似体）、ナフトフルオレセインカルボン酸およびそのスクシンイミジルエステル、カルボキシローダミン６Ｇ、ピリジルオキサゾール誘導体、Ｃｙ２、３および５、フィコエリトリン、スクシンイミジルエステル、カルボン酸、イソチオシアネート、塩化スルホニル、塩化ダンシル、テトラメチルローダミン、リサミンローダミンＢ、テトラメチルローダミン、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、カルボキシテトラメチルローダミンのスクシンイミジルエステル、ローダミンレッド−Ｘスクシンイミジルエステル、テキサスレッド塩化スルホニル、テキサスレッド−Ｘスクシンイミジルエステル、テキサスレッド−Ｘテトラフルオロフェノールエステルナトリウム、レッド−Ｘ、テキサスレッド色素、ナフトフルオレセイン、クマリン誘導体、ピレン、ピリジルオキサゾール誘導体、ダポキシル（ｄａｐｏｘｙｌ）色素、カスケードブルーおよびイエロー色素、ベンゾフランイソチオシアネート、プロピオン酸スクシンイミジルエステル、ペンタン酸スクシンイミジルエステル、テトラフルオロフェノールナトリウム、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，  ４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンなどの蛍光部分；アルカリ性ホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼなどの酵素性のもの；３５Ｓおよびｌ３５Ｉ標識をはじめとする放射性のもの、アビジン（またはストレプトアビジン）−ビオチンに基づく検出系（酵素性のものまたは金シグナル系と連動していることが多い）、および金粒子が挙げられる。酵素性のものに基づく検出系の場合には、酵素を、セイヨウワサビペルオキシダーゼには３，３'−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）などの適当な基質と反応させ、好ましくは、反応産物は不溶性である。金標識したサンプルを、たとえ超微細構造解析用には調製されていなくとも、金シグナルを増強するよう化学的に反応させればよく、このアプローチは光学顕微鏡には特に望ましいものである。標識の選択は用途、所望の解像度および所望の観察法によって異なる。蛍光標識には、蛍光を適当な波長で励起し、サンプルを顕微鏡、共焦点顕微鏡、またはＦＡＣＳ機器で観察する。放射性標識の場合には、サンプルをオートラジオグラフィーフィルムと接触させ、フィルムを現像するか、あるいは、オートラジオグラフィーはまた、超微細構造アプローチを用いて達成してもよい。共存実験には、当業者ならば適合性があり、かつ、情報価値のある、適当な可視化技術を選択するであろう。
【００８６】
タンパク質−タンパク質相互作用を調べるその他の実験も当業者には公知である。例えば、精製したＰＤＺドメイン含有タンパク質および候補結合ペプチドを用いて細胞の生理学的条件下でのインビトロ結合アッセイを実施してもよい。あるいは、サプレッサー分析において一般的な適当な生物（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、大腸菌、シロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）など）で遺伝的アプローチを用いてもよい。
【００８７】
ＩＩ．  ＰＤＺ−ドメインリガンドの使用
特定のＰＤＺドメインと結合するペプチドの解明およびＰＤＺドメインリガンドをそのカルボキシ末端に含むポリペプチドのさらなる解明により、相互作用を有利なように操作することが可能となる。かかる操作としてはＰＤＺドメインとその同族ＰＤＺリガンド含有タンパク質間の会合の阻害が挙げられる。その他の用途としては、ＰＤＺドメイン含有タンパク質およびその会合パートナーが関与している疾病の診断的アッセイ、基質に対する精製ハンドルおよびアンカーとしての融合タンパク質中のＰＤＺドメインおよびリガンドの使用が挙げられる。
【００８８】
Ａ．  ＰＤＺ−ドメイン−リガンド−相互作用インヒビター
ＰＤＺドメインリガンドとＰＤＺタンパク質間の相互作用を調節する１つの方法としては、ＰＤＺリガンドとその同族ＰＤＺドメイン間の相互作用を阻害することがある。「ＰＤＺ−ドメイン−リガンド−相互作用インヒビター」としては、ＰＤＺドメインとそのリガンド間の相互作用を部分的に、または完全にブロック、阻害または中和するいずれの分子も挙げられる。かかるインヒビターとして作用し得る分子としては、ＭＡＧＩ３またはＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメイン（配列番号１〜１８１、２０９〜２１３、２４１〜２４７＆５１２〜５７５）および本明細書に記載されるその他のものと結合するものなどの、特定のＰＤＺドメインと結合するペプチド、抗体（Ａｂ'ｓ）または抗体断片、内生ＰＤＺドメインリガンドの断片もしくは変異体、ＰＤＺドメインリガンド、同族ＰＤＺ含有タンパク質、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および小さな有機分子が挙げられる。
【００８９】
１．  ＰＤＺドメインリガンド相互作用のインヒビターの例
ＰＤＺ−ドメインリガンドの、その同族ＰＤＺドメインへの結合を混乱させるいずれの分子もインヒビターである。当業者に十分に公知のスクリーニング技術によってこれらの分子を同定することができる。インヒビターの例としては、（１）小さな有機および無機化合物、（２）小ペプチド、（３）抗体および誘導体、（４）ＰＤＺドメインリガンドと密接に関連しているペプチド（５）核酸アプタマーが挙げられる。
【００９０】
ＰＤＺドメインまたはＰＤＺドメインリガンドと結合し、ＰＤＺドメインリガンドの同族ＰＤＺドメインへの結合を阻害する小分子は有用なインヒビターである。小分子インヒビターの例としては、小ペプチド、ペプチド様分子、好ましくは可溶性の合成、非ペプチジル有機または無機化合物が挙げられる。
【００９１】
（ａ）  小分子
「小分子」とは分子量が約５ｋＤ未満の、より好ましくは約４ｋＤ未満の、最も好ましくは０．６ｋＤ未満の組成物を指す。小分子は核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチドミメティックス、炭水化物、脂質またはその他の有機もしくは無機分子であり得る。当技術分野では化学および／または、真菌、細菌もしくは藻類抽出物などの生物学的混合物のライブラリーが知られており、いずれかのアッセイを用いてスクリーニングすればよい。分子ライブラリーを合成する方法の例は記載されている（Carellら, 1994a;Carellら, 1994b;Choら, 1993;DeWittら, 1993;Gallopら, 1994;Zuckermannら, 1994）。
【００９２】
化合物のライブラリーは溶液で提示されていてもよいし（Houghtenら, 1992）、またはビーズに（Lamら, 1991）、チップ（Fodorら, 1993）、細菌、胞子（Ｌａｄｎｅｒら，米国特許第５，２２３，４０９号， 1993）、プラスミドに（Cullら, 1992）、またはファージに（Cwirlaら, 1990;Devlinら, 1990;Feliciら, 1991;Ladnerら,米国特許第５，２２３，４０９号， 1993；ScottおよびSmith, 1990）提示されていてもよい。細胞を含まないアッセイは、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰまたは生物活性断片をＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰと結合する既知の化合物と接触させてアッセイ混合物を形成し、このアッセイ混合物を試験化合物と接触させて、試験化合物のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰと相互作用する能力を調べることを含んでなり、ここで、試験化合物のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰと相互作用する能力を調べることとは、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ標的分子と優先的に結合する、またはその活性を調節する能力を調べることを含んでなる。
【００９３】
Ｂ．  ＰＤＺ−ドメインリガンド結合のインヒビターの同定
ＰＤＺ−ドメインリガンド結合のインヒビターを同定する１つのアプローチとしては理論的薬剤設計を取り入れること、すなわち、ＰＤＺ相互作用の生物学を理解し活用することがある。このアプローチでは、ＰＤＺリガンド中の重要な残基、場合によっては、最適ペプチド長を決定する。次いで、この情報を手に、小分子を設計する。例えば、チロシンがＰＤＺドメインとの結合に重要な残基であると認められる場合には、チロシン残基を含む小分子を調製し、インヒビターとして調べる。一般に、２、３、４または５個のアミノ酸残基が結合に重要であると決定し、候補小分子インヒビターはこれらの残基または残基側鎖を含めて調製する。次いで、試験化合物を当技術分野で十分に公知のプロトコール、例えば、競合的阻害アッセイを用いて、ＰＤＺ−ドメインリガンド相互作用を阻害するその能力についてスクリーニングする。
【００９４】
ＰＤＺ−ドメインリガンド結合相互作用を阻害する化合物は、ＰＤＺタンパク質の結合相互作用によって媒介される疾病または症状を治療するのに有用である。ＰＤＺタンパク質によって媒介される、または媒介され得る疾病および症状としては、例として、リケッチア疾病、マウスチフス、ツツガムシ病（KimおよびHahn, 2000）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（Boujuら, 1999;Kameyaら, 1999）、慢性骨髄性白血病（Nagaseら, 1995;Ruffら, 1999）、アルツハイマー病（Deguchiら, 2000;Lauら, 2000;McLoughlinら, 2001;TanahashiおよびTabira, 1999a;Tomitaら, 2000;Tomitaら, 1999）、パーキンソン病および総合失調症（Smithら, 1999）などの神経疾患、Ｘ染色体連鎖自己免疫腸疾患（ＡＩＥ）（Kobayashiら, 1999）、遅発性脱髄性疾病（Gillespieら, 2000）、アッシャー症候群タイプ１（ＵＳＨ１）  （DeAngelisら, 2001）、一酸化窒素媒介性組織損傷（Kameyaら, 1999;McLoughlinら, 2001）、腫瘍（Inazawaら, 1996）および嚢胞性線維症（Raghuramら, 2001）が挙げられる。
【００９５】
１．  ＰＤＺ結合ポリペプチド中の重要な残基の決定
（ａ）  アラニンスキャニング
リガンド中の各残基のＰＤＺ結合への相対的寄与を調べるために、ＰＤＺ−ドメイン結合ペプチド配列のアラニンスキャニングを用いてもよい。ＰＤＺリガンド中の重要な残基を調べるためには、残基を単一のアミノ酸、通常アラニン残基で置換し、ＰＤＺドメイン結合に対するその効果を評価する。米国特許第５，５８０，７２３号；同５，８３４，２５０号参照。
【００９６】
（ｂ）  末端切断物（欠失シリーズ）
ＰＤＺ−ドメイン結合ペプチドの末端切断により、結合に重要な残基が明らかとなるだけでなく、結合を達成するためのペプチドの最小の長さも求められ得る。末端切断が未変性リガンドよりもより強固に結合するリガンドを示す場合もあり、かかるペプチドはＰＤＺドメイン：ＰＤＺリガンド相互作用を阻害するのに有用である。
【００９７】
好ましくは、一連のＰＤＺ−ドメイン結合ペプチド末端切断物を調製する。一方のシリーズはアミノ末端アミノ酸を順次末端切断する、もう一方のシリーズでは末端切断物はカルボキシ末端で始まる。アラニンスキャニングの場合には、ペプチドはインビトロ合成してもよいし、または組換え法によって調製してもよい。
【００９８】
（ｃ）  理論的インヒビター設計
アラニンスキャニングおよび末端切断解析から得られる情報に基づいて、当業者ならば小分子を設計および合成、または結合を阻害する可能性のあるインヒビターが豊富な小分子ライブラリーを選択することができる。
【００９９】
（ｄ）  結合アッセイ
ＰＤＺ結合ペプチドおよびその同族ＰＤＺドメインの複合体を形成することにより、複合型をその非複合型および不純物から分離することが容易となる。ＰＤＺドメイン：結合リガンド複合体は、溶液中または結合パートナーの一方が不溶性支持体と結合しているところで形成すればよい。複合体は、例えば、カラムクロマトグラフィーを用いて溶液から分離すればよく、固体支持体と結合している間は、十分に公知の技術を用いて濾過、遠心分離などによって分離してもよい。ＰＤＺドメイン含有ポリペプチドまたはそのリガンドの固体支持体との結合によりハイスループットアッセイが容易になる。
【０１００】
試験化合物は、候補結合化合物の存在下および不在下で、ＰＤＺ結合ポリペプチドとＰＤＺドメインとの相互作用を阻害する能力についてスクリーニングすればよく、スクリーニングはマイクロタイタープレート、試験管および微量遠心管などのいずれかの適した容器で達成すればよい。また、試験または分離を容易にするために、一方または双方のタンパク質をマトリックスに結合されるようにする、さらなるドメインを含む融合タンパク質を調製してもよい。例えば、ＧＳＴ−ＰＤＺ結合ペプチド融合タンパク質またはＧＳＴ−ＰＤＺドメイン融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）またはグルタチオン誘導体化したマイクロタイタープレートに吸着させ、次いで、試験化合物と混合するかまたは試験化合物および非吸着ＰＤＺドメインタンパク質とＰＤＺ結合ペプチドのいずれかと混合し、この混合物を複合体形成を可能にする条件下（例えば、生理学的条件の塩およびｐＨ）でインキュベートしてもよい。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して結合していない成分、ビーズの場合には固定されたマトリックスをいずれも除去し、複合体を直接または間接的に調べる。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ、標準的な技術を用いてＰＤＢＰ結合または活性レベルを調べてもよい。
【０１０１】
タンパク質をマトリックスに固定化するその他の融合ポリペプチド技術をスクリーニングアッセイに用いてもよい。ＰＤＺ結合ペプチドまたはその標的ＰＤＺドメインのいずれかを、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジン系を用いて固定化してもよい。ビオチン化をビオチン−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ；  ＰＩＥＲＣＥ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）などの多数の試薬を用いて達成し、ストレプトアビジンコーティングした９６ウェルプレート（ＰＩＥＲＣＥ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化すればよい。あるいは、ＰＤＺ結合ペプチドまたは標的ＰＤＺドメインと反応性であるが、ＰＤＺ結合ペプチドとその標的分子の結合を干渉しない抗体をこのプレートのウェルに誘導体化し、結合していない標的またはＰＤＢＰを抗体結合によってウェル捕捉してもよい。かかる複合体を検出する方法としては、ＧＳＴによって固定化された複合体について記載されたものに加え、ＰＤＺ結合ペプチドまたは標的ＰＤＺドメインに反応性の抗体を用いる複合体の免疫検出が挙げられる。
【０１０２】
（ｅ）  結合についてのアッセイ：競合ＥＬＩＳＡ
ペプチド、タンパク質またはその他のＰＤＺリガンドの結合親和性を評価するには、競合結合アッセイを用いればよく、これではリガンドの対応するＰＤＺドメインと結合する能力（および必要であれば、結合親和性）を評価し、ＰＤＺドメインと結合すると知られている化合物、例えば、ファージディスプレイによって求められたコンセンサスペプチド配列または前記のように求められた同族タンパク質リガンドのものと、好ましくは並行して比較する。
【０１０３】
ＰＤＺドメイン結合リガンド（例えば、ペプチド、タンパク質、小分子など）の結合親和性を同定するためには、多数の方法が公知であり、用いてもよい。例えば、結合親和性は競合ＥＬＩＳＡを用いてＩＣ５０値として求めてもよい。ＩＣ５０値はＰＤＺドメインとリガンドの結合の５０％をブロックするリガンド濃度として定義する。例えば、固相アッセイでは、アッセイプレートをマイクロウェルプレート（好ましくは、タンパク質を効率的に吸収するよう処理された）をニュートラビジン、アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングすることで準備する。次いで、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはその他のタンパク質（例えば、脱脂乳）の溶液を加えることで非特異的結合部位をブロッキングし、次いで、好ましくはＴｗｅｅｎ−２０などの界面活性剤を含有するバッファーで洗浄する。ビオチン化した既知のＰＤＺドメインリガンド（例えば、ＧＳＴまたはその他の精製および検出を容易にする分子との融合物としてのファージペプチドまたは同族タンパク質）を調製し、プレートに結合させる。ＰＤＺドメインポリペプチドを含む、調べられるリガンドの希釈シリーズを調製し、結合しているリガンドと接触させる。固定化リガンドでコーティングされたプレートを洗浄し、その後各結合反応物をウェルに加えて短時間インキュベートする。さらに洗浄した後、結合反応物を、多くは非ＰＤＺ融合パートナーを認識する抗体および一次抗体を認識する、標識した（セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）、またはフルオレセインなどの蛍光タグなど）二次抗体を用いて検出する。次いで、プレートを適当な基質（標識による）で発現させ、分光光度的プレートリーダーなどを用いてシグナルを定量する。吸収シグナルは最小二乗適合を用いて結合曲線と一致させてもよい。したがって、種々のリガンドの、ＰＤＺドメインが既知のＰＤＺドメインリガンドと結合するのを阻害する能力を測定することができる。
【０１０４】
前記のアッセイの多数の変法が当業者には明らかである。例えば、アビジン−ビオチンに基づく系の代わりに、ＰＤＺドメインリガンドを基質と化学的に結合してもよいし、または単純に吸収させてもよい。かかるスクリーニングの例は実施例において見られる。
【０１０５】
２．  ファージディスプレイの際に認められるＰＤＺ−ドメインペプチドリガンド
ＭＡＧＩ３およびＥＲＢＩＮ  ＰＤＺ−ドメインリガンド；ｄｅｎｓｉｎ；ｓｃｒｉｂｂｌｅ  ＰＤＺ１および３；ｓｃｒｉｂｂｌｅ  ＰＤＺ２；ＭＵＰＰ  ＰＤＺ７；ヒトＩＮＡＤＬ  ＰＤＺ６；ヒトＺＯ１；ＡＦ６（ＭＬＬＴ４）；ＭＵＰＰ  ＰＤＺ３；ＭＡＧＩ１  ＰＤＺ３；ＭＡＧＩ３  ＰＤＺ３；ＩＮＡＤＬ  ＰＤＺ３；ヒトＩＮＡＤＬ  ＰＤＺ２  ；ヒトＰＡＲＤ３ＰＤＺ３；ＳＮＴＡｌ  ＰＤＺ；ＭＡＧＩ３  ＰＤＺ０；ＭＵＰＰ  ＰＤＺ１３；およびＭＡＧＩ３  ＰＤＺ２のスクリーニングで見出されたものをはじめとする、ＰＤＺドメインペプチドリガンドは、コンセンサス配列よりも低い親和性で結合するものでさえも、ＰＤＺ−ドメインリガンド：ＰＤＺドメイン相互作用の有用なインヒビターの可能性がある。したがって、かかるインヒビターを見出す方法としてはカルボキシ末端ファージディスプレイのものがある。
【０１０６】
競合結合ＥＬＩＳＡは各ファージによって提示されたＰＤＺドメイン結合ペプチドの効力を調べるための有用な方法である。
【０１０７】
３．  アプタマー
アプタマーとは、ほとんどのどんな分子も認識し、特異的に結合させるために使用できる短いオリゴヌクレオチド配列である。指数関数的強化によるリガンドの系統的な進化（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ）法（Ausubelら, 1987;EllingtonおよびSzostak, 1990;TuerkおよびGold, 1990）を用いてかかるアプタマーを見出してもよい。アプタマーには多数の診断上および臨床上の用途があり、抗体が臨床上または診断上用いられているいずれかの用途のほとんどで、アプタマーも用いてもよい。さらに、アプタマーは一度同定されれば、製造するのにあまり費用がかからず、医薬組成物における投与、バイオアッセイおよび診断検査をはじめとする、種々の形式に容易に適用できる（Jayasena, 1999）。
【０１０８】
前記の競合ＥＬＩＳＡ結合アッセイでは、候補アプタマーのスクリーニングはアプタマーをアッセイに組み入れ、ＰＤＺドメイン：ＰＤＺ−ドメインリガンド結合を阻害するその能力を調べることを含む。
【０１０９】
４．  抗体（Ａｂ）
ＰＤＺ−ドメインリガンド：ＰＤＺドメイン結合を阻害するいずれの抗体もＰＤＺドメイン−リガンド相互作用のインヒビターである。抗体インヒビターの例としてはポリクローナル、モノクローナル、一本鎖、抗イディオタイプ、キメラＡｂ、またはかかる抗体もしくはその断片のヒト化型が挙げられる。抗体は免疫応答が生じ得るいずれの種由来のものであってもよい。抗体の種々の種類は以下でより詳しく論じる。
【０１１０】
Ｃ．  ＰＤＺドメイン：ＰＤＺ−ドメインリガンド相互作用の有用性
１．  アフィニティー精製
アフィニティー精製とは、分子が化学または結合パートナーへ特異的に誘引または結合されて、結合または複合体が形成され、それによって、パートナー部分へ結合されるか、または誘引されている間に分子が不純物から分離されることが可能となることに基づく分子の単離を意味する。ＰＤＺリガンドと対応するＰＤＺドメイン間の相互作用を利用して、ＰＤＺドメインおよび／またはそのリガンドを含むか、または含むよう改変されているいずれかのタンパク質を精製することができる。かかる系の利点としては特異性を調節し、結合を制御する能力、およびほとんどが小さなサイズのＰＤＺ−ドメインリガンドの操作性が挙げられる。
【０１１１】
ＰＤＺ「融合タンパク質」は非ＰＤＺドメインもしくはリガンドタンパク質パートナー、または、タンパク質パートナーと融合しているＰＤＺドメインまたはＰＤＺ−ドメインリガンドを含んでなり、これには特定のＰＤＺドメインまたはリガンドは存在しない。ＰＤＺドメインまたはリガンドはパートナータンパク質のＮ末端と融合していてもよいし、Ｃ末端と融合していてもよい。
【０１１２】
かかる融合タンパク質は公知の組換え法を用いて容易に作製することができる。ＰＤＺドメインまたはリガンドをコードする核酸を、核酸をコードする非ＰＤＺドメインまたはリガンドとインフレームで融合すればよい。融合遺伝子はまた、自動ＤＮＡシンセサイザーをはじめとする従来技術によって合成してもよい。２つの連続する遺伝子断片の間に、相補的なオーバーハングが生じ、続いて、これらをアニーリングして再増幅しキメラ遺伝子配列を得ることができる、アンカープライマーを用いるＰＣＲ増幅（Ausubelら, 1987）も有用である。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを融合部分にインフレームでサブクローニングするのが容易になる、多数のベクターが市販されている。必要に応じて、細菌（大腸菌など）または真核生物（ＣＯＳ細胞または昆虫細胞を用いるバキュロウイルスベースの系など）などの宿主でタンパク質を発現させて、精製してもよい。
【０１１３】
あるいは、タンパク質は標準的なアミノ酸シンセサイザーを用いてインビトロで合成してもよい。
【０１１４】
ＰＤＺリガンドを精製するには、例えば、ＰＤＺドメイン含有ポリペプチドプチドを、例えば、臭化シアンなどの化学的架橋を用いてセファロースなどの固体支持体に固定し、カラムに詰め、リガンドをそれを含有する混合物から分離するのに用いてもよい。リガンドを含んでなる混合物を、結合されているＰＤＺドメインとリガンド間の特異的結合を可能にする条件下で支持体に通す。洗浄後、当技術分野で十分に公知の、塩勾配を高めるなどの、非共有結合による相互作用を混乱させる方法を用いてＰＤＺリガンドをカラムから溶出する。前記の方法の多数の並べかえが当業者には明らかである。例えば、融合タンパク質がＰＤＺドメインを含んでいてもよく、かつ、固体支持体を同族ＰＤＺリガンドを用いて調製してもよい。固体支持体はカラムに詰める代わりに「バッチ」アプローチで用いてもよい。溶出条件も変更してよく、例えば、ｐＨの変化またはカオトロープを利用してもよいし、特異的ＰＤＺドメインと結合すると認められた、ファージ提示されたペプチドのいずれかを用いて結合している融合タンパク質を遊離させてもよい。
【０１１５】
２．  固定系
ＰＤＺドメインとそのリガンド間の結合を、アビジン−ビオチン結合と同様の方法で、タンパク質またはその他の物質（核酸、有機および無機小分子等など）を基質に固定するために利用してもよい。かかる系の利点としては、アフィニティー精製について列挙されたもの、ならびに、例えば、種々のＰＤＺドメイン（またはＰＤＺ−ドメインリガンド）および同族ＰＤＺドメイン−リガンド（またはＰＤＺドメイン）の特定の配置によってパターン化されるように基質上に分子を並べる能力が挙げられる。
かかる固定系はアレイを利用するハイスループットアッセイに用途がある。
【０１１６】
Ｄ．  標的確証
前記のように、ＰＤＺドメインは細胞内タンパク質のシグナル伝達、局在化および輸送と関連のあるタンパク質−タンパク質相互作用に預かっている。これらのプロセスが混乱すると疾病をもたらすことが多い。前記のアッセイを用いて見出された、ＰＤＺ−ドメイン結合ペプチド、同族タンパク質リガンドおよびインヒビターを用いて、インビトロまたはインビボで内在ＰＤＺドメイン：ＰＤＺ−ドメインリガンド相互作用の混乱に対する表現型応答または生物学的応答をモニターすることによって、これらのタンパク質−タンパク質相互作用と特定の病状または症状との間の因果関係を検証することができる。
【０１１７】
このアプローチでは、ＰＤＺ−ドメインリガンドを細胞の内在リガンドと競合させる。ペプチドは、リポソーム、マイクロインジェクション、脂質トランスフェクション、アンテナペディックペプチドトランスフェクション等といった当技術分野で公知のいずれの方法によって細胞に導入してもよい。あるいは、ＰＤＺ−ドメインリガンドペプチドは適したベクターから発現させてもよい（以下のベクター議論を参照）。
【０１１８】
ＰＤＺドメインはそのタンパク質および同族リガンドを特定の細胞内部位へターゲッティングするので、ＰＤＺ−ドメインリガンド候補の、この相互作用を混乱させる能力を、好ましくは、間接的免疫蛍光または免疫電子顕微鏡観察などの免疫局在性プロトコールによってモニターする。
【０１１９】
Ｅ．  疾病についての試験
ＰＤＺ−ドメインリガンドペプチド／ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの双方を臨床的スクリーニングに用いて、疾病原因について検査してもよいし、またはこれらの疾患に対する危険度のレベルを評価してもよい。患者の組織サンプルをＰＤＺ−ドメイン同族タンパク質リガンドまたはそのｍＲＮＡ量について調べればよい。正常よりも有意に少ないか多い量が認められる場合には、それらは不適当または異常なタンパク質−タンパク質相互作用と関連している疾病または疾病の危険度を示す。ＰＤＺ−ドメインリガンド核酸の突然変異は活性の変更をもたらす場合があり、かかる突然変異を有する患者は疾病を患っている、または疾病の危険がある場合がある。最後に、哺乳類における、組織サンプルにおける、または組織培養物における、ＰＤＺ−ドメインリガンドの発現量の測定を用いて、遺伝子のインデューサーまたはリプレッサーを発見することもできる。
【０１２０】
臨床サンプルのＰＤＺ−ドメインリガンドｍＲＮＡ、タンパク質または活性レベルを測定することで、疾患の進行を追跡するための、または疾患を直すための治療モダリティが適用されている場合に予測値が得られ得る。
【０１２１】
ＩＩＩ．  本発明の方法は、ＰＤＺドメイン含有タンパク質の生物学的結合パートナーであるリガンドを同定する、新規方法を提供する。これらの新規相互作用の同定は、新たに同定されたＰＤＺドメインリガンドの既知の生物学的機能の混乱に関連している症状および疾病を治療または寛解させる新規診断および治療アプローチの基礎として役立つ。したがって、例えば、本明細書に記載のように、これらの相互作用のインヒビターを、例えば、診断用途に用いてもよく、これではリガンド量またはＰＤＺタンパク質と注目するリガンド間の相互作用量および／またはその程度を、当技術分野で公知のおよび本明細書に記載の定量的結合アッセイを用いて調べればよい。例えば、いずれかのタンパク質における、結合相互作用を低下させる突然変異に起因し得る、ＰＤＺドメインタンパク質と同族リガンド間の異常に低量の相互作用と関連している症状には、治療アプローチ／薬剤は、例えば、外来の同族リガンドおよび／またはＰＤＺドメインタンパク質、または該リガンドまたはタンパク質を発現する核酸の投与に基づくものであり得る。外来リガンドおよび／またはＰＤＺドメインタンパク質は結合相互作用親和性が増強した種類のリガンドまたはＰＤＺドメインタンパク質であってもよく、これは本明細書に記載のペプチド配列情報を基に設計および／または本明細書に記載の方法を基に決定すればよい。もう１つの例としては、特定の残基の結合相互作用にとっての重要性を、ＰＤＺドメイン配列および／または本明細書に記載された選択されたペプチド配列の構造−活性解析から得られる情報を基に求めてもよい。かかる情報を用い、当技術分野で公知の慣例法を用いて、より良好な結合配列を設計することができる。同様に、かかる情報を用いて、遺伝子治療に基づくものをはじめとする、強力で、かつ、特異的な、標的とされる治療的介入を設計することもできる。結合配列の最適化の例は本明細書に記載されている。
【０１２２】
前記のように、注目するＰＤＺドメインタンパク質の同族リガンドの同定により、これらのタンパク質および／またはその相互の相互作用と関連している、症状および疾病を治療または診断する試みにおける重大な情報が提供される。かかる情報を得るために本発明の方法を用いてもよい。以下に、ＰＤＺドメインタンパク質およびこれらの方法を用いて同定されたそのそれぞれの同族リガンドの部分的なリストを記載する。同族リガンドの既知の生物学的機能についての簡単な説明と、これらのリガンドおよびこれらと相互作用するＰＤＺドメインタンパク質をさらに記載する参照文献のデータベース受託番号も提供する。これらおよび本明細書に記載されたその他のデータベース受託番号によって同定される参照文献はその全体を参照により本明細書に組み入れる。
【０１２３】
（１）  Ｍａｇｉ３  ＰＤＺ２
逆方向の配向を有する膜会合型グアニレートキナーゼ３  （ＭＡＧＩ−３）、ＭＡＧＵＫファミリーのメンバーは、グアニレートキナーゼ、ＷＷおよびＰＤＺドメインを含み、ＰＴＥＮと会合し、ＰＴＥＮを原形質膜に局在化させてＡｋｔ（ＡＫＴ１）のＰＴＥＮ阻害を増強し得る。ＡＦ７２３８
前記の本発明の方法を用いて、ＭＡＧＩ３のＰＤＺ２の同族リガンドとしてのＰＴＥＮ／ＭＭＡＣ（配列番号７９７）の同定を確認することによって、ＰＤＺ同族リガンドを同定する方法の成否を示した。実施例１〜６参照。
【０１２４】
（２）  ＥＲＢＩＮ
前記の本発明の方法を用いて、ＥＲＢＩＮのＰＤＺドメインに対してファージペプチドを選択し、次いで、ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインによって選択したファージペプチドのアラインメントから導いたコンセンサス配列［ＤＥ］［ＳＴ］ＷＶ−ＣＯＯＨを用いてＤａｙｈｏｆｆデータベースを検索することによって３種の遺伝子産物を同定した。実施例７−１３参照。３種すべての遺伝子産物、（ａ）δ−カテニン（神経プラコフィリン（ｐｌａｋｏｐｈｉｌｉｎ）関連アームリピートタンパク質［ＮＰＲＡＰ］、プレセニリン−１相互作用タンパク質ＧＴ２４およびδ２−カテニン）、（ｂ）口蓋・心・顔面症候群（ＡＲＶＣＦ）で欠失しているアルマジロリピートタンパク質、および（ｃ）ｐ００７１はアルマジロファミリーのタンパク質のメンバーである。重要なことに、これらのタンパク質の３種すべては大きなアルマジロタンパク質ファミリーのｐ１２０（ｃｔｎ）サブファミリー内にあり、このことは保存されたＤＳＷＶ  ＰＤＺ結合モチーフが細胞内でこれらのタンパク質機能の特徴をどのように共有するかを反映するということを示唆する。ｐ００７１とＡＲＶＣＦの双方は広く発現されているが（HatzfeldおよびNachtsheim, 1996 Journal of Cell Science;Sirotkin-Hら 1997a Genomics）、他方、δ−カテニン発現はニューロンに限定されており、増殖しているニューロン前駆細胞では高レベルで、また、分裂終了ニューロンでは低レベルで認められている（Carole-Hら 2000 The Journal of Comparative Neurobiology）。δ−カテニン（ＮＰ＿００１３２２．１）はカドヘリン結合タンパク質のカテニンファミリーのメンバーであり、カドヘリンを細胞骨格と結びつける細胞骨格制御因子であり、細胞遊走において役割を果たし、発現の減少は進行性膀胱癌および直腸結腸癌と相関がある。３種はすべて接着結合でＩおよびＩＩ型カドヘレンと同様に相互作用し得るということ、また、カドヘレンの結合部位はβカテニンによって用いられるものとは異なることが知られている。βカテニンはアルマジロタンパク質ファミリーの最もよく理解されているメンバーであり、細胞接着および転写の双方において役割がある。細胞質におけるβカテニンのユビキチン媒介性タンパク質分解を混乱させる突然変異がこのタンパク質の異常に高い核レベルをもたらすということは十分に確立されている。かかる突然変異は大部分の大腸癌の原因である。βカテニンと同様に、３種すべてのタンパク質は接着結合に局在し、ｐ００７１とＡＲＶＣＦの双方は核と往復することもできる（HatzfeldおよびNachtsheim 1996 Journel of Cell Science;Mariner-D.J.ら 2000 Journal of Cell Science）。したがって、利用できるデータからＡＲＶＣＦ、ｐ００７１およびδカテニンには細胞結合部の形態形成および転写の双方においてβカテニンと類似の細胞性役割があるということが示唆される。これら３種のタンパク質の生理学的重要性はまた、文献に報告されているその他の特色に基づいており、ｐ００７１およびδ−カテニンは双方ともプレセニリン−１と相互作用すると示されており、その突然変異はアルツハイマー病の早期発症と関連がある。さらに、データではδ−カテニンはニューロン前駆細胞の遊走、このプロセスがβカテニンと大腸癌に関して起きるように調節されなくなれば、神経細胞性癌の転移の増加を必ずもたらすであろう機能にとって重要であると示唆されている。したがって、ＥＲＢＩＮとＡＲＶＣＦ、ｐ００７１またはδカテニンのいずれかまたはすべてとの相互作用の混乱はこれらの病状の１つを治療または緩和するのに有用である。
【０１２５】
（３）  ＤＥＮＳＩＮ
Ｄｅｎｓｉｎ（またはＤｅｎｓｉｎ−１８０）（ＮＰ＿４７６４８３．１）はＬＡＰ（ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）およびＰＤＺ）ファミリーの基本メンバーであり、シグナル伝達およびシナプス接着に関与し得る。これはインビトロでＣａＭキナーゼＩＩ（Ｃａｍｋ２ａ）およびαアクチニン（ヒトＡＣＴＮ４）と複合体を形成する。
【０１２６】
本明細書に記載の方法（例えば、ＥＲＢＩＮについて）を用いて、以下の遺伝子産物をｄｅｎｓｉｎのリガンドとして同定した：（１）ＡＲＶＣＦ（ＮＰ００１６６１．１）（配列番号７０６）−−口蓋・心・顔面症候群で欠失しているアルマジロリピート遺伝子、カドヘリンと結合し、接着結合での細胞接着において役割を果たし得；対応する遺伝子のヘミ接合性が口蓋・心・顔面症候群と関連している；（２）δ−カテニン（配列番号７０７）；および（３）ｐ００７１（配列番号７０８）。
【０１２７】
（４）  ＳＣＲＩＢＢＬＥ  ＰＤＺ１および３
ＳｃｒｉｂｂｌｅはＰＤＺ（ＤＨＲ、ＧＬＧＦ）ドメインを含有するタンパク質であり、膜のシグナル伝達タンパク質を標的とし、ロイシンリッチリピートを含み、また、タンパク質−タンパク質相互作用を媒介する。ＮＰ＿０５６１７１．１。
【０１２８】
本明細書に記載の方法（例えば、ＥＲＢＩＮについて）を用いて、以下の遺伝子産物をＳｃｒｉｂｂｌｅ  ＰＤＺ１およびＰＤＺ３のリガンドとして同定した：
１．  ＺＯ２：タイトジャンクションタンパク質２、膜会合型グアニレートキナーゼ含有ファミリーのメンバー、タイトジャンクションの確立および維持に関与し；調節解除は腺管癌の発症と関連があり得る。ＮＰ＿００４８０８．１（配列番号７０９）。
２．  Ｋｖｌ．５：電位開口型カリウムチャンネル（シェーカー関連サブファミリー１）メンバー５、迅速に活性化しゆっくりと不活化する遅延整流性Ｋ＋チャンネル、心臓における膜再分極および活動電位持続時間の調節に寄与。００２２２５．１（配列番号７１０）。
３．  ＧＰＲ８７：Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）のロドプシンファミリーのメンバー、血液凝固の際に血小板凝集を誘導するＧタンパク質（Ｇｉ）共役レセプターである、血小板ＡＤＰレセプター（ラットＰ２ｙｌ２）と中程度の類似性を有する。ＮＰ＿１１５７７５．１（配列番号７１１）。
４．  アクチニン：αアクチニンは、αおよびβスペクトリンおよびジストロフィンをはじめとする、細胞骨格タンパク質の多種多様な群に相当するスペクトリン遺伝子スーパーファミリーに属する。αアクチニンは種々の細胞種において多数の役割を有するアクチン結合タンパク質である。非筋肉細胞では、細胞骨格イソ型が微小線維束および接着型結合に沿って認められ、そこで結合に関与している。（配列番号７１２）。
５．  β−カテニン：カドヘリンと細胞骨格を結びつけ、また、転写因子との複合体でシグナルを核に伝達するｗｎｔシグナル伝達経路における機能はまた、前後軸形成に必要であり；この遺伝子の突然変異は種々の癌と関連している。ＮＰ＿００１８９５．１（配列番号：７１３）。
６．  ＣＤ３４：ＣＤ３４抗原、高内皮小静脈で造血幹細胞およびＬセレクチンリガンドと会合している膜貫通シアロムチン、造血細胞の細胞接着を調節するシグナルを伝達し、造血の初期に役割を果たし得る。ＮＰ＿００１７６４．１（配列番号７１４）
【０１２９】
（５）  ＳＣＲＩＢＢＬＥ  ＰＤＺ２
本発明の方法によって同定されたＳＣＲＩＢＢＬＥ  ＰＤＺ２のリガンドはＥＲＢＩＮのものと同一である。
【０１３０】
（６）  ＭＵＰＰ  ＰＤＺ７
ＭＵＰＰは複数ＰＤＺドメインタンパク質であり、複数ＰＤＺドメインタンパク質ファミリーのメンバーであり、１３個のＰＤＺドメインを含み、セロトニンレセプター（ＨＴＲ２Ａ、ＨＴＲ２ＢおよびＨＴＲ２Ｃ）のＣ末端と相互作用し、シグナル伝達を調節する多価の足場タンパク質として作用し得る。
【０１３１】
本明細書に記載の方法（例えば、ＥＲＢＩＮについて）を用いて、以下の遺伝子産物をＳｃｒｉｂｂｌｅ  ＰＤＺ１およびＰＤＺ３のリガンドとして同定した：
１．  ＨＴＲ２Ｂ：５−ヒドロキシトリプタミン２Ｂ（セロトニン）レセプター、ホスホリパーゼＣを活性化し、消化管における平滑筋収縮および線維芽細胞有糸分裂誘発をはじめとするセロトニンの生理学的機能を媒介する、Ｇタンパク質共役レセプター。ＮＰ＿００８５８．１（配列番号７１５）。
２．  ＰＤＧＦＲｂ：血小板由来増殖因子レセプターβ鎖、ＭＡＰＫキナーゼ経路を活性化して細胞増殖と細胞遊走の双方を調節するチロシンキナーゼレセプター。ＰＤＧＦＲｂ遺伝子は血小板由来増殖因子ファミリーのメンバーの細胞表面チロシンキナーゼレセプターをコードする。これらの増殖因子は間葉起源の細胞の分裂促進因子である。レセプター単量体と結合している増殖因子の同定により機能的レセプターが、双方とも血小板由来増殖因子レセプターαおよびβポリペプチドからなる、ホモ二量体であるかヘテロ二量体であるかが調べられる。Ｊ０３２７８（配列番号７１６）。
３．  δ−カテニン。
４．  ＳＧＫ：血清グルココルチコイド調節性キナーゼ、アポトーシスを阻害し、腎臓のナトリウム輸送を刺激する、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ。ＮＰ＿００５６１８．１（配列番号７１７）。
５．  ＳＳＴＲ３：ソマトスタチンレセプター３、アデニリルシクラーゼ活性を抑制し、ソマトスタチンの細胞増殖に対する抑制作用を媒介する、Ｇタンパク質共役レセプター。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、小さなＧＴＰ結合タンパク質のＲＡＳスーパーファミリーに属するＧＴＰアーゼである。このスーパーファミリーのメンバーは、細胞増殖の制御、細胞骨格再構築をはじめとする細胞事象の種々のアレイ、およびタンパク質キナーゼの活性化を調節すると考えられている。ソマトスタチンは多数の部位で作用して多数のホルモンおよびその他の分泌タンパク質の放出を抑制する。ソマトスタチンの生物学的作用はおそらくは、組織特異的に発現されたＧタンパク質共役レセプターのファミリーによって媒介されている。ＳＳＴＲ３は７つの膜貫通セグメントを有するレセプターのスーパーファミリーのメンバーであり、脳および膵臓において最高レベルで発現される。ＮＰ＿００１０４２．１（配列番号７１８）
【０１３２】
（７）  ヒトＩＮＡＤＬ  ＰＤＺ６
本発明の方法によって同定されたヒトＩＮＤＬ  ＰＤＺ６のリガンドはＭＵＰＰ  ＰＤＺ７のものと同一である。
【０１３３】
（８）  ヒトＺＯ１
タイトジャンクションタンパク質ＺＯ−１（Ｚｏｎｕｌａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ１タンパク質）（Ｚｏｎａ  ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ１タンパク質）（タイトジャンクションタンパク質１）。ＮＭ−００３２５７。
【０１３４】
本明細書に記載の方法（例えば、ＥＲＢＩＮについて）を用いて、以下の遺伝子産物をヒトＺＯ１のリガンドとして同定した：
１．  クローディン−１７、複合的膜タンパク質のクローディンファミリーのメンバー、４つの膜貫通ドメインを含み、タイトジャンクションストランドに局在する。タイトジャンクション形成および維持に関与し、細胞接着において役割を果たし得る。ＮＰ０３６２６３．１（配列番号７１９）
２．  クローディンｌ：クローディンファミリーのもう１つのメンバー、細胞極性の維持に関与し得る。ＮＰ＿０６６９２４．１（配列番号７２０）。
３．  クローディン３、複合的膜タンパク質のクローディンファミリーのもう１つのメンバー、ウェルシュ菌エンテロトキシンレセプター、卵巣腫瘍形成と関連があり得、ＣＬＤＮ３遺伝子はウィリアムズ症候群でよく欠失されている領域に位置付けられている。ＮＰ＿００１２９７．１（配列番号７２１）。
４．クローディン７、タイトジャンクション形成に関与し得る推定複合的膜タンパク質。ＮＰ＿００１２９８．１（配列番号７２２）。
５．クローディン９；タイトジャンクションストランドの形成に関与し得る、クローディンファミリーの膜貫通タンパク質。（配列番号７２３）。
６．  クローディン１８（配列番号７２４）。
７．  ＰＤＧＦＲＡ（配列番号７２５）。
８．  ＰＤＧＦＲＢ（配列番号７２６）。
９．  δ−カテニン（配列番号７０７）。
１０．  ＡＲＶＣＦ（配列番号７０６）。
１１．  ＳＧＫ（配列番号７１７）
【０１３５】
（９）  ＡＦ６（ＭＬＬＴ４）
骨髄性／リンパ性または混合系統白血病と関連し、染色体４に転座された遺伝子、４に転座した骨髄性／リンパ性または混合系統白血病（トリソラックス（ショウジョウバエ）相同体）。ＮＭ＿００５９３６。本明細書に記載の方法（例えば、ＥＲＢＩＮについて）を用いて、以下の遺伝子産物をＡＦ６（ＭＬＬＴ４）のリガンドとして同定した：
１．  ＦＹＣＯ１：ＦＹＶＥジンクフィンガードメインおよびＲＵＮドメインを含むタンパク質、Ｒａｓ様ＧＴＰアーゼシグナル伝達経路に関与し得、レセプター（ＧＰＣＲ）の領域を含み、Ｃ５ａ化学誘引物質（アナフィラトキシン）レセプターである、ラットＲｎ．１０６８０と中程度の類似性を有する。ＡＡＫ１２６４．１（配列番号７２７）。
２．  ＢＬＴＲ２：７膜貫通レセプター；ロイコトリエンＢ４レセプターＢＬＴ２。ロイコトリエンＢ４と低親和性で結合するＧタンパク質共役レセプター、細胞内カルシウム流動および走化性を媒介し、体液性防御機構においても役割を果たし得る。ＮＰ  ０６２８１３．１（配列番号７２８）。
３．  ＴＭ７ＳＦ３：膜貫通７スーパーファミリーメンバー３、７つの膜貫通ドメインを含み、外部のシグナルの細胞への伝達に関与し得る。ＮＰ  ０５７６３５．１（配列番号７２９）。
４．  ＯＲ１０Ｃ１：精細胞化学レセプターおよび嗅覚レセプターと高い類似性を有するタンパク質、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）のロドプシンファミリーのメンバー。ＮＰ０３９２２９．１（配列番号７３０）。
５．  ＣＮＴＮＡＰ２（コンタクチン関連タンパク質様２）：３つの細胞外ラミニンＧドメイン、２つの上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）様ドメインおよびＦ５または８タイプＣ（ジスコイジン）ドメインを含むタンパク質、ニューレキシン４（コンタクチン関連タンパク質１、マウスＣｎｔｎａｐｌ）と中程度の類似性を有する。ＮＰ  ０５４８６０．１（配列番号７３１）。
６．ネクチン３：ポリオウイルスレセプター関連１（ネクチン）、免疫グロブリン関連細胞接着分子、多数のαヘルペスウイルスの細胞侵入を媒介し；相当する遺伝子の常染色体劣性突然変異が口唇裂／口蓋−外胚葉性異形成症と関連している。ＮＰ＿００２８４６．２（配列番号７３２）。
７．  ＳＨ３Ｄ５：局所的接着およびアクチンストレス線維の形成と関連しており、また、プロトオンコジーンｃ−Ｃｂ１（Ｃｂ１）の産物と結合し、インスリンレセプターシグナル伝達を調節し得る、ＳＨ３ドメイン含有タンパク質。ＮＰ＿０３３１９２．１（配列番号７３３）
８．  ウトロフィン：細胞骨格タンパク質と相互作用する、膜会合型タンパク質。筋および神経筋接合部の発生および細胞接着と関連し、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）におけるジストロフィン欠損を部分的に代償し得る。ＮＰ＿００９０５５．１（配列番号７３４）
【０１３６】
（１０）  ＭＵＰＰ  ＰＤＺ３
本明細書に記載の方法（例えば、ＥＲＢＩＮについて）を用いて、以下の遺伝子産物をＭＵＰＰ  ＰＤＺ３のリガンドとして同定した：
１．ショウジョウバエＮＵＭＢ相同体：ホスホチロシン結合ドメインを含み、神経発生または神経可塑性を調節し得る、Ｎｕｍｂ様（Ｎｕｍｂ関連）、推定タンパク質結合タンパク質。ＮＰ＿００４７４７．１（配列番号７３５）。
２．  ＴＧＦＢＲ１：トランスフォーミング成長因子βレセプターＩ、シグナル伝達および細胞増殖に関与する、アクチビン−ＴＧＦスーパーファミリーのメンバーである、セリン−スレオニンキナーゼ；機能障害はアテローム性動脈硬化症および再狭窄と関連している。ＮＰ＿００４６０３．１（配列番号７３６）。
３．  ＩＧＦＢＰ７：インスリン様増殖因子結合タンパク質７、細胞増殖および細胞接着の調節において機能し、腫瘍サプレッサーとして作用し得、血管形成および老化において役割を果たし得る。ＮＰ＿００１５４４．１（配列番号７３７）。
４．  ＣＤ３６ｌ１：ＣＤ３６抗原（Ｉ型コラーゲンレセプター、トロンボスポンジンレセプター）様１。スカベンジャーレセプターＢＩ、ＣＤ３６スーパーファミリーのメンバーで高親和性細胞表面高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レセプター、高密度リポタンパク質からのコレステロールの選択的取り込みを媒介し、アポトーシス胸腺細胞と結合する。ＮＰ＿００５４９６．１（配列番号７３８）
【０１３７】
（１１）  Ｍａｇｉ１  ＰＤＺ３
グアニレートキナーゼドメイン、２つのＷＷドメインおよび数個のＰＤＺドメインを含み、脳特異的血管形成インヒビター１（ＢＡＩ１）と相互作用し、脳におけるシグナル伝達および細胞接着に関与し得る、ＢＡＩ１関連タンパク質１。この遺伝子によってコードされるタンパク質は膜会合型グアニレートキナーゼ相同体（ＭＡＧＵＫ）ファミリーのメンバーである。２つのＷＷドメイン、グアニレートキナーゼドメインおよび５つのＰＤＺドメインを特徴とするこのタンパク質は、ＢＡＩ１の細胞質領域と相互作用する。これらのタンパク質はともに、細胞接着およびシグナル伝達において役割を果たし得る。ＮＰ＿００４７３３．１。
【０１３８】
本明細書に記載の方法（例えば、ＥＲＢＩＮについて）を用いて、以下の遺伝子産物をＭａｇｉ１  ＰＤＺ３のリガンドとして同定した。：
１．  ＳＤＯＬＦ：嗅覚レセプターｓｄｏｌｆ、Ｇタンパク質共役レセプター（ＧＰＣＲ）のロドプシンファミリーのメンバー、嗅覚上皮の別個の領域に存在するレセプターである、匂い物質レセプター８３（マウスＯｒ８３）と中程度の類似性を有する。ＮＰ＿２７７０５４．１（配列番号７３９）。
２．  ＰＬＥＫＨＡ１：プレクストリン相同（ＰＨ）ドメイン含有ファミリーＡメンバー１（直列型ＰＨドメイン含有タンパク質１）、ＰＨドメインを介してホスファチジルイノシトール３，４ビスホスフェートと特異的に結合し、ＰＤＺドメインと結合し、ホスホイノシチドシグナル伝達経路を調節する。ＮＰ＿０６７６３５．１（配列番号７４０）。
３．  ＰＥＰＰ２：ホスホイノシトール３−ホスフェート結合タンパク質−２、推定ホスファチジルイノシトール３，４，５−トリホスフェート結合モチーフを含むプレクストリン相同ドメインおよび２つのＷＷドメインを含む、おそらくは、アダプタータンパク質として作用し得るリン脂質結合タンパク質。ＮＰ＿０６１８８５．１（配列番号７４１）。
４．  ＭＵＣ１２：上皮細胞増殖の調節において役割を果たし得る、ＥＧＦ様細胞表面糖タンパク質。ＡＡＤ５５６７８．１（配列番号７４２）。
５．  ＳＬＩＴ１：ＥＧＦ様モチーフおよびロイシンリッチモチーフを含み、脳でのみ発現され、嗅覚系の発達においてニューロンの遊走方向を導くよう作用し得る、ラットＲｎ．３０００２と強い類似性を有する、分泌タンパク質。ＮＰ＿００３０５２．１（配列番号７４３）。
６．  ＰＡＲＫ２：パーキンソン病（常染色体劣性、若年性）２、ＲＩＮＧ−フィンガーモチーフを含むユビキチン−タンパク質リガーゼ、αシヌクレイン（ＳＮＣＡ）、シンフィリン−１（ＳＮＣＡＩＰ）およびＣＤＣｒｅｌ  １（ＰＮＵＴＬ１）をユビキチン化するよう機能し；突然変異は常染色体劣性若年性パーキンソン症を引き起こす。ＮＰ＿０５４６４２．１（配列番号７４４）。
７．  ＨＴＲ２Ａ；５−ヒドロキシトルプタミン（セロトニン）２Ａレセプター、細胞内カルシウムレベルを調節し、認知、気分および食欲において役割を果たす、Ｇタンパク質共役レセプター；抑鬱性および摂食障害の病態生理において役割を果たし得る。ＮＰ＿０００６１２．１（配列番号７４５）。
８．  ＰＩＴＰＮＢ：ホスファチジルイノシトール輸送タンパク質α、ホスホリパーゼＣシグナル伝達にとって、ならびに恒常的および調節された小胞輸送にとって不可欠な、ホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルコリンの膜間の輸送を触媒する。ＮＰ＿００６２１５．１（配列番号７４６）。
【０１３９】
（１２）  ＭＡＧＩ３  ＰＤＺ３
本明細書に記載の方法（例えば、ＥＲＢＩＮについて）を用いて、以下の遺伝子産物をＭａｇｉ３  ＰＤＺ３のリガンドとして同定した：
１．  ＪＡＭ１：結合部接着分子１、血小板接着および凝集に関与し、細胞内シグナル伝達、タイトインジャンクションの構築、および炎症応答において役割を果たし得、免疫血小板減少症の病気の発生に関与し得る。ＮＰ＿０５８６４２．１（配列番号７４７）。
２．  ＪＡＭ２：結合部接着分子２、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、高内皮小静脈で発現され、好中球および単球経内皮遊走に役立ち得る。ＮＰ＿０６７０４２．１（配列番号７４８）。
３．  ＬＬＴ１：ヒトレクチン様ＮＫ細胞レセプターはヒトＮＫ遺伝子複合体に位置しているＮＫ細胞レセプターの新規メンバーである。タンパク質構造はＮ末端近くに膜貫通ドメインおよび他のＮＫ細胞レセプターと共通して、Ｃ型レクチン様ドメインと類似性を有する細胞外ドメインを含む。このタンパク質はシグナルの活性化を媒介することに関与し得る。ＮＰ＿０３７４０１．１（配列番号７４９）。
４．  ＰＴＴＧ３：下垂体腫瘍−トランスフォーミング３、腫瘍形成と関連し得るタンパク質。ＮＰ＿０６６２８０．１（配列番号７５０）
５．  ＣＤ８３抗原、（活性化Ｂリンパ球、免疫グロブリンスーパーファミリー）、抗原提示およびリンパ球活性化において役割を果たし得、樹状細胞で、その成熟の最後の段階で発現される。ＮＰ＿００４２２４．１（配列番号７５１）。
６．  δ様相同体（ショウジョウバエ）、前脂肪細胞因子（胎児抗原１）、推定成長因子、血球新生の調節に関与し得、脂肪細胞分化を阻害し得、神経内分泌分化において役割を果たし得る。ＮＰ＿００３８２７．１（配列番号７５２）。
７．  ＴＮＦＲＳＦ１８：腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１８、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２およびＴＲＡＦ３と会合し；ＮＦκＢ転写因子の活性を調節し、ＦＡＳ（ＴＮＦＲＳＦ６）およびＦａｓＬ（ＴＮＦＳＦ６）媒介性アポトーシスにおいて役割を果たし得る。ＮＰ＿００４１８６．１（配列番号７５３）。
８．  ＲＧＳ２０：Ｇタンパク質−シグナル伝達２０のレギュレーター、非リン酸化型のＧタンパク質αｚサブユニット（ＧＮＡＺ）と結合してその内因性ＧＴＰアーゼ活性を刺激することによって、Ｇタンパク質−シグナル伝達を負に調節する。ＮＰ＿００３６９３．２（配列番号７５４）。
９．  ＴＭ４ＳＦ６：膜貫通４スーパーファミリーメンバー６、テトラスパニンファミリーのメンバー、細胞接着、遊走および増殖に関与し得る。ＮＰ＿００３２６１．１（配列番号７５５）
１０．  ＰＡＲＫ２（配列番号７４４）。
１１．  ＧＰＲ１０；Ｇタンパク質共役レセプター１０、プロラクチン（ＰＲＬ）分泌を刺激するペプチドと結合する、推定Ｇタンパク質共役レセプター。ＮＰ＿００４２３９．１（配列番号７５６）。
１２．  ＩＬ２ＲＢ：インターロイキン２レセプターβ、ＭＡＰキナーゼ、ＪＡＫ−ＳＴＡＴおよびホスホイノシチド３−キナーゼ媒介性シグナル伝達経路においてシグナルトランスデューサー分子と結合してこれを活性化し、Ｔ細胞媒介性免疫応答および腫瘍増殖において役割を果たす。ＮＰ＿０００８６９．１（配列番号７５７）。
【０１４０】
（１３）  ＩＮＡＤＬ  ＰＤＺ３
ＰＤＺドメインタンパク質（ショウジョウバエｉｎａｄ様）、多タンパク質複合体の構築において役割を果たし得る。ＮＰ＿００５７９０．１。ＩＮＡＤＬ。
【０１４１】
本明細書に記載の方法（例えば、ＥＲＢＩＮについて）を用いて、以下の遺伝子産物をＩＮＡＤＬ  ＰＤＺ３のリガンドとして同定した：
１．  ＢＬＴＲ２（配列番号  ７２８）。
２．  ＪＡＭ１（配列番号  ７４７）。
３．  ＪＡＭ２（配列番号  ７４８）。
４．  ＫＶ８．１：ニューロンのカリウムチャンネルαサブユニット、Ｋｖ２およびＫｖ３サブファミリーの外向き整流性カリウムチャンネルのサブクラスの阻害的サブユニットとして機能する。ＮＰ＿０５５１９４．１（配列番号  ７５８）。
５．  ＰＴＴＧ３：下垂体腫瘍−トランスフォーミング３、腫瘍形成と関連し得るタンパク質。ＮＰ＿０６６２８０．１（配列番号７５０）。
６．  ＣＮＴＮＡＰ２（配列番号７３１）
７．  ＮＲＸＮ１；ニューレキシンＩ−α、クロゴケグモ毒由来の神経毒である、α−ラトロトキシンと結合する膜貫通タンパク質。ＮＰ＿００４７９２．１（配列番号７５９）。
８．  ＮＲＸＮ２：ニューレキシン２、軸索誘導に関与し得る、シナプス細胞表面タンパク質の神経毒ファミリーのメンバーである、ラットＮｒｘｎ２と極めて強い類似性を有するタンパク質。ＢＡＡ７６７６５．１、ＫＩＡＡ０９２１（配列番号７６０）。
９．  ＮＲＸＮ３：ニューレキシン３、シナプス細胞表面タンパク質のニューレキシンファミリーのメンバー、軸索誘導において役割を有し得る推定複合的膜タンパク質。ＮＰ＿００４７８７．１（配列番号７６１）。
１０．  ＴＮＦＲＳＦ１８（配列番号７５３）。
１１．  ＰＴＴＧ１（配列番号７６２）。
１２．  ＰＡＲＫ２（配列番号７４４）。
１３．  ＧＡＢＲＧ２：ＧＡＢＡ−Ａレセプターγ２サブユニット、脳における主要な抑制性神経伝達物質である塩素イオンチャンネル、サブユニットはベンゾジアゼピン結合をレセプターに付与し；変異体は癲癇と関連している。ＮＰ＿０００８０７．１（配列番号７６３）。
１４．  ＣＮＴＦＲ：繊毛様神経栄養因子レセプター、ｇｐ１３０を含む複合体の非シグナル伝達α成分（ＩＬ６ＳＴ）および白血病抑制因子レセプター（ＬＩＦＲ）、散発性筋萎縮性側索硬化症の発症におけるおよび患者における運動ニューロン生存を調節する。ＮＰ＿００１８３３．１（配列番号７６４）。
１５．  ＣＣＲ３：ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）レセプター３、エオタキシンレセプター、ＣＣサブファミリーのケモカインと結合し、細胞内カルシウム流動を媒介するＧタンパク質共役レセプター、ヒト免疫不全ウイルスの標的。ＮＰ＿００１８２８．１（配列番号７６５）。
１６．  ＧＡＢＲＧ３：γ−アミノ酪酸Ａレセプターのα３サブユニット。脳における主要な抑制性神経伝達物質レセプターおよびベンゾジアゼピンによって調節される塩素イオンチャンネルであるレセプター；ＧＡＢＲＡ３の特定の変異体は多発性硬化症と関連している。ＮＰ＿０００７９９．１（配列番号７６６）。
１７．  ＧＡＢＲＰ；γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）Ａ型レセプターｐｉサブユニット、ＧＡＢＡＡレセプターサブユニットを用いて構築し、調節性薬剤に対するレセプターの感受性を変更し、子宮収縮を阻害し妊娠を維持する。ＮＰ＿０５５０２６．１（配列番号７６７）
【０１４２】
（１４）  ヒトＩＮＡＤＬ  ＰＤＺ２
本明細書に記載の方法（例えば、ＥＲＢＩＮについて）を用いて、以下の遺伝子産物をヒトＩＮＡＤＬ  ＰＤＺ２のリガンドとして同定した：
１．  ＰＩＷＩ  １：Ｐｉｗｉ（ショウジョウバエ）様１、ショウジョウバエｐｉｗｉの相同体、細胞増殖およびアポトーシスの制御において役割を果たし、造血に関与し得る。ＡＡＫ６９３４８．１（配列番号７６８）。
２．  マウスｐｉｗｉ様相同体１の可能性ある相同分子種：生殖系列幹細胞分裂に必要であり得る、ＰＩＷＩ（ショウジョウバエｐｉｗｉの相同体）と高い類似性を有するタンパク質、Ｐｉｗｉドメインを含む。ＮＰ＿０６０５３８．１（配列番号７６９）。
３．  ＮＲＸＮ１（配列番号７５９）。
４．  ＮＲＸＮ２（配列番号７６０）。
５．  ＰＰＰ２ＣＡ：タンパク質ホスファターゼ２触媒作用サブユニットα、タンパク質リン酸化を介して多様な細胞プロセスの調節に関与しているタンパク質ホスファターゼ２Ａの触媒作用サブユニット。ＮＰ＿００２７０６．１（配列番号７７０）。
６．  ＰＰＰ２ＣＢ：多数の細胞経路において調節的な役割を果たすと考えられている、主要なセリン−スレオニンホスファターゼである、タンパク質ホスファターゼ２Ａの触媒作用サブユニットのβイソ型。ＮＰ＿００４１４７．１（配列番号７７１）。
【０１４３】
（１５）  ヒトＰＡＲＤ３  ＰＤＺ３
非対称細胞分裂および極性成長に不可欠な、多ＰＤＺタンパク質、上皮細胞−細胞接触でのタイトジャンクションの形成において役割を有し得る。ＮＰ＿０６２５６５．１、ＰＡＲＤ３。
【０１４４】
本明細書に記載の方法（例えば、ＥＲＢＩＮについて）を用いて、以下の遺伝子産物をヒトＰＡＲＤ３  ＰＤＺ３のリガンドと同定した：
１．  ＨＲＫ：Ｈａｒａｋｉｒｉ、推定ＢＨ３ドメインを含むタンパク質、ＢＣＬ２およびＢＣＬ−ＸＬ（ＢＣＬ２Ｌ１）と相互作用してその抗アポトーシス活性を阻害してアポトーシスを誘導し得；筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）患者におけるアポトーシス事象において役割を果たし得る。ＮＰ＿００３７９７．１（配列番号７７２）。
２．  ＤＯＣ１：卵巣癌１ではダウンレギュレートされている、正常卵巣表面上皮細胞によって発現されるが卵巣癌細胞株によっては発現されない推定タンパク質。ＮＰ＿０５５７０５．１（配列番号７７３）。
３．  ＰＩＷＩ（配列番号７６８）。
４．  ＰＰＰ１Ｒ３Ｄ：タンパク質のセリンおよびスレオニン残基のリン酸化は、細胞分裂に対するホルモン調節から短期間の記憶にわたる、多数の細胞機能の調節において重大なステップである。リン酸化レベルはタンパク質キナーゼとタンパク質ホスファターゼの相対する作用によって制御されている。タンパク質ホスファターゼ１（ＰＰ１）は４種の主要セリン／スレオニン特異的タンパク質ホスファターゼのうちの１種である。ＮＰ＿００６２３３．１（配列番号７７４）
【０１４５】
（１６）  ＳＮＴＡ１  ＰＤＺ
α１シントロフィン、ジストロフィン関連タンパク質のファミリーのメンバー、筋細胞膜でジストロフィン関連糖タンパク質複合体の成分と相互作用する。ＮＰ＿００３０８９．１。
【０１４６】
本明細書に記載の方法（例えば、ＥＲＢＩＮについて）を用いて、以下の遺伝子産物をＳＮＴＡ１  ＰＤＺのリガンドとして同定した：
１．  ＭＲＧＸ２  ＭＡＳ１関連Ｇタンパク質共役レセプターＸ２、ＭＡＳ１を類似している、推定Ｇタンパク質共役レセプター。ＮＰ＿４７３３７１．１（配列番号７７５）。
２．  ＮＬＧＮ１：ニューロリギン１、ニューロン細胞表面レセプターβニューレキシンの特定のスプライシング型のリガンドとして作用する、ニューロン細胞表面タンパク質である、ラットＮｌｇｎ１（ニューロリギン１）と極めて強い類似性を有するタンパク質。ＮＰ＿０５５７４７．１（配列番号７７６）。
３．  ＮＬＧＮ３；ニューロリギン、ＣＮＳの外側に発現されるメンバー。ＮＰ＿０６１８５０．１（配列番号７７７）。
４．  ＳＥＥＫ１：尋常性乾癬と関連している可能性があるタンパク質。ＮＰ＿０５４７８７．１（配列番号７７８）
５．  クローディンｌ７（配列番号７１９）。
６．  ＧＰＲ５６：（配列番号７７９）。
７．  ＳＳＴＲ５：ソマトスタチンレセプター５、アデニリルシクラーゼ活性を抑制し、ソマトスタチンの、細胞増殖および下垂体成長ホルモンおよび膵臓インスリンの分泌に対する抑制作用を媒介するＧタンパク質共役レセプター。ＮＰ＿００１０４４．１（配列番号７８０）。
８．  ＳＣＴＲ；セクレチンレセプター、ｃＡＭＰとホスファチジルイノシトール細胞内シグナル伝達経路とを共役させ得、膵臓、胆嚢および胃における水、炭酸水素塩および酵素分泌の制御に関与する、クラスＩＩＧタンパク質共役レセプター。ＮＰ＿００２９７１．１（配列番号７８１）。
９．  ＧＲＭ１；代謝調節型グルタメートレセプター１α、ホスホイノシチド加水分解を促進し、細胞内カルシウム流動および膜電位を調節する、Ｇタンパク質共役神経伝達物質レセプター。ＮＰ＿０００８２９．１（配列番号７８２）。
１０．  ＧＲＭ２；代謝調節型グルタメートレセプター２、抑制性Ｇタンパク質と共役している、神経伝達物質レセプター。ＮＰ＿０００８３０．１（配列番号７８３）。
１１．  ＧＲＭ３：代謝調節型グルタメートレセプター３型、抑制性Ｇタンパク質と共役しており、脳で発現される、神経伝達物質レセプター。ＮＰ−０００８３１．１（配列番号７８４）。
１２．  ＧＲＭ５；代謝調節型グルタメートレセプター５、ホスホリパーゼＣおよびカルシウム誘導性塩素イオンチャンネルを活性化し、シナプス性伝達および痛み認知を調節し得、総合失調症と関連があり得る、Ｇタンパク質共役神経伝達物質レセプター。ＮＰ＿０００８３３．１（配列番号７８５）
【０１４７】
（１７）  Ｍａｇｉ３  ＰＤＺ０
本明細書に記載の方法（例えば、ＥＲＢＩＮについて）を用いて、以下の遺伝子産物をＭａｇｉ３  ＰＤＺ０のリガンドとして同定した：
１．  ＬＡＮＯ：ＰＤＺドメインを含まないＬＡＰ、ＭＡＧＵＫタンパク質のＰＤＺドメインと結合し、Ｅｒｂｉｎ（ＥＲＢＢ２ＩＰ）と間接的に結合し、上皮組織ホメオスタシスに関与し得る、細胞タンパク質。ＮＰ＿０７９４４４．１（配列番号７８６）。
２．  ＳＳＴＲ３；ソマトスタチンレセプター３、アデニリルシクラーゼ活性を抑制し、ソマトスタチンの細胞増殖に対する抑制作用を媒介する、Ｇタンパク質共役レセプター。この遺伝子によってコードされるタンパク質は小さなＧＴＰ結合タンパク質のＲＡＳスーパーファミリーに属するＧＴＰアーゼである。このスーパーファミリーのメンバーは、細胞増殖の制御、細胞骨格再構築およびタンパク質キナーゼの活性化をはじめとする細胞事象の多様なアレイを調節すると考えられている。ソマトスタチンは多数の部位で作用して多数のホルモンおよびその他の分泌タンパク質の放出を抑制する。ソマトスタチンの生物学的作用は、おそらくは組織特異的に発現されたＧタンパク質共役レセプターのファミリーによって媒介されている。ＳＳＴＲ３は７つの膜貫通セグメントを有するレセプターのスーパーファミリーのメンバーであり、脳および膵臓において最高レベルで発現される。ＮＰ＿００１０４２．１（配列番号７８７）。
３．  ＮＲＣＡＭ：ニューロン細胞接着分子、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー、ニューロン細胞接着において役割を有すると予想されている。ＮＰ＿００５００１．１（配列番号７８８）。
４．  ＧＰＲ１９：Ｇタンパク質共役レセプターファミリーのメンバー、脳および末梢組織で発現される。ＮＰ＿００６１３４．１（配列番号７８９）。
５．  ＧＮＧ５：Ｇ−タンパク質γ５サブユニット、ゲラニルゲラニル化の結果としてのヘテロ三量体Ｇタンパク質複合体の細胞膜への輸送において役割を果たす。ＮＰ＿００５２６５．１（配列番号７９０）。
６．  ＨＴＲ２Ｂ（配列番号７１５）。
【０１４８】
（１８）  ＭＵＰＰ  ＰＤＺ１３
本明細書に記載の方法（例えば、ＥＲＢＩＮについて）を用いて、以下の遺伝子産物をＭＵＰＰ  ＰＤＺ１３のリガンドとして同定した：
１．  ＮＬＧＮ３（配列番号７７７）。
２．  ＮＬＧＮ１（配列番号７７６）。
３．  クローディン１６（パラセリン−１）、ヘンレの肉厚な上行肢における傍細胞のＭｇ２＋およびＣａ２＋再吸収に関与する腎臓タイトジャンクションタンパク質；相当する遺伝子の突然変異は低マグネシウム血症高カルシウム尿症症候群と関連している。ＮＰ＿００６５７１．１（配列番号７９１）。
４．  ＧＰＲ５６（配列番号７７９）。
５．  Ｅｎｉｇｍａ：（ＬＩＭミネラル化タンパク質１）、インスリンレセプター（ＩＮＳＲ）をはじめとする種々のレセプタータンパク質と結合し、細胞増殖において役割を果たす、ＬＩＭドメイン含有タンパク質。ＮＰ＿００５４４２．２（配列番号７９２）。
６．  ＦＺＤ９：Ｆｒｉｚｚｌｅｄ９、Ｗｎｔｌタンパク質と結合し、組織極性と関係があり、神経形成に関与し得る、７回膜貫通レセプター；相当する遺伝子はウィリアムズ・ビューレン症候群の患者で欠失している。ＮＰ＿００３４９９．１（配列番号７９３）。
７．  ＳＳＴＲ５：ソマトスタチンレセプター５、アデニリルシクラーゼ活性を抑制し、ソマトスタチンの細胞増殖ならびに下垂体成長ホルモンおよび膵臓インスリンの分泌に対する抑制作用を媒介する、Ｇタンパク質共役レセプター。ソマトスタチンは多数の部位で多数のホルモンおよびその他の分泌タンパク質の放出を抑制するよう作用する。ソマトスタチンの生物学的作用はおそらくは組織特異的に発現されたＧタンパク質共役レセプターのファミリーによって媒介されている。ＳＳＴＲ５は７つの膜貫通セグメントを有するレセプターのスーパーファミリーのメンバーである。ＮＰ＿００１０４４．１（配列番号７９４）。
８．  ＶＣＡＭ１：血管細胞接着分子１、炎症応答の際の特定の白血球の内皮細胞への補充および接着を媒介し、アテローム性動脈硬化症において役割を有し得る、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー。ＮＰ＿００１０６９．１（配列番番号７９５）。
９．  ＧＰＲＫ６；Ｇタンパク質共役レセプターキナーゼ６、アゴニストによって刺激されたレセプターをリン酸化することによってＧタンパク質共役レセプターの脱感作を調節する、タンパク質キナーゼ。ＮＰ＿００２０７３．１（配列番号７９６）。
【０１４９】
ＥＲＢＩＮ ＰＤＺドメインに対して、ならびに、前記のおよび本明細書に記載のその他のＰＤＺドメインに対して選択されたペプチドの有用性は少なくとも三重である。第１にそれらは、それに含まれる配列情報によって任意のＰＤＺドメインのタンパク質リガンドを同定するのに、例えば、ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインのリガンドとしてのＡＲＶＣＦ、ｐ００７１およびδカテニンの同定に役立つ。本発明の方法を用いる個々のＰＤＺドメイン（ひいてはこれらのドメインを含有するタンパク質）の同族リガンドの同定により、これまでに知られていない、生物学的に重要なＰＤＺドメイン同族リガンド相互作用が示される。これらの相互作用の生物学的機能は、前記で論じた同族リガンドおよびＰＤＺドメインタンパク質の既知の生物学から明らかである。したがって、これら新規相互作用の同定により、治療および／または診断適用の手段およびかかる相互作用についての知識がなければ可能でなかったであろう戦略が示される。第２に、ＰＤＺリガンド相互作用の生理学的関連性を確証するために、ＰＤＺドメイン特異的競合インヒビターとして働くよう、マイクロインジェクション、アンテナペディアペプチドまたは脂質トランスフェクション試薬によって、ペプチドを生細胞に送達してもよい。適したアッセイとしてＰＤＺリガンド相互作用をモニターすることが存在する。これにはＰＤＺドメインの生理学的リガンドをファージディスプレイによって発見することは必要ではなく、リガンドがそのＰＤＺドメインに特異的であり、該リガンドとＰＤＺドメインの相互作用を混乱させるのに十分な親和性を有していることのみが必要である。最後に、疾病プロセスと関連しているいずれかのタンパク質同様、薬剤がこのタンパク質にどのように影響を及ぼして治療的利益を達成するはずであるかを確立しなければならない。特定のＰＤＺ−リガンド相互作用の混乱が治療的利益の予想と一致した結果を提供するかどうかを判断するために、ペプチド／リガンドを生細胞または疾病のモデルである動物モデル（すなわち、疾病の特定の性質の模倣物）に送達してもよい。
【０１５０】
インビボでタンパク質−タンパク質（またはペプチド）相互作用を検出する方法は当技術分野では公知である。例えば、Ｍｉｃｈｎｉｃｋらによって米国特許第６，２７０，９６４Ｂ１号および同６，２９４，３３０Ｂ１号に記載された方法を用いて、ＰＤＺドメイン含有タンパク質（いずれかの本明細書に記載されたものをはじめとする）と同族リガンドまたは合成ペプチド（いずれかの本明細書に記載されたものをはじめとする）との相互作用を解析すればよい。さらに、これらの方法を用いて、合成ペプチドなどの分子の、ＰＤＺドメインタンパク質とその同族リガンドの結合相互作用を調節する能力をインビボで評価してもよい。
【０１５１】
Ａ．  定義
特に断りのない限り、すべての技術および科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者に一般的に理解されるものと同一の意味を有する。以下の定義は明確にするために提示する。
【０１５２】
本明細書には、（Demerecら, 1966）の、遺伝学と関連している推奨が適用されている。遺伝子（および関連する核酸）とそれがコードするタンパク質とを区別するために、遺伝子の略語はイタリック体の（または下線を引いた）文字であり、他方、タンパク質の略語はイタリック体ではない。したがって、ＰＤＢＰは核酸配列ＰＤＢＰによってコードされている。
【０１５３】
「単離された」とは分子に対して言及される場合には、その天然環境の構成要素から同定および分離および／または回収されている分子を指す。その天然環境の混入成分とは診断または治療用途を干渉する物質である。
【０１５４】
１．  核酸関連定義
（ａ）  制御配列
制御配列とは、特定の宿主生物における、機能し得る形で連結されたコード配列の発現を可能にするＤＮＡ配列である。原核生物の制御配列としてはプロモーター、オペレーター配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを利用する。
【０１５５】
（ｂ）  機能し得る形で連結された
核酸は、別の核酸配列と機能的関係におかれている場合に機能し得る形で連結されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーはコード配列と、その配列の転写に影響を及ぼす場合に機能し得る形で連結されており、またはリボソーム結合部位はコード配列と、転写を促進するよう位置する場合に機能し得る形で連結されている。一般に、「機能し得る形で連結された」とは、連結されているＤＮＡ配列が連続しており、また分泌リーダーの場合には、隣接しており、かつ、リーディングフェーズにあるということを意味する。しかしながら、エンハンサーは隣接している必要はない。連結は従来の組換えＤＮＡ法によって達成すればよい。
【０１５６】
（ｃ）  単離された核酸
単離された核酸分子は、そこでそれが天然に認められる周囲の環境から精製されており、かつ、少なくとも１種の混入核酸分子から分離されている。単離されたＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰ分子は細胞中に存在する特定のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰ分子とは区別される。しかしながら、単離されたＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰ分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なる染色体位置にある、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰを普通に発現する細胞に含まれているＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰ分子を含む。
【０１５７】
２．  タンパク質関連定義
（ａ）  精製ポリペプチド
分子が精製されたポリペプチドである場合には、ポリペプチドは（１）配列決定装置によってＮ末端または内部アミノ酸配列に少なくとも３個の残基が得られるように、または（２）クマシーブルーまたは銀染色を用いる非還元または還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一となるよう精製されている。単離されたポリペプチドは、少なくともＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰ天然環境のうちの１成分は存在しないので、遺伝子操作された細胞において異種性に発現されたものまたはインビトロで発現されたものを含む。通常、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【０１５８】
（ｂ）  活性ポリペプチド
活性ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰ、またはその断片は、未変性または天然のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰの生物学的および／または免疫学的活性を保持する。免疫学的活性とは、未変性のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰが持つ、抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力を指し、生物学的活性とは、未変性のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰによって媒介される、免疫学的活性を除く機能を指す。例えば、同族ＰＤＺＰに対するＰＩＰ結合。
【０１５９】
（ｃ）  Ａｂ
抗体は単一の抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰモノクローナルＡｂ（アゴニスト、アンタゴニストおよび中和Ａｂをふくむ）、ポリエピトープ特異性を有する、抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰ抗体組成物、一本鎖抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰＡｂ、および抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰ  Ａｂの断片であってもよい。「モノクローナル抗体」とは、実質的に相同なＡｂの集団から得られた抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々のＡｂは、微量で存在し得る天然の突然変異を除いて同一である。
【０１６０】
（ｄ）  エピトープタグ
エピトープタグをつけたポリペプチドとは、「タグポリペプチド」と融合しているキメラポリペプチドを指す。かかるタグはそれに対してＡｂが作製され得るか、Ａｂを入手できるが、ポリペプチド活性を干渉しないエピトープを提供する。内生エピトープとの抗タグ抗体反応性を低下させるために、タグポリペプチドは独特であることが好ましい。一般に、適したタグポリペプチドは少なくとも６個のアミノ酸残基、通常、約８個と５０個の間のアミノ酸残基、好ましくは８個と２０個の間のアミノ酸残基を含む。エピトープタグ配列の例としては、インフルエンザＡウイルスのＨＡ、ＧＤ、およびｃ−ｍｙｃ、ポリ−ＨｉｓおよびＦＬＡＧが挙げられる。
【０１６１】
本発明のＰＤＢＰは表１および３に提供される配列を含む。本発明はまた、その残基のいずれかが表１および３に示される相当する残基から変更されている場合もあるが、依然として、その未変性の活性および生理学的機能を維持するタンパク質または機能的断片をコードする、ＰＤＢＰ突然変異体または変異体タンパク質も含む。
【０１６２】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰポリヌクレオチド
本発明の一態様はＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰまたは生物活性部分をコードする単離された核酸分子に関する。「核酸分子」とはＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチド類似体を用いて作製されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体、および誘導体、断片および相同体を含む。核酸分子は一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、二本鎖ＤＮＡを含んでなることが好ましい。
【０１６３】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰをコードするポリヌクレオチドは標準的な遺伝暗号から推定すればよい（表Ｃ）。かかる配列は標準的な技術を用いてインビトロで容易に合成でき、ファージディスプレイに用いたものなどの既存のポリヌクレオチドから単離してもよい。
【０１６４】
2004533840.tif 000012
【０１６５】
１．  単離された核酸
単離された核酸分子はその核酸の天然の供給源に存在するその他の核酸分子から分離されている。単離された、ｃＤＮＡ分子などの核酸分子は、組換え技術によって生産される場合には、その他の細胞性物質または培養培地を、または化学合成による場合には、化学的前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まないものであり得る。
【０１６６】
本発明の核酸分子、例えば、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰをコードする核酸分子、または補体は標準的な分子生物学技術および提供された配列情報を用いて単離してもよいし、または化学的に合成してもよい（Ausubelら, 1987;Sambrook, 1989）。
【０１６７】
ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡあるいはゲノムＤＮＡを鋳型として、および適当なオリゴヌクレオチドプライマーを用いてＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰを増幅するためにＰＣＲ増幅技術を用いてもよい。かかる核酸は適当なベクターにクローニングして、ＤＮＡ配列解析によって特性決定してもよい。さらに、標準的な合成技術、例えば、自動化ＤＮＡシンセサイザーによって、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ配列に相当するオリゴヌクレオチドを調製してもよい。
【０１６８】
２．  オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドは一連の結合したヌクレオチド残基を含んでなり、このオリゴヌクレオチドはＰＣＲ反応またはその他の適用に用いられるのに十分な数のヌクレオチド塩基を有する。短いオリゴヌクレオチド配列はゲノムまたはｃＤＮＡ配列に基づくものであり得、またはそれらから設計されたものであり得、特定の細胞または組織において、同一のまたは類似のまたは相補的ＤＮＡまたはＲＮＡを、増幅、確認またはその存在を示すために用いられる。オリゴヌクレオチドは長さが約１０ｎｔ、５０ｎｔ、１００または１５０ｎｔの、好ましくは長さが約１５ｎｔ〜３０ｎｔの核酸配列部分を含んでなる。オリゴヌクレオチドは化学的に合成してもよいし、またプローブとして用いてもよい。
【０１６９】
３．  相補的核酸配列；結合
単離された本発明の核酸分子はＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰをコードするヌクレオチド配列、またはこのヌクレオチド配列の一部の補体（例えば、プローブまたはプライマーとして使用できる断片またはＰＤＺＤもしくはＰＤＢＰなどのＰＩＰもしくはＰＤＺＰの生物活性部分をコードする断片）である核酸分子を含んでなる。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰをコードする核酸配列と相補的である核酸分子とは、ヌクレオチド配列と十分に相補的であり、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰをコードするヌクレオチド配列とミスマッチがほとんどまたは全くない水素結合を形成し、それによって安定な二本鎖を形成するものである。
【０１７０】
「相補的な」とは、核酸分子のヌクレオチド単位間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型塩基対形成を指し、「結合」とは２つのポリペプチドもしくは化合物間の物理的または化学的相互作用または会合しているポリペプチドもしくは化合物またはその組み合わせを意味する。結合としては、イオン性、非イオン性、ファンデルワールス、疎水性相互作用などが挙げられる。物理的相互作用は直接または間接的なもののいずれかであり得る。間接的相互作用は別のポリペプチドまたは化合物の作用を介する、またはそれによるものであり得る。直接結合とは、別のポリペプチドまたは化合物の作用を介して、またはそれによっては起こらず、むしろ、その他の実質的な化学的中間体のない相互作用を指す。
【０１７１】
４．  保存的突然変異
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰをコードする核酸に、突然変異によって、コードされるＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰのアミノ酸配列の変更を招くが、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ機能は変更しない変化を導入してもよい。「非必須」アミノ酸残基とはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの野生型配列から、生物活性を変更せずに変更され得る残基であり、他方、「必須」アミノ酸残基とはかかる生物活性に必要とされる。例えば、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰにおいて保存されているアミノ酸残基は特に変更を受け入れられないと予想される。実施例も参照。保存的置換がなされ得るアミノ酸は当技術分野では十分に公知である。
【０１７２】
有用な保存的置換を表Ｄ、「好ましい置換」に示す。それによってあるクラスのアミノ酸が同一タイプの別のアミノ酸で置換される保存的置換は、その置換が化合物の生物活性を著しく変更しない限りは本発明の範囲内にある。かかる置換が生物活性の変化をもたらす場合には、例示的なものとして表Ｄに示されたものよりも、より大きな変化が導入され、産物をＰＤＺドメイン結合についてスクリーニングする。
【０１７３】
2004533840.tif 000013
【０１７４】
（１）β−シートまたはα−へリックスコンホメーションなどのポリペプチド主鎖の構造、（２）電荷、（３）疎水性、または（４）標的部位の側鎖の嵩に影響を及ぼす非保存的置換は、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ機能または免疫学的同一性を改変し得る。表Ｅに示されるように、残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けられる。非保存的置換はこれらのクラスの１つと別のクラスのメンバーの交換を伴う。置換は保存的置換部位に導入してもよいが、非保存部位がより好ましい。
【０１７５】
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【０１７６】
オリゴヌクレオチド媒介性（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、およびＰＣＲ突然変異誘発などの当技術分野で公知の方法を用いて変異体ＰＤＺＰ、ＰＤＢＰ、ＰＩＰまたはＰＤＺＤを作製してもよい。部位特異的突然変異誘発（Carter, 1986;ZollerおよびSmith, 1987）、カセット突然変異誘発、制限選抜突然変異誘発（Wellsら, 1985）またはその他の既知の技術をクローニングされたＤＮＡに実施してＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ変異体ＤＮＡを得てもよい（Ausubelら, 1987;Sambrook, 1989）。
【０１７７】
５．  アンチセンス核酸
予測された相互作用を確証するためにアンチセンス法を用いてもよい。すなわち、アンチセンスによって誘導された、予測されたＰＤＺ結合パートナーの減少はタンパク質の細胞内局在性または活性を変更し得る。
【０１７８】
アンチセンスおよびセンスＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰオリゴヌクレオチドを用いることで、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを妨げることができる。これらのオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列と結合して、標的配列の転写または翻訳をブロックする二本鎖を形成し、この二本鎖の分解を増強することによって、またはその他の手段によって、転写または翻訳を早まって終結させる。
【０１７９】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＮＲＡ（センス）またはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合できる、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかの一本鎖核酸である。アンチセンス核酸はＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋまたはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成則にしたがって設計すればよい。アンチセンス核酸分子はＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡの全コード領域に相補的であってもよいが、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡのコードまたは非コード領域の一部に相補的であるのがより好ましい。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位周辺の領域に相補的であってもよい。アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも約１４個のヌクレオチド、好ましくは約１４個〜３０個のヌクレオチドのＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ＤＮＡコード領域の断片を含んでなっていてもよい。一般に、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個またはそれより長い塩基長を含んでなり得る。中でも、（SteinおよびCohen, 1988;van der Krolら, 1988b）は所定のｃＤＮＡ配列からアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを導く方法を記載している。
【０１８０】
アンチセンス核酸を作製するために使用できる、改変されたヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５'−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、転写されたＲＮＡが注目する標的核酸に対して相補的であるよう、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に作製してもよい。
【０１８１】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞（標的核酸配列を含む細胞）に導入するには、いずれの遺伝子導入法を用いてもよい。遺伝子導入法の例としては、（１）エプステイン・バーウイルスのような遺伝子導入ベクターまたは外来ＤＮＡをリガンド結合分子に結合させることなどの生物学的なもの、（２）エレクトロポレーションおよびインジェクションなどの物理学的なもの、および（３）ＣａＰ０４沈殿およびオリゴヌクレオチド−脂質複合体などの化学的なものが挙げられる。
【０１８２】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは適した遺伝子導入レトロウイルスベクターに挿入してもよい。標的核酸配列を含む細胞を組換えレトロウイルスベクターとインビボまたはエキソビボのいずれかで接触させる。適したレトロウイルスベクターの例としては、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶ、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶ由来のレトロウイルス）、または二重コピーベクター設計されたＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５ＢおよびＤＣＴ５Ｃ（ＷＯ  ９０／１３６４１， 1990）由来のものが挙げられる。十分な核酸分子転写を達成するには、アンチセンス核酸分子の転写が強力なｐｏｌＩＩまたはｐｏｌＩＩＩプロモーターによって制御されているベクター構築物が好ましい。あるいは、構築物の発現が制御されることが望まれる場合には、誘導可能なプロモーターが好ましい場合もある。
【０１８３】
混合集団中で標的細胞を特定するために、標的細胞に特異的な細胞表面レセプターを利用してもよい。（ＷＯ  ９１／０４７５３， 1991）に記載されたように、アンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチドをリガンド結合分子に結合させる。リガンドを標的細胞に特異的なレセプターについて選択する。適したリガンド結合分子の例としては、細胞表面レセプター、成長因子、サイトカインまたは細胞表面レセプターまたは分子と結合するその他のリガンドが挙げられる。リガンド結合分子の結合は、レセプターまたは分子の、リガンド結合分子抱合体と結合する能力を実質的に干渉しない、またはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその結合された型の細胞への侵入をブロックしないことが好ましい。
【０１８４】
リポソームはセンスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞に効率よく導入する（ＷＯ  ９０／１０４４８，1990）。センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は内生リパーゼによって細胞内で解離することが好ましい。
【０１８５】
アンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子であってもよい。α−アノマー核酸分子は相補ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のα−ユニットとは反対に、両鎖は互いに並行に並ぶ（Gautierら, 1987）。アンチセンス核酸分子はまた、２'−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoueら, 1987a）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoueら, 1987b）を含んでなっていてもよい。
【０１８６】
一実施形態では、アンチセンス核酸はリボザイムである。リボザイムとは、それに対して相補的な領域を有する、ｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断できる、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒作用ＲＮＡ分子である。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰｍＲＮＡ転写物を触媒作用的に切断し、ひいては翻訳を阻害するために、ハンマーヘッドリボザイム（HaseloffおよびGerlach, 1988）などのリボザイムを用いてもよい。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づいて、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰに特異的なリボザイムを設計してもよい。例えば、活性部位のヌクレオチド配列がＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰｍＲＮＡ中の切断されるヌクレオチド配列と相補的である、テトラヒメナＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構築してもよい（Ｃｅｃｈら，米国特許第５，１１６，７４２号， 1992；Ｃｅｃｈら，米国特許第４，９８７，０７１号， 1991）。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰｍＲＮＡはまた、ＲＮＡ分子のプールから特異的なリボヌクレアーゼ活性を有する触媒作用ＲＮＡを選択するために用いてもよい（BartelおよびSzostak, 1993）。
【０１８７】
あるいは、ＰＤＺＰ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの調節領域（例えば、ＰＤＺＰ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰプロモーターおよび／またはエンハンサー）と相補的なヌクレオチド配列を標的として、標的細胞におけるＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの転写を妨げる三重らせん構造を形成することで、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現を阻害してもよい（Helene, 1991;Heleneら, 1992;Maher, 1992）。
【０１８８】
アンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチドの修飾はその有効性を増強し得る。修飾された糖−ホスホジエステル結合またはその他の糖結合（ＷＯ９１／０６６２９， 1991）は、標的配列に対する特異的結合を混乱させることなく内生ヌクレアーゼに対する耐性を付与することによってインビボ安定性を高める。その他の修飾はオリゴヌクレオチドの、共有結合された有機部分（ＷＯ９０／１０４４８， 1990）またはポリ−（Ｌ）−リジンなどのその標的に対する親和性を高め得る。金属複合体または介入剤（例えば、エリプチシン）およびアルキル化剤をはじめとするその他の付着はオリゴヌクレオチドのその標的に対する結合特異性を改変する。
【０１８９】
例えば、核酸のデオキシリボースホスフェート主鎖を修飾してペプチド核酸を作製してもよい（HyrupおよびNielsen, 1996）。「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」とは、デオキシリボースホスフェート主鎖がシュードペプチド主鎖で置換されており、かつ、４種の天然核酸塩基は保持されている、核酸模倣物（例えば、ＤＮＡ模倣物）を指す。ＰＮＡの中性主鎖により、低イオン強度という条件下でのＤＮＡとＲＮＡの特異的ハイブリダイゼーションが可能となる。ＰＮＡオリゴマーの合成は標準的な固相ペプチド合成プロトコールを用いて実施すればよい（HyrupおよびNielsen, 1996;Perry-O'Keefeら, 1996）。
【０１９０】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰのＰＮＡは治療および診断用途に用いてもよい。例えば、ＰＮＡを、転写または翻訳停止を誘導するか、または複製を阻害することによって遺伝子発現を配列特異的に調節するための、アンチセンスまたはアンチジーン剤として用いてもよい。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ＰＮＡはまた、単一塩基対突然変異の解析（例えば、ＰＮＡによるＰＣＲクランピング）において、その他の酵素、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼと併用する場合に人工制限酵素として（HyrupおよびNielsen, 1996）；またはＤＮＡ配列およびハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして（HyrupおよびNielsen, 1996;Perry-O'Keefeら, 1996）に用いてもよい。
【０１９１】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰのＰＮＡはその安定性または細胞取り込みを増強するよう修飾してもよい。ＰＮＡ、形成されたＰＮＡ−ＤＮＡ二量体に、親油性またはその他のヘルパー基をつけてもよいし、またはリポソームまたはその他の薬剤送達技術を用いてもよい。例えば、ＰＮＡとＤＮＡの有利な特性を組み合わせ得る、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを作製してもよい。かかるキメラにより、ＤＮＡ認識酵素（例えば、ＲＮアーゼＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡ部分と接触し、ＰＮＡ部分が高い結合親和性および特異性を提供することが可能となる。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合数、および配向の点から選択される適当な長さのリンカーを用いて結合させてもよい（HyrupおよびNielsen, 1996）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を実施してもよい（Finnら, 1996;HyrupおよびNielsen, 1996）。例えば、ＤＮＡ鎖を標準的なホスホルアミダイトカップリング化学、および修飾したヌクレオシド類似体を用いて固体支持体で合成すればよく、例えば、５'−（４−メトキシトリチル）アミノ−５'−デオキシ−チミジンホスホルアミダイトをＰＮＡとＤＮＡの５'末端の間に用いてもよい（Finnら, 1996;HyrupおよびNielsen, 1996）。次いで、ＰＮＡモノマーを段階的にカップリングさせて５'ＰＮＡセグメントと３'ＤＮＡセグメントを含むキメラ分子を得る（Finnら, 1996）。あるいは、５'ＤＮＡセグメントと３'ＰＮＡセグメントを含むキメラ分子を合成してもよい（Petersenら, 1976）。
【０１９２】
オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターをターゲッティングするための）などのその他の付加された基、または細胞膜（Lemaitreら, 1987;Letsingerら, 1989;Ｔｕｌｌｉｓ，米国特許第４９０４５８２号， 1988）または血液脳関門（例えば、（ＰａｒｄｒｉｄｇｅおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ，  Ｗ０８９／１０１３４， 1989））を通過する輸送を容易にする媒介物を含んでいてもよい。さらに、オリゴヌクレオチドはハイブリダイゼーション誘因性切断剤（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌら， 1988a）またはインターカレート剤（Zon, 1988）で修飾してもよい。オリゴヌクレオチドは別の分子、例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘因性架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘因性切断剤などと結合していてもよい。
【０１９３】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰペプチド／ポリペプチド
本発明の一態様は単離されたＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ、およびその生物活性部分誘導体、断片、類似体または相同体に関する。抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  Ａｂを産生するのに免疫原として適したポリペプチド断片も提供される。一実施形態では、未変性のＰＤＺＰまたはＰＩＰが細胞または組織供給源から、標準的なタンパク質精製技術を用いる適当な精製スキームによって単離され得る。もう１つの実施形態では、組換えＤＮＡ技術によってＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを生産する。組換え発現に代えて、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを標準的なペプチド合成技術を用いて化学的に合成してもよい。
【０１９４】
１．  ペプチド／ポリペプチド
ＰＤＢＰまたはＰＩＰペプチドは配列番号１〜１６３に提供されたアミノ酸配列を含む。本発明はまた、その残基のいずれかが配列番号１〜１６３に示された対応する残基から変化してもよいが、依然として、ＰＤＢＰまたはＰＩＰ活性および生理学的機能を維持するタンパク質、またはその機能的断片をコードする、突然変異体または変異体タンパク質を含む。
【０１９５】
２．  変異体ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰペプチド／ポリペプチド
一般に、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ様機能を保存するＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ変異体は、配列中の特定の位置の残基が他のアミノ酸で置換されているいずれの変異体も含み、さらに、親タンパク質の２つの残基間にさらなる残基または複数の残基が挿入している可能性、ならびに、親配列から１個以上の残基が欠失している、または親配列に１個以上の残基が付加している可能性を含む。アミノ酸置換、挿入または欠失のいずれも本発明に包含される。有利な状況では、置換は従前に定義した保存的置換である。
【０１９６】
「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」とは、２つの配列をアラインさせた場合に、開示されたＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰポリペプチド配列中の候補配列中のアミノ酸残基と同一であるアミノ酸残基のパーセンテージと定義する。％アミノ酸同一性を調べるためには、配列をアラインし、必要に応じて、ギャップを導入して最大％配列同一性を達成し、保存的置換は配列同一性の一部と考えない。パーセント同一性を調べるためのアミノ酸配列アラインメント手順は当業者には十分に公知である。ペプチド配列をアラインするには、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを用いる。当業者ならば、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要ないずれかのアルゴリズムをはじめ、アラインメントを測定するための適当なパラメーターを決定できる。
【０１９７】
アミノ酸配列をアラインする場合には、任意のアミノ酸配列Ａの任意のアミノ酸配列Ｂとの、に関する、またはに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、任意のアミノ酸配列Ｂと、に関して、またはに対して、ある％アミノ酸配列同一性を有するか、または含んでなる任意のアミノ酸配列Ａと表現してもよい）を以下のように算出すればよい：
％アミノ酸配列同一性＝Ｘ／Ｙ・１００
｛式中、
Ｘは配列アラインメントプログラムの、またはアルゴリズムのＡとＢのアラインメントによって、同一のマッチとスコアされたアミノ酸残基数であり、
かつ、
ＹはＢ中の全アミノ酸残基数である｝。
アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合には、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性はＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性と等しくならない。
【０１９８】
３．  単離された／精製されたペプチドおよびポリペプチド
「単離された」または「精製された」ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または生物活性断片はその天然環境の成分から分離かつ／または回収されている。混入成分としては、ポリペプチドの診断的または治療的使用を通常、干渉するであろう物質が挙げられ、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク性または非タンパク性物質が挙げられる。実質的に単離するには、調製物は３０％乾重未満の非ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ混入物質（夾雑物）、より好ましくは２０％、１０％未満、最も好ましくは５％未満の夾雑物を含む。単離された、組換えによって産生されたＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰまたは生物活性部分は培養培地を実質的に含まない、すなわち、培養培地がＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ調製物の容積の２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満に相当するがことが好ましい。夾雑物の例としては、細胞細片、培養培地ならびにＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰのインビトロ合成の際に用いたおよび生じた物質が挙げられる。
【０１９９】
４．  生物活性
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの生物活性部分は、ＰＤＺ相互作用などのＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの少なくとも１つの活性を示す。
ＰＤＢＰの生物活性部分は配列番号１〜１６３のアミノ酸配列を有し得るか、または配列番号１〜１６３と実質的に相同であり、配列番号１〜１６３のタンパク質の機能的活性を保持するが、天然の対立遺伝子変化または突然変異誘発性のためにアミノ酸配列は異なっている。
【０２００】
５．  キメラおよび融合タンパク質
融合ポリペプチドは発現研究、細胞局在性、バイオアッセイおよびＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ精製において有用である。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は非ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰポリペプチドと融合しているＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを含んでなる。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）配列のＣ末端と融合していてもよい。かかる融合タンパク質により組換えＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの精製が容易になる。さらなる例示的融合物は前記の表Ａに示されている。
【０２０１】
その他の融合パートナーはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを治療的に適応させ得る。免疫グロブリン（Ｉｇ）タンパク質ファミリーのメンバーとの融合は、インビボでＰＤＺ相互作用を阻害し、結果的にＰＤＺ媒介性シグナル伝達を抑制する治療において有用である。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ−Ｉｇ融合ポリペプチドはまた、被験者において抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  Ａｂを産生する免疫原として、またはＰＤＺ結合相互作用を阻害する分子をスクリーニングするために用いてもよい。
【０２０２】
融合タンパク質は組換え法を用いて容易に作製することができる。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰをコードする核酸をインフレームで非ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰをコードする核酸と、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ＮＨ２−またはＣＯＯ−−末端、もしくは内部に融合すればよい。融合遺伝子はまた、自動化ＤＮＡシンセサイザーをはじめとする従来技術によって合成してもよい。２つの連続する遺伝子断片の間に、相補的なオーバーハングが生じ、続いて、これらをアニーリングして再増幅してキメラ遺伝子配列を得ることができる、アンカープライマーを用いるＰＣＲ増幅（Ausubelら, 1987）も有用である。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを融合部分に対してインフレームでサブクローニングするのを容易にする多数のベクターが市販されている。
【０２０３】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの治療的用途
遺伝子治療を介してヒトなどの哺乳類におけるＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの発現を変更することは疾病の治療に有効であり得る。
【０２０４】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性を高めるか、または低下させる性質を有する化合物は有用である。この活性の増加は種々の方法で、例えば、（１）細胞中の遺伝子のコピーを増加または減少させることによって（アンプリファイアおよびデアンプリファイア）；（２）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ含有遺伝子の転写を増加または減少させることによって（転写アップレギュレーターおよびダウンレギュレーター）；（３）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ含有ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を増加させることまたは減少させることによって（翻訳アップレギュレーターおよびダウンレギュレーター）；（４）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ自体の活性を高めることまたは低下させることによって（アゴニストおよびアンタゴニスト）起こり得る。
【０２０５】
細胞または生物を化合物と接触させることによってアンプリファイアおよびデアンプリファイアである化合物を同定し、次いで、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰをコードする、存在するＤＮＡ量を測定してもよい（Ausubelら, 1987）。細胞または生物を化合物と接触させることによって転写アップレギュレーターおよびダウンレギュレーターである化合物を同定し、次いでＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰをコードする、産生されたｍＲＮＡ量を測定してもよい（Ausubelら, 1987）。翻訳アップレギュレーターおよびダウンレギュレーターである化合物は細胞または生物を化合物と接触させることによって同定し、次いで、産生されたＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰポリペプチド量を測定してもよい（Ausubelら, 1987）。
【０２０６】
アンプリファイア、転写アップレギュレーター、翻訳アップレギュレーターまたはアゴニストである化合物は、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性を低下させることによって寛解され得る疾病の治療に有効である。反対に、デアンプリファイア、転写ダウンレギュレーター、翻訳ダウンレギュレーターまたはアンタゴニストである化合物は、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性を高めることによって寛解され得る疾病の治療に有効である。遺伝子治療は転写および／または翻訳をアップレギュレートまたはダウンレギュレートするもう１つの方法である。
【０２０７】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰペプチド／ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは双方とも疾病の原因について調べるための、またはこれらの疾患の危険レベルを評価するための臨床スクリーニングに使用してよい。患者の組織サンプルをＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰタンパク質またはｍＲＮＡ量について調べればよい。量が正常よりも有意に少ないまたは多いと判明すれば、それらは疾病または疾病の危険を示す。ＰＤＺＰ、特に、ＰＤＺＰまたはＰＩＰ、特にＰＤＢＰの突然変異は活性の変更をもたらし得、かかる突然変異を有する患者は疾病を有するか、疾病の危険にある可能性がある。最後に、遺伝子のインデューサーまたはレプレッサーを発見するために、哺乳類における、組織サンプルにおける、または組織培養物における、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの発現量の測定を用いてもよい。
【０２０８】
臨床サンプルにおけるＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡ、タンパク質または活性レベルを測定することで、疾患の進行を追跡するための、または疾患を直すための治療モダリティが適用されている場合に予測値が得られ得る。
【０２０９】
１．  アゴニストおよびアンタゴニスト
「アンタゴニスト」とは、結合ＰＤＺドメインなどの内生ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの生物活性を部分的に、または完全に遮断、阻害または中和するいずれの分子も含む。同様に、「アゴニスト」は、内生ＰＤＺＰまたはＰＩＰの生物活性を模倣するか、または増強するいずれの分子も含む。アゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得る分子としては、Ａｂまたは抗体断片、内生ＰＤＺＰまたはＰＩＰまたはＰＤＢＰまたはＰＤＺＤの断片もしくは変異体、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、小さな有機分子およびその他のＰＤＬが挙げられる。
【０２１０】
２．  アンタゴニストおよびアゴニストの同定
（ａ）  可能性あるアンタゴニストおよびアゴニストの特定の例
ＰＤＺＰまたはＰＩＰ細胞作用を変更するいずれかの分子が候補アンタゴニストまたはアゴニストである。当業者に十分に公知のスクリーニング技術によりこれらの分子を同定すればよい。アンタゴニストおよびアゴニストの例としては、（１）小さな有機および無機化合物、（２）小ペプチド、（３）Ａｂおよび誘導体、（４）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰと密接に関連しているポリペプチド、（５）アンチセンスＤＮＡおよびＲＮＡ、（６）リボザイム、（７）三重らせんＤＮＡおよび（８）核酸アプタマーが挙げられる。
【０２１１】
ＰＤＺＰまたはＰＩＰ活性部位（例えば、ＰＤＺＰのＰＤＺＤ）と結合し、ＰＤＺＰの生物活性を阻害する小分子はアンタゴニストである。小分子アンタゴニストの例としては、小ペプチド、ペプチド様分子、好ましくは可溶性の、合成非ペプチジル有機または無機化合物およびその他のＰＤＬが挙げられる。これら同分子は、それらがＰＤＺＰまたはＰＩＰ活性を増強する場合には、アゴニストの例となる。
【０２１２】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ機能に影響を及ぼすほとんどどの抗体も候補アンタゴニストであるが、アゴニストであることもある。抗体アンタゴニストの例としては、ポリクローナル、モノクローナル、一本鎖、抗イディオタイプ、キメラＡｂ、またはかかるＡｂもしくは断片のヒト化型が挙げられる。そこでＡｂは免疫応答が生じ得れば、いずれの種由来のものであってもよい。ヒト化Ａｂも考慮される。
【０２１３】
あるいは、可能性あるアンタゴニストまたはアゴニストは密接に関連しているタンパク質、例えば、ＰＤＺＤまたはＰＤＢＰであり得る。あるいは、突然変異したＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰは不可逆的である相互作用をもたらす場合があり、アンゴニストとして作用し得る。
【０２１４】
アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ構築物は効果的なアンタゴニストであり得る。アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、標的とされるｍＲＮＡとハイブリダイズすることによって翻訳を阻害することにより機能をブロックする。三重らせん形成、またはその双方ともポリヌクレオチドに依存する、ＤＮＡまたはＲＮＡとのアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ結合を介して遺伝子発現を制御するために、アンチセンス技術を用いてもよい。例えば、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ配列の５'コード部分を用いて、約１０〜４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは転写に関与する遺伝子領域に相補的で（三重らせん）（BealおよびDervan, 1991;Cooneyら, 1988;Leeら, 1979）、それによって転写およびＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの産生を妨げるように設計する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡとハイブリダイズし、ｍＲＮＡ分子のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰへの翻訳をブロックする（アンチセンス）（Cohen, 1989;Okanoら, 1991）。これらのオリゴヌクレオチドはまた、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡがインビボで発現されてＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの産生を阻害し得るように細胞に送達してもよい。アンチセンスＤＮＡを用いる場合には、翻訳開始部位、例えば、標的遺伝子ヌクレオチド配列の約−１０と＋１０位置の間由来のオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０２１５】
リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒作用できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは相補的な標的ＲＮＡとの配列特異的ハイブリダイゼーションとそれに次ぐヌクレオチド鎖切断によって作用する。可能性あるＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は既知の技術によって同定すればよい（ＷＯ９７／３３５５１， 1997；Ｒｏｓｓｉ， 1994）。
【０２１６】
転写を阻害するには、一本鎖であり、かつ、デオキシヌクレオチドを含んでなる三重らせん体核酸は有用なアンタゴニストである。これらのオリゴヌクレオチドはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対形成則によって三重らせん体形成が促進されるよう設計し、一般に、プリンまたはピリミジンのひと続きを必要とする（ＷＯ９７／３３５５１， 1997）。
【０２１７】
アプタマーとは、ほとんどどの分子も認識し、かつ、特異的に結合させるために使用できる、短いオリゴヌクレオチド配列である。指数関数的強化によるリガンドの系統的な進化（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ）法（Ausubelら, 1987;EllingtonおよびSzostak, 1990;TuerkおよびGold, 1990）を用いてかかるアプタマーを見出してもよい。アプタマーには多数の診断上および臨床上の用途があり、抗体が臨床上または診断上用いられているいずれかの用途のほとんどで、アプタマーも用いてもよい。さらに、アプタマーは一度同定されれば、製造するのにあまり費用がかからず、医薬組成物における投与、バイオアッセイおよび診断検査をはじめとする、種々の形式に容易に適用できる（Jayasena, 1999）。
【０２１８】
抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ Ａｂ
本発明は、いずれかのＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰエピトープと免疫特異的に結合する、ＡｂｓおよびＦａｂまたは（Ｆａｂ）２などの抗体断片を包含する。
【０２１９】
「抗体」（Ａｂ）はＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰに対する単一のＡｂ（抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  Ａｂ；アゴニスト、アンタゴニストおよび中和抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する、抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰ  Ａｂ組成物、一本鎖抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰ  Ａｂ、および抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＤＢＰまたはＰＩＰ  Ａｂの断片を含んでなる。「モノクローナル抗体」は、実質的に相同なＡｂの集団から得られ、すなわち、集団を構成する個々のＡｂは、微量で存在し得る、あり得る天然の突然変異を除いて同一である。例示的Ａｂとしては、ポリクローナル（ｐＡｂ）、モノクローナル（ｍＡｂ）、ヒト化、二重特異性（ｂｓＡｂ）およびヘテロコンジュゲートＡｂが挙げられる。
【０２２０】
１．  ポリクローナルＡｂ（ｐＡｂ）
ポリクローナルＡｂは哺乳類宿主で、例えば、１種以上の、免疫原および、必要に応じてアジュバントの注入によって作製すればよい。一般に、免疫原および／またはアジュバントは複数の皮下または腹腔内注射によって哺乳類に注入する。免疫原はＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰまたは融合タンパク質を含む。アジュバントの例としては、フロイントの完全およびモノホスホリル脂質Ａ合成トレハロースジコリノミコレート（ＭＰＬ−ＴＤＭ）が挙げられる。免疫応答を改善するために、免疫原を、スカシガイヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロブリンおよびダイズトリプシンインヒビターなどの、宿主細胞において免疫原性であるタンパク質と結合させてもよい。抗体生産のプロトコールは記載されている（Ausubelら, 1987;HarlowおよびLane, 1988）。あるいは、ｐＡｂはまた、ＩｇＹ分子を産生するトリで作製してもよい（Schadeら, 1996）。
【０２２１】
２．  モノクローナルＡｂ（ｍＡｂ）
抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＡｂはハイブリドーマ法を用いて調製すればよい（MilsteinおよびCuello,1983）。ハイブリドーマ法は少なくとも４つのステップ：（１）宿主または宿主由来のリンパ球の免疫化；（２）ｍＡｂ分泌（または分泌する可能性のある）リンパ球の回収；（３）リンパ球の不死化細胞との融合、および（４）所望の（抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ）ｍＡｂを分泌する細胞の選択を含んでなる。
【０２２２】
マウス、ラット、モルモット、ハムスターまたはその他の適当な宿主を免疫化して、免疫原と特異的に結合するＡｂを産生するか、産生し得るリンパ球を誘発する。あるいはリンパ球をインビトロで免疫化してもよい。ヒト細胞が望まれる場合には、一般に末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を用いるが、脾臓細胞またはその他の哺乳類供給源由来のリンパ球も好ましい。通常、免疫原はＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰまたはその融合タンパク質を含む。
【０２２３】
次いで、リンパ球を不死化細胞株と融合してハイブリドーマ細胞を形成するが、これはポリエチレングリコールなどの融合剤によって促進される（Goding, 1996）。形質転換によって不死化された、齧歯類、ウシ、もしくはヒト骨髄腫細胞、またはラットもしくはマウス骨髄腫細胞株を用いてもよい。融合されていない不死化細胞を含まない、ハイブリドーマ細胞の純粋な集団が好ましいので、融合後、細胞を、融合していない不死化細胞の増殖または生存を阻害する、１種以上の物質を含有する適した培地で増殖させる。一般的な技術では酵素ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く親細胞を用いる。この場合には、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げ、一方でハイブリドーマが増殖するのを可能にするために、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを培地（ＨＡＴ培地）に添加する。
【０２２４】
効率よく融合し、ＨＡＴなどの培地で選抜することによって混合集団から単離することができ、融合後に抗体の安定、かつ、高レベルの発現を支援するのが好ましい不死化細胞である。好ましい不死化細胞株としては、アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクション  （マナサッス，バージニア）から入手できるマウス骨髄腫株がある。ヒトｍＡｂの生産のためには、ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株も記載されている（Kozborら,1984;Schook, 1987）。
【０２２５】
ハイブリドーマ細胞は抗体を細胞外に分泌するので、培養培地をＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰに対して向けられたｍＡｂ（抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＡｂ）の存在についてアッセイすればよい。免疫沈降またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイにより、スキャッチャード解析（MunsonおよびRodbard, 1980）をはじめ、ｍＡｂの結合特異性を評価する（HarlowおよびLane, 1988;HarlowおよびLane, 1999）。
【０２２６】
抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＡｂ分泌ハイブリドーマ細胞は、限界希釈手順によって単一クローンとして単離し、継代培養してもよい（Goding, 1996）。適した培養培地としては、ダルベッコの改変イーグル培地、ＲＰＭＩ−１６４０、または必要に応じて、タンパク質を含まないか、もしくは減少させた、もしくは血清を含まない培地（例えば、Ｕｌｔｒａ  ＤＯＭＡ  ＰＦまたはＨＬ−１；Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ；Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）が挙げられる。ハイブリドーマ細胞はまた、インビボで腹水として増殖させてもよい。
【０２２７】
ｍＡｂは培養培地または腹水液から、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、硫酸アンモニウム沈殿またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来のＩｇ精製手順によって単離または精製してもよい（HarlowおよびLane, 1988;HarlowおよびLane, 1999）。
【０２２８】
ｍＡｂはまた、組換え法によって作製してもよい（米国特許第４,１６６,４５２号， 1979）。抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＡｂをコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定でき、例えば、好ましくはマウス抗体重鎖および軽鎖遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを用いてプローブして、抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰｍＡｂ分泌ハイブリドーマ細胞株から単離されたＤＮＡをプローブする。ひと度単離すれば、単離されたＤＮＡ断片を発現ベクターにサブクローニングし、次いで、これをサルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはさもなければＩｇタンパク質を産生しない骨髄細胞などの宿主細胞にトランスフェクトしてｍＡｂを発現させる。単離されたＤＮＡ断片は、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を相同マウス配列と置換することによって（米国特許第４,８１６,５６７号， 1989；Morrisonら, 1987）、またはＩｇコード配列を非Ｉｇポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部と融合することによって改変してもよい。かかる非Ｉｇポリペプチドは抗体の定常ドメインと置換していもよいし、または、ある抗原結合部位の可変ドメインと置換して、キメラ二価抗体を作製してもよい。
【０２２９】
３．  一価Ａｂ
Ａｂは一価Ａｂであって、したがって、相互に架橋しないものであってもよい。例えば、ある方法はＩｇ軽鎖および改変された重鎖の組換え発現を含む。Ｆｃ領域のどの点での重鎖末端切断物も重鎖架橋を妨げる。あるいは、関係のあるシステイン残基が別のアミノ酸残基で置換されているか、欠失しており、このことが架橋を妨げる。一価Ａｂを調製するにはインビトロ法も適している。Ａｂを、架橋しないＦａｂ断片などの断片が得られるように消化してもよい（HarlowおよびLane, 1988;HarlowおよびLane, 1999）。
【０２３０】
４．  ヒト化およびヒトＡｂ
抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  Ａｂはさらに、ヒト化またはヒトＡｂを含み得る。非ヒトＡｂのヒト化型には、非ヒトＩｇ由来の最小配列を含む、キメラＩｇ、Ｉｇ鎖または断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ  （ａｂ'）２またはＡｂのその他の抗原結合部分配列など）がある。
【０２３１】
一般に、ヒト化抗体は非ヒト供給源から導入された１個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は「インポート」残基と呼ばれることが多く、これらは通常「インポート」可変ドメインからもちこまれる。ヒト化は齧歯類ＣＤＲ類またはＣＤＲ配列をヒト抗体の相当する配列と置換することで達成される（Jonesら, 1986;Riechmannら, 1988;Verhoeyenら, 1988）。かかる「ヒト化Ａｂ」はキメラＡｂであり（米国特許第４,８１６,５６７号， 1989）、これでは、実質的に無傷のヒト可変ドメイン未満のものが非ヒトの種由来の相当する配列と置換されている。実際には、ヒト化Ａｂとは通常、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくはいくつかのＦＲ残基が齧歯類Ａｂの類似の部位由来の残基で置換されているヒトＡｂである。ヒト化Ａｂは、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、マウス、ラットまたはウサギなどの非ヒトの種の（ドナー抗体）ＣＤＲ由来の残基で置換されており、所望の特異性、親和性および能力を有する、ヒトＩｇ（レシピエント抗体）を含む。相当する非ヒト残基をヒトＩｇのＦｖフレームワーク残基と置換する場合もある。ヒト化Ａｂはレシピエント抗体にもインポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られない残基を含む場合もある。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つの、通常２つの可変ドメインの実質的にすべてを含んでなり、それでは、全部ではなくともほとんどのＣＤＲ領域が非ヒトＩｇのものに相当し、かつ、全部ではなくともほとんどのＦＲ領域がヒトＩｇコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には、通常ヒトＩｇのものであるＩｇ定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでなる（Jonesら, 1986;Presta, 1992;Riechmannら, 1988）。
【０２３２】
ヒトＡｂはまた、ファージディスプレイライブラリー（Hoogenboomら, 1991;Marksら, 1991b）およびヒトｍＡｂの調製（Boernerら, 1991;ReisfeldおよびSell, 1985）をはじめとする種々の技術を用いて生産してもよい。同様に、ヒトＩｇ遺伝子を、内生Ｉｇ遺伝子が部分的または完全に不活化されている、トランスジェニック動物に導入することを利用してヒトＡｂを合成してもよい。曝露すると、ヒト抗体産生が認められ、これはヒトで見られるものと、遺伝子の再編成、構築および抗体レパートリーをはじめ、あらゆる点で極めて似ている（米国特許第５,５４５,８０７号， 1996；同第５,５４５,８０６号， 1996；同第５,５６９,８２５号， 1996；同第５,６３３,４２５号， 1997；同第５,６６１,０１６号， 1997；同第５,６２５,１２６号， 1997；Fishwildら, 1996;LonbergおよびHuszar, 1995;Lonbergら, 1994;Marksら, 1992）。
【０２３３】
５．  二重特異性ｍＡｂ
二重特異性Ａｂとは、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する、好ましくはヒトまたはヒト化モノクローナルである。例えば、一方の結合特異性がＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰであり；もう一方のものは選択するいずれかの抗原、好ましくは細胞表面タンパク質またはレセプターまたはレセプターサブユニットに対するものである。
【０２３４】
従来、二重特異性Ａｂの組換え生産は、２つのＩｇ重鎖が異なる特異性を有する、２つのＩｇ重鎖／軽鎖対の同時発現に基づいている（MilsteinおよびCuello, 1983）。Ｉｇ重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせのために、得られるハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子のあり得る混合物を産生し、そのうちの１種のみが所望の二重特異性構造を有する。所望の抗体はアフィニティークロマトグラフィーまたはその他の技術を用いて精製してもよい（ＷＯ９３／０８８２９，1993；Trauneckerら, 1991）。
【０２３５】
二重特異性抗体を作製するには（Sureshら, 1986）、所望の抗体−抗原結合部位を含む可変ドメインをＩｇ定常ドメイン配列と融合する。融合物は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含んでなる、Ｉｇ重鎖定常ドメインを含んでいることが好ましい。軽鎖結合に必要な部位を含有する第１重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合物の少なくとも一方にあることが好ましい。Ｉｇ重鎖融合物および必要に応じて、Ｉｇ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を別個の発現ベクターに挿入し、適した宿主生物に同時トランスフェクトする。
【０２３６】
抗体分子対間の界面を、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体のパーセンテージが最大となるよう設計してもよい（ＷＯ９６／２７０１１， 1996）。好ましい界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含んでなる。この方法では、第１の抗体分子の界面由来の１個以上の小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と置換する。大きなアミノ酸側鎖を小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置換することによって、第２の抗体分子の界面に大きな側鎖と同一または類似の大きさの代償的な「空洞」が生じる。このメカニズムによってホモ二量体などの不要な最終産物を上回ってヘテロ二量体の収率が高まる。
【０２３７】
二重特異性Ａｂは全長Ａｂまたは抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ'）２二重特異性Ａｂ）として調製してもよい。二重特異性Ａｂを作製するある技術は化学結合を利用する。無傷のＡｂをタンパク質分解によって切断してＦ（ａｂ'）２断片を作製する（Brennanら, 1985）。断片を亜ヒ酸ナトリウムなどのジチオール錯生成剤で還元して、近接するジチオール安定化させ、かつ、分子間ジスルフィド形成を妨げる。次いで、得られたＦａｂ'断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。次いで、Ｆａｂ'−ＴＮＢ誘導体の一方をメルカプトエチルアミンで還元することによってＦａｂ'−チオールに再変換し、等量のもう一方のＦａｂ'−ＴＮＢ誘導体と混合して二重特異性抗体を形成する。得られる二重特異性Ａｂは酵素の選択的固定化のための媒介物として用いてもよい。
【０２３８】
Ｆａｂ'断片は大腸菌から直接回収し、二重特異性Ａｂを形成するために化学的に結合させてもよい。例えば、完全ヒト化二重特異性Ｆ（ａｂ'）２Ａｂを得ることができる（Shalabyら, 1992)。各Fａｂ'断片を大腸菌から別個に分泌させ、インビトロで直接化学的に結合し、二重特異性抗体を形成する。
【０２３９】
二重特異性抗体断片を組換え細胞培養物から直接作製および単離するための種々の技術もまた記載されている。例えば、ロイシンジッパーモチーフを利用してもよい（Kostelnyら, 1992）。遺伝子融合によって、ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のペプチドを２つの異なるＡｂのＦａｂ'部分と連結する。抗体ホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、次いで、再酸化して抗体ヘテロ二量体を形成する。この方法では抗体ホモ二量体も生じ得る。「ｄｉａｂｏｄｙ」技術（Holligerら, 1993）は二重特異性抗体断片を作製する別の方法を提供する。この断片は軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と、短すぎて同一鎖上の２つのドメイン間では対形成できないリンカーによって結合されている重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなる。一方の断片のＶＨおよびＶＬドメインをもう一方の断片の相補的なＶＬおよびＶＨドメインと対にして、２つの抗原結合部位を形成させる。二特異性抗体断片を作製する別の戦略では一本鎖ＦＶ（ｓＦＶ）二量体を用いる（Gruberら, 1994）。三重特異性Ａｂなどの２より多い結合価を有するＡｂも考慮される（Tuttら, 1991）。
【０２４０】
例示的二特異性Ａｂは所与のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ上の２つの異なるエピトープと結合し得る。あるいは、細胞防御機構が特定のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを発現する特定の細胞に限定され得る：抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰアームが、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＢ７）などの白血球誘因分子と、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などのＩｇＧ（ＦｃγＲ）のＦｃレセプターと結合するアームと結合され得る。二重特異性Ａｂはまた、細胞傷害性薬剤が特定のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを発現する細胞を標的とするよう用いてもよい。これらのＡｂはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ結合アームと細胞傷害性薬剤または放射性核種キレート化剤と結合するアームとを保持する。
【０２４１】
６．  ヘテロコンジュゲートＡｂ
２つの共有結合しているＡｂからなる、ヘテロコンジュゲートＡｂが、免疫系細胞が不用な細胞を標的とするよう（４，６７６，９８０， 1987）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染の治療のために（ＷＯ９１／００３６０， 1991；ＷＯ９２／２０３７３， 1992）提案されている。インビトロで、架橋剤を必要とするものをはじめとする、合成タンパク質化学法を用いて調製したＡｂも考慮される。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成させることによって免疫毒素を構築してもよい。適した試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる（４，６７６，９８０， 1987）。
【０２４２】
７．  免疫コンジュゲート
免疫コンジュゲートは化学療法薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素または断片）などの細胞傷害性薬剤、または放射性同位元素（すなわち、放射性コンジュゲート）と結合している抗体を含んでなり得る。
【０２４３】
有用な酵素的に活性な毒素および断片としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、緑濃菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（Ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質、ゴーヤ（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）サパオナリア・オフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトジェリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）およびトリコセセンス（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅｓ）が挙げられる。放射性コンジュゲートＡｂの作製のためには、２１２Ｂｉ、ｌ３ｌＩ、ｌ３ｌＩｎ、９０Ｙおよびｌ８６Ｒｅなどの種々の放射性核種が入手できる。
【０２４４】
抗体と細胞傷害性薬剤とのコンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二機能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレートなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）およびビス−活性フルオリン化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの種々の二機能性タンパク質カップリング剤を用いて作製する。例えば、リシン免疫毒を調製してもよい（Vitettaら, 1987）。１４Ｃ標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性核種を抗体に結合させるための例示的なキレート化剤である。（ＷＯ９４／１１０２６， 1994）。
【０２４５】
もう１つの実施形態では、抗体は、患者に抗体−レセプターコンジュゲートを投与し、ついで、洗浄剤を用いて結合していないコンジュゲートを循環から除去し、次いで、細胞傷害性薬剤（例えば、放射性核種）と結合しているストレプトアビジン「リガンド」（例えば、ビオチン）を投与する、腫瘍プレターゲッティングにおいて利用するために「レセプター」（ストレプトアビジンなど）と結合させてもよい。
【０２４６】
８．  エフェクター機能工学
抗体は疾病の治療におけるその有効性を増強するよう改変してもよい。例えば、Ｆｃ領域にシステイン残基を導入してもよく、それによってこの領域における鎖間ジスルフィド結合形成が可能となる。かかるホモ二量体Ａｂでは内部移行能が改善し、かつ／または補体媒介性細胞死および抗体依存性の細胞の細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が増加し得る（Caronら, 1992;Shopes, 1992）。ヘテロ二機能性架橋剤を用いて、抗腫瘍活性が増強されたホモ二量体Ａｂを調製してもよい（Wolffら , 1993）。あるいは、２つのＦｃ領域を用いて設計された抗体では、補体溶解が増強されている場合もある（Stevensonら , 1989）。
【０２４７】
９．  イムノリポソーム
また、抗体を含有するリポソームを構築してもよい（米国特許第４,４８５,０４５号， 1984；同第４,５４４,５４５号， 1985；同第５,０１３,５５６号， 1991；Eppsteinら, 1985;Hwangら, 1980）。ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含んでなる脂質組成物を用いる逆相蒸発法によって有用なリポソームを作製することができる。かかる調製物を規定の孔径のフィルターを通して押し出すと所望の直径のリポソームが得られる。ジスルフィド鎖間反応によって、抗体のＦａｂ'断片をリポソームと結合させてもよい（MartinおよびPapahadjopoulos, 1982）。ドキソルビシンなどの化学療法薬をリポソームに含めてもよい（Gabizonら, 1989）。種々の組成物を含むその他の有用なリポソームも考慮される。
【０２４８】
１０．  ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰに対して向けられたＡｂの診断用途
抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  Ａｂは、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを局在化および／または定量化するために用いてもよい（例えば、組織サンプル内のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰレベルの測定において使用するために、または診断法において使用するために、など）。抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰエピトープＡｂは薬理学的に活性な化合物として利用してもよい。
【０２４９】
抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  Ａｂは、免疫アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準的な技術によってＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを単離するために用いてもよい。これらのアプローチにより、細胞および組織から内生ＰＤＺＰ、Ｐ、またはＰＩＰ抗原含有ポリペプチドを精製するのが容易になる。これらのアプローチ、ならびに、その他のものを用いて、サンプル中のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを検出して抗原性タンパク質の発現量およびパターンを評価してもよい。抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  Ａｂは、臨床試験手順の一貫として、例えば、所与の治療計画の有効性を調べるために、組織中のタンパク質レベルをモニターするために用いてもよい。抗体を検出可能な物質（標識）と結合させることにより、Ａｂ−抗原複合体の検出が可能となる。標識の種類としては、蛍光、発光、生物発光、および放射性物質、酵素および接合団が挙げられる。有用な標識としては、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、ストレプトアビジン／ビオチン、アビジン／ビオチン、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン・フルオレセイン、ダンシルクロライド（ｄａｎｓｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、フィコエリトリン、ルミノール、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリンおよびｌ２５Ｉ、ｌ３ｌＩ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０２５０】
１１．  抗体療法
ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化および完全ヒトＡｂをはじめとする、本発明のＡｂは治療的に用いてもよい。一般に、かかる薬剤は、被験者において疾病または病態を治療または予防するために用いる。一般に、抗体調製物、好ましくは高い抗原特異性および親和性を有するものは、標的エピトープと結合することによって作用を媒介する。一般に、かかるＡｂの投与は２つの作用のうちの一方を媒介し得る：（１）抗体はリガンド結合を妨げ、内生リガンド結合とそれに続くシグナル伝達を排除し得る、または（２）抗体は標的分子のエフェクター部位と結合し、シグナル伝達を開始することによって生理学的結果を誘発する。
【０２５１】
治療上有効量の抗体とは、一般に、治療目的、エピトープ結合親和性、投与速度および被験者からの抗体の枯渇速度を達成するのに必要な量に関する。治療上有効な用量の一般的な範囲は、限定しようとする例ではないが、約０．１ｍｇ／体重１ｋｇ〜約５０ｍｇ／体重１ｋｇであり得る。投薬頻度は、例えば、１日２回〜１週間に１回と変動し得る。
【０２５２】
１２．  Ａｂの医薬組成物
抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  Ａｂ、ならびにその他のアッセイで同定されたその他のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ相互作用分子（アプタマーなど）を種々の疾患を治療するために、医薬組成物で投与してもよい。かかる組成物の調製に関する原則および考慮すべき事柄、ならびに、成分の選択における指針は（de Boer, 1994;Gennaro, 2000;Lee, 1990）に見ることができる。
【０２５３】
全Ａｂをインヒビターとして用いる場合には、内部移行されるＡｂが好ましい。リポソームを細胞内導入のための送達媒体として用いてもよい。抗体断片を用いる場合には、エピトープと特異的に結合する最小の阻害性断片が好ましい。例えば、有用な抗体の可変領域配列を基に、好ましいエピトープと結合するペプチド分子を設計してもよい。かかるペプチドは化学的に合成してもよいし、かつ／または組換えＤＮＡ技術によって生産してもよい（Marascoら, 1993）。製剤はまた、特定の治療のための２種以上の活性化合物、好ましくは、相互に悪影響を及ぼさない活性を有するものを含んでもよい。組成物は、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、化学療法薬または増殖阻害薬などの機能を増強する薬剤含んでなってもよい。
【０２５４】
有効成分はまた、コロイド系薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）において、またはマクロエマルションにおいて、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって製造されたマイクロカプセル；例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリメチルメタクリレートマイクロカプセルに封入してもよい。
【０２５５】
インビボ投与に用いる製剤は無菌であることが極めて好ましい。これは無菌濾過膜を通して濾過すること、またはいくつかの技術のうちのいずれかによって容易に達成される。
【０２５６】
抗体を含有する、固体の疎水性ポリマーからなる半透性マトリックスであって、このマトリックスが造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルであるものなどの、徐放性製剤を調製してもよい。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ２−ヒドロキシエチルメタクリレート、またはポリビニルアルコール）、ポリ乳酸（ＢｏｓｗｅｌｌおよびＳｃｒｉｂｎｅｒ，  米国特許第３，７７３，９１９号， 1973）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌグルタメートの共重合体、非分解性エチレンビニルアセテート、乳酸−グリコール酸共重合体からなる注射用微粒子などの分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレンビニルアセテートおよび乳酸−グリコール酸などの重合体が１００日よりも長く分子を放出できるのに対し、特定のヒドロゲルはタンパク質をより短い期間放出し、これが好ましい場合もある。
【０２５７】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ組換え発現ベクターおよび宿主細胞
ベクターとはＤＮＡを宿主細胞間を往復させるために、またはヌクレオチド配列を発現させる手段として用いられる道具である。いくつかのベクターは原核生物においてのみ機能し、他方その他のものは原核生物および真核生物の双方で機能し、これにより真核生物における発現のための、原核生物からの大規模なＤＮＡ調製が可能となる。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰヌクレオチド配列または断片などの注目するＤＮＡの挿入は、当業者には十分に公知のライゲーション技術および／または接合プロトコールによって達成する。かかるＤＮＡはその組み込みがベクターのいずれかの必要な構成要素を破壊しないよう挿入する。挿入されたＤＮＡタンパク質を発現させるために用いられるベクターの場合には、導入されるＤＮＡはその転写および翻訳を司るベクターエレメントと機能しうる形で連結する。
【０２５８】
ベクターは２つの一般的なクラスに分けられる：クローニングベクターは、それに外来ＤＮＡを挿入することができ、その外来ＤＮＡがベクターの成分であるかのように複製、伝播される適当な宿主細胞において、増殖に必須でない領域を含むプラスミドまたはファージを複製している。発現ベクター（プラスミド、酵母または動物ウイルスゲノムなど）は、外来ＤＮＡを転写および翻訳するために、外来遺伝物質を宿主細胞または組織に導入するために用いる。発現ベクターでは、導入されたＤＮＡは、宿主細胞に挿入されたＤＮＡを転写するよう合図を送るプロモーターなどのエレメントと機能し得る形で連結されている。特定の因子に応じて遺伝子転写を制御する誘導可能プロモーターなどのいくつかのプロモーターが特に有用である。誘導可能プロモーターに機能し得る形で連結しているＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰまたはアンチセンス構築物は、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰまたは断片またはアンチセンス構築物の発現を制御することができる。古典的な誘導可能プロモーターの例としては、α−インターフェロン、熱ショック、重金属イオンおよびグルココルチコイドなどのステロイド（Kaufman, 1990）およびテトラサイクリンに応答性のものが挙げられる。その他の望ましい誘導可能プロモーターとしては、構築物が導入されている細胞に内生でないが、誘導剤が外因的供給された細胞において応答性であるものが挙げられる。
【０２５９】
ベクターには多数の異なる現れ方がある。「プラスミド」は環状の二本鎖ＤＮＡ分子であり、その中にさらなるＤＮＡセグメントを導入することができる。ウイルスベクターはさらなるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに受け入れることができる。特定のベクターは宿主細胞において自律増殖できる（例えば、エピソーム哺乳類ベクターまたは細菌複製起点を含む細菌ベクター）。その他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は宿主細胞に導入すると宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって宿主ゲノムとともに複製される。一般に、有用は発現ベクターはプラスミドであることが多い。しかしながら、ウイルスベクターなどのその他の形態の発現ベクター（例えば、複製に欠陥のあるレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）も考慮される。
【０２６０】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ（または断片）を含んでなる組換え発現ベクターは、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰと機能し得る形で連結されている、１以上の宿主細胞応答性（またはインビトロで操作され得る）調節配列を利用することによってＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ転写を調節する。「機能し得る形で連結されている」とは、注目するヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現が達成されるように調節配列と連結されているということを示す。
【０２６１】
ベクターは種々の生物および／または細胞に導入することができる（表Ｆ）。あるいは、ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写および翻訳させてもよい。
【０２６２】
2004533840.tif 000015
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【０２６３】
ベクター選択は用いられる生物または細胞およびベクターの所望の最終結果によって決まる。ベクターは標的細胞において一度複製してもよいし、または「自殺」ベクターであってもよい。一般に、ベクターはシグナル配列、複製起点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列を含んでなる。これらのエレメントの選択はベクターが用いられる生物によって異なるが、容易に決定される。これらのエレメントのいくつかは、条件が適当であると「オン」になる、誘導可能または条件的プロモーターなどのように条件的であってもよい。誘導可能プロモーターの例としては、発現を特定の細胞種にさせる、組織特異的であるもの、ステロイド応答性であるもの、または熱ショック応答性であるものが挙げられる。哺乳類細胞およびトランスジェニック動物ではｌａｃオペロンなどのいくつかの細菌抑圧システムが利用されている（Fieckら , 1992;Wyborskiら, 1996;WyborskiおよびShort, 1991）。ベクターには、ベクターを取り込んだ細胞の同定を容易にするために選択マーカーを用いることが多い。当技術分野では、原核生物とともに使用するための多数の選択マーカーが十分に公知であり、通常は、抗生物質耐性遺伝子または独立栄養および栄養要求性突然変異体の使用である。
【０２６４】
アンチセンスおよびセンスＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰオリゴヌクレオチドを用いることで、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰポリペプチド発現を妨げてもよい。これらのオリゴヌクレオチドは標的核酸配列と結合し、標的配列の転写または翻訳をブロックする二重鎖を形成し、この二重鎖の分解を増強することによって、またはその他の手段によって転写または翻訳を早まって終結させる。
【０２６５】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは、標的ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡ（センス）またはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ＤＮＡ（アンチセンス）配列と結合できる、一本鎖核酸、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかである。本発明によれば、アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも約１４個のヌクレオチド、好ましくは約１４個〜３０個のヌクレオチドのＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ＤＮＡコード領域の断片を含んでなる。一般に、アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡ分子は少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個またはそれより長い塩基長を含んでなり得る。中でも、（SteinおよびCohen, 1988;van der Krolら, 1988b）は所与のｃＤＮＡ配列からアンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを導く方法を記載している。
【０２６６】
アンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチドの修飾によってその有効性を増強してもよい。修飾された糖−ホスホジエステル結合またはその他の糖結合（ＷＯ９１／０６６２９， 1991）は、標的配列に対する特異的結合を混乱させることなく内生ヌクレアーゼに対する耐性を付与することによってインビボ安定性を高める。その他の修飾はオリゴヌクレオチドの、共有結合された有機部分（ＷＯ９０／１０４４８， 1990）またはポリ−（Ｌ）−リジンなどのその標的に対する親和性を高め得る。金属複合体または介入剤（例えば、エリプチシン）およびアルキル化剤をはじめとするその他の結合はオリゴヌクレオチドのその標的に対する結合特異性を改変する。
【０２６７】
アンチセンスまたはセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞（標的核酸配列を含む細胞）に導入するには、いずれの遺伝子導入法を用いてもよく、また当業者には十分に公知である。遺伝子導入法の例としては、１）エプステイン・バーウイルスのような遺伝子導入ベクターまたは外来ＤＮＡをリガンド結合分子に結合させることなどの生物学的なもの（ＷＯ９１／０４７５３， 1991）、２）エレクトロポレーションなどの物理学的なもの、および３）ＣａＰ０４沈殿およびオリゴヌクレオチド−脂質複合体などの化学的なもの（ＷＯ９０／１０４４８， 1990）が挙げられる。
【０２６８】
「宿主細胞」と「組換え宿主細胞」は同じ意味で用いられている。かかる用語は特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞のその子孫または可能性ある子孫も指す。突然変異か環境の影響いずれかのためにその後の世代で特定の修飾が起こり得るので、かかる子孫は、実際は親細胞と同一でないこともあるが、依然としてこの用語の範囲内に含まれる。
【０２６９】
真核細胞トランスフェクション法および原核細胞形質転換法は当技術分野では十分に公知である。宿主細胞の選択により、注目する核酸を導入するための好ましい技術が決まる。表Ｇは、限定されるものではないが、多数の、当技術分野で既知の技術をまとめたものである。核酸の生物への導入は、インビトロトランスフェクション法、ならびに、あれば、その特定の生物のために確立された遺伝子技術を用いるエキソビボ技術を用いて実施してもよい。
【０２７０】
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2004533840.tif 000018
【０２７１】
ベクターには、ベクターを取り込んだ細胞の同定を容易にするために選択マーカーを用いることが多い。当技術分野では、原核生物とともに使用するための多数の選択マーカーが十分に公知であり、通常は、抗生物質耐性遺伝子または独立栄養および栄養要求性突然変異体の使用である。表Ｈに哺乳類細胞トランスフェクションに用いられることの多い選択マーカーを記載する。
【０２７２】
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【０２７３】
原核生物の、または真核生物の培養宿主細胞などの宿主細胞を用いてＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを産生させてもよい。
【０２７４】
医薬組成物
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰをコードする核酸分子、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰペプチド／ポリペプチド、および抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  Ａｂ、ＰＤＬおよびその誘導体、断片、類似体および相同体を医薬組成物に組み入れてもよい。かかる組成物は、通常、核酸分子、タンパク質、または抗体および製薬上許容される担体を含んでなる。「製薬上許容される担体」とは、医薬上の投与と適合する、いずれかおよびすべての溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む（Gennaro, 2000）。かかる担体または賦形剤の好ましい例としては、限定されるものではないが、水、生理食塩水、Ｆｉｎｇｅｒ溶液、デキストロース溶液および５％のヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームおよび不揮発性油などの非水性ビヒクルを用いてもよい。従来の媒質または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除き、これらの組成物の使用が考慮される。補助的な活性化合物を組成物に組み入れてもよい。
【０２７５】
１．  概論
医薬組成物は、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（例えば、局所）、経粘膜および直腸投与をはじめとする、その意図される投与経路と適合するよう処方する。非経口、皮内、または皮下適用に用いられる溶液または懸濁液は、注射用水、生理食塩溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などのバッファー、および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整する薬剤を含んでもよい。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整すればよい。非経口製剤はガラス製またはプラスチック製の、アンプル、使い捨てシリンジまたは複用量バイアルに封入してもよい。
【０２７６】
２．  注射用製剤
注射に適した医薬組成物は滅菌水溶液（水溶性であれば）または滅菌注射用溶液または分散物を即時調製するための分散物および滅菌散剤を含む。静脈投与に適した担体としては生理食塩水、静菌水、ＣＲＥＭＯＰＨＯＲＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，  Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，  Ｎ．  Ｊ．）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は無菌でなくてはならず、シリンジを用いて投与されるために液体であるべきである。かかる組成物は製造および保存の間安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の混入に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）および適した混合物を含有する溶媒または分散媒であってよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被膜を用いることによって、分散物の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持すればよい。種々の抗菌剤および抗真菌剤；例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸およびチメロサールにより、微生物混入を抑えることができる。等張剤；例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコールおよび塩化ナトリウムを組成物に含めてもよい。吸収を遅延させ得る組成物はモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの薬剤を含む。
【０２７７】
滅菌注射用溶液は必要量の活性化合物（例えば、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰまたは抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ抗体）を、必要に応じて１種の成分または成分の組み合わせとともに適当な溶媒に組み入れ、次いで、滅菌することによって調製すればよい。一般に、分散物は活性化合物を、基礎分散媒およびその他の必要な成分を含む滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製する。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌散剤調製法としては、真空乾燥、および凍結乾燥が挙げられ、これにより滅菌溶液から有効成分およびいずれかの所望の成分を含有する散剤が得られる。
【０２７８】
３．  経口組成物
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらはゼラチンカプセルに封入してもよいし、または錠剤に打錠してもよい。経口治療的投与目的には、活性化合物を賦形剤とともに組み入れ、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で用いればよい。経口組成物はまた、うがい薬として用いるために液体担体を用いて調製してもよく、これでは液体担体中の化合物が経口投与される。製薬上適合する結合剤、および／またはアジュバント物質を含めてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などはまた、以下の成分、または類似の性質の化合物のいずれかを含んでもよい：微晶質セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、ＰＲＩＭＯＧＥＬ、またはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳＴＥＲＯＴＥＳなどの滑沢剤；コロイド状二酸化シリコンなどの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ香味料などの香料添加剤。
【０２７９】
４．  吸入用組成物
吸入による投与には、化合物は適した推進体、例えば、二酸化炭素などのガスを含む、噴霧器または加圧容器からのエアゾールスプレーとして送達される。
【０２８０】
５．  全身投与
全身投与はまた、経粘膜または経皮であり得る。経粘膜または経皮投与には、標的障壁を透過できる浸透剤を選択する。経粘膜浸透剤としては、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与には、点鼻薬または座剤を用いてもよい。経皮投与には、活性化合物は軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ジェルまたはクリームに処方する。
【０２８１】
化合物はまた、直腸送達のために、座剤（例えば、ココアバターおよびその他のグリセリドなどのベースを用いて）または停留浣腸の形態に調製してもよい。
【０２８２】
６．  担体
一実施形態では、活性化合物を、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系をはじめとする、徐放性製剤などの化合物を身体からの迅速な排除から保護する担体を用いて調製する。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ酢酸などの生分解性または生体適合性ポリマーを用いてもよい。かかる物質はＡＬＺＡ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）およびＮＯＶＡ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．（ＬａｋｅＥｌｓｉｎｏｒｅ，  ＣＡ）から商業的に入手してもよいし、当業者によって調製してもよい。リポソーム懸濁液もまた製薬上許容される担体として使用できる。これらは、（Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，米国特許第４，５２２，８１１号， 1985）のものなど当業者に公知の方法に従って調製すればよい。
【０２８３】
７．  単位用量
投与および投薬量均一性を容易にするために、単位剤形の経口製剤または非経口組成物を作製してもよい。単位剤形とは、治療される被験者にとって単回投薬量として適した物理的に別々の単位を指し、治療上有効量の活性化合物を必要な製薬上の担体と関連して含む。単位剤形の規格は活性化合物の特有の特性および特定の所望の治療効果および活性化合物の配合についての特有の制限によって定まり、かつ、それに直接的に依存する。
【０２８４】
８．  遺伝子治療組成物
核酸分子をベクターに挿入し遺伝子治療ベクターとして用いてもよい。遺伝子治療ベクターは被験者に、例えば、静脈注射、局所投与によって（ＮａｂｅｌおよびＮａｂｅｌ，  米国特許第５，３２８，４７０号， 1994）、または定位的注入（Chenら, 1994）によって送達すればよい。遺伝子治療ベクターの医薬製剤は許容される賦形剤を含んでいてもよく、または遺伝子送達ビヒクルが包埋されている徐放性マトリックスを含んでなってもよい。あるいは、組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから、完全な遺伝子送達ベクターが無傷で産生され得る場合には、医薬製剤は遺伝子送達システムを産生する１以上の細胞を含み得る。
【０２８５】
９．  投薬量
医薬組成物および方法は、通常、ＰＤＺＰまたはＰＩＰが関与する症状の治療に適用されるその他の治療上活性な化合物をさらに含んでなる。
【０２８６】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ調節を必要とする症状の治療または予防では、適当な投薬量レベルは、一般に、１日当たり患者の体重１ｋｇ当たり約０．０１〜５００ｍｇであり、これは単回または複用量で投与してもよい。好ましくは、投薬量レベルは１日当たり約０．１〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１日当たり約０．５〜約１００ｍｇ／ｋｇである。適した投薬量レベルは１日当たり約０．０１〜２５０ｍｇ／ｋｇ、１日当たり約０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、または１日当たり約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇであり得る。この範囲内で、投薬量は１日当たり０．０５〜０．５、０．５〜５または５〜５０ｍｇ／ｋｇであってもよい。経口投与には、組成物は治療される患者に対する投薬量の対症調節のために、１．０〜１０００ミリグラムの有効成分、特に、１．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、５０．０、７５．０、１００．０、１５０．０、２００．０、２５０．０、３００．０、４００．０、５００．０、６００．０、７５０．０、８００．０、９００．０および１０００．０ミリグラムの有効成分を含有する錠剤の形態で提供されるのが好ましい。化合物は１日当たり１〜４回の、好ましくは１日当たり１回または２回の投与計画で投与してもよい。
【０２８７】
しかしながら、いずれかの特定の患者のための投薬量の特定の用量レベルおよび頻度は様々であり得、用いられる特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、全身の健康状態、性別、食事制限、投与様式および回数、排出速度、薬剤の組み合わせ、特定の症状の重篤度および宿主が受けている治療をはじめとする種々の因子によって異なる。
【０２８８】
１０．  医薬組成物のキット
医薬組成物は投与についての説明書とともに、キット、容器、パックまたは取り出し容器に含めてもよい。キットとして供給される場合には、組成物の異なる成分を別個の容器に詰め、使用直前に混合してもよい。成分をこのように別個に詰めることで、活性化合物の機能を失うことなく長期間保存することが可能となり得る。
【０２８９】
キットにはまた、診断試験または組織分類などの特定の試験の実施を容易にする試薬を別個の容器に入れて含めてもよい。例えば、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ＤＮＡ鋳型および適したプライマーを内部対照として供給してもよい。
【０２９０】
（ａ）  容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）または容器（ｖｅｓｓｅｌ）
キットに含める試薬は、種々の成分の寿命が保護され、かつ、容器の材料によって吸着または変更されないような、どんな種類の容器に入れて供給してもよい。例えば、密閉型ガラス製アンプルに、窒素などの中性の非反応気体下で詰められた、凍結乾燥ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰまたはバッファーを含めてもよい。アンプルは、ガラス、有機ポリマーなど、ポリカーボネート、ポリスチレンなど、セラミック、金属などのいずれの適した材料、または試薬を入れるために通常使用されるいずれかのその他の材料からなっていてもよい。適した容器のその他の例としては、アンプルと同様の物質から加工され得る簡単な瓶、およびアルミニウムまたは合金などの金属裏張りで覆われた内側からなっていてもよい包装材料が挙げられる。その他の容器としては、試験管、バイアル、フラスコ、瓶、シリンジなどが挙げられる。容器は、皮下注射用の針を突き刺すことができる栓がついた瓶などのように、無菌のアクセスポートを含んでいてもよい。その他の容器は容易に取り外すことができ、除去すると成分が混合できるようになる膜によって分けられている２つの区画を含んでいてもよい。取り外すことができる膜はガラス製、プラスチック製、ゴム製などであってよい。
【０２９１】
（ｂ）  指示材料
キットは指示材料とともに供給されてもよい。使用説明書は紙またはその他の物質に印刷されていてもよいし、かつ／またはフロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、Ｚｉｐディスク、ビデオテープ、レーザーディスク、オーディオ・テープ等といった電子読取式媒体として供給されてもよい。詳細な使用説明書はキットと物理的に付随していなくてもよく、代わりにユーザーがキットの製造業者または配給業者指定のインターネットウェブサイトに導かれてもよいし、電子メールとして供給されてもよい。
【０２９２】
Ｂ．  スクリーニングおよび検出法
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを発現させるために（例えば、遺伝子治療適用において宿主細胞において組換え発現ベクターによって）、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡ（例えば、生物学的サンプルにおいて）またはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰにおける遺伝子の破壊を検出するために、およびＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性を調節するために、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰをコードする単離された核酸分子を用いてもよい。さらに、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性または発現を調節する薬剤または化合物をスクリーニングするために、ならびに、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの不十分なもしくは過剰な産生、またはＰＤＺＰまたはＰＩＰ野生型タンパク質と比べて活性が減少したか、もしくは異常な活性を有するＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ型の産生を特徴とする疾患を治療するために、またはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを必要とする生物学的機能を調節するために、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰペプチド／ポリペプチドを用いてもよい。さらに、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを検出および単離するために、ならびにＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性を調節するために抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  Ａｂを用いてもよい。
【０２９３】
（ｅ）  モジュレーターを同定するためのスクリーニング
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現のモジュレーターは、細胞を候補化合物と接触させ、細胞におけるＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を調べる方法で同定すればよい。候補化合物の存在下でのＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現レベルを、候補化合物の不在下でのＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質レベルと比較する。次いで、この比較に基づいて、候補化合物をＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のモジュレーターと同定すればよい。例えば、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下で、その不在下よりも多い（すなわち、統計的に有意に）場合に、候補化合物をＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激因子として同定する。あるいは、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が候補化合物の存在下で、その不在下よりも少ない（統計的に有意に）場合に、候補化合物をＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のインヒビターとして同定する。細胞におけるＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質発現レベルは、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の検出について記載した方法によって調べればよい。
【０２９４】
好ましい一実施形態では、分子を、ＰＤＺＰまたはＰＤＺＤが同族ＰＩＰまたはＰＤＢＰと相互作用するのを妨げるその能力についてアッセイする。例えば、候補モジュレーターの有効性を確認するために競合ＥＬＩＳＡを用いるＩＣ５０値を用いてもよい。ＩＣ５０値は固定化された同族ＰＩＰまたはＰＤＢＰまたはＰＩＰとのＰＤＺドメイン結合の５０％をブロックする候補物質の濃度と定義する。アッセイプレートはマイクロウェルプレート（好ましくは、タンパク質を効率的に吸収するよう処理された）をニュートラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）、アビジンまたはストレプトアビジンでコーティングすることによって準備する。次いで、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはその他のタンパク質（例えば、脱脂乳）の溶液を添加し、次いで、好ましくは、Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するバッファーで洗浄することによって、非特異的結合部位をブロックする。次いで、アミノ末端でビオチニル化したペプチドＰＤＢＰ、ＰＩＰまたはその断片を、好ましくは０．５％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０とともに加える（好ましくは、１００ｎＭの濃度で）。同時に、好ましくは、０．５％のＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含む、ＰＤＺドメイン融合タンパク質、ＰＤＺドメインペプチド／タンパク質を含有する試験分子の希釈シリーズからなる結合反応。固定化したＰＤＢＰ、ＰＩＰまたはその断片でコーティングしたプレートを好ましくは再度十分に洗浄し、その後各結合反応物をウェルに加え、短時間、好ましくは１５分インキュベートする。プレートを再度十分に洗浄し、次いで、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体、およびその結合がアッセイされる、ＰＤＺドメイン融合タンパク質、ＰＤＢＰまたはＰＩＰを認識する一次抗体を用いて発現させることなどで結合を可視化する。次いで、シグナルを、分光光度計などによって適切に読み取る。
【０２９５】
前記のアッセイの多数の変法が当業者には明らかである。例えば、アビジン−ビオチンベースの系に代えて、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを基質と化学的に結合させてもよいし、または単純に吸収させてもよい。かかるスクリーニングの特定の例は実施例に見られる。
【０２９６】
２．  検出アッセイ
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰをコードする核酸はそれ自体で有用である。例を限定するためではないが、（１）微小な生物学的サンプルから個体を同定する（組織分類）；および（２）生物学的サンプルの法医学的同定において補助するためにこれらの配列を用いてもよい。
【０２９７】
Ｃ．  予測的医薬
予測的医薬の分野は診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクスおよび個体を予防的に処置するために予後（予測）目的で臨床試験をモニターすることに関する。したがって、一態様はＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰおよび／または核酸発現、ならびに、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性を、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）との関連で調べて個体が疾病または疾患に苦しんでいるかどうか、または癌をはじめとする、異常なＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現または活性を伴う疾患を発症する危険にあるかどうかを調べるための診断アッセイに関する。本発明はまた、個体がＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ、核酸発現または活性と関連している疾患を発症する危険にあるかどうかを調べるための予後（または予測）アッセイを提供する。例えば、生物学的サンプルにおいてＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの突然変異をアッセイすることができる。かかるアッセイは、予後または予測目的で、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ、核酸発現または生物活性を特徴とするか、それと関連している疾患を発症する前に個体を予防的に処置するために用いてもよい。
【０２９８】
もう１つの態様は、個体において、その個体に適当な治療薬または予防薬を選択するためにＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性、または核酸発現を調べる方法を提供する（本明細書では「薬理ゲノミクス」と呼ぶ）。薬理ゲノミクスにより、個体の遺伝子型（例えば、個体の、特定の薬剤に応答する能力を左右する個体の遺伝子型）に基づく個体の治療的または予防的処置のモダリティ（例えば、薬剤、食品）の選択が可能となる。もう１つの態様は、臨床試験において、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの発現または活性に対するモダリティ（例えば、薬剤、食品）の影響をモニターすることに関する。
【０２９９】
１．  診断アッセイ
生物学的サンプルにおいてＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの有無を検出する例示的な方法は、被験者から生物学的サンプルを得、生物学的サンプルをＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰポリペプチドまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出できる化合物または薬剤と接触させ、その結果、サンプル中のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの存在が確認されることを含む。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出する薬剤には、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリダイズし得る標識された核酸プローブがある。核酸プローブは、例えば、少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００個のヌクレオチド長で、かつ、ストリンジェントな条件下でＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドなどの、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰをコードする核酸またはその一部であってもよい。
【０３００】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰポリペプチドを検出する薬剤には、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰと結合し得る抗体、好ましくは、検出可能な標識をつけた抗体がある。標識されたプローブまたは抗体を検出可能な物質と結合し（すなわち、物理的に連結する）、直接的に標識された別の試薬との反応性によってプローブまたは抗体を間接的に検出する。間接標識の例としては、蛍光標識された二次抗体を用いる一次抗体の検出および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出され得るようなビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。「生物学的サンプル」は被験者から単離された、組織、細胞および生物学的液体、ならびに、被験者内に存在する、組織、細胞および液体を含む。この検出法を用いて、インビトロならびにインビボで生物学的サンプル中のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡ、タンパク質、またはゲノムＤＮＡを検出してもよい。例えば、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、ノーザンハイブリダイゼーションおよびインサイツハイブリダイゼーションが挙げられる。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰポリペプチドを検出するためのインビトロ技術としては、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光が挙げられる。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術としては、サザンハイブリダイゼーションおよび蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）が挙げられる。さらに、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを検出するためのインビボ技術としては、被験者への、標識した抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ抗体の導入が挙げられる。例えば、抗体を、標準的なイメージング技術によって被験者内でのその存在および位置を検出することができる、放射性マーカーで標識してもよい。
【０３０１】
方法は、対照を提供するために被験者から生物学的サンプルを得ること、サンプルを化合物または薬剤と接触させてＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ；ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出すること、対照サンプル中のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ；ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在を、試験サンプル中のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ；ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在と比較することをさらに含み得る。
【０３０２】
本発明はまた、生物学的サンプル中のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを検出するキットを包含する。例えば、キットはサンプル中のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡ、ペプチドまたはタンパク質を検出し得る、標識された化合物または薬剤；サンプル中のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ量を調べるための試薬および／または装置；ならびにサンプル中のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ量を標準と比べるための試薬および／または装置を含んでなってもよい。化合物または薬剤は適した容器に詰められていてもよい。キットは、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰまたは核酸を検出するためにキットを用いるための使用説明書をさらに含んでなってもよい。
【０３０３】
２．  予後アッセイ
本明細書に記載された診断法はさらに、異常なＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現または活性を伴う疾病または疾患を患っているか、またはそれを発症する危険にある被験者を同定するために利用してもよい。例えば、記載されたアッセイを用いて、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ核酸発現または活性と関連している疾患を患っているか、またはそれを発症する危険にある被験者を同定してもよい。あるいは、疾病または疾患を患っているか、それを発症する危険にある被験者を同定するために、予後アッセイを用いてもよい。本発明は、異常なＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現または活性を伴う疾病または疾患を同定する方法を提供し、それでは、被験者から試験サンプルを得、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰまたは核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）を検出する。試験サンプルとは被験者から得た生物学的サンプルである。例えば、試験サンプルは生物学的液体（例えば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０３０４】
予後アッセイは、異常なＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現または活性を伴う疾病または疾患を治療するために、被験者にモダリティ（例えば、アゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、食品など）を投与してもよいかどうかを調べるために用いてもよい。かかる方法を用いて、疾患用の薬剤を用いて被験者を効果的に治療できるかどうかを調べることができる。異常なＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現または活性を伴う疾患用の薬剤を用いて被験者を効果的に治療できるかどうかを調べる方法は試験サンプルを得、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰまたは核酸を検出する（例えば、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰまたは核酸の存在が、異常なＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現または活性を伴う疾患を治療するために薬剤を投与してよい被験者の診断となる場合に）ことを含む。
【０３０５】
また、この方法を、遺伝子の破壊を有する被験者が疾患の危険にあるかどうかを調べるために、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰにおける遺伝子の破壊を検出するために用いてもよい。この方法は被験者由来のサンプルにおいて、変更でＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰタンパク質をコードする遺伝子の完全性に影響を及ぼすこと、またはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの異所性発現を特徴とする遺伝子の破壊の有無を検出すること含む。かかる遺伝子の破壊は（１）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰからの１個以上のヌクレオチドの欠失、（２）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰへの１個以上のヌクレオドの付加、（３）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ中の１個以上のヌクレオチドの置換、（４）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ遺伝子の染色体再構成、（５）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡ転写物レベルの変更、（６）ゲノムＤＮＡメチル化の変化などの、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの異常な修飾、（７）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、（８）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの非野生型レベル、（９）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの対立遺伝子の損失、および／または（１０）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰタンパク質の不適当な翻訳後修飾を確認することによって検出すればよい。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの破壊を検出するために使用できる、多数の既知のアッセイ技術がある。有核細胞を含有するいずれの生物学的サンプルを用いてもよい。
【０３０６】
特定の実施形態では、破壊検出に、アンカーＰＣＲまたはｃＤＮＡ末端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）ＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、（Ｍｕｌｌｉｓ，  米国特許第４，６８３，２０２号， 1987；Ｍｕｌｌｉｓら，米国特許第４，６８３，１９５号， 1987）で、あるいは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Landegrenら, 1988;Nakazawaら, 1994）でプローブ／プライマーを用いてもよく、後者はＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの点変異を検出するのに特に有用である（Abravayaら, 1995）。この方法は、患者からサンプルを回収すること、サンプルから核酸を単離すること、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰのハイブリダイゼーションおよび増幅が（あれば）起こるような条件下で、核酸を、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰと特異的にハイブリダイズする１以上のプライマーと接触させること、および増幅産物の有無を検出すること、または増幅産物の大きさを検出し、対照サンプルの長さと比較することを含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載された突然変異を検出するために用いられるいずれかの技術とともに予備的な増幅ステップとして用いるのに望ましいものであり得ると予想される。
【０３０７】
別の増幅法としては、自己持続性配列複製（Guatelliら, 1990）、転写増幅系（Kwohら, 1989）、Ｑβレプリカーゼ（Lizardiら, 1988）、またはいずれかの他の核酸増幅法とそれに次ぐ、当業者に十分に公知の技術を用いる増幅された分子の検出が挙げられる。これらの検出スキームは、少量で存在する核酸分子を検出するのに特に有用である。
【０３０８】
サンプル由来のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ中の突然変異は、制限酵素切断パターンの変化によって同定してもよい。例えば、サンプルおよび対照ＤＮＡを単離、増幅（所望により）、１種以上の制限エンドヌクレアーゼで消化し、ゲル電気泳動によって断片長サイズを調べ、比較する。サンプルと対照ＤＮＡ間の断片長サイズの相違がサンプルＤＮＡ中の突然変異を示す。さらに、配列特異的リボザイムの使用を用いて、リボザイム切断部位の発生または損失によって特定の突然変異の存在をスコアしてもよい。
【０３０９】
サンプルおよび対照核酸、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡを、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含有する高密度アレイとハイブリダイズすることによって、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ中の遺伝子突然変異を同定してもよい（Croninら, 1996;Kozalら, 1996）。例えば、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ中の遺伝子突然変異は、記載されたような（Croninら, 1996）光生成性ＤＮＡプローブを含有する二次元アレイで同定してもよい。便宜には、プローブの第１のハイブリダイゼーションアレイを用いて、サンプルおよび対照中のＤＮＡの長いひと続きをスキャンし、配列的に重複するプローブの直線アレイを作製することによって配列間の塩基変化を同定すればよい。このステップにより、点変異の同定が可能となる。検出されるすべての変異体または突然変異に相補的な、小さな、特殊化したプローブアレイを用いることで特定の突然変異を特性決定できる第２のハイブリダイゼーションアレイをこれに続ける。各突然変異アレイは、一方は野生型遺伝子に相補的であり、他方は突然変異遺伝子に相補的である、対応するプローブセットからなる。
【０３１０】
さらにもう１つの実施形態では、当技術分野で公知の種々の配列決定反応のいずれかを用いて、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰを直接配列決定し、サンプルＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの配列と、対応する野生型（対照）配列とを比較することによって突然変異を検出してもよい。配列決定反応の例としては、従来技術に基づくものが挙げられる（MaxamおよびGilbert, 1977;Sangerら, 1977）。診断アッセイを実施する場合には（Naeveら, 1995）、質量分析による配列決定をはじめとする（Cohenら, 1996;GriffinおよびGriffin, 1993;Ｋｏｓｔｅｒ，  Ｗ０９４／１６１０１，1994）、種々の自動化配列決定手順のいずれかを用いてもよい。
【０３１１】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ中の突然変異を検出するためのその他の方法としては、切断剤からの保護を用いて、ＲＮＡ／ＲＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二重鎖中のミスマッチした塩基を検出するもの（Myersら, 1985）が挙げられる。一般に、「ミスマッチ切断」技術は、野生型ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ配列を含む（標識した）ＲＮＡまたはＤＮＡを、サンプルから得られた突然変異の可能性のあるＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズすることによって形成されるヘテロ二重鎖を提供することからはじめる。二本鎖の二重鎖を、対照とサンプル鎖間の塩基対ミスマッチから生じるものなどの二重鎖の一本鎖領域を切断する薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖をＲＮアーゼで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理してミスマッチした領域を酵素的に消化してもよい。その他の実施形態では、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のいずれかを、ミスマッチした領域を消化するためにヒドロキシルアミンまたは四酸化オスミウムでおよびピペリジンで処理してもよい。次いで、消化された物質を、変性ポリアクリルアミドゲルで大きさによって分離して突然変異部位を決定する（Grompeら, 1989;SaleebaおよびCotton, 1993）。対照ＤＮＡまたはＲＮＡは検出のために標識してもよい。
【０３１２】
サンプル細胞から得られたＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｃＤＮＡ中の点突然変異を検出しマッピングするための規定の系において、ミスマッチ切断反応に、二本鎖ＤＮＡ中のミスマッチした塩基対を認識する（ＤＮＡミスマッチ修復）１種以上のタンパク質を用いもよい。例えば、大腸菌のｍｕｔＹ酵素はＧ／ＡミスマッチでＡを切断し、ＨｅＬａ細胞由来のチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチでＴを切断する（Hsuら, 1994）。例示的な実施形態によれば、野生型ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ配列を基にしたプローブを、試験細胞由来のｃＤＮＡまたはその他のＤＮＡ産物とハイブリダイズさせる。二重鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、切断産物があれば、これを電気泳動プロトコールなどで検出すればよい（Ｍｏｄｒｉｃｈら，  米国特許第５，４５９，０３９号， 1995）。
【０３１３】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ中の突然変異を同定するために、電気泳動移動度の変化を用いてもよい。例えば、突然変異体と野生型核酸間の電気泳動移動度の相違を検出するために一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）を用いてもよい（Cotton, 1993;Hayashi, 1992;Oritaら, 1989）。サンプルおよび対照ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ核酸の一本鎖ＤＮＡ断片を変性させ、次いで再生させる。一本鎖核酸の二次構造は配列によって異なり、得られる電気泳動移動度の変化によって単一塩基の変化でさえも検出できる。ＤＮＡ断片を標識してもよいし、または標識したプローブで検出してもよい。アッセイの感度は、二次構造が配列変化により敏感であるＲＮＡ（ＤＮＡではなく）を用いることで増強され得る。この方法は二本鎖のヘテロ二重鎖分子を電気泳動移動度の変化を基に分離するためにヘテロ二重鎖解析を用いることもある（Keenら, 1991）。
【０３１４】
変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ；（Myersら, 1985））を用いて突然変異または野生型断片の移動をアッセイしてもよい。ＤＧＧＥでは、ＤＮＡを、例えば、ＰＣＲによって約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチＤＮＡのＧＣクランプを付加することによって完全な変性を妨げるよう修飾する。変性勾配の代わりに温度勾配を用いて、対照およびサンプルＤＮＡの移動度の相違を同定してもよい（RossiterおよびCaskey, 1990）。
【０３１５】
点突然変異を検出するその他の技術の例としては、限定されるものではないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマー伸長が挙げられる。例えば、既知の突然変異が中心に位置するオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次いで、完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイズが可能となる条件下で標的ＤＮＡとハイブリダイズさせればよい（Saikiら, 1986;Saikiら, 1989）。かかる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅した標的ＤＮＡと、またはオリゴヌクレオチドをハイブリダイズするメンブランに付着させて標識した標的ＤＮＡとハイブリダイズさせる場合には、いくつかの異なる突然変異体とハイブリダイズさせる。
【０３１６】
あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅技術を用いてもよい。特異的増幅用オリゴヌクレオチドプライマーに、増幅がディファレンシャル・ハイブリダイゼーションによって異なるように、分子の中心に注目する突然変異を保持させてもよいし（Gibbsら, 1989）、または、適当な条件下でミスマッチがポリメラーゼ伸長を妨げ得るか、減少させ得る場合には、一方プライマーの３'末端に保持させてもよい（Prosser, 1993）。突然変異領域中に新規制限部位を導入して切断に基づく検出を創出してもよい（Gaspariniら, 1992）。増幅にＴａｑリガーゼを用いて特定の増幅を実施してもよい（Barany, 1991）。かかる場合には、ライゲーションは５'配列の３'末端に完全なマッチがある場合にのみ起こり、これによって増幅をスコアすることで既知の突然変異の検出が可能となる。
【０３１７】
記載された方法は、例えば、従来のように、例えば、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰが関与する疾病または疾患の症状を示すか、またはその家族歴の患者を診断する臨床条件で使用できる、少なくとも１種のプローブ（核酸または抗体）を含んでなる、予めまとめられたキットを用いることによって実施してもよい。
【０３１８】
さらに、本明細書に記載された予後アッセイにはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰが発現されるいずれの細胞種または組織を用いてもよい。
【０３１９】
３．  薬理ゲノミクス
スクリーニングアッセイによって同定される、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性または発現に対して促進または阻害作用を有する薬剤、またはモジュレーターを、疾患を予防的にまたは治療的に処置するために個体に投与してもよい。かかる治療と関連して、薬理ゲノミクス（すなわち、被験者の遺伝子型と被験者の外来のモダリティ、食品、化合物または薬剤などに対する応答との間の関連についての研究）も考慮され得る。治療薬の代謝の相違は、薬理学的に活性な薬剤の用量と血中濃度間の関係を変更することで重篤な毒性または治療の失敗をもたらし得る。したがって、個体の薬理ゲノミクスにより、個体の遺伝子型についての考慮に基づいた予防的または治療的処置に有効な薬剤（例えば、薬）の選択が可能となる。薬理ゲノミクスはさらに、適当な投薬量および治療計画を定めるために用いてもよい。したがって、個体におけるＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの活性、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの発現またはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ突然変異を調べて治療的または予防的処置のための適当な薬剤の選択を導くことができる。
【０３２０】
薬理ゲノミクスは、患者におけるモダリティの体内での処分の変更および異常な作用による、モダリティに応じた臨床的に重大な遺伝性の変化を扱う（EichelbaumおよびEvert, 1996;Linderら, 1997）。一般に、２つの遺伝薬理学的状態：（１）モダリティと身体の相互作用を変更する単一因子（薬剤作用の変更）として伝えられる遺伝的状態または（２）身体がモダリティに対して作用する方法を変更する単一因子（薬剤代謝の変更）として伝えられる遺伝的条件は区別され得る。これらの遺伝薬理学的状態は稀な欠損症として、または核酸多型のいずれかとして生じ得る。例えば、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ６ＰＤ）欠損症は代表的な遺伝性酵素異常症であり、それでは主な臨床上の合併症はオキシダント薬物（抗マラリア薬、スルホンアミド、鎮痛薬、ニトロフラン）の摂取およびソラマメの消費後の溶血である。
【０３２１】
例示的な一実施形態のように、薬剤代謝酵素の活性が薬剤作用の強度および期間双方の主要な決定因子である。薬剤代謝酵素（例えば、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）およびチトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９）の遺伝子多型の発見により、薬剤の標準的で、かつ、安全な用量を服用した後に、強められた薬剤応答および／または重篤な毒性を示す患者もいるという現象の説明がつく。これらの多型は集団で２種の表現型、迅速代謝型（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＥＭ）および低代謝型（ｐｏｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）（ＰＭ）に発現される。ＰＭの有病率は種々の集団の間で異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子は高度に多型であり、ＰＭにおいていくつかの突然変異が同定されており、そのすべてが機能的ＣＹＰ２Ｄ６の不在をもたらす。突然変異体ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ１９による低代謝型は、標準的な用量を服用した場合に、強められた薬剤応答および副作用を頻繁に経験する。代謝物が活性な治療部分である場合には、ＣＹＰ２Ｄ６によって形成されるその代謝物モルヒネによって媒介されるコデインの鎮痛作用について証明されるように、ＰＭは治療的応答を示さない。その他の極端な場合として、標準的な用量には無応答性である、いわゆる超迅速代謝型がある。最近、超迅速代謝型の分子的機序がＣＹＰ２Ｄ６遺伝子増幅によるものであると同定された。
【０３２２】
個体におけるＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの活性、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰをコードする核酸の発現、またはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ突然変異量を調べて、個体の治療的または予防的処置のための適当な薬剤を選択してもよい。さらに、個体の薬剤応答性表現型を同定するために、遺伝子薬理学研究を用いて薬剤を代謝する酵素をコードする多型対立遺伝子の遺伝子型同定を適用してもよい。この情報を投薬または薬剤選択に適用すると、有害反応または治療の失敗を避けることができ、したがって、記載された例示的なスクリーニングアッセイのうちの１つによって同定されたモジュレーターなどの、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰモジュレーターを用いて被験者を処置する場合に治療的または予防的効率を高めることができる。
【０３２３】
１．  臨床試験の際のモニタリング効果
薬剤（例えば、薬、化合物）の、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの発現または活性に対する影響をモニターすることは基礎的薬剤スクリーニングにおいてだけでなく臨床試験にも適用してよい。例えば、スクリーニングアッセイによってＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現、タンパク質レベルを高めると、またはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性をアップレギュレートすると決定された薬剤の有効性を、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現、タンパク質レベルの低下、またはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性のダウンレギュレートを示す被験者の臨床試験においてモニターしてもよい。あるいは、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現、タンパク質レベルを低下させると、またはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性をダウンレギュレートすると決定された薬剤の有効性を、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現、タンパク質レベルの増加、またはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性のアップレギュレートを示す被験者の臨床試験においてモニターしてもよい。かかる臨床試験では、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰおよび、好ましくは、例えば、癌と関係があるその他の遺伝子の発現または活性を特定の細胞の反応性についての「リードアウト」またはマーカーとして用いてもよい。
【０３２４】
例えば、細胞においてモダリティ（例えば、食品、化合物、薬または小分子）で処理することによって調節される、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰをはじめとする遺伝子を同定してもよい。薬剤の、臨床試験における疾患または疾患類に対する作用を調べるために、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰおよび疾患と関係しているその他の遺伝子の発現レベルを解析してもよい。遺伝子発現パターンは、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰまたはその他の遺伝子産物の、ノーザンブロット解析、核ランオンまたはＲＴ−ＰＣＲ実験によって、またはタンパク質量を測定することによって、または活性レベルを測定することによって定量化すればよい。この方法では、遺伝子発現パターン自体も、薬剤に対する細胞の生理学的応答を示すマーカーとして働き得る。したがって、この応答状態を、薬剤で個体を処理する前、およびその間の種々の時点で調べてもよい。
【０３２５】
被験者の薬剤（例えば、本明細書に記載されたスクリーニングアッセイによって同定された、アゴニスト、アンタゴニスト、タンパク質、ペプチド、ペプチドミメティック、核酸、小分子、食品またはその他の薬物候補）での処置の有効性をモニターする方法は、（１）被験者から投与前サンプルを得る、（２）投与前サンプルにおいてＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰタンパク質、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現レベルを検出する、（３）被験者から１以上の投与後サンプルを得る、（４）投与後サンプルにおいてＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベル検出する、（５）投与前サンプルにおけるＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性レベルを、投与後サンプルまたはサンプル類のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較する、および（６）相応に、被験者への薬剤の投与を変更するというステップを含んでなる。例えば、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの発現または活性を検出されたものよりもより高レベルに高めるために、すなわち、薬剤の有効性を高めるために、薬剤の投与の増加が望ましいことがある。あるいは、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰの発現または活性を検出されたものよりもより低レベルに低下させるために、すなわち、薬剤の有効性を低下させるために、、薬剤の投与の減少が望ましいこともある。
【０３２６】
２．  処置方法
本発明は、異常なＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現または活性と関連している疾患の危険にある（または感受性の）または疾患を患っている被験者を処置する予防的および治療的方法の双方を提供する。
【０３２７】
３．  疾病および疾患
リケッチア疾病、マウスチフス、ツツガムシ病（KimおよびHahn, 2000）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（Boujuら, 1999;Kameyaら, 1999）、慢性骨髄性白血病（Nagaseら, 1995;Ruffら, 1999）、アルツハイマー病（Deguchiら, 2000;Lauら, 2000;McLoughlinら, 2001;TanahashiおよびTabira, 1999a;Tomitaら, 2000;Tomitaら, 1999）、パーキンソン病および総合失調症（Smithら, 1999）などの神経疾患、Ｘ染色体連鎖自己免疫腸疾患（ＡＩＥ）（Kobayashiら, 1999）、遅発性脱髄性疾病（Gillespieら, 2000）、アッシャー症候群タイプ１（ＵＳＨ１）  （DeAngelisら, 2001）、一酸化窒素媒介性組織損傷（Kameyaら, 1999;McLoughlinら, 2001）、腫瘍（Inazawaら, 1996）および嚢胞性線維症（Raghuramら, 2001）などのＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰレベルまたは生物活性の変更を特徴とする疾病および疾患は、活性と拮抗する（すなわち、低下させる、または阻害する）治療薬で処置してもよい。アンタゴニストを治療的にまたは予防的に投与してもよい。使用してよい治療薬としては、（１）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰペプチド、またはその類似体、誘導体、断片または相同体、（２）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰに対するＡｂ、（３）ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰをコードする核酸、（４）内生機能を相同組換えによって排除するために用いる、アンチセンス核酸および機能障害性である（すなわち、コード配列内の異種挿入物による）核酸の投与（Capecchi, 1989）、（５）ＰＤＺＰ媒介性相互作用を変更するモジュレーター（すなわち、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰに特異的な、さらなるペプチドミメティックまたはＡｂをはじめとする、インヒビター、アゴニストおよびアンタゴニスト）が挙げられる。
【０３２８】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰレベルまたは生物活性の低下を特徴とする疾病および疾患は、活性を高める（そのアゴニストである）治療薬で処置してもよい。活性をアップレギュレートする治療薬を治療的または予防的に投与してもよい。使用してもよい治療薬としては、ペプチド、またはその類似体、誘導体、断片または相同体、またはバイオアベイラビリティーを高めるアゴニストが挙げられる。
【０３２９】
レベルの増加または低下は、患者の組織サンプルを得（例えば、組織診組織から）、インビトロでＲＮＡまたはペプチドレベル、発現されたペプチドの構造および／または活性（またはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  ｍＲＮＡ）についてアッセイすることによって、ペプチドおよび／またはＲＮＡを定量化することによって容易に検出することができる。方法としては、限定されるものではないが、免疫アッセイ（例えば、ウェスタンブロット解析、免疫沈降とそれに次ぐドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動、免疫細胞化学による）および／またはｍＲＮＡの発現を検出するハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンアッセイ、ドットブロット、インサイツハイブリダイゼーションなど）が挙げられる。
【０３３０】
４．  予防法
本発明は、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現を、または少なくとも１種のＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性を調節する薬剤を投与することによって、被験者において、異常なＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現または活性と関連している疾病または症状を防ぐ方法を提供する。異常なＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現または活性によって引き起こされるか、または、それによって寄与される疾病の危険にある被験者は、例えば、診断または予後アッセイのいずれかまたはまたはその組み合わせによって同定すればよい。予防薬の投与は、疾病または疾患を防ぐか、あるいは、その進行を遅延させるよう、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ異常を特徴とする症状の発現の前であってよい。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ異常の種類によって、被験者を処置するために、例えば、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰアゴニストまたはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰアンタゴニストを用いればよい。適当な薬剤はスクリーニングアッセイを基に決定すればよい。
【０３３１】
５．  治療法
もう１つの態様は、治療目的でＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現または活性を調節する方法に関する。調節方法は、細胞を、細胞と関連しているＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性の１以上の活性を調節する薬剤と接触させることを含む。ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性を調節する薬剤は核酸またはタンパク質、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ、ペプチド、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰペプチドミメティック、またはその他の小分子であり得る。薬剤はＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性を刺激し得る。かかる刺激性薬剤の例としては、活性ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰおよび細胞に導入されているＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰが挙げられる。もう１つの実施形態では、薬剤はＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性を阻害する。阻害性薬剤の例としては、アンチセンスＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ核酸および抗ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ  Ａｂが挙げられる。調節法はインビトロで（例えば、細胞を薬剤とともに培養することによって）、あるいは、インビボで（例えば、薬剤を被験者に投与することによって）実施してもよい。したがって、本発明はＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ核酸分子の異常な発現または活性を特徴とする疾病または疾患に苦しむ個体を処置する方法を提供する。一実施形態では、本方法はＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現または活性を調節する（例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートする）薬剤（例えば、スクリーニングアッセイによって同定された薬剤）、または薬剤の組み合わせを投与することを含む。もう１つの実施形態では、本方法はＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰまたは核酸分子を、減少したか、または異常なＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ発現または活性を補償する治療として投与することを含む。
【０３３２】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰが異常にダウンレギュレートされている、および／またはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性の増加が有益な作用を有すると思われる状況では、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性の刺激が望ましい。逆に、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性が異常にアップレギュレートされている、および／またはＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性の低下が有益な作用を有すると思われる状態では、ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ活性の減少が望まれる。
【０３３３】
６．  治療薬の生物学的作用の測定
特定の治療薬の作用およびその投与が患部組織の治療に必要とされるかどうかを調べるためには、適したインビトロまたはインビボアッセイを実施すればよい。
【０３３４】
種々の特定の実施形態では、患者の疾患に関与する代表的な細胞種を用いてインビトロアッセイを実施し、所与の治療薬がその細胞種に対して所望の作用を発揮するかどうかを調べればよい。ヒト被験者を試験する前に、限定されるものではないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、イヌなどをはじめとする適した動物モデル系において治療に用いるモダリティを試験してもよい。同様に、インビボ試験についても、ヒト被験者に投与する前に、当技術分野で公知のいずれかの動物モデル系を用いてもよい。
【０３３５】
７．  本組成物の予防的および治療的使用
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ核酸およびタンパク質は、疾患と関係のある可能性ある予防的および治療的用途において有用である。
【０３３６】
ＰＤＺＰ、ＰＤＺＤ、ＰＩＰまたはＰＤＢＰ核酸またはその断片はまた、核酸またはタンパク質の存在または量を評価する、診断用途においても有用であり得る。さらなる用途として、抗細菌分子としてがあろう（すなわち、いくつかのペプチドは抗細菌特性を有するとわかっている）。これらの物質は、治療または診断法に用いるための、新規物質と免疫特異的に結合するＡｂの作製においてもさらに有用である。
（実施例）
【０３３７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を証明する目的で含められる。当業者であれば、以下の実施例中で開示される技術は本発明者らが本発明の実施において十分に機能するよう見出した技術を表し、したがって、その実施に好ましい様式を構成すると考えられるということは十分理解するはずである。しかしながら、当業者ならば、本開示に照らし、開示された特定の実施形態には多くの変法が可能であり、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、依然、同様または類似の結果が得られるということを十分理解するはずである。
【実施例１】
【０３３８】
材料および方法
１．１  材料
ジデオキシヌクレオチド配列決定用の試薬はＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐより入手した。酵素およびプラスミドｐＭａｌ−ｐ２はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓより入手した。マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）イムノプレートはＮＵＮＣ（Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）より入手した。大腸菌ＸＬ１−ＢｌｕｅおよびＭ１３−ＶＣＳはＳｔｒａｔａｇｅｎｅより入手した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）およびＴｗｅｅｎ  ２０はＳｉｇｍａ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）より入手した。ストレプトアビジンはＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）より入手した。セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）／抗Ｍ１３抗体抱合体であるｐＧＥＸ−４Ｔ−３、およびグルタチオン・セファロースはＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈより入手した。抗テトラ−Ｈｉｓ抗体はＱｉａｇｅｎより入手した。抗ＧＳＴ抗体はＺｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．より入手した。セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ・ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体抱合体はＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手した。３，３'，５，５'−テトラメチルベンジジン／Ｈ２Ｏ２（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質はＫｉｒｋｅｇａａｒｄ  ＆  Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．より入手した。前処置されたＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｗａｎｇ樹脂および２−（ｌＨ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）はＮｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍより購入した。
【０３３９】
１．２  ペプチド合成
標準の９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）プロトコールを用いて、前処置したＦｍｏｃ−Ｖａｌ−Ｗａｎｇ樹脂を起点にペプチドを合成した。６倍過剰のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）の存在下、ＨＢＴＵで活性化した４倍過剰のアミノ酸を用いてカップリングを実施した。完成したペプチドはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中、２．５％水および２．５％トリイソプロピルシランの混合物を１時間用いて樹脂から切断し、逆相高圧液体クロマトグラフィーによって精製し、それらの質量をエレクトロスプレー質量分析によって確認した。
【０３４０】
１．３  ＰＤＺドメイン精製
哺乳類：ＭＡＧＩ−３の６種の個々のＰＤＺドメインを含む発現構築物を、鋳型として、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓ  ＴＯＰＯクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングしたヒトＭＡＧＩ−３の全長ｃＤＮＡ（Wu, Y.ら, 2000 J. Biol. Chem.）を用い、ＰＣＲクローニングによって構築した。ＰＤＺ１（配列番号２００のアミノ酸４１７〜５３５；図９）、ＰＤＺ２（配列番号２００のアミノ酸５８４〜７０７）、ＰＤＺ３（配列番号２００のアミノ酸７４１〜８４０）およびＰＤＺ４（配列番号２００のアミノ酸８７０〜９７６）はｐＥＢＧのＢａｍＨＩ／Ｎｏｔ１部位（Sanchezら, 1994 Nature）へクローニングしてＧＳＴのカルボキシ末端でインフレーム融合物を作製した。ＰＤＺ０（配列番号２００のアミノ酸１〜４０６）およびＰＤＺ５（配列番号２００のアミノ酸９８０〜１１５１）を含むＭＡＧＩ−３の領域は、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のＨｉｎｄＩＩＩ／Ｓａｌ１部位へクローニングしてＥＧＦＰのアミノ末端に融合物を作製した。ＥＲＢＩＮのＰＤＺドメインは（配列番号２０１のアミノ酸１２７３〜１３７１；図１０）は、ＥＳＴＡＡ９９２２５０からＰＣＲを用いて増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１−ＮＴ／ＧＦＰ  ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングしてＧＦＰのＣ末端で融合物を作製した。ＥＲＢＩＮのＰＤＺドメイン（配列番号２０１のアミノ酸１２７３〜１３７１；図１０）はｐＧＥＸ−６Ｐ−ｌからＰＣＲを用いて増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓにクローニングしてアミノ末端でＧＳＴとの融合タンパク質を、中央でＥＲＢＩＮ  ＰＤＺ  を、およびカルボキシ末端でＶ５／Ｈｉｓタグを作製した。Ｈｅｒ２およびＨｅｒ２キナーゼデッド（ｋｉｎａｓｅ  ｄｅａｄ）（ＫＤ）構築物は記載されたように（Schaefer, G.ら, 1999 J. Biol. Chem.）ｐＲＫにクローニングした。ヒトδ−カテニンおよびδ−カテニン（Δ６  ＣＯＯＨ  アミノ酸）はｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にＰＣＲクローニングしてＥＧＦＰのカルボキシ末端で融合物を作製した。
【０３４１】
原核生物：ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメイン（配列番号２０１のアミノ酸１２１７〜１３７１）またはＭＡＧＩ−３  ＰＤＺ２（配列番号２００のアミノ酸５８４〜７０７）は、ｐＧＥＸ６Ｐ−１およびｐＧＥＸ４Ｔ−３大腸菌発現ベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＥｃｏＲ１／Ｎｏｔ１またはＢａｍＨ１／Ｎｏｔ１部位にそれぞれクローニングした。大腸菌によって発現されたＧＳＴ−タンパク質の発現およびアフィニティー精製は製造者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の推奨する通りに実施した。
【０３４２】
１．４  ベクター構築および部位特異的突然変異誘発
Ｐｔａｃプロモーター（正プライマー、ａａａａｇａａｔｔｃｃｃｇａｃａｃｃａｔｃｇａａｔｇｇｔｇｃ（配列番号２０２、および逆プライマー、ａｃｃａｇａｔｇｃａｔａａｇｃｃｇａｇｇｃｇｇａａａａｃａｔｃａｔｃｇ  （配列番号２０３；ＥｃｏＲＩ部位は太字、ＮｓｉＩ部位は太字の斜体）の制御下、ポリメラーゼ連鎖反応を実施してｌａｃｌｑ  遺伝子およびマルトース結合タンパク質由来のシグナルペプチドをコードする遺伝子断片を含むｐＭａｌ−ｐ２の１．６キロ塩基対断片を増幅した。このＤＮＡ断片をＥｃｏＲ１およびＮｓｉＩで消化し、Ｐ８ディスプレイファージミドの同様の消化から得られた大きな断片と連結した（Lowmanら, 1998）。Ｋｕｎｋｅｌらの方法（Kunkelら, 1987）を用いて８個のコドン（ｔａａｔａａｃａｔｃａｃｃａｔｃａｃｃａｔｇｃｇ；配列番号２０４）をＰ８オープンリーディングフレームの最終コドンのすぐ後に挿入した。得られたファージミド（ｐＳ１２９０ａと表す）はＩＰＴＧ誘導性Ｐｔａｃプロモーターの下流に以下のＤＮＡ配列：マルトース結合タンパク質シグナルペプチドをコードするＤＮＡ、成熟Ｐ８、２個の停止コドン（ｔａａｔａａ；配列番号２０５）、ペンタ−Ｈｉｓ  ＦＬＡＧ（ＨＨＨＨＨＡ；  配列番号２０６）、およびさらに２個の停止コドン（ｔｇａｔａａ；配列番号２０７）を含んでいた。部位特異的突然変異誘発を用いてＰ８とペンタ−Ｈｉｓ  ＦＬＡＧとの間の２個の停止コドンを欠失させたか、あるいはＧｌｙコドンの数を変えてそれらを置換した。得られたファージミドは種々の数のＧｌｙ残基とそれに続くペンタ−Ｈｉｓ  ＦＬＡＧからなるカルボキシル末端融合物を含むＰ８部分を分泌した。
【０３４３】
１．５  Ｐ８のカルボキシル末端の配列連結ペプチドの至適化
鋳型としてファージミドｐＳ１２９０ａを用い、既に記載された方法（Sidhuら, 2000）を用いてＰ８とペンタ−Ｈｉｓ  ＦＬＡＧとの間の２個の停止コドンを４、５、６、８、または１０個の縮重コドンで置換したリンカーライブラリーを構築および選別した。このライブラリーを集めてプールして全体の多様性を１．１ｘ１０１１とした。このプールを、捕獲標的として抗テトラＨｉｓ抗体を用いて結合選択ラウンドを繰り返した。２ラウンドの結合選択の後、個々のファージを単離し、抗テトラＨｉｓ抗体を含むファージを捕獲し、結合したファージを検出することによってファージＥＬＩＳＡで解析した（下記参照）。ファージＥＬＩＳＡで強力なシグナルを示すファージを配列解析に付した。最も強力なＥＬＩＳＡシグナルを示すファージミドをｐＳ１４０３  ａと表した。
【０３４４】
１．６  ＭＡＧＩ３  ＰＤＺドメイン結合ペプチド（ＰＤＢＰ）の単離
ファージミドｐＳ１４０３ａを鋳型として用い、１３残基リンカー（ＡＷＥＥＮＩＤＳＡＰＧＧＧ  ；  配列番号１９９）とそれに続く７個の縮重コドン（ＮＮＳ、ここでＮ＝Ａ／Ｃ／Ｇ／ＴかつＳ＝Ｃ／Ｇ）からなるカルボキシル末端融合物を含むＰ８部分のライブラリーを構築した（Sidhuら, 2000）。このライブラリーの多様性は２．０×１０１０であった。このライブラリーに、９６ウェルマキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）イムノプレートにコーティングしたＧＳＴ−ＰＤＺ融合タンパク質を捕獲標的として用いる結合選択のラウンドを繰り返した。ファージは１０μＭ  ＩＰＴＧ誘導をしてもしなくても大腸菌ＳＳ３２０で増殖した（Sidhuら, 2000）。３または４ラウンドの結合選択の後、個々のファージを単離し、ファージＥＬＩＳＡで解析した（下記参照）。標的ＧＳＴ−ＰＤＺと結合しているが関係のないＧＳＴ−ＰＤＺとは結合していないファージを配列解析に付した。
【０３４５】
１．７  ライブラリー合成
化合物を、ペプチド合成プロトコールに従って準備した樹脂付着ジペプチドＦｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｗａｎｇ樹脂を起点に合成した。次いでこのＦｍｏｃ基を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中２０％ピペリジンで樹脂を５分間処理することで除去し、その後液体を濾去し、樹脂をジクロロメタンで３回、ジメチルアセトアミドで３回洗浄した。樹脂をイソシアネートで誘導体化する場合には、樹脂をＮ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）に懸濁し、１０当量の試薬で処理し、室温で１４時間攪拌した。樹脂を塩化スルホニルおよびクロロホルメートで誘導体化する場合には、樹脂をＮＭＰに懸濁し、１０当量の試薬および３０当量のＤＩＰＥＡで処理し、室温で１４時間攪拌した。樹脂を酸で誘導体化する場合には、樹脂をＮＭＰに懸濁し、１０当量の酸、１０当量のＨＢＴＵ、および３０当量のＤＩＰＥＡで処理し、室温で１４時間攪拌した。カップリング反応の後、樹脂をメタノールで２回、ジクロロメタンで２回、ＮＭＰで２回、５％酢酸を含有するＮＭＰで２回、そしてジクロロメタンで２回洗浄した。最後に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中２．５％の水および２．５％のトリイソプロピルシランの混合物で１時間の処理することで化合物を樹脂から切断し、逆相高圧液体クロマトグラフィーによって精製し、それらの質量をエレクトロスプレー質量分析によって確認した。
【０３４６】
１．８  結合アッセイ
ペプチドを提示するファージ粒子の、固定化した標的タンパク質との結合をファージＥＬＩＳＡを用いて検出した。このアッセイではファージが大腸菌ＳＳ３２０で産生され、アッセイプレートをＴＭＢペルオキシダーゼ基質系を用いて発現させ、４５０ｎｍで分光光度的に読み取ることを除いて記載されたように実施した（Pearceら, 1997）。
【０３４７】
ペプチドのＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインに対する結合親和性を競合ＥＬＩＳＡ法を用いてＩＣ５０値として調べた。ＩＣ５０値は固定化したペプチドと結合するＰＤＺドメインの５０％をブロックするペプチドの濃度として定義する。アッセイプレートはマキシソープ・プレートを、２μｇ／ｍｌのニュートラビジンＰＢＳ溶液６５μｌを用いて４℃で一晩コーディングすることで準備した。次いで、このプレートをＰＢＳ中、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の１％溶液６５μｌを室温で１時間添加することによってブロッキングし、次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで１０回洗浄した。次いで、アミノ末端をビオチニル化したペプチドＰＤＺ５０１（ＴＧＷＥＴＷＶ；配列番号２２２）６５μｌを、０．５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中、１００ｎＭの濃度で加え、室温で１時間インキュベートした。同時に、２μｇ／ｍｌのＥＲＢＩＮ  ＰＤＺ−ＧＳＴ融合タンパク質を含有する、０．５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中の試験化合物の希釈シリーズからなる結合反応物を室温で１時間インキュベートした。固定化したペプチドでコーティングしたプレートを再度１０回洗浄した後、各結合反応物６５μｌをウェルに加え、室温で１５分間インキュベートした。プレートを再度１０回洗浄した後、０．５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中の１：１０００希釈の抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体および１：２０００希釈のマウス抗ＧＳＴ抗体とともに３０分間インキュベートすることによって発現させた。このプレートを１０回洗浄し、次いで１００μｌ  ＨＲＰ基質で５分間インキュベートし、１００μｌの１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を添加することによって色を発現させた。このプレートは４５０ｎｍで読み取り、吸収は最小２乗適合を用いて結合曲線に適合させた。
【０３４８】
１．９  ペプチド濃度
ペプチド濃度は記載の通り測定した（Edelhoch, 1967）。ペプチドの濃縮ストックをＰＢＳで希釈し、その吸光度を２６７、２８０および２８８ｎｍで測定した。各波長での濃度を各々の吸光係数から計算し、次いで平均して最終値とした。
【０３４９】
１．１０  データベース検索および候補ＰＤＺ結合パートナーの決定
ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインと相互作用する候補タンパク質を決定するため、３ステップの方法を用いた。第１のステップでは、コンセンサス結合配列についてＣ末端だけを調べながらタンパク質データベースをクエリーした。第２のステップでは、脊椎動物でも細胞内にもないタンパク質（ＰＤＺドメインは細胞タンパク質に見出される）を除いた。最後に、第３のステップで、重複するデータベースエントリーおよび相同分子種を除いた。
【０３５０】
ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインに対してファージ選択されたペプチドに似たＣ末端を持つタンパク質をモチーフ検索アルゴリズムを用いて同定した。ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺに対しファージ選択されたペプチドの１００個を越えるアラインメントから、ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインとの密着結合に好ましい４個のＣ末端アミノ酸としてＤ／Ｅ  Ｔ／Ｓ  Ｗ  Ｖ  （配列番号：  ２０８）の明らかなコンセンサス配列が確立された。このコンセンサス配列を用いて、検索基準をデータベース内のタンパク質のＣ末端の４アミノ酸に限定し、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（Dayhoffら, 1978）を検索した。このＣ末端のコンセンサス配列で終了する２５種のタンパク質を同定した。非脊椎動物タンパク質ならびに１種の細胞外タンパク質を手作業で除き、基準に合致する合計１８配列を残した。これらのうち、いくつかは相同分子種または単に同一遺伝子産物の別個のＧｅｎｂａｎｋエントリーである。１８配列の最終的な検討により、δ−カテニン（ｐｐｌ２０ｃｔｎの別名であるδ−１カテニンと混同しない）、口蓋・心・顔面症候群（ＡＲＶＣＦ）において欠失しているアルマジロタンパク質（Sirotkinら, 1997）およびｐ００７１（プラコフィリン４）をはじめとする少なくとも３種の独特な遺伝子産物に相当することが示唆される。これら３種のタンパク質はすべて、そのＣ末端の４アミノ酸に基づいて、インビボでＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインの候補リガンドであったアルマジロファミリーのタンパク質のメンバーである。この限定されたリストを用い、これらのアルマジロファミリーメンバーを以下のインビトロおよびインビボ法によって選択的に試験し、実際にそれらがＥＲＢＩＮのＰＤＺドメインのリガンドかどうかを調べた。
【０３５１】
１．１１  共沈法
高グルコース・ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％ウシ胎児血清、１×非必須アミノ酸添加剤、１×Ｌ−グルタミン添加剤、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４）およびペニシリン／ストレプトマイシン（すべてＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより入手）で約８０％コンフルエンスまで増殖したＨＥＫ  ２９３（２９３）細胞をＦｕｇｅｎｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いて２μｇ  ＤＮＡ／直径３５  ｍｍウェル（例えば、実施例５．０に記載した配列をコードするＤＮＡ）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで１ｍｌ／ウェルのｌ２０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭジチオスレイトール、およびＥＤＴＡを含むプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、カタログ番号１  ８３６  １４５）にすくい取り、ｄｏｕｎｃｅホモジナイザー（Ｗｈｅａｔｏｎ）で緩いガラス製内筒を用いて穏やかに３〜５ストロークホモジナイズした。抽出物を卓上型遠心機にて４℃で１０分間、１２，０００ｒｐｍで遠心分離し、上清をＮａＣｌを含まない等量のホモジナイズバッファーと合わせて終塩濃度１００ｍＭとし、使用するまで−７０℃で凍結した。ＭＡＧＩ−３  ＰＤＺドメインまたはＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインのペプチドプルダウン実験のため、１００μｌの２９３細胞抽出物を結合バッファー（１００ｍＭ  ＮａＣｌに改変したホモジナイズバッファー）で４００μｌに希釈し、１０μＭのアミノ末端をビオチニル化したペプチドおよびストレプトアビジンアガロース１００μ１（Ｓｉｇｍａ）とともに回転装置上で４℃にて２時間インキュベートした。ビーズを１ｍｌの結合バッファーで３回洗浄し、６０μｌのＬａｅｍｍｌｉ還元サンプルバッファー中で煮沸し、このうち１５μｌをＳＤＳゲルにのせた。所与のビオチニル化ペプチドと共沈したＰＤＺドメインを抗ＧＳＴ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）または抗ＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）抗体を用いる免疫ブロット法解析により可視化した。δ−カテニン、δ−カテニン（Δ６ＣＯＯＨアミノ酸）およびＨｅｒ２を発現する２９３細胞との結合実験のため、１００μｌの抽出物を結合バッファーで５００μｌに希釈し、２０μｇの大腸菌によって発現されたＧＳＴ−ＭＡＧＩ−３  ＰＤＺ  ２またはＧＳＴ−ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺ  および５０μ１のグルタチオンセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とともに、回転装置上で４℃にて２時間インキュベートした。２９３細胞によって発現されたタンパク質の結合は、ＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＨｅｒ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の抗体を用いる免疫ブロット法解析によって検出した。
【０３５２】
１．１２  生細胞でのペプチドターゲッティング
Ｃａｃｏ−２細胞を、完全に極性化した単層が得られたと抵抗測定値によって決定されるまで、ポリカーボネートトランスウェル（ｔｒａｓｗｅｌｌ）フィルター（直径１２ｍｍ、孔径０．４μｍ；Ｃｏｓｔａｒ）ＨＥＫ  ２９３細胞と同一培地で）上で増殖させた。次いで、生細胞を、下層トランスウェルチェンバーの培地に加えた、アミノ末端でフルオレセイン（ＦＡＭ）が結合しているペプチド：（Ａ）２μＭのＡＴＱＩＴＷＶ（配列番号２１４）、（Ｂ）２μＭのＡＴＱＩＴＷＡ（配列番号２１５）または（Ｃ）５μＭのＡＳＫＩＴＷＶ（配列番号２１６）とともに一晩インキュベートした。次いで、細胞を１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有するハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、氷冷メタノールで固定し、ＰＢＳ中、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の溶液で透過処理し、ＰＢＳ中、５％ロバ血清の溶液でブロッキングし、１．５μｇのモノクローナル抗γ−カテニン抗体で染色した。基底膜マーカータンパク質γ−カテニンはＣｙ３−コンジュゲートロバ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ）を用いて可視化し、１：１０００希釈した。処理したフィルターをカミソリで切り取り、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄマウント剤（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ；  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）でスライドとカバーグラスとの間にマウントした。画像は６３倍油浸対物レンズを用いるライカ共焦点顕微鏡でとった。
【０３５３】
１．１３  ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺおよびδ−カテニンの共存
ＨＥＫ  ２９３細胞をコラーゲンＩＶコーティングしたカバーグラス上で７０％コンフルエンスまで増殖させ、次いで、１．４μｇのｐｃＤＮＡ  ３．１／Ｖ５／Ｈｉｓ中のＧＳＴ−ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺ  および１．１μｇの示されたＥＧＦＰ構築物でトランスフェクトした。トランスフェクトの２４〜４８時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、２．５％ホルムアルデヒドで３０分間固定し、ＰＢＳ中、０．２５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００の溶液で透過処理し、ＰＢＳ中、５％ロバ血清の溶液でブロッキングした。ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインはモノクローナル抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＣｙ３−コンジュゲート二次抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏｌａｂｓ）で染色して可視化したが、ＧＦＰ融合物は直接可視化した。画像は４０倍対物レンズおよびデジタルＣＣＤカメラを用いる標準の蛍光顕微鏡およびＳＰＯＴ画像化ソフトウェア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，  Ｉｎｃ．；  Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）でとった。
【実施例２】
【０３５４】
Ｐ８のカルボキシル末端と融合しているペプチドのファージディスプレイ
一連のファージミドを構築、設計し、Ｐ８のカルボキシル末端と融合しているペプチドがＭ１３ファージの表面に提示されるかどうか確認した。各ファージミドは、そのカルボキシル末端と融合しているペンタ−Ｈｉｓ  ＦＬＡＧ  エピトープ（ＨＨＨＨＨＡ；配列番号２１７）を含むＰ８部分を分泌するよう設計した。ファージミドおよびヘルパーファージに同時感染している大腸菌がファージミドＤＮＡを含むファージ粒子を産生した。かかる系では、ファージコートの大多数がヘルパーファージによって提供されるＰ８分子からなるが、いくらかのファージミドによってコードされるＰ８分子の組み込みの結果、カルボキシ末端で融合しているペンタ−Ｈｉｓ  ＦＬＡＧが提示される。ペンタ−Ｈｉｓ  ＦＬＡＧのディスプレイは、捕獲標的として抗テトラ−Ｈｉｓ抗体を用いるファージＥＬＩＳＡで検出した。図１はＦＬＡＧのＰ８のカルボキシル末端との直接融合がディスプレイをもたらさなかったということを示すが、ディスプレイはＰ８カルボキシル末端とＦＬＡＧとの間へ５個以上のＧｌｙ残基を挿入することによって達成される。ディスプレイレベルはリンカー長が増加するにつれ徐々に高まり、１６残基リンカーで最大に達した。
【０３５５】
リンカー配列を至適化するため、ペンタ−Ｈｉｓ  ＦＬＡＧとＰ８カルボキシル末端とを連結しているリンカーが４〜６、８、または１０個のランダム化残基を含むよう設計されているライブラリーを構築した。このライブラリーを集めてプールして抗テトラ−Ｈｉｓ抗体でコーティングしたプレートで２ラウンドの結合選択を繰り返した。多様な配列が選択されたが、すべての選択物は８または１０個いずれかの残基を含んでいた。最良のリンカー配列（ＡＷＥＥＮＩＤＳＡＰ、配列番号２１８）は匹敵する長さのポリグリシンリンカーと比べて約１０倍ディスプレイを増加させた。
【実施例３】
【０３５６】
ＭＡＧＩ  ３（ＰＤＺ２およびＰＤＺ３ドメイン）のＰＤＺドメイン結合ペプチド（ＰＤＢＰ）の単離
至適化された、介在する１３残基のリンカー（ＡＷＥＥＮＩＤＳＡＰＧＧＧ、配列番号１９９）を含むＰ８のカルボキシル末端と融合しているランダムペプチドのライブラリーを構築した。各ライブラリー位置に、２０種の天然アミノ酸すべてをコードする縮重コドンおよびアンバー（ＴＡＧ）停止コドンを用いた。このライブラリーは７個の縮重コドンを含むため、主にへプタペプチドをコードしたが、アンバー停止コドンが出現する可能性によってまた、より短いペプチドのディスプレイがもたらされた。このライブラリーは２．０ｘ１０１０の独特のメンバーを含むため、可能性ある天然へプタペプチドすべての多様性（〜１０９）を上回っていた。
【０３５７】
このライブラリーを用いて、逆のドメイン構造３を含む膜会合型グラニレートキナーゼである、ＭＡＧＩ  ３のＰＤＺドメイン２および３（それぞれＰＤＺ２およびＰＤＺ３）の結合特異性を調べた。ＰＤＺ２は腫瘍サプレッサーＰＴＥＮ／ＭＭＡＣと相互作用するが、ＰＤＺ３の結合特異性は分かっていない（Wuら, 2000）。ＰＤＺ２およびＰＤＺ３を大腸菌由来のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合物として精製し、ファージ提示されたペプチドライブラリーに、各ドメインに対し４ラウンドの結合選択を繰り返した。ファージミドによってコードされるＰ８遺伝子の転写はＬａｃリプレッサーにより調節される。したがって提示はＩＰＴＧの添加によって増加する可能性もある。ＰＤＺ２選別はＩＰＴＧがあってもなくても成功したが、ＰＤＺ３選別はＩＰＴＧ誘導によってのみ結合クローンが得られた。
【０３５８】
ＰＤＺ２選別では７〜４残基で長さの異なる種々の配列が得られた（表１）。４個のカルボキシル末端残基は、関連する１型のＰＤＺ結合コンセンサス配列Ｃｙｓ／Ｖａｌ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−ＣＯＯＨ（配列番号２１９）と強い一致を示したが、ＰＴＥＮ／ＭＭＡＣのカルボキシル末端配列とは明確に異なる（表１および２）。配列の多くは唯一のクローンによって示されたが、２種類のカルボキシル末端配列は双方ともテトラペプチドとして、またより長いペプチドのカルボキシル末端で複数回現れた（ＣＳＷＶおよびＶＴＷＶ、配列番号２および４）。したがって、これらの２配列は最小の、ＰＤＺ２の高親和性リガンドに相当した。ＰＤＺ３選別ではＰＤＺ２結合コンセンサス配列とは完全に異なるＩＩ型のＰＤＺ結合モチーフである、単一のへプタペプチド（ＴＲＷＷＦＤＩ、配列番号１３）のみが得られた。
【０３５９】
2004533840.tif 000020
【０３６０】
選択された配列に相当するペプチドを合成し、結合についてアッセイした（表２）。選択されたペプチドはそれらの同族ＰＤＺドメインと高親和性で結合したが、非同族ＰＤＺドメインとは検出可能な結合は示さなかった。ＰＤＺ３特異的ペプチドのカルボキシル末端のアミド化の結果、結合親和性が３００倍減少し、このことはＰＤＺ３とそのリガンドの末端のカルボキシル基間の相互作用の重要性を実証している。このデータからまた、ＰＤＺ２選別由来の最小のテトラペプチド選択物がＰＤＺ２と高親和性で結合することも確認された。驚くべきことに、選択物はＰＤＺ２とは、ＰＴＥＮ／ＭＭＡＣのカルボキシル末端配列に相当するへプタペプチドよりも一層緊密に結合した。結合親和性における大きな違いは、選択されたペプチドではＴｒｐであるのに対しＰＴＥＮ／ＭＭＡＣではＬｙｓである（ＨＴＱＩＴＷＶとＨＴＱＩＴＫＶ（配列番号２２０）を比較、表２；ＩＣ５０値はＥＬＩＳＡにおいて固定化したペプチドと結合しているＰＤＺドメインを５０％阻害したペプチド濃度である）Ｐ（−１）の残基に起因すると思われる。
【０３６１】
2004533840.tif 000021
【０３６２】
個々のリガンド側鎖の結合相互作用への寄与を評価するため、ＰＤＺ２に最高の親和性を示すテトラペプチド（ＣＳＷＶ、配列番号２）をアラニンスキャンに付した。ペプチドシリーズを合成してテトラペプチド内の各アミノ酸をＡｌａ残基へ個別に変換した。結果は４つの側鎖すべてが結合相互作用に有利に寄与する（表２）が、寄与の大きさは様々であるということを示唆する。Ｐ（０）またはＰ（−１）でのＡｌａ置換は結合を１００倍よりも低く減少させたが、Ｐ（−２）のセリン残基の置換ではわずか５倍の減少しかおこらなかった。Ｐ（−３）のシステイン残基のＡｌａ置換は中間の２５倍の結合の減少をもたらした。
【実施例４】
【０３６３】
ＰＤＺ２−ＰＤＢＰ相互作用のモデリング
ホモロジーモデリング技術を用いて高親和性ペンタペプチドリガンドＧＶＴＷＶ（配列番号２４０）との複合体におけるＰＤＺ２の三次元モデルを構築した（図２および３）。このモデルは、ｄｉｓｃｓ−ｌａｒｇｅタンパク質のヒト相同体由来の第３ＰＤＺドメイン（Morais Cabralら, 1996）およびペンタペプチド（ＫＱＴＳＶ）との複合体におけるＰＳＤ−９５の第３ＰＤＺドメイン（ＰＳＤ−９５−３）（Doyleら, 1996）の結晶構造を基にした。このモデルとペプチドアラニンスキャンデータはＰＤＺ２とペプチドリガンドとの間の結合相互作用を規定するのに役立つ。結晶構造とモデルの双方で、ペプチドリガンドはＰＤＺドメインのβ２とα２との間に介入するβストランドを形成し、このタンパク質のβ２およびβ３によって形成される逆平行βシートを拡げる（図２）。ペプチドの末端のカルボキシル基は高度に保存されたカルボキシル基結合ループ（残基Ｇｌｙ−２２、Ｐｈｅ−２３、およびＧｌｙ−２４からなる主鎖）と相互作用するが、Ｐ（０）Ｖａｌ側鎖残基は明確な疎水性ポケット中に存在する。ＰＳＤ−９５−３／ＫＱＴＳＶ結晶構造では、Ｐ（−１）のＳｅｒの側鎖が溶媒に曝されているので、タンパク質と相互作用しない（図２）。したがって、ＰＤＺドメインリガンドのＰ（−１）側鎖は結合には重要でないと考えられており、タイプＩコンセンサス配列Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｘ−Ｖａｌ−ＣＯＯＨが提案されている（Doyleら, 1996）。対照的に、本高親和性リガンドのＰ（−１）の大きなＴｒｐ側鎖はタンパク質に詰められるようモデリングすることができ（図２）、β３ストランドでＭｅｔ−３８およびＬｅｕ−４０の側鎖と有利なファンデルワールス接触を確立する（図３）。これらの相互作用により広い疎水性領域が覆われ、この複合体を大いに安定させると思われる。この予測はＰ（−１）のＴｒｐをＡｌａで置換すると結合が劇的に減少することによっても支持される（表２）。Ｍｅｔ−３８およびＬｅｕ−４０はＰＤＺファミリーでは保存されておらず（図２）、このことはこれらの位置の側鎖とＰ（−１）のペプチド側鎖との間の相互作用が結合親和性だけでなく特異性にも寄与し得るということを示している。Ｐ（−２）では、Ｔｈｒ側鎖が結晶構造とモデルの双方で保存されているＨｉｓ−６７残基と水素結合を形成する（図２）。しかしながら、この相互作用は溶媒に曝され、この位置のＡｌａ置換は親和性に対し中程度の効果しかない（表２）。したがって、Ｐ（−２）の側鎖は、特異性を決定し得るが、選択されたペプチドに対するＰＤＺ２結合の場合には、親和性にはわずかにしか寄与しない。最終的に、Ｐ（−３）の疎水性側鎖の結合への寄与を、β２ストランドの残基Ａｌａ−２６およびＡｌａ−２８の側鎖ならびにβ３ストランドのＬｙｓ−３７の側鎖によって形成されるタンパク質上の疎水性パッチとの有利なファンデルワールス接触の点から合理的に考えることができる（図２および３）。これらの結果はペプチドリガンドのカルボキシル末端とＰＤＺドメインのカルボキシル基結合ループとの間の既に記載された相互作用の重要性を確認するものである。さらに、これらのデータはペプチドリガンドのＰ（−１）およびＰ（−３）の疎水性側鎖とＰＤＺドメインのβ２およ��β３ストランドの側鎖との間の相互作用に帰因する、結合親和性および特異性への寄与を明らかにする。
【実施例５】
【０３６４】
ＭＡＧＩ  ３  ＰＤＺ２またはＰＤＺ３のＰＤＢＰは特異的に結合する
ＭＡＧＩ  ３の６個の各ＰＤＺドメインをＧＳＴ融合物（ＰＤＺ１；アミノ酸４１７〜５３５、配列番号２００、ＰＤＺ２；アミノ酸５８４〜７０７、配列番号２００、ＰＤＺ３；アミノ酸７４１〜８４０、配列番号２００、およびＰＤＺ４；アミノ酸８７０〜９７６、配列番号２００）またはＥＧＦＰ（ＰＤＺ  ０；アミノ酸１〜４０６、配列番号２００、およびＰＤＺ５；アミノ酸９８０〜１１５１、配列番号２００）としてＨＥＫ２９３細胞で発現させ、示されたビオチニル化したペプチドによって細胞抽出物から沈殿するその能力に関して試験した。ＰＤＺ２および３だけがそれらの同族のファージ選択されたペプチドと有意に結合した（図４）。これら同ＰＤＺドメインはそれぞれ（０）および（−１）位置でＶからＡまたはＷからＫへの変更を含むペプチドＡＴＱＩＴＷＡ（配列番号２１５）またはＡＴＱＩＴＫＶ（配列番号２１４）とは結合しなかった。注記：ＡＴＱＩＴＷＶ（配列番号２１４）はファージスクリーニングで得たものではなく、ＭＡＧＩ−３  ＰＤＺ  ２の低親和性リガンドであるＰＴＥＮのＣ末端（ＨＴＱＩＴＫＶ；配列番号２２０）の誘導体である。ＰＤＺ２のファージ選択されたペプチドの試験は、ＰＴＥＮ  Ｃ末端の（−１）位置のＫからＷへの変更によって結合親和性が高まるであろうと示唆した。レーン３および５での結果を比較すればこれが真実であることが明白に示される（図４）。
【実施例６】
【０３６５】
ＭＡＧＩ−３  ＰＤＺ２  ＰＤＢＰはＣａｃｏ−２生細胞のタイトジャンクションを標的とする
Ｃａｃｏ−２細胞を、完全に極性化した単層が得られるまでポリカーボネート・トランスウェルフィルター上で増殖させた。次いで、生細胞をフルオレセイン（緑色）が結合しているペプチド：（Ａ）２ｍＭのＡＴＱＩＴＷＶ（配列番号２１４）、（Ｂ）２ｍＭのＡＴＱＩＴＷＡ（配列番号２１５）または（Ｃ）５ｍＭのＡＳＫＩＴＷ（配列番号２２１）とともに一晩インキュベートした（図５）。次いで、細胞を固定し、タンパク質γ−カテニンに対する抗体で対比染色した（図５）。ｇ−カテニンについて認められた側底染色パターンとは対照的に、（Ａ）ＡＴＱＩＴＷＶ（配列番号２１４）および（Ｃ）ＡＳＫＩＴＷＶ（配列番号２１６）は、タイトジャンクションの側膜の先端に局在する。ペプチドカルボキシル末端でＶをＡに置換することは、リガンドとその同族ＰＤＺ結合パートナーとの相互作用を混乱させるはずである。したがって、パネルＢのペプチドＡＴＱＩＴＷＡ（配列番号２１５）（図  ５）はタイトジャンクションを標的にしない。特に、ＭＡＧＩ−３がこれらの細胞中のタイトジャンクションで見出されている。
【実施例７】
【０３６６】
ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインのＰＤＢＰの単離
至適化された、介在する１３残基のリンカー（ＡＷＥＥＮＩＤＳＡＰＧＧＧ、配列番号１９９）を含む、Ｐ８のカルボキシル末端と融合しているランダムペプチドのライブラリーを構築した。各ライブラリー位置に、２０種の天然アミノ酸すべてをコードする縮重コドンおよびアンバー（ＴＡＧ）停止コドンを用いた。このライブラリーは７個の縮重コドンを含むため、主にヘプタペプチドをコードしたが、アンバー停止コドンが出現する可能性によってまた、より短いペプチドの提示がもたらされた。このライブラリーは２．０ｘ１０１０の独特のメンバーを含むため、可能性ある天然へプタペプチドすべての多様性（〜１０９）を上回っていた。
【０３６７】
ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合物として大腸菌から精製し、ファージ提示されたペプチドライブラリーに、ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインに対する４ラウンドの結合選択を繰り返した。ＬａｃリプレッサーはファージミドによってコードされるＰ８遺伝子の転写を調節するので、提示はＩＰＴＧの添加によって増加する可能性もある。
【０３６８】
ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺ選別では７〜４残基で長さの異なる多様な配列が得られた（表３）。この４個のカルボキシル末端残基は配列Ｄ（Ｅ）Ｔ（Ｓ）ＷＶ（配列番号２２１）と強い一致を示した。
【０３６９】
2004533840.tif 000022
2004533840.tif 000023
2004533840.tif 000024
【実施例８】
【０３７０】
そのカルボキシ末端がＥＲＢＩＮ  ＰＤＢＰに類似するタンパク質のデータベース検索
ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインと相互作用／結合する候補タンパク質を決定するため、Ｄａｙｈｏｆｆタンパク質データベースを前記のコンセンサス結合配列についてＣ末端の４アミノ酸残基だけを調べてクエリーした。脊椎動物でも細胞内のものでもないタンパク質は除いた。最終的に重複するデータベースエントリーおよび相同分子種を除いた。
【０３７１】
合計２５種のタンパク質が検索から同定された。検索基準は４個のアミノ酸コンセンサス配列Ｄ（Ｅ）Ｔ（Ｓ）ＷＶ（配列番号２２１）からなり、このモチーフはタンパク質のカルボキシ末端に限定した。細胞外タンパク質または非脊椎動物種由来のものは表４に示すリストから除かれている。１８種すべてのタンパク質はアルマジロファミリーのメンバーのタンパク質である。
【０３７２】
2004533840.tif 000025
【実施例９】
【０３７３】
δ−カテニンはＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインと結合し、相互作用の重要な構成要素がそのＣ末端によって媒介される
ＭＡＧＩ３のＰＤＺ  ２（Sidhu et al., 2000）に対応するＥＲＢＩＮのアミノ酸１２１７−１３７１および５８４−７０７をＧＳＴ融合物として大腸菌で発現させた。次いで、このＰＤＺ融合物を、（Ａ）δ−カテニン、（Ｂ）Ｃ末端の６アミノ酸が欠失しているδ−カテニンまたは（Ｃ）トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞由来の抽出物に存在するＨｅｒ２レセプターを沈殿させる能力について試験した（図６）。ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインに対しファージ選択されたペプチドのアミノ酸配列を調べることで、δ−カテニンがこのＰＤＺドメインの可能性あるリガンドであるということが示唆された。図６の上のパネルの結果は、δ−カテニンはＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインと強く結合するがＭＡＧＩ−３のＰＤＺ２とはそうではないということを証明する。図６の中央のパネルは、δ−カテニンのＣ末端が密着結合に必要であるというＰＤＺリガンドに共通する特徴を証明する。下のパネルは、ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺの既に報告されているリガンドであるＨｅｒ２がこのアッセイでは特異的に沈殿するということを示す。しかしながら、δ−カテニンよりもＨｅｒ２のほうが一段と少なく細胞抽出物から枯渇しており、このことはδ−カテニン：ＥＲＢＩＮ ＰＤＺ相互作用のほうが親和性が高いということを示唆する。等量の抽出物と枯渇した抽出物（前記）を分析した。
【実施例１０】
【０３７４】
Ｅｒｂｉｎ ＰＤＺドメインはインビボでδ−カテニンと会合する
ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインを、ＥＧＦＰ、ヒトδ−カテニンまたはＣ末端６アミノ酸を欠失しているヒトδ−カテニンとＨＥＫ  ２９３  Ｅ細胞に同時トランスフェクトした（図７）。パネルＡは、ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインはδ−カテニンの不在下では主に細胞または小胞体に存在するのに対し、δ−カテニンの存在下（Ｂ）ではＥＲＢＩＮ  ＰＤＺの細胞間結合への完全な補充が認められるということを示す。δ−カテニンの６個のカルボキシ末端アミノ酸の欠失は、ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺのδ−カテニンとの共存をすべてではないがほとんど排除した。このデータはδ−カテニンのＣ末端がＥＲＢＩＮのＰＤＺドメインとの高親和性相互作用に必要であることを示唆する。
【実施例１１】
【０３７５】
ＰＤＺペプチドリガンドの（−３）位置の単一のアミノ酸変化がその結合特異性を変更する（ＥＲＢＩＮおよびＭＡＧＩ  ３  ＰＤＺドメイン）
ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインまたはＭＡＧＩ−３の第２のＰＤＺドメインをそれぞれＧＦＰおよびＧＳＴとの融合物としてＨＥＫ２９３細胞で発現させた。次いで、示されたビオチニル化したペプチド（図８）を、細胞抽出物において各ＰＤＺドメインと結合する能力について試験した。結果（図８）は、ＭＡＧＩ−３  ＰＤＺ２およびＥＲＢＩＮ  ＰＤＺに対してファージ選択されたペプチド（それぞれレーン２および６）が、それに対してファージ選択されたＰＤＺドメインのみを効果的に沈殿させることを示している。これは、ＰＤＺ２への親和性を高めるため（−１）位置でＫからＷへ変更したＰＴＥＮタンパク質Ｃ末端（ＭＡＧＩ−３  ＰＤＺ  ２の低親和性リガンド）の誘導体であるＡＴＱＩＴＷＶ（配列番号２１４）ペプチド（レーン３）にも当てはまる。ＭＡＧＩ−３  ＰＤＺ２に対してファージ選択されたすべてのペプチドが（−３）の位置でＩ、ＶまたはＣを有するのに対して、ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺに対してファージ選択されたペプチドではもっぱらＤまたはＥが現れる。ＰＤＺ２結合ペプチドＡＴＱＩＴＷＶ（配列番号２１４）ではこの位置でのＩからＥへの単純な変更により、ペプチドの結合特異性がＭＡＧＩ−３  ＰＤＺ  ２バインダーからＥＲＢＩＮ  ＰＤＺバインダーへ切り替わる。これらのデータは、ＰＤＺタンパク質リガンドの（−３）位置で有意に異なる側鎖を有するアミノ酸が、リガンドが可能性のある複数のＰＤＺ結合パートナーを識別するのを、たとえＣ末端のＰＤＺ結合モチーフがその他の点で同一であったとしても、可能にさせるということを示唆する。
【実施例１２】
【０３７６】
ファージディスプレイにより見出されたＥＲＢＩＮ  ＰＤＺ結合ペプチドは、ＥＲＢＩＮと、既に同定されているＰＤＺタンパク質ＥＲＢＢ２／Ｈｅｒ２よりも高親和性で結合する
ＥＲＢＩＮはＥＲＢＢ２／ＨＥＲ２レセプターのリガンドとして同定されている。しかし、データベースクエリーは、ファージディスプレイによって同定されたように、ＥＲＢＢ２／Ｈｅｒ２  レセプターがＥＲＢＩＮ  ＰＤＢＰのコンセンサス配列を有するとは同定しなかった。
【０３７７】
ＥＲＢＩＮのファージティスプレイによって同定されたリガンド（ＴＧＷＥＴＷＶおよびＴＧＷＤＴＷＶ、配列番号２２２〜２２３）との結合は、インビトロアッセイ（前記）でＥＲＢＢ２／Ｈｅｒ２、ＤＶＰＶ（配列番号２２４）（Borgら, 2000）に記載された既に同定されているリガンドのものと比較した。
【０３７８】
ＥＲＢＩＮは、競合相手であるＰＤＺ  ５０１（ＴＧＷＥＴＷＶ；配列番号２２２）の存在下で、ファージディスプレイによって同定されたＰＤＢＰ  ＴＧＷＥＴＷＶおよびＴＧＷＤＴＷＶ（配列番号  ２２２−２２３）と高親和性で結合した。ＴＧＷＥＴＷＶ（配列番号２２２）のＩＣ５０値は０．５〜１μＭ、ＴＧＷＤＴＷＶ（配列番号２２３）のＩＣ５０値は４．５〜５．０μＭであった。しかし、既に同定されているリガンドＤＶＰＶ（配列番号２２４）は結合が不十分で、ＩＣ５０が４００μＭを越え、その上ＤＶＰＡリガンドは１００μＭを越えた。
【０３７９】
ＭＡＧＩ  ３  ＰＤＺ２ドメインの「天然に選択された」リガンド、ＩＴＫＶ（配列番号２２５）を調べる同様の実験を実施し試験し、ファージディスプレイによって同定されたもの（ＣＳＷＶおよびＶＴＷＶ、配列番号２および４）と比較したところ、結合親和性に同様の違いが認められた。ＭＡＧＩ  ３は２００μＭのＩＣ５０でＩＴＫＶと結合したが、ファージ提示されたＰＤＢＰは１μＭ（ＣＳＷＶ；配列番号２）および４μＭ（ＶＴＷＶ；配列番号４）のＩＣ５０で結合すると認められた。
【実施例１３】
【０３８０】
ＥＲＢＩＮ  ＰＤＢＰコンセンサス解析
ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺ結合コンセンサスペプチド、ＷＥＴＷＶ（配列番号２２５）のアラニンスキャンをおこなってＰＤＺ結合に対する相対的寄与率を求めた。
ペプチドのＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインに対する結合親和性を競合ＥＬＩＳＡ法を用いてＩＣ５０値として測定した。ＩＣ５０値は固定化したペプチドと結合するＰＤＺドメインの５０％を阻害するペプチドの濃度と定義する。アッセイプレートはマイクロウェルプレートをニュートラビジンで一晩コーティングして準備した。次いで、ＢＳＡを添加してこのプレートをブロッキングし、次いで、アミノ末端をビオチニル化したＷＥＴＷＶ（配列番号２２５）をこのプレートに結合させた。同時に、試験ペプチドとＥＲＢＩＮ  ＰＤＺ−ＧＳＴ  融合タンパク質の希釈シリーズからなる結合反応物を用いて実施した。固定化されたＷＥＴＷＶ（配列番号２２５）でコーティングしたプレートを十分に洗浄し、その後、各結合反応物をウェルへ添加し、短時間インキュベートした。さらなる洗浄の後、抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体およびマウス抗ＧＳＴ  抗体を加えた。次いでこのプレートをＨＲＰ基質とＨ３ＰＯ４で発現させ、４５０ｎｍで読み取った。吸収は最小２乗適合を用いて結合曲線に適合させた。このように種々のペプチドが、ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインがその同族体と結合するのを阻害する能力を測定した。
【０３８１】
アシル化したＷＥＴＷＶ（配列番号２２５）ペプチドのアラニンスキャニングの結果、固定化したＰＤＢＰと結合するＥＲＢＩＮ  ＰＤＺ−ＧＳＴ融合物のあまり強力でない、効力が８．２から６９．３倍低下しているインヒビターであるペプチドが得られた（表５）。
【０３８２】
2004533840.tif 000026
【０３８３】
−１位置でトリプトファンをアラニン、フェニルアラニンまたはチロシンで置換することも、ペプチドがインヒビターとして働く効力を有意に低下させる（表６）；しかしながら、２−ナフチルアラニンはほとんど効果がなかった。
【０３８４】
2004533840.tif 000027
【０３８５】
しかしながら、−３（トレオニン）および−４（グルタミン酸塩）位置を（セリン、バリン、またはトレオニンで）置換すると、効力は低くなるが、−１位置の置換の大部分の程度までではない（表７）。
【０３８６】
2004533840.tif 000028
【０３８７】
末端切断解析によってもまた、配列のほとんどが強力な機能に必要であることが明らかとなった。興味深いことに、アミノ末端のグリシンの欠失により、そのペプチドがアシル化されていても（表８）いなくとも（表９）、野生型よりもさらに強力なペプチドが得られた。
【０３８８】
2004533840.tif 000029
【０３８９】
2004533840.tif 000030
【実施例１４】
【０３９０】
ＰＤＺ結合ペプチドは小分子インヒビターを発見するために使用してもよい
実施例１２．０と同じアッセイを用いて、Ｗ−Ｖ主鎖構造を含む小分子を、そのペプチドに置換し、ＧＳＴ−ＰＤＺドメインの固定化したＷＥＴＷＶ（配列番号２２５）との結合を阻害する能力についてアッセイした。最も有効な化合物を表１０に示し、それらの構造を以下に例示した。
【０３９１】
2004533840.tif 000031
【０３９２】
2004533840.tif 000032
【０３９３】
これらのデータはＰＤＺＢの医薬標的としての有用性を実証する。
【実施例１５】
【０３９４】
種々のＰＤＺドメインのＰＤＢＰの選択
ファージディスプレイ技術を基本的には前記の通りであるが、わずかに改変してさらに用い、種々のＰＤＺドメインのリガンドを選択した（さらなる独立したラウンドのＥＲＢＩＮ  ＰＤＺおよびＭＡＧＩ３  ＰＤＺ３の選択を含む）。便宜には、ペプチドリガンドをランダム化ペプチドのプールから選択した。ファージ提示されたペプチドプールは線状で、厳しくランダム化された７量体、８量体、９量体、１０量体、および１２量体を等量含み、理論上の多様性は３×１０１０であった。ペプチドは、ランダム化されたペプチドのＣ末端が遊離型で結合に利用できるようにＭ１３ファージメジャーコートタンパク質と融合させた。ＰＤＺドメインをＧＳＴ融合物（本実施例中では単に「ＰＤＺドメイン」と呼ぶ）として利用した。各ＰＤＺドメイン標的を含んでなる特定のアミノ酸を表１１〜２９の見出しに示した。
【０３９５】
１７種（ＥＲＢＩＮを含めて１８種）のＰＤＺドメインについてペプチドリガンドを選択し、同定した。結果を以下の表１１〜２９にまとめている。各表には０  から−７の位置に各アミノ酸残基が出現する、特定のＰＤＺドメインに選択されたペプチドの一覧を示す（表示の通り；場合によっては、位置−８も含める；「−」は未決定残基を示し、したがってどのアミノ酸でもあり得る）。各表の末尾には、各アミノ酸残基の出現率を該当する位置での残基の総計のパーセンテージとして表した。同胞（２以上のコピーとして現れる同一のＤＮＡを持つペプチド）は別個として計数した。出現回数をコドン使用について修正した。相対的なコドン使用を各表の下部の見出しにある各アミノ酸の後に示す。「ｎ」は配列の数を示し（同胞は別個として計数した）、出現値はこれを基にし、この数はまたコドン使用に関して標準化して示されている。
【０３９６】
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【０３９７】
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【０３９８】
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【０３９９】
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【０４００】
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【０４０１】
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【０４０２】
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【０４０３】
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【０４０４】
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【０４０５】
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【０４０６】
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【０４０７】
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【０４０８】
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【０４０９】
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【０４１０】
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【０４１１】
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【０４１２】
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【０４１３】
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【実施例１６】
【０４１４】
ＰＤＺドメインの同族リガンドの配列データベースの解析
実施例１５．０に記載されたファージ選択されたペプチド配列に基づく各ＰＤＺドメイン標的のＣ末端コンセンサス配列を作製した。コンセンサス配列は、例えばファージ選択されたペプチドに共通して存在する残基間のアミノ酸残基の類似性に基づいて導けばよい。例えば、ＤＥＴＶ＄などの配列には［ＤＥ］［ＤＥ］［ＳＴ］［ＶＩＬ］＄のパラメーター配列を用いればよいが、これは負に荷電したＤとＥが類似のアミノ酸であり、アルコール性残基ＳとＴが類似のアミノ酸であり、芳香族残基Ｗ、ＹおよびＦが類似であり、正に荷電したＲ、ＨおよびＫが類似のアミノ酸であるためである。次いで、検索結果を、特定のＣ末端配列を含むヒト配列に限定した。最終的に、相当する（ファージディスプレイ選択標的として）ＰＤＺドメインを含む標的タンパク質の生物学的機能（例えば、局在、組織発現パターンをはじめとする）に対する機能の類似性に基づいてリガンドを選定した。次いでこれらの配列を図１１に例示するプロテオームモチーフデータベースで検索した。図１１では、各標的ＰＤＺドメインの最初の行がファージ選択されたペプチド配列の配列の概要を示し、２行目／３行目はデータベース検索に用いた拡張配列を示す。拡張配列は前記の基準に基づいて決定した。
【実施例１７】
【０４１５】
選択されたＰＤＢＰの配列に基づくペプチドの結合親和性の解析
前記のように選択したペプチドの配列から得た情報は多様な目的に有用であり得る。例えば、ペプチド配列中の特定の残基のそのペプチドの１以上のＰＤＺドメインとの結合親和性への寄与を調べるために用いてもよい。構造活性相関はこのように調べればよい。特定のＰＤＺドメインに対してより高いまたはより低い結合親和性を持つバインダーの設計も前記のように選択したＰＤＢＰの配列を基にすればよい。ファージディスプレイ選択されたＰＤＢＰの配列と同一性が完全（１００％）よりも低い配列を含むペプチドを設計し、それらの注目するＰＤＺドメインとの結合能を本明細書に記載のように調べてもよい。
【０４１６】
配列の変化および／またはＮ末端残基の修飾（アセチル化による）を含む種々のペプチドを種々のＰＤＺドメインに対して試験した。結合親和性測定はＩＣ５０値を基にした。これを図１２に示す。
【０４１７】
図１２では、試験したペプチドの配列は（１）選択されたファージバインダーの配列（「Ｐｈａｇｅ  ｓｅｌ．」）；（２）選択されたファージバインダーから導いた、または選択されたファージバインダー配列を基にした配列（「Ｐｈａｇｅ  ｄｅｒ．」）；（３）ファージング（ｐｈａｇｉｎｇ）結果に基づく、理論上最適なバインダーの配列（「Ｐｈａｇｅ  ｏｐｔ．」）；（４）構造活性相関についての情報を得るのに適した設計（「ＳＡＲ」）；および／または（５）予測した同族リガンドの配列、に基づいて設計した。「ＮＡＣ」とはＮ末端残基のアセチル化をさす。「レセプター」とは、それに対して試験ペプチドの結合親和性を調べる標的ＰＤＺドメインをさす。「Ｂｉｏｔ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ」とはビオチニル化したペプチドをさす。
【０４１８】
ＩＣ５０アッセイ
すべての試験ペプチドはまず、ビオチニル化したペプチドの対応するレセプターとの結合を阻害するその能力について４００ｕＭで試験した。４０％を越える阻害を示したペプチドを、次にＩＣ５０値の測定のため濃度を変化させて再試験した。これを図１１に示す。示した値は各ペプチド／レセプターについての３データ点の平均である。
【０４１９】
均質結合アッセイを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｒｉｄｅｎ，  ＣＴ，  ＵＳＡ）製の３８４ウェルＯｐｔｉｐｌａｔｅｓまたはＮａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，  ＩＬ，  ＵＳＡ）製の３８４ウェルＮＵＮＣＴＭ  ホワイトアッセイプレートのどちらかで実施した。表３０に記載した試薬濃度を含有する反応混合物は、０．１％  ウシγグロブリン；０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０および１０ｐｐｍプロクリンｐｈ７．４を含むアッセイバッファー（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））で調製した。１５ｕｌのこの混合物を各ウェルに加えた。各サンプルを２０％ＤＭＳＯアッセイバッファーで希釈して２ｍＭとした。希釈した試料のアリコート５ｕｌを、１５ｕｌの反応混合物を含む各ウェルに加えた。室温にて暗所で１時間、ゆっくりと攪拌しながら反応を進行させた。５ｕｌのドナービーズ（１００ｕｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、暗所で２時間インキュベートを続けた。得られたプレートをＰａｃｋａｒｄ  ＡｌｐｈａＱｕｅｓｔ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍｅｒｉｄｅｎ，  ＣＴ，  ＵＳＡ）で読み取った。これは励起波長６８０ｎｍおよび発光波長５２０〜６２０ｎｍでの時間分解蛍光プレートリーダーである。
【０４２０】
４０％を越える阻害を示すペプチドはまず、２０％ＤＭＳＯアッセイバッファー中、ｌｍＭの濃度に調製した。２０％ＤＭＳＯアッセイバッファー中の１：３希釈シリーズを用いてさらに２３の希釈液を作製してペプチド（サンプル）につき合計２４の希釈液とした。これらの希釈サンプルの各５ｕｌを反応混合物１５  ｕｌを含む各ウェルに加えた。アッセイは前記の通り実施した。
【０４２１】
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【０４２２】
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【図面の簡単な説明】
【０４２３】
【図１】Ｐ８のカルボキシル末端に融合されたペンタＨｉｓＦＬＡＧペプチドのファージディスプレイ。ＦＬＡＧは種々の長さのポリグリシンリンカーの介入によってＰ８と結合した。ファージ溶液（１．３ｘ１０１２ファージ／ｍｌ）を抗テトラＨｉｓ抗体でコーティングしたウェルで（○）、または負の対照としてＢＳＡでコーティングしたウェル（□）でインキュベートして、ペンタＨｉｓＦＬＡＧを提示するファージを捕獲した。結合したファージをファージＥＬＩＳＡで検出した。光学密度は結合したファージ量に比例し、したがって、ペプチドディスプレイレベルの尺度となる。
【図２】高親和性ペプチドリガンドＧＶＴＷＶ（配列番号２４０）との複合体中のＰＤＺ２の相同性モデル。Ａは、ＰＳＤ−９５の第３のＰＤＺドメイン（タンパク質データバンクコード１ＢＥ９）およびｄｉｓｃｓ−ｌａｒｇｅタンパク質のヒト相同体（タンパク質データバンクコード１ＰＤＲ）およびシントロフィンのＰＤＺドメイン（タンパク質データバンクコード２ＰＤＺ）およびニューロン性一酸化窒素シンターゼ（タンパク質データバンクコード１Ｂ８Ｑ）とのＰＤＺ２の配列アラインメント。番号付けはＰＤＺ２モデル構造に対応している。二次構造エレメントがアラインメントの下部に矢印（βストランド）および矩形（αへリックス）で示されている。Ｂは、相同性モデル。上部左側、モデルＰＤＺ２／ＧＶＴＷＶ（配列番号２４０）複合体のリボン表示。二次構造エレメントが表示されている。破線の楕円は拡大された領域を示す。右側、β２、β３、α２およびペプチドリガンドの拡大。ペプチド側鎖は球および棒表示で示されている。ちなみに、Ｐ（−１）では、ＰＳＤ−９５−３／ＫＱＴＳＶ結晶構造のリガンドのＳｅｒ側鎖が示され、水素結合が白色の破線として示されている。いくつかのタンパク質側鎖は明快にするために省略されている。下部左側、テトラペプチドリガンドの４残基各々のＰＤＺドメイン結合部位の概略図。これまでに記載された残基Ｐ（０）およびＰ（−２）との相互作用に加え、この概略図には提案されたＰ（−１）およびＰ（−３）のペプチド側鎖とβ３ストランドのＰＤＺ側鎖間の相互作用も示されている。
【図３】モデルＰＤＺ２−ＧＶＴＷＶ（配列番号２４０）複合体の分子表面。結合親和性および／または選択性を付与されたタンパク質残基が示されている。
【図４】ＭＡＧＩ−３のＰＤＺ２またはＰＤＺ３に対してファージによって選択されたペプチドが、それに対してファージによって選択されたＰＤＺドメインには特異的に結合し、その他のＰＤＺドメインには結合しない。
【図５】ＭＡＧＩ−３  ＰＤＺ２に対してファージによって選択されたペプチドは生存Ｃａｃｏ−２細胞においてタイトジャンクションを標的とする。
【図６】δ−カテニンはＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインと結合し、この相互作用の重要な構成要素はそのＣ末端によって媒介される。
【図７】ＥＲＢＩＮ  ＰＤＺドメインはインビボでδ−カテニンと関連がある。
【図８】ＰＤＺペプチドリガンドの（−３）位での単一のアミノ酸の変化はその結合特異性を変更する。
【図９】ＭＡＧＩ−３（配列番号２００）のアミノ酸配列。
【図１０】ＥＲＢＩＮ（配列番号２０１）のアミノ酸配列。
【図１１Ａ】コンセンサス配列およびファージによって選択されたペプチド配列に基づいて拡張された配列を用いるデータベース検索パラメーターの例示。
【図１１Ｂ】コンセンサス配列およびファージによって選択されたペプチド配列に基づいて拡張された配列を用いるデータベース検索パラメーターの例示。
【図１２】種々のペプチドのＰＤＺドメインに対する結合親和性を示すＩＣ５０値。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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