(57)【要約】本発明は、硬皮症、特に全身性硬化症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のためのＳＡＲＰ−１の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＳＡＲＰ−１受容体に結合してシグナリングを開始させる物質、又は内因性ＳＡＲＰ−１の放出を刺激してその活性を強化する物質の、硬皮症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための使用。
【請求項２】
硬皮症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、
（ａ）成熟ＳＡＲＰ−１；
（ｂ）配列番号：２を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸２１から２９５を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸２４から２９５を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号：２のアミノ酸２５から２９５を含むポリペプチド；
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸２６から２９５を含むポリペプチド；
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸２７から２９５を含むポリペプチド；
（ｈ）配列番号：２のアミノ酸２８から２９５を含むポリペプチド；
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸３７から２９５を含むポリペプチド；
（ｊ）アミノ酸配列が（ａ）から（ｉ）の配列の少なくとも一つに対して少なくとも４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％同一性を有する、（ａ）から（ｉ）の何れかの変異蛋白質；
（ｋ）中度のストリンジェント条件下又は高度のストリンジェント条件下で（ａ）から（ｉ）の何れかをコードする天然ＤＮＡ配列の相補体にハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされる、（ａ）から（ｉ）の何れかの変異蛋白質；
（ｌ）アミノ酸配列の何らかの変化が（ａ）から（ｉ）のアミノ酸配列に対して保存的なアミノ酸置換である、（ａ）から（ｉ）の何れかの変異蛋白質；
（ｍ）（ａ）から（ｌ）の何れかの塩、アイソフォーム、融合蛋白質、機能性誘導体、活性画分、循環性入れ替わり誘導体
からなる群から選択される物質の使用。
【請求項３】
物質が一つ又は複数の部位においてグリコシル化されている、請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
融合した蛋白質がイムノグロブリン（Ｉｇ）融合を含む、請求項１乃至３の何れか１項記載の使用。
【請求項５】
機能性誘導体がアミノ酸残基上の一つ又は複数の側鎖として生じる一つ又は複数の官能基に結合した少なくとも一つのモイエティを含む、請求項２乃至４の何れか１項記載の使用。
【請求項６】
モイエティがポリエチレンモイエティである、請求項５記載の使用。
【請求項７】
硬皮症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、
（ａ）成熟ＳＡＲＰ−１；
（ｂ）配列番号：２を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸２１から２９５を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸２４から２９５を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号：２のアミノ酸２５から２９５を含むポリペプチド；
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸２６から２９５を含むポリペプチド；
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸２７から２９５を含むポリペプチド；
（ｈ）配列番号：２のアミノ酸２８から２９５を含むポリペプチド；
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸３７から２９５を含むポリペプチド；
（ｊ）アミノ酸配列が（ａ）から（ｉ）の配列の少なくとも一つに対して少なくとも４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％同一性を有する、（ａ）から（ｉ）の何れかの変異蛋白質；
（ｋ）中度のストリンジェント条件下又は高度のストリンジェント条件下で（ａ）から（ｉ）の何れかをコードする天然ＤＮＡ配列の相補体にハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされる、（ａ）から（ｉ）の何れかの変異蛋白質；
（ｌ）アミノ酸配列の何らかの変化が（ａ）から（ｊ）のアミノ酸配列に対して保存的なアミノ酸置換である、（ａ）から（ｉ）の何れかの変異蛋白質；
（ｍ）（ａ）から（ｌ）の何れかの、アイソフォーム、又は活性画分
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む核酸分子の使用。
【請求項８】
硬皮症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、請求項７記載の核酸分子を含むベクターの使用。
【請求項９】
ベクターが発現ベクターである、請求項８記載の使用。
【請求項１０】
ベクターが遺伝子治療用ベクターである、請求項８又は９記載の使用。
【請求項１１】
硬皮症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、細胞中の請求項１又は２記載のポリペプチドの内因性生産を誘導及び／又は増強するためのベクターの使用。
【請求項１２】
硬皮症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、請求項８乃至１１の何れか１項記載のベクターを含む細胞の使用。
【請求項１３】
硬皮症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、請求項１乃至４の何れか１項記載の物質を発現する細胞の使用。
【請求項１４】
硬皮症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための、請求項１乃至４の何れか１項記載のポリペプチドを生産するために遺伝子を修飾された細胞の使用。
【請求項１５】
硬皮症が全身性硬化症である、請求項１乃至１４の何れか１項記載の使用。
【請求項１６】
医薬が、さらに、同時、連続又は別々の使用のための、インターフェロンを含む、請求項１乃至１５の何れか１項記載の使用。
【請求項１７】
インターフェロンがインターフェロン−βである、請求項１６記載の使用。
【請求項１８】
医薬が、さらに、同時、連続又は別々の使用のための、腫瘍ネクローシス因子（ＴＮＦ）アンタゴニストを含む、請求項１乃至１７の何れか１項記載の使用。
【請求項１９】
ＴＮＦアンタゴニストがＴＢＰＩ又はＴＢＰＩＩである、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
医薬が、さらに、同時、連続又は別々の使用のための、抗硬皮症剤を含む、請求項１乃至１９の何れか１項記載の使用。
【請求項２１】
抗硬皮症剤が、ＡＣＥ阻害剤、カルシウムチャネルブロッカー、プロトンポンプ阻害剤、ＮＳＡＩＤｓ，ＣＯＸ−阻害剤、コルチコステロイド、テトラサイクリン、ペントキシフィリン、ブシルアミン、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ阻害剤、ロッテリン、プロピル−４−ヒドロキシラーゼ阻害剤、ｃ−プロテイナーゼ阻害剤、リジルーオキシダーゼ阻害剤、レラキシン、ハロフギノン、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、エンドセリン−１、一酸化窒素、アンギオテンシンＩＩ阻害剤及び抗酸化剤からなる群から選択される、請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
硬皮症、特に全身性硬化症の治療及び／又は予防のための、任意に一つ又は複数の薬学上受容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を伴う、請求項７乃至１１の何れか１項記載の核酸分子を含むベクターを含む薬学組成物。
【請求項２３】
硬皮症、特に全身性硬化症の治療及び／又は予防のための、任意に一つ又は複数の薬学上受容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を伴う、請求項１乃至４の何れか１項記載のポリペプチドを発現する細胞を含む薬学組成物。
【請求項２４】
ＡＣＥ阻害剤、カルシウムチャネルブロッカー、プロトンポンプ阻害剤、ＮＳＡＩＤｓ，ＣＯＸ−阻害剤、コルチコステロイド、テトラサイクリン、ペントキシフィリン、ブシルアミン、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ阻害剤、ロッテリン、プロピル−４−ヒドロキシラーゼ阻害剤、ｃ−プロテイナーゼ阻害剤、リジルーオキシダーゼ阻害剤、レラキシン、ハロフギノン、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、エンドセリン−１、一酸化窒素、アンギオテンシンＩＩ阻害剤及び抗酸化剤からなる群から選択される抗硬皮症剤と組み合わせた、請求項１乃至６の何れか１項記載の物質を含む薬学組成物。
【請求項２５】
請求項１乃至６の何れか１項記載の物質を有効量、任意に薬学上受容可能な担体と共に、それが必要な患者に投与することを含む、硬皮症、特に全身性硬化症を治療及び／又は予防する方法。
【請求項２６】
請求項２２乃至２４の何れか１項記載の薬学組成物をそれが必要な患者に投与することを含む、硬皮症、特に全身性硬化症を治療及び／又は予防する方法。
【請求項２７】
物質又は薬学組成物が全身投与される、請求項２５又は２６記載の方法。
【請求項２８】
物質又は薬学組成物が筋肉内注射により投与される、請求項２５乃至２７の何れか１項記載の方法。
【請求項２９】
物質又は薬学組成物が吸入により投与される、請求項２５乃至２８の何れか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、硬皮症の分野における。より特定すれば、発明は、硬皮症、特に全身性硬化症の治療及び／又は予防のためのＳＡＲＰ−１の使用に関する。
発明の背景
硬皮症は、皮膚及び内部器官の繊維症により特徴付けされる関節の組織の疾患であり、器官不全及び死を導く（Ｂｌａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｆｕｒｓｔ，１９９６）。硬皮症は、症状のある範囲及び様々な治療上の意味を有する。それは、局所性硬皮症、全身性硬化症、硬皮症様疾患、及びサイン（Ｓｉｎｅ）硬皮症を含む（Ｓｍｉｔｈ，２０００）。局所性の硬皮症は、繊維症に付随した稀な皮膚科学上の疾患であって、皮膚に限定された症状であるが、全身性の硬化症は、皮膚疾患の程度において内部器官の関与及びバリエーションに関して変更可能な危険度を伴う複数の体系の疾患である。全身性硬化症は拡散するか又は限定され得る。限定された全身性硬化症はＣＲＥＳＴ（石灰沈着性レイノー食道性機能不全、指硬化症、毛細管拡張症）とも呼ばれる。硬皮症様疾患は、工業的環境の暴露に関連すると信じられる。サイン硬皮症においては、皮膚の変化なしに内部器官の関与がある。
【０００２】
硬皮症及び特に全身性硬化症の主な症状は、不適当な過剰なコラーゲンの合成及び沈着、内皮機能不全、痙攣、衰弱及び繊維症による閉塞である。
【０００３】
硬皮症は、百万人あたり約１９ケースの安定した発生率の稀な疾患である。硬皮症の原因はわかっていない。しかしながら、遺伝的素因が重大である。異常性は、自己免疫及び内皮細胞及び繊維芽細胞の機能の変化を含む。事実、全身性硬化症は、おそらく診断から５年以内で５０％の死亡率のもっとも重度の自己免疫疾患である（Ｓｉｌｍａｎ，１９９１）。
【０００４】
診断に関しては、重要な臨床上のパラメーターは、中手指節関節に近位の皮膚の濃厚化である。レイノー現象は、硬皮症の頻繁でほとんど共通の成分である。寒さへの暴露に際しての皮膚の色の変化により診断される。貧血及び皮膚の濃厚化はレイノー疾患の兆候である。
【０００５】
いくつかの根源的な生物学上のプロセスは、疾患の開始、重度及び進行に関係し、そして血管の機能不全、内皮細胞の活性化、損傷、白血球の蓄積、自己抗体産生、及び、重大なのは、制御されない繊維の応答を含み、死を導くかもしれない（Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｆｒｕｓｔ，１９９６）。繊維芽細胞はこの疾患の病因において中心の役割を有する。硬皮症の患者から得た一次繊維芽細胞は、生体内で観察される上記疾患の多くの特徴的な特性、特に増加した細胞外マトリックス、特にコラーゲン及びフィブロネクチンの合成及び沈着、及び変更された成長因子及びサイトカイン、例えばＴＧＦβ及びＣＴＧＦの生産を呈する（Ｓｔｒｅｈｌｏｗ  ａｎｄ  Ｋｏｒｎ，１９９８  ａｎｄ  ＬｅＲｏｙ，１９７４）。
【０００６】
硬皮症に治癒力のある治療はない。提案された革新的であるが危険性の高い治療は自己幹細胞移植である（Ｍａｒｔｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。特に、繊維症のプロセスを標的とする硬皮症については現在治療法がない（Ｗｉｇｌｅｙ  ａｎｄ  Ｂｏｌｉｎｇ，２０００）。
【０００７】
疾患の危険性及び硬皮症の進行に関連した遺伝子の同定は、疾患の様々な段階における干渉のための有効な戦略の展開を導くかもしれない。
【０００８】
ＳＡＲＰ−１（分泌されたアポトーシス関連蛋白質１）は、７回膜貫通受容体の縮んだファミリーに見いだされるシステインリッチドメイン（ＣＲＤドメイン）に対するそれらの相同性に基づいて、分泌された縮れた関連する蛋白質として知られる分泌蛋白質のファミリーのメンバーである（Ｒａｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。縮れた蛋白質はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａにおいて初めて同定されて組織の極性を制御する（Ａｄｌｅｒ  ｅｔａｌ．，１９８７）。縮れた蛋白質は、胚発生の間に細胞と細胞の相互作用を制御する少なくとも１６の分泌されたシグナル分子の高度に保存されたＷｎｔファミリーの受容体である（Ｓｍａｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｄａｌｅ，１９９９）。Ｗｎｔ作用の機構への洞察はいくつかの系から現れた：Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ及びＣ．ｅｌｅｇａｎｓの遺伝学；細胞培養の生化学；及びＸｅｎｏｐｕｓの胚の異所性遺伝子発現。マウスの多くのＷｎｔ遺伝子は変異しており、極めて特定の発生上の欠陥を導く。Ｗｎｔシグナリング経路はＷｎｔと縮れた蛋白質の相互作用により引き起こされ、いくつかの細胞質性リレー成分を通して仲介され、そしてマルチ蛋白質β−カテニンの代謝回転複合体の活性を抑圧するように機能し、即ち、サイトゾルのβ−カテニンのビルドアップを可能にして、次に核に背離、そしてＴＣＦと複合体を形成することによりＷｎｔ標的遺伝子の転写を活性化する（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｋｕｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０００９】
Ｗｎｔ−縮れた相互作用は、別のＷｎｔ結合蛋白質、分泌された縮れた関連蛋白質（ｓＦＲＰ）の制限された発現を通して変調されるかもしれない。ＳＦＲＰｓはＮ−末端ＣＲＤドメインを通して結合することができる。それらは、よって、その受容体からＷｎｔを隔離することができ、それによりその作用をアンタゴナイズする（Ｂａｆｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。
【００１０】
ＳＡＲＰ−１はいくつかの別の名前、例えばＳＤＦ−５，ＰＲＯ６９７，ＡＴＧ−１６２２，ＨＬＨＤＹ３１，ＳＦＲＰ−２で知られている。マウス又はヒト濃縮ＳＡＲＰ−１の一部又は完全な長さの蛋白質及び／又は核酸配列がいくつかの特許出願、例えば、ＷＯ  ９８／３５０４３，ＷＯ  ９８／１３４９３，ＥＰ  ０  ８７９  ８８７，ＷＯ  ９９／４６２８１において記載された。
【００１１】
機能に関しては、分泌された縮れた関連蛋白質（ＳＦＲＰｓ）が、分泌されたＷｎｔリガンドに関して膜結合の縮れた受容体と競合することにより、Ｗｎｔシグナリングの可溶性変調因子として作用するらしい。ＳＡＲＰ−１は別として、これまでに知られているこのファミリーのヒトの蛋白質は、ＳＡＲＰ−２（ＳＦＲＰ−１）及びＳＡＲＰ−３（ＳＦＲＰ−５）を含む。マウスのＳＡＲＰ−１及びヒトのＳＡＲＰｓ−２及び−３は、細胞をアポトーシスに感作するか、又はアポトーシス応答を阻害するかのいずれかの能力を有すると記載された（Ｍｅｌｋｏｎｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。胸部アデノカルシノーマ細胞系において発現させた場合に、マウスＳＡＲＰ−１及びヒトＳＡＲＰ−２は、前アポトーシス（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）刺激に対する細胞の感受性に対して反作用を呈した。ＳＡＲＰ−１有する細胞は高い耐性を有するが、ＳＡＲＰ−２を発現する細胞は、腫瘍ネクローシス因子及びセラミドにより誘導されたアポトーシスに感作された。ＳＡＲＰ−１又はＳＡＲＰ−２の発現は、Ｗｎｔ媒介性シグナルトランスダクションのインディケーターであるβ−カテニンの細胞内レベルを修飾したことから、ＳＡＲＰｓはＷｎｔの縮れたシグナリング経路を干渉することが示唆される（Ｍｅｌｋｏｎｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００１２】
ノーザンブロット分析は、ＳＡＲＰ遺伝子が別の発現パターンを有することを明らかにした（Ｌｅｉｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＳＡＲＰ−１は２．２−及び１．３−ｋｂ転写物としていくつかのヒト組織に存在し、結腸及び小腸においてもっとも高いレベルである。Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９は、ＳＡＲＰ−１又はＳＡＲＰ−２がウシの網膜において内部核層にわたり高度にかつ選択的に発現されることを報告した。網膜内では、ＳＡＲＰ−３又はＳＡＲＰ−５が網膜色素上皮において特異的に発現される。
【００１３】
体細胞ハイブリッドの分析から、Ｍｅｌｋｏｎｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）は、ＳＡＲＰ−１遺伝子をヒトの第４染色体にマップした。Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）は、放射ハイブリッド分析を用いて、マップ位置を４ｑ３１．３に細かく区別した。
【００１４】
変更されたＳＡＲＰ−１の発現が癌と関連するとの準備的な（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）証拠もある。
【００１５】
発明の概要
発明は、硬皮症の確立された動物モデルにおけるＳＡＲＰ−１の有益な効果の発見に基づく。
【００１６】
よって、発明の第１の目的は、硬皮症、特に全身性硬化症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のためにＳＡＲＰ−１を使用することである。発明の第２の目的は、硬皮症、特に全身性硬化症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のために、ＳＡＲＰ−１発現細胞又はＳＡＲＰ−１のコーディング配列を含む発現ベクターを使用することである。ＳＡＲＰ−１を含む薬学組成物及びヒト体内へＳＡＲＰ−１を投与することを含む治療方法も本発明の範囲内である。
【００１７】
発明の記載
本発明によれば、分泌された蛋白質ＳＡＲＰ−１の発現が対照細胞に比較した場合に、硬皮症の患者由来の疾患繊維芽細胞において有意に低いことを見いだした。ＤＮＡ遺伝子フィルターマイクロアレイ技術を使用することにより、硬皮症の患者から得た繊維症の病変から単離された皮膚繊維芽細胞内で分化により発現された遺伝子を、同じ患者からの皮膚の臨床上罹患していないエリアから単離された繊維芽細胞との比較により、同定した。ＳＡＲＰ−１の発現は病変繊維芽細胞において試験された７人の患者のうち５人においてダウン制御された。これに加えて、硬皮症の患者からの異常な皮膚の全検体標本から単離された全ＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ分析は、臨床上正常な、年齢、性別、及び解剖学上の部位に適合した対照検体と比較して、ＳＡＲＰ−１  ｍＲＮＡの低いレベルを示した。
【００１８】
上記の結果の支持として、遺伝子フィルターマイクロアレイ上に含まれた遺伝子の全ての発現レベルを比較した統計学上の方法は、ＳＡＲＰ−１のダウン制御が上記患者の繊維症病変に９５％の可能性で関連することを示したことから、上記疾患の臨床上の進行との関連を示唆する。
【００１９】
硬皮症におけるＳＡＲＰ−１の有益な効果を、よく確立された硬皮症のマウスモデル、ブレオマイシン誘導された肺繊維症のモデルにおいて確認した。このモデルにおいて、ＳＡＲＰ−１発現細胞の投与は肺の繊維症の比率を顕著に減少させた。
【００２０】
よって、発明は、ヒトＳＡＲＰ−１受容体に結合してＳＡＲＰ−１受容体のシグナリングを開始させる物質又は内因ＳＡＲＰ−１の放出を刺激するか又は活性を強化する物質の、硬皮症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための使用に関する。上記物質は、ＳＡＲＰ−１自体であるか又はＳＡＲＰ−１受容体に結合してＳＡＲＰ−１のシグナリングを開始させるあらゆるＳＡＲＰ−１断片、並びにＳＡＲＰ−１受容体のさらなる別のアゴニスト、例えば、ＳＡＲＰ−１受容体に向けられたアゴニスト性抗体又はそれに特異的な化学物質アゴニストであってよい。
【００２１】
ＳＡＲＰ−１に関して示唆された受容体はｗｎｔ−蛋白質であり、仮想上、ＳＡＲＰ−１のシステインリッチの縮れた（ｆｒｚ）ドメインに結合する（ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。発明による物質は、よって、そのシステインリッチの縮れたドメインを含むＳＡＲＰ−１の断片であってもよい。
【００２２】
好ましくは、硬皮症の治療及び／又は予防に使用される物質は、
（ａ）成熟ＳＡＲＰ−１；
（ｂ）配列番号：２を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸２１から２９５を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸２４から２９５を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号：２のアミノ酸２５から２９５を含むポリペプチド；
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸２６から２９５を含むポリペプチド；
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸２７から２９５を含むポリペプチド；
（ｈ）配列番号：２のアミノ酸２８から２９５を含むポリペプチド；
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸３７から２９５を含むポリペプチド；
（ｊ）アミノ酸配列が（ａ）から（ｉ）の配列の少なくとも一つに対して少なくとも４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％同一性を有する、（ａ）から（ｉ）の何れかの変異蛋白質；
（ｋ）中度のストリンジェント条件下又は高度のストリンジェント条件下で（ａ）から（ｉ）の何れかをコードする天然ＤＮＡ配列の相補体にハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされる、（ａ）から（ｉ）の何れかの変異蛋白質；
（ｌ）アミノ酸配列の何らかの変化が（ａ）から（ｉ）のアミノ酸配列に対して保存的なアミノ酸置換である、（ａ）から（ｉ）の何れかの変異蛋白質；
（ｍ）（ａ）から（ｌ）の何れかの塩、アイソフォーム、融合蛋白質、機能性誘導体、活性画分、循環性入れ替わり誘導体
からなる群から選択される。
【００２３】
ヒトＳＡＲＰ−１の完全長のｃＤＮＡをクローン化して、図５及び添付の配列表の配列番号：１に描写する。対応するアミノ酸配列を図５及び添付の配列表の配列番号：２に描写する。以下の実施例に示すとおり、ＳＡＲＰ−１のＮ−末端は高度に不均一であることがわかった。ＳＡＲＰ−１のシグナルペプチドは、配列番号：２のアミノ酸２５から２９５又はアミノ酸２１から２９５の何れかにまたがると予測された。ＨＥＫ細胞において発現された精製組換えヒトＳＡＲＰ−１のＮ−末端配列は、さらに、配列番号：２のアミノ酸２４、２５、２６、２７、２８又は３７から始まる成熟ＳＡＲＰ−１のＮ−末端配列リーディングを明らかにした。
【００２４】
本明細書にて使用される用語「ＳＡＲＰ−１」は、（ａ）から（ｍ）において上で考究された物質の何れか又は全てに関する。
【００２５】
本明細書にて使用される用語「治療及び／又は予防」は、疾患の形成、発症、進行の、又は上記疾患のいくつか又はすべの何れか一つの形成、発症、進行の、あらゆる終結、減少又は一部、実質上又は完全な予防又はブロックを包含する。
【００２６】
本明細書にて使用される用語「硬皮症」は、如何なる分類及び定義、並びに一つ又は複数の硬皮症の兆候を含み序論において詳細に記載されたとおりである。用語「硬皮症」は、さらに、硬皮症に付随することが知られている疾患に関し、例えば引用により本明細書に完全に編入されるＳｍｉｔｈ（２０００）に記載されたような疾患である。
【００２７】
本明細書にて使用される用語「硬皮症」は、さらに、繊維症疾患、例えば、肝硬変、間質性肺繊維症、デユピュイトラン（Ｄｕｐｕｙｔｒｅｎ’ｓ）痙縮、ケロイド及び他の瘢痕／創傷治癒異常、述後癒着及び反応性繊維症、並びに慢性心臓病、特に心筋梗塞を含む。発明は、繊維症、例えば上でリストされた疾患の治療及び／又は予防のための医薬の製造のためのＳＡＲＰ−１の使用に関する。
【００２８】
さらに、ＳＡＲＰ−１により治療可能な疾患及び障害は、創傷治癒疾患、特に肺の創傷治癒を含み、肺の完成の炎症及び肺表面の根本的な繊維症又は瘢痕を含む。肺の炎症を含む障害は、例えば、特発性肺繊維症、サルコイドーシス、気管支肺異常形成、繊維増殖性（ｆｉｂｒｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ）ＡＲＤＳ、並びに、肺健在性疾患又は全身性疾患、例えば、慢性関節リウマチを含む（Ｋｒｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００２９】
用語「硬皮症」は、好ましくは、局所性、全身性、限定性及び拡散性硬皮症に関する。
【００３０】
局所性硬皮症は、主に皮膚に影響するが、根源的な筋肉及び骨にも影響するかもしれない。しかしながら、それは、内部の器官には影響しない。局所性の硬皮症は相対的に穏やかであり、そして類似の表在兆候、例えば顕微鏡下での皮膚検体の出現に特有の全身性硬皮症に関連するかもしれない。
【００３１】
全身性硬皮症は、兆候のいくつかの種類又は兆候のいくつかの群、例えば、ＣＲＥＳＴ、限定性及び拡散性を含む。全身性硬皮症は全身性硬化症としても知られる。それは、進行性全身性硬化症又は家族性進行性全身性硬化症とも呼んでよい。全身性硬皮症は、例えば、皮膚、血管、及び／又は内部器官に影響するかもしれない。皮膚に影響する場合、皮膚を硬くし、もっとも共通には手及び／又は顔に及ぶ。血管に影響する場合、レイノー病を引き起こし得る。全身性硬化症のもっとも重度の形態は、内部器官に影響し、そして能力障害及び死さえ引き起こすかもしれない。とりわけ、全身性硬化症は：硬皮症性肺疾患、硬皮症性腎臓急性発症、心臓顕在化、疲労性ＣＲＥＳＴ及び限定性ＣＲＥＳＴを含む筋肉虚弱、末梢神経系及び自律神経系を含む。神経系の異常に関しては、手根トンネル症候群、続く三叉神経痛がもっとも共通である。
【００３２】
限定性硬皮症は手に限定してよいが、顔と首も含めてよい。
【００３３】
拡散性硬皮症は、締めることを含み、手首（又はひじ）の上にも生じる。拡散性全身性硬化症、例えば「硬皮症サイン硬皮症」のいくつかの下位区分があり、内部器官の繊維症があるが、皮膚の締めはなく；そして家族性進行性硬化症は家族に起こる稀な形態である。
【００３４】
オーバーラップする症候群は、硬皮症患者が他の自己免疫疾患も有するならば（例えば、踉蹌、慢性関節リウマチ等）、例えば踉蹌とオーバーラップして拡散性硬皮症におけるように、注目される。硬皮症の兆候は、混合された関節組織疾患（ＭＣＴＤ）又は非分化関節組織疾患（ＵＣＴＤ）の一部でもあり得る。
【００３５】
本明細書にて使用される用語「ＳＡＲＰ−１」は、そのような蛋白質の命名に拘わらず、配列番号：２（ヒト）及び配列番号：５（マウス）の配列の全部又は一部を含む蛋白質に関し、限定ではないが、別の公知の命名、ＳＤＦ−５，ＰＲＯ６９７，ＡＴＧ−１６２２，ＨＬＨＤＹ３１，ＳＦＲＥ−２又はＦＲＰ−２、並びにその塩、アイソフォーム、融合蛋白質、機能性誘導体、活性画分、循環性入れ替わり誘導体を含む。
【００３６】
好ましくは、用語「ＳＡＲＰ−１」は、シグナルペプチドを欠く成熟蛋白質を意味する。シグナルペプチドは、配列番号：２において定義された最初の２０又は最初の２３、２４、２５、２６、２７又は３６アミノ酸を含むと予測され、成熟蛋白質は配列番号：２のアミノ酸２１から１９５又は２４、２５、２６、２７、２８又は３７から２９５の何れかを含むはずである。
【００３７】
下の図６に示すとおり、ＳＡＲＰ−１のヒトアミノ酸配列はマウスの配列（配列番号：５）に高度に相同性である。よって、蛋白質がその生物活性を呈することを可能にさせることに関して、蛋白質間の十分に高い同一性が、ヒトにおける実質上の免疫応答を排除することなく、存在する限りは、マウスのＳＡＲＰ−１は発明に従い使用してもよく、並びに他の種に由来する蛋白質であってよい。
【００３８】
用語「ＳＡＲＰ−１」は、さらに、硬皮症において所望の活性を示す配列番号：２又は５のあらゆる断片、部分、ドメイン又はサブドメインを意味する。蛋白質断片又は当該蛋白質の一つ又は複数のドメインは、それらが硬皮症に対して何らかの有益な効果、好ましくは完全長の蛋白質と少なくとも同等な効果を呈する限り、発明に従い使用してよい。有益な効果は、以下の実施例に記載されたインビトロ又はインビボ試験の一つ又は硬皮症において効果を示すのに十分な他のあらゆるアッセイにおいて測定することができる。例えば、ＳＡＲＰ−１は、システインリッチな縮んだドメイン、及びネトリン様ドメインを含み、ＮＴＲモジュールとも呼ばれ、金属プロティナーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰｓ）に相同である（Ｂａｎｙａｉ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｈｙ，１９９９）。よって、ＳＡＲＰ−１の縮んだドメインを含む断片、又はＮＴＲモジュールを含む断片は、発明によれば好ましい断片である。
【００３９】
本発明によれば、ＳＡＲＰ−１は天然に生じ、即ち、天然蛋白質、又は組換え蛋白質であり得る。組換え生産は、真核細胞、例えば酵母細胞又はＣＨＯ細胞において、ヒト繊維芽細胞又は細胞系において実施してよい。さらに、原核細胞、例えば大腸菌において生産してよい。
【００４０】
好ましくは、ＳＡＲＰ−１は一つ又は複数の部位においてグリコシル化される。与えられた要求及び蛋白質の生産又は単離の源によっては、グリコシル化されなくてもよい。
【００４１】
用語「塩」は、本明細書においては、ＳＡＲＰ−１分子のカルボキシル基の塩とアミノ基の酸付加塩の両者又はそれらの類似物を意味する。カルボキシル基の塩は当業界公知の手段により形成してよく、無機酸、例えば、ナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄又は亜鉛塩等、及びアミン、例えばアルギニン又はリジン、ピペリジン、プロカイン等により形成される有機塩基との塩を含む。酸付加塩は、例えば、無機酸、例えば塩化水素酸又は硫酸との塩、及び有機酸、例えば酢酸又は蓚酸との塩を含む。もちろん、如何なる塩も、本発明に関連した生物活性を保持しなければ、即ち硬皮症に有益な効果を及ぼさなければならない。
【００４２】
ＳＡＲＰ−１のアイソフォーム又はスプライス変種も、硬皮症の進行及び／又はその疾患の兆候を阻害することができる限り、本発明に従い使用してよい。ヒトの組織において別々に発現されることがわかった２つの１．３ｋｂと２．２ｋｂの転写物は、例えば、ＳＡＲＰ−１の異なるアイソフォームの典型を示すかもしれず、本発明に従い有用であり得た。
【００４３】
本明細書にて使用される用語「変異蛋白質（ｍｕｔｅｉｎｓ）」は、ＳＡＲＰ−１の類似物を意味し、天然ＳＡＲＰ−１の一つ又は複数のアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基に置換しているか、欠失しているか、又は一つ又は複数のアミノ酸残基がＳＡＲＰ−１の天然配列に付加されており、好ましくは野生型ＳＡＲＰ−１と少なくとも同じ活性を有するか、より大きな潜在活性を有してさえいる。これらの変異蛋白質は、公知の合成法によるか、及び／又は部位特異的変異導入技術によるか、又はそれに適した何れかの他の公知の技術により製造される。
【００４４】
如何なるそのような変異蛋白質も、好ましくは、配列番号：２に記載されたような、ＳＡＲＰ−１に少なくとも実質類似の活性を有するように、ＳＡＲＰ−１の十分な複製物のアミノ酸配列を有する。ＳＡＲＰ−１変異体の活性は、当業界公知のアッセイにより、特に以下の実施例に説明されるアッセイを用いて試験することができる。繊維芽細胞中のコラーゲン合成の量の測定（実施例７）は、例えば、ＳＡＲＰ−１の変異蛋白質の活性を評価するのに適した試験である。
【００４５】
本発明による変異蛋白質は、本発明に従いストリンジェントな条件下でＳＡＲＰ−１をコードするＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズする核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡによりコードされる蛋白質を含む。用語「ストリンジェントな条件」は、当業者により慣用的に「ストリンジェント」と呼ばれる、ハイブリダイゼーション及び続く洗浄の条件を意味する。Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，前記、Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，§§６．３及び６．４（１９８７，１９９２）及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｃ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照。
【００４６】
限定ではないが、ストリンジェント条件の例は、例えば、２  ｘ  ＳＳＣ及び０．５％  ＳＤＳ、５分間、２  ｘ  ＳＳＣ及び０．１％  ＳＤＳ、１５分間；及び０．１  ｘ  ＳＳＣ及び０．５％  ＳＤＳ、３７℃にて３０−６０分間及び次に０．１  ｘ  ＳＳＣ及び０．５％  ＳＤＳ、６８℃にて３０−６０分間における検討下のハイブリッドの１２−２０℃下の計算されたＴｍの洗浄条件を含む。当業者は、ストリンジェント条件がＤＮＡ配列の長さ、オリゴヌクレオチドプローブの長さ（例えば１０−４０塩基）又は混合されたオリゴヌクレオチドプローブの長さにも依存することを認識する。混合されたプローブを用いるなら、ＳＳＣの代わりにテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣ）を用いるのが好ましい。前記Ａｕｓｕｂｅｌを参照。
【００４７】
そのような変異蛋白質の何れもが、好ましくは、ＳＡＲＰ−１の生物活性と実質上類似か又はより良好な生物活性を有するように、ＳＡＲＰ−１のそれと十分な複製であるアミノ酸配列を有する。
【００４８】
ＳＡＲＰ−１の一つの容易に測定可能な活性は、コラーゲン合成を低下させるその能力である。この活性を測定するためのアッセイは以下の実施例６に詳細に記載される。上記変異蛋白質が実質的なコラーゲン減少活性を有する限り、それはＳＡＲＰ−１の実質類似の活性を有すると考えることができる。即ち、与えられた如何なる変異蛋白質も、例えば実施例７に記載されたような単純なアッセイにそのような変異蛋白質を供することを含む日常的な実験により、ＳＡＲＰ−１と少なくとも実質上同じ活性を有するか否か、決定することができる。
【００４９】
好ましい態様において、そのような変異蛋白質の何れも、添付の配列表の配列番号：２の配列に少なくとも４０％の同一性又は相同性を有する。より好ましくは、それが、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又はもっとも好ましくは少なくとも９０％の同一性又は相同性を有する。
【００５０】
同一性は、配列を比較することにより決定される、２つ又はそれより多いポリペプチド配列間又は２つ又はそれより多いポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。通常、同一性は、比較される配列の長さにわたり、２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチドの対応するそれぞれ同じ（ｅｘａｃｔ）ヌクレオチド又はアミノ酸を意味する。
【００５１】
同じ対応がない配列に関しては、「％同一性」を決定してよい。通常、比較される配列は、配列間の最大の関係を与えるように整列化させる（ａｌｉｇｎｅｄ）。これは、整列化の低度を上げるために、一方又は両方の配列中の「ギャップ」を挿入することを含んでよい。％同一性は、比較される配列各々の全長にわたり決定してよいから（いわゆるグローバルな整列化）、特に同じか又は極めて類似の長さの配列、又は短くて規定された配列（いわゆる局所整列化）は長さが等しくない配列により適している。
【００５２】
２つまたはそれより多い破裂の同一性及び相同性を比較する方法は、当業界でよく知られている。即ち、例えば、ウイスコンシン配列分析パッケージ、バージョン９．１（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ  １９８４）に利用可能なプログラム、例えばＢＥＳＴＦＩＴ及びＧａｐを使用することにより、２つのポリヌクレオチドの間の％同一性及び２つのポリペプチド配列の間の同一性及び％相同性を決定してよい。ＢＥＳＴＦＩＴはＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の「局所相同性」計算式を用い、そして２つの配列の間の類似性の最良の領域を見いだす。複数の配列の間の同一性及び／または類似性を決定するための他のプログラムも当業界において知られており、例えばプログラムのＢＬＡＳＴファミリー（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，１９９０，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖにてＮＣＢＩのホームページを通してアクセス可能）である。
【００５３】
ＳＡＲＰ−１の変異蛋白質は本発明に従い使用することができ、またはそれらをコードする核酸は、過度な実験なしに、本明細書で提示した教示及びガイダンスを基にして、当業者により日常的得ることができる置換ペプチド又はポリヌクレオチドとして実質上相当する配列の有限のセットを含む。
【００５４】
本発明による変異蛋白質の好ましい交換は、「保存された」置換として公知なものである。ＳＡＲＰ−１ポリペプチド又は蛋白質の保存されたアミノ酸置換は十分に類似の物理化学特性を有する群内での類義（ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ）アミノ酸を含んでよく、当該群のメンバー間の置換は上記分子の生物学上の機能を保持する（Ｇｒａｎｔｈａｍ，１９７４）。アミノ酸の挿入及び欠失もそれらの機能を変更することなく上で定義した配列になされてよく、特に挿入又は欠失が数アミノ酸、例えば３０未満しか含まないなら、そして好ましくは１０未満なら、機能性コンフォメーションに必須のアミノ酸、例えばシステイン残基は除去又は置換しない。そのような欠失及び／又は挿入により生じる蛋白質又は変異蛋白質は本発明のプレビューの範囲内である。
【００５５】
好ましくは、類義アミノ酸群は表Ｉに定義されたものである。より好ましくは、類義アミノ酸は表ＩＩに定義されたものであり；そしてもっとも好ましくは、類義アミノ酸は表ＩＩＩに定義したものである。
【００５６】
【表１】
2004525869.tif 000002
【００５７】
【表２】
2004525869.tif 000003
【００５８】
【表３】
2004525869.tif 000004
【００５９】
ＳＡＲＰ−１ポリペプチド又は蛋白質の変異蛋白質を得るために使用可能で、本発明における使用のための、蛋白質中のアミノ酸置換の生成の例は、あらゆる公知の方法の工程、例えば、Ｋｏｔｈｓらに対する米国特許４，９５９，３１４，４，５８８，５８５及び４，７３７，４６２、Ｎａｍｅｎらに対する４，９６５，１９５；Ｃｈｏｎｇらに対する４，８７９，１１１；及びＬｅｅらに対する５，０１７，６９１に提示された方法；及び米国特許４，９０４，５８４（Ｓｈａｗら）に提示されたリジン置換蛋白質を含む。
【００６０】
用語「融合蛋白質」は、ＳＡＲＰ−１を含むポリペプチド、その変異蛋白質、別の蛋白質に融合させたポリペプチドであって、例えば体液内で延長された残存時間を有するものを意味する。例えば体内における半減期のような、分子の生物学上の活性を改善することができる蛋白質の全て又は機能部分に融合させたＳＡＲＰ−１の全て又は機能部分を含む融合蛋白質は、本発明によると好ましい。好ましい態様において、融合蛋白質は、イムノグロブリン（Ｉｇ）融合を含む。イムノグロブリンの全部又は一部に融合させたＳＡＲＰ−１の全て又は一部を含む融合蛋白質は、かなり好ましい。それらは、モノマー又はマルチマー、ヘテロ又はホモマルチマーであり得る。有利なのは、融合蛋白質が、イムノグロブリンの定常領域、特にイムノグロブリンのＦｃ部分の定常領域を含む。イムノグロブリンがＩｇＧ１又はＩｇＧ２アイソタイプである態様は、本発明によればさらに好ましい。
【００６１】
ＳＡＲＰ−１は、即ち、別の蛋白質、ポリペプチド等、例えばイムノグロブリン又はその断片に融合させてよい。融合は、直接又は短いリンカーペプチドを通してであってよく、１から３アミノ酸残基長ほど又はより長い、例えば１３アミノ酸長であり得る。上記リンカーはＥ−Ｆ−Ｍ（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ）のトリペプチド、例えば、あるいはＳＡＲＰ―１配列とイムノグロブリン配列の間に導入されたＧｌｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔからなる１３アミノ酸のリンカーであってよい。
【００６２】
本明細書にて使用される「機能性誘導体」は、ＳＡＲＰ−１の誘導体、及びそれらの変異蛋白質及び融合蛋白質を包含し、残基上の側鎖として生じる機能性官能基又はＮ−又はＣ−末端基から当業界公知の手段により調製してよく、そして薬学上受容可能なＳＡＲＰ−１の活性を保持する限り、即ちＳＡＲＰ−１の活性と少なくとも実質類似の蛋白質活性を破壊せず且つそれを含む組成物に毒性を付与しない限り本発明に包含される。よって、好ましい態様において、機能性誘導体はアミノ酸残基上に一つ又は複数の側鎖として生じる一つ又は複数の官能基に結合した少なくとも一つのモイエティを含む。
【００６３】
本発明によれば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）側鎖がかなり好ましいモイエティである。ＰＥＧ側鎖は抗原性部位を覆って、体液中で付着する物質の残存を延長するかもしれない。他の誘導体は、カルボキシル基の脂肪族エステル、アンモニア又は第一アミン又は第二アミンとの反応によるカルボキシル基のアミド、アシルモイエティにより形成されるアミノ酸残基の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体（例えば、アルカノイル又はカルボサイクリックアロイル基）又はアシルモイエティにより形成される遊離ヒドロキシル基のＯ−アシル誘導体（例えば、セリル又はスレオニル残基のそれ）を含む。
【００６４】
ＳＡＲＰ−１及びその変異蛋白質及び融合蛋白質の「活性画分」は、上記活性画分がＳＡＲＰ−１に少なくとも実質類似の活性を有するとの条件で、単独又はそれに結合した残基、例えば糖又はリン酸残基を付随した蛋白質分子のポリペプチド鎖のあらゆる断片又は前駆体又は蛋白質分子又は糖残基それら自身のあらゆる凝集体を包含する。
【００６５】
本発明は、さらに、硬皮症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための核酸分子の使用に関し、但し、上記核酸分子は、
（ａ）成熟ＳＡＲＰ−１；
（ｂ）配列番号：２を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号：２のアミノ酸２１から２９５を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号：２のアミノ酸２４から２９５を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号：２のアミノ酸２５から２９５を含むポリペプチド；
（ｆ）配列番号：２のアミノ酸２６から２９５を含むポリペプチド；
（ｇ）配列番号：２のアミノ酸２７から２９５を含むポリペプチド；
（ｈ）配列番号：２のアミノ酸２８から２９５を含むポリペプチド；
（ｉ）配列番号：２のアミノ酸３７から２９５を含むポリペプチド；
（ｊ）アミノ酸配列が（ａ）から（ｉ）の配列の少なくとも一つに対して少なくとも４０％又は５０％又は６０％又は７０％又は８０％又は９０％同一性を有する、（ａ）から（ｉ）の何れかの変異蛋白質；
（ｋ）中度のストリンジェント条件下又は高度のストリンジェント条件下で（ａ）から（ｉ）の何れかをコードする天然ＤＮＡ配列の相補体にハイブリダイズするＤＮＡ配列によりコードされる、（ａ）から（ｉ）の何れかの変異蛋白質；
（ｌ）アミノ酸配列の何らかの変化が（ａ）から（ｉ）のアミノ酸配列に対して保存的なアミノ酸置換である、（ａ）から（ｉ）の何れかの変異蛋白質；
（ｍ）（ａ）から（ｌ）の何れかの塩、アイソフォーム、融合蛋白質、機能性誘導体、活性画分、循環性入れ替わり誘導体
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む。本発明は、硬皮症の治療及び／又は予防のための上記核酸分子の使用に等しく関する。
【００６６】
本発明によれば、ＳＡＲＰ−１は、上記核酸分子を含むベクターの形態でヒトの体内へ投与してもよい。よって、本発明は、さらに、硬皮症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のための上記核酸分子を含むベクターの使用に関する。好ましくは、上記ベクターは、ＳＡＲＰ−１のコーディング配列の全て又は一部に操作可能なように連結したプロモーターを含む発現ベクターである。さらに好ましい態様において、上記ベクターは遺伝子治療用ベクターである。遺伝子治療用ベクターは当業界で知られており、そしてそれらのほとんどはウイルス由来のベクター、例えばアデノウイルス又はレンチウイルスのベクターである。
【００６７】
本発明によれば、ＳＡＲＰ−１は、ＳＡＲＰ−１を生産及び／又は分泌する細胞の形態でヒトの体内へ投与してもよい。よって、本発明は、さらに、硬皮症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のためのＳＡＲＰ−１発現細胞の使用に関する。上記細胞は天然のＳＡＲＰ−１生産細胞及び／又は組換えＳＡＲＰ−１を生産するトランスフェクト細胞であってよい。好ましいのは、当該蛋白質を大量に発現及び分泌する細胞、例えばＳＡＲＰ−１をコードする核酸分子を含む発現ベクターを高コピー数有する過剰発現細胞である。
【００６８】
繊維芽細胞が繊維症の機構を表すように、それらは抗繊維症及び硬皮症の治療にもっとも適した細胞である。よって、好ましくは、ＳＡＲＰ−１発現繊維芽細胞を本発明により使用する。
【００６９】
本発明は、さらに、硬皮症の治療及び／又は予防のための医薬の製造のためのＳＡＲＰ−１の全部又は一部をコードする核酸分子を含むベクターを含む細胞の使用に関する。本発明によりポリペプチドを生産するように遺伝子修飾された細胞も、本発明の範囲内にある。
【００７０】
天然ではサイレントであるか又は十分ではない阻害剤の量を発現する細胞内でＳＡＲＰ−１の内因性生産を誘導及び／又は増強する発現ベクターの使用も、本発明により意図される。即ち、本発明は、所望の蛋白質の生産のための内因性遺伝子の活性化（ＥＧＡ）として知られる技術を利用する。
【００７１】
全身性の硬化症は硬皮症のうちでもっとも重度の疾患であり、しばしば身体障害と死を導く。よって、本発明のさらなる好ましい態様は全身性硬化症に関し、硬皮症の疾患内の指標であり、上で詳細に説明されたとおり、主に内部の器官の関与により特徴付けされる。
【００７２】
いくつかの組み合わせの治療が本発明によれば好ましい。よって、好ましくは、発明の医薬は、さらに、
・インターフェロン、特にインターフェロン−β
・腫瘍ネクローシス因子（ＴＮＴ）アンタゴニスト、特にＴＢＰＩ及び／又はＴＢＰ  ＩＩ
・別の抗硬皮症剤
・ＡＣＥ阻害剤、カルシウムチャネルブロッカー、プロトンポンプ阻害剤、ＮＳＡＩＤｓ，ＣＯＸ−阻害剤、コルチコステロイド、テトラサイクリン、ペントキシフィリン、ブシルアミン、ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ阻害剤、ロッテリン、プロピル−４−ヒドロキシラーゼ阻害剤、ｃ−プロテイナーゼ阻害剤、リジルーオキシダーゼ阻害剤、レラキシン、ハロフギノン、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、エンドセリン−１、一酸化窒素、アンギオテンシンＩＩ阻害剤及び抗酸化剤
を含む。
【００７３】
全ての治療は、同時、連続又は別々の使用を意図する。
【００７４】
硬皮症に関しては現在療法はないが、いくつかの剤又は治療法が現在硬皮症の兆候を治療するのに使用されている。そのような抗硬皮症剤は本発明によりコンビネーション治療として使用してよく、本明細書中に完全に編入されるＬｅｉｇｈｔｏｎ（２００１）又はＷｉｇｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｌｅ（２００１）に要約されている。
【００７５】
インターフェロンはウイルスの複製及び細胞の増殖に阻害効果に関して広く公知である。インターフェロン−γは、例えば、免疫応答及び炎症性応答を促進させることにおいて重要な役割を担う。インターフェロンβ（ＩＦＮ−β、インターフェロンタイプＩ）は抗炎症の役割を担うと言われる。
【００７６】
発明のまた別の態様において、ＳＡＲＰ−１はＴＮＦアンタゴニストと共に使用される。ＴＮＦアンタゴニストはいくつかの様式によりそれらの活性に影響する。最初に、アンタゴニストは十分な親和性及び特異性をもってＴＮＦ分子自身に結合するか又は封鎖することにより、ＴＮＦ受容体結合に必須のＴＮＦの一つ又は複数のエピトープの部分的又は実質上中和することができる（以後、「封鎖アンタゴニスト」と呼ぶ）。封鎖アンタゴニストは、例えば、ＴＮＦに対して向けられた抗体であってよい。
【００７７】
あるいは、ＴＦＮアンタゴニストは、ＴＦＮ結合後に細胞表面の受容体により活性化されるＴＦＮシグナリング経路を阻害することができる（以後、「シグナリングアンタゴニスト」と呼ぶ）。ＴＦＮアンタゴニストは、ＴＮＦが増殖及びイムノグロブリン分泌を引き起こすように、影響されやすい細胞上の天然のＴＮＦの活性に対するそれらの効果に関する候補の日常的なスクリーニングにより容易に同定されて評価される。上記アッセイは、候補アンタゴニストの希釈を変更して、例えばアッセイにて使用されるＴＮＦのモラー総計の０．１から１００倍のＴＮＦ製剤、及びＴＮＦを含まない対照又はアンタゴニストのみを含む（Ｔｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。
【００７８】
封鎖アンタゴニストは本発明に従い使用される好ましいＴＮＦアンタゴニストである。封鎖アンタゴニストのうちでも、高い親和性でＴＮＦを結合して低い免疫原性しか有さないポリペプチドが好ましい。可溶性ＴＮＦ受容体及びＴＮＦに対する中和抗体が特に好ましい。例えば、ＴＮＦ−ＲＩ（ｐ５５）及びＴＮＦ−ＲＩＩ（ｐ７５）の可溶性形態が本発明において有用である。受容体の細胞外ドメイン又はその機能性部分を含むこれらの受容体の末端削除型は、本発明によれば、さらに特に好ましいアンタゴニストである。末端削除型の可溶性ＴＮＦタイプＩ及びタイプＩＩ受容体は例えばＥＰ９１４４３１に記載される。
【００７９】
ＴＮＦ受容体の末端削除型は可溶性であり、尿及び血清中で約３０ｋＤａ又は４０ｋＤａのＴＮＦ阻害結合蛋白質として検出されており、それぞれＴＢＰＩ及びＴＢＰＩＩと呼ばれる（Ｅｎｇｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）。ＳＡＲＰ−１とＴＮＦアンタゴニストの同時、連続、又は別々の使用が、本発明によれば好ましい。
【００８０】
本発明によれば、ＴＢＰＩとＴＢＰＩＩはＳＡＲＰ−１と組み合わせて使用されるのに好ましいＴＮＦアンタゴニストである。上記受容体分子の誘導体、領域及び生物学上活性な部分は、本発明において使用することもできる受容体分子に機能上似ている。そのような生物学上活性な均等物又は受容体分子の誘導体は、ポリペプチドの一部、受容体分子の一部、即ち膜結合ＴＮＦ受容体との相互作用が阻害されるか又はブロックされるような親和性をもって、十分な長さでＴＮＦに結合できる部分を意味する。
【００８１】
さらに好ましい態様において、ヒトの可溶性ＴＮＦ−ＲＩ（ＴＢＰＩ）は本発明により使用されるＴＮＦアンタゴニストである。天然及び組換えの可溶性ＴＮＦ受容体及びそれらの生産方法は欧州特許ＥＰ  ３０８  ３７８，ＥＰ  ３９８  ３２７及びＥＰ  ４３３  ９００に記載された。
【００８２】
上記疾患の初期段階においてＴＮＦ−αをブロックすることは有益であるかもしれないが、後期の段階においては、ＴＮＦ自身が硬皮症に有益な効果を及ぼすかもしれない（Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。よって、本発明は、さらに、硬皮症、特に当該疾患の進行段階の治療又は予防のためのＳＡＲＰ−１及びＴＮＦ−αの組み合わせに関する。
【００８３】
ＣＯＸ阻害剤は当業界公知である。特異的ＣＯＸ−２阻害剤は例えばＷＯ  ０１／００２２９に記載される。
【００８４】
本発明は、さらに、硬皮症、特に全身性硬化症の治療及び／又は予防のための、一つ又は複数の薬学上受容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を任意に伴う、ＳＡＲＰ−１を含む薬学組成物に関する。上記薬学組成物は、さらに、上記のさらなる成分、及び特にインターフェロン、ＴＢＰ又はＣＯＸ阻害剤のいずれかを含んでよい。
【００８５】
本発明による上記薬学組成物は、本発明による核酸を含むベクター、又はＳＡＲＰ−１を発現する細胞を含んでもよい。
【００８６】
発明による薬剤、即ち、ポリペプチド、核酸又は細胞の活性成分、又はそれらの組み合わせ、並びに上記の物質の組み合わせは、様々な様式にて個体に投与してよい。投与経路は、皮膚内、経皮（例えば、除放性製剤にて）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所及び鼻内経路を含む。他のいずれの治療上有効な投与経路も使用することができ、例えば、上皮又は内皮組織を通しての吸収か又は上記活性成分をコードするＤＮＡを患者に投与して（例えばベクターにより）活性成分を発現させて生体内に分泌される遺伝子治療による。さらに、発明による蛋白質は生物学上活性な剤の他の成分、例えば薬学上受容可能な界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤及び媒体と共に投与することができる。
【００８７】
定義「薬学上受容可能な」は、活性成分の生物学上の活性の有効性を干渉しない、即ち投与される宿主に有害でない、あらゆる担体を包含することを意味する。例えば、非経口投与に関しては、活性な蛋白質を注射用ユニット用量形態にて、媒体、例えば塩溶液、デキストロース溶液、血清アルブミン及びリンゲル溶液中に製剤化してよい。
【００８８】
非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）投与のためには、活性な蛋白質を溶液、懸濁液又は凍結乾燥粉末として薬学上受容可能な非経口媒体（例えば、水、塩溶液、デキストロース溶液）及び等張性（例えば、マニトール）又は化学安定性（例えば、保存剤及びバッファー）を保持する付加物と共に製剤化してよい。上記製剤は、普通に使用される技術を用いて滅菌する。
【００８９】
本発明による活性蛋白質の生物利用性は、ヒト体内での分子の半減期を増加させる配合法を用いること、例えばＰＣＴ特許出願ＷＯ  ９２／１３０９５に記載されたポリエチレングリコールへ分子を連結することにより、改善することもできる。
【００９０】
治療上有効な量の活性蛋白質は、多数の可変物の函数になり、生体内において、ＳＡＲＰ−１受容体を活性化すること、又は受容体を刺激するリガンドを不活性化することを含む。単一用量又は複数用量として個体に投与される用量は、様々な因子に依存して変動し、ＳＡＲＰ−１薬力学特性、投与経路、患者の状態及び特徴（性別、年齢、体重、健康状態、サイズ）、兆候の程度、併用する治療法、治療の頻度及び所望の効果を含む。確立された用量範囲の調節と操作は、当業者にとって容易である。
【００９１】
本発明によるポリペプチドの必要とされる用量は、約０．０００１から１００ｍｇ／ｋｇ又は約０．０１から１０ｍｇ／ｋｇ又は約０．１から５ｍｇ／ｋｇ又は約１から３ｍｇ／ｋｇを変動するが、上記のとおり、これは相当量の治療上の裁量にゆだねられる。
【００９２】
毎日の用量は通常、所望の効果を選るために有効な、分割した用量にてか又は除放形態にて与えられる。第２又は次の投与は、個体に投与された初期の投与又は前回の投与と同じか又はより多い用量にて実施される。第２又は次の投与は疾患の始まりの間か又は前に投与することができる。
【００９３】
本発明は、さらに、有効量の本発明によるポリペプチドを、任意に薬学上受容可能な担体と共に、それが必要な患者に投与することを含む、硬皮症、特に全身性硬化症を治療及び／又は予防する方法に関する。あるいは、又はさらに、ＳＡＲＰ−１を生産する細胞又は発明の核酸分子、任意に発現ベクターを含めて、発明に従い投与してよい。
【００９４】
発現ベクターは、全身投与してよい。好ましくは、発現ベクターは、筋肉内注射により投与する。別の好ましい投与経路は、吸入、特に肺の繊維芽細胞が疾患に関与しているならである。
【００９５】
発明は、さらに、有効量のＳＡＲＰ−１を薬学上受容可能な担体と混合することを含む薬学上受容可能な組成物の製造方法、及び有効阻害量のＳＡＲＰ−１を、それが必要な宿主に投与することを含む関節炎を治療及び／又は予防する方法に関する。
【００９６】
定期刊行の論文又は抄録、公表又は未公表の米国又は外国の特許出願、発行された米国特許又は外国の特許又はあらゆる他の文献を含む、本明細書にて引用された全ての刊行物は、文献中に提示された全てのデータ、表、図面及びテキストを含めて、引用により本明細書に全体が編入される。さらに、本明細書に引用された文献の全部の内容も引用により編入される。
【００９７】
公知の方法の工程、慣用の方法の工程、公知の方法又は慣用の方法に対する文献も、本発明のあらゆる側面、記載又は態様も関連分野において開示、教示又は示唆されるという容認ではない。
【００９８】
特定の態様の前記の記載は、当業界の知見を適用することにより（本明細書に引用された文献を含む）、過度な実験なしに、本発明の一般的概念から逸脱することなく、そのような特定の態様を修飾し、及び／又は、様々な応用をそのような特定の態様に他人が適用することができる、発明の一般的性質をそうして完全に明らかにする。よって、そのような適用及び修飾は、本明細書に提示された教示及びガイダンスに基づき、開示された態様の均等物の範囲の意味の範囲であると意図される。本明細書中の語法又は述語は、本明細書のそのような語法又は述語が、当業者の知識と組合わさって、本明細書に提示された教示及びガイダンスに照らして当業者により解釈されるべきであることが認識される。
【００９９】
今、発明を記載してきたが、例示の目的で提供されたのであって、本発明を限定することを意図しない以下の実施例に対する参照により、発明がより容易に理解される。
【０１００】
実施例
実施例１：ＳＡＲＰ−１は硬皮症患者からの皮膚の繊維芽細胞内で特異に（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）発現される
方法
患者のサンプル
２つのｍｍ３パンチの生検を、拡散性の皮膚全身硬化症（ＳＳｃ）の９歳の性別適合患者の外傷性又は非外傷性の皮膚（通常は前腕の皮膚）から取り出した。全ての患者は、全身性硬化症の診断のためのリウマチ学の米国の大学の基準を満たした。
【０１０１】
繊維芽細胞
繊維芽細胞は、以前に記載されたとおり（Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）、インビトロ培養による生検から得た。簡単に言えば、生検を破片に切断して、滅菌したプラスチックチューブ皿又はフラスコの中に置いた。室温において１５分間乾燥後に、生検の破片を組織培養プラスチックに接着させて、次に１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１００ユニット／ｍｌのペニシリン、１００ユニット／ｍｌのストレプトマイシン、５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン及び２．５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢを含むダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる繊維芽細胞成育培地（ＦＧＭ）の中で培養した。空気中５％ＣＯ２の湿潤雰囲気における２−３週間のインキュベーションの後、繊維芽細胞副産物を、簡単なトリプシン処理により分離し、そしてゲンタマイシン及びアンフォテリシンを含まないＦＧＭ中で再度培養した。実験においては、繊維芽細胞を継代２と５の間で使用した。繊維芽細胞の表現型は、単層及び３次元コラーゲンゲル培養におけるそれらの典型的な形態により確認した。
【０１０２】
ＲＮＡ単離
全ＲＮＡを初期継代培養中のコンフルエントな硬皮症からか又は正常なヒト真皮（包皮）繊維芽細胞（プロモセルから購入）の初期培養物から、Ｔｒｉｚｏｌ（ライフサイエンステクノロジー）を用いて、製造者のプロトコルに従い単離した。最終ＲＮＡ沈殿物を滅菌ＤＥＰＣ処理水（１μｇ／ｍｌの濃度）中に懸濁して−８０℃に保存した。
【０１０３】
ｃＤＮＡプローブ合成
２μｇの全ＲＮＡを１．３μｌのサイトカイン特異的プライマー（Ｒ＆Ｄシステムズカタログ番号ＧＡＣ１１）と混合して、７０Ｃにおいて２分間０．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中でインキュベートした。チューブを次に５０Ｃに２分間冷やして、その時間の反応後に２μｌの５Ｘ反応バッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．３，３７５ｍＭ  ＫＣｌ及び１５  ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、１μｌの１０Ｘ  ｄＮＴＰ混合物（５ｍＭ  ｄＧＴＰ，５ｍＭ  ｄＣＴＰ及び５ｍＭ  ｄＴＴＰ）、３．５μｌのα３２Ｐ−ｄＡＴＰ（３０００／ｍｍｏｌ，アマシャムカタログ番号ＰＢ１０２０４）、０．５μｌのＤＴＴ（１００ｍＭ）及び１μｌのＳｕｐｒｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（ライフテクノロジーズ）を含む混合物を加えた。当該反応混合物をピペッティングにより簡単に混合して５０Ｃにおいて２５分間インキュベートした。反応は、１ｍｇ／ｍｌのグリコーゲンを含む１μｌの０．１Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０の添加により停止した。標識されたｃＤＮＡを次に未取り込みデオキシヌクレオチドからＣｈｒｏｍａｓｐｉｎ−２００  ＤＥＰＣ−Ｈ２０カラム（クロンテック）を用いて製造者の指示に従い精製した。ｃＤＮＡを含む画分をチェレンコフカウンティングにより同定した。ピークの画分（通常は回収された全部で６のうちの画分２）を、１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１容量の１Ｍ  ＮａＯＨにより２０分間７０Ｃにおいて処理して、ＲＮＡを加水分解し、次に、２．５μｇのヒトＣｏｔ−１  ＤＮＡ（ライフテクノロジーズ）を含む等容の１Ｍ  ＮａＨ２ＳＯ４により２０分間７０Ｃにて中和した。加熱処理した中和ｃＤＮＡプライマーを次に直接ハイブリダイゼーション混合物に加えた。
【０１０４】
遺伝子フィルターマイクロアレイへのハイブリダイゼーション
遺伝子フィルターマイクロアレイ（ヒトサイトカイン発現アレイ、Ｒ＆Ｄシステムズカタログ番号ＧＡ００１）を、Ｈｙｂａｉｄハイブリダイゼーションオーブン（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）中において、回転ボトル中の０．５μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ（ライフテクノロジーズ）を含む発現ハイブリダイゼーション溶液（クロンテック）５ｍｌと６８Ｃにおいて２時間プレハイブリダイズさせた。この時間の後に、プレハイブリダイゼーション溶液を、０．２５から１Ｘ１０６ｃｐｍ／ｍｌの間の比活性のｃＤＮＡプローブ調製物を含む新鮮なハイブリダイゼーション溶液に交換した。ハイブリダイゼーションは１６−２０時間６８Ｃにおいてであった。ハイブリダイゼーション後に、フィルターを４回洗浄したが、２Ｘ  ＳＳＣ／１％  ＳＤＳで各洗浄とも６８Ｃにおいて２０分間行ない、そして０．１Ｘ  ＳＳＣ／０．５％  ＳＤＳで２回洗浄あたり１５分間洗浄した。フィルターは次にサランラップ（登録商標）でシールして、室温にて時間を変えて（４時間から４日間）Ｋ−タイプ保存燐光体イメージング（バイオラッド）に暴露した。
【０１０５】
イメージ分析
イメージングスクリーンをバイオラッドパーソナルＦＸホスホイメージャーを用いて５０μｍの解析度にてスキャンした。結果の１６ビットのデジタルファイルをＴＩＦフォーマットに変換して、イメージをアレイビジョンソフトウエア（イメージングリサーチ社）を用いて分析した。各サンプルに関して、我々は、フィルター上の３８４遺伝子の画素強度を２通り測定した。バックグラウンドシグナルを差し引いて、アレイ中のスポットの各対に関しての平均画素強度を生じさせた（＝発現レベル）。
【０１０６】
ＲＴ−ＰＣＲによる選択された遺伝子のマイクロアレイの結果の確認
各患者サンプルからの１μｇの全ＲＮＡをオリゴｄＴプライマー（プロメガ）を用いて５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ  ＫＣｌ，０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，１ｍＭの各ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，０．５ユニットの組換えＲＮａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤（プロメガ）及び１５ユニットのＡＭＶ逆転写酵素（プロメガ）を含む２０μｌの反応容量にて逆転写した。反応混合物を４２Ｃにおいて６０分間インキュベートして、９５Ｃに５分間加熱して、次に滅菌水で２００μｌに希釈した。逆転写酵素反応物の希釈物を、次に、遺伝子フィルター製造者により提供されたデータベース受入番号に基づいて、Ｔａｑｍａｎ（ＰＥアプライドバイオシステムズ７７００）上のリアルタイムＰＣＲ分析に供した。結果を、各サンプルにおいてハウスキーピングの遺伝子グリセルアリデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの発現に対して標準化して（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）、対応する正常な患者のサンプルにより異常な患者のサンプルの発現値を割ることにより測定された、倍の変化（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅｓ）として表現された。
【０１０７】
硬皮症に付随した遺伝子を予測するための統計による方法
硬皮症に付随した遺伝子を予測するための統計による方法を、引用により本明細書に完全に編入されたＧｏｌｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９に記載されたとおりに、隣の分析（ｎｅｉｇｈｂｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ）及びクラス予想装置（ｃｌａｓｓ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ）により実施した。
【０１０８】
結果
遺伝子フィルターマイクロアレイを７人の硬皮症患者からの正常及び異常な繊維芽細胞上で実施した。各患者サンプルのＳＡＲＰ−１のｃＤＮＡの平均発現レベルを図１Ａに示し、中央値の発現を図１Ｂに示す。平均値と中央値は正常細胞と異常細胞の間で異なり、ＳＡＲＰ―１の正常な発現レベルは異常な発現レベルよりも高い。中央値はグループ内で広く変動する個々の効果を最小にするように、患者サンプルを扱うときに通常使用される。ここでは、異常繊維芽細胞により発現された顕著に低いレベルのＳＡＲＰ−１  ｍＲＮＡを、試験した７人の患者のうちの５人の正常繊維芽細胞と比較した。
【０１０９】
マイクロアレイにおいて得られた結果は、ＳＡＲＰ−１特異的ＰＣＲプライマーを用いて患者のサンプルのリアルタイムＰＣＲ分析によりさらに確認した。結果を図２に示し、そして発現レベルの倍の変化として表現される（正常割る異常）。試験した８人の患者のうちの６人において、同じ患者から採取された正常繊維芽細胞に比較して、疾患繊維芽細胞においては少なくとも２倍ダウン制御された。残りの２人の患者においては、発現レベルが正常及び異常繊維芽細胞と同等であった。
【０１１０】
同じ患者からの正常繊維芽細胞と異常繊維芽細胞の間に観察された発現の違いは、２つの集団の間の培養条件における違いによるのではないが、なぜならば、正常なヒトの真皮の繊維芽細胞の初期培養におけるＳＡＲＰ−１のｍＲＮＡの発現が細胞を継代することに対して顕著に変化をさせないからである（図３）。さらに、硬皮症患者からの異常な全生検検体から単離された全ＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析は、臨床上正常な、年齢、性別及び解剖学上の部位が適合した対照の生検に比較して、低いレベルのＳＡＲＰ−１  ｍＲＮＡを示した（図４）。
【０１１１】
それに加えて、ＳＡＲＰ−１のダウン制御は、統計の方法を用いると、硬皮症の進行に関連する確率が９５％であることを示した。
【０１１２】
結論
上に記載された結果は、健康な組織に比較して硬皮症の患者に由来する疾患組織においてはＳＡＲＰ−１を欠くことを示し、正常レベルのＳＡＲＰ−１の回復が上記疾患を治癒させる助けとなるかもしれないことを示唆する。即ち、ＳＡＲＰ−１は、上記疾患の、又は硬皮症の一つ又は複数の兆候の、部分的か又は完全な阻害を達成するためか、又は疾患の進行を阻害するための、新規な医薬を提示するかもしれない。
【０１１３】
実施例２：ヒトＳＡＲＰ−１の全ｃＤＮＡコーディング配列のクローン化
材料と方法
ＳＡＲＰ−１の部分コーディング配列から開始して（ＥＭＢＬ受入番号：ＡＦ０１７９８６）、連続的なＢＬＡＳＴの検索をヒトｄｂＥＳＴ（公的ＥＳＴデータベース）に実施し、そして関連するＥＳＴｓをｈｔｔｐ：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／Ｗｅｂ／Ｓｅａｒｃｈ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌにてＥＮＴＲＥＺを用いて回収した。以下のＥＳＴｓを、次に、ＡＦ０１７９８６配列と集合させることにより、ＳＡＲＰ−１のコンセンサス完全コーディング配列：ＡＷ５８０６４７，ＡＡ９７６４０３，及びＷ９２５３１を生じさせた。
【０１１４】
ＳＡＲＰ−１の完全長ｃＤＮＡコーディング配列を次に逆転写酵素ＰＣＲにより、上で得られたコンセンサス配列を基にした以下のプライマー：ＳＡＲＰ−１Ｆ  ５’  ＧＣＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＣＣ  ＡＣＧ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＧＧＣ  ＣＣＴ（配列番号：３）及びＳＡＲＰ−１Ｒ  ５’  ＧＣＧ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＴＡ  ＧＣＡ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＧＣＧ  ＧＡＴ（配列番号：４）を各５０ｐｍｏｌｅ用いて、０．３ｍＭ  ｄＮＴＰｓ，１ｍＭ  ＭｇＳＯ４を含む５０μｌの混合物、５μｌのヒト正常真皮（包皮）繊維芽細胞ｃＤＮＡ鋳型（上記のとおりに調製）、５μｌの１０Ｘ  Ｐｆｘ増幅バッファー（ライフテクノロジーズ）及び１μｌのＰｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（ライフテクノロジーズ）中でクローン化した。上記反応混合物を９４Ｃにて２分間加熱し、次に以下のとおりに３５サイクルのＰＣＲに供した：９４Ｃ  １５秒、５５Ｃ  ３０秒そして６８Ｃ  １分間。増幅産物を１Ｘ  ＴＡＥバッファー（ライフテクノロジーズ）中の１％アガロースゲルにより分析して、予測された分子量（９０６ｂｐ）に移動したＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ  ＰＣＲ精製キット（プロメガ）を用いてゲルから精製した。
【０１１５】
１００ｎｇのゲル精製されたＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ（プロメガ）により製造者の指示に従い消化して、上記のとおりに再度精製し、そして標準的な分子生物学の技術に従い、Ｔ４  ＤＮＡライゲース（ニューイングランドバイオラブズ）を用いてＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ消化プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）（インビトロジェン）に連結した。連結産物により、バイオラッドジーンパルサーを用いてエレクトロポレーションにより大腸菌ＴＯＰ  １０  Ｆ’（インビトロジェン）を形質転換した。結果のコロニーから成育させたプラスミドＤＮＡを５ｍｌ培養物から単離し、そしてＴ７及びｐｃＤＮＡ３．１ＡＳを用いてアプライドバイオシステムズ３７００配列決定機上での自動化配列分析に供することにより、ＳＡＲＰ−１の配列を確認した。
【０１１６】
結果
インビトロ及びインビボにおけるＳＡＲＰ−１活性を特性決定するために、完全長のｃＤＮＡコーディング配列をクローン化した。ヒトＳＡＲＰ−１の部分ｃＤＮＡ配列（ＥＭＢＬ受入番号ＡＦ０１７９８６）を用いてＢＬＡＳＴプログラムを用いるｄｂＥＳＴ公的データベースにおいてオーバーラップするＥＳＴｓを同定した。全長のｃＤＮＡコーディング配列を以下の配列受入番号：ＡＦ０１７９８６，ＡＷ５８０６４７，ＡＷ６０８３０１，ＡＡ９７６４０３，及びＷ９２５３１から集合させた。ＳＡＲＰ−１の完全長のＤＮＡ配列と予測されるアミノ酸配列を図５ＡとＢ（ＡとＢは連続して読まれるべき）に示す。ＳＡＲＰ−１のｃＤＮＡコーディング配列を逆転写酵素ＰＣＲにより、予測される開始コドンと停止コドンを周囲にもつプライマーを用いてクローン化した。結果のＳＡＲＰ−１のｃＤＮＡの配列分析は、、マウスＳＡＲＰ−１の公表配列（Ｍｅｌｋｏｎｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）に対してヌクレオチドレベルでの９３％の同一性及びアミノ酸レベルにおいてマウス配列に対しての９５％同一性を明らかにした。整列化されたヒトとマウスのＳＡＲＰ−１のアミノ酸配列を図６に示す。予測された蛋白質配列は２９５アミノ酸であり、ＳＩＧＮＡＬＡＳＥ（Ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，１９８６）又はＳＩＧＮＡＬＰプログラムを用いると、それぞれ２０又は２４のアミノ酸の予測されたシグナルペプチドを伴い、図５Ａの矢印を参照されたい。ヒトとマウスの配列の間のアミノ酸の違いは図６において強調され、Ｎ−末端シグナルペプチド（４アミノ酸）及び成熟蛋白質配列（２アミノ酸）中に存在する。
【０１１７】
同封の配列表の配列番号：１はヒトＳＡＲＰ−１のｃＤＮＡのコーディング鎖を含み、そして配列番号：２はヒトＳＡＲＰ−１のアミノ酸配列を含む。マウスのアミノ酸配列を同風の配列表の配列番号：５に示す。
【０１１８】
実施例３：ヒトＳＡＲＰ−１のＮ−末端配列
予測されたＳＡＲＰ−１シグナルペプチドは２０又は２４のアミノ酸長である（図５Ａ）。成熟ＳＡＲＰ−１の正確なＮ−末端を明らかにするため、６つの残基ヒスチジンタグを含む組換えＳＡＲＰ−１をＨＥＫ−２９３内で発現させて、ニッケルキレートカラム上で精製した。精製された蛋白質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で３２ｋＤａのバンドとして移動し、ＭＳにより測定された質量３４３１３Ｄａに相当した。
【０１１９】
精製された組換え蛋白質のＮ−末端配列を，アプライドバイオシステムズモデル４９４パルス液相蛋白質配列決定機及びモデル１４８Ｃオンラインフェニルチオ水和アミノ酸分析機を、Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）に従い用いて得た。簡単に言えば、精製されたＳＡＲＰ−１を、１Ｍ尿素、２０ｍＭメチルアラニン、１ｍＭジチオスレイトール及び５μｇのトリプシン（ベーリンガーマンハイム、配列決定グレード）を含む１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．５の９０μｌにおいて３７℃における一晩インキュベーションにより消化した。ペプチドは逆相ＨＰＬＣ（ヒューレットパッカードＨＰ１０９０）及びブラウンリーＣ１８カラム（２２０ｘ２．１ｍｍ）により分離した。ペプチドはアセトニトリル勾配（０．１％トリフルオロ酢酸中）により０から５５％にわたり６０分間かけて、次に５５−７０％を５分間かけて溶出した。溶出画分を回収し、そしてシンチレーション分光測定により同定された放射性３２Ｐ−標識したホスホペプチドを、アプライドバイオシステムズモデル４９４パルス液相蛋白質配列決定機及びモデル１４８Ｃオンラインフェニルチオ水和アミノ酸分析機を用いてエドマン分解により配列決定した。
【０１２０】
配列ＧＬＦＬＦＧＱＰＤＦＳＹＫがタンデム質量分光測定により、還元されてアルキル化された蛋白質のトリプシン消化により得られた。本質的にはＣａｖａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１に記載されたとおりに、ナノスプレーイオン源を備えたＱ−ＴＯＦ質量分光分析機（マイクロマスＵＫリミテッド、マンチェスター、英国）上で分析を実施した。簡単に言えば、１マイクログラムの精製された蛋白質を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。蛋白質のバンドを銀染色ゲルから切り出して、ゲル中でトリプシンにより消化した（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。抽出されたペプチド混合物を、ナノエレクトロスプレーイオン源を備えたタンデム質量分光分析配列決定機（マイクロマス、マンチェスター、英国）により分析した。
【０１２１】
結果
未成熟ＳＡＲＰ−１の理論上のＮ−末端配列は以下のとおりである：
【０１２２】
【化１】
2004525869.tif 000005
【０１２３】
第２の予測されたシグナル分割部位の位置は残基２４と２５（ＧとＬ）の間である。
【０１２４】
実施された配列決定実験において、ＳＡＲＰ−１のＮ−末端の相当な異質性が見いだされた。
【０１２５】
一つの実験において、２つの主要な配列が見いだされ、一方がＦＧＱＰＤから開始し、即ち配列番号：２のアミノ酸２８において開始し、他方がＬＦＧＱＰＤから開始し、即ち配列番号：２のアミノ酸２７から開始する。
【０１２６】
しかしながら、さらに、異なる精製されたバッチにおいて、４つの配列が見いだされた：
ＬＦＬＦＧＱＰＤＦＳ（アミノ酸２５から開始）
ＦＬＦＧＱＰＤＦＳ（アミノ酸２６から開始）
ＬＦＧＱＰＤ（アミノ酸２７から開始）
ＦＧＱＰＤ（アミノ酸２８から開始）。
【０１２７】
アミノ酸３７から開始する別の配列：ＲＳＮＣＫＰＩＰＡＮも存在する。この配列はリジン残基の後の分割による（トリプシン様分割）。
【０１２８】
さらに、別の実験は２４位から開始する配列：
ＧＬＦＬＦＧＱＰＤＦＳＹＫ
を明らかにした。
【０１２９】
即ち、Ｎ−末端は極めて異質性であるらしく、これもＳＡＲＰ−１中のエンドペプチダーゼ又はプロテアーゼ活性に起因し得た。成熟ＳＡＲＰ−１は異なるＮ−末端を有するいくつかの異なる変種において起こるかもしれない。
【０１３０】
実施例４：ＳＡＲＰ−１のトランスフェクションはインビトロにおいてアポトーシスを誘導する
方法
繊維芽細胞系（マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞及びヒトＡＧ１５１８細胞）及び初期繊維芽細胞培養物（正常ヒト細胞真皮繊維芽細胞継代１−５）（プロモセル）に、ジェネポーター２（ジーンセラピーシステムズ、サンディエゴ）又はフジーン６（ライフテクノロジーズ）のトランスフェクション試薬の何れかを製造者の薦めに従い、ＳＡＲＰ−１のｃＤＮＡコーディング配列を含むｐｃＤＮＡ３．１又はｐｃＤＮＡ３．１のみ（陰性対照として空のベクターを模擬トランスフェクトされた）をトランスフェクトした。アポトーシスは、Ｒ＆ＤシステムズからのＴｉｔｅｒＴａｃｓ９６ウエルアポトーシスアッセイキットを用いてトランスフェクションの２４時間後に測定して、ＣｙＱｕａｎｔ染料（モリキュラープローブス）を用いて製造者の指示に従い数えた。
【０１３１】
結果
繊維芽細胞中のＳＡＲＰ−１の効果を評価するために、繊維芽細胞系に、ＳＡＲＰ−１のｃＤＮＡをトランスフェクトして、アポトーシスの低度を評価した。結果を図７に示す。ＳＡＲＰ−１をトランスフェクトされた細胞内でのアポトーシスは、模擬（ｐｃＤＮＡ３．１）トランスフェクトされた細胞に比べて顕著に低下した（Ｐ＝０．０００９）ことから、ヒトＳＡＲＰ−１はそのマウス相同体に関して報告されたのと類似の活性を有することが示唆される。アポトーシスの基底レベルを非トランスフェクト細胞において測定した。ヌクレアーゼ処理したＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を陽性対照として用いた。「未標識」の欄はバックグラウンドの染色レベルを示し、そしてヌクレアーゼによる処理（「ヌクレアーゼ処理」）を陽性対照として用いた。
【０１３２】
実施例５：ＴＧＦβ１生産に対するＳＡＲＰ−１の効果
ＴＢＰＩＩβ１は硬皮症においてアップ制御される前繊維性（ｐｒｏｆｉｂｒｏｔｉｃ）のサイトカインであり、硬皮症の病理に以前から付随していた（Ｋａｗａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。ＳＡＲＰ−１が繊維芽細胞によるＴＧＦβ１の生産又は分泌をダウン制御するか又は阻害するか否かを評価するため、ＳＡＲＰ−１を精製蛋白質の形態にて繊維芽細胞に添加することができる。あるいは、ＳＡＲＰ−１  ｃＤＮＡを含む発現ベクターを上記細胞内にトランスフェクトすることにより、細胞培養液中の十分量のＳＡＲＰ−１を得ることができる。別の可能性は、十分量のＳＡＲＰ−１を達成するために濃縮されてよい、ＳＡＲＰ−１発現細胞からの培地を、繊維芽細胞の培養液に加えることである。健常個体又は疾患個体に由来するか又は硬皮症患者の皮膚の正常部分又は疾患部分に由来する、繊維芽細胞系又は初期繊維芽細胞を、この実験のために使用してよい。
【０１３３】
ＴＧＦβ１の量は、Ｒ＆ＤシステムズからのＴＧＦβ１のためのＱｕａｎｔｉｌｉｎｅ  ＥＬＩＳＡシステム（カタログ番号ＤＢ１００）を用いて、培養された細胞からの条件化培地においてＥＬＩＳＡにより測定することができる。
【０１３４】
実施例６：ヒト繊維芽細胞におけるＭＭＰ−１活性に対するＳＡＲＰ−１投与のインビトロにおける効果
方法
３’末端に６ＸＨｉｓタグのコーディング配列を含むヒトＳＡＲＰ−１のｃＤＮＡをバキュロウイルス伝達ベクターｐＤＥＳＴ  Ｆａｓｔｂａｃにサブクローン化した。Ｃ  末端の６ＸＨｉｓ標識化ＳＡＲＰ−１を、組換えバキュロウイルスを感染させたＳｆ５昆虫細胞中で生産させて、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィーにより精製した。
【０１３５】
硬皮症患者又は正常被験者からの損傷又は非損傷の皮膚に由来する低い継代数（２−５）の繊維芽細胞を、０、１００又は１０００ｎｇ／ｍｌの組換えＳＡＲＰ−１で２４時間処理した。条件化培地を回収して、細胞残渣を、１２００ｒｐｍにて１０分間の４℃における遠心分離により除去した。ＭＭＰ−１活性を、ＭＭＰ−１フルオロカインキット（Ｒ＆Ｄシステムズから購入）を製造者のプロトコルに従い使用して未希釈培養培地中で測定した。ＭＭＰ−９活性も同じサンプルにおいて測定した。
【０１３６】
結果
ＭＭＰ−１はタイプＩコラーゲンの分解に必須であることから、ＭＭＰ−１活性の低下が硬皮症の根源的な欠損の一つに対する貢献因子であり、過剰なコラーゲンの堆積を伴うことを示唆する。
【０１３７】
硬皮症の患者の真皮の繊維芽細胞は、同じ患者から単離された正常及び非損傷真皮繊維芽細胞との比較において、ｍＲＮＡレベル及び蛋白質レベルの両方において、ＭＭＰ−１の発現を低下させた。検出可能な全活性ＭＭＰ−１は患者によって顕著に変動したが、ＳＡＲＰ−１処理した繊維芽細胞は、硬皮症患者からの異常な繊維芽細胞（図８Ａ，Ｄ，Ｆ）並びに硬皮症患者由来の非罹患の健常な皮膚（図８Ｅ）及び臨床上正常な対照の個体からの繊維芽細胞（図８Ｂ及びＣ）の両方において、未処理の繊維芽細胞よりも高いＭＭＰ−１活性を示した。示された結果は、３通りの測定値の平均である。ＭＭＰ−１とは対照的に、ＭＭＰ−９活性に対してのＳＡＲＰ−１の効果は観察されなかった（データは示さず）。
【０１３８】
実施例７：ＳＡＲＰ−１  ｃＤＮＡのトランスフェクションはＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞においてコラーゲンタイプ１又は２のプロモーターの活性を低下させる
材料と方法
２ｍＭグルタミン、１００ユニット／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン及び１０％  ＦＣＳを含むＤＭＥＭ中で維持されたＮＩＨ３Ｔ３を、白壁の、透明底の組織培養グレードの９６ウエルプレート（Ｗａｌｌａｃ）に５０％コンフルエントにてプレートした。次の日に、細胞にｐｃＤＮＡ３．１  ＳＡＲＰ−１と３．５ｋｂコラーゲンプロモーター及びルシフェラーゼリポーター遺伝子（ローヤルフリーホスピタルのＤａｖｉｄ  Ａｂｒａｈａｍ博士の好意により提供された）を含むｐＧＬ３ベクター（プロメガ）を、ジーンポータートランスフェクション試薬を用いて、製造者の指示に従い、同時トランスフェクションした。ＴＧＦβ（Ｒ＆Ｄシステムズ、５ｎｇ／ｍｌ）をトランスフェクションの３０時間後に加えた。ルシフェラーゼ活性は、直接各ウエル中で、２４−３６時間後に、プロメガから購入したＢｒｉｇｈｔ−Ｇｌｏアッセイシステムを用いて測定した。
【０１３９】
結果
ＳＡＲＰ−１の過剰発現とコラーゲンの合成の間に何か関係が存在するか否かを評価するため、ＳＡＲＰ−１  ｃＤＮＡのトランスフェクションの、Ｃｏｌ１α２プロモーター−ルシフェラーゼリポーター構築物を同時トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３繊維芽細胞中のコラーゲンプロモーター活性に対する効果を試験した。
【０１４０】
ＳＡＲＰ−１  ｃＤＮＡのコラーゲンプロモーター−ルシフェラーゼリポータープラスミドによる同時トランスフェクションは、ＳＡＲＰ−１が基底コラーゲンプロモーター活性のみならず、コラーゲンプロモーター活性のＴＧＦβ誘導性の増加をも抑圧できたことを示した（図９）。これらの結果は、ＳＡＲＰ−１遺伝子産物がＳＡＲＰ−１媒介性シグナリング事象を通してインビトロにおいて直接又は間接にコラーゲンプロモーターの制御に関与するかもしれないことを示唆する。
【０１４１】
繊維芽細胞中のコラーゲンの堆積及び／又は合成及び／又は分泌に対するＳＡＲＰ−１の効果を試験するための別の方法は、精製されたＳＡＲＰ−１を繊維芽細胞培養物に添加することである。あるいは、ＳＡＲＰ−１  ｃＤＮＡを含む発現ベクターを繊維芽細胞にトランスフェクトすることにより、細胞培養物中のＳＡＲＰ−１の十分な濃度を達成することができる。
【０１４２】
別の可能性は、ＳＡＲＰ−１の十分な濃度を達成するために濃縮してよいＳＡＲＰ−１発現細胞からの培地を、繊維芽細胞培養物に添加することである。健常者又は疾患者由来か又は硬皮症の患者の皮膚の正常部分又は疾患部分由来の繊維芽細胞系又は初期繊維芽細胞をこの実験のために使用してよい。
【０１４３】
コラーゲン合成は、捕捉用ＥＬＩＳＡ系（サザンバイオテクノロジーアソシエイツ社から購入した抗体）を用いて、Ｓｈｉ−ｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７により記載されたとおりに、培養されたヒト繊維芽細胞中でインビトロにて測定することができる。
【０１４４】
実施例８：ＳＡＲＰ−１を過剰発現するか又は組換えヒトＳＡＲＰ−１を処理されたヒト真皮繊維芽細胞は、硬皮症の病理に付随した遺伝子のｍＲＮＡの発現の変更を示す。
【０１４５】
方法と材料
正常なヒト真皮（包皮）繊維芽細胞を繊維芽細胞培養培地中で維持した（プロモセル）。繊維芽細胞を組換えヒトＳＡＲＰ−１（１００ｎｇ／ｍｌ）で４時間又は２４時間、ヒトＴＧＦβ１の存在下及び不在下で処理した。処理期間の後に細胞を回収して、全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌＴＭ試薬（ライフテクノロジーズ）を用い製造者の指示に従い単離した。３２Ｐ−ｄＡＴＰ標識したｃＤＮＡプローブを上で記載されたとおりにＲＮＡから調製して、上で記載された通りにして、Ｒ＆Ｄシステムズヒトサイトカイン遺伝子フィルターアレイにハイブリダイズさせて、処理した。
【０１４６】
結果
ＳＡＲＰ−１はアポトーシス関連蛋白質として最初に記載されたが、その正確な機能は未知である。硬皮症におけるＳＡＲＰ−１の役割に関する洞察を得るために、硬皮症の表現型を模倣したＴＧＦβ前処理真皮繊維芽細胞のＳＡＲＰ−１処理の、繊維芽細胞遺伝子発現に対する効果を測定した。
【０１４７】
表ＩＶは、硬皮症を模倣するのに使用された、ＴＧＦαで４時間予め刺激された後に組換えＳＡＲＰ−１による繊維芽細胞の処理により影響されたｍＲＮＡを示す。細胞を２４時間ＳＡＲＰ−１で処理した。これらの条件下で、ＴＧＦαとＦＧＦ６はダウン制御された。ＴＧＦβ１結合蛋白質であるエンドグリンの低下した発現、及びマトリックス金属プロテアーゼの活性化に付随したプロテアーゼであるフューリンの増加した発現が観察された。ダウン制御された別のｍＲＮＡはＴＡＲＣであった。このケモカインは皮膚ホーミングＴ細胞の炎症部位への補充に関連する。よって、ＳＡＲＰ−１の投与は抗炎症効果を有するかもしれない可能性がある。ＴＮＦＲ１サブユニットのｍＲＮＡのアップ制御も観察された。この観察の重要性は、ＴＮＦが硬皮症において病理機能を有するのか防御の役割を担うのかについて科学文献において大いに矛盾しているらしいように、明らかではない。
【０１４８】
別の実験（示さず）において、硬皮症患者からの繊維芽細胞内の遺伝子の制御が、健常な対照繊維芽細胞との比較において分析された。おもしろいことに、表ＩＶに示された制御された遺伝子は硬皮症サンプルにおいて制御されたことがわかった。硬皮症繊維芽細胞においてアップ制御されることがわかったそれらの遺伝子は、上記のモデルにおいてＳＡＲＰ−１発現後にダウン制御され、そしてダウン制御されたそれらの遺伝子は上記モデルにおいてＳＡＲＰ−１発現後にアップ制御されたことがわかったことから、さらに、ＳＡＲＰ−１は硬皮症の治療において有益な効果を有するかもしれないことが示される。
【０１４９】
【表４】
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【０１５０】
実施例９：マウス疾患モデルにおけるインビボのＳＡＲＰ−１効果の評価
ブレオマイシン誘導性の肺の損傷は硬皮症に関して受容されたモデルである。上記の疾患は、ブレオマイシンの気管内投与により誘導される（Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。処理されたマウスは肺に炎症性の応答を発し（最大７日目付近）、のちに繊維症をもたらすが、ピークは誘導から１４日目付近である。このモデルを用いることにより肺の繊維症の発症に対するインビボのＳＡＲＰ−１の効果を評価した。細胞送達システム（完全長ＳＡＲＰ−１  ｃＤＮＡをトランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞）を用いてインビボにおいてＳＡＲＰ−１を生成させた。
【０１５１】
方法
動物の処理
塩水中のブレオマイシン（０．０７５ＩＵ）の１日目の気管内投与により、肺の繊維症をマウス（２０−２５ｇ）において誘導した。マウスは１０匹の４つの異なる群に分割した。第１の群はＳＡＲＰ−１／ｐｃＤＮＡ３．１をトランスフェクトした１０６のＮＩＨ３Ｔ３細胞の静脈内注射を受けた。第２の群は１０６の模擬トランスフェクトされた（ｐｃＤＮＡ３．１ベクター）ＮＩＨ３Ｔ３細胞を受けた。第３の群は２５０μｇの抗−ＴＧＦβ抗体（Ａｎｔｉ  Ｐａｎ  ＴＧＦβ：シグマカタログ番号９４２９）を受けて、最終群のマウスは塩水を受けた。全マウスを１４日目に犠牲にして、肺をホルマリン固定して、組織学のためにパラフィンに埋包した。肺の切片をコラーゲンのためにトリクローム又はピコシリウスレッドで染色して（Ｂａｎｃｒｏｆｔ  Ｊ．Ｄ．ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ  Ａ．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、繊維症／肺の程度をスコアした。
【０１５２】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクション
ＮＩＨ３Ｔ３細胞にＳＡＲＰ−１／ｐｃＤＮＡ３．１又はｐｃＤＮＡ３．１をジーンポーター２試薬を前記のとおりに使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後に、培養培地を除去して、細胞を１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）で３７Ｃにいて５分間処理した。細胞を穏やかに細胞スクラッパー（Ｃｏｓｔａｒ）を用いて分離して、４分間４Ｃにおいて遠心分離することにより、細胞を沈殿させ、そして１０７細胞／ｍｌの濃度にて注射グレードの塩水に懸濁した。
【０１５３】
結果
ＳＡＲＰ−１はブレオマイシン誘導性の肺繊維症に対して防御する
ブレオマイシンのみを処理した動物又は模擬トランスフェクトされたＮＩＨ３Ｔ３細胞を処理された動物は顕著な肺繊維症を発症した（示さず）。ＴＧＦβ１は繊維症を導く病理上の変化に必須の鍵の因子の一つであると考えられる。抗ＴＧＦβ１ポリクローナル抗体は、以前に、予防のために投与された場合に肺の繊維症の発症に対して防御して（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）、また硬皮症のＧｖＨＤモデルにおいて皮膚の繊維症を減少させたことが示された（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。よって、この抗体は、これらの実験において陽性対照として使用した。抗ＴＧＦβ処理したマウスは肺の広範囲な繊維症を発症しなかった。しかしながら、ＳＡＲＰ―１をトランスフェクトされた細胞を処理されたマウスは、ブレオマイシンのみを処理されたマウス又は模擬トランスフェクトされた細胞を処理されたマウスに比較した場合に、肺の中の繊維の損傷の数を顕著に減少させた。効果は抗ＴＧＦβ処理において観察されたのと同等か又はそれよりも良好であった（示さず）。
【０１５４】
上記の肺の組織学の分析は、ＳＡＲＰ−１処理された動物が、殆ど炎症浸潤物のない肺の正常な形態及びほとんど正常な肺胞の構造に近いことを示す。この形態は抗ＴＧＦβ処理した動物の形態に似ており、模擬動物及び未処理動物からの肺において観察される異常な形態とは鮮明に対照的である。後者の２群においては、肺胞スペースが細胞浸潤物とコラーゲン堆積物により満たされている（示さず）。
【０１５５】
別の実験群の肺の繊維の損傷の量を図１０に描写する。ＳＡＲＰ−１処理したマウスは、塩水又は抗−ＴＧＦβ処理したマウスに比較して、ほとんど繊維の損傷を含まなかった。
【０１５６】
ブレオマイシンの投与は死亡率の増加を導き得る。繊維症に対するＳＡＲＰ−１の投与の防御効果に加えて、多数のマウス（８／１０）が、塩水処理したマウス（６／１０）、抗ＴＧＦβ処理したマウス（４／１０）及び模擬処理されたマウス（３／１０）に比較して、処理に生き残った。よって、ＳＡＲＰ−１処理は肺の繊維症モデルにおいて死亡から防御さえすることから、ＳＡＲＰ−１処理がこの実験セッティングにおいては抗ＴＧＦβ処理よりも明らかに優れていることを示す。
【０１５７】
要約すると、この硬皮症の確立されたインビボモデルにおいては、ＳＡＲＰ−１の有益な効果が証明された。
【０１５８】
さらに、インビボモデルを使用することにより、ＳＡＲＰ−１硬皮症の効果、例えば硬皮症のためのマウス硬皮症のグラフト対グラフト疾患（Ｓｃｌ  ＧＶＨＤ）モデルを試験することができる。このモデルは、皮膚の肥厚、肺の繊維症、及び単球の浸潤と皮膚のＴＧＦ−ベータ１のｍＲＮＡのアップ制御にが先立つ皮膚のコラーゲンのｍＲＮＡのアップ制御を含む、硬皮症の重要な特徴を再生する。上記のモデルは詳細に（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ＬＬ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）に記載される。
【０１５９】
実施例１０：発現プラスミドＤＮＡの筋肉内注射によるＳＡＲＰ−１の全身送達
硬皮症の防御性因子としてのＳＡＲＰ−１の役割を証明するため、マウスにインビボにてマウスＳＡＲＰ−１  ｃＤＮＡをコードするプラスミドをトランスフェクトして、対照として空のプラスミドをトランスフェクトしたマウスと比較した。
【０１６０】
プラスミドは、以前に記載されたとおりに、麻酔したマウスの両脛骨頭蓋筋に注射した（Ｄｉｍｍｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｍｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。簡単に言うと、経皮電気パルス（２００Ｖ／ｃｍ、２Ｈｚにて２０ミリセカンド継続時間の８四方ウエーブ電気パルス）を、ＰＳ−１５エレクトロパルセーターにより、脚の各側面にて、４．２から５．３ｍｍ離して置かれた２つのステンレス鋼製のプレートの電極を用いて送達した。
【０１６１】
次に、ブレオマイシン誘導した肺の繊維症浜絵の実施例において説明したとおりであり、疾患の発症をＳＡＲＰ−１トランスフェクト動物と模擬トランスフェクト動物との両方で観察する。
【０１６２】
【表５】
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【０１６３】
【表６】
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【０１６４】
【表７】
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【０１６５】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、遺伝子フィルター分析により測定された７人の硬皮症の患者からの正常及び疾患繊維芽細胞内のＳＡＲＰ−１  ｍＲＮＡの発現を示す。各クラスのサンプル（正常又は異常）の平均発現レベルを（Ａ）に提供し、そして中央値を（Ｂ）に提供する。
【図２】
図２は、リアルタイムＰＣＲにより測定された８人の硬皮症の患者からの正常／疾患繊維芽細胞におけるＳＡＲＰ−１  ｍＲＮＡの発現の比を示す（低い継代数、＜５継代）。
【図３】
図３は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現に比較しての、正常ヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）のＳＡＲＰ−１  ｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【図４】
図４は、ＧＡＰＤＨに比較しての、硬皮症患者からの異常な皮膚検体（ｎ＝２）に比較した臨床上正常なヒト皮膚検体（ｎ＝６）のＳＡＲＰ−１  ｍＲＮＡ発現のリアルタイムＰＣＲ分析を示す。
【図５】
図５ＡとＢは連続し、ＳＡＲＰ−１  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び演繹されるアミノ酸配列を示す。シグナルペプチドの予測される分割位置を矢印で示す。
【図６】
図６は、ヒトとマウスのＳＡＲＰ−１アミノ酸配列の整列化（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を示す。２つの配列の間の非同一残基を目立たせた（グレー）。
【図７】
図７は、対照に比較した、ＳＡＲＰ−１トランスフェクト細胞及び模擬トランスフェクト細胞のアポトーシスのレベルを示す。＊＊＊は、統計上有意な減少である。
【図８】
図８は、ヒト皮膚繊維芽細胞の培養物からの回収された条件化培地中の全ＭＭＰ−１活性に対するＳＡＲＰ−１処理の効果を示す。繊維芽細胞は疾患組織（Ａ，Ｄ，Ｆ）又は健常固体（Ｂ，Ｃ）又は硬皮症間者の疾患エリア（Ｅ）に由来した。
【図９】
図９は、非刺激及びＴＧＦβ刺激ＮＩＨ３Ｔ３細胞中のコラーゲン活性細胞に対するＳＡＲＰ−１同時トランスフェクションの効果を示す。（Ａ）はリポーターアッセイにおいて測定された発光ユニットを示し、（Ｂ）は対照に関した発光のパーセンテージを与える。
【図１０】
図１０は、ブレオマイシン誘導肺繊維症モデルにおける肺あたりの繊維症スコアを示す。賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ）を受けたマウス、ＳＡＲＰ−１トランスフェクト細胞、模擬トランスフェクト細胞又は抗ＴＧＦ治療において測定されたスコアを示す。＊＊＊は、統計上有意な減少である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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