(57)【要約】本発明は、プラスミノゲン活性化因子、特にtPA又はuPAにより誘起される副作用の予防及び/又は治療におけるポリペプチド及びその使用に関する。本発明は、さらに、本発明のポリペプチドと、１以上の現在用いられているプラスミノゲン活性化因子との組合わせた組成物及び/又は治療法に関連し、さらに、副作用の低減しつつ線維素溶解効果の改善を達成する方法に関する。
2004534842.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
６つのアミノ酸を含みかつ、プラスミノゲン活性化因子により誘起される血管作動性に対する阻害効果を有することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】
変化する数のアミノ酸配列の成分であるか、又は前記シーケンス中の１以上のアミノ酸の変性を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記プラスミノゲン活性化因子が、tPA、又はuPAを含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記プラスミノゲン活性化因子が、tcuPA、tPA、ストレプトキナーゼ、rt-PA、rt-PA誘導体、APSC、組換えscuPA、プロウロキナーゼ、又は共有結合架橋したscuPA/suPAR複合体を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
さらにtPAを含み、その組合わせが出血を起こさず線維素溶解活性を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
さらにuPAを含み、その組合わせが出血を起こさず線維素溶解活性を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
tcuPA、tPA、ストレプトキナーゼ、rt-PA、rt-PA誘導体、APSC、組換えscuPA、プロウロキナーゼ、又は共有結合架橋したscuPA/suPAR複合体を含む１以上のプラスミノゲン活性化因子をさらに含み、かつ線維素溶解活性を有する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
線維素溶解治療を必要とする患者における線維素溶解治療法であって、前記患者に、血栓溶解投与量の血栓溶解剤を投与する工程、次いで出血又は副作用を予防する量の効果的な追加投与量のEEIIMIを投与する工程を含み、前記追加的投与量のEEIIMIが、治療期間中１〜１０日毎に１回投与されることを特徴とする線維素溶解治療法。
【請求項９】
前記血栓溶解剤が、tPA又はuPAを含み、かつ通常の臨床血栓溶解剤に十分な投与量投与される請求項８に記載の線維素溶解治療法。
【請求項１０】
前記追加的投与量が、500mgまでのボーラスである、請求項８に記載の線維素溶解治療法。
【請求項１１】
患者に１〜１０日毎に１回のボーラスの投与を含み、続いて通常の臨床投与量で投与される、tPA又はuPAを含むプラスミノゲン活性化因子の血管作動性を阻害する、患者が受ける出血予防の方法。
【請求項１２】
前記血栓溶解剤が、tcuPA/PAR又はtcuPAであって、請求項８に記載の線維素溶解治療法。
【請求項１３】
本質的にtcuPA、tPA、ストレプトキナーゼ、rt-PA、rt-PA誘導体、APSC、組換えscuPA、プロウロキナーゼ、又は共有結合架橋したscuPA/suPAR複合体を含む一種以上のプラスミノゲン活性化因子から、本質的になる１種以上のプラスミノゲン活性化因子をさらに含む請求項８に記載の線維素溶解治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子(uPA)及び組織性プラスミノゲン活性化因子(tPA)の活性部位外における“ドッキング”部位へ結合する特性を有する６つのアミノ酸(EEIIMD)を含むペプチドを開示する。本発明は、また、tPA又はuPAが虚血性脳卒中の治療において投与されるときの、tPA及びuPA活性の制御、特に大脳内の出血(ICH)を誘起するtPAの能力に関連する。
【背景技術】
【０００２】
組織型プラスミノゲン活性化因子は急性血栓塞栓症発作に対する唯一の治療法であり、食品医薬品局(FDA)により承認された。しかし虚血性脳卒中の治療に対するtPAの使用は患者に２次的な大脳内出血を起こす可能性のあることには懸念すべき理由がある。Wardlaw JC et al,Lancet 1997,350:607-614を参照されたい。続いて起こる前兆となる大脳内出血が約６％の発病率で起こり、そして約５０％の患者が死亡することが理由である。TPAによる治療後の大脳出血の発生は、大脳血管の正常な血管作動性を妨害する能力に起因する。tPAは、プラスミノゲン活性を促進することに加え、投与量依存的な血管作動性、又は血管拡張効果を有することが示されている。
組織型プラスミノゲン活性化因子は血管内皮細胞から放出される天然の分子であり、肝臓における排除、又はクリアランスにより血液からt-PAは迅速に除去される。肝細胞は、tPAと又は、tPA及びtcuPAとプラスミノゲン活性化因子阻害剤(PAI-1)との複合体と結合する低密度のリポ蛋白受容体関連蛋白又はd2-マクログロブリン受容体を発現させる。これとは別に、tPAの迅速なクリアランスにも関連する内皮細胞は170Kdaのマンノース依存受容体を交互に発現する。
【０００３】
プラスミノゲン活性化因子阻害剤タイプ１はtPA及びuPA両方と相互作用し、両方のタンパクの触媒活性を阻害する。tPA及びuPAと高親和性で結合するPAI-1は、高血圧患者の循環中に高濃度で存在する。また、医学的治療により血圧を低下させると、PAI-1濃度が減少する。一定の生理学的条件下でPAI-1を増加させる作用についての基礎的な機構は良く理解されていない。しかし、tPA及び/又はuPAとの逆の関係は、PAI-1がtPA及び/又はuPAの血管作用効果を何らかの方法で中和することを示唆する。Simmons M,Cardiol. Clin 1995,13:339-345;Cipolla M et al.,Stroke,2000,31:940-945;of PAI-1;and Higazi,A.A.-R et al.,J.Biol.Chem.,1997,272:27053-27057を参照されたい。
一定の生理学的条件下における増加したレベルのPAI-1濃度と天然に産生されたtPAとの間に関係があるかどうか、又はPAI-1と、商業的に生産されたtPAの使用に起因した大脳内出血との間に関係があるかどうかは従来評価されていなかった。本発明は、もしあればPAI-1、又はtPA、又はuPAの調節のより良い理解を得ること、また、tPA又はuPAの制御活性において好ましく効果的な組成物又は生成物を、提供し、これによって、tPA及び/又はuPAのような血栓溶解治療を受ける患者において大脳内出血の危険を減少させることを企図する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
（発明の概要）
本発明は、tPA及びuPAの血管作動性に対する阻害活性を有する６つのアミノ酸から構成されるポリペプチドの組成物、及びその使用に関する。
さらに具体的に述べると、前記ポリペプチドは、血栓塞栓症疾患の治療用に投与されたtPA治療に関連する出血疾患の予防及び/又は治療において有用である。
本発明は、また、線維素溶解治療としてtPA、又はuPAを受容する患者において、それに付加的な治療法として、大脳内出血の発生を低減する方法に関する。
さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物の血栓塞栓症の治療のための医薬品キットに関し、前記キットは商業的に利用可能な形体のtPAの殺菌容器と、薬剤の各々又はその混合物の殺菌容器とから構成され、両者は血栓塞栓症を治療するのに効果的であり、一方、同一の療法において、tPAの副作用の発生を予防する。
【０００５】
前述のキットは、所望であれば、副作用を予防しながら血栓塞栓症を治療するのに治療上効果的な量のuPA又はtPAを含んでもよい。
他の線維素溶解剤との組合わせ療法において、tPA又はuPAのキットを提供することもまた本発明の範囲内である。連結的な治療として、tPA、uPA、tcuPA、ストレプトキナーゼ、rt-PA、もしくはアルテプラーゼ、rt-PA誘導体（例えばレテプラーゼ、ラノテプラーゼ、及びTNK-rt-PA）、アニソイル化したプラスミノゲンストレプトキナーゼ複合体(APSC)、もしくはアニストレプターゼ、又はストレプトキナーゼ誘導体を含む、１種以上の線維素溶解剤との組合わせを用いた血栓塞栓症疾患の治療方法を提供することが本発明のさらなる目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の詳細な説明）
本発明の利点及び特徴は、以下の詳細な説明及び図面を参照することにより、直ちに明らかとなるであろう。
本発明に従えば、ペプチドの医薬組成物が提供され、その組成物は線維素溶解剤の深刻な副作用として生じる、tPA及び/又はuPAに関連する出血疾患に対する阻害効果を有する。また、血栓塞栓症疾患の治療においてtPA又はuPAを受容する患者において大脳内出血の発生を低減する方法が本発明により企図された。
【０００７】
本発明は、また１以上の線維素溶解剤の組合わせた、ポリペプチドから成る医薬品組成物、及びキットを含む。前記線維素溶解剤はtPA、uPA、scuPA、tcuPA、ストレプトキナーゼ、rt-PA、もしくはアルテプラーゼ、rt-PA誘導体（例えばレテプラーゼ、ラノテプラーゼ、及びTNK-rt-PA）、アニソイル化したプラスミノゲンストレプトキナーゼ複合体(APSC)、もしくはアニストレプラーゼ、又はストレプトキナーゼ誘導体を含む。
本発明はさらに、tPAやuPA等の線維素溶解剤に関連する副作用を予防及び/又は阻害する効果的な量で組み合わせて単独で又は組合わせで、提供することにより、大脳内出血や、血管異常等の副作用を、予防及び/又は治療する方法を提供する。
tPAは、530のアミノ酸で構成される一本鎖セリンプロテアーゼであるがもともと527が同定されていた。t-PA酵素は、他のタンパクと相同性を有する数個のドメインから構成される。
すなわち、4から50残基から構成されるフィンガードメイン、50から87残基から構成される成長因子ドメイン、残基87-176、及び176-262から構成される２つのクルングル構造、及び触媒三連構造(triad)を含む残基276-527から構成されるプロテアーゼドメインである。t-PAのフィブリンへの最初の結合はフィンガードメイン及びクリングル２によって決められ、t-PAはリジン残基の剥き出しのカルボキシル基末端に結合する。
【０００８】
tPAは、フィブリン不存在下(Km=76uM)において、プラスミノゲンに対して弱い親和性を有するが、フィブリン存在下においてより高い親和性を有する（Kは0.5〜1.5 ＯMの間）。この反応において、プラスミノゲンは“リジン結合部位”と呼ばれる特異的な構造を介して主にフィブリンに結合する。従って、線維素溶解を制御する１つの方法は、フィブリン表面に局在しているプラスミノゲン活性化のレベル(level)におけるものである。
プラスミノゲン活性化阻害剤、特にPAI-1及びPAI-2は生理学上プラスミノゲン活性化因子を阻害し、例えばPAI-1は血漿中の、t-PA及びu-PAの主要な阻害剤である。PAI-1すなわちセリンプロテアーゼ阻害剤は内皮細胞及び他の細胞型由来の一本鎖糖タンパクである。PAI-1は、tPAの活性部位とPAI-1の”バイト(bait)”残基(Arg346-Met347)の間での複合体の形成によりtPAを阻害する。
【０００９】
血漿中のPAI-1濃度は、静脈の血栓塞栓症、肥満、敗血症、及び冠状動脈疾患を含む、いくつかの疾患において増加する。高いPAI-1活性は、第一の発作から３年経過以内に、若い患者における心筋梗塞に対して独立した危険因子を構成する。午前8時に最も発症率が高い心筋梗塞の始まり時間における24時間周期の変化と、早朝に最も高い血漿PAI-1活性の24時間間隔のリズムとの間には明らかな相関がある。
プラスミノゲン活性化阻害タイプ１はtPAとuPAの両方に相互作用し、両方のタンパクの触媒活性を阻害する。PAI-1は、tPA及びuPAと高親和性で結合し(Heckman CM,Archires of Biochem Biophysics,1988,262:199-210を参照されたい。)、また高血圧症患者の循環において高濃度で存在する。医学的治療により血圧が低下すると、PAI-1濃度は減少する。Erden YC et al. AmJ Hypertens,1999,12:1071-1076を参照されたい。ある種の生理学的条件下において、PAI-1の増加を説明する根元的なメカニズムの作用は理解されていない。
PAI-1は、１本鎖tPA、２本鎖tPA及びtcuPAと反応する。PAI-1による１本鎖tPAの阻害のための２次速度定数は約107M-1sであり、一方２本鎖tPA及びtcuPAの阻害は幾分早い。TPA（残基296-304）及びuPA（9残基179-184）における正に荷電した領域はこの早い反応に関連する。PAI活性は肝臓の循環から非常に早く排除される。機能的で非活性なPAI-1を含む血小板を除いて、PAI-1は細胞内に蓄積されず、しかし、合成後、迅速に、構成的に分泌される。
【００１０】
PAI-1は、２つの独立したエピトープを介してtPAとuPAと結合し、エピトープの１つは活性部位に結合する。他方のエピトープは、PAI-1の350から355アミノ酸残基に対応する６個のアミノ酸残基EEIMDから構成される。この２番目のPAI-1のエピトープは活性部位の外側のuPA及びtPAの“ドッキング”結合部位と相互作用する。Adams DS et al.,J.Biol.Chem,1999,266:8476-8482を参照されたい。
本発明はtPA及びuPAの血管作動性に対するペプチドの効果を記述し、このペプチドは大動脈血管輪（aorta ring）培養におけるフェニレフリン誘起血管収縮に対するtPAの促進効果を無効にすることを示す。同様に、本発明のペプチドは、フェニルフリン誘起血管収縮におけるuPAの促進効果を排除する。これらの観察は実施例部分において詳細に記載されている。
本発明のペプチドは、血管に対するtPA又はuPAの副作用効果を予防し及び/又は阻害しながら、心筋梗塞、脳卒中、及び関連する合併症における血栓溶解の治療の間、血塊溶解に有用なtPA又はuPAの線維素溶解活性に対する効果を有しない。
市場で入手可能なtPAは、組換えDNA技術（組換えt-PA、rt-PA等）により、２つの形体で生産される。すなわち、１本鎖調製物（アルテプラーゼ）、及び２本鎖調製物（デューテプラーゼ）である。他のtPA型はレテプラーゼ（r-PA0、突然変異のrt-PA、TNK-rt-PA）を含む。
【００１１】
フィブリン選択的なアルテプラーゼの好ましい適用量の療法は重量-調整されかつ促進された（front-loaded）90分にわたる療法（15mgボーラス、30分にわたる0.75mg/kg[50mgを超えない]及び、60分にわたる0.05mg/kg[35mgを超えない]）からなる。
ペプチドの好ましい適用量の療法は、tPAの有害な血管作用効果をケースバイケースの原則に基づき予防するための効果量からなる。ペプチドは変化する数のアミノ酸の配列要素を構成してもよく、又はペプチドはその配列中の１以上のアミノ酸の修正を有しても良い。
本発明のペプチドは、単独で効果投与量投与されるか、又は伝統的な抗凝固薬治療と組合せて投与されると、敗血症の治療において有用である。生理学的条件下、いくつかの抗血栓症メカニズムが凝固の防止及び血液流動性の保護と協調して、働く。この生理学的抗血栓症系の監視を逃れるトロンビンは、フィブリノゲンをフィブリンに変換するのに利用される。フィブリンが次いで、線維素溶解系を刺激する。
【実施例１】
【００１２】
（フェニレフリン誘起収縮に対するtPAの効果）
図１はin vitro培養されたラット大動脈血管輪のフェニレフリン誘起収縮に対するtPAの効果を記述するグラフを示す。前記大動脈血管輪の収縮は、tPAの不存在下(黒抜き三角)、1nMのtPAの存在下（黒抜き四角）、又は10nMのtPAの存在下（白抜き四角）で、フェニレフリンの異なる濃度で誘起された。この実験はHaj-Yehia A et al.,FASEB J,2000,14:1411-1422によって、以前に記述された方法に従って実施された。
得られた結果はtPAが血管拡張を誘起する能力を有することを確認した。
図１は、1nMのtPAの存在がフェニレフレンに誘起された血管収縮を阻害することを示す。tPA濃度が増加すると、逆の効果が誘起された。すなわち、1nMのtPAの存在はフェニレフレンにより誘起された血管収縮を刺激した。同様に、uPAは血管収縮を誘起する能力を有する。Haj-Yehia A., et al. FASEB J,2000,14:1411-1422を参照されたい。
（uPA及びtPAの血管作動性におけるPAI-1の効果）
図２は、PAI-1の存在下、又は不存在下における、uPA及びtPAの作動活性における実験結果を記述する棒グラフを示し、例えば、フェニレフリン誘起血管収縮に対する2nM utPA又は1nM tPAの効果がPAI-1の等モル濃度の存在下又は不存在下で測定された。
【００１３】
図３は、tPAの血管作用に対するPAI-1由来のペプチドの効果について行われた研究結果を示す棒グラフである。大動脈血管輪の収縮は、1nMtPAの存在又は不存在下、1nMtPA及び1 ＯMの存在下、10nM tPAの存在下、10nM及び1 ＯMの存在下において、フェニレフリンの濃度の増加により誘起された。
得られた結果は、フェニレフレン誘起血管収縮に対するtPAの1 ＯMの促進効果は消失したことを示す。uPAに対しても同様の効果を示した。PAI-1は単独でも、大動脈血管輪の収縮効果に対する作用を有しなかった（図３）。従って、PAI-1がtPA又はuPAの血管作動効果に影響するメカニズムはドッキング部位との相互作用を介するものである。
（PAI-1由来ペプチドの、tPA介在血塊溶解への効果）
図４は、PAI-1由来ペプチドのtPA介在血塊溶解に対する効果に関する実験結果を示す棒グラフである。血塊溶解を誘起するtPAの能力は1 ＯMの存在下、不存在下決定した。これらの実験においてボランティアから得た血液を１時間、室温に放置して血塊を形成させ、この血塊を血漿と分離し、吸収紙に置いて、全ての血清を除去し、数個の部分に分けた。この部分を秤量し、PBSバッファー単独中か、又は100nMのtPAを含有するPBS中に、1 ＯM存在又は不存在下で置いた。室温で３時間のインキュベーション後、血栓を媒体から分離し、乾燥し、秤量した。
【００１４】
２つの方法を用いて、ペプチドがプラスミノゲン活性を阻害することにより、tPAの線維素溶解活性に作用するかどうか決定した。1) 以前に詳細に記述されたクロモジェニックアッセイ(Higazi AA.-R,et al.J.Biol.Chem.,1995,270:9472-9477)及び、2) 以前に記述された血塊溶解試験(Higazi AA-R et al.,Blood 1988,92:2075-2083)。
得られた結果は、tPAの触媒活性に対する重要な効果がないことを示した（図４）。
従って、これらのデータは、PAI-1由来ペプチド及びその誘導体がtPA又はuPAの血管作動性を中和し、その結果、血管において副作用を低減し、かつ心筋梗塞、脳卒中及び類似疾患の場合に、血栓治療の間生じる合併症を予防することができることを示す。
本発明の範囲は本発明の１観点の説明として意図されている実施例に開示されている態様によって限定されず、機能的に等価ないかなる方法も本発明の範囲内である。実際、ここで記載され、示されているものの他に本発明の種々の改良は、上記の記載から当業者にとって明らかとなるだろう。そのような改良は特許請求の範囲に含まれるであろう。
当業者は、ここに記載されている本発明の特定の態様のいかなる等価物を認識し、又は単に通常の実験を用いて、確かめることが出来る。そのような等価物は特許請求の範囲に包含されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、in vitroにおける単離されたラットの大動脈血管輪フェニレフリン誘起収縮に対するtPAの効果を記述する図である。大動脈血管輪の縮小は、tPA不存在下（黒抜き三角）、1nMのtPA存在下（黒抜き四角）、又は10nMのtPAの存在下（白抜き四角）におけるフェニレフリン濃度を変化させることより誘起した。この実験はHaj-Yahia A et al.,FASEB J,2000,14:1411-1422に以前記載された方法に従って実施した。
【図２】図２は、PAI-1の存在下又は不存在下におけるuPA及びtPAの血管作動に関する実験結果を示した棒グラフであり、例えば、2nM uP又は1nM tPAにおけるフェニレフリン誘起血管収縮が等モル濃度のPAI-1存在下又は不存在下で決定された。
【図３】図３は、tPAの血管作用に対するPAI-1由来ペプチドの効果に関して行った研究結果を示す棒グラフである。大動脈血管輪の収縮が、1nMのtPA存在下又は不存在下、1nMtPA＋1 ＯMの存在下、10mM tPAの存在下、10nM tPA＋1 ＯMの存在下において、フェニレフレン濃度の増加により誘起された。
【図４】図４は、tPA介在血塊溶解に対するPAI-1由来ペプチドの効果に関する実験結果を示した棒グラフである。血塊溶解を誘起するtPAの能力は、1 ＯMの存在又は不存在下で決定された。これらの実験において、ボランティアから得た血液を１時間、室温下で放置して、凝固させ、血塊を血漿から分離し、吸収紙の上に置き、全ての血清を除去し、いくつかの部分に分けた。その部分の重さを計り、PBSバッファー単独中か、又は100nMのtPAを含むPBSバッファー中に、1 ＯM存在又は不存在下、置いた。室温での３時間のインキュベーションの後、血栓を培地から分離し、乾燥し、秤量した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004534842.tif 000026
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2004534842.tif 000028