(57)【要約】植物由来の化合物および誘導体のプロドラッグを使用して、腫瘍成長を予防または阻害する、より詳細には、悪性腫瘍を治療する組成物および方法を開示する。本方法では、ベツリン酸およびベツリン酸誘導体を含む組成物を、ベツリン酸またはベツリン酸誘導体がｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍部位に放出するプロドラッグ形態で投与する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）式：
【化１】
2004517045.tif 000033
を有する化合物の治療有効量および
（ｂ）任意選択的なキャリアを含む、腫瘍成長治療用化合物。
【請求項２】
（ａ）
【化２】
2004517045.tif 000034
【化３】
2004517045.tif 000035
【化４】
2004517045.tif 000036
（式中、Ｒ１およびＲ３は、独立して、水素、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）ＮＲ４Ｒ５、ＣＯ（Ｃ１〜３アルキル）ＣＯ２Ｒ４、ＣＯＣＨ（Ｃ６Ｈ５）ＮＲ４Ｒ５、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）ＣＯ２Ｒ４、ＣＯ（Ｃ１〜６アルキル）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣ１〜３アルキル、ＣＨ２ＯＣＯ２Ｃ１〜６アルキル、ＣＨ２ＯＣＯＣ１〜６アルキル、ＰＯ（ＯＨ）２、およびＳＯ３Ｈからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｃ１〜Ｃ６アルキルＮＲ４Ｒ５、ＣＨ２ＯＣＯＣ１〜Ｃ６アルキル、ＰＯ（ＯＨ）２、ＳＯ３Ｈ、ＣＨ（Ｃ６Ｈ５）ＮＲ４Ｒ５、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）ＣＯ２Ｒ４、および（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣ１〜３アルキルからなる群から選択され、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、およびアリールからなる群から選択されるか、Ｒ４およびＲ５が共に５〜７員環を形成することができ、
ｎは１〜１０である）からなる群から選択される、ベツリン酸またはその誘導体およびその薬学的に許容可能な塩のプロドラッグ、および
（ｂ）任意選択的なキャリアを含む、腫瘍成長治療用組成物。
【請求項３】
少なくとも１つのＲ１、Ｒ２、およびＲ３は水素であり、少なくとも１つのＲ１、Ｒ２、およびＲ３は水素と異なる、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、
【化５】
2004517045.tif 000037
（式中、ＰｈはＣ６Ｈ５である）からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも１つのＲ１、Ｒ２、およびＲ３はＰＯ（ＯＨ）２であり、残りのＲ１、Ｒ２、およびＲ３は水素である、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
少なくとも１つのＲ１、Ｒ２、およびＲ３はＣＨ２ＯＣＯＣ（ＣＨ３）３である、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも１つのＲ１、Ｒ２、およびＲ３はＳＯ３Ｈであり、残りのＲ１、Ｒ２、およびＲ３は水素である、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
構造：
【化６】
2004517045.tif 000038
【化７】
2004517045.tif 000039
（式中、Ｒ１は、水素、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）ＮＲ４Ｒ５、ＣＯ（Ｃ１〜３アルキル）ＣＯ２Ｒ４、ＣＯＣＨ（Ｃ６Ｈ５）ＮＲ４Ｒ５、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）ＣＯ２Ｒ４、ＣＯ（Ｃ１〜６アルキル）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣ１〜３アルキル、ＣＨ２ＯＣＯ２Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＨ２ＯＣＯＣ１〜Ｃ６アルキル、ＰＯ（ＯＨ）２、およびＳＯ３Ｈからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｃ１〜Ｃ６アルキルＮＲ４Ｒ５、ＣＨ２ＯＣＯＣ１〜Ｃ６アルキル、ＰＯ（ＯＨ）２、ＳＯ３Ｈ、ＣＨ（Ｃ６Ｈ５）ＮＲ４Ｒ５、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）ＣＯ２Ｒ４、および（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣ１〜３アルキルからなる群から選択され、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、およびアリールからなる群から選択されるか、Ｒ４およびＲ５が共に５〜７員環を形成することができ、
ｎは１〜１０である（但し、少なくとも１つのＲ１およびＲ２がＨと異なる））を有する化合物およびその薬学的に許容可能な塩。
【請求項９】
構造：
【化８】
2004517045.tif 000040
【化９】
2004517045.tif 000041
（式中、Ｒ１およびＲ３は、独立して、水素、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）ＮＲ４Ｒ５、ＣＯ（Ｃ１〜３アルキル）ＣＯ２Ｒ４、ＣＯＣＨ（Ｃ６Ｈ５）ＮＲ４Ｒ５、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）ＣＯ２Ｒ４、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣ１〜３アルキル、ＣＨ２ＯＣＯ２Ｃ１〜６アルキル、ＣＨ２ＯＣＯＣ１〜６アルキル、ＰＯ（ＯＨ）２、およびＳＯ３Ｈからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｃ１〜Ｃ６アルキルＮＲ４Ｒ５、ＣＨ２ＯＣＯＣ１〜Ｃ６アルキル、ＰＯ（ＯＨ）２、ＳＯ３Ｈ、ＣＨ（Ｃ６Ｈ５）ＮＲ４Ｒ５、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）ＣＯ２Ｒ４、および（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣ１〜３アルキルからなる群から選択され、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、およびアリールからなる群から選択されるか、Ｒ４およびＲ５が共に５〜７員環を形成することができ、
ｎは１〜１０である）を有する化合物およびその薬学的に許容可能な塩。
【請求項１０】
前記化合物が、構造：
【化１０】
2004517045.tif 000042
【化１１】
2004517045.tif 000043
を有する、請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
本明細書中に記載の化合物であって、化合物２、３、４ａ〜４ｊ、５ａ〜５ｇ、６ａ〜６ｇ、７、８、９、１０ａ、１０ｂ、１１ａ〜１１ｇ、１２ａ〜１２ｇ、１３、１４ａ〜１４ｃ、１５ａ〜１５ｃ、２２、２３、２６、２７ａ〜２７ｉ、２８ａ〜２８ｉとして示される化合物、ならびにその塩。
【請求項１２】
治療有効量の請求項１１に記載の化合物を必要とする個体に投与する工程を含む、ベツリン酸またはベツリン酸誘導体に感受性を示す癌の治療法。
【請求項１３】
前記癌が、黒色腫、扁平上皮腫瘍、乳がん、大腸癌、肉腫、ヒト口腔表皮癌、ホルモン依存性乳癌、前立腺癌、肺癌、神経膠腫、黒色腫、および神経芽腫からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
治療有効量のベツリン酸のプロドラッグまたはベツリン酸誘導体のプロドラッグを必要とする個体に投与する工程を含む、ベツリン酸またはベツリン酸誘導体に感受性を示す癌の治療法。
【請求項１５】
前記癌が、黒色腫、扁平上皮腫瘍、乳がん、大腸癌、肉腫、ヒト口腔表皮癌、ホルモン依存性乳癌、前立腺癌、肺癌、神経膠腫、黒色腫、および神経芽腫からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記プロドラッグを、局所的、静脈内、または腹腔内投与する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
治療有効量の請求項１１に記載の化合物を必要とする個体に投与する工程を含む、ＨＩＶの治療法。
【請求項１８】
治療有効量のベツリン酸のプロドラッグまたはベツリン酸誘導体のプロドラッグを必要とする個体に投与する工程を含む、ＨＩＶの治療法。
【請求項１９】
前記プロドラッグを、局所的、静脈内、または腹腔内投与する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１１に記載の化合物および薬学的に許容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項２１】
治療有効量の請求項１１に記載の化合物およびキャリアを含む組成物を必要とする個体に投与する工程を含む、ベツリン酸またはベツリン酸誘導体に感受性を示す癌の治療法。
【請求項２２】
治療有効量の請求項１１に記載の化合物およびキャリアを含む組成物を必要とする個体に投与する工程を含む、ＨＩＶの治療法。
【請求項２３】
（ａ）構造：
【化１２】
2004517045.tif 000044
を有する保護ベツリン酸をＢＨ３−ジメチルスルフィドでヒドロホウ素化する工程と、
（ｂ）塩基性条件下で工程（ａ）の反応生成物を酸化して構造：
【化１３】
2004517045.tif 000045
を有するＣ−２９アルコールを得る工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の生成物のＣ−３アセテート基を加水分解する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）の生成物のＣ−２８ベンジルエステル基を触媒下で水素化分解する工程とを含む、構造：
【化１４】
2004517045.tif 000046
を有する化合物の調製法。
【請求項２４】
（ａ）二酸化セレン触媒およびｔ−ブチルヒドロペルオキシドを使用して、構造：
【化１５】
2004517045.tif 000047
を有する化合物を酸化する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の生成物のＣ−３アセテート基を加水分解する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の生成物のＣ−２８ベンジルエステル基を触媒下で水素化分解する工程とを含む、構造：
【化１６】
2004517045.tif 000048
を有する化合物の調製法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０００年８月１８日に提出された米国特許仮出願第６０／２２６，５３６号の利益を主張する。
（発明の分野）
本発明は、植物由来の化合物およびその誘導体、特にベツリン酸およびベツリン酸誘導体のプロドラッグを使用した、腫瘍の阻害、より詳細には黒色腫などの悪性腫瘍の治療のための組成物および方法に関する。
（発明の背景）
過去４０年間で、黒色腫の発症率は任意の他の癌型よりも急速に増加している。現在、白人アメリカ９０人あたり１人が悪性黒色腫を発症していると推定されている。手術が十分に有効なほど早期に黒色腫と診断される割合が増加し、９０％を超える十年生存率を達成している一方で、約７０００人の転移性黒色腫個体が米国で毎年死亡している。
【０００２】
手術摘出に適応しない転移性黒色腫を罹患した患者の治療選択肢は限られている。５−（３，３−ジメチル−１−トリアゼニル）−１−Ｈ−イミダゾール−４−カルボキシアミド（ダカルバジン、ＤＴＩＣ）は、全体的応答率が２４％である、黒色腫の最も有効な化学療法単剤である。しかし、ＤＴＩＣに対する応答は、一般に持続性が非常に低い。他の合成および組換え薬（Ｎ，Ｎ’−ビス（２−クロロエチル）−Ｎ−ニトロソ尿素（カルムスチン、ＢＣＮＵ）、シスプラチン、タモキシフェン、インターフェロンα（ＩＮＦ−α）、およびインターロイキン２（ＩＬ−２）を含む）との併用療法は、いくつかの試験では応答率がより高い（例えば、３０〜５０％）が、持続的で完全な応答率は稀であり、毒性が増大する。連続化学療法もまた有望であるが、現在の転移性黒色腫罹患個体の治療選択肢では不満足である。
【０００３】
天然産物由来の種々の薬物（アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ブレオマイシン、エトポシド、およびビンクリスチン、ならびにこれらの誘導体など）が、単剤または併用療法のいずれかとしての黒色腫に対する有効性について試験されている。しかし、合成および組換え化合物と同様に、これらの化合物は応答率が低く、完全な応答は一過性で、毒性が高い。
【０００４】
それにもかかわらず、公知且つ現在使用されている癌化学療法薬によって示されるように、植物由来天然産物が有効な薬物の供給源として立証されている。このような２つの有用な天然産物の薬物は、パクリタキセル（タキソール）およびカンプトテシンである。セイヨウイチイＴａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ Ｎｕｔｔ．（イチイ科）の樹皮由来のパクリタキセルが不応性または残留卵巣癌の治療に使用されている。より最近では、臨床試験により、転移性黒色腫治療におけるパクリタキセルの可能な役割が調査されている。単剤として、タキソールは、シスプラチンおよびＩＬ−２に匹敵する活性を示す。タキソールは固有の作用様式によって機能し、チューブリンの重合を促進する。したがって、タキソールによって媒介される抗腫瘍応答は、その抗有糸分裂活性による。
【０００５】
第２の卓越した薬物であるカンプトテシンは、中国産のＣａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｕｍｉｎａｔａ Ｄｅｃａｉｓｎｅ（Ｎｙｓｓａｃｅａｅ）の樹皮から単離された。カンプトテシンはまた、新規の作用機構（すなわち、トポイソメラーゼＩの阻害）によって機能する。種々の腫瘍に対する水溶性カンプトテシンプロドラッグアナログであるイリノチカン（ＣＰＴ−１１）の第ＩＩ相臨床試験は日本で完了しており、応答率は０％（リンパ腫）〜５０％（小細胞肺癌）の範囲であった。トポテカン（別の水溶性カンプトテシンアナログ）は、現在米国で第ＩＩ相試験が行われている。
【０００６】
さらに、研究により、ベツリン酸およびベツリン酸誘導体が黒色腫に加えて他の癌細胞型（神経芽腫など）を阻害することができることが示された。例えば、Ｄａｓ  Ｇｕｐｔａらに付与された米国特許第５，６５８，９４７号は、ベツリン酸はヒト黒色腫の選択的制御または治療に有用であることを開示し、Ｐｅｚｚｕｔｏらに付与された米国特許第５，９６２，５２７号は、黒色腫細胞に対するベツリン酸誘導体の選択的活性を開示している。
【０００７】
しかし、癌治療におけるベツリン酸またはベツリン酸誘導体使用に関する不都合は、これらの活性薬の処方および種々の癌治療に適切な投薬形態の獲得で遭遇する問題である。本出願は、不都合の克服および種々の投薬形態への処方が容易であり、且つｉｎ ｖｉｖｏでベツリン酸またはその誘導体が放出される有用なベツリン酸およびその誘導体のプロドラッグの獲得に関する。
（発明の要旨）
本発明は、腫瘍成長の予防または阻害のための方法および組成物に関する。活性化合物は、ベツリン酸またはその誘導体をｉｎ ｖｉｖｏで生成するベツリン酸またはベツリン酸誘導体のプロドラッグである。ベツリン酸は、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｍａｕｒｉｔｉａｎａの樹皮から抽出物を調製する工程およびベツリン酸を単離する工程とを含む方法によって得られる天然産物である。あるいは、ベツリンを、抽出物から単離することができ、その後ベツリン酸を一連の合成工程によってベツリンから調製する。
【０００８】
ベツリン酸を、ヒト癌細胞株の被験体パネルにおいてヒト黒色腫に対する選択的細胞傷害プロフィールを媒介する工程と、モニターとして培養ヒト黒色腫細胞（ＭＥＬ−２）を使用した生物活性プロフィールに基づくバイオアッセイ特異的分別を行う工程と、活性化合物としてベツリン酸を得る工程によって抽出物から単離することができる。得られたベツリン酸を使用して腫瘍成長を予防または阻害するか、誘導体に変換して腫瘍成長を予防または阻害することができる。
【０００９】
ベツリン酸の物理化学的性質（例えば、高い融点ならびに親水性および疎水性溶媒における限られた溶解性）により、ベツリン酸含有薬理学的処方物の作製は困難である。本発明は、処方が容易であり、内因性酵素によりｉｎ ｖｉｖｏでベツリン酸または誘導体を放出することができる形態のベツリン酸またはベツリン酸誘導体の獲得に関する。
【００１０】
したがって、本発明の重要な態様は、処方が容易な形態の天然産物由来化合物またはその誘導体を使用した、腫瘍成長の予防または阻害、特に悪性腫瘍成長の予防または阻害のための方法および組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の別の態様は、治療有効量のベツリン酸またはベツリン酸誘導体のプロドラッグの必要とする個体への投与によって、個体におけるベツリン酸およびベツリン酸誘導体の生物学的利用能を改良することである。
【００１２】
本発明の別の態様は、ベツリン酸またはその誘導体に感受性を示す癌治療と一致した様式（例えば、黒色腫の予防、阻害、もしくは治療のための局所調製物、または他の癌形態のための静脈内もしくは腹腔内調製物）でベツリン酸またはその誘導体を必要とする個体に投与する、癌細胞の成長および拡大を予防するためのベツリン酸またはその誘導体のプロドラッグを利用した治療法を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに別の態様は、天然産物由来の化合物（例えば、ベツリン酸またはベツリン酸誘導体のプロドラッグ）による合成抗癌薬に関する高い哺乳動物毒性の問題を克服することである。
【００１４】
本発明のさらに別の態様は、天然に存在する産物またはその誘導体での種々の癌形態を治療するための組成物および方法を提供することである。特に、本発明は、黒色腫、神経芽腫、乳癌、肺癌、線維肉腫、大腸癌、口腔表皮癌、類表皮癌、前立腺癌、ホルモン依存性乳癌、および神経膠腫に関連する悪性腫瘍成長の阻害に関する。
【００１５】
特に、本発明の態様は、
【００１６】
【化１７】
2004517045.tif 000002
【００１７】
【化１８】
2004517045.tif 000003
【００１８】
および（ｂ）選択可能なキャリアを含む、腫瘍成長治療用組成物を提供することである。
【００１９】
本発明の別の態様は、
【００２０】
【化１９】
2004517045.tif 000004
【００２１】
【化２０】
2004517045.tif 000005
【００２２】
【化２１】
2004517045.tif 000006
【００２３】
【化２２】
2004517045.tif 000007
【００２４】
（式中、Ｒ１およびＲ３は、独立して、水素、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）ＮＲ４Ｒ５、ＣＯ（Ｃ１〜３アルキル）ＣＯ２Ｒ４、ＣＯＣＨ（Ｃ６Ｈ５）ＮＲ４Ｒ５、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）ＣＯ２Ｒ４、ＣＯ（Ｃ１〜６アルキル）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣ１〜３アルキル、ＣＨ２ＯＣＯ２Ｃ１〜６アルキル、ＣＨ２ＯＣＯＣ１〜６アルキル、ＰＯ（ＯＨ）２、およびＳＯ３Ｈからなる群から選択され、
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＨ２Ｃ６Ｈ５、Ｃ１〜Ｃ６アルキルＮＲ４Ｒ５、ＣＨ２ＯＣＯＣ１〜Ｃ６アルキル、ＰＯ（ＯＨ）２、ＳＯ３Ｈ、ＣＨ（Ｃ６Ｈ５）ＮＲ４Ｒ５、（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）ＣＯ２Ｒ４、および（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣ１〜３アルキルからなる群から選択され、
Ｒ４およびＲ５は、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、ＣＯ（Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、およびアリールからなる群から選択されるか、Ｒ４およびＲ５が共に５〜７員環を形成することができ、
ｎは１〜１０である）ならびにその薬学的に許容可能な塩および（ｂ）選択可能なキャリアを含む、腫瘍成長治療用組成物を提供することである。
【００２５】
本発明の別の態様は、治療有効量のベツリン酸またはベツリン酸誘導体のプロドラッグを必要とする個体に投与する工程を含む、ベツリン酸またはベツリン酸誘導体に感受性を示す癌の治療法を提供することである。特に、癌は、黒色腫、扁平上皮腫瘍、乳がん、大腸癌、肉腫、ヒト口腔表皮癌、ホルモン依存性乳癌、前立腺癌、肺癌、神経膠腫、黒色腫、および神経芽腫からなる群から選択される。
【００２６】
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明から明らかであり、これらの態様は本発明の精神および範囲のいずれも制限することを意図せず、本発明の好ましい実施形態の例示としてのみ提供する。
（好ましい実施形態の詳細な説明）
ベツリン酸（３β−ヒドロキシ−ラップ−２０（２９）−エン−２８−オン酸）は、いくつかの高等植物属から単離される天然５員環トリテルペン生成物である。ベツリン酸は、ヒト黒色腫に対する顕著な選択的抗腫瘍活性（Ｅ．Ｐｉｓｈａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１、１０４６〜１０５１、１９９５）および抗ＨＩＶ活性（Ｔ．Ｆｕｊｉｏｋａら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．、５７、２４３〜２４７、１９９４）が証明されている。
【００２７】
Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｍａｕｒｉｔｉａｎａ  Ｌａｍ．（Ｒｈａｍｎａｃｅａｅ）の樹皮のバイオアッセイ特異的分別により、培養ヒト黒色腫細胞に対して細胞傷害性を示す活性化合物としてベツリン酸が単離された。ベツリン酸は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのその特有の細胞障害プロフィールによりヒト黒色腫に対する優れた抗腫瘍化合物であることが見出されている。ベツリン酸は、アポトーシス誘導による黒色腫に対する強力な選択的抗腫瘍活性を示した。
【００２８】
ベツリン酸はまた、試験した他の癌細胞株に対する活性を有することが認められた。ベツリン酸の細胞傷害性および正常な細胞に対する無毒性は好ましい治療指数を提供する。細胞傷害性が高い細胞株は、Ａ４３１（扁平上皮細胞）、ＢＣ−１（乳癌細胞）、ＺＲ−７５−１（ホルモン依存性ヒト乳癌細胞）、神経芽腫細胞、ＣＯＬ−２（大腸癌細胞）、ＨＴ−１０８０（肉腫細胞）、ＫＢ（ヒト口腔表皮癌細胞）、ＬＮＣａＰ（前立腺癌細胞）、ＬＵ−１（肺癌細胞）、Ｕ３７３（神経膠腫細胞）、およびＭＥＬ−１、−２、−３、および−４（黒色腫細胞）であった。
【００２９】
シラカバ（Ｂｅｔｕｌａ  ａｌｂａ）の樹皮は、ベツリン（約２５％まで）、ｌｕｐ−２０（２９）−エン−３β，２８−ジオール、およびベツリン酸（０．０２５％）を含むが、広範なバイオアッセイの実施に十分な量のベツリン酸を単離することは困難である。簡単な合成アプローチによってベツリンから一定量のベツリン酸を得ることができることが見出された。
【００３０】
表１に示すように、ＭＥＬ−２細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ成長がベツリン酸によって阻害された（すなわち、ＥＤ５０値が約２μｇ／ｍｌ）。この特定の試験では、他の試験癌細胞株はいずれもベツリン酸に影響を受けなかった（すなわち、ＥＤ５０値が約２０μｇ／ｍｌを超える）。ベツリン酸によって媒介された細胞障害応答は、ＭＥＬ−２細胞株に排他的に制限されない。ＭＥＬ−１、ＭＥＬ−３、およびＭＥＬ−４と呼ばれるさらなるヒト黒色腫細胞株を使用して用量−反応試験を行い、それぞれ１．１、３．３、および４．８μｇ／ｍｌのＥＤ５０値を示した。
【００３１】
表１にさらに示すように、他の公知の抗腫瘍薬（パクリタキセル、カンプトテシン、エリプチシン、ホモハリントニン、ミトラマイシンＡ、ポドピロトキシン、ビンブラスチン、およびビンクリスチンなど）が比較的強力で非選択的な細胞障害活性を示し、細胞型選択性は区別できなかった。
【００３２】
以下の表１では、抽出ベツリン酸および他の純粋な化合物を、以下の培養ヒト細胞株に対する細胞傷害性について試験した：Ａ４３１（扁平上皮細胞）、ＢＣ−１（乳癌細胞）、ＣＯＬ−２（大腸癌細胞）、ＨＴ−１０８０（肉腫細胞）、ＫＢ（ヒト口腔表皮癌細胞）、ＬＮＣａＰ（前立腺癌細胞）、ＬＵ−１（肺癌細胞）、ＭＥＬ−２（黒色腫細胞）、Ｕ３７３（神経膠腫細胞）、およびＺＲ−７５−１（乳癌細胞）。
【００３３】
【表１】
2004517045.tif 000008
【００３４】
表１のデータを得るために使用した試験方法（すなわち、方法Ａ）を使用した場合、ヒト黒色腫細胞に対してベツリン酸応答性細胞障害活性が最も高かった。表１にまとめたデータに基づいて、ベツリン酸を使用したｉｎ ｖｉｖｏ研究を行った。表２に示すように、他の試験（すなわち、方法ＢおよびＣ）を使用して癌細胞株に対する細胞傷害性についてベツリン酸を試験した場合、他のヒト癌細胞型（例えば、乳癌、肉腫、肺癌、大腸癌、扁平上皮癌、前立腺癌、および神経膠腫）に対しても明らかな活性が認められた。しかし、ヒト黒色腫細胞に対して最も高い活性が認められた。ベツリン酸はまた、ヒト神経芽腫細胞株に対して優れた細胞障害活性を示した。
【００３５】
表１でまとめたデータによって確認したように、ベツリン酸は、培養ＫＢ細胞に関して非細胞傷害性であると報告した。粗抽出物および精製化合物の細胞傷害性を、多数の培養ヒト癌細胞株で同定した。表１は、方法Ａを使用して評価した種々の癌細胞型を示す。適切な培地および標準的条件下で細胞を培養した。対数成長を維持するために、細胞傷害性アッセイの２４時間前に培地を交換した。アッセイ当日、細胞をトリプシン処理によって回収し、計数し、培地で希釈し、ＤＭＳＯ中に溶解した試験化合物を含む９６ウェルプレートに添加した。ＤＭＳＯの最終濃度は、０．０５％であった。
【００３６】
表２は、組織培養培地（方法Ｂ）または５％ウシ血清アルブミン水溶液（方法Ｃ）中に溶解した試験サンプルを使用したベツリン酸の細胞傷害性を示す試験データをまとめている。方法ＢおよびＣは、黒色腫、特に乳癌、線維肉腫、肺癌、大腸癌、表皮癌、ホルモン依存性乳癌、および神経膠腫に加えて癌細胞株に対するベツリン酸の細胞傷害性を例示する。
【００３７】
それぞれ方法Ａ〜Ｃにおいて、プレートを３日間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を固定し、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）色素で染色した。結合色素をＴｒｉｓ塩基で遊離させ、ＯＤ５１５（５１５ｎｍでの光学密度）を、ＥＬＩＳＡリーダーで測定した。ベツリン酸処理細胞の成長をＯＤ５１５値によって同定し、成長を方法Ａ〜Ｃの処理コントロール細胞のＯＤ５１５値と比較した。用量反応試験を行ってＥＤ５０値を得た。本明細書中で使用される、用語「ＯＤ５１５」は５１５ｎＭでの光学密度と定義し、用語「ＥＤ５０」は、５０％の細胞数を減少させるために必要な化合物の濃度と定義する。
【００３８】
【表２】
2004517045.tif 000009
【００３９】
したがって、本発明は、腫瘍成長の予防または阻害のための方法および組成物に関する。最高の活性化合物は、ベツリン酸またはその誘導体のプロドラッグからｉｎ ｖｉｖｏで生成されるベツリン酸またはベツリン酸誘導体である。Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｍａｕｒｉｔｉａｎａの樹皮由来の抽出物を調製する工程と、ベツリン酸を単離する工程とを含む方法によってベツリン酸を単離することができる。あるいは、ベツリンを抽出物から単離して、ベツリン酸合成の前駆体として使用することができる。次いで、ベツリン酸を、任意選択的にベツリン酸誘導体に変換し、ベツリン酸またはその誘導体をプロドラッグに変換する。
【００４０】
ベツリン酸は、構造式（１）：
【００４１】
【化２３】
2004517045.tif 000010
【００４２】
を有する。ベツリン酸は、植物界に広範に存在し、いくつかの生物活性が報告されている。
【００４３】
ベツリン酸を、風乾粉砕樹皮（４５０ｇ）のＺ．ｍａｕｒｉｔｉａｎａサンプルの８０％メタノール水溶液での抽出によって得た。次いで、抽出物のメタノール水溶液を、ヘキサンおよび酢酸エチルで連続的に分配して、ヘキサン、酢酸エチル、および抽出物水溶液を得た。これらの抽出物のうち、酢酸エチル抽出物（１３．５ｇ）は、培養黒色腫細胞株（ＭＥＬ−２）に対して細胞障害活性を示した（ＥＤ５０は３．７μｇ／ｍｌ）。酢酸エチル抽出物を、溶出液としてヘキサン−酢酸エチル（４：１〜１：４）を使用したシリカゲルカラムでのクロマトグラフィーに供して、１０個の画分を得た。画分３および４を合わせ、さらなる分画に供して薄層クロマトグラフィーによって主要な１つのスポット（Ｒｆ０．６７：ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ（クロロホルム：メタノール）（１０：１））を示す活性画分（画分１６）を得て、メタノールからの結晶化の反復後に７２ｍｇの透明ニードルを得た（乾燥植物材料からの全収率：０．０１６％ｗ／ｗ）。
【００４４】
単離活性化合物であるベツリン酸（ＭＥＬ−２についてのＥＤ５０は２．０μｇ／ｍｌ）は、高分解能質量スペクトル分析によって同定したところ、分子式はＣ３０Ｈ４８Ｏ３であり、融点範囲は２９２〜２９３℃であった（分解）。文献によるベツリン酸の融点範囲は、２９０〜２９３℃である。公知のベツリン酸サンプルの混合融点範囲は、添加しなかった。化合物の旋光度は、＋７．３°（ｃ＝１．２；ピリジン）（ｌｉｔ．＋７．５°）と測定された。単離化合物のベツリン酸との同一性を上記の物理的性質ならびに単離化合物の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ、および質量スペクトルデータと文献で報告された公知のベツリン酸サンプルの物理データおよびスペクトルとの比較によって確認した。
【００４５】
ベツリン酸誘導体のプロドラッグを、本発明の組成物および方法で使用することもできる。ベツリン酸の構造試験により、ベツリン酸がいくつかの官能基を導入することができるいくつかの位置（すなわち、Ｃ−３位、Ｃ−２０位、Ｃ−２８位、Ｃ−２９位、およびＣ−３０位）を有することが明らかである。例えば、Ｐｅｚｚｕｔｏら、米国特許第５，９６２，５２７号（本明細書中で参考として引用される）を参照のこと。さらに、所望ならば、導入した官能基を修飾することができる。これら５つの位置での一連の反応によって、多数のベツリン酸誘導体が調製され、これらを一連のヒト腫瘍細胞株、特にヒト黒色腫細胞株に対する生体有効性について評価した。
【００４６】
プロドラッグアプローチ（薬物を処方および／または投与に適切な形態に誘導体化し、薬物としてｉｎ ｖｉｖｏで放出する）を首尾よく使用して、薬物の物理化学的性質を一過性に（例えば、生態可逆的に）変化させた（Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編、「プロドラッグデザイン」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１９８５；Ｒ．Ｂ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、「薬物デザインおよび薬物作用の有機化学」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、第８章、１９９２；Ｋ．Ｍ．Ｈｉｌｌｇｒｅｎら、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．、１５、８３、１９９５を参照のこと）。
【００４７】
一般に、以下の２つのストラテジーを使用して、薬物化合物の水溶性を増加させることができる：イオン性基またはイオン化可能な基の導入および（ｂ）プロドラッグの融点が低下するような様式での誘導体化（Ｇ．Ｌ．Ａｍｉｄｏｎ、「薬物可溶化テクニック」、Ｙａｌｋｏｗｓｋｙら編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１８３〜２２１、１９８１を参照のこと）。ベツリン酸の３−ＯＨおよびカルボン酸基（Ｃ−２８）は共にこのような修飾のための潜在的な位置である。さらに、Ｃ−２９位（２）またはＣ−３０位（３）のいずれかの水酸基により、類似の修飾が可能である。
【００４８】
【化２４】
2004517045.tif 000011
【００４９】
置換基を欠く結合については、本明細書中の構造では、置換基はメチル、例えば、
【００５０】
【化２５】
2004517045.tif 000012
【００５１】
環上の炭素原子に結合する置換基が示されていない場合、炭素原子は適切な数の水素原子を含むと理解される。
【００５２】
イオン性またはイオン化可能部分の間で、ヘミスクシネート、ジアルキルアミノアセテート、およびアミノ酸エステルは、水酸基含有薬物の水溶性の増大のために一般に使用されるエステルである。したがって、化合物４ａ〜４ｇ、５ａ〜５ｇ、および６ａ〜６ｇを合成することができる。エステルの化学的および／または酵素による加水分解の感受性は広範に変化し、陰イオンおよび陽イオン部分の両方を含む本発明の化合物は、種々の内因性加水分解酵素（エステラーゼなど）の適切な基質であり、親薬物（すなわち、ベツリン酸またはベツリン酸誘導体）を生体可逆的に送達させると予想される。
【００５３】
【化２６】
2004517045.tif 000013
【００５４】
【化２７】
2004517045.tif 000014
【００５５】
【化２８】
2004517045.tif 000015
【００５６】
（式中、Ｒ１およびＲ２は、独立して、
【００５７】
【化２９】
2004517045.tif 000016
【００５８】
からなる群から選択される）。
【００５９】
リン酸プロドラッグを使用して、親薬物の治療上の利点を損ね得る薬物送達問題を克服することもできる（例えば、Ｍ．Ｇ．Ｎｉｃｏｌａｏｕら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６１、８６３６、１９９６を参照のこと）。アルカリホスファターゼの存在下で、種々の組織（肝臓、腎臓、細管、および小腸の上皮など）中に広範に分布する酵素（例えば、リン酸モノエステル）が加水分解されて親水酸基含有薬物および無機リン酸塩を放出することができる。リン酸塩プロドラッグ７〜９を、内因性アルカリホスファターゼの基質となるようにデザインする。
【００６０】
【化３０】
2004517045.tif 000017
【００６１】
化合物１０ａ〜１０ｂ、１１ａ〜１１ｇ、および１２ａ〜１２ｇは、ピバリロキシメチル誘導体である。プロドラッグのこの（アシルオキシ）アルキルクラスは、親カルボン酸およびアルコールの生物学的利用能の改良に関して有用であると証明されている（Ｎ．Ｂｏｄｏｒら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．、７、６３、１９８０およびＮ．Ｂｏｄｏｒら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、４８、５２８０、１９８３を参照のこと）。例えば、１７β−エストラジオールの３−ピバリルオキシメチルエーテルは、親１７β−エストラジオールの融点を実質的に低下させた。ピバリルオキシメチルプロドラッグは、吸収後に非特異的エステラーゼによって対応するヒドロキシメチル誘導体に加水分解され、その後自発的にベツリン酸（またはベツリン酸誘導体）およびホルムアルデヒドに分解されると理論付けられるが、本明細書中では信頼されない。
【００６２】
【化３１】
2004517045.tif 000018
【００６３】
【化３２】
2004517045.tif 000019
【００６４】
本発明の別のクラスのプロドラッグは、ベツリン酸（１３）およびベツリン酸誘導体（１４ａ〜ｃ、１５ａ〜ｃ）の硫酸塩である。硫酸塩部分により化合物の親水性が増大する一方で、内因性非特異的スルファターゼによりベツリン酸またはベツリン酸誘導体および無機硫酸塩がｉｎ ｖｉｖｏで放出される。
【００６５】
【化３３】
2004517045.tif 000020
【００６６】
ベツリン酸の合成
ベツリン酸が高等植物のいくつかの属から単離されているにもかかわらず、ベツリン酸の存在量は非常に少なく、使用可能な量の単離は冗漫な作業である（Ｔ．Ｆｕｊｉｏｋａら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．、５７、２４３〜７、１９９４；Ｓ．Ｓｉｄｄｉｑｕｉら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．、５７、２４３〜７、１９９４；Ｆ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、９、９０７〜９、１９７０を参照のこと）。しかし、以前に注目されていたように、ベツリン１６は約２５重量％までの濃度でシラカバから容易に利用可能であり、家具製造などの過程において毎年数百トンの樹皮が廃棄されている。
【００６７】
ベツリンからベツリン酸生成のための２つの合成法が報告されている。第１の方法は、全部で収率７１％の３つの工程を含み、第２の方法は、全部で収率５５％の５工程のプロセスである（Ｄ．Ｓ．Ｈ．Ｌ．Ｋｉｍら、Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｍ．、２７、１６０７〜１６１２、１９９７を参照のこと）。第１の方法では実験室でより高い全収率が得られるが、副産物として望ましくない３α異性体が形成されるので拡大中の生成は困難である。第２の方法は、低収率であるにもかかわらず、望ましくない３α異性体を生成せず、優先的に保護および脱保護手順を含むので、ベツリン酸合成に好ましい。
【００６８】
したがって、文献の方法に従ってベツリン１６をＢｅｔｕｌａ ａｌｂａの樹皮から単離して、以下のスキーム１に示すようにベツリン酸に変換することができる。簡単に述べれば、工程ｉ）でベツリンの第１の水酸基をテトラヒドロピラン（ＴＨＰ）エーテル１７として選択的に保護し、その後工程ｉｉ）で第２の水酸基をアセチル化して化合物１８を得る。工程ｉｉｉ）で化合物１８中のＴＨＰ基を選択的に除去後、工程ｉｖ）で得られた第一級アルコール１９をジョーンズ酸化条件下（ＣｒＯ３／Ｈ２ＳＯ４／アセトン／０℃）で酸化してカルボン酸２０を得る。工程ｖ）で最終的に穏やかな塩基性条件下でアセチル基を除去して，ベツリン酸を得る。
【００６９】
【化３４】
2004517045.tif 000021
【００７０】
Ｃ−２９およびＣ−３０ベツリン酸アルコールの合成
ベツリン酸誘導体２および３の合成を、それぞれヒドロホウ素化およびアリル酸化によって行う。Ｃ−２９アルコールを、共通の中間体２０から合成し、ベンジルエステル（２１）としてカルボン酸をさらに保護する。（２１）のＢＨ３−ジメチルスルフィドのヒドロホウ素化、その後の塩基性条件下での酸化によりＣ−２９アルコール（２２）が得られ、次いで、Ｃ−３アルコールまたはＣ−２８カルボン酸に妨害されずに選択的に官能化する。Ｃ−３酢酸塩の加水分解およびＣ−２８ベンジルエステルの触媒水素化分解により、非保護Ｃ−２９アルコールを得る。
【００７１】
【化３５】
2004517045.tif 000022
【００７２】
【化３６】
2004517045.tif 000023
【００７３】
保護ベツリン酸（２１）の反応および酸化セレン触媒およびｔ−ブチルヒドロペルオキシダーゼでの酸化によって、Ｃ−３０アリルアルコール（３）の合成を行った。保護Ｃ−３０アリルアルコール（２３）を、所望のようにさらに操作し、Ｃ−３酢酸塩およびＣ−２８ベンジルエステルを炭酸カリウムを使用した加水分解によって除去することができる。
【００７４】
プロドラッグ２ａ〜ｇを合成するために、ベツリン酸中のカルボン酸基を保護する。種々の保護基を使用することができる。本発明のプロドラッグ中のエステル基は不安定なので、非常に穏やかな条件下で除去可能な保護基を使用する。ベンジル基は、中世条件下での水素化分解によって容易に切断されるので、１つの好ましい保護剤はベンジル基である。ベツリン酸中の２０（２９）−エン二重結合を水素化分解中に飽和することができる。しかし、ｔ−ＢｕＭｅ２ＳｉＨおよびＰｄ（ＯＡｃ）２の使用によって二重結合の存在下でベンジル基を切断することができる（Ｍ．Ｓａｋａｉｔｇａｎｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．、２７、３７５３、１９８６を参照のこと）。したがって、ベツリン酸２６のベンジルエステルを、酢酸塩２０から調製する。炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）の存在下でのアセトン中での酢酸塩２０の臭化ベンジルとの反応により、二重エステル２１が得られ、これを上記のようにＫ２ＣＯ３のメタノール（ＭｅＯＨ）溶液を使用して脱アセチル化して、前駆体２６を得る（スキーム２）。
【００７５】
あるいは、Ｋ２ＣＯ３の存在下でのアセトン中での臭化ベンジルを使用したベツリン酸の直接的１工程ベンジル化により、許容される収率で前駆体２６を得た（スキーム２）。
【００７６】
【化３７】
2004517045.tif 000024
【００７７】
ベツリン酸エステルプロドラッグの合成
化合物（４）、（５）、および（６ａ〜ｄ）は、変換法に従って合成したアミノ酸エステルである。したがって、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の還流においてカルボニルイミダゾール（ＣＤＩ）またはジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）によって活性化した場合、ベンジルエステル２６は、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンまたはＣｂｚ保護アミノ酸（グリシン、Ｌ−ロイシン、およびＬ−フェニルアラニンなど）とそれぞれ反応する（スキーム３）。Ｃｂｚは、カルボキシベンゾイルの略語である。形成されたエステル２７ａ〜ｄをＰｄ（ＯＡｃ）２の存在下でｔ−ブチルジメチルシラン（ｔ−ＢｕＭｅ２ＳｉＨ）で処理して、ベンジルおよびＣｂｚ保護基を除去して化合物（４ａ〜ｄ）を得る。同一のスキームを使用して、（２７ａ〜ｆ）を介してそれぞれ化合物（４ｅ）、（４ｆ）、（５ａ〜ｆ）、および（６ａ〜ｆ）を合成することができる。全ての使用カルボン酸は、市販されている。
【００７８】
あるいは、遊離酸アナログ（４）を、ベツリン酸から直接合成することができる（スキーム３）。Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを、室温で２時間ＣＤＩで活性化し、ベツリン酸を一晩還流して、収率９７％で（４ｉ）を得た。Ｂｏｃは、ｔ−ブチルカルボキシの略語である。トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン（ＴＦＡ／ＤＣＭ）でのＢｏｃ基の脱保護により、ベツリン酸環系が再整列された。いくつかの方法を行った後、４Ｍ  ＨＣｌのジオキサン溶液はベツリン酸環系を攻撃することなくＢｏｃ基を切断することを見出した。
【００７９】
類似の方法により、合成スキーム３にしたがって生成物（４ｆ）および（４ｊ）を合成した。
【００８０】
ヘミコハク酸誘導体（４ｇ）を、文献の方法（Ｌ．Ｃｏｌｌａら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２６、６０２、１９８３）にしたがって、トリエチルアミンのＤＭＦ溶液の存在下でのベンジルエステル２６の無水コハク酸との反応によって調製し、その後脱ベンジル化した（スキーム４）。このスキームを使用して、誘導体（５ｇ）および（６ｇ）も調製する。
【００８１】
【化３８】
2004517045.tif 000025
【００８２】
【化３９】
2004517045.tif 000026
【００８３】
【化４０】
2004517045.tif 000027
【００８４】
リン酸塩プロドラッグ（７〜９）の合成
市販のテトラベンジルピロホスフェート（ＴＢＰＰ）は、適切なリン酸化剤である。したがって、ベンジルエステル２６のブチルリチウムのＴＨＦ溶液およびＴＢＰＰでの処理により、水中での処理後にリン酸ジエステル（７）を得ることができる（スキーム５）。Ｐｄ（ＯＡｃ）２の存在下でのｔ−ＢｕＭｅ２ＳｉＨでの処理によって脱ベンジル化を行ってリンを含むカルボン酸（７）を得る。この経路を誘導体（８）および（９）にも使用する。
【００８５】
【化４１】
2004517045.tif 000028
【００８６】
アシルオキシアルキル誘導体化プロドラッグの合成（１０〜１２）
ピバリン酸クロロメチルは市販されており、他のクロロメチルエステルを公開された文献の方法によって調製することができる（Ｅｕｒａｔｏら、Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ．、２０、１２７６、１９６６を参照のこと）。ベンジルエステル２６のナトリウム塩またはリチウム塩のピルビン酸クロロメチルとの反応により、ピバロイルオキシメチル誘導体２７ｉが得られる（スキーム６）。２７ｉのｔ−ＢｕＭｅ２ＳｉＨおよびＰｄ（ＯＡｃ）２での脱ベンジル化により、対応するモノピバロイルオキシメチル化合物１０ａが得られる。ベツリン酸の二ナトリウム塩のピバリン酸クロロメチルでの処理により、ビス−ピバロイルオキシメチル化合物１０ｂが得られる（スキーム６）。クロロメチルエステルは十分な反応性を示し得ないので、ＮａＩでの処理により対応するヨウ素アナログに変換することができることが文献で報告されている。
【００８７】
【化４２】
2004517045.tif 000029
【００８８】
【化４３】
2004517045.tif 000030
【００８９】
ベンジルエステル（２７ａ）〜（２７ｉ）の水素化分解により、対応する２０（２９）飽和ベツリン酸（２８ａ）〜（２７ｉ）が得られた（スキーム７）。
【００９０】
【化４４】
2004517045.tif 000031
【００９１】
合成手順において以下の略語を使用する：Ｋ２ＣＯ３（炭酸カリウム）、ＭｇＳＯ４（硫酸マグネシウム）、ＥｔＯＡｃ（酢酸エチル）、ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）、ＮａＨ（水素化ナトリウム）、ＨＣｌ（塩酸）、およびＥｔ２Ｏ（ジエチルエーテル）。
ベンジル保護ベツリン酸（２６）の合成
ベツリン酸（９，７６ｇ、２１．４１ｍｍｏｌ）およびＫ２ＣＯ３（４．３７ｇ、３１．６２ｍｍｏｌ）のアセトン（５００ｍｌ）溶液を、２０分間撹拌した。次いで、臭化ベンジル（６．４ｍｌ、５３．８１ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で一晩撹拌した。さらなる臭化ベンジル（４．０ｍｌ、３３．６３ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温でさらに２４時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣に水を添加し、酢酸エチルで抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４無水物で乾燥させた。溶媒の除去後、粗生成物を溶出液として１０％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用したシリカカラムで精製して、白色個体として７．５５ｇ（収率６４％）の生成物を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．６〜１．７（ｍ，３８Ｈ）、１．８〜１．９（ｍ，２Ｈ）、２．１〜２．３５（ｍ，２Ｈ）、２．９５〜３．０５（ｍ，１Ｈ）、３．１〜３．２（ｍ，１Ｈ）、４．５９（ｄ、Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）、４．７２（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）、５．１２（ｍ，２Ｈ）、７．３〜７．４（ｍ，５Ｈ）、ＭＳ（ＡＰＣＩ＋）：５４７．２（Ｍ＋１）、５２９．２（Ｍ−Ｈ２Ｏ）。ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ−１）：３５５３、２９４０、２８６６、１６９２、１４５１。
Ｃｂｚ−Ｇｌｙエステル誘導体（２７ａ）の合成
Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−ＯＨ（２０９ｍｇ、１ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液に，ＣＤＩ（１６２ｍｇ、１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で３０分間撹拌し、ベツリン酸ベンジルエステル（２６）（２３８ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、１日間還流した。反応混合物を水で希釈し、ＥｔＯＡｃで３回抽出した。有機相をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒の除去後、残渣を溶出液としてＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用したシリカゲルのカラムクロマトグラフィーによって精製して、１３０ｍｇのＣｂｚ−Ｇｌｙ−ベツリン酸エステル誘導体（２７ａ）を得た。収率：４１％。融点：５５〜５７℃。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．６〜１．７（ｍ，３８Ｈ）、１．８〜２．０（ｍ，２Ｈ）、２．１〜２．３５（ｍ，２Ｈ）、２．９５〜３．１（ｍ，１Ｈ）、３．９５（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．５５（ｍ，１Ｈ）、４．５９（ｓ，１Ｈ）、４．７２（ｓ，１Ｈ）、５．１２（ｍ，４Ｈ）、５．３（ｂｒ，１Ｈ）、７．３〜７．４（ｍ，１０Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：７５５．６（Ｍ＋ＮＨ４）。ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ−１）：３４２５、２９４３、２８６９、１７２２、１４５３。Ｃ４７Ｈ６３Ｎ１Ｏ６の計算値：Ｃ、７６．４９；Ｈ、８．６０；Ｎ、１．９０；実測値：Ｃ、７５．３８；Ｈ、８．７６；Ｎ、１．８３。
Ｃｂｚ−Ｐｈｅエステル誘導体（２７ｄ）の合成
化合物（２７ｄ）を、化合物（２７ａ）の調製と類似の方法により、Ｃｂｚ−Ｐｈｅ−ＯＨのベツリン酸ベンジルエステル（２６）との反応によって合成した。収率：１５％。融点：６７〜７１℃。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．７０〜１．７１（ｍ，３８Ｈ）、１．８０〜１．９５（ｍ，２Ｈ）、２．１〜２．３（ｍ，２Ｈ）、２．９５〜３．１５（ｍ，３Ｈ）、４．４〜４．５（ｍ，１Ｈ）、４．６〜４．６５（ｍ，１Ｈ）、４．５９（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）、４．７２（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、５．１２（ｍ，４Ｈ）、５．２２（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ、１Ｈ）、７．１〜７．４（ｍ，１５Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：８４５．６（Ｍ＋ＮＨ４）、８２８．５（Ｍ＋１）。ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ−１）：３４３１、２９４４、２８６８、１７２２、１４９７。Ｃ５４Ｈ６９Ｎ１Ｏ６の計算値：Ｃ、７８．３２；Ｈ、８．４０；Ｎ、１．６９；実測値：Ｃ、７８．０１；Ｈ、８．５２；Ｎ、１．６１。
Ｃｂｚ−Ｌｅｕエステル誘導体（２７ｃ）の合成
化合物２７ｃを、化合物（２７ａ）の調製と類似の方法により、Ｃｂｚ−Ｌｅｕ−ＯＨのベツリン酸ベンジルエステル（２６）との反応によって合成した。収率：６％。融点：６４〜６９℃。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．７〜１．８（ｍ，４７Ｈ）、１．８〜２．０（ｍ，２Ｈ）、２．１〜２．３（ｍ，２Ｈ）、２．９５〜３．１（ｍ，１Ｈ）、４．３〜４．４（ｍ，１Ｈ）、４．４５〜４．５５（ｍ，１Ｈ）、４．５９（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）、４．７２（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ、１Ｈ）、５．０８〜５．２０（ｍ，４Ｈ）、７．３〜７．４（ｍ，１０Ｈ）。ＭＳ（ＡＰＣＩ＋）：８１２．４（Ｍ＋ＮＨ４）、７９４．７（Ｍ＋１）。ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ−１）：３３５５、２９４６、２８６８、１７２２、１４５３。Ｃ５１Ｈ７１Ｎ１Ｏ６の計算値：Ｃ、７７．１４；Ｈ、９．０１；Ｎ、１．７６；実測値：Ｃ、７７．３６；Ｈ、９．１１；Ｎ、１．６９。
２−（２−メトキシエトキシ）酢酸エステル誘導体（２７ｅ）の合成
化合物（２７ｅ）を、化合物（２７ａ）の調製と類似の方法により、２−（２−メトキシエトキシ）酢酸のベツリン酸ベンジルエステル（２６）との反応によって合成した。収率：３８％。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．７５〜１．７（ｍ，３８Ｈ）、１．８５〜１．９５（ｍ，２Ｈ）、２．１〜２．３（ｍ，２Ｈ）、２．９５〜３．１０（ｍ，１Ｈ）、３．３８（ｓ，３Ｈ）、３．５８（ｍ，２Ｈ）、３．７２（ｍ，２Ｈ）、４．１３（ｓ，２Ｈ）、４．５〜４．６（ｍ，１Ｈ）、４．５９（ｓ，１Ｈ）、４．７２（ｓ，１Ｈ）、５．１２（ｍ，２Ｈ）、７．３〜７．４（ｍ，５Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：６８０．６（Ｍ＋ＮＨ４）。ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ−１）：２９４５、２８６７、１７５４、１７１５、１４５３。Ｃ４２Ｈ６２Ｏ６の計算値：Ｃ、７６．０９；Ｈ、９．４３；実測値：Ｃ、７６．２８；Ｈ、９．４７。
２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］酢酸エステル誘導体（２７ｆ）の合成
化合物（２７ｆ）を、化合物（２７ａ）の調製と類似の方法により、２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］酢酸のベツリン酸ベンジルエステル（２６）との反応によって合成した。収率：５２％。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．７５〜１．７（ｍ，３８Ｈ）、１．８５〜１．９５（ｍ，２Ｈ）、２．０５〜２．３（ｍ，２Ｈ）、２．９５〜３．１０（ｍ，１Ｈ）、３．３８（ｓ，３Ｈ）、３．５７（ｍ，２Ｈ）、３．６〜３．７５（ｍ，６Ｈ）、４．１３（ｓ，２Ｈ）、４．５〜４．６（ｍ，１Ｈ）、４．５９（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）、４．７２（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）、５．１２（ｍ，２Ｈ）、７．３〜７．４（ｍ，５Ｈ）。ＭＳ（ＡＰＣＩ＋）：７２４．３（Ｍ＋ＮＨ４）。ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ−１）：２９４２、２８６９、１７２４、１４５４。Ｃ４４Ｈ６６Ｏ６の計算値：Ｃ、７４．７５；Ｈ、９．４１；実測値：Ｃ、７３．７２；Ｈ、９．３４。
ピバロイルオキシメチルエーテル誘導体（２７ｉ）の合成
ベツリン酸ベンジルエステル（２６）（５２６ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１０ｍｌ）溶液に、ＮａＨ（６０％、６６ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で一晩混合し、その後、ピバリン酸クロロメチル（６３５ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、室温で一晩撹拌した。次いで、反応混合物を、水で希釈し、酢酸エチルで３回抽出した。有機相をブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させた。溶媒の除去後、残渣を、溶出液としてＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用したシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって精製して、１０２ｍｇの所望の生成物（２７ｉ）を得た。収率１６％。融点：１２２〜１２８℃。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．７〜１．７（ｍ，４７Ｈ）、１．８５〜１．９５（ｍ，２Ｈ）、２．１〜２．３（ｍ，２Ｈ）、２．９５〜３．１５（ｍ，２Ｈ）、４．５９（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）、４．７２（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）、５．１２（ｍ，２Ｈ）、５．２７（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ）、５．３５（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ）、７．３〜７．４（ｍ，５Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：６７８．７（Ｍ＋ＮＨ４）。ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ−１）：２９４７、２８６６、１７４６、１７１４、１４８０。Ｃ４３Ｈ６４Ｏ５の計算値：Ｃ、７８．１４；Ｈ、９．７６；実測値：Ｃ、７８．４６；Ｈ、１０．４９。
Ｂｏｃ−Ｇｌｙエステル誘導体（４ｉ）の合成
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（５２５ｍｇ、３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍｌ）溶液に、ＣＤＩ（４８６ｍｇ、３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で２時間混合し、その後、ベツリン酸（６８４ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、一晩還流した。溶媒の除去後、残渣をジクロロメタンに溶解し、水およびブラインで洗浄い、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒の除去後、残渣を、溶出液としてＥｔＯＡｃ／ヘキサンを使用したシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによって精製して、９００ｍｇのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ベツリン酸誘導体（４ｉ）を得た。収率９７％。融点：１３５〜１３６℃。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．７５〜１．７（ｍ，４７Ｈ）、１．７５〜１．９（ｍ，２Ｈ）、２．０５〜２．３（ｍ，２Ｈ）、２．９〜３．０（ｍ，１Ｈ）、３．６３（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ）、４．４（ｍ，１Ｈ）、４．５６（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）、４．６９（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）、７．１８（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，１Ｈ）、１２．０５（ｓ，１Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ−）：６１２．４（Ｍ−１）。ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ−１）：２９４３、２８６９、１７０２。Ｃ３７Ｈ５９Ｎ１Ｏ６の計算値：Ｃ、７２．３９；Ｈ、９．６９；Ｎ，２．２８；実測値：Ｃ、７２．１３；Ｈ、１０．０７；Ｎ，２．２０。
Ｃｂｚ−Ｇｌｙエステル誘導体（４ｊ）の合成
化合物（４ｊ）を、化合物（ＩＩＩｂ）の調製と類似の方法により、Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−ＯＨのベツリン酸との反応によって合成した。収率７％。融点：８２〜８８℃。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．７５〜１．７（ｍ，３８Ｈ）、１．９５〜２．０５（ｍ，２Ｈ）、２．１〜２．３（ｍ，２Ｈ）、２．９５〜３．０５（ｍ，１Ｈ）、３．９７（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ）、４．５〜４．６（ｍ，１Ｈ）、４．６０（ｓ，１Ｈ）、４．７５（ｓ，１Ｈ）、５．１２（ｓ，２Ｈ）、５．２５（ｍ，１Ｈ）、７．３〜７．４（ｍ，５Ｈ）。ＭＳ（ＡＰＣＩ−）：６４６．９（Ｍ＋ＮＨ４）。ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ−１）：２９４３、２８６９、１７０８。Ｃ４０Ｈ５７Ｎ１Ｏ６の計算値：Ｃ、７４．１５；Ｈ、８．８７；Ｎ，２．１６；実測値：Ｃ、７１．５７；Ｈ、８．６７；Ｎ，２．２２。
２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］酢酸エステル誘導体（４ｆ）の合成
化合物（４ｆ）を、化合物（ＩＩＩｂ）の調製と類似の方法により、２−［２−（２−メトキシエトキシ）エトキシ］酢酸のベツリン酸との反応によって合成した。収率：５２％。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：０．８〜１．７（ｍ，３８Ｈ）、１．９〜２．０（ｍ，２Ｈ）、２．１〜２．３（ｍ，２Ｈ）、２．９５〜３．０５（ｍ，１Ｈ）、３．３８（ｓ，３Ｈ）、３．５７（ｍ，２Ｈ）、３．６〜３．７５（ｍ，６Ｈ）、４．１３（ｓ，２Ｈ）、４．５〜４．６（ｍ，１Ｈ）、４．６１（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）、４．７４（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ，１Ｈ）。ＭＳ（ＡＰＣＩ−）：６１５．８（Ｍ−１）。ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ−１）：２９３７、２８６９、１７２９、１６９４。Ｃ３７Ｈ６０Ｏ６の計算値：Ｃ、７２．０４；Ｈ、９．８０；実測値：Ｃ、７１．９８；Ｈ、９．９０。
Ｇｌｙエステル誘導体（４ａ）の合成
化合物（４ａ）（６１ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を４Ｍ  ＨＣｌジオキサン溶液に溶解し、室温で１０分間撹拌した。反応混合物を、トルエン（３ｍｌ）で希釈した。真空下での溶媒の除去後、残渣をＥｔ２ＯＨで洗浄して、白色固体として２５ｍｇの所望の生成物を得た。収率：４５％。融点：２７５℃（ｄｅｃ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８〜１．７（ｍ，３８Ｈ）、１．７５〜１．９（ｍ，２Ｈ）、２．１〜２．３（ｍ，２Ｈ）、２．９〜３．０（ｍ，１Ｈ）、３．８〜３．９（ｍ，２Ｈ）、４．５〜４．６（ｍ，１Ｈ）、４．５６（ｓ，１Ｈ）、４．６９（ｓ，１Ｈ）、８．３０（ｂｒ，３Ｈ）。ＭＳ（ＡＰＣＩ−）：５１４．６（Ｍ＋１）。ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ−１）：２９４１、２８６９、１７４０。Ｃ３２Ｈ５２ＣｌＮＯ４の計算値：Ｃ、６９．８５；Ｈ、９．５３；Ｎ、２．５５；実測値：Ｃ、６６．３１；Ｈ、９．３８；Ｎ、２．６８。
Ｇｌｙエステル飽和誘導体（２８ａ）の合成
化合物（２７ａ）（１８０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を、ＥｔＯＡｃ（５ｍｌ）に溶解し、メタノール（１０ｍｌ）で希釈し、１滴のＨＣｌ溶液（６Ｎ）を添加した。反応混合物を、室温で４時間５０ｐｓｉの水素圧にて触媒として５０ｍｇの１０％パラジウム−活性炭で水素化した。触媒をろ過により除去した。溶媒の除去後、残渣をＥｔ２Ｏで洗浄して、白色固体として１１０ｍｇの所望の生成物を得た。収率：７２％。融点：２８５℃（ｄｅｃ）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：０．８〜１．７（ｍ，３８Ｈ）、１．７５〜１．９（ｍ，２Ｈ）、２．１〜２．３（ｍ，２Ｈ）、２．９〜３．０（ｍ，１Ｈ）、３．８〜３．９（ｍ，２Ｈ）、４．５〜４．６（ｍ，１Ｈ）、４．５６（ｓ，１Ｈ）、４．６９（ｓ，１Ｈ）、８．３０（ｂｒ，３Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ＋）：５１６．１（Ｍ＋１）。ＦＴ−ＩＲ（ｃｍ−１）：２９４７、２８６８、１７４０。Ｃ３２Ｈ５４ＣｌＮＯ４の計算値：Ｃ、６９．６０；Ｈ、９．８６；Ｎ、２．５４；実測値：Ｃ、６５．７６；Ｈ、９．６２；Ｎ、２．６３。
抗黒色腫活性アッセイ
癌細胞に対するベツリン酸およびベツリン酸誘導体のプロドラッグの相対的効果を、各プロドラッグが癌細胞活性を予め定義した範囲で阻害する濃度を同定し、結果を比較することによって確立することができる。典型的には、好ましい同定は、生化学アッセイにおいて５０％の活性を阻害する濃度（すなわち、５０％阻害濃度または「ＩＣ５０」）である。当該分野で公知の従来技術を使用して、ＩＣ５０を同定することができる。一般に、一定範囲の濃度の研究化合物の存在下での所与の細胞株の活性の測定によって、ＩＣ５０を同定することができる。次いで、細胞株活性の実験値を、使用した化合物濃度に対してプロットする。５０％細胞株活性（いかなるインヒビターの非存在下での活性と比較する）を示すインヒビターの濃度を、ＩＣ５０値として得る。
【００９２】
ベツリン酸およびベツリン酸誘導体のプロドラッグのＩＣ５０値を、典型的には０．０１〜１００μｇ／ｍＬの濃度範囲を使用して濃度−応答曲線から同定した。当該分野で周知の方法によってＩＣ５０を同定することができる。試験法の例を以下に示す。
【００９３】
試験化合物の細胞傷害潜在性を、以前にＫ．Ｌｉｋｈｉｔｗｉｔａｙａｗｕｉｄら，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．、５６、１４６８〜１４７８、１９９３に記載のように、種々の細胞株を使用して同定した。簡単に述べれば、種々の濃度の試験化合物（例えば、１０Ｌの１０％ＤＭＳＯに溶解した０．１〜１００μｇ／ｍＬ）を、９６ウェルプレートに移し、１９０Ｌアリコートの細胞懸濁液（例えば、５×１０４細胞／ｍｌ）を、各ウェルに添加した。次いで、プレートを３７℃で７２時間インキュベートし（湿度１００％、空気中５％のＣＯ２）、１００Ｌの冷２０％トリクロロ酢酸水溶液を各ウェル中の成長培地に添加して、細胞を固定した。培養物を４℃で３０分間インキュベートし、洗浄し、風乾し、スルホローダミンＢ溶液で染色し、１％酢酸で洗浄した。最後に、２００Ｌの１０ｍＭＴｒｉｓ塩基を各ウェルに添加し、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを使用して５１５ｎｍで光学密度を同定した。それぞれの場合、いくつかのウェルへの同数の細胞の添加および３７℃で３０分のインキュベーション、および上記のような処理によって、０日目コントロールを行った。０日目コントロールを使用して得た光学密度値を引き、コントロール（溶媒処理）培地と比較して細胞生存率を計算した。結果を、ＩＣ５０値（すなわち、細胞数を５０％減少させるために必要な試験化合物の濃度）として示した。
【００９４】
誘導体化ベツリン酸プロドラッグを、黒色腫（Ｍｅｌ  ２）に対して試験し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結果を以下の表にまとめる。
【００９５】
【表３】
2004517045.tif 000032
【００９６】
ベツリン酸が悪性黒色腫に対する抗腫瘍薬としてｉｎ ｖｉｖｏで作用する能力を試験するために、ヒト黒色腫細胞（ＭＥＬ−２）を皮下注射した無胸腺（ヌード）マウスを使用して一連の研究を行った。最初の研究は、非確立腫瘍に対するベツリン酸活性を調査した。ベツリン酸処理を腫瘍細胞注射から１日後（すなわち、２４時間後）に開始した。５０、２５０、および５００ｍｇ／ｋｇ（ミリグラム／キログラム）体重の用量では、ベツリン酸は、コントロールに対する各用量について０．００１のｐ値で腫瘍成長の有効な阻害を示した。
【００９７】
特に、データは、４週齢の無胸腺マウスの右側腹部に３．０×１０８ＵＩＳＯ  ＭＥＬ−２細胞を皮下注射した実験に由来していた。ＵＩＳＯ  ＭＲＬ−２は、ヒト強膜液由来の転移性黒色腫に由来する細胞株である。腫瘍細胞注射の翌日に薬物治療を開始し、４日毎に全部で６回投与を継続した。４匹のコントロールマウスに０．５ｍｌのＰＶＰコントロール溶液を腹腔内（ＩＰ）で投与し、治療動物（群あたり４匹）に、５０、２５０、または５００ｍｇ／ｋｇ／用量のＩＰベツリン酸／ＰＶＰの脱イオン水溶液を投与した。ベツリン酸を、ＰＶＰと共沈して溶解性および生物学的利用能が増大した。研究を通して、一日おきにマウスを秤量し、マイクロメーターで腫瘍を測定した。コントロールマウスにおける平均腫瘍体積が約１ｃｍ３となった場合、３３日目に全動物を屠殺して剖検した。
【００９８】
最も低用量と比較して最も高用量のベツリン酸でより高い腫瘍成長阻害が認められた（ｐ＝０．０４）。体重減少または他の急性毒性形態におって毒性を示すので、毒性はベツリン酸治療に関係なかった。体重減少は認められなかった。
【００９９】
次に、確立された黒色腫に対してベツリン酸のｉｎ ｖｉｖｏ試験を行った。この研究では、１３日目まで治療を行わず、このときまでに全てのマウスに触知可能な腫瘍塊が存在していた。これらの条件下で、ベツリン酸は首尾よく腫瘍生物を阻止した（ｐ＝０．０００１）。さらに、腫瘍成長は、処理終了から１４日後でさえもコントロール（非治療）群の腫瘍成長と類似していなかった。
【０１００】
特に、４週齢の無胸腺マウスの右側腹部に５×１０８個のＭＥＬ−２細胞を皮下注射した。各５匹のマウスから構成される４つの治療群について研究を行った。１つの群では、マウスに２５０ｍｇ／ｋｇ／用量のベツリン酸／ＰＶＰを腫瘍細胞注射の翌日から開始して３日毎に全部で６回ＩＰ投与した。コントロール群には、０．５ｍｌの生理食塩水をＩＰ投与した。ＤＴＩＣ治療群には、４ｍｇ／ｋｇ／用量のＤＴＩＣを３日毎に研究の１３〜２８日目にＩＰ投与した。ベツリン酸治療群には、２５０ｍｇ／ｋｇ／用量のベツリン酸／ＰＶＰを１３〜２７日目に３日毎にＩＰ投与した。腫瘍負荷量が増大したために、３６日目にコントロールおよびＤＴＩＣ治療マウスを屠殺して剖検した。４１日目に残りのマウスを屠殺して剖検した。
【０１０１】
ベツリン酸の有効性もまた転移性黒色腫治療に臨床的に利用可能なＤＴＩＣと比較した。毒性によって制限されるＤＴＩＣの用量を、ヒト患者と同一の投与量になるように選択した。ベツリン酸治療群における腫瘍成長は、ＤＴＩＣ治療動物で認められる成長よりも有意に小さい（ｐ＝０．０００１）。コントロールと比較して、ＤＴＩＣは、有意であるがあまり顕著ではない腫瘍成長の減少が認められる（ｐ値は０．０１）。本研究の第４群を、第１の研究に類似のスケジュールで処理した。先に示したように、これらの条件下では、ベツリン酸は腫瘍発達を有意に阻害し（ｐ＝０．０００１）、治療終了から３週間まで腫瘍成長の減少を延長させた。
【０１０２】
ベツリン酸は、ＭＥＬ−１細胞に対する活性も示した。特に、４週齢の無胸腺マウスの右側腹部に５．０×１０８個のＵＩＳＯ  ＭＥＬ−１細胞を皮下注射した。腫瘍細胞注射の翌日から薬物治療を開始し、４日毎に全部で６回継続した。４匹のコントロール動物に０．５ｍｌの性衿食塩水を腹腔内（ＩＰ）投与し、治療動物（群あたり４匹）に、５、５０、または２５０ｍｇ／ｋｇ／用量のベツリン酸／ＰＶＰのｄｄＨ２Ｏ溶液をＩＰ投与した。研究を通して、３日毎マウスを秤量し、マイクロメーターで腫瘍を測定した。コントロールマウスにおける平均腫瘍体積が約０．５ｃｍ３である場合、４１日目に治療動物を屠殺して剖検した。次いで、コントロールマウスに５０ｍｇ／ｋｇの用量を４１日目から開始して４日毎に６回投与し、７１日目に屠殺して剖検した。
【０１０３】
ＭＥＬ−１細胞に関する結果は、ＭＥＬ−２細胞に関する結果と類似していた。したがって、ベツリン酸は、ＭＥＬ−１およびＭＥＬ−２細胞のいずれにも活性である。ベツリン酸および誘導体の黒色腫に対するｉｎ ｖｉｖｏ活性および他の癌形態に対するｉｎ ｖｉｖｏ活性に関するさらなる情報については、Ｐｅｚｚｕｔｏら、米国特許第５，９６２，５２７号（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【０１０４】
固有のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害プロフィール、有意なｉｎ ｖｉｖｏ活性、および作用様式を考慮して、ベツリン酸は、ヒト黒色腫治療用の例外的に魅力的な化合物である。ベツリン酸はまた、５００ｍｇ／ｋｇのベツリン酸用量を反復投与した結果、急性の毒性徴候または体重の減少を起こすことがないことによって証明されるように、比較的毒性が低い。ベツリン酸は、ヒポクラテススクリーンにおいて２００および４００ｍｇ／ｋｇの用量で不活性であることが以前に認められていた。
【０１０５】
特に、ベツリン酸誘導体を合成し、生物学的に評価して、ベツリン酸およびベツリン酸誘導体がｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト黒色腫細胞株に対する選択的抗腫瘍活性を有することが示された。親構造のベツリン酸およびベツリン酸誘導体の修飾により、容易に処方して固体に投与することができ、ベツリン酸またはベツリン酸誘導体を放出し、悪性腫瘍成長、特にヒト黒色腫を予防または阻害するために使用することができる多数のプロドラッグが得られることが示された。ベツリン酸およびベツリン酸誘導体の抗腫瘍活性は、これらの化合物が黒色腫に対して高い活性を示すが、この化合物はまた水溶性が低いので、治療上重要である。しかし、ベツリン酸および誘導体の水溶性の低さは、ベツリン酸およびベツリン酸誘導体の適切なプロドラッグの提供によって克服することができる。
【０１０６】
上記の合成スキームは、ベツリン酸およびベツリン酸誘導体の修飾により、ベツリン酸およびベツリン酸誘導体をｉｎ ｖｉｖｏで放出することができるプロドラッグを得ることができることを示す。したがって、プロドラッグは、黒色腫および他の癌に対する強力な抗腫瘍薬として使用することができる。プロドラッグの調製により、ベツリン酸およびベツリン酸誘導体の低水溶性が克服される。
【０１０７】
したがって、ベツリン酸およびベツリン酸誘導体のプロドラッグは種々の癌（例えば、黒色腫、扁平上皮腫瘍、乳がん、大腸癌、肉腫、ヒト口腔表皮癌、前立腺癌、肺癌、神経膠腫、または神経芽腫）の治療に有用であることが予想される。したがって、本発明は、ヒトを含む哺乳動物の癌の治療または予防用薬物の製造のためのベツリン酸およびベツリン酸誘導体のプロドラッグまたはこのような構成要素を含む薬学的組成物の使用に関する。
【０１０８】
用語「治療」には、治療された病態または症状の進行または重症度の予防、低減、停止、または逆転が含まれる。したがって、用語「治療」には、必要に応じて、治療および／または予防投与の両方が含まれる。
【０１０９】
「ベツリン酸またはベツリン酸誘導体のプロドラッグ」を、そのままの化合物として、またはこのような構成要素を含む薬学的組成物として投与することができることも理解される。
【０１１０】
さらなる態様では、本発明は、治療有効量のベツリン酸またはベツリン酸誘導体のプロドラッグを身体に投与する工程を含む、ヒトまたは非ヒト動物の身体における癌の治療法を提供する。
【０１１１】
本発明のプロドラッグを、任意の適切な経路（例えば、経口、口内、吸入、舌下、直腸、膣、経尿道、鼻腔内、局所、経皮（すなわち、経皮）、非経口（静脈内、筋肉内、皮下、および歯冠内を含む）投与）で投与することができる。非経口投与をニードルおよびシリンジを使用するか高圧技術（ＰＯＷＤＥＲＪＥＣＴ（登録商標））を使用して行うことができる。
【０１１２】
本発明での使用に適切な化合物および薬学的組成物には、その意図する目的の達成のために有効な量でプロドラッグが投与されるものが含まれる。より詳細には、「治療有効量」は、治療を受ける被験体の治療もしくは発症の予防または既存の症状の緩和に有効な量を意味する。有効量の決定は、特に本明細書中の詳細な開示を考慮して十分に当業者の範囲内である。
【０１１３】
「治療有効量」は、所望の効果が達成されるプロドラッグの量をいう。プロドラッグの毒性および治療有効性を、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順（例えば、ＬＤ５０（集団の５０％が死亡する用量）およびＥＤ５０（数段の５０％に治療上有効な用量）の同定）によって同定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比で示される。治療指数の高い化合物が好ましい。得られたデータを、ヒト用の投薬量範囲での処方に使用することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは毒性がほとんどないか全く無いＥＤ５０を含む循環濃度範囲内である。投薬量は、使用する投薬形態および使用する投与経路に依存してこの範囲内で変化し得る。
【０１１４】
正確な処方、投与経路、および投薬量を、治療を受ける特定の疾患および患者の健康状態を考慮して各医師が選択することができる。投薬量および間隔をそれぞれ調整して治療効果の維持に十分な活性部分の血漿レベルを得ることができる。
【０１１５】
プロドラッグの投与量は、治療を受ける患者、患者の体重、疾患の重症度、投与様式、および処方する医師の判断に依存する。
【０１１６】
特に、上記で同定した病態および傷害の治療または予防治療におけるヒトへの投与のために、本発明のプロドラッグの投薬量は、一般に、平均的な成人患者（７０ｋｇ）では毎日約０．５〜約１０００ｍｇである。したがって、典型的な成人患者用の個別の錠剤またはカプセルは、単回投与または複数回投与、１日に１回または数回投与するために、適切な薬学的に許容可能な賦形剤またはキャリア中に０．２〜５００ｍｇのプロドラッグを含む。静脈内、口内、または舌下投与のための投薬量は、典型的には、必要に応じて１回の投与あたり０．１〜５００ｍｇである。実際には、各患者に最適な実際の投与計画を医師が決定し、この投薬量は特定の患者の年齢、体重、および応答によって変化する。上記の投薬量は平均的な症例の例示であるが、より高いまたは低い投薬量が有利である場合があり、これは本発明の範囲内である。
【０１１７】
ヒトについて本発明のプロドラッグを単独で投与することができるが、一般に、意図する投与経路および標準的な薬学上の業務に関して選択された薬学的キャリアとの混合物で投与される。したがって、本発明で使用される薬学的組成物を、プロドラッグの薬学的に使用することができる調製物への処理を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容可能なキャリアを使用した従来の様式で処方することができる。
【０１１８】
これらの薬学的組成物を、従来の様式（例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、糖衣丸作製、微粒子化、乳化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセス）で製造することができる。適切な処方は、選択した投与経路に依存する。治療有効量の本発明のプロドラッグを経口投与する場合、典型的には、組成物は、錠剤、カプセル、粉末、溶液、またはエリキシルの形態である。錠剤形態で投与する場合、組成物は、さらにゼラチンまたはアジュバントなどの固体キャリアを含むことができる。錠剤、カプセル、および粉末は、約５〜約９５％の本発明のプロドラッグ、好ましくは約２５〜約９０％の本発明のプロドラッグを含む。液体形態で投与する場合、水、石油、または動物油または植物油などの液体キャリアを添加することができる。組成物の液体形態は、さらに、生理食塩水、デキストロースもしくはは他の糖類溶液、またはグリコールを含むことができる。液体形態で投与する場合、組成物は約０．５〜約９０重量％の本発明のプロドラッグ、好ましくは約１〜約５０重量％の本発明のプロドラッグを含むことができる。
【０１１９】
治療有効量の本発明のプロドラッグを、静脈内、皮膚、または皮下注射によって投与する場合、組成物は、無発熱物質の非経口で許容可能な水溶液の形態である。ｐＨ、等張性、安定性などを十分に考慮したこのような非経口で許容可能な溶液の調製は、当業者の範囲内である。静脈内、皮膚、皮下注射に好ましい組成物は、典型的には、本発明の化合物に加えて、等張性賦形剤を含む。
【０１２０】
経口投与のために、本発明のプロドラッグと当該分野で周知の薬学的に許容可能なキャリアとの組み合わせによって化合物を容易に処方することができる。このようなキャリアは、治療を受ける患者による経口注入のために、本発明の化合物を錠剤、丸薬、糖衣丸、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして処方することができる。経口用薬学的調製物を、式（Ｉ）の化合物への固体賦形剤の添加、任意選択的に得られた混合物の粉砕、および所望ならば適切な補助薬の添加後の顆粒混合物の処理による錠剤および糖衣丸コアの獲得によって得ることができる。適切な賦形剤には、例えば、充填薬およびセルロース調製物が含まれる。所望ならば、崩壊薬を添加することができる。
【０１２１】
吸入投与のために、本発明の化合物は、適切な噴射剤を使用する加圧パックまたは噴霧器からのエアゾールスプレイの形態で都合よく送達される。加圧エアゾールの場合、投薬単位を、一定量を送達させるバルブの設置によって同定することができる。例えば、化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基剤の粉末混合物を含む吸入器または注入器用のゼラチンなどのカプセルおよびカートリッジを処方することができる。
【０１２２】
注射（例えば、ボーラス注射または継続的注入）による非経口投与のためのプロドラッグを処方することができる。注射用処方物は、単位投薬形態（例えば、防腐剤を含むアンプルまたは複数回投与コンテナ）で存在することができる。この組成物は、懸濁液、溶液、油性または水性賦形剤中の乳濁液などの形態をとることができ、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの処方剤を含み得る。
【０１２３】
非経口投与用の薬学的処方物には、水溶性形態のプロドラッグ水溶液が含まれる。さらに、プロドラッグの懸濁液を、適切な油性注射用懸濁液として調製することができる。適切な真油性溶液または賦形剤には、脂肪油または合成脂肪酸エステルが含まれる。水性注射用懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質を含み得る。任意選択的に、懸濁液はまた、適切な安定剤または化合物の溶解性を増大させて高濃縮溶液をつくることが可能な薬剤を含み得る。あるいは、本発明の組成物は、適切な賦形剤（例えば、滅菌無発熱物質水）で使用前に構築するための粉末形態であり得る。
【０１２４】
本発明のプロドラッグを、従来の坐剤用基剤を含む直腸組成物（坐剤または浣腸など）に処方することもできる。先に記載の処方物に加えて、蓄積調製物として処方することができる。このような長期作用処方物を、移植（例えば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、適切な重合または疎水性材料（例えば、許容可能な油中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂を使用して、または溶解性の低い誘導体（例えば、溶解性の低い塩）として処方することができる。
【０１２５】
特に、本発明のプロドラッグを、デンプンもしくはラクトースなどの賦形剤を含む錠剤の形態、単独または賦形剤との混合物のいずれかを含むカプセルもしくは小卵、または香料または着色料を含むエリキシルまたは懸濁液の形態で、経口、口内、または舌下投与することができる。このような液体調製物を、懸濁剤などの薬学的に許容可能な添加物を使用して調製することができる。プロドラッグを、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、または歯冠内）で注射することができる。非経口投与のために、プロドラッグを、溶液を血液と等張にするために他の物質（例えば、塩またはマンニトールまたはグルコースなどの単糖類）を含み得る滅菌水溶液の形態で使用することが最良である。
【０１２６】
獣医学的使用のために、本発明のプロドラッグまたはその無毒の塩を、通常の獣医学上の業務にしたがって適切に許容可能な処方物として投与する。獣医師は、特定の動物に最適な投与計画および投与経路を容易に決定することができる。
【０１２７】
したがって、さらなる態様では、本発明は、薬学的に許容可能な希釈剤またはキャリアと共に本発明のプロドラッグを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、さらに、本発明のプロドラッグと薬学的に許容可能な希釈剤またはキャリアと混合する工程を含む、薬学的組成物の調製法を提供する。
【０１２８】
特定の実施形態では、本発明には、薬学的に許容可能な希釈剤またはキャリアと共に本発明のプロドラッグを含む、ヒトを含む哺乳動物における癌の治療または予防的治療用の薬学的組成物が含まれる。
【国際公開パンフレット】
2004517045.tif 000049
2004517045.tif 000050
2004517045.tif 000051
2004517045.tif 000052
2004517045.tif 000053
2004517045.tif 000054
2004517045.tif 000055
2004517045.tif 000056
2004517045.tif 000057
2004517045.tif 000058
2004517045.tif 000059
2004517045.tif 000060
2004517045.tif 000061
2004517045.tif 000062
2004517045.tif 000063
2004517045.tif 000064
2004517045.tif 000065
2004517045.tif 000066
2004517045.tif 000067
2004517045.tif 000068
2004517045.tif 000069
2004517045.tif 000070
2004517045.tif 000071
2004517045.tif 000072
2004517045.tif 000073
2004517045.tif 000074
2004517045.tif 000075
2004517045.tif 000076
2004517045.tif 000077
2004517045.tif 000078
2004517045.tif 000079
2004517045.tif 000080
2004517045.tif 000081
2004517045.tif 000082
2004517045.tif 000083
2004517045.tif 000084
2004517045.tif 000085
2004517045.tif 000086
2004517045.tif 000087
2004517045.tif 000088
2004517045.tif 000089
2004517045.tif 000090
2004517045.tif 000091
2004517045.tif 000092
2004517045.tif 000093
2004517045.tif 000094
2004517045.tif 000095
2004517045.tif 000096
2004517045.tif 000097
2004517045.tif 000098
2004517045.tif 000099
2004517045.tif 000100
2004517045.tif 000101
2004517045.tif 000102
2004517045.tif 000103
2004517045.tif 000104
2004517045.tif 000105
2004517045.tif 000106
2004517045.tif 000107
2004517045.tif 000108
2004517045.tif 000109
2004517045.tif 000110
2004517045.tif 000111
2004517045.tif 000112
2004517045.tif 000113
2004517045.tif 000114
2004517045.tif 000115
2004517045.tif 000116
2004517045.tif 000117
2004517045.tif 000118
2004517045.tif 000119
2004517045.tif 000120
2004517045.tif 000121
2004517045.tif 000122
2004517045.tif 000123
2004517045.tif 000124
2004517045.tif 000125
2004517045.tif 000126
2004517045.tif 000127
2004517045.tif 000128
2004517045.tif 000129
2004517045.tif 000130
2004517045.tif 000131
2004517045.tif 000132
【国際調査報告】
2004517045.tif 000133
2004517045.tif 000134
2004517045.tif 000135
2004517045.tif 000136
2004517045.tif 000137
2004517045.tif 000138
2004517045.tif 000139
2004517045.tif 000140