(57)【要約】本発明は、ヒトパピローマウイルスから誘導されたエピトープ、及び最小のＴ細胞エピトープを含む約２２〜４５アミノ酸残基のサイズを有するペプチドに関する。本発明はさらに、（マイコ）バクテリア及び／若しくはウイルスに感染した細胞又は癌細胞に対して被検者を免疫するための臨床的な手法を提供する。本発明は、２２〜３５アミノ酸残基の長さを有するペプチド配列が、ペプチド特異的ＣＤ８＋細胞溶解性細胞及びＣＤ４＋Ｔ−ヘルパー細胞の両方を誘起することができることを示す。さらに、本発明は、２２〜３５残基長のペプチドをワクチン接種することにより、最小のＣＴＬエピトープそのものの長さを有するペプチドをワクチン接種する場合に比べて、より強いＣＤ８＋細胞溶解性Ｔ細胞応答がもたらされることを示す。本発明は、さらに、ある最小のＣＴＬエピトープが、細胞溶解性エフェクター細胞を活性化するのではなくこれらの細胞溶解性細胞に寛容をもたらす本来的な能力を、２２〜３５アミノ酸抗のペプチドを用いることにより克服できることを示す。本発明はさらに、ＨＰＶに対して、被検者をワクチン接種及び／又は処置するための臨床的な方法を提供する。本発明はまた、発達性病巣及び／又は子宮頚癌に罹患した被検者の処置に適した方法及び使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的Ｔ細胞応答を誘起及び／又は増強する方法であって、前記抗原に特異的なＴ細胞エピトープ含む、２２〜４５アミノ酸残基のペプチドを前記応答を示すことができる系に与えることを含む方法。
【請求項２】
前記ペプチドが２２〜４０のアミノ酸残基を含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ペプチドは、抗原提示細胞を活性化することができる配列を含む請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドは、Ｔ−ヘルパー活性化配列を含む請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドを与えると、該ペプチドが抗原提示細胞によりプロセスされる請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドは、前記抗原の少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含む請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記エピトープの少なくとも１つは、前記抗原のＴヘルパー細胞エピトープ又は前記抗原の細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドは、前記抗原の少なくとも１つのＴヘルパー細胞エピトープ及び前記抗原の少なくとも１つの細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記抗原は、ウイルスタンパク又はその免疫原性部分、誘導体及び／若しくは類似体を含む請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク又はその免疫原性部分、誘導体及び／若しくは類似体を含む請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパクは、Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７を含む請求項９又は１０記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原は、自己抗原、好ましくは腫瘍細胞特異的自己抗原又はその機能的部分、誘導体及び／若しくは類似体を含む請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原は、ウイルス性又は（マイコ）バクテリア性抗原を含む請求項１ないし８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ ｈｓｐ６５ ３６９−４１２を含む請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
２１個以下のアミノ酸を有するペプチドで免疫した場合には、前記系において抗原特異的ＣＴＬの寛容及び／又は機能欠失が誘起される請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記系にアジュバントを与えることをさらに含む請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記アジュバントは、エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、樹状細胞、モノホスホリルリピッドＡ及び／又はＣｐＧ核酸を含む請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記系は、動物を含む請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記系は、ヒトを含む請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記動物は、前記免疫応答を誘起及び／又は増強することにより少なくとも部分的に治療可能又は予防可能な疾患に罹患し又は罹患するリスクを有する請求項１８又は１９記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患は、（マイコ）バクテリア性疾患、ウイルス性疾患及び／又は癌である請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
抗原に特異的なＴ細胞エピトープを含む、２２〜４５個のアミノ酸残基を有するペプチド。
【請求項２３】
２２〜４０個のアミノ酸残基を有する請求項２２記載のペプチド。
【請求項２４】
前記抗原に特異的な少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含む請求項２３又は２４記載のペプチド。
【請求項２５】
前記ペプチドはＣＴＬエピトープを含む請求項２２ないし２４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２６】
前記ペプチドはＴヘルパー細胞エピトープを含む請求項２２ないし２５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２７】
前記ＣＴＬエピトープは、２２個未満のアミノ酸残基を有するペプチド上に存在すると、該エピトープに対するＣＴＬ特異性の寛容又は機能欠失がもたらされる請求項２６記載のペプチド。
【請求項２８】
２２〜３５個のアミノ酸残基を有する請求項２２ないし２７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項２９】
３２、３３、３４又は３５個のアミノ酸残基を有する請求項２８記載のペプチド。
【請求項３０】
前記抗原に特異的な免疫応答を誘起及び／又は増強するための請求項２２ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項３１】
ワクチンの製造のための請求項２２ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項３２】
ＨＰＶ関連疾患の治療及び／又は予防のためのワクチンを調製するための請求項２２ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項３３】
医薬を調製するための請求項２２ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項３４】
（マイコ）バクテリア性疾患、ウイルス性疾患及び／又は癌に罹患し又は罹患するリスクを有する個体を処置するための医薬を調製するための請求項２２ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項３５】
請求項１ないし２１のいずれか１項に記載の方法により前記抗原に特異的なＴ細胞応答を誘起及び／又は増強し、前記系から前記抗原特異的Ｔ細胞を回収することを含む、抗原特異的Ｔ細胞を得る方法。
【請求項３６】
請求項３５記載の方法により得ることができる、単離されたＴ細胞。
【請求項３７】
医薬を調製するための、請求項３６記載のＴ細胞の使用。
【請求項３８】
請求項２２ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドを含むワクチン。
【請求項３９】
請求項２２ないし２９のいずれか１項に記載のペプチド及び／又は請求項３６記載のＴ細胞を含む医薬。
【請求項４０】
前記抗原に特異的なエピトープを含む前記ペプチドの、細胞集団が抗原特異的Ｔ細胞を含むかどうか決定するための請求項２２ないし２９のいずれか１項に記載のペプチドの使用。
【請求項４１】
個体が前記抗原に対する免疫を有するかどうかを決定するための請求項４０記載の使用。
【請求項４２】
前記Ｔ細胞の存在は、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、遅延型過敏症応答、細胞内サイトカイン染色及び／又は細胞外サイトカイン染色により決定される請求項４０又は４１記載の使用。
【請求項４３】
ヒトパピローマウイルス１６ Ｅ７タンパクの中央部分から選ばれる免疫原性エピトープ。
【請求項４４】
前記中央部分は、ヒトパピローマウイルス１６ Ｅ７タンパクのアミノ酸３５〜７７に亘る領域を含む請求項４３記載の免疫原性エピトープ。
【請求項４５】
前記中央部分は、前記Ｅ７タンパクのアミノ酸３５〜５０に亘る領域を含む請求項４３記載の免疫原性エピトープ。
【請求項４６】
前記中央部分は、前記Ｅ７タンパクのアミノ酸５０〜６２に亘る領域を含む請求項４３記載の免疫原性エピトープ。
【請求項４７】
前記中央部分は、前記Ｅ７タンパクのアミノ酸４３〜７７に亘る領域を含む請求項４３記載の免疫原性エピトープ。
【請求項４８】
ヒトパピローマウイルス１６ Ｅ６タンパクのＣ末端部分から選ばれる免疫原性エピトープ。
【請求項４９】
前記Ｃ末端部分は、ヒトパピローマウイルス１６ Ｅ６タンパクの８１〜１５８アミノ酸に亘る領域を含む請求項４８記載の免疫原性エピトープ。
【請求項５０】
前記Ｃ末端部分は、ヒトパピローマウイルス１６ Ｅ６タンパクの１２７〜１４０アミノ酸に亘る領域を含む請求項４８記載の免疫原性エピトープ。
【請求項５１】
前記Ｃ末端部分は、ヒトパピローマウイルス１６ Ｅ６タンパクの１２１〜１４２アミノ酸に亘る領域を含む請求項４８記載の免疫原性エピトープ。
【請求項５２】
ヒトパピローマウイルス１６ Ｅ２タンパクのアミノ酸３１〜１２０、１５１〜１９５又は２７１〜３６５に亘る領域から選ばれる免疫原性エピトープ。
【請求項５３】
前記領域は、前記Ｅ２タンパクのアミノ酸４６〜７５に亘る請求項５２記載の免疫原性エピトープ。
【請求項５４】
前記領域は、前記Ｅ２タンパクのアミノ酸５１〜７０に亘る請求項５２記載の免疫原性エピトープ。
【請求項５５】
前記領域は、前記Ｅ２タンパクのアミノ酸６１〜７６に亘る請求項５２記載の免疫原性エピトープ。
【請求項５６】
前記領域は、前記Ｅ２タンパクのアミノ酸３１１〜３２５に亘る請求項５２記載の免疫原性エピトープ。
【請求項５７】
前記領域は、前記Ｅ２タンパクのアミノ酸３１６〜３３０に亘る請求項５２記載の免疫原性エピトープ。
【請求項５８】
前記領域は、前記Ｅ２タンパクのアミノ酸３４６〜３５５に亘る請求項５２記載の免疫原性エピトープ。
【請求項５９】
前記領域は、前記Ｅ２タンパクのアミノ酸３５１〜３６５に亘る請求項５２記載の免疫原性エピトープ。
【請求項６０】
請求項４３ないし５９のいずれか１項に記載の免疫原性エピトープを含むペプチド。
【請求項６１】
ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合することができる請求項６０記載のペプチド。
【請求項６２】
ＣＩＮ ＩＩＩ及び／又は子宮頚癌であると診断された個体から誘導されたＰＢＭＣによるＩＦＮγ生産を誘起する能力について試験された請求項６０記載のペプチド。
【請求項６３】
未利用のＴ細胞の集団を、請求項６０ないし６２のいずれか１項に記載のペプチドと接触させ、前記Ｔ細胞集団の少なくとも一部を培養することを含む、ヒトパピローマウイルス１６特異的Ｔ細胞の生成方法。
【請求項６４】
ヒトパピローマウイルス１６に感染した被検者のＴ細胞集団を、請求項６０ないし６２のいずれか１項に記載のペプチドと接触させ、前記Ｔ細胞集団の少なくとも一部を培養することを含む、ヒトパピローマウイルス１６特異的記憶Ｔ細胞によるＩＦＮγ生産を誘起する方法。
【請求項６５】
前記ヒトパピローマウイルス１６特異的Ｔ細胞を分離することをさらに含む請求項６３又は６４記載の方法。
【請求項６６】
請求項６５記載の方法により得ることができる、単離されたＴ細胞。
【請求項６７】
請求項６０ないし６２のいずれか１項に記載のペプチド及び／又は請求項６６記載のＴ細胞を個体に投与することを含む、個体におけるＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク特異的、及び／又はＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク特異的、及び／又はＨＰＶ１６  Ｅ２タンパク特異的免疫応答を誘起及び／又は増強する方法。
【請求項６８】
請求項６０ないし６２のいずれか１項に記載のペプチド及び適当な担体を含むワクチン。
【請求項６９】
請求項６６記載のＴ細胞の、免疫治療のための使用。
【請求項７０】
ＨＰＶ１６病巣を有する被検者の処置のための、請求項６８記載のワクチン又は請求項６６記載のＴ細胞の使用。
【請求項７１】
Ｔ細胞集団が、あるエピトープに特異的な記憶Ｔ細胞を含むかどうか決定するための方法であって、
・前記Ｔ細胞集団に、前記エピトープを含むペプチドを与え、
・ＩＦＮγ抗体の存在下において前記Ｔ細胞集団を培養し、そして
・結合されたあらゆるＩＦＮγを測定することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、一般的には医学の分野に関し、より詳細には、抗原に対する特異的エピトープをを含むペプチドを用いて、該抗原に対するＴ細胞の応答を誘起及び／又は増強することに関する。
【０００２】
本発明は、主としてＨＰＶに対する免疫をモデルとして用いて例示する。しかしながら、本発明は、ＨＰＶに限定されるものとして解釈してはならず、免疫に関連する又は関連可能な広範囲の疾患に関わるものであると解釈されるべきである。
【０００３】
ＨＰＶ感染は、若くて性的に活力のある男女の間で大いに流行している。３年間の追跡期間を伴う大規模な計画調査によると、男性パートナーからのＨＰＶの感染が一般的で患者の４０〜６０％に及ぶことが示された（Ｋｏｕｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｍａｒｒａｚｚｏ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。従って、ＨＰＶはおそらく最も一般的な性感染症である。
【０００４】
高リスクタイプのパピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ１６， １８， ３１， ３３ 及び４５）は、子宮頚癌の病因である（Ｂｏｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ， １９９６）。基底上皮細胞の感染に続き、即時ＨＰＶ初期遺伝子Ｅｌ， Ｅ２， Ｅ５， Ｅ６ 及びＥ７が発現される。Ｅ１及びＥ２遺伝子は、ウイルスの複製を制御する。さらに、Ｅ２タンパクは、Ｅ６及びＥ７腫瘍タンパクの発現を制御する。高リスクＨＰＶ型のＥ６タンパクは、ｐ５３に特異的に結合し、ユビキチン経路を介するその迅速な分解を標的にする。ｐ５３は、アポトーシスの開始に関与し、このタンパクが失われるとアポトーシスが防止される（Ｓｃｈｅｆｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９０）。高リスク型のＥ７タンパクは、ｐＲＢに結合し、これは通常、細胞サイクルに入るために必要なタンパクであるＥ２Ｆを不活性化することにより、細胞が細胞サイクルに入ることを妨げる（Ｄｙｓｏｎ ｅｔ ａｌ． １９８９）。Ｅ７の発現は、感染細胞が細胞サイクルから離脱して分化することをできなくする。Ｅ６及びＥ７腫瘍タンパクの延長され高められた発現は、ＨＰＶ誘導異形成及び子宮頚癌へのトランスフォーメーションに深く関連している。ヒトのＨＰＶ関連疾患及びＨＰＶにより誘起される癌に対する防御における免疫系の防御役割は、免疫抑制腎移植患者及びＨＩＶ感染患者では、生殖ＨＰＶ感染が健常対照に比べて１７倍高いことにより示唆される（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｍａｔｏｒｒａｓ ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｈａｌｐｅｒｔ ｅｔ ａｌ． １９８６）。免疫抑制された個体のＨＰＶ感染に対する解消能力の減少は、感染初期における免疫系の防御役割を間接的に示している。初期抗原Ｅ２，Ｅ６及びＥ７に対する免疫を介するＨＰＶに対する防御の証拠は、癌関連パピローマウイルスの主な動物モデルであるワタオウサギパピローマウイルスから来た。非構造タンパクＥ１及びＥ２でワクチン投与すると、ウイルスにより誘起されるパピローマの退縮が誘起され、ウイルス性腫瘍の成長が抑制される。さらに、Ｅ１，Ｅ２，Ｅ６及びＥ７遺伝子の組み合わせでワクチン投与されたウサギは、ウイルス攻撃に対して完全に守られた（Ｈａｎ ｅｔ ａｌ． １９９９， Ｓｅｌｖａｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ． １９９５）。これらのデータは、Ｅ２，Ｅ６及びＥ７に対する免疫がパピローマウイルス感染の免疫予防及びＨＰＶにより誘起される病変及び癌に対して治療的であることを示している。
【０００５】
ＨＰＶ１６に対する免疫応答に関与するエピトープを同定することは、これらをサブユニットとしてワクチンに組み込み、又はこれらのエピトープを用いてワクチンにより誘起された免疫性を生体内でモニターできる可能性があるので、かなり興味のあることである。ほとんどの上皮細胞はＭＨＣクラスＩを発現するがクラスＩＩを発現しないので、殺腫瘍性ＨＰＶ特異的ＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球に注意が集中的に向けられてきた（Ｍｅｌｉｅｆ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｒｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｒｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｒｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９６）。ＨＰＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応性は、子宮頚上皮内新生物グレードＩＩＩ（ＣＩＮ ＩＩＩ）病巣又は子宮頚癌（Ｎｉｍａｋｏ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｒｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９６）患者の末梢血及び子宮頚癌患者から単離された腫瘍浸潤性Ｔ細胞集団（Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．， １９９７）中で見つかっている。固形腫瘍のほとんどはＭＨＣクラスＩＩを発現しないにもかかわらず、腫瘍特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー（「Ｔｈ」）免疫はまた、現在、固形腫瘍の根絶に中心的な役割を果たすものと考えられている （Ｍｅｌｉｅｆ ｅｔ ａｌ．， ２０００； Ｐａｒｄｏｌｌ ａｎｄ Ｔｏｐａｌｉａｎ， １９９８； Ｔｏｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９中でレビュー）。ＣＤ４＋腫瘍特異性Ｔ細胞は、ＣＤ８＋腫瘍特異性ＣＴＬの最適な誘起のためだけではなく、これらのＣＴＬによる局所的エフェクター細胞の機能を最適に発現させるためにも必要であることを最近の証拠は示している（Ｏｓｓｅｎｄｏｒｐ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｔｏｅｓ ｅｔ ａｌ． ，１９９９）。ＭＨＣクラスＩに拘束された腫瘍特異的免疫を誘起することにとって、プロフェッショナル抗原提示細胞により捕獲された抗原を交差提示（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）することが主な役割を演じているものと思われる。交差初回免疫 （ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）により腫瘍特異的ＣＴＬを適切に誘起するためには、腫瘍特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の助けが必要である（Ｔｏｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ＨＰＶ特異的Ｔｈ免疫の積極的な役割が、生殖イボ（ｇｅｎｉｔａｌ ｗａｒｔｓ）の退縮においてＣＤ４＋Ｔ細胞が最も多くなること（Ｃｏｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）及びＣＩＮ病巣の自発的な退縮を示した被検者の大部分において、ＨＰＶ１６ Ｅ７に対する遅延型過敏症応答が検出されることにより示唆される（Ｈｏｐｆｌ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。さらに、ＨＰＶ１６特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＨＰＶ持続感染患者、高グレードＣＩＮ病巣又は子宮頚癌患者の血液中に検出されている（ｄｅ Ｇｒｕｉｊｌ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。より流行していない腫瘍原性型であるＨＰＶ５９及びＨＰＶ６８については、ＨＬＡ−ＤＲ４拘束Ｔｈ細胞が、子宮頚癌病巣に浸潤したＴ細胞から単離されている（Ｈｏｈｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。対照的に、進行性ＣＩＮ病巣及び子宮頚癌の大部分においてＨＰＶ１６が存在しているにもかかわらず、ＨＬＡ拘束及びＨＰＶ１６特異的Ｔヘルパー応答のエピトープ特異性については深い情報はない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
例えば（マイコ）バクテリア及び／又はウイルス感染細胞又は腫瘍細胞、並びに特にＨＰＶに対して、被検者を免疫する、臨床に関するアプローチでは、特異的Ｔヘルパー細胞及びＣＴＬの両者が誘起されることが好ましい。我々は、最小のＣＴＬエピトープで免疫することにより、いくつかのモデルでは腫瘍に対する防御がもたらされることを既に示した（Ｆｅｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ． １９９３， Ｋａｓｔ ｅｔ ａｌ． １９９１）が、一方、他のモデルでは、本来、誘起されれば防御的に機能するウイルス特異的又は腫瘍特異的ＣＴＬの寛容又は機能欠失が導かれ得る（Ｔｏｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９６ａｂ）。寛容又は機能欠失は、ワクチン投与の有効性を有意に減じる。しかしながら、本発明以前には、この現象の解決方法はなかった。この効果に関与するエピトープは、従って、免疫化の目的のためには相応しくない。交差初回免疫及び他のメカニズムによってＭＨＣクラスＩ分子による提示のための外部抗原のプロセッシングは、周知の内発的経路に次ぐ、ＭＨＣクラスＩによる提示のためのプロセッシングの第２の経路として広く認識されている（Ｊｏｎｄａｌ ｅｔ ａｌ． １９９６， Ｒｅｉｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． １９９７）。この経路を介する抗原プロセッシングの通常の結果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＡＰＣ活性化が起きない限りＣＴＬ寛容である（Ｋｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。さらに、マウスのウイルス感染を用いる数種類のの研究において、ＣＴＬ前駆体の頻度と防御的免疫の間に正の相関が認められた（Ｓｅｄｌｉｋ ｅｔ ａｌ． ２０００， Ｆｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。ＣＴＬを最適に誘起するために、ＣＴＬエピトープの提示が、樹状細胞のようなプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）の表面において好ましく起きる（Ｍｅｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． １９９８， Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ ｅｔ ａｌ． １９９９）。最小のＣＴＬエピトープ及びＴｈエピトープが、プロフェッショナル抗原提示細胞によるプロセッシングなしでＴ細胞に提示され得るが、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ中のＣＴＬ及びＴｈエピトープの最適な提示が起きるために、タンパクは取り込まれプロセッシングされる必要がある（Ｍａｎｃａ ｅｔ ａｌ． １９９４）。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、抗原特異的免疫応答を改善するための手段及び方法に関する。この目的のために、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘起及び／又は増強する方法であって、前記抗原に特異的なＴ細胞エピトープ含む、２２〜４５アミノ酸残基のペプチドを前記応答を示すことができる系に与えることを含む方法を提供する。これらのペプチドは効率的に合成することができるし、また、前記ペプチドをプロセッシングすることができる細胞によって効率的に取り込ませ、プロセスされたエピトープをＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩ内に提示させてもよい。好ましくは、前記ペプチドは、プロフェッショナル抗原提示細胞によりプロセスされる。抗原提示細胞、特に、樹状細胞のようなプロフェッショナル抗原提示細胞は、エピトープをプロセスして提示するのにきわめて効率的である。なぜなら、それらは、前記抗原特異的Ｔ細胞応答の改善された誘起及び／又は増強を究極的にもたらすＴ細胞との効率的な連絡を可能にするというさらなる機能を有しているからである。従って、本発明の方法の好ましい具体例では、前記ペプチドは、抗原提示細胞を活性化することができる配列を含む。抗原提示細胞を活性化することができる配列とは、抗原提示細胞、好ましくはプロフェッショナル抗原提示細胞を少なくとも部分的に活性化することができる配列を意味する。前記活性化は、好ましくは、前記ペプチドの少なくとも１つのエピトープを前記ＡＰＣの表面に提示することをもたらす。特に好ましい具体例では、前記ペプチドは、前記抗原についての少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含む。前記抗原についての２つのＴ細胞エピトープが存在することは、前記抗原特異的Ｔ細胞応答のより効率的な誘起及び／又は増強を可能にする。好ましくは、前記エピトープの少なくとも１つは、前記抗原についてのＴ−ヘルパー細胞エピトープ又は前記抗原についての細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む。ペプチド上に少なくとも１つの又は他のエピトープを有することが望ましい。効率的な誘起及び／又は増強は、前記ペプチドがＴ−ヘルパー活性化配列を含む場合に達成される。ここで、Ｔ−ヘルパー活性化配列とは、Ｔ−ヘルパー細胞を少なくとも部分的に活性化することができる配列を意味する。前記活性化は、好ましくは、前記抗原特異的Ｔ細胞応答の改善された誘起及び／又は増強をもたらす。１つの具体例では、前記ペプチドは、前記抗原についての少なくとも１つのＴ−ヘルパー細胞エピトープと、前記抗原についての少なくとも１つの細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む。驚くべきことに、このようなペプチドを用いると、前記ペプチド上のエピトープに対する（部分的）寛容の誘起の問題が起きず又はその程度が低く、一方、前記抗原に対する特異的Ｔ細胞応答の誘起及び／又は増強は非常に効率的であることが見出された。従って、本発明の特に好ましい具体例では、前記ペプチドは、前記抗原についての少なくとも１つのＴ−ヘルパー細胞エピトープと、前記抗原についての少なくとも１つの細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを含む。
【０００８】
ある抗原についてのエピトープは、該抗原に特異的なＴ細胞レセプターと相互作用することができる。該Ｔ細胞レセプターは、前記エピトープを含む、抗原から誘導された又は誘導可能なエピトープを提示するＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩ分子に対して特異的である。前記Ｔ細胞レセプターは、前記抗原から誘導された又は誘導可能なペプチドと相互作用することができなければならないが、前記エピトープは、広範囲の異なる化合物上に存在することができる。一般に、抗原のエピトープは、該抗原の免疫原性部分上に存在し、該部分は少なくとも９アミノ酸長で、ＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−ＩＩ分子により提示され得るものである。もっとも、現在の技術では、全く異なった方法により精製されたエピトープ又は異なるものを含むエピトープを提供することが可能である。例えば、前記抗原のある断片が１つのエピトープを含むことが一旦知られれば、１又は２以上のアミノ酸部位で異なる複数のペプチドを精製することができる。その結果、前記エピトープの存在又は不存在は、例えば、前記エピトープに特異的なＴ細胞を用いたＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより容易に確かめることができる。抗原のエピトープは、ペプチド、就職ペプチド、ペプチド類似物のような、これらに限定されない種々の異なる分子上に存在し得る。
【０００９】
本発明のペプチドは、いずれの特定の抗原のエピトープをも含むことができる。もっとも、好ましくは、前記抗原は、（マイコ）バクテリア及び／又はウイルスタンパク、又はその免疫原性部分、それらの誘導体及び／又は類似体を含む。本発明の１つの局面において、前記抗原は、マイコバクテリアタンパク又はその免疫原性部分、それらの誘導体及び／又は類似体を含む。本発明の好ましい具体例においては、前記抗原は、ｈｓｐ６５ ３６９−４１２ （Ｏｔｔｅｎｈｏｆ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｃｈａｒｏ ｅｔ ａｌ．， ２００１）を含む。ｈｓｐ６５ ３６９−４１２は、３６９−３７７部位に、細胞障害性Ｔ細胞により認識されるＨＬＡ−Ａ＊０２０１エピトープを含み、Ｔ−ヘルパー細胞により認識されるＤＲ５エピトープを３９０〜４１２部位に含む。もう１つの好ましい具体例では、前記抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク又はその免疫原性部分、それらの誘導体及び／又は類似体を含む。タンパク質の免疫原性部分、誘導体及び／又は類似体は、そのタンパク質自身と必ずしも同量ではないが同種の免疫原性能力を有する。このようなタンパク質の誘導体は、好ましくは保存的なアミノ酸置換により得ることができる。
【００１０】
さらに好ましくは、前記タンパク質は、Ｅ２、Ｅ６及び／又はＥ７を含む。Ｅ２、Ｅ６及びＥ７配列中の最も免疫原性の高い領域が同定された。さらに、この領域における、多数の自然にプロセスされたＴｈ−エピトープのマッピングが同定された。方法は、健常血液ドナーから誘導された短期間及び長期間ＰＢＭＣ培養物をそれぞれ含んでいた。ＰＢＭＣ培養物を、２２〜３５アミノ酸残基長のペプチドで刺激した。並行して、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより検出される、生体内で誘起されたＥ２、Ｅ６及びＥ７特異的免疫を、健常被検者及びＨＰＶ１６＋病巣を有すると診断された被検者において分析した。
【００１１】
ウイルス感染及び腫瘍に対する自然の及びワクチン誘導免疫防御において、病原体及び腫瘍特異的Ｔヘルパー免疫が中心的な役割を果たすことが見いだされた。ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６） Ｅ２， Ｅ６及びＥ７タンパクに対する応答を詳細に調べた。ＨＬＡ分類された健常ドナーからの短期間及び長期間のＰＢＭＣ培養により、我々は、Ｅ２タンパク中の３つの異なる領域（Ｅ２ ３１−１２０； Ｅ２ １５１−１９５； Ｅ２ ２７１−３６５） 、ＨＰＶ１６ Ｅ６ のＣ末端領域 （Ｅ６ ８１−１５８）、及びＨＰＶ１６ Ｅ７の中央領域 （Ｅ７ ３１−７７）を、これらの抗原における主な免疫原性領域であると同定した。さらに、我々は、これらのタンパク質中の１０個の異なるＴｈエピトープをマッピングした（ＤＲ１／Ｅ２ ３５１−３６５， ＤＲ２／Ｅ２ ３１６−３３０， ＤＲ２／Ｅ２ ３４６−３５５， ＤＲ４／Ｅ２ ５１−７０， Ｅ２ ６１−７６， ＤＱ６／Ｅ２ ３１１−３２５， ＤＲ１５／Ｅ７ ５０−６２， ＤＲ３／Ｅ７ ４３−７７， ＤＱ２／Ｅ７ ３５−５０， ＤＲ１／Ｅ６ １２７−１４２）。
【００１２】
ＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴ分析を採用することにより、我々は、健常人中のＨＰＶ１６ Ｅ２ 及びＨＰＶ１６ Ｅ６に対する記憶Ｔｈ免疫を、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞中に検出した。これは、以前のＨＰＶ感染に対するＥ２及びＥ６に向けられた防御的免疫を示唆する。さらに、ＨＰＶ１６＋病巣を有する被検者において、ＨＰＶ１６  Ｅ７に対するＴｈ免疫を検出した。これらの応答の数種類は、この研究で規定される３つのＥ７誘導Ｔｈエピトープに合致する。他の多数のＨＰＶ１６＋被検者は、Ｅ７特異的１型サイトカイン産生Ｔ細胞免疫を示さなかった。これは、免疫応答できなかったことを意味している。
【００１３】
我々は、ＣＴＬ及びＴｈ−エピトープを含む長いペプチドが、抗原特異的Ｔｈ細胞を誘起するだけでなく、抗原特異的ＣＴＬも誘起することができることを示した。このようなペプチドはまた、抗原特異的ＣＴＬ応答をも増強することができる。Ｃ５７／Ｂ１６マウスを最小のＥ１Ａ−誘導ＣＴＬエピトープ（ＳＧＰＳＮＴＰＰＥＩ）で免疫すると腫瘍の増殖が増強されるのとは対照的に、アデノウイルスＥ１Ａタンパク（ＲＥＣＮＳＳＴＤＳＣＤＳＧＰＳＮＴＰＰＥＩＨＰＶＶＲＬＣＰＩＩＫＰ）のこの最小のＣＴＬエピトープを含む、ＨＰＬＣで精製された３２アミノ酸長のペプチドで免疫すると、アデノウイルスＥ１Ａ＋ＲＡＳトランスフォーム腫瘍細胞による攻撃に対する防御がもたらされた。さらに、最小の９アミノ酸長のＣＴＬエピトープＲＡＨＹＮＩＶＴＦを含む、３５アミノ酸残基長のペプチドで免疫すると、脾細胞のＦＡＣＳ分析におけるＨ−２Ｄｂ−ＲＡＨＹＮＩＶＴＦテトラマー陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在により示されるように、ＨＰＶ１６特異的Ｈ−２Ｄｂ拘束ＣＴＬが誘起された。注目すべきことに、直接比較において、３５−ｍｅｒのペプチドにより誘起されるＣＴＬ応答は、最小のＣＴＬエピトープにより誘起されるＣＴＬ応答よりもはるかに強かった。そして、この差は、長いペプチド中のエピトープを最適に取り込み、プロセスし、エピトープを提示することができるプロフェッショナル抗原提示細胞の特異的活性化の後にはより顕著であった。さらに、本発明は、抗原提示細胞の存在下において、前記長いペプチドでＣＴＬを刺激すると、小さな腫瘍結節が根絶された。対照的に、前記最小のＣＴＬエピトープは、全てのマウスにおいて主要を完全に根絶することはできない。
【００１４】
このように本発明の長いペプチドをワクチン投与することにより、最小のＣＴＬエピトープペプチドを用いた場合のような寛容の誘起が回避される。本発明の長いペプチドは、より多量のＣＴＬをもたらし、これは一般的により良好な防御を伴う。理論に拘束されないが、これは２つの独立したメカニズムの少なくとも１つにより説明される。１つのメカニズムは、Ｔ−ヘルパーエピトープとＣＴＬエピトープが１つのペプチド中で物理的に結合されることである。もう１つのメカニズムは、本発明の長いペプチド中に存在する少なくとも１つのＣＴＬ−及び／又はＴ−ヘルパーエピトープが、プロフェッショナル抗原提示細胞によって優先的に提示されることである。本発明のペプチドは、その大きさの故にＭＨＣクラスＩに直接結合することができず、外来性の抗原をプロセスしてＭＨＣクラスＩ中にペプチドを提示することができるプロフェッショナルＡＰＣ（例えば樹状細胞）によって取り込まれる必要がある。他の細胞は、エピトープをプロセスし、次いで提示する能力がはるかに低い。従って、非プロフェッショナルＡＰＣによるバックグランドの提示は少なくとも部分的に妨げられる。本発明のペプチドが、優先的にＡＰＣを標的にする効果は、本発明の長いペプチドを樹状細胞活性化剤とともに用いることによって高められ、これは好ましい具体例である。もう１つの好ましい具体例では、前記抗原は自己抗原、好ましくは腫瘍細胞特異的自己抗原又はその機能的部分、その誘導体及び／又は類似体を含む。「自己抗原」という語は、そのＴ細胞が属する動物種によってコードされる抗原を意味する。それはまた、前記動物のタンパク質の異常な発現、修飾、折りたたみ、及び／又は前記動物のタンパク質をコードする細胞のＤＮＡ若しくはＲＮＡの配列の変異の結果生じ若しくは発現されるに至った抗原をも意味する。好ましい具体例では、前記自己抗原は、ＭＡＧＥ， ＣＴＡ又はＰＳＡ抗原を包含する。特に好ましい具体例では、前記ペプチドは、前記系において抗原特異的ＣＴＬ及び／又はＴ−ヘルパー細胞の寛容及び／又は機能欠失を誘起する、Ｔ細胞エピトープ特異的抗原を含む。
【００１５】
抗原特異的免疫応答は、アジュバントと共に前記応答を示すことができる系により強化することができることはこの分野において広く知られている。アジュバントはまた、本発明において有用である。好ましい具体例では、前記アジュバントは、エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）、樹状細胞、ＭＰＬ（モノホスホリルリピッドＡ）、ポリＩ：Ｃ、アンプリゲン（ポリＩ：ポリＣ１２Ｕ）及び／又はＣｐＧ核酸を包含する。
【００１６】
本発明において、エピトープ結合の利点は、単一のＡＰＣの表面上にＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ拘束エピトープの両方が同時に提示されるチャンスが増大し、それによって同族のＴ細胞の助けをＣＴＬ初回免疫に到達させることが容易になることである。プロフェッショナル抗原提示細胞による提示が好ましい。なぜなら、これらの細胞は、非プロフェッショナル抗原提示細胞に比較してより効率的に抗原を取り込むことができるからである。さらに、プロフェッショナル抗原提示細胞のみが、抗原の取り込みに応答してＴ−ヘルパー細胞を活性化することができる。この活性化は、最適の免疫応答にとって重要である。
【００１７】
本発明において示されるように、ＣＴＬ応答のレベルは、樹状細胞の活性化に依存している。我々の長いペプチドＨＰＶ１６ Ｅ７ワクチンの高い有効性をもたらす１つのメカニズムの１つは、天然のＨＰＶ１６ Ｅ７配列が、互いに物理的に結合されたＴ−ヘルパー−及びＣＴＬエピトープを含んでいることである。プロフェッショナル抗原提示細胞により好ましく提示される、Ｔｈエピトープ及びＣＴＬエピトープを含む長いペプチドを得るために、２種又はそれ以上のＴ−ヘルパー及びＣＴＬエピトープを結合し、天然には生じない配列を有するかなりの大きさのペプチドをもたらすことができる。これらのＴ−ヘルパー及びＣＴＬエピトープは、２つの異なる抗原であって、好ましくは同一の腫瘍細胞又は病原体から誘導された抗原であるが、無関係の抗原であってもよい。本発明において、前記抗原とは無関係のＴｈ−エピトープを含む本発明の長いペプチドによって、特定の抗原に対するＴ細胞応答を誘起又は増強することができる。ＡＰＣは、一般的に前記無関係のＴｈ−エピトープにより活性化されることができる。しかしながら、好ましくはＴｈ−エピトープは、前記抗原と関連するものである。
【００１８】
抗原に特異的なエピトープを含むペプチドを与えることによって抗原特異的応答を誘起及び／又は増強できる多くの系が利用可能である。例えば、末梢血単核細胞の生体外培養物である。他の多くの系が利用可能である。しかしながら、本発明の好ましい具体例では、前記系は動物を含む。より好ましくは、前記動物はヒトを含む。
【００１９】
本発明の方法は、前記抗原に対する免疫を与えること及び／又は該免疫を高めることに非常に適している。本発明の方法は、他の免疫戦略が用いられるいずれの目的にも適している。免疫は、古くからワクチン投与のため、すなわち疾病の予防のために用いられている。しかしながら、本発明の方法は、疾病の予防に適しているだけではない。方法はまた、現に存する疾病の治療にも用いることができる。もちろん、該疾病は、抗原特異的Ｔ細胞免疫を誘起及び／又は増強することにより治療可能なものに限定されるが。この特徴は、例えば、いくつかの癌のような、ウイルス感染に伴う疾病の治療に用いることができる。原則的に、免疫に関連する手法により治療可能ないずれの疾病も本発明の方法により利益を受けることができる。好ましい具体例では、前記動物は、前記免疫応答を誘起及び／又は増強することにより少なくとも部分的に治療可能又は予防可能な疾病を患っているか又は患う危険があるものである。好ましくは、前記疾病は、ウイルス性疾患及び／又は癌を包含する。もう１つの好ましい具体例では、前記疾病は、（マイコ）バクテリア感染を包含する。
【００２０】
本発明の他の局面では、抗原に特異的なＴ細胞エピトープを含む、２２〜４５アミノ酸残基のペプチドが提供される。好ましくは、前記ペプチドは、前記抗原に特異的な少なくとも２つのＴ細胞エピトープを含む。好ましくは、前記ペプチドは、前記抗原に対するＣＴＬエピトープ又は前記抗原に対するＴ−ヘルパー細胞エピトープを含む。特に好ましい具体例では、前記ペプチドは、前記抗原に対するＣＴＬエピトープと前記抗原に対するＴ−ヘルパー細胞エピトープを含む。好ましくは、前記抗原に対する前記ＣＴＬ及び／又はＴ−ヘルパーエピトープは、２１アミノ酸残基以下のペプチド中に存在する場合には、それぞれＣＴＬ及び／又はＴ−ヘルパー細胞の寛容又は機能欠失をもたらすものである。好ましい具体例では、前記ペプチドは、２２〜３５アミノ酸残基を含む。さらに好ましくは、前記ペプチドは、３２〜３５アミノ酸残基を含む。
【００２１】
本発明はさらに、前記抗原に特異的な免疫応答を誘起及び／又は増強するための本発明のペプチドの用途を提供する。ワクチンの調製のためのペプチドの用途も提供される。好ましくは、ＨＰＶ関連疾患及び／又は癌の治療及び／又は予防のためのワクチンの調製のためのものである。さらに、医薬の調製のための用途も提供される。好ましくは、ウイルス性疾患及び／又は癌に罹患している又は罹患するリスクがある個体の治療のための医薬である。もう１つの好ましい具体例では、前記個体は、（マイコ）バクテリア性疾患に罹患している又は罹患するリスクがある個体である。
【００２２】
本発明のさらにもう１つの局面では、前記系からの抗原特異的Ｔ細胞を獲得することを含む方法が提供される。従って、本発明の方法により得ることが可能な単離されたＴ細胞も提供される。該Ｔ細胞は、もちろん、医薬の調製に用いることができる。本発明のペプチドを含むワクチンもまた提供される。本発明のペプチド又はＴ細胞を含む医薬も提供される。
【００２３】
抗原のエピトープを含む本発明のペプチドはまた、細胞集団が抗原特異的Ｔ細胞を含むか否かを調べるために用いることもできる。例えば、ある個体が前記抗原に対する免疫を有するか否かを調べることができる。前記Ｔ細胞の存在は、好ましくはＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、遅延型過敏症応答、細胞内サイトカイン染色及び／又は細胞外サイトカイン染色により測定される。
【００２４】
本発明の他の局面では、ヒトパピローマウイルス１６型Ｅ２、Ｅ６及びＥ７タンパクの免疫原性領域から選択される免疫原性エピトープを含むペプチドが提供される。好ましくは、前記免疫原性領域は、ヒトパピローマウイルス１６Ｅ２タンパクの、アミノ酸３１〜１２０、１５１〜１９５及び２７１〜３６５に亘る、Ｅ２タンパクの３つの分離した領域（Ｅ２３１−１２０； Ｅ２１５１−１９５； Ｅ２２７１−３６５）、ＨＰＶ１６ Ｅ６タンパクのアミノ酸８１〜１５８に亘るＨＰＶ１６ Ｅ６のＣ末端領域 （Ｅ６８１−１５８）及びヒトパピローマウイルス１６  Ｅ７タンパクのアミノ酸３１〜７７に亘る、ＨＰＶ１６ Ｅ７の中央領域（Ｅ７３１−７７）を包含する。
【００２５】
より好ましくは、前記Ｅ２タンパク中の前記免疫原性領域は、アミノ酸４６〜７５に亘る領域、アミノ酸５１〜７０に亘る領域、アミノ酸６１〜７６に亘る領域、アミノ酸３１６〜３３０に亘る領域、アミノ酸３１１〜３２５に亘る領域、アミノ酸３４６〜３５５に亘る領域及びアミノ酸３５１〜３６５に亘る領域を包含する。さらに、前記Ｅ６タンパク中の前記免疫原性領域は、アミノ酸１２１〜１４２に亘る領域及び１２７〜１４０に亘る領域を包含する。さらに、前記Ｅ７タンパク中の前記免疫原性領域は、アミノ酸３５〜５０に亘る領域、アミノ酸５０〜６２に亘る領域及び／又はアミノ酸４３〜７７に亘る領域を包含する。Ｔ−ヘルパー細胞応答は、上記免疫原性領域のいずれかを用いて非常によく誘起及び／又は増強することができる。注目すべきことに、これらの免疫原性領域は、異なるＨＬＡクラスＩＩ分子によって拘束されるＴ−ヘルパー応答を誘起／増強することができる。
【００２６】
本発明の他の局面では、抗原の最小のＴ細胞エピトープを含み、約２２〜４５アミノ酸残基のサイズを有するペプチドとＴ細胞とを接触させることを含む、抗原に対するＴ細胞応答を誘起及び／又は増強する方法が提供される。好ましくは、本発明のペプチドは、約２２〜４０アミノ酸残基のサイズを有する。前記最小のＴ細胞エピトープは、約２２〜４０アミノ酸残基のサイズを有するペプチドの形態で提示されることが好ましい。なぜなら、我々は、最小エピトープで免疫することにより起きるＣＴＬの寛容又は機能欠失の問題は、ＣＴＬ及び／又はＴ−ヘルパー細胞を初回免疫 （ｐｒｉｍｅ）することができる長いペプチド（２２〜４５、好ましくは２２〜４０アミノ酸残基）を用いることにより回避できることを見出したからである。少なくとも１つの最小Ｔ細胞エピトープを含む前記長いペプチドは、Ｔ細胞応答を誘起及び／又は増強することができる。最小Ｔ細胞エピトープを含む前記長いペプチドで免疫することにより、該最小エピトープが裸の形態で前記ＣＴＬに投与された場合には、ウイルス−及び腫瘍特異的ＣＴＬの寛容又は機能的欠失をもたらすものである場合であっても、防御がもたらされる。前記最小のＴ細胞エピトープは、本発明の免疫原性領域から誘導することができる。従って、１つの局面において、本発明は、前記最小エピトープが、裸の形態でＣＴＬに投与された場合にウイルス−及び腫瘍特異的ＣＴＬの寛容又は機能的欠失をもたらす最小エピトープである本発明の方法を提供する。
【００２７】
本発明の他の局面では、抗原の最小のＴ細胞エピトープを含み、約２２〜４５アミノ酸残基のサイズを有するペプチドとＴ細胞とを接触させることを含む、抗原に対するＴ細胞応答を誘起及び／又は増強する方法が提供される。前記最小のＴ細胞エピトープは、約２２〜４５、好ましくは約２２〜４０アミノ酸残基のサイズを有するペプチドの形態で提示されることが好ましい。なぜなら、我々は、（ウイルス−及び腫瘍特異的）ＣＴＬの誘起が、前記長いペプチドでより効率的に誘起され、より多数の抗原特異的ＣＴＬがもたらされることを見出したからである。前記長いペプチドの使用により、含まれるＣＴＬ及び／又はＴｈエピトープの提示がより効率的に行われる。理論に拘束されないが、長いペプチドは、プロフェッショナル抗原提示細胞によってプロセスされ及び提示される必要があると考えられる。この理論を支持する証拠は、前記長いペプチド及びプロフェッショナル抗原提示細胞−活性化剤をワクチン投与した後、より効率的なＣＴＬ免疫が誘起されることである。
【００２８】
本発明において、Ｔ細胞をペプチドと接触させることは、好ましくはＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ分子により行われる。該ＭＨＣ分子は、ペプチドをプロセスした後、前記Ｔ細胞に提示することができる。本発明の抗原は、ウイルス、細菌又は関連する腫瘍細胞から誘導されたものであり得る。好ましくは、抗原は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）のタンパクを包含する。さらに好ましくは、前記ＨＰＶは、ＨＰＶ １６を包含する。最も好ましい局面では、前記タンパクは、ＨＰＶ １６ Ｅ２， Ｅ６ 及び／又はＥ７を包含する。前記長いペプチドは、ＣＴＬ及び／又はＴ−ヘルパー細胞を初回免疫することができる。従って、本発明の１つの局面において、前記Ｔ細胞は、ＣＤ８＋ ＣＴＬを包含する本発明の方法が提供される。あるいは、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を包含する。
【００２９】
ここで、Ｔ細胞応答を誘起するとは、ある抗原に対するＴ細胞応答が誘導されることを意味する。該誘起前には、該Ｔ細胞応答は存在しなかったか、検出レベル未満であったか又は機能的でなかった。ここで、Ｔ細胞応答を増強するとは、ある抗原に対するＴ細胞の総合的な作用が、前記増強前の前記Ｔ細胞の総合的な作用に比較してより高められ及び／又はより効率化されることを意味する。例えば、前記増強後、前記抗原に対するＴ細胞がより多数生成され得る。その結果、追加的に生成されたＴ細胞の作用が、前記抗原に対する総合的な作用を増大させる。あるいは、前記増強は、前記抗原に対するＴ細胞の作用の増大を包含する。前記Ｔ細胞は、例えば、前記抗原とより強く及び／又はより迅速に反応し得る。もちろん、前記増強の結果は、追加的なＴ細胞の生成と前記Ｔ細胞の作用の増大であってもよい。あるいは、前記増強は、追加的なＴ細胞の生成及び前記Ｔ細胞の作用の増大のいずれかのみを包含し得る。
【００３０】
ここで、最小のＴ細胞エピトープとは、抗原に対するＴ細胞応答を誘起することができる、抗原から誘導されるペプチドであると定義される。該最小のＴ細胞エピトープは、主要組織適合性分子のクラスＩ又はＩＩにより結合されるのに適している。典型的には、最小ＣＴＬエピトープは、８〜１１アミノ酸から成る。ＭＨＣクラスＩＩ分子により結合される最小のＴ細胞エピトープは、好ましくは少なくとも１１アミノ酸から成る。本発明において、最小エピトープを裸の形態で投与するとは、前記エピトープを、該エピトープのサイズを有するペプチドとして投与するか、又はその一端若しくは両端に追加的な配列を結合して２２個未満のアミノ酸残基を有するペプチドの形態で投与することを意味する。例えば、前記エピトープには、プロセッシング部位を結合することができる。
【００３１】
本発明の教示に従い、本発明のペプチドを用いて抗原に対するＴ細胞応答を誘起及び／又は増強することが可能である。もちろん、前記ペプチドの実施例はここに記載してある。すなわち、本発明の１つの具体例は、少なくとも１つの最小Ｔ細胞エピトープを含み、約２２〜４５、好ましくは約２２〜４０のアミノ酸残基のサイズを有するペプチドを提供する。該ペプチドは、最小のＣＴＬエピトープ及び／又は最小のＴ−ヘルパー細胞エピトープを含む。好ましくは、該ペプチドは、本発明の免疫原性エピトープを包含する。
【００３２】
最小エピトープでの免疫によりＣＴＬの寛容又は機能欠失がもたらされる場合には、本発明のペプチドは、裸の形態の最小エピトープよりもワクチン投与の目的により適している。従って、１つの局面において、本発明は、前記最小ＣＴＬエピトープが、裸の形態でＣＴＬに投与された場合にウイルス−及び腫瘍特異的ＣＴＬの寛容又は機能的欠失をもたらす最小エピトープである本発明の方法を提供する。本発明のペプチドは、好ましくは約２２〜４５アミノ酸残基のサイズを有する。好ましくは、本発明のペプチドは２２〜３５アミノ酸残基のサイズを有する。さらに好ましくは、本発明のペプチドは３２アミノ酸残基のサイズを有する。他の局面において、本発明のペプチドは、３５アミノ酸残基のサイズを有する。
【００３３】
本発明のペプチドで免疫することによりＣＴＬの数が増えるのであれば、本発明のペプチドは、裸の形態の最小エピトープよりもワクチン投与の目的により適している。これは、提示がプロフェッショナル抗原提示細胞により主として起きることを確保することにより達成することができる。従って、本発明の１つの局面において、前記ペプチドが、最小ＣＴＬエピトープを投与した場合よりもウイルス−及び／又は腫瘍特異的ＣＴＬの数が増加する本発明の方法を提供する。本発明のペプチドの他の局面では、（小さな）腫瘍結節を根絶することができる活発なＣＴＬ応答がもたらされる。現在、ペプチドを生成する多くの方法が知られている。生成されたペプチドが最小Ｔ細胞エピトープを含む限り、本発明は、生成されたペプチドのいずれの形態にも限定されない。例えば、本発明のペプチドは、生体外での合成により、又は例えばこれをコードする核酸を介して細胞により合成されたＥ２、Ｅ６又はＥ７タンパクから得ることができる。本発明のペプチドは、単一のペプチドとして、又は融合タンパクに組み込まれた形態で存在することができる。１つの具体例では、前記ペプチドにプロセッシング部位を結合して、細胞の表面上のＭＨＣ分子への輸送及び／又は取り込みを行わせる。好ましい具体例では、本発明のペプチドは、プロセッシング後、ＭＨＣクラスＩＩ分子と複合化することができる。腫瘍細胞はしばしばＭＨＣクラスＩＩ分子を発現していないが、ＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞免疫は、現在、例えば腫瘍細胞の根絶に重要であると考えられている。本発明のペプチドは、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ依存性Ｔ細胞の両者を誘導し、結城氏及び／又は刺激するのに特に適している。従って、本発明の１つの局面では、抗原に対するＴ細胞応答を誘起及び／又は増強する本発明のペプチドの用途が提供される。本発明のペプチドを個体に投与することを含む、個体中の免疫応答を誘起及び／又は増強する方法もまた提供される。他の局面において、本発明は、本発明のペプチドのワクチン調製のための用途を提供する。好ましくは、前記ワクチンは、少なくとも部分的に、ＨＰＶ関連疾患の予防のためのワクチンを包含する。
【００３４】
例えば、ＨＰＶ Ｅ２及びＥ６タンパクに対する反応性Ｔ細胞は、健常個体中に見出されている。このことは、ＨＰＶ１６ Ｅ２及びＥ６タンパク中の同定された免疫原性領域が、ワクチン投与及び／又は養子免疫治療的手法に基づく予防的抗癌処置に関連するエピトープを包含することを示している。さらに、ＨＰＶ Ｅ７及びＨＰＶ Ｅ６タンパクに対する反応性Ｔ細胞が、ＣＩＮ ＩＩＩ病巣を有する及び子宮頚癌を有する被検者中に見出されている。このことは、ＨＰＶ １６ Ｅ７及びＨＰＶ Ｅ６タンパクの同定された免疫原性領域が、ワクチン投与及び／又は養子免疫治療的手法に基づく抗癌治療に関連するエピトープを包含することを示している。本発明のペプチドは、ＨＰＶ特異的Ｔ細胞の生成及び／又は誘起に適している。従って、本発明の１つの局面において、未利用（ｎａｉｖｅ）のＴ細胞集団を本発明のペプチドと接触させ、該Ｔ細胞集団の少なくとも一部を培養することを含む、ヒトパピローマウイルス１６特異的Ｔ細胞の生成方法が提供される。本発明の他の局面において、ヒトパピローマウイルス１６に感染した被検者のＴ細胞集団を本発明のペプチドと接触させ、該Ｔ細胞集団の少なくとも一部を培養することを含む、ヒトパピローマウイルス１６特異的記憶Ｔ細胞による、抗原特異的サイトカイン（例えばＩＬ−２やＩＦＮγのような）産生を誘起する方法が提供される。これらの局面の好ましい具体例においては、前記ヒトパピローマウイルス１６特異的Ｔ細胞は単離される。
【００３５】
さらにもう１つの局面において、本発明の方法によりＴ細胞を誘起及び／又は増強し、抗原に対する形成されたＴ細胞を回収することを含む、抗原に対するＴ細胞を得ることをさらに含む本発明の方法が提供される。もちろん、本発明の方法により得ることができる単離されたＴ細胞もここに提供される。該Ｔ細胞は多くの方法で使用することができ、例えば、診断アッセイにおいて本発明のエピトープを検出するために用いることができる。もっとも、好ましくは、前記Ｔ細胞は、免疫治療的手法に用いられる。このような手法は、ＨＰＶ−１６により誘起された子宮頚癌又は病巣を患う被検者に該Ｔ細胞を注入する手法を包含するがこれに限定されるものではない。このように、本発明の１つの局面において、ＨＰＶ関連疾患の少なくとも部分的な治療のための本発明のＴ細胞の用途を提供する。このような手法において、前記Ｔ細胞と前記被検者は組織適合していることが好ましい。もっとも、これは必ずしも正しくないかもしれない。ある場合には、組織適合性が不一致の場合に、該被検者中での前記Ｔ細胞の機能が増強されることさえある。宿主対移植片疾患の発達は、該被検者に投与された移植片中に、本発明のエピトープに拘束されないＴ細胞が存在しないことを確保することによりしばしば制限することができる。もちろん、注入された本発明のＴ細胞を排除する結果となる宿主対移植片応答は起き得る。このような応答を制限するために、組織適合していることが好ましい。もっとも、腫瘍細胞の根絶が極めて迅速な場合には、宿主を介する移植細胞の除去は、免疫治療の更なる安全特徴として利点であり得る。従って、１つの具体例では、本発明は、個体に本発明のペプチド又は本発明のＴ細胞を投与することを含む、個体におけるＨＰＶ１６ Ｅ２， Ｅ６及び／又はＥ７タンパク特異的免疫応答を誘起及び／又は増強する方法を提供する。本発明のペプチドは、個体中でＨＰＶ １６特異的免疫応答を誘起するために特に適している。これらの免疫応答は、ＨＰＶ−１６による感染に対する防御を被検者に与えるのに十分に強い。もっとも、本発明のペプチド又はＴ細胞は、被検者中に既に存在する感染症との闘いを助けるために用いることもできる。従って、本発明のもう１つの具体例は、本発明のペプチド又はＴ細胞の、医薬の製造のための用途を提供する。好ましくは、前記医薬はＨＰＶ関連疾患のための医薬を包含する。もちろん、本発明のペプチドを含むワクチン及び／又は医薬もまたここに提供される。前記ワクチンは、ＨＰＶ関連疾患の予防に特に適している。従って、本発明はまた、本発明のワクチンを個体に投与することを含む、少なくとも部分的にＨＰＶ関連疾患を予防するための方法をも提供する。本発明の医薬はもちろん、ＨＰＶ関連疾患の治療のために特に適している。従って、本発明の医薬を個体に投与することを含む、ＨＰＶ関連疾患を少なくとも部分的に治療する方法もここに提供される。もう１つの本発明の局面において、エピトープを含む本発明のペプチドをＴ細胞の集団に与え、抗原特異的サイトカイン（例えばＩＬ−２やＩＦＮγのような）に特異的な抗体の存在下で前記Ｔ細胞集団を培養し、あらゆる結合された抗原特異的サイトカインを検出することを含む、Ｔ細���集団中に前記エピトープに特異的な記憶Ｔ細胞が含まれるか否かを決定する方法が提供される。１つの具体例では、前記抗体は固相、好ましくは固相表面に結合される。この方法は、個体が、ある抗原、例えばＨＰＶタンパクに対するＴ細胞応答を有するか否かを決定するためにきわめて有用である。該方法は、ＨＰＶ感染の診断に用いることができる。あるいは、前記方法は、個体にワクチン投与した後に、Ｔ細胞応答が誘起されたか否かを決定するために適している。好ましくは、前記個体は、本発明のワクチンを与えられる。このように本発明の１つの具体例は、抗原に対するＴ細胞の存在を調べるための、本発明のペプチドの用途を提供する。１つの具体例において、前記Ｔ細胞の前記存在は、試料中で調べられる。例えば、個体からの血液試料を得ることができる。その後、本発明のペプチドを用いた免疫測定により、特定の抗原に対するＴ細胞の存在を調べることができる。例えば、前記した方法を用いることができる。この方法では、結合された抗原特異的サイトカイン（例えばＩＬ−２やＩＦＮγのような）が検出されれば、前記Ｔ細胞の存在が示されている。もちろん、当業者は、本発明のペプチドを用いてある抗原に対するＴ細胞を検出するための多くの技術を考えることができる。例えば、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答、細胞内サイトカイン染色及び細胞外サイトカイン染色又は前記ペプチドを含むテトラメリックＭＨＣクラスＩＩ分子の使用は、当業者によって知られる重要な技術である。
【００３６】
本発明を、以下の例示的実施例を用いてさらに説明する。
【００３７】
【実施例】
実施例１
材料及び方法
被検者及び対照
臍帯血単核細胞（ＣＢＣ）を、インフルエンザマトリックス特異的応答のための免疫学的に未利用の対照として用いた。インフォームドコンセント後に得られた、ＨＬＡ型分類され、匿名の健常人血液銀行ドナー（Ｄ）からのＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６ Ｅ７及びインフルエンザマトリックス特異的応答の対照ＰＢＭＣとして用いた。これらのドナーは、匿名であるので、追加的なデータは入手できない。しかしながら、異常なパピローマウイルス塗沫（ｐａｐ−ｓｍｅａｒ）を包含する、最近の感染履歴が知られているドナーは、通常の規制の一部として、献血を思いとどまらされる。ＣＩＮ又は子宮頚癌を有する被検者（Ｓ，表１）の研究は、この論文において、ＨＰＶ１６感染子宮頚癌病巣に対する細胞性免疫を研究した「サークル研究 （ＣＩＲＣＬＥ ｓｔｕｄｙ）」に記載されている。ライデン大学医学センター（ＬＵＭＣ）の婦人科において、組織学的に照明されたＣＩＮ ＩＩＩ又は子宮頚癌を呈している婦人を、インフォームドコンセント後、この研究に利用させてもらった。研究計画は、ＬＵＭＣの倫理委員会で承認された。治療の日に採血した。ＣＩＮ ＩＩＩを有する被検者を、ＬＥＥＰ又は冷ナイフ円錐切除で処置した。ＩＢ−ＩＩＡの段階にある場合には、根治的な子宮摘出を行った。十分なＰＢＭＣが得られた全ての個体について、ＨＬＡ ＭＨＣクラスＩＩの分類を行った（Ｎａｉｐａｌ ｅｔ ａｌ．， １９８４）。バイオプシー又は外科的切除標本のパラフィン埋め込み切片から単離されたＤＮＡ上でＨＰＶ１６特異的プライマーを用いてＨＰＶ１６の分類を行った（Ｃｌａａｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。ＨＰＶ特異的Ｔ−ヘルパー応答は、進行性疾患を患っている被検者中に検出されると予測されたので（ｄｅ Ｇｒｕｉｊｌ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、我々は、ＣＩＮ ＩＩＩを呈する３名の被検者、子宮頚癌の段階ＩＢを呈する４名の被検者及び再発性子宮頚癌を呈する４名の被検者を選んだ。
【００３８】
抗原
第１番目と最後のアミノ酸で示される、Ｅ７タンパク上に亘る、９個の重複する２２−ｍｅｒのペプチド（１−２２， １１−３２， ２１−４２， ３１−５２， ４１−６２， ５１−７２， ６１−８２， ７１−９２及び７７−９８）又はアミノ酸１−３５， ２２−５６， ４３−７７及び６４−９８で規定される４個の長いペプチドを用いた。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて対照ペプチドとして用いた、インフルエンザマトリックス１タンパクＡ／ＰＲ／８／４３上に亘るペプチドは、１５アミノ酸重なる１６個の３０−ｍｅｒペプチドであった。ペプチドは、以前に記載した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）通りに合成し、溶解した。
【００３９】
組換えＨＰＶ１６−Ｅ７タンパク、ＨＰＶ１６−Ｅ６タンパク及びＨＩＶ−１ ＲＴタンパク（後二者のタンパクは、増殖アッセイにおける対照タンパクとして用いた）は、Ｐｅｔ− １９ｂ−ＨＰＶ１６−Ｅ７， Ｐｅｔ−１９ｂ−ＨＰＶ１６−Ｅ６ （Ｄｅ Ｂｒｕｉｊｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８）で形質転換された組換え大腸菌中で生産されたタンパク、又はＰｅｔ−１９ｂ−ＨＩＶ−１逆転写酵素（ＲＴ）であり、以前に記載したとおりに精製した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００４０】
記憶応答混合物（ＭＲＭ）：破傷風トキソイド（１ ＬＦ／ｍｌ； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， オランダ国Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ）及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの超音波破砕物（２．５μｇ／ｍｌ； オランダ国Ｒｏｙａｌ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ のＰ． Ｋｌａｔｓｅｒ博士が気前よく分与）を、典型的な普遍的（ｒｅｃａｌｌ）抗原に応答してＰＢＭＣが増殖する能力を制御するために用いた。
【００４１】
ＨＬＡ−ＤＲ抗原結合アッセイ
ペプチドの結合は、以前に報告したとおりに測定した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。短く述べると、ＨＬＡ−ＤＲ分子の供給源として、ＨＬＡ−ＤＲがホモ接合である、Ｂ−リンパ芽球性セルラインを用いた：ＬＧ２．１ （ＤＲＢ＊０１０１， ＤＲ１）， ＩＷＢ （ＤＲＢ１＊０２０１， ＤＲ２）， ＨＡＲ （ＤＲＢ＊０３０１， ＤＲ３）， ＢＳＭ （ＤＲＢ＊０４０１， ＤＲ４） 及びＰｉｔｏｕｔ （ＤＲＢ１＊０７０１， ＤＲ７）。ＤＲ分子は、アフィニティクロマトグラフィーで精製し、純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。精製ＨＬＲ−ＤＲ分子へのペプチドの結合の解析は、Ｎ末端を蛍光標識した標準ペプチドを用いて行った。結合アッセイにおける標準蛍光ペプチドとして、ＨＡ ３０８−３１９ （ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ， ＤＲ１及びＤＲ２）， ｈｓｐ６５ ３−１３ （ＫＴＩＡＹＤＥＥＡＲＲ， ＤＲ３）， ＨＡ ３０８−３１９ Ｙ？Ｆ （ＰＫＦＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ， ＤＲ４） 又はＩｉ ８０−１０３ （ＬＰＫＰＰＫＰＶＳＫＭＲＭＡＴＰＬＬＭＱＡ ＬＰＭ， ＤＲ７）を用いた。
【００４２】
免疫原性アッセイ
ＨＰＶ１６−Ｅ７から誘導されたペプチドにより誘起される、健常ドナーから得られた血液から単離されたＰＢＭＣの増殖を以前に記載した通りに測定した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。短く述べると、９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ， マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）に収容した、１０％自己血清が添加され、１０μｇ／ｍｌの前記２２−ｍｅｒのＥ７ペプチドを含む又は含まない２００μＬのＩＳＯＣＯＶＥの培地（Ｇｉｂｃｏ）中にＰＢＭＣを１．５ｘ１０５細胞／ウェルの密度で播種した。陽性コントロールとして、記憶応答混合物の存在下でＰＢＭＣを培養した。ペプチド特異的増殖は、トリチウム−チミジン取り込みにより第６日に測定した。８つの試験ウェルの＞２５％において、培地対照ウェルの平均増殖＋２ｘ標準偏差を超える場合に、そのペプチドが免疫原性を有する、すなわち、Ｔ細胞を刺激することができると記録した。
【００４３】
増殖アッセイ
培養物を、ウェル当り０．５μＣｉ ［３Ｈ］チミジン （５Ｃｉ／ｍＭ， 英国Ａｍｅｒｓｈａｍ）で１８時間パルス（ｐｕｌｓｅ）した。プレートを、Ｍｉｃｒｏ ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｓｋａｔｒｏｎ，ノルウェー国）で回収した。１０ｍＬのシンチレーション液を含むプラスチックバッグにフィルターを入れ、次いで１２０５ Ｂｅｔａｐｌａｔｅカウンター（Ｗａｌｌａｃ， Ｔｕｒｋｕ，フィンランド国）でカウントした。ＭＨＣクラスＩＩブロッキング実験は、抗ＨＬＡ−ＤＱ ＳＰＶ．Ｌ３， 抗ＨＬＡ−ＤＲ Ｂ８．１１．２ 及び抗ＨＬＡ−ＤＰ Ｂ７／２１マウスモノクローナル抗体を用いて以前に記載したとおりに行った（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。抗体は、タンパク−ＡＰＣインキュベーションの１時間前にＡＰＣに添加した。
【００４４】
ＨＰＶ１６−Ｅ７特異的Ｔ−ヘルパー細胞の単離及び増殖
Ｅ７ ２２−ｍｅｒ又はＥ７ ３５−ｍｅｒペプチドを用いて、以前に記載した通り（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）にペプチド特異的Ｔ細胞バルク培養物を生成した。特異的増殖は、５０，０００個の応答物（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒｓ）を等量の放射（３０Ｇｙ）ＡＰＣ（特に断りがない限り自己ＰＢＭＣ）及び上記ペプチド又はタンパクと共にインキュベートすることにより測定した。Ｅ７−ペプチド及び−タンパク特異的バルクＴ細胞は、以前に記載したとおりに（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）限界希釈によりクローニングした。
【００４５】
サイトカインアッセイ
サイトカインの特異的排出を測定するために、５０，０００個のＴ細胞を、等量のＡＰＣ（３０Ｇｙ）と１０μｇ／ｍｌの上記ペプチド、対照ペプチド、Ｅ７タンパク質又は対照タンパクと共にインキュベートすることによりＴ細胞クローンを刺激した。インキュベーション２４時間後、上清を回収し、レプリケートウェルをプールした。サイトカインの産生は、以前に記載したとおりに（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により測定した。
【００４６】
ＥＬＩＳＰＯＴによる抗原特異的Ｔ細胞の解析
２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ， マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）に収容した、１０％ＦＣＳが添加され、５μｇ／ｍｌのＥ７から誘導された前記２２−ｍｅｒのペプチドを含む又は含まない１ｍｌのＩＳＯＣＯＶＥの培地（Ｇｉｂｃｏ）中にＰＢＭＣ又は臍帯血細胞（ＣＢＣ）を２ｘ１０６細胞／ウェルの密度で播種した。陽性対照として、各プール中、４つの重なる３０アミノ酸長のペプチドから成る、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ Ｍ１タンパクの上記プールの存在下でＰＢＭＣを培養した。我々の観察に基づき、我々は、ＰＢＭＣをＥＬＩＳＰＯＴプレートに移す前に４日間の刺激を行った。これにより、Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＯ＋（記憶）サブセット中での、インフルエンザＭ１誘導ペプチドに対する明確なＩＦＮγの産生がもたらされたが、成人ＰＢＭＣから得られた未利用のＴ細胞中では産生されなかった（発行していない観察）。３７℃で４日間インキュベートした後、ＰＢＭＣを回収し、洗浄し、ＩＦＮγ捕獲抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ， スウェーデン国Ｎａｃｈａ）を被覆したＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ９６−ウェルプレート （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， オランダ国Ｅｔｔｅｎ−Ｌｅｕｒ）に１０５細胞／ウェルの密度で、６個のレプリケートを構成するように播種した。ＥＬＩＳＰＯＴを、製造者（Ｍａｂｔｅｃｈ）の指示に従ってさらに行った。スポットの数は、コンピューター制御の完全自動化ビデオイメージング分析システム（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｖｉｓｉｏｎ）を用いて分析した。特異的スポットは、試験ウェルの平均スポット数から、培地のみの対照のスポット数＋２ｘ標準偏差を差し引くことにより算出した。抗原特異的Ｔ細胞頻度は、Ｔ細胞頻度が＞１／１０，０００ ＰＢＭＣである場合に非応答物に比較して増加したと考えた。
【００４７】
結果
ＨＰＶ１６ Ｅ７中の免疫原性配列の同定
我々は、ＭＨＣクラスＩＩ内で主要な免疫原性決定基として機能する、ＨＰＶ１６ Ｅ７タンパク中の配列を同定することに取り掛かった。ＨＰＶ１６ Ｅ７から誘導された、重なるペプチドの定量的ペプチド／ＭＨＣ結合アッセイ（Ｇｅｌｕｋ ｅｔ ａｌ．， １９９５）におけるＨＬＡ−ＤＲ １， ２， ３， ４及び７に対する結合性を試験した。これらのＨＬＡ−ＤＲ分子は合計で白人、東洋人及び黒人の少なくとも５０〜６０％をカバーする（Ｂａｕｒ ｅｔ ａｌ．， １９８４）。４つのペプチドＥ７１−２２， Ｅ７４１−６２， Ｅ７５１−７２及びＥ７７７−９８は、３種以上の異なるＨＬＡ−ＤＲ分子に結合した（表２）。ペプチドＥ７１−２２は、ＨＬＡ ＤＲ２， ３， ４ 及び７に結合し、ペプチドＥ７４１−６２は、ＤＲ１， ２， ３ 及び４に結合したが、ペプチドＥ７５１−７２はＤＲ１， ３及び７に結合し、ペプチドＥ７７７−９８はＤＲ１， ２及びＤＲ７に結合した。これは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するペプチドの結合拘束性は、ＭＨＣクラスＩに対するほど厳格ではないという事実（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５）に符合する。注目すべきことに、これらのペプチドは、試験した１又は２以上の他のＤＲ分子に結合できなかった。これは、それらの結合が、かなり普遍的ではあるが特異的であることを示している。
【００４８】
我々の次の実験は、複数のＨＬＡ−ＤＲ分子に結合する４つのペプチドに焦点を合わせた。なぜなら、これらが最も天然に提示されたＴ−ヘルパー（Ｔｈ）エピトープ（Ｇｅｌｕｋ ｅｔ ａｌ．， １９９８）を含んでいそうであるからである。我々は、１３名のＨＬＡ分類した健常人ドナーからのＰＢＭＣにこれらのペプチドを加えることにより、Ｔ細胞を刺激して増殖させることができるか否かを調べた。このアッセイでは、記憶Ｔ細胞と未利用の生体外で初回免疫されたＴ細胞の反応性を識別することができないが、免疫原性ペプチドの同定に容易に用いることができる（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。４つのペプチドのいずれも、複数のドナーからのＰＢＭＣにおいて増殖的応答を刺激することができた（表２）。ほとんどのＰＢＭＣ培養物は、ペプチドＥ７４１−６２及びＥ７５１−７２と反応した。このことは、Ｅ７タンパクの中央領域に最も免疫原性の高い配列が存在し、この部分がＨＰＶ１６感染個体中での免疫系により標的にされやすいことを示している。
【００４９】
【表１】
2004525115.tif 000002
【００５０】
【表２】
2004525115.tif 000003
【００５１】
【表３】
2004525115.tif 000004
【００５２】
ＨＰＶ１６ Ｅ７中の、自然にプロセスされたＴ−ヘルパーエピトープのマッピング
ＨＰＶ１６ Ｅ７中のＴｈエピトープを同定する次の段階として、Ｅ７の中央領域をカバーする数種類の長いペプチドで、ＨＬＡ分類した健常血液ドナーからのＰＢＭＣを繰り返し刺激することにより、ペプチド特異的バルクＴ細胞培養物を生成した。応答Ｔ細胞は、次いで、ペプチド又は全Ｅ７タンパクでパルス（ｐｕｌｓｅ）した抗原提示細胞（ＡＰＣ）を認識するかどうかについて試験した。後者のセッティングでは、関連するペプチドエピトープの提示には、抗原の取り込み及びプロセッシングが必要である。生成したＴｈ細胞培養物の約３０％が、それらの誘導に用いたペプチドに対して特異的に応答した。これらのうち、３つの培養物はまた、Ｅ７タンパクでパルスしたＡＰＣに対してわずかだが特異的な活性を示した。このことは、自然にプロセスされた抗原に対して応答する能力を有するＴｈ細胞の存在を示している（図１ａ，２ａ及び３ａ）。図１ｂは、ペプチドＥ７４１−６２ に対して誘導された、ＨＬＡ−ＤＲ１５，４及びＤＱ６，７陽性ＰＢＭＣから単離されたＴｈクローンの反応性を示す。これらのＴｈ細胞は、ペプチドＥ７４１−６２、ペプチドＥ７４３−７７又はＥ７タンパクでパルスされたＡＰＣに特異的に応答した。このＴｈクローンによる応答の特異性は、このＴｈクローンが単離されたポリクローナル培養物の特異性を超えており（図１ａと比較して）、このことは、限界希釈により我々が目的のＴ細胞を単離することに成功したことを示している。ＨＬＡ−ＤＲ， −ＤＱ 又は−ＤＰ （図１ｂ）に対するＭＨＣクラスＩＩブロッキング抗体及び部分的ＭＨＣクラスＩＩ合致ＡＰＣを用いたさらなる研究により、該ＴｈクローンがＨＬＡ−ＤＲ１５に拘束されたことが分った（図１ｃ）。詳細なエピトープのマッピングにより、認識されたコア配列は、Ｅ７５０−６２であった。さらに、このＴｈクローンは、１型ＴｈサイトカインＩＦＮγを産生した（図１ｄ）。同様に、ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的Ｔｈクローンが、ペプチドＥ７２２−５６で刺激したＨＬＡ−ＤＲ３， ＤＱ２陽性ＰＢＭＣから得られた（図２ａ）。また、このＴｈクローンは、ペプチドＥ７２２−５６及びＥ７タンパクでパルスしたＡＰＣでトリガー（ｔｒｉｇｇｅｒ）することによりＩＦＮγを分泌した。さらなる分析により、ペプチドＥ７３０−５０及びＥ７３５−５５の両方が、ＨＬＡ−ＤＱ２拘束的に認識されたことから示されるように、このＴｈクローンは、コア配列Ｅ７３５−５０を認識した（図２ｃ）。明確な特異性を有する第３の１型サイトカイン産生Ｔｈクローンは、ペプチドＥ７４３−７７で刺激されたＨＬＡ−ＤＲ１， ３及びＤＱ２陽性ＰＢＭＣ培養物から誘導された（図３ａｂ）。このクローンは、ＨＬＡ−ＤＲ３拘束性（図３ｃｄ）で、ペプチド及びタンパクでパルスされたＡＰＣの両者を認識するとＩＦＮγを産生した（図３ｅ）。ペプチドＥ７４３−７７は認識されたが、より小さなペプチドＥ７４１−６２は認識されなかった。このことは、Ｅ７４３−７７のＣ末端領域がコアエピトープを有していることを示している。結論的に、確立されたＴｈクローンを用いて、我々は、ＨＰＶ１６ Ｅ７中の自然にプロセスされた３つのエピトープをマップした。関連するＭＨＣクラスＩＩ分子を生体内で発現するＨＰＶ１６＋の個体は、これらのペプチドに対するＴｈ免疫を誘導したものと思われる。
【００５３】
ＨＰＶ１６＋ ＣＩＮ ＩＩＩ病巣又は子宮頚癌を有する被検者中の記憶Ｔ−ヘルパー応答
健常人のＰＢＭＣ培養物を用いたＴｈエピトープのマッピングと並行した手法として、ＨＰＶ１６＋病巣を有する被検者中のＨＰＶ１６ Ｅ７に対する応答も解析した（被検者の特徴については表１参照）。本来、生体外では、新生児又は成人からの未利用のＴ細胞の刺激は、ＩＬ−２の生産及びＴ細胞の増殖をもたらし得る。しかしながら、この段階では、このようなＴ細胞は、ＩＦＮγを分泌できない。ＩＦＮγの生産は、再び抗原に出会った後に続く（Ｅａｒｌｙ ａｎｄ Ｒｅｅｎ， １９９９； Ｐｉｔｔｅｔ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｓａｌｌｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。この特徴に基づき、我々は、生体外での初回免疫と、ＥＬＩＳＰＯＴによる記憶Ｔ細胞応答との区別をすることができた。種々のＨＬＡのほとんどのドナーのＰＢＭＣ中に容易に検出可能な（表３及び我々の発行していない観察）、インフルエンザＡマトリックス（Ｍ１）タンパクに対するＴｈ応答は、アッセイにおける記憶Ｔ細胞免疫性の検出のための陽性対照として並行して測定した。ＭＡＣＳ−分離ＣＤ４５ＲＡ＋（未利用）Ｔ細胞及びＣＤ４５ＲＯ＋（記憶）Ｔ細胞のＭ１ペプチドによる刺激は、ＣＤ４５ＲＯ＋サブセット中においてのみＩＦＮγの生産をもたらした。このことにより、我々のＥＬＩＳＰＯＴセットアップが記憶応答を特異的に検出することが確認された（図４）。さらに、臍帯血細胞（ＣＢＣ）は、その未利用の形質に従い、インフルエンザＭ１誘導ペプチドで生体外で刺激した際に、ＩＦＮγの分泌による応答を示さなかった。全ての健常ドナーからのＰＢＭＣに加え、９／１１のＨＰＶ１６＋被検者からのＰＢＭＣもＭ１ペプチドの１又は２以上のプールと反応した（表３）。
【００５４】
ＨＰＶ１６  Ｅ７免疫の解析により、ＣＩＮ ＩＩＩと診断された被検者の２／３、子宮頚癌の被検者の３／８では、１又は２以上のペプチドに応答することが明らかになった。さらに、試験した７人のドナーの１人は、ペプチドに対する免疫性を示した。Ｅ７３１−５２， Ｅ７４１−６２及びＥ７５１−７２ によってカバーされるＨＰＶ１６  Ｅ７の中央領域は、全ての５名のＨＰＶ１６＋個体の免疫系に標的にされていた（表３）。このことにより、この領域が非常に免疫原性が高い（表２）ということが確認されただけではなく、ＨＰＶ１６に対する天然の免疫応答によって標的にされるエピトープをこの領域が有するということも示された。興味深いことに、３名のＨＰＶ１６＋被検者において検出されたＩＦＮγの特異性は、それらのＨＬＡ型と組み合わせて、我々が特異性及びＨＬＡ拘束性を詳細に調べた、確立されたＴｈクローンの特異性と合致していた（図１〜３）。特に（表３、下線を引いた頻度）、被検者２は２つのＨＬＡ−ＤＲに拘束された特異性に合致する、有意に増大された免疫性及びＨＬＡ−ＤＱ２／Ｅ７３５−５０クローンに合致する弱い免疫性を示した。被検者８は、ＤＲ１５／ Ｅ７５０−６２クローンに合致する応答を示し、被検者１１はＨＬＡ−ＤＱ２／Ｅ７３５−５０に合致する反応性を示した。なお、関連するＭＨＣクラスＩＩを発現する他の被検者では、このような応答は検出されなかった（被検者３、４、７及び１０）。
【００５５】
実施例２
材料及び方法
リンパ球
ＨＬＡ型分類され匿名の健常人からの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び血清を、インフォームドコンセント後に得た。これらのドナーは、匿名であるので、医学的な履歴に関するデータは入手できない。しかしながら、異常なパピローマウイルス塗沫（ｐａｐ−ｓｍｅａｒ）を包含する、最近の感染履歴が知られているドナーは、通常の規制の一部として、献血を思いとどまらされる。
【００５６】
抗原
全ＨＰＶ１６ Ｅ２タンパクに亘る、２３種類の重なり合うペプチドのセットを用いた。これらのうち２２種類の長さは３０アミノ酸であり、１種類（Ｅ２３３１−３６５）のものの長さは３５アミノ酸であった。これらのペプチドは、１５アミノ酸の重複を共有する。ＨＰＶ１６−Ｅ２特異的Ｔｈクローンの詳細なエピトープマッピング及び交差反応性の測定のために、１５及び２０アミノ酸長のペプチドを用いた。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける対照ペプチドとして用いたインフルエンザマトリックス１タンパクであるＡ／ＰＲ／８／３４に亘るペプチドは、１５アミノ酸ずつ重複する、１６種類の３０−ｍｅｒのアミノ酸であった。ペプチドは、自動マルチプルペプチド合成機（Ａｂｉｍｅｄ ＡＭＳ ４２２， ドイツ国Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ）を用いて固相上で合成し、逆相ＨＰＬＣにより分析した。凍結乾燥したペプチドを５０μＬのＤＭＳＯに溶解し、ＰＢＳで２．５ ｍｇ／ｍｌの終濃度に希釈した。ＨＰＶ１６  Ｅ２Ｃ末端（Ｅ２２８０−３６５）タンパク及びＨＰＶ１６  Ｅ７タンパクは、以前に記載した方法（Ｆｒａｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０００）により生産した。
【００５７】
破傷風トキソイド（終濃度０．７５ＬＦ／ｍｌ； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， オランダ国Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの超音波破砕物（２．５μｇ／ｍｌ； オランダ国Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｒｏｙａｌ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ のＰ． Ｋｌａｔｓｅｒ博士が気前よく分与）及びＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ （０．００５％， ＨＡＬ Ａｌｌｅｒｇｅｎｅｎ Ｌａｂ， オランダ国Ｈａａｒｌｅｍ）から成る記憶応答混合物（ＭＲＭ）を、典型的な普遍的（ｒｅｃａｌｌ）抗原に応答してＰＢＭＣが増殖し、サイトカインを産生する能力を確認するために用いた。
【００５８】
ＨＬＡ−ＤＲ−ペプチド結合アッセイ
ペプチドのＨＬＡ−ＤＲへの結合は、以前に報告したとおりに測定した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。短く述べると、ＤＲ分子の供給源として、ＤＲがホモ接合である、Ｂ−ＬＣＬを用いた： ＬＧ２．１ （ＤＲＢ＊０１０１， ＤＲ１）， ＩＷＢ （ＤＲＢ１＊０２０１， ＤＲ２）， ＨＡＲ （ＤＲＢ＊０３０１， ＤＲ３）， 及びＢＳＭ （ＤＲＢ＊０４０１， ＤＲ４）。ＤＲ分子は、アフィニティクロマトグラフィーで精製し、純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。精製ＤＲ分子へのペプチドの結合の解析は、Ｎ末端を蛍光標識した標準ペプチドを用いて行った。結合アッセイにおける標準ペプチドとして、ＨＡ３０８−３１９（ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ， ＤＲ１及びＤＲ２）、ｈｓｐ６５ ３−１３ （ＫＴＩＡＹＤＥＥＡＲＲ， ＤＲ３）又はＨＡ３０８−３１９Ｙ→Ｆ（ＰＫＦＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ）を用いた。
【００５９】
短期間Ｔ細胞増殖アッセイ
個々のＨＰＶ１６ Ｅ２ペプチドの免疫原性を、先に記載した方法（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ． １９９９）に従い、ＨＰＶ１６ Ｅ２ペプチドを用いた健常ドナーＰＢＭＣの短期間増殖アッセイにより調べた。短く述べると、９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ， マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）に収容した、１０％自己血清（ＣＢＣ培養物には１０％ ＦＣＳを用いた）が添加された２００μＬのＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅの修飾ダルベッコ培地、Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，  ベルギー国Ｖｅｒｖｉｅｒｓ）に、新しく単離されたＰＢＭＣを１．５ ｘ １０５細胞／ウェルの密度で播種した。ＨＰＶ１６−Ｅ２ペプチドを１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した。培地のみを陰性対照とした。フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ， ０．５μｇ／ｍｌ）を陽性対照として用いた。各ペプチドについて、８つのマイクロ培養を並行して開始した。各ドナーについて２回ずつ試験を行った。ペプチド特異的増殖は、３Ｈ−チミジン取込により、第６日に測定した。両方の試験において、＞５０％の試験ウェルにおける増殖が、対照ウェルにおける平均増殖＋３ｘＳＤを超えており、全ての試験ウェルにおいて、培地対照のウェルに対する刺激指数（ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）（ＳＩ） が３よりも高い場合に、そのペプチドが陽性であると記録した。
【００６０】
長期間ＨＰＶ１６−Ｅ２特異的Ｔｈ培養物の生成及び解析
長期培養ＨＰＶ１６  Ｅ２特異的Ｔ細胞培養物及びＴｈクローンを、先に記載した方法（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ． １９９９）により確立した。短く述べると、ＨＬＡ型分類した健常ドナーからのＰＢＭＣを、次のＨＰＶ１６  Ｅ２ペプチドで生体外で刺激したＥ２２７１−３００＋Ｅ２２８６−３１５； Ｅ２３０１−３３０＋Ｅ２３１６−３４５； Ｅ２３３１−３６５）。２５ｃｍ２の培養フラスコ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ，米国）に収容された、１０％自己血清を添加した６ｍｌのＩＭＤＭに１５ｘ１０６ＰＢＭＣを播種した。ペプチドを５μｇ／ｍｌの濃度に添加した。第７日に、１５ｘ１０６個のＰＢＭＣを、新鮮な培地及びペプチドと共に加えた。第１４日及び第２１日に、生きたＴ細胞を培養物から回収し、計数し、同量の照射された（ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ）自己ＰＢＭＣ及びペプチド（５μｇ／ｍｌ）で再刺激した。最終再刺激の２日後に、Ｔ細胞増殖因子（Ｂｉｏｔｅｓｔ、ドイツ国Ｄｒｅｉｅｉｃｈ）を１０％の終濃度で添加した。第２８日に、増殖アッセイにより、Ｔ細胞培養物のペプチド認識について試験した。ペプチド特異的Ｔ細胞培養物は、限界希釈によりクローニングし、次いでＴ細胞クローンの、Ｅ２ペプチド及び−タンパクでパルスされたＡＰＣの認識について試験した。Ｔｈクローンは、先に記載したように解析した（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ． １９９９）。注目すべきことに、Ｔｈクローンのタンパク認識について試験した増殖アッセイにおいて、自己単球をＡＰＣとして用いた。増殖の測定のために、培養物を、ウェル当り０．５Ｃｉ ［３Ｈ］チミジン （５μＣｉ／ｍＭ， 英国Ａｍｅｒｓｈａｍ）で１８時間パルス（ｐｕｌｓｅ）した。プレートは、Ｍｉｃｒｏ ｃｅｌｌ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ （Ｓｋａｔｒｏｎ、ノルウェー国）で回収した。１０ｍＬのシンチレーション液を含むプラスチックバッグにフィルターを入れ、次いで１２０５ Ｂｅｔａｐｌａｔｅカウンター（Ｗａｌｌａｃ，フィンランド国Ｔｕｒｋｕ）でカウントした。ＨＬＡクラスＩＩブロッキング実験は、抗−ＤＱ ＳＰＶ．Ｌ３， 抗−ＤＲ Ｂ８．１１．２ 及び抗−ＤＰ Ｂ７／２１マウスモノクローナル抗体を用いて行った。増殖アッセイの上清は、インキュベーションの２４時間後に回収し、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γの存在を調べた（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００６１】
ＥＬＩＳＰＯＴによる記憶Ｔｈ細胞の検出
ＣＤ４５ＲＯマイクロビーズ（カタログ番号４６０−０１， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， ドイツ国）と共にインキュベーションした後のＭＡＣＳによりバフィーコートから記憶細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋）を新たに単離した。得られたＣＤ４５ＲＯ＋分画の純度は、ＣＤ４５ＲＯ 及びＣＤ４５ＲＡ （ＣＤ４５ＲＡ−ＦＩＴＣ， カタログ番号３４７７２３、ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ， カタログ番号３４７９６７， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， 米国）に対して表面染色を行った後のフローサイトメトリーにより測定したところ＞９５％であった。２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）中に収容され、１０％ＦＣＳが添加された１ｍｌのＩＭＤＭ中に、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞を１０６細胞／ウェルの密度で播種した。 １０６個の照射された自己細胞をＡＰＣとして各ウェルに加えた。応答細胞を、培地単独、５μｇ／ｍｌ／ペプチドのＨＰＶ１６  Ｅ２ペプチドのプール、ＭＲＭの１：５０希釈物又はインフルエンザマトリックスペプチド（陽性対照）と共にインキュベートし、抗原特異細胞の検出を改善するために１１日間培養した（Ｍｃ Ｃｕｔｃｈｅｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９７）。次いで、細胞を回収し、洗浄し、ＩＦＮ−γ捕捉抗体で被覆したＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， オランダ国Ｅｔｔｅｎ−Ｌｅｕｒ）に、５ ｘ １０４細胞／ウェルの密度で、同じものを４つずつ、ウェルに播種した。１ウェル当り、１０５個の照射した自己ＰＢＭＣをＡＰＣとして、５μｇ／ｍｌのペプチドと共に加えた。ＥＬＩＳＰＯＴ分析を、製造者の指示に従ってさらに行った（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ， スウェーデン国Ｎａｔｃｈａ）。スポットの数は、コンピューター制御の完全自動化ビデオイメージング分析システム（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｖｉｓｉｏｎ）を用いて分析した。
【００６２】
記憶Ｔ細胞の細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
Ｘ−ｖｉｖｏ１５培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ， ベルギー国Ｖｅｒｖｉｅｒｓ）中で３７℃で２時間培養して４８ウェル平底プレートに接着させることにより自己単球を単離し、次いでＡＰＣとして用いた。ＣＤ４５ＲＯ＋細胞を、ペプチドで１１日間刺激した後、回収し、洗浄し、０．１％ ＢＳＡ含有ＩＭＤＭ中に１．５ ｘ １０６細胞／ｍｌの濃度で浮遊させた。２００μＬの細胞浮遊液を、単球＋２００μＬの１０μｇ／ｍｌ ＨＰＶ１６−Ｅ２ペプチド（刺激された）又は２００μＬの培地（非刺激対照）に加えた。３７℃で１時間インキュベートした後、８００μＬのＩＭＤＭ ＋ １０％ＦＣＳ ＋ １２．５μｇ／ｍｌ Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ （Ｓｉｇｍａ）を加え、細胞をさらに５時間インキュベートした。次いで細胞を回収し、Ｖ底９６ウェルプレートに移し、氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、５０μＬの４％パラホルムアルデヒドで氷上で４分間固定した。固定後、細胞を冷ＰＢＳで１回、ＰＢＳ／０．２％ ＮａＡｚ ／０．５％ ＢＳＡ／０．１％ サポニンで１回洗浄した。次いで、５０μＬのＰＢＳ／０．２％ ＮａＡｚ ／０．５％ ＢＳＡ／０．１％ サポニン／１０％ ＦＣＳ中で氷上で１０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／０．２％ ＮａＡｚ ／０．５％ ＢＳＡ／０．１％ サポニンで２回洗浄し、上清を除去し、１μＬのＦＩＴＣ−標識マウス抗ヒトＩＦＮ−γ（０．５ ｇ／ｍｌ， ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， カタログ番号５５４５５１）、２μＬのＰＥ−標識抗ＣＤ４ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， カタログ番号３４５７６９） 、及び２μＬのＰｅｒＣＰ−標識抗ＣＤ８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅカタログ番号３４７３１４）を含む、２５μＬのＰＢＳ／０．２％ ＮａＡｚ ／０．５％ ＢＳＡ／０．１％サポニンを添加した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、１００μＬのパラホルムアルデヒド中に浮遊させ、フローサイトメトリーで分析した。
【００６３】
タンパクデータベース上での相同性検索
標準的なＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ： ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ａｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌａｓｔｃｇｉ）を用いて、タンパクデータベース（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）上で、重複するＨＰＶ１６  Ｅ２ペプチドの配列の相同性検索を行った。統計学的有意閾値（ＥＸＰＥＣＴ）は１０であった（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。ＨＰＶ１６  Ｅ２ペプチドと＞６０％のアミノ酸相同性があると報告されたものを含めた。
【００６４】
結果
ＨＰＶ１６  Ｅ２−誘導ペプチドに対する健常ドナーＰＢＭＣの高い反応性
我々は、Ｅ２配列の全体をカバーする、重なり合う３０−ｍｅｒのペプチドのアレイを用いて、ＨＰＶ１６  Ｅ２タンパクに対する健常ドナーのＰＢＭＣの増殖的応答を調べた。８名のＨＬＡ型を分類したドナーからの新たに単離したＰＢＭＣを、２３種類のＥ２−誘導３０−ｍｅｒペプチドのそれぞれとインキュベートすると、８名のドナーのうちの４名では、２又はそれ以上のペプチドと反応した。Ｅ２特異的増殖応答は非常に強かった（表４）。全てのケースにおいて、７５％を超える並行的なマイクロ培養物は、刺激ペプチドに反応した。例えば、２つの独立した実験において、Ｅ２３１−６０， Ｅ２４６−７５， Ｅ２９１−１２０， Ｅ２１５１−１８０， Ｅ２２７１−３００及びＥ２２８６−３１５ペプチドに対するドナー番号８のペプチド特異的増殖は、試験した全ての８つの並行的マイクロ培養物の７５〜９４％においてバックグランドの増殖を超えたことを我々は見出した。このことは、ＰＢＭＣ単離物中に、Ｅ２−特異的Ｔ細胞が極めて高い頻度で存在することを示している。特に、ドナー番号３、５及び８からのＰＢＭＣは、広い特異性で強い応答を示した。３０−ｍｅｒペプチドは、隣り合うペプチドと１５アミノ酸だけ重なり合っていることに注目して頂きたい。従って、隣り合うペプチド（例えば、ドナー番号３、Ｅ２３１−６０及びＥ２４６−７５）は、同一のエピトープを含んでいる可能性が高く、隣接しないペプチドに対する応答は、異なるエピトープに対するものである。
【００６５】
応答培養物の頻度だけではなく、増殖応答の大きさも非常に高かった。ドナー番号３、５及び８からのいくつかの培養物におけるペプチド特異的増殖は、９．２〜１６．５の範囲にある平均刺激指数を有するバックグランドを超え、このような応答は、ドナーの数人における破傷風トキソイドに対する応答（番号３、４、５及び７、ＳＩは１３．３〜２５；表４参照）に比肩するものであった。これらの刺激指数は、記憶Ｔ細胞応答の検出に通常用いられる閾値（ＳＩ≧３） （Ｂｅｒｍａｓ ｅｔ ａｌ．， １９９７）を明確に超えるものであった。他のドナーのあるものにおいて、破傷風トキソイドに対する応答は、さらにかなり高かった（ドナー番号３及び６におけるＳＩ≧１００）。しかしこれらの強い値は、単一の３０−ｍｅｒ Ｅ２ペプチドに対するのではなく、全抗原に含まれる複数のエピトープに対する極めて広い応答を示している可能性が高い。総合すると、我々のデータは、健常人のＴ細胞レパートリーが、ＨＰＶ１６  Ｅ２抗原に特異的なＴ細胞を特に高い頻度で含むことができ、それによって、活発な増殖応答がもたらされることを示しており、これらの応答がＴ細胞記憶を反映しているかもしれないことを示唆している。
【００６６】
【表４】
2004525115.tif 000005
【００６７】
１Ｄ：ドナー、８名の異なる健常血液ドナーを試験した。
２ＨＰＶ１６  Ｅ２は、第１番目及び最後のアミノ酸で示す。 ＴＴは一般的な普遍性抗原である破傷風トキソイドである。
３両方のアッセイにおいて、＞５０％の試験ウェルにおける増殖が、対照ウェルにおける平均増殖＋３ｘＳＤを超えており、全ての試験ウェルにおいて、培地対照のウェルに対する刺激指数 （ＳＩ） が３よりも高い場合に、そのペプチドが陽性であると記録した。両方のアッセイにおいて、培地対照＋３ｘＳＤを超えたウェルの平均百分率として、陽性スコアのみを記載した。括弧の間には、両方のアッセイの全てのウェルの平均刺激指数を示す。
【００６８】
ＨＰＶ１６  Ｅ２特異的Ｔｈ培養物は自然にプロセスされたエピトープを認識する
増殖データは、ＨＰＶ１６  Ｅ２中に複数の免疫原性Ｔｈエピトープが存在することを示した。我々は、このような応答の性質及び特異性についてより詳細な分析を行い、それによって、我々のデータ（表４）が、高度に免疫原性の数個のペプチドを含むことを明らかにしたＮ末端及びＣ末端領域に焦点を合わせた。このＣ末端領域に含まれる、重なり合うペプチド （Ｅ２２７１−３００； Ｅ２２８６−３１５； Ｅ２３０１−３３０； Ｅ２３１６−３４５； Ｅ２ ３３１−３６５）の、ＨＬＡ−ＤＲ分子に結合する能力を試験した。５個のペプチドのそれぞれは、試験した一般的なＨＬＡ−ＤＲ分子の２種又はそれ以上に対して中程度から強度の結合性を示した（表５）。このことは、これらのペプチドが本当にクラスＩＩＭＨＣ−拘束Ｔｈエピトープを表しているという見解を支持している。
【００６９】
【表５】
2004525115.tif 000006
【００７０】
各ペプチドの結合親和性は、ＩＣ５０値により表す。これは、標準蛍光標識ペプチドの結合が、その最大値の５０％に減少する時のペプチド濃度（μＭ）である。＞７０は、検出できない結合を表す。
【００７１】
次に、ＨＬＡ型分類した健常血液ドナーからのＰＢＭＣを、１週間間隔で、ペプチドＥ２２７１−３００とＥ２２８６−３１５， ペプチドＥ２３０１−３３０とＥ２３１６−３４５、ペプチドＥ２３３１−３６５又はペプチドＥ２４６−７５で刺激することにより、長期間Ｅ２−特異的Ｔｈ培養物を生成した。２名のドナーからのＰＢＭＣが、１又はそれ以上の刺激ペプチドに対して強いペプチド特異的増殖応答を示した（データ示さず）。これらの培養物の限界希釈によるクローニングにより、我々は、均一にＣＤ４＋ＣＤ８−表現型を表す、６個の異なるペプチドエピトープに対する安定なＴ細胞クローンを単離することに成功した。これらのＴｈクローンのうちの２つは、Ｅ２３０１−３３０とＥ２３１６−３４５で刺激した、ＨＬＡ−ＤＲ１５（２）− ， −ＤＱ６（１）− ＰＢＭＣから確立された。これらのＴｈクローンの特異性を詳しく分析したところ、これらは、異なるクラスＩＩＨＬＡ分子により拘束される、重なり合うが異なる配列を認識することが明らかになった。クローンの１つは、ＨＬＡ−ＤＲ１５（２）内のペプチドＥ２３１６−３３０を認識し、他のクローンは、ＨＬＡ−ＤＱ６（１） 内のペプチドＥ２３１１−３２５に特異的であった（図５、６）。他の２つのＴｈクローンも同様に関連していた。すなわち、１つは、ＤＲ１５（２）内のペプチドＥ２３４６−３５５を認識し、他のクローンはＤＲ１拘束的にＥ２３５１−３６５と反応した（図７、８）。注目すべきことに、これらのＤＲ１５（２）及びＤＲ１−拘束エピトープのより長い変異体は、拘束するＨＬＡ分子に本当に結合することが見出された（ＨＬＡ−ＤＱ６については利用できない結合アッセイ）点で、これらのデータは、表５に示すペプチド結合データと符合している。さらに、２つのクローンは、ペプチドＥ２４６−７５と反応することがわかった。１つは、ＨＬＡ−ＤＲ４拘束的にペプチドＥ２５１−７０と反応し、他のクローンはペプチドＥ２６１−７５と反応した（図１５）。
【００７２】
同定された４つのＥ２ペプチドが、生理学的に関連するＴｈエピトープを表すさらなる証拠は、Ｅ２特異的ＴｈクローンがペプチドをロードしたＡＰＣに対して応答するだけではなく、Ｅ２タンパクでパルスしたＡＰＣとも特異的に反応する（図５〜８）という事実により与えられる。後者の場合には、ペプチドエピトープの提示は、Ｅ２抗原の取込み及びプロセッシングに依存し、ＡＰＣ細胞表面にクラスＩＩ分子が単に外来的にロードされたものではないので、これらのデータは、我々のＴｈクローンにより認識された４つのＥ２ペプチドは、自然にプロセスされたエピトープに対応していることの決定的な証拠を与える。最後に、全ての４つのＴｈクローンは、抗原で刺激するとＩＦＮ−γを生産した。これは、Ｔｈ−１型サイトカインプロフィールを示している。総合すると、我々のデータは、健常人のＴ細胞レパートリーは、ＩＦＮ−γ−分泌Ｅ２特異的ＣＤ４＋Ｔｈ細胞を有していることを示している（図５〜８）。
【００７３】
健常人中のＨＰＶ１６  Ｅ２特異的記憶Ｔｈ細胞の検出
第１段落に記載したような、健常人におけるＨＰＶ１６  Ｅ２特異的Ｔｈ免疫性の著しく頻繁な検出は、基礎となるＴ細胞レパートリーが、以前に抗原に遭遇したことによる免疫学的記憶を表しているのか、この抗原に特異的な、特に多数の未利用のＴ細胞前駆体から主として成るのかをさらに分析することに我々を駆り立てた。若い性的に活発な個体における一般的に一過性の生殖ＨＰＶ感染の高い出現率（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｋｏｕｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８）及びＨＰＶ感染中の顕著なＥ２の発現に鑑み、健常被検者中にＥ２に対するＴ細胞記憶が見出されるのではないかと思われる。我々は、抗原を経験したＴ細胞を含むが、未利用のＴ細胞を含まない、健常ドナーＰＢＭＣのＣＤ４５ＲＯ＋分画（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７）のＥ２特異的反応性の分析により、我々により検出されたＨＰＶ１６  Ｅ２特異的免疫の本質を試験した。我々は、健常ドナーのレパートリーが、ＩＦＮγ−産生Ｔｈ細胞を含むことを見出したので（図５〜８）、我々はＩＦＮγ ＥＬＩＳＰＯＴにより抗原特異的Ｔ細胞応答を測定した。我々はまず、我々の以前の実験（表４）に基づいて、ＨＰＶ１６  Ｅ２のほとんどの免疫原性領域中に位置すると思われるＥ２ペプチドの選択に我々の注意を集中しつつ、２名の健常ドナーのＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の反応性を分析した。興味深いことに、これらのＣＤ４５ＲＯ＋ ＰＢＭＣは、複数のＥ２ペプチドに応答することがわかった（図９ａ，ｂ）。このことは、健常被検者がＨＰＶ１６  Ｅ２特異的Ｔ細胞記憶を表し得るという概念を支持している。我々は、測定手法としてＥＬＩＳＰＯＴに代えてＩＦＮγ細胞内サイトカイン染色を採用することにより、応答ＩＦＮγ産生細胞がＣＤ４＋ Ｔｈ細胞サブセットに属することを確認した（示さず）。さらなる８名の健常ドナーからのＣＤ４５ＲＯ＋ ＰＢＭＣを用いた、ペプチドの全アレイに対するＥ２特異的反応性のより広範なサーベイにより、これらのＰＢＭＣ単離物のうちの４つは、１又はそれ以上のＨＰＶ１６  Ｅ２ペプチドと反応することが明らかになった（図９ｃ−ｆ、及び示さず）。総合すると、我々のデータにより、試験した健常ドナーの約半数中に、ＨＰＶ１６  Ｅ２ペプチドに対する、ＣＤ４５ＲＯ＋ 記憶型の、ＩＦＮγ分泌性Ｔｈ細胞が存在することが明らかになった。注目すべきことに、これらの応答が検出される頻度が、全ＰＢＭＣ中に見出される増殖性応答の最強のサブセットの頻度と非常に近い（表４）。このことは、これらの応答もまた、おそらく生体外で初回免疫された未利用のＴ細胞によるのではなく、記憶Ｔ細胞による反応性を表していることを示唆している。
【００７４】
ＨＰＶ１６  Ｅ２特異的Ｔｈクローンの、他のＨＰＶ型の配列を有するペプチドとの交差反応性
ＨＰＶ感染は普遍的な性質を持っているので、人類の大部分は、おそらく複数のＨＰＶ型に遭遇している（Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ． ２０００； Ｋｏｕｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ． １９９７）。さらに、ウイルス遺伝子産物のタンパク配列は、ＨＰＶ型同士の間でかなりの程度保存されている。従って、ある方のＨＰＶと以前に遭遇することにより誘起されるＴ細胞レパートリーの少なくともある分画が、他のＨＰＶ型に次に感染した際に交差反応し、従って防御していることがあり得る。ＨＰＶ１６  Ｅ２タンパクの配列を、種々の他のＨＰＶ型の配列と並べることにより、それは他の高リスク型の配列と顕著に保存されていることが明らかになった。この保存は、ＨＰＶ１６  Ｅ２配列を、低リスク又は一般的な方の配列と比較した場合ほどは顕著ではないが、全てのケースにおいて、最大の保存が、Ｅ２配列のある領域内に閉じ込められていることが明らかである。具体的には、ＨＰＶ１６  Ｅ２の３つの領域が、他の型のＨＰＶと相同性を共有している。３つの領域とは、Ｎ末端部分であるＥ２３１−１２０、Ｅ２１５１−１９５及びＣ末端領域であるＥ２２７１−３６５である。これらの領域は、Ｅ２の主な機能的ドメインと同じ位置にある。すなわち、Ｎ末端ドメインは、このタンパクの転写活性化機能を有しており、Ｃ末端部分は、その配列特異的ＤＮＡ結合性を媒介する。２１０〜２７０番目の残基に亘る中間配列は、２つのキーとなる機能的ドメインを連結する、いわゆるヒンジ領域を構成し、この部分はＨＰＶ型間であまり保存されていない。興味深いことに、短期間増殖アッセイにおけるＥ２特異的応答の我々の解析により、最も免疫原性なペプチドは、ＨＰＶ１６  Ｅ２配列の２つの保存ドメイン中に集中している（表４参照）。これらの考えに鑑み、ＨＰＶ１６  Ｅ２配列のＣ末端部分から誘導されたエピトープに対して育成された、我々の確立されたＴｈクローン（図５〜８）が、この特定のＥ２配列に関してＨＰＶ１６と最大の相同性を共有する、多数の他の型のＨＰＶのＥ２ペプチドと交差反応することができるかどうかを試験した。本当に、ＤＱ６−拘束Ｅ２３１１−３２５特異的Ｔｈクローンは、ＨＰＶ２６，３１，３５及び４５型の対応するペプチドを強く認識した（示さず）。このエピトープ内のアミノ酸相同性は、７３〜８７％である（同一又は類似の理化学的性質を有するアミノ酸）。我々の他のＴｈクローンは、高度に相同的な他のＨＰＶ型のＥ２ペプチドに対して考慮すべき交差反応性を示さなかった（示さず）。これらのデータは、我々のアッセイで検出されたＨＰＶ１６  Ｅ２反応性Ｔｈ記憶の一部は、ＨＰＶ１６以外の型のエピトープとの遭遇に関連しているかもしれないことを示しており、また、この免疫レパートリーの大部分は、おそらくＨＰＶ１６自身との遭遇を介して確立されたものであることを示唆している。
【００７５】
実施例３
材料及び方法
被検者及び対照
匿名の健常血液銀行ドナー（Ｄ）のＰＢＭＣを得た。これらのドナーは、匿名であるので、追加的なデータは入手できない。しかしながら、異常なパピローマウイルス塗沫を包含する、最近の感染履歴が知られているドナーは、通常の規制の一部として、献血を思いとどまらされる。
【００７６】
ＣＩＮ又は子宮頚癌を有する被検者（Ｓ，表２）の研究は、この論文において、ＨＰＶ１６感染子宮頚癌病巣に対する細胞性免疫を研究した「サークル研究 （ＣＩＲＣＬＥ ｓｔｕｄｙ）」に記載されている。ライデン大学医学センター（ＬＵＭＣ）の婦人科において、組織学的に照明されたＣＩＮ ＩＩＩ又は子宮頚癌を呈している婦人を、インフォームドコンセント後、この研究に利用させてもらった。研究計画は、ＬＵＭＣの倫理委員会で承認された。治療の日に採血した。ＣＩＮ ＩＩＩを有する被検者を、ＬＥＥＰ又は冷ナイフ円錐切除で処置した。ＩＢ−ＩＩＡの段階にある場合には、根治的な子宮摘出を行った。バイオプシー又は外科的切除標本のパラフィン埋め込み切片から単離されたＤＮＡ上でＨＰＶ１６特異的プライマーを用いてＨＰＶ１６の分類を行った（Ｃｌａａｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９）。ＨＰＶ特異的Ｔ−ヘルパー応答は、進行性疾患を患っている被検者中に検出されると予測されたので（ｄｅ Ｇｒｕｉｊｌ ｅｔ ａｌ．， １９９８）、我々は、ＩＢ段階の子宮頚癌を有する被検者を分析することを選んだ。
【００７７】
抗原
Ｅ６タンパク上に亘る、用いた１５個の重複する２２−ｍｅｒのペプチド（例えば、１−２２， １１−３２， ２１−４２， ３１−５２， ４１−６２， ５１−７２， ６１−８２， ７１−９２などで、最後のペプチドがアミノ酸１３７−１５８から成る）は、タンパク中の第１番目と最後のアミノ酸で示される。ペプチドは先に記載したように合成し、溶解した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００７８】
記憶応答混合物（ＭＲＭ）：破傷風トキソイド（１ ＬＦ／ｍｌ； Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， オランダ国Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ）及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの超音波破砕物（２．５μｇ／ｍｌ； オランダ国Ｒｏｙａｌ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ のＰ． Ｋｌａｔｓｅｒ博士が気前よく分与）を、典型的な普遍的（ｒｅｃａｌｌ）抗原に応答してＰＢＭＣが増殖する能力を制御するために用いた。
【００７９】
ＥＬＩＳＰＯＴによる抗原特異的Ｔ細胞の解析
２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ， マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）に収容した、１０％ＦＣＳが添加され、５μｇ／ｍｌのＥ６から誘導された前記２２−ｍｅｒのペプチドを含む又は含まない１ｍｌのＩＳＯＣＯＶＥの培地（Ｇｉｂｃｏ）中にＰＢＭＣを２ｘ１０６細胞／ウェルの密度で播種した。陽性対照として、各プール中、４つの重なる３０アミノ酸長のペプチドから成る、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４ Ｍ１タンパクの上記プールの存在下でＰＢＭＣを培養した。
【００８０】
ＣＤ４５ＲＯ＋細胞を用いた場合には、１０％ ＦＣＳ及び記載した単一のペプチド又はペプチドのプールを１０μｇ／ｍｌ／ペプチドの濃度で添加した、２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に収容された１ｍｌのＩＭＤＭ中に、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞を１０６細胞／ウェルの密度で播種した。３７℃で４日間インキュベートした後、ＰＢＭＣを回収し、洗浄し、ＩＦＮγ捕獲抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ ＡＢ， スウェーデン国Ｎａｃｈａ）を被覆したＭｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ ９６−ウェルプレート （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， オランダ国Ｅｔｔｅｎ−Ｌｅｕｒ）に１０５細胞／ウェルの密度で、４〜６個のレプリケートを構成するように播種した。ＥＬＩＳＰＯＴを、製造者（Ｍａｂｔｅｃｈ）の指示に従ってさらに行った。スポットの数は、コンピューター制御の完全自動化ビデオイメージング分析システム（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｖｉｓｉｏｎ）を用いて分析した。特異的スポットは、試験ウェルの平均スポット数から、培地のみの対照のスポット数＋２ｘ標準偏差を差し引くことにより算出した。抗原特異的Ｔ細胞頻度は、Ｔ細胞頻度が＞１／１０，０００ ＰＢＭＣである場合に非応答物に比較して増加したと考えた。
【００８１】
ＰＢＭＣのＣＤ４５ＲＯ＋記憶分画の単離
ＣＤ４５ＲＯマイクロビーズ（カタログ番号４６０−０１， Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ， ドイツ国）と共にインキュベーションした後のＭＡＣＳによりバフィーコートから記憶細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋）を新たに単離した。得られたＣＤ４５ＲＯ＋分画の純度は、ＣＤ４５ＲＯ 及びＣＤ４５ＲＡ （ＣＤ４５ＲＡ−ＦＩＴＣ， カタログ番号３４７７２３、ＣＤ４５ＲＯ−ＰＥ， カタログ番号３４７９６７， Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， 米国）に対して表面染色を行った後のフローサイトメトリーにより測定したところ＞９５％であった。
【００８２】
結果
若い性的に活発な個体における一般的に一過性の生殖ＨＰＶ感染の高い出現率（Ｋａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｋｏｕｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８）及び試験した健常被検者の約半数に見られた、ＨＰＶ１６ Ｅ２特異的免疫の顕著な発現（実施例２参照）に鑑み、我々は、４日間ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、ヒト集団中の自然な、生体内で誘起された、ＨＰＶ１６ Ｅ６−特異的応答を調べた。このアッセイは、刺激するとＩＦＮγを分泌するＴヘルパー細胞のみを検出し、未利用のＴヘルパー細胞は刺激してもＩＦＮγを分泌しない（実施例１及び２並びにその中で引用した文献参照）。１８名の健常血液ドナーからのＰＢＭＣ中に存在するペプチドの完全なアレイに対するＥ６特異的反応性のサーベイにより、これらの１８名のうちの１１名（＞６０％）のＰＢＭＣ単離物が、１又はそれ以上のＨＰＶ１６  Ｅ６ペプチドに応答した（表６ａ）。応答の大部分は、Ｅ６のＣ末端（Ｅ６８１−１５８）において認められた。さらに、全ての健常ドナーは、一般的な普遍性抗原であるインフルエンザマトリックス１タンパクに反応した。インフルエンザＭ１及びＨＰＶ１６  Ｅ６特異的Ｔヘルパー細胞の頻度は同程度であった。興味深いことに、ＨＰＶ１６＋患者について同様なサーベイを行ったところ、わずか３／１２（２５％）のみがＨＰＶ１６  Ｅ６ペプチドと反応した。このことは、健常被検者中に見出されるＥ６応答が、この疾病に対して防御的であることを示している。
【００８３】
【表６】
2004525115.tif 000007
【００８４】
１１８名の異なる健常血液ドナーを試験した。
２ ＨＰＶ１６ Ｅ６から誘導されたペプチドの第１番目及び最後のアミノ酸番号を示す。Ｍ１Ｐ１−Ｍ１Ｐ４は、インフルエンザＡマトリックス１タンパク（ｉｎｆ Ａ／ＰＲ／８／３４）から誘導された、１５残基重なり合う、４つの３０アミノ酸長ペプチドの４つの異なるプールである。
３示したものは、１００，０００個のＰＢＭＣ当りの特異的スポットの数である。特異的スポットは、ペプチドで刺激した後のスポットの平均数から、培地対照の平均スポット数＋２ｘＳＤを差し引くことにより算出される。太字の数字は、Ｔ細胞頻度≧１／１０，０００を示す。
【００８５】
【表７】
2004525115.tif 000008
【００８６】
ＨＰＶ１６特異的記憶Ｔ細胞が、ヒト集団の大きな分画中に存在するという我々の観察を確認するために、我々はＨＰＶ１６  Ｅ６ペプチドで刺激する前の、特異的ＣＤ４５ＲＯ＋の、ＰＢＭＣの記憶分画を単離した。４日間の刺激後、ＨＰＶ１６  Ｅ６に対する明確な応答を検出することができた。総合すると、我々のデータにより、試験した健常ドナーの約半数中に、ＨＰＶ１６  Ｅ６ペプチドに対する、ＣＤ４５ＲＯ＋ 記憶型の、ＩＦＮγ分泌性Ｔヘルパー細胞が存在することが明らかになった。
【００８７】
さらに、２名の異なるＨＬＡ−ＤＲ１陽性血液ドナーのＰＢＭＣを、協働してＥ６ １０９−１５８をカバーする、２個の長い３５−ｍｅｒのプールで刺激した。これらのドナーのＰＢＭＣは、ペプチドＥ６ １２１−１４２及びペプチドＥ６ １２７−１５８並びにＥ６タンパクに対して特異的に増殖した。これらのバルクの１つから誘導したＣＤ４＋Ｔヘルパークローンをさらに解析した。このクローンは、ＨＰＶ１６  Ｅ６ペプチド及びＨＰＶ１６  Ｅ６タンパクで刺激すると、ＨＬＡ−ＤＲ１拘束的に、特異的に増殖し、ＩＦＮγを産生した（図１６）。
【００８８】
結論
ＨＰＶ１６  Ｅ６抗原に対する、健常被検者からのＰＢＭＣ培養物中のＩＦＮγ応答の解析を通じて、我々は、このタンパクが、これらのドナーの約半数において強いＴ細胞反応性が検出される高度に免疫原性のペプチド配列を含んでいることを示した。次いで健常ドナーＰＢＭＣのＣＤ４５ＲＯ＋記憶分画の試験により、これらのＨＰＶ１６  Ｅ６−特異的ＩＦＮγ−分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞がＰＢＭＣのＴ細胞記憶分画中に存在し、従って、ＨＰＶに遭遇することにより生体内で初回免疫されていたことを明らかにした。同様なサーベイにより、ＨＰＶ１６  Ｅ６特異的ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞は、ＨＰＶ１６＋患者中にはほとんど存在しないことが示された。総合すると、我々のデータは、健常被検者の大部分のＴ細胞レパートリーは、ＨＰＶ１６  Ｅ６抗原に対して反応性を有する、記憶１型サイトカイン産生Ｔヘルパー細胞を高い頻度で含み、これらが疾病に対して防御的であることを示している。
【００８９】
重要なことに、健常個体中にＥ２及びＥ６又は他のいずれかの非構造ＨＰＶ１６タンパクに対する記憶Ｔ細胞応答が存在することに関する報告を我々は見つけていない。実際、多くの例で健常個体は、用いた培養条件についての陰性対照として用いられていた。今、我々は、２つの独立した研究（実施例２及び実施例３）において、健常ドナーから誘導されたＰＢＭＣがＨＰＶ１６特異的Ｔヘルパー細胞を含むことを示した。Ｔヘルパー応答の大部分は、Ｅ２及びＥ６の特定の領域に対するものである。これらの記憶型Ｔヘルパー細胞の存在は、これらの個体がＨＰＶ１６感染に遭遇したことがあり、免疫系の細胞性Ｔ細胞アームを介してその感染を排除したことを示している。このことは、これらの抗原に対するＴ細胞応答が、ＨＰＶ感染に対する防御的応答の一部であることを暗示している。したがって、これらの型の応答を誘起又は追加免疫することは、ＨＰＶにより誘起される疾病に対する防御のための有力な道具になり得る。
【００９０】
実施例４
材料及び方法
雄Ｃ５７／Ｂ１６マウス（１群当りｎ＝８）に、１０μｇのＥ１Ａ−誘導ＣＴＬエピトープ（ＳＧＰＳＮＴＰＰＥＩ）そのもの又は該ＣＴＬエピトープを含む、ＨＰＬＣで精製した、３０μｇの３２アミノ酸長のペプチドＲＥＣＮＳＳＴＤＳＣＤＳＧＰＳＮＴＰＰＥＩＨＰＶＶＲＬＣＰＩＫＰをワクチン投与した。ペプチドはＰＢＳ中に溶解し、ＩＦＡと１：１の比率で混合した。マウスには、第１日に２００μＬの体積でペプチドを皮下投与した。１４日後、マウスを０．５ ｘ １０６ 個のＡＲ５腫瘍細胞（Ｅ１Ａ ＋ Ｒａｓトランスフォームドマウス胎児細胞）で攻撃した。１００日間にわたり、マウスの生存を監視した。
【００９１】
結果
細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープを表す合成ペプチドをワクチン投与することにより、腫瘍又はウイルスに対して防御的ＣＴＬ媒介免疫がもたらされ得る。ヒトアデノウイルス早期領域１（Ａｄ５Ｅ１）によりトランスフォームされたＢ６腫瘍細胞は、Ａｄ５Ｅ１Ａ及びＡｄ５Ｅ１ＢによりコードされるＣＴＬエピトープを免疫系に提示する。これらのエピトープのどちらかに対するＣＴＬクローンは、確立されたＡｄ５Ｅ１−誘起腫瘍を根絶することができる。このことは、これらのＣＴＬエピトープが、腫瘍の縮退を媒介することができるＣＴＬの標的であることを示している。Ａｄ５Ｅ１−発現腫瘍細胞に対する防御的免疫は、Ａｄ５Ｅ１によりトランスフォームされた細胞及びＡｄ５Ｅ１領域を含むアデノウイルスベクターで免疫することにより確立することができる。いずれの場合も、防御的免疫は、特異的ＣＴＬ記憶を伴う。しかしながら、Ｅ１Ａ誘導ＣＴＬエピトープの最小のペプチドエピトープ配列又はＥ１Ｂ誘導ＣＴＬエピトープの最小のペプチドエピトープ配列をワクチン投与した場合には、Ａｄ５Ａ１発現腫瘍に対する防御は失われた。
【００９２】
ヒトアデノウイルス５型Ｅ１Ａ領域（Ａｄ５Ｅ１Ａ２３４−２４３）から誘導されたＣＴＬエピトープをワクチン投与すると、Ａｄ５Ｅ１Ａ発現腫瘍の成長が阻害されるのではなく促進された。ペプチドワクチンとは対照的に、Ａｄ５Ｅ１Ａを発現するアデノウイルスをワクチン投与すると、Ａｄ５Ｅ１Ａ特異的免疫が誘起され、Ａｄ５Ｅ１Ａ発現腫瘍の増殖が妨げられた。これらの結果は、合成ペプチドでの免疫が、抗腫瘍ＣＴＬ応答を排除し得ることを示している（Ｔｏｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６ａ）。さらに、少ない投与量のＡｄ５Ｅ１Ｂペプチドを皮下投与することによりワクチン接種すると、同様にこの有害反応が見られる。Ａｄ５Ｅ１ＢによりコードされたＣＴＬエピトープに対するＣＴＬ応答は、Ａｄ５Ｅ１でトランスフォームされた細胞によるワクチン接種後のＢ６マウスにおける抗腫瘍応答に最も寄与するので、Ａｄ５Ｅ１Ｂペプチドを選択した。Ａｄ５Ｅ１Ｂペプチドをワクチン投与されたマウスは、Ａｄ５Ｅ１発現腫瘍細胞の増殖に対して防御されず、しかしその代わりに、ワクチン接種されていないマウスにより排除される腫瘍接種物を排除することがもはやできなかった。さらに、Ａｄ５Ｅ１Ｂ発現腫瘍に対する腫瘍細胞のワクチン接種により誘起された防御は、腫瘍攻撃の数日前にＡｄ５Ｅ１ＢによりコードされるＣＴＬエピトープを注射することにより失われた。これは、Ａｄ５Ｅ１Ｂ特異的ＣＴＬ活性のペプチド誘起寛容を伴う（Ｔｏｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９６ｂ）。
【００９３】
結論として、ＣＴＬエピトープ長そのものの合成ペプチドで免疫すると、腫瘍排除能力の欠如を伴うＣＴＬ寛容がもたらされ得る。最小のエピトープで免疫することによるＣＴＬの寛容又は機能欠失の問題は、長いペプチド（２２〜３５アミノ酸残基）を用いることにより回避される。このことを証明するために、我々は、１０アミノ酸長のＥ１Ａ誘導ＣＴＬエピトープを含む、３２アミノ酸の長いＥ１Ａ誘導ペプチドをＣ５７／Ｂ１６マウスにワクチン接種した。 前記１０アミノ酸長のペプチドエピトープは、そのまま接種すると腫瘍に対する防御が失われるものである。図１０に示すように、ペプチドエピトープＳＧＰＳＮＴＰＰＥＩそのものをワクチン接種した対照マウス（ｎ＝８）は、腫瘍による攻撃後５０日以内に全て死亡した。対照的に、３２アミノ酸長のペプチドをワクチン接種した群のマウスは、第５０日には全て生きており、１００日間の追跡期間中にわずか１匹のみが死亡した。
【００９４】
結論
ウイルス感染した細胞又は腫瘍細胞に対して被検者を免疫することに臨床的に関連する手法では、特異的Ｔ細胞及びＣＴＬの両者が誘起されるべきである。我々は既に、いくつかのモデルでは、最小のＣＴＬエピトープで免疫することにより、腫瘍に対する防御がもたらされる （Ｋａｓｔ ｅｔ ａｌ． １９９１， Ｆｅｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ． １９９３）が、これはまた、誘導されると本来は防御的である（Ｔｏｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９６ａｂ）、ウイルス又は腫瘍特異的ＣＴＬの寛容又は機能欠失をもたらし得ることを示した。交差初回免疫及び他のメカニズムによる、ＭＨＣクラスＩ分子による提示のための外来性抗原のプロセッシングは、現在、周知の内発性経路に次ぐ、ＭＨＣクラスＩによる提示のためのプロセッシングの第２経路として広く認識されている（Ｊｏｎｄａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｒｅｉｍａｎｎ ｅｔ ａｌ． １９９７）。ペプチドエピトープそのものをマウスにワクチン接種する場合とは対照的に、ＣＴＬエピトープを含む長いペプチド配列をワクチン接種すると、腫瘍に対してマウスを防御することに関わるＣＴＬの喪失がもたらされず、その代わりに次なる腫瘍攻撃に対してマウスを防御する、ＣＴＬ媒介免疫応答がもたらされることを今、我々は示した。
【００９５】
実施例５
マウス及びセルライン。  Ｃ５７ＢＬ／６ （Ｂ６， Ｈ−２ｂ）マウスは、ＩＦＦＡ Ｃｒｅｄｏ （フランス国Ｐａｒｉｓ）から得た。ＭＨＣクラスＩＩ−／−Ｂ６マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ（米国）から購入し、ＣＤ４０−／− Ｂ６マウスはＴｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （米国Ｍａｉｎｅ）から得た。腫瘍セルラインＴＣ−１は、Ｃ５７ＢＬ／６起源のマウス胎児細胞（ＭＥＣ）を、ＨＰＶ１６ Ｅ６／Ｅ７及びｃ−Ｈ−ｒａｓ腫瘍遺伝子によりトランスフェクトすることによって生成された。腫瘍セルライン１３．２は、Ｈ−２Ｄｂ Ｅ１ＡエピトープがＨＰＶ１６ Ｅ７４９−５７ＣＴＬエピトープで置換された、アデノウイルス５型誘導Ｅ１タンパクでトランスフォームされたＭＥＣ（Ｂ６）から誘導された。Ｄ１細胞は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから誘導された、長期増殖因子依存性の未熟脾臓樹状細胞（ＤＣ）である。
【００９６】
ペプチド。  ＨＰＶ１６  Ｅ７誘導ペプチドＥ７４９−５７： ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ及びＥ７４３−７７： ＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲは、自動複数ペプチド合成機（Ａｂｉｍｅｄ ＡＭＳ ４２２， ドイツ国Ｌａｎｇｅｎｆｅｌｄ）上で固相法により合成した。ペプチドは、逆相ＨＰＬＣで混入物を分析し、−２０℃で保存した。
【００９７】
テトラマー及び抗体。  ＰＥ標識Ｈ−２ＤｂエピトープＥ７４９−５７（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）含有テトラマーを構築し、ペプチド特異的ＣＴＬ免疫の解析に用いた。ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８ｂ．２ Ａｂ （Ｌｙ−３．２） （クローン ５３−５．８）， ＡＰＣ標識抗ＣＤ４ Ａｂ （Ｌ３Ｔ４） （クローンＲＭ４−５）及びＰＥ 標識抗ＩＦＮ−γＡｂ （クローンＸＭＧ１．２） （ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， 米国Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を種々のＦＡＣＳ法に用いた。
【００９８】
アジュバント。    ＩＦＡ（フロインドの不完全アジュバント）は、Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ （米国Ｍｉｃｈｉｇａｎ）から得た。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５１は、ＳＥＰＰＩＣ （フランス国Ｐａｒｉｓ）から購入した。ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）１８２６は、Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｕｎｉｃｈ （ドイツ国Ｍｕｎｉｃｈ）のＧ．Ｂ． Ｌｉｐｆｏｒｄ博士から親切に提供してもらった。ＧＭ−ＣＳＦは、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ （米国Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ）から得た。刺激性抗ＣＤ４０抗体を産生するＦＧＫ−４５ハイブリドーマ細胞は、Ａ． Ｒｏｌｉｎｋにより提供された。ＭＰＬは、Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ （米国、Ｈａｍｉｌｔｏｎ）のＭ． Ｊｏｈｎｓｏｎ博士に親切に提供してもらった。
【００９９】
免疫戦略。  Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、Ｅ７４９−５７ ＣＴＬエピトープのモル濃度が同程度になるように、ＰＢＳに溶解した５０μｇのＥ７４９−５７ペプチド又は１５０μｇのＥ７４３−７７ ３５−ｍｅｒを皮下注射した。種々のアジュバントとの組み合わせを試験した。ＩＦＡ及びＭｏｎｔａｎｉｄｅの場合には、溶解したペプチドを、これらのそれぞれの物質５０％に乳化した。ＯＤＮ−ＣｐＧ （５０ μｇ／マウス）， ＭＰＬ （１０ μｇ／マウス）及びＧＭ−ＣＳＦ （４μｇ／マウス）は全てＰＢＳに溶解し、皮下ワクチン接種の前にペプチドと混合した。注射した総体積は２００μＬ／マウスであった。抗ＣＤ４０抗体はＰＢＳに溶解し、ペプチドとは別に、注射当り１００μｇの量（総体積２００μＬ／マウス）で第０、１及び２日に静脈内注射した。１０日後に脾臓を回収するか、又は、記載した場合には、初回免疫の５０日後に同一のワクチンを追加免疫し、追加免疫１０日後に脾臓を回収した。３５−ｍｅｒのＥ７４３−７７の場合には、後者の戦略により、最初のワクチン接種の跡に記憶ＣＴＬ及びＴヘルパー細胞が形成され、追加免疫を行ったときにＨＰＶ１６ Ｅ７４３−７７特異的Ｔヘルパー細胞によってＤＣが活性化されるかもしれない。治療的抗腫瘍実験では、腫瘍担持マウスは、全てのマウスにおいて腫瘍が触診可能な時及びその１４日後に、２回ワクチン接種した。
【０１００】
Ｔ細胞培養。    ０．５ ｘ １０６個のＥ７４９−５７発現細胞（腫瘍セルライン１３．２）の存在下、あるいは、記載した場合には、Ｄ１細胞の存在下で、完全培地中で脾細胞（２４ウェルプレート中５ ｘ １０６細胞／ウェル）を培養することにより免疫マウスからＴ細胞を得た。使用前に、Ｄ１細胞をＥ７４３−７７ ３５−ｍｅｒと共に１６時間培養し、次いでＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）を加えることにより６時間活性化し、次に完全に洗浄した。完全培地は、８％ ＦＣＳ， １００ ＩＵ／ｍｌペニシリン， ２ｍＭグルタミン （ＩＣＮ， 米国オハイオ州Ａｕｒｏｒａ）及び３０ μＭ ２−ＭＥ （Ｍｅｒｃｋ， ドイツ国Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）を添加したＩｓｃｏｖｅの修飾ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ； ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ， 米国メリーランド州Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）から成る。培養物は、５％ ＣＯ２を含む湿潤空気中で３７℃で維持した。外来性ＩＬ−２は添加しなかった。第６日に、死んだ細胞をＦｉｃｏｌｌ密度勾配遠心により培養物から除去し、残る細胞を１ｘ１０６細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。第７日にテトラマー染色又は細胞内サイトカイン染色を行った。
【０１０１】
テトラマー染色。    腫瘍セルライン１３．２で７日間刺激した脾臓培養物を、４０ｘ１０４個／ウェルの量で９６ウェルＶ底マイクロタイタープレートに移し、ＰＢＳ／０．５％  ＢＳＡで２回洗浄した。次いで、ＰＥ−標識Ｅ７４９−５７含有テトラマーを加えた。室温で３０分間インキュベートした後、細胞をＰＢＳ／０．５％  ＢＳＡで２回洗浄し、ＦＩＴＣ−標識抗ＣＤ８ｂ抗体と３０分間インキュベートした。次いで細胞を、ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡで２回洗浄し、プロピジウム  アイオダイド（ＰＩ）含有（０．５μｇ／ｍｌ） ＰＢＳ／０．５％ ＢＳＡに懸濁し、チューブに移した。細胞試料を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用い、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， 米国カリフォルニア州Ｓａｎ Ｊｏｓｅ）で解析した。合計２０ｘ１０４事象（ｅｖｅｎｔ）の蛍光強度を解析した。破片はＰＩ染色を用いてゲートアウトし、次いで、ＣＤ８＋分画をゲートした。非免疫対照マウスからの、同様に培養し、染色した細胞の平均バックグランドテトラマー染色では、ＣＤ８＋細胞が１％未満であることがわかった（０．９４％、標準偏差０．３６％）。陽性コントロールとして、ＨＰＶ１６ Ｅ７特異的ＣＴＬクローン９．５を用いた。
【０１０２】
細胞内サイトカイン染色。    Ｅ７４３−７７ ３５−ｍｅｒで７日間パルスしたＤ１細胞で脾臓培養物を刺激した。次いで、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋ ＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞の割合を以前に記載した方法（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２００１）で測定した。注目すべきことに、ＬＰＳ−活性化非パルスＤ１細胞又はＥ７４９−５７若しくはＥ４３−７７ ３５−ｍｅｒ（５μｇ／ｍｌ）でパルスしたＤ１細胞を、刺激細胞として用いた。
【０１０３】
結果
ＨＰＶ１６  Ｅ７Ｔヘルパー−及びＣＴＬエピトープを含む、３５アミノ酸長のＥ７４３−７７ペプチドを初回免疫−追加免疫ワクチン接種すると強いＣＴＬ応答がもたらされる
マウス（Ｂ６）に、ＩＦＡと混合した、最小のＣＴＬエピトープであるＨＰＶ１６ Ｅ７４９−５７又は３５残基長のＨＰＶ１６ Ｅ７４３−７７ペプチドを１回ワクチン接種した。ワクチン接種１０日後、脾臓を回収し、生体外で１週間刺激した。次に、Ｅ７４９−５７ペプチド特異的ＣＴＬの割合を、Ｈ２−Ｄｂ Ｅ７４９−５７ （ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ）−テトラマー染色（ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， ２００１）により測定した。両方の群で、９匹中３匹のマウスがワクチンに応答し、一般的にＣＤ８＋Ｔ細胞の５％がテトラマーで染色された（図１１Ａ−Ｂ）。これは、ワクチンが１回注射されたときに同等によく作用することを示している。
【０１０４】
強いＥ７４９−５７特異的ＣＴＬ応答を得るために、両方のワクチンを初回免疫−追加免疫法に用いた。これにより、初回免疫されたＴ細胞が、５０日後の第２のワクチン接種により応答が増強される前に記憶Ｔ細胞を形成することが可能であった。最小ＣＴＬエピトープを２回投与されたマウスは、１回ワクチン接種の後と同等なＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示した（図１１Ｃ）。対照的に、長いペプチドで初回免疫及び追加免疫されたマウスでは、１１匹のうち９匹が、より多数のＥ７４９−５７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞（平均１９％、５〜４０％の範囲）を形成し、強いＥ７４９−５７特異的ＣＴＬ応答を示した（図１１Ｄ）。これらの実験は、均一初回−追加免疫法で長いペプチドをワクチン接種する方が、最小のＣＴＬエピトープをワクチン接種するよりも優れていることを示しており、これは、長いペプチド中に本来的に存在するＴヘルパーエピトープによるＴヘルパー細胞の形成が、ＣＴＬ応答のレベルにかなり寄与していることを示している。
【０１０５】
強いＥ７４９−５７特異的ＣＴＬ応答はＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔヘルパー細胞とＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用に依存する
長いＥ７４３−７７ペプチドで初回−追加ワクチン接種した後に検出される印象的なＣＴＬ応答が実際にＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｅ７特異的Ｔヘルパー細胞により増強されたものであることを示すために、ＭＨＣクラスＩＩ−／−マウスに長いペプチドワクチンを初回−追加免疫した。ＭＨＣクラスＩＩ−／−マウス中に検出されるＥ７４９−５７特異的ＣＴＬの数は、２回のワクチン接種後のＢ６マウス中に見出される数よりもはるかに少なく、１回のワクチン接種後に見出される数と同等であった（図１１Ｅ）。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞が初回免疫後に既に誘起されていることを確認するために、ＩＦＡ中の長いペプチドをマウスに１回ワクチン接種した。次いで、Ｅ７４３−７７特異的ＩＦＮ？産生ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を細胞内サイトカイン染色により測定した。バックグランドを超える応答は、免疫されていないマウス中には観察されなかったが（データ示さず）、ワクチン接種したマウスからのＣＤ４＋Ｔ細胞の５％以上は、長いＥ７４３−７７ペプチドで刺激すると特異的に応答した（図１２Ａ）。これらのデータは、ＭＨＣクラスＩＩ拘束ＣＤ４＋Ｔヘルパー１型応答が１回のワクチン接種後に誘起されていることを示しているだけではなく、これらのＥ７４３−７７ペプチド特異的Ｔヘルパー細胞が、強いＣＴＬ応答を誘起するために必要であることを示している。追加免疫すると長いペプチドをプロセスして提示するプロフェッショナルＡＰＣは、Ｅ７４３−７７ペプチド特異的Ｔヘルパー細胞によるＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用を介して活性化される。これは次いで増強されたＣＴＬ活性化をもたらすであろう。
【０１０６】
Ｅ７４３−７７ペプチドとＤＣ−活性化剤とを１回ワクチン接種すると、ＨＰＶ１６  Ｅ７に対する強いＴ−ヘルパー及びＣＴＬ応答がもたらされる
もし、プロフェッショナルＡＰＣのＴ−ヘルパー媒介活性化が、観察される強いＣＴＬ応答にとって重要であるならば、ＤＣを直接活性化するとＴ細胞の助けの欠如を回避することができ、１回のワクチン接種が、十分なＣＴＬ応答を誘起するのに十分であるはずである。この主題について研究するために、Ｂ６マウスに、長いペプチド又は最小のＥ７４９−５７ペプチドを、種々のＤＣ活性化剤と組み合わせてワクチン接種した。ＩＦＡ及びヒト用ＩＦＡであるＭｏｎｔａｎｉｄｅを対照として用いた。ＩＦＡ（図１１Ａ−Ｂ）の場合と同様、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅアジュバントを投与した場合、応答は見られなかった（データ示さず）。さらに、最小のＣＴＬエピトープ又は長いペプチドと、抗ＣＤ４０抗体又はＧＭ−ＣＳＦとを組み合わせたものをワクチン接種されたマウスは、ＣＴＬ応答を全く又は最小にしか示さなかった（図１３Ａ−Ｂ）。しかしながら、ＧＭ−ＣＳＦとＩＦＡの組み合わせは、長いペプチドを投与した時に穏やかなＥ７４９−５７特異的ＣＴＬ応答をもたらした（図１３Ｃ）。ＭＰＬ又はＯＤＮ−ＣｐＧと混合した最小ペプチドを投与されたマウスは、ＩＦＡをワクチン接種されたマウスに比べて応答者の数は増えなかったが（それぞれ４／９及び４／１２）（図１１Ａ）、数匹のマウスは明確なＣＴＬ応答を示した（図１３Ｄ−Ｅ）。対照的に、長いペプチドをワクチン接種すると、すべてのマウスにおいてＥ７４９−５７特異的ＣＴＬ応答がもたらされた。さらに、大部分の動物において、検出されたＣＴＬ応答は高かった（ＣＤ８＋Ｔ細胞が４０％以下）。さらに、長いペプチドとＯＤＮ−ＣｐＧとを１回ワクチン接種すると、ＩＦＡをアジュバントとして用いた場合に比べ、さらに多数のＥ７４３−７７特異的ＩＦＮγ−産生ＣＤ４＋Ｔ細胞がもたらされた（ＣＤ４＋Ｔ細胞の１５〜２０％）（図１２Ｂ）。誘起された応答が、本当にＴヘルパー細胞に非依存的であることを示すために、ＭＨＣクラスＩＩ−／−マウスに長いペプチドとＯＤＮ−ＣｐＧをワクチン接種した。図１３Ｆに示す通り、１回のワクチン接種後に強いＣＴＬ応答が検出された。Ｔヘルパー非依存性のセッティングにおいて、長いペプチドとＤＣ活性化剤とをワクチン接種する方が最小のＣＴＬエピトープをワクチン接種するよりも優れていることは、全ての有核細胞上に存在するＭＨＣクラスＩ分子に結合することができる最小のＣＴＬエピトープに比べて、長いペプチドが優先的にプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）によりプロセスされ提示されることを示している。
【０１０７】
３５−ｍｅｒとＤＣ活性化アジュバントＯＤＮ−ＣｐＧをワクチン接種することによりＨＰＶ１６発現腫瘍を効果的に根絶し得る
長いペプチドワクチンの有効性を試験するために、腫瘍担持マウスを、ＯＤＮ−ＣｐＧと混合したＥ７４９−５７ペプチド又は長いＥ７４３−７７ペプチドで免疫した。注目すべきことに、全てのマウスにおいて腫瘍が触診可能である時（第１０〜１４日）にワクチン接種を行った。２回目のワクチン接種は、Ｅ７特異的Ｔヘルパー及びＣＴＬ免疫を維持するために１４日後に行った。ＯＤＮ−ＣｐＧ単独で処理したマウスは、抗腫瘍活性を示さなかった（図１４Ａ）。動物の大部分は、処理後１４日以内に、激しい腫瘍増殖の故に殺さなければならなかった。ペプチド及びＯＤＮ−ＣｐＧで処理した両方の群においては、処理の８〜１２日後に腫瘍増殖の阻害が見られた。Ｅ７４９−５７ペプチドとＯＤＮ−ＣｐＧで処理したマウスでは、９匹のうち３匹（動物の３０％）において根絶が観察されたが、他のものは一時的に腫瘍の増殖を安定化し得たに過ぎず、次いで腫瘍のために死亡した。対照的に、長いペプチドとＯＤＮ−ＣｐＧで処理した１０匹のマウスのうち８匹では、２００〜５００ｍｍ３のものもいくつかあった腫瘍が根絶された。
【０１０８】
結論
我々は、ＨＰＶ１６  Ｅ７から誘導された３５残基の長いペプチドをワクチン接種した後の方が、最小のＣＴＬエピトープをワクチン接種した後よりも、ＨＰＶ１６  Ｅ７特異的ＣＴＬ応答がはるかに強いことを示す。我々のデータは、２つの独立したメカニズムの少なくとも１つでこれが説明されることを示している。第１に、この実施例で用いた３５残基の長いペプチドは、ＣＴＬエピトープとＴヘルパーエピトープの両者を含んでいる。ＭＨＣクラスＩＩ−／−マウスのワクチン接種により、ＡＰＣとＥ７特異的Ｔヘルパー細胞の間の相互作用がＣＴＬ応答のレベルにかなり寄与していることが示された。さらに、強いＤＣ活性化剤と混合した前記長いペプチドを投与することにより、Ｔ細胞の助けの必要性を回避することができた。第２に、この実施例における最小のＣＴＬエピトープ（９残基）又は前記長いペプチドワクチンと、ＤＣ活性化剤との組み合わせにより誘起されるＣＴＬ応答を直接比較すると、野生型及びＭＨＣクラスＩＩ−／−の両方とも、長いペプチドをワクチン接種した方がはるかに良好なＣＴＬ応答をもたらすことが示された。このことは、最小のＣＴＬエピトープとは対照的に、長いペプチドが、プロフェッショナルＡＰＣによって好ましく提示されることを示している。さらに、我々は、長いペプチドと強いＤＣ活性化剤とをワクチン接種することにより、確立された腫瘍の完全な根絶がもたらされることを示す。これらのデータは、長い重なり合うペプチドを単独で、又は強いＤＣ活性化剤と組み合わせて将来のヒト試験に用いる科学的な根拠を与える。
【０１０９】
我々の長いペプチドワクチンが高い有効性を有していることは、他のことよりも、Ｔヘルパー及びＣＴＬエピトープが物理的に結合されていることに起因する。エピトープ連結の潜在的な利点は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩ拘束エピトープの両方を、単一のＡＰＣの表面上に同時に提示するチャンスが増加し、それによって、同族のＴ細胞の助けをＣＴＬの初回免疫に到達させることが容易になることにある。ＣＴＬ及びＴｈエピトープの混合物を用いたワクチンと、物理的に連結された同じＣＴＬ及びＴｈエピトープを用いたワクチンとの直接比較により、後者の方がより強いＣＴＬ応答をもたらすことが示された（Ｓｈｉｒａｉ， １９９４； Ｈｉｒａｎｕｍａ， １９９９； Ｂｒｉｓｔｏｌ， ２０００）。正常Ｂ６マウス及びＭＨＣクラスＩＩ−／−マウスの我々のワクチン接種により、物理的に結合されたＴ−ヘルパーエピトープを用いることが強いＣＴＬ応答の発達のために有利であることが確認された。さらに、これらの実験は、Ｅ７特異的Ｔｈ細胞とＡＰＣとの相互作用が、ＣＴＬ応答のこの増強の原因となっていることを示している。正常マウス及びＭＨＣクラスＩＩ−／−マウスにおける、最小ＣＴＬエピトープ及び長いペプチドにより誘起されるＣＴＬ応答を比較することにより、我々の長いペプチドワクチンのもう１つの興味深い性質が明らかになった。これらの実験では、Ｅ７特異的Ｔｈ細胞の寄与は排除されており、ペプチドの物理的性質又は動力学の相違のみが役割を果たす。そのサイズの故に、ペプチドを直接ＭＨＣクラスＩに結合させることができないので、前記長いペプチドは、外部由来の抗原をプロセスし、ＭＨＣクラスＩ中にペプチドを提示することができるプロフェッショナルＡＰＣに取り込まれる必要があった。我々は、最小ペプチドを用いた場合には、ＤＣ活性化がＥ７特異的ＣＴＬ応答の結果にわずかにしか影響しないが、長いペプチドワクチンによる、より優れたＥ７特異的ＣＴＬ応答の誘起のためにはＤＣ活性化が予め必要であることを示した。総合すると、これらのデータは、前記長いペプチド中に存在するＣＴＬ及びＴｈエピトープがプロフェッショナルＡＰＣの表面に好ましく提示されることを示している。最小のＨＰＶ１６誘導ＣＴＬエピトープをワクチン投与すると、ＤＣ活性化剤を共に注射しても改善されない、検出可能なＣＴＬ応答がもたらされる。このことは、前記ペプチドが、活性化されたプロフェッショナルＡＰＣの表面に提示されるだけではなく、他の有核細胞のＭＨＣクラスＩ分子中にも提示されることを示している。前記ペプチドは、細胞表面のＭＨＣクラスＩに直接結合することができる（Ｆｅｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．， １９９３）ので、驚くにはあたらない。共刺激を与えることができない細胞（例えば非免疫細胞）により前記ＣＴＬペプチドが提示されると、ＣＴＬ応答が弱められる。従って、これらの非プロフェッショナルＡＰＣによる前記Ｅ７−ＣＴＬエピトープの提示は、Ｅ７特異的ＣＴＬの誘起にとって害である。注目すべきことに、我々は以前に、最小のＥ１Ａ誘導ＣＴＬエピトープをワクチン接種すると、誘導されると本来はＥ１Ａ誘起腫瘍に対して防御的である（Ｔｏｅｓ ｅｔ ａｌ． １９９６ａｂ）Ｅ１Ａ特異的���ＴＬの寛容又は機能欠失をもたらしたことを示した。ＨＰＶ１６  Ｅ７誘導ＣＴＬエピトープの非プロフェッショナルＡＰＣの表面におけるあり得る提示は、アデノウイルス腫瘍モデルで見られるようにＥ７特異的ＣＴＬの誘起を妨害しないが、これらの応答の抗腫瘍効果は低減される。確立された腫瘍を、最小のＣＴＬエピトープとＤＣ活性化剤ＣｐＧの治療的ワクチン接種により処理することは、ＤＣ活性化剤と混合した長いペプチドワクチンと比較した場合にはるかに効果が少ない。
【０１１０】
これらの結果は、ＨＰＶ１６により誘起される疾病に対する、予防的及び治療的処置のヒト試験においてこのワクチンを評価するための科学的な基礎を与える。
【０１１１】
文献
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Ｆｕ ＴＭ， Ｇｕａｎ Ｌ， Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ａ， Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ ＴＬ， Ｕｌｍｅｒ ＪＢ， Ｌｉｕ ＭＡ， ｅｔ ａｌ．， Ｄｏｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ ＣＴＬ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９； １６２（７）：４１６３−４１７０．
Ｇｅｌｕｋ， Ａ．， Ｔａｎｅｊａ， Ｖ．， Ｖａｎ Ｍｅｉｊｇａａｒｄｅｎ， Ｋ．Ｅ．， Ｚａｎｅｌｌｉ， Ｅ．， Ａｂｏｕ−Ｚｅｉｄ， Ｃ．， Ｔｈｏｌｅ， Ｊ．Ｅ．， ｄｅ Ｖｒｉｅｓ， Ｒ．Ｒ．， Ｄａｖｉｄ， Ｃ．Ｓ． ａｎｄ Ｏｔｔｅｎｈｏｆｆ， Ｔ．Ｈ．， Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＨＬＡ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ， ｃｌａｓｓ ＩＩ− ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９５， １０７９７−１０８０２ （１９９８）．
ＧＥＬＵＫ， Ａ．， ＶＡＮ ＭＥＩＪＧＡＡＲＤＥＮ， Ｋ．Ｅ．， ＤＲＩＪＦＨＯＵＴ， Ｊ．Ｗ． ＡＮＤ ＯＴＴＥＮＨＯＦＦ， Ｔ．Ｈ．， Ｃｌｉｐ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｕｓｉｎｇ ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ−ｂａｓｅｄ， ａｌｌｅｌｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｏｔｉｆｓ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ａｌｌｅｌｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｕｐｅｒｍｏｔｉｆｓ． Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ３２， ９７５−９８１ （１９９５）．
ＧＨＯＳＨ， Ｐ．， ＫＯＭＳＣＨＬＩＥＳ， Ｋ．Ｌ．， ＣＩＰＰＩＴＥＬＬＩ， Ｍ．， ＬＯＮＧＯ， Ｄ．Ｌ．， ＳＵＢＬＥＳＫＩ， Ｊ．， ＹＥ， Ｊ．， ＳＩＣＡ， Ａ．， ＹＯＵＮＧ， Ｈ．Ａ．， ＷＩＬＴＲＯＵＴ， Ｒ．Ｈ． ＡＮＤ ＯＣＨＯＡ， Ａ．Ｃ．， Ｇｒａｄｕａｌ ｌｏｓｓ ｏｆ Ｔ−ｈｅｌｐｅｒ １ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｓｐｌｅｅｎ ｏｆ ｍｉｃｅ ｄｕｒｉｎｇ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ． Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ， ８７， １４７８−８３ （１９９５）．
ＨＡＬＰＥＲＴ Ｒ， ＦＲＵＣＨＴＥＲ ＲＧ， ＳＥＤＬＩＳ Ａ， ＢＵＴＴ Ｋ， ＢＯＹＣＥ ＪＧ， ＳＩＬＬＭＡＮ ＦＨ： Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ａｎｄ ｌｏｗｅｒ ｇｅｎｉｔａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ ｉｎ ｒｅｎａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ ６８（２）：２５１，１９８６
ＨＡＮ Ｒ， ＣＬＡＤＥＬ ＮＭ， ＲＥＥＤ ＣＡ， ＰＥＮＧ Ｘ， ＣＨＲＩＳＴＥＮＳＥＮ ＮＤ： Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｂｂｉｔｓ ｆｒｏｍ ｖｉｒａｌ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｂｙ ｇｅｎｅ ｇｕｎ−ｂａｓｅｄ ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎｔａｉｌ ｒａｂｂｉｔ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｅｌ， Ｅ２， Ｅ６， ａｎｄ Ｅ７ ｇｅｎｅｓ． Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７３（８）：７０３９， １９９９．
ＨＩＲＡＮＵＭＡ， Ｋ．， Ｓ． ＴＡＭＡＫＩ， Ｙ． ＮＩＳＨＩＭＵＲＡ， Ｓ． ＫＵＳＵＫＩ， Ｍ． ＩＳＯＧＡＷＡ， Ｇ． ＫＩＭ， Ｍ． ＫＡＩＴＯ， Ｋ． ＫＵＲＩＢＡＹＡＳＨＩ， Ｙ． ＡＤＡＣＨＩ， ＡＮＤ Ｙ． ＹＡＳＵＴＯＭＩ． １９９９． Ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ． Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８０：１８７．
Ｈｏ ＧＹ， Ｂｉｅｒｍａｎ Ｒ， ＢＥＡＲＤＳＬＥＹ Ｌ， ＣＨＡＮＧ ＣＪ， ＢＵＲＫ ＲＤ： Ｎａｔｕｒａｌ ｈｉｓｔｏｒｙ ｏｆ ｃｅｒｖｉｃｏｖａｇｉｎａｌ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｗｏｍｅｎ． Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３８（７）：４２３， １９９８．
ＨＯＨＮ， Ｈ．， ＰＩＬＣＨ， Ｈ．， ＧＵＮＺＥＬ， Ｓ．， ＮＥＵＫＩＲＣＨ， Ｃ．， ＨＩＬＭＥＳ， Ｃ．， ＫＡＵＦＭＡＮＮ， Ａ．， ＳＥＬＩＧＥＲ， Ｂ． ＡＮＤ ＭＡＥＵＲＥＲ， Ｍ．Ｊ．， ＣＤ４＋ ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ＨＬＡ−ＤＲ− ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−Ｅ７． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １６３， ５７１５−２２ （１９９９）．
ＨＯＰＦＬ， Ｒ．， ＷＩＤＳＣＨＷＥＮＤＴＥＲ， Ａ．， ＣＨＲＩＳＴＥＮＳＥＮ， Ｎ．Ｄ．， ＷＩＥＬＡＮＤ， Ｕ．， ＺＵＭＢＡＣＨ， Ｋ．， ＳＡＮＤＲＡ， Ｈ．， ＰＦＩＳＴＥＲ， Ｈ．Ｊ．， ＰＡＷＬＩＴＡ， Ｍ． ＡＮＤ ＨＥＩＭ， Ｋ．， Ｄｅｌａｙｅｄ−ｔｙｐｅ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ＨＰＶ１６ Ｅ７ ａｎｄ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ ＨＰＶ１６／１８ Ｅ６， Ｅ７ ａｎｄ ＨＰＶ ６／１１／１６／１８／３１ Ｌ１−ｖｉｒｕｓ ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｉｎ ｗｏｍｅｎ ｗｉｔｈ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ． Ｉｎ： Ｘ． Ｃａｓｔｅｌｌｓａｇｕｅ， Ｆ．Ｘ． Ｂｏｓｃｈ， Ｓ． ｄｅ Ｓａｎｊｏｓｅ， Ｖ． Ｍｏｒｅｎｏ ａｎｄ Ｊ． Ｒｉｂｅｓ （ｅｄｓ．）， １８ｔｈ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ， ｐｐ． ２９９， Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｃａｔａｌｅ ｄ’Ｏｎｃｏｌｏｇｉａ， Ｂａｒｃｅｌｏｎａ， Ｓｐａｉｎ （２０００）．
ＪＯＮＤＡＬ Ｍ， ＳＣＨＩＲＭＢＥＣＫ Ｒ， ＲＥＩＭＡＮＮ Ｊ： ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ ＣＴＬ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５（４）：２９５， １９９６
Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．， Ｊｏｎｓｓｏｎ，Ｍ．， Ｅｄｌｕｎｄ，Ｋ．， Ｅｖａｎｄｅｒ，Ｍ．， Ｇｕｓｔａｖｓｓｏｎ，Ａ．， Ｂｏｄｅｎ，Ｅ．， Ｒｙｌａｎｄｅｒ，Ｅ． ａｎｄ Ｗａｄｅｌｌ，Ｇ．， Ｌｉｆｅｔｉｍｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐａｒｔｎｅｒｓ ａｓ ｔｈｅ ｏｎｌｙ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ： ａ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｓｔｕｄｙ． Ｓｅｘ Ｔｒａｎｓｍ Ｄｉｓ， ２２， １１９−２７ （１９９５）．
ＫＡＳＴ ＷＭ， ＲＯＵＸ Ｌ， ＣＵＲＲＥＮ Ｊ， ＢＬＯＭ ＨＪ， ＶＯＯＲＤＯＵＷ ＡＣ， ＭＥＬＯＥＮ ＲＨ， ＫＯＬＡＫＯＦＳＫＹ Ｄ， ＭＥＬＩＥＦ ＣＪ： Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｌｅｔｈａｌ Ｓｅｎｄａｉ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｒｉｍｉｎｇ ｏｆ ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｆｒｅｅ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ． Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８（６）：２２８３， １９９１
ＫＯＵＴＳＫＹ Ｌ： Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｇｅｎｉｔａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ １０２（５Ａ）：３， １９９７．
ＫＵＲＴＳ Ｃ， ＣＡＲＢＯＮＥ ＦＲ， ＢＡＲＮＤＥＮ Ｍ， ＢＬＡＮＡＳ Ｅ， ＡＬＬＩＳＯＮ Ｊ， ＨＥＡＴＨ ＷＲ， ＭＩＬＬＥＲ ＪＦ：
ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｈｅｌｐ ｉｍｐａｉｒｓ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｌｆ−ａｎｔｉｇｅｎｓ ａｎｄ ｆａｖｏｒｓ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８６（１２）：２０５７， １９９７
Ｍａｎｃａ，Ｆ．， Ｌｉ Ｐｉｒａ，Ｇ．， Ｆｅｎｏｇｌｉｏ，Ｄ．， Ｆａｎｇ，Ｓ．Ｐ．， Ｈａｂｅｓｈａｗ，Ａ．， Ｋｎｉｇｈｔ，Ｓ．Ｃ． ａｎｄ Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ，Ａ．Ｇ．， Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｏｒ ＨＩＶ ｇｐ １２０． Ｊ Ａｃｑｕｉｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｅｆｉｃ Ｓｙｎｄｒ， ７， １５−２３ （１９９４）．
ＭＡＲＲＡＺＺＯ ＪＭ， ＳＴＩＮＥ Ｋ， ＫＯＵＴＳＫＹ ＬＡ： Ｇｅｎｉｔａｌ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｗｏｍｅｎ ｗｈｏ ｈａｖｅ ｓｅｘ ｗｉｔｈ ｗｏｍｅｎ： ａ ｒｅｖｉｅｗ． Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １８３（３）：７７０， ２０００
ＭＡＴＯＲＲＡＳ Ｒ， ＡＲＩＣＥＴＡ ＪＭ， ＲＥＭＥＮＴＥＲＩＡ Ａ， ＣＯＲＲＡＬ Ｊ， ＧＵＴＩＥＲＲＥＺ ＤＥ ＴＥＲＡＮ Ｇ， ＤＩＥＺ Ｊ，ＭＯＮＴＯＹＡ Ｆ， ＲＯＤＲＩＧＵＥＺ−ＥＳＣＵＤＥＲＯ ＦＪ： Ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ： ａ ｒｉｓｋ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ａｍ Ｊ Ｏｂｓｔｅｔ Ｇｙｎｅｃｏｌ １６４（１ Ｐｔ １）：４２， １９９１
ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ，Ｍ．， Ｗｅｈｎｅｒ，Ｎ．， Ｗｅｎｓｋｙ，Ａ．， Ｋｕｓｈｎｅｒ，Ｍ．， Ｄｏａｎ，Ｓ．， Ｈｉｓａｏ，Ｌ．， Ｃａｌａｂｒｅｓｉ，Ｐ．， Ｈａ，Ｔ．， Ｔｒａｎ，Ｔ．Ｖ．， Ｔａｔｅ，Ｋ．Ｍ．， Ｗｉｎｋｅｌｈａｋｅ，Ｊ． ａｎｄ Ｓｐａｃｋ，Ｅ．Ｇ．， Ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＰＯＴ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｌｏｗ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｊ ｌｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ２１０， １４９−６６ （１９９７）．
ＭＥＬＩＥＦ， Ｃ．Ｊ．Ｍ．， ＴＯＥＳ， Ｒ．Ｅ．Ｍ．， ＭＥＤＥＭＡ， Ｊ．Ｐ．， ＶＡＮ ＤＥＲ ＢＵＲＧ， Ｓ．Ｈ．， ＯＳＳＥＮＤＯＲＰ， Ｆ． ＡＮＤ ＯＦＦＲＩＮＧＡ， Ｒ．， Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ． Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ７５， ２３５ − ２８１ （２０００）．
Ｍｅｌｌｍａｎ，Ｉ．， Ｔｕｒｌｅｙ，Ｓ．Ｊ． ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｍａｎ， Ｒ．Ｍ．， Ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆｏｒ ａｍａｔｅｕｒｓ ａｎｄ ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， ８， ２３１−７ （１９９８）．
ＮＡＩＰＡＬ， Ａ．Ｍ．， Ｄ’ＡＭＡＲＯ， Ｊ．， ＢＲＵＮＩＮＧ， Ｊ．Ｗ．， ＶＡＮ ＬＥＥＵＷＥＮ， Ａ． ＡＮＤ ＶＡＮ ＲＯＯＤ， Ｊ．Ｊ．， Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｒｅａｄｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ Ｉｏｄｉｄｅ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ＨＬＡ− ＤＲ， ＭＢ， ＭＴ ｔｙｐｉｎｇ． Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ， ２４， ３０２−６ （１９８４）．
ＮＩＭＡＫＯ， Ｍ．， ＦＩＡＮＤＥＲ， Ａ．， ＷＩＬＫＩＮＳＯＮ， Ｇ．Ｗ．Ｇ．， ＢＯＲＹＳＩＥＷＩＣＺ， Ｌ．Ｋ． ＡＮＤ ＭＡＮ， Ｓ．， Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｎｅｏｐｌａｓｉａ ｇｒａｄｅ ＩＩＩ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５７， ４８５５−４８６１ （１９９７）．
ＯＳＳＥＮＤＯＲＰ Ｆ， ＭＥＮＧＥＤＥ Ｅ， ＣＡＭＰＳ Ｍ， ＦＩＬＩＵＳ Ｒ， ＭＥＬＩＥＦ ＣＪＭ： Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ ｆｏｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ ＩＩ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒｓ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １８７（５）：１， １９９８．
ＰＡＲＤＯＬＬ， Ｄ．Ｍ． ＡＮＤ ＴＯＰＡＬＩＡＮ， Ｓ．Ｌ．， Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １０， ５８８−９４ （１９９８）．
Ｐｉｔｔｅｔ， Ｍ．Ｊ．， Ｖａｌｍｏｒｉ， Ｄ．， Ｄｕｎｂａｒ， Ｐ．Ｒ．， Ｓｐｅｉｓｅｒ， Ｄ．Ｅ．， Ｌｉｅｎａｒｄ， Ｄ．， Ｌｅｊｅｕｎｅ， Ｆ．， Ｆｌｅｉｓｃｈｈａｕｅｒ， Ｋ．， Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ， Ｖ．， Ｃｅｒｏｔｔｉｎｉ， Ｊ．Ｃ． ａｎｄ Ｒｏｍｅｒｏ， Ｐ．， Ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ｎａｉｖｅ Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８（＋） Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａ ｌａｒｇｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ （ＨＬＡ）−Ａ２ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １９０， ７０５−１５ （１９９９）．
ＲＡＭＭＥＮＳＥＥ， Ｈ．Ｇ．， ＦＲＩＥＤＥ， Ｔ． ＡＮＤ ＳＴＥＶＡＮＯＶＩＩＣ， Ｓ．， ＭＨＣ ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｏｔｉｆｓ： ｆｉｒｓｔ ｌｉｓｔｉｎｇ． Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ４１， １７８−２２８ （１９９５）．
ＲＥＩＭＡＮＮ Ｊ， ＫＡＵＦＭＡＮＮ ＳＨ： Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎ ａｎｔｉ−ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９（４）：４６２，１９９７
ＲＥＳＳＩＮＧ， Ｍ．Ｅ．， ＳＥＴＴＥ， Ａ．， ＢＲＡＮＤＴ， Ｒ．Ｍ．Ｐ．， ＲＵＰＰＥＲＴ， Ｊ．， ＷＥＮＴＷＯＲＴＨ， Ｐ．Ａ．， ＨＡＲＴＭＡＮ， Ｍ．， ＯＳＥＲＯＦＦ， Ｃ．， ＧＲＥＹ， Ｈ．Ｍ．， ＭＥＬＩＥＦ， Ｃ．Ｊ．Ｍ． ＡＮＤ ＫＡＳＴ， Ｗ．Ｍ．， Ｈｕｍａｎ ＣＴＬ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １６ Ｅ６ ａｎｄ Ｅ７ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５４， ５９３４５９４３ （１９９５）．
ＲＥＳＳＩＮＧ， Ｍ．Ｅ．， ＶＡＮ ＤＲＩＥＬ， Ｗ．Ｊ．， ＢＲＡＮＤＴ， Ｒ．Ｍ．， ＫＥＮＴＥＲ， Ｇ．Ｇ．， ＤＥ ＪＯＮＧ， Ｊ．Ｈ．， ＢＡＵＫＮＥＣＨＴ， Ｔ．， ＦＬＥＵＲＥＮ， Ｇ．Ｊ．， ＨＯＯＧＥＲＨＯＵＴ， Ｐ．， ＯＦＦＲＩＮＧＡ， Ｒ．， ＳＥＴＴＥ， Ａ．， ＣＥＬＩＳ， Ｅ．， ＧＲＥＹ， Ｈ．， ＴＲＩＭＢＯＳ， Ｂ．Ｊ．， ＫＡＳＴ， Ｗ．Ｍ． ＡＮＤ ＭＥＬＩＥＦ， Ｃ．Ｊ．， Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ， ｂｕｔ ｎｏｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ， ａｆｔｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ２３， ２５５− ６６（２０００）．
ＲＥＳＳＩＮＧ， Ｍ．Ｅ．， ＶＡＮ ＤＲＩＥＬ， Ｗ．Ｊ．， ＣＥＬＩＳ， Ｅ．， ＳＥＴＴＥ， Ａ．， ＢＲＡＮＤＴ， Ｒ．Ｍ．Ｐ．， ＨＡＲＴＭＡＮ， Ｍ．， ＡＮＨＯＬＴＳ， Ｊ．Ｄ．Ｈ．， ＳＣＨＲＥＵＤＥＲ， Ｇ．Ｍ．Ｔ．， ＴＥＲ ＨＡＲＭＳＥＬ， Ｗ．Ｂ．， ＦＬＥＵＲＥＮ， Ｇ．Ｊ．， ＴＲＩＭＢＯＳ， Ｂ．Ｊ．， ＫＡＳＴ， Ｗ．Ｍ． ＡＮＤ ＭＥＬＩＥＦ， Ｃ．Ｊ．Ｍ．， Ｏｃｃａｓｉｏｎａｌ ｍｅｍｏｒｙ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １６−ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｌｅｓｉｏｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ−Ａ＊０２０１−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｅ７−ｅｎｃｏｄｅｄ ｅｐｉｔｏｐｅ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６， ５８２−５８８ （１９９６）．
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、自然にプロセスされた抗原（Ａｇ）を認識する、ペプチドＥ７４１−６２ により誘導されたＴ細胞応答を示す。健常ＨＬＡ−ＤＲ１５，４及びＤＱ６，７陽性血液ドナーからのＰＢＭＣを、ペプチドＥ７４１−６２で４回刺激した。応答Ｔ細胞は、３日間の増殖アッセイ（ａ，ｂ，ｃ）において試験し、又は、ＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡにより測定するために１日間刺激した（ｄ）。応答細胞（Ｒ）及び自己の、又はＭＨＣクラスＩＩが合致した抗原提示細胞（Ａ）を、記載した抗原、すなわち、組換えＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク（Ｅ６）、組換えＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク（Ｅ７）、組換えＨＩＶ ＲＴタンパク（ＲＴ）又はＥ６から誘導されたペプチド（例えばＥ６／８１−１０２、ペプチドＥ６８１−１０２）若しくはＥ７から誘導されたペプチドと共にインキュベートした。バルクＴ細胞培養物の増殖（ａ）、バルクＴ細胞培養物から誘導されたＴ−ヘルパークローンの増殖及びＨＬＡ−ＤＲに対する抗体を添加することによるＥ７タンパク特異的応答のブロッキング（ｂ）、部分的にＭＨＣクラスＩＩ合致抗原提示細胞で刺激した際のＴ−ヘルパークローンの増殖（ｃ）、及びＴ−ヘルパークローンによる２４時間当りのＩＦＮγの測定による最小エピトープの詳細なマッピング（ｄ）。
【図２】
図２は、自然にプロセスされた抗原（Ａｇ）を認識する、ペプチドＥ７２２−５６ により誘導されたＴ細胞応答を示す。健常ＨＬＡ−ＤＲ３及びＤＱ２陽性血液ドナーからのＰＢＭＣを、ペプチドＥ７２２−５６で４回刺激した。バルクＴ細胞培養物の増殖（ａ）、Ｅ７２２−５６、Ｅ７３１−５２及びＥ７タンパクで刺激した場合にバルクＴ細胞培養物から誘導されたＴ−ヘルパークローンの特異的増殖（ｂ）、及びＴ−ヘルパー細胞クローンによる２４時間当りのＩＦＮγ生産の測定による最小エピトープの詳細なマッピングとＭＨＣクラスＩＩ拘束 （ｃ）。（また、図１及びそれに付随する説明を参照）。
【図３】
図３は、自然にプロセスされた抗原（Ａｇ）を認識する、ペプチドＥ７４３−７７ により誘導されたＴ細胞応答を示す。健常ＨＬＡ−ＤＲ１，３及びＤＱ２陽性血液ドナーからのＰＢＭＣを、ペプチドＥ７４３−７７で４回刺激した。バルクＴ細胞培養物の増殖（ａ）、ペプチドＥ７４３−７７及びＥ７タンパクに対するＴヘルパー細胞クローンの特異的増殖（ｂ）、部分的に合致した（ＤＲ３， ＤＱ２）ペプチドでパルスした抗原提示細胞（「ＡＰＣ」）の認識（ｃ）、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体がＴヘルパー細胞クローンのＥ７特異的増殖をブロックすることによりＨＬＡ−ＤＲ３が拘束要素であることが明らかにされた（ｄ）、及びペプチドＥ７４３−７７又はＥ７タンパクで刺激した際の、Ｔヘルパー細胞クローンによるＩＦＮγの特異的生産（ｅ）。（また、図１及びそれに付随する説明を参照）。
【図４】
図４は、ＭＡＣＳにより分離したＣＤ４５ＲＡ＋（未利用の）Ｔ細胞（左）及びＣＤ４５ＲＯ＋（記憶）Ｔ細胞（右）を、インフルエンザマトリックス１（Ｍ１）ペプチドで刺激すると、ＣＤ４５ＲＯ＋サブセットのみにおいてＩＦＮγの生産がもたらされることを示す。Ｍ１タンパクは１６個の重なり合うペプチドに分けられた。各プールは、１５アミノ酸ずつ重なり合う４つの３０アミノ酸長ペプチドから成る。
【図５】
図５は、自然にプロセスされた抗原（Ａｇ）を認識する、ペプチドＥ２３０１−３３０及びＥ２３１６−３４５により誘導されたＴ細胞応答を示す。健常ＨＬＡ−ＤＲ２陽性血液ドナーからのＰＢＭＣを、ペプチドＥ２３０１−３３０及びＥ２３１６−３４５で４回刺激した。ペプチドＥ２３０１−３３０及びＥ２３１６−３４５並びにＥ２タンパクに対するＴ−ヘルパー細胞クローンの特異的増殖（ａ）、Ｅ２３０１−３３０及びＥ２３１６−３４５ペプチドで刺激した際のＴヘルパー細胞クローンによるＩＦＮγの特異的生産（ｂ）、最小エピトープＥ２３１６−３３０の詳細なマッピング（ｃ）、及び抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体がＴヘルパー細胞クローンのＥ２特異的ＩＦＮγ生産をブロックすることによりＨＬＡ−ＤＲ２が拘束要素であることが明らかにされた（ｄ）。 （また、図１及びそれに付随する説明を参照）。
【図６】
図６は、自然にプロセスされた抗原（Ａｇ）を認識する、ペプチドＥ２３０１−３３０及びＥ２３１６−３４５により誘導されたＴ細胞応答を示す。健常ＨＬＡ−ＤＲ２，ＤＱ６（１）陽性血液ドナーからのＰＢＭＣを、ペプチドＥ２３０１−３３０及びＥ２３１６−３４５で４回刺激した。ペプチドＥ２３０１−３３０及びＥ２タンパクに対するＴ−ヘルパー細胞クローンの特異的増殖（ａ）、Ｅ２３０１−３３０ペプチドで刺激した際のＴヘルパー細胞クローンによるＩＦＮγの特異的生産（ｂ）、最小エピトープＥ２３１１−３２５の詳細なマッピング（ｃ）、及び抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体がＴヘルパー細胞クローンのＥ２特異的ＩＦＮγ生産をブロックすることによりＨＬＡ−ＤＱ６（１）が拘束要素であることが明らかにされた（ｄ）。 （また、図１及びそれに付随する説明を参照）。
【図７】
図７は、自然にプロセスされた抗原（Ａｇ）を認識する、ペプチドＥ２３３１−３６５により誘導されたＴ細胞応答を示す。健常ＨＬＡ−ＤＲ２陽性血液ドナーからのＰＢＭＣを、ペプチドＥ２３３１−３６５で４回刺激した。ペプチドＥ２３３１−３６５及びＥ２タンパクに対するＴ−ヘルパー細胞クローンの特異的増殖（ａ）、Ｅ２３３１−３６５ペプチドで刺激した際のＴヘルパー細胞クローンによるＩＦＮγの特異的生産（ｂ）、最小エピトープＥ２３４６−３５５の詳細なマッピング（ｃ）、及び抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体がＴヘルパー細胞クローンのＥ２特異的ＩＦＮγ生産をブロックすることによりＨＬＡ−ＤＲ２が拘束要素であることが明らかにされた（ｄ）。 （また、図１及びそれに付随する説明を参照）。
【図８】
図８は、自然にプロセスされた抗原（Ａｇ）を認識する、ペプチドＥ２３３１−３６５により誘導されたＴ細胞応答を示す。健常ＨＬＡ−ＤＲ１陽性血液ドナーからのＰＢＭＣを、ペプチドＥ２３３１−３６５で４回刺激した。ペプチドＥ２３３１−３６５及びＥ２タンパクに対するＴ−ヘルパー細胞クローンの特異的増殖（ａ）、最小エピトープＥ２３５１−３６５の詳細なマッピング（ｂ）、及び抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体がＴヘルパー細胞クローンのＥ２特異的ＩＦＮγ生産をブロックすることによりＨＬＡ−ＤＲ１が拘束要素であることが明らかにされた（ｃ）。 （また、図１及びそれに付随する説明を参照）。
【図９】
図９は、ＰＢＭＣのＣＤ４５ＲＯ＋（記憶）分画中に存在するＴ細胞のＥ２ペプチド特異的ＩＦＮγ生産を示す。ＰＢＭＣのＣＤ４５ＲＯ＋記憶分画は、ＭＡＣＳ技術を用いて単離した。分離後、これらの記憶Ｔ細胞を、記載したペプチドで刺激した。１０日間のインキュベーション後、細胞を回収し、洗浄し、９６ウェルＥＬＩＳＰＯＴプレート中で、ウェル当り５００００個のＰＢＭＣを、記載したペプチドで刺激した。数種類のプールに対する反応性により、健常血液ドナーから誘導されたＣＤ４５ＲＯ＋  ＰＢＭＣがＨＰＶ１６  Ｅ２特異的記憶Ｔ細胞を含む。前記プールは、以前のアッセイにより確立された、これらのペプチドの免疫原性に基づいて選択された、２つの３０アミノ酸長Ｅ２ペプチド（第１のペプチドの第１番目のアミノ酸及び第２のペプチドの最後のアミノ酸をＸ軸に示す）（ａ−ｂ）、又は、４つの３０アミノ酸長Ｅ２ペプチド（Ｅ２タンパク中の、これら４つのペプチドでカバーされる配列の最初と最後のアミノ酸を示す）（ｄ−ｆ）。ＭＲＭ： Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、破傷風トキソイド及びＣａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ抗原の混合物から成る記憶応答混合物。（また、図４及びそれに付随する説明を参照）。＊、統計学的に有意な応答（ｐ＜０．０５）。
【図１０】
図１０は、最小のＣＴＬエピトープを含む、３０μｇの３２アミノ酸長ペプチド（ＲＥＣＮＳＳＴＤＳＣＤＳＧＰＳＮＴＰＰＥＩＨＰＶＶＲＬＣＰＩＩＫＰ）で１回免疫した時のＣ５７／Ｂ１６マウスの生存を示す。マウスは、１４日後に５０万個のＡＲ５腫瘍細胞で反対側の脇腹を攻撃した。対照的に、最小の１０アミノ酸長のＣＴＬペプチド（ＳＧＰＳＮＴＰＰＥＩ）で免疫したマウスは防御されなかった。
【図１１】
図１１Ａ−Ｅ。ＨＰＶ１６ Ｅ７４３−７７ ３５−ｍｅｒで初回−追加免疫した後、ＭＨＣクラスＩＩＴヘルパー細胞がＥ７４３−７７特異的ＣＴＬ応答を増強する。マウス（Ｂ６）は、Ｅ７４９−５７ペプチド（Ａ）又はＥ７４３−７７ ３５−ｍｅｒ（Ｂ）で１回初回免疫し、又は、５０日後に同一のペプチド、すなわち、Ｅ７４９−５７ペプチド（Ｃ）又はＥ７４３−７７ ３５−ｍｅｒ（Ｄ）で追加免疫した。ＭＨＣクラスＩＩ−／−マウスは、同様にＥ７４３−７７ ３５−ｍｅｒで初回及び追加免疫した（Ｅ）。ペプチドは、ＩＦＡ中に乳化した。最後のワクチン接種から１０日後に、脾臓を回収し、培養物をＥ７４９−５７発現腫瘍セルライン１３．２で刺激した。ＦＡＣＳにおける、単離脾細胞の前方及び側方散乱パターン、ＣＤ８ （ＦＬ４−Ｈ）染色並びにＨ−２Ｄｂ−ＲＡＨＹＮＩＶＴＦテトラマー染色に基づき、脾細胞ＣＤ８＋をＨ−２Ｄｂ−ＲＡＨＹＮＩＶＴＦテトラマー陽性細胞の解析に付した。Ｙ軸には、Ｈ−２Ｄｂ−ＲＡＨＹＮＩＶＴＦテトラマー陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を示す。Ｘ軸上の各カラムは各マウスを示す。水平な線は、未利用のマウスのバックグランド応答＋標準偏差を示す（１．３１％）。
【図１２】
図１２Ａ−Ｂ。Ｅ７４３−７７ ３５−ｍｅｒをワクチン接種した後に、Ｅ７特異的Ｔヘルパー１型細胞が誘起される。５匹のマウス（Ｂ６）のセットに、ＩＦＡ（Ａ）又はＣｐＧ（Ｂ）と混合したＥ７４３−７７ ３５−ｍｅｒを皮下注射した。１０日後に脾臓を回収し、Ｅ７４３−７７ ３５−ｍｅｒでパルスしたＤ１細胞で脾細胞培養物を刺激した。生体外刺激の１週間後、個々のＴ細胞のＩＦＮγ生産を測定することにより、培養物のＣＤ４＋分画の特異性を試験した。白抜きのカラムは、パルスされていないＤ１細胞で刺激されたＣＤ４＋Ｔ−ヘルパー細胞によるバックグランドＩＦＮγ生産を示し、黒塗りのカラムは、Ｅ７４３−７７ ３５−ｍｅｒでパルスしたＤ１細胞で刺激した際のＣＤ４＋Ｔ−ヘルパー細胞によるＩＦＮγ生産を示す。２つのカラムの各セットが個々のマウスを表す。
【図１３】
図１３Ａ−Ｆ。ＤＣ活性化アジュバントと組み合わせたＥ７４３−７７ ３５−ｍｅｒの１回のワクチン接種は、高いＣＴＬ応答をもたらす。マウス（Ｂ６）を、Ｅ７４９−５７ペプチド（左側に図示する）又は３５−ｍｅｒ（右側に図示する）で初回免疫のみ行い、追加免疫を行わなかった。抗ＣＤ４０抗体（Ａ）， ＧＭ−ＣＳＦ （Ｂ）， ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＦＡ （Ｃ）， ＭＰＬ （Ｄ）及びＯＤＮ−ＣｐＧ （Ｅ）をアジュバントとして用いた。同様に、ＭＨＣクラスＩＩ−／−マウスを、Ｅ７４３−７７ ３５−ｍｅｒとＯＤＮ−ＣｐＧ（１３Ｆ） で初回免疫のみ行い、追加免疫を行わなかった。１０日後に脾臓を回収し、培養物をＥ７４９−５７発現腫瘍セルライン１３．２で７日間生体外刺激した。次に、Ｅ７４９−５７テトラマー陽性ＣＤ８＋細胞の百分率をＦＡＣＳ解析（Ｙ軸）により測定した。Ｘ軸上の各カラムは、個々のマウスを示す。水平な線は、未利用のマウスのバックグランド応答＋標準偏差を示す（１．３１％）。
【図１４】
図１４は、樹状細胞活性化剤（ＣｐＧ）（Ｂ； ｎ＝９マウス）と混合した最小のＣＴＬエピトープＥ７４９−５７、もしくは樹状細胞活性化アジュバント （ＣｐＧ）（Ｃ； ｎ＝１０マウス）と混合したＨＰＶ１６ Ｅ７４３−７７をワクチン接種した、又はワクチン接種しなかった（Ａ； ｎ＝１０マウス）、ＴＣ−１腫瘍で攻撃したマウスにおけるＨＰＶ１６  Ｅ７陽性腫瘍の増殖を示す。ワクチン接種は、全てのマウスが触診可能な小さな腫瘍を有していた時（第１０日）に行った。１４日後にマウスに追加免疫を施し、最初の免疫から６５日間にわたって腫瘍の増殖を追跡した。腫瘍の体積は免疫後７〜１０日で減少し始め、それまでに２００〜５００ｍｍ３に達していた。さらに、非免疫マウスは、腫瘍がこのような体積に達した後、２〜３日で死亡した。最小のエピトープをワクチン接種された９匹のマウスのうち６匹は腫瘍が原因となって死亡した。一方、長いペプチドをワクチン接種した１０匹のマウスのうち８匹では、腫瘍が完全に根絶された。
【図１５】
図１５は、自然にプロセスされたＡｇを認識する、ペプチドＥ２ ４６−７５で刺激されたヒトＣＤ４＋ Ｔ−ヘルパークローンの増殖を示す。健常ＨＬＡ−ＤＲ４陽性血液ドナーからのＰＢＭＣを、ペプチドＥ２４６−７５で４回刺激した。ペプチドＥ２４６−７５及びＮ末端Ｅ２タンパクに対するがＥ２タンパクのＣ末端側半分には対しない、Ｔ−ヘルパー細胞クローン４７の特異的な増殖（左）並びにＨＬＡ−ＤＲ４を介する拘束（右）を示す。異なるが、重複するペプチドＥ２６１−７５を認識するＴ−ヘルパークローン３６のペプチド特異性を下に示す。（また、図１及びそれに付随する説明を参照）。
【図１６】
図１６は、自然にプロセスされたＡｇを認識する、ペプチドＥ６１２７−１５８で誘起されたＴ細胞応答を示す。健常ＨＬＡ−ＤＲ１陽性血液ドナーからのＰＢＭＣを、ペプチドＥ６１２７−１５８で４回刺激した。バルクＴ細胞培養物の増殖（上、左）及びＩＦＮγ生産（上、右）。さらに、バルクＴ細胞培養物から誘導されたＴ−ヘルパークローンの特異的増殖（下、左）及びＩＦＮγ生産（下、右）、並びにＥ６１２７−１５８又はＥ６タンパクで刺激した時のＨＬＡ拘束を示す。（また、図１及びそれに付随する説明を参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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