(57)【要約】本発明は、例えば自己免疫疾患、移植、および動脈硬化など、その進展において炎症性進行が一役を担う疾患の治療および予防に関する、妊娠タンパク質あるいはその断片、カルシウム結合化合物を含むリポソーム、自然源に由来する、あるいはそこから抽出されたムチン断片、またはシアル酸化ルイス糖質構造を模倣する擬態化合物、またはその組み合わせの状態での、セレクチン結合活性成分の使用に関する。本発明の意味における炎症性疾患は、感染性または非感染性の性質のものになりうる。本発明は、転移による腫瘍の拡大を部分的にまたは完全に防止するための前記活性成分の使用にも関する。前記活性成分の投与は、予防的方法で、または例えば一次腫瘍の切除、あるいは生検にともなって実行されうる。本発明はさらに、腫瘍性疾患の予防のための前記活性成分の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管の活性化内皮細胞組織への、血流からの細胞の接着を阻害するための、セレクチン結合妊娠タンパク質若しくはその断片、セレクチンに結合し、かつカルシウム結合化合物を含むリポソーム、自然源から得られ、若しくは抽出されたムチン断片、またはシアル酸化ルイス型糖質構造を模倣する擬態化合物、またはそれらの組み合わせ、の使用。
【請求項２】
ＥＤＴＡを含むリポソームが使用されることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
リポソーム膜の成分として、シアル酸化ルイス型糖質構造を有するリポソームが使用されることを特徴とする請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
セレクチン結合抗体、抗体断片、ペプチド、または他のタンパク質を有するリポソームが使用されることを特徴とする請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
セレクチン結合妊娠タンパク質を有するリポソームが使用されることを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記シアル酸化ルイス型糖質構造を模倣する擬態化合物を有するリポソームが使用されることを特徴とする請求項１または２に記載の使用。
【請求項７】
妊娠タンパク質として、性腺刺激ホルモン、α−フェトプロテイン、トランスフェリン、グリコデリン、またはそれらの断片が使用されることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項８】
腫瘍細胞または白血球の接着阻害における、請求項１乃至７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
炎症性疾患の治療および予防における、セレクチン結合妊娠タンパク質若しくはその断片、セレクチンへ結合し、かつカルシウム結合化合物を含むリポソーム、自然源から得られ、若しくは抽出されたムチン断片、またはシアル酸化ルイス型糖質構造を模倣する擬態化合物、またはそれらの組み合わせ、の使用。
【請求項１０】
転移の部分的若しくは完全な防止または腫瘍性疾患の予防における、セレクチン結合妊娠タンパク質若しくはその断片、セレクチンへ結合し、かつカルシウム結合化合物を含むリポソーム、自然源から得られ、若しくは抽出されたムチン断片、またはシアル酸化ルイス型糖質構造を模倣する擬態化合物、またはそれらの組み合わせ、の使用。
【請求項１１】
活性物質として、１またはそれ以上のセレクチン結合妊娠タンパク質若しくはその断片、および薬剤的に慣用されるアジュバントを含む薬剤。
【請求項１２】
前記妊娠タンパク質が、性腺刺激ホルモン、α−フェトプロテイン、トランスフェリン、グリコデリン、またはその断片であることを特徴とする請求項１１に記載の薬剤。
【請求項１３】
活性剤として、セレクチンに結合し、かつカルシウム結合化合物を含むリポソーム、および薬剤的に慣用されるアジュバントを含むことを特徴とする薬剤。
【請求項１４】
前記リポソームが、ＥＤＴＡを含むことを特徴とする請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１５】
前記リポソームが、前記リポソーム膜の成分として、シアル酸化ルイス型糖質構造を有することを特徴とする請求項１３または１４に記載の薬剤。
【請求項１６】
前記リポソームが、セレクチン結合抗体、抗体断片、ペプチドまたは他のタンパク質を有することを特徴とする請求項１３または１４に記載の薬剤。
【請求項１７】
前記リポソームが、セレクチン結合妊娠タンパク質を有することを特徴とする請求項１６に記載の薬剤。
【請求項１８】
前記リポソームが、シアル酸化ルイス型糖質構造を模倣する擬態化合物を有することを特徴とする請求項１３または１４に記載の薬剤。
【請求項１９】
活性物質として、自然源から得られ、若しくは抽出される１またはそれ以上のムチンの断片、および薬剤的に慣用されるアジュバントを含むことを特徴とする薬剤。
【請求項２０】
活性物質として、シアル酸化ルイス型糖質構造を模倣する１またはそれ以上の擬態化合物、および薬剤的に慣用されるアジュバントを含むことを特徴とする薬剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、自己免疫疾患、移植、および動脈硬化など、その過程において炎症性プロセスが関与する疾患の治療および予防における、妊娠タンパク質またはその断片、カルシウム結合化合物を含むリポソーム、自然源から得られ、あるいは抽出されたムチン断片、またはシアル酸化ルイス型糖質構造（ｓＬｅ）を模倣する擬態化合物あるいはそれらの組み合わせ形式におけるセレクチン結合活性剤の使用に関する。本発明の意味における炎症性疾患は、感染性あるいは非感染性の疾患でありうる。
【０００２】
本発明は、腫瘍転移の部分的あるいは完全な抑制における、上述の活性剤の使用にも関し、この場合活性剤の投与は予防的となりえ、または原発腫瘍の手術的切除において、または生検中において効力を奏し得る。加えて、本発明は、腫瘍性疾患の予防における上述の活性剤の使用にも向けられている。
【０００３】
本発明に従った活性剤の使用は、ヒト用医薬品および動物用医薬品の両方に関する。
【０００４】
本発明は、これらの活性剤を含む、請求項１０乃至１８に従った薬剤にも関する。
【０００５】
（背景技術）
文献から公知であるように、シアル酸化ルイスｘ−またはシアル酸化ルイスａ−糖質リガンド（ｓＬｅｘまたはｓＬｅａ）を伴うペプチドおよびリポソームは、Ｅ−またはＰ−セレクチン（活性化血管内皮細胞によって発現される表面タンパク質）への白血球あるいは腫瘍細胞の接着を阻害する。［参照、例えばＳｈ．Ａ．ＤｅＦｒｅｅｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８（１９９６）、６１０１−６１０４；Ｒ．Ｓｔａｈｎら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．４（１９９８）、３１１−３１９］。ルイス糖質構造は、これらのセレクチンにおけるレクチンドメインに結合し、それによって血流からの細胞接着を阻害する。これも公知のように、より効率的なセレクチンの阻害は、例えば二価および三価ｓＬｅｘペプチド［（ｓＬｅｘ）２ペプチドおよび（ｓＬｅｘ）３ペプチド］で、および膜の成分として複数のルイス糖残基を有するｓＬｅｘリポソームで達成されうる。そのような糖‐セレクチン結合の多価性は、結果としてセレクチンへの細胞の接着の阻害を向上させる。
【０００６】
文献は、ｓＬｅａまたはｓＬｅｘを有するムチンが、Ｅセレクチンに結合し、およびＥセレクチンへの白血球接着あるいは腫瘍細胞の接着を阻害することも説明している［Ｋ．Ｚａｎｇら、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １８（１９９７）、１７５−１８７；Ｔ．Ｓａｗａｄａら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５７（１９９４）、９０１−９０７］。ムチンは、高分子糖タンパク質である。
【０００７】
（発明の開示）
本発明の目的は、血管の活性化した内皮細胞組織への、血流からの細胞の接着を阻害する代替化合物を見つけること、または今までに説明された従来の阻害物質と比較して、より高い特異性および親和性で活性化内皮細胞組織に結合することによって、より効率的な阻害効果を示す化合物を見つけることであった。前記化合物は、炎症性疾患や腫瘍性疾患の予防および治療における活性剤として適しているはずである。
【０００８】
驚くことに、ヒトまたは動物の妊娠タンパク質は、活性化血管内皮への、血流からの細胞の接着の、大変効率的な阻害物質であることがわかった。この機能は新しく、および以後、本発明の意味における活性と称される。これらのタンパク質は、特異性および高い親和性でセレクチンに結合する。
【０００９】
本発明の意味において、妊娠中の胎盤によって形成される前記タンパク質が妊娠タンパク質として使用される。特に、そのようなタンパク質は、ヒトの妊娠タンパク質、好ましくはＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン、ｆｏｌｌｉｃｌｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）、ＬＨ（黄体形成ホルモン、ｌｕｔｅｉｎｉｚｉｎｇ ｈｏｒｍｏｎｅ）ｈＣＧ（ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ｈｕｍａｎ ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ）、またはα−フェトプロテイン、トランスフェリン、グリコデリン、特にグリコデリンＡ（ｐｐ１４）、またはそれらの断片などの性腺刺激ホルモンである。本発明によれば、適切な糖鎖修飾を持ち、および妊娠中の胎盤によって形成される天然のタンパク質と同じ属性を示しえる、合成によって生成されたタンパク質または部分ペプチドと同様に、ヒトまたは動物の羊水あるいは血清あるいは尿から単離されたタンパク質または糖タンパク質を使用することができる。本発明の意味における妊娠タンパク質の機能的活性は、これらのタンパク質において現在までのところ未知である特異的な糖鎖修飾が原因となる。これらの例は、妊娠タンパク質ｐｐ１４を説明しており、および妊娠中の女性からの尿、血清、および羊水からのｐｐ１４が使用されることができ、本発明の意味において匹敵する活性を有することを示している。
【００１０】
驚くことに、様々なソースから得られた他の妊娠タンパク質は［ｈＣＧ、トランスフェリン、およびα−フェトプロテインに関して実施例１，２および４において示されるように（表１および実施例４の表）］、本発明の意味における様々な活性を有する。こうして、妊娠中の女性の血清から、および羊水からのｈＣＧおよびα−フェトプロテインは、本発明の意味において高い、それぞれに最高である高い活性を有する一方で、妊娠中女性からの尿ｈＣＧは、本発明の意味における低活性により適していない。羊水から取り出されたトランスフェリンは、本発明の意味における活性を唯一有する。
【００１１】
タンパク質は、蓄積、適切な分子を用いた刺激、および／または適切な糖鎖修飾を含む、所望の妊娠タンパク質またはその一部を発現する適切な遺伝子の移入によって修飾されていない、または修飾された、トロホブラスト培養などの、胎盤から抽出された妊娠関連細胞培養からも得られうる。例えば、トロホブラスト細胞培養／細胞ラインから単離されたｈＣＧは、本発明に従った使用に適している。
【００１２】
本発明に従って使用される妊娠タンパク質は、タンパク質、バクテリオファージ、またはリポソーム、好ましくはカルシウム複合化合物を含むリポソームなど、適切な生物学的あるいは化学的担体分子または粒子にも結合されうる。
【００１３】
本発明の別の実施態様において、セレクチンに結合するリポソームは、カルシウム結合化合物、特にＥＤＴＡを含み、およびリポソーム膜の成分が、血管の活性化内皮細胞組織への、血流からの細胞の接着の効率的な阻害のために使用されると、糖脂質、糖タンパク質、または糖ペプチドの状態のシアル酸化したルイス型糖質構造を持つ。本発明に従って使用されるリポソームは、好ましくは単層または多層のベシクルの状態で存在し、およびベース脂質、好ましくはホスファチジルコリン、ならびにアンカー脂質、好ましくはホスファチジルエタノールアミンからなり、およびカルシウム結合あるいは複合化合物、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を追加活性成分として含む。糖リガンドは、例えばポリエチレングリコール鎖、ペプチド、またはアルキル基となりうるスペーサーを介して、アンカー脂質に結合する。この目的で、ｓＬｅｘ−ポリエチレングリコール２０００−ジステアリルホスホエタノールアミンが好ましく使用される。ジアセチルホスフェートなどの電荷担体およびコレステロールなどの膜安定化剤が、追加膜成分として可能である。
【００１４】
そのような糖リポソームの製剤は、当業者にはよく知られている。
【００１５】
本発明によれば、カルシウム結合化合物を含み、およびセレクチンに結合する抗体、抗体断片、ペプチドまたは他のタンパク質あるいはそれらの断片、例えば妊娠タンパク質を持つリポソームを使用することも可能である。同様に、カルシウム結合化合物を含み、およびｓＬｅ構造を模倣する擬態化合物を持つリポソームを使用することができる。
【００１６】
驚くことに、本発明のリポソームは、文献で説明されている“空の”糖リポソームと比較して、顕著に高い阻害活性を示す。このように、例えば、実施例４に従ったＥＤＴＡ糖リポソームは、同じ組成であるが、ＥＤＴＡが包括されていない糖リポソームと比較して、何倍も増加した腫瘍細胞結合への阻害効果を示す。
【００１７】
本発明の別の実施態様において、自然源、例えば自己体液または細胞培養からのムチンの低分子量断片が、活性化した内皮細胞への血流からの細胞の接着を阻害するために使用される。
【００１８】
ムチンは、接着阻害剤としての臨床的使用が問題となる原因である、免疫反応を引き起こしうる高分子量糖タンパク質である。そのような問題は、シアル酸化ルイス型糖質構造を有し、および天然ムチンから調製される本発明の低分子量断片を用いることによって回避されうる。驚くことに、低分子量断片は、文献で説明されたムチンと比較して向上した阻害作用を示す。
【００１９】
例えば、本発明に従ったムチン断片は、酵素分解によって生成される。他に、本発明のムチン断片は、合成によっても作られうる。
【００２０】
適切な糖鎖修飾を含む、これらの断片の合成にも適用される、酵素分解によるそのようなムチン断片の生成は、当業者にはよく知られている。
【００２１】
本発明によれば、前記ムチンは、タンパク質、バクテリオファージまたはリポソーム、好ましくはカルシウム複合化合物を含むリポソームなどの、適切な生物学的または化学的担体分子あるいは粒子にも結合されうる。
【００２２】
さらに別の実施態様においては、本発明の目的は、ルイス型糖質構造を認識する分子により得られる化合物であって、前記ルイス型糖質構造を模倣し（いわゆる擬態化合物）、および高い特異性と親和性でセレクチンに結合する化合物を用いることによって達成される。例えば、そのような化合物は線形あるいは環状ペプチド、抗体あるいは抗体断片、または抗体断片のそれと類似した効果を有する、様々なセクションを有するタンパク質骨格のような他のタンパク質構造にもなりうる。
【００２３】
擬態ペプチド、抗体、抗体断片、様々なセクションを伴うタンパク質の状態での擬態化合物は次のステップによって作られる
ａ）これらの物質の糖質結合領域を結合し、それによってルイス型糖質を模倣するモノクローナル抗体を、ルイス型糖質（例えば、抗体またはセレクチンではないレクチン）を特異的に認識する物質を用いたハイブリドーマ技術によって調製し、または選択すること；
ｂ）ルイス型糖質を特異的に認識する物質（例えば、抗体またはセレクチンではないレクチン）を用いたファージ表示技術またはリボソーム表示技術による、ゲノム、ハイブリッド、半合成あるいは合成抗体遺伝子ライブラリからの、および免疫性あるいは非免疫性ドナーの遺伝子ライブラリからの単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂ断片などの組み換え抗体断片であって、これらの物質の糖質結合領域を結合し、それによってルイス型糖質を模倣する前記断片を調製し、または選択すること；
ｃ）ルイス型糖質を特異的に認識する物質（例えば、抗体またはレクチン）を用いたファージ表示技術またはリボソーム表示技術によって、合成ペプチド遺伝子ライブラリから、線形または環状ペプチドであって、これらの物質の糖質結合領域を結合し、それによってルイス型糖質を模倣する前記ペプチドを調製し、または選択すること；
ｄ）例えば、ルイス型糖質を特異的に認識する物質（例えば、抗体またはセレクチンではないレクチン）を用いたファージ表示技術またはリボソーム表示技術によって、合成または半合成可変的セクションを含むタンパク質であって、これらの物質の糖質結合領域を結合し、それによってルイス型糖質を模倣する前記タンパク質を表すタンパク質を、タンパク質遺伝子ライブラリから調整し、または選択すること、および
ａ乃至ｄに従って、抗体、タンパク質またはペプチドに対応する構造、または本質的に公知である方法に従って、逆またはレトロインバース（ｒｅｔｒｏｉｎｖｅｒｓｅｒ）ペプチドまたは反復構造の状態で、例えば環状化、突然変異によって、適切な部分的ペプチドまたは抽出されたペプチドに対応する構造を作る。
【００２４】
本発明によれば、擬態化合物は好ましくは擬態分子としてｓＬｅｘまたはｓＬｅａ糖質を模倣するｓＬｅｘまたはｓＬｅａ特異抗体を用いて生成される。
【００２５】
今日まで、本発明の擬態化合物は、本質的に物質としては説明されておらず、その発明的使用に関する説明もない。それらは効率的にセレクチンへの腫瘍細胞および白血球の結合を防ぎ、よって炎症性疾患および腫瘍性疾患の予防または治療に使用されうる。特に好ましい実施態様においては、本発明に従った使用のための擬態化合物は、リポソーム、好ましくはＥＤＴＡのようなカルシウム複合化合物を含むリポソームに結合される。
【００２６】
上述の通り、擬態化合物は、線形あるいは環状ペプチド−後者はしばしばより高い血清安定性を有する−または他には、相対的に安定している逆あるいはレトロインバースペプチドでありうる。抗体あるいは抗体断片、単鎖（ｓｃＦｖ）あるいはＦａｂ抗体断片も本発明に従って使用され、ヒト抗体断片は、通常、抗体を結合し、それによって短い時間で抗体を中和するマウスや他の外部抗体への免疫反応を誘引しないという点で大変効果的であり、そのために、ヒト抗体断片も繰り返し使用されうる−この事実は、炎症反応を阻害し、および転移の形成を防止し、または低減するという点で効果的である。好ましくは、本質的に分子模倣を担当するさまざまなセクション（例えば、アフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ））と結合したヒトタンパク質の基本的主鎖（骨格）を含む、他のタンパク質も利用法がある。
【００２７】
これらの分子を得る１の方法は、抗原として抗ｓＬｅｘ抗体を使用し、および対応するライブラリから抗体の糖質特異結合場所を結合する分子を単離することによって、ファージ表示技術の助けで分子を選択することである：
‐  ファージ表示技術に加え、リボソーム表示または同等の技術が、前記擬態分子を得るのに適している。タンパク質ベース擬態分子は、分子モデリングの助けで構成されることもでき、および分子生物学的方法を用いた組み換えルートで生成されうる。タンパク質に基づいていない擬態分子は、化学的方法および／または分子モデリングの組み合わせも用いて得られうる。
‐  例えば、ライブラリは、線形または環状ペプチドを表すペプチドライブラリ；合成、半合成手段によって、または健康なドナーあるいは患者からのヒト物質（ｈｕｍａｎ ｍａｔｅｒｉａｌ）から生成される抗体ライブラリ；アフィボディなどの、ランダム化された可変的領域を伴う骨格タンパク質を表すライブラリである。
‐  ｓＬｅｘ特異マウス抗体とは別に、擬態構造の生成において、本特許の意味における活性化内皮への腫瘍細胞または白血球の接着を担当するｓＬｅｘ，ｓＬｅａは他のルイス型糖質を認識する、レクチン、ヒトまたは動物由来の他の抗体あるいは抗体断片を使用することもできる。
‐  選択における生成は、大過剰の適切な糖質を用いた特異的な溶離によって達成されることができ、操作時間を低減するという効果を奏する。しかしながら、最高の親和性の擬態分子を単離するために、そのような特異的溶離は省略されることが有利である。
【００２８】
ｓＬｅｘを模倣する擬態ペプチドおよびヒトｓｃＦｖ抗体断片の選択は、より詳細に実施例において説明される。
【００２９】
擬態分子はいくつかの利点を奏する：
‐  糖質の生成は大変コストがかかり複雑である；対照的に、糖質修飾を欠いた擬態ペプチドは、例えば、バクテリオファージへの結合を用いた分子生物学的方法によって、合成または生物学的手段によってより迅速に、かつ好ましく生成されうる；抗体断片および他のタンパク質は、組み換えルートでのバクテリアまたは動物細胞でより迅速に、かつより好ましく生成されうる。
‐  模倣分子は、セレクチンへのより高い親和性を有していてもよい。よって、それらの阻害ポテンシャルはより高い。
【００３０】
さらに親和性を高めるために：例えば、ＨＳＡなどの担体タンパク質への擬態分子の多重結合によって；バクテリオファージでのバクテリアコートタンパク質を伴う融合タンパク質としての擬態分子の多重発現；脂質への擬態分子の結合およびリポソームへの組み込みによって、分子または粒子の状態での多重結合模倣実体が生成される。
【００３１】
上述のものと類似のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験での、細胞接着の望ましい阻害においては、多重擬態分子を有するこれらの分子または粒子は、ある大きさ順によって、本来のモノマールイス型糖質より優れている。
【００３２】
本発明によれば、擬態化合物は、タンパク質、バクテリオファージ、またはリポソーム、好ましくはカルシウム複合化合物を含むリポソームなどの適切な生物学的または化学的担体分子または粒子にも結合してもよい。
【００３３】
本発明の別の実施態様においては、リポソームに、好ましくはＥＤＴＡなどのカルシウム複合化合物を含むリポソームに結合したセレクチン特異抗体または抗体断片が、活性化血管内皮への血流からの細胞の接着を阻害するため有利に使用される。そのような抗体は良く知られている。例えば、モノクローナル、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから市販されているＢＢＡ２抗体が抗体として使用されうる。加えて、セレクチン特異抗体の生成は、当業者には問題がない。
【００３４】
同様に、細胞接着の阻害は、リポソームに結合され、同時にカルシウム複合化合物を含むペプチドまたはタンパク質によっても達成されうる。
【００３５】
この実施態様は以下の利点を有する：
‐  単抗体と比較して、何倍も強化された活性化内皮細胞へのルイス型糖質を発現する腫瘍細胞または白血球の阻害につながる親和効果による親和性を増加させる、結合の多重化。
‐  上述の選択技術を用いて抗体ライブラリから単離された、および原則として、モノマー抗体断片であるヒトｓｃＦｖまたはＦａｂが直接使用されうる。これは、ヒト抗体断片への免疫反応が低減されるという点で効果的である。
‐  リポソーム膜での組み込み。膜における結合可能リガンドの横の可動性によって、効果的な結合のためのセレクチンの配列の調整が可能である。対照的に、固い主鎖（例えば、固いタンパク質構造）へリガンドを結合する時、立体障害が起こるかも知れず、阻害の効果の低減を生じる可能性がある。
【００３６】
上述のような細胞接着の阻害によって、上述の化合物は、その過程において炎症の進行が伴う疾患の予防および治療における活性剤として素晴らしく適している。前記化合物は、それだけで、または相乗的組み合わせで使用されうる。明らかに、本発明に従った化合物の効果は、適切な公式化によって、例えばリンフォカイン、サイトカイン、ケモカイン、またはアジュバントなどの免疫刺激または免疫阻害化合物を加えることによってさらに向上されうる。
【００３７】
上述の活性物質に基づいた薬剤は、薬学上従来のアジュバントを用いたガレヌス技術（ｇａｌｅｎｉｓｃｈｅｎ Ｔｅｃｈｎｉｋ）でよく知られる従来の方法に従って生成される。
【００３８】
特に、本発明の化合物は次の使用法がある
ａ）  リスクの高い状況、例えば腫瘍の手術または腫瘍が疑われる場合の生検での転移を防止し、または低減するための予防；
ｂ）  腫瘍性疾患が疑われる場合に転移を防止し、または低減するための予防；ｃ）  腫瘍性疾患の場合に転移を防止し、または低減するための予防；
ｄ）  微小残存腫瘍性疾患に関連する手術の場合に転移を防止し、または低減するための予防；
ｅ）  自己免疫疾患の治療；
ｆ）  手術、移植、虚血および再潅流に伴う組織損傷の低減；
ｇ）  妊娠初期段階での疾患の治療；
ｈ）  アテローム性動脈硬化の血管変化、例えば再狭窄の低減。
【００３９】
（発明を実施するための最良の形態）
限定的なことを意図せずに、本発明は以下の実施例を参照してより詳細に説明されるだろう。
【００４０】
実施例１
羊膜ｈＣＧの単離およびヒトのへその緒（ＨＵＶＥＣ）の血管からＥセレクチンへの、および活性化内皮細胞へのＨｅｐＧ２肝臓癌細胞の結合の阻害の実施例を用いた細胞接着を阻害する能力の試験。
【００４１】
実施例１ａ：羊膜液からのｈＣＧの単離
ｈＣＧは、肥沃な卵子の着床に続き、合胞体栄養細胞によって形成され、および妊娠した女性の血液循環および羊膜液へと分泌される。染色体分析（５００ｍｌ）からの羊膜液サンプルは、ＰＢＳに対して透析される。ｈＣＧのβサブユニットに対する、１ｍｇのマウスｍＡｂウサギ抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ＤＡＫＯ（ウサギ抗ヒト絨毛性ゴナドトロピン）は、対応する量のＣＮＢｒ セファロースに結合する。抗ｈＣＧ  セファロースは、ｈＣＧの免疫吸着のために使用されるクロマトグラフィー・カラムへ入れられる。ｈＣＧは、１００ｍＭクエン酸塩緩衝液を用いて単離され、さらにＲｅｓｏｕｒｃｅ−Ｑでの陰イオン交換クロマトグラフィを用いたＦＰＬＣによって精製される。ｈＣＧは、１のα−および１のβ−サブユニットからなる；インタクトｈＣＧに加えて、トロホブラストもフリーαおよびβ鎖を形成する。フリーβ鎖は、インタクトｈＣＧの約２乃至３％を占め、後者と同様に、妊娠１０週目には、その最大値に到達する。対照的に、フリーα鎖は妊娠中継続的に増加し、第３トリメノン（Ｔｒｉｍｅｎｏｎ）でその最大値に到達する。ｈＣＧのβ鎖に対する免疫吸着カラムを用いて、完全な分子およびフリーβ鎖はこのように単離される。フリーα鎖は、ｈＣＧのα鎖に対するモノクローナル抗体を載せられた第二抗体カラムを用いて単離される。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５でのゲルろ過を用いて、フリーβ鎖は、インタクトで完全な分子から分離され、および単離される。調製物の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色を用いて調べられる。
【００４２】
実施例１ｂ：接着阻害試験の実施
後述の接着試験は、活性物質を試験するためｉｎ ｖｉｔｒｏで用いられる。この目的のため、組み換えＥセレクチンが９６ウェルタイタープレートに固定されるか、またはヒトへその緒（ＨＵＶＥＣ）の血管からの活性化した内皮細胞上のＥセレクチンの発現が、サイトカインでの刺激によって誘導される。ＨＵＶＥＣ内皮細胞の培養も、９６ウェルマイクロタイタープレートで実行される。
【００４３】
Ｅセレクチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（５μｇ／ｍｌ）は、一晩、摂氏４度でインキュベートされることによって固定される。プレートは、カルシウム含有リン酸緩衝液（Ｃａ−ＰＢＳ）で洗浄され、および室温で１時間、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックされる。羊膜ｈＣＧ（０．００５乃至１ｎｍｏｌ／ウェル）が加えられ、および室温で３０分間あらかじめインキュベートされる。その後、Ｅセレクチンに接着する１×１０５ ５１Ｃｒ標識したＨｅｐＧ２肝臓癌細胞が加えられ、これは室温でさらに３０分間インキュベートされる。それに続いて、非結合細胞は、Ｃａ−ＰＢＳで３回洗浄することによって除去され、および結合細胞は、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液での溶解に続き、放射能測定によって定量化される。コントロールとして、Ｅセレクチン阻害モノクローナル抗体ＢＢＡ２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）の糖質結合領域、試験システムからカルシウムを除去するためのＥＤＴＡ、および選択的に結合するが、親和性が低い単価四糖シアル酸化ルイスｘ（ｓＬｅｘ）が、一連の試験において平行に使用され、および運ばれる。
【００４４】
ＨＵＶＥＣｓは、新鮮なヒトへその緒の血管から単離され、第３継代まで使用され、および試験のための９６ウェルタイタープレートで集密まで培養される。ＨＵＶＥＣでの発現は、ウェルごとに０．２ｎｇのＩＬ−１βを加えることによって誘導され、４時間後にその最大値に到達する。この点で、固定されたＥセレクチンに関するものと類似の、接着試験／接着阻害試験が実行される。
【００４５】
表１は、両方の試験システムにおける様々なソースから単離されたｈＣＧの有効性を示す。ＩＣ５０値（５０％の接着阻害に対する阻害剤の濃度）が表示されている。
【表１】
2004534722.tif 000002
【００４６】
明確に、尿からのｈＣＧではなく、羊膜、血清、およびトロホブラスト培養からのｈＣＧは、ｓＬｅｘよりも、少なくとも１０４倍効率的である。
【００４７】
実施例２：  血清からのｈＣＧの単離および実施例１ｂと類似の試験
妊娠期間中、ｈＣＧは継続的に血清へと分泌され、第１トリメノンでその最大値に到達する。第１トリメノンの妊娠中の女性から貯留した５００ｍｌの血清は、Ｈ２Ｏに対して、それに続いて２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４に対して２回透析される。血清ｈＣＧは、羊膜ｈＣＧの単離と類似して単離される。
【００４８】
実施例１ｂに続く接着阻害試験において、羊膜ｈＣＧと比較して３倍少ない効果ではあるが、単価四糖ｓＬｅｘに対して１０４倍の増加が測定される。図１は、血清ｈＣＧ濃度の関数として、ＨｅｐＧ２細胞接着の阻害を示す。
【００４９】
実施例３：グリコデリンＡ（羊膜ＰＰ１４）の単離および実施例１ｂに類似した試験
羊膜液からのグリコデリンＡのプレ精製は、本質的に、貯留された羊膜液サンプルが水に対して、その後に５０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３に対して透析されるプロトコルに従って進行する。この生成物は、ＤＥＡＥ−セファロースカラムでクロマトグラフィによって分離される。グリコデリンＡを含むフラクションはさらにＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラムで、その後、オクチル−セファロース（Ｏｃｔｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムで精製される。オクチル−セファロースでの、疎水性相互作用クロマトグラフィのこのステップに続き、溶媒として、イソプロパノール／リン酸緩衝液混合物を使用して、グリコデリンＡが、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ−Ｐｈｅカラムで精製される。
【００５０】
他に、グリコデリンＡは、免疫吸着クロマトグラフィを用いて精製されうる。この目的のために、１ｍｇの抗グリコデリンＡ  ｍＡｂ（マウス抗ヒトグリコデリン、ＤＮＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ  Ｎｏｒｄ  ＧｍｂＨ）がＣＮＢｒ−セファロースに結合される。前記物質は、５ｍｌのクロマトグラフィ・カラムに入れられる。こうして作られた免疫吸着カラムは、２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．０）に対して透析された５００ｍｌの羊膜液を載せられる。グリコデリンＡは、１００ｍＭのクエン酸緩衝液で溶離される。調製の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色を用いて調べられる。
【００５１】
実施例１ｂに類似した接着阻害試験において、羊膜ｈＣＧに匹敵する効率性が測定される。この活性は、妊娠女性の尿、血清および羊膜液からのｐｐ１４に匹敵する。図２は、グリコデリンＡ濃度の関数として、活性ＨＵＶＥＣへのＨｅｐＧ２細胞接着の阻害を示す。
【００５２】
実施例４：接着ブロッカーとしての様々なソースからの妊娠タンパク質の試験
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【００５３】
トロホブラスト培養ラインが購入され、および遺伝子操作は行わなれなかった。単離は、実施例１乃至３の妊娠タンパク質の生成に類似して達成される。
【００５４】
実施例５：ＥＤＴＡを含むグリコリポソームの調製および試験
実施例５ａ：
ホスファチジルコリン（ＰＣ；７．４４ｍｇ）、シアル酸化ルイスｘポリエチレングリコール（２０００）−ジステアリルホスホエタノールアミン（ｓＬｅｘ−ＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ；１．２６ｍｇ）、およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ；０．２２ｍｇ）が、クロロホルム溶液として混合され、溶媒は回転エバポレータ上で除去され、および得られた脂質フィルムは、完全な乾燥に続き、１ｍｌのＤＡＴＡ溶液に再懸濁される。数時間の強い攪拌の後、ホスフェート緩衝等張食塩溶液（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）での数回の洗浄およびその後の遠心分離の後に使用されうる多層ベシクル（ＭＬＶ）が得られる。
【００５５】
実施例５ｂ：
単層ベシクル（ＳＵＶ）を作るために、平均ベシクル直径が約１００ｎｍである均質な溶液に到達するまで、実施例５ａからのＭＬＶは超音波分解される。遠心分離（１６，０００ｇ；１０分）に続き、リポソームを含む上清が除去され、使用される。過剰なＥＤＴＡは、ゲル・クロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０）によって除去され、それに続く大きさならびに成分の決定は、実施例４ａに記載のように達成され、リポソーム群に直径８５ｎｍ（ＰＩ  ０．２）を与える。
【００５６】
実施例５ｃ：
単層ベシクル（ＬＵＶＥＴ）を作るために、平均ベシクル直径が約１００ｎｍである均質な溶液に到達するまで、実施例５ａからのＭＬＶは適切な方法で（例えば、小孔直径１００ｎｍの２のポリカーボネート・フィルタを通す、ＬｉｐｏｓｏＦａｓｔ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒを用いて）繰り返し押し出される。過剰なＥＤＴＡはゲル・クロマトグラフィ（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０）によって除去される。ＰＣおよびＰＥの成分はＨＰＴＬＣを用いて決定される。準弾性光散乱測定法による大きさ決定は、直径１１４ｎｍ（ＰＩ  ０．０２）を与える。リポソームＰＣの成分は、使用されるＭＬＶ懸濁のおよそ８５％である。
【００５７】
実施例５ｄ：実施例５ｃに従ってＥＤＴＡグリコリポソームを用いて接着阻害試験を実施する
マイクロタイタープレートに固定されたＥセレクチン（トリス／カルシウム含有緩衝液中５μｇ／ｍｌで、５０μｌ）は、実施例５ｃのリポソームを加えられ、その後ウェルごとに１００，０００の５１クロム標識されたＭＴ３乳癌細胞を加えられ、それから摂氏４度で１時間インキュベートされる。非結合細胞は洗い流され、それからＮａＯＨでの溶解に続き、結合細胞の数が、放射能測定を介して定量化される。腫瘍細胞結合の阻害は９５．６％である。こうして、阻害は、同じ組成であるがＥＤＴＡを伴わないリポソームと比較して、６４％向上する。
【００５８】
実施例５ｅ
１×１０５のＨＵＶＥＣ細胞は、ＴＮＦ−αで刺激され、そして摂氏３７度で４時間後、実施例５ｃからのリポソームを加えられる。それに続き、ウェルごとに１００，０００の５１クロム標識されたＭＴ３乳癌細胞が加えられる。摂氏４度で１時間後、非結合細胞が洗い流され、それからＮａＯＨでの溶解に続き、結合細胞の数が放射能測定を介して定量化される。腫瘍細胞結合の阻害は６１．６％である。このように、阻害は、同じ組成であるがＥＤＴＡを伴わないリポソームと比較して、３７．８％向上した。
【００５９】
実施例６：
擬態分子
ファージ表示技術を用いた抗体遺伝子ライブラリからのｓＬｅｘ模倣ヒト組み換え抗体断片の調製
ヒト単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を表す、２の異なる合成抗体遺伝子ライブラリが使用された。１の抗体遺伝子ライブラリは、ペプチド断片（リンカー）で結合され、およびファージコートタンパク質（ｐＩＩＩ）に共有結合している、ランダム化された超可変領域を部分的に伴う、ヒト抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の様々な組み合わせを伴う１０１０より多いファージからなる。それは、別の抗体遺伝子ライブラリから抽出される（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ａ．ら、１９９４年、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３、３２４５−３２６０）。第二の、より小さい遺伝子ライブラリは、抗体断片の活性フォールディングのためにあらかじめ選択されたｓｃＦｖからなる。第一のライブラリは、Ｇ．Ｗｉｎｔｅｒ博士の研究室によって、および第二のライブラリはＩ．Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ博士の研究室によって提供された（いずれもＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）。ＫＭ１３ヘルパーファージでのタンパク質分解選択の方法（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｐ．およびＷｉｎｔｅｒｓ，Ｇ．，Ｆｏｌｄｉｎｇ  ＆  Ｄｅｓｉｇｎ  ３，３２１，１９９８）を用いた２乃至３の実行（ファージパニング）で、特異ファージが選択された。精製されたｓＬｅｘ特異マウス抗体ＣＳＬＥｘ１は抗原として使用された（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。３μｇの抗体が、摂氏４度で一晩、それに続きＲＴで１時間、２００μｌの抗マウスＩｇＧ  Ｄｙｎａｂｅａｄ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｄｙｎａｌ，  Ｈａｍｂｕｒｇ）に結合された。洗浄されたビーズはその後、ＲＴで１時間、細胞培地において３０％ＦＣＳでブロックされ、そしてＲＴで２．５時間、抗体ライブラリからの５×１０１２ファージでインキュベートされた。厳重な洗浄ステップ（２０回までＰＢＳ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、その後２０回ＰＢＳ）に続き、抗体の結合場所に結合しているｓｃＦｖファージは、１００μｇ／ｍｌのｓＬｅｘ−ポリアクリルアミド共役（Ｓｙｎｔｈｅｓｏｍｅ）を用いて特異的溶離を受け、それからトリプシンで処理された（タンパク質分解選択の方法）。他に、ｓｃＦｖファージは、トリプシン処理によって直接溶離され、ｓＬｅｘ糖質による特異的な溶離はない（タンパク質選択の方法）。選択を実行する間、溶離されたファージは、ヘルパーファージを用いてバクテリアにおいて育てられ、それから再選択された。２乃至３の選択実行が実行された。
【００６０】
ペプチド遺伝子ライブラリ模倣ｓＬｅｘを用いたペプチドの識別
ｓｃＦｖ抗体断片を生成する実施例に類似して、可変的な長さのランダム化ペプチド（７乃至１２のアミノ酸；硫黄ブリッジを介したペプチドの環状化を可能にするフランキングまたは複数の体内システインを伴い、および伴わない；Ｏｌｉｇｉｎｏ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２９０４６，１９９７）を表し、かつファージコートタンパク質ｐＩＩＩに結合した１０６乃至１０８の様々な短いペプチドを有する、様々な独自のペプチド遺伝子ライブラリからのいくつかの選択実行において、特異的結合ペプチドが得られた。線形ペプチドと比較して、環状ペプチドは、より高い安定性と、および部分的により高い親和性を有することが知られている。選択および試験は、３の選択実行を用いて、シアル酸化ルイスｘ模倣ｓｃＦｖの生成のように実行された。
【００６１】
擬態ペプチドおよび擬態ｓｃＦｖの特異性試験
選択されたペプチドおよび抗体断片は、様々なｓＬｅｘ特異抗体およびＥセレクチンへの、および制御のための他のＩｇＭならびにＩｇＧ抗体への結合に関して、ＥＬＩＳＡ試験で試験をされた。この目的のため、９６ウェルプレートでのポリエチレングリコール析出によりあらかじめ精製された、ファージ結合型のペプチドおよび抗体断片が使用された。潜在的な擬態ペプチドおよび擬態ｓｃＦｖは、ＥＬＩＳＡ阻害試験において、シアル酸化ルイスｘポリアクリルアミドへの、ｓＬｅｘ特異抗体の結合の特異的阻害に関して試験された。シアル酸化ルイスｘポリアクリルアミド（０．５μｇ／ウェル）は乾燥によりＥＬＩＳＡプレートに固定され、および合成されたペプチドあるいは生成されたｓｃＦｖが単独で、あるいはファージと結合した形式で、擬態ペプチドまたは擬態ｓｃＦｖによるモノクローナル抗体の結合が、濃度依存の方法で阻害された。
【００６２】
実施例７
擬態ペプチドおよび擬態ｓｃＦｖによるＥセレクチンへの腫瘍細胞の結合の阻害
マイクロタイタープレートに固定されたＥセレクチン（トリス／カルシウム含有緩衝液において５μｇ／ｍｌで５０μｌ）は、その表面上に、多くの、しかし詳細に定義された数ではないコピーがある、ファージコートタンパク質ｐＶＩＩＩを伴う融合タンパク質の状態で、実施例５の擬態ペプチドを有するバクテリオファージを加えられ、それに続きウェルごとに１００，０００の５１クロム標識されたＭＴ３乳癌細胞を加えられ、それから摂氏４度で１時間インキュベートされる。非結合細胞は洗い流され、それからＮａＯＨでの溶解に続き、結合細胞の数が放射能測定を介して定量化される。グリコリポソームでの試験と類似の方法で、擬態ペプチドによって、腫瘍細胞結合の阻害はほぼ完全である。
【００６３】
本発明は、自己免疫疾患、移植、および動脈硬化など、その過程において炎症性の進行が関与する疾病の治療ならびに予防における、妊娠タンパク質あるいはその断片、カルシウム結合化合物を含むリポソーム、自然源から得られ、あるいは抽出されたムチン断片、またはシアル酸化ルイス型糖質構造（ｓＬｅ）を模倣する擬態化合物、またはそれらの組み合わせの状態でのセレクチン結合活性剤の使用に関する。本発明の意味における炎症性疾患は、感染性または非感染性の疾患であり得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
血清ｈＣＧによるＨｅｐＧ２細胞接着の阻害を示す。
【図２】
羊膜ＰＰ１４による、活性化ＨＵＶＥＣへのＨｅｐＧ２細胞接着の阻害を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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