(57)【要約】本発明は、オートロガス（自己）免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する免疫化の方法を開示する。本発明は、特に核酸ワクチン注射または生ワクチン注射を使い、特にＢ細胞生産オートロガスＩｇＥをダウン−レギュレートする、細胞毒Ｔリンパ球を誘導する方法を特に開示する。また、オートロガスＩｇＥと応する抗体を誘導する方法と組み合わした抗体およびＩｇＥに特異的なＣＴＫ反応を誘導する方法を開示する。本発明は、特異的な免疫原性タンパク質構築物、それらをエンコードする核酸と様々な製剤、ならびにベクターおよび形質転換体宿主細胞を含むワクチンを処方するための手段も開示する。
2004508028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−オートロガスＩｇＥ由来のＣＴＬエピトープの少なくとも１つ、および／またはオートロガスＩｇＥ由来のＢ細胞エピトープの少なくとも１つ、および
−動物に対して外来である第一Ｔヘルパー細胞エピトープ（ＴＨエピトープ）の少なくとも１つ
の免疫学的に有効な量を、ヒトを含む動物の免疫系の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって同時に提示させることからなる、動物におけるオートロガス免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対して免疫反応を誘導する方法。
【請求項２】
−動物のＩｇＥ由来のＣＴＬエピトープの少なくとも１つ、および
−動物に対して外来である第一Ｔヘルパーリンパ球（ＴＨ）エピトープの少なくとも１つ
を、適当な抗原提示細胞（ＡＰＣ）により、ヒトを含む動物で同時に提示させることからなる、オートロガスＩｇＥを生産する細胞に対して特異的細胞毒Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を誘導することによる、動物におけるオートロガスＩｇＥをダウン−レギュレートする方法。
【請求項３】
上記ＣＴＬエピトープの少なくとも１つが提示される場合、ＡＰＣ表面上でＭＨＣクラスＩ分子と結合している、および／または、上記第一外来ＴＨエピトープの少なくとも１つが提示される場合、ＡＰＣ表面上でＭＨＣクラスＩＩ分子と結合している請求項１または２による方法。
【請求項４】
ＡＰＣが、樹状細胞またはマクロファージである先の請求項のいずれか１つによる方法。
【請求項５】
ＣＴＬまたはＢ細胞エピトープのＡＰＣ、および第一外来ＴＨエピトープによる提示が、少なくともＣＴＬエピトープおよび第一外来ＴＨエピトープを含むＩｇＥのアミノ酸配列の変異体からなるＩｇＥの第一の類似体の少なくとも１つで、動物の免疫系を提示することにより行われる先の請求項のいずれか１つによる方法。
【請求項６】
少なくとも第一類似体が、オートロガスＩｇＥの重鎖および／または軽鎖の一定のドメイン由来の公知および想定されるＣＴＬエピトープの実質的なフラクションを含む請求項５による方法。
【請求項７】
類似体のアミノ酸配列中の公知および想定されるＣＴＬエピトープの実質的なフラクションが、オートロガスＩｇＥの重鎖および／または軽鎖の一定のドメインにおいて、公知および想定される全てのＣＴＬエピトープを認識するＭＨＣ−Ｉハプロタイプの少なくとも９０％で認識される請求項６による方法。
【請求項８】
オートロガスＩｇＥの重鎖および／または軽鎖の一定のドメインの公知の、実質的に全てのＣＴＬエピトープが第一類似体中に存在し、および／または、オートロガスＩｇＥの重鎖および／または軽鎖の一定のドメインの想定される、実質的に全てのＣＴＬエピトープが少なくとも第一類似体中に存在する請求項５〜７のいずれか１つによる方法。
【請求項９】
第一類似体の少なくとも１つが、オートロガスＩｇＥの構造の修飾からなる部分を含み、その結果、第一類似体を使った動物の免疫化がオートロガスＩｇＥに対して、動物で抗体の生産を誘導する請求項５〜８のいずれか１つによる方法。
【請求項１０】
オートロガスＩｇＥの構造の修飾を含む、オートロガスＩｇＥの第二類似体の少なくとも１つの免疫学的に有効な量を動物の免疫系に対して提示することからなり、その結果、第二類似体を使った動物の免疫化が、オートロガスＩｇＥに対して抗体の生産を誘導する先の請求項のいずれか１つによる方法。
【請求項１１】
修飾が、第二外来ＴＨエピトープの少なくとも１つが第二類似体で誘導されることからなる請求項９または１０による方法。
【請求項１２】
第一および／または第二類似体が、オートロガスＩｇＥが、第一および／または第二類似体に対して動物で誘導される抗体によってＦｃεＲ−保持細胞に結合した交差の結果として、アナフィラキシー反応を動物で誘導できない請求項６〜１１のいずれか１つによる方法。
【請求項１３】
第一および／または第二類似体が、オートロガスＩｇＥの重鎖および／または軽鎖の一定のドメインのＢ細胞エピトープの実質的なフラクションからなる請求項６〜１２のいずれか１つによる方法。
【請求項１４】
変異体および／または修飾体が、アミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含む請求項６〜１３のいずれか１つによる方法。
【請求項１５】
変異体および／または修飾体が、
−抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対して類似体を標的化させる第一部分の少なくとも１つが、第一および／または第二類似体中に含まれている、および／または
−免疫系を刺激する第二部分の少なくとも１つが、第一および／または第二類似体中に含まれている、および／または
−類似体の免疫系への提示を最適化する少なくとも１つの第三部分が、第一および／または第二類似体中に含まれている
ことからなる請求項６〜１４のいずれか１つによる方法。
【請求項１６】
変異体および／または修飾体が、オートロガスＩｇＥのＢ細胞エピトープの少なくとも１つおよび／またはＣＴＬエピトープの少なくとも１つの複製を含む請求項５〜１５のいずれか１つによる方法。
【請求項１７】
Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つが、ＦｃεＲ結合領域に含まれるか、またはそれを干渉するか、および／または、Ｂ細胞結合ＩｇＥの膜アンカー領域に含まれる先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項１８】
第一および／または第二外来ＴＨエピトープが免疫優勢である、および／または、第一および／または第二外来ＴＨエピトープが乱交雑である先の請求項のいずれか１つによる方法。
【請求項１９】
第一および／または第二類似体が、
−ＩｇＥのＭＩＧＩＳフラグメントの少なくとも２コピーを含むアミノ酸配列（ＭＩＧＩＳフラグメントの少なくとも２つが外来ＴＨエピトープの少なくとも１つで分離される）、
−ＣＨ１またはＣＨ２ドメイン中にＮ末端、およびＣＨ４ドメインまたはＭＩＧＩＳフラグメント中にＣ末端を有するＩｇＥのフラグメントを含むアミノ酸配列（外来ＴＨエピトープの少なくとも１つが挿入されるかまたは内部置換される、例えば、ループＢＣ、ＤＥ、ＦＧ、またはＣＨ４ドメインに面したループのいずれか１つでの内部置換）、
−ＣＨ２ドメイン中にＮ末端、およびＣＨ３中にＣ末端を有するＩｇＥのフラグメントからなるアミノ酸配列（外来ＴＨエピトープの少なくとも１つが挿入されるか、または内部置換されている、例えば、ループＢＣ、ＤＥ、ＦＧ、またはＣＨ４ドメインに面したループのいずれか１つでの内部置換）、
−少なくとも１つの外来ＴＨエピトープが挿入されたか、または内部置換された本質的に単一ＩｇＥドメインからなるアミノ酸配列、
−ＩｇＥループ領域のいずれか１つの少なくとも１つ、および／またはリンカー領域のいずれか１つの少なくとも１つを含むアミノ酸配列（外来ＴＨエピトープの少なくとも１つは、２つのＩｇＥ由来領域に分離する）、
−ＣＨ３ドメインを含むアミノ酸配列（外来ＴＨエピトープの少なくとも１つは、ＣＨ３ドメイン中のβ−シート構造を実質的に破壊するために導入される）、および
−ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループとＣＨ４ドメインに面するループ中のアミノ酸配列
からなる群から選択される、請求項６〜１８が請求項５に従属する限りにおける、請求項５〜１８のいずれか１つによる方法。さらに、その様な核酸構築物について得られた発現生産物は、本発明の具体例であると同様に、不活性またはＴＨエピトープ含有リンカーで共有結合された何れかの多量体である。
【請求項２０】
第一および／または第二外来ＴＨエピトープが、天然のＴＨエピトープおよび人工のＭＨＣ−ＩＩ結合ペプチド配列から選択される請求項１１〜１９のいずれか１つによる方法。
【請求項２１】
天然のＴＨエピトープが、破傷風トキソイド、例えばＰ２またはＰ３０、ジフテリアトキソイドエピトープ、インフルエンザ血球凝集素エピトープおよびピー・ファルシパルムＣＳエピトープから選択される請求項２０による方法。
【請求項２２】
第一および／または第二ＴＨエピトープおよび／または第一および／または第二および／または第三部分が、
−オートロガスＩｇＥのアミノ酸配列またはそのサブ配列での適切な化学基に共有または非共有結合した側鎖基、および／または
−オートロガスＩｇＥ由来のアミノ酸配列に対する融合パートナー
の形態で存在する請求項１１〜２１のいずれか１つによる方法。
【請求項２３】
第一部分が、ＡＰＣ上で受容体が存在する炭水化物、例えばマンナンまたはマンノースのようなＡＰＣ特異的な表面抗原に、実質的に特異的な結合パートナーであるか、または第一部分がハプテンである請求項２２による方法。
【請求項２４】
第二部分が、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、ＦＬｔ３Ｌ、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはその有効部分；ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＣ７０、ＧＲＰ９４およびカルレチクリン（ＣＲＴ）から選択されるヒートショックタンパク質またはその有効部分；またはホルモンから選択されるサイトカインである請求項１５〜２３のいずれか１つによる方法。
【請求項２５】
第三部分が、パルミトイル基、ミリスチル基、ファルネシル基、ゲラニル−ゲラニル基、ＧＰＩ−アンカー及びＮ−アシルジグリセリド基のような脂質である請求項１５〜２４のいずれか１つによる方法。
【請求項２６】
第一および／または第二類似体が、オートロガスＩｇＥの重鎖および／または軽鎖の一定のドメインの全体にわたる三次構造を、実質的に有している請求項５〜２５のいずれか１つの請求項による方法。
【請求項２７】
ＡＰＣによる提示を、第一類似体の少なくとも１つの免疫学的に有効な量を動物に投与することで行う請求項５〜２６のいずれか１つによる方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの第二類似体の免疫学的に有効な量も投与される請求項２７による方法。
【請求項２９】
上記第一および／または第二類似体の少なくとも１つが、医薬的および免疫学的に容認しえる担体および／またはビヒクルと、任意にアジュバントとで処方される請求項２７または２８による方法。
【請求項３０】
上記アジュバントが、少なくとも第一および／または第二類似体のＡＰＣ、例えば樹状細胞による取り込みを促進する請求項２９による方法。
【請求項３１】
アジュバントが、免疫標的化アジュバント；免疫調節アジュバント、例えば毒素、サイトカインおよびマイコバクテリア誘導体；油製剤；ポリマー；ミセル形成アジュバント；サポニン；免疫刺激複合体マトリクス（ＩＳＣＯＭマトリクス）；粒子；ＤＤＡ；アルミニウムアジュバント；ＤＮＡアジュバント；γ−イヌリン；およびカプセル化アジュバントからなる群より選択される請求項３０による方法。
【請求項３２】
サイトカインが請求項２４で定義されるとおりであるか、その有効部分であり、毒素がリステリオシン（ＬＩＯ）、脂質Ａ（ＭＰＬ、Ｌ１８０．５／Ｒａ１ＬＰＳ）および非耐熱性エンテロトキシンからなる群から選択され、マイコバクテリア誘導体がムラミルジペプチド、完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩおよびＴＤＭ及びＴＤＥのようなトレハロースジエステルからなる群より選択され、免疫標的化アジュバントがＣＤ４０リガンド及びＣＤ４０抗体、又はその特異的結合フラグメント、マンノース、Ｆａｂフラグメント及びＣＴＬＡ−４からなる群より選択され、油製剤がスクアレンまたは不完全フロイントアジュバントからなり、ポリマーがデキストラン、ＰＥＧ、澱粉、マンナン及びマンノース等の炭水化物；プラスチックポリマー自体；及びラテックスビーズ等のラテックスからなる群より選択され、サポニンがＱｕｉｌＡ及びＱＳ２１のようなキラヤサポニンであり、粒子がラテックスまたはデキストランからなる請求項３１による方法。
【請求項３３】
経口経路および、真皮内、真皮下、表皮内、表皮下；腹腔、口腔内、舌下、硬膜外、脊髄、肛門および頭蓋内経路のような非経口経路より選択される経路を通した投与を含む請求項２７〜３２のいずれか１つによる方法。
【請求項３４】
一年に少なくとも１回の投与、例えば一年に少なくとも２、３、４、５、６および１２回の投与を含む請求項２７〜３３のいずれかによる方法。
【請求項３５】
提示が、ＣＴＬエピトープの少なくとも１つおよびＴＨエピトープの少なくとも１つをエンコードして発現する核酸フラグメントを担持する非−病原性微生物またはウイルスを動物へ投与することで行われる請求項１〜４のいずれか１つによる方法。
【請求項３６】
提示が、少なくとも第一類似体をエンコードして発現する核酸フラグメントの少なくとも１つを担持する非−病原性微生物またはウイルスを、動物へ投与することで行われる請求項５〜１４のいずれか１つによる方法。
【請求項３７】
ＴＨエピトープおよび／または第一および／または第二および／または第三部分が、オートロガスＩｇＥ由来のアミノ酸配列に対する融合パートナーの形態で存在し、提示が、第一および／または第二類似体をエンコードして発現する核酸フラグメントの少なくとも１つを担持する非−病原性微生物またはウイルスを、動物へ投与することで行われる請求項１５〜２６のいずれか１つによる方法。
【請求項３８】
提示が、第二類似体を少なくともエンコードして発現する核酸フラグメントの少なくとも１つを担持する非−病原性微生物またはウイルスを、動物へ投与することで行われる請求項１１〜１４または３６のいずれか１つによる方法。
【請求項３９】
非−病原性微生物またはウイルスを、動物に一回投与する請求項３８による方法。
【請求項４０】
提示が、ＣＴＬエピトープの少なくとも１つおよび／またはＢ細胞エピトープの少なくとも１つ、ならびに第１外来ＴＨエピトープの少なくとも１つをエンコードして発現する核酸フラグメントの少なくとも１つを、ＡＰＣにインビボで導入することで行われる請求項１〜４のいずれか１つによる方法。
【請求項４１】
提示を、第一類似体をエンコードして発現する核酸フラグメントの少なくとも１つを、ＡＰＣにインビボで導入することで行う請求項５〜１４のいずれか１つによる方法。
【請求項４２】
ＴＨエピトープおよび／または第一および／または第二および／または第三部分が、オートロガスＩｇＥ由来のアミノ酸配列に対して融合パートナーの形態で存在し、提示が、第一および／または第二類似体をエンコードして発現する核酸フラグメントの少なくとも１つをＡＰＣにインビボで導入して行われる請求項１５〜２６のいずれか１つによる方法。
【請求項４３】
さらに、第二類似体をエンコードして発現する核酸フラグメントの少なくとも１つのインビボでのＡＰＣへの導入からなる請求項１１〜１４および４１のいずれか１つによる方法。
【請求項４４】
提示を、一方がＣＴＬエピトープの少なくとも１つをエンコードして発現し、他方が、請求項１、２および２１〜２４のいずれか１つに定義される第一外来ＴＨエピトープの少なくとも１つをエンコードして発現する核酸フラグメントの少なくとも２つをインビボでＡＰＣへ同時に導入することで行う請求項１〜４のいずれか１つによる方法。
【請求項４５】
導入された核酸フラグメントが、裸のＤＮＡ、荷電又は非荷電脂質で製剤化したＤＮＡ、リポソームで製剤化したＤＮＡ、乳化ＤＮＡ、ウイルスベクターに含めたＤＮＡ、トランスフェクション促進タンパク質又はポリペプチドで製剤化したＤＮＡ、標的タンパク質又はポリペプチドで製剤化したＤＮＡ、標的炭水化物で製剤化したＤＮＡ、カルシウム沈殿剤で製剤化したＤＮＡ、不活性担体分子に結合したＤＮＡ、ならびにアジュバントで製剤化したＤＮＡから選択される請求項４０〜４４のいずれか１つによる方法。
【請求項４６】
アジュバントが、請求項３０〜３２のいずれか１つで定義されるアジュバントからなる群から選択される請求項４５による方法。
【請求項４７】
投与方法が、請求項３３または３４で定義されている請求項４０〜４６のいずれか１つによる方法。
【請求項４８】
ａ） 公知または想定されるＣＴＬエピトープを含まないオートロガスＩｇＥのアミノ酸配列の少なくとも１つのサブ配列の同定、
ｂ）工程ａ）で同定される少なくとも１つのサブ配列内の位置で、動物に対して外来であるＴＨエピトープの少なくとも１つを、オートロガスＩｇＥのアミノ酸配列に導入することによるオートロガスＩｇＥの想定される免疫原性類似体の少なくとも１つの調製、および
ｃ） 動物で、ＣＴＬ反応を実証的に誘導することができる工程ｂ）で調製される類似体の選抜
からなる、オートロガスＩｇＥ由来のエピトープに結合するＭＨＣクラスＩ分子を示す細胞に対して、動物でＣＴＬ反応を誘導できる動物のオートロガスＩｇＥの免疫原性類似体の選抜方法。
【請求項４９】
１）工程ａ）で同定されるサブ配列が、さらに、システイン残基を含まないか、または工程ｂ）で導入されるＴＨエピトープがシステイン残基のパターンを実質的に変化させない、および／または
２）工程ａ）で同定されるサブ配列が、さらに、公知または想定されるグリコシル化部位を含まないか、または工程ｂ）で導入されるＴＨエピトープがグリコシル化パターンを実質的に変化させない、および／または
３）工程ａ）で同定されるサブ配列が、オートロガスＩｇＥにより発揮される病態生理学的作用に著しく寄与し、外来ＴＨエピトープの工程ｂ）での導入が前記病態生理学的作用を減少させるか、または廃する、および／または
４） 工程ｂ）での外来ＴＨエピトープの導入が、オートロガスＩｇＥのＢ細胞エピトープの実質的なフラクションを保護する
請求項４８による方法。
【請求項５０】
類似体が、オートロガスＩｇＥの全体にわたる三次構造を有する請求項４９、変形４による方法。
【請求項５１】
請求項４８〜５０のいずれか１つの方法に従って選抜された類似体をエンコードする核酸配列をベクターに導入し、そのベクターで適切な宿主細胞を形質転換することからなるオートロガスＩｇＥの類似体を生産する細胞の調製方法。
【請求項５２】
オートロガスＩｇＥをエンコードする核酸配列の発現を促進する条件下で、請求項５１の方法によって得られた細胞を培養し、培養上清または細胞から類似体を回収することからなる、オートロガスＩｇＥの類似体の調製方法。
【請求項５３】
さらに、回収された類似体を精製し、精製された生産物を人工的な翻訳後修飾、例えば、再生、酵素処理、化学修飾および接合に任意に供する工程からなる請求項５２による方法。
【請求項５４】
ヒト被験者でオートロガスＩｇＥに対して免疫反応を誘導することができ、一定のＩｇＥ重鎖または軽鎖のＣＴＬまたはＢ細胞エピトープの少なくとも１つおよび外来ＴＨ細胞エピトープの少なくとも１つからなるヒトＩｇＥの類似体。
【請求項５５】
外来ＴＨエピトープの少なくとも１つが、ＩｇＥアミノ酸配列で挿入として、またはＩｇＥアミノ酸配列の部分の置換として、またはＩｇＥアミノ酸配列の部分の欠失の結果として存在する請求項５４による類似体。
【請求項５６】
ＣＨ２ドメインのＣＴＬまたはＢ細胞エピトープの少なくとも１つ、および／または、ＣＨ３ドメインのＣＴＬまたはＢ細胞エピトープの少なくとも１つ、および／または、ＣＨ４ドメインのＣＴＬまたはＢ細胞エピトープの少なくとも１つ、および／または、ＭＩＧＩＳフラグメントのＣＴＬまたはＢ細胞エピトープの少なくとも１つからなる請求項５５による類似体。
【請求項５７】
実質的にＣＨ２ドメイン全体、および／または、実質的にＣＨ３ドメイン全体、および／または、実質的にＣＨ４ドメイン全体、および／または、実質的にＭＩＧＩＳフラグメント全体からなる請求項５６による類似体。
【請求項５８】
式
Ｉ１−（ＣＨ３）ｎ１−Ｉ２−（ＣＨ４）ｎ２−Ｉ３
（Ｉ１、Ｉ２およびＩ３は、各々が、外来ＴＨ細胞エピトープの少なくとも１つおよび／またはＢ細胞結合ＩｇＥのＭＩＧＩＳフラグメントを含むアミノ酸配列を示し、ＣＨ３はＩｇＥの一定の重鎖のＣＨ３ドメイン全体であり、ＣＨ４はＩｇＥの一定の重鎖のＣＨ４ドメイン全体であり、ｎ１およびｎ２は０以上の整数であり、ｎ１およびｎ２の少なくとも１つは１以上である）
を有する請求項５６による類似体。
【請求項５９】
免疫原を投与される動物において、ＡＰＣで免疫原由来のＣＴＬエピトープの提示を促進する医薬的および免疫学的に容認されうる担体またはビヒクル、および任意のアジュバントとの混合物中で、有効な免疫原性剤として請求項５４〜５８のいずれか１つによる類似体を含む免疫原性組成物。
【請求項６０】
請求項５４〜５８のいずれか１つよる類似体をエンコードする核酸フラグメント。
【請求項６１】
請求項６０による核酸フラグメントを担持するベクター。
【請求項６２】
自律複製しうる請求項６１によるベクター。
【請求項６３】
プラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体およびウイルスからなる群から選択される請求項６１または６２によるベクター。
【請求項６４】
５’→３’方向及び操作可能な連鎖において、請求項６０による核酸フラグメントの発現を駆動するプロモーター、ポリペプチドフラグメントの分泌又は膜への組み込みを可能にするリーダーペプチドをエンコードする任意の核酸配列、請求項６０による核酸フラグメント及び転写終結区をエンコードする任意の核酸配列からなる、請求項６１〜６３のいずれか１つによるベクター。
【請求項６５】
宿主細胞に導入する場合に、宿主細胞ゲノムに組み込まれるか、または宿主細胞ゲノムに組み込むことができない請求項６１〜６４のいずれか１つによるベクター。
【請求項６６】
請求項６１〜６５のいずれか１つのベクターを担持する形質転換細胞。
【請求項６７】
−請求項６０による核酸フラグメント、または請求項６１〜６５のいずれか１つによるベクター、ならびに
−医薬的および免疫学的に容認しうる希釈剤および／またはビヒクルおよび／またはアジュバント
からなるＩｇＥに対して抗体の生産を誘導する組成物。
【請求項６８】
請求項６１〜６５のいずれか１つによるベクターを担持し、請求項６０による核酸フラグメントを発現し、ならびにその表面で、請求項５４〜５８のいずれか１つによる類似体を任意に分泌または担持する安定した細胞系。
【請求項６９】
請求項６０による核酸フラグメントまたは請求項６１〜６５のいずれか１つによるベクターで宿主細胞を形質転換することからなる請求項６８による細胞系の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｉ型過敏症を伴うアレルギーに対する新規な方法に関する。特に、本発明は、ＩｇＥ生産Ｂ細胞に対する細胞毒Ｔリンパ球（ＣＴＬ）で行われる免疫反応を誘導し、それによって、これらＢ細胞を攻撃してＣＴＬで死滅させる方法に関する。
【０００２】
発明の背景
免疫グロブリンＥは、アナフィラキシーで主要なエフェクターであり、例えば、高親和性Ｆｃε受容体（ＦｃεＲＩ）を有する細胞表面でＩｇＥに対する抗原の結合により誘発される一連のメカニズムの開始の原因となっている。
抗−ＩｇＥ反応は、寄生体に対する有益で素早い免疫反応であるが、ＩｇＥ分泌を誘導したアレルゲンは、喘息およびアナフィラキシーについて死亡を含む重篤な症例もありうる様々な合併症を生じる。これらのアレルギー性疾患が流行している。例えば、アレルギー性鼻炎（枯草熱）は、アメリカ合衆国の人口の２２％以上に影響を与えており、対して、アレルギー性喘息は、アメリカ合衆国の在住者の少なくとも２千万人に影響を与えていると考えられる。ヘルスケア費用および生産力の損失を含む合衆国でのアレルギー性疾患の経済的な影響は、９０年代初期だけで、６４億ドルの額に達すると予想された。さらに、少なくとも信頼性のあるデータが得られる集団で、これらＩｇＥを伴う疾患の発病率は、増加しているようである。
【０００３】
増加したＩｇＥ分泌の役割は、アレルギー性疾患の大部分で明確に立証されている。生物学的な特性およびＩｇＥがどの様にしてアレルギー症状を促進させるかを以下に要約する。
ＩｇＥは、免疫グロブリン（Ｉｇ）の全てのクラスで最も短い生物学的半減期を有するばかりではなく、血清中に最も低いレベルで存在する。しかし、個体中のアレルギー反応（アトピー）でのＩｇＥ濃度は、正常な個体よりも１００〜１０００倍高い。ＩｇＥは、様々なエフェクター細胞、例えば肥満細胞や好塩基球に結合し、多価アレルゲンとの接触で、活性化する能力の結果、多くのアレルギー反応を媒介することに直接関与する（以下を参照）。
ＩｇＥ合成の誘導は、Ｔヘルパー２（Ｔｈ２）表現型のＣＤ４＋Ｔ細胞で分泌されるサイトカインを必要とする。Ｔｈ２細胞は、ＩｇＥ−結合型アレルギー反応を含む体液（ｈｕｍｅｒａｌ）免疫反応の発生で重要であるＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３を分泌する。一方、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞は、細胞媒介免疫反応の発生で重要なサイトカイン、ＩＬ−２、γＩＦＮおよびＴＮＦを分泌する。これらの事実は、望ましくないＩｇＥ−結合型免疫反応が、あたかも寄生体由来であるかのように、それ以外の実質的に無害なアレルゲンを認識して反応する免疫系の望ましくない結果であるという広く受け入れられている見解を裏付けている。
【０００４】
ＩｇＥ−結合型急性、遅延および慢性アレルギー性疾患のメカニズム
感作された個体のアレルゲン誘発は、３つのタイプの反応を誘発することができる：ａ）急性アレルギー反応、ｂ）遅延反応およびｃ）慢性アレルギー炎症。
ａ）急性アレルギー反応：アレルゲンに暴露後、数秒または数分で発現されえる急性アレルギー反応の主な特徴は、本来、組織で、アレルゲン誘導の部位に通常内在する既存のＩｇＥ付加肥満細胞や他のエフェクター細胞から放出された媒介物の活性を反映している。
ｂ）遅延アレルギー反応：急性アレルギー反応に対して放出され、加えて、冒される組織、例えば血管内皮細胞、分泌腺、知覚神経、および血管、呼吸または胃腸の平滑筋細胞に内在する細胞を直接冒す媒介物のいくつかは、循環白血球の新規補充を生じる作用も有する。その様な新規補充された白血球は、例えば、紅斑の再発または発生（増加された血流量を反映している）、および皮膚での腫脹（増大された血管透過性を反映している）、あるいは気道中の気道狭窄に寄与することで、進展性（ｅｖｏｌｖｉｎｇ）アレルギー反応の局所的な特性に、次々に影響を及ぼすことができる。これら遅延反応は、急性アレルギー反応に関連する兆候や症状が著しく減少したか、または消失さえしてしまった後の多くの場合で、初期アレルゲン誘発後数時間までは特質上発生しない。
【０００５】
ｃ）慢性アレルギー炎症：これは、一般的には、持続期間にわたってアレルゲンで繰り返し感作された解剖部位で起こる。慢性アレルギー炎症の部位は、多くがＴｈ２表現型である好塩基球およびＴ細胞数の増加を特に含む、循環から新規補充されたエフェクター細胞を含むだけでなく、基礎となった組織での著しい慢性（つまり、長期継続）変化とも関連している。ヒトのアレルギー性喘息は、アレルゲンによる持続的な傷害が、冒される気道の全ての層での主要な構造変化と関連している代表的な例である。アレルゲンに対して繰り返される暴露は、全ての、またアレルゲン特異的ＩｇＥの著しい上昇をもたらす。このＩｇＥは、次に肥満細胞や好酸球がＩＬ−４、ＩＬ−３、およびＩｇＥ産生を促進する他の媒介物を分泌する能力を高める。これらサイトカインの分泌物も新規補充し、さらにＴｈ２細胞駆動性の、ＩｇＥ結合型免疫反応のサイクルのためにＴｈ２細胞を活性化させる。
【０００６】
ＩｇＥ結合のための受容体
ＩｇＥにとって２つの主要なＦｃ受容体（Ｆｃε）は、それらの構造やＩｇＥに対する相対的な親和性で区別される。ＩｇＥにとって高親和性受容体（ＦｃεＲＩ）は、約１０１０Ｍ−１の親和性（Ｋａ）で、単量体ＩｇＥに結合し、一方、ＩｇＥにとっての二次受容体、ＦｃεＲＩＩ（ＣＤ２３）は、非常に低い親和性（Ｋａ＝１０８Ｍ−１）で結合する。それゆえ、研究の大部分は、ＦｃεＲ１で行われている。
肥満細胞および好塩基球は、構造的に、高レベルのＦｃεＲＩを発現する。低レベルのＦｃεＲＩも、ＩｇＥ媒介抗原提示で機能するヒトのランゲルハンス島、末梢性樹状細胞および単核白血球で検出される。加えて、ＦｃεＲＩは、好酸球で報告されている。
【０００７】
証拠の多くは、有効で生物学的に活性な媒介物の放出を生じる肥満細胞、好塩基球、および幾つかの状況では、ＦｃεＲＩを経た好酸球の活性化が明らかにＩｇＥ依存型であるアレルギー反応、例えば抗原特異的ＩｇＥ抗体で受動的に伝達される反応で、初期（多くの場合、第一）エフェクターメカニズムを示すことを示している。ＦｃεＲ１凝集による肥満細胞および好塩基球の活性化は、１）ヒスタミンを含む分泌顆粒および他の既成媒介物のエキソサイトーシス；２）新規に形成された液体媒介物、例えばプロスタグランジンおよびロイコトリエンの合成ならびに分泌、３）ＩｇＥ生産を促進するＴｈ２サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−３およびＭＩＰ−１ａ）の合成および分泌を生じる生化学的および形態学的な現象の協調連鎖を引き起こす。合わせて、これら媒介物は、急性ＩｇＥ結合型アレルギー反応と関連する臨床症状の大部分の原因であり、遅延反応および慢性アレルギー炎症の発生にも寄与している。ＦｃεＲＩの重大な役割は、マウスで、ＩｇＥ結合型ＦｃεＲＩの標的化遺伝子の鎖の破壊で立証されている。
【０００８】
マウスとヒトでの研究は、肥満細胞および好塩基球で、ＦｃεＲＩ表面発現のレベルがＩｇＥのレベルで調節されることを明らかにした。さらに、遺伝学的に、ＩｇＥ欠損マウスが、肥満細胞および好塩基球で、ＦｃεＲＩ発現の劇的な減少（８０％以上）を示し、それは、インビボでの単量体ＩｇＥの投与で補正できる。単量体ＩｇＥがＦｃεＲＩ発現を調節するメカニズムは、未だ明らかではないが、この分野での研究は、アレルギー性疾患の管理のための新規な治療法を既に開発している。
【０００９】
主要なＩｇＥ結合型ヒト疾患
１．アナフィラキシー
アナフィラキシーは、アレルゲンに対する急性、全身性、過敏症反応であり、一般に、複数の臓器系に関与し、治療しなければ急速に死に至る。その様な反応は、異なる薬剤（例えば、毒液類、空中浮遊アレルゲン（ａｉｒｂｏｒｎｅ ａｌｌｅｒｇｅｎ）類、食品類、抗生物質など）由来のアレルゲンで誘導される。全てではないにしても、兆候および症状の殆どは、ＩｇＥ抗体の過剰生産と関連していると広く信じられている。このことは、１） 肥満細胞および／または好塩基球の全身性のＦｃεＲＩ依存型活性、ならびに２）これら細胞による媒介物の放出の最終臓器の結果を反映している。
【００１０】
２．アレルギー性鼻炎
上記のように、枯草熱として一般に知られているアレルギー性鼻炎は、アメリカ合衆国だけで、人口の約２２％を悩ませている。くしゃみ、鼻充血、およびかゆみと（鼻分泌物の生産が増加された）鼻汁を含む症状は、殆どの場合、主に、肥満細胞および好塩基球による空中浮遊アレルゲンに対する媒介物のＩｇＥ依存型放出を反映している。アレルギー性鼻炎の病態生理学は、局所的に誘導された急性アレルギー反応の結果を明確に反映しているものもあるが、かなりの量の症状が、エフェクター細胞の大規模な新規補充ならびにＩｇＥおよびＴｈ２サイトカインの産生のために、遅延反応（遅延された反応）および慢性アレルギー炎症すらを有している。これら媒介物、サイトカインと細胞との組み合わせは、上記したメカニズムによってＩｇＥ依存型アレルギー性疾患の経過を長引かせる。
【００１１】
３．喘息
喘息は、世界中の１００万人の人々に影響を与えている。この疾患の人および経済のコスト（羅患率、ヘルスケア費用、生産力の損失および最も悲劇的には死亡率）は、計り知れない。喘息は、単一の「疾患」からなるものというよりむしろ、３つの主要な特徴：１）間欠性および可逆性の気道閉塞；２） （つまり、免疫学的に非特異的な刺激、例えばヒスタミンやコリン作用性アゴニストに対する気管支収縮に反映されるような気道の感受性を著しく増大させる）「過敏症の」気道および３）気道炎症で一般に特色付けられる症状であると今日では考えられている。
喘息の症状は、複数の遺伝子因子と環境因子との相互作用の結果として生じる。それにも関わらず、ほとんどの喘息疾患は、所定の環境アレルゲンに反応する急性即時型過敏症反応を示す被験者でも発症する。喘息の全体的な発症率は、ＩｇＥの血清濃度と強いポジティブな相関関係を示すことも知られている。さらに、かつて組織肥満細胞および組織好塩基球に限定されると考えられていた高親和性ＩｇＥ受容体、ＦｃεＲＩが、単核白血球、循環樹状細胞、ランゲルハンス細胞ならびに好酸球の表面でも発現されており、この結果、様々なＩｇＥ依存型炎症反応で、媒介物の付加的な潜在源としてこれらの細胞を同定できることが示された。
【００１２】
好酸球とＴｈ２細胞の両方は、喘息の患者の気道で、慢性的な炎症浸潤をかなり示しており、サイトカイン、または疾患の多くの特徴の一因である他の媒介物を産生することができる。しかし、ＦｃεＲＩの発現およびＩｇＥの血清レベルは、Ｔｈ２サイトカインで媒介される免疫反応とＴｈ２細胞および好酸球の新規補充とを切り替える。従って、ＩｇＥは、ヒトで腕肥満細胞および他のエフェクター細胞に働くだけでなく、ＩｇＥ産生を増大させることで喘息症状の更なる発生に寄与し得る。
【００１３】
４．アトピー性皮膚炎
この流行している厄介な慢性皮膚疾患は、アトピーの皮膚症状発現（アレルギー反応）とみなされる。
抗−ＩｇＥワクチン注射
オートロガスＩｇＥに対するワクチン注射は、以前より提唱されている。ヨーロッパ特許Ａ−６６６７６０号は、ＩｇＥ 重鎖のＣＨ２〜ＣＨ３ドメイン（またはその一部）を含むポリペプチド結合を免疫原として使用するワクチン注射のストラテジを提案している。その理論的根拠は、肥満細胞および好塩基球の表面でＩｇＥに結合したＦｃεＲＩの連鎖を避けることである−ＦｃεＲＩ結合領域がＣＨ２とＣＨ３ドメインとの間のいわゆる蝶番領域から（部分的に）なっているため、免疫原性結合の自己タンパク質部分としてのこの領域の使用が、可溶性ＩｇＥのみと結合するはずである抗体の誘導を引き起こす。
【００１４】
担体分子に結合されたＣＨ４ドメイン由来の短いペプチドを利用した関連する研究が、Ｓｔａｎｗｏｒｔｈらによって以前に提案された。
最後に、Ｔａｎｏｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍに譲渡された特許出願（例えば、ＷＯ ８９／０６１３８）の幾つかは、Ｂ細胞結合ＩｇＥのＭＩＧＩＳ断片、例えば、Ｂ細胞結合ＩｇＥの膜アンカー部分の細胞外部分と反応する抗体を使った受動免疫化に主眼を置いている。また、この短いペプチド断片は、ＦｃεＲ保持細胞で欠損しており、それゆえ、受動的な免疫化は、ＩｇＥに結合したＢ細胞をもっぱら標的としているようである。Ｔａｎｏｘは、ＩｇＥのＭＩＧＩＳ断片または受容体結合部位のいずれかと反応する抗体に対して抗イディオタイプ抗体を使った免疫化の形態での活性型ワクチン注射も提唱している。
ＷＯ ９５／０５８４９もＩｇＥに対するワクチン注射を提唱している。これは、本来のＩｇＥのＢ細胞エピトープの最大数を維持しながら、ＩｇＥ配列での置換によって、１つ以上のＴヘルパーエピトープを導入することでＩｇＥを免疫原性する状況で行われる。
【００１５】
全身におけるＴ−細胞の助力の誘導
抗原の提示は、教義上、２つの別々の経路、クラスＩＩ外因性およびクラスＩ内生経路としてみなされている。
簡単に言えば、細胞外部または細胞膜由来の外来タンパク質は、タンパク質分解酵素およびＭＨＣクラスＩＩ分子を含む細胞間区画と融合（ｆｕｓｅ）するエンドソームとしてＡＰＣで吸収される。生産されたペプチドのいくつかは、クラスＩＩに結合し、そして細胞膜に転移される。
クラスＩ内生経路は、サイトソル様タンパク質の支配的な提示によって特徴付けられる。このことは、小胞体（ＥＲ）の膜に位置するＴＡＰ分子を経てペプチドのＥＲへの輸送後、プロテオソーム媒介分裂によって起こると考えられている。ペプチドは、原形質膜への輸送後、ＥＲでクラスＩに結合する。
【００１６】
しかし、これら２つの経路は、十分に明確ではない。例えば、樹状細胞および幾つかの伸張マクロファージは、細胞外タンパク質をエンドサイトーシス （飲作用化） することができ、実質上、ＭＨＣクラスＩの状況でそれらを提示することが知られている。特殊化された投与方法、例えば酸化鉄ビーズへの結合によって、外来抗原がクラスＩ経路に入ることができることは、以前から実証されていた（Ｒｏｃｋ、１９９６）。このメカニズムは、３つの細胞タイプクラスターを誘導する同じＡＰＣで、クラスＩとクラスＩＩの両方の共働発現が重要なために、主要なもののようである。この３つの細胞タイプクラスターの相互作用は、Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ（１９８７）およびその後の他の著者によって提唱された。彼らは、同じＡＰＣで、クラスＩとクラスＩＩのエピトープの共働提示の重要性を示した。ＣＴＬ活性化について最近記載されたメカニズム（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４１３、Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ５：６１６、Ｒｉｄｇｅら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７４，Ｂｅｎｎｅｔｔら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７８，Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４８０，Ｏｓｓｅｎｄｒｏｐら，１９９８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ １８７：６９３，およびＭａｃｋｅｙら，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １６１：２０９４を参照）によれば、ＭＨＣクラスＩＩで専門的なＡＰＣ提示抗原は、Ｔヘルパー細胞で認識される。このことは、（Ｔヘルパー細胞でのＣＤ４０ＬとＡＰＣでのＣＤ４０による相互作用で媒介される）ＡＰＣの活性化を引き起こす。このことは、ＡＰＣがＣＴＬを直接刺激し、それによって活性化されるのを可能にする（図２も参照）。
【００１７】
外来ＭＨＣクラスＩＩ 限定Ｔヘルパー細胞エピトープの自己抗原への挿入が、非修飾自己抗原に対して強い交差反応性抗体反応を誘導しえる抗原の供給を引き起こすことは、以前から実証されていた（ＷＯ ９５／０５８４９参照）。自己抗体誘導が、挿入された外来エピトープで誘導される特異的なＴ細胞の助力によって引き起こされることが示された。
後に、修飾された自己抗原が−適切なアジュバントを使って−、ＭＨＣクラスＩ限定自己エピトープに対して強いＣＴＬ反応も誘導できるはずであることが結論付けられた。それ故、ＷＯ ９５／０５８４９に記載される技術は、細胞内およびＭＨＣクラスＩの状況で提示されるエピトープを有する他の細胞結合型抗原に対してワクチン注射を提供するのにもあてはめることができる−この概念は、ＷＯ ００／２００２７の主題であり、ここで引用することによりここに組み込まれる。
本発明者の知りうる限りで、ＩｇＥに対する核酸ワクチン注射を使用することは、提唱されていない。ＩｇＥ 生産Ｂ細胞と反応性の細胞毒性リンパ球を誘導するために、ワクチン注射することも提唱されていない。
【００１８】
発明の目的
本発明の目的は、宿主生物で、ＩｇＥに対する免疫反応を誘導するために改良された方法および薬剤を提供することである。さらに、ＩｇＥに対して効果的な免疫反応を誘導しえるＩｇＥのポリペプチド類似体を調製するための方法を提供することが目的である。
【００１９】
発明の要約
本発明は、ＩｇＥ発生量の免疫学的な調節を通してＩ型過敏症反応を減少させうる方法の綿密な解析に一部基づいている。
発明の一側面で、ＩｇＥ生産Ｂ細胞に対するＣＴＬ反応の誘導が、ＩｇＥ発生量を減少させるのに効果的な方法であると結論付けられた。ＩｇＥ生産Ｂ細胞は、ヒトにとって極めて重要であるとは思われないため、それゆえ、循環内しているＩｇＥ生産細胞の数を減少させ、それによってＩｇＥの発生量を減少させることに関係しているであろう。
【００２０】
発明のもう一つの側面で、（ＣＴＬを呼び起こす能力とは別に）ＤＮＡワクチン注射は、とりわけ、Ｔｈ２からＴｈ１細胞へ強いて移動させることができるため、ＩｇＥに対する免疫化の効果的な方法であると結論付けられる−これは、Ｔｈ１助力を選択的に誘導することができるＤＮＡワクチン注射の本来有する特性の結果である。
【００２１】
第３の広い側面で、モノクローナル抗ＩｇＥの授与での最近の研究がＦｃεＲ結合ＩｇＥの交差性、ならびに肥満細胞および好塩基球の付随する脱顆粒化が発生することを実証したとしても、ＩｇＥに対する広域スペクトル化（ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｅｄ）ポリクローナル抗体反応を発生させる薬剤を使った免疫化が同じ望ましくない作用を有することは、全く明らかにされていないことが結論付けられた。つまり、言い換えれば、ポリクローナル抗ＩｇＥ反応の誘導は、脱顆粒化を刺激するという欠点を受けることなく、ＩｇＥの低減に効果的であると考えられている。
【００２２】
本発明は、ＷＯ ００／２００２７の技術に一部基付いている−ＩｇＥ生産細胞に対するＣＴＬ反応の誘発は、ＩｇＥを生産するＢ細胞の有益なダウン−レギュレーションを提供することが新たに認識された。このことは、循環している、ならびに受容体結合しているＩｇＥの両方のレベルを下げることにもなる。
【００２３】
ＷＯ ００／２００２７に記載の自己ワクチン構築物およびワクチン注射のプロトコルを使って、修飾したＩｇＥを専門的な抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩとＭＨＣクラスＩＩ分子で提示することができる。ＭＨＣクラスＩ上の亜優勢（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ）自己エピトープとＭＨＣクラスＩＩ分子上の免疫優勢外来エピトープとの同時提示は、活性型ＭＨＣクラスＩＩ限定Ｔヘルパー細胞からＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬへの直接的なサイトカイン助力を媒介するであろう（図２）。このことは、ＩｇＥに対するＴ細胞自己耐性の特異的な崩壊に繋がる。
結論として、上記概要の両方の技術を使って構築されたワクチンは、補体の二次活性と反応する体液の自己抗体反応および抗体依存型細胞毒性活性（ＡＤＣＣ）を誘発するであろう。更に重要なことに、オートロガスＩｇＥ生産細胞に対する細胞毒Ｔ細胞反応をも誘発するであろう。
【００２４】
ここで、最も広く一般的な範囲で、本発明は、
−オートロガスＩｇＥ由来のＣＴＬエピトープの少なくとも１つ、および／または、オートロガスＩｇＥ由来のＢ細胞エピトープの少なくとも１つ、ならびに、
−動物に対して外来である第一Ｔヘルパー細胞エピトープ（ＴＨエピトープ）の少なくとも１つ
の免疫学的に有効な量を、ヒトを含む動物の免疫系の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって同時に提示させることからなる、動物におけるオートロガス免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対して免疫反応を誘導する方法に関する。
発明の方法のより明確な変形で、本発明は、
−動物のＩｇＥ由来のＣＴＬエピトープの少なくとも１つ、および
−動物に対して外来である第一Ｔヘルパーリンパ球（ＴＨ）エピトープの少なくとも１つ
を、適当な抗原提示細胞（ＡＰＣ）により、ヒトを含む動物で同時に提示させることからなる、オートロガスＩｇＥを生産する細胞に対して特異的細胞毒Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を誘導することによる、動物におけるオートロガスＩｇＥをダウン−レギュレートする方法に関する。
【００２５】
また、免疫原性剤を調製するための新規なストラテジが、発明の部分である。この新規なストラテジは、公知および想定されるＣＴＬエピトープの実質的なフラクションの維持が少なくとも１つの外来ＴＨエピトープの導入を同時に目的としているＩｇＥ類似体の選抜および生産を含む。
さらに、本発明は、哺乳類ＩｇＥを基にしたある特異的な免疫原性構築物、ならびにこれらの構築物を含む組成物に関する。
最後に、本発明は、ＩｇＥ類似体の分子生物学的な製造方法で有益な核酸フラグメント、ベクター、形質転換細胞、および他の手段に関する。
【００２６】
図面の説明
図１：従来のＡｕｔｏＶａｃ概念。Ａ：抗原提示細胞（ＡＰＣ）で、ＭＨＣクラスＩＩ上で提示される寛容優勢自己エピトープは、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ） （Ｔヘルパー細胞は、点線で示す）レパートリーの涸渇のため無視される。ＭＨＣクラスＩＩに提示される挿入された外来免疫優勢Ｔ細胞エピトープは、Ｔヘルパー細胞を活性化し、ＭＨＣクラスＩＩで外来免疫優勢Ｔ細胞エピトープを提示する自己タンパク質の天然部分に特異的なＢ細胞（Ｂ）は、Ｔヘルパー細胞によって供されるサイトカインの助力によって活性化される。
【００２７】
図２：ＷＯ ００／２００２７に開示のＣＴＬ反応を誘発するＡｕｔｏＶａｃ概念。ＭＨＣクラスＩＩで提示される挿入された外来免疫優勢Ｔ細胞エピトープは、Ｔヘルパー細胞を活性化する。ＭＨＣクラスＩ上で提示される亜優勢自己エピトープを認識するＣＴＬは、アジュバント活性型Ｔヘルパー細胞で活性化される。
【００２８】
図３：幾つかの好ましいＩｇＥベースの免疫原性構築の概略図の説明。
ＣＨ３ドメイン（Ｃ３）のみを基にした構築物は、付加（ＮまたはＣ末端）、挿入または置換の形態で、破傷風トキソイド由来のＰ２およびＰ３０エピトープを含むことができる。同様な方法で、ＭＩＧＩＳフラグメントのアミノ酸配列を含む可能性もある。ＣＨ３（Ｃ３）およびＣＨ４（Ｃ４）ドメインを基にした構築物は、同様な方法で、Ｐ２および／またはＰ３０エピトープならびにＭＩＧＩＳフラグメントのみならず２つのドメイン間に挿入または置換を含むことができる。ＣＨ３ドメインで濃い灰色領域は、ＦｃεＲＩ結合領域を示す。
【００２９】
発明の詳細な説明
定義
以下に、本発明の境界を明確にするために、本明細書及び請求の範囲において使用する用語を幾つか定義し、詳細に説明する。
「オートロガス」ＩｇＥとは、本明細書および請求の範囲において、自己が有するＩｇＥに対してワクチン注射された動物のＩｇＥポリペプチドを意味する。その用語は、通常、ＩｇＥの非可変領域（つまり、重鎖または軽鎖の一定の部分）に関するものであり、ＩｇＥの一定のドメインの様々なイソ型はその用語に含まれるが、可変領域はオートロガスＩｇＥの部分とはみなされないことを意味する。
【００３０】
「Ｔ−リンパ球」及び「Ｔ−細胞」という用語は、様々の細胞介在免疫応答ならびに体液免疫応答におけるヘルパー活性のようなエフェクター機能の原因となる胸腺由来リンパ球と互換可能に使用される。同様に、「Ｂ−リンパ球」及び「Ｂ細胞」という用語は、抗体産生リンパ球と互換可能に使用される。
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、Ｔ細胞に対してエピトープを提示する細胞である。一般的な抗原提示細胞は、マクロファージ、樹状細胞、ならびに他の食作用化および飲作用化細胞である。ＴＨエピトープを提示することでＡＰＣとしても機能するＢ細胞は、本明細書および請求の範囲で、通常、用語ＡＰＣを使用する場合に上記食作用化および飲作用化細胞を引用することを意味する以外は、ＴＨ細胞に対するＭＣＨクラスＩＩ分子に結合すると留意すべきである。
【００３１】
「ヘルパーＴリンパ球」つまり「ＴＨ細胞」は、抗原提示細胞上でＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するＴＨエピトープの識別を通じてＢ細胞および細胞毒Ｔ細胞に対する助力を提供するＣＤ４ポジティブＴ細胞を意味する。
用語「細胞毒Ｔリンパ球」（ＣＴＬ）は、活性化するためにＴＨ細胞の補助を必要とするＣＤ８ポジティブＴ細胞で使われる。
「特異的な」免疫反応は、本発明の本文において、擬似同一分子の分子または群に対して、あるいは擬似同一分子の分子または群のＣＴＬエピトープを提示する細胞に対して優勢なポリクローナル免疫反応を意味する。
【００３２】
「ポリペプチド」という用語は、本文において、アミノ酸残基が２〜１０の短いペプチド、アミノ酸残基が１１〜１００のオリゴペプチド、ならびにアミノ酸残基が１００より多いポリペプチドを意味する。さらに、この用語はタンパク質、すなわち少なくとも１つのポリペプチドからなり、少なくとも２つのポリペプチドからなる場合には複合体を形成するか、共有結合するか、又は非共有結合する機能的生体分子をも含む。タンパク質中のポリペプチドはグリコシル化及び／又は脂質化されていてもよく、及び／又は補欠分子団を含んでいてもよい。
「サブ配列」という用語は、それぞれ天然に存在するアミロイドアミノ酸配列又は核酸配列から直接誘導される、少なくとも３つのアミノ酸、又は関連するときは少なくとも３つのヌクレオチドのいずれかの連続的なストレッチを意味する。
【００３３】
用語「動物」は、本文において一般にホモ・サピエンス、カニス・ドメスティカス（Ｃａｎｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ）などの動物種（好ましくは哺乳動物）を意味し、ただ１種の動物ではない。しかし、この用語は、そのような動物種の個体群も意味する。なぜなら、この発明の方法によって免疫化された個体は全て、同じ免疫原での動物の免疫化を可能にする、実質的に同一のＩｇＥを有することが重要であるからである。例えばＩｇＥの遺伝変異型が異なるヒト個体群で存在する場合には、各群におけるＩｇＥに対する自己耐性を破壊できるように、これらの異なる個体群で異なる免疫原を使用する必要がある。
「オートロガスＩｇＥをダウン−レギュレートする」という用語は、ここで生物におけるＩｇＥの量および／または活性の低下を意味する。ダウンレギュレーションは、ＦｃεＲ結合領域での干渉、スカベンジャー細胞（例えばマクロファージ及びその他の食細胞）によるＩｇＥの除去を含むいくつかの機序によって生じることができ、そして、より重要なことに、抗原を保有するか持つ細胞は、動物でＣＴＬにより殺される。
【００３４】
「適当なＡＰＣで同時に提示させる」という表現は、動物の免疫系が問題のＩｇＥエピトープおよび外来エピトープのＡＰＣによる同時提示を引き起こす制限された方法で、免疫原性の感染に付されることを意味する。下記の開示から明らかであるように、このような免疫系の感染は多くの方法によって行うことができる。そのなかで最も重要なものは、「ファーマシン（ｐｈａｒｍａｃｃｉｎｅｓ）」を含有するポリペプチドでのワクチン注射（すなわち進行中の疾患を治療又は改善するために投与されるワクチン）、又は核酸「ファーマシン」のワクチン注射である。達成されるべき重要な結果は、動物中の免疫受容細胞が免疫学的に有効な方法で関連エピトープを示すＡＰＣと相対することである。
「免疫原」という用語は、特定の動物で免疫反応を誘導しえる物質を意味する。それゆえ、オートロガスＩｇＥは、オートロガス宿主中で免疫原でないことが理解される−オートロガスＩｇＥに対する免疫反応を高めるため、何れかの強力なアジュバントを使用する、および／またはＴヘルパーエピトープをオートロガスＩｇＥと共に提示する必要があり、その場合、「免疫原」は、自己耐性を破壊しえる物質の組成物である。
【００３５】
「免疫学的に有効な量」という用語は、当該技術において通常の意味を有する。つまり、免疫学的特徴を免疫原と共有する発病剤を著しく連動させる免疫応答を誘発し得る免疫原の量である。
オートロガスＩｇＥが「修飾」に付されたという表現を使用するときは、ここではオートロガスＩｇＥの一定のドメインの少なくとも１つの部分を構成するポリペプチドの化学的修飾を意味する。そのような修飾は、例えばアミノ酸配列中のあるアミノ酸残基の誘導 （例えばアルキル化）である。しかし、以下の開示から明らかであるように、好ましい修飾は、アミノ酸配列の一次構造の変更からなる。
【００３６】
「耐性および自己耐性」を論じるときは、本発明方法の対象であるＩｇＥ分子がワクチン注射される個体群で自己タンパク質であるため、個体群の正常な個体がＩｇＥに対する免疫応答を増さないことが理解される。しかし、動物個体群において、例えば自己免疫疾患の一部として、オートロガスＩｇＥに対する抗体を産生できる偶発的な個体があり得ることは否定できない。いずれにしても、動物は通常、それ自身のＩｇＥに対してのみ自己耐性であるが、その他の動物種又は表現型が異なる個体群に由来する類似体もまた、その動物により耐性であろうことは否定できない。
【００３７】
「外来Ｔ−細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子に結合でき、かつ動物種でＴ−細胞を刺激するペプチドである。好ましい外来エピトープは「乱交雑」エピトープ、すなわち動物種又は個体群におけるＭＨＣクラスＩＩ分子の実質的なフラクションに結合するエピトープである。当該技術分野でしばしば互換的に使用される用語は、この種のエピトープについて、用語「広域Ｔ細胞エピトープ」である。そのような乱交雑Ｔ−細胞エピトープは、ごく限られた数しか知られていないが、それらについては以下に詳細に論じる。本発明に従って使用される免疫原が動物個体群のできるだけ大きいフラクションで有効となるためには、１）数個の外来Ｔ−細胞エピトープを同一類似体に挿入するか、又は２）それぞれに異なる乱交雑エピトープが挿入された数個の類似体を製造する必要があり得ることは理解されたい。外来Ｔ−細胞エピトープの概念が、クリプティックＴ−細胞エピトープ、すなわち自己タンパク質に由来するエピトープであって、当該自己タンパク質の一部ではなく、単離した形態で存在するときにのみ免疫原性挙動を発揮するエピトープの使用をも包含することは理解されたい。
【００３８】
「外来Ｔヘルパーリンパ球エピトープ」（外来ＴＨエピトープ）は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合した抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に提示されうる外来Ｔ細胞エピトープである。それゆえ、「外来」の特徴は、外来ＴＨエピトープが、１）ＭＨＣクラスＩＩに関連して当該の動物によって提示される、および２）外来エピトープが、免疫化のための標的抗原として同一のポリペプチド由来ではない、という２つの側面を有していることを付け加えることも重要である。
「ＣＴＬエピトープ」は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合しえるペプチドである。
【００３９】
（生体）分子の「機能的部分」とは、本文においては、分子によって発揮される生化学的又は生理学的作用の少なくともひとつの原因となる分子の一部を意味する。多くの酵素及び他のエフェクター分子が、当該分子によって発揮される作用の原因となる活性部位を有することは、当該技術において周知である。その分子の他の部分は、安定化又は可溶性の増強目的に役立っている可能性がある。したがって、これらの目的が本発明の特定の実施例に関連がない場合は、排除され得る。例えば、類似体において特定のサイトカインを修飾部分として使用することができる（下記の詳細な論述を参照）。そのような場合には、類似体への結合は必要な安定性を生ずるので、安定性の問題は無関係であるかもしれない。
【００４０】
「アジュバント」という用語は、ワクチン技術の分野において通常の意味を有する。つまり、１）それ自体ではワクチンの免疫原に対する特異的な免疫応答を増加することはできないが、２）それにもかかわらず、免疫原に対する免疫応答を高めることができる物質又は組成物である。つまり、言い換えれば、アジュバントのみのワクチン注射は免疫原に対する免疫応答を生じない。免疫原でのワクチン注射は免疫原に対する免疫応答を生じさせるかもしれないし、させないかもしれない。しかし、免疫原とアジュバントとのワクチン注射の組み合わせは、免疫原のみで誘発されるよりも強い免疫原への免疫応答を誘発する。
分子の「標的化」とは、本文において、動物に導入される分子が特定組織で優先的に現れるか、又は特定の細胞又は細胞型に優先的に結合している状態を意味する。これは、標的化を促進する組成物に分子を処方することを含む多くの方法、又は標的化を促進する基を分子に導入することによって達成することができる。これらの問題は以下に詳細に論述する。
【００４１】
「免疫系の刺激」とは、物質又は組成物が一般に非特異免疫刺激作用を示すことを意味する。多くのアジュバント及び推定上のアジュバント（例えば特定のサイトカイン）は、免疫系を刺激する能力を共有する。免疫刺激剤を使用すると、免疫系の「機敏性（ａｌｅｒｔｎｅｓｓ）」が増加する。これは免疫原を用いた同時又はその後の免疫化が、免疫原のみの使用と比較して、著しく有効な免疫応答を誘発することを意味する。
【００４２】
好ましい実施態様
本質的に、ＩｇＥに対する活性免疫性の誘導は、１）Ｂ細胞の表面に結合する、２）可溶性の形態で、ならびに３）肥満細胞および好塩基球のようなエフェクター細胞上でＦｃε受容体に結合する、３つの異なる位置で、ＩｇＥを標的としてもよい。ＦｃεＲ保持細胞の脱顆粒の形態で、望ましくない副作用を誘導することなく３つの全ての目的を達することができるワクチン構築物は、ＩｇＥ媒介疾患の治療および予防で優れた医薬品であろう。
【００４３】
その表面でオートロガスＩｇＥ由来のエピトープを提示する細胞に対してＣＴＬ反応を誘導するために、ＣＴＬエピトープの少なくとも１つが提示される場合、ＡＰＣの表面上でＭＨＣクラスＩ分子と結合することが、通常必要である。さらに、第一外来ＴＨエピトープの少なくとも１つが提示される場合、ＡＰＣの表面上でＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することが好ましい。
エピトープを提示する好ましいＡＰＣは、樹状細胞およびマクロファージであるが、１）ＭＨＣクラスＩ分子に結合するＣＴＬエピトープ、および２）ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するＴＨエピトープを同時に提示しえるいずれの飲−または食作用化ＡＰＣも本発明による好ましいＡＰＣである。
【００４４】
通常、免疫系をオートロガス標的ＩｇＥのアミノ酸配列の大きなフラクションと相対させることが有利である。それ故、好ましい具体例で、ＡＰＣによるＣＴＬエピトープおよび第一ＴＨエピトープの提示は、少なくともＣＴＬエピトープと第一外来ＴＨエピトープとを含む、オートロガスＩｇＥのアミノ酸配列の変化を含む、少なくとも１つのオートロガスＩｇＥ第一類似体で、動物の免疫系を提示することで行われる。このことは、例えば、ＣＴＬおよびＴＨエピトープが個々のポリペプチドの部分以外は同一の細胞で発現される、ＤＮＡワクチン注射ストラテジとは対照的である；その様なＤＮＡワクチン注射ストラテジは本発明の具体例でもあるが、同一のポリペプチドの一部として２つのエピトープを有することが通常免疫反応を増大させると考えられ、いずれにせよ、唯一の発現産物の供給が必要であろう。
【００４５】
効果的な免疫反応を増大する機会を最大限に活用するため、上記第一類似体が、オートロガスＩｇＥの公知および想定されるＣＴＬエピトープの実質的なフラクション、つまり個体群中のＭＨＣクラスＩ分子の十分なフラクションに結合する公知および想定されるＣＴＬエピトープのフラクションを含むことが好ましい。例えば、類似体のアミノ酸配列で、公知および推定されるＣＴＬエピトープの実質的なフラクションは、オートロガスＩｇＥ中の公知および想定される全てのＣＴＬエピトープを認識するＭＨＣ−Ｉハプロタイプの少なくとも５０％で認識されるが、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、および少なくとも９０％のように、比較的高い割合が好ましい。類似体に存在するオートロガスＩｇＥの公知の実質的に全てのＣＴＬエピトープ、つまり公知のＣＴＬエピトープの１００％近くを保存する類似体を使用することが特に好ましい。それゆえ、オートロガスＩｇＥの想定される実質的に全てのＣＴＬエピトープは、少なくとも第一類似体に存在することが特に好ましい。
上記方法は、膜アンカー領域の膜内外および細胞内部分を含むＢ細胞結合ＩｇＥの全ての部分に対するＣＴＬ反応の増大を可能にする。
ＣＴＬエピトープの存在を推定する方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、Ｒｏｔｈｂａｒｄら．ＥＭＢＯ Ｊ．７：９３〜１００（１９８８）を参照されたい。
【００４６】
本明細書および請求の範囲から明らかにされるように、ここに記載の発明方法がオートロガスＩｇＥに対してＣＴＬ反応を効果的に誘導させえることが予想される。
ＩｇＥがＢ細胞で膜結合抗原であるため、ＣＴＬ媒介免疫性を誘導すると同時に抗体反応を誘導することが有利である。しかし、オートロガスＩｇＥに対する体液免疫反応が起こった場合、通常、抗体との潜在的な相互作用に暴露されえる抗原の部分との相互作用に対する抗体反応を実質的に限定することが好ましい。さもなければ、結果は、最も高い可能性としては、体液免疫系に通常従事しない抗原の部分（例えば、Ｂ細胞結合ＩｇＥの膜アンカー領域の膜内外および細胞内部分）に対する抗体反応の誘導であり、このことは、疾患とは関係がない抗原との交差反応性を誘導する危険性をも増大させる。この限定を生じる簡潔な方法の１つは、オートロガスＩｇＥの類似体（その細胞外部分は、変化してないか、または抗原の関連する細胞外部分の三次構造を実質的に変化させないＴＨエピトープを含むかのいずれかである）で核酸ワクチン注射行うことである。１つの代替案として、免疫化は、ＣＴＬに対する免疫原と、標的抗原の細胞内部分に対し実質的に免疫化できないＢ細胞に対する免疫原（Ｂ細胞に対する免疫原は、例えば抗原由来の非細胞外物質を欠いていてもよい）の双方を用いて行うことができる。
【００４７】
抗体反応の誘導は、当業者に公知の幾つかの方法で行うことができる。例えば、第一類似体の少なくとも１つが、オートロガスＩｇＥの構造の修飾からなる部分を含み、その結果、第一類似体を使った動物の免疫化がオートロガスＩｇＥに対して、動物で抗体の生産を誘導する−この変異体は、上記のように、核酸ワクチン注射に特に適している。あるいは、本発明の方法は、そのような修飾を含むオートロガスＩｇＥの少なくとも１つの第二類似体の免疫学的に有効な量の動物の免疫系に対する効果的な提示を含むことができる。修飾が望ましい抗体誘導効果を有するのを達成するための簡便な方法は、第二類似体で、第二外来ＴＨエピトープを少なくとも１つ含むこと、つまり第一類似体について使用される方法と類似したストラテジである。
効果的な体液免疫反応をも増大させることが望ましい場合、第一および／または第二類似体は、オートロガスＩｇＥのＢ細胞エピトープの実質的なフラクション、特に、オートロガスＩｇＥの天然に存在する形態で細胞外であるＢ細胞エピトープのような実質的なフラクションからなることが有利である。
【００４８】
オートロガスＩｇＥの上記変異体および修飾は、様々な形態を取ることができる。変異体および／または修飾は、アミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を伴うことが好ましい。アミノ酸配列の操作に関連するこれらの基本操作は、単一アミノ酸変化とアミノ酸のストレッチとを含む操作の両方をカバーすることを意味する（とりわけ、ポリペプチド抗原内でのアミノ酸ストレッチのシャッフル；このことは、抗原決定基がＢ細胞結合ＩｇＥの細胞内部分由来である場合、ＣＴＬエピトープの保存に関する考察のみが関連するため、特に興味深い）。例えば、１つの単一アミノ酸の挿入または欠失の導入が、類似体の配列で、外来ＴＨエピトープの出現、つまりＭＨＣクラスＩＩ分子結合配列の出現を引き起こしてもよいことが理解されるであろう。しかし、殆どの状況で、公知の外来ＴＨエピトープを導入することが好ましく（必要でさえあり）、その様な操作は、アミノ酸の置換および／または挿入、または時として分子生物学的な手法による担体タンパク質への接合、または融合ポリペプチドの供給のいずれかの形態での付加を要するであろう。アミノ酸の挿入、欠失、置換又は付加の数は、好ましくは少なくとも２、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０及び２５の挿入、置換、付加又は欠失である。アミノ酸の置換の数は、１５０を超えないことがさらに好ましく、例えば多くても１００、多くても９０、多くても８０、ならびに多くても７０である。置換、挿入、欠失又は付加の数は、６０を超えないことが特に好ましく、とりわけその数は５０又は４０を超えるべきではない。最も好ましいのは、３０以下の数である。
【００４９】
本発明の好ましい具体例は、少なくとも１つの免疫優勢な外来ＴＨエピトープの導入による修飾を含む。Ｔ細胞エピトープの免疫優勢の問題が当該の動物種に依存することは、理解されたい。ここで使用する限り、「免疫優勢」という用語は単に、ワクチン注射した個体／群において顕著な免疫応答をもたらすエピトープを意味する。しかし、一個体において免疫優勢なＴ−細胞エピトープが、同一種の別の個体においてＭＨＣ−ＩＩ分子を結合できるからといって、必ずしも後者の個体において免疫優勢であるとは限らないことは周知の事実である。真の免疫優勢ＴＨエピトープは、サブ配列を形成するポリペプチドから独立して、ＴＨ細胞活性化を引き起こすものである−言い換えれば、幾つかのＴＨエピトープは、実質的に常にＡＰＣで処理され、ＭＨＣクラスＩＩ分子の状況で、ＡＰＣの表面上で提示されるため、本質的な特性として、実質的に決してクリプティックではない特徴を有する。
【００５０】
もう一つの重要な点は、Ｔ−細胞エピトープのＭＨＣ制限の問題である。一般に、天然に存在するＴ−細胞エピトープはＭＨＣ制限性である。すなわち、Ｔ−細胞エピトープを構成するあるペプチドのみがＭＨＣクラスＩＩ分子のサブセットに効果的に結合する。これはその結果、多くの場合において、１つの特異的なＴ−細胞エピトープの使用が個体群のフラクションにのみ有効なワクチン成分を生じるという効果を有する。また、フラクションのサイズ次第でより多くのＴ−細胞エピトープを同一分子内に必然的に含めることができ、あるいは導入されたＴ−細胞エピトープの性質によって互いに識別される抗原の変異体が成分である多成分ワクチンを調製することができる。
使用するＴ−細胞のＭＨＣ制限が全く未知である場合（例えばワクチン注射した動物があまり確定されていないＭＨＣ組成を有している場合）、特異的なワクチン組成によってカバーされる動物個体群のフラクションは以下の式によって決定することができる：
【００５１】
【数１】
2004508028.tif 000003
［式中、ｐｉはワクチン組成中に存在するｉｔｈの外来Ｔ−細胞エピトープに対して応答する個体群における頻度、ｎはワクチン組成中の外来Ｔ−細胞エピトープの総数である］。この結果、個体群において０．８、０．７及び０．６の応答頻度をそれぞれ有する３個の外来Ｔ−細胞エピトープを含むワクチン組成は
１ − ０．２ × ０．３ × ０．４ ＝ ０．９７６
となり、すなわち、個体群のうち９７．６％がＭＨＣ−ＩＩを介したワクチンへの応答を統計的に高める。
【００５２】
上記の式は、使用されるペプチドについて多少とも正確なＭＨＣ制限パターンが知られている場合には適用されない。例えば、あるペプチドのみがＨＬＡ−ＤＲアレレＤＲ１、ＤＲ３、ＤＲ５及びＤＲ７によってエンコードされるヒトＭＨＣ−ＩＩ分子に結合する場合には、このペプチドを、ＨＬＡ−ＤＲアレレによってエンコードされる残りのＭＨＣ−ＩＩ分子に結合する別のペプチドとともに使用することにより、当該個体群で１００％の到達範囲が達成される。同様に、第二のペプチドがＤＲ３及びＤＲ５のみに結合する場合には、このペプチドの付加は到達範囲を全く増加させない。個体群応答の算出の基礎を完全にワクチン中のＴ−細胞エピトープのＭＨＣ制限におく場合、特異的なワクチン組成物でカバーされる個体群のフラクションは以下の式によって決定される：
【００５３】
【数２】
2004508028.tif 000004
［式中、φｊはワクチン中のＴ−細胞エピトープのいずれか１つを結合し、かつｊｔｈの３つの公知のＨＬＡ座（ＤＰ、ＤＲ及びＤＱ）に属するＭＨＣ分子をエンコードするアレリックハプロタイプの個体群における頻度の合計である。実際には、どのＭＨＣ分子がワクチン中の各Ｔ−細胞エピトープを認識するかをまず測定し、その後、これらＭＨＣ分子を型（ＤＰ、ＤＲ及びＤＱ）によってリストする。次いで、リストした種々のアレリックハプロタイプの個々の頻度を型ごとに合計し、φ１、φ２及びφ３を得る］。
【００５４】
式ＩＩの値ｐｉは対応する理論値πｉを超えることがあるかもしれない：
【数３】
2004508028.tif 000005
［式中、νｊは ワクチン中のｉｔｈのＴ−細胞エピトープを結合し、かつｊｔｈの３つの公知のＨＬＡ座（ＤＰ、ＤＲ及びＤＱ）に属するＭＨＣ分子をエンコードするアレリックハプロタイプの個体群における頻度の合計である。これは、１−πｉの個体群で、ｆ誤差（ｒｅｓｉｄｕａｌ）＿ｉ ＝ （ｐｉ−πｉ）／（１−πｉ） の応答頻度が存在することを意味する。したがって、式ＩＩＩを調整して式Ｖとすることができる：
【００５５】
【数４】
2004508028.tif 000006
［式中、用語１−ｆ誤差＿ｉは、負のときは０に設定される］。式Ｖにより、全てのエピトープが同一セットのハプロタイプにハプロタイプマップ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｍａｐｐｅｄ）される必要のあることに留意されたい。
したがって、類似体に導入されるＴ細胞エピトープを選択するときは、エピトープに関する利用可能な全ての知識： １）個体群における各エピトープへの応答頻度、２）ＭＨＣ制限データ及び３）関連するハプロタイプ個体群における頻度を含めることが重要である。
【００５６】
動物種の個体又は動物個体群の大部分において活性な、天然に存在する「乱交雑」Ｔ−細胞エピトープが多量に存在する。これらは好ましくはワクチンに導入され、それによって同一ワクチンにおける極めて多量の異なる類似体の必要性を低減する。
本発明によれば、乱交雑エピトープは、破傷風トキソイド（例えばＰ２及びＰ３０エピトープ、ＷＯ ００／２００２７中のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２および１４参照）、ジフテリアトキソイド、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）及びピー・ファルシパルム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ） ＣＳ抗原由来エピトープのような天然に存在するヒトＴ−細胞エピトープであってもよい。
【００５７】
長年にわたり、その他の乱交雑Ｔ−細胞エピトープが多数同定されている。特に、異なるＨＬＡ−ＤＲアレレによってエンコードされるＨＬＡ−ＤＲ分子の大部分を結合しうるペプチドが同定されており、これらは全て本発明にしたがって使用される類似体に導入される可能性のあるＴ−細胞エピトープである。すべてここに引用して組み込まれる以下の文献に記載のエピトープも参照のこと： ＷＯ ９８／２３６３５ （Ｆｒａｚｅｒ ＩＨ ら、Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄに譲渡）； Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄ Ｓ ら、１９９８、 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０： ３３６３〜３３７３； Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ Ｆ ら、１９８８、Ｎａｔｕｒｅ ３３６： ７７８〜７８０； Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ ＨＧら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ４１：４ １７８〜２２８；Ｃｈｉｃｚ ＲＭ ら、１９９３、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ １７８： ２７〜４７； Ｈａｍｍｅｒ Ｊ ら、１９９３、Ｃｅｌｌ ７４： １９７〜２０３； 及びＦａｌｋ Ｋ ら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ３９： ２３０〜２４２。最後の文献は、ＨＬＡ−ＤＱリガンド及びＨＬＡ−ＤＰリガンドについても論じている。これら５文献に挙げられるエピトープは、全て本発明で使用される天然エピトープと共通のモチーフを共有するため、その候補として適切である。
【００５８】
あるいは、エピトープはハプロタイプの大部分を結合しうるいずれかの人為的なＴ−細胞エピトープであってもよい。この明細書において、ＷＯ ９５／０７７０７及び対応する論文Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｊ ら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １： ７５１〜７６１ （両者ともここに引用して組み込む）に記載のｐａｎ ＤＲ エピトープペプチド（「ＰＡＤＲＥ」）が、本発明にしたがって使用されるエピトープの候補として興味深い。これらの論文に開示される最も有効なＰＡＤＲＥペプチドは、投与時の安定性を改善するためにＣ−末端及びＮ−末端にＤ−アミノ酸を担持することに留意されたい。しかしながら、本発明は第一に、適切なエピトープを修飾ＩｇＥの一部として組み込むことを目的とする。これはその後、ＡＰＣのリソソーム分画内で酵素的に破壊し、続いてＭＨＣ−ＩＩ分子に関連して提示を行う。したがって、本発明において使用されるエピトープにＤ−アミノ酸を組み込むことは得策ではない。
【００５９】
特に好ましいＰＡＤＲＥペプチドのひとつは、アミノ酸配列ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）又は免疫学的に有効なそのサブ配列を有するペプチドである。これと、同じＭＨＣ制限を欠いている他のエピトープが、本発明の方法で使用される類似体に存在すべき好ましいＴ−細胞エピトープである。このような超−乱交雑エピトープは、ワクチン注射した動物の免疫系に単一の類似体のみを提示する、本発明の最も簡単な具体例を可能にする。
上記変異体／修飾体の特性は、好ましくは、
−抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対して類似体を標的化させる第一部分の少なくとも１つが、第一および／または第二類似体中に含まれている、および／または
−免疫系を刺激する第二部分の少なくとも１つが、第一および／または第二類似体中に含まれている、および／または
−類似体の免疫系への提示を最適化する少なくとも１つの第三部分が、第一および／または第二類似体中に含まれている
ことからなる。
【００６０】
これら第一、第二および第三部分に関連する機能的ならびに構造的な特性を次に論じる：
それらは、オートロガスＩｇＥのアミノ酸配列またはそのサブ配列中の適切な化学基へ共有結合したか、非共有結合した側基の形態で存在してもよい。これは、オートロガスＩｇＥから誘導されるアミノ酸残基のストレッチが、主たるアミノ酸配列を変更させることなく、あるいは少なくとも鎖内の個々のアミノ酸間のペプチド結合に変化を加えることなく、誘導されることを意味する。
部分は、オートロガスＩｇＥ由来のアミノ酸配列に対する融合パートナーの形態であってもよい。これに関連して、両者の可能性は、担体にアミノ酸配列を接合させる選択肢（以下の論議を参照）を含むことが言及されるべきである。言い換えれば、本文で「融合タンパク質」という用語は、構築物をエンコードするＤＮＡフラグメントの発現を用いて調製される融合構築物に限定されるだけでなく、その後の化学反応でペプチド結合を用いて結合される２つのタンパク質間の接合でもある。
【００６１】
上記のように、類似体は、類似体をＡＰＣ又はＢ−リンパ球に標的化する第一部分の導入を含んでいてもよい。例えば、第一部分は、Ｂ−リンパ球の特異的な表面抗原又はＡＰＣ特異的な表面抗原に特異的な結合パートナーであってもよい。そのような特異的な表面抗原の多くは、当該技術において公知である。例えば、部分はＢ−リンパ球又はＡＰＣに受容体がある炭水化物であってもよい（例えばマンナン又はマンノース）。又は、第二部分はハプテンであってもよい。ＡＰＣ又はリンパ球で表面分子を特異的に認識する抗体フラグメントも、第一部分として使用することができる（表面分子は、例えばＦＣγＲＩのようなマクロファージ及び単球のＦＣγ受容体、あるいはＣＤ４０又はＣＴＬＡ−４等のようないずれかの他の特異的な表面マーカーであってもよい）。これら全ての代表的な標的化分子は、アジュバントの一部として使用できることは理解されたい（以下を参照のこと）。ＣＤ４０リガンド、ＣＤ４０に対する抗体またはＣＤ４０を結合するその変異体は、樹状細胞に対して類似体を標的とするであろう。同時に、近年の成果は、ＣＤ４０分子との相互作用は、ＴＨ細胞がＣＴＬ反応を得るためには必須ではないことを示している。それ故、第一部分としての（またはアジュバントとしての、以下を参照）ＣＤ４０結合分子の一般的な使用は、ＣＴＬ反応を大幅に増大させると考えられる：事実、本発明の意味においてアジュバントおよび「第一部分」としてのＣＤ４０結合分子の使用は、それ自体が発明であると考えられる。
【００６２】
免疫応答を増強するために類似体をある細胞型に標的化することの代案又は補足として、免疫系を刺激する上記第二部分を含むことによって免疫系の応答レベルを増すことができる。このような第二部分の一般的な例は、サイトカイン、熱ショックタンパク質およびホルモン、ならびにそれらの有効な部分である。
本発明にしたがって使用される適切なサイトカインは、通常ワクチン組成物でアジュバントとしても機能するもの、例えばインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。あるいは、サイトカイン分子の機能的部分が第二部分として十分である。このようなサイトカインのアジュバント物質としての使用に関しては、下記の記載を参照のこと。
【００６３】
あるいは、第二部分はリステリオリシン（ｌｉｓｔｅｒｉｏｌｙｃｉｎ）（ＬＬＯ）、脂質Ａ及び非耐熱性エンテロトキシンのような毒素であってもよい。また、ＭＤＰ（ムラミルジペプチド）、ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）及びトレハロースジエステルＴＤＭ及びＴＤＥなどの多数のマイコバクテリア誘導体が、興味深い可能性のあるものである。
本発明によれば、第二部分として使用される適当な熱ショックタンパク質は、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＣ７０、ＧＲＰ９４およびカルレチクリン（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ） （ＣＲＴ）であってもよい。
【００６４】
免疫系への類似体の提示を高める第三部分を導入しうることもまた、本発明の重要な具体例である。この原理のいくつかの例が当該技術において示されている。例えば、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）タンパク質ＯｓｐＡのパルミトイル脂質化アンカーを利用して、自己アジュバント化ポリペプチドを提供できることが知られている（例えばＷＯ ９６／４０７１８を参照）。脂質化したタンパク質は、ポリペプチドの脂質化アンカー部分とそこから突出する残りの分子部分からなる核を有するミセル状構造を形成し、その結果、抗原決定基を多数提示するものと考えられる。したがって、これの使用及び異なる脂質化アンカー（例えばミリスチル基、ファルネシル基、ゲラニル−ゲラニル基、ＧＰＩアンカー及びＮ−アシルジグリセライド基）を用いた関連の研究は、特に、組換えて製造したタンパク質内の脂質化アンカーの供給がかなり簡単で、例えば天然に存在するシグナル配列を類似体の融合パートナーとして使用することを要求するにすぎないため、本発明の好ましい具体例である。もう一つの可能性として、相補因子Ｃ３のＣ３ｄフラグメント又はＣ３自体の使用が挙げられる（Ｄｅｍｐｓｅｙ ら，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１、３４８〜３５０及びＬｏｕ ＆ Ｋｏｈｌｅｒ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６，４５８〜４６２参照）。
【００６５】
ＩｇＥの細胞外で暴露される部分のエピトープに対して本発明の方法を使う場合、第一および／または第二類似体は、ＩｇＥの重鎖または軽鎖の１つ以上の一定のドメインの三次構造の全般を実質的に有するのが最も好ましい点に留意することが重要である。つまり、本明細書および請求の範囲で、このことは、細胞外で暴露されるＩｇＥの部分の三次構造全般が保存されていることを意味している。というのは、上記のように、必須の細胞内部分の三次構造（例えば、Ｂ細胞膜アンカー領域の細胞内部分）が、体液免疫系に従事しないからである。事実、本発明のワクチン注射のストラテジの部分として、ＩｇＥの細胞内部分由来の想定されるＢ細胞エピトープの細胞外区画を暴露するのを避けるのが時として望ましい；この様にして、他の抗原との交差反応で引き起こされる潜在的な副作用を最小限にすることができる。
しかし、本発明の目的において、変異／修飾（挿入、付加、欠失または置換である）が外来Ｔ細胞エピトープに生じ、同時にＩｇＥ内のＣＴＬエピトープの実質的な数（時としてＢ細胞エピトープの実質的な数も）を保存していれば十分である。
【００６６】
以下の式は、この発明で全体的に包含される構築物を記載している：
（ＭＯＤ１）ｓ１（ＩｇＥｅ１）ｎ１（ＭＯＤ２）ｓ２（ＩｇＥｅ２）ｎ２．．．．（ＭＯＤｘ）ｓｘ（ＩｇＥｅｘ）ｎｘ　　　　（Ｉ）
− ここで、ＩｇＥｅ１−ＩｇＥｅｘ は、ｘのＣＴＬおよび／またはＢ細胞エピトープを含有するオートロガスＩｇＥのサブ配列で、個々に同一であるか又は非同一であり、外来側基を含んでいてもよく含まなくてもよい。ｘは３以上の整数で、ｎ１−ｎｘは０以上のｘの整数（少なくとも１つは１以上）であり、ＭＯＤ１−ＭＯＤｘ は保存されたエピトープ間に挿入されたｘ の修飾で、かつｓ１−ｓｘ は０以上のｘの整数である（側基が配列に導入されないならば、少なくとも１つは１以上である）。したがって、全般的な機能が構築物の免疫原性を限定するので、この発明は、本来の一定のＩｇＥ重鎖または軽鎖配列のあらゆる種類の置換及びそれにおけるあらゆる種類の修飾を可能にする。つまり、例えばインビボで副作用を示すオートロガスＩｇＥ配列の一部（例えば、ＩｇＥの重鎖のＣＨ１ドメインの部分） を省くか、あるいは普通は細胞内にあり、この結果、望ましくない免疫学的反応を生じる部分を省いて得られる類似体は、本発明に含まれる（以下の詳細な論議を参照）。
【００６７】
オートロガスＩｇＥの大部分に対して抗体を生じさせることができる免疫原で免疫化する際に伴われる深刻な副作用が存在することを明らかにされれば、ＩｇＥの「安全」領域に対する抗体反応を限定することが好ましい。例えば、完全なＣＨ２−ＣＨ３ドメイン（およびＣＨ３ドメインのみも）での免疫化は、ＦｃεＲ結合ＩｇＥの交差によって肥満細胞の脱顆粒化を引き起こさないことがこれまでに実証されているため、それ故、これらドメイン由来のＢ細胞エピトープを含むのが論理的である−特に、ＣＨ２とＣＨ３とのドメイン間の蝶番領域がＩｇＥの７６アミノ酸ＦｃεＲＩ結合部分を含むことは公知であり、この特異領域を用いることで、交差が確実に生じることができないであろう。さらに、Ｂ細胞結合ＩｇＥの膜アンカー領域の細胞外部分（ＭＩＧＩＳフラグメント）は、交差抗体を誘導できない興味深いエピトープも含む。最後に、近年の研究は、ＩｇＥのＣＨ４ドメインが、ＩｇＥのＦｃεＲＩ結合に結合する現象に関与することも明らかにした。それゆえ、本発明で使用される免疫原は、好ましくは、オートロガスＩｇＥのＣＨ２ドメイン由来および／またはＣＨ３ドメイン由来および／またはＣＨ４ドメイン由来および／またはＭＩＧＩＳフラグメント由来の少なくとも１つのＢ細胞エピトープを含む。好ましい具体例で、免疫原（例えば、第一および／または第二類似体）は、少なくとも１つの外来Ｔヘルパーエピトープが挿入または置換によって導入される完全なＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含む。その様な構築物もＭＩＧＩＳフラグメントを含むことができる。
【００６８】
本発明の特に好ましい構築物は、
Ｉ１−（ＣＨ３）ｎ１−Ｉ２−（ＣＨ４）ｎ２−Ｉ３
（この中で、ＣＨ３は、オートロガスＩｇＥの完全なＣＨ３ドメインであり、ＣＨ４は、オートロガスＩｇＥの完全なＣＨ４ドメインであり、Ｉ１、Ｉ２およびＩ３は、各々がオートロガスＩｇＥの外来Ｔヘルパーエピトープおよび／またはＭＩＧＩＳフラグメントを少なくとも１つ取り込んだアミノ酸配列であり、ｎ１およびｎ２は０以上の整数であり、少なくとも１つは１以上である）の構造物を含むか、またはそれからなる。あるいは、本発明の構築物は、ＣＨ３またはＣＨ４ドメイン中で置換基として外来Ｔ細胞エピトープを含み、同時に、選択されたドメインの三次構造が置換によって著しく影響されないことを立証した。
適用可能な場合、変異および／または修飾は、オートロガスＩｇＥのＢ細胞エピトープの少なくとも１つ、またはＣＴＬエピトープの少なくとも１つの複製を含むことがさらに好ましい。このストラテジは、好ましいエピトープ領域の複数のコピーが免疫系に提示され、そして効果的な免疫反応の確率を最大化する結果をもたらす。それゆえ、本発明のこの具体例は、オートロガスＩｇＥ由来のエピトープ（つまり、少なくとも１つのＢ細胞エピトープが２つの位置に存在する式Ｉ）の複数提示を利用している。
【００６９】
このことは、様々な方法、例えば、単に構造（ＩｇＥｅ）ｍ（式中、ｍは２以上の整数、ＩｇＥは、少なくとも１つのＣＴＬまたはＢ細胞のエピトープを含む一定のＩｇＥ重鎖または軽鎖の領域である）からなる融合ポリペプチドを調製し、次いでここに論ずる修飾をエピトープ含有配列の少なくとも１つに導入することによって達成することができる。
好ましくは、オートロガスＩｇＥの重要なエピトープ領域の多数（例えば少なくとも２つ）のコピーを免疫系に提示する本発明の別の具体例は、ある分子に対するオートロガスＩｇＥ、そのサブ配列又は変異型の共有結合である。例えば、デキストランのような炭水化物などのポリマーが使用可能である（例えば、Ｌｅｅｓ Ａ ら，１９９４，Ｖａｃｃｉｎｅ １２： １１６０〜１１６６； Ｌｅｅｓ Ａ ら，１９９０，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５： ３５９４〜３６００を参照のこと）。しかし、マンノースやマンナンも有用な代替手段である。例えば、大腸菌及び他の細菌からの膜内在性タンパク質も、有用な接合パートナーである。キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような従来の担体分子も好ましく、有用な接合パートナーである。
【００７０】
Ｂ細胞エピトープの時として有益な実質的なフラクション又は上記の修飾に付されるオートロガスＩｇＥの全体的な三次構造の維持は、幾通りかの方法によって達成することができる。ひとつは、単にオートロガスＩｇＥに対するポリクローナル抗血清（例えばウサギまたは他の適切な動物で調製した抗血清）を調製し、その後この抗血清を、製造される修飾タンパク質に対する試験薬として（例えば競合ＥＬＩＳＡで）使用する方法である。オートロガスＩｇＥと同程度まで抗血清と反応する修飾形（類似体）は、オートロガスＩｇＥと同じ全体的な三次構造を有しているとみなさなければならない。しかし、そのような抗血清と制限された（それでも依然として有意かつ特異的な）反応性を示す類似体は、本来のＢ細胞エピトープの実質的なフラクションを維持しているものとみなされる。
あるいは、オートロガスＩｇＥでの異なるエピトープと反応性のモノクローナル抗体の選択は、テストパネルとして用意し、使用することができる。この方法は、１）オートロガスＩｇＥのエピトープマッピング、及び２）調製した類似体に維持されるエピトープのマッピングを可能にするという利点がある。
【００７１】
当然のことながら、第三の方法は、オートロガスＩｇＥ又は生物学的に活性な切頭（ｔｒｕｎｃａｔｅ）（上記参照）の三次元構造を解析し、これを、調製した類似体について解析した三次元構造と比較することである。三次元構造は、Ｘ線回折研究及びＮＭＲ分光法によって解析することができる。三次構造に関するさらなる情報は、ある程度までは、純粋型のポリペプチドを要するという利点があるにすぎない円偏光二色性研究から得ることができ（Ｘ線回折では結晶化ポリペプチドの準備、ＮＭＲではポリペプチドの同位体変異型の準備を要する）、所定の分子の三次構造についての有用な情報が提供される。しかしながら、最終的には、Ｘ線回折及び／又はＮＭＲが確実なデータを得るために必要である。なぜなら、円二色性は、二次構造要素の情報を介すると正確な三次元構造については間接的な証拠しか提供できないからである。
【００７２】
三次構造上の破壊効果をなくすため、外来Ｔヘルパーエピトープの挿入に特に適したＩｇＥ内での領域を選択することは、相対的に単純であることに留意すべきである。特に好ましい領域は、（三次構造に直接寄与しない）柔軟なループ領域と柔軟な蝶番領域、およびＮまたはＣ末端である。あるいは、ＴＨエピトープの導入は、エピトープの二次構造と高度な類似性を有する二次構造を有する領域で行うことができる（α−へリックス領域は、α−へリックスエピトープで置換されてもよく、β−シート領域は、エピトープ等を含むβ−シートで置換されてもよい）。
【００７３】
本発明で有用なＩｇＥの特に好ましい類似体は、
−ＩｇＥのＭＩＧＩＳフラグメントの少なくとも２コピーを含むアミノ酸配列（ＭＩＧＩＳフラグメントの少なくとも２つが外来ＴＨエピトープの少なくとも１つで分離される）、−ＣＨ１またはＣＨ２ドメイン中にＮ末端、およびＣＨ４ドメインまたはＭＩＧＩＳフラグメント中にＣ末端を有するＩｇＥのフラグメントを含むアミノ酸配列（外来ＴＨエピトープの少なくとも１つが挿入されるかまたは内部置換される、例えば、ループＢＣ、ＤＥ、ＦＧ、またはＣＨ４ドメインに面したループのいずれか１つでの内部置換）、
−ＣＨ２ドメイン中にＮ末端、およびＣＨ３中にＣ末端を有するＩｇＥのフラグメントからなるアミノ酸配列（外来ＴＨエピトープの少なくとも１つが挿入されるか、または内部置換されている、例えば、ループＢＣ、ＤＥ、ＦＧ、またはＣＨ４ドメインに面したループのいずれか１つでの内部置換）、
−少なくとも１つの外来ＴＨエピトープが挿入されたか、または内部置換された本質的に単一ＩｇＥドメインからなるアミノ酸配列、
−ＩｇＥループ領域のいずれか１つの少なくとも１つ、および／またはリンカー領域のいずれか１つの少なくとも１つを含むアミノ酸配列（外来ＴＨエピトープの少なくとも１つは、２つのＩｇＥ由来領域に分離する）、
−ＣＨ３ドメインを含むアミノ酸配列（外来ＴＨエピトープの少なくとも１つは、ＣＨ３ドメイン中のβ−シート構造を実質的に破壊するために導入される）、および
−ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループとＣＨ４ドメインに面するループ中のアミノ酸配列
ならびに不活性またはＴＨエピトープ含有リンカーで共有結合された何れかの多量体
からなる群から選択される。 （それ自体が発明の権利部分でもある）その様な構築物の具体例を実施例の中で例示する。
【００７４】
ＩｇＥ構築物が外来エピトープでのアミノ酸置換で調製される場合、導入は、関連するＩｇＥフラグメント中のエピトープに最小限に影響を及ぼすように考えられることに留意するのが重要である。それゆえ、通常、置換は、欠失されたＩｇＥアミノ酸が関連するＩｇＥ（サブ）配列の３０％以下からなるＩｇＥ変異体を引き起こすだけであり、通常の状況下で、この数は、多くて２０％、多くて１５％、多くて１０％および多くて７．５％のように非常に低いであろう。
「ＭＩＧＩＳフラグメント」という用語は、ここで配列リストに示すＭＩＧＩＳフラグメントのみではなく、遺伝学的な変異および／または代替的なスプライシングの結果である様々な天然に存在するＭＩＧＩＳフラグメントも含むことも留意すべきである。
本質的に、免疫系に関係するエピトープを提示させる３つの可能な方法が現在存在する：ポリペプチド抗原を使った伝統的なサブユニットワクチン注射、遺伝学的に修飾した生ワクチンの投与、および核酸ワクチン注射。これら３つの可能性を、個々に次で論議する：
【００７５】
ポリペプチドワクチン注射
これは、当該動物に対する少なくとも１つの第一類似体の免疫学的な有効量の投与、および関連がある場合、少なくとも１つの第二類似体の免疫学的な有効量の投与を必要とする。第一および／または第二類似体の少なくとも１つは、医薬的および免疫学的に容認されうる担体および／またはビヒクルと任意のアジュバントと共に処方されるのが好ましい。
動物に投与することによって類似体を動物の免疫系に提示するとき、ポリペプチドの処方は、当該技術において一般に承認されている原理に基づく。
【００７６】
ペプチド配列を有効成分として含有するワクチンの調製法は、ここに引用してすべて組み込まれる米国特許第４，６０８，２５１号；第４，６０１，９０３号；第４，５９９，２３１号；第４，５９９，２３０号；第４，５９６，７９２号及び４，５７８，７７０号に例示されるように、一般に当該技術においてよく理解されている。通常、このようなワクチンは液体溶液又は懸濁液のいずれかのような注射剤；溶液又は懸濁液に入れるのに適した固体、注射前の液体として調製されてもよい。製剤は乳化されていてもよい。有効な免疫原性成分は、しばしば医薬的に受容され有効成分に和合する賦形剤と混合される。適当な賦形剤は、例えば水、塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等及びそれらの組み合わせである。また、望ましい場合には、ワクチンは少量の補助物質、例えば湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝薬、又はワクチンの有効性を高めるアジュバントを含んでいてもよい（アジュバントについての下記の詳細な記述を参考のこと）。
【００７７】
ワクチンは従来、例えば、表皮下、表皮内、真皮下又は筋肉内のいずれかの注射によって非経口的に投与される。他の投与方法に適した追加的な処方としては坐剤があり、時に経口、口腔内、舌下、腹腔内、鞘膜内、肛門、及び頭蓋内処方が含まれる。坐剤については、従来の結合剤及び担体、例えばポリアルカレングリコール又はトリグリセライドが含まれていてもよい。このような坐剤は有効成分を０．５〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲で含有する混合物から形成してもよい。経口処方は、例えば医薬等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出処方又は粉剤の形状をとり、１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％の有効成分を含有する。経口処方については、コレラ毒素が興味深い処方パートナーである（可能性のある接合パートナーでもある）。
【００７８】
類似体は、中性又は塩の形態としてワクチンに処方してもよい。医薬的に受容な塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基で形成される）及び例えば塩酸又はリン酸のような無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される塩が含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄のような無機塩基、ならびにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導されてもよい。
ワクチンは、用量処方に適合する方法で、治療的に有効かつ免疫原性となる量で投与される。投与量は、例えば免疫応答を増加させる個体の免疫系の能力、及び所望の防御の程度を含めて、治療される被験者に依存する。適当な用量範囲は、１回のワクチン注射あたりで有効成分が数百μｇのオーダーであり、好ましい範囲は（１〜１０ ｍｇ範囲でのより多い量を考慮しても）約０．１μｇ〜２，０００μｇであり、例えば約０．５μｇ〜１，０００μｇ、好ましくは１μｇ〜５００μｇ、特に約１０μｇ〜１００μｇの範囲である。初回投与のための適当な養生法及び追加注射も変えられるが、典型的には初回投与の後に続けて接種するか、又はその他の投与が行われる。
【００７９】
適用方法は、広く異なっていてもよい。いずれの従来のワクチン投与法も適用可能である。これらは生理的に受容な固体の基剤での経口適用、又は注射等による生理的に受容な分散液の非経口的適用を含む。ワクチンの用量は投与経路に依存し、ワクチン注射を受ける人の年齢及び抗原処方に応じて変化する。
ワクチンのポリペプチドには、ワクチン内で十分に免疫原性のものもあるが、その他の幾つかにおいては、ワクチンがアジュバント物質をさらに含む場合に免疫応答を高める。自己抗原に対する自己耐性の破壊を促進することが立証されているアジュバントを使用するのが特に好ましい。
【００８０】
ワクチンへのアジュバント効果を達成するための様々の方法が公知である。一般的な原理及び方法は、ともに引用してここに組み込まれる”Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ”， １９９５， Ｄｕｎｃａｎ Ｅ．Ｓ． Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ （編集）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ， ＩＳＢＮ ０−４７１−９５１７０−６及び”Ｖａｃｃｉｎｅｓ： Ｎｅｗ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ”， １９９５， Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ Ｇ ら （編集）， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＩＳＢＮ ０−３０６−４５２８３− ９に詳細に述べられている。
好ましいアジュバントは、ＡＰＣ、例えば樹状細胞によるワクチン分子の取り込みを促進し、これらを活性化させる。非制限的な例は、免疫標識化アジュバント；毒素、サイトカイン及びマイコバクテリア誘導体などの免疫調節アジュバント；油製剤；ポリマー；ミセル形成アジュバント；サポニン；免疫刺激複合体マトリクス（ＩＳＣＯＭマトリクス）；粒子；ＤＤＡ；アルミニウムアジュバント；ＤＮＡアジュバント；γ−イヌリン；及びカプセル化アジュバントからなる群より選択される。一般に、類似体において第一、第二及び第三の部分として有用な化合物及び薬剤に関する上記の開示は、本発明のワクチンのアジュバントにおけるそれらの使用にも必要な変更を加えて言及することに留意されたい。
【００８１】
アジュバントの適用は、通常、緩衝食塩水中０．０５〜０．１％溶液として使用される水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム（ａｌｕｍ）等の薬剤、０．２５％溶液として使用される糖の合成ポリマー（例えばカルボポル（登録商標））との混和物の使用を含み、７０〜１０１℃の温度範囲でそれぞれ３０秒〜２分熱処理することによるワクチン内でのタンパク質の凝集、ならびに架橋剤による凝集も可能である。ペプシンで処理した抗体（Ｆａｂフラグメント）での再活性化によるアルブミンへの凝集、シー・パルブム（Ｃ． ｐａｒｖｕｍ）または内毒素、又はグラム陰性細菌のリポ多糖類成分などの細菌細胞との混合、マンニッドモノ−オレエート（Ａｒａｃｅｌ Ａ）のような生理的に受容な油性ビヒクル中の乳化、又は阻害基体として使用されるパーフルオロカーボン（Ｆｌｕｏｓｏｌ−ＤＡ）の２０％溶液との乳化も、用いることができる。スクアレン及びＩＦＡなどの油との混和も好ましい。
本発明によれば、ＤＤＡ （ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）はＤＮＡやγ−イヌリンと同様、アジュバントの候補として興味深い。しかし、フロイント完全アジュバント及び不完全アジュバント、ならびにＱｕｉｌＡ及びＱＳ２１のようなキラヤサポニンもまた興味深い。さらなる可能性としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、上記のＣ３とＣ３ｄがある。
リポソーム処方もまたアジュバント効果を与えることが知られている。したがってリポソームアジュバントは本発明において好ましい。
【００８２】
免疫刺激複合体マトリクス型（ＩＳＣＯＭ（登録商標）マトリクス）アジュバントも、本発明において好ましい選択肢である。なぜなら特にこの種のアジュバントがＡＰＣによるＭＨＣクラスＩＩの発現をアップレギュレートできることが分かっているからである。ＩＳＣＯＭ（登録商標）マトリクスは、キラヤ・サポナリア（Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａ）由来の（任意に分画した）サポニン（トリテルペノイド）、コレステロール、及びリン脂質からなる。免疫原性タンパク質と混和した場合、得られる粒状処方は、サポニンが６０〜７０％ ｗ／ｗを構成し、コレステロール及びリン脂質１０〜１５％ ｗ／ｗ及びタンパク質１０〜１５％ ｗ／ｗのＩＳＣＯＭ粒子として既知のものである。免疫刺激複合体の組成及び使用に関する詳細は例えばアジュバントに関する上記教本にみられるが、Ｍｏｒｅｉｎ Ｂ ら、１９９５、Ｃｌｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３： ４６１−４７５ならびにＢａｒｒ ＩＧ 及び Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ＧＦ、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｌ． ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ７４： ８−２５ （両者とも引用してここに組み込まれる）にも完全な免疫刺激複合体の製法に関する有用な教示が示されている。
【００８３】
アジュバント効果を達成するもう一方の非常に興味深い（ゆえに好ましい）可能性は、Ｇｏｓｓｅｌｉｎら，１９９２（ここに引用して組み込まれる）に記載の技術を採用することである。要約すると、本発明の類似体のような関連抗原の提示は、単球／マクロファージのＦｃγ受容体に対して抗体（又は抗原結合抗体フラグメント）に抗原を接合させることによって高められる。特に、類似体と抗−ＦｃγＲＩとの接合体が、ワクチン注射を目的とした免疫原性を高めることが証明されている。
その他の可能性は、上記の標的化物質及び免疫調節物質（とりわけサイトカイン）を、補正された類似体で第一及び第二の部分の候補物として使用することが含まれる。これに関して、ポリＩ：Ｃのようなサイトカインの合成誘導物質もまた可能性がある。
適切なマイコバクテリア誘導体は、ムラミルジペプチド、完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ、ならびにＴＤＭ及びＴＤＥなどのトレハロースジエステルからなる群より選択される。
【００８４】
適切な免疫標的化アジュバントは、ＣＤ４０リガンド及びＣＤ４０抗体、又はその特異的結合フラグメント（上記論述を参照）、マンノース、Ｆａｂフラグメント及びＣＴＬＡ−４からなる群より選択される。
適切なポリマーアジュバントは、デキストラン、ＰＥＧ、澱粉、マンナン及びマンノース等の炭水化物；プラスチックポリマー；及びラテックスビーズ等のラテックスからなる群より選択される。
【００８５】
免疫応答を調節するさらに別の興味深い方法は、免疫原を（任意にアジュバント及び医薬的に受容な担体及びビヒクルとともに）「仮想リンパ節（ｖｉｒｔｕａｌ ｌｙｍｐｈｎｏｄｅ）」 （ＶＬＮ） （ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ， Ｉｎｃ．， ３６０ Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ １００１７−６５０１により開発された特許医療装置）に含めることである。ＶＬＮ（細管状装置）は、リンパ節の構造と機能を模倣している。ＶＬＮを皮膚下に挿入することにより、サイトカイン及びケモカインを増加させた滅菌炎症部位が形成される。Ｔ−細胞及びＢ細胞ならびにＡＰＣは、危険信号に迅速に応答し、炎症箇所に戻り、ＶＬＮの多孔質マトリクス内部に蓄積する。抗原に対する免疫応答を増加させるために要求される必要抗原用量はＶＬＮを使用すると減少すること、ＶＬＮを使用したワクチン注射によって付与される免疫防御はＲｉｂｉをアジュバントとして使用する従来の免疫化を凌ぐものであることが、分かっている。この技術はとりわけ”Ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ， Ｂｏｏｋ ｏｆ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ， Ｏｃｔｏｂｅｒ １２ｔｈ − １５ｔｈ １９９８， Ｓｅａｓｃａｐｅ Ｒｅｓｏｒｔ， Ａｐｔｏｓ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ”中のＧｅｌｂｅｒ Ｃ ら、１９９８， ”Ｅｌｉｃｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｏｂｕｓ Ｔ−ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｈｕｍｏｒａｌ Ｉｍｍｕｎｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ Ｓｍａｌｌ Ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅ Ｄｅｓｉｇｎａｔｅｄ ｔｈｅ Ｖｉｒｔｕａｌ Ｌｙｍｐｈ Ｎｏｄｅ”に簡潔に記載されている。
【００８６】
いずれにしても、発明による全ての（ポリ）ペプチドワクチン製剤について、ＣＴＬ反応を目的としたものであれば、製剤は、オートロガスＩｇＥのＣＴＬエピトープが、ＡＰＣの表面上でＭＨＣクラスＩ分子の状況で提示されるのを確証するため、ＭＨＣ Ｉ型分解系にポリペプチド免疫原を移行させえることが重要である。当業者は、この特殊な目的のために、選択すべき上記のアジュバントが判るであろう。
ワクチンは一年に少なくとも１回、例えば一年に少なくとも１、２、３、４、５、６および１２回投与されることが期待される。さらに詳しくは、１年間に１〜１２回、例えば必要な個体に１年間に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２回である。本発明による好ましい自家ワクチンの使用によって誘発される記憶免疫性が永続的ではないことは、先に示されている。したがって、免疫系を類似体で定期的に感染する必要がある。
【００８７】
遺伝的変異のため、異なる個体は、同一ポリペプチドに異なる強度の免疫応答で反応する可能性がある。したがって、本発明のワクチンは、免疫応答を増加するために数個の異なる類似体から構成されていてもよい（外来Ｔ−細胞エピトープ導入の選択に関する上記記載も参照のこと）。ワクチンは、２以上のポリペプチドから構成されていてもよい。その場合、全てのポリペプチドは上記で定義したものである。
したがって、ワクチンは３〜２０個の異なる修飾又は非修飾ポリペプチド、例えば、３〜１０個の異なるポリペプチドで構成されていてもよい。しかし、通常、ペプチドの数は、最少、例えば１または２個のペプチドを保持すると思われる。
【００８８】
生ワクチン
免疫系への提示をもたらす第二の代替例は、生ワクチン技術の使用である。生ワクチン注射において、免疫系への提示は、必要なエピトープ領域または完全な第一および／または第二類似体をエンコードする核酸フラグメントで形質転換した非病原性微生物を動物に投与することによって行われる。あるいは、微生物は、そのような核酸フラグメントを挿入したベクターで形質転換される。非病原性微生物は、いずれかの適当な弱毒化細菌株（継代培養又は組換えＤＮＡ技術による病原性発現生成物の除去によって弱毒化）であってもよく、例えばマイコバクテリウム・ボビスＢＣＧ、非病原性ストレプトコッカス種、大腸菌、サルモネラ種、ビブリオ・コレラ、シゲラなどが挙げられる。最先端技術を用いた生ワクチンの調製法に関する考察は、例えば両者ともここに引用して組み込まれるＳａｌｉｏｕ Ｐ， １９９５， Ｒｅｖ． Ｐｒａｔ． ４５： １４９２−１４９６ 及び Ｗａｌｋｅｒ ＰＤ， １９９２， Ｖａｃｃｉｎｅ １０： ９７７−９９０に見ることができる。このような生ワクチンで使用される核酸フラグメント及びベクターの詳細については、以下の記載を参照のこと。
【００８９】
ポリペプチドワクチンについては、ＴＨエピトープおよび／または第一および／または第二および／または第三部分は、存在するとすれば、オートロガスＩｇＥ由来のアミノ酸配列に対する融合パートナーの形態でありえる。
細菌性生ワクチンの別の例として、後述する本発明の核酸フラグメントを非毒性ウイルスワクチンベクターに組み込むことができる。１つの可能性は、ポックスウイルス、例えばワクシニア、ＭＶＡ（修飾型ワクシニアウイルス）、カナリア痘、アビボックスウイルスおよび水痘などである。あるいは、ヘルペス単一ウイルス変異体を使うことができる。
【００９０】
通常、非病原性の微生物又はウイルスは、動物に対して１回だけ投与される。しかし、ある場合においては、微生物を一生のうちで１回以上投与する必要があるかもしれない。
また、微生物は、例えば有用なアジュバントとして記載したサイトカインなどの上記の免疫調節物質の形態で、第一、第二及び／又は第三の部分をエンコードする領域を含む核酸で形質転換することができる。この具体例の好ましい例は、異なるオープンリーディングフレームにおいて、又は少なくとも異なるプロモーターの制御下で、類似体のコード領域と免疫調節物質のコード領域を有することを包含する。これにより、類似体又はエピトープが免疫調節物質の融合パートナーとして調製されることが回避される。あるいは、２つの異なるヌクレオチドフラグメントを形質転換剤として使用することができる。
【００９１】
生ワクチンの安全性を高め、ならびに膜結合ＩｇＥの抗−ＩｇＥ抗体による交差によって肥満細胞および好塩基球の脱顆粒化を確実に誘発できないようにするため、生ワクチン（特にウイルスの場合）中の発現カセットは、発現産物が確実に輸出されないように構築することができる。この様に、ほんの微量の発現産物が輸出されるが、残余物は、ＭＨＣ分子の状況でペプチドフラグメントとして処理され、提示される。それゆえ、誘発される抗体反応はないか、または極めて限られているが、ＣＴＬ反応は増大される。その結果、このストラテジは、アナフィラキシーを誘導する危険性を最小限にする。
【００９２】
核酸ワクチン注射
ペプチドベースワクチンの伝統的な投与の代替案として、核酸ワクチン注射技術（「核酸免疫化」、「遺伝的免疫化」、「遺伝子免疫化」および「ＤＮＡワクチン注射」としても知られる）は、多くの興味ある特徴を提供する。
まず、従来のワクチン法と対比して、核酸ワクチン注射は、免疫原性剤の資源を消費するような大規模製造（例えば、ポリペプチドワクチン注射で必要な類似体を製造する微生物の産業規模の発酵形態）を必要としない。さらに、装置の清浄化及び免疫原の再生スキームの必要がない。最後に、核酸ワクチン注射は、ワクチン注射した個体の生化学的器官に依存して導入した核酸の発現生成物を生ずるため、発現生成物について最適な翻訳後プロセシングが起こることが期待される。これは、自家ワクチン注射の場合には特に重要である。なぜなら、上記したように、最初のＢ細胞エピトープに関し有意なフラクションは細胞外で暴露されたポリペプチド配列由来の類似体で保持されるべきであり、Ｂ細胞エピトープは原則としていずれかの（生体）分子の部分（例えば炭水化物、脂質、タンパク質など）によって構成できるからである。したがって、免疫原の天然のグリコシル化及び脂質化パターンは免疫原性全体に極めて重要であり、これは宿主に免疫原を生じさせることによって最も確実となる。
【００９３】
更なる２つの特徴は、本発明の状況で核酸ワクチン注射を特に興味深いものにする。ワクチン剤としてＤＮＡを使うことで、ＭＨＣクラスＩの状況でＡＰＣにＣＴＬエピトープを確実に提示させるのは比較的単純である。さらに、ＤＮＡの投与を含む免疫化が、Ｔヘルパー細胞プロフィールでＴｈ２からＴｈ１細胞への移行をもたらすことは繰り返し立証されており、ＩｇＥで媒介されたアレルギー副作用は、最初のもので、最も重要なこととしてＴｈ２細胞により支持されるので、ＤＮＡワクチン注射の使用は、それ自体、基礎疾患に有益な効果を供給するであろう。
それゆえ、本発明の方法の重要な具体例は、提示が、ＣＴＬエピトープの少なくとも１つおよび／またはＢ細胞エピトープの少なくとも１つ、ならびに第一外来ＴＨエピトープ（代替例は、一方が少なくとも１つのＣＴＬエピトープをエンコードし、他方が少なくとも１つの外来ＴＨエピトープをエンコードする少なくとも２つの異なる核酸フラグメントの投与を含む）の少なくとも１つをエンコードして発現する核酸配列の少なくとも１つを、インビボでＡＰＣへ導入して行われることを含む。これは、上記第一類似体をエンコードして発現する核酸フラグメントを使って行われるのが好ましい。第一類似体が上記ＴＨエピトープおよび／または第一および／または第二および／または第三部分を備えている場合、これらは、オートロガスＩｇＥ由来のアミノ酸配列に対する融合パートナーの形態で存在し、融合構築物は核酸フラグメントでエンコードされる。
【００９４】
従来のワクチン法に関して、核酸ワクチン注射は、第二類似体をエンコードして発現する核酸フラグメントの少なくとも１つのＡＰＣへのインビボでの導入と組み合わせることができる。第一、第二および第三部分、ならびにＴＨエピトープに関する考察は、ここでもあてはまる。
この具体例において、導入された核酸は、裸のＤＮＡ、荷電又は非荷電脂質で製剤化したＤＮＡ、リポソームで製剤化したＤＮＡ、乳化ＤＮＡ、ウイルスベクターに含めたＤＮＡ、トランスフェクション促進タンパク質又はポリペプチドで製剤化したＤＮＡ、標的タンパク質又はポリペプチドで製剤化したＤＮＡ、カルシウム沈殿剤で製剤化したＤＮＡ、不活性担体分子に結合したＤＮＡ、およびアジュバントで製剤化したＤＮＡの形態になり得るＤＮＡであることが好ましい。本文において、従来のワクチン処方におけるアジュバントの使用に関するほとんど全ての考察が、ＤＮＡワクチンの処方に適用されることに留意されたい。したがって、ポリペプチドベースワクチンに関連したアジュバントの使用に関するここでの全ての開示は、必要な変更を加えて、核酸ワクチン注射技術におけるその使用に適用される。同様なことは、製剤、ならびに投与の形態および経路に関与する他の考察についてもあてはまり、それゆえ、従来のワクチンと関連するこれら上記の考察は、核酸ワクチン注射技術での使用にも必要な変更を加えて適用される。
【００９５】
核酸ワクチンの製剤の特に好ましい型の一つは、ＤＮＡを含む微粒子である。適した微粒子は、例えばＷＯ ９８／３１３９８に記載している。
さらに、免疫化剤として使用される核酸は、例えば有用なアジュバントとして論じたサイトカインのような上記免疫調節物質の形態で、第一、第二及び／又は第三の部分をエンコードする領域を含むことができる。この具体例の好ましい例には、異なるオープンリーディングフレーム中又は少なくとも異なるプロモーターの制御下で、類似体をコードする領域と免疫調節物質をコードする領域を有することが包含される。これにより、類似体またはエピトープが、免疫調節物質に対する融合パートナーとして生産されることが回避される。あるいは、２つの異なるヌクレオチドフラグメントを使用することができるが、これは両方のコード領域が同一分子に含まれる際に確実に同時発現されるという利点から、あまり好ましくない。
【００９６】
通常の状況では、ワクチンの核酸は、発現がウイルスプロモーター制御下にあるベクターの形態で導入される。本発明によるベクターについてのさらに詳細な論述については、下記の記載を参照のこと。また、核酸ワクチンの処方及び使用に関する詳細な記載も利用可能である：Ｄｏｎｎｅｌｌｙ ＪＪ ら、 １９９７， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５： ６１７−６４８及びＤｏｎｎｅｌｌｙ ＪＪ ら、 １９９７， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ６０： １６３−１７２を参照のこと。これらの文献は両者ともここに引用して組み込まれる。
生ワクチンの安全性を高め、ならびに膜結合ＩｇＥの抗−ＩｇＥ抗体による交差によって肥満細胞および好塩基球の脱顆粒化を確実に誘発できないようにするため核酸ワクチン中の発現カセットは、（例えば、膜取り込みまたは分泌を引き起こすシグナル配列によって）発現産物が確実に輸出されないように構築することができる。この様に、ほんの微量の発現産物が輸出されるが、残余物は、ＭＨＣ分子の状況でペプチドフラグメントとして処理され、提示される。それゆえ、誘発される抗体反応はないか、または極めて限られているが、ＣＴＬ反応は増大される。その結果、このストラテジは、アナフィラキシーを誘導する危険性を最小限にする。
【００９７】
本発明の重要な部分は、オートロガスＩｇＥ由来のエピトープに結合するＭＨＣクラスＩ分子を示す細胞に対して、動物でＣＴＬ反応を誘導できるオートロガスＩｇＥの適切な免疫原性類似体を選択するための新規な方法に関連する。この方法は、
ａ）公知または想定されるＣＴＬエピトープを含まないオートロガスＩｇＥのアミノ酸配列の少なくとも１つのサブ配列の同定、
ｂ）工程ａ）で同定される少なくとも１つのサブ配列内の位置で、動物に対して外来であるＴＨエピトープの少なくとも１つを、オートロガスＩｇＥのアミノ酸配列に導入することによるオートロガスＩｇＥの想定される免疫原性類似体の少なくとも１つの調製、および
ｃ）動物で、ＣＴＬ反応を実証的に誘導することができる工程ｂ）で調製される類似体の選抜
の工程からなる。
【００９８】
あるいは、上の選抜方法は、核酸ワクチン注射の目的のための核酸フラグメントの調製を伴う。その状況下では、エンコードされたペプチドは少なくとも１つのＴＨエピトープを含むことが要求される。
類似体が細胞外相に暴露されるＩｇＥの部分由来である場合、工程ａ）で同定されたサブ配列は、さらにシステイン残基を含まないか、あるいは工程ｂ）で導入されるＴＨエピトープがシステイン残基のパターンを実質的に変化させないことが好ましい。この方法は、オートロガスＩｇＥ中のＢ細胞エピトープに類似した最終構築物中の空間的なＢ細胞エピトープの保存を促進する。
【００９９】
同様な理由で、工程ａ）で同定されるサブ配列は、さらに公知または推定されるグリコシル化部位を含まないか、あるいは工程ｂ）で導入されるＴＨエピトープが、グリコシル化パターンを実質的に変化させないことが好ましい。
他の重要な考察は、ワクチンのポリペプチド生産物と病状とは関連しない他の自己タンパク質との免疫学的な交差反応性の問題に関連する。その様な交差反応性は、好ましくは避けられるべきであり、それゆえ、本発明のこの方法の重要な具体例は、工程ａ）で同定されるサブ配列が動物の異なるタンパク質抗原のアミノ酸配列に相同性があり、工程ｂ）でのＴＨエピトープの導入が相同性を実質的に除去する場合である：このことは、例えば他の免疫グロブリンと相同性がある領域が、これら免疫グロブリンの望ましくないダウン−レギュレートに関連する副作用を回避するために除去されることを意味する。
【０１００】
この具体例には、１）通常、細胞外相に暴露されない、および２） ＩｇＥのＢ細胞エピトープからなってもよい何れかのアミノ酸配列が類似体中で保存されていない具体例が関連している。これは、その様なアミノ酸配列を、それらを完全に除去するか、またはそれらを部分的に除去することで、Ｂ細胞エピトープからは構成されないＴＨエピトープと変換することで達成することができる。
一方、オートロガスＩｇＥのあらゆる「真の」Ｂ細胞エピトープは、高度に保存され、それゆえ、本発明の選抜方法の重要な具体例は、工程ｂ）での外来ＴＨエピトープの導入が、オートロガスＩｇＥのＢ細胞エピトープの実質的なフラクションの保存を生じることを伴う。類似体は、オートロガスＩｇＥの全体にわたる三次構造を保存していることが特に好ましい。
【０１０１】
工程ｂ）での調製は、分子生物学的手法または固相あるいは液相ペプチド合成法で行われるのが好ましい。短いペプチドは、周知の固相または液相ペプチド合成の技術で調製されるのが好ましい。しかし、この技術の近年の進歩は、これらの手段でのポリペプチドおよびタンパク質の全長の製造を可能にし、それゆえ、本発明の範囲内で、合成手段を使って長い構築物を調製することも可能である。
上記方法に従って有用な類似体を同定した後、類似体を大規模に製造することが必要である。ポリペプチドは、当該分野で周知の方法に従って調製される。
これは、方法に従って選抜された類似体をエンコードする核酸配列をベクターに導入し、かつ、ベクターを使って適切な宿主細胞を形質転換することで形質転換細胞を調製する第一工程からなる分子生物学的な手法にて行うことができる。次の工程は、オートロガスＩｇＥの類似体をエンコードする核酸フラグメントの発現を促進し、続いて、培養上清液または例えば溶解物の形態の細胞から直接類似体を回収する条件下で、形質転換細胞を培養することである。あるいは、類似体は、固相または液相ペプチド合成（上記参照）で大規模に調製できる。
【０１０２】
最終的に、生産物は、宿主細胞として選択した細胞、または使用される合成方法によって、人工的な翻訳後修飾に付すことができる。これらは、当該分野で公知の再生スキーム、（グリコシル化をするか、または望ましくない融合パートナーを除去するための）酵素処理、化学修飾（再度グルコシル化する可能性がある）および接合（例えば従来の担体分子に対して）であってもよい。
本発明の好ましい類似体（および本発明の方法で使用される関連類似体も）は、オートロガスＩｇＥ又は少なくとも１０アミノ酸長のそのサブ配列と配列が少なくとも７０％同一のポリペプチドを生じる修飾を含むことに留意されたい。配列同一性はより高いことが好ましく、例えば少なくとも７５％又は少なくとも８０％または８５％でさえある。タンパク質及び核酸の配列同一性は、（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）・１００／Ｎｒｅｆ（式中、Ｎｄｉｆ は、アラインしている際の２つの配列における非同一残基総数、Ｎｒｅｆ は一方の配列における残基数）として計算され得る。従って、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣ （Ｎｄｉｆ＝２及びＮｒｅｆ＝８）と７５％の配列同一性を有するであろう。
【０１０３】
本発明の核酸フラグメントおよびベクター
類似体が組換え遺伝子技術のみならず化学合成又は半合成によっても調製できることが上記の開示から理解できるであろう。この後者２つの選択肢は、修飾がタンパク質担体（例えばＫＬＨ、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド及びＢＳＡ）及び炭水化物ポリマーのような非タンパク質分子に結合することからなる場合、また、当然のことながら修飾が側鎖又は側基のポリペプチド由来ペプチド鎖への付加からなる場合、特に適切である。
遺伝子組換え技術のために、また当然のことながら核酸免疫化のために、必要なエピトープ領域および類似体をエンコードする核酸フラグメントは重要な化学生成物である。従って、発明の重要な部分は、上記の類似体をエンコードする核酸フラグメント、好ましくは、挿入及び／又は付加、好ましくは置換及び／又は欠失によって外来ＴＨ−細胞エピトープを導入したポリペプチドに関する。本発明の核酸フラグメントは、ＤＮＡ又はＲＮＡフラグメントのいずれかである。
【０１０４】
本発明の核酸フラグメントは、通常適切なベクターに挿入されて発明の核酸フラグメントを有するクローニング又は発現ベクターを形成する。このような新規なベクターもまた発明の一部である。本発明のこれらのベクターの構築に関する詳細は、形質転換細胞及び微生物との関連で下記に記載する。ベクターは用途の目的及び種類に応じてプラスミド、ファージ、コスミド、ミニ染色体又はウイルスの形態であってよいが、ある種の細胞で一時的に発現されるにすぎない裸のＤＮＡも重要なベクターである。本発明の好ましいクローニング及び発現ベクターは自律複製でき、後のクローニング用の高レベルの発現又は高レベルの複製のために高いコピー数を可能にする。
【０１０５】
本発明のベクターの概要は、５’→３’方向及び操作可能な連鎖において次の特徴を含む：本発明の核酸フラグメントの発現を駆動するプロモーター、ポリペプチドフラグメントの分泌あるいは膜への組み込みを可能にするリーダーペプチドをエンコードする任意の核酸配列、本発明の核酸フラグメント、及び転写終結区をエンコードする核酸配列。産生株あるいは細胞系で発現ベクターを操作する場合、宿主細胞への導入時にベクターを宿主細胞ゲノムに組み込むことが、形質転換細胞の遺伝的安定性のために好ましい。一方、動物でのインビボ発現を行うために使用されるベクターを用いて操作する場合（即ち、ＤＮＡワクチン注射にベクターを用いる場合）は、ベクターが宿主細胞ゲノムに組込まれ得ないことが安全性のため好ましい。通常、裸のＤＮＡ又は非組込み型ウイルスベクターが用いられる。これらの選択は当業者には周知である。
【０１０６】
本発明のベクターは、宿主細胞を形質転換し、本発明の類似体を産生するのに用いられる。そのような形質転換細胞も発明の一部であり、本発明の核酸フラグメント及びベクターの増殖に用いられるか又は本発明の類似体の組換え産生に用いられる培養細胞あるいは細胞系であってもよい。あるいは、形質転換細胞は、細菌膜や細胞壁への類似体の分泌又は組込みを行うように核酸フラグメント（単コピーあるいは多コピー）が挿入された適切な生ワクチン株であってもよい。
本発明の好ましい形質転換細胞は、細菌（エシェリキア種（例えば大腸菌）、バチルス（例えば、バチルス・ズブチリス）、サルモネラ菌又はマイコバクテリウム（好ましくは非病原性のもの、例えば．エム・ボビスＢＣＧ））、酵母（例えばサッカロマイセス・セレビジエ）等の微生物及び原生動物である。あるいは、形質転換細胞は、真菌、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞等の多細胞生物由来のものである。ヒト由来の細胞が、極めて好ましい（以下の細胞系及びベクターについての議論参照）。
【０１０７】
クローニング及び／又は最適発現のために、形質転換細胞が本発明の核酸フラグメントを複製できることが好ましい。核酸フラグメントを発現する細胞は、本発明の好ましい有用な具体例である。それらは、類似体の小規模あるいは大規模調製や、非病原性細菌の場合には、生ワクチンのワクチン成分として用いることができる。
形質転換細胞によって本発明の類似体を産生する場合、発現生成物を培養培地に運び出すか形質転換細胞表面に保持することが便利であるが、かならずしも必須ではない。
有効な産生細胞を同定した際には、それに基づいて、本発明のベクターを担持し、類似体をエンコードする核酸フラグメントを発現する安定な細胞系を確立することが好ましい。この安定な細胞系は、本発明の類似体を分泌あるいは担持することによってその精製を簡単にするのが好ましい。
【０１０８】
一般に、宿主細胞と和合性の種由来のレプリコン及びコントロール配列を含むプラスミドベクターが、宿主と組み合せて用いられる。ベクターは元来複製部位と、形質転換細胞に表現型の選択を与えることができるマーキング配列とを有する。例えば、大腸菌は、通常大腸菌種由来のプラスミドｐＢＲ３２２を用いて形質転換される（例えば、Ｂｏｌｉｖａｒら、１９７７参照）。ｐＢＲ３２２プラスミドはアンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、このために形質転換細胞の同定に簡単な手段を提供している。ｐＢＲプラスミド又は他の微生物プラスミドもしくはファージも、発現のために原核微生物によって用いられるプロモーターを含むか、あるいは含むように修飾する必要がある。
【０１０９】
組換えＤＮＡの構築に最も一般的に用いられるプロモーターには、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）及びラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇら、１９７８； Ｉｔａｋｕｒａら、１９７７； Ｇｏｅｄｄｅｌら、１９７９）及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が含まれる（Ｇｏｅｄｄｅｌ ら， １９７９； ＥＰ−Ａ−０ ０３６ ７７６）。これらが最も普通に用いられる一方、他の微生物プロモーターが発見され利用されている。それらのヌクレオチド配列については詳細が公表されており、当業者はそれらをプラスミドベクターと機能的に結合することができる（Ｓｉｅｂｗｅｎｌｉｓｔら， １９８０）。原核生物由来のある種の遺伝子は人工的な手段で別のプロモーターを付加する必要がなく、それ自体のプロモーター配列から大腸菌中で効率的に発現され得る。
【０１１０】
原核生物に加えて酵母培養物のような真核微生物もまた使用でき、ここでもプロモーターが発現を駆動できるはずである。サッカロマイセス・セレビジエあるいは通常のパン酵母が真核微生物の中で最も普通に用いられるが、いくつかの他の株、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）も一般に利用可能である。サッカロマイセスでの発現には、例えばプラスミドＹＲｐ７が通常用いられる（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ ら， １９７９； Ｋｉｎｇｓｍａｎ ら， １９７９； Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ ら， １９８０）。このプラスミドはｔｒｐｌ遺伝子をすでに含んでおり、これにより例えばＡＴＣＣ Ｎｏ． ４４０７６あるいはＰＥＰ４−１のようなトリプトファン中で成長できる能力を欠く酵母変異株に選択的なマーカーを提供している（Ｊｏｎｅｓ， １９７７）。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐｌ欠陥の存在は、次いで、トリプトファン不在下での成長によって形質転換を検出する有効な環境となる。
【０１１１】
酵母ベクター中の適切な促進配列には、３‐ホスホグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｍａｎ ら， １９８０）又は他の解糖酵素（Ｈｅｓｓ ら， １９６８； Ｈｏｌｌａｎｄ ら， １９７８）、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルべートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルべートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼのプロモーターが含まれる。適切な発現プラスミドの構築では、ｍＲＮＡのポリアデニル化と終結を生じるように、これらの遺伝子に関連する終結配列も発現が望まれる配列の発現ベクター３’に結合される。
成長条件によって転写が制御されるという別の利点を有する他のプロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロームＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝関連分解酵素、及び上記のグリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、マルトース及びガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域がある。酵母和合性プロモーター、複製起点及び終結配列を含むプラスミドベクターは、いずれも適切である。
【０１１２】
微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養物を宿主として用いてもよい。原則として、そのような細胞培養物は、脊椎動物の培養物であれ無脊椎動物の培養物であれ、いずれも使用可能である。しかしながら、脊椎動物細胞に対する関心が大きく、培養での脊椎動物の増殖（組織培養）は近年常套手段となっている（Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ， １９７３）。そのような有益な宿主細胞系の例は、ＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、及びＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７ ２９３、及びＭＤＣＫ細胞系である。
このような細胞用の発現ベクターは、通常（必要であれば）複製起点、発現すべき遺伝子の前に位置するプロモーター、いずれかの必要なリボソーム結合部位と共に、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転移終結配列を含む。
【０１１３】
哺乳動物細胞で用いるため、コントロール機能がウイルス性の材料によって発現ベクターにしばしば付与される。例えば、通常使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウィルス２、最も頻繁にはシミアンウィルス４０ （ＳＶ４０）由来である。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、いずれもＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むフラグメントとしてウイルスから簡単に得ることができるので、特に有用である（Ｆｉｅｒｓ ら， １９７８）。ＨｉｎｄＩＩＩ部位からウイルスの複製起点に位置するＢｇｌＩ部位に向かって伸びる約２５０ｂｐの配列を含む場合には、より小さいかより大きいＳＶ４０フラグメントを使用してもよい。さらに、所望の遺伝子配列と通常結合しているプロモーターあるいはコントロール配列を利用することも、そのようなコントロール配列が宿主細胞系と和合性であれば、可能であるし、利用することがしばしば望ましい。
複製起点は、ベクターを構築して外来の起点、例えばＳＶ４０やその他のウイルス（例えばポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）由来であり得る起点を含むように生じてもよいし、宿主細胞染色体複製メカニズムにより生じてもよい。ベクターが宿主細胞染色体に組み込まれるのであれば、後者で十分であることがよくある。
【０１１４】
発明の構成
本発明は、効果的な免疫原性剤として、医薬的にまたは免疫学的に容認しえる担体、ビヒクル、希釈剤または賦形剤、ならびに任意のアジュバントとの混合物中に、ここで記載の類似体の少なくとも１つを含む免疫原性組成物に関する（これらの議論については、上記の本発明の方法の記載を参照）。
さらに、本発明は、オートロガスＩｇＥの抗体生産を誘導するための組成物にも関しており、組成物は、
−本発明の核酸フラグメントまたはベクター、ならびに
−医薬的におよび免疫学的に容認しうる希釈剤および／またはビヒクルおよび／または担体および／または賦形剤および／またはアジュバント
からなる。
その様な組成物に関連する処方および他の詳細は、上の核酸免疫化に関する関連部分で論議されている。
次の実施例で、本発明の好ましい構築物と、それらの製法およびこれら構築物の免疫学的な特性の試験の論議を提示する。
【０１１５】
実施例
ＩｇＥ重鎖遺伝子およびコードする配列のクローニング
ＩｇＥ重鎖Ｃ領域および／または膜結合ＩｇＥ重鎖Ｃ領域をエンコードするヒトおよびマウスの遺伝子を含むプラスミドは、様々な供給源から入手できる。また、ヒトおよびマウスの両方のＩｇＥ重鎖に関連する配列情報は、公的に入手できる。
ＣＨ２−ＣＨ３領域をエンコードする遺伝子の単離または合成は、Ｆｃ受容体結合分子フラグメントの構築に必要である。膜結合マウスＩｇＥ重鎖をエンコードする遺伝子の単離または合成は、Ｔａｎｏｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍに譲渡された特許に開示のＭＩＧＩＳ配列の同定に必要である。
【０１１６】
当初、プラークハイブリダイゼーションおよび／または保存プライマーを使ったＰＣＲ技法の何れかを使って、全ＣＨ２−ＣＨ４（ＭＩＧＩＳを含むものと含まないもの）をエンコードする遺伝子フラグメントを単離することが目的であった。しかし、後の段階で、全ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４（Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４）ドメインをエンコードする天然に存在しない遺伝子、およびＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４−ＭＩＧＩＳ（Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−ＭＩＧＩＳ）をエンコードする天然に存在しない遺伝子の合成も決定した−遺伝子は個々に、哺乳類細胞および大腸菌で発現するのに最適化されたコドンを有しているため、天然に存在しないものである。一般に、ＩｇＥエンコード材料の未知の供給源由来のコンタミネーションを伴うあらゆる想定される問題を克服できるため、および関連する発現系についてコドン選択を容易に最適化できるため、遺伝子を合成するのが好ましい。
【０１１７】
配列は、：
Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４をエンコードするＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３および５（ヒトＩｇＥ、個々に、哺乳類および大腸菌の発現に最適化したコドン選択）、ならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４および２６（マウスＩｇＥ、コドン選択は、個々に、哺乳類および大腸菌の発現に最適化される）。
Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−ＭＩＧＩＳをエンコードするＤＮＡ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（ヒトＩｇＥ、コドン選択は、哺乳類の発現に最適化される）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１（マウスＩｇＥ、コドン選択は、哺乳類の発現に最適化される）である。
人工および天然由来の構築物は、その後は本発明に従って試験される多数の構築物について、必要な構築ブロックを提供する。ＣＨ１ドメインエンコード領域も含む同様な構築物を同様な方法で合成できることはもちろんである−ヒトＩｇＥのＣ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４およびＣ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−ＭＩＧＩＳのタンパク質配列を、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および７に示し、対して、相当するマウス配列は、それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８および１９に示す。
【０１１８】
免疫原性ＩｇＥ分子フラグメントの構築
ヒトＩｇＥ由来の３−Ｄ構造を、ＦｃεＲ１非結合および結合状態の両方で決定した。この知見は、単鎖Ｆｃフラグメント（ｓｃＦｃ）構築物でリンカーを構築する際に役立てられる。
ヒトＩｇＥ重鎖ＣＨ２−ＣＨ３領域（３０１〜３７６、アミノ酸番号付けは、Ｂｅｎｎｉｃｈ １９７４年 ７月 Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＩＩ，ｖｏｌ Ｉ，ｐｐ．４９−５８のものに相当する−ＳＥＤ ＩＤ ＮＯに明確には引用していない全てのＩｇＥセグメントの番号付けは、Ｂｅｎｎｉｃｈの番号付けを引用することを意味する）由来のフラグメントは、高親和性ＩｇＥ受容体に結合するため、積極的に競合することが記載されている（Ｈｅｌｍ １９８８）。このフラグメントは、さらに、接合ワクチンの構築で使用され、肥満細胞刺激抗体が生じないことを示している。さらに、これらのあまり定義されておらず、免疫原性が比較的低い構築物を使用するにも関わらず、とにかく、誘導される自己抗体は、ＩｇＥの病原作用を無力化することを明確に示すことができる（Ｌ．Ｈｅｌｌｍａｎ，１９９４）。さらに、Ｄａｖｉｓらは、ＭＩＧＩＳ領域に対するモノクローナル抗体−膜結合ＩｇＥ重鎖領域の膜隣接部分由来の短いセグメント−が、Ｆｃ受容体結合ＩｇＥを干渉することなく、膜結合ＩｇＥを発現するＢ細胞と反応できることを示した（Ｄａｖｉｓら，１９９１）。また、ＣＨ４ドメインは、どういうわけか膜受容体へのＩｇＥの結合に関与している。
【０１１９】
ＩｇＥのこれらの部分に基付いた様々な免疫原性分子を構築することを目的としている。構築物は、ヒトおよびマウスの公知のアミノ酸配列を基にしている（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、７、１９および２８を参照）。
図３に関しては、破傷風トキソイドＰ２およびＰ３エピトープが例示される次の構築物が最初に考えられるが、この中で示される他のＴＨエピトープを利用してもよい：
構築物ｎｏ．１は、それぞれ外来エピトープが交替するＭＩＧＩＳフラグメントの幾つかのコピーを含んでいる。このタイプの構築物は、抗−ＭＩＧＩＳ抗体の誘導に大変効果があり、正確に処方されれば、ＩｇＥを生産するＢリンパ球に対してＣＴＬを誘導することができる。この構造をエンコードするＤＮＡは、それ自体も効果があるＣＴＬ誘導体でもある。
【０１２０】
構築物ｎｏ．２で、重鎖ｍＩｇＥ ＣＨ２−ＣＨ４−Ｍｉｇｉｓフラグメントの一部（３０１〜５４７、「Ｂｅｎｎｉｃｈ番号付け」）を使用した。このタンパク質フラグメントで、配列３７７〜５３５は、破傷風トキソイドＰ２およびＰ３０エピトープの２つの連続したコピーで置換した。この構築物は、Ｆｃ−受容体結合ならびに膜結合ＩｇＥを発現するＢリンパ球を干渉できる抗体の無力化を引き起こすことができると考えられている。
構築物ｎｏ．３で、ＣＨ２−ＣＨ４−ＭＩＧＩＳセグメントの大きなフラグメント（２８２〜５４７、「Ｂｅｎｎｉｃｈ番号付け」）を使用した。このフラグメントで、２８６〜３００は、１つの一般的なＴＨエピトープ（Ｐ２）と実質的に置換され、３７７〜５３３は、他方（ｐ３０）と置換されている。異なる位置で、Ｔ細胞エピトープを挿入する我々の以前の実験を基にすると、このフラグメントは、構築物ｎｏ．１および２と比べて、抗体の無力化を引き起こす異なる能力を有しているようである。
【０１２１】
構築物ｎｏ．４で、構築物ｎｏ．２の２つのコピーは、適切なリンカーを通して結合された。このことは、各々の鎖のみと比べ、大変高い結合力で関連抗原に結合するＩｇＥ抗体由来の抗原結合可変領域−いわゆる単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント−を使って以前に行ったものに匹敵する。それゆえ、構築物ｎｏ．４を単鎖Ｆｃ（ｓｃＦｃ）フラグメントと名づけた。その様な分子は、関連する本来のＩｇＥ Ｆｃ部分の模倣に優れているようである。リンカーは、公知のヒトＩｇＥ ３−Ｄ構造を基にして設計される。
【０１２２】
構築物ｎｏ．５もｓｃＦｃフラグメントである。マウスＩｇＥフラグメント３０１〜５４７で、３８１〜５２９残基は欠失されている。その後、残っているフラグメントを、Ｐ２およびＰ３０の各々少なくとも２コピーを含むリンカーを介して連結する。この様に、Ｐ２およびＰ３０は、ＩｇＥ Ｆｃフラグメントの関連する部分の二次構造に極僅かに影響を与えるであろう。
構築物ｎｏ．６もｓｃＦｃフラグメントであり、構築物ｎｏ．２の２つのコピーからなる。
構築物ｎｏ．７、８および９は、Ｆｃ受容体結合に関わる分泌されたＩｇＥの７６アミノ酸ＣＨ２−ＣＨ３配列のみを基にしている。構築物ｎｏ．７で、外来エピトープは、ＣＨ２−ＣＨ３の２８２−４０１の２８６−３００位置に挿入され、Ｐ３０は、３７７−３９７に挿入されている。構築物ｎｏ．８は、構築物ｎｏ．５と同様なＴ細胞エピトープリンカーで連結された２つの３０１−３７６セグメントである。構築物ｎｏ．９で、Ｐ２はｍＩｇＥセグメント３０１−３９５の３７７−３９１に挿入される。同様に、Ｐ３０は、ｍＩｇＥ ３７７−４０１の３７７−３９７位置に挿入され、構築物ｎｏ．１０を作り出す。
【０１２３】
他の企画された構築物は、ＣＨ４ドメインも含んでいる。一連のＤＮＡは、ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４ドメイン（ＤＮＡフラグメントをエンコードする適したＴＨエピトープの少なくとも１つに内部置換されたか挿入された）を有するＩｇＥフラグメントをエンコードする−また、相当するポリペプチド構築物は、もちろん好ましい。特に好ましい構築物の１つは、ヒト変異体で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３または５中で１２位置の後、あるいはマウス変異体で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４または２６中で９位置の後に挿入されるＰＡＤＲＥエピトープ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）をエンコードするＤＮＡ（および、もちろんＰＡＤＲＥペプチドがヒトＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１中でアミノ酸４、またはマウスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３中でアミノ酸３の後に挿入される同一のポリペプチドをエンコードする適切なＤＮＡ構築物）を含むが、挿入または置換は、ＡｕｔｏＶａｃ（登録商標）の原理に従って作製でき、つまり構築物が抗体を誘導できると考えられる場合、外来ＴＨエピトープの導入は、野生型ＩｇＥのＢ細胞エピトープの大多数を実質的に干渉しない領域で作製できる（上の一般的な記載を参照）。
【０１２４】
その他の好ましい構築物の群は、ＤＮＡが、ＣＨ２−ＣＨ３−ＣＨ４ドメイン（ＤＮＡフラグメントをエンコードする適したＴＨエピトープの少なくとも１つに内部置換されたか挿入された）を有するＩｇＥフラグメントをエンコードすることを含む−また、相当するポリペプチド構築物は、もちろん好ましい。特に好ましい構築物の１つは、ヒトで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９中で９４５位置の後、あるいはマウスで、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１中で９７２位置の後に挿入されるＰＡＤＲＥエピトープ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）をエンコードするＤＮＡ（および、もちろんＰＡＤＲＥペプチドがヒトＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８中でアミノ酸３１５、またはマウスＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０中でアミノ酸３２４の後に挿入される同一のポリペプチドをエンコードする適切なＤＮＡ構築物）を含むが、挿入または置換は、ＡｕｔｏＶａｃ（登録商標）の原理に従って作製でき、つまり構築物が抗体を誘導できると考えられる場合、外来ＴＨエピトープの導入は、野生型ＩｇＥのＢ細胞エピトープの大多数を実質的に干渉しない領域で作製できる（上の一般的な記載を参照）。
【０１２５】
免疫原由来のその他のＩｇＥの群は、ループ領域および／またはリンカー領域と導入される外来Ｔ細胞の助力との組合せからなる。すなわち、その様なヒト構築物は、あらゆる順序または散在したＴ細胞エピトープの少なくとも１つとの組み合わせで、ＢＣループエピトープ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２４４−２５１位置）および／またはＤＥループエピトープ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２７２−２８０位置） および／またはＦＧループエピトープ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３０１−３１１位置） および／またはＣ２Ｃ３リンカーエピトープ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４） および／またはＣ３Ｃ４リンカーエピトープ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）をエンコードするＤＮＡから作製される。マウス構築物は、あらゆる順序または散在したＴ細胞エピトープの少なくとも１つとの組み合わせで、ＢＣループエピトープ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）および／またはＤＥループエピトープ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２） および／またはＦＧループエピトープ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０） および／またはＣ２Ｃ３リンカーエピトープ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６） および／またはＣ３Ｃ４リンカーエピトープ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）をエンコードするＤＮＡから作製される−核酸構築物とこれら構築物のタンパク質型の両方は、本発明の部分である。具体的な構築物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と１２、ならびに核酸構造Ａ−Ｐ−Ａおよび／またはＡ−Ｐ−Ｂおよび／またはＢ−Ｐ−Ｂ（ＡがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＢがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ならびにＰがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７、あるいはＡがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、ＢがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５、ならびにＰがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）を有するか、またはこれによりエンコードされる構築物を含むが、それらに限定されない。
【０１２６】
構築物のさらに別の群は、外来エピトープが配列のＣＨ３部分の公知のβ−シート構造中で挿入または置換により導入されたＣＨ３ドメインのβ−シート（とりわけＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、７、８、１９、２０、２３および２８）の三次構造を破壊する目的での、外来エピトープの挿入を含む−ここでも、ポリペプチド自体としてポリペプチドをエンコードする核酸は、もちろん、本発明の具体例でもある。
また、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のような核酸をエンコードする外来エピトープが、ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループならびにＣＨ４ドメインに面するループの少なくとも１つに導入されたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、７、８、１９、２０、２３および２８のいずれか１つのような、ＩｇＥポリペプチドを基にした免疫原性構築物が企画される。また、その様な核酸構築物の最終発現産物は、本発明の具体例である。
最後に、ＩｇＥの単一ドメインをエンコードする核酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７のような外来ヘルパーエピトープの導入で「免疫化される」核酸構築物を製造することも考えられる。これらおよびこれらの発現産物も本発明の具体例である。
【０１２７】
Ｔ細胞エピトープのＩｇＥ分子への挿入は、ＰＣＲを使った従来の分子生物学的手法および他の従来の分子生物ツールで、ＩｇＥの発現部分のコード配列を置換することで行われる−あるいは、エピトープ配列は、従来のＤＮＡ合成で調製される完全な合成遺伝子に含まれる。最も短い遺伝子フラグメントに関して、最も合理的な方法は、確かに、人工的に遺伝子を製造することであろう。このことは、コドン使用頻度が発現系に最適化され、変異誘発が適切な制限部位を有する遺伝子を設計することで促進されるため、一連の利点を提供する。
【０１２８】
タンパク質発現および精製
ＩｇＥの精製；純粋なＩｇＥ分子は、後の幾つかのアッセイで必要である。最も簡便には、これらは、それ自体が公知の方法で、アレルギー患者からの血清から精製される。精製されたＩｇＥ分子は、免疫化構築物の精製の間、続く解析作業で使用するためのウサギ抗体の製造のため、および機能的な細胞のアッセイでのポジティブコントロールとして使用される。
ＩｇＥの発現および精製：第一分子構築物を作製するとすぐに、タンパク質を大腸菌で発現させるのが好ましい。これは、タンパク質構築物をグリコシル化しないが、この生物は、比較的低生産コストであるために好ましい。
目的とされるＩｇＥ構築物の多くは、相対的に小さなタンパク質（凡そ１２〜２５ＫＤ）であり、それらは、発現、精製および再生の間、恐らく、極めて様々にふるまうであろう。それゆえ、処理は、各々の構築物で個々に最適化されなければならない。精製は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびポリクローナルウサギ抗−ＩｇＥ抗体を使ってウエスタンブロッティングでモニターされる。
精製処理の間、従来のクロマトグラフィー技術を使用することが期待される。恐らく、ゲルろ過工程を組み合わせた２つのイオン変換クロマトグラフィー工程が、純度９５％より高い材料を得るのに十分であろう。
【０１２９】
スクリーニング処理
マウスでの抗−ＩｇＥ抗体の特異性：マウスの群は、従来から成功裏に使用されているフロイントアジュバントまたは明礬のいずれか中で、２５〜１００μｇの各々の精製ＩｇＥ構築物を用いて免疫化する。明礬（例えば、アドジュホス（Ａｄｊｕｐｈｏｓ））は、ヒトならびに動物の使用で容認されている。マウスは、完全に免疫性となるまでに、恐らく、３〜４回免疫化されなければならない。抗−ＩｇＥ抗体の生産は、ＥＬＩＳＡと抗原として精製された天然のＩｇＥとを使って試験される。
ＩｇＥ分子の選抜におけるマウスの使用は、分子が結局犬において免疫原性であるかどうかを解明しないであろう。しかし、これは、ＴＮＦａを使って得た以前の我々の結果（Ｈｉｎｄｅｒｓｓｏｎら，１９９８）に基づくと、極めて可能性がある。
選抜処理で、マウスに代る他の動物を使用することを決めた場合、３〜５の関連する実験動物の群は、各々の構築物を使って免疫化されるであろう。
肥満細胞の脱顆粒を干渉するマウス抗−ＩｇＥ抗体の能力：マウス抗−ＩｇＥ血清を、例えば、アレルギー患者から新たに調製された血液好塩基球または肥満細胞からのＩｇＥ誘導ヒスタミンの放出低下能を、関連する肥満細胞の脱顆粒のアッセイでモニターする。その様なアッセイは、既に公表されている。
【０１３０】
ＭＩＧＩＳ配列を含む構築物の機能性を試験するため、上記の血清が膜結合ＩｇＥを発現するＢリンパ球と反応できるかどうかも試験される。これは、マウス血清が構築物の選抜で使用される場合、アレルギー患者由来のＢ細胞上で、ＦＡＣＳを使って試験される。または、抗−ＩｇＥ血清は、例えばＭＩＧＩＳ配列をも含む膜結合ＩｇＥでトランスフェクトされたＬ−細胞上で試験される。
マウス抗−ＩｇＥ抗体がＩｇＥ媒介アレルギー障害を抑制する能力は、十分に確立された好酸球増加疾患モデル、およびアレルゲン特異的ＩｇＥの転移とマウス肥満脱顆粒でのアレルゲン感染からなるモデルで試験される。
臨床上の展開のために抗−ＩｇＥ抗体を誘導する選抜した分子の能力： １〜３個の分子構築物を、上記の試験を基にして一度選抜すれば、多くの量が臨床試験のために精製されるはずである。
【０１３１】
引用文献のリスト
Ｃｈｒｅｔｉｅｎ Ｉ．ら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８８， １４１：３１２８．
Ｃｏｙｌｅ Ａ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １９９６， １８３：１３０３
Ｄａｌｕｍ Ｉ．ら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５７， ４７９６−４８０４， １９９６．
Ｄａｖｉｓ Ｆ．Ｍ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ） １９９１， ９（１）：５３．
Ｆｅｉ Ｄ． Ｔ．ら，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｏｄｓ １９９４， １７１：１８９．
Ｈｅｌｍ Ｂ．ら， Ｎａｔｕｒｅ， １９８８， ３３１：１８０．
Ｈｅｌｌｍａｎ Ｌ Ｔ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９４， ２４：４１５．
Ｊａｒｄｉｅｕ Ｐ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９５， ７ （６）：７７９．
Ｌｕｓｔｇａｒｔｅｎ Ｊ．ら，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９６， ３３：２４５．
ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ Ｊ． Ｍ．ら， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １９９６， ３：４１９．
Ｍｅｎｇ Ｙ．Ｇ．ら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９６， ３３ （７／８）， ６３５
Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｒ．Ｌ．ら，Ｉｎｔ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９５， １０７：３０８．
【図面の簡単な説明】
【図１】従来のＡｕｔｏＶａｃ概念。Ａ：抗原提示細胞（ＡＰＣ）で、ＭＨＣクラスＩＩ上で提示される寛容優勢自己エピトープは、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ） （Ｔヘルパー細胞は、点線で示す）レパートリーの涸渇のため無視される。ＭＨＣクラスＩＩに提示される挿入された外来免疫優勢Ｔ細胞エピトープは、Ｔヘルパー細胞を活性化し、ＭＨＣクラスＩＩで外来免疫優勢Ｔ細胞エピトープを提示する自己タンパク質の天然部分に特異的なＢ細胞（Ｂ）は、Ｔヘルパー細胞によって供されるサイトカインの助力によって活性化される。
【図２】ＷＯ ００／２００２７に開示のＣＴＬ反応を誘発するＡｕｔｏＶａｃ概念。ＭＨＣクラスＩＩで提示される挿入された外来免疫優勢Ｔ細胞エピトープは、Ｔヘルパー細胞を活性化する。ＭＨＣクラスＩ上で提示される亜優勢自己エピトープを認識するＣＴＬは、アジュバント活性型Ｔヘルパー細胞で活性化される。
【図３】幾つかの好ましいＩｇＥベースの免疫原性構築物の概略図の説明。
ＣＨ３ドメイン（Ｃ３）のみを基にした構築物は、付加（ＮまたはＣ末端）、挿入または置換の形態で、破傷風トキソイド由来のＰ２およびＰ３０エピトープを含むことができる。同様な方法で、ＭＩＧＩＳフラグメントのアミノ酸配列を含む可能性もある。ＣＨ３（Ｃ３）およびＣＨ４（Ｃ４）ドメインを基にした構築物は、同様な方法で、Ｐ２および／またはＰ３０エピトープならびにＭＩＧＩＳフラグメントのみならず２つのドメイン間に挿入または置換を含むことができる。ＣＨ３ドメインで濃い灰色領域は、ＦｃεＲＩ結合領域を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年10月31日(2002.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
−オートロガスＩｇＥ由来のＣＴＬエピトープの少なくとも１つ、および／またはオートロガスＩｇＥ由来のＢ細胞エピトープの少なくとも１つ、および
−動物に対して外来である第一Ｔヘルパー細胞エピトープ（ＴＨエピトープ）の少なくとも１つ
の免疫学的に有効な量を、ヒトを含む動物の免疫系の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって、同時に提示させることからなり、同時提示が動物の遺伝学的感作法を使って達成される動物におけるオートロガス免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対して免疫反応を誘導する方法。
【請求項２】
−動物のＩｇＥ由来のＣＴＬエピトープの少なくとも１つ、および
−動物に対して外来である第一Ｔヘルパーリンパ球（ＴＨ）エピトープの少なくとも１つ
を、適当な抗原提示細胞（ＡＰＣ）により、ヒトを含む動物で、同時に提示させることからなり、同時提示が動物の遺伝学的感作法を使って達成されるオートロガスＩｇＥを生産する細胞に対して特異的細胞毒Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を誘導することによる、動物におけるオートロガスＩｇＥをダウン−レギュレートする方法。
【請求項３】
上記ＣＴＬエピトープの少なくとも１つが提示される場合、ＡＰＣ表面上でＭＨＣクラスＩ分子と結合している、および／または、上記第一外来ＴＨエピトープの少なくとも１つが提示される場合、ＡＰＣ表面上でＭＨＣクラスＩＩ分子と結合している請求項１または２による方法。
【請求項４】
ＡＰＣが、樹状細胞またはマクロファージである先の請求項のいずれか１つによる方法。
【請求項５】
ＣＴＬまたはＢ細胞エピトープのＡＰＣ、および第一外来ＴＨエピトープによる提示が、少なくともＣＴＬエピトープおよび第一外来ＴＨエピトープを含むＩｇＥのアミノ酸配列の変異体からなるＩｇＥの第一の類似体の少なくとも１つで、動物の免疫系を提示することにより行われる先の請求項のいずれか１つによる方法。
【請求項６】
少なくとも第一類似体が、オートロガスＩｇＥの重鎖および／または軽鎖の一定のドメイン由来の公知および想定されるＣＴＬエピトープの実質的なフラクションを含む請求項５による方法。
【請求項７】
類似体のアミノ酸配列中の公知および想定されるＣＴＬエピトープの実質的なフラクションが、オートロガスＩｇＥの重鎖および／または軽鎖の一定のドメインにおいて、公知および想定される全てのＣＴＬエピトープを認識するＭＨＣ−Ｉハプロタイプの少なくとも９０％で認識される請求項６による方法。
【請求項８】
オートロガスＩｇＥの重鎖および／または軽鎖の一定のドメインの公知の、実質的に全てのＣＴＬエピトープが第一類似体中に存在する、および／または、オートロガスＩｇＥの重鎖および／または軽鎖の一定のドメインの想定される、実質的に全てのＣＴＬエピトープが少なくとも第一類似体中に存在する請求項５〜７のいずれか１つによる方法。
【請求項９】
第一類似体の少なくとも１つが、オートロガスＩｇＥの構造の修飾からなる部分を含み、その結果、第一類似体を使った動物の免疫化がオートロガスＩｇＥに対して、動物で抗体の生産を誘導する請求項５〜８のいずれか１つによる方法。
【請求項１０】
さらに、オートロガスＩｇＥの構造の修飾を含む、オートロガスＩｇＥの第二類似体の少なくとも１つの免疫学的に有効な量を動物の免疫系に対して提示することからなり、その結果、第二類似体を使った動物の免疫化が、オートロガスＩｇＥに対して抗体の生産を誘導する先の請求項のいずれか１つによる方法。
【請求項１１】
修飾が、第二外来ＴＨエピトープの少なくとも１つが第二類似体で誘導されることからなる請求項１０による方法。
【請求項１２】
第一および／または第二類似体が、オートロガスＩｇＥが、第一および／または第二類似体に対して動物で誘導される抗体によってＦｃεＲ−保持細胞に結合した交差の結果として、アナフィラキシー反応を動物で誘導できない請求項６〜１１のいずれか１つによる方法。
【請求項１３】
第一および／または第二類似体が、オートロガスＩｇＥの重鎖および／または軽鎖の一定のドメインのＢ細胞エピトープの実質的なフラクションからなる請求項６〜１２のいずれか１つによる方法。
【請求項１４】
変異体および／または修飾体が、アミノ酸の置換および／または欠失および／または挿入および／または付加を含む請求項６〜１３のいずれか１つによる方法。
【請求項１５】
変異体および／または修飾体が、
−抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対して類似体を標的化させる第一部分の少なくとも１つが、第一および／または第二類似体中に含まれている、および／または
−免疫系を刺激する第二部分の少なくとも１つが、第一および／または第二類似体中に含まれている、および／または
−類似体の免疫系への提示を最適化する少なくとも１つの第三部分が、第一および／または第二類似体中に含まれている
ことからなる請求項６〜１４のいずれか１つによる方法。
【請求項１６】
変異体および／または修飾体が、オートロガスＩｇＥのＢ細胞エピトープの少なくとも１つおよび／またはＣＴＬエピトープの少なくとも１つの複製を含む請求項５〜１５のいずれか１つによる方法。
【請求項１７】
Ｂ細胞エピトープの少なくとも１つが、ＦｃεＲ結合領域に含まれるか、またはそれを干渉するか、および／または、Ｂ細胞結合ＩｇＥの膜アンカー領域に含まれる先の請求項のいずれかによる方法。
【請求項１８】
第一および／または第二外来ＴＨエピトープが免疫優勢である、および／または、第一および／または第二外来ＴＨエピトープが乱交雑である先の請求項のいずれか１つによる方法。
【請求項１９】
第一および／または第二類似体が、
−ＩｇＥのＭＩＧＩＳフラグメントの少なくとも２コピーを含むアミノ酸配列（ＭＩＧＩＳフラグメントの少なくとも２つが外来ＴＨエピトープの少なくとも１つで分離される）、
−ＣＨ１またはＣＨ２ドメイン中にＮ末端、およびＣＨ４ドメインまたはＭＩＧＩＳフラグメント中にＣ末端を有するＩｇＥのフラグメントを含むアミノ酸配列（外来ＴＨエピトープの少なくとも１つが挿入されるかまたは内部置換される、例えば、ループＢＣ、ＤＥ、ＦＧ、またはＣＨ４ドメインに面したループのいずれか１つでの内部置換）、
−ＣＨ２ドメイン中にＮ末端、およびＣＨ３中にＣ末端を有するＩｇＥのフラグメントからなるアミノ酸配列（外来ＴＨエピトープの少なくとも１つが挿入されるか、または内部置換されている、例えば、ループＢＣ、ＤＥ、ＦＧ、またはＣＨ４ドメインに面したループのいずれか１つでの内部置換）、
−少なくとも１つの外来ＴＨエピトープが挿入されたか、または内部置換された本質的に単一ＩｇＥドメインからなるアミノ酸配列、
−ＩｇＥループ領域のいずれか１つの少なくとも１つ、および／またはリンカー領域のいずれか１つの少なくとも１つを含むアミノ酸配列（外来ＴＨエピトープの少なくとも１つは、２つのＩｇＥ由来領域に分離する）、
−ＣＨ３ドメインを含むアミノ酸配列（外来ＴＨエピトープの少なくとも１つは、ＣＨ３ドメイン中のβ−シート構造を実質的に破壊するために導入される）、および
−ＢＣ、ＤＥおよびＦＧループとＣＨ４ドメインに面するループ中のアミノ酸配列
からなる群から選択される、請求項６〜１８が請求項５に従属する限りにおける、請求項５〜１８のいずれか１つによる方法。
【請求項２０】
第一および／または第二外来ＴＨエピトープが、天然のＴＨエピトープおよび人工のＭＨＣ−ＩＩ結合ペプチド配列から選択される請求項１１〜１９のいずれか１つによる方法。
【請求項２１】
天然のＴＨエピトープが、破傷風トキソイド、例えばＰ２またはＰ３０、ジフテリアトキソイドエピトープ、インフルエンザ血球凝集素エピトープおよびピー・ファルシパルムＣＳエピトープから選択される請求項２０による方法。
【請求項２２】
第一および／または第二ＴＨエピトープ、および／または第一および／または第二および／または第三部分が、オートロガスＩｇＥ由来のアミノ酸配列に対する融合パートナーの形態で存在する請求項１１〜２１のいずれか１つによる方法。
【請求項２３】
第一部分が、ＡＰＣ特異的な表面抗原において、実質的に特異的な結合パートナーであるか、または第一部分がハプテンである請求項２２による方法。
【請求項２４】
第二部分が、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、ＦＬｔ３Ｌ、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）および顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはその有効部分；ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＨＳＣ７０、ＧＲＰ９４およびカルレチクリン（ＣＲＴ）から選択されるヒートショックタンパク質またはその有効部分；またはホルモンから選択されるサイトカインである請求項１５〜２３のいずれか１つによる方法。
【請求項２５】
第三部分が、パルミトイル基、ミリスチル基、ファルネシル基、ゲラニル−ゲラニル基、ＧＰＩ−アンカー及びＮ−アシルジグリセリド基のような脂質である請求項１５〜２４のいずれか１つによる方法。
【請求項２６】
第一および／または第二類似体が、オートロガスＩｇＥの重鎖および／または軽鎖の一定のドメインの全体にわたる三次構造を、実質的に有している請求項５〜２５のいずれか１つの請求項による方法。
【請求項２７】
少なくとも１つの第一類似体の免疫学的に有効な量を、動物に投与する請求項５〜２６のいずれか１つによる方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの第二類似体の免疫学的に有効な量も投与される請求項２７による方法。
【請求項２９】
上記第一および／または第二類似体の少なくとも１つが、医薬的および免疫学的に容認しえる担体および／またはビヒクルと、任意にアジュバントとで処方される請求項２７または２８による方法。
【請求項３０】
上記アジュバントが、少なくとも第一および／または第二類似体のＡＰＣ、例えば樹状細胞による取り込みを促進する請求項２９による方法。
【請求項３１】
アジュバントが、免疫標的化アジュバント；免疫調節アジュバント、例えば毒素、サイトカインおよびマイコバクテリア誘導体；油製剤；ポリマー；ミセル形成アジュバント；サポニン；免疫刺激複合体マトリクス（ＩＳＣＯＭマトリクス）；粒子；ＤＤＡ；アルミニウムアジュバント；ＤＮＡアジュバント；γ−イヌリン；およびカプセル化アジュバントからなる群より選択される請求項３０による方法。
【請求項３２】
サイトカインが請求項２４で定義されるとおりであるか、その有効部分であり、毒素がリステリオシン（ＬＩＯ）、脂質Ａ（ＭＰＬ、Ｌ１８０．５／Ｒａ１ＬＰＳ）および非耐熱性エンテロトキシンからなる群から選択され、マイコバクテリア誘導体がムラミルジペプチド、完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩおよびＴＤＭ及びＴＤＥのようなトレハロースジエステルからなる群より選択され、免疫標的化アジュバントがＣＤ４０リガンド及びＣＤ４０抗体、又はその特異的結合フラグメント、マンノース、Ｆａｂフラグメント及びＣＴＬＡ−４からなる群より選択され、油製剤がスクアレンまたは不完全フロイントアジュバントからなり、ポリマーがデキストラン、ＰＥＧ、澱粉、マンナン及びマンノース等の炭水化物；プラスチックポリマー自体；及びラテックスビーズ等のラテックスからなる群より選択され、サポニンがＱｕｉｌＡ及びＱＳ２１のようなキラヤサポニンであり、粒子がラテックスまたはデキストランからなる請求項３１による方法。
【請求項３３】
経口経路および真皮内、真皮下、腹腔、口腔内、舌下、硬膜外、脊髄、肛門および頭蓋内経路のような非経口経路より選択される経路を通した投与を含む請求項２７〜３２のいずれかいつによる方法。
【請求項３４】
一年に少なくとも１回の投与、例えば一年に少なくとも２、３、４、５、６および１２回の投与を含む請求項２７〜３３のいずれかによる方法。
【請求項３５】
提示が、少なくとも１つのＣＴＬエピトープおよび／または少なくとも１つのＢ細胞をエンコードして発現する少なくとも１つの核酸フラグメント、ならびに少なくとも１つの第一外来ＴＨエピトープを、ＡＰＣにインビボで導入することで行われる請求項１〜４のいずれか１つによる方法。
【請求項３６】
提示が、少なくとも第一類似体をエンコードして発現する核酸フラグメントの少なくとも１つを担持する非−病原性微生物またはウイルスを、動物へ投与することで行われる請求項５〜１４のいずれか１つによる方法。
【請求項３７】
ＴＨエピトープおよび／または第一および／または第二および／または第三部分が、オートロガスＩｇＥ由来のアミノ酸配列に対する融合パートナーの形態で存在し、提示が、第一および／または第二類似体をエンコードして発現する核酸フラグメントの少なくとも１つを担持する非−病原性微生物またはウイルスを、動物へ投与することで行われる請求項１５〜２６のいずれか１つによる方法。
【請求項３８】
さらに、第二類似体をエンコードして発現する少なくとも１つの核酸フラグメントを、ＡＰＣにインビボで導入することからなる請求項１１〜１４および３６のいずれか１つによる方法。
【請求項３９】
提示を、一方がＣＴＬエピトープの少なくとも１つをエンコードして発現し、他方が、請求項１、２および２１〜２４のいずれか１つに定義される第一外来ＴＨエピトープの少なくとも１つをエンコードして発現する核酸フラグメントの少なくとも２つをインビボでＡＰＣへ同時に導入することで行う請求項１〜４および２１〜２４のいずれか１つによる方法。
【請求項４０】
導入された核酸フラグメントが、裸のＤＮＡ、荷電又は非荷電脂質で製剤化したＤＮＡ、リポソームで製剤化したＤＮＡ、乳化ＤＮＡ、ウイルスベクターに含めたＤＮＡ、トランスフェクション促進タンパク質又はポリペプチドで製剤化したＤＮＡ、標的タンパク質又はポリペプチドで製剤化したＤＮＡ、標的炭水化物で製剤化したＤＮＡ、カルシウム沈殿剤で製剤化したＤＮＡ、不活性担体分子に結合したＤＮＡ、ならびにアジュバントで製剤化したＤＮＡから選択される請求項３５〜３９のいずれか１つによる方法。
【請求項４１】
アジュバントが、請求項３０〜３２のいずれか１つで定義されるアジュバントからなる群から選択される請求項４０による方法。
【請求項４２】
投与方法が、請求項３３または３４で定義されている請求項３５〜４１のいずれか１つによる方法。
【請求項４３】
−請求項５〜９および１２〜２６のいずれか１つで定義される第一類似体をエンコードする核酸フラグメント、および
−医薬的および免疫学的に容認しうる希釈剤および／またはビヒクルおよび／またはアジュバント
からなるＩｇＥに対して抗体の生産を誘導する組成物。
【国際調査報告】
2004508028.tif 000163
2004508028.tif 000164
2004508028.tif 000165