(57)【要約】本発明は、水溶性の超分子自己集合体、及び疎水性のモノマー単位の使用を介した高分子電解質のミセル化によるその調製方法を指向する。本発明では、高分子電解質断片は最終的には超分子集合体の核を形成するが、殻は荷電していない疎水性のポリマー又はオリゴマーから成る。ミセルの核を形成する高分子電解質断片への疎水性のコモノマーの封入は安定性を高めた構造を招くことが確定されている。
2004534879.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン化可能な単位、永久荷電した単位又はイオン化可能な単位と永久荷電した単位との混合物を含むジブロックコポリマー類、イオン化可能な単位、永久荷電した単位又はイオン化可能な単位と永久荷電した単位との混合物を含むマルチブロックコポリマー類、及びグラフトされた親水性で且つ実質的に非イオン性のオリゴマー又はポリマーを伴ったランダムコポリマー類より成る群から選択される少なくとも１種の高分子電解質を含み、前記ランダムコポリマーが、イオン化可能な単位、永久荷電した単位又はイオン化可能な単位と永久荷電した単位との混合物を含んでなる高分子電解質の水溶性超分子自己集合体であって、高分子電解質断片が、該集合体の核を形成し、非イオン性の疎水性繰り返し単位を化学的に有する高分子電解質の水溶性超分子自己集合体。
【請求項２】
前記ジブロックコポリマーが、少なくとも２種のブロックを包含し、その一方は、親水性で且つ実質的に荷電しておらず、他方は、実質的に疎水性のモノマーとの組み合わせでイオン化可能な繰り返し単位又は永久荷電した繰り返し単位より成る群から選択される少なくとも１種の繰り返し単位を含有する請求項１の超分子自己集合体。
【請求項３】
前記イオン化可能な単位が、外部の刺激を介して非イオン性の状態から荷電した状態に転換することができる繰り返し単位である請求項２の超分子自己集合体。
【請求項４】
前記外部の刺激がｐＨにおける変化又は化学反応の伝導より成る群から選択される請求項３の超分子自己集合体。
【請求項５】
前記永久荷電した単位が外部の刺激にかかわりなく静電気的に荷電される繰り返し単位である請求項２の超分子自己集合体。
【請求項６】
疎水性の繰り返し単位を持つ、前記イオン化可能なブロック又は永久荷電したブロックが、ビニルモノマー類、ビニルオリゴマー類及びビニルポリマー類より成る群から選択される少なくとも１種の疎水性化合物から合成される請求項２の超分子自己集合体。
【請求項７】
前記疎水性化合物がアクリレート、アクリルアミド、アルキルアクリレート、アルキルアクリルアミド、アリールアクリレート及びアリールアクリルアミドの誘導体より成る群から選択される少なくとも１種の化合物である請求項６の超分子自己集合体。
【請求項８】
前記アルキル誘導体又はアリール誘導体が、アクリレート、アクリルアミド、メタクリレート及びメタクリルアミドの誘導体より成る群から選択される少なくとも１種の脂肪族部分又は芳香族部分を包含する請求項７の超分子自己集合体。
【請求項９】
前記疎水性化合物が少なくとも１種のビニル末端の生分解性ポリエステルである請求項６の超分子自己集合体。
【請求項１０】
前記ビニル末端の生分解性ポリエステルが、ビニル末端のポリ（ラクチド）及びビニル末端のポリ（ε−カプロラクトン）より成る群から選択される請求項９の超分子自己集合体。
【請求項１１】
前記イオン化可能な単位が、アルキルアクリル酸誘導体、（アミノアルキル）アクリレート誘導体及び（アミノアルキル）アルキルアクリレート誘導体より成る群から選択される少なくとも１種の化合物を包含する請求項２の超分子自己集合体。
【請求項１２】
前記親水性のブロックが、ビニルモノマー類、ビニルオリゴマー類及びビニルポリマー類より成る群から選択される少なくとも１種の親水性化合物から合成される請求項２の超分子自己集合体。
【請求項１３】
前記親水性化合物が、アクリレート誘導体、アクリルアミド誘導体、アルキルアクリレート誘導体、アルキルアクリルアミド、及びＮ−ビニル−２−ピロリドン誘導体より成る群から選択される少なくとも１種の化合物である請求項１２の超分子自己集合体。
【請求項１４】
前記親水性のブロックが、ポリ（エチレングリコール）又はポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）を基にしたマクロ開始剤に由来する請求項２の超分子自己集合体。
【請求項１５】
有効量の少なくとも１種の薬理構成物質と組み合わせて請求項１の超分子自己集合体を含んでなる医薬品製剤。
【請求項１６】
薬理構成物質が薬剤である請求項１５の医薬品製剤。
【請求項１７】
薬理構成物質が、ペプチド、タンパク質又は遺伝子材料である請求項１５の医薬品製剤。
【請求項１８】
標的リガンドを包含してなる請求項１５の医薬品製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に水溶性の自己集合体に関するものであり、詳しくは、イオン化可能な又は永久に荷電されたコポリマーの会合体に関するものであり、最も詳しくは、集合体の核を形成する高分子電解質断片への疎水性コモノマーの封入に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療指標の低い薬剤の特異的送達を向上するために、例えば、リポソーム、微粒子、ナノ集合体（例えば、高分子ミセル、ポリイオン複合体ミセル（ＰＩＣＭ））、及び薬剤−ポリマー抱合体等のような幾つかの薬剤担体が検討されている。近年、高分子ミセルやＰＩＣＭのような水溶性の超分子集合体が、それぞれ、疎水性の薬剤やポリイオン（例えば、アンチセンス、オリゴヌクレオチド）を送達する有望な新しいコロイド状担体として出現している。
【０００３】
高分子ミセルは、増大する科学的注目の対象であり、その内核に薬剤を可溶化することができ、一般にサイズが小さい（＜３００ｎｍ）及び単核貪食細胞系の捕捉を逃れる傾向等のような魅力的な特徴を提供するので、水溶性に乏しい薬剤の担体になる可能性があるとして出現してきている。
【０００４】
ミセルはウイルス又はリポタンパク質のような天然の担体と比較されることが多い。これら担体の３種すべては、類似する核−殻構造を示しており、それによって、内容物がウイルスのためのＤＮＡであれ、リポタンパク質及びミセルのための水不溶性薬剤であれ、標的細胞に輸送する間、それを保護することができる。
【０００５】
ジョーンズ（Jones）及びレロックス（Leroux）（Eur. J. Pharm. Biopharm., 48:101-111, 1999）並びにクオン（Kwon）及びオカノ（Okano）（Adv. Drug Deliv. Rev.,21:107-116, 1996 ）並びにアレン（Allen）ら（Colloids Surf. B: Biointerf.,16:3-27, 1999）により報告されているように、高分子ミセルは、水溶性に乏しい薬剤の送達に最も有利な担体の１つであると思われる。それらは、核−殻構造を特徴とする。疎水性の内核は、一般的に水溶性に乏しい薬剤の可溶化に対する微小環境として役立ち、親水性の外殻はミセルの安定性、オプソニン作用及び単核貪食細胞系の取り込みに対する保護を担当する。
【０００６】
高分子ミセルに関する薬学上の研究は、主として、それぞれ、Ａである親水性の殻部分及びＢである疎水性の核ポリマーを持つＡＢジブロック構造を有するコポリマーに着目している。ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）（Ａ−Ｂ−Ａ）のようなマルチブロックコポリマーもミセルに自己集合し、薬剤担体の可能性があるとして、例えば、カバノフ（Kabanov）ら（FEBS Lett.,258:343-345, 1989 ）により記載されている。一般に、ポリ（β−ベンジルアスパルテート）（ＰＢＬＡ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸）又はポリ（ε−カプロラクトン）等のような生分解性ポリマーから成る疎水性の核は、水性環境との接触から保護する、水溶性に乏しい薬剤の容器として役立つ。核はまた、ポリ（アスパラギン酸）（Ｐ（Ａｓｐ））のような水溶性のポリマーから成ってもよく、それは、疎水性の薬剤との共役によって疎水性にされるか、又は２つの相対する電荷を持つポリイオン（ＰＩＣＭ）との会合を介して形成される。また、幾つかの研究が、内核の構成物質としての、ポリスチレン（ＰＳｔ）又はポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）のような生分解性に乏しい又は生分解性でないポリマーの使用を記載している。
Zhao et al., Langmuir 6:514-516, 1990; Zhang et al., Science 268:1728-1731, 1995; Inoue et al., J. Controlled Release 51:221-229, 1998 及びKataoka, J. Macromol. Sci. Pure Appl. Chem., A31:1759-1769, 1994を参照のこと。疎水性の内核は、また、アルキル鎖又はジアシル脂質（例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）のような高度に疎水性の小さな鎖から成ることもできる。疎水性の鎖は、ポリマーの一方の末端に結合することもできるし、高分子構造の中で無作為に分布させることもできる。殻は通常、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）（Allen et al., Colloids Surf. B: Biointerf., 16:3-27, 1999及びKataoka et al., J. Controlled Release 64:143-153, 2000を参照のこと）、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）（ＰＶＰ）（Benahmed A et al., Pharm. Res., 18:323-328, 2001を参照のこと）又はポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）（Lee et al., Macromolecules32:1847-1852, 1999を参照のこと）のような親水性の、生分解性ではない、生体適合性のポリマーの鎖から成る。
【０００７】
担体の生体分布は主として親水性の殻の性質によって決定される。ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）及びポリ（アルキルアクリル酸）のようなそのほかのポリマーは、ミセルに温度感受性又はｐＨ感受性を付与し、最終的に生体付着性を与えるのに用いればよい（米国特許第５，７７０，６２７号を参照のこと）。標的部分と共役するために表面に官能基を提示するミセルも記載されている（例えば、Scholz, C. et al., Macromolecules 28:7295-7297, 1995を参照のこと）。
【０００８】
現在のところ、文献に記載されている高分子ミセルのほとんどは、イオン化可能なモノマーを用いてミセルコロナを形成し、核は疎水性の中性のホモポリマー又はコポリマーから成るイオン化可能ではないブロックポリマー又はブロックコポリマーを用いて調製される。イオン化可能なジブロックコポリマーはｐＨ依存性のミセル化を呈することが示されている。最近、ウエーバー（Webber）とマーチン（Martin）（米国特許第５，９５５，５０９号）は、高分子電解質の核を持ったｐＨ依存性のミセルを記載している。これらのミセルは、ジブロックコポリマー、ポリ（ビニルＮ−複素環）−ブロック−ポリ（アルキレンオキシド）で構成されている。そのようなコポリマーは、窒素原子のプロトン化のために正に荷電した酸性ｐＨであるので、酸性溶液中でユニマーとして存在する。高いｐＨでは、プロトン化していないコポリマーは高分子ミセルに自己集合する。超分子集合の酸性条件下での解離によって薬剤を放出することができるので、これらのミセルは主として低いｐＨでその内容を送達するように意図される。そのような条件は、例えば、腫瘍で見い出される可能性がある。経口経路で投与するのが目的であれば、これらのミセルは酸性ｐＨであるがゆえに胃の中でその内容物を迅速に放出する。従って、経口で送達するには、薬剤の早すぎる漏出を防ぐために、それらは腸溶コーティングを用いて処方される。
【０００９】
イオン化可能なコポリマーによる潜在的な問題は、酸性ｐＨにて、プロトン化された親水性ブロックとイオン化可能でない親水性ブロックとの間に分子内及び分子間の水素結合を形成する可能性があることであり、それは、不溶性の複合体の形成を招く可能性がある。このことは最近、レレ（Lele）らJ. Controlled Release 69:237-248, 2000によってポリ（アクリル酸）とポリ（エチレングリコール）との間で記載されている。酸性ｐＨでのミセルの沈殿は、経口送達を考える場合、系の有効性を落とす可能性がある。
【００１０】
ＰＩＣＭはブロックコポリマー又はグラフトコポリマー構造を有し、非イオン性水溶性のポリマーに連結した高分子電解質から成る。それらは、高分子電解質との静電気相互作用により荷電した化合物と結合する（例えば、Kataoka et al., Macromolecules 29:8556-8557, 1996を参照のこと）。複合体は、中和された高分子電解質及び対イオンからの疎水性の核並びに親水性のコロナを有するミセル様構造に自己集合する。ＰＩＣＭはそのほかの静電気複合体と比べて改善された溶解性を示す。さらに、それらは血漿成分に対する低い親和性を示し、酵素分解に対してＤＮＡのような活性化合物を保護することができる。
【００１１】
ＰＩＣＭは、イオン化可能で永久荷電したジブロックコポリマー、イオン化可能で永久荷電したマルチブロックコポリマー、及びグラフトされた親水性且つ実質的に非イオン性のオリゴマーを伴ったイオン化可能で永久荷電したランダムコポリマーである荷電した薬剤や核酸のような化合物より成る群から選択される多様性に対する担体としての大きな有望性を保持しているけれども、幾つかの重要な問題点が残されている。例えば、高分子ミセルの安定性は、ポリマーの濃度、温度及び化学構造のような種々の因子に影響される。特に、荷電した断片の間のクーロン相互作用が添加した塩によって選別されるので、塩の存在は、ＰＩＣＭの解離に関して鍵となるパラメータである。この問題を克服するために、核又は殻を架橋することによって高分子ミセルを安定化することができる（例えば、Kakizawa et al., J. Am. Chem. Soc., 121:11247-11248, 1999を参照のこと）。しかしながら、核又は殻を架橋することは、活性剤を化学的に変化させる可能性があり、及び／又はミセルからの放出を過剰に遅くする可能性がある。
【００１２】
米国特許第５，６９３，７５１号は、薬剤が共有結合する側鎖に親水性の断片と親水性の薬学上機能的な断片とを有する水溶性のブロックコポリマーで構成される高分子ミセルの調製を教示している。
【００１３】
米国特許第５，７０２，７１７号は、薬剤及びポリ（エチレングリコール）とポリ（α−ヒドロキシ酸）又はポリ（炭酸エチレン）との両親媒性のブロックコポリマーを含む溶液の調製を教示している。これらのコポリマーは高分子電解質ではない。
【００１４】
米国特許第５，９３９，４５３号は、ポリ（エチレングリコール）−ポリ（オルソエステル）ジブロック及びトリブロックコポリマーを用いた高分子ミセル及び生体腐食性の薬剤送達マトリクスの調製を教示している。この発明の原理的な新規性は、疎水性の生体腐食性の断片としてポリ（オルソエステル）を使用していることである。これらのブロックコポリマーはイオン化可能でもなければ、永久荷電もされない。
【００１５】
米国特許第５，７８６，３８７号は、薬剤送達の適用に関する、ポリ（オキシエチレン）を含有する脂質二重鎖を用いた超分子集合体の調製を教示している。これらのブロックコポリマーはイオン化可能でもなければ、永久荷電もされない。それらは、細網内皮系を効率的に避けることができ、長い循環時間を持つ。米国特許第５，８４０，３１９号は、等張の水溶液中にて３７℃で０．５％（ｗ／ｗ）以下の決定的なミセル濃度を有するポリエーテルのブロックコポリマーを用いた高分子ミセルの調製を教示している。その処方は化学療法剤も含有する。
【００１６】
米国特許第５，７７０，６２７号は、疎水性に変性させた生体付着性の高分子電解質の調製を教示している。これらの高分子電解質は水溶液中にてミセル構造を形成することができ（実施例６）、活性剤を装填することができる。高分子電解質はグラフトコポリマー又はブロックコポリマーであればよい。外殻は、カルボン酸基を含有しているのでイオン化可能であるが、内核は、ホモポリマー、コポリマー、不飽和又は飽和のアルキル鎖、又はそのほかの疎水性の部分から成る。そのような作用剤を動物に投与する方法が開示されている。
【００１７】
米国特許第５，９５５，５０９号は、薬学上の処方を含有するミセルにおけるポリ（ビニルＮ−複素環）−ブロック−ポリ（アルキレンオキシド）コポリマーの使用に関する。該コポリマーは、それが暴露される環境におけるｐＨの差異に有利に反応し、さらに高いｐＨ値でミセルを形成する。治療用化合物及びコポリマーを含むミセルは、ｐＨ依存性の方式で薬剤を送達する。
【００１８】
米国特許第５，９２９，１７７号は、その両末端に官能基を有し、親水性／疎水性の断片を含むブロックポリマーを提供する。両末端における官能基については、ブロックポリマーは、アルファ末端にアミノ基、カルボキシル基、又はメルカプト基を有し、オメガ末端にヒドロキシル基、カルボキシル基、アルデヒド基、又はビニル基を有する。親水性の断片は、ポリエチレンオキシドを含むが、疎水性の断片は、ラクチド、ラクトン又は（メタ）アクリル酸エステルに由来する。この発明のブロックポリマーは、生体適合性材料として使用可能である高分子ミセルを形成する。
【００１９】
米国特許第５，９２５，７２０号は、リビング重合によって調製することができ、水性溶媒中で安定なミセルを形成することができるヘテロテレケリックなオリゴマー又はポリマーを提供する。この発明では、高分子電解質のミセルの核の安定化に関する引用がない。
【００２０】
米国特許第５，６５６，６１１号は、ポリイオン性複合体を用いてポリ核酸を安定化するための組成物に関する。態様の１つでは、この発明は、ポリヌクレオチド及びポリエステルブロックとポリカチオンブロックとを含むブロックコポリマーのポリヌクレオチド複合体を提供する。
【００２１】
米国特許第６，２１７，９１２号は、遺伝子を細胞の中に送達するのに好適な生分解性組成物を提供する。
【００２２】
米国特許第６，２２１，９５９号は、ポリ核酸を安定化し、細胞膜を横切る及び細胞の内部で作用するポリ核酸の能力を高めるための組成物を提供する。態様の１つでは、この発明は、ポリヌクレオチドと特定のポリエチレンブロックコポリマーとの間のポリヌクレオチド複合体を提供する。
【００２３】
米国特許第５，５１０，１０３号は、親水性及び疎水性の断片を有するブロックコポリマーで構成される薬剤の担体、上記薬剤の担体において物理的処理によって捕捉される疎水性薬剤を含む高分子型の薬剤、及び担体における疎水性薬剤の捕捉方法に関する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
当該技術に欠けているものは、物理的に安定化された高分子電解質の核及び荷電していない親水性の殻を有する水溶性の超分子集合体並びにそれらを調製する技術である。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明は、水溶性の超分子自己集合体及び方法を指向する。本発明は、水溶性の超分子自己集合体及び疎水性のモノマー単位の使用を介した高分子電解質のミセル化によってそれらを調製する方法に関する。本発明では、高分子電解質断片は最終的には超分子集合体の核を形成するが、殻は、荷電していない水溶性のポリマー又はオリゴマーから成る。疎水性のコモノマーを、ミセルの核を形成する高分子電解質断片に封入することが安定性を高めた構造を招くことは確定している。そのようなコモノマーは、核の断片の間の引力を増すことによって、ミセルを安定化し、及び／又はコポリマーのイオン化可能な又は永久荷電された断片とイオン化可能ではない断片との間の相互作用を減らす。
【００２６】
従って、安定化された超分子集合体及びその製造方法を提供することが本発明の目的である。
【００２７】
疎水性モノマーの使用を介して、殻の外側のコポリマーのイオン化可能な又は永久荷電された断片とイオン化可能ではない断片との間の相互作用を低下させるｐＨ依存性の高分子ミセル又はポリイオン複合体を提供することが本発明のさらなる目的である。
【００２８】
不溶性複合体の不都合な処方の対象にならない薬学上の構成物質に対する担体として好適なｐＨ依存性のミセルのビヒクルを提供することが本発明のさらにもう１つの目的である。
【００２９】
疎水性のモノマー単位の使用を介して、高分子電解質の核を有する安定化された超分子集合体の調製方法を教示することは、本発明のその上さらなる目的である。
【００３０】
本発明のそのほかの目的及び利点は、本発明の説明、実施例、特定の実施形態によってそのなかで述べられている添付の図面とともに以下の説明から明らかになるであろう。図面は本明細書の一部を構成し、本発明の例示実施形態を包含し、その種々の目的及び特徴を説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明では、「水溶性自己集合体」及び「ミセル」は、提案される構造がミセルの真の定義に必ずしも相当しなくてもよいが、同等に用いられる。
【００３２】
ミセルの形成は２つの力の結果生じる。一方は分子の会合を招く引力であり、他方は、識別可能な巨視的相へのミセルの無制限の成長を妨げる斥力である。両親媒性のコポリマーは、親水性ポリマー又は疎水性ポリマーのいずれかに選択性である溶媒に入れると自己会合する。
【００３３】
両親媒性コポリマーのミセル化過程は、低分子量の界面活性剤に似ている。極めて低い濃度では、ポリマーは一本鎖としてのみ存在する。臨界会合濃度（「ＣＡＣ」）と呼ばれる臨界値に達するように濃度が上がるにつれて、コポリマーの疎水性部分が、ポリマーが希釈される水性媒体との接触を避けるようにして、ポリマー鎖は会合し、ミセルを形成し始める。両親媒性のコポリマーは通常、低分子量の界面活性剤よりもはるかに低いＣＡＣを呈する。例えば、ＰＥＯ−ＰＢＬＡ及びＰＮＩＰＡ−ＰＳｔのＣＡＣは０．０００５〜０．００２％の間である。しかしながら、両親媒性のコポリマーには、はるかに高いＣＡＣを呈するものもあり、ポロキサマーの場合、０．０１〜１０％にまで達する。ＣＡＣが高い両親媒性のコポリマーは水性環境で不安定であり、希釈の際、解離し易いので薬剤標的手段として好適でない可能性がある。
【００３４】
両親媒性のコポリマーのミセル化過程は、低分子量の界面活性剤に似ている。極めて低い濃度では、ポリマーは一本鎖としてのみ存在する。臨界会合濃度（「ＣＡＣ」）と呼ばれる臨界値に達するように濃度が上がるにつれて、コポリマーの疎水性部分が、ポリマーが希釈される水性媒体との接触を避けるようにして、ポリマー鎖は会合し、ミセルを形成し始める。両親媒性のコポリマーは通常、低分子量の界面活性剤よりもはるかに低いＣＡＣを呈する。例えば、ＰＥＯ−ＰＢＬＡ及びＰＮＩＰＡ−ＰＳｔのＣＡＣは０．０００５〜０．００２％の間である。しかしながら、両親媒性のコポリマーには、はるかに高いＣＡＣを呈するものもあり、ポロキサマーの場合、０．０１〜１０％にまで達する。ＣＡＣが高い両親媒性のコポリマーは水性環境で不安定であり、希釈の際、解離し易いので薬剤標的手段として好適でない可能性がある。
【００３５】
両親媒性のコポリマーのミセル化は、疎水性の鎖が親水性のポリマーに無作為に結合しているか、又は親水性の鎖の一方の末端にグラフトしているかどうかによって２種の異なった型のミセルを生じることができる。無作為に変性されたポリマーから形成されたミセルは、末端を変性させたポリマーよりも一般に小型である。ミセルのサイズは、疎水性の鎖を核の中に隔離する疎水性の力及びサイズを制限する鎖間の排除容積相反によって主として決定される。無作為変性コポリマーと末端変性コポリマーにおけるこれら２つの力のバランスにおける差異によって異なるサイズを説明してもよい。
【００３６】
ミセルの分子量及び凝集数を決定するのに、光散乱が広く使用されている。しかしながら、ＣＡＣが散乱法の感度の範囲内にある場合のみ、ミセル化の開始を検出することができる。これは水中のポリマーにとって稀な場合である。コポリマーの一本鎖及びミセル分画は異なった溶出容積を呈するので、水性条件下でのゲル透過クロマトグラフィ（ＧＰＣ）を用いることができる。ＧＰＣによってミセルの分子量と凝集数を同時に決定することもできる。
【００３７】
ＣＡＣを決定する好ましい方法には、蛍光プローブの使用が含まれ、中でもピレンが広く使用されている。ピレンは、高度に疎水性であり、周囲環境の極性に感受性である縮合芳香族炭化水素である。ＣＡＣより下で、ピレンは高い極性の媒体である水に溶解する。ミセルが形成される場合、ピレンはミセルの核により提供される疎水性ドメインに優先的に区分化するので非極性環境を経験する。その結果、蛍光強度の増加、放射スペクトルの振動微構造の変化及び励起スペクトルにおける（０，０）バンドの赤への移動のような多数の変化が認められる。ピレンの蛍光、放射スペクトルのＩ１／１３の比又は励起スペクトルのＩ３３８／Ｉ３３３の比を濃度に対してプロットすることにより見かけのＣＡＣを得ることができる。傾きにおける主な変化がミセル化の開始を指している。蛍光プローブの異方性における変化もミセルの開始に関係する（例えば、Jones and Leroux Eur., J. Pharm. Biopharm., 48:101-111, 1999を参照のこと）。
【００３８】
本発明の組成物のもののような高分子ミセルはサイズが小さいことを特徴とする。その上、担体材料の噴出に対して必要なので、この小さなサイズにより、単にろ過するだけで達成される組成物の滅菌ができ、静脈注射の後、毛細血管における塞栓症のリスクができるだけ抑えられる。ミセルのサイズは、コポリマーの分子量、親水性の鎖と疎水性の鎖の相対比率及び凝集数を含む幾つかの因子に依存する。
【００３９】
ミセルの直径及びサイズの多分散性は、動態光散乱（ＤＬＳ）によって水中又は等張の緩衝液の中で直接得ることができる。ミセルのサイズは、原子力顕微鏡（ＡＦＭ）、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）及び走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）によっても推定することができる。これらの方法によってミセルの形状及びサイズの分散性の性状分析をすることができる。高分子ミセルの多分散性を評価するために超遠心の速度の検討を行うこともある。
【００４０】
１又はそれより多くの薬理構成物質、例えば、種々の治療剤、薬剤、ペプチド、タンパク質、遺伝子材料（例えば、オリゴヌクレオチド）、遺伝的に変化させた構成物質、ポリイオン性構成物質のミセル内への装填は、当業者に周知の技術に従って実現することができる。例えば、化学共役又は透析を介した物理的捕捉、乳化技法、水性媒体中における薬剤とミセルの単純な平衡、又は水中の薬剤／ポリマー固形分散の可溶化によって薬剤を本発明の高分子ミセルに組み込むことができる。
【００４１】
使用してもよい治療剤は、以下に列記するものを含めて安定な方式で高分子ミセルに捕捉することができ、治療上有効な用量で投与することができる任意の化合物である。好ましくは、本発明に従って使用される治療剤は、疎水性又はポリイオン性である（例えば、ＤＮＡ）。好適な薬剤には、フタロシアニン類（例えば、塩化アルミニウムフタロシアニン）、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン）のような抗腫瘍化合物、溶解性の乏しい代謝拮抗剤（例えば、メソトレキセート、マイトマイシン、５−フルオロウラシル）及びアルキル化剤（例えば、カムスチン）が挙げられる。ミセルはまた、パクリタキセルのようなタキサンを含有してもよい。
【００４２】
ミセルに含有することができる追加の薬剤は、アンフォテリシンＢ及びイトラコナゾールのような従来の疎水性の抗生剤及び抗真菌剤、シクロスポリンのような水溶性に乏しい免疫調整剤、ＨＩＶプロテアーゼ阻害剤のような水溶性に乏しい抗ウイルス剤、水溶性に乏しいステロイド性（例えば、デキサメタゾン）及び非ステロイド性（例えば、インドメタシン）の抗炎症薬剤である。
【００４３】
タンパク質のような親水性の化合物も本発明の高分子ミセル組成物に組み入れてもよい。しかしながら、そのような親水性の種の組み込みには、分子の化学的疎水化又は親水性の殻への特殊な親和性が必要である。反対に荷電したブロック高分子電解質との静電気相互作用により、ＰＩＣＭの形成を介してミセルにポリイオン性化合物（例えば、アンチセンス、オリゴヌクレオチド、ゲノム断片、ペプチド）を組み込むことができる。
【００４４】
本発明の高分子ミセル組成物は、経口送達、徐放性及び部位特異的の薬剤を目標とするような種々の製剤分野における使用に好適である。好ましくは、本発明のミセルは水不溶性及びポリイオン性の化合物のための輸送体として使用される。本発明の範囲内に包含されるのは、好適な標的リガンドを含む超分子集合体組成物である。
【００４５】
特定の合成手順に限定されることを意図しないで、本発明のブロック高分子電解質は最も好ましくは、例えば、原子移動ラジカル重合（ＡＴＲＰ）（Coessens et al., Prog. Polym. Sci., 26:337-377, 2001を参照のこと）又はニトロキシド介在ラジカル重合（ＮＭＰ）（Benoit et al., J. Am. Chem. Soc., 121:3904-3920, 1999を参照のこと）のような「リビング」／制御ラジカル重合（ＬＣＲＰ）によって調製される。しかしながら、そのほかのリビングラジカル重合又は実施された官能化されたポリマーの縮合のような代替の手順を使用してもよい。一方、現在開示される本発明の範囲内における多様な適用に対して、ブロックコポリマーの代わりに、（ｉ）イオン化可能な永久荷電されたマルチブロックコポリマー類、（ｉｉ）グラフトされた親水性オリゴマー（又はポリマー）を伴ったイオン化可能な永久荷電された両親媒性のランダムコポリマー類を使用することができる。
【００４６】
ＡＴＲＰによるポリマーの合成のためのラジカル開始剤は、適宜、いかなる官能化された分子（例えば、ポリ（エチレングリコール、（ＰＥＧ）、ＰＶＰ）であることもできる。開始剤は、ＡＴＲＰのために活性化されることができるハロゲノ官能性を持つ（Coessens et al., Prog. Polym. Sci., 26:337-377, 2001を参照のこと）。この官能性は、いかなる特定の置換基に限定されることも意図されないが、２−ハロゲノイソブチリレート誘導体、２−ハロゲノプロピオネート誘導体、２−ハロゲノアセテート誘導体、又は１−（ハロゲノメチル）ベンゼン誘導体であることができる。そのほかの型の重合については（例えば、ＮＭＰ）、この官能性は使用されるモノマーに従って適宜選択される。
【００４７】
ＡＴＲＰの触媒には通常、金属塩及び配位子が挙げられる。配位子は、有機溶媒中での塩の可溶化のために、及び／又は塩に存在する金属のレドックス反応を活性化するために使用される。塩は、ＡＴＲＰのラジカル開始剤を活性化する。いかなる特定の塩に限定されることも意図しないで、後者は、臭化銅（Ｉ）、塩化銅（Ｉ）又は銅（Ｉ）チオシアネート、鉄（ＩＩ）及びニッケル（０又は１）の化合物であることができる。配位子には、２，２’−ビピリジン誘導体又はビス（ジメチルアミノ）化合物（例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタメチルジエチレン−トリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）を挙げることができる。
【００４８】
超分子自己集合体の調製に有用な好適な高分子電解質化合物は、イオン化可能な単位、永久荷電された単位又はイオン化可能な単位と永久荷電された単位との混合物を含むジブロックコポリマー類、イオン化可能な単位、永久荷電された単位又はイオン化可能な単位と永久荷電された単位との混合物を含むマルチブロックコポリマー類、及びグラフトされた親水性且つ実質的に非イオン性のオリゴマー又はポリマーを伴ったランダムコポリマー類より成る群から選択されてもよく、上記ランダムコポリマーには、イオン化可能な単位、永久荷電された単位又はイオン化可能な単位と永久荷電された単位との混合物が含まれる。
【００４９】
ジブロックコポリマーは、一般に２つのブロックから成り、その一方は、親水性であり、一般に荷電されず、他方は、実質的に疎水性、例えば、疎水性又は相対的に疎水性の非イオン性モノマーとの組み合わせでイオン化可能な永久荷電させた繰り返し単位（又はその組み合わせ）から成る群より選択される少なくとも１つの化合物を含有する。イオン化可能な単位は、外部の刺激（例えば、ｐＨ又は化学反応）によって非イオン性から荷電した状態に変換されうる繰り返し単位を言う。永久荷電された単位は、外部の条件にかかわりなく実際、静電気的に荷電している繰り返し単位を言う。
【００５０】
疎水性の繰り返し単位を持つイオン化可能な及び／又は永久荷電されたブロックは、ビニルモノマー類、ビニルオリゴマー類、又は最終的にはビニルポリマー類から合成することができる。これらの疎水性モノマー類／オリゴマー類／ポリマー類は、アルキル又はアリールの用語がそれぞれ脂肪族又は芳香族の部分を表す、アクリレート、アクリルアミド、アルキルアクリレート、アルキルアクリルアミド、アリールアクリレート、及びアリールアクリルアミドの誘導体であることができる（例えば、メタクリレート誘導体、メタクリルアミド誘導体）。疎水性化合物は、例えば、ビニル末端のポリ（ラクチド）及びビニル末端のポリ（□−カプロラクトン）のような生分解性ポリエステルであることができる。イオン化可能なモノマー類はアルキルアクリル酸誘導体、（アミノアルキル）アクリレート又は（アミノアルキル）アルキルアクリレートの誘導体であることができる。ポリマーの酸性単位又は塩基性単位は、酸性部分に切断されるイオン化可能でない前駆体（例えば、３級−ブチルメタクリレート）に由来することができる。
【００５１】
親水性ブロックは、ビニルモノマー類、ビニルオリゴマー類又は結局はビニルポリマー類から合成することができる。これらの親水性モノマー類／オリゴマー類／ポリマー類は、アクリレート、アクリルアミド、アルキルアクリレート及びアルキルアクリルアミド（例えば、ＰＥＧ、メタクリレート及びＮ−（２−ヒドロキシプロピル）アクリルアミド）であることができる。一方、親水性ブロックは、ＰＥＧ又はＰＶＰの誘導体に基づいたブロックラジカルマクロ開始剤に由来することもできる。
【００５２】
非経口で投与することを意図される非生分解性のイオン化可能な及び／又は永久荷電されたコポリマーは、４０，０００を超えない分子量を有するべきである。経口又は局所で使用される生分解性又は非生分解性のイオン化可能なコポリマーについては、分子量に制約はない。
【００５３】
水溶性に乏しく且つ非イオン性の薬剤の装填は、有機溶媒、又は核が荷電しない若しくはほとんど荷電しないｐＨでの水溶液の中で行うべきである。荷電した薬剤は、イオン化可能な又は永久荷電された断片との静電気的相互作用が可能である条件下（例えば、ｐＨ）で装填されるべきである。
【実施例】
【００５４】
以下の非限定的実施例により本発明をさらに詳しく説明する。
【００５５】
略語：
下付き文字は、高分子断片における比率を示す。文字ｂは、ポリマー及び／又はポリマーのアームがジブロックコポリマー構造に基づくことを表す。用語「ｃｏ」は、繰り返し単位が高分子断片に沿って無作為に配置されることを意味する。
【００５６】
実施例１
ＤＭＡＥＭＡ／ＥＭＡ比７０／３０のポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチレンメタクリレート−ｃｏ−エチルメタクリレート）の合成
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ７０−ｃｏ−ＥＭＡ３０）
（材料）
製品はすべてアルドリッチ（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から購入した。臭化第一銅（等級、９９．９９％）、２−ブロモイソブチリルブロミド、無水トリエチルアミン及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）をさらに精製することなく使用した。使用前に共沸蒸留によりトルエンにてポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨ、Ｍｎ：２０００）を乾燥した。ビニルモノマーとしてエチルメタクリレート（ＥＭＡ）及び２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を用い、重合する前に蒸留した。乾燥指標としてベンゾフェノンを用いて、使用前にナトリウム上にてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を蒸留した。
【００５７】
（ＰＥＧ  ＡＴＲＰマクロ開始剤（α−（２−ブロモイソブチリレート）−ω−メチル（ＰＥＧ）の合成）
図１に例示するように、氷冷槽にてやや冷却した、ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨ（Ｍｎ：２０００、１０ｇ、０．００５モル）及びトリエチルアミン（１．０ｇ、０．０１モル）の７０ｍＬ無水ＴＨＦ溶液に２−ブロモイソブチリルブロミド（４．３ｍＬ、０．０３５モル）をゆっくり加えた。次いで溶液を室温まで温め、２４時間攪拌した。混合液を水に注ぎ、塩化メチレンで抽出した。有機抽出物を１ＭのＨＣｌ及び１ＭのＮａＯＨ溶液（ＮａＣｌを含有する）にて順に洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥した。減圧下で溶媒を除いた。粗生成物を最少量の塩化メチレンに溶解し、ジエチルエーテルに沈殿させた。単純なろ過にて表題の化合物を回収した。収率：沈殿後７０％。白色の固形物。融点６０〜６５℃。１Ｈ  ＮＭＲ（δ、ｐｐｍ、ＣＤＣｌ３）：４．１８（２Ｈ）；３．５０（１８８Ｈ）；３．２３（３Ｈ，ｓ）；１．８０（６Ｈ，ｓ）
【００５８】
（ＡＴＲＰ）
ＡＴＲＰマクロ開始剤としてα−（２−ブロモイソブチリレート）−ω−メチル−ＰＥＧを用いて、モノマーのＡＴＲＰを大量に溶液で得た。ＰＭＤＥＴＡ（１．１当量）Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ（１．１当量）、ＥＭＡ（６当量）及びＤＭＡＥＭＡ（１４当量）を含有するＴＨＦ（０．８Ｍ）溶液にＰＥＧ  ＡＴＲＰマクロ開始剤（１当量）を加えた。室温にてアルゴンで１５〜２０分間混合物を脱気し、次いで一晩６０℃に加熱した。重合後、１０％のメタノールを含有するＴＨＦに混合物を注いだ。得られたポリマーを溶出液としてのＴＨＦと共にシリカゲル上でろ過し、臭化銅を除いた。最後に、水に対して４８時間ポリマーを透析し（ＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯＲ  Ｎｏ．１、分子量カットオフ６０００〜８０００）、凍結乾燥した。収率：９８％（図１）
ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエタンメタクリレート−ｃｏ−エチルメタクリレート）
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ７０−ｃｏ−ＥＭＡ３０）
１Ｈ  ＮＭＲ（δ、ｐｐｍ、ＭｅＯＤ）４．３０（１８Ｈ）；４．０４（３２Ｈ）；３．６０（１８２Ｈ）；３．３８（３Ｈ）；２．６９（５４Ｈ）；２．０５〜１．８７（４２Ｈ）；１．４３（６Ｈ）；１．２６（５６Ｈ）；１．０５及び０．８８（７３Ｈ）
【００５９】
（ポリマー及びミセルの性状分析）
２５℃にて重水素を含むクロロホルム（ＣＤＣｌ３）及びメタノール（ＣＤ３ＯＤ）（カナダ、ＣＤＮアイソトープ）中で１Ｈ及び１３ＣのＮＭＲをブルッカーＡＭＸ３００及びＡＲＸ４００に記録した。アライアンスＧＰＣＶ２０００（マサチューセッツ州、ミルフォード、ウォルター）によるサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）及び核磁気共鳴分光計（１Ｈ−ＮＭＲ）によって数平均分子量（Ｍｎ）及び重量平均分子量（Ｍｗ）を決定した。動態光散乱により粒子サイズを評価した。見かけのＣＡＣは定常状態のピレン蛍光法により測定した。
【００６０】
（結果）
銅（Ｉ）ブロミド−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＣｕＢｒ−ＰＭＤＥＴＡ）を触媒として用い、ＴＨＦ中にて１００％に達する重合の収率を得た。ＴＨＦ中におけるＥＭＡとＤＭＡＥＭＡの反応性は類似しており、Ｋａｐｐは１．９５ｘ１０−４Ｌ／モル-1秒-1であった。５時間後、モノマーはすべて完全に消費され、実験的に得られたＭｎは理論値に近かった（表１）。さらに、多分散度指数（ＰＩ）はおよそ１．４であり、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ３０−ｃｏ−ＥＭＡ７０）の調製に用いたＰＥＧマクロ開始剤の多分散度にほぼ相当した。
【００６１】
【表１】
2004534879.tif 000003
【００６２】
図２は、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ３０−ｃｏ−ＥＭＡ７０）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。ＰＥＧ（シグナル１、３．３５ｐｐｍ）の末端メトキシ基を参照として用いて、そのほかのシグナルの積分を較正した。シグナル２の積分は、エチレンオキシド（ＰＥＧ鎖）の重合度（ＤＰ）が各コポリマーにおいておよそ４５であり、使用した市販のＰＥＧのＤＰに相当することを示した。ブロモイソブチリル基のメチルに割り当てられる１．８０ｐｐｍにおけるＰＥＧ  ＡＴＲＰマクロ開始剤の狭いシグナルが、重合開始時に迅速に減少し、１０分以内に１．４ｐｐｍ（シグナル３）に移動したということは、ＰＥＧ鎖がすべてポリビニル断片に結合したことを裏付けている。主鎖におけるメチレン基に割り当てられるシグナルは、１．８ｐｐｍにて認められ（シグナル４及び４’）低い強度の３つの連続したピークで表される。ポリメタクリレート誘導体は、主鎖に結合したメチルに割り当てられる２つのシグナルを提示した（シグナル５及び５’）。比率は、シグナル７、８及び９を用いて決定した。
【００６３】
塩が自己集合を干渉するかどうかを確証するために、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ３０−ｃｏ−ＥＭＡ７０）のＣＡＣを水中及びリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中で測定した。注目に値する事実は、水溶液中でイオン化するＤＭＡＥＭＡの存在にもかかわらず、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ３０−ｃｏ−ＥＭＡ７０）が、水中及びＰＢＳ中で低いＣＡＣを示すことだった（表２）。これはポリマーにおけるＥＭＡの存在により説明されうる。興味深いことに、ＣＡＣは水中で塩の存在による影響をあまり受けなかった。ＰＩＣＭの共通する欠点は、生理的媒体中で相対的に溶解性が乏しいということなので、これは重要な点である。従って、ＰＩＣＭの溶解性は、ポリマー主鎖に疎水性のコモノマーを導入することにより容易に高めることができる。ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ３０−ｃｏ−ＥＭＡ７０）のミセルのサイズについては、水溶液（水対ＰＢＳ）の性質が、二次的凝集の比率に影響を与えると思われる（表２）。
【００６４】
【表２】
2004534879.tif 000004
【００６５】
実施例２
イオン化可能な単位としてメタクリル酸単位を含有するジブロックコポリマーの合成
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＥＡ５０−ｃｏ−ｔＢＭＡ５０）（前駆体）
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＥＡ５０−ｃｏ−ＭＡＡ５０）
（材料、ＰＥＧ−ＡＴＲＰマクロ開始剤及びＡＴＲＰの合成）
実施例１に記載のように実施した。しかしながら、唯一の違いは、１当量のＰＥＧ−ＡＴＲＰマクロ開始剤に対して５当量のＥＭＡ及び５当量の３級ブチルメタクリレート（ｔＢＭＡ）を、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＥＡ５０−ｃｏ−ｔＢＭＡ５０）の重合に使用したことであった。ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＭＡＡ）の場合は、ｔＢＭＡモノマー（１８当量）のみを使用した（図１）。
【００６６】
（ｔＢＭＡのＭＡＡへの転換）
酸性条件における３級ブチルの切断により、３級ブチル鎖（ｔＢＭＡ）を持つエステル基をカルボン酸基に転換した。ｔＢＭＡ単位（７．７ミリモル）を有するポリマーのジオキサン（２．６Ｍ）溶液に、５時間、濃塩酸（３２ミリモル）を加えた。ジエチルエーテルにメタクリル酸誘導体を沈殿させ、ろ過した。ポリマーをエタノールに溶解し、水に対してと透析して、凍結乾燥した。
【００６７】
（ポリマー及びミセルの性状分析）
少量のＨＣｌ及びＮａＯＨを用いて異なったｐＨにてＣＤＣｌ３、ＣＤ３ＯＤ及びＤ２Ｏ（ＣＤＮアイソトープ）中で、１Ｈ及び１３ＣのＮＭＲをブルッカーＡＭＸ３００及びＡＲＸ４００に記録した。アライアンスＧＰＶＣ２０００（マサチューセッツ州、ミルフォード、ウォルター）によるＳＥＣ及びＮＭＲ分光計によってＭｎ及びＭｗを決定した。流体力学平均直径及びサイズ分布は、差動サイズ分布処理強度分析（Ｎ４プラス、フロリダ州、マイアミ、コールターエレクトロニクス）を用いてＤＬＳによる角度９０℃で測定した。見かけのＣＡＣは、定常状態のピレン蛍光法により測定した。自己会合のｐＨは、シリーズ２アミンコ蛍光計を用いて、４８０ｎｍにて静止光散乱により測定した。会合のｐＨは定常状態のピレン蛍光法によっても測定した。
【００６８】
ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（３級−ブチルメタクリレート）
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ｔＢＭＡ）；Ｍｎ  ４５６０；  モノマーとしてｔＢＭＡを用いた；
１Ｈ  ＮＭＲ（δ、ｐｐｍ、ＣＤＣｌ３）：  ４．１０（３６Ｈ）；３．６４（１８１Ｈ）；３．３７（３Ｈ，ｓ）；２．０２〜１．８０（３６Ｈ）；１．４４（６Ｈ，ｓ）；１．４０（１６２Ｈ，ｓ）；１．１３（１８Ｈ，ｓ）；１．０２（３６Ｈ，ｓ）
【００６９】
ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（メタクリル酸）
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＭＡＡ）；  Ｍｎ  ３１８０；  ３級ブチル基の切断後、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ｔＢＭＡ）から得られた：
１Ｈ  ＮＭＲ（δ、ｐｐｍ、ＭｅＯＤ）：  ４．１９（３６Ｈ）；３．６６（１８６Ｈ）；３．３８（３Ｈ）；２．０２（２４Ｈ）；１．５７（２Ｈ）；１．１６（４３Ｈ）
【００７０】
ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（エチルアクリレート−ｃｏ−３級ブチルメタクリレート）：  ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＥＡ５０−ｃｏ−ｔＢＭＡ５０）；  Ｍｎ  ３６００：  ｔＢＭＡ及びＥＭＡをモノマーとして用いた；
１Ｈ  ＮＭＲ（δ、ｐｐｍ、ＣＤＣｌ３）：  ４．１０（１２Ｈ）；３．６６（１８１Ｈ）；３．３９（３Ｈ）；２．１０〜１．７０（２２Ｈ）；１．４４（５４Ｈ）；１．２８（１８Ｈ）；１．００（２２Ｈ）
【００７１】
ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（エチルアクリレート−ｃｏ−メタクリル酸）：  ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＥＡ５０−ｃｏ−ＭＡＡ５０）；  Ｍｎ  ３４００；３級ブチル基の切断後、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＥＭＡ５０−ｃｏ−ｔＢＭＡ５０）から得られた；
１Ｈ  ＮＭＲ（δ、ｐｐｍ、ＭｅＯＤ）：４．１０（１２Ｈ）；３．６３（１８１Ｈ）；３．３６（３Ｈ）；２．２０〜１．７０（２２Ｈ）；１．６５（６Ｈ）；１．２６（１８Ｈ）；１．１４（２２Ｈ）
【００７２】
（結果）
ＰＥＧを結合したＡＴＲＰマクロ開始剤を用いたＡＴＲＰによって、疎水性単位を含有する又は含有しない明確な酸性の（イオン化可能な）コポリマーを調製した。ＰＥＧモノメチルエーテルを２−ブロモイソブチルブロミドに結合することにより高い収率でこのマクロ開始剤を合成した。銅（Ｉ）ブロミド−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＣｕＢｒ−ＰＭＤＥＴＡ）を触媒として用い、ＴＨＦ中にて１００％に達する重合の収率を得た。ＮＭＲにより推定されたＭｎは、ＰＥＧ鎖の末端メトキシ基（約３．４ｐｐｍ）から算出した。モノマーはすべて５時間後完全に消費され、実験的に得られたＭｎは理論値に近かった。コポリマーすべてについて、多分散度は、約１．３〜約１．５の範囲内であった（表３）。
【００７３】
【表３】
2004534879.tif 000005
【００７４】
ジオキサン中の塩酸の存在下で３級ブチル基を切断することにより、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＥＡ５０−ｃｏ−ｔＢＭＡ５０）及びＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ｔＢＭＡ）前駆体をそれぞれのＰ（ＭＡＡ）誘導体に転換した。調製されたコポリビニルポリマーのモノマー比は、重合に使用されたモノマーの比率にほぼ相当していた。疎水性単位、ＥＡをポリビニル断片に組み込んで疎水性を高めた。高いｐＨ値にてコポリマーを完全にイオン化し、個々の高分子鎖としてほとんど溶解状態にすべきである。ｐＨが下がるにつれて、カルボキシル基のプロトン化がコポリマーの疎水性の特徴を高め、鎖の凝集を誘発する。プローブとしてピレンを用い、静止光散乱及び蛍光分光計によって体温（３７℃）にて鎖間会合のｐＨを測定した（表２）。
【００７５】
図３は、ｐＨに対する蛍光強度（Ｉ３３８／Ｉ３３３）及びＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＥＡ５０−ｃｏ−ＭＡＡ５０）に関するｐＨの関数としての散乱した光の一次誘導体を示す。双方の技法で測定すると、高分子鎖は、６に近いｐＨ値で会合した（図３）。
【００７６】
興味深いことに、酸性ｐＨでＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＥＡ５０−ｃｏ−ＭＡＡ５０）が可溶性のままであったということは、ＭＡＡ単位のプロトン化がジブロックコポリマーを沈殿させなかったことを示している。ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＭＡＡ）の場合、ｐＨが３．５〜４あたりに低下すると、分散した沈殿が出現した。アクリル酸高分子誘導体は、酸性溶液中で水素結合を介してＰＥＧと相互作用をし、結果的にポリマーの沈殿を生じることが知られている。いかなる特定のメカニズムにも束縛されることを意図しないで、我々は、疎水性のエチルアクリレートコモノマーの存在下では、プロトン化されたＭＡＡとエチレンオキシド単位との間の引力は立体的に隠されていると考えている。従って、ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＥＡ５０−ｃｏ−ＭＡＡ５０）は酸性ｐＨにて可溶性のままであるので、ＭＡＡ単位は、ＰＥＧ鎖で安定化された超分子集合体（おそらく、ミセル）の内側の核に中に隔離されるようになる。
【００７７】
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＥＡ−ｃｏ−ＭＡＡ）のｐＨに依存した会合の挙動を確認するために、その１Ｈ  ＮＭＲスペクトルをＤ２ＯにてｐＨ１０及びｐＨ３で記録した（図４）。ｐＨ１０では（図４Ａ）、コポリマーはＰＥＧ及びイオン化部分に特有のピークをすべて示しているということは、分子量（Ｍｎ）に従った積分を提示している。これはポリマー鎖すべてが高いｐＨで水中で互いに分離されていることを示唆している。しかしながら、低いｐＨでは（約３）、Ｐ（ＥＡ−ｃｏ−ＭＡＡ）断片に割り当てられたピークが減少しており、これは鎖の凝集の存在を示している（図４Ｂ）。鎖の凝集（高分子ミセルへの）は粘度の高い内核の形成を招くので、ＥＡ単位及びＭＡＡ単位のシグナルの部分的な抑制が生じる。これらの結果を支持して、ＤＬＳの解析は、ｐＨ３では、ｐＨ１０で存在しなかったコロイド集団（２１５±５０ｎｍ）の存在が明らかにされた。
【００７８】
【表４】
2004534879.tif 000006
＊３級ブチル基を有する相当するコポリマーの１Ｈ  ＮＭＲ分光計によって評価されるポリビニル断片におけるＭＡＡ単位の数
【００７９】
本明細書で述べた特許及び出版物はすべて本発明が参加する当業者のレベルを示している。特許及び出版物はすべて、あたかも個々の出版物が参考として具体的に且つ個別に引用し、援用されるかのごとく、参考として本明細書に引用し、援用される。
【００８０】
発明の特定の形態を説明するが、それは、本明細書で記載され且つ示された具体的な形態又は部品の配列に限定されないことが理解されるべきである。発明の範囲から逸脱することなく種々の変更を行ってもよいこと及び本発明は明細書及び図面に示され、記載されたものに限定されるとはみなされないことが当業者に明らかになるであろう。
【００８１】
当業者は、本発明が目的を実施し、述べられた目的及び利点、並びにその中に固有のものを得るために適応されることを容易に十分理解するであろう。本明細書に記載された化合物、組成物、生物学的に関連する化合物、方法、手順及び技法は、現在、好ましい実施形態の代表例であり、例示を意図するものであり、範囲の限定を意図するものではない。そこでの変更及びそのほかの使用は、本発明の範囲内に包含され、添付のクレームの範囲によって定義される当業者に思い浮かぶであろう。本発明は具体的な好ましい実施形態と共に記載されているが、請求されるような本発明は、そのような具体的な実施形態に非公式に限定されないことが理解されるべきである。実際、当業者に明白である記載された発明の実施の形態の種々の改変は、以下のクレームの範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】疎水化された高分子電解質ブロックを持つブロックコポリマーを調製するための合成経路である。
【図２】ＣＤＣｌ３中におけるＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ７０−ｃｏ−ＥＭＡ３０）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルである。
【図３】ｐＨの関数としてのＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＥＡ５０−ｃｏ−ＭＡＡ５０）水溶液の光散乱及びピレン蛍光のＩ３３８／Ｉ３３３の比の変動を示す。
【図４】ｐＨ１０（Ａ）及びｐＨ３（Ｂ）におけるＤ２Ｏ中でのＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＥＡ５０−ｃｏ−ＭＡＡ５０）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図１】
2004534879.tif 000007
【図２】
2004534879.tif 000008
【図３】
2004534879.tif 000009
【図４】
2004534879.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004534879.tif 000011
2004534879.tif 000012
2004534879.tif 000013
2004534879.tif 000014
2004534879.tif 000015
2004534879.tif 000016
2004534879.tif 000017
2004534879.tif 000018
2004534879.tif 000019
2004534879.tif 000020
2004534879.tif 000021
2004534879.tif 000022
2004534879.tif 000023
2004534879.tif 000024
2004534879.tif 000025
2004534879.tif 000026
2004534879.tif 000027
2004534879.tif 000028
2004534879.tif 000029
2004534879.tif 000030
2004534879.tif 000031
2004534879.tif 000032
2004534879.tif 000033
2004534879.tif 000034
2004534879.tif 000035
2004534879.tif 000036
2004534879.tif 000037
2004534879.tif 000038
2004534879.tif 000039
2004534879.tif 000040
2004534879.tif 000041
2004534879.tif 000042
2004534879.tif 000043
2004534879.tif 000044
2004534879.tif 000045
2004534879.tif 000046
2004534879.tif 000047
2004534879.tif 000048
【手続補正書】
【提出日】平成15年6月30日(2003.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
ＰＩＣＭは、荷電した薬剤や核酸のような様々な化合物のための担体としての大きな有望性を保持しているけれども、幾つかの重要な問題点が残されている。例えば、高分子ミセルの安定性は、ポリマーの濃度、温度及び化学構造のような種々の因子に影響される。特に、荷電した断片の間のクーロン相互作用が添加した塩によって選別されるので、塩の存在は、ＰＩＣＭの解離に関して鍵となるパラメータである。この問題を克服するために、核又は殻を架橋することによって高分子ミセルを安定化することができる（例えば、Kakizawa et al., J. Am. Chem. Soc., 121:11247-11248, 1999を参照のこと）。しかしながら、核又は殻を架橋することは、活性剤を化学的に変化させる可能性があり、及び／又はミセルからの放出を過剰に遅くする可能性がある。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
米国特許第５，５１０，１０３号は、親水性及び疎水性の断片を有するブロックコポリマーで構成される薬剤の担体、上記薬剤の担体において物理的処理によって捕捉される疎水性薬剤を含む高分子型の薬剤、及び担体における疎水性薬剤の捕捉方法に関する。
欧州特許出願公開第0963 758号及び国際公開第98 19710は、ポリ核酸を濃縮してポリ核酸の細胞膜を通過して細胞内で機能する能力を増大する配合組成に関する。これらの組成はポリカチオンと錯体を形成したポリヌクレオチドである。これらの錯体は第２工程で親水性のポリマーにより覆われる。国際公開第96  21036号は、ポリ核酸を濃縮してポリ核酸の細胞膜を通過して細胞内で機能する能力を増大する配合組成に関する。これらの組成は減弱した免疫原性を有する。これらの参考文献は、安定な自己集合体の形態のポリ核酸を要求する組成を開示している。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
本発明は、水溶性の超分子自己集合体及び疎水性のモノマー単位の使用を介した高分子電解質のミセル化によってそれらを調製する方法に関する。本発明では、高分子電解質断片は最終的には超分子集合体の核を形成するが、殻は、荷電していない水溶性のポリマー又はオリゴマーから成る。疎水性のコモノマーを、ミセルの核を形成する高分子電解質断片に封入することが安定性を高めた構造を招くことは確定している。そのようなコモノマーは、核の断片の間の引力を増すことによって、ミセルを安定化し、及び／又はコポリマーのイオン化可能な又は永久荷電された断片とイオン化可能ではない断片との間の相互作用を減らす。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３５】
ミセルは、例えばモノクローナル抗体、レクチン、糖、ビタミン、ペプチド又は免疫学的に識別できる断片又はミセルに特定の標的エリアに優先的に集中させる機能を提供する同類の一部分等のような標的リガンドの封入によって、特異的な細胞又は組織に対する標的とされ得る。
両親媒性のコポリマーのミセル化は、疎水性の鎖が親水性のポリマーに無作為に結合しているか、又は親水性の鎖の一方の末端にグラフトしているかどうかによって２種の異なった型のミセルを生じることができる。無作為に変性されたポリマーから形成されたミセルは、末端を変性させたポリマーよりも一般に小型である。ミセルのサイズは、疎水性の鎖を核の中に隔離する疎水性の力及びサイズを制限する鎖間の排除容積相反によって主として決定される。無作為変性コポリマーと末端変性コポリマーにおけるこれら２つの力のバランスにおける差異によって異なるサイズを説明してもよい。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
疎水性の繰り返し単位を持つイオン化可能な及び／又は永久荷電されたブロックは、ビニルモノマー類、ビニルオリゴマー類、又は最終的にはビニルポリマー類から合成することができる。これらの疎水性モノマー類／オリゴマー類／ポリマー類は、アルキル又はアリールの用語がそれぞれ脂肪族又は芳香族の部分を表す、アクリレート、アクリルアミド、アルキルアクリレート、アルキルアクリルアミド、アリールアクリレート、及びアリールアクリルアミドの誘導体であることができる（例えば、メタクリレート誘導体、メタクリルアミド誘導体）。疎水性化合物は、例えば、ビニル末端のポリ（ラクチド）及びビニル末端のポリ（ε−カプロラクトン）のような生分解性ポリエステルであることができる。イオン化可能なモノマー類はアルキルアクリル酸誘導体、（アミノアルキル）アクリレート又は（アミノアルキル）アルキルアクリレートの誘導体であることができる。ポリマーの酸性単位又は塩基性単位は、酸性部分に切断されるイオン化可能でない前駆体（例えば、３級−ブチルメタクリレート）に由来することができる。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
実施例１
ＤＭＡＥＭＡ／ＥＭＡ比３０／７０のポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチレンメタクリレート−ｃｏ−エチルメタクリレート）の合成
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ30−ｃｏ−ＥＭＡ70）
（材料）
製品はすべてアルドリッチ（ウィスコンシン州、ミルウォーキー）から購入した。臭化第一銅（等級、９９．９９％）、２−ブロモイソブチリルブロミド、無水トリエチルアミン及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタメチルジエチレントリアミン（ＰＭＤＥＴＡ）をさらに精製することなく使用した。使用前に共沸蒸留によりトルエンにてポリ（エチレングリコール）モノメチルエーテル（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＯＨ、Ｍｎ：２０００）を乾燥した。ビニルモノマーとしてエチルメタクリレート（ＥＭＡ）及び２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）を用い、重合する前に蒸留した。乾燥指標としてベンゾフェノンを用いて、使用前にナトリウム上にてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を蒸留した。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
（ＡＴＲＰ）
ＡＴＲＰマクロ開始剤としてα−（２−ブロモイソブチリレート）−ω−メチル−ＰＥＧを用いて、モノマーのＡＴＲＰを大量に溶液で得た。ＰＭＤＥＴＡ（１．１当量）Ｃｕ（Ｉ）Ｂｒ（１．１当量）、ＥＭＡ（１４当量）及びＤＭＡＥＭＡ（６当量）を含有するＴＨＦ（０．８Ｍ）溶液にＰＥＧ  ＡＴＲＰマクロ開始剤（１当量）を加えた。室温にてアルゴンで１５〜２０分間混合物を脱気し、次いで一晩６０℃に加熱した。重合後、１０％のメタノールを含有するＴＨＦに混合物を注いだ。得られたポリマーを溶出液としてのＴＨＦと共にシリカゲル上でろ過し、臭化銅を除いた。最後に、水に対して４８時間ポリマーを透析し（ＳＰＥＣＴＲＡ／ＰＯＲ  Ｎｏ．１、分子量カットオフ６０００〜８０００）、凍結乾燥した。収率：９８％（図１）
ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエタンメタクリレート−ｃｏ−エチルメタクリレート）
ＰＥＧ−ｂ−Ｐ（ＤＭＡＥＭＡ30−ｃｏ−ＥＭＡ70）
1Ｈ  ＮＭＲ（δ、ｐｐｍ、ＭｅＯＤ）４．３０（１８Ｈ）；４．０４（３２Ｈ）；３．６０（１８２Ｈ）；３．３８（３Ｈ）；２．６９（５４Ｈ）；２．０５〜１．８７（４２Ｈ）；１．４３（６Ｈ）；１．２６（５６Ｈ）；１．０５及び０．８８（７３Ｈ）


【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2004534879.tif 000049
【国際調査報告】
2004534879.tif 000050
2004534879.tif 000051
2004534879.tif 000052