(57)【要約】目的のタンパク質分子（４ａ−４ｃ、１０、１０ａ−１０ｃ）は単離されて線状化タンパク質分子（１０、１０ａ−１０ｃ）に修飾される。個々のタンパク質分子は、流体力学焦点装置（１３０）、原子間力顕微鏡（１５０）、分離プレート（１７０）または等電点電気泳動ゲル（１８０）と電気泳動ゲル（１８４）との組合わせを用いて観察するために単離される。線状化されたタンパク質分子（１０、１０ａ−１０ｃ）において、第一型アミノ酸残基（Ｋ）は第一タグ（１２）で、そして第二型アミノ酸残基（Ｃ）は第二タグ（１４）で標識される。タグ（１２、１４）は検出可能な一連の目印となる特徴的補助的性質（２４、３４、３８、４４、４８、５２、６４、６８、７２、１２０、１２２、２０６、２０８、２１０、２４４、２４６、２４８）をそのフィンガープリントを定義する線状化されたタンパク質分子（１０、１０ａ−１０ｃ）に付与する。タンパク質フィンガープリントはカメラ（２０４）または蛍光顕微鏡（２３０）による画像（２０６、２０８、２１０、２４４、２４６、２４８）として、または光学検出器（１５）によるスペクトル分析（２４、３４、３８、４４、４８、５２、６４、６８、７２、１２０、１２２）として回収される。既知タンパク質分子に関するフィンガープリントの蓄積は、目的のタンパク質分子のフィンガープリントをそれと比較するフィンガープリントライブラリーを構成する。
2004506871.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一型アミノ酸残基および第二型アミノ酸残基を有するタンパク質分子のフィンガープリントを決定するシステムであって、該システムは次を含んでなる：
（ａ）　タンパク質分子を線状化するための変性手段；
（ｂ）　タンパク質分子の各第一型アミノ酸残基にタグを付するための標識手段；および
（ｃ）　タンパク質分子のフィンガープリントを検出するための検出器手段、
ここで該フィンガープリントは
（ｉ）　該タグによってタンパク質分子に与えられる第一フィンガープリント構成要素；および
（ｉｉ）　タンパク質分子の第二型アミノ酸残基によってタンパク質分子に与えられる第二フィンガープリント構成要素
を有する。
【請求項２】
該変性手段が洗剤を含んでなる、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
該洗剤がドデシル硫酸ナトリウムを含んでなる、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
該変性手段がカオトロピック塩を含んでなる、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
該標識手段が蛍光色素を含んでなる、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
該検出器手段が初期励起放射を含んでなり、該蛍光色素が該初期励起放射によって励起され得る、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
該検出器手段が該蛍光色素の放出放射に感受性の検出器をさらに含んでなる、請求項６に記載のシステム。
【請求項８】
該検出器が電荷結合素子を含んでなる、請求項７に記載のシステム。
【請求項９】
該検出器手段が
（ａ）　該第一タグを励起できる電磁放射の第一源および
（ｂ）　該第二型アミノ酸残基を励起できる電磁放射の第二源
を含んでなる、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
該検出器手段が該第一タグおよび該第二型アミノ酸残基からの放出放射を検出するために位置された電荷結合素子をさらに含んでなる、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
該検出器手段が該第一タグおよび該第二型アミノ酸残基からの励起放射を検出するために位置されたカメラをさらに含んでなる、請求項９に記載のシステム。
【請求項１２】
該検出器手段が該第一タグおよび該第二型アミノ酸残基からの励起放射を検出するために位置された顕微鏡をさらに含んでなる、請求項９に記載のシステム。
【請求項１３】
該検出器手段が該第一タグおよび該第二型アミノ酸残基を励起することができる電磁放射の源を含んでなる、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
該検出器手段が該第一タグおよび該第二型アミノ酸残基からの放出放射を検出するために位置された検出器をさらに含んでなる、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
該検出器手段が原子間力顕微鏡を含んでなる、請求項１に記載のシステム。
【請求項１６】
該原子間力顕微鏡がそこに付されたドナータグを有する検出器チップを含んでなり、該第一タグが該ドナータグに接近したときに励起されるアクセプタータグである、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
該検出器手段が核磁気共鳴装置を含んでなる、請求項１に記載のシステム。
【請求項１８】
該標識手段がタンパク質分子の各第一型アミノ酸残基に金属タグを付すための化学前駆体を含んでなる、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
該第一型アミノ酸残基がシステインおよびリジンから事実上なる群から選択される、請求項１に記載のシステム。
【請求項２０】
該第二型アミノ酸残基がトリプトファンである、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
複数型のタンパク質分子を有する試料中において第一および第二型のアミノ酸残基を有するタンパク質分子を同定するシステムであって、該システムは次を含んでなる：
（ａ）　複数のタンパク質分子の各タンパク質分子を線状化するための変性手段；
（ｂ）　複数のタンパク質分子の他のタンパク質分子からタンパク質分子を分離するための単離手段；
（ｃ）　タンパク質分子の各第一型アミノ酸残基に第一タグを付するための標識手段；
（ｄ）　タンパク質分子のフィンガープリントを決定するための検出器手段、ここで該フィンガープリントが
（ｉ）　該第一タグによってタンパク質分子に与えられる第一フィンガープリント構成要素；および
（ｉｉ）　タンパク質分子の各第二型アミノ酸残基によってタンパク質分子に与えられる第二フィンガープリント構成要素を含んでなり；そして
（ｅ）　該フィンガープリントを既知タンパク質分子に関するフィンガープリントのライブラリーと比較するための照合手段。
【請求項２２】
該単離手段が流体力学焦点装置を含んでなる、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
該単離手段がそれを貫通して形成された開口を有する光不透明性の分離プレートを含んでなる、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２４】
各該開口が約１ナノメートルから約１０ナノメートルの直径を有する、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
該分離プレートがシリコンおよび不透明プラスチックから事実上なる群から選択される材料から形成される、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２６】
該単離手段が電気泳動ゲルを含んでなる、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２７】
該単離手段が希薄溶液を含んでなる、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２８】
該照合手段が該検出器手段からシグナルを受信するコンピュータプロセッサーを含んでなる、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２９】
第一型アミノ酸残基および第二型アミノ酸残基を有するタンパク質分子のフィンガープリントを決定するシステムであって、該システムは次を含んでなる：
（ａ）　タンパク質分子がそれを用いて線状化される変性エレメント；
（ｂ）　該変性エレメントに連合した標識エレメントであって、該標識エレメントはタンパク質分子の各第一型アミノ酸残基にタグを付することができ；そして
（ｃ）　該変性エレメントおよび該標識エレメントの下流に位置する検出器であって、該検出器は
（ｉ）　該タグによってタンパク質分子に与えられる第一フィンガープリント構成要素；および
（ｉｉ）　タンパク質分子の第二型アミノ酸残基によってタンパク質分子に与えられる第二フィンガープリント構成要素
を検出することができる。
【請求項３０】
該変性エレメントが該標識エレメントの上流に位置する、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
一連の既知タンパク質分子に関するフィンガープリント値のライブラリーであって、該ライブラリーは次を含んでなる：
（ａ）　一連既知タンパク質分子の各タンパク質分子の同定特性（アイデンティティ）の一覧；
（ｂ）　一連既知タンパク質分子の各該タンパク質分子に対応する第一フィンガープリント構成要素であって、該第一フィンガープリント構成要素は一連既知タンパク質分子の各該タンパク質分子における第一型アミノ酸残基の数および配列を表し；そして
（ｃ）　一連既知タンパク質分子の各該タンパク質分子に対応する第二フィンガープリント構成要素であって、該第二フィンガープリント構成要素は一連既知タンパク質分子の各該タンパク質分子における第二型アミノ酸残基の数および配列を表す。
【請求項３２】
一連既知タンパク質分子の各該タンパク質分子に対応する第三フィンガープリント構成要素をさらに含んでなり、該第三フィンガープリント構成要素が一連既知タンパク質分子の各該タンパク質分子における第三アミノ酸残基の数および配列を表す、請求項３１に記載のライブラリー。
【請求項３３】
同定可能なフィンガープリントを有するタンパク質分子であって、該タンパク質分子は次を含んでなる：
（ａ）　少なくとも一つの第一型アミノ酸残基；
（ｂ）　タンパク質分子の各第一型アミノ酸残基に付される第一タグであって、各該第一型アミノ酸残基上の該第一タグは該タンパク質分子に第一フィンガープリント構成要素を集合的に与え；
（ｃ）　少なくとも一つの第二型アミノ酸残基；および
（ｄ）　タンパク質分子の各第二型アミノ酸残基に付される第二タグであって、各該第二型アミノ酸残基上の該第二タグは該タンパク質分子に少なくとも第二フィンガープリント構成要素を集合的に与える。
【請求項３４】
該タンパク質分子が少なくとも一つの第三アミノ酸残基をさらに含んでなり、各該第三アミノ酸残基が該タンパク質分子に少なくとも第三フィンガープリント構成要素を集合的に与える、請求項３３に記載のタンパク質分子。
【請求項３５】
該第三アミノ酸残基がトリプトファン残基である、請求項３４に記載のタンパク質分子。
【請求項３６】
少なくとも一つのトリプトファンアミノ酸残基、少なくとも一つの第一型アミノ酸残基および少なくとも一つの第二型アミノ酸残基を有するタンパク質分子であって、該タンパク質分子は次を含んでなる：
（ａ）　第一初期励起放射で第一タグを刺激する際に各第一型アミノ酸残基上の第一タグによって該タンパク質分子に集合的に与えられる第一フィンガープリント構成要素であって、該第一タグは刺激される際に第一波長の放出放射を生じ；
（ｂ）　第二初期励起放射で第二タグを刺激する際に各第二型アミノ酸残基上の第二タグによって該タンパク質分子に集合的に与えられる第二フィンガープリント構成要素であって、該第二タグは刺激される際に第二波長の放出放射を生じ；
（ｃ）　該第二初期励起放射によって誘導される該第二波長の放出放射によって刺激される際に該第一タグによって該タンパク質分子に与えられる第三フィンガープリント構成要素；
（ｄ）　該トリプトファンアミノ酸残基を第三初期励起放射で刺激する際に各トリプトファンアミノ酸残基によって該タンパク質分子に与えられる第四フィンガープリント構成要素であって、該トリプトファンアミノ酸残基は刺激される際に第三波長の放出放射を生じ；
（ｅ）　該第三波長の放出放射で刺激される際に該第二タグによって該タンパク質分子に与えられる第五フィンガープリント構成要素であって、該第二タグは刺激される際に該第三初期励起放射によって誘導される該第二波長の放出放射を生じ；そして
（ｆ）　該第三波長の放出放射によって誘導される該第二波長の放出放射によって刺激される際に該第一タグによって該タンパク質分子に与えられる第六フィンガープリント構成要素。
【請求項３７】
タンパク質分子を特徴づける方法であって、
（ａ）　タンパク質分子を単離すること；
（ｂ）　タンパク質分子を線状化すること；
（ｃ）　タンパク質分子に第一フィンガープリント構成要素を与える第一タグでタンパク質分子の各第一型アミノ酸残基を標識すること；
（ｄ）　タンパク質分子に第二フィンガープリント構成要素を与える第二タグでタンパク質分子の各第二型アミノ酸残基を標識すること；
（ｅ）　該第一フィンガープリント構成要素を決定するためにタンパク質分子上の各第一タグを検出すること；および
（ｆ）　該第二フィンガープリント構成要素を決定するためにタンパク質分子上の各第二タグを検出すること
を含んでなる方法。
【請求項３８】
各該第一タグを検出するステップが、
（ａ）　タンパク質分子を第一初期励起放射に曝露すること；および
（ｂ）　各該第一タグからの第一放出放射の強度を測定すること
を含んでなる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
各該第二タグを検出するステップが、
（ａ）　タンパク質分子を該第一放出放射に曝露すること；および
（ｂ）　各該第二タグからの第二放出放射の強度を測定すること
を含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
各該第二タグを検出するステップが、
（ａ）　タンパク質分子を第二初期励起放射に曝露すること；および
（ｂ）　各該第二タグからの第二放出放射の強度を測定すること
を含んでなる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
線状化のステップが各第一型アミノ酸残基を標識するステップおよび各第二型アミノ酸残基を標識するステップに先行する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
トリプトファンアミノ酸残基および第二型アミノ酸残基を有するタンパク質分子を特徴づける方法であって、該方法は次を含んでなる：
（ａ）　タンパク質分子を単離すること；
（ｂ）　タンパク質分子の各第二型アミノ酸残基をタグで標識することであって、該タグは第一波長の第一放出放射または第一波長の第二初期励起放射のいずれかで励起されたときに第二波長の第二放出放射を放射し；
（ｃ）　該第一放出放射を放射するためにタンパク質分子の各トリプトファンアミノ酸残基を励起することができる第一初期励起放射にタンパク質分子を曝露すること；
（ｄ）　タンパク質分子の第一フィンガープリント構成要素を得るために該第一放出放射の強度を検出すること；
（ｅ）　タンパク質分子の第二フィンガープリント構成要素を得るために該第一放出放射によって刺激された該タグからの第二放出放射の強度を検出すること；
（ｆ）　該第二放出放射を放射するためにタンパク質分子上の該各タグを励起するために該第二初期励起放射にタンパク質分子を曝露すること；そして
（ｇ）　タンパク質分子の第三フィンガープリント構成要素を得るために該第二初期励起放射によって刺激された該タグからの該第二放出放射の強度を検出すること。
【請求項４３】
タンパク質分子を線状化することをさらに含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
線状化ステップが単離ステップに先行する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
線状化ステップが標識ステップに先行する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
複数の型のタンパク質分子を含む試料中のタンパク質分子を同定する方法であって、該方法は次を含んでなる：
（ａ）　タンパク質分子を試料中の他のタンパク質分子から単離すること；
（ｂ）　第一フィンガープリント構成要素をタンパク質分子に与える第一タグでタンパク質分子の各第一型アミノ酸残基を標識すること；
（ｃ）　第二フィンガープリント構成要素をタンパク質分子に与える第二タグでタンパク質分子の各第二型アミノ酸残基を標識すること；
（ｄ）　タンパク質分子の該第一フィンガープリント構成要素を決定するためにタンパク質分子上の各該第一タグを検出すること；
（ｅ）　該第二フィンガープリント構成要素を決定するためにタンパク質分子上の各該第二タグを検出することであって、該第一フィンガープリント構成要素は該第二フィンガープリント構成要素とともにタンパク質に関するフィンガープリントを定義し；そして
（ｆ）　タンパク質の該フィンガープリントをそのために同定されたタンパク質分子と相関させてライブラリー中の複数のフィンガープリントと比較すること。
【請求項４７】
複数の型のタンパク質分子を含む試料中のタンパク質分子を同定する方法であって、該方法は次を含んでなる：
（ａ）　タンパク質分子を試料中の他のタンパク質分子から単離すること；
（ｂ）　第一放出放射を生じさせるためにタンパク質分子の各トリプトファンアミノ酸残基を励起することができる第一初期励起放射にタンパク質分子を曝露すること；
（ｃ）　第二波長の第二放出放射を生じさせるために第一波長の該第一放出放射および第二初期励起放射によって励起されることができるタグでタンパク質分子の各第二型アミノ酸残基を標識すること；
（ｄ）　タンパク質分子の第一フィンガープリント構成要素を得るために該第一放出放射の強度を検出すること；
（ｅ）　タンパク質分子の第二フィンガープリント構成要素を得るために該第一放出放射によって刺激された該タグからの該第二放出放射の強度を検出すること；
（ｆ）　該第二放出放射を放射するためにタンパク質分子上の各タグを励起するために該第二初期励起放射にタンパク質分子を曝露すること；
（ｇ）　第三フィンガープリント構成要素を得るために該第二初期励起放射によって刺激された該タグからの該第二放出放射の強度を検出することであって、該第一、第二および第三フィンガープリント構成要素はタンパク質のフィンガープリントを定義し；そして
（ｈ）　タンパク質の該フィンガープリントを既知同定特性を有するタンパク質分子と相関するライブラリー中の複数のフィンガープリントと比較すること。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の背景］
発明の分野
本発明は、一連の特有不変の容易に検出可能な目印となる特徴をタンパク質分子の各タイプそれぞれに関して系統的に展開することによるタンパク質分子の迅速同定に関し、以下便宜的にこの一連の特徴を対応型のタンパク質分子に関するフィンガープリントと称する。本発明はまた、種々のタンパク質分子のライブラリーおよびそれらに関して対応するフィンガープリント、さらにタンパク質分子の同定すなわちフィンガープリンティングにおいて使用するシステムに関する。本発明は、生物学的試料から得られるタンパク質分子の同定に特別な適用性を有する。
【０００２】
背景技術
生体組織の作用過程にはおおよそ１００，０００の異なる型のタンパク質分子が関与している。しかし各タンパク質分子は、約２０の異なるアミノ酸の一群からの種々のアミノ酸構築ブロックで構成される。アミノ酸は末端と末端が化学結合してペプチドと称される鎖を形成する。ペプチド鎖におけるアミノ酸構築ブロックは、一群として各アミノ酸の多種周辺原子構成要素を共有する。その結果、ペプチド鎖中のアミノ酸は生体内原位置では完全アミノ酸ではなく、したがって「アミノ酸残基」と称される。ペプチド鎖が真のタンパク質分子となるのは、構成要素のアミノ酸残基が連結された場合、ペプチド鎖のあるアミノ酸残基が、ある型の分子のこれらアミノ酸残基の官能基への付加あるいはそれらからの除去によって修飾された場合、およびアミノ酸残基の完全鎖がアミノ酸残基の配列およびその化学的修飾によって決定される特有の立体（三次元）構造をとる場合だけである。
【０００３】
タンパク質分子は、天然では一次元線状配列を維持しない。タンパク質分子におけるアミノ酸残基の配列は、しばしば複雑であるが特徴的な立体形状をとる。この三次元形状から一次元線状配列に強いてなされたタンパク質分子は、「線状化」されたと表現される。
【０００４】
タンパク質分子は事実上全ての生物学的過程に関与している。タンパク質分子の異常型または突然変異型は正常の生物学的過程を混乱させ、それによってある種の癌および嚢胞性線維症や血友病などの遺伝病を含む多くの型の疾患が起こる。タンパク質分子がその本来の機能を果たす能力は、一部はタンパク質分子のアミノ酸残基の配列、タンパク質分子の特定アミノ酸残基への修飾、およびタンパク質分子の立体構造に依存する。
【０００５】
アミノ酸残基の配列、特定アミノ酸残基の修飾またはタンパク質分子の立体構造への改変は、生物学的過程におけるタンパク質分子の関与のしかたを変更し得る。多くのタンパク質分子およびそれらの生物学的過程における機能が知られているが、タンパク質分子の単離、単離された各タンパク質分子の化学的組成および構造の同定ならびにタンパク質分子の機能の決定、さらにタンパク質分子の構造変化の結果に関しての、科学者によるたゆみない努力が続けられている。
【０００６】
タンパク質分子におけるアミノ酸残基の配列はタンパク質分子に独自な同定特性（アイデンティティ）および一連の独自な特性を付与するが、その迅速かつ信頼性のある検出は困難である。
【０００７】
タンパク質分子の識別同定には一般に二つのステップが関わる。すなわち、（１）タンパク質分子の精製および（２）タンパク質分子の特徴づけ（キャラクタリゼーション）である。
【０００８】
タンパク質分子の単離または精製において、標的タンパク質分子は他の異なる型のタンパク質分子から分離される。最新の精製技術には、タンパク質分子の異常型を同型の正常タンパク質分子から精製するに十分な感度を有するものがある。種々の精製技術は、タンパク質分子量、タンパク質分子の水および他溶媒中での溶解性、タンパク質分子の種々試薬との反応性およびタンパク質分子が電気的に中性となるｐＨ値などのタンパク質分子の種々の特性に基づいている。最後の特性はタンパク質分子の等電点と称される。異なる型のタンパク質分子が多数であるため、さらにある型のタンパク質分子が他の型のタンパク質分子と極めて類似した特徴を有するために、一つの型のタンパク質分子を他から単離するためには極めて高感度の精製工程がしばしば要求される。類似型のタンパク質分子を互いに分離する感度は、これら異なる精製技術を組合わせることによって向上させることができる。
【０００９】
特徴づけ工程において個々のタンパク質分子が研究されることがある。個々のタンパク質分子が研究できる特徴づけ工程が用いられる場合、試料中の単一タンパク質分子は試料の希釈によって試料中の他のタンパク質分子から分離または単離され得る。
【００１０】
多くの精製技術が異なる型のタンパク質分子の物理的または化学的特性に基づいて異なる型のタンパク質分子を分離することから、これら精製技術自体が特定の型のタンパク質分子の同定に関する情報のいくつかを提供し得る。特定の型のタンパク質分子がいったん精製されると、精製されたタンパク質分子の同定のために精製タンパク質分子をさらに特徴づけすることが必要となり得る。これは、タンパク質分子の異常型や突然変異型などの以前に同定されなかった型のタンパク質分子の特徴づけを試みる場合にとくに当てはまる。
【００１１】
通常、タンパク質分子は、ゲル電気泳動のような技術で感度を上げてタンパク質分子の分子量を決定する手法を用いるかまたはタンパク質分子を構成するアミノ酸残基の配列を決定することによって、さらに特徴づけされる。これらの作業の両方を行うために有用な一手法は質量分析である。
【００１２】
質量分析によって一型のタンパク質分子を特徴づけするために、精製型タンパク質分子または精製型タンパク質分子の特定断片に正または負の電荷を与え、すなわちイオン化し、質量分析計中で揮発性にする。イオン化され揮発性にされたタンパク質分子または断片は次いで質量分析計によって分析される。これによってタンパク質分子または断片の質量スペクトルが得られる。質量スペクトルはタンパク質分子または断片の分子量に関して極めて正確な情報を提供する。質量分析計で決定されるタンパク質分子およびタンパク質分子断片の分子量の正確さのために、タンパク質分子または断片が分析される場合、質量分析計によって提供される情報はタンパク質分子または断片中のアミノ酸残基の配列の推量に使用できる。質量分析計はまた、タンパク質分子または断片の特定アミノ酸残基への修飾に関する情報を提供するに十分な感受性を有する。ある型のタンパク質分子からの一連の断片が質量分析計で分析されると、各断片のアミノ酸残基配列および各断片のアミノ酸残基への修飾に関する情報を組合わせて全タンパク質分子のアミノ酸残基の配列および全タンパク質分子のアミノ酸残基への修飾を推量することができる。
【００１３】
質量分析の感度ならびにその結果としての特定型タンパク質分子のアミノ酸残基の配列およびそれに対する修飾を推量する能力によって、正常タンパク質分子と異常型または突然変異型とのアミノ酸残基配列およびアミノ酸残基修飾の違いもまた推量することができる。
【００１４】
しかしながら、質量分析は高価な装置と試薬を要する時間のかかる工程である。
【００１５】
［発明の概要］
したがって本発明は、タンパク質分子を特徴づけし得るための迅速性および効率の向上をその広い目的とする。
【００１６】
本発明の目的はまた、迅速かつ確かに検出可能な補助的性質の特性セットをタンパク質分子に与えることである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、本発明の方法によって提供および決定される公知タンパク質分子およびそれらに対応するフィンガープリントの一覧を作出することである。
【００１８】
上記目的の達成は、生化学的研究およびヘルスケアの向上という本発明のさらなるより広い目的を果たすであろう。
【００１９】
上記目的の達成のため、そしてここに具体化し広範に記述する本発明によって、タンパク質分子の特徴づけのためのシステムおよび方法が提供される。また、フィンガープリントとして有用な区別できる特徴をタンパク質分子に付与するようなタグをそこに付けて有するタンパク質分子が提供される。
【００２０】
一形態において、タンパク質分子を特徴づけし得る本発明の教示を包含するシステムは、迅速かつ確かに検出可能な補助的性質の特性セットをタンパク質分子に与える。指紋がヒトの識別を反映するようにこれら補助的性質はタンパク質分子の型を独自に識別することから、タンパク質分子の補助的性質の特性セットはタンパク質分子の型を迅速かつ確かに同定するために使用し得るタンパク質分子の「フィンガープリント（指紋）」として機能する。
【００２１】
本発明の教示によるシステムは、タンパク質分子を線状化するための変性手段、タンパク質分子の第一型アミノ酸残基のそれぞれにタグを付する標識手段およびタグを付したタンパク質分子のフィンガープリントを検出する検出器手段を有する。タンパク質分子のフィンガープリントは、タンパク質分子中の各第一型アミノ酸残基上のタグによってタンパク質分子に与えられる第一フィンガープリント構成要素およびタンパク質分子中の各第二型アミノ酸残基によってタンパク質分子に与えられる第二フィンガープリント構成要素を有する。
【００２２】
本発明の教示によるシステムはまた、試料中の他のタンパク質分子からタンパク質分子を分離するための分離手段、さらに目的のタンパク質分子のフィンガープリントをライブラリーに記載された既知タンパク質分子のフィンガープリントと比較するための照合手段を含むことができる。
【００２３】
変性手段の一例はドデシル硫酸ナトリウム（以下「ＳＤＳ」と表示）などの洗剤であり、これはタンパク質分子全体を負に荷電することによってタンパク質分子の立体構造を壊す。変性手段の別の例はβ−メルカプトエタノールで、これは二つのアミノ酸残基のイオウ原子間の化学結合を切断する化学物質である。
【００２４】
目的のタンパク質分子はタンパク質分子分離のための分離手段によって試料中に存在する他の型のタンパク質分子から分離される。本発明のシステムおよび方法において有用な分離手段の例としては、流体力学焦点装置、電気泳動ゲル、それを通す開口を有する分離プレートおよび目的タンパク質分子を含む試料のための希釈システムなどが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００２５】
標識手段の第一の例では、アミノ酸残基の特有化学構造との化学結合によって特定型アミノ酸残基に蛍光色素を付して、それによってタンパク質分子の各特定型アミノ酸残基上にタグを形成する。第二の例の標識手段は、特定型アミノ酸残基の特有化学構造と化学結合してタンパク質分子の各特定型アミノ酸残基上にタグを形成する金属タグ前駆体である。
【００２６】
タンパク質分子中の２０余りの型のアミノ酸残基のうち、トリプトファンとして知られる一型のアミノ酸残基は、ある範囲の波長の電磁励起放射に曝露すると自己蛍光を発する。
【００２７】
標識手段として蛍光色素が用いられる場合、検出器手段の例は、タンパク質分子のトリプトファンアミノ酸残基を刺激して、第一放出波長の放射を放出するような一つまたはそれ以上の励起波長または励起波長の範囲の電磁励起放射を含む。検出器手段の励起放射はまた、第二放射波長の蛍光色素の放射の放出をも起こさせる。この例では、検出器手段はまた、タンパク質分子のトリプトファンアミノ酸残基からの放出放射の波長および蛍光色素に対して感受性のある検出器を含む。
【００２８】
タンパク質分子の各特定型アミノ酸残基に付したタグが金属性である場合、検出器手段は核磁気共鳴装置または単一金属原子の検出能を有することが当業者に公知である他の装置を含み得る。
【００２９】
代わりに、タグはタンパク質分子の一つまたはそれ以上の型のアミノ酸残基に付することができる。一型のアミノ酸残基上のタグは、一つまたはそれ以上の他型のアミノ酸残基上のタグと区別して検出され、タンパク質分子の異なるフィンガープリント構成要素を決定する。
【００３０】
本発明の別の様相によれば、タンパク質分子を同定するための特定プロトコールとともに使用できる一覧またはデータベースが作出される。この一覧またはデータベースはここではライブラリーと称し、一連の既知タンパク質分子の同定特性および一覧の各既知タンパク質分子の異なるフィンガープリント構成要素に関する情報を含む。異なるフィンガープリント構成要素はシステムの標識手段によってタンパク質分子に与えられ、システムの検出手段によって検出される。次いで目的タンパク質分子のフィンガープリントをライブラリーに記述された既知タンパク質分子のフィンガープリントと比較するための照合手段を用いて、目的タンパク質分子を同定する。通常そのような照合手段の機能は、コンピュータプロセッサーによって遂行できる。
【００３１】
さらなる別の様相において、本発明は異なるフィンガープリント構成要素をタンパク質分子に与えるためのタグで標識したタンパク質分子を含む。各フィンガープリント構成要素はタンパク質分子中の特定型アミノ酸残基の数およびタンパク質分子中の異なる型のアミノ酸残基の相対位置を示す。
【００３２】
タンパク質分子の型を迅速かつ確かに同定できるということは、広範囲の研究および臨床適用、例えば患者の選択細胞が癌の初期段階に入ったかどうかの決定などにおける利用の可能性を示す。
【００３３】
本発明のさらなる目的および利益は次の説明に記述される通りであって、一部は説明から明白であるかまたは本発明の実施によって理解されよう。本発明の目的および利益は、添付した特許請求の範囲に特に示した装置および組合わせの手段によって実現かつ獲得され得る。
【００３４】
簡略に上記した発明を、上記および他の本発明の利益および目的を達成する方法を例示して説明するために、添付図面に示すその具体的態様を参照しながらより詳細に説明する。これら図面は本発明の代表的態様を示すだけのものであって、したがってその範囲の限定を意図するものではないことを理解の上で、添付した図面を用いてさらに具体的に詳細に本発明を記述説明する。図面は以下の通りである。
【００３５】
［図示された実施態様の詳細な説明］
図１は、異なる型のタンパク質分子４ａ、４ｂ、４ｃの混合試料２を動物、植物、微生物または図示したヒトなどの生物体６から通常手順で得るステップを表す。組織や図示した細胞のような生物学的試料８は、生物体６から得られる。タンパク質４ａ、４ｂ、４ｃの混合試料２は、次に例えば細胞膜破壊などによって生物学的試料８から得られる。タンパク質分子４ａ、４ｂ、４ｃは次いで、立体構造から図１右に示した線状化（繊維状）タンパク質分子１０のような一次元構造に線状化される。
【００３６】
図２は、単一の線状化タンパク質分子１０を表す。タンパク質分子１０は、多数の第一型アミノ酸残基Ｋ、多数の第二型アミノ酸残基Ｃ、多数のトリプトファンアミノ酸残基Ｗおよび多数の他型アミノ酸残基Ｘを含むアミノ酸残基の鎖であるが、それらの多くは示されずに省略記号で示唆されているだけである。第一型のタグ１２はタンパク質分子１０の各アミノ酸残基Ｋに化学的に付されて示されている。第二型のタグ１４はタンパク質分子１０の各アミノ酸残基Ｃに化学的に付されて示されている。図２ではそのようなタグはトリプトファンアミノ酸残基Ｗまたは他のアミノ酸残基Ｘには付されていない。タグ１２および１４は、異なる型の蛍光タグ、異なる型の金属タグあるいは他の検出可能な種類の異なる型のタグでもよい。
【００３７】
タンパク質分子１０における隣接して連結したアミノ酸残基の小結合は図２でペプチド１１として識別される。ペプチド１１は配列の左から右に、単一のアミノ酸残基Ｗ、タグ１２を付したアミノ酸残基Ｋおよびタグ１４を付したアミノ酸残基Ｃを含む。図示するように、アミノ酸残基Ｗはトリプトファン、アミノ酸残基Ｋはリジン、そしてアミノ酸残基Ｃはシステインである。
【００３８】
図２のタンパク質分子１０をアミノ酸残基Ｗ、ＫおよびＣを含むそこで選択されたアミノ酸残基を用いて再び図３に示すが、これらはより高度に抽象化して簡略化した記号で表されている。ＮＨ２はタンパク質分子１０の第一端すなわち末端を示し、ＣＯＯＨはタンパク質分子１０の第二末端を示す。
【００３９】
図４は、図２および図３よりさらに高度に抽象化してさらに簡略化した記号で表したタンパク質分子１０を表す。
【００４０】
本発明の教示の一様相に従って、図５−７Ｃはタンパク質分子のトリプトファンアミノ酸残基の天然蛍光ならびに実質的に全てのリジンおよびシステインアミノ酸残基に付された蛍光タグによってタンパク質分子に与えられた補助的性質に基づいてタンパク質分子を特徴づけする方法を説明する。
【００４１】
開示したタンパク質フィンガープリンティング技術の実行を説明するに際して便宜的に、図５−７Ｃにおいてペプチド１１は分子１０の残りの部分とは別に直線として示されている。これら図中のペプチド１１の図示では、対応する説明に直接関与するアミノ酸残基Ｗ、ＫまたはＣのみが表示されている。さらなる簡略化として、図３および４の場合のように、アミノ酸残基Ｋ上のタグ１２およびアミノ酸残基Ｃ上のタグ１４は省略されている。それでも、これらの図は説明を目的にするだけのものであって、タグ１２およびタグ１４はそれぞれアミノ酸残基Ｋおよびアミノ酸残基Ｃ上に存在していると解されるべきである。
【００４２】
説明の目的で、タグ１２およびタグ１４は適切な各波長の電磁放射に曝されると蛍光を発するタグである。トリプトファンアミノ酸残基Ｗは自然に蛍光発光し、すなわちアミノ酸残基Ｗはタグ１２やタグ１４などの蛍光タグが付されていなくても適切な波長の電磁放射に曝露されると蛍光を発する。したがって、そのような蛍光タグは図２のアミノ酸残基上Ｗには示されていないし、付随する図の他にも示唆されていない。
【００４３】
図５は、波長λＳＣの第一初期電磁励起放射２０の源Ｓに曝露されたタンパク質分子１０のペプチド１１を表す。初期励起放射２０はアミノ酸残基Ｃ上のタグを刺激して蛍光発光させて波長λＣの放出放射２２を生じる。
【００４４】
放出放射２２の強度は検出器１５によって測定されて、図５右方のグラフに反映されるスペクトル分析に供される。グラフは、波長λＳＣでのペプチド１１に関するフィンガープリント構成要素２４として役立つ波長λＣ付近を中心とするピークによって特徴づけられる。
【００４５】
このように、図５のスペクトル図に示されるように、蛍光タグがアミノ酸残基Ｃに化学的に付された場合は、波長λＳＣの第一初期励起放射２０は対応するフィンガープリント構成要素２４の放出を刺激する。それでも、図５に反映される活性は、ペプチド１１またはさらにはタンパク質分子１０中の他のアミノ酸残基全てから単離されている単一アミノ酸残基Ｃに関連する活性を示すものである。
【００４６】
異なるアプローチを用いて波長λＳＣでのタンパク質分子１０の全体に関する対応するフィンガープリント構成要素を得る。
【００４７】
比較的広範なアプローチにおいて、第一初期励起放射２０を用いてタンパク質分子１０の全長を照射する。結果として放出される放射全ての累積強度を検出器によって測定して適切なスペクトル分析に供する。
【００４８】
代わりに、線状化したタンパク質分子１０を源Ｓおよび検出器１５を通してスクロールさせる。その結果、波長λＳＣでのタンパク質分子１０に関する連続した一連のフィンガープリント構成要素が得られる。このスクロール工程によって、既記された広範なアプローチよりも顕著により豊富な情報がタンパク質分子１０の構造に関して得られる。
【００４９】
図６Ａおよび６Ｂは、アミノ酸残基Ｋ上のタグを刺激して蛍光発光させる波長λＳＫでの第二初期電磁放射３０の源Ｓへのタンパク質分子１０のペプチド１１の曝露の結果を順に示す図である。工程はまた、間接的ではあるがアミノ酸残基Ｃ上のタグを刺激して蛍光発光させる。図６Ａおよび６Ｂはそれぞれ、波長λＳＫでのペプチド１１に関する応答スペクトルの対応部分を示すグラフを含む。
【００５０】
図６Ａは、波長λＳＫでの第二初期電磁放射３０の源Ｓに曝露されたタンパク質分子１０のペプチド１１を説明している。励起放射３０によってアミノ酸残基Ｋ上のタグの蛍光発光が起こり、波長λＫＣの放出放射３２が生じる。
【００５１】
放出放射３２の強度は検出器１５によって測定されて、図６Ａ右方のグラフをもたらすスペクトル分析に供される。グラフは波長λＫＣ付近を中心とするピークによって特徴づけられる。これは波長λＫＣでのペプチド１１に関する第一フィンガープリント構成要素３２として役立つ。
【００５２】
しかし、放出放射３２はアミノ酸残基Ｃ上のタグを励起して蛍光発光させることができる。
【００５３】
図６Ｂは、ペプチド１１の放出放射３２への曝露がアミノ酸残基Ｃ上のタグを励起することを示す。これによりアミノ酸残基Ｃ上のタグの蛍光発光が起こり、波長λＣの放出放射３６が生じる。
【００５４】
放出放射３２および放出放射３６の強度は検出器１５によって測定されて、図６Ｂ右方のグラフをもたらすスペクトル分析に供される。グラフは、第一フィンガープリント構成要素３４によってのみならず波長λＣ付近を中心とする第二ピークによっても特徴づけられる。後者は波長λＳＫでのペプチド１１に関する第二フィンガープリント構成要素３８として役立つ。
【００５５】
放出放射３２がアミノ酸残基Ｃ上のタグに図示された影響を及ぼすには、放出放射３２を生じたアミノ酸残基Ｋ上のタグはタンパク質分子１０上でアミノ酸残基Ｃ上のタグに比較的近接して配置されねばならない。
【００５６】
したがって、図６Ｂのスペクトル図に示すように、蛍光タグが二つの異なる型のアミノ酸残基ＫおよびＣに化学的に付された場合、アミノ酸残基Ｋ上のタグを励起する波長λＳＫの第二初期励起放射３０はペプチド１１に関する二つの対応する追加フィンガープリント構成要素の放出を刺激するであろう。
【００５７】
図７Ａ−７Ｃは、トリプトファンアミノ酸残基Ｗを刺激して蛍光発光させる波長λＳＷでの第二初期電磁励起放射４０の源Ｓへのタンパク質分子１０のペプチド１１の曝露の結果を順に示す図である。工程はまた、ペプチド１１のアミノ酸残基ＫおよびＣ上のタグを間接的に刺激して蛍光発光させる。図７Ａ−７Ｃはそれぞれ、波長λＳＷでのペプチド１１に関する応答スペクトルの対応部分を示すグラフを含む。
【００５８】
図７Ａにおいて、第三初期電磁励起放射４０へのペプチド１１の曝露がトリプトファンアミノ酸残基Ｗを励起することがわかる。これによりトリプトファンアミノ酸残基Ｗの蛍光発光が起こり、波長λＷＫの放出放射４２が生じる。放出放射４２の強度は検出器１５によって測定されて、図７Ａ右方のグラフをもたらすスペクトル分析に供される。グラフは、波長λＳＷでのペプチド１１に関する第一フィンガープリント構成要素４４として役立つ波長λＷＫ付近を中心とするピークによって特徴づけられる。
【００５９】
しかし、図７Ａの放出放射４２はアミノ酸残基Ｋ上のタグを励起して蛍光発光させることができる放射である。
【００６０】
図７Ｂにおいて、放出放射４２へのペプチド１１の曝露がアミノ酸残基Ｋ上のタグを励起することがわかる。これによりアミノ酸残基Ｋ上のタグの蛍光発光が起こり、波長λＫＣの放出放射４６が生じる。放出放射４６の強度は検出器１５によって測定されて、図７Ｂ右方のグラフをもたらすスペクトル分析に供される。グラフは、第一フィンガープリント構成要素４４によってのみならず波長λＫＣ付近を中心とする第二ピークによっても特徴づけられる。後者は波長λＳＷでのペプチド１１に関する第二フィンガープリント構成要素４８として役立つ。
【００６１】
放出放射４２がアミノ酸残基Ｋ上のタグに図示された影響を及ぼすには、放出放射４２を生じたトリプトファンアミノ酸残基Ｗはタンパク質分子１０上でアミノ酸残基Ｋ上のタグに比較的近接して配置されねばならない。
【００６２】
しかし、図７Ｂの放出放射４６はアミノ酸残基Ｃ上のタグを励起して蛍光発光させることができる放射である。
【００６３】
図７Ｃにおいて、放出放射４６へのペプチド１１の曝露がアミノ酸残基Ｃ上のタグを励起することがわかる。これによりアミノ酸残基Ｃ上のタグの蛍光発光が起こり、波長λＣの放出放射５０が生じる。放出放射５０の強度は検出器１５によって測定されて、図７Ｃ右方のグラフをもたらすスペクトル分析に供される。グラフは、第一フィンガープリント構成要素４４および第二フィンガープリント構成要素４８によってのみならず波長λＣを中心とする第三ピークによっても特徴づけられる。後者は波長λＳＷでのペプチド１１に関する第三フィンガープリント構成要素５２として役立つ。
【００６４】
放出放射４６がアミノ酸残基Ｃ上のタグに図示された影響を及ぼすには、放出放射４６を生じたアミノ酸残基Ｋ上のタグはタンパク質分子１０上でアミノ酸残基Ｃ上のタグに比較的近接して配置されねばならない。
【００６５】
したがって、図７Ｃのスペクトル図に示すように、蛍光タグが二つの異なる型のアミノ酸残基ＫおよびＣに化学的に付された場合、トリプトファンアミノ酸残基Ｗを励起する波長λＳＷの第三初期励起放射４０はペプチド１１に関する波長λＳＷでの三つの対応するフィンガープリント構成要素の放出を刺激するであろう。
【００６６】
フィンガープリント構成要素２４、３４、３８、４４、４８および５２は合わせて、ペプチド１１に関する、または類推によってタンパク質分子１０に関する、一つの可能なフィンガープリントを構成する。フィンガープリント構成要素はその他の既知タンパク質分子に関して得られ、コンピュターデータベースに集められる。次いでデータベースは、波長λＳＣ、λＳＫおよびλＳＷの初期励起放射に曝露された場合のアミノ酸残基Ｋ、Ｃ上のタグを有する一連のタンパク質分子に関するフィンガープリントのライブラリーとしての役目を果たす。
【００６７】
未知のタンパク質分子は、そのタンパク質分子の全対応型のアミノ酸残基に同一型のタグを化学的に付することによって同定される。未知タンパク質分子のフィンガープリント構成要素は記述された方法を用いて決定される。未知タンパク質分子のフィンガープリント構成要素は、タンパク質フィンガープリントのライブラリー中の見出し記載と比較される。合致する一組のタンパク質フィンガープリントがライブラリー中に見つかれば、未知タンパク質分子は同定される。
【００６８】
開示されたフィンガープリンティング法を用いて、試料細胞内に含まれるようなタンパク質分子の混合物における複数の未知タンパク質分子を迅速に同定することができる。
【００６９】
図４−７Ｃで説明したフィンガープリンティング法の変法において、図８に示すように、波長λＳＷ、λＳＫおよびλＳＣを含む初期電磁励起放射６０の波長の広範なスペクトルを放射する単一源Ｓを用いてペプチド１１のアミノ酸残基Ｗ、ＫおよびＣを同時に刺激して蛍光発光させる。
【００７０】
工程はまた、ペプチド１１のアミノ酸残基ＫおよびＣ上のタグを間接的に刺激して蛍光発光させる。図８は、波長λＳＷ、λＳＫおよびλＳＣでのペプチド１１の応答スペクトルの対応部分を示すグラフを含む。
【００７１】
図８において、初期電磁励起放射６０へのペプチド１１の曝露がトリプトファンアミノ酸残基Ｗを励起することがわかる。これによりトリプトファンアミノ酸残基Ｗの蛍光発光が起こり、波長λＷＫの放出放射６２が生じる。
【００７２】
放出放射６２はアミノ酸残基Ｋ上のタグを励起して蛍光発光させることができる放射である。加えて、源Ｓからの初期電磁励起放射６０の波長λＳＫは、アミノ酸残基Ｋ上のタグに蛍光発光を起こさせる。励起放射６０または放出放射６２のいずれかによって刺激された場合、アミノ酸残基Ｋ上のタグは波長λＫＣの放出放射６６を生じる。
【００７３】
放出放射６６はアミノ酸残基Ｃ上のタグを励起して蛍光発光させることができる。加えて、源Ｓからの初期電磁励起放射６０の波長λＳＣは、アミノ酸残基Ｃ上のタグに蛍光発光を生起する。励起放射６０または放出放射６６のいずれかによって刺激された場合、アミノ酸残基Ｃ上のタグは波長λＣの放出放射７０を生じる。
【００７４】
放出放射６２、６６、７０の強度は検出器１５によって測定されて、図８右方のグラフをもたらすスペクトル分析に供される。グラフは、ペプチド１１が波長λＳＷ、λＳＫおよびλＳＣを含む励起放射６０に曝露された場合、ペプチド１１に関する第一フィンガープリント構成要素６４として役立つ波長λＷＫ／λＳＫ付近を中心とする第一ピークによって、ペプチド１１に関する第二フィンガープリント構成要素６８として役立つ波長λＫＣ／λＳＣ付近を中心とする第二ピークによって、およびペプチド１１に関する第一フィンガープリント構成要素７２として役立つ波長λＣ付近を中心とする第三ピークによって、特徴づけられる。
【００７５】
本発明の他の様相において、本発明の教示を組み入れた方法によるタンパク質分子の特徴づけはタンパク質を分離して特徴づけする方法の一ステップである。図９はそのような方法の一例を示すフローチャートであるが、これは例示であってこれに限定されない。図９の特徴づけステップは図５−８に図示された特徴づけステップよりも広範である。図９のフローチャートの囲みのそれぞれは、方法の一般ステップを表す。囲みの順序は限定を意図するものではなく、図示されたいずれのステップも限定されず、ステップによっては任意である。
【００７６】
囲み７４において、試料中のタンパク質分子はタンパク質分子を天然の三次元構造をより線状の一次元構造に変えるために、一つまたはそれ以上の化学物質に曝露される。これら化学物質をここではタンパク質分子を線状化するための変性手段と称する。タンパク質分子の構造がこのように修飾された場合、タンパク質分子は「線状化された」と言う。
【００７７】
限定を意味しない例として、本発明による線状化手段にはタンパク質分子の線状化に有用であることが知られている化学物質の使用が含まれる。本発明の範囲を限定することなく、これらにはＳＤＳなどのイオン系洗剤ならびにカオトロピック塩グアナジニウムおよび尿素などの非洗剤が含まれる。メチオニンおよびシステインアミノ酸残基などの二つのアミノ酸残基のイオウ原子間に形成される化学結合を切断するβ−メルカプトエタノールとして知られる化学物質もまた線状化手段として用い得る。
【００７８】
代わりに、タンパク質分子をその天然の立体構造のままで、または二つのアミノ酸残基のイオウ原子間の化学結合が切断されない状態で分析することが望ましい場合もある。
【００７９】
囲み７６において、タンパク質分子の第一型アミノ酸残基をそれぞれ第一タグで標識する。アミノ酸残基は蛍光タグまたは金属タグなどのタグで標識される。既知の化学反応によって特定のタグを特定のアミノ酸残基に付することができる。代わりに、タンパク質分子の第一型アミノ酸残基を、囲み７４に示した線状化ステップの前に標識することができる。
【００８０】
囲み７８において、試験されるタンパク質分子またはタンパク質分子型を試料中の他のタンパク質分子またはタンパク質分子型から単離する。囲み７８に示した単離ステップは、囲み７４に示した線状化ステップの前もしくは後、または囲み７６に示した標識ステップの前もしくは後であってもよい。
【００８１】
試験されるタンパク質分子またはタンパク質分子型がいったん単離されると、タンパク質分子は特徴づけされ得る。囲み８０において、タンパク質分子の第二型のアミノ酸残基が検出される。第二型アミノ酸残基はそれ自体が検出されるか、第二型アミノ酸残基によって生じる何らかのシグナルが検出される。第一型アミノ酸残基上のタグとして蛍光色素が用いられた場合、波長λＳＷなどの放射によって励起された場合にアミノ酸残基Ｗの自己蛍光によって生じる放射は、例えば７Ａおよび８に示した方法を用いて検出される。
【００８２】
次いで、囲み８２において、第二型アミノ酸残基と第一型アミノ酸残基上の第一タグとの間の相互作用が検出される。例えば、第一タグが図７Ｂおよび８に示されるような蛍光タグである場合、この例の場合はアミノ酸残基Ｗである第二型アミノ酸残基が、波長λＷＫの放射を放出し、これはこの例ではアミノ酸残基Ｋである第一型アミノ酸残基上の第一タグを励起することができる。
【００８３】
次にタンパク質分子の第一型アミノ酸残基上の第一タグが、図９のフローチャートの囲み８４に示すように検出される。第一タグが蛍光タグである場合、第一タグは図６Ａおよび８に示す方法で検出されるが、ここでペプチド１１は、第一タグを刺激して検出可能な放射を放出するような波長λＳＫを有する励起放射に対して曝露される。
【００８４】
囲み８６において、囲み８０、８２および８４によって示されたステップのそれぞれから得られるデータが記録される。データは手作業でまたはコンピュータデータベースなどに当業者に公知の任意の方法で記録することができる。
【００８５】
他の様相によると、本発明は未知タンパク質分子を同定する方法を含む。図１０はその方法を遂行するために行われる典型的ステップを示すフローチャートである。図１０のフローチャートの各囲みは、本方法の一般的ステップを表す。図１０に示した囲みの順序は限定を意味するものではない。さらに、本方法の実施には必ずしも全ステップが要求されるわけではない。
【００８６】
囲み９０において、タンパク質分子の混合物が試料から得られる。再び図１を参照して、生物学的試料８は生物体６から既知の工程で得ることができる。次いでタンパク質分子４ａ、４ｂ、４ｃを当業者に公知の抽出工程によって生物学的試料８から取り出すことができる。
【００８７】
図１０の囲み９２において、生物学的試料から得られたタンパク質分子を、図９の囲み７４に関して記述されたのと同様の方法で線状化する。タンパク質分子を完全にまたは部分的に天然の立体構造のままで残すことが望ましいかも知れないので、囲み９２の線状化ステップは任意である。
【００８８】
タンパク質分子の一つまたはそれ以上の型のアミノ酸残基を囲み９４で標識する。アミノ酸残基を蛍光タグまたは金属タグのような公知のタグで標識する。公知の化学反応によって、特定のタグを特定のアミノ酸残基に付することができる。したがって、異なる蛍光色素を異なる型のアミノ酸残基に付することができる。タンパク質分子のあるアミノ酸残基は代わりにまたは加えて金属タグで標識され得る。
【００８９】
例えば、図２では、各アミノ酸残基Ｋに第一タグ１２が付されている。図２に示した各アミノ酸残基Ｃはその上に第二タグ１４を有する。異なるタグを異なる型のアミノ酸残基上に用いた場合、各異なる型のアミノ酸残基の数および相対位置は互いに識別することができる。図５−８は、異なる型のアミノ酸残基上の異なるタグをいかに用いてタンパク質分子を特徴づけするかを例示したものである。
【００９０】
タンパク質分子の異なる型のアミノ酸残基は種々の方法を用いて標識される。そのような方法の第一の実施態様を限定を意図しない例として図１１に示す。システイン反応性蛍光タグ１４をペプチド１１の各アミノ酸残基Ｃに公知の工程によって付する。別のリジン反応性蛍光タグ１２をペプチド１１の各アミノ酸残基Ｋにこれも公知の工程によって付する。
【００９１】
図１２は本発明の教示に従って行う標識方法の第二実施態様を示すが、これは説明のためで限定を意図しない。第二の実施態様において、化学式−ＣＨ２ＮＨ２を有するシステイン反応性アミノ基１１０をペプチド１１の各アミノ酸残基Ｃに付する。アミノ基１１０によってリジン反応基がアミノ酸残基Ｃに付される。次いで、リジン反応性蛍光タグ１２がペプチド１１の各アミノ酸残基Ｋおよび各アミノ酸残基Ｃ上のアミノ基１１０に付される。タグ１２からの放出放射が検出され、ペプチド１１の第一フィンガープリント構成要素が提供される。タグ１２の放出放射の検出後、アミノ酸残基Ｃ上のアミノ基１１０に付されたタグ１２は当業者に公知のように加水分解試薬１１２を用いて除去され得る。次いで、アミノ酸残基Ｋ上にのみ残ったタグ１２が検出されて、ペプチド１１の第二フィンガープリント構成要素が提供される。
【００９２】
本発明の教示による標識方法の第三の実施態様を図１３に示すが、これは説明のためであって限定を意図しない。まず、当業者に公知の型のシステイン反応性封鎖基１１４をペプチド１１の各アミノ酸残基Ｃに化学的に付する。次いで、リジン反応性蛍光タグ１２をペプチドの各アミノ酸残基Ｋに付す。次いで封鎖基１１４を、当業者に公知のようにして加水分解試薬１１２を用いて各アミノ酸残基Ｃから除去する。次に、アミノ酸残基Ｋまたはアミノ酸残基Ｃのいずれかと反応できる異なる蛍光タグ１１６を各アミノ酸残基Ｃに化学的に付する。
【００９３】
図１０に示した発明の方法に戻って、囲み９６は試料中の他のタンパク質分子からの一タンパク質分子の単離、または試料中の他の型のタンパク質分子からの一型のタンパク質分子の単離を表す。試料中の他のタンパク質分子からの一タンパク質分子の単離または試料中の他の型のタンパク質分子からの一型のタンパク質分子の単離は、囲み９２に示した線状化ステップの前もしくは後、または囲み９４に示した標識ステップの前もしくは後であってもよい。
【００９４】
いったん所望のタンパク質分子またはタンパク質分子の型が単離されると、タンパク質分子またはタンパク質分子の型は囲み９８で特徴づけされる。タンパク質分子またはタンパク質分子の型の特徴づけにおいて、タンパク質分子のフィンガープリントが決定される。図５−７Ｂおよび８はタンパク質分子のフィンガープリントの決定法の例を示すが、ここでタンパク質分子のアミノ酸残基は蛍光タグで標識される。
【００９５】
目的のタンパク質分子のフィンガープリントが決定された場合、そのフィンガープリントは囲み１００でフィンガープリントのライブラリーにあるフィンガープリントと比較される。フィンガープリントのライブラリーは既知タンパク質分子の一覧を有する。一覧中の各既知タンパク質分子は、目的タンパク質分子のフィンガープリントの決定に用いたものと同じ工程で決定された対応するフィンガープリントを有する。したがって、目的タンパク質分子のフィンガープリントがライブラリー中のフィンガープリントと一致した場合に目的タンパク質分子が同定される。
【００９６】
図１４は、二つの異なるタンパク質分子の蛍光スペクトルすなわちフィンガープリント１２０、１２２を示すグラフである。フィンガープリント１２０、１２２は図８に示した方法によって得られた。フィンガープリント１２０はウシ血清アルブミン（以下「ＢＳＡ」）として知られるタンパク質分子の特徴を示し、フィンガープリント１２２はアルコールデヒドロゲナーゼ（以下「ＡＤＨ」）として知られるタンパク質分子に対応する。各フィンガープリント１２０、１２２は、それぞれ同波長での二つの主要な強度ピークを含む。
【００９７】
フィンガープリント１２０、１２２は、ＢＳＡおよびＡＤＨの各トリプトファンアミノ酸残基の自己蛍光、各リジンアミノ酸残基上のナフタレンジカルボキシアルデヒド（以下「ＮＤＡ」）タグの蛍光、および各システインアミノ酸残基上のローダミンタグの蛍光によってＢＳＡおよびＡＤＨに与えられたものである。
【００９８】
本発明は、目的タンパク質分子の単離および目的タンパク質分子のフィンガープリントの決定への種々のアプローチを含む。これら各機能を遂行できる構造をそれぞれ、タンパク質分子を分離するための単離手段およびタンパク質分子のフィンガープリントを検出するための検出器手段と称する。図１５−３３は、例示であって限定を意図しないが、本発明の教示による単離手段および検出器手段の機能を遂行するための構造の種々の組合わせを示し、これによって目的タンパク質分子のフィンガープリントが単離され決定される。
【００９９】
図１５は、タンパク質分子を特徴づけおよび同定することを目的として試料中の他のタンパク質分子から一タンパク質分子を単離するための本発明の教示によって用い得る検出器手段の第一の実施態様を示す。図１５に図示した装置は、個々のタンパク質分子を互いに単離する流体力学焦点装置１３０である。
【０１００】
流体力学焦点装置１３０は、一つまたはそれ以上のタンパク質分子の試料２をそこに導入する第一領域１３２を有する。第一領域１３２から試料２が流体力学焦点装置１３０の第二領域１３４に流入し、そこで試料２中のタンパク質分子が線状化されて、注入口１３５経由で第二領域１３４に導入される化学物質によってタグで標識される。次に、試料２は第三領域１３６に流入し、そこで試料２中の異なる型のタンパク質分子が互いに分離される。第三領域１３６は、小分離カラム、マイクロ電気泳動ゲル、または異なる型のタンパク質分子を分離できることが知られている他の装置をそこに有することができる。試料２からの異なる型のタンパク質分子４ａ、４ｂ、４ｃを含む溶出液１３７は、第三領域１３６の分離装置から流体力学焦点装置１３０の第四領域１３８に流入する。異なる型のタンパク質分子４ａ、４ｂ、４ｃは、第三領域１３６の分離装置から別々に第四領域１３８中に溶出する。
【０１０１】
分離された型のタンパク質分子４ａ、４ｂ、４ｃを含む溶出液１３７は、第四領域１３８を通って流体力学焦点装置１３０の層流領域１４０に流入する。二つの向かい合った注入口１４２は層流領域１４０と通じて、緩衝液１４４を層流領域１４０中に導入する。緩衝液１４２は圧力下で導入されて、溶出液１３７と緩衝液１４４の流路が合流するので緩衝液１４２と溶出液１３７の層流が生じる。緩衝液１４４の溶出液１３７への層流のために、溶出液は緩衝液１４４の二層１４８間の薄層１４６内に流入する。十分な圧力下で緩衝液１４４が層流領域１４０中に導入されると、個々のタンパク質分子４ａ、４ｂ、４ｃは緩衝液１４４の溶出液１３７への層流によって単離される。
【０１０２】
タンパク質分子４ａ、４ｂ、４ｃが流体力学焦点装置１３０の検出領域１４９を通って層１４６中に流入するので、本発明の教示によって各タンパク質分子４ａ、４ｂ、４ｃに与えられるフィンガープリントを決定することができる。
【０１０３】
図１６は、タンパク質分子を単離して特徴づけるために本発明の教示によって用いる装置の第二の実施態様を図示する。図１６の装置は原子間力顕微鏡１５０である。個々のタンパク質分子１０は原子間力顕微鏡の原子解像度によって原子間力顕微鏡１５０によって別々に分析される。
【０１０４】
タンパク質分子１０は希釈されて、相互に分離された別個のタンパク質分子１０とともに支持体１５２上に置かれる。支持体１５２は雲母やガラスなどの材料で形成され、これにタンパク質分子１０が付着してそこでタンパク質分子１０が固定される。
【０１０５】
原子間力顕微鏡１５０は検出器チップ１５６を備えた片持ち梁１５４を有する。検出器チップ１５６をタンパク質分子１０に近づけると、検出器チップ１５６とタンパク質分子１０の化学構造との間の相互作用によって片持ち梁１５４が振動する。片持ち梁１５４の振動は、レーザー光線Ｌを片持ち梁１５４上に向けると同振動が片持ち梁１５４によって反射されるために、レーザー光線Ｌの振動を検出するレーザー検出システム１５８によって測定される。測定値を用いてタンパク質分子１０の分子量および長さを決定する。
【０１０６】
検出器チップ１５６は蛍光ドナー分子１６０をそれに付する。検出チップ１５６がタンパク質分子１０を長さに沿ってスキャンするときに、励起レーザー１６２はレーザー光線Ｍを検出チップ１５６に向ける。レーザー光線Ｍは蛍光ドナー分子１６０を励起する波長を有する。検出器チップ１５６上の励起されたドナー分子１６０をそこに蛍光タグを付したアミノ酸残基Ｃに近づけると、蛍光ドナー分子１６０が放出する蛍光がタグを励起する。タンパク質分子１０の各アミノ酸残基Ｃ上のタグの励起は検出器チップ１５６を振動させて、タンパク質分子１０上にあるアミノ酸残基Ｃの位置を示す。
【０１０７】
代わりに、原子間力顕微鏡の検出器チップ上の蛍光ドナー分子は、タンパク質分子のトリプトファンアミノ酸残基またはタンパク質分子の各他型アミノ酸残基上にある蛍光タグを励起する波長の電磁放射を放出し得る。
【０１０８】
本発明の教示に従ってタンパク質分子を単離および特徴づけるのに有用な装置の第三の実施態様を図１７および１８に示す。
【０１０９】
図１７は、分離プレート１７０、分離プレート１７０の第一面１７２上に位置してそれに向けられた電磁放射源Ｓおよび分離プレート１７０の第二面１７４上に位置しそれに対向する検出器１５を含む装置を図式的に示す。
【０１１０】
分離プレート１７０は、薄い平面構造物でそこを貫通して形成された分離開口１７６を有する。溶液またはゲルのかたちでタンパク質分子１０を、電場を利用する当分野で電気泳動と呼ばれる手法によって開口１７６を通して推進させる。各開口１７６は単一線状タンパク質分子１０がそこを通過できるような直径Ｄを有する。例えば、直径Ｄは約１−１０ｎｍであり得る。タンパク質分子１０が開口１７６を通過する速度は加える電場によって異なる。その間での光学的分析ができるように隣接する開口１７６は互いに離れて配置される。例えば、隣接する開口１７６は、互いに約１、１０または１００μｍの間隔で配置され得る。分離プレート１７０は、可視波長の電磁放射を透さず、微細加工ができるか公知工程で加工して所望の半径と間隔の開口１７６をつくることができるシリコンやプラスチックのような材料から形成される。
【０１１１】
源Ｓは、開口１７６を通過するタンパク質分子１０のトリプトファンアミノ酸残基または一つまたはそれ以上の他型アミノ酸残基上の蛍光タグを励起するような波長の電磁励起放射１７８を放出する。例えば、タンパク質分子１０のリジンおよびシステインアミノ酸残基は異なる蛍光タグで標識することができ、タンパク質源Ｓは広範囲の波長の電磁放射を放出して、図８に示したスペクトルをもたらす。
【０１１２】
検出器１５は、分離プレート１７０の第二面１７４上の開口１７６をタンパク質分子１０が出るときにタンパク質分子１０のアミノ酸残基からの放出放射を検出するように位置されている。電磁放射は光学的手段で検出器１５上に焦点合わせしてもよい。電荷結合素子（以下「ＣＣＤ」）またはアバランシェダイオードアレイのような電磁放射を検出する公知の装置を検出器１５として用い得る。検出器１５は、異なるタンパク質分子１０のアミノ酸残基またはアミノ酸残基上のタグから放出される蛍光を同時検出することができる。プロセッサー１６は検出器１５からのシグナルを受信し、検出される特定型の放射に関するデータを作出する。
【０１１３】
図１８は、分離プレート１７０の第一面１７２上の源Ｓからの電磁放射に曝露されたタンパク質分子１０が開口１７６を通過する際に起こる「近距離場励起」の現象を説明する。直径Ｄは、源Ｓからの励起放射波長１７８ならびに刺激されたアミノ酸残基Ｗまたはアミノ酸残基ＫおよびＣ上の蛍光タグからの放出放射の波長よりも小さい。したがって、分離プレート１７０の第一面１７２上の励起放射および放出放射は開口１７６を通過しない。しかし、刺激されたアミノ酸残基Ｗまたはアミノ酸残基ＫまたはＣ上の刺激されたタグは分離プレート１７０の第二面１７４上の開口１７６を抜けるので、アミノ酸残基Ｗまたは蛍光タグは直径Ｄで高さ約Ｄの事実上円錐形容積を抜け出るまでは源Ｃからの放射によって励起された状態を維持する。この近距離場励起すなわち分離プレート１７０の第二面１７４上の放出放射は、検出器１５によって検出される。次いで、検出器１５からのシグナルはプロセッサー１６によって、タンパク質分子が開口１７６を通過する速度も合わせて、タンパク質分子１０縦長上の特定の場所に位置する特定の型のアミノ酸残基を表すと特徴づけられる。
【０１１４】
本発明の教示によってタンパク質分子を単離して特徴づける装置の第四の実施態様を図１９−２７において説明する。
【０１１５】
図１９は、各型タンパク質分子の正荷電領域と負荷電領域の相対比に基づいて試料中の異なる型のタンパク質分子を単離するために使用する等電点電気泳動ゲル１８０を表す。各型のタンパク質分子に関して、この比は「等電点」と呼ばれる。等電点に基づくタンパク質分子の分離工程は「等電点電気泳動」と呼ばれる。
【０１１６】
クモの巣状すなわちマトリックス構造を有する等電点電気泳動ゲル１８０への導入に先だって、タンパク質分子を線状化して等電点電気泳動ゲル１８０の網状構造をタンパク質分子が通過しやすくする。タンパク質分子は、図９に関して上記したような公知化学物質を用いて線状化できる。負に荷電したすなわち陰イオン系洗剤のＳＤＳを用いてタンパク質分子を線状化する場合、各タンパク質分子には負の実効電荷が与えられる。タンパク質分子はまた、図９に関して上記したのと同様にしてタグで標識することができる。代わりに、異なる型のタンパク質分子を互いに分離した後でタンパク質分子をタグで標識してもよい。
【０１１７】
線状化したタンパク質分子が等電点電気泳動ゲル１８０にいったん導入されると、等電点電気泳動ゲルはｐＨ勾配１８２中に置かれる。等電点電気泳動ゲル１８０中の各タンパク質分子は矢印Ａの方向に等電点電気泳動ゲル１８０の長さにそってそのタンパク質分子の等電点に等しいｐＨまで移動する。
【０１１８】
等電点電気泳動は単独であるいは他の分離技術と組合わせて、異なる型のタンパク質分子の単離に用いられる。一般に等電点電気泳動は、「二次元」分離と称される二ステップ分離工程における第一ステップである。
【０１１９】
図２０は二次元分離の第二ステップ、ゲル電気泳動を示す。ゲル電気泳動において、天然または線状化されたタンパク質分子は電気泳動ゲル１８４中に導入される。図示するように、予め等電点電気泳動ゲル１８０中で分離されたタンパク質分子は電気泳動ゲル１８４のへり１８６に導入される。等電点電気泳動ゲル１８０のように、電気泳動ゲル１８４はクモの巣状構造を有する。しかし、電気泳動ゲル１８４を抜ける通路は等電点電気泳動ゲル１８０を抜ける通路よりもずっと小さいので、電気泳動ゲル１８４を通過する線状化タンパク質分子は大きさに基づいて分離される。
【０１２０】
電場１８８が電気泳動ゲル１８４に加えられると、線状化されたタンパク質分子は矢印Ａの方向に電気泳動ゲル１８４を通過する。より小さいタンパク質分子は大きいタンパク質分子よりも速く電気泳動ゲルの通路を通過する。
【０１２１】
図２１は、異なる型のタンパク質分子の分離バンド１９０をそこに有する電気泳動ゲル１８４を示す。次に、図２２に示すように、バンド１９０中のタンパク質分子を、ニトロセルロースフィルターまたは「ＰＶＤＦ」とも称されるポリビニリデンジフルオリドなどの材料の膜１９２、またはビニールあるいはナイロン支持体などの別の公知の固体支持体にさらなる試験のために移す。この工程は当分野で「ブロッティング」と称される。図２３は、膜１９２およびその上の異なる型のタンパク質分子のバンド１９４を示す。バンド１９４はそれぞれ、図２１の電気泳動ゲル１８４の同様に位置されたバンド１９０に対応する。
【０１２２】
一つまたはそれ以上のバンド１９４におけるタンパク質分子のアミノ酸残基は、等電点電気泳動ゲル１８０および電気泳動ゲル１８４上で分離された後で電気泳動ゲル１８４上のバンド１９０から膜１９２へのタンパク質分子の移動に続いて標識することができる。次いで、膜１９２上で分離された異なる型のタンパク質分子は特徴づけまたは同定されて、互いに比較される。
【０１２３】
図２４に示すように、タンパク質分子が蛍光タグで標識される場合、一つまたはそれ以上の適当な波長の電磁励起放射１９６を源Ｓから膜１９２に対して向けることができる。トリプトファンアミノ酸残基または一つまたはそれ以上の異なる型のアミノ酸残基上のタグが励起放射１９６によって刺激されると、図８に示すアミノ酸残基Ｗならびにアミノ酸残基ＫおよびＣ上のタグと同様に、これらアミノ酸残基またはタグのそれぞれは独特な波長範囲の放射を放出する。放出放射の異なる範囲の波長は、アミノ酸残基Ｗからまたはアミノ酸残基ＫもしくはＣ上のタグからの放出放射の特定範囲の波長のみを通過させる異なる光学フィルター１９８、２００、２０２を利用して相互にそして励起放射１９６から分離することができる。
【０１２４】
一つの光学フィルター１９８を用いる場合、単一型アミノ酸残基からのまたは単一型アミノ酸残基上のタグからの放出放射の強度がこの場合カメラ２０４によって検出できる。カメラ２０４は、異なる波長の放出放射の強度を表す処理可能なシグナルを生じるデジタルカメラでも光学カメラでもよい。
【０１２５】
図２５、２６および２７は、それぞれ単一光学フィルター１９８、２００、２０２を通して撮影された膜１９２の写真２０６、２０８、２１０である。各波長範囲の各バンド１９４の放出放射の強度は、そのバンド１９４において単離されたタンパク質分子中の特定型アミノ酸残基の数を表し、そのバンド１９４中のタンパク質分子の型のフィンガープリント構成要素を提供する。
【０１２６】
図示するように、いくつかのバンド１９４ａおよび１９４ｂのタンパク質分子は特定波長の放出放射を発しない。バンド１９４ａは図２４の写真２０６に現われず、バンド１９４ｂは図２７の写真２１０に現われない。
【０１２７】
図２８−３３は、タンパク質分子の単離および特徴づけのための装置の第五実施態様を示す。第五実施態様において、混合試料中のタンパク質分子のあるアミノ酸残基は図９に関して記述した方法によって蛍光タグで標識される。混合試料のタンパク質分子は任意に線状化され得る。混合試料のタンパク質分子は試料を希釈することによって互いに分離される。次いで、希釈した試料の一滴２２０を図２８に示すように顕微鏡カバースリップ２２２上に置く。
【０１２８】
その表面に凹部２２６を形成した顕微鏡スライド２２４を逆さにして小滴２２０上に被せて、小滴２２０を顕微鏡スライドとカバースリップ２２２間の凹部２２６に封じ込む。図２９はこのようにして調製した顕微鏡スライド２２４を示す。
【０１２９】
図３０において、蛍光顕微鏡２３０を用いて小滴２２０中のタンパク質分子のトリプトファンアミノ酸残基の蛍光およびアミノ酸残基上の蛍光タグの蛍光を検出する。蛍光顕微鏡は、顕微鏡スライド２２４によって保持された小滴２２０に向けられた励起放射２３２の源Ｓを有する。図８に示したと同様にして、源Ｓはトリプトファンアミノ酸残基および一つまたはそれ以上の他のアミノ酸残基上の蛍光タグを励起する。
【０１３０】
顕微鏡のレンズ２３４はトリプトファンアミノ酸残基からおよび蛍光タグからの放出放射を拡大する。次いで、小滴２２２中のタンパク質分子のトリプトファンアミノ酸残基からおよび一つまたはそれ以上の他の型のアミノ酸残基上の蛍光タグからの拡大された放出放射は、トリプトファンアミノ酸残基からまたは他の型のアミノ酸残基上のタグからの放出放射の特定範囲の波長だけを通過させる光学フィルター２３６、２３８、２４０を通過する。光学フィルター２３６、２３８および２４０は、放出放射の無用の波長を選別する。一つの光学フィルター２３６を用いる場合、単一型アミノ酸残基からまたは単一型アミノ酸残基上のタグからの放出放射の強度がこの場合カメラ２０４によってまたは蛍光顕微鏡２３０の接眼レンズ２４２を通して肉眼で検出できる。
【０１３１】
図３１−３３は、蛍光顕微鏡２３０を通した滴２２２の部分の異なる視野を図示したものである。図３１は光学フィルター２３６を通した視野２４４を示す。図３２は光学フィルター２３８を通した視野２４６を示す。図３３は光学フィルター２４０を通した視野２４８を示す。図示するように、タンパク質分子１０ａはいくつかの波長の放射を放出し、したがって視野２４６では見られるが視野２４４では見られない。他のタンパク質分子１０ｂからの放出放射の強度もまた、タンパク質分子１０ｂが異なるフィルターを通して可視化されるので異なる。例えば、図３１の視野２４４におけるタンパク質分子１０ｂからの第一波長の放出放射強度は、図３２の視野２４６で可視化されるタンパク質分子１０ｂからの第二波長の放出放射強度よりもおよび図３３の視野２４８のタンパク質分子１０ｂからの第三波長の放出放射強度よりも大きい。この図３３においてはタンパク質分子１０ｂは第三波長ではいかなる放出放射も発しない。タンパク質分子１０ｃは各視野２４４、２４６、２４８に現れる。
【０１３２】
本発明は、その精神または本質的特徴から離れることなく他の特定のかたちで具体化することができよう。記述された実施態様はもっぱら説明のためであって限定するものではないと理解されるべきである。したがって、本発明の範囲は、先行の記述によらずに添付したクレイムによって示される。クレイムの等価の意味および範囲内での変更は全て、これら範囲内に包含されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】異なる型のタンパク質の混合試料を通常手順で得るステップを模式的に説明する図である。
【図２】選択されたアミノ酸残基にタグを付した、典型的タンパク質分子中のアミノ酸残基の配列の一部分の模式図である。
【図３】タグを付したアミノ酸残基を含む選択されたアミノ酸残基を有する図２のタンパク質分子の部分の模式図であり、高度に抽象化して簡略化して記号で表したものである。
【図４】図３で示したタンパク質分子の部分の模式図であり、より高度に抽象化してさらに簡略化して記号で表したものである。
【図５】第一励起波長での電磁放射への断片の曝露によって生じる一段階放出を用いて図４に示したタンパク質分子断片に関する第一フィンガープリント構成要素を得るための、本発明の教示を組み入れた方法の模式図である。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは合わせて、第二励起波長での電磁放射への断片の曝露によって生じる二段階放出を用いて図４に示したタンパク質分子断片に関する第二フィンガープリント構成要素および第三フィンガープリント構成要素を得る方法を模式的に示したものであり、図６Ａは工程中の最初の一段階放出を示し、図６Ｂはそれによって始まる二段階放出の全体を示す。
【図７】図７Ａ−７Ｃは合わせて、第三励起波長での電磁放射への断片の曝露によって生じる三段階放出を用いて図４に示したタンパク質分子断片に関する第四、第五および第六フィンガープリント構成要素を得る方法を模式的に示したものであり、図７Ａは工程中の最初の一段階放出を示し、図７Ｂはそれによって起きる二段階放出を示し、図７Ｃは三段階放出の全体を示す。
【図８】広範囲の励起波長での電磁放射への断片の曝露によって生じる三段階放出を用いて図４に示したタンパク質分子断片に関する三つのフィンガープリント構成要素を得るための、本発明の教示を組み入れた方法の第二の実施態様の模式図である。
【図９】タンパク質分子に関するフィンガープリントを決定するための本発明の教示を組み入れた方法におけるステップを示すフローチャートである。
【図１０】図９の方法にしたがって決定されたタンパク質分子のフィンガープリントを用いてそのタンパク質分子を同定するための本発明の教示を組み入れた方法におけるステップを示すフローチャートである。
【図１１】タンパク質分子の一つ以上の型のアミノ酸残基をタグで標識する方法の第一実施態様におけるステップの模式図である。
【図１２】タンパク質分子の一つ以上の型のアミノ酸残基をタグで標識する方法の第二実施態様におけるステップおよび中間構造を示す模式図である。
【図１３】タンパク質分子の一つ以上の型のアミノ酸残基をタグで標識する方法の第三実施態様におけるステップおよび中間構造を示す模式図である。
【図１４】タンパク質分子の各二つの異なる型のアミノ酸残基に二つの異なる蛍光タグを付することによって、二つの異なる型のタンパク質分子に与えられるフィンガープリントを示すグラフである。
【図１５】フィンガープリントの決定を促進することを目的として、試料中の他のタンパク質分子からタンパク質分子を単離するための本発明の教示に従って用いる装置の第一実施態様を図式的に表したものである。
【図１６】フィンガープリントの決定を促進することを目的として試料中の他のタンパク質分子からタンパク質分子を単離するための本発明の教示に従って用いる装置の第二実施態様の透視図である。
【図１７】フィンガープリントの決定を促進することを目的として、試料中の他のタンパク質分子からタンパク質分子を単離するための本発明の教示に従って用いる装置の第三実施態様の透視図である。
【図１８】図１７に示した装置の部分の拡大透視図である。
【図１９】試料中のタンパク質分子の型を同定することを目的として、複数の型のタンパク質分子の試料中のタンパク質分子の型を単離するための、本発明の教示に従って用いる等電点電気泳動ゲルを図式的に表したものである。
【図２０】図１９に示した等電点電気泳動ゲルを用いて予め互いに分離した複数型タンパク質分子の試料中のタンパク質分子の型の単離を精密化するための、本発明の教示に従って用いる電気泳動ゲルを図式的に表したものである。
【図２１】試料中の種々の型のタンパク質分子を図１９および図２０に示した方法で各バンドに互いに分離した後の電気泳動ゲルの図式的平面図である。
【図２２】図２１の電気泳動ゲルのバンドを膜上に移動させる方法の図式的透視図である。
【図２３】異なる型のタンパク質分子のバンドを図示するようにそこに移動させた後の図２２の膜を図式的に表したものである。
【図２４】図２１の電気泳動ゲルの各バンドにそれぞれ分離されて、図２３の膜に移動させたタンパク質分子の型を同定するための、本発明の教示に従って用いるシステムの実施態様の図式的表示である。
【図２５】図２４に示したシステムを用いて得られた図２４の膜のバンド中にある各型のタンパク質の第一フィンガープリント構成要素を決定するためのデータを具体的に示す図２４の膜の第一写真の図式的表示である。
【図２６】図２４の膜のバンド中にある各型のタンパク質の第二フィンガープリント構成要素を決定するためのデータを具体的に示す、図２４に示される膜の第二写真の図式的表示である。
【図２７】図２４の膜のバンド中にある各型のタンパク質の第三フィンガープリント構成要素を決定するためのデータを具体的に示す、図２４に示される膜の第三写真の図式的表示である。
【図２８】タンパク質分子を含む溶液の一滴を支えている顕微鏡スライドのためのカバースリップの透視図である。
【図２９】図２８に示したカバースリップを顕微鏡スライド上の浅い凹部にかぶせて逆さにして置いた透視図であり、それによって溶液の滴がカバースリップから凹部内に垂れる。
【図３０】図２９の溶液滴の部分の視野の写真を得るための、本発明の教示に従って用いる装置の透視図である。
【図３１】異なるフィルターを用いて図３０の装置を用いることによって得られた図２９の溶液滴の部分の視野を図式的に示したものであり、視野はその視野に現れるタンパク質分子に関するフィンガープリントを決定するためのデータを具体的に示す。
【図３２】異なるフィルターを用いて図３０の装置を用いることによって得られた図２９の溶液滴の部分の視野を図式的に示したものであり、視野はその視野に現れるタンパク質分子に関するフィンガープリントを決定するためのデータを具体的に示す。
【図３３】異なるフィルターを用いて図３０の装置を用いることによって得られた図２９の溶液滴の部分の視野を図式的に示したものであり、視野はその視野に現れるタンパク質分子に関するフィンガープリントを決定するためのデータを具体的に示す。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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