(57)【要約】本発明は抗体のＦｃ部位を特異的に認識する能力を持つ、固定化した抗体結合タンパク質を用いて、安定した、再生可能な抗体アレイを作製する方法に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下による、安定した、再生可能な抗体アレイの作製方法。
a)平板な台座の表面に、抗体のＦｃ部位を特異的に認識可能な抗体結合タンパク質を共有結合で固定化し、
b)複数の特異的モノクローナル抗体をそのＦｃ部位で抗体結合タンパク質に結合させ、それにより、パターンが形成され、
及び、
c)固定化された抗体結合タンパク質抗体複合体は共有結合の架橋（crosslink）で結合される。
【請求項２】
平板な台座がガラス、金属、金属酸化物、半金属酸化物、又はプラスチックの表面を有する請求項１の方法。
【請求項３】
抗体結合タンパク質が、Ｆｃ−特異的二次抗体、タンパク質Ａ、及び、タンパク質Ｇより選択される請求項１又は２の方法。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか一の方法で取得できる抗体アレイ。
【請求項５】
請求項４の抗体アレイを保持する医学用又は医療診断用器具。
【請求項６】
抗原の定性的又は定量的測定の為の、請求項４による抗体アレイ又は請求項５による医学用又は医療診断用器具の使用。
【請求項７】
測定されるべき抗原がタンパク質である請求項６による使用。
【請求項８】
請求項４の抗体アレイ、及び、結合した抗原を定性的又は定量的に測定する試薬を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗体のＦｃ部位を特異的に認識する能力を持つ、固定化した抗体結合タンパク質を用いて、安定した、再生可能な抗体アレイを作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
多種の検定化合物を数多く収集し、平面に規則正しく配置／固定したものは科学技術分野でアレイとして公知である；例として、EP 0 373 203（特許文献１）とEP 0 619 321（特許文献２）を参照されたい。このようなアレイは相互作用解析法により、迅速に、同時に生物学的な試料に含まれるあらゆる化合物の検査を可能にする。アレイの有利な点は、例えば、ビーズのような可動性の物質に固定された検定化合物の同時的な検査と比べて、アレイに固定された検定分子の性質（化学構造及び／又は同一性）は完全にアレイ表面の位置により知られており、それにより、局所的な検定シグナルが直ちに一つの分子タイプに分類することができるのである。特に、微小化した形の、生物検定分子用アレイはバイオチップと呼ばれる。
【０００３】
このようなアレイに関して実証されている例を以下に述べる：
【０００４】
ＤＮＡ断片、ｃＤＮＡｓ、ＲＮＡｓ、ＰＣＲ産物、プラスミド、バクテリオファージ、合成オリゴヌクレオチド又は合成ＰＮＡオリゴマーである核酸アレイは相補的な核酸分析物とのハイブリダイセーション（二本鎖分子の形成）の手段により選択され、及び、合成ペプチド、それらの類似体、オリゴカルバミン酸等のようなペプトイド、又は普通の有機化合物の化合物アレイは親和的なタンパク分析物又は他の分析物との結合、又は酵素学的反応の手段により選択される。
【０００５】
対照的に、抗体の、及び細胞中に発現されたタンパク質とファージの融合タンパク質（ファージディスプレイ）のタンパク質アレイはまだ開発段階である（下記参照）。このようなアレイ及び方法、及び器具は生物学的な基礎研究のみならず、医療診断方法や医薬の有効成分の開発に用いられる。科学的研究の他の部門では、例えば触媒の開発、材料科学、などがこのようなコンセプトに適合し、成功し始めている。このようなアレイを有用で型どおりに使用する前提条件とは、それを安価に、迅速で、しかも全自動で作製でき、検定構造（情報内容）が高密度で、多様性があることである。
【０００６】
現在、このようなアレイは前もって準備しておいた材料表面の上に検定分子を付着させて、以下の様に２つの異なった原理に基づいて作製される。
【０００７】
(a)  前もって作っておいた検定結合分子の溶液を材料表面に一回のみ配分する。
(b)  表面の位置（in situ）に検定化合物を合成するために材料を連続的に分配する。
【０００８】
最新の概要は、ヴォフル（S. Woffl）により報告されている：transcript Laborwelt 2000,3,13-20）（非特許文献１）。
【０００９】
従来知られており使用されているチップ形状は、光学的平板印刷若しくはプリントマスクに適するように製造された直角x/yに配置されたもの、又はチップ表面（ｒΦアレイ）が回転運動及びファースト−パルス分配デバイスにより製造された円形ｒΦに配置されたものである。このような形状のものは、１ｃｍ２あたり百万までのテスト化合物密度とするか、又は個々の表面面積を数平方マイクロメーターにすることを達成することができる。
【００１０】
ＤＮＡアレイは、多くの生物医学研究分野においてこの方法の有効性を実証している（概要を記した文献はS. Khan et al. in Biochim. Biophys. Acta 1999, 1423; 1117-1128;  DeRisi et al. in Nat. Genet. 1996, 14: 457-460; Debouck and Goodfellow in Nat. Genet. 1999, 21, 48-50を参照（非特許文献２））。それ故に、特異的なタンパク質を微量配列したものを迅速及び安価に試験できることを基本として、同時に並行して検出し、定量することを可能とする技術を必要とすることは理解できる。その前提として、高特異的であり、安定であり及び再現可能なタンパク質アレイ又はタンパク質チップの確立があり、そのために、従来からのモノクローナル抗体は極めて適している。ハイブリドーマ技術は長年にわたって確立し、標準化しており、望ましい特異性、親和性、安定性を持った抗体を提供している。
【特許文献１】
欧州特許0 373 203号明細書
【特許文献２】
欧州特許0 619 321号明細書
【非特許文献１】
S. Woffl. transcript Laborwelt 2000,3,13-20
【非特許文献２】
S. Khan et al. in Biochim. Biophys. Acta 1999, 1423; 1117-1128;  DeRisi et al. in Nat. Genet. 1996, 14: 457-460; Debouck and Goodfellow in Nat. Genet. 1999, 21, 48-50
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、結果的に以下により、安定した、再現可能な抗体アレイを作製する方法に関する。
【００１２】
a)平板な台座の表面に、抗体のＦｃ部位を特異的に認識可能な抗体結合タンパク質を共有結合で固定化し、
b)複数の特異的モノクローナル抗体をそのＦｃ部位で抗体結合タンパク質に結合させ、それにより、パターンが形成され、
及び、
c)固定化された抗体結合タンパク質抗体複合体は共有結合の架橋（crosslink）で結合される。
【００１３】
また、本発明は、本発明に係る方法で入手できる抗体アレイ、本発明に係る抗体アレイを保持する医学用又は医療診断用器具、本発明の抗体アレイ及び本発明の抗体アレイに結合された結合抗原を定性的又は定量的に測定する検出試薬を含むキット、に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、本発明に係る抗原の定性的又は定量的測定の為の、本発明に係る抗体アレイ又は医学用又は診断用装置の使用を提供する。
【００１５】
従属請求項は、本発明の有効な及び／又は好適な実施形態に関するものである。
【００１６】
本発明の実施形態においては、平板な台座はガラス、金属、金属酸化物、半金属酸化物、又は、プラスチックの表面を有する。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態においては、抗体結合タンパク質は、Ｆｃ−特異的二次抗体、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇより選択される。
【００１８】
本発明により示される使用の実施形態においては、測定されるべき抗原はタンパク質である。
【００１９】
以下、本発明の詳細をこれに限定されることなく説明する。
【００２０】
新規作製方法では下記の特徴が際立っている：
【００２１】
(a)特異的な抗体は、抗原認識に影響を及ぼさないように、ある”向き”、すなわちＦｃ部分によって固定化される。このために、まず特異的抗体のＦｃ部位を特異的に識別するタンパク質を格子状に、該当のチップ表面上に共有結合で結合する（例えば、誘導されたＦｃ特異的二次抗体、又は、タンパク質Ａ−分子、又は、タンパク質Ｇ−分子）。
【００２２】
(b)固定化されたタンパク質／抗体複合体又は抗体／抗体複合体の必要な安定性は、化学的な共有結合の架橋（crosslink）で達成され、そのために必要に応じ通常の試薬が使用される。タンパク質−タンパク質の相互作用による安定性に加えて、つまりサブユニットが化学的架橋（crosslink）することで特異的抗体の分子内安定化が生じる。
【００２３】
一方で例えば保存中に特異的抗体の分離を防ぎ、しかし他方で非特異的な、若しくは低親和性の物質と抗体マトリックスとの相互作用を防ぐために、高塩濃度、若しくは低若しくは高ｐＨ値のような厳格な条件下で処理された、極めて高い安定性を有する抗体アレイが得られる。その結果、前処理されて分析されるべきタンパク質混合物の反応が、厳格に反応可能となる。
【００２４】
(c)共有架橋（crosslink）した抗体の使用には、該当する抗体の抗原結合部位が架橋（crosslink）試薬により不活性化せず又は変化しないことが必要となる。したがって、結果として、抗原結合する特性は使用される架橋（crosslink）試薬による影響をうけないモノクローナル抗体が形成又は選択される。架橋（crosslink）についてはWehland & Weber in J. Cell  Biol., 104(1987)  1059.などが参照される。
【００２５】
これらの全プロセスは、安定性があり、再現可能な抗体アレイを産出する。
【国際公開パンフレット】
2004536290.tif 000002
2004536290.tif 000003
2004536290.tif 000004
2004536290.tif 000005
2004536290.tif 000006
2004536290.tif 000007
2004536290.tif 000008
2004536290.tif 000009
2004536290.tif 000010
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004536290.tif 000011
【国際調査報告】
2004536290.tif 000012
2004536290.tif 000013
2004536290.tif 000014
2004536290.tif 000015
2004536290.tif 000016
2004536290.tif 000017