(57)【要約】脳虚血性損傷部におけるＧＡＤＤ３４およびＰＣＮＡポリペプチドおよび抗体の定位（位置決定）方法について記載する。これらのポリペプチドもしくはホモローグまたはその誘導体のそうした損傷の治療および診断のための使用方法についても記載する。これらのポリペプチドは脳虚血性損傷治療薬製造や診断においても使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＤＤ３４ポリペプチドもしくはホモローグまたはその誘導体の脳虚血性損傷治療剤製造における使用。
【請求項２】
前記治療剤がＧＡＤＤ３４から誘導される活性化合物を含むものである請求項１に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３】
前記治療剤がポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を脳内に導入するべく設計されたウイルスベクターを含むものである請求項１または２に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチド断片が低酸素応答要素（ＨＲＥ）を含むものである請求項３に記載のポリペプチドの使用。
【請求項５】
ＰＣＮＡポリペプチドもしくはホモローグまたはその誘導体の脳虚血性損傷治療剤製造における使用。
【請求項６】
前記治療剤がＧＡＤＤ３４から誘導される活性化合物を含むものである請求項５に記載のポリペプチドの使用。
【請求項７】
前記治療剤がポリペプチドをコードするポリヌクレオチド断片を脳内に導入するべく設計されたウイルスベクターを含むものである請求項５または６に記載のポリペプチドの使用。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチド断片が低酸素応答要素（ＨＲＥ）を含むものである請求項７に記載のポリペプチドの使用。
【請求項９】
ＧＡＤＤ３４ポリペプチドもしくはホモローグまたはその誘導体とＰＣＮＡポリペプチドもしくはホモローグまたはその誘導体との間の相互作用を分断する能力を有する物質の脳虚血性損傷治療剤製造における使用。
【請求項１０】
脳虚血性損傷の治療を必要としているヒトまたは動物に、薬学的に活性量のＧＡＤＤ３４ポリペプチドもしくはホモローグまたはその誘導体を投与する工程を含む脳虚血性損傷治療剤方法。
【請求項１１】
脳虚血性損傷の治療を必要としているヒトまたは動物に、薬学的に活性量のＰＣＮＡポリペプチドもしくはホモローグまたはその誘導体の有効量を投与する工程を含む脳虚血性損傷治療剤方法。
【請求項１２】
脳虚血性損傷の治療を必要としているヒトまたは動物に、ＧＡＤＤ３４ポリペプチドもしくはホモローグまたはその誘導体とＰＣＮＡポリペプチドもしくはホモローグまたはその誘導体との間の相互作用を分断する能力を有する物質を薬学的に活性な量投与する工程を含む脳虚血性損傷治療剤方法。
【請求項１３】
ＧＡＤＤ３４ポリペプチドに対する抗体の脳虚血性損傷治療剤送達のための使用。
【請求項１４】
患者に、ＧＡＤＤ３４ポリペプチドに対する抗体を投与する工程および前記抗体の存在する領域を検出する工程を含む脳虚血性損傷の診断方法。
【請求項１５】
検出を容易にするため前記抗体を標識化しておく脳虚血性損傷の診断方法。
【請求項１６】
ＧＡＤＤ３４ポリペプチドもしくは生理学的に許容可能なその塩、エステルまたはその他の生理学的に許容可能な機能性誘導体およびこれらのための担体を含むヒトまたは動物のための脳虚血性損傷治療用医薬処方物。
【請求項１７】
ＰＣＮＡポリペプチドもしくは生理学的に許容可能なその塩、エステルまたはその他の生理学的に許容可能な機能性誘導体およびこれらのための担体を含むヒトまたは動物のための脳虚血性損傷治療用医薬処方物。
【請求項１８】
ＧＡＤＤ３４ポリペプチドもしくはホモローグまたはその誘導体とＰＣＮＡポリペプチドもしくはホモローグまたはその誘導体との間の相互作用を分断する能力を有する物質、または生理学的に許容可能なその塩、エステルまたはその他の生理学的に許容可能な機能性誘導体およびこれらのための担体を含むヒトまたは動物のための脳虚血性損傷治療用医薬処方物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、脳虚血時において活性な化合物の特定、および脳の虚血性損傷の治療または予防におけるそのような化合物の使用に関する。本発明は、さらに、そのような化合物に対する抗体、および脳の虚血性損傷の診断または治療におけるその使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】
脳虚血は、脳血管性疾病での発生率が高く後遺症も重篤なため重要な問題である。脳血管性疾病は、西洋諸国では癌と心臓病に次いで死亡原因の第３位にランクする。脳虚血性損傷は多くの病態の特徴であるが、最も顕著なのは頭部外傷と脳卒中である。
【０００３】
脳卒中によるものであれ頭部外傷によるものであれ、脳血流量の減少は多数の神経化学的カスケードの開始契機となり、これらのカスケードは脳組織の不可逆損傷をもたらす。これらのカスケードに対する薬学的介入は、脳組織を損害から保護する効果を持つ可能性がある。しかし、こうした介入が治療可能性を示す有力な証拠は動物モデルでは見つかっているものの、人間の頭部外傷および脳卒中における臨床試験結果はそれほど決定的ではなかった。現状において脳卒中のための唯一有効な治療法はｔＰＡ（組織プラスミノゲン活性化因子）であるが、安全性および物流の面で脳卒中患者における利用率は１％未満である。
【０００４】
これに代わる治療戦略は、脳組織に脳血流量の減少などの外傷を引き起こした場合、他の多くの種類の細胞における外傷の場合と同様に、多数の遺伝子の活性化をもたらし、こうした遺伝子は、特に虚血性損傷部の縁部ないし周辺部（半影部）で脳組織の存続あるいはプログラム化された細胞死を促進するという観察結果から示唆される。しかし、これまでに関与している正確な遺伝子の特定や介入のための有効な戦略は特定されていない。
【０００５】
そこで、ラットの脳虚血モデルを使用し、虚血時に発現する２つの遺伝子を特定し、かつ虚血性損傷の経時的進展を研究した。
【０００６】
ラットにおける実験的な脳卒中は不可逆的損傷を受けた脳組織（梗塞部）を再現性をもって、かつ定量可能な体積で生成させることができる。実験的な脳卒中は、半一時的頭蓋骨局部切除術を介して大脳動脈をジアテルミー閉塞することによって生じさせることができる。あるいは、頚動脈内に管腔内フィラメントを導入し、フィラメントをウィリス輪に進めることで中大脳動脈の起点を閉鎖し、皮質および尾状核中に再現性のある虚血を生じさせる。フィラメントを引き抜くことで、この領域への血液の再潅流を実現できる。虚血を２時間持続し次いで２２時間再潅流することによって、皮質および尾状核領域に実質的に不可逆的な損傷をもたらした。梗塞部の体積は２４時間の時点で最大ではなく、次の２４時間で梗塞周辺（半影）ゾーンの組織がさらに梗塞部に加わった。従来の研究では、４８〜７２時間では梗塞部の大きさはそれ以上増加しないことが示されている。したがって、２４時間の時点では、介入を行なわない場合には次の２４時間に不可逆的に損傷を受ける救助可能な組織領域が存在している。
【０００７】
ラット虚血モデルに関する免疫組織化学的研究は、虚血領域に２種類のタンパク質、具体的にはＧＡＤＤ３４およびＰＣＮＡが存在することを示した。
【０００８】
ＧＡＤＤ３４（Ｇｒｏｗｔｈ Ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ＤＮＡ Ｄａｍａｇｅ―成長停止およびＤＮＡ損傷）（フォルナス（Ｆｏｒｎａｃｅ）ら、１９８９年）（非特許文献１）は、損傷後の成長およびＤＮＡ複製をブロックし、したがって腫物抑圧遺伝子の役割を有すると考えられている細胞タンパク質である。ＧＡＤＤ３４のアミノ末端領域はアポトーシス経路に関わっていると見られ、一方、カルボキシ末端領域はマウスミエロイド分化タンパク質ＭｙＤ１１６（ロード（Ｌｏｒｄ）ら、１９９０年）（非特許文献２）および単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）タンパク質ＩＣＰ３４．５（マギュー（ＭｃＧｅｏｃｈ）およびバーネット（Ｂａｒｎｅｔｔ）、１９９１年）（非特許文献３）と相同性を有することが示されている。ＩＣＰ３４．５タンパク質の１つの機能は、宿主細胞タンパク質合成の遮断を防止し（チョウ（Ｃｈｏｕ）およびロイズマン（Ｒｏｉｚｍａｎ）、１９９２年（非特許文献４）；ヘ（Ｈｅ）ら、１９９７年（非特許文献５）；ノボア（Ｎｏｖｏａ）ら、２００１年（非特許文献６））、ＨＳＶ感染細胞を生存させてＨＳＶの複製を可能にしているようである。
【０００９】
これらのタンパク質の保存されたカルボキシ領域は第２の特定されたタンパク質であるＰＣＮＡ（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ Ｃｅｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｎｔｉｇｅｎ―増殖細胞核抗原）と結合新和性を有していることが知られている。なお、ＰＣＮＡはそれ自体、細胞周期制御およびＤＮＡ修復に関わっていると考えられている（プレリッヒ（Ｐｒｅｌｉｃｈ）ら、１９８７年）（非特許文献７）。
【００１０】
ＧＡＤＤ３４とＭｙＤ１１６はＰＣＮＡと相互作用して細胞周期の調節に影響を及ぼし、一方、ＩＣＰ３４．５はＰＣＮＡと相互作用して細胞の増殖、したがってＨＳＶ　ＤＮＡの増殖の進行を可能にすると考えられている。これらのタンパク質の機能、特定および特性、ならびにＧＡＤＤ３４のヒトホモローグの特定は、国際特許出願ＷＯ９８／４１８７３（特許文献１）に詳細が記載されており、その内容は参照によって本願に組み込まれる。
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ９８／４１８７３
【非特許文献１】Ｆｏｒｎａｃｅ ＡＪ Ｊｒ， Ｎｅｂｅｒｔ ＤＷ， Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ ＭＣ， Ｌｕｅｔｈｙ ＪＤ， Ｐａｐａｔｈａｎａｓｉｏｕ Ｍ， Ｆａｒｇｎｏｌｉ Ｊ， Ｈｏｌｂｒｏｏｋ ＮＪ （１９８９） Ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｅｓ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｌｙ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｇｒｏｗｔｈ ａｒｒｅｓｔ ｓｉｇｎａｌｓ ａｎｄ ＤＮＡ−ｄａｍａｇｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ９： ４１９６−２０３
【非特許文献２】Ｌｏｒｄ ＫＡ， Ｈｏｆｆｍａｎ−Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ Ｂ， Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ ＤＡ （１９９０） Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＭｙＤ１１６ ｃＤＮＡ： ａ ｎｏｖｅｌ ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＩＬ６． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８：２８２３
【非特許文献３】ＭｃＧｅｏｃｈ， ＤＪ， ＢＣ Ｂａｒｎｅｔｔ （１９９１） Ｎｅｕｒｏｖｉｒｕｌｅｎｃｅ ｆａｃｔｏｒ． Ｎａｔｕｒｅ ３５３： ６０９
【非特許文献４】Ｃｈｏｕ Ｊ， Ｒｏｉｚｍａｎ Ｂ （１９９２） Ｔｈｅ ｇａｍｍａ １ （３４．５） ｇｅｎｅ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ １ ｐｒｅｃｌｕｄｅｓ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ ｔｏｔａｌ ｓｈｕｔｏｆｆ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９： ３２６６−７０
【非特許文献５】Ｈｅ Ｂ， Ｇｒｏｓｓ Ｍ， Ｒｏｉｚｍａｎ Ｂ （１９９７） Ｔｈｅ ｇａｍｍａ（１） ３４．５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ １ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ １ａｌｐｈａ ｔｏ ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｅ ｔｈｅ ａｌｐｈａ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２ ａｎｄ ｐｒｅｃｌｕｄｅ ｔｈｅ ｓｈｕｔｏｆｆ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４： ８４３−８．
【非特許文献６】Ｎｏｖｏａ Ｉ， Ｚｅｎｇ Ｈ， Ｈａｒｄｉｎｇ ＨＰ， Ｒｏｎ Ｄ （２００１） Ｆｅｅｄｂａｃｋ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｕｎｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｂｙ ＧＡＤＤ３４−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅＩＦ２ａ． Ｔｈｅ Ｊ ｏｆ Ｃｅｌｌ ｉｓ Ｂｉｏｌ １５３：１０１１−１０２１
【非特許文献７】Ｐｒｅｌｉｃｈ Ｇ， Ｋｏｓｔｕｒａ Ｍ， Ｍａｒｓｈａｋ ＤＲ， Ｍａｔｈｅｗｓ ＭＢ， Ｓｔｉｌｌｍａｎ Ｂ （１９８７） Ｔｈｅ ｃｅｌｌ−ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ＳＶ４０ ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． Ｎａｔｕｒｅ ３２６： ４７１−５
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、脳虚血性損傷部におけるタンパク質ＧＡＤＤ３４およびＰＣＮＡの識別および定位（位置決定）方法に関する。
【００１３】
上記のラット虚血モデルを使用して、脳、具体的には脳卒中損傷の周辺部でＧＡＤＤ３４のアップレギュレーション（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）があることが特定された。細胞内において、ニューロピル（ｎｅｕｒｏｐｉｌ）が薄く染色された背景の中に強く特異的な免疫組織化学的染色される部分が見出される。皮質、尾状核、そして皮質下の白質領域における梗塞周辺領域中には免疫陽性な細胞が存在する。
【００１４】
全細胞死が生じた損傷部位（梗塞）の中核部分ではＧＡＤＤ３４の発現は検出されず、また、対側性半球などの正常な脳領域でもＧＡＤＤ３４の発現は検出されない。
【００１５】
ＰＣＮＡも、ＧＡＤＤ３４と同じ領域で特異的にアップレギュレートされるが、正常脳領域および梗塞部位ではＰＣＮＡは事実上検出されない。
【００１６】
アップレギュレーション領域では、両方のタンパク質が発現されている細胞も、タンパク質のうちの１つだけが発現されている細胞もあるようである。
【００１７】
これらのタンパク質は初期損傷後に梗塞部の成長に役割を果たし、これらのタンパク質の一方または両方が発現されている細胞は、虚血損傷から回復しようと努めているか、または再生を進行中であり、あるいは死に至る過程にあるように思われる。また、これらのプロセスの各々が起こっている細胞集団が個別に存在するようである。したがって、適当な化合物によって介入および治療を行なえば、梗塞部の拡大に影響を及ぼし得るであろう。同様のプロセスが別のかたちの病理状態（例えば、急性損傷、物理的な損傷および神経組織変成性疾患）後にも脳に生じると考えられる。したがって、本発明はさらにそのような外傷の診断および治療にも有用であろう。
【００１８】
【発明の実施の形態】
したがって、本発明は第一に、脳虚血性損傷治療用薬剤の製造におけるＧＡＤＤ３４ポリペプチド、またはそのホモローグもしくは誘導体の使用を提供する。梗塞の周辺部の細胞に過剰のＧＡＤＤ３４を導入することで、細胞の虚血損傷からの回復を助け、したがって、梗塞部の拡大を抑えることができる。あるいは、必要な場合には、損傷細胞において本来のＧＡＤＤ３４の活性や効果を調整するためにＧＡＤＤ３４ポリペプチドの誘導体を用いてもよい。ＧＡＤＤ３４の発現を調整するためにＧＡＤＤ３４ポリペプチドのポリヌクレオチド誘導体を使用してもよい。
【００１９】
ＧＡＤＤ３４ホモローグはＷＯ９８／４１８７３に記載されているようなヒトホモローグ、ＭｙＤ１１６またはＩＣＰ３４．５を含んでいる。ホモローグには、ＧＡＤＤ３４ポリペプチド配列またはその本質的な領域とのアミノ酸相同性（同一性）が少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９５％である他のポリペプチド配列も含まれる。
【００２０】
ＧＡ−ＤＤ３４の誘導体には、完全なＧＡＤＤ３４ペプチド配列およびそのホモローグの断片および、ペプチドに由来する修飾された化合物、例えば、糖鎖形成、アミド化、カルボキシル化、リン酸化などによる修飾を受けた化合物が含まれる。ＧＡＤＤ３４ポリペプチド誘導体には、適当な酵素機構に導入されたときにそのようなポリペプチドを発現するように選択または設計されたポリヌクレオチド配列も含まれる。
【００２１】
薬剤は、ＧＡＤＤ３４に由来する薬学的に活性な化合物、あるいは、ＧＡＤＤ３４ポリペプチドをコード化するＤＮＡまたはＲＮＡ断片を脳細胞に導入すべく設計したウイルスベクター（例えばＨＳＶ）；非修飾ＧＡＤＤ３４；「裸の」ポリヌクレオチド断片；ＧＡＤＤ３４ポリペプチドエピトープに対する抗体またはその活性な断片；ＧＡ−ＤＤ３４ポリペプチドをコード化するゲノムＤＮＡに対して設計されたアンチセンスポリヌクレオチド断片などを含んでもよい。
【００２２】
薬剤はまた、適当な送達媒体および／または手段と共に提供してもよい。例えば、ポリペプチドの脂質カプセル化；薬理学的に受容可能な担体；ウイルス粒子；注射可能な手段などである。
【００２３】
ポリヌクレオチド断片を生体内で発現させる意図の下に薬剤に含有させる場合は、適当なヌクレオチド・プロモーター、レギュレーター、および標的配列と共にこの断片を提供してもよい。例えば、梗塞領域は低酸素状態にある可能性が高いので、低酸素応答要素（ＨＲＥ：ｈｙｐｏｘｉｃ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ）プロモーターにポリヌクレオチド断片をつなぎ、結果として、梗塞部領域のみでペプチドを発現させるのが便利であろう。
【００２４】
本発明の別の態様では、ＰＣＮＡポリペプチド、あるいはそのホモローグもしくは誘導体の脳虚血性損傷治療用薬剤の製造における使用が提供される。本発明のこの態様は、上記のＧＡ−ＤＤ３４ポリペプチド、ホモローグまたは誘導体の使用と同様の有用性を有するであろう。
【００２５】
本発明のさらに別の態様によれば、ＧＡＤＤ３４もしくは生理学上受容可能な塩、エステルまたは生理学上機能的なその他の誘導体、および人間または他の動物において脳虚血性損傷の治療で使用するための担体を含む医薬処方物が提供される。
【００２６】
本発明のさらに別の態様によれば、ＰＣＮＡまたは生理学上受容可能な塩、エステルまたはその他の生理学上機能的な誘導体、および人間または他の動物において脳虚血性損傷の治療で使用するための担体を含む医薬処方物が提供される。
【００２７】
ＧＡＤＤ３４またはＰＣＮＡの生理学上受容可能な塩類の例には、酢酸、乳酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、ピルビン酸、蓚酸、フマル酸、オキザロ酢酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸およびコハク酸などの有機カルボン酸から形成された酸性添加塩類；メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸などの有機スルホン酸、塩酸、硫酸、リン酸、スルファミン酸などの無機酸が含まれる。
【００２８】
ＧＡＤＤ３４またはＰＣＮＡの生理学上機能的な誘導体は、体内で親化合物に変換され得るか、それ自体で活性な誘導体である。このような生理学上機能的な誘導体は「プロドラッグ」または「バイオプレカーサー」とも呼ばれることがある。
【００２９】
ＧＡＤＤ３４もしくはＰＣＮＡまたは生理学上受容可能な塩、エステルあるいは他の生理学上機能的な誘導体は、単独で、あるいは脳虚血性治療法の一部として他の薬と組み合わせて投与してもよく、あるいは、他の形態の治療法に付属するものとして投与してもよい。
【００３０】
脳虚血性損傷の治療で使用するために必要なＧＡＤＤ３４あるいはＰＣＮＡ化合物量は、投与のルート、患者の年齢および重量、ならびに治療しようとする症状の性質および重篤さに依存し、最終的には関係する内科医または獣医の判断によるであろう。一般には、人への投与の場合の適当な服用量は、１日当たりキログラム体重当たり０．１〜１００ｍｇ、例えば、１日当たり１ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇまで、特に１日当たり５〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲である。吸入による投与では、服用量は０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲が便利であろう。
新生児への投与については、より低用量が要求されるかもしれないことが認識されるであろう。
【００３１】
本発明による使用においてＧＡＤＤ３４またはＰＣＮＡは、好ましくはＧＡＤＤ３４またはＰＣＮＡもしくは生理学上受容可能なその塩、エステルまたはその他の生理学上機能的な誘導体（以下「活性化合物」と呼ぶ。）と１種以上の薬学的に受容可能な担体、ならびに場合によっては他の治療用および／または予防用成分を含む医薬処方物として提供される。担体は処方物中の他の成分と適合性を有しその受容者の健康に害を及ぼさないという意味で受容可能でなければならない。
【００３２】
活性化合物は、単位投薬形式の医薬処方物として提供するのが便利であろう。単位服用量処方物が２５ｍｇから１００ｍｇまでの量の活性化合物を含むのが適当である。
【００３３】
医薬処方物は、経口、局所的（皮膚剤、バッカル剤と舌下腺剤を含む。）、直腸経由、腸管外（皮下、皮内、筋肉内、静脈内を含む。）あるいは経鼻、肺投与、例えば、吸入によって投与するのが適当なものを含む。処方物は、適当な場合は、便利なように個別の投薬単位として提供し、薬学技術においてよく知られた方法のうちのいずれによってでも調製することができる。本発明の方法はすべて、液体の担体もしくは微粉砕した固体担体またはこの両者と活性化合物を組み合わせるステップ、次いで、必要な場合はその生成物を所望の処方物の形に成形するステップを含む。
【００３４】
担体が固体である経口投与に適した医薬処方物は、最も好ましくはそれぞれ所定量の活性化合物を含む大型丸薬、カプセルあるいはタブレットなどの単位服用量処方として提供される。タブレットは、必要に応じて１種以上の成分を加えて圧縮によってあるいは型を用いて製造することができる。圧縮タブレットは、粉末または顆粒などの自由流動状態の活性化合物をバインダー、潤滑剤、不活性希釈剤、界面活性剤または分散剤と混合し適当な機械を用いて圧縮することにより製造することができる。成形タブレットは、活性化合物を不活発な液体希釈剤を用いて成形することにより製造することができる。タブレットは必要に応じてコーティングしてもよいし、コーティングしない場合は必要に応じて切り溝を設けてもよい。カプセルは、活性化合物を単独であるいは１種以上の成分を添加した混合物としてカプセルシェルに満たし、次いで、これを通常の方法で封止することにより製造することができる。カシェー（ｃａｃｈｅｔ）剤は、カプセルに類似したもので、任意の添加剤成分とともに活性化合物を例えばライスペーパー・エンベロープ中に封止したものである。活性化合物も分散可能な顆粒として処方してもよく、これを例えば投与前に水中に懸濁させてもよいし、食品に散布してもよい。顆粒は例えばカシェー剤としてパッケージングしてもよい。担体が液体である経口投与に適した処方物は、水性または非水性の液体を用いた溶液または懸濁液として、あるいは水中油型液体乳剤として提供することもできる。
【００３５】
経口投与用処方物は徐放性投薬形式を含み、例えば、活性化合物を適当な徐放性マトリクス中に処方するか、徐放性フィルムでコーティングしたタブレットである。このような処方物は、予防目的での使用に特に適している。
【００３６】
担体が固体である直腸経由の投与に適した医薬処方物は、最も好ましくは単位服用量の坐薬として提供される。適当な担体はカカオバター、および本技術分野で一般に使用される他の材料を含む。坐薬は、軟化したか融解した担体と活性化合物との混和物を冷却成形すれば形成するのに適している。
【００３７】
腸管外投与に適した医薬処方物は、水性または油性のビヒクルを用いた活性化合物の無菌溶液または懸濁液を含む。注射可能な製剤はボーラス注射または連続注入に適したものであればよく、このような製剤は、使用のために必要になるまで処方物の導入の後に密閉される単位服用量か多数回服用量容器を用いて提供するのが便利である。あるいは、活性化合物を粉末形式とし、発熱物質を含まない無菌水などの適当なビヒクルを使用前に加えてもよい。
【００３８】
活性化合物は持続性デボー製剤として処方してもよく、これは、筋肉注射によって、あるいは埋め込み（例えば、皮下埋め込みまたは筋肉内埋め込み）によって投与することができる。デボー製剤は、例えば、適当なポリマー材料または疎水性材料あるいはイオン交換樹脂を含んでもよい。このような持続性処方物は、予防目的では特に便利である。
【００３９】
頬洞（ｂｕｃｃａｌ ｃａｖｉｔｙ）を介して肺に投与するのに適した処方物は、活性化合物を含み、望ましくは０．５〜７ミクロンの範囲の直径を有する粒子を受容者の気管支樹に送達されるようなものとする。
【００４０】
１つの可能性としては、このような処方物は、微粉化された粉末の形態をとる。これは、例えばゼラチンのような貫通可能なカプセル中に封じて吸入装置で用いるのが便利であるが、あるいは、活性化合物および例えば適当な液体やガス状推進剤、場合によっては界面活性化剤および／または固形希釈剤などの他の成分を含むそれ自体噴射可能な処方としてもよい。適当な液体推進剤はプロパンおよびクロロフルオロカーボンを含み、また、適当なガス噴射剤は二酸化炭素を含む。それ自体噴射可能な処方物は、活性化合物が溶液または懸濁液中の小滴の形で調剤すればよい。
【００４１】
このようなそれ自体噴射可能な処方物は、本技術分野で既知のものと同様であり、確立した手順によって調製することができる。これらは手動で操作可能な容器か自動的に機能するバルブを有する容器に入れて提供するのが適当である。バルブは各操作で固定量（例えば、２５〜１００μｌ）を送達する計量タイプが有利である。
【００４２】
別の可能性として、活性化合物はアトマイザーまたはネビュライザーで使用するための溶液または懸濁液の形態であってもよく、この場合、吸入のための微小滴霧を生成するために、加速気流または超音波振動を使用する。
【００４３】
経鼻投与に適した処方物は、上記の肺投与用処方物と概ね類似している。このような処方物は、分配時、鼻腔中の保持を可能にするために、１０〜２００ミクロンの範囲の粒子直径を有していることが望ましい。これは必要に応じて適当な粒径の粉末を使用するか適当なバルブを選択することで実現できる。他の適当な処方物は、鼻に近付けた容器から素早く息を吸い込むことによって鼻経路により投与するためには粒子直径が２０〜５００ミクロンの範囲である粗粉末、および活性化合物０．２〜５％ｗ／ｖを水性または油性の溶液または懸濁液中に含む鼻腔滴下剤を含む。
【００４４】
前述の担体成分に加え、希釈剤、バッファー、香料、バインダー、界面活性化剤、増粘剤、潤滑剤、保存剤（抗酸化剤を含む）など１種以上の追加的な担体成分、および投与対象とする受容者の血液と等張な処方物を与える目的で含有される物質を含んでも良いという点が理解されるべきである。
【００４５】
動物治療用の処方物は、粉末または原液（濃縮液体）のいずれかが便利である。標準的な動物治療用処方のプラクティスに従って、その物理的性質を改善するためにラクトースまたはショ糖のような従来の水溶性賦形剤を粉末に組み入れてもよい。したがって、本発明の特に適当な粉末は５０〜１００％ｗ／ｗ、好ましくは６０〜８０％ｗ／ｗの活性成分、および０〜５０％ｗ／ｗ、好ましくは２０〜４０％ｗ／ｗの従来の動物治療用賦形剤を含む。これらの粉末は、例えば、中間的なプリミックスとして動物飼料に加えるか、あるいは動物飲料水中に希釈してもよい。
【００４６】
ＧＡＤＤ３４はＰＣＮＡに結合親和性を有することが知られていることから、これら２種のペプチド間の相互作用が、脳の虚血性損傷の進行に何らかの影響を及ぼしている可能性がある。国際特許出願ＷＯ９８／４１８７３は、ＧＡＤＤ３４とＰＣＮＡの間の相互作用を分断することができる物質を特定する方法について記載する。
【００４７】
本発明の別の態様によれば、ＧＡＤＤ３４ポリペプチドもしくはそのホモローグまたはこれらの誘導体とＰＣＮＡポリペプチドもしくはそのホモローグまたはそれらの誘導体の間の相互作用を分断することができる物質の脳の虚血性損傷の治療の薬剤の調製における使用が提供される。
【００４８】
本発明のさらに別の態様によれば、ＧＡＤＤ３４ポリペプチドとＰＣＮＡポリペプチドの間の相互作用を分断することができる物質、もしくは生理学上受容可能な塩またはエステルその他の生理学上機能的な誘導体および担体を含む人間あるいは他の動物における脳虚血性損傷の治療で使用するための医薬処方物が提供される。
【００４９】
また、本発明のさらに別の態様によれば、脳虚血性損傷の治療を必要としている人間または動物患者に、薬理学的に活性な服用量のＧＡＤＤ３４ポリペプチドもしくはそのホモローグまたはこれらの誘導体を投与するステップを含む脳虚血性損傷の治療方法が提供される。
【００５０】
本発明のさらに別の態様によれば、脳虚血性損傷の治療を必要としているヒトまたは動物患者に、ＰＣＮＡポリペプチドもしくはホモローグまたはこれらの誘導体を薬学的に活性な服用量投与するステップを含む脳虚血性損傷の治療方法が提供される。
【００５１】
本発明のさらに別の態様によれば、脳虚血性損傷の治療を必要としているヒトまたは動物患者に、ＧＡＤＤ３４ポリペプチドもしくはそのホモローグまたはこれらの誘導体とＰＣＮＡポリペプチドもしくはそのホモローグまたはこれらの誘導体との間の相互作用を分断させることができる物質を薬学的に活性な服用量投与するステップを含む脳虚血性損傷の治療方法が提供される。
【００５２】
ＧＡＤＤ３４抗体は損傷周辺部を際立たせることが判明したので、薬剤または他の化合物を損傷周辺部に特異的送達（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）するためにこのような抗体を使用することもできるであろう。
【００５３】
したがって、本発明の別の態様によれば、脳虚血性損傷治療薬を送達するためのＧＡＤＤ３４ポリペプチド抗体の使用方法が提供される。本願明細書で使用する用語「抗体」は、ＧＡＤＤ３４ポリペプチドまたは免疫原断片と特異的に反応する、ポリクローナルもしくはそのモノクローナル抗体またはこれらの断片を含む。抗体は断片化し、有用な断片を既知の技術を使用してスクリーニングすることができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片はペプシンで抗体を処理することにより生産できる。また、生じた（ａｂ’）２断片をジスルフィドブリッジが還元されるように処理することでＦａｂ’断片を生産することができる。本願明細書に記載した抗体はさらに、ＧＡＤＤ３４に対する抗原決定基を有する二重特異的キメラ分子を含む。
【００５４】
本発明は、またさらに、患者にＧＡ−ＤＤ３４ポリペプチド抗体を投与する工程と前記抗体の局在化領域を検出する工程を含む脳虚血性損傷の診断方法を提供する。内科医は、このように方法によって虚血初期のステージで損傷の範囲を決定することができる。また、研究用途、例えば、ラット・モデルにおける損傷の範囲を検出するためにこの方法を使用してもよい。
【００５５】
抗体は何らかの方法（例えば、蛍光または放射能による標識、あるいは酵素で開裂する基質を用いてその生成物を検出してもよい。）で標識化（ラベリング）してもよい。あるいは、第２の手段（例えば、ＧＡＤＤ３４抗体に対する標識化抗体を患者に導入することによる。）によって検出してもよい。
【００５６】
本発明のこれらまた他の態様は以下、実施例により、また添付図面を参照して説明するが、これらは例示のみを目的とするものである。
【００５７】
図１は、２時間のＭＣＡ閉塞群におけるＧＡＤＤ３４およびＰＣＮＡの免疫組織化学的を示す。主として皮質の梗塞周辺ゾーン（左上）にＧＡＤＤ３４陽性な細胞を見ることができる。ＧＡＤＤ３４　免疫染色が最小となる部位は、対側性（非虚血側）半球（右上）に存在した。ＰＣＮＡ陽性な細胞は同側の皮質および尾状核には検出されなかったが、脳質内側の脳質下領域（左下）に存在した。概略図（右下）は、ＭＣＡ領域の中核部前頭面側において虚血性損傷（影を付けた部分）に関連して、ＧＡＤＤ３４（白丸）およびＰＣＮＡ（黒丸）陽性な細胞パターンを表示したものである。さらに、脳質下領域におけるＰＣＮＡ免疫陽性細胞はＧＡＤＤ３４についても免疫陽性であった。
【００５８】
図２はＭＣＡ閉塞後２時間（白棒；ｎ＝６）および２４時間（黒棒；ｎ＝５）におけるニューロンの核周核部損傷体積を示す。データは平均値＋Ｓ．Ｅ．Ｍ．（平均値の標準誤差）である。
【００５９】
図３は同側半球のＭＣＡ閉塞後の２時間（白棒；ｎ＝６）および２４時間（黒棒；ｎ＝５）におけるＧＡＤＤ３４とＰＣＮＡの免疫陽性細胞の定量データを示す。細胞は、１００ｍｍ２目盛板を使用し、顕微鏡（倍率２０倍）下に計測したものであり、０．２５ｍｍ２あたりの細胞数として表わす。データは平均値＋Ｓ．Ｅ．Ｍ．（平均値の標準誤差）である。脳室内側の上衣下細胞を別にすれば、免疫陽性な細胞の検出量は対側性半球では少なかった。
【００６０】
図４は、ＭＣＡ閉塞群の２４時間後におけるＧＡＤＤ３４およびＰＣＮＡの免疫化学。ＧＡＤＤ３４陽性な細胞は、主として皮質の梗塞周辺部に見られる（左上）。ＧＡＤＤ３４　免疫染色が最小となる部位は、対側性（非虚血側）半球（右上）に存在した。ＰＣＮＡ陽性な細胞は梗塞周辺部に見られ（左下）、さらに同側半球の帯状皮質にまで及んでいた。さらに、ＰＣＮＡ陽性な細胞が、対側性の帯状皮質中および左右両方の脳質下領域に散在していた。概略図（右下）は、ＭＣＡ領域の中核部前頭面側において虚血性損傷（影を付けた部分）に関連して、ＧＡＤＤ３４（白丸）およびＰＣＮＡ（黒丸）陽性な細胞パターンを表示したものである。
【００６１】
図５は、２４時間後に梗塞部領域を共焦点レーザー顕微鏡を使用して走査した結果を示す。
上列：この領域でのほとんどのニューロン（ＮｅｕＮ）はＧＡＤＤ３４陽性である。
下列：この領域のアストロサイト（ＧＦＡＰ）はＧＡＤＤ３４陽性ではない。
【００６２】
図６はＭＣＡ閉塞後２４時間における、同側皮質梗塞周辺部および脳室内側（ＳＶＺ）から得た二重標識蛍光顕微鏡写真である。梗塞周辺部（左上）では、細胞は主として、ＧＡＤＤ３４免疫反応性が増加していること、また、これらの細胞の多くはＰＣＮＡ陽性でもあることを示し、脳質下領域（右上）の上衣下細胞は、核の中の強いＰＣＮＡ免疫反応性を示した。上衣層の最下部細胞質はさらにＧＡＤＤ３４免疫反応性を示す。梗塞周辺部の大多数のＰＣＮＡ陽性細胞（左下）はＭｒｆ−１と重なる位置に局在しており、これは、それらがミクログリアであることを示している。もっとも、この領域のＰＣＮＡ免疫細胞にはＭｒｆ−１陽性でないものも存在する。強いＧＦＡＰ免疫反応性を示すアストロサイト（右下）は、ＰＣＮＡ（赤）と重なる位置に局在して現れることはなかった。
【００６３】
図７は、２４時間後に梗塞部領域を共焦点レーザー顕微鏡を使用して走査した結果を示す。
上列：ＰＣＮＡ陽性な細胞はミクログリアである（Ｍｒｆ−１陽性）。
下列：ＰＣＮＡ陽性な細胞はＧＡＤＤ３４陽性であるが、ＧＡＤＤ３４陽性な細胞の中にはＰＣＮＡ陰性なものもある。
【００６４】
材料および方法
実験操作はすべて動物（科学的処置）法（１９８６）に規定された適当なホームオフィス・ライセンスおよび規則に則って行なった。この研究で使用したスプラギー・ドーレー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）雄ラット（体重：２５０〜３５０ｇ。ハーラン・オラク（Ｈａｒｌａｎ Ｏｌａｃ）社、英国バイセスター（Ｂｉｃｅｓｔｅｒ））は、１２時間の明／暗サイクル、餌と水に常時アクセス可能な条件で飼育したものである。
【００６５】
限極性脳虚血の誘導
中脳動脈（ＭＣＡ）の電気凝固（ジアテルミー療法閉塞）によって、あるいは頸動脈内に管路スレッドを挿入することによってＭＣＡ基部をブロックしてＭＣＡ閉塞を行なった。最初に、５％のハロタンを含む３０％Ｏ２：７０％Ｎ２Ｏ混合物で被験動物を麻酔した。挿管後、動物を機械的に換気したところ、ハロタンレベルは１〜１．５％まで落ちたが麻酔は維持された。直腸プローブを使用して、体温をモニターし、加熱ランプを用いてこれを維持した（３６．８〜３７．２℃）。生理学的なモニタリングを行なうため、麻酔状態および意識のある状態の両者でカニューレを左大腿動脈に挿入した。ラットは麻酔状態において正常圧（平均動脈血圧（ＭＡＢＰ）≒８．０ｍｍＨｇ）、炭酸正常状態（３６＜ＰａＣＯ２＜４４ｍｍＨｇ）および適当な酸素供給状態（ＰＯ２＞１００ｍｍＨｇ）に維持した。レーザー−ドップラー流速計（ＬＤＦ、ムーア・インストゥルメント社（Ｍｏｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｌｔｄ．））を用いて脳血流量を監視し適当な虚血および次いでの再潅流を確認した。局所的な脳血流量が、直ちに基線信号の３５％未満に減少して安定したケース以外は、ＭＣＡの閉塞は不完全なものと見なし、こうした動物は研究から除外した。３５％の閾値は、梗塞部サイズの再現性に関する予備的研究の結果（データは示していない）に基づく。
【００６６】
ＭＣＡのジアテルミー閉塞
頬骨弓上の毛を剃り、頬骨弓の口吻側に直角に１ｃｍの切り口を入れた。側頭筋を縮め、またＭＣＡ閉塞中、脳温度の指標を得るために筋肉内に細いプローブを挿入した（アロノウスキー（Ａｒｏｎｏｗｓｋｉ）ら、１９９４年）。動脈血圧平均値（ＭＡＢＰ）が安定した時点で開頭術を行なった。タムラら（１９８１）に記載された方法を修正して使用し左中脳動脈（ＭＣＡ）を露出させた。簡単に言えば、２ｃｍの皮膚切開部を通じて、側頭筋肉に切り込みを入れ側頭骨の腹側および側頭側で骨膜下を露出させ、視神経孔から口吻側に向けて側頭下窩から卵円孔へと後端側に入った。小規模な側頭下頭蓋骨局部切除術を卵円孔に向けて口吻側３ｍｍのところを中心に行ない、２５ゲージ針を使用して線状切開によって硬膜を開いた。次いで、レンズ核線条体動脈の起点に近位の点からそれが下大脳静脈と交差する遠位の点に向けてＭＣＡ電気凝固によって脳虚血を引き起こした。次いで、ＭＣＡ閉塞が完全に行なわれたかを確認するために嗅索部においてＭＣＡを横断切開した。横断切開の時間はＭＣＡの閉塞の正確な時間としてみなした。次いで、頭蓋骨局部切除術の傷を縫合し、動物を麻酔から回復させた。麻酔後脱水症を防ぐために食塩水２ｍｌを皮下注射で与えた。ハロタンからの回復した後、換気、心拍数およびＭＡＢＰが安定するまで動物を監視した。次いで、動脈カニューレを粘性ヘパリン溶液（５０％ポリビニルピロリドン；２００単位のヘパリン／ｍｌ）で満たし、カニューレ開放を維持してから柔らかい餌および水を与えて一夜かけて動物を回復させた。
【００６７】
管路内スレッド誘導性虚血
コイズミ（Ｋｏｉｚｕｍｉ）ら（１９８６）によって最初に紹介された管路内スレッドモデル（４−０のナイロン・モノフィラメント縫合糸）を変形して用い、限局性（ｆｏｃａｌ）脳虚血を実現した。簡単に言えば、右総頚動脈、内頚動脈および外頚動脈を腹部正中線頸部切開によって露出させた。外頚動脈を結紮し、次に、ちょうど近位から外頚動脈の分岐に向けて切断した。総頚動脈を微小血管用クリップで一時的に閉塞した。４−０ナイロン・モノフィラメントを総頚動脈の分岐部から２０〜２３ｍｍ注意深く挿入し、外部頚動脈を通って内部頚動脈に進ませ、右ＭＣＡの起点を閉鎖した。この地点にフィラメントを残してＭＣＡ領域内で虚血を発生維持するか所定時間（例えば２時間）経過後引き抜いて再潅流させた。次いで、傷を縫合し、動物をジアテルミー療法閉塞の場合と同様な方法で麻酔から回復させた。
【００６８】
虚血モデルの双方について実験が終了し、虚血損傷の後の定義された時間で動物は灌流固定によって死に至った。ほとんどの場合これは虚血処理後２４時間であった。
【００６９】
虚血性損傷組織の処置および組織学的定量化
ラットを神経病理学的および免疫組織化学的に分析するためにＰＡＭ（４％パラホルムアルデヒドＰＢＳ溶液）を用いて灌流固定した。簡単に言えば、ラットは、５％ハロタンを用いて深麻酔し、両側切開部を通じて胸郭を開くことができるように仰臥位の姿勢とした。カテーテルを左心室に挿入し右心房を切開した。また、右心房からの潅水に血液が含まれなくなるまで、ヘパリン添加した食塩水を動物のＭＡＢＰ（９０〜１１０ｍｍＨｇ）と等しい圧力で注入した。食塩水に続けておよそ３００ｍｌのＰＡＭを用いた。灌流固定直後にラットの首を切り落とし、次いで、頭部を少なくとも２４時間固定液中に保存した。脳を取り出した。後脳を分離した後、前脳をショ糖中で凍結防止するか（固定された凍結部位の生成）、アルコールとキシレンによって自動プロセッサー中処理し、次いで固形パラフィンに埋め込んだ。７０％エタノール２時間；８０％エタノール３時間；９６％エタノール４時間；無水エタノール中４、５、５および６時間をそれぞれ４ステージ；キシレン／無水エタノール（５０：５０）４時間；キシレン中各５時間の２ステージ。これらの１０ステージを３５℃で行ない、パラフィンロウ中５時間、５時間および６時間の３ステージを６０℃で続けた。次いで、組織学と免疫組織化学のために５〜７μｍのパラフィン固定片を多数の冠状面レベルでミクロトームを用いて切断した。２０〜３０ｍｍの凍結部位も低温保持装置上で同様に切断した。組織学断片をガラススライド上に載せ、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。虚血性損傷領域（ブリアリー（Ｂｒｉｅｒｌｙ）およびグレアム（Ｇｒａｈａｍ）、１９８４年）をＨ＆Ｅ断片上光顕微鏡使用によって特定し、ＭＣＡ領域（前部１０．５０ｍｍから前部１．０２ｍｍまで。オズボーン（Ｏｓｂｏｒｎｅ）ら、１９８７）全体をあらかじめ選択した８つの冠状面レベルで描画した。脳障害領域は、ケーニッヒ（Ｋｏｎｉｇ）およびクリッペル（Ｋｌｉｐｐｅｌ）の脳アトラス（１９６３）に基づいて前脳部をスケール・ダイアグラム（実寸×３．３６）上に描き、イメージアナライザー（ＭＣＩＤ、Ｍ４、イメージング・リサーチ（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）社、セント・カトリーヌス（Ｓｔ Ｃａｔｈｅｒｉｎ’ｓ）、オンタリオ州）を用いて測定した。次いで、各冠状面レベル間の既知の距離を用いてこれらの領域を統合し、各標本での虚血性損傷部分の体積を決定した。
【００７０】
二重標識免疫蛍光法
ヒストクリアー（Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ）でロウを除去した後、切片を無水アルコール中で２０分かけて脱水し、次いで、１０ｍＭクエン酸（ｐＨ　６．０）に漬けて１０分間高周波加熱し、６０分かけて室温まで冷やし、切片を５０ｍＭリン酸塩バッファーを加えた５％ウシ血清アルブミンおよび１０％の正常なウマ血清を含む食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ　７．２）からなるブロック用溶液を用いてインキュベートした。ＰＣＮＡ（サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）；　ＰＣ１０）に対するマウスモノクローナル抗体をＰＢＳで１：１，０００に希釈し、切片に塗付して４℃で一夜インキュベートした。切片をＰＢＳ（２×）で２０分洗浄した。第２の抗体（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ、１：１００、ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））を切片に塗付し１時間置いた後、再び洗浄を行なった（２×２０分）。ＰＢＳでの洗浄処理を繰り返さした後、切片を５０ｍＭリン酸塩バッファーを加えた５％ウシ血清アルブミンおよび１０％の正常なヤギ血清を含む食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ　７．２）からなるブロック用溶液を用いてインキュベートした。ＧＡＤＤ３４（サンタクルーズ）に対するポリクローナルな抗血清をＰＢＳで１：１００に希釈し、切片に塗付し、４℃で一夜インキュベートした。切片をＰＢＳ（２×）で２０分洗浄した。第２の抗体（フルオレスセイン結合抗ウサギ血清（１：１００，ベクター・ラボラトリーズ）を塗付して１時間置いた。切片をＰＢＳ（２×）と水で再び洗浄した後、切片を浸漬溶液（ベクター）中に装入した。ＧＡＤＤ３４またはＰＣＮＡを含む細胞の種類を分類するために、上記のプロトコルに従い以下の抗体を用いて二重免疫蛍光検査法のために行なった。ニューロンはＮｅｕ−Ｎ（マウスモノクローナルＡｂ、ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ））、アストロサイトはＧＦＡＰ（マウスモノクローナルＡｂ、シグマ）、ミクログリアはＭｒｆ−１（ウサギポリクローナル　Ａｂ、北海道大学Ｓ．タナカ博士より贈られたもの）である。
【００７１】
ＧＡＤＤ３４に対するポリクローナル抗体の生成
一端にＥｃｏＲＩサイトを有し、他端にＳａｌＩサイトを有する１０８塩基から構成されたオリゴヌクレオチド：
ＧＡＤＤ３４　１：
５’　ＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＣＡＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＴＧＣＡＣＧＡＧＡＴＡＧＧＡＧＣＣＧＴＴＴＴＧＣＴＣＧＡＡＧＡＡＴＴＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＴＧＴＡＧ　３’
および
ＧＡＤＤ３４　２：
５’　ＴＣＧＡＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＴＴＣＴＴＣＧＡＧＣＡＡＡＡＣＧＧＣＴＣＣＴＡＴＣＴＣＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＡＧＧＧＡＣＣＡＣＧＴＣＧＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＧＴＣＣＣＡＴＧＧ　３’
をＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ切断ｐＧＥＭ　３ＺＦとともにアニールしライゲートした。
【００７２】
このプラスミドをＮＭ５２２　Ｅ．ｃｏｌｉに導入し、ＤＮＡを抽出しＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩで切断した。インサートをアガロース・ゲル上で分離し、Ｓｐｉｎｎｅｘチューブ遠心分離によって精製した。次いで、インサートをＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ切断ｐＧＥＸ　４Ｔ−３にライゲートしＢＬ２１　Ｅｐｉｃｕｒｅａｎ　Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換した。バクテリア培養物を３７℃で３時間成長させ、ＩＰＴＧ（１μｌ／ｍ１の１００ｍＭ溶液）を用いて３７℃で２時間誘導した。バクテリアを遠沈し、ＰＢＳ中に再懸濁し、プローブを超音波処理してから砕片を遠沈した。上清を室温で４０分間グルタチオン・アガロースビーズと混合した。ビーズを遠沈し、ＰＢＳで３回洗浄した。ＧＳＴ／ＧＡＤＤ３４融合タンパク質を還元されたグルタチオン溶出バッファー（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））で溶出した。抽出を数回行ない各タンパク質を定量した。
【００７３】
４頭のニュージーランド白ウサギそれぞれに２週間間隔で６回、接種物０．５ｍｌ（約１ｍｇのタンパク質）を注入した。５回目の追加刺激（ｂｏｏｓｔ）後、ウサギから血を抜き、ＢＨＫ細胞抽出物に対してウェスタンブロッティングを行なうことによって血清のＧＡＤＤ３４特異性を分析した。４種の抗血清が特定された。これらを１５９、１６０、１６１および１６２と呼ぶ。
【００７４】
免疫組織化学
あらかじめ選択した８枚の冠状面レベルにおける多重切断面を免疫組織化学分析のために処理した。ポリ−Ｌ−リジン（シグマ（ＳＩＧＭＡ））コーティングを施したスライドに切片を載せ、３７℃で一夜乾燥し、次いでロウを除くためにヒストクリア（Ｈｉｓｔｏｃｌｅａｒ）内に２０分間置き、次いで無水アルコール中で２０分間脱水した。次いで、これらを１０ｍＭクエン酸（ｐＨ　６．０）中で１０分間高周波加熱し、６０分間かけて室温まで冷やし、３％Ｈ２Ｏ２メタノール溶液で３０分間、次いで、５０ｍＭリン酸塩バッファーを加えた５％ウシ血清アルブミンおよび１０％の正常ヤギ血清または正常ウマ血清を含む食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ　７．２）を用いてインキュベートした。ＧＡＤＤ３４に対するウサギポリクローナル抗血清（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、１９９７年）およびＰＣＮＡに対するマウスモノクローナル抗体（サンタクルーズ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ）；　ＰＣ１０）をＰＢＳでそれぞれ１：１０００および１：２０，０００に希釈し、切片に塗付し、４℃で一夜インキュベートした。切片をＰＢＳ（２×）で２０分洗浄した。第２の抗体（ビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体およびウマ抗マウス抗体１：１００，ベクター・ラボラトリーズ）を１時間塗付し、切片を２０分ずつ２回再び洗浄した。アビジン／ビオチン化ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣキット，ベクター・ラボラトリーズ）を１時間塗付した。ＰＢＳによる洗浄プロセスを繰り返し、次いで、切片をＧＡＤＤ３４用には３，３’−ジアミノベンジジン溶液（ベクター・ラボラトリーズ）で３分間、ＰＣＮＡ用にはＳＧ溶液（ベクター・ラボラトリーズ）で３分間現像した。最後に、切片を脱水して取り出し、光顕微鏡使用分析のために装着した。ＧＡＤＤ３４およびＰＣＮＡ抗体用ノネガティブコントロール（第１抗体に関する処理を省略）もプロトコルに含めたが、これは染色検知量が最小だった。さらに詳しい分析はすべて盲験で、すなわち、各切片がどういうものかを知らない研究者によって行なった。
【００７５】
尾状核の冠状面レベルにおいて、虚血中核部および梗塞周辺ゾーン内の顕微鏡視野（１００ｍｍ２グリッド；倍率２００倍）内におけるＧＡＤＤ３４とＰＣＮＡに対して免疫陽性な細胞を計数した。
【００７６】
結果
非虚血組織中でのＧＡＤＤ３４およびＰＣＮＡの発現
擬似操作した動物において、虚血損傷に対して対側半球のＭＣＡ領域では、ＭＣＡの閉塞後２時間ではＧＡＤＤ３４またはＰＣＮＡ免疫陽性な細胞染色を示す証拠はなかった（図１右上）。しかし、ＰＣＮＡ免疫陽性な細胞は、両側において脳室内側の上衣層中に一貫して観察された（図１右下）。二重標識による研究では、これらの細胞はＧＡＤＤ３４を共発現していることが見出された（図６右上）。
【００７７】
限極性虚血後のＧＡＤＤ３４とＰＣＮＡの発現
前頭皮質、背側頭頂葉皮質および尾状核を含む同側ＭＣＡ領域においては虚血性損傷が一貫して見られ、この損傷は時間とともに前頭頭頂葉皮質内に拡大した。ニューロンの周核体は、虚血性損傷の特有の形態的特徴（つまり核および細胞質の収縮、三角化）を示し、細胞質の好酸球増加を増加させた。正常なニューロンの周核体と虚血による細胞変化との間の顕著な遷移は識別可能で、スケールダイアグラム上に転写した。
【００７８】
ｉ．限極性脳虚血２時間後
ＭＣＡ閉塞２時間後に犠牲にした動物において、虚血性損傷は同側の脳皮質および尾状核に局在しており（図１右下）、その体積は合計で４８．４±８．３ｍｍ３であった（図２）。
【００７９】
ＧＡＤＤ３４免疫陽性細胞は、すべての動物の同側皮質および尾状核中に存在した。細胞（ニューロンの形態を示し、主として梗塞周辺領域の同側皮質のニューロン層（特に軟膜表面に隣接しているもの）に分布するもの）（図１左上）。ＧＡＤＤ３４免疫陽性細胞は、梗塞周辺領域におけるよりも少ないが、不可逆的に損傷を受けた虚血中核部中にも存在した（図１右下、図３左上）。
【００８０】
ＰＣＮＡ免疫陽性細胞は、この時点では、虚血性中華部および梗塞周辺領域のいずれにも一貫して検出されなかった（図３左下）。
【００８１】
ｉｉ．限極性脳虚血２４時間後
ＭＣＡ閉塞２４時間後に犠牲にした動物において、虚血性損傷は同側の脳皮質および尾状核に局在しており（図１右下）、その体積は合計で１５４±１３．２ｍｍ３であった（図２）。
【００８２】
ＧＡＤＤ３４免疫陽性細胞は、主として梗塞周辺領域の同側皮質のニューロン層（特に軟膜表面に隣接しているもの）に分布し、ほとんどの細胞は正常なニューロンの形態を示した（図４左上）。さらに、少数のＧＡ−ＤＤ３４免疫陽性細胞が、不可逆的に損傷を受けた虚血中核部中にも存在した（図４右上および右下）。
【００８３】
梗塞周辺ゾーンで、ＧＡＤＤ３４は主としてＮｅｕＮとともに定位され、このタンパク質がニューロンで発現していることが確認された。共焦点顕微鏡を用い核染色により、いくつかの細胞ではＧＡＤＤ３４が細胞質内に定位された（図６左上、図７下列中央の図）。ＧＡＤＤ３４はＭｒｆ−１とともに定位されたが、ＧＡ−ＤＤ３４を発現するミクログリアもあったが、アストロサイトはこの時点ではこのタンパク質を発現しないことを確認した（図５下列）。二重標識免疫蛍光検査法により、梗塞周辺ゾーン中ニューロンの形態を示すいくつかの細胞中ではＧＡＤＤ３４とＰＣＮＡの免疫反応性が同時に定位された。ＰＣＮＡは核に集中していたが、ＧＡＤＤ３４染色部位は細胞質／核に存在していることが明らかになった（図６左上）。さらに、ＧＡＤＤ３４とＰＣＮＡの同時定位部位は、脳質下領域の上衣細胞中にも存在した（図６右上）。
【００８４】
ＰＣＮＡ免疫陽性細胞は、ＭＣＡＯ２時間後と比較して２４時間後でより広範囲に分布していた（図３右下および図４下列）。ＰＣＮＡ陽性細胞の大半は、皮質、脳梁および尾状核を含む同側の梗塞周辺領域に分布していた（図４左下）。上記載のように、ニューロンの形態を備えたいくつかの細胞はＰＣＮＡ陽性であったがＰＣＮＡ陽性細胞の大多数はミクログリア（つまり、Ｍｒｆ−１陽性、図６左下、図７上列）だった。ＰＣＮＡ陽性ミクログリアは、同側および対側半球の帯状皮質中でも観察された（図４右下）。梗塞周辺領域のアストロサイトはＰＣＮＡを発現しなかった（図６右下）。
【００８５】
下記の表１は、ＭＣＡ閉塞２４時間後でのＧＡＤＤ３４およびＰＣＮＡ免疫反応性細胞の定位結果をまとめたものである。
【表１】
2004506653.tif 000002
【００８６】
考察
ＧＡＤＤ３４およびＰＣＮＡタンパク質の発現は、限極性ラットの脳虚血モデルにおいて同定されている。ＭＣＡ閉塞２時間後に、相当数のＧＡＤＤ３４免疫陽性細胞が虚血性損傷の中核部を囲む梗塞周辺ゾーン（周辺部）で観察された。また、中核領域内にも免疫陽性細胞が散在していた。虚血損傷直後、脳内タンパク質の合成は著しく抑制されるが、特異的なストレス誘導性タンパク質（例えば熱衝撃タンパク質）が発現することが知られている（コグレおよびカトウ、１９９３年；シャープ（Ｓｈａｒｐ）、２０００年）。この特定の遺伝子発現のアップレギュレーションは、細胞存続、修理または細胞死に不可欠なものであろう。ＧＡＤＤ３４は虚血ストレスに応じて、特に不可逆的損傷領域と潜在的に可逆的な損傷領域との境界ゾーンの細胞中で生産され、これらの細胞の運命に影響を及ぼすことにおいて重要な役割を果たす。虚血の最初の数時間においてＧＡＤＤ３４タンパク質が合成されることを示す証拠は、脳全体の虚血に対応したＧＡＤＤ３４　ｍＲＮＡの転写を報告する従来の研究成果（ドウテヒル（Ｄｏｕｔｅｈｉｌ）、１９９９年）とも矛盾しない。
【００８７】
組織学的に正常な組織と付加逆的な損傷を受けた組織との間の境界面は、損傷後２時間でも未だ前進しているため、梗塞周辺ゾーンのほとんどの細胞は死亡過程にあり、その多くは２４時間以内に不可逆損傷を受ける。このゾーン内の細胞のいくつかでは、ＧＡＤＤ３４はＰＣＮＡと同じ場所に定位される。このＰＣＮＡと同じ場所に定位されるＧＡＤＤ３４陽性細胞の増加は、この段階では、ＧＡＤＤ３４がＤＮＡの修復と増殖プロセスにおいて機能し、さらなる組織の損失を抑えていることを示唆する。本発明者は以前に次のことを示した、ＧＡＤＤ３４およびＨＳＶ　ＩＣＰ３４．５に保存された６３個のアミノ酸領域が、インビトロで特異的にＰＣＮＡと複合体を形成する（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら、１９９７年）。したがって、利用可能なデータによれば、ＰＣＮＡと独立にせよＰＣＮＡとの相互作用においてにせよ、ＧＡＤＤ３４がＤＮＡ応答を継続可能にすることにより細胞存続に役割を果たすことを示唆している。
【００８８】
ＰＣＮＡは、梗塞周辺ゾーンでのニューロンのみならず、同側の脳半球の隣接した帯状皮質および対側性の帯状皮質中でも観察された。また、ＰＣＮＡは通常、細胞周期のＳ期中において合成されるが、静止期細胞では極めて低濃度存在する（ミヤチら、１９７８年）。ミクログリア応答因子−１を用いた二重標識免疫蛍光検査法は、梗塞周辺ゾーン、同側半球の帯状皮質および対側半球の帯状皮質中のほとんどのＰＣＮＡ免疫反応性細胞が、ミクログリアであることを示している。ＧＦＡＰ陽性なアストロサイトはＰＣＮＡ陽性染色を示さなかった。この結果は細胞分裂の大部分を構成する細胞がミクログリアであることを示すノートン（Ｎｏｒｔｏｎ）（１９９９）による報告と一致する。
【００８９】
限極性虚血に際しては、酸素の減少およびアデノシン一燐酸の増加に敏感なタンパク質キナーゼＲによって真核生物の翻訳開始因子２α（ｅＩＦ２α）がリン酸化されるので、タンパク質合成は完全に抑えることができる（シュリヴァスタヴァ（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ）ら、１９９８年）。虚血によって誘導されたｅＩＦ２αのリン酸化は傷つきやすいニューロンにおけるタンパク質合成の阻害およびこれに続くアポトーシスの主たる原因であると考えられている（デグラシア（ＤｅＧｒａｃｉａ）、１９９７年）。また、ｅＩＦ２αの脱ホスホリル化は、ニューロンの正常なタンパク質合成への復帰および損傷したニューロンの保護における決定的なステップである（サリヴァン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）ら、１９９９年）。ＧＡＤＤ３４のＣ−末端の６３個のアミノ酸は、ホスファターゼ１α（ＰＰ１α）と相互作用して、真核生物の翻訳開始要因２ａ（ｅＩＦ２Ｑ）サブユニットを活発に脱ホスホリル化してタンパク質合成を阻害し、ストレスによって引き起こされた遺伝子発現を阻害を不可能にする（シーク（Ｓｈｅｉｋｈ）およびフォルナス（Ｆｏｒｎａｃｅ）、１９９９年；ノヴォア（Ｎｏｖｏａ）ら、２００１年）。梗塞周辺領域における細胞が高い比率でＧＡＤＤ３４を発現するという事実は、ｅＩＦ２αを脱ホスホリル化し、よってタンパク質合成阻害を排除するために、このタンパク質が合成されていることを示唆する。
【００９０】
要約して言えば、梗塞周辺領域では虚血損傷に応じてＧＡＤＤ３４とＰＣＮＡがアップレギュレートされているという証拠が得られた。虚血の急性ステージでは、ＧＡＤＤ３４が、細胞の死あるいは存続の制御に関与しているように見える。また、本発明の結果からは、虚血誘導後、時間が経過すると、ＧＡＤＤ３４はそれ自身であるいはＰＣＮＡとの相互作用を介して、ＤＮＡ増幅および必須タンパク質の発現を促進することにより、細胞存続に役割を果たすことを示唆している。
【００９１】
参考文献
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【０１１３】
【配列表】
2004506653.tif 000003
2004506653.tif 000004
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、２時間のＭＣＡ閉塞群におけるＧＡＤＤ３４およびＰＣＮＡの免疫組織化学的分析結果を示す分布図。
【図２】図２は、ＭＣＡ閉塞後２時間（白棒；ｎ＝６）および２４時間（黒棒；ｎ＝５）経過時におけるニューロンの核周核部損傷体積を示すグラフ。
【図３】図３は、同側半球のＭＣＡ閉塞後２時間（白棒；ｎ＝６）および２４時間（黒棒；ｎ＝５）経過時におけるＧＡＤＤ３４とＰＣＮＡの免疫陽性細胞の定量データを示すグラフ。
【図４】図４は、ＭＣＡ閉塞群の２４時間後におけるＧＡＤＤ３４およびＰＣＮＡの免疫化学分析結果を示す分布図。
【図５】図５は、２４時間後に梗塞部領域を共焦点レーザー顕微鏡を使用して走査した結果を示す図である。
【図６】図６は、ＭＣＡ閉塞２４時間後における、同側皮質梗塞周辺部および脳室内側（ＳＶＺ）から得た二重標識蛍光顕微鏡写真である。
【図７】図７は、２４時間後に梗塞部領域を共焦点レーザー顕微鏡を使用して走査した結果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004506653.tif 000058
【国際調査報告】
2004506653.tif 000059
2004506653.tif 000060
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2004506653.tif 000064