(57)【要約】本発明はウシ上皮成長因子（ｂＥＧＦ）をコードするヌクレオチド配列並びにコードされるタンパク質の推定されるアミノ酸配列を提供している。更に本発明は成熟ｂＥＧＦのヌクレオチド配列及び推定される成熟ｂＥＧＦタンパク質を提供する。本発明は相同の核酸、タンパク質並びにｂＥＧＦ遺伝子のヌクレオチド配列及びｂＥＧＦタンパク質のそれぞれに対して機能的に等価な断片にまで拡張される。ウシＥＧＦは微生物、例えばＥ．コリ又はＰ．パストリス及び植物宿主、例えばポテトで発現させることができる。組み換えｂＥＧＦの活性は細胞増殖／ＤＮＡ合成アッセイを使用して確認できる。ウシＥＧＦは家畜飼料中のサプリメントとして家畜及び酪農生産において、成長を促進するため、腸内感染症を予防又は治療するため、適当な種類の消化酵素を分泌するように腸管細胞の早熟を刺激するため、及び栄養吸収を増大させるために利用されることを証明する。
2004536589.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ上皮成長因子のためのポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項２】
コードされたポリペプチドが
ａ）配列番号９に記載されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列；及び
ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも５５％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載の単離された核酸。
【請求項３】
コードされたポリペプチドが、配列番号９に示されるアミノ酸配列又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも６０％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項２記載の単離された核酸。
【請求項４】
コードされたポリペプチドが、配列番号９に示されるアミノ酸配列又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも６５％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項３記載の単離された核酸。
【請求項５】
コードされたポリペプチドが、配列番号９に示されるアミノ酸配列又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項４記載の単離された核酸。
【請求項６】
コードされたポリペプチドが、配列番号９に示されるアミノ酸配列又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも７５％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項５記載の単離された核酸。
【請求項７】
コードされたポリペプチドが、配列番号９に示されるアミノ酸配列又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも８０％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項６記載の単離された核酸。
【請求項８】
コードされたポリペプチドが、配列番号９に示されるアミノ酸配列又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項７記載の単離された核酸。
【請求項９】
コードされたポリペプチドが、配列番号９に示されるアミノ酸配列又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項８記載の単離された核酸。
【請求項１０】
コードされたポリペプチドが、配列番号９に示されるアミノ酸配列又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも９５％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項９記載の単離された核酸。
【請求項１１】
コードされたポリペプチドが、配列番号９に示されるアミノ酸配列又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも９９％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項１０記載の単離された核酸。
【請求項１２】
核酸が
ａ）配列番号８に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１０に示されるヌクレオチド配列及び
ｃ）配列番号８に示されるヌクレオチド配列又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列に少なくとも７５％のホモロジーを有する機能的に等価なヌクレオチド配列
からなる群から選択される、請求項１記載の単離された核酸。
【請求項１３】
核酸が配列番号８又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列に少なくとも８０％のホモロジーを有するヌクレオチド配列を有する、請求項１２記載の単離された核酸。
【請求項１４】
核酸が配列番号８又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列に少なくとも８５％のホモロジーを有するヌクレオチド配列を有する、請求項１３記載の単離された核酸。
【請求項１５】
核酸が配列番号８又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％のホモロジーを有するヌクレオチド配列を有する、請求項１４記載の単離された核酸。
【請求項１６】
核酸が配列番号８又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列に少なくとも９５％のホモロジーを有するヌクレオチド配列を有する、請求項１５記載の単離された核酸。
【請求項１７】
核酸が配列番号８又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列に少なくとも９９％のホモロジーを有するヌクレオチド配列を有する、請求項１６記載の単離された核酸。
【請求項１８】
ウシ上皮成長因子のためのポリペプチドをコードする単離された核酸の断片であって、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列と機能的に等価なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸の断片。
【請求項１９】
ウシ上皮成長因子のための単離されたポリペプチドの断片であって、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と機能的に等価なポリペプチドを含む、単離されたポリペプチドの断片。
【請求項２０】
適当な宿主細胞中でウシ上皮成長因子の発現をもたらしうる発現構築物であって、宿主細胞に適合された調節配列に機能的に結合された請求項１から１７までのいずれか１項記載の核酸配列を含む、発現構築物。
【請求項２１】
請求項１から１７までのいずれか１項記載の核酸を含むベクター。
【請求項２２】
請求項１から１７までのいずれか１項記載の核酸を有し、細胞が該核酸によってコードされるウシ上皮成長因子のためのポリペプチドを発現しうる宿主細胞。
【請求項２３】
細胞がアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フィクーム、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・オリザエ、トリコデルマ・レエサイ、ムコール・ミエヘイ、クルイベロマイセス・ラクティク、ピチア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、エシェリキア・コリ、バチルス・サチリス又はバチルス・リケニホルミス又は植物細胞から選択される、請求項２２記載の宿主細胞。
【請求項２４】
細胞がエシェリキア・コリである、請求項２３記載の宿主細胞。
【請求項２５】
細胞がピチア・パストリスである、請求項２３記載の宿主細胞。
【請求項２６】
試料添加剤であって、
ａ）請求項１から１７までのいずれか１項記載の核酸によってコードされるウシ上皮成長因子のためのポリペプチド；
ｂ）不活性又は活性の成分と組み合わされた、請求項１から１７までのいずれか１項記載の核酸によってコードされるウシ上皮成長因子のためのポリペプチド；
ｃ）請求項１から１７までのいずれか１項記載の核酸によってコードされるウシ上皮成長因子のためのポリペプチドを発現する微生物又は植物組織；及び
ｄ）請求項１から１７までのいずれか１項記載の核酸によってコードされるウシ上皮成長因子のためのポリペプチドを含有する、微生物又は植物組織から得られる培養培地又は抽出物
からなる群から選択される調製物を含有する試料添加剤。
【請求項２７】
微生物が、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フィクーム、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・オリザエ、トリコデルマ・レエサイ、ムコール・ミエヘイ、クルイベロマイセス・ラクティク、ピチア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、エシェリキア・コリ、バチルス・サチリス又はバチルス・リケニホルミスから選択される、請求項２６記載の試料添加剤。
【請求項２８】
微生物がエシェリキア・コリである、請求項２７記載の試料添加剤。
【請求項２９】
微生物がピチア・パストリスである、請求項２７記載の試料添加剤。
【請求項３０】
ウシ上皮成長因子のポリペプチドと組み合わされた飼料又は請求項１から１１までのいずれか１項記載のウシ上皮成長因子のポリペプチドで処理された飼料を含有する、飼料組成物。
【請求項３１】
ウシ上皮成長因子のポリペプチドが粉末又は液体の形である、請求項３０記載の飼料組成物。
【請求項３２】
飼料がトウモロコシ、穀類、モロコシ、小麦、大麦、オート麦、植物性タンパク質ミール、牧草、干し草、緑蔵飼料及びトウモロコシ飼料から選択される、請求項３１記載の飼料組成物。
【請求項３３】
ウシ上皮成長因子活性を有するポリペプチドを製造するための方法において、
ａ）請求項１から１７までのいずれか１項記載の核酸を有する宿主細胞を、核酸によってコードされるポリペプチドの発現に構成的な条件下に培養し、かつ
ｂ）コードされるポリペプチドを、宿主細胞、宿主細胞を含有する培養培地又は宿主細胞から得られる抽出物から回収するウシ上皮成長因子活性を有するポリペプチドを製造するための方法。
【請求項３４】
宿主細胞がアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フィクーム、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・オリザエ、トリコデルマ・レエサイ、ムコール・ミエヘイ、クルイベロマイセス・ラクティク、ピチア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、エシェリキア・コリ、バチルス・サチリス又はバチルス・リケニホルミス又は植物細胞から選択される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
宿主細胞がエシェリキア・コリである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
宿主細胞がピチア・パストリスである、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
核酸が植物細胞のゲノムに組み込まれるように核酸を植物細胞に導入することによって、請求項１から１７までのいずれか１項記載の核酸を発現する植物を製造するための方法。
【請求項３８】
植物がキャノーラ、大豆、トウモロコシ及びポテトから選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
動物の成長を改善するために動物に投与するためのウシ上皮成長因子のためのポリペプチドの使用。
【請求項４０】
ポリペプチドが請求項１から１１までのいずれか１項記載のポリペプチドから選択される、請求項３９記載の使用。
【請求項４１】
動物がブタ、仔ブタ、ウシ、仔ウシ、ヤギ、仔ヤギ、ヒツジ及び仔ヒツジから選択される、請求項４０記載の使用。
【請求項４２】
動物がウシ又は仔ウシである、請求項４１記載の使用。
【請求項４３】
動物の腸内感染症を予防及び治療するために動物に投与するためのウシ上皮成長因子のためのポリペプチドの使用。
【請求項４４】
ポリペプチドが請求項１から１１までのいずれか１項記載のポリペプチドから選択される、請求項４３記載の使用。
【請求項４５】
動物がブタ、仔ブタ、ウシ、仔ウシ、ヤギ、仔ヤギ、ヒツジ及び仔ヒツジから選択される、請求項４４記載の使用。
【請求項４６】
動物がウシ又は仔ウシである、請求項４５記載の使用。
【請求項４７】
感染症が白痢、腸病原性大腸菌感染症及びランブル鞭毛虫症から選択される、請求項４５記載の使用。
【請求項４８】
腸病原性大腸菌感染症が腸内大腸菌病である、請求項４７記載の使用。
【請求項４９】
動物が仔ウシである、請求項４８記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウシ上皮成長因子の核酸及びタンパク質配列に関する。
【０００２】
背景技術
近年では、非常に激しい市場及び環境的考慮が研究者に家畜及び酪農生産の効率を改善する技術の発展を奨励している。しかしながら動物福祉問題及び食料生産の非常に広範な認識は、効率における更なる改善が動物の衛生及び健康を危険にさらすことなく達成すべきであることを示している。多くの動物系における最近の発見は、上皮成長因子（ＥＧＦ）を家畜及び酪農生産において試料添加剤として使用して、腸管細胞の早熟を刺激し、適当な種類の消化酵素を分泌させ、栄養吸収を高め、かつ腸内感染症を予防又は治療することを可能にしている。
【０００３】
約１２００アミノ酸の前駆タンパク質から誘導されて、ＥＧＦは５３アミノ酸から構成される６ｋＤａのポリペプチドである（カーペンターとコーエン（Carpenter and Cohen）, 1979）。該ポリペプチドは唾液、腸内分泌物及び他の体液中に天然に存在し、かつ初乳及び乳汁中で大量に生産される（ドノヴァンとオードル（Donovan and Odle）, 1994）。ＥＦＧはヒト胎児の胃の成長及び成熟を刺激する。殆どの種の初乳における高いＥＧＦ濃度並びに腸管内のＥＧＦ受容体の存在のため、ＥＧＦ（及び他の成長因子）は出生初期の胃腸管発育に寄与するとも提唱されている（ドノヴァンとオードル, 1994）。
【０００４】
ＥＧＦは栄養吸収の調節に関与することがある。齧歯動物においてＥＧＦは電解質、グルコース及びプロリンの空腸の刷子縁膜を介する輸送を増大する。仔ブタにおいて、ＥＧＦは、スクラーゼとマルターゼの両者の活性をラクターゼ及びアルカリ性ホスファターゼ活性に及ぼすいかなる顕著な効果なくして促進することによって腸管細胞機能の成熟を促進する（ウィルソン（Wilson）他による国際出願第８８／０４１８０号パンフレット）。成長促進のための試料添加剤としてのＥＧＦの使用はこのように有利である。
【０００５】
腸内大腸菌病又は白痢は病原性大腸菌によって引き起こされる細菌性感染症である。新生家畜及び若い家畜に共通して、白痢は農業経済に相当の衝撃を及ぼす。狭い領域における若い動物の過密状態は通常、白痢の発生をもたらし、これは下痢、脱水症状及び最終的な死によって特徴付けられる。代用乳が与えられる乳牛は、７５％までの感染による罹患率で牛乳を与えられた牛よりもより白痢に感受性である。
【０００６】
白痢のためのワクチンは最近では不足しているので、効果的な治療、例えばＥＧＦが望まれている。ＥＧＦの供給はロタウイルスに感染した仔ブタの腸内感染症を改善する（ジルストラ他（Zijlstra et al.）, 1994）。更に経口でのＥＧＦ投与はウサギにおける腸内感染症率を低減し、かつ感染により引き起こされる体重低下を抑える（ブレット他、１９９７）。ブレット他（Buret et al.）による米国特許第５，７５３，６２２号は、白痢及び他の病原性感染症の治療法並びにＥＧＦを経口で又は直接的に動物試料中で投与することによる体重増加のための方法を開示している。これらの従来の研究のほとんどにおいて、受容個体とは異なる種からのＥＧＦが使用されるが、原則的に同種のＥＧＦが不所望の副作用を回避するには有利である。酪農生産又は肉牛生産での使用のために、こうしてウシＥＧＦ（ｂＥＧＦ）を使用することが有利である。
【０００７】
試料添加剤又はサプリメントは生産者によって広範に適合されることが経済的である。
【０００８】
分子生物学及び組み換えＤＮＡ技術の進歩のため、調査用、治療用及び工業的使用のための多量の外来タンパク質が効率的に生産される。
【０００９】
所望のタンパク質をコードする遺伝子を、生産のために非実用的な生物から微生物系、植物系又は動物発現系に、その増殖及び遺伝子操作の簡易さのゆえに異種タンパク質の発現のために最も通常使用される微生物を用いて移入できる。ヒトＥＧＦは酵母中で４０ｎｇ／ｍｇタンパク質の割合で発現されているが（バール他（Barr et al.）による米国特許第５，０９６，８２５号）、一方でマウスＥＧＦは酵母のピチア・パストリス（Pichia pastoris）中で４５０μｇ／ｍｌ培地の割合で生産されている（クラレ他（Clare et al.）, 1991）。
【００１０】
成熟ＥＧＦタンパク質をコードする相補ＤＮＡ配列は既にマウス、ラット、ブタ、ウマ及びヒトからクローニングされている（グレイ他（Gray et al.）, 1983、シンプソン他（Simpson et al.）, 1985、キム他（Kim et al.）, 2001、スチュワート他（Stewart et al.）, 1994、ベル他（Bell et al.）, 1986）。推定されるアミノ酸配列は、主要な構造残基の厳密な保存を伴って、特に３個のグリシン（残基１８、３６及び３９）、６個のシステイン（残基６、１４、２０、３１、３３及び４２）及びチロシン３７の保存を伴って互いに５５％〜８５％の同一性を示している。
【００１１】
他の残基の変異は、恐らく抗血清及び核酸プローブで観察される種間の非常に低い交差反応性の説明となる。前駆体タンパク質をコードするｃＤＮＡはヒト、ブタ及びマウスからクローニングされている。
【００１２】
成熟ＥＧＦタンパク質をコードするｃＤＮＡは既に前記のような種々の起源からクローニングされているが、成熟ＥＧＦタンパク質をコードするＤＮＡ配列は今までウシ起源からは得られていなかった。しかしながら、ｂＥＧＦは、成長促進、腸内感染症の予防又は治療、栄養吸収の増加並びに未熟な腸管細胞の発育促進によって乳牛製品及び肉牛生産の役に立つことが考えられる。
【００１３】
かかる商業的な応用の可能性のために、ウシ起源からのＥＧＦの使用自体は、動物衛生及び健康を害しうる不所望な副作用を回避することが望まれている。こうして、成熟ｂＥＧＦタンパク質をコードするＤＮＡ配列を得る必要があり、かつ組み換え系で効果的にｂＥＧＦを生産する必要がある。
【００１４】
一般にヒトの配列及びウシの配列の間のホモロジーは、ヒトのプローブ又はプライマーを使用することで相応のｂＥＧＦのＤＮＡ配列を得ることを可能にする。しかしながらｂＥＧＦのＤＮＡのための配列及びタンパク質配列は他の種のそれらとは極めて異なり、そのことはｂＥＧＦのＤＮＡ配列をクローニングすることを試みるにあたっての初期の困難性を説明し、かつこの配列が、かかる発明の多くの有望な商業的利用があるにもかかわらず依然としてクローニングに成功していないことの所以を説明している。
【００１５】
発明の開示
本発明はウシ上皮成長因子（ｂＥＧＦ）をコードするＤＮＡ配列並びにコードされるタンパク質の配列を提供している。ｂＥＧＦ遺伝子の一部のＤＮＡ配列並びにコードされるｂＥＧＦタンパク質の推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号８及び９に示す。成熟ｂＥＧＦタンパク質のためのＤＮＡ配列並びに成熟ｂＥＧＦタンパク質の推定されるアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１０及び１１に規定する。
【００１６】
このように本発明は広範に、ｂＥＧＦのためのポリペプチドをコードする単離された核酸を提供し、その際、コードされるポリペプチドは
ａ）配列番号９に示されるアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列及び
ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも５５％、より有利には少なくとも６０％、より有利には少なくとも６５％、より有利には少なくとも７０％、より有利には少なくとも７５％、より有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも８５％、より有利には少なくとも９０％、より有利には少なくとも９５％、より有利には９９％のホモロジーを有する機能的等価なアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
本発明はウシ上皮成長因子のための単離されたポリペプチドの断片にまで拡張され、その際、該断片は配列番号１１に示されるアミノ酸配列と機能的等価なポリペプチドを含む。
【００１８】
本発明のもう一つの範囲においては、ｂＥＧＦのためのポリペプチドをコードする単離された核酸を提供し、その際、該核酸は
ａ）配列番号８に示されるヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１０に示されるヌクレオチド配列並びに
ｃ）配列番号８に示されるヌクレオチド配列又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％、より有利には少なくとも８０％、より有利には少なくとも８５％、より有利には少なくとも９０％、より有利には少なくとも９５％、より有利には少なくとも９９％のホモロジーを有する機能的等価なヌクレオチド配列
から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
本発明はｂＥＧＦのためのポリペプチドをコードする単離された核酸の断片にまで拡張され、その際、該断片は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列と機能的等価なヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
もう一つの広範な範囲において、本発明はｂＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター及び細胞並びにコードされるポリペプチドを生産するための方法を提供している。
【００２１】
本発明は、適当な宿主中でｂＥＧＦの直接的な発現を可能にする調節配列と機能的に結合された、ｂＥＧＦをコードする核酸を構成する発現構築物にまで拡張される。
【００２２】
更に本発明は、ｂＥＧＦポリペプチドをコードするＤＮＡで形質転換され、かつ該ＤＮＡを発現する宿主細胞並びにかかる形質転換された宿主細胞を製造する方法にまで拡張される。
【００２３】
更に本発明はｂＥＧＦポリペプチド又はその断片に対して作成されたモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体にまで拡張される。
【００２４】
ｂＥＧＦポリペプチド又はその機能的等価な断片は家畜及び酪農生産において家畜飼料におけるサプリメントとして、成長促進、腸内感染症、特に腸病原性大腸菌感染症、例えば腸内大腸菌病、ランブル鞭毛虫病及び白痢の予防又は治療、栄養吸収の増加並びに腸管細胞の早熟の刺激による適当な種類の消化酵素の分泌のために使用できる。
【００２５】
もう一つの広範な範囲において、本発明は、ｂＥＧＦポリペプチドの投与による、動物の成長の改善のための方法並びに動物の腸内感染症の予防及び治療のための方法を提供している。こうして本発明は
ａ）核酸によってコードされるｂＥＧＦのためのポリペプチド、
ｂ）核酸によってコードされるｂＥＧＦのためのポリペプチド（該ｂＥＧＦのためのポリペプチドは不活性又は活性な成分と組み合わされる）、
ｃ）微生物又は植物組織（該微生物又は植物組織は核酸によってコードされるｂＥＧＦのためのポリペプチドを発現する）並びに
ｄ）培養培地又は微生物又は植物組織から得られる抽出物（該培養培地又は抽出物は核酸によってコードされるｂＥＧＦのためのポリペプチドを含有する）
から選択される調製物を含む試料添加剤を提供している。
【００２６】
更にもう一つの広範な範囲において、本発明はｂＥＧＦのための核酸によってコードされるｂＥＧＦと組み合わされた又はそれによって処理された飼料を含む飼料組成物を提供している。
【００２７】
本願で使用される場合に、以下に述べられる用語及び言い回しは以下の定義を有する。
【００２８】
「抗体」はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む。
【００２９】
"ウシ"とは亜種のウシの種を呼称し、これはバイソン・バイソン（Bison bison）（バイソン、バッファロー）、バイソン・ボナサス（Bison bonasus）（ヨーロッパバイソン又はヤギュウ）、ボス・フロンタリス（Bos frontalis）（ガヤル）、ボス・インディカス（Bos indicus）（コブウシ）、ボス・タウルス（Bos taurus）（家畜ウシ）、ボセラファス・トラゴカメラス（Boselaphus tragocamelus）、ブバルス・ブバリス（Bubalus bubalis）（スイギュウ）、シンセラス・カーファー（Syncerus caffer）（アメリカンバッファロー、アフリカスイギュウ）、タウロトラガス・ダービアナス（Taurotragus derbianus）、タウロトラガス・オリクス（Taurotragus oryx）（通常のレイヨウ）、トラゲラファス・アンガシイ（Tragelaphus angasii）（ニアラ）、トラゲラファス・オイリセラス（Tragelaphus eurycerus）、トラゲラファス・イムベルベス（Tragelaphus imberbes）（レッサークーズー）、トラゲラファス・スクリプタス（Tragelaphus scriptus）（ブッシュバック）、トラゲラファス・スペキイ（Tragelaphus spekii）（シタツンガ）、トラゲラファス・ストレプシセロス（Tragelaphus strepsiceros）（クーズー）を含む。
【００３０】
「環状化」は直鎖状ＤＮＡの末端の整合及びそのライゲーション共有結合により閉鎖された環状分子又は「環状ＤＮＡ」を形成させることを意味する。「コーディング配列」はタンパク質のアミノ酸配列又は機能的ＲＮＡ、例えばｔＲＮＡ又はｒＲＮＡをコードする遺伝子の部分を意味する。
【００３１】
「相補」又は「相補配列」は、ワトソン−クリック塩基対則に従って、別のヌクレオチドの配列と水素結合されたデュプレックスを形成するヌクレオチドの配列を意味する。例えば５′−ＡＡＧＧＣＴ−３′のための相補塩基配列は３′−ＴＴＣＣＧＡ−５′である。
【００３２】
「慣用のポリメラーゼ連鎖反応」は、ターゲットＤＮＡ断片を、プライマーをＤＮＡの反対の鎖にハイブリダイズするように設計し、かつ伸長が２つのプライマーに渡って内側で進行するようにして指数的に増幅させる技術を意味する。
【００３３】
「縮重の」又は「縮重」は、１つより多くのコドンが特定のアミノ酸を規定しうる遺伝子コードの特性を意味する。
【００３４】
「下流」はＤＮＡ又はＲＮＡの任意の部位の３′側を意味する。
【００３５】
「腸内大腸菌病」は腸内毒性（毒素産生）大腸菌株によって引き起こされる感染症を意味する。該大腸菌株は小腸の表面に付着し、大量に増殖し、かつ臨床的な下痢、脱水症状及び高い致死率に導く重度の消化変容を引き起こす腸内毒素を分泌する。
【００３６】
「腸内病原性」は腸管に疾患を生ずる傾向を意味する。
【００３７】
「エキソン」はタンパク質の特異的ドメインをコードする真核性遺伝子のセグメントを意味する。
【００３８】
「発現」は、ある遺伝子が構造ＲＮＡ（ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）又はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、引き続きタンパク質に翻訳されることを意味する。
【００３９】
ｂＥＧＦに"機能的等価"であるアミノ酸配列は１つ以上のアミノ酸置換、アミノ酸の付加及び／又は欠失によって改変されているか又は１つ以上のアミノ酸が化学的に改変されているが、それにもかかわらずｂＥＧＦの活性を保持しているアミノ酸配列である。「機能的等価」なヌクレオチド配列は、実質的にｂＥＧＦと同じ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする配列である。
【００４０】
「ランブル鞭毛虫症」は鞭毛性原生動物（ギアリダ属）による外寄生又は該動物によって引き起こされるしばしば下痢を特徴とする疾患を意味する。
【００４１】
２つの核酸配列は、これらの配列が別の生物から由来する場合には、かかる生物が異なる種であろうとなかろうと、配列が同一の生物中で同じ配置で一緒に天然に存在しない限りは互いに「異種」である。
【００４２】
２つのポリヌクレオチド又はポリペプチドは、該ヌクレオチドの配列又はアミノ酸残基がそれぞれ２つの配列において前記のような最大の一致のために整列された場合に同じであれば「相同」又は「同一」である。２つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチドの間の配列比較は、一般に２つの配列の一部を比較ウインドウにわたって比較し、局所領域の配列類似性を同定及び比較することによって実施される。比較ウインドウは一般に約２０〜２００の隣接ヌクレオチド又は隣接アミノ酸残基である。ポリヌクレオチド及びポリペプチドについての「配列同一性のパーセンテージ」又は「配列ホモロジーのパーセンテージ」は、２つの最適に整列された配列を比較ウインドウにわたって比較することによって測定でき、その際、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド又はポリペプチドの部分は２つの配列の最適な整列のために参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して付加又は欠失（すなわちギャップ）を含みうる。パーセンテージは（ａ）同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を測定し、マッチした位置の数を取得し、（ｂ）マッチした位置の数を比較ウインドウにおける位置の全数で除算し、かつ（ｃ）結果に１００を掛けて配列同一性を得ることによって計算される。
【００４３】
比較のための配列の最適な整列は公知のアルゴリズムのコンピュータによる実行又は検査によって実施してよい。市販のソフトウェアと無料のソフトウェアの両方のソースを提供するリストはアウスベル他（Ausubel et al.） (1990)に見られる。容易に入手可能な配列比較及び多重配列アラインメントのアルゴリズムは、それぞれBasic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）（Altschul et al., 1997）及びClustal W プログラムである。他の適当なプログラムはウィスコンシン ジェネティクス ソフトウェア パッケージ（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡを含む。より確実には、本願で使用されるようにアミノ酸配列の「配列同一性のパーセンテージ」又は「配列ホモロジーのパーセンテージ」は、前記のように入手できるＢＬＡＳＴＰプログラムのデフォルト値に従って規定される最適な配列アラインメントに基づいて測定される。
【００４４】
以下により詳細に議論するように、ヌクレオチド配列間のホモロジーはＤＮＡハイブリダイゼーション分析によって測定でき、その際、二本鎖ＤＮＡハイブリッドの安定性は生じる塩基対の含有量に依存する。高い温度及び／又は低い塩含有量の条件は該ハイブリッドの安定性を下げ、かつ選択される度合い未満のホモロジーを有する配列のアニーリングを抑えるように変化させてよい。
【００４５】
「宿主細胞」は動物、植物、酵母、菌類、原生動物及び原核生物の宿主細胞を含む。
【００４６】
「腸内感染症」とは、制限されることなく、腸内病原性大腸菌感染症、例えば腸内大腸菌病、ランブル鞭毛虫症及び白痢を含むと解される。
【００４７】
「イントロン」は遺伝子における介在配列を意味する。イントロンは転写されるが、ｍＲＮＡが翻訳される前に除去される。
【００４８】
「逆ポリメラーゼ連鎖反応」は、ＤＮＡを適当な制限酵素で消化し、環状化させ、かつプライマーを、伸長が外側に進行しかつ産物が公知の配列の上流及び下流の配列を有するように設計することで、公知の配列のコア領域に隣接する未知のＤＮＡ配列を増幅させるために使用される技術を意味する。
【００４９】
「単離された」は自然の状態から「人の手によって」改質されたことを意味する。「単離された」組成物又は物質が天然に存在するのであれば、その本来の環境から変更又は分離されている、又はその両方である。例えば生きている動物中に天然に存在するポリヌクレオチド又はポリペプチドは「単離された」ではないが、その自然の状態の一緒に存在する物質から分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドが、本願で使用される用語としての「単離された」である。
【００５０】
「家畜」とは、例えば乳牛及び肉牛、ブタ、ヤギ及びヒツジを含むと解される。家畜という用語は若い動物及び成体の動物を含むと解される。
【００５１】
"ポリヌクレオチド"又は"核酸"は、１つのヌクレオチドの五炭糖の３′炭素が隣接したヌクレオチドの五炭糖の５′炭素に、リン酸基を介して結合されているデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡにおいては）又はリボヌクレオチド（ＲＮＡにおいては）の直鎖状の配列を意味する。"ポリペプチド"又は"核酸"はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡ又は、二本鎖又は一本鎖であってよく、一本鎖の場合にはコーディング鎖もしくは非コーディング（アンチセンス）鎖であってよいＲＮＡを含んでよい。
【００５２】
「ポリヌクレオチド構築物」は、天然に存在する遺伝子から単離された又は天然には存在しないように組み合わせかつ並べられた核酸のセグメントを有するように改変されている核酸分子を意味する。
【００５３】
２つのＤＮＡ配列は、結合の状態が、互いに関連して配列の正常な機能を果たす能力を妨げない場合に「機能的に結合」されている。例えばプロモーター領域は、プロモーターがそのコーディング配列の転写をもたらすことが可能であれば機能的に結合されている。
【００５４】
「ポリペプチド」はペプチド結合によって結合されているアミノ酸の直鎖状のポリマーを意味する。
【００５５】
「プロモーター」は、一般に８０〜１２０塩基対長であり、ＲＮＡポリメラーゼが結合して正確な転写が開始する遺伝子の開始部位の上流に位置するシスに作用するＤＮＡ配列を意味する。
【００５６】
「組み換え」核酸分子は、例えば組み換えＤＮＡ分子を意味し、２つ以上の非相同ＤＮＡ分子のライゲーションによってインビトロで形成される新規の核酸分子（例えばクローニングサイト又はそのポリリンカーにクローニングされた外来ＤＮＡの１つ以上のインサートを有する組み換えプラスミド）を意味する。
【００５７】
「白痢」は動物における長期の下痢を意味する。
【００５８】
「サイレント変化」は、例えばポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を変更しない変化の包含を意味する。
【００５９】
「形質転換」は、種々の遺伝子型の別の細胞からの精製された組み換えＤＮＡを外部適用し、その吸収及び対象の細胞ゲノムへの組み込みを導くことによる、細胞のゲノムの意図的な改変を意味する。細菌において組み換えＤＮＡは細菌染色体に組み込まれないが、その代わりにプラスミドとして自律的に複製する。
【００６０】
「トランスジェニック」は、外来ＤＮＡが生殖細胞系に導入されている生物を意味する。
【００６１】
「トランスジェニック植物」は有性生殖であろうが無性生殖であろうが、外来ＤＮＡを保持し続ける全ての子孫、雑種及びその異種交配を含み、かつこれはトランスジェニック植物、植物組織及び植物細胞を含むと解される。
【００６２】
「上流」はＤＮＡ又はＲＮＡの任意の部位の５′側を意味する。
【００６３】
遺伝子の「変異体」又は「変異」は同じタンパク質をコードするか又はｂＥＧＦ活性を有する等価のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味する。
【００６４】
タンパク質の「変異体」又は「変異」はｂＥＧＦタンパク質又はその断片の変異体（誘導体又はアナログを含む）を意味する。かかる変異体はアミノ酸配列において任意の組み合わせで存在してよい１つ以上の置換、付加、欠失、融合及び欠損によってｂＥＧＦタンパク質と異なってよい。
【００６５】
「ベクター」は宿主細胞中で自律的に複製可能であり、かつ外来ＤＮＡを受容できる核酸分子を意味する。ベクターは、その自身の複製起点、外来ＤＮＡの挿入のために使用できる制限エンドヌクレアーゼのための１つ以上のユニークな認識部位並びに通常に選択可能なマーカー、例えば抗生物質耐性をコードする遺伝子及びしばしば挿入されたＤＮＡの発現のための認識配列（例えばプロモーター）を有する。
【００６６】
一般的なベクターは、制限されないがファージ、コスミド、バキュウロウイルス、レトロウイルス及びプラスミドベクターを含む。
【００６７】
図面の簡単な説明
図１Ａ及び１Ｂは、ウシＥＧＦの配列をコードするＤＮＡ（配列番号８）の部分とマウス、ブタ及びヒトからの相応のＥＧＦ配列との配列アラインメントである。ＥＧＦ配列の起源は
１）マウス（グレイ他, 1983；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ００３８０）ヌクレオチド３１０８−３５３９、配列番号２４、
２）ブタ（キム他, 2001；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３６１５１）ヌクレオチド３１７２−３６０６、配列番号２５；並びに
３）ヒト（ベル他, 1986；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０４５７１）ヌクレオチド３１７０−３６０７、配列番号２６である。
【００６８】
図２は成熟ｂＥＧＦタンパク質のためのＤＮＡコーディング配列（配列番号１０）と、相応のマウス（ヌクレオチド３２８２−３４４０、配列番号２７）、ブタ（ヌクレオチド３３４６−３５０４、配列番号２８）及びヒト（ヌクレオチド３３４７−３５０５、配列番号２９）の配列とのアラインメントを示している。
【００６９】
図３は推定されるｂＥＧＦタンパク質配列（配列番号９）と相応のマウス（残基９１９−１０６３、配列番号３０）、ブタ（残基９１２−１０５６、配列番号３１）及びヒト（残基９１２−１０５７、配列番号３２）のＥＧＦタンパク質配列とのアラインメントを示している。
【００７０】
図４は推定される成熟ｂＥＧＦタンパク質（配列番号１１）と相応のマウス（前記９７７−１０２９、配列番号３３）、ブタ（前記９７０−１０２２、配列番号３４）及びヒト（前記９７０−１０２２、配列番号３５）の成熟ＥＧＦタンパク質とのアラインメントである。
【００７１】
有利な態様の記載
ＥＧＦは、より大きな前駆体タンパク質から生成される５３アミノ酸の小さなポリペプチドである。前駆体タンパク質は、２４個の短いエキソンが種々のサイズのイントロンによって分離されている１１０ｋｂのＤＮＡにわたる遺伝子によってコードされている。イントロンの切り出し後に、約１２００アミノ酸の前駆体タンパク質をコードする約４７００塩基対のｍＲＮＡが生成される。成熟のヒトＥＧＦタンパク質は、エキソン２０の３′末端の最後の９５個のヌクレオチドによってコードされ、かつｍＲＮＡの核酸３３４７−３５０５に相当するエキソン２１の５′末端の最初の６４個のヌクレオチドによってコードされる前駆体タンパク質のアミノ酸残基９７７−１０２９の切り出しによって生成される。
【００７２】
Ｉ．ｂＥＧＦの核酸配列及びポリペプチド配列
ゲノムＤＮＡをまずウシ血液から単離する（例１）。ｂＥＧＦをコードする配列のクローニングを続行するために、配列番号１及び２のプライマーをウシの全ゲノムＤＮＡの存在下にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において使用する（例２）。配列番号１のプライマーはヒトのＥＧＦのｃＤＮＡ配列のヌクレオチド３２１５−３２３７を含み、従って成熟ＥＧＦタンパク質をコードする配列の上流に位置する。このプライマーは、可能な縮重をヌクレオチド塩基の混合によって考慮して設計されている。また縮重し、配列番号２のプライマーはヒトＥＧＦのｃＤＮＡ配列のヌクレオチド３３７７−３４００を含み、従って成熟領域の範囲内にある。
【００７３】
これらの２つのプライマーを用いて１４５６塩基対の断片（配列番号３）が得られ、該断片をクローニングし、かつ配列決定する。該断片は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（アルトシュル他, 1997）のヴァージョン２を使用する類似性についてのＤＮＡ及びタンパク質のデータベースの調査によって示されるように、成熟ＥＧＦタンパク質のＮＨ２末端の最初の１０個のアミノ酸をコードする３０塩基対を含むエキソン１９の５６塩基対、１３２０塩基対のイントロン及びエキソン２０の８０塩基対を含有するＤＮＡ配列を有するマウス及びヒトのＥＧＦに対して高いホモロジーを有する。
【００７４】
成熟ＥＧＦタンパク質の残りの部分をコードするＤＮＡ配列をクローニングするための発明者の最初の戦略は、前記で得られる配列から設計されるウシ特異的５′プライマー及び成熟領域の下流の他の種の配列から設計される３′プライマーを使用することであるが、この戦略は、多くの試験されたプライマー組はアニーリングせず、ｂＥＧＦ配列を増幅できないので成功しなかった。従って、成熟領域から下流のｂＥＧＦ配列は他の種の配列から設計されたプライマーを使用した場合に効果的な増幅が不可能であると考えられる。未知の隣接配列を増幅させる逆ＰＣＲを次いで使用した。慣用のＰＣＲにおいては、プライマーをＤＮＡの反対の鎖にハイブリダイズするように設計し、２つのプライマーにわたって内側で伸長が進行する。逆ＰＣＲにおいては、該ＤＮＡを環状化させ、プライマーを、伸長が外側で進行し、かつ産物が公知の配列の上流及び下流の配列を有するように設計する（オッホマン他（Ochman et al.）, 1988； Benkel and Fong, 1996）。
【００７５】
前記で得られるｂＥＧＦ配列の上流及び下流のＤＮＡ配列を増幅するために、ウシのゲノムＤＮＡを特異的制限酵素で消化させ、次いで低濃度に希釈し、かつライゲーションさせる（例３）。低濃度では、分子内ライゲーションが優位であり、ＤＮＡ環が生成する。それぞれ６塩基対の配列を認識し、従って消化後に生じる平均断片サイズが４ｋｂであり、これは長距離ポリメラーゼ酵素によって容易に増幅できるので、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩが選択される。更に既に得られた配列によれば、エキソン１９及び２０の間のイントロンの５′末端の近くにＢａｍＨＩが存在し、従ってゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで消化させ、環状化させ、かつＢａｍＨＩの下流の配列から設計されたプライマーで増幅させた場合に、得られる断片はそのＢａｍＨＩ部位から後続の下流のＢａｍＨＩに隣接するイントロンまでの配列を有する。既に得られた配列中に３つの他の制限酵素のための認識部位は存在せず、従って増幅産物は生じる最初の認識部位までの公知の配列の上流の配列並びに生じる制限部位の後続の公知の配列の下流の配列を含有する。
【００７６】
配列番号４及び５のプライマー（配列番号３のヌクレオチド１１８４−１２０４；及び１０７０−１０９０のそれぞれ）を前記で挙げた酵素で消化されたＤＮＡの増幅のために使用する。配列番号６及び７のプライマー（配列番号３のヌクレオチド１４１３−１４３４；及び３７５−３９４）を次いで鋳型としての第一の反応のアリコートに使用する。これらのプライマーは、配列番号４及び５のプライマーによって増幅された断片に対して内側の断片を増幅するように設計され、かつこのネステッド反応は最初の反応で増幅された配列がＥＧＦ配列を含有することを裏付ける。ＳａｃＩで消化されたＤＮＡの増幅はアガロースゲル上で約７５００ｂｐの単一のバンドをもたらし、かつその材料のネステッド増幅は期待されるより小さなサイズの非常に強いバンドをもたらす。この産物を次いでクローニングし、かつ配列決定する（配列番号８、例３）。該ＤＮＡ断片は、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（アルトシュル他, 1997）のヴァージョン２．０を使用する類似性のためのＤＮＡ及びタンパク質のデータベースの調査によって示されるように、他の種からのＥＧＦ配列と高いホモロジーを有する。該断片はイントロンの４８３ヌクレオチド、エキソン１９、前記で同定された１３２０塩基対のイントロン、エキソン２０、４．８ｋｂのイントロン及びエキソン２１の１５８ヌクレオチドを含む。
【００７７】
従ってこの断片は、前記で同定された断片と、ウシ成熟ＥＧＦタンパク質の残りの部分をコードする断片を含む付加的な配列に配列ホモロジーを有する。
【００７８】
ヒトはエキソン１９から２１までのＥＧＦ遺伝子のゲノム配列（イントロンを含む）を利用できる唯一の種であり、ヒト染色体４から誘導される１２７ｋｂのクローン中に含まれる（ストーン他（Stone et al.）, 1998；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＣ００４０５０）。エキソン１９はウシ及びヒトにおいて１２４塩基対であり、かつエキソン２０はウシにおいては１４５塩基対であり、ヒトにおいては１４９塩基対である。本発明のウシのクローンはエキソン２１の全配列を有さないので、そのサイズはヒトのエキソン２１と比較できない。
【００７９】
イントロンのサイズに、より多くのヴァリエーションが存在し、そこではエキソン１９と２０との間のイントロンはヒトにおいては１３６２塩基対であり、ウシにおいては１３２０塩基対である。エキソン２０と２１との間のイントロンはヒトにおいては４７９９塩基対であり、かつウシにおいては５１７１塩基対である。ウシのイントロンにおいてＳＩＮＥ配列の挿入があると考えられるが、イントロン配列の残りの部分はヒトのイントロンに高いホモロジーを示す。
【００８０】
図１はウシのＥＧＦ配列とヒト、ブタ及びマウスのＥＧＦ配列とのアラインメントを示している。ウシとヒト、ブタ及びマウスとの核酸配列の間の全ホモロジーは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムのヴァージョン２．０を使用して対の配列を比較して、それぞれ７０％、７３％及び６４％である。ホモロジーのレベルは配列の種々の領域間で変化し、例えば成熟タンパク質の核酸配列（図２）だけを比較した場合にはウシ（配列番号９）とヒト、ブタ及びマウスとの配列間のホモロジーはそれぞれ６４％、６６％及び５９％である。しかしながら成熟タンパク質をコードする配列の上流の核酸配列だけを比較した場合にはウシとヒト、ブタ及びマウスとの配列の間のホモロジーはそれぞれ８２％、８５％及び７２％である。
【００８１】
前記で得られるｂＥＧＦ遺伝子のエキソン配列は配列番号１０の推定されるタンパク質をコードする。
【００８２】
推定されるｂＥＧＦタンパク質配列とヒト、ブタ及びマウスのＥＧＦ配列とのアラインメントを図３に示す。
【００８３】
ウシとヒト、ブタ及びマウスとの推定されたタンパク質配列間の全ホモロジーは、これらの配列をＢＬＡＳＴアルゴリズムのヴァージョン２．０を使用して対で比較した場合に４９％、５１％及び４６％である。類似の特性を有する（又は同じグループからの）アミノ酸を考慮する場合に、ホモロジーはヒト、ブタ及びマウスに関してそれぞれ６６％、６９％及び６２％である。核酸配列での場合と同様に、ホモロジーのレベルは配列の種々の領域間で変化し、例えば成熟タンパク質だけを比較する（ウシの配列についての配列番号１１、図４）場合にウシとヒト、ブタ及びマウスとのタンパク質配列間のホモロジーはそれぞれ３９％、３６％及び３６％である（類似のアミノ酸を考慮すれば６５％、６２％及び６０％）。しかしながら成熟タンパク質の上流の配列だけを比較した場合には、ウシとヒト、ブタ及びマウスとの間のホモロジーはそれぞれ６６％、７３％及び６１％（類似のアミノ酸を考慮すれば７８％、８４％及び７３％）である。
【００８４】
推定される成熟ｂＥＧＦタンパク質は計算された６１１２．１０Ｄａの分子量を有し、かつ他の種のタンパク質構造のために重要と思われる特異的アミノ酸、すなわち位置１７、３６及び３９におけるグリシン（他の種では位置１８、３６及び３９）及びチロシン３７を有する。
【００８５】
ヒトのＥＧＦにおいては、チロシン１３、２２及び２９は互いに近接している（コーケ他（Cooke et al.）, 1987）。推定されるｂＥＧＦタンパク質においては、チロシン１３及び２２が存在し、かつ芳香族アミノ酸であるフェニルアラニン２９及び他の公知のＥＧＦでの６つに対して５つのシステインが存在する。タンパク質中のジスルフィド結合はタンパク質鎖の異常なフォールディングの第一の理由ではなく、むしろ既に安定なコンホメーションの安定性を増大させるための策である（ワトソン他（Watson et al.）, 1985）。推定されたｂＥＧＦタンパク質はまたコンセンサススコア４４．８で示されるフォールディング認識によって裏付けられるようにマウスＥＧＦのホモログである。
【００８６】
１２より大きなスコアは時間の８０％より高く正確に予測されている（フィッシャー（Fisher）, 2000）。
【００８７】
配列番号８の配列の分析はエキソン１９（成熟領域の上流）中のインフレームＴＧＡコドンを明らかにしている。遺伝子コードの３つの連鎖終止コドンの１つのＴＧＡはセレノシステイン、２１番目のアミノ酸をコードしてよい（ナジム他（Nasim et al.）, 2000；タテ他（Tate et al.）, 199）。他の種からのＥＧＦ遺伝子においては、相応のコドンはシステインをコードするＴＧＣであり、従ってセレノシステインの存在は保存的置換を構成する。本発明において、ウシのゲノムＤＮＡのサザンブロット分析を実施して、ウシゲノム中のＥＧＦ遺伝子のコピー数を測定する（例４）。１コピーだけが存在すると思われるのであれば、得られた配列は機能的ＥＧＦ遺伝子由来であり、前駆体タンパク質はセレノタンパク質であると仮定することが合理的である。
【００８８】
ウシのゲノムＤＮＡを別個の反応において制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ及びＸｂａＩで消化させる。
【００８９】
各消化物３５ｍｇをアガロースゲルの別個のレーンに流す。該ＤＮＡをナイロンメンブレンに移し、それを３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識された配列番号３の断片とハイブリダイズさせ、かつ３日間Ｘ線フィルムに暴露する。該プローブは各消化物について単一のバンドにハイブリダイズし、これはウシゲノムに単一のコピーのＥＧＦ遺伝子だけが存在することを強く示唆している。
【００９０】
従って、本発明の１つの態様は配列番号９の配列及びそれに相補的な配列を含む単離された、精製された又は富化された核酸である。その単離された、精製された又は富化された核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ及び合成ＤＮＡを含むＤＮＡであってよい。該ＤＮＡは二本鎖又は一本鎖であってよく、かつ一本鎖であるならばコーディング鎖又は非コーディング鎖（アンチセンス）鎖であってよい。
【００９１】
選択的にその単離された、精製された又は富化された核酸はＲＮＡであってよい。
【００９２】
配列番号９の配列を含むゲノムＤＮＡは幾つかの方法を用いて、例えばＳａｃＩで消化されたウシのゲノムＤＮＡの配列番号４及び５のプライマー並びに配列番号６及び７のプライマーによる前記のような逆ＰＣＲによって単離できる。他のプライマー組はウシの配列に基づいて、ＳａｃＩ又は他の制限酵素で消化されたゲノムＤＮＡの逆ＰＣＲによって配列番号９のＤＮＡが単離されるように設計されてもよい。配列番号９のゲノム配列は、慣用のＰＣＲによって、例えば配列番号６及び１４のプライマーをそれぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用することによって得ることもできる。
【００９３】
第二に、配列番号９を含むゲノムＤＮＡはエキソン２０及び２１からの配列を、慣用のＰＣＲによって別個の反応において増幅させることによって単離してもよく、例えばエキソン２０は配列番号６及び１２をそれぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用して増幅される。エキソン２１は配列番号１３及び１４をそれぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用して増幅させ、その２つの得られた断片をライゲーションさせる。
【００９４】
第三に、配列番号９を含むゲノムＤＮＡは、ゲノムライブラリーと関連の配列に特異的にプローブがハイブリダイズしうる条件下に配列番号８の配列の断片から作成されたプローブとを接触させることによって単離することもできる。プローブの関連の配列の核酸へのハイブリダイゼーションは、放射性同位体、蛍光色素又は検出可能な生成物の形成を触媒しうる酵素でプローブを標識することによって検出できる。ゲノムライブラリーをスクリーニングするための手法はアウスユーベル他（１９９０）及びサムブローク他（１９８９）によって記載されている。
【００９５】
ｂＥＧＦをコードしている相補的ＤＮＡは逆転写ＰＣＲによって単離できる。本発明において、成熟ｂＥＧＦタンパク質をコードしているｃＤＮＡ断片と上流及び下流の配列を単離して、得られたゲノム配列が転写されることを確認する（例５）。ウシ腎臓のｍＲＮＡを配列番号１４のプライマーで逆転写させる。
【００９６】
逆転写の後にｃＤＮＡを、配列番号１６及び１４をそれぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用するＰＣＲ反応において使用する。
【００９７】
幾つかの産物がアガロースゲル上で観察される。４００塩基対より僅かに大きいバンドをゲルから切り出し、精製し、かつ該ＤＮＡを２つの別個のＰＣＲ反応のために鋳型として、すなわち一方で配列番号１６及び１２のプライマーをそれぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用し、かつ他方で配列番号１５及び１４のプライマーをそれぞれフォワードプライマー及びリバースプライマーとして使用する。得られた断片をクローニングし、かつ配列決定する。組み合わされた配列（配列番号１７）は相応のゲノム配列に対して９８％相同であることが判明した。差異（４１１ヌクレオチドからの６ヌクレオチド）は種々の動物からの組織がゲノムＤＮＡ及びＲＮＡの単離のために使用されたという事実に起因する。ゲノム配列からの推定されるタンパク質と比較した場合に、ｃＤＮＡ配列から推定される成熟タンパク質配列における２つのアミノ酸変化が明らかである、すなわち位置１８においてアルギニンの代わりにグルタミンであり、かつ位置３２においてヒスチジンの代わりにグルタミンである。
【００９８】
選択的にｂＥＧＦをコードする相補的ＤＮＡ配列は、ＥＧＦ遺伝子を発現するウシ組織から構築されたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによって単離できる。
【００９９】
次いで該ｃＤＮＡライブラリーをＥＧＦのコーディング配列又はＥＧＦのコーディング配列の断片を含むプローブと、該プローブがその相補配列に特異的にハイブリダイズしうる条件下に接触させる。プローブにハイブリダイズする相補的ＤＮＡを次いで検出し、かつ単離する。ＥＧＦを発現するウシの組織を次いでノーザンブロット又はＰＣＲ分析によって同定する。
【０１００】
成熟ｂＥＧＦタンパク質（配列番号９）をコードする配列を慣用のＤＮＡシンセサイザーによって、配列番号９の断片又は一部を相応の全長配列を製造するための中間体として用いて合成できる。従って配列番号９の単離された、精製された又は富化された核酸は配列番号１１のペプチドの製造のために使用できる。
【０１０１】
しばしば全長未満のタンパク質が完全なタンパク質の機能を有することはよく知られている。Ｎ末端部分、内側部分又はＣ末端部分を欠落する欠損タンパク質は全長タンパク質の全ての又は部分的な生物学的及び／又は酵素的な活性を保持でき、例えばＣＯＯＨ末端の最後の５個のアミノ酸を欠落するヒトのＥＧＦはその胃酸分泌阻害能を保持し、他方で３個までのＮ末端残基を失ったラットのＥＧＦは本来のタンパク質と同等の活性を有する（Hollenberg and Gregory 1980；シンプソン他, 1985）。
【０１０２】
従って完全なｂＥＧＦタンパク質の活性を保持する、内側で欠失したｂＥＧＦタンパク質及び欠損したｂＥＧＦタンパク質をコードする配列番号９の断片も本発明の範囲内である。欠損したタンパク質及び内側で欠失を有するタンパク質を作成する方法は当業者に公知である。
【０１０３】
欠損したｂＥＧＦ又は内側で欠失したｂＥＧＦの活性は、例えばＤＮＡ合成／細胞増殖アッセイを用いて確認できる。
【０１０４】
本発明のもう一つの態様は、少なくとも７個、より有利には少なくとも１０個、より有利には少なくとも１５個、より有利には少なくとも２０個、より有利には少なくとも２５個、より有利には少なくとも３０個、より有利には少なくとも３５個、より有利には少なくとも４０個、より有利には少なくとも４５個、より有利には少なくとも５０個、より有利には少なくとも５１個、より有利には少なくとも５２個の成熟ｂＥＧＦタンパク質の連続したアミノ酸を含むｂＥＧＦタンパク質又は断片をコードする単離された、精製された又は富化された核酸である。これらの核酸のコーディング配列はｂＥＧＦタンパク質のコーディング配列又はｂＥＧＦタンパク質又は、当業者に公知の遺伝子コードの重複又は縮重の結果として少なくとも７個、より有利には少なくとも１０個、より有利には少なくとも１５個、より有利には少なくとも２０個、より有利には少なくとも２５個、より有利には少なくとも３０個、より有利には少なくとも３５個、より有利には少なくとも４０個、より有利には少なくとも４５個、より有利には少なくとも５０個、より有利には少なくとも５１個、より有利には少なくとも５２個の成熟ｂＥＧＦタンパク質の連続したアミノ酸を含む断片をコードする種々のコーディング配列と同一であってよい。
【０１０５】
成熟ｂＥＧＦタンパク質をコードする単離された、精製された又は富化された核酸は、制限されないが、成熟ｂＥＧＦタンパク質のコーディング配列だけを含んでよく、その成熟ｂＥＧＦタンパク質のコーディング配列及び付加的なコーディング配列、例えばリーダー配列又は前駆タンパク質配列又は成熟ｂＥＧＦタンパク質のコーディング配列及び非コーディング配列、例えばイントロン又はコーディング配列の５′及び／又は３′の非コーディング配列を含んでよい。
【０１０６】
選択的にｂＥＧＦの核酸配列を、部位特異的突然変異誘発又は他の技術（アウスユーベル他, 1990）を使用して突然変異誘発して、成熟ｂＥＧＦタンパク質にサイレント変化、すなわちポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を変更しない変化を導入してよい。かかる変化は、宿主生物によって有利なコドンを導入するために望ましく、それによりかかるポリペプチドをコードするベクターを有する宿主細胞によって産生されるポリペプチドのレベルが増大する。
【０１０７】
一定のアミノ酸置換はタンパク質の機能に影響を及ぼすことなくタンパク質配列中になされてよい。従って本発明は、成熟ｂＥＧＦタンパク質にアミノ酸置換、付加、欠失、融合及び欠損をもたらすヌクレオチド変化を有するポリヌクレオチドに関する。かかるヌクレオチド変化は部位特異的突然変異誘発、無作為な化学的突然変異誘発、エキソヌクレアーゼＩＩＩ欠失及び他の組み換えＤＮＡ技術（アウスユーベル他, 1990）を用いて導入できる。得られた変異体はｂＥＧＦの生物学的特性を示してよく、例えば位置１３におけるチロシンのフェニルアラニンによる置換はヒトＥＧＦのその受容体への結合に殆ど影響を及ぼさない（タダキとニヨギ（Tadaki and Niyogi）, 1993）。選択的にかかるヌクレオチド変化は、少なくとも２０個、より有利には少なくとも３０個、より有利には少なくとも４０個、より有利には少なくとも５０個、より有利には少なくとも６０個、より有利には少なくとも７０個、より有利には少なくとも８０個、より有利には少なくとも９０個、より有利には少なくとも１００個、より有利には少なくとも１１０個、より有利には少なくとも１２０個、より有利には少なくとも１３０個、より有利には少なくとも１４０個、より有利には少なくとも１５０個、より有利には少なくとも１５９個の配列番号９の連続的な塩基又はそれに相補的な配列を含むプローブに特異的にハイブリダイズするウシ起源の核酸を同定することによって単離できる天然に存在するアレル変異体であってよい。
【０１０８】
ハイブリダイゼーションは低い、中程度の又は高い厳密な条件下に実施してよい。
【０１０９】
簡単に、固定された変性された核酸を有するポリマーメンブレンをまず０．９ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．０、５．０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．５％のＳＤＳ、１０×デンハルト及び０．５ｍｇ／ｍｌのポリリボアデニル酸からなる溶液中で４５℃において３０分間プレハイブリダイゼーションさせる。次いで該溶液に約２×１０７ｃｐｍ（比活性４〜９×１０８ｃｐｍ／μｇ）の３２Ｐ末端標識されたオリゴヌクレオチドプローブを添加する。１２〜１６時間のインキュベーションの後に、該ポリマーメンブレンを、０．５％のＳＤＳを含有する１×ＳＥＴ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ７．８、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ）中で室温において３０分間洗浄し、引き続きオリゴヌクレオチドプローブＴｍ−１０℃で新たな１×ＳＥＴ中で３０分間洗浄する。該ポリマーメンブレンを次いでオートラジオグラフィーフィルムに曝して、ハイブリダイゼーションシグナルを検出する。
【０１１０】
ハイブリダイゼーション条件の厳密さを変更することによって、プローブに種々のレベルのホモロジーを有する核酸を同定し、かつ単離することができる。厳密さは以下の式を用いて算出できるプローブの溶融温度（Ｔｍ）未満の種々の温度でハイブリダイゼーションを実施することによって変更できる。
【０１１１】
１００ヌクレオチド長より長いプローブについては、Ｔｍは以下の式を用いて計算される：
Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはプローブの長さである。ハイブリダイゼーションをホルムアミドを含有する溶液中で実施する場合に、Ｔｍは以下の式を用いて計算できる：Ｔｍ＝８１．５−１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（小数部Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）（６００／Ｎ）、式中、Ｎはプローブの長さである。
【０１１２】
プレハイブリダイゼーションは６×ＳＳＣ、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性され断片化されたサケ精子ＤＮＡ又は６×ＳＳＣ、５×デンハルト試薬、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの変性され断片化されたサケ精子ＤＮＡ、５０％のホルムアミド中で実施してよい。ＳＳＣ及びデンハルト溶液のための配合はサンブローク他（サムブローク（Sambrook）, (1989)）に列記されている。
【０１１３】
ハイブリダイゼーションは前記のプレハイブリダイゼーション溶液に検出可能なプローブを添加することによって実施される。プローブが二本鎖ＤＮＡである場合には、プレハイブリダイゼーション溶液に添加する前に変性させる。メンブレンをハイブリダイゼーション溶液と、プローブが相補配列又は相同配列を有するｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡにハイブリダイズしうるのに十分な時間にわたって接触させる。２００ヌクレオチド長より長いプローブに関しては、ハイブリダイゼーションはＴｍの１５〜２５℃未満で実施してよい。より短いプローブ、例えばオリゴヌクレオチドプローブに関しては、ハイブリダイゼーションはＴｍより５〜１０℃未満で実施してよい。有利には６×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーションに関しては、ハイブリダイゼーションは約６８℃で実施する。
【０１１４】
有利には５０％のホルムアミドを含有する溶液中でのハイブリダイゼーションに関しては、ハイブリダイゼーションは約４２℃で実施する。
【０１１５】
前記のハイブリダイゼーション条件の全ては高い厳密さを有すると考えられる。
【０１１６】
ハイブリダイゼーションの後に、メンブレンをまず２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で室温において１５分間洗浄し、次いで０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で室温で３０分から１時間洗浄し、次いで０．１×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーション温度において洗浄し、かつ最後に０．１×ＳＳＣ中で室温で洗浄する。オリゴヌクレオチドプローブに関してはより短い洗浄が推奨される。プローブとハイブリダイズする核酸はオートラジオグラフィー又は他の慣用の技術によって同定される。
【０１１７】
検出可能なプローブに対して低いホモロジーの核酸を得るためには、より厳密でない条件が使用される、例えばハイブリダイゼーション温度は、約１ＭのＮａ＋濃度を有するハイブリダイゼーションバッファー中で６８℃から４２℃まで５℃の増分で減少させてよい。
【０１１８】
ハイブリダイゼーションの後に、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中でハイブリダイゼーション温度において洗浄してよいかかる条件は５０℃より高い温度で「中程度」の厳密さであり、かつ５０℃未満の温度で「低い」厳密さであると考えられる。
【０１１９】
選択的にハイブリダイゼーションはバッファー、例えばホルムアミドを含有する６×ＳＳＣ中で４２℃において実施してよい。
【０１２０】
この場合にハイブリダイゼーションバッファー中のホルムアミドの濃度は、プローブに対して低いレベルのホモロジーを有するクローンを同定するのに５０％から０％まで５％の増分で低下させてよい。ハイブリダイゼーションの後に、メンブレンを６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中で５０℃において洗浄してよい。
【０１２１】
かかる条件は、２５％のホルムアミドより高い濃度で「中程度」の厳密さであり、かつ２５％未満のホルムアミドで「低い」厳密さであると考えられる。
【０１２２】
従ってかかる方法は、ｂＥＧＦ配列又は少なくとも２０個、より有利には少なくとも３０個、より有利には少なくとも４０個、より有利には少なくとも５０個、より有利には少なくとも６０個、より有利には少なくとも７０個、より有利には少なくとも８０個、より有利には少なくとも９０個、より有利には少なくとも１００個、より有利には少なくとも１１０個、より有利には少なくとも１２０個、より有利には少なくとも１３０個、より有利には少なくとも１４０個、より有利には少なくとも１５０個、より有利には少なくとも１５９個のその連続的な塩基を含む断片に対して少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％のホモロジーを有する配列及びそれに相補的な配列を単離するために使用してよい。ホモロジーはＢＬＡＳＴＮのヴァージョン２を使用してデフォルト値で測定できる（アルトシュル他, 1990）。
【０１２３】
付加的に議論される手法は、ｂＥＧＦタンパク質又は、ＢＬＡＳＴＮのヴァージョン２を使用して測定されるような、少なくとも７個、より有利には少なくとも１０個、より有利には少なくとも１５個、より有利には少なくとも２０個、より有利には少なくとも２５個、より有利には少なくとも３０個、より有利には少なくとも３５個、より有利には少なくとも４０個、より有利には少なくとも４５個、より有利には少なくとも５０個、より有利には少なくとも５１個、より有利には少なくとも５２個のその連続的なアミノ酸を含むｂＥＧＦタンパク質の断片に対して少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％のホモロジーを有するポリペプチドをコードする核酸を単離するために使用できる。
【０１２４】
配列番号９の単離された、精製された又は富化された核酸、それに相補的な配列又は、少なくとも２０個、より有利には少なくとも３０個、より有利には少なくとも４０個、より有利には少なくとも５０個、より有利には少なくとも６０個、より有利には少なくとも７０個、より有利には少なくとも８０個、より有利には少なくとも９０個、より有利には少なくとも１００個、より有利には少なくとも１１０個、より有利には少なくとも１２０個、より有利には少なくとも１３０個、より有利には少なくとも１４０個、より有利には少なくとも１５０個、より有利には少なくとも１５９個の配列番号９の連続的な塩基又はそれに相補的な配列を含む断片を配列番号１１のポリペプチドをコードするｃＤＮＡ又はその変異体を同定及び単離するプローブとして使用してよい。かかる手法において、ｃＤＮＡライブラリーをｂＥＧＦ遺伝子を発現するウシ組織から抽出されたＲＮＡから構築し、該ライブラリーをコーディング配列からなるプローブと、プローブが後に検出及び単離される相補的配列にハイブリダイズ可能な条件下に接触させる。ＥＧＦのｃＤＮＡを同定するために使用されるハイブリダイゼーション条件の厳密さを変更することによって、プローブに種々のレベルのホモロジーを有する核酸を同定し、かつ単離することができる。変異ｃＤＮＡを、コーディング配列又はその断片から設計されたプライマーを使用して、ウシＲＮＡから合成されたｃＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲ反応で単離できる。
【０１２５】
本発明のもう一つの態様は、少なくとも７個、より有利には少なくとも１０個、より有利には少なくとも１５個、より有利には少なくとも２０個、より有利には少なくとも２５個、より有利には少なくとも３０個、より有利には少なくとも３５個、より有利には少なくとも４０個、より有利には少なくとも４５個、より有利には少なくとも５０個、より有利には少なくとも５１個、より有利には少なくとも５２個のその連続したアミノ酸を含む単離された又は精製されたｂＥＧＦタンパク質である。ｂＥＧＦタンパク質又はその断片はｂＥＧＦのＤＮＡ配列を、前記の組み換え宿主中で発現させることによって得ることができる。
【０１２６】
選択的に、ｂＥＧＦタンパク質又は、少なくとも７個、より有利には少なくとも１０個、より有利には少なくとも１５個、より有利には少なくとも２０個、より有利には少なくとも２５個、より有利には少なくとも３０個、より有利には少なくとも３５個、より有利には少なくとも４０個、より有利には少なくとも４５個、より有利には少なくとも５０個、より有利には少なくとも５１個、より有利には少なくとも５２個のその連続したアミノ酸を含む断片は慣用のペプチドシンセサイザーによって合成できる。かかる断片はペプチド合成により相応の全長ｂＥＧＦタンパク質を製造するための中間体として用いてよい。
【０１２７】
選択的にｂＥＧＦタンパク質又はその断片は、ｂＥＧＦタンパク質をコードする核酸又はその断片に結合されたプロモーターを有するＤＮＡ構築物から転写されるｍＲＮＡを使用して得ることもできる。該ＤＮＡ構築物はインビトロ転写反応の実施の前に直鎖状にしてよい。転写されたｍＲＮＡを次いで適当な細胞不含の翻訳抽出物、例えば網状赤血球抽出物とインキュベートして、ｂＥＧＦタンパク質又はその断片を製造する。
【０１２８】
更にｂＥＧＦポリペプチド又はその断片は、生物学的富化手法又は精製手法によって得ることができる。潜在的に相同なポリペプチド又は断片の配列はタンパク質分解及び／又はマイクロシーケンシングによって測定できる。見込みのある相同ポリペプチド又は断片の配列を、ＢＬＡＳＴＰ，ヴァージョン２のようなプログラムを使用して、推定されるｂＥＧＦタンパク質又は少なくとも７個、より有利には少なくとも１０個、より有利には少なくとも１５個、より有利には少なくとも２０個、より有利には少なくとも２５個、より有利には少なくとも３０個、より有利には少なくとも３５個、より有利には少なくとも４０個、より有利には少なくとも４５個、より有利には少なくとも５０個、より有利には少なくとも５１個、より有利には少なくとも５２個のその連続したアミノ酸を含む断片と比較してよい。
【０１２９】
本発明は、ｂＥＧＦタンパク質又は、少なくとも７個、より有利には少なくとも１０個、より有利には少なくとも１５個、より有利には少なくとも２０個、より有利には少なくとも２５個、より有利には少なくとも３０個、より有利には少なくとも３５個、より有利には少なくとも４０個、より有利には少なくとも４５個、より有利には少なくとも５０個、より有利には少なくとも５１個、より有利には少なくとも５２個のその連続したアミノ酸を含む断片の変異体（誘導体又はアナログを含む）にまで拡張される。かかる変異体はアミノ酸配列において任意の組み合わせで存在してよい１つ以上の置換、付加、欠失、融合及び欠損によってｂＥＧＦタンパク質と異なってよい。
【０１３０】
変異体は、天然に存在するか、又はインビトロで部位特異的突然変異誘発、無作為な化学的突然変異誘発、エキソヌクレアーゼＩＩＩ欠失法及び標準的なクローニング技術を用いて作成できる。選択的に、かかる変異体、断片、アナログ又は誘導体は化学合成又は変性法を用いて作成できる。
【０１３１】
ｂＥＧＦタンパク質の変異体は、ｂＥＧＦタンパク質の１つ以上のアミノ酸残基が保存的又は非保存的なアミノ酸残基で（有利には保存的アミノ酸残基）置換され、かつかかる置換されたアミノ酸残基は遺伝子コードによってコードされる残基であるか又は遺伝子コードによってコードされる残基ではない変異体であってよい。保存的置換は、ポリペプチド中に与えられたアミノ酸を類似の特性を有する別のアミノ酸によって置換することに関する、そして典型的な置換は以下の通りである：
・  脂肪族アミノ酸、例えばアラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンを別の脂肪族アミノ酸で置き換える、
・  セリンをトレオニンで置き換えるか又はその逆、
・  酸性残基、例えばアスパラギン酸又はグルタミン酸を別の酸性残基で置き換える、アミド基を有する残基、例えばアスパラギン又はグルタミンをアミド基を有する別の残基で置き換える、
・  塩基性残基、例えばリジン又はアルギニンを別の塩基性残基で置き換える、及び
・  芳香族残基、例えばフェニルアラニン又はチロシンを別の芳香族残基で置き換える。
【０１３２】
他の変異体は、ウシＥＧＦタンパク質の１つ以上のアミノ酸残基が置換基を含む変異体である。
【０１３３】
更に他の変異体は、付加的なアミノ酸、例えばリーダー配列、分泌配列又はタンパク質の精製、富化又は安定化を促進する配列をポリペプチドに融合させた変異体である。
【０１３４】
幾つかの態様において、断片、誘導体又はアナログは前駆体配列を含み、断片、誘導体又はアナログは前駆部分の開裂によって活性化して、活性ペプチドを生成できる。
【０１３５】
本発明の他の態様は、ｂＥＧＦタンパク質又は少なくとも７個、より有利には少なくとも１０個、より有利には少なくとも１５個、より有利には少なくとも２０個、より有利には少なくとも２５個、より有利には少なくとも３０個、より有利には少なくとも３５個、より有利には少なくとも４０個、より有利には少なくとも４５個、より有利には少なくとも５０個、より有利には少なくとも５１個、より有利には少なくとも５２個のその連続なアミノ酸を含む断片に対して、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％のホモロジーを有するポリペプチド又は断片である。
【０１３６】
ホモロジーは、比較されるポリペプチド又は断片を整列させ、かつそれらの間のホモロジーの程度を測定するＢＬＡＳＴＰのヴァージョン２を用いてデフォルト値で測定できる。アミノ酸「ホモロジー」は前記のような保存的アミノ酸置換を含むことは明らかである。ｂＥＧＦ又はその断片に対してホモロジーを有するポリペプチド又は断片は、それらをコードする核酸を本願で議論される技術を使用して単離することによって得ることができる。
【０１３７】
ｂＥＧＦタンパク質又は、少なくとも７個、より有利には少なくとも１０個、より有利には少なくとも１５個、より有利には少なくとも２０個、より有利には少なくとも２５個、より有利には少なくとも３０個、より有利には少なくとも３５個、より有利には少なくとも４０個、より有利には少なくとも４５個、より有利には少なくとも５０個、より有利には少なくとも５１個、より有利には少なくとも５２個のその連続したアミノ酸を含む断片は該タンパク質又は断片に特異的に結合する抗体を作成するために使用してもよい。組織又は液状試料中のＥＧＦを検出するために、該試料をかかる抗体と接触させ、かつその結合能を次いで、検出可能な蛍光標識、酵素的標識又は放射性標識、又は選択的にかかる標識を有する二次抗体で抗体を標識することによって測定する。試料中のｂＥＧＦの検出のために有用な公知のアッセイは、ＥＬＩＳＡ、サンドウィッチアッセイ、ラジオイムノアッセイ及びウェスタンブロットである。
【０１３８】
ｂＥＧＦタンパク質又は、少なくとも７個、より有利には少なくとも１０個、より有利には少なくとも１５個、より有利には少なくとも２０個、より有利には少なくとも２５個、より有利には少なくとも３０個、より有利には少なくとも３５個、より有利には少なくとも４０個、より有利には少なくとも４５個、より有利には少なくとも５０個、より有利には少なくとも５１個、より有利には少なくとも５２個のその連続したアミノ酸を含む断片に対して作成されたポリクローナル抗体は、該タンパク質又は断片を動物に直接注射又は投与することによって得ることができる。得られた抗体は次いでタンパク質自体と結合し、こうしてタンパク質の断片だけをコードしている配列でさえも、全長の本来のタンパク質に結合しうる抗体を作成するために使用できる。
【０１３９】
かかる抗体を次いで、該抗体を発現する細胞からのタンパク質を単離するために使用してよい。
【０１４０】
モノクローナル抗体の製造のために、連続細胞系統培養によって作成される抗体を提供する任意の方法、例えばハイブリドーマ、トリオーマ、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術を使用してよい。
【０１４１】
従ってｂＥＧＦタンパク質又は、少なくとも７個、より有利には少なくとも１０個、より有利には少なくとも１５個、より有利には少なくとも２０個、より有利には少なくとも２５個、より有利には少なくとも３０個、より有利には少なくとも３５個、より有利には少なくとも４０個、より有利には少なくとも４５個、より有利には少なくとも５０個、より有利には少なくとも５１個、より有利には少なくとも５２個のその連続したアミノ酸を含む断片に対して作成された抗体は、ウシの組織及び体液中のＥＧＦタンパク質を検出するために、かつ類似のタンパク質を他の生物、有利には反芻動物からスクリーニングするために使用できる。ウシ又は他の反芻動物の組織又は体液から抽出されて、これらのタンパク質を抗体及び前記の手法のいずれかによって特異的な結合が検出されたタンパク質と接触させる。
【０１４２】
本発明のｂＥＧＦ遺伝子は異種ハイブリダイゼーション及び、他の哺乳動物からのＥＧＦをコードする遺伝子の単離を可能にするＰＣＲ実験で使用できる。
【０１４３】
ＩＩ．ｂＥＧＦタンパク質の過剰発現
特徴付けられたｂＥＧＦコーディング配列を市販生産のために、種々の発現系に導入してよい。組み換えＤＮＡ技術はペプチドホルモン、例えばＥＧＦの効率的な製造を促進する。ｂＥＧＦの製造のために工業的な微生物株（例えばアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・フィクーム（Aspergillus ficuum）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）、アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・レエサイ（Trichodema reesei）、ムコール・ミエヘイ（Mucor miehei）、クルイベロマイセス・ラクティク（Kluyverromyces lactic）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エシェリキア・コリ（Escherichia coli）、バチルス・サチリス（Bacillus subtilis）又はバチルス・リケニホルミス（licheyiiforfriis）又は植物宿主（例えばキャノーラ、大豆、トウモロコシ、ポテト）を使用してよい。全ての系は、発現構築物を当該タンパク質コーディング配列及び調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー及びターミネーターと所望であればシグナル配列及び選択可能なマーカーを含むように組み立てられる類似の試みを使用する。
【０１４４】
ｂＥＧＦの細胞外発現を達成するために本発明の発現構築物は、細胞質発現が望ましいのであれば含まれるべきでないが、分泌シグナル配列を利用する。プロモーター及びシグナル配列は宿主細胞中で機能的であり、かつコーディング配列の産物の発現及び分泌をもたらす。転写ターミネーターは効率的な転写を保証するために含まれる。発現又はタンパク質精製を促進する補助的な配列が配列構築物に含まれていてもよい。
【０１４５】
ウシＥＧＦをＥ．コリ及びＰ．パストリス中で発現させてよい（例６）。成熟タンパク質をコードする配列だけを有するＤＮＡ断片は、成熟タンパク質をコードする配列を５ｋｂのイントロンの各側部で別個に、配列番号６及び１２のプライマー並びに配列番号１３及び１４のプライマーを使用して増幅させ、かつ次いでジャンクションプライマー（配列番号１５）で２つの産物を結合させることによって製造される。最終産物をＥ．コリ及びＰ．パストリスの発現ベクター中にクローニングする。
【０１４６】
適当なベクターは宿主細胞中で自律的に複製可能であり、かつ外来ＤＮＡを許容しうるべきである。ベクターは、その自身の複製起点、外来ＤＮＡの挿入のために使用できる制限エンドヌクレアーゼのための１つ以上のユニークな認識部位及びしばしば挿入されるＤＮＡの発現のための認識配列（例えばプロモーター）を有する。選択可能なマーカーは、所望の構築物を有する細菌細胞の選択を可能にするために含まれてよく、例えば適当な原核性の選択可能なマーカーはアンピシリンのような抗生物質耐性を付与するマーカーを含む。当業者に公知の任意の適当なベクターを選択してよい。一般的なベクターは、制限されないがファージ、コスミド、バキュウロウイルス、レトロウイルス及びプラスミドベクターを含む。以下のプラスミドベクターを例として与える：ｐＥＱ４０又はｐＥＴ系のプラスミド、例えばｐＥＴ２６。しかしながら宿主中で複製可能でありかつ存続可能である限りはいかなるプラスミドベクターを使用してもよい。
【０１４７】
適当なベクターを組み立てたら、宿主細胞中に外来ＤＮＡを導入するために種々の技術を利用できる。ベクター又は発現構築物を、エレクトロポレーションによってＥ．コリに導入してよく、かつプロトプラスト形質転換又はエレクトロポレーションによってＰ．パストリス細胞中に導入してよい。エレクトロポレーションのために細胞を滅菌水で洗浄し、高導電性溶液（例えば１Ｍのソルビトール溶液）中に再懸濁する。細胞懸濁液に適用される高い電圧ショックにより、形質転換するＤＮＡが細胞に移入する細胞膜中の一時的な孔が生成する。Ｐ．パストリスにおいて、発現構築物は相同組み換えによるａｏｘ１（アルコールオキシダーゼ）座への組み込みによって安定に保持される。ベクター又は発現構築物を有する宿主細胞を、発現構築物又はベクター中にある選択可能なマーカーを使用することで同定し、かつ当該遺伝子の存在をハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、抗体又は他の技術によって確認した。形質転換された微生物細胞を、かかる技術によって回分式又は連続的な発酵として液体培地又は半固体培地で増殖させることができる。形質転換された細胞を最大の生産対費用の比について最適化された条件下で増殖させる。生産収率を培養パラメーター、例えば温度、ｐＨ、エアレーション及び培地組成の操作によって増大させることができる。過剰発現する組み換えＥ．コリのための増殖条件の慎重な操作及びモニタリングにより、それぞれ１５０ｇ（湿質量）の細胞／ｌ及び５ｇの不溶性タンパク質／ｌの培養バイオマス及びタンパク質収率が得ることができる。低濃度のプロテアーゼインヒビター（例えばフェニルメチルスルホニルフルオリド又はペプスタチン）を使用して、過剰発現されるタンパク質のタンパク質分解を低減させ、一方でプロテアーゼを欠損する宿主細胞を選択的に使用してタンパク質分解を低減又は排除することができる。微生物的な発現のために、融合タンパク質の製造は精製を容易にするために所望され、又はｂＥＧＦをタンパク質分解から保護するために所望されることもある。
【０１４８】
発酵の後に、微生物細胞を培地から後続プロセス、例えば遠心分離及び濾過により除去してよい。所望の生成物が分泌される場合に、それを栄養培地から抽出してよい。細胞内生産の場合に、細胞を回収し、かつ機械的な力、超音波、酵素、化学物質及び／又は高圧を使用して細胞を破壊することによって放出された産物を回収する。過剰発現するＥ．コリ系中に生じる不溶性生成物の生産は生成物の精製を容易にする。生成物封入体を破壊された細胞から遠心分離によって抽出し、コンタミしているタンパク質を低濃度の変性剤（例えば０．５〜６Ｍの尿素、０．１〜１％ＳＤＳ、又は０．５〜４．０Ｍのグアニジン−ＨＣｌ）を含有するバッファーで洗浄することによって除去する。洗浄された封入体を６〜８Ｍの尿素、１〜２％ＳＤＳ、又は４〜６Ｍグアニジン−ＨＣｌを含有する溶液中に溶解させ、かつ溶解された生成物を透析の間に変性剤をゆっくりと除去することによって復元することができる。
【０１４９】
ウシＥＧＦを植物細胞、例えばポテト又はブラシカ・ナプス（Brassica napus）中で発現させてもよい。
【０１５０】
発現構築物をＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）中で複製可能であり、かつ植物細胞に移動可能なバイナリベクターに挿入する。得られた構築物をＡ．ツメファシエンス細胞に形質転換し、かつ該発現構築物を次いでＢ．ナプス葉細胞にバイナリベクター：：発現構築物の接合伝達によって移入させる。発現構築物は無作為に植物細胞ゲノム中に組み込まれる。
【０１５１】
選択及びスクリーニングの後に、形質転換された植物細胞を公知の方法を用いて発生及び培養されたトランスジェニック植物の全植物及び変種系列に再生させてよい。
【０１５２】
ウシＥＧＦを収穫された部分又は全植物から破砕、均質化及び／又は化学処理によって抽出できる。種子特異的親油性オレオシン融合はオレオシン融合タンパク質を破砕されたキャノーラ種子の油分画に水性タンパク質から分離することによって精製を容易にする（van Rooijen and Moloney,1994）。
【０１５３】
必要に応じて、微生物抽出物、発酵抽出物及び植物抽出物からの生成物の精製は沈殿（例えば硫酸アンモニウム沈殿）、クロマトグラフィー（例えばゲル濾過、イオン交換、アフィニティー液体クロマトグラフィー）、限外濾過、電気泳動、溶剤−溶剤抽出（例えばアセトン沈殿）又はかかる方法の組み合わせを用いて実施してよい。
【０１５４】
ＩＩＩ．ｂＥＧＦタンパク質の活性
得られた組み換えｂＥＧＦタンパク質を、例えばＤＮＡ合成／細胞増殖アッセイを使用して活性について試験する。それというのもＥＧＦは多くの細胞型のためのマイトジェンだからである。簡単に、ウシの線維芽細胞を半集密にまで２４ウェルプレート中で成長させ、そこに組み換えｂＥＧＦ（種々の濃度）及びヒトのＥＧＦ（ポジティブコントロール）を次いで別個のウェルに添加する。ｂＥＧＦ添加の１８時間後にトリチウムチミジンを各ウェルに添加して、新規に合成されるＤＮＡに導入する。８時間後に細胞を回収し、かつ導入されていないチミジン及び導入されたチミジンを酸沈殿によって分離する。各フラクション中の放射活性の量をシンチレーション計数によって測定する。対照細胞と比較される導入されたトリチウムチミジンの増加は組み換えｂＥＧＦによる線維芽細胞中のＤＮＡ合成の刺激を指摘している。このアッセイを用いて、ヒトのＥＧＦとｂＥＧＦがウシの細胞でＤＮＡ合成及び増殖を刺激する能力を比較することもできる。類似のアッセイにおいて、細胞をｂＥＧＦ添加の１８時間後に回収し、細胞増殖に対するｂＥＧＦの効果を測定するために計数する。
【０１５５】
ＩＶ．ｂＥＧＦの配合及び適用
ｂＥＧＦタンパク質又はその機能的等価な断片、全て又は一部の形質転換された微生物培養及び植物並びに培養又は植物から得られる抽出物を、ｂＥＧＦ活性を必要とする適用に直接使用してよい。かかる適用は、成長の促進、腸内感染症の予防又は治療、栄養吸収の増大並びに未熟な腸管細胞の発育促進を含む。
【０１５６】
大多数の家畜はヒトとは異なり、イムノグロブリンを胎盤を介して摂取できず、その代わりに「漏洩性の」未熟な腸管細胞構造を通して母乳中の抗体を摂取することで免疫を獲得する。この摂取は生後直ちに達成されるが、未熟な腸管細胞を成熟した腸管細胞とを交換する時間は、例えば仔ブタにおいて４週間及び恐らくウシにおいては３ヶ月まで長いことがある。この段階は畜産における種々の問題、特に成体型食事の利用の妨げ、新生動物を必須栄養のために哺乳に依存させることが引き起こされうる。
【０１５７】
ウィルソン他（Wilson et al.）による国際出願番号ＷＯ８８／０４１８０号は、家畜にＥＧＦを投与することによって消化酵素の早熟及び成長を促進する方法を提供している。乳牛又は肉牛の成長を促進するために投与されたＥＧＦは理論的に任意の哺乳動物起源から誘導できる。通常、ＥＧＦ活性配列は種間で厳密に保存されていると考えられている。しかしながらｂＥＧＦ活性配列は本発明に裏付けられるように全ての他の哺乳類ＥＧＦ配列とは大きく異なる。従って乳牛又は肉牛の成長を促進するために、代替の起源からのＥＧＦが使用される場合に、ウシの消化生理に影響を及ぼしかつ不所望の副作用を回避することに、より効果がありそうなｂＥＧＦを使用することが有利である。
【０１５８】
ウシＥＧＦはまた他の家畜種、有利には反芻動物、例えばヤギ及びヒツジの成長を促進するために使用してもよい。
【０１５９】
ＥＧＦは栄養吸収を制御することに関連し、例えば齧歯類においてＥＧＦは空腸の刷子縁を通る電解質、グルコース及びプロリンの輸送を増大させる。
【０１６０】
従って本発明のｂＥＧＦは前記のように腸管細胞構造を改変するのに必要な時間より長い期間使用できる。ｂＥＧＦに応じた栄養吸収の見込みのある増大は給餌効率を増大させ、成長を促進する。
【０１６１】
若い動物の腸管細胞は母親の免疫の移行を可能にする十分な時間にわたり未熟な状態に保持せねばならない。従ってｂＥＧＦの投与は、ウシが２日齢、３日齢又は４日齢である場合に開始してよく、かつ所望の効果が腸管細胞構造の成熟促進であれば２〜４日間だけ継続してよく、又は所望の効果がｂＥＧＦによって媒介される栄養吸収の増大を利用することであればより長い期間、例えば４〜６週間継続してよい。ウシにおける最適な効果のためのｂＥＧＦ投与のための最良の時間は実験的に規定する必要があることもある。ウシＥＧＦは幾つかの方法で、すなわちウィルソン他による国際出願番号ＷＯ８８／０４１８０号で示唆されるようにインプラントか非経口経路のいずれかによって８時間間隔で投与してよい。
【０１６２】
しかしながら動物の餌又は飲料水中での経口投与が有利である。毎日のＥＧＦ投与は１００μｇ／ｋｇ体重の用量を９日間ででニュージーランドシロウサギ（New Zealand white rabbits）の体重増加を促進する（ブレット他による米国特許第５，７５３，６２２号）。ウシに関しては、ｂＥＧＦを、例えば１日に１０〜１００００μｇ／ｋｇに変化する用量範囲で経口投与してよい。
【０１６３】
ウシＥＧＦは腸内感染症の予防又は治療のために使用してもよい。かかる感染症は、制限されることなく、腸内病原性大腸菌感染症、例えば腸内大腸菌病、ランブル鞭毛虫症及び白痢を含む。ＥＧＦの供給はロタウイルスに感染した仔ブタの腸内感染を改善する（ジルストラ他, 1994）。更に経口でのＥＧＦ投与はウサギにおける腸内感染率を低減し、かつ感染により引き起こされる体重低下を抑える（ブレット他, 1997）。ブレット他による米国特許第５，７５３，６２２号は、白痢及び他の病原性感染症の治療法並びにＥＧＦを経口で又は直接的に動物飼料中で投与することによる体重増加のための方法を開示している。ウシのためには、ｂＥＧＦは、例えば白痢又は他の病原性感染症の予防又は治療のために、１日あたり１０〜１００００μｇ／ｋｇに変化する用量範囲で経口投与してよい。
【０１６４】
前記の適用のために、ｂＥＧＦを粗製ｂＥＧＦ、精製ｂＥＧＦの形で又は形質転換された微生物、形質転換された植物組織又はｂＥＧＦが形質転換された微生物によって分泌されていてよい培養培地又は栄養培地から調製することができる。従って若い動物及び成体の動物（すなわちウシ、家禽、ブタ、ヒツジ、ヤギ、他の単胃又は反芻の家畜）にその成長及び健康を促進するために投与するためにｂＥＧＦの種々の配合物を製造することができる。ウシＥＧＦは固体、液体、懸濁液、飼料添加剤、混合物又は試料組成物として以下のように配合できる。
【０１６５】
ｉ）固体
ウシＥＧＦを固体として、無機ブロック、塩、顆粒、錠剤、ペレット又は粉末として配合できる。粉末の形において、ｂＥＧＦは飼料貯槽中に散布するか、又は食料と混合するか、又は公知の方法により別の飼料と一緒にペレット化してよい。ｉｉ）液体及び懸濁液
ウシＥＧＦを溶液中に導入し、溶液又は懸濁液として配合し、凍結乾燥された又は粉末化されたｂＥＧＦを適当な液体に添加してよい。
【０１６６】
ウシＥＧＦを動物の飲料水と混合するか、又は消費のための他の液体形で提供してよい。ウシＥＧＦを液体飼料、例えばウシに栄養の供給及び免疫保護のために使用されることが当業者に公知な初乳、医用ミルク、全乳及び代替乳と合してよい。活性成分を液体飼料に添加する方法は当業者に公知である（例えばラングレール（Langrehr）による米国特許第５，７８５，９９０号を参照のこと）。
【０１６７】
ｉｉｉ）試料添加剤
ウシＥＧＦを、ｂＥＧＦを発現するように形質転換された凍結乾燥された微生物又は植物組織の調製物を含有する試料添加剤の形で投与してよい。試料添加剤は標準の飼料と一緒に含まれていてよい。ｉｖ）混合物
活性成分を動物飼料に導入することは一般に、活性成分のプレミックスを調製し、該プレミックスとビタミン及びミネラルとを混合し、次いで該プレミックス又は試料添加剤を飼料に添加することによって達成される。ウシＥＧＦを当業者に公知の活性成分、例えば酵素、抗生物質、プロバイオティック又はビフィズス菌及び乳酸菌の生製剤と混合してよい。ｂＥＧＦ単独又は他の活性成分と組み合わせて含む活性成分を栄養と組み合わせて予混サプリメントを提供できる。栄養は、微量養素、例えばビタミン（例えばビタミンＡ、Ｄ、Ｅ及びＫ、チアミン、リボフラビンなど）及びミネラル（例えば銅、コバルト、マグネシウム、ヨウ素、硫酸鉄など）及び多量養素（例えば穀粒、種子、牧草、脂肪及び油）を含む。次いでプレミックスを、穀類（例えば、小麦、オート麦、大麦及びトウモロコシ）、植物性タンパク質飼料、動物性タンパク質飼料及び乳製品（例えば粉乳及びホエイ粉末）を含む乾燥飼料成分に添加してよい。
【０１６８】
ｖ）飼料組成物のウシＥＧＦを、ｂＥＧＦと組み合わせて又はそれで処理された飼料を含有する飼料組成物の形で提供してよい。ウシＥＧＦを乾燥形で飼料と混合してよい；例えば粉末又は、例えば飲薬又は噴霧薬として使用されるべき液体として混合してよい。穀粒、例えばトウモロコシ、モロコシ、小麦、大麦、オート麦、植物性タンパク質ミール、牧草、干し草、緑蔵飼料及びトウモロコシ飼料を含む任意の慣用の飼料を使用してよい。
【０１６９】
ｂＥＧＦの配合物は、他のタンパク質（例えばゼラチン、スキムミルク粉末など）又は化学薬品（例えばグリセロール、ポリエチレングリコール、還元剤及びアルデヒド）の添加によって安定化させてよい。製薬学的に認容性のキャリヤー、希釈剤及び賦形剤を配合物、例えば糖類、粉末乳又はミルク副産物及びセルロース誘導体に導入してもよい。動物が十分な量を消費することを保証するために、フレーバーを該組成物に添加して、動物の口に合いかつ慣れたように見える形でｂＥＧＦを提供してよい。ｂＥＧＦの配合物を成長段階及び肥育段階の間の若い動物に適合させ、成体の動物が必要とする量より変更された量のｂＥＧＦを含有してよい。
【０１７０】
ウシＥＧＦを幾つかの方法で、すなわちインプラント又は非経口経路のいずれかによって投与してよい。しかしながら動物飼料又は飲料水での経口投与が簡便である。選択的に、適当なプロモーター−エンハンサー配列を有するｂＥＧＦ遺伝子を動物ゲノムに組み込み、かつ選択的に、ｂＥＧＦを胃腸管に分泌する器官又は組織中で発現させてよく、それにより追加のｂＥＧＦの必要が排除される。
【０１７１】
ｂＥＧＦの用量は、当業者によく知られた多くの要因、例えばｂＥＧＦの特定の形；ｂＥＧＦが使用される条件（すなわち成長促進又は腸内感染症の治療）；動物の型、齢及び体重に依存する。ウシに関しては、ｂＥＧＦを、例えば１日あたり１０〜１００００μｇ／ｋｇに変化する用量範囲で経口投与してよい。より広い用量範囲が成体動物に必要とされる。
【０１７２】
以下の実施例を説明するが、これは本発明を制限するものでない。使用される数値（例えば温度、ｐＨ、量）に関する正確さを保証する試みがなされたが、幾つかの実験的な分散及び偏差の可能性は認められるべきである。
【０１７３】
例１  −  ボス・タウルスからのゲノムＤＮＡの単離
ゲノムＤＮＡをウシ血液（ボス・タウルス）から塩抽出法（ミラー他（Miller et al.）, 1988）を使用して単離した。簡単に抗凝血化された血液から得られる有核細胞を３ｍｌの核溶解バッファー（１０ｍＭのトリスＨＣｌ、４００ｍＭのＮａＣｌ及び２ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ８．２）中で１５ｍｌの遠心分離管中で再懸濁させた。その溶解物を２００μｌの１０％ＳＤＳ及び０．５ｍｌのプロテアーゼＫ溶液（１％ＳＤＳ及び２ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ中の１ｍｇのプロテアーゼＫ）と一緒に一晩インキュベートした。消化後に、１ｍｌの飽和ＮａＣｌ（約６Ｍ）を各管に添加し、それを１５秒間激しく振り、かつ次いで２５００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。
【０１７４】
上清を別の１５ｍｌ管に移し、２容量の無水エタノール（室温）を添加し、かつ該管をＤＮＡが沈殿するまで数回逆さにした。
【０１７５】
ＤＮＡ鎖をピペットで分離し、かつ３００μｌのトリスバッファーを含有する微量遠心管に移した。
【０１７６】
例２  −  ｂＥＧＦ遺伝子の１．５ｋｂ断片の増幅、クローニング及び配列決定
ｉ）ゲノムｂＥＧＦ断片のＰＣＲ増幅のためのプライマー設計
哺乳動物種由来の以下のＥＧＦのｃＤＮＡ配列を分析し、ホモロジーの領域を同定した：
１）ヒト（ベル他, 1986；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０４５７１）；
２）マウス（グレイ他, 1983；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ００３８０）；
３）ラット（サギ他（Saggi et al.）, 1992；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ０４８４２）；
４）ブタ（キム他, 2001；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ３３６１５１）；及び
５）ウマ（スチュワート他；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｓ７３５２７）。
【０１７７】
成熟ＥＧＦタンパク質の８３アミノ酸上流に位置する高度に保存された領域を同定し、かつ該領域はアミノ酸配列「ＣＴＮＴＥＧＧＹ」をコードする。該配列を使用して、潜在的な縮重をこれらの位置でヌクレオチド塩基を混合することによって図り、配列番号１のプライマーを設計した：５′ＧＡＣＡＣＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔ  ＴＧＣ／Ｔ  ＡＣＡ  ＡＡＴ  ＡＣＡ／Ｃ／Ｇ／Ｔ  ＧＡＧ  ＧＧ  ３′。配列番号２のプライマーをヒトＥＧＦ中の配列「ＤＧＹＣＬＨＤＧ」の成熟タンパク質の非常に保存された領域から設計した。潜在的な縮重はまたこれらの位置でヌクレオチド塩基を混合することによって図った：５′ＧＡＣ／Ｔ  ＧＧＧ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＣＡＣ／Ｔ  ＧＧ／ＡＴ  ＧＧ  ３′。これらのプライマーをＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City CA, 94404, USA, モデル番号３９２）で作成した。
【０１７８】
ｉｉ）１．５ｋｂのゲノムｂＥＧＦ断片のＰＣＲ増幅及びクローニング
増幅を、鋳型として３００ｎｇのウシのゲノムＤＮＡ（例１で単離されたように）、２００ｎＭの配列番号１及び２の各プライマー、１００μＭのｄＮＴＰ（Roche Molecular Biochemicals, 201 Boulevard Armand-Frappier, Laval, QC H7V 4A2, Canada, カタログ番号１５８１２９５）、１．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Life Technologies, 9800 Medical Center Drive, P. O. Box 6482, Rockville, MD 20850, USA, カタログ番号１０３４２−０５３）、１×反応バッファー（酵素と一緒に提供される）及び１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する５０μｌ中で実施した。３．０分の９６℃での最初の変性工程の後に、（１）９４℃で３０秒の変性工程、（２）５７℃で１５秒のアニーリング工程及び（３）７２℃で２分間の伸長工程、７２℃で５分間の最終伸長工程からなるＰＣＲサイクルを３５回繰り返した。
【０１７９】
１５μｌのＰＣＲ反応物を１％のアガロースゲル上に流し、これを次いでエチジウムブロマイドで染色し、かつ紫外光下に可視化させた。約１．５ｋｂのバンドをゲルから切り出し、かつガラスウールへの導通によって精製した。簡単に、少量のガラスウールを、底部に小さな穴を有する０．５ｍｌ管に載置した。該ゲル片をガラスウールの頂部に載置し、かつ該管を１．５ｍｌ管中に載置した。該管を１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。２μｌの溶出物を１００μｌのＰＣＲ反応（前記と同じ条件）における鋳型として使用し、クローニングのために十分な鋳型を作成した。全ての増幅反応物を１％のアガロースゲル上に流し、これを次いでエチジウムブロマイドで染色し、かつ紫外光下に可視化させた。１．５ｋｂのバンドをゲルから切り出し、かつＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（QIAquick gel extraction kit）（Qiagen Inc., 28159 Avenue Stanford, Valencia, CA 91355, USA, カタログ番号２８７０４）を用いて精製した。約５０ｎｇのＤＮＡを１２．５ｎｇのｐＧＥＭＴ−ＥＡＳＹ ＴＡクローニングベクター（Promega Corporation, 2800 Wood Hollow Road, Madison,WI 53711-5399, USA, カタログ番号Ａ１３６０）に３ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Promega Corporation, カタログ番号Ｍ１８０１）を用いて１０μｌの容量で４℃で１６時間ライゲーションした。
【０１８０】
２μｌのライゲーション混合物をＥ．コリＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（Ｒ）ＤＨ５αＴＭコンピテント細胞（Life Technologies, カタログ番号１８２５８−０１２）中で形質転換した。
【０１８１】
ｉｉｉ）１．５ｋｂのゲノムのウシＥＧＦ断片の配列決定
１．５ｋｂのインサートの完全な配列（配列番号３）を以下の方法によって測定した。鋳型ＤＮＡをＥ．コリ（ｂＥＧＦを有するプラスミドで形質転換された）のオーバーナイト培養からＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Qiagen Inc, カタログ番号２７１０４）を用いて抽出した。BIGDYE TERMINATOR CYCLE SEQUENCING KIT（Applied Biosystems, カタログ番号４０３０５１）を使用してＤＮＡ配列決定システム上での分析のために試料を調製した。重複配列をプライマー歩行によって作成した。該ＤＮＡ配列データをＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲＴＭソフトウェア（Gene Codes Corporation, 640 Avis Drive, Suite 300 Ann Arbor, Michigan 48108, カタログ番号ＳＱＡ３．１）を使用して分析した。
【０１８２】
例３  −  ＤＮＡ配列の増幅のための逆ＰＣＲ
ｉ）プライマーを逆ＰＣＲのために１．５ｋｂのｂＥＧＦ断片の配列から設計する。
【０１８３】
プライマーを例２で得られる１．５ｋｂのｂＥＧＦ遺伝子断片の配列から設計した。
【０１８４】
配列番号４（配列番号３のヌクレオチド１１８４〜１２０４）及び配列番号５（配列番号３のヌクレオチド１０７０〜１０９０）のプライマーを最初の増幅のために使用し、かつ配列番号６（配列番号３のヌクレオチド１４１３〜１４３４）及び配列番号７（配列番号３のヌクレオチド３７５〜３９４）を設計し、配列番号４及び５のプライマーで作成された断片に対して内側で断片を増幅した。
【０１８５】
ｉｉ）鋳型製造
鋳型を、１μｇのウシゲノムのＤＮＡを４０ＵのＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳｃａＩ（New England BioLabsInc., 32 Tozer Road, Beverly, MA 01915, USA, カタログ番号ＲＯ１０１Ｓ、Ｒ０１３６Ｓ、Ｒ０１０４Ｓ、Ｒ０１５６Ｓ）を用いて３７℃で別個の１００μｌの反応で一晩消化させることによって製造した。消化後に、これらの酵素を８０℃で１０分間インキュベートすることによって不活性化させた。ＤＮＡを水中１μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、かつ次いで３０ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Promega Corporation, カタログ番号Ｍ１８０１）及び１×リガーゼバッファーと一緒に１ｍｌの容量で１６℃において１６時間インキュベートした。
【０１８６】
この低濃度では分子内ライゲーションが優勢であり、その際、ＤＮＡ環が生じる。ライゲーション後にＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Qiagen Inc., カタログ番号２８１０４）で浄化し、かつ３０μｌの最終容量の１０ｍＭのトリスで溶出させた。容量を蒸発によって１０μｌに減らした。
【０１８７】
ｉｉｉ）ポリメラーゼ連鎖反応
各消化物からライゲーションされたＤＮＡの５μｌのアリコート（約３００ｎｇのＤＮＡに相当する）をＰＣＲにおける鋳型として使用した。反応混合物は１×ＬＡ ＰＣＲバッファーＩＩ（PanVera Corporation, 545 Science Drive, Madison,WI 53711 USA, カタログ番号ＲＲ００２Ｍ）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．６ｍＭのｄＮＴＰ（Pan Vera Corporation, カタログ番号ＲＲ００２Ｍ）、０．２μＭの配列番号４のプライマー、０．２μＭの配列番号５のプライマー、１．２５ＵのＴＡＫＡＲＡ ＬＡ ＴＡＱポリメラーゼ（PanVera Corporation, カタログ番号ＲＲ００２Ｍ）を２５μｌに水中に含有した。９６℃での３．０分の最初の変性工程の後に、（１）９４℃で３０秒の変性工程；（２）６１℃で１５秒のアニーリング工程；及び（３）６８℃で７分間の伸長工程；引き続いての７２℃で５分間の最後の伸長工程からなるＰＣＲサイクルを３５回繰り返した。
【０１８８】
１μｌの増幅生成物を直接、配列番号６及び７のプライマーによる二重ネステッド増幅の３０サイクルのために、反応容量が５０μｌであること以外は前記と同じ条件で使用した。
【０１８９】
最初のネステッド増幅と二重ネステッド増幅の両者からの１５μｌの反応物を０．７％のアガロースゲル上に流し、これを次いでエチジウムブロマイドで染色し、かつ紫外光下に可視化させた。ＳａｃＩで消化されたＤＮＡの増幅から生じた産物を分析のために選択した。それというのも最初の増幅反応は約７．５ｋｂの単一の偽のバンドをもたらし、かつネステッド増幅は期待されるより僅かに小さいより多量のＤＮＡをもたらすからである。ネステッド増幅からの産物を前記のようにクローニング及び配列決定した。得られたＤＮＡ断片（配列番号８）はＢＬＡＳＴアルゴリズム（アルトシュル他、１９９０）のヴァージョン２．０を使用する類似性に関するＤＮＡ及びタンパク質のデータベースの調査によって示されるようにヒトＥＧＦ（ベル他, 1986; Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｘ０４５７１）に対して高いホモロジーを有する。該断片は４８３ヌクレオチドのイントロン、エキソン１９、１３２０塩基対の前記に定義されたイントロン、エキソン２０、５ｋｂのイントロン及び１５８ヌクレオチドのエキソン２１を含み、従ってこの断片は前記に定義された配列と成熟ｂＥＧＦタンパク質の残りの部分をコードする配列を含む付加的な配列と配列ホモロジーを有する。
【０１９０】
例４  −  ウシのゲノム中のＥＧＦ遺伝子のコピー数を測定するためのサザンブロット
ｉ）ナイロンメンブレンへのＤＮＡのトランスファー
ウシのゲノム中のＥＧＦ遺伝子のコピー数を測定するために、ウシのゲノムＤＮＡのサザンブロットを配列番号３の断片とハイブリダイズさせた。
【０１９１】
簡単に、３５μｇのウシのゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｃＩ及びＸｂａＩ（New England BioLabs Inc., カタログ番号Ｒ０１３６Ｓ、ＲＯｌＯＩＳ、Ｒ０１０４Ｓ、Ｒ０１５６Ｓ、Ｒ０１４５Ｓ）で別個の反応において一晩消化させた。消化されたＤＮＡを０．７％のアガロースゲル中で３０Ｖにおいて１６時間分離させ、かつ該ゲルを染色した。ゲル写真を撮影した後に、該ＤＮＡを０．２ＮのＨＣｌ中でゲルを１０分間浸漬させることによって脱プリンさせ、次いで１．５ＭのＮａＣｌ／０．５ＮのＮａＯＨ中で緩慢な撹拌を伴って３回の１５分間の洗浄によって変性させた。次いで該ゲルを１．５ＭのＮａＣｌ／１ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で３回の１０分間の洗浄によって中和させた。
【０１９２】
次いでＤＮＡを正に荷電したナイロンメンブレン（Roche Molecular Biochemicals, カタログ番号１４１７２４０）にトランスファーバッファーとして１０×ＳＳＣを用いて上昇毛細管現象によってトランスファーした。
【０１９３】
２４時間後にメンブレンをブロッティング紙の間に載置し、かつ８０℃で３時間焼き付けた。
【０１９４】
ｉｉ）プローブ製造
２５ｎｇの配列番号３の断片を５０μｌＣｉの３２ＰｄＣＴＰ（Amersham Pharmacia Biotech, 500 Morgan Boulevard, Baie d'Urfe, QCH9X-3V1, Canada, カタログ番号ＰＢ１０２０５-250μCi）でランダム標識キット（Roche Molecular Biochemicals, カタログ番号１００４７６０）を用いて標識した。該プローブをＮＵＣ−ＴＲＡＰカラム（Stratagene,11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, USA, カタログ番号４００７０１）を使用して精製した。
【０１９５】
ｉｉｉ）プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄及びオートラジオグラフィー
メンブレンを２×ＳＳＣ中で１５分間事前に湿らせた。プレハイブリダイゼーションを１０ｍｌの５０％の脱イオンされたホルムアミド、１％ＳＤＳ、１ＭのＮａＣｌ、１０％の硫酸デキストラン及び１ｍｇの変性されたサケ精子ＤＮＡの容量中で回転ハイブリダイゼーションオーブン中で１時間４２℃において実施した。該プローブを次いでプレハイブリダイゼーションバッファーに添加し、かつハイブリダイゼーションを４２℃で１２時間実施した。
【０１９６】
メンブレンを１００ｍｌの２×ＳＳＣ／１％ＳＤＳ中で室温３０分間で２回洗浄し、２００ｍｌの０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６０℃において１時間で２回洗浄し、かつ２００ｍｌの０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で６０℃において３０分間で２回洗浄した。
【０１９７】
メンブレンを３日間、ＫＯＤＡＫ ＢＩＯ−ＭＡＸ ＭＳフィルム（Kodak Canada, 3500 Eglinton Avenue West, Toronto, ON M6M1V3, Canada, カタログ番号１４３５７２６）に曝した。
【０１９８】
例５  −  ｃＤＮＡ単離
得られたゲノム配列が転写されることを確認するために、相応のｃＤＮＡをクローニングした。１μｇのウシ腎臓ｍＲＮＡ（Clontech, 1020 East Meadow Circle, Palo Alto, CA 94303-4230, USA, カタログ番号６８２４−１）を１０ピコモルの配列番号１４のプライマーで、１×逆転写バッファー、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのｄＮＴＰミックス、４０ＵのＲＮＡアーゼインヒビター及び１５Ｕのサーモスクリプト（Thermoscript）逆転写酵素（Life Technologies, カタログ番号１１１４６−０２４）を用いて５５℃で１時間逆転写させた。
【０１９９】
逆転写酵素を８５℃で５分間において失活させ、１００ＵのＲＮＡアーゼＨを添加し、かつ該反応物を３７℃で２０分間インキュベートし、かつ次いで７０℃で１０分間加熱した。ｃＤＮＡをＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Qiagen Inc., カタログ番号２８１０４）を用いて浄化した。
【０２００】
５μｌの逆転写反応物を、１×ＰＣＲバッファー（１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する）、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．４μＭの配列番号１６のプライマー、０．４μＭの配列番号１４のプライマー及び０．６２５ＵのＴＡＫＡＲＡ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（PanVera Corporation, カタログ番号ＴＡＫＲＯＯ１Ｂ）及び水を２５μｌまで含有するＰＣＲ反応物中で鋳型として使用した。９４℃での４分間の最初の変性工程の後に、（１）９４℃で３０秒間の変性工程；（２）５９℃で３０秒間のアニーリング工程；及び（３）７２℃で３０秒間の伸長工程；引き続いての７２℃での１０分間の最後の伸長工程からなるＰＣＲサイクルを５５回繰り返した。
【０２０１】
１５μｌを１．８％のアガロースゲルに流し、これを次いでエチジウムブロマイドで染色し、かつ紫外光下に可視化させた。該反応からの幾つかの産物をアガロースゲル上で観察した。４００ｂｐより僅かに大きいバンドをゲルから切り出し、精製し、かつ該ＤＮＡを２つの別個のＰＣＲ反応のための鋳型として使用し：一方は配列番号１６及び１２のプライマーをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ使用し、かつ他方で配列番号１５及び１４のプライマーをフォワードプライマー及びリバースプライマーとしてそれぞれ使用した。条件は３５回だけのサイクルを実施すること以外は前記と同じであった。得られた断片をクローニング及び配列決定し（配列番号１７及び１８）、かつ該配列はＢＬＡＳＴアルゴリズムのヴァージョン２．０（アルトシュル他, 1997）を使用する相応のゲノム配列に対して９８％相同であることが判明した。
【０２０２】
例６  −  ウシＥＧＦ成熟タンパク質のＥ．コリ及びＰ．パストリスにおける過剰発現
ｉ）イントロンを有さない成熟のウシＥＧＦ成熟タンパク質をコードする配列の増幅
成熟のウシＥＧＦタンパク質の過剰発現のための配列を製造するために、この配列を分ける５ｋｂのイントロンを分離する必要があった。タンパク質のＮ末端をコードする配列を配列番号６及び１２のプライマーで増幅させ、一方でタンパク質のカルボキシ末端をコードする配列を配列番号１３及び１４のプライマーで別個の反応において増幅させた。５ユニットのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene, カタログ番号６００１５３）を１．５ｍＭのＭｇＣｌ２の存在下に９４℃で４分間の最初の変性工程のために使用し、引き続きＰＣＲサイクルを３０回繰り返し、該サイクルは（１）９４℃で３０秒の変性工程；（２）５７℃で３０秒のアニーリング工程；及び（３）７２℃で３０秒の伸長工程；引き続いての７２℃で１０分の最後の伸長工程からなる。
【０２０３】
ＰＣＲ反応物を１．８％のアガロースゲル上に流し、エチジウムブロミドで染色し、かつ該産物をＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Qiagen Inc., カタログ番号２８７０４）を使用して精製し、かつ１μｌの各産物を、２つの断片を結合する一本鎖の合成のための鋳型として使用した。これを、配列番号６及び１５のプライマー（これはＮ末端断片の３′末端とカルボキシ断片の５′末端に重複している）を用いてフォワード方向に増幅させることによって達成した。一本鎖生成物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Qiagen Inc., カタログ番号２８１０４）を用いて浄化し、かつ５０μｌで溶出させた。１μｌの溶出物を配列番号６及び１４のプライマーを用いる増幅のための鋳型として使用した。
【０２０４】
２９２ｂｐの産物を１．５％のアガロースゲルから精製し、かつ例２に記載されるようにｐＧＥＭＴ−ＥＡＳＹ ＴＡクローニングベクター（Promega Corporation, カタログ番号Ａ１３６０）にクローニングした。
【０２０５】
ｉｉ）Ｅ．コリ発現ベクターの構築
多くのＥ．コリ発現ベクターは市販されており、かつ組み換えｂＥＧＦを製造するために使用できる。本願で該構築物を、Ｔ５プロモーター転写−翻訳系をベースとし、かつＥＧＦのような短いペプチドをタンパク質分解から保護するマウスのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）融合タンパク質の発現のために設計されたベクターｐＱＥ４０（Qiagen Inc., カタログ番号３２９１５）を用いて製造した。ｌａｃリプレッサーはＴ５プロモーターを抑制するが、イソプロピル−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加はｌａｃリプレッサーを不活性化し、引き続き組み換えタンパク質の発現を誘導する。
【０２０６】
成熟ＥＧＦタンパク質をコードし、かつｐＧＥＭＴ−ＥＡＳＹ ＴＡクローニングベクター（Promega Corporation, カタログ番号Ａ１３６０）中にクローニングされた配列を配列番号１８及び１９のオリゴヌクレオチドプライマーで増幅させた。
【０２０７】
かかるプライマーを、得られた産物をｐＱＥ４０にクローニングするのを容易にするために適当な制限部位（配列番号１８のプライマーのためのＳｐｈＩ及び配列番号１９のプライマーのためのＨｉｎｄＩＩＩ）を有するように設計した。配列番号１８のプライマーはＸａ因子のための認識部位をコードする配列も含有する。増幅された産物をＳｐｈＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、かつ同様に分解されたｐＱＥ４０にライゲーションした。
【０２０８】
ｉｉｉ）Ｅ．コリの形質転換及びｂＥＧＦの発現
構築物ｐＱＥ４０：：ｂＥＧＦを使用して熱ショック法（サムブローク他, 1989）によってコンピテントＥ．コリＭ１５［ｐＲｅｐ４］細胞（Qiagen Inc., カタログ番号３４２１０）を形質転換させた。細胞を次いで２５μｇ／ｍｌのカナマイシン及び１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢアガー上にプレーティングし、かつ３７℃で一晩増殖させた。
【０２０９】
高レベルの発現を有するクローンを同定するために、形質転換体の単コロニーを前記のような抗生物質を有する１．５ｍｌのＬＢ培地に取った。これらの少量培養を一晩増殖させ、かつ抗生物質を有する１０ｍｌのＬＢ培地に接種するために使用した。
【０２１０】
これらの培養を次いで３７℃で３０分間、激しく振盪しながら、ＯＤ６００が０．５〜０．７に達するまで増殖させた。ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度にまで添加して、組み換えタンパク質の発現を誘導し、かつ培養を更に４〜５時間増殖させた。該細胞を１５００ＲＰＭで１０分間遠心分離することによって回収し、４００μｌの細胞溶解バッファー中で再懸濁させ、かつＮｉ−ＮＴＡ（Qiagen Inc., カタログ番号３０２１０）で精製した。組み換えのＨｉｓタグを有するタンパク質をＮｉ−ＮＴＡカラム（Qiagen Inc., カタログ番号３０２１０）で精製し、かつ生成するタンパク質の量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによって見積もった。高度に発現するクローンは従って発現パラメータの確立、精製法の試験及び大規模での組み換えタンパク質の製造のために使用してよい。
【０２１１】
ｉｖ）Ｐ．パストリス発現ベクターの構築
成熟のウシＥＧＦタンパク質をコードし、かつＰ．パストリス発現ベクターへの挿入のために適当な配列をＰＣＲによって作成した。細胞外発現のための「ＥｘｔｒａＳｔｏｐ」及び「ＥｘｔｒａＴａｇ」と呼称される２つの構築物を製造した。ＥｘｔｒａＳｔｏｐ構築物をプライマーのアルファＡ ｂＥＧＦフォワード（配列番号２０）及びアルファＡ＆ＺＢ ｂＥＧＦリバース（配列番号２１）を用いて作成した。ＥｘｔｒａＴａｇ構築物をアルファＡ ｂＥＧＦフォワードプライマー及びアルファＡＦＸａ＆ｍｙｃＨＩＳリバースプライマー（配列番号２２）を用いて作成した。これらのプライマーはＰ．パストリス発現ベクター中に得られたＰＣＲ産物をクローニングするのを容易にするための制限酵素のための認識部位を有する（フォワードプライマー中のＸｈｏＩ部位及びリバースプライマー中のＸｂａＩ部位）。これらのプライマーを使用して、前記のように製造された成熟のウシＥＧＦタンパク質のコーディング配列を増幅させた。ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City CA, 94404, USA, カタログ番号Ｎ８０８−０１６０）をＰＣＲサイクルで使用し、（１）９４℃で１分間の変性工程；（２）６５℃で１分間のアニーリング工程；及び（３）７２℃で４分間の最後の伸長工程からなるＰＣＲサイクルを３５回繰り返した。
【０２１２】
ＰＣＲ産物を１．５％のアガロースゲルから精製し、かつＥ．コリ中の構築物を増殖させるためのｐＧＥＭＴ−ＥＡＳＹクローニングベクター（Promega Corporation, カタログ番号Ａ１３６０）にクローニングした。
【０２１３】
ｂＥＧＦのコーディング配列をＰ．パストリス発現ベクターに移行させるために、該構築物をｐＧＥＭＴからＸｈｏＩ及びＸｂａＩ（New England BioLabs Inc., カタログ番号Ｒ０１４６Ｓ、Ｒ０１４５Ｓ）で消化し、ゲル精製し、かつ同様に消化されたｐＰＩＣＺαＡベクター（Invitrogen Corporation, 3985 B Sorrento Valley Blvd.San Diego, CA 92121, USA, カタログ番号Ｖ１９５−２０）中にライゲーションした。ライゲーションされたＤＮＡを使用して、コンピテントのＥ．コリＭＡＸＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（Ｒ）ＤＨ５αＴＭコンピテント細胞（Life Technologies, カタログ番号１８２５８−０１２）を形質転換させ、かつ得られた形質転換体を所望の構築物の存在に関してＰＣＲによってスクリーニングした。
【０２１４】
プラスミドＤＮＡを精製し、かつそれを使用してＰ．パストリスを形質転換させた。
【０２１５】
ｖ）Ｐ．パストリスの形質転換及びｂＥＧＦ発現
Ｐ．パストリス細胞を５０ｍｌの新鮮なＹＰＤ培地（５０ｍｌ）に１〜５ｍｌの株ＧＳ１１５（Invitrogen Corporation, カタログ番号Ｋ１７１０−０１）のオーバーナイト培養を接種し、かつ２８℃において振盪しながら培養が１．２〜１．５のＯＤ６００に達するまで（約６時間）増殖させた。ＯＤ６００が１．５に等しい２０ｍｌの培養からの細胞を遠心分離によって回収し、かつ１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１ＭのＬｉＣｌ及び０．１Ｍのジチオトレイトールバッファー（ｐＨ７．４）で洗浄し、かつ１ｍｌのＴＥ／ＬｉＣｌ／ＤＴＴバッファー中に再懸濁させた。該懸濁液を３０℃で１時間インキュベートし、１ｍｌの氷冷水で１回、かつ１ｍｌの氷冷１Ｍソルビトールで１回洗浄し、かつ１６０μｌの氷冷ソルビトール中に再懸濁させ、約１０１０細胞／ｍｌの細胞濃度を得た。予めＢｓｔＸＩ（New England BioLabs Inc., カタログ番号Ｒ０１１３Ｓ）で直鎖化された発現構築物ｐＰＩＣＺα：：ｂＥＧＦ（５〜１０μｇ）を８０μｌの細胞と混合し、かつ冷却されたエレクトロポレーションキュベット（０．２ｃｍの内部電極距離）中に氷上で５分間置いた。これらの細胞を１．５ｋＶ、２０μＦ、２００ΩでＧＥＮＥ ＰＵＬＳＥＲ（Bio-Rad Laboratories, Ltd., 5671 McAdam Road, Mississauga, ON L4Z1N9, Canada, カタログ番号１６５２１０５）を用いてパルスを与えた。１ｍｌの氷冷１Ｍソルビトールを次いでキュベットに添加し、かつ得られた混合物を３０℃で１〜２時間インキュベートした。ゼオシン耐性の形質転換体を１００μｇ／ｍｌのゼオシン及び１Ｍソルビトールを含有するＹＰＤアガー上で選択した。バイオマスをゼオシン耐性クローンから、単離物をＢＭＧＹブロス中で３０℃、３００ｒｐｍで２４時間増殖させることによって製造した。細胞を遠心分離によって回収し、誘導培地（ＢＭＭＹ）中に再懸濁し、かつ更に６〜１２日間、最終濃度０．５％で無水メタノールを添加して２４時間インキュベートした。培養のアリコートを回収し、かつ分析に必要とされるまで−２０℃で貯蔵した。
【０２１６】
ｖｉ）Ｎｉ−ＮＴＡアフィニティ樹脂による発現タンパク質の精製
タグ付与されたタンパク質をＮｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen Inc., カタログ番号３０２１０）を使用して精製した。
【０２１７】
ＮＴＡマグネティックアガロースビーズ上に固定されたニッケルイオンはポリヒスチジンに対して高い親和性を有する。ｂＥＧＦ配列をＥ．コリ及びＰ．パストリスにクローニングするために使用するためのベクターは組み換えタンパク質のカルボキシ末端に（Ｅ．コリベクターに関してはＮ末端に）６個の連続したヒスチジン残基（６×タグ）をコードしている。Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（エタノール中の５０％のスラリー）の３ｍｌのアリコートを５容量（１５ｍｌ）の細胞溶解バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４中３００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）で４回洗浄した。該樹脂を３ｍｌの細胞溶解バッファー中に再懸濁し、ｐＨを０．２ＭのＮａＯＨを用いて８．０に調製した。精製タンパク質は１ｍｌの懸濁されたＥ．コリ又はＰ．パストリスの細胞と１００μｌの洗浄された樹脂とを混合することによって得られる。
【０２１８】
試料を緩慢に混合しながら４℃で３０分間インキュベートし、かつ次いで５００μｌの洗浄バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４中の３００ｍＭのＮａＣｌ及び２０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）で２回洗浄した。
【０２１９】
精製タンパク質をスラリーから１００ｍｌの溶出バッファー（５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ中の３００ｍＭのＮａＣｌ、２５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ８．０）を用いて溶出させた。Ｅ．コリ又はＰ．パストリス中に生じるｂＥＧＦからのＨｉｓタグをＸａ因子（New England BioLabs Inc., カタログ番号Ｐ８０１０Ｓ）で分解し、かつｂＥＧＦタンパク質を再びＮｉ−ＮＴＡアフィニティ樹脂（Ｈｉｓタグが樹脂に結合するにすぎない）で浄化した。組み換えタンパク質の生物学的活性を次いで細胞増殖／ＤＮＡ合成アッセイで試験した。
【０２２０】
例７  −  細胞増殖／ＤＮＡ合成アッセイ
ウシ線維芽細胞を骨格筋結合組織から単離し、かつ１０％のウマ血清（HyClone Laboratories, Inc., 1725 S. HyClone Road, Logan, UT 84321, USA,カタログ番号ＳＨ３００７４．０３）及び重炭酸ナトリウムを含有する１ｍｌのＭＥＭ（Life Technologies, カタログ番号２３７００）中で２４ウェルプレートにおいて所望の集密レベルにまで増殖させた。組み換えｂＥＧＦ又はｂＥＧＦを含有するタンパク質分画を培地に添加し、かつ細胞を３９℃で１８時間培養した。
【０２２１】
組み換えのヒトＥＧＦ（Sigma, 3050 Spruce Street, St-Louis, MO, USA, カタログ番号Ｅ９６４４）をポジティブコントロールとして使用し、ネガティブコントロールとして添加しなかった。１μＣｉ／ｍｌのトリチウムチミジン（Amersham Pharmacia Biotech, カタログ番号ＴＲＡ３１０-250μCi）を各ウェルに添加し、かつ培養を３９℃で更に１８時間インキュベートした。
【０２２２】
培地を除去した後に、細胞を２００μｌのＰＢＳで２回洗浄し、かつ次いで２００μｌの容量の０．１％のトリプシンで３９℃で約３０分間で引き離した。
【０２２３】
ピペットチップでの出し入れによって細胞を破壊した後に、１２５μｌを分離して、血球計で細胞を計数し、かつ残りに３７５μｌの氷冷２０％ＴＣＡを添加して２０分間沈殿させた。細胞を次いで１．５ｍｌの遠心分離管に移し、かつ各ウェルを、適当な管に添加された２００μｌのＰＢＳで洗浄した。該管を１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、かつ上清をシンチレーションバイアルに移した。ペレットを２００μｌの１０％ＴＣＡで洗浄し、かつ再び遠心分離した。上清を、こうして細胞によって取り込まれるが、ＤＮＡには組み込まれない標識チミジンを含有する同じシンチレーションバイアルに移した。該ペレットを４０μｌの１ＮのＮａＯＨで１０分間可溶化させ、かつ７５μｌの１ＮのＨＣｌを含有するシンチレーションバイアルに移し、かつこうしてＤＮＡに組み込まれた標識チミジンを含有した。シンチラントを全てのバイアルに添加し、これらをシンチレーション計数器（Beckman Coulter Inc., 4300 N. Harbor Boulevard, P. O.Box3100, Fullerton, CA92834-3100, USA, モデル番号ＬＳ６００１Ｃ）中で１分／試料で計数した。
【０２２４】
本明細書に挙げられる全ての文献は本発明に関連する当業者の水準の指標である。全ての文献は、それぞれ個々の文献が特にかつ個々に参照により記載されたものとすると示されるのと同程度で参照により記載されたものとする。
【０２２５】
本明細書における用語及び表現は特に記載がない限りは詳細な説明の用語として使用され、制限されるものではない。かかる用語及び表現の使用にあたり、説明されかつ記載された特徴の等価物を排除する意図はなく、その際、本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ定義されかつ制限されると認識される。
【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１Ａ】ウシＥＧＦの配列をコードするＤＮＡ（配列番号８）の部分とマウス、ブタ及びヒトからの相応のＥＧＦ配列との配列アラインメントである
【図１Ｂ】ウシＥＧＦの配列をコードするＤＮＡ（配列番号８）の部分とマウス、ブタ及びヒトからの相応のＥＧＦ配列との配列アラインメントである
【図２】成熟ｂＥＧＦタンパク質のためのＤＮＡコーディング配列（配列番号１０）と、相応のマウス（ヌクレオチド３２８２−３４４０、配列番号２７）、ブタ（ヌクレオチド３３４６−３５０４、配列番号２８）及びヒト（ヌクレオチド３３４７−３５０５、配列番号２９）の配列とのアラインメントを示している
【図３】推定されるｂＥＧＦタンパク質配列（配列番号９）と相応のマウス（残基９１９−１０６３、配列番号３０）、ブタ（残基９１２−１０５６、配列番号３１）及びヒト（残基９１２−１０５７、配列番号３２）のＥＧＦタンパク質配列とのアラインメントを示している
【図４】図４は推定される成熟ｂＥＧＦタンパク質（配列番号１１）と相応のマウス（前記９７７−１０２９、配列番号３３）、ブタ（前記９７０−１０２２、配列番号３４）及びヒト（前記９７０−１０２２、配列番号３５）の成熟ＥＧＦタンパク質とのアラインメントである
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年5月14日(2003.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウシ上皮成長因子のためのポリペプチドをコードする単離された核酸。
【請求項２】
コードされたポリペプチドが
ａ）配列番号９に記載されるアミノ酸配列；
ｂ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列；
ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列に少なくとも８０％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列、及び
ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも５５％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載の単離された核酸。
【請求項３】
コードされたポリペプチドが、配列番号９に示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項２記載の単離された核酸。
【請求項４】
コードされたポリペプチドが、配列番号９に示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項３記載の単離された核酸。
【請求項５】
コードされたポリペプチドが、配列番号９に示されるアミノ酸配列に少なくとも９５％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項４記載の単離された核酸。
【請求項６】
コードされたポリペプチドが、配列番号９に示されるアミノ酸配列に少なくとも９９％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項５記載の単離された核酸。
【請求項７】
コードされたポリペプチドが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも６０％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項２記載の単離された核酸。
【請求項８】
コードされたポリペプチドが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも６５％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項７記載の単離された核酸。
【請求項９】
コードされたポリペプチドが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項８記載の単離された核酸。
【請求項１０】
コードされたポリペプチドが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも７５％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項９記載の単離された核酸。
【請求項１１】
コードされたポリペプチドが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも８０％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項１０記載の単離された核酸。
【請求項１２】
コードされたポリペプチドが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも８５％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項１１記載の単離された核酸。
【請求項１３】
コードされたポリペプチドが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項１２記載の単離された核酸。
【請求項１４】
コードされたポリペプチドが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも９５％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項１３記載の単離された核酸。
【請求項１５】
コードされたポリペプチドが、配列番号１１に示されるアミノ酸配列に少なくとも９９％のホモロジーを有する機能的に等価なアミノ酸配列を有する、請求項１４記載の単離された核酸。
【請求項１６】
核酸が
ａ）配列番号８に示されるヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１０に示されるヌクレオチド配列及び
ｃ）配列番号８に示されるヌクレオチド配列又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列に少なくとも７５％のホモロジーを有する機能的に等価なヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する、請求項１記載の単離された核酸。
【請求項１７】
核酸が配列番号８又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列に少なくとも８０％のホモロジーを有するヌクレオチド配列を有する、請求項１６記載の単離された核酸。
【請求項１８】
核酸が配列番号８又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列に少なくとも８５％のホモロジーを有するヌクレオチド配列を有する、請求項１７記載の単離された核酸。
【請求項１９】
核酸が配列番号８又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列に少なくとも９０％のホモロジーを有するヌクレオチド配列を有する、請求項１８記載の単離された核酸。
【請求項２０】
核酸が配列番号８又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列に少なくとも９５％のホモロジーを有するヌクレオチド配列を有する、請求項１９記載の単離された核酸。
【請求項２１】
核酸が配列番号８又は配列番号１０に示されるヌクレオチド配列に少なくとも９９％のホモロジーを有するヌクレオチド配列を有する、請求項２０記載の単離された核酸。
【請求項２２】
ウシ上皮成長因子のためのポリペプチドをコードする単離された核酸の断片であって、配列番号１０に示されるヌクレオチド配列と機能的に等価なヌクレオチド配列を有する、単離された核酸の断片。
【請求項２３】
ウシ上皮成長因子のための単離されたポリペプチドの断片であって、配列番号１１に示されるアミノ酸配列と機能的に等価なポリペプチドを有する、単離されたポリペプチドの断片。
【請求項２４】
適当な宿主細胞中でウシ上皮成長因子の発現をもたらしうる発現構築物であって、宿主細胞に適合された調節配列に機能的に結合された請求項１から２１までのいずれか１項記載の核酸を有する、発現構築物。
【請求項２５】
請求項１から２１までのいずれか１項記載の核酸を有するベクター。
【請求項２６】
請求項１から２１までのいずれか１項記載の核酸を有し、細胞が該核酸によってコードされるウシ上皮成長因子のためのポリペプチドを発現しうる宿主細胞。
【請求項２７】
細胞がアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フィクーム、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・オリザエ、トリコデルマ・レエサイ、ムコール・ミエヘイ、クルイベロマイセス・ラクティク、ピチア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、エシェリキア・コリ、バチルス・サチリス又はバチルス・リケニホルミス又は植物細胞、及び哺乳動物細胞から選択される、請求項２６記載の宿主細胞。
【請求項２８】
細胞がエシェリキア・コリである、請求項２７記載の宿主細胞。
【請求項２９】
細胞がピチア・パストリスである、請求項２７記載の宿主細胞。
【請求項３０】
試料添加剤であって、
ａ）請求項１から２１までのいずれか１項記載の核酸によってコードされるウシ上皮成長因子のためのポリペプチド；
ｂ）不活性又は活性の成分と組み合わされた、請求項１から２１までのいずれか１項記載の核酸によってコードされるウシ上皮成長因子のためのポリペプチド；
ｃ）請求項１から２１までのいずれか１項記載の核酸によってコードされるウシ上皮成長因子のためのポリペプチドを発現する微生物、植物組織又は哺乳動物細胞；及び
ｄ）請求項１から２１までのいずれか１項記載の核酸によってコードされるウシ上皮成長因子のためのポリペプチドを含有する、微生物、植物組織又は哺乳動物細胞から得られる培養培地又は抽出物
からなる群から選択される調製物を含有する試料添加剤。
【請求項３１】
微生物が、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フィクーム、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・オリザエ、トリコデルマ・レエサイ、ムコール・ミエヘイ、クルイベロマイセス・ラクティク、ピチア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、エシェリキア・コリ、バチルス・サチリス又はバチルス・リケニホルミスから選択される、請求項３０記載の試料添加剤。
【請求項３２】
微生物がエシェリキア・コリである、請求項３１記載の試料添加剤。
【請求項３３】
微生物がピチア・パストリスである、請求項３１記載の試料添加剤。
【請求項３４】
ウシ上皮成長因子のポリペプチドと組み合わされた飼料又は請求項１から１５までのいずれか１項記載のウシ上皮成長因子のポリペプチドで処理された飼料を含有する、飼料組成物。
【請求項３５】
ウシ上皮成長因子のポリペプチドが粉末又は液体の形である、請求項３４記載の飼料組成物。
【請求項３６】
飼料がトウモロコシ、穀類、モロコシ、小麦、大麦、オート麦、植物性タンパク質ミール、牧草、干し草、緑蔵飼料及びトウモロコシ飼料から選択される、請求項３５記載の飼料組成物。
【請求項３７】
ウシ上皮成長因子活性を有するポリペプチドを製造するための方法において、
ａ）請求項１から２１までのいずれか１項記載の核酸を有する宿主細胞を、該核酸によってコードされるポリペプチドの発現に誘導的な条件下に培養し、かつ
ｂ）コードされるポリペプチドを、宿主細胞、宿主細胞を含有する培養培地又は宿主細胞から得られる抽出物から回収するウシ上皮成長因子活性を有するポリペプチドを製造するための方法。
【請求項３８】
宿主細胞がアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フィクーム、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・オリザエ、トリコデルマ・レエサイ、ムコール・ミエヘイ、クルイベロマイセス・ラクティク、ピチア・パストリス、サッカロマイセス・セレビシエ、エシェリキア・コリ、バチルス・サチリス又はバチルス・リケニホルミス又は植物細胞、及び哺乳動物細胞から選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
宿主細胞がエシェリキア・コリである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
宿主細胞がピチア・パストリスである、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
核酸が植物細胞のゲノムに組み込まれるように核酸を植物細胞に導入することによって、請求項１から２１までのいずれか１項記載の核酸を発現する植物を製造するための方法。
【請求項４２】
植物がキャノーラ、大豆、トウモロコシ及びポテトから選択される、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
動物の成長を改善するために動物に投与するためのウシ上皮成長因子のためのポリペプチドの使用。
【請求項４４】
ポリペプチドが請求項１から１５までのいずれか１項記載のポリペプチドから選択される、請求項４３記載の使用。
【請求項４５】
動物がブタ、仔ブタ、ウシ、仔ウシ、ヤギ、仔ヤギ、ヒツジ及び仔ヒツジから選択される、請求項４４記載の使用。
【請求項４６】
動物がウシ又は仔ウシである、請求項４５記載の使用。
【請求項４７】
動物の腸内感染症を予防及び治療するために動物に投与するためのウシ上皮成長因子のためのポリペプチドの使用。
【請求項４８】
ポリペプチドが請求項１から１５までのいずれか１項記載のポリペプチドから選択される、請求項４７記載の使用。
【請求項４９】
動物がブタ、仔ブタ、ウシ、仔ウシ、ヤギ、仔ヤギ、ヒツジ及び仔ヒツジから選択される、請求項４８記載の使用。
【請求項５０】
動物がウシ又は仔ウシである、請求項４９記載の使用。
【請求項５１】
感染症が白痢、腸病原性大腸菌感染症及びランブル鞭毛虫症から選択される、請求項４９記載の使用。
【請求項５２】
腸病原性大腸菌感染症が腸内大腸菌病である、請求項５１記載の使用。
【請求項５３】
動物が仔ウシである、請求項５２記載の使用。
【国際調査報告】
2004536589.tif 000079
2004536589.tif 000080
2004536589.tif 000081
2004536589.tif 000082