(57)【要約】本発明は、容易に検出可能な生物学的マーカーの血清濃度を用いることによる、患者、特にＣ型肝炎ウイルスに感染した患者における炎症性、繊維性または癌性の疾患の進展を検出するための新規な診断に関する。本発明は、この方法を実行するための診断キットにも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の炎症性、繊維性または癌性の疾患の診断方法であって、
ａ）　患者の血清または血漿中の生化学マーカーの値を測定し、
ｂ）　前記マーカーを含むロジスティック関数によって、前記値を組合わせて、
ｃ）　前記ロジスティック関数の限界値を分析して、患者における肝繊維症および／または肝壊死炎症性病変の存在を測定する
段階を含んでなる、方法。
【請求項２】
疾患が肝繊維症および／または肝壊死炎症性病変の存在である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ロジスティック関数が、
ｉ）　疾患の拡張にしたがって、様々な群の患者を分類し、
ｉｉ）　一次元分析によってこれらの群の間で有意に異なる因子を同定し、
ｉｉｉ）　ロジスティック回帰分析を行って、繊維症および／または肝壊死炎症性病変の診断の目的でマーカーの独立した特有の値を評価し、
ｉｖ）　これらの同定した独立因子を組合せることによって、ロジスティック関数を構築する、
ことによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも４種類の生化学マーカーを段階ａ）において検討する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記マーカーが、α２−マクログロブリン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＧＧＴ、γ−グロブリン、総ビリルビン、アルブミン、α１−グロブリン、α２−グロブリン、ハプトグロビン、β−グロブリン、アポＡ１、ＩＬ１０、ＴＧＦ−β１、アポＡ２、アポＢからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ロジスティック関数が更に患者の年齢および性別を考慮に入れる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
繊維症の診断に用いる測定した前記生化学マーカーが、α２−マクログロブリン、ＧＧＴ、γ−グロブリン、総ビリルビン、（α２−グロブリンまたはハプトグロビン）、およびアポＡ１を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
壊死炎症性病変の存在の診断に用いる測定した前記生化学マーカーが、α２−マクログロブリン、ＧＧＴ、γ−グロブリン、（ＡＬＴまたはＡＳＴ）、およびアポＡ１を包含する、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
ロジスティック関数が、下記ｆ１〜ｆ５からなる群より選択される、請求項２に記載の方法：
ｆ１＝ａ１×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−ａ２×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋ａ３×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋ａ４×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋ａ５×［年齢（才）］＋ａ６×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−ａ７×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋ａ８×［性（女性＝０，男性＝１）］−ａ９
（式中、
ａ１は６．５〜６．９であり、
ａ２は０．４５０〜０．４８５であり、
ａ３は１．１００〜１．３００であり、
ａ４は０．０７００〜０．０７５０であり、
ａ５は０．０２６５〜０．０３００であり、
ａ６は１．４００〜１．７００であり、
ａ７は０．９００〜１であり、
ａ８は０．３００〜０．４５０であり、かつ
ａ９は４．２００〜４．７００である）；
ｆ２＝ｂ１×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−ｂ２×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋ｂ３×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋ｂ４×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋ｂ５×［年齢（才）］＋ｂ６×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−ｂ７×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋ｂ８×［性（女性＝０，男性＝１）］＋ｂ９［アルブミン（ｇ／ｌ）］＋ｂ１０［α１−グロブリン（ｇ／ｌ）］−ｂ１１［β２−グロブリン（ｇ／ｌ）］２．１８９−ｂ１２×Ｌｏｇ［ＡＬＴ（ＩＵ／ｌ）］−ｂ１３
（式中、
ｂ１は９．９〜１０．２であり、
ｂ２は０．７〜０．７７であり、
ｂ３は２〜２．４であり、
ｂ４は０．１〜０．２であり、
ｂ５は０．０４〜０．０７であり、
ｂ６は４〜４．６であり、
ｂ７は２〜２．５であり、
ｂ８は０．２８〜０．３２であり、
ｂ９は０．０２５〜０．０４であり、
ｂ１０は２〜２．２であり、
ｂ１１は０．１〜０．１６であり、
ｂ１２は０．７〜０．９であり、かつ
ｂ１３は１２〜１４である）；
ｆ３＝ｃ１×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−ｃ２×［β２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋ｃ３×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋ｃ４×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］−ｃ５×［年齢（才）］＋ｃ６×Ｌｏｇ［ＡＬＴ（ＩＵ／ｌ）］−ｃ７×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］−ｃ８×［性（女性＝０，男性＝１）］−ｃ９
（式中、
ｃ１は３．４５〜３．６５であり、
ｃ２は０．３〜０．４であり、
ｃ３は０．８〜１であり、
ｃ４は０．０７５〜０．０９であり、
ｃ５は０．００１５〜０．００３であり、
ｃ６は２．１〜２．５であり、
ｃ７は１．５５〜１．７５であり、
ｃ８は０．３５〜０．４５であり、かつ
ｃ９は４〜４．６である）；
ｆ４＝ｄ１×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−ｄ２×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋ｄ３×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋ｄ４×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋ｄ５×［年齢（才）］＋ｄ６×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−ｄ７×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋ｄ８×［性（女性＝０，男性＝１）］＋ｄ９Ｌｏｇ［ＡＬＴ（ＩＵ／ｌ）］−ｄ１０
（式中、
ｄ１は５．３〜６．７であり、
ｄ２は０．４５〜０．５であり、
ｄ３は０．８〜１．２であり、
ｄ４は０．０６〜０．０８であり、
ｄ５は０．００１５〜０．００２５であり、
ｄ６は１〜１．２であり、
ｄ７は１〜１．２であり、
ｄ８は０．０９〜１．１であり、
ｄ９は１．２〜１．５であり、かつ
ｄ１０は４〜５である）；
ｆ５＝ｚ１×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−ｚ２×Ｌｏｇ［ハプトグロビン（ｇ／ｌ）］＋ｚ３×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋ｚ４×［年齢（才）］＋ｚ５×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−ｚ６×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋ｚ７×［性（女性＝０，男性＝１）］−ｚ８
（式中、
ｚ１は４〜５であり、
ｚ２は１．２〜１．５であり、
ｚ３は０．９〜１．１であり、
ｚ４は０．００２６〜０．０３であり、
ｚ５は１．６〜１．９であり、
ｚ６は１〜１．３であり、
ｚ７は０．２５〜０．３５であり、かつ
ｚ８は５〜６である）。
【請求項１０】
ロジスティック関数が、下記ｆ１−ａ〜ｆ５からなる群より選択される、請求項９に記載の方法：
ｆ１−ａ＝６．８２６×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−０．４７９×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋１．２５２×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．０７０７×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．０２７３×［年齢（才）］＋１．６２８×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−０．９２５×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋０．３４４×［性（女性＝０，男性＝０）］−４．５４４；
ｆｌ−ｂ＝６．５５２×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−０．４５８×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋１．１１３×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．０７４０×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．０２９５×［年齢（才）］＋１．４７３×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−０．９７９×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋０．４１４×［性（女性＝０，男性＝１）］−４．３０５；
ｆ２＝１０．０８８×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−０．７３５×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋２．１８９×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．１３７×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．０５４６×［年齢（才）］＋４．３０１×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−２．２８４×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋０．２９４×［性（女性＝０，男性＝１）］＋０．０３１２×［アルブミン（ｇ／ｌ）］＋２．１０９×［α１−グロブリン（ｇ／ｌ）］−０．１３６×［β２−グロブリン（ｇ／ｌ）］−０．８１３×Ｌｏｇ［ＡＬＴ（ＩＵ／ｌ）］−１３．１６５；
ｆ３＝３．５１３×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−０．３５４×［β２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．８８９×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．０８２７×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］−０．００２２×［年齢（才）］＋２．２９５×Ｌｏｇ［ＡＬＴ（ＩＵ／ｌ）］−１．６７０×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］−０．４１５×［性（女性＝０，男性＝１）］−４．３１１；
ｆ４＝５．９８１×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−０．４８１×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．９６５×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．０６７９×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．０１９０×［年齢（才）］＋１．１４３×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−１．０９７×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋０．０９２×［性（女性＝０，男性＝１）］＋１．３５５×Ｌｏｇ［ＡＬＴ（ＩＵ／ｌ）］−４．４９８；
ｆ５＝４．４６７×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−１．３５７×Ｌｏｇ［ハプトグロビン（ｇ／ｌ）］＋１．０１７×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．０２８１×［年齢（才）］＋１．７３７×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−１．１８４×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋０．３０１×［性（女性＝０，男性＝０）］−５．５４０。
【請求項１１】
ロジスティック関数の限界値を用いて肝硬変を診断する、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
ロジスティック関数の限界値を用いて疾患の発生を予測する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ロジスティック関数の限界値を用いて、患者に適当な治療を選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ロジスティック関数の限界値を患者の肝生験を行うことの決定に用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
患者が、場合によっては肝硬変に進展するような肝繊維症を伴う疾患に罹っている、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
疾患が、ＢおよびＣ型肝炎、アルコール中毒、血色素症、代謝性疾患、糖尿病、肥満症、自己免疫肝疾患、原発性胆汁性肝硬変、α１−アンチトリプシン欠損症、Ｗｉｌｓｏｎ病からなる群に包含される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
疾患がＣ型肝炎ウイルス感染症である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
患者の炎症性、繊維性または癌性の疾患の診断キットであって、生化学マーカーを投薬した後、患者における炎症性、繊維性または癌性の疾患の存在を決定しうる使用説明書を含んでなる、キット。
【請求項１９】
患者の肝繊維症および／または肝壊死炎症性病変の診断キットであって、生化学マーカーを投薬した後、患者における肝繊維症および／または肝壊死炎症性病変の存在を決定しうる使用説明書を含んでなる、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、容易に検出可能な生物学的マーカーの血清濃度を用いることによって患者、特にＣ型肝炎ウイルスに感染した患者の炎症性、繊維性または癌性疾患、特に肝繊維症の拡張を検出するための新規な診断方法に関する。本発明は、この方法を実行するための診断キットにも関する。
【０００２】
背景技術
肝生験は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染した患者の管理のために、特に繊維症期（１−４）には是非とも必要であると考えられている。患者と一般の開業医にとっては、これは積極的な処置と考えることができる（５−６）。多数の研究により、肝硬変の診断のための幾つかのマーカーの重要な予測値が示されているが（６−１５）、ＨＣＶウイルスだけに感染した大きな個体群で予想される僅かな隔壁（架橋状繊維症の開始）のような初期段階の診断については、全く報告がなされていない。
【０００３】
しかしながら、肝病理学の進展においてこれらの初期段階を検出できるようにすることは、患者の治療および疾病の継続管理を向上させる上で重要である。肝生験は未だに侵襲性の処置であるので、患者の繊維症のレベルの良好な予測値が得られる迅速且つ容易に行われる検査があれば有利であろう。
【０００４】
Ｃ型肝炎ウイルスに感染した後、この疾患の進展により繊維症を生じ、後に肝硬変となる可能性がある。肝生験は繊維症の段階の決定を考慮しているが、肝壊死炎症性病変の存在も考慮している。繊維症の程度を補完するこのような病巣の強度および活性は、この疾患の進展の診断および予知、および施療のタイプを決定する上で重要な要因として医師によって認知されている。
【０００５】
従って、患者における繊維症および／または病変の存在（または非存在）の良好な予測値が得られ且つ肝生験の必要性を少なくするのに十分な信頼性のある診断法を開発することが求められている。
【０００６】
【発明の概要】
本発明は、特に有意な繊維症（僅かな隔膜から肝硬変まで）および／または肝壊死炎症性病変の診断に極めて適した患者の肝臓における、炎症性、繊維性または癌性疾患の診断のための簡単な血清生化学マーカーの組合せの予測値を予想して評価する診断方法を提供する。高い正の予測値（有意な繊維症の予測）または負の予測値に到達することにより、生験指示の数は減少することになる。これは、患者と社会にとって生験特に肝生験の費用と危険性を減少する上で有用である（６）。
【０００７】
【発明の具体的説明】
従って、本発明は、患者の炎症性、繊維性または癌性の疾患の診断方法であって、
ａ）　患者の血清中の生化学マーカーの値を測定し、
ｂ）　前記マーカーを含むロジスティック関数によって、前記値を組合わせて、
ｃ）　前記ロジスティック関数の限界値を分析して、患者における肝繊維症および／または肝壊死炎症性病変の存在を測定する
段階を含んでなる方法に関する。
【０００８】
生化学マーカーは患者の血漿で評価することもでき、この方法は、（患者の血清または血漿を採取する）任意の第一段階を用いないときには、イン・ビトロにおいてであると考えることができる。
【０００９】
特に、本発明の方法は、患者における肝繊維症および／または肝壊死炎症性病変の存在の診断に完全に適している。これは、患者の肺または腎臓における炎症性および／または繊維性疾患の診断に用いることもできる。これは、例えば肺、胸部、膀胱、結腸における癌性病変の診断にも適している。
【００１０】
ロジスティック関数は、下記の方法、すなわち
ｉ）　疾患の拡張にしたがって、様々な群の患者を分類し、
ｉｉ）　一次元分析によってこれらの群の間で有意に異なる因子を同定し、
ｉｉｉ）　ロジスティック回帰分析を行って、繊維症および／または肝壊死炎症性病変の診断の目的でマーカーの独立した特有の値を評価し、
ｉｖ）　これらの同定した独立因子を組合せることによって、ロジスティック関数を構築する（指標を構築する）
ことによって得られる。
【００１１】
定義によれば、識別による最良の指標（「繊維症スコア」）は、独立した因子を合わせるロジスティック回帰関数であった。
【００１２】
ロジスティック関数は、マーカーが繊維症の段階と負の相関を含むときは、ロジスティック回帰で個々に決定したそれぞれのパラメーターの相対重量を負の符号と組み合わせることによって得られる。値が極めて大きな範囲であるマーカーについては、対数を用いる。
【００１３】
ロジスティック関数は、診断について所望される閾値によって得られるＲＯＣ曲線によって分析される。ＲＯＣ曲線を得る方法は、例に記載されている。本発明では、患者は少数の隔膜から出発する繊維症の存在によって分類されたが、多数の隔膜または肝硬変のみの患者を診断使用とするものである場合には、これは変更することができる。この結果、例に記載されているもう一つのＲＯＣ曲線が得られる。
【００１４】
患者の肝繊維症および／または肝壊死炎症性病変の存在の診断は、個体群における肝繊維症の予想有病率に関するデータによって更に正確にすることができる。
【００１５】
好ましくは、本発明による方法の段階ａ）で投与される生化学マーカーは「単純な」生化学マーカーであり、これは、生化学マーカーが当該技術分野で既に知られている方法（クロマトグラフィー、電気泳動、ＥＬＩＳＡドーシング（ｄｏｓｉｎｇ）など）によって容易に投与されることを意味する。
【００１６】
例えば、本発明の方法に完全に適するマーカーとしては、α２−マクログロブリン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ガンマ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、γ−グロブリン、総ビリルビン、アルブミン、α１−グロブリン、α２−グロブリン、ハプトグロビン、β−グロブリン、アポリポタンパク質Ａ１（アポＡ１）、ＩＬ１０、ＴＧＦ−β１、アポＡ２、アポＢが挙げられる。検討を行った疾患によっては、他のサイトカイン、または当業者に知られている特異的マーカーを用いることもできる。腎臓または膀胱疾患については、患者の尿試料について幾らかドーシングを行うのが好都合であることがある。
【００１７】
本発明の方法の特定の態様では、少なくとも４、更に好ましくは５または６、７または１０個の生化学マーカーを検討し、方法の段階ａ）で投与する。
【００１８】
好ましくは、肝繊維症の診断を目的とするときには、これらのマーカーは、α２−マクログロブリン、ＧＧＴ、γ−グロブリン、総ビリルビン、（α２−グロブリン、またはハプトグロビン）、およびアポＡ１である。α２−グロブリンは主としてハプトグロビンから構成されているα２−マクログロブリンとα２−ミクログロブリンとの和であるので、ハプトグロビンをα２−グロブリンの代わりに用いることができる。従って、α２−ミクログロブリンとハプトグロビンの相対重量は、ロジスティック関数で調整される。
【００１９】
肝壊死炎症性病変の存在の診断を目的とするときには、投与されるマーカーがα２−マクログロブリン、ＧＧＴ、γ−グロブリン、（ＡＬＴまたはＡＳＴ）およびアポＡ１を含むときが最良である。本発明の出願明細書に記載のデータはＡＳＴまたはＡＬＴが相関していることを示しているので、これらのマーカーは区別なく用いることができる。従って、一方のマーカーを他のものに代えても、相関因子を考慮したロジスティック関数の係数の平衡化が生じるだけである。
【００２０】
ロジスティック関数は、患者の年齢および性別のような他のマーカーを用いることもできる。ロジスティック関数の異なるマーカーについて得た値に用いる異なる係数は、例に記載されている通りに、統計解析によって計算することができる。
【００２１】
特に、本発明の方法の実行に用いることができる適当なロジスティック関数は、下記の通りである。
【００２２】
６個のマーカーを使用：
ｆ１＝ａ１×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−ａ２×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋ａ３×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋ａ４×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋ａ５×［年齢（才）］＋ａ６×Ｌｏｇ［ビリルビン（μｍｏｌ／ｌ）］−ａ７［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋ａ８×［性（女性＝０，男性＝１）］−ａ９
（式中、
ａ１は６．５〜６．９であり、
ａ２は０．４５０〜０．４８５であり、
ａ３は１．１００〜１．３００であり、
ａ４は０．０７００〜０．０７５０であり、
ａ５は０．０２６５〜０．０３００であり、
ａ６は１．４００〜１．７００であり、
ａ７は０．９００〜１であり、
ａ８は０．３００〜０．４５０であり、かつ
ａ９は４．２００〜４．７００である）。
【００２３】
特異的に使用可能な関数は、具体的には下記の通りである。
ｆ１−ａ＝６．８２６×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−０．４７９×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋１．２５２×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．０７０７×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．０２７３×［年齢（才）］＋１．６２８×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−０．９２５×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋０．３４４×［性（女性＝０，男性＝１）］−４．５４４；または
ｆｌ−ｂ＝６．５５２×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−０．４５８×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋１．１１３×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．０７４０×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．０２９５×［年齢（才）］＋１．４７３×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−０．９７９×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋０．４１４×［性（女性＝０，男性＝１）］−４．３０５ ；
【００２４】
１０個のマーカーを使用：
ｆ２＝ｂ１×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−ｂ２×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋ｂ３×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋ｂ４×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋ｂ５×［年齢（才）］＋ｂ６×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−ｂ７×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋ｂ８×［性（女性＝０，男性＝１）］＋ｂ９［アルブミン（ｇ／ｌ）］＋ｂ１０［α１−グロブリン（ｇ／ｌ）］−ｂ１１［β２−グロブリン（ｇ／ｌ）］２．１８９−ｂ１２×Ｌｏｇ［ＡＬＴ（ＩＵ／ｌ）］−ｂ１３
（式中、
ｂ１は９．９〜１０．２であり、
ｂ２は０．７〜０．７７であり、
ｂ３は２〜２．４であり、
ｂ４は０．１〜０．２であり、
ｂ５は０．０４〜０．０７であり、
ｂ６は４〜４．６であり、
ｂ７は２〜２．５であり、
ｂ８は０．２８〜０．３２であり、
ｂ９は０．０２５〜０．０４であり、
ｂ１０は２〜２．２であり、
ｂ１１は０．１〜０．１６であり、
ｂ１２は０．７〜０．９であり、かつ
ｂ１３は１２〜１４である）。
【００２５】
特異的に使用可能な関数は、下記の通りである。
ｆ２＝１０．０８８×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−０．７３５×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋２．１８９×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．１３７×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．０５４６×［年齢（才）］＋４．３０１×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−２．２８４×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋０．２９４×［性（女性＝０，男性＝１）］＋０．０３１２［アルブミン（ｇ／ｌ）］＋２．１０９［α１−グロブリン（ｇ／ｌ）］−０．１３６［β２−グロブリン（ｇ／ｌ）］−０．８１３×Ｌｏｇ［ＡＬＴ（ＩＵ／ｌ）］−１３．１６５。
【００２６】
有意な活性を測定するために６個のマーカーを使用：
ｆ３＝ｃ１×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−ｃ２×［β２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋ｃ３×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋ｃ４×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］−ｃ５×［年齢（才）］＋ｃ６×Ｌｏｇ［ＡＬＴ（ＩＵ／ｌ）］−ｃ７×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］−ｃ８×［性（女性＝０，男性＝１）］−ｃ９
（式中、
ｃ１は３．４５〜３．６５であり、
ｃ２は０．３〜０．４であり、
ｃ３は０．８〜１であり、
ｃ４は０．０７５〜０．０９であり、
ｃ５は０．００１５〜０．００３であり、
ｃ６は２．１〜２．５であり、
ｃ７は１．５５〜１．７５であり、
ｃ８は０．３５〜０．４５であり、かつ
ｃ９は４〜４．６である）。
【００２７】
特異的な使用可能な関数は、特に下記の通りである：
ｆ３＝３．５１３×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−０．３５４×［β２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．８８９×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．０８２７×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］−０．００２２×［年齢（才）］＋２．２９５×Ｌｏｇ［ＡＬＴ（ＩＵ／ｌ）］−１．６７０×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］−０．４１５×［性（女性＝０，男性＝１）］−４．３１１。
【００２８】
有意な繊維症または有意な活性の診断のために７個のマーカーを使用：
ｆ４＝ｄ１×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−ｄ２×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋ｄ３×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋ｄ４×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋ｄ５×［年齢（才）］＋ｄ６×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−ｄ７×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋ｄ８×［性（女性＝０，男性＝１）］＋ｄ９Ｌｏｇ［ＡＬＴ（ＩＵ／ｌ）］−ｄ１０
（式中、
ｄ１は５．３〜６．７であり、
ｄ２は０．４５〜０．５であり、
ｄ３は０．８〜１．２であり、
ｄ４は０．０６〜０．０８であり、
ｄ５は０．００１５〜０．００２５であり、
ｄ６は１〜１．２であり、
ｄ７は１〜１．２であり、
ｄ８は０．０９〜１．１であり、
ｄ９は１．２〜１．５であり、かつ
ｄ１０は４〜５である）。
【００２９】
特異的な使用可能な関数は、下記の通りである：
ｆ４＝５．９８１×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−０．４８１×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．９６５×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．０６７９×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．０１９０×［年齢（才）］＋１．１４３×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−１．０９７×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋０．０９２×［性（女性＝０，男性＝１）］＋１．３５５Ｌｏｇ［ＡＬＴ（ＩＵ／ｌ）］−４．４９８。
【００３０】
有意な繊維症の診断のため、５個のマーカーを使用：
ｆ５＝ｚ１×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−ｚ２×Ｌｏｇ［ハプトグロビン（ｇ／ｌ）］＋ｚ３×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋ｚ４×［年齢（才）］＋ｚ５×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−ｚ６×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋ｚ７×［性（女性＝０，男性＝１）］−ｚ８
（式中、
ｚ１は４〜５であり、
ｚ２は１．２〜１．５であり、
ｚ３は０．９〜１．１であり、
ｚ４は０．００２６〜０．０３であり、
ｚ５は１．６〜１．９であり、
ｚ６は１〜１．３であり、
ｚ７は０．２５〜０．３５であり、かつ
ｚ８は５〜６である）。
【００３１】
特異的な使用可能な関数は、下記の通りである：
ｆ５＝４．４６７×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−１．３５７×Ｌｏｇ［ハプトグロビン（ｇ／ｌ）］＋１．０１７×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．０２８１×［年齢（才）］＋１．７３７×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−１．１８４×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋０．３０１×［性（女性＝０，男性＝０）］−５．５４０。
【００３２】
実際に、様々な関数の係数に対する多数の定義は、検討を行う患者の数および特徴によって若干変動することができる（約１０〜１５％）。従って、異なるマーカーの係数について与えられる値は、本発明の範囲を減少することなく若干異なるものであることができると解釈されなければならない。
【００３３】
生物学的マーカーについて測定した値のロジスティック関数を用いて解析することによって得た限界値によっては、患者について肝繊維症の存在を結論づけることができる。ＲＯＣ曲線の図面における閾値として肝硬変を見なすことによって肝硬変の存在を結論づけることもできる。
【００３４】
本発明の方法は、疾患の発生の予測手段として用いることもできる。特に、患者がＣ型肝炎ウイルスに感染しているときには、感染（通常は輸血による）日を確定できることが多い。従って、診断日による疾患の発生率を測定する目的で本発明の方法を用い、疾患の将来における進展を予測することもできる。
【００３５】
本発明による診断法によって得られたデータは、疾患の病期に準じて患者の適当な治療法を選択する上で医師にとって極めて重要である可能性もある。
【００３６】
医者にかかっている患者の個体群における肝繊維症の有病率によっては、本発明の方法によって得たデータを用いて、患者の肝生験を行う必要性を決定することができる。本発明の方法により、肝生験の必要性が約５０％まで減少することが予想される。
【００３７】
本発明の方法は、肝硬変にまで進展する可能性がある肝繊維症などの任意の疾患に罹っている患者に用いようとするものである。特に、本発明の方法は、ＢおよびＣ型肝炎、アルコール中毒、血色素症、代謝性疾患、糖尿病、肥満症、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、α１−アンチトリプシン欠損症、Ｗｉｌｓｏｎ病からなる群に包含される疾患に罹っている患者で肝繊維症を検出する目的で有利に行われる。
【００３８】
本発明の方法は、肝炎ウイルス、特にＣ型肝炎ウイルスに感染した患者で最も良好に行われる。
【００３９】
本発明はまた、患者の炎症性、繊維性または癌性の疾患の診断キットであって、生化学マーカーを投薬した後、患者における炎症性、繊維性または癌性の疾患の存在を決定しうる使用説明書を含んでなる、キットに関する。
【００４０】
本発明はまた、患者の肝繊維症および／または肝壊死炎症性病変の診断キットであって、生化学マーカーを投薬した後、患者における肝繊維症および／または肝壊死炎症性病変の存在を決定しうる使用説明書を含んでなる、キットに関する。
【００４１】
使用説明書は、生化学マーカーの投薬量を決定した後に用いなければならないロジスティック関数を含んでなることがある。これは、印刷されたサポートとしても、ソフトウエアのようなコンピューターで使用可能なサポートとして出版される可能性がある。この使用説明書は、ロジスティック関数から得られる限界値を分析するための検討を行う閾値によってはＲＯＣ曲線を含んでなることもある。それらは、患者個体群における繊維症の予想有病率によっては、予測値を得る様々な表を含んでなることもある。
【００４２】
本発明による診断キットは、目的とする生物学的マーカーを投薬できる要素を含むこともある。
【００４３】
本発明の方法は、容易に自動化し、マーカーの投薬を自動的に行い、データをコンピューターまたはロジスティック関数の値を計算してＲＯＣ曲線を用いてこれを解析し、最終的に患者個体群における肝繊維症の有病率を解析する計算機に送ることができる。従って、医師によって得られるデータは一層容易に解釈可能となり、生験の必要性または処方すべき適正な治療法を決定する過程が改良される。
【００４４】
下記の例は、発明の態様を説明し、本発明の方法を反復するための方法を得ることを意味するが、発明を制限するものではない。
【００４５】
【実施例】
例１：　患者および方法
１．１．患者
検討に含まれる患者は、単一センターのコホートに属した（ＤＯＳＶＩＲＣ）。このコホートは、１９９３年以前および以後のＰｉｔｉｅ−Ｓａｌｐｅｔｒｉｅｒｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、パリ、フランス国の肝および消化器ユニットで追跡した総てのＣ型肝炎患者を包含した（１６）。社会人口統計学的管理データ、危険因子、および来診時毎の臨床的、生物学的、ウイルス学的および治療項目など１２９項目、および肝生験を行ったときの組織学的データを含む特定の質問票を、患者毎に記入した。ＨＣＶ感染の期間を輸血または非経口的供給源に最初に暴露した日から推定したが、散発性感染患者や感染源が不明な患者については算出することができなかった。除外基準は、ＨＢｓＡｇまたはＨＩＶ陽性抗体の存在であった。１９９７年８月から２０００年３月まで、ＰＣＲにより検出可能なＨＣＶを有する肝生験を行う総ての情報を知らされた患者が予め包含され、血液試料を生験の当日に採取した。除外基準は、ＨＩＶ、ＨＢＶ、他の肝疾患への同時感染、および解釈不能な肝生験であった。
【００４６】
解析は第一期について行い（初年のトレーニング期、患者数２０６）、第二期で確認した（確認期、患者数１５６）（表１）。
もう一つの解析は、トレーニング期の１名の患者と確認期の２２名の患者を除外した後に行った（表４）。
【００４７】
１．２．血清マーカー
下記の１１項目の試験を、２つの期間について評価した：α２−マクログロブリン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＧＧＴ、総ビリルビン、アルブミン、αｌ−、α２−、β−およびγ−グロブリン、アポＡｌ。α２グロブリン（主としてα２−マクログロブリンおよびハプトグロビンからなる）の独立した診断値を説明するため、ハプトグロビンの遡及評価を２期間について行った。
【００４８】
ＩＬ１０、ＴＧＦ−β１、アポＡ２、およびアポＢは、第二期のみについて評価した。
ＡＳＴ、ＡＬＴ、ＧＧＴ、総ビリルビンは、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ試薬（Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ国）を用いてＨｉｔａｃｈｉ ９１７自動分析装置によって評価した。
【００４９】
アルブミンは、自動分析装置Ｈｙｄｒａｓｙｓ ａｎｄ Ｈｙｒｙｓ （Ｓｅｂｉａ、Ｉｓｓｙ−Ｌｅｓ−Ｍｏｕｌｉｎｅａｕｘ、フランス国）で行った血清タンパク質電気泳動（αｌ−、α２−、β−およびγ−グロブリン画分）とは別に、ブロモクレゾールグリーン法（１７）によって評価した。
アポリポタンパク質−Ａ１、−Ａ２、−Ｂ、およびα２マクログロブリンは、血清試料（分析まで−８０℃で保存）で自動比濁計ＢＮＩＩ（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｍａｒｂｕｒｇ、ドイツ国）を用いて測定した。
血漿ＴＧＦβｌ濃度は、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＴＧＦβｌイムノアッセイ（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．、ミネアポリス、ミネソタ、米国）を用いて測定した。潜在性のＴＧＦβ１を免疫反応性形態に活性化するため、試料を酸によって活性化した後、中和した。
血漿インターロイキン１０は、イムノアッセイキット（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，マルセイユ，フランス国）を用いて測定した。
血漿試料は、分析を行うまで−８０℃で保存した（１年未満）。
【００５０】
１．３．組織学的な段階および等級の決定
肝標本の組織学的特徴を、ＭＥＴＡＶＩＲスコアリングシステムによって分析した（１８，１９）。長さが１０ｍｍを上回る肝生験を固定して、パラフィン包埋し、コラーゲンについて少なくともヘマトキシリンエオシンサフランおよびＭａｓｓｏｎ三原色またはピクロシリウスレッドで染色した。
【００５１】
それぞれの肝生験について、繊維症の段階および活性の等級を下記の基準に準じて確定した。肝生験は、０〜４の尺度で段階設定した： ０＝繊維症なし、１＝隔膜なしの肝門部繊維症、２＝少数の隔膜、３＝肝硬変のない多数の隔膜、および４＝肝硬変。この特徴は、病理学者間で極めて再現性が高いことが示されている。
【００５２】
壊死炎症性病変の強度を評価する活性の等級付けは、下記のように示した：Ａ０＝組織学的活性なし、Ａ１＝穏やかな活性、Ａ２＝中程度の活性、およびＡ３＝強い活性。ＭＥＴＡＶＩＲスコアリングシステムは、患者の特徴を知らない単一の病理学者（ＦＣ）によって評価された。
【００５３】
例２：統計分析
統計分析には、ロジスティック回帰およびＲＯＣ曲線を用いた（２０）。分析は第一期（最初の年のトレーニング期）に行い、第二期（確認期）で確認した。患者のコホートは表１および４の通り。
【００５４】
次に、最終分析を、２つの期間を合わせて全個体群について行った（表２および５参照）。
ＭＥＴＡＶＩＲスコアリングシステムに準じて、患者を数群に分けた。
主要な限界値は、有意な繊維症を有する患者（Ｆ２、Ｆ３またはＦ４）対有意な繊維症を持たない患者（Ｆ０またはＦｌ）の同定であった。
【００５５】
第二の分析では、患者を活性等級によって分類した：有意な活性を持たない患者（Ａ０またはＡｌ）および組織学的活性を有する患者（Ａ２またはＡ３）。
有意でない組織学的特徴を有する群（Ａ＜２およびＦ＜２）と有意な病変の群（Ａ＞２および／またはＦ＞２）を定義した。
最後に、広汎な繊維症または肝硬変を有する群（Ｆ３またはＦ４）も定義した。
【００５６】
第一段階は、カイ二乗、 Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ検定、またはＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いる一次元分析によってこれらの群で有意差を示す因子を同定することからなっていた。
第二段階は、繊維症の診断のためのマーカーの独立した識別値を評価するためのロジスティック回帰分析からなっていた。
第三段階は、これらの同定した独立因子を合わせる指標を構築することであった。定義によれば、識別に関する最良の指標（「繊維症スコア」）は、独立因子を合わせるロジスティック回帰関数であった。
【００５７】
これらの指標および単離した因子の診断値を、感受性、特異性、正および負の予測値、およびレシーバー操作特性によって評価した。これらの予測値を有意な繊維症の実測有病率（この検討では４０％）に対して評価したが、これより低い（１０％）またはこれより高い有病率（９０％）に対しても評価した。
【００５８】
それぞれの総合診断値を、レシーバー操作特性（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線の下の面積によって比較した。ＲＯＣ曲線は、異なる閾値（０〜１）についてのロジスティック関数に対して得られた値に準じて患者を分類した後、感受性対（１−特異性）をプロットすることによって描かれる。通常は、ＲＣＯ曲線の下の面積が０．７より大きな値を有する曲線は、診断に良好な予測曲線であると認められている。ＲＯＣ曲線は、診断法の品質を予測する曲線として認められなければならない。
【００５９】
これらの統計分析は、上記で定義した異なる群について別々に行った。
因子の数を減少させるため、６個の極めて有意なマーカーのみを合わせる分析を行った（ｆ１−ａまたはｆｌ−ｂ）。
分析の際に、α２マクログロブリンを考慮するときにはα２グロブリンが独立した診断値を有することが見られたので、α２グロブリンの第二の主成分であるハプトグロビンの診断値を遡及的に評価した。
【００６０】
タンパク質電気泳動成分を除く５個のマーカーを有する指標を、最終的にハプトグロビンと４個の他の同定されたマーカーを合わせて構築した（ロジスティック関数ｆ５）。
【００６１】
例３：ロジスティック関数の決定
総数が４２２名の慢性Ｃ型肝炎の患者を、予め包含した。
繊維症ステージングが他では不可能であったこと、または１１個のマーカーから少なくとも１個を投薬することが不可能であったことの理由により除外された数によっては（ＨＩＶ同時感染、ＨＢＶ同時感染および移植）、それぞれ表１および４に示されるように、総数３６２（最初の検討）または３３９（二番目の検討）名の慢性Ｃ型肝炎患者が検討に包含された。
第一および第二の試料の間には、患者の特徴と生化学マーカーとの間に差はなかった（表１および４）。有意な繊維症の総有病率は、組織学によって測定されたように、４０％（Ｆ０ １７〜１８％、Ｆ１ ４２〜４３％、Ｆ２ １９〜２０％、Ｆ３ ８％、Ｆ４ １２〜１３％）であった。
【００６２】
３．１．有意な繊維症の診断
１１個の生化学マーカーのそれぞれの診断値（ＲＯＣ曲線の下の面積）、並びに繊維症とのそれらの独立結合（ロジスティック回帰）を、表２および５に示す。
１０または６個の極めて有益なマーカー（α２−マクログロブリン、α２−ミクログロブリン、総ビリルビン、γ−グロブリン、アポＡ１、およびＧＧＴ）または５個のマーカー（α２−ミクログロブリン、γ−グロブリンを除外し、ハプトグロビンを包含後）、および年齢および性別を合わせる繊維症スコアは、トレーニング試料並びに確認試料について、および総個体群において高い診断値を有した（表２および５）。
トランスアミナーゼＡＬＴおよびＡＳＴは高度に相関していたので（相関係数＝０．８８）、このマーカーが必要なときにはＡＬＴのみを用いた。
【００６３】
６個のマーカー、および年齢および性別のロジスティック関数は、下記のようにして決定した：
ｆ１−ａ＝６．８２６×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−０．４７９×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋１．２５２×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．０７０７×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．０２７３×［年齢（才）］＋１．６２８×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−０．９２５×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋０．３４４×［性（女性＝０，男性＝１）］−４．５４４、または
ｆｌ−ｂ＝６．５５２×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−０．４５８×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋１．１１３×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．０７４０×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．０２９５×［年齢（才）］＋１．４７３×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−０．９７９×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋０．４１４×［性（女性＝０，男性＝０）］−４．３０５。
【００６４】
６個のマーカー、および年齢および性別のロジスティック関数は、下記のようにして決定した：
ｆ５＝４．４６７×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−１．３５７×Ｌｏｇ［ハプトグロビン（ｇ／ｌ）］＋１．０１７×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．０２８１×［年齢（才）］＋１．７３７×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−１．１８４×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋０．３０１×［性（女性＝０，男性＝１）］−５．５４０。
【００６５】
これらの関数は、ロジスティック回帰において個々に決定されたそれぞれのパラメーターの相対重量を、マーカーが繊維症の段階と負の相関を含むときには負の符号と合わせることによって得られた。極めて広範囲の値を有するマーカーについては、対数を用いた。
【００６６】
繊維症の決定のためのロジスティック関数の計算に１０個のマーカーを用いるときには、関数は下記の通りである：
ｆ２＝１０．０８８×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−０．７３５×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋２．１８９×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．１３７×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．０５４６×［年齢（才）］＋４．３０１×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−２．２８４×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋０．２９４×［性（女性＝０，男性＝１）］］＋０．０３１２［アルブミン（ｇ／ｌ）］＋２．１０９［α１−グロブリン（ｇ／ｌ）］−０．１３６［β２−グロブリン（ｇ／ｌ）］−０．８１３×Ｌｏｇ［ＡＬＴ（ＩＵ／ｌ）］−１３．１６５。
【００６７】
１０または６個の極めて有益なマーカー（図１）または１０、６または５個の極めて有益なマーカー（図３）を用いる繊維症スコアについてのＲＯＣ曲線は、同一であった。曲線の下の面積は、差がなかった。
繊維症段階による６個のマーカーの繊維症スコア分散プロットを、図２に示す。
繊維症段階による５または６個のマーカー繊維症スコア（０．００〜１．００）のボックスプロット を、図４に示す。
【００６８】
６個のマーカー繊維症スコアを用いたときには、０〜０．２０の範囲のスコア（１２５名の患者（第一の検討）、または１１９名の患者（第二の検討））については、高い負の予測値（＞９０％ Ｆ２ Ｆ３ Ｆ４の非存在）が得られ、これは患者の約３５％であり、３４〜５９才の１３名が偽陰性であった（４ Ｆ２Ａ０， ６ Ｆ２Ａ１， ３Ｆ２Ａ２）。０．８０〜１（５３名の患者（第一の検討）、または５０名の患者（第二の検討））については、高い正の予測値（＞９０％Ｆ２ Ｆ３ Ｆ４の存在）が得られ、これは患者の１５％であり、４７〜６８才の４または５名が偽陽性であった（１または２，Ｆ１Ａ１， ３ Ｆ１Ａ２）（表３および６）。
【００６９】
これらの値は、試験個体群では繊維症（Ｆ＞１）の有病率について４０％と計算された。試験個体群における繊維症の有病率が９０％または１０％であるときに考慮される予測についての値も、表３および６に示す。
【００７０】
神経結合法でも同様な結果が得られ、正確に分類した患者の比率は、トレーニング、確認および試験試料について、それぞれ７７％、７４％および７９％であった（図示せず）。
第二の試料では、ＩＬ１０、ＴＧＦＢ１、アポＡ２およびアポＢの添加により、面積曲線が０．８８９±０．０３０に若干増加したが、６個のマーカーの繊維症スコアとは差はなかった。
【００７１】
３．２． 低ＡＬＴ患者での有意な繊維症の診断（第二の検討）
総数が４３名の患者が３５ＩＵ／ｌより低いＡＬＴを有し、１０名の患者は有意な繊維症を有していた。６マーカー繊維症関数の診断値は高いままであり、ＲＯＣ曲線の下の面積は０．７５８±０．０９０であった。スコアが０．８０より大きな２名の患者は、肝硬変を有していた。スコアが０．２０より低い２９名の患者中、２５名は有意な繊維症を示さなかった。
【００７２】
３．３． 肝硬変または拡張性繊維症の診断（第一の検討）
肝硬変または拡張性繊維症の診断については、同じ６マーカー（Ｒ２＝０．３４５、Ｐ＜０．００１）を用いる繊維症スコアは極めて高いＲＯＣ曲線の下の面積０．９２９±０．０２０に達した。
この関数を用いて、高い負の予測値（＞９０％ Ｆ３Ｆ４の非存在）が０〜０．８０の範囲のスコアに対して得た（３０９名の患者、これは患者の８５％であり、２７〜７４才の３２名が偽陰性であった：１３肝硬変および１９Ｆ３）。＞０．８０のスコアについては、極めて高い正の予測値（＞８５％ Ｆ３ Ｆ４の存在）が５３名の患者で見られ、これは患者の１５％であり、４７〜６８才の８名が偽陽性であった： ４ Ｆ２および ２ Ｆ１。
【００７３】
３．４． 肝硬変または拡張性繊維症の診断（第二の検討）
肝硬変または拡張性繊維症の診断については、６マーカー（Ｒ２＝０．３４７、ｐ＜０．００１）を用いる同じ繊維症スコアは極めて高いＲＯＣ曲線の下の面積０．９２３±０．０２０に達した。
この関数を用いて、高い負の予測値（＞９０％ Ｆ３Ｆ４の非存在）が０〜０．８０の範囲のスコアに対して得た。患者総数の８５％である２８９名の患者の中、３０名が偽陰性であった：１１肝硬変および１９ Ｆ３。＞０．８０のスコアについては、極めて高い正の予測値（＞８５％ Ｆ３ Ｆ４の存在）が見られた。患者総数の１５％であるこれら５０名の患者の中、１０名が偽陽性であった： ５ Ｆ２および ５ Ｆ１。
【００７４】
３．５． 有意な活性あるいは繊維症または活性の診断（第一および第二の検討）
有意な活性（Ａ２Ａ３）の診断については、最良の最終的ロジスティック回帰により、ＡＬＴ、α２−マクログロブリン、β−グロブリン、γ−グロブリン、アポＡ１、およびＧＧＴ（Ｒ＝０．２４３、Ｐ＜０．００１）を合わせた。
【００７５】
用いたロジスティック関数は、下記の通りであった：
ｆ３＝３．５１３×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−０．３５４×［β２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．８８９×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．０８２７×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］−０．００２２×［年齢（才）］＋２．２９５×Ｌｏｇ［ＡＬＴ（ＩＵ／ｌ）］−１．６７０×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］−０．４１５×［性（女性＝０，男性＝１）］−４．３１１。
【００７６】
有意な繊維症（Ｆ２Ｆ３Ｆ４）または有意な活性（Ａ２Ａ３）の診断については、最良の最終的ロジスティック回帰により、有意な繊維症のみとＡＬＴ（Ｒ２＝０．２９０、Ｐ＜０．００１）についてと同じ６個のマーカーを合わせた。
【００７７】
この診断に用いるロジスティック関数は、下記の通りであった：
ｆ４＝５．９８１×Ｌｏｇ［α２−マクログロブリン（ｇ／ｌ）］−０．４８１×［α２−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．９６５×Ｌｏｇ［ＧＧＴ（ＩＵ／ｌ）］＋０．０６７９×［γ−グロブリン（ｇ／ｌ）］＋０．０１９０×［年齢（才）］＋１．１４３×Ｌｏｇ［ビリルビン（ｕｍｏｌ／ｌ）］−１．０９７×［アポＡ１（ｇ／ｌ）］＋０．０９２×［性（女性＝０，男性＝１）］＋１．３５５Ｌｏｇ［ＡＬＴ（ＩＵ／ｌ）］−４．４９８。
【００７８】
３．６．サイトカインと生化学マーカーの結合（第二の検討）
ＴＧＦ−β１はプラス方向にハプトグロビン（Ｒ＝０．３９、ｐ＜０．００１）と結合し、マイナス方向にα２マクログロブリン（Ｒ＝−０．２０、ｐ＝０．０２）、ビリルビン（Ｒ＝−０．３２、ｐ＜０．００１）およびＧＧＴ（Ｒ＝−０．２０、ｐ＝０．０１）と結合した。ＨＧＦはα２マクログロブリン（Ｒ＝０．４５、ｐ＝０．００６）およびＧＧＴ（Ｒ＝０．５４、ｐ＜０．００１）と結合した。ＩＬ１０は、γ−グロブリン（Ｒ＝０．２０、ｐ＝０．０１）のみと結合した。
【００７９】
例４：データの解析
得られた結果は、繊維形成には直接は関係しない５または６個の単純な生化学マーカーの組合せにより、隔膜が僅かである初期段階においても有意な繊維症の診断のための高い正または負の予測値を得ることができることを示している。
【００８０】
検討を行った試料が偏向していたりまたは最も一般的な患者の第非用例でないときには、診断法の結論は通常は弱いものである。この検討で予想される個体群の臨床的、組織学的および生化学的特徴は検討の３３ヶ月間安定であり、最近の大規模な無作為試験に含まれる個体群と同様であった（２２）。明白な代償不全肝硬変の患者は、含まれなかった。重症肝疾患の患者を包含することによって、ロジスティック関数の予測値は人工的に向上した。一方、組織学的特徴の極めて少ない患者も有意な数であり（１３〜１８％ 繊維症なし）、患者の９％はＡＬＴが３０ＩＵ／ｍｌを下回り、１３％はＡＬＴが３５ＩＵ／ｍｌを下回り、これらは通常は無作為試験に包含されないものであった。
【００８１】
繊維症スコアの診断値は、２つの期間で再現性があった（表２および５）。これらの結果を解析することにより、生験数を慢性Ｃ型肝炎の管理では５０％減少させることができると結論される。
【００８２】
実際には、患者は、繊維症段階および等級によって治療される（１〜４）。生験なしで治療せずの決定が繊維症スコア＜０．２０によって採用されたときには、１２５または１１９名の患者の１３名だけが偽陰性であった。これらの中で、肝硬変または拡張性繊維症（Ｆ３〜Ｆ４）の患者はなく、２名だけが中程度の活性を示した。生験なしでの治療の決定が繊維症スコア＞０．８０によって採用されたときには、５３名中４名または５０名中５名の患者だけが偽陽性であった。それらの中、３名の患者は中程度の活性であり、同意書によれば肝門部繊維症のみであるが、治療を正当化した。
【００８３】
これら３名の患者の２名は経静脈肝生験を行い、それぞれ１９および１３ｍｍＨｇの肝門−大静脈グラディエントの増加を示した。従って、これらの患者は実際に有意な繊維症を有する可能性が高い。
この場合には、１または２名の患者のみ（４％）を過剰に治療した。従って、このスコアは、中程度および重度の組織学的活性を有するが有意な繊維症のないほとんどの患者を検出することもできる。最後に、繊維症スコアを用いて、生験なしで肝硬変の治療を行うこともできた。
【００８４】
本発明の方法は、多数の患者の過度の治療をおこないまたは治療の必要のある患者を除外することにはならない点に留意することが極めて重要である。本出願明細書に示されているデータは、本発明による診断法の信頼性を高めている。
繊維症スコアを用いて、生験なしの肝硬変の治療を行うこともできる。従って、静脈瘤および肝細胞癌のスクリーニングを、繊維症スコアが＞０．８０の患者では推奨することができる。
【００８５】
最も有益なマーカーは、下記の低下順位のものであった：α２マクログロブリン、α２−グロブリン、ＧＧＴ、γ−グロブリン、総ビリルビン、およびアポＡ１。
【００８６】
α２−グロブリン（正常範囲 ４〜６ｇ／ｌ）はα２−マクログロブリン（１．４〜４．０ｇ／ｌ）、およびα２−ミクログロブリン：ハプトグロビン（０．４〜２ｇ／ｌ）、セルレオプラスミン（０．２〜０．４）、アンチトロンビンＩＩＩ（０．２〜０．３）、およびレチノール結合タンパク質（０．０３〜０．０７）によって構成されている（２３）。α２−グロブリンの診断値は一変量分析では見られなかったが、これは、繊維症α２−マクログロブリンの増加およびα２−ミクログロブリンの減少と関連していたからである（図５）。
【００８７】
これらのデータは、α２−ミクログロブリンの主成分であるハプトグロビンは、繊維症が増加し且つ予測因子であるときには、減少することを示している。実際に、α２−グロブリンと、主としてハプトグロビンによって構成されているα２−マクログロブリンとの差は、繊維症と強力に且つマイナス方向に結合していた（Ｒ＝−０．３３，ｐ＜０００１）。α２−ミクログロブリンの他の成分（セルレオプラスミン、アンチトロンビンＩＩＩ、およびレチノール結合タンパク質）の血清濃度はずっと低く、それらの個々の診断値は評価しなかった。
【００８８】
繊維症とα２−マクログロブリン（正の相関Ｒ＝０．４６、ｐ＜０．００１）対α２−ミクログロブリン（ハプトグロビンに富む，負の相関 Ｒ＝−０．４０）との間には、逆の相関が見られた。
【００８９】
この仮説は、５個のマーカーを有するロジスティック関数によって強化される。
【００９０】
繊維症のステージングのためのぞうかしたα２−マクログロブリンの有意な診断値は、アルコール性肝疾患の患者で既に見られている。α２−マクログロブリンは急性期タンパク質に属し、肝細胞、星状細胞、および肉芽腫細胞によって炎症および肝繊維症の部位で局所的に産生される。更に、α２−マクログロブリンは、星状細胞活性化の特徴として繊維症に特異的に関係している。α２−マクログロブリンはプロテイナーゼ阻害薬でもあり、その合成の増加により、マトリックスタンパク質の異化作用を阻害し且つ肝臓における繊維性過程を増進することができる。
【００９１】
繊維症が増加すると、ハプトグロビンが減少するので、α２−マクログロブリンと合わせたときのα２−グロブリンの予測値が説明される。ハプトグロビンは、既に観察したように、繊維症と強力且つマイナス方向に結合していた。この結合は、溶血、脾臓機能亢進症または肝機能不全とは関係していない。同様に、未抱合ビリルビンとの有意な結合は、この検討では見られなかった（データは示さず）。
【００９２】
繊維症とα２マクログロブリン（正）およびハプトグロビン（負）との逆相関は、繊維形成および急性期応答の際のＨＧＦとＴＧＦ−β１の役割が異なっていることによって説明することができた。α２−マクログロブリンについては、ＨＧＦとの強力なプラス方向の結合およびＴＧＦ−β１血清濃度との負の相関が見られた。
【００９３】
対照的に、ハプトグロビンについては、ＴＧＦ−β１で強力且つ正の相関が見られた。実験的繊維症では、ＨＧＦ遺伝子による形質導入はＴＧＦ−β１の増加を抑制し、ＨＧＦはα２−マクログロブリンの合成を刺激し、ハプトグロビンの合成を減少することが観察されている。従って、これら２種類のタンパク質は極めて有益であり、２種類の主要な繊維形成サイトカインの典型的なものであり、すなわち、α２−マクログロブリンはＨＧＦの典型的なものであり、ハプトグロビンはＴＧＦ−β１の典型的なものである。
【００９４】
繊維症と結合し且つプロトロンビンおよびアポリポタンパク質Ａ１ＰＧＡインデックスと共に用いられるＧＧＴが、数回観察されている（７−８，１３−１４，３４）。この検討では、ＧＧＴの診断値は他の因子、特にトランスアミナーゼおよびビリルビンから独立している。非肝硬変患者での総血清ビリルビンの独立した診断値については、現在のところは説明がなされていない。ＧＧＴおよびビリルビンは、いずれもＨＧＦと結合した。初期胆汁鬱帯の他に、表皮増殖因子の増加をＧＧＴ増加の一つの説明として挙げることができる。
【００９５】
γ−グロブリン血清濃度は、以前から肝硬変および門脈体静脈シャントと関連づけられている（３６）。この検討では、γ−グロブリン濃度は、肝硬変患者よりは低いが、ＦｌまたはＦ０の患者と比較して非肝硬変性繊維症患者では既に増加していることが示された。
【００９６】
繊維症と結合し且つプロトロンビンおよびＧＧＴ：ＰＧＡインデックスと共に用いられるアポＡｌ血清濃度が、数回観察されている（上記参照）。アポＡ１単独と比較して、アポ−ＡＩＩまたはアポＢの有意な追加診断値は、この検討では見られなかった。
【００９７】
繊維症段階による血清ＴＧＦ−β１の予想外の減少がこの検討で見られたが、６マーカーの組合せに有意な診断値を加えなかった。最も強力な相関は、ＴＧＦ−β１とα２−ミクログロブリンとの間で見られ（Ｒ＝０．４２、ｐ＜０．００１）、ハプトグロビンが慢性Ｃ型肝炎でのＴＧＦ−β１活性化の単純なマーカーとなり得ることを示唆している。
【００９８】
最後に、血清サイトカインの評価は、測定が一層容易で且つ一層廉価な生化学マーカーに有意な診断値を加えなかった。電気泳動化合物（α２−グロブリンおよびγ−グロブリン）の測定は、旧式の半定量評価法として考察することができる。５マーカー関数でそれらをハプトグロビンに代えたところ、同様な予測値が得られた。
【００９９】
結論として、本発明は、肝繊維症および／または炎症性病変の存在の検出に用いられる５、または６個以上の生化学マーカーの組合せを提供する。本発明で用いられるマーカーを、このような方法で患者の年齢および性別と組み合わせて、ＲＯＣ曲線の下の面積によって示される良好な予測値を得たことはなかった。
【０１００】
本発明の診断法は、マーカーの値を自動的に測定した後に自動的に解析することができ、慢性Ｃ型肝炎患者に有利に適用して、肝生験の指示を減少させることができる。
【０１０１】
【表１】
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【０１０２】
【表２】
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【０１０３】
【表３】
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【０１０４】
【表４】
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【０１０５】
【表５】
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【０１０６】
【表６】
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【０１０７】
参考文献
【化１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
６（α２−マクログロブリン、α２−ミクログロブリン、総ビリルビン、γ−グロブリン、アポＡ１、およびＧＧＴ）または１０個の生化学因子（上記の因子にアルブミン、αｌ−ミクログロブリン、β−グロブリンおよびＡＬＴを加えたもの）および年齢と性別を合わせた繊維症マーカー関数のＲＯＣ曲線を示す。曲線の下の面積には、差がない：それぞれ０．８５３±０．０２および０．８５１±０．０２。
【図２】
繊維症段階による６マーカー繊維症スコア（０．００〜１．００）の分散プロットである。
【図３】
５（α２−マクログロブリン、ハプトグロビン、総ビリルビン、アポＡｌ、およびＧＧＴ）、６（α２−マクログロブリン、α２−ミクログロブリン、総ビリルビン、γ−グロブリン、アポＡ１、およびＧＧＴ）、または１０個の生化学因子（上記の因子にアルブミン、αｌ−ミクログロブリン、β−グロブリンおよびＡＬＴを加えたもの）、および年齢および性別を合わせた繊維症マーカー関数のＲＯＣ曲線を示す。曲線の下の面積には、有意差がない：それぞれ、０．８３７±０．０２、０．８４７±０．０２および０．８５１±０．０２。
【図４ａ】
繊維症段階による繊維症スコアを示す。
ボックスの上端および下端は２５および７５百分位数点である。従って、ボックスの長さは四分位数間領域である。すなわち、ボックスはデータの中央の５０％を表している。線分が、メジアンにおけるボックスの中央を通って惹かれている（５０百分位数）。上方の隣接値は、７５百分位数＋１．５×四分位数間領域以下の最大観察値である。下方の隣接値は、２５百分位数＋１．５×四分位数間領域以上の最小観察値である。分散分析は、総ての段階間に有意差があることを示している（（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ａｌｌ−ｐａｉｒｗｉｓｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｔｅｓｔ）； ｐ＜０．００１）。
６マーカー関数 Ｆ０ ｎ＝５６ メジアン＝０．１０；Ｆ１ ｎ＝１４５ メジアン＝０．２２； Ｆ２ ｎ＝６８ メジアン＝０．４１； Ｆ３ ｎ＝２８ メジアン＝０．６６； Ｆ４ ｎ＝４２ メジアン＝０．８９。
【図４ｂ】
繊維症段階による繊維症スコアを示す。
ボックスの上端および下端は２５および７５百分位数点である。従って、ボックスの長さは四分位数間領域である。すなわち、ボックスはデータの中央の５０％を表している。線分が、メジアンにおけるボックスの中央を通って惹かれている（５０百分位数）。上方の隣接値は、７５百分位数＋１．５×四分位数間領域以下の最大観察値である。下方の隣接値は、２５百分位数＋１．５×四分位数間領域以上の最小観察値である。分散分析は、総ての段階間に有意差があることを示している（（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ ａｌｌ−ｐａｉｒｗｉｓｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ Ｔｅｓｔ）； ｐ＜０．００１）。
５マーカー関数 Ｆ０ ｎ＝５５ メジアン＝０．１４； Ｆ１ ｎ＝１３９ メジアン＝０．２１； Ｆ２ ｎ＝６４ メジアン＝０．４３； Ｆ３ ｎ＝２６ メジアン＝０．７３； Ｆ４ ｎ＝４１ メジアン＝０．８５。
【図５ａ】
図５は、繊維症段階によるα２−グロブリン、α２−マクログロブリンおよびハプトグロビンを示す。
α２−グロブリンについては、有意差は段階４と段階１および段階３の間だけであった（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの総てペアの多群比較試験；ｐ＝０．０１）。
【図５ｂ】
α２−マクログロブリンについては、段階２、３および４より低い段階０と１の値の間で有意差が見られた（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの総てペアの多群比較試験；ｐ＜０．００１）。段階２の値は、段階３および４の値より低かった（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの総てペアの多群比較試験；ｐ＜０．００１）。段階０と１の間、および段階３と４の間には有意差はなかった。
【図５ｃ】
ハプトグロビンについては、段階２、３および４より大きい段階１の値の間で有意差が見られた。段階４の値は、段階０、１および２の値より低かった（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉの総てペアの多群比較試験；ｐ＜０．００１）。段階０と１の間、および段階３と４の間には有意差はなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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