(57)【要約】本発明は、ラットＲＴＡ受容体に類似（３７％）し、睾丸、胸腺及び子宮において発現される、Ｇタンパク質共役受容体又はＧＰＣＲｘ１１に関する。ＧＰＣＲｘ１１を発現するエクオリン細胞株が、組織抽出物及び参照リガンドのスクリーニングに用いられた。ＧＰＣＲｘ１１細胞は、この細胞系統の天然又は合成アゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニングの検証を可能にする合成アンギオペプチンおよびソマトスタチン類似体で、特異的なシグナルを提供した。並行して、拡大された組織分布及びポリクローナル抗体が産生され、ＧＰＣＲｘ１１の特徴づけが容易となった。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列との７５％を越える配列同一性を示すアミノ酸配列を有するＧタンパク質共役受容体。
【請求項２】
配列番号１の配列との８０％を越える配列同一性を示すアミノ酸配列を有する、請求項１記載のＧタンパク質共役受容体。
【請求項３】
配列番号１の配列との８５％を越える配列同一性を示すアミノ酸配列を有する、請求項１記載のＧタンパク質共役受容体。
【請求項４】
配列番号１の配列との９０％を越える配列同一性を示すアミノ酸配列を有する、請求項１記載のＧタンパク質共役受容体。
【請求項５】
配列番号１の配列との９５％を越える配列同一性を示すアミノ酸配列を有する、請求項１記載のＧタンパク質共役受容体。
【請求項６】
配列番号１の配列のアミノ酸配列、またはその特異的活性部分を有するＧタンパク質共役受容体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のＧタンパク質共役受容体のアミノ酸配列のいずれかをコードしているポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の受容体またはポリヌクレオチドのアゴニスト、リバースアゴニスト、アンタゴニストもしくは阻害物質。
【請求項９】
請求項７記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項９記載のベクターによって形質転換された細胞。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の受容体をコードしている、請求項８記載のポリヌクレオチドの部分的または全体的欠失を含む、ヒトではない哺乳動物であって、好ましくは、該ポリヌクレオチドの相同組換えの「ノックアウト」を含む、ヒトではない哺乳動物、または該ポリヌクレオチドを自然のレベルを超えて過剰発現するトランスジェニックな、ヒトではない哺乳動物。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の受容体に対するアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害物質であることが既知もしくは未知である、化合物もしくは天然抽出物のスクリーニングする（検出し、おそらくは回収する）方法であって、
−請求項９記載のベクターを核酸移入された細胞、または該細胞からの細胞抽出物を接触させる工程と、
−該受容体と結合する化合物を有する細胞抽出物または完全な細胞から、該天然抽出物中に存在する該化合物または分子の該受容体との結合を許す条件下で、おそらくは機能的応答の活性化によって、膜画分を、おそらくは単離する工程と、
−該受容体に対するアゴニスト、リバースアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害物質として働く、その他の既知化合物の存在下で、バイオアッセイ（好ましくは、第二メッセンジャーの生成の変化、または受容体活性の上昇）によって、そのような化合物または分子の存在を検出し、それによって、該未知の化合物または分子が、その受容体に対して該化合物のアゴニスト、アンタゴニストもしくは阻害物質として作用できるか否かを決定して回収する工程と
を含む方法。
【請求項１３】
請求項１２記載のスクリーニング方法によって同定される未知の化合物または分子。
【請求項１４】
適切な薬学的担体と、請求項８または１３記載の、充分な量の化合物または分子とを含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４記載の医薬組成物の使用であって、ウイルス感染、または種々のウイルスもしくは細菌によって誘導される疾病よりなる群から選択される疾病の予防および／もしくは処置における医薬の製造と、細胞移動の妨害の処置；癌、腫瘍の進行や腫瘍転移、炎症性および新生物性過程、細菌および真菌性感染を包含する、免疫系の疾病もしくは撹乱の処置、創傷および骨治癒、ならびに調節性成長機能の不全；疼痛；糖尿病；肥満；食欲不振；過食症；急性心不全；低血圧；高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；再発狭窄症；アテローム性動脈硬化症；過剰な平滑筋細胞増殖を特徴とする疾病；動脈瘤；創傷治癒；平滑筋細胞の損失、または平滑筋細胞増殖の減退を特徴とする疾病；卒中；虚血；潰瘍；アレルギー；良性前立腺肥大；偏頭痛；嘔吐；不安、精神分裂病、躁うつ病、うつ病、せん妄、痴呆、および重篤な知恵遅れを包含する、精神および神経学的疾患；退行性疾病；アルツハイマー病もしくはパーキンソン病のような神経変性性疾病；ならびに異常運動症、たとえばハンチントン病もしくはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群その他の関連する疾病の処置のための使用。
【請求項１６】
請求項１４記載の医薬組成物の使用であって、急性心不全、低血圧、高血圧もしくは心筋梗塞を包含する、血液循環疾患の予防および／または処置における医薬の製造のための使用。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の受容体、およびそれをコードしているヌクレオチド配列、または該受容体、およびそれをコードしているヌクレオチド配列の活性を検出するための、すべての媒体および手段を含む診断キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体のスーパーファミリーの新規に特定された成員はもとより、該受容体を利用することができる様々な使用にも関する。
【０００２】
本発明は、該受容体をコードしているポリ核酸配列（ポリヌクレオチド）にも関する。
【０００３】
本発明は、さらに、受容体が介在する疾患における診断および処置に適用できる、受容体ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いる方法に関する。
【０００４】
本発明は、さらに、該受容体ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いて、該様々な疾患の診断、予防および／または処置に適用できる、アゴニストおよびアンタゴニストを特定する、薬物スクリーニングの方法に関する。
【０００５】
本発明は、さらに、該受容体ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに基づいて検出かつ回収される、未知のアゴニストおよびアンタゴニストを包含する。
【０００６】
本発明は、さらに、本発明による受容体ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを、好ましくは遺伝学的組換え法によって、製造するための手順に関する。
【０００７】
（発明の背景）
Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞内のシグナルを形質導入する原因となるタンパク質である。ＧＰＣＲは、通常、７カ所の膜貫通ドメインを有する。リガンドがＧＰＣＲの細胞外部分またはフラグメントに結合すると、細胞の生物学的または生理学的特性もしくは挙動の変化につながるシグナルが、細胞内に形質導入される。ＧＰＣＲは、Ｇタンパク質およびエフェクター（Ｇタンパク質によって調整される細胞内酵素およびチャンネル）とともに、細胞内の第二メッセンジャーの状態を細胞外出力に結び付けるモジュール式シグナリング系の構成要素である。
【０００８】
ＧＰＣＲの遺伝子および遺伝子産物は、疾病の潜在的な原因となる作用因であり、これらの受容体は、中枢神経系および末梢生理学的過程の双方に対して決定的な重要性を有すると思われる。
【０００９】
ＧＰＣＲタンパク質スーパーファミリーは、五つのファミリーで表される：第１ファミリー、ロドプシンおよびβ２−アドレナリン受容体を代表とする、現在２００を越える独自の成員で表される受容体群；第２ファミリー、副甲状腺ホルモン／カルシトニン／セクレチン受容体のファミリー；第３ファミリー、代謝共役型グルタミン酸受容体のファミリー；第４ファミリー、Ｄ．ディスコイデウムＤ． ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍの化学走性および発生に重要である、ＣＡＭＰ受容体ファミリー；ならびに第５ファミリー、ＳＴＥ２のような、真菌交配フェロモン受容体。
【００１０】
Ｇタンパク質は、α、βおよびγサブユニットで構成される、グアニジンヌクレオチドと結合するヘテロ三量体タンパク質のファミリーを表す。これらのタンパク質は、通常、細胞表面受容体（７カ所の膜貫通ドメインを有する受容体）に結合されている。
【００１１】
リガンドがＧＰＣＲに結合した後、配座の変化は、Ｇタンパク質に伝達されて、それがαサブユニットに、結合したＧＤＰ分子にＧＴＰ分子に交換させ、βγサブユニットから解離させる。
【００１２】
ＧＴＰと結合した形態のα、βおよびγサブユニットは、代表的には、エフェクター調節部分として機能して、第二メッセンジャー、たとえばｃＡＭＰ（たとえばアデニルシクラーゼの活性化による）、ジアシルグリセロール又はイノシトールリン酸の生成へと導く。
【００１３】
ヒトでは、２０を越える種類のαサブユニットが公知である。これらのサブユニットは、βおよびγサブユニットの小さいプールと連携している。哺乳動物のＧタンパク質の例は、Ｇｉ、Ｇｏ、Ｇｇ、ＧｓおよびＧｔを包含する。Ｇタンパク質は、Ｌｏｎｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９９５）に詳しく記載されており、その内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００１４】
今や、既知および未知のＧＰＣＲは、薬物の作用および開発の主要な標的を構成するものである。
【００１５】
したがって、好都合な潜在的予防および治療特性を有する、新規なアゴニストおよびアンタゴニストのスクリーニングに用いることができるような、新規なＧタンパク質共役受容体を提供する必要性が存在する。
【００１６】
３００を越えるＧＰＣＲが、これまでにクローニングされており、１，０００を充分に上回るそのような受容体が存在すると広く想定されている。機械学的には、臨床的に適切なすべての薬物のほぼ５０〜６０％は、様々なＧＰＣＲの機能を調節することによって作用する〔Ｃｕｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．， Ｖｏｌ． ７３， ｐｐ．５１−６３， １９９５〕。
【００１７】
（発明の要約）
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体、好ましくはヒトの受容体の新規に特定された成員はもとより、以下に記載される該ヒト受容体をコードしているポリヌクレオチド配列（配列番号１および２）にも関する。
【００１８】
本発明は、Ｇタンパク質共役受容体、好ましくはヒトの受容体の新規に特定された成員はもとより、以下に記載される該その他のヒト受容体をコードしているポリヌクレオチド配列（配列番号３〜２２）にも関する。
【００１９】
本発明は、以下に記載される受容体に相当する配列に相同である、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列にも関する。
【００２０】
（他の哺乳動物種にも存在し得る）相同配列は、以下に記載される、完全なヒトの配列との高い配列同一性または相同性を示す（７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％より高い同一性を示す）配列を意味し、好ましくは、類似する薬理学、特にアンギオペプチンおよび／またはソマトスタチン類似体に対する優先的選択を特徴とする。
【００２１】
本発明のもう一つの態様は、該配列の特異的な活性部分に関する。該活性部分は、完全なヌクレオチドまたはアミノ酸配列における部分的欠失を含み、かつ該受容体と作用し合える特異的リガンドが結合するのに必要な活性部位を依然として保っている受容体であってもよい。
【００２２】
本発明による配列の相同配列は、他の動物（ラット、マウス、イヌ等々）、またはヒトの特定の集団に存在するが、同じ生化学的経路に関与する、同様の受容体を含んでもよい。
【００２３】
そのような相同配列は、本発明による受容体の機能的特徴を実質的に変えることはない、一つまたはそれ以上のアミノ酸もしくはヌクレオチドの付加、欠失もしくは置換を含んでもよい。
【００２４】
したがって、本発明は、本明細書に含まれる配列表に示されたのと全く同一のアミノ酸またはヌクレオチド配列はもとより、それとは異なるが、本発明による完全な受容体の基本的な質的結合特性を保持している分子を有する受容体、および相当するヌクレオチド配列も包含する。
【００２５】
本発明は、好ましくは、以下に記載される完全なヌクレオチドおよびアミノ酸配列を特徴とする該（ヒト）受容体、該受容体の未知の（かつ当技術の現状に記載されていない）アゴニスト、リバースアゴニストおよびアンタゴニスト化合物、または阻害物質に関する。好ましくは、該阻害物質は、該受容体、またはそのコーディングヌクレオチド配列に特異的に結合する（すなわち、該受容体に対して、天然に産するその他のいかなる抗体よりも少なくとも１０倍高い親和性を有する）アンチセンスＲＮＡ、リボザイムもしくは抗体（またはその特異的な、超可変（ＦＡＢ、ＦＡＢ′２、・・・）部分）である。該特異的抗体は、好ましくは、該受容体に対して向けられた抗体を産生できる動物への、そのようなアミノ酸配列の薬学的に許容され得る調製品の注入を含む工程によって得られる。
【００２６】
たとえば、本発明による受容体に向けられたモノクローナル抗体は、該受容体をコードしているＤＮＡを含む、発現プラスミドをマウスに注入し、次いで、マウスの脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させることによって得られる。
【００２７】
本発明は、他の発現配列に結合され、ベクター（プラスミド、ウイルス、リポソーム、陽イオン小胞、・・・）に組み込まれていてもよい、本発明によるポリヌクレオチド、およびそのようなベクターによって形質転換された宿主細胞にも関する。
【００２８】
本発明は、そのような宿主細胞が当業者に周知の方法に従って産生した、好ましくはヒトの、本発明による組換え受容体はもとより、該受容体、そのヌクレオチド配列、ならびに該受容体またはそのヌクレオチド配列のアゴニスト、リバースアゴニスト、アンタゴニストおよび阻害物質を特定するためのすべての手段および媒体も含む、機能的なアッセイ（診断キット）にも関する。該診断キットは、好ましくは、下記の要素：すなわち、受容体、そのコードしているヌクレオチド配列、該受容体またはそのヌクレオチド配列のアゴニストに対して指向された抗体、ならびに該受容体の、存在し得るアゴニスト、リバースアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害物質化合物を含む。該診断キットは、該受容体ヌクレオチド配列の遺伝学的分析によって、好ましくは、ＲＴ／ＰＣＲによってか、または、好ましくは該受容体に対して指向された抗体の使用による、免疫分析によって、好ましくは該受容体の用量／活性の測定を通じて、該診断を実施するための手段および媒体を含む。
【００２９】
本発明は、本発明による受容体をコードしている遺伝子配列の部分的または全体的欠失を含む、トランスジェニックな、ヒトではない哺乳動物に、好ましくは、本発明によるヌクレオチド配列（ポリヌクレオチド）の相同組換えの「ノックアウト」を含む、ヒトではない哺乳動物、または該ポリヌクレオチド配列を自然のレベルを超えて過剰発現するトランスジェニックな、ヒトではない哺乳動物にも関する。
【００３０】
該トランスジェニックな、ヒトではない哺乳動物は、当業者に周知の方法によって、たとえば、胚性幹細胞のトランスフェクションに基づく古典的な手法を用いて、好ましくはＣａｒｍｅｌｉｅｔら〔Ｎａｔｕｒｅ， Ｖｏｌ．３８０， ｐ．４３５−４３９， １９９６〕が記載した方法に従って、ＷＯ／９８２０１１２という文書の記載によって得ることができる。
【００３１】
好ましくは、本発明によるポリヌクレオチド、またはその活性部分を過剰発現する、該トランスジェニックな、ヒトではない哺乳動物は、その過剰発現を許す誘導できるプロモーター、およびおそらくは組織その他の特異的調節要素とともに、ＤＮＡ構成体に予め組み込んでおく。
【００３２】
本発明のもう一つの側面は、本発明による受容体に対する、天然化合物であるアゴニスト、リバースアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害物質であることが未知である（当技術の現状に記載されていない）か、または公知ではない、化合物もしくは天然抽出物をスクリーニングする（検出し、おそらくは回収する）方法であって、
−本発明による受容体をコードしているポリヌクレオチドを発現するベクターを核酸移入された細胞、または該細胞からの細胞抽出物を接触させる工程と、
−該受容体と結合する化合物を有する細胞抽出物、または完全な細胞から、該天然抽出物中に存在する該化合物または分子の該受容体との結合を許す条件下で、おそらくは機能的応答の活性化によって、膜画分を、おそらくは単離する工程と、
−該受容体に対するアゴニスト、リバースアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害物質として働く、その他の既知化合物の存在下で、バイオアッセイ（好ましくは、第二メッセンジャーの生成の変化、または受容体活性の上昇）によって、該化合物、または分子の該混合物の存在（およびおそらくは該受容体との結合）を検出し、それによって、該未知の化合物または分子の混合物が、その受容体に対して該化合物のアゴニスト、アンタゴニストもしくは阻害物質として作用できるか否かをおそらくは決定し、回収する工程と
を含む方法、ならびに該方法を実施するためのキットに関する。
【００３３】
好ましくは、第二メッセンジャーのアッセイは、細胞内ｃＡＭＰ、細胞内イノシトールリン酸、細胞内ジアシルグリセロール濃度、アラキノイド酸濃度、ＭＡＰキナーゼもしくはチロシンキナーゼ経路の活性化、または細胞内カルシウムの可動化の測定を含む。
【００３４】
好ましくは、該バイオアッセイは、本発明による受容体へのアンギオペプチンその他の適切ないかなる関連ペプチドの、当業者に周知の、以下に記載する方法による付加によって、確認される。
【００３５】
本発明によるスクリーニング法は、当業者に周知の方法によって、好ましくは、当業者に公知の手法に従って、マイクロタイタープレートまたはバイオチップ（マイクロアレー）のような様々な固体担体上で実施される、国際特許出願のＷＯ００／０２４５に記載された方法に基づく高処理量のスクリーニング、診断および投与装置によって実施することができると思われる。
【００３６】
本発明は、処置における医薬としてのその使用について、該方法によって特徴付けられ、おそらくは回収される、既知または未知の化合物もしくは分子にも、また充分な量の該化合物または分子と、様々な疾病の予防および／または処置における医薬の製造のための、薬学的に許容され得る担体もしくは希釈剤とを含む医薬組成物にも関する。
【００３７】
該医薬組成物中では、該担体、または適切な製剤担体または希釈剤は、ヒトを包含する患者に無害であり、経口投与、静脈内投与、皮内投与等々のような様々な投与経路を通じて（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで）投与するの適応させた、いかなる固体、液体または気体の担体であることもできる。
【００３８】
該医薬組成物は、当業者に周知であり、患者の免疫応答を調整できる、様々な小胞またはアジュバントも含んでよい。活性化合物−分子／製剤担体の百分率は、変化させることができ、その範囲は、患者に対する活性化合物の許容度および効率によってのみ限定されるにすぎない。該投与の範囲は、投与の頻度、および該化合物または分子の、可能性のある副作用によっても限定される。
【００３９】
本発明のさらに一つの側面は、該スクリーニング法によって特定された該未知の化合物または分子に、それを含む医薬組成物に、ならびにウイルス感染、または様々なウイルスもしくは細菌によって誘発される疾病の処置、細胞移動の混乱；癌、腫瘍の発達や腫瘍転移、炎症性および新生物性過程、細菌および真菌性感染を包含する、免疫系の疾病もしくは撹乱；創傷および骨治癒、ならびに調節性成長機能の不全；疼痛；糖尿病；肥満；食欲不振；過食症；急性心不全；低血圧；高血圧；尿閉；骨粗鬆症；狭心症；心筋梗塞；再発狭窄症；アテローム性動脈硬化症；過剰な平滑筋細胞増殖を特徴とする疾病；動脈瘤；創傷治癒；平滑筋細胞の損失、または平滑筋細胞増殖の減退を特徴とする疾病；卒中；虚血；潰瘍；アレルギー；良性前立腺肥大；偏頭痛；嘔吐；不安、精神分裂病、躁うつ病、うつ病、せん妄、痴呆、および重篤な知恵遅れを包含する、精神および神経学的疾患；退行性疾病；アルツハイマー病もしくはパーキンソン病のような神経変性性疾病；ならびに異常運動症、たとえばハンチントン病もしくはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群その他の関連する疾病の処置もしくは予防におけるその使用に関する。
【００４０】
列挙された疾病のうちでも、好適な適応症は、受精率、胎児の発育、細菌、真菌、原生動物およびウイルスによる感染のような感染症、特にＨＩＶ１およびＨＩＶ２によって生じる感染症、疼痛、癌、食欲不振、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、高血圧、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大；不安、うつ病、偏頭痛、嘔吐、卒中、精神分裂病、躁うつ病、うつ病、せん妄、痴呆、重篤な知恵遅れおよび異常運動症、たとえばハンチントン病もしくはジル・ド・ラ・トゥーレット症候群を包含するが、これらに限定されない機能不全を予防するか、改善するか、または矯正する際に機能を果たすことができる、７ＴＭ受容体を標的とする治療剤に関する。
【００４１】
本発明は、この受容体の発現の結果として生じる、エクオリンの発光のアゴニストまたはアンタゴニストを特定するためのスクリーニングツールとしての、ヒトＧタンパク質共役受容体の使用に関する。
【００４２】
例１：ヒトＧＰＣＲｘ１１受容体のクローニング
新規なヒトＧＰＣＲ（Ｇタンパク質共役受容体）を同定し、かつクローニングするために、下記の取組み方を用いた。下記のＧＰＣＲ：すなわち、ＧＰＲ８，ＣｈｅｍＲ２３、ＨＭ７４およびＧＰＲ１４を、公開された高処理量ゲノム配列データベース（ＮＣＢＩ）における相同性について検索するための問合せ配列として用いた。
【００４３】
上記の戦略を用いて、新規なヒトＧＰＣＲ配列を同定した。本発明者らは、この新規なＧＰＣＲをＧＰＣＲｘ１１（配列番号１および２）とした。
【００４４】
ＧＰＣＲｘ１１配列をクローニングするために、本発明者らは、全ヒトゲノムＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。プライマーは、ヒトＧＰＣＲｘ１１配列に基づいて合成し、下記のとおりであった：
【００４５】
配列番号２３　ＧＰＣＲｘ１１　ｆｗ：　５’−ｃｃｇｇａａｔｔｃａｃｃａｔｇｇａｔｃｃａａｃｃａｃｃｃｃｇ−３’
配列番号２４　ＧＰＣＲｘ１１　ｒｖ：　５’−ｃｔａｇｔｃｔａｇａｃｔｃｔａｃａｃｃａｇａｃｔｇｃｔｔｃｔｃ−３’
【００４６】
増幅の結果、ＧＰＣＲｘ１１遺伝子のコーディング配列全体を含む、０．９９キロベースのフラグメントを得た。このフラグメントを、ＤＮＡ配列分析のために、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）というベクターにサブクローニングした。
【００４７】
ヒトＧＰＣＲｘ１１のヌクレオチド、および演繹されたアミノ酸配列を示す（配列番号１）：
【００４８】
【表１】
2004500125.tif 000003
2004500125.tif 000004
2004500125.tif 000005
【００４９】
ヒトＧＰＣＲｘ１１（３３０アミノ酸）のアミノ酸配列を示す（配列番号２）。予測された７カ所の膜貫通ドメインには、下線を付した。
【００５０】
【表２】
2004500125.tif 000006
【００５１】
アミノ酸配列のレベルでは、ヒトＧＰＣＲｘ１１は、ラットのＲＴＡ受容体に対して３７％同一であった。ＧＰＣＲｘ１１をコードしている遺伝子は、第１１染色体に定位された。
【００５２】
ＧＰＣＲｘ１１の整列（図１）
ＲＴＡ、および他のＲＴＡ関連配列とのＧＰＣＲｘ１１のアミノ酸配列の整列を、ＣｌｕｓｔａｌＸというアルゴリズムを用いて実施した。次いで、ＴｒｅｅＶｉｅｗというアルゴリズムを用いて、系統樹を構成した。
【００５３】
【表３】
2004500125.tif 000007
【００５４】
ＧＰＣＲｘ１１の組織分布
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の実験を、ポリＡ＋ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のパネルを用いて実施した。プライマーは、下記のとおりであった：ＧＰＣＲｘ１１センスプライマー（配列番号２５：５’−ＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＡＣＧＴＣＣＴＣＡＧ−３’）。増幅されたＤＮＡバンドの予測された大きさは、５８６ｂｐであった。ポリＡ＋ＲＮＡ約７５ｎｇを、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で逆転写し、ＰＣＲに用いた。ＰＣＲは、下記の条件下で実施した：９４℃で３分間変性、９４℃で１分間、５８℃で２分間、および７２℃で２分間の３８サイクル。ＰＣＲ反応のアリコート（１０μｌ）を、１％アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【００５５】
ＧＰＣＲｘ１１のｍＲＮＡを、ヒトの１６の組織でＲＴ−ＰＣＲによって検定した。予測された大きさ（５８６ｂｐ）の強いバンドが睾丸で、より低いレベルで子宮および胸腺で検出されたが、脳下垂体、脊椎、膵臓、小腸、胎盤、胃、肝臓、肺、脾臓、脳、心臓、腎臓および骨格筋では検出されなかった。
【００５６】
ＧＰＣＲｘ１１の機能アッセイ
ＧＰＣＲｘ１１発現クローンは、ミトコンドリアのアポエクオリンおよびＧａｌｐｈａ１６を同時発現するＣＨＯ−Ｋ１の核酸移入、限界希釈、およびノーザンブロット分析による選別によって得た。陽性のクローンを、２５０のペプチドおよび神経ペプチドを１００ｎＭの濃度で含有する、参照ペプチドライブラリーによるスクリーニングに用いた。特異的活性は、アンギオペプチン（Ｄ−ＮａＩ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−ＮＨ２、二つのシステイン間にジスルフィド架橋を有する）で得て、用量応答曲線によって確認した（図１を参照されたい）。追加の関連ペプチドを、同じ細胞を用いて試験した。試験した異なるペプチドのうち、ソマトスタチン類似体（Ｄ２−ＮａＩ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｄ２−ＮａＩ−ＮＨ２）が、類似の親和性を示した。ソマトスタチン１４は、ＧＰＣＲｘ１１に対する活性を全く保有しなかった。
【００５７】
材料：
化学薬品は、記述されない限り、すべてＳｉｇｍａから入手した。細胞培養の培地は、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬから、ペプチドは、ｂａｃｈｅｍから入手した。
【００５８】
エクオリンアッセイ：
ＧＰＣＲｘ１１受容体、Ｇａｌｐｈａ１６およびミトコンドリアアポエクオリンを発現する、ＣＨＯ−Ｋ１細胞系を確立した。細胞内Ｃａ２＋放出後のミトコンドリアアポエクオリンの発光に基づく機能アッセイ（１）を、記載したとおりに（２）実施した。略述すると、細胞を、５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＰＢＳとともにプレートから捕集し、ペレット化し、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中に５ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁させ、５μＭのセレンテラジンＨ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）とともに、室温で４時間温置した。次いで、細胞を、ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中で洗浄し、０．５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。次いで、細胞を、ペプチドと混合し、Ｍｉｒｏｌｕｍａｔルミノメーター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、３０秒間発光記録した。結果を、相対光単位（ＲＬＵ）として表す。
【００５９】
抗体：
ＧＰＣＲｘ１１に向けて誘導された抗体を、ＧＰＣＲｘ１１をコードしているプラスミドのマウスへの反復注射によって産生させておいた。５回の注射の後、血清を捕集し、ＧＰＣＲｘ１１を核酸移入した細胞によるフローサイトメトリー分析に用いた。いくつかの血清が、陽性であり、免疫組織化学その他の関連する適用に用いることができた。
【００６０】
例２：Ｇタンパク質共役受容体に関連するその他の配列のクローニング
ＧＰＣＲに関連する新規なヒトＤＮＡ配列を同定し、かつクローニングするために、下記の取組み方を用いた。下記のＧＰＣＲの配列：すなわちＧＰＲ８，ＣｈｅｍＲ２３、ＨＭ７４およびＧＰＲ１４を、公開された高処理量ゲノム配列データベース（ＮＣＢＩ）における相同性について検索するための問合せ配列として用いた。
【００６１】
上記の戦略を用いて、ＧＰＣＲの新規な１０のヒトの配列を同定した。これらのクローンのうち、イントロンを含むものは皆無であった：
【００６２】
【表４】
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【００６３】
これらのＧＰＣＲｘ配列をクローニングするために、全ヒトゲノムＤＮＡに対してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。プライマーは、上記のヒトの配列に基づいて合成し、下記のとおりであった：
【００６４】
【表５】
2004500125.tif 000009
【００６５】
増幅の結果、ヒト遺伝子のコーディング配列全体を含む、約１〜１．５キロベースのフラグメントを得た。得られたこれらのフラグメントを、ＤＮＡ配列分析のために、ｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）ベクターにサブクローニングした。
【００６６】
特定された（ＧＰＣＲｘ）受容体の組織分布
ＧＰＣＲｘの異なるｍＲＮＡの組織分布を決定するために、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の実験を、ヒトの組織から単離されたｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）２００ｎｇを用いて実施した。逆転写工程では、オリゴ（ｄＴ）プライマーを用いた。次いで、ＧＰＣＲｘの異なるｃＤＮＡを、特定プライマーとともに増幅した。
【００６７】
【表６】
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【００６８】
表１：ＧＰＣＲｘの組織分布
異なるＧＰＣＲｘの存否を、ＲＴ−ＰＣＲ分析によって決定した。＋＋、強いシグナル；＋、明確に検出されたシグナル；＋／−、弱いシグナル；−、検出されなかったシグナル。組織は、下記のとおりである：Ｌｉ、肝臓；Ｌｕ、肺；Ｓｐ、脾臓、Ｔｅ、睾丸；Ｂｒ、脳；Ｈｅ、心臓；Ｋｉ、腎臓；Ｓｋ．Ｍ、骨格筋；Ｐｉ．Ｇ、脳下垂体；Ｓｐ．Ｃ、脊椎；Ｔｈ、胸腺；Ｐａ、膵臓；Ｓ．Ｉｎ、小腸；Ｕｔ、子宮；Ｐｌ、胎盤；Ｓｔ、胃。
【００６９】
【表７】
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【配列表】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004500125.tif 000080
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