(57)【要約】本発明は、チオール含有メイタンシノイド類の製造および精製方法であって、（１）水素化リチウムトリメトキシアルミニウム（ＬｉＡｌ（ＯＭｅ）３Ｈ）、水素化リチウムトリエトキシアルミニウム（ＬｉＡｌ（ＯＥｔ）３Ｈ）、水素化リチウムトリプロポキシアルミニウム（ＬｉＡｌ（ＯＰｒ）３Ｈ）、水素化ナトリウムトリメトキシアルミニウム（ＮａＡｌ（ＯＭｅ）３Ｈ）、水素化ナトリウムトリエトキシアルミニウム（ＮａＡｌ（ＯＥｔ）３Ｈ）および水素化ナトリウムトリプロポキシアルミニウム（ＮａＡｌ（ＯＰｒ）３Ｈ）からなる群から選択される還元剤でメイタンシノイドＣ−３エステルの還元的加水分解を行って、メイタンシノールを得る工程；（２）前記メイタンシノールを精製して、副生成物が存在する場合にはそれを除去する工程；（３）前記精製メイタンシノールをカルボン酸でエステル化して、メイタンシノールのＬ−およびＤ−アミノアシルエステルの混合物を得る工程；（４）メイタンシノールの前記Ｌ−アミノアシルエステルを（３）で得られた反応混合物から分離する工程；（５）メイタンシノールの前記Ｌ−アミノアシルエステルを還元して、チオール含有メイタンシノイドを得る工程；ならびに（６）前記チオール含有メイタンシノイドを精製する工程を含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオール含有メイタンシノイドの製造方法であって、
（１）水素化リチウムトリメトキシアルミニウム（ＬｉＡｌ（ＯＭｅ）３Ｈ）、水素化リチウムトリエトキシアルミニウム（ＬｉＡｌ（ＯＥｔ）３Ｈ）および水素化リチウムトリプロポキシアルミニウム（ＬｉＡｌ（ＯＰｒ）３Ｈ）からなる群から選択される還元剤でメイタンシノイドＣ−３エステルの還元的加水分解を行って、メイタンシノールを得る工程；
（２）前記メイタンシノールを精製して、副生成物が存在する場合にはそれを除去する工程；
（３）前記精製メイタンシノールをカルボン酸でエステル化して、メイタンシノールのＬ−およびＤ−アミノアシルエステルの反応混合物を得る工程；
（４）メイタンシノールの前記Ｌ−アミノアシルエステルを（３）で得られた反応混合物から分離する工程；
（５）メイタンシノールの前記Ｌ−アミノアシルエステルを還元して、チオール含有メイタンシノイドを得る工程；ならびに
（６）前記チオール含有メイタンシノイドを精製する工程
を含む、製造方法。
【請求項２】
（１）での前記還元剤が、水素化リチウムトリメトキシアルミニウムである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（１）での前記還元剤を、メイタンシノイドＣ−３エステル１モル当たり約５〜１００当量の濃度で使用する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
（１）での前記還元剤を、メイタンシノイドＣ−３エステル１モル当たり約７．５〜３０当量の濃度で使用する請求項１に記載の方法。
【請求項５】
（１）での前記還元剤を、メイタンシノイドＣ−３エステル１モル当たり約１０〜２０当量の濃度で使用する請求項１に記載の方法。
【請求項６】
（１）での前記還元的加水分解を、約−８０℃〜０℃の温度で行う請求項１に記載の方法。
【請求項７】
（１）での前記還元的加水分解を、約−４５℃〜−２７．５℃の温度で行う請求項１に記載の方法。
【請求項８】
（１）での前記還元的加水分解を、約−３５℃〜３０℃の温度で行う請求項１に記載の方法。
【請求項９】
（１）での前記還元剤を、約５〜４０分間かけて加える請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（１）での前記還元剤を、約７〜２０分間かけて加える請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
（１）での前記還元剤を、約８〜１２分間かけて加える請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
（２）において前記メイタンシノールを、クロマトグラフィーによって精製する請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記クロマトグラフィーが、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、シリカゲルでの分取薄層クロマトグラフィーまたはシアノ結合シリカＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーである請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記クロマトグラフィーが、シリカゲルカラムクロマトグラフィーである請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記精製を周囲温度で行う請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記メイタンシノールを約９５％の純度まで精製する請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
（３）における前記カルボン酸が、Ｎ−メチル−Ｎ−メチルジチオアセチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−プロパノイル）−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−ブタノイル）−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（４−メチルジチオ−ブタノイル）−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（５−メチルジチオ−ペンタノイル）−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−フェニルジチオ−プロパノイル）−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−（４−ニトロフェニルジチオ）−プロパノイル）Ｌ−アラニン、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−メチルジチオシステインおよびＮ−アセチル−Ｎ−メチル−メチルジチオホモシステインからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
（３）での前記カルボン酸が、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−プロパノイル）−Ｌ−アラニンである請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
（３）での前記エステル化を周囲温度で行う請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
（３）での前記エステル化が、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび塩化亜鉛の使用をさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
（４）での前記分離を、シアノ結合シリカＨＰＬＣカラムに前記反応混合物を通すことで行う請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
（４）での前記分離を約２５℃で行う請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
（５）での前記還元で、前記還元剤としてジチオトレイトールを用いる請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
（５）での前記還元を、酢酸エチル−メタノール−緩衝水溶液の混合物であって、緩衝塩、ジチオトレイトール、未還元メイタンシノイド類および還元メイタンシノイド類を溶液の状態に維持できる混合物中で行う請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記酢酸エチル−メタノール−緩衝水溶液の混合物の酢酸エチル：メタノール：緩衝水溶液の体積比が、１：１．５：１である請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記チオール含有メイタンシノイドの濃度を、そのチオール含有メイタンシノイドが酢酸エチル−メタノール−緩衝水溶液中に溶解した状態のままであるようなものとする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記チオール含有メイタンシノイドの濃度が約４ｇ／Ｌである請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
（５）での前記還元を、酸素を含まない雰囲気下で行う請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
（５）での前記還元を約２５℃で行う請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
（６）での前記チオール含有メイタンシノイドの前記精製を、クロマトグラフィーによって行う請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
（６）での前記チオール含有メイタンシノイドの前記精製を、シアノ結合ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーによって行う請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記クロマトグラフィーを、有機溶媒で平衡とし、その溶媒で溶離するシアノ結合ＨＰＬＣカラムによって行う請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記有機溶媒が、ヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチルの混合物である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記有機溶媒のヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチルの体積比が７８．０：５．５：１６．５である請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞傷害性薬剤の製造および精製方法に関する。より具体的には本発明は、チオール含有メイタンシノイド類（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）を含む細胞傷害性薬剤の製造および精製方法に関するものである。この細胞傷害性薬剤は、チオール基を介してそれを細胞結合剤に連結し、次にそれをターゲティング様式で特定の細胞集団に送達することで、治療薬として用いることができる。
【０００２】
発明の背景
近年、モノクローナル抗体−薬剤コンジュゲートを用いた腫瘍細胞への特異的ターゲティングの試みに関する報告が非常に多くなってきた（Ｒ． Ｖ． Ｊ． Ｃｈａｒｉ．， ３１ Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｓ．， ８９−１０４ （１９９８）； Ｇ． Ａ． ＰｉｅｔｅｒｓｚおよびＫ． Ｋｒａｕｅｒ， ２ Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ １８３−２１５ （１９９４）； Ｓｅｌａら， Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ中、１８９−２１６ （Ｃ． Ｖｏｇｅｌ， ｅｄ． １９８７）； Ｇｈｏｓｅら， Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇｓ中、１−２２ （Ｅ． Ｇｏｌｄｂｅｒｇ， ｅｄ． １９８３）； Ｄｉｅｎｅｒら， Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ中、１−２３ （Ｊ． Ｒｏｄｗｅｌｌ， ｅｄ．， １９８８）； Ｐｉｅｔｅｒｓｚら， Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ中、２５−５３ （Ｊ． Ｒｏｄｗｅｌｌ， ｅｄ．， １９８８）； Ｂｕｍｏｌら， Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ中、５５−７９ （Ｊ． Ｒｏｄｗｅｌｌ， ｅｄ．， １９８８））。メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣおよびクロラムブシルなどの細胞傷害性薬剤について、各種マウスモノクローナル抗体への結合が行われている。場合によっては、血清アルブミン（Ｇａｒｎｅｔｔら， ４６ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２４０７−２４１２ （１９８６）； Ｏｈｋａｗａら， ２３ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ８１−８６ （１９８６）； Ｅｎｄｏら， ４７ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １０７６−１０８０ （１９８０））、デキストラン（Ｈｕｒｗｉｔｚら， ２ Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５−３５ （１９８０）； Ｍａｎａｂｉら， ３４ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２８９−２９１ （１９８５）； Ｄｉｌｌｍａｎら， ４６ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８８６−４８９１ （１９８６）； Ｓｈｏｖａｌら， ８５ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８２７６−８２８０ （１９８８））またはポリグルタミン酸（Ｔｓｕｋａｄａら， ７３ Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃ． Ｉｎｓｔ． ７２１−７２９ （１９８４）； Ｋａｔｏら， ２７ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １６０２−１６０７ （１９８４）； Ｔｓｕｋａｄａら， ５２ Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ １１１−１１６ （１９８５））などの中間担体分子を介して、薬剤分子を抗体分子に連結した。
【０００３】
非常に多様なリンカー技術が、そのような免疫コンジュゲートの製造に用いられており、開裂性および非開裂性の両方のリンカーについて研究が行われている。しかしながらほとんどの場合、薬剤分子が標的部位で未修飾の形でコンジュゲートから放出され得る場合に限り、その薬剤が有し得る完全な細胞傷害性が認められると考えられる。
【０００４】
抗体−薬剤コンジュゲートの製造に用いられてきた開裂性リンカーの一つは、受容体介在エンドサイトーシス時に遭遇するエンドソームおよびリソソームなどの各種細胞内区画の酸性環境を利用するシス−アコニット酸に基づく酸不安定性（ａｃｉｄ−ｌａｂｉｌｅ）リンカーである。ＳｈｅｎおよびＲｙｓｅｒは、ダウノルビシンの巨大分子担体とのコンジュゲートの製造にこの方法を導入した（１０２ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １０４８−１０５４ （１９８１））。ＹａｎｇおよびＲｅｉｓｆｅｌｄは、同一の技術を用いて、ダウノルビシンを抗メラノーマ抗体に結合させた（８０ Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃ． Ｉｎｓｔ． １１５４−１１５９ （１９８８））。Ｄｉｌｌｍａｎらも、酸不安定性リンカーを同様に用いて、ダウノルビシンの抗Ｔ細胞抗体とのコンジュゲートを製造した（４８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０９７−６１０２ （１９８８））。Ｔｒａｉｌらは、酸不安定性ヒドラゾン結合を介して、ドキソルビシンを抗体に連結させた（５２ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６９３−５７００ （１９９２））。
【０００５】
Ｔｒｏｕｅｔらが研究した別途のアプローチには、ペプチドスペーサーアームを介して抗体にダウノルビシンを連結することが含まれた（７９ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６２６−６２９ （１９８２））。これは、リソソームペプチダーゼの作用により、遊離薬剤がそのようなコンジュゲートから放出され得るという前提のもとに行われたものである。
【０００６】
しかしながらｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞傷害性試験から、抗体−薬剤コンジュゲートが、遊離の非コンジュゲート薬剤と同じ細胞傷害力を示すことは稀であることが明らかになっている。これは、薬剤分子が抗体から放出される機構が非常に効率の悪いものであることを示唆するものであった。免疫毒素の分野では、モノクローナル抗体と触媒活性タンパク質毒素との間のジスルフィド架橋を介して形成されるコンジュゲートが、他のリンカーを有するコンジュゲートより細胞傷害性が高いことが明らかになった（Ｌａｍｂｅｒｔら， ２６０ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １２０３５−１２０４１ （１９８５）； Ｌａｍｂｅｒｔら， Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ中、１７５−２０９ （Ａ． Ｆｒａｎｋｅｌ， ｅｄ． １９８８）； Ｇｈｅｔｉｅら， ４８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２６１０−２６１７ （１９８８）参照）。これは、抗体分子と毒素との間のジスルフィド結合の効果的な開裂に寄与する高い細胞内グルタチオン濃度によるものであった。それにもかかわらず、薬剤と巨大分子との間のコンジュゲート製造におけるジスルフィド架橋の使用については、ごくわずかな報告例しかない。Ｓｈｅｎらは、メトトレキセートのメルカプトエチルアミド誘導体への変換とそれに続くジスルフィド結合を介したポリ−Ｄ−リジンとの結合について報告した（２６０ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １０９０５−１０９０８ （１９８５））。最近の報告では、トリスルフィド含有毒物であるカリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）と抗体とのコンジュゲートの製造について報告された（Ｌ． Ｍ． Ｈｉｎｍａｎら， ５３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３３３６−３３４２ （１９９３）； Ｅ． Ｌ． Ｓｉｅｖｅｒｓら， ９３ Ｂｌｏｏｄ ３６７８−３６８４ （１９９９））。
【０００７】
ジスルフィド連結抗体−薬剤コンジュゲートがない理由の一つは、ジスルフィド架橋を介して抗体に薬剤を連結させるのに容易に使用可能な含硫黄原子部分を有する細胞傷害性薬剤が入手できないことにある。さらに、細胞傷害能力を低下させることなく既存の薬剤の化学修飾を行うことは困難である。
【０００８】
既存の抗体−薬剤コンジュゲートにおける別の主要な欠点は、標的抗原数が限られており、メトトレキセート、ダウノルビシンおよびビンクリスチンなどの癌抑制性薬剤（ｃａｎｃｅｒｏｓｔａｔｉｃ ｄｒｕｇ）の細胞傷害性が比較的温和であるために、そのコンジュゲートによっては、標的部位に十分な濃度の薬剤を送達できないという点である。例えば、ドキソルビシンの抗体コンジュゲートについてヒト臨床試験での評価が行われたが、有効性がないことが認められた（Ｔｏｌｃｈｅｒら， １７ Ｊ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌ． ４７８−４８４ （１９９９））。有意な細胞傷害性を得るには、抗体に直接あるいはポリマー担体分子を介して多数の薬剤分子を連結させることが必要になる。しかしながら、そのような高度に修飾された抗体は、標的抗原に対する結合力低下および血流での急速なｉｎ ｖｉｖｏクリアランスを示す場合が多い。
【０００９】
メイタンシノイド類は、細胞傷害性の高い薬剤である。メイタンシンは最初に、Ｋｕｐｃｈａｎらによって、東アフリカの低木であるマイテヌス・セラッタ（Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａ）から単離され、メトトレキセート、ダウノルビシンおよびビンクリスチンなどの従来の癌化学療法薬よりも１００〜１０００倍の細胞傷害性を有することが示された（米国特許第３８９６１１１号）。その後、一部の微生物も、メイタンシノールおよびメイタンシノールのＣ−３エステル類などのメイタンシノイド類を産生することが発見された（米国特許第４１５１０４２号）。メイタンシノールの合成Ｃ−３エステル類およびメイタンシノールの類似体も報告されている（Ｋｕｐｃｈａｎら， ２１ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３１−３７ （１９７８）；Ｈｉｇａｓｈｉｄｅら， ２７０ Ｎａｔｕｒｅ ７２１−７２２ （１９７７）； Ｋａｗａｉら， ３２ Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ３４４１−３４５１ （１９８４））。Ｃ−３エステル類が製造されているメイタンシノール類似体の例としては、芳香環が修飾された（例：脱クロロ）またはＣ−９、Ｃ−１４（例：ヒドロキシ化メチル基）、Ｃ−１５、Ｃ−１８、Ｃ−２０およびＣ−４，５で修飾されたメイタンシノールなどがある。
【００１０】
天然および合成のＣ−３エステル類は、下記の２つの群に分類することができる：
（ａ）簡単なカルボン酸とのＣ−３エステル類（米国特許第４２４８８７０号、同４２６５８１４号、同４３０８２６８号、同４３０８２６９号、同４３０９４２８号、同４３１７８２１号、同４３２２３４８号および同４３３１５９８号）、および
（ｂ）Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンの誘導体とのＣ−３エステル類（米国特許第４１３７２３０号、同４２６０６０８号、同５２０８０２０号、同５４１６０６４号および１２ Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ３４４１ （１９８４））。
【００１１】
群（ｂ）のエステル類の方が群（ａ）のエステル類より、細胞傷害性がかなり高いことが認められた。
【００１２】
メイタンシンは有系分裂インヒビターである。Ｌ１２１０細胞をｉｎ ｖｉｖｏにてメイタンシンで処理すると、細胞の６７％が有系分裂状態に留まることが報告されている。未処理の対照細胞は、３．２〜５．８％の範囲の有糸分裂指数を示すことが報告された（Ｓｉｅｂｅｒら， ４３ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９７５， Ｂｉｂｌ． Ｈａｅｍａｔ． ４９５−５００ （１９７６））。ウニ卵およびハマグリ卵を用いた実験で、メイタンシンが、微小管タンパク質であるチューブリンの重合阻害を介して微小管形成を妨害することによって、有糸分裂を阻害することが示唆されている（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄら， １８９ Ｓｃｉｅｎｃｅ １００２−１００５ （１９７５））。
【００１３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏのＰ３８８、Ｌ１２１０およびＬＹ５１７８マウス白血病細胞懸濁液が、用量１０−３〜１０−１μｇ／ｍＬのメイタンシンによって阻害され、Ｐ３８８系が最も感受性が高いことが認められている。メイタンシンが、ヒト鼻咽頭癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖の活性インヒビターであることも明らかになっている。ヒト急性リンパ芽球性白血病系Ｃ．Ｅ．Ｍ．が、１０−７μｇ／ｍＬという低濃度によって阻害されることが報告された（Ｗｏｌｐｅｒｔ−ＤｅＦｉｌｌｉｐｐｅｓら， ２４ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １７３５−１７３８ （１９７５））。
【００１４】
ｉｎ ｖｉｖｏでのメイタンシンも活性であることが明らかになっている。Ｐ３８８リンパ球性白血病系での腫瘍成長が、高い治療指数を示唆する５０〜１００倍の用量範囲で阻害されることが示された。さらに、Ｌ１２１０マウス白血病系、ヒトルイス肺癌系およびヒトＢ−１６黒色腫系で、かなりの阻害活性を示すことができた（Ｋｕｐｃｈａｎ， ３３ Ｐｅｄ． Ｐｒｏｃ． ２２８８−２２９５ （１９７４））。
【００１５】
メイタンシノイド類は非常に細胞傷害性が高いことから、癌などの多くの疾患の治療において有用であるものと期待されたが、その期待はまだ実現していない。メイタンシンを用いた臨床試験は、多くの副作用のために好ましいものではなかった（Ｉｓｓｅｌら， ５ Ｃａｎ． Ｔｒｔｍｎｔ． Ｒｅｖ． １９９−２０７ （１９７８））。中枢神経系に対する有害効果および胃腸に関する症状のために、一部の患者は治療を続けることを拒絶することになり（Ｉｓｓｅｌ、２０４）、メイタンシンが、累積的と考えられる末梢神経障害に関連しているように思われた（Ｉｓｓｅｌ、２０７）。
【００１６】
しかしながら、非常に細胞傷害性が高いが、なおも多くの疾患の治療において効果的に用いることができる形態のメイタンシノイド類が報告されている（米国特許第５２０８０２０号および同５４１６０６４号； Ｃｈａｒｉら， ５２ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １２７−１３１ （１９９２）； Ｌｉｕら， ９３ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６１８−８６２３ （１９９６））。
【００１７】
本明細書で対象となるメイタンシノイド類の治療的使用におけるさらに別の欠点は、チオール含有メイタンシノイド類の製造および精製方法には、手間がかかり、大量化が困難であって、収率があまり高くない低効率のクロマトグラフィーのいくつかの段階が含まれるという点である。
【００１８】
米国特許第５２０８０２０号および同５４１６０６４号には、最初にエステル基を有するメイタンシノイドをメイタンシノールに変換し、得られたメイタンシノールをＮ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体またはＮ−メチル−Ｌ−システイン誘導体でエステル化してジスルフィド含有メイタンシノイド類を得て、次にジスルフィド基をジチオトレイトールで開裂させてチオール含有メイタンシノイド類とすることで、チオール含有メイタンシノイドを製造できることが開示されている。しかしながらこの方法には、手間を要し、収率があまり高くない低効率のいくつかの段階が含まれる。
【００１９】
より具体的には、最初にメイタンシノールを、水素化アルミニウムリチウムなどでの還元によって、メイタンシンまたはその他のメイタンシノールのエステルから誘導する（Ｋｕｐｃｈａｎ， Ｓ． Ｍ．ら， ２１ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３１−３７ （１９７８）； 米国特許第４３６０４６２号）。さらに、微生物のノカルジア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）からメイタンシノールを単離することも可能である（Ｈｉｇａｓｈｉｄｅら， 米国特許第４１５１０４２号参照）。具体的な例では、−５℃でのテトラヒドロフラン中の水素化アルミニウムリチウムを用いた還元的加水分解によるアンサマイトシンＰ−３のメイタンシノールへの変換が、米国特許第４１６２９４０号に記載された。しかしながら、水素化アルミニウムリチウムとの反応によって副生成物がいくつか生成し、それらは注意深いシリカゲルでの分取薄層クロマトグラフィーによってのみ除去可能である。従って、この方法は工業的規模での使用には適さない。
【００２０】
この方法における次の段階は、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体またはＮ−メチル−Ｌ−システイン誘導体ならびにジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および触媒量の塩化亜鉛などの好適な薬剤を用いたメイタンシノールの各種エステル誘導体への変換である（米国特許第４１３７２３０号； Ｋａｗａｉら， ３２ Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ３４４１−３９５１ （１９８４）； 米国特許第４２６０６０９号参照）。ＤおよびＬ−アミノアシル側鎖を有する２種類のジアステレオマー生成物が生じ、それとともに少量の未反応メイタンシノールが得られる。未反応のメイタンシノールは、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーによってエステル類から容易に分離されるが、ジアステレオマーメイタンシノイドエステル類は、ほとんど分離できない。前述の方法では（Ｋｕｐｃｈａｎ， Ｓ． Ｍ．ら， ２１ Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３１−３７ （１９７８）； 米国特許第４３６０４６２号）、２本のシリカゲルカラムでの精製とそれに続くシリカゲルでの分取薄層クロマトグラフィーによるさらなる精製後に、所望のＬ−アミノアシルエステルが得られる。従ってこの方法も、工業的規模での使用には適さない。
【００２１】
この方法における最後の段階、すなわちジスルフィド含有メイタンシノイド類の対応するチオール含有メイタンシノイド類への還元は、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）による処理、Ｃ−１８カラムおよび直線勾配で５５％から８０％のアセトニトリル／Ｈ２Ｏによる溶出を用いるＨＰＬＣによる精製によって達成される。しかしながらこの段階では収率が低く、やはり工業的規模での使用には適さない。チオール含有メイタンシノイド類は、この反応に用いられるエタノール／水混合溶媒にはあまり溶けない。さらに、移動相としてアセトニトリル／水を用いる逆相Ｃ−１８カラムでのＨＰＬＣによる精製では回収率が低く、一部の生成物は二量化する場合がある。
【００２２】
従って、方法の複雑さを軽減し、スケーラビリティ（ｓｃａｌａｂｉｌｉｔｙ）が可能であって、収率が上昇するチオール含有メイタンシノイド類の改良された製造および精製方法が強く望まれている。
【００２３】
発明の概要
そこで本発明の目的は、方法の複雑さを軽減し、スケーラビリティが可能であって、収率を向上させるチオール含有メイタンシノイド類の改良された製造および精製方法を提供することにある。
【００２４】
上記目的および他の目的は、チオール含有メイタンシノイド類の改良された製造および精製方法を提供することによって達成された。
【００２５】
１実施形態において本発明は、チオール含有メイタンシノイドの製造方法であって、
（１）水素化リチウムトリメトキシアルミニウム（ＬｉＡｌ（ＯＭｅ）３Ｈ）、水素化リチウムトリエトキシアルミニウム（ＬｉＡｌ（ＯＥｔ）３Ｈ）、水素化リチウムトリプロポキシアルミニウム（ＬｉＡｌ（ＯＰｒ）３Ｈ）、水素化ナトリウムトリメトキシアルミニウム（ＮａＡｌ（ＯＭｅ）３Ｈ）、水素化ナトリウムトリエトキシアルミニウム（ＮａＡｌ（ＯＥｔ）３Ｈ）および水素化ナトリウムトリプロポキシアルミニウム（ＮａＡｌ（ＯＰｒ）３Ｈ）からなる群から選択される還元剤でメイタンシノイドＣ−３エステルの還元的加水分解を行って、メイタンシノールを得る工程；
（２）前記メイタンシノールを精製して、副生成物が存在する場合にはそれを除去する工程；
（３）前記精製メイタンシノールをカルボン酸でエステル化して、メイタンシノールのＬ−およびＤ−アミノアシルエステルの反応混合物を得る工程；
（４）メイタンシノールの前記Ｌ−アミノアシルエステルを（３）で得られた反応混合物から分離する工程；
（５）メイタンシノールの前記Ｌ−アミノアシルエステルを還元して、チオール含有メイタンシノイドを得る工程；ならびに
（６）前記チオール含有メイタンシノイドを精製する工程
を含む、製造方法を提供する。
【００２６】
好ましくは（１）での還元剤は、水素化リチウムトリメトキシアルミニウムである。
【００２７】
やはり好ましくは、（１）での還元剤は、メイタンシノイドＣ−３エステル１モル当たり約５〜１００当量の濃度で使用する。より好ましくは（１）での還元剤は、メイタンシノイドＣ−３エステル１モル当たり約７．５〜３０当量の濃度で使用する。最も好ましくは（１）での還元剤は、メイタンシノイドＣ−３エステル１モル当たり約１０〜２０当量の濃度で使用する。
【００２８】
好ましくは（１）での還元的加水分解は、約−８０℃〜０℃の温度で行う。より好ましくは（１）での還元的加水分解は、約−４５℃〜−２７．５℃の温度で行う。最も好ましくは（１）での還元的加水分解は、約−３５℃〜−３０℃の温度で行う。
【００２９】
好ましくは（１）での還元剤は、約５〜４０分間かけて加える。より好ましくは（１）での還元剤は、約７〜２０分間かけて加える。最も好ましくは（１）での還元剤は、約８〜１２分間かけて加える。
【００３０】
好ましくは、（２）においてメイタンシノールは、クロマトグラフィーによって精製する。より好ましくは、（２）においてメイタンシノールは、シリカゲルカラムクロマトグラフィー、シリカゲルでの分取薄層クロマトグラフィーまたはシアノ結合シリカＨＰＬＣカラムクロマトグラフィーであるクロマトグラフィーによって精製する。最も好ましくは、（２）においてメイタンシノールは、シリカゲルカラムクロマトグラフィーであるクロマトグラフィーによって精製する。
【００３１】
好ましくは（２）での精製は、周囲温度で行う。
【００３２】
好ましくは（２）でのメイタンシノールは、約９５％の純度まで精製する。
【００３３】
好ましくは（３）でのカルボン酸は、Ｎ−メチル−Ｎ−メチルジチオアセチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−プロパノイル）−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−ブタノイル）−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（４−メチルジチオ−ブタノイル）−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（５−メチルジチオ−ペンタノイル）−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−フェニルジチオ−プロパノイル）−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−［３−（４−ニトロフェニルジチオ）−プロパノイル］Ｌ−アラニン、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−メチルジチオシステインおよびＮ−アセチル−Ｎ−メチルメチルジチオホモシステインからなる群から選択される。より好ましくは（３）でのカルボン酸は、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−プロパノイル）−Ｌ−アラニンである。
【００３４】
好ましくは（３）でのエステル化は、周囲温度で行う。
【００３５】
好ましくは（３）でのエステル化は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび塩化亜鉛の使用をさらに含む。
【００３６】
好ましくは（４）での分離は、シアノ結合シリカＨＰＬＣカラムに前記反応混合物を通すことで行う。
【００３７】
好ましくは（４）での分離は、約２５℃で行う。
【００３８】
好ましくは（５）での還元では、還元剤としてジチオトレイトールを用いる。
【００３９】
好ましくは（５）での還元は、酢酸エチル−メタノール−緩衝水溶液の混合物であって、緩衝塩、ジチオトレイトール、未還元メイタンシノイド類および還元メイタンシノイド類を溶液の状態に維持できる混合物中で行う。より好ましくは、酢酸エチル−メタノール−緩衝水溶液の混合物の酢酸エチル：メタノール：緩衝水溶液の体積比は１：１．５：１である。
【００４０】
好ましくはチオール含有メイタンシノイドの濃度は、そのチオール含有メイタンシノイドが酢酸エチル−メタノール−緩衝水溶液中に溶解した状態のままであるようなものとする。好ましくはチオール含有メイタンシノイドの濃度は約４ｇ／Ｌである。
【００４１】
好ましくは（５）での還元は、酸素を含まない雰囲気下で行う。
【００４２】
好ましくは（５）での還元は、約２５℃で行う。
【００４３】
好ましくは（６）でのチオール含有メイタンシノイドの精製はクロマトグラフィーによって行う。より好ましくはそのクロマトグラフィーは、シアノ結合ＨＰＬＣカラムによって行う。最も好ましくはそのクロマトグラフィーは、有機溶媒で平衡とし、その溶媒で溶離するシアノ結合ＨＰＬＣカラムによって行う。好ましくは前記有機溶媒は、ヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチルの混合物であり、より好ましくは前記有機溶媒のヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチルの体積比は７８．０：５．５：１６．５である。
【００４４】
図面の簡単な説明
（図面の説明については下記参照）
発明の説明
本発明は、高い細胞傷害性を保持し、かつ細胞結合剤に効果的に連結することができるチオール含有メイタンシノイド誘導体の合成に基礎をおくものである。当該技術分野では、チオール含有メイタンシノイド類の既存の製造方法が複雑で、スケーラビリティが困難であり、生成物の収率の低いものであることがわかっている。本発明は、方法の複雑さを低減し、スケーラビリティを可能とし、生成物収率を向上させるチオール含有メイタンシノイド類の新規な製造方法を開示することで、これらの問題を克服するものである。
【００４５】
従って本発明は、腫瘍細胞（特に固形腫瘍細胞）、ウィルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生生物感染細胞、自己免疫細胞（自己抗体を産生する細胞）、活性化細胞（移植片拒絶または移植片対宿主病に関与する細胞）あるいは他のいずれかの種類の病変細胞または異常細胞のような殺滅または溶解させるべき病変細胞または異常細胞を排除する上で有用であって、しかも副作用の少ない薬剤であるチオール含有メイタンシノイド類の新規な製造方法を提供する。
【００４６】
このチオール含有メイタンシノイド類は、結合型（ｂｏｕｎｄ ｆｏｒｍ）もしくは遊離型（ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｏｒｍ）あるいはその両方の状態で高い細胞傷害性を保持しながら、細胞結合剤に化学的に連結することができる。高い細胞傷害性とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにて薬剤に２４時間曝露したＫＢ細胞で測定した場合に、ＩＣ５０（生存率０．５となる、毒性物質の阻害濃度）が約１０−８ Ｍ以下の毒性を示すことと定義される。
【００４７】
本発明の化合物の治療薬としての有効性は、適切な細胞結合剤の注意深い選択によって決まる。細胞結合剤は、現在公知のあるいは今後公知となるいかなる種類のものであっても良く、ペプチド類および非ペプチド類などがある。一般にはそれは、抗体（特にはモノクローナル抗体）、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、栄養素輸送分子（トランスフェリンなど）または他のいずれかの細胞結合性分子もしくは物質であることができる。
【００４８】
好適なメイタンシノイド類
細胞傷害性薬剤として使用可能なメイタンシノイド類およびメイタンシノイド誘導体の製造について説明した開示は多くある。好適なメイタンシノイドの例としては、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体などがある。好適なメイタンシノール類似体の例としては、修飾芳香環を有するものならびに他の位置に修飾を有するものなどがある。
【００４９】
修飾芳香環を有する好適なメイタンシノール類似体およびそれの製造方法の具体例には、以下のものなどがある：
（１）Ｃ−１９−脱クロロ体（米国特許第４２５６７４６号）（アンサマイトシンＰ−２の水素化リチウムアルミニウム還元によって製造）；
（２）Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０脱メチル）および／またはＣ−１９−脱クロロ体（米国特許第４３６１６５０号および同４３０７０１６号）（ストレプトミセス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）もしくはアクチノミセス属菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）を用いる脱メチル化またはＬＡＨを用いる脱塩素化によって製造）；ならびに
（３）Ｃ−２０−脱メトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）および／または脱クロロ体（米国特許第４２９４７５７号）（塩化アシル類を用いるアシル化によって製造）。
【００５０】
他の位置の修飾を有する好適なメイタンシノール類似体の具体例には、以下のものなどがある：
（１）Ｃ−９−ＳＨ体（米国特許第４４２４２１９号）（メイタンシノールとＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応によって製造）；
（２）Ｃ−１４−アルコキシメチル体（脱メトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４３３１５９８号）；
（３）Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル体（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４４５０２５４号）（ノカルジア属菌（Ｎｏｃａｒｄｉａ）から取得）；
（４）Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ体（米国特許第４３６４８６６号）（メイタンシノールのストレプトミセス属菌による変換によって製造）；
（５）Ｃ−１５−メトキシ体（米国特許第４３１３９４６号および同４３１５９２９号）（トレウィア・ヌーディフローラ（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｌｆｌｏｒａ）から単離）；
（６）Ｃ−１８−Ｎ−脱メチル体（米国特許第４３６２６６３号および同４３２２３４８号）（メイタンシノールのストレプトミセス属菌による脱メチル化によって製造）；ならびに
（７）４，５−デオキシ体（米国特許第４３７１５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元によって製造）。
【００５１】
メイタンシノイドを細胞結合剤に連結させるには、連結基を用いる。
【００５２】
好適な連結基は当業界では公知であり、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性（ｌａｂｉｌｅ）基、光不安定性（ｐｈｏｔｏｌａｂｉｌｅ）基、ペプチダーゼ不安定性基およびエステラーゼ不安定性基などがある。好ましいものはジスルフィド基およびチオエーテル基である。
【００５３】
本発明によれば、連結基は、開示の方法によってメイタンシノイドに共有結合させた化学部分の一部である。好ましい実施形態において、その化学部分は、エステル結合を介してメイタンシノイドに共有結合している。
【００５４】
メイタンシノイド上の多くの位置が連結箇所として有用であると予想されるが、それは連結の種類によって決まる。例えばエステル結合を形成するには、水酸基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、水酸基で修飾されたＣ−１５位および水酸基を有するＣ−２０位がいずれも有用であると予想される。しかしながら、Ｃ−３位が好ましく、メイタンシノールのＣ−３位が特に好ましい。
【００５５】
メイタンシノールのＮ−メチル−Ｌ−アラニン含有Ｃ−３エステルおよびメイタンシノールのＮ−メチル−Ｌ−システイン含有Ｃ−３エステルあるいはそれらの類似体も好ましい。
【００５６】
本発明は、メイタンシノールのＣ−３位に連結基があるチオール含有メイタンシノイドの製造および精製方法に関するものである。
【００５７】
工程１：エステルを有するメイタンシノイドからのメイタンシノール（２）の合成
チオール含有メイタンシノイド類の製造および精製における第１工程では、メイタンシノイドＣ−３エステルの還元的加水分解を行ってメイタンシノール（２）を得ることを含む。
【００５８】
Ａ）メイタンシノイドＣ−３エステルを無水溶媒に溶かし、それを不活性ガス雰囲気下に置き、冷却する。
【００５９】
好ましくはメイタンシノイドＣ−３エステルはメイタンシンまたはアンサマイトシンＰ−３（１ｃ）である。アンサマイトシンＰ−４、Ｐ−３、Ｐ−２およびＰ−１などのアンサマイトシン（１ａ−ｅ）（Ａｓａｉら， ３５ Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １０７９−１０８５ （１９７９）； 米国特許第４４５０２３４号； Ｈａｔａｎｏら， ４８ Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １７２１−１７２９ （１９８４）に記載）も使用可能であり、より好ましくはアンサマイトシンＰ−３（１ｃ）である。メイタンシンは、Ｋｕｐｃｈａｎらの報告（Ｋｕｐｃｈａｎら， ４２ Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２３４９−２３５７ （１９７７））に記載の方法に従って得ることができる。アンサマイトシンＰ−３（１ｃ）の微生物的製造が米国特許４４５０２３４号およびハタノらの報告（Ｈａｔａｎｏら， ４８ Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １７２１−１７２９ （１９８４））に記載されている。
【００６０】
好ましくは前記無水溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、２−メトキシエチルエーテル、ジオキサンまたはジエチルエーテルである。ただし、他の溶媒も使用可能である。より好ましくは無水溶媒はテトラヒドロフランである。好ましくは、エステル１ ｇ当たり前記無水溶媒２０〜３０ ｍＬを使用し、より好ましくは２５ ｍＬ／ｇとする。好ましくは前記不活性ガスはアルゴン、窒素またはヘリウムである。ただし、他のガスも使用可能である。より好ましくは不活性ガスはアルゴンである。好ましくは前記溶液は、ドライアイス−アセトン浴で約０℃〜−８０℃、より好ましくは約−３０℃〜−５０℃、最も好ましくは約−３５℃〜−４５℃に維持する。
【００６１】
Ｂ）還元剤も冷却してから、メイタンシノイドＣ−３エステルの冷却溶液に移し入れる。反応液を、不活性ガス雰囲気下および低温に維持し、撹拌する。
【００６２】
好ましくは還元剤は、水素化リチウムトリメトキシアルミニウム（ＬｉＡｌ（ＯＭｅ）３Ｈ）、水素化リチウムトリエトキシアルミニウム（ＬｉＡｌ（ＯＥｔ）３Ｈ）、水素化リチウムトリプロポキシアルミニウム（ＬｉＡｌ（ＯＰｒ）３Ｈ）、水素化ナトリウムトリメトキシアルミニウム（ＮａＡｌ（ＯＭｅ）３Ｈ）、水素化ナトリウムトリエトキシアルミニウム（ＮａＡｌ（ＯＥｔ）３Ｈ）または水素化ナトリウムトリプロポキシアルミニウム（ＮａＡｌ（ＯＰｒ）３Ｈ）である。より好ましくは還元剤は、水素化リチウムトリメトキシアルミニウム（ＬｉＡｌ（ＯＭｅ）３Ｈ）である。好ましくは、還元剤は、ドライアイス−アセトン浴で約−３０℃〜−４０℃まで冷却する。好ましくは、冷却した還元剤を、カニューレを介してメイタンシノイドＣ−３エステルの冷却溶液に移し入れる。好ましくは前記不活性ガスはアルゴン、窒素またはヘリウムである。ただし、他のガスも使用可能である。より好ましくは不活性ガスはアルゴンである。
【００６３】
好ましくは還元剤は、メイタンシノイドＣ−３エステル１モル当たり約５〜１００当量、より好ましくは約７．５〜３０当量／モル、最も好ましくは約１０〜２０当量／モルの濃度で使用する。当業者であれば、メイタンシノイドＣ−３エステル１モル当たり約１００当量を超える量で還元剤を使用すると、望ましくない副生成物が生じる場合があることは明らかであろう。好ましくは還元剤は、約５〜４０分間、より好ましくは約７〜２０分間、最も好ましくは約８〜１２分間の時間をかけて、メイタンシノイドＣ−３エステルの冷却溶液に加える。好ましくは反応液は、不活性ガス雰囲気下、約−２５℃〜−８０℃、より好ましくは約−２７℃〜−４５℃、最も好ましくは約−３０℃〜−３５℃の温度範囲に維持する。好ましくは反応液は、約３０分間〜３時間、より好ましくは約３時間撹拌する。
【００６４】
当業者であれば、使用する還元剤の量、反応時に維持される温度、還元剤を加える時間の長さおよび反応時間は、それぞれ互いに依存していることは明らかであろう。例えば、還元剤の量が少ないほど、反応時間は長くなる。同様に、温度が低いほど、より過剰量の還元剤が必要となり、反応を完結させるのに要する時間が長くなる。さらに、還元剤を加える速度が遅くなるほど、反応を完結させるのに要する反応時間が長くなる。
【００６５】
Ｃ）反応停止を行い、抽出し、脱水し、濾過する。溶媒を減圧留去して、粗メイタンシノールを得る。
【００６６】
好ましくは反応停止は、飽和塩化ナトリウム溶液、水または塩化アンモニウム溶液を加えることで行い、より好ましくは飽和塩化ナトリウム溶液を加えることで行う。好ましくは反応停止は、使用するメイタンシノイドエステル１ ｇ当たり前記溶液約２０〜４０ ｍＬを用いて行う。好ましくは反応液は、酢酸エチル、塩化メチレン、トルエン、クロロホルムまたはエーテルで抽出し、より好ましくは酢酸エチルで抽出する。好ましくは反応液は、使用するメイタンシノイド１ ｇ当たり約４×８０〜４×２００ ｍＬの速度で抽出する。好ましくは、合わせた酢酸エチル抽出液を硫酸ナトリウムまたは硫酸マグネシウム、より好ましくは硫酸ナトリウムで脱水し、濾過する。
【００６７】
Ｄ）得られた粗メイタンシノール（２）は、必要に応じてクロマトグラフィーによって精製することができる。
【００６８】
好ましい実施形態では、粗メイタンシノール（２）は、それを最小量の酢酸エチル、塩化メチレン、エーテル、クロロホルムまたはトルエン、より好ましくは酢酸エチルに溶かし、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチルまたはトルエン、より好ましくは塩化メチレンを用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーによる精製を行うことで精製することができる。好ましくはメイタンシノール（２）は、塩化メチレンもしくは酢酸エチルから出発する段階的濃度勾配で、または塩化メチレン：酢酸エチル：アルコール、クロロホルム：酢酸エチルもしくはトルエン：酢酸エチル、好ましくは体積比７７：２３：０の塩化メチレン：酢酸エチル：アルコールの混合液で溶離する。アルコールの濃度を、０％から約２０％まで、好ましくは０％から約１０％まで徐々に上昇させる。所望の生成物を含む分画をまとめ、減圧下に溶媒留去して、純粋なメイタンシノール（２）を白色固体として得る。精製は周囲温度で行うことができる。好ましくは、精製は、約２０℃〜約２５℃の温度で行う。好ましくは、前記アルコールは、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−、イソ−、ｓｅｃ−もしくはｔｅｒｔ−ブタノールであり、より好ましくはメタノールである。
【００６９】
別の好ましい実施形態では、粗メイタンシノール（２）は、移動相に有機溶媒を用いる順相で溶離を行うシアノ結合シリカＨＰＬＣカラムを用いて精製することができる。粗メイタンシノール（２）を酢酸エチル、酢酸エチル：イソプロパノール：ヘキサン（移動相）または酢酸エチル−イソプロパノール、好ましくは酢酸エチルに溶かし、カラムに注入し、該当するピークを回収する。好ましくは、分離に使用するシアノ結合ＨＰＬＣカラムは、シリカ骨格に安定に結合したシアノプロピル基およびシアノ−ジイソプロピル基を有するものである。そのようなカラムは、数例挙げると、商品名ジアゼム（Ｄｉａｚｅｍ；商標名）、ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ；商標名）、モノクロム（Ｍｏｎｏｃｈｒｏｍ；商標名）およびクロマジル（Ｋｒｏｍａｓｉｌ；商標名）で入手可能である。好ましくは移動相で使用される有機溶媒は、ヘキサン：２−プロパノール：塩化メチレン：酢酸エチルである。好ましくはその有機溶媒の各成分の濃度は、それぞれ体積比６５〜７５：２〜４：１５〜２０：５〜１０の範囲である。より好ましくはその有機溶媒の各成分の濃度は、体積比７２：３：１８：７である。
【００７０】
好ましくは、この方法によって精製されたメイタンシノール（２）は、少なくとも９０％の純度、より好ましくは少なくとも９５％の純度のものである。当業者であれば、純度９０％未満のメイタンシノール（２）をその後の工程で用いると、追加の精製工程が必要になる場合があることは明らかであろう。
【００７１】
当業者であれば、前記還元反応によって、メイタンシノール（２）以外に、少量の望ましくない副生成物が生じる場合があることは明らかであろう。従って、その混入物を除去するために精製を行う必要が生じる場合がある。しかしながら、詳細な時間、温度および量が確立している場合のように、副生成物が生じない場合は、精製工程は必要ない。
【００７２】
工程２：連結基を有するメイタンシノール（２）のエステルの合成
次に、工程１で得られた（２）を、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）および塩化亜鉛存在下に、ジスルフィドを含むＮ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体６ａ−ｇまたはＮ−メチル−Ｌ−システイン誘導体９ａ−ｂでエステル化して、ジスルフィド連結基を有するメイタンシノールのＬ−およびＤ−アミノアシルエステル１０ａ−ｇおよび１２ａ−ｂを得る。これらの立体異性体を分離し、Ｌ−アミノアシルエステルを回収する。このエステル化反応により、アミノ酸誘導体６ａ−ｇおよび９ａ−ｂのキラル中心で何らかのエピマー化が生じることから、当業者であれば、前記立体異性体に代えて、工程２で６ａ−ｇおよび９ａ−ｂのラセミ体（すなわち、Ｄ， Ｌ−混合物）を用いることが可能であることは明らかであろう。
【００７３】
Ａ）１実施形態において、ジスルフィド基を有するＮ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体６ａ−ｇは、各種鎖長のω−メルカプト−カルボン酸３ａ−ｅを、メタンチオールスルホン酸メチルまたはジフェニルジスルフィドなどのアリールジスルフィド、ならびに環置換ジフェニルジスルフィドおよび２，２′−ジチオピリジンなどの複素環ジスルフィドと反応させることで、それらの個々のメチルジチオ誘導体、例えば４ａ−ｅ（ｎは１〜４であり、分岐および環状の脂肪族化合物を含む）またはアリール−ジチオ誘導体、例えば５ａ−ｂに変換することによって製造される。これらのカルボン酸を次に、Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンと反応させて、ジスルフィド基を有する所望のＮ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体６ａ−ｇを形成する。それをメイタンシノール（２）と縮合させて、ジスルフィド連結基を有するメイタンシノイド１０ａ−ｇを形成する。
【００７４】
Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンは、文献記載の方法（Ｆｕ， Ｓ． Ｊ． ＆ Ｂｉｒｎｂａｕｍ， Ｓ． Ｍ．， ７５ Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ９１８ （１９５３）参照）に従って製造することができるか、あるいは市販されている（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）。
【００７５】
好ましくは、ジスルフィド基を有するＮ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体は、Ｎ−メチル−Ｎ−メチルジチオアセチル−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−プロパノイル）−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（４−メチルジチオ−ブタノイル）−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−ブタノイル）−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（５−メチルジチオ−ペンタノイル）−Ｌ−アラニン、Ｎ−メチル−Ｎ−（３−フェニルジチオ−プロパノイル）−Ｌ−アラニンおよびＮ−メチル−Ｎ−［３−（４−ニトロフェニルジチオ）−プロパノイル］Ｌ−アラニンである。
【００７６】
Ｂ）別の実施形態では、Ｎ−メチル−Ｌ−システイン（７ａ）またはＮ−メチル−Ｌ−ホモシステイン（７ｂ）を個々のジスルフィド誘導体８ａ−ｂ（それぞれｎ＝１および２）に変換することができ、次にそれをアシル化して、ジスルフィド基を有するＮ−メチル−Ｌ−システインまたはＮ−メチル−Ｌ−ホモシステイン誘導体９ａ−ｂ（それぞれｎ＝１および２）を得る。これらのジスルフィド含有誘導体９ａ−ｂを、メイタンシノール（２）と縮合させることで、ジスルフィド連結基を有するメイタンシノイド１２ａ−ｂを形成する。
【００７７】
Ｎ−メチル−Ｌ−システインは、Ｕｎｄｈｅｉｍらの報告（ＵｎｄｈｅｉｍおよびＥｉｄｅｍ， ２３ Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ． Ｓｃａｎｄ． ３１２９−３１３３ （１９７０））に記載の方法に従って製造することができる。
【００７８】
好ましくはジスルフィド基を有するＮ−メチル−Ｌ−システイン誘導体は、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−メチルジチオシステイン（９ａ）およびＮ−アセチル−Ｎ−メチル−メチルジチオホモシステイン（９ｂ）である。
【００７９】
Ｃ）最初に、ジスルフィド基を有するＮ−メチル−Ｌ−アラニンまたはＮ−メチル−Ｌ−システイン誘導体（６ａ−ｇおよび９ａ−ｂ）の溶液を調製することで、メイタンシノール（２）をそのジスルフィド含有誘導体でエステル化する。その溶液を不活性ガス雰囲気下で撹拌し、それを（ａ）ＤＣＣまたはＥＤＣ（［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩）、好ましくはＤＣＣ溶液、（ｂ）ＺｎＣｌ２溶液および（ｃ）メイタンシノール溶液の順で処理する。反応が完結するまで混合物を撹拌する。反応完結後、それを濾過し、濾液を減圧下に溶媒留去して、メイタンシノールのＬ−およびＤ−アミノアシルエステル１０および１２の混合物を得る。
【００８０】
前述のように、このエステル化反応により、アミノ酸誘導体６ａ−ｇおよび９ａ−ｂのキラル中心で何らかのエピマー化が生じることから、当業者であれば、前記立体異性体に代えて、６ａ−ｇおよび９ａ−ｂのラセミ体（すなわち、Ｄ， Ｌ−混合物）を用いることが可能であることは明らかであろう。
【００８１】
好ましくは、ジスルフィド基を有するＮ−メチル−Ｌ−アラニンまたはＮ−メチル−Ｌ−システイン誘導体は、それぞれＮ−メチル−Ｎ−（メチルジチオ−プロパノイル）−Ｌ−アラニン（６ｂ）およびＮ−アセチル−Ｎ−メチル−メチルジチオシステイン（９ａ）である。好ましくは、ジスルフィド含有誘導体の溶液は、無水塩化メチレン、テトラヒドロフランまたはエーテル、好ましくは無水塩化メチレンを含むものであり、それはメイタンシノール１ ｇ当たり約１０〜５０ ｍＬ、好ましくは２０ ｍＬ／ｇで用いる。好ましくは不活性ガスはアルゴン、窒素またはヘリウムである。ただし、他のガスも使用可能である。より好ましくは不活性ガスはアルゴンである。
【００８２】
好ましくはＤＣＣまたはＥＤＣは、塩化メチレン溶液、テトラヒドロフラン溶液またはエーテル溶液、好ましくは塩化メチレン溶液とし、その溶媒はＤＣＣまたはＥＤＣ １ ｇ当たり約１０〜１５ ｍＬ、好ましくは１２ ｍＬ／ｇで用いる。好ましくはＤＣＣまたはＥＤＣ溶液は、メイタンシノール１モル当たり約５〜７モルの割合で加える。好ましくはＺｎＣｌ２は約１ Ｍであり、それはエーテル溶液または塩化メチレン溶液、好ましくはエーテル溶液で、メイタンシノール１モル当たり約１．２〜１．５モル、好ましくは１．２５モルで用いる。好ましくはメイタンシノールは、塩化メチレン溶液、テトラヒドロフラン溶液またはエーテル溶液、より好ましくは塩化メチレン溶液であり、溶媒はメイタンシノール１ ｇ当たり約１０〜１２０ ｍＬ、好ましくは１００ ｍＬ／ｇで用いる。反応混合物は、４〜３０℃、好ましくは室温で、１〜２４時間、好ましくは３時間撹拌する。当業者であれば、反応が必要とする攪拌時間の長さは温度によって決まるものであり、温度が低いほど反応時間が長くなることは明らかであろう。
【００８３】
Ｄ）Ｌ−およびＤ−アミノアシルメイタンシノールエステル１０ａ−ｇおよび１２ａ−ｂの分離は、移動相に有機溶媒を用いる順相で溶離を行うシアノ結合シリカＨＰＬＣカラムによって行う。酢酸エチルまたはヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチルに溶かしたＬ−およびＤ−アミノアシルメイタンシノールエステル混合物をカラムに注入する。移動相を調節して、これら２種類の異性体の保持時間の間隔が１０分を上回るようにすることができる。
【００８４】
別法として、シリカゲルクロマトグラフィーを用いて分離を行うことができるが、その方法は工業的規模に変換するのが容易ではない。分離は、キラルカラムまたはシリカカラムを用いるＨＰＬＣなどの他の手段によって行うこともできるが、それはあまり望ましいものではない。
【００８５】
この分離に使用されるシアノ結合ＨＰＬＣカラムは、シリカ骨格に安定に結合したシアノプロピル基およびシアノ−ジイソプロピル基を有するものである。そのようなカラムは、特には商品名Ｄｉａｚｅｍ（商標名）、Ｚｏｒｂａｘ（商標名）、Ｍｏｎｏｃｈｒｏｍ（商標名）およびＫｒｏｍａｓｉｌ（商標名）で入手可能である。好ましくは移動相で使用される有機溶媒は、ヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチルである。好ましくは分離の収率は約９０％を超えるものであり、生成物は少なくとも約９５％の純度のものであり、より好ましくは光学的に純粋なものである。上記の条件下では、所望のＬ−異性体は約３６〜４６分、好ましくは４２分の保持時間を有し、Ｄ−異性体は約５０〜６０分、好ましくは５６分で溶出する。好ましくはこのエステル化は、約２５℃で行う。
【００８６】
工程３：チオール含有メイタンシノイド１１ａ−ｇおよび１３ａ−ｂの合成
チオール含有メイタンシノイド１１ａ−ｇおよび１３ａ−ｂを得るには、工程２から得られたＬ−アミノアシルメイタンシノールエステルを、溶媒およびアルコールを含む溶液に溶かす。その混合物を不活性ガス雰囲気下で撹拌し、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むジチオトレイトールまたはジチオエリスリトールの緩衝液溶液で処理する。反応の進行はＨＰＬＣによってモニタリングすることができ、通常は３時間以内に完結する。ただしそれは１〜２４時間の範囲で変動し得る。反応完結した反応液を、ＥＤＴＡを含む緩衝液で処理し、抽出する。有機層を合わせ、洗浄および脱水を行う。溶媒を留去することで粗チオール含有メイタンシノイド１１ａ−ｇおよび１３ａ−ｂの残留物が得られ、それを分取シアノ結合シリカＨＰＬＣカラムを用いて精製することができる。生成物を含む分画を溶媒留去して、純粋なチオール含有メイタンシノイドを白色固体として得ることができる。
【００８７】
好ましくは、工程２で得られたＬ−アミノアシルメイタンシノールエステルを溶かす溶媒は、酢酸エチル、塩化メチレンまたはエーテル、より好ましくは酢酸エチルであり、溶媒はメイタンシノイド１ ｇ当たり約６０〜８０ ｍＬ、好ましくは７２ ｍＬ／ｇで使用する。好ましくは、工程２から得られたＬ−アミノアシルメイタンシノールエステルを溶かすアルコールはメタノールまたはエタノール、より好ましくはメタノールであり、アルコールはメイタンシノイド１ ｇ当たり約９０〜１２０ ｍＬ、好ましくは１０８ ｍＬ／ｇで使用する。好ましくは、Ｌ−アミノアシルメイタンシノールエステルとジチオトレイトールとの間の反応は、酢酸エチル：メタノール：緩衝水溶液の混合物であって、緩衝塩、ジチオトレイトールおよびメイタンシノイド類（還元型および未還元型）を溶液の状態に維持できる混合物中で行う。より好ましくはＬ−アミノアシルメイタンシノールエステルとジチオトレイトールとの間の反応は、酢酸エチル：メタノール：緩衝水溶液の１：５：１混合物中で行う。
【００８８】
好ましくは工程３で用いるＬ−アミノアシルメイタンシノールエステルの濃度は約４ｇ／Ｌ未満として、Ｌ−アミノアシルメイタンシノールエステルが溶解状態に維持されるようにする。
【００８９】
好ましくはこの還元反応は、酸素を含まない雰囲気下で行う。好ましくは不活性ガスはアルゴン、窒素またはヘリウムである。ただし他のガスも使用可能である。より好ましくは不活性ガスはアルゴンである。
【００９０】
好ましくはこの還元反応は、４〜３０℃、より好ましくは室温で行う。当業者であれば、この反応がそれより低い温度で実施可能であるが、反応完結に要する時間が長くなるということは明らかであろう。
【００９１】
好ましくは、Ｌ−アミノアシルメイタンシノールエステルを含む溶液を、ジチオトレイトール、ジチオエリスリトールまたはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などのホスフィン試薬、より好ましくはジチオトレイトールで処理し、還元剤はメイタンシノイド１モル当たり約２〜３モル、好ましくは２．５モル／モルでリン酸カリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液もしくはトリエタノールアミン緩衝液、好ましくはリン酸カリウム緩衝液中で使用し、その緩衝液の濃度は約２０〜１００ ｍＭ、好ましくは５０ ｍＭとし、緩衝ＤＴＴの量はメイタンシノイド １ ｇ当たり６０〜８０ ｍＬ、好ましくは７２ ｍＬ／ｇとし、約１〜１０ ｍＭ、好ましくは２ ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含有させる。
【００９２】
好ましくは、反応完結した反応液を、０．２ Ｍのリン酸カリウム緩衝液、リン酸ナトリウム緩衝液もしくはトリエタノールアミン緩衝液、好ましくはリン酸カリウム緩衝液で処理し、緩衝液はメイタンシノイド １ ｇ当たり約１２０〜１６０ ｍＬ、好ましくは１４４ ｍＬ／ｇで用い、約１〜１０ ｍＭ、好ましくは２ ｍＭのＥＤＴＡを含有させる。好ましくは抽出は、酢酸エチル、塩化メチレンまたはエーテル、より好ましくは酢酸エチルで行い、溶媒はメイタンシノイド１ ｇ当たり２００〜５００ ｍＬ、好ましくは３００ ｍＬ／ｇの量で使用し、抽出を３回繰り返す。好ましくは、合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム溶液、水または飽和塩化アンモニウム溶液、より好ましくは飽和塩化ナトリウム溶液で、メイタンシノイド１ ｇ当たり４０−１００ ｍＬ、好ましくは５０ ｍＬ／ｇの量にて洗浄し、次に硫酸ナトリウムまたは硫酸マグネシウム、好ましくは硫酸ナトリウムで脱水する。
【００９３】
好ましくは、分離に用いられるシアノ結合ＨＰＬＣカラムは、シリカ骨格に安定に結合したシアノプロピル基およびシアノ−ジイソプロピル基を有するものである。そのようなカラムは、数例挙げると、商品名Ｄｉａｚｅｍ（商標名）、Ｚｏｒｂａｘ（商標名）、Ｍｏｎｏｃｈｒｏｍ（商標名）およびＫｒｏｍａｓｉｌ（商標名）で入手可能である。より好ましくは、Ｄｉａｚｅｍ分取ＣＮカラム（２５０ ｍｍ×５０ ｍｍ、粒径１０ミクロン）を用いる。好ましくは移動相で使用される有機溶媒は、ヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチルである。より好ましくは、移動相で用いられる有機溶媒は、ヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチルの７８．０：５．５：１６．５（体積比）混合物である。好ましくは流量は１５０ ｍＬ／分である。好ましくは、分離収率は７５％より高く、生成物は少なくとも約９０％の純度を有し、より好ましくは少なくとも約９５％の純度を有する。好ましくは所望のチオール含有メイタンシノイド１１ａ−ｄおよび１３ａ−ｂは、保持時間１６分を有し、約１４〜１８分の範囲内である。
【００９４】
本発明によるＮ−メチル−Ｌ−アラニン含有メイタンシノイド誘導体の具体例は、下記式（Ｉ）−（ＩＶ）によって表されるものである。
【００９５】
【化１】
2004506738.tif 000002
［式中、ＺはＨまたはＳＲを表し；Ｒはメチル、直鎖アルキル、分岐アルキル、環状アルキル、単純もしくは置換アリールまたは複素環基を表し；ｌは１〜１０の整数を表し；ｍａｙはメイタンシノイドを表す］；
【００９６】
【化２】
2004506738.tif 000003
［式中、Ｒ１およびＲ２は同一でも異なっていても良く、Ｈ、ＣＨ３またはＣＨ２ＣＨ３を表し；ＺはＨまたはＳＲを表し；Ｒはメチル、直鎖状アルキル、分岐状アルキル、環状アルキル、単純もしくは置換アリールまたは複素環を表し；ｍは０、１、２または３を表し；ｍａｙはメイタンシノイドを表す］；
【００９７】
【化３】
2004506738.tif 000004
［式中、ＺはＨまたはＳＲを表し；Ｒはメチル、直鎖状アルキル、分岐状アルキル、環状アルキル、単純もしくは置換アリールまたは複素環を表し；ｐは３〜８の整数を表し；ｍａｙはメイタンシノイドを表す］；
【００９８】
【化４】
2004506738.tif 000005
［式中、ＺはＨまたはＳＲを表し；Ｒはメチル、直鎖状アルキル、分岐状アルキル、環状アルキル、単純もしくは置換アリールまたは複素環を表し；ｑは１〜１０の整数を表し；ＹはＣｌまたはＨを表し；ＸはＨまたはＣＨ３を表す］。
【００９９】
本発明で有用なＮ−メチル−Ｌ−システイン含有メイタンシノイド誘導体の具体例は、下記式（Ｖ）および（ＶＩ）によって表される。
【０１００】
【化５】
2004506738.tif 000006
［式中、ＺはＨまたはＳＲを表し；Ｒはメチル、直鎖状アルキル、分岐状アルキル、環状アルキル、単純もしくは置換アリールまたは複素環を表し；ｏは１または２を表し；ｑは０または１〜１０の整数を表し；ｍａｙはメイタンシノイドを表す］；
【０１０１】
【化６】
2004506738.tif 000007
［式中、ＺはＨまたはＳＲを表し；Ｒはメチル、直鎖状アルキル、分岐状アルキル、環状アルキル、単純もしくは置換アリールまたは複素環を表し；ｏは１または２を表し；ｑは０または１〜１０の整数を表し；ＹはＣｌまたはＨを表し；ＸはＨまたはＣＨ３を表す］。
【０１０２】
直鎖状アルキルの例には、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルなどがある。
【０１０３】
分岐状アルキルの例には、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルおよび１−エチル−プロピルなどがある。
【０１０４】
シクロアルキルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルなどがある。
【０１０５】
単純アリールの例としては、フェニルおよびナフチルなどがある。
【０１０６】
置換アリールの例としては、アルキル基、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆなどのハロゲン、ニトロ基、アミノ基、スルホン酸基、カルボン酸基、水酸基およびアルコキシ基によって置換された上記のもののようなアリールなどがある。
【０１０７】
複素環の例としては、ヘテロ原子がＯ、ＮおよびＳから選択される化合物であり、ピロリル、ピリジル、フリルおよびチオフェンなどがある。
【０１０８】
定義
本明細書で使用する場合、「室温」および「周囲温度」という用語は、環境温度または未制御の温度を意味する。「光学純度」という用語は、純度が９８％を超えることを意味している。本明細書において例えば温度、時間、濃度などで範囲が具体的に示されている場合、その範囲は、その範囲内の全ての具体値、ならびにその広い範囲に含まれる小範囲を含む。値を具体値に「約」を付して、あるいは値の範囲で記載する場合、理解しておくべき点として、その値の統計的に有意性のない変動も含まれる。
【０１０９】
実施例
以下、実施例にて本発明を説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。別段の断りがない限り、パーセント表示、比率、部表示などはいずれも重量基準である。
【０１１０】
実施例１−チオール含有メイタンシノイド誘導体の合成
融点は、電熱融点計で測定した。プロトン磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルは、６０ ＭＨｚのＶａｒｉａｎ（登録商標）ＥＭ３６０分光計または３００ ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ（登録商標）ＡＭ３００装置で得た。化学シフトは、内部テトラメチルシラン（ＴＭＳ）標準に対するδ値で報告している。ＵＶスペクトルは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標）λ４Ａ分光光度計で記録した。旋光度は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（登録商標）２４１型旋光計を用いて測定した。ＨＰＬＣ分析および精製には、波長もしくはダイオードアレイＵＶ検出器およびＷａｔｅｒｓ（登録商標）Ｒａｄｉａｌｐａｋ Ｃ−１８カラムまたはＤｉａｚｅｍ（登録商標）シアノカラムもしくはＣｈｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）シアノカラムを搭載したＲａｉｎｉｎ（登録商標）ＨＰ、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ（登録商標）またはＨｉｔａｃｈｉ（登録商標）の装置を用いた。元素分析は、Ａｔｌａｎｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｌａｂｓ， Ａｔｌａｎｔａ， Ｇａが行った。
【０１１１】
２−メルカプト酢酸（３ａ）、３−メルカプトプロパン酸（３ｂ）および４−メルカプトブタン酸（３ｃ）は市販されている。
【０１１２】
５−メルカプトペンタン酸（３ｄ）。５−メルカプトペンタン酸（３ｄ）は、文献の方法（Ｋｈｉｍら， ３７ Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ２７１４−２７２０ （１９７２））の変法によって製造した。５−ブロモペンタン酸（１．８０ ｇ、０．０１ ｍｏｌ）の無水エタノール（２５ ｍＬ）攪拌溶液に、チオ尿素（０．７６１ ｇ、０．０１ ｍｏｌ）を加え、反応混合物を６時間還流させた。次いで５０％ＮａＯＨ水溶液（２０ ｍＬ）を加え、混合物をさらに２時間還流させた。次に混合物を水（１００ ｍＬ）で希釈し、酸性とし（ＨＣｌ水溶液）、酢酸エチルで抽出した（５０ ｍＬで４回）。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させた。残留物について、塩化メチレン／酢酸エチルで溶出するシリカゲルでのクロマトグラフィーを行って、無色液体０．８８５ ｇ（６６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）δ１．３ （１Ｈ， ｔ）， １．６ （４Ｈ， ｍ）， ２．４ （４Ｈ， ｍ）， １１．５ （１Ｈ， ｓ）。
【０１１３】
３−メルカプトブタン酸（３ｅ）。市販のβ−ブチロラクトン（３．０ ｇ、３５．０ ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２０ ｍＬ）溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（１０．０ ｇ、７７．５ ｍｍｏｌ）に加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下で撹拌し、チオ酢酸（３．０ ｇ、３９．０ ｍｍｏｌ）で処理した。反応混合物を室温で６時間撹拌した。次いで溶媒を蒸発させ、生成物について、３％酢酸を含むエチル：ヘキサン（体積比３：１）を用いて溶出するシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー精製を行った。３ｅのチオアセテート誘導体を無色油状物として得た（２．０ ｇ、収率３５％）。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）：δ１．５ （３Ｈ， ｄ）， ２．３ （３Ｈ， ｓ）， ２．８ （２Ｈ， ｄ）， ４．０ （１Ｈ， ｍ）および１１．３ （１Ｈ， ｓ）。このチオアセテートを、塩基加水分解によってチオール３ｅに変換した。チオアセテート（１．５ ｇ、９．３ ｍｍｏｌ）のメタノール（６ ｍＬ）溶液を、３．３ Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（１０ ｍＬ）で処理した。反応物をアルゴン雰囲気下で撹拌した。反応の進行をＴＬＣによってモニタリングし、３時間以内に完了したものと判断した。１ Ｍ塩酸（４０ ｍＬ）を加えることで反応混合物を酸性とし、酢酸エチル（７０ ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発して３−メルカプトブタン酸（３ｅ）を得た。それをそれ以上精製せずに、４ｅの合成に用いた。
【０１１４】
メチルジチオ−酢酸（４ａ）。氷浴で冷却したメルカプト酢酸（３ａ）（３．０ ｇ、０．０３２６ ｍｍｏｌ）の水溶液（水１００ ｍＬ）の撹拌したものに、メタンチオスルホン酸メチル（４．５２ ｇ、０．０３６ ｍｏｌ）の無水エタノール（４０ ｍＬ）溶液を加えた。反応混合物を昇温させて室温とし、終夜撹拌した。次いで反応混合物を飽和ＮａＣｌ水溶液（３００ ｍＬ）で希釈し、ジエチルエーテルで抽出した（１００ ｍＬで３回）。合わせた有機層を飽和塩化ナトリウム（１００ ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過した。濾液を減圧下で蒸発し、残留物を減圧蒸留して、４ａを無色油状物として得た（２．９０ ｇ、収率６４％）。沸点１ｍｍ＝１００℃。１Ｈ ＮＭＲ：δ２．４ （３Ｈ， ｓ）， ３．５ （３Ｈ， ｓ）および１０．２ （１Ｈ， ｓ）。
【０１１５】
３−メチルジチオ−プロパン酸（４ｂ）。氷浴で冷却した３−メルカプトプロパン酸（３ｂ）（５．００ ｇ、０．０４７ ｍｏｌ）の水溶液（水１５０ ｍＬ）の攪拌したものに、メタンチオスルホン酸メチル（６．５４ ｇ、０．０５２ ｍｏｌ）の無水エタノール（７５ ｍＬ）溶液を加えた。反応混合物を室温で終夜撹拌した。次いで混合物を飽和ＮａＣｌ水溶液（４００ ｍＬ）で希釈し、エーテルで抽出した（１５０ ｍＬで３回）。合わせたエーテル抽出物を飽和ＮａＣｌで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。残留物を蒸留して、無色液体を得た（６．４７ ｇ、収率９０％）。沸点１．０ １０５℃。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）δ２．３ （３Ｈ， ｓ）， ２．８ （４Ｈ， ｍ）， １１．２ （１Ｈ， ｓ）。
【０１１６】
４−メチルジチオ−ブタン酸（４ｃ）。ビス−（３−カルボキシプロピル）−ジスルフィド（１．００ ｇ、４．２０ ｍｍｏｌ）のメタノール（２０ ｍＬ）攪拌溶液に、ジチオトレイトール（０．６４７ ｇ、４．２０ ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（２０ ｍＬ）溶液を加えた。次に、１０ Ｍ ＮａＯＨ溶液（０．８４２ ｍＬ、８．４２ ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で終夜撹拌して、還元を完結させた。メタンチオールスルホン酸メチル（１．１７ ｇ、９．２４ ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物をさらに３時間撹拌した。次いで混合物を飽和ＮａＣｌ水溶液（１５０ ｍＬ）で希釈し、酸性とし（ＨＣｌ水溶液）、エチルエーテルで抽出した（１００ ｍＬで３回）。合わせた有機層を飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮し、濃縮物について、塩化メチレン／酢酸エチルを用いて溶出するシリカゲルでのクロマトグラフィーを行って、透明液体０．８６７ ｇ（５６％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）δ２．１ （２Ｈ， ｍ）， ２．４ （３Ｈ， ｓ）， ２．４ （２Ｈ， ｍ）， ２．７ （２Ｈ， ｍ）， １１．１ （１Ｈ， ｓ）。
【０１１７】
５−メチルジチオ−ペンタン酸（４ｄ）。５−メルカプトペンタン酸（３ｄ）（０．５００ ｇ、３．７３ ｍｍｏｌ）の水溶液（水２０ ｍＬ）の攪拌したものに、メタンチオスルホン酸メチル（０．５１７ ｇ、４．１０ ｍｍｏｌ）の無水エタノール（５ ｍＬ）溶液を加え、混合物を室温で３時間撹拌した。次いで混合物を飽和ＮａＣｌ水溶液（１００ ｍＬ）で希釈し、エチルエーテルで抽出した（１００ ｍＬで３回）。合わせた有機層を飽和ＮａＣｌで洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、減圧下で蒸発し、濃縮物について、塩化メチレン／酢酸エチルを用いて溶出するシリカでのクロマトグラフィーを行って、白色結晶０．６０２ ｇ（９０％）を得た。融点４２〜４４℃。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）δ１．７ （４Ｈ， ｍ）， ２．４ （３Ｈ， ｓ）， ２．４ （２Ｈ， ｍ）， ２．７ （２Ｈ， ｍ）， １１．１ （１Ｈ， ｓ）。
【０１１８】
３−メチルジチオ−ブタン酸（４ｅ）。３ｅ（１．１ ｇ、９．３ ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（１０ ｍＬ）溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（３．４ ｇ、２７ ｍｍｏｌ）およびメタンチオスルホン酸メチル（１．５ ｇ、１２．０ ｍｍｏｌ）の無水エタノール（８ ｍＬ）溶液の順で処理した。反応混合物をアルゴン下にて室温で３時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を３ Ｍ塩酸（１５ ｍＬ）で処理し、酢酸エチル（４０ ｍＬ）で抽出した。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させた。残留物について、３％酢酸をを含む酢酸エチル：ヘキサン（体積比３：１）を用いて溶出するシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー精製を行った。生成物４ｅを無色油状物として得た（０．６１ ｇ、収率４０％）。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）：δ１．４ （３Ｈ， ｄ）， ２．３ （３Ｈ， ｓ）， ２．８ （２ Ｈ， ｄ）， ３．９ （１Ｈ， ｍ）および１１．５ （１Ｈ， ｓ）。
【０１１９】
３−フェニルジチオ−プロパン酸（５ａ）。ジフェニルジスルフィド（３．０ ｇ、１３．８ ｍｍｏｌ）のエーテル（１０ ｍＬ）およびメタノール（２０ ｍＬ）混合溶液の攪拌したものに、窒素雰囲気下にて室温で３−メルカプトプロパン酸（３ｂ）（０．４９ ｇ、４．６ ｍｍｏｌ）のエーテル（５ ｍＬ）溶液を加え、次に１０ Ｍ ＮａＯＨ溶液（０．４６ ｍＬ、４．６ ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で２０時間撹拌し、減圧下に溶媒を除去した。生成物について、酢酸エチル／ヘキサンを用いて溶出するシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー精製を行った。生成物を白色固体として得た（０．５６ ｇ、５６．６％）。融点５７〜５９℃。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３， ＴＭＳ）δ２．６−３．０ （４Ｈ， ｍ）， ７．１−７．６ （５Ｈ， ｍ）， １０．６ （１Ｈ， ｓ）。
【０１２０】
３−（４−ニトロフェニルジチオ）−プロパン酸（５ｂ）。ＴＨＦ（２００ ｍＬ）およびメタノール（５０ ｍＬ）の混合物に溶解したビス−（４−ニトロフェニル）−ジスルフィド（３．００ ｇ、９．７３ ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、３−メルカプトプロパン酸（３ｂ）（０．６８８ ｇ、６．４９ ｍｍｏｌ）を加えた。次いで１０ Ｎ ＮａＯＨ溶液１滴を混合物に加え、反応物を１時間撹拌した。次に、反応混合物を飽和ＮａＣｌ（１００ ｍＬ）で希釈し、酢酸エチルで抽出した（７５ ｍＬで３回）。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させ、生成物について、塩化メチレン／酢酸エチルを用いて溶出するシリカゲルでのクロマトグラフィーを行って、明黄色固体０．８８５ ｇ（５３％）を得た。融点９８〜１００℃。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣＯＣＤ３）δ２．８ （２Ｈ， ｍ）， ３．１ （２Ｈ， ｍ）， ７．８ （２Ｈ， ｄ）， ８．２ （２Ｈ， ｄ）。
【０１２１】
Ｎ−メチル−Ｎ−メチルジチオアセトイル−Ｌ−アラニン（６ａ）。１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（２．９９ ｇ、１５．６ ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．５８ ｇ、１５．６ ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（４０ ｍＬ）攪拌溶液に、０℃でメチルジチオ−酢酸（Ｓｉｎｇｈら， １０４ Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５１−５８ （１９８０）（４ａ）（１．６６ ｇ、１２．０ ｍｍｏｌ）の脱水ＣＨ２Ｃｌ２（２０ ｍＬ）溶液を加えた。４−ジメチルアミノピリジン（０．０７３ ｇ、０．６０ ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（２ ｍＬ）溶液を加え、混合物を０℃で４５分間撹拌した。次いでＮ−メチル−Ｌ−アラニン（０．６１９ ｇ、６．００ ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．６０７ ｇ、６．００ ｍｍｏｌ）との無水ＤＭＦ（３０ ｍＬ）中の混合物を加え、混合物を０℃で２時間撹拌した。反応混合物を水（１００ ｍＬ）で希釈し、さらに３０分間撹拌し、次いで酸性とし（ＨＣｌ水溶液）、酢酸エチルで抽出した（７５ ｍＬで４回）。合わせた有機層を水で数回洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、減圧下にて蒸発させた。残留物について、塩化メチレン酢酸エチルを用いて溶出するシリカゲルでのクロマトグラフィーを行って、淡黄色油状物０．２５ ｇ（１９％）を得た。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）δ１．４ （３Ｈ， ｄ）， ２．４ （３Ｈ， ｓ）， ２．９， ３．０ （計３Ｈ， ２ｓ）， ３．６ （２Ｈ， ｓ）， ４．７， ５．２ （計１Ｈ， ２ｑ）， ９．８ （１Ｈ， ｓ）。
【０１２２】
Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−プロパノイル）−Ｌ−アラニン（６ｂ）。３−メチルジチオ−プロパン酸（４ｂ）（１．００ ｇ、６．５７ ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（２０ ｍＬ）攪拌溶液に、アルゴン下にて−１０℃でクロロギ酸イソブチル（０．８９７ ｇ、６．５７ ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．６６５ ｇ、６．５７ ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１５分間撹拌した。Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（０．６７７ ｇ、６．５７ ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１．３３ ｇ、１３．１４ ｍｍｏｌ）との水（１０ ｍＬ）中の混合物を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌した。次いで混合物を水（５０ ｍＬ）で希釈し、酸性とし（ＨＣｌ水溶液）、酢酸エチルで抽出した（５０ ｍＬで４回）。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物について、塩化メチレン／酢酸エチルを用いて溶出するシリカゲルでのクロマトグラフィーを行って、白色結晶０．５５６ ｇ（３４％）を得た。融点９８〜１００℃。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）δ１．３ （３Ｈ， ｄ）， ２．２ （３Ｈ， ｓ）， ２．７ （４Ｈ， ｍ）， ４．５ （１Ｈ， ｑ）， １０．７ （１Ｈ， ｓ）。Ｃ８Ｈ１５ＮＯ３Ｓ２についての元素分析計算値：Ｃ， ４０．４９； Ｈ， ６．３７； Ｎ， ５．９０；分子量２３７．３３。実測値：Ｃ， ４０．４２； Ｈ， ６．４１； Ｎ， ５．９３。
【０１２３】
Ｎ−メチル−Ｎ−（４−メチルジチオ−ブタノイル）−Ｌ−アラニン（６ｃ）。４−メチルジチオ−ブタン酸（４ｃ）（０．２００ ｇ、１．２０ ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１０ ｍＬ）攪拌溶液に、アルゴン下にて−２０℃でクロロギ酸（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍｅｔａ）イソブチル（０．１６４ ｇ、１．２０ ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．１２１ ｇ、１．２０ ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２０分間撹拌した。次いでＮ−メチル−Ｌ−アラニン（０．１２４ ｇ、１．２０ ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．２４３ ｇ、２．４０ ｍｍｏｌ）との水（５ ｍＬ）中の混合物を加え、反応混合物を室温で５時間撹拌した。反応混合物を６ｂにおいて前述した方法に従って処理して、標題化合物を白色結晶として得た（０．１３５ ｇ、４４％）。融点９２〜９３℃。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）δ１．４ （３Ｈ， ｄ）， ２．０ （２Ｈ， ｍ）， ２．３ （３Ｈ， ｓ）， ２．７ （４Ｈ， ｍ）， ２．９ （３Ｈ， ｓ）， ５．１ （１Ｈ， ｑ）， １０．５ （１Ｈ， ｓ）。
【０１２４】
Ｎ−メチル−Ｎ−（５−メチルジチオ−ペンタノイル）−Ｌ−アラニン（６ｄ）。５−メチルジチオ−ペンタン酸（４ｄ）（０．２０２ ｇ、１．１２ ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１５ ｍＬ）攪拌溶液に、アルゴン下にて−４０℃でクロロギ酸イソブチル（０．１５３ ｇ、１．１２ ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．１１３ ｇ、１．１２ ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を−１０℃で２０分間撹拌した。Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（０．１１６ ｇ、１．１２ ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．２２７ ｇ、２．２４ ｍｍｏｌ）との水溶液（水５ ｍＬ）を加え、混合物を０℃で５時間撹拌した。反応混合物を６ｂにおいて前述した方法に従って処理して、標題化合物を白色結晶として得た（０．１９６ ｇ、６６％）。融点８４℃。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）δ１．４ （３Ｈ， ｄ）， １．８ （４Ｈ， ｍ）， ２．４ （３Ｈ， ｓ）， ２．７ （４Ｈ， ｍ）， ３．０ （３Ｈ， ｓ）， ５．２ （１Ｈ， ｑ）， １０．７ （１Ｈ， ｓ）。
【０１２５】
Ｎ−メチル−Ｎ−（３−フェニルジチオ−プロパノイル）−Ｌ−アラニン（６ｅ）。３−フェニルジチオ−プロパン酸（５ａ）（１．８ ｇ、８．４ ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ溶液を、窒素雰囲気下にて力強く撹拌し、冷却して−１５℃とした。クロロギ酸イソブチル（１．２ ｍＬ、９．２５ ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１．２９ ｍＬ、９．２５ ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物をその温度で１０分間撹拌した。Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（０．８７ ｇ、８．４ ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（１．２９ ｍＬ、９．２５ ｍｍｏｌ）との水溶液（水１０ ｍＬ）を加え、反応混合物を−１５℃で１５分間撹拌し、昇温させて室温とし、さらに２．５時間撹拌した。１ Ｍ ＨＣｌ（１０ ｍＬ）を加え、反応混合物を酢酸エチルで抽出した（５０ ｍＬで４回）。合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発させた。粗混合物について、２％酢酸を含む酢酸エチル／ヘキサンを用いて溶出するシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー精製を行って、６ｅを白色固体として得た（１．５ ｇ、６０％）。融点９６〜９７℃。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３／ＴＭＳ）δ１．４ （２Ｈ， ｄ）， ２．７−３．０ （７Ｈ， ｍ）， ５．２ （１Ｈ， ｑ）， ７．２−７．６ （５Ｈ， ｍ）。
【０１２６】
Ｎ−メチル−Ｎ−［３−（４−ニトロフェニルジチオ）−プロパノイル］−Ｌ−アラニン（６ｆ）。３−（４−ニトロフェニルジチオ）−プロパン酸（５ｂ）（０．１００ ｇ、０．３８６ ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１０ ｍＬ）攪拌溶液に、アルゴン下にて−４０℃でクロロギ酸イソブチル（０．０５３ ｇ、０．３８６ ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．０３９ ｇ、０．３８ ｍｍｏｌ）を加え、反応物を０℃で１時間撹拌した。次いでＮ−メチル−Ｌ−アラニン（０．０４０ ｇ、０．３８６ ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．０３９ ｇ、０．３８６ ｍｍｏｌ）との水溶液（５ ｍＬ）を加え、混合物を０℃で５時間撹拌した。混合物を水（５０ ｍＬ）で希釈し、酸性とし（ＨＣｌ水溶液）、エチルエーテルで抽出した（２５ ｍＬで３回）。合わせた有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、減圧下にて溶媒を蒸発させた。残留物について、塩化メチレン／酢酸エチルを用いて溶出するシリカゲルでのクロマトグラフィーを行って、黄色結晶０．０４８ ｇ（３６％）を得た。融点７４〜７７℃。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）δ１．４ （３Ｈ， ｄ）， ２．６−３．４ （４Ｈ， ｍ）， ２．９ （３Ｈ， ｓ）， ５．１ （１Ｈ， ｑ）， ７．６−８．３ （４Ｈ， ２ｄ）。
【０１２７】
Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−ブタノイル）−Ｌ−アラニン（６ｇ）。４ｅ（３．５２ ｇ、２１．２ ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン（２０ ｍＬ）溶液を冷却して−２０℃とし、アルゴン雰囲気下にて撹拌した。次に、クロロギ酸イソブチル（３．４８ ｍＬ、２１．２ ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３．７ ｍＬ、２５．４ ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を−２０℃で１５分間撹拌した。Ｎ−メチル−Ｌ−アラニン（２．７４ ｇ、２６．６ ｍｍｏｌ）の水溶液（水５ ｍＬ）およびトリエチルアミン（７．４ ｍＬ、５０．８ ｍｍｏｌ）を加え、反応物を昇温させて室温とし、２時間撹拌した。反応混合物を水（１００ ｍＬ）で希釈し、１ Ｍ ＨＣｌを加えることでｐＨ ２の酸性とした。生成物を酢酸エチルで抽出した（５０ ｍＬで５回）。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、蒸発させた。残留物について、酢酸エチル：ヘキサン（体積比１：１）を用いて溶出するシリカゲルでのカラムクロマトグラフィー精製を行って、純粋な６ｇを白色固体として得た（０．６９ ｇ、収率１２％）。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）：δ１．３ （３Ｈ， ｄ）， １．５ （３Ｈ， ｄ）， ２．４１ （３Ｈ， ｓ）， ２．８ （２Ｈ， ｍ）， ３．０ （３Ｈ， ｓ）， ３．５ （１Ｈ， ｍ）および５．３ （１Ｈ， ｍ）。
【０１２８】
メチルジチオ−Ｎ−メチルシステイン（８ａ）。Ｎ−メチルシステイン（７ａ）（Ｕｎｄｈｅｉｎ， Ｋ．， ＆ Ｅｉｄｅｍ， Ａ．， ２３ Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ． Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ ３１２９−３１３３ （１９７０））（１．５ ｇ、１１．１ ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（２０ ｍＬ）溶液を、アルゴン雰囲気下にて室温で撹拌し、メタンチオールスルホン酸メチル（３．０ ｍＬ、２９．２ ｍｍｏｌ）のエタノール（１０ ｍＬ）溶液で処理した。反応混合物をこの温度で２時間撹拌し、次いでＨ２Ｏ（１００ ｍＬ）で希釈し、エーテルで洗浄した（４０ ｍＬで４回）。水層をｐＨ ２の酸性とし、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲＡ ９３（−ＯＨ型）カラムに通した。カラムを水で洗浄し、溶出物を回収し、減圧下にて蒸発させて乾固させることで、白色固体を得た（１．２ ｇ、６０％）。融点１９４〜１９５℃。１Ｈ ＮＭＲ （Ｄ２Ｏ， ＴＭＳ外部標準）：δ２．２ （３Ｈ， ｓ）， ２．５ （３Ｈ， ｓ）， ３．２ （２Ｈ， ｄ）， ３．７ （１Ｈ， ｑ）。
【０１２９】
メチルジチオ−Ｎ−メチルホモシステイン（８ｂ）。当業者であれば、メチルジチオ−Ｎ−メチルシステイン（８ａ）の製造方法に基づいて、メチルジチオ−Ｎ−メチルホモシステイン（８ｂ）の製造方法を理解できるものと考えられる。
【０１３０】
Ｎ−メチルホモシステイン（７ｂ）は、Ｎ−メチルシステインについて既報の方法（Ｕｎｄｈｅｉｎ， Ｋ．， ＆ Ｅｉｄｅｍ， Ａ．， ２３ Ａｃｔａ Ｃｈｅｍ． Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ ３１２９−３１３３ （１９７０））によって製造することができる。
【０１３１】
Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−メチルジチオシステイン（９ａ）。Ｎ２雰囲気下にて−２０℃で、氷酢酸（０．２５ ｍＬ、４．４ ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（４ ｍＬ）溶液に、撹拌しながらクロロギ酸イソブチル（０．５７ ｍＬ、４．４ ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（０．６１ ｍＬ、４．４ ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物をその温度で２０分間撹拌し、次いでメチルジチオ−Ｎ−メチルシステイン（８ａ）（０．４ ｇ、２．２ ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（０．４５ ｍＬ、３．３ ｍｍｏｌ）とのＨ２Ｏ溶液で処理し、終夜撹拌した。次に混合物を水（２５ ｍＬ）で希釈し、ＨＣｌでｐＨ ２の酸性とし、酢酸エチルで抽出した（５０ ｍＬで４回）。合わせた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧下にて蒸発させ、生成物を淡黄色固体として得た（０．２ ｇ、５５％）。融点１３７〜１３８℃。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）：δ２．１ （３Ｈ， ｓ）， ２．３ （３Ｈ， ｓ）， ３．０ （３Ｈ， ｓ）， ３．２ （２Ｈ， ｄ）および４．８ （１Ｈ， ｑ）。
【０１３２】
Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−メチルジチオホモシステイン（９ｂ）。当業者であれば、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−メチルジチオシステイン（９ａ）の製造方法に基づいて、Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−メチルジチオホモシステイン（８ｂ）の製造方法を理解できるであろう。
【０１３３】
工程１：アンサマイトシンＰ−３（１ｃ）のメイタンシノールへの還元
還元的加水分解によって、アンサマイトシンＰ−３（１ｃ）をメイタンシノール（２）に変換した。アンサマイトシンＰ−３（１ｃ）（３．２ ｇ、５．０ ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（８０ ｍＬ）に溶解し、得られた溶液をアルゴン雰囲気下に置き、ドライアイス−アセトン浴で冷却して−４０℃とした。
【０１３４】
別のフラスコに、水素化アルミニウムリチウム溶液（７５ ｍｍｏｌ、１．０ ＭのＴＨＦ溶液７５ ｍＬ）を入れた。溶液をアルゴン雰囲気下に置き、冷却して−４０℃とした。無水メタノール（９．１ ｍＬ、２２５ ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（４０ ｍＬ）溶液を、滴下漏斗を用いて滴下添加した。温度を−３０℃〜−４０℃に維持し、添加完了後、反応混合物をさらに１０分間撹拌した。得られた水素化トリメトキシアルミニウムリチウム（ＬｉＡｌＨ（ＯＭｅ）３Ｈ）溶液を、カニューレを用いて、アンサマイトシンＰ−３（１ｃ）の冷却溶液に１０分間かけて移し入れた。アルゴン下にて反応温度を−３０℃〜−３５℃に維持し、１時間撹拌した。
【０１３５】
飽和塩化ナトリウム（１００ ｍＬ）を加えることで反応停止し、酢酸エチルで抽出した（４００ ｍＬで４回）。合わせた酢酸エチル抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。溶媒を減圧下にて蒸発させ、粗メイタンシノール（２）を得た。
【０１３６】
得られた粗生成物を酢酸エチルに溶解し、塩化メチレン中に充填したシリカゲルカラムに負荷した。塩化メチレン：酢酸エチル：メタノール混合物（体積比７７：２３：０）から開始し、メタノール濃度を０％から１０％まで徐々に上昇させる段階的勾配によってカラムの溶出を行った。所望の生成物を含む分画を集め、減圧下にて蒸発させ、純粋なメイタンシノールを白色固体として得た（収率７１％）。
【０１３７】
得られたメイタンシノールは、以下のようにしてＨＰＬＣによってさらに精製した。Ｋｒｏｍａｓｉｌ（登録商標）シアノ分取ＨＰＬＣカラム（２５０ ｍｍ×５０ ｍｍ、粒径１０ミクロン）を、流量１５０ ｍＬ／分のヘキサン：２−プロパノール：塩化メチレン：酢酸エチル（体積比７２：３：１８：７）の混合物で平衡状態とした。メイタンシノールの溶液をカラム上に注入した。この条件下で、メイタンシノールの保持時間は２２分であり、純度は＞９８％であった。
【０１３８】
工程２：Ｎ−メチル−Ｎ−メチルジチオアセトイル−Ｌ−アラニン（６ａ）によるメイタンシノール（２）のエステル化
Ｎ−メチル−Ｎ−メチルジチオアセトイル−Ｌ−アラニン（６ａ）（４．２ ｍｇ、０．０１７ ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（０．１ ｍＬ）溶液をアルゴン雰囲気下にて撹拌し、それをメイタンシノール（２ ｍｇ、０．００３５ ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（０．２ ｍＬ）溶液、ＤＣＣ（４．４ ｍｇ）の塩化メチレン（０．２ ｍＬ）溶液および１ Ｍ塩化亜鉛（０．００３５ ｍｍｏｌ）のエーテル溶液の順で処理した。反応物を７５分間撹拌した。次いで反応混合物を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を、６％メタノール／クロロホルムを用いたシリカゲルでの分取ＴＬＣによって精製して、所望のＬ−メイタンシノイドエステル１０ａを得た。
【０１３９】
化合物１０ａは、流量４．７ ｍＬ／分のヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチル（体積比１７：２：６）混合物で平衡状態としたＤｉａｚｅｍ（登録商標）シアノＨＰＬＣカラム（２５０ ｍｍ×１０ ｍｍ、粒径１０ミクロン）を用いて、より効果的に精製することができる。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） Ｌ−アミノアシル異性体（１０ａ）：δ０．９０ （３Ｈ， ｓ）， １．３ （６Ｈ， ｄ，ｄ） １．４６−１．５２ （１Ｈ， ｍ）， １．６０ （３Ｈ， ｓ）， ２．３０ （１Ｈ， ｄ）， ２．５０ （３Ｈ， ｓ）， ２．７ （１Ｈ， ｄｄ）， ２．９０ （１Ｈ， ｍ） ３．１５ （３Ｈ， ｓ）， ３．２８ （３Ｈ， ｓ）， ３．３ （１Ｈ， ｄ）， ３．３５ （３Ｈ， ｓ）， ３．５０ （１Ｈ， ｍ）， ３．６５ （２Ｈ， ｄ）， ３．７７ （１Ｈ， ｄ，）， ４．０２ （３Ｈ， ｓ）， ４．３０ （１Ｈ， ｔ）， ４．８２ （１Ｈ， ｄｄ）， ５．１５ （１Ｈ， ｑ， Ｊ＝７ Ｈｚ）， ５．９０ （１Ｈ， ｄｄ）， ６．２５ （１Ｈ， ｓ）， ６．４７ （１Ｈ， ｄｄ）， ６．６０ （１Ｈ， ｄ）， ６．７５ （１Ｈ， ｄ）， ６．８５ （１Ｈ， ｄ）。
【０１４０】
Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−プロパノイル）−Ｌ−アラニン（６ｂ）によるメイタンシノール（２）のエステル化
Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−プロパノイル）−Ｌ−アラニン（６ｂ）（５．０ ｇ、２１．５ ｍｍｏｌ）の無水塩化メチレン（８０ ｍＬ）溶液をアルゴン雰囲気下にて撹拌し、それをＤＣＣ（４．５８ ｇ、２２．２ ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（５４ ｍＬ）溶液、１ Ｍ ＺｎＣｌ２のエーテル（４．４ ｍｍｏｌ）溶液およびメイタンシノール（２）（２．０ ｇ、３．５ ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（８０ ｍＬ）溶液の順で処理した。反応混合物を室温で４時間撹拌し、次いで濾過した。
【０１４１】
Ｄｉａｚｅｍ（登録商標）シアノ分取ＨＰＬＣカラム（２５０ ｍｍ×５０ ｍｍ、粒径１０ミクロン）を、流量１５０ ｍＬ／分のヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチル（体積比１７：２：６）混合物で平衡状態とした。メイタンシノールのＬ−およびＤ−アミノアシルエステル１０の混合物の溶液（酢酸エチル２５ ｍＬ中１ ｇ）をカラムに注入した。この条件下では、所望のＬ−異性体（１０ｂ）の保持時間は４２分であり、Ｄ−異性体は５６分で溶出する。この方法によって光学的に純粋な生成物が得られ、回収率は＞９０％である。
【０１４２】
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） Ｌ−アミノアシル異性体（１０ｂ）：δ０．８４ （３Ｈ， ｓ）， １．１１−１．２３ （１Ｈ， ｍ）， １．３１ （３Ｈ， ｄ， Ｊ＝６ Ｈｚ）， １．３５ （３Ｈ， ｄ， Ｊ＝７ Ｈｚ）， １．４６−１．５２ （１Ｈ， ｍ）， １．６８ （３Ｈ， ｓ）， １．９７ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝９ Ｈｚ）， ２．２４ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１２ Ｈｚおよび１５ Ｈｚ）， ２．３０ （３Ｈ， ｓ）， ２．６５ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１２ Ｈｚおよび１５ Ｈｚ）， ２．７３−２．８６ （２Ｈ， ｍ）， ２．９０ （３Ｈ， ｓ）， ２．９２−３．０３ （２Ｈ， ｍ）， ３．０８ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝９ Ｈｚ）， ３．１４ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１２ Ｈｚ）， ３．２８ （３Ｈ， ｓ）， ３．３９ （３Ｈ， ｓ）， ３．５４ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝９ Ｈｚ）， ３．７２ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１３ Ｈｚ）， ４．０２ （３Ｈ， ｓ），４．３１ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝１１ Ｈｚ）， ４．８２ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝３ Ｈｚおよび１２ Ｈｚ）， ５．４５ （１Ｈ， ｑ， Ｊ＝７ Ｈｚ）， ５．６９ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝９ Ｈｚおよび１５ Ｈｚ）， ６．２５ （１Ｈ， ｓ）， ６．４７ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１ Ｈｚおよび１５ Ｈｚ）， ６．６７ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１．５ Ｈｚ）， ６．７７ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１１ Ｈｚ）， ６．８５ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１．５ Ｈｚ）。
【０１４３】
Ｎ−メチル−Ｎ−（メチルジチオブタノイル）−Ｌ−アラニン（６ｃ）によるメイタンシノール（２）のエステル化
Ｎ−メチル−Ｎ−（メチルジチオブタノイル）−Ｌ−アラニン（６ｃ）（８．９ ｍｇ、３５．５μｍｏｌ）の無水塩化メチレン（０．１５ ｍＬ）溶液をアルゴン雰囲気下にて撹拌し、それをＤＣＣ（８．８ ｍｇ、４２．６μｍｏｌ）の塩化メチレン溶液、１ Ｍ ＺｎＣｌ２（７．１μｍｏｌ）のエーテル溶液およびメイタンシノール（２）（４．０ ｍｇ、７．１μｍｏｌ）の塩化メチレン溶液の順で処理した。反応混合物を室温で３時間撹拌し、次に濾過し、減圧下にて濾液の蒸発を行って、メイタンシノールのＬ−およびＤ−アミノアシルエステル混合物を得た。この物質は、１０ｂにおいて前述した流量１５０ ｍＬ／分のヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチル（体積比１７：２：６）混合物で平衡状態としたＤｉａｚｅｍ（登録商標）シアノ分取ＨＰＬＣカラム（２５０ ｍｍ×５０ ｍｍ、粒径１０ミクロン）を用いてさらに精製することができる。
【０１４４】
Ｎ−メチル−Ｎ−（フェニルジチオ−プロパノイル）−Ｌ−アラニン（６ｅ）によるメイタンシノール（２）のエステル化
Ｎ−メチル−Ｎ−（フェニルジチオ−プロパノイル）−Ｌ−アラニン（６ｅ）（３１．５ ｍｇ、１０５μｍｏｌ）の塩化メチレン（０．４ ｍＬ）溶液をアルゴン下にて撹拌し、それをＤＣＣ（２６ ｍｇ、１２６μｍｏｌ）の塩化メチレン溶液、１ Ｍ ＺｎＣｌ２（１７．７μｍｏｌ）のエーテル溶液およびメイタンシノール（２）（１０ ｍｇ、１７．７μｍｏｌ）の塩化メチレン（０．２ ｍＬ）溶液の順で処理した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。沈殿物を濾去し、濾液を減圧下にて濃縮した。
【０１４５】
この混合物は、（１０ｂ）において前述した流量１５０ ｍＬ／分のヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチル（体積比１７：２：６）混合物で平衡状態としたＤｉａｚｅｍ（登録商標）シアノ分取ＨＰＬＣカラム（２５０ ｍｍ×５０ ｍｍ、粒径１０ミクロン）を用いてさらに精製することができる。
【０１４６】
１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） Ｌ−アミノアシル異性体（１０ｅ）：δ０．８２ （３Ｈ， ｓ）， １．１１−１．２５ （１Ｈ， ｍ）， １．３３ （３Ｈ， ｄ， Ｊ＝３ Ｈｚ）， １．６１ （３Ｈ， ｓ）， １．６３ （３Ｈ， ｄ， Ｊ＝１４ Ｈｚ）， ２．１９ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１３ Ｈｚおよび１５ Ｈｚ）， ２．６１ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１２ Ｈｚおよび１５ Ｈｚ）， ２．７８ （３Ｈ， ｓ）， ２．６８−３．０３ （２Ｈ， ｍ）， ３．０７ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝９ Ｈｚ）， ３．２０ （３Ｈ， ｓ）， ３．３８ （３Ｈ， ｓ）， ３．５３ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝９ Ｈｚ）， ３．６３ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１３ Ｈｚ）， ３．６８ （３Ｈ， ｓ）， ４．０１ （３Ｈ， ｓ）， ４．３０ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝１１ Ｈｚ）， ４．７９ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝３ Ｈｚおよび８ Ｈｚ）， ５．４３ （１Ｈ， ｑ， Ｊ＝７ Ｈｚ）， ５．６８ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝９ Ｈｚおよび１５ Ｈｚ）， ６．２３ （１Ｈ， ｓ）， ６．４５ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１２ Ｈｚおよび１５ Ｈｚ）， ６．６０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１．５ Ｈｚ）， ６．７５ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１２ Ｈｚ）， ６．７７ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１．５ Ｈｚ）， ７．２２−７．４０ （５Ｈ， ｍ）。
【０１４７】
Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−ブタノイル）−Ｌ−アラニン（６ｇ）によるメイタンシノール（２）のエステル化
Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メチルジチオ−ブタノイル）−Ｌ−アラニン（６ｇ）（２３．２ ｍｇ、０．０８８ ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（０．２ ｍＬ）溶液をアルゴン雰囲気下にて撹拌し、それをメイタンシノール（５ ｍｇ、０．００８８ ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（０．２ ｍＬ）溶液、ＤＣＣ（２０．６ ｍｇ）の塩化メチレン（０．２ ｍＬ）溶液および１ Ｍ塩化亜鉛（０．００８８ ｍｍｏｌ）のエーテル溶液の順で処理した。反応物を室温で終夜撹拌した。次いで反応混合物を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物について、６％メタノール／クロロホルムを用いるシリカゲルでの分取ＴＬＣによる精製を行って、所望のＬ−メイタンシノイドエステル１０ｇを得た。この生成物１０ｇは、（１０ｂ）において前述した流量４．７０ ｍＬ／分のヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチル（体積比１７：２：６）混合物で平衡状態としたＤｉａｚｅｍ（登録商標）シアノ分取ＨＰＬＣカラム（２５０ ｍｍ×１０ ｍｍ、粒径１０ミクロン）を用いて、より効果的に精製することができる。
【０１４８】
Ｎ−アセチル−Ｎ−メチルメチルジチオシステイン（９ａ）によるメイタンシノール（２）のエステル化
Ｎ−アセチル−Ｎ−メチル−メチルジチオシステイン（９ａ）（１５．６ ｍｇ、０．０７ ｍｍｏｌ）の無水塩化メチレン（０．４５ ｍＬ）溶液をアルゴン雰囲気下にて室温で撹拌し、それを１ Ｍ ＺｎＣｌ２のエチルエーテル（０．０２８ ｍｍｏｌ）溶液、ＤＣＣ（１７．３ ｍｇ、０．０８４ ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（０．２ ｍＬ）溶液およびメイタンシノール（２）（４．０ ｍｇ、０．００７ ｍｍｏｌ）の塩化メチレン（０．１ ｍＬ）溶液の順で処理した。反応混合物を３時間撹拌し、次いで濾過し、濾液を減圧下にて蒸発させた。
【０１４９】
この残留物は、（１０ｂ）において前述した流量１５０ ｍＬ／分のヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチル（体積比１７：２：６）混合物で平衡状態としたＤｉａｚｅｍシアノ分取ＨＰＬＣカラム（２５０ ｍｍ×５０ ｍｍ、粒径１０ミクロン）を用いてさらに精製することができる。
【０１５０】
工程３：ジスルフィド含有メイタンシノイドの還元
メイタンシノールのジスルフィド含有Ｌ−アミノアシルエステル１０ｂ（１．９５ ｇ、２．５ ｍｍｏｌ）の酢酸エチル（１４０ ｍＬ）およびメタノール（２１０ ｍＬ）混合溶液をアルゴン雰囲気下にて室温で撹拌し、２ ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むジチオトレイトール（０．９５ ｇ、６．２ ｍｍｏｌ）の０．０５ Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ７．５）（１４０ ｍＬ）溶液で処理した。反応の進行をＨＰＬＣでモニタリングしたところ、反応は３時間以内に完結した。
【０１５１】
反応が完結した反応混合物を、２ ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．２ Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ６．０）（２５０ ｍＬ）で処理し、次に酢酸エチルで抽出した（６００ ｍＬで３回）。有機層を合わせ、ブライン（１００ ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発させることで、粗チオール含有メイタンシノイド１１ｂの残留物を得た。
【０１５２】
得られた粗チオール含有メイタンシノイド１１ｂを、ヘキサン：２−プロパノール：酢酸エチル（体積比７８．０：５．５：１６．５）混合物で平衡状態とし、流量１５０ ｍＬ／分で流す分取Ｄｉａｚｅｍ（登録商標）シアノＨＰＬＣカラム（２５０ ｍｍ×５０ ｍｍ、粒径１０ミクロン）を用いるＨＰＬＣによって精製した。チオール含有メイタンシノイド１１ｂは、１６分を中心とするピークとして溶出した。生成物を含む分画の蒸発を行って、純粋なチオール含有メイタンシノイド１１ｂを白色固体として得た（純度９９％で収率７６％）。
【０１５３】
Ｅｌｌｍａｎアッセイを用いて、生成物１モル当たりスルフヒドリル基が１モル存在することが確認された。この生成物について、ＮＭＲ分光法によってさらなる特性決定を行った。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３）：δ０．８４ （３Ｈ， ｓ）， １．３３ （３Ｈ， ｄ， Ｊ＝ ５ Ｈｚ）， １．３５ （３Ｈ， ｄ， Ｊ＝５ Ｈｚ）， １．６０ （３Ｈ， ｓ）， １．６８ （３Ｈ， ｓ）， ２．２２ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝３ Ｈｚおよび１４ Ｈｚ）， ２．６０−２．８２ （２Ｈ， ｍ）， ２．８８ （３Ｈ， ｓ）， ３．０８−３．２０ （２Ｈ， ｍ）， ３．２５ （３Ｈ， ｓ）， ３．３９ （３Ｈ， ｓ）， ３．５５ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝９ Ｈｚ）， ３．７１ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１２ Ｈｚ）， ４．０２ （３Ｈ， ｓ）， ４．３２ （１Ｈ， ｔ， Ｊ＝１０ Ｈｚ）， ４．８１ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝３ Ｈｚおよび１２ Ｈｚ）， ５．４５ （１Ｈ， ｑ， Ｊ＝７ Ｈｚ）， ５．６７ （１Ｈ， ｄｄ Ｊ＝９ Ｈｚおよび１５ Ｈｚ）， ６．２５ （１Ｈ， ｓ）， ６．４７ （１Ｈ， ｄｄ， Ｊ＝１１ Ｈｚおよび１５ Ｈｚ）， ６．７０ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１．５ Ｈｚ）， ６．７５ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１１ Ｈｚ）， ６．８６ （１Ｈ， ｄ， Ｊ＝１．５ Ｈｚ）。
【０１５４】
以上、本発明についての詳細な説明および具体的な実施形態を参照しながらの説明を行ったが、当業者には、本発明の趣旨および範囲を逸脱しない限り、本発明において各種の変更および改変を行うことが可能であることは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、アンサマイトシン類１ａ−ｅの還元によるメイタンシノール（２）の生成を示す図である。
【図２】
図２ａは、ω−メルカプト−カルボン酸３ａ−ｅの個々のメチル−ジチオ誘導体４ａ−ｅへの転化を示す図である。
図２ｂは、ω−メルカプト−カルボン酸３ｂの個々のアリール−ジチオ誘導体５ａ−ｂへの転化を示す図である。
図２ｃは、メチル−ジチオ誘導体４ａ−ｅおよびアリール−ジチオ誘導体５ａ−ｂのジスルフィド基を有するＮ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体６ａ−ｇへの転化を示す図である。
【図３】
図３ａは、Ｎ−メチルシステインおよびＮ−メチルホモシステイン（７ａ−ｂ）の個々のジスルフィド誘導体８ａ−ｂへの転化を示す図である。
図３ｂは、ジスルフィド誘導体８ａ−ｂのアシル化によるジスルフィド基を有するＮ−メチル−Ｌ−システイン誘導体９ａ−ｂの形成を示す図である。
【図４】
図４は、ジスルフィド基を有するＮ−メチル−Ｌ−アラニン誘導体６ａ−ｇでメイタンシノール（２）をエステル化してジスルフィド含有メイタンシノイド立体異性体１０を得て、それからＬ−異性体をクロマトグラフィーによって分離してジスルフィド含有メイタンシノイドＬ−異性体１０ａ−ｇを得て、次にそれを還元してチオール含有メイタンシノイド１１ａ−ｇを得る工程を示す図である。
【図５】
図５は、ジスルフィド基を有するＮ−メチル−Ｌ−システイン誘導体９ａ−ｂでメイタンシノール（２）をエステル化してジスルフィド含有メイタンシノイド立体異性体１２を得て、それからＬ−異性体をクロマトグラフィーによって分離してジスルフィド含有メイタンシノイドＬ−異性体１２ａ−ｂを得て、次にそれを還元してチオール含有メイタンシノイド１３ａ−ｂを得る工程を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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