(57)【要約】本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅された核酸分子を定性的および／または定量的に同定するための装置および方法に関する。
2004533839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
増幅反応、特にポリメラーゼ連鎖反応において増幅された核酸分子の、定性的検出および定量的検出のうち少なくとも一方のための方法であって、増幅反応、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中の増幅溶液中におけるオリゴヌクレオチドの質量の変化を決定することを特徴とする方法。
【請求項２】
ＰＣＲ中のオリゴヌクレオチドの質量の変化の決定は、少なくとも２回のＰＣＲサイクルについて１回のＰＣＲサイクル、好ましくはＰＣＲサイクルの各回において、存在するオリゴヌクレオチドの質量を決定することによって実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１回のＰＣＲサイクル時に存在するオリゴヌクレオチドの質量の決定は、表面に結合したオリゴヌクレオチドの質量を決定することによって実施されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
表面へのオリゴヌクレオチドの結合は可逆的であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＰＣＲにおいてモノマーとして用いられるデオキシリボヌクレオシド三リン酸は表面に結合しないことを特徴とする請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドの質量の変化の決定は、ｉｎ  ｓｉｔｕで実施されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドの質量の変化の決定は、好ましくは白色光干渉計、表面波センサ、マイクロバランス、水晶振動子マイクロバランス散逸センサ、および表面プラズモン共鳴検出用センサからなる群より選択される、質量を感知する検出器によって実施されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法であって、
ａ）適切な温度（変性温度）に設定することにより、ＤＮＡ二本鎖を変性させる工程と、
ｂ）適切な温度（アニーリング温度）に設定することにより、オリゴヌクレオチドプライマーを増幅すべき核酸分子にアニーリングさせる工程と、
ｃ）適切な温度（鎖長伸長温度）でのＤＮＡ合成または鎖長伸長の工程と、
ｄ）随意で、工程ａ）〜ｃ）を繰り返す工程と、
を含み、１回のＰＣＲサイクル時に存在するオリゴヌクレオチドの質量を工程ｂ）後および／または工程ｃ）後に決定することができることを特徴とする方法。
【請求項９】
表面に結合したオリゴヌクレオチドは、変性温度において表面から脱離することを特徴とする請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
１回のＰＣＲサイクル時に存在するオリゴヌクレオチドについて決定された質量に対するゼロ値として機能する測定値は、変性温度において決定されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
１回のＰＣＲサイクル時に存在するオリゴヌクレオチドの質量の決定は、アニーリング温度で行われることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
１回のＰＣＲサイクル時に存在するオリゴヌクレオチドの質量の決定は、アニーリング温度未満の温度、好ましくは２５℃〜５０℃、特に好ましくは３０℃〜４０℃の温度で行われることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
増幅された核酸分子の分子量は、ＰＣＲ中のオリゴヌクレオチドの質量の変化から決定されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＣＲの増幅率は、ＰＣＲ中のオリゴヌクレオチドの質量の変化から決定されることを特徴とする前出の請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＣＲに先だって増幅すべき核酸分子の初期濃度を決定するために、様々な確定した初期濃度の前記核酸分子を用いた多数のポリメラーゼ連鎖反応を較正のために実施することを特徴とする請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
増幅によるオリゴヌクレオチドの総質量の変化が測定可能なＰＣＲサイクルを、増幅すべき核酸分子の初期濃度に対する尺度として用いることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＰＣＲの終了後に、表面からオリゴヌクレオチドが脱離する温度が決定されることを特徴とする請求項３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＰＣＲにおいて増幅された核酸分子の、定性的検出および定量的検出の少なくとも一方のための装置であって、
ａ）反応チャンバと、
ｂ）温度制御ユニットと、
ｃ）オリゴヌクレオチドの結合に適した表面と、
ｄ）表面に結合したオリゴヌクレオチドの質量を決定するための検出器と、
を含む装置。
【請求項１９】
表面がオリゴヌクレオチドに非特異的に結合するかまたは同様の親和性で結合するか少なくともいずれかであることを特徴とする請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
表面上への増幅された核酸分子の結合は、表面上へのオリゴヌクレオチドプライマーの結合よりも優先して起こることを特徴とする請求項１８に記載の装置。
【請求項２１】
表面はデオキシリボヌクレオシド三リン酸には結合しないことを特徴とする請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドに対する結合部位は、表面上に均等に分布していることを特徴とする請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２３】
結合部位は表面に結合されたオリゴヌクレオチドプローブであり、該プローブは、増幅すべき核酸分子およびオリゴヌクレオチドプライマーのうち少なくとも一方とのハイブリダイゼーションに適していることを特徴とする、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２４】
表面に結合されたオリゴヌクレオチドすべてが同じ長さを有することを特徴とする請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドプローブは、表面上にコンビナトリアル合成されることを特徴とす
る請求項２３または２４に記載の装置。
【請求項２６】
表面はシラン化されたガラスであることを特徴とする請求項１８〜２５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２７】
表面は干渉法に適した厚みを有し、該厚みは好ましくは３００ｎｍ〜７００ｎｍ、特に好ましくは４００ｎｍ〜６００ｎｍ、最も好ましくは約５００ｎｍであることを特徴とする請求項１８〜２６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２８】
表面上にあるオリゴヌクレオチドに対する結合部位の数は、オリゴヌクレオチドの数より大きいことを特徴とする請求項１８〜２７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２９】
チャンバ体積に対する表面の比は、可能な限り小さく、好ましくは１０−１ｍｍ２／μＬ〜１０−３ｍｍ２／μＬであり、特に好ましくは５×１０−２ｍｍ２〜５×１０−３ｍｍ２／μＬであり、最も好ましくは約０．０２ｍｍ２／μＬであることを特徴とする請求項１８〜２８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３０】
検出器の制御のためだけでなく、データ記録および温度制御のための制御コンピュータをさらに含むことを特徴とする請求項１８〜２９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３１】
試料入口および試料出口をさらに含むことを特徴とする請求項１８〜３０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３２】
検出器は、白色光干渉計、表面波センサ、マイクロバランス、水晶振動子マイクロバランス散逸センサ、および表面プラズモン共鳴検出用センサからなる群より選択されることを特徴とする請求項１８〜３１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３３】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法を実施するための、請求項１８〜３２のいずれか一項に記載の装置の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅された核酸分子の定性的および／または定量的検出のための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においては、ＤＮＡ鋳型が、一連の温度制御状態を順次繰り返すことによって指数関数的かつ配列特異的に増幅される（とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第４，９６５，１８８号、欧州特許第０５０２５８８号；エム  ジェイ  マクファーソン（Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）、ディ  ディ  ヘームス（Ｄ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ）、ジー  アール  テイラー（Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ）、「ＰＣＲ１および２：実践的アプローチ（PCR 1 and 2: A Practical Approach ）」、オックスフォード大学出版局のＩＲＬプレス、オックスフォード（１９９５）を参照のこと）。変性温度において、増幅すべきＤＮＡは融解して一本鎖ＤＮＡになる。次にそれより低いアニーリング温度において、両ＤＮＡ一本鎖にプライマーが結合する。次にこれより僅かに高い伸長温度で、両ＤＮＡ一本鎖は酵素触媒反応によって二本鎖を形成するように埋められていく。このサイクルは、増幅されたＤＮＡ、すなわちＰＣＲ産物が分析的に利用可能な量になるまで、ほぼ要求される回数だけ繰り返すことができる。ＰＣＲはＤＮＡ分析における最も重要な方法の１つであり、従って経済的意義も大きい。
【０００３】
ＰＣＲにおいては、所望の、かつ必要であれば分析的に利用可能な量の核酸の増幅に必要とされるＰＣＲサイクル数の決定が大きな問題となる。例えば、この目的のために、二本鎖ＤＮＡにインターカレートするか、若しくは二本鎖ＤＮＡに結合して、ＰＣＲ産物を可視化する染料を用いてもよい。
【０００４】
なかでも、エフ  ロットスパイヒ（Ｆ．Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ）、ハー  ツォルバス（Ｈ．Ｚｏｒｂａｓ）、「生物分析（Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ）」、ハイデルベルク所在のスペクトルム・アカデミシャー出版（Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）、（１９９８）は、インターカレータと同様に、二本鎖ＤＮＡだけに特異的に付着する染料ＳＹＢＲグリーンについて記載している。付着によって染料の蛍光が活性化される。この染料をＰＣＲに加える。伸長温度における蛍光測定値の増加によって、二本鎖ＤＮＡが合成されたことがわかる。さらに、ＤＮＡ融解プロセスによって蛍光が消失する温度を、本方法においてはＰＣＲの終了後に試料を９５℃に加熱することにより決定できる。このようにして、ＰＣＲ産物のＧＣ含量を推定することができる。最後に、上記方法は、較正すれば、鋳型の濃度、すなわち増幅すべき核酸の初期濃度を決定するのにも適している。
【０００５】
国際出願国際公開第９７／２９２１０号および米国特許第５，７１６，７８４号は、ＰＣＲ産物のｉｎ  ｓｉｔｕ特異的および配列特異的検出を容易にする、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）法として知られる方法について記載している。Ｔａｑｍａｎ法では、互いに隣接した位置に２つの蛍光染料を担持するプライマーを用いる。このようにして、励起された染料は共鳴移動によって該染料の「エネルギー」を、赤色へシフトした蛍光を発する第２の染料へと移動させる。プライマーがＴａｑポリメラーゼによって取り込まれる場合には、プライマーはポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性のために第２の染料を損失し、蛍光発光は青色へシフトするという特徴を示す。ＰＣＲ産物は、この蛍光のシフトによって検出される。較正後、この方法は鋳型濃度の決定にも適したものとなる。
【０００６】
さらに、ハイブリダイゼーションプローブとして知られているものが、ロシュ・ダイアグノスティクス社（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）、ロシュ・モレキュラー・バイオケミカルズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（在ドイツ連邦共和国マンハイム）に記載されている。この種のハイブリダイゼーションプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって相互作用する２つの異なる蛍光染料を両端に保持したハイブリダイズ可能なオリゴヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションプローブは、ＰＣＲ産物上で隣同士でハイブリダイズするように選択されるので、２つの隣り合う染料の共鳴エネルギー移動によって蛍光の赤色へのシフトが開始される。ＰＣＲ産物を検出するために、この色のシフトが測定される。この方法の重要な欠点は、ＰＣＲ産物のコンセンサス配列が分かっていなければならないことである。較正後、この方法は鋳型濃度の決定にも適したものとなる。
【０００７】
上記方法の欠点は、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅された核酸分子を検出するために、ＰＣＲ産物を標識しなければならないことにある。従来技術の方法の別の欠点は、ＰＣＲ産物の分子量を決定するために、時間を要するＰＣＲ産物の電気泳動処理が通常必要なことである。
【０００８】
したがって、ＰＣＲ産物の標識を必要とせず、同時にＰＣＲ中にＰＣＲ産物をそのまま（ｉｎ  ｓｉｔｕ）検出することを容易にする、増幅された核酸分子のための代替の検出方法が必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅された核酸分子を定性的および／または定量的に検出することができ、例えば染料法などによるＰＣＲ産物の標識やＰＣＲ産物の電気泳動処理を必要としない方法を提供することにある。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、ＰＣＲ産物の電気泳動処理を行う必要なく、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅された核酸分子の分子量を決定することができる方法を提供することにある。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、所望の量のＰＣＲ産物を得るのに十分な増幅サイクル数に関してＰＣＲの持続時間を最適化できるようにするために、ＰＣＲ中にＰＣＲ産物のｉｎ  ｓｉｔｕ検出を行えるようにすることである。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、初期鋳型濃度の決定を可能にする方法を提供することにある。
さらなる目的は以下の説明から収集できるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の目的は、特許請求の範囲に特徴を示した実施形態を提供することにより解決される。
驚いたことに、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅された核酸分子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中における増幅溶液中のオリゴヌクレオチドの質量変化を検出することにより、定性的および／または定量的に検出できることが分かってきた。
【００１４】
増幅溶液中に存在するオリゴヌクレオチドは、増幅すべき鋳型核酸分子、増幅された核酸分子、および使用したオリゴヌクレオチドプライマーである。増幅すべき鋳型核酸分子および増幅された核酸分子は、以後「標的ＤＮＡ」という用語によっても表される。
【００１５】
以下、本発明を記載するために用いるいくつかの用語について説明する。
本発明の文脈において、ＳＭＯとは、オリゴヌクレオチドの分子量特異的検出のためのセンサシステムを意味する。
【００１６】
本発明の文脈において、ＳＭＯ‐ＰＣＲは、ＰＣＲ中にオリゴヌクレオチドの分子量特異的検出を行うためのセンサシステムであるとする。
本発明の文脈において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、通常は約１０〜１５０サイクルまたはそれ以上のＰＣＲサイクル、好ましくは約２０〜４０ＰＣＲサイクル、特に好ましくは約３０ＰＣＲサイクルを含む。
【００１７】
本発明の文脈において、ＰＣＲサイクルとは、ＰＣＲの１回の増幅ステップを意味する。
本発明の文脈において、ＰＣＲ産物とは、ＰＣＲによって増幅すべき核酸分子の増幅または複製によって得られる産物を意味する。
【００１８】
本発明の文脈において、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプライマーは、標的ＤＮＡに結合またはハイブリダイズして、ＰＣＲ中に結合部位から始まる標的ＤＮＡのアンチセンス鎖を合成するようなオリゴヌクレオチドを意味する。
【００１９】
本発明の文脈において、標的または標的ＤＮＡは、ＰＣＲ中に複製されるＤＮＡを意味する。
本発明の文脈において、鋳型または鋳型ＤＮＡは、ＰＣＲによって増幅または複製すべきＤＮＡを意味するものとする。
【００２０】
本発明の文脈において、増幅溶液とは、該溶液を用いてＰＣＲが実施される反応混合物を意味するものとする。
本発明の文脈において、ｄＮＴＰという用語は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、すなわちＰＣＲのための遊離体（Ｅｄｕｋｔ）として必要とされるモノマーを意味する。
【００２１】
Ａ，Ｇ，ＣおよびＴは、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンを意味する。
本発明の文脈において、オリゴヌクレオチドという用語は、デオキシリボヌクレオシド三リン酸からなるポリマーを意味する。
【００２２】
本発明の文脈において、試料溶液とは、増幅すべき核酸分子を含んだ分析すべき液体を意味する。
本発明の文脈において、変性温度とは、ＰＣＲサイクル中に当該温度にて二本鎖ＤＮＡが一本鎖に分離される温度を意味する。変性温度は一般に９０℃より高く、好ましくは約９５℃である。
【００２３】
本発明の文脈において、アニーリング温度とは、当該温度にてプライマーが標的にハイブリダイズする温度を意味する。アニーリング温度は通常は６０℃〜７０℃であり、好ましくは約６５℃である。
【００２４】
本発明の文脈において、鎖長延長温度または鎖長伸長温度とは、当該温度にてモノマー成分の取り込みによってＤＮＡが合成される温度を意味する。伸長温度は、一般に約７０℃〜約７５℃であり、好ましくは約７２℃である。
【００２５】
本発明の文脈において、ハイブリダイゼーションとは２本の一本鎖ＤＮＡ断片が会合して二本鎖を形成することを意味する。会合は常にＡとＴの対、またはＧとＣの対を形成するように起こる。
【００２６】
本発明の文脈において、ユニバーサルオリゴヌクレオチドセンサ領域（ＵｖＯＳ領域）とは、所定の長さを持つすべてのコンビナトリアル合成可能なオリゴヌクレオチドが均一な分布で結合する表面を意味する。
【００２７】
本発明の文脈において、検出段階とは、ＰＣＲ中のオリゴヌクレオチドの質量変化を決定する段階を意味する。
本発明の文脈において、増幅段階とは、ＰＣＲを行う段階を意味する。
【００２８】
本発明は、各ＰＣＲサイクルにおいて、オリゴヌクレオチドの数ではなく質量が増加するという事実に基づいている。このことについては、一本鎖産物の増幅で始まる以下の実施例において説明する。ＰＣＲの開始にあたって、増幅溶液中に例えば１０μｍｏｌのオリゴヌクレオチドプライマーと１μｍｏｌの鋳型核酸分子が存在するとする。増幅率が２の理想的ＰＣＲにおいて、２回のＰＣＲサイクル後の溶液中には、４μｍｏｌの産物と、プライマーは増幅のために消費されているため７μｍｏｌのプライマーとが存在する。プライマーの質量は、一般に産物の約１０分の１しか占めていないことから、標的ＤＮＡの質量とオリゴヌクレオチドプライマーの質量からなるオリゴヌクレオチド質量は、本例においては２サイクル後に約２．４倍しか上昇しない。ＰＣＲの開始時のプライマー濃度が、鋳型核酸の濃度の１００倍であったとしたら、本例においては２回のＰＣＲサイクル後にオリゴヌクレオチドの総質量は１．０３倍増加することになるであろう。質量増加は、いずれの場合も、ＰＣＲ産物の合成に用いられるデオキシヌクレオシド三リン酸モノマー（ｄＮＴＰｓ）の取り込みによって起こる。
【００２９】
したがって、本発明はポリメラーゼ連鎖反応において増幅された核酸分子の定性的および／または定量的検出方法に関し、該方法においては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）中における、標的ＤＮＡの質量と、随意でオリゴヌクレオチドプライマーの質量とからなる増幅溶液中のオリゴヌクレオチドの質量の変化が決定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明に従う方法の重要な利点は、他のすべての既知の方法とは違い、ＰＣＲ産物を検出するために、増幅された核酸分子の例えば染料法による標識を必要とせず、その代わりに、増幅反応中の正常な増幅の検出が、生成されるＰＣＲ産物の質量の決定だけに基づいていることにある。その結果、当該分野で知られている検出方法に付随する、特に蛍光染料などの染料のためのコストは、本発明に従う方法においてはもはや生じない。したがって、隣り合った２つの蛍光染料を有し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）法において特異的に用いられる蛍光標識プライマーのためのコストを削減することができる。
【００３１】
本発明に従う方法の他の利点は、ポリメラーゼ連鎖反応が、増幅された核酸分子検出のために例えば染料法などの標識方法を必要としないため、遙かに堅牢に、すなわち反応終結の危険性が少なく、および／またはより高い増幅率が得られる。
【００３２】
本発明の検出方法は、ＰＣＲ反応における用途に限定されないことは当業者にとって自明である。それどころか、本発明は他の増幅反応に対して使用してもよい。例として、いわゆるＩＤＡ反応（ドイツ特許第１９７４１７１４を参照のこと）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ法）、Ｐ＆ＬＣＲ、３ＳＲ（Ｓｅｌｆ‐ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）反応、ＮＡＳＢＡ法（核酸配列に基づく増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））およびＳＤＡ反応（鎖交換増幅（ｓｔｒａｎｄ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））などが挙げられる。本発明に従う検出方法は、核酸分子が増幅される反応、すなわち核酸の質量変化によって増幅の成功が表されうるすべての反応に適している。
【００３３】
好ましくは、ＰＣＲ中のオリゴヌクレオチドの質量の変化は、少なくとも２回のＰＣＲサイクルにつき、１回のＰＣＲサイクルに存在するオリゴヌクレオチドの質量を決定することによって決定される。特に好ましくは、１回のＰＣＲサイクルに存在するオリゴヌクレオチドの質量が、ＰＣＲサイクルごとに決定される。あるいは、増幅溶液中またはＰＣＲ反応溶液中のオリゴヌクレオチドの質量を、２サイクル毎または３サイクル毎、あるいは他の任意の間隔で決定するようにしてもよい。しかしＰＣＲ中のオリゴヌクレオチドの質量の変化を決定するためには、少なくとも２回のＰＣＲサイクルにおけるオリゴヌクレオチドの質量を決定しておく必要がある。
【００３４】
本発明に従う方法の好ましい実施形態において、増幅された核酸分子の質量の増加は、ＰＣＲ中のオリゴヌクレオチドプライマーの質量を考慮することなく、特異的に決定される。しかしながら、代替として、ＰＣＲ中のオリゴヌクレオチドの全質量、すなわち、ＰＣＲ中に複製されるＤＮＡの質量およびオリゴヌクレオチドプライマーの質量の変化を、ＰＣＲ中に決定することも有益である。
【００３５】
１回のＰＣＲサイクルに存在するオリゴヌクレオチドの質量は、好ましくは、表面に結合しているオリゴヌクレオチドの質量を決定することによって決定される。特に好ましくは、ＰＣＲ産物とプライマーとにほぼ同じ親和性で結合する表面が、本発明に従う方法においては用いられる。しかしながら、標的ＤＮＡに優先的に結合する表面を用いることも好適であろう。いずれの代替においても、ＰＣＲにおけるモノマー成分として用いられるデオキシリボヌクレオシド三リン酸は上記表面に結合しないことが有益である。さらに、上記表面へのオリゴヌクレオチドの結合は可逆的であることが好ましい。
【００３６】
本発明に従う方法の特に好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドの質量変化の決定はｉｎ  ｓｉｔｕ、すなわちＰＣＲを実施する反応チャンバ内で行われる。このようにして、所望の量の標的ＤＮＡを得るのに必要なＰＣＲサイクル数をオンラインで決定することができる。例えば、所望の量の標的ＤＮＡが生産されたことを検出したときに、ＰＣＲを自動的に停止させるようにしてもよい。このように、ＰＣＲのサイクル数を、本発明に従う方法によって、標的ＤＮＡの量に対して十分なサイクル数に制限するようにしてもよい。こうした反応時間のｉｎ  ｓｉｔｕにおける最適化により、時間と費用を節約できる。
【００３７】
さらなる好ましい実施形態では、各増幅ステップ後に、上記表面上に存在する結合部位をオリゴヌクレオチドによって飽和する。各ＰＣＲサイクル（オリゴヌクレオチドのモル数は変化しない）において質量が増加するので、各ＰＣＲサイクルにおいて表面に結合した質量も増加する。
【００３８】
本発明に従う方法において、ＰＣＲ中のオリゴヌクレオチドの質量の変化は、好ましくは質量を感知する検出器を用いて決定される。質量を感知する検出器としては、例えば変換器を用いることができ、該変換器は表面上の質量の変化を電気または光学シグナルに変換する。本発明の文脈において、一般に、表面フィルム上の質量変化に敏感に反応するような方法を検出方法として用いることができる。しかしながら、測定量が質量変化そのものを表している必要はない。したがって、屈折率、密度の変化、層厚の変化および圧縮性、ならびにそれらの組み合わせなどのすべての質量依存性の測定値を、本発明におけるオリゴヌクレオチドの質量変化を決定するために用いることができる。
【００３９】
以下の検出器または変換器は、本発明の方法において使用するのに特に好ましい。
自身の質量に大きく依存するセンサ表面の自己振動を測定するためにフィードバック機構を用いる表面波センサまたは表面弾性波（ＳＡＷ）センサ（エヌ  バリエ（Ｎ．Ｂａｒｉｅ）、エム  ラップ（Ｍ．Ｒａｐｐ）、エイチ  ジェイ  アチェ（Ｈ．Ｊ．Ａｃｈｅ）、「長期安定性を有するＳＡＷ装置のための新しい塗装材料としての、ＵＶ架橋ポリシロキサン（ＵＶ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｐｏｌｙｓｉｌｏｘａｎｅｓ  ａｓ  ｎｅｗ  ｃｏａｔｉｎｇ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  ＳＡＷ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｌｏｎｇ‐ｔｅｒｍ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ，第４６巻（１９９８）Ｓ．９７〜１０３頁）。
【００４０】
表面負荷に基づいて自身の周波数を変える、発振水晶に基づくマイクロバランス（ゲー  シュベト（Ｇ．Ｓｃｈｗｅｄｔ）；「分析化学：基礎、方法および実践（Ａｎａｌｙｔｉｓｃｈｅ  Ｃｈｅｍｉｅ：Ｇｒｕｎｄｌａｇｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｅｎ  ｕｎｄ  Ｐｒａｘｉｓ）」；シュツットガルト（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）その他に所在のティーメ（Ｔｈｉｅｍｅ）、１９９５）。
【００４１】
水晶振動子マイクロバランス散逸に基づくセンサ、すなわち水晶発振の減衰をさらに用いるマイクロバランス法の改良法（Ｑ‐Ｓｅｎｓｅ、在スウェーデン国ヨーテボリ）。
屈折率と層厚の変化を測定する干渉法に基づいた検出器。
【００４２】
本発明の範囲における特に好ましい干渉法は、白色光干渉法（ヴェー  ネーベ（Ｗ．Ｎｅｂｅ）、「分析的干渉法（Ａｎａｌｙｔｉｓｃｈｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｉｅ）」、ライプツィヒ（Ｌｅｉｐｚｉｇ）：Ａｋａｄ．Ｖｅｒｌ．‐Ｇｅｓ．，１９７０）であり、この方法は、層厚の変化を分析的に測定する場合には、ＲＩＦＳ（反射率測定干渉分光法：Ｒｅｆｌｅｃｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）とも呼ばれる（ゲー  ゴーグリッツ（Ｇ．Ｇａｕｇｌｉｔｚ）、アー  ブレヒト（Ａ．Ｂｒｅｃｈｔ）、ゲー  クラウス（Ｇ．Ｋｒａｕｓ）、ヴェー  ナーム（Ｗ．Ｎａｈｍ）；「薄（多）層での干渉に基づく化学および生化学センサ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｓｅｎｓｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ  ａｔ  ｔｈｉｎ（ｍｕｌｔｉ‐）ｌａｙｅｒｓ）」；Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ、第１１巻（１９９３）２１〜２７頁）。
【００４３】
表面プラズモン共鳴を決定するための検出器。
表面プラズモン共鳴分光法（ＳＰＲ）において、例えば、ガラス‐金‐センサ表面‐増幅溶液の界面システムにおける、反射強度の角度依存性を測定する（イー  ステムラー（Ｉ．Ｓｔｅｍｍｌｅｒ）、アー  ブレヒト（Ａ．Ｂｒｅｃｈｔ）、ゲー  ゴーグリッツ（Ｇ．Ｇａｕｇｌｉｔｚ）；「バイオセンシング用途のためのスペクトル読みとりを備えた小型ＳＰＲ変換器（Ｃｏｍｐａｃｔ  ＳＰＲ‐ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｓ  ｗｉｔｈ  ｓｐｅｃｔｒａｌ  ｒｅａｄｏｕｔ  ｆｏｒ  ｂｉｏｓｅｎｓｉｎｇ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」；Ｓｅｎｓ．Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ  第５４巻，９８〜１０５頁（１９９９））。プラズモン共鳴周波数は、センサ領域の密度に大きく依存する。プラズモン共鳴周波数の変化に伴って、反射強度が変化する。
【００４４】
さらに好ましい実施形態において、本発明に従う方法は、
ａ）適切な温度（変性温度）に設定することにより、ＤＮＡ二本鎖を変性させる工程と、
ｂ）適切な温度（アニーリング温度）に設定することにより、オリゴヌクレオチドプライマーを増幅すべき核酸分子にアニーリングさせる工程と、
ｃ）適切な温度（鎖長伸長温度）でのＤＮＡ合成または鎖長伸長の工程と、
ｄ）随意で、工程ａ）〜ｃ）を繰り返す工程と、
を含み、１回のＰＣＲサイクルに存在するオリゴヌクレオチドの質量を工程ｂ）後および／または工程ｃ）後に決定することができる方法である。
【００４５】
ＰＣＲにおいて、従来どおり各ＰＣＲサイクルに対して３つの温度を適用する。表面に結合したオリゴヌクレオチドは、最も高い温度、すなわち変性温度にて該表面から脱離することが好ましい。変性温度に対する好ましい値は９５℃である。したがって、測定値を上記変性温度にて決定し、これを各ＰＣＲサイクルにおいて決定されるオリゴヌクレオチドの質量についてのゼロ値または基準値とすることができる。
【００４６】
次のＰＣＲサイクル温度、すなわち、例えば約６５℃のアニーリング温度において、オリゴヌクレオチドは例えばセンサ領域などの表面に再度完全に吸着される。したがって、本発明に従う方法の実施形態において、ＰＣＲサイクル時に存在するオリゴヌクレオチドの質量は、アニーリング温度において決定される。
【００４７】
本発明に従う方法の感受性を高めるために、アニーリング温度未満まで温度を下げて、ＰＣＲサイクル時に存在するオリゴヌクレオチドの質量をアニーリング温度未満の温度で優先的に決定できるようにするとさらに有益である。例えば、質量の決定を２５℃〜５０℃の温度、好ましくは３０℃〜４０℃の温度で行うことができる。
【００４８】
変性温度において決定されたゼロ値または基準値を、アニーリング温度またはそれ未満で得た測定値から差し引くと、変動と偏差が解消された干渉のない測定結果が得られる。適当な質量を感知する測定方法を用いた場合には、この結果はｎサイクル後のオリゴヌクレオチドの質量ｍｃｎに比例することになる。このような検出方法の結果を図１に示す。
【００４９】
本発明に従う方法の特に好ましい実施形態において、増幅された核酸分子の分子量および／またはポリメラーゼ連鎖反応の増幅率は、ＰＣＲ中のオリゴヌクレオチドの質量の変化から決定される。
【００５０】
増幅された核酸分子の分子量および／またはＰＣＲの増幅率は、下記の等式に従って決定する。これらの等式において、Ｍは、例えば白色光干渉法による質量変化の検出において屈折率差Δｎと層厚の変化Δｄの積から得られた測定結果を表している。ｃｐｎは、ｎサイクル後のプライマー濃度を表し、ｃｔｎはｎサイクル後の標的濃度を示している。ｎはＰＣＲサイクルの数を表し、ｖはＰＣＲの増幅率を示す。ｍｃｎはｎサイクル後のオリゴヌクレオチドの質量を表す。ｌｐおよびｌｔは、ＰＣＲのプライマーの長さ、または標的およびＰＣＲ産物の長さを塩基数で示し、ＭＢは４つの塩基の平均モル重量を示し、このＭＢは３２５ｇ／モルに設定可能である。以下のすべての導出と濃度は一本鎖ＤＮＡについて示すものである。
【００５１】
０ステップ後の標的濃度：ｃｔ０＝ｃｔ０×ｖ０
理想的ＰＣＲにおいて増幅率はｖ＝２である。これは、すべてのステップにおいて、すなわちすべてのＰＣＲサイクルにおいて、標的濃度が倍になることを意味する。
【００５２】
第１ステップ後の標的濃度はｃｔ１＝ｃｔ０×ｖとなり、第２ステップ後はｃｔ２＝ｃｔ１×ｖ＝ｃｔ０×ｖ２となり、第ｎステップ後はｃｔｎ＝ｃｔ０×ｖｎとなる。
標的が生成される各ステップにおいて、プライマーが、すなわち各標的一本鎖に対して１つのプライマー一本鎖が消耗される。したがって、第１ステップ後のプライマー濃度は、ｃｐ１＝ｃｐ０−ｃｔ０となり、第２ステップ後は、ｃｐ２＝ｃｐ１−ｃｔ１＝ｃｐ０−ｃｔ０−ｃｔ１＝ｃｐ０−ｃｔ０−ｃｔ０×ｖとなり、第３ステップ後は、ｃｐ３＝ｃｐ２−ｃｔ２＝ｃｐ０−ｃｔ０×（１−ｖ−ｖ２）となり、第ｎステップ後は、ｃｐｎ＝ｃｐ０−ｃｔ０×（１−ｖ−ｖ２−ｖ３・・・ｖｎ）となる。
【００５３】
括弧内は幾何数列を表す。したがって、ｃｐｎは、
ｃｐｎ＝ｃｐ０−（ｃｔ０×（ｖｎ−１）／（ｖ−１））
となる。
【００５４】
標的の長さｌｔに塩基の平均分子量を乗じると標的ＤＮＡの分子量が得られ、増幅率ｖは以下のようにして決定することができる。
オリゴヌクレオチドの質量濃度ｍｃｎは、プライマー濃度にプライマー長ｌｐを乗じ、標的濃度に標的の長さｌｔを乗じ、その結果に塩基の平均モル重量ＭＢを乗じることによって得られる。
【００５５】
ｍｃｎ＝ＭＢ×ｃｐｎ×ｌｐ＋ＭＢ×ｃｔｎ×ｌｔ
ここでは、最初の複数回のＰＣＲステップ（図３においては、およそステップ２０まで）の間、溶液中の全プライマー量に対するプライマー消費量は一定に維持されていることから、最初の複数回のＰＣＲステップにおいて、ＭＢ×ｃｐｎ×ｌｐはほぼ一定であることを想定している。
【００５６】
したがって、
定数Ｋ＝ＭＢ×ｃｐｎ×ｌｐ
を導入することができる。
【００５７】
測定シグナルＭｎは、システム定数Ｅを介して全質量濃度に線形従属する。すなわち、Ｍｎ＝Ｅ×ｍｃｎ
最初の複数ステップにおいて、プライマーの濃度と比べると標的はまだ殆ど全く生成されていないため、シグナルはプライマーのみによって発生する。この場合、ＭｓｔａｒｔはＥ×ＭＢ×ｃｐｎ×ｌｐ＝Ｋ×Ｅに相当する。
【００５８】
総測定シグナルは、ＭｓｔａｒｔとＭ’ｎの和から得られる。Ｍ’ｎ＝Ｅ×ＭＢ×ｃｔｎ×ｌｔ＝Ｅ×ＭＢ×ｃｔ０×ｖｎ×ｌｔ
ｖおよびｌｔだけが問題の変数であるので、ＭｎからＭｓｔａｒｔを減じる。
【００５９】
Ｍ’ｎ＝Ｍｎ−Ｍｓｔａｒｔ
第２の測定値として、オリゴヌクレオチドの質量に対する測定値以外に入手できるのはサイクル数またはステップ数ｎだけであり、かつ飽和相達成前のＭ’ｎとｎとの間には指数相関が存在するため、ｌｔおよびｖを確定するためには、直線回帰を行えるように測定値Ｍ’ｎを対数化する。
【００６０】
ｌｏｇ（Ｍ’ｎ）＝ａ×ｎ＋ｂ＝ｌｏｇ（ｖ）×ｎ＋ｌｏｇ（Ｅ×ＭＢ×ｌｔ×ｃｔ０）
ａおよびｂは直線回帰によって得られ、次いで変換により求める値である標的の長さｌｔと増幅率ｖが得られる。
【００６１】
５００塩基対の長さと２００塩基対の長さの鋳型に対するＰＣＲサイクル数に依存する質量濃度の変化を、図１に示す。
上述のようにしてＰＣＲ産物の分子量を決定する利点は、分子量を決定するために、ＰＣＲ後にＰＣＲ産物に対して時間のかかる電気泳動処理を行う必要がなくなることである。
【００６２】
本発明に従う方法のさらなる好適な実施形態において、鋳型ＤＮＡの初期濃度を決定するために、同一の核酸分子、すなわち同一の鋳型分子を様々な所与の初期濃度で用いた多数のＰＣＲを較正のために実施した。好ましくは、増幅によって誘導されるオリゴヌクレオチドの質量変化が測定可能なＰＣＲサイクルを、鋳型分子の初期濃度に対する尺度として用いる。ＰＣＲ反応中のオリゴヌクレオチドの質量の変化は、指数的増加と飽和相とからなるシグモイド関数を示すので、この開始サイクルｎｓは、例えば、シグモイド関数の屈曲点を求めることにより、またこの屈曲点を通る関数に接線を適応することにより、確定することができる。ｘ軸におけるこの接線の切片（図１参照）が、開始サイクルｎｓを与える。屈曲点は、シグモイド関数の一次微分の最大値を求めることによって得られる。
【００６３】
あるいは、開始サイクルｎｓは、シグモイド関数の頂点、すなわちシグモイド関数の二次微分の最大値を求め、これらを直線で結ぶことによっても確定することができる。この場合も、この直線がｘ軸と交差する点が開始サイクルｎｓを表す。
【００６４】
したがって、上記のようにして決定された開始サイクルｎｓは実数である場合もある。
同様の方法で、未知濃度の試料に対する開始サイクルｎｓが求められる。回帰計算および補間計算により、鋳型ＤＮＡの初期濃度ｃｔ０が得られる。
【００６５】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、ＰＣＲの終了後に、オリゴヌクレオチドが表面から脱離する温度が決定される。このようにして、ＰＣＲ産物の特異的性質についての情報、特に増幅された核酸分子のＧＣ含量を得ることができる。例えば、ＰＣＲの終了後に連続的に温度を上げていき、オリゴヌクレオチドが表面上のオリゴヌクレオチドプローブから脱離する温度を測定するようにしてもよい。
【００６６】
本発明のさらなる態様において、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅された核酸分子を定性的および／定量的に検出するための装置が提供される。
本発明に従う装置は、ＰＣＲを行う反応チャンバと、温度を制御するためのユニットと、オリゴヌクレオチドの結合に適した表面と、該表面に結合したオリゴヌクレオチドの質量を決定するための検出器とを含んでいる。
【００６７】
本発明の文脈において、表面への結合または付着とは、当該表面への結合を質量を感知して決定するのに適した表面と、オリゴヌクレオチドとの、あらゆる可能な種類の相互作用を意味する。
【００６８】
好ましくは、表面は、該表面上に結合したオリゴヌクレオチドの質量を決定するための検出器上に配置されている。この実施形態において、表面は本発明の文脈におけるセンサ領域としても設計されるであろう。
【００６９】
基本的にほとんどすべての表面タイプが、表面またはセンサ領域として適している。ブイ  チャン（Ｖ．Ｃｈａｎ）らの「液体／固体界面におけるＤＮＡオリゴヌクレオチドの吸着および表面拡散に対する疎水性および静電気の影響（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓ  ｏｎ  Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｔ  Ｌｉｑｕｉｄ／Ｓｏｌｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ）」（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９８）第２０３巻，１９７〜２０７頁）の中に記載されているように、オリゴヌクレオチドの表面への結合または吸着はほぼ常に非特異的である。
【００７０】
好ましい実施形態において、表面はオリゴヌクレオチドに非特異的に、すなわちオリゴヌクレオチドプライマーと、通常は相当に長い鋳型ＤＮＡまたは標的ＤＮＡとのいずれが意図されているかに関係なく、結合する。さらに、表面はオリゴヌクレオチドプライマーと鋳型ＤＮＡまたは標的ＤＮＡとに、同様の親和性で結合することが好ましい。
【００７１】
本発明の代替実施形態において、表面への結合は、オリゴヌクレオチドプライマーよりも、増幅された核酸分子の方が起こりやすい。この実施形態では、ＰＣＲサイクルあたりのオリゴヌクレオチド質量の変化が大きくなるが、これは、プライマー濃度の影響が小さいため、または、オリゴヌクレオチドプライマーが表面に結合しなければオリゴヌクレオチドプライマーの質量を検出できないためである。
【００７２】
さらに、上記表面はデオキシリボヌクレオシド三リン酸とは結合しないことが好ましい。
さらに、本発明に従う装置の好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドのための結合部位は、表面上に均等に分布される。このようにして、全てのオリゴヌクレオチドが同じ確率で表面に結合するようにする。
【００７３】
本発明に従う装置のさらなる好ましい実施形態において、表面上にあるオリゴヌクレオチドのための結合部位の数は、オリゴヌクレオチドの数より大きい。これは、すべてのオリゴヌクレオチドが表面に結合することができ、ＰＣＲサイクル毎に対比可能な質量値が得られるという利点を有する。
【００７４】
本発明に従う装置の特に有益な実施形態は、表面上にある結合部位が、増幅すべき核酸分子（すなわち標的および鋳型ヌクレオチド配列、および／またはオリゴヌクレオチドプライマー）とのハイブリダイゼーションに適した、結合されたオリゴヌクレオチドプローブであるような、表面であることが分かっている。
【００７５】
この場合、全てのオリゴヌクレオチドプローブは同じ長さを有することが特に好ましい。
さらに、該オリゴヌクレオチドプローブは表面上にコンビナトリアル合成することが好ましい。所定の長さのあらゆるコンビナトリアル合成可能なオリゴヌクレオチドが均等な分布で結合している表面またはセンサ領域を、これ以後ユニバーサルオリゴセンサ（ＵｖＯＳ）領域と呼ぶ。センサ領域に対する支持体としてガラスチップを用いて上記ＵｖＯＳ領域を製造するために、例えば、ガラス表面を３‐グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＯＰＳ）でシラン化し（ユー  マスコス（Ｕ．Ｍａｓｋｏｓ）、イー  エム  サザン（Ｅ．Ｍ．Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９２）、第２０巻：１６７９頁を参照のこと）、エポキシドをペンタエチレングリコールで開環およびエステル化する。次に、ホスホアミダイト化学を用いて（エム  ジェイ  ガイト（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ）、「オリゴヌクレオチド合成：実践的手法（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）；オックスフォード大学出版局のＩＲＬ出版、１９９０」、表面結合オリゴヌクレオチドを表面上に合成するが、４つすべての塩基（Ａ，Ｇ，ＣおよびＴ）が各合成ステップに同時に加味される。このようにして、すべての可能な２量体、すなわち１６の異なるオリゴヌクレオチドが第２ステップ後に、表面上に均等な分布で得られる。第３ステップ後、すべての可能な３量体（４３）が得られ、第ｎステップ後、全ての可能なｎ量体（４ｎ）が表面またはセンサ領域上に得られる。このようにして、すべての想定しうるオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイズ可能なプローブがＵｖＯＳ領域上に形成される。このような方法は、コンビナトリアル合成と呼ばれる。
【００７６】
増幅溶液中に存在するすべてのオリゴヌクレオチドは、このようなＵｖＯＳ領域に結合またはハイブリダイズすることができる。したがって、センサ領域としてのＵｖＯＳ領域は、表面に結合したオリゴヌクレオチドの質量を決定することにより、ＰＣＲにおいて増幅された核酸分子を定性的および／または定量的に検出するための、すべての要件を満たす。
【００７７】
このようなＵｖＯｓ領域を用いる場合、ハイブリダイゼーション温度は非常に重要である。温度が低ければ低いほど、オリゴヌクレオチドは表面に結合しやすくなる。これに対して、例えば約９５℃の変性温度などの高い温度では、いかなるＤＮＡ‐ＤＮＡ相互作用もＰＣＲ中に可逆的に融解される。したがって、各ＰＣＲサイクルにおける質量変化を決定するためのゼロ値または基準値は、変性温度において測定することができる。表面に付着したオリゴヌクレオチドの質量を決定するためには、検出の感度を高めるために温度をアニーリング温度より低くすることが有益であろう。
【００７８】
さらに、好ましい表面またはセンサ領域は、短いＤＮＡ分子よりも長いＤＮＡ分子に結合しやすい、すなわち短いオリゴヌクレオチドプライマーよりも鋳型ＤＮＡ分子または標的ＤＮＡ分子の方に結合しやすいという特徴をもつ。このようにして、質量変化を介して標的ＤＮＡの増幅検出のシグナルが高められる。
【００７９】
表面またはセンサ領域への結合による、アニーリング中のプライマーおよび標的濃度の変化を最小限に保つために、反応チャンバ体積に対するセンサ表面の比をできるだけ低く保つことが好ましい。チャンバ体積に対する表面の比の好ましい値は、１０−１ｍｍ２／μＬ〜１０−３ｍｍ２／μＬ、特に好ましくは５×１０−２ｍｍ２〜５×１０−３ｍｍ２／μＬ、最も好ましくは約０．０２ｍｍ２／μＬである。
【００８０】
表面に結合したオリゴヌクレオチドの質量を決定するための好ましい検出器は、すでに上述したとおりであり、好ましくは、白色光干渉計、表面波センサ、マイクロバランス、水晶振動子マイクロバランス散逸センサ、ならびに表面プラズモン共鳴検出用センサからなる群より選択される。
【００８１】
例えば、白色光干渉計を用いて質量の決定を行う場合には、本発明に従う装置の表面が干渉法に適した厚み、好ましくは３００ｎｍ〜７００ｎｍ、特に好ましくは４００ｎｍ〜６００ｎｍ、最も好ましくは約５００ｎｍの厚みを有すると有益であるかもしれない。
【００８２】
さらなる好ましい実施形態において、本装置は、検出器だけでなく、測定データを記録および／または温度調節を制御する、制御コンピュータをさらに含んでいる。
さらに、本発明に従う装置は、増幅すべき試料のための入口または増幅された試料の出口をさらに含む。
【００８３】
本発明のさらなる態様は、本発明の方法を実施するための、本発明に従う上述の装置の用途である。
したがって、本発明は、オリゴヌクレオチドの質量特異的検出を保証するオリゴヌクレオチドの分子量特異的検出のためのセンサシステムを提供する。ＰＣＲ産物の特異的ｉｎ  ｓｉｔｕ検出のために本発明に従う装置を使用すると特に有益である。ＰＣＲ産物の収量ならびに塩基長を測定することができ、したがって、本発明に従う上述の方法および／または本発明に従う装置を用いて、ＰＣＲ産物の分子量を測定することができるので、ゲルマトリックス中の移動度によってサイズでＤＮＡを分離する、産物の電気泳動処理などの通常の時間のかかる分析工程は不要である。オンライン検出の可能性を利用することにより、サイクルの数を、本発明に従う方法および／または本発明に従う装置を用いて、所望の量のＰＣＲ産物に必要なサイクル数に制限することができる。
【００８４】
本発明を以下の実施例によって説明するが、実施例は本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００８５】
本例においてはＳＭＯ‐ＰＣＲ（１）と呼ぶ本発明に従う装置は、ここでは白色光干渉計（２００）を含み、該干渉計を用いてＰＣＲセンサセル（１００）のセンサ表面（１２１）における層の変化が測定される（図４参照）。制御コンピュータ（３００）は、制御ライン（３０２）を介して測定値を記録する。さらに、制御コンピュータは、制御ライン（３０１，３０３）を介して、温度制御システム（４００）ならびに白色光源（２０１）の制御と監視を行う。
【００８６】
［ＰＣＲセンサセル（１００）の組み立て］
国際特許国際公開第０１／０２０９４号は小型ＰＣＲチャンバを記載しているが、該小型ＰＣＲチャンバは、国際特許国際公開第０１／０２０９４号の中で用いられているチップに代えて、本発明に従うセンサチップ（１）を挿入することにより、本発明に従うセンサシステムの意味で使用しうる（図５を参照）。これに関して、国際特許国際公開第０１／０２０９４号の開示を説明的に参照する。
【００８７】
本発明に従う装置またはＰＣＲセンサセル（１００）は筐体（１１０）で構成され、該筐体（１１０）内には、出口（１１２）および入口（１１１）を介して試料溶液を排出または充填可能なチャンバ（１１４）が配置されている。チャンバ（１１４）は、白色光干渉計（２００）を用いてセンサ表面（１２１）における相互作用を測定するための、光進入円錐部（１１５）を有する。光進入円錐部（１１５）は、センサチップ（１２０）によって閉じられている。チャンバ（１１４）の下側は、加熱ユニット（１３０）に貼着され、覆われている。加熱ユニット（１３０）によって、試料溶液を正確な温度に加熱することができる。加熱ユニットは国際特許国際公開第０１／０２０９４号に記載されている。流体の挙動ならびにセンサ領域（１２１）の確実な加湿についても、国際特許国際公開第０１／０２０９４号に記載されている。
【００８８】
［白色光干渉計（２００）の組み立て］
白色光干渉計（２００）、例えば、「応用分光学技術会社（Ｉｎｇｅｎｉｅｕｒｂｕｅｒｏ  ｆｕｅｒ  Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｓｐｅｋｔｒｏｍｅｔｒｉｅ）」、ドイツ連邦共和国、Ｄ‐７３４３１、アーレン（Ａａｌｅｎ）レントゲンシュトラーセ（Ｒｏｅｎｔｇｅｎｓｔｒａｓｓｅ）３３所在、より市販されているものは、白色光源（２０１）で構成され、該光源の光は光学導波路（２１０）を通って、集束前方対物レンズまたは補助対物レンズ（２２０）に達する。集束前方対物レンズ（２２０）は、センサ領域（１２１）上に光を集束させる。センサ領域（１２１）から反射された光線（２３０）は、集束前方レンズ（２２０）によって２本アームのＹ光学導波路に結合される。反射光は、ダイオードアレイ分光器（２０２）に入射し、波長に依存する反射光の強度を測定することによって解析される。
【００８９】
［センサチップ（１２０）］
センサチップ（１２０）はガラスから成り、該ガラス上にセンサ領域（１２１）として機能する３次元ＳｉＯ２の網目が、ゾル‐ゲル技術によって施されている（シー  ジェイ  ブリンカー（Ｃ．Ｊ．Ｂｒｉｎｋｅｒ）、ジー  ダブリュ  シェラー（Ｇ．Ｗ．Ｓｃｈｅｒｅｒ）、「ゾル‐ゲル科学：ゾル‐ゲル処理の物理学と化学（Ｓｏｌ‐ｇｅｌ  ｓｃｉｅｎｃｅ：Ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｓｏｌ‐ｇｅｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）」；ボストンその他に所在のアカデミックプレス、１９９０）。ゾル‐ゲルは約５００ｎｍの厚みを有する。ゾル‐ゲルはグリシドキシプロピル基で修飾されており、該基に対してペンタエチレングリコールを介してオリゴヌクレオチドが合成される。オリゴヌクレオチドの合成はコンビナトリアルに行われる。この製造方法を用いて、５００ｎｍの強度を有し、さらに厚く、したがって白色光干渉法に適したＵｖＯＳ表面が得られる。屈折率は約１．４である。
【００９０】
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、屈折率と層厚の積は約１０ｎｍ変化する。この変化は図８および図９に模式的に示されている。白色光干渉計（２００）の光学経路も描かれている。入射白色光線（２３１）は、センサ領域（１２１）とチャンバ（１１４）の界面だけでなく、センサチップ（１２０）とセンサ領域（１２１）の界面でも反射される。一次（２３３）および二次（２３４）反射光は、センサチップ（１２０）を励起する際に僅かな位相シフト（２３５）を見せる。センサ領域（１２１）の厚みは、オリゴヌクレオチドの結合（ハイブリダイゼーション）によって一般に増大する。これによる位相差（２３５）は、無負荷のセンサ領域（１２２）（図８参照）から負荷センサ領域（１２３）（図９参照）へ移行する間に増大する。しかしながら、層厚の変化が小さいため、干渉法によって位相差を直接測定することはできない。したがって、発生した光は、ダイオードアレイ分光計（２０２）によってスペクトル的に分割され、波長に対する光強度が測定される（図２参照）。
【００９１】
［白色光干渉法シグナル］
干渉シグナルは、波長に依存して破壊的干渉および建設的干渉を示す（図２参照）。２つのスペクトルのシフトから、１測定値から次の測定値まで（ピーク間距離）の、表面領域（１２１）の層厚変化Δｄと屈折率差Δｎとの積を求めることができる。測定はまず９５℃の変性温度で行ってから、次に６５℃のアニーリング温度で行う。次に、白色光干渉スペクトルから最大と最小の間の距離の平均値を求める。このようにして、９５℃の無負荷センサ領域と６５℃の負荷センサ領域との間の、層厚変化Δｄと屈折率差Δｎの積が、各ＰＣＲサイクルに対して測定値として得られる。対応する例が図３に示されている。
【００９２】
［データ評価（３００）］
制御コンピュータ（３００）は、白色光源（２０１）、ＰＣＲ用の温度制御システム（４００）を駆動するために、またダイオードアレイ分光計（２０２）の測定値の読み出しのためにソフトウェアプログラムを使用する。コンピュータプログラムは、ダイオードアレイ分光計（２０２）の測定データから、各ＰＣＲサイクルに対する測定値Ｍを算出する（図３参照）。各ＰＣＲサイクルごとのＭの変化から、各ＰＣＲサイクルの増幅を判定することができる。測定値Ｍの強い増加は、増幅がうまくいっていることを示す。測定は中止することもできる。得られた測定値対から、長さｌｔおよびＰＣＲの増幅率ｖを決定することができる。これを行うために、まだ増幅が全く検出されていない、すべての測定値Ｍｓｔａｒｔの平均値を、残りの測定値Ｍｎから差し引く。すなわち、
Ｍ’ｎ＝Ｍｎ−Ｍｓｔａｒｔ
測定値Ｍ’ｎが得られる。このようにして得られた値の対を対数化し、直線回帰によって以下の等式より係数を求める。すなわち、
ｌｏｇ（Ｍ’ｎ）＝ａ・ｎ＋ｂ
これより、ＰＣＲ産物の長さｌｔと、増幅率ｖを以下のようにして算出することができる。すなわち、
ｖ＝ｅｘｐ（ａ），
ｌｔ＝ｅｘｐ（ｂ）／Ｅ・ｃｔ０・ＭＢ
（式中、Ｅは測定装置のシステム定数である）。
図３に示した曲線に対しては、標的の長さｌｔについて１７０（理論的には２００）または４７０塩基対（理論的には５００）という数値が得られる。
【００９３】
標的の初期濃度ｃｔ０は、較正測定によって得られる。様々な既知の初期濃度で同一の鋳型を用いたいくつかのポリメラーゼ連鎖反応を調べる。各ＰＣＲについて、増幅が測定可能となる、開始サイクルｎｓを求める。開始サイクルは外挿によって得られるので、ｎｓは自然数ではなく実数である。未知濃度の試料の開始サイクルも同様の方法で求める。回帰と補間の計算によって、初期濃度ｃｔ０が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】２つの異なる標的長（５００塩基対および２００塩基対）について、増幅溶液中のオリゴヌクレオチドの質量または質量濃度ｍｃｎを、ＰＣＲサイクルの数に関して示した図。
【図２】白色光干渉シグナルを波長に関して示した図。シグナルは、０と１の間の値に標準化されている。標的によるセンサ領域（１２１）の負荷の変化によるシグナルのシフトが明らかである。
【図３】２つの異なる標的長（５００塩基対および２００塩基対）について、層厚差Δｄと屈折率差Δｎとの積として白色光干渉法により得られた測定値Ｍを、ＰＣＲサイクル数に関して示した図。
【図４】制御コンピュータ（３００）と、白色光干渉計（２００）と、ＰＣＲセンサセル（１００）と、温度制御システム（４００）とで構成されるＳＭＯ  ＰＣＲ完全組立体の形態の本発明に従う装置の概略図。
【図５】筐体（１１０）と、入口（１１１）と、出口（１１２）と、センサチップ（１２０）と、反応チャンバ（１１４）とで構成されるＰＣＲセンサセル（１）の概略図。
【図６】加熱ユニット（１３０）が貼着されているＰＣＲセンサセル（１）の断面線Ａ−Ａに沿った概略図。
【図７】光進入円錐部（１１５）を有したＰＣＲセンサセル（１）の上方から見た概略図。
【図８】無負荷センサ領域（１２２）を有するセンサチップ（１２０）、ならびに白色光源（２０１）の入射白色光（２３１）、一次反射光（２３３）および二次反射光（２３４）で構成されている光路の概略図。一次反射光（２３３）と二次反射光（２３４）の間の波長依存性の位相シフトが図面から明らかである。
【図９】負荷センサ領域（１２３）を有するセンサチップ（１２０）の概略図。図８と比べて、負荷に関連して、波長依存性の位相シフトの変化が明瞭になっている。約１０ｎｍの長さの変化は小さすぎるために、この位相シフトを直接測定することはできないことに注意が必要である。したがって、反射光はスペクトル的に分割しなければならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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