(57)【要約】本発明はΔＦｏｓＢの過剰発現が骨生成を誘導し、ΔＦｏｓＢ発現が脂質生成を阻害するという発見に基づく。本発明は、骨生成および脂質生成を変調する物質の同定方法を提供する。さらに本発明はΔＦｏｓＢ、骨生成および脂質生成により変調される遺伝子を同定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨形成を変調する物質を同定する方法であって、
（ａ）被験物質を投与する工程と、
（ｂ）該物質が骨形成を変調するかどうかを決定するためにΔＦｏｓＢの発現をモニター観察する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２】
物質が培養系で単離された細胞に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞が骨芽細胞または軟骨細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞が、初代骨芽細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞またはＣ２Ｃ１２細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
物質が、ヒト以外のトランスジェニック動物に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
トランスジェニック動物がマウスである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
トランスジェニック動物がΔＦｏｓＢを過剰発現するように誘導され得る、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
物質が細胞ライゼートに投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
脂質生成を変調する物質を同定する方法であって、
（ａ）被験物質を投与する工程と、
（ｂ）該物質が脂質生成を変調するかどうかを決定するためにΔＦｏｓＢの発現をモニター観察する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項１０】
物質が、ΔＦｏｓＢを発現しているインビトロの細胞に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
細胞が、初代脂肪細胞及び３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞から成る群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
物質がヒト以外のトランスジェニック動物に投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
トランスジェニック動物がマウスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
トランスジェニック動物がΔＦｏｓＢを過剰発現するように誘導され得る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
物質が細胞ライゼートに投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
骨芽細胞形成を誘導する方法であって、多能性前駆細胞においてΔＦｏｓＢ発現を増加させる物質を投与することを含む、前記方法。
【請求項１７】
脂肪細胞形成を阻害する方法であって、多能性前駆細胞においてΔＦｏｓＢ発現を増加させる物質を投与することを含む、前記方法。
【請求項１８】
骨硬化症を処置する方法であって、ΔＦｏｓＢ発現を阻害する物質を投与することを含む、前記方法。
【請求項１９】
患者の骨形成を増加させる方法であって、ΔＦｏｓＢを誘導する物質を投与することを含む、前記方法。
【請求項２０】
患者が、骨折、骨粗鬆症、または上皮小体機能亢進症で病んでいる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｂ）が、酵母２ハイブリッド系を用いて実行される、請求項１または９に記載の方法。
【請求項２２】
ΔＦｏｓＢの発現が、ΔＦｏｓＢによって転写が調節されるレポーター遺伝子の発現を測定することによってモニター観察される、請求項１または９に記載の方法。
【請求項２３】
ΔＦｏｓＢによって変調される遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）細胞においてΔＦｏｓＢを誘導させる工程と、
（ｂ）どの遺伝子が差異的に発現されるかを決定することにより、ΔＦｏｓＢによって変調される遺伝子を同定する工程と、
を含む、前記方法。
【請求項２４】
工程（ｂ）が、酵母２ハイブリッド系またはＤＮＡチップへの細胞性核酸のハイブリダイゼーションを用いて実行される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ΔＦｏｓＢ発現を変調する遺伝子を同定する方法であって、被験遺伝子の存在下ΔＦｏｓＢの発現レベルを測定することにより、ΔＦｏｓＢを変調する遺伝子を同定する、前記方法。
【請求項２６】
被験遺伝子が核酸ライブラリーの中にある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ΔＦｏｓＢの発現レベルが、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、ＰＣＲ分析、または２ハイブリッドスクリーニングアッセイ、またはレポーター遺伝子系を用いて決定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
レポーター遺伝子系が、ΔＦｏｓＢと相互作用するプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ΔＦｏｓＢが異種性タンパク質に連結している、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
ΔＦｏｓＢが異種性ベクター上の核酸によってコードされている、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明者）
Ｒｏｌａｎｄ　Ｅ．、Ｎａｔａｌｉｅ　Ｓｉｍｓ、Ｇｅｏｇｉｏｓ　Ｓａｂａｋａｋｏｓ、Ｅｒｉｃ　Ｎｅｓｔｌｅｒ、Ｊｉｎｇｓｈａｎ　Ｃｈｅｎ、およびＭａｘ　Ｋｅｌｚ
【０００２】
（関連出願）
本出願は、２０００年８月２９日出願の米国仮出願第６０／２２８４５０号の優先権を主張するものであり、その全てを参照により本明細書に取り込む。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、ΔＦｏｓＢ発現を変調する物質を同定する方法に関する。とりわけ本発明は骨生成および脂質生成を変調する物質の同定に関する。また、本発明は、ΔＦｏｓＢにより変調されるまたはΔＦｏｓＢ発現を変調する、並びに骨生成および脂質生成に関連した遺伝子を同定する方法にも関する。さらに、本発明は骨生成異常および脂質生成異常に関連した疾患または症状を持つ被験者を処置するための、同定された物質の使用に関する。
【０００４】
（背景）
骨形成
骨形成、すなわち骨生成は成人骨格における骨量の維持に必須である。これは出生前の発生期に始まり、成人期にわたって持続する。骨生成は、２つの様式（結合組織性骨化および軟骨内骨化）によって生じる。
【０００５】
骨生成においては、２種類の重要な細胞がある。骨芽細胞は軟骨内および結合組織性骨化の双方に関与し、マトリックスタンパク質を作る骨組織における特殊化した細胞で、これにより新しい骨の形成が起こる。これらの骨生成細胞は間葉性骨芽前駆細胞に由来する。これらの細胞は、骨マトリックスを形成し、そこに骨細胞として封入されるようになる。これらの細胞は、脂肪細胞、軟骨細胞および筋肉などのその他の系列に分化できる（Ｂｅｌｌｏｗｓら、１９９４）。破骨細胞は、骨芽細胞とは異なり、軟骨内骨化において使われる。これらの細胞は、予め骨に蓄えられたカルシウムを溶解し、必要なときはいつでもそれを組織に運ぶ。このように、骨芽細胞は新たな骨成長に関連するが、破骨細胞は骨吸収および除去に関連する。
【０００６】
骨は、新たな骨を生成する骨芽細胞、および骨を破壊する破骨細胞により媒介される複合過程において定常的な崩壊および再合成に供される。正常な骨では、骨芽細胞に媒介される骨生成と破骨細胞に媒介される骨吸収とのバランスが複合的な調節相互作用を介して維持される。
【０００７】
骨生成関連症状および疾患
骨格系に関連する多くの欠損、疾患および障害がある。いくつか例示すると、骨粗鬆症、骨癌、関節炎、くる病、骨折、歯周疾患、骨区域性欠損、溶骨性骨疾患、原発性および続発性上皮小体機能亢進症、パジェット病、骨軟化症、骨化過剰症、並びに大理石骨病などがあるが、これらに限定されない。
【０００８】
従って、骨成長障害に関連する疾患を処置する方法、骨生成を促進する方法、骨生成を変調する（増加または減少させる）物質の同定方法、および骨成長障害に関連する遺伝子を同定する方法を開発する必要がある。
【０００９】
ΔＦｏｓＢ
転写因子のＡＰ−１ファミリーはＦｏｓ関連（ｃ−Ｆｏｓ、ＦｏｓＢ、ΔＦｏｓＢ、Ｅｒａ−１およびＦｒａ−２）およびＪｕｎ関連（ｃＪｕｎ、ＪｕｎＢおよびＪｕｎＤ）タンパク質の二量体複合体から成る。これらは目的の遺伝子のプロモーターで特異的配列との相互作用を介して種々遺伝子の転写を変調する塩基性ロイシンジッパータンパク質である。ＡＰ−１ファミリーのメンバーは骨細胞増殖および分化の制御に関わり、骨生成に関与するいくつかの遺伝子のプロモーターはＡＰ−１コンセンサス配列を含有する。加えて、骨生成のいくつかのレギュレーターは初期骨芽前駆細胞においてＡＰ−１発現を誘導する（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｅｓら、１９９３）。さらにｃ−Ｆｏｓを過剰発現するマウスは、骨肉腫を生ずるが（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｅｓら、１９９３；Ｗａｎｇら、１９９２）、ｃ−ｆｏｓノックアウトマウスは破骨細胞を欠如しており、大理石骨病を生ずる（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９２；Ｗａｎｇら、１９９２）。対照的に、ｆｏｓＢノックアウトマウスでは骨の異常は報告されておらず（Ｇｒｕｄａら、１９９６）、ＦｏｓＢ、Ｆｒａ−２、ｃ−ＪｕｎまたはＪｕｎＢが単独で過剰発現するマウスでも報告されていない（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓら、１９９３）。
【００１０】
ＡＰ−１ファミリーのメンバーの骨格生物学における役割に関する多大な研究にもかかわらず、ｆｏｓＢ転写体の選択的スプライシングから生じるＦｏｓ関連タンパク質であるΔＦｏｓＢの役割は分析されていない。ΔＦｏｓＢは、乱用薬物、抗精神病薬、抗うつ薬、発作および損傷などの数種の慢性的摂動に応答して脳で領域特異的に誘導され得る（Ｃｈｅｎら、１９９８）。一度誘導されると、ΔＦｏｓＢイソ型はその並外れた安定性により比較的長時間脳において維持される。ｆｏｓＢ遺伝子を欠如するマウスは、薬物乱用または抗うつ処置の慢性的な投与に対して異常な生化学および行動応答を呈し、脳での長期間適応を媒介するΔＦｏｓＢの重要な役割と合致する（Ｎｅｓｔｌｅｒら、１９９９）。
【００１１】
脂質生成と骨生成の関係
脂肪細胞は骨髄の間質系の必須部分を形成し、造血性微環境の確立および維持に関わる（Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄら、１９９２）。脂肪細胞および骨生成原細胞は骨髄間質系の２つの主要な細胞系である。これらは成人骨髄の多分化能間質幹細胞に由来するという証拠もある（Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄら、１９９２）。Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄら（１９９２）はラット骨髄間質細胞の培養において脂肪細胞の発現および骨生成原細胞表現型間で反比例の関係があるという証拠があると報告している。Ｂｅｒｅｓｆｏｒｄら（１９９２）はまたこの知見は脂質生成および骨生成の制御が共通の前駆体のレベルで生じ得るという可能性に合致すると報告している。
【００１２】
Ｇｉｍｂｌｅら（１９９５）は多分化能ネズミ骨髄間質細胞系、ＢＭＳ２における脂質生成に及ぼす骨形態形成タンパク質の影響について記載している。Ｇｉｍｂｌｅら（１９９５）は骨形態形成タンパク質が多分化能骨髄間質細胞において脂質細胞分化を阻害することを報告している。
【００１３】
脂質生成関連疾患
脂質生成に関連する疾患には体重障害、例えば肥満、食欲不振、悪液質、並びに非震えおよび震え熱産生などがある。肥満は通常理想体重の２０％以上過剰の体重として定義される。肥満は心臓血管系疾患、糖尿病および致死率の増加の危険性の増加に関連する（Ｇｒｕｎｄｙら、Ｄｉｓｅａｓｅ−ａ−Ｍｏｎｔｈ　３６：６４５−６９６（１９９０））。一方、食欲の喪失、食物摂取の減少、および体重減少もまた多くの疾患に関連する問題でもある。
【００１４】
従って、脂質生成に関連する疾患の処置方法、脂質生成を変調する物質の同定方法、および脂質生成関連遺伝子の同定方法を開発する必要性もある。
【００１５】
（発明の概要）
本発明は、骨形成すなわち骨生成を変調する物質の同定方法を提供する。好ましくは、該方法は、被験物質を投与し、該物質が骨の形成を変調するかどうかを決定するためにΔＦｏｓＢの発現をモニター観察することにより実施される。ここで、ΔＦｏｓＢの発現の増加は物質が骨形成のインデューサーであることを示し、ΔＦｏｓＢの発現の低下は物質が骨形成のインヒビターであることを示す。
【００１６】
また、本発明は、ΔＦｏｓＢと相互作用する物質の同定方法を提供し、該方法は、被験物質をΔＦｏｓＢと共にインキュベートして、ΔＦｏｓＢと被験物質との相互作用を検出することを含む。
【００１７】
本発明の１つの実施形態では、培養で単離された細胞（例えば、非限定例としては、骨芽細胞および軟骨細胞、好ましくは初代骨芽細胞、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞、またはＣ２Ｃ１２細胞）に物質を投与する。別の実施形態では、細胞ライゼート、とりわけ核抽出物に物質を投与する。本発明の第３の実施形態では、ヒト以外のトランスジェニック動物、好ましくはマウス、最も好ましくはΔＦｏｓＢを過剰発現するマウスに物質を投与する。
【００１８】
また、本発明は、脂質生成を変調する物質を同定する方法をも提供する。好ましくは、該方法は、被験物質を投与し、該物質が脂質生成を変調するかどうかを決定するためにΔＦｏｓＢの発現をモニター観察することにより実施される。ここで、ΔＦｏｓＢの発現の増加は物質が脂質生成のインヒビターであることを示し、ΔＦｏｓＢの発現の低下は物質が脂質生成のインデューサーであることを示す。
【００１９】
本発明の１つの実施形態では、培養で単離された細胞（例えば、非限定例としては、初代脂肪細胞、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞、３Ｔ３Ｆ４２２Ａ、およびｏｂ１７７１）に物質を投与する。別の実施形態では、細胞ライゼート、とりわけ核抽出物に物質を投与する。本発明の第３の実施形態では、ヒト以外のトランスジェニック動物、好ましくはマウス、最も好ましくはΔＦｏｓＢを過剰発現するマウスに物質を投与する。
【００２０】
また別に、本発明の方法は、ΔＦｏｓＢの発現をモニター観察するために、酵母２ハイブリッド系またはレポーター遺伝子系を用いて実施されてよい。
【００２１】
さらに、本発明は、骨の形成またはΔＦｏｓＢ発現を変調する物質を投与することにより、細胞（例えば、非限定例としては、骨芽細胞、骨髄間質細胞、または多能性前駆細胞）の分化または増殖を変調する方法を提供する。
【００２２】
１つの実施形態では、本発明は、脂質形成またはΔＦｏｓＢ発現を変調する物質を投与することにより、細胞（例えば、非限定例としては、脂肪細胞、前脂肪細胞、骨髄間質細胞、または多能性前駆細胞）の分化または増殖を変調する方法を企図する。
【００２３】
もう１つの実施形態では、本発明は、骨生成または脂質生成に関連する疾患を処置するために、骨形成または脂質生成を変調すると同定された物質を使用することを企図する。これらの疾患には、骨粗鬆症、骨癌、関節炎、くる病、骨折、歯周疾患、骨区域性欠損、溶骨性骨疾患、原発性および続発性上皮小体機能亢進症、パジェット病、骨軟化症、骨化過剰症、大理石骨病、骨硬化症、骨粗鬆症、肥満、食欲不振、悪液質、並びに非震えおよび震え熱産生などがあるが、これらに限定されない。
【００２４】
さらに、本発明は、ΔＦｏｓＢにより変調される遺伝子の同定方法を提供する。該方法は、細胞においてΔＦｏｓＢを誘導し、どの遺伝子が差異的に発現されるかを決定し、それにより、ΔＦｏｓＢにより変調される遺伝子または骨形成もしくは脂質生成においてその作用を媒介するΔｆｏｓＢに関連する遺伝子を同定することを含む。好ましくは、該方法は、酵母２ハイブリッド系または（例えば、ターゲット同定に使われる）ＤＮＡチップへの細胞性核酸のハイブリダイゼーションを用いて実施される。
【００２５】
また、本発明は、ΔＦｏｓＢ発現を変調する遺伝子を同定する方法を提供する。該方法は、被験遺伝子の存在下ΔＦｏｓＢの発現レベルを測定し、それによりΔＦｏｓＢを変調する遺伝子を同定することを含む。被験遺伝子は核酸ライブラリーに由来してよく、被験遺伝子は異種性ベクターに存在し得る。ΔＦｏｓＢの発現レベルは、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、ＰＣＲ分析、または２ハイブリッドスクリーニングアッセイ、またはレポーター遺伝子系を用いて決定できる。企図されるレポーター遺伝子系は、ΔＦｏｓＢと相互作用するプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を含んでいてよい。さらに、該方法は、異種性タンパク質に連結したΔＦｏｓＢを含む。該方法は、細胞をベースにした系または細胞を含まない系を用いて実行され得る。さらに、該方法は、例えばＤＮＡチップを使用した高速大量処理アッセイを用いて実行され得る。
【００２６】
（発明の詳細な説明）
Ａ．一般的概念
本発明は、テトラサイクリン制御系を用いるマウスにおけるΔＦｏｓＢの過剰発現が骨格の至る所で骨の形成を増加させ、深刻な骨硬化症に至ったこという知見に基づくものである。この表現型は、骨芽細胞において細胞自律的である。加えて、ΔＦｏｓＢはインビボおよびインビトロの双方で脂質生成を阻害し、脂肪細胞の分化の初期マーカーの発現をダウンレギュレートする。
【００２７】
本発明は、ΔＦｏｓＢの発現をモニター観察することにより骨生成および脂質生成を変調する物質を同定する方法を提供する。また、本発明は、骨生成または脂質生成に関連する特定の疾患を処置するものと同定された物質の使用をも企図する。さらに、本発明は、ΔＦｏｓＢにより変調される、またはΔＦｏｓＢを変調する遺伝子の同定方法を提供する。これらの遺伝子は疾患の診断および処置のための手段として、および疾患を処置する可能性のある薬物を同定するための標的として有用である。
【００２８】
Ｂ．特定の実施形態
１．ΔＦｏｓＢ
ΔＦｏｓＢは、選択的スプライシングによりｆｏｓＢ遺伝子から誘導される。本明細書で用いる「ΔＦｏｓＢ」なる用語は、Ｎａｋａｂｅｐｐｕら（１９９１、この全てを出展明示により本明細書の一部とする）により記載されたタンパク質を意味する。用語はまた種々の動物種からの天然発生ΔＦｏｓＢ、およびＮａｋａｂｅｐｐｕら（１９９１）に記載されたタンパク質とはアミノ酸配列がわずかに異なっているアレル変種をも包含する。非限定例としてはヒト、ウサギ、ラット、ネズミ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマおよびヒト以外の霊長類の種などのその他の種からのΔＦｏｓＢが企図される。アレル変種はアミノ酸配列がわずかに異なっているが、なお骨形成を変調する能力を有している。
【００２９】
さらに、用語はＮａｋａｂｅｐｐｕら（１９９１）に記載されたΔＦｏｓＢの保存変種を含む。保存変種は、骨形成の変調等のΔＦｏｓＢの機能的活性を変化させないΔＦｏｓＢのアミノ酸における変化を意味する。ΔＦｏｓＢのアミノ酸配列を変化させて、例えばΔＦｏｓＢの活性に不都合な影響を及ぼすことなくより高い親水性または疎水性を付与することができる。
【００３０】
かかる保存変異には、非限定例としては１つのアミノ酸を以下の群の１つの中の別のものと交換する変異などがある：
１．小型脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＰｒｏおよびＧｌｙ；
２．極性の負に荷電した残基およびそのアミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；
３．極性の正に荷電した残基：Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＬｙｓ；
４．大型脂肪族、非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；並びに
５．芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。
【００３１】
置換基の種類は、Ｓｃｈｕｌｚら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、スプリンガー・フェアラグ、１４−１６頁（１９７８）により開発された異なる種の相同性タンパク質間のアミノ酸置換の頻度の分析、およびＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１３：２１１（１９７４）により開発された構造−形成ポテンシャルの分析、またはＳｃｈｕｌｚら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、スプリンガー・フェアラグ、１０８−１３０頁（１９７８）により概説された別の同様の方法、並びにＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）により開発された疎水性パターンの分析に基づいて選択することができる。
【００３２】
また、「ΔＦｏｓＢ」なる用語は、骨形成の変調等のΔＦｏｓＢの機能的活性を保持するペプチドをも含む。ペプチドは少なくとも５、８、１０、１５、２０またはそれ以上のアミノ酸のいずれかの長さでよい。これらのペプチドは抗体生成のための抗原として有用であることも指摘されている。
【００３３】
さらに、該用語は天然の供給源からの単離されたタンパク質を包含する。物理的、機械的または化学的方法を用いて通常タンパク質に関連する細胞成分からタンパク質を除去する場合、タンパク質が単離されているということになる。当業者は標準的な精製方法を容易に用いて単離されたΔＦｏｓＢタンパク質を得ることができる。また、該用語は、組換え手段または化学的手段により得られたΔＦｏｓＢタンパク質をも包含する。
【００３４】
本明細書で用いる「ΔＦｏｓＢをコードする核酸」なる用語は、非限定例としてはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびアンチセンス分子などのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を包含する。また、本発明の核酸分子は、ΔＦｏｓＢをコードする元来のまたは合成ＲＮＡ、ＤＮＡまたはｃＤＮＡを含む。該用語は、先に論じた「ΔＦｏｓＢ」なる用語により包含されるΔＦｏｓＢタンパク質の全て、非限定例としては種々の動物種からの変種、アレル変種、および天然発生ΔＦｏｓＢをコードする核酸を含む。
【００３５】
２．トランスジェニック動物
本明細書で用いる「トランスジェニック動物」とは、トランス遺伝子の導入によりゲノムが変化しているいずれかの動物、好ましくはヒト以外の動物を意味する。本発明の「ヒト以外の動物」は脊椎動物、例えばげっ歯類、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等を含む。好ましいヒト以外の動物は、ラットおよびマウスなどのげっ歯類ファミリーから選択され、好ましくはマウスである。
【００３６】
本明細書で用いる「トランス遺伝子」なる用語は、核酸配列（例えばＩＬ−６ポリペプチドをコードする）を意味し、それが導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞に対して部分的または全体的に異種性（すなわち外来性）であるか、それが導入されるトランスジェニック動物もしくは細胞の内因性遺伝子に対して同種性であるが、それが挿入される細胞のゲノムを変化させるような方法で動物のゲノムに挿入されるように設計されるかまたは挿入されている（例えばこれは天然の遺伝子の位置とは異なる位置で挿入されるか、またはその挿入の結果ノックアウトになる）。トランス遺伝子は、選択された核酸の最適な発現に必要であり得る１つまたはそれ以上の転写制御配列およびいずれか別の核酸、例えばイントロンを含むことができる。
【００３７】
トランスジェニック動物を作る手順は技術分野で既知である（Ｈｏｇａｎら、「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ」コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、米国；および米国特許第４８７３１９１号）。一般にトランス遺伝子は、直接的または間接的に細胞の前駆体への導入により、慎重な遺伝子操作により、例えばマイクロインジェクションによりまたは組換えウイルスでの感染により細胞に導入される。遺伝子操作なる用語は組換えＤＮＡ分子の導入を意味する。この分子は染色体内に組み込むことができるか、または染色体外でＤＮＡを複製できる。望ましいポリペプチド、例えばΔＦｏｓＢをコードするトランス遺伝子は１つまたはそれ以上の制御領域に連結されている。適当な制御領域または複数の制御領域の選択は日常的な事柄であり、技術分野の通常の当業者のレベル内である。制御領域は、目的の遺伝子の３’に位置する領域と共に、機能的転写のプロモーター領域を含んでなってよい。この領域は、転写の終止のためのシグナルおよびポリアデニル化部位を特定する。これは、エンハンサー領域をも含む。
【００３８】
本発明で用いられるプロモーターには構成プロモーターおよび制御（誘導）プロモーターの双方が含まれ得る。プロモーターは天然に核酸の発現に寄与できる。また、プロモーターは、異種性の供給源からのものである。とりわけ、プロモーターは、真核生物またはウイルス遺伝子のプロモーター配列でよい。例えば、プロモーターは、感染が所望の細胞のゲノムに由来するプロモーター配列でよい。同様に、使用されたアデノウイルスなどのウイルスのゲノムに由来するプロモーター配列でよい。この点で、プロモーターには、非限定例としてはＥＩＡ、ＭＬＰ、ＨＣＭＶおよびＲＳＶ遺伝子等がある。加えて、組織特異的または優性発現を可能にする活性化または制御配列または複数の配列を付加することによりプロモーターを修飾することができる。
【００３９】
トランス遺伝子産物の発現を変調するために、トランス遺伝子を誘導プロモーターに連結させる。誘導プロモーターにはインデューサーへの暴露に応答して特定の遺伝子により産生される遺伝子産物の量を増加させることができるいずれかのプロモーターが含まれる。誘導プロモーターは当業者に既知であり、トランス遺伝子の発現を誘導するのに使用できると考えられる種々のものが存在する。いくつかの誘導プロモーターの例としてはマウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導プロモーター、熱ショックプロモーター、ＨＬＡ−ＤＲプロモーター、ステロイドホルモンレセプター（Ｃｉｃａｔｉｅｌｌｏら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．９：１０７７−１０９０（１９９５））、レチノイン酸レセプター（Ｍｅｎｄｅｏｌｓｏｈｎら、Ｄｅｖ．４５（３）：２２７−２４１（１９９４））、テトラサイクリン制御転写モデュレーター（Ｆｕｒｔｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１（２０）：９３０２−９３０６（１９９４））、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期；レトロウイルスＬＴＲ（Ｃｈｏａｔｅら、Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．８（８）：８９５−９０１（１９９７））、メタロチオネイン−１（Ｆａｔｔｏｒｉら、Ｂｌｏｏｄ　８３：２５７０−２５７９（１９９４））などがある。テトラサイクリン制御転写モデュレーターおよびＣＭＶプロモーターはまた国際公開公報第９６／０１３１３号および米国特許第５１６８０６２号および第５３８５８３９号にも記載されている。
【００４０】
最も広く用いられているトランスジェニック動物の作製方法は受精胚の前核へのＤＮＡのマイクロインジェクションである。この方法はトランスジェニックマウスの作製には有効であるが、ウシおよびヒツジなどの大きな哺乳動物を用いるトランスジェニック動物の作製にはあまり有効ではない。例えば、前核段階での１０００から２０００個のウシ胚をマイクロインジェクションに供して１匹のトランスジェニックウシを作成しなければならず、見積原価は５０００００ドルを越えると報告されている（Ｗａｌｌら、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：１１３（１９９２））。さらに前核のマイクロインジェクションは、家畜（例えばウシ、ヒツジ、ブタ）に由来する胚を用いる場合、前核はしばしば卵黄物質により不明瞭であるのでさらに困難である。前核を可視化する技術は既知である（すなわち胚を遠心して卵黄を沈降させる）が、前核の注入は高度な操作技術を要する侵入性技術である。
【００４１】
別の作製方法には、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターで胚を感染させることなどがある。野生型または組換えレトロウイルスのいずれかでの移植前または後のマウス胚の双方の感染が報告されている。（Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７３：１２６０−１２６４（１９７６）；Ｊａｅｎｉｓｃｈら、Ｃｅｌｌ　２４：５１９（１９８１）；Ｓｔｕｈｌｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：７１５１（１９８４）；Ｊａｈｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：６９２７−６９３１（１９８５）；Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：６１４８−６１５２（１９８５）；Ｓｔｅｗａｒｔら、ＥＭＢＯ　Ｊ．６：３８３−３８８（１９８７））。トランスジェニック動物を形成する細胞のサブセットでのみ組み込みが生じるので、結果として得られるトランスジェニック動物は、通常、トランス遺伝子のモザイクである。モザイク創始動物の作製に加えて、レトロウイルスで胚を感染させる（これは典型的には細胞分裂の第８期またはそれ以降で胚を用いて実施される）結果、しばしば、一般に子孫を分離するゲノムの異なる位置において、レトロウイルスプロウイルスの複数のコピーを含有する創始動物の作製に至る。初期胚をレトロウイルス産生細胞と共に同時培養するには、初期マウス胚の感染には透明帯を取り除くために酵素による処置が必要とされる（Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、２５１−２５２頁）。
【００４２】
レトロウイルスで胚を感染させるための別の手段は、マウス胚分割腔へのウイルスまたはウイルス産生細胞の注入である（Ｊａｈｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　２９８：６２３−６２８（１９８２））。細胞分裂第８期の胚感染の場合のように、分割腔への注入により産生されたほとんどの創始動物はモザイクになる。妊娠中期のマウス胚の子宮内レトロウイルス感染を用いて、マウスの生殖細胞系へトランス遺伝子を導入させることが報告されている（Ｊａｈｎｅｒら、１９８２前出）。
【００４３】
要約すると、安定して繁殖して遺伝子を含有する子孫を産み出すことができるトランスジェニック動物を作製する方法は以下の工程からなる：
（ａ）第１の雌動物から受精した卵母細胞を単離すること；
（ｂ）トランス遺伝子を受精した卵母細胞に移入すること；
（ｃ）トランス遺伝子を含有する受精した卵母細胞を第１の動物と同一種の子宮に移入すること；
（ｄ）第２の雌動物を：
（ｉ）第２の雌動物がトランス遺伝子を含有する受精した卵母細胞に由来する胚を持って妊娠する；
（ｉｉ）胚がトランスジェニック動物に成長する；および
（ｉｉｉ）トランスジェニック動物が第２の雌動物から生存して誕生する；ように維持する。ここで、トランスジェニック動物は望ましいタンパク質の遺伝子配列を有し、繁殖して望ましい遺伝子配列を安定して含有する細胞を有する子孫を産み出すことができる。
【００４４】
Ｃｈｅｎら（１９９８）は、トランス遺伝子発現を、線条、小脳、海馬のＣＡ１領域または大脳新皮質などの特定の脳領域に指向させるトランスジェニックマウスのいくつかの系の作製について報告している。これらのマウスはニューロン特異的エノラーゼプロモーターの変調下で修飾されたテトラサイクリン制御系を用いて作製される。これらのマウスにおけるトランス遺伝子発現をデオキシサイクリン（テトラサイクリン誘導体）の低量投与で完全に止め、デオキシサイクリンの不在下で非常に高レベルに誘導することができる。トランスジェニックマウスを得る方法に関してはＣｈｅｎら（１９９８）により記載されている。
【００４５】
３．骨形成および脂質生成を変調する物質を同定する方法
本発明は、骨形成を変調する物質を同定する方法を提供する。該方法は、被験物質を投与し、およびΔＦｏｓＢの発現をモニター観察して、物質が骨の形成を変調するかどうかを決定することからなる。ここで、ΔＦｏｓＢの発現の増加または減少は、物質が骨の形成を変調することを示している。さらに、ΔＦｏｓＢの発現の増加は物質が骨の形成のインデューサーかまたはプロモーターであることを示しており、一方ΔＦｏｓＢの発現の減少は物質が骨の形成のインヒビターであることを示している。
【００４６】
本発明はまた脂質生成を変調する物質を同定する方法をも提供する。該方法は、被験物質を投与し、およびΔＦｏｓＢの発現をモニター観察して、物質が脂質生成または脂肪細胞分化を変調するかどうかを決定することからなる。ここで、ΔＦｏｓＢの発現の増加または減少は物質が脂質生成を変調することを示している。さらに、ΔＦｏｓＢの発現の増加は物質が脂質生成のインヒビターであることを示しており、一方ΔＦｏｓＢの発現の減少は物質が脂質生成のインデューサーかまたはプロモーターであることを示している。
【００４７】
本明細書で用いる「物質」または「被験物質」なる用語は、被験されるいずれかの化合物、または分子を意味する。
【００４８】
本明細書で用いる「モジュレーター」なる用語は、例えば骨形成、脂質生成またはΔＦｏｓＢ発現などの特異的活性の発現を変化させるいずれかの物質を意味する。本明細書で用いる「変調する」なる用語は変わるまたは変化することを意味する。従って、骨生成の発現を変調する被験物質は骨生成を変えるまたは変化させ、骨生成のモデュレーター（変調物質）は骨生成を増加または減少させる。
【００４９】
本明細書で用いる「インデューサー」または「プロモーター」なる用語は特異的活性、例えば骨の形成、脂質生成またはΔＦｏｓＢ発現などを誘導、増強、促進または増加させるいずれかの物質を意味する。
【００５０】
本明細書で用いる「インヒビター」または「レプレッサー」なる用語は特異的活性、例えば骨の形成、脂質生成またはΔＦｏｓＢ発現などを阻害、抑制、または減少させるいずれかの物質を意味する。
【００５１】
本発明の物質の例には、非限定例としてはペプチド、小型分子および抗体などがある。物質を無作為にまたは合理的に選択または設計できる。物質と標的化合物または部位との特異的相互作用を考慮せずに物質を選択する場合、本明細書で用いるように物質は「無作為に選択される」と称される。物質と標的化合物または部位との特異的相互作用および／または物質の作用に関係するコンフォメーションを考慮に入れる非無作為をベースに物質を選択する場合、本明細書で用いるように物質は「合理的に選択または設計される」と称される。
【００５２】
ΔＦｏｓＢのイソ型は多くの型の慢性的摂動（例えばコカイン、アンフェタミン、ニコチン、アヘン製剤、抗うつ薬および抗精神病薬への暴露）の後に誘導されることが知られている。Ｎｅｓｔｌｅｒら（１９９９）は、一度ΔＦｏｓＢイソ型が誘導されると通常以上の安定性のために比較的長時間脳内に留まることを報告している。従って、骨生成および脂質生成を変調するための合理的に選択された物質には非限定例としては薬物乱用、抗うつ薬および抗精神薬などがある。薬物乱用の具体的な例には、非限定例としてはコカイン、アンフェタミン、ニコチンおよびアヘン製剤などがある。
【００５３】
インビトロ細胞（培養細胞）および細胞ライゼート、とりわけ核抽出物を用いて本発明の方法を実施できる。骨形成を変調する物質を同定するために企図される細胞の例には、非限定例としては頭蓋冠細胞、骨芽細胞、破骨細胞、および多分化能前駆体細胞、例えば多分化能骨髄間質細胞などがある。骨芽細胞系の具体的な例としてはＭＣ３Ｔ３−Ｅ１、Ｃ２Ｃ１２、ＭＧ−６３細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＵＭＲ１０６細胞、ＲＯＳ１７／２．８細胞、ＳａＯＳ２細胞などがあり、同様のものがＡＴＣＣからのカタログで提供される。加えて、トランスジェニックマウスから確立された骨および軟骨細胞系を使用できる。脂質生成を変調する物質を同定するのに有用な細胞の例には、非限定例としては脂肪細胞、前脂肪細胞および多分化能前駆体細胞（例えば多分化能骨髄間質細胞）がある。脂肪細胞系の具体的な例としては３Ｔ３−Ｌ１、前脂肪細胞、３Ｔ３、Ｆ４２２Ａおよびｏｂ１７７１などがある。通常的に実施される方法により企図される細胞から細胞ライゼートおよび核抽出物を得ることができる（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、１９８９）。
【００５４】
さらに、米国特許第６０８２３６４号は、骨髄から得られ、遭遇する環境および用いる処置に依存して骨細胞、軟骨細胞および脂肪細胞に分化できる多分化能幹様Ｄ１細胞を開示している。全身的に投与する場合、細胞は骨髄に移動する。レポーター遺伝子および生物学的因子例えば成長因子の双方を発現するための組換えＤＮＡで細胞を形質転換することができる。該特許は、細胞の全身的投与により骨粗鬆症、骨溶解を処置し、骨移植片着生を改善し、骨成長または骨修復を増強し、軟骨修復を増強し、例えば豊胸のための脂質生成を増強することを教示している。
【００５５】
また本発明の方法を動物、好ましくはヒト以外のトランスジェニック動物全体を用いて実施することもできる。好ましいヒト以外のトランスジェニック動物にはΔＦｏｓＢを過剰発現する動物などがある。かかるトランスジェニック動物の具体的な例にはＴｅｔＯＰ−ΔＦｏｓＢ遺伝子を担持する動物およびバイジェニックＮＳＥ−ｔＴＡｘＴｅｔＯｐ−ΔＦｏｓＢ動物などがある（Ｃｈｅｎら、１９９８）。最も好ましくは、これらの動物はトランスジェニックマウスである。別の実施形態では、トランスジェニック動物から得られた細胞を、骨生成または脂質生成を変調する物質を同定するためのΔＦｏｓＢの供給源として使用する。
【００５６】
被験物質がΔＦｏｓＢの発現を変化させるかどうかを決定する方法には当業者に既知の分析およびアッセイを実施することなどがある。非限定例としては、組織化学的分析、破骨細胞様細胞（ＯＣＬ）形成アッセイ、標準破骨細胞ピット形成アッセイ、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析、並びに電気泳動可動性シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）およびスーパーシフト分析などがある。ΔＦｏｓＢ発現を変調する被験物質を同定するための本発明により企図される別の方法にはＰＣＲ分析、２ハイブリッドスクリーニングアッセイ（Ｆｉｅｌｄｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３４０：２４５（１９８９）；Ｇｙｕｒｉｓら、Ｃｅｌｌ　７５：７９１（１９９３）；Ｈａｒｐｅｒら、Ｃｅｌｌ　７５：８０５（１９９３）；Ｓｅｒｒａｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ　３６６：７０４（１９９３）；Ｈａｎｎｏｎら、Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖ．７：２３７８（１９９３））およびレポーター遺伝子系などがある。特定の実施形態では、レポーター遺伝子はβガラクトシダーゼをコードすることができる。別の実施形態では、レポーター遺伝子はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、およびその他のレポーター遺伝子をコードすることができる。例えばレポーター遺伝子をΔＦｏｓＢと相互作用するプロモーターの制御下に置くことができる。このように、レポーターの発現はΔＦｏｓＢの発現を示す。
【００５７】
被験物質を投与されたトランスジェニック動物を屠殺し、動物からの標本を用いてアッセイを実施する。加えて、骨の組織形態計測的測定（Ｐａｒｆｉｔｔら、１９８７）、血清オステオカルシン測定、尿クレアチン測定、血清レプチン測定、および骨髄塗抹を実施して被験物質がΔＦｏｓＢの発現を変化させるかどうかを決定できる。
【００５８】
被験物質がΔＦｏｓＢ発現を変調するかどうかを決定するためのコントロール実験を並行して実施することは当業者の技術範囲内である。コントロールと比較したΔＦｏｓＢ発現の増加は、被験物質が骨生成のプロモーターである可能性を示しており、一方、コントロールと比較したΔＦｏｓＢ発現の減少は、被験物質が骨生成のインヒビターである可能性を示している。同様にコントロールと比較したΔＦｏｓＢ発現の増加は、被験物質が脂質生成のインヒビターである可能性を示しており、一方コントロールと比較したΔＦｏｓＢ発現の減少は、被験物質が骨生成のインデューサーである可能性を示している。
【００５９】
また、本発明の方法を、細胞不含系を用いて実施することもできる。
【００６０】
高速大量処理アッセイなどのいずれかの利用可能な様式で本発明の方法を修飾または実施することができる。高速大量処理アッセイは所与の時間内で多数の化合物をスクリーニングするのに有用である。１つの実施形態では核酸を用いてアッセイを形成することができ、ここで核酸はＤＮＡチップに載せる。別の実施形態では細胞をベースにしたスクリーニングを用いてアッセイを実施する。米国特許第６１０３４７９号は細胞をベースにしたスクリーニングのための微小細胞アレイ法および装置を開示している。例えばフォトケミカルレジストリソグラフィー等の別の適用については、均一にマイクロパターン化された細胞アレイを作成するための方法が記載されている（ＭｒｋｓｉｃｈおよびＷｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２５：５５−７８（１９９６））。米国特許第６０９６５０９号は、細胞の流動懸濁液に及ぼす被験化合物の細胞性応答を即時的に測定するための装置および方法を提供する。ここで、一連の細胞型の各メンバーの同種懸濁液はある濃度の被験化合物と組み合わされ、検出ゾーンを通って方向付けられ、被験混合物の細胞が検出ゾーンを通って流れるのと即時的に生存細胞の細胞応答性が測定される。該特許は、化合物のライブラリーの自動スクリーニングでの装置の使用を教示している。米国特許で開示される方法を修飾して、細胞例えば脂肪細胞または骨芽細胞を用いて被験物質がΔＦｏｓＢの発現を変調するかどうかを決定することができる。
【００６１】
４．ΔＦｏｓＢの発現を変調する物質を使用する方法
本発明は、トランスジェニックマウスにおけるΔＦｏｓＢの過剰発現が骨格のいたるところで骨の形成を増加させ、発育後に骨量を連続的に増加させるという知見に部分的に基づいている。また、本発明は、ΔＦｏｓＢの発現がインビトロおよびインビボの双方で脂質生成を抑制し、脂肪細胞分化の初期マーカーの発現をダウンレギュレートするという発見に部分的に基づいている。加えて、骨芽細胞および脂肪細胞が共通の前駆体を共有すると考えられているので、本発明は、ΔＦｏｓＢが転写的に骨芽細胞形成を制御するという結論に部分的に基づいている。
【００６２】
骨生成は骨芽細胞の成長、分化または活性化を刺激することにより促進されると考えられ、一方脂質生成は脂肪細胞の成長、分化または活性化を刺激することにより促進されると考えられている。従って、ΔＦｏｓＢの発現を変調する物質は骨生成、脂質生成、骨芽細胞増殖および分化、脂肪細胞増殖または分化、間質幹細胞分化、並びに多分化能前駆体細胞分化を変調するのに有用である可能性がある。従って、ΔＦｏｓＢの発現を変調する物質は骨生成および脂質生成に関連し疾患または症状の処置、および骨芽細胞および脂肪細胞の分化および増殖を調節するのに有用である可能性がある。
本明細書で用いる「骨生成」なる用語は骨の形成を意味する。
本明細書で用いる「脂質生成」なる用語は脂質の生成、脂肪の沈着、または炭水化物もしくはタンパク質の脂肪への変換を意味する。この用語は「リポゲネシス」（脂肪生成）と同義である。
本明細書で用いる「骨芽細胞形成」なる用語は骨芽細胞の形成である。
本明細書で用いる「分化する」なる用語は源種の組織または細胞とは異なる特性または機能を有することを意味する。従って「分化」は分化する過程または作用である。
本明細書で用いる「増殖」なる用語は類似する細胞の成長および産生を意味する。
本明細書で用いる「処置」なる用語は治療的処置および予防または防止手段の双方を意味する。処置の目的は疾患または症状を防止または鈍化（軽減）し、徴候を改善することである。
【００６３】
一般に、骨の形成および代謝に関連する疾患および症状には、非限定例としては、くる病、骨軟化症、オステオペニア、骨硬化症、腎性骨ジストロフィー、骨粗鬆症（老衰および閉経後骨粗鬆症を含む）、パジェット病、骨転移、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、大理石骨病、歯周炎、およびリュウマチ性関節炎および骨関節炎に関連し得る骨代謝の異常な変化などがある。これらの疾患には不十分な骨形成または骨損失により特徴づけられるものや、骨組織の異常な肥厚または硬化が関与するものがある。骨の異常な肥厚を抑制することから有利になる疾患の例としては大理石骨病および骨硬化症などがある。実施形態は、骨硬化症、低身長、遠位指節骨の先端骨溶解、骨脆弱性、鎖骨形成異常および遅延縫合閉鎖を伴う頭蓋奇形により特徴づけられる、まれな常染色体劣性形質であるピクノディスオストーシス（ＰＹＣＮＯ）である（Ｍａｒｏｔｅａｕｘら、Ｐｒｅｓｓｅ　Ｍｅｄ．７０：９９９（１９６２）；Ａｎｄｒｅｎら、Ａｃｔａ．Ｃｈｉｒ．Ｓｃａｎｄ．１２４：４９６（１９６２））。従って、骨の形成のインヒビターとして同定される物質はＰＣＹＮＯおよびその他の疾患または骨硬化症および大理石骨病により特徴づけられる症状の処置に有用である可能性がある。
【００６４】
骨の形成を増強する必要により特徴づけられる多くの疾患および症状もある。最も明白であるのは骨折であり、この場合骨成長を刺激し、骨修復を早め、完成させるのが望ましい。骨の形成を増強する物質は復顔手順において有用である可能性がある。その他の骨欠損症状には、骨区域性欠損、歯周疾患、骨転移性疾患、骨溶解性疾患および結合組織修復が有利である症状（例えば軟骨欠損または損傷の治癒または再生など）がある。加齢性骨粗鬆症および閉経後ホルモン状態に関連する骨粗鬆症などの骨粗鬆症の慢性的症状もまた非常に重要である。骨の成長の必要性により特徴づけられるその他の症状には、原発性または続発性上皮症体機能亢進症、廃用性骨粗鬆症、糖尿病関連骨粗鬆症、および糖質コルチコイド関連骨粗鬆症などがある。
【００６５】
本発明の１つの実施形態では、骨形成のインデューサーまたはスティミュレーターとして同定される物質は、骨欠損および欠損症を修復するのに、形成外科における骨の治癒を促進し、非セメント人工関節および歯科インプラントへの骨成長を刺激し、閉経前女性の骨量ピークを上昇させ、成長不全を処置し、歯周疾患および欠損並びにその他の歯修復過程を処置し、骨格障害、例えば加齢性骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症、糖質コルチコイド関連骨粗鬆症または廃用性骨粗鬆症および関節炎、または骨の形成の刺激により有利になるいずれかの症状を処置するのに有用である可能性がある。本発明の別の実施形態では、これらの物質はそれ自体または別の物質と組み合わせて、骨の先天的、外傷に引き起こされる、または外科的な（例えば癌の処置のため）切除の修復において、および美容外科において有用である可能性がある。本発明の別の実施形態では、本発明により同定された物質およびその組み合わせを軟骨欠損または障害を制限または処置するために使用でき、外傷の治癒または組織修復に有用であり得る。
【００６６】
さらに、骨生成のモデュレーターとして同定された物質は、物質が骨の形成のインデューサーまたはインヒビターであるかどうかに依存して、骨芽細胞、破骨細胞、および軟骨細胞のインビトロでの増殖を増強または防止するのに有用である可能性がある。また、これらの物質は、多分化能前駆体細胞（好ましくは骨髄間質幹細胞）の骨芽細胞への分化を誘導または阻害するのにも有用である。培養において単離された細胞に物質を投与すること、およびインビトロで細胞の分化または増殖を観察することは当業者の技術範囲内である。
【００６７】
一般に、脂質生成により関連する疾患には体重障害、例えば肥満および悪液質、並びに非震えおよび震え熱産生などがある。従って、本発明の１つの態様では、脂質生成のモデュレーターとして同定される物質は、体重に関連する過程を変調するのに有用である可能性がある。例えば、肥満および悪液質等の体重障害、並びに熱産生の処置である。望ましい結果に依存して、脂質生成を誘導すると同定された物質は体重増加に有用である可能性があり、脂質生成を防止すると同定された物質は体重減少に有用である可能性がある。
【００６８】
脂質生成は骨髄で生じる場合、骨が壊死を起こすので有害である。かかる骨は脆弱で骨折しやすい。しかしながら、肉体の別の場所での脂質生成は、例えば豊胸のために乳房では非常に望ましい。多分化能骨髄細胞を直接乳房の脂肪嚢に移植することができる。多分化能骨髄細胞の分化を誘導することができると同定された物質を投与して、乳房における脂肪細胞の生成を増強させることができる。
【００６９】
脂質生成のモデュレーターとして同定された物質を用いて培養中の単離された前脂肪細胞または脂肪細胞、例えば３Ｔ３−Ｌ１、３Ｔ３　Ｆ４２２Ａ、ｏｂ１７７１またはΔＦｏｓＢの過剰発現を誘導できるトランスジェニック動物からの前脂肪細胞または脂肪細胞の増殖または分化を誘導または阻害することもできる。被験物質を単離された前脂肪細胞または脂肪細胞に投与して、インビトロで細胞の増殖または分化を観察することは当業者の技術範囲内である。
【００７０】
５．医薬用組成物およびデリバリー方法
ΔＦｏｓＢ発現を変調すると同定された被験物質および物質または化合物を単独でまたは医薬用組成物中のいずれかで対象に投与することができる。本明細書で用いる「医薬用組成物」なる用語は物質を医薬適合性の担体または希釈剤と一緒に含んでなる組成物を意味する。本明細書で用いる組成物中の「担体」なる用語は希釈剤、アジュバント、賦形剤または物質または化合物を混合するベヒクルを意味する。
【００７１】
医薬用化合物からの副作用を最小にし、かつ、処置または物質の機能が無効になる程度まで物質の作用が取り消されまたは阻害されないように、医薬用担体を選択する。担体は、化合物の投与を促進する（例えば化合物の溶解性を高める）ために用いられる。医薬適合性の担体には、非限定例としては生理学的食塩水、リンガー液、リン酸塩緩衝生理食塩水、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖またはデンプンの型、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、およびポリエチレングリコールなどがある。本発明により同定された被験物質または物質を含んでなる医薬用組成物を固体または液体のいずれかの形態にできる。
【００７２】
医薬用組成物の固形製剤には粉末、錠剤、丸剤、カプセル、カシェ剤、坐剤および分散可能な顆粒などがある。「製剤」なる用語は担体としてカプセル化物質と共に物質の処方を含み、活性成分が別の担体と共にまたは伴わずに担体により取り囲まれているカプセルを提供することを意図する。同様にカシェ剤およびトローチ剤が含まれる。錠剤、粉末、カプセル、丸剤およびトローチ剤を経口投与に適した固体投与形態として用いることができる。固体担体は希釈剤、着香剤、結合剤、保存剤、錠剤崩壊剤、またはカプセル化素材として作用することもできる１つまたはそれ以上の物質でよい。粉末では担体は混合物中微細に分割された活性物質と共に存在する微細に分割された固体である。錠剤では活性物質は適当な比率で必要な結合特性を有する担体と混合され、望ましい形態および大きさに圧縮されている。粉末および錠剤は好ましくは５または１０から約７０％の活性物質または化合物を含有する。適当な担体には炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバター等がある。
【００７３】
坐剤を調製するためには、低融点ワックス、例えば脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物を最初に溶融し、攪拌することにより活性化合物をそこに均質にデリバリーする。溶融した均質な混合物を次いで都合のよい大きさの型に注ぎ、覚まし、それにより固化させる。
【００７４】
液状製剤には溶液、懸濁液、および乳液、例えば、水、またはプロピレングリコール水溶液などがある。非経口注射用には液体製剤をポリエチレングリコール水溶液で溶液に処方できる。
【００７５】
水に活性化合物を溶解し、望ましい適当な着色剤、着香剤、安定剤および濃化剤を添加することにより、経口用に適した水溶液を調製できる。天然または合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、その他の周知の懸濁化剤等の粘性物質と共に、微細に分割した活性成分を水に分散させることにより経口用に適した水性懸濁液を作製できる。
【００７６】
使用直前に経口投与用の液状製剤に変換することを意図する固形製剤もまた含まれる。かかる液体形態には溶液、懸濁液および乳濁液などがある。これらの製剤は活性物質に加えて着色剤、着香剤、安定剤、バッファー、人工および天然甘味剤、分散剤、濃化剤、可溶化剤等を含んでよい。
【００７７】
被験物質およびΔＦｏｓＢ発現を変調すると同定された物質または化合物を医薬適合性の塩として対象に投与することができる。医薬適合性の塩の例としては酸添加塩、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩、スルファミン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファミン酸塩およびキニン酸塩を含有するものなどがある（例えばＰＣＴ／ＵＳ９２／０３７３６参考）。かかる塩を酸例えば塩酸、硫酸、リン酸、スルファミン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、マロン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキシルスルファミン酸およびキニン酸を用いて誘導することができる。
【００７８】
医薬適合性の塩を標準的な技術により調製することができる。例えば、化合物の遊離の塩基の形態を最初に適当な酸を含有する適当な溶媒、例えば水溶液または水性アルコール溶液に溶解する。そして塩は溶液を蒸発させ単離させる。別の例では、有機溶媒中遊離の塩基を酸と反応させることにより塩を調製する。
【００７９】
本発明は、被験化合物を医薬用組成物の形態で対象に投与し、物質がΔＦｏｓＢ発現、骨生成または脂質生成を変調するのに有効であるかどうかを決定する方法を提供する。さらに本発明はΔＦｏｓＢ発現を変調すると同定された物質を含んでなる医薬用組成物を投与して、骨生成または脂質生成に関連する疾患または症状と診断された対象を処置する方法を提供する。骨生成または脂質生成に関連する障害を呈する患者の処置の場合、物質または複数の物質の治療上有効量を投与する。治療上有効投与量とは患者の徴候の改善または生存期間の延長に至る化合物の量を意味する。例えば治療上有効量は、骨折の修復；骨粗鬆症における骨損失の逆転；軟骨欠損または障害の逆転；骨粗鬆症の発病の予防または遅延；非癒合骨折および仮骨延長における骨形成の刺激および／または抑制；人工器官への骨成長の増加および／減少；歯性欠損の修復；脂質生成または肥満の増加または減少；並びに食欲喪失の増加または減少において治癒速度を臨床上有意に増加させる活性物質を含んでなる組成物の量である。かかる有効量は日常的な最適化技術を用いて決定され、処置すべき特定の症状、患者の状態、投与経路、処方、および医師の判断、並びに技術分野の当業者に明らかなその他の因子に依存する。本発明の化合物に必要な投与量（例えば骨形成の増加が望ましい骨粗鬆症において）は処置群とコントロール群との骨量の統計上の有意差として明示される。この骨量の差は例えば、処置群の骨量の５から２０％またはそれ以上の増加として認められる。治癒における臨床上有意な増加のその他の測定には、例えば破断強度および張力に関する試験、破断強度および捻転、４点屈曲、骨生検における結合度の増加並びに技術分野の当業者に周知のその他の性化学的試験などがある。処置計画の一般的な手引きは目的の疾患の動物モデルにおいて実施された実験から得られる。
【００８０】
処置すべき特定の症状に依存して物質を処方し、全身的または局所的に投与することができる。処方および投与の技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、マック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ペンシルバニア（１９９０）に見出すことができる。適当な経路には、ただいくつか列挙してみると、経口、直腸、経皮、膣、経粘膜または腸管投与などがあり；非経口デリバリーには筋肉内、皮下、骨髄内注射、および鞘内、直接脳室内、静脈内、腹膜内、鼻腔内または眼内注射などがある。使用できるいくつかのデリバリー方法には、非限定例としては、リポソームのカプセル化、レトロウイルスベクターによる形質導入、たいていの核タンパク質で見出される核標的化部位を使用する核区画への局在、細胞のエクソビボトランスフェクションとそれに続くトランスフェクトされた細胞の再移植または投与、およびＤＮＡ輸送体系などがある。
【００８１】
物質または化合物の毒性および治療効果を細胞培養または実験動物における標準的な医薬的手順、例えばＬＤ５０（集団の５０％に致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効である用量）の決定により決定できる。毒性および治療効果間の用量比は治療指標であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比率により表現できる。大きな治療指標を呈する物質または化合物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験により得られたデータを用いてヒトで使用するための用量範囲を処方できる。かかる物質または化合物の用量は毒性がほとんどないか全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内であるのが好ましい。用量は用いる投与形態および利用される投与経路に依存してこの範囲内で変化できる。
【００８２】
本発明の方法で用いるいずれかの物質に関しては、治療上有効量を細胞培養アッセイから最初に見積もることができる。例えば細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわちタンパク質複合体の最大崩壊の５０％、または細胞レベルおよび／または複合体成分の活性の最大抑制の５０％を達成する被験化合物濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成する用量を動物モデルで処方できる。かかる情報を用いてヒトにおいて有用な用量をより正確に決定できる。血漿レベルを例えばＨＰＬＣにより測定できる。正確な処方、投与経路、および用量は個々の医師が患者の症状を考慮して選択することができる。（例えばＦｉｎｇｌら、Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１章、１頁、１９７５参照）。主治医はどのようにおよびいつ毒性または器官機能不全により投与を中止、中断または調整すべきかを知っているであろうことに注目すべきである。逆に、主治医は臨床応答が十分ではなかった場合（毒性は除外する）、処置を高レベルに調整することをも知っているであろう。目的の障害の管理において投与される量は処置すべき症状の重篤度でおよび投与経路に対して変化する。症状の重篤度は例えば部分的には標準的な予後評価の方法により評価され得る。さらに用量および恐らく投与頻度もまた年齢、体重、および個々の患者の応答に準じて変化する。前記したプロブラムに匹敵するプログラムを獣医学において使用することができる。
【００８３】
一般に、本発明の医薬的方法において利用される物質を典型的なヒトに毎日約０．１ｍｇ／ｋｇから１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１ｍｇ／ｋｇから２００ｍｇ／ｋｇの経口用量で投与できる。非経口投与用量は経口用量の約２０から１００％であるのが適当であろう。たいていの場合経口投与が好ましい（平易さ、患者の許容性等の理由で）が、投与の別法が選択された化合物および選択された欠損または疾患に適当であってもよい。しかしながら、用量は患者の要求、処置すべき症状の重篤度、および用いられる物質に依存して変化し得る。前記したように、特定の事態に適切な用量の決定は技術分野の当業者の範囲内である。一般に、化合物の最適用量よりも少ないより少量で処置を開始する。その後、状況が到達する最適効果まで少量ずつ増加させる。便利には、望まれる場合、１日全量を分割し、１日の間で分けて投与することもできる。
【００８４】
さらに本発明により同定された疾患および症状を処置するための物質または化合物を、処置すべき症状に対して特別な有用性のために選択された別の既知の治療用物質と同時投与することもできる。エストロゲンは骨再吸収を抑制することが解っているので、物質をエストロゲンまたはエストロゲン関連化合物と組み合わせることができる。典型的なエストロゲン化合物にはエストラジオール、プロゲステロンおよび技術分野で既知のそのアナログなどがある。その他の化合物には、非限定例としては、ビスホスホネートおよび関連する化合物、例えば米国特許第５３１２８１４号に示される化合物、カルシウムサプリメント（Ｐｒｉｎｃｅ，Ｒ．Ｌ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５：１１８９（１９９１））、ビタミンＤサプリメント（Ｃｈａｐｕｙ，Ｍ．Ｃ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：１６３７（１９９２））、フッ化ナトリウム（Ｒｉｇｇｓ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７：６２０（１９９２））、アンドロゲン（Ｎａｇｅｎｔ　ｄｅ　Ｄｅｕｘｃｈａｉｓｎｅｓ，Ｃ．、Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ，ａ　Ｍｕｌｔｉ−Ｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ　Ｐｒｏｂｌｅｍ，Ｒｏｙａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ａｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　Ｓｅｒｉｅｓ、第５５号、アカデミック・プレス、ロンドン、２９１頁（１９８３））、およびカルシトニン（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ，Ｃ．Ｂｏｎｅ　１３（Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ３５（１９９２））などがある。
【００８５】
加えて、本発明で同定された物質または化合物を肥満、食欲不振、悪液質および体重の過剰な増加または食欲損失に関連するその他の疾患または症状を変調するのに有効な化合物と同時投与することもできる。米国特許第６０６８９７６号はｏｂ遺伝子発現のダウンレギュレート物質であるＢＲＬ４９６５３について開示しており、これはラットにおいて食物摂取および体重を増加させる。有効量のｏｂ遺伝子発現ダウンレギュレート物質を投与することにより食欲不振、悪液質および食欲損失、食物摂取の減少または体重低下により特徴づけられるその他の消耗性疾患を処置することができる。加えて、糖質コルチコイドはラットにおいて食物消費および体重増加を減少させる特徴を有することが知られている。有効量のｏｂ遺伝子発現アップレギュレート物質を投与することにより過剰な食物消費および肥満、並びに関連する病理学的症状、例えばＩＩ型成人発症型糖尿病、不妊症（Ｃｈｅｈａｂら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１２：３１８−３２０（１９９６））、高コレステロール血症、高脂血症、心臓血管疾患および高血圧を被る患者を処置できる。従って、本発明は過剰な体重損失または体重増加および食欲の損失または増加に関連する疾患または症状を処置するために体重および食欲を制御することが知られている物質と組み合わせて、ΔＦｏｓＢ発現のモデュレーターとして同定された物質を含んでなる医薬用組成物を投与することを企図する。
【００８６】
これらのさらなる化合物の投与をΔＦｏｓＢ発現のモデュレーターとして同定された物質と同時に投与できるか、または本発明の化合物の投与と並行して投与することができる。いずれかの適当なプロトコルが考案され、それにより組み合わせ処置に含まれる種々の化合物は互いに数分、数次間、数日または数週以内に投与される。循環プロトコルの反復投与もまた構想されている。
【００８７】
６．ΔＦｏｓＢ発現に関連する遺伝子を同定する方法
また、本発明は、ΔＦｏｓＢ発現に関連する遺伝子、すなわちΔＦｏｓＢ発現により制御され得るかまたはΔＦｏｓＢ発現を制御する遺伝子の同定方法をも企図する。また、本発明は、骨生成および脂質生成に関連する遺伝子の同定をも企図する。加えて、本発明は遺伝子の発現または異常な骨形成または異常な脂質生成に関連する遺伝子産物の活性を変調する化合物を同定するための方法を提供する。
【００８８】
高等生物では、細胞の特定の遺伝子発現が、細胞により実行される生命過程（例えば成長および分化、ホメオスタシス、発作に対する応答、細胞サイクル制御、加齢、アポプトシス等）を決定する。遺伝子発現の変化は正常細胞の成長の道筋を変化させる。明らかに、どの遺伝子が発現されるかはいずれかの所与の細胞の特性に深刻な影響を与える。従って、遺伝子発現を分析する方法は基礎分子生物学研究に非常に重要である。差異的に発現される遺伝子の同定は、ヒトを含む動物および植物の種々の疾患または症状の診断、予後および処置の手掛かりを提供できる。加えて、これらの方法を用いて、疾患または症状に対する素因に関連する、好ましくは骨生成または脂質生成に関連する遺伝子発現レベルの変化により特異的に発現された配列を同定することができる。かかる遺伝子の同定により、かかる疾患の発生を処置または防止するための新規な薬物および診断方法の開発が助けられる。
【００８９】
特定の細胞における遺伝子発現を分析する１つの方法は差別的遺伝子発現アッセイを実施することであり、このアッセイでは異なる細胞の遺伝子の発現が比較され、発現における不一致が同定され、この場合不一致の存在が、比較される細胞において発現される遺伝子のクラスにおける差異を示している。
【００９０】
本明細書で用いる「差別的発現」なる用語は遺伝子の時間経過および／または組織発現パターンにおける量的および質的の双方の差異を意味する。従って、差別的発現された遺伝子は、正常な骨形成状態と異常な骨形成状態または異常体重状態との対比、またはコントロール条件下と実験条件下での対比、その発現を質的に活性化するかまたは完全に不活性化する。かかる質的に制御された遺伝子は所与の組織または細胞型内でコントロール対象かまたは障害を有する対象のいずれかで検出できるが、双方共では検出できない発現パターンを呈する。また別に、かかる質的に制御された遺伝子は所与の組織または細胞型内でコントロール対象かまたは実験対象のいずれかで検出できるが、双方共では検出できない発現パターンを呈する。本明細書で用いる「検出できる」とは技術分野の当業者に既知のディフェレンシャルディスプレイ、ＲＴ−ＰＣＲおよび／またはノーザン分析の標準的な技術により検出できるＲＮＡ発現パターンを意味する。
【００９１】
正常および異常動物または細胞系のモデルを用いて、ΔＦｏｓＢにより変調されるかまたは制御される特異的に発現された遺伝子を同定することができる。本発明の１つの実施形態では、ΔＦｏｓＢを過剰発現するように誘導されたトランスジェニック動物、好ましくはマウスおよび誘導されていないトランスジェニック動物を用いて差別的遺伝子発現を研究する。別の実施形態では、正常な個体および非限定例としては骨粗鬆症、くる病、骨軟化症、オステオペニア、骨硬化症、腎性骨ジストロフィー、パジェット病、骨転移、高カルシウム血症、上皮小体機能亢進症、大理石骨病、歯周炎、肥満、食欲不振、悪液質、並びに非震えおよび震え熱産生などの疾患を有する個体に由来する細胞系を利用してΔＦｏｓＢ発現に関連する差別的遺伝子発現を研究する。
【００９２】
特異的に発現された遺伝子を同定するために、ＲＮＡすなわち全ＲＮＡまたはｍＲＮＡを動物の組織から、または前記した細胞から単離できる。ＲＮＡサンプルは実験対象の組織から、およびコントロール対象の対応する組織から得られる。ｍＲＮＡの単離に対しては選択されないいずれかのＲＮＡの単離技術をかかるＲＮＡサンプルの精製に利用できる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン・ウィレイ・アンド・サンズ・インコーポレーティッド、ニューヨーク（その全体が参照により本明細書に取り込まれる）参照。加えて、技術分野の当業者に既知の技術、例えばＣｈｏｍｅｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．の無段階式ＲＮＡ単離方法（米国特許第４８４３１５５号（１９８９）；その全体が参照により本明細書に取り込まれる）を用いて多くの組織サンプルを容易に処理できる。
【００９３】
差異的に発現された遺伝子により産生されるＲＮＡに相当する、収集されたＲＮＡサンプルでの転写を、技術分野の当業者に既知の種々の方法を利用して同定することができる。例えばディフェレンシャルスクリーニング（Ｔｅｄｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２０８−２１２（１９８８））、サブトラクティブハイブリダイゼーション（Ｈｅｄｒｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ　３０８：１４９−１５３；Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：２０８−２８５２（１９８４））、および好ましくはディフェレンシャルディスプレイ（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．およびＰａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：９６７−９７１（１９９２）；米国特許第５２６２３１１号（その全体が参照により本明細書に取り込まれる））を利用して特異的に発現された遺伝子に由来する核酸および配列を同定できる。
【００９４】
米国特許第５９６８７８４号は所与の細胞集団において発現された遺伝子の全てをタグ化および同定する方法を提供している。従ってこの方法によりコピー数の低いｍＲＮＡでさえも検出することが可能になる。細胞間の遺伝子発現プロファイルを比較することにより、この方法を用いて、その発現が病理学的表現型に関連する個々の遺伝子を同定することができる。高速大量処理ＤＮＡシークエンシング、およびかかるＤＮＡシークエンシングの分析を補助する関連する情報系を用いて、開示された方法により妥当な時間で遺伝子全体の発現プロファイルを作製することが可能になる。従って、該特許は、遺伝子全体の発現プロファイルを入手し、目的の遺伝子を同定するための、技術分野の当業者に既知の情報系で使用するのに十分なデータを入手する単純で迅速な方法を提供する。
【００９５】
可能性のある差別的発現遺伝子配列が、バルク技術、例えば前記した技術によりいったん同定されると、そのような推定される差別的発現遺伝子の差別的発現が確認されるはずである。例えばノーザン分析、定量的ＲＴ　ＰＣＲまたはリボヌクレアーゼ保護などの技術により確認を達成できる。確認時に特異的に発現された遺伝子をさらに特徴づけおよび同定できる。
【００９６】
７．核酸を用いるΔＦｏｓＢ発現を抑制する方法
また、本発明は、骨生成および脂質生成を変調する能力を呈するアンチセンス核酸およびリボザイムをも提供する。かかる分子は、ΔＦｏｓＢ遺伝子活性を低減または阻害するように設計される。かかる分子の作製および使用は技術分野の当業者に既知である。
【００９７】
アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は標的とされるｍＲＮＡにハイブリダイズし、タンパク質翻訳を防止することによりｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するように作用する。アンチセンス研究法には標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的であるオリゴヌクレオチドの設計が関係する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは相補的標的遺伝子ｍＲＮＡ転写物に結合し、翻訳を防止する。完全相補性が好ましいが、必要ではない。
【００９８】
本明細書で記載する、ＲＮＡの一部分に対する配列「相補性」は、ＲＮＡとハイブリダイズできる十分な相補性を有し、安定した二重鎖を形成する配列を意味する。二本鎖アンチセンス核酸には、二重鎖ＤＮＡの一本の鎖は、このように試験されるか、または三重鎖形成がアッセイされる。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの双方に依存する。一般にハイブリダイズする核酸が長いほど、それが含有し、依然安定した二重鎖（場合によっては三重鎖）を形成できるＲＮＡとの塩基誤対合が多い。技術分野の当業者はハイブリダイズした複合体の融点を決定するための標準的な手順を用いることにより、誤対合の耐え得る程度を確認できる。
【００９９】
メッセージの５’末端に相補的であるオリゴヌクレオチド（例えばＡＵＧ開始コドンまでおよびこれを含む５’未翻訳配列）は、翻訳抑制で最も有効に作用するはずである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’未翻訳配列に相補的な配列もまた同様にｍＲＮＡの翻訳の抑制に有効であることが示されている（Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．　Ｎａｔｕｒｅ　３７２：３３３−３３５（１９９４））。
【０１００】
ｍＲＮＡの５’未翻訳領域に相補的であるオリゴヌクレオチドはＡＵＧ開始コドンの相補対を含むはずである。ｍＲＮＡコード化領域に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドはあまり有効でない翻訳インヒビターであるが、本発明に従って用いることができる。標的遺伝子ｍＲＮＡの５’、３’またはコード化領域にハイブリダイズするように設計されたとしても、アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチドの長さにすべきであり、６から約５０ヌクレオチドの長さにわたるオリゴヌクレオチドであるのが好ましい。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチドまたは少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０１０１】
オリゴヌクレオチドはＤＮＡもしくはＲＮＡまたはそのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾体、一本鎖または二本鎖でよい。例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等の安定性を改善するために、塩基部分、糖部分、またはリン酸塩バックボーンでオリゴヌクレオチドを修飾することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは非限定例としては５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウィブトキソシン、プセウドウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル５−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンからなる群から選択される修飾された塩基部分を含んでなってよい。
【０１０２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、非限定例としてはアラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースからなる群から選択される少なくとも１つの修飾された糖部分を含んでなってもよい。さらに別の実施形態では、アニチセンスオリゴヌクレオチドはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはそのアナログからなる群から選択される少なくとも１つの修飾されたリン酸塩バックボーンを含んでなってよい。
【０１０３】
本発明のオリゴヌクレオチドを技術分野で既知の標準的な方法により、例えば自動ＤＮＡ合成器（例えばバイオサーチ、アプライド・バイオシステムズ等から市販により入手可能なもの）の使用により合成することができる。例えばホスホロチオエートオリゴヌクレオチドをＳｔｅｉｎらの方法（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：３２０９（１９８８））により合成でき、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは制御ポアガラスポリマー支持体等の使用（Ｓａｒｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：７４４８−７４５１（１９８８））により調製できる。
【０１０４】
アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを細胞にデリバリーするための多くの方法が開発され、例えばアンチセンス分子を直接組織部位に注射できるか、または所望の細胞を標的とするように設計された修飾された分子（特異的にレセプターに結合するペプチドもしくは抗体、または標的細胞表面に発現された抗原に連結されたアンチセンス）を全身的に投与することができる。また別に、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロおよびインビボ転写によりＲＮＡ分子を作製できる。適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーター、例えばＴ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターを組みこんだ広範な種類のベクターにかかるＤＮＡ配列を組みこむことができる。また別に、用いるプロモーターに依存して構成的または誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構築物を安定して細胞系に導入することができる。
【０１０５】
しかしながら、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分なアンチセンスの細胞内濃度を達成するのはしばしば困難である。従って、好ましい研究法はアンチセンスオリゴヌクレオチドを強力なｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの制御下に置いた組換えＤＮＡ構築物を利用する。かかる構築物を使用して患者の標的細胞をトランスフェクトすると、結果的に内因性の標的遺伝子転写物と相補的塩基対を形成する一本鎖ＲＮＡが十分量転写され、それにより標的遺伝子ｍＲＮＡの翻訳を防ぐことができる。例えば、ベクターは、細胞により取り込まれ、アンチセンスＲＮＡの転写を指向するようにインビボで導入される。かかるベクターは所望のアンチセンスＲＮＡを産生するように転写されれば、エピソームのままであるか、または染色体に組み込まれてよい。技術分野で標準的な方法である組換えＤＮＡ技術によりかかるベクターを構築できる。ベクターは哺乳動物細胞における複製および発現に使用されるプラスミド、ウイルス、または技術分野で既知のその他のものでよい。哺乳動物、好ましくはヒト細胞において作用する、技術分野で既知のいずれかのプロモーターによりアンチセンスＲＮＡをコードする配列を発現できる。かかるプロモーターは誘導性または構成性でよい。かかるプロモーターには非限定例としては：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ　２９０：３０４−３１０（１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの３’の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｃｅｌｌ　２２：７８７−７９７（１９８０））、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：１４４１−１４４５（１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ２９６：３９−４２（１９８２））等がある。いずれかの型のプラスミド、コスミド、ＹＡＣまたはウイルスベクターを用いても直接組織部位に導入できる組換えＤＮＡ構築物を調製できる。また別に、所望の組織を選択的に感染するウイルスベクターを用いることができ、この場合、別の経路により（例えば全身的に）投与を達成できる。
【０１０６】
リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに類似の方法で、他の一本鎖ＲＮＡを特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾により、ＲＮＡ分子において特異的ヌクレオチド配列を認識し、それを切断する分子を操作することが可能である（Ｃｅｃｈ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．２６０：３０３０（１９８８））。この研究法の主要な利点は、これらが配列特異的であるので、特定の配列を有するｍＲＮＡのみが活性化される点である。
【０１０７】
２つの基本的な型のリボザイムがある。すなわち、テトラヒメナ型（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ、Ｎａｔｕｒｅ　３３４：５８５（１９８８））および「ハンマーヘッド」型である。テトラヒメナ型リボザイムは、４塩基の長さである配列を認識し、一方「ハンマーヘッド」型リボザイムは、１１から１８塩基の長さである配列を認識する。認識配列が長くなるほど、配列が標的のｍＲＮＡ種でのみ生じる可能性が高くなる。結果的に、特異的ｍＲＮＡ種を不活性化するためには、テトラヒメナ型リボザイムに対してハンマーヘッド型リボザイムが好ましく、短い認識配列に対して１８塩基の認識配列が好ましい。
【０１０８】
８．遺伝子治療
前記したように、本発明はΔＦｏｓＢ発現により調節される、およびΔＦｏｓＢ発現を調節する遺伝子を含む、骨生成、脂質生成、またはΔＦｏｓＢ発現に関連する遺伝子を同定する方法を提供する。また、本発明は、核酸分子、例えばΔＦｏｓＢ核酸を骨生成および脂質生成に関連する疾患の処置のための標的部位にデリバリーする方法をも企図する。
【０１０９】
遺伝子治療は、機能的に活性な治療用のまたはその他の形態の遺伝子を標的の細胞にデリバリーするための方法である。体組織への遺伝子移入の最初の努力はエクソビボ遺伝子治療と称される間接的な手段に頼っている。ここで、標的細胞は肉体から取り出され、組換え遺伝子を担持するベクターでトランスフェクトまたは感染され、そして肉体に再移植される。現在用いられているＤＮＡをインビトロで細胞に移入する技術には、リン酸カルシウムＤＮＡ沈降、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム媒介ＤＮＡ移入、または組換えウイルスベクターでの形質導入などがある。これらのトランスフェクションプロトコルを用いて上皮細胞（米国特許第４８６８１１６号）、内皮細胞（国際公開公報第８９／０５３４５号）、肝細胞（Ｌｅｄｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４（１５）：５３３５−５３３９（１９８７））、繊維芽細胞（米国特許第４９６３４８９号）、リンパ球（米国特許第５３９９３４６号）および造血幹細胞（米国特許第５３９９３４６号）などの異なる細胞型にＤＮＡを移入している。
【０１１０】
直接インビボ遺伝子移入はリポソーム（Ｓｅｏｌら、Ｉｎ　Ｖｉｖｏｌ　４（４）：５１３−５１７（２０００））、またはウイルスエンベロープレセプタータンパク質を含有するタンパクリポソーム（Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅら、Ｇｅｎｅ　８４（２）：４２９−４３８（１９８９））にトラップされたＤＮＡの処方を用いて、およびポリリジン糖タンパク質キャリヤ複合体に結合したＤＮＡを用いて実施されている。加えて、細胞への遺伝子デリバリーには「遺伝子ガン」が用いられている（オーストラリア特許第９０６８３８９号）が用いられている。最近では、ＤＮＡの細胞への移入のために、間質腔への注射用の液体キャリヤ溶液に裸のＤＮＡまたはリポソームに関連するＤＮＡを処方できる（国際公開公報第９０／１１０９２号）。
【０１１１】
ウイルスベクターは、しばしば、最も有効な遺伝子治療系であり、組換え複製欠損ウイルスベクターを用いて細胞をエクソビボおよびインビボの双方で形質導入（すなわち感染）している。かかるベクターには、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連およびヘルペスウイルスベクターなどがある。従って、１つの実施形態では、脂質生成、骨生成、またはΔＦｏｓＢ発現に関連する遺伝子、リボザイム、およびアンチセンス分子などの核酸を適当なベクターにサブクローン化し、前記した遺伝子移入技術により細胞または組織に移入することができる。
【０１１２】
別の実施形態では、トランスフェクション促進組成物（例えば所望のポリヌクレオチドを含有するカチオン性リポソーム）を用いて、脂質生成、骨生成、またはΔＦｏｓＢ発現に関連する核酸を、細胞または組織にデリバリーできる。
【０１１３】
前記の一般的な記載に鑑みて、以下に示す具体的な実施例は説明のためのみであり、本発明の範囲を限定することは意図しない。別の包括的および具体的構成は技術分野の当業者に明らかであろう。
【０１１４】
実施例
材料および方法
組織形態計測的および生化学的アッセイ：
１０週齢の１Ａ、１１Ａマウスとコントロールマウスに、カルセニン（２０ｍｇ／ｋｇ、シグマ、ミズーリー）を屠殺前１０および３日に各々注射し、骨無機質化前線を標識した。マウスを異型接合性繁殖用動物から繁殖させ、バイトランスジェニックΔＦｏｓＢ発現マウスおよびモノトランスジェニック非発現同腹子コントロールを提供した。標本を３．７％ホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定し、標準的な手順によりメチルメタクリレート樹脂に包埋した。５Ｍ　トルイジンブルーまたは１０μｍ　非染色切片を骨測定（オステオメトリックス、ジョージア）を用いる標準的な骨組織形態計測（Ｐａｒｆｉｔｔら、１９８７）に使用した。ラジオイムノアッセイ（バイオメディカル・テクノロジーズ・インコーポレーティッド、マサチューセッツ）により血清オステオカルシンを測定した。尿デオキシピロジノリン架橋をピリリンクス・Ｄアッセイ（メトラ・バイオシステムズ・インコーポレーティッド、カリフォルニア）により測定し；尿クレアチニンを臨床化学分析器（ＢＭ／ヒタチ　７１７、カリフォルニア）で酵素的に測定した。マウス特異的イムノアッセイ（クアチカインＭ、ＲアンドＤシステムズ、ミネアポリス）により血清レプチンを測定した。コントロールマウスと１Ａマウスの前脚で骨髄塗抹を実施した。関節を除去し、α修飾イーグル最小必須培地（α−ＭＥＭ、シグマ）を用いて骨髄を顕微鏡スライドに流し、続いてオイルレッドＯおよび１％　トルイジンブルー染色を行った。各ゲノタイプの４匹のマウスからの各塗抹標本の５つの無作為に選択した視野で脂肪細胞および全骨髄細胞を計数した。脂肪細胞数を骨髄細胞数ノパーセンテージとして表現し、１Ａマウスでは骨髄低下が低下した。一方向ＡＮＯＶＡおよびフィッシャーの多重比較試験によりデータを分析し、ｐ＜０．０５が統計上有意であると考えられる。
【０１１５】
細胞培養およびＤＮＡトランスフェクション：
初代ネズミ頭蓋冠細胞培養物を、１から２日齢コントロールマウスまたはＮＳＥ−ΔＦｏｓＢ　１１Ａマウスから調製し、Ｂｅｌｌｏｗｓら（１９９０）に記載のとおりに維持した。同型接合性バイトランスジェニック１１Ａ同腹子を繁殖させた。同一の繁殖用雄および非トランスジェニック雌を用いてモノトランスジェニック非発現コントロールを提供した。全面成長時に培養物に５０μｇ／ｍｌ　アスコルビン酸（ワコー、日本）、５ｍＭ　β−グリセロホスフェート（シグマ）および１０ｎＭ　デキサメサゾン（シグマ）を補充した。４週齢マウスの大腿および脛骨から骨髄細胞をフラッシュさせ、１０％　ＦＢＳおよび１％　ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（シグマ）中に維持した。培養の５日後、プレートを洗浄して非付着細胞を除去し、付着層を全面成長まで培養した。細胞を剥がし、２×１０４／ｃｍ２の密度で再プレートした。全面成長時に、細胞を前記したように骨芽細胞誘導物質または脂肪細胞誘導物質のいずれかと一緒にインキュベートした（Ｑｕａｒｌｅｓら、１９９２）後、実験用に収穫した。Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞を以前に記載されているように維持した（Ｃａｏら）。５％　ＦＢＳおよび３００ｎｇ／ｍｌ　ヒト組換えＢＭＰ−２を補充したＤＭＥＭ中で４８時間インキュベートすることにより骨芽細胞表現型を誘導した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１（前骨芽）および３Ｔ３−Ｌ１（前脂肪）細胞系をＡＴＣＣから購入し、標準的なプロトコルに従って維持し；骨芽細胞または脂肪細胞表現型を各々Ｑｕａｒｌｅｓら（１９９２）およびＣａｏら（１９９１）に記載されるように誘導した。製造者指示書に従ってリポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ　ＢＲＬ）を用いて細胞をトランスフェクトした。一過性発現研究では、トランスフェクション後４８から７２時間に細胞を収穫した。安定したトランスフェクトを確立するために、トランスフェクション後７２時間に細胞を１：１０に分け、３から４週間０．５ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８（ギブコ）で選別した。
【０１１６】
破骨細胞様細胞（ＯＣＬ）形成アッセイ：
Ａｏｋｉら（１９９３）により以前に記載されているようにＯＣＬを作製し、次いで固定し、酒石酸塩抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ；３４）およびＴＲＡＰ陽性多核性ＯＣＬ（核＞３）を計数した。
【０１１７】
標準破骨細胞ピット形成アッセイ：
インビトロ骨再吸収を前記したように検定した（Ａｏｋｉら、１９９３）。骨測定分析系（オステオメトリックス、ジョージア）を用いて再吸収ピットを測定した。各象牙質切片に関して全ピット面積および数を測定した。
【０１１８】
ＲＮＡ抽出およびノーザンブロット分析：
製造者の指示書に従ってＴＲＩＺＯＬ（ギブコ）を用いて細胞から全ＲＮＡを抽出した。２０μｇの全ＲＮＡを１％　変性アガロース／ホルムアルデヒドゲルに溶解し、記載されるように（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）ハイボンド−Ｎナイロン膜（アメルシャム）に移した。マウスオステオカルシン、オステオポンチンおよびコラーゲンＩ型に関する３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブで膜を連続的にハイブリダイズした。以前に記載した条件（Ｓａｂａｋａｔｏｓら、１９９８）を用いてＲＴ−ＰＣＲによりＣ／ＥＢＰプローブを得た。
【０１１９】
タンパク質抽出物およびウェスタンブロット分析：
細胞からの核抽出物を以前に記載したように調製した（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒら、１９８９）。プロテイナーゼおよびホスファターゼインヒビター（ＲＥＦ）を補充した修飾ＲＩＰＡバッファー中でソニケートすることにより組織からの全細胞性タンパク質を調製した。ＢＣＡアッセイ（ピアース、イリノイ）によりタンパク質濃度を決定した。タンパク質サンプルをウェスタンブロットにより分析し、続いて標準的な方法を用いて化学ルミネサンス検出（アメルシャム、ニュージャージー）を行った。ＯＳＦ２／ＣＢＦＡ１を除いて、用いた全抗体をサンタ・クルーズ・バイオテクノロジー（カリフォルニア）から購入した。
【０１２０】
骨芽細胞培養の組織化学的分析：
頭蓋冠骨芽細胞培養を、骨芽細胞に関してはアルカリ性ホスファターゼ（シグマ）で、脂肪細胞脂質に関してはオイル・レッドＯ（シグマ）で染色した。脂肪細胞および無機質化の測定に関しては、培養を２４ウェルプレートで設定し、修飾フォン・コッサ技術によりオイルレッドＯで染色した（Ｂａｒｏｎら、１９８３）。同一のウェルを用いて無機質化および脂肪細胞数の双方を測定した。光学顕微鏡下対物レンズ４０ｘで５つの無作為の視野（視野面積０．１９６３ｍｍ２）から脂肪細胞を計数した。無機質化面積は全ウェルにわたって測定した。２実験の各々で各時点において３つのウェルを測定した。
【０１２１】
電気泳動可動性シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）およびスーパーシフト分析：
ＡＰ−１結合部位（ＧＴＣＧＡＣＧＴＧＡＧＴＣＡＧＣＧＣＧＣ）を含有する、ヒトコラゲナーゼＴＰＡ応答性エレメントに対応する３２Ｐ標識二本鎖オリゴヌクレオチドを用いてＥＭＳＡを実施した。これについては、Ｓａｂａｋａｔｏｓら（１９９８）に記載されている。スーパーシフト分析では、３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドを添加する前に、核抽出物と共に３０分間氷上で抗体をインキュベートした。電気泳動の後、ゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィーにより複合体を可視化した。
【０１２２】
実施例１．ＮＳＥ−ＦｏｓＢ　は著明な高密度骨を呈するトランスジェニックマウスにおいて発現される
【０１２３】
本発明は、ＮＳＥ−ＦｏｓＢが高密度骨を呈するトランスジェニックマウスにおいて発現されるという知見に部分的に基づいている。ＮＳＥ−ｔＴＡ（ラインＡ）ｘＴｅｔＯｐ−ΔＦｏｓＢ（ライン１１）バイトランスジェニック動物を最初に作製して脳におけるΔＦｏｓＢの役割を研究し（Ｃｈｅｎら、１９９８）、特定の脳領域におけるΔＦｏｓＢの発現誘導および行動応答の変化が示された（Ｋｅｌｚら、１９９９）が、動物をドキシサイクリンから避けさせておくとＮＳＥ（データは示されていない）および結果的にΔＦｏｓＢ（図１Ｂ）が骨芽細胞、軟骨細胞および脂肪細胞において発現されたが、破骨細胞では発現されなかった（データは示されていない）。トランスジェニックマウスをドキシサイクリン消費させないようにしておくと、成長中にΔＦｏｓＢ発現が導かれ、骨密度が顕著に増加したことが見出された。この表現型は、より高レベルのΔＦｏｓＢを発現することで知られている別のＴｅｔＯｐ−ΔＦｏｓＢ創始ライン（ライン１）に由来するマウスにおいてさらに劇的である（Ｃｈｅｎら、１９９８）。これらのＮＳＥ−ΔＦｏｓＢ創始ラインのＸ線分析により成熟マウスの骨格全体で骨密度が著明に増加したことが示された（図１Ａ）。ＮＳＥ発現のパターンから予想されるように、双方のラインは高レベルのΔＦｏｓＢイソ型（図１Ｂ）を脳のみならず骨（頭蓋冠）および脂肪組織においても発現し、脾臓および皮膚において（図１Ｃ）はより少ない程度で発現した。トランスジェニックマウスからの骨芽細胞調製物では著明に上昇したが、ΔＦｏｓＢイソ型は野生型骨芽細胞においても検出可能なレベルで発現した（図１Ｃ）。
【０１２４】
ＮＳＥ−ΔＦｏｓＢマウスは、誕生時にはコントロール同腹子と区別がつかないが、年齢が進むにつれて、髄腔がほとんど全部層状骨で満たされるまで（１５週齢１Ａマウス）骨梁骨容量が著明に増加し、（図２Ａ）髄外造血および脾腫に至った。骨梁骨容量は１１Ａマウスで有意に増加したが、１Ａマウスではさらに多かったので、骨量の増加は遺伝子用量に比例した（図２Ｂ）。さらに、骨量増加はドキシサイクリンを除去することにより成熟動物において誘導できるか、または２週間のドキシサイクリン処置で逆転できる（データは示していない）。これらのデータにより、観察された骨格表現型が成長変化の結果であり得るという可能性が排除される。頭蓋冠の骨の厚みもまた増加し、これは膜内または軟骨内のいずれかの骨化から誘導された骨が同様に影響したことを示している。ｃ−Ｆｏｓ過剰発現マウス（Ｇｒｉｇｏｒｉａｄｉｓら、１９９３；Ｗａｎｇら、１９９５）と対照的に、骨肉腫は決して観察されなかった。骨芽細胞は規則的であり、蛍光色素標識は鮮明であり、骨髄繊維症または網状骨はなく、これは、骨形成は著明に増加したが、これらのトランスジェニック動物は依然制御された過程にあることを示している。
【０１２５】
実施例２．インビボの骨密度の増加は骨形成の増加に起因する
本発明はまたインビボの骨密度の増加は骨形成の増加に起因するという知見に部分的に基づく。骨量がインビボで増加し得る可能な経路は全ては、骨形成に傾いた骨再吸収および形成間の不均衡の結果である。第１には、損傷された破骨細胞機能により骨量が増加し、その結果成長板軟骨および損傷された歯牙萌出を含む多くのリモデリングされない細い骨梁の存在により特徴づけられる大理石骨病に至る（Ｓｏｒｉａｎｏら、１９９１；Ｈａｙｍａｎら、１９９６；Ｓｅｉｆｅｒｔら、１９８５）。破骨細胞分化の損傷により骨再吸収が低減する場合、形態学的に類似の表現型が観察される（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９２；Ｗａｎｇら、１９９２；Ｆｒａｎｚｏｓｏら、１９９７；Ｔｏｎｄｒａｖｉら、１９９７、Ｍａｒｋｓら、１９７６；Ｓｉｍｏｎｅｔら、１９９７）。骨量がインビボで増加し得る第３のメカニズムは骨形成増加を介する（骨硬化症）。しかしながら本明細書で報告されたものほど劇的な表現型は記載されていない。ＰＴＨまたはＰＧＥ２１７、１８での長期間処置の後、オステオカルシン遺伝子の標的化破壊（Ｄｕｅｙら、１９９６）に続く、またはより最近ではレプチンシグナル発生欠損ｏｂ／ｏｂおよびｄｂ／ｄｂマウスにおける（Ｄｕｃｙら、２０００）、骨密度の穏やかな増加のみが文献化されている。
【０１２６】
１０週齢１１Ａマウスの近位脛骨の詳細な静的および動的な組織形態学的分析および生化学的分析により、ＮＳＥ−ΔＦｏｓＢマウスにおける骨量増加は骨再吸収の損傷よりもむしろ骨形成の増加の結果であることが示された。血清オステオカルシンレベルを含む、骨芽細胞増殖および機能の組織形態学的マーカーが増加した（図２Ｂ）。これは、全身レベルでの骨形成を反映する。加えて、骨マトリックスタンパク質をコードする遺伝子の発現もまたＮＳＥ−ΔＦｏｓＢマウスの頭蓋冠においてアップレギュレートされた（図２Ｂ）。対照的に、破骨細胞表面または数も尿デオキシピロジノリン架橋も増加せず、これは骨再吸収がインビボにおいて変化しなかったことを示している（図２Ｃ）。単離されたＮＳＥ−ΔＦｏｓＢ（１１Ａ）破骨細胞で実施したインビトロ骨再吸アッセイによりピット数または大きさには差異がないことが示された（図２Ｃ）。同様に、ＮＳＥ−ΔＦｏｓＢ（１１Ａ）またはコントロール動物からの骨芽細胞および骨髄を用いる相互同時培養実験により、ΔＦｏｓＢ骨髄または骨芽細胞の破骨細胞生成能力において有意な差異は示されなかった（図２Ｃ）。酒石酸塩抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）染色は新生および成熟マウスの双方において正常なようであった。最後に、歯牙萌出は損傷も遅延もされず、骨梁骨および皮質骨は誕生時に正常なようであり、軟骨残遺物は２次界面質（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｐｏｎｇｉｏｓａ）の中では検出されず、それによりさらに大理石骨病が排除された。従って、これらのマウスにおける主要な細胞性欠損は骨形成の著明な増加であり、進行性の重篤な骨硬化症に至る。
【０１２７】
実施例３．骨形成の増加はΔＦｏｓＢトランスジェニック骨芽細胞系統において細胞自律的である
【０１２８】
また、本発明は、骨形成がΔＦｏｓＢトランスジェニック骨芽細胞系統において細胞自律的であるという知見にも基づいている。ＮＳＥ−ΔＦｏｓＢマウスにおける骨形成の増加が骨芽細胞系統に固有であるか、または全身的もしくは微環境的変化の結果であるかどうかを決定するために、初代頭蓋冠培養を行い、インビトロで分化させた。ＮＳＥ−ΔＦｏｓＢ培養はより早期でより迅速な無機質化結節形成、および骨芽細胞表現型に関連するマーカー遺伝子の発現増加を示し、従って、骨芽細胞および骨形成に及ぼすΔＦｏｓＢの細胞自律性効果を確立することを示した（図３Ａ−Ｄ）。
【０１２９】
骨芽細胞および脂肪細胞は、共通の間葉細胞前駆体に由来し、双方共に長期間のネズミ頭蓋冠初代培養で見出される（Ｂｅｌｌｏｗｓら、１９９４）。ＮＳＥ−ΔＦｏｓＢマウスからの頭蓋冠培養において脂肪細胞数の有意な減少が観察された。ＮＳＥ−ΔＦｏｓＢ培養で分化したいくつかの脂肪細胞はあまり成熟しておらず、少しだけ小型の脂質ドロップレットを有し、対照的に、コントロール頭蓋冠培養では大きな多数のドロップレットが観察された（図４Ａ、Ｂ）。これに合致して、研究した全ての時点で野生型培養に相対して脂肪細胞表現型、例えばＰＰＡＲ２、Ｃ／ＥＢＰおよびＣ／ＥＢＰに関連する転写因子の発現もまた減少した（図４Ｃ）。
【０１３０】
インビトロで観察された変化を確認するように、ＮＳＥ−ΔＦｏｓＢマウスで腹部脂肪レベルが減少し（図４Ｄ）、骨髄塗抹により脂肪細胞の減少が示された（平均脂肪細胞／骨髄細胞（％）±ＳＥＭ：コントロール、１４．２±２；１１Ａ、２．３±１、ｐ＜０．０５）。さらに、骨芽細胞表現型に関連する遺伝子発現の増加に対して、骨生成または脂質生成物質のいずれかで処置したΔＦｏｓＢマウスからの骨髄間質細胞のインビトロ培養により脂肪細胞数、成熟の有意な低減が示された（図４Ｅ、データは示されていない）。従って、インビボおよびインビトロの結果は、ΔＦｏｓＢ過剰発現が初期間葉細胞前駆体の骨芽細胞系統への参与を好むが、脂肪細胞の分化を抑制することを強く示唆している。
【０１３１】
次の質問で最も重要な質問は、ΔＦｏｓＢイソ型の発現が生物学的に重要であるかどうか、または観察された表現型が単に正常では骨芽細胞に存在しないタンパク質の過剰発現の結果であるかどうかということである。ΔＦｏｓＢおよびΔＦｏｓＢイソ型の共通のエピトープを認識する抗体は、ΔＦｏｓＢレベルが未変化のままであるが、ΔＦｏｓＢレベルは培養物が分化したときに増加し、一方さらにトランケートされたΔ２ΔＦｏｓＢイソ型の発現は同一の時間枠で減少したことが見出された（図５Ａ）。従って、ｆｏｓＢ　ｍＲＮＡの段階特異的選択的スプライシングおよびＦｏｓＢの選択的開始部位の使用（Ｃｈｅｎら、１９９７）はＦｏｓＢそのものの発現よりむしろ骨芽細胞の分化を調節する。
【０１３２】
実施例４．インビトロおよびインビボでの脂肪細胞分化の抑制
さらに本発明は、ΔＦｏｓＢの過剰発現が脂肪細胞分化を抑制するという発見に基づく。次に、脂肪細胞経路を使って、ΔＦｏｓＢの過剰発現が、多分化能前駆体細胞の分化を骨芽細胞表現型に向かうように誘導するメカニズムを研究した。初代骨芽細胞、またはＭＣ３Ｔ３−Ｅ１もしくはＣ２Ｃ１２細胞系のΔＦｏｓＢまたはＮ末端トランケートされたΔ２ΔＦｏｓＢイソ型の過剰発現に続いて、ノーザンおよびウェスタンブロット分析の組み合わせを用いて、Δ２ΔＦｏｓＢを過剰発現する細胞において骨マトリックスタンパク質および骨芽細胞特異的因子ＯＳＦ２／ＣＢＦＡ１が特異的にアップレギュレートされることを見出した。Δ２ΔＦｏｓＢイソ型はΔＦｏｓＢ全長でトランスフェクトされた細胞でも発現されるはずであるが、第３のメチオニンの使用はΔＦｏｓＢを過剰発現する細胞では有効でなく、Δ２ΔＦｏｓＢ発現レベルが低くなり、興味深いことには骨芽細胞マーカー遺伝子の刺激が並行して低下または欠如し（図５Ｂ、Ｃおよびデータは示していない）、さらにΔ２ΔＦｏｓＢがトランスジェニック表現型に関与し得ることを示唆している。驚くべきことに、３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞におけるΔ２ΔＦｏｓＢの発現は脂質生成物質で処置した後でさえＣ／ＥＢＰ　ｍＲＮＡ発現をダウンレギュレートしたのみならず、代わりにＩ型コラーゲン　ｍＲＮＡレベルの上昇を引き起こした（Ｄｏｒｈｅｉｍら、１９９３）（図５Ｄ）。さらに、ゲルシフト分析を使用してΔＦｏｓＢ頭蓋冠培養からの抽出物を用いてコンセンサスＡＰ−１エレメントで形成された複合体の増加を観察した。しかしながらＣ２Ｃ１２由来の安定した細胞系では、ΔＦｏｓＢを過剰発現する細胞からの抽出物用いると、コントロールおよびΔ２ΔＦｏｓＢ過剰発現細胞からの抽出物よりも同一のＡＰ−１エレメントへの結合は少なかった（図５Ｅ）。これらの知見は骨生成および脂質生成に及ぼすΔＦｏｓＢの効果がほとんどΔ２ΔＦｏｓＢイソ型の過剰発現により媒介されていることを示している。抗体スーパーシフト分析により、初代培養（データは示していない）およびトランスフェクトされた細胞（図５Ｆ）ではＡＰ−１エレメントに関連する複合体は主に、以前は骨芽細胞分化の制御に関係していたＦｏｓＢ／ΔＦｏｓＢ、Ｆｒａ−２およびＪｕｎＤ（ＭｃＣａｂｅら、１９９６）、並びに最近ＡＰ−１メンバーに直接関係することが示されているＳｍａｄ４（Ｌｉｂｅｒａｔｉら、１９９９）を含むことが示された。さらに、これはＪｕｎＤが脳におけるΔＦｏｓＢの好ましいパートナーであることを示す以前の研究に合致する。
【０１３３】
従って、Δ２ΔＦｏｓＢレベルは分化の初期に最も高く、脂肪細胞分化を抑制する一方で、骨芽細胞マーカーの発現を促進する。Ｆｏｓファミリーのメンバーがホモ二量体を形成しないので、ΔＦｏｓＢイソ型の過剰発現は、主にＪｕｎＤとの高親和性Δ２ΔＦｏｓＢヘテロ二量体の形成をとおして、脂肪生成を使い、骨芽細胞参与を好む。Δ２ΔＦｏｓＢは、いずれかの既知のトランス活性化または抑制ドメインを欠いているので、これらの複合体はＪｕｎパートナーを介する転写のアクチベーターとして作用するか、または特定の系統への参与に寄与する遺伝子のコアクチベーターまたはプロモーター制御エレメントへの結合を競合することにより、別のＡＰ−１複合体の転写作用を防止するかのいずれかであるか、または双方である。興味深いことに、骨芽細胞（Ｏｗｅｎら、１９９０；Ｂａｎｅｒｊｅｅら、１９９６）および脂肪細胞（Ｄｉｓｔｅｌら、１９８７；Ｓｔｅｐｈｅｎら、１９９２）の分化に関与するいくつかの遺伝子のプロモーターは機能的ＡＰ−１結合部位を含む。次いで、ＡＰ−１ファミリーのメンバーの古典的なＣ−末端トランス活性化ドメインを欠如するが、より議論の多いＦｏｓ相同性ドメイン（ＦＨＤ）をさらに含有するΔＦｏｓＢおよびΔ２ΔＦｏｓＢの双方について、主にトランス活性化のアクチベーターまたはレプレッサーとして作用するかどうかを決定した。一過性トランス活性化アッセイにおいて安定した細胞系を用いて、ΔＦｏｓＢおよびΔ２ΔＦｏｓＢがオステオカルシン（ＯＧ２）プロモーター／ＣＡＴレポーター遺伝子構築物の作用を活性化または抑制する能力を比較した。ＯＧ２−ＣＡＴの濃度が異なるΔＦｏｓＢおよびΔ２ΔＦｏｓＢのトランスフェクションにより、ΔＦｏｓＢおよびΔ２ΔＦｏｓＢ過剰発現細胞の双方が、用いたレポータープラスミドの濃度に依存して、擬似トランスフェクトされた細胞と比較して２から８倍のＣＡＴ発現を誘導することが示された（データは示していない）。従って、ΔＦｏｓＢおよびΔ２ΔＦｏｓＢイソ型は双方共に転写アクチベーターとして作用できる。
【０１３４】
脂肪細胞分泌レプチンが視床下部による骨芽細胞の全身的制御を介して骨形成の陰性のレギュレーターとして作用することが最近示唆されている（Ｄｕｃｙら、２０００）。インビトロおよびインビボでの脂肪細胞の著明な減少、および結果的に血清レプチンの減少がトランスジェニックマウスにおいて観察されたが（９．９±２．４ｎｇ／ｍｌ対３．９±０．９ｎｇ／ｍｌ、ｐ＜０．０５）、ΔＦｏｓＢトランスジェニックマウスで観察された骨格表現型がレプチンレベルの低下の結果であるという可能性は以下の観察に基づいて排除され得る。第１に、ΔＦｏｓＢ表現型は、Ｃ２Ｃ１２細胞系において（すなわち脂肪細胞不在下で）ΔＦｏｓＢの安定したトランスフェクションの後でさえでも、細胞自律性であり、インビトロで再現性がある。第２に、レプチンの効果をインビトロで擬似できず、骨芽細胞機能に影響するのに視床下部の存在が必要であることがＤｕｃｙら（２０００）により示された。第３に、レプチンは依然我々のトランスジェニックマウスに存在するが、ΔＦｏｓＢトランスジェニクマウスで観察された骨硬化症の骨格表現型が、レプチン（ｏｂ／ｏｂ）またはレプチンレセプター（ｄｂ／ｄｂ）欠損マウスにおいて見出された骨形成の穏やかな増加よりもさらに顕著である。最後に、とりわけ興味深いのは、ネズミＨ２−ＫｂクラスＩ　ＭＨＣプロモーターの制御下、ｆｒａ−１を過剰発現するマウスにおける類似の骨格表現型がＪｏｃｈｕｍらにより記載されている（共同で提出された）。Ｆｒａ−１はＦｏｓファミリーメンバーに近縁であり、Δ２ΔＦｏｓＢと同様、未知の転写活性化ドメインを有する。このトランスジェニックモデルでは体脂肪および／または脂肪細胞分化において明らかな変化はない。従って、ΔＦｏｓＢおよびＦｒａ−１過剰発現がインビトロおよびインビボで骨形成を増加させる能力は細胞自律性であり、レプチンレベルの変化に起因するものではない。
【０１３５】
従って、転写ドメインを欠くが、ＤＮＡ結合およびヘテロ二量体形成特性は保持しているＦｏｓファミリーメンバー、例えばΔ２ΔＦｏｓＢまたはＦｒａ−１の過剰発現は骨形成の著明な増加を誘導し、インビボで骨硬化症に至る。さらに骨格のこの同化応答に関与する経路をさらに理解することにより薬物開発の新たな標的の同定が補助され得る。
【０１３６】
実施例５．被験物質が骨形成を誘導するかどうかを決定する方法
国立衛生研究所および施設動物保護ガイドラインに厳密に準拠して全てのトランスジェニックマウスを保持する。トランスジェニックマウスＴｅｔＯｐ−ΔＦｏｓＢ（Ｃｈｅｎら、１９９８）に被験物質および５％　スクロースを含有する水を与える。低用量のドキシサイクリンでΔＦｏｓＢの発現を止めるか、またはドキシサイクリンの不在下で非常に高レベルに誘導することができる。従って、ドキシサイクリンの不在下および／または存在下で被験物質を投与する。
【０１３７】
ルシフェラーゼアッセイ
肉眼的切開により異なる器官からの組織を得る。ソニケーターまたはポリトロンを用いて組織をホモジナイズする。ホモジネートを微量遠心管中５分間遠心する。ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイキットを使用することにより、上澄１０μｌを用いてルミノメーターでルシフェラーゼ活性を測定する（ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ、インディアナポリス、インディアナ）。ルシフェラーゼ活性を全タンパク質濃度に対して正規化する。
【０１３８】
ウェスタンブロッティング
抗Ｆｏｓ関連抗原抗体（Ｍ．Ｉｄａｄｒｏｌａにより提供、ベセスダ、メリーランド）および化学ルミネサンス検出（アメルシャム、アーリントン・ハイツ、イリノイ）を用いてΔＦｏｓＢに関する１次元ウェスタンブロッティングをＣｈｅｎら（１９９８）に記載されるように厳密に実施する。マッキントッシュをベースにした画像分析系をＮＩＨ画像ソフトウェアと共に用いて特定のバンドの光学密度を測定することによりΔＦｏｓＢの免疫反応性のレベルを定量化する。
【０１３９】
免疫組織化学
Ｃｈｅｎら（１９９８）に従ってΔＦｏｓＢの免疫組織化学分析を実施する。トランスジェニックマウスを４％パラホルムアルデヒドリン酸塩緩衝生理食塩水で潅流する。切片をウサギポリクローナル抗ＦｏｓＢ抗体（１：５０００；サンタ・クルーズ・バイオケミカルズ、サンタ・クルーズ、カリフォルニア）で標識する。Ｃｈｅｎら（１９９８）に記載されるようにジアミノベンジジン染色により免疫反応性を検出する。
【０１４０】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡクエアウス（ＲＮｑｕｅｏｕｓ）フェノール不含全ＲＮＡ単離キット（アンビオン、オースチン、テキサス）を用いてトランスジェニックマウスの線条から全ＲＮＡを単離し、オリゴテックスｍＲＮＡミニキット（キアゲン、チャッツウォース、カリフォルニア）を用いてポリ（Ａ）＋を単離する。マラソンｃＤＮＡ増幅キット（クロンテック、パロ・アルト、カリフォルニア）を使用して１μｇのポリ（Ａ）＋　ｍＲＮＡをｃＤＮＡ合成の鋳型として用いる。クロンテックからの標準的なプロトコルに従ってＰＣＲを実施する。内因性遺伝子からトランス遺伝子の発現を区別するようにＰＣＲプライマー対を設計する。ΔＦｏｓＢプライマー（５’ＣＡＧ　ＴＣＴ　ＣＡＧ　ＴＡＣ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＴＣ　３’）およびＳＶ４０プライマー（５’ＧＴＣ　ＡＧＣ　ＡＧＴ　ＡＧＣ　ＣＴＣ　ＡＴＣ　ＡＴＣ　ＡＣＴ　３’）を使用することにより、ΔＦｏｓＢおよびＳＶ４０配列の双方を含有するΔＦｏｓＢトランス遺伝子の発現を検出できる。
【０１４１】
材料および方法で記載した組織形態計測的および生化学的分析をこれらのトランスジェニックマウスにおいても実施することができる。初代ネズミ頭蓋冠細胞をトランスジェニックマウスから得、材料および方法で記載したように分析することもできる。当業者に既知の別のアッセイを実施して被験物質が骨形成を変調するかどうかを決定することもできる。
【０１４２】
前記した論考および実施例は単に特定の好ましい実施形態の詳細な記載を提示するものである。従って、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾および等価物を作製できることは技術分野の当業者に明らかなはずである。本願で同定される全ての学術論文、その他の参考文献、特許および特許出願は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ＮＳＥ−ΔＦｏｓＢマウスにおける骨密度上昇およびΔＦｏｓＢイソ型の組織特異的発現を示す。
Ａ．１５週齢コントロール（左）および１ＡΔＦｏｓＢ同腹子（右）の近接放射線撮影を示す。
Ｂ．ＦｏｓＢおよびΔＦｏｓＢの機能的ドメインの概略図を示す（上部パネル）。ＦＨＤ：Ｆｏｓ相同性ドメイン、ＢＲ：塩基性領域、ＬＺ：ロイシンジッパー、ＰＰＰ：プロリン富化トランス活性化ドメイン。ΔＦｏｓＢ（Δ）のインビトロ転写／翻訳または第１（Δ１）もしくは第１および第２（Δ２）メチオニン残基を欠如する変異体のインビトロ転写／翻訳（下部パネル）（Ｃｈｅｎら、１９９７）。
Ｃ．成体コントロール（Ｃ）および１１Ａ（Δ）マウスにおけるΔＦｏｓＢイソ型の組織特異的発現を示す（左パネル）。筋肉（Ｍｕｓ）、骨、皮膚、脳、肺、心臓、脂肪（Ａｄｉｐ）および脾臓（Ｓｐｌ）。ΔＦｏｓＢイソ型はコントロール（Ｃ）およびΔＦｏｓＢ（Δ）動物の頭蓋冠に由来する骨芽細胞において発現する（右パネル）。
【図２】
ΔＦｏｓＢを過剰発現するマウスにおける進行性骨硬化症を示す。
Ａ．６日（ｄ６）、４週（４ｗｋ）、８週（８ｗｋ）、１０週（１０ｗｋ）および１５週（１５ｗｋ）でのコントロール（下部パネル）および１ＡΔＦｏｓＢ（上部パネル）マウスからのフォン・コッサ染色した近位脛骨である。
Ｂ．骨形成：１０週齢のΔＦｏｓＢ発現マウス（１１Ａおよび１Ａ）およびコントロール（Ｃｔｒｌ）における骨梁骨容量の増加（ＢＶ／ＴＶ）、骨生成速度（ＢＦＲ／ＢＶ）、無機質付加速度（ＭＡＲ）、骨芽細胞表面（ＯｂＳ／ＢＳ）、骨芽細胞数（ＯｂＮ／ＢＰｍ）および血清オステオカルシン（ＯＣＮ）を示す。出生後２日のコントロール（Ｃ）および１１ＡΔＦｏｓＢ（Δ）マウスの頭蓋冠からの前ＲＮＡのノーザンブロット分析により、ΔＦｏｓＢマウスにおけるより高度なオステオカルシン（ＯＣ）、Ｉ型コラーゲン（Ｃｏｌ　Ｉ）およびオストコポンチン（ＯＰ）ｍＲＮＡ発現が示してある。
Ｃ．骨再吸収：１０週齢のコントロール（Ｃｔｒｌ）およびΔＦｏｓＢ（１１Ａ）マウスの未変化破骨細胞表面（ＯｃＳ／ＢＳ）、および尿のデオキシピロジノリン架橋（ＤＰｙｒ／Ｃｒ）である。コントロール（Ｃｔｒｌ）およびΔＦｏｓＢ（１１Ａ）マウスからの初代骨芽細胞（ＯＢ）および骨髄細胞（ＢＭ）のインビトロ破骨細胞生成分析により検出される酒石酸塩抵抗性酸ホスファターゼ染色多核細胞（ＴＲＡＰ＋ＭＮＣ）の数が示されている。象牙質切片におけるコントロール（Ｃｔｒｌ）およびΔＦｏｓＢ（１１Ａ）マウスからの基準破骨細胞の骨再吸収が示されている。
【図３】
ΔＦｏｓＢマウスの初代頭蓋冠培養における細胞自律的に増加した骨芽細胞発生を示す。
Ａ．ファン・コッサ染色による、６日（ｄ６）および１４日（ｄ１４）でのコントロール（Ｃ）およびΔＦｏｓＢ（Δ）頭蓋冠培養における細胞外マトリックス無機質化を示す。
Ｂ．６日（ｄ６）、１４日（ｄ１４）、２１日（ｄ２１）および３１日（ｄ３１）でのコントロール（白抜きした棒グラフ）およびΔＦｏｓＢ（影をつけた棒グラフ）培養における無機質化の定量を示す。
Ｃ．全面成長（ｄ０）でのコントロール（Ｃ）およびΔＦｏｓＢ（Δ）初代骨芽細胞培養の全ＲＮＡのノーザンブロット分析を示す（Ｃｏｌ　Ｉ：Ｉ型コラーゲン、ＯＰ：オステオポンチン）。臭化エチジウム染色により同量のローディングが確認された。
Ｄ．全面成長（ｄ０）でのコントロール（Ｃ）およびΔＦｏｓＢ（Δ）初代骨芽細胞培養からの細胞全体の抽出物のウェスタンブロット分析を示す。抗アクチン抗体で再プロービングすることにより同量のタンパク質ローディングが示された。
【図４】
ΔＦｏｓＢマウスの初代頭蓋冠および骨髄間質細胞培養における脂質生成の低下を示す。
Ａ．コントロール（白抜き棒グラフ）およびΔＦｏｓＢ（影付き棒グラフ）骨芽細胞培養における脂肪細胞数を示す。
Ｂ．無機質化の１４日での初代ΔＦｏｓＢ（上部パネル）およびコントロール（下部パネル）頭蓋冠培養のアルカリ性ホスファターゼ／オイルレッドＯ染色を示す。
Ｃ．無機質化の４日（ｄ４）および１４日（ｄ１４）での初代コントロール（Ｃ）およびΔＦｏｓＢ（Δ）頭蓋冠培養からの細胞全体の抽出物のウェスタンブロット分析を示す。
Ｄ．１０週齢コントロール（Ｃ）およびΔＦｏｓＢ（１Ａおよび１１Ａ）マウスの腹部脂肪重量を示す。
Ｅ．方法に記載される脂質生成物質で処置された、初代コントロール（Ｃ）およびΔＦｏｓＢ（Δ）骨髄間質細胞培養からの全ＲＮＡのノーザンブロット分析；ＯＰ：オステオポンチン、Ｃｏｌ　Ｉ：Ｉ型コラーゲンを示す。臭化エチジウム染色により同量のローディングが確認された。
【図５】
骨芽細胞分化におけるΔＦｏｓＢイソ型の分子インビトロ分析を示す。
Ａ．４日（Ｄ４）、１４日（Ｄ１４）および２１日（Ｄ２１）でのマウスＣＤ１の頭蓋冠からの初代全面成長（ｄ０）および無機質化培養の核抽出物をウェスターン分析によりＦｏｓＢおよびΔＦｏｓＢイソ型の発現に関して分析した。
Ｂ．空のベクター（Ｃ）、ΔＦｏｓＢ（Δ）およびΔ２ΔＦｏｓＢ（Δ２）イソ型で安定してトランスフェクトされたＣ２Ｃ１２細胞からの全ＲＮＡのノーザンブロット分析。ＲＮＡ抽出物に関して収穫する４８時間前に細胞を３００ｎｇ／ｍｌ　ｒｈＢＭＰ−２で処置した（ＯＣ：オステオカルシン）。臭化エチジウム染色により同量のローディングが示される。
Ｃ．空のベクター（Ｃ）、ΔＦｏｓＢ（Δ）またはΔ２ΔＦｏｓＢ（Δ２）でのＣＤ１頭蓋冠に由来する初代骨芽細胞の一過性トランスフェクションの後の核抽出物のウェスタンブロット分析を示す。
Ｄ．空のベクター（Ｃ）、ΔＦｏｓＢ（Δ）およびΔ２ΔＦｏｓＢ（Δ２）で安定してトランスフェクトされた３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞からの全ＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。ＲＮＡ抽出の４８時間前に細胞を未処置（ＵＮ）、またはインスリン、イソブチルメチルキサンチンおよびデキサメタゾン（ＩＮＳ／ＩＢＭＸ／ＤＥＸ）で刺激した。臭化エチジウム染色により同量のローディングが確認された。
Ｅ．コントロール（Ｃ）およびΔＦｏｓＢマウス（左パネル）の初代骨芽細胞培養からの、および空のベクター（Ｃ）、ΔＦｏｓＢ（Δ）およびΔ２ΔＦｏｓＢ（Δ２）［右パネル］を発現するＣ２Ｃ１２安定細胞系からの核抽出物を、コンセンサスＡＰ−１オリゴヌクレオチドプローブを用いてＥＭＳＡにより分析した。形成された複合体を矢印で示す（Ｆ：核抽出物を含まず放射標識ＡＰ−１プローブを含む反応混合物）。
Ｆ．ΔＦｏｓＢ（Δ）およびΔ２ΔＦｏｓＢ（Δ２）イソ型を過剰発現するＣ２Ｃ１２安定細胞系からの抽出物を用いてコンセンサスＡＰ−１オリゴヌクレオチドプローブに形成された複合体の抗体スーパーシフト分析。用いた抗体が示され、スーパーシフト複合体が矢印で示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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