(57)【要約】哺乳類の患者のスキャンの際の使用に適した、放射性標識した大凝集血清アルブミンの無菌の注射可能な懸濁液を調製する方法であって：１）血清アルブミンを塩溶液を用いて精製し；２）精製した血清アルブミンを緩衝化し；３）反応混合物を得るために、ハロゲン化第一スズ／HCl溶液を緩衝化した混合物に添加し；４）大凝集体粒子を形成するために、当該反応混合物を徐々に加熱して冷却し；５）大凝集体を反応混合物から分離し；６）大凝集体を注射用の滅菌水中で懸濁し；７）精製した血清アルブミンを添加し；８）懸濁液を凍結乾燥し；そして９）放射性標識した凍結乾燥物を99mTcで再構成すること、から成る方法。本発明はまた、段階１〜７から成る、ヒト血清アルブミンの大凝集粒子の安定な無菌凍結乾燥物を調製する方法も含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の患者をスキャニングする際の使用に適した、放射性標識した大凝集アルブミン粒子の、無菌で発熱物質のない注射可能な懸濁液を調製する方法であって：
ａ）血清アルブミンを０．９％ｗ／ｖの塩溶液と混合し、そして当該混合物を１，０００の名目上の分子量限界の多孔度を有する膜を介して限外濾過し；
ｂ）緩衝化して限外濾過した混合物を得るために、約４．９５〜約５．２５のｐＨを有する緩衝液を限外濾過した混合物と混合し；
ｃ）無菌の混合物を得るために、緩衝化して限外濾過した混合物を、無菌フィルターを通過させ；
ｄ）無菌の反応混合物を得るために、無菌濾過した塩化第一スズ／塩酸溶液を、緩衝化して限外濾過した混合物に添加し；
ｅ）約９０〜１００分で約７５℃〜９５℃に達するように、連続的に攪拌しながら反応混合物を徐々に加熱し；
ｆ）ハロゲン化第一スズを含む大凝集体が形成されるように、連続的に攪拌しながら反応混合物を徐々に冷却し；
ｇ）反応混合物から大凝集体を分離し、注射用の滅菌水でそれらを再懸濁し、そしてサイジングスクリーンを介してそれらを濾過し；
ｈ）大凝集体の濃度を注射用の滅菌水で調整し、そして無菌濾過した精製アルブミンを添加し；
ｉ）保存及び凍結乾燥のためのバイアル内に懸濁液を移し；
ｊ）不活性ガス雰囲気のもとで凍結乾燥したバイアルを密封する前に、凍結乾燥したバイアルを不活性ガスで溢れさせ；そして
ｋ）凍結乾燥したヒト血清アルブミンを、99mTc過テクネチウム酸塩の水溶液で再構成する、
段階を含んで成る方法。
【請求項２】
前記血清アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記緩衝液が酢酸ナトリウム及び酢酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ハロゲン化第一スズが塩化第一スズである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記加熱が約１００分以内で約８０℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記冷却が１００分未満で約７５℃〜９５℃から約２５℃である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記冷却が３０分未満で約７５℃〜９５℃から約２５℃である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記サイジングスクリーンが約７５ミクロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記大凝集体が１０〜７５ミクロンの平均粒径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記大凝集体が４０〜６０ミクロンの平均粒径を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１１】
前記大凝集体が４５〜５５ミクロンの平均粒径を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳類の患者をスキャニングする際の使用のための、再構成及び99mTcを用いる放射性標識に適した大凝集ヒト血清アルブミン粒子の安定で無菌の凍結乾燥物を調製する方法であって：
ａ）血清アルブミンを０．９％ｗ／ｖの塩溶液と混合し、そして当該混合物を１，０００の名目上の分子量限界の多孔度を有する膜を介して限外濾過し；
ｂ）緩衝化して限外濾過した混合物を得るために、約４．９５〜約５．２５のｐＨを有する緩衝液を限外濾過した混合物と混合し；
ｃ）無菌の混合物を得るために、緩衝化して限外濾過した混合物を、無菌フィルターを通過させ；
ｄ）無菌の反応混合物を得るために、無菌濾過した塩化第一スズ／塩酸溶液を、緩衝化して限外濾過した混合物に添加し；
ｅ）約９０〜１１０分で約７５℃〜９５℃に達するように、連続的に攪拌しながら反応混合物を徐々に加熱し；
ｆ）ハロゲン化第一スズを含む大凝集体が形成されるように、連続的に攪拌しながら反応混合物を徐々に冷却し；
ｇ）反応混合物から大凝集体を分離し、注射用の滅菌水でそれらを再懸濁し、そしてサイジングスクリーンを介してそれらを濾過し；
ｈ）大凝集体の濃度を注射用の滅菌水で調整し、そして無菌濾過した精製アルブミンを添加し；
ｉ）保存及び凍結乾燥のためのバイアル内に懸濁液を移し；そして
ｊ）不活性ガス雰囲気のもとで凍結乾燥したバイアルを密封する前に、凍結乾燥したバイアルを不活性ガスで溢れさせる、
段階を含んで成る方法。
【請求項１３】
前記血清アルブミンがヒト血清アルブミンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記緩衝液が酢酸ナトリウム及び酢酸である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ハロゲン化第一スズが塩化第一スズである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記加熱が約１００分以内で約８０℃である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記冷却が１００分未満で約７５℃〜９５℃から約２５℃である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記サイジングスクリーンが約７５ミクロンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
再構成及びテクネチウム-99mを用いる放射性標識及び患者の肺をスキャニングする際の使用に適した大凝集ヒト血清アルブミン粒子の安定な無菌の凍結乾燥物を調製する方法であって、
ａ）１ユニットの２５％ｗ／ｖヒト血清アルブミンを５ユニットの０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ溶液と混合し；
ｂ）ヒト血清アルブミンを精製するために、１０，０００の名目上の分子量限界の多孔度を有する膜を介して、十分量の０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて混合物を濾過し；
ｃ）混合物の終濃度が、混合物１ｍｌ当たり約５０ｍｇの精製ヒト血清アルブミンとなるように混合物の体積を調整し；
ｄ）試薬混合物を得るために、攪拌しながら、１ユニットの精製ヒト血清アルブミンに対し、２ユニットの、４．９５〜５．２５のｐＨを有する酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液及び３ユニットの注射用水を添加し；
ｅ）無菌の０．２ミクロンのフィルターを介して試薬混合物を反応用のケトルに濾過し；
ｆ）均一な反応混合物を得るために、０．２ミクロンのフィルターを介して、ＨＣｌ中で２．５〜３ユニットの０．４３％ｗ／ｖの塩化第一スズ溶液を反応用ケトルに濾過し；
ｇ）攪拌しながら、約１００分以内に約８０℃に達するように、反応混合物を徐々に加熱し；
ｈ）攪拌しながら、反応混合物を徐々に約２５℃に冷却し；
ｉ）大凝集体を得て、そして上清を廃棄するために、冷却した反応混合物を遠心し；
ｊ）注射用の滅菌水中で大凝集体を再懸濁し；
ｋ）再懸濁した大凝集体を、７５ミクロンの無菌のサイジングスクリーンを通して無菌の検量バイアルに入れ；
ｌ）懸濁液のタンパク質濃度を決定し；
ｍ）１．５ｍｇ／ｍｌの、凝集アルブミンについての最終タンパク質濃度を有するバッチの体積を算出し；
ｎ）合計１０ｍｇ／ｍｌの精製した未変性アルブミンを含むように、当該バッチに対し、０．２ミクロンのフィルターを介して、十分な注射用水及び精製したアルブミン(5% w/v アルブミン)を添加し；
ｏ）１．０ｍｌのアリコートを無菌のガラスバイアルに移し、そして当該アリコートを乾燥状態に凍結乾燥する、
段階を含んで成る方法。
【請求項２０】
前記大凝集体が、１０〜７５ミクロンの平均粒径を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記大凝集体が、４０〜６０ミクロンの平均直径を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記大凝集体が、４５〜５５ミクロンの平均直径を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
放射性標識及び哺乳類の患者をスキャニングする際の使用に適した大凝集アルブミン粒子の、無菌で発熱物質無しの注射可能な懸濁液を調製する方法であって；
ａ）血清アルブミンを０．９％の塩溶液と混合し、そして当該混合物を１，０００の名目上の分子量限界の多孔度を有する膜を介して限外濾過し；
ｂ）緩衝化して限外濾過した混合物を得るために、約４．９５〜約５．２５のｐＨを有する緩衝液を限外濾過した混合物と混合し；
ｃ）無菌の混合物を得るために、緩衝化して限外濾過した混合物を、無菌フィルターを通過させ；
ｄ）無菌の反応混合物を得るために、無菌濾過した塩化第一スズ／塩酸溶液を、緩衝化して限外濾過した混合物に添加し；
ｅ）約９０〜１００分で約７５℃〜９５℃に達するように、連続的に攪拌しながら反応混合物を徐々に加熱し；
ｆ）ハロゲン化第一スズを含む大凝集体が形成されるように、連続的に攪拌しながら反応混合物を徐々に冷却し；
ｇ）反応混合物から大凝集体を分離し、注射用の滅菌水でそれらを再懸濁し、そしてサイジングスクリーンを介してそれらを濾過し；そして
ｈ）大凝集体の濃度を注射用の滅菌水で調整し、そして無菌濾過した精製アルブミンを添加する、
段階を含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類における器官及び組織のスキャニングの用途において有用な放射線医薬の診断剤の製造方法に関する。更に具体的には、本発明は、肺の診断的スキャニングのために患者にヒト血清アルブミンを注入する前に、テクネチウム-99mTcで標識された形態の、高度に精製され、安定なヒト血清アルブミン担体中で懸濁された、無菌の安定な大凝集ヒト血清アルブミンに関する。
【背景技術】
【０００２】
テクネチウム−９９ｍで放射性標識された、３〜１５０ミクロンの直径の粒径を有するヒト血清アルブミンの大凝集粒子は、肺機能の研究及び診断において使用されている。患者への注入後、放射性標識された大凝集粒子は拡散し、そして肺の毛細血管系に保持されて、診断技師のシンチグラフィーによる可視化が可能となる。放射性標識された大凝集体は、ごく短期間で毛細血管を塞ぎ、そして肺の組織には悪影響をもたらさない。短期間の保持の後、当該大凝集体は血中の食細胞によって消化され、それによって毛細血管は大凝集体を除かれる。ガンマ線を放射するテクネチウム-99mは、わずかに６時間の放射能の半減期を有しており、そしてそれに伴う放射は、大凝集体の粒子と共に肺組織から消失する。
【０００３】
大凝集ヒト血清含有産物の臨床的な特徴は粒径にある。当該産物は、大凝集体が肺の毛細血管で捕捉されるよう設計される。塞栓症が毛細血管系に存在する場合、大凝集体は閉塞を通過して移動することはなく、その結果、大凝集体粒子が侵入し得ない毛細血管の領域からの放射線の欠如によって血液循環の問題を示唆する。
【０００４】
そのような閉塞はまた、大きすぎて健康な毛細血管のある部分を通過することができない大凝集体によって引き起こされることもあり、それによって不適切な血液循環又は疾患が示唆される。１５０ミクロン超の直径の大凝集粒子は、大きな毛細血管さえも閉塞させうる。他方で、大凝集粒子が約３ミクロン未満の直径である場合、それらは毛細血管壁を通過して直接肺に向かって影をもたらし、そして肺のシンチフォトを歪める。（例えば、米国特許第3,987,157号を参照のこと）。大きな粒径の大凝集体による毛細血管の人工的な閉塞の問題を排除し、そして小さい粒径の凝集体の通過を防ぐために、従来技術は、最小約５〜１０ミクロン、そして最大約８０〜１００ミクロンの平均直径の範囲の粒径に制限されており、一方、好ましい範囲は、最小約１５〜３０ミクロンで、そして最大３０〜５０ミクロンの直径の範囲である。（例えば、米国特許第３，６７４，９００号；第３，８６３，００４号；第３，８６２，２９９号；第４，０２４，２３３号；及び第４，０９４，９６５号を参照のこと。）
【０００５】
必要な粒径の大凝集体を得るために、従来技術は約７０℃〜１００℃の温度の加熱段階、及び約１８℃〜２２℃に及ぶ冷却段階を使用する。
【０００６】
大凝集体の粒径が所望の範囲内であっても、粒径の分布は変化して、小、中、大の粒子の混合物をもたらすことがある。放射性標識される場合、粒子は、十分量のテクネチウム-99mを担持せず、診断の有効性の低下を招く。また、毛細血管中の血流は、優先的により小さい粒子を運び、より低速で移動するより大きな粒子を置き去りにする。これは、テクネチウム-99mの均一でない分布をもたらし、毛細血管及び組織の症状のシンチグラフィーの解釈に影響を及ぼす。従って、放射性標識された粒子が毛細血管及び組織中に十分に分布され、そして肺組織の症状に対する最大の診断上の有効性の信頼性のある解釈をもたらすように、本質的に均一のサイズの大凝集粒子を製造することが重要である。
【０００７】
従来技術はまた、粒子の凝集の問題にも直面していた。米国特許第3,863,004号は、そのまま凝集する傾向にあり、そして使用前に粒子の超音波処理を必要としたテクネチウム硫黄コロイドによる変性アルブミンの標識を開示している。米国特許第4,187,285号は、凝集から守るために、抗凝集性の界面活性剤、例えばPoloxamer 188を使用する。前者の特許において示唆された超音波処理は面倒であり、一方、後者の特許で示唆された界面活性剤の使用は、添加剤、例えば界面活性剤を使用していない、放射性標識ヒト血清アルブミンよりも望ましくない。
【０００８】
市販のアルブミンは、添加物、例えば炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム及び／又はアセチルトリプトファンを含む水性の希釈剤中の２５％アルブミン溶液である。
【０００９】
我々は、有効なアルブミン産物を得るために、市販のヒトアルブミン溶液は、凝集段階が進む前に最初に精製されなければならないことを発見した。
【００１０】
我々はまた、テクネチウム-99mで標識したヒト血清アルブミン産物が、本質的に、従来技術の方法で使用される微量の酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液及び塩酸無しに生成されうることも発見した。
【００１１】
我々は更に、粒径が、大凝集体を産生する場合に、制御された加熱−冷却サイクルを用いることによって本質的に均一に生成されうることを発見した。このことで、バイアル当たりの粒子の数の制御が可能となる。
【００１２】
我々はまた、所望の粒径が、USPの要求をみたすため、大凝集体をサイズ限定スクリーンを通過させることによって保証されうることも発見した。
【発明の開示】
【００１３】
本発明の要約
本発明の注射可能な懸濁液の調製方法は、
ａ）ヒト血清アルブミンを０．９％ｗ／ｖの塩溶液と混合し、そして当該混合物を１，０００の名目上の分子量限界の多孔度を有する膜を介して限外濾過し；
ｂ）４．９５〜５．２５のｐＨを有する緩衝液を混合し、そして、緩衝化して限外濾過した混合物を得るために、当該緩衝液を限外濾過した混合物に添加し；
ｃ）無菌の０．２ミクロンのフィルターを介して０．４３％ｗ／ｖの塩化第一スズ／ＨＣｌ溶液を濾過し、そして、反応混合物を得るために、当該溶液を、緩衝化して限外濾過した混合物に添加し；
ｄ）約９０〜１００分で約７５℃〜９５℃に達するように、反応混合物を徐々に加熱し；
ｅ）反応混合物を徐々に冷却し、それによって結果的に形成した大凝集体中の塩化スズ粒子を捕捉し；
ｆ）大凝集体を分離し、そしてそれらを注射用の滅菌水中で再懸濁し；
ｇ）７５ミクロンの無菌のサイジングスクリーンを介して濾過し；
ｈ）ヒト血清アルブミンの濃度を決定し；
ｉ）ヒト血清アルブミンの濃度を所望の分量に調整し；
ｊ）所望の体積をバイアルに移し、そしてそれらの含有物を凍結乾燥し；そして
ｋ）凍結乾燥したヒト血清アルブミンを、99mTc過テクネチウム酸塩、又は別の99mTc同位体、例えばTc94又はTc96の水溶液で再構成する、
段階を含んで成る。
【００１４】
本発明の注射可能な懸濁液は、肺の血液供給量を決定するために、静脈内から患者に投与される。静脈内投与の後、99mTc大凝集アルブミンは、機能している肺の毛細血管及び小動脈において捕捉される。in-vivoでの放射性分布の画像は、その結果肺潅流を示す。
【００１５】
本明細書の説明は、本発明の大凝集体を形成するためのヒト血清アルブミンの使用に関するが、他のタンパク質が利用されてもよく、例えばアルファ、ベータ又はガンマグロブリン又はフィブリノーゲンである。
【００１６】
フローダイアグラムを参照すると、本発明の方法の５つの一般的なカテゴリー：
（１）ヒト血清アルブミンの精製；
（２）大凝集体の形成；
（３）スクリーニング及びサイジング
（４）最終的なバッチ調製；
（５）再構成及び放射性標識、
が示されている。
【００１７】
これらは、本発明の詳細な説明中で詳細に論じられる。
【００１８】
本発明の詳細な説明
本発明は、肺スキャンの診断手順における使用のためにテクネチウム-99mで放射性標識されるヒト血清アルブミンの無菌の注射可能な懸濁液の調製方法及びこの方法によって調製した放射性標識産物に関する。ヒト血清アルブミンの注射可能な懸濁液の調製方法は、
ａ）１ユニットの２５％ｗ／ｖヒト血清アルブミンを５ユニットの０．９％ｗ／ｖＮａＣｌ溶液と混合し；
ｂ）ヒト血清アルブミンを精製するために、１０，０００の名目上の分子量限界の多孔度を有する膜を介して、十分量の０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて混合物を濾過し；
ｃ）混合物の終濃度が、混合物１ｍｌ当たり約５０ｍｇの精製ヒト血清アルブミン(5% w/v)となるように混合物の体積を調整し；
ｄ）試薬混合物を得るために、攪拌しながら、１ユニットの精製ヒト血清アルブミンに対し、２ユニットの、４．９５〜５．２５のｐＨを有する酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液及び３ユニットの注射用水を添加し；
ｅ）無菌の０．２ミクロンのフィルターを介して試薬混合物を反応用のケトルに濾過し；
ｆ）均一な反応混合物を得るために、０．２ミクロンのフィルターを介して、ＨＣｌ中で２．５〜３ユニットの０．４３％ｗ／ｖの塩化第一スズ溶液を反応用ケトルに濾過し；
ｇ）攪拌しながら、約１００分以内に約８０℃に達するように、反応混合物を徐々に加熱し；
ｈ）攪拌しながら、反応混合物を徐々に約２５℃に冷却し；
ｉ）大凝集体を得て、そして上清を廃棄するために、冷却した反応混合物を遠心し；
ｊ）注射用の滅菌水中で大凝集体を再懸濁し；
ｋ）再懸濁した大凝集体を、７５ミクロンの無菌サイジングスクリーンを通して無菌の検量バイアルに入れ；
ｌ）懸濁液のタンパク質濃度を決定し；
ｍ）１．５ｍｇ／ｍｌの、凝集アルブミンについての最終タンパク質濃度を有するバッチの体積を算出し；
ｎ）合計１０ｍｇ／ｍｌの精製した未変性アルブミンを含むように、当該バッチに対し、０．２ミクロンのフィルターを介して、十分精製したアルブミン(5% w/v アルブミン)を添加し；
ｏ）１．０ｍｌのアリコートを無菌のガラスバイアルに移し、そして当該アリコートを乾燥状態に凍結乾燥し；
ｐ）凍結乾燥したヒト血清アルブミンを、水性の99mTc過テクネチウム酸塩溶液又は別の99mTcの放射性同位体を再構成する、
段階を含んで成る。
【００１９】
本発明の製剤は、哺乳類の器官及び組織のスキャニングの利用において有用な診断剤におけるあらゆる必要な特性に合致する。当該製剤は、９５％の肺での取り込みを有し、そして肝臓及び腎臓での取り込みは１％未満である。凍結乾燥製剤は、約４０℃及び室温の両方で優れた安定性を有する。
【００２０】
本発明は更に、再構成及び99mTc過テクネチウム酸溶液を用いる放射性標識及び患者の肺をスキャニングする際の使用に適したヒト血清アルブミンの大凝集粒子の安定で無菌の凍結乾燥物の調製方法、並びにこの方法によって調製された産物、を含む。ヒト血清アルブミンの大凝集体粒子の安定で無菌の凍結乾燥物の調製方法は、上記段階ａ）〜ｏ）を含んで成る。
【００２１】
本発明はまた、放射性標識に適した大凝集体の無菌の注射溶液の調製方法及び当該方法による製造産物、を含む。この方法は、上記段階ａ）〜ｎ）を含んで成る。
【００２２】
（１）ヒト血清アルブミンの精製
正常なヒト血清アルブミン(USP)とは、健康なヒトのドナー由来の血液を分画することによって得られた血清アルブミンの無菌の調製物であって、その全体積のうち９６％以上であるものである。それは、若干の添加物、例えば、その保存期間が延長されるように保存剤を含む。本発明の方法において、市販の供給元から得られるヒト血清アルブミンは、無菌濾過した０．９％ＮａＣｌ（塩）溶液の使用によって最初に精製され；正常な血清アルブミンは、当該塩溶液と、好ましくは１対５ユニットの比率で徹底的に混合され、そして当該混合物は１０，０００の名目上の分子量限界の多孔度を有する膜を含む限外濾過系を通過される。当該混合物を膜に通過させる際、ヒト血清アルブミンを精製するのに十分な塩溶液が使用される。限外濾過後、アリコートがアッセイされ、そして濃度が、所望により、好ましくは当該溶液１ｍｌ当たり５０ｍｇに調整される。
【００２３】
本発明をヒト血清アルブミンに関して記載すると、当然の事ながら、動物血清アルブミン、例えばネコ、ウマ及び他の哺乳類起源の血清アルブミンが同様に精製されることがあり、そして、本発明を構成する工程段階がこれらの哺乳類種の診断に使用されうることが意図される。更に、上述の通り、他のタンパク質、例えばアルファ、ベータ又はガンマグロブリン又はフィブリノーゲンも本発明の方法において利用されうる。
【００２４】
（２）凝集体の形成
本発明のヒト血清アルブミンが構成する粒子は、５〜１００ミクロン又はそれ以上の平均直径を有する不規則な形状の凝集体として特徴づけられる。
【００２５】
本発明の大凝集体を形成するために、精製したヒト血清アルブミンは、適当な緩衝化剤を用いて、約４．９５〜５．２５のｐＨに、好ましくは５．１のｐＨに最初に緩衝化される。適当な緩衝化剤は、酢酸ナトリウム、酢酸、リン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム又は、最終産物から容易に除去可能な、他の当業界で認められている緩衝化剤である。
【００２６】
ヒト血清アルブミンの緩衝化した精製溶液に対する、無機酸、例えば塩酸に溶解した第一スズ塩の添加は、第一スズ塩と精製アルブミンの均一な混合物をもたらす。当該混合物の均一性は、加熱／冷却サイクルの完了時に、第一スズ塩が、ヒト血清アルブミンと均一に、すなわち分子同士で結合することを保証する。更に、この方法は、大凝集アルブミン粒子内に第一スズ塩を取りこみ、それを酸化から防ぐ。これは、例えば、既に形成した大凝集体が、緩衝液中で懸濁され、続いて塩化第一スズ溶液が添加される米国特許第3,863,004号に開示されている方法と反対である。この方法において、塩化スズは、大凝集体と、それらの表面でのみ、且つ大凝集体のサイズの変更に依存して複合化し、大凝集体の表面に結合した塩化第一スズは均一に分布しない。このことは、大凝集体の放射性標識の均一度、そして最終的には患者のラジオスキャンに影響を及ぼす。
【００２７】
第一スズ溶液と、均一になるまで混合した緩衝液中の精製ヒト血清アルブミンは反応混合物を構成し、大凝集体を形成するために、加熱−冷却サイクルにかけられる。当該反応混合物は、約１００分以内に徐々に室温から約８０℃に加熱されなければならない。加熱の増大速度は、約０．６７℃／分であるべきである。加熱の過程の間、反応混合物は、加熱の十分な分布及び精製アルブミンの均一な凝集を保証するために、約２６０ｒｐｍで攪拌され、極めて制御された粒径範囲をもたらす。
【００２８】
約８０℃に達すると、反応混合物は、２６０ｒｐｍで攪拌しながら、再び徐々に、約２５℃±５℃の温度に冷却される。漸次的な加熱／冷却過程及び制御された攪拌速度は、大凝集体の極めて均一な粒子をもたらす。我々は、この漸次的な加熱／冷却過程が、約１０５℃〜１１０℃の温度へと分散液を急速に加熱することを必要とする米国特許第4,024,233号に開示されているものと反対であることを発見した。
【００２９】
加熱／冷却サイクルの速度は、当該サイクルの間の攪拌速度とともに、大凝集体の粒径分布及び粒径の計算の両方の制御因子である。
【００３０】
（３）スクリーニング及びサイジング
加熱／冷却サイクルの完了時に、大凝集体の懸濁液は無菌で遠心され、そして上清は廃棄される。分離した大凝集体は、注射用の滅菌水を用いて再懸濁され、そして所望のもの大きい粒径の大凝集体がサイジングスクリーンを通過しないように、サイジングスクリーンを通過させられる。我々は７５ミクロンの無菌のサイジングスクリーンを好むが、他のサイジングスクリーン、例えば６０ミクロン以下のものも使用されうる。
【００３１】
（４）最終的なバッチ調製
サイジングされた懸濁液のタンパク質濃度は、懸濁液をアッセイすることによって決定される。明らかとなったタンパク質濃度に基づき、バッチの体積は、懸濁液１ｍｌ当たりの凝集アルブミンのｍｇの所望の濃度が達成されるように調整される。
【００３２】
我々は、懸濁液１ｍｌ当たり１．５ｍｇの変性した凝集ヒト血清アルブミン及び懸濁液１ｍｌ当たり１０ｍｇの未変性アルブミンの最終濃度を有することを好む。濃度の調整のために、5% w/v精製アルブミンが。０．２ミクロンのフィルター及び無菌の窒素パージフィルター又は注射用の滅菌水を用いて懸濁液に添加される。これらの方法は、異なる用量が最終産物にとって望まれる場合に、他の濃度を得るために使用されうる。
【００３３】
濃度の調整段階の後、１．０〜１．５ｍｌのアリコートが、無菌的に、無菌で発熱物質無しのガラスバイアルに移される。無菌で発熱物質無しの溝付きの栓が当該バイアル上に載せられ、そしてそれらの中身が乾燥状態へと凍結乾燥される。当該バイアルは、続いて無菌の窒素で満たされ、それらのストッパーが載せられ、アルミニウム又はプラスチックにシールで封をされ、そして２℃〜８℃で保存される。
【００３４】
あるいは、懸濁液は、上清が短期間のうちに使用されることが意図される場合、凍結乾燥なしに２℃〜８℃で保存されうる。
【００３５】
（５）再構成及び放射性標識
凍結乾燥した大凝集体は、無菌で発熱物質無しの過テクネチウム酸ナトリウムTc-99mの溶液で再構成され、ヒト血清アルブミンのTc-99m放射性標識大凝集体の懸濁液を形成する。凍結乾燥されていない大凝集体の懸濁液が使用される場合、無菌で発熱物質無しの過テクネチウム酸ナトリウムTc-99mの溶液が、大凝集体の懸濁液に直接添加される。テクネチウムは、原子番号４３の金属性の放射性合成化学元素である。テクネチウム−９９ｍ（Ｔｃ）は、６．０時間の半減期を有し、且つ主にガンマ線を放射するテクネチウムの放射性同位体である。99mTcは、器官、例えば脳、肺、心臓、肝臓及び腎臓のスキャニングのための調製物において使用される。大凝集体の懸濁液を放射性標識するために、テクネチウムの起源は水溶性であるべきであり、好ましくは当業界で周知で、且つ市販されている99mTcの発生源由来の過テクネチウム酸ナトリウムの形態である。典型的に、99mTc発生源由来の１〜３ｍｌの溶出液が、所望の放射性レベルを達成するために使用される。これは、大凝集体１ｍｇ当たり最大約５〜２０ｍＣｉのTcO4を提供する。99mTcの発生源から得られた溶出液は、大凝集体の懸濁液と混合され、そして患者の血流中に注入される。投与量は、実施される試験の性質及び当該試験が実施される対象者の性質に依存して、体重１ｋｇ当たり約１〜約４００μＣｉに及ぶ。
【００３６】
肺スキャンにとって、大凝集体１ｍｇ当たり１５〜２０ mCi TcO-4を有する大凝集体の懸濁液が好ましい。静脈内注射の３〜１０分後、患者の肺は９０〜９５％の注射された99mTcを含む。病状が存在する場合、それは患者の肺をラジオスキャンし、そして得られた放射パターンを標準的なパターンと比較することによって決定される。
【００３７】
大凝集体の好ましい範囲及びバイアル当たりの補助剤を表Iに示す。
【表１】
2004521920.tif 000002
【００３８】
最も好ましい投与量及び補助剤を表IIに示す。
【表２】
2004521920.tif 000003
【００３９】
以下の例は本発明を例示する。
【００４０】
例１
試薬の調製
注射用水
２０．０リットルの脱イオン水を、２つのステンレス鋼の圧力バイアルのそれぞれに加えた。当該バイアルに封をし、そしてオートクレーブにかけた。一方のバイアルを室温で保持し、そして他方のものを２℃〜１０℃で保持した。
【００４１】
窒素パージした注射用水
１３リットルの収容能力のアスピレーターボトルに対し、１０リットルの注射用水を加え、そして使用３０分前に、窒素で水を泡立たせた。
【００４２】
０．９％w/v NaCl溶液
６３０．０ｇのNaClを７０．０リットルの注射用水に溶解した。溶液は、０．２ミクロンのフィルター、例えばMllipak 60 MPGL又はMillidisk 40を介して無菌タンク内へと濾過滅菌した。
【００４３】
精製アルブミンの調製(5% w/v ヒトアルブミン)
５リットルの0.9% w/v NaCl溶液を、目盛り付きの１０リットルの収容能力を有する瓶内に移した。１リットルの25% w/v ヒト血清 アルブミンを当該瓶に加え、そして均一な溶液が得られるまでよく混合した。続いて、当該溶液は、ヒト血清アルブミンを精製するために、十分量の0.9% w/v NaCl溶液を用いて、１０，０００の名目上の分子量限界の多孔度を有する膜を含む限外濾過系を介して再循環させた。精製後、精製したヒト血清アルブミンの体積を限外濾過によって約２リットルに減少させた。当該系に残っている精製ヒト血清アルブミンは、0.9% w/v NaCl溶液をすすぎ剤として用いて回収した。アルブミン溶液の体積は、追加の0.9% w/v NaCl溶液を用いて４リットルに調整し、そしてよく混合した。アリコートを採取し、そしてアッセイし、そして終濃度を、追加の0.9% w/v NaCl溶液を用いて50 mg/ml (5% w/v)精製ヒト血清 アルブミンに調整した。
【００４４】
1M (pH 5.10)酢酸緩衝液の調製
41.0gの酢酸ナトリウムを300mlの窒素パージした注射用水中に溶解した。12mlの濃酢酸を添加し、そしてよく混合した。溶液は、窒素パージした注射用水を用いて500mlに希釈された。pHは5.0であった。
【００４５】
第一塩化スズ溶液の調製
4.30gの塩化第一スズを4.8mlの濃塩酸中に溶解した。
【００４６】
大凝集体の生成過程
351mlの1M(pH 5.1)酢酸緩衝液、876mlの窒素パージした注射用水及び613mlの精製アルブミンを、０．２ミクロンのフィルター(Millipak 60 MPGL又はMillidisk 40)を介して、窒素圧力下で、無菌の反応ケトル内に濾過した。試薬混合物を数分間攪拌した。攪拌しながら、640mlの第一塩化スズ溶液を、０．２ミクロンのフィルターを介して、窒素圧力下で、無菌の反応ケトル内に濾過し、反応混合物を構成した。
【００４７】
反応混合物は、約260rpmで攪拌しながら、コンピューター化された工程の制御装置(CPC)を用いて、１００分以内（±５分）に室温から８０℃に加熱された。時間／温度勾配は表IIIに示したとおりである。
【表３】
2004521920.tif 000004
【００４８】
この段階の完了時に、混合物は大凝集体を含んでいた。スターラーから離し、そして大凝集体を含む反応ケトルを、冷却した（２℃〜１０℃）の注射用の滅菌水を含む冷却槽内に据えた。スターラーと再び接続し、そして攪拌は約260rpmで再開した。バッチ温度が２５℃（±５℃）に達したとき、攪拌を停止し、そしてケトルを浴槽から離した。この段階の完了時に、混合物は変性した大凝集アルブミンを含んでいた。
【００４９】
大凝集体を含む混合物は、ねじ蓋を有する滅菌ポリプロピレン遠心管内に移された。混合物を２５００±１００rpmで約５分間遠心した。上清をデカントし、そして廃棄した。大凝集アルブミンは、希釈剤として注射用の滅菌水を用いて、各遠心管内で600mlに再懸濁した。再懸濁した大凝集アルブミンを、７５ミクロンの無菌サイジングスクリーンを介して無菌の計量済みのバイアル内に移し、そしてバルクの大凝集アルブミンの体積を、注射用の滅菌水を用いて３．０リットルに調整した。
【００５０】
タンパク質濃度、すなわち、大凝集アルブミンの濃度が決定され、そして、存在する大凝集アルブミンの合計量に基づき、1.5mg/mlの大凝集アルブミンを含む比（最終バッチ）体積が算出された。精製したヒト血清アルブミンは、その後の凍結乾燥の間の大凝集のために且つ保存期間を向上させるために、安定化剤として添加された。既に算出された最終バッチ体積は、10 mg/mlの最終濃度に必要とされる精製アルブミンの量を決定するために使用された。注射用の滅菌水及び5% w/vの精製アルブミンは、無菌の０．２ミクロンのフィルターに精製アルブミンを通過させることによって懸濁液に添加された。
【００５１】
大凝集体を含む懸濁液の1.0mlのアリコートが、溝付きのストッパーを取り付けた、無菌で発熱物質無しのバイアルに無菌的に移された。当該バイアルの中身は乾燥状態に凍結乾燥された。当該バイアルを無菌の窒素で満たし、ストッパーを載せ、アルミニウムのシールで封をされた。
【００５２】
生成物は、１〜３ｍｌの無菌の99mTcの過テクネチウム酸溶液を、凍結乾燥物を含むバイアルに徐々に注入し、凍結乾燥した材料が懸濁液を形成するために穏やかにバイアルを振とうすることによって再構成された。
【００５３】
当該方法によって得られた生成物の特徴を表IVに示す。
【表４】
2004521920.tif 000005
【００５４】
例２
重要な安定性を示すパラメーター、すなわち上清の活性(SA)、放射化学的純度(RCP)、粒径分布及び平均粒径の測定が３つの典型的なバッチで実施された。SA及びRCPは、室温(RT)及び４０℃で、再構成５分後の試料で測定された。SAは、再構成された放射性標識懸濁液の２つのアリコートのうちのそれぞれを、計数管A及びB内にピペットで分けて遠心することによって決定した。管Aを遠心し、その後上清を第三の計数管C内に除去した。管B及びCの放射能が測定され、そしてSAが%SA=C/Bx100の方程式から算出される。
【００５５】
RCPは、再構成された放射性標識懸濁液がWhatman No.3クロマトグラフィーペーパーのストリップの底辺から約2cm（起点）にスポットされ、そして乾燥させられたペーパークロマトグラフィーを上昇させることによって決定された。当該ストリップは、溶媒の先端が起点から約２ｃｍ移動するまで、７０％メタノールの水性混合物中でクロマトグラフィーを上らせることによって展開される。ストリップは乾燥させられ、そして起点の１ｃｍ上で切断される。ストリップの起源及び先端部は、別々の計数管A及びB内にそれぞれ据えられ、そして放射能が決定される。アルブミンに結合した99mTcは、起点からストリップのより下の部分に留まり、結合していない99mTcはストリップのより上の部分にある。２つのセグメントの合計の放射能(C)は、AとBで見られる放射能の合計によって決定される。RCPは、結合した99mTc(%)=A/Cx100の方程式から決定される。
【００５６】
粒径分布は、血球計算板を用いて、光学顕微鏡によって決定された。１００粒子以上の長さが測定され、そして１０〜５０ミクロンの範囲内の粒子のパーセントが決定された。平均粒径は式：
【数１】
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（ここで、ni=特定の粒径の範囲内にある粒子の数；
di=当該粒径の範囲の中点；及び
n=合計；測定した粒子の数、である。）
【表５】
2004521920.tif 000007
【００５７】
本発明の説明によって、変更及び修飾が本発明の精神及び範囲内で達成されうることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、本発明の工程のフローダイアグラムである。
【図１−１】
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【図１−２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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