(57)【要約】本発明は、コルチコトロピン放出因子サブタイプ−２（ＣＲＦ２）レセプターのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、齧歯目脳におけるＣＲＦ２レセプター発現を実質的に減少させるオリゴヌクレオチドおよび遺伝子発現のインビボＣＮＳ研究におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用および、不安、強迫障害、パニック障害、外傷後ストレス障害、恐怖症および鬱病を含む広い範囲の精神医学的障害の処置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害の処置方法であって、それを必要としている患者に、治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与することを含む方法。
【請求項２】
ＣＲＦ１レセプターリガンドがＣＲＦ１レセプターに対してアゴニスト性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＲＦ１レセプターリガンドがＣＲＦ１レセプターに対してアンタゴニスト性である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＲＦ２レセプターリガンドがＣＲＦ２レセプターに対してアゴニスト性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＣＲＦ２レセプターリガンドがＣＲＦ２レセプターに対してアンタゴニスト性である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害の処置方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与する（ここにＣＲＦ２リガンドレセプターは、１０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである）ことを含む方法。
【請求項７】
修飾ヌクレオチド残基が以下からなる群から選択される、請求項６に記載の方法：
２’−メトキシリボヌクレオチドホスホジエステル、２’−メトキシ−エトキシリボヌクレオチドホスホジエステル、２’−フルオロ−リボヌクレオチドホスホジエステル、５−（１−プロピニル） シトシンホスホロチオエート、５−（１−プロピニル） ウラシルホスホロチオエート、５−メチルシトシンホスホロチオエート、２’−デオキシリボヌクレオチド−Ｎ３’−Ｐ５’ ホスホルアミデート、ポリアミド核酸、および式：
【化１】
2004513880.tif 000007
［式中、Ｂはプリンまたはピリミジン塩基である］
で示されるロックされた核酸。
【請求項８】
オリゴヌクレオチドが約１５〜約２５ヌクレオチド長である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの６０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されている、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが以下の配列を含む、請求項６に記載の方法：
【表１】
2004513880.tif 000008
。
【請求項１１】
障害が精神医学的障害である、請求項１または６に記載の方法。
【請求項１２】
精神医学的障害が、不安、強迫障害、パニック障害、外傷後ストレス障害、恐怖症および鬱病からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
障害が、頭部外傷、脊髄外傷、虚血性ニューロン損傷（例えば脳海馬虚血のような脳虚血）、興奮毒性ニューロン損傷、てんかん、発作、ストレス誘発性免疫不全、恐怖症、筋痙攣、パーキンソン疾患、ハンチントン疾患、尿失禁、アルツハイマー型の老年痴呆、脳血管性痴呆、筋萎縮性側索硬化症、化学物質依存症および耽溺症（例えばアルコール、コカイン、ヘロイン、ベンゾジアゼピンまたは他の薬物に対する依存症）、および低血糖症からなる群から選択される、請求項１または６に記載の方法。
【請求項１４】
ＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンドが同時に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンドが連続して投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害の処置方法であって、有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンドを、ＣＲＦ１レセプターおよびＣＲＦ２レセプターを含有する組成物と接触させることを含む方法。
【請求項１７】
有効量のＣＲＦ２レセプターリガンドを、ＣＲＦ２レセプターを含有する組成物と接触させることを含む、ＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害の処置方法。
【請求項１８】
ＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグ、および医薬的担体を含む医薬組成物。
【請求項１９】
ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置または予防するための医薬キットであって、複数の別個の容器を含み、少なくとも１個の容器がＣＲＦ１レセプターリガンド、または製薬的に許容されるその塩またはプロドラッグを含有し、少なくとも１個の別の容器がＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるその塩またはプロドラッグを含有し、さらにこれらの容器が任意的に医薬的担体を含有するキット。
【請求項２０】
ＣＲＦ１レセプターリガンド活性およびＣＲＦ２レセプターリガンド活性を有する、精神医学的障害の処置において使用するための化合物。
【請求項２１】
ＣＲＦ１レセプターリガンドがＤＰＣ９０４またはＳＣ−２４１である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＲＦ２レセプターリガンドがサウバジン、ウロコルチンまたは他のＣＲＦ２ペプチドである、請求項４に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＲＦ２レセプターリガンドが抗サウバジンである、請求項５に記載の方法。
【請求項２４】
精神医学的障害の処置を増強する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与することを含む方法。
【請求項２５】
精神医学的障害の処置を増強する方法であって、それを必要としている患者にＣＲＦ１リガンドレセプターおよびＣＲＦ２リガンドレセプター活性を有する化合物、または製薬的に許容されるその塩またはプロドラッグの治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項２６】
化合物がアストレシンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが表１に記載される領域を標的とする、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する分野
本発明は、ＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド、またはそれらの製薬的に許容される塩またはプロドラッグを含む医薬組成物；およびＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性が関連する障害の処置方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与することを含む方法（ここに本発明のＣＲＦレセプターリガンドはＣＲＦレセプターのアゴニストまたはアンタゴニストである）に関する。本発明の医薬的標的はＣＲＦレセプターであることに加えて、本発明はまた、標的がＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプターｍＲＮＡである医薬物質に関する。
【０００２】
発明の背景
詳細にわたる実験により、下垂体−副腎皮質系の制御および、ストレスに対する行動、自律および免疫応答の媒介におけるコルチコトロピン放出因子（ＣＲＦ）の重要性が確立された。これによると、このペプチドは情緒性障害の病態生理学に関与すると考えられる。現在、ＣＲＦの作用を媒介する２つの７回膜貫通レセプター、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２が同定されている。両レセプターは脳内で広く発現されるが、この２つのレセプターサブタイプが高度に発現する領域の間に有意な重複はほとんど見られない。ＣＲＦ−過剰発現トランスジェニックマウスは不安原性（不安を生じさせる）行動の増加を示すことが報告された（Ｓｔｅｎｚｅｌ−Ｐｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ．， Ｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｉｃｅ： Ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｘｉｏｇｅｎｉｃ ｂｅｈａｖｉｏｒ．　Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １４， ２５７９−２５８４， １９９５）。特に重要なのは、これらの不安原性応答が、ＣＲＦ１レセプター、ＣＲＦ２レセプターまたは両者に対するＣＲＦ作用を介して媒介されるかどうかの問題である。
【０００３】
コルチコトロピン−放出因子（ＣＲＦ）アンタゴニストは米国特許第４，６０５，６４２号、第５，８７４，２２７号、第５，９６２，４７９号、第５，０６３，２４５号、第５，８６１，３９８号および第６，０８３，９４８号（これらは引用によりその全開示内容が本明細書中に包含される）に記載されている。いくつかの公開された特許出願はまた、コルチコトロピン放出因子アンタゴニスト化合物を開示しており、これらのうちには、ＤｕＰｏｎｔ Ｍｅｒｃｋ ＰＣＴ出願ＵＳ９４／１１０５０、Ｐｆｉｚｅｒ ＷＯ９５／３３７５０、Ｐｆｉｚｅｒ ＷＯ９５／３４５６３、Ｐｆｉｚｅｒ ＷＯ９５／３３７２７および米国特許第５，４２４，３１１号がある。ＣＲＦアンタゴニストで処置可能であると考えられる疾患は、米国特許第５，０６３，２４５号および Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｖ．， ４３： ４２５−４７３ （１９９１） に議論されている。
【０００４】
ＣＲＦの役割はまた、アルツハイマー疾患、パーキンソン疾患、ハンチントン疾患、神経性無食欲症、進行性核上性麻痺および萎縮性側索硬化症の病因論および病態生理学にあると仮定された。これはこれらが中枢神経系のＣＲＦニューロンの機能不全に関連しているからである［再考に関して、Ｅ． Ｂ． Ｄｅ Ｓｏｕｚａ， Ｈｏｓｐ． Ｐｒａｃｔｉｃｅ ２３：５９ （１９８８）； Ｇ． Ｎ． Ｓｍａｇｉｎ， Ｌ． Ａ． Ｈｏｗｅｌｌ， Ｄ． Ｈ． Ｒｙａｎ， Ｅ． Ｂ． Ｄｅ Ｓｏｕｚａ ａｎｄ Ｒ． Ｂ． Ｓ． Ｈａｒｒｉｓ Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ９， １６０１−１６０１， １９９８； および Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒａｐ．， ２９３， ７００−８０６， ２０００；］。引用によりその全開示内容が本明細書中に包含される米国特許第６，０５１，５７８号は、頭部外傷、脊髄外傷、虚血性ニューロン損傷（例えば脳海馬虚血のような脳虚血）、興奮毒性ニューロン損傷、てんかん、発作、ストレス誘発性免疫不全、恐怖症、筋痙攣、パーキンソン疾患、ハンチントン疾患、尿失禁、アルツハイマー型の老年痴呆、脳血管性痴呆、筋萎縮性側索硬化症、化学物質依存症および耽溺症（例えばアルコール、コカイン、ヘロイン、ベンゾジアゼピンまたは他の薬物に対する依存症）、および低血糖症の処置および予防に有用な（ＣＲＦ）レセプターアンタゴニストを開示する。
【０００５】
引用によりその全開示内容が本明細書中に包含される、米国特許第６，００１，８０７号は、嘔吐の処置および予防に有用な（ＣＲＦ）レセプターアンタゴニストを開示する。ＣＲＦ−アンタゴニストの抗嘔吐活性は、例えば Ｕｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４１： ５１３−５１８ （１９８７）； および Ｒｕｄｄ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １１９： ９３１−９３６ （１９９６） に記載されているように行われる実験によって示される。
【０００６】
また、多数の刊行物がＣＲＦ１レセプターアンタゴニストを開示している（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３９： ４３５８−４３６０ （１９９６）； Ｗｈｉｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３９： ４３５４−４３５７ （１９９６）； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４０ （１１） １７４９−１７５４ （１９９７）； Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｙ． ３０９， １９８−２００， １９９６； および Ｍａｎｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｙ． ３２３， ２１−２６， １９９７ （これらは引用によりその全開示内容が本明細書中に包含される））。より具体的には、ＣＲＦ１レセプターリガンドＤＰＣ９０４は、Ｇｉｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＯｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ． ８， １８１−１８９， ２０００（これは引用によりその全開示内容が本明細書中に包含される）に開示されている。
【０００７】
また、ＣＲＦ２レセプターリガンド、例えばサウバジン（ｓａｕｖａｇｉｎｅ）、ウロコルチンおよび他のＣＲＦ２ペプチドは、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ６， １１， １９９８； Ｊ． Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ９， １４０−１４５， １９９８ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＦ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ； および Ｄ． Ｐ． Ｂｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ １， ２６５−２７７， １９９６（これは引用によりその全開示内容が本明細書中に包含される）に開示されている。
【０００８】
選択的アンタゴニストによるＣＲＦ１レセプターの遮断は、動物において不安緩解性（不安−減少性）および抗鬱作用を生じさせることが示されているが、ＣＲＦ２レセプターの機能は十分に研究されていない。インサイチュハイブリダイゼーションおよびレセプターオートラジオフラフィー実験により、このレセプターが主に辺縁系および視床下部の脳領域に局在することが示され、これはＣＲＦの不安原性および摂食障害作用の媒介における役割を示唆する。最近、ＣＲＦ２選択的アンタゴニスト（抗サウバジン３０）が同定された（Ｇｕｌｙａｓ Ｊ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２， １０５７５−５７９）。さらに、二重ＣＲＦ１およびＣＲＦ２活性を有するペプチド、アストレシン（Ａｓｔｒｅｓｓｉｎ）が同定された（Ｒｕｈｍａｎｎ， Ａ．， Ｂｏｎｋ， Ｉ．， Ｌｉｎ， Ｃ． Ｒ．， Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ， Ｍ． Ｇ． ＆ Ｓｐｉｅｓｓ， Ｊ． （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５， １５２６４−１５２６９）。このレセプターに対する特定のアゴニストまたはアンタゴニストの不存在下では、ＣＲＦ２レセプター発現のアンチセンス抑制は正常な生理学上のこのレセプターの役割に関する証拠を提供することができる。
【０００９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ部分に相補的であるように設計されている短いオリゴヌクレオチド（典型的には、約１５〜約２５ヌクレオチド長）である。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ワトソンクリック塩基対形成により、そのｍＲＮＡ標的部位へハイブリダイゼーションすると、標的ｍＲＮＡ分子のオリゴヌクレオチド指向性分解を終結させるイベントのカスケードが開始される。このｍＲＮＡ分解はダイレクトに、そのコード化タンパク質合成の抑制に結び付く。標的タンパク質の量が有意に減少する実験では、その機能が示され得る。（ＣＲＦ２レセプターを用いる場合のような）小分子リガンドの不存在下では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質の機能を研究するために極めて有用なツールである。さらに、これらを用いて、ファミリータンパク質の密接に関連するメンバー（例えばＣＲＦ１およびＣＲＦ２）を区別できる（これは小分子リガンドを用いた場合、しばしば不可能である）。
【００１０】
効果的なアンチセンス配列の設計および選択は簡単な作業ではない。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、そのｍＲＮＡ標的が有意な二次または三次構造を有し、これが大部分のｍＲＮＡ分子をハイブリダイズしにくくするため、その活性の点で大きく予測不能に変化する。２０〜３５％のアンチセンス配列しか有意な阻害活性（５０％またはそれ以上）を示さない。我々が開発した分子技術（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−１ ｍＲＮＡ ａｒｅ ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｍａｐｐｉｎｇ ＲＮＡ−ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｉｔｅｓ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ． Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４， １９０１−１９０７， １９９６； Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １６， ５９−６３， １９９８）を用いて、ＣＲＦ２レセプターｍＲＮＡの複数の利用可能領域を同定した。これらの利用可能部位を指向するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２５Ｉ−サウバジンのＣＲＦ２レセプターへの結合をインビボで少なくとも５０％阻害した。
【００１１】
ＣＲＦ２レセプターの機能を試験する２アンチセンス実験が報告されている。両実験は、ＣＲＦの不安原性作用の媒介についてのＣＲＦ２レセプターの関与に関する証拠を見出していない。しかし、１実験（Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ＣＲＦ１ ｂｕｔ ｎｏｔ ＣＲＦ２， ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｍｅｄｉａｔｅ ａｎｘｉｏｇｅｎｉｃ−ｌｉｋｅ ｂｅｈａｖｉｏｒ． Ｒｅｇ． Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ７１， １５−２１， １９９７）では、ＣＲＦ２レセプターは１５〜２０％しか減少せず、使用したオリゴヌクレオチドは毒性副作用（有意な体重喪失）を生じ、これは行動実験を混同させた。第二の報告（Ｍｏｎｔｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｌ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ ３９， ５６６， １９９６； および Ｌｉｅｂｓｃｈ， Ｇ．， Ｌａｎｄｇａｒｆ， Ｒ．， Ｅｎｇｅｌｍａｎｎ， Ｍ． Ｌｏｒｓｃｈｅｒ， Ｐ． ＆ Ｈｏｌｓｂｏｅｒ， Ｆ． （１９９９） Ｊ． Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ Ｒｅｓ． ３３， １５３−１６３）では詳細がほとんど提供されていない。
【００１２】
しかし、ＣＲＦ２アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる実験（これは、その全開示内容が本明細書中に包含される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／０８１９号および米国特許出願第０９／４８１９８１号に記載されている）では、我々はＣＲＦ２レセプター発現の抑制が動物における不安原性作用を生じさせることを発見した。
【００１３】
さらに、我々は、ＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドをＣＲＦ１レセプターリガンドと同時投与すると、不安緩解作用が大きく高められることを発見した。
【００１４】
発明の要旨
本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与することを含む方法に関する。
【００１５】
一態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与する（ここにＣＲＦ１リガンドレセプターはＣＲＦ１レセプターに対してアゴニスト性である）ことを含む方法を提供する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与する（ここにＣＲＦ１リガンドレセプターはＣＲＦ１レセプターに対してアンタゴニスト性である）ことを含む方法を提供する。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与する（ここにＣＲＦ２リガンドレセプターはＣＲＦ２レセプターに対してアゴニスト性である）ことを含む方法を提供する。
【００１８】
さらに別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与する（ここにＣＲＦ２リガンドレセプターはＣＲＦ２レセプターに対してアンタゴニスト性である）ことを含む方法を提供する。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与する（ここにＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである）ことを含む方法を提供する。
【００２０】
さらに別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与する（ここにＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が以下の群から選択される修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである）ことを含む方法を提供する：
２’−メトキシリボヌクレオチドホスホジエステル、２’−メトキシ−エトキシリボヌクレオチドホスホジエステル、２’−フルオロ−リボヌクレオチドホスホジエステル、５−（１−プロピニル） シトシンホスホロチオエート、５−（１−プロピニル） ウラシルホスホロチオエート、５−メチルシトシンホスホロチオエート、２’−デオキシリボヌクレオチド−Ｎ３’−Ｐ５’ ホスホルアミデート、およびポリアミド核酸、および式：
【化２】
2004513880.tif 000002
［式中、Ｂはプリンまたはピリミジン塩基である］
で示されるロックされた核酸。
【００２１】
さらに別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与する（ここにＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、このオリゴヌクレオチドは約１５〜約２５ヌクレオチド長である）ことを含む方法を提供する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与する（ここにＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの６０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである）ことを含む方法を提供する。
【００２３】
さらに別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与する（ここにＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドである）ことを含む方法を提供する：
【表２】
2004513880.tif 000003
。
【００２４】
さらに別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与することを含み、この障害が精神医学的障害である方法を提供する。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する精神医学的障害を処置する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与することを含み、この精神医学的障害が、不安、強迫障害、パニック障害、外傷後ストレス障害、恐怖症、神経性無食欲症、および鬱病からなる群から選択される方法を提供する。
【００２６】
別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与することを含み、この障害が頭部外傷、脊髄外傷、虚血性ニューロン損傷（例えば脳海馬虚血のような脳虚血）、興奮毒性ニューロン損傷、てんかん、発作、ストレス誘発性免疫不全、恐怖症、筋痙攣、パーキンソン疾患、ハンチントン疾患、尿失禁、アルツハイマー型の老年痴呆、脳血管性痴呆、筋萎縮性側索硬化症、化学物質依存症および耽溺症（例えばアルコール、コカイン、ヘロイン、ベンゾジアゼピンまたは他の薬物に対する依存症）、および低血糖症からなる群から選択される方法を提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与することを含み、ここにＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンドが同時に投与される方法を提供する。
【００２８】
さらに別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、それを必要としている患者に治療有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグを投与することを含み、ここにＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンドが連続して投与される方法を提供する。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンドを、ＣＲＦ１レセプターおよびＣＲＦ２レセプターを含有する組成物と接触させることを含む方法を提供する。
【００３０】
さらに別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置する方法であって、有効量のＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＣＲＦ１レセプターを含有する組成物と接触させることを含み、ここにＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドが、１０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドである方法を提供する。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、有効量のＣＲＦ２レセプターリガンドを、ＣＲＦ２レセプターを含有する組成物と接触させることを含む、ＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害の処置に関する。
【００３２】
さらに別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるそれらの塩またはプロドラッグ、および医薬的担体を含む医薬組成物を提供する。
【００３３】
さらに別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置または予防するための医薬キットであって、複数の別個の容器を含み、少なくとも１個の容器がＣＲＦ１レセプターリガンド、または製薬的に許容されるその塩またはプロドラッグを含有し、少なくとも１個の別の容器がＣＲＦ２レセプターリガンド、または製薬的に許容されるその塩またはプロドラッグを含有し、さらにこれらの容器が任意的に医薬的担体を含有するキットを提供する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプター活性に関連する障害を処置または予防するための医薬キットであって、複数の別個の容器を含み、少なくとも１個の容器がＣＲＦ１レセプターリガンド、または製薬的に許容されるその塩またはプロドラッグを含有し、少なくとも１個の別の容器がＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチド、または製薬的に許容されるその塩またはプロドラッグを含有し、さらにこれらの容器が任意的に医薬的担体を含有するキットを提供する。
【００３５】
さらに別の態様では、本発明は、精神医学的障害の処置において使用するための、ＣＲＦ１レセプターリガンド活性およびＣＲＦ２レセプターリガンド活性を有する化合物を提供する。
【００３６】
さらに別の態様では、本発明は、齧歯目脳内のＣＲＦ２レセプター発現を実質的に減少させる、ＣＲＦ２レセプターのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。これらのオリゴヌクレオチドを用いるＣＲＦ２レセプター機能の抑制は、動物において有意な不安緩解（不安を減少させる）作用を生じさせた。これらのデータは、ＣＲＦ２レセプターがコルチコトロピン放出因子の不安原性（不安を生じさせる）作用の媒介において重要な役割を担うことの第一の機能的証拠を提供する。さらにこのデータは、小さい分子を含むＣＲＦ２レセプターアンタゴニストの効力が、不安、強迫障害、パニック障害、外傷後ストレス障害、恐怖症および鬱病を含む広い範囲の精神医学的障害の処置に有効であることを示す。
【００３７】
さらなる態様では、本発明は、患者における、不安、強迫障害、パニック障害、外傷後ストレス障害、恐怖症および鬱病を含むが、これらに限定されない精神医学的障害を処置する方法であって、その処置を必要としている患者に、１０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む治療有効量の医薬組成物を投与することによる方法を提供する。
【００３８】
さらに別の態様では、本発明は、不安、強迫障害、パニック障害、外傷後ストレス障害、恐怖症および鬱病を含むがこれらに限定されない精神医学的障害の処置活性を決定するための、化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００３９】
さらに別の態様では、本発明は、１０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００４０】
本発明の特定の態様は、例示および説明のために選択されたものであり、いかなる意味においても、本発明の範囲を限定することを意図しない。本発明のこれらの態様は添付した図面に示されている。
【００４１】
発明の詳細な説明
すべてのオリゴヌクレオチドが阻害活性を増強可能なわけではなく、ＣＲＦ２レセプターｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドもその規則の例外ではない。活性なアンチセンス配列の同定は、アンチセンス実験の成功を決定するより重要なパラメータの１つである。アンチセンス配列の効力に影響する要因は複雑であり、理解は乏しい；その結果、標的とされるタンパク質合成に対する５０％阻害作用を生じさせるのに十分な活性を有するものは、試験されるアンチセンスオリゴヌクレオチドの２０〜３５％でしかない。
【００４２】
活性なアンチセンス配列の選択は、おおいに経験的であり、かなり時間を要するものである。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドとのハイブリダイズに関して最も利用可能なｍＲＮＡ分子上の部位を決定する方法が工夫された（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６； Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。これは、ＲＮＡ転写物を、化学的に合成された半ランダムオリゴヌクレオチドのライブラリー（図１ｂ）でプローブすることによって達成された（図１ａ）。いっしょに混合された場合、このＲＮＡの利用可能領域は、ライブラリー内に見出せる相補的配列とハイブリダイズするはずである。これらの領域は、次いでリボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）を用いて同定される。このリボヌクレアーゼＨは、ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖のみのホスホジエステルバックボーンの加水分解を触媒するものである。生じたＲＮＡ断片を配列決定すると、特定のｍＲＮＡ配列内のこれらの領域が同定可能であるはずであり、これらの領域はアンチセンスオリゴヌクレオチドを標的化するための部位となり得るものである。ＣＲＦ２レセプターｍＲＮＡの完全コード領域を含有するＲＮＡ転写物に対してこのＲＮＡマッピング法を適用することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに利用可能な複数のＲＮＡ部位を同定できる（表１）。
【００４３】
表１
【表３】
2004513880.tif 000004
表１：ＣＲＦ２レセプターｍＲＮＡ内のオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションに利用可能な部位。配列情報はＲＮＵ１６２５３．ＧＢ＿ＲＯ（ＧｅｎＢａｎｋ 配列、受け入れ番号Ｕ１６２５３）。
【００４４】
１５〜２５ヌクレオチド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、表１に提供されるデータによって特定される利用可能部位にアンチセンスオリゴヌクレオチドの５’末端を標的化することによって設計できる。例えば、以下に記載の実験において用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、利用可能部位Ｅの部位７５８〜７７７に標的化された２０ヌクレオチドの配列（ＴＧＡ ＣＧＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＡＣＣ ＡＧＡ ＣＣ）である。
【００４５】
これらの部位のいくつかに対するアンチセンス配列は、細胞に基づくアッセイにおいてＣＲＦ２レセプター合成を少なくとも５０％阻害する。これは、１２５Ｉ−サウバジンを用いるＣＲＦ２放射性リガンド結合アッセイによって決定された。アンチセンス阻害は配列特異的であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドの４塩基ミスマッチは１２５Ｉ−サウバジン結合の極めて少ない減少しか生じさせない。さらに、これらの配列はまた、インビボＣＲＦ２レセプター合成を抑制した。
【００４６】
ＣＮＳインビボアンチセンス実験において最も一般的に用いられる２つの化学バージョンのオリゴヌクレオチドは、２’−デオキシリボヌクレオチドホスホジエステルオリゴヌクレオチドおよび２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである（図２ａ）。遺伝子中の二本鎖ＤＮＡと化学構造が同一であっても、一本鎖ホスホジエステルオリゴヌクレオチドはエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ分解を受けやすく、血清中の半減期は２０分である。低いレベルのヌクレアーゼ活性を有する脳内の「特別扱いされる」環境においてさえ、よりゆっくりではあるが、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドは分解される。架橋されていないリン酸の酸素分子の１つが硫黄で置換されているホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、分解酵素に対してよりずっと耐性である。血清中および組織培養実験において、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは１２時間を超える半減期を有し、ラット脳から抽出されたホスホロチオエートの分析により、これらのオリゴヌクレオチドが、少なくとも２４時間、化学的に無傷であることが示される。しかし、脳内におけるこれらのオリゴヌクレオチドの投与は、化学的に関連するが配列特異的ではない毒性作用を生じる。熱性応答、炎症媒介物の誘発、体重喪失および種々の臨床的徴候が最近報告された。我々の実験では、ホスホロチオエート化学を含有するＣＲＦ２アンチセンス配列は、ＣＲＦ２レセプターに対して大きな阻害作用を生じさせたが、処置された動物において、（Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓ の報告と同様の）重大な重量喪失およびホストの病態生理学的徴候群を引き起こした。これらの作用は多数の種々の配列、アンチセンスならびにコントロール配列を用いて観察され、それが標的関連性の作用である可能性が除外された。
【００４７】
これらのオリゴヌクレオチド中のホスホロチオエート全含量を減少させるストラテジーは、これらの毒性を回避しつつオリゴヌクレオチド効力を維持するのに最も有効であった。６０％までの２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾リボヌクレオチドホスホジエステル残基で置換されたキメラオリゴヌクレオチド（図２ｂ）は、重量喪失および他のすべての毒性徴候を排除した。残りの４０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基は隣接する区間に存在し、標的ｍＲＮＡ種のＲＮアーゼＨ分解を促進する（図２ｃ）。また、他の化学的アナログ、例えば５−プロピニル−２’−デオキシシチジン、５−プロピニル−２’−デオキシウリジンおよび５−メチル−２’−デオキシシチジン（ホスホロチオエート連結を伴わない（図２ｂ））を包含させると、これらの毒性作用が大きく減少した。減少した毒性を有することに加えて、これらの修飾ヌクレオチド残基は、２’−デオキシリボヌクレオチドホスホジエステル残基より細胞性のヌクレアーゼ分解に耐性である。
【００４８】
小さいアンチセンス阻害作用から生じる機能的変化がないと、しばしば、解釈不能な結果が導かれる。これは、実験が真にネガティブな結果を生じたかどうか、あるいはアンチセンス阻害が機能的変化を表すのに十分でないかどうかが不確定であるせいである。アンチセンス配列に加えて、アンチセンス阻害作用の大きさは、アンチセンス処置の期間および標的タンパク質の半減期に対するその関連に影響される。ＣＲＦ２レセプターの半減期は不明であるが、齧歯目脳内の他の７回膜貫通レセプター（ＣＲＦ２レセプターはそのメンバーである）の半減期は２〜３日のオーダーである。最大の阻害作用は、典型的に、少なくとも３タンパク質の半減期に関してアンチセンス処理後に見られた。５日間のＣＲＦ２アンチセンス投与により、このレセプターの４０〜５０％阻害が生じ、投与期間を９日にすると、レセプター結合の７０〜８０％阻害作用が導かれた。さらに、定量的インサイチュハイブリダイゼーションによれば、ＣＲＦ２レセプターｍＲＮＡの同等の減少が示された。４塩基ミスマッチコントロールオリゴヌクレオチドは、これらの条件下、レセプターおよびｍＲＮＡ結合の両者に関して極めて少ない減少を生じたのみであった。したがって、ＣＲＦ２アンチセンスオリゴヌクレオチドが、処置された動物において、重大な重量喪失と同時に、１５〜２０％のＣＲＦ２レセプター減少しか生じさせなかった Ｈｅｉｎｒｉｃｈｓ ｅｔ ａｌ． とは対照的に、我々はアンチセンス試薬をＣＲＦ２レセプター機能の実験に関して最適化した。最適化されたヌクレオチド化学と組み合わせて、ＲＮＡマッピング法を用い、アンチセンス配列を選択することにより、強力なアンチセンス配列が得られ、これは齧歯目に８〜１０日間投与された場合、ＣＲＦ２レセプター結合の大きな（約７０％の）減少を生じさせた。
【００４９】
ＣＲＦ２アンチセンスオリゴヌクレオチドを、外側中隔（高レベルのＣＲＦ２レセプターおよびｍＲＮＡを含有する脳領域）を標的として脳室内投与した。外側中隔は、恐れおよび情緒の調節に関与することが知られている辺縁系脳領域の部分である。食塩水、アンチセンスおよびミスマッチ−コントロールオリゴヌクレオチドで処置されたラットを２つの異なる不安の行動モデルにおいて試験した。齧歯目は恐れや不安を経験すると、特徴的なフリーズ（動けなくなる）行動を示す。不安のフリーズモデルでは、短い電気フットショックへの曝露によってこの行動を誘発する。このラットを数日空けた後に、ショックボックスに戻すと、さらなるショックへの曝露がなくてもフリーズ行動を示す。ベンゾジアゼピンのような不安緩解性薬物および選択的セロトニン再摂取阻害剤を投与すると、以前にショックをうけた動物をショックボックスに戻したとき、フリーズ期間が減少する。アンチセンス実験では、２日連続のフットショック処置後にオリゴヌクレオチドの投与を開始した。投薬８日目に最後にオリゴヌクレオチドを投与した２時間後、ラットをショックボックスに戻し、１０分間観察した。条件付けされた恐れに対する薬理学的物質の作用を試験するこの部分の実験では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはフリーズ期間を５０％減少させたが、ミスマッチコントロールではそうではなかった（図３ａ）。この最初の１０分の期間後、ラットは２回の短いフットショックを受け、さらに１０分間観察された。再び、アンチセンス処理ラットは、食塩水またはミスマッチオリゴヌクレオチド−処置動物と比較して、フリーズ期間の５０％減少を示した（図３ａ）。これらのデータはＣＲＦ２レセプターにおける機能の第一の証拠を構成する。これらのラットにおける中隔脳領域のレセプターオートラジオグラフィー分析では、アンチセンス処置ラットにおけるＣＲＦ２レセプターに対する１２５Ｉ−サウバジン結合の７０％減少が示された（図３ｂ）。したがって、ＣＲＦ２レセプターの阻害は、減少した不安レベルを導き、このことは、ＣＲＦペプチドの不安原性作用がＣＲＦ１レセプターを介してだけでなく、ＣＲＦ２レセプターによっても媒介されることを示す。さらに、ＣＲＦ２レセプターの強い抑制は、より低いレベルのＣＲＦ２レセプター阻害では明らかではない重要な機能的結果を生じさせた。これらの結果は、恐れおよび不安の調節応答におけるＣＲＦ２レセプターの関与を示す。
【００５０】
高架式十字迷路（ＥＰＭ）は、不安緩解または不安原性薬物作用の決定に広く用いられている。装置は＋−型迷路からなり、床から５０ｃｍ高くしてある。２つの反対のアームは開口し、環境に曝露されており、一方、他の２つのアームは黒色プレクシグラス面で閉じられている。齧歯目では、ＥＰＭへの曝露により、概してこの動物に、迷路の閉じたアーム内において、その時間のほとんどを使わせる接近／回避葛藤が生じる。このような接近／回避葛藤は、いくつかの型のヒト不安障害の発生の原因である重要な要因であると思われる。重要なのは、現在、不安障害の処置用に処方されている薬物は、ＥＰＭで試験された齧歯目の不安緩解応答を生じさせるのに有効であることである。
【００５１】
アンチセンス実験では、ラットは８日間投薬された後、最後のオリゴヌクレオチド注射の２時間後に、ＥＰＭ内で試験される。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処置されたラットは、迷路の開口した、曝露されたアーム内で有意により多くの時間を費やす（図４ａ）。この行動は、不安が減少した状態を示す。ミスマッチオリゴヌクレオチドで処置されたラットは食塩水で処置されたラットと統計学的に差異がなかった。外側中隔内のＣＲＦ２レセプターに対する１２５Ｉ−サウバジンの結合は、この実験においてアンチセンスオリゴヌクレオチドによって６０％減少した（図４ｂ）。
【００５２】
迷路のオープンアーム、ならびにクローズドアームへの侵入の合計を分析すると、３つの処置群間で差異がないことが示された（データは示していない）。さらに運動活性試験ではまた、３処置群すべてが区別できなかった（データは示していない）。あわせて考えると、これらのデータは、ラットの運動機能は、オリゴヌクレオチド処置によって有意に変更されていないことを示す。
【００５３】
７回膜貫通レセプター系のアンチセンス阻害は、選択的な小さい分子アンタゴニストによるレセプター遮断を介して得られる作用と同様の生理学的作用を生じさせることが示された（Ｈｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。したがって我々のＣＲＦ２アンチセンスの結果はＣＲＦ２レセプターのアンチセンス抑制に加えて、このレセプターを小さい分子リガンドによって遮断することがまた不安緩解作用を生じさせるはずであることを意味する。したがって、ＣＲＦ２レセプターに対する小さい分子またはペプチドのアンタゴニストが有益な治療価値を有する有効な不安緩解物質であるはずである。
【００５４】
本明細書中で用いられる用語「製薬的に許容されるプロドラッグ」とは、本発明の有用な化合物のプロドラッグであって、信頼できる医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答などを伴うヒトおよび下等動物の組織と接触しての使用に適当であり、妥当な利益／リスクの割合と見合い、ならびにその意図される使用に関して有効であるもの、ならびに、可能であれば、本発明化合物の双性イオン型を意味する。用語「プロドラッグ」は、例えば血液中での加水分解により、インビボで迅速に変換されて親化合物を生じる化合物を意味する。代謝性分解によりインビボで迅速に変換され得る官能基は本発明化合物のカルボキシル基と反応性の基のクラスを形成する。これらには、アルカノイル（例えばアセチル、プロピオニル、ブチニル、など）、非置換および置換のアロイル（例えばベンゾイルおよび置換ベンゾイル）、アルコキシカルボニル（例えばエトキシカルボニル）、トリアルキルシリル（例えばトリメチル−およびトリエチルシリル）、ジカルボン酸とともに形成されたモノエステル（例えばスクシニル）などが含まれるが、これらに限定されない。本発明の有用な化合物の、代謝によって分解される基がインビボで分解される、その容易性ゆえ、このような基を有する化合物はプロドラッグとして作用する。代謝的に分解可能な基を有する化合物は、代謝的に分解可能な基が存在するが故に、親化合物に対して付与された高められた溶解性および／または吸収率の結果として、改善されたバイオアベイラビリティーを示し得るという利点を有する。プロドラッグの詳細な議論は、以下に提供されている：Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ， Ｈ． Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， ｅｄ．， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， １９８５； Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｋ． Ｗｉｄｄｅｒ ｅｔ ａｌ； Ｅｄ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ４２， ｐ．３０９−３９６， １９８５； Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ ａｎｄ Ｈ． Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， ｅｄ．， Ｃｈａｐｔｅｒ ５； ”Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ” ｐ．１１３−１９１， １９９１； Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， Ｈ． Ｂｕｎｄｇａｒｄ， ８， ｐ．１−３８， １９９２； Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， ７７， ｐ． ２８５， １９８８； Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．， Ｎ． Ｎａｋｅｙａ ｅｔ ａｌ； ３２， ｐ． ６９２， １９８４； Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ ａｓ Ｎｏｖｅｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｔ． Ｈｉｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｖ． Ｓｔｅｌｌａ， Ｖｏｌ． １４ ｏｆ ｔｈｅ Ａ． Ｃ． Ｓ． Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ， ａｎｄ Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， Ｅｄｗａｒｄ Ｂ． Ｒｏｃｈｅ， ｅｄ．， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， １９８７（これらは引用により本明細書中に包含される）。
【００５５】
用語「製薬的に許容される塩」とは、本発明化合物の、比較的無毒の、無機および有機の酸付加塩および塩基付加塩を意味する。これらの塩は、化合物の最終の単離および精製時にインサイチュで調製できる。特に、酸付加塩は、別々の工程にて、精製された遊離塩基型の化合物を適当な有機または無機の酸と反応させ、このように形成された塩を単離することによって製造できる。例示的な酸付加塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、ホウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシラート、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチラート、メシラート、グルコヘプトナート、ラクチオビオナート、スルファマート（ｓｕｌｐｈａｍａｔｅｓ）、マロン酸塩、サリチル酸塩、プロピオン酸塩、メチレン−ビス−ｂ−ヒドロキシナフトエート、ゲンチシン酸塩、イセチオン酸塩、ジ−ｐ−トルオイル酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、シクロヘキシルスルファマートおよびキナートラウリルスルホナート塩（ｑｕｉｎａｔｅｓｌａｕｒｙｌｓｕｌｐｈｏｎａｔｅ）などが含まれる。（例えば Ｓ． Ｍ． Ｂｅｒｇｅ， ｅｔ ａｌ．， ”Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ，” Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， ６６： ｐ．１−１９ （１９７７）（これは引用により本明細書中に包含される）を参照のこと。）また塩基付加塩は、別々の工程にて、精製された酸型の化合物を適当な有機または無機の塩基と反応させ、このように形成された塩を単離することによって製造できる。塩基付加塩には、製薬的に許容される金属およびアミン塩が含まれる。適当な金属塩には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、バリウム、亜鉛、マグネシウム、およびアルミニウム塩が含まれる。ナトリウムおよびカリウム塩が好ましい。適当な無機の塩基付加塩は、以下を含む金属塩基から調製されるものである：水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化アルミニウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化亜鉛。適当なアミン塩基付加塩は、安定な塩を形成するのに十分な塩基性を有するアミンから調製され、好ましくは、このようなアミンには、医薬用途のための低い毒性および慣用性ゆえに製薬化学においてしばしば用いられるアミンが含まれる。アンモニア、エチレンジアミン、Ｎ−メチル−グルカミン（Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−ｇｌｕｃａｍｉｎｅ）、リシン、アルギニン、オルニチン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、ジエタノールアミン、プロカイン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、ジエチルアミン、ピペラジン、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、テトラメチルアンモニウムヒドロキシド、トリエチルアミン、ジベンジルアミン、エフェナミン（ｅｐｈｅｎａｍｉｎｅ）、デヒドロアビエチルアミン（ｄｅｈｙｄｒｏａｂｉｅｔｙｌａｍｉｎｅ）、Ｎ−エチルピペリジン、ベンジルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチ��アミン、エチルアミン、塩基性アミノ酸、例えばリシンおよびアルギニン、およびジシクロヘキシルアミン、など。
【００５６】
本明細書中で用いられる用語「ＣＲＦ２アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、ＣＲＦ２レセプターのｍＲＮＡ部分に相補的であるように設計された短いオリゴヌクレオチド（典型的には、約１５〜約２５ヌクレオチド長）を表す。アンチセンスオリゴヌクレオチドが、そのｍＲＮＡ標的部位と、ワトソン−クリック塩基対形成を介してハイブリダイズすると、ＣＲＦ２レセプターの標的ｍＲＮＡのオリゴヌクレオチド指向性分解を終結させるイベントのカスケードが開始される。
【００５７】
本明細書中で用いられる用語「ＣＲＦ２レセプター（群）」とは、１９９８年７月２８日発行の米国特許第５，７８６，２０３号（この開示内容は引用により本明細書中に包含される）に記載される細胞表面レセプターを表す。
【００５８】
本明細書中で用いられる用語「特定の利用可能部位」とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに利用可能なＣＲＦ２レセプターｍＲＮＡ中の複数の部位を表す。これらの部位は上記表１にさらに詳細に示されている。
【００５９】
本明細書中で用いられる用語「修飾ヌクレオチド残基」には、２’−メトキシリボヌクレオチドホスホジエステル、２’−メトキシエトキシリボヌクレオチドホスホジエステル、２’−フルオロ−リボヌクレオチドホスホジエステル、５−（１−プロピル）シトシンホスホロチオエート、５−（１−プロピニル）ウラシルホスホロチオエート、５−メチルシトシンホスホロチオエート、２’−デオキシリボヌクレオチド−Ｎ３’−Ｐ５’ホスホルアミデート、ポリアミド核酸、および式：
【化３】
2004513880.tif 000005
［式中、Ｂはプリンまたはピリミジン塩基である］
で示されるロックされた核酸が含まれるがこれらに限定されない。
【００６０】
本発明の一態様では、患者における、不安、強迫障害、パニック障害、外傷後ストレス障害、恐怖症、神経性無食欲症および鬱病を含むがこれらに限定されない精神医学的障害を処置する方法であって、その処置を必要としている患者に、１０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む治療有効量の医薬組成物を投与することによる方法を提供する。
【００６１】
好ましい態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオチド残基は以下の群から選択される：２’−メトキシリボヌクレオチドホスホジエステル、２’−メトキシ−エトキシリボヌクレオチドホスホジエステル、２’−フルオロ−リボヌクレオチドホスホジエステル、５−（１−プロピニル）シトシンホスホロチオエート、５−（１−プロピニル）ウラシルホスホロチオエート、５−メチルシトシンホスホロチオエート、２’−デオキシリボヌクレオチド−Ｎ３’−Ｐ５’ホスホルアミデート、およびポリアミド核酸。
【００６２】
より好ましい態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約１５〜約２５ヌクレオチド長である。
【００６３】
別の態様では、ＣＲＦレセプタータンパク質によって媒介される疾患を有する患者を処置する方法であって：
（ａ）ＣＲＦレセプターｍＲＮＡに特異的なキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し；
（ｂ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的作用を模倣する組成物を決定し；ならびに、
（ｃ）ＣＲＦレセプターに対する内因性リガンドの結合を阻害する組成物を患者に投与する
ことを含む方法を提供する。
【００６４】
別の態様は、ＣＲＦレセプタータンパク質によって媒介される疾患を有する患者を処置する方法であって：
（ａ）ＣＲＦレセプターｍＲＮＡに特異的なキメラアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し；
（ｂ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの生物学的作用を模倣する組成物を決定し；
（ｃ）ＣＲＦレセプターにおける内因性リガンドの作用を模倣する組成物を患者に投与する
ことを含む方法を提供する。
【００６５】
本発明の別の態様では、ＣＲＦによって媒介される疾患を有する患者を処置する方法であって、ＣＲＦまたは他の密接に関連するペプチドの、ＣＲＦ２レセプターへの結合を有効に阻害する組成物を患者に投与することを含む方法を提供する。
【００６６】
本発明の別の態様では、ＣＲＦ２レセプターの阻害剤を設計する方法であって、このようなレセプターの三次元構造を決定し、基質の可能性ある結合部位に関する三次元構造を分析し、予測される反応部位を包含する分子を合成し、ならびにこの分子のレセプター阻害活性を決定する工程を含む方法を提供する。
【００６７】
本発明の別の態様では、１０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を提供する。
【００６８】
本発明のより好ましい態様では、１５〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を提供する。
【００６９】
本発明のより好ましい態様では、２０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を提供する。
【００７０】
本発明のより好ましい態様では、２５〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を提供する。
【００７１】
本発明のより好ましい態様では、３０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を提供する。
【００７２】
本発明のより好ましい態様では、３５〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を提供する。
【００７３】
本発明のより好ましい態様では、４０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を提供する。
【００７４】
本発明のより好ましい態様では、４５〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を提供する。
【００７５】
本発明のより好ましい態様では、５０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を提供する。
【００７６】
本発明のより好ましい態様では、５５〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を提供する。
【００７７】
本発明のより好ましい態様では、６０〜７０％の２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基が修飾ヌクレオチド残基で置換されているキメラオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの配列を提供する。
【００７８】
本発明のさらに好ましい態様では、定められた利用可能部位内に位置し、定められた利用可能部位内に位置にする任意の塩基に出発点を有し、約１５〜約２５塩基長を有する標的塩基を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００７９】
最も好ましい態様では、以下の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【表４】
2004513880.tif 000006
【００８０】
本発明の別の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを利用する、不安、強迫障害、パニック障害、外傷後ストレス障害、恐怖症および鬱病を含むがこれらに限定されない精神医学的障害の処置において有用な化合物の決定に関するスクリーニングアッセイを提供する。
【００８１】
本発明の別の態様では、ＣＲＦ２レセプターの結合領域の構造を決定する方法を提供する。
【００８２】
ＣＲＦ１レセプターリガンドを、ＣＲＦ２リガンドと組み合わせて投与すると、ＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンド単独より有益な効率を提供することができ、このことは、より少ない投与量の各レセプターリガンドを用いて可能であり得る。より少ない投与量により、副作用の可能性を最小化することができ、これにより安全性のゆとりが増大する。本発明化合物を、さらなる治療物質と組み合わせることは、好ましい相乗作用的組み合わせである。例えば Ｃｈｏｕ ａｎｄ Ｔａｌａｌａｙ， Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇｕｌ． ２２：２７−５５ （１９８４） に記載されるように、相乗作用は、組み合わせて投与された化合物および物質の治療作用が、単独で投与されたＣＲＦ１レセプターリガンドおよびＣＲＦ２レセプターリガンドの加算した作用より大きい場合である。一般に、相乗作用は、ＣＲＦ１レセプターリガンドまたはＣＲＦ２レセプターリガンド単独に関して（治療的に）最適以下であるが、組み合わせにおいて高度な効力を有するレベルにおいて最も明らかに示される。
【００８３】
ＣＲＦ１レセプターアンタゴニストは、不安のいくつかの動物のモデルにおいて活性である（Ｌｕｎｄｋｖｉｓｔ， Ｊ．， Ｃｈａｉ， Ｚ．， Ｔｅｈｅｒａｎｉａｎ， Ｒ．， Ｈａｓａｎｖａｎ， Ｈ．， Ｂａｒｔｆａｉ， Ｔ．， Ｊｅｎｃｋ， Ｆ．， Ｗｉｄｍｅｒ， Ｕ． ＆ Ｍｏｒｅａｕ， Ｊ． −Ｌ． （１９９６） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３０９， １９５−２００； および Ｗｅｎｉｎｇｅｒ， Ｓ． Ｃ．， Ｄｕｎｎ， Ａ． Ｊ．， Ｍｕｇｌｉａ， Ｌ． Ｊ．， Ｄｉｋｋｅｓ， Ｐ．， Ｍｉｃｚｅｋ， Ｋ． Ａ．， Ｓｗｉｅｒｇｉｅｌ， Ａ． Ｈ．， Ｂｅｒｒｉｄｇｅ， Ｃ． Ｗ． ＆ Ｍａｊｚｏｕｂ， Ｊ． Ａ． （１９９９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６， ８２８３−８２８８）。ＣＲＦ１レセプターの高度に選択的で強力なピラゾール−ピリミジンアンタゴニストであるＤＰＣ９０４（Ｇｉｌｌｉｇａｎ， Ｐ． Ｊ．， Ｂａｌｄａｕｆ， Ｃ．， Ｃｏｃｕｚｚａ， Ａ．， Ｃｈｉｄｅｓｔｅｒ， Ｄ．， Ｚａｃｚｅｋ， Ｒ．， Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ， Ｌ．， ＭｃＥｌｒｏｙ， Ｊ．， Ｓｍｉｔｈ， Ｍ． Ａ．， Ｓｈｅｎ， Ｈ． −Ｓ． Ｌ．， Ｓａｙｅ， Ｊ． Ａ．， Ｃｈｒｉｓｔ， Ｄ．， Ｔｒａｉｎｏｒ， Ｇ． Ｌ．， Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｄ． Ｗ． ＆ Ｈａｒｔｉｇ， Ｐ． Ｒ． （２０００） Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ８， １８１−１８９， ２０００）を、条件付けされた不安試験において試験し、フリーズ期間が用量依存的に減少することが観察された（図７ａ）。中枢ＣＲＦ１およびＣＲＦ２レセプターは、その解剖学上の分布において、有意に重ならない（Ｃｈａｌｍｅｒｓ， Ｄ． Ｔ．， Ｌｏｖｅｎｂｅｒｇ， Ｔ． Ｗ． ＆ Ｄｅ Ｓｏｕｚａ， Ｅ． Ｂ． （１９９５） Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １５， ６３４０−６３５０； および Ｒｏｍｉｎｇｅｒ， Ｄ． Ｈ．， Ｒｏｍｉｎｇｅｒｍ， Ｃ． Ｍ．， Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ， Ｌ． Ｗ．， Ｇｒｚａｎｎａ， Ｒ．， Ｌａｒｇｅｎｔ， Ｂ． Ｌ． ＆ Ｚａｃｚｅｋ， Ｒ． （１９９８） Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． ２８６， ４５９−４６８）ため、実験は、両レセプターサブタイプの同時阻害により、フリーズ行動においてより強力な減少が生じるかどうかを決定するように設計された。動物に対して、食塩水またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを７日間脳室内投与した。最後のｉｃｖ投与の２４時間後、ラットはビヒクル（メトセル）またはＤＰＣ９０４の経口投与を受けた。ＤＰＣ９０４またはアンチセンスオリゴヌクレオチド単独を服用した動物は、以前に観察されたフリーズ行動の有意な減少を示した。ＤＰＣ９０４およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの両者を服用した動物においては、条件付けされた不安試験において、フリーズ行動はＤＰＣ０４処置またはアンチセンス処置動物のレベルより有意に減少した（図７ｂ）。ＤＰＣ９０４での急性の処置はショック再曝露試験におけるフリーズ期間を減少させたが、両レセプターの同時阻害は、ＣＲＦ２アンチセンスオリゴヌクレオチド単独を用いて得られた作用と異なる作用を生じさせなかった（図７ｂ）。ＣＲＦ２レセプター結合は、全アンチセンス処置群の動物（食塩水／メトセル：１．２０±０．０５ｎＣｉ／ｍｇ、食塩水／ＤＰＣ９０４：１．２１±０．０５ｎＣｉ／ｍｇ、アンチセンスオリゴヌクレオチド／メトセル：０．５１±０．０８ｎＣｉ／ｍｇ、アンチセンスオリゴヌクレオチド／ＤＰＣ９０４：０．４５±０．０４ｎＣｉ／ｍｇ；ｐ＜０．００１（全アンチセンス群対非オリゴヌクレオチド処置群に関して））同程度に減少した。
【００８４】
本発明は、本明細書中に言及する具体的な好ましい群分けまたは態様のすべての適当な組み合わせを包含することが理解されるべきである。
【００８５】
本発明は以下の実施例によってさらに理解することが可能である。この実施例では、特に記載しない限り、部分およびパーセンテージは重量単位である。
【００８６】
実施例１
インビボ実験に関するオリゴヌクレオチドの合成および精製
オリゴヌクレオチドは自動化ＡＢＩ３９４ＲＮＡ／ＤＮＡ合成装置において標準的合成プロトコルを用いて合成した。図３および４に記載の実験において用いられるアンチセンスおよびミスマッチオリゴヌクレオチドは以下の配列からなる：
アンチセンス：　ＴＧＡ ＣＧＣ ａｇｃ ｇｇｃ ａｃＣ ＡＧＡ ＣＣ
ミスマッチ：　ＴＧＡ ＧＧＣ ａｃｃ ｇｇａ ａｃＣ ＡＣＡ ＣＣ
［ここに、大文字は２’−メトキシリボヌクレオチドホスホジエステル残基を示し、小文字は２’−デオキシリボヌクレオチドホスホロチオエート残基を示す］。２’−メトキシリボヌクレオチドホスホルアミダイトは Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ から購入し、プロピニルおよび５−メチルシチジンホスホルアミダイトは Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ から購入し、２’−フルオロホスホルアミダイトは ＮｅＸｓｔａｒ から購入した。ホスホロチオエート結合の合成用のビューケージ（ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬およびオリゴヌクレオチドの５’−ラベル用のフルオレセインホスホルアミダイトは、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ から購入した。これらの試薬は、製造元の指示書にしたがって用いた。
【００８７】
粗製のオリゴヌクレオチド混合物は、ＰＲＰ−３カラム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｃｏ．）上の逆相ＨＰＬＣ（アセトニトリルと０．１Ｍ 酢酸トリエチルアンモニウムの濃度勾配を用いる）によって精製した。ＨＰＬＣカラムから集められたフラクションを２回凍結乾燥し、過剰の酢酸トリエチルアンモニウムを除去した。次いでオリゴヌクレオチドの水溶液をブタノールで数回抽出した。カチオン交換は、０．３Ｍ 酢酸ナトリウムの存在下、エタノール沈殿を用いて行った。次いで０．０１Ｍ 水酸化ナトリウムを添加して、オリゴヌクレオチド溶液のｐＨを７．０に上げた。このオリゴヌクレオチドを、ＮＡＰ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製し、残りのフルオレセインホスホルアミダイト試薬を除去した。滅菌は、０．２　ｍ酢酸セルロースフィルター（Ｒａｉｎｉｎ）を通すろ過によって行い、ＵＶ分光法によって定量した。オリゴヌクレオチドの純度は、キャピラリーゲル電気泳動（ＰＡＣＥ２１００， Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって測定した。蒸留水中のオリゴヌクレオチド保存液は、−２０℃で保存した。
【００８８】
実施例２
動物および手術
体重３２０〜３６０ｇ（手術時）の雄性 Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）は、ステンレス鋼のケージに個別に飼育し、えさおよび水を自由に利用可能にした。４日の適応期間の後、Ｒｏｍｐｕｎ（１００ｍｇ／ｋｇ）およびケタミン（９ｍｇ／ｋｇ）麻酔下で、外側脳室に向けられた慢性２６ゲージガイドカニューレを用い、ラットに定位的に両外側移植した。定位座標は：門歯バー 耳内線下３．３ｍｍ；ブレグマの背側０．２ｍｍ；中線の側方±２．７ｍｍ；頭蓋表面の腹側３．８ｍｍおよび２４°角度であった。注射器（３３ゲージ）はガイドカニューレの先端から０．５ｍｍ出ている。動物は手術後の最初の２日間毎日の手当てによって適応させた。
【００８９】
記載されるすべての動物のケアおよび使用手段は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ （ＩＡＣＵＣ） によって是認されるものであった。ＤｕＰｏｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ は Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ （ＡＡＡＬＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ） によって認可されている。
【００９０】
実施例３
オリゴヌクレオチド投与
オリゴヌクレオチド注入は、ラットが手術重量の約２０ｇ増である手術後第８日から開始した。凍結乾燥オリゴヌクレオチドペレットを滅菌食塩水に溶解することによって新たなオリゴヌクレオチド溶液を毎日調製した。オリゴヌクレオチド注入前、午前９：００に毎日、ラットの体重を測定した。マイクロプロセッサで制御されたシリンジポンプ（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）を用いて、脳室当たり溶液１　Ｌを２分間かけて注射した。注射器はさらに数分間ガイドカニューレ内に残した。個々の各ラットに関してそれぞれの注射器は、エタノールおよび滅菌水ですすぎ、毎日の注射の間、乾燥させた。
【００９１】
実施例４
不安に関するフリーズアッセイ
ショックボックスは、壁およびカバーを有する黒色プレクシグラスチャンバーで構成されていた。ボックスのドアは透明なプレクシグラスで構築され、これには観察用のワンウェイミラーが取付けられていた。ボックスのフロアーは Ｃｏｕｌｂｏｕｒｎ ステンレス鋼ショックグリッドを含有し、このグリッドのバーは１ｃｍ離れた間隔にあった。手術によりガイドカニューレを移植した後８日目に、ラットをボックスに入れ、２分間慣らしておいた。次いでトータル３回の乱雑ランダム化された回避できないフットショック（１．０ｍＡ、１秒間）を、グリッドフロアーに２０秒間隔で加えた。このラットをフリーズ行動に関して１５分間観察した後、ホームケージに戻した。
【００９２】
オリゴヌクレオチド処置はショック処置の翌日に開始した。動物を７日続けて処置した。２４時間後、ラットをショックボックスに戻し、フリーズ行動を１０分間観察した。次いで２フットショック（１．０ｍＡ、１秒間、２０秒間隔）を施し、その後、ラットのフリーズ行動をさらに１０分間観察した。この最後の１０分間の直後、ラットを安楽死（ｅｕｔｈａｎｉｔｉｚｅｄ）させた。
【００９３】
実施例５
高架式十字迷路アッセイ
ラットのオリゴヌクレオチド処置は手術後８日目に開始した。処置８日目の投与２時間後に、ラットをＥＰＭにおいて試験した。試験開始時、ラットを迷路の中央区画に置き、その探査行動をその後１０分間、ビデオカメラで記録した。試験部屋の外にいる観察者は、オープンおよびクローズドアームで費やされた時間ならびに迷路の各アーム内への侵入回数をスコアした。このラットを試験の終了後すぐに安楽死させた。
【００９４】
実施例６
組織調製
マウスをＣＯ２に曝露して犠牲にした。脳をとり出し、乾燥氷上で冷却されたメチルブタン中で凍らせた後、−８０℃で保存した。外側中隔を横切る２０μｍセクションを、レセプターオートラジオグラフィー用にクライオスタット（Ｋｏｐｆ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で切除した。
【００９５】
実施例７
ＣＲＦ２レセプターオートラジオグラフィー
室温にまで１時間あたためた後、脳セクションを、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチル エーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸）、０．１％卵白アルブミン、０．０８ＴＩＵアプロチニンおよび０．１ｍＭバシトラシンを含む５０ｍＭトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）中で５分間プレインキュベートした。０．１５ｎＭ １２５Ｉ−サウバジン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）を用いてトータル結合を規定した。１μＭ ＳＣ−２４１（ＣＲＦ１選択的レセプターアンタゴニスト（Ｄ． Ｈ． Ｒｏｍｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌＪ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒａｐ．， ２８６， ４５９−４６８， １９９８ ））の存在下、ＣＲＦ２特異的結合を測定した。１μＭ ａ−ヘリックス性ＣＲＦ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ）を用いて非特異的結合を測定した。放射性リガンドおよび適当なアンタゴニストを含有するプレインキュベーションバッファー中で１５０分間インキュベーションを行った。次いで組織セクションを、０．０１％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ中で２回、各５分間洗浄した。最後に水ですすいだ後、過剰の水を吸引し、このセクションを一晩空気乾燥した。このセクションおよび１２５Ｉ標準片（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ μ−Ｍａｘ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に７２時間曝露した。
【００９６】
ＣＲＦ２特異的結合の定量は ＮＩＨ ＩｍａｇｅＭＧ １．４４ プログラムを用いて行った。１２５Ｉ標準片を用いて、光学密度読み取り値を、タンパク質組織１ｍｇ当たりのリガンド結合のｎＣｉに変換した。ラット当たり７〜９の隣接セクションを定量した。
【００９７】
実施例８
ＣＲＦ１レセプターアンタゴニストおよびＣＲＦ２アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる混合処置
３２〜４０のラットを実施例４（第一段落）に記載の条件付けフットショック処置に付した。フットショック後、動物を等しく二群に分けた。第一群は７日間連続の脳室内食塩水注射を受け、一方、第二群の動物は７日間連続のアンチセンスオリゴヌクレオチド脳室内注射（各外側脳室内２．５ｎｍｏｌ）を受けた。８日目に、各群の動物をさらに２群に細分した。食塩水処置動物の半分は１０ｍｇ／ｋｇ用量のＤＰＣ９０４（メトセル中）のｐ．ｏ．投与を受けた（Ｓ／Ｒ１群と称される）。食塩水処置動物の他方の半分は、ビヒクルメトセルを受けた（Ｓ／Ｍ群と称される）。アンチセンスオリゴヌクレオチドを投与されたラットを同様に扱い、すなわち、これらの動物の半分は１０ｍｇ／ｋｇ用量のＤＰＣ９０４（メトセル中）のｐ．ｏ．投与を受けた（Ｒ２／Ｒ１群と称される）。アンチセンス処置動物の他方の半分はビヒクルメトセルを受けた（Ｒ２／Ｍ群と称される）。経口投与３０分後、実施例４（第二段落）に記載のように動物をショックボックスにおいて試験した。
【００９８】
本発明は、その思想または本質的属性から逸脱することなく、他の特定の型に具体化され得るものである。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】図１ａはアンチセンス配列選択に関する模式図である。
【図１ｂ】図１ｂはキメラ、半ランダムオリゴヌクレオチドライブラリーの同定を示す。
【図２ａ】図２ａはアンチセンス実験において最も一般的に使用されるヌクレオチドアナログの構造である；ホスホロチオエートバリエーションはＣＮＳ毒性作用を生じさせる。
【図２ｂ】図２ｂは、ＣＮＳ適用に関して、オリゴヌクレオチドに組み込まれたときに効力を維持するが、毒性が排除されている修飾オリゴヌクレオチドアナログの構造を示す。
【図２ｃ】図２ｃは、キメラオリゴヌクレオチドに関するいくつかの可能な構成の１つである。
【図３ａ】図３ａは、ラットにおけるフリーズ行動に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用を示す。
【図３ｂ】図３ｂは、フリーズアッセイにおいて、アンチセンス処置されたラットの外側中隔における１２５Ｉ−サウバジン結合の阻害を示す。
【図４ａ】図４ａは、高架式十字迷路における齧歯目の行動に対するアンチセンス処置の作用を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、高架式十字迷路アッセイにおいて、アンチセンス処置されたラットの外側中隔における１２５Ｉ−サウバジン結合の阻害を示す。
【図５】図５は、ラットのフリーズ行動に対する抗サウバジン−３０の作用を示す。
【図６】図６は、ラットのフリーズ行動に対する、ＣＲＦ２レセプターアンチセンスオリゴヌクレオチドをＣＲＦ１アンタゴニストと組み合わせることの作用を示す。
【図１ａ】
2004513880.tif 000009
【図１ｂ】
2004513880.tif 000010
【図２ａ】
2004513880.tif 000011
【図２ｂ】
2004513880.tif 000012
【図２ｃ】
2004513880.tif 000013
【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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