(57)【要約】本発明は、抗体の作製方法、形質細胞と特異的に反応する抗体、かかる抗体をコードする遺伝子、かかる抗体により標識される抗原、該抗原に対するさらなる抗体および該抗体の作製方法、ならびにかかる抗体の使用に関する。また、本発明は、（ａ）本明細書において規定する抗体の結合部位を含む第１ドメイン、および（ｂ）ＣＤ３抗原を特異的に認識する免疫グロブリン鎖または抗体の結合部位を含む第２ドメインを含有する単鎖多機能ポリペプチドに関する。さらに、本発明の化合物を含んでなる組成物およびキットを開示する。好ましくは、該組成物は、医薬用および／または診断用組成物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一方の軽鎖（Ｌ−鎖）の可変領域（Ｆｗ（Ｌ））が以下のアミノ酸配列の少なくとも１つまたはその一部：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳＬＳＣ （ＦＷ−１；配列番号：１）
ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮ（ＣＤＲ−１ ；配列番号：２）
ＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＳ （ＦＷ−２；配列番号：３）
ＬＶＳＫＬＤＳ （ＣＤＲ−２ ；配列番号：４）
ＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣ（ＦＷ−３；配列番号：５）
ＷＱＧＴＨＬＰＷＴ （ＣＤＲ−３ ；配列番号：６）および／または
ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ （ＦＷ−４；配列番号：７）
を有する、
および／または少なくとも一方の重鎖（Ｈ−鎖）の可変領域（Ｆｗ（Ｈ））が以下のアミノ酸配列の少なくとも１つまたはその一部：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＴＧＡＳＶＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＳ（ＦＷ−１；配列番号：８）
ＧＹＹＭＨ （ＣＤＲ−１ ；配列番号：９）
ＷＶＫＱＳＨＧＫＲＬＥＷＩＧ（ＦＷ−２；配列番号：１０）
ＹＩＳＧＹＮＧＤＴＲＹＮＱＫＦＲＧ （ＣＤＲ−２ ；配列番号：１１）
ＫＡＴＦＩＶＤＩＳＳＲＴＡＹＭＱＦＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲ（ＦＷ−３；配列番号：１２）
ＧＧＹＹＧＹＶＤＹ （ＣＤＲ−３ ；配列番号：１３）および／または
ＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ （ＦＷ−４；配列番号：１４）
を有することを特徴とする抗体。
【請求項２】
少なくとも一方の軽鎖（Ｌ−鎖）に対して以下のヌクレオチド配列またはその一部：
ｇａａｇｃａｃｇｃｇ ｔａｇａｔａｔｃｇｔ ｇａｔｇａｃｃｃａａ ａｃｔｃｃａｃｔｃａ ｃｔｔｔｇｔｃｇｇｔ ｔａｃｃａｔｔｇｇａ ｃａａｃｃａｇｃｃｔ ｃｃｃｔｃｔｃｔｔｇ ｃａａｇｔｃａａｇｔ ｃａｇａｇｃｃｔｃｔ ｔａｇａｔａｈｔｇａ ｔｇｇａａａｇａｃａ ｔａｔｔｔｇａａｔｔ ｇｇｔｔｇｔｔａｃａ ｇａｇｇｃｃａｇｇｃ ｃａｇｔｃｔｃｃａａ ａｇｃｇｃｃｔａａｔ ｃｔｃｔｃｔｇｇｔｇ ｔｃｔａａａｔｔｇｇ ａｃｔｃｔｇｇａｇｔ ｃｃｃｔｇａｃａｇａ ｔｔｃａｃｔｇｇｃａ ｇｔｇｇａｔｃａｇｇ ｇａｃａｇａｔｔｔｃ ａｃａｃｔｇａａａａ ｔｃａｇｃａｇａｇｔ ｇｇａｇｇｃｔｇａｇ ｇａｔｔｔｇｇｇａｇ ｔｃｔａｔｔａｔｔｇ ｃｔｇｇｃａａｇｇｔ ａｃａｃａｔｃｔｔｃ ｃｇｔｇｇａｃａｔｔ ｃｇｇｔｇｇａｇｇｃ ａｃｃａａｇｃｔｇｇ ａａａｔｃａａａｃｇ ｇｇｃｔｇａｔｇｃｔ ｇｃｇｇｃｃｇｃｔｇ ｇａｔｃｃａｔｃｔｔ ｃ
を含有する、
および／または少なくとも一方の重鎖（Ｈ−鎖）に対して以下のヌクレオチド配列またはその一部：
ｃｇｃｃａｔｇｇｃｃ ｇｃｇｇｇａｔｔｃｃ ｇｇｃｃａｔｇｇｃｇ ｃａｇｇｔｇｃａｇｃ ｔｇｃａｇｃａｇｔｃ ｔｇｇａｃｃｔｇａｇ ｃｔａｇｔｇａａｇａ ｃｔｇｇｇｇｃｔｔｃ ａｇｔｇａａｇａｔａ ｔｃｔｔｇｔａａｇｇ ｇｔｔｃｔｇｇｔｔａ ｃｔｃａｔｔｃａｇｔ ｇｇｔｔａｃｔａｃａ ｔｇｃａｃｔｇｇｇｔ ｃａａｇｃａｇａｇｃ ｃａｔｇｇａａａｇａ ｇｇｃｔｔｇａｇｔｇ ｇａｔｔｇｇａｔａｔ ａｔｔａｇｔｇｇｔｔ ａｔａａｔｇｇｔｇａ ｔａｃｔａｇｇｔａｔ ａａｔｃａｇａａｇｔ ｔｃａｇｇｇｇｃａａ ｇｇｃｃａｃａｔｔｔ ａｔｔｇｔａｇａｃａ ｔａｔｃｃｔｃｃａｇ ｇａｃａｇｃｃｔａｃ ａｔｇｃａｇｔｔｃａ ａｃａｇｃｃｔｇａｃ ａｔｃｔｇａａｇａｃ ｔｃｔｇｃｇｇｔｃｔ ａｔｔａｃｔｇｔｇｃ ａａｇａｇｇｇｇｇｔ ｔａｃｔａｃｇｇｃｔ ａｃｇｔｇｇａｃｔａ ｃｔｇｇｇｇｃｃａａ ｇｇｃａｃｃａｃｃｃ ｔｃａｃａｇｔｃｔｃ ｃｔｃａｇｃｃａａａ ａｃｇａｃａｃｃｃａ ａｇｃｔｔｇｔｃｔａ ｔｃｃａｃｔｇｇｃｃ ｃｃｔｇｇｔａａｔｃ ａｃｔｇｔｇｃｇｇｃ ｃｇｃｃｇ
を含有する遺伝子によりコードされることを特徴とする抗体。
【請求項３】
免疫グロブリンＧであることを特徴とする請求項１または２記載の抗体。
【請求項４】
両軽鎖および／または両重鎖が同じアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の抗体。
【請求項５】
ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ　ＡＣＣ　２４４１により産生される請求項１〜４いずれか記載の抗体。
【請求項６】
多機能抗体であることを特徴とする請求項１〜４いずれか記載の抗体。
【請求項７】
毒素もしくはサイトカインもしくは抗体フラグメントもしくは酵素などのタンパク質、またはホルモン、蛍光染料、ビオチンおよび／または放射性同位体とコンジュゲートした抗体であることを特徴とする請求項１〜６いずれか記載の抗体。
【請求項８】
毒素、酵素、サイトカインおよび／またはホルモンとの融合タンパク質であることを特徴とする前記請求項いずれか記載の抗体。
【請求項９】
以下のヌクレオチド配列またはその一部：
ｇａａｇｃａｃｇｃｇ ｔａｇａｔａｔｃｇｔ ｇａｔｇａｃｃｃａａ ａｃｔｃｃａｃｔｃａ ｃｔｔｔｇｔｃｇｇｔ ｔａｃｃａｔｔｇｇａ ｃａａｃｃａｇｃｃｔ ｃｃｃｔｃｔｃｔｔｇ ｃａａｇｔｃａａｇｔ ｃａｇａｇｃｃｔｃｔ ｔａｇａｔａｈｔｇａ ｔｇｇａａａｇａｃａ ｔａｔｔｔｇａａｔｔ ｇｇｔｔｇｔｔａｃａ ｇａｇｇｃｃａｇｇｃ ｃａｇｔｃｔｃｃａａ ａｇｃｇｃｃｔａａｔ ｃｔｃｔｃｔｇｇｔｇ ｔｃｔａａａｔｔｇｇ ａｃｔｃｔｇｇａｇｔ ｃｃｃｔｇａｃａｇａ ｔｔｃａｃｔｇｇｃａ ｇｔｇｇａｔｃａｇｇ ｇａｃａｇａｔｔｔｃ ａｃａｃｔｇａａａａ ｔｃａｇｃａｇａｇｔ ｇｇａｇｇｃｔｇａｇ ｇａｔｔｔｇｇｇａｇ ｔｃｔａｔｔａｔｔｇ ｃｔｇｇｃａａｇｇｔ ａｃａｃａｔｃｔｔｃ ｃｇｔｇｇａｃａｔｔ ｃｇｇｔｇｇａｇｇｃ ａｃｃａａｇｃｔｇｇ ａａａｔｃａａａｃｇ ｇｇｃｔｇａｔｇｃｔ ｇｃｇｇｃｃｇｃｔｇ ｇａｔｃｃａｔｃｔｔ ｃ
および／または以下のヌクレオチド配列またはその一部
ｃｇｃｃａｔｇｇｃｃ ｇｃｇｇｇａｔｔｃｃ ｇｇｃｃａｔｇｇｃｇ ｃａｇｇｔｇｃａｇｃ ｔｇｃａｇｃａｇｔｃ ｔｇｇａｃｃｔｇａｇ ｃｔａｇｔｇａａｇａ ｃｔｇｇｇｇｃｔｔｃ ａｇｔｇａａｇａｔａ ｔｃｔｔｇｔａａｇｇ ｇｔｔｃｔｇｇｔｔａ ｃｔｃａｔｔｃａｇｔ ｇｇｔｔａｃｔａｃａ ｔｇｃａｃｔｇｇｇｔ ｃａａｇｃａｇａｇｃ ｃａｔｇｇａａａｇａ ｇｇｃｔｔｇａｇｔｇ ｇａｔｔｇｇａｔａｔ ａｔｔａｇｔｇｇｔｔ ａｔａａｔｇｇｔｇａ ｔａｃｔａｇｇｔａｔ ａａｔｃａｇａａｇｔ ｔｃａｇｇｇｇｃａａ ｇｇｃｃａｃａｔｔｔ ａｔｔｇｔａｇａｃａ ｔａｔｃｃｔｃｃａｇ ｇａｃａｇｃｃｔａｃ ａｔｇｃａｇｔｔｃａ ａｃａｇｃｃｔｇａｃ ａｔｃｔｇａａｇａｃ ｔｃｔｇｃｇｇｔｃｔ ａｔｔａｃｔｇｔｇｃ ａａｇａｇｇｇｇｇｔ ｔａｃｔａｃｇｇｃｔ ａｃｇｔｇｇａｃｔａ ｃｔｇｇｇｇｃｃａａ ｇｇｃａｃｃａｃｃｃ ｔｃａｃａｇｔｃｔｃ ｃｔｃａｇｃｃａａａ ａｃｇａｃａｃｃｃａ ａｇｃｔｔｇｔｃｔａ ｔｃｃａｃｔｇｇｃｃ ｃｃｔｇｇｔａａｔｃ ａｃｔｇｔｇｃｇｇｃ ｃｇｃｃｇ
を含有することを特徴とする、抗体をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１０】
請求項１〜９いずれか記載の抗体の少なくとも可変領域をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１１】
請求項９または１０記載のヌクレオチド配列を含有するベクターであって、該ベクターが、任意に、請求項１０記載のヌクレオチド配列と組み合せて該抗体の他方の免疫グロブリン鎖の可変領域を含有してなるベクター。
【請求項１２】
請求項９もしくは１０記載のヌクレオチド配列を含有してなるか、または請求項１１記載のベクターを含有してなる宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１〜１０いずれか記載の抗体を産生しうる連続的継代安定抗体産生細胞株。
【請求項１４】
ハイブリドーマ細胞株、好ましくは寄託番号ＤＳＭ　ＡＣＣ　２４４１を有するハイブリドーマ細胞株である請求項１３記載の細胞株。
【請求項１５】
リンパ球形質細胞系細胞段階を含めた該細胞段階に至るまでの形質細胞分化株のＢ細胞で動物を免疫し、調製された抗体を常套的に該動物の血液から単離することを特徴とする、形質細胞に対する抗体の調製方法。
【請求項１６】
（ａ）　請求項１２、１３または１４記載の細胞を培養する工程、および
（ｂ）　培養物から抗体、その機能性フラグメントまたは（１もしくは複数の）免疫グロブリン鎖を単離する工程
を含む、形質細胞を認識しうる抗体またはその機能性フラグメントもしくは誘導体の調製方法。
【請求項１７】
請求項１〜８いずれか記載の抗体と結合する、および／または該抗体により認識されることを特徴とする抗原。
【請求項１８】
ヒト形質細胞によりその表面に提示され、かつ約９４ｋＤまたは約５５ｋＤの分子量を有することを特徴とする請求項１７記載の抗原。
【請求項１９】
請求項１８記載の抗原のエピトープ。
【請求項２０】
請求項１７〜１９いずれか記載の抗原またはエピトープと結合する、および／または該抗体またはエピトープを認識することを特徴とする抗体。
【請求項２１】
請求項２０記載の抗体の少なくとも一方の可変領域をコードするヌクレオチド配列。
【請求項２２】
請求項１０、１１もしくは２１記載のヌクレオチド配列によりコードされるか、または請求項１５もしくは１６記載の方法により得られうる抗体、そのフラグメントもしくは誘導体または免疫グロブリン鎖。
【請求項２３】
請求項１７または１９いずれか記載の抗原またはエピトープで動物を免疫し、形成された抗体を常套的に該動物の血液から単離することを特徴とする、形質細胞に対する抗体の調製方法。
【請求項２４】
抗体をモノクローナル抗体として産生する細胞株を常套的に作製するために、免疫した動物の細胞を用いることを特徴とし、かつこの細胞株を培養し、産生された抗体を単離することを特徴とする、請求項１５または１６記載の抗体の調製方法。
【請求項２５】
対応する抗原を同定するための請求項１〜９、２０または２２いずれか記載の抗体の使用。
【請求項２６】
形質細胞を特異的に標識するための請求項１〜９、２０または２２いずれか記載の抗体の使用。
【請求項２７】
形質細胞を標識するさらなる抗体を引き続いて調製するための請求項１〜９、２０または２２いずれか記載の抗体の使用。
【請求項２８】
（ａ）　請求項１〜９、２０または２２いずれか記載の抗体または免疫グロブリンの結合部位を含む第１ドメイン、および
（ｂ）　ＣＤ３抗原を特異的に認識する免疫グロブリン鎖または抗体の結合部位を含む第２ドメイン
を含有してなる単鎖多機能ポリペプチド。
【請求項２９】
前記ドメインがポリペプチドリンカーにより連結されてなる請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３０】
前記第１および／または第２ドメインが、天然抗体由来のＶＨ 領域およびＶＬ 領域を擬態するか、またはこれらに相当する請求項２８または２９記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記抗体が、モノクローナル抗体、合成抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である請求項２８〜３０いずれか記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記ドメインが抗体の可変領域の単鎖フラグメントである請求項２８〜３１いずれか記載のポリペプチド。
【請求項３３】
二重特異性単鎖抗体である請求項２８〜３２いずれか記載のポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号：２１に示す核酸分子によりコードされる請求項２８〜３３いずれか記載のポリペプチド。
【請求項３５】
配列番号：２２に示すアミノ酸配列を含有してなる請求項２８〜３３いずれか記載のポリペプチド。
【請求項３６】
発現する際、請求項２８〜３５いずれか記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３７】
請求項３６記載のポリペプチドを含有してなるベクター。
【請求項３８】
請求項３６記載のポリヌクレオチドまたは請求項３７記載のベクターでトランスフェクトした細胞。
【請求項３９】
請求項１〜９、２０または２２いずれか記載の抗体またはその機能性フラグメントもしくは誘導体、請求項２８〜３５いずれか記載の多機能ポリペプチド、請求項１０、１１、２１または３６いずれか記載のヌクレオチド配列／ポリヌクレオチド、請求項３７記載のベクター、請求項１２または３８記載の細胞を含有してなる組成物。
【請求項４０】
任意に、薬学的に許容され得る担体をさらに含有する医薬組成物である請求項３９記載の組成物。
【請求項４１】
任意に、適当な検出手段をさらに含む診断用組成物である請求項３９記載の組成物。
【請求項４２】
自己免疫疾患および／または腫瘍、例えば多発性骨髄腫、リンパ腫および／または形質細胞腫の治療のための、請求項１〜９、２０または２２いずれか記載の抗体、請求項２８〜３５いずれか記載の多機能ポリペプチド、請求項１０、１１、２１または３６いずれか記載のヌクレオチド配列／ポリヌクレオチド、請求項３７記載のベクター、請求項１２または３８記載の細胞の使用。
【請求項４３】
自己免疫疾患、腫瘍、例えば多発性骨髄腫および／またはリンパ腫の治療のための医薬品の調製のための、請求項１〜９、２０または２２いずれか記載の抗体、請求項２８〜３５いずれか記載の多機能ポリペプチド、請求項１０、１１、２１または３６いずれか記載のヌクレオチド配列／ポリヌクレオチド、請求項３７記載のベクター、請求項１２または３８記載の細胞の使用。
【請求項４４】
請求項１〜９、２０または２２いずれか記載の抗体またはその機能性フラグメントもしくは誘導体、請求項１７または１８記載の抗原、請求項１９記載のエピトープ、請求項２８〜３５いずれか記載の多機能ポリペプチド、請求項１０、１１、２１または３６いずれか記載のヌクレオチド配列／ポリヌクレオチド、請求項３７記載のベクター、請求項１２または３８記載の細胞を含んでなるキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、形質細胞に対する抗体の作製方法、抗体、かかる抗体をコードする遺伝子、かかる抗体により標識される抗原、該抗原に対するさらなる抗体および該抗体の作製方法、ならびにかかる抗体の使用に関する。また、本発明は、（ａ）本明細書において規定する抗体の結合部位を含む第１ドメイン、および（ｂ）ＣＤ３抗原を特異的に認識する免疫グロブリン鎖または抗体の結合部位を含む第２ドメインを含有する単鎖多機能ポリペプチドに関する。かかる抗体および／または単鎖多機能ポリペプチドは、生物学的および医学的診断の分野において、ならびに自己免疫疾患または形質細胞腫もしくはリンパ腫などの腫瘍の治療において特に必要とされる。本発明はまた、該抗体および／または単鎖多機能ポリペプチドをコードする核酸分子／ポリヌクレオチド、ならびに該核酸分子／ポリヌクレオチドを含有するベクターおよび宿主細胞を提供する。最後に、本発明は、本発明の化合物を含有してなる組成物を提供する。好ましくは、該組成物は、医薬用および／または診断用組成物である。
【０００２】
動物生体において、およびヒトにおいてもまた、免疫システムは２通りの異なる様式で刺激（抗原）に応答する。一方で、異物として認識される抗原に対する抗体が形質細胞（分化Ｂリンパ球）により産生される体液性免疫応答が生じる。他方で、Ｔリンパ球による細胞性免疫応答が生じ得、これがＢ細胞を刺激する。
【０００３】
体液性免疫応答により産生される抗体は、抗原決定基、すなわち抗体と結合する抗原上の特異的領域（エピトープ）に対するものである。これらの抗体は、それぞれ同一の２種の鎖、重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）からなる（各Ｌ鎖はジスルフィド結合により一方のＨ鎖に連結しており、各ペアは抗原決定基の特異的結合部位を形成する）、球状タンパク質（免疫グロブリンＩｇ、例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ）である。
【０００４】
任意の抗原に対する抗体は、動物生体に抗原を播種し、続いて、その体液性免疫応答によって該播種した抗原に対する抗体が形成されるというような常套手法により産生される。これらの抗体は、その後、単離されうる。さらに、最近では、いわゆるモノクローナル抗体を作製することが可能である。この目的のために、増殖中の骨髄腫細胞を、免疫した動物生体由来のＢ細胞と融合させ、これがＢ細胞として対応する抗体を産生する。その結果、ハイブリドーマ細胞が形成され、これは、一方で骨髄腫細胞のように増殖し、他方で形質細胞のように抗体を形成する。これらのハイブリドーマ細胞を培養し、産生されたモノクローナル抗体を培養物から得る。これらの一般に知られ、かつ頻繁に使用される方法に関しては、例えば、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ａ．ら Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ （１９９４）、７０巻、５７２−５７８ 頁、およびそこに記載の他の出展を参照されたい。
【０００５】
したがって、モノクローナル抗体技術は、多数の同一抗体の産生を可能にする。
【０００６】
抗体産生形質細胞へのＢ細胞の分化の間、ヒトおよび動物における重篤な疾患をもたらす種々の障害が生じ得る。Ｂ細胞レベルでは、内因性細胞が抗体によって誤って検出することにより、例えば、対応する形質細胞により該内因性細胞に対する多数の抗体が産生および分泌される自己免疫疾患を生じ得る。他方、Ｂ細胞は、制御不能に分裂を開始し、それにより腫瘍（リンパ腫）が形成され得る。さらに、かかる無制限の増殖は、形質細胞レベルでも知られている（症候群：形質細胞腫、多発性骨髄腫）。
【０００７】
多発性骨髄腫は、骨髄における悪性形質細胞の蓄積および特異的免疫グロブリン、通常モノクローナルＩｇＧまたはＩｇＡの産生の増加を特徴とする形質細胞障害である。明白な多発性骨髄腫の一般的な合併症には、再発性の細菌感染、貧血、骨溶解性病変および腎不全が含まれる。多発性骨髄腫は、西洋諸国において癌が関連するすべての死の約１％を占める。その疫学的様式は依然として不明であり、その原因は未知である（ＢａｔａｉｌｌｅおよびＨａｒｏｕｓｓｅａｕ， １９９７， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３３６）。
【０００８】
該疾患を治療するために、関与している変性細胞を免疫学的に検出することが必要である。
【０００９】
先行技術において、すべての形質細胞を認識する、形質細胞に対する抗体が記載されているのは真実である。しかしながら、これらの抗体に対応する抗原は、細胞内にのみ存在し、したがって検出前に細胞を破壊する必要がある（Ａｎｄｅｒｓｏｎら （１９８４） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ｖｏｌ． １３２， ３２７１−３１７９参照のこと）。したがって、形質細胞を破壊せずにこれを検出することは不可能であった。
【００１０】
さらに、表面抗原に対する抗体が知られている（Ａｎｄｅｒｓｏｎら （１９８４） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ｖｏｌ． １３２， ３１７２−３１７９， Ａｎｄｅｒｓｏｎら （１９８３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ｖｏｌ． １３０， １１３２−１１３８， Ｔｏｎｇら （１９８７） Ｂｌｏｏｄ， ｖｏｌ． ６９， ２３８−１４８ または Ｔｕｒｌｅｙ ら （１９９４）， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ．， ｖｏｌ． ４７， ４１８−４２２ 参照のこと）。しかしながら、これらの抗体は、特異性を持たず、未成熟前駆細胞および成熟形質細胞の両方を検出する。これらの研究によると、分化した抗体分泌段階の形質細胞は、Ｂ細胞段階に典型的な表面抗原を失う。したがって、成熟細胞（抗体そのものを形成する分化形質細胞）から未熟前駆細胞（骨髄細胞またはＢ細胞）を分取することが不可能であった。
【００１１】
結果的に、抗体受容体（抗原決定基）として機能しうる特異的表面分子（ｃｌｕｓｔｅｒ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、ＣＤ）を検出することは、これまでは不可能であった。それが完全に分化した状態により、無傷の形質細胞は、免疫学的にほとんど認識できないか、区別不可能である。
【００１２】
したがって、成熟形質細胞を特異的に攻撃する、前述の症候群の治療は知られていない。
【００１３】
このように、前述の症候群に対してこれまで利用可能な唯一の治療は、特にマルチモード（ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ） 化学療法の形態の化学療法である。しかしながら、これは、化学療法の一般に知られた欠点を有する。これまでに知られた該治療コンセプトの概要は、例えば、Ｌｏｋｈｏｒｓｔ Ｈ．Ｍ． ら、Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． （１９９９） 、１０６ 巻、１８−２７ 頁に記載されている。
【００１４】
上記の高用量化学療法および自己由来幹細胞／骨髄移植に関してある程度進歩したにも関わらず、多発性骨髄腫はなお、平均余命が約３〜５年の治療不可能な疾患である（Ｐｅｅｓｔ （１９９５） Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ３１ａ：１４６−１５１； Ａｔｔａｌ （１９９６） Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３５：９１−９７）。この厳しい（ｂｌｅａｋ） 状況が、代替治療ストラテジーの研究を刺激しており、なかでも免疫療法的ストラテジーの役割が大きくなっている。形質細胞の除去一般および特に多発性骨髄腫の治療のための、抗体に基づくストラテジーの開発は、安定な形質細胞特異的表面抗原がこれまでに見つかっていないという事実により妨げられている（Ｂａｔａｉｌｌｅおよび Ｈａｒｏｕｓｓｅａｕ， １９９７， ｌｏｃ． ｃｉｔ．； Ｈａｌｌｅｋ， １９９８ Ｂｌｏｏｄ ９１， ３−２１；また、Ｇｒｅｉｎｅｒ， ２０００， Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ ４３７， ３７２−３７９ も参照のこと）。これまで、Ｂ細胞発達の初期段階でのＢ細胞分化に関する研究作業がたくさん行われてきたが、形質細胞までの途中で分化が終結することに関してほとんどわかっていない。したがって、その本質的な理由は、形質細胞に特異的な抗体が形質細胞の同定のために利用し得ないということである。形質細胞に関してこれまで公表されているＣＤ４４、ＣＤ３８、ＰＣ−１、ＰＣＡ−１、ＭＭＡ、ＢＢ−１またはＶＳ３８などの抗体は、反応する範囲が広いという不都合ならびに種々の他の組織および細胞質抗原とも反応するという不都合を有する。正常形質細胞および悪性形質細胞は、いくつかの充分に特性付けされた表面マーカーを発現するが、それらはすべて、形質細胞非特異的であることがわかっている。ＣＤ３８は、分化関連抗原というよりむしろ活性化関連抗原であり、系統制限（ｌｉｎｅａｇｅ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ） がない（Ｆｕｎａｒｏ， １９９０； Ａｌｅｓｓｉｏ， １９９０， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５， ８７８−８８４ ）。ＣＤ５６は、ＮＫ細胞上でも発現されるＮ−ＣＡＭスプライスバリアントである（Ｐｅｌｌａｔ−Ｄｅｃｅｕｎｙｎｃｋ ら、１９９８， Ｌｅｕｋｅｍｉａ １２， １９７７−１９８２； Ｒｏｂｉｌｌａｒｄ， １９９８， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４， １５２１−１５２６ ）， ３ ）。ＣＤ１３８（シンデカン−１）もまた、上皮上で発現される（Ｓｅｂｅｓｔｙｅｎ， １９９９， Ｂｒ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． １０４， ４１２−４１９； Ｍａａｔｔａ， １９９９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， ９８９１−９８９８； Ａｎｔｔｏｎｅｎ， １９９９， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７９， ５５８−５６４； Ｋａｔｏ， １９９５， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ ６， ５５９−５７６）。最近記載された形質細胞関連抗原ＨＭ１．２４は、骨髄間質細胞などの他の細胞型によっても発現されることがわかった（Ｂａｔａｉｌｌｅおよび Ｈａｒｏｕｓｓｅａｕ， １９９７， ｌｏｃ． ｃｉｔ．； Ｈａｌｌｅｋ， １９９８， ｌｏｃ． ｃｉｔ．； Ｇｒｅｉｎｅｒ， ２０００， ｌｏｃ． ｃｉｔ．； Ｏｈｔｏｍｏ， １９９９， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２５８， ５８３−５９１）。このように、上記抗体のすべてが形質細胞および多発性骨髄腫細胞を特異的に同定するわけではない。
【００１５】
リンパ腫細胞を排除するための、抗体に基づくアプローチは、人間において、標準ＩｇＧ抗体および放射性免疫コンジュゲートの形態のいずれかで有効であることが証明されている。そのような分子は、ＣＤ２０およびＣＤ５２を認識する抗体に基づくものである（リチュキシマブ、イブリチュモマブ、トシチュモマブ、キャンパス−１Ｈ）。これらの抗体に基づくアプローチは、リンパ腫および白血病の治療において非常に有望な結果を示すが、標的は形質細胞悪性腫瘍（形質細胞腫／多発性骨髄腫）に適さない。
【００１６】
形質細胞は、すべてのＢ細胞のうちたった１％を占め、ごく少数のみがパンＢ細胞（ｐａｎ−Ｂ ｃｅｌｌ）マーカーであるＣＤ１９（通常ＣＤ１９ネガティブ）およびＣＤ２０（２０％未満）を発現する。したがって、ＣＤ１９またはＣＤ２０に対する抗体に基づく治療アプローチは、形質細胞の少数のサブセットのみを標的とする一方で、非形質Ｂ細胞の望ましくない排除による大きな細胞毒性応答を誘導する。
【００１７】
結果として、本発明は、形質細胞を特異的に標識する抗体の調製方法を提案する課題および該抗体を提案する課題に取り組むものである。さらに、本発明は、対応する抗体をコードする遺伝子およびかかる抗体の使用を提案する課題に取り組むものである。さらにまた、本発明は、かかる抗体により標識される抗原を提案する課題に取り組むものである。また、本発明の技術的課題は、形質細胞悪性腫瘍を緩和、予防または治療するための手段および方法を提供することであった。
【００１８】
この課題は、本発明の抗体、単鎖ポリペプチド、抗原、該抗体、該単鎖ポリペプチドもしくは該抗原をコードするヌクレオチド配列、さらなる抗体および／または単鎖ポリペプチドの使用およびこれらを調製する方法により解決される。有利な態様は添付の請求の範囲において特定化される。
【００１９】
特異的抗原に対する抗体を得るために、当該技術水準では、対応する抗原を動物生体に播種する（例えば、注射により）ことが提案されており、その結果、体液性免疫応答によりこの抗原に対する抗体が形成される。産生された抗体を、続いて分離および精製しうる。これまで、この方法は、無傷の成熟形質細胞では、表面上に抗原決定基がほとんどないため結果が良好でなかった。この方法では、形質細胞に特異的な特異的抗体を調製することはおそらく不可能であり、形質細胞に関しては播種を行う試みは結果が良好でなかった。
【００２０】
これは本発明の起点であり、本発明では、普及した教示とは対照的に、リンパ球形質細胞系細胞段階を含めた該細胞段階に至るまでの形質分化株のＢ細胞で動物生体を免疫する。したがって、先行技術とは対照的に、播種に用いるのは所望の抗原、すなわち形質細胞ではなく、その前駆細胞である。しかしながら、驚いたことに、まさにこの方法は、対応する前駆細胞段階を標識せずに形質細胞を特異的に標識する抗体を得ることを可能にする。この理由は、対応する前駆細胞が播種後、動物生体においてさらに形質細胞へと発達し、形質細胞が、形質細胞の直接免疫では生じ得ない特異的抗体反応を誘発するためであろう。現在、該動物生体由来の対応する脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマ細胞とすることにより、産生された抗体をモノクローナル抗体としてかかる免疫した動物生体から容易に得ることが可能である。この点について、モノクローナル抗体の産生方法の一般に知られた技術水準に関する記載がある（本明細書中の以下の記載も参照のこと）。
【００２１】
抗体は、本質的に、そのＬ鎖およびＨ鎖の可変領域（Ｆｗ）により規定される。Ｌ鎖およびＨ鎖のそれぞれのその他の領域（Ｆｃ）は、該抗体の抗原特異性に何ら貢献せず、各場合で異なる抗体クラスにおいて大きくは変わり得ない。
【００２２】
本発明の抗体は、軽鎖（Ｌ−鎖）の少なくとも１つの可変領域（Ｆｗ（Ｌ））が以下のアミノ酸配列の少なくとも１つまたはその一部：
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳＬＳＣ （可変領域ＦＷ−１；配列番号：１）
ＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮ（相補性決定領域ＣＤＲ−１ ；配列番号：２）
ＷＬＬＱＲＰＧＱＳ　　　ＰＫＲＬＩＳ （可変領域ＦＷ−２；配列番号：３）
ＬＶＳＫＬＤＳ （相補性決定領域ＣＤＲ−２ ；配列番号：４）
ＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣ（可変領域ＦＷ−３；配列番号：５）
ＷＱＧＴＨＬＰＷＴ （相補性決定領域ＣＤＲ−３ ；配列番号：６）および／または
ＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ （可変領域ＦＷ−４；配列番号：７）
を有する、
および／または重鎖（Ｈ−鎖）の少なくとも１つの可変領域（Ｆｗ（Ｈ））が以下のアミノ酸配列の少なくとも１つまたはその一部：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＴＧＡＳＶＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＳ（可変領域ＦＷ−１；配列番号：８），
ＧＹＹＭＨ （相補性決定領域ＣＤＲ−１ ；配列番号：９）
ＷＶＫＱＳＨＧＫＲＬＥＷＩＧ（可変領域ＦＷ−２；配列番号：１０）
ＹＩＳＧＹＮＧＤＴＲＹＮＱＫＦＲＧ （相補性決定領域ＣＤＲ−２ ；配列番号：１１）
ＫＡＴＦＩＶＤＩＳＳＲＴＡＹＭＱＦＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲ（可変領域ＦＷ−３；配列番号：１２）
ＧＧＹＹＧＹＶＤＹ （相補性決定領域ＣＤＲ−３ ；配列番号：１３）および／または
ＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ （可変領域ＦＷ−４；配列番号：１４）
を有することを特徴とする。
【００２３】
これらの抗体はまた、該抗体の個々の鎖（Ｌ−鎖およびＨ−鎖）をコードする遺伝子が、Ｌ−鎖に対して以下：
ｇａａｇｃａｃｇｃｇ ｔａｇａｔａｔｃｇｔ ｇａｔｇａｃｃｃａａ ａｃｔｃｃａｃｔｃａ ｃｔｔｔｇｔｃｇｇｔ ｔａｃｃａｔｔｇｇａ ｃａａｃｃａｇｃｃｔ ｃｃｃｔｃｔｃｔｔｇ ｃａａｇｔｃａａｇｔ ｃａｇａｇｃｃｔｃｔ ｔａｇａｔａｈｔｇａ ｔｇｇａａａｇａｃａ ｔａｔｔｔｇａａｔｔ ｇｇｔｔｇｔｔａｃａ ｇａｇｇｃｃａｇｇｃ ｃａｇｔｃｔｃｃａａ ａｇｃｇｃｃｔａａｔ ｃｔｃｔｃｔｇｇｔｇ ｔｃｔａａａｔｔｇｇ ａｃｔｃｔｇｇａｇｔ ｃｃｃｔｇａｃａｇａ ｔｔｃａｃｔｇｇｃａ ｇｔｇｇａｔｃａｇｇ ｇａｃａｇａｔｔｔｃ ａｃａｃｔｇａａａａ ｔｃａｇｃａｇａｇｔ ｇｇａｇｇｃｔｇａｇ ｇａｔｔｔｇｇｇａｇ ｔｃｔａｔｔａｔｔｇ ｃｔｇｇｃａａｇｇｔ ａｃａｃａｔｃｔｔｃ ｃｇｔｇｇａｃａｔｔ ｃｇｇｔｇｇａｇｇｃ ａｃｃａａｇｃｔｇｇ ａａａｔｃａａａｃｇ ｇｇｃｔｇａｔｇｃｔ ｇｃｇｇｃｃｇｃｔｇ ｇａｔｃｃａｔｃｔｔ ｃ （配列番号：１５）
および／またはＨ−鎖に対して以下：
ｃｇｃｃａｔｇｇｃｃ ｇｃｇｇｇａｔｔｃｃ ｇｇｃｃａｔｇｇｃｇ ｃａｇｇｔｇｃａｇｃ ｔｇｃａｇｃａｇｔｃ ｔｇｇａｃｃｔｇａｇ ｃｔａｇｔｇａａｇａ ｃｔｇｇｇｇｃｔｔｃ ａｇｔｇａａｇａｔａ ｔｃｔｔｇｔａａｇｇ ｇｔｔｃｔｇｇｔｔａ ｃｔｃａｔｔｃａｇｔ ｇｇｔｔａｃｔａｃａ ｔｇｃａｃｔｇｇｇｔ ｃａａｇｃａｇａｇｃ ｃａｔｇｇａａａｇａ ｇｇｃｔｔｇａｇｔｇ ｇａｔｔｇｇａｔａｔ ａｔｔａｇｔｇｇｔｔ ａｔａａｔｇｇｔｇａ ｔａｃｔａｇｇｔａｔ ａａｔｃａｇａａｇｔ ｔｃａｇｇｇｇｃａａ ｇｇｃｃａｃａｔｔｔ ａｔｔｇｔａｇａｃａ ｔａｔｃｃｔｃｃａｇ ｇａｃａｇｃｃｔａｃ ａｔｇｃａｇｔｔｃａ ａｃａｇｃｃｔｇａｃ ａｔｃｔｇａａｇａｃ ｔｃｔｇｃｇｇｔｃｔ ａｔｔａｃｔｇｔｇｃ ａａｇａｇｇｇｇｇｔ ｔａｃｔａｃｇｇｃｔ ａｃｇｔｇｇａｃｔａ ｃｔｇｇｇｇｃｃａａ ｇｇｃａｃｃａｃｃｃ ｔｃａｃａｇｔｃｔｃ ｃｔｃａｇｃｃａａａ ａｃｇａｃａｃｃｃａ ａｇｃｔｔｇｔｃｔａ ｔｃｃａｃｔｇｇｃｃ ｃｃｔｇｇｔａａｔｃ ａｃｔｇｔｇｃｇｇｃ ｃｇｃｃｇ （配列番号：１６）
のヌクレオチド配列または対応するそのフラグメントを含有することを特徴とし得る。
【００２４】
各場合における本発明のヌクレオチド配列は、上述のヌクレオチド配列またはその一部を含有し、各場合において上述の抗体、機能性抗体、そのフラグメントおよび／または機能性誘導体に必要な遺伝子の１つを提示する。
【００２５】
該抗体は、両軽鎖および両重鎖がそれぞれ同じアミノ酸配列を有する従来の免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）でありうる。好ましくは、該抗体はマウスＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ１であり、さらに他のＩｇＧも想定される。しかしながら、本発明は、多機能ポリペプチドおよび／または二重特異性であり、例えば、上述の重鎖の一方だけおよび軽鎖の一方だけを含み、その結果形質細胞に対する結合部位が１つしか形成されない抗体も包含する。特に好ましい二重特異性抗体は、本明細書において以下に記載する。該二重特異性抗体は単鎖構築物であることが特に好ましい。
【００２６】
したがって、本発明の抗体は、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、合成抗体、Ｆａｂフラグメント、ＦｖフラグメントもしくはｓｃＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントなど、またはこれらの任意の化学修飾誘導体でありうる。モノクローナル抗体は、例えば、マウス骨髄腫細胞の免疫した哺乳動物由来脾臓細胞との融合に当該技術分野において開発された修正を加えた技術を記載した、ケーラー（Ｋｏｅｈｌｅｒ） およびミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ ２５６ （１９７５）， ４９５， ならびにガルフレー（Ｇａｌｆｒｅ）、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７３ （１９８１）， ３ により最初に記載されたような技術により調製することができる。モノクローナル抗体は、とりわけ、マウス、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスを、実施例１に記載のようにして得られ得るヒト単核血液細胞で免疫することにより得ることができる。さらにまた、前述の形質細胞に対するさらなる抗体またはそのフラグメントを、例えば、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ） ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， １９８８ に記載の方法を用いることにより得ることができる。本発明の抗体は、例えば、本発明の形質細胞の免疫沈降、免疫学的局在化または精製に使用することができ、ならびにかかる形質細胞の存在のモニタリングおよび本発明の形質細胞と相互作用する化合物の同定のために使用するすることができる。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステムにおいて用いられるような表面プラスモン共鳴を、本発明の抗体により認識されるエピトープと結合する抗体のファージディスプレーの効率を上げるために使用することができる（Ｓｃｈｉｅｒ， Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ７ （１９９６）， ９７−１０５； Ｍａｌｍｂｏｒｇ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８３ （１９９５）， ７−１３）。キメラ抗体の産生は、例えば、ＷＯ８９／０９６２２に記載されている。ヒト化抗体の産生方法は、例えば、ＥＰ−Ａ１　０　２３９　４００およびＷＯ９０／０７８６１に記載されている。さらにまた、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖（ＶＨ およびＶＬ ）の可変領域のインビトロの組合せならびにその抗原結合特異性のインビトロ選択（Ｗｉｎｔｅｒ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２ （１９９４）， ４３３−４５５）を可能にする、異種抗体（Ｂｒｕｅｇｇｅｍａｎｎ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １７ （１９９６）， ３９１−３９７；マウスにおけるヒト抗体などの異種抗体の産生の一般原理は、例えば、ＷＯ９１／１０７４１、ＷＯ　９４／０２６０２、ＷＯ　６／３４０９６およびＷＯ　９６／３３７３５に記載されている）ともよばれるヒト抗体を発現するトランスジェニックマウスが入手可能であるため、およびコンビナトリアル抗体ライブラリーおよびファージディスプレー技術が入手可能であるため、ヒト抗体が一般に利用しやすくなっている。ファージディスプレー法を用いることにより、１０７ 〜１０９ の異なるＶＬ ／ＶＨ − ペアおよびＶＨ ／ＶＬ − ペアの中の１つの特��的結合実体のような稀な事象を容易に単離しうる。これは、レパートリークローニングのための供給源として免疫した宿主由来のＢリンパ細胞を用いることにより可変領域のレパートリーが特異的結合実体に関して富化された場合に特にあてはまる。また、半合成または完全合成ＶＨ − および／またはＶＬ − 免疫グロブリン鎖レパートリーを用いるアプローチが開発されている。例えば、転位していないヒトＶ遺伝子セグメントのほぼ完全なレパートリーが、ゲノムＤＮＡからクローニングされており、Ｖ−Ｊ−またはＶ−Ｄ−Ｊ−インビボ組換えに類似する、機能性可変領域遺伝子のインビトロ組換えに使用されている（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７ （１９９２）， ３８１−３８８； Ｎｉｓｓｉｍ， ＥＭＢＯ Ｊ． １３ （１９９４） ６９２−６９８； Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， ＥＭＢＯ Ｊ． １３ （１９９４）， ３２４５−３２６０ ）。したがって、本明細書の下記の記載の、および実施例に記載の抗体のこれらの誘導体のすべては、抗体が形質細胞、好ましくはヒト形質細胞に特異的な抗原の少なくとも１つのエピトープを特異的に認識するかぎり本発明の範囲に包含される。本明細書に記載するように、本発明の抗体は、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２ を含む完全抗体以外の種々の形態で、ならびに単鎖で存在しうる（例えば、ＷＯ８８／０９３４４および本明細書の以下の記載を参照のこと）。
【００２７】
本発明の抗体、その対応する（１または複数の）免疫グロブリン鎖および／またはその機能性フラグメントおよび誘導体を、当該技術分野で公知の常套的技術、例えば、アミノ酸の（１または複数の）欠失、（１または複数の）挿入、（１または複数の）置換、（１または複数の）付加および／または（１または複数の）組換えおよび／または当該技術分野で公知の任意の他の（１または複数の）修飾を単独または組み合せて用いることによりさらに修飾することができる。免疫グロブリン鎖のアミノ酸配列の下地となるＤＮＡ配列に、かかる修飾を導入するための方法は、当業者に周知である。例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９） Ｎ．Ｙ．を参照のこと。
【００２８】
本発明の好ましい態様では、本発明の抗体は、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ　ＡＣＣ　２４４１により産生される抗体であり、好ましくは該抗体は、該ハイブリドーマ細胞株により産生される抗体ＷＵＥ−１である。
該ハイブリドーマ細胞は、ブダペスト条約に従って、ドイツ、ブラウンシュヴァイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）、培養物所蔵所（ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ） Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ （ＤＳＭＺ） ＧｍｂＨ に、２０００年１月１日に寄託された。本明細書に記載の抗体は、とりわけ、形質細胞の免疫学的単離、免疫学的局在化および／または精製に特に有用である。さらにまた、それらは、形質細胞と相互作用しうるか、または形質細胞と相互作用する化合物の検出および／または同定のためのアッセイに使用しうる。
【００２９】
本発明はまた、例えば、免疫グロブリンの定常ドメインに連結したＷＵＥ−１抗体の可変重鎖ドメインおよび軽鎖ドメインをコードするｃＤＮＡのヒトＢ細胞株へのトランスダクションにより、ヒト化形態の本発明の抗体を産生しうる（ヒト）Ｂ細胞株に関する。該ｃＤＮＡは、当業者に周知の方法、とりわけ、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）， ｌｏｃ． ｃｉｔ． およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ） ”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ． （１９８９） に記載されている方法により得られ得る。発現（または配列決定）のための該ｃＤＮＡのクローニングは、例えば、オーランディ（Ｏｒｌａｎｄｉ） 、ＰＮＡＳ ８６ （１９８９）， ３８３３−３８３７ に記載のような標準プロトコル、またはｍＡｂ　ＷＵＥ−１の可変領域のクローニングを記載した本実施例に示すような標準プロトコルに従いうる。
【００３０】
さらにまた、本発明は、本発明の抗体および／または本発明の前述の抗体の任意の免疫グロブリン鎖の少なくとも可変領域をコードするヌクレオチド配列／ポリヌクレオチドを提供する。該領域をコードするポリヌクレオチドは、当業者に周知の方法（とりわけ、オーランディ（Ｏｒｌａｎｄｉ） 、ＰＮＡＳ ８６ （１９８９）， ３８３３−３８３７ またはサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）， ｌｏｃ． ｃｉｔ． に記載のようなクローニング技術を含む）により得ることができる。免疫グロブリンの一形態は、抗体の基本構造ユニットを構成する。この形態は、四量体であり、２つの同一の免疫グロブリン鎖ペア（各ペアは、１つの軽鎖と１つの重鎖とを有する）からなる。各ペアにおいて、軽鎖および重鎖の可変領域またはドメインは共に、抗原との結合を担い、定常領域は、抗体エフェクター機能を担う。抗体に加えて、免疫グロブリンは、上述のＦｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２ならびに単鎖抗体（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５（１９８８，５８７９−５８８３ およびＢｉｒｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２（１９８８）， ４２３４２６）；本明細書の以下の記載も参照のこと）を含む種々の他の形態（所望の活性を保持している完全長未満のものを含む）で存在しうる。免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは、ＣＤＲともよばれる３つの超可変領域が介在した「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域およびＣＤＲの大きさは、正確に規定されている；例えば、”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，” Ｋａｂａｔ， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ （１９９０） を参照のこと。異なる軽鎖まはた重鎖のフレームワーク領域の配列は、種間で比較的保存されている。構成的軽鎖および構成的重鎖の組合せフレームワーク領域である、抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲの位置決定およびアラインメント（ａｌｉｇｎ） に役立つ。ＣＤＲは、主に、抗原のエピトープへの結合を担う。キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖の遺伝子が、典型的には遺伝子操作によって、異なる種に属する免疫グロブリンの可変領域および定常領域の遺伝子から構築された抗体である。例えば、マウスモノクローナル抗体由来の該遺伝子の可変セグメントを、ヒト定常セグメントと連結しうる。
【００３１】
したがって、本発明の教示は、可変領域、特に形質細胞を特異的に検出／これと相互作用する抗体のＣＤＲを提供する。該可変領域は、とりわけ、公知の組換え技術により、キメラ、合成などの抗体および／またはその免疫グロブリン分子もしくはその誘導体を作製するのに使用しうる。例えば、本発明の抗体の可変領域を、異なる種の異なるＩｇサブタイプまたはＩｇ／Ｉｇサブタイプの抗体の定常領域と組合せることが想定される。このことは、とりわけ、該抗体のエフェクター機能、例えば、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞毒性の誘導のエフェクター機能を増強するのに特に有用でありうる。当業者は、かかるエフェクター機能が抗体／免疫グロブリン分子の定常部分に大いに依存することを認識しており、それに応じてかかる定常部分を選択しうる。
【００３２】
したがって、本発明の抗体は、本発明の抗体の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の単独または組み合せのいずれかをコードする組換えＤＮＡセグメントを発現させることにより作製することができる。該ポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、または合成により作製したＤＮＡもしくはＲＮＡ、または任意のこれらのポリヌクレオチドの単独または組合せを含有する組換えにより作製したキメラ核酸分子でありうる。好ましくは、該ポリヌクレオチドはベクターの一部である。かかるベクターは、適切な条件下で適切な宿主細胞内での該ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などのさらなる遺伝子を含有しうる。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞における発現を可能にする発現制御配列に作動可能に連結している。該ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへのポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞での発現を確実にする調節エレメントは当業者に周知である。それらは、通常、転写の開始を確実にする調節配列ならびに、任意に、転写の終結および転写産物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含む。さらなる調節エレメントには、転写エンハンサーおよび翻訳エンハンサーおよび／または天然のもしくは異系のプロモーター領域が含まれうる。これに関して、当業者は、軽鎖および／または重鎖の少なくとも可変領域をコードするポリヌクレオチドが両方または一方のみの免疫グロブリン鎖の可変領域をコードしうることを容易に理解する。同様に、該ポリヌクレオチドは、発現に関して、同じプロモーターの制御下であってもよく、別々に制御されてもよい。原核宿主細胞での発現を可能にする考え得る調節エレメントとしては、例えば、大腸菌におけるＰＬ 、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモーターが挙げられ、真核宿主細胞での発現を可能にする調節エレメントの例には、酵母におけるＡＯＸ１またはＧＡＬ１プロモーター、または哺乳動物細胞および他の動物細胞におけるＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ４０−エンハンサーまたはグロビンイントロンが挙げられる。抗体誘導体、例えば、単鎖構築物については実施例で後述するように、ＥＦ−２プロモーターを用い得る。転写の開始を担うエレメントの他に、かかる調節エレメントはまた、該ポリヌクレオチドの下流のＳＶ４０−ポリ−Ａ部位またはｔｋ−ポリ−Ａ部位などの転写終結シグナルを包含しうる。本文脈において、適切な発現ベクターは、当該技術分野で公知であり、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ　ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 社）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（インビトロゲン（Ｉｎ−ｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）社）、ｐＳＰＯＲＴ１（ギブコ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ） 社）などである。
好ましくは、発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトしうる、ベクター内の真核生物プロモーターシステムであるが、原核宿主の制御配列もまた使用し得る。いったんベクターが適切な宿主内に取り込まれると、該宿主は、ヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件下に維持され、所望により、免疫グロブリンの軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖二量体もしくは無傷の抗体、結合フラグメントまたは他の免疫グロブリン型の回収および精製を続いて行いうる。ベイコック（Ｂｅｙｃｈｏｋ）， Ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， （１９７９）参照のこと。
【００３３】
上述のように、本発明のヌクレオチド配列ポリヌクレオチドは、例えば、形質細胞の悪性腫瘍に関連する疾患の遺伝子治療または診断のために、細胞内で本発明の抗体を発現させるために単独で、またはベクターの一部として使用することができる。上記抗体の任意の１つをコードする（１または複数の）ＤＮＡ配列を含有してなるポリヌクレオチドまたはベクターを細胞内に導入すると、次にこれが目的の抗体を産生する。エキソビボまたはインビボ技術によって細胞内に治療用遺伝子を導入することに基づく遺伝子治療は、遺伝子導入の最も重要な応用である。インビトロまたはインビボ遺伝子治療のための適切なベクター、方法、または遺伝子送達システムは、文献に記載されており、当業者に公知である。例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２ （１９９６）， ５３４−５３９； Ｓｃｈａｐｅｒ， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７９ （１９９６）， ９１１−９１９； Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６ （１９９２）， ８０８−８１３； Ｉｓｎｅｒ， Ｌａｎｃｅｔ ３４８ （１９９６）， ３７０−３７４； Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ， Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７７ （１９９５）， １０７７−１０８６； Ｗａｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２ （１９９６）， ７１４−７１６； ＷＯ９４／２９４６９； ＷＯ ９７／００９５７， Ｏｎｏｄｕａ， Ｂｌｏｏｄ ９１ （１９９８）， ３０−３６； Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉ， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９ （１９９８）， ２２４４−２２５１； Ｖｅｒｍａ， Ｎａｔｕｒｅ ３８９ （１９９７）， ２３９−２４２； 米国特許第５，５８０，８５９ 号明細書； 米国特許第５，５８９，４６６ 号明細書； 米国特許第４，３９４，４４８ 号明細書またはＳｃｈａｐｅｒ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７ （１９９６）， ６３５−６４０ 、および本明細書に引用した文献を参照のこと。本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、細胞内に直接導入するために設計されてもよく、リポソームまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介して導入するために設計されてもよい。好ましくは、該細胞は、生殖細胞、胚細胞もしくは卵細胞またはそれらの誘導体であり、最も好ましくは、該細胞は幹細胞である。この態様は、例えば、本明細書に記載　（下記の実施例も参照のこと）の、一方の特異性が、形質細胞関連疾患の治療を容易にしうる形質細胞抗原に対するものである本発明の二重特異性抗体に特に好適である。
【００３４】
さらに、本発明は、ベクター、特に、本発明の抗体の鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを、任意に、本発明の抗体の他の鎖の可変ドメインをコードする本発明のポリヌクレオチドとの組合せで含有してなる、従来より遺伝子操作に用いられているプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージに関する。好ましくは、該ベクターは、発現ベクターおよび／または遺伝子導入ベクターまたはターゲティングベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシ乳頭腫ウイルスなどのウイルス由来の発現ベクターを、標的細胞集団に本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを送達するために使用しうる。組換えウイルスベクターを構築するために、当業者に周知の方法を使用することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９） Ｎ．Ｙ．および Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎ．Ｙ． （１９８９） に記載の技術を参照のこと。あるいはまた、標的細胞への送達のために、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターを、リポソーム内に再構築することができる。本発明のポリヌクレオチド（例えば、配列および発現制御配列をコードする、免疫グロブリン鎖の重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン）を含有するベクターを、周知の方法（宿主細胞の型により異なる）により宿主内に導入することができる。例えば、塩化カルシウムトランスフェクションが原核細胞に通常使用されるが、他の宿主細胞には、リン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが使用されうる。上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ参照のこと。いったん発現されると、本発明の全抗体、その二量体、個々の軽鎖および重鎖または他の免疫グロブリン型を、硫安沈降法、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当該技術分野の標準手順（Ｓｃｏｐｅｓ， ”Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ． （１９８２）参照のこと）に従って精製し得る。医薬用途のためには、少なくとも約９０〜９５％の均一度の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％以上の均一度の実質的に純粋な免疫グロブリンが最も好ましい。いったん、部分的または所望の均一度まで精製すると、次に、該ポリペプチドを治療（生体外を含む）に、またはアッセイ手順の開発および実施に使用し得る。
【００３５】
本発明はさらにまた、本発明のヌクレオチド配列／ポリヌクレオチドまたはベクターで形質転換した宿主細胞に関する。該宿主細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。宿主細胞内に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、該宿主細胞のゲノムに組み込まれていてもよく、染色体外に維持されていてもよい。
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞でありうる。「原核細胞の」という用語は、本発明の抗体の発現のためにＤＮＡまたはＲＮＡ分子で、または対応する免疫グロブリン鎖で形質転換またはトランスフェクトされうるすべての細菌を含むことを意図する。原核宿主には、例えば大腸菌、Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ， Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ などのグラム陰性菌およびグラム陽性菌が含まれ得る。「真核細胞の」という用語は、昆虫、真菌、植物、動物またはヒトの細胞を含むことを意図するが、これらに限定されない。好ましい真菌細胞は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ 属のもの、特にＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ 種のものである。本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、当業者に一般に知られた任意の技術を用いて宿主を形質転換またはトランスフェクトするのに使用することができる。真核細胞または原核細胞それぞれの形質転換またはトランスフェクションの目的のために、形質細胞、例えば、本発明の抗原のエピトープを認識する抗体のコード配列を含有するプラスミドまたはウイルスを使用することが特に好ましい。融合した、作動可能に連結した遺伝子の調製ならびに例えば、哺乳物細胞および細菌におけるその発現のための方法は当該技術分野において周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９ ）。そこに記載された遺伝子構築物および方法は、真核宿主または原核宿主において本発明の抗体を発現させるのに使用するこができる。一般に、挿入されたポリヌクレオチドの効率的な転写を促進するプロモーター配列を含有する発現ベクターを、宿主と組み合せて使用する。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーターおよびターミネーター、ならびに形質転換された細胞の表現型選択を提供しうる特異的遺伝子を含有する。形質転換された宿主は、当該技術分野で公知の技術に従って、ファーメンター内で成長させ、最適な細胞増殖が達成されるまで培養することができる。次いで、本発明の抗体またはその対応する（１または複数の）免疫グロブリン鎖を、増殖培地、細胞溶解物または細胞膜の画分から単離し得る。例えば、微生物により発現された本発明の抗体または免疫グロブリン鎖の単離および精製は、例えば本発明の抗体の定常領域に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の使用を含むものなどの、例えば調製用クロマトグラフィーによる分離および免疫学的分離などの常套的な任意の手段でありうる。
【００３６】
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体またはその機能性フラグメントもしくは誘導体を産生しうる連続的安定継代抗体産生細胞株に関する。該細胞株は、先に本明細書にて記述したように、ハイブリドーマ細胞株、好ましくは寄託番号ＤＳＭ　ＡＣＣ　２４４１を有する該ハイブリドーマ細胞株である。
【００３７】
さらに別の態様では、本発明は、リンパ球形質細胞系細胞段階を含めた該細胞段階に至るまでの形質細胞分化株のＢ細胞で動物を免疫し、調製された抗体を常套手法により該動物の血液から単離することを特徴とする、形質細胞に対する抗体の調製方法を提供する。
とりわけ、下記の実施例で示すように、マウス、好ましくはＢＡＬＢ／ｃマウスを標準プロトコルに従って、例えばインビトロで形質細胞に分化しうるリンパ腫細胞株、とりわけＭＡＬＴ−型（Ｈ３３０２）のリンパ腫で、免疫しうる。
【００３８】
さらにまた、本発明は、
（ａ）　抗体、その機能性フラグメント、誘導体または免疫グロブリン鎖を発現し得る、本発明の（宿主）細胞またはハイブリドーマ細胞を培養する工程、および
（ｂ）　細胞または培養培地から該抗体、その機能性フラグメント、誘導体または免疫グロブリン鎖を単離する工程
を含む、形質細胞を認識しうる抗体またはその機能性フラグメントもしくは誘導体の調製方法を提供する。
【００３９】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターで細胞を遺伝子操作する工程を含む、本発明の抗体またはその対応する（１または複数の）免疫グロブリン鎖を発現しうる細胞の作製方法に関連する。好ましくは、このようにして発現された（１または複数の）免疫グロブリン鎖はトランスフェクトされた細胞の細胞表面上にディスプレーされる。この態様および本明細書に記載の他のいくつかの態様は、上述のものなどのファージディスプレー技術に適合しうる。本発明の方法により得られ得る細胞は、例えば、本発明の抗体とその抗原との相互作用を試験するために使用することができる。上記の方法により得られ得る細胞はまた、本明細書において以下に言及するスクリーニング方法に使用しうる。さらにまた、本発明のポリヌクレオチド、ベクターまたは細胞を含有するトランスジェニック動物、好ましくはトランスジェニック哺乳動物を、本発明の抗体の大規模産生のために用い得る。
【００４０】
さらにまた、本発明は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるか、あるいは上述の方法により得られうるか、または上述の方法により作製される細胞から得られ得る本発明の抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体または免疫グロブリン鎖に関する。
【００４１】
本文脈において、本発明の抗体、そのフラグメントおよび／または誘導体は、当該技術分野で公知の常套法によりさらに修飾しうることも理解される。本発明の抗体を提供することにより、その結合活性に関連する部分を決定することも可能になる。これにより、結合活性に重要な本発明の抗体由来のアミノ酸配列、および異種タンパク質由来であり得る他の機能性アミノ酸配列、例えば、核局在化シグナル、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ホルモン結合ドメイン、タンパク質タグ（ＧＳＴ、ＧＦＰ、Ｈ−ｍｙｃペプチド、Ｆｌａｇ、ＨＡペプチド）を含有するキメラタンパク質の構築が可能となりうる。
【００４２】
本発明の抗体は、例えば毒素、サイトカイン、抗体フラグメントもしくは酵素などのタンパク質、および／または発蛍光団、ビオチンおよび／または放射性同位体との抗体コンジュゲートしても存在しうる。かかる抗体コンジュゲートおよびその調製は、例えば、”Ｇ． Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ”Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ” Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ＩＳＢＮ ０−１２−３４２３３６−８， １９９５” 、特に第８、１０、１１および１３章、または”Ｊ． Ｅ． Ｃｏｌｉｇａｎら、”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． ＩＳＢＮ ０−４７１−５２２７６−７， １９９１” に記載されており、これらはすべて参照により本出願の開示内容に取り込まれる。
放射性同位体のコンジュゲーションは、ヘテロ二官能性キレート形成性活性成分により媒介される（上記Ｇ． Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ の第８章参照のこと）。
好適な放射性同位体には、イットリウム−８８、イットリウム−９０、インジウム−１１１、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、サマリウム−１５３、ルテチウム−１７７、レニウム−１８６、ビスマス−２１２またはビスマス−２１３が含まれる。
好適な毒素には、自身を組換え融合毒素の調製に供しうる単鎖毒素である、リシン、組換えリシン、細菌毒素ＰＥ（シュードモナス外毒素（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｅｘｏｔｏｔｏｘｉｎ））またはＤＴ（ジフテリア毒素（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ））が含まれる。
毒性抗体とコンジュゲートした抗体は、例えば、米国特許第５，０１３，５４７号明細書およびＷＯ　９２／０７４６６に開示されている。
【００４３】
本出願の本明細書中に取り込まれる先行技術の概要は、
放射免疫療法については、Ｓ． Ｊ． ＤｅＮａｒｄｏ ら、「癌における放射標識抗体の新時代（”Ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｆｏｒ ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ”）」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９９，第１１巻， ５６３−５６９ 頁、
免疫毒素については、Ｒ． Ｊ． Ｋｒｅｉｔｍａｎ「癌における免疫毒素（”Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ”）」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９９，第１１巻， ５７０−７８頁、
二重特異性抗体については、Ｄ． Ｍ． Ｓｅｇａｌ ら、「癌治療における二重特異性抗体（”Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ”） 」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， １９９９，第１１巻， ５５８−５６２ 頁、
単鎖Ｆｖ−抗体の調製については米国特許第５，２６０，２０３号明細書、
コンジュゲートされる、または単鎖ポリペプチド鎖として発現される抗体フラグメントの調製についてはＷＯ　９１／１９７３９、
ヒト化抗体の調製については米国特許第５，８５９，２０５号明細書、
キメラ抗体（「ＣＤＲグラフティング（ｇｒａｆｔｉｎｇ）」）の調製については欧州特許第０　６２０　２７６号明細書、
架橋抗体の調製については米国特許第５，７１４，１４９号明細書、
抗体−サイトカイン融合タンパク質の調製については、Ｓ． Ｄ． Ｇｉｌｌｉｅｓ らによる「抗体標的化インターロイキン２は自己由来腫瘍細胞の死滅を刺激する（”Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ Ｔ−ｃｅｌｌ ｋｉｌｌｉｎｇ ｏｆ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ”） 」、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．， １９９２， 第８９巻， １４２８ − １４３２ 頁または Ｔ． Ｄｒｅｉｅｒらによる「マウストランスフェリンレセプターを標的化する組換え免疫サイトカイン；構築および生物学的活性（”Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ； ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ”）」、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ． １９９８，第９ 巻， ４８２−４８９頁
に記載されている。
【００４４】
上述の抗体を、形質細胞（好ましくはヒト形質細胞）を同定するため、および例えばそれらを分取するために使用することができる。例えば、この目的のために必要とされるすべてのことは、本発明の抗体を常套的に蛍光色素で標識すること、および蛍光標示式細胞分取（ＦＡＣＳ）を実施することである。さらなる分離方法は、当該技術分野の技術水準において知られている（例えば、Ｇｒｅｉｎｅｒ Ａ．ら （１９９７） Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ． １５０， ｐａｇｅｓ １５８３−１５９３ 参照のこと）。しかしながら、免疫学的単離および免疫学的分離のさらなる方法は当該技術分野において公知であり、ビーズ、好ましくは磁気ビーズのような固体支持体への結合を含みうる。
【００４５】
このようにして、すべての形質細胞を血液試料または組織から分離および単離することが可能である。この方法において、腫瘍または自己免疫疾患を引き起こす形質細胞を除去するために、変性した形質細胞もまた除去される。
【００４６】
特に、形質細胞の標識および除去は、体外、例えば透析と同様の様式での外部人工血液循環でも行いうる。
【００４７】
本発明はまた、本発明の抗体と結合する、および／または該抗体により認識されることを特徴とする抗原に関する。
【００４８】
本発明の抗原は本発明の抗体により標識される。これらの抗原の１つは、形質細胞の表面タンパク質であり、かつ約９４ｋＤまたは約５５ｋＤの分子量を有することを特徴とする。本発明の抗原の分子量は、５０〜６０ｋＤの間であり、最も好ましくは約５０〜５５ｋＤであることが特に好ましい。該分子量は、とりわけ、以下の方法を用いて推定することができる。すなわち、スルホ−ＮＨＳ−ビオチン（ＭＷ４００；ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社）の添加により細胞懸濁物（１０７ 細胞）をビオチン化する。該細胞、例えば患者の細胞をＣＨＡＰＳ−バッファー中で溶解させ、本明細書において開示した抗体、例えば、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ　ＡＣＣ　２４４１により分泌される抗体を免疫沈降アプローチに使用しうる。免疫沈降した物質をＳＤＳ−試料バッファー中で可溶化し得、試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて電気泳動させうる。分子量標準品として、ＳＩＧＭＡ社のＨＭＷ（予備染色していない）のような商業的に入手可能な標準品を使用しうる。電気泳動させたタンパク質をニトロセルロース膜上に移し、免疫沈降させたビオチン化タンパク質をストレプトアビジン−ＨＲＰ（例えば、ファルマシア社製）およびＥＣＬ−システムを用いて可視化しうる。この抗原は、形質細胞の表面上だけでなく、細胞のプラスマ内にも存在することがわかった。
【００４９】
したがって、本発明はまた、上述の抗原および／またはそのエピトープと結合することを特徴とする抗体にも関する。該抗体は、常套法および／または本明細書に記載の方法により得られ得る。特に、該抗体は、本発明の抗原および／またはそのエピトープで動物を免疫し、形成された抗体を該動物の血液から単離することにより得られ得る（とりわけ、Ｈａｒｌｏｗおよび Ｌａｎｅ， ｌｏｃ． ｃｉｔ．参照のこと）。
該抗体（１つまたは複数）はまた、抗体をモノクローナル抗体として産生する細胞株を作製するために、免疫した動物の細胞を用いることにより調製しうる。ここで、この細胞株を培養し、産生された抗体を単離する。好ましくは、該培養細胞は、免疫した動物の脾臓細胞由来の細胞であり、好ましくは該細胞は、骨髄腫細胞との融合により調製したハイブリドーマ細胞である（下記実施例も参照のこと）。
【００５０】
本発明の好ましい態様では、本発明の抗体を、対応する抗原を同定および／または特性付けするため、および／または形質細胞、好ましくはヒト形質細胞を特異的に標識／検出／認識するために使用する。該抗体はまた、形質細胞を標識／認識するさらなる抗体、そのフラグメントまたは誘導体を調製するために使用しうる。本発明はまた、このような抗体、そのフラグメントまたは誘導体の少なくとも一方の可変領域をコードするヌクレオチド配列／ポリヌクレオチドに関する。
本発明の抗体を用い、本発明の抗原の少なくとも１つのエピトープを有するペプチドに関して大腸菌のｃＤＮＡ発現ライブラリーを間接的にスクリーニングしうることも強調しておかなければならない（Ｃｈａｎｇ および Ｇｏｔｔｌｉｅｂ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， ８：２１２３， １９８８ ）。かかる抗原の構造が明らかになると、結合パートナーおよび／またはドメインの合理的な設計が可能となりうる。例えば、フォールディングのシミュレーションおよび構造モチーフのコンピュータによる再設計を、適切なコンピュータプログラムを用いて行い得る（Ｏｌｓｚｅｗｓｋｉ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２５ （１９９６）， ２８６−２９９； Ｈｏｆｆｍａｎ， Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． １１ （１９９５）， ６７５−６７９ ）。さらにまた、詳細なタンパク質モデルのコンフォメーション解析およびエネルギー解析のために、コンピュータを用いることができる（Ｍｏｎｇｅ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２４７ （１９９５）， ９９５−１０１２； Ｒｅｎｏｕｆ， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ３７６ （１９９５）， ３７−４５ ）。
【００５１】
この抗原の知見により、同じ抗原に対するさらなる抗体を作製するために、簡便に常套的に、例えばゲル電気泳動により抗原を精製し、次にこの抗原により動物生体を免疫することが可能となった。もちろん、このようにして産生された抗体は、形質細胞が９４ｋＤ抗原または５５ｋＤ抗原をその表面上に提示するため、引き続いて形質細胞のみを特異的に再度標識し、上述のようにして使用することができる。
【００５２】
したがって、形質細胞に対する特異的な任意のさらなる抗体を作製するための明確な（ｄｅｆｉｎｅｄ） 方法が利用可能であり、これは、多くのテキストブック（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｅ， １９９５， Ｓｐｅｋｔｒｕｍ−Ｖｅｒｌａｇ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｏｘｆｏｒｄ ）に記載のような標準免疫学的技術により実施することができる。もちろん、動物を免疫した後、当該技術水準で知られているような常套手法により対応する抗体を再度モノクローナル抗体として作製することができる。
【００５３】
本発明はまた、ポリペプチドの少なくとも一部が、本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の結合部位を含有する多機能ポリペプチドを提供する。
好ましくは、該多機能ポリペプチドは、
（ａ）　本明細書において規定した免疫グロブリンまたは抗体の結合部位を含む第１ドメイン、および
（ｂ）　ＣＤ３抗原を特異的に認識する免疫グロブリン鎖または抗体の結合部位を含む第２ドメイン
を含有する単鎖多機能ポリペプチドである。
【００５４】
本発明による「第１ドメイン」および「第２ドメイン」という用語は、一方の結合部位が、本発明の抗原のエピトープ、例えば形質細胞、好ましくはヒト形質細胞上の抗原の特異的エピトープに対するものであり、他方の結合部位が、Ｔ細胞、好ましくはヒトＴ細胞のＣＤ３抗原に対するものであることを意味する。
本発明において用いられる「結合部位」という用語は、天然の抗体、遊離のｓｃＦｖフラグメントまたはその対応する免疫グロブリン鎖、好ましくはＶＨ 鎖のようなエピトープに特異的に結合しうる三次元構造を有するドメインを示す。したがって、該ドメインは、抗体または免疫グロブリン鎖のＶＨ ドメインおよび／またはＶＬ ドメイン、好ましくは少なくともＶＨ ドメインを含有しうる。他方において、本発明のポリペプチドに含有される該結合部位は、本発明の抗原およびＣＤ３抗原のそれぞれを認識する抗体または免疫グロブリン鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有し得る。この点において、本発明のポリペプチドに存在する結合部位のドメインが抗体に由来しうるだけでなく、ＣＤ３または本発明の抗原を認識する、天然の表面受容体またはリガンドなどの他の結合タンパク質に由来しうることは注目すべきことである。本発明によれば、該結合部位はドメインに含有される。
本明細書で用いる「多機能ポリペプチド」という用語は、任意に異なる種（該少なくとも２つの供給源は該結合部位を特定する）に由来する異なる供給源、すなわち２種類の異なる分子由来の少なくとも２種類のアミノ酸配列を含有してなるポリペプチドを示す。したがって、該結合部位は、該多機能ペプチドの機能または機能の少なくともいくつかを特定する。かかるポリペプチドには、例えば、二重特性単鎖（ｂｓｃ）抗体が含まれる。
本発明において使用される「単鎖」という用語は、ポリペプチドの前記第１および第２ドメインが共有結合により、好ましくは核酸分子によりコードされうるコリニアなアミノ酸配列形態で連結していることを意味する。
ＣＤ３は、Ｔ細胞上に多分子Ｔ細胞受容体複合体の一部として発現され、かつＣＤ３ε、ＣＤ３δおよびＣＤ３γの３種の異なる鎖からなる抗原を示す。例えば、固定化した抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞上のＣＤ３のクラスタリングにより、Ｔ細胞受容体の結合に類似するが、そのクローンに典型的な特性とは独立したＴ細胞活性化を導く。実際、ほとんどの抗ＣＤ抗体がＣＤ３ε鎖を認識する。
ＣＤ３抗原を特異的に認識する抗体は、先行技術に記載されており、当該技術分野で公知の常套法により作製することができる。とりわけＷＯ　９９／５４４４０参照のこと。
【００５５】
単鎖多機能ポリペプチドは、医学目的、例えば腫瘍、特にリンパ腫および／または形質細胞腫、多発性骨髄腫の治療、または自己免疫疾患などの免疫学的障害の治療に特に有用でありうる。
【００５６】
本発明のポリペプチドの好ましい態様では、多機能ポリペプチドの該ドメインは、ポリペプチドリンカーにより連結されている。該リンカーは、前記第１および前記第２ドメインとの間に配置され、該ポリペプチドリンカーは、好ましくは、複数の親水性のペプチド結合したアミノ酸を含有し、前記第１ドメインのＮ末端と前記第２ドメインのＣ末端とを連結する。
【００５７】
本発明のさらに好ましい態様では、上述のポリペプチドの前記第１および／または第２ドメインが、天然抗体由来のＶＨ 領域およびＶＬ 領域を擬態するか、またはこれらに相当する。本発明のポリペプチドに対する結合部位を提供する抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、合成抗体、Ｆａｂフラグメント、ＦｖフラグメントもしくはｓｃＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントなど、または本明細書において先に記載したようなこれらの任意の化学修飾誘導体でありうる。
【００５８】
本発明のさらに好ましい態様では、上述のポリペプチドの前記ドメインの少なくとも一方が、該抗体の可変領域の単鎖フラグメントである。
【００５９】
周知であるように、完全な抗原認識部位および抗体結合部位を含む最小の抗体フラグメントであるＦｖは、１つの重鎖の可変領域と１つの軽鎖の可変領域（ＶＨ およびＶＬ ）とが非共有結合により会合した二量体からなる。天然の抗体に見られるようなものに相当するこのコンフィギュレーションでは、各可変ドメインの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）が相互作用してＶＨ −ＶＬ 二量体の表面上の抗原結合部位を規定する。集合的に６個のＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。ＣＤＲに隣接するフレームワーク（ＦＲ）は、ヒトおよびマウスなどの異なる種間の天然の免疫グロブリンで本質的に保存されている三次構造を有する。これらのＦＲは、適切な向きにＣＤＲを保持するために役立つ。定常ドメインは、結合機能には必要とされないが、ＶＨ −ＶＬ 相互作用の安定化を補助し得る。たった１つの可変ドメイン（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含有するＦｖの半分）でも抗原を認識し、これと結合する能力を有するが、通常、完全な結合部位より低いアフィニティーで認識および結合する（Ｐａｉｎｔｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１ （１９７２）， １３２７−１３３７）。したがって、本発明のポリペプチドの結合部位の該ドメインは、同じ免疫グロブリンか異なる免疫グロブリンのいずれかのＶＨ −ＶＬ 、ＶＨ −ＶＨ またはＶＬ −ＶＬ のペアのドメインでありうる。ポリペプチド鎖内のＶＨ およびＶＬ ドメインの順番は、本発明にとって重要ではなく、前述のドメインの順番は、通常機能の損失を何ら伴うことなく逆順にしうる。しかしながら、ＶＨ およびＶＬ ドメインは、抗原結合部位が適切にフォールディングしうるように配列していることが重要である。多機能ポリペプチドの調製は当該技術分野において周知であり、とりわけ、ＷＯ　９９／５４４４０またはＷＯ　００／０６６０５に開示されている。
【００６０】
本発明のポリペプチドの好ましい態様では、該ドメインは、ＶＬ ＷＵＥ−１−ＶＨ ＷＵＥ−１−ＶＨ ＣＤ３−ＶＬ ＣＤ３の順で配列されており、ここで、「ＶＬ 」および「ＶＨ 」は、特異的抗ＷＵＥ−１抗体および抗ＣＤ３抗体のドメインの可変ドメインの軽鎖および重鎖を意味する。
【００６１】
先に記述したように、該結合部位は、好ましくは可動性リンカーにより、好ましくは前記ドメイン間に配置されたポリペプチドリンカーにより連結されている。ここで、前記ポリペプチドリンカーは、本発明のポリペプチドが水溶液中に配置されて結合に適したコンフォメーションをとったとき、前記結合部位を含有する前記ドメインの一方のＣ末端と、前記結合部位を含有する前記ドメインの他方のＮ末端との間の間隔を埋めるのに充分な長さの、複数の親水性のペプチド結合したアミノ酸を含有する。
【００６２】
好ましくは、前記ポリペプチドリンカーは、複数のグリシン、アラニンおよび／またはセリン残基を含有する。前記ポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列の複数の連続したコピーを含有することがさらに好ましい。通常、該ポリペプチドリンカーは、１〜１５個のアミノ酸を含有するが、１５個を超えるアミノ酸からなるポリペプチドリンカーも良好に機能しうる。本発明の好ましい態様では、前記ポリペプチドリンカーは１〜５個のアミノ酸残基を含有する。
本発明の特に好ましい態様では、本発明のポリペプチドの前記ポリペプチドリンカーは、５個のアミノ酸を含有する。下記の実施例で示すように、前記ポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒを含有することが有利である。
【００６３】
本発明の最も好ましい態様では、本明細書で先に定義した多機能ポリペプチドは、単鎖抗体である。多機能ポリペプチドは、下記の実施例および配列番号：２１に示す核酸分子にコードされ、好ましくは配列番号：２２に示すアミノ酸配列を含有することが特に好ましい。
【００６４】
本発明はさらに、共有結合または非共有結合により連結されている少なくとも１つのさらなるドメインを含有する（多機能）ポリペプチドに関する。したがって、前記多機能ポリペプチドは、ＷＯ　００／０６６０５で考察されているような「ヘテロミニボディ」の形態でありうる。
該連結は、当該技術分野において公知の方法および上述の方法による遺伝子融合に基づくものであり得、あるいは、例えば、ＷＯ　９４／０４６８６に記載されているような化学的架橋により行われ得る。本発明のポリペプチドに存在するさらなるドメインは、好ましくは可動性リンカーにより、有利にはポリペプチドリンカーにより結合部位ドメインの一方に連結されている。ここで、前記ポリペプチドリンカーは、該ポリペプチドが水溶液中に配置されて結合に適したコンフォメーションをとったとき、前記ドメインの一方のＣ末端と前記ドメインの他方のＮ末端との間の間隔を埋めるのに充分な長さの、複数の親水性のペプチド結合したアミノ酸を含有する。好ましくは、前記ポリペプチドリンカーは、前述の態様において記載したようなポリペプチドリンカーである。本発明のポリペプチドは、エンテロキナーゼなどのプロテイナーゼが切断可能なリンカーまたは切断部位をさらに含有しうる。下記の実施例もまた参照のこと。
【００６５】
さらにまた、前記さらなるドメインは、あらかじめ規定した特異性または機能のものでありうる。例えば、文献には、悪性細胞の破壊もしくは位置決定のため、または局在化した薬物または酵素効果の誘導のために、薬物、毒素および酵素などの生体活性物質を身体の特定の位置にターゲティングする概念に対する多数の記載が含まれている。生体活性物質をモノクローナル抗体にコンジュゲートさせることによりこの効果を達成することが提案されている（例えば、Ｎ．Ｙ． Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ； およびＧｈｏｓｅ， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ６１ （１９７８）， ６５７−６７６ 参照のこと）。
また、本文脈において、本発明のポリペプチドは、当該技術分野で公知の常套法によりさらに修飾しうることも理解される。これにより、本発明のポリペプチド、および異種タンパク質由来であり得る他の機能性アミノ酸配列、例えば、核局在化シグナル、トランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、ホルモン結合ドメイン、タンパク質タグ（ＧＳＴ、ＧＦＰ、ｈ−ｍｙｃペプチド、ＦＬＡＧ、ＨＡペプチド）を含有するキメラタンパク質の構築が可能となりうる。
【００６６】
本発明の文脈において、本発明はまた、本明細書において先に記載したように、ベクター内に含有される、および／または宿主細胞内にトランスフェクされる、本発明の多機能ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド／核酸分子に関する。一般に、「ポリヌクレオチド」「核酸分子」および「ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡならびに任意のこれらのポリヌクレオチドを単独または組合せで含有する、組換えにより作製したキメラ核酸分子に関する。
【００６７】
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体またはその機能性フラグメントもしくは誘導体、多機能ポリペプチド、ヌクレオチド配列／ポリヌクレオチド、ベクターおよび／または細胞を含有してなる組成物に関する。好ましくは前記組成物は、医薬用または診断用組成物である。
【００６８】
本発明の医薬用組成物は、薬学的に許容され得る担体をさらに含有しうる。適切な医薬用担体の例は、当該技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、種々の種類の湿潤剤、滅菌溶液などが含まれる。かかる担体を含有する組成物は、周知の常套法により配合しうる。これらの医薬用組成物は、適切な投薬量で被験体に投与しうる。適切な組成物の投与は、様々な様式、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与により行い得る。投薬治療計画は、担当医師および臨床的因子により決定される。医学分野で周知のように、任意の一患者に対する用量は、患者の体格、体表面積、年齢、投与する具体的な化合物、性別、投与の期間および経路、一般健康状態ならびに同時に投与する他の薬物を含む多くの要因に依存する。通常、該医薬用組成物の標準投薬としての治療計画は、１日あたり１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲内であるべきである。治療計画が連続注入である場合も、それぞれ、１分あたり体重１ｋｇあたり１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲内であるべきである。しかしながら、連続注入のためのより好ましい用量は、１時間あたり体重１ｋｇあたり０．０１μｇ〜１０ｍｇ単位の範囲内であろう。特に好ましい用量を本明細書において以下に記載する。進行は定期的な評価により監視しうる。用量は異なりうるが、ＤＮＡの静脈投与のための好ましい用量は、ＤＮＡ分子約１０６ 〜１０１２コピーである。本発明の組成物は、局所または全身に投与しうる。投与は通常、非経口的、例えば静脈内であり、ＤＮＡはまた、例えば、標的部位の内部または外部への微粒子銃送達により、または動脈内の部位へのカテーテルにより標的部位に直接投与しうる。非経口投与のための調製物には、滅菌した水溶液または非水溶液、懸濁液およびエマルジョンが含まれる。非水溶性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水溶性担体には、水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が含まれ、生理食塩水および緩衝媒体が挙げられる。非経口用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液または固定油が含まれる。静脈用ビヒクルには、液体および栄養分補給物、電解質補給物　（リンゲルのデキストロースに基づくものなど）などが含まれる。保存料および、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなどの他の添加剤もまた存在してもよい。また、本発明の医薬用組成物は、例えば、血清アルブミンまたは免疫グロブリン（好ましくはヒト由来）のようなタンパク質様担体を含有しうる。さらにまた、本発明の医薬用組成物は、該医薬用組成物の目的用途に応じて生物学的活性剤をさらに含有しうることが想定される。かかる活性剤は、胃腸系に作用する薬物、細胞増殖抑制剤、または自己免疫疾患、（多発性）リンパ腫、多発性骨髄腫または形質細胞腫の治療に用いられる薬剤でありうる。
【００６９】
本発明により、本発明の種々のポリヌクレオチドおよびベクターが、単独、または標準的なベクターおよび／または遺伝子送達システムの使用との任意の組合せのいずれかで、任意に薬学的に許容されうる担体または賦形剤とともに投与されることが想定される。投与後、該ポリヌクレオチドまたはベクターは被験体のゲノム内に安定的に組み込まれうる。
【００７０】
一方で、ある種の細胞または組織に特異的で、かつ該細胞内に存在し続けるウイルスベクターを使用しうる。好適な医薬用担体および賦形剤は当該技術分野において周知である。本発明により調製される医薬用組成物は、悪性腫瘍に関連する種々の疾患、特にリンパ腫、多発性骨髄腫、形質細胞腫および自己免疫疾患の予防または治療または遅滞のために使用することができる。
【００７１】
さらにまた、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを含有する本発明の医薬用組成物を遺伝子治療に使用することが可能である。好適な遺伝子送達システムは、リポソーム、受容体媒介送達システム、裸のＤＮＡおよびウイルスベクター、中でもヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスなどを含みうる。遺伝子治療のための身体の特定部位への核酸の送達は、Ｗｉｌｌｉａｍｓにより記載されたもの（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８ （１９９１）， ２７２６−２７２９ ）などのバイオリスティック送達システムを用いても達成しうる。核酸の送達のためのさらなる方法には、例えば、Ｖｅｒｍａ， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５ （１９９８）， ６９２−６９９ に記載のような粒子媒介性遺伝子導入が含まれる。
導入されたポリヌクレオチドおよびベクターは、細胞内に導入された後、遺伝子産物を発現し、好ましくは細胞の一生の間、この状態で維持されることを理解されたい。例えば、適切な調節配列の制御下でポリヌクレオチドを安定的に発現する細胞株は、当業者に周知の方法に従って遺伝子操作しうる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりもむしろ、宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド、および同じプラスミドまたは別のプラスミドのいずれかにある選択マーカーで形質転換されうる。外来ＤＮＡの導入後、遺伝子操作した細胞を富化培地内で１〜２日間成長させ得、次いで選択培地に交換する。組換えプラスミド内の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、染色体内にプラスミドを安定的に組み込み、かつフォーカス形成するまで成長する細胞の選択を可能にし、次にこれをクローニングして細胞株に拡張しうる。かかる遺伝子操作した細胞株はまた、例えばＢ細胞／Ｔ細胞相互作用に関与する化合物の検出のためのスクリーニング方法に特に有用である。
それぞれ、ｔｋ− 細胞、 ｈｇｐｒｔ− 細胞またはａｐｒｔ− 細胞における単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｃｅｌｌ １１ （１９７７）， ２２３ ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８ （１９６２）， ２０２６ ）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ， Ｃｅｌｌ ２２ （１９８０）， ８１７ ）を含むいくつかの選択系を使用しうるが、これらに限定されない。また、メトトレキサートに対して耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７ （１９８０）， ３５６７； Ｏ’Ｈａｒｅ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８ （１９８１）， １５２７）、ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８ （１９８１）， ２０７２）； アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０ （１９８１）， １ ）；ハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ， Ｇｅｎｅ ３０ （１９８４）， １４７ ）；またはプロマイシン（ｐａｔ、プロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ）の選択の根拠として代謝拮抗物質耐性を用いうる。さらなる選択可能な遺伝子が記載されている。例えば、トリプトファンの代わりにインドールを細胞に利用させるｔｒｐＢ、ヒスチジンの代わりにヒスチノールを細胞に利用させるｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５ （１９８８）， ８０４７ ）；およびオルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯに対する耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）（ＭｃＣｏｌｏｇｕｅ， １９８７， Ｉｎ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｅｄ）。
【００７２】
本発明の化合物、特に抗体は、フィルタリングシステムに特に有用でありうる。例えば、治療上望ましい場合、本発明の抗体またはその機能性フラグメントもしくは誘導体を、骨髄移植中に患者、例えば形質細胞腫患者の血液または骨髄から悪性形質細胞、例えば腫瘍細胞を除去する、いわゆる「パージング」ストラテジーに用いうる。
【００７３】
上述の本発明の抗体、（多機能）ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターまたは（宿主）細胞の任意の１種を含有してなる本発明の診断用組成物は、検出のための適切な手段を任意に含みうる。
【００７４】
本発明の抗体および（多機能）ポリペプチドはまた、これらを液相において、または固相担体に結合して使用しうるイムノアッセイにおける使用にも適する。本発明のポリペプチドを利用し得るイムノアッセイの例は、直接または間接のいずれかの形態の競合イムノアッセイおよび非競合イムノアッセイである。かかるイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（免疫定量アッセイ）およびウエスタンブロットアッセイである。該抗体およびポリペプチドはまた、免疫学的単離アプローチおよび免疫沈降においても有用である。　本発明の抗体およびポリペプチドは、多くの異なる担体に結合させることができ、該抗体およびポリペプチドに特異的に結合する細胞を単離するのに使用しうる。周知の担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および修飾セルロース、コロイド状金属、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱が含まれる。担体の性状は、本発明の目的のために可溶性または不溶性であり得る。
【００７５】
当業者に公知の多くの異なる標識および標識方法がある。本発明において使用しうる標識の種類の例は、酵素、放射性同位体、コロイド状金属、蛍光化合物、化学発光化合物および生物発光化合物であり得る（本明細書の上記態様も参照のこと）。本発明の診断用組成物は、形質細胞、好ましくはヒト形質細胞の検出、標識および単離に特に有用である。該診断用組成物はまた、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞分化のメカニズムまたは形質細胞の生物学のインビボおよびインビトロ研究にも有用である。
【００７６】
本発明はまた、形質細胞悪性腫瘍、特に多発性骨髄腫、リンパ腫、形質細胞腫（腫瘍）および自己免疫疾患の治療のための医薬組成物の調製のための本明細書において上述した本発明の化合物の使用に関する。
【００７７】
本発明はまた、本発明の抗体またはその機能性フラグメントもしくは誘導体、本発明の抗原、本発明のエピトープ、本発明の（多機能）ポリペプチド、本発明のヌクレオチド配列および／または本発明のベクターおよび／または本発明の宿主を含んでなるキットを提供する。
【００７８】
かかるキットは、バイアル、チューブなどの１つ以上の容器手段を密閉して受容するために区画化された担持手段を含みうる。各容器手段は、該方法で使用する別々の要素の１つを含有する。例えば、１つの容器手段は担体に結合した本発明の抗原またはエピトープを含有し得、第２の容器は可溶性の検出可能に標識された第２抗体を凍結乾燥形態または溶液状で含有しうる。さらに、該担持手段はまた、各々が異なる所定量の本発明の抗原またはエピトープを含有する複数の容器を含みうる。
【００７９】
まとめると、形質細胞に関して、細胞質成分に対して特異的な抗体しか当該技術水準ではこれまで得られていなかったため、形質細胞表面を認識することができなかった。本発明の抗体は、形質細胞の細胞表面上に発現される抗原の初めての抗体であり、形質細胞に特異的である。したがって、例えば自己免疫疾患、リンパ腫または形質細胞腫の診断および治療に使用しうる抗体を初めて得ることができ、これまでに当該技術分野で知られた唯一の治療法であった、あらゆる副作用を伴う化学療法の代用法を提供する。
【００８０】
以下に、本発明による抗体の調製方法の一例、および本発明の抗体の一例を示す。さらに本発明の単鎖多機能化合物の調製および対応するその使用を示す。
【００８１】
実施例１：抗体（「Ｗｕｅ−１」）の調製方法
ａ）　マウスの免疫
ＭＡＬＴ型（細胞株番号Ｈ３３０２／８８、Ａ． Ｇｒｅｉｎｅｒ博士、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｅｒ Ｐａ−ｔｈｏｌｏｇｉｅ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｅｔ Ｗｕｅｒｚｂｕｒｇ ）のリンパ腫から得た細胞株の細胞でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。これらの細胞はインビトロで形質細胞に分化しうる。
【００８２】
ｂ）　免疫したマウスの脾臓細胞の単離
５ｍｌの無血清ＲＰＭＩを含むペトリ皿に、滅菌的に取り出した脾臓を入れ、ナイロンゲージネット（孔径１００μｍ）に通した。続いて、細胞懸濁物を５ｍｌピペットで数回再懸濁し、５０ｍｌバイアルに移した。このようにして得た脾臓細胞を２０ｍｌのＨＢＳＳで２回洗浄した。すなわち、各場合において該細胞を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清みを除去し、ペレットを各場合において２０ｍｌのＨＢＳＳ中に再懸濁した。
【００８３】
ｃ）　融合パートナー（骨髄腫細胞）の調製
融合前に、骨髄腫細胞（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３、Ｋｅａｒｎｅｙ Ｊ． Ｆ． ら （１９７９） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１２３ 巻， １５４８−１５５０ 頁を参照のこと）をアザグアニン培地（１ｍｇ／ｍｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＫＳ）内に数日間維持した。マウスの脾臓の融合には、約４×１０７ 骨髄腫細胞は必要であった（これは、１７５ｃｍ２ のコンフルエントに増殖した細胞培養物のバイアル約１つ分の量である）。ＥＤＴＡバッファーにより骨髄腫細胞をバイアルの底部から取り出し、続いて、脾臓細胞と同様にＨＢＳＳで洗浄し、再度遠心分離してペレット上部の上清みを吸引除去した。
【００８４】
ｄ）　細胞融合
ステップ２の脾臓細胞を含む懸濁物をステップ３の骨髄腫細胞のペレット上に置き、混合した。
【００８５】
標準的手順（例えば、Ｇｒｅｉｎｅｒ ら （１９９４） ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ｇａｍｍａｐａｔｈｉｅｓ ＩＩＩ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ａｎｄ ｂａｓｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ” （Ｒａｄｌら編）， １８７−１９０頁， ＥＵＲＡＧＥ， Ｌｅｉｄｅｎ， ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ を参照のこと）に従って＋３７℃で融合を行った。この目的のために、必要とされる培地はすべて水浴中で＋３７℃に予備加熱した。
【００８６】
脾臓細胞を骨髄腫細胞と混合した後１分以内に、凝集塊の形成を防ぐために、細胞混合物を攪拌しながら、１ｍｌの５０％ＰＥＧを細胞混合物にゆっくりと滴下した。１．５分間待った後、該混合物を攪拌しながら、最初に１５ｍｌの無血清ＲＰＭＩ、次いで２０ｍｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＫＳをゆっくりと該混合物に滴下した。骨髄腫融合パートナー細胞とマウス脾臓細胞との細胞混合物を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清みを除去し、ペレットを１２５ｍｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＫＳ＋１ｍｌあたり２００単位のＩＬ−６＋１００ｍｌあたり０．５ｍｌのゲンタマイシン中に再懸濁した。このようにして得た細胞懸濁物を５つの２４ウェルプレートに数ミリリットルずつ分配した。約２４時間培養した後、１ｍｌのＲＰＭＩ＋１０％ＦＫＳ＋１ｍｌあたり２００単位のＩＬ−６＋１００ｍｌあたり０．５ｍｌのゲンタマイシン＋２×ＨＡＴを各ウェルに添加した。
【００８７】
ｅ）　ハイブリドーマ細胞の培養
融合したハイブリドーマ細胞に新しい培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＫＳ＋１ｍｌあたり２００単位のＩＬ−６＋１００ｍｌあたり０．５ｍｌのゲンタマイシン＋１×ＨＡＴ）を４日ごとに提供した。この目的のために、ウェルの培養上清みは完全に吸引除去し（ハイブリドーマ細胞が接着するように増殖する）、２ｍｌの新しい培地を各ウェルに添加した。１４日後、「ＨＡＴ培地」を「ＨＴ培地」　（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＫＳ＋１ｍｌあたり２００単位のＩＬ−６＋１００ｍｌあたり０．５ｍｌのゲンタマイシン＋１％ＨＡＴ）と交換した。増殖クローンが顕微鏡の視野を覆っている場合、それらを免疫グロブリン産生について試験した。すべての陽性クローンを小さな培養バイアル（２５ｃｍ２ ）に移した。
【００８８】
ｆ）　特異性試験
すべての陽性クローンを、凍結状態で切断し、免疫染色に供することにより特異性について免疫組織化学的に試験した（下記参照）。
再クローニングを繰り返し、安定な細胞株を得た。
【００８９】
ｇ）　産生された抗体の単離
前述の細胞株の培養物の上清みを除去し、硫安での沈降、続くプロテインＡアフィニティクロマトグラフィーにより精製し、標準法（Ｇｒｅｉｎｅｒ ら （１９９４） Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ．， 第７０巻， ５７２−５７８ 頁）に従ってＮ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル（シグマ社、ドイツ）を用いてＦＩＴＣまたはビオチンで標識した。この細胞株により産生された抗体を以下「Ｗｕｅ−１」という。これは、イソタイプＩｇＧ２ａにより同定された。
【００９０】
ｈ）抗体Ｗｕｅ−１をアミノ酸配列について特性付けした。その軽鎖（Ｌ−鎖）の可変領域Ｆｗ（Ｌ）は、以下の配列
その部分配列
可変領域ＦＷ−１に相当するＤＩＶＭＴＱＴＰＬＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳＬＳＣ
相補性決定領域ＣＤＲ−１に相当するＫＳＳＱＳＬＬＤＳＤＧＫＴＹＬＮ
可変領域ＦＷ−２に相当するＷＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫＲＬＩＳ
相補性決定領域ＣＤＲ−２に相当するＬＶＳＫＬＤＳ
可変領域ＦＷ−３に相当するＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣ
相補性決定領域ＣＤＲ−３に相当するＷＱＧＴＨＬＰＷＴ
および
可変領域ＦＷ−４に相当するＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ
を有する。
その重鎖（Ｈ−鎖）の可変領域Ｆｗ（Ｈ）は、以下の配列：
ＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＴＧＡＳＶＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＳＧＹＹＭＨＷＶＫＱＳＨＧＫＲＬＥＷＩＧＹＩＳＧＹＮＧＤＴＲＹＮＱＫＦＲＧＫＡＴＦＩＶＤＩＳＳＲＴＡＹＭＱＦＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＧＧＹＹＧＹＶＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
その部分配列
可変領域ＦＷ−１に相当するＱＶＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶＫＴＧＡＳＶＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＳ
相補性決定領域ＣＤＲ−１に相当するＧＹＹＭＨ
可変領域ＦＷ−２に相当するＷＶＫＱＳＨＧＫＲＬＥＷＩＧ
相補性決定領域ＣＤＲ−２に相当するＹＩＳＧＹＮＧＤＴＲＹＮＱＫＦＲＧ
可変領域ＦＷ−３に相当するＫＡＴＦＩＶＤＩＳＳＲＴＡＹＭＱＦＮＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲ
相補性決定領域ＣＤＲ−３に相当するＧＧＹＹＧＹＶＤＹ
および
可変領域ＦＷ−４に相当するＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
を示す。
【００９１】
さらに、抗体Ｗｕｅ−１をコードする遺伝子配列のヌクレオチド配列を解析した。抗体Ｗｕｅ−１の軽Ｌ鎖をコードする遺伝子は、以下のヌクレオチド配列を含有する。
ｇａａｇｃａｃｇｃｇ ｔａｇａｔａｔｃｇｔ ｇａｔｇａｃｃｃａａ ａｃｔｃｃａｃｔｃａ ｃｔｔｔｇｔｃｇｇｔ ｔａｃｃａｔｔｇｇａ ｃａａｃｃａｇｃｃｔ ｃｃｃｔｃｔｃｔｔｇ ｃａａｇｔｃａａｇｔ ｃａｇａｇｃｃｔｃｔ ｔａｇａｔａｈｔｇａ ｔｇｇａａａｇａｃａ ｔａｔｔｔｇａａｔｔ ｇｇｔｔｇｔｔａｃａ ｇａｇｇｃｃａｇｇｃ ｃａｇｔｃｔｃｃａａ ａｇｃｇｃｃｔａａｔ ｃｔｃｔｃｔｇｇｔｇ ｔｃｔａａａｔｔｇｇ ａｃｔｃｔｇｇａｇｔ ｃｃｃｔｇａｃａｇａ ｔｔｃａｃｔｇｇｃａ ｇｔｇｇａｔｃａｇｇ ｇａｃａｇａｔｔｔｃ ａｃａｃｔｇａａａａ ｔｃａｇｃａｇａｇｔ ｇｇａｇｇｃｔｇａｇ ｇａｔｔｔｇｇｇａｇ ｔｃｔａｔｔａｔｔｇ ｃｔｇｇｃａａｇｇｔ ａｃａｃａｔｃｔｔｃ ｃｇｔｇｇａｃａｔｔ ｃｇｇｔｇｇａｇｇｃ ａｃｃａａｇｃｔｇｇ ａａａｔｃａａａｃｇ ｇｇｃｔｇａｔｇｃｔ ｇｃｇｇｃｃｇｃｔｇ ｇａｔｃｃａｔｃｔｔ ｃ
（配列番号：１５）
【００９２】
抗体Ｗｕｅ−１の重Ｈ鎖をコードする遺伝子は、以下のヌクレオチド配列を含有する。
ｃｇｃｃａｔｇｇｃｃ ｇｃｇｇｇａｔｔｃｃ ｇｇｃｃａｔｇｇｃｇ ｃａｇｇｔｇｃａｇｃ ｔｇｃａｇｃａｇｔｃ ｔｇｇａｃｃｔｇａｇ ｃｔａｇｔｇａａｇａ ｃｔｇｇｇｇｃｔｔｃ ａｇｔｇａａｇａｔａ ｔｃｔｔｇｔａａｇｇ ｇｔｔｃｔｇｇｔｔａ ｃｔｃａｔｔｃａｇｔ ｇｇｔｔａｃｔａｃａ ｔｇｃａｃｔｇｇｇｔ ｃａａｇｃａｇａｇｃ ｃａｔｇｇａａａｇａ ｇｇｃｔｔｇａｇｔｇ ｇａｔｔｇｇａｔａｔ ａｔｔａｇｔｇｇｔｔ ａｔａａｔｇｇｔｇａ ｔａｃｔａｇｇｔａｔ ａａｔｃａｇａａｇｔ ｔｃａｇｇｇｇｃａａ ｇｇｃｃａｃａｔｔｔ ａｔｔｇｔａｇａｃａ ｔａｔｃｃｔｃｃａｇ ｇａｃａｇｃｃｔａｃ ａｔｇｃａｇｔｔｃａ ａｃａｇｃｃｔｇａｃ ａｔｃｔｇａａｇａｃ ｔｃｔｇｃｇｇｔｃｔ ａｔｔａｃｔｇｔｇｃ ａａｇａｇｇｇｇｇｔ ｔａｃｔａｃｇｇｃｔ ａｃｇｔｇｇａｃｔａ ｃｔｇｇｇｇｃｃａａ ｇｇｃａｃｃａｃｃｃ ｔｃａｃａｇｔｃｔｃ ｃｔｃａｇｃｃａａａ ａｃｇａｃａｃｃｃａ ａｇｃｔｔｇｔｃｔａ ｔｃｃａｃｔｇｇｃｃ ｃｃｔｇｇｔａａｔｃ ａｃｔｇｔｇｃｇｇｃ ｃｇｃｃｇ （配列番号：１６）
【００９３】
ｉ）　上記で使用した物質を以下に明確に示す。
ＮＯＲＡＳ社製ナイロンゲージ
シグマ社製Ｎｏ．Ａ１００７の８−アザグアニン
リナリス（Ｌｉｎａｒｉｓ） 社製Ｎｏ．Ｆ１４３１ＫＧのＨＢＳＳ（ハンクス塩）
リナリス社製Ｎｏ．Ｌ１２５３ＧＧのＥＤＴＡバッファー
ベーリンガー（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）社製のＰＥＧ（ポリエチレングリコール１５００）
リナリス社製Ｎｏ．Ｓ３１８１ＫＧのＦＫＳ（ウシ胎児血清）
リナリス社製Ｎｏ．Ｆ２６１３ＫＧのＲＰＭＩ
リナリス社製Ｎｏ．Ｋ１９３１ＧＧのＨＡＴ補給物５０×
リナリス社製Ｎｏ．Ｋ１９３２ＧＧのＨＴ補給物５０×
リナリス社製Ｎｏ．Ｆ１１４１ＦＧのゲンタマイシン
ファーミノーゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）社（ハンブルグ）製のＩＬ−６（インターロイキン−６）
【００９４】
特異性試験のために、硫安沈降および続くアフィニティクロマトグラフィーにより抗体を細胞培養物の上清みから精製した。特異性試験は、新しい組織切片、細胞の遠心分離産物および細胞懸濁溶液を用い、免疫組織化学により行った。
【００９５】
ｊ）　結果
Ｗｕｅ−１陽性細胞は、二次胚中心内、および辺縁ゾーン内、および扁桃陰窩の下方に免疫組織化学により明白にかつ再現可能に同定された（図１Ａおよび図１Ｂ）。形態学および免疫組織化学は、Ｍａｒｓｃｈａｌｋｏ型またはリンパ球形質細胞系型のいずれかの成熟形質細胞に相当する（挿入図を伴う図１Ｃ）。
【００９６】
図１Ａの部分図ａに、中央（星型）に胚中心を有する二次リンパ組織およびこの胚中心の上側３分の１における個々の褐色に染色された形質細胞を示す。これはリンパ球から形質細胞になる典型的な成熟ゾーンである。さらに、小節の外側でも、いくつかの陽性に標識された細胞（矢印）が図の上縁部の表面上皮付近に見られる。図１Ａの部分図ｂは、形質細胞株ＮＣＩ−９２３の免疫染色を示し、ここで、すべての細胞は、Ｗｕｅ−１で免疫組織化学的に強く陽性に標識されている。標識パターンは各場合において細胞質性であり、膜に現れており、これは、図１Ｃに示す非透過性ＦＡＣＳ染色により示された。
【００９７】
Ｗｕｅ−１はマクロファージまたはＴリンパ球などの他のリンパ細胞またはマクロファージと反応せず、末梢血、肝臓組織、腎臓、筋肉、皮膚、膀胱、精巣および卵巣における結合は示さず、胃腸管（胃、腸）の分泌性上皮とは弱く、不定的に反応した。
【００９８】
しかしながら、Ｗｕｅ−１は、形質細胞由来のすべての悪性腫瘍と反応した。対照的に、正常Ｔリンパ球およびＢリンパ球ならびに初期Ｂ細胞分化期由来の腫瘍との反応は陰性であった（図１Ｂ）。図１Ｂの部分図ａでは、Ｗｕｅ−１陰性反応を生じるリンパ腫の未分化腫瘍部分を除いて、陽性に標識された形質細胞のびまん性宿主で、形質細胞に分化しているＢ細胞腫瘍（いわゆる小悪性ＭＡＬＴリンパ腫）が見られる。図１Ｂの部分図ｂでは、悪性形質細胞（いわゆる形成不全形質細胞腫）に相当し、細胞質の染色および膜の染色を有する高度に悪性のリンパ腫がＷｕｅ−１で標識されている。
【００９９】
図１Ｃの左側半分に、正常扁桃リンパ球細胞懸濁物のＦＡＣＳグラフを示す。各場合における細胞の大きさをｘ軸にプロットし、細胞の顆粒度をｙ軸にプロットしている。Ｒ１およびＲ２は、２種類の細胞集団を示し、通常の経験に従って、休止期のリンパ球をＲ１とし、活性化されたリンパ球をＲ２とする。この概念は、Ｗｕｅ−１で染色された、遠心分離された細胞懸濁調製物の挿入した内部図からわかる。この図において、リンパ球形質細胞系形質細胞（矢印）に相当し、Ｒ１の小陽性細胞、ならびにＲ２由来のＭａｒｓｃｈａｌｋｏ型の大形質細胞が見られる。
【０１００】
図１Ｃの右側半分に、４つのヒストグラムを示し、ここで、染色強度をｘ軸にプロットし、細胞数をｙ軸にプロットしている。上側の２つのヒストグラムはＲ１由来のＷｕｅ−１陽性細胞を示す。左側の上下では、細胞を軽鎖κおよびλ抗原についてさらに染色し、右側の上下では、表面抗原ＣＤ５４について染色した。非特異的バックグランド染色の程度を示すために、無関連抗原に対する染色を、いわゆるイソタイプ対照として図に示す。成熟形質細胞は、イソタイプ対照と比べて軽鎖およびＣＤ５４のいずれも発現しないので、リンパ球形質細胞系細胞（上列）は、軽鎖およびＣＤ５４の発現に関して成熟形質細胞（下列）と異なることは顕著である。
【０１０１】
図１Ｄは、形質細胞株（ＮＣＩ−Ｈ９２９）を抗原供給源としたウエスタンブロットを示す。陽性バンドが約９４ｋＤに生じ（図１Ｄ）、すなわちＷｕｅ−１により標識された抗原は、９４ｋＤの見かけ分子量を有する。
【０１０２】
図２（ビデオプリント）の説明
図２のすべての部分図ａ〜ｈは、形質細胞に対して選択的な特異的結合パターンをヒト扁桃に基づいて記載したものである。Ｃｙ３−蛍光色素とコンジュゲートしたＷｕｅ−１　ｍＡＢ（赤色染色）を、任意に他の規定された抗原（緑色染色）とともに、二重免疫蛍光を用いるアッセイ技術として使用し、ここでは重複染色シグナルが次いで黄色（緑色と赤色の和）になる。現在一般的に使用されている方法（詳細は、Ｊａｎｅｗａｙ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｅ， Ｓｐｅｋｔｒｕｍ−Ｖｅｒｌａｇ， １９９５ などの関連文献を参照のこと）に従って免疫染色を行った。要約すると、染色は、まず非コンジュゲート抗体（ここでは抗原を緑色で示す）で間接的に行い、次いで、この抗体が緑色蛍光で標識された第２の二次抗体により提示される。次の工程では、Ｗｕｅ−１が非特異的に結合できないようにするために、すべての遊離結合価の二次抗体をマウス血清でブロックする。最後に、染色を二次特異性（ここでは赤色標識されたＷｕｅ−１）により行う。数種類の特異性および感受性対照を各実験と平行して行うと組織の染色挙動が示されるが、対応する個々のステップは省略する。
【０１０３】
図２ａは、Ｗｕｅ−１（赤）のＣＤ４４（緑）での二重染色を示す。リンパ小節の胚中心が図においてあいまいにしか見えないため、星印で示す。ＣＤ４４は成熟Ｂ細胞（胚中心付近）および形質細胞（胚中心から離れた部分）を標識し、二重染色が顕著な胚中心から離れた集団でのみスペクトルが重複した。胚中心に位置するが典型的にはＣＤ４４陰性である個々の形質細胞に矢印を付している。
【０１０４】
図２ｂでは、この所見を再度特に強調する。ここで、胚中心を選択的に示した。Ｇ０期を過ぎ（Ｋｉ−６７−陽性で示される）ており、したがって増殖し、リンパ組織の胚中心に特徴的である細胞は緑色で標識されている。Ｗｕｅ−１陽性細胞は分化し、もはや増殖しない。その結果、二重染色はみられない。
【０１０５】
図２ｃでは、リンパ組織内の別の重要な細胞集団からの限界決定を、ＣＤ３染色により行った。その結果、扁桃では、Ｗｕｅ−１細胞はＴ細胞の外側ゾーン　（形質細胞に典型的な局在化）を縁取るが、Ｐａｎ−Ｔ細胞マーカーについて陰性である。
【０１０６】
図２ｄでは、公知の形質細胞抗体であるが細胞質抗原しか認識しないＶＳ−３８を用いて二重染色を行った。したがって、高度に重複が存在し、ほぼ完全に黄色の染色である。さらに、個々の細胞は、ＶＳ−３８により認識され、Ｔ細胞であり得、これはＶＳ−３８がＷｕｅ−１に対して低特異性を有するという事実を示す。
【０１０７】
図２ｅは、扁桃表面を緑でマーキングする（上皮マーカーサイトケラチン８）染色を示す。これはまた、上皮内に特徴的に遊走する細胞の場合でさえＷｕｅ−１が交差反応性を持たないことを示す。
【０１０８】
図２ｆでは、機能的に重要な抗原ＣＤ９５（ＦＡＳ）との共発現を調べた。形質細胞発現に関するデータはこれまでに公表されていない。
【０１０９】
図２ｇでは、Ｗｕｅ−１および、辺縁ゾーンのＢ細胞（すなわち、形質細胞の直接的な前駆体である細胞）を認識する抗体４Ｄ１２との組合せを選択した。その結果、移行を特徴づける二重標識細胞も、対応する個々の染色とは別に見られる。
【０１１０】
図２ｈでは、対照的に、ＣＤ２３での二重染色を行ない、二重染色は、胚中心細胞および未成熟Ｂ細胞（いわゆる末梢ゾーン細胞）においてみられる。リンパ小節の胚中心の構造および末梢ゾーンの構造は、緑色でマーキングされ、非標識細胞のストリップ（Ｔ細胞ゾーンは図２ｃを、辺縁ゾーンは図２ｇを参照のこと）およびＷｕｅ−１陽性外側ゾーンが認められる。
【０１１１】
Ｗｕｅ−１が形質細胞を特異的に認識するという事実は、多重染色（図１Ａおよび２（ビデオプリント））により多数の形態学的試験および免疫組織化学的試験の両方において示されている。特に、Ｗｕｅ−１はまた、逆に担体またはメッセンジャー物質に結合することができ、次いで、インビトロおよびインビボの両方において診断用物質または治療用物質を形質細胞に導くことができる（これは、形質細胞の細胞膜に結合する自身の能力により確実にされる）ため、正常形質細胞および悪性形質細胞の膜表面への結合に対するＷｕｅ−１の特異性および性質により、Ｗｕｅ−１が価値のある免疫学的ツールとなる。さらに、Ｗｕｅ−１を体外でのフィルターとして治療に使用することができ（いわゆるパージング）、ここでは、骨髄移植の間に形質細胞腫患者の血液または骨髄から腫瘍細胞が除去される。
【０１１２】
実施例２：Ｗｕｅ−１は健常形質細胞および悪性形質細胞に高度に特異的である　形質細胞悪性腫瘍（形質細胞腫／多発性骨髄腫）の抗体に基づく治療に対する第１ステップは、形質細胞に特異的なモノクローナル抗体を確立することであった。かかる抗体は、上述したＷｕｅ−１であった。リンパ組織に対するＷｕｅ−１の結合特性を調べるため、Ｗｕｅ−１のさらなる特性付けを行った。Ｗｕｅ−１での二重染色のためにヒト扁桃組織および一組の組織マーカーを選択した。Ｗｕｅ−１（ＤＳＭ　ＡＣＣ２４４１）を上記実施例に記載のようにして使用した。
簡単には、新鮮な凍結外科的試料の４マイクロメータークリオスタット切片で免疫組織化学的染色を行った。形質細胞が集まっていることが知られている器官、すなわち、骨髄、リンパ節、胸腺および扁桃に特に注目した。さらに、正常末梢血リンパ球のサイトスピン調製物、二次リンパ組織およびリンパ腫細胞懸濁物、ならびに骨髄腫／形質細胞腫細胞株を免疫組織化学的試験に供した。クリオスタットでの二重染色ために、ビオチン標識抗体が結合した切片を、Ｃｙ３−ストレプトアビジン（ダイアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ） 社、ドイツ）を用い、記載（Ｇｒｅｉｎｅｒ （１９９４） Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ７０：５７２−５７８）にようにして検出した。３工程インキュベーション手順を用い、希釈した精製モノクローナル抗体Ｗｕｅ−１およびイソタイプ対照を別文献（Ｍａｒｘ （１９９２） Ｌａｎｃｅｔ ３３９：７０７−７０８）に詳細に記載のように用いてイムノペルオキシダーゼ法を適用した。実験時に新たに切片を調製するまで生検組織をスナップ凍結塊として−７０℃で維持した。間接染色に使用したモノクローナル抗体は、ＣＤ２２、ＣＤ２３、Ｋｉ６７、ＣＤ１０、ｂｃｌ−２（すべてダコ（ＤＡＫＯ）社製）、４Ｄ１２（Ｓｍｉｔｈ （１９９０） Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８２：１８１−１８７）、ＶＳ３８（１９９４） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ ４７：４１８−４２２ ）であった。フローサイトメトリー解析を、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）社）でアルゴンイオンレーザーを４８８ｎｍで用いて行ない、データの取得および解析にはＬＹＳＩＳ　ＩＩを用い、直接コンジュゲートしたモノクローナル抗体（ＣＤ１９　ＨＤ　３７、シグマ（Ｓｉｇｍａ） 社；ＣＤ３　ＵＣＨＴ−１、シグマ社；ＣＤ１４；Ｌｅｕ−Ｍ３、（ベクトン・ディッキンソン社）；ＣＤ５４、８４Ｍ１０、イムノテック（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）社；ＡＰＯ−１、Ｂｅｈｒｍａｎｎ （１９９４） Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４：３０５７−３０６２）；ＣＤ６６Ｌ、ＤＲＥＧ　５６、ダイアノバ社；ＣＤ４０、ｍＡｂ８９ Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３５３：６７８−６７９ ；ＣＤ３８、ＡＴ　１３／５、セロテック（Ｓｅｒｏｔｅｃ） 社）での三重免疫染色を用いた。Ｗｕｅ−１を、直接ＦＩＴＣとコンジュゲートさせるか、またはストレプトアビジン−フィコエリトリン（ＰＥ、シグマ社）で検出されるビオチン化抗体としてのいずれかで使用した。設備装置設定試料は、未染色試料、およびＣＤ１９−ＦＩＴＣ、ＣＤ１９−ＰＥおよびＣＤ１９−ＱＲで染色した試料を含んだ。参照物質として正常扁桃由来のＣＤ１９＋Ｂリンパ球を用い、ＣＤ１９リンパ球の蛍光強度をゲートオン（ｇａｔｉｎｇ ｏｎ） した後、前方および側方光散乱の相関的表示における標準位置にＢ細胞が配置されるように光散乱検出器を調整することにより装置設定を標準化した。ＣＤ１９＋リンパ球の光散乱から得られたタイト光散乱ゲートを用いて蛍光検出器を調整した後、未染色試料の３つの蛍光検出器の調整を行った。各測定では２００００細胞を含んだ。死細胞識別を、７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ、カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社、ドイツ）を別文献（Ｓｃｈｍｉｄ （１９９２） Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ １３：２０４−２０８）に記載のようにして二色免疫蛍光と組み合せて行った。
【０１１３】
胚中心の解析により、Ｗｕｅ−１標識が細胞質Ｉｇ、表面Ｉｇ、ＩｇイソタイプＩｇＭ＞＞ＩｇＧ＞ＩｇＡ、ＣＤ３８、ＶＳ３８、ＨＬＡ−ＤＲとの強い共局在化を示し、Ｂ細胞マーカーＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４０；４Ｄ１２（辺縁ゾーンのＢ細胞）、ＣＤ１３６、ＣＤ９５について弱い染色を観察することができ、ＣＤ２３、ＣＤ４４、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１４（マクロファージ）、Ｋｉ６７、ＣＤ６６Ｌ、ＣＤ５４、ＣＤ１０、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−６、サイトケラチン８、ＣＤ６８（マクロファージ）では染色はなかった。副皮質の染色対胚中心の染色における違いは、表面Ｉｇ染色の非存在、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ４０、ＣＤ９５、ＨＬＡ−ＤＲなしであり；ＣＤ１３６、ＣＤ４４、ＣＤ５４で強い染色が観察され、ｂｃｌ２で弱い染色が観察され；他のすべてのマーカーでは胚中心と副皮質との間で変化はなかった。これらの所見は、他のリンパ組織および骨髄で確認した（データ示さず）。さらにまた、Ｗｕｅ−１は末梢血、肝臓、心臓、筋肉、皮膚、膀胱、卵巣、精巣および中枢神経系と交差反応しなかったが、胃腸組織の分泌性上皮の弱い染色を示した。これらの結果はＷｕｅ−１の選択的標識特性を裏付けた。
【０１１４】
特異的リンパ腫サブタイプを分化させるＷｕｅ−１の能力を、上述のようにして解析した多数の患者試料により測定した。Ｗｕｅ−１は、形質細胞悪性腫瘍　（形質細胞腫／骨髄腫）に高度に特異的であり、かつ免疫細胞腫とのみ交差反応性であることが示された。リンパ腫サブタイプを改定欧米人（ＲＥＡＬ）分類に従って分類した。陽性染色は、１１例の形質細胞腫／骨髄腫試料のうち１１例、形質細胞分化を伴う１３例のＭＡＬＴ（粘膜関連リンパ組織）型リンパ腫のうち１３例で観察されたが、形質細胞分化なしでは全くなかった（１９例中０）。６例の免疫細胞腫のうち５例および、１３例のびまん性大細胞リンパ腫のうち１例でＷｕｅ−１陽性であったが、小節中心リンパ腫（２３例中０）、およびマントル細胞リンパ腫（１０例中０）、バーキットリンパ腫（５例中０）、Ｂ細胞リンパ球白血病（５例中０）、末梢Ｔ細胞リンパ腫（７例中０）、血管性免疫芽球性リンパ腫（９例中０）およびホジキン病（１３例中０）では染色は観察されなかった。この高度に選択的な形質細胞腫／骨髄腫の認識は、前述の抗体ではいずれも観察されなかった。
【０１１５】
実施例３：Ｗｕｅ−１は、高度に選択的な抗体に基づく形質細胞の排除に適する　このＷｕｅ−１による形質細胞の選択的認識に基づき、かかる抗体が悪性形質細胞（形質細胞腫／骨髄腫）の標的化排除における使用に好適であろうことは当業者に明白である。標的細胞の抗体媒介性排除に使用される典型的なメカニズムは、放射能（放射性免疫コンジュゲート、ＤｅＮａｒｄｏ （１９９９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１， ５６３−５６９）の標的化送達、毒素（免疫毒素、Ｋｒｅｉｔｍａｎ （１９９９） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１， ５７０−５７８ ）の標的化送達または抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）である。ＡＤＣＣは、Ｆｃ−γ受容体を有する細胞（単球、マクロファージ、顆粒球）、ナチュラルキラー細胞またはＴ細胞により媒介されうる。抗体の可変ドメインに連結したエフェクタードメインは、正常なモノクローナル抗体におけるものなどのＦｃドメイン、またはエフェクター細胞上の他の表面抗原と相互作用するドメインでありうる。
【０１１６】
抗体に基づくストラテジーの有望な変形例の１つは、所定の腫瘍標的にエフェクター細胞を再指向させるために、１つの抗体分子において異なる特異性の２つの抗原結合部位を連結することによる二重特異性抗体アプローチである。二重特異性抗体は、インビトロおよびインビボで腫瘍細胞に対して細胞障害性エフェクター細胞を漸増させるのに極めて効率的であるが（Ｓｔａｅｒｚおよび Ｂｅｖａｎ （１９８６）． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ ８３， １４５３−１４５７ Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａおよび Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ （１９８７） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７， １０５−１１１．； Ｋｒｏｅｓｅｎ （１９９５） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５， ４４０９−４４１５； Ｋｒｏｅｓｅｎ （１９９５） Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒ． ４， ４０９−４１４；Ｋｒｏｅｓｅｎ （１９９３） Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３７， ４００−４０７）、臨床的有効性を証明する大規模無作為臨床試験はまだない。これらの有望な抗体構築物がなぜ、臨床試験において無傷の抗体に対して劇的な遅れをとっているのかという主な理由は、充分量の臨床グレード物質を製造することの困難性にある。最近まで、製造および精製プロセスは極めて非効率的であり、ハイブリッド−ハイブリドーマアプローチ、化学結合または組換えＦａｂまたはＦｖフラグメントの細菌の封入体からの再生を続いて行うか否かに関わらず、収率が低かった。また、これらの産物のほとんどすべては不明確な副生成物による汚染を被る（Ｓｔａｅｒｚおよび Ｂｅｖａｎ， １９８６； Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａおよび Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ， １９８７； Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ （１９９４） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３， １０１００−１０１０８； Ｇｒｕｂｅｒ （１９９４） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２， ５３６８−５３７４ ）。以前に２つの異なる（１７−１ＡｘＣＤ３およびＣＤ１９ｘＣＤ３）抗体で示されたように、これらの欠点は、Ｍａｃｋ （１９９５）． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ ９２， ７０２１−７０２５ ａｎｄ Ｌｏｅｆｆｌｅｒ （２０００） Ｂｌｏｏｄ １５， ２０９８−２１０３ に記載されているような４つの可変が連結された分子形態の開発により克服しうる。哺乳動物細胞により産生されて得られる組換え６０ｋＤ分子は、さらなる再生を必要としない充分に活性な形態で高収率で分泌される。
【０１１７】
Ｗｕｅ−１モノクローナル抗体の可変領域を、上述のような標準的ＰＣＲに基づく手順を用いてクローニングし、Ｍａｃｋ （１９９５） に記載のようにして、Ｗｕｅ−１可変軽鎖および重鎖を単鎖抗体にし、短鎖ペプチドリンカーを介して１７−１ＡｘＣＤ３の抗ＣＤ３単鎖Ｆｖ部分を合わせて単鎖二重特異性抗体を合成した。該二重特異性分子をＷｕｅ−１ｘＣＤ３と命名した。簡単には、Ｗｕｅ−１可変領域のコード配列の５’および３’末端からプライマーを選択し、Ｗｕｅ−１−ＶＬの５’末端にＢｓｒＧ１制限部位を導入し、Ｗｕｅ−１−ＶＨの３’末端にＢｓｐＥ１制限部位を導入し、合成（Ｇｌｙ４ Ｓｅｒ１ ）３ リンカーに内部ＢｓｐＥ１に制限部位を導入するように設計した。プライマーは、Ｗｕｅ−ＬＣ−Ｆ： ５’−ＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＴＣＣＧＡＴＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣ−３’； 配列番号：１７、Ｗｕｅ−１−ＬＣ−Ｒ：５’−ＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣ−ＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣ−３’；配列番号：１８、Ｗｕｅ−１−ＨＣ−Ｆ：５’− ＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＴＣ−ＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧ−３’；配列番号：１９、およびＷｕｅ−１−ＨＣ−Ｒ：５’−ＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧ−ＴＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＣＣ−３’；配列番号：２０であった。Ｗｕｅ−１ｘＣＤ３を、１７−１ＡｘＣＤ３のＦｌａｇエピトープが除去されるように設計した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞内のＷｕｅ−１ｘＣＤ３二重特異性単鎖構築物および安定クローンを、選択マーカージヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）を用いて選択した。ＤＨＦＲを、内部リボソームエントリー配列を介してＷｕｅ−１ｘＣＤ３転写物に連結し、両方の発現単位を同じＥＦα−プロモーター（Ｍａｃｋ （１９９５） ）により駆動した。
【０１１８】
得られたＷｕｅ−１ｘＣＤ３構築物は以下のヌクレオチド配列（配列番号：２１）
ＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡ ＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧ ＣＴＧＴＡＴＣＡＴＣ ＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧ ＴＡＧＣＡＡＣＡＧＣ ＴＡＣＡＧＧＴＧＴＡ ＣＡＣＴＣＣＧＡＴＡ ＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣ ＣＣＡＡＡＣＴＣＣＡ ＣＴＣＡＣＴＴＴＧＴ ＣＧＧＴＴＡＣＣＡＴ ＴＧＧＡＣＡＡＣＣＡ ＧＣＣＴＣＣＣＴＣＴ ＣＴＴＧＣＡＡＧＴＣ ＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣ ＣＴＣＴＴＡＧＡＴＡ ＧＴＧＡＴＧＧＡＡＡ ＧＡＣＡＴＡＴＴＴＧ ＡＡＴＴＧＧＴＴＧＴ ＴＡＣＡＧＡＧＧＣＣ ＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴ ＣＣＡＡＡＧＣＧＣＣ ＴＡＡＴＣＴＣＴＣＴ ＧＧＴＧＴＣＴＡＡＡ ＴＴＧＧＡＣＴＣＴＧ ＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡ ＣＡＧＡＴＴＣＡＣＴ ＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴ ＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡ ＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧ ＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡ ＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣ ＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧ ＧＧＡＧＴＣＴＡＴＴ ＡＴＴＧＣＴＧＧＣＡ ＡＧＧＴＡＣＡＣＡＴ ＣＴＴＣＣＧＴＧＧＡ ＣＡＴＴＣＧＧＴＧＧ ＡＧＧＣＡＣＣＡＡＧ ＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡ ＡＡＣＧＧＧＧＴＧＧ ＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴ ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧ ＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧ ＡＧＧＡＧＧＡＴＣＴ ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣ ＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣ ＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧ ＣＴＡＧＴＧＡＡＧＡ ＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣ ＡＧＴＧＡＡＧＡＴＡ ＴＣＴＴＧＴＡＡＧＧ ＧＴＴＣＴＧＧＴＴＡ ＣＴＣＡＴＴＣＡＧＴ ＧＧＴＴＡＣＴＡＣＡ ＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴ ＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣ ＣＡＴＧＧＡＡＡＧＡ ＧＧＣＴＴＧＡＧＴＧ ＧＡＴＴＧＧＡＴＡＴ ＡＴＴＡＧＴＧＧＴＴ ＡＴＡＡＴＧＧＴＧＡ ＴＡＣＴＡＧＧＴＡＴ ＡＡＴＣＡＧＡＡＧＴ ＴＣＡＧＧＧＧＣＡＡ ＧＧＣＣＡＣＡＴＴＴ ＡＴＴＧＴＡＧＡＣＡ ＴＡＴＣＣＴＣＣＡＧ ＧＡＣＡＧＣＣＴＡＣ ＡＴＧＣＡＧＴＴＣＡ ＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣ ＡＴＣＴＧＡＡＧＡＣ ＴＣＴＧＣＧＧＴＣＴ ＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣ ＡＡＧＡＧＧＧＧＧＴ ＴＡＣＴＡＣＧＧＣＴ ＡＣＧＴＧＧＡＣＴＡ ＣＴＧＧＧＧＣＣＡＡ ＧＧＣＡＣＣＡＣＣＣ ＴＣＡＣＡＧＴＣＴＣ ＣＴＣＣＧＧＡＧＧＴ ＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧ ＡＴＡＴＣＡＡＡＣＴ ＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡ ＧＧＧＧＣＴＧＡＡＣ ＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣ ＴＧＧＧＧＣＣＴＣＡ ＧＴＧＡＡＧＡＴＧＴ ＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣ ＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣ ＡＣＣＴＴＴＡＣＴＡ ＧＧＴＡＣＡＣＧＡＴ ＧＣＡＣＴＧＧＧＴＡ ＡＡＡＣＡＧＡＧＧＣ ＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧ ＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧ ＡＴＴＧＧＡＴＡＣＡ ＴＴＡＡＴＣＣＴＡＧ ＣＣＧＴＧＧＴＴＡＴ ＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡ ＡＴＣＡＧＡＡＧＴＴ ＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧ ＧＣＣＡＣＡＴＴＧＡ ＣＴＡＣＡＧＡＣＡＡ ＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣ ＡＣＡＧＣＣＴＡＣＡ ＴＧＣＡＡＣＴＧＡＧ ＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡ ＴＣＴＧＡＧＧＡＣＴ ＣＴＧＣＡＧＴＣＴＡ ＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡ ＡＧＡＴＡＴＴＡＴＧ ＡＴＧＡＴＣＡＴＴＡ ＣＴＧＣＣＴＴＧＡＣ ＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣ ＡＡＧＧＣＡＣＣＡＣ ＴＣＴＣＡＣＡＧＴＣ ＴＣＣＴＣＡＧＴＣＧ ＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧ ＴＧＧＡＧＧＴＴＣＴ ＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧ ＧＡＧＧＴＴＣＡＧＧ ＴＧＧＡＧＴＣＧＡＣ ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＣ ＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣ ＴＣＣＡＧＣＡＡＴＣ ＡＴＧＴＣＴＧＣＡＴ ＣＴＣＣＡＧＧＧＧＡ ＧＡＡＧＧＴＣＡＣＣ ＡＴＧＡＣＣＴＧＣＡ ＧＡＧＣＣＡＧＴＴＣ ＡＡＧＴＧＴＡＡＧＴ ＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴ ＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡ ＧＡＡＧＴＣＡＧＧＣ ＡＣＣＴＣＣＣＣＣＡ ＡＡＡＧＡＴＧＧＡＴ ＴＴＡＴＧＡＣＡＣＡ ＴＣＣＡＡＡＧＴＧＧ ＣＴＴＣＴＧＧＡＧＴ ＣＣＣＴＴＡＴＣＧＣ ＴＴＣＡＧＴＧＧＣＡ ＧＴＧＧＧＴＣＴＧＧ ＧＡＣＣＴＣＡＴＡＣ ＴＣＴＣＴＣＡＣＡＡ ＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴ ＧＧＡＧＧＣＴＧＡＡ ＧＡＴＧＣＴＧＣＣＡ ＣＴＴＡＴＴＡＣＴＧ ＣＣＡＡＣＡＧＴＧＧ ＡＧＴＡＧＴＡＡＣＣ ＣＧＣＴＣＡＣＧＴＴ ＣＧＧＴＧＣＴＧＧＧ ＡＣＣＡＡＧＣＴＧＧ ＡＧＣＴＧＡＡＡＣＡ ＴＣＡＴＣＡＣＣＡＴ ＣＡＴＣＡＴＴＡＧＴ ＣＧＡＣ
および以下のアミノ酸配列（配列番号：２２）
ＤＩＶＭＴＱＴＰＬＴ ＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳ ＬＳＣＫＳＳＱＳＬＬ ＤＳＤＧＫＴＹＬＮＷ ＬＬＱＲＰＧＱＳＰＫ ＲＬＩＳＬＶＳＫＬＤ ＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳ ＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩ ＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶ ＹＹＣＷＱＧＴＨＬＰ ＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥ ＩＫＲＧＧＧＧＳＧＧ ＧＧＳＧＧＧＧＳＱＶ ＱＬＱＱＳＧＰＥＬＶ ＫＴＧＡＳＶＫＩＳＣ ＫＧＳＧＹＳＦＳＧＹ ＹＭＨＷＶＫＱＳＨＧ ＫＲＬＥＷＩＧＹＩＳ ＧＹＮＧＤＴＲＹＮＱ ＫＦＲＧＫＡＴＦＩＶ ＤＩＳＳＲＴＡＹＭＱ ＦＮＳＬＴＳＥＤＳＡ ＶＹＹＣＡＲＧＧＹＹ ＧＹＶＤＹＷＧＱＧＴ ＴＬＴＶＳＳＧＧＧＧ ＳＤＩＫＬＱＱＳＧＡ ＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫ ＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦ ＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱ ＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧ ＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮ ＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴ ＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡ ＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥ ＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹ ＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷ ＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ ＶＥＧＧＳＧＧＳＧＧ ＳＧＧＳＧＧＶＤＤＩ ＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳ ＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴ ＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭ ＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳ ＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫ ＶＡＳＧＶＰＹＲＦＳ ＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬ ＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡ ＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳ ＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫ ＬＥＬＫＨＨＨＨＨＨ
を含有した。
【０１１９】
トランスフェクトしたＣＨＯ細胞を無血清培地で培養し、Ｗｕｅ−１ｘＣＤ３を上清みから回収した。カチオン交換カラムクロマトグラフィーから始め、続いて固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）およびゲルろ過の３工程精製でＷｕｅ−１ｘＣＤ３を上清みから精製した。単離したタンパク質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（示さず）により測定すると＞９５％であった。適用した条件下で、分子はその単量体型で約５４ｋＤと思われる。精製タンパク質の最終収率は約２．５ｍｇ／細胞培養上清み１ｌであった。すべてのクロマトグラフィー工程は、Ａｅｋｔａ　ＦＰＬＣシステム（ファルマシア）で行った。すべての化学薬品は、研究グレードのものであり、シグマ社（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ） またはメルク （Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）から購入した。
【０１２０】
二重特異性Ｗｕｅ−１抗体は、患者試料において効率的な抗体依存性細胞障害を媒介する
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ（セロメド／バイオクロム（Ｓｅｒｏｍｅｄ／Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）社、ドイツ）密度勾配遠心分離により調製し、ＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）およびＩＬ−２（６０Ｕ／ｍｌ）で刺激した。ＲＰＭＩ、２０％ＦＣＳ（セロメド／バイオクロム社、ドイツ）、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびピルベート（共にライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） 社、ドイツ）でＰＢＭＣを培養した。患者のインフォームドコンセントおよび地方倫理委員会の承認を得た後、該患者の細胞を通常の診断用検体から採取した。一次骨髄腫細胞の調製は標準的手順に従った。簡単には、多発性骨髄腫患者の骨髄吸引物由来の単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離により分離し、抗ＣＤ１３８コート磁気ビーズ（ミルテニ・バイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ） 社、ドイツ）とともに１５分間４℃でインキュベートした。ＣＤ１３８＋細胞の分離は、ＭＡＣＳ装置（ミルテニ・バイオテク社、ドイツ）において製造業者の指示書に従って実施した。精製後、７０〜９０％の細胞がＣＤ１３８＋であった（データ示さず）。患者のインフォームドコンセントおよび地方倫理委員会の承認を得た後、該患者の細胞を通常の診断用検体から採取した。抗体媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）をフローサイトメトリーにより測定した。富化された多発性骨髄腫細胞を、ＰＫＨ−２６染料（シグマ社）で製造業者の指示書に従って標識し、ＰＢＭＣ、抗体および２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６（ペプロテック（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ） 、ドイツ）とともに培養した。その後のインキュベーション時、細胞をＰＢＳで洗浄し、プロピジウムヨウ素（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｎｅ） （ＰＩ）（２．５μｇ／ｍｌ）で染色した。「Ｃｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔ」ソフトウェアを用いる「Ｆａｃｓｃａｌｉｂｕｒ」フローサイトメーター（ともにベクトン・ディッキンソン社、ドイツ）で解析を行った。生存している骨髄腫細胞は、ＰＫＨ−２６染料（ＦＬ−２で測定）について陽性であり、ＦＬ−３で測定したＰＩについて陰性であった。死滅した多発性骨髄腫細胞はＰＫＨ−２６およびＰＩの両方について陽性であった。ＰＢＭＣはＰＫＨ−２６について陰性であった。特異的細胞障害性は、１００×（１−被検試料中の増殖可能な多発性骨髄腫細胞／１７−１ＡｘＣＤ３対照試料中の増殖可能な多発性骨髄腫細胞の数）として計算した。アッセイは、６日後または培地の色が赤から黄色っぽくなったときに終了した。
【０１２１】
図３および４に示すように、ＰＨＡ／ＩＬ−２で予備刺激したＰＢＭＣとともに多発性骨髄腫試料をインキュベートした。６つの実験では骨髄ドナーから自己末梢血液試料を得ることが可能であり、５つの実験は健常ドナー由来の同種異系ＰＢＭＣを用いて行った。自己または同種異系のＰＢＭＣを含有する試料間で有意差は見られなかった。殺傷の特異性は、形質細胞上に存在しない上皮表面抗原に結合する二重特異性抗体１７−ＡｘＣＤ３とのインキュベーションにより制御された。図３は、代表的な実験を示し、ＰＫＨ−２６染色をｘ軸に示し、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）をｙ軸に示す。Ｗｕｅ−１ｘＣＤ３は、ＰＫＨ−２６標識された多発性骨髄腫細胞のＰＩ陰性からＰＩ陽性への有意なシフト　（細胞溶解を示す）を示す。図４は、抗体濃度の関数としての多発性骨髄腫細胞の特異的溶解を示す。
【０１２２】
2004500070.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明の抗体を用いた免疫組織化学である。
図１ａは、中央（星型）に胚中心を有する二次リンパ組織およびこの胚中心の上側３分の１における個々の褐色に染色された形質細胞である。
図１ａの部分図ｂは、形質細胞株ＮＣｌ−９２３の免疫染色を示し、ここですべての細胞はＷｕｅ−１により免疫組織化学的に強く陽性に標識されている。
図１ｂの部分図ａでは、Ｗｕｅ−１陰性反応を生じるリンパ腫の未分化腫瘍部分を除いて、陽性に標識された形質細胞のびまん性宿主で、形質細胞に分化しているＢ細胞腫（いわゆる小悪性ＭＡＬＴリンパ腫）が見られうる。図１ｂの部分図ｂでは、高度に悪性のリンパ腫がＷｕｅ−１により標識され、これは悪性形質細胞（いわゆる退形成形質細胞腫）に相当し、細胞質の染色および膜の染色を有する。
図１ｃの挿入図は、成熟形質細胞の免疫組織化学である（ＦＡＣＳ解析）。
図１ｄは、形質細胞株（ＮＣＩ−Ｈ９２９）を抗原供給源としたウエスタンブロットである。
【図２】
図２のすべての部分図ａ〜ｈは、形質細胞に対して選択的な特異的結合パターンをヒト扁桃に基づいて記載したものである。
【図３】
図３は、ＣＤ１３８に基づく免疫学的単離により富化されたＭＭ細胞で行った細胞障害性アッセイである。骨髄腫生細胞の画分は、ＰＫＨ−２６染色（ＦＬ−２で測定）について陽性であり、ＰＩ（ＦＬ−３で測定）について陰性であった。ＭＭ死細胞はＰＫＨ−２６およびＰＩの両方について陽性であった。ＰＢＭＣは、ＰＫＨ−２６について陰性であった。ＰＩ陰性骨髄腫細胞の顕著な損失が、４日間のインキュベーション期間後、ｂｓｃ１７−１ＡｘＣＤ３と比べ、ｂｓｃＷｕｅ−１ｘＣＤ３を含有する試料において検出可能であり、Ｅ：Ｔ比は１０：１である。三連で試料の解析を行うと、自己予備刺激ＰＢＭＣによる標的細胞の平均特異的溶解は５６％であった。
【図４】
図４は、ｂｓｃＷｕｅ−１ｘＣＤ３の用量依存的活性である。アッセイインキュベーション期間は６日間であり、Ｅ：Ｔ比は１０：１である。二連で試料の解析を行うと、自己予備刺激ＰＢＭＣによる標的細胞の最大特異的溶解は６５％であった。
【図１】
2004500070.tif 000003
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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