(57)【要約】ＨＣＶ　Ｅ２ポリペプチドまたはＨＣＶ　Ｅ１Ｅ２ポリペプチドおよび／またはＨＣＶ　Ｅ２ポリヌクレオチドまたはＥ１Ｅ２ポリヌクレオチドを使用して、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ１Ｅ２抗原またはＥ２抗原に対する抗体および結合中和抗体を誘発する方法が、本明細書中で記載される。抗Ｅ２抗体および抗Ｅ２　ＮＯＢ抗体が、特に、ＨＣＶに対する抗Ｅ２抗体反応および／またはＨＣＶに対する抗Ｅ２　ＮＯＢ抗体反応を最適化するモデル系を提供するため、そしてＨＣＶ感染に対する予防的処置および治療的処置を提供するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＥ２抗原またはＥ１Ｅ２抗原に対する免疫応答を誘発する方法であって、（ａ）該Ｅ２抗原または該Ｅ１Ｅ２抗原をコードするポリヌクレオチドを被験体に投与する工程であって、該Ｅ２抗原および該Ｅ１Ｅ２抗原が分泌されずそしてＥ２が全長である、工程、を包含する、方法。
【請求項２】
前記免疫応答が体液性免疫応答である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記体液性免疫応答が、少なくとも１つの結合中和抗体（ＮＯＢ）を産生する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドがＥ１Ｅ２ポリペプチドをコードする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチド全長Ｅ２ポリペプチドをコードする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記ＨＣＶ抗原が、ｐ７ポリペプチドを含まない、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法であって、前記ＨＣＶ抗原が、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜７４６；ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜７４９；ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜７４６；ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜８０９；ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜７４９；およびＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜８０９からなる群より選択される、方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドがプラスミド中に存在する、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記被験体がＨＣＶに感染している、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記被験体がＨＣＶに感染していない、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記被験体に心臓毒を投与する工程をさらに包含する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが微粒子を使用して投与される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記微粒子がＰＬＧ微粒子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験体が哺乳動物である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物が、マウス、ウサギ、モルモット、マカク、ヒヒ、チンパンジー、およびヒトからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが微粒子銃送達デバイスを使用して投与される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが、筋内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経口投与、および皮内投与からなる群より選択される方法によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
請求項３に記載の方法であって、前記結合中和抗体が、Ｅ２ポリペプチドがその同族レセプターに結合することを、該結合中和抗体の非存在下で該Ｅ２ポリペプチドがその同族レセプターへ結合することと比較して、より大きな量阻害する、方法。
【請求項１９】
前記結合中和抗体を検出する工程をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
前記結合中和抗体が、少なくとも１：７０の希釈度で、該Ｅ２ポリペプチドの結合を少なくとも５０％阻害する、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記結合中和抗体が、少なくとも１：１４０の希釈度で、該Ｅ２ポリペプチドの結合を少なくとも５０％阻害する、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
前記結合中和抗体が、少なくとも１：３００の希釈度で、該Ｅ２ポリペプチドの結合を少なくとも５０％阻害する、請求項３に記載の方法。
【請求項２３】
前記結合中和抗体が、少なくとも１：６００の希釈度で、該Ｅ２ポリペプチドの結合を少なくとも５０％阻害する、請求項３に記載の方法。
【請求項２４】
前記結合中和抗体が、少なくとも１：８００の希釈度で、該Ｅ２ポリペプチドの結合を少なくとも５０％阻害する、請求項３に記載の方法。
【請求項２５】
前記結合中和抗体が、少なくとも１：３０００の希釈度で、該Ｅ２ポリペプチドの結合を少なくとも５０％阻害する、請求項３に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ａ）を反復する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを前記被験体に投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する抗体および結合中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ　ｏｆ　ｂｉｎｄｉｎｇ）抗体の誘発に関する。より詳細には、本発明は、哺乳動物において抗Ｅ２抗体および抗Ｅ２結合中和抗体を誘発するための、ＨＣＶ　Ｅ１Ｅ２およびＨＣＶ　Ｅ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの使用に関する。
【０００２】
（背景）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、重大な健康問題であり、世界人口の約１％がこのウイルスに感染している。急性感染した個体の７５％以上は、最終的に、肝硬変、肝不全および肝細胞癌を生じ得る、慢性キャリア状態に進行する。非常にわずかな割合の慢性的に感染した患者は、ＨＣＶを自然にクリアし、そして慢性肝炎を解消する。例えば、Ａｌｔｅｒら（１９９２）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２７；１８９９−１９０５；ＲｅｓｎｉｃｋおよびＫｏｆｆ（１９９３）Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｍ．Ｍｅｄ．１５３：１６７２−１６７７；Ｓｅｅｆｆ（１９９５）Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｄｉｓ．６：２０−２７；Ｔｏｎｇら（１９９５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３２：１４６３−１４６６を参照のこと。
【０００３】
ＨＣＶによる感染の過程中においてＨＣＶ特異的中和抗体が存在する証拠が、存在する。Ｉｓｈｉｉら（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　２８：１１１７−１１２０を参照のこと。さらに、この慢性ＨＣＶ感染の過程における抗Ｅ２結合中和（ＮＯＢ）抗体の高い血清力価の出現および維持が、ＨＣＶ感染からの防御、ＨＣＶのクリアランスおよびＨＣＶ肝臓疾患の臨床的解決と相関付けられている。Ｉｓｈｉｉら、（１９９８）；Ｒｏｓａら、（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：１７５９。しかし、今日まで、アミノ酸７１５で短縮化された精製ＨＣＶ　Ｅ２ポリペプチドのみが、抗Ｅ２　ＮＯＢを誘導することが動物研究において示されている。Ｆｏｕｒｎｉｌｌｉｅｒら、（１９９９）　Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７３：７４９７−７５５０４。従って、抗Ｅ２　ＮＯＢ抗体力価を誘発する効果的な方法に対する必要性が依然存在する。
【０００４】
（要旨）
Ｅ２抗原およびＥ１Ｅ２抗原に対する免疫応答（詳細には、体液性免疫応答）を誘発する（例えば、結合中和（ＮＯＢ）抗体を誘発する）方法を、本明細書中に記載する。この方法は、これらの抗原の１以上をコードするポリヌクレオチドを投与することによる。さらに、炭水化物部分は、ヒト細胞へのＥ２結合に必要ではなく、そしてモノマーの非凝集画分のみがＣＤ８１に結合し得る。好ましい実施形態において、タンパク質および／またはＤＮＡでの免疫は、細胞内画分から精製した、哺乳動物細胞によって発現されたモノマーＥ２タンパク質を使用して達成される。従って、抗Ｅ２抗体および細胞へのＥ２の結合を中和する抗Ｅ２抗体を誘発するための方法および試薬を提供することが、本発明の目的である。
【０００５】
従って、１つの局面において、本発明は、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）Ｅ２および／またはＥ１Ｅ２抗原（例えば、これらの抗原をコードする、１以上の精製ポリヌクレオチド）に対する免疫応答を誘発する方法を包含し、この方法は、Ｅ２抗原および／またはＥ１Ｅ２抗原をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを、被験体に投与する工程（ａ）を包含する。これらのポリヌクレオチドは、好ましくは、非分泌性であり、そしてさらには、全長のＥ２をコードする、ＨＣＶ　Ｅ２および／またはＥ１Ｅ２ポリペプチドをコードする。好ましい実施形態において、この免疫応答は、体液性の免疫応答（例えば、少なくとも１つの結合中和（ＮＯＢ）抗体を生成する応答）である。特定の実施形態において、異なるＥ２またはＥ１Ｅ２抗原をコードする１より多いポリヌクレオチドを投与する。種々の実施形態において、これらのポリヌクレオチドによってコードされる全長（すなわち、非短縮型）Ｅ２抗原は、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜７４６；ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜７４９；ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜８０９；またはそれらの組み合わせを含む。他の実施形態において、これらのポリヌクレオチドによってコードされる抗原は、Ｅ１およびＥ２を含む（例えば、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜７４６、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜８０９、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜７４９をコードする構築物）。従って、これらのポリヌクレオチドは、１以上の全長Ｅ２および１以上のＥ１Ｅ２抗原をコードし得る。さらなる実施形態において、これらの抗原は、細胞内産生（例えば、分泌されない）される、短縮型Ｅ２（例えば、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜７１５；ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６６１；ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３４０〜６７４）である。これらのポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたは他の発現ベクターであり得る。本明細書中に記載の任意の方法において、被験体は、ＨＣＶの１以上の株に感染しているか、または感染してない。さらに、種々の実施形態において、これらの方法は、その哺乳動物にアジュバント（例えば、心臓毒（ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ））を投与する工程を包含する。
【０００６】
本明細書中に記載の任意の方法において、被験体は、哺乳動物（例えば、ウマ、ウサギ、モルモット、サル、ヒヒ、チンパンジーおよびヒト）であり得る。ＨＣＶをコードするポリヌクレオチドは、任意の適切な送達機構（例えば、微粒子銃送達技術、ＰＬＧマイクロカプセルなど）によって送達され得る。これらのポリヌクレオチドは、筋内、皮下、腹腔内、粘膜、鼻内、経口および経皮などで送達され得る。
【０００７】
他の実施形態において、これらの方法は、結合中和抗体を検出する工程をさらに包含する。さらに、特定の実施形態において、この結合中和抗体は、その同族のレセプターへのＥ２ポリペプチドの結合を、この結合中和抗体の非存在下でのその同族のレセプターに対するＥ２ポリペプチドの結合よりも高い量で阻害する。この結合中和抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：少なくとも１：７０の希釈度で、Ｅ２ポリペプチドの結合を少なくとも５０％阻害する結合中和抗体；少なくとも１：１４０の希釈度で、Ｅ２ポリペプチドの結合を少なくとも５０％阻害する結合中和抗体；少なくとも１：３００の希釈度で、Ｅ２ポリペプチドの結合を少なくとも５０％阻害する結合中和抗体；少なくとも１：６００の希釈度で、Ｅ２ポリペプチドの結合を少なくとも５０％阻害する結合中和抗体；少なくとも１：８００の希釈度で、Ｅ２ポリペプチドの結合を少なくとも５０％阻害する結合中和抗体；および少なくとも１：３００の希釈度で、Ｅ２ポリペプチドの結合を少なくとも５０％阻害する結合中和抗体。
【０００８】
従って、本発明は、抗Ｅ２抗体および抗Ｅ２　ＮＯＢ抗体を誘発するための方法および試薬を提供する。これらの方法および試薬は、強力な抗Ｅ２抗体応答および抗Ｅ２　ＮＯＢ抗体応答の生成に関連するＨＣＶ　Ｅ２ポリペプチドまたはＨＣＶ　Ｅ１Ｅ２ポリペプチドのエピトープの同定、およびＨＣＶに対する動物（ヒトを含む）の免疫に、特に有利である。
【０００９】
これらおよび他の実施形態は、本明細書中の教示を鑑みれば当業者に容易に理解される。
【００１０】
本発明の実施は、他に記載がない限り、化学、生化学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来技法を用い、このような技術は以下の文献で十分説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　第２版；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｉｎｃ．）；ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ　Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編）；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編）；Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ。
【００１１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、その内容が明らかにそうではないことを示さない限り、複数の対象を含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「１つの抗原（ａｎ　ａｎｔｉｇｅｎ）」は、２つ以上の抗原などの混合物を含む。
【００１２】
（Ｉ．定義）
本発明の記載において、以下の用語は、以下に示されるように用いられ、そして以下に示されるように定義されることが意図される。
【００１３】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーをいい、そして最小の長さの産物に規定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどが、この定義に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方は、この定義に包含される。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）を含む。さらに、本発明の目的のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望される活性を維持する限り、ネイティブ配列に対する修飾（例えば、欠失、付加、および置換（一般に性質は保存される））を含むタンパク質をいう。これらの修飾は、部位特異的変異誘発を介して意図され得るか、またはタンパク質を産生する宿主の変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーを介するように、偶然であり得る。
【００１４】
ＨＣＶポリペプチドは、上記のようなポリペプチドであり、ＨＣＶポリタンパク質から誘導される。ポリペプチドは、ＨＣＶから物理的に誘導される必要はなく、合成的または組換え的に産生され得る。さらに、このポリペプチドは、様々なＨＣＶ株（例えば、ＨＣＶの株１、２、３または４）のいずれかから誘導され得る。多数の保存された領域および可変領域が、これらの株の間で公知であり、一般的に、これらの領域由来のエピトープのアミノ酸配列は、高い程度の配列相同性（例えば、２つの配列が整列された場合、本明細書中に記載される方法を用いて決定されるような、分子の規定された長さにわたる参照配列に対して、少なくとも約３０％−４０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも約４０％−６０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約６０％−７０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約７０％−７５％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約８０％−８２％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約８５％−９０％の配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約９２％の配列同一性、なおさら好ましくは９５％の配列同一性、および最も好ましくは９８％の配列同一性、のアミノ酸配列相同性）を有する。従って、例えば、用語［Ｅ２」ポリペプチドとは、様々なＨＣＶ株のいずれか由来のネイティブのＥ２、ならびに以下でさらに定義されるような、Ｅ２のアナログ、ムテインおよび免疫原性フラグメントをいう。
【００１５】
用語「アナログ」および「ムテイン」とは、以下で定義されるような所望の活性（例えば、細胞媒介免疫応答および／または体液性免疫を刺激する能力）を保持する参照分子の生物学的に活性な誘導体、またはそのような誘導体のフラグメントをいう。一般的に、用語「アナログ」とは、改変が免疫原性活性を破壊しない限り、ネイティブの分子に関して、１つ以上のアミノ酸付加、置換（一般的に、特徴は保存的である）、および／または欠失を有するネイティブのポリペプチド配列および構造を有する化合物をいう。用語「ムテイン」とは、国際公報ＷＯ９１／０４２８２に記載されるような、１つ以上のペプチド模倣物（「ペプトイド」）を有するペプチドをいう。好ましくは、アナログまたはムテインは、ネイティブの分子と少なくとも同じ免疫活性を有する。ポリペプチドアナログおよびムテインを作製するための方法は、当該分野で公知であり、そして以下でさらに記載される。
【００１６】
特に好ましいアナログは、本質的に保存的な置換（すなわち、それらの側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内に生じる置換）を含む。詳細には、アミノ酸は一般に、４つのファミリーに分割される：（１）酸性−アスパラギン酸、およびグルタミン酸；（２）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンは、時々、芳香族アミノ酸として分類される。例えば、ロイシンのイソロイシンまたはバリンとの孤立置換、アスパラギン酸のグルタミン酸との孤立置換、トレオニンのセリンとの孤立置換、またはアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸との類似の置換が、生物学的活性に主要な効果を有さない。例えば、目的のポリペプチドは、この分子の所望の機能がインタクトなままである限り、約５〜１０までの保存的もしくは非保存的アミノ酸置換、または約１５〜２５までの保存的もしくは非保存的アミノ酸置換でさえ、または５〜２５の間の任意の整数を含み得る。当業者は、当該分野で周知のＨｏｐｐ／ＷｏｏｄｓおよびＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットを参照することにより、変化に耐え得る目的の分子の領域を容易に決定し得る。
【００１７】
「フラグメント」によって、インタクトな全長ポリペプチド配列および構造の一部のみからなる、ポリペプチドが意図される。このフラグメントは、ネイティブなポリペプチドのＣ末端欠失および／またはＮ末端欠失を含み得る。特定のＨＣＶタンパク質の「免疫原性フラグメント」または「抗原性フラグメント」は、全長分子の少なくとも約５〜１０個連続するアミノ酸残基、好ましくは、全長分子の少なくとも約１５〜２５個連続するアミノ酸残基、そして最も好ましくは全長分子の少なくとも約２０〜５０個以上連続するアミノ酸残基を一般に包含し、このアミノ酸残基は、本明細書中に記載のアッセイにより測定した場合に、そのフラグメントが免疫原性活性または抗原性活性を保持する場合に、エピトープ（または５アミノ酸と全長配列との間の任意の整数）を規定する。種々のＨＣＶエピトープの記載については、例えば、Ｃｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：１００１１〜１００１５；Ｃｈｉｅｎら、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔ．Ｈｅｐａｔｏｌ．（１９９３）８：Ｓ３３〜３９；Ｃｈｉｅｎら、国際公開番号ＷＯ９３／００３６５；Ｃｈｉｅｎ，Ｄ．Ｙ．、国際公開番号ＷＯ９４／０１７７８；共有に係る特許査定された米国特許出願第０８／４０３，５９０号および同第０８／４４４，８１８号を参照のこと。
【００１８】
用語「エピトープ」は本明細書中で使用される場合、少なくとも約３〜５アミノ酸、好ましくは約５〜１０または１５アミノ酸、そして約１，０００アミノ酸以下（または３と１０００との間の任意の整数）の配列をいい、この配列は、単独でかまたはより大きな配列の一部として、そのような配列に応答して生じる抗体に結合する配列を規定する。このフラグメントの長さに対する臨界的上限は存在せず、この長さは、タンパク質配列のほぼ全長を含み得るか、またはＨＣＶポリタンパク質由来の２つ以上のエピトープを含む融合タンパク質さえ含み得る。本発明における使用のためのエピトープは、それが由来する親タンパク質の一部の正確な配列を有するポリペプチドに限定されない。実際、ウイルスゲノムは、不断の変化状態にあり、そして単離株間で比較的高い程度の変動性を示す、いくつかの可変ドメインを含む。従って、用語「エピトープ」は、ネイティブ配列と同一の配列、ならびにそのネイティブ配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般に本質的に保存的である））を包含する。
【００１９】
エピトープを含む所定のポリペプチド領域は、当該分野で周知の、かなり多数のエピトープマッピング技術を使用して同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ　Ｍａｐｐｉｎｇ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第６６巻（Ｇｌｅｎｎ　Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）、Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ、Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ。例えば、線状エピトープは、例えば、固体支持体上に、タンパク質分子の一部に対応する多数のペプチドを同時合成すること、およびそのペプチドを依然としてその支持体上に付着させつつ、そのペプチドを抗体を反応させることによって、決定され得る。このような技術は、当該分野で公知であり、かつ、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：３９９８〜４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９〜７１５を参照のこと。同様に、構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープは、アミノ酸の空間立体配座を、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴によって決定することによって、決定され得る。例えば、前出の、Ｅｐｉｔｏｐｅ　Ｍａｐｐｉｎｇ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照のこと。タンパク質の抗原性領域もまた、標準的抗原性プロットおよびヒドロパシープロット（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｒｏｕｐから入手可能なＯｍｉｇａバージョン１．０ソフトウェアプログラムを使用して計算されるプロット）を使用して同定され得る。このコンピュータープログラムは、抗原性プロフィールを決定するためにＨｏｐｐ／Ｗｏｏｄｓ法（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ（１９８１）７８：３８２４〜３８２８を使用し、そしてヒドロパシープロットのためにＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ技術（Ｋｙｔｅら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８２）１５７：１０５〜１３２）を使用する。
【００２０】
本明細書中に使用される場合、用語「構造エピトープ」は、全長タンパク質またはそのアナログもしくはムテインの一部であって、天然の全長タンパク質内のエピトープをコードするアミノ酸配列にネイティブな（ｎａｔｉｖｅ　ｔｏ）構造的特徴を有するものをいう。ネイティブな構造的特徴とは、グリコシル化および３次元構造を包含するが、これらに限定されない。好ましくは、構造エピトープは、組換え産生され、そしてその所望の構造的特徴を保存する条件下で（例えば、そのエピトープの変性を伴わずに）その構造エピトープが抽出可能である細胞中で発現される。このような細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。ＨＣＶポリタンパク質からの組換え構造エピトープの発現および単離が、例えば、国際公開番号ＷＯ９６／０４３０１、ＷＯ９４／０１７７８、ＷＯ９５／３３０５３、ＷＯ９２／０８７３４に記載される。
【００２１】
ＨＣＶ抗原（ポリペプチドと、インビボで発現されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとの両方を包含する）または組成物に対する「免疫原性応答」は、目的の組成物中に存在する分子対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答が被験体中で発生することである。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」は、抗体分子により媒介される免疫応答をいい、一方「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球により媒介される免疫応答をいう。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞傷害性（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ）Ｔ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を包含する。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質とともに提示され、そして細胞表面上に発現される、ペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内破壊またはこのような微生物に感染した細胞の溶解を、誘導および促進することを補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的応答を包含する。ヘルパーＴ細胞は、ペプチド抗原をＭＨＣ分子とともにその表面上に提示する細胞に対する、非特異的エフェクター細胞の機能を刺激しそしてその活性を集中させるのを補助するように作用する。「細胞性免疫応答」はまた、活性化Ｔ細胞および／または他の白血球により産生される（ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む）サイトカイン、ケモカインおよび他のこのような分子の産生をいう。
【００２２】
細胞性免疫応答を惹起する組成物またはワクチンは、細胞表面上でのＭＨＣ分子を伴う抗原の提示によって、脊椎動物被験体を感作するように作用し得る。細胞媒介性免疫応答は、その表面に抗原を提示する細胞に対するかまたはその細胞近辺に対する。さらに、抗原特異的Ｔリンパ球は、免疫された宿主の将来の防御を可能にするように生成され得る。
【００２３】
用語「抗原」は、免疫応答を惹起し得る組成物をいい、そして例えば、ポリペプチドかまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであり得る。特定の抗原が細胞媒介性免疫学的応答を刺激する能力は、多数のアッセイ（例えば、リンパ増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性細胞アッセイ）によってか、感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球についてアッセイすることによって、決定され得る。このようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９〜４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９〜２３７６；および下記の実施例を参照のこと。「抗原決定基」は、特定の抗体分子または特定の細胞表面レセプターが結合する、抗原またはハプテン上の部位をいう。
【００２４】
従って、免疫学的応答は、本明細書中で使用される場合、ＣＴＬの生成および／またはヘルパーＴ細胞の生成もしくは活性化を刺激する応答であり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性免疫応答、例えば、結合中和（ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｎｄｉｎｇ）（ＮＯＢ）抗体を、惹起し得る。従って、免疫学的応答は、以下の効果のうちの１つ以上を包含し得る：Ｂ細胞による抗体の産生；および／または目的の組成物もしくはワクチン中に存在する抗原を特異的に指向する、サプレッサーＴ細胞および／もしくはγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染性を中和し、そして／または抗体−補体依存性細胞傷害もしくは抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介して、免疫された宿主に対する症状の防御もしくは軽減を提供するように、作用し得る。このような応答は、当該分野で周知の標準的免疫アッセイおよび中和アッセイを使用して、決定され得る。
【００２５】
「コード配列」または選択されたポリペプチドを「コードする」配列は、適切な制御配列の制御下におかれた場合、インビトロまたはインビボでポリペプチドに転写（ＤＮＡの場合）および翻訳（ｍＲＮＡの場合）される核酸分子である。このコード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’（カルボキシ）末端における翻訳終止コドンによって決定される。転写終止配列は、コード配列に対して３’に位置し得る。
【００２６】
「核酸」分子または「ポリオヌクレオチド」は、二本鎖および一本鎖の両方の配列を含み得るが、ウイルス、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、ウイルス性ＤＮＡ（例えば、ＤＮＡウイルスおよびレトロウイルス）または原核生物ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および特に合成ＤＮＡ配列に限定されない。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの既知の塩基アナログのいずれかを含む配列を含む。
【００２７】
「作動可能に連結された」とは、そのように記載された成分がそれらの所望の機能を行うように構成されたエレメントの配置をいう。従って、コード配列に作動可能に連結された所定のプロモーターは、プロモーター転写因子などが存在する場合、このコード配列の発現に影響し得る。プロモーターは、それらの発現を指向するように機能する限り、このコード配列と接近している必要はない。従って、例えば、介在非翻訳、転写配列は、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、転写イントロンが存在し得、そしてプロモーター配列はさらに、コード配列に「作動可能に連結された」と考えられ得る。
【００２８】
本明細書中で核酸分子を記載するために使用する場合、「組換え体」は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成または合成由来（これはこの起源または操作によって、天然で関連するポリヌクレオチドの全てまたは一部に会合しない）のポリヌクレオチドを意味する。タンパク質またはポリペプチドに関して使用する場合、用語「組換え体」とは、組換えポリヌクレオチドの発現によって産生されるポリペプチドを意味する。一般的に、目的の遺伝子は、クローン化され、次いで、以下にさらに記載されるように、形質転換された生物において発現される。宿主生物は、発現条件下でタンパク質を産生する異種遺伝子を発現する。
【００２９】
「制御エレメント」とは、連結されたコード配列の発現を助けるポリヌクレオチド配列をいう。この用語は、プロモーター、転写終結配列、上方制御ドメイン、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域（５’−ＵＴＲおよび３’−ＵＴＲを含む）、および適切な場合、リーダー配列およびエンハンサーを含み、これは集合的に宿主細胞におけるコード配列の転写および翻訳を提供する。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、「プロモーター」は、宿主細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そしてそれらに作動可能に連結されたコード配列の下流（３’方向）の転写を開始し得る。本発明の目的のため、プロモーター配列は、バックグラウンドより上の検出可能なレベルで、目的の遺伝子の転写を開始するのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内に、転写開始部位ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合の原因であるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在する。真核生物のプロモーターは、常にではないが、しばしば、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。
【００３１】
制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、そしてコード配列をｍＲＮＡに転写する場合、細胞においてコード配列の「転写を指向」し、これは次いで、このコード配列によってコードされるポリペプチドに翻訳される。
【００３２】
「発現カセット」または「発現構築物」とは、目的の配列または遺伝子の発現を指向し得るアセンブリをいう。この発現カセットは、上記のような制御エレメント（例えば、目的の配列または遺伝子に（その転写を指向するよう）作動可能に連結されたプロモーター）を含み、しばしば同様にポリアデニル配列を含む。本発明の特定の実施形態において、本明細書中で記載される発現カセットは、プラスミド構築物中に含まれ得る。発現カセットの成分に加えて、プラスミド構築物はまた、１つ以上の選択マーカー、プラスミド構築物を一本鎖ＤＮＡとして存在させ得るシグナル（例えば、Ｍ１３の複製起点）、少なくとも１つの多クローニング部位、および「哺乳動物」の複製起点（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの複製起点）を含み得る。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、「形質転換」とは、挿入に使用される方法：例えば、直接取込み、トランスフェクション、感染などによる形質転換とは関係なく、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入をいう。トランスフェクションの特定の方法については、以下をさらに参照のこと。外因性ポリヌクレオチドは、非統合ベクター（例えば、エピトープ）として保持され得るか、あるいは宿主ゲノムに統合され得る。
【００３４】
「宿主細胞」は、形質転換された細胞であるか、または外因性ＤＮＡ配列によって形質転換され得る。
【００３５】
「単離された」とは、ポリペプチドについて言及する場合、示された分子が、生物全体から分離され個別にされていることを意味する。ここでは、この分子は、天然に見出されるかまたは同じタイプの他の生物学的高分子の実質的に非存在下で存在する。ポリヌクレオチドに関して、用語「単離された」は、以下の全体または一部が全くない、核酸分子である：そのポリヌクレオチドに天然に通常関連する配列；または配列が天然に存在する場合は、それに関連する異種配列を有する配列；または染色体から分離した分子。
【００３６】
本明細書中で使用する場合、用語「精製された」とは、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは、少なくとも８５重量％、さらにより好ましくは、少なくとも９５重量％、最も好ましくは、少なくとも９８重量％の同じ型の生物学的高分子が存在することを意味する。
【００３７】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチドの間、または２つのポリペプチド部分の間の同一性パーセントをいう。２つのＤＮＡ、または２つのポリペプチド配列は、この配列がこの分子の規定された長さにわたって、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％〜８５％、好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは、少なくとも約９５％〜９８％以上の配列同一性を示す場合、互いに対して「実質的に相同」である。本明細書において用いる場合、実質的に相同とは、また、特定のＤＮＡまたはポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列をいう。
【００３８】
一般に、「同一性」とは、それぞれ、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の、ヌクレオチド間またはアミノ酸間の正確な一致をいう。同一性パーセントは、配列の整列、整列された２つの配列間の一致する正確な数の計数、より短い配列の長さによる徐算、そしてこの結果に１００を掛算することによる、２つの分子の間の配列情報の直接的な比較によって決定され得る。容易に利用可能なコンピュータプログラム（例えば、ＡＬＩＧＮ，Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５、補遺３：３５３−３５８，Ｎａｔｉｏｎａｌ　ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）は、分析における援助のために使用され得、このプログラムは、ペプチド分析のためのＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのＡｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２−４８９，１９８１の局所相同性アルゴリズムに適応する。ヌクレオチドの配列同一性を決定するためのプログラムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージ、バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩから入手可能）、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラム（これらはまた、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムに依存する）において利用可能である。これらのプログラムは、製造者によって推奨され、そして上記のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージに記載されるデフォルトパラメータを用いて容易に利用される。例えば、参照配列に対する特定のヌクレオチド配列の同一性パーセントは、デフォルトスコアリングテーブルおよび６ヌクレオチド位置のギャップペナルティーを用いるＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの相同性アルゴリズムを使用して決定され得る。
【００３９】
本発明の状況において、同一性パーセントを確立する別の方法は、Ｊｏｈｎ　Ｆ．ＣｏｌｌｉｎｓおよびＳｈａｎｅ　Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、そしてＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって配給される、著作権Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ＥｄｉｎｂｕｒｇｈのＭＰＳＲＣＨパッケージプログラムを使用することである。このパッケージのスートから、Ｓｍｉｔｈ　Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが利用され得、ここでデフォルトパラメータが、スコアリングテーブルのために使用される（例えば、１２のｇａｐ　ｏｐｅｎ　ｐｅｎａｌｔｙ、１のｇａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｐｅｎａｌｔｙ、および６のｇａｐ）。このデータから作製された「一致」値は、「配列同一性」を反映する。配列間の同一性または相同性のパーセントを算出する他の適切なプログラムは、一般に、当該分野で公知であり、例えば、別の整列プログラムは、デフォルトパラメータで使用されるＢＬＡＳＴである。例えば、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを使用して使用され得る：ｇｅｎｅｔｉｃ　ｃｏｄｅ＝ｓｔａｎｄａｒｄ；ｆｉｌｔｅｒ＝ｎｏｎｅ；ｓｔｒａｎｄ＝ｂｏｔｈ；ｃｕｔｏｆｆ＝６０；ｅｘｐｅｃｔ＝１０；Ｍａｔｒｉｘ＝ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ＝５０配列；ｓｏｒｔ　ｂｙ＝ＨＩＧＨ　ＳＣＯＲＥ；Ｄａｔａｂａｓｅｓ＝ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ，ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ　ＣＤＳ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｓ＋Ｓｗｉｓｓ　ｐｒｏｔｅｉｎ＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスで見出され得る：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００４０】
あるいは、相同性は、相同な領域間に安定な二重鎖を形成する条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて単鎖特異的ヌクレアーゼでの消化、および消化されたフラグメントのサイズ決定によって決定され得る。実質的に相同なＤＮＡ配列は、例えば、特定の系のために規定されたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件の規定は、当業者の範囲内である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出；ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，前出；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前出を参照のこと。
【００４１】
「核酸免疫化」とは、抗原のインビボ発現のために、１つ以上の選択された抗原をコードする核酸分子の宿主細胞への導入を意味する。核酸分子は、例えば、注入、吸引、経口投与、鼻腔内投与、および粘膜投与などによってレシピエントの被験体に直接導入され得るか、あるいは、エキソビボで宿主から取り除かれた細胞に導入され得る。後者の場合において、形質転換された細胞は、免疫応答がこの核酸分子によってコードされる抗原に対してマウントされ得る被験体に再導入される。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、「処置」とは、以下のいずれかをいう：（ｉ）伝統的なワクチンのように、感染または再感染の予防、（ｉｉ）症状の低減または排除、および（ｉｉｉ）問題の病原の実質的または完全な排除。処置は、予防的に（感染の前）または治療的に（感染後）になされ得る。
【００４３】
用語「微粒子」は、本明細書中で使用される場合、約１００ｎｍ〜約１５０ｎｍの直径、より好ましくは約２００ｎｍ〜約３０μｍの直径、そして最も好ましくは、約５００ｎｍ〜約１０μｍの直径の粒子をいう。好ましくは、微粒子は、針およびキャピラリーを閉塞することなく、非経口投与を可能にする直径である。微粒子サイズは、光子相関（ｐｈｏｔｏｎ　ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）分光計、レーザー回折法および／または走査電子顕微鏡のような、当該分野で周知の技術によって容易に決定される。
【００４４】
「脊椎動物被験体」によって、心臓型亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ　ｃｏｒｄａｔａ）の任意のメンバーが意味され、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ヒトおよび他の霊長類（チンパンジーならびに他の無尾猿（ａｐｅ）およびサル種のような非ヒト霊長類を含む）；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマのような家畜；イヌおよびネコのような家畜；マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ、および他の家禽のトリ、アヒル、ガチョウのような家禽、野生のトリおよび狩猟鳥を含むトリなど。この用語は、特定の年齢を意味しない。従って、成体および新生仔の両方の個体を網羅するように意図される。本明細書中に記載される本発明は、上記の脊椎動物種のいずれかにおける使用のために意図される。なぜなら、これらの脊椎動物の全ての免疫系は、同様に作用するためである。
【００４５】
（概観）
ＨＣＶ抗エンベロープ−２糖タンパク質（Ｅ２）抗体力価および結合中和（ＮＯＢ）抗体力価が、ＨＣＶ　Ｅ２ポリペプチド（Ｅ２ポリペプチドの全長形態および短縮形態を含む）、およびＨＣＶ　Ｅ１Ｅ２ポリペプチドによって、そしてＥ２ポリペプチドおよびＥ１Ｅ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドによって誘発され得ることが、本発明の発見である。さらに、適切なアジュバントをともなう、ＨＣＶ　Ｅ１Ｅ２ポリペプチドまたはＨＣＶ　Ｅ２ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）応答および傷害性Ｔ細胞リンパ球（ＣＤ８＋）応答のような細胞性免疫応答を誘発する。
【００４６】
Ｅ１Ｅ２およびＥ２のポリヌクレオチドおよびポリペプチドによるＨＣＶ特異的抗体の惹起は、特に、強力な抗Ｅ２抗体力価および強力な抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体力価の惹起と関連したＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドエピトープおよびＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２ポリペプチドエピトープを同定するために、ＨＣＶワクチンの開発のためのインビトロモデル系とインビボモデル系との両方を提供する。Ｅ１Ｅ２およびＥ２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドはまた、治療目的または予防目的のいずれかのために、哺乳動物におけるＨＣＶに対する免疫応答（特に、抗Ｅ２抗体応答および抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体応答）を生成するために使用され得る。
【００４７】
（Ｅ１Ｅ２およびＥ２ポリペプチド）
Ｃ型肝炎ウイルスのゲノムは、典型的に、約９，６００ヌクレオチドの単一のオープンリーディングフレームを含み、このオープンリーディングフレームは、ポリタンパク質に転写される。ＨＣＶポリタンパク質は、少なくとも１０個の異なる生成物を、ＮＨ２−コア−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨの順序で形成するように切断される。ＨＣＶ  Ｅ１ポリペプチドは、糖タンパク質であり、アミノ酸およそ１９２からアミノ酸３８３（ＨＣＶ−１に関して番号付けした）まで伸長する。Ｃｈｏｏら、（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：２４５１〜２４５５を参照のこと。ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドは、糖ペプチドであり、そしてアミノ酸およそ３８４からアミノ酸７４６（ＨＣＶ−１に関して番号付けした）まで伸長する。Ｃｈｏｏらを参照のこと。従って、本明細書中で使用する場合、用語「全長Ｅ２」または「非短縮型Ｅ２」とは、ＨＣＶポリタンパク質の少なくともアミノ酸３８４からアミノ酸７４６まで（ＨＣＶ−１に関して番号付けした）を含むポリペプチド（およびそれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）をいう。この開示から明らかなように、全長Ｅ２ポリペプチドは、アミノ酸３８４および７４６の上流および／または下流のさらなるアミノ酸（例えば、アミノ酸７４７〜７４９または７４７〜８０９）を含み得る。非限定的な例の全長Ｅ２ポリペプチドは、アミノ酸３８４〜７４６；３８４〜７４９および３８４〜８０９（ならびにそれらのポリペプチドをコードする構築物）を含む。
【００４８】
典型的には、Ｃ末端ドメインにおいて欠失を有するＥ２ポリペプチドは、細胞から分泌され、一方、全長Ｅ２ポリペプチドは、細胞内に保持される。Ｆｏｒｎｓら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１９９２〜２００２；Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）１８８：８１９〜８３０；Ｒａｌｓｔｏｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：６７５３〜６７６１。Ｅ１およびＥ２タンパク質は、通常、これらの発現系において膜結合型であり、研究者は以前に、さらなる用途のためにタンパク質の精製を容易にする分泌形態を生成することが望ましいと考えた。例えば、アミノ酸６６１において短縮型であり、そして哺乳動物細胞から分泌されるＨＣＶ  Ｅ２分子が記載されている。Ｓｐａｅｔｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９２）１８８：８１９〜８３０。短縮型の分泌ＨＣＶ  Ｅ１およびＥ２分子の生成はまた、国際公開番号ＷＯ  ９６／０４３０１（１９９６年２月１５日公開）および米国特許第６，１２１，０２０号に開示される。Ｉｎｕｄｏｈら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９６）１４：１５９０〜１５９６は、Ｃ末端疎水性ドメインを欠くＨＣＶ  Ｅ２分子の生成を記載する。このタンパク質は、培養培地中に分泌され、そして細胞内で産生された対応物よりも抗原性であることが見出された。
【００４９】
結合中和（ＮＯＢ）抗体を誘発し得るＥ２ポリペプチド（およびこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）、特に非分泌Ｅ２およびＥ１Ｅ２ポリペプチドの使用が、本明細書中に記載される。本発明のＥ２ポリペプチドは、全長Ｅ２ポリペプチド、Ｅ２ポリペプチドのフラグメント、またはＥ２ポリペプチドの短縮型セグメントのいずれかであり得る。例えば、Ｅ２ポリペプチドのフラグメントは、Ｅ２ポリペプチドの６、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００または３５０のアミノ酸を含み得る。短縮型Ｅ２ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６６１、６７５、７００、７１５、７２５または７３５または７４６において、切断され得る。本発明の目的のために、通常は宿主細胞から分泌される短縮型Ｅ２およびＥ１Ｅ２ポリペプチドは、好ましくは、Ｃ末端におけるＫＤＥＬ配列を使用して、宿主細胞の小胞体に固定される。必要に応じて、Ｅ２ポリペプチドは、さらなるアミノ酸（例えば、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸７４７〜７４９，またはＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸７４７〜８０９）を含み得る。好ましくは、Ｅ２ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜６６１、３８４〜７４６、３８４〜７４９、３８４〜７１５、または３８４〜８０９を含む。
【００５０】
本発明のＥ２ポリペプチドは、Ｅ１Ｅ２ポリペプチドを形成するために、短縮型Ｅ１ポリペプチド、Ｅ１ポリペプチドのフラグメント、または全長Ｅ１ポリペプチドと合わせられるか、またはこれらを用いて合成され得る。例えば、Ｅ１ポリペプチドのフラグメントは、Ｅ１ポリペプチドの６、１０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０または１７５のアミノ酸を含み得る。好ましくは、Ｅ１Ｅ２ポリペプチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜７４６、１９２〜７４９、３４０〜６７４、または１９２〜８０９（ＨＣＶ−１に関する番号付け）を含む。Ｅ１およびＥ２ポリペプチドは、同じかまたは異なるＨＣＶ株由来であり得る。Ｅ２およびＥ１Ｅ２ポリペプチドは、米国特許第６，１２１，０２０号に記載されるような構築物から組み替え的に産生され得る。
【００５１】
Ｅ１Ｅ２およびＥ２ポリペプチドは、抗Ｅ２抗体または抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体により認識される少なくとも１つのエピトープを含む。Ｅ２内のエピトープは、いくつかの方法によって同定され得る。例えば、Ｅ２ポリペプチドは、Ｅ２のモノクローナル抗体を使用する免疫親和性精製のような方法によって単離され得る。次いで、単離されたポリペプチド配列はスクリーニングされ得る。ポリペプチド配列全体を一緒に架橋する一連の短ペプチドは、蛋白質分解的切断により調製され得る。例えば、１００マーのポリペプチドフラグメントを用いて開始することによって、各フラグメントは、抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体アッセイまたは抗Ｅ２酵素結合免疫ソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）で認識されるエピトープの存在について試験され得る。次第に小さくなる重複したフラグメントは、次いで、同定された１００マーから試験されて、目的のエピトープをマッピングし得る。ＮＯＢ抗体アッセイは、実施例１およびＲｏｓａら（１９９６）に記載される。ＥＬＩＳＡアッセイは、実施例３に記載される。
【００５２】
ＨＣＶの様々な株および単離体が生じ、そしてこれらの株および単離体のいずれかのＥ１Ｅ２またはＥ２ポリペプチドは、本発明において使用され得る。ＨＣＶ  Ｅ１およびＥ２遺伝子およびポリペプチドの核酸配列およびアミノ酸配列は、当該分野において公知である。例えば、単離体のＨＣＶ  Ｊ１．１は、Ｋｕｂｏら（１９８９）、Ｊａｐａｎ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：１０３６７〜１０３７２；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｇｅｎｅ  ９１：２８７〜２９１；Ｔａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３０２７〜２０３３；およびＴａｋｅｕｃｈｉら（１９９０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４６２６に記載される。２つの独立した単離体である、ＨＣＶ−ＪおよびＢＫの完全コード配列は、それぞれ、Ｋａｔｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：９５２４〜９５２８およびＴａｋａｍｉｚａｗａら（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：１１０５〜１１１３により記載される。
【００５３】
ＨＣＶ−１単離体を記載する刊行物としては、Ｃｈｏｏら（１９９０）Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．４６：４２３−４４１；Ｃｈｏｏら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：２４５１−２４５５およびＨａｎ  ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１７１１−１７１５が挙げられる。ＨＣＶ単離体ＨＣ−Ｊ１およびＨＣ−Ｊ４は、Ｏｋａｍｏｔｏら（１９９１）Ｊａｐａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  ６０．１６７−１７７に記載されている。ＨＣＶ単離体（ＨＣＴ１８〜、ＨＣＴ２３，Ｔｈ、ＨＣＴ２７、ＥＣ１およびＥＣ１０）は、Ｗｅｉｎｅｒら（１９９１）Ｖｉｒｏｌ．１８０：８４２−８４８に記載される。ＨＣＶ単離体（Ｐｔ−１、ＨＣＶ−Ｋ１０およびＨＣＶ−Ｋ２）は、Ｅｎｏｍｏｔｏら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７０：１０２１〜１０２５に記載される。ＨＣＶ単離体Ａ，Ｃ，Ｄ  ＆  Ｅは、Ｔｓｕｋｉｙａｍａ−Ｋｏｈａｒａら（１９９１）Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ５：２４３−２５４に記載されている。
【００５４】
好ましくは、Ｅ１Ｅ２またはＥ２ポリペプチドは、例えば、インビトロまたはインビボにおいて、組換え的に産生される。Ｅ１Ｅ２またはＥ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、当該分野で周知（以下で記載される）の技術を使用して、適切な発現系において発現され得る発現ベクターに導入され得る。様々な細菌、酵母、植物、哺乳動物および昆虫発現系が、当該分野で利用され得、そしてこのような任意の発現系が使用され得る。必要に応じて、Ｅ１Ｅ２またはＥ２ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、細胞を含まない翻訳系において翻訳され得る。
【００５５】
所望ならば、Ｅ１Ｅ２またはＥ２ポリペプチドは、融合タンパク質として産生され得、これはまた、他のアミノ酸配列（例えば、アミノ酸リンカーまたはシグナル配列）、ならびにタンパク質精製において有用なリガンド（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌タンパク質Ａ）を含み得る。１つ以上のＥ１Ｅ２またはＥ２ポリペプチドが、融合タンパク質中に存在し得る。所望ならば、異なるＨＣＶ株または単離体由来のＥ１Ｅ２およびＥ２ポリペプチドの様々な組み合わせが、融合タンパク質に含まれ得る。
【００５６】
（Ｅ１Ｅ２およびＥ２ポリヌクレオチド）
Ｅ１Ｅ２およびＥ２ポリヌクレオチドは、ＨＣＶゲノム全体より小さいゲノムを含み、そしてＲＮＡ、または一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡであり得る。好ましくは、このポリヌクレオチドは、他の成分（例えば、タンパク質および脂質）を含まないように精製される。Ｅ１Ｅ２およびＥ２ポリヌクレオチドは、上記のＥ１Ｅ２およびＥ２ポリペプチドをコードする。本発明のポリヌクレオチドはまた、他のヌクレオチド配列（例えば、リンカーをコードする配列、シグナル配列、異種シグナル配列、ＴＭＲ終止転移配列、膜貫通ドメイン、またはタンパク質精製において有用なリガンド（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌タンパク質Ａ））を含み得る。
【００５７】
Ｅ１Ｅ２およびＥ２ポリヌクレオチドは、例えば、ＨＣＶに感染した個体の血漿、血清または肝臓に存在する核酸配列由来のゲノムライブラリーから単離され得る。Ｅ１Ｅ２およびＥ２ポリヌクレオチドは、例えば、自動合成機を使用して、研究室で合成され得る。ＰＣＲのような増幅方法は、ＨＣＶゲノムＲＮＡまたはＥ１Ｅ２またはＥ２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡのいずれかからポリヌクレオチドを増幅するために使用され得る。
【００５８】
Ｅ１Ｅ２およびＥ２ポリヌクレオチドは、天然に存在するＥ１Ｅ２またはＥ２ポリペプチドのコード配列を含み得るか、または天然に存在しない変化されたＥ１Ｅ２またはＥ２配列をコードし得る。所望ならば、Ｅ１Ｅ２およびＥ２ポリヌクレオチドは、発現ベクターにクローン化され、そして例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞に形質転換され、その結果、本発明のポリペプチドは、細胞培地で発現され、そして単離され得る。Ｅ１Ｅ２およびＥ２ポリヌクレオチドは、プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣまたはＣｏｌＥ１）、またはアデノウイルスベクター（例えば、アデノウイルス２型ベクターまたは５型ベクター）内に含まれ得る。必要に応じて、他のベクターが使用され得、これには、以下が挙げられるが、これらに限定されない：シンドビスウイルス、シミアンウイルス４０、アルファウイルスベクター、ならびにサイトメガロウイルスおよびレトロウイルスベクター（例えば、マウス肉腫ウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、およびラウス肉腫ウイルス）。細菌ベクター（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｓｐ．、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＢＣＧ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが使用され得る。ミニ染色体（例えば、ＭＣおよびＭＣ１）、バクテリオファージ、ウイルス粒子、ウイルス様粒子、コスミド（ファージλｃｏｓ部位が挿入されたプラスミド）、およびレプリコン（細胞におけるこれら固有の制御下で増幅し得る遺伝エレメント）が使用され得る。
【００５９】
ポリペプチドは、ＨＣＶゲノム全体より小さいゲノムを含み、そしてＲＮＡ、または一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡであり得る。そしてＲＮＡ、または一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡであり得る。好ましくは、このポリヌクレオチドは、他の成分（例えば、タンパク質および脂質）を含まないように単離される。本発明のポリヌクレオチドはまた、他のヌクレオチド配列（例えば、リンカーをコードする配列、シグナル配列、またはタンパク質精製において有用なリガンド（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、およびブドウ球菌タンパク質Ａ））を含み得る。
【００６０】
本発明の発現構築物は、核酸免疫化のために使用され、標準的な遺伝子送達プロトコルを使用してＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化し得る。遺伝子送達のための方法が、当該分野において公知である。例えば、米国特許第５，３９９，３４６号、同５，５８０，８５９号、同５，５８９，４６６号を参照のこと。遺伝子は、脊椎動物被験体に直接送達され得るか、あるいは被験体由来の細胞およびこの被験体に再移植された細胞にエキソビボで送達され得る。例えば、この構築物は、例えば、プラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣまたはＣｏｌＥ１）内に含まれるプラスミドＤＮＡとして送達され得る。
【００６１】
さらに、発現構築物は、細胞に送達される前に、リポソームにパッケージングされ得る。脂質カプセル化は、一般的に、核酸に安定に結合するか、または核酸を捕捉して保持し得るリポソームを使用して達成される。脂質調製物に対する濃縮ＤＮＡの割合は、変動し得るが、一般的に、脂質の約１：１（ｍｇＤＮＡ：μｍｏｌ脂質）であるか、または脂質がより多い。核酸の送達のためにキャリアとしてのリポソームの使用の総説については、ＨｕｇおよびＳｌｅｉｇｈｔ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９９１）１０９７：１−１７；Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８３）第１０１巻、５１２〜５２７ページを参照のこと。
【００６２】
本発明と共に使用するためリポソーム調製物としては、カチオン性（正に荷電した）リポソーム、アニオン性（負に荷電した）リポソーム、および中性の調製物が挙げられ、カチオン性リポソームが特に好ましい。カチオン性リポソームは、容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームは、商品名Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎで、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．から入手可能である（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３〜７４１６もまた参照のこと）。他の市販の脂質としては、トランスフェクテース（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ）（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）が挙げられる。他のカチオン性リポソームは、当該分野において周知の技術を使用して、容易に入手可能な材料から調製され得る。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載について、Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；ＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９０／１１０９２を参照のこと。種々のリポソーム−核酸複合体が、当該分野において公知の方法を使用して調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（１９８３），Ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．５１２−５２７；Ｓｚｏｋａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：４１９４−４１９８；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ（１９７９）１７：７７）；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９７６）４４３：６２９；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７７）７６：８３６；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：３３４８）；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７９）７６：１４５）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：１０４３１；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１４５；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８２）２１５：１６６を参照のこと。
【００６３】
ＤＮＡもまた、Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．（１９７５）３９４：４８３−４９１に記載される脂質組成物と類似の渦巻形の脂質組成物中で、送達され得る。米国特許第４，６６３，１６１号および同４，８７１，４８８号もまた、参照のこと。
【００６４】
多くのウイルスを基礎にした系が、哺乳動物細胞中への遺伝子移入のために開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のための便利なプラットホームを提供し、これには、マウスザルコーマウイルス、マウス乳腺癌ウイルス、マウスモロニー白血病ウイルス、およびラウス肉腫ウイルスなどがある。選択された遺伝子が、ベクター中に挿入され、そして当該分野で公知の技法を用いてレトロウイルス粒子中にパッケージされ得る。次いで、組換えウイルスは、単離され、そしてインビボまたはエキソビボのいずれかで、被験体の細胞に送達され得る。多くのレトロウイルス系が記載されている（米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９）７：９８０−９９０）；Ｍｉｌｌｅｒ、Ａ．Ｄ．、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９０）１：５−１４；Ｓｃａｒｐａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９１）１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：８０３３−８０３７；およびＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．（１９９３）３：１０２−１０９）。簡単に述べれば、本発明のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルは、例えば、Ｂ、Ｃ、およびＤ型レトロウイルス、およびＦＩＶ、ＨＩＶ、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２およびＳＩＶのようなスプマウイルスおよびレンチウイルス（ＲＮＡ  Ｔｕｍｏｒ  Ｖｉｒｕｓｅｓ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８５を参照のこと）を含む広範な種々のレトロウイルスから容易に構築され得る。このようなレトロウイルスは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」；１０８１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１１０−２２０９）のような寄託またはコレクションから容易に得られ得るか、一般に利用可能な技法を用いて既知の供給源から単離され得る。
【００６５】
２型および５型アデノウイルスベクターのような、多くのアデノウイルスベクターもまた記載されている。宿主ゲノム中に組み込まれるレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外に維持され、それ故、挿入変異誘発にともなうリスクを最小にする（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９３）６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４）１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｋ．Ｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８８）６：６１６−６２９；およびＲｉｃｈら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）４：４６１−４７６）。
【００６６】
Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６−６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９−６１０３に記載のアデノウイルスキメラベクターのような分子複合体ベクターもまた、遺伝子送達に用いられ得る。
【００６７】
制限されないで、シンドビスウイルスおよびセムリキ森林ウイルス、ＶＥＥ由来のベクターのような、アルファウイルス属のメンバーもまた、目的の遺伝子を送達するためのウイルスベクターとしての使用を見出す。本発明の方法の実施のために有用なシンドビスウイルス由来のベクターの記載については、Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９６）７０：５０８−５１９；および国際公開番号ＷＯ９５／０７９９５およびＷＯ９６／１７０７２を参照のこと。
【００６８】
使用され得るその他のベクターは、制限されないで、シミアンウイルス４０、サイトメガロウイルスを含む。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｓｐ．Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株ＢＣＧ、およびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのような細菌ベクターもまた用いられ得る。ＭＣおよびＭＣ１のようなミニ染色体、細菌ファージ、コスミド（λファージｃｏｓ部位が挿入されているプラスミド）およびレプリコン（細胞中でそれら自身の制御下で複製し得る遺伝子エレメント）もまた使用され得る。
【００６９】
本明細書中に記載されるポリヌクレオチド（例えば、発現構築物）はまた、粒子状キャリア（例えば、微小粒子）にカプセル化されるか、吸着されるか、またはそれに結合され得る。これらのキャリアは、選択された分子の多コピーを免疫系に提示し、そして局所リンパ節における分子の捕捉および保持を促進する。これら粒子は、マクロファージによって貧食され、そしてサイトカイン放出によって抗原提示を増大し得る。本明細書中に記載される使用のための微粒子は、代表的には滅菌可能、非毒性および生分解性である物質から形成される。このような物質としては、制限することなく、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリチオエステル、ポリアンヒドライドが挙げられる。好ましくは、本発明を用いる使用のための微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）由来であり、特にポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびグリコシドまたはグリコシル酸（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコシド）（「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」））、あるいはＤ，Ｌ−ラクシドおよびカプロラクトンのコポリマー）由来である。微粒子は、種々の分子量を有する任意の種々の重合開始物質に由来し得、ＰＬＧのようなコポリマーの場合、種々のラクチド：グリコライド比率、ほとんど選りすぐりの物質の選択であり得、同時投与された抗原に一部依存する。粒子状キャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマー由来のもの、およびＰＬＧとして知られるポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）由来の微粒子が挙げられる。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；およびＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。ポリメチルメタクリレートポリマーは非分解性であるが、ＰＬＧ粒子は、正常な代謝経路に沿って排出される乳酸およびグリコール酸へのエステル結合のランダムな非酵素学的加水分解によって生物分解される。
【００７０】
最近の研究によって、包括された抗原を用いるＰＬＧ微粒子は、細胞媒介免疫を誘発可能であることを示す。例えば、マイクロカプセルに入れられたヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ１２０は、マウスにおいて、ＨＩＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘導することを示してきた（Ｍｏｏｒｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９５）１３：１７４１−１７４９）。同様に、微粒子カプセルに包まれた卵白アルブミンは、インビボで細胞性免疫応答を初回刺激可能であることが示されており、そして、経口投与される場合に粘膜のＩｇＡ応答を誘導し得る（Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：１４９−１５４）。さらに、抗体およびＴ細胞応答の両方は、ＰＬＧを包括したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｃｕｌｏｓｉｓ抗原を用いて、ワクチン接種したマウスで誘導された（Ｖｏｒｄｅｒｍｅｉｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９５）１３：１５７６−１５８２）。抗原特異的ＣＴＬ応答はまた、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｂｅｒｇｈｅｉの周囲のスポロゾイトタンパク質由来の微粒子カプセルに包まれた短い合成ペプチドを使用して、マウスにおいて誘導される。従って、特定の実施形態において、Ｅ２ポリペプチドおよびＥ１Ｅ２ポリペプチドならびに／またはＥ２ポリヌクレオチドおよびＥ１Ｅ２ポリヌクレオチドは、ＰＬＧ微粒子を用いて送達される（例えば、実施例４を参照のこと）。
【００７１】
広範な種類のその他の方法もまた、細胞に発現構築物を送達するために用いられ得る。このような方法は、ＤＥＡＥデキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリリジン−またはポリオルニチン媒介トランスフェクション、またはリン酸ストロンチウム、（ベントナイトおよびカオリンを含む）ケイ酸アルミニウム、酸化クロム、ケイ酸マグネシウム、タルクなどのようなその他の不溶性無機塩を用いる沈殿を含む。その他の有用なトランスフェクションの方法は、エレクトロポーレーション、ソノポーレーション、プロトプラスト融合、リポソーム、ペプトイド送達、またはマイクロインジェクションを含む。例えば、目的の細胞を形質転換する技法の論議については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前述、；そして遺伝子移入に有用な送達系の総説には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、Ｐ．Ｌ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９０）５：１６３−１８７を参照のこと。エレクトロポーレーションを用いてＤＮＡを送達する１つの特に有効な方法は、国際公開番号ＷＯ／００４５８２３に記載されている。
【００７２】
さらに、金およびタングステンのような粒子状キャリアを採用する微粒子銃送達系は、本発明の発現構築物を送達するために特に有用である。これらの粒子は、送達されるべき構築物でコートされ、そして「遺伝子銃」から放出される銃粉末を用い、一般に減圧雰囲気下で、高速度まで加速される。そのために有用な技法、および装置の記載については、例えば、米国特許第４，９４５，０５０号；第５，０３６，００６号；第５，１００，７９２号；第５，１７９，０２２号；第５，３７１，０１５号；および第５，４７８，７４４号を参照のこと。
【００７３】
（Ｅ１Ｅ２ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドまたはＥ１Ｅ２ポリヌクレオチドおよびＥ２ポリヌクレオチドを含む組成物）
本発明はまた、Ｅ１Ｅ２ポリペプチドおよびＥ２ポリペプチドまたはＥ１Ｅ２ポリヌクレオチドおよびＥ２ポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。本発明の組成物は、好ましくは、薬学的に受容可能なキャリアを含む。このキャリアは、それ自身、宿主に有害な抗体の産生を誘導すべきではない。薬学的に受容可能なキャリアは、当業者に周知である。このようなキャリアは、制限されないで、タンパク質、（ラテックス官能化セファロース、アガロース、セルロース、セルロースビーズなどのような）多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、（ポリグルタミン酸、ポリリジンなどのような）ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、ペプトイド、リプトイド、および不活性化ウイルス粒子のような、大きな、ゆっくりと代謝される高分子である。
【００７４】
薬学的に受容可能な塩もまた、本発明の組成物中で用いられ、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩または硫酸塩のような鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、または安息香酸塩のような有機酸の塩がある。特に有用なタンパク質基質は、血清アルブミン、キーホールリムペットヘモシアニン、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オバルブミン、破傷風トキソイド、および当業者に周知のその他のタンパク質である。本発明の組成物はまた、水、生理食塩水、グリセロール、デキストロース、エタノールなどのような液体または賦形剤を単独または組合わせて、および湿潤剤、乳化剤、またはｐＨ緩衝剤のような物質を含み得る。リポソームもまた、本発明の組成物のためにキャリアとして用いられ得、このようなリポソームは上記に記載される。
【００７５】
所望であれば、Ｂ７−１またはＢ７−２、またはＧＭ−ＣＦＳ、ＩＬ−２、およびＩＬ−１２のようなサイトカインなどのリンパ球に対する免疫原性の提示を改良する同時刺激分子が、本発明の組成物中に含まれ得る。必要に応じて、アジュバントもまた、組成物中に含められ得る。用いられ得るアジュバントは、制限されないで：（１）水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸アルミニウムなどのようなアルミニウム塩（ミョウバン）；（２）（ムラミルペプチド（以下を参照のこと）または細菌壁成分のようなその他の特異的免疫刺激剤ありまたはなしの）水中油型エマルジョン処方物、例えば、（ａ）５％スクァレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ８０、および０．５％Ｓｐａｎ８５を含み（必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含む）、Ｍｏｄｅｌ  １１０Ｙマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）のようなマイクロフルイダイザーを用いてミクロン以下の粒子に処方される、ＭＦ５９（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１４８３７）、（ｂ）１０％スクァレン、０．４％Ｔｗｅｅｎ８０、５％プルロニック−ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰ（以下を参照のこと）を含み、ミクロン以下に微小流動化されるか、またはより大きな粒子サイズエマルジョンを生成するためにボルテックスにかけられたＳＡＦ、および（ｃ）ＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）、（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、これは、２％スクァレン、０．２％Ｔｗｅｅｎ８０、および以下からなる群から選択される細菌壁の１つ以上の成分を含む：モノホスホリリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および細胞壁スケルトン（ＣＷＳ）を含み、好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ）である；（３）ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ、ＭＡ）のようなサポニンアジュバント、またはＩＳＣＯＭのようなそれから生成された粒子もまた用いられ得る（免疫刺激複合体）；（４）フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）；（５）インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）のようなサイトカイン、インターフェロン（例えば、γインターフェロン）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、など；（６）コレラトキシン（ＣＴ）、百日咳毒素（ＰＴ）、またはＥ．ｃｏｌｉ熱不安定性トキシン（ＬＴ）のような細菌ＡＤＰリボシル化トキシンの弱毒化変異体、特に、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＣＴ−Ｓ１０９、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９；例えば、ＷＯ９３／１３３０２およびＷＯ９２／１９２６５を参照のこと；（７）組成物の有効性を増大するための免疫刺激薬剤として作用するその他の物質；および（８）例えば、ＷＯ００／０６１２３およびＷＯ００／５０００６において記載されるような吸着された高分子を有する微粒子。ミョウバンおよびＭＦ５９が好適である。ＰＬＧのような微粒子が、上記により詳細に記載される。
【００７６】
上記のように、ムラミルペプチドは、制限されないで、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも称される）などを含む。
【００７７】
必要に応じて、Ｅ１Ｅ２ポリヌクレオチドまたはＥ２ポリヌクレオチドの送達の効率は、Ｅ１Ｅ２ポリヌクレオチドまたはＥ２ポリヌクレオチド注射の約１週間前に、心臓毒（Ｎａｊａ  ｎｉｇｒｉｃｏｌｌｉｓの毒液から精製される）の注射によって改善され得る。薬学的に受容可能なビヒクル（例えば、０．９％ＮａＣｌ）中に溶解された約０．１〜２０μＭの心臓毒を使用して注射された。
【００７８】
従って、このような組換えまたは合成ＨＣＶポリペプチドＥ２およびＥ１／Ｅ２およびポリヌクレオチドＥ２およびＥ１／Ｅ２は、ワクチン中および診断薬として用いられ得る。さらに、以下に詳細に記載されるように、これらのポリペプチドに対して惹起された抗体はまた、診断薬として、または受動的免疫治療のために用いられ得る。さらに、これらポリペプチドに対する抗体は、ＨＣＶ粒子を単離および同定するために有用である。
【００７９】
（抗体）
本発明のＥ１Ｅ２またはＥ２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、抗Ｅ２抗体および／または抗Ｅ２ＮＯＢ抗体を誘発するために使用され得る。抗Ｅ２および／または抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体の誘発は、特に、ＨＣＶに対する抗Ｅ２および／または抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体応答を最適化するためのモデル系を提供するため、およびＨＣＶ感染に対する予防的処置または治療的処置を提供するために、使用され得る。
【００８０】
ポリクローナル抗体は、哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、またはウマ）にこの融合タンパク質を投与することによって生成され得る。この免疫された動物由来の血清を集め、そしてこの抗体は、例えば、硫酸アンモニウムでの沈澱、続いてクロマトグラフィー（好ましくはアフィニティークロマトグラフィー）によって血漿から精製される。ポリクローナル抗血清を生成およびプロセシングするための技術は、当該分野で公知である。
【００８１】
この融合タンパク質中に存在するＨＣＶ特異的エピトープに対して指向されたモノクローナル抗体はまた、容易に生成され得る。例えば、Ｅ１Ｅ２またはＥ２ポリペプチドで免疫された哺乳動物（例えば、マウス）由来の正常なＢ細胞は、例えば、例えば、ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞と融合されて、ハイブリドーマを生成し得る。ＨＣＶ特異的抗体を産生するハイブリドーマは、ＲＩＡまたはＥＬＩＳＡを使用して同定され、そして半固体寒天中でのクローニングまたは限界希釈によって単離され得る。ＨＣＶ特異的抗体を産生するクローンは、スクリーニングの別のラウンドによって単離される。
【００８２】
ＨＣＶエピトープに対して指向された抗体（モノクローナルおよびポリクローナルのいずれか）は、サンプル（例えば、ＨＣＶに感染したヒト由来の血清サンプル）中のＨＣＶまたはＨＣＶ抗原の存在の検出のために特に有用である。ＨＣＶ抗原についてのイムノアッセイは、１つの抗体またはいくつかの抗体を用い得る。ＨＣＶ抗原についてのイムノアッセイは、例えば、ＨＣＶエピトープに対して指向されたモノクローナル抗体、１つのＨＣＶポリペプチドのエピトープに対して指向されたモノクローナル抗体の組み合わせ、異なるＨＣＶポリペプチドのエピトープに対して指向されたモノクローナル抗体、同じＨＣＶ抗原に対して指向されたポリクローナル抗体、異なるＨＣＶ抗原に対して指向されたポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との組合せを使用し得る。イムノアッセイプロトコルは、例えば、標識された抗体を使用する、競合アッセイ、直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づき得る。この標識は、例えば、蛍光、化学発光、または放射活性であり得る。
【００８３】
このポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、免疫親和性カラムによってＨＣＶの粒子または抗原を単離するために、さらに使用され得る。この抗体は、この抗体がその免疫選択活性を保持するように、例えば吸着または共有結合によって固体支持体に結合され得る。必要に応じて、この抗体の抗原結合部位が接近しやすいままであるように、スペーサー基が含まれ得る。次いで、この固定された抗体は、生物学的サンプル（例えば、血液または血漿）からＨＣＶの粒子または抗原を結合するために使用され得る。この結合したＨＣＶの粒子または抗原は、例えば、ｐＨにおける変化によってカラムマトリックスから除去される。
【００８４】
（抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体）
ＨＣＶ  Ｅ１Ｅ２およびＥ２ポリペプチドは、同族のレセプター（例えば、ヒトＣＤ８１）を発現する細胞の表面に特異的に結合する、Ｆｌｉｎｔら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：６２３５。この結合は、潜在的に、宿主細胞のＨＣＶ結合および引き続く感染の原因である。Ｒｏｓａら（１９９６）。ＨＣＶ  抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体は、ＨＣＶ  Ｅ２のその同族レセプターへの結合を、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％阻害（「中和」）する。
【００８５】
Ｅ２の少なくとも２つのエピトープが存在し、これらは抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体応答を誘発し得る。ＨＣＶ型１ｂ、２ａ、および２ｂに感染した患者由来の抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体は、ＨＣＶ型１ａ由来のＥ２ポリペプチドの哺乳動物細胞への結合を中和し得る。したがって、抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体応答の誘発の原因である少なくとも１つのエピトープは、ＨＣＶゲノムにおいておそらく保存性である。さらに、ＨＣＶ  Ｅ２超可変領域１（ＨＶＲ１）（アミノ酸３８４〜４１４）に対するモノクローナル抗体は、Ｅ２の哺乳動物細胞に対する結合を部分的に中和し得、これはＨＶＲ１中のエピトープの存在を示唆する。したがって、結合エピトープの少なくとも２つの中和（そのうちの１つが超可変である）が、Ｅ２ポリペプチドに存在する。
【００８６】
ＨＣＶ  抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体は、ＷＯ９６／０５５１３；Ｉｓｈｉｉら（１９９８）；およびＲｏｓａら（１９９６）に記載される抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体アッセイを使用して、検出および／または数量化され得る。この抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体アッセイは、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドについてのレセプターを含む細胞または溶解性ＣＤ８１へのＥ２ポリペプチドの結合の阻害を検出する。アッセイのために、Ｅ２ポリペプチドは、例えば、ＨＣＶに感染した哺乳動物および／あるいはＨＣＶ感染についてワクチン接種したかまたは処置された哺乳動物由来の血清の段階希釈物と混合される。この哺乳動物は、例えば、マウス、ウサギ、モルモット、マカク、ヒヒ、チンパンジー、またはヒトであり得る。この血清およびＥ２ポリペプチドはインキュベートされる。細胞（例えば、ヒトＴ細胞リンパ腫株  Ｍｏｌｔ−４、悪性ヘパトーム細胞株、またはＢ細胞）は、この混合物に添加され、そしてインキュベートされる。必要に応じて、ヒトＣＤ８１でトランスフェクトされた細胞が使用され得る。洗浄後、Ｅ２のこの細胞への結合の中和が評価される。この細胞に結合したＥ２の存在または量は、この細胞を同じ種の哺乳動物（血清の中和を受けたが、このアッセイで使用した特定のＥ２ポリペプチドで免疫した）由来の血清とインキュベートすることによって決定される。次いで、この細胞は、蛍光性標識化合物（例えば、フルオレセインイソチソシアネート、フィコエリトリン、ローダミン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、またはフルオレサミン）を使用して標識される。好ましい実施形態において、ＩｇＧに対するフルオレセインイソチオシアネート結合体化抗血清は、検出可能な標識として使用される。Ｅ２ポリペプチドのこの細胞への結合は、好ましくは、フローサイトメトリーのような方法を使用して間接的に検出される。抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体の力価は、その同族レセプターへのＥ２の結合の少なくとも１０〜９０％、そして好ましくは少なくとも５０％の中和を生じる血清希釈として規定される。
【００８７】
（抗Ｅ２抗体）
抗Ｅ２抗体は、ＨＣＶ  Ｅ２ポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的かつ安定に結合する抗体分子である。ＨＣＶ  抗Ｅ２抗体は、例えば、直接的結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはＥＬＩＳＡアッセイ）を使用して検出および／または数量化され得る。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、Ｅ２ポリペプチドは、固体支持体（例えば、プラスチックの複数ウェルプレートのウェル）に連結される。抗体の集団は標識され、この固体支持体に加えられ、そして非特異的吸着がブロックされる条件下で非標識Ｅ２抗原に結合され、そして他のタンパク質が洗い流される。抗体結合は、無色の基質を有色の反応生成物へと転換する反応によって検出される。
【００８８】
抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体の力価の生成とＨＣＶ感染からの保護の間に、直接的な相関性が存在する。Ｒｏｓａら（１９９１）；Ｉｓｈｉｉら（１９９８）。通常、ＨＣＶによる感染は、持続性の高レベルの抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体力価を誘発しない。しかし、自発的にＨＣＶ感染から回復する、慢性的にＨＣＶに感染した個体のうちの数パーセントは、持続性の、高レベルの抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体力価を有する。したがって、慢性ＨＣＶ感染の過程における抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体の高い血清力価の出現および維持は、ＨＣＶ感染のクリアランスおよび臨床的回復と関連する。抗Ｅ２抗体応答の生成は、ＨＣＶによる感染に対するワクチン接種の提供において重要であることが見出された。Ｃｈｏｏら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１１２９４−１２９８。さらに、抗Ｅ１力価の生成は、ＨＣＶ感染からの保護およびクリアランスにおいて重要であり得る。
【００８９】
Ｅ１Ｅ２またはＥ２のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの送達後の、抗Ｅ２抗体力価または抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体力価の検出および／または数量化は、抗Ｅ２抗体力価および／または抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体力価の誘発に特に有効なＥ２エピトープの同定のために使用され得る。ＨＣＶに対する強力な抗Ｅ２抗体および／または抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体の応答の原因であるＥ１Ｅ２またはＥ２エピトープは、異なる長さ（例えば、アミノ酸６６１，７１５，７４６，７４９，または８０９でのＨＣＶポリペプチドの終端、あるいはＨＣＶポリペプチドのアミノ末端からのアミノ酸の除去）のＥ１Ｅ２またはＥ２ポリペプチドに対して指向された抗Ｅ２抗体および／または抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体の誘発によって同定され得る。次いで、特定のＥ２ポリペプチドエピトープによって誘発された抗Ｅ２および抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体は、どのポリペプチドが強力な応答の生成において最も有効なエピトープを含むかを決定するために、抗Ｅ２  ＥＬＩＳＡアッセイまたは抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体アッセイを使用して試験され得る。次いで、これらのエピトープまたはこのエピトープをコードするポリヌクレオチドを含むＥ１Ｅ２またはＥ２のポリペプチドまたは融合タンパク質が構築され、そして強力な抗Ｅ２抗体応答および／または強力な抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体応答を誘発するために使用され得る。
【００９０】
（送達）
Ｅ１Ｅ２もしくＥ２のポリペプチドまたはＥ１Ｅ２もしくはＥ２のポリヌクレオチドは、抗Ｅ２または抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体をインビボで誘発するために、哺乳動物（例えば、マウス（例えば、ＣＢ６／Ｆ１もしくはＣ５７Ｂ１／６マウス）、ウサギ、モルモット、マカク、ヒヒ、チンパンジー、またはヒト）に投与され得る。Ｅ１Ｅ２またはＥ２ポリヌクレオチドの注入は好ましい。構築および改変における単純さの実用的な利点に加えて、Ｅ１Ｅ２またはＥ２ポリヌクレオチドの注入は、宿主細胞におけるＥ１Ｅ２またはＥ２ポリペプチドの合成を生じる。したがって、このＥ１Ｅ２またはＥ２ポリペプチドは、ネイティブの翻訳後の改変、構造、および構成で宿主の免疫系に提供される。Ｅ１Ｅ２またはＥ２ポリヌクレオチドは、好ましくは、「裸のＤＮＡ」として送達される。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの投与は、筋肉内注入、皮内注入、腹腔内注入、または皮下注入（生物学的な衝撃銃（「遺伝子銃」）を使用する注入を含む）を含む、当該分野で公知の任意の手段によるものであり得る。投与はまた、鼻腔内または経口的であり得る。さらに、投与は、エレクトロポレーションによって達成され得る。Ｍｉｓｈｉｍｕｒａ（２０００）Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：６７５を参照のこと。好ましくは、Ｅ１Ｅ２またはＥ２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、経口投与のためのタンパク質キャリアに付随する。投与方法の組み合わせはまた、抗Ｅ２および／または抗Ｅ２  ＮＯＢの抗体応答を誘発するために使用され得る。
【００９１】
Ｅ１Ｅ２もしくはＥ２ポリペプチドまたはＥ１Ｅ２もしくはＥ２ポリヌクレオチドの投与は、この哺乳動物において、少なくとも１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、１年またはそれより長く持続する抗Ｅ２抗体力価および／または抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体力価を誘発し得る。必要に応じて、最初の注入後１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、１年、またはそれ以上で、Ｅ１Ｅ２もしくはＥ２ポリペプチドまたはＥ１Ｅ２もしくはＥ２ポリヌクレオチドの１回以上のブースター注入物を提供することによって、抗Ｅ２または抗Ｅ２  ＮＯＢの抗体力価は哺乳動物中で維持され得る。
【００９２】
好ましくは、Ｅ１Ｅ２もしくはＥ２ポリペプチドまたはＥ１Ｅ２もしくはＥ２ポリヌクレオチドは、少なくとも１：２５、１：５０、１：６５、１：７０、１：７３、１：７５、１：１００、１：１４０、１：２００、１：３００、１：３７５、１：４００、１：４２０、１：５００、１：６００、１：７００、１：８００、１：９００、１：１，０００、１：３，０００、１：４，０００またはそれ以上の抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体力価を誘発する。
【００９３】
好ましくは、Ｅ１Ｅ２もしくはＥ２ポリペプチドまたはＥ１Ｅ２もしくはＥ２ポリヌクレオチドは、少なくとも  １００、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、７５０、１，０００、１，５００、２，０００、３，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００（幾何学的平均力価）またはそれ以上の抗Ｅ２抗体力価を誘発する。
【００９４】
Ｅ１Ｅ２もしくはＥ２ポリペプチド、Ｅ１Ｅ２もしくはＥ２ポリヌクレオチド、またはその組み合わせを含む本発明の組成物は、使用される特定の組成物と適合性の様式で、そして上記のような抗Ｅ２  ＮＯＢアッセイによって検出される抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体力価、またはＥＬＩＳＡによって検出される抗Ｅ２抗体力価を誘発するために有効な量で投与される。Ｅ１Ｅ２またはＥ２ポリヌクレオチドは、好ましくは、大型哺乳動物（例えば、ヒヒ、チンパンジー、またはヒト）に、１ｎｇ／ｋｇ、１０ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ、１０００ｎｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、または０．５ｍｇ／ｋｇの用量で筋肉内注入される。Ｅ１Ｅ２またはＥ２ポリペプチドは、好ましくは、ヒトのような大型哺乳動物に０．０１、０．０５、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、５または１０ｍｇ／ｋｇの用量で筋肉内注入される。Ｅ１Ｅ２もしくはＥ２ポリペプチドおよび／またはＥ１Ｅ２もしくはＥ２ポリヌクレオチドは、ＨＣＶに感染していない哺乳動物に投与され得るか、またはＨＣＶに感染した哺乳動物に投与され得るかのいずれかでる。組成物中のＥ１Ｅ２もしくはＥ２ポリヌクレオチドまたはＥ１Ｅ２もしくはＥ２ポリペプチドの特定の用量は、この組成物が投与される哺乳動物の種、年齢、および全身的状態、ならびにこの組成物の投与形態が挙げられるがこれらに限定されない多くの要因に依存する。本発明の組成物の有効量は、慣用的な実験法のみを用いて容易に決定され得る。上記のインビトロおよびインビボモデルは、適切な用量を同定するために用いられ得る。以下の実施例において使用されるＥ１Ｅ２もしくはＥ２ポリヌクレオチドまたはＥ１Ｅ２もしくはＥ２ポリペプチドの量は、一般的な手引きを与え、これは抗Ｅ２および／または抗Ｅ２  ＮＯＢ抗体の誘発を最適化するために使用され得る。所望される場合、同時刺激性分子またはアジュバントがまた、Ｅ１Ｅ２またはＥ２の組成物の前、後、または一緒に提供され得る。
【００９５】
本発明の組成物の送達によって生成される哺乳動物の免疫応答（抗Ｅ２および抗−Ｅ２  ＮＯＢ抗体の誘発を含む）は、投薬量、投与経路、またはブーストレジメンの変化によって増強され得る。本発明の組成物は、単一用量の計画、または好ましくは複数用量の計画（ここで、最初のワクチン接種の経過は１〜１０の別個の用量を含む）で与えられ得、続いて、免疫応答を維持および／または再増強するために必要な時間間隔（例えば、第２用量について１〜３ヶ月、および必要に応じて第３の用量について３〜６ヶ月）後に他の用量が与えられ、そして必要な場合、数ヶ月後に続く用量が与えられる。同様に、いくつかの実施形態において、免疫応答は、プライム−ブースト計画（１回以上のＤＮＡプライムおよび１回以上のタンパク質ブースト）を使用して誘発される。
【００９６】
以下は、例示目的のみで提供され、そして上記の広い用語で記載された本発明の範囲を限定するようには意図されない。
【００９７】
（実施例）
（実施例１：短縮型Ｅ２ポリペプチドまたはポリヌクレオチドでの免疫化は、抗Ｅ２−ＮＯＢ抗体力価を誘発する。）
（Ｅ２組成物）
アミノ酸６６１または７１５で短縮された全長ＨＣＶ  Ｅ２またはＨＣＶ  Ｅ２をコードするポリヌクレオチドを、プラスミドベクターｐｎｅｗＣＭＶに連結した。ｐｎｅｗＣＭＶは、以下のエレメントを含むｐＵＣ１９ベースのクローニングベクターである：ＳＶ４０複製起源、ヒトＣＭＶエンハンサー／プロモーター、ヒトＣＭＶイントロン、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）リーダー、およびウシ成長ホルモンポリＡターミネーター。単離され、そして精製されたｐｎｅｗＣＭＶベクター（Ｅ２挿入物を含む）を、滅菌した０．９％生理食塩水緩衝液に溶解した。
【００９８】
アミノ酸７１５で短縮されたＥ２ポリペプチドを、組換え産生し、そしてＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用して精製した。アミノ酸６６１で短縮されたＥ２ポリペプチドは、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能な、組換え産生した分泌ポリペプチドである。
【００９９】
Ｎａｊａ  ｎｉｇｒｉｃｏｌｌｉｓの毒液から精製した心臓毒を、Ｌａｔｏｘｉｎ（Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。この心臓毒を、０．９％  ＮａＣｌ中で１０μＭの最終濃度まで希釈した。
【０１００】
（免疫）
ＣＢ６／Ｆ１マウスを、各１０〜１２マウスの６つのグループに分けた。グループ１のマウスに、全長Ｅ２をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡの１００μｇを注入した（ｐｎｅｗＣＭＶＥ２−７４６  ＤＮＡ）。グループ２に、アミノ酸７１５で短縮したＥ２をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡの１００μｇを注入した（ｐｎｅｗＣＭＶＥ２−７１５  ＤＮＡ）。グループ３に、アミノ酸６６１で短縮したＥ２をコードするポリヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡの１００μｇを注入した（ｐｎｅｗＣＭＶＥ２−６６１  ＤＮＡ）。グループ４に、アミノ酸７１５で短縮したＥ２ポリペプチドの１μｇを注入した（ＣＨＯ  Ｅ２−７１５  １μｇ）。グループ５に、アミノ酸６６１で短縮したＥ２ポリペプチドの１μｇを注入した（ＣＨＯ  Ｅ２−６６１）。グループ６に、アミノ酸７１５で短縮したＥ２ポリペプチドの５μｇを注入した（ＣＨＯ  Ｅ２−７１５  ５μｇ）。Ｅ２組成物を、表１の計画に従って投与した。
【０１０１】
【表１】
2004500366.tif 000002
心臓毒（１０μＭ溶液の０．０５ｍｌ）を、各マウスの前脛骨筋に筋肉内注射した。０．９％生理食塩水中のＥ２プラスミド（１ｍｇ／ｍｌ）を、各マウスの前脛骨筋に筋肉内注射し（０．０５ｍｌを各筋肉に）、総量約１００μｇのＤＮＡを注入した。約０．０２ｍｇ／ｍｌまたは０．１ｍｇ／ｍｌでのＥ２ポリペプチドを、ＭＦ５９−０アジュバントと１：１で組合せ、０．０５ｍｌを各前脛骨筋に、筋肉内注射し、総量約１μｇまたは５μｇのポリペプチドを注入した。群１〜５のマウスについて、０．２ｍｌの血液を、２１日目、４３日目および９９日目の各マウスから得た。群６のマウスについて、０．２ｍｌの血液を、５５日目および８３日目の各マウスから得た。
【０１０２】
（抗Ｅ２　ＮＯＢ力価の検出および測定）
組換えＥ２ポリペプチドを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｅ２のエンベローブ領域（アミノ酸３８４−７１５）をコードするＨＣＶ　１ａ型相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を発現する）から作製し、そして精製した。Ｍｏｌｔ−４細胞（ウェルあたり１０５）を、９６ウェルＵ字型底マイクロプレート中に、４℃で５分間の２００×ｇでの遠心分離によってペレット化した。異なる濃度でＰＢＳにおいて希釈したＥ２ポリペプチドの２０μｌを、ＨＣＶで感染されたか、またはＨＣＶ組換えタンパク質で免疫したかのいずれかのマウス由来の血清の種々の希釈物と混合した。４℃で１時間のインキュベーション後、Ｍｏｌｔ−４細胞を添加し、そして４℃で１時間インキュベートした。非結合ＨＣＶタンパク質および抗体を、４℃で５分間の２００×ｇでのＰＢＳ中での２回の遠心分離によって除去した。細胞を、引き続き、ＨＣＶエンベローブ組み換えタンパク質で免疫したマウスからの結成の１／１００希釈物とともに、４℃で３０分間インキュベートした。可能である場合、対応する予備免疫血清をコントロールとして使用した。これらの細胞を、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ＩｇＧに対するフルオレセインイソチオシアネート−結合体化抗血清についての適切な希釈物と共に３０分間インキュベートした。細胞を４℃でＰＢＳで洗浄し、そして１００μｌ  ＰＢＳに再懸濁した。
【０１０３】
細胞結合蛍光を、Ｂｅｃｔｏｎ  ＤｉｃｋｉｎｓｏｎからのＬｙｓｉｓ  ＩＩソフトウェアプログラムを使用するＦＡＣＳｃａｎフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。細胞集団の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、計算した。ＭＦＩは、直接、細胞に結合した蛍光標識ＨＣＶの表面密度に関係する。この例において、ＮＯＢ抗体力価は、Ｅ２結合の５０％中和を示す血清希釈物として規定される。
【０１０４】
ＮＯＢ力価を示すマウスの平均抗Ｅ２ＮＯＢ抗体力価を表２に報告する。抗Ｅ２ＮＯＢ抗体力価を示す各群のマウスの数を、平均抗ＮＯＢ抗体力価の下の括弧内に示す。
【０１０５】
【表２】
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表２は、Ｅ２をコードするプラスミドＤＮＡおよびその短縮型での免疫化が抗Ｅ２　ＮＯＢ抗体力価を誘発することを示す。抗Ｅ２　ＮＯＢ抗体力価は、Ｅ２がプラスミドＤＮＡに送達された場合でさえ、誘発された。抗Ｅ２　ＮＯＢ抗体は、全長Ｅ２ポリペプチドを含むプラスミドによって誘発されることは、以前には示されていない。表２はさらに、Ｅ２ポリペプチドがアミノ酸７１５または６６１において切断された場合でさえ、Ｅ２ポリペプチドでの免疫化が、抗Ｅ２　ＮＯＢ抗体力価を誘発することを示す。
【０１０６】
（実施例２：Ｅ１Ｅ２ポリペプチドをコードするＤＮＡでの免疫化は抗Ｅ２−ＮＯＢ抗体力価を誘発する）
（Ｅ１Ｅ２組成物）
Ｅ１Ｅ２をコードするポリヌクレオチドをプラスミドベクターｐｎｅｗＣＭＶにライゲーションした。このポリヌクレオチドは、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜７４６（ｐｎｅｗＣＭＶＥ１Ｅ２−７４６）、アミノ酸１９２〜７４９（ｐｎｅｗＣＭＶＥ１Ｅ２−７４９）、アミノ酸１９２〜８０９（ｐｎｅｗＣＭＶ１Ｅ２−８０９）（ＨＣＶ−１に関するアミノ酸の番号付け）をコードした。Ｅ１Ｅ２挿入物を含む単離および精製されたｐｎｅｗＣＭＶベクターを、０．９％滅菌生理食塩水緩衝液に溶解した。
【０１０７】
（免疫）
ＣＢ６／Ｆ１マウスの群に、実施例１の記載と同様に、０週、４週、および８週で心臓毒を筋肉内注射した。このマウスに、実施例１の記載と同様に、１週、５週、および９週に、１００μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐｎｅｗＣＭＶＥ１Ｅ２−７４６、ｐｎｅｗＣＭＶＥ１Ｅ２−７４９、またはｐｎｅｗＣＭＶＥ１Ｅ２−８０９）を注射した。
【０１０８】
（抗Ｅ２−ＮＯＢ力価の検出および測定）
各群のマウスについての平均の抗Ｅ２　ＮＯＢ抗体力価を、実施例１に記載のように決定した。結果を表３に示す。抗Ｅ２　ＮＯＢ抗体力価を表す各群のマウスの数を、以下の平均抗Ｅ２　ＮＯＢ抗体力価のカッコ内に示す。
【０１０９】
【表３】
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表３は、Ｅ１Ｅ２をコードするプラスミドＤＮＡによる免疫が、抗Ｅ２　ＮＯＢ抗体力価を惹起することを実証する。Ｅ１Ｅ２がプラスミドＤＮＡによって誘導された場合でさえも、抗Ｅ２抗体力価は惹起される。抗Ｅ２　ＮＯＢ抗体が、全長Ｅ１Ｅ２ポリペプチドを含むプラスミドによって惹起されることは以前に示されていない。
【０１１０】
（実施例３：Ｅ１Ｅ２ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＥ２ポリペプチドをコードするＤＮＡでの免疫によって、抗Ｅ２抗体力価が誘発される）
（Ｅ１Ｅ２およびＥ２組成物）
ＤＮＡプラスミドｐｎｅｗＣＭＶＥ２−７４６、ｐｎｅｗＣＭＶＥ１Ｅ２−７４６、ｐｎｅｗＣＭＶＥ１Ｅ２−７４９、およびｐｎｅｗＣＭＶＥ１Ｅ２−８０９を、実施例１および２に記載のように調製した。
【０１１１】
（免疫）
ＣＢ６／Ｆ１マウス群に、実施例１に記載のように、０、４および８週目に筋内に心臓毒を注射した。このマウスに、実施例１に記載のように、１、５および９週目に、１００μｇのプラスミドＤＮＡ（ｐｎｅｗＣＭＶＥ２−７４６、ｐｎｅｗＣＭＶＥ１Ｅ２−７４６、ｐｎｅｗＣＭＶＥ１Ｅ２−７４９、またはｐｎｅｗＣＭＶＥ１Ｅ２−８０９）を注射した。
【０１１２】
（抗Ｅ２抗体力価の検出および測定）
抗Ｅ２抗体の検出および測定を、本質的にＩｓｈｉｉら（１９９８）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　２８：１１１７−２０およびＴｅｄｅｓｃｈｉら（１９９７）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　２５：４５９−４６２に記載のように、ＥＬＩＳＡによって達成した。簡潔には、組換えＣＨＯ細胞によって産生されたＨＣＶ　Ｅ２またはＥ１／Ｅ２抗原を、ＰＢＳ中に希釈し、そしてマイクロタイタープレートのウェルにコーティングした。試験マウス血清を、サンプル希釈液中に希釈し、そして３７℃で１時間、このプレートにおいてインキュベートした。このウェルを、プレート洗浄緩衝液で洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化されたモノクローナルマウス抗ヒトＩｇＧ抗体を、各ウェルに添加した。Ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）および過酸化水素を、このウェルに添加した。結果を、４９２／６２０ｎｍで、マイクロタイタープレートリーダー（Ｔｅｔｅｒｔｅｋ　ＭＣＣ／３４０；Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して読み取った。これらの抗原のカットオフ光学密度（ＯＤ）値を、陰性サンプル（出血前（ｐｒｅｂｌｅｅｄ））の平均、および平均ＯＤの標準偏差の７倍として決定した。試験されたサンプルの力価を、相対的な直線範囲のシグナルＯＤ／カットオフＯＤ×希釈率として決定した。相乗平均力価（ＧＭＴ）を、表４に報告する。
【０１１３】
【表４】
2004500366.tif 000005
表４は、Ｅ１Ｅ２またはＥ２をコードするプラスミドＤＮＡでの免疫が、抗Ｅ２抗体力価を誘発することを示す。抗Ｅ２抗体力価は、たとえ全長のＥ１Ｅ２またはＥ２がプラスミドＤＮＡにより送達されたとしても誘発された。抗Ｅ２抗体が全長のＥ１Ｅ２またはＥ２ポリペプチド（ここで、このポリペプチドはｐ７ポリペプチドを含まない）を含むプラスミドにより誘発されることは、以前には示されなかった。
【０１１４】
（実施例４：ＰＬＧで送達されるＤＮＡでの免疫）
ポリ乳酸−コ−グリコリド（ＰＬＧ）ポリマーをＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｕ．Ｓ．Ａから得た。この研究に用いたＰＬＧポリマーは、５０／５０のコポリマー比および６５ｋＤａの分子量（製造業者のデータ）を有するＲＧ５０５であった。本質的には、Ｓｉｎｇｈら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００）９７：８１１−８１６）に記載されるように、ＤＮＡが吸着されたカチオン性微粒子を、改変溶媒エバポレーションプロセスを用いて調製した。簡潔には、この微粒子を、塩化メチレン中の５％　ｗ／ｖポリマー溶液１０ｍｌをＰＢＳ　１ｍｌと、ＩＫＡホモジナイザーを用いて高速で乳化することにより調製した。次いで、最初の乳濁液を、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＢＡ）（０．５％　ｗ／ｖ）を含む蒸留水５０ｍｌに添加した。このことにより、ｗ／ｏ／ｗ乳濁液の形成が生じ、これを室温で１２時間６０００ｒｐｍで攪拌して、塩化メチレンを蒸発させた。得られた微粒子を蒸留水中で２回、１０，０００ｇで遠心分離することにより洗浄し、そして凍結乾燥した。調製、洗浄および収集後、ＤＮＡを、カチオン性微粒子１００ｍｇを、ＤＮＡの１ｍｇ／ｍｌ溶液中で、４℃で６時間インキュベートすることにより、微粒子上に吸着させた。次いで、この微粒子を遠心分離により分離し、ペレットをＴＥ緩衝液で洗浄し、そしてこの微粒子を凍結乾燥し、再懸濁し、そして動物被験体に投与した。
【０１１５】
抗体力価を、本明細書中に記載のようにＥＬＩＳＡアッセイにより測定した。図１および２は、以下のＤＮＡ構築物を用いたＰＬＧ免疫の結果を示す：ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜７４６（Ｅ２）および１９２〜７４６（Ｅ１Ｅ２）をコードする構築物。図３および４は、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜７４９（Ｅ２）および１９２〜７４９（Ｅ１Ｅ２）をコードする構築物を用いたＰＬＧ免疫の結果を示す。これらの結果により、ＰＬＧ／Ｅ１Ｅ２　ＤＮＡを用いたマウスの免疫が、高い抗体力価を生じることが実証される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、１０μｇのＥ１Ｅ２／ＰＬＧ　ＤＮＡ（左のバー）；１０μｇのＥ１Ｅ２　ＤＮＡ（中のバー）、および１００μｇのＥ１Ｅ２／ＰＬＧ　ＤＮＡを用いて免疫したマウスのＥＬＩＳＡ力価を示すグラフである。
【図２】
図２は、種々のアジュバント中のＥ１Ｅ２　ＤＮＡおよび／またはタンパク質を用いて免疫したマウスのＥＬＩＳＡ力価を示すグラフである。黒のバーは、２回目のブースト（追加免疫）後の力価を示し、そして白のバーは、３回目のブースト（追加免疫）後の力価を示す。
【図３】
図３は、種々のアジュバント中のＥ１Ｅ２　ＤＮＡおよび／またはタンパク質を用いて免疫したマウスのＥＬＩＳＡ力価を示すグラフである。黒のバーは、２回目のブースト（追加免疫）後の力価を示し、そして白のバーは、３回目のブースト（追加免疫）後の力価を示す。図３および図４は、２つの別々の実験を示す。
【図４】
図４は、種々のアジュバント中のＥ１Ｅ２　ＤＮＡおよび／またはタンパク質を用いて免疫したマウスのＥＬＩＳＡ力価を示すグラフである。黒のバーは、２回目のブースト（追加免疫）後の力価を示し、そして白のバーは、３回目のブースト（追加免疫）後の力価を示す。図３および図４は、２つの別々の実験を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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