(57)【要約】本発明は、リガンドとの会合について少なくとも約９×１０７Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎを含み、そして治療効力を有する、結合性ポリペプチドまたはその機能的フラグメントを提供する。本発明はまた、結合性ポリペプチドの治療効力を決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）結合性ポリペプチドをリガンドと接触させる工程；（ｂ）該結合性ポリペプチドと該リガンドとの間の結合についての会合速度を測定する工程；および（ｃ）該結合性ポリペプチドについての該会合速度を、治療コントロールについての会合速度と比較する工程であって、該治療コントロールについての該会合速度と比較した該結合性ポリペプチドについての相対的な会合速度は、該結合性ポリペプチドが、該会合速度の間の差異と相関して治療効力における差異を示す、工程からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドとの会合について少なくとも約９×１０７Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎを含み、そして治療効力を有する、結合性ポリペプチドまたはその機能的フラグメント。
【請求項２】
リガンドに対して少なくとも約１．３×１０６Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎを含み、そして治療効力を有する、グラフト化抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項３】
リガンドに対して少なくとも約９×１０７Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎを含み、そして治療効力を有する、ヒト抗体またはその機能的フラグメント。
【請求項４】
結合性ポリペプチドの治療効力を決定する方法であって、以下の工程を包含する、方法：
（ａ）結合性ポリペプチドをリガンドと接触させる工程；
（ｂ）該結合性ポリペプチドと該リガンドとの間の結合についての会合速度を測定する工程；および
（ｃ）該結合性ポリペプチドについての該会合速度を、治療コントロールについての会合速度と比較する工程であって、該治療コントロールについての該会合速度と比較した該結合性ポリペプチドについての相対的な会合速度は、該結合性ポリペプチドが、該会合速度の間の差異と相関して治療効力における差異を示すことを示す、工程。
【請求項５】
さらに以下の工程を包含する、請求項４に記載の方法：
（ｄ）前記結合性ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸を変更し、そして工程（ａ）から（ｃ）を１回以上繰り返す、工程。
【請求項６】
前記変更された結合性ポリペプチドについての前記会合速度が、少なくとも４倍増大する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記結合性ポリペプチドについての前記会合速度が、改善された治療効力と相関して増大する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記結合性ポリペプチドについての前記会合速度が、前記治療コントロールについての前記会合速度よりも少なくとも４倍高い、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記会合速度が、ｋｏｎによって示される、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記結合性ポリペプチドについての前記ｋｏｎが、少なくとも約８×１０６Ｍ−１ｓ−１である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記結合性ポリペプチドについての前記ｋｏｎと前記治療コントロールについての前記ｋｏｎとの間の差異と相関した前記治療効力が、前記結合性ポリペプチドについてのｋａと前記治療コントロールについてのｋａとの間の差異の効果とは独立している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記結合性ポリペプチドについての前記ｋｏｎと前記治療コントロールについての前記ｋｏｎとの間の前記差異が増加であり、そして前記結合性ポリペプチドについてのｋａが、前記治療コントロールについてのｋａに類似した値である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記結合性ポリペプチドについての前記ｋｏｎと前記治療コントロールについての前記ｋｏｎとの間の前記差異が増加であり、そして前記結合性ポリペプチドについてのｋａが、前記治療コントロールについてのｋａより低い値である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記結合性ポリペプチドが、レセプター、酵素、ホルモン、免疫グロブリン、抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、Ｔ細胞レセプター、インテグリン、ホルモンレセプター、レクチン、膜レセプター、トランスミッターレセプター、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ＤＮＡ修飾酵素、転写因子、ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰａｓｅ、膜チャネル、増殖因子、インスリン、サイトカイン、神経ペプチド、細胞外基質タンパク質および凝固因子、またはそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療コントロールが、レセプター、酵素、ホルモン、免疫グロブリン、抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、Ｔ細胞レセプター、インテグリン、ホルモンレセプター、レクチン、膜レセプター、トランスミッターレセプター、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ＤＮＡ修飾酵素、転写因子、ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰａｓｅ、膜チャネル、増殖因子、インスリン、サイトカイン、神経ペプチド、細胞外基質タンパク質および凝固因子、またはそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
結合性ポリペプチドの治療効力を決定する方法であって、以下の工程を包含する、方法：
（ａ）集団のうちの２つ以上の結合性ポリペプチドをリガンドと接触させる工程；
（ｂ）該リガンドに結合する該２つ以上の結合性ポリペプチドについての会合速度を測定する工程；
（ｃ）該リガンドに結合する該２つ以上の結合性ポリペプチドについての該会合速度を比較する工程；および
（ｄ）該集団のうちの１つ以上の他の結合性ポリペプチドよりも、該リガンドへの結合についてより高い会合速度を示す結合性ポリペプチドを同定する工程であって、該より高い会合速度が、該同定された結合性ポリペプチドの治療効力と相関する、工程。
【請求項１７】
前記より高い会合速度が、４倍高い、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
さらに以下の工程を包含する、請求項１６に記載の方法：
（ｄ）前記同定された結合性ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸を変更し、そして工程（ａ）から（ｃ）を１回以上繰り返す、工程。
【請求項１９】
前記会合速度が、ｋｏｎによって同定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｋｏｎが、少なくとも約１．５×１０６Ｍ−１ｓ−１である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記高いｋｏｎが、治療コントロールについてのｋｏｎより大きい、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記結合性ポリペプチドが、レセプター、酵素、ホルモン、免疫グロブリン、抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、Ｔ細胞レセプター、インテグリン、ホルモンレセプター、レクチン、膜レセプター、トランスミッターレセプター、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ＤＮＡ修飾酵素、転写因子、ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰａｓｅ、膜チャネル、増殖因子、インスリン、サイトカイン、神経ペプチド、細胞外基質タンパク質および凝固因子、またはそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
改善された治療効力を有する結合性ポリペプチドを生成するための方法であって、以下の工程を包含する、方法：
（ａ）親ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸を変更して、１つ以上の異なる子孫ポリペプチドを生成する工程；
（ｂ）リガンドと会合する該１つ以上の異なる子孫ポリペプチドについての会合速度を測定する工程；および
（ｃ）該親ポリペプチドと比較して、リガンドへの会合速度が少なくとも４倍増大した該１つ以上の子孫ポリペプチドから結合性ポリペプチドを同定する工程であって、該増大した会合速度は、病理学的状態に対する改善された治療効力を生じる、工程。
【請求項２４】
前記会合速度が、ｋｏｎによって示される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記増大したｋｏｎが、少なくとも約３×１０５Ｍ−１ｓ−１である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
改善された治療効力を生じるｋｏｎの前記増大が、前記結合性ポリペプチドについてのｋａの変化の効果とは独立している、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
ｋｏｎが少なくとも４倍増大した前記結合性ポリペプチドが、前記親ポリペプチドについてのｋａと類似したｋａ値を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
ｋｏｎが少なくとも４倍増大した前記結合性ポリペプチドが、前記親ポリペプチドについてのｋａより低いｋａ値を有する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記結合性ポリペプチドが、レセプター、酵素、ホルモン、免疫グロブリン、抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、Ｔ細胞レセプター、インテグリン、ホルモンレセプター、レクチン、膜レセプター、トランスミッターレセプター、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ＤＮＡ修飾酵素、転写因子、ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰａｓｅ、膜チャネル、増殖因子、インスリン、サイトカイン、神経ペプチド、細胞外基質タンパク質および凝固因子、またはそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記親ポリペプチドが、レセプター、酵素、ホルモン、免疫グロブリン、抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、Ｔ細胞レセプター、インテグリン、ホルモンレセプター、レクチン、膜レセプター、トランスミッターレセプター、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ＤＮＡ修飾酵素、転写因子、ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰａｓｅ、膜チャネル、増殖因子、インスリン、サイトカイン、神経ペプチド、細胞外基質タンパク質および凝固因子、またはそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
改善された治療効力を有する結合性ポリペプチドを生成するための方法であって、以下の工程を包含する、方法：
（ａ）親ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸を変更して、１つ以上の異なる子孫ポリペプチドを生成する工程；
（ｂ）リガンドと会合する該１つ以上の異なる子孫ポリペプチドについての会合速度を測定する工程；および
（ｃ）該１つ以上の異なる子孫ポリペプチドから、リガンドと会合する結合性ポリペプチドについての少なくとも約１．５×１０６Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎを有する結合性ポリペプチドを同定する工程であって、該結合性ポリペプチドが、改善された治療効力を有する、工程。
【請求項３２】
前記ｋｏｎが、少なくとも約９×１０７Ｍ−１ｓ−１である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記結合性ポリペプチドが、レセプター、酵素、ホルモン、免疫グロブリン、抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、Ｔ細胞レセプター、インテグリン、ホルモンレセプター、レクチン、膜レセプター、トランスミッターレセプター、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ＤＮＡ修飾酵素、転写因子、ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰａｓｅ、膜チャネル、増殖因子、インスリン、サイトカイン、神経ペプチド、細胞外基質タンパク質および凝固因子、またはそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記親ポリペプチドが、レセプター、酵素、ホルモン、免疫グロブリン、抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、Ｔ細胞レセプター、インテグリン、ホルモンレセプター、レクチン、膜レセプター、トランスミッターレセプター、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ＤＮＡ修飾酵素、転写因子、ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰａｓｅ、膜チャネル、増殖因子、インスリン、サイトカイン、神経ペプチド、細胞外基質タンパク質および凝固因子、またはそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
病理学的状態を処置する方法であって、リガンドとの会合について少なくとも約９×１０７Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎを含む結合性ポリペプチドの有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３６】
前記結合性ポリペプチドが、レセプター、酵素、ホルモン、免疫グロブリン、抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、Ｔ細胞レセプター、インテグリン、ホルモンレセプター、レクチン、膜レセプター、トランスミッターレセプター、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ＤＮＡ修飾酵素、転写因子、ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰａｓｅ、膜チャネル、増殖因子、インスリン、サイトカイン、神経ペプチド、細胞外基質タンパク質および凝固因子、またはそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、一般に、疾患の処置に関し、そしてより詳細には、治療剤として有用な結合性分子に関する。
【０００２】
近代医学は、個々の疾患を仲介する分子レベル相互作用の増加した操作からの利益を受ける。これは、特に、薬物治療をともなう疾患および疾患症状の処置についてあてはまる。薬物開発産業は、治療的に有効な薬物を開発するための試みにおいて分子レベル分析に基づく戦略を用いている。
【０００３】
薬物開発産業で用いられるこのような戦略の１つは、疾患にともなう標的分子を同定すること、および、標的分子の活性をブロックするか、または疾患個体において標的分子が存在する部位に毒性有効荷重を送達するために、標的分子に結合する薬物を生成することである。このような戦略下では、研究の発見フェーズは、インビトロ方法を利用して標的分子に結合する先導薬物候補を同定する。次いで、この先導薬物候補を研究の確証フェーズに入れ、そこでインビボ試験を実施してこの先導薬物候補が治療有効性を示すか否かを決定する。
【０００４】
２つの一般に用いられる発見フェーズアプローチは、構造を基礎にする薬物設計と候補分子のプールのスクリーニングである。構造を基礎にする薬物設計は、先導薬物候補のための構造的モデルを同定するために薬物候補が適合されるテンプレートとして、標的分子の三次元構造を用いるか、または、その他の構造関連性質を用いる。次いで、この先導薬物候補が合成され、そしてインビトロで試験される。あるいは、スクリーニングは、単離された標的分子を用い、薬物候補の大集団からインビトロで先導薬物候補を選択する。両方のアプローチにおける１つの因子は、標的分子と先導薬物候補との間の結合相互作用の安定性の開発である。この点について、構造を基礎にする多数の設計アルゴリズムは、標的分子とドッキングして安定複合体を形成する先導薬物候補を同定することを狙い、そして標的分子と安定な結合複合体を形成する先導薬物候補を選択するために多数のスクリーニングが設計される。
【０００５】
ゲノミクス、タンパク質エンジニアリングおよびコンビナトリアル化学が、発見フェーズ研究のインビトロ方法にインプットされる標的および可能な薬物候補を同定するために用いられている。これらおよびその他の方法は、疾患標的数および先導薬物候補数の両方の増加に至る治療薬物の高スループット識別および産生を可能にし得る。
【０００６】
不運なことに、治療薬物の産生は、発見フェーズアプローチの方法における改善、またはより多数および種類の発見フェーズインプットと相関する様式で改善されなかった。特に、同定された先導薬物候補は、しばしば、治療有効性を示さないのがほとんどである。確証フェーズにおいて不成功薬物候補への薬物資源の転換は、コスト高であり得る。なぜなら、失敗した先導薬物候補に対し何百万ドルおよび多数年が浪費され得るからである。より重要なことは、被害疾患を受ける者が処置または治癒を奪われることである。
【０００７】
従って、疾患に対し治療有効性を示す成功した先導薬物候補を正確に予見する迅速かつ有効な方法に対する必要性が存在する。本発明はこの必要性を満たし、そしてまた関連する利点を提供する。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、リガンドと会合するための少なくとも約９×１０７Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎおよび治療効力を備える結合性ポリペプチド、またはその機能的フラグメントを提供する。本発明はまた、結合性ポリペプチドの治療効力を決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）結合性ポリペプチドをリガンドと接触させる工程；（ｂ）この結合性ポリペプチドとリガンドとの間の結合について会合速度を測定する工程、および（ｃ）この結合性ポリペプチドについての会合速度を治療コントロールについての会合速度と比較する工程であって、この治療コントロールについての会合速度と比較した結合性ポリペプチドについての相対会合速度が、この結合性ポリペプチドが会合速度間の差異と相関する治療効力における差異を示すことを示す工程からなる。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、分子の治療効力が、治療分子が病理学的状態を媒介またはそれと相関するリガンドと会合する速度と相関するという発見に関する。本発明は、リガンドとの会合について少なくとも約９×１０７Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎおよび治療効力を有する結合性ポリペプチド、またはその機能的フラグメントを提供する。本発明はさらに、リガンドに対し、少なくとも約１．３×１０６Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎおよび治療効力を有するグラフト化抗体、またはその機能的フラグメントを提供する。
【００１０】
１つの実施形態では、本発明の方法は、治療効力を有する分子の正確なインビトロ予見および識別を可能にする。１つの実施形態では、本方法は、結合性ポリペプチドについての会合速度を治療コントロールについての会合速度と比較することにより、結合性ポリペプチドの治療効力を決定する工程を含む。この結合性ポリペプチドは、上記会合速度間の差異と相関する治療効力における差異を示す。別の実施形態では、本発明の方法は、その治療効力と相関する、高い会合速度またはｋｏｎを示す結合性ポリペプチドを同定することにより、結合性ポリペプチドの治療効力を同定することを含む。本発明の方法はまた、１つ以上の子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）ポリペプチドを作製するため、およびリガンドとの増加した会合速度から得られる改善された治療効力を有する結合性ポリペプチドである子孫ポリペプチドを同定するために、親ポリペプチドの構造およびリガンド結合活性を変えるために用いられ得る。
【００１１】
本発明の利点は、改善された治療効力を有する結合性ポリペプチドが、改善された治療効力ではなく、リガンドに対する増加したＫａを有する結合性ポリペプチドから区別し得ることである。本発明の方法のさらなる利点は、インビトロで多数の可能な治療分子をスクリーニングする手段が提供され、それによって、失敗した治療剤のインビボ試験にともなうコストを低減しながら、有効な治療剤を同定する速度および効率を増大することである。
【００１２】
本明細書中で用いられる場合、用語「結合性ポリペプチド」は、リガンドと選択的に会合するアミノ酸のポリマーをいう。結合性ポリペプチドは、このポリペプチドがリガンドと会合する能力を保持する限り、例えば、少なくとも２、５、８、１０、１２、１５、２０、２５、５０、１００、２００または４００またそれ以上のアミノ酸を有し得る。従って、本明細書中で用いられる場合、用語結合性ポリペプチドは、２〜数百または数千アミノ酸さえの範囲のアミノ酸ポリマーのすべてのサイズを含む。
【００１３】
結合性ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、例えば、レセプター、酵素またはホルモンであり得る。レセプターは、例えば、抗体またはＴ細胞レセプターのような免疫グロブリン；インテグリン；ホルモンレセプター；レクチン；膜レセプター；またはトランスミッターレセプターを含み得る。酵素は、例えば、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、キナーゼ、リパーゼ、ホスファターゼ、ＤＮＡ改変酵素、ポリメラーゼ、カスパーゼ、転写因子、ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰａｓｅ、または膜チャネルを含み得る。ホルモンは、例えば、増殖因子、インスリン、サイトカイン、神経ペプチド、細胞外基質タンパク質または凝固因子を含み得る。結合性ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドの、このようなポリペプチドがリガンドと会合する能力を保持する限り、その改変形態、例えば、フラグメント、ドナーポリペプチドからのアミノ酸を含むキメラ、または１つ以上のドナーポリペプチドからのフラグメントの融合であり得る。
【００１４】
結合性ポリペプチドは、例えば、アミノ酸誘導体、アミノ酸の立体異性体、アミノ酸アナログまたはアミノ酸の機能的模倣物を含む、天然に存在しない成分を含むポリペプチドであり得る。例えば、誘導体は、アルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨウ素化、またはポリペプチドを誘導体化する任意の改変のような、ポリペプチドの化学的改変を含み得る。アナログは、例えば、ヒドロキシプロリンまたはカルボキシグルタメートなどの改変されたアミノ酸を含み得、そしてペプチド結合により連結されないアミノ酸を含み得る。模倣物は、結合性ポリペプチドと模倣物との間の三次元構造における差異にかかわらず、ポリペプチドの機能を模倣する化学的成分を含む分子を包含する。例えば、ポリペプチドが、機能的ドメインに２つの荷電された化学的成分を含む場合、模倣物は、２つの荷電された化学的成分を空間的配向および拘束構造で配置し得、その結果、これらの荷電した化学的成分の相対的位置が、このポリペプチドと模倣物との間の任意の他の差異とは独立に三次元空間で維持される。
【００１５】
本明細書中で用いられる場合、用語「リガンド」は、結合性ポリペプチドと選択的に会合し得る小分子、化合物または高分子をいう。リガンドは、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、脂質、炭水化物、アミノ酸、ヌクレオチドまたはホルモンを含む、天然に存在する分子、化合物または高分子であり得る。リガンドは、例えば、成分の相対的位置において、付加成分、除去成分または再配置を生じる、天然に存在する分子、化合物または高分子の誘導体であり得る。付加成分の例は、例えば、ビオチン、ポリヒスチジンのようなペプチド、ラジオアイソトープまたは第２の分子に対する共有結合を形成し得る化学的反応基を含む。リガンドは、天然に存在する分子、化合物または高分子の模倣物であり得る。模倣物は、模倣物とリガンドとの三次元構造間の差異にかかわらず、リガントの機能を模倣する化学的成分を含む分子を包含する。模倣物は、例えば、合成により調製された分子、または天然に存在するアミノ酸の改変形態を含むポリペプチドであり得る。リガンドは、癌細胞、微生物、細菌、真菌またはウイルスのような細胞上に見出される抗原であり得る。リガンドはまた、毒性物質である分子であり得る。
【００１６】
本明細書中で用いられる場合、用語「親ポリペプチド」は、結合性ポリペプチドを生成するために変化し得るアミノ酸のポリマーをいう。従って、親ポリペプチドは、本発明の方法を用いて改変される分子である。本発明で用いられるとき、親ポリペプチドは、例えば、少なくとも２、５、８、１０、１２、１５、２０、２５、５０、１００、２００または４００またはそれ以上のアミノ酸を有し得る。従って、用語親ポリペプチドは、本明細書で用いられる場合、アミノ酸の２〜数百または数千さえの範囲のアミノ酸ポリマーのすべてのサイズを含む。
【００１７】
親ポリペプチドは、結合性ポリペプチドを参照して上記に記載のような、天然に存在するポリペプチド、例えば、レセプター、酵素またはホルモンであり得る。親ポリペプチドは、結合性ポリペプチドを参照して上記に記載のような、例えば、アミノ酸誘導体、アミノ酸の立体異性体、アミノ酸アナログまたはアミノ酸の機能的模倣体を含む天然に存在しない成分を含むポリペプチドであり得る。
【００１８】
本明細書中で用いられる場合、用語「子孫ポリペプチド」は、それが生成される親ポリペプチドと比較して異なる構造を有するアミノ酸のポリマーをいう。異なる構造は、例えば、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換または化学的改変を含み得る。子孫ポリペプチドは、親ポリペプチドとは異なる種であり得る。子孫ポリペプチドは、その親ポリペプチドが同じリガンドと会合する会合速度と比較して、同じかまたは異なる会合速度でリガンドと会合し得る。本明細書中で用いられる場合、子孫ポリペプチドは、例えば、少なくとも２、５、８、１０、１２、１５、２０、２５、５０、１００、２００または４００またはそれ以上のアミノ酸を有し得る。従って、用語子孫ポリペプチドは、本明細書中で用いられる場合、アミノ酸の２〜数百または数千さえの範囲のアミノ酸ポリマーのすべてのサイズを含む。
【００１９】
子孫ポリペプチドは、親ポリペプチドの改変形態、例えば、フラグメント、ドナーポリペプチドからのアミノ酸を含むキメラ、または１つ以上のドナーポリペプチドからのフラグメントの融合であり得る。子孫ポリペプチドは、上記で記載のような、例えば、アミノ酸誘導体、アミノ酸の立体異性体、アミノ酸アナログまたはアミノ酸の機能的模倣物を含む、天然に存在しない成分を含むポリペプチドであり得る。
【００２０】
本明細書中で用いられる場合、抗体、またはその機能的フラグメントを参照して用いるとき、用語「グラフト化」は、ドナーまたは第２の種からの１つ以上のＣＤＲを含む１つの種からの可変領域アクセプターフレームワークを有する抗体またはその機能的フラグメントをいう。当業者は、抗体、またはその機能的フラグメントの機能が、単一ＣＤＲにおけるか、またはより好ましくは複数ＣＤＲにおける変化により影響され得ることを知る。アミノ酸は、アクセプターフレームワークまたはドナーＣＤＲにおける任意の位置で付加、欠失または置換され得、そして、例えば、抗体、またはその機能的フラグメントが、１つの種からの可変領域アクセプターフレームワークおよび別の種からの少なくとも１つのＣＤＲを含む限り、小量または顕著であるかにかかわらず、グラフト化抗体、またはその機能的フラグメントの構造または機能を改変する変化を含み得る。グラフト化抗体の記載およびそれらの産生の方法は当該技術分野で周知であり、そして、例えば、本明細書に参考として援用される、米国特許第５，２２５，５３９号；「Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｍａｎ，」Ｃｌａｒｋ、Ｍ．編、Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ、Ｅｎｇｌａｎｄ：Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｔｉｔｌｅｓ（１９９３）；ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１４：２４３−２４６（１９９３）；ＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ、Ｔｉｐｓ、１４：１３９−１４３（１９９３）およびＣｏｕｔｏら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、５５：１７１７−１７２２（１９９５）に記載されている。
【００２１】
本明細書中で用いられる場合、結合性ポリペプチドを参照して用いられるとき、用語「機能的フラグメント」は、リガンドと選択的に会合する能力を保持する結合性ポリペプチドの部分をいうことが意図される。機能的フラグメントは、結合性ポリペプチドの解離したサブユニット、例えば、抗体の個々の重鎖または軽鎖を含み得る。機能的フラグメントは、低減した数のアミノ酸を有する結合性ポリペプチドの部分、例えば、抗体のＦｄ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）２部分を含み得る。機能的フラグメントは、例えば、抗体のＦｖ、ＶＨ、ＣＤＲ、またはｓｃＦｖ部分を含む、低減した数のアミノ酸を有する結合性ポリペプチドの解離したサブユニットの部分を含み得る。このような用語は、例えば、本明細書に参考として援用される、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｄｅｓｋ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓ、Ｒ．Ａ．編、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：ＶＣＨ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｉｎｃ．）；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、２２：１８９−２２４（１９９３）；ＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎおよびＳｋｅｒｒａ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１７８：４９７−５１５（１９８９）およびＤａｙ、Ｅ．Ｄ．、Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｉｎｃ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９０）に記載されている。従って、機能的フラグメントは、抗体の免疫学的活性部分、フラグメントまたはセグメントを含み得る。
【００２２】
結合性ポリペプチドの機能的フラグメントは、完全長結合性ポリペプチドと比較して、このフラグメントが完全長結合性ポリペプチドの対応する領域とほぼ同じ構造を有し、そしてリガンドと選択的に会合する能力を保持する限り、主要でない（マイナーな）構造の差異を有し得る。主要でない構造の差異は、一次、二次、三次または四次配列レベルであり得る。一次配列レベルにおける構造的差異は、アミノ酸配列における変化を含み、そして、例えば、このようなポリペプチドがリガンドと会合する能力を保持する限り、アミノ酸の付加、欠失または置換、または化学的成分の付加のようなアミノ酸の化学的改変であり得る。付加された成分は、例えば、化学的に誘導体化されたアミノ酸、アミノ酸のＤ−立体異性体、天然に存在しないアミノ酸、アミノ酸アナログまたはアミノ酸の模倣物を含み得る。二次レベルにおける結合性ポリペプチドとその機能的フラグメントとの間の構造的差異は、例えば、αヘリックス、ループまたはβシート構造における変化を含み、得られる機能的フラグメントがリガンドと会合する能力を保持する限り生じ得る。結合性ポリペプチドの機能的フラグメントはまた、三次レベルにおける構造的差異を有し得、これには、例えば、二次構造エレメントの相対的位置における変化、または結合性ポリペプチドの全体折り畳みにおける変化が含まれる。四次レベルにおける構造的差異は、機能的フラグメントがリガンドと会合する能力を保持する限り、例えば、結合性ポリペプチドにおけるサブユニットの数の変化、または結合性ポリペプチド中のサブユニットが相互作用する界面における変化を含み得る。
【００２３】
本明細書中で用いられる場合、用語「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドまたは軽鎖ポリペプチドいずれかの可変領域内に見出される非連続抗原結合部位を意味することが意図される。この用語ＣＤＲ領域は、当該技術分野で周知であり、そして本明細書に参考として援用される、Ｋａｂａｔら、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）により、およびＣｈｏｔｈｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）により、およびさらにＭａｃＣａｌｌｕｍら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）により規定され、そして互いに対して比較されたとき、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。抗体、またはその機能的フラグメントのＣＤＲをいうための上記３つの定義の任意の適用は、本明細書で規定および用いられるような用語の範囲内であることが意図される。上記引用される参考文献の各々により規定されるように、ＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として以下の表１に提示される。特定のＣＤＲを包含する正確な残基の数は、ＣＤＲの配列およびサイズに依存して変動する。当業者は、抗体の可変領域アミノ酸配列が与えられれば、どの残基が特定のＣＤＲを構成するかを慣用的に決定し得る。
【００２４】
（表１）
ＣＤＲ定義
Ｋａｂａｔ１　Ｃｈｏｔｈｉａ２　ＭａｃＣａｌｌｕｍ３
ＶＨ　ＣＤＲ１　３１−３５　　　２６−３２　　　　３０−３５
ＶＨ　ＣＤＲ２　５０−６５　　　５２−５６　　　　４７−５８
ＶＨ　ＣＤＲ３　９５−１０２　　９５−１０２　　　９３−１０１
ＶＬ　ＣＤＲ１　２４−３４　　　２４−３４　　　　３０−３６
ＶＬ　ＣＤＲ２　５０−５６　　　５０−５６　　　　４６−５５
ＶＬ　ＣＤＲ３　８９−９７　　　８９−９７　　　　８９−９６
１　残基番号付は、Ｋａｂａｔら、前述の命名に従う。
２　残基番号付は、Ｃｈｏｔｈｉａら、前述の命名に従う。
３　残基番号付は、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、前述の命名に従う。
【００２５】
本明細書中で用いられる場合、用語「会合速度」は、結合性ポリペプチドおよびリガンドが複合体を形成するために結合するようになる時間をいう。本明細書における用語の使用は、当該技術分野で公知であるような用語の意味と一致することが意図される。この会合速度は、結合性ポリペプチドおよびリガントを含む種の混合物中の、リガンドに結合した結合性ポリペプチドから構成される種の時間依存性出現、フリーの結合性ポリペプチドの時間依存性消失またはフリーのリガンドの時間依存性消失と相関し得る。フリーの結合性ポリペプチド種は、少なくとも１つのリガンドを結合するためにコンピテントである結合性ポリペプチドをいい、そしてフリーのリガンドは、少なくとも１つの結合性ポリペプチドを結合するためにコンピテントであるリガンドをいう。用語会合速度の範囲は、ｋｏｎを含むことが意図される。この会合速度は、当該技術分野で、ｋｏｎに比例すること、およびＫａおよびｋｏｆｆの積に比例することが知られている。
【００２６】
結合性ポリペプチドおよびリガンドに関連して用いられるとき、本明細書中で用いられる場合、用語「会合すること」は、結合性ポリペプチドとリガンドとが、リガンドに結合した結合性ポリペプチドの種を生じる様式で互いに接触するプロセスをいうことが意図される。用語会合することの使用は、それが当該技術分野で公知のようなこの用語の意味と一致することが意図される。このプロセスは、リガンドに結合した結合性ポリペプチドの複合体が解離し、フリーの結合性ポリペプチドおよびフリーのリガンドを生じる逆プロセスとは異なり、そして当業者により区別され得る。
【００２７】
本明細書中で用いられる場合、用語「ｋｏｎ」は、会合速度を、フリーの結合性ポリペプチドおよびフリーのリガンドの濃度と等式化する会合速度定数をいう。この用語ｋｏｎは、それが当該技術分野で公知のようなこの用語の意味と一致することが意図される。従って、ｋｏｎは、会合速度の定量的尺度である。例えば、結合性ポリペプチドＡおよびリガンドＢが会合して結合種ＡＢを形成するとき、会合速度は、フリーの結合性ポリペプチドＡの濃度にフリーのリガンドＢの濃度を乗じた積を乗じたｋｏｎに等しい。この関係を記載する数学的等式は：会合速度＝ｋｏｎ＊［Ａ］＊［Ｂ］であり、ここで［Ａ］はポリペプチドＡの濃度、そして［Ｂ］はリガンドＢの濃度である。
【００２８】
本明細書中で用いられる場合、用語「Ｋａ」は会合定数をいい、そしてそれが当該技術分野で理解されるような意味と一致することが意図される。このＫａは、結合の強度、親和性および堅さの尺度である。詳細には、Ｋａは、平衡にある、フリーの結合性ポリペプチド、フリーのリガンドおよびリガンドに結合した結合性ポリペプチドの濃度を等式化する平衡定数である。このＫａは、平衡にある種々のリガンドに対する異なる結合性ポリペプチドの親和性を比較するために用いられ得る。例えば、同じリガンドを結合する第２の結合性ポリペプチドに対するＫａと比較してリガンドへの結合に対するより高い数値のＫａをもつ結合性ポリペプチドは、当該技術分野では、そのリガンドに対してより高い親和性を有することが理解される。このＫａは、Ｋａ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆの関係に従って、会合速度定数（ｋｏｎ）および解離速度定数（ｋｏｆｆ）と関連する。このｋｏｆｆは、当該技術分野で、会合した結合性ポリペプチドとリガンドとが分離する時間を定量化するために用いられる数学的定数である。従って、ｋｏｎは、Ｋａとｋｏｆｆの積である。Ｋａの数学的逆数は、当該技術分野では、Ｋｄまたは解離定数として公知である。従って、Ｋｄ＝１／Ｋａ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎである。従って、同じリガンドを結合する第２の結合性ポリペプチドに対するＫｄと比較してリガンドへの結合についてより低い数値のＫｄをもつ結合性ポリペプチドは、当該技術分野では、そのリガンドに対してより高い親和性を有することが理解される。
【００２９】
本明細書で用いられる用語「治療効力」は、効力または相対的効力の予測尺度をいうことが意図される。結合性ポリペプチドが治療効力を有する場合、それは、所望の治療効果を生成する。治療効力は、動力学的性質を含み、そしてリガンドと会合する結合性ポリペプチドの会合速度に比例する。従って、この用語は、病理学的状態の徴候を治癒、軽減、除去または少なくするか、または病理学的状態にかかる可能性を防ぐかまたは低減する、結合性ポリペプチドとリガンドとの間の迅速な会合の影響を反映する。リガンドと会合するとき増加したｋｏｎを有する結合性ポリペプチドは、リガンドとのより迅速な会合を示し、それによって同じリガンドと会合するときより低いｋｏｎを有する親ポリペプチドまたはその他のポリペプチドと比較して改善された治療効力を有する。
【００３０】
本明細書中で用いられる場合、用語「治療コントロール」は、治療効力を決定または同定するとき結合性ポリペプチドが比較され得、そして結合性ポリペプチドが標的にする病理学的状態に関連する分子をいう。例えば、病状を処置することにおいて効力を示したことより、病理学気的状態と関連するリガンドと相互作用を示したこと、または病状を処置するために見込みがあると当該技術分野で同定された性質を有することにより、分子は、病理学的状態に関連し得る。この用語の範囲は、両者が同一のリガンドを結合し得る限り、結合性ポリペプチドと比較して構造的類似性または差異とは関係なくすべての分子を含むことが意図される。この分子は、例えば、天然に存在する分子、合成分子、化合物または高分子であり得る。
【００３１】
親ポリペプチドを参照して用いられるとき、本明細書中で用いられる場合、用語「変化すること」は、親ポリペプチドの構造を改変することをいう。親ポリペプチドの構造の改変は、例えば、成分を付加すること、アミノ酸を欠失すること、アミノ酸を置換すること、またはアミノ酸を化学的に改変することを含み得る。置換され得る成分は、例えば、化学的に誘導体化されたアミノ酸、アミノ酸のＤ−立体異性体、天然に存在しないアミノ酸、アミノ酸アナログまたはアミノ酸の模倣物を含む。アミノ酸の化学的改変は、例えば、α位置、リジン、ヒスチジン、アルギニン、またはトリプトファンにおけるアミノ基の結合構造における共有結合変化；α位置、アスパルテートまたはグルタメートにおけるカルボニルの結合構造における共有結合変化；またはシステイン、シスチンまたはメチオニンにおけるイオウの結合構造の共有結合変化を含む。
【００３２】
会合速度を参照して用いられるとき、本明細書中で用いられる場合、用語「測定すること」は、少なくとも１つの規定された時間間隔で、リガンドに結合した結合性ポリペプチドから構成される種の出現に相関する決定をいう。従って、この用語は、結合性ポリペプチドがリガンドに結合する時間の量または速度の決定を包含する。会合速度の決定は、非平衡状態で実施されるとき意味がある。非平衡状態は、例えば、フリーのリガンドの、フリーの結合性ポリペプチドとの混合の後に生じ得るプレ平衡、および平衡混合物中の種の濃度を改変した後に生じ得るポスト平衡を含み得る。会合速度のポスト平衡決定は、例えば、ｋｏｆｆの決定、およびこの値を用いて、結合性ポリペプチドおよびリガンドに対して測定されたＫａまたはＫｄからｋｏｎを算出することを含む。
【００３３】
会合速度のプレ平衡決定は、相対的決定、定量的決定または時間ベースの選択を含む。相対的決定は、個々の速度の定量が必要でないように、類似の条件下で、２つの結合性分子に対する会合の速度を比較する工程を含む方法を含む。定量的決定は、会合速度またはｋｏｎのような速度定数の数値を決定するための方法を含む。時間ベースの選択は、例えば、結合性ポリペプチドが、リガンドと、特定された時間間隔で結合した種を選択するように会合するときに生じるリガンドまたは結合性ポリペプチドの性質の変化を利用することを含む。
【００３４】
リガンドに結合した結合性ポリペプチドから構成される種の出現に相関する決定は、結合性ポリペプチドがリガンドと会合するとき変化する任意の性質について、第１の状態から第２の状態への時間依存変化を含み、このような性質には、例えば、熱の吸収および放出、電磁放射の吸収および放出、取り囲む溶媒の屈折率、レセプターに対する親和性、分子量、密度、電荷、極性、分子形状、または分子サイズが挙げられる。結合性ポリペプチドがリガンドと会合するとき変化する性質は、結合性ポリペプチドがリガンドに結合する間に第１の状態に戻る、一時的であり得るか、または結合性ポリペプチドおよびリガンドが結合している全時間第２の状態のままであり得る。
【００３５】
本明細書中で使用されるように、用語「同定する」とは、増加した会合速度を有する結合性ポリペプチドに関して使用される場合、結合性ポリペプチドを増加した会合速度を有するとして認識することをいう。増加した会合速度を有する結合性ポリペプチドは、集団から単離される前に、集団から単離された後に、認識され得るか、または結合性ポリペプチドを集団から単離するプロセスは、増加した会合速度を有する結合性ポリペプチドを認識する形態であり得る。増加した会合速度を有する結合性ポリペプチドは、その会合速度またはｋｏｎ値を別の結合分子についての会合速度またはｋｏｎ値と比較することにより、またはより迅速な会合速度に基づいて結合性ポリペプチドを選択することにより認識され得る。従って、改善された会合速度またはｋｏｎを有する結合性ポリペプチドを認識することは、手動の方法または自動化された方法を含み得る。
【００３６】
本明細書中で使用されるように、用語「病理学的状態」とは、疾患または異常状態（例えば、哺乳動物細胞または組織の傷害を含む）をいう。病理学的状態は、望ましくないまたは異常な細胞増殖、生存性、または増殖を生じる疾患または異常状態であり得る。調節されないまたは異常な細胞増殖によって特徴付けられる病理学的状態としては、例えば、癌または他の新生物形成状態、感染性疾患、または自己免疫疾患が挙げられる。例えば、癌細胞は、望ましくない様式で増殖し、結果として、組織破壊を生じる。同様に、自己免疫疾患を媒介する細胞の増殖は異常に調節され、例えば、宿主の細胞および組織の破壊を伴う、免疫機構のとぎれない増殖および活性化を生じる。癌の具体的な例としては、前立腺癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、子宮癌、脳癌、および皮膚癌が挙げられる。感染性疾患の具体的な例としては、ＤＮＡウイルス疾患またはＲＮＡウイルス疾患、細菌性疾患、寄生生物疾患が挙げられ、一方、自己免疫疾患としては、例えば、糖尿病、慢性関節リウマチ、および多発性硬化症が挙げられる。
【００３７】
本発明は、リガンドとの会合について少なくとも約９×１０７Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎを有し、そして治療効力を有する、結合性ポリペプチドまたはその機能的フラグメントを提供する。
【００３８】
治療効力を有する結合性ポリペプチドは、治療効果を示し、そしてリガンドとの迅速な会合を呈し、病理学的状態の症状を治癒する、緩和する、除去する、または弱める、あるいは病理学的状態に罹患する可能性を防ぐまたは減少させる。治療効力を有する本発明の結合性ポリペプチドは、高い効力の結合性ポリペプチドとして理解される。治療効力は、速度論特性、特に、リガンドと会合する結合性ポリペプチドについての会合速度に従って、インビトロで同定され得る。治療効力を有する結合性ポリペプチドは、例えば、リガンドと会合し、そして細胞表面上に局在するレセプターへのその結合を妨害することにより、病理学的状態を防止するかまたは減少させる結合性ポリペプチドであり得る。リガンドと会合するときに増加した会合速度を有する結合性ポリペプチドは、同じリガンドと会合するときにより低い会合速度を有するポリペプチド（結合性ポリペプチドを含む）に比較して改善された治療効力を有する。従って、会合速度は、治療効力を示し、そしてこれと相関し、従って、効力の推定尺度または相対的効力を提供する。
【００３９】
結合性ポリペプチドはまた、例えば、細胞の表面に局在するリガンドと会合することにより、病理学的状態を経験した細胞に細胞傷害性薬剤または細胞増殖抑制薬剤を送達するように、これら薬剤に付着され得る。リガンドと会合するときに増加した会合速度を有する、細胞傷害性薬剤または細胞増殖抑制薬剤に付着された結合性ポリペプチドは、同じリガンドと会合したときにより低い会合速度を有するポリペプチドに比較して改善された治療効力を有する。
【００４０】
本発明の結合性ポリペプチドは、リガンドと選択的に会合するその能力に従って同定される。結合性ポリペプチドとリガンドとの間の選択的結合は、当該分野で公知の方法によって同定され得る。選択的結合を決定する方法としては、例えば、平衡結合分析、競合アッセイ、および速度論アッセイ（Ｓｅｇｅｌ，Ｅｎｚｙｍｅ　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７５）（これは、本明細書中に参考として援用される）に記載される）が挙げられる。熱力学的定数は、互いに選択的に結合する結合性ポリペプチドとリガンドとを同定し、かつ比較するために用いられ得、そしてこれらとしては、例えば、解離定数またはＫｄ、会合定数またはＫａ、およびミカエリス定数またはＫｍが挙げられる。
【００４１】
本発明の方法において用いられ得る結合性ポリペプチドは、リガンドに結合することが知られる任意のポリペプチド、リガンドに結合するように作製された任意のポリペプチド、またはリガンドを結合し得ることが知られる任意のポリペプチドを含む。従って、本発明の結合性ポリペプチドは、レセプター、酵素、ホルモン、免疫グロブリン、抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、Ｔ細胞レセプター、インテグリン、ホルモンレセプター、レクチン、膜レセプター、トランスミッターレセプター、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ＤＮＡ修飾酵素、転写因子、ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰａｓｅ、膜チャネル、増殖因子、インスリン、サイトカイン、神経ペプチド、細胞外基質タンパク質および凝固因子、またはそれらの機能的フラグメントからなる群から選択される。
【００４２】
結合性ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドまたは天然に存在しないポリペプチドであり得る。天然に存在する結合性ポリペプチドは、例えば、このポリペプチドを天然の組織から直接単離すること、またはこのポリペプチドをコードするヌクレオチドを単離し、そして組換え系においてこのポリペプチドを発現させることにより得られ得る。当業者は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ　１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　（１９９０）；Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ　２１７，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　（１９９３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９９２），およびＡｕｓｅｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（２０００）（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載のような、当該分野で公知の方法に従って、ポリペプチドをコードするヌクレオチドを単離し、そして組換え発現系でこのポリペプチドを発現させ得る。組換えまたは天然の組織から親ポリペプチドを単離する方法は、例えば、当該分野で周知であり、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，、第３版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９４）；Ｄｕｅｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ　１８２，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ（１９９０），およびＣｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（２０００）（これらは、本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００４３】
天然に存在する結合性ポリペプチドは、例えば、合成され得るか、または組換え発現系で産生され得る。例えば、結合性ポリペプチドは、天然の供給源から単離されたポリペプチド配列またはポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列から同定され得るか、あるいは、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、配列データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋまたは当該分野で公知の他のデータベースを含む）から得られ得る。ヌクレオチドおよびポリペプチドを単離するための方法は、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出に記載されている。結合性ポリペプチドは、当該分野で周知の方法（例えば、本明細書中、以下に記載される方法を含む）を用いて組換え系において発現され得る。結合性ポリペプチドはまた、当該分野で周知の合成方法（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成、ｔ−Ｂｏｃに基づく合成、Ｆｍｏｃ合成、およびそれらの変形）によって生成され得る。
【００４４】
本発明の結合性ポリペプチドは、天然に存在しないものであり得る。天然に存在しないポリペプチドは、例えば、ポリペプチドのランダム集団から、選択され得る。天然に生じないポリペプチドのランダム化された集団）は、当該分野で周知のペプチド合成法（例えば、上記の方法を含む）によって生成され得る。ポリペプチドの集団から親ポリペプチドを選択する方法は、選択されるべき親ポリペプチドに特異的であり、そしてポリペプチドの物理的特性および化学的特性に基づいて当業者に周知の方法を用いて達成され得る。
【００４５】
本発明の結合性ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドまたは本発明の方法での使用のために改変される天然に存在しないポリペプチドであり得る。本発明の方法における結合性ポリペプチドの使用を促進するための改変としては、例えば、ポリペプチドの検出のための標識の組込み、結合性ポリペプチドの捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）のための結合基の組込み、またはポリペプチドの安定性を増加させるための改変が挙げられる。組込まれ得る標識としては、例えばフルオロフォア、発色団、常磁性のスピン標識、または放射性核種が挙げられる。ポリペプチドを捕捉するために使用され得る結合基は、例えば、ビオチン、ポリヒスチジンタグ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、抗体エピトープ（例えば、ｆｌａｇペプチド（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ　Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、セルロース結合ドメイン（Ｎｏｖａｇｅｎ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、カルモジュリン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ブドウ球菌プロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ；Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、マルトース結合タンパク質（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ；Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，ＭＡ）またはストレップ（ｓｔｒｅｐ）−タグ（Ｇｅｎｏｓｙｓ；Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ、ＴＸ）あるいはそれらのマイナーな改変が挙げられる。安定性を増加させるための改変としては、例えば、チオエーテル架橋を形成するためのシステインの組込み、プロテアーゼ認識配列の除去、イオン相互作用を促進するための荷電アミノ酸の付加、または疎水性相互作用を促進するための疎水性アミノ酸の付加が挙げられる。本発明の方法は、このような改変がこの結合性ポリペプチドの結合活性を阻害しない限り、本発明の結合性ポリペプチドにさらなる特性を与え得る他の改変も適用し得る。例としては、アミノ酸の付加、アミノ酸の欠失、アミノ酸の置換、アミノ酸の化学修飾、および非天然アミノ酸の組込みが挙げられる。
【００４６】
本発明の結合性ポリペプチドは、結合活性を有意に変化させないマイナーな構造的改変を含むことをが意図される。例えば、その結合性ポリペプチドと比較してマイナーな構造的改変および類似の結合活性を有し、そして本発明の結合性ポリペプチドの範囲に含まれる、結合性ポリペプチドのホモログまたはアイソタイプが単離され得るか、または合成され得る。当業者は、構造的相同性の領域を同定するために、例えば、アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ２（ＡｌｔｓｃｈｕｌｌおよびＧｉｓｈ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０−４８０（１９９６））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７−２５８（１９９６））またはＳＳＥＡＲＣＨ（Ｐｅａｒｓｏｎ、前出））を用いてそれらの配列を整列させることによりホモログまたはアイソタイプを同定し得る。当業者はまた、ポリペプチド構造を比較するアルゴリズムを用いて、ホモログまたはアイソタイプを同定し得る。このポリペプチド構造を比較するアルゴリズムとしては、例えば、ＨａｄｌｅｙおよびＪｏｎｅｓ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　７：１０９９−１１１２（１９９９）において総説される、ＳＣＯＰ、ＣＡＴＨ、またはＦＳＳＰが挙げられる。配列および構造のアラインメントアルゴリズムを参照するこれら刊行物は、本明細書中に援用される。部位特異的突然変異誘発方法（例えば、本明細書中に記載される方法）を使用して、適切な変化を作製し、本発明の結合性ポリペプチドと類似の会合速度および治療効力を有するように相同ポリペプチドを改変し得る。会合速度、および従って、治療効力に対して有意でない影響を有する、相同な結合性ポリペプチド間の差異は、マイナーな改変であるとみなされる。例えば、第２の種由来の第２の抗体は、本発明の方法において産生または使用された第１の種由来の第１の抗体と比較した場合、リガンドと会合する場合の類似の会合速度を有するように改変され得る。
【００４７】
結合活性を有意に変化させないマイナーな改変としては、例えば、リガンドと接する結合性ポリペプチドの領域の機能に影響しない結合性ポリペプチド中に作製される変化、結合性ポリペプチドとリガンドとの間の相互作用に影響しない１つ以上のアミノ酸の保存的置換、および機能的に同等なアミノ酸の置換が挙げられる。リガンドと接する結合性ポリペプチドの領域の機能に影響しない領域に作製される変化としては、例えば、１つ以上のアミノ酸の付加、１つ以上の成分の付加、１つ以上のアミノ酸の欠失、１つ以上のアミノ酸の置換または１つ以上のアミノ酸の化学修飾が挙げられる。マイナーな改変は、アミノ酸の保存的置換であり得る。コードされるアミノ酸の保存的置換は、例えば、以下の群内に属するアミノ酸を含む：（１）非極性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ）；（２）極性中性アミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、およびＧｌｎ）；（３）極性酸性アミノ酸（ＡｓｐおよびＧｌｕ）；（４）極性塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓ）；および（５）芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＨｉｓ）。他のマイナーな改変は、その結合性ポリペプチドが結合活性を保持する限り含まれる。機能的に同等のアミノ酸置換は日常的であり、当業者に公知の方法によって達成され得る。手短に言うと、機能的に同等のこのアミノ酸置換は、変化されることが望まれるアミノ酸を同定し、コードする核酸中にその変化を組込み、次いで組換え的に発現されそして改変された結合性ポリペプチドの機能を同定することによって作製され得る。
【００４８】
本発明はまた、リガンドに対し少なくとも約１．３×１０６Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎを有しかつ治療効力を有する、グラフト化抗体またはその機能的フラグメントを提供する。
【００４９】
本発明の１つの実施形態において、治療効力または高い効力を有する結合性ポリペプチドは、グラフト化抗体であり得る。グラフト化抗体およびグラフト化抗体を作製する方法は、本明細書中で前述されている。従って、抗体またはその機能フラグメントは、ヒト定常領域、あるいは少なくとも一部分が１つ以上のヒト抗体由来である重鎖または軽鎖フレームワーク領域を有し得る。抗体またはフラグメントで使用される重鎖または軽鎖フレームワーク領域は、特定の抗体由来であり得るか、またはヒト抗体のコンセンサス配列由来であり得る。治療効力を有するグラフト化抗体は、本発明の方法によって産生され得るか、または同定され得る。本発明の抗体またはその機能フラグメントは、ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）以外の抗体であり得る。
【００５０】
本発明はまた、リガンドに対し少なくとも約９×１０７Ｍ−１ｓ−ｌのｋｏｎを有し、そして治療効力を有する、ヒト抗体またはその機能フラグメントを提供する。ヒト抗体を同定および産生するための方法は、当業者に周知であり、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（前書）に記載される方法が挙げられる。
【００５１】
本発明の抗体または免疫グロブリンは、中和抗体または中和免疫グロブリンであり得る。この用語「中和」とは、生物体内または培養される細胞内の微生物またはウイルスを減少させる能力をいう。従って、治療効力を有する抗体またはその機能フラグメントは、微生物（例えば、ウイルス、細菌、または真菌）に見出される抗原決定基に対する特異性を有し得る。抗体またはその機能フラグメントが特異性を有し得るウィルスの例としては、ＲＳウイルスまたはパラインフルエンザウイルスがある。本発明の中和抗体またはその活性フラグメントを含む中和免疫グロブリンは、ウイルス（例えば、ＲＳＶまたはＰＩＶ）によって発現される少なくとも１つのタンパク質に特異的であり得る。ＲＳＶによって発現されるタンパク質は、Ｆタンパク質（Ｆプロテイン）であり得る。
【００５２】
本発明は、結合性ポリペプチドの治療効力の定量方法を提供する。この方法は、以下：（ａ）結合性ポリペプチドをリガントと接触させる工程；（ｂ）その結合性ポリペプチドとリガントとの間の結合についての会合速度を測定する工程；および（ｃ）その結合性ポリペプチドについての会合速度を、治療コントロールについての会合速度と比較する工程からなり、この治療コントロールについての会合速度と比較した結合性ポリペプチドについての相対的な会合速度は、結合性ポリペプチドが、会合速度の間の差異と相関して治療効力における差異を示すことを示す。本発明はさらに、会合速度がｋｏｎによって示される方法を提供する。例えば、本発明の結合性ポリペプチドのｋｏｎは、少なくとも約８×１０６Ｍ−１ｓ−ｌであり得る。本発明の結合性ポリペプチドはまた、少なくとも約９×１０６Ｍ−１ｓ−ｌ、１×１０７Ｍ−１ｓ−ｌ、２×１０７Ｍ−１ｓ−ｌ、３×１０７Ｍ−１ｓ−ｌ、４×１０７Ｍ−１ｓ−ｌ、５×１０７Ｍ−１ｓ−ｌ、６×１０７Ｍ−１ｓ−ｌ、７×１０７Ｍ−１ｓ−１、８×１０７Ｍ−１ｓ−ｌ、９×１０７Ｍ−１ｓ−ｌ、または１×１０８Ｍ−１ｓ−１以上のｋｏｎを有し得る。より低いｋｏｎを有する結合性ポリペプチドもまた、治療効力を有し得る。例えば、治療上有効なポリペプチドは、８×１０６Ｍ−１ｓ−１未満のｋｏｎを有し得る。従って、１×１０４Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎを有するポリペプチドが治療効力を有し得る場合、１×１０６Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎを有する結合性ポリペプチドは、治療効力を有し得る。従って、治療上有効なポリペプチドは、約５×１０４Ｍ−１ｓ−１、１×１０５Ｍ−１ｓ−１、２．５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−ｌ、５×１０５Ｍ−１ｓ−１、または７．５×１０５Ｍ−１ｓｅｃ−ｌのｋｏｎ値を有し得る。
【００５３】
会合速度は、任意の非平衡混合物（例えば、結合性ポリペプチドとリガンドとを迅速に接触させることによって、または温度を迅速に変えることによって形成される非平衡混合物）中で定量され得る。非平衡混合物は、プレ平衡（ｐｒｅ−ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）混合物であり得る。プレ平衡混合物は、例えば、検出チャンバー内の総リガンド量と総結合性ポリペプチド量が一定である条件において、可溶性結合性ポリペプチドと可溶性リガンドとを接触させることによって形成され得る。プレ平衡混合物中の会合速度の測定は、結合性ポリペプチドのリガンドとの迅速な混合、およびミリ秒またはより速いタイムスケールでの結合性ポリペプチドまたはリガンドの変化する特性の迅速な検出を提供する形式において実施され得る。停止流動装置および迅速クエンチ（ｒａｐｉｄ　ｑｕｅｎｃｈ）流動装置（例えば、以下に記載される装置）は、非平衡速度論を測定するための簡便な手段を提供する。この会合速度はまた、例えば、不溶性種の結合性ポリペプチド、リガンドまたはリガンドに結合した結合性ポリペプチドを含む溶液、あるいは変動する濃度の総リガンドおよび総結合性ポリペプチドを含む、非平衡混合物においても測定され得る。非平衡混合物での会合速度の測定は、表面へのリガンドの結合およびその表面にわたる結合性ポリペプチドを含む溶液の連続的な流れを提供する形式またはその逆の形式で、その結合性ポリペプチド、リガンドまたは表面の変化する性質の迅速な検出と組み合わせて、測定がミリ秒またはより速いタイムスケールで実施されるように、実施され得る。非平衡混合物の会合速度の測定を提供する形式の例としては、以下に記載されるような、表面プラスモン共鳴装置およびエバネッセント波装置が挙げられる。
【００５４】
会合速度の測定のために混合物中で接触させられる結合性ポリペプチドとリガンドは、それらがそれらのリガンドまたは結合性ポリペプチドパートナーとそれぞれ結合し得る限り、別の分子、リガンドまたは表面に結合され得る。結合性ポリペプチドまたはリガンドに結合され得る分子としては、例えば、標識および結合基（例えば、結合性ポリペプチドに組込むための本明細書中に以前に記載される標識および結合基）が挙げられる。結合されるリガンドは、例えば、結合性ポリペプチドとリガンドとの間で結合が生じる場合に競合的に置換される阻害剤、結合が結合性ポリペプチドと目的のリガンドとの間で生ずるように結合性ポリペプチドに結合する第２のリガンド、または結合が目的の結合性ポリペプチドとリガンドとの間で生ずるようにリガンドに結合する第２の結合性ポリペプチドを含み得る。結合される表面は、例えば、デキストラン表面、ポリマービーズ、生物学的膜または任意のバイオセンサー表面を含む。
【００５５】
会合速度測定は、結合状態と非結合状態との間で存在する結合性ポリペプチドまたはリガンドの特性における変化を検出することにより、あるいは結合性ポリペプチドとリガンドとが会合する場合、その周囲の環境における変化を検出することにより、成され得る。会合の際に変化し得、そして会合速度を測定するために使用され得る、結合性ポリペプチドまたはリガンドの特性としては、例えば、熱の吸収と放出、電磁放射線の吸収と放出、レセプターに対する親和性、分子量、密度、質量、電荷、伝導性、核磁気モーメント、電子のスピン状態、極性、分子形状または分子サイズが挙げられる。結合性ポリペプチドがリガンドと会合する場合に変化し得る周囲の環境の特性としては、例えば、温度および周辺溶媒の屈折率を含む。
【００５６】
プレ平衡混合物中の会合速度を測定するための形式は、例えば、停止流動運動速度論装置および迅速クエンチ流動装置を含む。停止流動装置は、検出セル中に通過させる直前に結合性ポリペプチドおよびリガンドを含む溶液を別々のリザーバーから混合チャンバー中に押し出すために使用され得る。次いで、この装置は、結合事象の進行をモニターするために１つ以上の上記の特性における変化を検出し得る。迅速クエンチ流動装置は、結合性ポリペプチドを含む溶液をリガンドを含む溶液と迅速に混合し、その後、制限された時間後に、その結合反応をクエンチ（ｑｕｅｎｃｈ）するために使用され得る。次いで、１つ以上の上記の特性における変化は、混合後の異なる時間でのクエンチにより産生された、クエンチされた混合物について検出され得る。クエンチは、クエンチ工程が、結合速度の測定のために依存する特性の検出を阻害しない限り、例えば、凍結または化学クエンチ剤の添加により実施され得る。従って、迅速クエンチ装置は、例えば、分光器検出が便利でない状況において有用であり得る。種々の装置が、販売者（例えば、ＫｉｎＴｅｋ　Ｃｏｒｐ．（Ｓｔａｔｅ　Ｃｏｌｌｅｇｅ、ＰＡ）およびＨｉ−Ｔｅｃｈ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ、ＵＫ））から商業的に入手可能である。
【００５７】
非平衡混合物における会合速度を測定するための形式としては、例えば、表面プラスモン共鳴装置およびエバネッセント波装置が挙げられる。表面プラスモン共鳴およびエバネッセント波技術は、バイオセンサー表面に結合されたリガンドまたは結合性ポリペプチド、ならびに、それぞれ、結合性ポリペプチドまたはリガンドのいずれかを含む溶液を利用し、この溶液を、そのバイオセンサー表面上に通過させる。結合性ポリペプチドがリガンドと会合する場合の、チップ表面に生ずる溶液の屈折率における変化が、時間依存性方式で測定され得る。例えば、表面プラスモン共鳴は、表面プラスモン波が金属／液体界面で励起される場合に生ずる現象に基づく。光は、サンプルと接触しない表面側に指向され、そしてそこから反射され、そしてＳＰＲは、角度と波長との特定の組み合わせで、その反射する光の強度の減少を引き起こす。生体分子結合事象は、表面層での屈折率における変化を引き起こし、これが、ＳＰＲシグナルにおける変化として検出される。その結合事象は、レセプター−リガンド対間の結合の会合または解離のいずれかであり得る。屈折率における変化は、本質的に瞬間的に測定され得、従って、親和性定数の個々の成分（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）の同定を可能にする。さらに詳細には、この方法は、会合速度（ｋｏｎ）および解離速度（ｋｏｆｆ）の正確な測定を可能にする。表面プラスモン共鳴装置は、当該分野で利用可能であり、これらとしては、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ装置、ＩＢＩＳシステム、ＳＰＲ−ＣＥＬＬＩＡシステム、Ｓｐｒｅｅｔａ、およびＰｌａｓｍｏｎ　ＳＰＲが挙げられ、そしてエバネッセント波技術は、Ｉａｓｙｓシステム（例えば、ＲｉｃｈおよびＭｙｓｚｋａ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：５４−６１（２０００）に記載されるように）において利用可能である。
【００５８】
会合速度は、リガンドまたは結合性ポリペプチドの特性における変化を、例えば、上記の方法を用いて、結合事象中の１つ以上の別個の時間間隔で測定することにより決定され得る。結合事象中の別個の時間間隔で定量される測定は、会合速度の定量的尺度または会合速度の相対的な尺度を決定するために使用され得る。会合速度の定量的尺度としては、例えば、会合速度値またはｋｏｎ値が挙げられ得る。会合速度またはｋｏｎの定量的値は、時間依存性測定の数学的解析または図式解析から決定され得る。このような解析は、当該分野で公知であり、そして指数関数的または直線的な項（ｔｅｒｍ）の集合（ｓｕｍ）に対してデータを当てはめるためのアルゴリズム、あるいは、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．９：８７−８９（１９９８）（本明細書中に参考として援用される）に記載されるような結合モデルにデータを当てはめるためのコンピューターシミュレーションについてのアルゴリズムを含む。
【００５９】
会合速度は、質量輸送の影響が溶液中で考慮される場合、不溶性種を含む混合物あるいは可変濃度の総リガンドまたは総結合性ポリペプチドを含む混合物から数学的解析または図式解析（例えば上記の解析）を用いて決定され得る。当業者は、質量輸送に関する類似の制限を有する条件下で会合速度を比較することによってか、または当該分野で入手可能なモデル（例えば、Ｍｙｓｚｋａら、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７５：５８３−５９４（１９９８）（本明細書中に参考として援用される）に記載されるモデルを含む）に従って計算された会合速度を調整することにより、質量輸送を考慮し得る。
【００６０】
会合速度またはｋｏｎのいずれかのより高い値は、改善された治療効力を示す。従って、定量的測定は、使用される方法が当業者によって首尾一貫した結果を生ずると理解される限り、異なる方法によって定量された結合性ポリペプチドと治療コントロールとの会合速度間の比較を可能にすることによって利点を提供する。
【００６１】
会合速度の相対的な測定は、例えば、類似の条件下でリガンドに結合する２つ以上の結合性ポリペプチドについての会合速度の比較、または予め規定された速度とのリガンドへの結合性ポリペプチドの結合についての会合速度の比較を含み得る。２つ以上の結合性ポリペプチドについての会合速度の比較は、既知の会合速度の標準または既知の治療効果の分子を含み得る。比較について使用される予め規定された速度は、以前に測定された速度（例えば、科学的な文献またはデータベースで入手可能な速度を含む）に関連するように測定を校正することによって決定され得る。予め規定された速度との比較の例は、時間始動型選択デバイスを用いることによる、予め規定された速度によって規定される別個の時間間隔でのリガンドに結合された結合性ポリペプチドの種の選択である。
【００６２】
本発明の利点は、その方法が、病理学的状態を媒介するかまたは病理学的状態に特異的に関連する任意のリガンドと使用され得ることである。この方法はまた、病理学的状態を媒介するかまたは病理学的状態に特異的に関連するリガンドの構造的に改変された付加物（ａｄｄｕｃｔ）、あるいは病理学的状態を媒介するかまたは病理学的状態に特異的に関連するリガンドの結合機能を模倣するリガンドと一緒に使用され得る。構造的改変は、本発明の方法におけるリガンドの使用を容易にし得、そして、例えば、リガンドの決定のための標識の組込み、リガンドの捕捉のための結合基の組込み、またはリガンドの安定性を増加させるための改変を含み得る。標識、結合基、および安定性を増加させるための改変としては、例えば、ポリペプチド中への組込みについて本明細書中で前に記載されたものが挙げられる。結合性ポリペプチドとのその機能的な会合に影響する物理的相互作用のサブセットへとその結合相互作用を偏らせるためにリガンドの模倣物を使用することもまた、有利であり得る。リガンドと結合性ポリペプチドとが会合するのを可能にする物理的相互作用としては、例えば、水素結合、イオン力、ファンデルワールス相互作用、または疎水性相互作用、あるいはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００６３】
本発明の方法で使用されるリガンドは、当業者に公知の種々の方法によって合成され得るかまたは天然供給源から単離され得る。リガンドを合成するための合成方法は、例えば、有機合成、抽出された細胞成分を用いた無細胞合成、および化学合成を含む。ポリペプチドまたは核酸であるリガンドは、例えば、以下に記載の方法と類似の方法を用いる組換え発現系において、合成され得る。さらに、リガンドは、宿主中間体または外因的に供給された中間体をリガンドに変換する１つ以上の酵素を発現するように改変された、組換え生物において産生され得る。天然供給源からのリガンドの単離は、当業者に公知の方法によって実施され得る。例えば、ポリペプチドベースまたは核酸ベースのリガンドは、親のポリペプチドまたは結合性ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸について、本明細書中に記載されるように単離され得る。低分子リガンドは、例えば、抽出、クロマトグラフィー、結晶化、または蒸留を含む、当該分野で公知の方法に従って単離され得る。低分子の単離方法は、例えば、ＧｏｒｄｏｎおよびＦｏｒｄ、Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔ’ｓ　Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ、Ｊｏｈｎ　ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（１９７３）ならびにＶｏｇｅｌ、Ｖｏｗｅｌ’ｓ　Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第５版、Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ　Ｐｕｂ．Ｃｏ．（１９８９）において見出され得る。
【００６４】
改善された治療効力を有する結合性ポリペプチドは、結合性ポリペプチドとリガンドとの間の結合についての会合速度を、そのリガンドへの治療コントロールの結合についての会合速度と比較することにより、決定または同定され得る。治療コントロールの治療効力は、リガンドに会合するその会合速度に関連するので、その治療コントロールは、インビトロで測定される会合速度に従って治療効力を決定する手段を提供する。
【００６５】
治療コントロールは、その分子が、比較される結合性ポリペプチドと同じリガンドに会合する限り、任意の分子であり得る。本発明の治療コントロールとしては、例えば、レセプター、酵素、ホルモン、免疫グロブリン、抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、Ｔ細胞レセプター、インテグリン、ホルモンレセプター、レクチン、膜レセプター、トランスミッターレセプター、プロテアーゼ、オキシドレダクターゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ＤＮＡ修飾酵素、転写因子、ＧＴＰａｓｅ、ＡＴＰａｓｅ、膜チャネル、増殖因子、インスリン、サイトカイン、神経ペプチド、細胞外基質タンパク質、凝固因子、またはそれらの機能フラグメントが挙げられる。
【００６６】
比較の目的については、結合性ポリペプチドとリガンドとの会合速度は、治療コントロールとその同じリガンドとの会合速度に相関して決定され得る。比較はまた、治療コントロールとリガンドについての定量的会合速度と比較される、結合性ポリペプチドとリガンドについての定量的会合速度に従って行われ得る。相対的な会合速度または定量的会合速度は、上記の方法によって決定され得る。リガンドと会合する結合性ポリペプチドについての会合速度の決定は、条件が、有効な比較を可能にするのに各々のアッセイにおいて十分に類似する限り、結合性ポリペプチドと治療コントロールとを同時に、または別々の時点で実施され得る。従って、本発明の方法によって決定される、結合性ポリペプチドについて会合速度は、治療コントロールについての先に測定された会合速度と比較され得る。
【００６７】
本発明は、結合性ポリペプチドの治療効力の測定方法を提供する。この方法は、以下からなる：（ａ）結合性ポリペプチドをリガンドと接触させる工程；（ｂ）結合性ポリペプチドとリガンドとの間の結合についての会合速度を測定する工程；（ｃ）結合性ポリペプチドについての会合速度を治療コントロールについての会合速度と比較する工程であって、治療コントロールについての会合速度と比較した結合性ポリペプチドについての相対的な結合速度は、その結合性ポリペプチドが、会合速度の間の差異と相関して、治療効力における差異を示すことを示す、工程、および（ｄ）結合性ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸を変更し、そして工程（ａ）から（ｃ）を１回以上繰り返す工程。さらに、工程（ａ）から（ｄ）が、１回以上繰り返され得、そして工程（ｃ）で終了され得る。増加された会合速度は、改善された治療効力と相関し、ここで、会合速度における増加は、少なくとも４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍、あるいはそれ以上であり得る。
【００６８】
上記したように、工程（ａ）から（ｃ）は、会合速度を測定することによる、結合性ポリペプチドの治療効力を決定するための本明細書に先に記載の方法によって実施され得る。上記の工程（ｄ）は、当業者が、本発明の方法を用い、結合性ポリペプチドを変化させること、および会合速度から変化した結合性ポリペプチドの治療効力における差異を同定することにより、結合性ポリペプチドの治療効力を変化させることにおいて利点を提供する。結合性ポリペプチドの治療効力は、リガンドを結合するときに増加または減少した会合速度を有するか、または新たなリガンドを結合するときに増加した会合速度を有するように、結合性ポリペプチドを変化させることにより改変され得る。新たなリガンドに結合することにより改善された治療効力を有するように本発明の方法により変化した結合性ペプチドは、当初のリガンドに対する実質的に改変されていない会合速度を有し得るか、または当初のリガンドに対する会合速度における増加または減少を有し得る。変化した結合性ポリペプチドへの新たなリガンドの結合は、当初のリガンドの結合と競争的であり得るか、当初のリガンドの結合と非競争的であるか、または当初のリガンドの結合とアロステリックであり得る。２つのリガンドの、結合性ポリペプチドへの競争的、非競争的およびアロステリック結合は、Ｓｅｇｅｌ、前述に記載のような当該分野で利用可能な方法により認識され得る。
【００６９】
治療効力を変化させるためにポリペプチド中で変化されるアミノ酸は、ランダムに取り込まれ得るか、または結合性ポリペプチドとリガンドとの間の相互作用の知識に基づき取り込まれ得る。ランダム取り込みは、例えば、１つ以上の規定された位置で２０の天然に存在するアミノ酸残基の各々、またはそのサブセットを取り込むこと、またはポリペプチドまたはその一部分中のランダムな位置で２０の天然に存在するアミノ酸残基の各々、またはそのサブセットを取り込むことを含む。例えば、ポリペプチドの一部分は、ランダムに変化して、すべての２０の天然アミノ酸またはそのサブセットを取り込み得る。ポリペプチド中のランダム部位を変化する例として、ポリペプチドは、すべての２０の天然アミノ酸またはそのサブセットを取り込むことにより、その全配列に沿ってランダムに変異され得る。
【００７０】
結合性ポリペプチドとリガンドとの間の相互作用の知識は、部位特異的変化を案内し、ランダム変化を偏らせ、または偏位変化を生成するために用いられ得る。例えば、当初の結合性ポリペプチドの残基がリガンドと相互作用することが知られている場合、これらの残基は、同じ部位で、第２のリガンドとの相互作用に順応するかまたはもたらすように改変され得る。結合性ポリペプチドとリガンドとの間の相互作用の知識は、例えば、リガンドと相互作用する結合性ポリペプチドにおける残基の同定、結合性ポリペプチド結合部位の構造または機能に影響する残基の同定、または結合性ポリペプチドリガンド結合部位の近位にある残基の同定を含み得る。このような相互作用は、結合性ポリペプチド、リガンド、またはリガンドに結合した結合性ポリペプチドの構造および機能に関する情報に由来し得る。
【００７１】
構造および機能情報を用い、結合性ポリペプチドとリガンドとの間の相互作用を同定し得る。例えば、相互作用は、構造モデル、アミノ酸配列、機能的結合データ、または結合性ポリペプチドのアミノ酸を選択的に改変する試薬で標識された部位または領域の同定から同定され得る。結合性ポリペプチドの構造モデルは、例えば、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴分光光度法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡、Ｘ線散乱、または中性子散乱に由来し得る。構造モデルは、結合性ポリペプチドの構造、リガンドの構造、または結合性ポリペプチドおよび結合リガンドの両方の構造を含み得る。構造モデルとの組合せにおいて分子モデリングを用い得、結合性ポリペプチドとリガンドとの間の可能な相互作用を同定し得る。
【００７２】
結合性ポリペプチドまたはリガンドのアミノ酸配列を用い、例えば、他の結合性ポリペプチドおよびリガンドとの相同性に従って、結合性残基を決定し得る。例えば、第１の結合性ポリペプチドにおいて変化されるべきアミノ酸は、第２のポリペプチド中のリガンドと相互作用することが知られるアミノ酸への相同性に基づいて選択され得る。ここで再び、分子モデリングを相同性サーチと組合せて用い得、結合性ポリペプチドまたはリガンドに対する推定の構造をモデルし、それによって可能な相互作用するアミノ酸（複数）の同定を可能にする。
【００７３】
改変された結合性ポリペプチドを用いる機能的結合研究は、本発明の方法において、変化させる領域を同定することにおいて有用であり得る。例えば、結合性ポリペプチドのアミノ酸における変化と相関する結合活性における変化は、変化したアミノ酸位置が、リガンドと潜在的に相互作用することを示し得る。
【００７４】
ランダムに変化したポリペプチドから生成されたポリペプチドの集団のサイズは、ランダム変異誘発法中に偏り（ｂｉａｓ）を導入することにより最小にされ得る。偏りは、取り込まれる特定のアミノ酸に関して、ポリペプチドが変化するアミノ酸部位に関して、または取り込まれる特定のアミノ酸および取り込みの部位の両方に関して導入され得る。
【００７５】
偏りはまた、保存的置換に基づく特定の位置におけるランダム化中に導入され得る。アミノ酸の保存的置換は、例えば、（１）非極性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ）；（２）極性中性アミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎ）；（３）極性酸性アミノ酸（ＡｓｐおよびＧｌｕ）；（４）極性塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓ）；および（５）芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＨｉｓ）を含む。さらに、アミノ酸の保存的置換は、例えば、本明細書に参考として援用される、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、ＳｈｕｌｚおよびＳｃｈｉｒｍｅｒ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ　Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７９）中に記載されるような、同種生物の対応するタンパク質間のアミノ酸変化の頻度に基づく置換を含む。
【００７６】
ポリペプチド内のランダム化のための残基のサブセットは、ポリペプチドの性質に基づいて選択され得る。例えば、プロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、免疫グロブリン、ＤＮＡ結合性ポリペプチドおよびＲＮＡ結合性ポリペプチドの偏った変異誘発は、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２６７：５２−６８（１９９６）に記載され、ストレプトアビジンの偏った変異誘発は、ＶｏｓｓおよびＳｋｅｒｒａ、Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：９７５−９８２（１９９７）に記載され、リポカリン折り畳みを有する結合性ポリペプチドの偏った変異誘発は、Ｂｅｓｔｅら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６：１８９８−１９０３（１９９９）に記載され、成長ホルモンの偏った変異誘発は、Ｂａｌｌｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１１６７５−１１６８４（１９９８）に記載され、そして抗体の偏った変異誘発は、Ｗｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：６０３７−６０４２（１９９８）に記載されている。
【００７７】
ランダム変異誘発法および偏った変異誘発法は、領域内の残りのアミノ酸位置を改変することなく、１つ以上の選択された位置で変化を生成し得る。例えば、単一位置変化の集団は、残存する位置を変化させないままにしておきながら、ランダムまたは偏った頻度のいずれかで取り込まれた、各位置における変化したアミノ酸残基を含み得る。１０残基領域の特定の例について、集団は、残りの位置を変化させないままで、独立にランダム化されたか、または取り込まれたアミノ酸残基の偏った頻度により提示された、それぞれ、第１番目、第２番目および第３番目、続いて第１０番目までの残基を有する種を含み得る。上記に記載の特定の例には、これらの非変化位置は、それぞれ、２−１０；１、３−１０；１、２、４−１０、続いて位置１−９までに対応し得る。従って、得られる集団は、すべての単一位置変化を示す種を含む。
【００７８】
同様に、二重、三重、四重またはそれ以上のアミノ酸位置変化が、残存するアミノ酸位置を改変することなく、ポリペプチドの領域内で生成され得る。例えば、二重の位置変化の集団は、残存する位置を非変化残基としたまま、２つの位置の各セットにおいて、変化したアミノ酸残基を含む。このセットは、例えば、位置１および２、１および３、１および４、および続いて、最後のセットが領域の最初および最後の位置に対応するまでの領域のペアに対応する。この集団はまた、位置２および３、２および４、２および５、続いて領域の第２および最後の位置に対応するセットまでに対応するセットを含む。同様に、この集団は、領域の位置３で始まる位置変化のすべてのペアに対応する二重位置変化のセットを含む。位置変化の同様のペアが、アミノ酸位置の残存セットを用いてなされる。従って、この集団は、アミノ酸位置変化のすべてのペアを成す組合せを示す種を含む。同様の様式で、領域に沿って、すべての三重および四重の変化を示す変化のセットに対応する集団は、同様に、本発明の方法を用いて標的とされ得る。
【００７９】
本発明の方法は、ポリペプチドの多様な集団の生成およびスクリーニングを採用し得るので、固有に有害な変化の中和または増加および有利なアミノ酸変化の中和または増強のような、会合速度に対する影響が、単一ポリペプチド内の２つ以上のアミノ酸変化の組み合わさった相互作用に起因して生じ得る。どのアミノ酸位置または変化が固有に有利であり得るかもしくは有害であり得るか、またはどの位置または変化が第２の部位変化によりさらに増強され得るかを評価するために、先立つ情報は必要ではない。その代わりに、アミノ酸位置またはそのサブセットを選択すること、およびこれらの位置でアミノ酸改変体を含む多様な集団を生成することにより、選択された位置で生じる有利な変化の組合せが、増加または最適化された会合速度についてスクリーニングすることにより同定され得る。このような有利な組合せは、内因的に有利な残基のベールをとること、および内因的に有害な残基の中和を含む。
【００８０】
オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を用いて合成される、変化したポリペプチドの集団の効果的な合成および発現のための方法は、先の記載、例えば、本明細書に参考として援用される、Ｗｕら、前述；Ｗｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２９４：１５１−１６２（１９９９）およびＫｕｎｋｅｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４８８−４９２（１９８５）のように実施され得る。オリゴヌクレオチド特異的変異誘発は、それらの表現型とは独立に、変異を系統的に導入するための周知であり効率的な手順であり、そしてそれ故、タンパク質工学への進化アプローチを行うのに適している。この方法は柔軟であり、制限酵素の使用なくして、導入されるべき正確な変異を許容し、そして比較的安価である。要約すれば、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発を実施するために、所望の変異（単数または複数）をコードするオリゴヌクレオチドの集団を、野生型配列の一本鎖ウラシル含有テンプレートとハイブリダイズさせ、ポリメラーゼおよびリパーゼにより二本鎖環状ＤＮＡを生成し、そしてウラシル含有野生型テンプレートを複製し得ないｄｕｔ＋　ｕｎｇ＋細菌株の形質転換後、変異体ＤＮＡを効率的に回収する。
【００８１】
変化したポリペプチドの集団はまた、遺伝子シャフリングを用いて生成され得る。遺伝子シャフリングまたはＤＮＡシャフリングは、組換えにより多様性を生成する指向性進化のための方法であり、例えば、本明細書に参考として援用される、Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：１０７４７−１０７５１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ　３７０：３８９−３９１（１９９４）；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３９１：２８８−２９１（１９９８）；Ｓｔｅｍｍｅｒら、米国特許第５，８３０，７２１号に記載されている。遺伝子シャフリングまたはＤＮＡシャフリングは、選択された変異体遺伝子のプールのインビトロの相同的組換えを用いる方法である。例えば、特定遺伝子の点変異のプールが用いられ得る。例えば、ＤＮａｓｅを用いて複数の遺伝子がランダムにフラグメント化され、そしてＰＣＲにより再アセンブルされる。所望であれば、ＤＮＡシャフリングは、異なる生物からの相同遺伝子を用いて実施され、多様性を生成し得る（Ｃｒａｍｅｒｉら、前述、１９９８）。所望であれば、このフラグメント化および再アセンブリは、例えば、複数ラウンドで実施され得る。得られる再アセンブルされた遺伝子は、本発明で用いられ得る改変体の集団である。
【００８２】
すべてのコード核酸およびすべての選択されたアミノ酸位置変化の同時取り込みは、当業者に公知の種々の方法により達成され得、これには、例えば、組換えおよび化学的合成が含まれる。同時取り込みは、例えば、領域のヌクレオチド配列を化学的に合成する工程、および可変のアミノ酸残基を有するために選択された位置に、複数の対応するアミノ酸コドンを取り込む工程により達成され得る。
【００８３】
既知のアミノ酸配列において多数の改変を迅速かつ効率的に生成するため、または可変もしくはランダム配列の多様な集団を生成するための当該技術分野で周知の１つの方法は、コドンをベースにした合成または変異誘発として知られている。この方法は、米国特許第５，２６４，５６３号および同第５，５２３，３８８号の主題であり、そしてまたＧｌａｓｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１４９：３９０３（１９９２）に記載されており、これらすべては参考として本明細書に援用される。要約すれば、例えば、遺伝子コードのアミノ酸を特定する２０のコドンのすべてのランダム化のためのカップリング反応を、別個の反応ベッセル（ｖｅｓｓｅｌ）中で実施し、そして特定のコドン位置に対するランダム化は、反応ベッセルの各々の産物を混合することにより生じる。混合の後、２０のすべてのアミノ酸の等しい混合物をコードするコドンに対応するランダム化反応産物を、次いで、次の位置における各ランダム化コドンの合成のための別個の反応ベッセルに分割する。２０のすべてのアミノ酸の等しい頻度の合成のために、２までのコドンが各反応ベッセル中で合成され得る。
【００８４】
この合成法に対する改変がまた存在し、そして、例えば、所望の位置における予め決定されたコドンの合成および１つ以上のコドン位置における予め決定された配列の偏った合成を含む。偏った合成は、２つの反応ベッセルの使用を含み、ここで、予め決定されたか、または親コドンが１つの反応ベッセル中で合成され、そしてランダムコドン配列が第２のベッセル中で合成される。この第２のベッセルは、特定位置における全くランダムなアミノ酸を特定するコドンの合成のために上記したような複数の反応ベッセルに分割され得る。あるいは、縮重コドンの集団が、例えば、ＮＮＧ／Ｔヌクレオチド（ここで、Ｎは４つすべてのヌクレオチドの混合物である）のカップリングにより、第２の反応ベッセル中で合成され得る。所定のコドンおよびランダムコドンの合成の後、この２つの反応ベッセルの各々における反応産物が混合され、そして次に、次のコドン位置における合成のためにさらなる２つのベッセル中に再分割される。
【００８５】
多様な数の変化した配列を生成するため上記のコドンベースの合成に対する改変は、本明細書に記載の変化したポリペプチドの集団の生産に同様に採用され得る。この改変は、上記の２ベッセル法に基づき、これは、合成を、親配列に向かって偏らせ、そしてユーザーがランダムコドン変化を有する特定の数のコドン位置を含む集団中に改変体を分離することを可能にする。
【００８６】
要約すれば、この合成は、各コドン位置の合成の後、反応ベッセルを２つの新たなベッセルに分割することを継続することにより実施される。分割の後、第２番目のベッセルから初めて、反応ベッセルの各継続ペアからの反応産物を混合する。この混合は、ランダム変化を備えた同じ数のコドン位置を有する反応産物を引き合わせる。次いで、最初および最後のベッセルの産物および反応ベッセルの各継続ペアからの新たな混合産物を分割し、そして２つの新たなベッセルに再分割することにより合成は進行する。新たなベッセルの１つにおいて、親コドンが合成され、そして第２のベッセルでは、ランダムコドンが合成される。例えば、第１のコドン位置における合成は、１つの反応ベッセル中の親コドンの合成、および第２の反応ベッセル中のランダムコドンの合成を仕立てる。第２のコドン位置における合成には、第１番目の２つの反応ベッセルの各々を、２つのベッセルに分割し、２つのペアのベッセルを生じる。各ペアについて、親コドンがベッセルの１つで合成され、そしてランダムコドンが第２のベッセル中で合成される。直線状に配置されるとき、第２および第３のベッセル中の反応産物が混合されて、単一のコドン位置においてランダムコドン配列を有する産物を引き合わせる。この混合はまた、産物集団を３に低減し、これは、次のラウンドの合成のための開始集団である。同様に、第３、第４および各残存位置には、先立つ位置のための各反応産物集団が分割され、そして親コドンおよびランダムコドンが合成される。
【００８７】
コドンベースの合成の上記の改変の後、１、２、３および４位置におけるランダムコドン変化ならびにその他を含む集団が好都合に分離され、そして個体の必要性に基づいて用いられる。さらに、この合成スキームはまた、親配列を超えて、ランダム化配列についての集団の富化を可能にする。なぜなら、親配列合成のみを含むベッセルが、ランダムコドン合成から同様に分離されるからである。
【００８８】
既知のアミノ酸配列中に多数の改変を生成するため、または可変またはランダム配列の多様な集団を生成するための当該分野で周知のその他の方法は、例えば、縮重または部分的縮重オリゴヌクレオチド合成を含む。ＮＮＮとして表される４つのすべてのヌクレオチドモノマーの等しい混合物を特定するコドンは、縮重合成を生じる。その一方、部分的縮重合成は、例えば、先に記載のようなＮＮＧ／Ｔコドンを用いることにより達成され得る。あるいは、当該分野で周知のその他の方法が用いられ得、これには、統計学的に予め決定されるか、またはまだらのコドン合成があり、これは、本明細書に参考として援用される、米国特許第５，２２３，４０９号および同第５，４０３，４８４号の主題である。
【００８９】
一旦、上記のように、核酸をコードする変化したポリペプチドの集団が構築されると、それらは発現されて、会合速度のついてスクリーニングされ得る変化したポリペプチドの集団を生成し得る。例えば、変化したポリペプチドをコードする核酸を、増殖、操作および発現のために適切なベクター中にクローン化し得る。このようなベクターは、当業者により公知であるか、または当業者によって構築され得、そして転写、翻訳、調節のため、そして所望であれば、改変されたポリペプチド（単数または複数）のソーティングおよび分泌に十分なすべての発現エレメントを含む。このベクターはまた、発現および調節エレメントが適合可能な起源にある限り、原核生物または真核生物宿主系いずれかにおける使用のためであり得る。この発現ベクターは、さらに、誘導可能であるかまたは細胞型特異的発現のための調節エレメントを含み得る。当業者は、どの宿主系が特定のベクターと適合するか、およびどの調節または機能的エレメントが可溶性形態、分泌形態または細胞表面形態のポリペプチドの発現を達成するに十分であるかを知る。
【００９０】
適切な発現ベクターは当該分野で周知であり、そしてプロモーター領域またはエンハンサー領域のような調節配列またはエレメントに作動可能に連結された核酸を発現し得、調節配列またはエレメントがこのような核酸の発現を調節し得るベクターを含む。プロモーターまたはエンハンサーは、調節の性質に依存して、構成的または誘導性であり得る。調節配列または調節エレメントは、本発明の核酸または上記のような変化した核酸の集団に、核酸の転写を可能にする適切な配向で作動可能に連結される。
【００９１】
適切な発現ベクターは、真核生物細胞および／または原核生物細胞中で複製可能であるベクター、およびエピソームのままであるベクター、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれるベクターを含む。原核生物細胞または真核生物細胞中の発現に適切なベクターは当業者に周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、前述に記載されている。真核生物細胞における発現に有用なベクターは、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導性プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターなどを含む、調節エレメントを含み得る。本発明の方法に有用なベクターは、例えば、細菌ファージ、バキュロウイルスまたはレトロウイルスのようなウイルスベクター；コスミドまたはプラスミド；および特に大きな核酸分子のクローニングのための細菌人工染色体ベクター（ＢＡＣ）および酵母人工染色体ベクター（ＹＡＣ）を含み得る。このようなベクターは市販されており、そしてそれらの使用は当該技術分野で周知である。当業者は、特定の宿主細胞中の発現に適切なプロモーターを知っており、そして容易に決定し得る。
【００９２】
適切な宿主細胞は、例えば、細菌および対応する細菌ファージ発現系、酵母、鳥類、昆虫および哺乳動物細胞および各宿主種に対応する当該技術分野で公知の適合可能な発現系を含む。種々の宿主系における、子孫ポリペプチドの集団またはそのような集団内の子孫ポリペプチドの組換え発現のための方法は、当該分野で周知であり、そして、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前述、およびＡｕｓｕｂｌｅら、前述、に記載されている。子孫ポリペプチドの発現およびスクリーニングのための特定のベクターおよび宿主系の選択は、当業者に知られ、そしてユーザーの選択に依存する。繊維状細菌ファージベクター／宿主系を用いる、可溶性形態または細胞表面形態いずれかのヘテロマーレセプターの多様な集団の発現は、当該技術分野で周知であり、そして本明細書に参考として援用される米国特許第５，８７１，９７４号の主題である。
【００９３】
組換え細胞は、宿主細胞中に、結合性ポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターまたはベクターの集団を導入することにより生成される。この組換え細胞は、外因性核酸を細胞中またはそのゲノム中に取り込むために、当該技術分野で公知の任意の種々の方法により、形質導入、トランスフェクト、またはその他により遺伝的に改変される。結合性ポリペプチドを発現するために用いられ得る例示の宿主細胞は、哺乳動物始原細胞；ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨＥＫ２９３およびＰＣ１２細胞のような、確立された哺乳動物細胞株；Ｘｅｎｏｐｕｓ胚および卵母細胞のような両生類細胞；およびその他の脊椎動物細胞を含む。例示の宿主細胞はまた、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのような昆虫細胞、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅまたはＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓのような酵母細胞、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉのような原核生物細胞を含む。
【００９４】
１つの実施態様では、ポリペプチドをコードする核酸は、当該技術分野で周知の適切なベクターを用いてインビボまたはインビトロのいずれかで、哺乳動物細胞中に送達され得る。哺乳動物細胞にポリペプチドをコードする核酸を送達するために適切なベクターは、レトロウイルスベクター、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルスのようなウイルスベクター、およびプラスミドベクターのような非ウイルスベクターを含む。
【００９５】
ウイルスを基礎にした系は、種々の細胞中に相対的に高いレベルの異種核酸を導入し得る利点を提供する。哺乳動物細胞中にポリペプチドをコードする核酸を導入するために適切なウイルスベクターは、当該技術分野で周知である。これらのウイルスベクターは、例えば、単純ヘルペスウイルスベクター（Ｇｅｌｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１６６７−１６６９（１９８８））；ワクシニアウイルスベクター（Ｐｉｃｃｉｎｉら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３；５４５−５６３（１９８７））；サイトメガロウイルスベクター（Ｍｏｃａｒｓｋｉら、Ｖｉｒａｌ　Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｙ．ＧｌｕｚｍａｎおよびＳ．Ｈ．Ｈｕｇｈｅｓ編、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８８、７８−８４頁）；モロニーマウス白血病ウイルスベクター（Ｄａｎｏｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：６４６０−６４６４（１９８８）；Ｂｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：４７５−４７９（１９９５）；Ｏｎｏｄｅｒａら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７２：１７６９−１７７４（１９９８））；アデノウイルスベクター（Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６１６−６２６（１９８８）；Ｃｏｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：６０９４−６０９８（１９９２）；Ｇｒａｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、７：１０９−１２７（１９９１）；Ｌｉら、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ、４：４０３−４０９（１９９３）；Ｚａｂｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、６：７５−８３（１９９４））；アデノ随伴ウイルスベクター（Ｇｏｌｄｍａｎら、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ、１０：２２６１−２２６８（１９９７）；Ｇｒｅｅｌｉｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．、５：４３９−４４３（１９９９）；Ｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：３９０６−３９１０（１９９９）；Ｓｎｙｄｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．、５：６４−７０（１９９９）；Ｈｅｒｚｏｇら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．、５：５６−６３（１９９９））；レトロウイルスベクター（Ｄｏｎａｈｕｅら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．、４：１８１−１８６（１９９８））；Ｓｈａｃｋｌｅｆｏｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：９６５５−９６５９（１９８８）；米国特許第４，４０５，７１２号、第４，６５０，７６４号および第５，２５２，４７９号、およびＷＩＰＯ公報、ＷＯ９２／０７５７３、ＷＯ９０／０６９９７、ＷＯ８９／０５３４５、ＷＯ９２／０５２６６およびＷＯ９２／１４８２９；およびレンチウイルスベクター（Ｋａｆｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１７：３１４−３１７（１９９７））を含む。ベクターまたはそれらの使用を記載する上記刊行物は、本明細書に参考として援用される。
【００９６】
上記の変異誘発法に加え、ポリペプチドは、化学的改変により変化させられ得る。化学的改変は、ポリペプチドの結合性質を変化するためになされ得、会合速度の測定に利益をもたらすか、または結合性ポリペプチドの同定に利益をもたらす。アミノ酸の化学的改変は、例えば、アミジン化、グアニジン化、還元的メチル化、カルバミル化、アセチル化、トリニトロベンゾイル化、スクシニル化またはホルミル化によるアミノ基の改変；ブタンジオール反応、フェニルグリオキサル反応、またはニトロマロンジアルデヒド反応によるアルギニンの改変；エステル化またはカルボジイミドカップリングによるカルボニルの改変；トリプトファンのスルフェニル化；ニトロ化またはヨウ素化によるチロシンの改変；還元、酸化、カルボキシルメチル化、カルボキシエチル化（ｃａｒｂｏｘｙｅｒｔｈｙｌａｔｉｏｎ）、アミノエチル化、メチル化，スルホン化、チオールの付加、またはシアン化によるスルフヒドリルの改変を含む。当業者は、本明細書に参考として援用される、ＭｅａｎｓおよびＦｅｅｎｅｙ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ　Ｉｎｃ．、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９７１）およびＧｌａｚｅｒら、Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７５）に記載の方法により親ポリペプチドを化学的に改変し得る。
【００９７】
本明細書に記載の方法により結合性ポリペプチドの構造を変化させることは、会合速度を増加または減少することによるか、または、新たなリガンドに対する会合速度を増加することにより、治療効力を改変する手段を提供する。従って、増加または減少した治療効力を有する結合性ポリペプチドは、実施者の必要性に応じて同定され得る。本発明の方法は、増加または減少のいずれであれ、治療効力において所望の変化を有する結合性ポリペフチドが得られるような可能性を生じるに十分なサイズおよび多様性を有する子孫ポリペプチドの集団の生産を提供する。先に記載のように、この集団のサイズおよび多様性は、変異誘発の選択された方法に従って調整され得る。例えば、ランダム変異誘発法が採用されるべき場合、高い多様性の大きな集団が生成され得る。この集団のサイズまたは多様性は、偏った（ｂｉａｓｅｄ）変異誘発、集中（ｆｏｃｕｓｅｄ）変異誘発または部位特異的変異誘発を用いることにより低減され得る。当業者は、変化させるべき特定のポリペプチドの性質およびこのポリペプチドを変化させるためにどの方法が用いられるべきであるかに基づいて子孫ポリペプチドの集団のサイズおよび多様性を決定し得る。
【００９８】
本発明の方法は、結合性ポリペプチドの治療効力をさらに最適化するために工程の繰り返しを提供する。結合性ポリペフチドの治療効力は、改変された治療効力を有する結合性ポリペプチドを単離すること、および本明細書に記載の方法の工程を繰り返すことにより最適化され得る。詳細には、改変された治療効力を有する単離された結合性ポリペプチドの治療効力は、１つ以上のアミノ酸を変化させること、改変された治療効力を有する単離された結合性ポリペプチドをリガンドと接触させること、この改変された治療効力を有する単離された結合性ポリペプチドとリガンドとの間の結合に対する会合速度を測定すること、および治療コントロールについての会合速度に対してこの結合性ポリペプチドについての会合速度を比較することにより決定され得る。これら工程は、所望の治療効力が得られるまで、１回、２回、または多数回繰り返され得る。
【００９９】
本発明の方法とともに作製され得、かつ用いられ得る結合性ポリペプチドの例は、抗体、またはその機能的フラグメントである。例えば、しばしば、グラフト化抗体は、ＣＤＲが由来するドナー抗体と比較したとき、低下した親和性を有することが観察されている。本発明の方法は、リガンドに結合するグラフト化抗体についての会合速度、それ故、グラフト化抗体の治療効力を改善するために用いられ得る。グラフト化抗体結合部位は、先に、および実施例において特定された規準のいずれかまたは全てにより同定され得、そして結合性ポリペプチドに関して先に記載した本発明の方法が利用され得る。グラフト化抗体は、治療効力のある抗体またはその他の機能的抗体からの少なくとも１、２、３、４、５または６のＣＤＲを有し得る。抗体またはそのフラグメントのＣＤＲは、Ｌ１、Ｌ２もしくはＬ３のような軽鎖ＣＤＲ、またはＨ１、Ｈ２およびＨ３のような重鎖ＣＤＲから選択され得る。
【０１００】
本発明は、結合性ポリペプチドの治療効力を決定するための方法をさらに提供し、結合性ポリペプチドについてのｋｏｎと治療コントロールについてのｋｏｎとの間の差異は、結合性ポリペプチドについてのＫａと治療コントロールについてのＫａとの間の差異の影響とは独立である。結合性ポリペプチドについてのｋｏｎと治療コントロールについてのｋｏｎとの間の差異が増加であり得、そして結合性ポリペプチドのＫａが治療コントロールのＫａに類似の値であり得る方法もまた提供される。同様に、結合性ポリペプチドについてのｋｏｎと治療コントロールについてのｋｏｎとの間の差異が増加であり得、そして結合性ポリペプチドについてのＫａが治療コントロールについてのＫａより低い値であり得る方法もまた提供される。
【０１０１】
本発明の利点は、改善された治療効力を有する結合性ポリペプチドが、リガンドに対する増加したＫａをもつが、改善された治療効力を有さない結合性ポリペプチドから区別され得ることである。Ｋａに基づいて治療結合性ポリペプチドを同定する方法は、平衡測定に依存し、非平衡条件でなされる時間依存性の測定がなければ、増加した会合速度、そしてそれ故改善された治療効力を有する結合性ポリペプチドを同定するために不正確である。Ｋａ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆの関係に従って、結合性ポリペプチドとリガンドとについての会合の増加したＫａは、ｋｏｎまたはｋｏｆｆにおける変化に起因し得る。例えば、改善された治療効力を有する結合性ポリペプチドは、ｋｏｆｆにおける減少がｋｏｎにおける増加の補償を超えて起こる場合、低下したＫａを有し得る。従って、ｋｏｆｆにおける変化により影響される、Ｋａにおける変化は、治療効力における変化と明白には相関しない。なぜなら、改善された治療効力を有する結合性ポリペプチドは、低下または増加したＫａのいずれかを示し得るからである。
【０１０２】
抗体またはその機能的フラグメントのような治療効力を有する結合性ポリペプチドは、少なくとも約１×１０９Ｍ−１、１×１０１０Ｍ−１または１×１０１１Ｍ−１のＫａを有し得る。抗体またはその機能的フラグメントのような本発明の結合性ポリペプチドは、ＥＣ５０のようなその他の公知の尺度により評価され得る。結合性ポリペプチドは、約６．０ｎＭ、３．０ｎＭ、または１．０ｎＭより少ないＥＣ５０を有し得る。
【０１０３】
本発明は、結合性ポリペプチドの治療効力を決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）２つ以上の結合性ポリペプチドをリガンドと接触させる工程；（ｂ）この２つ以上の結合性ポリペプチドとリガンドとの間の結合についてのｋｏｎを測定する工程、および（ｃ）高いｋｏｎを示す結合性ポリペプチドを同定する工程であって、このｋｏｎ値が同定された結合性ポリペプチドの治療効力と相関する、工程からなる。
【０１０４】
本発明はさらに、結合性ポリペプチドの治療効力を決定する方法を提供し、ここでこの方法は、（ａ）集団の２つ以上の結合性ポリペプチドをリガンドと接触させる工程；（ｂ）このリガンドに結合する２つ以上の結合性ポリペプチドについての会合速度を測定する工程；（ｃ）リガンドに結合するこの２つ以上の結合性ポリペプチドについての会合速度を比較する工程、および（ｄ）このリガンドに対する結合について、集団の１つ以上の他の結合性ポリペプチドより高い会合速度を示す結合性ポリペプチドを同定する工程であって、このより高い会合速度が、この同定された結合性ポリペプチドの治療効力と相関する工程からなる。この方法により同定される会合速度はｋｏｎにより示され得る。リガンドに対しより高い会合速度を示す結合性ポリペプチドのｋｏｎは、少なくとも約１．５×１０６Ｍ−１ｓ−１であり得る。リガンドに対しより高い会合速度を示す結合性ポリペプチドはまた、少なくとも約２×１０６Ｍ−１ｓ−１、４×１０６Ｍ−１ｓ−１、６×１０６Ｍ−１ｓ−１、８×１０６Ｍ−１ｓ−１、１×１０７Ｍ−１ｓ−１、２×１０７Ｍ−１ｓ−１、４×１０７Ｍ−１ｓ−１、６×１０７Ｍ−１ｓ−１、８×１０７Ｍ−１ｓ−１、または１×１０８Ｍ−１ｓ−１またはそれより高いｋｏｎを有し得る。好ましくは、高いｋｏｎは、治療コントロールについてのｋｏｎより大きい。
【０１０５】
集団の２つ以上の結合性ポリペプチドをリガンドと接触させる工程は、リガンドまたは集団からの２つ以上の結合性ポリペプチドを含む混合物と接触させる前に、集団から単離された結合性ポリペプチドを用いて実施され得る。集団から単離された結合性ポリペプチドについての会合速度を測定する工程は、本明細書で先に記載される方法の本質的にいずれかに従って実施され得る。２つ以上の結合性ポリペプチドを含む混合物中の結合性ポリペプチドについての会合速度を測定する工程は、例えば、時間じかけで回収するデバイスを用いることにより、個別の（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）時間間隔における、リガンドに結合した結合性ポリペプチドの選択を含む、相対的方法により実施され得る。
【０１０６】
集団から単離される２つ以上の結合性ポリペプチドについての会合速度を比較する工程は、本質的に先に記載のように達成され得る。同じ混合物中の２つ以上の結合性ポリペプチドについての会合速度を比較する工程は、例えば、上記のように、時間じかけのデバイスを用いる選択方法により達成され得る。このような比較方法は、既知の会合速度または治療効力の標準である１つ以上の結合性ポリペプチドを含む結合性ポリペプチドの集団を用いてなされ得る。さらに、未知の会合速度の結合性ポリペプチドを含む集団は、１つ以上の結合性ポリペプチドが、集団の平均と比較して増加した会合速度および改善された治療効力を有するとして同定されるように測定され得る。
【０１０７】
本発明の方法において用いられるポリペプチドの集団は、２、１０、１００、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、または１×１０１０またはそれ以上の異なる結合性ポリペプチドを含み得る。先に記載のように、当業者は、変化されるべき特定のポリペプチドの性質、およびポリペプチドを変化させるためにどの方法が用いられるかに基づき、結合性ポリペプチドの集団のサイズおよび多様性を決定し得る。当業者はまた、集団から測定されるべき結合性ポリペプチドの数を、サブ集団が測定され得るように改変し得る。測定されるべきポリペプチドの数は、集団の多様性、治療効力において所望される変化の大きさ、または変異誘発の間に取り込まれる偏りの程度のうな因子に基づき得る。従って、会合速度は、集団からの、２、１０、１００、１×１０３、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、または１×１０１０またはそれ以上の異なる結合性ポリペプチドについて測定され得る。
【０１０８】
本発明は、改善された治療効力をもつ１つ以上の結合性ポリペプチドを生成する方法を提供する。この方法は、（ａ）親ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸を変化させて１つ以上の異なる子孫ポリペプチドを生成する工程；（ｂ）リガンドと会合する１つ以上の異なる子孫ポリペプチドについての会合速度を測定する工程、および（ｃ）親ポリペプチドと比較してリガンドに対する会合速度において少なくとも４倍の増加をもつ結合性ポリペプチドを、１つ以上の子孫ポリペプチドから同定する工程であって、この増加した会合速度が病理学的状態に対する改善された治療効力を生じる工程からなる。さらに、会合速度における倍数増加が、ｋｏｎにおける増加により示される方法が提供される。従って、本発明の方法では、ｋｏｎは、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍またはそれ以上増加し得る。増加したｋｏｎは、少なくとも約３×１０５Ｍ−１ｓ−１であり得る。この増加したｋｏｎはまた、少なくとも約５×１０５Ｍ−１ｓ−１、７×１０５Ｍ−１ｓ−１、９×１０５Ｍ−１ｓ−１、１×１０６Ｍ−１ｓ−１、３×１０６Ｍ−１ｓ−１、５×１０６Ｍ−１ｓ−１、７×１０６Ｍ−１ｓ−１、９×１０６Ｍ−１ｓ−１または１×１０７Ｍ−１ｓ−１またはそれ以上であり得る。さらに、改善された治療効力を生じるｋｏｎにおける増加は、結合性ポリペプチドについてのＫａにおける変化の影響とは独立であり得る。このｋｏｎにおける増加をもつ結合性ポリペプチドは、その親ポリペプチドについてのＫａに類似のＫａ値を有し得るか、またはその親ポリペプチドについてのＫａより低いＫａ値を有し得る。
【０１０９】
本発明の方法により変化したポリペプチドは親ポリペプチドであり得る。親ポリペプチドは、本明細書に記載のペプチドの１つの例であり、そしてそれ故その性質のいずれかを有し得、そして本明細書で提供される記載に従って作製および使用される。例えば、親ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸は、先に記載の方法に従って変化されて、１つ以上の異なる子孫ポリペプチドを生成し得る。子孫ポリペプチドは、本明細書に記載の変化したポリペプチドの１つの例であり、そしてそれ故、本明細書の先の記載に従って作製および使用され得る。従って、リガンドと会合する１つ以上の異なる子孫ポリペプチドについての会合速度を測定する工程は、先に本明細書に記載したように実施され得る。さらに、リガンドに対する結合をその親ポリペプチドと比較したときに会合速度において少なくとも４倍の増加を有する結合性ポリペプチドを、１つ以上の子孫ポリペプチドから同定する工程は、会合速度および治療効力を決定するため、先に本明細書に記載の方法に従って実施され得る。
【０１１０】
親ポリペプチドと比較してリガンドに対する会合速度における少なくとも４倍の増加を有する１つ以上の子孫ポリペプチドから結合性ポリペプチドを同定する工程は、病理学的状態に対して改善された治療効力を生じる会合速度における、少なくとも５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍またはそれ以上の増加をもつ結合性ポリペプチドを、１つ以上の子孫ポリペプチドから同定するために実施され得る。会合速度におけるより大きな倍数の増加をもつ結合性ポリペプチドは、増加した治療効力をもつ。さらに、増加したｋｏｎは、少なくとも約１×１０８Ｍ−１ｓ−１、１．５×１０８Ｍ−１ｓ−１、２×１０８Ｍ−１ｓ−１、２．５×１０８Ｍ−１ｓ−１、３×１０８Ｍ−１ｓ−１、４×１０８Ｍ−１ｓ−１、５×１０８Ｍ−１ｓ−１、または１×１０９Ｍ−１ｓ−１またはそれ以上であり得る。
【０１１１】
従って、本発明は、改善された治療効力をもつ結合性ポリペプチドを生成する方法をさらに提供する。この方法は、（ａ）親ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸を変化させて１つ以上の異なる子孫ポリペプチドを生成する工程；（ｂ）リガンドと会合する１つ以上の異なる子孫ポリペプチドについての会合速度を測定する工程、および（ｃ）リガンドと会合する結合性ポリペプチドについて、少なくとも約１．５×１０６Ｍ−１ｓ−１のｋｏｎをもち、それによって改善された治療効力をもつ結合性ポリペプチドを、１つ以上の異なる子孫ポリペプチドから同定する工程からなる。この方法はまた、改善された治療効力、およびリガンドと会合する結合性ポリペプチドについて、少なくとも約３×１０６Ｍ−１ｓ−１、５×１０６Ｍ−１ｓ−１、７×１０６Ｍ−１ｓ−１、９×１０６Ｍ−１ｓ−１、１×１０７Ｍ−１ｓ−１、３×１０７Ｍ−１ｓ−１、５×１０７Ｍ−１ｓ−１、７×１０７Ｍ−１ｓ−１または９×１０７Ｍ−１ｓ−１またはそれ以上のｋｏｎをもつ結合性ポリペプチドを、１つ以上の異なる子孫ポリペプチドから同定する工程を包含する。
【０１１２】
リガンドと会合し、しかもそのリガンドとの測定可能な会合速度をもたない親ポリペプチドから生成される、結合性ポリペプチドは、改善された会合速度をもつ。詳細には、当該技術分野で利用可能な検出の限界より少なくとも４倍大きい会合速度またはｋｏｎについての測定可能な値をもつ、本発明の方法により改善された結合性ポリペプチドは、そのリガンドについての会合速度またはｋｏｎにおける少なくとも４倍の増加を構成する。従って、リガンドと会合し、しかもそのリガンドとの測定可能な会合速度をもたない親ポリペプチドから生成される、結合性ポリペプチドは、改善された治療効力をもつことが理解される。
【０１１３】
改善された治療効力をもつ結合性ポリペプチドの効力は、処置される個体において、またはその代替として、例えば、細胞をベースにしたアッセイ、組織ベースアッセイ、または全体生物アッセイを含むインビボモデル系中で観察され得る。当業者は、研究下のアッセイおよび疾患に特異的な条件に従ってモデルにおいていかに効力を決定するかを知る。例えば、ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイは、血管形成を測定し、そしてインビボ血管形成について十分に認識されたモデルである。このアッセイは詳細に記載され、そして新生血管形成および腫瘍組織の新生血管形成を測定するために用いられている（本明細書に参考として援用される、Ａｕｓｐｒｕｎｋら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、７９：５９７−６１８（１９７５）；Ｏｓｓｏｎｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、４０：２３００−２３０９（１９８０）；Ｂｒｏｏｋｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４：５６９−５７１（１９９４ａ）およびＢｒｏｏｋｓら、Ｃｅｌｌ、７９：１１５７−１１６４（１９９４ｂ））。
【０１１４】
本発明の方法により同定、決定、または生成され、そして改善された治療効力をもつ結合性ポリペプチドは、改善された効力を有し得る。例えば、既知の効力の治療コントロールに対して同定または決定されるような、改善された治療効力をもつ結合性ポリペプチドは、改善された効力を示す。本発明の方法はまた、先に記載のように、効力が決定されていない治療コントロールに対して改善された治療効力をもつ結合性ポリペプチドを同定するために用いられ得る。未知の効力の治療コントロールに対して改善された治療効力をもつ結合性ポリペプチドの効力は、上記のようにインビボモデルで試験され得る。所望されるより効力が少ない場合には、この結合性ポリペプチドは、本発明の方法によりさらに改善され、そしてインビボモデルで再試験され得る。本発明の方法の繰り返し、およびインビボモデルにおいて試験することを繰り返して用い、所望の効力を生じる結合性ポリペプチドが生成されるまで、結合性ポリペプチドの治療効力を改善し得る。
【０１１５】
当業者は、結合性ポリペプチドに関して本明細書に例示されている本発明の方法が、任意の結合性分子を用いて実施され得ることを認識する。この点において、当業者は、リガンドが結合性分子であることを知る。従って、リガンドを同定することおよび生成することに関する本明細書に記載の方法に従って、結合性分子が同定および生成され得る。従って、本発明は、結合性分子の治療効力を決定する方法を提供する。この方法は、（ａ）結合性分子をリガンドと接触させる工程；（ｂ）この結合性分子とリガンドとの間の結合について会合速度を測定する工程、および（ｃ）この結合性分子についての会合速度を、治療コントロールについての会合速度と比較する工程であって、この治療コントールについての会合速度に比較した結合性分子の相対会合速度が、結合性分子が会合速度間の差異と相関する治療効力における差異を示すことを示す工程からなり得る。この方法はさらに、（ｄ）この結合性分子中の１つ以上の成分を変化させ、そして工程（ａ）から（ｃ）を１回以上繰り返す工程からなり得る。当業者は、コンビナトリアル化学の方法が、任意の結合性分子を生成または変化させるために、本発明の方法において用いられ得ることを知る。
【０１１６】
本発明はさらに、ウイルス関連疾患を予防または処置する方法を提供する。この方法は、その危険性にあるか、またはそれに罹患している患者に、治療的に有効な量の本発明の抗体またはその活性フラグメントを投与する工程を包含し得る。
【０１１７】
本発明はさらに、高い能力の中和抗体を生成するプロセスを提供する。このプロセスは、（ａ）予め選択されたアミノ酸配列を有する１つ以上のフレームワークおよび／またはＣＤＲを含む重鎖および軽鎖可変領域を有する、その免疫学的に活性なフラグメントを含む、組換え抗体を生成する工程；（ｂ）この抗体が、選択された抗原とインビトロで反応するとき、高いｋｏｎについてこの組換え抗体をスクリーニングする工程；および（ｃ）高いｋｏｎをもつ抗体を選択する工程を包含する。抗体のＫａまたはｋｏｎは、上記の値のいずれかであり得る。
【０１１８】
本発明はさらに、可変領域フレームワークおよび／またはＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸を、測定されるＫａまたはｋｏｎ値を増加するように選択的に変化させることにより、抗体またはその機能的フラグメントの能力を増加する方法を提供する。アミノ酸変化は、可変領域フレームワークまたはＣＤＲ領域のいずれかに限定され得る。アミノ酸を変化させる前後の抗体のＫａまたはｋｏｎは、上記に記載の値のいずれかであり得、そして少なくとも上記の値まで増加させ得る。
【０１１９】
（実施例Ｉ）
コドンベースの変異誘発によるブチリルコリンエステラーゼ改変体の焦点（ｆｏｃｕｓｅｄ）ライブラリーの合成
この実施例は、ブチリルコリンエステラーゼ改変体ライブラリーの設計および合成を記載する。
【０１２０】
別個の（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）領域に対するブチリルコリンエステラーゼ改変体の初期ライブラリーの合成に焦点を当てるために、種々の情報を用い得る。例えば、ブチリルコリンエステラーゼおよびシビレエイ（Ｔｏｒｐｅｄｏ）アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）は、高い程度の相同性（５３％同一性）を共有する。さらに、シビレエイＡＣｈＥの残基４〜５３４は、欠失または挿入なしに、ブチリルコリンエステラーゼの残基２〜５３２とアラインされ得る。触媒的な三つ組残基（ブチリルコリンエステラーゼ残基のＳｅｒ１９８、Ｇｌｕ３２５、およびＨｉｓ４３８）および鎖内ジスルフィドは、すべて同じ位置にある。これらタンパク質間の高い程度の類似性に起因して、シビレエイＡＣｈＥの精緻な２．８Åｘ線構造（Ｓｕｓｓｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５３：８７２−８７９（１９９１））は、ブチリルコリンエステラーゼ構造をモデルするために用いられている（Ｈａｒｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０８２７−１０８３１（１９９２））。
【０１２１】
コリンエステラーゼ類を用いた研究は、リガンド結合に関与する触媒的三つ組残基およびその他の残基が、疎水性残基が豊富な深く狭い活性部位小渓谷（ｇｏｒｇｅ）内に位置していることを示した（Ｓｏｒｅｑら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３５３−３５８（１９９２）に総説がある）。ブチリルコリンエステラーゼ改変体の７つの焦点ライブラリーの部位を、活性部位小渓谷に並んでいることが決定されたアミノ酸を含むように選択した。
【０１２２】
ブチリルコリンエステラーゼの構造的モデリングに加え、ブチリルコリンエステラーゼの生化学的データを、ライブラリー設計プロセス中に組み込んだ。例えば、改変されたコカイン加水分解活性をもつ天然に存在するブチリルコリンエステラーゼの特徴付け、および部位特異的変異誘発研究は、コカイン加水分解活性に重要なアミノ酸位置およびセグメントに関する情報を提供する（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．６７：２８３−３２２（１９９５）に総説がある）。さらに、異なる種からのブチリルコリンエステラーゼの配列およびコカイン加水分解データの比較はまた、これらブチリルコリンエステラーゼのコカイン加水分解活性の比較に基づく分子のコカイン加水分解活性に重要な領域に関する情報を提供する。Ａ３２８Ｙ変異体は、ライブラリー中に存在し、そしてライブラリー合成および哺乳動物細胞中の発現の質を示すためのコントロールとして働く。
【０１２３】
焦点ライブラリー合成について選択されたブチリルコリンエステラーゼの７つの領域（表２に要約される）は、８つの疎水性活性部位小渓谷残基および２つの活性三つ組残基を含む残基にまたがる。６５Ｃｙｓ−９２Ｃｙｓ、２５２Ｃｙｓ−２６３Ｃｙｓ、および４００Ｃｙｓ−５１９Ｃｙｓ間に位置する鎖内ジスルフィド結合の一体性は、機能的ブチリルコリンエステラーゼ構造を確実にするように維持される。さらに、残基１７、５７、１０６、２４１、２５６、３４１、４５５、４８１、４８５、および４８６に位置する推定のグリコシル化部位（Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ）はまた、ライブラリー合成では避けられる。全部で、７つの焦点ライブラリーは７９残基（これは、ブチリルコリンエステラーゼ直線状配列の約１４％を示す）にまたがり、そして約１５００の別個のブチリルコリンエステラーゼ改変体の発現を得る。
【０１２４】
【表２】
2004513133.tif 000002
変異されるべきヒトブチリルコリンエステラーゼの７つの領域に対応する核酸のライブラリーを、上記のように、コドンベース変異誘発により合成する。要約すれば、複数のＤＮＡ合成カラムを、Ｇｌａｓｅｒら、前述、１９９２により先に記載のように、β−シアノエチルホスホルアミダイト化学によりオリゴヌクレオチドを合成するために用いる。最初の工程では、ブチリルコリンエステラーゼのアミノ酸をコードするトリヌクレオチドを、１つのカラム上で合成し、その一方、第２のカラムを用いてトリヌクレオチドＮＮ（Ｇ／Ｔ）を合成する。ここで、Ｎは、ｄＡ、ｄＧ、ｄＣ、およびｄＴシアノエチルホルホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍａｄｉｔｅｓ）の混合物である。トリヌクレオチドＮＮ（Ｇ／Ｔ）を用いることで、各位置毎の２０のすべてのアミノ酸の系統的発現により達成される、最小縮重での完全な変異誘発を生じる。
【０１２５】
第１のコドンの合成の後，２つのカラムからの樹脂を一緒に混合し、分割し、そして４つのカラム中に置き換える。各コドンについてさらなる合成カラムを付加し、そしてカラム樹脂を混合することにより、縮重オリゴヌクレオチドのプールが、変異誘発の程度に基づいて分離される。コドンベース変異誘発の樹脂混合局面は、プロセスを迅速かつ安価にする。なぜなら、それは、複数オリゴヌクレオチドを合成する必要性をなくするからである。現在の研究では、単一アミノ酸変異をコードするオリゴヌクレオチドのプールを用い、焦点ブチリルコリンエステラーゼライブラリーを合成する。
【０１２６】
単一アミノ酸変異を含むブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードするオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ、前述、１９８５）を用い、二重ｌｏｘ標的化ベクター中にクローン化する。変異誘発効率を改善するため、および野生型ブチリルコリンエステラーゼを発現するクローンの数を低減するため、ライブラリーを二段階プロセスで合成する。第１の段階では、各ライブラリー部位に対応するブチリルコリンエステラーゼＤＮＡ配列を、ハイブリダイゼーション変異誘発により欠失する。第２の段階では、各ライブラリーに対応する１つの欠失変異体である、各欠失変異体についてのウラシル含有一本鎖ＤＮＡを単離し、そしてオリゴヌクレオチド部位特異的変異誘発によるライブラリーの合成のためのテンプレートとして用いる。このアプローチは、抗体ライブラリーの合成のために慣用的に用いられており、そして変異誘発オリゴヌクレオチドの異なるＤＮＡ配列から潜在的に生じるアニーリング偏りを除去することによってより均一な変異誘発を生じる。さらに、二段階プロセスは、ライブラリー中の改変体に対する野生型配列の頻度を低減し、そしてその結果、野生型ブチリルコリンエステラーゼをコードするクローンの繰り返しスクリーニングをなくすることにってライブラリースクリーニングをより効率的にする。
【０１２７】
ライブラリーの質および変異誘発の効率は、各ライブラリーからの約２０のランダムに選択されたクローンからＤＮＡ配列を得ることにより特徴付けられる。このＤＮＡ配列は、変異誘発が各ライブラリー内の複数位置で生じ、しかも複数アミノ酸が各位置で発現されたことを示す。さらに、ランダムに選択されたクローンのＤＮＡ配列は、ライブラリーが多様なクローンを含み、そして２〜３のクローンが優勢であるわけではないことを示す。
【０１２８】
（部位特異的組み込みのためのトランスフェクションパラメーターの最適化）　Ｃｒｅ媒介部位特異的組み込みのためのトランスフェクションパラメーターの最適化を、モデル系としてブレオマイシン耐性タンパク質（ＢＲＰ）ＤＮＡを利用して達成した。
【０１２９】
Ｃｒｅリコンビナーゼは、細菌ファージＰ１における配列特異的組換えのために必要かつ十分の両方である、良く特徴付けされた３８ｋＤａ　ＤＮＡリコンビナーゼである（Ａｂｒｅｍｓｋｉら、Ｃｅｌｌ　３２：１３０１−１３１１（１９８３））。組換えは、各々が、コア領域を取り囲む２つの逆方向１３塩基対リコンビナーゼ認識配列からなる、２つの３４塩基対のｌｏｘＰ配列の間で生じる（ＳｔｅｒｎｂｅｒｇおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：４６７−４８６（１９８１ａ）；ＳｔｅｒｎｂｅｒｇおよびＨａｍｉｌｔｏｎ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５０：４８７−５０７（１９８１ｂ））。ＤＮＡ切断および鎖交換は、コア領域のエッジにおける頂部鎖または底部鎖上で生じる。Ｃｒｅリコンビナーゼはまた、酵母（Ｓａｕｅｒ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２０８７−２０９６（１９８７））および哺乳動物細胞（ＳａｕｅｒおよびＨｅｎｄｅｒｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５１６６−５１７０（１９８８）；ＦｕｋｕｓｈｉｇｅおよびＳａｕｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：７９０５−７９０９（１９９２）；ＢｅｔｈｋｅおよびＳａｕｅｒ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、２５：２８２８−２８３４（１９９７））の両方を含む真核生物における部位特異的組換えを触媒する。
【０１３０】
１３−１細胞のリン酸カルシウムトランスフェクションは、プレートにまかれた生存細胞の１％において標的化された組み込みを生じることが先に示された（ＢｅｔｈｋｅおよびＳａｕｅｒ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、２５：２８２８−２８３４（１９９７））。従って、初期研究は、１３−１細胞を４μｇのｐＢＳ１８５および１０、２０、３０または４０μｇのｐＢＳ３９７−ｆｌ（＋）／ＢＲＰでトランスフェクトするためにリン酸カルシウムを用いて行った。トランスフェクションあたりのＤＮＡの総レベルは、非関連ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ　ＤＮＡ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて一定に保ち、そして形質転換体を、４００μｇ／ｍｌゲネシチンを含む培地中に再プレートすることにより４８時間後に選択した。１０日後、コロニーを計数し、標的化組み込みの効率を決定した。最適標的化組み込みは、代表的には、３０μｇの標的ベクターおよび４μｇのＣｒｅリコンビナーゼベクターｐＢＳ１８５を用いて観察され、これは先に報告された２０μｇの標的するベクターおよび５μｇのｐＢＳ１８５と一致した（ＢｅｔｈｋｅおよびＳａｕｅｒ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、２５：２８２８−２８３４（１９９７））。観察された標的化組み込みの頻度は、一般に、１％より少なかった。用いたＤＮＡの量および緩衝液ｐＨに対するリン酸カルシウム法の感度にかかわらず、観察された標的化組み込み効率は、タンパク質ライブラリーを発現するに十分であった。
【０１３１】
表３に示されるように、いくつかの細胞株およびその他のトランスフェクション法もまた、特徴付けられた。一般に、脂質媒介トランスフェクション法が、リン酸カルシウムトランスフェクションおよびＤＥＡＥデキストラントランスフェクションのような化学的環境を改変する方法より効率的である。さらに、脂質媒介トランスフェクションは、ＤＮＡ調製物中の汚染物、塩濃度、およびｐＨによる影響が少なく、そしてそれ故、一般に、より再現性の良い結果を提供する（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３−７４１７（１９８７））。その結果、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と呼ばれる、中性脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびカチオン性脂質の処方物を、代替のトランスフェクションアプローチとして評価した。要約すれば、内毒素のないＤＮＡを、ＥｎｄｏＦｒｅｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉキット（ＱＩＡＧＥＮ；Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、標的するベクターｐＢＳ３９７−ｆ１（＋）／ＢＲＰおよびＣｒｅリコンビナーゼベクターｐＢＳ１８５の両方について調製した。次に、５μｇのｐＢＳ１８５および変化する量のｐＢＳ３９７−ｆ１（＋）／ＢＲＰを、無血清培地中に希釈し、そしてＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬と混合した。このＤＮＡ／脂質混合物を、次いで、約５×１０５細胞／１００ｍｍディッシュからなる１３−１細胞の６０−７０％集密単層に添加し、そして３７℃でインキュベートした。５時間後、ウシ胎児血清を１０％まで添加し、そして翌日トランスフェクション培地を除去し、そして新鮮培地で置き換えた。
【０１３２】
標的ベクターの可変量を用いた細胞のトランスフェクションは、０．１％〜１．０％の範囲の標的化組み込み効率を生じ、最適標的化組み込み効率は、標的ベクターおよびＣｒｅリコンビナーゼベクターの各々５μｇを用いて観察された。最適化された条件下の１３−１宿主細胞の脂質ベースのトランスフェクションは、０．５％標的化組み込み効率を生じた。これは、一致して観察される。０．５％標的化組み込みは、先に報告された１．０％の効率よりわずかに少なく（ＢｅｔｈｋｅおよびＳａｕｅｒ、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．、２５：２８２８−２８３４（１９９７））、そして大きなタンパク質ライブラリーを発現するに十分であり、そして哺乳動物細胞中のタンパク質改変体のライブラリーの発現を可能にする。
【０１３３】
【表３】
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これらの結果は、Ｎ１Ｈ３Ｔ３　１３−１細胞中の標的化挿入のためのトランスフェクション条件の最適化を示す。小量のＤＮＡで済み、そして再現性のよい０．５％の標的効率を生成する簡単な脂質ベースのトランスフェクション法の条件が確立された。
【０１３４】
（哺乳動物細胞におけるブチリルコリンエステラーゼ改変体ライブラリーの発現）
ブチリルコリンエステラーゼ改変体の７つのライブラリーの各々を、二重ｌｏｘ標的ベクターおよび上記の最適化トランスフェクション条件を用いて宿主哺乳動物細胞株中に形質転換する。Ｃｒｅ媒介形質転換の後、宿主細胞を限界希釈でプレートにまき、９６ウェルフォーマットで別個のクローンを単離する。Ｃｒｅ／ｌｏｘ標的化部位中に組み込まれたブチリルコリンエステラーゼ改変体をもつ細胞を、ゲネチシンで選択する。次いで、各ライブラリーからの２０−３０のランダムに選択されたクローンからブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードするＤＮＡを配列決定し、そして上記のように分析する。要約すれば、総細胞ＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｋｉｔｓ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用い、目的の各クローンの約１０４細胞から単離する。次いで、このブチリルコリンエステラーゼ遺伝子を、Ｐｆｕ　ＴｕｒｂｏＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて増幅し、そしてＰＣＲ産物のアリコートを、次いで、ネスト化オリゴヌクレオチドプライマーを用いる蛍光ジデオキシヌクレオチド終止法（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）により、ランダムに選択されたクローンからのブチリルコリンエステラーゼ改変体をコードするＤＮＡを配列決定するために用いる。
【０１３５】
先に記載のように、この配列決定は、ライブラリーの均一導入を示し、そして哺乳動物形質転換体の多様性は、細菌の形質転換後の二重ｌｏｘ標的ベクター中のライブラリーの多様性に似る。
【０１３６】
本発明を、開示の実施形態を参照して記載したが、当業者は、詳述した特定の実験が本発明の例示のみであることを容易に認識する。種々の改変が本発明の範囲から逸脱することなくなされ得ることを理解すべきである。従って、本発明は以下の請求の範囲によってのみ制限される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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