(57)【要約】親油性化合物および一般式：｛Ｘ−ＯＯＣ−［（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ］ｍ｝ｐ−Ｙ（式中：Ｘは疎水性部分の残基であり、Ｙは親水性部分の残基であり、ｐは１または２であり、ｍは０または１であり、ｎは０以上の整数である）の可溶化剤を含む水溶性組成物が開示される。親油性化合物は、好ましくは、水不溶性ユビキノン、ユビキノール、ビタミン、プロビタミン、ポリエンマクロライド抗生物質、およびその混合物からなる群から選択される。疎水性部分は、好ましくはステロールまたはトコフェロールであり、親水性部分は、好ましくはポリアルキレングリコールである。数例において、ステロールはコレステロールまたはシトステロールであり、トコフェロールはα（＋）−トコフェロールであり、ポリアルキレングリコールは４００〜１０００の間の平均分子量を有するポリエチレングリコールまたはそのメチルモノマーであり、ｐは１または２であり、ｍは０または１であり、ｎは２から１８の間の整数である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトまたは温血動物における真菌感染症の治療法であって、かかる治療を必要とするヒトまたは温血動物に、治療的に有効な量の、ポリオキシエタニル−シトステロールセバケート、ポリオキシエタニル−コレステリルセバケートおよびポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートからなる群から選択される可溶化剤、およびマクロライドポリエン抗生物質（可溶化剤と抗生物質の重量比が２：１ないし４：１で処方）を医薬的に有効な担体または賦形剤との組み合わせにおいて含む水溶性組成物を投与することを含む方法。
【請求項２】
抗生物質が、アンホテリシンＢおよびナイスタチンからなる群から選択される請求項１記載の方法。
【請求項３】
抗生物質がアンホテリシンＢであり、可溶化剤の抗生物質に対する重量比が３：１ないし４：１ｗ／ｗである請求項１記載の方法。
【請求項４】
抗生物質がナイスタチンであり、可溶化剤の抗生物質に対する重量比が２：１ないし４：１ｗ／ｗである請求項１記載の方法。
【請求項５】
ポリオキシエタニル−シトステロールセバケート、ポリオキシエタニル−コレステリルセバケートおよびポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートからなる群から選択される可溶化剤、およびマクロライドポリエン抗生物質を含み、可溶化剤の抗生物質に対する重量比が２：１ないし４：１で処方される水溶性組成物。
【請求項６】
抗生物質がアンホテリシンＢおよびナイスタチンからなる群から選択される請求項５記載の組成物。
【請求項７】
抗生物質がアンホテリシンＢであり、可溶化剤の抗生物質に対する重量比が３：１ないし４：１ｗ／ｗである請求項５記載の組成物。
【請求項８】
抗生物質がナイスタチンであり、可溶化剤の抗生物質に対する重量比が２：１ないし４：１ｗ／ｗである請求項５記載の組成物。
【請求項９】
可溶化剤がポリオキシエタニル−シトステロールセバケートである請求項７記載の組成物。
【請求項１０】
可溶化剤がポリオキシエタニル−コレステリルセバケートである請求項７記載の組成物。
【請求項１１】
可溶化剤がポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートである請求項７記載の組成物。
【請求項１２】
可溶化剤がポリオキシエタニル−シトステロールセバケートである請求項８記載の組成物。
【請求項１３】
可溶化剤がポリオキシエタニル−コレステリルセバケートである請求項８記載の組成物。
【請求項１４】
可溶化剤がポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートである請求項８記載の組成物。
【請求項１５】
請求項５記載の水溶性組成物の調製法であって、
（ｅ）水混和性有機溶媒中、２：１ないし４：１の可溶化剤と抗生物質の重量比にて抗生物質と可溶化剤を溶解させる工程；
（ｆ）溶液から有機溶媒を除去して、所望の濃度の水溶性組成物を得る工程；
（ｇ）組成物を水に溶解させる工程；および
（ｈ）乾燥工程
を含む方法。
【請求項１６】
抗生物質がアンホテリシンＢであり、可溶化剤と抗生物質の重量比が３：１ないし４：１ｗ／ｗである請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
抗生物質がナイスタチンであり、可溶化剤と抗生物質の重量比が２：１ないし４：１ｗ／ｗである請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
溶媒がメタノール／酢酸３：１ｖ／ｖである請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
α−トコフェリロールをヒトまたは温血動物にデリバリーする方法であって、かかるデリバリーを必要とするヒトまたは温血動物に有効量の水溶性形態のビタミンＥを投与することを含む方法。
【請求項２０】
ビタミンＥの水溶性形態が、ポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートである請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ポリオキシエタニル−シトステロールセバケート、ポリオキシエタニル−コレステリルセバケートおよびポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートからなる群から選択される可溶化剤、および高含量の多不飽和脂肪酸を有する化合物を含む水溶性組成物。
【請求項２２】
化合物が油状物であり、可溶化剤および油状物が２：１ないし３：１の可溶化剤の油状物に対する重量比において処方される請求項２１記載の組成物。
【請求項２３】
油状物がアマニ油および魚油からなる群から選択される請求項２２記載の組成物。
【請求項２４】
ポリオキシエタニル−シトステロールセバケート、ポリオキシエタニル−コレステリルセバケートおよびポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートからなる群から選択される可溶化剤、ならびにテルペンおよびテルペノイドからなる群から選択される生物活性親油性化合物を含む水溶性組成物。
【請求項２５】
可溶化剤および生物活性化合物が、３：１ないし４：１の可溶化剤の生物活性化合物に対する重量比にて処方される請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
生物活性親油性化合物が、スクアレン、ゲラノイル、ファルネソール、β−カロテン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテインおよびリコペンからなる群から選択される請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
ポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートおよびスクアレンを、３：１のポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートのスクアレンに対する重量比にて含む、請求項２５記載の組成物。
【請求項２８】
ポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートおよびアスタキサンチンを、４：１のポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートのアスタキサンチンに対する重量比にて含む、請求項２５記載の組成物。
【請求項２９】
ａ）可溶化剤およびアスタキサンチンを、４：１の可溶化剤とアスタキサンチンの重量にて水混和性有機溶媒に溶解させて混合物を形成し；
ｂ）混合物を水で希釈して、水性溶液を形成し；
ｃ）水性溶液を濃縮して有機溶媒と過剰の水を除去することを含む、請求項２８記載の水溶性組成物の調製法。
【請求項３０】
工程ｃ）が減圧下で蒸発させることにより行われる請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
２：１ないし５．５：１ｗ／ｗの比で処方されたポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートおよびα−トコフェリルアセテートを含む水溶性組成物。
【請求項３２】
ＰＣＳ−４００のα−トコフェリルアセテートに対する比が２：１ないし４．５：１ｗ／ｗで処方されたＰＣＳ−４００およびα−トコフェリルアセテートを含む請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
ＰＣＳ−６００のα−トコフェリルアセテートに対する比が５．５：１ｗ／ｗで処方されたＰＣＳ−６００およびα−トコフェリルアセテートを含む請求項３１記載の組成物。
【請求項３４】
可溶化剤のトコトリエノールに対する比が約５．５：１ｗ／ｗにおいて処方された、ポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートおよびポリオキシエタニルトコトリエニルセバケートからなる群から選択される可溶化剤、およびトコトリエノールを含む水溶性組成物。
【請求項３５】
可溶化剤がＰＴＳ−６００である請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
可溶化剤がＰｔｒｉｅｎＳ−６００である請求項３４記載の組成物。
【請求項３７】
可溶化剤のコエンザイムＱ１０に対する比が２．５：１ないし３．５：１ｗ／ｗにおいて処方された、ポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートおよびポリオキシエタニルトコトリエニルセバケートからなる群から選択される可溶化剤、およびコエンザイムＱ１０を含む水溶性組成物。
【請求項３８】
可溶化剤がＰＴＳ−４００であり、ＰＣＳ−４００のコエンザイムＱ１０に対する比が２．５：１ｗ／ｗである請求項３６記載の組成物。
【請求項３９】
可溶化剤がＰｔｒｉｅｎＳ−６００であり、ＰｔｒｉｅｎＳ−６００のコエンザイムＱ１０に対する比が３．５：１ｗ／ｗないし２．５：１ｗ／ｗである請求項３６記載の組成物。
【請求項４０】
生物活性親油性化合物および一般式：
｛Ｘ−ＯＯＣ−［（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ］ｍ｝ｐ−Ｙ
（式中：ｐは１または２であり、
ｍは０または１であり、
ｎは０≦ｎ≦１８の範囲の整数であり、
Ｘは、コレステロール、７−デヒドロコレステロール、カンペステロール、シトステロール、エルゴステロール、スチグマステロール、およびα−、β−、γ−、およびΔ−トコフェロールおよびその誘導体からなる群から選択される疎水性部分の残基であり、Ｙはポリアルコール、ポリエーテル、ポリアニオン、ポリカチオン、ポリリン酸、ポリアミン、多糖類、ポリヒドロキシ化合物、ポリリシンおよびその誘導体からなる群から選択される親水性部分の残基である；ただし、ｐおよびｍが１であり、疎水性部分が（＋）−α−トコフェロールである場合、ｎは２以外の数とする）
で示される可溶化剤を含む水溶性組成物。
【請求項４１】
生物活性親油性化合物が、ユビキノン、ユビキノール、ビタミン、プロビタミン、ポリエンマクロライド抗生物質、およびその混合物からなる群から選択される請求項３９記載の組成物；ただし、該生物活性親油性化合物がユビキノンであり、疎水性部分がコレステロールである場合、ｎは８以外の数とする。
【請求項４２】
親水性部分がＰＥＧ−４００である請求項３９記載の組成物。
【請求項４３】
ａ）トコトリエノールを有機溶媒に溶解させ；
ｂ）溶液を一般式：Ｚ−ＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−Ｚ（式中、Ｚは脱離基である）の化合物と反応させ；
ｃ）一般式：ＨＯ−Ｙ−ＯＲ（式中、Ｒは水素またはアルキルであり、ｎは０ないし１８である）の化合物と反応させることを含む、ポリオキシエタニルトコトリエニルセバケートの調製法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物活性親油性化合物の水溶性組成物、かかる組成物の調製に有用な化合物、かかる化合物および組成物の調製法、およびかかる組成物の治療薬および化粧品としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの生物活性化合物は高度に親油性（疎水性）であり、このことは、これらが脂質（油）と一部の有機溶媒中に可溶性である一方、水中には実質的に不溶性であるかまたはわずかに溶解するだけであることを意味する。生物活性化合物が水性媒体中に溶解しないことは、その治療的用途を制限する重大な因子であり、該化合物の患者への有効な投与を困難にする。油性溶液の形態またはある種の水および／または油状懸濁液または乳液において投与される場合、親油性化合物は通常、不十分な生物学的利用能を示し、このことは、該化合物の体循環における低濃度および長期蓄積時間を意味する。この生物学的利用能の欠如は、通常、投与経路（局所、経口、または非経口）と無関係である。
この制限を克服するための様々な方法が従来技術において公知である。公知の一方法は、親油性化合物を水混和性有機溶媒、例えば、エタノールまたはプロピレングリコール中に溶解させることからなる。しかしながら、このような溶液を血液または胃腸液と混合すると、親油性化合物は通常固体または乳液として沈殿し、その結果、生物学的利用能が低くなる。さらに、多くの親油性化合物について、有機水混和性溶媒は存在しない。もう一つの方法は、親油性化合物を、油および溶媒を界面活性剤と組み合わせて含む様々な組成物（不均質、多相乳液であることが多い）中に組み入れることからなる。これらの組成物は、水性媒体中への溶解度を著しく増大させることなく化合物の生物学的利用能を向上させることができるが、通常、特定の投与形態（通常は局所適用）についてのみて好適である。哺乳動物において防御免疫反応も誘発することができるこのような組成物は、摂取または注射による化合物の投与が必要であり、水性溶液または水溶性固体組成物がしばしば唯一の許容される投与形態である治療的用途にほとんど価値がない。
【０００３】
親油性生物活性化合物の均一な水性溶液を調製するためのいくつかの方法が従来技術において公知である。一方法は、もとの化合物よりも良好な水溶性を有する親油性化合物の誘導体または類似体を調製することからなる。最も単純な場合において、この誘導体は化合物の水溶性塩であり、この塩は通常、本来の生物学的活性を保持するが、この方法は酸性または塩基性特性を有する化合物にのみ適用可能である。その溶解度を向上させるためにさらに実質的な変更をもとの化合物に導入するならば、化合物の本来の生物活性の減少または完全な損失がしばしば観察される。
もう一つ別の可溶化法は、本来の生物活性化合物を生理学的条件下で放出できる水溶性誘導体を調製することからなる。このような誘導体はプロドラッグともよばれ、通常、化合物の生物学的利用能を向上させ、さらに目的の化合物のデリバリーまたは時間をかけた持続性放出を確実にする。しかしながら、この方法は通常ある種の官能基がもとの化合物中に存在することに基づき、従って一般に適用可能でない。加えて、化学的修飾による化合物の溶解度を向上させる合成法は、比較的複雑で、費用がかかる。
【０００４】
生物活性親油性化合物を可溶化するためのさらに別の方法は、水溶性複合体の形成に基づく。一例は、２つの相対する溶解性傾向（親油性および親水性）を有する部分を含む両親媒性化合物との複合体である。このような化合物は、有機溶媒中および水中の両方に可溶性であることが多く、従って、可溶化は通常、生物活性親油性化合物および両親媒化合物を適当な水混和性有機溶媒中に溶解させ、溶液を水で希釈することにより達成される。いくつかの場合において、有機溶媒は蒸発または凍結乾燥により本来または水で希釈された溶液から部分的または完全に除去され、濃縮物は、水不溶性親油性化合物が沈殿することなく、適当な水性媒体で復元される。補助有機溶媒を組成物から完全に除去できない場合、この溶媒は医薬的に許容できなければならず、このことは適当な溶媒の選択を制限する。
可溶化を必要とする生物活性な親油性化合物は、様々な治療薬の種類に属し、例えば、ビタミン（例えば、ビタミンＥ）、抗生物質、特にマクロライドポリエン抗生物質（アンホテリシン−Ｂ、ナイスタチン、カンジシジン）、フリーラジカルスカベンジャー（例えば、トコフェロール、ユビキノン）、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン）などである。これらおよび他の親油性化合物の溶解度を達成し、生物学的利用能を向上させるための、水溶性複合体の形成を含む様々な方法が従来技術において公知である。
【０００５】
米国特許第５６８６１１０号は、アンホテリシン−Ｂおよびシクロスポリンを含む水不溶性化合物の、アルキルまたはオレフィン基でエンドキャップされたポリアルキレンオキシドポリマー（該ポリマーは水中および有機溶媒中のどちらにも可溶性である）との水溶性複合体を開示している。補助有機溶媒の存在下でのみ形成される水溶性複合体を凍結乾燥し、緩衝溶液で復元する。復元された水性溶液は、主に溶液のｐＨに応じて、ある程度しか安定性を示さない。さらに、好ましい可溶化剤としての比較的高分子量（２０００ないし５０００）のメトキシポリエチレングリコールポリマーの使用は、生物活性化合物の可溶化に必要なポリマーの重量を増大させる。
米国特許第５７９８３３３号は、シクロスポリンの均一な水溶性組成物（濃縮物）を開示し、これはシクロスポリンが沈殿することなく水性溶液で希釈することができる。濃縮物は、親水性有機溶媒、例えば、プロピレングリコール中に溶解させたシクロスポリンとトコフェルソラン（ポリオキシエタニル−ａ−トコフェリルスクシネート、ＴＰＧＳ）を含む。無溶媒組成物は、不安定または不均一である傾向にあるので開示されていない。
【０００６】
ＷＯ９６／１７６２６は、可溶化剤としてポリオキシエタニル−コレステリルセバケート（ＰＣＳ）を含むユビキノンの水溶性組成物を開示している。ユビキノン、特にコエンザイムＱ１０は、コエンザイムＱ１０とＰＣＳの両方をテトラヒドロフラン中に１：３の適当なモル比で溶解させ、この溶液を水で希釈することにより可溶化される。溶液を次いで減圧下で蒸発乾固させ、適当な緩衝溶液で復元する。
コエンザイムＱ１０（ＣｏＱ１０）は、数例を挙げれば、鬱血性心不全、筋ジストロフィー、歯周病、薬物による欠乏症の矯正、および免疫再構築（ＡＩＤＳ、アレルギー）を包含する多くの疾患について、その治療可能性が近年認められている天然の化合物である。コエンザイムＱ１０はまた、自然の皮膚老化プロセスを遅らせる薬剤として化粧製品中に含めることができるので、化粧品産業においても非常に重要である。コエンザイムＱ１０の生物学的活性は、その酸化防止剤およびフリーラジカルスカベンジャーとして作用し、ミトコンドリア呼吸およびＡＴＰの産生を刺激することにより、細胞膜の一体性を保護し、病的な細胞が細胞修復に十分なエネルギーを産生することができないことを補う能力と関連すると信じられている。臨床および化粧品用途の両方における有効性のためには、高い生物学的利用能および水性媒体中の溶解性を有するコエンザイムＱ１０の製剤が通常必要とされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
コエンザイムＱ１０などの親油性化合物の水性媒体中の溶解度を向上させるための様々な方法が従来技術において公知であるが、これらは調製された処方の簡便性、実用性、安定性などの点で等しくない。本発明は、多くの従来技術の欠点および制限のない、親油性化合物の新規可溶化法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一態様に従って、本発明は、親油性化合物および一般式：
｛Ｘ−ＯＯＣ−［（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ］ｍ｝ｐ−Ｙ      （Ｉ）
（式中：
Ｘは疎水性部分の残基であり、
Ｙは親水性部分の残基であり、
ｐは１または２であり、
ｍは０または１であり、
ｎは０以上の整数である）
の可溶化剤を含む水溶性組成物を提供する。
親油性化合物は、好ましくは、ユビキノン、ユビキノール、ビタミン、プロビタミン、ポリエンマクロライド抗生物質、およびその混合物からなる群から選択される。疎水性部分は、好ましくはステロールまたはトコフェロールであり、親水性部分は、好ましくはポリアルキレングリコールである。好ましい具体例において、ステロールはコレステロールまたはシトステロールであり、トコフェロールはα−（＋）−トコフェロールであり、ポリアルキレングリコールは４００から１０００の間の平均分子量を有するポリエチレングリコールまたはそのメチルモノエーテルであり、ｐは１または２であり、ｍは０または１であり、ｎは２〜１８の間の整数である。
【０００９】
本発明のもう一つの態様に従って、生物活性親油性化合物および一般式；
｛Ｘ−ＯＯＣ−［（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ］ｍ｝ｐ−Ｙ
（式中：
ｐは１または２であり、
ｍは０または１であり、
ｎは０≦ｎ≦１８の範囲の整数であり、
Ｘは、コレステロール、７−デヒドロコレステロール、カンペステロール、シトステロール、エルゴステロール、スチグマステロール、およびα−、β−、γ−、およびΔ−トコフェロールおよびその誘導体からなる群から選択される疎水性部分の残基であり、Ｙはポリアルコール、ポリエーテル、ポリアニオン、ポリカチオン、ポリリン酸、ポリアミン、多糖類、ポリヒドロキシ化合物、ポリリシンおよびその誘導体からなる群から選択される親水性部分の残基である。ただし：ｐおよびｍが１であり、疎水性部分が（＋）−α−トコフェロールである場合、ｎは２でないとする）
の可溶化剤を含む水溶性組成物。
【００１０】
もう一つの態様に従って、本発明は、一般式（Ｉ）の可溶化剤を含む水溶性組成物の、補助有機溶媒の存在下または不在下での調製および精製法を提供する。可溶化は、水不溶性親油性化合物および可溶化剤を水混和性有機溶媒中に溶解させ、この溶液を水で希釈し、有機溶媒および所望により水の一部を減圧下で除去することにより達成される。別法として、親油性化合物および可溶化剤をあらかじめ決められたモル比で直接混合し、それぞれの融点より高い温度まで加熱して、透明溶融物の形態の水溶性組成物を形成することができ、これを次いで水性溶液で所望の濃度まで希釈することができる。水溶性組成物を少量の水中に溶解させ、組成物が透明な液相として分離するまで溶液を加熱し、溶液の温度を実質的に変化しない状態に保ちながら、分離した組成物を溶液から除去することにより、さらに精製することができる。
さらにもう一つの態様に従って、本発明は、親油性化合物および式（Ｉ）の可溶化剤を含む医薬または化粧品処方を提供する。
さらにもう一つの態様に従って、本発明は式（Ｉ）の新規可溶化剤およびその調製法および精製法を提供する。
【００１１】
本発明のさらにもう一つの具体例に従って、このような治療を必要とするヒトまたは温血動物における真菌感染症の治療法であって、このようなヒトまたは温血動物に、治療的に有効な量の、ポリオキシエタニル−シトステロールセバケート、ポリオキシエタニル−コレステリルセバケートおよびポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートからなる群から選択される可溶化剤、およびマクロライドポリエン抗生物質（可溶化剤の抗生物質に対する重量比が２：１ないし４：１で処方される）を、医薬的に有効な担体または賦形剤とともに含む水溶性組成物を投与することを含む方法が提供される。
本発明のさらにもう一つの具体例に従って、ポリオキシエタニル−シトステロールセバケート、ポリオキシエタニル−コレステリルセバケートおよびポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートからなる群から選択される可溶化剤、およびマクロライドポリエン抗生物質を含み、可溶化剤の抗生物質に対する重量比が２：１ないし４：１で処方された水溶性組成物が提供される。
【００１２】
本発明のさらにもうひとつの具体例によると、水溶性組成物の調製法であって、
（ａ）抗生物質および可溶化剤を水混和性有機溶媒中、可溶化剤の抗生物質に対する重量比が２：１ないし４：１で溶解させる工程、
（ｂ）溶液から有機溶媒を除去して、水溶性組成物の所望の濃度を達成する工程、
（ｃ）組成物を水中に溶解させる工程、および
（ｄ）乾燥させる工程
を含む方法が提供される。
本発明のさらにもう一つの具体例によると、α−トコフェロールを、これを必要とするヒトまたは温血動物にデリバリーする方法であって、このようなヒトまたは温血動物に有効量の水溶性形態のビタミンＥを投与することを含む方法が提供される。
ＰＴＳは水溶性形態のビタミンＥである。本発明者らは、動物の体内において、水溶性形態のビタミンＥ、例えばＰＴＳは加水分解され、全身的に、ビタミンＥの活性な無毒形態であるα−トコフェロールに変換されることを見いだした。従って、ＰＴＳはそれ自体、これを必要とする動物に、活性な無毒性ビタミンＥをデリバリーする手段として投与することができる。
【００１３】
本発明のさらにもう一つの具体例によると、ポリオキシエタニル−シトステロールセバケート、ポリオキシエタニル−コレステリルセバケートおよびポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケートからなる群から選択される可溶化剤、および高含量の多不飽和脂肪酸およびその誘導体を有する化合物を含む水溶性組成物が提供される。誘導体は、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリドおよびその脂肪族エステルを包含する。このような化合物の例は、魚油、植物油および他の植物抽出物を包含する。このような化合物のさらに別の例は、Ｂ．Ｆｉｔｃｈ  Ｈａｕｍａｎｎ：ｎ−脂肪酸の別の供給源（Ａｌｔｅｒｎａｔｅ  Ｓｏｕｒｃｅｓ  ｆｏｒ  ｎ−ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ）：Ｉｎｆｏｒｍ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｎｅｗｓ  ｏｎ  ｆａｔｓ，ｏｉｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ（１９９８）、第１９巻、ｎｏ．１２、１１０８ページ、およびＧ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓら、オメガ−３−脂肪酸の健康状態および疾患における役割（Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｏｍｅｇａ−３−ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）：Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９３）、第１３巻、１９−４５（その開示を出典明示により本発明の一部とする）の文献において見いだすことができる。
【００１４】
本発明のさらに別の具体例によると、ポリオキシエタニル−シトステロールセバケート、ポリオキシエタニル−コレステリルセバケートおよびポリオキシエタニル−α―トコフェリルセバケートからなる群から選択される可溶化剤、およびテルペンおよびテルペノイドからなる群から選択される生物活性親油性化合物を含む水溶性組成物が提供される。
本発明者らは、ＰＴＳ−６００およびＰＴＳ−４００を含む様々な可溶化剤を用いて、水中にα−トコフェリルアセテート（合成形態のビタミンＥ）を可溶化させた。
可溶化剤のα−トコフェリル−アセテートに対する比は、２：１ないし５．５：１ｗ／ｗの範囲であった。アウェイティング（ａｗａｉｔｉｎｇ）溶媒、例えばＴＨＦ法を用いるか、または前記の直接混合法を用いることにより水溶性組成物を得た。
【００１５】
トコトリエノールは酸化防止剤として有用な水不溶性トコフェロール誘導体である。本発明者らは、可溶化剤として有用なトコトリエノールポリオキシエタニルトコトリエニルセバケート（ＰＴｒｉｅｎＳ−６００）のポリエチレングリコール付加形態を製造した。この方法は、トコトリエノールおよびトリエチルアミンを水混和性有機溶媒、例えば、酢酸エチル中に溶解させ、溶液をセバコイルクロリドと反応させ、続いてポリエチレングリコール付加することを含む。実施例３１および３２参照。本発明はまた他のトコトリエノール、例えば、ｗｗｗ．ｅａｓｔｍａｎ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅ、Ｎｕｔｒｉｅｎｅ  ｔｏｃｏｔｏｒｉｅｎｏｌｓ．Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｖ−２４（１９９８）（その開示を出典明示により本発明の一部とする）に記載されているものにも適用可能である。本発明者らはまた、可溶化剤、例えば、ＰＴＳ−６００またはポリエチレングリコール付加トコトリエノールポリオキシエタニルトコトリエニルセバケート（例えばＰｔｒｉｅｎｅＳ−６００）を用いてトコトリエノールを水中に溶解させた（実施例３２参照）。可溶化剤のトコトリエノールに対する比は約５．５：１ｗ／ｗである。水溶性組成物は、補助溶媒法、または前記の直接混合法のいずれかを用いて得られる。
【００１６】
本発明者らは、ＰＴＳ−４００、またはトコトリエノールのポリエチレングリコール付加誘導体、例えばポリオキシエタニルトコトリエニルセバケート（ＰｔｒｉｅｎｓＳ−６００）を可溶化剤として用いて、ＣｏＱ１０を水中に可溶化できることを示した。可溶化剤のＣｏＱ１０に対する比は２．５：１ないし３．５：１の範囲であった。前記の直接混合法を用いた。実施例３３参照。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、親油性化合物および次の一般式：
｛Ｘ−ＯＯＣ−［（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ］ｍ｝ｐ−Ｙ      （Ｉ）
（式中：
Ｘは疎水性部分の残基であり、
Ｙは親水性部分の残基であり、
ｐは１または２であり、
ｍは０または１であり、
ｎは０以上の整数である）
の可溶化剤を含む水溶性組成物を提供することにより、実質的に水不溶性の生物活性親油性化合物を可溶化する方法を提供する。
【００１８】
可溶化剤の疎水性部分は、例えばステロールまたはα−トコフェロール、特にコレステロール、７−デヒドロコレステロール、カンペステロール、シトステロール、エルゴステロール、スチグマステロール、あるいはα−、β−、γ−、またはΔ−トコフェロールなどのエステル化可能なヒドロキシ基を有する疎水性（親油性）分子である。コレステロールおよびシトステロールが好ましいステロールであり、シトステロールが特に好ましい。α−（＋）−トコフェロールおよびα−（±）−トコフェロールがトコフェロールの例であり、α−（＋）−トコフェロール（ビタミンＥ）が好ましい。疎水性部分の残基は、コレステロールまたはシトステロールの３−β−ヒドロキシ基あるいはα−トコフェロールの６−ヒドロキシなどのエステル化されたヒドロキシ基を除く疎水性分子全体である。
【００１９】
可溶化剤の親水性部分は、例えば、ポリアルコール、ポリエーテル、ポリアニオン、ポリカチオン、ポリリン酸、ポリアミン、多糖類、ポリヒドロキシ化合物、ポリリシン、およびその誘導体からなる群から選択される、エステル化可能なヒドロキシまたはカルボキシ基を有する親水性分子である。これらのうち、ポリエーテルが好ましく、ポリアルキレングリコールが特に好ましい。「ポリアルキレングリコール」なる用語は、低級アルキレンオキシドのポリマー、特にポリマー分子の少なくとも一端にエステル化可能なヒドロキシ基を有するエチレンオキシドのポリマー（ポリエチレングリコール）およびプロピレンオキシドのポリマー（ポリプロピレングリコール）、ならびにエステル化可能なカルボキシ基を有するこのようなポリマーの誘導体を包含する。親水性部分の残基は、ポリエチレングリコール分子の末端ヒドロキシ基などのそのエステル化されたヒドロキシまたはカルボキシ基を除く親水性分子全体である。
適当なポリエチレングリコールは、ポリマー分子の各末端に遊離ヒドロキシ基を有してもよいし、あるいは低級アルキル、例えばメチル基でエーテル化された一つのヒドロキシ基を有していてもよい。エステル化可能なカルボキシ基を有するポリエチレングリコールの誘導体も本発明の実施に好適である。ポリエチレングリコールは、ＰＥＧの商品名で、通常、平均分子量により特徴づけられるポリマーの混合物として商業的に入手可能である。約３００ないし約５０００の平均分子量を有するポリエチレングリコールが好ましく、約６００ないし約１０００の平均分子量を有するものが特に好ましい。
【００２０】
ｍが１である式（Ｉ）の化合物は、一般式ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨのアルカン二酸のジエステルと見なすことができる。本発明の実施について、ｎが０〜１８であるアルカン二酸が好ましく、ｎが６から１０であるものが特に好ましい。セバシン酸（ｎ＝８）が最も好ましい。
本発明の可溶化剤を用いて可溶化できる生物活性な親油性化合物は、様々な治療薬および化学物質の種類に属し、ユビキノン、ユビキノール、ステロール、ビタミン、プロビタミンおよびマクロライドポリエン抗生物質を包含する。
好ましいユビキノンおよびユビキノールは、式：
【化１】
2004521900.tif 000002
（式中、Ｒは
【化２】
2004521900.tif 000003
または
【化３】
2004521900.tif 000004
であり、ｋは６ないし１２の整数である）を有するものである。ｋが１０であるもの（それぞれ、ユビキノン−５０またはコエンザイムＱ１０およびユビキノール−５０または還元コエンザイムＱ１０）が特に好ましい。
【００２１】
コレステロール、シトステロール、エルゴステロールおよび７−デヒドロコレステロールが好ましいステロールである。ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、およびＫが好ましいビタミンであり、プロビタミンＡ（β−カロテン）が好ましいプロビタミンである。マクロライドポリエン抗生物質の内、アンホテリシン−Ｂ、ナイスタチン、およびカンジシジンが好ましい。
本発明の水溶性組成物は、生物活性親油性化合物および可溶化剤を、約１：１ないし１：５のモル比で含む。約１：２のモル比が好ましい。モル比の上限は重要ではなく、可溶化剤は幾分過剰で用いることができる。しかしながら、可溶化剤の量が増大するにつれ組成物中および水性溶液中の活性成分の濃度が減少するので、これは好ましくない。
本発明の水溶性組成物は、補助有機溶媒の存在下または不在下のいずれかで２つの異なる手順により調製することができる。第一の場合において、親油性化合物および可溶化剤をまずあらかじめ決められたモル比において水混和性有機溶媒中に溶解させ、この溶液を次いであらかじめ決められた量の水で親油性化合物を沈殿させずに希釈する。有機溶媒および水を次いで減圧下で蒸発させることにより除去する。揮発性有機溶媒は通常最初に除去され、続いて水が除去され、この場合において、残存する濃縮物中、所望の濃度の水溶性組成物を得るために、溶液から除去される水の量を調節することができる。別法として、有機溶媒と水の両方を蒸発により除去し、ワックス質残留物を適当な水性媒体（例えば、水、生理食塩水、または緩衝溶液）で復元して、透明な水性溶液が得られる。
【００２２】
前記方法において用いられる有機溶媒は、親油性化合物と可溶化剤の両方に対して良好な溶媒でなければならず、水と混和性でなければならない。医薬処方において水溶性組成物が用いられるならば、蒸発による溶媒の除去は必ずしも可能であるとは限らないので、この溶媒はさらに医薬的に許容されなければならない。本発明の実施に好適な溶媒の例は、テトラヒドロフラン、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、および酢酸である。低沸点の溶媒、例えばテトラヒドロフランが好ましい。
有機溶媒の量は重要ではなく、所定の量の親油性化合物および可溶化剤を溶解させるために必要な溶媒の最小量以上である。希釈に用いられる水の量も重要ではなく、好ましくは、有機溶媒の体積の１０〜２５倍である。
本発明の水溶性組成物のもう一つの調製法は、まず、あらかじめ決められたモル比の親油性化合物と可溶化剤の混合物を調製することからなる。この混合物を次いで親油性化合物および可溶化剤のそれぞれの融点より高い温度まで、透明な溶融物を得るために十分な時間加熱し、このプロセスは可溶化剤中への親油性化合物の溶解として確認できる。このようにして得られた溶融物をあらかじめ決められた量の適当な水性媒体で復元して、所望の濃度の透明な水性溶液を得ることができる。本発明の水溶性組成物のこの調製法は、より簡単であり、ほとんどの用途に必要とされる溶媒の医薬的に許容される特性などの補助有機溶媒による方法の制限を回避するので好ましい。
【００２３】
本発明の可溶化剤の、補助有機溶媒の非存在下で親油性を溶解させる能力は、合成後に結晶化により精製することなく水溶性形態の生物活性化合物、特にコエンザイムＱ１０を調製し、この化合物の水溶性組成物を調製するための全体的なコストを減少させるために用いることができる。
本発明の多くの組成物は、溶液の温度が上昇すると水中の溶解度が減少する。これにより、このような組成物の単離および／または精製の別の方法が提供される。精製の目的について、組成物の水に対する比が１：２（体積）を越えないように組成物を水中に溶解させ、溶液を、例えば沸騰水浴中、液相として水溶性組成物の分離を達成するために必要な時間、通常は数分間加熱する。溶液の冷却により組成物の溶解度が増大し、その結果、回収の収率が減少するので、溶液の温度を実質に変化しない状態に保ちながら、油性相を次いで熱溶液から分離する。冷却をさけるために油性相の迅速な分離を、例えば遠心分離により達成することができる。
【００２４】
本発明の水溶性組成物は、ワックス状の濃度を有し、このような高度に濃縮された形態において操作することは困難である。これらを固体としてより容易に処理可能にするために、適当な固体、水溶性添加剤、例えばビタミンＣ、ゼラチン、プロテインサプリメント、またはポリエチレングリコールと組み合わせることができる。後者の場合において、約５０００より多い平均分子量を有するポリエチレングリコールが好ましい。組成物と添加剤の比は重要ではないが、添加剤による活性成分の不必要な希釈をさけるために通常限定される。このような固体組成物は、生物活性な化合物のある種の投与形態、例えば錠剤または顆粒の調製に特に有用である。
本発明の組成物は、優れた水中溶解度を示し、ほとんど任意の濃度の水性溶液の調製を可能にする。濃縮溶液を、親油性化合物が沈殿することなく、任意の割合の水性媒体で、広範囲のｐＨ条件にわたって希釈できるので、化合物の溶解度は、例えば組成物の経口または非経口投与後の生理学的条件下で維持される。この結果、通常、化合物の生物学的利用能が向上される。
【００２５】
本発明の組成物およびその水性溶液は、長時間（室温で数ヶ月、冷蔵すると少なくとも１年、または凍結すると無期限）にわたり、広範囲の温度およびｐＨ条件（８０℃ないし１２０℃の温度、２．０ないし８．０のｐＨ）にわたってすぐれた安定性を示す。水性溶液は、繰り返し凍結し、解凍することができ、劣化は認知されない。高温条件下で安定なので、活性成分の溶解度を損なうことなく溶液を容易に滅菌できる。
本発明の水溶性組成物は、容易に医薬処方または化粧品処方中に組み入れることができ、これは親油性活性成分の向上された生物学的利用能を特徴とする。このような処方はさらに、溶媒、アジュバント、賦形剤、甘味料、フィラー、着色料、矯味矯臭剤、滑剤、バインダー、湿潤剤、防腐剤およびその混合物を含む追加の活性成分および／または医薬的または化粧品的に許容される添加剤またはビヒクルを含んでもよい。処方は、局所（例えば、クリーム、ローション、ゲル、軟膏、皮膚粘着性貼剤）、経口（例えば、カプセル、錠剤、キャプレッツ、顆粒）、または非経口（例えば、坐剤、滅菌溶液）投与に適した形態を有してもよい。注射により投与するために用いることができる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、弱酸性化水、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。
【００２６】
水溶性組成物ならびに医薬および化粧品処方のうち、コエンザイムＱ１０を含むものが特に重要である。コエンザイムＱ１０は、フリーラジカルおよびオキシダントにより引き起こされるミトコンドリア異常および／または組織損傷に関連する多くの状態および障害についてその治療可能性が近年認められている天然の化合物である。これらは：心血管障害（例えば、鬱血性心不全）、筋肉疾患（例えば、筋ジストロフィー）、ミトコンドリア脳脊髄症（例えば、ＭＥＬＡＳ、ＫＳＳ）、神経変性障害（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病）、薬物または感染により引き起こされる免疫不全症の再構築（ＡＩＤＳ、アレルギー、癌）を包含するが、これらに限定されない。特に重要なのは、虚血／再潅流の結果起こる組織損傷（例えば、卒中、頭部外傷、血管形成、臓器移植、一般的な手術）を最小限に抑えるためのコエンザイムＱ１０の臨床的使用である。もう一つ別の重要な分野は、例えば感染性疾患について、高コレステロール血症を治療するためのコレステロール低下剤との組み合わせにおいて、または癌の治療において化学療法薬との組み合わせにおいて、アジュバントとしての療法におけるコエンザイムＱ１０の使用である。コエンザイムＱ１０はさらに、化粧品産業にとって、自然皮膚の老化プロセスを遅らせる薬剤として非常に興味深い。マクロライドポリエン抗生物質、例えば、アンホテリシン−Ｂ、ナイスタチン、またはカンジシジンを含む水溶性組成物は、免疫不全患者における真菌感染症を包含する真菌感染症の治療に対して特に興味深い。
【００２７】
本発明の水溶性組成物の形態の生物活性親油性化合物は、予防または治療を必要とする温血動物、特にヒトに投与することができる。前記疾患または障害を治療するための生物活性親油性化合物の用量およびその水溶性組成物の対応する用量は、投与方法、患者の年齢、性別、体重、および治療される状態によって変わり、最終的に診察している医師または獣医師により決定される。診察する医師または獣医師により決定されるような水溶性組成物の形態の生物活性化合物のこのような量を本発明において「治療的に有効な量」と呼ぶ。
コエンザイムＱ１０の生物学的活性は、その酸化防止剤およびフリーラジカルスカベンジャーとして作用して、細胞膜の一体性を保護する能力、ならびにミトコンドリア呼吸およびＡＴＰの産生を刺激することにより細胞修復に十分なエネルギーを製造するための病的な細胞の欠陥を補う能力に関連すると考えられる。臨床および化粧用途の両方における有効性のために、高い生物学的利用能および水性媒体中の溶解度を有するコエンザイムＱ１０の調製物が通常望ましい。
【００２８】
コエンザイムＱ１０について現在まで提案されたほとんどの医薬および化粧品処方は、多くの欠点、例えば、非経口投与された場合に望ましくない免疫反応、または経口投与された場合に胃障害を引きおこす成分を使用することなどがある。いくつかの処方は、狭いｐＨ範囲においてのみ安定であり、ほとんどは活性成分（コエンザイムＱ１０）の不十分な生物学的利用能を特徴とする。特に、局所、経口および非経口投与経路に普遍的に適用可能な処方はないので、コエンザイムＱ１０の静脈内投与について信頼できる処方はない。コエンザイムＱ１０を含む本発明の水溶性組成物は前記欠点がなく、安定で、活性成分の良好な溶解性および生物学的利用能を特徴とする、あらゆる経口経路、局所、経口、および非経口に適した医薬処方に組み入れることができる。
【００２９】
本発明はさらに、一般式：
｛Ｘ−ＯＯＣ−［（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ］ｍ｝ｐ−Ｙ      （Ｉ）
（式中：
ｐは１または２であり、
ｍは０または１であり、
ｎは０≦ｎ≦１８の範囲であり、
Ｘは、コレステロール、７−デヒドロコレステロール、カンペステロール、シトステロール、エルゴステロール、スチグマステロール、およびα−、β−、γ−、およびΔ−トコフェロールおよびその誘導体からなる群から選択される疎水性部分の残基であり、Ｙはポリアルコール、ポリエーテル、ポリアニオン、ポリカチオン、ポリリン酸、ポリアミン、多糖類、ポリヒドロキシ化合物、ポリリシンおよびその誘導体からなる群から選択される親水性部分の残基である。ただし：ｐおよびｍが両方とも１であり、疎水性部分がα−（＋）−トコフェロールである場合、ｎは２でないとする）
の新規可溶化剤を提供する。
ただし書きにより除外される化合物は当該分野においては公知であり、特に、ポリオキシエタニル−コレステリルセバケート（ＰＣＳ）およびポリオキシエタニル−α−トコフェリルスクシネート（ＴＰＧＳ）である。しかしながら、ＰＣＳはＣｏＱ１０の可溶化剤として従来、すなわち、本発明者らの公開されたＰＣＴ出願番号ＷＯ９６／１７６２６に開示されているだけであった。
【００３０】
式（Ｉ）の化合物は、当業者に周知の合成有機化学の標準的方法により調製することができる。特に、ｐが１または２であり、ｍが１である化合物は、一般式Ｘ−ＯＨの化合物を一般式Ｚ−ＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−Ｚ（式中、Ｚは脱離基である）の化合物と反応させ、さらにこのようにして得られた生成物を一般式ＨＯ−Ｙ−ＯＲ（式中、Ｒは水素またはアルキルであり、Ｘ、Ｙおよびｎは前記定義の通りである）と反応させることにより調製できる。ハロゲン、特にＣｌおよびＢｒが脱離基Ｚとして好ましい。水素および低級アルキル（Ｃ１−Ｃ４）がＲに関して好ましい。
式（Ｉ）の多くの可溶化剤は、溶液の温度が上昇するにつれ水中の溶解度が減少し、これによりこれらの化合物の都合の良い精製法が得られる。精製プロセスの工程および条件は、本発明の水溶性組成物の精製についてすでに記載したのと実質的の同じである。
本発明の様々な態様を次の非制限的実施例によりさらに説明する。
【００３１】
実施例
次の略語を実施例全体にわたって使用する：
ＣｏＱ１０、ＣｏＱ１０  −  コエンザイムＱ１０
ＰＣＳ  −  ポリオキシエタニル−コレステリルセバケート
ＰＴＳ  −  ポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケート
ＰＳＳ  −  ポリオキシエタニル−シトステリルセバケート
ＰＴＤ  −  ポリオキシエタニル−α−トコフェリルドデカノジオエート
ＰＴＳｒ  −  ポリオキシエタニル−α−トコフェリルスベレート
ＰＴＡｚ  −  ポリオキシエタニル−α−トコフェリルアゼラート
ＴＰＧＳ  −  ポリオキシエタニル−α−トコフェリルスクシネート
前記の略語の一つの後に続く数字（例えば、ＰＣＳ−６００）は化合物のポリオキシエタニル部分の平均分子量を示す。略語Ｍｅがその後に続く数字（例えば、ＰＴＳ−７５０Ｍｅ）は、メチル基でキャップされたポリオキシエタニル部分（メトキシポリオキシエタニル）を示す。
実施例１および２は本発明の可溶化剤の調製法を説明する。
【実施例１】
【００３２】
ポリオキシエタニル−シトステリルセバケート（ＰＳＳ−６００）の調製
０．８３ｇのｂ−シトステロール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏ．、製品番号Ｓ−５７５３、約６０％）を３ｍｌの無水トルエン中に４０℃で溶解させ、続いて１．３３ミリモルのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を添加した。２ｍｌの無水トルエン中に溶解させた１．３３ミリモルのセバコイルクロリドを次いでｂ−シトステロール−ＴＥＡ溶液に添加した（撹拌しながら、無水条件下で滴下）。反応を１０分間室温で行い、この時間に２ミリモルのＰＥＧ−６００（ポリエチレングリコール、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．；製品番号Ｐ−３３９０）および３ｍｌの無水トルエン中に溶解させた２．６６ミリモルのＴＥＡを反応混合物に滴下した。撹拌しながらさらに２０分間室温で反応を続け、反応混合物を４回、それぞれ３ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で抽出した。トルエンを減圧下で除去し、ワックス質残留物が残った。この生成物を１５ｍｌの水中に溶解させ、水不溶性物質を濾過により除去した。濾液を凍結乾燥し、０．８ｇの淡黄色ワックス質生成物（ＰＳＳ−６００）を得た。同じ方法をポリオキシエタニル−コレステリルセバケート（ＰＣＳ−６００）の調製に用いた。
【実施例２】
【００３３】
ポリオキシエタニル−α−トコフェリルセバケート（ＰＴＳ−６００）の調製
１ミリモルのａ−トコフェロール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、製品番号Ｔ−３２５１）および１．３３ミリモルのＴＥＡの３ｍｌの無水トルエン中溶液を、２ｍｌの無水トルエン中に溶解させた１．３３ミリモルのセバコイルクロリドに添加した（撹拌しながら、無水条件下で滴下）。反応を１０分間室温で行い、続いて２ミリモルのＰＥＧ−６００（ポリエチレングリコール、Ｓｉｇｍａ、Ｐ−３３９０）および３ｍｌのトルエン中に溶解させた２．６６ミリモルのＴＥＡを滴下した。さらに２０分間室温で一定して撹拌しながら反応を続けた。反応混合物を４回、それぞれ３ｍｌの飽和ＮａＣｌ溶液で抽出し、トルエンを減圧下で蒸発させた。生成物を５ｍｌの水中に溶解させ、残存するトルエンをさらに減圧下で水との同時蒸発により除去した。最終ワックス質生成物（１．１５ｇ）を凍結乾燥により得た。
アジポイル、スベロイル、アゼラオイルまたはドデカンジオイルジクロリドを用いて、ポリエチレングリコール（平均分子量１０００、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、製品番号Ｐ−３５１５）またはメトキシポリエチレングリコール（平均分子量７５０、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．、製品番号Ｍ−７０１８）をα−トコフェリルと結合させることにより、他の可溶化剤（表１）を得た。
実施例３は合成された可溶化剤の分子特性を提供する。
【実施例３】
【００３４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により得られる可溶化剤の分子特性
表１．合成された可溶化剤の分子量
2004521900.tif 000005
【００３５】
実施例４は可溶化剤の精製法を説明する。
【実施例４】
【００３６】
実施例１または２に従って調製された可溶化剤を水中に２：１ｖ／ｖ比で溶解させた。目に見える沈殿が起こるまで、溶液を沸騰水浴中で約２分間加熱した。これに続いて、熱混合物を短時間遠心分離機にかけ（少なくとも２０００×ｇ）、熱湯中に不溶性である沈殿した生成物を分離した。水相（上清）をデカンテーションにより除去し、約１０％の水を含む生成物の透明なペレットが残った。
実施例５および６は、２成分を直接混合することによる水溶性コエンザイムＱ１０組成物の調製を説明する。
【実施例５】
【００３７】
コエンザイムＱ１０のトコフェロールベースの水溶性組成物の直接調製法
表２．トコフェロールベースの水溶性コエンザイムＱ１０組成物の成分
2004521900.tif 000006
【００３８】
表２は、コエンザイムＱ１０のトコフェロールベースの水溶性組成物の調製に用いられる出発物質の量を示す。それぞれの場合において、２成分をあらかじめ決められた比で混合し、成分が一緒に溶融して、透明で均一な溶融物が形成されるまで、それらの融点より高い温度、典型的には６０℃から８０℃に加熱した。可溶化剤のコエンザイムＱ１０に対する最適比は、２：１モル／モルまたは３：１ｗ／ｗであることが見いだされた。これらの組成物は冷蔵した場合に密封されたバイアル中に少なくとも２〜３年間貯蔵することができた。これらは任意の時に、任意の割合で水または生理食塩水（０．９％）で復元することができ、これらは引き続き水溶性であり、冷蔵または凍結した場合に数ヶ月間安定であった。
【実施例６】
【００３９】
コエンザイムＱ１０のステロールベースの水溶性組成物の直接調製法
表３．  ステロールベースの水溶性コエンザイムＱ１０組成物の成分
2004521900.tif 000007
【００４０】
表３は、コエンザイムＱ１０のステロールベースの水溶性組成物の調製に用いられる出発物質の量を示す。それぞれの場合において、２成分をあらかじめ決められた比（可溶化剤のＣｏＱ１０に対する最適比は、２：１モル／モルまたは３：１ｗ／ｗであることが見いだされた）で混合し、成分が一緒に溶融して、透明な液体が形成されるまで、それらの融点より高い温度、典型的には６０℃から８０℃に加熱した。液体を水中に溶解させ（２：１ｖ／ｖの比）、透明なワックス質沈殿が形成されるまで溶液を沸騰水浴中、約２分間加熱した。沈殿を次いで２０００×ｇでの遠心分離により熱溶液から分離できた。室温で水中に完全に溶解させるために、加熱、遠心分離および室温への冷却のサイクルを、サイクル間で上清の除去をせずに２ないし３回繰り返した。最後の遠心分離の後、熱上清をデカントし、生成物の透明なペレットを回収した。組成物を密封したバイアル中、少なくとも２〜３年間冷蔵保存できた。前記組成物の水性溶液（水または食塩水中）を調製でき、これらは冷蔵した場合に数ヶ月間安定であった。
【００４１】
実施例７、８および９は、補助溶媒の存在下での水溶性コエンザイムＱ１０組成物の調製を説明する。
【実施例７】
【００４２】
コエンザイムＱ１０の水溶性組成物の溶媒ベースの調製法
表４．  コエンザイムＱ１０の水溶性組成物の成分
2004521900.tif 000008
【００４３】
表４はさまざまな水溶性コエンザイムＱ１０組成物に用いられる出発物質の量を示す。それぞれの場合において、コエンザイムＱ１０および可溶化剤を両方ともテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中に溶解させ、混合物の温度を０℃付近に維持しつつ、溶液を激しく撹拌しながら、水に添加した。溶媒および水の一部を次いで減圧下で蒸発させて、所望の濃度のコエンザイムＱ１０（通常８０〜１００ｍｇ／ｍｌ）を得た。これらの組成物は少なくとも２〜３年間冷蔵保存でき、水性媒体（水、食塩水）で復元して、水溶性形態の所望の最終濃度のコエンザイムＱ１０を得ることができた。さらに高い濃度のコエンザイムＱ１０（２００ｍｇ／ｍｌまで）を含む組成物もこの手順により得た。
【実施例８】
【００４４】
水溶性ＴＰＧＳ−コエンザイムＱ１０組成物の溶媒ベースの調製法
表５．  水溶性ＴＰＧＳ−コエンザイムＱ１０組成物の成分
2004521900.tif 000009
【００４５】
表５は、実施例７に記載された手順に従って調製された水溶性ＴＰＧＳ−コエンザイムＱ１０組成物に用いられる出発物質の量を示す。しかしながら、この生成物は加熱後水性溶液から沈殿しなかった。水および溶媒を減圧下蒸発により除去できた。組成物の水溶性および安定性は実施例４および５に記載されているのと同じであった。
実施例９は水溶性ユビキノール組成物を調製するための手順を記載する。
【実施例９】
【００４６】
水溶性ユビキノール組成物の調製
表６．  水溶性ユビキノール組成物の成分
2004521900.tif 000010
【００４７】
表６は、水溶性ユビキノール（コエンザイムＱ１０の還元された形態）組成物に用いられる出発物質の量を示す。ユビキノールをまず次の方法により調製した。０．３ｇのコエンザイムＱ１０および０．２ｇの亜鉛末を２．５ｍｌの氷酢酸中に懸濁させた。混合物を５０℃水浴中に時々振とうしながら約１５分間入れた。反応混合物を２．５ｍｌの水で希釈し、５ｍｌのヘキサンで２回抽出した。ヘキサン抽出物を合わせ、２．５ｍｌの水で２回洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下、最後に高真空下で蒸発させた。結果として得られたユビキノールの白色ワックス質残留物を０．９ｇのＴＰＧＳと合わせ、混合物が溶融し、透明になるまで、これを６０℃〜８０℃に加熱した。水で復元すると、不透明溶液が形成された。この組成物はアルゴン下で密封し、凍結した場合に、２ヶ月まで変化しないままであった。プロピレングリコールと表６に示す比で混合することにより、この組成物の水溶性を向上させることができた。この組成物の水性（水および食塩水）溶液は安定で、凍結した場合にアルゴン下で密封貯蔵することができた。
【００４８】
実施例１０および１１は水溶性ビタミンＥおよびβ−カロテン組成物の調製を説明する。
【実施例１０】
【００４９】
ビタミンの水溶性処方の調製
表７．  ビタミンＥおよびβ−カロテンの水溶性組成物の成分
2004521900.tif 000011
【００５０】
表７は直接混合法（実施例５）または補助溶媒の助けを借りて（実施例７）調製された様々な組成物に用いられる出発物質の量を示す。可溶化剤のビタミンＥに対する最適比は２：１モル／モルまたは６：１ｗ／ｗであることが見いだされた。濃縮された組成物を２年まで冷蔵保存することができた。水性溶液（水または食塩水中）も安定であり、凍結貯蔵することができた。
【００５１】
実施例１１は本発明の組成物の単離、濃縮および滅菌の方法を説明する。
【実施例１１】
【００５２】
水溶性組成物の単離、濃縮および滅菌
本発明によると、２つのプロセスを親油性化合物の水溶性組成物を調製するために適用することができる：（ｉ）親油性化合物および可溶化剤を直接組み合わせ、一緒に溶融させることができるか、または（ｉｉ）両者をまず水混和性補助溶媒中に溶解させ、溶液を水と混合し、溶媒と過剰の水の両方を蒸発により除去することができる。得られた組成物は室温で水性媒体中に可溶性であるが、約８０℃より高い温度では可溶性でない。これらは加熱すると水から析出するが、冷却すると溶液に戻る。これにより、単離、濃縮および滅菌の簡単で有効かつ費用のかからない方法が提供される。
典型的には、組成物の水性溶液（ＴＰＧＳ−コエンザイムＱ１０、実施例９を除く）を沸騰水浴中で約２分間、または目に見える沈殿が形成されるまで加熱する。沈殿の熱湯からの分離は２０００×ｇでの高速遠心分離により加速される。水相をデカントし、得られるワックス質透明組成物は密封されたバイアル中冷蔵保存できる。これは少なくとも８ヶ月間安定なままであり、さらに水性媒体（水、食塩水または緩衝液）で希釈することができる。冷蔵すると、これらの溶液は少なくとも３年間安定である。沈殿／可溶化のプロセスは可逆的であり、これを数回繰り返すことにより組成物の希釈された水溶液の安定性が向上される。貯蔵中に組成物の沈殿が生じるならば、前記加熱／遠心分離サイクルを適用することにより、その溶解度を回復できる。前記プロセスはその滅菌に適用することができるので、組成物は注射にも好適である。
【００５３】
実施例１２はコエンザイムＱ１０を含む乾燥粉末組成物の調製を説明する。
【実施例１２】
【００５４】
乾燥粉末コエンザイムＱ１０組成物の調製
表８．  乾燥粉末コエンザイムＱ１０組成物の成分
2004521900.tif 000012
【００５５】
表８はコエンザイムＱ１０の乾燥粉末組成物の調製に用いられる出発物質の量を示す。前記成分の水性溶液を組み合わせ、凍結乾燥する。結果として得られる粉末生成物を圧縮して錠剤にすることができ、これは安定で水溶性のままであった。
【００５６】
実施例１３は複数の成分を含む乾燥粉末組成物の調製を説明する。
【実施例１３】
【００５７】
コエンザイムＱ１０、ビタミンＥおよびビタミンＣを含む組成物の調製
表９．  水溶性複合体組成物の成分
2004521900.tif 000013
【００５８】
表９は用いられる組成物の量を示す。前記成分の水性溶液を組み合わせ、凍結乾燥した。結果として得られる粉末生成物を圧縮して錠剤にし、これは安定で、水溶性のままであった。
【００５９】
実施例１４は可溶化剤に毒性がないことを示す。
【実施例１４】
【００６０】
インビトロ毒性試験
可溶化剤のストック溶液（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌ）を調製し、リンパ球Ｊｕｒｋａｔおよび神経芽腫ＮＴ２細胞培養物に、培養中の最終濃度を２００、１００および５００ｍｇ／ｍｌにするために必要な量において直接添加し、細胞生存性をトリパンブルー排除分析により評価した。評価の結果を図１に示す。
商業的に入手可能なＴＰＧＳを除いて、いずれの本発明の可溶化剤も、細胞培養物に２００ｍｇ／ｍｌまでの濃度で添加した場合に、細胞増殖またはインビトロ生存性に悪影響を及ぼさなかった。さらに、図２に示すように、ＣｏＱ１０およびＰＴＳ、ＰＣＳまたはＰＳＳを含む組成物をスプラグ・ドーリーラットに体重１ｋｇあたり２０ｍｇまでの濃度で投与した場合に、毒性は観察されなかった。
用いた実験例において観察されるＴＰＧＳの毒性を説明するための原理を提示することは出来ないが、その医薬処方における可溶化剤としての有用性はさらに調査されるべきであり、慎重に取り扱わなければならない。
【００６１】
実施例１５は，ＣｏＱ１０の水溶性形態の向上された生物学的利用能を説明する。
【実施例１５】
【００６２】
コエンザイムＱ１０の水溶性形態の生物学的利用能
水溶性組成物または油溶性組成物のいずれかの形態のＣｏＱ１０を、体重１ｋｇあたり６ｍｇの用量で、３００〜３５０ｇオススプラグ・ドーリーラットに摂食により投与した。血液サンプルを集め、ＣｏＱ１０含量を本発明者らが生物学的サンプル中のＣｏＱ１０の分析のために開発したＨＰＬＣ法により血漿中で測定した（Ｇｒａｖｅｓら、ヒト血漿および他の生物学的サンプル中のコエンザイムＱ１０含量の分析、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｄ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ  ３５３〜３６５ページ、１９８８）。
簡単に説明すると、血漿または溶解した細胞の０．１ｍｌサンプル（実施例１５および１６）を０．３３ｍｌの１−プロパノールと混合し、３０秒間撹拌し、室温で１分間静置した。０．８６ｍｌのｎ−ヘキサンを次に添加し、サンプルを３０秒間激しく撹拌し、遠心分離機にかけて、相分離を達成し、変性タンパク質をペレット化した。ｎ−ヘキサンと１−プロパノールからなり、ＣｏＱ１０を含む上部相を集め、アルゴン雰囲気下で蒸発乾固させた。全てのＣｏＱ１０をその酸化形態に変換するために、残存する乾燥残留物を６０ｍｌのエタノールおよび２ｍｌのＨ２Ｏ２中に再溶解させた。サンプルアリコートを、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ  ＬＣ−１８−ＤＢカラム（粒径５ｍｍ、内径３０ｃｍ×４．０ｍｍ、Ｓｕｐｅｌｃｏ）上、逆相クロマトグラフィー（エタノール：メタノール８０：２０（ｖ／ｖ）の移動相で、１ｍｌ／分の流量）により分析した。２７５ｎｍおよび２９０ｎｍでの吸光度をモニターした。
【００６３】
データ定量化のために、ＣｏＱ１０の標準校正曲線およびベックマン・システム・ゴールドソフトウェアを利用した。コエンザイムＱ１０の量を、分析されたサンプルの測定されたピーク面積によって計算した。２７５ｎｍでのその吸光計数ε＝１４２００から分光測光法により決定された濃度のＣｏＱ１０エタノール溶液から校正曲線を作成した。ＣｏＱ１０のエタノール溶液は密封された褐色バイアル中２０℃で貯蔵できる。
図２に示すデータは、油状処方と比較した、水溶性組成物として経口投与された場合のＣｏＱ１０の著しく向上された（１．５ないし２倍）生物学的利用能を示す。明らかに、ＣｏＱ１０が水溶性形態において投与された場合に、吸収速度はずっと速く（血漿レベルは約３時間で最大値に達した）、到達した最大血漿レベルもずっと高い（２倍）。
【００６４】
実施例１６はＣｏＱ１０の水溶性形態を内在化するための細胞の能力を説明する。
【実施例１６】
【００６５】
コエンザイムＱ１０の細胞内吸収
次の実験は外因性ＣｏＱ１０を内在化するためのヒトケラチン合成細胞の能力を示すためにデザインされた。ヒト皮膚ケラチン合成細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−８８５８）を、０．２ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（上皮成長因子）、３０ｍｇ／ｍｌのウシ下垂体抽出物および異なる濃度のＣｏＱ１０で補足されたＳＦＭ（無血清培地、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、カタログ番号１０７２４）中で培養し、これを水溶性ＰＣＳ処方の形態で組織培地に直接添加した。細胞をこれらの条件下で３日まで成長させ、次に収穫し、よく洗浄した。細胞（約１〜３×１０６／サンプル）をｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁させ、凍結・解凍サイクル後、浸透圧衝撃により破壊した。ＣｏＱ１０をプロパノール／ヘキサン溶媒混合物により抽出し、その含量を前記のＨＰＬＣ分析により測定した。
ミトコンドリアフラクションを得るために、２５０ｍＭシュークロース、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む緩衝液中で細胞を均質化した。ホモジネートを８００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。上清を集め、さらに１００００ｇで１０分間、４℃で遠心分離した。粗ミトコンドリアフラクションであるペレットを１００ｍｌのｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁させ、プロパノール／ヘキサン溶媒混合物で抽出し、ＣｏＱ１０分析のために処理した。
【００６６】
表１０．  培養されたヒトケラチン合成細胞によるＣｏＱ１０の細胞内吸収
2004521900.tif 000014
【００６７】
表１０にまとめたデータは、組織培地の水性環境からのヒトケラチン合成細胞によるＣｏＱ１０細胞内吸収を示す。３日の実験期間中、ＣｏＱ１０の細胞内含量は、ＰＣＳ処方中再懸濁された１０ｍｇ／ｍｌおよび１００ｍｇ／ｍｌのＣｏＱ１０を含む培地から、それぞれ約２倍および５倍増加した。
【００６８】
表１１．  ケラチン合成細胞における増大したミトコンドリアＣｏＱ１０含量
2004521900.tif 000015
【００６９】
表１１に示す結果は、１０ｍｇ／ｍｌのＣｏＱ１０の存在下で３日間成長させた細胞のミトコンドリアフラクション中のＣｏＱ１０含量の著しい増加を示す。その脂溶性酸化防止剤としての機能に加えて、特にミトコンドリアにおいて増大したＣｏＱ１０含量は細胞生存能力の中心となる呼吸鎖を産生するエネルギーの有効性を増強することが期待される。
【００７０】
実施例１７はさらにＡＴＰを産生するためのミトコンドリア呼吸鎖の有効性を増大させるためのＣｏＱ１０の能力を示す。
【実施例１７】
【００７１】
ヒトＮＴ２細胞における細胞性ＡＴＰ含量に対するＣｏＱ１０の効果
ヒト奇形癌ＮＴ２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、１０％ＦＢＳ（ウシ胎仔血清）および１０ｍｇ／ｍｌのＣｏＱ１０で補足されたＤＭＥ培地（ＧｉＢｃｏ  ＢＲＬ）中で成長させ、これを水溶性ＰＴＳ処方の形態で組織培地に直接添加した。細胞を２４時間間隔で収穫し、０．０２Ｍグリシン、０．０５Ｍ  ＭｇＳＯ４、０．００４Ｍ  ＥＤＴＡからなる緩衝液（ｐＨ７．４）中に再懸濁させ、１００μＬサンプルに等分した。
ルシフェリン−ルシフェラーゼ生物発光分析（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を用いてＡＴＰ含量を測定した。ルシフェラーゼはルシフェリンの脱カルボキシル化およびＡＴＰの加水分解を触媒して、ピロリン酸塩およびオキシルシフェリンを生じる。これらの反応の結果、５６０ｎｍで発光する。発光強度はＡＴＰ濃度と比例する。１００μＬのサンプルを７５μＬのルシフェラーゼ−ルシフェリンの０．５ｍｇ／ｍＬ溶液と混合することによりＡＴＰ分析を行った。発光は、ベックマンＬＳ３８０１シンチレーションカウンターを用いて検出された。ＡＴＰ１０ないし１００ピコモルの範囲の標準曲線を作成した。ＡＴＰレベルを１μｇのタンパク質あたりのＡＴＰのピコモル数として表した。
図３は、ＮＹ２細胞における細胞性ＡＴＰレベルに対するＰＴＳ−ＣｏＱ１０組成物の影響を示す。ＡＴＰレベルは水溶性ＰＴＳ−ＣｏＱ１０処方の存在下で３日間培養された細胞において高く、これは再現可能であった。データポイントは３つの別個の試験からの平均値±ＳＥＭを表す。
【００７２】
実施例１８は、ヒト神経芽腫ＮＴ２細胞における酸素低下に対するＣｏＱ１０の防御効果を示す。
【実施例１８】
【００７３】
酸素低下に対する防御
ヒト奇形癌ＮＴ２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を２５ｃｍ２組織培養フラスコ中に接種し（０．３×１０６細胞／ｍｌの濃度で）、１０％ＦＢＳで補足されたＤＭＥ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中、組織培地に直接添加された１０ｍｇ／ｍｌのＣｏＱ１０−ＰＴＳ処方の存在下または不在下で、３日間成長させた。フラスコを、ガスパックプラスガス発生エンベロープを含む嫌気性チャンバー中で密封し、嫌気性条件下、３７℃で１７．５時間、無グルコース培地中でインキュベートした。酸素低下処置後、細胞を完全培地（ＣｏＱ１０またはビタミンＥを含むかまたは含まない）中に再び入れ、直ちに（時間０）または酸素正常条件下でさらに２４時間培養した後のいずれかに分析した。細胞生存能力をトリパンブルー排除分析により測定した。結果を図４に示す。
ＣｏＱ１０のＮＴ２細胞中の酸素低下に対する防御効果は明らかである。ＣｏＱ１０を受けていない細胞と比較して、約５０％少ない、３日間ＰＴｓ−ＣｏＯ１０であらかじめ処理された細胞が、低酸素からの２４時間の回復期間中に死んだ。
【００７４】
実施例１９は、酸素低下により引き起こされる細胞死に対する細胞の防御においてＣｏＱ１０はビタミンＥと同様に有効であることを示す。
【実施例１９】
【００７５】
コエンザイムＱ１０とビタミンＥ酸化防止機能の比較
ヒト奇形癌ＮＴ２（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を２５ｃｍ２組織培養フラスコ中に接種し（０．３×１０６細胞／ｍｌの濃度で）、１０％ＦＢＳで補足されたＤＭＥ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中、１０ｍｇ／ｍｌのＣｏＱ１０−ＰＴＳ処方または同じ濃度のビタミンＥ−ＰＴＳ処方（組織培地に直接添加した）のいずれかの存在下または非存在下で３日間成長させた。フラスコを、ガスパックプラスガス発生エンベロープを含む嫌気性チャンバー中で密封し、嫌気性条件において、３７℃で１７．５時間、無グルコース培地中でインキュベートした。酸素低下処理後、細胞を完全培地（ＣｏＱ１０またはビタミンＥを含むかまたは含まない）中に再び入れ、直ちに（時間０）または酸素正常条件下、さらに２４時間培養した後に分析した。細胞生存性をトリパンブルー排除分析により測定した。結果を図５に示す。
両実験例、ＣｏＱ１０およびビタミンＥ処理において、低酸素からの２４時間の回復期間中の死亡率（％）は半減する。これは、低酸素による細胞損傷に対するＣｏＱ１０の防御効果が、効果が証明されている酸化防止剤であるビタミンＥのそれと匹敵することを示す。
【００７６】
実施例２０は虚血／再潅流により引き起こされる組織損傷に対するＣｏＱ１０の防御効果を示す。用いられる動物モデルは、ヒト卒中の実験例であるが、データは虚血／再潅流の結果として組織が損傷されるあらゆる用途に関連する。
【実施例２０】
【００７７】
虚血／再潅流に対するＣｏＱ１０の防御効果
体重２２５〜２５０ｇの成体自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）（血管を短時間閉塞させた後、容易に卒中の特徴的な病変を発症する）を、中大脳動脈閉塞モデル（ＭＣＡＯ）に用いた。動物を麻酔し、右総頸動脈を永久的に閉塞させた。頭蓋を暴露し、頭蓋の２ｍｍバー孔から右中脳動脈（ＭＣＡ）に接近した。解剖顕微鏡下で、ミクロクリップをＭＣＡ血管に適用した。６０分の閉塞期間後、クリップをはずし、傷を閉じた。加熱ランプに接続された直腸サーミスタープローブを用いて体温を手術中および回復中３７．５℃に維持した。クリップを除去した直後に、ＣｏＱ１０（６ｍｇ／ｋｇ）を静脈内投与した（首静脈）。テトラゾリウム塩ＴＴＣ（２，３，５−トリフェニル、２Ｈ−テトラゾリウムクロリド）により、６０分虚血の効果を定量化した。
組織損傷を定量化するために、脳を５ｍｍ冠状断片に切断し、一夜２％ＴＴＣで染色した。アセトニトリルを用いて着色されたホルマザンを抽出し、その濃度を分光測光法により４８０ｎｍで測定した。結果を乾燥脳組織１ｇあたりのＯＤとして表した。
【００７８】
表１２．  虚血により引き起こされる脳損傷に対するＣｏＱ１０の防御効果
2004521900.tif 000016
【００７９】
テトラゾリウム塩はミトコンドリア呼吸酵素の組織化学的インジケーターであり、組織梗塞を検出するために用いられる。ＴＴＣは無傷酸化酵素系、例えばスクシネートおよびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼと反応し、電子を受容し、還元されて着色されたホルマザンになり、これは組織を赤く染色する。対照的に、無傷酸化系を有さない不可逆的に損傷を受けたミトコンドリアはＴＴＣを還元できず、組織は染色されず、白色のままである。従って、組織が健全であるほど、ＯＤの読みが高い。虚偽手術された対照ラットの脳（組織１ｇあたり約１２５０ＯＤ）および実験ラットの脳（組織１ｇあたり８９８．３ＯＤ）についてえら得られた値を比較する。虚血により引き起こされる組織損傷に対するＣｏＱ１０の防御効果は明らかであり、ＴＴＣ含量が高いほど、虚血後にＣｏＱ１０処置を受けた動物の脳から得られるＯＤの読みは高かった。
【００８０】
実施例２１は化粧品における水溶性ＣｏＱ１０組成物の実用性および適性を説明する。
【実施例２１】
【００８１】
化粧品における水溶性ＣｏＱ１０組成物
表１３．  化粧品の調製
2004521900.tif 000017
【００８２】
表１３は、ＣｏＱ１０含有皮膚生成物を調製するために用いられる出発物質の量を示し、これらは次の手順に従って組み合わされる。コエンザイムＱ１０が水溶性のままであるクリームの均一な組成物が形成されるまで、２つの成分を室温で混合した。クリームの０．２ｍｌのサンプルに水を添加することにより、これを試験した（合計体積１ｍｌ）。サンプルを激しく撹拌し、遠心分離機にかけて相を分離した。水性相は溶解したＣｏＱ１０を含んでいるので黄色のままであった。クリームは安定で、室温で数ヶ月後でさえも、相分離は見られなかった。
これらの化粧品を２０人の健康なボランティアについて１年間の期間にわたって試験した。全員皮膚の状態が向上された、すなわち、皮膚の弾力が改善され、しわが減少したと報告した。副作用を報告した者はいなかった。
【００８３】
実施例２２はポリエンマクロライド抗生物質を含む水溶性組成物の調製法を説明する。
【実施例２２】
【００８４】
抗真菌抗生物質の組成物の調製
表１４．  抗真菌抗生物質の水溶性処方の調製
2004521900.tif 000018
【００８５】
表１４は抗生物質の水溶性組成物を調製するために用いられる出発物質の量を示す。抗生物質および可溶化剤を別々に適当な溶媒または溶媒混合物中に溶解させた。溶液を合わせ、水で希釈した。溶媒をおよび過剰の水を減圧下で蒸発させることにより除去した。氷酢酸を溶媒として使用する場合、水との同時蒸発を数回繰り返した。２０ｍｇ／ｍｌの抗生物質を含有する組成物を溶媒の蒸発により得た。これらは安定であり、長時間にわたり（８か月）凍結保存できた。これらの組成物も実施例１１において記載した技術により単離し、さらに濃縮し、滅菌することができた。最終生成物はワックス質の透明なペレットであり、これはアルゴン雰囲気下密封されたバイアル中で最もよく凍結保存できた（８ヶ月まで）。これらは水性媒体（水または食塩水）中所望の濃度まで復元できた。
【００８６】
実施例２３は、ポリエンマクロライド抗生物質を含む水溶性組成物の調製を説明する。
【実施例２３】
【００８７】
抗真菌抗生物質の水溶性処方の調製
表１５．  抗真菌抗生物質の水溶性処方の調製
2004521900.tif 000019
【００８８】
表１５は、抗生物質の水溶性組成物を調製するために用いられる出発物質の量を示す。抗生物質および可溶化剤（１：２ないし１：４ｗ／ｗ比）を溶媒混合物（メタノール／氷酢酸３：１ｖ／ｖ）中に直接溶解させた。溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去し、ワックス質残留物を得た。この残留物を次に水中に溶解させ、沸騰水浴中で５分間滅菌し、凍結乾固させた。最終生成物は乾燥粉末であり、これをアルゴン雰囲気下で密封貯蔵した（少なくとも１年）。これらを水、食塩水またはデキストロース溶液中で所望の濃度まで復元した。典型的には、この方法により、５〜３０ｍｇ／ｍｌの抗生物質を含む溶液が得られた。アンホテリシンＢの水性溶液は４℃で少なくとも６ヶ月間安定であった。
【００８９】
実施例２４および２５は本発明に従って処方されたアンホテリシンＢおよびナイスタチンの減少した毒性を説明する。
【実施例２４】
【００９０】
赤血球（ＲＢＣ）のインビトロ溶血現象
Ｂａｌｂ／ｃマウスから単離した赤血球（ＲＢＣ）を用いて溶血分析を行った。血液をヘパリン（５０単位／ｍｌ）の存在下で抜き取り、ＲＢＣを単離し、リン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄した。分析するために、０．８ｍｌの０．１％ＰＢＳ中ＲＢＣ（ｖ／ｖ）を、ＰＳＳ、ＰＣＳおよびＰＴＳまたはファンギゾン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）を用いて処方された、増加する濃度のアンホテリシンＢ（最終濃度０から２００μｇ／ｍｌ）を含む０．２ｍｌのＰＢＳ緩衝液と混合した。混合物を３７℃で１時間、穏やかに回転させながらインキュベートした。サンプルを１０００×ｇで２分間スピンさせた。５４１ｎｍでの吸光度により上清中のヘモグロビンの含量を測定した。同じ３７℃で１時間のインキュベーション期間中に０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の存在下で放出されるヘモグロビンの量を１００％溶血の尺度とした。
【００９１】
表１６．  ＰＳＳ、ＰＣＳおよびＰＴＳとファンギゾンを用いて処方されたアンホテリシンＢの溶血活性の比較
2004521900.tif 000020
注：＊３回の別個の実験の平均値±平均の標準誤差、それぞれ二重反復試験において行った。
【００９２】
表１６に示す結果によると、本発明に従って調製されたアンホテリシンＢの３つの処方全てはファンギゾンよりもずっと毒性が低かった。しかしながら、ファンギゾン中１０μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢは１時間のインキュベーション期間中に１００％のＲＢＣ溶解を引き起こし、ＰＳＳを用いて処方された２００μｇ／ｍｌの抗生物質は、同じ時間中に細胞の１．７％しか溶解しなかった。
【実施例２５】
【００９３】
赤血球（ＲＢＣ）のインビトロ溶血
表１７．  ＰＳＳ、ＰＣＳおよびＰＴＳを用いて処方されたナイスタチンの溶血活性
2004521900.tif 000021
注：＊４つの異なるサンプルの平均値±平均の標準誤差
【００９４】
表１７に示すように、本発明に従って調製されたナイスタチンの３つの処方の全ては、１０〜２００μｇ／ｍｌの濃度範囲内で無毒であった。
【００９５】
実施例２６は抗生物質処方のインビボ有効性を説明する。
【実施例２６】
【００９６】
本発明に従ってＰＣＳまたはＰＴＳのいずれかを用いて処方されたアンホテシリンＢ、あるいはファンギゾンでの７日間の治療後のマウス脳におけるシー・ネオホルマンス負荷の減少
ネズミクリプトコッカス・ネオフォーマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）の全身性感染症に対するアンホテリシンＢ処方のインビボ有効性試験を、次のプロトコルに従って８週令メスＣＤ１マウスについて行った。全動物に１．８４×１０３コロニー形成単位（ＣＦＵ）のシー・ネオフォーマンスを静脈内接種した。４日後、ファンギゾンまたはアンホテリシンＢ−ＰＣＳ、アンホテリシンＢ−ＰＴＳおよびＰＣＳ単独（ビヒクル）のいずれかを用いた７日間処置レジメにマウスを付した。抗生物質処方を最終濃度２５０μｇ／ｍｌまで５％デキストロースで希釈し、マウスに０．２ｍｌ／用量（体重１ｋｇあたり２ｍｇに相当）の適当な抗真菌処方を静脈内投与した。最後の抗真菌剤治療の２４時間後、マウスを屠殺し、脳を取り出し、均質化し、ＳａｂＤｅｘ寒天上にプレートした。シー・ネオフォーマンスコロニーを２６℃で３日インキュベーションした後に計数した。
抗カビ剤で処置した動物の感染負荷量をビヒクル処置と比較した。
【００９７】
表１８．  アンホテリシンＢ−ＰＣＳ、アンホテリシンＢ−ＰＴＳおよびファンギゾンで７日処置した後のマウス脳のおけるシー・ネオフォーマンス感染負荷量
2004521900.tif 000022
【００９８】
表１８に示したデータは、本発明に従って調製されたアンホテリシンＢ処方は、脳においてシー・ネオフォーマンス負荷量を著しく減少させ、ファンギゾンと同等に有効であることを示す。
【００９９】
実施例２７はＰＴＳの経口または静脈内投与のいずれかの後の血流中の遊離α−トコフェロールの放出を説明する。
【実施例２７】
【０１００】
ＰＴＳ投与後のビタミンＥの全身性放出
水中に溶解させたＰＴＳ（５０ｍｇ／ｍｌ）をスプラグ・ドーリーオスラット（３００〜３５０ｇ）に経口または静脈内のいずれかで、体重１ｋｇあたり５０ｍｇの量で投与した。ヘパリン化血液サンプルをＰＴＳ投与後０、３、８および２４時間に集めた。血漿サンプルを得、Ｓｕｐｅｒｃｏｓｉｌ  ＬＣ−１８−ＤＢカラムおよび流速１ｍｌ／分でエタノール：メタノール（８０：２０ｖ／ｖ）の移動相を用いたＨＰＬＣ法を用いて、アルファ−トコフェロールの含量について分析した。ベックマン・システム・カラットソフトウェアをデータ定量化に用いた。
【０１０１】
表１９．  ＰＴＳ投与後のラット血漿中のα−トコフェロールの濃度
2004521900.tif 000023
α−トコフェロールの上昇した血漿含量は、動物の身体によるＰＴＳの活性非毒性ビタミンＥへの全身性変換を示す。
【０１０２】
実施例２８は、リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびその誘導体などの高含量の多不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を有する異なる油を水中に溶解させる能力を示す。
【実施例２８】
【０１０３】
ＰＵＦＡを含有する油状物の水溶性処方の調製
油状物をＰＴＳ−６００またはＰＳＳ−６００のいずれかと１：２ないし１：３ｗ／ｗの比で直接混合した。混合物を次いで４０〜５０℃の温度に加熱して、透明溶融物の形態の水溶性組成物を形成した。混合物を次いで水で希釈して、溶液を形成した。これらのＰＵＦＡの水溶液は冷蔵した場合に数ヶ月間安定であった。
【０１０４】
表２０．  ＰＵＦＡの水溶性処方の調製
2004521900.tif 000024
【０１０５】
実施例２９は、スクアレン、ゲラニオール、ファルネソール、β−カロテン、アスタキサンチン、カンタキサンチン、ゼアキサンチン、クリプトキサンチン、ルテインおよびリコペンを含むテルペンおよびテルペノイドを水中に溶解させる能力を説明する。このような化合物は、酸化防止剤、着色料および香料として有用である。
【実施例２９】
【０１０６】
テルペンおよびテルペノイドの可溶化
表２１．  スクアレンの水溶性処方の調製
2004521900.tif 000025
【０１０７】
成分を、ＰＴＳ−６００、ＰＣＳ−６００またはＰＳＳ−６００のいずれかと、１：３ｗ／ｗの比で直接混合する。混合物を次いで４０〜５０℃の温度まで加熱して、透明溶融物の形態の水溶性組成物を形成した。混合物を次いで水で希釈して、溶液を形成した。溶液は冷蔵した場合に数ヶ月間安定であった。
【０１０８】
表２２．  水溶性アスタキサンチンの調製
2004521900.tif 000026
【０１０９】
アスタキサンチンおよびＰＴＳ−６００（重量比１：４）を水混和性溶媒（ＴＨＦ）中に溶解させ、混合物を水で希釈して、水性溶液を形成した。溶液を次いで減圧下で濃縮して、有機溶媒および水を除去した。濃縮された溶液（２ｍｇ／ｍｌ）を冷蔵し、数ヶ月間安定なままであった。
実施例３０はα−トコフェリルアセテートの水可溶化を説明する。
【実施例３０】
【０１１０】
表２３．  水溶性α−トコフェリルアセテートの調製
2004521900.tif 000027
（ポリオキシエタニル−トコトリエニルセバケート）
【０１１１】
表２３はα−トコフェリルアセテートのさまざまな水溶性処方に用いられる出発物質の量を示す。可溶化剤のα−トコフェリルアセテートに対する比は、ＰＴＳ−４００については２：１モル／モルまたは４／５：１ｗ／ｗであり、ＰＴＳ−６００については５．５：１ｗ／ｗであった。補助溶媒の助けを借りるか、または直接混合法のいずれかにより水溶性処方を得た。直接混合は、熱湯浴（８０〜１００℃）の高温で行った。混合物を水で希釈して、所望の濃度のα−トコフェリルアセテートにすることができた。
直接混合により得られる水性溶液は、補助溶媒の助けを借りて得られる溶液よりも若干不透明であった。溶液は冷蔵した場合に安定であった。
【０１１２】
実施例３１は、ポリオキシエタニルトコトリエニルセバケート（ＰＴｒｉｅｎＳ）の調製法を説明する。
【実施例３１】
【０１１３】
ポリオキシエタニルトコトリエニルセバケート（ＰＴｒｉｅｎＳ−６００）の合成
５ｍｌの無水酢酸エチル中に溶解させた２．１５ｇのトコトリエノール（ＮｕＴｒｉｅｎｅ、Ｅａｓｔｍｎａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）および０．９２５ｍｌのトリエチルアミン（ＴＥＡ）を、撹拌しながら無水条件下で１．４５ｍｌのセバコイルクロリドに滴下した。反応を５分間、室温で行い、この時点で、５ｍｌの無水酢酸エチル中に溶解させた３ｇのＰＥＧ−６００（ポリエチレングリコール、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，製品番号Ｐ−３３９０）および１．８５ｍｌのＴＥＡを、氷浴中で冷却しながら滴下した。反応を一定して撹拌しながらさらに５分間、室温で続けた。反応混合物を４回、５ｍｌ（各回）のＮａＣｌの飽和溶液で抽出した。反応生成物は有機相中に可溶性のままであり、この有機相から酢酸エチルを減圧下で除去すると、生成物のワックス質残留物が残った。生成物をさらに５０ｍｌのメタノール中に溶解させ、メタノール不溶性副生成物を遠心分離により除去し、メタノールを減圧下で蒸発させた。固体ワックス質生成物を２０ｍｌの水中に溶解させ、凍結乾燥して、約１．３ｇの褐色ワックス質固体のＰＴｒｉｅｎＳ−６００を得た。
【０１１４】
実施例３２はトコトリエノールの水可溶化を説明する。
【実施例３２】
【０１１５】
トコトリエノールの水可溶化
表２４．  水溶性トコトリエノールの調製
2004521900.tif 000028
【０１１６】
表２４は、トコトリエノールのさまざまな水溶性処方に用いられる出発物質の量を示す。可溶化剤のトコトリエノールに対する比は、約２：１モル／モルまたは５．５：１ｗ／ｗであった。補助溶媒の助けを借りるか、または直接混合法のいずれかにより水溶性処方を得た。高温の熱湯浴（８０〜１００℃）で直接混合を行った。混合物を水で希釈して、所望の濃度のトコトリエノールにした。ＰＴＳを用いて得られる水性溶液は不透明であり、一方、ＰＴｒｉｅｎＳを用いて得られる溶液は透明であった。溶液は冷蔵すると安定であった。
【０１１７】
実施例３３は、ＰｔｒｉｅｎＳ−６００およびＰＴＳ−４００中のコエンザイムＱ１０の水可溶化を説明する。
【実施例３３】
【０１１８】
コエンザイムＱ１０の水溶性処方の調製
表２５．  水溶性コエンザイムＱ１０の調製
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【０１１９】
表２５は、コエンザイムＱ１０の水溶性処方を調製するために用いられる出発物質の量を示す。コエンザイムＱ１０のＰＴＳ−４００に対する比は１：２．５ｗ／ｗであり、ＰｔｒｉｅｎＳ−６００に対しては１：３．５ｗ／ｗであった。高温の熱湯浴（８０〜１００℃）での直接混合により処方を得た。混合物を水で希釈して、所望の濃度のコエンザイムＱ１０にした。水性溶液は冷蔵すると安定であった。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】様々な可溶化剤の毒性を示すグラフである。
【図２】様々な水溶性組成物中のＣｏＱ１０の生物学的利用能を示すグラフである。
【図３】ＮＴ２細胞における細胞ＡＴＰレベルに対するＰＴＳ−ＣｏＱ１０組成物の影響を示すグラフである。
【図４】ＮＴ２細胞における低酸素に対するＰＴＳ−ＣｏＱ１０組成物の防御効果を示すグラフである。
【図５】ＰＴＳ−ＣｏＱ１０およびＰＴＳ−ビタミンＥ組成物の、低酸素処理ＮＴ２細胞の生存力に対する影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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2004521900.tif 000107
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004521900.tif 000108
【国際調査報告】
2004521900.tif 000109
2004521900.tif 000110
2004521900.tif 000111
2004521900.tif 000112
2004521900.tif 000113
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