(57)【要約】サンプル中の１以上の標的ポリヌクレオチドを検出または定量するための方法が、開示される。１つの局面において、サンプルは、それぞれ、選択された標的配列と対応する相補配列とにハイブリダイズし得る、第一のプローブ対と第二のプローブ対とを接触させる。プローブ切断および連結は、連結産物の形成を生じる。これは、この標的配列および／または相補配列がサンプル中に存在する場合に、対数様式で生成され得る。別の実施形態において、単一のプローブ対を使用して、相補的なテンプレートから直線様式で連結産物を形成し得る。試薬およびキットもまた、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）標的ポリヌクレオチド鎖領域および標的相補鎖領域を、第一のプローブ対および第二のプローブ対と反応させる工程であって、
該第一のプローブ対は、（ｉ）該標的鎖領域中の第一の標的領域に相補的な配列を含む、第一のポリヌクレオチドプローブと、（ｉｉ）該標的鎖領域中の第二の標的領域に相補的な配列を含む、第二のポリヌクレオチドプローブとを含み、ここで、該第二の領域は、該第一の領域に対して５’側に位置されかつ少なくとも１つのヌクレオチド塩基によって該第一の領域と重複し、そして
該第二のプローブ対は、（ｉ）該標的相補鎖領域中の第一の領域に相補的な配列を含む、第三のポリヌクレオチドプローブと、（ｉｉ）該標的相補鎖領域中の第二の領域に相補的な配列を含む、第四のポリヌクレオチドプローブとを含み、ここで、該第二の領域は、該第一の領域に対して５’側に位置されかつ少なくとも１つのヌクレオチド塩基によって該第一の領域と重複し、
該第一のプローブおよび該第二のプローブが、該標的鎖領域中のそれぞれ該第一の領域および該第二の領域にハイブリダイズして第一のハイブリダイゼーション複合体を形成し、かつ該第三のプローブおよび該第四のプローブが、該標的相補鎖領域中のそれぞれ該第一の領域および該第二の領域にハイブリダイズして第二のハイブリダイゼーション複合体を形成するために効果的な条件下で反応させる、工程；
（ｂ）（ｉ）該標的鎖領域、該第一のプローブ、および該第一のプローブの３’末端ヌクレオチドにすぐ連続して位置される５’末端ヌクレオチドを有する該第二のプローブの第一のフラグメント、を含む、第三のハイブリダイゼーション複合体；ならびに（ｉｉ）該標的相補鎖領域、該第三のプローブ、および該第一のプローブの３’末端ヌクレオチドにすぐ連続して位置される５’末端ヌクレオチドを有する該第四のプローブの第一のフラグメント、を含む、第四のハイブリダイゼーション複合体、を形成させるために、該第一のハイブリダイゼーション複合体中の該第二のプローブ、および該第二のハイブリダイゼーション複合体中の該第四のプローブを切断する工程、
（ｃ）該標的鎖領域にハイブリダイズした第一の連結鎖を形成するために、該第二のプローブのハイブリダイズしたフラグメントに該第一のプローブを連結させる工程、および該標的相補鎖領域にハイブリダイズした第二の連結鎖を形成するために、該第四のプローブのフラグメントに該第三のプローブを連結させる工程、
（ｄ）該標的鎖領域から該第一の連結鎖を、および該標的相補鎖領域から該第二の連結鎖を変性させる工程；そして
（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）の１以上のさらなるサイクルを実施する工程であって、ただし、最後のサイクルにおいて工程（ｄ）は必要に応じて省かれる、工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記第一の領域が、１ヌクレオチド塩基によって前記第二の領域と重複する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一のプローブの５’末端および前記第三のプローブの５’末端が、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基を有して終結する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第一のプローブの５’末端および前記第三のプローブの５’末端が、ヌクレオチド５’水酸基を有して終結する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第二のプローブの５’末端および前記第四のプローブの５’末端が、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基を有して終結する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第二のプローブの５’末端および前記第四のプローブの５’末端が、ヌクレオチド５’水酸基を有して終結する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第一のプローブの５’末端、前記第二のプローブの５’末端、前記第三のプローブの５’末端および前記第四のプローブの５’末端が、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基を有して終結する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第二のプローブの３’末端および前記第四のプローブの３’末端が、ヌクレオチド３’水酸基以外の基を有して終結する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第二のプローブの３’末端および前記第四のプローブの３’末端が、ヌクレオチド３’リン酸基を有して終結する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの前記プローブが、検出可能な標識を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識が蛍光標識である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識が放射標識である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記標識が化学発光標識である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記標識が酵素である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記第一のプローブおよび前記第三のプローブの少なくとも１つが、検出可能な標識を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一のプローブおよび前記第三のプローブの各々が、検出可能な標識を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第一のプローブおよび前記第三のプローブ上の検出可能な標識が、同一である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第二のプローブおよび前記第四のプローブの少なくとも１つが、検出可能な標識を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記第二のプローブおよび前記第四のプローブの各々が、検出可能な標識を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第二のプローブおよび前記第四のプローブが、同一の検出可能な標識を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１に記載の方法であって、前記切断工程が、前記第三のハイブリダイゼーション複合体と結合しない前記第二のプローブ由来の第二のフラグメントを産生し、そして該方法は、該第二のフラグメントを検出する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記第二のプローブおよび前記第四のプローブの少なくとも１つが、（ｉ）蛍光色素および（ｉｉ）該蛍光色素が蛍光発光エネルギーに供される場合に該蛍光色素からの蛍光発光をクエンチし得るクエンチャー色素、の両方を含み、そして、前記切断工程は、該第二のプローブおよび／または該第四のプローブ中の該蛍光色素と該クエンチャー色素との間の共有結合を切断し、それにより該蛍光色素からの観察可能な蛍光シグナルを増加させる、方法。
【請求項２３】
前記第二のプローブおよび前記第四のプローブの各々が、（ｉ）蛍光色素および（ｉｉ）クエンチャー色素を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項２１に記載の方法であって、前記切断工程が、前記第四のハイブリダイゼーション複合体と結合しない前記第四のプローブ由来の第二のフラグメントをさらに産生し、そして該方法は、両方の第二のフラグメントを検出する工程をさらに包含する、方法。
【請求項２５】
前記第二のフラグメントが、前記標的鎖領域に対して実質的に非相補性である、１個以上連続するヌクレオチドを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記１個以上連続するヌクレオチドが、１ヌクレオチド〜２０ヌクレオチドを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第二のフラグメントを固体支持体上に固定化させる工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記第二のフラグメントを電気泳動に供する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
質量分析によって前記第二のフラグメントを検出する工程をさらに包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記最後のサイクルの後に前記第二のフラグメントを検出する工程を包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
複数のサイクルの間にかまたはその後に前記第二のフラグメントを検出する工程を包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
全てのサイクルの間に前記第二のフラグメントを検出する工程を包含する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも１回のサイクルの後に前記第一のハイブリダイゼーション複合体、前記第二のハイブリダイゼーション複合体、またはこれらの両方を検出する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも１回のサイクルの後に前記第三のハイブリダイゼーション複合体、前記第四のハイブリダイゼーション複合体、またはこれらの両方を検出する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１回のサイクルの後に前記第一の連結鎖、前記第二のの連結鎖、またはこれらの両方を検出する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
前記検出工程が、電気泳動的に分離することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第一の連結鎖、前記第二の連結鎖、またはこれらの両方が、質量分析によって検出される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記第一連結鎖が検出される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記第一の連結鎖が、蛍光標識を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第一の連結鎖および前記第二の連結鎖が検出され、そして各連結鎖が、検出可能な標識を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
各検出可能な標識が蛍光標識である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第一の連結鎖、前記第二の連結鎖、またはこれらの両方が、固体支持体上に固定化されている、請求項３５に記載の方法。
【請求項４３】
前記最後のサイクルの後、前記第一連結鎖が、前記固体支持体上に固定化されており、そして検出される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記反応が、前記固体支持体上に固定化されている前記第一のプローブまたは前記第二のプローブを提供し、その結果、前記第一の連結鎖が、該固体支持体上に固定化される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記第一のプローブ対が、第一のプローブがその５’末端で第二のプローブの３’末端に連結部分によって共有結合で連結されるように、該第一のプローブおよび該第二のプローブを共有結合型で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記第二のプローブ対が、第三のプローブがその５’末端によって第四のプローブの３’末端に連結部分によって共有結合で連結されるように、該第三のプローブおよび該第四のプローブを共有結合型で含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記連結部分が、前記標的ポリヌクレオチドに実質的に相補的ではないポリヌクレオチド鎖を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記反応工程が、前記第一のプローブ、前記第二のプローブ、前記第三のプローブまたは前記第四のプローブのいずれかが相補的である領域の配列改変体に相補的な、第五のポリヌクレオチドプローブを提供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
前記第五のポリヌクレオチドプローブおよび前記第一のポリヌクレオチドプローブが、前記標的ポリヌクレオチド鎖領域中の代替的多型配列に相補的である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記第五のポリヌクレオチドプローブおよび前記第一のポリヌクレオチドプローブの標的相補配列が、代替的多型配列中の代替的標的ヌクレオチドに相補的である、異なる３’末端ヌクレオチドを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記第一のポリヌクレオチドプローブが、第一の検出可能な標識を含み、前記第五のポリヌクレオチドプローブが、該第一の検出可能な標識とは区別可能である第二の検出可能な標識を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記標識が蛍光標識である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記第五のポリヌクレオチドプローブおよび前記第二のポリヌクレオチドプローブが、前記標的ポリヌクレオチド鎖領域中の代替的多型配列に相補的である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記第五のポリヌクレオチドプローブおよび前記第二のポリヌクレオチドプローブの標的相補配列が、前記代替的多型配列中の代替的標的ヌクレオチド塩基に相補的である、異なる５’末端ヌクレオチドを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第二のポリヌクレオチドプローブが、第一の検出可能な標識を含み、そして前記第五のポリヌクレオチドプローブが、該第一の検出可能な標識とは区別可能である第二の検出可能な標識を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記標識が蛍光標識である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記標的鎖領域の前記第一の領域の５’末端塩基が、前記標的相補鎖領域の前記第一の領域の５’末端塩基と隣接する、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
前記標的鎖領域の前記第一の領域の５’末端塩基が、前記標的相補鎖領域の前記第一の領域の５’末端塩基と少なくとも１塩基離れる、請求項１に記載の方法。
【請求項５９】
前記反応工程が、第二の標的ポリヌクレオチド鎖領域に相補的である第三のプローブ対、および該第二の標的ポリヌクレオチド鎖領域の相補体に相補的である第四のプローブ対を提供することをさらに含む、請求項１に記載の方法であって、
該第三のプローブ対は、（ｉ）前記第二の標的鎖領域中の第一の標的領域に相補的な配列を含む、第五のポリヌクレオチドプローブ、および（ｉｉ）該第二の標的鎖領域中の第二の標的領域に相補的な配列を含む、第六のポリヌクレオチドプローブ、を含み、ここで、該第二の領域は、該第一の領域に対して５’側に位置されかつ少なくとも１つのヌクレオチド塩基によって該第一の領域と重複し、そして
該第四のプローブ対は、（ｉ）前記第二の標的相補鎖領域中の第一の領域に相補的な配列を含む、第七のポリヌクレオチドプローブ、および（ｉｉ）該第二の標的相補鎖領域中の第二の領域に相補的な配列を含む、第八のポリヌクレオチドプローブ、を含み、ここで、該第二の領域は、該第一の領域に対して５’側に位置されかつ少なくとも１つのヌクレオチド塩基によって該第一の領域と重複し、
該第二の標的相補鎖領域が前記サンプル中に存在する場合、該第五のプローブおよび該第六のプローブが、該第二の標的鎖領域中のそれぞれ該第一の領域および該第二の領域にハイブリダイズして第五のハイブリダイゼーション複合体を形成し、かつ該第七のプローブおよび該第八のプローブが、該第二の標的相補鎖領域中のそれぞれ該第一の領域および該第二の領域にハイブリダイズして第六のハイブリダイゼーション複合体を形成するために効果的な条件下で反応させる、方法。
【請求項６０】
前記第一のプローブ対および前記第二のプローブ対が、合わさって第一のプローブセットを構成する、請求項１に記載の方法であって、該方法は、サンプルを複数の異なるプローブセットと反応させる工程をさらに包含し、該複数の異なるプローブセットは、該サンプル中に存在し得る異なる標的ポリヌクレオチド配列を検出するために各々設計される、方法。
【請求項６１】
前記検出工程が、対応する標的配列が存在する場合、異なるプローブセットの各々によって生成される少なくとも１つの連結鎖を検出することを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
異なるプローブセット由来の連結鎖が、質量分析によって検出される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
異なるプローブセット由来の連結鎖が、電気泳動によって検出される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
異なるプローブセット由来の連結鎖が、異なる電気泳動移動度を有する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
異なるプローブセット由来の連結鎖が、同一であり得るかまたは異なり得る検出可能な標識を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記標識が蛍光標識である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
少なくとも２つの異なるプローブセット由来の連結鎖が、異なる蛍光標識を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
工程（ａ）の前に、異なるプローブセット由来の前記第一のプローブ、前記第二のプローブ、前記第三のプローブまたは前記第四のプローブが、固体支持体の異なる領域に固定化されている、請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
各プローブセットにおいて前記第一のプローブ、前記第二のプローブ、前記第三のプローブまたは前記第四のプローブの１つが、そのプローブセットを同定する異なるポリヌクレオチドタグを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７０】
前記タグを含む種を、固体支持体の異なる領域上に固定化されている複数の対応するタグ相補体にハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
異なるポリヌクレオチドタグの各々が、異なるプローブセットの各々における第一のプローブの５’末端に付着されている、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
異なるポリヌクレオチドタグの各々が、異なるプローブセットの各々における第二のプローブの３’末端に付着されている、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記固体支持体の異なる領域が、実質的に平坦な表面上に位置される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記固体支持体の異なる領域が、異なるビーズ上に位置される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
各プローブセットについて、前記切断工程が、前記第三のハイブリダイゼーション複合体と結合しない該プローブセットの第二のプローブから第二のフラグメントを生成する、請求項６０に記載の方法であって、該方法は、該第二のフラグメントを検出する工程をさらに包含する、方法。
【請求項７６】
異なるプローブセット由来の第二のフラグメントが、質量分析によって検出される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
異なるプローブセット由来の第二のフラグメントが、電気泳動によって検出される、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
異なるプローブセット由来の第二のフラグメントが、異なる電気泳動移動度を有する、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
異なるプローブセット由来の第二のフラグメントが、同一であり得るかまたは異なり得る検出可能な標識を含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記標識が蛍光標識である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
少なくとも２つの異なるプローブセット由来の第二のフラグメントが、異なる蛍光標識を含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８２】
異なるプローブセットの各々由来の前記第二のフラグメントが、該プローブセットを同定する異なるポリヌクレオチドタグを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項８３】
前記タグを含む第二のフラグメントを、固体支持体の異なる領域上に固定化されている複数の対応するタグ相補体にハイブリダイズさせる工程を包含する、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記固体支持体の異なる領域上が、実質的に平坦な表面上に位置される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記固体支持体の異なる領域上が、異なるビーズ上に位置される、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）標的ポリヌクレオチド鎖領域を、第一のプローブ対と反応させる工程であって、該第一のプローブ対は、（ｉ）該標的鎖領域中の第一の標的領域に相補的な配列を含む、第一のポリヌクレオチドプローブと、（ｉｉ）該標的鎖領域中の第二の標的領域に相補的な配列を含む、第二のポリヌクレオチドプローブとを含み、ここで、該第二の領域は、該第一の領域に対して５’側に位置されかつ少なくとも１つのヌクレオチド塩基によって該第一の領域と重複し、該第一のプローブおよび該第二のプローブが、該標的鎖領域中のそれぞれ該第一の領域および該第二の領域にハイブリダイズして第一のハイブリダイゼーション複合体を形成するのに効果的な条件下で反応させる、工程；
（ｂ）（ｉ）該標的鎖領域、該第一のプローブ、および該第一のプローブの３’末端ヌクレオチドにすぐ連続して位置される５’末端ヌクレオチドを有する該第二のプローブの第一のフラグメント、を含む、第二のハイブリダイゼーション複合体、を形成させるために、該第一のハイブリダイゼーション複合体中の該第二のプローブを切断する工程、
（ｃ）該標的鎖領域にハイブリダイズした第一の連結鎖を形成するために、該第二のプローブのハイブリダイズしたフラグメントに該第一のプローブを連結させる工程、
（ｄ）該標的鎖領域から該第一の連結鎖を変性させる工程；ならびに
（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）の１以上のさらなるサイクルを実施する工程であって、ただし、最後のサイクルにおいて工程（ｄ）は必要に応じて省かれる、工程、
を包含する、方法。
【請求項８７】
前記第一の領域が、１ヌクレオチド塩基によって前記第二の領域と重複する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記第一のプローブの５’末端が、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結する、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記第一のプローブの５’末端が、ヌクレオチド５’水酸基で終結する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記第二のプローブの５’末端が、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
前記第二のプローブの５’末端が、ヌクレオチド５’水酸基で終結する、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記第一のプローブおよび前記第二のプローブの５’末端が、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９３】
前記第二のプローブの３’末端が、ヌクレオチド３’水酸基以外の基で終結する、請求項８６に記載の方法。
【請求項９４】
前記第二のプローブの３’末端が、ヌクレオチド３’リン酸基で終結する、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記プローブの少なくとも１つが、検出可能な標識を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項９６】
前記標識が蛍光標識である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記標識が放射標識である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記標識が化学発光標識である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
前記標識が酵素である、請求項９５に記載の方法。
【請求項１００】
前記第一のプローブが、検出可能な標識を含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項１０１】
前記第二のプローブが、検出可能な標識を含む、請求項９５に記載の方法。
【請求項１０２】
請求項８６に記載の方法であって、前記切断する工程は、前記第二のハイブリダイゼーション複合体と結合しない前記第二のプローブから第二のフラグメントを産生し、そして、該方法は、該第二のフラグメントを検出する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１０３】
請求項１０２に記載の方法であって、ここで、前記第二のプローブは、（ｉ）蛍光色素および（ｉｉ）該蛍光色素が蛍光発光エネルギーに供される場合に該蛍光色素からの蛍光発光をクエンチし得るクエンチャー色素の両方を含み、そして、前記切断する工程は、該第二のプローブ中の該蛍光色素と該クエンチャー色素との間の共有結合を切断し、それにより該蛍光色素からの観察可能な蛍光シグナルを増加させる、方法。
【請求項１０４】
請求項１０２に記載の方法であって、ここで、前記第二のフラグメントは、前記標的鎖領域に実質的に非相補的である１個以上連続するヌクレオチドを含む、方法。
【請求項１０５】
前記１個以上連続するヌクレオチドは、１〜２０ヌクレオチドを含む、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記第二のフラグメントを固体支持体上に固定化させる工程をさらに包含する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０７】
前記第二のフラグメントを電気泳動に供する工程をさらに包含する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０８】
前記第二のフラグメントを質量分析によって検出する工程をさらに包含する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０９】
前記最後のサイクルの後に前記第二のフラグメントを検出する工程を包含する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１１０】
複数のサイクルの間またはその後に前記第二のフラグメントを検出する工程を包含する、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１１１】
全てのサイクルの後に前記第二のフラグメントを検出する工程を包含する、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
少なくとも１サイクルの後に前記第一のハイブリダイゼーションを検出する工程をさらに包含する、請求項８６に記載の方法。
【請求項１１３】
少なくとも１サイクルの後に前記第二のハイブリダイゼーションを検出する工程をさらに包含する、請求項８６に記載の方法。
【請求項１１４】
少なくとも１サイクルの後に前記第一の連結鎖を検出する工程をさらに包含する、請求項８６に記載の方法。
【請求項１１５】
前記検出する工程が電気泳動的に分離することを含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記第一の連結鎖が、質量分析によって検出される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
前記第一の連結鎖が、蛍光標識を含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１８】
前記第一の連結鎖が、固体支持体上に固定化されている、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１９】
前記最後のサイクルの後に、前記第一の連結鎖が、前記固体支持体上に固定化されそして検出される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
請求項１１８に記載の方法であって、前記反応工程が、前記固体支持体上に固定化されている前記第一のプローブおよび前記第二のプローブを提供し、その結果、前記第一の連結鎖が該固体支持体上に固定化されることを含む、方法。
【請求項１２１】
請求項８６に記載の方法であって、第一のプローブが、その５’末端で該第二のプローブの３’未満に連結部分によって共有結合的に連結されるように、該第一のプローブ対が、共有結合形態の第一のプローブと第二のプローブとを含む、方法。
【請求項１２２】
前記連結部分は、前記標的ポリヌクレオチドに実質的に相補的ではないポリヌクレオチド鎖を含む、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
請求項８６に記載の方法であって、前記反応工程が、前記第一のプローブまたは前記第二のプローブのいずれかが相補的である領域の配列改変体に相補的である、第三のポリヌクレオチドプローブをさらに含む、方法。
【請求項１２４】
請求項１２３に記載の方法であって、前記第三のポリヌクレオチドプローブおよび前記第一のポリヌクレオチドプローブが、前記標的ポリヌクレオチド鎖領域中の代替的多型配列に相補的である、方法。
【請求項１２５】
請求項１２４に記載の方法であって、前記第三のポリヌクレオチドプローブの前記標的相補配列および前記第一のポリヌクレオチドプローブの前記標的相補配列が、代替的多型配列中の代替的標的ヌクレオチド塩基に相補的である、異なる３’末端ヌクレオチドを含む、方法。
【請求項１２６】
請求項１２４に記載の方法であって、前記第一のポリヌクレオチドプローブが、第一の検出可能な標識を含み、そして前記第三のポリヌクレオチドプローブが、該第一の検出可能な標識とは区別可能な第二の検出可能な標識を含む、方法。
【請求項１２７】
前記標識が蛍光標識である、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
請求項１２３に記載の方法であって、前記第三のポリヌクレオチドプローブおよび前記第二のポリヌクレオチドプローブが、前記標的ポリヌクレオチド鎖領域中の代替的多型配列に相補的である、方法。
【請求項１２９】
請求項１２８に記載の方法であって、前記第三のポリヌクレオチドプローブの前記標的相補配列および前記第二のポリヌクレオチドプローブの前記標的相補配列が、前記代替的多型配列中の代替的標的ヌクレオチド塩基に相補的である、異なる５’末端ヌクレオチドを含む、方法。
【請求項１３０】
請求項１２８に記載の方法であって、前記第二のポリヌクレオチドプローブが、第一の検出可能な標識を含み、そして前記第三のポリヌクレオチドプローブが、該第一の検出可能な標識とは区別可能な第二の検出可能な標識を含む、方法。
【請求項１３１】
前記標識が蛍光標識である、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
請求項８６に記載の方法であって、前記標的鎖領域の第一の領域の前記５’末端塩基が、前記標的相補鎖領域の前記第一の領域の５’末端塩基と隣接する、方法。
【請求項１３３】
請求項８６に記載の方法であって、前記標的鎖領域の第一の領域の前記５’末端塩基が、前記標的相補鎖領域の前記第一の領域の５’末端塩基と少なくとも１ヌクレオチド塩基離れる、方法。
【請求項１３４】
請求項８６に記載の方法であって、前期反応工程は、第二の標的ポリヌクレオチド鎖領域に相補的な第二のプローブ対を提供することをさらに含み、
該第二のプローブ対は、（ｉ）該第二の標的鎖領域中の第一の標的領域に相補的な配列を含む、第三のポリヌクレオチドプローブと、（ｉｉ）該第二の標的鎖領域中の第二の標的領域に相補的な配列を含む、第四のポリヌクレオチドプローブとを含み、ここで、該第二の領域は、該第一の領域に対して５’側に位置されかつ少なくとも１つのヌクレオチド塩基によって該第一の領域と重複し、
前記第二の標的相補鎖領域がサンプル中に存在する場合、該第三のプローブおよび該第四のプローブが、該第二の標的鎖領域中のそれぞれ該第一の領域および該第二の領域にハイブリダイズして第三のハイブリダイゼーション複合体を形成するために効果的な条件下で反応させる、
方法。
【請求項１３５】
請求項８６に記載の方法であって、該方法は、サンプルを、複数の異なるプローブ対と反応させる工程をさらに包含し、該複数の異なるプローブ対は、該サンプル中に存在し得る異なる標的ポリヌクレオチド配列を検出するように各々設計されている、方法。
【請求項１３６】
請求項１３５に記載の方法であって、前記検出する工程が、対応する標的配列が存在する場合に各々異なるプローブ対によって産生される、少なくとも１つの連結鎖を検出することを含む、方法。
【請求項１３７】
異なるプローブ対由来の連結鎖が、質量分析によって検出される、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
異なるプローブ対由来の連結鎖が、電気泳動によって検出される、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３９】
異なるプローブ対由来の連結鎖が、異なる電気泳動的移動度を有する、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
異なるプローブ対由来の連結鎖が、同一であり得るかまたは異なり得る検出可能な標識を含む、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記標識が蛍光標識である、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
少なくとも２つの異なるプローブ対由来の連結鎖が、異なる蛍光標識を含む、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４３】
工程（ａ）の前に、１以上の異なるプローブ対由来の前記第一のプローブまたは前記第二のプローブが、固体支持体の異なる領域上に固定化されている、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４４】
各プローブ対中の前記第一のプローブおよび前記第二のプローブが、そのプローブ対を同定する、異なるポリヌクレオチドタグを含む、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１４５】
請求項１４４に記載の方法であって、前記タグを含む種を、固体支持体の異なる領域上に固定化されている、複数の対応するタグ相補体にハイブリダイズさせる工程をさらに包含する、方法。
【請求項１４６】
異なるポリヌクレオチドタグの各々が、各異なるプローブ対中の前記第一のプローブの５’末端に付着されている、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
異なるポリヌクレオチドタグの各々が、各異なるプローブ対中の前記第二のプローブの３’末端に付着されている、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４８】
前記異なる固体支持体領域が、実質的に平坦な表面上に位置されている、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４９】
前記異なる固体支持体領域が、異なるビーズ上に位置されている、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１５０】
請求項１３５に記載の方法であって、各プローブ対について、前記切断する工程が、前記第三のハイブリダイゼーション複合体に結合しない前記プローブ対の前記第二のプローブからの第二のフラグメントを産生することを含み、そして該方法は、該第二のフラグメントを検出する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１５１】
異なるプローブ対由来の第二のフラグメントが、質量分析によって検出される、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
異なるプローブ対由来の第二のフラグメントが、電気泳動によって検出される、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５３】
異なるプローブ対由来の第二のフラグメントが、異なる電気泳動的移動度を有する、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
異なるプローブ対由来の第二のフラグメントが、同一であり得るかまたは異なり得る検出可能な標識を含む、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５５】
前記標識が蛍光標識である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
少なくとも２つの異なるプローブ対由来の第二のフラグメントが、異なる蛍光標識を含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５７】
異なるプローブ対の各々からの前記第二のフラグメントが、そのプローブ対を同定する、異なるポリヌクレオチドタグを含む、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５８】
請求項１５７に記載の方法であって、前記タグを含む第二のフラグメントを、異なる固体支持体領域上に固定化されている複数の対応するタグ相補体にハイブリダイズさせる工程をさらに包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、参考として本明細書に援用される、２０００年７月３日出願、米国仮出願番号６０／２１６，５１４の優先権の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、１つ以上のサンプル中の１つ以上のポリヌクレオチド配列を検出または定量するための方法、およびそれにおける使用のための試薬およびキットに関する。
【０００３】
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（序論）
標的核酸の検出および分析の方法は、基礎研究、臨床診断、法医学、および他の分野において広範な有用性を見出している。１つの重要な用途は、遺伝的多型性の分野である。遺伝的多型は一般に、１つの種の異なる数に由来する相同な遺伝子座の間に存在する遺伝子配列のバリエーションに関与する。遺伝的多型は、種々のプロセス（例えば、ＤＮＡ複製または修復におけるエラー、遺伝子組み換え、自然発生的変異、転位など）による遺伝子座の変異を通じて生じ得る。このような変異は、単一のまたは複数の塩基置換、欠失、または挿入、および転位、複製などを生じ得る。
【０００４】
遺伝子配列内の１塩基置換（転位、および転座）は、ミスセンス変異におよびナンセンス変異を生じ得る。ミスセンス変異においては、アミノ酸残基は、異なるアミノ酸残基で置換され、一方、ナンセンス変異においては、終止コドンが生成されて、これが短縮ポリペプチド産物をもたらす。例えば、ｍＲＮＡのエキソン／イントロンスプライシングを指示するためにシグナル配列内に生じる変異は、劇的に変化したタンパク質配列を有する欠損スプライス改変体を生じ得る。欠失、挿入、および他の変異はまた、フレームシフトを生じ得、ここではこの変異体の下流にコードされた連続残基が、全体として異なるアミノ酸残基で置換されている。エキソンの外側の変異は、遺伝子発現および他のプロセスに干渉する。
【０００５】
遺伝子変異は、多くの疾患状態および障害の根底にある。いくつかの疾患は、ゲノム配列における単一の点変異にまで直接さかのぼられる（例えば、鎌状赤血球貧血に関連するＡからＴへの変異）が、その他は、同じ遺伝子座または異なる遺伝子座に位置された可能性のある異なる多数の多型に関連していた（例えば、嚢胞性線維症）。同じ遺伝子座内の変異は、異なる疾患（例えば、異常血色素症）を生じ得る。他の場合、変異の存在は、疾患について特定の条件に対する感受性を示し得るが、その存在は、その疾患の発生を確度をもって確実に予測するには不十分である。ほとんどが既知の変異が、遺伝子をコードする配列、スプライスシグナル、および調節配列に位置決定された。しかし、他の型の配列における変異も有害な効果、または時には有益な効果をもたらし得ることが、予想される。
【０００６】
多数の潜在的な遺伝子多型によって、核酸サンプルを同定および特徴付けるための方法、ならびに疾患を診断および予想するための方法の開発に対する重要なチャレンジが引き起こされる。他の出願において、病原体または外因性核酸の存在を検出すること、およびＲＮＡ転写物レベルを検出または定量することが、所望され得る。
【０００７】
種々の生物体について、特に高等生物（例えば、ヒト）について、利用可能になってきている配列データの量が増加していることに照らして、標的変異体の存在または非存在を決定するための迅速かつ便利な方法が必要である。理想的には、このような方法は、高い感度、正確性、および再現性を有していなければならない。また、この方法は、単一の反応混合物における複数の標的配列の同時検出を可能にしなければならない。
【０００８】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法を包含する。この方法において、標的ポリヌクレオチド鎖領域および標的相補鎖領域を、標的鎖領域における第一領域および第二領域に対する第一プローブ対のハイブリダイズに有効な条件下で、第一プローブ対および第二プローブ対と反応させて、第一ハイブリダイゼーション複合体を形成し、そして標的相補鎖領域における第一領域および第二領域に対する第二プローブ対のハイブリダイズに有効な条件下で、第一プローブ対および第二プローブ対と反応させて、第二ハイブリダイゼーション複合体を形成する。１つの実施形態において、第一プローブ対は、以下：（ｉ）標的鎖領域における第一標的領域に相補的である配列を含む第一ポリヌクレオチドプローブ、および（ｉｉ）標的鎖領域における第二標的領域に相補的である配列を含む第二ポリヌクレオチドプローブ、を含み、ここでこの第二領域は、この第一領域に対して５’側に位置し、そして少なくとも１つのヌクレオチド塩基分この第一領域と重複し、そしてこの第二プローブ対は、以下：（ｉ）標的相補鎖領域における第一標的領域に相補的である配列を含む第三ポリヌクレオチドプローブ、および（ｉｉ）標的相補鎖領域における第二領域に相補的である配列を含む第四ポリヌクレオチドプローブ、を含み、ここでこの第二領域は、この第一領域に対して５’側に位置し、そして少なくとも１つのヌクレオチド塩基分この第一領域に重複する。
【０００９】
ハイブリダイゼーション後、この第一ハイブリダイゼーション複合体における第二プローブ、および第二ハイブリダイゼーション複合体における第四プローブは、切断されて、以下を形成し得る：（ｉ）標的鎖領域と、第一プローブと、第二プローブの第一フラグメント（第一プローブの３’末端ヌクレオチドに直ぐ隣接して配置された５’末端ヌクレオチドを有する）とを含む第三ハイブリダイゼーション複合体、および（ｉｉ）標的相補鎖領域と、第三プローブと、第四プローブの第一フラグメント（第三プローブの３’末端ヌクレオチドに直ぐ隣接して位置する５’末端ヌクレオチドを有する）とを含む、第四ハイブリダイゼーション複合体。ついで、この第一プローブは、第二プローブのハイブリダイズされたフラグメントに連結されて、標的鎖領域にハイブリダイズした第一の連結された鎖を形成し得、そして第三プローブは、第四プローブのフラグメントに連結されて、標的−相補鎖領域にハイブリダイズした第二の連結された鎖を形成し得る。
【００１０】
標的鎖領域からの第一の連結した鎖の変性、および標的−相補鎖領域からの第二の連結した鎖の変性によって、さらなるプローブ切断および連結のために未反応の第一プローブ対および第二プローブ対にハイブリダイズされ得る（これによって連結したプローブの量が増大する）一本鎖テンプレートが提供される。テンプレート依存性連結の発生は、標的配列（またはその相補体）がサンプル中に存在することの証拠である。
【００１１】
１つの実施形態において、標的鎖領域における第一領域は、単一ヌクレオチド塩基分、標的鎖領域における第二領域と重複し、そして／または標的相補鎖領域における第一領域は、単一ヌクレオチド塩基分、標的−相補鎖領域における第二領域と重複する。別の実施形態において、この標的鎖領域における第一領域は、二ヌクレオチド塩基分、標的鎖領域における第二領域に重複し、そして／または標的相補鎖領域における第一領域は、二ヌクレオチド塩基分、標的−相補鎖領域における第二領域に重複する。
【００１２】
別の実施形態において、第一プローブの５’末端および第三プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基（例えば、ヌクレオチド５’ヒドロキシル基）で終わる。別の実施形態において、第二プローブの５’末端および第四プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終わる。別の実施形態において、第一プローブ、第二プローブ、第三プローブ、および第四プローブの５’末端は、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終わる。
【００１３】
別の実施形態において、第二プローブの３’末端および第四プローブの３’末端は、ヌクレオチド３’ヒドロキシル基以外の基（例えば、ヌクレオチド３’リン酸基）で終わる。別の実施形態において、第二プローブの３’末端および第四プローブの３’末端は、ヌクレオチド３’リン酸基以外の基で終わる。別の実施形態において、第一プローブ、第二プローブ、第三プローブ、および第四プローブの３’末端は、ヌクレオチド３’リン酸基以外の基で終わる。
【００１４】
１つの実施形態において、第一プローブ、第二プローブ、第三プローブおよび第四のプローブは、共有結合的に別個の存在として提供される。別の実施形態において、第一のプローブ対は、共有結合的に連結した形態で第一プローブおよび第二プローブを含み、その結果この第一プローブは、連結部分によって、その第二プローブの３’末端に対して第一プローブの５’末端で共有結合的に連結される。同様に、この第二プローブ対は、共有結合的に連結した形態で第三プローブおよび第四プローブを含み得、その結果この第一プローブは、連結部分によって、その第四プローブの３’末端に対して第三プローブの５’末端で共有結合的に連結される。
【００１５】
別の実施形態において、このプローブの少なくとも１つは、検出可能標識を含む。例えば、第一プローブまたは第三プローブの少なくとも１つが、検出可能標識を含み得る。同様に、第二プローブまたは第四プローブの少なくとも１つが、検出可能標識を含み得る。好ましくは、この標識は、非放射性標識であり、そしてより好ましくは、蛍光標識であるが、任意の適切な標識が用いられ得る。
【００１６】
本発明の実施において、プローブ連結を検出または測定するために任意の方法が使用され得る。１実施形態において、プローブ切断により、第三ハイブリダイゼーション複合体に会合しない、第二プローブ由来の第二フラグメントを生成する。第二フラグメントを検出または測定することにより、直接的にまたは間接的に、標的配列が存在することが示される。反応混合物中の第二フラグメントの量の増大を用いることによっても、その前の切断および連結のサイクルにおけるプローブ連結の程度を測定し得る。同様に、第四プローブの切断によって、第四ハイブリダイゼーション複合体に会合しない第四フラグメントを生成し得る。第四フラグメントを検出または測定すること、または第二フラグメントおよび第四フラグメントの両方を検出または測定することにより、直接的にまたは間接的に、標的配列が存在することが示され得る。
【００１７】
１実施形態において、第二プローブおよび第四プローブの少なくとも１つが、以下：（ｉ）蛍光色素と、（ｉｉ）クエンチャー色素であって、蛍光色素が蛍光励起エネルギーに供されるとき、この蛍光色素からの蛍光放射をクエンチングし得るクエンチャー色素とを含み、そしてその切断が、第二プローブおよび／または第四プローブにおける蛍光色素とクエンチャー色素との間の共有結合を切断し、これによって、この蛍光色素からの観察可能な蛍光シグナルを増大する。
【００１８】
１実施形態において、第二フラグメントは、検出用の固体支持体上に固定される。他の実施形態において、この第二フラグメントは、電気泳動または質量分析法を用いて検出される。
【００１９】
第二フラグメントは、任意の適切な時点で（例えば、連続的に、または選択された期間の後、または選択されたサイクル数の後に）、検出され得る。
【００２０】
別の実施形態において、第一の連結された鎖、第二の連結された鎖、またはその両方が、少なくとも１サイクル後に測定される。例えば、連結された鎖は、検出用の固体支持体上に固定されてもよいし、または電気泳動もしくは質量分析法を用いて検出されてもよい。１つの実施形態において、検出される連結された各鎖は、蛍光標識を含む。
【００２１】
なお別の実施形態において、反応工程はさらに第五のポリヌクレオチドプローブを提供する工程を含む。このプローブは、第一プローブ、第二プローブ、第三プローブ、または第四プローブのいずれかが相補的である配列領域の配列改変体に相補的である。例えば、第五ポリヌクレオチドプローブおよび第一ポリヌクレオチドプローブは、別の多型の配列に相補的であり得る。１つの好ましい実施形態において、第五ポリヌクレオチドプローブおよび第一ポリヌクレオチドプローブは、別の標的ヌクレオチド塩基に相補的である異なる３’末端ヌクレオチドを含む。さらに、第一ポリヌクレオチドプローブおよび第五ポリヌクレオチドプローブは、お互いに識別可能である第一および第二の検出可能標識を含み得る。あるいは、第五ポリヌクレオチドプローブおよび第二ポリヌクレオチドプローブは、別の多型配列に相補的であり得る。
【００２２】
第一プローブセットおよび第二のプローブセットは、切断によって平坦（ｆｌｕｓｈ）隣接末端、または食い違った（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）隣接末端を有する、切断されたプローブを生成するように設計され得る。例えば、平坦隣接末端を生成するために、第一および第三のプローブは、標的鎖領域の第一領域の５’末端塩基が、標的相補鎖領域のその第一領域の５’末端塩基に隣接するように、設計され得る。あるいは、食い違い末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ　ｅｎｄ）は、標的鎖領域の第一領域の５’末端塩基が、標的−相補鎖領域の第一領域の５’末端塩基から１つ以上の塩基離れている場合に、生成され得る。
【００２３】
なお別の実施形態において、第一プローブ対および第二プローブ対は、一緒に第一プローブセットを構成し、そしてこの方法は、さらに、サンプルを複数の異なるプローブセット（サンプル中に存在し得る異なる標的ポリヌクレオチド配列を検出するように各々設計されている）と反応させる工程を包含する。１つの実施形態において、この方法は、対応する標的配列が存在する場合、各々異なるプローブセットによって生成される少なくとも１つの連結された鎖を検出する工程を包含する。１実施形態において、異なるプローブセット由来の連結された鎖は、質量分析法によって検出される。別の実施形態において、異なるプローブセット由来の連結した鎖は、電気泳動によって、例えば、異なる標識または電気泳動移動度に基づいて検出される。
【００２４】
各プローブセットにおける第一プローブ、第二プローブ、第三プローブ、または第四プローブは、異なる固体支持体領域上に固定され得る。例えば、反応工程の前に、各セット由来のプローブは、別個の固体支持体領域上に固定される。１実施形態において、各プローブセットにおけるプローブは、そのプローブセットを同定する別個のポリヌクレオチドタグを含む。これらのタグを用いて、切断および連結のサイクルの前、間、または好ましくは後に、別個の固体支持体領域に対してそのプローブを固定して、異なる標的配列の検出を容易にすることができる。このようなタグは、プローブ中の任意の適切な位置（例えば、各々異なるプローブセットにおける第一プローブの５’末端、または各々異なるプローブセットにおける第二プローブの３’末端など）を介して結合され得る。
【００２５】
別の実施形態において、各プローブセットについて、切断工程によって、各プローブセットの第二プローブから第二フラグメントを遊離する。そしてこの方法はさらに、存在する各標的について第二フラグメントを検出する工程を包含する。１実施形態において、異なるプローブセットからの第二フラグメントは、質量分析法によって検出される。別の実施形態において、第二フラグメントは、別個の標識、別個の電気泳動移動度、またはその両方に基づいて、電気泳動によって検出される。
【００２６】
別の実施形態において、各プローブセット由来の第二フラグメントは、そのプローブセットを同定する別個のポリヌクレオチドタグを含む。このタグを用いて、上記のように、別個の固体支持体領域に対してプローブを固定し得る。
【００２７】
別の局面において、本明細書に記載の方法は、改変され、その結果第二プローブ対が除外され、そしてプローブのハイブリダイゼーション、切断、および連結の１回以上のサイクルによって、このサイクル数に直線的に比例する率で、連結された鎖が生成される。
【００２８】
例えば、本発明は、また標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法を包含する。この方法は、以下を包含する：（ａ）標的ポリヌクレオチド鎖領域を、この標的鎖領域における第一領域および第二領域に対する、それざおれプローブ対中の第一プローブおよび第二プローブのハイブリダイズに有効な条件下で、上記の型の第一プローブ対と反応させて、第一ハイブリダイゼーション複合体を形成する工程、（ｂ）第一ハイブリダイゼーション複合体において第二プローブを切断して、（ｉ）標的鎖領域と、第一プローブと、第二プローブの第一フラグメント（第一プローブの３’末端ヌクレオチドに直ぐ隣接して配置された５’末端ヌクレオチドを有する）とを含む第二ハイブリダイゼーション複合体を形成する工程、（ｃ）第二プローブのハイブリダイズしたフラグメントに対して第一プローブを連結して、標的鎖領域に対してハイブリダイズした第一の連結された鎖を形成する工程、（ｄ）標的鎖領域から第一の連結された鎖を変性する工程、および（ｅ）工程（ａ）〜（ｄ）の１回以上のさらなるサイクルを実施する工程（ただし、最終サイクルにおいては、工程（ｄ）は必要に応じて省略される）。
【００２９】
本明細書においてさらに考察されるように、キットおよび種々のアッセイ成分および試薬もまた意図される。本発明のこれらの特徴および利点、ならびに他の特徴および利点は、本明細書の詳細な説明に照らして容易に明らかになる。
【００３０】
（詳細な説明）
本発明は、サンプル中の１つ以上の選択されたポリヌクレオチド配列を検出または定量するための方法を提供する。本発明は、高度に正確であり、高い特異性で標的配列の検出を可能にし、そして高感度で、少量の標的配列の検出および／または定量を可能にする。本発明はまた、遺伝子多型の遺伝子型および検出のために有利である。
【００３１】
（定義）
以下の用語または句は、他に示さない限り、以下の意味を有することを意図する。
【００３２】
「ヌクレオシド」とは、プリンのヌクレオシド塩基、デアザプリンのヌクレオシド塩基、またはピリミジンのヌクレオシド塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシン、イノシン、またはそれらの任意の機能的な等価物）のような塩基対形成部分（「塩基」とも呼ばれる）を含む化合物をいう。これらの塩基対形成部分は、糖環のような骨格部分またはその任意の機能的等価物に結合される。ヌクレオシドは、ペントース環（その２’−デオキシ型および２’−ヒドロキシル型）（例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，１９９２を参照のこと）、ならびにまたペントースアナログおよびその開環等価物（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，１９８０；Ｕｈｌｍａｎｎら、１９９０を参照のこと）の１’炭素に連結した塩基対形成部分（Ａ，Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）を含む天然に存在するヌクレオシドを含む。
【００３３】
用語「ヌクレオチド」は、本明細書において用いる場合、ヌクレオシドのリン酸エステル（例えば、三リン酸エステル）をいい、ここでエステル化の最も通常の部位は、ペントース５’−ヒドロキシル基である。特定の場合、用語「ヌクレオシド」は、都合によって、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方をいう。用語、ヌクレオチドおよびヌクレオシドは本明細書において用いる場合、改変されたヌクレオシド塩基部分、改変された糖部分、および／または改変されたリン酸基、およびリン酸エステル部分を有する合成アナログ（例えば、他のどこか（Ｓｃｈｅｉｔ　１９８０；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９１）で記載されたような）を含むことを意図する。
【００３４】
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書の目的について互換可能であり、そしてヌクレオシドモノマーのポリマーをいい、このポリマーには、一本鎖、二本鎖、および三本鎖のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、そのα−アノマー型、などが挙げられる。通常、このヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル結合で連結され、その結果「ホスホジエステル結合」とは、リン酸エステル結合またはそのアナログをいい、ここでリン原子は、＋５形式的酸化状態にあり、そして１つ以上の酸素原子が、非酸素部分で置換されている。代表的なリン酸アナログとしては、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェートなどが挙げられ、これには対イオンが存在する場合は、関連する対イオン（例えば、Ｈ＋、ＮＨ４＋、Ｎａ＋など）を含む。「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」はまた、標的核酸と配列特異的ハイブリッドを形成し得る、リン酸（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ、例えば、Ｋｕｎｄｓｅｎ、１９９６を参照のこと））エステルまたは他の結合によって連結した非ヌクレオチドモノマーのポリマーを含む。１つの型より多い結合および／またはヌクレオチドサブユニットを含むキメラ構造も意図される。ポリヌクレオチドは、代表的に、２〜３モノマーユニット（例えば、８〜４０）から、数百または数千のモノマーユニットのサイズにわたる。ポリヌクレオチドを文字の配列で提示する場合（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」）は常に、他に注記しない限り、このヌクレオチドは、左から右に５’から３’方向であること、そして「Ａ」はデオキシアデノシンを示し、「Ｃ」はデオキシシチジンを示し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを示し、「Ｔ」はチミジンを示すことが理解される。
【００３５】
「ポリヌクレオチドプローブ」とは、本発明の目的に適切な配列特異性を有する標的核酸配列に対して、水素結合を介してハイブリダイズし得る、任意の部分をいう。
【００３６】
「標的特異的ポリヌクレオチド」とは、標的配列に完全に相補的であるか、または実質的に相補的である標的結合セグメントを有するポリヌクレオチドであって、その結果、このポリヌクレオチドは、十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で非標的配列に有意に結合することなく、意図された標的に特異的に結合する、ポリヌクレオチドをいう。
【００３７】
「標識」とは、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに結合された場合、公知の検出方法を用いてこのようなヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを検出可能にする、任意の部分を意味する。
【００３８】
「診断」とは、診断方法、予後予測方法、およびスクリーニング方法を包含することを意図する。
【００３９】
「連結不能」とは、特定の条件下で、連結酵素により温度依存性連結されることができない、実体をいう。
【００４０】
「連結阻止」とは、ブロック基が除去されるまで、どんな条件下でも連結されることが化学的にできない、実体をいう。
【００４１】
（サンプル）
本発明との使用のための標的核酸は、任意の生物または他の供給源（例えば、原核生物、真核生物、植物、動物、およびウイルス、ならびに合成核酸を含むが、これらに限定されない）に由来し得る。この標的核酸は、広範な種類のサンプル型（例えば、細胞核（例えば、ゲノムＤＮＡ）、全細胞、組織サンプル、ファージ、プラスミド、ミトコンドリアなど））のいずれかに由来し得る。この標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ，および／またはその改変体もしくは改変形を含み得る。
【００４２】
多くの方法が、本発明における使用のための標的核酸の単離および精製に利用可能である。好ましくは、この標的核酸は、適切な標的特異的プローブアニーリング、切断、および連結を可能にするに十分に、タンパク質および妨害する他のいかなる物質も含まない。例示的精製方法としては、（ｉ）例えば、フェノール／クロロホルム有機試薬（Ａｕｓｕｂｅｌ）を使用し、好ましくは自動ＤＮＡ抽出機（例えば、ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）から入手可能なＭｏｄｅｌ　３４１　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ）を用いる、有機抽出、およびその後のエタノール沈殿；（ｉｉ）固相吸着法（Ｗａｌｓｈ　１９９１；Ｂｏｏｍ）；および（ｉｉｉ）塩誘導性ＤＮＡ沈殿法（Ｍｉｌｌｅｒ）（このような方法は、代表的には、「塩析」法と呼ばれる）が挙げられる。必要に応じて、上記精製法の各々に前に、サンプルからタンパク質を除去するのを補助するための酵素消化工程（例えば、プロテイナーゼＫまたは他のプロテナーゼによる消化）が、行われる。
【００４３】
検出を促進するために、この標的核酸は、本発明のハイブリダイゼーション工程、切断工程、および連結工程を行う前に、適切な増幅手順を使用して増幅され得る。このような増幅は、線形であってもまたは指数関数的であってもよい。好ましい実施形態において、この標的核酸の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して達成される（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、１９９４）。一般に、このＰＣＲは、二本鎖核酸サンプルの鎖を分離する最初の変性工程と、その後に続く、（ｉ）アニーリング工程（増幅プライマーが、標的配列と隣接する位置に特異的にアニーリングするのを可能にする）；（ｉｉ）伸長工程（５’から３’の方向にこのプライマーを伸長し、それにより、その標的配列に対して相補的なアンプリコン核酸を形成する）；および（ｉｉｉ）変性工程（標的配列からのそのアンプリコンの分離を生じる）の反復、からなる。上記工程の各々が、異なる温度で、好ましくは自動サーモサイクラー（ＰＥ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、実行され得る。所望される場合は、ＲＮＡサンプルが、公知の方法によって、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖または二重鎖ｃＤＮＡへと変換され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ）。
【００４４】
（方法）
本発明は、相補的標的配列にハイブリダイズするように各々設計され、そして標的配列にハイブリダイズした場合には特異的切断および連結をされることができる、プローブ対を使用する。このプローブ対は、例えば、本明細書中に記載される線形プローブ連結法および指数関数的プローブ連結法において、有用である。種々の異なるプローブ構築物および構成のいずれもが使用され得、同様に、以下の記載からより完全に理解される。
【００４５】
代表的には、各プローブ対は、（ｉ）標的鎖領域中の第１の標的領域に対して相補的な配列を含む、第１のポリヌクレオチドプローブ、および（ｉｉ）標的鎖領域中の第２の標的領域に対して相補的な配列を含む、第２のポリヌクレオチドプローブを、含む。この第２の領域は、第１の領域の５’側に位置し、そして少なくとも１ヌクレオチド塩基分、第１の領域と重複する。プローブは、任意の適切な方法により、好ましくは、自動ＤＮＡ合成機および標準的化学物質（例えば、ホスホロアミダイト化学）（Ｂｅａｕｃａｇｅ；Ｇａｉｔ、１９８４，１９９０）を使用して、調製され得る。
【００４６】
１つの局面において、本発明は、標的ポリヌクレオチド配列を検出するための方法を包含する。この方法において、標的ポリヌクレオチド鎖領域は、第１のプローブ対と、そのプローブ対のうちの第１プローブおよび第２プローブがそれぞれ標的鎖領域中の第１領域および第２の領域にハイブリダイズするに有効な条件下で、反応させられて、第１ハイブリダイゼーション複合体を形成する。ハイブリダイゼーションの後、第１のハイブリダイゼーション複合体中の第２のプローブは切断されて、標的領域と、第１プローブと、第１プローブの３’末端ヌクレオチドにすぐ連続して位置する５’末端ヌクレオチドを有する、第２プローブの第１フラグメントとを含む、ハイブリダイゼーション複合体を形成し得る。この第１プローブは、その後、第２プローブのハイブリダイズしたフラグメントに連結されて、標的鎖領域にハイブリダイズした第１の連結鎖を形成し得る。変性によって標的鎖領域から第１の連結鎖を分離した後、一本鎖形態の標的鎖領域が、さらなるプローブ切断および連結のための新しいプローブ対にハイブリダイズされ得、それにより、連結したプローブの量が増大し得る。テンプレート依存性連結の発生は、標的配列がサンプル中に存在することの証拠である。
【００４７】
１つの実施形態において、この第１の領域は、１ヌクレオチド塩基分だけ、第２の領域と重複する。別の実施形態において、この第１領域は、２ヌクレオチド塩基分だけ、第２領域と重複する。本発明はまた、第１領域と第２領域とが、３、４、５、６、７、８、９、１０ヌクレオチド以上重複する実施形態を、包含する。
【００４８】
例示的実施形態が、下記スキームＩに示され、このスキームＩは、第１プローブ対の第１ポリヌクレオチドプローブ（Ｐ１）および第２ポリヌクレオチドプローブ（Ｐ２）と整列した、一本鎖標的領域（Ｔ０）を示す。この２つのプローブは、５’から３’（左から右）への方向で示されるが、その標的は、３’から５’への方向で示される。この標的鎖領域は、実施例１に示されるヒトＡｐｏＢ配列の相補対であり、第１領域（Ｒ１）と、第１領域の５’側に位置する隣接領域（Ｒ２）とを含む。「Ｘ」は、この２つの標的領域と隣接し、かつ第１プローブおよび第２プローブにハイブリダイズしない、塩基を示す。
【００４９】
（スキームＩａ）
【００５０】
【化１】
2004507230.tif 000002
スキームＩａにおいて、第１領域と第２領域は、１塩基分重複する。この第１プローブは、領域Ｒ１中の対応する塩基に対して相補的な、２８個連続する塩基からなる。この第１プローブは、好ましくは、３’−ヒドロキシル基（−ＯＨ）を含む。第２プローブは、領域Ｒ２中の対応する塩基に対して相補的な、２４個連続する塩基からなる。第１プローブおよび第２プローブの両方が標的鎖領域にハイブリダイズした場合、第１プローブの３’末端Ａ塩基が、第２プローブの５’末端Ａ塩基と整列され、その結果は、両方のＡ塩基が、標的鎖領域中の対応するＴ塩基（太字かつ下線）へのハイブリダイゼーションについて競合し得る。換言すると、第１プローブの標的相補性セグメント（Ｒ１にハイブリダイズする）と第２プローブの標的相補性セグメント（Ｒ２にハイブリダイズする）とは、それらが標的配列に完全にハイブリダイズした場合には、１塩基分重複する。
【００５１】
標的配列への第１プローブおよび第２プローブのハイブリダイゼーションは、「置換鎖構造」と呼ばれ得る三重複合体を生成し、ここで、ハイブリダイズした第１プローブと第２プローブとの重複末端は、標的鎖領域中の同じ相補的塩基へのハイブリダイゼーションについて、競合し得る。この重複末端は、（ｉ）第１プローブの３’末端が標的鎖領域に直接ハイブリダイズして、第２プローブの５’末端を置換する状態、（ｉｉ）第２プローブの５’末端が、標的鎖領域に直接ハイブリダイズして、第１プローブの３’末端を置換する状態、（ｉｉｉ）重複末端が、フーグスティーン型塩基対または逆フーグスティーン型塩基対を含む三重鎖構造を形成する状態、または（ｉｖ）他の起こり得る任意の平衡状態間で、平衡して存在し得る。このハイブリダイゼーション複合体（１）は、連結不能であり（これは、相補的標的塩基に適合する隣接末端が存在しないことが原因で、隣接末端が、テンプレート依存性連結酵素の存在下で容易には連結可能でないことを意味する）、そして（２）は、第１ポリヌクレオチド部分および第２ポリヌクレオチド部分を含むハイブリッド構造を認識する、特定の５’ヌクレアーゼ酵素（本明細書中で、５’ヌクレアーゼまたは５’ヌクレアーゼ酵素と呼ばれる）についての基質であり、この５’ヌクレアーゼ酵素は、相補鎖にハイブリダイズした場合に、重複する標的相補的末端を有する、第１ポリヌクレオチド部分と第２ポリヌクレオチド部分を含む、ハイブリッド構造を認識する。このような５’ヌクレアーゼの存在下で、複合体中の第２プローブが切断されて、標的鎖と、第１プローブと、第１プローブの３’末端ヌクレオチドとすぐに連続して位置する５’末端ヌクレオチドを有する第２プローブの第１フラグメントとを含む、切断されたハイブリダイゼーション複合体を形成し得る。
【００５２】
第１プローブおよび第２プローブと標的鎖とのハイブリダイゼーションの際に形成した、スキームＩからの複合体に関して、切断が、第２プローブから５’末端塩基の分離を生じ、第１プローブと、第２プローブのフラグメントとを、標的鎖にハイブリダイズしたままにする。生じた複合体が、スキームＩｂに示され、第１プローブと、第２プローブの残りのフラグメントとが、隣接する末端が、互いにすぐに連続するが共有結合していないことを強調するために、異なる線上で示される。第２プローブ由来の残りのフラグメントの５’末端は、５’ヌクレアーゼの作用に起因して、５’−リン酸基を含む。
【００５３】
（スキームＩｂ）
【００５４】
【化２】
2004507230.tif 000003
スキームＩｂにおけるハイブリダイゼーション複合体は、連結能を有する。なぜなら、第１プローブの隣接末端および第２プローブのフラグメントが、適切な条件下で連結されやすい、化学基（３’ヒドロキシルおよび５’リン酸）を有するからである。例えば、切断された複合体のリガーゼ酵素による処理は、スキームＩｃに示されるように、標的鎖にハイブリダイズされた連結鎖（ＬＳ１）を生成するために有効である。
【００５５】
（スキームＩｃ）
【００５６】
【化３】
2004507230.tif 000004
標的鎖からの連結鎖の変性の後、この標的鎖は、新しいプローブ対にハイブリダイズされ得、そしてプローブ切断および連結が、別の連結鎖を形成するために反復され得る。このような連結鎖の形成は、標的配列が、そのサンプル中に存在することを示す。
【００５７】
スキームＩａ〜Ｉｃは、プローブ対（標的鎖の量に対して過剰に存在する）の複数コピーを、ハイブリダイゼーション、切断、連結、および変性の各サイクルの期間に依存する線形率で、連結鎖へと変換するために実行され得るプロセスを示す。
【００５８】
さらなる実施形態において、連結鎖の指数関数的生成は、標的鎖領域および標的鎖領域の相補体にそれぞれ標的化される、第１プローブ対および第２プローブ対を使用して、達成され得る。このような実施形態の例は、スキームＩＩａ〜ＩＩｄに関して、以下に示される。
【００５９】
スキームＩＩａは、ヒトリガーゼＩの遺伝子の「Ａ対立遺伝子」（ヒトリガーゼＩのＡ対立遺伝子を表す、「ＡＨＬ」）について、部分的二重鎖配列を示し、これは、相補的第１プローブ対および相補的第２プローブ対と整列されている。第１プローブ対のプローブ（Ａｐ１およびＡｐ２）は、標的鎖領域Ｔ１の第１領域および第２領域（Ｒ１およびＲ２）に対して相補的である。第２プローブ対の第１プローブおよび第２プローブ（Ａｐ３およびＡｐ４）は、相補的標的鎖領域Ｔ２中の第１領域および第２領域（Ｒ３およびＲ４）に対して相補的である。
【００６０】
（スキームＩＩａ）
【００６１】
【化４】
2004507230.tif 000005
第１プローブ対の第１プローブ（Ａｐ１）は、２４ヌクレオチドを含む。Ａｐ１の５’末端塩基は、標的中の対応するＴ塩基に対して適合する。Ａｐ１の５’末端からの第２塩基は、Ｔ１中のＣ塩基に対してミスマッチする。Ａｐ１中の塩基３〜２４は、鎖領域Ｔ１に対する、２２個連続する標的相補的塩基の配列を構成する。第２プローブ（Ａｐ２）は、２５ヌクレオチドを含み、その５’末端Ａ塩基は、鎖領域Ｔ１中の対応するＧ塩基に対してミスマッチであり、そして残りの塩基は、Ｔ１に対して、２４個連続する適合塩基の配列を構成する。従って、第１プローブ対が結合する標的領域（Ｒ１およびＲ２）は、それぞれ、長さが２２ヌクレオチドおよび２４ヌクレオチドであり、そして一塩基分重複する。
【００６２】
第２プローブ対に関して、第１プローブ（Ａｐ３）は、２６ヌクレオチドを含み、その５’末端の最初の２塩基は、標的鎖領域Ｔ２（ヒトリガーゼＩコード鎖領域であり、標的鎖領域Ｔ１に対して相補的である）中の２つのＧ塩基に関してミスマッチしており、そして残りの塩基は、Ｔ２中の対応する塩基に対して相補的である。第２プローブ（Ａｐ４）は、２３ヌクレオチドを含み、その５’末端塩基は、Ｔ２中の対応するＡ塩基に関してミスマッチしており、そして残りの塩基は、Ｔ２中の対応する塩基に対して相補的である。従って、標的領域（Ｒ３およびＲ４）（鎖領域Ｔ２中の第１領域および第２領域）は、それぞれ、長さが２４ヌクレオチドおよび２２ヌクレオチドであり、そしてその２つの領域は、一塩基分重複する。
【００６３】
多くの状況において、二重鎖標的の２本鎖を「標的鎖」および「標的鎖の相補体」と命名することは、自由裁量選択であり、これらの命名の逆もまた適切であり得ることが、理解される。例えば、遺伝子コード鎖は、「標的鎖」とも、または「標的鎖の相補体」とも指定され得、それは、使用者の好みに依存する。あるいは、標的二重鎖の両方の鎖が、「標的鎖」と呼ばれ得る。
【００６４】
また、複数のプローブ対が、サンプル中の可能な複数の標的配列を検出するために使用される場合、その異なる標的配列は、同じ標的鎖中（すなわち、同じ染色体または同じ制限フラグメント中）に存在してもよいし、または異なる鎖中に存在してもよいことが、理解される。この理由のために、句「標的ポリヌクレオチド鎖領域」または「標的鎖領域」を使用して、２つの異なる標的配列が同じ鎖中に存在するか否かに関わらず、標的配列をいう。
【００６５】
第１プローブ対の両方のプローブが、鎖領域Ｔ１にハイブリダイズされる場合、その第１プローブの３’末端Ａ塩基は、第２プローブの標的相補的領域の５’末端の重複Ａ塩基と整列され、それにより、これらの２つの重複塩基が、鎖領域Ｔ１中の対応する標的Ｔ塩基（太字および下線）へのハイブリダイゼーションについて競合し得る。同様に、第２プローブ対の両方のプローブが鎖領域Ｔ２にハイブリダイズされる場合、第１プローブの３’末端Ｔ塩基が、第２プローブの標的相補的領域の５’末端の重複Ｔ塩基と整列され、それにより、これらの２つの重複塩基が、鎖領域Ｔ２中の対応する標的Ａ塩基（太字および下線）へのハイブリダイゼーションについて競合し得る。
【００６６】
Ｔ１またはＴ２中の相補的配列への各プローブ対のハイブリダイゼーションは、（１）連結不能であり、かつ（２）本明細書中に記載されるような特定の５’ヌクレオアーゼの基質である、ハイブリダイゼーション複合体を生じる。ハイブリダイゼーションの前に、二重鎖標的は、その標的の相補鎖を分離するために変性され、その後、その分離した鎖とその相補的プローブ対とのアニーリングが行われるべきである。過剰に各プローブ対が存在することは、プローブ−標的複合体の形成を支持し、かつ標的二重鎖の再形成を最小にすることを補助する。生じる複合体が、スキームＩＩｂに示される。
【００６７】
（スキームＩＩｂ）
【００６８】
【化５】
2004507230.tif 000006
各複合体において、第１プローブ、および第２プローブの残りのフラグメントは、互いとすぐに連続するがまだ共有結合はしていない、隣接末端を有する。第２プローブからの残りのフラグメントの５’末端は、５’ヌクレアーゼ酵素の作用に起因して、５’リン酸基を含む。スキームＩＩｂ中の各ハイブリダイゼーション複合体は、連結不能である。なぜなら、第１プローブと第２プローブのフラグメントとの隣接末端が、適切な条件下で連結されやすい化学基（３’ヒドロキシルおよび５’リン酸）を有するからである。各複合体中の隣接末端の連結は、スキームＩＩｃに示すように、標的鎖領域にハイブリダイズした、連結鎖（ＬＳ１１またはＬＳ１２）を生じる。
【００６９】
（スキームＩＩｃ）
【００７０】
【化６】
2004507230.tif 000007
標的鎖領域から連結鎖を分離した後、その連結鎖および標的鎖領域は、各々が、別の第１プローブまたは第２プローブにハイブリダイズされ得、そしてプローブ切断および連結の工程が反復されて、別の連結鎖を形成し得る。各々のハイブリダイゼーション、切断、連結、および鎖分離サイクルの後、連結プローブの合計は、Ｃ×２Ｎに等しくなると予期され、ここでＣは、サンプル中の標的配列の初期量であり、そしてＮはサイクル数であり、各工程で１００％の収量を仮定している。連結鎖の形成は、標的配列がサンプル中に存在することを示す。
【００７１】
ハイブリダイゼーション、切断、連結、および鎖分離のサイクルがより多く実施される場合、プローブ連結産物は、プローブのハイブリダイゼーション、切断および連結のための有力なテンプレートとなり、そしてその産物の混合物は、スキームＩＩｄに示されるような相補的連結鎖を形成するように第１プローブ対と第２プローブ対との連結から形成された、二重鎖が優勢となる。二重下線部は、それぞれ、第１プローブ対および第２プローブ中の第１プローブの３’末端塩基に由来する、Ａ塩基およびＴ塩基を示す。
【００７２】
（スキームＩＩｄ）
【００７３】
【化７】
2004507230.tif 000008
サンプルが最初に一本鎖標的のみを含む（すなわち、相補鎖が存在しない）かまたは標的：相補鎖の比が１：１未満である場合、プローブハイブリダイゼーション、切断、および連結の最初のサイクルは、最初の標的鎖中の標的配列（標的鎖領域）に対して相補的な連続配列を含む、連結鎖を生じるために有効でありこともまた、理解される。この連結した相補鎖は、その後、第２プローブ対の結合のためのテンプレートとして役立ち得、最初の標的鎖中の対応する配列と同一な配列を含む、連結鎖を形成する。
【００７４】
上記のように、各プローブ対中の第１プローブおよび第２プローブは、それぞれ、標的鎖中の第１標的領域および第２標的領域に対して相補的な、配列を含み、その標的領域は、少なくとも１ヌクレオチド塩基分互いに重複する。その標的領域は、標的（例えば、遺伝子、異種標的核酸、または病原体核酸）がサンプル中に存在する場合に、好ましくは、そのサンプル中に存在する不変異標的配列中に存在するように選択される。従って、各プローブ中の標的相補的配列は、通常は、各標的領域と完全に相補的であるように設計される。さらに、切断／連結部位付近の第１標的領域および第２標的領域に結合するプローブ部分が、標的鎖領域と完全に相補的であることが、好ましい。換言すると、標的相補的配列が実質的に相補的であり、但し、部位特異的プローブ切断およびその後の連結が、ミスマッチ塩基により有意には妨害されない場合に、ハイブリダイゼーションが成功し得る。しかし、標的に関して意図的にミスマッチしているがプローブ切断および連結の位置付近（例えば、２〜４塩基内）（または既知の多型部位付近）に位置して、非標的配列とのプローブハイブリダイゼーションを不安定にする、ヌクレオチド塩基を含むプローブ対中の第１プローブまたは第２プローブを設計することが、望ましくあり得る。
【００７５】
例示のみのために、第１プローブの３’塩基が、標的鎖領域中の対応する塩基に関してミスマッチしている場合、ハイブリダイズした第２プローブの切断は、その第２プローブ中の整列した塩基が標的に対して相補的なプローブ配列中にある場合に、可能である。しかし、３’ミスマッチが存在すると、その後、第２プローブの残りのフラグメントへの第１プローブの連結を、阻害または妨害し得る。標的鎖領域の第２領域が、第１プローブの３’末端に対して相補的な標的塩基のすぐ５’側に塩基変異を含む場合、第２プローブとのミスマッチは、その第２プローブの部位特異的切断に必要なハイブリダイゼーション複合体の安定な形成を妨害し得る。
【００７６】
いくつかの状況において、標的配列は、ＨＩＶおよび他の病原生物の場合のように、迅速な配列変異に対して感受性であり得る。このような状況に関して、そのプローブは、可能な場合は保存標的領域に標的化されるべきであり、または少なくとも、可能な塩基変化を最小数有する標的領域に標的化されるべきである。あるいは、可能な配列改変体が既知である場合は、いくつかの異なるプローブが、その反応物に含められ得、そのプローブ各々は、異なる標的配列改変体に標的化され、その標的配列が検出されるのを確実にする。同様のストラテジーを使用して、対立遺伝子改変体および一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を適切なように検出し得る。
【００７７】
標的二重鎖の２つの相補鎖に対して相補的な第１プローブ対および第２プローブ対が使用される場合（スキームＩＩａ〜ＩＩｄ）、その２つのプローブ対は、各プローブ対の第２プローブ中の切断部位が互いと直接整列されるか、または互いに対して交互になっているように、設計され得ることもまた、注意されるべきである。例えば、スキームＩＩａ中の第１プローブ対および第２プローブ対（Ａｐ１およびＡｐ３）中の第１プローブの３’末端は、互いに一塩基分重複する。１塩基より多く（例えば、２塩基、３塩基、４塩基、またはそれ以上）の重複もまた、意図される。同様に、プローブ対はまた、各プローブ対中の第２プローブの３’末端が互いに隣接する（０個重複する）ようにも、またはその３’末端間に１塩基以上のギャップ（例えば、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、またはそれ以上のギャップ）を生じるように互いにから後退するようにも、設計され得る。特定の重複または後退を達成するためのプローブ設計の選択は、温度、サイクル回数、および他の実験パラメーターを所望するように調整することによって、特定の実験条件およびサンプルが非テンプレート連結または非特異的連結を減少するように、最適にされ得る。
【００７８】
各プローブにおける標的相補的配列の長さは、好ましくは、サンプル中の非標的配列に対する有意な交差ハイブリダイゼーションを伴うことなく、所望の標的領域に対するプローブの特異的ハイブリダイゼーションを保証するように選択される。標的配列を検出するために標的特異的プローブ対を使用する１つの利点は、両方のプローブが、標的配列の第１の領域および第２の領域に結合しなければならないことである。第１のプローブおよび第２のプローブの一方のみが相補鎖領域にハイブリダイズされる場合、次いで、切断およびもう一方のプローブに対する連結は、生じない。
【００７９】
これらのプローブの標的相補的配列は、本発明の実施に適切な任意の長さのプローブであり得る。一般に、これらのプローブにおける標的特異的配列の長さは、非標的配列に対するハイブリダイゼーションからの有意な干渉を伴うことなく標的配列の特異的検出を可能にするのに、十分な長さであるべきである。代表的に、プローブ中の標的相補的配列は、少なくとも８、１０、１５または１８ヌクレオチド長である。標的相補的配列についての好ましい長さの範囲は、８〜４０ヌクレオチド、１０〜３５ヌクレオチド、１５〜３０ヌクレオチド、および１８〜２４ヌクレオチドである。２つのプローブ対を使用して、それぞれ、標的二重鎖の２つの鎖に結合させる場合、または、複数のプローブ対を使用して、異なる標的配列を検出する場合、それらの相補的標的配列にハイブリダイズさせた場合のプローブの融解温度は、好ましくは、１５℃以下、１０℃以下、および好ましくは、５℃以下のΔＴｍ範囲（Ｔｍａｘ−Ｔｍｉｎ）内にある。類似の融解温度を有するプローブ対はまた、ハイブリダイゼーション速度論におけるより良好な均一性を得るために有利であり、それ故、サイクルにおける収率が、異なるプローブ対について同等である。
【００８０】
プローブの融解温度は、例えば、オリゴヌクレオチドの融解温度を予測するための公知の方法を使用して計算され得る（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ、１９８６；Ｒｙｃｈｌｉｋ、１９８９および１９９０；Ｗｅｔｍｕｒ、１９９１；Ｏｓｂｏｒｎｅ、１９９１；Ｍｏｎｔｐｅｔｉｔ、１９９２）。約１８〜２４塩基長の標的相補的プローブ配列が好ましい。なぜなら、そのようなポリヌクレオチドは、アニーリング温度がオリゴヌクレオチド融解温度の数度以内に設定される場合に、非常に配列特異的である傾向にあるからである（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、１９９５）。プローブの特性は、所望の場合、経験的な方法によってさらに最適化され得る。
【００８１】
ハイブリダイゼーション複合体が、プローブ対と相補的標的配列との間で形成された場合、標的ハイブリダイゼーション複合体における第２のプローブの切断が、所望の結果を達成するのに効果的である任意の条件および試薬を使用して達成され得る。好ましくは、切断は、ＦＥＮ（５’フラップエンドヌクレアーゼ）ファミリーの酵素（５’ヌクレアーゼ、５’エンドヌクレアーゼ、および５’エキソ／エンドヌクレアーゼとも呼ばれる）由来の酵素、またはＦＥＮ活性を有する多酵素ポリペプチドを使用して達成される。以下の議論については、ＦＥＮ活性を含むポリペプチドを、まとめて、５’ヌクレアーゼと称する。非ポリメラーゼ５’ヌクレアーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、マウス、ヒト、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｗｏｅｓｅｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ、およびＡｒｃｈａｅｇｌｏｂｕｓ　ｆｕｌｇｉｄｕｓから得られ得る（例えば、Ｄ．Ｊ．Ｈｏｓｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２７１５４（１９９８）；Ｂ．Ｓｈｅｎら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２３：１７１（１９９８）；ＰＣＴ公開ＷＯ９８／４２８７３；および米国特許第５，８７４，２８３号（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら）を参照のこと）。多くのＤＮＡポリメラーゼ酵素が、５’ヌクレアーゼ活性を含むことが示されており、これらとしては、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｆｌａｖｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼが挙げられる（例えば、ＷＯ９７／２７２１４、ＷＯ９８／２３７７４およびＷＯ９８／４２８７３を参照のこと）。多くの場合において、これらの酵素の遺伝子は、多量の酵素を発現するために適切な宿主生物に導入されている。組換え法またはタンパク質分解法によって生成され得、そして（ｉ）減少されたポリメラーゼ活性（しかし、ヌクレアーゼ活性は維持する）および／または（ｉｉ）増強された５’ヌクレアーゼ活性を有する、短縮型または改変型ＤＮＡポリメラーゼポリペプチド、５’ヌクレアーゼ活性を有するキメラポリペプチドおよび融合ポリペプチド、および５’ヌクレアーゼ変異体（例えば、ＷＯ９８／４２８７３を参照のこと）もまた、有用である。５’ヌクレアーゼ活性を有する種々の酵素は、Ｔｈｉｒｄ　Ｗａｖｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎおよび種々の学術研究機関から入手可能である。
【００８２】
本明細書中に記載される切断工程および連結工程は、所望の結果を提供する任意の適切な条件下で行われ得る。緩衝液条件は、ヌクレアーゼ切断について上記のような文献に、および連結について下記のような文献に、見出され得る（以下の実施例１および２もまた参照のこと）。代表的な緩衝液としては、Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ，Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＭＯＢＳおよび他の利用可能な緩衝液（例えば、「Ｇｏｏｄ　ｂｕｆｆｅｒｓ」についてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃａｔａｌｏｇを参照のこと）。５〜１００ｍＭの緩衝液濃度が、代表的には、有用であるが、より高い濃度またはより低い濃度もまた、利用され得る。塩および他の添加剤（例えば、ＮａＣｌ、ＬｉＣｌ、ＫＣｌ、グリセロール（例えば、１〜１０容量％）など）もまた、所望の場合に含まれ得、そして使用される特定の酵素についての適切な補因子（例えば、いくつかのヌクレアーゼについて、ＭｇＣｌ２またはＭｎＣｌ２）が、含まれ得る。
【００８３】
上記のように、第１のプローブおよび第２のプローブが正しい標的配列にハイブリダイズされている場合、切断は、第２のプローブにおいて、第１のプローブの最も３’側の塩基と並ぶ塩基の直ぐ３’側に位置する、ヌクレオチド間連結にて生じる。切断反応は、標的鎖領域にハイブリダイズされたままの第２のプローブのフラグメント、および標的鎖から放れている第２のプローブの第２のフラグメントをも生じる。標的鎖における第１の標的領域および第２の標的領域が、１塩基重複する場合、この放れている第２のフラグメントは、切断部位の直ぐ５’側にあった第２のプローブ由来の標的相補的塩基、およびその塩基に連結されている任意の他の基を含む。標的鎖における第１の標的領域および第２の標的領域が、４個の標的相補的塩基で重複する場合、例えば、この放れている第２のフラグメントは、その３’末端にて、切断部位の直ぐ５’側にあった第２のプローブ由来の４個の標的相補的塩基セグメント、および任意の他の結合されている基を含む。
【００８４】
５’ヌクレアーゼ酵素によって触媒される切断反応は、構造特異的かつ配列特異的の両方であると説明され得る。この反応は、構造特異的である。なぜなら、５’ヌクレアーゼ酵素は、第１のプローブ、第２のプローブおよび標的鎖領域の特定の配列に関係なく、第１のプローブの３’末端塩基と並んでいる１番目の塩基とその１番目の塩基の３’側にある２番目の塩基との間で、その第２のプローブのヌクレオチド間連結を特異的に切断するからである。この反応は、配列特異的である。なぜなら、標的配列と比較して、切断部位は、第１のプローブおよび第２のプローブの標的相補的配列によって、そしてまた、それらのプローブの標的相補的配列間の重複の長さによって決定されるからである。
【００８５】
好ましくは、５’ヌクレアーゼ酵素は、加熱と冷却の複数回のサイクル（例えば、３０サイクル）後に実質的に完全な活性を維持する、熱安定性の酵素であり、それ故、サイクル中の５’ヌクレアーゼ酵素の補充は、必要とされない。このような酵素は、上記のような、好熱性生物から容易に得られ得る。例示的な好ましい実施形態において、この酵素は、６５℃で１分間（アニーリング／切断／連結）および９５℃で１５秒間（鎖変性）の３０サイクル後に、最初の５’ヌクレアーゼ活性の少なくとも８０％を維持する。
【００８６】
１つの実施形態に従って、プローブ対の第２のプローブは、１以上の切断耐性ヌクレオチド間連結を含み、意図される切断部位以外の連結部位でのプローブの切断を減少または防止する。このような切断耐性連結としては、例えば、ホスホロチオエート（５’Ｓ、３’Ｓ、またはエキソＳ）、ホスホロジチオエート（例えば、ジ−エキソまたはジ−エンド）、ホスホルアミデート（５’−３’Ｎ、３’−５’Ｎ、またはエキソ−Ｎ）、Ｏ−メチルホスホネート、およびペプチド核酸連結などが挙げられる。このような連結を合成するための方法は、周知であり、そして例えば、米国特許第５，８３７，８３５号（Ｇｒｙａｚｎｏｖら）、米国特許第５，８５９，２３３号（Ｈｉｒｓｃｈｂｅｉｎら）、Ｈｎｚｉｋｅｒら（１９９５）、およびＵｈｌｍａｎｎら（１９９０）に記載される。１つの実施形態において、第２のプローブの標的相補的部分のサブユニット間連結は、切断されるべき連結以外は、全て切断耐性連結である。しかし、二次部位（意図される連結以外の）でのプローブ切断の発生および程度は、配列依存性であり得るか、または他の理由で、プローブ内の数個の連結のみに限定され得る。これらの二次部位は、電気泳動または他の方法によって同定および特徴付けされ得、ここで、特に感受性の連結が、切断耐性連結で置換され得、安定な連結が、標準的なホスホジエステル連結として維持する。
【００８７】
特定の型の連結の効果は、使用される特定の５’ヌクレアーゼに依存し得ることが理解される。例えば、いくつかのエンドヌクレアーゼは、Ｓｐキラリティーを有する連結よりもＲｐキラリティーを有するエキソ−Ｓホスホロチオエート連結を、より容易に切断し得る（Ｔａｙｌｏｒら、１９８５を参照のこと）。また、標的切断部位に近接する１以上のＰＮＡ連結の存在は、酵素結合を阻害し得、それ故、このような連結は、切断されるべき連結から少なくとも数（例えば、少なくとも５）連結にて位置する場合に、最も有用であり得る。プローブ内の特定の連結型の使用および配置は、使用者および特定のアッセイについての設計事項である。
【００８８】
第２のプローブ部位特異的切断後、第１のプローブ、および残っている第２のプローブのフラグメントは、連結されて連結鎖を形成する。連結工程は、近接してハイブリダイズされた第１のプローブおよび切断された第２のプローブの、隣接する標的相補的末端の共有結合連結を促進するのに効果的な、任意の適切な条件を使用して達成される。通常、連結は、リガーゼ酵素を使用して、酵素的に達成され得る。好ましい形態において、連結は、第１のプローブの３’末端３’ヒドロキシル基を、切断される第２のプローブの５’リン酸基に連結する工程を包含し、標準的なホスホジエステル結合によって接続されている連結された鎖を生成する。しかし、プローブが意図される標的配列に結合されている場合、連結が生じるかぎり、反応基の任意の他の組み合わせが、使用され得る。
【００８９】
多くのリガーゼ酵素が、当該分野で公知であり、そして種々の生物学的供給源および商業的供給源から得られ得る。例示的なリガーゼとしては、Ｅ．ｃｏｌｉリガーゼ、Ｔ４リガーゼ、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓリガーゼ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓリガーゼ、Ｐｆｕリガーゼなど（例えば、米国特許第５，８３０，７１１号（Ｂａｒｎａｙら）および欧州特許第３２０３０８　Ｂ１号（ＢａｃｋｍａｎおよびＷａｎｇ）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。熱安定性リガーゼが、好ましい。なぜなら、温度サイクリング中のリガーゼ活性の補充を必要としないからである。例示的な好ましい実施形態において、この酵素は、６５℃で１分間（アニーリング／伸長）および９５℃で１５秒間（鎖変性）の３０サイクル後に、最初の５’ヌクレアーゼ活性の少なくとも８０％を維持する。
【００９０】
連結がリガーゼ酵素を使用して行われることが好ましいが、化学的（非酵素的）連結もまた意図される。１つの実施形態において、化学的連結は、第２のプローブの残っているフラグメントの５’末端にて化学的反応基を生成することによって行われ、この化学的反応基が、ハイブリダイズされた第１のプローブの３’末端の対応する反応基と反応し得る。第１のプローブの３’塩基は、第２のプローブのフラグメントの５’塩基と直ぐ連続しており、そしてその３’塩基およびその５’塩基が、標的鎖領域において対合する塩基にハイブリダイズされている場合、この２つの反応基は、互いの密接した近位に起因して共有結合連結を形成する。この反応は、反応混合物の温度で生じ、そして高エネルギーの光の照射を必要としないが、マイクロ波照射を使用して、連結を容易にし得る。例えば、第１のプローブは、３’ブロモアセチルアミノ基を含むように設計され得、そして第２のプローブは、切断される部位でホスホロチオエート連結を含むように設計され得る。第２のプローブの切断は、５’チオリン酸基を生じ、これが、３’ブロモアセチル基と直ぐ連続する。このチオリン酸基の硫黄原子による臭素原子の置換は、第１のプローブと第２のプローブの残っている第２のフラグメントとの間で、チオホスホリルアシルアミノ結合を生じる。次いで、この得られた連結された鎖は、検出され得るか、または相補的な第２のプローブ対のハイブリダイゼーション、切断、および連結のためのテンプレートとして作用し得る。熱化学的連結に使用され得る例示的な化学基についてのガイダンスは、例えば、米国特許第５，４７６，９３０号（ＬｅｔｓｉｎｇｅｒおよびＧｒｙａｚｎｏｖ）、米国特許第５，７４１，６４３号（Ｇｒａｙａｚｎｏｖら）およびそれらに引用される参考文献に見出され得る。例えば、欧州特許第３２４６１６　Ｂ１（Ｒｏｙｅｒら）に記載されるような、光励起による化学的連結もまた意図される。
【００９１】
本発明において使用されるプローブ対は、第１のプローブおよび第２のプローブが、それらの対応する第１の標的領域および第２の標的領域にハイブリダイズされている場合に連結不能であるように設計される。これは、その２つのプローブが、適切に反応する隣接しているプローブ末端を用いて、ニックの入った二重鎖構造を形成し得ないことに起因する。正確にハイブリダイズされたプローブ対は、上記で議論したような第２のプローブの部位特異的切断後にのみ連結可能になる。一般に、切断後に生じる「ニックの入った二重鎖」は、リガーゼ酵素（酵素的実施形態）または化学的カップリング（化学的実施形態）によって容易に連結される。なぜなら、第１のプローブおよび切断された第２のプローブの隣接している末端は、標的鎖領域へのハイブリダイゼーションに起因して互いに近接しているからである。しかし、不正確な連結反応もまた、誤ったプローブ切断事象、テンプレート非依存性の連結反応、および偽二重鎖形成から生じるテンプレート依存性の反応に起因して、生じ得る。このような副反応は、連結をブロックされた末端を有するプローブを提供することによって阻止され得る。例えば、プローブ対におけるこれらのプローブの５’末端は、標的特異的連結に関与しないので、これらは、本発明の反応条件下で連結し得ない５’末端基を提供することによって、「連結がブロックされる」ようになり得る。従って、酵素的連結の実施形態において、プローブは、ヌクレオチド５’リン酸基でない５’末端基を提供することによって、連結がブロックされるようになり得る。このような連結不能性のブロッキング基は、多くの種々の化学的実体（例えば、５’デオキシ、５’ヒドロキシ、５’Ｎ−アセチル、５’Ｏ−トリチル、５’Ｏ−モノメトキシトリチルなど）のいずれかであり得る。例えば、二重鎖標的の両方の鎖に相補的な第１のプローブ対および第２のプローブ対を使用する場合、第１のプローブおよび第３のプローブの５’末端は、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基で終結し、そして／または、第２のプローブおよび第４のプローブの５’末端は、ヌクレオチド５’リン酸基以外の基（例えば、５’ヒドロキシル）で終結する。
【００９２】
同様に、各プローブ対における第２のプローブの３’末端は、ヌクレオチド３’ヒドロキシル基でない３’末端基を提供することによって、連結がブロックされるようになり得る。例示的な３’ブロッキング基としては、３’デオキシ、３’リン酸基、３’Ｎ−アセチル、３’Ｏ−トリチル、３’Ｏ−モノメトキシトリチルなどが挙げられる。
【００９３】
別の実施形態において、プローブ対の第１のプローブおよび第２のプローブは、第１のプローブが、連結部分によって、第２のプローブの３’末端にて、その５’末端で共有結合的に連結されるように、共有結合的に連結された形態で提供される。１つの実施形態において、連結部分は、標的鎖にも、プローブにも、そしてサンプル中のいかなる他の核酸にも有意に相補的でないポリヌクレオチドの鎖を含む。連結部分は、プローブ中の標的相補的配列が標的鎖領域へのハイブリダイズを可能にするように、そして、切断に利用可能なハイブリダイゼーション複合体を形成するのに、十分な長さである。代表的には、この連結部分は、第１の標的領域および第２の標的領域の合わせた長さよりも長く、好ましくは、その合わせた長さよりも、少なくとも１０ヌクレオチド長い。ポリヌクレオチド連結部分は、任意の適切な配列を含み得るかまたはそれらからなり得る。例えば、連結部分は、Ｃ、Ｔ、ＧまたはＡのホモポリマーであり得る。あるいは、連結部分は、非ヌクレオチドポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリグリシンのようなポリペプチドなど）を含み得るかまたはそれらからなり得る。
【００９４】
本発明の実施において、標的ポリヌクレオチドは、好ましくは、公知の方法に従う変性によって一本鎖形態に変換され、相補的プローブとのハイブリダイゼーションのために標的配列の接近可能性を増加する。代表的には、適切な変性は、サンプルを、高い温度（例えば、少なくとも９０℃または少なくとも９５℃）に適切な時間（通常、少なくとも数秒〜数分、または必要な場合にはそれ以上）加熱し、さもなければプローブハイブリダイゼーションを干渉し得る鎖間および鎖内の二次構造を十分に除去することによって達成される。
【００９５】
次いで、標的鎖領域は、第１のプローブおよび第２のプローブが、それぞれ、標的鎖領域中の第１の領域および第２の領域にハイブリダイズして、第１のハイブリダイゼーション複合体を形成し、そして（存在する場合）第２のプローブ対の第３のプローブおよび第４のプローブが、それぞれ、標的相補鎖中の第１の領域および第２の領域にハイブリダイズして、第２のハイブリダイゼーション複合体を形成するのに効果的な条件下で、相補的プローブにアニールされ得る。
【００９６】
ハイブリダイゼーション（プローブアニーリング）は、配列特異性を促進するのに十分にストリンジェントであり、受容可能な割合の安定なハイブリッドの形成を可能にするのになお十分に許容的な条件下で行われる。プローブアニーリングに必要とされる温度および時間の長さは、プライマーの塩基組成、長さおよび濃度、および使用される溶媒の性質（共溶媒（例えば、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、ホルムアミド、グリセロール、および対イオン（例えば、マグネシウム）の濃度）を含む、いくつかの因子に依存する。例えば、ハイブリダイゼーション（アニーリング）は、反応混合物中のプローブ−標的ハイブリッドの融解温度より約５〜１０℃低い温度で行われるが、この範囲外の温度もまた意図される。例えば、たとえ反応温度が、第１のプローブおよび第２のプローブの融解温度以上であるとしても、これらのプローブはなお、一過的に、標的と二重鎖を形成し、この二重鎖は、正確に切断および連結され得る。代表的には、アニーリング温度は、５５℃〜７５℃の範囲にある。
【００９７】
プローブおよびプローブ対は、所望の結果を提供する任意の濃度で提供される。各プローブ対は、標的配列の最初の量と比較して過剰に、そしてまた、反応物中に予測される連結産物の最終的な量と比較して過剰に提供される。アニーリングは、通常、数秒または数分以内に完了する。１つの実施形態において、反応混合物は、ハイブリダイゼーション、部位特異的プローブ切断、および連結に適切な一定温度で維持される。しかし、プローブハイブリダイゼーションのための温度が、プローブの切断および連結に使用される温度と異なり得ること、または他の温度プロフィールが使用され得ることもまた、意図される。例えば、開始ハイブリダイゼーション時間の期間後、温度は、使用されるプローブおよび任意の酵素の特徴に依存して、切断反応または連結反応を促進するために上昇され得る。十分な時間後、連結された鎖は、上記のような高い温度で変性され得、その後、冷却して、標的鎖領域および連結されたプローブ産物が、さらなるサイクルのための新しいプローブ対にハイブリダイズするのを可能にする。
【００９８】
過剰なプローブの存在に起因して、標的鎖領域および標的相補的鎖領域は、互いよりも、対応する相補的プローブ対にアニールすることが理解される。また、アニーリング条件の結果として、過剰のプローブのほとんどまたは全てが、それらのプローブ相補体にハイブリダイゼーションする。言い換えると、第１のプローブは、第３のプローブにハイブリダイズし得、そして第２のプローブは、第４のプローブにハイブリダイズし得る。通常の環境下で、このようなプローブ−プローブ二重鎖は、残りのアッセイ工程を干渉しない。
【００９９】
標的鎖領域は、最初に、一本鎖形態（すなわち、相補的標的鎖を欠失する）でサンプル中に存在する場合、第１のサイクルの接触工程において、ハイブリダイゼーション複合体は、標的鎖領域とプローブ対の一方（例えば、第１のプローブ対）との間で形成し、もう一方のプローブ対が、溶液中に残る。しかし、切断および連結の第１のサイクル後、標的相補的鎖領域（第１のプローブと切断された第２のプローブの連結産物）は、次のサイクルにおいて第２のプローブ対へのアニーリングに利用可能である。
【０１００】
標的配列（単数または複数）は、任意の適切な方法で検出または定量され得る。標的の検出または定量は、標的が存在しない場合にその反応混合物中に存在しないか、またはさもなければ標的配列の非存在下で存在する種の量よりも多い量で存在する、任意の種または複合体の存在に基づき得る。例示として（これらに限定されない）、このような検出可能な種として、以下が挙げられ得る：
１）第２のプローブの切断後に標的鎖領域にハイブリダイズされたままである第２のプローブ由来の第１のフラグメント
２）第３のハイブリダイゼーション複合体と会合しない第２のプローブ由来の第２のフラグメント（そして、この方法は、その第２のフラグメントを検出する工程をさらに包含する）
３）相補的標的鎖領域（または相補的な連結された鎖）への、それぞれ、第１のプローブ対および第２のプローブ対のハイブリダイゼーションによって形成される第１のハイブリダイゼーション複合体、第２のハイブリダイゼーション複合体、またはその両方
４）先行する項目３）において言及される複合体の各プローブ対の第２のプローブの部位特異的切断後に形成される、第３のハイブリダイゼーション複合体、第４のハイブリダイゼーション複合体、またはその両方
５）プローブ連結から生じる、第１の連結された鎖、第２の連結された鎖（第１の鎖に相補的）、またはその両方。
【０１０１】
各々の種は、固有の特性（例えば、電気泳動移動度、質量、または特定の検出可能な標識（またはこのような標識に関連する検出可能なシグナル））に基づいて検出され得る。核酸および他の種の電気泳動分離方法は、周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９３および後版）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）の研究に記載される。本発明はまた、篩媒体または非篩媒体において検出される種に別個の移動度を付与するポリマーセグメントまたは他の部分（例えば、米国特許第５，４７０，７０５号、同第５，５１４，５４３号、および同第５，５８０，７３２号（Ｇｒｏｓｓｍａｎら）に教示されるような）の存在に起因して別個の電気泳動移動度を有する、プローブの使用を意図する。
【０１０２】
１つの実施形態において、検出を容易にするために、少なくとも１つのプローブは、標識を含む。任意の適切な標識が、使用され得る。標識は、それ自体で検出可能である直接的な標識であり得るか、または他の因子との組み合わせにおいて検出可能である間接的な標識であり得る。例示的な直接的な標識としては、蛍光団、発色団、放射性同位体（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈ）、スピン標識、化学発光標識などが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な間接的な標識としては、シグナル生成事象を触媒する酵素、および検出可能な抗リガンド（例えば、標識された抗体またはアビジン）に対して高い親和性で特異的に結合し得るリガンド（例えば、抗原またはビオチン）が挙げられる。ＤＮＡを標識するための方法の多くの包括的な総説は、本発明に適用可能なガイダンスを提供する。このような総説としては、Ｍａｔｔｈｅｗｓら（１９８８）；Ｈａｕｇｌａｎｄ（１９９２）、ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ（１９９３）；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（１９９１）；Ｋｒｉｃｋａ（１９９２）などが挙げられる。標識ヌクレオチドを作製するためのさらなる方法は、Ｆｕｎｇら；Ｈｏｂｂｓら、Ｍｅｎｃｈｅｎら、およびＢｅｒｇｏｔら、およびＲｏｓｅｎｂｌｕｍら（全て前出）に記載される。
【０１０３】
好ましい実施形態において、少なくとも１つのプローブ対における第２のプローブは、（１）蛍光色素および（２）消光色素の両方を含み、この消光色素は、両方の色素がプローブ中に存在する場合に蛍光色素の少なくとも一部を消光する。この２つの色素は、それらが、切断工程において特異的に切断される連結によって離されるように、第２のプローブ中に配置される。第２のプローブの切断は、そのプローブの標的相補的配列のほとんどまたは全てを含む（そして、標的鎖領域にハイブリダイズされたままである）、第１のフラグメント、およびハイブリダイゼーション複合体から放れる、第２のフラグメントを生じる。その放されることによる蛍光色素および消光色素の分離は、蛍光色素からの蛍光シグナルの増加を導く。蛍光因子／消光因子対を含む適切なプローブを調製するための方法は、例えば、Ｌｉｖａｋら（１９９５）および米国特許第５，８７６，９３０号（Ｌｉｖａｋら）に見出され得る。消光因子はまた、Ｅｐｏｃｈ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのような、種々の商業的供給源から入手可能である。
【０１０４】
別の実施形態において、プローブ対中の第１のプローブは、ドナー部分を含み得、そして第２のプローブは、アクセプター部分を含み、連結の際に、ドナー部分およびアクセプター部分が、密接に近位し、アクセプター部分の蛍光発光を増加する。
【０１０５】
別の実施形態において、プローブ対中の第１のプローブは、蛍光因子部分を含み得、そして第２のプローブは、消光因子部分を含み得、連結の際に、蛍光因子部分の蛍光発光が、消光に起因して減少する。
【０１０６】
１以上のプローブはまた、特異的結合対のメンバーを含み得る。「特異的結合対」とは、互いに特異的に結合して結合複合体を形成する、分子の対をいう。特異的結合対の例としては、抗体−抗原（またはハプテン）対、リガンド−レセプター対、酵素−基質対、ビオチン−アビジン対、相補的ポリヌクレオチド対などが挙げられるが、これらに限定されない。結合対の使用は、上記のように、プローブに対して種々の標識を結合するためにか、または結合対の他方のメンバーでコートされた固体支持体上でのプローブの捕捉のために使用され得る。
【０１０７】
なお別の実施形態において、連結は、例えば、サンプル中の二本鎖核酸の量に比例した蛍光の増加を示す化合物である、インターカレーター色素（例えば、エチジウムブロミドまたはＳＹＢＲ　ＧＲＥＥＮ（Ｍｏｒｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）またはマイナーグルーブバインダー（ｍｉｎｏｒ　ｇｒｏｏｖｅ　ｂｉｎｄｅｒ）（例えば、Ｈｏｅｃｈｅｓ　３３２５８）を使用して検出または定量される。
【０１０８】
（複数の標的物；アレイ）
本発明は、１つのサンプルまたは複数のサンプルにおいて、複数の異なる標的配列を検出するために用いられ得る。１つの実施形態では、異なる標的配列は、別々の反応混合物において、別個に検出される。別の実施形態では、サンプルは、複数のプローブセットと接触され得、このプローブセットは、サンプルに存在し得る異なる標的配列を検出するように各々が設計される。種々の標的配列は、各々のプローブ対に固有である検出可能な特徴（例えば、質量、電気泳動移動度、蛍光シグナル、またはこれらの組合せ）に基づいて検出され得る。電気泳動の方法は、周知であり、そして例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）、およびＧｒｏｓｓｍａｎおよびＣｏｌｂｕｒｎ（１９９２）に記載される。標的配列、および対応するプローブ対（これらは単一の反応において用いられ得る）の数は、使用者により選択され、そして種々の反応産物を区別するために用いられる特性の分離能に一部依存する。
【０１０９】
１つの実施形態では、プローブ対の第１のプローブおよび第２のプローブの１つは、このプローブ対を同定する別個のポリヌクレオチドタグ（規定されたポリヌクレオチド配列を有するタグ）を含む。このタグは、プローブの標的に相補的な配列の遠位端に直接付着され得るか、または、必要に応じて、介在性のスペーサー基によりプローブに連結され得る。別の実施形態では、このタグは、プローブの標的に相補的な配列の内部に連結され得る。従って、このタグは、サブユニット間の連結基に連結され得るか、またはプローブ内のヌクレオチド塩基に連結され得る。例えば、各々のタグは、異なるプローブ対の各々における第１のプローブの５’末端に付着され得るか、または異なるプローブ対の各々における第２のプローブの３’末端に付着され得る。
【０１１０】
タグ化プローブまたはタグ化プローブフラグメントは、別個の固体支持体領域に固定される対応するタグ相補体に対するハイブリダイゼーションにより、お互いに分離され得る。好ましくは、固体支持体領域は、アドレス可能なアレイとして構成される。「アドレス可能なアレイ」とは、各々のプローブまたはプローブフラグメントの正体が、既知であるか、またはアレイ上のこのプローブまたはプローブフラグメントのハイブリダイゼーションの位置から決定され得ることを意味する。好ましくは、タグ相補体は、平面上の別個の領域に固定され、その結果、別個の領域の各々は、特定の配列のみを有するタグ相補体のみを含み、そしてその結果、様々な別個の領域の各々におけるタグ相補体の配列が判明する。好都合なことに、このタグ相補体は、Ｘ座標およびＹ座標、またはそれらの任意の等価物により示され得る、別個のタグ相補体領域の周期的な二次元アレイような分布をしている。
【０１１１】
固相支持体は、タグセグメントを、この支持体上のそれらに相補的なタグ相補体に特異的にハイブリダイズさせる任意の材料を用いて形成され得る。例示的な支持体材料としては、以下が挙げられる：ガラス；水晶；シリコン；ポリカーボネート；金属材料（例えば、ＧａＡｓ、銅、またはゲルマニウム）；重合ゲル（例えば、架橋ポリアクリルアミド）；または膜（例えば、ナイロン、ポリビニリジンジフルオリド（ＰＶＤＦ）、もしくはポリテトラフルオロエチレン）。
【０１１２】
アレイにおけるタグ相補体の固定化は、種々の適切な方法のいずれかを用いて達成される。１つのアプローチでは、このタグ相補体は、液体分配（ｌｉｑｕｉｄ　ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）法を用いて固相表面上にデポジットされる。例えば、デポジットは、Ｓｃｈｅｎａら（１９９５）およびＳｈａｌｏｎ（１９９５）に記載されるように、ポリリジンをコートした顕微鏡用スライド上にロボットを利用して達成された後、無水コハク酸を用いて処理して、タグ相補体をポリリジン部分にカップリングさせ得る。共有結合のために、タグ相補体は、この支持体に共有結合に適切な反応性の官能基を含み得る。連結化学の例は、Ｂａｒａｎｙら（１９９１）、Ｐｏｎら（１９８８）、およびＭｅｎｃｈｅｎら（１９９４）に開示される。
【０１１３】
別のアプローチでは、タグ相補体は、Ｆｏｄｏｒら（１９９１、１９９５）、Ｐｉｒｒｕｎｇら（前出）、およびＳｈｏｅｍａｋｅｒ（１９９７）に記載されるように、フォトリソグラフ法によって支持体上で合成され得る。光除去可能な基が基材表面に付着され、そして光に曝露した領域を活性化することによる、基材表面の選択した領域へのモノマーの付加を制御するために、光不透過性マスクを用いる。成長するポリマー鎖へのモノマーの付加は、所望の様々な配列タグ相補体が所望のアドレス可能な位置で形成されるまで、様々なマスク配置を用いて続けられる。Ｆｏｄｏｒらのマスキング法はまた、ブロックポリマー合成に適用するように改変され得る。例えば、リンカー基（例えば、ポリペプチド、またはアミノプロピル基に連結したＮ−保護アミノカプロン酸）のアレイは、リンカー基の「カーペット」を形成する全ての固定領域の同時活性化により、基材表面上に形成される。次いで、タグ相補体は、選択したアドレス可能な位置で、液滴として、基材表面上に個々にデポジットされ（またはこの基材表面に吸収され）、そして（好ましくは、十分な量の溶媒が、未だ液滴の各々に残る間に）結合部分を固定したリンカー基へとカップリングさせるために、必要な場合、光または熱に曝露される。
【０１１４】
あるいは、タグ相補体は、例えば、リガンド−レセプター型の相互作用を用いて、非共有結合的に支持体上に固定化され得る。例えば、タグ相補体は、支持体に取り付けられたアビジンポリペプチドまたはストレプトアビジンポリペプチドに結合するための、共有結合したビオチン基をリンカー基として含み得る（例えば、Ｂａｒｒｅｔｔ、１９９６）。
【０１１５】
リンカーセグメントはまた、タグ相補配列とスペーサーアームを提供するための支持体との間に含まれ得る。このスペーサーアームは、タグ特異的結合領域が、支持体から分離することを可能にして、サンプルによりアクセスし易くする。例示的リンカー基は、例えば、Ｆｏｄｏｒら（１９９５）およびＢｒｅｎｎｅｒ（上記に引用されるＰＣＴ公開）に記載される。好ましくは、タグ相補体は、少なくとも１０個の鎖原子を含む鎖により支持体から隔てられる。
【０１１６】
この支持体は、デポジットしたタグ相補体を保持するために、支持体に窪みを備え得る。高い突起もまた用いられる。この突起に、タグ相補体がデポジットされる。さらに別のアプローチでは、タグ相補体は、例えば、米国特許第５，８４６，７１９号（Ｂｒｅｎｎｅｒら）に記載されるように、ビーズ上に形成され得る。あるいは、タグ相補体は、表面に付着したた個々のビーズのアレイに、ビーズが磁性体である（Ａｌｂｒｅｔｓｅｎ，１９９０）場合は磁力を介して、または接着剤を用いて、付着させる。
【０１１７】
別のアプローチでは、アレイが基材（例えば、ガラスプレート）上に形成される。これは、ポリアクリルアミドゲルの小片の長方形アレイで覆われている（例えば、Ｋｈｒａｐｋｏら、１９９１）。様々なタグ相補体は、選択された部位にデポジットされ、そしてタグ相補体上の３’末端ジアルデヒドをポリアクリルアミドゲル片上のヒドラジン基と反応させることにより、選択された部位に結合される。本発明に従うタグ相補体アレイはまた、ナイロンへのタグ相補体のロボットを利用したデポジットにより形成され得る（Ｋｈｒａｐｋｏら、前出）。デポジットの後、タグ相補体の固定を、必要に応じて、熱または光活性化により容易にし得る。
【０１１８】
タグ検出に用いられるアッセイ試薬の量を減少せるために、アレイは、１００領域／ｃｍ２、３００領域／ｃｍ２、１０３領域／ｃｍ２、３×１０３領域／ｃｍ２、１０４領域／ｃｍ２、１０５領域／ｃｍ２、または１０６領域／ｃｍ２を超えるタグ相補体領域密度を有する、マイクロアレイとして形成され得る。さらに、各アレイにおける様々な配列タグ相補体の数は、好ましくは、１０、２０、５０、１００、２００、５００、１０００、３０００、１０，０００、３０，０００、１００，０００、または３００，０００以上である。
【０１１９】
タグおよびタグ相補体は、一本鎖または二本鎖であり得、その結果、配列特異的ハイブリダイゼーションは、ＷａｔｓｏｎおよびＣｒｉｃｋ塩基対合による二重鎖か、または正もしくは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ結合による三重鎖のいずれかを形成する。特定のハイブリダイゼーションが、三重鎖形成を介して生じる実施形態では、タグ配列のコーディングは、二重鎖形成タグについての原理と同じ原理に従う。しかし、文字列の選択際のさらなる制約が存在する。一般に、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の結合を介する第３の鎖の会合は、二重鎖標的中のホモピリミジン−ホモプリントラクトに沿って最も安定である。通常、三重の塩基は、Ｔ−Ａ＊ＴモチーフまたはＣ−Ｇ＊Ｃモチーフ（ここで、「−」は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合を示し、そして「＊」は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の結合を示す）において形成する；しかし、他のモチーフもまた可能である。例えば、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合は、鎖の条件および組成に依存して、第３の鎖（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ鎖）と第３の鎖が結合する二重鎖のプリンリッチ鎖との間のパラレル配向およびアンチパラレル配向を可能にする。さらに、本発明はまた、米国特許第５，４３２，２７２号（Ｂｅｎｎｅｒ）に記載されるような非標準的塩基対合部分の使用を意図し、そしてこれは、「ＡＥＧＩＳ」システムとしてＥｒｏｇｅｎから入手可能である。
【０１２０】
特定の実施形態（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ（前出））で所望されるように三重鎖安定性を最大にするかさもなければ調節するために、適切な、配列、配向、条件、ヌクレオシド型（例えば、リボースヌクレオシドが用いられるか、デオキシリボースヌクレオシドが用いられるか）、塩基修飾（例えば、メチル化シトシン）などを選択するための文献に広範な手引きが存在する。より一般的には、一本鎖タグまたは二重鎖タグを、一本鎖配列相補体または二重鎖配列相補体にアニーリングさせるための条件は、周知である（例えば、Ｂｒｅｎｎｅｒ（前出）、Ｊｉら（１９９３）、Ｃａｎｔｏｒら（前出）、Ｗｅｔｍｕｒ（１９９１）、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら（１９８６）、Ｓｃｈｅｎａ（１９９５）など）。
【０１２１】
（検出）
用いられ得る標識の型に適切な任意の検出方法が用いられ得る。従って、例示的検出方法としては、放射性検出、光吸収検出（例えば、ＵＶ−可視吸収検出）、発光検出（例えば、蛍光または化学発光）が挙げられる。例えば、捕捉されたタグ種は、用いられるスキャニング法に依存して、各アレイの全てまたは一部を、同時にもしくは連続してスキャニングすることにより、アレイ上で検出され得る。蛍光標識について、アレイ上の選択された領域は、例えば、Ｆｏｄｏｒ（１９９５）およびＭａｔｈｉｅｓら（１９９２）に記載されるように、蛍光顕微鏡装置を使用して１つずつまたは一列ずつ連続的にスキャンされ得る。ハイブリダイゼーションパターンはまた、Ｙｅｒｓｈｏｖら（１９９６）に記載されるような、適切な光学系を備えるＣＣＤカメラ（例えば、モデルＴＥ／ＣＣＤ５１２ＳＦ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｔｒｅｎｔｏｎ，ＮＪ）を用いてスキャンされ得る（Ｐｌｏｅｍ，１９９３）か、またはＴＶモニタリングにより画像化され得る（Ｋｈｒａｐｋｏ，１９９１）。放射性シグナル（例えば、３２Ｐ）について、ホスホルイメージャーデバイスが用いられる（Ｊｈｏｎｓｔｏｎら、１９９０；Ｄｒｍａｎａｃら、１９９２；１９９３）。画像化装置の他の商業的供給業者としては、Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｓｃａｎｎｉｎｇ　Ｉｎｃ．，（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ，ｗｗｗ．ｇｅｎｓｃａｎ．ｃｏｍ）、Ｇｅｎｉｘ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗａｔｅｒｌｏｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ；ｗｗｗ．ｃｏｎｆｏｃａｌ．ｃｏｍ）、およびＡｐｐｌｉｅｄ　Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｉｎｃ．が挙げられる。このような検出方法は、複数のタグ相補体領域の同時スキャニングを達成するために、特に有用である。
【０１２２】
測定されたシグナルは、結果を表にするために、手動で分析されるか、または適切なコンピューター方法によって分析され得る。この結果は、使用者の必要に応じて、定性的結果または定量的結果を提供するために測定され得る。反応条件は、ハイブリダイゼーションの完全性を検証するため、および、必要ならば、定量化のための標準曲線を提供するために、適切なコントロールを含み得る。
【０１２３】
（キット）
本発明はまた、本発明を実施する際に有用であるキットを意図する。このようなキットは、上記のプローブ対の１つ以上、および、必要に応じて、５’ヌクレアーゼ酵素、およびリガーゼ酵素を含み得る。このキットはまた、緩衝液および本方法を容易にする任意の他の試薬を含み得る。
【０１２４】
前述から、本発明の特徴および利点が、どのように達成され得るかを理解し得る。本発明は、１つ以上の標的配列の有無を決定するため、さらには、定量のための、簡便な方法を提供する。この方法は、多くの標的配列および多くの様々なサンプルの高スループット処理に従う。本発明は、種々の目的（例えば、遺伝子スクリーニング、対立遺伝子決定、サンプル同定、疾患の診断、法医学、農学的分析など）に用いられ得る。この方法はまた、サンプルを同定または識別するための１つ以上のサンプルの配列プロフィールを確立するために用いられ得る。
【０１２５】
本発明を、特定の実施例によりさらに例示する。これらに実施例は、本発明を限定することを決して意図しない。
【０１２６】
（実施例１）
Ａｆｕ　ＦＥＮを、Ｔｈｉｒｄ　Ｗａｖｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から得た。ＡＭＰＬＩＧＡＳＥＴＭを、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。反応緩衝液（１Ｘ）は、１０ｍＭ　ＭＯＰＳ　ｐＨ７．５、１０μＭ　ＮＡＤ＋、３．０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．０５％　ＮＰ−４０、０．０５％　ＴＷＥＥＮ−２０（ｖ：ｖ）、および６０ｎＭ　ＲＯＸパッシブリファレンス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を含んでいた。
【０１２７】
ヒトリガーゼＩのＡ対立遺伝子（Ｒａｊｉ白血病細胞由来）にホモ接合性であるゲノムＤＮＡを、ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得た（ＤＮＡテンプレート試薬、品番４０１９７０）。ヒトリガーゼＩのＣ対立遺伝子にホモ接合性であるか、またはＡ対立遺伝子およびＣ対立遺伝子にヘテロ接合性である、ゲノムＤＮＡを、Ｃｏｒｉｅｌｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈから得た。
【０１２８】
プローブセット（以下を参照のこと）を、以下の標的配列を検出するために調製した：
【０１２９】
【化８】
2004507230.tif 000009
以下のプローブセットを、ホスホルアミダイト合成法により合成し（ここで、Ｆ＝６−Ｆａｍ、およびＱ＝Ｔａｍｒａ）、そして全てのプローブ配列は、５’から３’の方向である（Ｍｕｌｌａｈら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２６：１０２６−１０３１（１９９８）；および「Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　５’　ｎｏｎ−ｉｓｏｔｏｐｉｃ　ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｏｆ　ＰＣＲ　ｐｒｏｂｅｓ　ａｎｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ」（第３章）Ａｌｅｘ　Ａｎｄｒｕｓ、ＰＣＲ２：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｊ．ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９５）を参照のこと）。
【０１３０】
【化９】
2004507230.tif 000010
【０１３１】
【化１０】
2004507230.tif 000011
対応する標的配列を用いるプローブのアライメントを、以下に示す。１つの標的鎖領域のみが、各標的配列について示される。各プローブセット由来のプローブ３およびプローブ４は、標的鎖領域に相補的である。各プローブセット由来のプローブ１およびプローブ２は、標的鎖領域の相補体（示さず）に相補的である。ヒトリガーゼＩ遺伝子のＡ対立遺伝子およびＣ対立遺伝子を、区別する、それぞれ、Ａ塩基およびＣ塩基は、太字および下線により強調している。二重下線は、第２のプローブおよび第４のプローブの５’末端または５’末端付近の同じ塩基配列に、進入する、それぞれ、第１のプローブおよび第３のプローブの３’末端の塩基を示す。小文字は、標的配列（またはこの標的の相補体）に非相補的である塩基を示す。
【０１３２】
【化１１】
2004507230.tif 000012
【０１３３】
【化１２】
2004507230.tif 000013
反応混合物（各３０μＬ）を調製した。これらは、約１〜３ｎｇのゲノムＤＮＡ、ＡｐｏＢプローブセット、ＡＨＬプローブセット、またはＣＨＬプローブセット由来の１００ｎＭの各プローブ、１ｎｇのＡｆｕ　ＦＥＮ、および５単位のＡＭＰＬＩＧＡＳＥＴＭを１Ｘ反応緩衝液中に含む。反応チューブを、ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　ＧＥＮＥＡＭＰＴＭ　Ｓｙｓｔｅｍ　７７００の９６ウェル光学プレート（品番Ｎ８０１−０５６０）に置いた。９５℃にて２分間の加熱の後、反応混合物を、６５℃にて１分間、そして９５℃にて１５秒の、５０回の二工程加熱サイクルに供した。各ウェルについて、スペクトルを、各データ収集サイクルの間に、５００〜６００ｎｍの波長ウィンドウ内で収集した。各データ収集サイクル時間は、約７秒続けた。各ウェルについて記録したスペクトルを、個別の色素の各々のシグナル強度を反映するようにデコンヴォルーションし、そして各サイクルの終了時のＦＡＭについてのシグナル強度を、サイクル数の関数として、ＲＯＸのシグナル強度に対する比としてプロットした。結果を、以下の表１に示す。表１は、サイクル数（Ｃｔ）についての計算値を示す。このＣｔにおいて、特定のシグナルが、任意に選択した閾値レベルにわたって検出可能であり、その結果、より低く見積もったＣｔ値は、より高い開始標的濃度を示している。
【０１３４】
【表１】
2004507230.tif 000014
結果は、ＡＨＬプローブセットおよびＣＨＬプローブセットが、標的と一致したゲノム配列の各々に特異的な検出を提供することを実証する。詳細には、ＡＨＬプローブセットの存在下でのホモ接合性Ａサンプルについて、３０．５のＣｔ値を観察したが、ＣＨＬプローブセットは、４０サイクルを通して検出可能な増幅を示さなかった。逆に、ＣＨＬプローブセットの存在下でホモ接合性Ｃサンプルについて、３２．７のＣｔ値を算出したが、ＡＨＬプローブセットは、約３６サイクルまで検出可能な増幅を示さなかった。ヘテロ接合性Ａ／Ｃサンプルについて、ＡＨＬプローブセットおよびＣＨＬプローブセットについて、ほぼ同じサイクル数（それぞれ、約３０または３１）（１：１の対立遺伝子比と一致する）で、検出可能なシグナルを観察した。
【０１３５】
非標的対立遺伝子サンプルの存在下で、ＡＨＬプローブセットおよびＣＨＬプローブセットを用いて観察された遅発型（ｌａｔｅ−ｏｃｃｕｒｉｎｇ）のシグナルは、標的と一致したプローブセットにより生成されたシグナルの傾きよりも有意により緩い傾きであり、そしてこのシグナルは、非テンプレートバックグラウンド反応に恐らく起因していた。非テンプレートバックグラウンド反応に関するシグナルは、「なし」と同定されるデータの列に提供される。例えば、ゲノムＤＮＡのフラグメント存在下では、ＡＨＬプローブセットは、３５．９のＣｔ値を生じ、この値は、ホモ接合性のＣサンプルと反応したＡＨＬプローブセットについて得られた３６．０のＣｔ値と実質的に同じである。同様に、ゲノムＤＮＡの非存在下では、ＣＨＬプローブセットは、４２．８のＣｔ値を生じ、この値は、ホモ接合性のＡサンプルとＣＨＬプローブセットとの反応について得られた４１．０のＣｔ値に近似している。
【０１３６】
標的と一致したＡＨＬプローブセットおよびＣＨＬプローブセットについての結果はまた、ＡｐｏＢプローブセットを用いて得られたデータと十分に一致し、その結果、ＡｐｏＢシグナルについて得られたＣｔ値は、標的と一致したＡＨＬプローブセットおよびＣＨＬプローブセットについて観察された、Ｃｔ値の約２サイクル以内であった。ＡｐｏＢ　Ｃｔ値と標的と一致したＡＨＬ値もしくはＣＨＬ値との間の差異は、様々なプローブセットについての様々な増幅係数、またはピペッティングエラーに起因し得る。全ての場合では、様々なプローブセットについての非サンプルコントロール反応は、Ｃｔサイクル数よりも、かなり後のサイクルで生じ、これによりプローブセットの標的特異性を確認した。
【０１３７】
（実施例２）
実施例１の条件は、ＣＨＬプローブセットの存在下でのヒトリガーゼＩのＣ対立遺伝子にホモ接合性の標的ＤＮＡの様々な濃度（０コピー、１コピー、１０コピー、１００コピー、および１０００コピー（各々４連））を用いて繰り返された。この結果を以下に示す：
【０１３８】
【表２】
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結果は、予想通りの結果を示し、Ｃｔ値は、標的コピー数のｌｏｇに逆線形の関係を示し、そして１０未満のコピーは、確実に検出することができた。
【０１３９】
本明細書中で引用される全ての参考文献は、各々が、別々ではあるが、明確に参考として援用されるように、参考として援用される。
【０１４０】
本発明は、特定の実施形態に関して記載されているが、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、種々の変更および改変がなされ得ることが理解される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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