(57)【要約】本発明は、（ａ）被検物質反応性部分と、（ｂ）少なくとも１つのシグナル生成核酸と、（ｃ）前記被検物質反応性部分を前記少なくとも１つの前記シグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーとを含有し、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを含む少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、前記第１の配列エレメント及び前記第２の配列エレメントが相補的である、増幅可能なプローブに関する。本発明のプローブは、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質又はハプテンなどの被検物質を検出するための方法において使用することができる。本発明のプローブは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得る核酸分子に連結された被検物質反応性部分を含有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被検物質反応性部分と、
（ｂ）少なくとも１つのシグナル生成核酸であって、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、それぞれ、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、前記少なくとも１つの自己相補的ユニットが、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを含み、前記第１の配列エレメントと前記第２の配列エレメントが相補的である、少なくとも１つのシグナル生成核酸と、
（ｃ）前記被検物質反応性部分を、前記少なくとも１つの前記シグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカー
とを含有する増幅可能なプローブ。
【請求項２】
前記シグナル生成核酸が、伸長可能である、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項３】
前記被検物質反応性部分が、ポリペプチドである、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項４】
前記被検物質反応性部分が、核酸分子である、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項５】
前記被検物質反応性部分が、１つ又は複数のポリペプチドと相互作用する、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項６】
前記被検物質反応性部分が、１つ又は複数の核酸分子と相互作用する、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項７】
前記被検物質反応性部分が、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質及びハプテンからなる群から選択される１つ又は複数の分子と相互作用する、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項８】
介在配列エレメントが、少なくとも１つの前記自己相補的ユニットの前記第１の配列エレメントと前記第２の配列エレメントとの間に存在し、前記介在配列エレメントが、前記少なくとも１つの自己相補的ユニットの前記第１の配列エレメント及び前記第２の配列エレメントに対して相補的ではない、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項９】
前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、少なくとも２つの自己相補的ユニットを有し、介在配列エレメントが、前記自己相補的ユニットの少なくとも２つの間に存在し、前記介在配列エレメントは前記少なくとも２つの自己相補的ユニットの前記第１のヌクレオチド配列エレメント及び前記第２のヌクレオチド配列エレメントに対して相補的ではない、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項１０】
前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、２つ以上の３’端を有する、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項１１】
サンプル中の被検物質の存在又は非存在を検出する方法において、
（ａ）前記被検物質が存在する場合、前記被検物質が増幅可能なプローブと結合して、プローブ／被検物質の複合体を形成する条件で、前記サンプルを前記増幅可能なプローブと接触させるステップであって、
前記増幅可能なプローブが、
（１）被検物質反応性部分、
（２）少なくとも１つのシグナル生成核酸であって、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、それぞれ、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、前記自己相補的ユニットが、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを含み、前記第１の配列エレメントと前記第２の配列エレメントが相補的である、少なくとも１つのシグナル生成核酸、並びに
（３）前記被検物質反応性部分を、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーを含む前記ステップと；
（ｂ）前記少なくとも１つの伸長可能なシグナル生成核酸を、前記プローブ／被検物質複合体を含む反応混合物において伸長させるステップと、
（ｃ）前記伸長されたシグナル生成核酸の存在又は非存在を検出するステップとを含み、
前記伸長されたシグナル生成核酸の存在が、前記被検物質の存在と相関する、前記方法。
【請求項１２】
前記反応混合物が、検出可能に標識された少なくとも１つのヌクレオチド三リン酸をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのヌクレオチド三リン酸が、放射性同位体で標識されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのヌクレオチド三リン酸が、非放射性標識で標識されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのヌクレオチド三リン酸が、蛍光標識で標識されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
非放射性色素が、前記伸長された核酸分子を検出するために使用される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記反応混合物が、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有する単離された核酸テンプレートを更に有し、前記自己相補的ユニットが、それぞれ、第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び第２のハイブリダイゼーション配列エレメントを含み、前記第１のハイブリダイゼーション配列エレメントと前記第２のハイブリダイゼーション配列エレメントは互いに相補的であり、前記核酸テンプレートは、その３’末端及び５’末端がブロックされている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記単離された核酸テンプレートがホスホロチオアート骨格を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも伸長可能なシグナル生成核酸が、等温的に伸長される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも伸長可能なシグナル生成核酸を伸長するステップが、少なくとも１サイクルの伸長を行うことを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
２サイクル以上の伸長が行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
サンプル中の被検物質の存在又は非存在を検出する方法において、
（ａ）前記被検物質が存在する場合、前記被検物質が前記増幅可能なプローブと反応して、改変された増幅可能なプローブを形成する条件で、前記サンプルを増幅可能なプローブと接触させるステップであって、
前記増幅可能なプローブが、
（１）被検物質反応性部分、
（２）少なくとも１つのシグナル生成核酸であって、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、それぞれ、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、前記自己相補的ユニットが、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを含み、前記第１の配列エレメントと前記第２の配列エレメントが相補的である少なくとも１つのシグナル生成核酸；並びに
（３）前記被検物質反応性部分を前記少なくとも１つのシグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーを含む前記ステップと、
（ｂ）前記少なくとも１つの伸長可能なシグナル生成核酸を、前記改変された増幅可能なプローブを含む反応混合物において伸長させるステップと、
（ｃ）前記伸長されたシグナル生成核酸の存在又は非存在を検出するステップとを含み、
前記伸長されたシグナル生成核酸の存在、が前記被検物質の存在と相関する、前記方法。
【請求項２３】
前記少なくとも伸長可能なシグナル生成核酸が、等温的に伸長される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも伸長可能なシグナル生成核酸を伸長するステップが、少なくとも１サイクルの伸長を行うことを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
２サイクル以上の伸長が行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの自己相補的ユニットを有数する単離された核酸テンプレートであって、
前記自己相補的ユニットが、それぞれ、第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び第２のハイブリダイゼーション配列エレメントを含み、前記第１のハイブリダイゼーション配列エレメントと前記第２のハイブリダイゼーション配列エレメントは互いに相補的であり、その３’末端がブロックされている単離された核酸テンプレート。
【請求項２７】
ホスホロチオアート骨格を含む、請求項２６に記載の核酸テンプレート。
【請求項２８】
その３’末端及び５’末端がブロックされている、請求項２６に記載の単離された核酸テンプレート。
【請求項２９】
介在配列エレメントが、少なくとも１つの前記自己相補的ユニットの前記第１のハイブリダイゼーション配列エレメントと前記第２のハイブリダイゼーション配列エレメントとの間に存在し、前記介在配列エレメントが、前記少なくとも１つの自己相補的ユニットの前記第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び前記第２のハイブリダイゼーション配列エレメントに対して相補的ではない、請求項２６に記載の単離された核酸テンプレート。
【請求項３０】
少なくとも２つの自己相補的ユニットを含有し、介在配列エレメントが、前記自己相補的ユニットの少なくとも２つの間に存在し、前記介在配列エレメントが、前記少なくとも２つの自己相補的ユニットの前記第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び前記第２のハイブリダイゼーション配列エレメントに対して相補的ではない、請求項２６に記載の単離された核酸テンプレート。
【請求項３１】
（ａ）（１）被検物質反応性部分；
（２）少なくとも１つのシグナル生成核酸であって、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、それぞれ、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、前記自己相補的ユニットが、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを含み、前記第１の配列エレメントと前記第２の配列エレメントが相補的である、少なくとも１つのシグナル生成核酸；並びに
（３）前記被検物質反応性部分を、前記少なくとも１つの前記シグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーを含む増幅可能なプローブと、
（ｂ）少なくとも１つの自己相補的ユニットを含む単離された核酸テンプレートであって、前記自己相補的ユニットが、それぞれ、第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び第２のハイブリダイゼーション配列エレメントを有し、前記第１のハイブリダイゼーション配列エレメントと前記第２のハイブリダイゼーション配列エレメントは互いに相補的であり、３’末端及び５’末端がブロックされている単離された核酸テンプレートとを含有し、
前記単離された核酸テンプレートが、前記少なくとも１つの伸長可能なシグナル生成核酸にハイブリダイゼーションする、増幅可能な複合体。
【請求項３２】
前記被検物質反応性部分が、被検物質に結合する、請求項３１に記載の増幅可能な複合体。
【請求項３３】
サンプル中の被検物質の存在又は非存在を検出する方法において、
（ａ）前記被検物質が存在する場合、前記被検物質が増幅可能なプローブと結合して、プローブ／被検物質の複合体を形成する条件で、前記サンプルを増幅可能なプローブと接触させるステップであって、
前記増幅可能なプローブが、
（１）被検物質反応性部分；
（２）少なくとも１つのシグナル生成核酸であって、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、それぞれ、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、前記自己相補的ユニットが、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを含み、前記第１の配列エレメントと前記第２の配列エレメントが相補的である、少なくとも１つのシグナル生成核酸；並びに
（３）前記被検物質反応性部分を、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーを含む前記ステップと、
（ｂ）前記プローブ／被検物質複合体を、コグネイト核酸テンプレートと接触させるステップと、
（ｃ）前記プローブ／被検物質複合体を含む反応混合物において、等温増幅反応を行うことによって前記コグネイト核酸テンプレートを伸長させるステップと、
（ｄ）前記伸長されたシグナル生成核酸の存在又は非存在を検出するステップとを含み、
前記伸長されたシグナル生成核酸の存在が、前記被検物質の存在と相関する、前記方法。
【請求項３４】
前記シグナル生成核酸が、伸長可能である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３５】
増幅可能なプローブを含むキットにおいて、
前記増幅可能なプローブが、
（ａ）被検物質反応性部分と、
（ｂ）少なくとも１つのシグナル生成核酸であって、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、それぞれ、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、前記少なくとも１つの自己相補的ユニットが、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを含み、前記第１の配列エレメントと前記第２の配列エレメントが相補的である少なくとも１つのシグナル生成核酸と、
（ｃ）前記被検物質反応性部分を、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーとを含む、キット。
【請求項３６】
ブロックされたテンプレートをさらに含み、前記ブロックされたテンプレートは、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、前記自己相補的ユニットは、それぞれ、第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び第２のハイブリダイゼーション配列エレメントを含み、前記第１のハイブリダイゼーション配列エレメントと前記第２のハイブリダイゼーション配列エレメントは互いに相補的であり、かつ前記核酸テンプレートは、その３’末端及び５’末端がブロックされている、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記シグナル生成核酸が、伸長可能である、請求項３５に記載のキット。
【請求項３８】
前記シグナル生成分子上の配列エレメントに対して相補的であるハイブリダイゼーション配列エレメントを含むコグネイト核酸プライマーをさらに含む、請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、検体を検査するための方法及び材料に関する。より詳細には、本発明は、核酸及びポリペプチドなどの被検物質を検出するための増幅可能なプローブ及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
被検物質結合アッセイは、研究室及び臨床実験室における様々な検体の測定に有用である。免疫アッセイは、多くの異なる形式において、ウイルス抗原及び細菌抗原、免疫グロブリン、ホルモン、細胞サブタイプ、医薬品、乱用薬物、並びに毒素などの被検物質を検出するために使用されている。免疫アッセイでは、抗原性物質と抗体との間における複合体の形成を伴う。典型的には、定量的又は定性的な検体の測定を可能とするために、複合体の一成分又は競合抗体のいずれかを、放射性同位体又は蛍光標識のいずれかで標識する。免疫アッセイの感度は、二次シグナル生成酵素系を酵素／抗体コンジュゲート体に結合させる酵素媒介増幅法によって高められてはいるが、感度をさらに増大すれば、被検物質の検出能が高められるであろう。
【０００３】
核酸ハイブリダイゼーションアッセイが、特定の核酸被検物質を検出するために使用されている。核酸ハイブリダイゼーションアッセイでは、標的核酸と、相補的なプローブ核酸との間における複合体の形成を伴う。典型的には、標的核酸の定量的又は定性的な測定を可能とするために、プローブ核酸を放射性同位体又は蛍光標識のいずれかで標識する。核酸ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、二次シグナル生成プローブが結合する高分子末端（polymer tail）を有するプローブ核酸の使用によって高められている（たとえば、米国特許第４，８８２，２６９号を参照のこと）。核酸ハイブリダイゼーションアッセイの感度はまた、ハイブリダイズしたプローブ核酸に、シグナル放出二次プローブを結合させるためのさらなる部位を組み込む手法によっても高められている（たとえば、国際特許出願公開ＷＯ８９／０３８９１及び欧州特許出願２０４５１０を参照のこと）。しかしながら、その感度が標識の性質によって制限されるため、被検物質を検出するためのより高感度な方法が求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、たとえば、疾患に関連する分子又は遺伝子座の存在若しくは非存在を検出するためのさまざまな診断用途において使用することができる新しい種類の増幅可能なプローブに基づく。増幅可能なプローブは、シグナル生成核酸と、被検物質に結合する分子又は被検物質によって改変され得る分子とを有するものである。被検物質は、被検物質と反応したプローブを増幅することによってｉｎ  ｓｉｔｕで検出することができる。
【０００５】
１つの態様において、本発明は、被検物質と反応する部分と、少なくとも１つのシグナル生成核酸と、被検物質反応性部分を少なくとも１つのシグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーとを含有する、増幅可能なプローブであって、少なくとも１つのシグナル生成核酸が、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを有する少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントが相補的であることを特徴とする。
シグナル生成核酸は、伸長可能にすることができ、３’端を２つ以上有することができる。被検物質と反応する部分は、ポリペプチド又は核酸分子とすることができ、１つ又は複数のポリペプチド又は１つ又は複数の核酸分子と相互作用することができる。たとえば、被検物質反応性部分は、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質及びハプテンからなる群から選択される１つ又は複数の分子と相互作用することができる。
【０００６】
介在配列エレメントを、少なくとも１つの自己相補的ユニットにおける第１の配列エレメントと第２の配列エレメントとの間に設けることができる。この場合、介在配列エレメントは、少なくとも１つの自己相補的ユニットにおける第１の配列エレメント又は第２の配列エレメントに対して相補的ではない。少なくとも１つのシグナル生成核酸は、少なくとも２つの自己相補的ユニットを有することができる。この場合、介在配列エレメントを、少なくとも２つの自己相補的ユニットの間に設けることができ、介在配列エレメントは、少なくとも２つの自己相補的ユニットにおける第１のヌクレオチド配列エレメント又は第２のヌクレオチド配列エレメントに対して相補的ではない。
【０００７】
本発明はまた、サンプル中の被検物質の存在又は非存在を検出する方法であることを特徴とする。
この方法は、被検物質が存在する場合、被検物質が増幅可能なプローブと結合して、プローブ／被検物質複合体を形成する条件で、サンプルを増幅可能なプローブと接触させることを含むものである。増幅可能なプローブは、被被検物質反応性部分と、少なくとも１つの伸長可能なシグナル生成核酸と、被検物質反応性部分を少なくとも１つのシグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーとを含有しており、少なくとも１つの伸長可能なシグナル生成核酸が、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを含む少なくとも１つの自己相補的ユニットを含み、第１のヌクレオチド配列エレメント及び第２のヌクレオチド配列エレメントが相補的なものである。
この方法はまた、プローブ／被検物質複合体を含む反応混合物において、少なくとも１つの伸長可能なシグナル生成核酸を、たとえば、等温的に、又は少なくとも１サイクルの伸長を行うことによって伸長させ、伸長されたシグナル生成核酸の存在又は非存在を検出することを含み、この方法においては、伸長されたシグナル生成核酸の存在が被検物質の存在と相関する。この方法は、２サイクル以上の伸長を行うことができる。
また、反応混合物は、たとえば、放射性同位体、非放射性色素又は蛍光標識などの非放射性標識で検出可能に標識されている少なくとも１つのヌクレオチド三リン酸を含ませることができる。また、反応混合物は、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有する単離された核酸テンプレートを含むことができる。この場合、少なくとも１つの自己相補的ユニットは、それぞれ、互いに相補的である第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び第２のハイブリダイゼーション配列エレメントを含んでおり、核酸テンプレートは、その３’末端及び５’末端をブロックされている。単離された核酸テンプレートは、ホスホロチオアート骨格を含むことができる。
【０００８】
別の態様において、本発明は、サンプル中の被検物質の存在又は非存在を検出する方法であることを特徴とする。
この方法は、被検物質が存在する場合、被検物質が増幅可能なプローブと反応して、改変された増幅可能なプローブを形成する条件で、サンプルを増幅可能なプローブと接触させることを含むものである。
増幅可能なプローブは、被検物質反応性部分と、少なくとも１つの伸長可能なシグナル生成核酸と、被検物質反応性部分を少なくとも１つのシグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーとを含有し、少なくとも１つの伸長可能なシグナル生成核酸が、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを含む少なくとも１つの自己相補的ユニットを含み、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントが相補的なものとすることができる。
この方法はまた、少なくとも１つの伸長可能なシグナル生成核酸を、改変された増幅可能なプローブを含む反応混合物において伸長させ、伸長させたシグナル生成核酸の存在又は非存在を検出することを含むものであり、この方法において、伸長されたシグナル生成核酸の存在は、被検物質の存在と相関する。
伸長可能なシグナル生成核酸は、等温での伸長によって、又は少なくとも１サイクルの伸長（たとえば、２サイクル以上の伸長）を行うことによって伸長させることができる。
【０００９】
さらに別の態様において、本発明は、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有する単離された核酸テンプレートであって、少なくとも１つの自己相補的ユニットが、互いに相補的である第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び第２のハイブリダイゼーション配列エレメントを含み、３’末端が、ブロックされている単離された核酸テンプレートであることを特徴とする。この核酸テンプレートは、ホスホロチオアート骨格を含むことができ、３’末端及び５’末端を、ブロックすることができる。介在配列エレメントを、少なくとも１つの前記自己相補的ユニットにおける第１のハイブリダイゼーション配列エレメントと第２のハイブリダイゼーション配列エレメントとの間に設けることができる。この場合、介在配列エレメントは、少なくとも１つの自己相補的ユニットにおける第１のハイブリダイゼーション配列エレメント又は第２のハイブリダイゼーション配列エレメントに対して相補的ではない。
核酸テンプレートは、少なくとも２つの自己相補的ユニットを含有することができる。この場合、介在配列エレメントが、自己相補的ユニットの少なくとも２つの間に存在し、介在配列エレメントは、少なくとも２つの自己相補的ユニットにおける第１のハイブリダイゼーション配列エレメント又は第２のハイブリダイゼーション配列エレメントに対して相補的ではない。
【００１０】
本発明はまた、増幅可能なプローブと、単離された核酸テンプレートとを含み、単離された核酸テンプレートが、増幅可能なプローブの少なくとも１つの伸長可能なシグナル生成核酸にハイブリダイズする、増幅可能な複合体であることを特徴とする。
増幅可能なプローブは、被検物質反応性部分と、少なくとも１つの伸長可能なシグナル生成核酸と、被検物質反応性部分を少なくとも１つのシグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーとを含有し、伸長可能なシグナル生成核酸が、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを有する少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントが相補的なものである。
単離された核酸テンプレートは、相補的である第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び第２のハイブリダイゼーション配列エレメントを有する少なくとも１つの自己相補的ユニットを含有しており、３’末端及び５’末端はブロックされている。被検物質に反応する部分は、被検物質に結合することができる。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、サンプル中の被検物質の存在又は非存在を検出する方法であることを特徴とする。
この方法は、被検物質が存在する場合、被検物質が増幅可能なプローブと結合して、プローブ／被検物質の複合体を形成する条件で、サンプルを増幅可能なプローブと接触させることを含む。この方法において、増幅可能なプローブは、被検物質に反応する部分と、少なくとも１つのシグナル生成核酸と、被検物質に反応する部分を少なくとも１つのシグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーとを有するものであり、少なくとも１つのシグナル生成核酸が、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを有する少なくとも１つの自己相補的ユニットを含有し、前記第１のヌクレオチド配列エレメント及び前記第２のヌクレオチド配列エレメントが相補的なものである。
この方法はさらに、プローブ／被検物質複合体をコグネイト核酸テンプレートと接触させ、プローブ／被検物質複合体を含む反応混合物において、等温増幅反応を行うことによってコグネイト核酸テンプレートを伸長させ、伸長させたシグナル生成核酸の存在又は非存在を検出することを含み、この方法において、伸長されたシグナル生成核酸の存在は、被検物質の存在と相関する。シグナル生成核酸は伸長可能にすることができる。
【００１２】
本発明はまた、上記に記載されるような増幅可能なプローブを含むキットであることを特徴とする。
このキットはさらに、ブロックされたテンプレートをさらに含むことができる。このブロックされたテンプレートは、少なくとも１つの自己相補的ユニットを含み、この少なくとも１つの自己相補的ユニットは、相補的である第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び第２のハイブリダイゼーション配列エレメントを含む。この核酸テンプレートは、その３’末端及び５’末端がブロックされている。シグナル生成核酸は、伸長可能にすることができる。
キットはさらに、シグナル生成分子上の配列エレメントに対して相補的であるハイブリダイゼーション配列エレメントを含むコグネイト核酸プライマーをさらに含むことができる。
【００１３】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法及び材料と類似するか、又は同等であるさまざまな方法及び材料を、本発明を実施するために使用することができるが、好適な方法及び材料を下記に記載する。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を含め、本明細書が適用される。さらに、材料、方法及び例は、単なる例示であり、限定することを意図しない。
【００１４】
本発明の他の特徴及び利点が、下記の詳細な説明、及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００１５】
（詳細な説明）
一般に、本発明は、検体を測定するために使用することができる増幅可能なプローブを提供する。
増幅可能なプローブは、被検物質と反応する部分と、シグナル生成核酸とを含む。被検物質と反応した増幅可能なプローブは、シグナル生成核酸を増幅することによって検出される。「増幅」とは、シグナル生成核酸を伸長させること（すなわち、限局的な増幅）又はコグネイト核酸プライマーを伸長させること（すなわち、非限局的な増幅）のいずれかによって、シグナル生成核酸の長さを増大させることを意味する。被検物質と反応した増幅可能なプローブの増幅により、被検物質をｉｎ  ｓｉｔｕで可視化するための非常に高感度な方法が提供される。
【００１６】
増幅可能なプローブ
本発明の増幅可能なプローブは、被検物質と反応する部分と、シグナル生成核酸と、被検物質と反応する部分をシグナル生成核酸に連結するリンカーとを含有する。
用語「被検物質と反応する部分」とは、被検物質と反応して、増幅可能なプローブ／被検物質複合体を生じる分子、又は被検物質と反応して、化学的もしくは酵素的に改変された被検物質と反応する部分を生じる分子を意味する。被検物質と反応する部分の改変としては、たとえば、原子又は化学基の付加、原子又は化学基の欠失、切断、連結、及び短縮化を挙げることができる。被検物質と反応する部分は、たとえば、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質又は小分子とすることができる。したがって、形成され得るプローブ／被検物質複合体には、たとえば、ポリペプチド−ポリペプチドの複合体、ポリペプチド−核酸の複合体、核酸−核酸の複合体、及びポリペプチド−小分子の複合体が含まれる。用語「小分子」とは、１０００ダルトン未満の分子量を有する任意の有機分子を意味する。用語「ポリペプチド」は、少なくとも５アミノ酸からなる鎖を示し、非限定的に、抗体、抗原、酵素又は酵素基質の全体又は一部分を挙げることができる。用語「核酸」は、天然に存在する核酸又は合成された核酸の、少なくとも１０ヌクレオチドからなる鎖を意味する。天然に存在する核酸は、天然に存在するゲノムにおいて、核酸分子の一方又は両方の端部に通常隣接している配列が存在しなければ、「単離」されている。合成された核酸は、合成反応の構成成分から分離されていれば、「単離」されている。核酸の被検物質と反応する部分には、非限定的に、ＤＮＡ又はＲＮＡ（たとえば、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ及びｔＲＮＡ）が含まれる。パドロック（ｐａｄｌｏｃｋ）プローブが、特に有用な被検物質と反応する部分である。
【００１７】
パドロックプローブは、通常、オリゴヌクレオチドの５’端及び３’端で、標的配列に対して相補的なヌクレオチド配列と、オリゴヌクレオチドの中央部分で、非標的配列とを含む直鎖状オリゴヌクレオチドである。標的配列に対して相補的な配列は、標的配列にハイブリダイズすることができ、オリゴヌクレオチドの両端を結びつけ、これにより、連結され、環状プローブを生じさせることができる。パドロックプローブの記載については、Ｎｉｌｓｓｏｎ他、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２６５：２０８５〜２０８８（１９９４）；国際特許出願公開ＷＯ９９／４９０７９を参照のこと。
【００１８】
シグナル生成核酸は、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有する。「自己相補的ユニット」とは、２つの相補的な配列エレメント（すなわち、互いに相補的である２つの配列エレメント）を含有する核酸セグメントである。
それぞれの相補的配列エレメントは、長さが約２ヌクレオチド〜約４００ヌクレオチド（たとえば、２ヌクレオチド〜１０ヌクレオチド、１０ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド〜６０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド〜８０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド〜１５０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド〜２００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド〜３００ヌクレオチド、３００ヌクレオチド〜４００ヌクレオチド）とすることができるヌクレオチドの連続領域である。相補的配列ユニットのＧＣ含有量は、約２０％〜６０％（たとえば、約２５％〜５０％）の範囲とすることができる。例示的な自己相補的ユニットとしては、５’から３’への方向で、ＡＴ／ＡＴ、ＡＡ／ＴＴ、ＡＣ／ＧＴ、ＡＴＡ／ＴＡＴ、ＡＣＴ／ＡＧＴ、ＡＧＣＴ／ＡＧＣＴ、ＴＣＡＧ／ＣＴＧＡ、ＴＡＣＡＴＧＴＡ／ＴＡＣＡＴＧＴＡ及びＡＧＡＴＡＴＣＴ／ＡＧＡＴＡＴＣＴが含まれる。回文配列の（ＡＧＡＴＡＴＣＴ）６又は（ＴＡＣＡＴＧＴＡ）６を有するシグナル生成核酸が特に有用である。たとえば、Ｏｇａｔａ及びＭｏｒｉｎｏ、核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、２８（２０）：３９９９〜４００４（２０００）；Ｏｇａｔａ及びＭｉｕｒａ、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、３９：１３９９３〜１４００１（２００１）を参照のこと。
【００１９】
自己相補的ユニットにおける相補的配列エレメントは、厳密に相補的である必要はない（すなわち、各配列位置において相補的である必要はない）。むしろ、自己相補的ユニットにおける相補的配列エレメントは、互いにハイブリダイズできなければならない。相補的配列エレメントが互いにハイブリダイズできるかどうかを決定するために、一方が第１の相補的配列エレメントのみを含有し、他方が第２の相補的配列エレメントのみを含有する２つのオリゴヌクレオチドを合成する。これら２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを、緩やかなストリンジェントな条件から高度なストリンジェントな条件で評価する。緩やかなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、２５ｍＭのＫＰＯ４（ｐＨ７．４）、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、５０μｇ／ｍｌの変性された超音波処理サケ精子ＤＮＡ、５０％のホルムアミド、１０％のデキストラン硫酸、及び１ｎｇ／ｍｌ〜１５ｎｇ／ｍｌのプローブ（約５×１０７ｃｐｍ／μｇ）を含有するハイブリダイゼーション溶液における約４２℃でのハイブリダイゼーションステップ、並びに２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含有する洗浄液を用いた約５０℃での洗浄ステップが含まれる。高度なストリンジェント条件では、同じハイブリダイゼーション条件を使用することができるが、洗浄が、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを含有する洗浄液を用いて約６５℃で行われる。したがって、自己相補的ユニットにおける配列エレメントの長さ及び相補性の程度を、これらのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件によって規定される結合の範囲内で変化させることができる。一般に、比較的長い相補的配列エレメントから構成される自己相補的ユニットは、相補的配列エレメント間のミスマッチをより多く含むことができ、ストリンジェントな条件のもとで依然として互いにハイブリダイゼーションすることができる。比較的短い相補的配列エレメントから構成される自己相補的ユニットは、一般に、相補的配列エレメント間のミスマッチの許容性がより低い。
【００２０】
シグナル生成核酸は、１個の自己相補的ユニットＡａを含有することができる（この場合、イタリック体の文字対は自己相補的ユニットを表し、大文字は、対応する小文字によって表される配列エレメントに対して相補的である配列エレメントを表す；図１を参照のこと）。また、シグナル生成核酸は、同一の自己相補的ユニット（たとえば、Ａａ、Ａａ、Ａａ）、異なる自己相補的ユニット（たとえば、Ａａ、Ｂｂ、Ｃｃ）、又は同一の自己相補的ユニット及び異なる自己相補的ユニットの混合（たとえば、Ａａ、Ｂｂ、Ａａ）を含む、多数の自己相補的ユニットを含有することができる。シグナル生成核酸は、相補的配列エレメントが厳密な対関係を有する必要はない。
【００２１】
シグナル生成核酸は、相補的配列エレメントに対して相補的でない介在配列エレメントを含有することができる（図１を参照のこと）。介在配列エレメントは、自己相補的ユニットの間（たとえば、Ａａ＊Ａａ）、自己相補的ユニットの隣り（たとえば、＊Ａａ）、及び相補的配列エレメントの間（たとえば、Ａ＊ａ）を含めてシグナル生成核酸上の任意のところに存在させることができる（＊により、介在配列エレメントが示される）。介在配列エレメントは、長さを１ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチドの範囲にすることができ、たとえば、１ヌクレオチド〜１０ヌクレオチド、１０ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド〜６０ヌクレオチド、６０ヌクレオチド〜８０ヌクレオチド、８０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド〜１５０ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド〜２００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド〜４００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド〜６００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド〜８００ヌクレオチド、又は８００ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチドの範囲にすることができる。
【００２２】
典型的には、シグナル生成核酸は伸長可能である。本明細書中で使用される用語「伸長可能」は、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長され得る少なくとも１つのフリーな３’末端を有する核酸を意味する。伸長可能なシグナル生成核酸は、１つのフリーな３’末端を有することができ、又は２つ以上のフリーな３’末端を有することができる。そのような核酸は、ホスホルアミダイト技術を使用する３’から５’方向に自動的にＤＮＡを合成することを含む既知の方法論を使用して合成することができる。第２の自由な３’末端を、アミダイト官能基が５’位に存在する反転アミダイト技術を使用する５’から３’方向への合成を続けることによって導入することができる。さまざまな反転アミダイトが市販されており、たとえば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手することができる。また、第２のフリーな３’末端を、その５’端が修飾されている核酸を結合させることによって導入することができる。また、２つの５’−チオール化核酸を酸化しても、２つのフリーな３’末端を有するジスルフィド連結による核酸を形成することができる。数個の３’端を有する分枝型のオリゴヌクレオチドを、Ｈｏｒｎ及びＵｒｄａ（核酸研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）、１７：６９５９〜６９６７（１９８９））又は米国特許第５，８４９，４８１号の手法に類似する手法によって合成することができる。また、同じ目的で、別々に調製された分枝型の連結分子に対するオリゴヌクレオチド合成後におけるカップリングを利用することができる。
【００２３】
シグナル生成核酸は、典型的には、長さが約２０ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチド（たとえば、２０ヌクレオチド〜８０ヌクレオチド、２０ヌクレオチド〜６０ヌクレオチド、２４ヌクレオチド〜４８ヌクレオチド、３０ヌクレオチド〜７０ヌクレオチド、４０ヌクレオチド〜６５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド〜１００ヌクレオチド、１００ヌクレオチド〜２００ヌクレオチド、２００ヌクレオチド〜４００ヌクレオチド、４００ヌクレオチド〜６００ヌクレオチド、６００ヌクレオチド〜８００ヌクレオチド、又は８００ヌクレオチド〜１０００ヌクレオチド）の範囲である。伸長可能なシグナル生成核酸の長さは、増幅後、かなり増大させることができる。
【００２４】
シグナル生成核酸は、リンカーによって被検物質と反応する部分に連結させることができる。用語「リンカー」は、被検物質に反応する部分をシグナル生成核酸に共有結合的又は非共有結合的のいずれかで連結することができる任意の分子を意味する。したがって、好適なリンカーは、被検物質に反応する部分に連結することができる少なくとも１つの官能基と、シグナル生成核酸に連結することができる少なくとも１つの官能基とを有する。使用されるリンカーのタイプは、被検物質と反応する部分及びシグナル生成核酸に存在する官能基の性質に依存する。
【００２５】
リンカー、又は連結官能基の一部分を、シグナル生成核酸に、その化学合成のときに組み込むことができる。たとえば、２つの３’端を有する伸長可能なシグナル生成核酸の化学合成を行っているときに、修飾した主要ヌクレオチドを、３’から５’方向への合成時において最後のアミダイトとして取り込ませることができる。伸長可能なシグナル生成核酸は、官能基Ｒを介して被検物質と反応する部分に連結することができる（式１を参照、式１中、（１）は、３’から５’方向へ合成されたオリゴヌクレオチドを表す；（２）は、５’から３’への方向で合成されたオリゴヌクレオチドを表す；Ｒは、ビオチン、ジゴキシン、ジニトロフェノール又は反応性官能基（たとえば、アミノ、チオールもしくはカルボキシルなどの求核種）などのハプテンを表す）。
【００２６】
【化１】
2004533257.tif 000002
【００２７】
必要な場合、主要ヌクレオチドは、ヌクレオチド特性を有しないリンカーによって両方のオリゴヌクレオチドから隔てることができる。中央の組立てブロックは、ヌクレオシド（Ｂは典型的にはｄＵ又はｄＣである）の誘導体、又はヌクレオシドでない三官能性化合物とすることができる。三官能性化合物の例を、式２に示す。
【００２８】
【化２】
2004533257.tif 000003
【００２９】
そのような組立てブロックは市販されており、たとえば、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から入手することができる（ビオチンについてはカタログ＃１０−１０３８−９０、アミンについてはカタログ＃１０−１０３７−０２、及びカルボキシについてはカタログ＃１０−１０３５００２）。中央の組立てブロックを取り込んだ後、合成を５’から３’方向へ続けることができる。または、標準的な５’アミノ修飾剤アミダイトを、伸長可能な核酸分子に取り込むことができ、その後、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）により活性化して、５’−チオール誘導体化核酸分子へ結合させることができる。いずれの場合でも、２つの３’端を有する伸長可能なシグナル生成核酸が得られ、これは、ハプテン又は反応性官能基（式１におけるＲ）を介して被検物質と反応する部分に連結することができる。
【００３０】
リンカーは、アミノ官能基、ヒドロキシルアミノ官能基又はヒドラゾ官能基で誘導された１つ又は複数のシグナル生成核酸又は被検物質反応性部分に、リンカー上のアルデヒド官能基を介して連結することができる。アルデヒド官能基は、特異的な試薬（たとえば、スクシンイミジル４−ホルミルベンゾアート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を用いて、又は糖などのジオールの酸化的過ヨウ素酸切断によって、リンカーに導入することができる。リンカーは、リンカー上のヨードアセトアミド官能基、ブロモアセトアミド官能基、マレイミド官能基又はピリジルジチオ官能基を介して、チオール化シグナル生成核酸又はチオール化被検物質反応性部分に連結することができる。
【００３１】
リンカーは、１つ又は複数のシグナル生成核酸を、１つ又は複数の被検物質反応性部分に連結することができる（すなわち、１つのシグナル生成核酸を１つの被検物質反応性部分に、１つのシグナル生成核酸を多数の被検物質反応性部分に、多数のシグナル生成核酸を１つの被検物質反応性部分に、又は多数のシグナル生成核酸を多数の被検物質反応性部分に連結することができる。）。たとえば、多数のシグナル生成核酸を、多数のアミノ官能基を含有するリンカーの導入によって連結することができる。アミンを、直接的に（たとえば、アミン−カルボキシル又はアミン−オリゴヌクレオチド−５’−一リン酸）、或いはアミノ基と、アルデヒド、ジチオピリジルもしくはマレイミドなどの官能基を導入する試薬との反応、及び、適当な５’−修飾の核酸分子との反応によって間接的に、シグナル生成核酸に結合させることができる。被検物質反応性部分はまた、スクシンイミジルヨードアセタート、スクシンイミジル６−マレイミジルヘキサノアート、又はＮ−（（２−ピリジルジチオ）エチル）−４−アジドサリチルアミド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）などの架橋剤によってシグナル生成核酸に連結することができる。核酸被検物質反応性部分は、典型的には、非ヌクレオチド型リンカーによってシグナル生成核酸に連結される。
【００３２】
被検物質の検出方法
本発明の増幅可能なプローブは、血液、血漿、血清、尿、唾液、痰、脳脊髄液もしくは組織などの生物学的サンプルにおいて、又は核酸アレイもしくはポリペプチドアレイにおいて、被検物質の存在又は非存在を検出するために使用することができる。増幅可能なプローブは、ｉｎ  ｓｉｔｕで局在化した被検物質の検出（たとえば、固定されたサンプルを含有する顕微鏡スライドガラスにおける披検物質の検出、又は二次元ゲル電気泳動プレートにおける披検物質の検出）のために特に有用である。典型的には、この被検物質を検出する方法は、増幅可能なプローブをサンプルと接触させ；増幅可能なプローブの核酸分子を伸長させ；増幅可能なプローブの伸長した核酸分子を検出することを含む。被検物質は、典型的には、既知の方法を使用して、接触工程に先立って固定化される（即ち、空間的に拘束される）。被検物質は、たとえば、被検物質を引き付ける固体表面（たとえば、フィルターもしくはガラス製スライドガラス）、被検物質と結合するバイオリアクター（たとえば、アフィニティーカラム）、配列させた液相アレイ又は固相アレイ（たとえば、核酸チップもしくはポリペプチドチップ、一体化バイオコンパクトディスク（米国特許第６，０３０，５８１号を参照のこと）、又はマイクロタイターディッシュ）、ゲル電気泳動、あるいは薄層クロマトグラフィーを使用して固定化することができる。高密度オリゴヌクレオチドアレイなどのアレイが市販されており、たとえば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）から入手することができる。さらに、逆オリゴヌクレオチドのアレイについては国際特許出願公開ＷＯ９８／５７６９８を参照のこと。被検物質はまた、接触ステップのとき、溶液中に存在させることができる。
【００３３】
接触ステップは、被検物質がサンプル中に存在する場合、被検物質が増幅可能なプローブの被検物質反応性部分と反応して、プローブ／核酸複合体又は改変されたプローブが形成される条件で行われる。増幅可能なプローブの被検物質反応性部分は、たとえば、原子もしくは化学基の付加、原子もしくは化学基の欠失、連結、切断又は短縮化による被検物質との反応の後、化学的又は酵素的に改変され得る。たとえば、シグナル生成核酸に、非ヌクレオチドにより連結された被検物質反応性部分として、オリゴヌクレオチドを含有する増幅可能なプローブを、オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）において使用することができる。このアッセイにおいて、増幅可能なプローブの被検物質反応性部分は、オリゴヌクレオチドアレイの一部分である第２のオリゴヌクレオチドと一緒に、標的核酸にハイブリダイズすることができる。相補的な標的配列が存在する場合、増幅可能なプローブの被検物質反応性部分及びアレイの第２のオリゴヌクレオチドを、リガーゼによって連結することができ、これにより、増幅可能なプローブを固相に共有結合により固定化する。シグナル生成核酸の伸長により、アレイ上の特定の位置でシグナルがもたらされる。好適な接触ステップ条件は、使用されている被検物質反応性部分のタイプに依存して変化する。
【００３４】
未反応のプローブを、反応したプローブから、増幅の前に、又は増幅ステップと検出ステップとの間で分離することができる。たとえば、プローブ／核酸複合体を、固定化されたプローブ／核酸複合体から非結合のプローブを洗浄することによって、非結合のプローブから分離することができる。被検物質が接触ステップの前に固定化されないとき、反応したプローブを、電気泳動によって、あるいは抗被検物質抗体（たとえば、被検物質反応性部分に結合しない被検物質上のエピトープに対して特異的な抗体）又は結合したもしくは非結合の被検物質反応性部分のいずれかと選択的に結合する抗体を使用する免疫アフィニティー精製によって未反応のプローブから分離することができる。次いで、反応したプローブ／核酸複合体は、被検物質について上記したようにして固定化することができる。同様に、改変されたプローブを、改変された又は非改変の被検物質反応性部分のいずれかと選択的に結合する抗体を使用する免疫アフィニティー精製によって非改変のプローブから分離することができる。核酸被検物質反応性部分を含有する改変されたプローブを、改変された被検物質反応性部分又は非改変の被検物質反応性部分のいずれかに対するハイブリダイゼーションを可能にする条件で、固定化核酸テンプレートを使用するディファレンシャルハイブリダイゼーションによって非改変のプローブから分離することができる。
【００３５】
反応したプローブは、１）伸長可能なシグナル生成核酸を熱変性し、２）より低い温度で相補的配列エレメントをアニーリングし、３）伸長可能なシグナル生成核酸を、ＤＮＡポリメラーゼを用いて５’から３’方向へ伸長させる、ことを含む少なくとも１サイクルの伸長（たとえば、２サイクル以上の伸長）によって増幅することができる。あるいは、シグナル生成核酸は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて等温的に伸長させることができる。好適なＤＮＡポリメラーゼは、６０℃を超える温度での不活性化に対して抵抗性であり、このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、たとえば、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）から得られる市販のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、Ｔ．サーモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から得られる市販のＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、及びＴ．フラブス（ｆｌａｖｕｓ）から得られる市販のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）が含まれる。典型的には、伸長反応液には、約２００μＭの各デオキシヌクレオチド三リン酸及び約２５Ｕ／ｍｌのＤＮＡポリメラーゼがある。伸長反応のための好適な緩衝液が市販のポリメラーゼとともに供給される。
【００３６】
単離された核酸テンプレートを反応液に含めることができ、これは「ブロック化テンプレート」と呼ばれる。ブロック化テンプレートは、互いに相補的で、且つ伸長可能なシグナル生成核酸に存在する少なくとも１つの配列エレメントに対して相補的であるハイブリダイゼーション配列エレメントから構成される少なくとも１つの自己相補的ユニットを含有する。テンプレートの伸長及びエキソヌクレオチド分解を防止するために、ブロック化テンプレートは、その３’末端が、又は５’末端及び３’末端の両方が、たとえば、リン酸残基、オリゴエチレングリコール残基又は非ヌクレオチドアミダイトユニットでブロックされる。増幅されたプローブ及び外因性テンプレートの両方のエンドヌクレオチド分解もまた、ホスホロチオアート骨格を有する外因性核酸テンプレートを使用することによって、及び増幅されたプローブの酵素による伸長のためのヌクレオチドチオ三リン酸を使用することによって、防止することができる。ブロック化テンプレートが伸長反応において存在するとき、伸長可能なシグナル生成核酸内の配列エレメントを、ＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’への伸長のためのテンプレートとして役立つブロック化テンプレート上のハイブリダイゼーション配列エレメントにアニーリングさせることができる（図２Ａを参照のこと）。したがって、１回の増幅の後、伸長可能なシグナル生成核酸は、ブロック化テンプレートに対して相補的な配列を有する新しく加えられたヌクレオチドで延長される。
【００３７】
伸長可能なシグナル生成核酸はまた、それ自身のテンプレートとして供することができる。したがって、増幅は、伸長可能なシグナル生成核酸を自身にアニーリングさせた後における分子間でのテンプレートによる伸長を含むことができる（図２Ｂを参照のこと）。この増幅モードでは、１つの伸長可能なシグナル生成核酸の内部における相補的配列エレメントが、熱変性の後で互いにアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’への伸長のためのテンプレートとして役立つ。
増幅はまた、伸長可能なシグナル生成核酸を、同じ被検物質反応性部分につながれた第２のシグナル生成核酸にアニーリングさせた後における分子間でのテンプレートによる伸長を含むことができる（図２Ｃを参照のこと）。
第２のシグナル生成核酸もまた伸長可能である実施形態においては、シグナル生成核酸にある相補的配列エレメントを、熱変性の後で互いにアニーリングさせることができ、一方又は両方のシグナル生成核酸が、ＤＮＡポリメラーゼにより５’から３’へ伸長させるためのテンプレートとして寄与することができる。分子間テンプレートによる伸長はまた、伸長可能なシグナル生成核酸を、異なる増幅可能なプローブに連結されたシグナル生成核酸にアニーリングさせることで、生じさせることもできる（図２Ｄを参照のこと）。各プローブにおけるシグナル生成核酸が伸長可能である実施形態においては、異なる被検物質反応性部分に連結する２つの異なるシグナル生成核酸にある相補的配列エレメントを、熱変性の後で互いにアニーリングさせることができ、一方又は両方のシグナル生成核酸がＤＮＡポリメラーゼによる５’から３’への伸長のためのテンプレートとして寄与することができる。個々の様式による増幅を発生させる頻度は、ハイブリダイゼーション条件を改変することで操作することができる。
【００３８】
反応させた増幅可能なプローブはまた、コグネイト核酸プライマーを伸長させることにより等温増幅反応において増幅することができる。この実施形態においては、増幅可能なプローブのシグナル生成核酸を、伸長可能にすることができるが、伸長可能である必要はない。コグネイト核酸プライマーは、増幅可能なプローブのシグナル生成核酸に存在する配列エレメント（たとえば、自己相補的ユニットの相補的配列エレメント、又は介在配列エレメント）に対して相補的であるハイブリダイゼーション配列エレメントを含有する。等温増幅反応において、増幅可能なプローブのシグナル生成核酸は、コグネイト核酸プライマーとハイブリダイゼーションする。コグネイト核酸プライマーは、増幅可能なプローブを被検物質と反応させているときに存在させても、後で加えてもよい。ハイブリダイズしたコグネイト核酸プライマーは、シグナル生成核酸がテンプレートになる伸長において、ＤＮＡポリメラーゼによって５’から３’に伸長される（図３Ａを参照のこと）。等温増幅のための好適な温度は、ポリメラーゼを不活性化させない温度であり、そのような温度は、たとえば、２５℃〜９０℃、６０℃〜８０℃、６５℃〜８０℃、又は７０℃〜７５℃である。反応時間は、自己相補的ユニット及びプライマーの両方の配列及び長さに応じて調節することができる。さらに、反応温度は、個々のハイブリッドのおよその融解温度に基づいて調節することができる。融解温度は、たとえば、Ｏｌｉｇｏ６．６（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．）を含むこの分野で知られているさまざまなコンピューター法によって決定することができ、又は実験的に見出すことができる。コグネイト核酸プライマーを伸長させた後、当該プライマーはまた、それ自身にハイブリダイズすることができ、伸長されたコグネイト核酸プライマーの自律性伸長(self-primed extension)を行うことができる（図３Ｂを参照のこと）。伸長されたコグネイト核酸プライマーの自律性伸長(self-primed extension)は、ヘアピン構造を生じさせることがあり、これにより、さらなる自律性伸長(self-primed extension)をもたらすことがある図３Ｃを参照のこと）。
【００３９】
伸長された核酸分子はさまざまな方法で検出することができる。典型的には、検出可能に標識されたヌクレオチド三リン酸を増幅反応混合物に含め、伸長可能な核酸分子の伸長時に、当該核酸分子に酵素的に取り込む。ヌクレオチドは、３２Ｐもしくは３５Ｓなどの同位体で放射能標識することができ、又はＣｈｒｏｍａＴｉｄｅＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）などのヌクレオチド誘導体で非放射能的に標識することができる。あるいは、ＤＮＡに結合したときに蛍光を発する非放射性の色素、たとえば、臭化エチジウム（挿入色素）、Ｈｏｅｓｃｈｔ３３２５８、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、及びＹＯＹＯ（登録商標）−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）などを、伸長された核酸分子を検出するために使用することができる。これらの検出方法及び他の検出方法は、Ｃａｐａｌｄｉ他、核酸研究（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．）、２８：ｅ２１（２０００）；ｄｅ  Ｓｉｌｖａ及びＷｉｔｔｗｅｒ、ジェイ・クロマトグラフィー  Ｂ  生物医学科学応用（Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ．）、７４１：３〜１３（２０００）に記載されている。
【００４０】
製品
本明細書中に記載される増幅可能なプローブは、パッケージング用材料と組み合わせることができ、被検物質を検出するためのキットとして販売することができる。製品を製造するためのさまざまな成分及び方法が広く知られている。製品は、増幅可能なプローブと、いくつかの実施形態では、対応するブロック化テンプレート及び／又はコグネイト核酸プライマーとを含むことができる。さらに、製品は、被検物質を検出するためのさまざまな試薬をさらに含むことができ、そのような試薬には、ヌクレオチド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼが含まれる。増幅可能なプローブが、被検物質の存在を検出するためにいかに効果的であるかを記載する説明書をそのようなキットに含めることができる。
【００４１】
他の実施形態
本発明を、その詳細な説明とともに記載したが、以上の説明は、本発明の範囲を例示するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。本発明の範囲は、添付された請求項の範囲によって規定される。他の態様、利点及び改変は下記の請求項の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】代表的な増幅可能なプローブの概略図である。
【図２Ａ】核酸分子を伸長させる一の形式の概略図である。
【図２Ｂ】核酸分子を伸長させる一の形式の概略図である。
【図２Ｃ】核酸分子を伸長させる一の形式の概略図である。
【図２Ｄ】核酸分子を伸長させる一の形式の概略図である。
【図３Ａ】非局所的な増幅の概略図である。
【図３Ｂ】非局所的な増幅の概略図である。
【図３Ｃ】非局所的な増幅の概略図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図３Ａ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年1月15日(2003.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被検物質反応性部分と、
（ｂ）少なくとも１つの伸長可能なシグナル生成核酸であって、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、それぞれ、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、前記少なくとも１つの自己相補的ユニットが、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを含み、前記第１の配列エレメントと前記第２の配列エレメントが相補的であり、前記シグナル生成核酸が、２以上のサイクルの伸長に従って伸長可能である、少なくとも１つのシグナル生成核酸と、
（ｃ）前記被検物質反応性部分を、前記少なくとも１つの前記シグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーとを含有する増幅可能なプローブ。
【請求項２】
前記被検物質反応性部分が、ポリペプチドである、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項３】
前記被検物質反応性部分が、核酸分子である、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項４】
前記被検物質反応性部分が、１つ又は複数のポリペプチドと相互作用する、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項５】
前記被検物質反応性部分が、１つ又は複数の核酸分子と相互作用する、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項６】
前記被検物質反応性部分が、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質及びハプテンからなる群から選択される１つ又は複数の分子と相互作用する、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項７】
介在配列エレメントが、少なくとも１つの前記自己相補的ユニットの前記第１の配列エレメントと前記第２の配列エレメントとの間に存在し、前記介在配列エレメントが、前記少なくとも１つの自己相補的ユニットの前記第１の配列エレメント及び前記第２の配列エレメントに対して相補的ではない、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項８】
前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、少なくとも２つの自己相補的ユニットを有し、介在配列エレメントが、前記自己相補的ユニットの少なくとも２つの間に存在し、前記介在配列エレメントは前記少なくとも２つの自己相補的ユニットの前記第１のヌクレオチド配列エレメント及び前記第２のヌクレオチド配列エレメントに対して相補的ではない、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項９】
前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、２つ以上の３’端を有する、請求項１に記載の増幅可能なプローブ。
【請求項１０】
サンプル中の被検物質の存在又は非存在を検出する方法において、
（ａ）前記被検物質が存在する場合、前記被検物質が増幅可能なプローブと結合して、プローブ／被検物質の複合体を形成する条件で、前記サンプルを前記増幅可能なプローブと接触させるステップであって、
前記増幅可能なプローブが、
（１）被検物質反応性部分、
（２）少なくとも１つのシグナル生成核酸であって、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、それぞれ、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、前記自己相補的ユニットが、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを含み、前記第１の配列エレメントと前記第２の配列エレメントが相補的である、少なくとも１つのシグナル生成核酸、並びに
（３）前記被検物質反応性部分を、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーを含む前記ステップと；
（ｂ）前記少なくとも１つの伸長可能なシグナル生成核酸を、前記プローブ／被検物質複合体を含む反応混合物において、２サイクル以上の伸長を実施することにより伸長させるステップと、
（ｃ）前記伸長されたシグナル生成核酸の存在又は非存在を検出するステップとを含み、
前記伸長されたシグナル生成核酸の存在が、前記被検物質の存在と相関する、前記方法。
【請求項１１】
前記反応混合物が、検出可能に標識された少なくとも１つのヌクレオチド三リン酸をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのヌクレオチド三リン酸が、放射性同位体で標識されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのヌクレオチド三リン酸が、非放射性標識で標識されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのヌクレオチド三リン酸が、蛍光標識で標識されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
非放射性色素を、前記伸長された核酸分子を検出するために使用する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応混合物が、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有する単離された核酸テンプレートを更に有し、前記自己相補的ユニットが、それぞれ、第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び第２のハイブリダイゼーション配列エレメントを含み、前記第１のハイブリダイゼーション配列エレメントと前記第２のハイブリダイゼーション配列エレメントは互いに相補的であり、前記核酸テンプレートは、その３’末端及び５’末端がブロックされている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記単離された核酸テンプレートが、ホスホロチオアート骨格を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも伸長可能なシグナル生成核酸が、等温的に伸長される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
サンプル中の被検物質の存在又は非存在を検出する方法において、
（ａ）前記被検物質が存在する場合、前記被検物質が前記増幅可能なプローブと反応して、改変された増幅可能なプローブを形成する条件で、前記サンプルを増幅可能なプローブと接触させるステップであって、
前記増幅可能なプローブが、
（１）被検物質反応性部分、
（２）少なくとも１つのシグナル生成核酸であって、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、それぞれ、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、前記自己相補的ユニットが、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを含み、前記第１の配列エレメントと前記第２の配列エレメントが相補的である少なくとも１つのシグナル生成核酸；並びに
（３）前記被検物質反応性部分を前記少なくとも１つのシグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーを含む前記ステップと、
（ｂ）前記少なくとも１つの伸長可能なシグナル生成核酸を、前記改変された増幅可能なプローブを含む反応混合物において、２サイクル以上の伸長を実施することにより、伸長させるステップと、
（ｃ）前記伸長されたシグナル生成核酸の存在又は非存在を検出するステップとを含み、
前記伸長されたシグナル生成核酸の存在、が前記被検物質の存在と相関する、前記方法。
【請求項２０】
前記少なくとも伸長可能なシグナル生成核酸が、等温的に伸長される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも１つの自己相補的ユニットを有数する単離された核酸テンプレートであって、
前記自己相補的ユニットが、それぞれ、第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び第２のハイブリダイゼーション配列エレメントを含み、前記第１のハイブリダイゼーション配列エレメントと前記第２のハイブリダイゼーション配列エレメントは互いに相補的であり、その３’末端がブロックされている単離された核酸テンプレート。
【請求項２２】
ホスホロチオアート骨格を含む、請求項２１に記載の核酸テンプレート。
【請求項２３】
その３’末端及び５’末端がブロックされている、請求項２１に記載の単離された核酸テンプレート。
【請求項２４】
介在配列エレメントが、少なくとも１つの前記自己相補的ユニットの前記第１のハイブリダイゼーション配列エレメントと前記第２のハイブリダイゼーション配列エレメントとの間に存在し、前記介在配列エレメントが、前記少なくとも１つの自己相補的ユニットの前記第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び前記第２のハイブリダイゼーション配列エレメントに対して相補的ではない、請求項２１に記載の単離された核酸テンプレート。
【請求項２５】
少なくとも２つの自己相補的ユニットを含有し、介在配列エレメントが、前記自己相補的ユニットの少なくとも２つの間に存在し、前記介在配列エレメントが、前記少なくとも２つの自己相補的ユニットの前記第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び前記第２のハイブリダイゼーション配列エレメントに対して相補的ではない、請求項２１に記載の単離された核酸テンプレート。
【請求項２６】
（ａ）（１）被検物質反応性部分；
（２）少なくとも１つのシグナル生成核酸であって、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、それぞれ、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、前記自己相補的ユニットが、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを含み、前記第１の配列エレメントと前記第２の配列エレメントが相補的であり、前記シグナル生成核酸が、２以上のサイクルの伸長に従って伸長可能である、少なくとも１つのシグナル生成核酸；並びに
（３）前記被検物質反応性部分を、前記少なくとも１つの前記シグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーを含む増幅可能なプローブと、
（ｂ）少なくとも１つの自己相補的ユニットを含む単離された核酸テンプレートであって、前記自己相補的ユニットが、それぞれ、第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び第２のハイブリダイゼーション配列エレメントを有し、前記第１のハイブリダイゼーション配列エレメントと前記第２のハイブリダイゼーション配列エレメントは互いに相補的であり、３’末端及び５’末端がブロックされている単離された核酸テンプレートとを含有し、
前記単離された核酸テンプレートが、前記少なくとも１つの伸長可能なシグナル生成核酸にハイブリダイゼーションする、増幅可能な複合体。
【請求項２７】
前記被検物質反応性部分が、被検物質に結合する、請求項２６に記載の増幅可能な複合体。
【請求項２８】
サンプル中の被検物質の存在又は非存在を検出する方法において、
（ａ）前記被検物質が存在する場合、前記被検物質が増幅可能なプローブと結合して、プローブ／被検物質の複合体を形成する条件で、前記サンプルを増幅可能なプローブと接触させるステップであって、
前記増幅可能なプローブが、
（１）被検物質反応性部分；
（２）少なくとも１つのシグナル生成核酸であって、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、それぞれ、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、前記自己相補的ユニットが、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを含み、前記第１の配列エレメントと前記第２の配列エレメントが相補的である、少なくとも１つのシグナル生成核酸；並びに
（３）前記被検物質反応性部分を、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーを含む、前記ステップと、
（ｂ）前記プローブ／被検物質複合体を、コグネイト核酸テンプレートと接触させるステップと、
（ｃ）前記プローブ／被検物質複合体を含む反応混合物において、等温増幅反応を行うことによって前記コグネイト核酸テンプレートを伸長させ、更に、前記伸長したコグネイト核酸を、自律性繰り返し伸長させるステップと、
（ｄ）前記伸長されたシグナル生成核酸の存在又は非存在を検出するステップとを含み、
前記伸長されたシグナル生成核酸の存在が、前記被検物質の存在と相関する、前記方法。
【請求項２９】
前記シグナル生成核酸が、伸長可能である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
増幅可能なプローブを含むキットにおいて、
前記増幅可能なプローブが、
（ａ）被検物質反応性部分と、
（ｂ）少なくとも１つのシグナル生成核酸であって、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸が、それぞれ、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、前記少なくとも１つの自己相補的ユニットが、それぞれ、第１の配列エレメント及び第２の配列エレメントを含み、前記第１の配列エレメントと前記第２の配列エレメントが相補的であり、前記シグナル生成核酸が、２以上のサイクルの伸長に従って伸長可能である、少なくとも１つのシグナル生成核酸と、
（ｃ）前記被検物質反応性部分を、前記少なくとも１つのシグナル生成核酸に連結する１つ又は複数のリンカーとを含む、キット。
【請求項３１】
ブロックされたテンプレートをさらに含み、前記ブロックされたテンプレートは、少なくとも１つの自己相補的ユニットを有し、前記自己相補的ユニットは、それぞれ、第１のハイブリダイゼーション配列エレメント及び第２のハイブリダイゼーション配列エレメントを含み、前記第１のハイブリダイゼーション配列エレメントと前記第２のハイブリダイゼーション配列エレメントは互いに相補的であり、かつ前記核酸テンプレートは、その３’末端及び５’末端がブロックされている、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記シグナル生成分子上の配列エレメントに対して相補的であるハイブリダイゼーション配列エレメントを含むコグネイト核酸プライマーをさらに含む、請求項３０に記載のキット。
【国際調査報告】
2004533257.tif 000038
2004533257.tif 000039
2004533257.tif 000040