(57)【要約】本発明は、不適当な線維症または瘢痕形成（たとえば、デュピュイトラン病）によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態への素因のインビトロ診断または検出方法に関する。該方法は、対象となる患者由来のＺＦ９遺伝子およびその調節エレメントを検査して、該状態に関連する該遺伝子における遺伝子多型または突然変異の存在を検出することを含む。
2004525629.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態への素因のインビトロ診断または検出方法であって、対象となる患者由来のＺＦ９遺伝子およびその調節エレメントを検査して、遺伝子多型または突然変異の存在を検出することを含む方法。
【請求項２】
該状態が、デュピュイトラン病である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該状態が、ケロイドまたは肥厚性瘢痕である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該状態が、強皮症；全身性硬化症；クレスト症候グループ；皮膚斑点を伴う結節硬化症；家族性皮膚コラーゲン腫；皮膚の代謝および免疫疾患；好酸球筋膜炎；円板状エリテマトーデス；皮膚筋炎；混合結合組織疾患；薬物誘発性皮膚線維症；口腔粘膜下線維症；食事および環境によって誘発される線維症；肺／心臓線維症；肝線維症／硬変；腎線維症；薬物誘発性線維症；中枢および末梢神経系線維症；血管系線維症；男性および女性尿生殖器線維症；および女性線維症のいずれか１つである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該状態が、肝硬変、肝線維症、糸球体腎炎、肺線維症、嚢胞性繊維症、強皮症、心筋線維症、心筋梗塞後の線維症および脳卒中後の中枢神経系線維症または神経変性疾患のいずれか１つである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＺＦ９遺伝子およびその調節エレメントが、ゲノムＤＮＡ由来である前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ゲノムＤＮＡが、血液または組織サンプルから単離される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子多型または突然変異の存在を検出するために、Ｚｆ９遺伝子の翻訳開始の３’の１０２２塩基の周囲の領域を検査する前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
アデノシンからグアノシンへの遺伝子多型の存在を検出するために、該領域を検査する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
アデノシンからグアノシンへの遺伝子多型の存在が、以下のヌクレオチド配列：
【数１】
2004525629.tif 000010
（配列番号１）
をもつＤＮＡの領域において検査される前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
遺伝子多型の存在が、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）による少なくとも１つのＤＮＡ断片の増幅の後に決定される前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
ＤＮＡを、請求項６に記載の領域に対して特異的なＰＣＲプライマーを用いるＰＣＲ増幅に付す請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
プライマーが、
フォワードプライマー：
【数２】
2004525629.tif 000011
（配列番号３）；および
リバースプライマー：
【数３】
2004525629.tif 000012
（配列番号４）
である請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＺＦ９遺伝子およびその調節エレメントを、制限酵素切断およびサイズ分析によって検査する前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
（Ａ）不適当な線維症または瘢痕形成によって特徴付けられる状態に関連するＺＦ９遺伝子およびその調節エレメントにおける遺伝子多型を増幅するためのＰＣＲプライマー；および
（Ｂ）各多型に対する遺伝子型が既知であるコントロールＤＮＡサンプル；
を含む請求項１１〜１４のいずれか１つに記載の方法において用いるためのキット。
【請求項１６】
ＰＣＲプライマーが、請求項１３に記載のプライマーである請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
キットがさらに、ＤＮＡの断片を作成するための適当な制限酵素を含む請求項１５に記載のキット。
【請求項１８】
キットがさらに、特定の多型と疾患との間の関連をまとめるデータカード；および／またはＰＣＲ増幅、ＰＣＲ産物の制限酵素切断およびＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動のためのプロトコルを含む請求項１５〜１７のいずれか１つに記載のキット。
【請求項１９】
キットがさらに、請求項６〜１３のいずれか１つに記載の方法で用いるための緩衝液を含む請求項１５〜１７のいずれか１つに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態の発症への遺伝的素因に関連するＺｆ９遺伝子における多型の存在を決定するためのサンプルの遺伝子検査方法に関する。
瘢痕は、先の傷害や創傷（たとえば、切開、摘出または外傷性傷害など）に起因する異常な形態学的構造である。瘢痕は、主として１型および３型コラーゲンならびにフィブロネクチンを基質とする結合組織からなる。瘢痕は、異常な組織形成におけるコラーゲン線維からなる場合もあり（皮膚の正常な瘢痕にみられる）、あるいは結合組織の異常な蓄積である場合もある（中枢神経系の瘢痕または皮膚の病的な瘢痕形成にみられる）。
【０００２】
瘢痕形成は、ほとんどの成体動物およびヒトの組織における治癒過程の通常の結果である。皮膚において、瘢痕は、皮膚の表面下に押さえられているか、あるいは表面より盛り上がっている。肥厚性瘢痕は、特定の状態または特定の個体において生じ得る、より重篤な形態である。肥厚性瘢痕は、皮膚の正常な表面より盛り上がっており、異常なパターンに配置された過剰のコラーゲンを含む。ケロイドは、皮膚の表面より盛り上がるばかりでなく、もとの傷害の境界を越えて広がる病的瘢痕形成の１つの形態である。ケロイドには、主としてコラーゲン性組織の渦巻きにおいて異常な様式で組織化された過剰の結合組織がある。
【０００３】
不適当で、特に病的な瘢痕（たとえば、肥厚性瘢痕およびケロイドなど）を形成するのは、遺伝的素因であると考えられる。たとえば、アフリカ系カリブ人およびモンゴロイド人種は、特にケロイド瘢痕を発生しがちである。
瘢痕形成が問題となる医学的状況は多い。このような状況の例は、過剰の瘢痕形成が組織の機能にとって有害な皮膚の瘢痕であり、特に、瘢痕拘縮が起こる場合である（たとえば、関節の柔軟性を損なう皮膚の火傷および創傷など）。美容上の考慮が重要である場合に皮膚の瘢痕形成を減少させることも非常に望ましい。皮膚において、肥厚性またはケロイド瘢痕は（特に、アフリカ系カリブ人およびモンゴロイド人種において）、機能的および美容上の減損を引き起こしうるものであり、それらの発生を防止する必要がある。２箇所のドナー部位における皮膚移植および人工皮膚の適用に起因する瘢痕形成も問題を含むものであり、最小化または防止する必要がある。このような状況における瘢痕形成の重要性を考えると、当然のことながら、被験者が不適当な瘢痕形成を発生させやすいか否かを調べるために被験者を検査することが可能である必要がある。
【０００４】
皮膚の瘢痕のみならず、内部の瘢痕形成または線維症は、非常に有害であり、その特定の例として、以下のものが挙げられる：
（ｉ）中枢神経系内で、グリア細胞における瘢痕形成は、ニューロン再接続を妨げる（たとえば、神経外科手術または脳の貫通性傷害後など）。
（ii）眼球内の瘢痕形成は、有害である。角膜では、瘢痕形成の結果として、異常な不透明になり、視力に問題が生じるか、あるいは失明に至る可能性もある。網膜では、瘢痕形成は、ゆがみまたは網膜剥離を引き起こし、次いで失明に至る。緑内障における眼圧低下のための手術（たとえば、緑内障濾過手術）における創傷治癒後の瘢痕形成の結果として、水性体液を排出することができなくなり、緑内障が再発することにより、手術が失敗に終わることとなる。
（iii）心臓における瘢痕形成（たとえば、手術または梗塞後など）は、異常な心臓機能を引き起こす。
（iv）腹部および骨盤などに関わる手術は、内臓間の癒着に至ることがしばしばある。たとえば、胃腸エレメントと体壁間の癒着は、腸ループにねじれを形成し、虚血、壊疽を引き起こし、次いで、緊急治療が必要になる（治療しないと死に至る場合もある）。同様に、胃腸に対する外傷または切開は、瘢痕形成および瘢痕拘縮に至ることがあり、それによって、再度生命を脅かす胃腸の内腔の閉塞を引き起こす狭窄の生じる可能性もある。
（ｖ）卵管の領域での骨盤における瘢痕形成は、不妊の原因となりうる。
（vi）筋肉への傷害後の瘢痕形成はの結果として、異常な拘縮が生じ、それによって筋肉機能が損なわれる。
（vii）腱および靭帯の傷害後の瘢痕形成または線維症の結果として、機能の重篤な喪失に至る。
【０００５】
上述した事項に関連するのは、過剰の線維組織の発生によって組織の病的混乱状態および機能不全が引き起こされる、線維性障害として知られる多くの病状があるという事実である。線維性障害は、組織内の異常な様式での線維性組織（主としてコラーゲン）の蓄積を特徴とする。このような線維性組織の蓄積は、種々の疾病過程に起因する。これらの疾病は、必ずしも、手術、外傷性傷害または創傷によって引き起こされなくてもよい。線維性障害は、通常、慢性である。線維性障害の例として、肝硬変、肝線維症、糸球体腎炎、肺線維症、嚢胞性繊維症、強皮症、心筋線維症、心筋梗塞後の線維症、脳卒中後の中枢神経系線維症または神経変性疾患（たとえば、アルツハイマー病など）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）および関節炎が挙げられる。
【０００６】
瘢痕形成の場合、多くの線維性障害の発生またはその重篤度において遺伝的影響があると考えられる。幾つかの場合、遺伝的影響は、障害の発生についての直接的原因であるが、その他の線維性障害については、その障害の一次的原因に対して二次的である線維性障害の発生に影響を及ぼす遺伝的因子がある（たとえば、嚢胞性繊維症など）。
【０００７】
線維症が関連し、遺伝によって影響を及ぼされると考えられる障害の一例は、デュピュイトラン病（Dupuytren's disease：ＤＤ）である。
ＤＤは、指の進行性および永続性拘縮を引き起こす結節性手掌線維腫症である。ＤＤは、しばしば家族性であり、北欧系の個人によく見られる。６０歳以上のケルト民族の男性の２５％以上において、ＤＤの徴候が見られ、カフカス人における結合組織の最も一般的な遺伝性の障害の１つであると考えられる。
【０００８】
可変性浸透度をもつ常染色体優性が、ＤＤについての遺伝形質のありそうなモードとして提案されている。しかし、該状態の原因となる単一の遺伝子を同定した文献はこれまでに発表されていない。さらに、ＤＤが複合主働遺伝子状態であるか、単純な単一遺伝子のメンデル型遺伝病であるかどうかは不明である。したがって、可能な遺伝子座の同定は、この一般的疾患の遺伝的構成エレメントを解明する理想的なアプローチを提供し、ＤＤに対する治療および管理方策の次なる発達においても価値がある。
【０００９】
上述の内容から当然のことながら、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態を生じることに対する罹患性について個人を評価すること、およびこのような状態に罹っている個体について予後を評価することが可能であることが必要である。これに近づく１つの手段は、特定の病状に関連する遺伝子における多型または突然変異の同定である。いったん同定されると、このような多型は、状態の発生に対する管理、治療または罹患性の確立を必要とする医師に有用な情報を提供することができる。情報が用いられる１つの手段は、遺伝子検査の開発においてである。
【００１０】
遺伝子検査は、患者のＤＮＡが、ある状態への罹患性を引き起こすかまたは増大させる突然変異（または多型）、もしくは該状態を引き起こす遺伝子に関連し、したがって、その状態への素因の潜在的に示す突然変異（または多型）を含むかどうかを決定するための患者の核酸の分析検査として定義される。
【００１１】
ある状態への素因の早期検出は、医療的治療介入にとって最高の機会を与える。危険度の早期遺伝的同定は、早期治療的介入を通して、臨床的症状が現れる前における患者の予測を改善する。
同じ治療論によって同様の症状をもつ患者の治療を行って、成功の程度が相異する場合、遺伝子検査により、患者を彼らの症状についての発生的基盤よりもむしろ遺伝子的基盤により区別することができる。
不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態に対する危険度または素因を示すための遺伝子スクリーニング方法を提供することが本発明のねらいである。
【００１２】
本発明の第１の態様は、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態への素因のインビトロ診断または検出方法であって、対象となる患者由来のＺＦ９遺伝子およびその調節エレメントを検査して、該状態に関連する該遺伝子における遺伝子多型または突然変異の存在を検出することを含む方法を提供する。
【００１３】
「多型」は、ヌクレオチド塩基配列が個体間で変化する遺伝子またはその調節エレメントの領域を意味する。異なる遺伝子型を与える多型を有する集団のサブセットをもつ遺伝子の通常の形態または野生型を示す優勢な遺伝子型がしばしばある。特定の多型は、特定の人種的背景に属する個体または特定の地理的領域においてよく見られる。多型は、遺伝子の機能に影響を及ぼさない；遺伝子の機能に差異を与える；不活性な遺伝産物を産生する；または遺伝産物の産生を調節する。
【００１４】
「突然変異」は、ヌクレオチド塩基配列が野生型から変化する遺伝子またはその調節エレメントの領域を意味する。突然変異は、たとえば、塩基置換、欠失または付加を含む。遺伝子の特定の突然変異形は、特定の人種的背景に属する個体または特定の地理的領域においてよく見られる。突然変異は、遺伝子の機能に影響を及ぼさない；遺伝子の機能に差異を与える；不活性な遺伝産物を産生する；または遺伝産物の産生を調節する。
【００１５】
「遺伝子」は、Ｚｆ遺伝子の開始および終止コドンの間のすべてのコーディング配列を意味する（イントロンおよびエクソンを含む）。
「調節エレメント」は、遺伝子の５’および３’であり、調節遺伝子転写に関与するＤＮＡを意味する。たとえば、転写因子結合配列、ＴＡＴＡボックス、５’プロモーターならびに５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲｓ）。
【００１６】
本発明の第１の態様である方法によって、研究者は、ＺＦ９遺伝子またはその調節エレメントに遺伝子多型または突然変異をもつ患者を同定して、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態を発生する危険度があるか、または危険度がより大きい患者を決定することができる。このことによって、該状態の開始の可能性を防止または減少させるため、あるいはその適当な治療をするための適当な処置を取ることができるようになる。該方法は、すでに特定の状態に罹っていることを診断されている患者についての予測を確立することにも有用である。
【００１７】
転写因子Ｚｆ９は、瘢痕または線維症組織を発生させる病態生理学的過程に関連する数多くの生体分子のうちの１つである。Ｚｆ９の遺伝子は、ヒト染色体１０ｐ１５上の遺伝子座にあることがマッピングされている。全長ヒト（およびラット）ｃＤＮＡの配列は、Ratziuら(Proc. Nat. Acad. Sci 95: 9500-9505,1998)によって同定されており、Ｚｆ９の遺伝子配列は、Gene Bank Accession No. AB017493として公的に入手可能である。
Ｚｆ９は、コアプロモーターエレメント−結合タンパク質（ＣＯＰＥＢまたはＣＰＢＰ）；Ｂ細胞由来がん原遺伝子１（ＢＣＤ１）；ＧＣリッチ部位結合因子（ＧＢＦ）；およびKruppel様因子６（ＫＬＦ６）としても知られている。
【００１８】
本発明者らは、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態に関連する多型および突然変異について、Ｚｆ９遺伝子およびその調節エレメントをスクリーニングする実験を行った。このような関連を確証して、本発明者らは、患者からのＤＮＡを分析することが、該状態の診断の確立を補助すること、または患者がこのような状態を発生する素因をもっているかどうかを確かめることを確証している。
【００１９】
該状態は、上述したような皮膚の病的瘢痕形成（たとえば、肥厚性瘢痕形成またはケロイド）の形態または内部の瘢痕もしくは線維症である。さらに、該状態は、また上述したように、線維性疾患または障害である。本発明方法によって診断または検出される他の状態として、以下の皮膚の線維性障害が挙げられる：
強皮症；全身性硬化症；クレスト症候グループ；皮膚斑点を伴う結節硬化症；家族性皮膚コラーゲン腫；皮膚の代謝および免疫疾患（晩発性皮膚ポルフィリン症、慢性移植片対宿主病）；好酸球筋膜炎；円板状エリテマトーデス；皮膚筋炎；混合結合組織疾患；薬物誘発性皮膚線維症−ブレオマイシン、ＰＶＣ、シリケート；ペイロニー病；口腔粘膜下線維症；食事および環境によって誘発される線維症。
【００２０】
他の臓器の線維性障害もまた検出または診断することができる。このような障害として、以下のものが挙げられる：
肺／心臓線維症；肝線維症／硬変；腎線維症；胃腸管線維症；薬物誘発性線維症（たとえば、臓器移植後など）；中枢および末梢神経系線維症；血管系（静脈および動脈）線維症；男性および女性尿生殖器線維症；女性（卵管線維症、子宮線維症）。
【００２１】
本発明の第１の態様の方法は、特に、デュピュイトラン病に対する素因を診断または検出するのに適している。
検査されるＺｆ９遺伝子は、ヒト患者由来のものが好ましい。しかし、当然のことながら、獣医学の対象である動物患者由来のＤＮＡも本発明ほうほうによって検査することができる。
本発明の第１の態様にしたがって検出される好ましい多型および突然変異は、Ｚｆ９コーディング配列の非翻訳ＤＮＡ３’に位置する。最も好ましい多型は、Gene Bank Accession No. AB017493460 (NCBI Assay Id (ss#) 20354; and Reference SNP Id (rs#) 17731)の１１４０位に位置し、本明細書中では「１１４０多型」と称する。
【００２２】
１１４０多型は、グアノシンヌクレオチド（Ｇ）のアデノシンヌクレオチド（Ａ）への点突然変異を示す。遺伝子型ＡＡ、ＡＧおよびＧＧは、この多形について同定された。
点突然変異は、Ｚｆ９遺伝子のコーディング配列の開始位置から１０２２塩基に位置し、３’非翻訳領域に見出される。２つの対立遺伝子体は、以下の塩基配列をもつ：
「Ｇ」体：
【数１】
2004525629.tif 000003
（配列番号１）
「Ａ」体：
【数２】
2004525629.tif 000004
（配列番号２）
【００２３】
最初の実験は、ＧＧおよびＡＧ遺伝子型が、デュピュイトラン病の患者において有意に過剰出現しているが、高比率のコントロール患者は、ＡＡ遺伝子型であったことを実証した。
さらなる研究によって、他の線維性疾患（たとえば、強皮症または腎線維症）の患者および重篤な／病的瘢痕形成（たとえば、ケロイドなど）を生じやすい患者も、高頻度でＧ対立遺伝子をもつことが確証された。それゆえに、該多型は、本発明の不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態への素因の診断または検出方法にしたがって、検査することができる。
種々の技術を用いて、本発明方法にしたがって、多型または突然変異を検出することができる。
【００２４】
１つの好ましい技術は、制限酵素切断（ＲＥＤ）であり、制限酵素での処理後、多型によって異なるサイズのＤＮＡ断片が作成されるという事実に基いている（多型を引き起こす突然変異による制限部位の導入または欠失による）。これらの断片は、ゲルによって視覚化することができ、患者由来のＤＮＡサンプルからの断片の数およびサイズ（すなわち、ゲル上で移動した距離）に基いて同定することができる。
【００２５】
Ｚｆ９遺伝子および／またはその調節エレメントを含むＤＮＡを増幅した後に、多型を検出するのが好ましい。この増幅は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて行うのが好ましい。たとえば、ＰＣＲ制限断片長多型法（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）として知られる本発明における好ましい方法は、実施例１においてより詳細に記載され、多型を含むＤＮＡのＰＣＲ増幅を含み、その後、ＲＥＤおよび分析を行う。
【００２６】
ＰＣＲプライマーは、関連する多型の周囲の領域を増幅するのに適するように設計することが必要である。１１４０多型の増幅に適したプライマーを以下に配列番号３および配列番号４として挙げる。
フォワードプライマー：
【数３】
2004525629.tif 000005
（配列番号３）
リバースプライマー：
【数４】
2004525629.tif 000006
（配列番号４）
【００２７】
幾つかの多型または突然変異については、野生型も突然変異対立遺伝子も、制限酵素部位を廃止または導入しない。この場合、制限酵素部位は、制限部位を増幅産物に導入する特別に設計されたＰＣＲプライマーによって導入することができる。導入された制限酵素部位によって、サイズ分析による多型対立遺伝子と野生型の間の区別が可能になる。たとえば、増幅産物の制限産物をゲル電気泳動（アガロースまたはポリアクリルアミドゲルなど）によって分析する場合、導入された制限酵素部位をもつ対立遺伝子は、ゲル上に余分のバンドを作成する。
【００２８】
本発明において多型または突然変異を検出するのに用いる他の技術として、以下のものが挙げられる：
（１）対象の多型領域の直接配列決定（たとえば、Cy５ＴＭThermo Sequence dye terminator kit-Amersham Pharmacia Biotech)などの市販のキットを用いる）；
（２）配列特異的オリゴヌクレオチドハイブリッド形成（Sequence Specific Oligonucleotide Hybridization：ＳＳＯ）（多型領域を含む増幅ＤＮＡ分子のドットまたはスロットブロッティング；各多型変異体に特異的であるように設計される標識プローブとのハイブリッド形成；および該標識の検出）；
（３）ヘテロ二本鎖および一本鎖コンホーメーション多型（Heteroduplex and single-stranded conformation polymorphism：ＳＳＣＰ）分析（多型領域を含む変性増幅ＤＮＡ分子の電気泳動バンドパターンの分析を含む）；
（４）配列特異的プライミング（Sequence Specific Priming：ＳＳＰ）［増幅不応性突然変異システム(Amplification Refractory Mutation System：ARMS)ともいう］；
（５）突然変異走査［たとえば、PASSPORTＴＭ突然変異走査キット(Amersham Pharmacia Biotech)などを用いる］；
（６）ミスマッチの化学的切断分析；
（７）非同位体ＲＮアーゼ切断アッセイ(Ambion Ltd.)；
（８）酵素ミスマッチ切断アッセイ；および
（９）単一ヌクレオチド伸長アッセイ。
【００２９】
本発明の第１の態様の方法は、ゲノムＤＮＡにおいて、特に単離されたゲノムＤＮＡにおいて行われるのに特に適している。このようなゲノムＤＮＡは、血液または組織サンプル（たとえば、毛髪、口頬スワブ、爪または皮膚など）から、あるいはその他の適当なソースから慣例の方法を用いて単離することができる。全血または顆粒球からＤＮＡを単離するのが好ましい。
【００３０】
本発明方法に基いた予測または診断は、問題とする特定の状態と特定の多型または突然変異との間に作られる関連性に従属する。このような関連性は、本発明者らによって、さらなる実験を行い、統計的分析を行うことによって確証された（たとえば、実施例を参照）。１１４０多型間の関連性は、上記および実施例において論じている。関連性分析に基くデータを蓄えることによって、本発明方法にしたがってＤＮＡ配列決定を行うことによって同定された遺伝子型の重要性を臨床医が解釈するのが可能になる。次いで、臨床医は、特定の疾患または障害を患っている、または保有している患者の可能性に関して判断を下すことができる。このような知識は、不適当な瘢痕形成または線維症に関連する特定の状態の臨床管理において重要である。当然のことながら、特定の遺伝子型と状態の関連性に関するデータは、キットの一部としてデータシートを組み込むことによって、本発明方法の利用者に提供される（後記参照）。
【００３１】
新生児または小児が、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態の発生の素因を受け継いでいるかどうかを検査することが必要である場合、遺伝子検査は、胎児期、周産期または出生後のいずれかに行うことができる。これは、該状態の発生の家族暦がある場合、特に有用である。
検査は、手術前に患者を検査するのに特に有用である。このような検査の結果は、手術を受けようとする患者にとって治癒合併症が起こり得るかどうかを確証するのに有用である（たとえば、肥厚性瘢痕形成、ケロイドまたは内部線維症／瘢痕形成）。
【００３２】
検査は、不適当な線維症または瘢痕形成によって特徴付けられる状態を治療するために治療処方計画を確立する前にも有用である。本発明の検査の結果は、臨床医が、使用する医薬およびその用量を選択するのを補助することができる。
本発明方法は、不適当な線維症または瘢痕形成によって少なくとも部分的に特徴付けられる状態の発生の家族暦をもつ患者を検査するのに用いるのが最も好ましい。
【００３３】
本発明の第１の態様の方法を行う専門家にとって必要な種々の要素をキットに組み込むことができる。したがって、本発明の第２の態様は、
（Ａ）不適当な線維症または瘢痕形成によって特徴付けられる状態に関連するＺＦ９遺伝子およびその調節エレメントにおける遺伝子多型を増幅するためのＰＣＲプライマー；および
（Ｂ）各多型に対する遺伝子型が既知であるコントロールＤＮＡサンプル；
を含むキットを提供する。
【００３４】
キットが、対象の多型を含むことがわかっているサンプルＤＮＡの標的配列に特異的なプライマーを含むのが好ましい。たとえば、１１４０多型の遺伝子型を特定するためのキットにとって適当なＰＣＲプライマーは、配列番号３および配列番号４のプライマーである。
キットは、さらに以下のものを含むことができる：
（Ｃ）ＤＮＡサンプルの断片を作成するための適当な制限酵素；
（Ｄ）特定の多型と疾患との間の関連をまとめるデータカード；
（Ｅ）ＰＣＲ増幅、ＰＣＲ産物の制限酵素切断およびＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動のためのプロトコル；
（Ｆ）適切な緩衝液。
キットで提供される緩衝液は、液体であってよく、前処理したアリコートとして提供されるのが好ましい。あるいは、緩衝液は希釈用に濃縮形態（または粉末形態）であってよい。
キットは、さらに適当な反応容器、遠沈管などを含むことができる。
【００３５】
数多くの生体分子が、線維性および瘢痕形成過程に関与しており、当然のことながら、多くの相異する因子が、瘢痕または線維症の発生に至らしめる。成長因子ＴＧＦ−β１は、瘢痕および線維性組織の発生における主要因子として関わる生体分子の一例である。ＴＧＦ−β１遺伝子は、多型であることが知られており、ＴＧＦ−β１遺伝子の数個の多型が文献に報告されている。本発明者らは、４つの既知のＴＧＦ−β１多型と線維性状態であるデュピュイトラン病（ＤＤ）の間に関連があるという仮説を探求した。ＤＤのカフカス人個体グループにおいて、ＴＧＦ−β１の遺伝子型の特定を行い、コントロールカフカス人集団と比較した。これらの研究は、カフカス人コントロールとデュピュイトラン病患者の間には、ＴＧＦ−β１多型について、消極的な関連しかないことを実証した。ＴＧＦ−β１などの線維性成長因子における多型が、不適当な瘢痕形成または線維症によって特徴付けられる状態との何らかの関連を示さないという事実は、Ｚｆ９の遺伝子における多型が非常に大きな関連を示すという本発明者らの発見がいかに驚くべきものであったかを示している。
【００３６】
本発明を後述のとおり図面に関連してさらに詳しく説明するが、これは例示に過ぎない。
【実施例】
【００３７】
実施例１：ＺＦ９多型の関連解析
サンプルは、デュピュイトラン病（ＤＤ）の患者グループおよびコントロールグループから採取して、Ｚｆ９多型と状態との間の相関関係を研究した。
【００３８】
１．１  患者および方法
１．１．１  患者
デュピュイトラン病の患者（ｎ＝１３８）が実験に参加した（男性１１９名および女性１９名）。年齢幅は３７歳〜９０歳であり、平均年齢は５５．８歳であった。患者はイギリス国イングランドの北西地域のすべて親族でないカフカス人であった。デュピュイトラン病の患者は、北西地域にあるサウス・マンチェスター・ユニバーシティ・トラストおよびライティントン・ホスピタルからの手術記録臨床コードで確認した。すべての患者は、プロフォーマを用いて、全病歴を把握する医学的適任者によって配慮され、各患者の両手が審査された。すべての患者は、中手指節間関節または近位指節間関節のいずれかの拘縮の有無とともに、掌および／または足指に特徴的なデュピュイトラン病の小結節の存在により、手術前にデュピュイトラン病の診断を承認していた。
コントロールグループ（ｎ＝１６１）は、民族的にマッチした健康なカフカス人の男性および女性からなり、一般の実践登録者から選ばれた。
地方および病院の倫理委員会は、実験プロトコルおよびプロフォーマを許諾していた。書面承諾は、すべての個人から得られた。
【００３９】
１．１．２  ＤＮＡ抽出法
血液サンプルは、標準的技術を用いて患者から採取した（１５ｍｌの静脈血を採取した）。
ＤＮＡは、市販のＤＮＡ抽出キット(Qiagen, UK)を用いて末梢血細胞から抽出した。ＤＮＡ濃度を測定し、滅菌Qiagen緩衝液を用い、緩衝液で１００ｎｇ／μＬに希釈した。
【００４０】
１．１．３  遺伝子型特定法
ポリメラーゼ鎖反応−制限断片長多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）法を用いて、Ｚｆ９の遺伝子型特定を行った。
この実験について選択された多型は、ＺＦ９遺伝子の３’非翻訳領域であることが見出され、前述の１１４０多型に対応した（ＮＣＢＩアッセイ Ｉｄ(ss＃)：２０３５４  Reference ＳＮＰ(rs＃)：１７７３１）。
【００４１】
９６ウエルのマイクロリットルプレートにてＰＣＲを行った。各ＰＣＲは、１μＬのＤＮＡ（１００ｎｇ／μＬ）、２．５μＬのｘ１ＮＨ４緩衝液（Bioline）、各２．５μLの２ｍM ｄ'ＮＴＰ（Behring）、０．１μLの０．１ユニットＴａｑポリメラーゼ（Bioline）、６μＬのベタイン、０．７５μＬのＭｇＣｌ２、２．５pmolのそれぞれ配列番号３および４のフォワードおよびリバースプライマー各０．１μＬからなり、オートクレーブ処理し、蒸留水にて反応混合物２５μLを調製した。用いたプライマーの配列は、以下の通りである。
フォワードプライマー：
【数５】
2004525629.tif 000007
（配列番号３）；および
バックワードプライマー：
【数６】
2004525629.tif 000008
（配列番号４）
【００４２】
ＰＣＲは、以下の条件下で行った：９５℃にて２分間変性；次いで、９５℃にて４５秒間変性を３５サイクル；次いで、いずれかのアニーリング温度（表１に記載）で１分間および７２℃にて４５秒間伸長；７２℃にて５分間の最終伸長ステップを行う。
ＰＣＲ−ＲＦＬＰは、次のように行った：緩衝液（１μＬ）中、増幅したＤＮＡ（５μＬ）を適当な酵素（０．８μＬ）で切断し、蒸留水を用いて反応混合物１０μＬを調製した。Hybaid Omnigeneサーマルサイクラーにて一夜切断をおこなった。使用した酵素は、AciＩ（認識配列ccgc）であった。酵素は、New England Biolabsから購入した。切断産物は、４％ポリアクリルアミドゲルにて分画し、標準的方法を用いて臭化エチジウムおよび紫外線によって視覚化した。
【００４３】
１．１．４  統計分析
シングル・グローバル・ピアソンのχ二乗検定を用いて、ＤＤ患者とコントロール間の対立遺伝子頻度の分布を比較することによって、ＤＤとの関連を調査した。ＳＴＡＴＡ６統計データ分析プログラムを用いてｐ値および確率比を計算した。
【００４４】
１．２  結果
Genbank Accession No. AB017493の１１４０領域の周囲領域の電気泳動波形データの結果は、図１の通りであり、Ｇ／Ａ多型の存在が確認される。
多型の存在が確認されたので、方法１．１．３にしたがって作成したＤＮＡ断片をポリアクリルアミドゲルに付した。図２は、異なる遺伝子型により、ゲルを読み取ることによって容易に区別することができる独特のサイズのＤＮＡ断片が作成されることを示す。したがって、ＤＤグループおよびコントロールグループの各個体に対してゲルを作成し、遺伝子型と健康状態の間の関連を作成した。
遺伝子型サンプルの統計分析を表１に示す。これらのデータから、ＧＧおよびＡＧ遺伝子型はデュピュイトラン病（ＤＤ）患者において有意に過剰出現しており、高比率のコントロール被験者がＡＡ遺伝子型であることを示す。
【００４５】
したがって、Ｚｆ９遺伝子の３’非翻訳領域における１１４０多型のＧＧおよびＡＧ遺伝子型とＤＤの間の関連が実証された。当然のことながら、このような関連は、他の不適当な線維症または瘢痕形成によって特徴付けられる状態でも存在するであろう。
【００４６】
表１：Ｚｆ９遺伝子型および対立遺伝子頻度
【表１】
2004525629.tif 000009
【００４７】
実施例２
不適当な線維症または瘢痕形成によって特徴付けられる状態とＺＦ９についての１１４０多型遺伝子型の間の相関関係が確立されたので、本発明の第１の態様の方法にしたがって、実施例１の方法論を繰り返して、患者をスクリーニングし、患者の遺伝子型を確証する。
その結果、臨床医は、遺伝子検査の結果を用いて、個人に医療的アドバイスを提供することができる。たとえば、Ｇ対立遺伝子を有することがわかっている無症候性の個人には、不適当な線維症または瘢痕形成によって特徴付けられる状態を発生する危険度が大きいとアドバイスする。適当であれば、このような個人に、生活様式を変更するように、および／または予防的処置を受けるようにアドバイスすることができる。すでに、不適当な線維症または瘢痕形成によって特徴付けられる状態に罹っているＧ対立遺伝子を有する個人には、潜在的に該状態のより重篤な形態を発生する危険度をもつので、彼らの投薬療法および習慣を調整することをアドバイスすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】Gene Accession No. AB017493の１１４０位における多型を説明する電気泳動の波形データである。
【図２】実施例１の遺伝子型ＧＧ、ＡＧおよびＡＡに対応する増幅されたＤＮＡ断片のサイズにおける差異を説明するゲルの写真である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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