(57)【要約】ＣｌｆＡタンパク質へ結合し得、そしてＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ａｕｒｅｕｓ由来のＣｌｆＡタンパク質の結合サブドメインまたは結合フラグメント（そのフィブリノゲン結合ドメインからの活性フラグメントタンパク質（Ｃｌｆ４０タンパク質、Ｃｌｆ３３タンパク質、またはＣｌｆＡ  Ｎ３）を含む）から生成されるモノクローナル抗体が提供され、これは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのようなブドウ球菌属細菌からの感染を処置または予防することにおいて有用であり得る。さらに、医療機器は、それらが汚染される、またはさらに感染を広める可能性を低減または排除するために、本発明のモノクローナル抗体を用いて処理され得る。特に、本発明の抗体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＣｌｆＡのフィブリノゲンまたはフィブリンへ結合する能力を弱めるまたは妨げることによって、宿主細胞への細菌の付着を阻害することができ、それゆえブドウ球菌発明（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｉｎｖｅｎｔｉｏｎｓ）を処置または予防する方法において利用され得るので、有益である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣｌｆＡタンパク質に結合するモノクローナル抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体がＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃｌｆ４０タンパク質、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃｌｆ３３タンパク質、およびＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＣｌｆＡ  Ｎ３タンパク質からなる群より選択されるタンパク質に対して惹起される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体がヒトまたは動物におけるＳ．ａｕｒｅｕｓ感染を処置または予防する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、フィブリノゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）またはフィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）へのブドウ球菌属細菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  ｂａｃｔｅｒｉａ）の結合を阻害する、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、ヒトまたは動物における非経口、経口、鼻腔内、皮下、エアゾール化（ａｅｒｏｓｏｌｉｚｅｄ）または静脈内投与に適している、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、マウス、キメラ、ヒト化およびヒトモノクローナル抗体からなる群より選択される型に属する、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
抗体が、単鎖モノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項８】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＣｌｆＡタンパク質へ結合する抗体と同一の結合特異性を有する抗体フラグメントを含む請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号２および配列番号４からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して惹起される請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
タンパク質が配列番号１または配列番号３に記載の核酸配列、またはその縮重体によってコードされるアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号６、配列番号１０、配列番号１４および配列番号１８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する可変軽鎖を有する請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７およびその縮重体からなる群より選択される配列に従う核酸配列によってコードされる可変軽鎖配列を有する請求項１に記載の抗体。
【請求項１３】
配列番号８、配列番号１２、配列番号１６および配列番号２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する可変重鎖を有する請求項１に記載の抗体。
【請求項１４】
配列番号７、配列番号１１、配列番号１５、配列番号１９からなる群より選択される配列を有する核酸、およびその縮重体によってコードされる可変重鎖を有する請求項１に記載の抗体。
【請求項１５】
請求項１に記載の抗体を含む単離抗血清。
【請求項１６】
請求項１に記載の抗体およびその抗体による結合を検出するための手段を含む診断キット。
【請求項１７】
前記結合を検出するための手段が前記抗体へ連結される検出可能な標識を含む、請求項１６に記載の診断キット。
【請求項１８】
請求項１に記載の抗体をＳ．ａｕｒｅｕｓに感染していると疑われるサンプルへ添加すること、および抗体が該サンプルへ結合したか否かを決定することを包含する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの感染を診断する方法。
【請求項１９】
有効量の請求項１の抗体および薬学的に許容されるビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）、担体、または賦形剤を含む、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの感染を処置又は予防するための、薬学的組成物。
【請求項２０】
有効量の請求項１に記載の抗体をヒトまたは動物患者へ投与することを包含する、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの感染を処置または予防する方法。
【請求項２１】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃｌｆ４０タンパク質、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃｌｆ３３タンパク質、およびＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎ３タンパク質からなる群より選択されるＳ．  ａｕｒｅｕｓ由来の単離ＣｌｆＡタンパク質の免疫原性量をヒトまたは動物へ投与することを包含する、免疫応答を誘導する方法。
【請求項２２】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃｌｆ４０、Ｃｌｆ３３およびＣｌｆＡ  Ｎ３からなる群より選択される単離タンパク質を、抗−ＣｌｆＡ抗体を含むと疑われるサンプルへ添加すること、および抗体が該サンプルへ添加される単離タンパク質へ結合したか否かを決定することを包含する、ＣｌｆＡタンパク質に対するモノクローナル抗体を同定する方法。
【請求項２３】
配列番号２のアミノ酸配列へ結合する能力を有する請求項１に記載の単離抗体。
【請求項２４】
配列番号１の核酸配列またはその縮重体によってコードされるアミノ酸配列へ結合する能力を有する請求項１に記載の単離抗体。
【請求項２５】
Ｃｌｆ４０タンパク質、Ｃｌｆ３３タンパク質およびＣｌｆＡ  Ｎ３領域からなる群より選択されるＳ．ａｕｒｅｕｓ由来ＣｌｆＡタンパク質のＡドメインからの単離活性フラグメント。
【請求項２６】
生理学的に許容される抗生物質をさらに含む請求項１に記載の単離抗体。
【請求項２７】
可変重鎖が配列ＲＹＳＶＨを含むＣＤＲ１領域を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２８】
可変重鎖が配列ＭＩＷＧＧＧＮＴＤＹＮＳＡＬＫＳを含むＣＤＲ２領域を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２９】
可変重鎖が配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡを含むＣＤＲ１領域を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３０】
可変軽鎖が配列ＷＡＳＴＲＥＳを含むＣＤＲ２領域を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３１】
可変軽鎖が配列ＨＱＹＬＳＳＹＴを含むＣＤＲ３領域を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３２】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの複数の株に対して交差反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｅ）である、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項３３】
可変軽鎖が配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載のヒト化抗体。
【請求項３４】
可変軽鎖が配列番号１７に記載の配列を有する核酸またはその縮重体によってコードされる、請求項６に記載のヒト化抗体。
【請求項３５】
可変重鎖が配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する、請求項６に記載のヒト化抗体。
【請求項３６】
可変重鎖が配列番号１９に記載の配列を有する核酸またはその縮重体によってコードされる、請求項６に記載のヒト化抗体。
【請求項３７】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＣｌｆＡタンパク質のＡドメインを認識する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本出願は、Ｕ．Ｓ．仮出願Ｓｅｒ．Ｎｏ．６０／３０８，１１６（２００１年７月３０日  提出）、Ｓｅｒ．Ｎｏ．６０／２９８，４１３（２００１年６月１８日  提出）、Ｓｅｒ．Ｎｏ．６０／２７４，６１１（２００１年３月１２日  提出）、およびＳｅｒ．Ｎｏ．６０／２６４，０７２（２００１年１月２６日  提出）の利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、凝集因子Ａ（ｃｌｕｍｐｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  Ａ）（またはＣｌｆＡ）に対して生成された抗体、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓまたはその他のブドウ球菌属細菌において発現される表面局在タンパク質に、そして特に、ＣｌｆＡタンパク質に対するモノクローナル抗体およびその活性フラグメントまたはそのフィブリノゲン（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ）結合ドメインからのタンパク質（Ｃｌｆ４０、Ｃｌｆ３３またはＣｌｆＡ  Ｎ３のような）、さらにフィブリノゲンまたはフィブリン（ｆｉｂｒｉｎ）へのＣｌｆＡタンパク質の結合を阻害することおよびＳ．ａｕｒｅｕｓ感染を処置または予防することにおけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
宿主の首尾よいコロニー形成は、動物およびヒトにおいて、ほとんどの微生物が感染を引き起こすのに必要とされるプロセスである。微生物の付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）は、最終的に疾患を引き起こし得る一連の出来事において、最初の重要なステップである。病原性微生物は、細菌の表面上に存在する特定の付着素（ａｄｈｅｓｉｎｓ）を介して、カテーテル、人工関節、および脈管移植片のような宿主組織または血清のならされ埋入された生体材料に結合することによって、その宿主にコロニー形成する（ｃｏｌｏｎｉｚｅｄ）。ＭＳＣＲＡＭＭTMｓ  （Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  Ａｄｈｅｓｉｖｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）は、宿主の細胞外マトリックスにおける異なる成分を認識し且つ特異的に結合する細胞表面付着素のファミリーである。一旦細菌が付着に成功し、そして宿主組織にコロニー形成すると、それらの生理機能が劇的に変化し、そして損傷を与える成分（トキシンおよび蛋白加水分解酵素のような）が分泌される。さらに、付着性細菌はしばしば、バイオフィルムを生成し、そして迅速に主要な抗生物質の殺傷効果に対してより耐性になる。
【０００４】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、皮膚損傷（創傷感染、インペチゴ、およびフランケルのような）から生命を脅かす状態（肺炎、敗血性関節炎（ｓｅｐｔｉｃ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、敗血症、心内膜炎、および生体材料に関連する感染を含む）までにわたる感染スペクトルをもたらす。Ｓ．ａｕｒｅｕｓは、特定の宿主組織成分への微生物付着を促進するように、個別にか、または協調的に働き得る、異なるＭＳＣＲＡＭＭのレパートリーを発現することが知られている。ＭＳＣＲＡＭＭは、抗体（特に、モノクローナル抗体）による免疫学的攻撃のための優れた標的を提供する。適切な抗−ＭＳＣＲＡＭＭ高親和性抗体の存在は、両刃の攻撃（ｄｏｕｂｌｅ−ｅｄｇｅｄ  ａｔｔａｃｋ）を有すし、先ず、抗体が微生物付着を予防し、そして次に、増大したレベルのＭＳＣＲＡＭＭ抗体が、オプソニン食作用殺傷（ｏｐｓｏｎｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ｋｉｌｌｉｎｇ）を介して、体からの微生物の迅速な除去を促進する。
【０００５】
しかしながら、有効なモノクローナル抗体を生成するためのＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＭＳＣＲＡＭＭTM（ＣｌｆＡタンパク質のような）に関する情報を特定および利用するという問題が、異なるＭＳＣＲＡＭＭTMの結合特性おける多様性ならびに細菌感染の伝染力および蔓延（ｓｐｒｅａｄ）におけるそれらの役割ゆえに、依然として残されている。特に、ＣｌｆＡへ結合することができ、且つフィブリノゲンまたはフィブリンへのブドウ球菌ＣｌｆＡの結合を阻害するまたは弱める（ｉｍｐａｉｒ）のに役立つことができるゆえにブドウ球菌感染を予防または処置する方法において有用である、モノクローナル抗体を開発することが問題であった。従って、とりわけ細菌のフィブリノゲンまたはフィブリンへ結合する能力を阻害することまたは弱めることによって多種多様なブドウ球菌感染を首尾良く処置および予防するモノクローナル抗体および他の組成物を開発するという感染疾患の分野において非常に所望される課題が残っている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
発明の要旨
従って、本発明の目的は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＣｌｆＡタンパク質へ結合し、それゆえブドウ球菌感染を処置または予防するための方法において有用であり得る、モノクローナル抗体を提供することである。
【０００７】
本発明の目的はまた、ＣｌｆＡを結合することができ、またＳ．ａｕｒｅｕｓＣｌｆＡタンパク質の結合サブドメイン（Ｃｌｆ４０、Ｃｌｆ３３およびＣｌｆＡ  Ｎ３タンパク質を含む）またはそれらの活性部分から生成され、ブドウ球菌感染に対して処置または予防する方法において利用される、モノクローナル抗体を提供することである。
【０００８】
本発明の目的はまた、フィブリノゲンまたはフィブリンへのＣｌｆＡタンパク質の結合を阻害することまたは弱めることによってブドウ球菌属細菌の付着を予防するのに有用であり得る、Ｃｌｆ４０、Ｃｌｆ３３およびＣｌｆＡ  Ｎ３タンパク質に対するモノクローナル抗体を提供することである。
【０００９】
本発明のさらなる目的は、ＣｌｆＡタンパク質のフィブリノゲン結合Ａドメインを認識することができ、それゆえブドウ球菌感染を処置、予防、同定、または診断する方法において有用であり得る、抗体および抗血清を提供する事である。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、本発明のモノクローナル抗体の可変軽鎖配列および可変重鎖配列をコードするアミノ酸配列および核酸配列を提供することである。
【００１１】
本発明の目的はまた、さらに、Ｓ．ａｕｒｅｕｓからの感染に対して保護し、そして他の型のブドウ球菌感染に対して交差反応性を成し遂げることができる、ＣｌｆＡに対するモノクローナル抗体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
これらおよび他の目的は、ブドウ球菌感染の予防および処置のための、ＣｌｆＡタンパク質および／またはその結合サブドメイン（タンパク質Ｃｌｆ４０、Ｃｌｆ３３およびＣｌｆＡ  Ｎ３を含む）に対するモノクローナル抗体の単離および使用を包含する本発明によって、提供される。よって、本出願は、ＣｌｆＡ（実質的に全てのＳ．ａｕｒｅｕｓ株によって発現される表面局在タンパク質）に対するモノクローナル抗体の発見、生成、キャラクタライゼーション、およびｉｎ  ｖｉｖｏ評価を記載する。本明細書中で示されるデータは、ＣｌｆＡおよびその活性サブドメイン（Ｃｌｆ４０、Ｃｌｆ３３およびＮ３のような）に対するモノクローナル抗体がＳ．ａｕｒｅｕｓ感染に対する処置または保護（ｐｒｏｔｅｃｔ）のために使用され得ることを明確に実証する。
【００１３】
よって、本発明に記載の抗−ＣｌｆＡモノクローナル抗体の発見および単離は、フィブリノゲンまたはフィブリンへのＣｌｆＡタンパク質の結合を弱めるか、または阻害し、それによってブドウ球菌感染を処置または予防するのに有用であるように使用され得る。本発明に従って、単離ＣｌｆＡタンパク質サブドメインおよびそれらに対して惹起される抗体に基づく好適な組成物およびワクチン、ならびにそれらの使用のための方法が、さらに企図される。
【００１４】
これらの実施形態ならびに本開示発明の精神および範囲内での他の変更および改変は、本明細書および／または本明細書中に引用される参考文献（参照によって援用されるものの全て）の範囲から、当業者に容易に明らかになるであろう。
【００１５】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明に従って、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＣｌｆＡタンパク質へ結合し得るモノクローナル抗体が提供され、これらのモノクローナル抗体は、本発明によって単離され且つ精製された活性な結合サブドメインタンパク質（Ｃｌｆ４０、Ｃｌｆ３３、およびＣｌｆＡ  Ｎ３領域を含む）に対して惹起された。本発明に従うモノクローナル抗体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染を処置または予防することが示された。
【００１６】
以前に、ＭｃＤｅｖｉｔｔら（ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ，  １９９４，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １１，２３７−２４８）は、９２ｋＤａ表面タンパク質（Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ株Ｎｅｗｍａｎ由来）を同定し、細菌のフィブリノゲン−依存凝集の原因であることを実証し、これは、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，１７７，０８４（本明細書中で参考として援用される）において開示される。遺伝子（ＣｌｆＡと称される）は、クローン化および配列決定され、そしてＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，００８，３４１（これもまた、参考として援用される）において開示され、そしてこの領域（ＤＮＡ配列から予測されるような８９６アミノ酸タンパク質を表す）は、フィブリノゲンコーティングされた表面（ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ−ｃｏａｔｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅｓ）への細菌の付着を媒介し、それゆえＣｌｆＡは、ＭＳＣＲＡＭＭTMと同定される。ＣｌｆＡ遺伝子は、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）、細胞壁へのアンカードメイン（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）および細胞アンカードメインをＮＨ2−末端領域Ａ（特有の５２０残基セグメントからなる）と結合させる領域（Ｒと称される）からなる。このＭＳＣＲＡＭＭのフィブリノゲン−結合ドメインは、領域Ａ内の２１８残基セグメントに局在された。ＭｃＤｅｖｉｔｔら  （ＭｃＤｅｖｉｔｔら、１９９５，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １６，  ８９５−９０７）は、ＣｌｆＡの領域Ａが凝集表現型（ｔｈｅ  ｃｌｕｍｐｉｎｇ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）に十分であることを示した。
【００１７】
しかしながら、誰もＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＣｌｆＡタンパク質に対するモノクローナル抗体を生成できなかった。従って、本発明は、ＣｌｆＡタンパク質またはその結合サブドメイン（Ｃｌｆ４０、Ｃｌｆ３３およびＣｌｆＡ  Ｎ３タンパク質を含む）へ結合することができ、それゆえブドウ球菌感染を予防または処置するのに有効な量において使用される場合にこのような感染を予防または処置する方法において有用であり得る、単離および／または精製モノクローナル抗体に関する。これらのモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  および  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７  （１９７５）の方法、または当該分野において知られる他の適切な方法を用いて生産され得、さらに、当該分野において周知であろう方法においてキメラ、ヒト化、またはヒトモノクローナル抗体として調製され得る。なお、さらに、モノクローナル抗体は、単鎖（軽鎖または重鎖のような）から調製され得、さらに全抗体の結合特性（例えば、特異性および／または親和性）を維持する抗体の活性フラグメントから調製され得る。活性フラグメントによって、ＣｌｆＡタンパク質に結合する完全な抗体と同じ結合特異性を有する抗体フラグメントが意味され、また本明細書中において使用される場合の用語「抗体」は、該フラグメントを含むことを意味する。さらに、本発明に従うモノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて調製される抗血清もまた企図され、当業者によって認識される多くの適切な方法において調製され得る。
【００１８】
上記に示されるように、ＣｌｆＡに対する抗体は、当該分野において周知である多数の適切な方法（モノクローナル抗体を作製するために利用され得る十分に確立された上記のＫｏｈｌｅｒ  および  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ法のような）において調製され得る。１つのこのような方法において、マウスは、腹腔内に、週一回、長期間、精製された組換えＣｌｆＡタンパク質、または単離サブドメインタンパク質（Ｃｌｆ４０、Ｃｌｆ３３およびＣｌｆＡ  Ｎ３のような）、またはそれらの活性部分を注射され、次いで、精製ＣｌｆＡに対する反応性を測定するために、免疫されたマウスから採取された血液の検査が行われる。ＣｌｆＡに対して反応性のマウスの同定が行われた後に、マウス脾臓から単離されたリンパ球がマウスミエローマ細胞へ融合され、ＣｌｆＡに対する抗体に対して陽性なハイブリドーマが作製され、次いでそれらは単離および培養され、その後精製およびアイソタイピング（ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ）される。
よって、本発明に従うモノクローナル抗体を作製するために、これらは、当該分野において周知の慣用方法を用いて、組換的に調製されるＣｌｆＡ、Ｃｌｆ４０、Ｃｌｆ３３またはＮ３タンパク質を用いて作製されることが好ましい。例えば、１つのこのような方法は、組換えタンパク質およびペプチドをクローニングおよび発現するための発現ベクターとしてＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＱＥ−３０の使用を採用する。
【００１９】
ＰＣＲを用いて、ＣｌｆＡのＡドメイン（Ｃｌｆ４０ではＡＡ  ４０−５５９を意味し、またはＣｌｆ３３ではＡＡ  ２２１−５５０を意味する）をＳ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ  ゲノムＤＮＡから増幅し、そして６個のヒスチジン残基を含む組換え融合タンパク質の発現を可能にするＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターＰＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ）へのサブクローニングした。その後、このベクターをＥ．ｃｏｌｉ株ＡＴＣＣ  ５５１５１中に形質転換し、１５−リットル発酵槽中で光学密度（ＯＤ600）０．７まで増殖させ、そして０．２ｍＭのイソプロピル−１−ベータ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）と共に４時間誘導した。ＡＧテクノロジーズ中空糸アッセンブリー（ＡＧ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｈｏｌｌｏｗ−ｆｉｂｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）（孔サイズ０．４５μｍ）を使用して細胞を回収し、そしてこの細胞ペーストを−８０℃で凍結した。Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ＠１１００ｐｓｉによる２回の通過を使用して、細胞を１×ＰＢＳ（１０ｍＬの緩衝液／１ｇの細胞ペースト）中で溶解した。溶解させた細胞を１７，０００ｒｐｍで３０分間スピンダウンし、細胞片を除いた。０．１Ｍ  ＮｉＣｌ2でチャージした５−ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上に、上清を通した。負荷後、５カラム容量の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ）を用いて、このカラムを洗浄した。３０カラム容量以上の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  イミダゾール（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ）の０−１００％グラディエントを使用して、タンパク質を溶出した。Ｃｌｆ４０またはＣｌｆ３３は〜１３％Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（〜２６ｍＭイミダゾール）にて溶出した。２８０ｎｍにおける吸光度をモニターした。Ｃｌｆ４０またはＣｌｆ３３を含む画分を１×ＰＢＳ中で透析した。
【００２０】
その後、このタンパク質をエンドトキシン除去プロトコールにかけた。このプロトコールの間使用された緩衝液は、５−ｍＬ  Ｍｏｎｏ−Ｑ  セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上を通過させることによって、エンドトキシンフリーにされた。タンパク質を４×１５ｍＬ管の間で均等に分けた。ＢｕｆｆｅｒＡを用いて、それぞれの管の容量を９ｍＬにした。１ｍＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４をそれぞれの管に加え、４℃で１時間、回転させながらインキュベーションした。相を分離するため、管を３７℃の水浴中に置いた。管を２，０００ｒｐｍで１０分間スピンダウンし、そしてそれぞれの管の上部水相を回収し、さらに界面活性剤抽出を繰り返した。二度目の抽出物からの水相を混合し、そして残留する界面活性剤を除くために、０．１Ｍ  ＮｉＣｌ2でチャージした５−ｍＬ  ＩＤＡ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ（Ｓｉｇｍａ）カラム上を通過させた。３カラム容量のＢｕｆｆｅｒ  Ｂでこのタンパク質を溶出する前に、このカラムを９カラム容量のＢｕｆｆｅｒ  Ａで洗浄した。この溶出物は、５−ｍＬ  Ｄｅｔｏｘｉｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）カラム上を通され、そしてその通過液（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を回収し、そしてカラムに再アプライ（ｒｅａｐｐｌｙ）した。二度目の通過からの通過液を回収し、１×ＰＢＳ中で透析した。マウスに投与する前に、この精製産物を濃度、純度、およびエンドトキシンレベルについて分析した。
【００２１】
この方法において得られるＣｌｆ４０についてのアミノ酸配列は、本明細書中で配列番号２として示され、そして配列番号１に記載されるような配列を有する核酸、またはその縮重体によってコードされる。さらに、この方法において得られるＣｌｆ３３についてのアミノ酸配列は、本明細書中で配列番号４として示され、そして配列番号３に記載されるような配列を有する核酸、またはそれらの縮重体によってコードされる。
【００２２】
本発明に従って、ＣｌｆＡタンパク質またはその活性サブドメイン（Ｃｌｆ４０、Ｃｌｆ３３またはＣｌｆＡ  Ｎ３のような）の単離の後に、これらのタンパク質に対するモノクローナル抗体が多くの適切な方法によって生産され得る。例えば、１つの好ましい方法において、マウスモノクローナル抗体のパネルを生成するために、精製Ｃｌｆ４０またはＣｌｆ３３タンパク質を使用した。簡単には、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの群は、溶液状態か、または以下に記載されるようなアジュバントと混合された５０ｇのＣｌｆ４０またはＣｌｆ３３タンパク質の一連の皮下免疫を受けた
【００２３】
【表１】
2004534000.tif 000002
最終ブーストの三日後、脾臓を除き、細かく切って（ｔｅａｓｅｄ）単一細胞懸濁液にし、そしてそのリンパ球を回収した。その後、そのリンパ球をＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞株（ＡＴＣＣ＃１５８１）へ融合した。細胞融合、続くプレーティングおよび栄養補給（ｆｅｅｄｉｎｇ）は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｃｈａｐｔｅｒ２，Ｕｎｉｔ２．）からのｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌに従って行った。その後、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、この融合から生成された全てのクローンを特異的抗−Ｃｌｆ４０抗体産生についてスクリーニングした（ｓｃｒｅｅｎｅｄ）。陽性のクローンを拡大し（ｅｘｐａｎｄｅｄ）、さらに試験した。当初、１５個の陽性クローンを同定し、さらなるキャラクタライゼーションのために、限界希釈（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）によってクローン化した。単一細胞クローンを、直接結合ＥＬＩＳＡ（ＣＬＦ４０へのフィブリノゲン結合の阻害を測定するための改良されたＥＬＩＳＡ）において活性、フローサイトメトリーによって全細菌細胞結合性、そしてビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）解析によってＣｌｆ４０結合に対する親和性、について試験した。
【００２４】
ウサギＩｇＧ（５０ｍｇ／ｍｌ）でタンパク質Ａ部位をブロッキングした後、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌サンプル（Ｂａｒｎｅｔｔ株、６７−０、ＡＴＣＣ＃２５９２３およびＡＴＣＣ＃４９２３０）を回収し、洗浄し、そして２ｍｇ／ｍｌの濃度のＭａｂ  １３−２、１２−９、１３−１またはＰＢＳ単独（コントロール）と共にインキュベートした。抗体を用いるインキュベーションの後、細菌細胞を、検出抗体として働くヤギ−Ｆ(ab')2−抗−マウス−Ｆ(ab')2−ＦＩＴＣと共にインキュベーションした。抗体標識化の後、細菌細胞は、蛍光発光（励起：４８８、発光：５７０）を分析するために、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒフローサイトメーターを通してアスピレーションされた（ａｓｐｉｒａｔｅｄ）。各細菌株について、１０，０００の事象（ｅｖｅｎｔ）が収集され、そして測定された。
【００２５】
高結合９６ウェルプレート（ｈｉｇｈ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓ）  を１ｍｇ／ｍｌ  Ｃｌｆ４０  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）溶液でコーティングし、覆い、そして室温で２時間インキュベーションした。次いで、プレートをＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、１時間、室温にて、１％ＢＳＡ溶液を用いてブロッキングした（ｂｌｏｃｋｅｄ）。洗浄の後、モノクローナル抗体上清を添加し、そしてプレートを１時間、室温にて、インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、そして０．１ｍｇ／ｍｌヒトフィブリノゲン溶液を各ウェルへ添加した。プレートを一時間、室温にて、インキュベートし、さらに洗浄した。ヒツジ抗−フィブリノゲン  ＡＰ複合体を１：７５０希釈率で、ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％  ＢＳＡ中に添加し、そして１時間、室温にてインキュベートさせた。次いで、プレートを洗浄し、ｐＮＰＰ（現像溶液（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ））を１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。プレートを１５−３０分間３７℃でインキュベートし、そして結果を、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ  ７０００  Ｂｉｏ−Ａｓｓａｙ  ｒｅａｄｅｒを用いて、４０５ｎｍで読み取り、そして分析した。
【００２６】
動力学的分析は、ソフトウェア中に入っているリガンドキャプチャー法（Ｌｉｇａｎｄ  ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００にて行った。ウサギ抗−マウス−Ｆｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ）をＣＭ５チップにアミン結合させた（ａｍｉｎｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ）。次いで、分析されるモノクローナル抗体をチップ上へ通し、Ｆｃ部分へ結合させる。次に、種々の濃度のＣｌｆ４０またはＣｌｆ３３タンパク質をチップ表面上へ通し、そしてデータを収集した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ｐｒｏｖｉｄｅｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン３．１）を用いて、ＫonおよびＫoffを測定し、ＫAおよびＫDを計算した。
【００２７】
以下のデータにおいて示されるように、Ｃｌｆ４０またはＣｌｆ４０の活性部分（Ｎ２Ｎ３またはＮ３領域）に対する本発明に従うモノクローナル抗体を作製するための免疫（ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）は、異なる多様な反応性および交差反応性プロフィールを有するモノクローナル抗体を生成した。
【００２８】
ＣｌｆＡタンパク質の組換え型を用いる抗体の産生が好ましいけれども、抗体は、天然の単離および精製されたＣｌｆＡタンパク質または領域からも生成され得、また上記と同様の方法において天然ＣｌｆＡタンパク質または活性領域を用いて、モノクローナルまたはポリクローナル抗体が生成され、このような抗体が得られ得る。なお他の慣用的な方法も、当業者によって認識されるように、組換えまたは天然精製ＣｌｆＡタンパク質またはその活性領域を用いて本発明のＣｌｆＡ抗体を生成するのに使用可能である。
【００２９】
当業者によって認識されるように、本発明の抗体はまた、ブドウ球菌属細菌によって引き起こされる感染を処置または予防するためのヒトまたは動物患者への投与のための好適な薬学的組成物へ形成され得る。本発明の抗体（またはその有効フラグメント）を含む薬学的組成物は、当該分野において一般的に使用され得る好適な薬学的ビヒクル、賦形剤または担体（生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、他の治療化合物、およびそれらの組み合わせなどを含む）と共に処方され得る。当業者が認識するように、使用される特定のビヒクル、賦形剤または担体は、患者および患者の状態に依存して異なり、また当業者によって認識されるように、種々の投与形態が本発明の組成物に適する。本出願に開示される任意の薬学的組成物の投与の好適な方法としては、局所、経口、肛門、膣、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内および皮内投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３０】
局所投与のために、該組成物は、軟膏、クリーム、ゲル、ローション、滴剤（点眼剤および点耳剤のような）、または液剤（マウスウォッシュのような）の形態で処方される。創傷または外科用包帯、縫合糸およびエアロゾルは、この組成物で含浸され得る。この組成物は、慣用的な添加剤（保存剤、浸透を促進させるための溶媒、皮膚緩和薬（ｅｍｏｌｌｉｅｎｔｓ）のような）を含み得る。局所製剤はまた、慣用的な担体（クリームまたは軟膏基剤、エタノール、あるいはオレイルアルコールのような）を含み得る。
【００３１】
抗体組成物のさらなる形態、および他のＭＳＣＲＡＭＭTMについての組成物、方法および適用に関する他の情報もまた、概して、ＣｌｆＡ  ＭＳＣＲＡＭＭTMに対する抗体を含む本発明に適用可能であり、例えば、米国特許６，２８８，２１４（Ｈｏｏｋら）（本明細書中で参考として援用される）に開示される。
【００３２】
ＣｌｆＡタンパク質またはその有効なサブドメイン（Ｃｌｆ４０、Ｃｌｆ３３またはＮ３のような）に対して生成される本発明の抗体組成物はまた、この複合体に対する免疫原性応答を促進させるのに有効な量の好適なアジュバントを用いて投与され得る。例えば、好適なアジュバントとしては、ミョウバン（リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）（これは、ヒトにおいて広く使用される）、および他のアジュバント（サポニンおよびその精製成分  Ｑｕｉｌ  Ａ、フロイント完全アジュバント、ＲＩＢＢＩアジュバントおよび研究および獣医学の適用において使用される他のアジュバントのような）が挙げられ得る。さらに他の化学的に定義される調製物（ムラミルジペプチド、モノホスホリル脂質Ａ、リン脂質複合体（Ｇｏｏｄｍａｎ−Ｓｎｉｔｋｏｆｆら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：４１０−４１５（１９９１）によって記載され且つ本明細書中で参考として援用されるもののような）、プロテオリポソーム内での複合体のカプセル化（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７６：１７３９−１７４４  （１９９２）によって記載され且つ本明細書中で参考として援用されるような）、および脂質小胞（ＮｏｖａｓｏｍｅTM脂質小胞（Ｍｉｃｒｏ  Ｖｅｓｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｎａｓｈｕａ，ＮＨ）のような）におけるタンパク質のカプセル化もまた、有用であり得る。
【００３３】
いずれにしても、本発明の抗体組成物は、このように、ブドウ球菌属細菌上のＣｌｆＡと宿主細胞または組織上のフィブリノゲンとの間の結合相互作用を妨げ、調節し、阻害するために、または宿主細胞または組織と結合するフィブリノゲンへ結合したブドウ球菌属細菌を追放すること（ｄｉｓｐｌａｃｉｎｇ）において、有用であろう。従って、本発明は、ブドウ球菌感染を予防または処置する組成物および方法を開発すること、ならびに宿主組織および／または細胞へのブドウ球菌属細菌の結合を阻害することにおいて、特別な適用性を有するであろう。
【００３４】
本発明に従って、上記のようなＣｌｆＡタンパク質またはその活性サブ領域（Ｃｌｆ４０、Ｃｌｆ３３、Ｎ３のような）に対する抗体の有効量を感染の処置または予防に有効な量において投与することを包含する方法が、ブドウ球菌感染を予防または処置するために提供される。さらに、これらのモノクローナル抗体は、フィブリノゲンまたはフィブリンへのブドウ球菌属細菌の結合を損なわせるのに有用であることが示され、そしてそれゆえＳ．ａｕｒｅｕｓのようなブドウ球菌からの感染を処置または予防するのに有効であることが証明された。一層さらに、本発明に従う抗体は、多種多様なＳ．ａｕｒｅｕｓ株にわたり交差反応性であることが示されたことから、二重に有効であり、それゆえ、本発明のモノクローナルに基づく組成物の有効性および効率を改善するであろう。
【００３５】
従って、本発明に従って、上記の慣用的な方法（例えば、局所的、非経口、筋肉内など）のいずれかにおいて本発明の抗体の投与がなされ、それゆえ、ヒトまたは動物患者におけるブドウ球菌感染を処置または予防する極めて有効な方法が提供されるであろう。有効量とは、細菌の付着を予防するか、宿主細胞へのブドウ球菌の結合を阻害するかのいずれかに十分であり、それゆえブドウ球菌感染の処置または予防において有用である使用レベル（抗体力価のような）を意味する。当業者によって認識されるように、ブドウ球菌感染の処置または予防において有効であるために要求される抗体力価のレベルは、患者の性質および状態、および／または予め存在するブドウ球菌感染の重篤度に非常によく依存するであろう。
【００３６】
上記のようなＳ．ａｕｒｅｕｓ感染を処置または予防するためのＣｌｆＡタンパク質およびそのタンパク質のＡドメイン内の領域に対する抗体の使用に加え、本発明は、患者中か汚染される可能性のある医療機器上において、種々の方法におけるこれらの抗体の使用（ブドウ球菌感染を診断するためのＳ．ａｕｒｅｕｓの存在の検出）を企図する。本発明に従って、ブドウ球菌感染の存在を検出する好ましい方法は、１つ以上のブドウ球菌属細菌種または株によって感染していると疑われるサンプル（個体から採取されるサンプル（例えば、該個体の血液、唾液、組織、骨、筋肉、軟骨または皮膚）のような）を得る工程を包含する。次いで、細胞が破砕され得、そしてＤＮＡが抽出され、沈殿され、そして増幅され得る。サンプルの単離に続いて、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの存在を検出するために本発明の抗体を使用する診断アッセイが行われ得、サンプル中のこのような存在を検出するためのこのようなアッセイ技術は、当業者に周知であり、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイのような方法を含む。概して、本発明に従って、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ感染に感染した疑いのあるサンプルが本発明に従うＣｌｆＡタンパク質抗体へ添加され、さらにＳ．ａｕｒｅｕｓがサンプル中のＣｌｆＡタンパク質へ結合する抗体によって示されるＳ．ａｕｒｅｕｓ感染の診断方法が企図される。
【００３７】
従って、本発明に従う抗体は、ブドウ球菌のｍａｐタンパク質の特異的検出のためにか、ブドウ球菌からの感染を予防するためにか、進行中の感染の処置か、あるいは研究道具としての使用のために用いられ得る。用語「抗体」は、本明細書中で使用される場合、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、単鎖、二重特異的（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）、サル化（ｓｉｍｉａｎｉｚｅｄ）、およびヒト化または霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体、ならびにＦａｂイムノグロブリン発現ライブラリーの産物を含むＦａｂフラグメント（ＣｌｆＡタンパク質に対する抗体の結合特異性を維持するそれらのフラグメントのような）が挙げられる。従って、本発明は、以下に示されるような抗体の可変重鎖および軽鎖のような単鎖の使用を企図する。これらのいかなる型の抗体または抗体フラグメントの生成も、当業者に周知である。本発明の場合において、ＣｌｆＡタンパク質に対するモノクローナル抗体は、生成および単離され、そしてブドウ球菌属感染から保護することが示された。
【００３８】
上記抗体のいずれも、ブドウ球菌の同定および定量のための検出可能な標識で直接的に標識され得る。イムノアッセイにおける使用のための標識は、一般的に当業者に知られており、酵素、放射性同位体、ならびに蛍光、発光および発色物質（コロイドゴールド（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  ｇｏｌｄ）またはラテックスビーズのような着色粒子を含む）が挙げられる。好適なイムノアッセイとしては、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
【００３９】
あるいは、抗体は、イムノグロブリンに対する親和性を有する標識物質との反応によって間接的に標識され得る。抗体は第二物質と結合され、そしてその抗体に結合された第二物質に対する親和性を有する標識された第三物質を用いて検出され得る。例えば、抗体がビオチンへ結合され、そしてこの抗体−ビオチン複合体が標識されたアビジンまたはストレプトアビジンを用いて検出され得る。同様に、抗体がハプテンへ結合され、そして抗体−ハプテン複合体が標識された抗−ハプテン抗体を用いて検出され得る。抗体およびアッセイ複合体を標識するこれらおよび他の方法は、当業者に周知である。
【００４０】
上記のようなＣｌｆＡに対する抗体はまた、さらなる量のタンパク質を単離する（例えば、アフィニティークロマトグラフィーによる）ために、製造施設または実験室において使用され得る。例えば、本発明の抗体はまた、さらなる量のＣｌｆＡタンパク質またはその活性フラグメントを単離するために利用され得る。
【００４１】
本発明の単離抗体またはその活性フラグメントはまた、ブドウ球菌感染に対する受動免疫のためのワクチンの開発において利用され得る。さらに、薬学的組成物として創傷へ投与されるか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの医療デバイスまたはポリマー生体材料（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）をコーティングするために使用される場合、本発明の抗体は、予めブドウ球菌感染が存在する場合において、フィブリノゲンまたはフィブリンに対するＳ．ａｕｒｅｕｓ結合をさらに制限および阻害し、それによって感染の拡大（ｅｘｔｅｎｔ）および蔓延（ｓｐｒｅａｄ）を制限するこの抗体の能力のために、有用であり得る。さらに抗体は、必要に応じて、ある場合において、それが投与される患者においてより低い免疫原性であるように改変される。例えば、患者がヒトである場合、抗体は、ヒトモノクローナル抗体中へハイブリドーマ由来の抗体の相補性決定領域を移植することによって「ヒト化」されるか（例えば、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５  （１９８６）またはＴｅｍｐｅｓｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７３  （１９９１）に記載されるように）、または相同的なヒトフレームワーク対応物を真似るようにイムノグロブリン可変領域中の表面に露出されるマウスフレームワーク残基を変更することによって「うわべを飾られ（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）」得る（例えば、Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍ．２８：４８９−４９８  （１９９１）によって記載されるように）（これらの参考文献は、本明細書中において参考として援用される）。またさらに、そのように所望される場合、本発明のモノクローナル抗体は、本発明の組成物の細菌感染と戦う能力をさらに高めるのに適する抗生物質と共に投与され得る。
【００４２】
本明細書中に記載される抗体、タンパク質または活性フラグメントでコーティングされるであろう医療デバイスまたは重合性生体材料としては、ステープル（ｓｔａｐｌｅ）、縫合糸、代替心臓弁（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｈｅａｒｔ  ｖａｌｖｅｓ）、心臓補助装置（ｃａｒｄｉａｃ  ａｓｓｉｓｔ  ｄｅｖｉｃｅ）、ハードおよびソフトコンタクトレンズ、眼内レンズインプラント（ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  ｌｅｎｓ  ｉｍｐｌａｎｔ）（前眼房または後眼房）、角膜インレー（ｃｏｒｎｅａｌ  ｉｎｌａｙｓ）、ケラト−プロテーゼ（ｋｅｒａｔｏ−ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ）、血管ステント（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔｅｎｔｓ）、エピケラトファリア（ｅｐｉｋｅｒａｔｏｐｈａｌｉａ）デバイス、緑内障シャント（ｇｌｕｃｏｍａ  ｓｈｕｎｔｓ）、網膜ステープル（ｒｅｔｉｎａｌ  ｓｔａｐｌｅｓ）、強膜バックル（ｓｃｌｅｒａｌ  ｂｕｃｋｌｅｓ）、歯科プロテーゼ、甲状軟骨形成術用デバイス、喉頭形成術用（ｔｈｙｒｏｐｌａｓｔｉｃ）デバイス、血管移植片、軟部および硬部組織プロテアーゼ（ポンプを含むがこれに限定されない）、電気デバイス（刺激器および記録器を含む）、聴覚プロテーゼ、ペースメーカー、人工喉頭、歯科インプラント、乳房インプラント、陰茎インプラント、頭蓋／顔面の腱（ｃｒａｎｉｏ／ｆａｃｉａｌ  ｔｅｎｄｏｎｓ）、人工関節、腱、靱帯、半月および盤（ｄｉｓｃｓ）、人工骨、人工臓器（人工膵臓、人工心臓、人工四肢、および心臓弁；ステント、ワイヤー、ガイドワイヤー、静脈内および中心静脈カテーテル、レーザーおよびバルーン血管形成術用デバイス、血管および心臓デバイス（チューブ、カテーテル、バルーン）、心室補助材、血液透析コンポーネント、血液酸素供給器、尿道／尿管／泌尿器デバイス（フォーリーカテーテル、ステント、チューブおよびバルーン）、気道カテーテル（気管内および気管開口チューブおよびカフ）、経腸栄養チューブ（経鼻胃、胃内および空腸チューブを含む）、創傷ドレーナッジチューブ（体腔（胸膜、腹膜、頭蓋、および心膜の腔のような）を除液する（ｄｒａｉｎ）ために使用されるチューブ）、血液バッグ、試験管、血液採取管、ヴァキュテーナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒｓ）、シリンジ、ニードル、ピペット、ピペットチップ、および血液チュービングが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「コーティングされた」または「コーティング」が、抗体または活性フラグメント、またはそれに由来する薬学的組成物をデバイスの表面（好ましくは連鎖球菌属（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃａｌ）細菌感染に曝される外表面）へ塗布することを意味することは、当業者によって理解されるであろう。デバイスの表面は、このタンパク質、抗体または活性フラグメントによって完全に覆われる必要はない。
【００４４】
好ましい実施形態において、抗体はまた、ブドウ球菌感染を処置または予防するのに適切な抗体を提供する際に有用であろう受動ワクチンとして使用され得る。当業者によって認識されるように、数多くの適切な方法（例えば、非経口（すなわち筋肉内、皮内または皮下）投与または鼻咽頭（すなわち鼻腔内）投与による）における投与のためにパッケージ化され得る。１つのこのような形態では、ワクチンが筋肉内的に（例えば、三角筋へ）注射されるが、しかしながら投与の特定の形態は、処理される細菌感染の性質および患者の状態に依存する。ワクチンは、好ましくは、投与を促進するための薬学的に許容される担体と組み合わせられ、そしてこの担体は通常、保存剤を含むまたは含まない水または緩衝生理食塩水である。このワクチンは、投与時の再懸濁に適するよう凍結乾燥され得、または溶液であり得る。
【００４５】
本発明に従う抗体組成物の投与のための好ましい用量は、ブドウ球菌感染を予防するまたは処置するのに有効であろう量であり、そしてこの量が感染の性質および患者の状態に依存して非常に大きく変化するであろうことは容易に認識される。上記に示すように、本発明に従って使用される抗体または薬剤の「有効量」は、所望の予防または治療効果をもたらすような、薬剤の非毒性であるが十分な量を意味することを意図される。以下に指摘するであろうように、必要とされる抗体または特定の剤の正確な量は、被験体の種、年齢および全体的な状態、処置される状態の重篤度、使用される特定の担体またはアジュバントおよびその投与形態などに依存して、被験体ごとに異なる。従って、任意の特定の抗体組成物の「有効量」は、特定の環境に基づいて異なり、そして適切な有効量は、適用の各々の場合において、日常的に行われる実験のみを用いて当業者により決定され得る。その用量は、組成物が投与される個体に合わせて調整されるべきであり、また年齢、体重、および個体の代謝に伴って変化する。この組成物はさらに、（チメロサール（エチル（２−メルカプトベンゾエート−Ｓ）水銀ナトリウム塩）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）のような薬学的に許容される保存剤または安定化剤を含み得る。
【００４６】
適切な標識または他のふさわしい検出可能な生体分子または化学物質と共に使用される場合、本明細書中において記載されるモノクローナル抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏのブドウ球菌感染の診断あるいはブドウ球菌属細菌の検出のような目的のために有用である。研究所の研究もまた、このような抗体の使用を通じて促進され得る。以下に示されるもののように、様々な型の標識およびこの標識を本発明の抗体へ複合体化させる方法は、当業者に周知である。
【００４７】
例えば、抗体は、（直接的にか、またはキレート化を経て）32Ｐ、3Ｈ、14Ｃ、35Ｓ、125Ｉ，または131Ｉ（これらに制限されない）のような放射性標識へ複合体化され得る。標識の検出は、シンチレーション計数、ガンマ線分光測定、またはオートラジオグラフィーのような方法によるものであり得る。生物発光標識（ホタルルシフェリンの誘導体ような）もまた、有用である。この生物発光物質は、従来法によってタンパク質へ共有結合され、そしてこの標識タンパク質は、酵素（ルシフェラーゼのような）が、生体発光分子に光の光子を放出させるＡＴＰを用いる反応を触媒する際に、検出される。発蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｓ）はタンパク質を標識するためにも使用され得る。発蛍光団の例としては、フルオレセインおよび誘導体、フィコエリトリン、アロ−フィコシアニン、フィコシアニン、ローダミン、およびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが挙げられる。発蛍光団は一般的に、蛍光検出器によって検出される。
【００４８】
細胞におけるリガンドの位置は、上記のように抗体を標識すること、および当業者に周知の方法（Ｗａｒｒｅｎ  ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ，  ７：  １３２６−１３３７，  １９８７）によって記載されるような方法を用いる免疫蛍光顕微鏡法のような）に従って標識を検出することによって、決定され得る。
【００４９】
上に示されるように、本発明のモノクローナル抗体、あるいはその活性部分またはフラグメントは、哺乳類動物細胞外マトリックスタンパク質（フィブリノゲンのような）への細菌の接着のような感染の原因となるブドウ球菌病原体と哺乳類動物宿主との間の最初の物理的相互作用を妨害するために特に有用であり、そしてこの物理的相互作用の妨害は、患者を処置すること、および内在する医療デバイスへの細菌感染を予防および減少させ、それらの使用についてより安全にすることの両方において有用であり得る。
【００５０】
本発明の別の実施形態において、後にブドウ球菌細菌を含むと疑われる水性サンプルの添加によって活性になるような、単一容器内に凍結乾燥され、適切な形態で本発明の抗体を含む、ブドウ球菌属細菌および感染を単離および同定することにおいて有用であり得るキットが提供される。このようなキットは代表的に、本発明のＣｌｆＡ抗体へ結合する複合体の同定を可能にするであろう適切な免疫検出試薬と共に適切な形態において抗体を収容するための適切な容器を含み得る。例えば、免疫検出試薬は、ビオチンまたは検出可能な色を生成する酵素のような、通常抗体へ結合され得るか、またはその抗体が抗原へ結合する際に検出可能な結果をもたらすような別の好適な方法において利用され得る適切な検出可能なシグナルまたは標識を含み得る。
【００５１】
簡単には、ＣｌｆＡタンパク質またはその活性フラグメントに結合する本発明の抗体は、このように、ヒトおよび動物患者におけるブドウ球菌感染を処置または予防することにおいて、ならびに医療用または他の内在デバイスにおいて格別に有用である。従って、本発明は、ＣｌｆＡへ結合し得且つ細菌のオプソニン食作用性殺傷を伴うブドウ球菌感染の処置の方法において使用され得る抗体を同定するおよび単離する方法に関する。ＣｌｆＡタンパク質を結合し得、そしてブドウ球菌感染を予防または処置し得るＣｌｆＡ抗体のような、本発明の方法を用いて同定および／または単離される抗体はそれゆえ、本発明の一部である。
【００５２】
実施例
本発明の好ましい実施態様の局面を例示する以下の実施例が提供される。当業者らは以下の実施例に開示される当該技術が、本発明の実施において有効に機能するように本発明者らによって発見された技術であり、またそれゆえに、その実施のための好ましい様式を構成すると考えられることを理解すべきである。しかしながら、本開示に鑑み、当業者は開示される特定の態様において多くの改変がなされ得、そしてまた本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様もしくは類似の結果を得ることを理解すべきである。
【００５３】
実施例１．Ｃｌｆ４０およびＣｌｆ３３の単離ならびに配列決定
ＰＣＲを使用し、ＣｌｆＡのＡドメイン（ＡＡ４０−５９９を表すＣｌｆ４０またはＡＡ２２１−５５０を表すＣｌｆ３３）を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｎｅｗｍａｎ  ゲノムＤＮＡから増幅し、そして６つのヒスチジン残基を含む組換え融合タンパク質の発現を可能にするＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターＰＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ）中にサブローニングを行った。その後、このベクターをＥ．ｃｏｌｉ株ＡＴＣＣ  ５５１５１中に形質転換し、１５−リットル発酵槽中で光学密度（ＯＤ600）０．７まで増殖させ、そして０．２ｍＭイソプロピル−１−ベータ−Ｄガラクトシド（ＩＰＴＧ）と共に４時間誘導した。ＡＧテクノロジーズ中空糸アッセンブリー（ＡＧ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｈｏｌｌｏｗ−ｆｉｂｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）（孔サイズ０．４５μｍ）を使用してこの細胞を回収し、そしてこの細胞ペーストを−８０℃にて凍結した。Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ  ＠１１００ｐｓｉ．による２回の通過を用い、細胞を１×ＰＢＳ（１０ｍＬの緩衝溶液／１ｇ細胞ペースト）中で溶解した。細胞片を除去するために、溶解させた細胞を１７．０００ｒｐｍにて３０分間スピンダウンした。０．１Ｍ  ＮｉＣｌ2でチャージした５−ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上に、上清を通した。負荷後、該カラムを５カラム容量の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ  （Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ）で洗浄した。３０カラム容量以上の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  イミダゾール（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ）の０−１００％グラディエントを使用して、タンパク質を溶出した。Ｃｌｆ４０またはＣｌｆ３３は、〜１３％Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（〜２６ｍＭイミダゾール）にて溶出された。２８０ｎｍにおける吸光度をモニターした。Ｃｌｆ４０またはＣｌｆ３３を含む画分を、１×ＰＢＳ中で透析した。
【００５４】
その後、該タンパク質をエンドトキシン除去プロトコールにかけた。このプロトコールの間使用された緩衝溶液を、５−ｍＬ  Ｍｏｎｏ−Ｑセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上を通過させることによって、エンドトキシンフリーにした。タンパク質を、４×１５ｍＬ管間で均等に分けた。Ｂｕｆｆｅｒ  Ａを用いて、それぞれの管の容量を９ｍＬにした。１ｍＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を各管に加え、４℃で１時間回転させながらインキュベーションした。相を分離するため、管を３７℃の水浴中に置いた。管を２，０００ｒｐｍで１０分間スピンダウンし、そしてそれぞれの管から上部水相を回収し、さらに界面活性剤抽出を繰り返した。二度目の抽出からの水相を混合し、そして残留する界面活性剤を除くために、０．１Ｍ  ＮｉＣｌ2でチャージした５−ｍＬ  ＩＤＡ  ｃｈｅｌａｔｉｎｇ（Ｓｉｇｍａ）カラム上を通過させた。３カラム容量のＢｕｆｆｅｒ  Ｂでこのタンパク質を溶出する前に、このカラムを９カラム容量のＢｕｆｆｅｒ  Ａで洗浄した。この溶出物を、５−ｍＬ  Ｄｅｔｏｘｉｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）カラム上に通し、そしてその通過液（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を回収し、そしてカラムに再アプライ（ｒｅａｐｐｌｙ）した。二度目の通過からの通過液を回収し、１×ＰＢＳ中で透析した。マウスに投与する前に、この精製産物を濃度、純度、およびエンドトキシンレベルについて分析した。
【００５５】
該タンパク質および核酸配列は、以下に含まれる。Ｃｌｆ４０アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２として以下に含まれ、そしてこれは核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１によってコードされ、またそれらへの縮重物（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｓ）によって同様にコードされる。Ｃｌｆ３３アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として以下に含まれ、そしてこれは核酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３によってコードされ、またそれらへの縮重物（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｓ）によって同様にコードされる。
【００５６】
実施例２．Ｃｌｆ４０およびＣｌｆ３３を使用したモノクローナル抗体の生産
この精製されたＣｌｆ４０またはＣｌｆ３３タンパク質を使用し、マウスモノクローナル抗体のパネル（ｐａｎｅｌ）を生成した。簡潔には、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの群は、溶液中または以下の表Ｉに示すアジュバンドと混合される５０μｇのＣｌｆ４０またはＣｌｆ３３タンパク質の一連の皮下免疫を受けた：
【００５７】
【表２】
2004534000.tif 000003
最終ブーストの三日後、脾臓を除き、細かく切って（ｔｅａｓｅｄ）単一細胞懸濁液にし、そしてそのリンパ球を回収した。その後、そのリンパ球をＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞株（ＡＴＣＣ＃１５８１）へ融合した。細胞融合、続くプレーティングおよび栄養補給（ｆｅｅｄｉｎｇ）は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｃｈａｐｔｅｒ２，  Ｕｎｉｔ  ２．）からのｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌに従って行った。
【００５８】
その後、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、この融合から生成された全てのクローンを特異的抗−Ｃｌｆ４０抗体産生についてスクリーンした。陽性のクローンを拡大し（ｅｘｐａｎｄｅｄ）、さらに試験した。当初は、１５個の陽性クローンを同定し、そしてさらなる特徴付けのために限界希釈によってクローニングした（ｃｌｏｎｅｄ）。ＣＬＦ４０へのフィブリノゲン結合の阻害、フローサイトメトリーによる全細菌細胞結合およびＢｉａｃｏｒｅ解析によるＣｌｆ４０結合への親和性を測定するために改良されたＥＬＩＳＡである、直接結合ＥＬＩＳＡにおいて、単一細胞クローンを、活性について試験した。試験結果は、以下の表ＩＩ中に挙げられる：
【００５９】
【表３】
2004534000.tif 000004
全細菌への結合
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌の試料（Ｂａｒｎｅｔｔ株、６７−０、ＡＴＣＣ＃２５９２３およびＡＴＣＣ＃４９２３０）を採取、洗浄し、そしてウサギＩＧｇ（５０ｍｇ／ｍｌ）でタンパク質Ａ部位をブロッキングした後、２ｍｇ／ｍｌの濃度にてＭａｂ１３−２，１２−９、１３−１またはＰＢＳ単独（コントロール）と共にインキュベートした。抗体とのインキュベーションに続き、検出抗体として役立つヤギ−Ｆ(ab')2−抗−マウス−Ｆ(ab')2−ＦＩＴＣと共に、細菌の細胞をインキュベートした。抗体標識後、蛍光発光を解析するためにＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ  フローサイトメーターを通して、細菌細胞を吸引した（励起：４８８、発光：５７０）。各細菌株について、１０，０００イベントを採取し、測定した。
【００６０】
阻害（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）（ＥＬＩＳＡ）
高結合９６ウェルプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に１μｇ／ｍｌのＣｌｆ４０溶液でコーティングし、カバー（ｃｏｖｅｒｅｄ）し、そして室温で２時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、そして１％ＢＳＡ溶液で１時間、室温にてブロックした。洗浄に続き、モノクローナル抗体上清を加え、そしてプレートを１時間、室温にてインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、そして０．１ｍｇ／ｍｌヒトフィブリノゲン溶液を各ウェルに加えた。プレートを１時間、室温にてインキュベートし、そして洗浄した。ヒツジ抗フィブリノゲンＡＰ複合体を、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ＢＳＡ中に１：７５０希釈にて加え、そして１時間、室温でインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、ｐＮＰＰ（現像溶液）を１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。プレートを１５−３０分、３７℃にてインキュベートし、４０５ｎｍにて結果を読みとり、そしてＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ７０００  Ｂｉｏ−Ａｓｓａｙ  ｒｅａｄｅｒを使用して解析した。
【００６１】
反応速度論分析（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）
ソフトウェアに含まれる、リガンド捕捉法（Ｌｉｇａｎｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用するＢｉａｃｏｒｅ  ３０００上にて反応速度論解析を行った。ウサギ抗−マウス−Ｆｃ抗体（Ｂｉａｃｏｒｅ）を、ＣＭ５チップにアミン結合（ａｍｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ）した。その後、この解析されたモノクローナル抗体を、前記Ｆｃタンパク質への結合を可能にするために、このチップ上を通した。その後、様々な濃度のＣｌｆ４０またはＣｌｆ３３タンパク質を、このチップ表面上を通し、そしてデータを採取した。Ｂｉａｃｏｒｅ  ｐｒｏｖｉｄｅｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン３．１）を使用してＫonおよびＫoffを測定し、そしてＫAおよびＫDを算出した。
【００６２】
実施例３．  Ｃｌｆ４０およびＣｌｆ３３の追加研究
ＰＣＲを使用し、ＣｌｆＡのＡドメイン（ＡＡ４０−５９９を表すＣｌｆ４０、ＡＡ２２１−５５０を表すＣｌｆ３３−Ｎ２Ｎ３ドメインまたはＡＡ３７０−５５９を表すＣｌｆ−Ｎ３ドメイン）を、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＮｅｗｍａｎゲノムＤＮＡから増幅し、そして６つのヒスチジン残基を含む組換え融合タンパク質の発現を可能にするＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターＰＱＥ−３０（Ｑｉａｇｅｎ）中にサブローニングを行った。その後、このベクターをＥ．ｃｏｌｉ株ＡＴＣＣ  ５５１５１中に形質転換し、１５−リットル発酵槽中で光学密度（ＯＤ600）０．７まで増殖させ、そして０．２ｍＭイソプロピル−１−ベータ−Ｄガラクトシド（ＩＰＴＧ）と共に４時間誘導した。ＡＧテクノロジーズ中空糸アッセンブリー（ＡＧ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｈｏｌｌｏｗ−ｆｉｂｅｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）（孔サイズ０．４５ｍｍ）を使用して細胞を回収し、そしてこの細胞ペーストを−８０℃にて凍結した。Ｆｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓ  ＠１１００ｐｓｉ．による２回の通過を用い、細胞を１×ＰＢＳ（１０ｍＬの緩衝溶液／１ｇ細胞ペースト）中で溶解した。溶解させた細胞を１７．０００ｒｐｍにて３０分間スピンダウンし、細胞片を除去した。０．１Ｍ  ＮｉＣｌ2でチャージした５−ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上に、上清を通した。負荷後、該カラムを５カラム容量の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ  （Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ）で洗浄した。３０カラム容量以上の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２００ｍＭ  イミダゾール（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ）の０−１００％グラディエントを使用して、タンパク質を溶出した。Ｃｌｆタンパク質を、〜１３％Ｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（〜２６ｍＭイミダゾール）にて溶出した。２８０ｎｍにおける吸光度をモニターした。Ｃｌｆ４０およびＣｌｆ３３を含む画分を、１×ＰＢＳ中で透析した。
【００６３】
その後、該タンパク質をエンドトキシン除去プロトコールにかけた。５−ｍＬ  Ｍｏｎｏ−Ｑセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上を通過させることによって、このプロトコールの間使用された緩衝溶液を、エンドトキシンフリーにした。タンパク質を、４×１５ｍＬ管間で均等に分けた。Ｂｕｆｆｅｒ  Ａを用いて、それぞれの管の容量を９ｍＬにした。１ｍＬの１０％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４を各管に加え、４℃で１時間回転させながらインキュベーションした。相を分離するため、管を３７℃の水浴中に置いた。管を２，０００ｒｐｍで１０分間スピンダウンし、そしてそれぞれの管の上部水相を採取し、さらに界面活性剤抽出を繰り返した。二度目の抽出からの水相を混合し、そして残留する界面活性剤を除くために、０．１Ｍ  ＮｉＣｌ2でチャージした５−ｍＬ  ＩＤＡ  Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ（Ｓｉｇｍａ）カラム上を通過させた。３カラム容量のＢｕｆｆｅｒ  Ｂでこのタンパク質を溶出する前に、このカラムを９カラム容量のＢｕｆｆｅｒ  Ａで洗浄した。この溶出物を、５−ｍＬ  Ｄｅｔｏｘｉｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ）カラム上に通し、そしてその通過液（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を回収し、そしてカラムに再アプライ（ｒｅａｐｐｌｙ）した。二度目の通過からの通過液を回収し、１×ＰＢＳ中で透析した。マウスに投与する前に、この精製産物を濃度、純度、およびエンドトキシンレベルについて分析した。
【００６４】
モノクローナル抗体産生
マウスモノクローナル抗体のパネルを生成するために、精製したＣｌｆ４０、Ｃｌｆ３３またはＮ３タンパク質を使用した。簡潔には、Ｂａｌｂ／ＣまたはＳＪＬマウスの群は溶液または以下の表ＩＩＩに示すアジュバントと混合したタンパク質１−１０ｍｇの一連の皮下免疫を受けた：
【００６５】
【表４】
2004534000.tif 000005
犠牲の際（ＲＩＭＭＳ）またはブースト（コンベンショナル（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ））の７日後、血清を採取し、そしてＭＳＣＲＡＭＭｓに対するＥＬＩＳＡアッセイにおいて、または全ての細胞（Ｓ．ａｕｒｅｕｓおよびＳ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）について力価を測定した（ｔｉｔｔｅｒｅｄ）。最終ブーストの三日後、脾臓またはリンパ節を除き、細かく切って（ｔｅａｓｅｄ）単一細胞懸濁液にし、そしてそのリンパ球を回収した。その後、そのリンパ球をＳＰ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞株（ＡＴＣＣ＃１５８１）へ融合した。細胞融合、続くプレーティングおよび栄養補給（ｆｅｅｄｉｎｇ）は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｃｈａｐｔｅｒ２，  Ｕｎｉｔ  ２．）からのｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｐｒｏｔｏｃｏｌに従って行った。
【００６６】
その後、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを用いて、この融合から生成された全てのクローンを特異的抗−Ｃｌｆ４０、ＳｄｒＧまたはＦｎｂｐＡ抗体産生についてスクリーンした。陽性のクローンを拡大し（ｅｘｐａｎｄｅｄ）、さらに試験した。さらに、候補物（Ｃａｎｄｉｄａｔｅ）を直接結合ＥＬＩＳＡにおいて活性を試験し、ＣＬＦ４０に対するフィブリノゲン結合阻害、フローサイトメトリーによる全細菌細胞結合およびＢｉａｃｏｒｅ解析によるフィブリノゲン−Ｃｌｆ４０結合のＣｌｆ４０結合／阻害を測定した。
【００６７】
Ｂｉａｃｏｒｅ解析
この解析を通し、流速を常に１０ｍｌ／ｍｉｎに保った。ＣｌｆＡ４０注入の前に、ＲＡＭ−Ｆｃ結合を通して、試験抗体を前記チップに吸着した。時間０にて、３０ｍｇ／ｍｌの濃度でのＣｌｆ４０を３分間、前記チップ上に注入し、続いて２分間解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）した。解析のこの段階では、Ｍａｂ／ＣｌｆＡ相互作用の相対的な結合および解離速度を測定した。この解析の第２段階において、フィブリノゲンに作用および結合するためのＣｌｆＡに結合するＭａｂの能力（ａｂｉｌｉｔｙ）を測定した。１００ｍｇ／ｍｌ濃度でのフィブリノゲンを前記チップ上に注入し、そして３分後にレポートポイント（ｒｅｐｏｒｔ  ｐｏｉｎｔ）を取った。
【００６８】
全細菌への結合
細菌の試料（Ｎｅｗｍａｎ）を採取、洗浄し、そしてウサギＩＧｇ（５０ｍｇ／ｍｌ）でタンパク質Ａサイトをブロッキングした後、２ｍｇ／ｍｌの濃度にてＭａｂまたはＰＢＳ単独（コントロール）と共にインキュベートした。抗体とのインキュベーションに続き、検出抗体として役立つヤギ−Ｆ(ab')2−抗−マウス−Ｆ(ab')2−ＦＩＴＣと共に、細菌細胞をインキュベートした。抗体標識後、蛍光発光を分析するためにＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ  フローサイトメーターを通して、細菌細胞を吸引した（励起：４８８、発光：５７０）。各細菌株について、１０，０００イベントを採取し、測定した。
【００６９】
阻害（ＥＬＩＳＡ）
高結合９６ウェルプレートを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に１μｇ／ｍｌのＣｌｆ４０溶液でコーティングし、カバー（ｃｏｖｅｒｅｄ）し、そして室温で２時間インキュベートした。その後、プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄し、そして１％ＢＳＡ溶液で１時間、室温にてブロックした。洗浄に続き、モノクローナル抗体上清を加え、そしてプレートを１時間、室温にてインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、そして０．１ｍｇ／ｍｌヒトフィブリノゲン溶液を各ウェルに加えた。プレートを１時間、室温にてインキュベートし、洗浄した。ヒツジ抗フィブリノゲンＡＰ複合体を、ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％  ＢＳＡ中に１：７５０希釈にて加え、そして１時間、室温でインキュベートした。その後、プレートを洗浄し、ｐＮＰＰ（現像溶液）を１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。プレートを１５−３０分、３７℃にてインキュベートし、４０５ｎｍにて結果を読みとり、そしてＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＨＴＳ７０００  Ｂｉｏ−Ａｓｓａｙ  ｒｅａｄｅｒを使用して解析した。
【００７０】
実施例４．  異なる反応パターンを有するＣｌｆ４０生成モノクローナル抗体の全てまたは一部を用いた免疫
以下の表ＩＶは、Ｃｌｆ４０、Ｃｌｆ３３（ＣｌｆＡドメインのＮ２Ｎ３領域を構成する）、およびＣｌｆＡＮ３領域のみを含む、本発明の活性領域との免疫試験の結果を示す。
【００７１】
【表５】
2004534000.tif 000006
この表中に表される結果は、Ｃｌｆ４０またはＣｌｆ４０の一部（Ｎ２Ｎ３またはＮ３）とのモノクローナル抗体生成のための免疫は、幅広く、かつ多様な反応プロフィールを有し、また様々なスタフィロコッカス株にわたって、十分な交叉反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を示すモノクローナル抗体をもたらすということを示す。
【００７２】
実施例５．  フィブリノゲンに対するＣｌｆＡ結合をブロックする高親和性Ｍａｂｓを選択するためのＢｉａｃｏｒｅの使用
Ｂｉａｃｏｒｅ解析
図１に表されるこの実験を通し、流速を常に１０ｍｌ／ｍｉｎに保った。ＣｌｆＡ４０注入の前に、ＲＡＭ−Ｆｃ結合を通して、Ｍａｂ１３−１の９４６ＲＵおよびＭａｂ１３−２の７６８ＲＵを前記チップに吸着した。グラフ上の時間０にて、３０ｍｇ／ｍｌの濃度でのＣｌｆＡ４０を３分間、前記チップ上に注入し、続いて２分間の解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を行った。ＣｌｆＡ注入時間の終わりにおいて、１３−１ＭａｂはＣｌｆＡの５８ＲＵに結合し、また１３−２ＭａｂはＣｌｆＡの１６８ＲＵに結合した。該実験のこの段階は、Ｍａｂ／ＣｌｆＡ相互作用の相対的な結合および解離速度論を測定した。該実験の第２段階において、フィブリノゲンに作用および結合するためにＣｌｆＡに結合するＭａｂの能力を測定した。１００ｍｇ／ｍｌ濃度でのフィブリノゲンを前記チップ上に注入し、そして３分後、ＣｌｆＡに結合するフィブリノゲンの６４ＲＵはＭａｂ１３−１に結合したが、ＣｌｆＡに結合するフィブリノゲンの０ＲＵがＭａｂ１３−２に結合した。
【００７３】
実施例６．  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株ＢａｒｎｅｔｔおよびＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３に対するＭａｂ１３．２の比較
抗体のスケールアップおよび精製
ハイブリドーマ細胞を、ＲＰＭＩ／ＤＭＥＭ、２−３リットル培養容量に対し２ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、４ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび２×ペニシリン−ストレプトマイシンを含む１×Ｎｕｔｒｉｄｏｍａ−ＳＰ培地中で増殖した。その後、ハイブリドーマ上清を遠心分離によって回収した。この上清を０．４５μＭフィルターを介して濾過し、そしてプロテインＧクロマトグラフィーを用いて、このＩｇＧをアフィニティ精製した。０．１Ｍグリシン、ｐＨ２．７を使用してこのモノクローナル抗体を溶出し、直ちに１０分の１容量の２Ｍ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０で中和した。次いでこの精製したＩｇＧを、１×Ｄ−リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４に対して透析した。必要であれば、この精製抗体を濃縮し、アリコートを凍結した。
【００７４】
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ株
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細胞は凍結グリセロールストックから得られ、そして一枚の血液寒天プレート上に植え付けられ、そして２４時間、３７℃で増殖させた。その後、単独コロニーを新たな血液寒天プレート上に移した。５０ｍｌｓの最終凍結ストックを用意するために、８０プレートに植え付けた。その後、このプレートを２４時間、３７℃でインキュベーションした。インキュベーション後、この細菌をスクレイパー（ｓｃｒａｐｅｒ）から取り除くために穏やかにボルテックスしながら、このコロニーを各プレートの表面から１０ｍｌｓの１×ＰＢＳを含む４つの５０ｍｌ管（１管あたり２０プレート）へ掻き取った。次いで、細菌からの全ての寒天片の分離を容易にするため勢いよくボルテックスしながら、さらなる１０ｍｌｓの１×ＰＢＳを１０ｍｌｓの細菌懸濁液に加えた。この懸濁液を１０分間、３５００×ｇ、４℃で遠心分離することによって、ペレット化した。この細菌をＤ−ＰＢＳ中で洗浄し、そして５０ｍｌｓの凍結培地に再び懸濁した。この細菌ストックを、エタノール／ドライアイス浴中で急速凍結することによって１ｍｌのアリコート中に入れ、そして−８０℃の冷凍庫中に置いた。凍結ストックの濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）を、ストックの１ｍｌアリコートを解凍し、１０-5から１０-11の連続希釈液を調製することで測定した。希釈液を二分して、血液寒天プレート上にプレーティングし、そして１６−１８時間、３７℃でインキュベートした。このＣＦＵ／ｍｌを測定し（ＣＦＵ／ｍｌ＝（コロニー平均＃×希釈ファクター）／０．０５０ｍｌｓ）そして平均ＣＦＵ／ｍｌを測定するために各希釈液を平均した。注射の日、各株のアリコートを解凍し、その後それぞれの株について１つの管に混合し、そして攪拌した。
動物、性別、種、数、年齢および供給源
Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ａｎｄ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，  ＮＹ）より雌のＢａｌｂ／Ｃマウス（５−６週齢）を購入した。動物は、処理開始前に少なくとも１４日間の間、順応させた。到着してすぐに、マウスは検診され、吸湿性のある敷きわらを敷いたポリカーボネート靴箱型ケージ中でグループ飼育した（５／ケージ）。全てのマウスは、ｔｈｅ  ＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに示される必要な飼育基準の下、１２時間の明暗周期に置かれた。
同定および無作為化
全ての動物は、投与前に尾の入れ墨を使用することによって、独自に同定された。処理の開始前に、動物は個別に体重測定され、そしてそれらの健康状態が評価された。マウスを無作為化し、そして等級別に分けた体重を用いて処理群に割り当てた。
ＣｌｆＡ特異的モノクローナル抗体（Ｍａｂ）、アイソタイプ
ＣｌｆＡ特異的マウスモノクローナル抗体を、マウスのアイソタイピング用のＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｂｅａｄ  Ａｒｒａｙを使用してアイソタイプ化（ｉｓｏｔｙｐｅｄ）した。製造業者プロトコルに従い、フローサイトメトリーを使用してアイソタイプを決定した。
１３．１  Ｃｌｆ４０  Ｍａｂ，  ＩｇＧ1
１３．２  Ｃｌｆ４０  Ｍａｂ，  ＩｇＧ1
１２．９  Ｃｌｆ３３  Ｍａｂ，  ＩｇＧ1
コントロール
ＡＴＴＣ  １７７１，  ＩｇＧ1
リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１００１０−０２３；  Ｌｏｔ  Ｎｏ．１０７８７４９）から購入した。
実験計画
【００７５】
【表６】
2004534000.tif 000007
ｉｎ  ｖｉｖｏ動物データ
０．５ｍｇのモノクローナル抗体１３−２、アイソタイプコントロールモノクローナル抗体ＣＲＬ−１７７１、またはＰＢＳでマウスを腹腔内（ＩＰ；０．５ｍｌ）注射によって処理した。ＩｇＧ投与の１８時間後、マウスをＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＢｅｒｎｅｔｔまたはＳ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２５９２３の単独静脈（ＩＶ）注射でチャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）した。１２日間の後、この時点にて全ての生存しているマウスを犠牲にした。処理群間での相対的な生存時間において、有意差が検出された。Ｍａｂ１３−２を受けたマウスの８３パーセント（１０／１２）、ＣＲＬ−１７７１を受けた動物の１３％（２／１５）、およびＰＢＳを受けたものの０％（０／１５）が、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｂｅｒｎｅｔｔ（１３−２ｖｓ．ＰＢＳ，ｐ＜０．０００１；  １３−２ｖｓ．ＣＲＬ−１７７１，  ｐ＝０．０００９）との細菌チャレンジを生き延びた（ｓｕｒｖｉｖｅｄ）。動物データの統計分析は、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ（ｌｏｇｒａｎｋ）試験と共にＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓを使用して実施された。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２５９２３が細菌チャレンジであった実験において、Ｍａｂ１３−２を投与されたマウスの６７％（８／１２）が生存し、ＣＲＬ−１７７１処理群においては２７％（４／１２）が生存し、そしてＰＢＳグループでは、７％（１／１５）のみが生存した（１３−２ｖｓ．ＣＲＬ−１７７１，ｐ＝０．０２；１３−２ｖｓ．ＰＢＳ，０．０００２）。これらの結果は、ＭＳＣＲＡＭＭ特異モノクローナル抗体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株での致死的感染に対する有意なレベルの防御を提供することを明確に示している。
【００７６】
実施例  ７．  可変領域配列の単離および配列決定
Ａ．  モノクローナル抗体１３−２
Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ２．０キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；  ｃａｔ＃Ｋ４５００）を使用して、ＣｌｆＡ１３−２ハイブリドーマ細胞からメッセンジャーＲＮＡを単離した。簡潔には、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−１０培地中で培養した１．４×１０8ハイブリドーマ細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離によってペレット化した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＲＮａｓｅ  Ｄｅｇｒａｄｅｒを含む界面活性剤中に溶解させた。オリゴ−ｄＴセルロース上でのアフィニティ精製によって、ＰｏｌｙＡ+ ｍＲＮＡを単離した。第一鎖（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡ合成は、５μｇのｍＲＮＡおよび各可変重および可変軽鎖に対する、２０ｐｍｏｌの３’オリゴヌクレオチドマウス−特異的プライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ；  ｃａｔ＃６９７９６および６９８１２）を含む、ｃＤＮＡ合成キット（Ｎｏｖａｇｅｎ；ｃａｔ＃６９００１−３）中の逆転写酵素を使用することによって達成された。ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｃａｔ＃１０１９８−０１８）ならびにマウス可変重鎖および軽鎖特異的プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ；ｃａｔ＃７００８１−３、各５ｐｍｏｌ）を使用する３０サイクル（９４Ｃ  ホットスタートの後、９４Ｃ  １分間、５０Ｃ  １分間そして７２Ｃ  １分間のサイクル）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｃＤＮＡの一部（５から５０ｎｇ）を増幅した。ＰＣＲ産物を酢酸ナトリウム緩衝液中の１％超純粋アガロースゲル中で電気泳動的に分別し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。予想されたサイズにマッチングするＰＣＲ断片をそのゲルから切り出し、そしてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドへのライゲーションのためにＢＩＯ１０１  Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピンカラム（ｃａｔ＃１１０１−４００）を使用して精製し、続いてコンピテントＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ｃａｔ＃Ｋ４５００）への形質転換を行った。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ；ｃａｔ＃２７１０６）を使用してプラスミドＤＮＡを単離した後、インサートを含む陽性クローンを制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって同定し、続いてＭ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーを使用してＡＢＩ自動シークエンサー上で配列決定した。
【００７７】
得られた配列は以下のとおりである：
１３−２ＶＬＡ−１（可変軽配列）
【００７８】
【化１】
2004534000.tif 000008
・ＣＤＲを表すアミノ酸には下線が引かれる。
【００７９】
１３−２ＶＨＣ−３（可変重配列）
【００８０】
【化２】
2004534000.tif 000009
・ＣＤＲを表すアミノ酸には下線が引かれる。
【００８１】
B.モノクローナル抗体１２−９
Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ２．０キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；  ｃａｔ＃Ｋ４５００）を使用して、ＣｌｆＡ１２−９ハイブリドーマ細胞からメッセンジャーＲＮＡを単離した。簡潔には、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−１０培地中で培養した１．４×１０8ハイブリドーマ細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離によってペレット化した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＲＮａｓｅ  Ｄｅｇｒａｄｅｒを含む界面活性剤中に溶解させた。オリゴ−ｄＴセルロース上でのアフィニティ精製によって、ＰｏｌｙＡ+ ｍＲＮＡを単離した。第一鎖（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡ合成は、５μｇの  ｍＲＮＡおよび各可変重および可変軽鎖に対する、２０ｐｍｏｌの３’オリゴヌクレオチドマウス−特異的プライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ；  ｃａｔ＃６９７９６および６９８１２）を含む、ｃＤＮＡ合成キット（Ｎｏｖａｇｅｎ；ｃａｔ＃６９００１−３）中の逆転写酵素を使用することによって達成された。ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｃａｔ＃１０１９８−０１８）ならびにマウス可変重および軽鎖特異的プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ；ｃａｔ＃７００８１−３、各５ｐｍｏｌ）を使用する３０サイクル（９４Ｃ  ホットスタートの後、９４Ｃ  １分間、５０Ｃ  １分間そして７２Ｃ  １分間のサイクル）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｃＤＮＡの一部（５から５０ｎｇ）を増幅した。ＰＣＲ産物を酢酸ナトリウム緩衝液中の１％超純粋アガロースゲル中で電気泳動的に分別し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。予想されたサイズにマッチングするＰＣＲ断片をそのゲルから切り出し、そしてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドへのライゲーションのためにＢＩＯ１０１  Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピンカラム（ｃａｔ＃１１０１−４００）を使用して精製し、続いてコンピテントＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ｃａｔ＃Ｋ４５００）への形質転換を行った。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ；ｃａｔ＃２７１０６）を使用してプラスミドＤＮＡを単離した後、インサートを含む陽性クローンを制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって同定し、続いてＭ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーを使用してＡＢＩ自動シークエンサー上で配列決定した。
【００８２】
得られた配列は以下のとおりである：
１２−９ＶＬＡ−１（可変軽配列）
【００８３】
【化３】
2004534000.tif 000010
・ＣＤＲを表すアミノ酸には下線が引かれる。
【００８４】
１２−９ＶＨＣ−１（可変重配列）
【００８５】
【化４】
2004534000.tif 000011
・ＣＤＲを表すアミノ酸には下線が引かれる。
【００８６】
C.モノクローナル抗体３５−２２０
可変領域配列の単離および配列決定：
Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ２．０キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；  ｃａｔ＃Ｋ４５００）を使用して、ＣｌｆＡ３５−２２０ハイブリドーマ細胞からメッセンジャーＲＮＡを単離した。簡潔には、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−１０培地中で培養した１．４×１０8ハイブリドーマ細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離によってペレット化した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＲＮａｓｅ  Ｄｅｇｒａｄｅｒを含む界面活性剤中に溶解させた。オリゴ−ｄＴセルロース上でのアフィニティ精製によって、ＰｏｌｙＡ+ ｍＲＮＡを単離した。第一鎖（ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡ合成は、５ｍｇのｍＲＮＡおよび各可変重および可変軽鎖に対する、２０ｐｍｏｌの３’オリゴヌクレオチドマウス−特異的プライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ；  ｃａｔ＃６９７９６および６９８１２）を含む、ｃＤＮＡ合成キット（Ｎｏｖａｇｅｎ；ｃａｔ＃６９００１−３）中の逆転写酵素を使用することによって達成された。ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｃａｔ＃１０１９８−０１８）ならびにマウス可変重鎖および軽鎖特異的プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ；ｃａｔ＃７００８１−３、各５ｐｍｏｌ）を使用する３０サイクル（９４Ｃ  ホットスタートの後、９４Ｃ  １分間、５０Ｃ  １分間そして７２Ｃ  １分間のサイクル）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｃＤＮＡの一部（５から５０ｎｇ）を増幅した。ＰＣＲ産物を酢酸ナトリウム緩衝液中の１％超純粋アガロースゲル中で電気泳動的に分別し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。予想されたサイズにマッチングするＰＣＲ断片をそのゲルから切り出し、そしてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドへのライゲーションのためにＢＩＯ１０１  Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピンカラム（ｃａｔ＃１１０１−４００）を使用して精製し、続いてコンピテントＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ｃａｔ＃Ｋ４５００）への形質転換を行った。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ；ｃａｔ＃２７１０６）を使用してプラスミドＤＮＡを単離した後、インサートを含む陽性クローンを制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって同定し、続いてＭ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーを使用してＡＢＩ自動シークエンサー上で配列決定した。
【００８７】
得られた配列は以下のとおりである：
３５−２２０ＶＬＤ−４（可変軽配列ＤＮＡ）
【００８８】
【化５】
2004534000.tif 000012
３５−２２０ＶＬＤ−４（可変軽配列）
【００８９】
【化６】
2004534000.tif 000013
ＣＤＲを表すアミノ酸には下線が引かれる。
【００９０】
３５−２２０ＶＨＣ−１（可変重配列ＤＮＡ）
【００９１】
【化７】
2004534000.tif 000014
３５−２２０ＶＨＣ−１（可変重配列）
【００９２】
【化８】
2004534000.tif 000015
ＣＤＲを表すアミノ酸には下線が引かれる。
【００９３】
D.モノクローナル抗体３５−００６
可変領域配列の単離および配列決定：
Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ２．０キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；  ｃａｔ＃Ｋ４５００）を使用して、ＣｌｆＡ３５−００６ハイブリドーマ細胞からメッセンジャーＲＮＡを単離した。簡潔には、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−１０培地中で培養した１．４×１０8ハイブリドーマ細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離によってペレット化した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＲＮａｓｅ  Ｄｅｇｒａｄｅｒを含む界面活性剤中に溶解させた。オリゴ−ｄＴセルロース上でのアフィニティ精製によって、ＰｏｌｙＡ+ ｍＲＮＡを単離した。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、５ｍｇのｍＲＮＡおよび各可変重および可変軽鎖に対する、２０ｐｍｏｌの３’オリゴヌクレオチドマウス−特異的プライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ；  ｃａｔ＃６９７９６および６９８１２）を含む、ｃＤＮＡ合成キット（Ｎｏｖａｇｅｎ；ｃａｔ＃６９００１−３）中の逆転写酵素を使用することによって達成された。ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｃａｔ＃１０１９８−０１８）ならびにマウス可変重鎖および軽鎖特異的プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ；ｃａｔ＃７００８１−３、各５ｐｍｏｌ）を使用する３０サイクル（９４Ｃ  ホットスタートの後、９４Ｃ  １分間、５０Ｃ  １分間そして７２Ｃ  １分間のサイクル）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｃＤＮＡの一部（５から５０ｎｇ）を増幅した。ＰＣＲ産物を酢酸ナトリウム緩衝液中の１％超純粋アガロースゲル中で電気泳動的に分別し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。予想されたサイズにマッチングするＰＣＲ断片をそのゲルから切り出し、そしてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドへのライゲーションのためにＢＩＯ１０１  Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピンカラム（ｃａｔ＃１１０１−４００）を使用して精製し、続いてコンピテントＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ｃａｔ＃Ｋ４５００）への形質転換を行った。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ；ｃａｔ＃２７１０６）を使用してプラスミドＤＮＡを単離した後、インサートを含む陽性クローンを制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって同定し、続いてＭ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーを使用してＡＢＩ自動シークエンサー上で配列決定した。
【００９４】
得られた配列は以下のとおりである：
３５−００６ＶＬＤ−１（可変軽配列ＤＮＡ）
【００９５】
【化９】
2004534000.tif 000016
３５−００６ＶＬＤ−１（可変軽配列）
【００９６】
【化１０】
2004534000.tif 000017
ＣＤＲを表すアミノ酸には下線が引かれる
３５−００６ＶＨＣ−１（可変重配列ＤＮＡ）
【００９７】
【化１１】
2004534000.tif 000018
３５−００６ＶＨＣ−１（可変重配列）
【００９８】
【化１２】
2004534000.tif 000019
ＣＤＲを表すアミノ酸には下線が引かれる。
【００９９】
実施例８．マウス１２−９に対する全細胞反応性および結合速度論において等価なキメラ１２−９の生成
ヒト志願者の全血から単離されたヒト不変領域（軽鎖：カッパ；重鎖：Ｇ１、３または４）を使用して、キメラ１２−９を生成した（Ｐｏｌｙ  Ａ  ＲＮＡの選択および第一鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅）。哺乳類細胞中での発現のため、重および軽鎖可変領域配列の両方の５‘末端に、固有の制限サイトＢｓｍ１を加えた。３’末端（それぞれの不変領域に対するスプライス部位）では、Ｂｓｉｗ１部位を軽鎖可変領域に加え、また重鎖可変領域にはＡｐａ１部位を加えた。これは、オリゴヌクレオチドプライマーの設計および適切な１２−９ＤＮＡテンプレートのＰＣＲ増幅に続く確認ＤＮＡ配列決定（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって達成された。
【０１００】
キメラバージョンの１２−９タンパク質の発現は、軽鎖発現のためのカッパ不変領域または重鎖発現のためのガンマ（１、３または４）不変領域を含む、ヒト免疫グロブリンリーダー（ｌｅａｄｅｒ）分泌配列（Ｂｓｍ１をクローニングサイトとする）を含むｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ｃａｔ＃  Ｖ０４４−５０）哺乳類発現ベクターを使用することで達成された。この哺乳類発現プラスミドは、同一プラスミド上の別々のｈＣＭＶプロモーターを有する重鎖および軽鎖の両方の発現、またはコトランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）による別々のｐＣＥＰ４プラスミド上の軽鎖および重鎖の発現のために設計された。１２−９の重鎖および軽鎖を含むプラスミドＤＮＡのＦｕｇｅｎｅを有するＨＥＫ２９３  ＥＢＮＡ細胞（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，  ｃａｔ＃  １８１４４４３）へのトランスフェンション後、ハイグロマイシン（３００μｇ／ｍｌ）選択下にて機能的キメラ１２−９を発現させた。上清を回収し、Ｂｉａｃｏｒｅによって結合速度論、およびＳ．ａｕｒｅｕｓ細胞への結合をフローサイトメトリーによって解析した。
【０１０１】
組換えキメラ１２−９とともに図２および３に示される結果は、１２−９の重鎖および軽鎖の配列は、ハイブリドーマ上清として特徴付けられるオリジナル１２−９の結合速度論および特異性を複製することを確認する。
【０１０２】
実施例９．  １２−９の重および軽鎖可変領域のヒト化
このヒト化工程は、分子の特異性およびＣｌｆＡ標的抗原に対する親和性に関与しないマウス可変領域の溶媒露出残基（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ）のみを変化することに焦点を合わせている。これらの決定のための情報は、Ｐｄｌａｎによって出版された、溶媒利用可能性決定（ｓｏｌｖｅｎｔ  ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ）（抗体可変ドメインの免疫原性を減少する一方、それらのリガンド結合特性を保存するために可能な方法。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２８（４）；  ４８９−４９８，  １９９１）を利用し、またこれらの決定をするために、Ｔ−細胞エピトープを決定するためのインシリコまたはアルゴリズムにおける分子モデリングは、使用しなかった。
【０１０３】
このアプローチは、公式データベースから最も相同性の高い（ｍｏｓｔ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）ヒト可変領域の表面露出構造を反映するために、部位特異的突然変異誘発によって、軽および重鎖のマウス可変領域残基を変化させる方法を表す。具体的には、可変重および軽鎖を規定するアミノ酸を各ヒトフレームワークサブ−グループ（重鎖のＩ−ＩＩＩおよび軽鎖のＩ−ＩＶ）からのアミノ酸のアラインメントを可能にするＰａｄｌａｎに基づくＫａｂｏｔポジション番号および“露出（ｅｘｐｏｓｕｒｅ）”記号（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）が与えられる。この解析をサポートするために、ヒト免疫グロブリンデータベース上においてＢＬＡＳＴサーチを行い、同様にこの可変領域がこのマウス配列に最も高い相同性を有する全タンパク質データベース（生殖細胞系および成熟の両方）を選択し、そして対象のマウス配列と並べた（ａｌｉｅｎｅｄ）。ひとたび並べられると（ａｌｉｅｎｅｄ）、このマウス配列に最も高い相同性を有するヒトサブグループが同定された。露出したマウスアミノ酸残基を、最も相同なヒトサブグループに似せるため変異させた。この部位においてこのサブグループ中に１を超えるアミノ酸が見出された場合、１２−９に対して最も高い相同性を有するヒト生殖細胞系配列において示されたアミノ酸を使用した。これらの変化は、ＰＣＲによる変異原性オリゴヌクレオチド、続くコンフォーメーショナルＤＮＡ配列決定で達成された。
【０１０４】
１２−９ＶＬ−Ｈｕ（ヒト化可変軽配列ＤＮＡ）
【０１０５】
【化１３】
2004534000.tif 000020
１２−９ＶＬ−Ｈｕ（ヒト化可変軽配列）
【０１０６】
【化１４】
2004534000.tif 000021
ＣＤＲを表すアミノ酸には下線が引かれ、太字のアミノ酸はヒト化の変化を表す。
【０１０７】
１２−９ＶＨ−Ｈｕ（ヒト化可変重配列ＤＮＡ）
【０１０８】
【化１５】
2004534000.tif 000022
１２−９ＶＨ−Ｈｕ（ヒト化可変重配列）
【０１０９】
【化１６】
2004534000.tif 000023
ＣＤＲを表すアミノ酸には下線が引かれ、太字のアミノ酸はヒト化の変化を表す。
【０１１０】
実施例１０．  メチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ株６７−０（ＭＲＳＡ）を使用したマウス敗血症モデルにおける、ＣｌｆＡモノクローナル抗体、１２−９Ａ（ＩＮＨ−Ｍ０１０００１）および３５−０５２．１（ＩＮＨ−Ｍ０１０１６）のアイソタイプ適合コントロールＣＲＬ１７７１抗体、ＩＮＨ−Ｍ００００２９との比較。
【０１１１】
本実施例の目的は、マウス敗血症モデルにおいて０．３ｍｇ用量の抗体およびＳ．ａｕｒｅｕｓ株６７−０を使用し、アイソタイプ適合コントロールＣＲＬ１７７１抗体（ＩＮＨ−Ｍ００００２９）と比較したＣｌｆＡモノクローナル抗体、１２−９Ａ（ＩＮＨ−Ｍ０１０００１）および３５−０５２．１（ＩＮＨ−Ｍ０１０１６）の防御効果を特徴付けることである。
【０１１２】
【表７】
2004534000.tif 000024
適当な動物（下記参照）へのモノクローナル抗体の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射の投与によって、投薬を行った。Ｓ．ａｕｒｅｕｓの静脈（ｉ．ｖ．）注射の約１８時間前に、抗体の投与を行った。単独パラメーター（死亡率）を用いて、全身感染を測定した。
【０１１３】
【表８】
2004534000.tif 000025
調製、保存および取り扱い：
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ
ＭＲＳＡ株６７−０細胞は凍結グリセロールストックから得られ、そして一枚の血液寒天プレート上に植え付けられ、そして２４時間、３７℃で増殖させた。その後、単独コロニーを新たな血液寒天プレート上に移した。８０プレートを接種し、５０ｍｌｓの最終凍結ストックを調製した。その後、プレートを２４時間、３７℃でインキュベーションした。インキュベーション後、細菌をスクレイパー（ｓｃｒａｐｅｒ）から取り除くために穏やかにボルテックスしながら、コロニーを各プレートの表面から１０ｍｌｓの１×ＰＢＳを含む４つの５０ｍｌ管（１管あたり２０プレート）へ掻き取った。次いで、細菌からの全ての寒天片の分離を容易にするため勢いよくボルテックスしながら、さらなる１０ｍｌｓの１×ＰＢＳを１０ｍｌｓの細菌懸濁液に加えた。この懸濁液を１０分間、３５００×ｇ、４℃で遠心分離することによって、ペレット化した。この細菌をＤ−ＰＢＳ中で洗浄し、そして５０ｍｌｓの凍結培地に再び懸濁した。この細菌ストックを、エタノール／ドライアイス浴中で急速凍結することによって１ｍｌのアリコート中に入れ、そして−８０℃の冷凍庫中に置いた。凍結ストックの濃度（ＣＦＵ／ｍｌ）を、ストックの１ｍｌアリコートを解凍し、１０-5から１０-11の連続希釈液を用意することで測定した。希釈液を二分して、血液寒天プレート上にプレーティングし、そして１６−１８時間、３７℃でインキュベートした。このＣＦＵ／ｍｌを測定し（ＣＦＵ／ｍｌ＝（コロニー平均＃×希釈ファクター）／０．０５０ｍｌｓ）そして平均ＣＦＵ／ｍｌを決定するために各希釈液を平均した。注射の日、各株のアリコートを解凍し、１つの管に混合し、攪拌した。その後、各ストックの希釈液が用意される。
【０１１４】
ＣｌｆＡ１２−９Ａモノクローナル抗体、ＩＮＨ−Ｍ０１０００１（ＬＮ：  ＩＡＡ２Ｅ１３５４）
１２−９Ａモノクローナル抗体（ＩｇＧ1サブタイプ）を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを使用して、血清フリーハイブリドーマ培養液から精製した。この材料は、エンドトキシン濃度１．０ＥＵ／ｍｇタンパク質を有する７．０ｍｇ／ｍｌの濃度であると報告された。この材料を、４℃にて冷蔵保存した。注射の日、この材料を、０．６ｍｇ／ｍｌまで希釈し、そして０．５ｍｌを適切な動物群に腹腔内注射を介して投与する。投与される最終用量は、０．３ｍｇのＩｇＧになる。
【０１１５】
ＣｌｆＡ３５−０５２．１モノクローナル抗体、ＩＮＨ−Ｍ０１０１６（ＬＮ：ＩＡＡ２Ｈ１４２２）
３５−０５２モノクローナル抗体（ＩｇＧ1サブタイプ）を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを使用して、血清フリーハイブリドーマ培養液から精製した。この材料は、エンドトキシン濃度１．０ＥＵ／ｍｇタンパク質を有する４．２ｍｇ／ｍｌの濃度であると報告された。この材料を、４℃にて冷蔵保存した。注射の日、この材料を、０．６ｍｇ／ｍｌまで希釈し、そして０．５ｍｌを適切な動物群に腹腔内注射を介して投与する。投与される最終用量は、０．３ｍｇのＩｇＧになる。
【０１１６】
コントロールＣＲＬ１７７１モノクローナル抗体（ＩＮＨ−Ｍ００００２９，ＬＮ：ＩＡＡ２Ｅ１３３７）
ＣＲＬ１７７１モノクローナル抗体（ＩｇＧ1サブタイプ）を、プロテインＧアフィニティクロマトグラフィーを使用して、血清フリーハイブリドーマ培養液から精製した。この材料は、エンドトキシン濃度０．２ＥＵ／ｍｇタンパク質を有する５．０ｍｇ／ｍｌの濃度であると報告された。この材料を、４℃にて冷蔵保存した。注射の日、この材料を、０．６ｍｇ／ｍｌまで希釈し、そして０．５ｍｌを腹腔内注射を介して投与する。投与される最終用量は、０．３ｍｇのＩｇＧになる。
【０１１７】
ハウジング、食物、水および環境：
受け取ってすぐに、全ての動物を検診し、吸湿性のあるｂｅｄ−ｏ−ｃｏｂｂ敷きわらを敷いたポリカーボネート靴箱型ケージ中でグループ飼育した（５／ケージ）。全ての動物は、１２時間の明暗周期で、自由に食事（Ｈａｒｌａｎ／Ｔｅｋｌａｄ  Ｍｏｕｓｅ  Ｐｅｌｌｅｔｅｄ  Ｄｉｅｔ  ＃７０１２）および水道水を得ることができる。動物の世話および必要な飼育条件の全ての面は、ｔｈｅ  ＮＩＨ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓに従った。
【０１１８】
同定および無作為化：
全てのマウスは、処理前に尾の入れ墨を使用することによって、独自に同定された。処理の開始前に、マウスは個別に体重測定され、そしてそれらの健康状態が再評価された。マウスを体重の階層化による無作為化に基づき処理群に割り当てた。
このデータは、ＣｌｆＡ−フィブリノゲン結合と無関係な部位においてＣｌｆＡを認識する特異的コントロール（３５−０５２）だけでなく、非ＣｌｆＡ特異的アイソタイプコントロール（ＣＲＬ１７７１）と比較した、ＣｌｆＡ−フィブリノゲン接着を妨げる１２−９などの抗−ＣｌｆＡ抗体の治療価値を示す。
【０１１９】
実施例１１．  アイソタイプコントロール（ＣＲＬ１７７１）と比較した１２−９および３５−０５２のＳ．ａｕｒｅｕｓ株認識
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ細菌試料（株Ｎｅｗｍａｎ−ＷＴ，  ６７−０，  ５６０  Ｓａｌ  １，  ２０３  Ｓａｌ  ２，  ４５１  Ｓａｌ  ４，  ２０６  Ｓａｌ  ５，  ３９７  Ｓａｌ  ６，  ４９，  １８９，  ２０３  および４０４６）を、３時間および一晩にて採取し、洗浄し、そしてウサギＩｇＧ（５０ｍｇ／ｍｌ）でタンパク質Ａ部位をブロッキングした後、２ｍｇ／ｍｌの濃度にてＭａｂ１２−９、３５−５２または１７７１単独（コントロール）と共にインキュベートした。Ｓａｌ記号（ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）を含むＳ．ａｕｒｅｕｓ株は、全ての臨床分離株の６５．６８％を占める５つの明確な系を表す（Ｂｏｏｔｈ，ら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９，３４５−３５３，２００１）。同様に、Ｎｅｗｍａｎ  ＣｌｆＡ：：ｅｍｒ（ＣｌｆＡノックアウト）およびＮｅｗｍａｎ  Ｓｐａ：：ｋａｎ（プロテインＡノックアウト）を、特異性コントロールと同じように解析した。抗体とのインキュベーションに続き、検出抗体として役立つヤギ−Ｆ(ab')2−抗−マウス−Ｆ(ab')2−ＦＩＴＣと共に、細菌の細胞をインキュベートした。抗体標識後、蛍光発光を解析するためにＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ  フローサイトメーターを通して、細菌細胞を吸引した（励起：４８８、発光：５７０）。各細菌株について、１０，０００イベントを採取し、測定した。
【０１２０】
【表９】
2004534000.tif 000026
このデータは、ＣｌｆＡ分子上、すなわちフィブリノゲンの結合部位の機能的エピトープを認識することができる抗−ＣｌｆＡ抗体（１２−９など）を選択することの重要性を強調する。
【０１２１】
Ｓ．ａｕｒｅｕｓ分離株の他のセット、すなわち疾病の原因に不均衡に共通と同定された、１１の異なるクローンの遺伝子型複合体（ｃｌｏｎａｌ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）の表示、はマルチローカスシークエンスタイピング（ｍｕｌｔｉ−ｌｏｃｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｙｐｉｎｇ）に由来した（Ｄａｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１．  Ａ  ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｂｕｎｄａｎｃｅ  ｉｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９２：１１４−１１６）。各株を、上記のフローサイトメトリーによって１２−９に対する反応性について試験した。
【０１２２】
【表１０】
2004534000.tif 000027
さらに、この反応性は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓの分離株にわたって（ａｃｒｏｓｓ）ＣｌｆＡ上の１２−９エピトープの保存を表し、ＣｌｆＡ−フィブリノゲン結合が機能的に保存されているということを示唆する。
実施例１２．全細胞Ｓ．ａｕｒｅｕｓ結合を阻害する抗−ＣｌｆＡ抗体における可変領域の相同性
フィブリノゲンへのＣｌｆＡ結合を阻害する能力に基づく抗−ＣｌｆＡ抗体の選択からの予想外の結果は、軽および重可変鎖領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）アミノ酸配列における類似性である。これをプロファイルするために、抗−ＣｌｆＡ抗体を、以下の工程を使用するフィブリゲン−コーティングしたプレートへの結合の全細胞Ｓ．ａｕｒｅｕｓ阻害に基づいて選択した：対象の抗体を、アッセイ緩衝溶液中に４μｇ／ｍｌの濃度から始め、連続的に希釈した。同時に（ｃｏｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（Ｎｅｗｍａｎ  ｓｐａ：：ｋａｎ）の一晩の培養を洗浄、ウサギＩｇＧでブロックし、その後Ｓｙｔｏ１３細胞浸透性蛍光ＤＮＡ染色（ｃｅｌｌ  ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＤＮＡ  ｓｔａｉｎ）で染色し、そして１０分間インキュベートした。等量の染色細胞および希釈抗体を混合し、そして３０分間４℃にてインキュベートし、その後、ヒトフィブリノゲンコーティングした／ブロックしたマイクロタイタープレートの２重のウェルを各サンプルに加えた。プレートを１時間４℃にてインキュベートし、洗浄し、各ウェルに緩衝溶液を加え、そして蛍光プレートリーダー（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ）において読み取った。
【０１２３】
ＣＲＬ１７７１（非−特異的コントロール）と同様に、抗−ＣｌｆＡモノクローナル、１２−９、１３−２、３５−００６および３５−２２０の可変軽鎖および重鎖をクローニングし、そして予想されたアミノ酸配列を導くために以下の方法において配列決定をした：簡潔には、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ−１０培地中で培養した１．４×１０8ハイブリドーマ細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離によってペレット化した後、Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＲＮａｓｅ  Ｄｅｇｒａｄｅｒを含む界面活性剤中に溶解させた。オリゴ−ｄＴセルロース上でのアフィニティ精製によって、ＰｏｌｙＡ+ ｍＲＮＡを単離した。第一鎖ｃＤＮＡ合成は、５ｍｇのｍＲＮＡおよび各可変重および可変軽鎖に対する、２０ｐｍｏｌの３’オリゴヌクレオチドマウス−特異的プライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ；  ｃａｔ＃６９７９６および６９８１２）を含む、ｃＤＮＡ合成キット（Ｎｏｖａｇｅｎ；ｃａｔ＃６９００１−３）中の逆転写酵素を使用することによって達成された。ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｃａｔ＃１０１９８−０１８）ならびにマウス可変重および軽鎖特異的プライマーセット（Ｎｏｖａｇｅｎ；ｃａｔ＃７００８１−３、各５ｐｍｏｌ）を使用する３０サイクル（９４Ｃ  ホットスタートの後、９４Ｃ  １分間、５０Ｃ  １分間そして７２Ｃ  １分間のサイクル）のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｃＤＮＡの一部（５から５０ｎｇ）を増幅した。ＰＣＲ産物を酢酸ナトリウム緩衝液中の１％超純粋アガロースゲル中で電気泳動的に分別し、エチジウムブロマイド染色によって可視化した。予想されたサイズにマッチングするＰＣＲ断片をそのゲルから切り出し、そしてｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミドへのライゲーションのためにＢＩＯ１０１  Ｇｅｎｅｃｌｅａｎスピンカラム（ｃａｔ＃１１０１−４００）を使用して精製し、続いてコンピテントＴＯＰ１０  Ｅ．ｃｏｌｉ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ｃａｔ＃Ｋ４５００）への形質転換を行った。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ；ｃａｔ＃２７１０６）を使用してプラスミドＤＮＡを単離した後、インサートを含む陽性クローンを制限エンドヌクレアーゼ消化およびアガロースゲル電気泳動によって同定し、続いてＭ１３フォワードおよびＭ１３リバースプライマーを使用してＡＢＩ自動シークエンサー上で配列決定した。
図７に示されるように、このデータは、フィブリノゲンへのＳ．ａｕｒｅｕｓ結合の阻害と共に、抗−ＣｌｆＡモノクローナルに対する結合特異性を規定する免疫グロブリン鎖の最も可変な部分の中に、かなりの保存があるということを示す。この相同性は、３つの異なるハイブリドーマ−生成融合物（ｆｕｓｉｏｎｓ）（１２、１３および３５）から表される；Ｃｌｆ−Ａ抗原の作成のように変わりやすい条件下における、融合の前の免疫の方法およびシーケンス。特に、このデータは、本発明の抗体の可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域における保存領域と同様に、ＣｌｆＡに結合するモノクローナル抗体の可変重鎖のＣＤＲ１およびＣＤＲ２領域におけるコンセンサス（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ）保存領域を明らかにした。このデータは、したがって、保存配列を有する抗体の調製は、同一の結合特性を有すべきであることを示し、したがって本発明の範囲に含まれる。
【０１２４】
したがって、本発明によれば、ＣｌｆＡに結合する抗体を、図８のコンセンサス中に示される、同一の主要なＣＤＲ領域を有する可変軽または重鎖を使用して調製することができる。特に、これらの抗体は、配列ＲＹＳＶＨを含むＣＤＲ１領域、および／または配列ＭＩＷＧＧＧＮＴＤＹＮＳＡＬＫＳを含むＣＤＲ２領域である可変重鎖を有し、ならびに配列ＫＳＳＱＳＶＬＹＳＳＮＱＫＮＹＬＡを含むＣＤＲ１領域、配列ＷＡＳＴＲＥＳを含むＣＤＲ２領域、および／または配列ＨＱＹＬＳＳＹＴを含むＣＤＲ３領域を有する可変軽鎖を含むものを包含する。
実施例１３．  前−臨床および臨床使用のためのヒト化１２−９の発現
重および軽免疫グロブリンポリペプチド鎖の同時発現のため、２つの遺伝子を、別々のｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーターの制御下にある各遺伝子を有する単独プラスミド中にクローニングした。この二重遺伝子ベクターは、単独のトランスフェクションイベントにおいて、宿主細胞中への導入のためのＧＳ選択マーカー（Ｌｏｎｚａ；  Ｓｌｏｕｇｈ，  ＵＫ）の単独コピーを保持する。細胞を、製造業者によって示される条件下で、Ｆｕｇｅｎｅ−６（Ｒｏｃｈｅ）を使用してトランスフェクションした。上清を、一時的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）または安定的（ｓｔａｂｌｙ）由来の細胞系から試験し、そしてマウスおよびキメラ由来１２−９と比較した。
【０１２５】
本実施例は、ヒト化１２−９を、ヒト化し、クローニングし、そして商業的な規模の質および純度を産生することができ、単独発現カセットを発現し得るということを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１２６】
【図１】図１は、ウサギ抗−マウスＦｃ（ＲＡＭ−Ｆｃ）抗体を用いて、本発明に従うモノクローナル抗体１３−１または１３−２がチップへ結合される場合のＣｌｆＡ結合およびそれに続くフィブリノゲンの結合／阻害を測定するために使用されるビアコア分析（ｂｉａｃｏｒｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ）のグラフである。
【図２】図２は、本発明に従うキメラモノクローナル抗体１２−９のビアコア分析のグラフである。
【図３】図３は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（Ｓｔｒａｉｎ  Ｎｅｗｍａｎ）への結合を示すモノクローナル抗体キメラ１２−９のフローサイトメトリー分析のグラフである。
【図４】図４は、本発明に従うキメラおよびヒト化モノクローナル抗体１２−９のＣｌｆＡに対する結合親和性を示すグラフである。
【図５】図５は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓマウス致死チャレンジモデルに対する保護を示すグラフである。
【図６】本発明のモノクローナル抗体を用いて、固定化フィブリノゲンへのＳ．ａｕｒｅｕｓ付着の細胞全体の阻害を示すグラフである。
【図７】本発明に従う１２−９マウス、１２−９キメラ、および１２−９ヒト化モノクローナル抗体を用いるＳ．ａｕｒｅｕｓの比較結合を示すグラフである。
【図８】ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域において保存配列を示す本発明のモノクローナル抗体の可変重鎖および可変軽鎖配列の図である。
【図１】
2004534000.tif 000028
【図２】
2004534000.tif 000029
【図３】
2004534000.tif 000030
【図４】
2004534000.tif 000031
【図５】
2004534000.tif 000032
【図６】
2004534000.tif 000033
【図７】
2004534000.tif 000034
【図８】
2004534000.tif 000035
【国際公開パンフレット】
2004534000.tif 000036
2004534000.tif 000037
2004534000.tif 000038
2004534000.tif 000039
2004534000.tif 000040
2004534000.tif 000041
2004534000.tif 000042
2004534000.tif 000043
2004534000.tif 000044
2004534000.tif 000045
2004534000.tif 000046
2004534000.tif 000047
2004534000.tif 000048
2004534000.tif 000049
2004534000.tif 000050
2004534000.tif 000051
2004534000.tif 000052
2004534000.tif 000053
2004534000.tif 000054
2004534000.tif 000055
2004534000.tif 000056
2004534000.tif 000057
2004534000.tif 000058
2004534000.tif 000059
2004534000.tif 000060
2004534000.tif 000061
2004534000.tif 000062
2004534000.tif 000063
2004534000.tif 000064
2004534000.tif 000065
2004534000.tif 000066
2004534000.tif 000067
2004534000.tif 000068
2004534000.tif 000069
2004534000.tif 000070
2004534000.tif 000071
2004534000.tif 000072
2004534000.tif 000073
2004534000.tif 000074
2004534000.tif 000075
2004534000.tif 000076
2004534000.tif 000077
2004534000.tif 000078
2004534000.tif 000079
2004534000.tif 000080
2004534000.tif 000081
2004534000.tif 000082
2004534000.tif 000083
2004534000.tif 000084
2004534000.tif 000085
2004534000.tif 000086
2004534000.tif 000087
2004534000.tif 000088
2004534000.tif 000089
2004534000.tif 000090
2004534000.tif 000091
2004534000.tif 000092
2004534000.tif 000093
2004534000.tif 000094
2004534000.tif 000095
2004534000.tif 000096
2004534000.tif 000097
2004534000.tif 000098
2004534000.tif 000099
2004534000.tif 000100
2004534000.tif 000101
2004534000.tif 000102
2004534000.tif 000103
2004534000.tif 000104
2004534000.tif 000105
2004534000.tif 000106
2004534000.tif 000107
2004534000.tif 000108
2004534000.tif 000109
2004534000.tif 000110
2004534000.tif 000111
2004534000.tif 000112
2004534000.tif 000113
2004534000.tif 000114
2004534000.tif 000115
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004534000.tif 000116
【国際調査報告】
2004534000.tif 000117
2004534000.tif 000118
2004534000.tif 000119
2004534000.tif 000120
2004534000.tif 000121
2004534000.tif 000122