(57)【要約】染色体ＤＮＡ及び他の不純物の沈殿、並びにこの上清の回収を可能にする、一般的に使用される酢酸バッファーに代えて鉱酸及び無機塩の組み合わせ物を用いた細胞ライセートの酸性化によりプラスミドＤＮＡを細胞ライセートから精製する。鉱酸及び有機塩の使用は、反復使用をしばしば伴うハイドロキシアパタイトの酢酸及び関連成分による分解を回避する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物細胞からのプラスミドＤＮＡの抽出方法であって、以下のステップ：
（ａ）上記細胞をアルカリ性溶解剤と接触させて細胞ライセートを形成し；
（ｂ）上記細胞ライセートを無機塩の存在下、鉱酸を用いてｐＨ約４．０〜約５．０に酸性化して沈殿物及び上清の形成を引き起こし；
（ｃ）上記上清を上記沈殿物から分離し、さらに上記上清をｐＨ約７．０〜約７．５に中和し；そして
（ｄ）上記の中和した上清を、ハイドロキシアパタイト・クロマトグラフ媒体に直接適用し、そして精製されたプラスミドＤＮＡを上記媒体から溶出する、
を含む上記方法。
【請求項２】
前記ステップ（ｂ）が、塩化アルカリ金属及びアルカリ土類金属から成る群から選ばれるメンバーの存在下、塩酸を用いて前記細胞ライセートを酸性化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップ（ｂ）が、塩化ナトリウム及び塩化カリウムから成る群から選ばれるメンバーの存在下、塩酸を用いて前記細胞ライセートを酸性化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（ｂ）が、塩化カリウムの存在下、塩酸を用いて前記細胞ライセートを酸性化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ステップ（ｂ）が、塩化アルカリ及びアルカリ土類金属から成る群から選ばれるメンバーの存在下、塩酸を用いてｐＨ約４．５〜５．０に前記細胞ライセートを酸性化することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ハイドロキシアパタイト・クロマトグラフ媒体が、焼結したハイドロキシアパタイトである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ステップ（ｄ）が、塩グラジエントを用いて前記精製されたプラスミドＤＮＡを溶出することを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の背景
１．本発明の分野
本願発明は、プラスミドＤＮＡ精製の分野、そして特にプラスミドＤＮＡの精製のためのハイドロキシアパタイト・カラム・クロマトグラフィーの使用にある。
【０００２】
２．従来技術の説明
遺伝子治療は、疾病、並びに遺伝子異常及び障害の治療における最も有望な成果の１つである。遺伝子治療とは、患者の細胞への遺伝子断片の導入であり、上記断片とは、発現されたときに、その患者へ治療としての利益を提供するものである。前述の利益の１つの例は、本来の遺伝子の異常により前記患者によって他の方法では十分に発現されないタンパク質の発現である。他の例は、突然変異遺伝子、アンチセンス配列又はリボザイムの導入による望まれない遺伝子機能、例えばウイルス感染又は癌の阻止である。
【０００３】
遺伝子の導入法の１つは、ベクターとしてのプラスミドＤＮＡの使用により、そして遺伝子治療への関心は、高純度プラスミドＤＮＡに対する需要を生み出している。プラスミドＤＮＡの精製は、他の細胞成分、例えば宿主タンパク質、エンドトキシン、染色体ＤＮＡ及びＲＮＡの完全な除去を必要とする。これは、培養宿主細胞、典型的にはプラスミドＤＮＡを含む細菌細胞を培養し、遠心分離により上記細胞を回収し、それらを好適な懸濁バッファー中に再懸濁し、そしてアルカリ性溶解剤を用いて細胞溶解を実行し、次に一般的にｐＨ５．５の酢酸カリウム・バッファーを用いて上記溶解物のｐＨを下げて染色体ＤＮＡ及び他の細胞性物質を沈殿させる一方で上清中に上記プラスミドＤＮＡを残すことにより成される。次に前記上清を回収し、浄化し、そしてクロマトグラフィーによりプラスミドＤＮＡを上記上清から単離する。好適なクロマトグラフィー法は、陰イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及び逆相高速液体クロマトグラフィーである。
【０００４】
ハイドロキシアパタイトは、それが陽性及び陰性荷電部分の両者を含むために混合様式イオン交換により動作する、タンパク質及び核酸のための特に有効な分離媒体である。よって、ハイドロキシアパタイトは、プラスミドＤＮＡの精製へのその使用について知られている。しかしながら、中和ステップからの酢酸イオンの滞留がハイドロキシアパタイトの有効性を制限する。なぜなら、酢酸イオンは、その媒体の分解の原因となるハイドロキシアパタイトとの相互作用を生じる傾向にあるからである。この問題を回避するために、前記上清は、クロマトグラフィーの前に一般的に沈殿、脱塩、ダイアフィルトレーション又は透析により処理される。当然、これらのステップは、精製されたプラスミドＤＮＡの製造の時間を消費し、費用をかさませ、そしてサンプルの浪費及び／又は変性の原因となる。
【０００５】
本発明の概要
プラスミドＤＮＡを含むアルカリ性細胞ライセートを従来技術の酢酸バッファーよりも無機塩の存在下、鉱酸により酸性化し、そしてこの上清を得られた沈殿物から除去し、そしてハイドロキシアパタイト・クロマトグラフ分離媒体に直接適用したとき、精製プラスミドＤＮＡをこの分離媒体から溶出しうることをここで発見した。従来技術によるライセート処理の介在ステップを産物の質の低下なしに省きうる。これらのステップを省くことの費用及び時間的利点に加え、増加した産物の収量が期待される。この発見は、酢酸イオンの使用、そしてそのハイドロキシアパタイトに対する分解作用を回避する。故に、ハイドロキシアパタイトのさらなるライセート上清の多くの精製への再利用を可能にする。故に、本発明は、細菌細胞からのプラスミドＤＮＡの抽出方法にあり、ここで細胞ライセートを、まずアルカリ性溶解剤の作用により形成し、次にこのライセートを鉱酸と無機塩の混合物を用いて酸性化し、得られた上清と沈殿物を分離し、そしてこの上清をハイドロキシアパタイトに直接適用し、その後上記プラスミドＤＮＡを適当な溶出バッファーを用いて溶出する。本発明のさらなる特性及びその好ましい態様は、以下の説明から明らかになる。
【０００６】
本発明の詳細な説明及び好ましい態様
本願発明により精製されうるプラスミドＤＮＡは、あらゆる染色体外ＤＮＡを含む。本発明は、高コピー数プラスミド及び低コピー数プラスミドの両者、並びにラナウェイ・プラスミドに及ぶ。前記プラスミドは、各種遺伝子、ポリリンカー、複製開始点、プロモーター、エンハンサー、リーダー配列、ポリアデニル化部位、終止配列及びプラスミド構造内に存在することが分かっている他の遺伝子要素を含みうる。ヒト遺伝子又は動物遺伝子をコードするプラスミドを使用しうる。
【０００７】
前記プラスミドＤＮＡを、本技術分野で周知の方法による宿主細胞の微生物発酵から得ることができる。前記宿主細胞は、多種多様な微生物のいずれか、特に酵母細胞及び細菌細胞でありうる。細菌細胞は、この目的のために最も一般的に使用されており、そしてそれ故に好ましいものである。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞は、特に好ましい。前記発酵工程は、バッチ発酵及び供給バッチ発酵（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を含む当業者に周知の方法を用いて慣習的な培地中で実施される。前記宿主細胞の収穫は、同様に慣習法により成され、その例は遠心分離、ろ過及び沈殿である。
【０００８】
前記宿主細胞の溶解をアルカリ性溶解媒体中への前記収穫された細胞の懸濁により実施する。同様に、前記手順のこのステップは、本技術分野で知られ、そして染色体ＤＮＡの変性させる能力を持ついずれかのアルカリ性塩基により成される。有名な例は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属水酸化物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、及び水酸化リチウムである。薄い水性ＮａＯＨを一般的に使用する。好ましくは、イオン性界面活性剤が前記変性を助けるために存在する。ドデシル硫酸ナトリウムを一般的に使用するが、しかしながら、他の好適な界面活性剤は当業者にとって容易に理解できるであろう。
【０００９】
一旦溶解物を生じたら、前記アルカリ性ライセートを鉱酸及び無機塩の添加により本発明に従い酸性化する。好ましい酸は塩酸である。前記酸の濃度は本発明にとって重要ではなく、そして変化しうる。たいていの場合、最良の結果は、約０．１Ｎ〜約１．０Ｎの範囲内の酸濃度を用いて達成される。水中によく溶解するあらゆる無機塩を使用しうるが、しかし好ましい無機塩は、そのアニオンが前記酸のそれと同じものである。塩酸を使用するとき、例の好ましい鉱物塩は、塩化アルカリ金属又はアルカリ土類金属、特に塩化ナトリウム及び塩化カリウムである。酸性域、好ましくは約ｐＨ４．０〜約ｐＨ５．０の範囲に、そして最も好ましくは約ｐＨ４．５〜約ｐＨ５．０の範囲内にｐＨを下げるのに十分な酸を使用する。前記塩濃度は、同様に変化するが、しかし上記塩の利点は高濃度により最もよく達成される。なぜなら、得られた溶液の高いイオン濃度は染色体ＤＮＡ及び他の不純物の沈殿の助けとなり、そしてそれによりプラスミドＤＮＡからこれらの不純物を分離する。ほとんどの場合、最良の結果は、約１．０Ｍ〜約１０Ｍ（１塩基塩に基づく）の範囲内の塩濃度により達成される。
【００１０】
前記酸性化ステップから得られた沈殿物質は慣習の手段、例えば遠心分離法、沈殿法又はろ過法、あるいはこれらの方法の組み合わせにより除去される。次に、この上清をハイドロキシアパタイト分離媒体に直接適用する。
【００１１】
その化学式がＣａ１０（ＰＯ４ ）６ （ＯＨ）２ であるところのハイドロキシアパタイトは、骨塩及び歯塩（ｔｏｏｔｈ  ｍｉｎｅｒａｌ）、並びに他の生物起源のものの主な構成要素であり、既知の方法による合成が可能でもある。ハイドロキシアパタイトはクロマトグラフ媒体又は支持体として、特にタンパク質及び核酸のクロマトグラフ分離のために広く使用される。さまざまなハイドロキシアパタイト・クロマトグラフ媒体が市販されており、そして、あらゆる利用可能な形状の媒体を本願発明の実行に使用されうる。本願発明に使用するための好ましいハイドロキシアパタイトは、凝集して粒子を形成し、そして高温で安定な多孔質セラミック塊に焼結する。前記粒子サイズは厳密ではなく、そして幅広く変化するが、典型的な粒子サイズは直径で約１μｍ〜約１，０００μｍ、好ましくは約１０μｍ〜約１００μｍの範囲に渡る。多孔度は大きく異なる。ほとんどの場合、最良の結果は、約１００Å〜約１０，０００Å、又は好ましくは約５００Å〜約３，０００Åの平均孔直径により達成される。本願発明の前記粒子として有効であるセラミック・ハイドロキシアパタイト材料の例は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ製のＭＡＣＲＯ−ＰＲＥＰ（商標）Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｔｙｐｅ  Ｉ及びＩＩである。
【００１２】
ハイドロキシアパタイトによるプラスミドＤＮＡの単離は、充填されたハイドロキシアパタイト・カラム、あるいはクロマトグラフ分離の用途のために使用されるか又は知られるあらゆる他の形態により達成されうる。前記ハイドロキシアパタイトからのプラスミドＤＮＡの溶出は、前記酸性化ライセートの浄化され上清中に残った他の成分からのプラスミドＤＮＡの分離を助けるための塩勾配のような一般的な修飾を伴う慣習的な組成の溶出バッファーにより典型的には成される。
【００１３】
以下の実施例を説明目的のためだけに提供する。
【００１４】
実施例
当該実施例は、本発明によるハイドロキシアパタイトカラムを用いたＰＵＣ１９由来のプラスミドＤＮＡの精製を説明する。このプラスミドは、２６０ｎｍの波長で１００ｍＬの細胞培養物当たり３５０吸光度単位の吸光度の表示度数を有する。
【００１５】
従来法に従い１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを追加したＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）により前記プラスミドを増やした。対照として使用するために、前記培養物の２５ｍＬアリコートをＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて精製した。この試験のために、前記培養物の他の２５ｍＬアリコートを、氷浴上で４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０及び２５ｍＭエチレン・ジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中に前記細胞を再懸濁することにより溶解した。次に、１％ドデシル硫酸ナトリウム及び０．２Ｎ  ＮａＯＨを含む細胞溶解溶液を前記懸濁液に添加し、すぐに混合し、そして氷上に３〜５分間静置した。１ｍＬの３Ｍ  ＫＣｌを直接添加し、そして混合した、そして得られた懸濁液を１．０Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ４．５に調整し、次にＮａＯＨ水溶液を用いてｐＨ７．０に中和した。未加工のライセートを４℃で１５，０００ｇ、２０分間遠心分離した。この沈殿物を７０μｍナイロン製細胞ろ過器を用いたろ過により除去した。
【００１６】
次に、プラスミド含有ライセート（８９２μｇ／ｍＬ）の５ｍＬアリコートをセラミック・ハイドロキシアパタイト・カラム（平均粒子サイズ２０μｍ±１０、公称孔直径８００〜１，０００Å、カートリッジ容量５ｍＬのＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，製ＥＣＯＮＯ−ＰＡＣ  ＣＨＴ  ＩＩカートリッジ）上に注入した。このカラムを、５倍量の、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０を加えた１０ｍＭリン酸ナトリウムを用いて洗浄し、続いて１．５ｍＬ／分の流速で１０カラム容量に渡ってリン酸ナトリウム濃度を０．４Ｍまで上げた線形グラジエントにより洗浄した。
【００１７】
溶出物を２５４ｎｍで観察し、そして画分を収集し、かつＤＮＡ含量について２６０ｎｍで及びタンパク質含量について２８０ｎｍで分光光度法で分析した。図１は、課せられた伝導度（ラインＡ、リン酸ナトリウム・グラジエントを反映する）、計測された伝導度（ラインＢ）、及び吸光度（ラインＣ、画分の原寸として吸光度単位で表される）を表すクロマトグラムのトレースである。番号付けした画分を前記トレースの上部の縁に表し、そして経過時間を下部の縁に表した。次に、このプラスミドの純度を０．８％アガロース・ゲルを用いた電気泳動により測定した。当該クロマトグラムの対照サンプルを用いて実施した対応のクロマトグラムとの比較は画分３５〜３７に渡るピークが純粋なプラスミドＤＮＡであることを示した。
【００１８】
これらの３の画分及び対照を、この画分が純粋なプラスミドＤＮＡであることを確認する、単独の０．８％アガロース・ゲルを用いた別個のレーンでの電気泳動により分析した。
【００１９】
別個に、画分３５〜３７をＥｃｏＲＩ制限酵素を用いて消化し、そして未消化と消化状態の両方を０．８％アガロース・ゲルを用いた電気泳動により分析した。前記ゲルの実験は、線形になった（消化された）ＤＮＡよりもスーパーコイルＤＮＡ（消化されなかった）ＤＮＡが速いことを示し、画分３５〜３７がプラスミドＤＮＡを含むことを確認した。
【００２０】
先の記載を説明するために提供する。さまざまな物質、試薬、操作条件、及び手順ステップの修飾、並びに置換が本発明の範囲内にあることは、これらの記載の解釈により当業者に明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明に従い準備された細菌細胞ライセートを注入したハイドロキシアパタイト・カラムからの溶出液の吸光度のクロマトグラフ・トレースである。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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2004520079.tif 000010
2004520079.tif 000011
【国際調査報告】
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