(57)【要約】本発明は、タンパク質性繊維を酵素処理する方法に関する。本方法では、酵素の機能に適切な条件下に、タンパク質繊維とチロシナーゼ酵素を含有する水溶液とを接触させる。チロシナーゼ酵素は、植物、動物または微生物由来などの様々な源に由来してよい。タンパク質性繊維には、ウール、ウール繊維または獣毛が含まれ、あるいはシルク、クモシルクまたはヒトの毛髪も含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質性繊維を酵素処理する方法であって、タンパク質性繊維を、タンパク質性繊維中のチロシン残基の酸化をもたらすチロシナーゼ酵素が作用するのに適した条件下で、該酵素を含有する水溶液に接触させることを特徴とする方法。
【請求項２】
チロシナーゼ処理が、タンパク質性繊維中のチロシン残基を酸化してこれらの残基を水酸化するか、あるいは水酸化したのちキノンを形成するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
チロシナーゼが、ベリー類や果実、好ましくは、グレープフルーツ等のかんきつ類果実、またはリンゴ、ナシ、モモ、バナナなどの果実、またはジャガイモ、キャベツ、エンドウ豆、豆、キュウリ、トマト、ホウレンソウ、オリーブなどの野菜、または大麦、小麦、ライ麦などの穀類、または茶、コーヒー豆およびカカオ豆、またはマウス、カエル、小エビなどの動物、またはＡｇａｒｉｃｕｓ属のＡｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ、ＰｌｅｕｒｏｔｕｓまたはＬｅｎｔｉｎｕｓなどの食用キノコに由来するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
チロシナーゼが、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ、ＴｒａｍｅｔｅｓのＴｒａｍｅｔｅｓ　ｈｉｒｓｕｔａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒまたはＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａなどのカビに由来するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
チロシナーゼがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属のＰ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属のＸ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属のＳ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属のＳ．ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｃａｓｔａｎｅｏｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ属のＶ．ｔｙｒｏｓｉｎａｔｉｃｕｓ、Ｒｏｓｅｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属のＴ．ｒｏｓｅｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｍｏｎａｓ属のＭ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ属のＡ．ｔｅｎｕｉｓ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属またはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属等の細菌に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
チロシナーゼが、ジャガイモあるいはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．などのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅに属する細菌由来のチロシナーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
チロシナーゼが、発現または産生宿主中で、該酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子を発現させることによって、組換え宿主により産生される、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質材料がヒツジ、ヤギ、ラマ、ラクダまたはウサギに由来する、ウールやウール繊維、アンゴラ、モヘア、カシミア、アルパカなどの獣毛または商業的に有用な獣毛製品である、あるいはタンパク質材料がシルクまたはクモシルクである、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
タンパク質材料が、ヒトの毛髪を含む、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
繊維が、繊維、ウールトップ、糸、織物、ニットまたは衣料品の形である、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
処理される材料が、少なくとも２０％のタンパク質性繊維を含有する混合材料を含む、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
混合材料が、木綿、リネン、ラミー、ジュート、サイザル、レーヨン、アセテート、ビスコースなどのセルロース性繊維、またはポリアミド、ポリエステル、ポリプロピレン、アクリル、スパンデックス、ナイロンなどの合成繊維、またはリヨセル（Ｌｙｏｃｅｌｌ）（登録商標）、テンセル（登録商標）を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
チロシナーゼの量が、タンパク質繊維材料に対し１　ｎｋａｔ／ｇ〜５０００　ｎｋａｔ／ｇまたはタンパク質繊維材料に対し１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｇ／ｋｇ、好ましくはタンパク質繊維材料に対し１０　ｎｋａｔ／ｇ〜５００ｎｋａｔ／ｋｇまたは１００ｍｇ／ｋｇ〜５ｇ／ｋｇである、請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
処理を、ｐＨ３〜８の範囲のｐＨ、好ましくは５〜７の範囲のｐＨで実施する、請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
処理を、２０〜８０℃、好ましくは３０〜７０℃、特に好ましくは４０〜５０℃で実施する、請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
処理を、化学的防縮処理の前、その間および／またはその下で実施する、請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
処理を、染色の前および／またはその間に実施する、請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
処理を、仕上げ処理の前および／またはその間に実施する、請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
チロシナーゼを、メディエーターと一緒に使用する、請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
メディエーターが、チロシンあるいは任意のチロシン含有ペプチドまたはポリペプチドである、請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
メディエーターがフェノール系または非フェノール系化合物である、請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
チロシナーゼ処理を、アスコルビン酸などの還元剤と組み合わせる、請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質性繊維を、チロシナーゼ処理の前、その間、またはその後に、他の酵素的または化学的な慣用の収縮低減処理により処理する、請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
他の酵素がリパーゼ、リポキシゲナーゼ、トランスグルタミナーゼ、ラッカーゼ、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼまたはこれらの組合せである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
処理が攪拌を含む、請求項１乃至２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
処理を攪拌することなしに実施する、請求項１乃至２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１乃至２６のいずれか１項に記載の方法により処理されているタンパク質性繊維。
【請求項２８】
布、衣料品、繊維、ウールトップあるいは獣毛またはヒトの毛髪を含む、請求項２７に記載の繊維。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、請求項１の導入部によるタンパク質性繊維を処理するための新規の方法および請求項２７の導入部による方法により製造された製品に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ウール（羊毛）は、非常に複雑な、高度に架橋したタンパク質性繊維である。他のタンパク質繊維の例は、ヒトの毛髪、アルパカ、モヘア、カシミア、アンゴラ、ラマおよびシルクである。ウールタンパク質は、ケラチンである。純粋なウールは、タンパク質９７％、脂質２％および塩類および炭水化物などの他の化合物１％からなる。大部分のケラチンは、微結晶性α−へリックス構造から構成されている。システインが大量に存在するためケラチンには鎖間または鎖内共有Ｓ−Ｓ−架橋が多い。これらの結合の開裂またはその再配列が、防縮加工またはセッティングなどの多くの重要なウール処理工程で行われる。共有架橋に加えて、水素結合、イオン結合および疎水性相互作用が、ウール中には存在する。
【０００３】
ウールの収縮は、動物のケラチン繊維の代表的な特性である（Ｍａｋｉｎｓｏｎ、１９７９年）。収縮は、洗毛、カーディング、紡績、製織、後染めおよび仕上げを含むウール加工工程の間に生じる。Ｍａｋｉｎｓｏｎ（１９７９年）によると、ウールの収縮は、３つの異なるクラスに分けることができる：１）繊維の含水分に応じた吸湿膨張（ｈｙｇｒａｌ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）、２）ウールを水に浸すような加工の間に生じた水素結合が加工の後に再配列することにより生じる緩和収縮および３）繊維の毛元方向移動（ｒｏｏｔｗａｒｄ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）により生じるフェルト化収縮、の３つである。吸湿膨張および緩和収縮は、基本的には変えられない特性であるが、フェルト化収縮は変えることができる。フェルト化収縮は、攪拌を必要とし、進行性である。フェルト化収縮の予防が、ウールの防縮には重要であり、そのためには繊維の毛元方向移動を防止する。
【０００４】
ウールの防縮は、主に、２つの異なる方法を使用して実施されている；塩素／ハーコセット（Ｈｅｒｃｏｓｅｔｔ）方法およびディラン（Ｄｙｌａｎ）ＧＲＣ法（Ｍａｋｉｎｓｏｎ、１９７９年；Ｌｅｗｉｓ、１９９２年）である。いずれの方法も、塩素化および脱塩素化工程とそれに続くポリマー添加からなる。塩素によるスケールの化学的分解により、繊維中の帯電基の量が増加し、ジスルフィド架橋は酸化されて、システイン酸基になる（Ｍａｋｉｎｓｏｎ、１９７９年）。ポリマー処理の目的は、スケールをポリマー・フィルムで覆うことにより、スケールを軟化させることである（Ｍａｋｉｎｓｏｎ、１９７９年）。これらの方法に加えて、ＳＩＭＰＬ−Ｘなど他のいくつかの方法が開発されている（ＥＰ６１８９８６号）。さらに、ポリマーのみの適用を特徴とする２つの方法即ち、Ｓｙｎｔｈａｐｒｅｔｔ　ＢＡＰ（Ｂａｙｅｒ）およびＤＣ１０９（Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ／ＰＰＴ）がある（Ｂｙｒｎｅ、１９９５年）。現在の防縮方法には、いくつかの欠点があり、例えば、塩素処理により環境に有害なＡＯＸ−化合物が生じることなどである。
【０００５】
酵素によるウール加工に関する研究は、ペプチド架橋を加水分解するプロテイナーゼから始まった。Ｅｌｌｉｓにより検討されているように（１９９５年）、ウール加工のためにプロテイナーゼを使用することは文献では広範囲の研究が行われているが、プロテイナーゼ処理すると、強度および重量が著しく減少する。
ウール加工のための酵素的方法は例えば、次の特許文献に記載されている：ＷＯ９６／１９６１１号には、ウール繊維のスケールを変性するためにプロテイナーゼを使用して、フェルト化収縮に対する耐性を与えることが記載されている。ＷＯ９８／２７２６４号には、酵素とウールとの反応に適した条件下にウールとオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ溶液とを接触させることを含む、ウールの収縮を低減するための方法が記載されている。ＵＳ５５２９９２８号には、始めに化学的または酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、カタラーゼまたはリパーゼ）処理工程、それからプロテイナーゼおよび熱処理を使用することにより、柔らかいウールの手触りと耐収縮性を有するウールを得る方法が記載されている。ＥＰ３５８３８６号には、タンパク質分解処理と、酸化処理（ＮａＯＣｌなど）とポリマー処理のいずれかまたはその両方、とからなるウール処理方法が記載されている。ＥＰ１３４２６７号には、動物性繊維をまず酸化剤で処理し、続いて塩をふくむ組成物中のタンパク質分解酵素で処理する方法が記載されている。ＷＯ９９／６０２００号には、ウール（羊毛繊維または獣毛）をタンパク質分解酵素およびトランスグルタミナーゼで処理することが記載されている。
【０００６】
ウールの耐収縮性を増すために、フェノールオキシダーゼに属するラッカーゼを使用する報告が、公表されている（ＷＯ９４／２５５７４号）。ラッカーゼ処理は、ＨＢＴ−またはＡＢＴＳ−メディエーターを用いて実施されている。処理されたウールフランネルは、処理の後の収縮が少ないと報告されている。ラッカーゼ処理により生じる化学的変化は、分析されていない。ウールを含む繊維製品をオキシダーゼまたはペルオキシダーゼおよび特に、Ｔｒａｍｅｔｅｓ　ｓｐｐ．またはＰｌｅｕｒｏｔｕｓ　ｓｐｐ由来のラッカーゼと接触させることによりウールの収縮を減らす方法が、ＷＯ９８／２７２６４号に記載されている。しかしながら、強力なラジカル形成性のメディエーターであるＨＢＴおよびＡＢＴＳを用いると、ウール繊維は過剰に酸化されていたむことがある。さらに、例えばラッカーゼ／ＨＢＴ反応で、ウールの着色が生じる。この着色は、後続のウールの染色段階に、悪影響を及ぼす。
【０００７】
ＷＯ９８／０５８１６号には、セルロース性テキスタイルを過染色する酵素的方法が記載されている。この方法では、布や繊維製品を、単環式、二環式または多環式芳香族または複素芳香族化合物、過酸化水素源、ペルオキシダーゼおよび／またはオキシダーゼ、とを含有する水性染料系で処理する。ＷＯ００／３１３３３号には、材料を還元建染め（バット）染料および／または還元硫化染料を含有する染料系で処理することにより、材料を染色する方法が記載されており、これらの還元染料は、酸素源およびオキシダーゼまたは過酸化水素源およびペルオキシダーゼを含有する酸化系で酸化される。ＷＯ９９／１５１３７号は、ケラチン性繊維を染色するために適した酵素の発泡組成物に関し、この組成物は、酸化酵素、発泡剤、染料前駆体および、場合によっては改質剤を含有する。これら３つの特許刊行物が開示する方法では全て、使用される酵素は染料または染料前駆体と反応するが繊維とは直接反応しない。ＵＳ特許６１４０１０９号には、ウールを、過酸化水素源およびハロゲン化物源と共にハロペルオキシダーゼで処理することが記載されている。
【０００８】
ウール工業で化学薬品を使用して収縮を防ぐことには著しい進歩がみられるが、化学的方法は多く環境に有害であるという欠点が残っている。一方酵素的方法の多くは、重量および強度を減らしてウールを傷める。したがって、耐収縮性その他の性質を改善しかつ既知の酵素的処理よりも繊維を傷めることが少ない、ウール、ウール繊維または獣毛材料を処理するための酵素方法の改良法は依然として必要とされている。
【０００９】
（概要）
本発明の目的は、先行技術に伴う問題をとり除き、ウールまたはウール含有材料または他のタンパク質由来またはタンパク質含有材料を処理する方法におけるこれらの問題を解決することである。本発明は特に、タンパク性繊維を処理するための改良法を提供する。本方法は、チロシナーゼと材料の反応に適した条件下で、タンパク性材料と、チロシナーゼ酵素を含有する水溶液とを接触させることからなる。
より具体的には、本方法は主として請求項１の特徴部の記載により特徴付けられる。
【００１０】
本発明の方法は、タンパク質含有繊維、例えばケラチン繊維を処理するために適用することができる。これは、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ラクダ、ウサギなどから取れるウール、ウール繊維、アンゴラ、モヘア、カシミア、アルパカなどの獣毛、または商業価値のある他の獣毛製品を処理するのに適している。さらに、本発明の方法で、シルク、スパイダーシルク（クモの糸）またはヒトの毛髪を処理することもできる。繊維は、繊維、ウールトップ、糸、織物、ニットまたは衣料品の形であってもよい。
【００１１】
チロシナーゼ酵素は、チロシナーゼを産生しうる植物、動物または微生物のどれに由来してもよいし、新しい源に由来してもよいし、適切な宿主生物中で遺伝子工学的に製造することもできる。この酵素は、タンパク質性材料中のチロシン残基の対応するヒドロキシ化合物への変換を触媒することができる。あるいは初めにヒドロキシ化合物にしてからキノンにする変換を触媒することができる（図１参照）。
【００１２】
好ましくは、この酵素は、ベリー類、果実（グレープフルーツ等のかんきつ類、リンゴ、ナシ、モモ、バナナなど）、野菜（ジャガイモ、キャベツ、エンドウ豆、豆、キュウリ、トマト、ホウレンソウ、オリーブ）、穀類（大麦、小麦、ライ麦）、茶、コーヒー豆およびカカオ豆、動物（マウス、カエル、小エビ）、食用キノコ（Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓなどのＡｇａｒｉｃｕｓ、ＰｌｅｕｒｏｔｕｓやＬｅｎｔｉｎｕｓ）、カビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、細菌（Ｐ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｘ．ｍａｌｔｉｐｈｉｌｉａなどのＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａなどのＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ属、Ｓ．ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｃａｓｔａｎｅｏｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓなどのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｖｉｂｒｉｏ ｔｙｒｏｓｉｎａｔｉｃｕｓなどのＶｉｂｒｉｏ属、Ｒｏｓｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍなどのＴｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ属、Ｍ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａなどのＭａｒｉｎｏｍｏｎａｓ属、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｔｅｎｕｉｓなどのＡｌｔｅｒｎａｒｉａ属、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ属またはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属）に由来する。
【００１３】
好ましい実施形態では、酵素は、ジャガイモ、あるいはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ科に属する細菌、または以前はシュードモナスに分類されていたザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、または初めはＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓに分類されていたＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓと近縁の細菌に由来する。特に、チロシナーゼが由来してよいのは、本発明に関連して２０００年６月１６日に番号ＤＳＭ１３５４０としてＤＳＭＺ（Ｄｕｅｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨ）に寄託された菌株により代表される属および種に属する微生物株である。この株は、シュードモナス属のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｂｅｔｅｌｉに非常に類似しているが、シュードモナス科（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ）、ステノトロフォモナス属（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ）、ステノトロフォモナス種（Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）に属すると同定された。
【００１４】
チロシナーゼはまた、ラッカーゼを産生することが知られている微生物、例えばＴ．ｈｉｒｓｕｔａまたはＴ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒなどのＴｒａｍｅｔｅｓやＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ起源の物でもよい。
【００１５】
ウール、ウール含有材料または他のタンパク質性繊維含有材料１ｋｇ当たりのチロシナーゼ処理用量は、タンパク質繊維材料に対し１　ｎｋａｔ／ｇ〜５０００　ｎｋａｔ／ｇまたはタンパク質繊維材料に対し１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｇ／ｋｇである。好ましくは、処理用量は、１０ｎｋａｔ／ｇ〜５００ｎｋａｔ／ｇまたは１００ｍｇ／ｋｇから５ｇ／ｋｇである。処理時間は、５分〜２４時間、特に好ましくは、３０分から２時間である。この処理は、加工の様々な段階で実施することができる。この処理は、収縮条件前、その途中、および／またはそのあいだ、および／または染色やその他の仕上げ段階の前および／またはその間に実施することができる。
【００１６】
処理は、ｐＨ３〜８の範囲のｐＨ、好ましくは５〜７の範囲のｐＨで実施することができる。加工温度は、２０〜８０℃、好ましくは３０〜７０℃、最も好ましくは４０〜５０℃がよい。
【００１７】
チロシナーゼ処理は、チロシナーゼの酵素活性を強める促進剤またはメディエーターと組み合わせることができる。チロシナーゼ処理は、アスコルビン酸などの還元剤と組み合わせることもできる。
【００１８】
さらにタンパク質性繊維は、チロシナーゼ処理の前、その間またはその後に、他の酵素処理または化学処理をすることもできる。酵素処理には例えば、プロテイナーゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、ラッカーゼ、ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、トランスグルタミナーゼまたはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ処理またはこれらの組合せがある。化学的処理は、収縮低減のために慣用的に使用されているいずれの化学的処理を含んでもよい。このような化学的処理とは例えば、塩素性収縮低減剤を用いる処理である。
【００１９】
チロシナーゼ処理は、湿潤剤および軟化剤などの化学的添加剤と組み合わせることもできる。
好ましくは、本発明のチロシナーゼ処理は、加工工程の前またはその間に、攪拌しながら、またはせずに実施する。
【００２０】
本発明は、本発明の方法で処理されたタンパク質由来繊維も提供する。より具体的には、請求項２７の特徴部の記載により特定されるタンパク質性繊維である。
【００２１】
この繊維は、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ラクダまたはウサギなどに由来する、ウール、ウール繊維またはアンゴラ、モヘア、カシミア、アルパカなどの獣毛、または商業的に有用な他の獣毛製品でよい。この繊維は、繊維、ウールトップ、紡糸、織物、ニットまたは衣料品の形であってよい。さらに、本発明の１つの目的は、本発明の方法により処理されたヒトの毛髪、シルク、クモシルクである。
【００２２】
本発明の好ましい一実施形態では、タンパク質性材料を、本発明に関連して寄託され受託番号ＤＳＭ１３５４０を有する菌株が代表する属または種に属する微生物から単離可能な新規の酵素で処理する。この株は、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．に属すると同定されている。この酵素の至適ｐＨは８．０であり、至適温度は４０〜５０℃である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより概算された分子量は、約９５０００Ｄａ（または９５±１ｋＤａ）であり、等電点電気泳動により概算されたｐＩ値は、約５（または５±０．５）であった。この酵素は、タンパク質性材料、特にウールを処理するために特に適している。タンパク質を架橋することにより、チロシナーゼは、ウールタンパク質の構造を安定化して、フェルト化条件でウール繊維のスケールが、毛元方向へスライドするのを防ぐ。この酵素は、酸素を消費する。即ち、ｐＨ５〜７および４０〜５０℃のウール処理に好適な条件下で、ウールタンパク質を酸化する。ＥＳＣＡにより測定したところ、酵素によりウール繊維のチロシン基を酸化すると、繊維表面に存在する炭素の酸化レベルが上昇した。
【００２３】
チロシナーゼ処理は、使用する加工法に応じていくつかの利点をもたらすことができる。この処理により架橋が増えると、より高い強度、より良好な皺特性およびフェルト化収縮の減少をもたらす。さらに、表面酸化によりぬれ性が変化すると、布の染色または捺染が改善される。繊維上に反応部位が生じると、染色特性の改善がもたらされる。
【００２４】
ウールの化学的酸化は、イオウ架橋の酸化をもたらし、結果として、繊維構造が弱くなり、繊維は機械的および化学的損傷をさらに受けやすくなる。一方、チロシナーゼでウール構造に存在するアミノ酸基を酸化すると、別のタイプの酸化が起こり、必ずしもイオウ架橋に影響しない。その結果、繊維強度を効率よく保つことができる。
【００２５】
前記の利点に加えて、もう１つの利点は、ウールまたは他のタンパク質含有動物性繊維のための防縮処理を主眼とする環境に優しい新規の方法である。この方法は世界のテキスタイル市場が要求している柔軟性および低公害特性を提供する。この方法はまた、ウールまたは他のタンパク質含有動物性繊維製衣服に洗濯機での洗濯可能性（ｍａｃｈｉｎｅ　ｗａｓｈａｂｉｌｉｔｙ）を付与し、それらの染色性および快適さを改善する。チロシン基から生じるキノンの官能性により、様々なタイプの化学薬品をこれらの部位を介してウール繊維にグラフトすることも可能である。
【００２６】
＜寄託＞
本発明で単離された微生物株は、ブタペスト条約に従い、２０００年６月１６日にＤＳＭＺ、Ｄｕｅｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨ（Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ　Ｗｅｇ１ｂ、Ｄ−３８１２４、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ所在）に寄託し、ＤＳＭ１３５４０と指定された。この株は、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．に属すると同定された（ＩＤ００−３０９）。
【００２７】
発明の詳細な説明
「タンパク質性繊維」との用語は、ここではタンパク質由来繊維のことを意味する。これらの繊維はケラチン繊維構造を有するもの、あるいは、織られたり加工されて、衣服やタンパク質性繊維含有物品、例えばカーペット、帽子などにするためのものである。この用語には、ヒツジ、ヤギ、ラマ、ラクダまたはウサギなどに由来するウール、ウール繊維や獣毛、他の商業的に有用な獣毛製品が含まれる。例は、アンゴラ、モヘア、カシミア、アルパカ、メリノおよびシェットランドウールである。この用語にはさらに、シルク、クモシルクおよびヒトの毛髪が含まれる。繊維は、繊維、ヤーン、織物、ニットまたは衣料品の形であってよい。本発明により加工することができるタンパク質材料には、他の非タンパク質性成分との組成物、例えば、ウール（または他のタンパク質性繊維）とセルロース性繊維（木綿、リネン、ラミー、ジュート、サイザルなど）とのブレンドまたはウール（または他のタンパク質性繊維）とポリアミド、ポリエステル、ポリプロピレン、アクリル、スパンデックス、ナイロンなどの合成繊維、あるいは、ビスコース、レーヨン、アセテート、Ｌｙｏｃｅｌｌ（登録商標）、テンセル（登録商標）などの人造繊維とのブレンドなどが含まれる。本発明の組成物は、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも８０％のタンパク質性材料を含有する。
【００２８】
「タンパク質性繊維中のチロシン基の酸化」という表現は、ここでは、タンパク質性繊維中のチロシン基が、処理されていないタンパク質性繊維に比較して測定可能な量、酸化されることを意味している。この酸化は、例えばＥＳＣＡまたはラマン分光法により測定することができる。チロシン処理により酸化が起こるが、これはＯ／Ｃ比が、処理されていないタンパク質性繊維と比べ処理されたタンパク質性繊維で少なくとも５％、好ましくは７％、特に好ましくは少なくとも１０％増加することにより示される。繊維は、水酸化だけ、あるいは水酸化とそれに続くキノン形成によって酸化される。チロシン基の修飾をラマン分光法により測定すると、吸光度の変化は少なくとも５％で、好ましくは少なくとも１０％、特に好ましくは少なくとも２０％である。
【００２９】
「収縮」との用語は、ここでは、収縮条件下に加工した場合に、ウールなどのタンパク質性材料が縮む能力を意味している。
【００３０】
「収縮条件」とは、ここでは、ウールなどのタンパク質性材料が、フェルト化メカニズムによって不可逆的に縮む条件のことを意味している。フェルト化収縮をもたらす条件は、Ｍａｋｉｎｓｏｎ（１９７９年）に記載されている。特に機械的な攪拌を伴う水の存在は収縮を惹き起こすことが知られている。単独で、または組合せでフェルト化を増すと報告されている他の条件は、２０から６０℃、またそれ以上の温度、酸またはアルカリ、アルカリまたは中性媒体中の洗浄剤（石鹸）の存在、中性塩、潤滑剤、アルコールの存在および攪拌である。
【００３１】
「フェルト化収縮の低減」とは、ここでは、本発明の処理を伴わない収縮に比較しての収縮の低減を意味している。
【００３２】
「通常の防縮方法および化学薬剤」とは、ここでは、フェルト化収縮を制御または減少させるために現在、工業的に使用されている方法および化学薬剤を意味している。このような方法は、バッチまたは連続ベースで実施することができ、通常は、ウールの酸化、それに続くポリマーの塗布を含む多段階処理からなる。最も一般的に使用されている酸化剤は、塩素および塩素化剤または一過硫酸などの過酸素化合物である。ポリマーには、幅広く使用されているＨｅｒｃｏｓｅｔｔポリマー（ポリアミノアミド）または特別に開発された多くのポリマーのどれが含まれる。現在工業的に用られているのは、これらの酸化−ポリマー方法にかわるものとしては、ポリマーのみの方法だけである。この方法ではテキスタイルの表面上でポリマーを沈着させ硬化させる。これらの方法の適用性は限られており、人造テキスタイル物品にしか適用することができない。
【００３３】
「手触り」という用語は、布に触れ、その粗さ、ざらつき（ｈａｒｓｈｎｅｓｓ）、柔軟性または柔らかさを評価することにより得られる主観的な反応のことである。
【００３４】
「柔らかさ」という用語は、簡単に変形される表面および心地よい触覚を伴う柔軟なテキスタイルの感触のことである。
【００３５】
＜チロシナーゼ酵素＞
チロシナーゼは、補助基質として酸素を使用するフェノールオキシダーゼに属し、したがって、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ／ＮＡＤ（Ｐ）などの高価な補因子を反応で必要としないので、酵素方法に特に適している。チロシナーゼは、モノフェノールのｏ−水酸化およびｏ−ジフェノールからｏ−キノンへの酸化の両方を触媒する（ＥＣ１．１４．１８．１；モノフェノールモノオキシゲナーゼ、ＥＣ１．１０．３．１；カテコールオキシダーゼ）（Ｌｅｒｃｈ、１９８１年）。したがって、酵素活性を２種の異なる反応に分けることは、同じ酵素により触媒される２種の反応を区別することになる（Ｍａｙｅｒ、１９８７年）。ウールは、かなりの量のチロシン基を含み、その量はタンパク質がウール繊維中のどこに存在するか、すなわち繊維のキューティクル、毛皮質、耐性膜または細胞間セメントに由来するかどうか、で決まる。ウールは全体で約３〜４％のチロシンを含有し、細胞間セメントは、７％を上回るチロシンを含有する。したがって、チロシナーゼは特に、ウールまたは他のタンパク質繊維の特性を改変するのに役立つ。
【００３６】
チロシナーゼとラッカーゼはともに、分子酸素を用いてとてもよく似た基質を酸化するが、両者は区別することができる。チロシナーゼの典型的な特性は、ｐ−ジフェノールの酸化を触媒することができないことである（ＭａｙｅｒおよびＨａｒｅｌ、１９７９年）。一方、ラッカーゼ活性の証拠としては、チロシンを酸化させることはできないが、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）を酸化させることができることが挙げられる（Ｍａｙｅｒ、１９８７年）。　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ（Ｍｅｒｃａｄｏ−Ｂｌａｎｃｏ　ｅｔ　ａｌ．、１９９３年）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（Ｂｅｒｎａｎ　ｅｔ　ａｌ．、１９８５年；Ｈｕｂｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、１９８５年；Ｋａｗａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．、１９９３年；Ｉｋｅｄａ　ｅｔ　ａｌ．、１９９６年）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ（Ｆｕｊｉｔａ　ｅｔ　ａｌ．、１９９５年）、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　Ｃｒａｓｓａ（Ｋｕｐｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、１９８９年）、Ｒａｎａ　ｎｉｇｒｏｍａｃｕｌａｔａ（Ｔａｋａｓｅ　ｅｔ　ａｌ．、１９９２年）、Ｍｕｓ　ｍｕｓｃｕｌｕｓ（Ｋｗｏｎ　ｅｔ　ａｌ．、１９８８年；Ｍｕｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．、１９８８年）およびＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎｓ（Ｋｗｏｎ　ｅｔ　ａｌ．、１９８７年；Ｇｉｅｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．、１９９１年）のチロシナーゼの一次構造は分析されていて、かなりの相同性を有する。これらの酵素全ての触媒ドメインには、ヘモシアニンと同様、双核銅中心（ｂｉｎｕｃｌｅａｒ ｃｏｐｐｅｒ ｃｅｎｔｅｒ）が１つある（Ｇａｙｋｅｍａ　ｅｔ　ａｌ．、１９９１年）。
【００３７】
食品タンパク質を架橋するチロシナーゼの能力は、既に調査されている（ＭａｔｈｅｉｓおよびＷｈｉｔａｋｅｒ、１９８７年）。ＭａｔｈｅｉｓおよびＷｈｉｔａｋｅｒ（１９８４ａ）によると、チロシナーゼによる架橋の形成は、チロシンからのｏ−キノンの形成を介して進行する。これらのｏ−キノンは、相互に縮合するか、タンパク質中のアミノ基およびスルフヒドリル基と反応する（ＭａｔｈｅｉｓおよびＷｈｉｔａｋｅｒ、１９８４ａ）。さらにチロシナーゼは、チロシン基のｐ−ヒドロキシフェニル基の酸化を触媒することができ、したがって、タンパク質の架橋をもたらす（ＭａｔｈｅｉｓおよびＷｈｉｔａｋｅｒ、１９８４ｂ；ＥＰ９４７１４２号）。
【００３８】
チロシンまたはチロシン含有ポリペプチドなどの低分子量のフェノール系化合物または他の非フェノール系メディエーターを加えると、タンパク質を架橋または改変するチロシナーゼの能力を高めることができる。メディエーターとしてチロシンを使用する場合には、酵素により生じたｏ−キノンが、タンパク質中のアミノ、スルフヒドリル、チオエーテル、フェノール、インドールおよびイミダゾール基と反応できる（ＭａｔｈｅｉｓおよびＷｈｉｔａｋｅｒ、１９８４ａ；ＭａｔｈｅｉｓおよびＷｈｉｔａｋｅｒ、１９８４ｂ）。
【００３９】
チロシナーゼは、コラーゲン繊維の成分であるトロポコラーゲン高分子を重合するために使用されている（Ｄａｂｂｏｕｓ、１９６６年）。分子間および分子内チロシン残基架橋の形成が、重合をもたらす。
【００４０】
タンパク質性材料の改変に適した新規のチロシナーゼは、チロシナーゼ活性の基質として適切なタンパク質を包含する加工工程または天然環境から単離された微生物から見つけることができる。微生物を適切なスクリーニング培地上で培養することにより、微生物をチロシナーゼ活性に関してスクリーニングし、純粋な培養物として単離する。微生物はチロシナーゼ産生を誘導する適切な液体培地中で培養する。また、チロシナーゼはベリー類、果実（グレープ、リンゴ、ナシ、モモ、バナナ）、野菜（ジャガイモ、キャベツ、エンドウ豆、豆、キュウリ、トマト、ホウレンソウ、オリーブ）、穀類（大麦、小麦、ライ麦）、茶、コーヒー豆およびカカオ豆、動物（マウス、カエル、小エビ）、食用キノコ（Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ、ＰｌｅｕｒｏｔｕｓまたはＬｅｎｔｉｎｕｓなどのＡｇａｒｉｃｕｓ）、カビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、細菌（Ｐ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｘ．ｍａｌｔｉｐｈｉｌｉａなどのＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｓ．ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａなどのＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄａｃｅａｅ科に属する他の細菌、Ｓ．ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓなどのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓ．ｃａｓｔａｎｅｏｇｌｏｂｉｓｐｏｒｕｓなどのＳ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｖｉｂｒｉｏ．ｔｙｒｏｓｉｎａｔｉｃｕｓなどのＶｉｂｒｉｏ、Ｒｏｓｅｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ　ｒｏｓｅｕｍなどのＴｈｅｒｍｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅａなどのＭａｒｉｎｏｍｏｎａｓ、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ｔｅｎｕｉｓなどのＡｌｔｅｒｎａｒｉａ、ＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓまたはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ）から単離することもできる。チロシナーゼは、ラッカーゼを産生することが知られている微生物から、例えばＴ．ｈｉｒｓｕｔａ、Ｔ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒなどのＴｒａｍｅｔｅｓから、またはＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａから単離することもできる。
【００４１】
必要なｐＨおよび温度特性を有するチロシナーゼを、ウールまたは他のタンパク質性材料と反応させることができる。チロシナーゼは、培養濾液のかたちで、または部分的にまたは完全に精製されたタンパク質として適用することができる。チロシナーゼをコードする遺伝子を、前記の微生物からクローニングし、続いて、適切な生産生物に移すことができる。適切な発現および産生ホストは、例えば、ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどのカビ、酵母、ＢａｃｉｌｌｕｓおよびＥ．ｃｏｌｉなどの細菌である。効率のよいチロシナーゼのスクリーニングは、酵素反応の間の酸素消費を測定することにより実施することができる。
【００４２】
＜繊維、糸または布の処理条件＞
あらゆる形態のタンパク質性繊維、好ましくはウールまたはウール含有材料であるタンパク質性繊維１ｋｇ当たりのチロシナーゼ処理用量は、タンパク質繊維材料に対し１　ｎｋａｔ／ｇ〜５０００　ｎｋａｔ／ｇまたはタンパク質繊維材料に対し１０ｍｇ／ｋｇ〜５０ｇ／ｋｇである。好ましくは、処理用量は、１０ｎｋａｔ／ｇ〜５００ｎｋａｔ／ｇまたは１００ｍｇ／ｋｇから５ｇ／ｋｇである。処理時間は、５分〜２４時間、特に好ましくは、３０分から２時間である。この処理は、ｐＨ３〜８の範囲のｐＨ、好ましくは５〜７の範囲のｐＨで実施することができる。加工温度は、２０〜８０℃、好ましくは３０〜７０℃、特に好ましくは４０〜５０℃であってよい。この処理は、加工の様々な段階で実施することができる。この処理は、防縮加工の前、その間、および／またはその下で、かつ／または染色またはその他の仕上げ段階の前および／またはその間に実施することができる。さらにこの処理は、他の化学的ステップを伴わずに、実施することもできる。
【００４３】
この酵素的加工方法は、化学的耐収縮処理と同様に、ウール加工のどの段階―繊維からニットや織物製品まで―でも実施することが可能である。同様に、酵素加工方法は染色の前またはその後に実施することもできる。さらに酵素処理は、酵素段階の前またはその後に、酸化などの化学的処理と組み合わせることもできる。さらに酵素段階は、アスコルビン酸などの還元剤と組み合わせて実施することもできる。可能性の１つは、化学的処理の条件が酵素方法に適合する場合に、化学的処理と酵素処理とを同時に行うことである。処理は様々なタイプの繊維機械中で、例えば、ニットを処理する場合にはサイドパドルまたはロータリーマシーン中で、または織物を処理する場合には、ウインチ、ジェットまたはジグ中で実施することができる。
次の実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【００４４】
（実施例）
実施例１　ウール加工工場から単離された微生物からチロシナーゼを得るためのスクリーニング
【００４５】
ウール加工工場からの埃、ウールおよび粉塵サンプルを、工程の様々な段階で集めた。微生物を単離するために、液体サンプルは１ｍｌを生理食塩水（ＮａＣｌ０．９ｗ／ｖ％溶液）で１０ｍｌに希釈した。固体サンプルは約１ｇを生理食塩水１０ｍｌに浸漬し、その後、全てのサンプルを、２００ｒｐｍで２時間攪拌した。攪拌の後に、希釈溶液を調製した（通常、１０−２〜１０−４）。細菌株はカビの成長を抑制するためにベノミル（Ｓｉｇｍａ）０．０１％を含有する生菌数寒天（Ｐｌａｔｅ　Ｃｏｕｎｔ　Ａｇａｒ）プレート（ＰＣＡ−プレート）上でサンプルを培養して稀釈液から単離した。糸状菌株は細菌の成長を抑制するためにクロラムフェニコールおよびクロルテトラサイクリン（Ｓｉｇｍａ）０．０１％を含有する麦芽エキス寒天（Ｍａｌｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　Ａｇａｒ）プレート（ＭＥＡ−プレート）を使用して単離した。全ての微生物を３０℃で生育させた。最初の培養後、細菌のコロニーまたはカビ胞子をそれぞれＰＣＡ−またはＭＥＡ−プレートに継代して接種することにより、純粋な培養を調製した。
【００４６】
様々な呈色試薬を、プレート培養における酸化酵素活性のインジケータとして使用した（表１）。チロシン（Ｓｉｇｍａ）を、チロシナーゼ特異的インジケータとして使用した。使用したラッカーゼ特異的インジケータは、グアイアコール（Ｍｅｒｃｋ）であった。加えて、Ｒｅｍａｚｏｌ　Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒ（ＲＢＢＲ、Ｓｉｇｍａ）を、酸化酵素活性のためのインジケータとして使用した。グアイアコールおよびＲＢＢＲは、Ｐａａｓｉｖｉｒｔａ（２０００）に記載されているように使用した。
【００４７】
【表１】
スクリーニングで使用された特異的インジケータ、その色反応およびプレート上での濃度
2004506816.tif 000002
ＲＢＢＲ＝レマゾールブリリアントブルーＲ
【００４８】
カビ約３０種および細菌約９５種を、ウール加工工場から分離して純粋培養とし、チロシナーゼ、ラッカーゼおよびペルオキシダーゼ活性に関してスクリーニングした。これらのスクリーニングされた微生物のうちに、ラッカーゼやペルオキシダーゼ陽性と判明したものは無かったが、８種の細菌がチロシナーゼ陽性であると判明した（表２）。
【００４９】
【表２】ウール加工工場から単離されたチロシナーゼ陽性細菌の由来
2004506816.tif 000003
【００５０】
ＢＷ６５は本発明で単離された細菌株で、２０００年６月１６日にＤＳＭＺ−Ｄｕｅｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇ　ｖｏｎ　Ｍｉｋｒｏｏｒａｎｉｓｍｅｎ　ｕｎｄ　Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ　ＧｍｂＨに番号ＤＳＭ１３５４０として寄託された。寄託された株は、ＤＳＭＺにより、Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．であると同定された。この株はＤＳＭＺの同定によってもＳｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ　ｍａｌｔｏｐｈｉｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｂｅｔｅｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｈｉｂｉｓｃｉｃｏｌａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｅｎｉｃｕｌａｔａと同定することも可能であった。
【００５１】
実施例２　ＤＳＭ１３５４０によるチロシナーゼの産生
寄託株ＤＳＭ１３５４０を、グルコース２０ｇ／ｌ、カゼイン２．５ｇ／ｌ、チロシン２ｇ／ｌおよびウール２ｇ／ｌを含有する培地を使用して培養した。ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、中性プロテイナーゼおよびチロシナーゼ酵素活性を、培養の間に測定した。加えて、生菌数および培養液のｐＨを測定した。チロシナーゼ活性は、菌がその定常期に達したときに、最高値に達した（図２）。最も高いチロシナーゼ活性は、約８ｎｋａｔ／ｍｌであった。ラッカーゼ活性もペルオキシダーゼの活性も、培養液中に検出されなかった。
【００５２】
チロシナーゼ活性を、基質として２ｍＭのＤＬ−ＤＯＰＡ（Ｓｉｇｍａ）を使用して測定した。基質溶液のｐＨを、０．０５Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液を用いて７に調節した。サンプル４０μｌを、２ｍＭのＤＬ−ＤＯＰＡ溶液９６０μｌと混合した。Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｌａｍｂｄａ　２０−分光光度計を用いて、３０℃で３分間、４７５ｎｍでの吸収の増加を測定することにより、チロシナーゼ活性を求めた。
チロシナーゼ活性（ｎｋａｔ／ｍｌ）＝（１０６×ΔＡｂｓ４７５ｎｍ×Ｖｔｏｔ）／（Ｖｎ×ｔ×ε×ｋ×ｌ）により、活性を算出した
［上式中、
ΔＡｂｓ４７５ｎｍは、４７５ｎｍでの反応時間内での吸収の増加であり、
Ｖｔｏｔは、全容量（１ｍｌ）であり、
εは、酸化されたドーパクロムのモル吸光係数（３４００ｌｍｏｌ−１ｃｍ−１）であり、
ｔは、反応時間（秒）であり、
Ｖｎは、サンプルの容量（０．０４ｍｌ）であり、
ｋは、希釈係数であり、
ｌは、キュベット中での光通過距離（１ｃｍ）である］。
チロシナーゼ活性の１単位（ｋａｔａｌ）は、３０℃およびｐＨ７．０で、１秒間にドーパクロム１モルの形成を触媒する酵素の量と定義される。
【００５３】
培養中様々な時間間隔でサンプル１ｍｌを採取した。プロテイナーゼ活性はフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ、Ｓｉｇｍａ）の１７ｍｇ／ｍｌ溶液０．１ｍｌをサンプルに加えることにより阻害した。上澄みを４℃で遠心分離して澄明にし、この上澄みを用いてチロシナーゼ活性を測定した。
【００５４】
実施例３　ジャガイモチロシナーゼの単離
ジャガイモチロシナーゼを、Ａｓｔｅｒｉｘというジャガイモの品種から単離した。新鮮重量で５００ｇ、乾燥重量で９５ｇの剥皮後のジャガイモと０．１Ｍのリン酸Ｎａ緩衝液ｐＨ７．０　２００ｍｌとを、Ｗａｒｉｎｇ　Ｂｌｅｎｄｏｒ　ホモジナイザーをハイパワーで１５秒間４回使用して均質化した。この懸濁液をさらに、氷浴中で３０分間、７５０ｒｐｍで攪拌し、篩絹およびガラス繊維フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ　ＧＦ／Ｃ）で濾過した。最終濾液容量は、３００ｍｌであった。濾液中のチロシナーゼ活性を不活性化しているフェノールを、タンパク質を４℃で１時間、７０％硫酸アンモニア飽和で沈殿させることにより、タンパク質から分離した。沈殿物を０．１Ｍのリン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）２５０ｍｌに溶かした。粗製ジャガイモチロシナーゼは４℃で貯蔵した（表３）。
【００５５】
【表３】粗製ジャガイモチロシナーゼの調製
2004506816.tif 000004
粗製ジャガイモチロシナーゼは、タンパク質分解性の不純物を含有しなかった。
【００５６】
実施例４　新規のチロシナーゼの至適ｐＨおよび至適温度の決定
ＤＳＭ１３５４０株が産生した新規のチロシナーゼを、濃縮培養濾液からイオン交換クロマトグラフィにより部分的に精製した。培養濾液を限外濾過により濃縮し、濃縮物を、２５ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７で平衡化したＱ−セファロースアニオン交換体に吸着させた。酵素を出発緩衝液および０．３ＭのＮａＣｌを加えた出発緩衝液からなる勾配で溶離した。各分画のチロシナーゼおよびタンパク質分解活性を監視した。チロシナーゼ活性のみを有するフラクションをまとめ、新規の酵素を同定するために使用した。精製により、培養濃縮物中の活性の５８％が得られた。ｐＨ６．５〜９．０で部分的に精製された酵素調製物のチロシナーゼ活性を測定することにより、至適ｐＨおよび至適温度を決定した。基質としてＤＬ−ＤＯＰＡ（２ｍＭ）を使用し、反応混合物を１０分間インキュベーションし、その後、４７５ｎｍでの吸光を記録した。新規のチロシナーゼの至適温度は、至適ｐＨで、２０℃〜９０℃でのチロシナーゼ活性を測定することにより決定した。至適ｐＨは、８．０であり、至適温度は４０〜５０℃であることが判明した（図３Ａおよび３Ｂ）。
【００５７】
このチロシナーゼ酵素は、同時出願された国際特許出願にも記載されており、その内容は全て、ここで参照して援用することができる。この国際特許出願は、本出願と同日に提出されており、２０００年８月１５日に提出されたフィンランド特許出願２０００１８０８号に基づく。
【００５８】
実施例５　新規のチロシナーゼの分子量および等電点の決定
新規のチロシナーゼの生化学的特性は、標準的な技術により求められる。分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、ｐＩ値は等電点電気泳動により推定された。ＭＷは、約９５０００Ｄａであり、ｐＩ値は約５であった。
【００５９】
実施例６　新規酵素の基質特異性の決定
新規酵素の基質特異性は、基質として２ｍＭのチロシン、カテコールおよびＤＯＰＡを使用することにより決定した。ｐＨ８、５０℃でのこれらの基質に対する相対的活性はそれぞれ、１０、４０および１００％であった。
【００６０】
実施例７　新規なチロシナーゼをコードする遺伝子の単離
精製されたチロシナーゼタンパク質からＮ−末端および内部ペプチドの配列を決定した。ペプチド配列に基づき、オリゴヌクレオチドプローブを、通常のＰＣＲ技術により作成する。オリゴヌクレオチドプローブは、ＤＳＭ１３５４０ゲノムからチロシナーゼをコードする遺伝子をクローニングする際に使用する。
【００６１】
実施例８　酸素消費により測定されるチロシナーゼとウール繊維との反応性
様々なチロシナーゼ、即ちＡｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｏｐｒｕｓ（Ｓｉｇｍａ）、ジャガイモチロシナーゼ（実施例３から）およびＤＳＭ１３５４０チロシナーゼ（実施例２から）がウール繊維を酸化する能力を、ＶＴＴ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｓｔａｎｄａｒｄ　５５５５〜９５に従い、Ｏｒｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ９７〜０８酸素電極を用いて、密閉されたエーレンマイヤーフラスコ中での酵素反応の酸素消費を測定することにより、明らかにした。使用したチロシナーゼ用量は、５００または１０００ｎｋａｔ／ｇウール繊維であった。洗毛されたウール繊維を、基質として使用した。処理を、４５℃で、２００ｒｐｍの攪拌と共に実施した。使用したウール対液体比は、１：１００であった。溶解した酸素の濃度を、１５秒毎に４５分間測定した。
【００６２】
酸素消費により測定したところ、ジャガイモおよび新規の微生物チロシナーゼの両方が、ウールを酸化させることができた。Ａｇａｒｉｃｕｓ　ｂｉｓｐｏｒｕｓ−ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ（Ｓｉｇｍａ　Ｔ−７７５５）は、ウール繊維中のチロシン基を酸化させることはできなかった（図４）。この研究で単離された細菌ＤＳＭ１３５４０により産生されたチロシナーゼ（図５）は、ジャガイモチロシナーゼにくらべかなり多い酸素をウール繊維に消費した（図４）。
【００６３】
実施例９　ウール繊維特性に対する酵素処理の効果
ウール繊維（ウールトップ）を新規のチロシナーゼ（ＤＳＭ１３５４０）およびジャガイモチロシナーゼで処理した。処理は２０ｒｐｍで攪拌しながら、Ｌｉｎｉｔｅｓｔ　Ｐｌｕｓ装置（Ａｔｌａｓ）中で実施した。用いたウール対液体比は、１：１５だった。様々な酵素用量および処理条件を表４に示す。ｐＨは０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）で調節した。酵素を添加せずに対照処理を同様に実施した。プロテイナーゼは阻害するか、プロテイナーゼを含有しない酵素調製物を使用した。
【００６４】
【表４】ウール繊維処理での処理条件（処理時間は２時間）
2004506816.tif 000005
【００６５】
酵素処理は、繊維を７５℃で５分間、７５％酢酸で調節されたｐＨ３．０溶液に含浸させることにより停止した。その後、繊維を水道水で５分間すすぎ、５０℃で乾燥させた。ＳＦＳ２６００標準に従い、繊維を最終的に格付けした（湿度６５％±２％、温度２０℃±２℃）。
【００６６】
ウール繊維の重量損失は酵素処理の前と後に繊維を秤量することにより求めた。ウール繊維のアルカリ可溶性は、ＩＷＴＯ−４−６０（Ｄ）標準に従い測定した。ウール繊維の乾燥重量は、１０５℃でサンプルを一定重量になるまで乾燥させた後に秤量することにより求めた。ウール繊維の簡単な濡れ性試験は、標準条件下で繊維切片が脱イオン水中沈下する時間を測定することにより実施した。標準格付けされた（ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）繊維約１０ｍｇを、小さい切片に切断し、脱イオン水５０ｍｌの表面に慎重に置き繊維切片の沈下時間を記録した。ウール繊維のフェルトボール密度は、標準ＩＷＴＯ２０〜６９（Ｄ）（Ａａｃｈｅｎｅｒ　Ｆｉｌｚ　ｔｅｓｔ）に従い測定した。
【００６７】
＜ウール繊維の重量損失に対する酵素処理の効果＞
酵素処理の間に、１．７〜３．０％という軽度のウール繊維の重量損失が観察された。酵素処理は、対照品に比較して重量損失が増加するということはなかった（表５）。
【００６８】
【表５】ウール繊維の重量損失およびチロシナーゼおよびラッカーゼ処理の処理濾液のプロテイナーゼ活性
2004506816.tif 000006
【００６９】
＜ウール繊維の架橋度に対する酵素処理の効果＞
アルカリ可溶性を、ＩＷＴＯ４−６０に従って求めた。２、３の測定の平均を図６に示す。この結果によると、チロシナーゼ処理は架橋をもたらした（図６）。ＢＷＶ１は、同様の条件で処理されたが、酵素添加をしなかった対照区である。
【００７０】
＜ウール繊維の湿潤性およびフェルト化特性に対する酵素処理の効果＞
酵素により処理されたウール繊維の濡れ特性を、簡単な沈下試験により求めた。対照として処理された繊維よりも、酵素により処理された繊維が早く沈下した場合に、繊維の疎水性が低下したと判定した。疎水性の低下はジャガイモチロシナーゼ処理されたウール繊維で観察された。
【００７１】
＜フェルトボール密度に対する酵素処理の効果＞
ウールフェルト化特性を、ばら（ｌｏｏｓｅ）ウールについてＡａｃｈｅｎフェルト化試験を使用して試験した（表６）。この結果によると、フェルト化傾向が減少した（表６）。
【００７２】
【表６】チロシナーゼ処理されたウールサンプルのフェルト密度
2004506816.tif 000007
【００７３】
＜ＥＳＣＡおよびラマンにより分析されたウール繊維の化学組成に対する酵素処理の効果＞
ＥＳＣＡ分析によると、チロシナーゼ処理された繊維表面中の酸素（Ｏ）量の増加と表面の炭素量の減少により示されるように、ウール繊維の明確な酸化が生じた。その結果酸化の指標であるＯ／Ｃ比が高くなった（表７）。
【００７４】
【表７】酵素処理されたＢＩＯＷＯＯＬ標品の表面の元素組成（原子％）
2004506816.tif 000008
【００７５】
＜酵素処理されたウールトップのラマン分光分析＞
タンパク質のラマン・スペクトルは、アミノ酸類の特徴的な振動を示し、特に、６４３ｃｍ−１でのスペクトル強度はチロシンと関連付けることができる。大筋として集められたラマン・データは、プロジェクトの様々な段階で処理された比較可能なサンプル間で合理的な再現性を示し、加えて酵素系によりチロシンが改変された証拠がある（表８）。処理条件：０．１ＭのＮａＰ緩衝液、３０℃、ジャガイモチロシナーゼｐＨ７。
【００７６】
【表８】処理されたウールトップのラマン強度データ
2004506816.tif 000009
【００７７】
参照文献
【外１】
2004506816.tif 000010
【外２】
2004506816.tif 000011
【外３】
2004506816.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】チロシナーゼにより触媒される反応を示す図である。
【図２】チロシナーゼ産生細菌ＤＳＭ１３５４０を培養している間のチロシナーゼ活性、ｐＨおよび生菌の量を示す図である。ｃｆｕ＝コロニー形成単位。
【図３Ａ】本発明で単離されたＤＳＭ１３５４０により産生された部分的に精製されたチロシナーゼ活性の至適ｐＨを示す図である。基質は、２ｍＭのＤｏｐａで、５０℃で１０分間のインキュベーション、Ａ４７５ｎｍ。
【図３Ｂ】本発明で単離されたＤＳＭ１３５４０により産生された部分的に精製されたチロシナーゼ活性の至適温度を示す図である。基質は、２ｍＭのＤｏｐａで、５０℃で１０分間のインキュベーション、Ａ４７５ｎｍ。
【図４】酸素消費により測定される、様々なチロシナーゼとウール繊維との反応性を示す図である。
【図５】酸素消費により測定される、ＤＳＭ１３５４０により産生されたチロシナーゼとウール繊維との反応性を示す図である。
【図６】チロシナーゼ処理された標品のアルカリ可溶性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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