(57)【要約】本発明は、（ｉ）  ＨＩＶのＬＴＲ領域、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、（ｉｉ）  他のＨＩＶ分離株の対応する領域、（ｉｉｉ）  複数のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、またはそれらに相補的な配列に由来する少なくとも１０個連続したヌクレオチドを含む、少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを用いて、サンプル中のＨＩＶをサブタイプ非依存的および／または種非依存的に検出する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のＨＩＶの核酸と、２種以上のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの組合せとをハイブリダイズさせて、酵素的増幅ステップを実施することにより、サンプル中のＨＩＶの核酸をサブタイプ非依存的および／または種非依存的に検出する方法であって、該２種以上のオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ核酸と特異的にハイブリダイズするものであり、かつそれぞれが
（ｉ）  配列番号１〜１３に示す配列のうちの１つで表される、ＨＩＶのＬＴＲ領域、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の同一で高度に保存されている領域、
（ｉｉ）  他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）  数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
またはそれらに相補的な配列に由来する１０〜８０個連続したヌクレオチドを含むものである、上記方法。
【請求項２】
以下のステップ：
（ａ）  オリゴヌクレオチドがサンプル中に存在するＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２由来のＨＩＶ核酸とハイブリダイズする条件下で、サンプルをオリゴヌクレオチドと接触させること、
（ｂ）  サンプル中のＨＩＶ核酸の存在および／または量を決定すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
オリゴヌクレオチドの単一の組合せを用いる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＨＩＶ−１のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＯのサブタイプから選択される少なくとも７種のＨＩＶ−１サブタイプ、およびＨＩＶ−２のＡ、Ｂ、ＣおよびＤのサブタイプから選択される少なくとも２種のＨＩＶ−２サブタイプを検出する様式でサブタイプ非依存的に検出するように、前記オリゴヌクレオチドを選択する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ＨＩＶ−１のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＯのサブタイプから選択される少なくとも７種のＨＩＶ−１サブタイプと、さらにＨＩＶ−２のＡ、Ｂ、ＣおよびＤのサブタイプから選択される少なくとも１種のＨＩＶ−２サブタイプを検出する様式で種非依存的に検出するように、前記オリゴヌクレオチドを選択する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サンプル中のＨＩＶの核酸と、２組以上のオリゴヌクレオチドの組合せとをハイブリダイズさせて、酵素的増幅ステップを実施することにより、サンプル中のＨＩＶの核酸をサブタイプ非依存的および／または種非依存的に検出する方法であって、それぞれのオリゴヌクレオチド組合せは、
（ｉ）  配列番号１〜１３に示す配列のうちの１つで表される、ＨＩＶのＬＴＲ領域、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）  他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）  数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
またはそれらに相補的な配列に由来する１０〜８０個連続したヌクレオチドを含む第１のオリゴヌクレオチドと、ＨＩＶ核酸とサブタイプ特異的および／または種特異的なハイブリダイゼーションが可能な第２のオリゴヌクレオチドとを含むものであり、該オリゴヌクレオチド組合せが全体でＨＩＶのサブタイプ非依存的および／または種非依存的検出を可能とする、上記方法。
【請求項７】
ＨＩＶ−１のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＯのサブタイプから選択される少なくとも７種のＨＩＶ−１サブタイプ、およびＨＩＶ−２のＡ、Ｂ、ＣおよびＤのサブタイプから選択される少なくとも２種のＨＩＶ−２サブタイプを検出する様式でサブタイプ非依存的に検出するように、前記オリゴヌクレオチドを選択する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
検出のために少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを使用し、各オリゴヌクレオチドが
（ｉ）  配列番号２、４、５、６、８、９、１０、１２および１３に示す配列のうちの１つで表されるＨＩＶのＬＴＲ遺伝子、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）  他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）  数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
またはそれらに相補的な配列に由来する１０〜８０個連続したヌクレオチドを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＨＩＶ−１のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＯのサブタイプから選択される少なくとも７種のＨＩＶ−１サブタイプと、さらにＨＩＶ−２のＡ、Ｂ、ＣおよびＤのサブタイプから選択される少なくとも１種のＨＩＶ−２サブタイプを検出する様式で種非依存的に検出するように、前記オリゴヌクレオチドを選択する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
検出のために少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを使用し、各オリゴヌクレオチドが
（ｉ）  配列番号１、２、３、４、５、７、９、１０および１３に示す配列のうちの１つで表されるＨＩＶのＬＴＲ遺伝子、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）  他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）  数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
またはそれらに相補的な配列に由来する１０〜８０個連続したヌクレオチドを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチドが配列番号１４〜２５に示す配列を有するまたは含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１種のオリゴヌクレオチドが１個または数個の標識を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
以下の領域：
（ｉ）  配列番号４、５、９または１０に示す配列のうちの１つで表されるＨＩＶのｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）  他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）  数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
またはそれらに相補的な配列に由来する１０〜８０個連続したヌクレオチドを含むが、次のヌクレオチド配列：ＣＴＡＣＴＡＣＴＣＣ ＴＴＧＡＣＴＴＴＧＧ ＧＧＡＴＴＧ、またはその相補的配列を含まない、オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
以下の領域：
（ｉ）  配列番号４、５または９に示す配列のうちの１つで表されるＨＩＶのｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）  他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）  数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
またはそれらに相補的な配列に由来する１０〜８０個連続したヌクレオチドを含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号１４、１６、１７、１８、２０、２２、２３、２４および２５に示す配列のうちの少なくとも１つを含むオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドの３’末端に、ＨＩＶ−１のサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＯ、およびＨＩＶ−２のサブタイプＡ、Ｂ、ＣおよびＤの核酸とのミスマッチがない、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
１個または数個の標識を有する、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを含む数種のオリゴヌクレオチドの組合せであって、該少なくとも２種のオリゴヌクレオチドはそれぞれが、
（ｉ）  配列番号１〜１３に示す配列のうちの１つで表されるＨＩＶのＬＴＲ領域、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）  他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）  数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
またはそれらに相補的な配列に由来する１０〜８０個連続したヌクレオチドを含み、かつ該組合せは酵素的増幅を可能とするように選択される、上記組合せ。
【請求項１９】
請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを、場合によりＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２の単一のサブタイプに特異的な配列をそれぞれが含有する追加のオリゴヌクレオチドとともに、含む数種のオリゴヌクレオチドの組合せであって、該オリゴヌクレオチドが全体でＨＩＶのサブタイプ非依存的および／または種非依存的検出を可能とする、上記組合せ。
【請求項２０】
ＨＩＶまたはその核酸を検出するためのプライマーおよび／またはプローブとしての請求項１３〜１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項１８もしくは１９に記載のオリゴヌクレオチドの組合せ、ならびにサンプル中の核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅を行うための手段を含む試薬キット。
【請求項２１】
ＨＩＶのサブタイプ非依存的および／または種非依存的検出のためのプライマーおよび／またはプローブとしての、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの組合せの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、サンプル中のＨＩＶのサブタイプ非依存的および／または種非依存的検出方法、および該方法に好適なオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
ＨＩＶの検出は、分析診断学において、極めて重要である。ＨＩＶ特異的抗体、逆転写酵素などのＨＩＶタンパク質またはＨＩＶに特異的な核酸の免疫学的検出に基づく多くの検出方法がある。
【０００３】
ＨＩＶおよびその遺伝物質は、体液中に極めて低濃度でしか存在しないため、検出方法の感度が前記方法の有用性において重要な要因となる。
【０００４】
この理由のために、現在では、検出する核酸の増幅に基づくＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）が、より広範に用いられるようになりつつある。ＨＩＶを直接検出するための該方法の適用については、例えば、ＥＰ−Ｂ−０ ２００ ３６２およびＥＰ−Ｂ−０ ２０１ １８４に記載されている。
【０００５】
ＰＣＲすなわちポリメラーゼ連鎖反応により、検出する核酸に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド（いわゆる、プライマー）を用いて、核酸を部分的に増幅できる。この過程で生成する増幅産物を、次に、他の特異的なオリゴヌクレオチド（いわゆる、プローブ）を用いて検出できる。
【０００６】
ＨＩＶの検出に成功するＰＣＲの必須条件は、一つには、用いるプライマーの相補的塩基配列が、検出する核酸の塩基配列とできるだけ正確に一致し、そのハイブリダイゼーションができるだけ特異的であることである。しかし、一方では、同じプライマーを用いて、できるだけ多くのＨＩＶ変異体を増幅できると有利である。
【０００７】
ＨＩＶ−１の発見以来、起源の異なるＨＩＶの核酸配列には相違があることがわかってきた。ＨＩＶ−１の種々のタイプは、通常、サブタイプと呼ばれている。現在、少なくとも９種のサブタイプが知られており、サブタイプＡ〜ＨおよびＯと命名されている（ヒトレトロウイルスおよびエイズ（Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ＡＩＤＳ）、 Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， Ｎａｔｌ． Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ， Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ， １９９４； Ｇ．Ｍｅｙｅｒｓら出版、Ｉ−Ａ−Ｉ）。ＨＩＶ−１の公知のサブタイプ全てを認識できるプライマーまたはプローブは、未だ開発されていない。さらに、同じプライマーおよびプローブで、ＨＩＶ−２およびそのサブタイプも検出できると有益でもある。現在、ＨＩＶ−２のサブタイプは、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤが知られている。
【０００８】
いくつかの特許出願において、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブが開示されているが、それらは、本出願には包含されない。
【０００９】
ＷＯ９６／０２５５７は、ＨＩＶの増殖を阻害するため、および該ウイルスを検出するための、オリゴヌクレオチドの一般的な使用について記載している。しかし、種非依存的、またはサブタイプ非依存的な検出についての適合性は言及していない。
【００１０】
ＨＩＶ−１分離株Ｂｒｕ、ＭａｌおよびＥｌｉのｇａｇ、ｖｐｒ、およびｐｏｌ遺伝子の保存されている領域に由来の塩基配列、ならびにＨＩＶ−２のＲＯＤおよびＳＩＶ Ｍａｃの対応する領域とそれぞれハイブリダイズするプライマーおよびプローブは、欧州特許出願ＥＰ ０ ４０３ ３３３に記載されている。さらに、ＨＩＶ−１のＢｒｕ、ＭａｌおよびＥｌｉの、ｅｎｖ、ｎｅｆ１、ｖｉｆ１、およびｖｐｒ遺伝子に由来する部分とそれぞれハイブリダイズするプライマーおよびプローブ、ならびにＨＩＶ−２のＲＯＤおよびＳＩＶ Ｍａｃの、ｎｅｆ２、ｖｉｆ２、およびｖｐｘ遺伝子に由来する部分とハイブリダイズするプライマーおよびプローブが開示されている。これらのオリゴヌクレオチドには、明らかに種非依存的にハイブリダイズするものもあるが、個々のウイルスのどのサブタイプが認識されるのかということに関する記載はない。
【００１１】
ＨＩＶ−１のサブタイプだけを検出できるさらなるＨＩＶ検出方法が、例えばＥＰ ８３９ ９１７、ならびに、後に公開されたＥＰ ８８７ ４２７、ＷＯ９９／０７８９８、およびＷＯ９８／５８０８６の出願に開示されている。ＨＩＶ−１のｐｏｌ遺伝子に対する配列部分を増幅し、それにより、ＨＩＶ−１の５種のサブタイプを認識できるプライマーおよびプローブが、欧州特許出願ＥＰ ７２７ ４９７ に開示されている。
【００１２】
ＥＰ ０ ６１７ １３２もまた、ＨＩＶ−１とその系統学的近縁種（ＨＴＬＶ−ＩＩまたはＨＩＶ−２など）を識別できる、ＨＩＶ−１検出用のプライマーおよびプローブを開示している。この場合、選択されるオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶゲノム由来の、ＬＴＲおよび構造遺伝子のほとんどを含む多くの領域とハイブリダイズする。しかし、サブタイプ非依存的な検出についての適合性には言及していない。
【００１３】
さらに、先行技術には、標的オリゴとのハイブリダイゼ―ションによる精製にオリゴヌクレオチドを用いる方法がある（例えば、ＷＯ９８／２７４２５）。しかし、このようなオリゴはＨＩＶのサブタイプ非依存的検出には適していない。
【００１４】
ＷＯ９０／０１０６９は、ＨＩＶ検出用のオリゴヌクレオチド対を開示しているが、かかるオリゴヌクレオチド対は酵素的増幅用のプライマーとしては用いられず、同一の鎖とハイブリダイズし、その結合後に所望の配列をそれら自身が示す。
【００１５】
以前から、１対のプライマーで、サブタイプ非依存的および／または種非依存的な検出に好適なものはなく、現在は、数対のプライマーを用いて増幅させることが多い。しかし、これは、一つには、試薬の経費の増大をもたらし、またもう一つには、ＰＣＲが極度に複雑化する。
【００１６】
従って、本発明の目的は、サンプル中のＨＩＶのサブタイプ非依存的（重複する）および／または種非依存的（重複する）検出方法を提供することであった。特に、本発明の一つの目的は、以前に可能であったものより多くのＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２のサブタイプを検出できる方法を提供することであった。
【００１７】
本発明のこの目的は、サンプル中のＨＩＶ核酸と少なくとも１種のオリゴヌクレオチドとをハイブリダイズさせて、サンプル中のＨＩＶの核酸をサブタイプ非依存的および／または種非依存的に検出する方法であって、この少なくと１種のオリゴヌクレオチドはＨＩＶ核酸と特異的にハイブリダイズするものであり、かつ
（ｉ）  配列番号１〜１３に示す配列のうちの１つで表される、ＨＩＶのＬＴＲ領域、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）  他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）  数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
または、これらに相補的な配列に由来する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むものである、上記方法により達成される。
【００１８】
好ましくは、サンプル中のＨＩＶ核酸と、２種または数種のオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの組合せとハイブリダイズさせて、増幅ステップを実施することにより、サンプル中のＨＩＶの核酸をサブタイプ非依存的および／または種非依存的に検出する方法であって、該２種または数種のオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ核酸と特異的にハイブリダイズするものであり、かつそれぞれが
（ｉ）  配列番号１〜１３に示す配列のうちの１つで表される、ＨＩＶのＬＴＲ領域、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）  他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）  数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
または、これらに相補的な配列に由来する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むものである上記方法により、上記目的が達成される。
【００１９】
本発明の方法は、以前に先行技術を用いることで可能であったものより多くのＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のサブタイプを検出（サブタイプ非依存的検出）できる。サブタイプ非依存的検出は、それぞれの種の少なくとも２つのサブタイプを単一のプローブ、または単一のオリゴヌクレオチドの組合せを用いて検出できることを意味する。上述したように、以前は、ＨＩＶ−１のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＯのサブタイプを、単一のプローブ、または２種のオリゴヌクレオチドからなる１対の増幅用プライマーを用いて、従来の検出方法を利用して検出することができなかった。現在、本発明の方法によれば、極めて少ない種のオリゴヌクレオチドを用いて、そして、最良の場合は、同一のオリゴヌクレオチドを用いて、ＨＩＶ−１の９種のサブタイプのうち少なくとも７種を、特に、他のサブタイプとともにサブタイプＯも含めて、検出可能である。好ましい実施形態では、すでに公知の９種のサブタイプの全てを検出できる。サブタイプ非依存的試験は、ＨＩＶ−２のＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤのサブタイプのうち、少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種、そして最も好ましくは全種の検出が可能である。サブタイプ非依存的検出に加えて、種非依存的なＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の核酸を検出することも可能である。種非依存的とは、免疫不全ウイルスの異なる種（例えば、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２）を、同じヌクレオチドを用いて検出できることを意味する。好ましくは、現在公知の９種のＨＩＶ−１サブタイプのうち少なくとも７種と、その他に、現在公知のＨＩＶ−２のサブタイプが検出される。特に好ましくは、９種のＨＩＶ−１のサブタイプ全てに加えて、さらにＨＩＶ−２のサブタイプを、特に好ましくは、さらに現在公知の全てのＨＩＶ−２のサブタイプを検出できる。
【００２０】
本発明の方法は、プライマーとして、またはプローブとして機能可能な特定のオリゴヌクレオチドを用いて、ＨＩＶの核酸の部分を増幅することに基づいている。
【００２１】
オリゴヌクレオチドは、一本鎖の直鎖状核酸分子である。一般に、オリゴヌクレオチドは、１０〜１００塩基を有している。本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜８０ヌクレオチド長であることが好ましく、特に好ましくは１０〜６０、さらに好ましくは１０〜３０ヌクレオチド長であり、そして、最も好ましくは２０〜３０ヌクレオチド長である。核酸と同様に、本明細書では、オリゴデオキシリボヌクレオチドとオリゴリボヌクレオチドとを区別する。しかしながら、オリゴリボヌクレオチドは水酸基の水素がアリル基などの有機残基で置換された化合物も含む。このような化合物は、当業者には、かなり以前から周知である。さらに、「オリゴヌクレオチド」という用語は、糖リン酸主鎖がペプチド主鎖に置き換わった分子も指すことがある。該化合物群は、ＰＮＡと呼ばれる。全てのオリゴヌクレオチドの共通な特徴としては、相補的な塩基と水素結合を形成できる塩基を主鎖に有していることである。該塩基は、天然の塩基である、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＴおよびＵを含み、ｄｅａｚａ−Ｇのような人工的な塩基も含む。
【００２２】
オリゴヌクレオチドプライマーとは、第２の同様に一本鎖の核酸とハイブリダイズでき、続いて、例えばＤＮＡポリメラーゼのような適切な酵素により、鋳型として働く第２の核酸に沿ってヌクレオシド三リン酸により伸長して二本鎖核酸を形成するオリゴヌクレオチドである。従って、プライマーは、通常、３’末端つまりヌクレオチド成分が結合する末端にある糖の３’のＣ原子に水酸基を有している。
【００２３】
オリゴヌクレオチドの組合せは、数種のオリゴヌクレオチドを含み、また好ましくは、プライマー対、または、プライマー対とプローブというような、プライマーおよびプローブの組合せを含む。プライマー対は、核酸の特定部分の増幅（好ましくは酵素的増幅）を可能にする２種のオリゴヌクレオチドプライマーからなる。好ましくは、プライマー対のプライマーの双方が、由来する核酸の異なる鎖とハイブリダイズし、それぞれの伸長産物が互いに重なり合う。その結果、各プライマーは他のプライマーの伸長産物とハイブリダイズでき、２つのプライマーの間の部分が増幅産物として増加する。いわゆるプローブもまた、一本鎖オリゴヌクレオチドであり、プライマーとしても働くが、主に、すでに増幅された核酸の部分に特異的にハイブリダイズさせるのに用いられ、このことにより核酸の検出が可能になる。このように、オリゴヌクレオチドという名称は、機能のみが相違するプライマーという用語とプローブという用語を包含する。本発明の方法に用いるオリゴヌクレオチドは、放射性標識または蛍光標識などのマーカー基を含んでもよい。特に、プローブは標識を有する。
【００２４】
増幅とは、核酸または核酸の部分が増加することと解する。公知の増幅方法は、前述のＰＣＲである。該方法では、通常の二本鎖ＤＮＡ分子をまず変性させ、即ち一本鎖に開裂させる。続いて、増幅プライマーを、標的ＤＮＡ配列と該プライマーのハイブリダイゼーションを可能にする条件下で添加する。その後、ポリメラーゼ酵素およびヌクレオチド成分を用いて核酸鋳型に沿って該プライマーを伸長させる。続いて、新たに形成された二本鎖核酸を再び変性し、新たなポリメラーゼのサイクルを開始する。従来のＰＣＲ法は、典型的には２５〜４０サイクルを使用する。本発明の意味する増幅は、二本鎖ＤＮＡの変性などの核酸の増幅に必要な調製のステップも含むことがある。
【００２５】
本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション」は、２本の相補的な核酸一本鎖が結合して、二本鎖を形成することを意味する。該一本鎖は、このために１００％の相補性を有している必要はなく、その塩基配列に偏りがあってもよい。しかし、本発明の方法における適切なハイブリダイゼーションを達成するには、該一本鎖（この場合は、オリゴヌクレオチド）が、一般的なハイブリダイゼーション条件下で十分な特異性を有していなければならない。
【００２６】
本明細書に記載の本発明の方法における上記の利点を確保するには、用いるオリゴヌクレオチドは少なくとも２つの条件を満たさなければならない。その一つは、該オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶに由来する核酸とだけハイブリダイズするよう、十分な特異性を有しなければならないことである。もう一つは、これらのウイルスは、ゲノムのいくつかの領域内で非常に大幅に変異していること、すなわち、塩基配列に比較的大きな相違があることである。一方では、これらの相違に基づいて、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２、ならびにいわゆるサブタイプ（同じウイルスの比較的近縁関係にある株を意味する）を識別する。本発明のオリゴヌクレオチドに関しては、このことは、該オリゴヌクレオチドが特定のウイルスまたは特定のサブタイプを認識できなければならないだけでなく、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２のできるだけ多くのサブタイプと、または、公知のサブタイプ全てともハイブリダイゼーション可能であるか、あるいは、双方ともとハイブリダイゼーション可能な、塩基配列も有していなければならないことを意味する。
【００２７】
この目的のためには、通常、検出するウイルスのゲノムの比較的保存されている領域からオリゴヌクレオチドを選択し、そして、それぞれの相補的配列を用いる。高度に保存されている領域のいくつかは、先行技術によってすでに公知となっている（上記参照）。保存されている領域とは、ＨＩＶのゲノムの核酸の、残りのゲノムに比べて塩基配列に微差があるだけの部分である。このことは、パーセントで表示される塩基同一性、または相同性とも呼ばれる。
【００２８】
驚くべきことに、本発明において、ＨＩＶのサブタイプ非依存的検出ならびに種非依存的検出を可能にするオリゴヌクレオチドが見出された。該オリゴヌクレオチドは、新しく発見されたＨＩＶの高度に保存されている領域とハイブリダイズする。これらは、ＬＴＲ領域、ｇａｇ遺伝子、およびｐｏｌ遺伝子内に位置する。これらの領域は、比較的小さく、平均的には５０〜１００ヌクレオチド長であり、１つまたは数個のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが可能である。ほとんどの先行技術の引用文献にあるように、本明細書中のＨＩＶゲノムの該領域の位置は、ＨＩＶ−１分離株ＨＸＢ２（Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌら、Ｎａｔｕｒｅ、３１３、２７７−２８４ （１９８５）に公表されている）の番号づけに基づいている。これら新規の高度に保存されている領域の配列は、それぞれ配列番号１〜１３に示されており、これらの配列はＨＩＶ配列データベース（ｈｔｔｐ：／／ＨＩＶ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ．／）の登録番号Ｋ０３４５５ のＨＩＶ−１ ＨＸＢ２の配列を参照した配列である。かかる高度に保存されている配列の位置は、以下のとおりである：
配列番号１：ＬＴＲ領域、位置５０４〜５６５、６２ヌクレオチド長、
配列番号２：ｇａｇ遺伝子、位置７６１〜８２２、６２ヌクレオチド長、
配列番号３：ｇａｇ遺伝子、位置１７８６〜１８４７、６２ヌクレオチド長
配列番号４：ｐｏｌ遺伝子、位置２３０７〜２３６０、５４ヌクレオチド長、
配列番号５：ｐｏｌ遺伝子、位置２３７６〜２４３４、５９ヌクレオチド長、
配列番号６：ｐｏｌ遺伝子、位置２５６８〜２６３２、６５ヌクレオチド長、
配列番号７：ｐｏｌ遺伝子、位置３０９３〜３１４５、５３ヌクレオチド長、
配列番号８：ｐｏｌ遺伝子、位置４１３１〜４２０７、７７ヌクレオチド長、
配列番号９：ｐｏｌ遺伝子、位置４３３３〜４３９９、６７ヌクレオチド長、
配列番号１０：ｐｏｌ遺伝子、位置４６３８〜４６９６、５９ヌクレオチド長、
配列番号１１：ｐｏｌ遺伝子、位置４８８４〜４９８４、１０１ヌクレオチド長、
配列番号１２：ｐｏｌ遺伝子、位置５０３４〜５０９５、６２ヌクレオチド長、
配列番号１３：ｐｏｌ遺伝子、位置４４１０〜４５０６、９７ヌクレオチド長。
【００２９】
本発明の好適なオリゴヌクレオチドは、好ましくは、上述の高度に保存されている領域に位置している塩基配列またはそれらに相補的な配列を有する。
【００３０】
「重複する（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）」という用語は、本発明のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、高度に保存されている領域のうちの１つに由来する少なくとも１０個の連続した塩基と重複していることを意味すると解するべきである。
【００３１】
好ましくは、各オリゴヌクレオチドは、配列番号４，５，９，１０および１３の領域のうち１つと、より好ましくは、配列番号４、５、９、および１０の領域のうち１つと重複する。他の好ましい実施形態では、各オリゴヌクレオチドが、配列番号６、８、１０、１１、および１３の領域のうち１つと重複する。
【００３２】
高度に保存されている領域を、単一のＨＩＶ−１ウイルス分離株に関して記載しているが、「高度に保存されている領域」という語は、もちろん単一の特定の配列以外にも適用され、従って、種々のＨＩＶの株、またはＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２に関係するＨＩＶ分離株に由来する全ての対応する領域を含む。本発明の好適なオリゴヌクレオチド配列は、数種のＨＩＶ分離株またはＨＩＶ株の高度に保存されている領域に由来する共通配列を表す塩基配列を有してもよい。このことは、例えば、数塩基の塩基配列はあるＨＩＶ分離株に相当し、同じオリゴヌクレオチド内の他の塩基配列は、他のＨＩＶ分離株に対応するということを意味する。そして、該オリゴヌクレオチドは、異種塩基配列を含む。該オリゴヌクレオチドのそれぞれは、上述の領域のうちの１つに由来する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むことが好ましい。該オリゴヌクレオチドのそれぞれが、１５〜３０個のそのようなヌクレオチドを含むと、より好ましい。
【００３３】
本発明の方法は、少なくとも以下のステップ：
（ａ）  オリゴヌクレオチドがサンプル中に存在するＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２から選択されたＨＩＶ核酸とハイブリダイズする条件下で、サンプルをオリゴヌクレオチドと接触させること、
（ｂ）  サンプル中のＨＩＶ核酸の存在および／または量を決定すること、
ステップを含む。
【００３４】
増幅ステップは、ステップ（ｂ）で実施することが好ましい。
【００３５】
本発明の方法の好ましい実施形態では、ＨＩＶ核酸のサブタイプ非依存的および／または種非依存的検出は、少なくとも２種の本発明のオリゴヌクレオチドを使用することにより可能となる。好ましくは、これらのオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとして使用して、例えば、それら各々が高度に保存されている領域の一方の末端の近傍にハイブリダイズさせて、それにより、増幅（好ましくはＰＣＲ）において、それぞれの高度に保存されている領域の部分に対応する増幅産物を作製する。その後、該増幅産物、およびこのＨＩＶ特異的核酸を、プライマーとして用いたオリゴヌクレオチドの１つ、または、増幅された配列内にハイブリダイズする他のオリゴヌクレオチドをプローブに用いて検出できる。この好ましい実施形態の利点は、１対のオリゴヌクレオチドまたはプライマーで、十分にサブタイプおよび／または種に非依存的にＨＩＶを検出するということである。
【００３６】
増副産物の検出にプローブを使う代わりに、例えば、ＤＮＡ結合色素（例えば、サイバーグリーン（Ｓｙｂｅｒｇｒｅｅｎ））などのＤＮＡ結合性試薬を用いて検出することもできる（ＷＯ９７／４６７０７）。
【００３７】
本発明の方法の他の好ましい実施形態では、１つのオリゴヌクレオチドプライマーだけが１つの保存されている領域内に位置し、他方のプライマーはその領域の外側に位置するオリゴヌクレオチドの組合せまたはプライマー対を用いて、この方法により生成する増幅産物の一部だけが、高度に保存されている領域の１つに由来する塩基配列になるようにする。好ましくは、後者のプライマーはサブタイプ特異的および／または種特異的であり、それにより、かかる組合せを用いてサブタイプまたは種を特異的に検出できる。
【００３８】
この場合、その中の少なくとも２種のオリゴヌクレオチドのそれぞれが、上述の配列（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、またはこれらに相補的な配列に由来する、少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの組合せとして、２つ以上のプライマー対を用いることが好ましい。従って、プライマーの組合せ全体が、サブタイプおよび／または種に非依存的なＨＩＶの検出を可能にする。
【００３９】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の方法に好適なオリゴヌクレオチドの組合せは２種、好ましくは３種のオリゴヌクレオチド（例えば、プライマー対またはプライマー対とプローブ）を含み、各オリゴヌクレオチドはそれぞれ、
（ｉ）  配列番号１〜１３に示す配列のうちの１つで表される、ＨＩＶのｇａｇ遺伝子またはｐｏｌ遺伝子の同一で高度に保存されている領域、
（ｉｉ）  他のＨＩＶ分離株に由来する対応する領域、
（ｉｉｉ）  数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
またはそれらに相補的な配列に由来する少なくとも１０個のヌクレオチドを含む。
【００４０】
少なくとも１種、および好ましくは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドは、ＨＩＶ−１のサブタイプ非依存的検出が可能となるように、即ち、ＨＩＶ−１の、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＯのサブタイプのうち少なくとも７種、およびより好ましくは全サブタイプが検出されるように選択することが好ましい。
【００４１】
サブタイプ非依存的検出には少なくとも１種、および好ましくは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを用いることが好ましく、各オリゴヌクレオチドは、
（ｉ）  配列番号１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１２、および１３に示す配列のうちの１つで表される、ＨＩＶのＬＴＲ、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）  他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）  数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
またはそれらに相補的な配列に由来する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む。
【００４２】
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のサブタイプ非依存的および／または種非依存的な検出には、少なくとも１種、および好ましくは少なくとも２種のオリゴヌクレオチドを用いることが好ましく、各オリゴヌクレオチドは、
（ｉ）  配列番号１、２、３、４、５、７、９、１０、および１３に示す配列のうちの１つで表される、ＨＩＶのＬＴＲ、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）  他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）  数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
またはそれらに相補的な配列に由来する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む。
【００４３】
驚くべきことに、極めて特殊なオリゴヌクレオチドが本発明の方法に特に適していることが判明した。これらのオリゴヌクレオチドは、配列番号１４〜２５に示す配列により表されている。上述のように、これらのオリゴヌクレオチドは、天然または合成の核酸成分で、または前記のＰＮＡでも、構成されうる。好ましくは、本発明の方法に用いるオリゴヌクレオチドの少なくとも１種は、１個または数個の標識を担持する。好適な標識物は、蛍光標識、または［３２Ｐ］標識化オリゴヌクレオチドのような放射性標識である。
【００４４】
本発明のさらなる主題は、
（ｉ）  配列番号４、５、９、または１０に示す配列のうちの１つで表されるＨＩＶのｐｏｌ遺伝子の高度に保存されている領域、
（ｉｉ）  他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）  数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
または、それらに相補的であるか、もしくは配列番号１４〜２５に示す配列のうちの１つを含む配列に由来する、
少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドである。
【００４５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１４〜２５に示すオリゴヌクレオチドの１つを含むことが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは、１０〜８０ヌクレオチドである。特に好ましくは、該オリゴヌクレオチドは、約２０〜３０塩基を有し、４０〜６０％のＧＣ含量を有する。該オリゴヌクレオチドが、３’末端に自己相補性がなく、さらに３’末端にＣＧの連続（ｒｕｎ）がない場合、さらに有利である。ＧＣの連続とは、塩基ＣおよびＧでほとんどまたは全てが構成されている塩基配列である。加えて、オリゴヌクレオチドはパリンドロームを含むべきではない。本発明のオリゴヌクレオチドは、全てのサブタイプの同じ位置において該オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする対応配列とのミスマッチが２つ以下であることが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドの３’末端には、ＨＩＶ−１のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨおよびＯのサブタイプ、ならびに／またはＨＩＶ−２のＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤのサブタイプの核酸とミスマッチがないことが好ましい。
【００４６】
プライマー対の場合、該プライマーの５’末端が、検出する核酸にプライマーがハイブリダイズする領域において、互いのプライマーの５’末端から８０塩基以内に位置するように、それぞれのプライマーを選択する。特に好ましいプライマー対は、該プライマーにより増幅される領域内に、さらにＨＩＶ特異的配列があるプライマー対である。好ましくは、その後、この配列を、この配列に対して特異的なプローブにより該増幅産物を検出するのに使用できる。本発明のオリゴヌクレオチドが上記のマーカー基のうちの少なくとも１つを備えていることが好ましい。
【００４７】
また、本発明のさらなる態様は、上述した本発明の性質を双方のオリゴヌクレオチドが有しており、かつ、その全てがＨＩＶのサブタイプ非依存的および／または種非依存的な検出に適している、２種以上のオリゴヌクレオチドの組合せである。
【００４８】
本発明は、さらに、オリゴヌクレオチドの組合せを包含する。オリゴヌクレオチドのそれぞれが、
（ｉ）  配列番号１〜１３に示す配列のうちの１つで表される、ＨＩＶのＬＴＲ領域、ｇａｇ遺伝子、またはｐｏｌ遺伝子の、同一で高度に保存されている領域、
（ｉｉ）  他のＨＩＶ分離株の対応する領域、
（ｉｉｉ）  数種のＨＩＶ分離株に由来する共通配列の対応する領域、
またはそれらに相補的な配列に由来する少なくとも１０個の連続したヌクレオチドを含む、少なくとも２種のオリゴヌクレオチドの組合せが好ましい。
【００４９】
また、本発明のさらなる態様は、少なくとも２種の本発明のオリゴヌクレオチドが存在し、かつ、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２の単一のサブタイプに特異的な配列をそれぞれが含むさらなるオリゴヌクレオチドが存在する、数種のオリゴヌクレオチドの組合せであり、該オリゴヌクレオチドの組合せ中の全てのオリゴヌクレオチドがＨＩＶのサブタイプ非依存的および／または種非依存的な検出を可能にする。
【００５０】
本発明のさらなる目的は、プライマーまたはプローブとして、少なくとも１種の本発明のオリゴヌクレオチドまたは本発明のオリゴヌクレオチドの組合せを含む、ＨＩＶまたはその核酸の検出用の試薬キット、ならびにサンプル中の核酸のハイブリダイゼーションおよび増幅を行うのに適当な手段を提供することである。
【００５１】
本発明は、さらに、ＨＩＶの検出、および特に、サブタイプ非依存的および／または種非依存的検出のためのプライマーおよび／またはプローブとしてのオリゴヌクレオチドあるいはオリゴヌクレオチドの組合せの使用に関する。
【００５２】
以下の実施例では、一つの実例として本発明を説明することが目的であり、限定する意図ではない。
【００５３】
実施例
実施例１
ＨＩＶ血漿の連続的希釈物に基づく感度、特異性および動的測定範囲
血液サンプルを試験するために、ＲＮＡを初期濃度１５，０００ゲノム等量（ｇｅｑ）ＨＩＶ／ｍｌであるＨＩＶ−陽性血漿から単離した。この血漿を、陰性血漿中に連続して１０倍希釈し、サンプル調製の後、対応するプライマー対を用いて二回繰り返した測定において、それぞれのサンプルを増幅した。ＨＩＶ−陰性血漿と水を対照とした。特異性を決定するために、ＨＢＶ−陽性血漿およびＨＣＶ−陽性血漿を同様に処理した。全てのサンプルを増幅後に測定した（ＥＣＬ検出、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）１０１０）。
【００５４】
１．サンプル調製：
最初に４２０μｌの血漿を８０μｌのプロテイナーゼＫ（２５ｍｇ／ｍｌ）と混合し、数秒間ボルテックス混合した。次に１μｇのキャリアＲＮＡ（ポリＡ／ｍｌ）を含む５００μｌの溶解バッファー（５．４Ｍグアニジニウムチオシアネート、１０ｍＭ尿素、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００、ｐＨ ４．４）を添加した。混合物をボルテックス混合し、続いて１０分間室温で振とうした。続いて、５００μｌのイソプロパノール−ＭＧＰを添加した（イソプロパノール中には６ｍｇの磁性ガラス粒子を含ませた）。混合物を再びボルテックス混合し、続いて２０分間室温で振とうした。ＭＧＰを磁気を利用して溶液から分離した。上清を除去し、廃棄した。７５０μｌの洗浄バッファー（２０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、７０％エタノール）を添加し、ボルテックス混合してＭＧＰを再懸濁させ、再び磁気分離を行った。洗浄工程を合計５回繰り返し、最後に１００μｌのＤＥＭＣ水を溶出のために添加した。混合物を８０℃で１５分間振とうし、続いてさらに磁気分離を行った。１０μｌの溶出液をＲＴ−ＰＣＲに使用した。
【００５５】
２．使用したプライマーおよびプローブ：
使用したプライマーおよびプローブは、それらの各々の高度保存領域およびゲノム中の位置、およびプライマー対によって産生される増幅産物とともに以下の表１に示す。
【００５６】
【表１】
2004500014.tif 000002
【００５７】
３．ＲＴ−ＰＣＲのための増幅用混合物およびサーモサイクラープロトコル：
2004500014.tif 000003
【００５８】
４．検出：
全体の検出反応を、Ｅｌｅｃｓｙｓ（登録商標）１０１０自動分析器を用いて完全に自動化した。
最初に１０μｌの増幅産物および３５μｌの変性溶液（ＢＭ−ＩＤ−Ｎｏ． １４６９０５３， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を取り出した。これらを反応容器中で３７℃、５分間インキュベートし、次いで１２０μｌのハイブリダイゼーション溶液（ＢＭ−ＩＤ−Ｎｏ． １４６９０４５， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、２５ｎｇ／ｍｌのルテニウム−標識プローブを添加したもの）を加えた。反応混合物を再び３７℃で３０分間インキュベートした。続いて３５μｌのＥｌｅｃｓｙｓ ＳＡ磁性ビーズ溶液 （ＢＭ−ＩＤ−Ｎｏ． １７１９５５６， Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ） を添加した。溶液を３７℃で１０分間インキュベートした。１２０μｌの反応混合物の電気化学的ルミネセンスを、Ｅｌｅｃｓｙｓ １０１０測定セル中で測定した。ハイブリダイゼーションのために、表１に記載の好適なルテニウム−標識プローブを使用した。
【００５９】
５．結果
2004500014.tif 000004
【００６０】
新規プライマーのシグナルは対照標準と同様の感度を有していた。連続的希釈内での、良好なシグナルグラデーションが存在した。
【００６１】
プライマー対ＳＫおよびＧＨ−Ａ３を用いた場合のバックグラウンドの増加は、非最適の増幅プロトコルによると推定される。
【００６２】
配列表
配列番号：１
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：６２塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：二本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000005
配列番号：２
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：６２塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：二本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000006
配列番号：３
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：６２塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：二本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000007
配列番号：４
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：５４塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：二本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000008
配列番号：５
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：５９塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：二本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000009
配列番号：６
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：６５塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：二本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000010
配列番号：７
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：５３塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：二本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000011
配列番号：８
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：７７塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：二本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000012
配列番号：９
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：６７塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：二本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000013
配列番号：１０
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：５９塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：二本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000014
配列番号：１１
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：１０１塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：二本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000015
配列番号：１２
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：６２塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：二本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000016
配列番号：１３
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：９７塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：二本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000017
配列番号：１４
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：２０塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000018
配列番号：１５
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：２６塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000019
配列番号：１６
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：１８塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000020
配列番号：１７
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：２０塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000021
配列番号：１８
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：２６塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000022
配列番号：１９
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：１５塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000023
配列番号：２０
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：２４塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000024
配列番号：２１
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：２０塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000025
配列番号：２２
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：１９塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000026
配列番号：２３
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：２６塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000027
配列番号：２４
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：２５塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000028
配列番号：２５
（ｉ） 配列の特徴
（Ａ） 配列の長さ：２３塩基対
（Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド
（Ｃ） 鎖の数：一本鎖
（Ｄ） トポロジー：直鎖状
（ｘｉ） 配列
2004500014.tif 000029
【国際公開パンフレット】
2004500014.tif 000030
2004500014.tif 000031
2004500014.tif 000032
2004500014.tif 000033
2004500014.tif 000034
2004500014.tif 000035
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2004500014.tif 000038
2004500014.tif 000039
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2004500014.tif 000063
2004500014.tif 000064
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500014.tif 000065
2004500014.tif 000066
【国際調査報告】
2004500014.tif 000067
2004500014.tif 000068
2004500014.tif 000069
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