(57)【要約】本発明は、海洋棘皮動物ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａからの蛍光染料の抽出、精製および特性解析の工程、前記染料含有組成物類および前記染料の種々の適用を開示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
海洋生物から得られかつ下記の特徴を有する天然蛍光色素として有用である生物活性抽出物：
ｉ．還元剤による脱色、
ｉｉ．合成化合物ではない、
ｉｉｉ．前記染料の粗抽出物は、色が黄緑色である、
ｉｖ．日光光線の下裸眼で観察すると、精製染料は、赤茶色の粉末である、
ｖ．電灯の光の下では、やや緑色色調が発光する、
ｖｉ．性質が無定形、
ｖｉｉ．水溶性、
ｖｉｉｉ．エタノール、メタノールおよびアセトンのような有機溶媒中で不溶性、
ｉｘ．陰電荷、
ｘ．ｐＨ６．５を有する、
ｘｉ．フェノール性基の存在、
ｘｉｉ．キノイド環の不在、
ｘｉｉｉ．芳香族アミン基類の不在、
ｘｉｖ．性質が非たんぱく質性、
ｘｖ．還元性糖が不在、
ｘｖｉ．染料は生物界面活性剤の性質を有する、
ｘｖｉｉ．また、染料は抗菌性を示し、抗菌アッセイを実施した時、阻害ゾーンを示した、
ｘｖｉｉｉ．色素兼染料は蛍光染料で、分光測光計でＵＶおよび可視スペクトル範囲の異なる波長で励起すると、蛍光を発する、
ｘｉｘ．３００ｎｍ−７００ｎｍのＵＶ，可視分光分析、およびピークは、３７９ｎｍおよび４３９ｎｍ波長で記録される、
ｘｘ．２５０ｎｍ−３５０ｎｍのＵＶ，可視分光分析、およびピークは、２７２ｎｍおよび２９９ｎｍ波長にある、
ｘｘｉ．ＵＶおよび可視スペクトルにおける蛍光分光分析は、ＵＶ２７０ｎｍ波長で励起すると、３２４ｎｍ−３８０ｎｍ範囲に蛍光を発し、太陽光線の紫外線のＵＶＡ波長範囲に入る、
ｘｘｉｉ．蛍光分光分析における励起波長４５０ｎｍにおいて、蛍光発光は５００ｎｍ−５８０ｎｍで起こり、最大強度を有していた、
ｘｘｉｉｉ．蛍光分光分析における励起波長５４０ｎｍにおいて、蛍光発光は５００ｎｍ−６２０ｎｍで起こり、最大強度を有していた、
ｘｘｉｖ．蛍光分光分析における励起波長５５５ｎｍにおいて、蛍光発光は５７５ｎｍ−６２０ｎｍで起こり、最大強度を有していた、
ｘｘｖ．２６０ｎｍ−２８０ｎｍ範囲のＵＶ灯を有するＵＶトランスイルミネータおよびゲルドキュメンテーション（Ｇｅｌ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）システムの下で、染料濃度１：４００００希釈液に浸漬したＷｈａｔｍａｎｎ  フィルタＮｏ．１による物理的検査では、青緑色色調の蛍光を発する、
ｘｘｖｉ．エピフルオロセンスマイクロスコープの蛍光キューブ類のＵＶおよび可視範囲の３種の異なる波長において、３種の異なる着色蛍光を発する、
ｘｘｖｉｉ．蛍光青色発光は、紫外キューブＷＵ３３０ｎｍ−３８５ｎｍ励起範囲で励起したとき、３８０ｎｍ−４００ｎｍ範囲のＵＶＡに出現する、
ｘｘｖｉｉｉ．蛍光黄色発光は、ＷＢキューブ４５０ｎｍ−４８０ｎｍ励起範囲で励起したとき、５００ｎｍ−５７０ｎｍ範囲で出現する、
ｘｘｉｘ．蛍光橙色発光は、ＷＧキューブ５１０ｎｍ−５５０ｎｍ励起範囲で励起したとき、５７０ｎｍ−６５０ｎｍ範囲で出現する、
ｘｘｘ．前記染料は、１０倍対物レンズで観察したとき、エピフルオロセンスマイクロスコープの通常の透過光灯の下で、灰色色調を呈する、
ｘｘｘｉ．前記染料は、１：４００００倍の希釈範囲（すなわち、染料粉末１グラムを超純水４０リットル中に溶解させた）でさえもこれらの蛍光色を発光する、
ｘｘｘｉｉ．抽出物の蛍光は、室温で少なくとも１年経過後も持続していた、
ｘｘｘｉｉｉ．前記染料の蛍光は、高度に光安定であり、直射光線に長時間暴露しても劣化しない、および
ｘｘｘｉｖ．前記染料の蛍光は、２０℃で凍結しても変化せず、化学発光生物類からの抽出物中においてと同様、前記分子類は活性化に必要なエネルギーを得ることができない温度である。
【請求項２】
前記染料が、潮間の浸水した浅瀬および深層水に出現し通常アクローブズ（ａｃｌｏｖｅｓ）、割れ目、岩だな、張り出し、岩状かつ砂状生息地のような日陰のところに豊富に生息し鈍い色から明るい色まで着色され外および内骨格を有している場合も有していない場合もあり、固着し定着性の浮遊体であり、泳ぐ力がさまざまである遊泳生物であり、通常夜行性であり、活発な餌食となりやすいナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａのような海洋生物から得られる請求項１記載の染料。
【請求項３】
異なる励起波長における前記染料の多色発光が、既に市場にあるフルオロクロムマイクロスコピイ染色剤類に匹敵する請求項１記載の染料。
【請求項４】
本染料の青色着色蛍光が、同一波長励起において生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識キット類の成分として使用されるＤＡＰＩフルオロクロムによる同色発光に匹敵する請求項１記載の染料。
【請求項５】
本染料の可視範囲における黄色着色蛍光は、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されるオーラミンの同色発光に匹敵する請求項１記載の染料。
【請求項６】
本染料の可視範囲における黄色着色蛍光は、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されるＦＩＴＣの同色発光に匹敵する請求項１記載の染料。
【請求項７】
前記橙色着色蛍光発光は、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されるヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）フルオロクロムの橙色蛍光色に匹敵する請求項１記載の染料。
【請求項８】
前記橙色着色蛍光発光は、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されるローダミンフルオロクロムの橙色蛍光色に匹敵する請求項１記載の染料。
【請求項９】
前記橙色着色蛍光発光は、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されるＴＲＩＴＣフルオロクロムの橙色蛍光色に匹敵する請求項１記載の染料。
【請求項１０】
前記染料は、室温で安定かつ長い貯蔵期間を有する請求項１記載の染料。
【請求項１１】
前記染料の分子性および放射性キット類が室温で輸出できる請求項１記載の染料。
【請求項１２】
前記単一染料は、現在市販されている少なくとも１００種の異なるフルオロクロム類、すなわち（ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ（ヘキスト）３３２５８、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２、ＦＩＴＣ，アクリジンオレンジ、オーラミン、ローダミン、ＴＲＩＴＣ，およびヨウ化プロピジウム等）の特徴を有している請求項１記載の染料。
【請求項１３】
前記染料が現在フィコビリプロテイン類が使用されているあらゆる適用において使用でき、その理由は、それらと異なり前記染料が凍結しても蛍光損失を受けないことにある請求項１記載の染料。
【請求項１４】
蛍光マイクロスコープの明視野において、１０倍対物レンズ下で観察すると、青灰色色調が、細胞遺伝的、細胞学的、および組織化学スライド類の迅速スクリーニングに有用な相コントラスト効果をもたらし、マイクロスコープの余分の相コントラストアクセサリ部品に対する出費を節約する請求項１記載の染料。
【請求項１５】
通常の透過光線マイクロスコープの１００倍油浸対物レンズ下で観察すると、活発に分裂している卵割細胞の卵黄、核質およびクロマチンのたんぱく質類が異なる染色の色を示し、前者に対して茶黄色、後者に対して黄色、および最後の細胞成分に対して暗青色の色調である請求項１記載の染料。このことは効果の迅速バイオアッセイに用いることができ前記細胞の前記種々の生化学成分類で観察できる。
【請求項１６】
前記蛍光色発光が、蛍光のストークス則に従う請求項１記載の染料。
【請求項１７】
コダック（Ｋｏｄａｋ）ロールフィルムによるマイクロフォトグラフが、エピフルオロセンス下における青色蛍光のような隣接色発光波長類の色調を示す請求項１記載の染料。
【請求項１８】
コダックロールフィルムによるマイクロフォトグラフ類が、エピフルオロセンスマイクロスコープ下において黄色蛍光をマイクロフォトグラフにおいて観察した時緑色色調もまた出現するように、隣接色発光波長類の色調を示す請求項１記載の染料。
【請求項１９】
エピフルオロセンスマイクロスープ下において橙色蛍光色をマイクロフォトグラフで観察するとき、赤色色調もまた出現する請求項１記載の染料。
【請求項２０】
全蛍光下において観察した細胞遺伝的スライド類が、試料がなく染料のみが存在するときの背景色に対して細胞類および細胞成分類の逆染色効果を示す請求項１記載の染料。
【請求項２１】
前記染料が比１：１０，０００倍で水で希釈されかつこのことが異なる３種の波長において３種の色の蛍光を付与する請求項１記載の染料。
【請求項２２】
前記染料が比１：４０，０００倍で水で希釈されかつこのことが異なる３種の波長において３種の色の蛍光を付与する請求項１記載の染料。
【請求項２３】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、蛍光色を呈する可撓性塩化ポリビニルフィルムの調製に有用である。
【請求項２４】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、被覆組成物類およびインク類の調製に有用である。
【請求項２５】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、もれ検出に有用である。
【請求項２６】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、海中プローブに有用である。
【請求項２７】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、皮膚がんの光化学療法に有用である。
【請求項２８】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む化粧品組成物。
【請求項２９】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、分子診断のための蛍光分子プローブインサイチュハイブリッド形成キット類として有用である。
【請求項３０】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として有用である。
【請求項３１】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、免疫蛍光検出において有用である。
【請求項３２】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドプローブ類および抗ＤＩＧ  Ｆａｂフラグメント類の逆染色剤として有用である。
【請求項３３】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、単色および多色フローサイトメトリ適用における単一および複数細胞定量的蛍光において有用である。
【請求項３４】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を含む組成物であり、種々の蛍光染料類の適用を氷点下温度領域に位置する屋外ステーション類で実施する必要がある実験において使用できる。
【請求項３５】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、エピフルオロセンスマイクロスコピイのためのフルオロクロム染色剤類として有用である。
【請求項３６】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、健康食品業界、化粧品業界、薬品および化学業界における生物汚染の迅速検査のために有用である。
【請求項３７】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、実験室培養物における生物汚染物の迅速推定のために有用である。
【請求項３８】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、屋外条件下における生物汚染物質の迅速検査のために有用である。
【請求項３９】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、コリンエステラーゼ類の競合阻害剤として有用である。
【請求項４０】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、抗菌組成物において有用である。
【請求項４１】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、トイレッタリ組成物における生物界面活性剤として有用である。
【請求項４２】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、殺虫殺鼠組成物中において有用である。
【請求項４３】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物であり、天然着色剤として有用である。
【請求項４４】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た抽出物を超純水中に１：４００００比で含む生物活性組成物で、３種の異なる波長において３種の色の蛍光を得ることができる。
【請求項４５】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た抽出物を含む生物活性組成物であり、透過光線下において細胞類の異なる生化学構成分のために相コントラストおよび組織化学的逆染色効果を得ることができる。
【請求項４６】
前記染料を生理学的および化粧品学的に許容できる希釈剤、分散剤または担体のような賦形剤とともに含むスキンケア組成物。
【請求項４７】
請求項１記載の染料で、
（ａ）蛍光色を発するか可撓性塩化ポリビニルフィルムの調製；
（ｂ）種々の塗料類、インク類およびテキスタイル類における蛍光色の使用；
（ｃ）ポリマーの漂白および増白のための蛍光染料組成物；
（ｄ）全スペクトル蛍光染料によるもれ検出；
（ｅ）自動化化学測定系における使用；
（ｆ）墜落航空機、救命イカダ、およびロケットのような装備の位置を記録するため；
（ｇ）海中プローブ類；
（ｈ）ＵＶＡは皮膚がんの光化学療法において使用される；
（ｉ）化粧品クリーム類および化粧液類のクロマトフォアサンスクリーン成分；
（ｊ）前記染料の水混合性は、モイスチャライザー類と容易に混合できるようにしている；
（ｋ）分子診断学のための蛍光インサイチュハイブリッド形成適用キット成分；
（ｌ）ＤＮＡ，ＲＮＡ，たんぱく質類および酵素類の標識のため、生化学、細胞生物学、免疫化学、および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分；
（ｍ）免疫蛍光検出類；
（ｎ）ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドプローブ類および抗ＤＩＧ  Ｆａｂフラグメント類の逆染色；および
（ｏ）単一および複数フローサイトメトリ適用；
（ｐ）エピフルオロセンスマイクロスコピイのためのフルオロクロム染色剤類；
（ｑ）健康食品業界、化粧品業界における生物汚染の迅速検査のため；
（ｒ）薬品および化学業界；
（ｓ）実験室培養物中の生物汚染物の迅速推定のため；
（ｔ）屋外条件下における生物汚染物質の迅速検査のため；
（ｕ）コリンエステラーゼ類の競合的阻害剤；
（ｖ）抗菌組成物において；
（ｗ）トイレッタリ組成物中で生物界面活性剤として；
（ｘ）天然着色剤；
（ｙ）超純水中１：４００００比における前記海洋性染料の生物活性組成物；
（ｚ）異なる３種の波長における３種の色の蛍光と透過光線下で相コントラスト効果を得るため；
（ａａ）氷点下温度の領域において実施される種々の蛍光適用のための染料；
のために有用である。
【請求項４８】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから天然蛍光染料抽出のための工程で、
ａ）海岸から前記材料を採取し、海水を交換し、一晩中の機械的通気を全く行うことなく実験室タンクに維持すること、
ｂ）前記動物類を−２０℃で凍結すること、
ｃ）前記動物を融解させ前記色素を得ること；および
ｄ）色素取り出しのため段階（ｂ）から（ｃ）を３−４回繰り返すこと、およびもし所望であれば、前記色素類を精製すること、
の段階を含む。
【請求項４９】
海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから天然蛍光染料抽出のための工程で、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａの皮膚から前記色素を浸透性ショックによって、好適には超純水に最初５０％エタノールを添加しこれを少なくとも４回繰り返して抽出し、前記色素を得る段階を含む。
【請求項５０】
前記染料を水で比１：４００００に希釈し、このことが異なる３種の波長における３種の色の蛍光を付与する請求項４８記載の工程。
【請求項５１】
５０％エタノール粗抽出物２５０ｍｌを８０℃の水浴で５分間蒸発させ精製し、粉末形状の部分精製染料２．５グラムを得る請求項４８記載の工程。
【請求項５２】
前記染料を水で比１：１００００に希釈し、このことが異なる３種の波長における３種の色の蛍光を付与する請求項４８記載の工程。
【請求項５３】
前記染料の物理的特長が分光測光のために２ｍｇ／１０ｍｌ溶液を取ることによって評価される請求項４８記載の工程。
【請求項５４】
前記染料が、化学的方法を用いる染料分析のため濃度１０ｍｇ／ｍｌで使用された請求項４８記載の工程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、海洋無脊椎動物ナマコ（ホロチュリアスカブラ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａ））から得た新規な蛍光染料に関する。また、本発明は、海洋無脊椎動物、特にナマコから得た天然染料であるこの新規染料の抽出、精製および特性解析の工程を提供する。ナマコ類は、ヒトデ類およびウニ類も含む棘皮動物群に属する棘皮動物である。それらは、下記の分類学上の位置を占めている。
【０００２】
（背景技術）
前記ナマコは、下記の分類学上の位置を有している：
亜界：後生動物
門：棘皮動物門
亜門：遊在類
綱：ナマコ類
亜綱：アスピドキロタセア（楯手類：Ａｓｐｉｄｏｃｈｉｒｏｔａｃｅａ）、デンドロキロタセア（樹手類：Ｄｅｎｄｒｏｃｈｉｒｏｔａｃｅａ）、アポダセア（Ａｐｏｄａｃｅａ）
目：デンドロキロタ（Ｄｅｎｎｄｒｏｃｈｉｒｏｔａ），アスピドキロタ（Ａｓｐｉｄｏｃｈｉｒｏｔａ），エラシポダ（Ｅｌａｓｉｐｏｄａ）、モルパドニア（Ｍｏｌｐｏｄｏｎｉａ）およびアポダ（Ａｐｏｄａ）
これらの目の中で、ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａは、
目：アスピドキロタ（Ａｓｐｉｄｏｃｈｉｒｏｔａ）
科：ホロチュリイダエ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉｉｄａｅ）
属：ホロチュリア（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ）
種：スカブラ（ｓｃａｂｒａ）
に属する。
【０００３】
棘皮動物は真体腔類無脊椎動物で、陸地にはおらず海洋のみに存在しており、成体において基本的な５本の放射対称形により分割されておらず、頭部または脳を有しておらず、他の全ての動物類と骨格と真体腔という構造的特異性によって識別される。属ナマコ類Ｈｏｌｏｔｈｕｒｏｉｄｅａは、両側が対称的な体部を有する動物類であり、通常、口−反口軸に沿って伸びており、１端またはその近くに口を有し、他端またはその近くに肛門を有している。体表面はざらざらし、内骨格は体壁に埋めこまれた顕微鏡的大きさの交尾針または楯板に変化し、口は水管系に連結した１組の触手によって取り囲まれている；足すなわち管足が通常存在しており、運動性である；栄養性管腔は長くコイル状になっており、直腸壁には通常呼吸樹がある。性は通常分離しており、生殖腺は１個であるかまたは対になった管状房である。それらは、硬い基質または潜穴に結合して柔らかい部分となった定在類形であり、前部および後部端が突出している。それらは、主に浅瀬のすべての海に出現し、わずかの種は、１０００メートル以上の深部に出現する。種Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａは一部でメトリアチラスキャブラジャエゲア（Ｍｅｔｒｉａｔｙｌａ  ｓｃａｂｒａ  Ｊａｅｇｅａ）とも呼ばれているおり、本種は、東アフリカ、紅海、ベンガル湾、東インド、オーストラリア、日本、南太平洋、フィリピーン諸島、インド洋、および他のインド太平洋領域に広く分布している。それは、サバ、マレーシア、およびインドネシアおよび他のインド太平洋諸国で人間／動物消費に用いられている。
【０００４】
色素類は、無機および有機種類の範囲に属している。前者は、種々の装飾および塗装目的等のために使用される無機化学化合物類である。有機染料のような有機色素類は、古代にさかのぼる。ブラジル木材、ロッグウッド、ペルシアベリーインディゴおよびマダーのような植物類由来の染料の使用は、はるか紀元前から近東および極東諸国で報告されている（Ｇｅｏｒｇｅ Ｌ． Ｃｌａｒｋ，１９６６ （Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（、第２版、８３３−８３５ヘ゜ージ）。Ｄｅｂｒａ  Ｋ．  ＨｏｂｓｏｎおよびＤａｖｉｄ  Ｓ．  Ｗａｌｅｓは、真菌類、青緑藻類、ウニ類、ヒトデ類、および珊瑚腔腸動物類のようないいくつかの群の生物類から二次代謝物として産生される“緑色染料類”について記載している（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｄｙｅｒｓ ａｎｄ Ｃｏｌｏｕｒｉｓｔｓ（ＪＳＤＣ）、１１４、４２−４４、１９９８）。これらはアントラキノン化合物類であり、歴史的にも色素類工業において極めて重要であった。ステインズファイル−ダイ（Ｓｔａｉｎｓｆｉｌｅ−Ｄｙｅｓ）Ａは、２６４染料類についてダイインデックスを示している。それらのうち６種のみが、全ての生体種からの天然染料類である。
ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｍｅｍｂｅｒｓ” ｈｔｔｐ：／／ｍｅｍｂｅｒｓ．ｐｇｏｎｌｉｎｅ．ｃｏｍ／？ｂｒｙａｎｄ／ｄｙｅｓ／ｄｙｅｓ．ｈｔｍ
【０００５】
最近２−３の特許が天然染料について公表されたが、それらの多くは、植物由来である。Ｗｒｏｌｓｔａｄらは、馬鈴薯抽出物からの天然着色剤を記載した（２００１年１月３０日発行の米国特許第６，１８０，１５４号）。Ｓｈｒｉｎｋｈａｎｄｅ、Ａｎｉｌ  Ｊは、１９８４年６月５日発行の米国特許第４，４５２，８２２号において、グレープポマス（ｇｒａｐｅ  ｐｏｍａｃｅ）および他の材料由来のアントシアニン類の抽出と強化について報告した。Ｌｅｎｏｂｌｅら、１９９９年６月１日発行の米国特許第５，９０８、６５０号は、アントシアニン色素の赤色を増強する新規組成物を記載した。カロテノイド産生菌種が、発明者Ｈｉｒｓｃｈｂｅｒｇら、１９９９年８月１０日発行の米国特許第５，９３５，８０８号および発明者らＴｓｕｂｏｋｕｒａら、１９９９年１月１２日の第５，８５８，７６１号の２種の米国特許において、開示されている；Ｃｏｌｌｉｎ；Ｐｅｔｅｒ  Ｄｏｎａｌｄは、その２０００年５月２日発行の米国特許第６，０５５、９３６号において、ナマコカロテノイド脂質分画類および方法を開示している。
【０００６】
しかし、これらの着色剤類および染料類はすべて蛍光性ではない。合成であるのがほとんどである蛍光染料類は、２−３の米国および国際特許において開示されている。これらは、種々の適用において使用されてきた。この分野における特許の量は、これらの染料の重要性を示している。
【０００７】
合成パラアゾアントキサンチンＡ（分子量２１４．２）は、λ（ｅｍ）４２０ｎｍにおいて蛍光を発し、コリンエステラーゼの純粋な競合的阻害剤であることがわかった。Ｓｅｐｃｉｃ  Ｋ，Ｔｕｒｋ  Ｔ，Ｍａｃｅｋ  Ｐ（Ｔｏｘｉｃｏｎ，３６（６）：９３７−９４０，１９９８）。Ｗｅｌｃｈ；Ｄａｖｉｄ  Ｅｍａｎｕｅｌ（１９９９年１１月２３日発行米国特許第５，９８９，１３５号は、化学発光ゴルフボールを開示した。Ｗｈｉｔｅら（２０００年８月２９日付け米国特許第６，１１０、５６６号およびＷＯ９９２０６６８）は、耐久性の蛍光色を発する可撓性塩化ポリビニルフィルムを記載している。
【０００８】
Ｄｉｐｉｅｔｒｏ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｃ（国際特許ＷＯ９９３８９１６）は、種々の塗料類、インク類およびテキスタイル類における蛍光高分子性色素類の使用を開示した。Ｃｒａｍｅｒ  Ｒａｎｄａｌｌ  Ｊ（１９８６年１２月３０日発行特許ＥＰ０２０６７１８）は、高分子の漂白および増白用蛍光染料組成物を記載した。
【０００９】
もれ検出は、他者によって開示された別の用途である（Ｌｅｉｇｈｌｅｙ；Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｃ．２０００年５月２日付け米国特許６，０５６，１６２）。Ｃｏｏｐｅｒら、２０００年１２月２６日発行米国特許６，１６５，３８４は、同一目的のための全スペクトル蛍光染料組成物を開示した。
【００１０】
Ｌｉｃｈｔｗａｒｄｔら、１９９９年５月１１日付け米国特許５，９０２，７４９は、自動化学測定系において蛍光染料を使用している。
【００１１】
海洋動物についての報告はほとんどない。太平洋クラゲアエクオラアエクオラ（Ａｅｑｕｏｒａ  ａｅｇｕｏｒａ）由来の緑蛍光蛋白ＧＦＰ−新規レポーター遺伝子は、Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ，Ｏ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｆ．Ｈ．およびＳａｉｇａ，Ｙ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，５９，２２３−２３９，１９６２）によって記載されている。ＧＰＦは、高蛍光性色素含有細胞（クロマトフォア）の存在を特徴としている。精製ＧＦＰは、３９５ｎｍにおいて青色光を最大に吸収し、マイナーピークは４７０ｎｍにあり、緑色光を発する。Ｓｅｐｃｉｃ  Ｋ，Ｔｕｒｋ  Ｔ，Ｍａｃｅｋ  Ｐは、蛍光ゾアンチド色素、パラゾアントキサンチンＡを報告した。Ｔｏｘｉｃｏｎ， ３６（６）： ９３７−９４０，１９９８。
【００１２】
海洋性染料類は、それ自体および組成物の一部として染料としてのいくつかの用途を有している。
【００１３】
数名の著者らは、多目的のための蛍光染料混合物を開示した（Ｂｕｒｎｓら、１９９９年７月６日発行米国特許第５，９２０、４２９；Ｂｕｒｎｓ；Ｄａｖｉｄ  ＭおよびＰａｖｅｌｋａ  Ｌｅｅ  Ａ，（国際特許ＡＵ７０４１１２）。海洋性染料組成物類はいくつかの適用において使用され、墜落航空機、救命イカダ、およびロケットのような軍備の位置を記録している。よく使用されている染料類は、水溶性合成染料であるフルオレセインである。より高い効率性と希釈形態での長い耐久性の蛍光を求めて異なる染料組成物類が試験されているところである（Ｓｗｉｎｔｏｎ；Ｒｏｂｅｒｔ  Ｊ，１９９５年４月１１日発行米国特許第５４０５，４１６号；１９９０年７月７日開示国際特許ＷＯ９０１００４４）。Ｈｙｏｓｕら（１９７７年４月５日、米国特許４，０１６，１３３）は、蛍光着色レジン粒子類を調製している。
【００１４】
海洋性染料の海中プローブとしての別の用途は、Ｃｒｏｓｂｙ  Ｄａｖｉｄ  ＡおよびＥｋｓｔｒｏｍ  Ｐｈｉｌｉｐ  Ａによって１９９４年６月１４日発行米国特許第５３２１２６８号において報告されている。このプローブ機器には、透明または透過性の、保護性でかつもつれ耐性の鞘に囲まれた蛍光染料を含有する中心オプティカルファイバーを含んでいる。これは、海洋動物が動き回る領域における光強度および温度に関してのデータ収集のため、海洋動物に付着させることができる。
【００１５】
数名の著者らは、皮膚がんのための光化学療法においてＵＶＡを使用している。Ｋｏｗａｌｚｉｃｋ  Ｌ；Ｏｔｔ  Ａ；Ｗａｌｄｅｍａｎｎ  Ｔ；Ｓｕｃｋｏｗ  Ｍ；Ｐｏｎｎｉｇｈａｕｓ  Ｊ，Ｍ．Ｖｏｇｔｌａｎｄｋｌｉｎｉｋｕｍ  Ｐｌａｕｅｎは、リンパ腫様丘疹症（皮膚がんの１種）におけるＰＵＶＡ浴光化学療法を開示しており、ＵＶＡ治療が改善を示している（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂ．Ｖ，２０００）。ＵＶ  Ａサンベッド類は、乾癬患者によって広く使用されている。
【００１６】
Ｓａｂａｔｅｌｌｉ、Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｄ（発行日１９９３年５月１１日、米国特許第５，２１０、２７５号）は、日焼け防止のためのクロマトフォアサンスクリーン組成物を開示した。このクロマトフォアは、ＵＶＡおよびＵＶＢ波長放射線を吸収する能力を有している。
【００１７】
蛍光染料類は、フルオロセンスマイクロスコピイのための分子プローブ類標識において非常に有用である。フルオロセンスマイクロスコピイはまた反射光蛍光またはエピフルオロセンスマイクロスコピイとしても公知であり、非放射性インサイチュハイブリッド形成にとって非常に重要であるが、それは、その高感受性とスペクトル上分離して発光する異なる３種のイムノフルオロフォアを励起する能力による。それは、多重検出を可能にする（Ｃｈａｐｔｅｒ ＩＩ． Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ． Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ， ｐｒｉｎｔｅｄ ｉｎ Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９２）。背景となる原理はといえば、試料に対して、蛍光放射線の波長が常に励起放射線の波長よりも長いことを述べたストークス則（（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ（ ｂｙ Ｇｅｏｒｇｅ Ｌ． Ｃｌａｒｋ， １９９６，ｉｎ Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ ｏｆ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２ｎｄ ｅｄ． Ｐａｇｅ ４３５−４３６）に対応する励起波長を照射する。Ｃｈａｐｔｅｒ Ｖ ｉｎ： Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ． Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＧｍｂＨ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ， ｐｒｉｎｔｅｄ ｉｎ Ｇｅｒｍａｎｙ， １９９２， ｐａｇｅ ２３−６２ ａｎｄ Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｃｏ． Ｌｔｄ， Ｔｏｋｙｏ Ｊａｐａｎ． Ｃａｔａｌｏｇｕｅ． （Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ ＢＸ−ＦＬＡ Ｒｅｆｌｅｃｔｅｄ Ｌｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ（ Ｐａｇｅ １６． １９９９は、最近の用途における種々の非放射性フルオロクロム染色剤類を記載した。
【００１８】
異なる染色剤類は、フルオロセンスマイクロスコープの異なる励起キューブのために使用されている。たとえば、ＤＡＰＩ（ＤＮＡ染色、青色発光）、フルオレセイン−ｄＵＴＰ；Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８、３３３４２は、３３０−３８５励起キューブによる励起において観察される；４５０−４８０励起キューブによるＦＩＴＣ，アクリジンオレンジ（ＤＮＡ，ＲＮＡ用、緑色／黄色色調を発光する）、オーラミンおよび５１０−５５０励起キューブの下でローダミン、ＴＲＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム（ＤＮＡ、オレンジ色調を発光する）。
【００１９】
Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ  Ｂａｒｎｅｔｔ  ＢおよびＳｐｕｒｇｅｏｎ  Ｓａｎｄｒａ  Ｌ；Ｌｅｅ  Ｌｉｎｄａ  Ｇ；Ｂｅｎｓｏｎ  Ｓｃｏｔｔ  ｃ；Ｇｒａｈａｍ  Ｒｏｎａｌｄ  Ｊは、２０００年１０月５日発行国際特許ＷＯ００５８４０６において分子プローブとして、蛍光染料類として有用な４，７−ジクロロローダミン化合物類群を使用した。
【００２０】
ＬａＣｌａｉｒ；Ｊａｍｅｓ  Ｊ．（２０００年１０月３１日発行米国特許第６，１４０，０４１号およびＷＯ９９３８９１９）は、蛍光染料の合成および蛋白標識、ＤＮＡ標識、単分子分光分析におけるその適用および蛍光を開示した。
【００２１】
本出願者らは、異なる手法を採用した；本発明に報告した染料は、天然染料であり合成ではない。それは、海洋動物由来であり、植物または菌類由来ではない。部分的に純粋な染料は、無脊椎動物の皮膚細胞から直接抽出される。これは、海洋動物由来天然染料についての初めての報告であり、この染料は、蛍光染料である。前記海洋動物源である棘皮動物、ホロチュリアスキャブラ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａ）と称されるナマコは、新規材料源である。ほとんどの他の公知蛍光合成染料類と異なり、我々の染料は、異なる波長における異なる蛍光色調を得るために別の染料と混合する必要がない。それは、異なる３種の励起波長において複数の色調を有することができる異なる３種の着色蛍光を発する。さらに、最も知られているクラゲ由来緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）のような公知の天然蛍光染料のなかでも、我々の染料は、性質が非たんぱく質性でありかつ室温で何ヶ月もより安定であり、かつ菌類によって汚染されることがない。それは、また、生物界面活性剤の性質も有している。前記染料のもうひとつの重要な特性として、低ＵＶ波長スペクトル範囲（ＵＶＢ）における励起後において、それがＵＶＡ波長範囲の蛍光を発することである。これらの吸収および発光範囲が両者とも、どのＵＶスペクトルが特定の状況に好適であるかに応じて、選択的適用に供することができる。
【００２２】
前記染料のひとつの重要な面は、それが、分子プローブ類の非放射性標識および逆染色のための組成物類およびキット類を製造することである。それは、異なる波長励起において、ＤＡＰＩ，ＦＩＴＣおよびＰＩの色に匹敵する効果をもたらす。単一染料であるにもかかわらず、ひとつで３種（スリーインワン）の効果を有している。この染料は単一染料であるにもかかわらず、ひとつで３種の効果を有している。実際、この単一染料は、市場で現在公知の１２３種のフルオロクロム類の波長スペクトルの色調を網羅している。（インターネットのＢｉｔｐｌａｎｅ製品類（Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ） ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂ” ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｔｐｌａｎｅ．ｎｅ．ｃｈ／ｐｕｂｌｉｃ／ｓｕｐｐｏｒｔ／ｓｔａｎｄａｒｄ／Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ．ｈｔｍ．を参照。
【００２３】
さらに別の面は、エピフルオロセンスマイクロスコピイにおけるフルオロクロム染色剤として用途にあり、このことは、いかなる海洋性天然染料についても本文が初めての報告である。この適用は、蛍光インサイチュハイブリッド形成法を用いた分子診断、組織培養における生物汚染の迅速診断、工業調製、実験室および屋外条件における水質検査のような複数用途のための細胞遺伝的調製物検査の簡易迅速方法を提供する。
【００２４】
前記染料のさらに別の面は、先端分子生物学適用のための非放射性標識キット類の成分としてのその用途である。
【００２５】
発明の目的
本発明の主要目的は、ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た新規蛍光染料を提供することである。
【００２６】
本発明の別の目的は、海洋動物ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａ由来の前記天然染料／色素の抽出、部分精製および特性解析のための工程を提供することである。
【００２７】
さらに本発明の目的は、ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａ組織から得た染料を用いた組成物類を提供することである。
【００２８】
さらに本発明の目的は、その殺虫および殺虫殺鼠剤効果を調べることである。
【００２９】
さらに本発明の目的は、動物用処方剤のためのその適用である。
【００３０】
さらに本発明の目的は、ＵＶおよび可視光スペクトルの異なる３種の波長範囲において特定励起波長で蛍光を発する染料を提供することである。
【００３１】
さらに本発明の別の目的は、発光波長の蛍光および可視分光分析およびその範囲を観察することである。
【００３２】
さらに別の目的は、エピフルオロセンスマイクロスコピイキューブ類のＵＶおよび可視範囲における前記染料の異なる３種の蛍光着色発光を観察することである。
【００３３】
さらに別の本発明の目的は、細胞遺伝的スライドの蛍光染色効果を観察し、本発明の染料を用いて染色体類、細胞および組織をスクリーニングすることである。
【００３４】
さらに本発明の目的は、生物界面活性剤性質分析である。
【００３５】
さらに本発明の目的は、分子プローブ用非放射性標識としての前記蛍光染料を含有するキット類を開発することである。
【００３６】
発明の要約
したがって、本発明は、ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得られた新規蛍光染料を提供する。本発明はまた、前記染料の抽出、単離および特性解析工程を提供する。さらに、本発明は、前記染料含有組成物類を提供する。
【００３７】
発明の詳細な説明
本出願者らは、膨大な研究の後、海洋動物類、特に無脊椎動物類、さらに特定すればナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得られた新規蛍光染料を同定した。
亜界：後生動物
門：棘皮動物門
亜門：遊在類
綱：ナマコ類
亜綱：アスピドキロタセア（Ａｓｐｉｄｏｃｈｉｒｏｔａｃｅａ）
目：アスピドキロタ（Ａｓｐｉｄｏｃｈｉｒｏｔａ）
これらの目の中で、ナマコＨｏｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａは、
目：アスピドキロタ（Ａｓｉｐｉｄｏｃｈｉｒｏｔａ）
科：ホロチュリイダエ（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉｉｄａｅ）
属：ホロチュリア（Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ）
種：スキャブラ（ｓｃａｂｒａ）
に属する。
【００３８】
本発明は、さらに、前記動物の皮膚から得られた新規蛍光染料を提供する。それは、また、前記染料の物理化学的性質および直射日光、高温および低温におけるその安定性を記載している。前記染料は、ＵＶおよび可視光スペクトルの３種の異なる励起波長において３種の着色蛍光発光を有している。本発明は、また、汚染の迅速検査および細胞遺伝的スクリーニングのためのフルオロセンスマイクロスコープ下における細胞類スクリーニングに関する。本発明は、また、先端分子診断のためのたんぱく質、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子プローブ類の非放射性標識としての前記染料の用途、染色体類、細胞類および組織類の単回および二重染色用のエピマイクロスコピィ、蛍光インサイチュハイブリッド形成適用類、生物界面活性剤、生物汚染およびもれ検査、光化学療法、新規遠隔探査デバイス類、海中プローブ類、救命装具類、墜落航空機、救命いかだおよびロケット類のような軍備の位置の記録、氷点下条件における種々の蛍光適用類およびその他多くに関する。
【００３９】
本発明は、その生理的機能のために太陽光線を吸収するかまたは長期間太陽光線に暴露し異なる波長における蛍光の進化機構を有しているらしい海洋動物から得た蛍光染料を記載している。植物プランクトン、ピコプランクトン、および光合成菌類がその光合成機能のために太陽光線を吸収するように、光スペクトルの中から必要な波長を化学経路で用い、余分な光は、ストークス則に従って発光する。
【００４０】
殻および明瞭な防御器官類のような過剰な外部装備を有しておらず、硬くかつとがった皮膚を有し、柱状構造（ｏｓｓｉｃｌｅｓ）で形成された強力な内骨格を有する無脊椎動物は、固着性ですなわち動作が遅く、直射太陽光線に長時間暴露され、砂中または裂け目に生息し、蛍光を示すこともある。
【００４１】
本発明は、海洋無脊椎動物からの染料の抽出、精製および特性解析のための高効率かつ選択的な方法類、および非放射性標識類を用いた分子診断のためのキット類の製造、分子マーカー類、エピフルオロセンスマイクロスコピイ、光化学療法類、陸上および海中プローブ類のための新規機器デバイス類の成分、化粧品業界、食品業界および軍備等におけるその多くの用途を提供することによって、先行技術に固有の欠点を克服することを目指している。
【００４２】
前記海洋無脊椎動物は、属ナマコ類Ｈｏｌｏｔｈｕｒｏｉｄｅａに属するナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａと分類学的に称される棘皮動物である。本発明の産物は新規染料であり、それは、初めて報告されることになる。前記動物類は、引き潮のときにインド中央西沿岸の海岸から採取され、実験室にもってきて、基準量当たり塩度３０−３２％の海水を含むガラス水槽で保持した。前記動物は成体であり性的に成熟していた。前記の分類位置は、上記に述べたようにして同定した。実際、入手可能な染料のほとんどは、事実上、合成されている。天然染料の種類は６種しかない。これには、全生物から得られた染料類が含まれる。本発明に報告した蛍光染料は、海洋生物由来の種で唯一のものである。
【００４３】
本文では、用語染料とは、還元剤で脱色されない色素のために使用している。前記染料は、繊維、セルロース等に色を付与する。それは、その起源が世界の海岸で事実上よく見られる海洋動物由来でありかつ合成色素ではないので、天然染料とよばれる。蛍光染料は、特定波長で励起されると、極めて短時間において高電子状態から低電子状態へ遷移する間に光を発するものである。
【００４４】
多着色蛍光とは、異なる波長範囲で励起されると、異なる着色光線を発することを意味する。それは、異なるＵＶおよび可視光スペクトルによる励起において、青色、黄色および橙色の蛍光色調を発する。生物界面活性剤とは、振とうすると石鹸のような泡を作り抗菌性を呈する染料溶液を意味する。本文では、分子診断とは、分子細胞遺伝学における蛍光インサイチュハイブリッド形成適用のための分子プローブ類の非放射性標識として、およびミクロアレイ中におけるマーカー類として、および分子生物研究において前記染料を使用することを意味する。本文では、エピフルオロセンスマイクロスコピイとは、本染料を染色剤として使用し異なるキューブ構造物により観察したときに公知のフルオロクロム類による励起により特定の着色蛍光を発光した際に異なる着色蛍光を記録することによるスライド類の細胞遺伝的調製物のマイクロスコープ研究に関している。フルオロクロムキューブ類ＷＵＢ、ＷＢ、ＷＧは、異なる波長用Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ−ＦＬＡ反射光蛍光アタッチメントの指定フィルタキューブ構造物である。
【００４５】
したがって、本発明は、天然蛍光染料の抽出、精製および特性解析のための方法を提供し、前記方法は、
（ｉ）屋外からの前記材料の採取および実験室条件下におけるその維持、
（ｉｉ）棘皮動物ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａの皮膚からの色素の抽出、および
（ｉｉｉ）前記染料の部分精製、
を含む。
【００４６】
本発明の生物活性抽出物は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得られる。この抽出物は天然蛍光染料として有用であり、下記の特徴を有している：
ｉ．還元剤による脱色、
ｉｉ．合成化合物ではない、
ｉｉｉ．前記染料の粗抽出物は、色が黄緑色である、
ｉｖ．日光光線の下、裸眼で観察すると、部分精製染料は、赤茶色の粉末である、
ｖ．電灯の光の下では、やや緑色色調が発光する、
ｖｉ．性質が無定形、
ｖｉｉ．水溶性、
ｖｉｉｉ．エタノール、メタノールおよびアセトンのような有機溶媒中で不溶性、
ｉｘ．陰電荷、
ｘ．ｐＨ６．５を有する、
ｘｉ．フェノール性基の存在、
ｘｉｉ．キノノイド環の不在、
ｘｉｉｉ．芳香族アミン基類の不在、
ｘｉｖ．性質が非たんぱく質性、
ｘｖ．還元性糖が不在、
ｘｖｉ．染料は生物界面活性剤の性質を有する、
ｘｖｉｉ．また、染料は抗菌性を示し、抗菌アッセイを実施した時、阻害ゾーンを示した、
ｘｖｉｉｉ．色素兼染料は蛍光染料で、分光測光計でＵＶおよび可視光スペクトル範囲の異なる波長で励起すると、蛍光を発する、
ｘｉｘ．３００ｎｍ−７００ｎｍのＵＶ，可視分光分析、およびピークは、３７９ｎｍおよび４３９ｎｍ波長で記録される、
ｘｘ．２５０ｎｍ−３５０ｎｍのＵＶ，可視分光分析、およびピークは、２７２ｎｍおよび２９９ｎｍ波長にある、
ｘｘｉ．ＵＶおよび可視スペクトルにおける蛍光分光分析は、波長ＵＶ２７０ｎｍで励起すると、３２４ｎｍ−３８０ｎｍ範囲に蛍光を発し、太陽光線の紫外線のＵＶＡ波長範囲に入る、
ｘｘｉｉ．蛍光分光分析における励起波長４５０ｎｍにおいて、蛍光発光は５００ｎｍ−５８０ｎｍで起こり、最大強度を有していた、
ｘｘｉｉｉ．蛍光分光分析における励起波長５４０ｎｍにおいて、蛍光発光は５００ｎｍ−６２０ｎｍで起こり、最大強度を有していた、
ｘｘｉｖ．蛍光分光分析における励起波長５５５ｎｍにおいて、蛍光発光は５７５ｎｍ−６２０ｎｍで起こり、最大強度を有していた、
ｘｘｖ．２６０ｎｍ−２８０ｎｍ範囲のＵＶ灯を有するＵＶトランスイルミネータおよびゲルドキュメンテーション（Ｇｅｌ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）システムの下で、染料濃度１：４００００希釈に浸漬したＷｈａｔｍａｎｎ  フィルタＮｏ．１による物理的検査では、青緑色色調の蛍光を発する、
ｘｘｖｉ．エピフルオロセンスマイクロスコープの蛍光キューブのＵＶおよび可視範囲の３種の異なる波長において、３種の異なる着色蛍光を発する、
ｘｘｖｉｉ．蛍光青色発光は、ＵＶキューブＷＵ−３３０ｎｍ−３８５ｎｍ励起範囲で励起したとき、３８０ｎｍ−４００ｎｍ範囲のＵＶＡで出現する、
ｘｘｖｉｉｉ．蛍光黄色発光は、ＷＢキューブ−４５０ｎｍ−４８０ｎｍ励起範囲で励起したとき、５００ｎｍ−５７０ｎｍ範囲で出現する、
ｘｘｉｘ．蛍光橙色発光は、ＷＧキューブ−５１０ｎｍ−５５０ｎｍ励起範囲で励起したとき、５７０ｎｍ−６５０ｎｍ範囲で出現する、
ｘｘｘ．前記染料は、１０倍対物レンズで観察したとき、エピフルオロセンスマイクロスコープの通常の透過光線灯の下で、灰色色調を呈する、
ｘｘｘｉ．前記染料は、１：４００００倍の希釈範囲（すなわち、染料粉末１グラムを超純粋水４０リットル中に溶解させた）でさえもこれらの蛍光色を発光する、
ｘｘｘｉｉ．抽出物の蛍光は、室温で少なくとも１年経過後も持続していた、
ｘｘｘｉｉｉ．前記染料の蛍光は高度に光安定であり、直射光線に長時間暴露しても劣化しないし、および
ｘｘｘｉｖ．前記染料の蛍光は２０℃で凍結しても変化せず、化学発光生物類からの抽出物中においてと同様、前記分子類が活性化に必要なエネルギーを得ることができない温度である。
【００４７】
前記染料の物理的および他の特徴は、下記の段階によって評価することもできる：
（ｉ）前記染料の構造解析、
（ｉｉ）生物界面活性剤分析、
（ｉｉｉ）抗菌試験、
（ｉｖ）前記染料の可視分光分析、
（ｖ）前記染料の蛍光分光分析、
（ｖｉ）ＵＶトランスイルミネータ２６０−２８０ｎｍ範囲における発光の物理的検査
（ｖｉｉ）風乾法による細胞遺伝的スライド類の調製
（ｖｉｉｉ）前記染料によるスライド類の染色
（ｉｘ）フルオロクロムキューブ類ＷＵ、ＷＢ、ＷＧおよび明視野（Ｂｒｉｇｈｔ  Ｆｉｅｌｄ）における細胞遺伝的スライド類のエピフルオロセンスマイクロスコピイスクリーニング
（ｘ）全く細胞遺伝的物質を有していないスライド領域中における発光蛍光のマイクロフォトグラフィ、
（ｘｉ）フルオロクロムキューブ類ＷＵ，ＷＢ、ＷＧおよび明視野（Ｂｒｉｇｈｔ  Ｆｉｅｌｄ）下における細胞遺伝的スライド類の発光蛍光のマイクロフォトグラフィ、および
（ｘｉｉ）発光した蛍光色調の波長範囲およびフルオロクロムウキューブ類の励起範囲の波長範囲を調べること。
【００４８】
したがって、本発明は、エピフルオロセンスマイクロスコープのＵＶおよび可視光スペクトルキューブ中の波長の異なる３種の範囲で励起したときに、青色、黄色および橙色の色調における異なる３種の着色蛍光を発する海洋動物起源の天然蛍光染料を提供する。本発明はさらに、それぞれ、蛍光分光測光計および可視光分光測光計の読み取り値を記録することによる励起波長のほとんど同一範囲における発光ピークに関する。本発明は、さらに、この染料をエピフルオロセンスマイクロスコピイ染色剤として用いることによる風乾調製物上の細胞遺伝材料のエピフルオロセンスマイクロスコピイに関する。この染料は、種々の分子、生体医療および工学サイエンスにおける蛍光インサイチュハイブリッド形成による分子診断のための非放射性標識キット類の製造に使用することもできるであろう。
【００４９】
１態様において、前記染料材料源は、亜界：後生動物、門：棘皮動物門、亜門：遊在類、属：ナマコ類、名称：ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａに属する無脊椎海洋動物である。
【００５０】
さらに別の態様において、前記ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａは、ナマコ類で構成された群から選択され、世界中、特にインド太平洋の海岸、浅瀬、深層水に広く分布している。ナマコに最も近縁の周知の関連生物は、ウニ類およびヒトデ類である。
【００５１】
さらに１態様において、ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａの皮膚を分離し秤量する。皮膚湿潤重量１５ｇに対して５０％アルコール２５０ｍｌを添加し、２００ｒｍｐ速度で稼動するぜん動性ポンプを用いて真空中でろ過する。
【００５２】
さらに１態様において、前記抽出物を、８０℃の水浴上に保持してその容量が３分の１になるまで蒸発させ、すなわち、２５０ｍｌから８０ｍｌまで濃縮する。蒸発させるには、約３時間を要する。
【００５３】
さらに１態様において、９９．５％エタノール１００ｍｌを前記抽出物の濃縮液８０ｍｌに添加し、一晩沈殿させる。
【００５４】
さらに１態様において、沈殿物を有する前記濃縮液を１５００ｒｐｍで４−５分遠心分離して、最上層を捨てる。前記沈殿物は、８０℃の水浴上で５分間乾燥するまで蒸発させる。５０％エタノール抽出物２５０ｍｌから、蒸発後に染料２．５グラムが得られる。
【００５５】
さらに１態様において、部分純粋染料をスパーテルによって掻きだし、室温で乾燥したガラスの水薬瓶中に保存する。
【００５６】
さらに１態様において、前記染料の物理的性質を記録する。純粋な乾燥染料は、日光光線で色が赤茶色である。電灯光線の下では、緑色色調が観察される。前記染料は水溶性である。純粋エタノール、メタノール、クロロホルムおよびアセトンのような有機溶媒に不溶である。性質が無定形である。水溶液では、ｐＨ６．５を有する。
【００５７】
さらに１面において、構造分析を化学的方法によって実施した。この染料は、蒸留水に＠２ｍｇ／ｍｌで溶解させ、化学的性質を調べた。
【００５８】
さらに１態様において、中性（Ｎｅｕｔｒａｌ）塩化第二鉄を添加し、紫色の発色が観察された。それは、フェノール性基が存在することを証明した。
【００５９】
さらに別の態様において、β−メルカプトエタノール（ベータ  メルカプトエタノール）還元剤を添加した。前記化合物の脱色は全くなかった。このことは、キノノイド環が不在でかつ前記色素が染料であることを証明した。
【００６０】
別の態様において、ジアゾ化を０．１Ｎ  ＨＣｌおよびＮａＮＯ２（亜硝酸ナトリウム）を添加することによって実行し、ベータ（（）ナフトールのアルカリ溶液をそれに添加した。沈殿は全く観察されなかった。このことは、アミン基の不在を証明した。
【００６１】
別の態様において、＠１０ｍｇ／ｍｌの濃縮染料溶液を加熱したが、沈殿または凝固は全く観察されなかった。このことは、前記化合物が性質上非タンパク質性であることを証明した。同一溶液に対して濃縮ＨＣｌ  １滴を添加し、フェーリング溶液を添加した。色変化が皆無であることは、還元性糖が不在であることを証明した。
【００６２】
別の態様において、前記染料の生物界面活性剤性質が、水に添加し振とうしている間に泡を形成させることによって、観察された。
【００６３】
別の態様において、抗菌ディスク試験を実施し、阻害ゾーンが観察された。
【００６４】
本出願者らは、前記染料の性質を研究し、それが、異なる励起波長において既に市場にあるフルオロクロムマイクロスコピイ染色剤類に匹敵する多色発光を示すことを見出した。本染料の青色蛍光は、同一波長励起において生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識キット類の成分として使用されるＤＡＰＩフルオロクロムによる同色発光に匹敵する。前記染料の可視範囲の黄色蛍光は、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されるオーラミンの同色発光に匹敵する。前記染料の可視範囲の黄色蛍光は、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されるＦＩＴＣの同色発光に匹敵する。橙色蛍光発光は、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されるヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）フルオロクロムの橙色蛍光色に匹敵する。請求項１に記載の染料においては、その橙色蛍光発光は、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されるＴＲＩＴＣフルオロクロムによる橙色蛍光色に匹敵する。前記染料は、室温で安定で長い貯蔵期間を有する。前記染料の分子性および放射性キット類は、室温で輸出できる。前記染料は、少なくとも１２３種の異なるフルオロクロム類を特徴としており、それらは、すなわち、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２、ＦＩＴＣ，アクリジンオレンジ、オーラミン、ローダミン、ＴＲＩＴＣ，およびヨウ化プロピジウムであり、それらは、現在市販されている。前記染料は、通常のマイクロスコープ光線の下で灰色色調を呈し、これは、相コントラスト効果をもたらし、それは、細胞遺伝的、細胞学的、および組織化学的スライド類の迅速スクリーニングに有用であり、マイクロスコープの相コントラスト付属部品オプションに余分な出費をしないですむ。蛍光色発光は、蛍光のストークス則に従う。コダック（Ｋｏｄａｋ）フィルムロールによるマイクロフォトグラフは、緑色色調のマイクロフォトグラフにおいてエピフルオロセンスマイクロスコープ下において青色蛍光のような隣接色発光波長の色調を示す。コダックフィルムロールによるマイクロフォトグラフは、マイクロフォトグラフにおいてエピフルオロセンスマイクロスコープの下で黄色蛍光を観察したとき緑色色調が出るように、隣接色発光波長の色調を示す。同様に、マイクロフォトグラフにおけるエピフルオロセンスマイクロスコープの下で橙色蛍光色では、赤色色調が出現する。蛍光について調べた細胞遺伝的スライド類は、試料がなく染料のみが存在するバックグランドに比較して、細胞の逆染色効果を示す。
【００６５】
別の面において、３００ｎｍ−７００ｎｍ波長（図３）のＵＶ可視分光分析を実施した。ピークは、３７９ｎｍおよび４３９ｎｍ波長で記録される。
【００６６】
別の態様において、前記２５０ｎｍ−３５０ｎｍ波長のＵＶ分光分析（図４）を実施した。ピークは、２７２ｎｍおよび２９９ｎｍ波長で記録される。
【００６７】
さらに別の面において、励起波長２７０ｎｍにより蛍光分光分析。前記蛍光は、３２４ｎｍ−３８０ｎｍにおいて出現し最大強度を有していた（図５）。
【００６８】
別の態様において、励起波長４５０ｎｍにより蛍光分光分析。前記蛍光は、最大強度を有して５００ｎｍ−５８０ｎｍにおいて出現した（図６）。
【００６９】
別の態様において、励起波長５４０ｎｍにより蛍光分光分析。前記蛍光は、最大強度を有して５００ｎｍ−６２０ｎｍにおいて出現した（図７）。
【００７０】
別の態様において、励起波長５５５ｎｍにより蛍光分光分析。前記蛍光は、最大強度を有して５７５ｎｍ−６２０ｎｍにおいて出現した（図８）。
【００７１】
別の態様において、Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１フィルタペーパーを、前記染料抽出物中に浸漬し、２６０ｎｍ−２８０ｎｍ波長範囲のＵＶ灯を有するＵＶトランスイルミネータの下で観察した。それは、青色蛍光を発光した。
【００７２】
さらに別の面において、この染料を染色剤として１：１００００（１０リットル当たり１ｇ）希釈で用いて異なるキューブ類によって励起したときの光の放出を記録し、色調を公知のフルオロクロム類と比較することによって、エピフルオロセンスマイクロスコピイ研究を行う。
【００７３】
異なる染色剤類は、前記フルオロセンスマイクロスコープの異なる励起キューブ類のために使用する。たとえば、ＤＡＰＩ（ＤＮＡ染色、青色発光）、フルオロセイン−ｄＵＴＰ；Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８，３３３４２は、３３０ｎｍ−３８５ｎｍ励起キューブ類による励起下で観察される；４５０ｎｍ−４８０ｎｍ励起キューブ下でＦＩＴＣ、アクリジンオレンジ（ＤＮＡ、ＲＮＡは、緑色／黄色がかった色調を発光する）、オーラミン；および５１０ｎｍ−５５０ｎｍ励起キューブ下におけるローダミン、ＴＲＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム（ＤＮＡは橙色色調を発光する）。
【００７４】
このエピフロオロセンスに対する１態様において、細胞遺伝的スライド類のマイクロスコープスクリーニングは、希釈抽出物１滴を置きかつスペクトル範囲３３０−３８５ｎｍ波長を有するＷＵフィルタによる励起によって、行われる。
【００７５】
別の態様において、前記細胞遺伝的スライド類のエピフルオロセンスマイクロスコープスクリーニングは、抽出物１滴を置きかつスペクトル範囲４５０−４８０ｎｍ波長を有するＷＢフィルタによる励起によって、行われる。
【００７６】
別の態様において、前記細胞遺伝的スライド類のエピフルオロセンスマイクロスコープスクリーニングは、抽出物１滴を置きかつスペクトル範囲５１０−５５０ｎｍ波長を有するＷＧフィルタによる励起によって、行われる。
【００７７】
別の態様において、明視野（Ｂｒｉｇｈｔ  Ｆｉｅｌｄ）対物下における前記細胞遺伝的スライド類のエピフルオロセンスマイクロスコープスクリーニングは、この染料を用いて透過光線によって行う。
【００７８】
さらに別の態様において、この染料で染色した細胞遺伝的スライド類のエピフルオロセンスマイクロスコピイスクリーニングは、それぞれの励起によって発光した蛍光色の色調を観察することによって行う。
【００７９】
別の態様において、ＷＵ３３０ｎｍ−３８５ｎｍ範囲による励起が発光した蛍光は、３８０ｎｍ−４００ｎｍ範囲である。
【００８０】
さらに別の態様において、スペクトル範囲４５０ｎｍ−４８０ｎｍを有するＷＢフィルタによる励起は、５５０ｎｍ−５７０ｎｍ範囲の蛍光を発光した。
【００８１】
さらに別の態様において、スペクトル範囲５１０ｎｍ−５５０ｎｍを有するＷＧフィルタによる励起は、６００ｎｍ−６５０ｎｍ範囲の蛍光を発光した。
【００８２】
さらに別の態様において、明視野（Ｂｒｉｇｈｔ  Ｆｉｅｌｄ）下における前記細胞遺伝的スライド類の透過光線を用いたエピフルオロセンスマイクロスコープスクリーニングは、細胞成分類の濃度に応じて全白色範囲の可視光スペクトルにおいて光を発し、相コントラスト効果をもたらした。
【００８３】
さらに本発明の別の面において、細胞を含まないスライド領域において発光した蛍光のＷＵ３３０ｎｍ−３８５ｎｍ範囲におけるマイクロフォトグラフィは４００ＡＳＡスピードのコダックフィルムによって露光を５０秒から６０秒に変化させることによって行う。青色蛍光色調が発光した。
【００８４】
別の態様において、細胞を含まないスライド領域において発光した蛍光のＷＢ４５０ｎｍ−４８０ｎｍ範囲におけるマイクロフォトグラフィは、４００ＡＳＡスピードのコダックフィルムによって露光を５０秒から６０秒に変化させることによって行う。黄色蛍光色調が発光した。
【００８５】
別の態様において、細胞を含まないスライド領域において発光した蛍光のＷＧ５１０ｎｍ−５５０ｎｍ範囲におけるマイクロフォトグラフィは、４００ＡＳＡスピードのコダックフィルムによって露光を５０秒から６０秒に変化させることによって行う。橙色蛍光色調が発光した。
【００８６】
別の態様において、細胞を含まないスライド領域において明視野（Ｂｒｉｇｈｔ  Ｆｉｅｌｄ）下において発光した蛍光のマイクロフォトグラフィは、灰色色調を呈した。
【００８７】
さらに別の態様において、細胞を含むスライド領域において発光した蛍光のＷＵ３３０ｎｍ−３８５ｎｍ範囲におけるマイクロフォトグラフィは、４００ＡＳＡスピードのコダックフィルムによって露光を５０秒から６０秒に変化させることによって行う。青色蛍光色調が発光した。
【００８８】
別の態様において、細胞を含むスライド領域において発光した蛍光のＷＢ４５０ｎｍ−４８０ｎｍ範囲におけるマイクロフォトグラフィは、４００ＡＳＡスピードのコダックフィルムによって露光を５０秒から６０秒に変化させることによって行う。黄色蛍光色調が発光した。
【００８９】
別の態様において、細胞を含むスライド領域において発光した蛍光のＷＧ５１０ｎｍ−５５０ｎｍ範囲におけるマイクロフォトグラフィは、４００ＡＳＡスピードのコダックフィルムによって露光を５０秒から６０秒に変化させることによって行う。橙色蛍光色調が発光した。
【００９０】
別の態様において、明視野（Ｂｒｉｇｈｔ  Ｆｉｅｌｄ）下において細胞を有するスライド領域に発光した蛍光のマイクロフォトグラフィは、灰色色調を呈した。
【００９１】
本発明のさらに別の面において、蒸留水で調製し染色剤として使用したときの前記染料の１：１００００倍希釈は、エピフルオロセンスマイクロスコープのＵＶおよび可視範囲において着色蛍光発光が出現した。
【００９２】
さらに別の態様において、前記染料を水で１：４００００倍に希釈し、このことは、異なる３種の波長において３種の色の蛍光を生み出す。
【００９３】
さらに別の態様において、本発明は、超純水中１：４００００比において海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た抽出物含有生物活性組成物を提供し、透過光線下異なる３種の波長における３種の色の蛍光および相コントラスト効果をもたらす。
【００９４】
本発明は、また、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含有する組成物を提供し、蛍光色を呈する可撓性塩化ポリビニルフィルムの調製に有用である。
【００９５】
ある態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含有する組成物を提供し、被覆組成物類およびインク類の調製に有用である。
【００９６】
別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、もれ検出に有用である。
【００９７】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、海中プローブに有用である。
【００９８】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、皮膚がんの光化学療法に有用である。
【００９９】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む化粧品組成物を提供する。
【０１００】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、分子診断のための蛍光プローブインサイチュハイブリッド形成キット類として有用である。
【０１０１】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として有用である。
【０１０２】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、免疫蛍光検出において有用である。
【０１０３】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドプローブ類および抗ＤＩＧ  Ｆａｂフラグメント類の逆染色剤として有用である。
【０１０４】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、フローサイトメトリにおける単一および複数細胞定量的蛍光において有用である。
【０１０５】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、エピフルオロセンスマイクロスコピイのためのフルオロクロム染色剤として有用である。
【０１０６】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、健康食品業界、化粧品業界、薬品および化学業界において生物汚染の迅速検査に有用である。
【０１０７】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、実験室培養において生物汚染の迅速推定に有用である。
【０１０８】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、屋外条件下における生物汚染物質の迅速検査に有用である。
【０１０９】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、コリンエステラーゼ類の競合的阻害剤として有用である。
【０１１０】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、抗菌組成物において有用である。
【０１１１】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、洗浄（ｔｏｉｌｅｔｒｙ）組成物類における生物界面活性剤として有用である。
【０１１２】
さらに別の態様において、本発明は、海洋ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａから得た生物活性抽出物を従来の添加物とともに含む組成物を提供し、天然着色剤として有用である。
【０１１３】
表の説明
表１（ａ）（ｂ）  キノノイド環、フェノール性およびアミン基の存在または不在のための化学的方法による前記染料の構造解析。
表２  キノノイド環の不在、タンパク質性／非タンパク質性性質および還元性糖の存在／不在を調べるための化学的方法による前記染料の構造解析。
表３  オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）エピフルオロセンスマイクロスコープの異なる波長キューブ類で励起した際の染色剤として使用した前記染料の異なる色調蛍光の色。
【０１１４】
本発明は、世界中でインド中央西海岸およびインド太平洋領域に沿って広く分布している棘皮動物（ナマコ類Ｈｏｌｏｔｈｕｒｏｉｄｅａ：ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａ）由来の天然染料である新規色素の抽出、精製および特性解析の工程に関する。
【０１１５】
本発明は、さらに、前記動物の皮膚色素由来の新規蛍光純粋染料を提供し、それは、−２０℃に保存することによって繰り返し３−４回同一試料から抽出でき、したがって、天然資源の乱獲に歯止めをかけることができる。
【０１１６】
さらに本発明は、前記染料が、ＵＶおよび可視光スペクトルの３種の異なる励起波長において蛍光マイクロスコピイ用に現在市販されている３種の異なるフルオロクロム類（ＤＡＰＩ，ＦＩＴＣおよびＰＩ）による発光と同等の３種の着色蛍光発光を有することに関する。
【０１１７】
したがって、前記染料は、染色体類、細胞類および組織類の一重および二重染色のために簡易なプロトコールに従い、スリーインワン（１種で３種の働きをする）エピフルオロセンスマイクロスコピイ用フルオロクロム染料として市販できる。
【０１１８】
本発明は、また、分子生物学において蛍光インサイチュハイブリッド形成適用のためのたんぱく質、ＤＮＡおよびＲＮＡプローブ類の非放射性標識における染料用途を検討している。
【０１１９】
したがって、好適な用途形態において、前記染料は、分子標識および検出キット類の成分となることができ、それらのほとんどは、高価格で輸入され販売されている。
【０１２０】
これらの標識キット類は、迅速分子細胞遺伝およびミクロアレイ技術を用いる分子診断学のために広く求められている。
【０１２１】
さらに別の好ましい用途形態では、染料は、太陽光線からＵＶＢ吸収のための化粧品組成物類製造において有益であることができる。
【０１２２】
さらに別の本染料の利点は、その蛍光が、非常に希釈した溶液（１：４００００）でさえも可視できることである。
【０１２３】
この性質は、救命ジャケット類の部品として救命装具類において利用でき、墜落航空機、救命いかだおよびロケットのような軍備の位置の記録に用いることができ、産業界におけるもれ検査にも利用できる。
【０１２４】
本発明は、単一および複数細胞のためのフローサイトメータにおける蛍光の定量的測定に有用であろう。
【０１２５】
本発明は、また、組織培養物、汚染、健康、食品および化粧品業界における産業汚染物のような天然および制御環境における生物汚染物の迅速推定に有益であろう。
【０１２６】
低波長ＵＶ照射によってＵＶＡ範囲に蛍光を発光できる本染料の能力は、皮膚がんの選択的光化学療法に有用である。別の好適な形態において、前記染料は、化粧品業界におけるサンスクリーン組成物の成分としての用途であることもできる。
【０１２７】
さらに別の用途は、前記染料が生物界面活性剤であり抗菌洗面洗浄剤類（ｔｏｉｌｅｔｒｙ）及び組成物類において使用できることである。
【０１２８】
さらに別の使用の好適な形態において、前記染料は、蛍光分光測光分析で検査したところ室温で長い保存期間を有している。
【０１２９】
さらに別の好適な使用の形態において、前記存在するフルオロクロム類は、化粧品類に対して天然の色を付与し、着色添加物に要する出費を節約させるであろう。
【０１３０】
前記蛍光染料の別の用途は、新規遠隔探査機器類および海中プローブ類の成分としてであり、これらでは、光波長感度に基づくデータが必要である。
【０１３１】
本発明を下記の実施例で例示するが、それらは、本発明の範囲を限定するものとしては全くみなすべきではない。
【０１３２】
【実施例】
前記染料の抽出、部分精製および特性解析のための方法類および前記染料の蛍光効果を分光分析およびエピフルオロセンスマイクロスコピイによって検査するために実施した実験類の詳細を開示する。
【０１３３】
実施例１
材料採取
亜界：後生動物
門：棘皮動物門
亜門：遊在類
綱：ナマコ類
亜綱：樹手類（デンドロキロタセア：Ｄｅｎｄｒｏｃｈｉｒｏｔａｃｅａ）
目：デンドロキロタ（Ｄｅｎｄｒｏｃｈｉｒｏｔａ）
属：Ｈｏｌｏｔｈｕｒｉａ
種：ｓｃａｂｒａ
上記に属する動物類を、引き潮時にインド中央西沿岸の海岸で採取した。これらを実験室に持ち帰り、分類学的同定とその後使用するまで塩度１００当たり３０−３２（３０％）の海水を含むガラス水槽で保持した。前記動物は成体であり性的に成熟していた。
【０１３４】
実施例２
色素抽出
２つの方法を試した。
１）我々の当初の実験では、採取後の動物を−２０℃に凍結し、融解したとき、部分色素がトレイ中に出てきた。これを処理し、このように３−４回して、動物１匹から色素を取り出した。図１および図２は、新鮮動物および抽出のために４回使用した動物を示している。
２）第２の方法では、前記動物を水道水で最初に洗浄し、その後、Ｍｉｌｌｉｑ水（ミリキュ水；超純水）で洗浄した。体部を鋭利なはさみで切り開き、体壁を他の内臓から分離した。体壁から鋭利な剃刀で表皮皮膚部分をはぎとり、すぐに処理しない場合には−２０℃の冷蔵庫で保存した。その後ビーカーに入れ、それに対して、５０％ｖ／ｖエタノールアルコールおよびＭＱ水混合物を下記比率で添加した。
動物皮膚１５ｇ：５０％エタノールアルコール２５０ｍｌ
【０１３５】
実施例３
色素溶液のろ過
この段階は、細胞残渣および懸濁不純物および沈殿不純物類の一部を除去するために実施した。透明溶液を作成し懸濁物を全て沈殿させるために、それを遠心分離した。
着色溶液をデカントし、ミクロろ過ユニット（Ｖｅｎｓｉｌ  ｍａｋｅ）ガラスフィルタによりぜん動性ポンプを補助的に用いてろ過した。ろ液を放物状フラスコに入れ、２００ｒｐｍ回転で３０分間放置した。
【０１３６】
実施例４
色素の濃縮
着色溶液をその後８０℃の水浴に載せ、その容量が３分の１になるまで濃縮した。これは、また、存在するアルコールを蒸発させることになった。濃縮物を、再度、同一フィルタ装置によるろ過に供した。
【０１３７】
実施例５
染料精製
色素溶液は、ＮａＣｌ，ＭｇＣｌ２，ＭｇＳＯ４および他の水溶性化合物類のような不純物類を含んでいるであろう。アルコール（脱水）、アセトンのような極性有機溶媒類を前記色素濃縮溶液に添加すると、それが、急激に沈殿するであろうことがわかった。
その後、それは、海水塩類から分離できる。これは、分光分析のために色素を精製することである。
上記に述べた実施例５により調製した濃縮溶液を、５００ｍｌの分液漏斗に取り、これに対してエタノール（濃縮上清８０ｍｌ＋９９．５％エタノール１００ｍｌ）を添加した。分液漏斗を傾け、内容物をゆっくりと混合し、一晩かかって沈殿したものを採取した。沈殿物を含む濃縮物は、１５００ｒｐｍで４−５分間遠心分離し、上層を捨てる。沈殿物を再度ＭＱ水５ｍｌに溶解させ、沈殿が完了するまで再度１００％エタノールを添加した。これをもう一度遠心分離し、沈殿物を採取した。この段階を３−４回繰り返し、色素を精製する。
沈殿物は、８０℃の水浴で乾燥するまで５分間蒸発させる。純粋な染料は、スパーテルによって掻きだし、室温で乾燥したガラスの水薬瓶中に保存する。
実施例２からの５０％エタノール粗抽出物２５０ｍｌは、粉末形状になるまで蒸発させると、部分精製染料２．５ｇを付与した。
【０１３８】
実施例６
前記化合物の物理特性
粗抽出物は、色が黄緑色である。純粋乾燥染料の物理的性質は、裸眼で見たとき日光光線の下で色が赤茶色である。電灯光線では、緑色色調が観察される。前記染料は水溶性であり、純粋エタノール、メタノール、およびアセトンのような有機溶媒中に不溶である。それは、性質が無定形である。それは、ｐＨ６．５を有し、陰電荷を有している。
【０１３９】
実施例７
化学的方法による前記染料の構造分析
実験１：前記染料のＣＨＮＳ元素分析を行い、結果を表１（ａ）および（ｂ）に示した。
実験２：
前記染料を、＠２ｍｇ／ｍｌでＭＱ水に溶解させ、化学的性質を調べる。ある基類の存在および不在を試験し、結果を表２に示した。試験が陰性であることを示した時には、必ず、高濃度の染料を用いて実験を再度行った。
たとえば、２ｍｇ／ｍｌ染料溶液に対して、ベータ−メルカプトエタノール（還元剤）を添加した。前記化合物の脱色は全く起こらなかった。このことは、キノノイド環が不在であり前記色素が染料であることを証明した。
実験３において、濃縮染料溶液＠１０ｍｇ／ｍｌを加熱したが、沈殿または凝集は全く観察されなかった。このことは、前記化合物が性質上非タンパク質性であることを証明した。
実験４において、同一溶液に対して濃ＨＣｌを１滴を添加し、フェーリング溶液を添加した。色無変化であることは、前記還元性糖が不在であることを証明した。
【０１４０】
実施例８
前記染料の電荷検査：
前記化合物の電荷は、ゲル電気泳動によって行った。
染料試料（１０ｍｌ）を、０．５Ｘ  ＴＢＥで調製した１％アガロースゲルに載せる。前記ゲルは、６５ボルトで１時間泳動させた。それを、ゲル鋳型システムから取り除き、肉眼およびＵＶトランスイルミネータで観察した。前記染料が陽電荷電極に向かって移動していることがわかり、染料それ自体は、陰電荷の化合物である。したがって、それが、陽電荷の電極に向かって引き寄せられていた。
【０１４１】
実施例９
生物界面活性剤分析：
前記染料の生物界面活性剤性質は、水に添加し振とうしている間に泡を形成することによって観察された。溶液は、泡っぽい感触を呈した。
【０１４２】
実施例１０
抗菌試験：
前記海洋性染料はフェノール性化合物でありかつフェノール性化合物類は一般的に抗菌活性を有しているので、この化合物で抗菌アッセイを実施し、阻害ゾーンを観察した。
Ｅ．ｃｏｌｉ（野生型）培養物を一晩、三角フラスコ（１００ｍｌ）中のマッコンキー（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）培養液５０ｍｌ中で増殖させた。抗生物質アッセイ寒天培地を調製し、殺菌した。その後、５０℃の温度に置き、Ｅ．ｃｏｌｉ（野生型）培養物１ｍｌをそれに添加した。前記培養物を抗生物質アッセイ寒天培地と混合して、固化させた。試料１０ｍｇ／ｍｌを調製し、フィルタペーパディスク中に浸漬させた。その後、Ｅ．ｃｏｌｉを接種した前記抗生物質アッセイ寒天培地に置いた。
その後、インキュベータ中で２４時間、３７℃でインキュベーションした。フィルタディスクを取り囲む阻害ゾーンを観察した。このことは、前記染料が、Ｅ．ｃｏｌｉのようなグラム陰性生物に対する抗菌活性を有していることを証明した。
【０１４３】
実施例１１
前記染料のＵＶ／可視分光分析
使用機器：Ｇｅｎｅｓｙｓ２  ＵＶ分光測光機器
２ｍｇ／１０ｍｌ溶液をメスフラスコ中で調製し、スペック読み取りは、石英セルを用いて、前記溶液を２ｍｌ添加することによって、ＵＶ可視範囲で行った。対照は、超純水とした。
３００ｎｍ−７００ｎｍ波長のＵＶ、可視分光分析（図３および図４）を実施した。ピークは、波長３７９ｎｍおよび４３９ｎｍに記録される。
２５０ｎｍ−３５０ｎｍ波長のＵＶ可視分光分析（図３および図４）を実施した。ピークは、波長２７２ｎｍおよび２９９ｎｍにおいて記録される。
【０１４４】
実施例１２
前記染料の蛍光分光分析
使用装置：Ｈｉｔａｃｈｉ蛍光分光測光機器
蛍光分光分析を、可視およびＵＶスペクトルの異なる波長範囲で実施し、発光範囲を調べた。それは、励起波長２７０ｎｍを有していた。蛍光は、最大強度３２４−３８０に出現した（図５）。
蛍光分光分析では、励起波長４５０ｎｍにおいて、蛍光は、最大強度５００−５８０に出現した（図６）。
蛍光分光分析では、励起波長５４０ｎｍにおいて、蛍光は、最大強度５００−６２０に出現し（図７）、励起波長５５５ｎｍにおける蛍光分光分析では、蛍光は、最大強度５７５−６２０ｎｍに出現した（図８）。
【０１４５】
実施例１３
ＵＶトランスイルミネータおよびゲルドキュメンテーション（Ｇｅｌ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）システムによる発光の物理的検査
Ｗｈａｔｍａｎ  Ｎｏ．１フィルタペーパーを切り、希釈粗抽出物に浸し、ゲルドック（ｇｅｌ  ｄｏｃ）ＵＶ灯の下で観察した。染料の染み込みが進むにつれて、蛍光領域がさらに深まることが明瞭に見て取れた（図９）。
別の試験では、ろ過に用いたフィルタペーパーを２６０−２８０ｎｍＵＶ範囲を有する灯のＵＶトランスイルミネータによって観察した。青色がかった緑色調の蛍光が認められた（図１０）。
【０１４６】
実施例１４
エピフルオロセンスマイクロスコピイ
この染料を希釈１：４００００で染色剤として用いてかつ異なるキューブで励起し発光する光を記録することによって、エピフルオロセンスマイクロスコピイ研究を行い、公知のフルオロクロムと色調を比較した。固定組織の細胞遺伝的風乾調製物を作製した。これに対して、前記染色剤を１滴添加し、カバースリップを置いた。Ｏｌｙｍｐｕｓ反射光のＷＵ、ＷＢおよびＷＧキューブ類によってＵＶ光および可視光スペクトルの励起を用いて、スクリーニングを行った。
ＷＵキューブの波長範囲は、３３０ｎｍ−３８５ｎｍであった。
ＷＢキューブの波長範囲は、４５０ｎｍ−４８０ｎｍであった。
ＷＧキューブの波長範囲は、５１０ｎｍ−５５０ｎｍであった。
【０１４７】
実施例１５
異なる励起範囲における発光範囲が見出された。それは、下記のようであった：
ＷＵ３３０ｎｍ−３８５ｎｍ範囲の励起は、３８０ｎｍ−４００ｎｍ範囲の蛍光を放出した。４５０ｎｍ−４８０ｎｍのスペクトル範囲を有するＷＢフィルタによる励起は、５００ｎｍ−５７０ｎｍ範囲の蛍光を放出した。５１０ｎｍ−５５０ｎｍのスペクトル範囲を有するＷＧフィルタによる励起は、５７０ｎｍ−６５０ｎｍ範囲の蛍光を放出した。
透過光線を用いる明視野（Ｂｒｉｇｈｔ  Ｆｉｅｌｄ）下における細胞遺伝的スライド類のエピフルオロセンスマイクロスコピイスクリーニングは、可視スペクトルの全白色範囲で発光し、細胞成分の密度に依存して、灰色色調、相コントラスト様効果を付与した。
【０１４８】
実施例１６
発光蛍光色
発光した色の色調は、染料のみが存在する領域およびいくつかの試料が存在するところで観察された。励起スペクトル範囲および発光した蛍光は、厳密にストークス則に従った（表３）。
【０１４９】
実施例１７
エピフルオロセンスマイクロスコピイ染色剤として用いた前記染料によるスライド類のマイクロフォトグラフィ
細胞なしまたは試料細胞ありのスライド類領域で発光蛍光のマイクロフォトグラフィを、ＷＵ３３０−３８５ｎｍ範囲、ＷＢ４５０ｎｍ−４８０ｎｍ範囲、ＷＧ５１０ｎｍ−５５０ｎｍ範囲および明視野下で、コダックフィルム４００ＡＳＡスピードによって露出を５０秒から６０秒まで変化させて、実施した。
結果を、図１１−２４に示した。
【０１５０】
実施例１８
安定性検査
前記染料は安定で、室温で活性のままであり、１２０℃までその状態に留まり、このような処理後もスペクトル性質の変化が全くないことが証明された。前記化合物は、その安定性を約１年間、いかなる汚染または化学的分解もなく保持した。前記海洋性染料は、光処理後も光分解を受けなかった。したがって、前記海洋性染料は、安定剤を必要としなかった。
【０１５１】
実施例１９
殺虫殺鼠効果
前記化合物は、昆虫類に有毒であった。それは、アリのような昆虫類に対して毒性を示した。前記染料を湿らせたフィルタをそのまま実験台上に放置した。翌日、それには、死んだアリがいっぱいであることが観察された。
【０１５２】
実施例２０
染料を細胞株で試験し、活性を確認した。
【０１５３】
実施例２１
染料による染色
氷酢酸およびメタノールによる種々の起源由来固定組織をスライドに取り、前処理を行うことなく染料溶液をそれに添加した。異なる細胞部分は、さまざまに染料溶液を取り込むことが観察された。核に存在するアルギニンおよびリシン高含量たんぱく質類染色のゆえに、核が染色された（例  ヒストン）。他の細胞オルガネラもまた、染色された。前記海洋性染料が染色体たんぱく質を染色するに伴い、細胞の核型研究における価値が高まった。
【０１５４】
実施例２２
前記染料の生物活性抽出物を、ミクロ遠心管に入れ、−２０℃で保存し、ＵＶ光で凍結状態を観察した。別の実験では、染料溶液に後で入れたものを−２０°Ｃに保持し、ＵＶトランスイルミネータで観察した。
【０１５５】
実施例２３
前記抽出物を、イヌのダニ／ノミ殺しの動物用処方として用いた。１：２００希釈粗抽出物は、４０秒未満でダニおよびノミを殺した。
【０１５６】
【表１】
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【０１５７】
【表２】
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【０１５８】
【表３】
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【０１５９】
現在市販の染料に勝る利点
１．前記染料は、天然起源由来の染料でありかつ合成ではないので、非放射性である。
【０１６０】
２．この染料はその単一形状において、３種の異なる合成フルオロクロム類に匹敵し、同一蛍光色発光を示す。
【０１６１】
３．前記染料は迅速マイクロスコピイ染色剤として使用でき、マイクロスコープの相コントラストアクセサリーに全く余分な出費をすることなくかつ試料の固定および保存に長いプロトコールを実行することなく相コントラスト効果を付与する。特に、生試料の現場での定性検査。
【０１６２】
４．長期にわたり蛍光品質に劣化がないので、輸出時に冷蔵を必要としない。現在市販の蛍光染料類は、−２０℃に相当する冷蔵下で輸出されている。
【０１６３】
５．我々の染料は、前に公知となっている海洋性クラゲ由来緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）と異なり、レポーター遺伝子ではない。結果は直接的である。ＧＦＰは、３９５ｎｍの青色光を吸収し、４７０ｎｍに小ピークを有し、緑色光を発する。我々の染料は、３種の異なる蛍光波長で３種の蛍光色を発光する。前記染料は水に溶解性であり、したがって、水溶性染料類が必要な成分中で使用可能である。前記染料は、エタノール、メタノールおよびアセトンのような有機溶媒中で不溶性である。
【０１６４】
６．前記染料は、陰電荷を有している。
【０１６５】
７．前記染料はｐＨ６．５であり、ほとんど中性であり、したがって、組成物中において最終ｐＨ性に大きな影響をもたらすことはないであろう。
【０１６６】
８．前記染料は性質が非タンパク質性であり、したがって、天然条件下で分解しない。
【０１６７】
９．前記染料は、生物界面活性剤の性質を有しており、したがって、石鹸類およびトイレッタリ組成物中で使用できる。
【０１６８】
１０．前記染料は、抗菌性を有している。
【０１６９】
１１．前記染料は、１：４００００倍（すなわち、染料粉末１グラムを超純水４０リットルに溶解させた）の希釈範囲でもこれらの蛍光色を発光した。抽出物の蛍光は、室温で少なくとも１年後も持続していた。異なる励起波長におけるこれらの多色発光染料は、既に市販されているフルオロクロムマイクロスコピイ用染色剤類に匹敵する。
【０１７０】
１２．本染料の青色着色蛍光は、同一波長励起におけるＤＡＰＩフルオロクロムによる同一色発光に匹敵し、前記ＤＡＰＩフルオロクロムは、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識キット類の成分として使用されている。
【０１７１】
１３．本染料の青色着色蛍光は、また、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されているＨｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８による色発光に匹敵する。
【０１７２】
１４．本染料の青色着色蛍光は、また、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されているＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２フルオロクロムの同一励起波長における色発光に匹敵する。
【０１７３】
１５．本染料の可視範囲における黄色着色蛍光は、また、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されているアクリジンオレンジの同一色発光に匹敵する。
【０１７４】
１６．本染料の可視範囲における黄色着色蛍光は、また、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されているオーラミンの同一色発光に匹敵する。
【０１７５】
１７．本染料の可視範囲における黄色着色蛍光は、また、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されているＦＩＴＣの同一色発光に匹敵する。
【０１７６】
１８．その橙色着色蛍光発光は、また、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されているヨウ化プロピジウムフルオロクロムの橙色蛍光色に匹敵する。
【０１７７】
１９．その橙色着色蛍光発光は、また、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されているローダミンフルオロクロムの橙色蛍光色に匹敵する。
【０１７８】
２０．その橙色着色蛍光発光は、また、生化学、細胞生物学、免疫化学および分子生物学の非放射性標識および検出キット類の成分として使用されているＴＲＩＴＣフルオロクロムの橙色蛍光色に匹敵する。
【０１７９】
２１．同一目的のために使用されている合成市販染料類と異なり、本染料は、室温で安定で長い保存期間を有している。前記染料の分子非放射性キット類は、室温で輸出できる。
【０１８０】
２２．前記の単一染料は、現在市場にある少なくとも１２３種の異なるフルオロクロム類（ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２、ＦＩＴＣ，アクリジンオレンジ、オーラミン、ローダミン、ＴＲＩＴＣ、およびヨウ化プロピジウム等）の特徴を有している。通常のマイクロスコープの光線の下で、灰色色調は相コントラスト効果をもたらし、それは、細胞遺伝的、細胞学的、および組織化学的スライド類の迅速スクリーニングに有用でありマイクロスコープの余分な相コントラストアクセサリ部品に対する出費を節約させる。蛍光色発光は、蛍光のストークス則に従う。
【０１８１】
２３．コダックフィルムロールによるマイクロフォトグラフは、隣接色発光波長の色調を示す。マイクロフォトグラフにおいてエピフルオロセンスマイクロスコープの下で青色蛍光を観察するときのように、緑色色調も同様にでてくる。
【０１８２】
２４．コダックフィルムロールによるマイクロフォトグラフは、隣接色発光波長の色調を示す。マイクロフォトグラフにおいてエピフルオロセンスマイクロスコープの下で黄色蛍光を観察するときのように、緑色色調も同様にでてくる。マイクロフォトグラフにおいてエピフルオロセンスマイクロスコープの下で橙色蛍光色を観察するときのように、赤色色調も同様にでてくる。
【０１８３】
２５．全蛍光下で観察した細胞遺伝的スライド類は、試料がなく染料のみが存在するバックグランドにおいて細胞の逆染色効果をもたらす。
【０１８４】
２６．前記染料は、蛍光色を発する塩化ポリビニルの調製のために使用できる。それはまた、種々の塗料類、インク類およびテキスタイル類において蛍光色で使用できる。
【０１８５】
２７．前記染料は、ポリマーの漂白および増白のための蛍光染料組成物中で使用できる。前記染料は、全スペクトル蛍光染料によるもれ検出に使用できる。それはまた、自動化化学測定系でも使用できる。それはまた、墜落航空機、救命イカダ、およびロケットのような装備の位置を記録するために使用できる。さらに、それは、海中プローブ類中でも使用できる。前記染料は、皮膚がんの光化学療法において使用できる。
【０１８６】
２８．前記染料は、化粧品クリーム類および化粧液類のクロマトフォアサンスクリーン成分として使用できる。
【０１８７】
２９．前記染料の水混合性は、モイスチャライザー類と容易に混合できるようにしている。それは、分子診断学のための蛍光インサイチュハイブリッド形成適用キット成分として使用できる。それはまた、ＤＮＡ，ＲＮＡ，たんぱく質類および酵素類の標識用として生化学、細胞生物学、免疫化学、および分子生物学の非放射性標識および検出キット類、免疫蛍光検出類、ＤＩＧ標識オリゴヌクレオチドプローブ類および抗ＤＩＧ  Ｆａｂフラグメント類の逆染色、フローサイトメトリにおける単一および複数細胞定量的蛍光、エピフルオロセンスマイクロスコピイのためのフルオロクロム染色剤類の成分として使用できる。
【０１８８】
３０．前記染料は、健康食品業界、化粧品業界、薬品および化学業界における生物汚染の迅速検査、実験室培養物中の生物汚染物の迅速推定、および屋外条件下における生物汚染物質の迅速検査のために使用できる。それはまた、コリンエステラーゼ類の競合的阻害剤でもある。
【０１８９】
３１．前記染料は、抗菌組成物中で使用できる。
【０１９０】
３２．前記染料は、トイレッタリ組成物中で生物界面活性剤として使用できる。
【０１９１】
３３．前記染料は、超純水中１：４００００比率で海洋性染料の天然着色剤Ａ生物活性組成物として使用でき、異なる３種の波長における３種の色の蛍光と透過光線下で相コントラスト効果を得ることができる。
【０１９２】
３４．前記染料の精製は、５０％エタノール粗抽出物２５０ｍｌで実施でき、８０℃の水浴で５分間蒸発させ精製し、粉末形状の精製染料２．５グラムを得ることができる。２ｍｇ／１０ｍｌ溶液組成物を、濃度１０ｍｇ／ｍｌを用いる化学的方法による前記染料の分光測光法構造解析のために用いる。前記染料の結合剤としての水による１：４００００倍希釈生物活性組成物は、３種の異なる波長における３種の色の蛍光を付与する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
染料抽出前、屋外由来の新鮮ナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａ。
【図２】
染料４回抽出後のナマコＨｏｌｏｔｈｕｒｉａ  ｓｃａｂｒａ。
【図３】
ＵＶ可視領域におけるスキャニング。
【図４】
ＵＶ領域におけるスキャニング。
【図５】
蛍光分光測光。励起波長２７０ｎｍ。
【図６】
蛍光分光測光。励起波長４５０ｎｍ。
【図７】
蛍光分光測光。励起波長５４０ｎｍ。
【図８】
蛍光分光測光。励起波長２７０ｎｍ。
【図９】
ＷｈａｔｍａｎフィルタＮｏ．１を丸く切り、その先端を前記染料の希釈粗抽出物に浸漬し、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ．においてＵＶ放射線下で観察する。矢印は蛍光を示し、ＵＶフィルタを通して写真撮影した。下部は、染料を含まない対照である。
【図１０】
Ｗｈａｔｍａｎフィルタ類を前記抽出物のろ過のために使用し、ＵＶトランスイルミネータ（２６０ｎｍ−２８０ｎｍ波長範囲バルブ）の下で観察した。矢印は、蛍光を示す。下部フィルタペーパーは抽出物がなく、対照として保持した。
【図１１】
励起範囲３３０ｎｍ−３８５ｎｍを有するＷＵキューブによるエピフルオロセンスマイクロスコピイ青色蛍光発光であり、図１１は、試料を全く含まない染料の蛍光である。
【図１２】
励起範囲３３０ｎｍ−３８５ｎｍを有するＷＵキューブによるエピフルオロセンスマイクロスコピイ青色蛍光発光であり、図１２は、１０倍対物レンズで観察した細胞を含む場合である。
【図１３】
励起範囲３３０ｎｍ−３８５ｎｍを有するＷＵキューブによるエピフルオロセンスマイクロスコピイ青色蛍光発光であり、図１３は、同じ物を４０倍対物レンズで観察したものである。
【図１４】
励起範囲３３０ｎｍ−３８５ｎｍを有するＷＵキューブによるエピフルオロセンスマイクロスコピイ青色蛍光発光であり、図１４は、１００倍油浸対物レンズで観察した細胞である。
【図１５】
励起範囲４５０ｎｍ−４８０ｎｍを有するＷＢキューブによるエピフルオロセンスマイクロスコピイ緑黄色蛍光発光。図１５は、試料を全く含まない染料の蛍光である。
【図１６】
励起範囲４５０ｎｍ−４８０ｎｍを有するＷＢキューブによるエピフルオロセンスマイクロスコピイ緑黄色蛍光発光。図１６は、４０倍対物レンズで観察した細胞を含む場合である。
【図１７】
励起範囲４５０ｎｍ−４８０ｎｍを有するＷＢキューブによるエピフルオロセンスマイクロスコピイ緑黄色蛍光発光。図１７は、同一物を１００倍油浸対物レンズで観察したものである。
【図１８】
励起範囲４５０ｎｍ−４８０ｎｍを有するＷＢキューブによるエピフルオロセンスマイクロスコピイ緑黄色蛍光発光。図１８は、同一物を１００倍油浸対物レンズで観察したものである。
【図１９】
励起範囲５１０ｎｍ−５５０ｎｍを有するＷＧキューブによる橙色蛍光発光のエピフルオロセンスマイクロスコピイ色調。図１９は、試料を全く含まない染料の蛍光である。
【図２０】
励起範囲５１０ｎｍ−５５０ｎｍを有するＷＧキューブによる橙色蛍光発光のエピフルオロセンスマイクロスコピイ色調。図２０は、１０倍対物レンズで観察した細胞を含む場合の蛍光である。
【図２１】
励起範囲５１０ｎｍ−５５０ｎｍを有するＷＧキューブによる橙色蛍光発光のエピフルオロセンスマイクロスコピイ色調。図２１は、同一物を４０倍対物レンズで観察した場合である。
【図２２】
励起範囲５１０ｎｍ−５５０ｎｍを有するＷＧキューブによる橙色蛍光発光のエピフルオロセンスマイクロスコピイ色調。図２２は、１００倍油浸対物レンズで観察した細胞である。
【図２３】
１０倍対物レンズ下における明視野を通して観察した細胞。灰色色調−相コントラスト効果が見られた。
【図２４】
１００倍油浸対物レンズ下における明視野を通して観察した同一細胞。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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