(57)【要約】本発明は、α／βタイプＳＡＳＰ活性を有するポリペプチドであって、薬剤として使用できるものである。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
α／βタイプＳＡＳＰ様活性を有するポリペプチドであり、薬剤として使用するものであるポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドであって、以下のアミノ酸配列を含むものであるポリペプチド。
【化１】
2004513647.tif 000074
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドであって、補足図１に示す何れかのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項４】
請求項２または３に記載のポリペプチドであって、そのα／βタイプＳＡＳＰ様活性を実質的に減ずるものでない置換および／または欠失を含むポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを使用する方法であって、細胞増殖を阻害または予防する薬剤を製造するための使用方法。
【請求項６】
請求項５に記載の使用方法であって、上記細胞増殖として細菌細胞の増殖が含まれる使用方法。
【請求項７】
請求項５または６に記載の使用方法であって、ヒトの治療のための使用方法。
【請求項８】
請求項７に記載の使用方法であって、局所的感染症，ムシ歯，呼吸器系感染症，眼科系感染症，または局所器官感染症の治療のための使用方法。
【請求項９】
細胞増殖を阻害または予防するための組成物であって、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドおよびそのデリバリーシステムを含むことを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを使用する方法であって、微生物除去剤としての使用方法。
【請求項１１】
請求項１０の使用方法であって、表面的な微生物汚染の処理，土壌の改善，または水処理を含む使用方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを使用する方法であって、植物体に対する抗微生物剤としての使用方法。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドを使用する方法であって、その腸内細菌を除去するために有害動物を非治療的に処理する際の使用方法。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、薬剤として使用するためのポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載のポリヌクレオチドであって、ＤＮＡを含むポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリヌクレオチドであって、バシラス サブティラス（Ｂ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｓｓｐＣ遺伝子を含むポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを使用する方法であって、細胞増殖を阻害または予防する薬剤を製造するための使用方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の使用方法であって、上記薬剤がポリヌクレオチドを含むものである使用方法。
【請求項１９】
請求項１７または１８に記載の使用方法であって、上記細胞増殖として細菌の細胞増殖が含まれる使用方法。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれかに記載の使用方法であって、ヒトの治療のための使用方法。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のいずれかに記載の使用方法であって、局所的感染症，ムシ歯，呼吸器系感染症，眼科系感染症，または局所器官感染症の治療のための使用方法。
【請求項２２】
細胞増殖を阻害または予防するための組成物であって、請求項１４〜１６のいずれかに記載のポリヌクレオチドおよびデリバリーシステムを含み、当該デリバリーシステムが細胞をターゲットにできるものであることを特徴とする組成物。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組成物であって、上記デリバリーシステムがウィルスを含むものであり、且つ上記ポリヌクレオチドが当該ウィルスのゲノム中に挿入されている組成物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の組成物であって、上記ウィルスが、細菌をターゲットにできるバクテリオファージを含むものである組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の組成物であって、上記バクテリオファージが非溶原性バクテリオファージである組成物。
【請求項２６】
請求項２５に記載の組成物であって、上記非溶原性バクテリオファージが、少なくとも１つの非活性化された溶菌遺伝子を有する溶原性バクテリオファージを含むものである組成物。
【請求項２７】
請求項２６に記載の組成物であって、少なくとも１つの上記溶菌遺伝子が、ポリヌクレオチドの挿入によって非活性化されている組成物。
【請求項２８】
請求項２３〜２７のいずれかに記載の組成物であって、上記ウィルスが、その宿主特異性を増大させたり或いは変化させるために修飾されたものである組成物。
【請求項２９】
請求項１４〜１６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを使用する方法であって、微生物除去剤としての使用方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の使用方法であって、表面的な微生物汚染の処理，土壌の改善，または水処理を含む使用方法。
【請求項３１】
請求項１４〜１６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを使用する方法であって、植物体に対する抗微生物剤としての使用方法。
【請求項３２】
請求項１４〜１６のいずれかに記載のポリヌクレオチドを使用する方法であって、その腸内細菌を除去するために有害動物を非治療的に処理する際の使用方法。
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
本発明は、ポリペプチド，ポリヌクレオチド，およびこれらを含む薬剤組成物に関するものであり、特に、細菌細胞の増殖などの細胞増殖を阻害または防止するために使用されるものに関する。
【０００１】
（背景技術）
有芽胞細菌は、内生胞子を産生し得るという性質を有し、比較的小さな綱に分類される。この「内生胞子」は細菌の休眠状態での非生殖性生存形態であり、高温や有毒化学薬品，紫外線によるダメージなどの劣悪環境に対して抵抗性を示すものである。これら有芽胞細菌には、ゼマクチノミセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）や、スポロラクトバシラス（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）およびオシロスピラ（Ｏｓｃｉｌｌｏｓｐｉｒａ）といったあまり一般的でない菌株と同様に、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ），クロストリジア（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ），スポロサルチナ（Ｓｐｏｒｏｓａｒｃｉｎａ）種が含まれる。胞子の形成過程において、低分子量酸可溶性胞子タンパク質（ｓｍａｌｌ ａｃｉｄ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｐｏｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＳＡＳＰ）として知られているある種のタンパク質が産生される。「ＳＡＳＰ」は酸に可溶であり、且つ５〜１１ｋＤａという低分子量を有する。「ＳＡＳＰ」は、細菌の胞子において２つの主要な役割を有することが報告されている。即ち：先ずＳＡＳＰは、紫外線，熱，脱プリン化や潜在的に有害となり得る多くの化学薬品によるダメージから胞子ＤＮＡを守り；また、胞子が発芽するに当たって独立のアミノ酸供給源となるという役割を有し、栄養細胞はＳＡＳＰ無しでは新たに成長することができない。
【０００２】
バシラス種では、α，βおよびγタイプＳＡＳＰという３タイプのＳＡＳＰが知られている。α／βタイプＳＡＳＰのアミノ酸配列は、α−βタイプ間でも菌種間でも高い相同性を示す（バシラス種では、おしなべて〜７０％が一致し、〜８０％が類似している）。しかし、これらタンパク質は、他のあらゆるタンパク質ファミリーと相同性を示さず、また、他のＤＮＡ結合性タンパク質に特徴的なモチーフを含まない（Ｓｅｔｌｏｗ，１９８８年）。α／βタイプのＳＡＳＰは、免疫原性という観点からは密接な関連性を有しており、その分子量はおおよそ６．２〜７．６ｋＤａであり、疎水性アミノ酸を有意なパーセンテージ（〜３０％）で有する（Ｓｅｔｌｏｗ，１９８８年）。γタイプのＳＡＳＰは、８〜１１ｋＤａの分子量を有し、大分子量の疎水性アミノ酸が極端に少なく（＜１１％）、同種菌由来のα／βタイプＳＡＳＰよりも等電点が高い（Ｓｅｔｌｏｗ，１９８８年）。あらゆる生物体中には、多くのマイナーなα／βタイプＳＡＳＰと共に２つのメジャーなα／βタイプＳＡＳＰが存在し、それぞれが特有の遺伝子によりコードされている（Ｓｅｔｌｏｗ，１９８８年）。対照的に、これまで試験対象とされた全ての生物体においては、γタイプのＳＡＳＰは１種しか見出されておらず、その機能は、主として生育に必要なアミノ酸を供給するために使用されるα／βタイプＳＡＳＰの機能とは大きく異なる（ＨａｃｋｅｔｔとＳｅｔｌｏｗ，１９８７年）。これまで配列が同定されている全てのα／βタイプＳＡＳＰのリストを、関連するタンパク質の配列と共に補足図１として示す。これらタンパク質の配列間において共通するアミノ酸残基の範囲を、補足図２に示す。
【０００３】
これまで、α／βタイプのＳＡＳＰが紫外線によるダメージからＤＮＡを保護する作用機序に関して、様々な研究が為されてきた。ある研究（Ｓｅｔｌｏｗら，１９９１年）では、ＳＡＳＰが栄養細胞のＤＮＡに胞子特性を発現させることを証明するために、α／βタイプのＳＡＳＰをコードしている遺伝子（ｓｓｐＣ）が、誘導型プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の制御下にあるプラスミドへ挿入されている。大腸菌のＤＮＡにα／βタイプのＳＡＳＰが結合すると、プラスミドにおいて負の超らせん濃度が上昇し、これに付随してＤＮＡ構造に変化の生じることが観察された。ＤＮＡのコンフォメーションがＢ型からＡ型へと変化すると、ＤＮＡは紫外線から保護される様になると仮定されている。
【０００４】
医学分野では、細胞増殖の制御は、重要な関心事である。生体内での細胞増殖は、厳格なコントロール下にある；ここでの「細胞」には、皮膚フローラや腸内フローラ等の共生細菌細胞と同様に、生体の組織や器官を形成する細胞も含まれる。細菌や真菌などの微生物の増殖制御に乱れが生じると問題が発生し、患者の生命を脅かしかねない。細菌感染症に対する一般的な治療としては、特に、細菌の細胞壁を通常のターゲットとして作用し、広範な抗菌活性スペクトルを示す従来の抗生物質（例えば、ペニシリン）の使用を挙げることができる。また、他種の抗生物質の多くはヒトやその他の動物の細胞に対しても様々なレベルの毒性を示すが、これらは細菌細胞中でタンパク質の産生を阻害する様に作用する。細菌は、従来の抗生物質に対してかなりの抵抗性を示し得るが、今や“超抵抗性”を示す主が出現している。そこで、現在有効とされている抗生物質に替わる手段が求められている。
【０００５】
ある状況のもと、生体の組織や器官の正常細胞が異常な性質を示し制御なく増殖する様になり、命に関わるガンへと発展する可能性が生じ得る。現在採用されているガンの治療方法の多くは、毒性および／または好ましくない副作用を有する薬品または薬剤を使用するものである。ある種のガンでは薬剤に対して耐性をも獲得したり、或いは他の治療方法に応答しないものもあることから、従来の治療方法に替わる手段が切望されている。
【０００６】
（発明の開示）
本発明の第一の目的は、α／βタイプＳＡＳＰ様活性を有するポリペプチドであり、薬剤として使用するものを提供することにある。
【０００７】
驚くべきことに、本発明に係るポリペプチドは薬剤として使用できるものであり、特に患者に対して病原性を示す細胞の好ましくない増殖を阻害したり予防するための薬剤として使用できることが明らかにされた。その様な細胞増殖には、細菌細胞や、真菌，ガン細胞などの真核細胞の増殖も含まれる。
【０００８】
本発明に係るポリペプチドには、ペプチド，オリゴペプチド，タンパク質が含まれ、また、グリコシル化を含む翻訳後修飾（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）など共有結合による修飾があっても無くてもよい様な単量体や複合体として存在してもよい。本発明の代表的なポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含むものである。
【０００９】
【化２】
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【００１０】
好適には、本発明に係るペプチドは、補足図１で示されている何れか１つのアミノ酸配列を含み、当該アミノ酸配列としては、補足図３に示す様にバシラス サブティラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のｓｓｐＣ遺伝子によりコードされるものがある。これらポリペプチドは、何れも、ランダムな変異誘発や部位特異的な変異誘発により引発される様な置換および／または欠失を有していてもよいが、斯かる変異や欠失は、α／βタイプＳＡＳＰの活性を実質的に減ずるものであってはならない。天然由来のＳＡＳＰタンパク質間には高い保存性があるにもかかわらず、ＤＮＡへの親和性には有意に相違がある（Ｓｅｔｌｏｗら，１９９２年）。ＳＡＳＰのタンパク質配列を調整することによって、標的とするＤＮＡに対する親和性を向上させることができる可能性がある。斯かる観点から、与えられた生物体中に存在する互いに異なる複数の種に属する細菌および／または標的とする遺伝子へのターゲッティングを最も効果的にするために、天然由来ＳＡＳＰのバリエーションを利用したり、ＳＡＳＰを設計することが可能であると考えられる。
【００１１】
α／βタイプＳＡＳＰの活性は、一般的に、ＤＮＡのコンフォメーションに対するポリペプチドの効果の評価により測定することができる。従って、α／βタイプＳＡＳＰの活性は、ＤＮＡをＢ型コンフォメーションからＡ型コンフォメーションに変換することができる能力として定義することができる。これは、以下に説明する何れかの方法によって測定できる。
【００１２】
（ａ）　ＤＮＡコンフォメーションのＢ型からＡ型への変換に関しては、１９９１年のＭｏｈｒらによる参考文献に記載されている。円二色性スペクトルの変化は、長年にわたり、ＤＮＡコンフォメーションに関する鋭敏な基準とされてきており、また、二次構造の主要なファミリー間における相違が明白になるものとして認識されている（Ｍｏｈｒら，１９９１年）。真核細胞（ウシ胸腺）のＤＮＡと原核細胞のＤＮＡの両方と、α／βタイプＳＡＳＰとの相互作用は、（特に、バシラス サブティラス由来のＳｓｐＣを使用した実験では）、Ａ型ＤＮＡに特徴的な分光結果を示した。フーリエ変換赤外分光（ＦＴＩＲ）は、α／βタイプＳＡＳＰと複合したＤＮＡコンフォメーションの状態を評価する独立手段となる。ウシ胸腺ＤＮＡの濃縮溶液に関するＦＴＩＲスペクトルでは、主な吸収バンドが１２２５ｃｍ−１に表われるが、このバンドは、反対称的なＯ−Ｐ−Ｏというリン酸の伸縮振動によるものである（Ｍｏｈｒら，１９９１年）。このバンドは、ＳｓｐＣ−ウシ胸腺では１２４６ｃｍ−１にシフトする。水和効果単独でもＯ−Ｐ−Ｏの伸縮振動による位置に影響を与え得ることを考慮すべきであるが、斯かる挙動はＢ型からＡ型への変換に特徴的なものである。従って、ＳＡＳＰ−ＤＮＡ複合体（１：１の割合）が形成されるとＦＴＩＲスペクトルで１１８５ｃｍ−１のバンド吸収が検出されるが、斯かるＢ型からＡ型への変換の補助的な指標は有用となる。即ち、Ｂ型或いはＣ型ＤＮＡは、１１８５ｃｍ−１の赤外線バンドを示さないので、斯かる指標は、Ａ型コンフォメーションをとるＤＮＡの特異的なマーカーとなる（ＰｈｏｌｅとＦｒｉｔｚｓｃｈｅ，１９８０年）。水和効果は、１１８５ｃｍ−１のバンドによる解析に、作用も影響も与えない。脱水和はＤＮＡに対してＢ型からＡ型というコンフォメーションの変化を与え得るが、ＦＴＩＲの結果は、ＳＡＳＰがこのコンフォメーション変化を促進し、ＤＮＡ単独のプロセスで求められる場合よりも、湿気による減衰を有意に減じつつ、Ａ型への変化を達成できることを示している（Ｍｏｈｒら，１９９１年）。
【００１３】
（ｂ）　また、ＤＮＡへ結合したＳＡＳＰは、ＤＮａｓｅによる分解作用からＤＮＡを保護する（Ｓｅｔｌｏｗら，１９９２年）。ＤＮＡへ結合したＳＡＳＰが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヌクレアーゼによる分解から核酸を保護することを、２つのアッセイにより示すことができる。その一つは電気泳動によるアッセイであり、最も直接的なものである。簡単にいえば、核酸（ｐＵＣ１９とｐＵＢ１１０を含む）を様々な量のＳＡＳＰと共に３７℃で１時間インキュベートする。この時点で、ＤＮａｓｅＩ（またはスタフィロコッカス アウレウス由来のヌクレアーゼ）を加え、ＤＮＡを沈殿させるためにＳＤＳ／ＥＤＴＡに続いてＮａＣｌとエタノールを加える前に、更に１５分間インキュベートする。沈殿したＤＮＡは、アガロース電気泳動（２％）により（ポリヌクレオチドとして）、又はアクリルアミド電気泳動により（オリゴヌクレオチドとして）分析する。ｐＵＣ１９とｐＵＢ１１０の両方の保護は、ＳＡＳＰとＤＮＡの割合が１：１である場合に観察され、４：１の割合で最大になる。他の４つのα／βタイプＳＡＳＰに関するＤＮａｓｅからの保護の分析は、これらタンパク質が、このプラスミドへもＤＮａｓｅに対する抵抗性を付与することを示唆している。クロストリディア ビフェメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来のＳＡＳＰ−αと−βが異なるパターンを示す一方で、バチルス セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）由来のＳＡＳＰ−ＩとＳＡＳＰ−Ａは、同様の保護バンドパターンを示す（Ｓｅｔｌｏｗら，１９９２年）。もう一つのアッセイは、酸沈殿アッセイである。
【００１４】
（ｃ）　ＤＮＡに結合したＳＡＳＰは、制限酵素による切断、特にＧＣリッチな配列に特異的な制限酵素からＤＮＡを保護する（Ｓｅｔｌｏｗら，１９９２年）。ＳｓｐＣに結合されたｐＵＣ１９ＤＮＡ（ＤＮＡに対するＳｓｐＣの割合は８：１）の制限酵素による切断を行ない、その分解物がアガロースゲル電気泳動により分析されている。ＡＴリッチな配列、即ちＤａｒＩ（ＴＴＴＡＡＡ）を認識する制限酵素では、阻害率は＜１０％であった。一方、制限酵素の認識部位においてＧＣの含有レベルを上げると、ＳＡＳＰによる保護は強まり、ＧＣリッチな配列（即ち、ＫｐｎＩ ＧＧＴＡＣＣ）を認識する制限酵素に対する阻害率は＞７５％となった。
【００１５】
（ｄ）　また、ＳＡＳＰは、トポイソメラーゼＩの存在の下で、プラスミドの負の超らせん濃度を増加させる。当該効果をアッセイするための方法は、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎらによる１９９０年の参考文献ｂに記載されている。これを要約すると、プラスミド（ｐＵＣ１９またはｐＵＢ１１０）試料１μｇを、２０μｌの反応混合物中で種々の量のＳｓｐＣと共に４℃で一晩インキュベートし、続いてトポイソメラーゼＩを加え、更に３７℃で２時間インキュベートする。タンパク質を除去した後、クロロキン（２μｇ／ｍＬ）を含むアガロースゲルを用いた電気泳動により試料を分析する。負の超らせんの平均値は、アガロースゲル上のバンド位置を、プラスミドＤＮＡを異なる量の臭化エチジウムの存在下トポイソメラーゼと共にインキュベートして調製した一組のスタンダードと比較することによって決定できる（ＮｉｃｈｏｌａｓとＳｅｔｌｏｗ，１９９０年）。ＳｓｐＣが最大限に結合すると、双方のプラスミドで多くの負の超らせんが導入される結果となる。１２μｇのＳｓｐＣをプラスミドＤＮＡに加えると、およそ１８と３８の超らせんがｐＵＣ１９とｐＵＢ１１０へそれぞれ導入される。ｐＵＣ１９はｐＵＢ１１０の約６０％のサイズであるため、ＳｓｐＣに結合されることによって双方のプラスミドに導入される超らせんの濃度は似通ったものになる。プロテインＨＵがＤＮＡに結合してもＤＮＡのコンフォメーションにＢ型からＡ型への変化は起こらず、ＳｓｐＣが結合する場合に比してＤＮＡ１ユニット当たり〜４０％の負の超らせんが生じるに過ぎないことは、注目すべきである（Ｎｉｃｈｏｌａｓら，１９９０年）。
【００１６】
（ｅ）　また、ＤＮＡへ結合したＳＡＳＰは、紫外線照射によるシクロブタンタイプのチミン二量体の形成を防止するが、隣接するチミン残基間の付加生成物である胞子の光産物の形成を促進する（Ｎｉｃｈｏｌａｓら，１９９１年）。ＳＡＳＰにより飽和されているＤＮＡが３０ｋＪ／ｍ２で２５４ｎｍの光照射を受けた場合、ピリミジン二量体と胞子の光産物（ＳＰ）の収率は、それぞれ全チミンの＜０．２％と８％であった。ＳＡＳＰが存在しない場合、当該収率は、相互に逆転して４．５％と０．３％であった（Ｎｉｃｈｏｌａｓら，１９９１年）。Ｉｎ ｖｉｖｏ、即ち胞子でのＳＰの収率と栄養細胞でのチミン二量体の収率は、ほぼ同様であり極めて高いものである（全チミン量の＞２５％）（ＤｏｎｎｅｌｌａｎとＳｅｔｌｏｗ，１９６５年）。Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＤＮＡへの紫外線照射も、６−４ビピリミジン付加生成物と同様に、蛍光性のビピリミジン付加生成物，シクロブタンタイプのシトシン二量体，およびシトシンとチミン間のシクロブタン二量体を形成させる。あらゆるタイプの光産物の収率は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける光照射実験によれば、α／βタイプのＳＡＳＰがＤＮＡに結合することによって大幅に低下する。
【００１７】
（ｆ）　α／βタイプのＳＡＳＰは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＤＮＡの脱プリン化を少なくとも２０倍減少させることも明らかにされている。ＤＮＡの脱プリン化をｉｎ ｖｉｔｒｏで測定するための様々な方法が、Ｆａｉｒｈｅａｄらによる１９９３年の文献に記載されている。
【００１８】
更に、本発明は、上述したポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドであって薬剤として使用されるものを提供する。
【００１９】
本発明の斯かる観点によれば、本発明に係るポリペプチドは活性物質であると考えられるので、本発明のポリヌクレオチドを標的細胞で発現させるためにそこまで送達すれば、細胞の増殖を阻害したり防止するポリペプチドを発現させることができる。
【００２０】
本発明のポリヌクレオチドは、使用するデリバリーシステムによってＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。安定性や操作性の点からは、本発明のポリヌクレオチドはＤＮＡとすることが好ましいが、ＲＮＡを使用すれば、ＳＡＳＰがＲＮＡのポリペプチド産生能を阻害する可能性を排除することができる。特に好ましい具体例では、当該ＤＮＡはバシラス サブティラス由来のｓｓｐＣ遺伝子を含有する。遺伝暗号の縮重は、ＤＮＡの発現産物のアミノ酸配列を変化させない様な変異を可能にする。
【００２１】
本発明のポリヌクレオチドは、様々な方法により細胞増殖を阻害したり予防するための薬物製剤として使用することができる。一つの具体例としては、当該薬剤は本発明のポリヌクレオチドを含み、典型的には患者に投与するために調剤される。他の具体例では、本発明のポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドを含む薬剤を製造するために使用される。更なる具体例としては、本発明に係る薬剤は、標的細胞の内部でポリペプチドとして合成されるものであってもよい。
【００２２】
理論に縛られるものでなければ、本発明のポリペプチドは、標的細胞内に存在する場合には細胞内のＤＮＡと結合し、ＤＮＡの複製を妨げると仮定される。また、本発明のポリペプチドは、ＤＮＡと会合することによって、その翻訳を完全に或いは部分的に阻害したり防止し得る。この様にして、それ以上の細胞増殖が阻害されたり防止されたりする。特に微生物細胞の感染においては、細胞増殖を予防したり阻害したりすれば、患者の免疫システムが感染細胞に対処する見込みが生じる。他の観点からは、ＤＮＡへのＳＡＳＰの結合は、細胞に対して、宿主の免疫システムを回避するための遺伝子の発現を妨げる可能性もある。
【００２３】
更に本発明は、上述したポリペプチドを含有し、細胞増殖を阻害または防止するための組成物およびそのデリバリーシステムを提供する。更に本発明は、細胞を標的とすることができるものであって、上述したポリヌクレオチドを含有し、細胞増殖を阻害または防止するための組成物、およびそのデリバリーシステムを提供する。
【００２４】
本発明に係る組成物は、医療用途としても非医療用途としても使用できる。ここで説明する様に、医療用途で用いる場合には、使用されるデリバリーシステムは、対象とする医療状態を治療するに適したものである必要がある。好適には、ポリヌクレオチドを含有する組成物を使用する。ウィルスなどポリヌクレオチドを基礎とするデリバリーシステムによって、標的細胞へ送達することが可能だからである。デリバリーシステムがウィルスにより構成されている場合には、ポリヌクレオチドをウィルスのゲノム内に組み込むことができるので、細胞内に侵入し細胞内で当該ポリペプチドの効果を発現させることができるというメカニズムを目的として、ウィルスを利用することができる。標的細胞が真核細胞である場合は、アデノウィルス，ＨＳＶ，ＨＩＶなどの真核ウィルスを修飾して使用するか、標的細胞に対して特別な親和性を有する他のウィルスを使用する。
【００２５】
本発明において特に有利な具体例は、上記ウィルスをバクテリオファージ（即ち、細菌性ウィルス）により構成することにある。バクテリオファージは、一般的に細菌を標的にすることができ、通常、あらゆる種の細菌がバクテリオファージに対して独自のレンジを持つ点で特異的である。更に、それぞれの細菌種は、その菌種に特有のバクテリオファージを少なくとも一つ有する。従って、デリバリーシステムとしてバクテリオファージを使用すれば、標的とするもの以外の細胞は感染しない。一般的な病原体とそのバクテリオファージのリストを、補足図４に示す。
【００２６】
ファージには、ラムダなどの溶原性ファージ，繊維状ファージや、溶原性を示さない溶菌ファージなどを含む様々なタイプのものが存在する。バクテリオファージは、ラムダの様なより一般的な二重鎖ＤＮＡのみならず、ＳＡＳＰが結合できない一本の鎖状ＤＮＡまたはＲＮＡを有し得る。バクテリオファージとしては、溶原性を示さないバクテリオファージか、溶原性を発現する遺伝子が不活性化された溶原性ファージを用いることが好ましい。これら何れのケースでも、溶菌プロセスに関わる化合物をコードしている少なくとも一つの遺伝子を不活性化することが好ましい。このことは、標的となる細胞の溶菌を防ぐことによって、当該細胞に含まれている毒性物質の放出を防止し、宿主に有害な影響を与えない様にする点で有益である。従来の抗生物質の欠点は、いったん患者へ投与されると、細菌の細胞壁の崩壊によって細胞壁成分に対する過剰免疫応答が引き起こされ、患者に致命的なダメージを与え得る点にある。この問題は、本発明に従って、細菌細胞の溶菌を防ぐことによって回避することができる。
【００２７】
溶菌に関わる遺伝子の不活性化は、当該遺伝子へ本発明のポリヌクレオチドを挿入することによって利便性良く行なうことができる。斯かる手法によって、溶菌に関わる遺伝子の発現をファージのライフサイクル中で充分に遅延させることができ、本発明のポリヌクレオチドによりポリペプチドが産生される前に多くのファージ粒子が宿主細胞中で産生される点で、更なる有利点を有する。
【００２８】
典型的な溶菌遺伝子には、バクテリオファージラムダのＳ遺伝子が含まれる。この遺伝子は、ホリン（ｈｏｌｉｎ）をコードしている。ホリンは、宿主細胞中で孔を形成し、次いでバクテリオファージにより産生された他の溶菌酵素に溶菌を起こさせるタンパク質である。本発明のポリヌクレオチドはＳ遺伝子へ挿入されることもあるが、主としてＳ遺伝子と置換され、好適にはＳ遺伝子プロモーターであるＰＲ’により制御を受けるようになる。類似的には、本発明のヌクレオチドは、Ｒ遺伝子などの溶菌サイクルに関わる他の遺伝子の一つに挿入されてもよい。Ｒ遺伝子の産物は、溶菌に関わるトランスグルコシラーゼである。このケースでは、Ｓ遺伝子は付随的に不活性化されてもよいし、或いは不活性化されなくてもよい。バクテリオファージにおける他のタイプの等価遺伝子は、標的とする細菌が大腸菌以外である場合、同様の方法で本発明のヌクレオチドが挿入される位置として用いられ得る。
【００２９】
更なる具体例では、本発明のヌクレオチドはバクテリオファージ染色体の他の位置に挿入され、バクタリオファージや細菌のプロモーターによって制御される。溶菌に関わる１またはそれ以上のタンパク質の産生は、任意に阻害され得る。その一方で、溶菌サイクルは進行することもあり得る。例えば、感染状態にある宿主中で生じる合図（ｃｕｅｓ）に反応する細菌プロモーター、例えばスタフィロコッカス アウレウスのａｇｒ遺伝子座のＰ３プロモーターの様な熱感応性プロモーターや、２成分センサーによる調節経路に関わる他のプロモーターを使用することが可能である。更なる例としては、微好気状態の下や微鉄存在下で活性化するプロモーター、また、ニコチン酸やマグネシウムイオンの様な宿主特異的な要素により刺激されるプロモーターを挙げることができる。
【００３０】
更に、本発明で用いられるウィルスは、宿主特異性を向上させたり変化させたりするために修飾されてもよい。バクテリオファージを使用するケースでは、多様な親和性および／または細胞への感染能を生じさせるために、尾部を修飾することによって、細菌以外の細胞に対する感染が可能となる様にバクテリオファージを設計することができる。例えば、哺乳動物細胞の表面分子に結合するリガンドをバクテリオファージの殻タンパク質上に存在せしめることによって、哺乳動物細胞への親和性を繊維状バクテリオファージへ与えることができる（Ｌａｒｏｃｃａら，１９９８年）。例えば、遺伝的な増殖因子リガンドであるＦＧＦ２を提示する様に、（マイナーな殻タンパク質であるｐＩＩＩと融合させた状態で）、ファージ（Ｍ１３）が設計された場合、当該バクテリオファージは、ＦＧＦ受容体を通じて遺伝子を哺乳動物細胞へ送達し細胞を形質転換する能力を獲得する（Ｌａｒｏｃｃａら，１９９９年）。他の研究者も、ＥＧＦ（上皮増殖因子）受容体ファミリーの一つであるＥｒｂＢ２に対する一本鎖抗体（ｓｃＦｖｃ）を提示するファージを用いて、同様の知見を報告している（ＰｏｕｌとＭａｒｋｓ，１９９９年）。受容体を介して遺伝子を哺乳動物に移す様に設計されたファージの選択は、ＤＮＡを細胞へ送達することができる機能的リガンドのためのファージライブラリーをスクリーニングすることによって効率的にすることができる（Ｋａｓｓｎｅｒら，１９９９年）。
【００３１】
コウドヴァイラルス（Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ）（有尾バクテリオファージ）が本来の宿主細胞以外の細胞へ感染することを阻害する要因は、標的とする細菌の表面にファージが吸着できる様な適切な受容体が存在しないことにある。この問題に取り組むことによって、同じ修飾をされたＤＮＡ（つまり、ＳＡＳＰを含むもの）を有しながらも、広い範囲の宿主を標的にできる様なファージを調製することが可能になる。例えば、数種の細菌に一般的な受容体を標的にすることができる様に、ファージを修飾することができる。その代わりに、修飾されたファージＤＮＡが同一のファージ頭部でパッケージングされ、且つ様々な細菌に発現している受容体に親和性を示す様な種々の尾部を有するファージを調製できる。また、バクテリオファージは、融合タンパク質として抗体フラグメントも発現することができる。例えば、繊維状のファージＭ１３は、ｇ３ｐ融合タンパク質を発現するよう設計されてきており、当該タンパク質は、ヘリコバクターピロリ−抗原に結合する一本鎖可変領域フラグメント（ＳｃＦｖ）を含んでいる（Ｃａｏら，２０００年）。このＳｃＦｖファージは、試験された全てのヘリコバクターピロリ菌種のＣＦＵを減少させた。また、標的とする細菌に選択した受容体を発現させることも可能である。例えば、シュードモナス種は、ラムダバクテリオファージ受容体であるＬａｍＢ受容体を発現する様に修飾することが可能であることが既に示されている（ｄｅ Ｖｒｉｅｓら，１９８４年）。これらタンパク質受容体をコードしている遺伝子であるｌａｍＢは、プラスミドを用いてシュードモナスへ導入され、相同組換えによってシュードモナス染色体へ挿入される。プラスミドによって細胞を形質転換することは常に実用的である訳ではないが、標的細胞に特異的な修飾溶原性バクテリオファージを用いて、ｌａｍＢ遺伝子をあらゆるグラム陰性細菌へ送達することは可能である。ｌａｍＢ遺伝子は強い細菌プロモーターの制御下になければならず、ファージは常に溶原性が確立する様に変化されなければならない。また、このタイプのファージを投与すると、シュードモナス種は、続いて投与されるＳＡＳＰ／ラムダに感染され易くなる。その他の修飾ファージは、個々の標的種に有効な様に調製でき、ＳＡＳＰを含むバクテリオファージの宿主範囲を広げるような挙動を示す。
【００３２】
この様に、ＳＡＳＰを含むファージが標的にすることができる細菌の範囲を広げることが可能であり、少なくとも、広い範囲のグラム陽性細菌とグラム陰性細菌を標的にすることができる。
【００３３】
特別にクローニングされたり遺伝子発現が意図的にされデザインされている修飾バクテリオファージが市販されており、これらの中には、多数のクローニング部位を備えていたり、本質的でない領域に誘導プロモーターが挿入されているものもある。
【００３４】
ラムダクローニングベクターには２つのクラスがある。：挿入型ベクターは０〜１２ｋｂのＤＮＡを受け入れることができるものであり、これにはラムダＺＡＰＩＩ，Ｕｎｉ−ＺＡＰ ＸＲおよびラムダＺＡＰ−Ｅｘｐｒｅｓｓが含まれ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）；置換型ベクターは９〜２３ｋｂＤＮＡを受け入れることができるものであり、ラムダＦＩＸＩＩとラムダＤＡＳＨＩＩが含まれる（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）。毒性遺伝子の発現を許容する細菌タンパク質の発現キットは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、デリバリーのために大腸菌株ＢＬ２１細胞へ運搬するラムダＣＥ６バクテリオファージを含み、これもまた有用である。Ｓ遺伝子で自然な変異を起こしているバクテリオファージは、大量合成のため商業的に使用されている。
【００３５】
本発明のポリペプチドとポリヌクレオチドは、薬剤として使用される場合、ヒトの治療のために使用することができ、特に微生物感染症をはじめとする様々な病態を治療することが可能である。本発明により治療可能な微生物感染症としては、局所的感染症，ムシ歯，呼吸器系感染症，眼科系感染症や局所器官の感染症がある。本発明は、ヒトと動物の両方の治療に有効であり、例えば、魚類における全身性の或いは局所的な感染症の治療にも使用できる。薬剤または医療用組成物は、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを添加して製造することができる。代表的な薬剤は、活性物質に加え、任意に医療上許容される賦形剤，希釈液や担体を加えることによって製造することができる。斯かる医療用組成物の成分の正確な性質と量は経験的に決定することができるが、ある程度は組成物の投与経路に依存する。被投与者に対する投与経路としては、経口投与，口内投与，舌下投与，吸入，局所投与（眼を含む），直腸投与，膣内投与，鼻腔内投与，非経口投与（静脈注射，動脈注射，筋肉注射，皮下注射および関節投与を含む）を挙げることができる。使い易くするためには、本発明での投与量は、治療や予防をすべき感染症の部位やタイプにより決定すればよい。例えば、呼吸器系感染症の治療の場合には、ＳＡＳＰ／ファージの懸濁液を吸入によって散布すればよい。眼科系感染症の治療では、ＳＡＳＰ／ファージの懸濁液を目薬などの形態で使用することが効果的である。ＳＡＳＰ／ファージを含ませて調剤した口内洗浄剤や歯磨き粉は、歯垢形成に関与する細菌を排除することから、ムシ歯治療のために使用できる。つまり、本発明に係るポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む口内衛生製品も提供される。
【００３６】
本発明のポリペプチド，ポリヌクレオチドおよびこれらを含む組成物は、非医療用途にも使用することができる。つまり、本発明で定義されたポリペプチドやポリヌクレオチドは、微生物による汚染の除去、特に表面における微生物の汚染除去に使用することができ、土壌改善や水処理のために使用することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、手の洗浄剤として、医療関係者の消毒処置に使用することができる。また、器具表面や装置の処置、特に病院での処置や食品製造に用いられるものの処置にも使用できる。本発明は、デリケートな装置や食品製造領域にダメージを与え得るものであって、これらに対して好ましくない従来の抗細菌化合物よりも有利である。表面における微生物汚染の除去の更なる例としては、本発明は死体の局所的処置にも使用できる。水の処理においては、本発明は水系汚染の原因菌、特にビブリオ コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ），レジオネラ ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ），チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ），シゲラ ディセンテリエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）に対して有効である。土壌の微生物汚染も、同様に本発明により対抗できる。
【００３７】
更に、本発明のポリペプチドとポリヌクレオチドは、抗微生物剤、特に抗菌または抗真菌剤として、穀物など植物体の処置や、穀物から得られる種，穀粒の処置において使用することができる。果物には、腐敗を発生させる細菌に対するファージをスプレーすればよい。エルウィニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）種などの微生物は、この方法により処理できる。ゼラニウムなどの観賞用植物は、例えば、キサントモナス キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）などにより引き起こされる細菌性胴枯れ病に感受性が高い。；当該細菌は、トマトにも悪影響を及ぼす。同様に、豆類やキノコ類に感染するシュードモナス種も、本発明により処理することができる。
【００３８】
更に、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、ネズミなどの害獣の処置にも使用することができ、これら害獣に特異的な細菌を排除することができる。ネズミを排除するための一般的な処置は、ワルファリンなどの抗凝血化合物を含む食餌を与えるものである。斯かる化合物の解毒剤は、一般的にはビタミンＫである。ビタミンＫは、細菌によって哺乳動物の腸で作られる。抗凝血剤に対するネズミの抵抗性は、高いレベルでビタミンＫを産生する細菌の腸内におけるコロニー形成により獲得される。従って、本発明により害獣を処理すれば、従来の抗凝血薬による害獣の制御を成功させることが可能になる。
【００３９】
以下、図面および以降の実施例や補足図を参照することによって、本発明を更に詳しく説明するが、これらは例示に過ぎない。
【００４０】
（実施例）
全ての実験手法は、特に断らない限り、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９９１年）による参考文献に記載されている方法に従っている。
【００４１】
制限酵素による分解は、特に断らない限り、総量５０μｌ中それぞれの酵素を２μｌ使用し、３７℃で４時間インキュベートすることにより行なった。
【００４２】
鋳型ＤＮＡの脱リン酸化は、総量５０μｌ中、１０Ｘバッファー（５μｌ）およびリン酸アルカリ（２．５Ｕ）（５μｌ）を使用し、３７℃で１時間インキュベートすることにより行なった。
【００４３】
ライゲーションは、総量１０μｌ中、３ウェスユニット（Ｗｅｉｓｓ Ｕｎｉｔｓ）のＴ４ ＤＮＡリガーゼ（１μｌ）を使用して行ない、通常、１６℃で一晩行なった。
【００４４】
ＰＣＲ用反応液は、通常、以下に示す様に調製した（総量１００μｌ）：
鋳型ＤＮＡ　０．１μｇプラスミドまたは精製ラムダＤＮＡ／１μｇ染色体ＤＮＡ／１コロニー
１０Ｘバッファー（１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２含有）　１０μｌ
ｄＮＴＰ ｍｉｘ（１０ｍＭ ｓｔｏｃｋ）　２μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ（２．５Ｕ）　１μｌ
プライマー（フォワードおよびリバース）　それぞれ１００ｐｍｏｌ
最終量の調整　ｄＨ２Ｏにより１００μｌへ。
【００４５】
ＰＣＲ反応は、特に断らない限り、以下に示す通り行なった：
９５℃で３分（変性）
９４℃で３０秒（変性）　　　　　　　　　　　）
５８℃で３０秒（アニーリング）　　　　　　　）２５サイクル
ＤＮＡ１ｋｂ当たり７２℃で３０秒（伸長）　）
７２℃で１０分。
【００４６】
プライマーは、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社とＳｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ社から得た。プライマーが制限酵素の認識配列を含む場所には、それぞれの酵素の好ましい上流配列が含まれていた（ＰＣＲ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｄａｔａ，１９９５年）。
【００４７】
Ａ　Ｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｉｎ ｖｉｖｏでの製造Ｉ
１．　Ｓ遺伝子に及ぶラムダゲノムのフラグメントを、ＰＣＲにより増幅した。当該ＰＣＲ反応では、ｐＵＣ１８やｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）などの一般的な大腸菌クローニングベクターへの方向を指定したライゲーションを可能にするために、その５’末端が適切な制限酵素の認識部位であるプライマーを用いた。つまり、プライマーＢ１の配列中には、ラムダの第４４６６０塩基から第４４６７７塩基までの配列がそれに続く、ＰｓｔＩの制限酵素認識部位が含まれている。プライマーＢ２は、ラムダの第４５０７２塩基から第４５９５６塩基までの逆配列と相補配列がそれに続く、ＸｂａＩの制限酵素認識部位により構成されている。
【００４８】
【化３】
2004513647.tif 000004
【００４９】
図１には、ＰＲ’プロモーターと共に、溶菌に関係する後期遺伝子の位置が相対的に示されている。また、ＥｃｏＲＩ制限酵素の認識部位と共に、プロモーターＢ１とＢ２の位置も示してある。
【００５０】
２．　１３２８ｂｐのＰＣＲ産物をＰｓｔＩ／ＸｂａＩにより分解し、同じ制限酵素で分解した上で脱リン酸化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにライゲーションし、ｐＢ／ＬＦ１（図２に示す）を得た。図２は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ （＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）の基本鎖とＰｓｔＩ／ＸｂａＩ制限酵素の認識部位（図１を参照）で区切られたラムダフラグメントの挿入部位を示すｐＢ／ＬＦ１の直鎖状マップを示す。Ｓ ＯＲＦの開始位置に亘る配列が、リボソーム結合部位（ｒｂｓ）と、第１，第２開始コドンと共に与えられている。インバースＰＣＲプライマーの相対位置と配列が示されている。プライマーＢ３は、５’末端が平滑平面であるＰＣＲ産物を製造する。プライマーＢ４は、制限酵素ＮｃｏＩによる分解に続いて、５’末端にオーバーハングを持つＰＣＴ産物を製造する。
【００５１】
３．　プラスミドｐＢ／ＬＦ１を電気穿孔法により大腸菌へ導入し、推定される組換え体を、Ｘ−ｇａｌ（８０μｌ，２０ｍｇ／ｍＬ）とアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ寒天プレート上の白色コロニーとして検出した。正確な変異体は、ＥｃｏＲＩによるプラスミドの制限的分解により約３００ｂｐと３０５０ｂｐの２つのフラグメントが生じることによって、同定される。
【００５２】
４．　ラムダのＳ遺伝子は２箇所で翻訳が開始される遺伝子であり、第２ｆＭｅｔ開始コドンからの転写によって、タンパク質を２倍レベルで産生できる。そこで、選択されたＳＡＳＰ遺伝子（この場合、バシラス サブティラス由来のｓｓｐＣ遺伝子）を、この第２開始コドンのフレーム内へ挿入した。プラスミドｐＢ／ＬＦ１のインバースＰＣＲ反応を、５’末端にオーバーハング構造を有するフラグメントを得るためにリバースプライマーを用いて行なった（エクステンションタイム：６８℃で４分３０秒）。制限酵素ＮｃｏＩは、ヌクレオチドＡＴＧを含む制限酵素認識配列（ＣＣＡＴＧＧ）を有する。ＮｃｏＩの認識配列を鋳型（ｐＢ／ＬＦ１）と挿入（ｓｓｐＣ）ＤＮＡプライマーの前に付加することによって、ｓｓｐＣ遺伝子がラムダＳ遺伝子の開始コドンのフレーム内に存在する様な、これらＰＣＲ産物のその後におけるライゲーションが可能になる。
【００５３】
リバースプライマー（Ｂ４）は、Ｓ遺伝子の第２ＡＴＧ開始コドンの５’末端から３番目のヌクレオチドから始まるラムダの配列の相補鎖である（図２）。当該プライマーは、制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を有し、例えば、以下に示すものである。
【００５４】
【化４】
2004513647.tif 000005
【００５５】
Ｓ遺伝子を、平滑末端ライゲーションによってＳＡＳＰ遺伝子で置換することは可能である。この場合、Ｓ遺伝子の第２ＡＴＧ開始コドンの相補鎖で始まるリバースプライマーを使用することができる（図２）。その様な配列の例を、以下に示す。
【００５６】
【化５】
2004513647.tif 000006
【００５７】
フォワードプライマーは、ラムダＲ遺伝子の第４５４９９塩基から第４５５１５塩基の始めの配列に基づくものとした（図２を参照）。制限酵素ＳｐｅＩの認識配列は、ｓｓｐＣ遺伝子と方向性をもったライゲーションを可能にする様にラムダ配列の直前で使用される。例えば、以下に示す配列を有する。
【００５８】
【化６】
2004513647.tif 000007
【００５９】
５．　ｓｓｐＣ遺伝子を、プライマーＢ３とＢ５またはプライマーＢ４とＢ５の何れかから得られるインバースＰＣＲ産物とライゲーションできる様に、ＰＣＲにより増幅した（エクステンションタイム：２０秒）。例えば、：
（ｉ）　（プラスミドｐＢ／ＳＡＰＢを与えるため）プライマーＢ３とＢ５を用いて得られるｐＢ／ＬＦ１インバースＰＣＲ産物とライゲーションするために、ｓｓｐＣ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの３’側ヌクレオチドの直後から始まるフォワードプライマーを用いた（図３）。例えば、以下の配列である。
【００６０】
【化７】
2004513647.tif 000008
【００６１】
（ｉｉ）　（プラスミドｐＢ／ＳＡＰＯを与えるため）プライマーＢ４とＢ５を用いて得られるｐＢ／ＬＦ１インバースＰＣＲ産物とライゲーションするために、ｓｓｐＣ ＯＲＦの５番目ヌクレオチドから始まるｓｓｐＣの配列を有するフォワードプライマーを用いた（図３）。このプライマーは、ｓｓｐＣ配列の直前に制限酵素ＮｃｏＩの認識配列を有し、実際、ｓｓｐＣ遺伝子自体の最初の４ヌクレオチドが組み込まれている。例えば、以下の配列である。
【００６２】
【化８】
2004513647.tif 000009
【００６３】
リバースプライマーは、ｓｓｐＣ ＯＲＦの末端における配列の相補鎖である。つまり、ｓｓｐＣ遺伝子の終止コドンを含むＰＣＲ産物を調製するためのものである（図３）。当該プライマーは、ｐＢ／ＬＦ１のインバースＰＣＲ産物に方向性をもったライゲーションを可能にするためのＳｐｅＩ配列を含む。例えば、以下の配列である。
【００６４】
【化９】
2004513647.tif 000010
【００６５】
図３では、ｓｓｐＣ遺伝子が、ＰＣＲプライマーであるＢ６，Ｂ７およびＢ８の相対位置と共に表されている。プライマーＢ６によって、５’末端が平滑末端であるＰＣＲ産物が得られる。プライマーＢ７は、ＮｃｏＩによる分解に続いて、５’末端にオーバーハング構造を有するＰＣＲ産物を産生する。
【００６６】
６．　ＰＣＲで増幅したｓｓｐＣ遺伝子（プライマーＢ７とＢ８による）とインバースＰＣＲで増幅したｐＢ／ＬＦ１（プライマーＢ４とＢ５による）を、制限酵素ＮｃｏＩとＳｐｅＩにより分解した。分解されたインバースＰＣＲ産物である直鎖状ｐＢ／ＬＦ１は、ライゲーションに先立って脱リン酸化した。
【００６７】
７．　分解されたＤＮＡを洗浄した後、プラスミドｐＢ／ＳＡＰＯを得るためにライゲーションを行なった。このプラスミドｐＢ／ＳＡＰＯ中では、ｓｓｐＣ遺伝子によりラムダのＳ遺伝子の大部分が置き換わっている（図４）。プラスミドｐＢ／ＳＡＰＯを得るために、ＰＣＲ産物を単純にライゲーションした。（図４）。図４は、（Ａ）ｐＢ／ＳＡＰＢまたは（Ｂ）ｐＢ／ＳＡＰＯの直鎖状マップを示している。これらプラスミドは、インバースＰＣＲにより増幅されたプラスミドｐＢ／ＬＦ１（プライマーＢ３とＢ５或いはＢ４とＢ５を用いて増幅したもの（セクションＡ４を参照））へのｓｓｐＣ遺伝子の挿入に続いて構築される。
【００６８】
（Ａ）　ｐＢ／ＳＡＰＢの直鎖状マップであり、インバースＰＣＲにより増幅され（プライマーＢ３とＢ５による）、ｓｓｐＣ遺伝子を含むｐＢ／ＬＦ１を示すものである。与えられた配列は、Ｓ遺伝子のリボソーム結合部位と、平滑末端でのライゲーションによって連結されたｓｓｐＣ ＯＲＦの開始部位に及んでいる。
【００６９】
ｐＢ／ＳＡＰＯの直鎖状マップであり、インバースＰＣＲにより増幅され（プライマーＢ４とＢ５による）、ｓｓｐＣ遺伝子を含むｐＢ／ＬＦ１を示すものである。与えられた配列は、Ｓ遺伝子のリボソーム結合部位と、ＮｃｏＩによる分解に続くライゲーションによって連結されたｓｓｐＣ ＯＲＦの開始部に及んでいる。
【００７０】
８．　抗生物質耐性遺伝子を伴うＳＡＳＰ遺伝子や、伴わないＳＡＳＰ遺伝子を運搬するラムダを調製することは可能である。抗生物質耐性遺伝子を使用すれば、これをＳＡＳＰ遺伝子の存在を探知する選択的マーカーとすることができ、この様な遺伝子としては、クロラムフェニコール耐性遺伝子（Ｃｍｒ）を使用することができる。Ｃｍｒ遺伝子（それ自体のプロモーターを備えるもの）は、ＳｐｅＩによるｐＢ／ＳＡＰＯの分解に続いて、ｓｓｐＣ遺伝子の３’末端に逆方法で挿入されている。その結果、プラスミドｐＢ／ＳＡＰＯＣができる（図５）。図５は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔの基本骨格を示すｐＢ／ＳＡＰＯＣの直鎖状マップと、ＰｃｔＩ／ＸｂａＩの制限酵素認識部位により境をなされているラムダフラグメント中のｓｓｐＣおよびＣｍｒ遺伝子の位置を示している。
【００７１】
９．　ＳＡＳＰ／ラムダを調製する一方法は、ラムダファージをｐＢ／ＳＡＰＯＣを運搬する大腸菌株に感染させるものである。ファージが繁殖する際には、ｐＢ／ＳＡＰＯＣ中のラムダ／ｓｓｐＣ／Ｃｍｒフラグメントは、ラムダゲノムへ組み込まれることになる。この方法は、温度感受性（ｔｓ）ラムダを用いることによって、成功裏に採用されてきた。このタイプのラムダは、３０℃ではプロファージとして大腸菌の染色体中に安定に保持される一方で、４２℃では保持されない。ｐＢ／ＳＡＰＯＣを運搬する菌株は、ＯＤ６００が０．３に到達するまで、ＬＢ培地（１０ｍＭ ＭｇＳＯ４と０．２％マルトース（ｗ／ｖ）を含む）で増殖させた。１００μＬの部分試料を取り、１００μＬのラムダファージ調製物と混合した。当該混合物を振盪しないで室温で２０分間インキュベートし、４５℃に保った３．５ｍＬの溶解トップアガー（１０ｍＭ ＭｇＳＯ４と０．２％マルトース（ｗ／ｖ）を含むＬＢ０．６％寒天培地）を加え、事前に暖めておいたＬＢ寒天プレートに注いだ。ＬＢ（３ｍＬ）をトップアガー表面へ加える前に、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。プラークを含むトップアガーを５０ｍＬの遠心分離チューブに移し、４℃で一晩保存した。遠心分離（４，０００ｒｐｍ，１０分，室温）に先立ってクロロホルム（２５０μＬ）を加え、全ての細菌細胞を溶菌するため、静かに数回反転させた。得られたファージ溶菌物の上澄みを滅菌チューブに移し、溶菌物１００μＬとＯＤ６００が０．３に到達するまで培養増殖させた大腸菌１００μＬとを混合することによって、ＮＭ５５２やＹ１０８９ｒ−などの溶原化され得る大腸菌株に感染させるために用いた。室温で３０分間インキュベートした後、８００μＬのＬＢを加え、当該混合物を１００μＬに分割してクロラムフェニコール（１０μ／ｍＬ）が添加されているＬＢ寒天プレートで培養した。３０℃で一晩インキュベートした後、Ｃｍｒコロニーを単離し、ｓｓｐＣを運搬しているラムダプロファージの存在を試験した。
【００７２】
１０．　Ｃｍ抵抗性コロニーをクロラムフェニコール（１０μ／ｍＬ）を含む２つのＬＢプレート上で継代培養し、当該プレートを３０℃または４２℃で一晩インキュベートした。翌日、４２℃ではなく３０℃で増殖しているコロニーは、ｓｓｐＣとＣｍｒ遺伝子を含む遺伝子組換えラムダにより溶原化しているものと推定した。コロニーは、ｐＢ／ＳＡＰＯＣプラスミドの全体がラムダゲノムへ統合されていないことを確認するために、アンピシリンを含むＬＢプレートでも継代培養した。こうしてＣｍ抵抗性であり且つアンピシリン感受性である溶原性の大腸菌株は同定され、プロファージはＳＳＰＣ−ラムダを構成していた（図６）。図６は、バシラス サブティラス由来のｓｓｐＣ遺伝子によるラムダＳ遺伝子の置換と、クロラムフェニコール抵抗性のマーカー遺伝子（Ｃｍｒ）の挿入を示すＳＳＰＣ−ラムダの直鎖マップである。
【００７３】
１１．　シーケンス反応は、宿主大腸菌染色体中に存在するＳＳＰＣ−ラムダゲノム内のｓｓｐＣとＣｍｒ遺伝子の存在と正確性と位置を確認するために行なった。染色体ＤＮＡは、ＳＳＰＣ−ラムダを含む大腸菌株から調製し、制限酵素ＣｌａＩで分解した。この制限酵素は、ラムダゲノム内で１５箇所の切断を行ない、大腸菌ゲノム内では決定できないほど多くの部位で切断を行なう。特に、この制限酵素は、ラムダゲノムの第４３８２５塩基と第４６４３９塩基で切断を行ない、その結果、プライマーＢ１とＢ２とで隔てられるラムダのＳおよびＲ溶菌遺伝子領域におよぶフラグメントを切り出す（図７）。図７は、プライマー位置と共にＳＳＰＣ−ラムダ染色体ゲノムの領域を示す。即ち、：
−　ｐＢ／ＬＦ１を調製するためのラムダフラグメントを最初に増幅するために用いられるプライマーＢ１とＢ２の位置（セクションＡ１）
−　ＰＣＲによる増幅や配列の確認のためのライゲーション産物の範囲を示すＣｌａＩの位置（セクションＡ１１）
−　シーケンシングのための、Ｂ１−Ｂ２フラグメントに及ぶラムダの領域をＰＣＲにより増幅するために用いられるプライマーＢ３１とＢ３２（セクションＡ１１）
−　ＳＳＰＣ−ラムダ構造の配列をシーケシングするために用いられるプライマー１３ｆ１，Ｂ３０，Ｂ５５およびＢ５４（セクションＡ１１）。
【００７４】
全ての分解ＤＮＡは一晩かけてライゲーションされ、ライゲーションされたものの混合体の部分試料（２．５μＬ）は、次に示す工程によるＰＣＲ反応のための鋳型ＤＮＡとして使用される。：
９５℃で３分（変性）
９４℃で２０秒（変性）　　　　　　　　　　）
６２℃で３０秒（アニーリング）　　　　　　）１０サイクル
６８℃で３分５０秒（伸長）　　　　　　　　）
９４℃で２０秒（変性）　　　　　　　　　　）
６２℃で３０秒（アニーリング）　　　　　　）２５サイクル
６８℃で３分５０秒＋１０秒（伸長）　　　　）
伸長時間（伸長）　７２℃で１０分。
【００７５】
フォローイングプライマー（第４３９７６〜４４０００塩基であるＢ３１；ラムダの第４６２２５〜４６２０３塩基であるＢ３２）を、ラムダ／ｓｓｐＣ／Ｃｍｒ遺伝子ＤＮＡに及ぶラムダＤＮＡフラグメントを調製するために用いた。当該ラムダ／ｓｓｐＣ／Ｃｍｒ遺伝子ＤＮＡは、ＰｓｔＩ／ＸｂａＩ挿入物としてのｐＢ／ＳＡＰＯＣに起源を有する（図７）。
【００７６】
【化１０】
2004513647.tif 000011
【００７７】
上記ＰＣＲによる産物は、フォローイングプライマーを用いたシーケンス反応において用いた（図７を参照）：
【００７８】
【化１１】
2004513647.tif 000012
【００７９】
１２．　天然のＳ遺伝子ｒｂｓの代わりとして、ＳＡＳＰ遺伝子の上流にある種々のリボソーム結合部位（ｒｂｓ）を用いて、同様のコンストラクトを得ることも可能である。例えば、Ｔ７ファージ遺伝子１０リーダーＲＮＡは、大腸菌で外来遺伝子の発現を劇的に高めることができる（Ｏｌｉｎｓら，１９８８年）。その代わりに、ラムダＶ遺伝子のリボソーム結合部位を使用することができた。Ｖ遺伝子は、バクテリオファージラムダの通常の溶菌ライフサイクルにおいて、Ｓ遺伝子産物よりも豊富に存在する尾部タンパク質をコードしているからである。この例では、ｓｓｐＣ遺伝子が、ｓｓｐＣ開始コドンの約４０塩基上流の配列と相同性があるフォワードプライマーを用いたＰＣＲで増幅されたものである場合を除いて、天然のｓｓｐＣ ｒｂｓを用いた上記と同様の手法によって、コンストラクトを得ることができる。制限酵素ＢａｍＨＩの認識部位は、ｓｓｐＣ配列の前方に含まれていた。例えば、次の通りである。
【００８０】
【化１２】
2004513647.tif 000013
【００８１】
リバースプライマーＢ８を用い、そのＰＣＲ産物をインバースＰＣＲで増幅したｐＢ／ＬＦ１とライゲーションし、前述したフォワードプライマーＢ５と、ｐＢ／ＬＦ１配列の前に制限酵素ＢａｍＨＩの認識部位を有するリバースプライマーＢ２１を用いて増幅した。リバースプライマーＢ２１を以下に示す。
【００８２】
【化１３】
2004513647.tif 000014
【００８３】
プロファージとしてこの形のラムダ（ＳＰＰＣ−ラムダと表す）を運搬する菌株の調製と同定は、ＳＳＰＣ−ラムダと同様に行なった。ＳＰＰＣ−ラムダは、前述したセクションＡ１１で説明したものと同様の手法によりシーケンスした。
【００８４】
１３．　ＳＳＰＣ−とＳＰＰＣラムダコンストラクトは、両方ともプロファージとして保持され、宿主である大腸菌染色体中で安定に残存する。成熟したファージ粒子の第一世代のみが感染に用いられる。これによって、産生された一群の成熟ファージの比較が可能になる。しかし、治療目的にテンペレートファージ（或いは、溶原性ファージ）を用いることは必ずしも理想的なものではないので、溶原性の確立に関わる遺伝子に変異を加えることによって、感染状態においてこれら遺伝子を不活性化することは可能である。ここで説明するシステムでは、温度感応性（ｔｓ）ファージを使用するということは、３７℃かそれ以上での溶原化が比較的まれであることを意味する。もちろん、ファージのストック自体は、溶原性大腸菌よりも維持され易い。
【００８５】
１４．　ＳＳＰＣ−とＳＰＰＣラムダは、両方とも、成熟ファージ粒子を産生するために組換えプロファージを運搬する菌株を誘発することによって得ることができる。それぞれの菌株は、ＯＤ６００が０．６に到達するまで３０℃で育生し、次いで温度を４２℃へ１５分かけて変更した。その後、当該培養菌を適度な通気状態が保たれる様に３５０ｒｐｍで振盪しつつ３７℃でインキュベートし、遠心分離（４，０００ｒｐｍ，１０分，室温）で回収する前に、更に３時間インキュベートした。上澄みを除去し、ペレットを１／５容積のファージバッファーへ再懸濁した。クロロホルム（１／１００容積）を再懸濁した細胞へ加え、当該懸濁液を静かに混合した。得られた溶菌物を遠心分離し（４，０００ｒｐｍ，１０分，室温）、上澄みを滅菌チューブへ移した後、４℃で保存した、当該溶菌物は、以下のセクションＡ１５で説明する方法により力価測定した。
【００８６】
１５．　誘導に続いて産生されたＳＳＰＣ−ファージ粒子の力価を測定するために、ファージ溶菌物を、ＳおよびＲ溶菌遺伝子とＰＲ’プロモーターにおよぶラムダＤＮＡのフラグメントを運搬するプラスミド（ｐＢ／ＬＦ２という）を含む非溶原性の大腸菌株に感染させるために用いた。このプロモーターを含むラムダフラグメントは、第４４３７１〜第４４３９０塩基であるプライマーＢ５１（５’−ＡＡＣＴＧＣＡＧＣＧＣＴＧＴＧＡＣＧＡＴＧＣＴＡＡＴＣＣ−３’ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）とプライマーＢ２（前述した通り）を用いたＰＣＲにより増幅した（図７を参照）。ｐＢ／ＬＦ２を運搬する菌株において増殖したラムダファージの存在によって、プラスミドを基礎とするＰＲ’プロモーターから下流の溶菌遺伝子カセットの発現が可能になる。プラスミドから発現した溶菌遺伝子産物は、細菌の溶菌とプラークの形成を容易にする。ファージの力価は、各プラークを分離し観察が容易になる様に希釈して、プラークを数え上げることによって決定することができる。感染は、０．２％マルトース，１０ｍＭ ＭｇＳＯ４および５０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地でＯＤ６００が０．３になるまでｐＢ／ＬＦ２を含む菌株を培養することによって行なった。細胞培養物の部分試料（１００μｌ）を、１００μｌのＳＳＰＣファージ溶菌物と共に室温で２０分間インキュベートした後にトップアガーと混合し、セクションＡ９で説明した様にプレートへ注いだ。その起源となる親ラムダに比べ、ＳＳＰＣ−ラムダ粒子の力価において、５ログまでの減少が見られる。以下で説明するプロトコールによって、親ラムダを約１０１５ｐｆｕ／ｍＬ調製することができる。
【００８７】
Ｂ　Ｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｉｎ ｖｉｖｏでの製造ＩＩ
ラムダＳ遺伝子の代わりにＳＡＳＰ遺伝子を有するラムダを得るための他方法を以下に示すが、当該方法は、ラムダの溶原性をプラスミドｐＢ／ＳＡＰＯまたはｐＢ／ＳＡＰＢ（前述したセクションＡを参照）により変化させることに基づいている。この場合、コンピテント細胞としては、例えばＭＯＢ１４５が例として挙げられるラムダ溶原性の制限−／修飾＋の大腸菌株を用意すべきである。
【００８８】
１．　電気反応性溶原性大腸菌細胞は、プラスミドｐＢ／ＳＡＰＯまたはｐＢ／ＳＡＰＢ、或いはラムダ／ｓｓｐＣフラグメントと等価のＤＮＡを有する自殺ベクターの何れかにより形質転換すればよい。この形質転換細胞は、ＳＯＣ中３７℃で１時間保持した後に遠心分離（４０００ｒｐｍ，１０分，室温）することによって取り出すことができる。得られたペレット細胞はＬＢ培地（１ｍＬ）へ再懸濁し、そこから５０μｌを取り出し、滅菌ＬＢ培地を加えて１ｍＬとする。ここから２００μｌの部分試料とり、このＬＢ寒天培地上へ細胞を接種し、３７℃で一晩インキュベートした。残った９５０μｌは、５０μｌずつに分けて急速冷凍し、−２０℃で保存した。
【００８９】
２．　ｐＢ／ＳＡＰＢまたはｐＢ／ＳＡＰＯプラスミドへ挿入されたラムダフラグメントとラムダゲノム内の相同配列との間で二重交差現象を起こす方法がいくつかある。自殺ベクターは大腸菌の溶原化工程で維持されないので、これを用いれば、二重交差現象を促進することができる。ＬＢアガープレートで一晩育生することによって得られた組換えラムダプロファージを運搬していると考えられる菌種コロニーは（セクションＡ９を参照）、ｓｓｐＣ遺伝子とラムダに基づくプライマー、即ちＢ１とＢ８またはＢ２とＢ７（セクションＡを参照）を用いたＰＣＲでスクリーニングすることができる。何れかのプライマーの組合わせを用いたＰＣＲ産物は、約１．３ｋｂである。ＳＡＳＰを有するファージはＳ遺伝子の機能を示すことはなく、その宿主細胞を溶菌することはできないので、替わりに、ラムダプロファージの誘発に基づく方法を用いることもできる。「スクリーニング」は、以下の何れかの方法により行なうことができる。：
ｉ）Ｈｅｎｄｒｉｘらの方法（１９８３年）による形質転換細胞への紫外線照射
上記ステップ９の細胞の部分試料（２０μｌ）を、標準的なペトリ皿（９ｃｍ）中の好適な非紫外線吸収性培地（例えば、Ｍ９ａやＰＢＳ）１０ｍＬへ、細胞を最大限である２×１０８ｃｆｕまで懸濁したものに再懸濁する。当該細胞へ、紫外光線源（最大出力２６０ｎｍ）を用いて紫外線照射する。紫外線照射に続いて、誘発された培養細胞を好気条件下で３７℃のＭ９ａ培地でインキュベートする（懸濁培地としてＰＢＳを使用する場合には、新しい滅菌生育培地に１／１０容量の１０Ｘ Ｍ９ａ培地を加える）。照射された細菌を可視光線から保護することによって、光回復を防止することができる。
【００９０】
ｉｉ）Ｈｅｎｄｒｉｘらの方法（１９８３年）に従った、チミジン枯渇によるｔｈｙ−ラムダ溶原菌の誘発
ｔｈｙ変異株の単離（Ｍｉｌｌｅｒ，１９７２年）：チミジンを１０μｇ／ｍＬ添加したＭ９ａ培地中で、溶原性菌株を２×１０８ｃｆｕ／ｍＬまで培養する。当該細胞を洗浄し、チミジンフリーのＭ９ａ培地へ再懸濁した後、３７℃で２時間インキュベートする。チミジン（１０〜２５μｇ／ｍＬ）を培養株へ添加し、更に３７℃で９０〜１２０分のインキュベーションを行なった。
【００９１】
ｉｉｉ）セクションＡで示した温度シフト誘発（ラムダｃＩｔｓ溶原菌を用いた場合）
３．　細胞を２時間まで培養する。当該培養は、非溶菌性の細菌細胞へ結合するあらゆるフリーファージの数を減らすことができる様に（即ち、ＳＡＳＰ−フリーとなる様に）、０．２％のグルコース存在下で行なわれる。あらゆるフリーファージは、遠心分離（４，０００ｒｐｍ，１０分間，室温）によって、ＳＡＳＰ／バクテリオファージを含有し得る細胞から分離されなければならない。ペレット細胞は、０．２％グルコースを含むＬＢ培地へ再懸濁し、約１時間インキュベートする。細胞は遠心分離（４，０００ｒｐｍ，１０分間，室温）し、ＬＢ培地（２ｍＬ）中へ再懸濁した後、クロロホルム（０．０２ｍＬ）で溶菌する。クロロホルムによる溶菌で細胞から放出された成熟ファージは、遠心分離（４，０００ｒｐｍ，１５分間，室温）によって細胞残渣から分離する。
【００９２】
４．　ＳＡＳＰを含むバクテリオファージは、濃縮してから好適な方法で精製する。精製方法の１つとしては、感受性大腸菌の培養株へＳＡＳＰ−ラムダを感染させ、上記ステップＢ３を繰り返す方法がある。
【００９３】
５．　組換えラムダの存在は、セクションＢ２で記載した通り、ＳＡＳＰ−ラムダであると推定されるものからＤＮＡを単離し、適切なプライマーペアを用いてＳＡＳＰ遺伝子の存在を確かめるためのＰＣＲスクリーニングを行なうことによって確認されなければならない。推定ＳＡＳＰ−ラムダについては、セクションＡに記載した通り、シーケンスと力価測定を行なう。
【００９４】
Ｃ．　Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの製造（Ｉ）
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法によって、ＳＡＳＰ遺伝子を単独で運搬するラムダファージを生産することは可能である。これは、ｓｓｐＣとＣｍ抵抗性遺伝子を、ラムダのＲ溶菌遺伝子中へ挿入することにより達成されている。
【００９５】
１．　ラムダゲノムを、その制限酵素認識配列がラムダ中にて特有の制限酵素認識部位、つまりペプチドグリカンハイドロラーゼをコードしている遺伝子であるＲ中の第４５６７９塩基で切断するＫａｓＩにより制限分解した。次いで、制限分解したラムダＤＮＡを脱リン酸化した。
【００９６】
２．　ｓｓｐＣ遺伝子は、伸長時間２０秒のＰＣＲにより増幅した。その際には、以下のプライマーを使用した。：
（ｉ）　そのプライマーの１つは、ＰｓｔＩの制限酵素認識配列（好ましい上流塩基配列と共に）と、ｓｓｐＣリボソーム結合部位の上流配列とを含むフォワードプライマーＢ１３である（図８）。使用したリボソーム結合部位はｓｓｐＣ自体であるが、翻訳を増強できる様にするために代替配列が挿入されたものであってもよい（セクションＡ１２を参照）。
【００９７】
【化１４】
2004513647.tif 000015
【００９８】
（ｉｉ）　もう１つは、リバースプライマーＢ８である。
【００９９】
３．　ｓｓｐＣ ＰＣＲ産物をＰｓｔＩとＳｐｅＩで制限分解し、同様に分解・脱リン酸化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（＋）とライゲーションさせて、ｐＢ／ＰＩＰを得た。Ｃｍｒ遺伝子（セクションＡ８を参照）を、逆方向でｓｓｐＣ遺伝子の３’末端部位のＳｐｅＩ部位に挿入して、ｐＢ／ＰＩＰＣを得た（図９）。図９は、ｐＢ／ＰＩＰＣの直鎖状マップを示す。プライマーＢ２６とＢ２７の位置も示されている。
【０１００】
４．　ｐＢ／ＰＩＰＣ中に存在するｓｓｐＣ／Ｃｍフラグメントを、以下のプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。：
（ｉ）　そのプライマーの１つは、ｓｓｐＣリボソーム結合部位配列の前に、ＫａｓＩの制限酵素認識部位が挿入されているフォワードプライマーＢ１３である（図９を参照）。
【０１０１】
【化１５】
2004513647.tif 000016
【０１０２】
（ｉｉ）　もう１つは、Ｃｍｒ遺伝子の終わりにＫａｓＩの制限酵素認識部位が挿入されたリバースプライマーである（図９を参照）。
【０１０３】
【化１６】
2004513647.tif 000017
【０１０４】
５．　ＰＣＲを行なった結果得られた産物をＫａｓＩで制限分解し、同様に制限分解した後に脱リン酸化したラムダゲノム（セクションＣ１を参照）とライゲーションし、ＳＰＰＣ−ラムダを得た（図１０）。
【０１０５】
６．　組換えラムダＤＮＡを、ＨｏｈｎとＭｕｒｒｙ（１９７７年）の方法或いはＰａｃｋａｇｅｎｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ）などのキットを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージングした。
【０１０６】
７．　ファージバッファー中のパッケージされたラムダから連続希釈液（１０−５まで希釈）を調製した。それぞれのパッケージング抽出希釈液からの部分試料（１００μｌ）を、１０ｍＭのＭｇＳＯ４と０．２％マルトース（ｗ／ｖ）を含むＬＢ培地中でＯＤ６００が０．３になるまで新たに培養した大腸菌株ＮＭ５２２を０．１ｍＬ含むバイアル中に加えた。
【０１０７】
８．　この事前に吸着させた混合物をピペットで取り１００μｌの部分試料とし、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含む乾燥ＬＢアガープレート表面へ注ぐ前に、室温で２０分間インキュベートした。当該プレートを逆さにし、３０℃で一晩インキュベートした。
【０１０８】
９．　一晩インキュベートした後のコロニーは、ラムダのＲ溶菌遺伝子がｓｓｐＣ遺伝子に挿入されることによって溶原化していると推定された。約５０コロニーを、クロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含む２つのＬＢプレートに移し、当該プレートを３０℃または４２℃の何れかの温度で一晩インキュベートした。クロラムフェニコールの存在下、４２℃では生育しないが３０℃で増殖したコロニーを、ｓｓｐＣおよびＣｍｒ遺伝子を含む溶原性ラムダであると推定した。ＲＰＰＣ−ラムダを含むものを単離し、ｓｓｐＣとＣｍ抵抗性遺伝子を確固たるものとしてこれらがラムダゲノム中に正しく溶け込んでいることを確認するために、セクションＡに記載されている通りシーケンシングした。シーケンスプライマーとしては、第４５６１３〜４５６２９塩基であるＳＥＱＬ１Ｆ（５’−ＣＴＡＴＴＴＡＣＴＧＡＴＴＡＣＴＣ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）と、第４５７９２〜４５７７６塩基であるＳＥＱＬ２Ｒ（５’−ＣＴＴＡＡＴＣＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧ−３’）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）とを使用した（図１０を参照）。
【０１０９】
Ｄ．　タンデムｓｓｐＣ遺伝子を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ／ ｉｎ ｖｉｖｏでの製造
ＤＮＡへ結合する際におけるα／β−タイプＳＡＳＰ間のタンパク質同士の接触が形成されることが、既に報告されている（ＨａｙｅｓとＳｅｔｌｏｗ，１９９８年）。ＤＮＡにより誘発されるタンパク質−タンパク質結合表面の斯かる形成は、ＤＮＡ結合性タンパク質クラスターの末端へのα／β−タイプＳＡＳＰ分子の更なる付加を引き起こし得、その結果、タンパク質の結合が制御される可能性がある（Ｈａｙｅｓら，２０００年）。（全てではないが）いくつかのα／β−タイプＳＡＳＰの初期結合率は、初期の結合していないタンパク質濃度に対して二次的なものとなるが、このことは、結合現象を起こすためには２つのＳＡＳＰモノマーが必要であることを示唆している（Ｈａｙｅｓら，２０００年）。この観点から、細胞中のＳｓｐＣレベルを増やしておくことが好ましいであろうことが分かる。セクションＡ１２で示した様な強力なプロモーター、或いは翻訳エンハンサー配列、およびＳＡＳＰの翻訳を増強するための最適化されたスペーサー領域と共にコンセンサスリボソーム結合部位を用いるレベルの制御は別として、２つのＳＡＳＰ遺伝子はタンデムでラムダゲノムへ挿入され得る。部分的には、これまでのセクションで説明したプライマーと方法を用いて達成することが可能である。
【０１１０】
例えば、ラムダＳ遺伝子の代わりにタンデムｓｓｐＣ遺伝子を作成するために、リバースプライマー（Ｂ１５）と共にプライマー（Ｂ６）または（Ｂ７）を用いたＰＣＲによって、ｓｓｐＣ遺伝子を増幅する（図１１）。：
【０１１１】
【化１７】
2004513647.tif 000018
【０１１２】
図１１には、ｐＢ／ＬＦ１のインバースＰＣＲ産物へのライゲーションに先立って遺伝子をＰＣＲ増幅するために用いられるプライマーと共に、タンデムｓｓｐＣ遺伝子が示されている。プライマーＢ６またはＢ７，およびＢ１５は、プライマーＢ３とＢ５またはＢ４とＢ５（図２を参照）を用いて増幅されたｐＢ／ＬＦ１のインバースＰＣＲ産物へライゲーションする。得られるプラスミドであるｐＢ／ＳＡＰＢ２またはｐＢＳＡＰＯ２のそれぞれは、次にＭｌｕＩとＳｐｅＩで制限分解され、更に同様に制限分解されたプライマーＢ１６とＢ８のＰＣＲ産物が挿入されることによって、それぞれｐＢ／ＳＡＢＰ２ＴとｐＢ／ＳＡＰＯ２Ｔとなる。
【０１１３】
プライマーＢ１５は、ｓｓｐＣ配列とＳｐｅＩ制限酵素認識配列との間に、独特の制限酵素認識部位、即ちＭｌｕＩの認識部位が挿入されていることを除けば、プライマーＢ８と同じである。第２ｓｓｐＣ遺伝子に対して、プライマーＢ８はフォワードプライマー（Ｂ１６）と一緒に用いられ、当該フォワードプライマー（Ｂ１６）は、プライマーＢ１３およびＢ２３と同様のｓｓｐＣ配列を含むが、プライマーＢ１５（即ち、ＭｌｕＩ）から生産されるｓｓｐＣ ＰＣＲ産物と共存できる制限酵素認識部位を組み込まれている（図１１）。
【０１１４】
【化１８】
2004513647.tif 000019
【０１１５】
与えられたｒｂｓ配列はｓｓｐＣ自身のものであるが、この第２ｓｓｐＣ遺伝子の発現に影響を及ばしめるために、代わりのリーダー配列を用いてもよい（セクションＡ１２を参照）。
【０１１６】
プライマーＢ６またはＢ７とＢ１５を用いてｓｓｐＣを増幅した結果得られるＰＣＲ産物は、セクションＡで説明した様に増幅されたプラスミドｐＢ／ＬＦ１のインバースＰＣＲ産物とライゲーションされる。その結果得られるプラスミドｐＢ／ＳＡＰＢ２またはｐＢ／ＳＡＰＯ２のそれぞれは、次いでＭｌｕＩとＳｐｅＩで制限分解され、脱リン酸化される。プライマーＢ１６とＢ８を用いて増幅した結果得られるＰＣＲ産物は、ＭｌｕＩとＳｐｅＩで制限分解され、プラスミドｐＢ／ＳＡＰＢ２ＴまたはｐＢ／ＳＡＰＯ２Ｔの何れかを与えるために、上述した様に制限分解されたプラスミドの何れかそれぞれとライゲーションされる。再度、第２ｓｓｐＣ遺伝子の末端部位におけるＳｐｅＩ部位へＣｍｒ遺伝子を挿入し得る。当該物のラムダへの組み込みは、前述したセクションＡで説明した方法により達成できる。
【０１１７】
代わりになるものとして、クロストリディア ビフェメンタンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ ｂｉｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）由来のＳＡＳＰβの様な別のＳＡＳＰ遺伝子を、ｓｓｐＣ遺伝子の後またはそれ自身へ挿入することも可能である。ＳＡＳＰβは、いまだにその特性はよく明らかにされている訳ではないが、ｓｓｐＣよりもＤＮＡに対するアフィニティーが高いからである（Ｈａｙｅｓら，２０００年）。
【０１１８】
Ｅ．　ＳＡＳＰの効果を示す実施例
１．　ｓｓｐＣ遺伝子を運搬するベクテリオファージにより送達されるＳＡＳＰの、ｉｎ ｖｉｔｒｏで大腸菌細胞の生育活性の減退を引き起こす作用効果を試験する方法例を、以下に示す。：
ｉ．　感染させるべき大腸菌株を、凍結ストックまたは新しいλＬＢアガープレート（ＬＢは、０．２％マルトースと１０ｍＭ ＭｇＳＯ４を含む）から一晩生育させる。
【０１１９】
ｉｉ．　この一晩生育菌を３ｍＬのλＬＢ培地に接種（ＯＤ６００ ０．０２で）するために用い、次いで３５０ｒｐｍで振蕩しつつ３７℃でＯＤ６００が約０．３になるまで生育させる。その後、この培養菌の部分試料（１ｍＬ）を直接、或いは１００μｌを、細胞数に対するファージ数割合が必要とされるものになる様に、０．９ｍＬのλＬＢ中へ加えることにより連続希釈物を調製するために用いる。
【０１２０】
ｉｉｉ．　次に、この細胞培養物の部分試料（１ｍＬ）を、滅菌ユニバーサルチューブとファージ溶菌物へ移すか、またはファージ溶菌物の希釈液（前述した様に調製したもの）（１ｍＬ）へ加える。この細胞／ファージ混合物を、振蕩しないで３７℃で３０分間インキュベートした後、新しいλＬＢ２ｍＬを加える。
【０１２１】
ｉｖ．　様々なＯＤ６００のテスト試料を得て、そこから部分試料（１００μｌ）を取り、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）とＬＢプレート上に広がっている適当な希釈液１００μｌで希釈する。サンプルとコントロールのインキュベーションを、２５０ｒｐｍで振蕩しつつ３７℃で継続し、適当な時間、例えば１時間ごとに、このステップを繰り返す。
【０１２２】
ｖ．　プレートを３７℃で一晩インキュベートし、翌日、それぞれのプレートにおけるコロニー形成単位（ｃｆｕ）の数を測定した。
【０１２３】
２．　上記試験方法によって、例えばＳＳＰＣ−ラムダに感染させた細胞の具体的結果（４検体による）を下の表に示す。
【０１２４】
表１：ＳＳＰＣ−ラムダに感染させた大腸菌細胞の生育活性
【０１２５】
【表１】
2004513647.tif 000020
【０１２６】
大腸菌細胞は、約１．４×１０８細胞／ｍＬに相当するＯＤ６００ ０．３５まで生育した。培養細胞の部分試料（１ｍＬ）を、前述した方法によって、新たなＬＢ２ｍＬを加える前に、約１×１０１０のＳＳＰＣ−ラムダファージ（約１０１０ファージ／ｍＬを含む溶菌物１ｍＬ）に感染させた。
【０１２７】
４検体の実験結果から、ＳＳＰＣ−ラムダによる大腸菌への感染後３０分までは、感染前の細胞数に比べて≧６０％の細胞生育活性の低下が観察された。；斯かる生育活性は、感染後３時間までには、通常（非感染レベル）の≧９５％まで低下した。表１で示した当該実験から得られた細胞生育活性の低下を、図１２に示した。
【０１２８】
３．　前述したデータは、ｓｓｐＣ遺伝子を含む発現プラスミドを運搬する菌株中のＳｓｐＣ産物によるデータと比較することができる。この様なプラスミド（ｐＥＴ／ＰＩＰ）は、発現ベクターｐＥＴ／２４ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入されたｓｓｐＣ遺伝子により構成されている。当該プラスミドでは、ｓｓｐＣはＴ７ ＲＮＡポリメラーゼジーンプロモーターの制御下にあり、ＳｓｐＣ産物は、生育培地中の０．２％グルコースの存在により充分に発現され、ＩＰＴＧ（〜１ｍＭ）の添加により誘導される。標準プライマーＴ７とＴ８を使用して得られ、ｓｓｐＣの挿入と完全性を確認することができる完全配列データを、補足図７として示している。表２は、菌株ＰＴＬ１４（ｐＥＴ／ＰＩＰを含む大腸菌株であるＢＬ２１ λＤＥ３）を次に示す様に生育して得られる具体的結果（３検体による）を示すものである。：
ｉ）　菌株ＰＴＬ１４を、カナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ２５ｍＬ中、３７℃，２５０ｒｐｍで振蕩しつつ、ＯＣ６００が０．２５になるまで１００ｍＬフラスコ中で培養した。次に当該培養物を１２．５ｍＬずつに分割し、新しい１００ｍＬフラスコへ移した。
【０１２９】
ｉｉ）　１つのフラスコ中の培養物にＩＰＴＧ（〜１ｍＭ）を加えて誘導し、両方のフラスコを３５０ｒｐｍで振蕩しつつ３７℃でインキュベートした。部分試料（０．５ｍＬ）を、コントロールと、誘導直前および感染後３時間にわたり３０〜６０分インターバルで、更に２４時間後の試料から取った。
【０１３０】
ｉｉｉ）　これら部分試料を、ＯＤ６００を読み取るためと適当なＬＢの連続希釈液を調製するために使用し、部分試料の１００μｌをカナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢアガープレート上へ注いだ。プレートを３７℃で一晩インキュベートし、それぞれのプレート上のコロニー形成単位（ｃｆｕ）を数え、１ｍＬ当たりのｃｆｕを測定した。
【０１３１】
これらの実験により、プラスミドを介したｓｓｐＣ遺伝子の細胞への送達と、それに続くＳｓｐＣの発現、および当該発現による細胞の生育活性の顕著な抑制を確認することができた。感染後２４時間までに、ｐＥＴ／ＰＩＰベクターを運搬する細胞の生育活性は、ＳｓｐＣの発現を損なう様な宿主細胞および／またはプラスミドの変異の結果、わずかに増加する。
【０１３２】
表２：ＩＰＴＧ（１ｍＭ）の非存在下（非誘導条件）或いは存在下（誘導条件）における、ｐＥＴ２４ｄ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にｓｓｐＣ遺伝子を有する菌株ＰＴＬ１４の生育
【０１３３】
【表２】
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【０１３４】
ｓｓｐＣが発現している細胞において観察された細胞生育活性の減退は、上述した通り、増殖させ発現を誘導するか或いは発現を抑制した菌株ＰＴＬ１４からプラスミドＤＮＡを単離することによって得たデータにより確認できる。ネガティブコントロールとして、ＮＭ５２２はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有さず、従って、ｓｓｐＣが発現し得ないことから、（ＰＴＬ３８菌株を得るために）、プラスミドｐＥＴ／ＰＩＰによるＮＭ５２２大腸菌株の形質転換も行なった。並行して培養した菌種ＰＴＬ１４（誘導したか或いは誘導しなかったもの）および菌種ＰＴＬ３８から得たプラスミドＤＮＡを、Ｋｉｅｓｅｒ（１９８４年）のプロトコールに従って単離した。プラスミドの超らせん構造を解くため、それぞれの試料（０．５〜１μｇ）から得たプラスミドＤＮＡを、トポイソメラーゼＩ（２ユニット）と共に３７℃で２時間インキュベートした。次いで、当該ＤＮＡを、０．０６μｇ／ｍＬのエチジウムブロマイドの存在下、ＴＡＥアガロースゲル電気泳動（４．５Ｖ／ｃｍで５時間）により解析した（Ｋｅｌｌｅｒ，１９７５年）。ＵＶ透過による可視化に続いて、ゲルを図１３に示す様に写真撮影した。図１３は、±ＳｓｐＣ生産物で育生した菌種から調製したプラスミドＤＮＡのバンドパターンを示す。各列の説明は、次の通りである。
【０１３５】
レーン１　１ｋｂのＤＮＡラダー（全ＤＮＡは０．２５μｇ）
レーン２　大腸菌株ＢＬ２１ □ＤＥ３（ＰＴＬ１４）中の非誘導ｐＥＴ／ＰＩＰ
レーン３　大腸菌株ＢＬ２１ □ＤＥ３（ＰＴＬ１４）中の誘導ｐＥＴ／ＰＩＰ
レーン４　大腸菌株ＢＬ２１ □ＤＥ３（ＰＴＬ１４）複製調製物中の誘導ｐＥＴ／ＰＩＰ
レーン５　大腸菌株ＮＭ５２２（ＰＴＬ３８）中の非誘導ｐＥＴ／ＰＩＰ。
【０１３６】
ＰＴＬ３８菌株から調製したｐＥＴ／ＰＩＰ ＤＮＡと比較すると、ＳｓｐＣの存在下においてはプラスミドＤＮＡの形態には明らかな違いが見られ、この違いは、誘導条件下において顕著に示されている（レーン３と４）。図中に見られるより目立たない変化も、非誘導化試料（レーン２）におけるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現の読み漏らし条件下に見られる。高レベルのＳｓｐＣ発現に伴う図中の主な変化は、次の通りである。：
ｉ）　非誘導化菌株ＢＬ２１（レーン２）と菌株ＰＴＬ３８（レーン５）と比較して見られる、モノマーのスーパーコイル形成（１ｍＳ／Ｃ）の阻害（レーン３と４）。
【０１３７】
ｉｉ）　モノマーの直鎖状／開環体の後ろに存在する分散バンドの発生（レーン３と４）。
【０１３８】
Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ発現が誘導され（レーン３と４）、特に、レーン３と４の分散バンドがＤＮＡタンパク質複合体の特徴を示す場合には、モノマー超らせんプラスミドｐＥＴ／ＰＩＰの阻害が形成される。非誘導化細胞由来のプラスミドＤＮＡでこれらバンドが見られないということは（レーン５）、当該阻害やｐＥＴ／ＰＩＰ ＤＮＡとＳｓｐＣタンパク質との複合体により形成される分散バンドと首尾一貫している。
【０１３９】
これらデータによれば、プラスミドから発現するＳｓｐＣは、農薬やＧＭ植物体へ応用できる可能性を有することが示唆されている。
【０１４０】
４．　ｓｓｐＣの発現レベルの重要性を示すために、ｓｓｐＣ遺伝子をＳ遺伝子中へ挿入はするが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼリボソーム結合部位は使用せずにラムダファージを調製した。この菌株（ＳＴ７ＰＣ）は、Ｔ７ ｒｂｓの代わりに天然ｓｓｐＣ ｒｂｓを用いる他は、ＳＰＰＣ−ラムダと同様の方法によって調製した。ＳＳＰＣ−ラムダの感染のために使用したプロトコールに続いて、ＳＴ７ＰＣ−ラムダを細胞に感染させると、一時的に生育活性の減退を促進する結果となる。例えば、典型的な実験では、≧９５％の細胞生育活性の減退が感染１時間後で見られ、≧９９％の減退は３時間以内で観察される（表３を参照）。これら結果は、何れか一方のｒｂｓを使用することによって、ＳｓｐＣの発現レベルを調節するための手段を提供できることを示唆している。
【０１４１】
表３：ＳＴ７ＰＣ−ラムダによる感染に続く細胞の生育活性
【０１４２】
【表３】
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【０１４３】
【化１９】
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【０１４４】
【化２０】
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【０１４５】
【化２１】
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【０１４６】
【化２２】
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【０１４７】
【化２３】
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【０１４８】
【化２４】
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【０１４９】
【化２５】
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【０１５０】
【化２６】
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【０１５１】
【化２７】
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【０１５２】
【化２８】
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【０１５３】
【化２９】
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【０１５４】
【化３０】
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【０１５５】
【化３１】
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【０１５６】
【表４】
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【０１５７】
【表５】
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【０１５８】
配列表
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ラムダゲノムの一部（Ｓ遺伝子を含む範囲）を概略図により示したものである。
【図２】図２は、ｐＢ／ＬＦ１のマップである。
【図３】図３は、バシラス サブティラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ゲノムの一部（ｓｓｐＣ遺伝子を含む範囲）を概略図により示したものである。
【図４】図４は、（Ａ）ｐＢ／ＳＡＰＢと（Ｂ）ｐＢ／ＳＡＰＯのマップである。
【図５】図５は、ｐＢ／ＳＡＰＯＣのマップである。
【図６】図６は、バシラス サブティラス由来のｓｓｐＣ遺伝子によるラムダＳ遺伝子の置換と、クロラムフェニコール耐性マーカー遺伝子（Ｃｍｒ）の挿入とを示すＳＳＰＣ−ラムダのマップである。
【図７】図７は、プライマーの位置と、ＳＳＰＣ−ラムダゲノムＤＮＡの範囲のマップである。
【図８】図８は、ｓｓｐＣ遺伝子を含むバシラス サブティラスゲノムの一部を概略図により示したものである。
【図９】図９は、ｐＢ／ＰＩＰＣのマップである。
【図１０】図１０は、シーケンスプライマーであるＳＥＱＬ１ＦとＳＥＱＬ２Ｒの位置を示しつつ、ＲＰＰＣ−ラムダの構成を含むフラグメントを概略図により示したものである。
【図１１】図１１は、タンデムｓｓｐＣ遺伝子と、ラムダへのライゲーションに先立って遺伝子をＰＣＲにより増幅するために使用されるプライマーを概略図により示したものである。
【図１２】図１２は、ＳＳＰＣ−ラムダの感染に続く大腸菌の生育活性の低下を示す図である。
【図１３】図１３は、ＳｓｐＣ産物の＋／−条件下で増殖させた菌株から得たプラスミドＤＮＡのバンドパターンを表すゲルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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