(57)【要約】シンデカン１、コラーゲン１α２、ならびに２つの新規タンパク質７０１３および７０１８を含む肺癌用の新規に同定されたマーカーを用いる新規または残留肺癌の診断および同定方法が開示される。本方法は、患者からの血液における肺癌マーカーの判別を含む。４つのうちの少なくとも１つのマーカー、またはそれらの任意の混合物を使用し得ることが想定される。本方法は、サイトケラチン−１９の判別も含み得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺癌の鑑別方法であって、
患者から血液または非肺組織を単離すること、
シンデカン１、コラーゲン１α２、７０１３および７０１８からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの存在を判別すること
を含む方法。
【請求項２】
マーカーであるサイトケラチン−１９の存在を判別することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも２つのマーカーを判別する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
３つ以上のマーカーが判別される、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記判別が、ＲＴ−ＰＣＲによる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記判別が、抗体結合による、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記患者が、哺乳動物である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物が、ヒト、イヌまたはネコである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
転移性癌細胞を単離または除去する方法であって、
癌細胞を含む細胞または非肺組織をシンデカン１、コラーゲン１α２、７０１３および７０１８からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーに特異的な抗体で処理すること
を含む方法。
【請求項１０】
マーカーサイトケラチン−１８に特異的な抗体をさらに含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、金属粒子、蛍光粒子、クロマトグラフィービーズ、クロマトグラフィーゲルおよび固体支持体からなる群から選択される部分に結合される、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
２つのマーカーを用いる、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
３つ以上のマーカーを用いる、請求項９記載の方法。
【請求項１４】
配列番号１６（ｐ７０１３、ＡＴＣＣアクセッション番号　　　　（２００１年６月２１日））の少なくとも１７個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号１７（ｐ７０１８、ＡＴＣＣアクセッション番号　　　　（２００１年６月２１日））の少なくとも１７個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項１６】
ｐ７０１３／１２、ＡＴＣＣアクセッション番号　　　　（２００１年６月２１日））の少なくとも１７個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項１７】
患者における固形腫瘍の転移の鑑別方法であって、
前記患者から血液または骨髄を単離すること、および
シンデカン１、コラーゲン１α２、７０１３および７０１８からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの存在を判別すること
を含む方法。
【請求項１８】
前記固形腫瘍が、胆管、結腸、乳房、子宮、食道および喉頭からなる群から選択される、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
癌腫の鑑別方法であって、
癌細胞を得ること、および
７０１３、７０１８およびその両方からなる群から選択されるマーカーの存在を判別すること
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、残留肺癌の診断および鑑別方法に関する。本発明はさらに、肺癌用の新規に同定された細胞マーカーの使用に関する。これらのマーカーとしては、シンデカン１、コラーゲン１α２、ならびに２つの新規タンパク質７０１３および７０１８が挙げられる。
【０００２】
［発明の背景］
肺癌は工業国における最も一般的な癌の１つであり、非常に高い死亡率を有する。初期診断および有効な治療は現時点では利用可能でない。胸部Ｘ線はしばしば、肺癌スクリーニングに用いられるが、それは初期段階の癌の検出には有用でない。ＣＴスキャンも用いられ、初期段階の癌の検出を可能にし得るが、この手法は時間を要し、被曝の危険性を有する。
【０００３】
癌細胞または微小転移はしばしば、黒色腫、甲状腺癌および前立腺癌患者の血流中で検出される。現在、逆転写ベースのポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、癌特異的遺伝子またはマーカーを増幅することにより、無数の正常細胞内の単一癌細胞を検出し得るひとつの強力な方法である。これは、微小転移のＲＴ−ＰＣＲ検出を、予後、適切な治療の選択、および各治療の効力のモニタリングのための有望な診断手法にする。さらに、血液試験はいかなる健康的被害をも誘導しないが、Ｘ線またはＣＴスキャンのような方法は有害作用をもたらす。さらに血液試験は、内視鏡検査および生検と比較して、引き起こす物理的不快が非常に小さい。肺癌はしばしば、初期段階、すなわち症候性疾患および多数の肺癌が脳、骨および肝臓におけるような遠方の転移として再発する前でさえ、血行性転移を誘導する。これは、肺癌誘導性の血行性転移によるものである。しかしながらこの知識は、それが再発の診断および検出が極初期段階でのこれらの血行性転移に基づいてなされ得るということを示唆するため、有益である。しかしながら、血液中の転移性肺癌細胞の同定に利用可能な良好なマーカーはない。現在、肺癌マーカー、例えばサイトケラチン−１９およびＣＥＡは、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）による非小細胞肺癌の診断のために用いられるが、特異性を欠き、多数の擬陽性および陰性を生じる。
【０００４】
微小転移のＲＴ−ＰＣＲは、次いで、多数の患者人口、血行性転移の高発生率、不十分な予後および高次癌治療のための高医療費のために、肺癌の検出に特に有益である。さらに特異的抗体は、今までのところ肺癌に利用可能ではない。
【０００５】
したがって、特異的マーカー、および血行性転移を検出することによる肺癌の診断方法が必要とされる。
【０００６】
［発明の概要］
一実施形態は、患者から血液または非肺組織を単離すること、および、以下の：シンデカン１、コラーゲン１α２、７０１３および７０１８からの少なくとも１つのマーカーの存在を判別することによる肺癌の鑑別方法である。本方法は、マーカーであるサイトケラチン−１９の存在を判別することも含み得る。さらなる実施形態では、少なくとも２つのマーカーを判別する。さらなる実施形態では、２より多いマーカーを判別する。判別方法は当業者に既知の任意のものであり得るが、ＲＴ−ＰＣＲおよび／または抗体結合も含み得る。患者は任意の生体であり得るが、一実施形態では、哺乳動物、特にヒト、イヌまたはネコである。
【０００７】
さらなる実施形態は、転移性癌細胞を単離または除去する方法であって、癌細胞を含む細胞または非肺組織を、シンデカン１、コラーゲン１α２、７０１３および７０１８からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーに特異的な抗体で処理することによる方法である。本方法は、マーカーであるサイトケラチン−１８に特異的な抗体も含み得る。一実施形態では、抗体は金属粒子、蛍光粒子、クロマトグラフィービーズ、クロマトグラフィーゲルおよび固体支持体からなる群から選択される部分に結合される。さらなる実施形態では、２つのマーカーが用いられる。さらなる実施形態では、３つ以上のマーカーが用いられる。
【０００８】
さらなる実施形態は、マーカー７０１３として本明細書中でも同定される配列番号１６（ＡＴＣＣアクセッション番号　　　　として寄託された（２００１年６月２１日））の少なくとも１７個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。さらなる実施形態は、ＡＴＣＣアクセッション番号　　　　として寄託された（２００１年６月２１日））少なくとも１７個のヌクレオチドのポリヌクレオチドである。
【０００９】
さらなる実施形態は、マーカー７０１８として本明細書中でも同定される配列番号１７（ＡＴＣＣアクセッション番号　　　　として寄託された（２００１年６月２１日））の少なくとも１７個のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである。
【００１０】
さらなる実施形態は、患者における固形腫瘍の転移の鑑別方法であって、以下の：上記患者から血液または骨髄を単離すること、ならびにシンデカン１、コラーゲン１α２、７０１３および７０１８からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーの存在を判別することによる方法である。本方法は、サイトケラチン−１８を同定することも包含し得る。一実施形態では、上記固形腫瘍は胆管、結腸、乳房、子宮、食道および喉頭からなる群から選択される。
【００１１】
さらなる実施形態は、癌腫の鑑別方法であって、癌細胞を得ること、ならびに７０１３、７０１８およびその両方からなる群から選択されるマーカーの存在を判別することによる方法である。
【００１２】
［好ましい実施形態の詳細な説明］
ディファレンシャルディスプレイを用いて、血中を循環し、正常血液細胞で発現しない、肺癌細胞で特異的に発現するｍＲＮＡを同定した。ディファレンシャルディスプレイ方法は、細胞中で発現する遺伝子のより包括的表現を可能にする古典的手法からの変法である。
【００１３】
候補遺伝子を同定するために、３つの主な技術が目下利用可能である。すなわち、サブトラクションライブラリー、ディファレンシャルディスプレイおよびＤＮＡマイクロチップアレイである。しかしながらサブトラクションライブラリーは、潜在的に有用であるが、遺伝子配列の部分的類似性を示す遺伝子も同定することができ、非常に労力を要しかつ時間集約的技法である。ＤＮＡマイクロチップアレイは、使用が迅速かつ容易であるが、血液試料中の稀少遺伝子を検出するのに十分に感受性ではない。これは、本方法が特異的マーカーを発現しない正常細胞の大きなバックグラウンド（無数の白血球）内に特異的マーカーを発現する稀少微小転移を検出できる必要があるため、特に重要である。ディファレンシャルディスプレイ（ｄｄ−ＰＣＲ）は、多重縮重プライマーの組合せを用いてすべての既存の遺伝子の増幅を可能にし、したがって稀少マーカーまたは遺伝子が検出されるという見込みを増大させる。
【００１４】
しかしながら、できるだけ多数の遺伝子を表現するようにディファレンシャルディスプレイ技術を改良するために、選択的増幅断片長多型（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ｓ−ＡＦＬＰ））を実施例１で用いた。このアプローチは、１）遺伝子の３’末端のみを増幅する、２）より再現可能なゲルパターンを生成する、３）より少数の余分な遺伝子を同定する、および４）より選択的なＰＣＲ条件を用いるという利点を有する。本方法は、４つのマーカー、すなわちＳｙｎｄ、Ｃｏｌ、７０１３および７０１８の同定に至った。
【００１５】
これらのマーカーを用いて、疾患のあらゆる段階における患者の血中の肺癌細胞を判別し得る。当業者に既知の任意の方法を用いて、血中または任意の転移性組織中のマーカーを判別し得る。例えば、マーカーに特異的である細胞で発現するｍＲＮＡが判別され得る。
【００１６】
あるいは、タンパク質それ自体は、免疫技法、例えばウエスタンブロット、ＦＡＣＳ技術、ＥＬＩＳＡおよび当業者に既知のその他の方法を用いて同定され得る。これら抗体または機能性抗体部分は、既知の方法を用いて購入、単離、または生産され得る。
【００１７】
一実施形態では、マーカーの遺伝子発現が同定される。マーカーに関連した遺伝子の発現の判別を可能にする任意の方法が用いられ得る。典型的には、本方法は、遺伝子の発現に起因するｍＲＮＡを増幅する。一実施形態では、血液または組織からのｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲが用いられる。さらなる実施形態では、これらのマーカーを含む血中の細胞を判別するために抗体が用いられる。例えば細胞選別を用いて、これらのマーカーに対する抗体で蛍光標識されていた細胞を判別し得る。
【００１８】
一実施形態では、本方法は、血中または骨髄中の肺癌細胞の存在を判定するために用いられる。しかしながら、普通はこれらのマーカーを生じない任意の組織からのｍＲＮＡが用いられ得ることが想定される。例えば、典型的に転移の部位である器官からのｍＲＮＡが用いられ得る。したがって、さらなる実施形態では、本方法は、肝臓または脳のような器官中の肺癌細胞を判別するために用いられる。
【００１９】
一実施形態では、本方法は、疾患の極初期段階での肺癌細胞の存在を判別するために用いられる（さらなる実施形態では、肺癌細胞は寛解後に判別される）か、あるいは再発を判別するために用いられる。
【００２０】
さらなる実施形態では、マーカーは、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで肺癌細胞を標的化するために用いられる。一実施形態では、癌細胞を標的とし、血液から除去させるアフィニティー技法を用いて、身体から癌細胞が除かれる。
【００２１】
さらなる実施形態では、マーカーを用いて、血中もしくは骨髄中の転移性細胞を、または胆管、結腸、乳房、子宮、食道および喉頭のような癌により生成される転移性器官もしくは組織を鑑別する。あるいはマーカーは、血液から転移性細胞を除去するために用いられ得る。
【００２２】
さらなる実施形態では、マーカー７０１３および７０１８は、癌細胞またはその他の細胞が上皮由来のものであるか否かを判別するために用いられる。例えば細胞が一方または両方のマーカーを発現する場合、それは上皮由来のものであると考えられる。
【００２３】
患者は、癌を有することが可能な任意の動物であり得る。一実施形態では、患者は哺乳動物である。さらなる実施形態では、哺乳動物はペット、例えばイヌまたはネコである。さらなる実施形態では、患者はヒトである。
【００２４】
ここで以下の実施例を参照して本発明を説明する。しかしながら、これらの実施例は本発明を単に説明するものであって、本発明を限定するものではない、と理解される。
【００２５】
実施例１および２では、マーカーは、種々のディファレンシャルディスプレイ技法を用いて同定される。同定されるマーカーは、実施例２で説明される。
【００２６】
実施例１
ｓ−ＡＦＬＰディファレンシャルディスプレイ
ｓ−ＡＦＬＰは、ｃＤＮＡライブラリーからの制限断片の選択的ＰＣＲ増幅に基づいている。２組の選択的プライマーを用いた。第１のもの、すなわち図１の選択的プライマーＡは、３つの部分：コア配列、酵素特異的配列および３’末端の２つの選択的ヌクレオチドからなる。選択的配列の変異のために、これは４２＝１６種類のプライマーを提供する。第２のもの、すなわち図１の選択的プライマーＢも、３つの部分：アンカー配列、ポリＴ配列および蛍光標識される３’末端の２つの選択的ヌクレオチドからなる。ポリＴ（Ａ、ＧおよびＣ）後の３つの選択的配列のために、これは次に、３×４＝１２種類のプライマーを提供する。したがって、ポリＡ領域を含めた３’末端ｃＤＮＡ制限断片はすべて、選択的ＰＣＲのこの方法により生成される１９２（１６×１２）群に含まれた。増幅断片のゲル表示上の各シグナルは、ｃＤＮＡライブラリー中の非オーバーラップ遺伝子を示した。この技法を用いて、肺癌検体から単離されるＲＮＡを、健常個体の血液からのＲＮＡと比較した。癌検体中で過剰発現した示差的に発現した遺伝子を、腫瘍細胞播種に関する一般的遺伝子マーカーのための候補と考えた。
【００２７】
ｓ−ＡＦＬＰを成功させるためには、優れた品質のＲＮＡが重要であった。しかしながら肺検体は、肺胞マクロファージからの豊富なＲＮａｓｅの存在により、ＲＮＡを調製するのが最も難しい組織の１つである。したがって、ＮＣＣＲＩ（Ｃｈｕｏｕ−ｋｕ， Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）から急速凍結肺癌検体を購入し、過去に記載されたようなＡＧＰＣ法により全ＲＮＡを精製した（Ｔｏｍｉｎａｇａ， Ｋ， Ｍｉｕｒａ， Ｙ． Ａｒａｋａｗａ， Ｔ． Ｋｏｂｏｙａｓｈｉ， Ｋ． ａｎｄ Ｍｉｔｓｕｈａｓｈｉ， Ｍ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ．， ４２， １７５０−１７８３， １９９８）。アガロースゲル電気泳動またはマイクロキャピラリーチップを用いて、ＲＮＡの品質を評価し、２つのｒＲＮＡバンドの存在を確証した。次にｓ−ＡＦＬＰに関して許容可能な検体を用いた。６つの肺癌検体を用い、各試料を異なる患者から得た。６つのうちの４つは腺癌であり、２つは扁平上皮癌であった。２０の対照血液は、悪性疾患またはその他の疾患の病歴または現在の診断を有さない健常有志から得た。
【００２８】
腫瘍および血液検体の全ＲＮＡ調製物
新鮮な凍結腫瘍検体を液体窒素中で小片に壊した。グアニジン法により、１００ｍｇ検体から全ＲＮＡを抽出した（Ｃｈｏｍｚｙｎｓｋｉ， Ｐ． ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ， Ｎ． １９８７． Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｂｙ ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ−ｐｈｅｎｏｌ−ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２： １５６−１５９）。末梢血試料を、ヘパリン凝固防止剤含有試験管中に患者および健常有志の静脈から採取した。第１の試験管中には１〜２ｍｌの末梢血、および第２の試験管中には１０ｍｌの末梢血の、２つの試料を各被験者から採取した。第１の試験管は、針が皮膚をさしたときに針が引っかかった上皮細胞で汚染された可能性があるため廃棄し、第２の試験管のみをアッセイした。メーカーの使用説明書に従ってＲｉｂｏＣａｐ（商標）（ＲＮａｔｕｒｅ， Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ）を用いて、末梢血試料から全ＲＮＡを抽出した。１８ｓおよび２８ｓリボソームＲＮＡバンドに関してアガロースゲル電気泳動により精製全ＲＮＡ品質を検査し、ＵＶ分光分析器によりそれらの量を測定した。
【００２９】
ディファレンシャルディスプレイｓ−ＡＦＬＰ解析
選択的プライマー技法を用いて、ディファレンシャル「ｓ−ＡＦＬＰ」変法を実行した。
【００３０】
６つの肺癌検体（肺癌組織）および５名の健常個体を含む２つのプールした健常血液試料をそれぞれｓ−ＡＦＬＰ解析のために用いた。全アッセイに用いたオリゴマーはすべて、Ｓａｗａｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）から入手した。３０μｇの全ＲＮＡから、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。６５℃で５分間変性後、以下の：５０μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， ＵＳＡ）、５００μＭの各デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２０単位のＲＮＡｓｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および１０，０００単位／ｍｌのＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有した５０μｌの反応ミックス中で３７℃で９０分間、ＲＮＡを逆転写した。最終濃度のために以下の構成成分：２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、０．１５ｍＭのＮＡＤ、５ｍＭのＤＴＴ、２５０単位／ｍｌのＤＮＡポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、および３０単位／ｍｌのＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加することにより、１６℃で１２０分間、第２鎖反応を実施した。反応後、試験管を氷上に置き、１２．５μｌの０．２５Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ；ｐＨ７．５）を酵素不活性化のために添加した。生成物をフェノール／クロロホルムで１回抽出し、エタノール沈殿させた。二本鎖ｃＤＮＡをＸ単位の４塩基認識制限酵素Ｍｂｏｌ（↓ＧＡＴＣ；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， ＵＳＡ）で３７℃で６０分間消化した。消化断片の５’末端のリン酸塩残基を仔牛腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ；Ｔａｋａｒａ， Ｊａｐａｎ）を用いて除去して、連結過程中の自己連結を回避させた。２０単位のＣＩＡＰおよび１０μｌの１０×アルカリ性リン酸塩緩衝液（５００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。生成物をフェノール／クロロホルムで２回抽出し、エタノール沈殿させた。断片をオリゴマーと連結させて、プライミング部位に導入した。連結のために以下のオリゴマーを用いた：（Ｐ１）５’−Ｐ−ＧＡＴＣＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣ−３’（リンカーオリゴマー）［配列番号１］；（Ｐ２）５’ＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−Ｐ−３’（ヘルパーオリゴマー）［配列番号２］。ヘルパーオリゴマーを３’末端でリン酸化して、オリゴマー二量体の生成を防止した。１：１００：２００モル比の消化断片：ヘルパーオリゴマー：リンカーオリゴマーを用いて、連結反応を実施した。
【００３１】
４５μｌの反応物中で１５μｌのＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（Ｔｏｙｏｂｏ）を添加することにより、１６℃で一夜、反応を実施した。ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）による非連結オリゴマーの除去後、ポリＡテールを含む３’末端の断片を増幅し、２種類の選択的プライマーを用いて検出した。それらのうちの１つ（Ｐ３）は、３つの部分：アンカーオリゴマーの相補的配列、Ｍｂｏｌ認識配列（ＧＡＴＣ）および３’末端の２つの縮重ヌクレオチド（５’−ＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＴＣＮＮ−３’）［配列番号３］からなっていた。Ｐ３は、選択的配列（ＮＮ）の変異のために、４２＝１６型を有した。第２の選択的プライマー（Ｐ４）も３つの部分：アンカー配列、スルホローダミン１０１標識で標識されたポリＴ配列および３’末端の２つの縮重ヌクレオチド（５’−ＴＣＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ−３’）［配列番号４］からなっていた。選択的配列「Ｖ」がＴ以外の任意のヌクレオチドであるため、Ｐ４は３×４＝１２型を有する。したがってポリＡ領域を含む３’末端ｃＤＮＡ制限断片はすべて、各々別々に１９２ＰＣＲ反応により１９２（＝１６×１２）群に分類される。ＰＣＲは、ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ， Ｊａｐａｎ）を用いて実行し、サイクリングパラメータは９４℃で３０秒、５６℃で１分および７２℃で１分（３０サイクル）であった。ＨｉｔａｃｈｉＳＱ−３０００蛍光ＤＮＡシーケンサーで、１ＸＴＢＥ（０．０９Ｍトリス−ホウ酸塩および０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ）および７Ｍ尿素を含有するポリアクリルアミドゲル（４％Ｔ、５％Ｃ）電気泳動により、増幅産物を分離した。
【００３２】
当該ｃＤＮＡをゲルから切り出し、粉砕浸漬法により精製した。図２は、６つの候補を産生する試料ゲルを示す。バンドは、正常血液より肺癌ＲＮＡ中でより豊富である特定断片を示す。６つの肺癌組織レーンのうちの少なくとも２つにおいてバンドが存在し、どの正常血液レーンにも存在しない場合に、バンドを単離した。ディファレンシャルディスプレイはしばしば多数の擬陽性を生じるため、選択判定基準は重要であった。ｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター系（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ）を用いて、単離断片をサブクローニングした。ミニプレパレーションにより精製された生成物を、Ｂｉｇ  Ｄｙｅターミネーターサイクルシーケンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）およびＡＢＩＰｒｉｓｍ３７７ＤＮＡシーケンシング装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、Ｔ７プライマー（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ−３’）［配列番号１５］を用いてシーケンシングした。
【００３３】
ノーザンブロット解析
ホルムアルデヒドゲル電気泳動により全ＲＮＡを分離し、ナイロン膜（＋）（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｅｎｇｌａｎｄ）に移した。候補をｐＣＲ２−１を用いてクローニングした。配列解析により、クローンを検証した。プラスミドＤＮＡを適切な酵素で制限処理し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のために用いた。
【００３４】
選択方法
最初に、健常血液中では陰性であり、肺癌中では陽性である１２１個の候補を同定した。これら１２１個の候補をシーケンシング後、ＧｅｎＢａｎｋならびに発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース中の既知の配列との相同性に関して、配列を解析した。
【００３５】
真のシグナル対偽のシグナルの選択のための手法を以下に示す：当該バンドをディスプレイゲルから切り出し、ＤＮＡをクローニングした。次に当該単離物をシーケンシングした。遺伝子が血球中に普通に存在することを配列データが示した場合、それを廃棄した。次に特定プライマーを設計し、各クローンに関してＰＣＲを実行した。まず正常血液ＲＮＡをＰＣＲにより増幅し、ＰＣＲ産物が産生された場合には、候補を廃棄した。残りの２１候補を、肺癌患者からの血液に対して検査し、シグナルがいかなる患者においても見出されない場合には候補を廃棄した。この手法から、４つの候補の単離を生じた（実施例２参照）。
【００３６】
【表１】
2004500895.tif 000002
【００３７】
実施例２
候補遺伝子
候補マーカーを表１に示す。見出された第１の候補マーカーをシンデカン１遺伝子（ヌクレオチド配列ＰｕｂＭｅｄアクセッション番号ＢＣ００８７６５、タンパク質配列アクセッション番号ＡＡＨ０８７６５）（配列番号１８および１９）と同定した。図６は、ｓ−ＡＦＬＰによりもたらされた断片の配列を提示する（配列番号２２）。この配列のｂｌａｓｔ検索は、シンデカン１遺伝子（ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｚ４８１９９）のエキソン２〜６に相当した。シンデカン１は、細胞外マトリックスおよび成長因子と結合するプロテオグリカンのファミリーからの細胞表面膜貫通ヘパラン硫酸プロテオグリカンである。いくつかの癌において、この遺伝子の調節の不全が明らかにされた。
【００３８】
次の候補は、コラーゲン１α２と同定した（ヌクレオチド配列ＰｕｂＭｅｄアクセッション番号Ｊ００１１４、タンパク質配列アクセッション番号ＡＡＡ５１９９６）（配列番号２０および２１）。図７は、ｓ−ＡＦＬＰにより提供された旧断片（配列番号２４）ならびに新規断片（配列番号２３）の配列を提供する。この配列のｂｌａｓｔ検索は、コラーゲンプロ−α２（１）遺伝子（ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｊ０３４６４）のエキソン１に相当した。これは、特に肺における広範発現遺伝子である。当該遺伝子が脂肪芽細胞腫におけるＰＬＡＧ１（多形腺腫遺伝子１）との融合タンパク質として関わることは興味深い。
【００３９】
第３の候補は、７０１３（配列番号１６）と呼ばれ、ＥＳＴデータベースに対して検索した場合、新規遺伝子と同定された。図８は、ｓ−ＡＦＬＰから得られる断片の配列（配列番号２５）を示す。この断片を用いて、プライマー伸長法により大型断片を同定した（配列番号１６）。この大型断片をｐＣＲＩＩ中にクローニングし、その結果生じたプラスミドｐ７０１３は、ブダペスト条約下で、８２２０８０４３７７７８のラベルを付したＦＥＤＥＸ発送により２００１年６月２１日にＡＴＣＣ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）に寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号        を割り当てられた。ｃＤＮＡライブラリーから大型クローンを単離し、プラスミドｐ７０１３／１２は、ブダペスト条約下で、８２２０８０４３７７７８のラベルを付したＦＥＤＥＸ発送により２００１年６月２１日にＡＴＣＣ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）に寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号        を割り当てられた。プラスミドは、ｐＣＭＶ６−ＸＬ４中に約２２００塩基の挿入物を有する。ＢＬＡＳＴ検索の実行に際して、最高の相同性を示すＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＫ００２２０８）、およびゲノムクローン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＬ０３５４０８）を同定した。配列は任意の既知の遺伝子とのいかなる相同性も示さないが、いくつかの上皮癌において増幅を受けると報告されている領域である染色体１のｑ３２領域に局在した。
【００４０】
次の候補は７０１８（配列番号１７）と呼ばれ、これも新規の遺伝子である。図９は、ｓ−ＡＦＬＰから得られる断片の配列を提示する（配列番号２６）。この配列を用いて、ｃＤＮＡにプライマー伸長して、大型断片を得た（配列番号１７）。この大型断片をプラスミドｐＣＲＩＩ中でクローニングし、その結果生じたプラスミドｐ７０１８は、ブダペスト条約下で、８２２０８０４３７７７８のラベルを付したＦＥＤＥＸ発送により２００１年６月２１日にＡＴＣＣ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， ＵＳＡ）に寄託され、ＡＴＣＣアクセッション番号        を割り当てられた。ＢＬＡＳＴ検索の実行に際して、最高の相同性を示したが、既知の遺伝子とのいかなる相同性も示さない２つのＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＷ９５６７２７およびＡＷ４５２７９５）を同定した。さらにそれは、今までのところいかなる染色体領域にも局在化されていない。
【００４１】
実施例３および４は、正常肺細胞および肺癌細胞系でマーカーが発現するか否かを判別する。
【００４２】
実施例３
正常肺細胞および肺細胞系におけるマーカーの発現
これらのマーカーが正常ヒト肺細胞中で発現したか否かを判別するために、ヒト肺小気道上皮細胞、肺からの微小血管上皮細胞、気管支上皮細胞および正常ヒト肺繊維芽細胞からの同一量のＲＮＡを用いて、正常ヒト肺ＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００４３】
正常肺または肺癌細胞系からの全ＲＮＡ調製
ＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（登録商標）プロトコール（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ， ＯＨ， ＵＳＡ）を用いた酸−グアニジンチオシアネート／フェノール／クロロホルム抽出により、細胞から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを完全に精製する必要はなく、実際、プライマーがイントロンに及ぶ領域で設計される場合、多少のＤＮＡ夾雑は許容可能である。
【００４４】
ＲＴ−ＰＣＲ
逆転写前に、すべてのＲＮＡ試料をＤＮａｓｅＩで処理して、ゲノムＤＮＡ夾雑がないことを保証した。全ＲＮＡ１μｇ毎に１単位のＤＮａｓｅＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いた。生成物をフェノール／クロロホルムで２回抽出し、エタノール沈降させた。細胞系からのＲＮＡの各０．５μｇに対して２００単位のＭＭＬＶ転写酵素を用いて（４２℃で５０分間）、かつ血液全ＲＮＡからの各１μｇに対して１００単位の転写酵素ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（商標）を用いて（３７℃で６０分間）、ｃＤＮＡを合成した。
【００４５】
まず、全ＲＮＡの各１μｇに対する１００単位の逆転写酵素ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（商標）（ＴＯＹＯＢＯ， Ｊａｐａｎ）、５０μｇ／ｍｌのオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライマー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５００μＭの各デオキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、３７℃で６０分間、ｃＤＮＡ合成を実施した。すべてのＰＣＲに関して、５０ｎｇの全ＲＮＡ、１０ｐｍｏｌのプライマー対および０．１２５単位のＥＸ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを、２５μｌ反応物の総容量中に用いた。各遺伝子マーカーに関するプライマー対およびサイクリング条件は以下の通りであった：ＳＹＮＤマーカーをプライマーｒＰ５（５’−ＴＣＡＴＧＴＧＴＧＣＡＡＣＡＧＧＧＴＡＴ−３’）［配列番号５］およびプライマーＰ６（５’−ＡＡＴＡＴＴＣＣＴＧＡＴＴＣＣＡＧＣＣＣ−３’）［配列番号６］を用いて増幅した。サイクリング条件は、９４℃で３０秒、６５℃で１分および７２℃で１分（３０サイクル）であった。プライマーＰ７（５‘ＯＡＧＡＧＣＡＴＴＧＴＧＣＡＡＴＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴＡＡＣＴＣＣＴ−３’）［配列番号７］およびプライマーＰ８（５’−ＧＧＴＴＴＴＣＴＴＡＣＡＡＡＧＧＴＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＣＴＡＡＣＡＧ−３’）［配列番号８］を用いて、ＣＯＬを増幅した。サイクリングパラメータは、９４℃で３０秒、５８℃で１分および７２℃で１分（２０サイクル）であった。第２ラウンドのＰＣＲ反応に関しては、反応ミックスは１μｌの第１ラウンドＰＣＲ産物を鋳型として、ならびにプライマー対Ｐ３およびＰ４を含入した。ＰＣＲの第２段階は、９４℃で３０秒、６０℃で１分および７２℃で１分を２０回実施した。７０１３を、プライマーＰ９（５’−ＡＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＴＧＴＧＣＧ−３’）［配列番号９］およびプライマーＰ１０（５’−ＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＧＡＴＴＡＡＧＧＴＴＣＣＣＡＴＣＴＧＣＧ−３’）［配列番号１０］を用いて増幅した。サイクリング条件は９４℃で３０秒、６３℃で１分および７２℃で１分（３８サイクル）であった。７０１８を、プライマーＰ１１（５’−ＡＴＣＣＡＴＧＣＡＣＧＴＣＡＣＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣ−３’）［配列番号１１］およびプライマーＰ１２（５’−ＴＣＡＡＧＴＡＧＧＣＡＣＡＡＣＣＣＡＧＴＣＣＴ−３’）［配列番号１２］を用いて増幅した。サイクリング条件は９４℃で３０秒、６３℃で１分および７２℃で１分（３８サイクル）であった。ＣＫ−１９を、プライマーＰ１３（５’−ＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＴＧＡＣＡＴＧＣＧＡＡＧ−３’）［配列番号１３］およびプライマーＰ１４（５’−ＣＧＣＴＧＡＴＣＡＧＣＧＣＣＴＧＧＡＴＡＴＧ−３’）［配列番号１４］を用いて増幅した。サイクリングパラメータは９４℃で３０秒、６０℃で１分および７２℃で１分（２０サイクル）であった。第２ラウンドのＰＣＲ反応に関しては、１μｌの第１ラウンドＰＣＲ産物が鋳型であり、Ｐ１３およびＰ１４の同一プライマー対は同一サイクルパラメータを有した。ＰＣＲ後、４％ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロースゲル（Ｔａｋａｒａ， Ｊａｐａｎ）上での電気泳動により、１μｌのＰＣＲ産物を解析した。
【００４６】
陽性対照として、全試料にβ−アクチンに関してＰＣＲを施した。４つの候補、７０１８、７０１３、シンデカン１（Ｓｙｎｄ）、コラーゲン１Ａ２（Ｃｏｌ）のプライマー、および陽性対照サイトケラチン−１９（Ｃｋ−１９）のプライマーをＲＴ−ＰＣＲのために用いた。サイトケラチン−１９は、上皮細胞マーカーとして既知である。これらのマーカーに対する５つのプライマー対の使用により、ＰＣＲ増幅を実施した。細胞系に関しては、０．１容量のＲＴ反応物、１０μＭの各プライマーおよび１．２４単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを、５０μｌ反応物の総容量中に用いた。全血に関しては、０．１容量のＲＴ反応物、１０μｍの各プライマーおよび０．１２５単位のＥＸＴａｑＤＮＡポリメラーゼを、２５μｌ反応物の総容量中に用いた。各プライマーのＰＣＲ条件は、表２に示したとおりである。アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を解析し、シーケンシングによりいくつかの生成物を確認した。
【００４７】
【表２】
2004500895.tif 000003
【００４８】
正常細胞のＰＣＲの結果を表３に示す。これは、４つの新規単離マーカーが検査した正常肺細胞系中でしばしば発現したことを示す。さらに、新規マーカー７０１３および７０１８は、肺上皮細胞に特異的である（表３、ならびに図３も参照）。シンデカン１は、５つのＲＮＡすべてで発現することが見出された。コラーゲン遺伝子も５つすべてで発現した。７０１３遺伝子は、７０１８と同様に、全体的肺癌組織および上皮細胞でのみ見出された。肺癌サイトケラチン−１９に関するマーカーも、全体的肺および上皮細胞でのみ見出された。
【００４９】
【表３】
2004500895.tif 000004
【００５０】
実施例４
肺癌細胞系におけるマーカーの発現
これらのマーカーが肺癌細胞系中で発現したか否かを判別するために、同量のＲＮＡを用いて１２個の肺癌細胞系からのＲＮＡで、ＲＴ−ＰＣＲを実施した（表４参照）。アガロースゲル電気泳動により全ＰＣＲ産物を解析し、シーケンシングによりいくつかの生成物を確認した。ＲＮＡすべてが同等に、陽性対照−アクチンを十分に増幅した。癌細胞系Ｌｕ９９（Ｙａｍａｄａ， ｅｔ ａｌ． Ｇｉａｎｔ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｏｆ ｔｈｅ ｌｕｎｇ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ７６：９６７−９７６， １９８５）、ＰＣ１３（大細胞癌）、Ａ５４９（Ｉｍａｎｉｓｈｉ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｙ ａｎｔｉ−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ａｌｐｈａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．， ８１：２２０−２３， １９８９）、ＰＣ１４、ＮＣＩ−Ｈ４４１（腺癌）、ＰＣ１およびＱＧ５６（扁平上皮癌）を用いた。
【００５１】
図４に示したように、６つの肺癌細胞系中のＲＮＡ中のマーカーの存在もＲＴ−ＰＣＲにより調べた。系のうち４つは腺癌で、レーン５および６のものは扁平上皮癌であった。シンデカン１は、６つすべてで発現したことが判明した。コラーゲン遺伝子は、６つのうち４つでは強く、２つでは弱く見出された。興味深いことに、７０１３および７０１８は、異なる発現パターンを示した。７０１３は、６つのうち４つで見出され、そして７０１８は６つの系のうち５つに見出された。これは、６つのうち５つに見出されたサイトケラチン−１９に匹敵する。扁平上皮系５０８２は、サイトケラチン−１９を発現しなかったが、７０１８を発現した。
【００５２】
【表４】
2004500895.tif 000005
【００５３】
実施例５は、これらのマーカーを用いた血中の肺癌細胞の判別方法を提供する。実施例５では、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、血液試料中のこれらのマーカーに関するｍＲＮＡの存在を判別する。
【００５４】
実施例５
患者血液中のマーカーの発現
１９９８年１１月から２０００年４月までの間に慶応大学病院で診断され、治療された肺癌患者６８名、ならびに同一時期の慶応大学病院の転移性肺癌患者７名を調査した。患者の特徴を表５に示す。
【００５５】
４つの候補７０１８、７０１３、シンデカン１（ｓｙｎｄ）、コラーゲン１Ａ２（Ｃｏｌ）、および陽性対照サイトケラチン−１９（Ｃｋ−１９）を用いたＲＴ−ＰＣＲを用いて、患者の血液試料からのＲＮＡを試験した。陽性結果として認めるためには、試料においてマーカーが良好に増幅し、そして−アクチンも良好に増幅しなければならない。
【００５６】
全血からの全ＲＮＡ調製物
ヘパリン凝固防止剤含有試験管中に、患者および健常有志の肘前静脈から、末梢血試料を採取した。標準低張溶液により赤血球（ＲＢＣ）を溶解し、全血球集団をＲｉｂｏＣａｐ注射器フィルター（ＲＮＡｔｕｒｅ， Ｉｒｖｉｎｅ， ＣＡ）上に収集した。グアニジン溶液を添加し、その後標準ＡＧＰＣ法を用いることにより、注射器フィルターからＲＮＡを溶離した。１８ｓおよび２８ｓリボソームＲＮＡバンドを有するアガロースゲル電気泳動により精製全ＲＮＡ品質を解析し、ＵＶ分光計によりそれらの量を測定した。調製後、ＲＮＡペレットを２０μｌのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）処理水中に再懸濁し、−８０℃で保存した。
【００５７】
ＲＴ−ＰＣＲ
逆転写前に、全ＲＮＡ試料をＤＮａｓｅＩで処理して、可能性のあるいかなるゲノムＤＮＡ夾雑をも除去した。細胞系からのＲＮＡの各０．５μｇに対して２００単位のＭＭＬＶ転写酵素を用いて（４２℃で５０分間）、全血液ＲＮＡからの各１μｇに対して１００単位の転写酵素ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（商標）を用いて（３７℃で６０分間）、ｃＤＮＡを合成した。
【００５８】
全試料を、陽性対照としてのβ−アクチンに関するＰＣＲに付した。図５は、血液ＲＮＡからの陽性試験の一例を示す。４つの候補７０１８、７０１３、シンデカン１（ｓｙｎｄ）、コラーゲン１Ａ２（Ｃｏｌ）、ならびに上皮細胞マーカーとして既知であるサイトケラチン−１９（Ｃｋ−１９）のプライマーをＲＴ−ＰＣＲのために用いた。細胞系のＲＴ−ＰＣＲに関しては、０．１容量のＲＴ反応物、１０μＭの各プライマーおよび１．２４単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼを、５０μｌ反応物の総容量中に用いた。全血のＲＴ−ＰＣＲに関しては、０．１容量のＲＴ反応物、１０μｍの各プライマーおよび０．１２５単位のＥＸＴａｑＤＮＡポリメラーゼを、２５μｌ反応物の総容量中に用いた。ＰＣＲ条件は、表２と同様であった。
【００５９】
【表５】
2004500895.tif 000006
【００６０】
表６では、同定されたマーカーの存在に関して、肺癌患者および対照健常有志からの血液のＲＴ−ＰＣＲの結果を試験した。段階Ｉ〜ＩＶ患者を、４０名の健常有志と同様に、マーカーの発現に関して試験した。要約すると、結果は、４つの遺伝子７０１８、７０１３、Ｓｙｎｄおよびｃｏｌは健常対照血中では発現しないが、癌細胞系中では発現することを示した（表６参照）。
【００６１】
【表６】
2004500895.tif 000007
【００６２】
特に表７では、肺癌患者の血液試料において、各遺伝子はそれぞれ３％、４１％、１９％および１６％発現したが、これら４つの遺伝子のうちの少なくとも１つは患者の血液試料の５７％で発現する。また、サイトケラチン−１９を用いると、これら５つの遺伝子のうちの少なくとも１つは７１％の患者で発現する。１つまたはそれ以上のこれらの遺伝子は、腺癌の８０．５％、および扁平上皮癌の６８．４％で発現する。シンデカンは、１３名の肺癌患者で見出され、対照（健常）患者では見出されなかった。コラーゲンは、肺癌患者においてのみ見出された。７０１３マーカーは、肺癌患者において広範に発現したが、対照では全く発現しなかった。７０１８だけは、対照試料ならびに肺癌患者において発現することが判明した。
【００６３】
【表７】
2004500895.tif 000008
【００６４】
したがって、患者の５４％が、４つのマーカーのうちの少なくとも１つまたはそれ以上を表示した。
【００６５】
要するに、肺癌患者の血液中に存在し、正常血液中には存在しない４つの新規の潜在的マーカーが同定された。マーカーのうちの２つは新規の遺伝子である。
【００６６】
新規のマーカーの組合せは、検査した肺癌患者の血液の５４％で観察され（表５）、これらのマーカーとサイトケラチン−１９との組合せは、検査した肺癌患者の血液の６８％で見出されるマーカーを生じた。したがって組合せは、初期段階の肺癌の微小転移の診断のために、または再発に関する診断のために理想的である。
【００６７】
実施例６では、任意の型または段階の肺癌において肺癌細胞を判別する５つのマーカーを用いるアッセイの能力を調べる。
【００６８】
実施例６
肺癌の型および段階による解析
異なる型および段階の肺癌を有する患者を、４つのマーカーの発現に関して試験した（表８参照）。
【００６９】
【表８】
2004500895.tif 000009
【００７０】
実施例５と同様に、６９名の肺癌患者の血液試料を慶応大学病院から得た。腫瘍−結節−転移（ＴＮＭ）スコア（Ｍｏｕｎｔａｉｎ ＣＥ： Ａ ｎｅｗ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｓｔａｇｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｈｅｓｔ ８９：２２５Ｓ−２３３Ｓ， １９８６）に従って、段階分類を実施した。ＲＮＡを精製し、ＲＴ−ＰＣＲを実施例５と同様に実施した。血液試料中の各マーカーの発現を解析し、結果を表９に示す。
【００７１】
表９では、マーカーは後期段階で多少多く発現するようであるが、５つすべての組合せを用いる場合、それらは疾患の全段階で判別され得ることが観察され得る。したがって、これら５つの遺伝子を組合せて用いると、少なくとも１つの遺伝子は段階ＩＡの５６％で、ＩＢの３３％、ＩＩの５０％、ＩＩＩＡの９２％、ＩＩＩＢの６０％、ならびにＩＶの８７％で発現する。
【００７２】
【表９】
2004500895.tif 000010
【００７３】
転移性疾患を有する患者からの血液を試験した場合、少なくとも１つのマーカーがすべての型の転移性疾患において検出されたことが観察され得る（表１０参照）。これは、マーカーを用いて肺癌の全段階における疾患を検出すること、ならびに再発性転移を検出することができることを示唆する。
【００７４】
【表１０】
2004500895.tif 000011
【００７５】
実施例１１
同定されたマーカーのうちの１つまたはそれ以上からのｍＲＮＡを用いた肺癌の存在の診断および解析
患者から血液を単離し、血液試料からのＲＮＡを精製した。以下のマーカーのうちの少なくとも１つを用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実施する：シンデカン１、コラーゲン１α２、７０１３および７０１８。−アクチンのような対照も実施する。あるいは、付加的マーカーであるサイトケラチン−１９も、ＲＴ−ＰＣＲにより試験する。結果をプールし、各マーカーの発現に関して解析する。
【００７６】
実施例１２
同定されたマーカーのうちの１つまたはそれ以上に対する抗体を用いた肺癌の存在の診断および解析
マーカー：シンデカン１、コラーゲン１α２、７０１３および７０１８ならびにサイトケラチン−１９に特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体を購入し、調製し、または患者の血液から単離した。当業者に既知の方法、例えばハイブリドーマ技法、融合タンパク質のウサギへの注射、ヒト化抗体の産生、ライブラリー技法等を用いて、抗体を調製する。さらに、全抗体または機能性部分を用い得る。患者からの血液を単離し、１つまたはそれ以上の同定されたマーカーに対する抗体で細胞を処置する。抗体を蛍光標識するか、あるいは二次抗体を蛍光標識する。ＦＡＣＳ技法を用いて蛍光標識の存在により、これらのマーカーを有する細胞を判別する。異なる蛍光標識抗体を用いて各マーカーを判別し、単一血液試料中の２つ以上のマーカーの判別を可能にする。
【００７７】
実施例１３
血液または骨髄からの癌細胞の単離
シンデカン１、コラーゲン１α２、７０１３および７０１８ならびにサイトケラチン−１８からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーに特異的な抗体で、当該細胞または当該細胞を含む非肺組織を処置することにより、転移性癌細胞を血液または骨髄から単離する。
【００７８】
抗体を、金属粒子、蛍光粒子、クロマトグラフィービーズ、クロマトグラフィーゲルおよび固体支持体からなる群から選択される部分と結合させる。
【００７９】
次に、癌細胞の転移元である部位の特定のために、または癌に特異的な活性化免疫細胞の産生のために、単離細胞を用い得る。あるいは本方法を用いて、血液から細胞を精製し得る。
【００８０】
実施例１４
全長ｃＤＮＡクローンの単離
ｓ−ＡＦＬＰ技法から得たクローンを用いて、全長ｃＤＮＡクローンの検出のためのプライマーを設計する。ヒトｃＤＮＡライブラリーをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｔｏｒｒｅｙ Ｐｉｎｅｓ， ＣＡ）から購入する。７０１３（配列番号１６）または７０１８（配列番号１７）に特異的なプローブを用いて、ライブラリーをスクリーニングする。陽性クローンを得た後、ＰＣＲを用いてクローンを試験し、シーケンシングする。
【００８１】
実施例１５
細胞上皮由来／癌腫の鑑別
マーカー７０１３および７０１８は上皮由来を有する細胞を特異的に判別したため、当該マーカーは、細胞が上皮由来を有するか否か、あるいは癌の場合にはそれが癌腫であるか否かを鑑別するために用いられる。マーカー７０１３および７０１８のみを用いて、ＦＡＣＳ解析のために、実施例１２と同様に細胞を処置する。細胞が一方または両方のマーカーにより蛍光標識される場合、細胞は上皮由来であるか、あるいは癌腫であると確定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
好ましい実施形態で用いられる、修飾ディファレンシャルディスプレイ手法である選択的増幅断片長多型（ｓ−ＡＦＬＰ）を示す。
【図２】
正常血液レーンよりも肺癌ＲＮＡでより豊富であった６つの候補バンドを示すポリアクリルアミドゲルである。Ｈ：健常ヒト、Ｌ：肺癌組織。
【図３】
各候補マーカーならびにサイトケラチン−１９およびβ−アクチンに関する肺細胞のＲＴ−ＰＣＲを示すゲルである。
【図４】
各候補マーカーならびにサイトケラチン−１９およびβ−アクチンに関する肺細胞のＲＴ−ＰＣＲを示すゲルである。
【図５】
血液ＲＮＡからの陽性ＰＣＲおよび陰性ＰＣＲの一例である。
【図６】
シンデカン１に関する配列情報ならびにプローブ配列である。
【図７】
コラーゲン−１Ｐｒｏα２に関する配列情報ならびにプローブ配列である。
【図８】
７０１３遺伝子に関する配列情報ならびにプローブ配列である。
【図９】
７０１８遺伝子に関する配列情報ならびにプローブ配列である。
【図１】
2004500895.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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