(57)【要約】ウイルス感染宿主細胞からの核酸を、検出可能なシグナルをポリメラーゼ連鎖反応中に与える少なくとも２つのプライマーおよび／またはプローブを含有する増幅反応混合物と接触させることを含み、第１プライマーおよび／またはプローブが、ウイルス核酸の転写の際に、検出可能なシグナルを与え、第２プライマーおよび／またはプローブが、宿主核酸の転写の際に、第２の検出可能なシグナルを与えることを特徴とする、ウイルス複製を抑制する化合物の同定方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス感染宿主細胞からの核酸を、検出可能なシグナルをポリメラーゼ連鎖反応中に与える少なくとも２つのプライマーおよび／またはプローブを含有する増幅反応混合物と接触させることを含み、
第１プライマーおよび／またはプローブは、ウイルス核酸の転写の際に、検出可能なシグナルを与え、
第２プライマーおよび／またはプローブは、宿主核酸の転写の際に、第２の検出可能なシグナルを与える、
ウイルス複製を抑制する化合物の同定方法。
【請求項２】
該宿主核酸が核核酸である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該宿主核酸がミトコンドリア核酸である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該ミトコンドリア核酸がミトコンドリアＤＮＡである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該ミトコンドリア核酸がミトコンドリアＲＮＡである、請求項３記載の方法。
【請求項６】
該ウイルス核酸が非コード配列である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
該非コード配列が５’非コード配列である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該非コード配列が３’非コード配列である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
該非コード配列がイントロンである、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
該非コード配列がβ−アクチン由来である、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
該非コード配列がＧＡＰＤＨ由来である、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
該ウイルス核酸がコード配列である、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
該コード配列がＨＩＶ由来である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該コード配列がＨＢＶ由来である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
該コード配列がＨＣＶ由来である、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
該コード配列がＢＶＤＶ由来である、請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
該コード配列がウエストナイルウイルス由来である、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
該コード配列がヘルペス由来である、請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
該コード配列がインフルエンザ由来である、請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
該コード配列がＲＳＶ由来である、請求項１２記載の方法。
【請求項２１】
該コード配列がＥＢＶ由来である、請求項１２記載の方法。
【請求項２２】
該コード配列がＣＭＶ由来である、請求項１２記載の方法。
【請求項２３】
宿主からの核酸を、検出可能なシグナルをポリメラーゼ連鎖反応中に与える少なくとも２つのプライマーおよび／またはプローブを含有する増幅反応混合物と接触させることを含み、
第１プライマーおよび／またはプローブが、宿主ミトコンドリア核酸の転写の際に、検出可能なシグナルを与え、
第２プライマーおよび／またはプローブが、宿主核核酸の転写の際に、第２の検出可能なシグナルを与える、
化合物の毒性の評価方法。
【請求項２４】
該宿主ミトコンドリア核酸がミトコンドリアＤＮＡである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
該宿主ミトコンドリア核酸がミトコンドリアＲＮＡである、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
該宿主ミトコンドリア核酸が非コード配列である、請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
該非コード配列が５’非コード配列である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該非コード配列が３’非コード配列である、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
該非コード配列がイントロンである、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
該非コード配列がβ−アクチン由来である、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
該非コード配列がＧＡＰＤＨ由来である、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
該宿主ミトコンドリア核酸がコード配列である、請求項２３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本出願は、ウイルス感染症およびミトコンドリア毒性の検出および分析のための方法、ならびにウイルス感染症の治療用の活性化合物の同定のための方法、ならびに薬物療法から生じるミトコンドリア毒性を測定するための方法の分野におけるものである。
【０００２】
（発明の背景）
核酸配列の検出および定量は広範な用途に重要である。最も広く用いられている核酸検出方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくものである。ＰＣＲは、公知配列の伸長に隣接するＤＮＡセグメントを増幅するために用いる。これらの公知フランキング（隣接）配列に結合する２つのオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡポリメラーゼにより触媒される一連のインビトロ反応のためのプライマーとして使用する。これらのオリゴヌクレオチドは、典型的には、異なる配列を有し、鋳型ＤＮＡの反対鎖上に存在する配列に相補的であり、増幅されるＤＮＡセグメントに隣接する。鋳型ＤＮＡを、まず、大モル過剰のそれらの２つのオリゴヌクレオチドのそれぞれ及び４種の２’−デオキシヌクレオチド三リン酸の存在下、熱により変性させる。ついで該反応混合物を、オリゴヌクレオチドプライマーがそれらの標的配列にアニールする温度にまで冷却する。その後、アニールしたプライマーをＤＮＡポリメラーゼにより伸長させる。ついで、変性、アニーリングおよびＤＮＡ合成のサイクルを約１０〜５０回繰返す。１サイクルの産物は次のサイクルの鋳型として利用されるため、増幅されるＤＮＡ断片の量は、理論的には、１００％のＰＣＲ効率を与える各サイクルにおいては２倍になる。
【０００３】
「リアルタイムＰＣＲ」は、特定配列の増幅の度合（例えば、増幅標的配列へのプローブのハイブリダイゼーションの度合）に関連したパラメーターを測定するために、増幅過程中に時間経過と共に通常は蛍光によりモニターされるポリメラーゼ連鎖反応を意味する。ＰＣＲにおいて生成したＤＮＡは、ＰＣＲ反応中にサイクルごとに検出される。元のサンプル中に存在する鋳型配列が多ければ多いほど、ＤＮＡ量は速く増加する。十分な増幅産物が生成すると、ＰＣＲ産物が検出される閾値に達する。このように、増幅および検出が同一チューブ中で同時に行われる。
【０００４】
生物学的研究において、ＰＣＲは伝染病の試験の研究を促進している。ＰＣＲの医学的用途には、ヒト組織中のウイルス、細菌および癌性細胞の同定が含まれる。ＰＣＲは、特定の細胞型を同定するために、ｉｎ  ｓｉｔｕ（本来の位置の）ＰＣＲと称される方法において、単細胞中においてさえも使用することができる。ＰＣＲはまた、ＲＮＡの増幅、すなわち、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）と称される方法にも適用することができる。ＲＴ−ＰＣＲは、通常のＰＣＲに類似しているが、この場合は、逆転写酵素と称される酵素を使用してＲＮＡ標的からＤＮＡが合成される初期工程が追加される。リボソームＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡおよびゲノムウイルスＲＮＡを含む多種多様なＲＮＡ分子がＲＴ−ＰＣＲにおいて使用されている。
【０００５】
ＰＣＲ自体は非常に簡便であるが、サンプルの調製に手間がかかることがある。サンプルの調製の目的には、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の遊離、ＰＣＲのための小容積への核酸の濃縮、およびＰＣＲのインヒビターの除去が含まれる。ＰＣＲのインヒビターは、ＰＣＲの効率を減少させる、臨床サンプル中にしばしば存在する天然に存在する物質である。試料が多量の標的核酸を含有する場合には、サンプル調製は取るに足りないことである。しかし、ほとんどの臨床試料においては、特に、大容積の試料を加工しなければならない場合や少しの病原体しか存在しない場合には、サンプル調製は、より困難である。複雑なプロトコールが要求されることが多い。
【０００６】
ＰＣＲは特定の核酸標的の存在または不存在を検出するため、ＰＣＲは、その核酸が特定の試料中に存在する場合に限り、病原体を検出することになる。ＰＣＲは、生きた又は死んだ微生物に由来する核酸を検出する。療法に対する応答をモニターするためにＰＣＲを使用する場合には、このことを認識しなければならない。ＰＣＲは、せいぜい、核酸配列の情報を提供するに過ぎない。ＰＣＲは、薬物耐性突然変異に関してスクリーニングするために使用しうるが、それは、直接的な抗生物質感受性データは提供しない。
【０００７】
ＰＣＲを診断的に使用する場合には、適当な対照が必要である。これには、陰性対照、陽性対照および特異性対照が含まれる。陰性対照（非標的ＤＮＡ）は、汚染（コンタミネーション）を検出するために必要である。汚染はサンプル調製中または試薬混合中に生じうるため、陰性対照は、臨床サンプルと平行して加工しなければならない。サンプルからサンプルへの交差汚染を検出するために、陰性対照は、サンプル間に点在させるべきである。汚染はしばしば断続的であり、低度の汚染を検出するためには十分な数の陰性対照を加えなければならない。公開されているほとんどの研究においては、十分な数の陰性対照が加えられていない。
【０００８】
陽性対照は少数の標的ＤＮＡコピーを含む。陽性対照は、病原体からの標的ＤＮＡの効率的な遊離を保証するために、およびサンプル加工中のＤＮＡの喪失を監視するために、およびインヒビター（ＰＣＲ効率を減少させる、臨床サンプル中に時々存在する天然物）の存在を同定するために必要である。陽性対照は、臨床試料と平行して加工すべきである。臨床試料はＰＣＲのインヒビターの存在下で変化するため、各サンプルについての内部陽性対照を加えることが必要であろう。内部陽性対照は、標的ＤＮＡと同じ認識部位を有するが、内部配列における何らかの相違を伴うように設計されている。内部陽性対照の増幅は、真の標的ＤＮＡの増幅から区別されうる。
【０００９】
特異性対照は、ＰＣＲアッセイにより増幅される標的ＤＮＡの範囲を決定するために必要とされる。臨床サンプル中の病原体を検出するよう設計されたアッセイの場合、ＰＣＲプライマーがヒトＤＮＡを偶然に認識することがないことを保証するために、ヒトＤＮＡサンプルを試験しなければならない。増幅される種／株の範囲を決定するためには、関連病原体を試験しなければならない。新規ＰＣＲアッセイを設計する場合には、特異性対照は１回しか必要とされない。陰性対照および陽性対照は、サンプルを加工するたびに加えることが必要であり、臨床サンプルと同時に加工すべきである。
【００１０】
ＰＣＲは、３つの広い範疇の診断方法、すなわち、検出、特徴づけ及び定量において使用されている。
【００１１】
検出は、試料中の病原体の数が少ない場合には特に、最も困難なＰＣＲ方法である。該ＰＣＲは、高感度の条件下で行わなければならない。多数の温度サイクルを用いるか、またはネスティド・プロトコールを用いて第１反応からの産物を第２組のプライマーで再増幅する。これは、検出用のＰＣＲを、汚染を特に引き継ぎ易いものとする。可能な限り大きな容積の試料を加工することを試みる場合には、サンプル調製は面倒であろう。ＰＣＲのインヒビターは、多数の臨床サンプル中に天然に存在し、大きな制約となる。前記のとおり、多数の陽性および陰性対照を加えなければならない。
【００１２】
特徴づけ方法においては、２つのＰＣＲプライマーの間の核酸配列に基づき核酸変異体を同定する。変異配列を検出するためには、断片長多型、制限部位における変化および直接的ＤＮＡ配列決定を含む多数の技術を用いることができる。これは、しばしば、臨床的に行う最も容易なタイプのＰＣＲである。既に成長している細菌もしくはウイルス培養または多数の微生物を含有する臨床サンプル中のどちらの試料にも、十分な量の核酸標的が存在しうる。薬物耐性突然変異の迅速な検出、臨床的に意味のある系統群への株の帰属、疫学的追跡などが、その目的に含まれうる。
【００１３】
定量（どのくらい多くの標的核酸のコピーが存在するのか示すこと）は、主として、慢性ウイルス感染症、特にＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染症に適用されている。ウイルス血症のレベルは予後的意味を有し、抗ウイルス薬に対する応答を示すために用いられている。ＰＣＲは非常に高感度であるが、本来は定量的ではない。通常、１０または１０，０００コピーを含有する初期サンプルからの最終ＰＣＲ産物の量は類似している。この制約は、標的ＤＮＡが検出されなくなるまで臨床サンプルを系列希釈することにより又は合成競合ＤＮＡ分子を加えることにより克服することができる。該競合分子は、それらの２つのプライマーに相補的な領域を有するが、天然標的とは何らかの点で異なる（例えば、長さが異なる）。天然および競合ＰＣＲ産物の量を比較することにより、サンプル中の標的分子の数のおおよその推定が可能である。
【００１４】
ＰＣＲは、研究場面において何百種もの病原体に適用されており、多数の感染症の病理発生および疫学に対する重要な洞察をもたらしている。臨床目的には、以下の条件が満たされている場合に、ＰＣＲに基づく診断試験が最も良く適用される：（１）試験の結果が、明らかな臨床的相違をなし、ＰＣＲの結果に基づいて治療が行われる又は見合わされる；（２）微生物が増殖不可能である（例えば、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、ＨＣＶ）、または微生物の増殖が遅い（例えば、エム・ツベルクローシス（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））、または培養が困難である（例えば、ブルセラ属菌種、ＨＩＶ）ため、通常の培養方法が制限されている；および（３）多数の微生物を含有する利用可能な臨床試料（例えば、ＨＣＶまたはＨＩＶに関する血液）が存在する。
【００１５】
ＰＣＲは、種々の慢性ウイルス感染症（ＨＩＶ、ＨＣＶ、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒトパピローマウイルスおよびサイトメガロウイルス）において有用である。ＰＣＲは、新生児におけるＨＩＶ感染の検出に非常に重要である。なぜなら、母親由来抗体が血清学的診断を複雑にするからである。ＰＣＲによるＨＩＶおよびＨＣＶウイルス血症の定量は、重要な予後的意味を有し、薬物療法に対する応答をモニターするために用いられている。ＰＣＲは、易感染者における肺感染症（特に、サイトメガロウイルスおよびニューモシスチス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ））の迅速な診断に有用である。
【００１６】
ＨＩＶ
ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は、レンチウイルスのファミリーに属するレトロウイルスである。このウイルス群の特徴的性質の１つは、そのメンバーがウイルスコード化逆転写酵素（ＲＴ）酵素活性によりＤＮＡ中間体を介して複製される点である。その高い複製率は、その逆転写酵素の低い忠実度と一緒になって、非常に高いゲノム柔軟性を有するウイルスを与える。その結果、ＨＩＶ−１では種々のレベルの遺伝的可変性が認められる。その流行性は、Ｍ群ウイルス内のクレードの存在により特徴づけられるが、Ｏ群およびＮ群ウイルスも記載されており、それらの各々もまた、種々のクレードを含む。感染個体内には偽似種（クエイザイスペーシス）集団も認められる。臨床的には、例えばワクチン開発および免疫回避（ｉｍｍｕｎｅ  ｅｓｃａｐｅ）において、この偽似種の概念による幾つかの重要な結果が認められる。この概念は、抗ウイルス療法のもとで表面化する薬物耐性変異体の出現の一因となる。
【００１７】
感染個体における疾患の経過を抑制するために、強力な高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）が設計されている。該ウイルスの進行中の複製のため、抗レトロウイルス薬物耐性が最終的に現れ、治療の失敗につながる。したがって、益々強力な抗ＨＩＶ−１薬が尚も要求されている。
【００１８】
インビボでの患者の治療における薬物の効力を評価するためには、ウイルス複製の臨床マーカーを定義する必要がある。これまでのところ、ＣＤ細胞数のような幾つかの代替マーカーが使用されている。最近になって、Ｑｕａｎｔｉｐｌｅｘ（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓｅ（Ｏｒｇａｎｏｎ−Ｔｅｋｎｉｋａ）およびＡｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＩＶ−１  Ｍｏｎｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ）のような、ウイルス負荷を直接測定するための幾つかの市販のアッセイが開発された。これらのウイルス負荷測定は、ＨＡＡＲＴに関する及び新規実験薬での臨床試験に関する治療効力をモニターする際の優れた手段であることが判明している。
【００１９】
ＨＩＶ−１ウイルス負荷試験の設計は真の挑戦である。理想的には、ウイルス負荷試験は以下の基準を満たすべきである：
ｉ）１つの群内のクレードの莫大な可変性を、同じ効率で検出しうること；
ｉｉ）少なくとも５ｌｏｇ以上のダイナミックレンジを有すること；および
ｉｉｉ）検出下限は、わずか数ウイルスコピー／ｍＬであるべきであること。ＰＣＲプライマー結合部位における可変性は、アッセイ開発において真に懸念されることであるが、ＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイが最も高感度な技術と考えられる。
【００２０】
ミトコンドリア毒性
ミトコンドリア毒性は、抗ウイルス剤（特に逆転写酵素インヒビター）の長期使用の副作用であると明らかに認識されている。このミトコンドリア毒性の臨床的特徴は、罹患組織に応じて様々である。それは、その特定の組織に要求されるエネルギー供給に必要な好気的代謝に著しく左右される。最も毒性である事象は初期段階では可逆的であるが、乳酸アシドーシスはしばしば不可逆的であり、死を招きうる。
【００２１】
抗ウイルス剤により誘発される毒性の共通経路はミトコンドリア機能不全である。抗ウイルス剤（十中八九はヌクレオシド類似体の三リン酸形態）は、ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼγを阻害して、ミトコンドリアの喪失を招く。この酵素はミトコンドリアゲノムの複製に必須である。高いＡＴＰ要求性を有する組織がミトコンドリア毒性に最も感受性である。
【００２２】
このミトコンドリア機能不全を引き起こすメカニズムは、エネルギー依存性イオン平衡の不全を含む。ついで、細胞内カルシウムの増加が生じ、脂肪分解およびタンパク質分解が開始し、乳酸の蓄積が生じ、呼吸活動の部分的減弱が生じる。
【００２３】
ミトコンドリア機能不全は何ヶ月にもわたり進展し、症状は最初は軽度であるため、選択した抗ウイルス剤による阻害および酵素活性の測定を可能にする高感度診断試験を開発することが重要である。同様に重要なのは、新規候補の抗ウイルス剤は、その好ましくないＤＮＡポリメラーゼγ阻害能に関して評価される必要があることである。
【００２４】
Ｃ型肝炎
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は汎流行性感染であり、肝疾患の主要原因である。インターフェロンでのＨＣＶ感染の治療の成功の報告は、ＲＴ−ＰＣＲの適用に対する関心を増大させている。
【００２５】
ＨＣＶ感染のための利用可能な試験は限られたものである。ＨＣＶに関する初期血清学的試験は低感度である。第２世代および第３世代の血清学的試験は感度を向上させているが、依然として、完全に信頼できるというわけではない。ＨＣＶ  ＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲを使用して血清中で容易に検出される。ウイルス血症の患者は、典型的には、非常に高いウイルス力価を有する。
【００２６】
ＰＣＲは、種々の臨床場面においてＨＣＶ感染の診断に適用されている。ＨＣＶは、早くも感染の１週間後に検出することが可能であり、感染と血清変換との間の「ウィンドウ」期間中にＨＣＶ感染を検出するためにＰＣＲを使用することができる。ＨＣＶ  ＰＣＲは、肝疾患を有する血清陰性個体においてＨＣＶを検出するのに有用である。母体から胎児へのＨＣＶの広がりを確認するために、それを使用することが可能である。ＨＣＶ  ＰＣＲは、インターフェロンまたは他の療法に対する候補体として血清陽性個体を評価する際に有用でありうる。ＨＣＶ血清陽性患者の一部はＨＣＶ  ＰＣＲでは陰性であり、それらの感染から回復している可能性がある。ＰＣＲ陰性個体は、より低い血清トランスアミナーゼ濃度を有し、肝生検上で、より低い組織学的活性を有する。長期にわたる追跡研究が必要ではあるが、陰性ＨＣＶ  ＰＣＲの結果を有する患者の療法は見合わせるのが妥当かもしれない。
【００２７】
ＨＣＶウイルス血症の量は定量的ＰＣＲにより測定することができる。ＰＣＲは高感度であり、広範囲のウイルス力価にわたり定量的である。高力価ウイルス血症は、進行した病期と相関する。ＨＣＶ定量の予後的評価には前向き研究が待たれるが、ウイルス血症のレベルは、治療のための候補を選択する際に有用でありうる。定量的ＨＣＶ  ＰＣＲはまた、治療に対する応答をモニターするのにも有用であるらしい。
【００２８】
Ｂａｖａｒｉａｎ  Ｎｏｒｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａ／Ｓにより出願されたＷＯ  ００／４４９３６は、プローブ結合部位において相違する核酸配列の変異体の検出および定量のためのリアルタイムＰＣＲ法を記載している。該方法は、該変異体の同じ領域の完全または部分的な増幅、および同じＰＣＲ混合物への２以上のオリゴヌクレオチドプローブ（各プローブは、少なくとも１つの変異体のプローブ結合部位に特異的である）の添加に基づく。
【００２９】
Ｅ．Ｉ．ＤｕＰｏｎｔ  Ｎｅｍｏｕｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙにより出願されたＷＯ  ０１／６６７９９は、融解特性が予め定められた標的の蛍光を選択時点において各増幅サイクル中にモニターする、ＰＣＲに基づくｄｓＤＮＡ定量法を開示している。特徴的な融解曲線特性を有する標的を選択することにより、複数の標的を同時に検出することができる。
【００３０】
Ｎａｔｉｏｎａｌｅｓ  Ｚｅｎｔｒｕｍ  ｆｕｒ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｅｎにより出願されたＷＯ  ００／６８４３６は、ヒト免疫不全ウイルスの検出および定量を可能にする配列を開示している。
【００３１】
Ｒｏｃｋｅｆｅｌｌｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに譲渡された米国特許第６，２３５，５０４号は、生物のためのゲノム等価マーカーとして有用な遺伝的配列の同定方法を記載している。
【００３２】
米国特許第６，２１０，８７５号は、ＨＩＶ感染宿主における抗ウイルス療法の効力の測定方法を開示している。この方法は、同時に、ＨＩＶ  ｍＲＮＡの少なくとも一部に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブ（該オリゴヌクレオチドプローブは蛍光標識で比較されている）に被験者の単球をさらし、該単球を抗体にさらし、検出されたＨＩＶレベルを比較し、時間経過と共にＨＩＶレベルを該治療計画と相関させることにより、複数の時点における被験者の単球中の転写的に活性なＨＩＶのレベルを検出することを含む。
【００３３】
米国特許第５，８４３，６４０号は、同一細胞中の特異的な所定の配列および特異的な所定の細胞性抗原を同時に検出するｉｎ  ｓｉｔｕ法を開示している。
【００３４】
リアルタイムＰＣＲ法を含むＰＣＲを記載している文献には以下のものが含まれる。
【００３５】
【表１】
2004533805.tif 000002
2004533805.tif 000003
2004533805.tif 000004
2004533805.tif 000005
2004533805.tif 000006
【００３６】
ウイルス感染の診断および評価のためのアッセイは存在するが、より高感度または高精度な疾患細胞の状態の分析をもたらす更なるアッセイおよびキットが必要とされている。標的ウイルスに対する化合物または物質の活性を評価するための及び該化合物または物質により誘発される宿主毒性を評価するための、より高感度かつ高精度な方法も必要とされている。
【００３７】
したがって、ウイルス感染の治療のための活性化合物の同定方法を提供することが、本発明の１つの目的である。
【００３８】
ミトコンドリア毒性の測定方法を提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【００３９】
ウイルス感染の検出および分析のための方法を提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【００４０】
ミトコンドリア毒性の検出および分析のための方法を提供することが、本発明のもう１つの目的である。
【００４１】
（発明の概要）
リアルタイムＰＣＲに基づく疾患細胞中の核酸の同時定量のための方法を提供する。このリアルタイムＰＣＲプロトコールは、可能性ある抗ウイルス剤の効力を測定するための評価プロトコールおよびインビトロ薬物スクリーニングの信頼しうる定量のための優れた手段である。１工程のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）中にこれらの同時ＰＣＲサイクル閾値（Ｃｔ）検出技術を用いる定量は、最終ＲＴ−ＰＣＲ産物の定量から生じるばらつきを排除する。また、ミトコンドリア毒性アッセイは、これらの化学療法剤の潜在的副作用を評価するための追加的手段である。
【００４２】
このリアルタイム多重（マルチプレックス）ＰＣＲ系は、細胞ＤＮＡ（例えば、ｒＤＮＡ）または細胞ＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡまたはβ−アクチン  ｍ−ＲＮＡ）、およびウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの同時測定を含む。１つの実施形態においては、宿主およびウイルス核酸の同時リアルタイム分析は、該宿主細胞および該ウイルスの比較状態を示す高感度アッセイの算定を可能にする。本発明の別の態様においては、多重ＰＣＲを用いて、細胞の核核酸およびミトコンドリア核酸を同時に測定して、薬物毒性に関する情報を得たり、あるいはミトコンドリア毒性が関わる疾患（例えば、末梢性ニューロパシー、末梢性リポジストロフィー、またはミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡ合成の破綻を引き起こす遺伝病）を示しうる細胞を（インビボまたはインビトロで）評価する。
【００４３】
この方法は経済的であり、非放射性であり、迅速であり、高精度であり、再現性があり、ハイスループットに適している。それは、５〜７ｌｏｇを超える線形性を有する定量のダイナミックレンジをもたらしうる。化合物の抗ウイルス有効性を表すための１つの方法は、この試験化合物の閾値ＲＴ−ＰＣＲサイクルを陰性対照の平均閾値ＲＴ−ＰＣＲサイクルで差し引くことである。この値はデルタＣｔ（ΔＣｔ）と称される。３．３のΔＣｔｈは、ウイルス核酸産生における１−ｌｏｇの減少（ＥＣ９０に等しい）に等しい。１．５Ｃｔ値より大きな、より好ましくは、２Ｃｔ値（ウイルス核酸の７５％の減少）より大きなウイルス核酸の減少を引き起こす化合物が、典型的には、ウイルス増殖の抑制に有用な化合物である。
【００４４】
ウイルスΔＣｔデータおよび宿主ΔＣｔの両方が入手可能であれば、特異性パラメーターを導くことができる。このパラメーターは、宿主ΔＣｔ値をウイルスΔＣｔ値から差し引くことにより得られる。これはΔΔＣｔ値を与え、０を超える値は、ウイルス核酸に対して、より抑制性の効果が存在することを意味し、０未満のΔΔＣｔ値は、宿主核酸が、より影響されることを意味する。一般則としては、２を超えるΔΔＣｔ値は、非薬物処理対照と有意に異なるとみなされ、したがって、有用な抗ウイルス活性を示す。しかし、２未満のΔΔＣｔ値を有するが限られた分子細胞毒性データ（０〜２のｒＲＮＡ  ΔＣＴ）しか示さない化合物も、低毒性の化合物を要する或る用途に望ましいであろう。
【００４５】
例えば、ある化合物は、宿主ＲＮＡポリメラーゼ活性を減少させうるが、宿主ＤＮＡポリメラーゼ活性を減少させ得ないであろう。したがって、ｒＤＮＡまたはβ−アクチンＤＮＡ（または他の任意の宿主ＤＮＡ断片）の定量、および非薬物対照のＤＮＡレベルとの比較は、細胞性ＤＮＡポリメラーゼに対する試験化合物の抑制効果の相対的測定である。ＨＣＶ  ΔＣｔデータおよびｒＤＮＡ  ΔＣｔの両方が入手可能であれば、特異性パラメーターを導くことができる。このパラメーターは、両方のΔＣｔ値をお互いから差し引くことにより得られる。これはΔΔＣｔ値を与え、０を超える値は、ウイルスコード化ポリメラーゼに対して、より抑制性の効果が存在することを意味し、０未満のΔΔＣｔ値は、宿主ｒＤＮＡレベルがウイルス核酸レベルより影響されることを意味する。一般則としては、２を超えるΔΔＣｔ値は、非薬物処理対照と有意に異なるとみなされ、したがって、そのような化合物は更なる評価のために関心が持たれる。しかし、２未満のΔΔＣｔ値を有するが限られた分子細胞毒性データ（０〜２のｒＤＮＡ  ΔＣＴ）しか示さない化合物も、更なる評価のための見込みのある活性候補化合物である。
【００４６】
第１の実施形態においては、ウイルス感染宿主細胞からの核酸を、検出可能なシグナルをポリメラーゼ連鎖反応中に与える少なくとも２つのプライマーおよび／またはプローブを含有する増幅反応混合物と接触させることを含み、
第１プライマーおよび／またはプローブは、宿主核酸の転写の際に、検出可能なシグナルを与え、
第２プライマーおよび／またはプローブは、ウイルス核酸の転写の際に、第２の検出可能なシグナルを与える、ウイルス疾患の評価方法を提供する。
【００４７】
特定の実施形態においては、ウイルスおよび宿主核酸の転写のレベルを、既知ウイルス感染宿主細胞を含む（これに限定されるものではない）標準と比較する。あるいは、感染における変化をモニターし測定するために、該宿主からの多数のサンプルにわたり宿主およびウイルス核酸の転写の度合を比較することにより内部標準を確立することができる。もう１つの実施形態においては、ΔＣＴおよびΔΔＣｔ値を用いて前記のとおりにデータを評価することができる。
【００４８】
好ましい実施形態においては、該核酸はコンセンサスまたは非コード配列であり、これは、標的発現配列の５’または３’側でありうる。１つの実施形態においては、この非コード配列はイントロンまたはその一部である。非限定的な具体例としては、β−アクチンまたはＧＡＰＤＨ由来の非コード配列が挙げられる。
【００４９】
この宿主核酸は、核または細胞質のもの、特にミトコンドリア核酸であり得、このウイルス核酸はＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。
【００５０】
この方法は、レトロウイルス科、フラビウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、ピコルナウイルス科、レオウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、パポーバウイルス科、パルボウイルス科、ブニヤウイルス科、フィロウイルス科、アレナウイルス科またはトガウイルス科からのウイルスを含むいずれかのウイルス（これらに限定されるものではない）の複製をこの化合物または物質が抑制する能力を評価するために用いることができる。特に、このウイルスは、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＧ型肝炎ウイルスを含むが、これらに限定されるものではない）、ＢＶＤＶ（ウシ下痢症ウイルス）、単純ヘルペスウイルス、１型アデノウイルス、インフルエンザウイルス、例えばインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＢ、インフルエンザＣおよびインフルエンザＤウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス３型、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）またはウイエストナイルウイルスである。
【００５１】
第２の実施形態においては、宿主からの核酸を、検出可能なシグナルをポリメラーゼ連鎖反応中に与える少なくとも２つのプライマーおよび／またはプローブを含有する増幅反応混合物と接触させることを含み、
第１プライマーおよび／またはプローブは、宿主ミトコンドリア核酸の転写の際に、検出可能なシグナルを与え、
第２プライマーおよび／またはプローブは、宿主核核酸の転写の際に、第２の検出可能なシグナルを与える、ミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡ合成の破綻を含む病態の評価方法を提供する。
【００５２】
第３の実施形態においては、（ｉ）該化合物で処理されたウイルス感染宿主からの核酸を、（ｉｉ）検出可能なシグナルをポリメラーゼ連鎖反応中に与える少なくとも２つのプライマーおよび／またはプローブを含有する増幅反応混合物と接触させることを含み、
第１プライマーおよび／またはプローブは、ウイルス核酸の転写の際に、検出可能なシグナルを与え、
第２プライマーおよび／またはプローブは、宿主核酸の転写の際に、第２の検出可能なシグナルを与える、ウイルス複製を抑制する化合物または物質の同定方法を提供する。
【００５３】
第４の実施形態においては、化合物で処理された宿主からの核酸を、検出可能なシグナルをポリメラーゼ連鎖反応中に与える少なくとも２つのプライマーおよび／またはプローブを含有する増幅反応混合物と接触させることを含み、
第１プライマーおよび／またはプローブは、宿主ミトコンドリア核酸の転写の際に、検出可能なシグナルを与え、
第２プライマーおよび／またはプローブは、宿主核核酸の転写の際に、第２の検出可能なシグナルを与える、化合物のミトコンドリア毒性の評価方法を提供する。
【００５４】
第５の実施形態においては、化合物で処理された宿主細胞からの核酸を、検出可能なシグナルをポリメラーゼ連鎖反応中に与える少なくとも２つのプライマーおよび／またはプローブを含有する増幅反応混合物と接触させることを含み、
第１プライマーおよび／またはプローブは、宿主ミトコンドリア核酸の転写の際に、検出可能なシグナルを与え、
第２プライマーおよび／またはプローブは、宿主核核酸の転写の際に、第２の検出可能なシグナルを与える、化合物が末梢性ニューロパシーまたは末梢性リポジストロフィーを誘発する傾向の評価方法を提供する。
【００５５】
これらの方法は、ＰＣＲプライマー／プローブセットの特有の組合せを設計するために、ウイルスおよび宿主のゲノム中の保存された領域を最適に利用する。１つの実施形態においては、このプローブは、エキソヌクレアーゼ分解の際に、標的核酸を示すシグナルがリアルタイムで検出されうるよう、検出可能なシグナルを含有する。この技術は高感度かつ高精度であることが判明している。また、１工程リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）中にＰＣＲサイクル閾値（Ｃｔ）検出を用いる定量は、最終ＲＴ−ＰＣＲ産物の定量から生じるばらつきを排除している。
【００５６】
本発明の特定の実施形態においては、同時リアルタイムＰＣＲの方法は、
ａ）サンプル中の標的核酸配列の少なくとも一部を、
ｉ）適当な増幅反応混合物、
ｉｉ）該標的核酸配列が増幅されると、それぞれの独立して標識されたプローブが特有の検出可能なシグナルを放出するよう、該標的核酸配列にハイブリダイズする２以上の独立して標識されたオリゴヌクレオチドまたはプローブ、
ｉｉｉ）標的ウイルス核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの独立して標識されたオリゴヌクレオチドまたはプローブ、および
ｉｖ）標的宿主核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの独立して標識されたオリゴヌクレオチドまたはプローブ
と接触させ、
ｂ）該増幅混合物に関して増幅方法を行い、
ｃ）該特有シグナルの放出をリアルタイムで検出する工程を含む。
【００５７】
該アンプリコンの存在は、もちろん、該標的核酸が該サンプル中に存在することを示し、該サンプル中の標的ＲＮＡまたはＤＮＡは、シグナル強度に基づき定量することができる。
【００５８】
本発明はまた、ミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡに対する核（または内因性対照）ＤＮＡまたはＲＮＡの比率を測定することによる、リアルタイムＰＣＲを用いる、候補化学療法化合物のミトコンドリア毒性の高感度かつ高精度の測定のための新規方法に適用されうる。好ましい実施形態においては、この毒性スクリーニングアッセイは、潜在的抗ウイルス剤（特に抗ＨＩＶ、特に抗ＨＩＶ−１剤）および抗肝炎ウイルス（特にＨＢＶおよびＨＣＶ）剤の毒性を測定するために用いる。
【００５９】
ミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡの全量を定量するためには、そのようなミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡの量を標準化するよう内因性対照の増幅を行う必要がある。この内因性対照は、核ＤＮＡまたはＲＮＡの全量を表し各実験サンプル中に存在するＲＮＡまたはＤＮＡである。この内因性対照を活性参照体として使用することにより、ミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡの量を、各反応に加えた全ＤＮＡまたはＲＮＡの量における相違に関して正規化することができる。内因性対照のいくつかの非限定的な具体例としては、任意のヒト遺伝子、特に、β−アクチン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼまたはリボソームＲＮＡが挙げられる。
【００６０】
この方法は、
ａ）サンプル中の核核酸配列の少なくとも一部を、
ｉ）増幅反応混合物、
ｉｉ）該標的核酸配列が増幅されると、それぞれの独立して標識されたプローブが特有の検出可能なシグナルを放出するよう、該標的核酸配列にハイブリダイズする２以上の独立して標識されたオリゴヌクレオチドまたはプローブ、
ｉｉｉ）標的核核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの独立して標識されたオリゴヌクレオチドまたはプローブ、および
ｉｖ）標的ミトコンドリア核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの独立して標識されたオリゴヌクレオチドまたはプローブ
と接触させ、
ｂ）該増幅混合物に関して増幅方法を行い、
ｃ）該シグナルの放出をリアルタイムで検出する工程を含む。
【００６１】
核アンプリコンの量は、シグナル強度の相違に基づきミトコンドリアアンプリコンの量と比較することが可能であり、したがって、それはミトコンドリア毒性のレベルを示す。
【００６２】
（図面の簡単な説明）
図１は、ＨＩＶ−１（１ａ）、ＨＣＶ（１ｂ）、ＢＶＤＶ（１ｃ）、ミトコンドリアＤＮＡ（１ｄ）および分子毒性（１ｅ）ＲＴ−ＰＣＲに関する標準曲線の較正を示する。弱毒化臨床サンプルをＤＭＥＭ−Ｆ１２／１０％  ＦＢＳ中で希釈した。Ｃｔ値は、標的の１工程ＲＴ−ＰＣＲ検出が陽性になる閾値サイクルを示す。Ｌｏｇ  ｃｐ／ｍＬ値は、サンプル１ｍＬ当たりの標的コピーの量の対数である。◆線はＲｏｃｈｅ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＩＶ−１  Ｍｏｎｉｔｏｒを示し、■線はリアルタイムＨＩＶ−１  ＲＴ−ＰＣＲを示す。
【００６３】
図２は、ＨＩＶ−１のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲとＮＡＳＢＡ  ＨＩＶ−１技術との相関を示すグラフである。ＨＩＶ−１感染サンプルはＳＣＩＤマウス実験から採取した。９９％信頼区間が破線で示されている。
【００６４】
図３は、培養上清中のＲＴ活性およびウイルス負荷に対する抗ウイルス化合物の効果を例示する。◆線は通常のＲＴアッセイからのデータを示し、■線は、ＨＩＶ−１  ＲＴ−ＰＣＲを使用して得たデータを示す。
【００６５】
図４は、ＲＴ−ＰＣＲ標準曲線および相対効率プロットの非限定的な例を示す。この特定の具体例においては、β−アクチンＤＮＡおよびミトコンドリアＤＮＡの量をリアルタイムで測定して、以下のプロットを得た。１）◆線はβ−アクチン標準曲線である。２）■線はミトコンドリアＤＮＡ標準曲線である；および３）黒三角線はΔＣｔプロット（Ｃｔ  β−アクチン−Ｃｔミトコンドリア）である。
【００６６】
図５は、ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼγに対する抗ウイルス化合物の効果を例示する。２−ΔΔＣＴは、較正（薬物無し）および正規化（β−アクチン）の後のミトコンドリアＤＮＡの相違を表すために使用する計算式である。濃度はμＭ単位である。
【００６７】
図６は、リアルタイムＰＣＲによるウイルス核酸の定量的検出を例示する。ＰＣＲの伸長期に発蛍光性プローブが表示される。該標的配列が存在する場合には、該プローブは、該プライマー部位の１つの下流にアニールし、このプライマーが伸長するにつれてＴａｑポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性により切断される。該プローブのこの切断は消光（クエンチャー）色素からレポーター色素を分離し、レポーター色素シグナルを増強する。切断は該プローブを該標的鎖から除去して、プライマー伸長を該鋳型鎖の末端まで継続させる。したがって、該プローブの含有は全体的なＰＣＲ過程を抑制しない。追加的なレポーター色素分子は各サイクルでそれらのそれぞれのプローブから切断され、アンプリコンの生成量に比例する蛍光強度の増加を引き起こす。
【００６８】
図７は、Ｃ型肝炎ウイルスレプリコンと比較してＨＣＶゲノムの体制を例示し、非翻訳領域（ＮＴＲ）およびポリタンパク質中の切断部位の位置を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、内部リボソーム侵入シグナル（ＩＲＥＳ）として機能するＮＴＲに５’末端で隣接し、ゲノム複製に必須の高度に保存された配列に３’末端で隣接する。
【００６９】
図８は、Ｈｕｈ７／ＨＣＶレプリコン細胞内の７日間のインキュベーション期間にわたる細胞およびウイルス核酸の量の変化のグラフである。
【００７０】
図９は、Ｈｕｈ７  ＨＣＶレプリコン系におけるＨＣＶ  ＲＮＡレベルに対する試験化合物の効果の棒グラフである。
【００７１】
図１０は、種々の薬物と共に７日間インキュベートした後の、それぞれ、ミトコンドリアＲＮＡの量に関するＨｕｈ７細胞内の核酸レベルの変化、およびミトコンドリアＤＮＡにおける変化を示す２種類の棒グラフを含む。
【００７２】
（発明の詳細な記載）
リアルタイムＰＣＲに基づく疾患細胞中の核酸の同時定量のための方法を提供する。該リアルタイムＰＣＲプロトコールは、潜在的抗ウイルス剤の効力を測定するための評価プロトコールおよびインビトロ薬物スクリーニングの信頼しうる定量のための優れた手段である。１工程のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）中にこれらの同時ＰＣＲサイクル閾値（Ｃｔ）検出技術を用いる定量は、最終ＲＴ−ＰＣＲ産物の定量から生じるばらつきを排除する。また、ミトコンドリア毒性アッセイは、これらの化学療法剤の潜在的副作用を評価するための追加的手段である。
【００７３】
このリアルタイム多重（マルチプレックス）ＰＣＲ系は、細胞ＤＮＡ（例えば、ｒＤＮＡ）または細胞ＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡまたはβ−アクチン  ｍ−ＲＮＡ）、およびウイルスＲＮＡまたはＤＮＡの同時測定を含む。１つの実施形態においては、宿主およびウイルス核酸の同時リアルタイム分析は、該宿主細胞および該ウイルスの比較状態を示す高感度アッセイの算定を可能にする。本発明の別の態様においては、多重ＰＣＲを用いて、細胞の核核酸およびミトコンドリア核酸を同時に測定して、薬物毒性に関する情報を得たり、あるいはミトコンドリア毒性が関わる疾患（例えば、末梢性ニューロパシー、末梢性リポジストロフィー、またはミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡ合成の破綻を引き起こす遺伝病）を示しうる細胞を（インビボまたはインビトロで）評価する。
【００７４】
該方法は経済的であり、非放射性であり、迅速であり、高精度であり、再現性があり、ハイスループットに適している。それは、５〜７ｌｏｇを超える線形性を有する定量のダイナミックレンジをもたらしうる。化合物の抗ウイルス有効性を表すための１つの方法は、該試験化合物の閾値ＲＴ−ＰＣＲサイクルを陰性対照の平均閾値ＲＴ−ＰＣＲサイクルで差し引くことである。この値はデルタＣｔ（ΔＣｔ）と称される。３．３のΔＣｔｈは、ウイルス核酸産生における１−ｌｏｇの減少（ＥＣ９０に等しい）に等しい。１．５Ｃｔ値より大きな、より好ましくは、２Ｃｔ値（ウイルス核酸の７５％の減少）より大きなウイルス核酸の減少を引き起こす化合物が、典型的には、ウイルス増殖の抑制に有用な化合物である。
【００７５】
ウイルスΔＣｔデータおよび宿主ΔＣｔの両方が入手可能であれば、特異性パラメーターを導くことができる。このパラメーターは、宿主ΔＣｔ値をウイルスΔＣｔ値から差し引くことにより得られる。これはΔΔＣｔ値を与え、０を超える値は、ウイルス核酸に対して、より抑制性の効果が存在することを意味し、０未満のΔΔＣｔ値は、宿主核酸が、より影響されることを意味する。一般則としては、２を超えるΔΔＣｔ値は、非薬物処理対照と有意に異なるとみなされ、したがって、有用な抗ウイルス活性を示す。しかし、２未満のΔΔＣｔ値を有するが限られた分子細胞毒性データ（０〜２のｒＲＮＡ  ΔＣＴ）しか示さない化合物も、低毒性の化合物を要する或る用途に望ましいかもしれない。
【００７６】
例えば、ある化合物は、宿主ＲＮＡポリメラーゼ活性を減少させうるが、宿主ＤＮＡポリメラーゼ活性を減少させ得ないであろう。したがって、ｒＤＮＡまたはβ−アクチンＤＮＡ（または他の任意の宿主ＤＮＡ断片）の定量、および非薬物対照のＤＮＡレベルとの比較は、細胞性ＤＮＡポリメラーゼに対する該試験化合物の抑制効果の相対的測定である。ＨＣＶ  ΔＣｔデータおよびｒＤＮＡ  ΔＣｔの両方が入手可能であれば、特異性パラメーターを導くことができる。このパラメーターは、両方のΔＣｔ値をお互いから差し引くことにより得られる。これはΔΔＣｔ値を与え、０を超える値は、ウイルスコード化ポリメラーゼに対して、より抑制性の効果が存在することを意味し、０未満のΔΔＣｔ値は、宿主ｒＤＮＡレベルがウイルス核酸レベルより影響されることを意味する。一般則としては、２を超えるΔΔＣｔ値は、非薬物処理対照と有意に異なるとみなされ、したがって、そのような化合物は更なる評価のために関心が持たれる。しかし、２未満のΔΔＣｔ値を有するが限られた分子細胞毒性データ（０〜２のｒＤＮＡ  ΔＣＴ）しか示さない化合物も、更なる評価のための見込みのある活性候補化合物である。
【００７７】
第１の実施形態においては、ウイルス感染宿主細胞からの核酸を、検出可能なシグナルをポリメラーゼ連鎖反応中に与える少なくとも２つのプライマーおよび／またはプローブを含有する増幅反応混合物と接触させることを含み、
第１プライマーおよび／またはプローブが、宿主核酸の転写の際に、検出可能なシグナルを与え、
第２プライマーおよび／またはプローブが、ウイルス核酸の転写の際に、第２の検出可能なシグナルを与える、ウイルス疾患の評価方法を提供する。
【００７８】
特定の実施形態においては、ウイルスおよび宿主核酸の転写のレベルを、既知ウイルス感染宿主細胞を含む（これに限定されるものではない）標準と比較する。あるいは、感染における変化をモニターし測定するために、該宿主からの多数のサンプルにわたり宿主およびウイルス核酸の転写の度合を比較することにより内部標準を確立することができる。もう１つの実施形態においては、ΔＣＴおよびΔΔＣｔ値を用いて前記のとおりに該データを評価することができる。
【００７９】
好ましい実施形態においては、該核酸はコンセンサスまたは非コード配列であり、それは、標的発現配列の５’または３’側でありうる。１つの実施形態においては、該非コード配列はイントロンまたはその一部である。非限定的な具体例としては、β−アクチンまたはＧＡＰＤＨ由来の非コード配列が挙げられる。
【００８０】
該宿主核酸は、核または細胞質のもの、特にミトコンドリア核酸であることが可能であり、該ウイルス核酸はＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。
【００８１】
この方法は、レトロウイルス科、フラビウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、ピコルナウイルス科、レオウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、パポーバウイルス科、パルボウイルス科、ブニヤウイルス科、フィロウイルス科、アレナウイルス科またはトガウイルス科からのウイルスを含むいずれかのウイルス（これらに限定されるものではない）の複製を該化合物または物質が抑制する能力を評価するために用いることができる。特に、該ウイルスは、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＧ型肝炎ウイルスを含むが、これらに限定されるものではない）、ＢＶＤＶ（ウシ下痢症ウイルス）、単純ヘルペスウイルス、１型アデノウイルス、インフルエンザウイルス、例えばインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＢ、インフルエンザＣおよびインフルエンザＤウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス３型、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）またはウイエストナイルウイルスである。
【００８２】
第２の実施形態においては、宿主からの核酸を、検出可能なシグナルをポリメラーゼ連鎖反応中に与える少なくとも２つのプライマーおよび／またはプローブを含有する増幅反応混合物と接触させることを含み、
第１プライマーおよび／またはプローブが、宿主ミトコンドリア核酸の転写の際に、検出可能なシグナルを与え、
第２プライマーおよび／またはプローブが、宿主核核酸の転写の際に、第２の検出可能なシグナルを与える、ミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡ合成の破綻を含む病態の評価方法を提供する。
【００８３】
第３の実施形態においては、（ｉ）化合物で処理されたウイルス感染宿主からの核酸を、（ｉｉ）検出可能なシグナルをポリメラーゼ連鎖反応中に与える少なくとも２つのプライマーおよび／またはプローブを含有する増幅反応混合物と接触させることを含み、
第１プライマーおよび／またはプローブが、ウイルス核酸の転写の際に、検出可能なシグナルを与え、
第２プライマーおよび／またはプローブが、宿主核酸の転写の際に、第２の検出可能なシグナルを与える、ウイルス複製を抑制する化合物または物質の同定方法を提供する。
【００８４】
第４の実施形態においては、該化合物で処理された宿主からの核酸を、検出可能なシグナルをポリメラーゼ連鎖反応中に与える少なくとも２つのプライマーおよび／またはプローブを含有する増幅反応混合物と接触させることを含み、
第１プライマーおよび／またはプローブが、宿主ミトコンドリア核酸の転写の際に、検出可能なシグナルを与え、
第２プライマーおよび／またはプローブが、宿主核核酸の転写の際に、第２の検出可能なシグナルを与える、化合物のミトコンドリア毒性の評価方法を提供する。
【００８５】
第５の実施形態においては、化合物で処理された宿主細胞からの核酸を、検出可能なシグナルをポリメラーゼ連鎖反応中に与える少なくとも２つのプライマーおよび／またはプローブを含有する増幅反応混合物と接触させることを含み、
第１プライマーおよび／またはプローブが、宿主ミトコンドリア核酸の転写の際に、検出可能なシグナルを与え、
第２プライマーおよび／またはプローブが、宿主核核酸の転写の際に、第２の検出可能なシグナルを与える、化合物が末梢性ニューロパシーまたは末梢性リポジストロフィーを誘発する傾向の評価方法を提供する。
【００８６】
これらの方法は、ＰＣＲプライマー／プローブセットの特有の組合せを設計するために、該ウイルスおよび宿主のゲノム中の保存された領域を最適に利用する。１つの実施形態においては、このプローブは、エキソヌクレアーゼ分解の際に、標的核酸を示すシグナルがリアルタイムで検出されるよう、検出可能なシグナルを含有する。この技術は高感度かつ高精度であることが判明している。また、１工程リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）中にＰＣＲサイクル閾値（Ｃｔ）検出を用いる定量は、最終ＲＴ−ＰＣＲ産物の定量から生じるばらつきを排除している。
【００８７】
本発明の特定の実施形態においては、同時リアルタイムＰＣＲの方法は、
ａ）サンプル中の標的核酸配列の少なくとも一部を、
ｉ）適当な増幅反応混合物、
ｉｉ）該標的核酸配列が増幅されると、それぞれの独立して標識されたプローブが特有の検出可能なシグナルを放出するよう、該標的核酸配列にハイブリダイズする２以上の独立して標識されたオリゴヌクレオチドまたはプローブ、
ｉｉｉ）標的ウイルス核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの独立して標識されたオリゴヌクレオチドまたはプローブ、および
ｉｖ）標的宿主核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの独立して標識されたオリゴヌクレオチドまたはプローブ
と接触させる工程、
ｂ）該増幅混合物に関して増幅方法を行う工程、
ｃ）該特有シグナルの放出をリアルタイムで検出する工程を含む。
【００８８】
該アンプリコンの存在は、もちろん、該標的核酸が該サンプル中に存在することを示し、該サンプル中の標的ＲＮＡまたはＤＮＡは、シグナル強度に基づき定量することができる。
【００８９】
本発明はまた、ミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡに対する核（または内因性対照）ＤＮＡまたはＲＮＡの比率を測定することによる、リアルタイムＰＣＲを用いる、候補化学療法化合物のミトコンドリア毒性の高感度かつ高精度の測定のための新規方法に適用されうる。好ましい実施形態においては、この毒性スクリーニングアッセイは、潜在的抗ウイルス剤（特に抗ＨＩＶ、特に抗ＨＩＶ−１剤）および抗肝炎ウイルス（特にＨＢＶおよびＨＣＶ）剤の毒性を測定するために用いる。
【００９０】
この方法は、
ａ）サンプル中の核核酸配列の少なくとも一部を、
ｉ）増幅反応混合物、
ｉ）該標的核酸配列が増幅されると、それぞれの独立して標識されたプローブが特有の検出可能なシグナルを放出するよう、該標的核酸配列にハイブリダイズする２以上の独立して標識されたオリゴヌクレオチドまたはプローブ、
ｉｉ）標的核核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの独立して標識されたオリゴヌクレオチドまたはプローブ、および
ｉｉｉ）標的ミトコンドリア核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの独立して標識されたオリゴヌクレオチドまたはプローブ
と接触させる工程、
ｂ）該増幅混合物に関して増幅方法を行う工程、
ｃ）該シグナルの放出をリアルタイムで検出する工程を含む。
【００９１】
核アンプリコンの量は、シグナル強度の相違に基づきミトコンドリアアンプリコンの量と比較することが可能であり、したがって、それはミトコンドリア毒性のレベルを示す。
【００９２】
Ｉ．スクリーニング
これらの方法は、レトロウイルス科、フラビウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ヘルペスウイルス科、ヘパドナウイルス科、ピコルナウイルス科、レオウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、パポーバウイルス科、パルボウイルス科、ブニヤウイルス科、フィロウイルス科、アレナウイルス科またはトガウイルス科からのウイルスを含むいずれかのウイルス（これらに限定されるものではない）の複製を該化合物または物質が抑制する能力を評価するために用いることができる。特に、該ウイルスは、ＨＩＶ、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＧ型肝炎ウイルスを含むが、これらに限定されるものではない）、ＢＶＤＶ（ウシ下痢症ウイルス）、単純ヘルペスウイルス、１型アデノウイルス、インフルエンザウイルス、例えばインフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）、インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）、インフルエンザＢ、インフルエンザＣおよびインフルエンザＤウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス３型、ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）またはウイエストナイルウイルスである。
【００９３】
特に、定量的リアルタイムＰＣＲ抗ウイルススクリーニングは、以下の非限定的な具体例において、宿主ＲＮＡ標的（ＲＴ−ＰＣＲの場合）に関する較正と組合せることができる。
ａ）抗ＨＣＶ化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、ｍＲＮＡ較正、特にアクチンｍＲＮＡ較正、ミトコンドリアＲＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｂ）抗ＨＩＶ化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、ｍＲＮＡ較正、特にアクチンｍＲＮＡ較正、ミトコンドリアＲＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｃ）抗ＨＢＶ化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、ｍＲＮＡ較正、特にアクチンｍＲＮＡ較正、ミトコンドリアＲＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｄ）抗ＲＳＶ化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、ｍＲＮＡ較正、特にアクチンｍＲＮＡ較正、ミトコンドリアＲＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｅ）抗ＢＶＤＶ化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、ｍＲＮＡ較正、特にアクチンｍＲＮＡ較正、ミトコンドリアＲＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｆ）抗レンチウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、ｍＲＮＡ較正、特にアクチンｍＲＮＡ較正、ミトコンドリアＲＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｇ）抗フラビウイルス科（フラビウイルス属、ヘパシウイルス属、ペスチウイルス属）ウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、ｍＲＮＡ較正、特にアクチンｍＲＮＡ較正、ミトコンドリアＲＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｈ）抗ヘパドナウイルス科ウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、ｍＲＮＡ較正、特にアクチンｍＲＮＡ較正、ミトコンドリアＲＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｉ）抗ピコナウイルス科ウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、ｍＲＮＡ較正、特にアクチンｍＲＮＡ較正、ミトコンドリアＲＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｊ）抗ヘルペトウイルス科ウイルス（ＨＳＶ、ＨＣＭＶ、ＥＢＶ）化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、ｍＲＮＡ較正、特にアクチンｍＲＮＡ較正、ミトコンドリアＲＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
【００９４】
定量的リアルタイムＰＣＲ抗ウイルススクリーニングは、以下の非限定的な具体例において、宿主ＤＮＡ標的（ＰＣＲの場合）に関する較正と組合せることができる。
ａ）抗ＨＣＶ化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、ＤＮＡ較正、特にアクチンＤＮＡ較正、ミトコンドリアＤＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｂ）抗ＨＩＶ化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、ＤＮＡ較正、特にアクチンＤＮＡ較正、ミトコンドリアＤＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｃ）抗ＨＢＶ化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、ＤＮＡ較正、特にアクチンＤＮＡ較正、ミトコンドリアＤＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｄ）抗ＲＳＶ化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、ＤＮＡ較正、特にアクチンＤＮＡ較正、ミトコンドリアＤＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｅ）抗ＢＶＤＶ化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、ＤＮＡ較正、特にアクチンＤＮＡ較正、ミトコンドリアＤＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｆ）抗レンチウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、ＤＮＡ較正、特にアクチンＤＮＡ較正、ミトコンドリアＤＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｇ）抗フラビウイルス科（フラビウイルス属、ヘパシウイルス属、ペスチウイルス属）ウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、ＤＮＡ較正、特にアクチンＤＮＡ較正、ミトコンドリアＤＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｈ）抗ヘパドナウイルス科ウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、ＤＮＡ較正、特にアクチンＤＮＡ較正、ミトコンドリアＤＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｉ）抗ピコナウイルス科ウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、ＤＮＡ較正、特にアクチンＤＮＡ較正、ミトコンドリアＤＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
ｊ）抗ヘルペトウイルス科ウイルス（ＨＳＶ、ＨＣＭＶ、ＥＢＶ）化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、ＤＮＡ較正、特にアクチンＤＮＡ較正、ミトコンドリアＤＮＡ較正および／または任意の他の核内またはミトコンドリア内核酸較正と組合せることができる。
【００９５】
本発明はまた、核ＤＮＡまたはＲＮＡに対するミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡの比率を測定することによる、化学療法剤または他の医薬物質のミトコンドリア毒性の高感度かつ高精度な測定のための新規方法を提供する。この方法の原理は、ＤＮＡポリメラーゼγの阻害は最終的に、より少量のミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡを与えるが、核ＤＮＡまたはＲＮＡ（その複製はＤＮＡポリメラーゼαおよび／またはβに依存する）の量は一定のままであるということにある。
【００９６】
ミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡの全量を定量するためには、そのようなミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡの量を標準化するよう内因性対照の増幅を行う必要がある。この内因性対照は、核ＤＮＡまたはＲＮＡの全量を表し各実験サンプル中に存在するＲＮＡまたはＤＮＡである。この内因性対照を活性参照体として使用することにより、ミトコンドリアＤＮＡまたはＲＮＡの量を、各反応に加えた全ＤＮＡまたはＲＮＡの量における相違に関して正規化することができる。内因性対照は任意のヒト遺伝子でありうるが、しばしば、β−アクチン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼまたはリボソームＲＮＡが使用される。リアルタイムＰＣＲにより反応における内因性対照の全量を定量するための有効な方法を提供する。
【００９７】
ＩＩ．定義
本発明で用いる「サンプル」または「臨床サンプル」は、本発明の方法の実施において使用するための、宿主から得た任意のサンプルに関するものである。１つの態様においては、該宿主は、ウイルスにより少なくとも部分的に引き起こされる疾患または症候群に罹患している。該宿主は、ウイルス感染の危険にあると考えられる無症候体でありうる。該サンプルは、細胞性サンプル、例えば組織サンプル、例えば生検として又は死後に得た肺組織のサンプル、流体サンプル、例えば血液、唾液、喀痰、尿、脳脊髄液、または鼻表面、咽頭表面、頬表面などのような粘膜表面をスワブ化することにより得たスワブ化サンプルでありうる。あるいは、それは糞便のような排泄物から得ることが可能であり、あるいはそれは、診断試験において一般に使用される他の体組織または体液から得ることが可能である。
【００９８】
本発明において用いる、ＲＮＡまたはＤＮＡに関する「精製」なる語は、ビリオンまたは細胞中の潜伏または潜在形態から遊離したＲＮＡまたはＤＮＡに関するものであり、それにより、該ＲＮＡまたはＤＮＡは自由に入手（利用）可能となる。そのような状態においては、それは、ポリメラーゼ連鎖反応を用いることによる有効な増幅に適している。ＲＮＡまたはＤＮＡの遊離は、ウイルスＲＮＡまたはＤＮＡを含有するビリオンの破壊およびそのようなビリオンを保持しうる細胞の破壊を達成する工程を含みうる。ＲＮＡまたはＤＮＡの精製は、一般には、存在しうるいずれかのヌクレアーゼ活性を厳密かつ有効に排除または抑制する条件下で行う。また、精製は、水性媒体に溶解したＲＮＡまたはＤＮＡを他の細胞成分またはウイルス成分（ここで、そのような成分は粒子状または溶解状態でありうる）から少なくとも部分的に分離することを達成する工程を含みうる。
【００９９】
本発明で用いる「逆転写」または「ＲＴ」は、遊離３’−ヒドロキシル基を有するオリゴヌクレオチドプライマーを利用して一本鎖ＲＮＡ分子からｃＤＮＡを合成する逆転写酵素により触媒される過程に関するものである。本発明で用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」なる語は、核酸分子の一定のセグメント（これは、しばしば、所望のセグメントまたは標的セグメントである）を反復的に増幅して、そのセグメントのみからなる大量のＤＮＡ分子を得る方法に関するものである。該方法は、多数のプライミングおよび転写サイクルの反復に基づく。各サイクルにおいて、２つのオリゴヌクレオチドプライマーが該セグメントに結合し、該セグメントの範囲を定める。ついでプライマー依存性ＤＮＡポリメラーゼが、該プライマーが結合している鎖を転写または複製する。したがって、各サイクルにおいて、ＤＮＡ二本鎖の数が２倍になる。
【０１００】
本発明で用いる「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」なる語は、ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖上の特定の配列に相補的な特異的な又は所望のヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドに関するものである。該プライマーが、それと相補的なＤＮＡ二本鎖中の特異的配列にハイブリダイズすると、それは、プライマー依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の作用のためのプライミング位置（すなわち、開始位置）として機能しうる。該プライマーは、一旦ハイブリダイズすると、該二本鎖に対する該ポリメラーゼの転写活性の作用の５’末端を定めるよう作用する。ＰＣＲにおいては一般に、プライマーの特異的ペアを使用し、ここで、該プライマーの一方は該鎖の一方にハイブリダイズし、もう一方のプライマーは相補鎖にハイブリダイズする。それらのプライマーは、５’から３’の方向に進行する転写が各プライマーから他方のプライマーのハイブリダイゼーション部位へと向かう方向となるような配向でハイブリダイズする。数ラウンドのハイブリダイゼーションおよび転写の後、生成した増幅ＤＮＡは、該プライマーがハイブリダイズした部位により末端が定められた一定の長さを有するセグメントである。
【０１０１】
本発明で用いる「プローブ」または「標識オリゴヌクレオチド」なる語は、ＤＮＡ二本鎖の一方の鎖上の特定の配列に相補的な特異的な又は所望のヌクレオチド配列と、蛍光色素のような検出可能なシグナルとを有するオリゴヌクレオチドに関するものである。該プライマーが、それと相補的であるＤＮＡ二本鎖中の特異的配列にハイブリダイズしている場合には、該シグナルは、例えば共有結合している消光色素のために不活性である。しかし、増幅および後続の分析に際しては、該シグナルはエキソヌクレアーゼ分解により活性化されて、リアルタイムで検出されうる。特に、該プローブは蛍光色素および消光色素を含有していて、ハイブリダイゼーション時には該蛍光色素は該消光色素により消光されている。増幅およびエキソヌクレアーゼ分解の後、該蛍光色素が該消光色素から遊離し、蛍光シグナルがリアルタイムで検出されうる。
【０１０２】
本発明で用いる「増幅反応混合物」なる語は、任意の反応物質、または標的核酸配列の増幅を促進する物質（ポリメラーゼまたはエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼのような酵素、核酸のような基質およびオリゴヌクレオチドプライマー（本明細書中に定義されているもの）を含む）の組合せを意味する。
【０１０３】
本発明で用いる、オリゴヌクレオチド配列のような核酸配列に関する、標的配列に「特異的」なる語は、与えられた実験状況において用いる条件下で該標的にはハイブリダイズするがそれらの状況下で標的配列以外の配列にはハイブリダイズしないヌクレオチド配列に関するものである。本発明の内容に含まれるＨＩＶ標的配列のような特定の標的に特異的なヌクレオチド配列は、それが含む塩基のすべてが該標的上の対応塩基に相補的であるようなものである。
【０１０４】
さらに、本発明で用いる、標的配列に対する核酸配列の「特異性」なる語はまた、該標的配列の対応ヌクレオチドに相補的でないことがある少数のヌクレオチドを有する核酸およびオリゴヌクレオチドを包含する。相補性からの逸脱の度合が依然として機能的に重要でない限り、そのような配列は尚も該標的配列に「特異的」である。特に、そのような配列は、与えられた実験状況において用いる条件下でそれが標的配列には有効にハイブリダイズするが該サンプル中の標的配列以外のいずれの配列にもハイブリダイズしない限り、該標的配列に「特異的」である。
【０１０５】
本発明で用いる「アンプリコン」なる語は、ＰＣＲ法のような増幅法から生じた一定のサイズおよび配列を有する二本鎖核酸セグメントを意味する。該アンプリコンのサイズは、プライマーが結合する核酸二本鎖の２つの鎖上の部位により限定される。少数の増幅サイクルの後、該生成核酸のそのセグメントは該増幅法の優勢な生成物となる。
【０１０６】
本発明で用いる「宿主」なる語は、ウイルスの複製の場となりうる単細胞生物または多細胞生物を意味し、細胞系および動物、好ましくはヒトを含む。あるいは、該宿主は、本発明の化合物により複製または機能が改変されうるウイルスゲノムの一部を保持していることが可能である。宿主なる語は、特に、感染細胞、該ウイルスゲノムの全部または一部でトランスフェクトされた細胞、ならびに動物、特に霊長類（チンパンジーを含む）およびヒトを意味する。本発明のほとんどの動物用途においては、該宿主はヒト患者である。しかし、本発明により、ある適応症における獣医学用途（例えば、ウシにおけるウシ下痢症ウイルス、ブタにおけるブタコレラウイルス、およびヒツジにおけるボーダー病ウイルス）が明らかに予想される。
【０１０７】
ＩＩＩ．宿主プライマーおよびプローブ
宿主核酸の検出のためには、当技術分野で公知の任意の適当なプライマーおよび／またはプローブを使用することができる。これらのプライマーおよび／またはプローブは購入されうるか、または当技術分野で公知の任意の手段により製造されうる。いくつかのプライマーおよび／またはプローブの組合せ、例えば、ｒＲＮＡ遺伝子用のプライマー・プローブ・セット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）が、商業的に入手可能である。後者のセットは、しばしば、本発明における較正ＰＣＲとして使用される。あるいは、適当なプローブおよびプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）および特にβ−アクチン遺伝子用およびミトコンドリアシトクロムオキシダーゼサブユニットＩＩ（ＣＯＸＩＩ）遺伝子用の新規プライマーおよびプローブを使用することにより設計することができる。
【０１０８】
β−アクチン
１つの実施形態においては、内因性対照のための１組のオリゴヌクレオチドを誘導するために使用する核ＤＮＡまたはＲＮＡは、β−アクチンのＤＮＡである。任意の適当なプライマーおよび／またはプローブを使用することができる。本発明の特定の実施形態においては、該プライマーおよび／またはプローブは、ヒトアクチン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｅ０１０９４）の第３エキソンからの配列に相補的である。該プローブは、増幅の際に検出可能なシグナルを与えるクエンチャー（消光体）およびレポーターを含む。任意のレポーター／クエンチャープローブセットを使用することが可能であり、それらには、ＴａｑＭａｎ、モレキュラー・ビーコンズ、シングル・ダイ・プローブ、ＳＹＢＲグリーン、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプローブおよび二重標識プローブセットが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１０９】
本発明の好ましい実施形態においては、β−アクチンを増幅するために使用するオリゴヌクレオチド（プライマー）は、センス  ５’−ＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＣＴＴＣＡ−３’（配列番号１）およびアンチセンス  ５’−ＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴ−３’（配列番号２）である。宿主核酸を検出するために使用する標識オリゴヌクレオチド（プローブ）は、５’−ＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣＧＡＧＣＧＧＧＡ−３’（配列番号３）の配列を有する。１つの実施形態においては、該プローブは、５’末端においてはレポーターで、３’末端においてはクエンチャー分子で標識されており、特に、５’末端においてはレポーターＦＡＭで、３’末端においてはクエンチャー分子ＴＡＭＲＡで標識されている。
【０１１０】
ミトコンドリア核酸
１つの実施形態においては、該ミトコンドリア核酸はミトコンドリアＤＮＡから特異的に誘導されうる。もう１つの実施形態においては、該ミトコンドリア核酸はミトコンドリアＲＮＡから特異的に誘導されうる。もう１つの実施形態においては、該ミトコンドリア核酸はミトコンドリアＣＯＸＩＩ遺伝子由来の配列に相補的である。任意の適当なプライマーおよび／またはプローブを使用することができる。該プローブは、増幅に際して検出可能なシグナルを与えるクエンチャーおよびレポーターを含む。任意のレポーター／クエンチャープローブセットを使用することが可能であり、それらには、ＴａｑＭａｎ、モレキュラー・ビーコンズ、シングル・ダイ・プローブ、ＳＹＢＲグリーン、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプローブおよび二重標識プローブセットが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
本発明の好ましい実施形態においては、ミトコンドリア核酸を増幅するために使用するオリゴヌクレオチド（プライマー）は、センス  ５’−ＴＧＣＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＡ−３’（配列番号１９）および５’−ＴＣＧＴＣＴＧＴＴＡＴＧＴＡＡＡＧＧＡＴＧＣＧＴ−３’（配列番号２０）である。宿主核酸を検出するために使用する標識オリゴヌクレオチド（プローブ）は、５’−ＴＣＣＴＣＡＴＣＧＣＣＣＴＣＣＣＡＴＣＣＣ−３’（配列番号２１）の配列を有する。１つの実施形態においては、該プローブは、５’末端においてはレポーターで、３’末端においてはクエンチャー分子で標識されており、特に、５’末端においてはレポーターＴＥＴで、３’末端においてはクエンチャー分子ＴＡＭＲＡで標識されている。
【０１１２】
ＩＶ．ウイルスプライマーおよびプローブ
ウイルス標的には、当技術分野で公知の任意の適当なプライマーおよび／またはプローブを使用することができる。これらのプライマーおよび／またはプローブは購入されうるか、または当技術分野で公知の任意の手段により製造されうる。あるいは、適当なプローブおよびプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）を使用することにより設計することが可能であり、特に、高度に保存された領域に相補的となるようプライマーおよびプローブを設計することが可能である。これは、例えばＨＣＶ、ＨＢＶおよびＨＩＶ、ＢＶＤＶおよびＲＳＶのような高い遺伝的可変性を有するウイルスの場合に特に重要である。
【０１１３】
理想的には、該ウイルスプライマー／プローブセットは以下の基準を満たすべきである：（ｉ）クレードまたは遺伝子型の莫大な可変性を、同じ効率で検出しうること；ｉｉ）少なくとも５ｌｏｇ以上のダイナミックレンジを有すること；およびｉｉｉ）検出下限が僅か数ウイルスコピー／ｍＬであるべきであること。ＰＣＲプライマー結合部位における可変性がしばしば問題となるが、ＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイは、最も高感度な技術のうちのいくつかである。
【０１１４】
本発明の１つの実施形態においては、ＰＣＲプライマーおよび／またはプローブセットの特有の組合せを得るために、ウイルスゲノムの保存領域に基づいて相補的ウイルス配列を設計した。本発明のもう１つの実施形態においては、種々の遺伝子型に及ぶ推定配列保存性に基づいて、該プライマーおよび／またはプローブを設計する。好ましい実施形態においては、種々の遺伝子型に及ぶ推定配列保存性およびウイルスゲノムの保存領域の両方に基づいて、該プライマーおよび／またはプローブを設計する。
【０１１５】
ＨＩＶ
本発明の１つの実施形態においては、該標的ウイルス核酸はＨＩＶ、特にＨＩＶ−１に由来する。任意の適当なプライマーおよび／またはプローブを使用することができる。本発明の特定の実施形態においては、該プライマーおよび／またはプローブはコドン２００〜２８０の逆転写酵素ドメインに相補的である。該プローブは、増幅に際して検出可能なシグナルを与えるクエンチャーおよびレポーターを含む。任意のレポーター／クエンチャープローブセットを使用することが可能であり、それらには、ＴａｑＭａｎ、モレキュラー・ビーコンズ、シングル・ダイ・プローブ、ＳＹＢＲグリーン、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプローブおよび二重標識プローブセットが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１６】
本発明の好ましい実施形態においては、ＨＩＶ−１を増幅するために使用するオリゴヌクレオチド（プライマー）は、センス  ５’−ＴＧＧＧＴＴＡＴＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号４）およびアンチセンス  ５’−ＴＧＴＣＡＴＴＧＡＣＡＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＴ−３’（配列番号５）である。ＨＩＶ−１ウイルス負荷を検出するために使用する標識オリゴヌクレオチド（プローブ）は、５’−ＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＣＧＧＣＴＧＴＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴ−３’（配列番号６）の配列を有する。１つの実施形態においては、該プローブは、５’末端においてはレポーターで、３’末端においてはクエンチャー分子で標識されており、特に、５’末端においてはレポーターＦＡＭで、３’末端においてはクエンチャー分子ＴＡＭＲＡで標識されている。
【０１１７】
ＨＣＶ
本発明のもう１つの実施形態においては、該標的ウイルス核酸はＨＣＶに由来する。任意の適当なプライマーおよび／またはプローブを使用することができる。本発明の特定の実施形態においては、該プライマーおよび／またはプローブは、ＨＣＶ  ５’非コード領域のようなＨＣＶ中に存在するＲＮＡ配列に相補的な高度に保存された配列に由来する。該プローブは、増幅に際して検出可能なシグナルを与えるクエンチャーおよびレポーターを含む。任意のレポーター／クエンチャープローブセットを使用することが可能であり、それらには、ＴａｑＭａｎ、モレキュラー・ビーコンズ、シングル・ダイ・プローブ、ＳＹＢＲグリーン、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプローブおよび二重標識プローブセットが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１１８】
本発明の好ましい実施形態においては、ＨＣＶを増幅するために使用するオリゴヌクレオチド（プライマー）は、センス  ５’−ＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡ（Ｔ／Ａ）ＧＡＧＴＧＴ−３’（配列番号７）およびアンチセンス  ５’−ＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧＧ−３’（配列番号８）である。ＨＣＶウイルス負荷を検出するために使用する標識オリゴヌクレオチド（プローブ）は、５’−ＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣ−３’（配列番号９）の配列を有する。１つの実施形態においては、該プローブは、５’末端においてはレポーターで、３’末端においてはクエンチャー分子で標識されており、特に、５’末端においてはレポーターＦＡＭで、３’末端においてはクエンチャー分子ＴＡＭＲＡで標識されている。
【０１１９】
ＢＶＤＶ
本発明のもう１つの実施形態においては、該標的ウイルス核酸はＢＶＤＶに由来する。任意の適当なプライマーおよび／またはプローブを使用することができる。本発明の特定の実施形態においては、該プライマーおよび／またはプローブは、ＮＳ５Ｂ遺伝子のヌクレオチド１６１１〜１７５１に相補的な配列のような相補的な高度に保存された配列に由来する。該プローブは、増幅に際して検出可能なシグナルを与えるクエンチャーおよびレポーターを含む。任意のレポーター／クエンチャープローブセットを使用することが可能であり、それらには、ＴａｑＭａｎ、モレキュラー・ビーコンズ、シングル・ダイ・プローブ、ＳＹＢＲグリーン、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプローブおよび二重標識プローブセットが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２０】
本発明の好ましい実施形態においては、ＢＶＤＶを増幅するために使用するオリゴヌクレオチド（プライマー）は、センス  ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＴ−３’（配列番号１０）およびアンチセンス  ５’−ＴＧＴＴＧＣＧＡＡＡＧＧＡＣＣＡＡＣＡＧ−３’（配列番号１１）である。ＢＶＤＶウイルス負荷を検出するために使用する標識オリゴヌクレオチド（プローブ）は、５’−ＡＡＡＴＣＣＴＣＣＴＡＡＣＡＡＧＣＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧ−３’（配列番号１２）の配列を有する。１つの実施形態においては、該プローブは、５’末端においてはレポーターで、３’末端においてはクエンチャー分子で標識されており、特に、５’末端においてはレポーターＦＡＭで、３’末端においてはクエンチャー分子ＴＡＭＲＡで標識されている。
【０１２１】
ＨＢＶ
本発明のもう１つの実施形態においては、該標的ウイルス核酸はＨＢＶに由来する。任意の適当なプライマーおよび／またはプローブを使用することができる。本発明の特定の実施形態においては、該プライマーおよび／またはプローブは、ＨＢＶ表面抗原遺伝子のアミノ末端領域のようなＨＢＶ中に存在するＤＮＡ配列に相補的な高度に保存された配列に由来する。該プローブは、増幅に際して検出可能なシグナルを与えるクエンチャーおよびレポーターを含む。任意のレポーター／クエンチャープローブセットを使用することが可能であり、それらには、ＴａｑＭａｎ、モレキュラー・ビーコンズ、シングル・ダイ・プローブ、ＳＹＢＲグリーン、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプローブおよび二重標識プローブセットが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２２】
本発明の好ましい実施形態においては、ＨＢＶを増幅するために使用するオリゴヌクレオチド（プライマー）は、センス  ５’−ＧＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＡ−３’（配列番号１３）およびアンチセンス  ５’−ＧＡＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＣＣＡＣＧＡＧＴＣＴＡＧ−３’（配列番号１４）である。ＨＢＶウイルス負荷を検出するために使用する標識オリゴヌクレオチド（プローブ）は、５’−ＴＧＴＴＧＡＣＡＡ（Ａ／Ｇ）ＴＣＣＴＣＡＣＡＡＴＡＣＣ（Ａ／Ｇ）ＣＡＧＡ−３’（配列番号１５）の配列を有する。１つの実施形態においては、該プローブは、５’末端においてはレポーターで、３’末端においてはクエンチャー分子で標識されており、特に、５’末端においてはレポーターＦＡＭで、３’末端においてはクエンチャー分子ＴＡＭＲＡで標識されている。
【０１２３】
ＲＳＶ
本発明のもう１つの実施形態においては、該標的ウイルス核酸はＲＳＶに由来する。任意の適当なプライマーおよび／またはプローブを使用することができる。本発明の特定の実施形態においては、該プライマーおよび／またはプローブは、ＲＮＡポリメラーゼラージサブユニット（Ｌ）をコードするヌクレオチドに相補的な配列のような相補的な高度に保存された配列に由来する。該プローブは、増幅に際して検出可能なシグナルを与えるクエンチャーおよびレポーターを含む。任意のレポーター／クエンチャープローブセットを使用することが可能であり、それらには、ＴａｑＭａｎ、モレキュラー・ビーコンズ、シングル・ダイ・プローブ、ＳＹＢＲグリーン、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒプローブおよび二重標識プローブセットが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２４】
本発明の好ましい実施形態においては、ＲＳＶを増幅するために使用するオリゴヌクレオチド（プライマー）は、センス  ５’−ＣＡＡＣＡＡＣＣＣＴＡＡＴＣＡＴＧＴＧＧＴＡＴＣＡ−３’（配列番号１６）およびアンチセンス  ５’−ＣＣＧＧＴＴＧＣＡＴＴＧＣＡＡＡＣＡ−３’（配列番号１７）である。ＲＳＶウイルス負荷を検出するために使用する標識オリゴヌクレオチド（プローブ）は、５’−ＴＧＡＣＡＧＧＣＡＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＣＴＣＡＧＴＧＴＡＧＧＴＡＧＡ−３’（配列番号１８）の配列を有する。１つの実施形態においては、該プローブは、５’末端においてはレポーターで、３’末端においてはクエンチャー分子で標識されており、特に、５’末端においてはレポーターＦＡＭで、３’末端においてはクエンチャー分子ＴＡＭＲＡで標識されている。
【０１２５】
Ｖ．方法
増幅方法
所望の核酸配列の増幅方法は、所望のアンプリコンの増幅を達成するのに必要な任意の手段により達成することができる。該増幅は、当技術分野における任意の公知手段を用いて達成することができる。該プライマーおよびプローブは購入可能であるか、または当技術分野で公知の任意の手段（例えば、自動化方法）により製造することができる。好ましい実施形態においては、該プライマーおよびプローブは、本明細書に開示する標的核酸配列に対する特異性に関して設計する。増幅を促進するために使用する酵素は購入可能であるか、または当技術分野で公知の任意の手段（細胞抽出を含む）により製造することができる。増幅を補助する基質は購入可能であるか、または当技術分野で公知の任意の手段（天然および非天然核酸を合成するための任意の合成方法を含む）により製造することができる。該酵素および基質は、所望のアンプリコンの増幅を可能にする任意の時点および順序で増幅混合物に加えることができる。好ましい実施形態においては、該ポリメラーゼおよび基質は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により提供されたＴａｑＭａｎ  ７７００化学に従う。
【０１２６】
また、増幅条件は、プライマーおよびプローブの選択に応じて、それらの融解温度の相違により様々となる。好ましい温度は、インキュベーションには５０℃〜９５℃、増幅には６０℃〜９５℃である。増幅のための温度は、適当な速度で所望のアンプリコンの複製を可能にする任意の温度で行うことができる。典型的な実施形態として、所望のアンプリコンを増幅するために逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ−ＰＣＲ」）を用いることができる。逆転写インキュベーションの後、増幅サイクルを行うことができる。インキュベーションサイクルは１つの温度で又は複数の温度で行うことが可能であり、例えば、インキュベーションサイクルは２工程の温度勾配で行うことが可能であり、好ましくは、まず、中等度の温度で中等度の時間にわたり、ついで、より高温で長時間にわたり行うことが可能である。増幅サイクルは１つの温度で又は複数の温度で行うことが可能であり、例えば、増幅サイクルは２工程の勾配で行うことが可能であり、好ましくは、まず、より高温で短時間にわたり、ついで、中等度の温度で、より長時間にわたり行うことが可能である。増幅方法は、必要なだけ多くの回数反復することが可能であるが、好ましくは４０回反復する。
【０１２７】
非限定的な具体例として、ＨＩＶ−１、β−アクチンおよびミトコンドリア核酸配列を、以下の方法を用いて増幅することができる。増幅反応混合物を、まず５０℃で２分間、ついで９５℃で２分間インキュベートする。この後、９５℃で１５秒間、ついで６０℃で６０秒間の２工程の増幅反応を４０サイクル行う。
【０１２８】
検出系
該アンプリコンの存在は、レポーター色素および消光色素（これは、増幅の際に、検出可能なシグナルを放出しうる）と称される種々の物質で標識された標識オリゴヌクレオチドに基づき、リアルタイムで検出することができる。レポーター色素および消光色素の任意の組合せを用いることができる。レポーター色素のいくつかの非限定的な具体例としては、ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＰＡＴおよびＪＯＥが挙げられる。消光色素の非限定的な具体例としては、ＴＡＭＲＡが挙げられる。これらのレポーター色素および消光色素は購入可能であるか、または当技術分野で公知の任意の手段（ラジカルおよび有機金属化学を含む）により製造することができる。
【０１２９】
１つの実施形態においては、検出可能なシグナルは、オリゴヌクレオチドを介して消光色素に共有結合した、分光計で検出されうる蛍光色素である。これは、該オリゴヌクレオチドに結合している間は蛍光色素を不活性にする。しかし、該オリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼ分解に際して、蛍光色素が消光色素から遊離されて、検出可能なシグナルを放出しうる。
【０１３０】
新規ＤＮＡタグおよび標識の多くは、蛍光の延長である２つの現象、すなわち、消光およびエネルギー転移に左右される。一般に、励起状態の寿命を減少させるものはすべて、発蛍光団の量子収率を減少させ、量子収率を減少させるものはすべて、消光と称される。これらの現象を決定する３つの主要メカニズム、すなわち、衝突（これにおいて、非蛍光分子にぶつかることにより発蛍光団の励起状態がそのエネルギーを失う）、静的（これにおいて、励起状態がクエンチャーと反応して、非蛍光複合体を形成する）、およびエネルギー転移（これは、供与体から受容体へのエネルギーの非放射性転移を含む）が存在する。
【０１３１】
蛍光色素の明るさは多数のパラメーターに左右される。該パラメーターは、該色素および該励起系の物理的特性および化学的特性に分類されうる。該色素の重要な物理的特性は量子収率および消光率である。量子収率は、吸収光子数で割り算した放出光子数の表現である。量子収率０は非蛍光分子を示し、量子収率１は、励起光子の１００％が、より低い波長の放出光子を与えることを示す。消光率は、与えられた波長の光子が発蛍光団により吸収される確率の表現である。高い消光率と高い量子収率との組合せは、一般には、「明るい」発蛍光団をもたらす。例えば、フルオレセインは、その吸収極大において約８０，０００の消光率および〜０．９の量子収量を有する比較的「明るい」色素である。
【０１３２】
蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）が生じるためには、供与体と受容体との間の量子エネルギーレベルにおける厳密な重複が存在しなければならず、該エネルギーは、光子の放出および再吸収ではなく双極子カップリングにより転移される。ＦＲＥＴは、ＤＮＡ配列決定のための色素を生成させるために非常に生産的に用いられており、この場合、共通の供与体が、複数の励起波長の必要性を排除し、そのエネルギーを、容易に識別されうる発光スペクトルを有する４つの別々の色素に転移させる。ＦＲＥＴおよび蛍光消光は距離に非常に依存したものであり、そのため、供与体−受容体の幾何配置を変化させるいくつかの新規アッセイにおけるそれらの利用が可能となる。
【０１３３】
記載されている方法の多くは、種々の修飾オリゴヌクレオチドに依存する。多数の蛍光色素は、自動オリゴヌクレオチド合成方法に適合する色素−ホスホルアミジットとして（または色素−ＣＰＧ誘導体として）入手可能である。このアプローチを用いて、通常の合成中に色素を５’または３’末端、あるいは任意の内部位置に取り込むことが可能であり、より広範な標識が可能となる。なぜなら、多数の追加的な色素は、合成後にアミノ修飾オリゴヌクレオチドに連結されうるＮＨＳ−エステル形態で入手可能だからである。用途が異なれば、異なる修飾が必要となり、そのような修飾には、可変長スペーサー、普遍的塩基よび分枝バックボーンのような秘伝的技術が含まれる。
【０１３４】
多重的な定量的増幅および検出を支持する試薬キットが商業的に入手可能である。ＱＰＣＲキットは、ＤＮＡ突然変異を検出するため又は遺伝子もしくはウイルスコピー数を測定するために、ＤＮＡ鋳型と共に使用する。ＱＲＴ−ＰＣＲキットは、典型的には、ＲＮＡレベルを測定するために、ＲＮＡ鋳型と共に使用する。また、これらのキットを使用して、発現されたＲＮＡにおいて突然変異を検出することができる。これらのキットは、ＡｍｐｌｉＦｌｕｏｒ系、モレキュラー・ビーコンズ、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、二重発蛍光団アプローチ、単一色素プライマーおよびＤＮＡバインディング（ｂｙｎｄｉｎｇ）色素を含む種々の蛍光検出系と共に高い性能を発揮しうる。
【０１３５】
（ｉ）Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ．，Ｐｕｒｃｈａｓｅ，Ｎ．Ｙ．
この系においては、ＰＣＲ増幅および検出の工程が同じ反応容器中で生じる。得られたＰＣＲ産物は蛍光を発し、リアルタイムまたはエンドポイント（終点）蛍光検出装置でモニターすることができる。Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ系は、モレキュラー・ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎ）技術の革新的応用に基づく。モレキュラー・ビーコンは、発蛍光団およびクエンチャー部分を含有するヘアピン状オリゴヌクレオチドである。モレキュラー・ビーコンは、発蛍光団／クエンチャーのペアが一緒になって蛍光を「消す」ように通常は閉じているスイッチのように作用する。該ヘアピン構造を開くコンホメーション変化を受けるように促されると、発蛍光団とクエンチャーとが分離し、蛍光を「点ける」。同様に、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ系は、フルオレセインがクエンチャー  ４−（ジメチルアミン）アゾベンゼンスルホン酸（ＤＡＢＳＹＬ）とペアになったヘアピン状末端を含有するプライマーを使用する。しかし、Ｉｎｔｅｒｇｅｎは、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ系と、エネルギー転移に基づく現在入手可能な他のＰＣＲ法（例えば、モレキュラー・ビーコンまたはＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒのＴａｑｍａｎ（商標））との間には、重要な相違があると指摘している。Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒにおいては、蛍光オリゴヌクレオチドが実際に反応産物中に取り込まれる。これは、ＰＣＲ産物の直接的検出を可能にし、偽陽性反応（これは、最も少ない繰越し（ｃａｒｒｙ−ｏｖｅｒ）汚染によってさえも生じうる）の数を減少させる。ＩｎｔｅｒｇｅｎのＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒ系で産物を増幅するためには、３つのプライマーを使用する。関心のある遺伝子に特異的なフォワードおよびリバースプライマーは、使用者により作製される。さらに、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ系の鍵成分であるＵｎｉＰｒｉｍｅｒ（商標）Ｅｎｅｒｇｙ−Ｔｒａｎｓｆｅｒ−ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｒｉｍｅｒを、反応が含有する。ＵｎｉＰｒｉｍｅｒの５’末端は、フルオレセインおよびＤＡＢＳＹＬで標識されたヘアピン構造よりなる。尾部配列（Ｚ）はプライマーの３’末端に存在する。該Ｚ配列は普遍的ＰＣＲプライマーとして作用し、それは、ヘテロ二量体形成によるＰＣＲバックグラウンドを減少させるよう特別に設計される。標的特異的プライマーの１つの修飾形態を合成することにより（該Ｚ配列は、該修飾プライマーの５’末端に単に付加される）、任意のＰＣＲ反応をＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒ系に適合させることが可能である。ゲル電気泳動またはドットブロット技術のような通常のＰＣＲ後検出方法は要求されない。
【０１３６】
（ｉｉ）モレキュラー・ビーコン
モレキュラー・ビーコンは、短い（５〜７塩基対）のステムを形成するようアニールする２つのアームに隣接し標的配列の一部に相補的なループ配列を有するヘアピン状オリゴである。一方のアームの末端には発蛍光団が存在し、もう一方には、該ステムが無傷の場合には蛍光を妨げるクエンチャーが存在する。しかし、該ステムと該ビーコン−標的ハイブリッドとの相対安定性に対して注意深い配慮がなされると、該オリゴは、設計される。遊離溶解状態でフォールディングしたままで及び任意の入手可能な標的に容易にハイブリダイズするよう設計され、一旦ハイブリダイズすると、該クエンチャーは該発蛍光団から離れ、ついでそれは蛍光を発して、標的が存在することを表示する。したがって、アンプリコンの中央部で標的配列を使用しＰＣＲのアニーリング工程中に蛍光を測定することにより、リアルタイムＰＣＲをモニターするために、モレキュラー・ビーコンを使用することができる。
【０１３７】
同一溶液中で複数の標的を検出するために、広範な発蛍光団を利用して多数の異なる色でモレキュラー・ビーコンが作製されうる。非蛍光発色団であるＤａｂｃｙｌは、モレキュラー・ビーコンにおいて、任意の発蛍光団の普遍的クエンチャーとして働く。それらのステムのため、モレキュラー・ビーコンによる標的の認識は非常に特異的であるため、単一ヌクレオチドの相違が容易に検出されうる。これらの特性のため、モレキュラー・ビーコンは、生きた細胞中のＲＮＡの検出のために、および密封反応容器中の特異的核酸の合成のモニターのために、およびＤＮＡ中の単一ヌクレオチド変異に関する均一ワン・チューブ（ｏｎｅ−ｔｕｂｅ）アッセイのために、および４つの異なる病原ウイルスの検出のための多重ＰＣＲのために使用されている（Ｖｅｔら，１９９９）。
【０１３８】
モレキュラー・ビーコンは、完全に最適化されると、効率的な検出系に役立つが、いくつかの陥穽に陥ることもある。遊離発蛍光団を含有する不純調製物から、または発蛍光団を含有するがクエンチャーを含有しないオリゴから、または低温において強固過ぎるステムのような設計上の問題から、偽陽性または低いシグナル対バックグラウンド比が生じうる。意図されたとおりにモレキュラー・ビーコンが作動することを保証するための必要な対照実験および設計に注意しなければならない。
【０１３９】
（ｉｉｉ）ＴａｑＭａｎプローブ
モレキュラー・ビーコンの類似物として、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｏｆ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣａｌｉｆからのＴａｑＭａｎプローブが挙げられる。この系は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性を利用する。ＰＣＲ伸長中に、５’エキソヌクレアーゼにレポーター発蛍光団を有し３’エキソヌクレアーゼにクエンチャーを有するアニール化オリゴヌクレオチドが５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により砕かれて、該発蛍光団をそのクエンチャーから遊離させる（ＴａｑＭａｎプローブの存在はＰＣＲ産物の合成を有意に抑制しない）。得られた蛍光はＰＣＲ産物の量に比例する。
【０１４０】
（ｉｖ）二重発蛍光団（Ｄｕａｌ  Ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）
発蛍光団−クエンチャー系の代替手段としては、ＦＲＥＴを利用する二重発蛍光団アプローチが挙げられる。これは、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）からのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒハイブリダイゼーションプローブの原理である。ＴａｑＭａｎのオリゴプローブ以外の２つのオリゴプローブがアンプリコンにアニールする。一方のオリゴプローブはその３’末端にフルオレセイン標識（ＦＲＥＴ供与体）を保持し、もう一方のオリゴプローブはその５’末端でＬＣレッド６４０（ＦＲＥＴ受容体）で標識されている。該オリゴは、効率的なエネルギー転移に適合しうる距離で隔たれた該発蛍光団に頭−尾配向でハイブリダイズするように設計される。
【０１４１】
（ｖ）均一検出のための蛍光オリゴヌクレオチド（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）
均一検出のための、消光部分を必要としない新規蛍光検出系が開発された。この技術は、二本鎖ＤＮＡへのハイブリダイゼーションまたは取込みに際して蛍光強度の有意な増加を伴う単一の発蛍光団で標識されたオリゴヌクレオチドに基づく。この検出技術は、密封チューブ最終フォーマットで又はリアルタイムで核酸を蛍光検出するためのプラットフォームである。この検出方法論は、ハイブリダイゼーションプローブとして及び均一ＰＣＲ増幅アッセイにおける増幅プライマーとして用いられている。
【０１４２】
（ｖｉ）ＳＹＢＲグリーンＩ色素
蛍光色素ＳＹＢＲグリーンＩはＤＮＡ二重らせんの小溝に結合する。溶解状態で、該未結合色素は非常に僅かな蛍光しか示さないが、ＤＮＡと結合すると蛍光が著しく増強される。ＳＹＢＲグリーンＩ色素は非常に安定である（３０サイクルの増幅中に活性の６％が失われるに過ぎない）。
【０１４３】
増幅の開始時には、該反応混合物は変性ＤＮＡ、プライマーおよび該色素を含有する。該未結合色素分子は弱い蛍光を発して、コンピューター解析時に差し引かれる最小バックグラウンド蛍光シグナルを与える。
【０１４４】
該プライマーのアニーリング後、少数の色素分子が該二本鎖に結合しうる。ＤＮＡ結合は、励起後に発光するＳＹＢＲグリーンＩ分子の劇的な増加を引き起こす。
【０１４５】
伸長中は、益々多くの色素分子が、新たに合成されたＤＮＡに結合する。該反応を連続的にモニターすると、蛍光の増加がリアルタイムで示される。次の熱サイクルのために該ＤＮＡを変性させると、該色素分子が遊離し、蛍光シグナルが低下する。
【０１４６】
増幅ＤＮＡの増量をモニターするために、各ＰＣＲサイクルの伸長工程の終了時に蛍光の測定を行う。特異的シグナルを非特異的シグナルから分離するために、蛍光を高温で測定することができる。該非特異的産物は、通常、該特異的産物より遥かに低い温度で融解する。したがって、該特異的断片の融解点付近まで温度を上昇させると、該シグナルの特異性が有意に増強されうる。
【０１４７】
（ｖｉｉ）他のＤＮＡ結合色素／インターカレーション
ＤＮＡ結合色素（そのうちの幾つかはインターカレーターである）は二本鎖ＤＮＡに結合し、また、それより低い度合で一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡに結合する。これらの色素の幾つかがＤＮＡに結合すると、それらの蛍光強度が実質的に増加する。二量体色素は、より高いアフィニティーの点で注目に値する。ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡを検出するためには、ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ染色剤が使用されている。
【０１４８】
他の検出方法は以下の文献に記載されている。
【表２】
2004533805.tif 000007
2004533805.tif 000008
【０１４９】
ＶＩ．ＴａｑＭａｎを使用する定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応
ＴａｑＭａｎおよびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓディビジョン７７００配列検出器（ＰＥ／ＡＢＤ  ７７００）を使用する定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は、サンプル中の特異的ＤＮＡおよびＲＮＡ配列のレベルの測定のための高精度な方法をもたらす。それは、ＰＣＲ産物の増幅中に比例的に生じる蛍光シグナルの検出に基づくものである。
【０１５０】
ＰＥ／ＡＢＤ  ７７００を使用する定量的リアルタイムＰＣＲは、ＰＣＲ産物の増幅中に比例的に生じる蛍光シグナルの検出に基づくものである。化学が、その検出系の鍵となる。プローブは、通常のフォワードプライマーとリバースプライマーとの間の標的配列にアニールするように設計される。該プローブは、５’末端においてレポーター蛍光色素（通常は６−カルボキシフルオレセイン［６−ＦＡＭ］）で、そして任意のＴ位または３’末端において付加されたクエンチャー蛍光色素（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン［ＴＡＭＲＡ］）で標識されている。該プローブは、該プライマーより高いＴｍを有するように設計され、該アッセイが成功するためには、伸長期に、該プローブが１００％ハイブリダイズしていなければならない。両方の蛍光色素が該プローブ上に存在する限り、該クエンチャー分子は該レポーターによる全ての蛍光を阻止する。しかし、Ｔａｑポリメラーゼが該プライマーを伸長させるにつれて、Ｔａｑの固有の５’から３’へのヌクレアーゼ活性が該プローブを分解して、該レポーター蛍光色素を遊離させる。該増幅サイクル中に遊離した蛍光の量は、各サイクルにおいて生成した産物の量に比例する。
【０１５１】
該７７００検出系は、レーザーおよび荷電結合素子（ＣＣＤ）光学系に接続された９６ウェルのサーマルサイクラーよりなる。レンズを介して挿入された光ファイバーが各ウェル上に位置し、レーザー光が該ファイバーを介して導かれて該ＰＣＲ溶液中の蛍光色素を励起する。発光が該ファイバーを介して該ＣＣＤカメラに送られ、ここで、それがソフトウェアのアルゴリズムにより解析される。ついで、収集されたデータがコンピューターに送られる。
【０１５２】
その検出感度は、ＰＣＲ増幅が尚も指数期にある際のデータの収集を可能にする。これは、レポーター色素の発光強度がバックグラウンドノイズより上昇したサイクル番号を同定することにより決定され、このサイクル番号は閾値サイクル（Ｃｔ）と称される。該Ｃｔは、該反応の最も指数関数的な段階で測定され、伝統的なＰＣＲ法で用いられる蓄積ＰＣＲ産物の終点（エンドポイント）測定より信頼しうるものである。該Ｃｔは標的鋳型のコピー数に反比例し、鋳型濃度が高ければ高いほど、測定される閾値サイクルは低くなる。
【０１５３】
この技術を用いた遺伝子配列の定量には多数の利点があり、まず挙げられるのは、感度および精度である。この精密さが存在する理由は、遺伝子配列の定量がＣｔにより測定され、それが該反応の指数期で算出されることにある。データが収集される前に３つのオリゴがＤＮＡにアニールする必要があることにより、高い特異性が得られる。
【０１５４】
競合ＰＣＲは、ＤＮＡまたはＲＮＡを定量するために用いられるもう１つの技術である。競合ＰＣＲの最適化には手間暇がかかる。競合体に対する標的の適当な比率を得るためには、標的配列の希釈度の幾つかを試験する必要があり、標的および競合体の効率は同様のものでなければならない。このアッセイが線形性であるのは、該７７００での定量と比べて非常に短い範囲でしかかない。加工されうるサンプル数も限定因子となる。
【０１５５】
リアルタイムＰＣＲの用途は無数にある。組織中のゲノムＤＮＡまたはウイルスＤＮＡの検出は重要な診断手段でありうる。遺伝子発現は、全ＲＮＡの抽出および逆転写（ＲＴ）工程によるｃＤＮＡの調製の後で測定されうる。設定および解析は簡便であり、伝統的なＰＣＲ技術より容易に臨床環境に拡張適用されうる。
【０１５６】
ＰＣＲ反応の最適化が各プライマーおよびプローブセットに要求される。最適なＭｇ２＋濃度は通常は４〜６ｍＭであるが、時には僅か２ｍＭとなることもある。最適なプライマー濃度は通常は１００〜８００ｎＭである。最適化のためには、一方のプライマーに対する他方のプライマーの濃度を様々に変化させることが必要である。なぜなら、両方の最適濃度は同じでないかもしれないからである。最適なプローブ濃度は僅か５０ｎＭとなることがあり、あるいは２００ｎＭにもなることがある。また、最適なＭｇ２＋濃度およびリバースプライマー濃度をＲＴ工程に適したものにする必要がある。
【０１５７】
該検出系は、１０コピー未満のＤＮＡを検出しうるほどに高感度である。ＤＮＡが抽出されている実験室内でサンプルを調製する場合には、プライマーおよびプローブのエーロゾル汚染が潜在的な問題となる。
【０１５８】
病原体の判定のためには、全核酸を単離する。ＰＣＲ反応において同じリバースプライマーを使用することにより特異的ｃＤＮＡを産生させたり、あるいはランダムヘキサマープライマーを使用して或る範囲のｃＤＮＡ産物を得ることが可能である。ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）からのＲＮＡＥａｓｙおよびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）からのＴｒｉａｚｏｌのようなキットを使用して容易に調製することができる。
【０１５９】
チューブ１本当たり２以上の蛍光色素を使用することによる多重（マルチプレックス）定量ＰＣＲ反応が、内部チューブ対照に利用可能となった。対照としてのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）または１８ＳリボソームＲＮＡのためのキットが入手可能である。これらの２つの蛍光色素は、該プローブ上で使用するレポーターであるＦＡＭと共に使用するのに好ましい。
【０１６０】
コピー数が要求される場合には、プラスミドＤＮＡの標準曲線を作成し、毎回、標的遺伝子配列を含有するサンプルでアッセイすることが可能である。出発分子がＲＮＡである場合には、ｃＲＮＡを調製し、標準体として使用することが可能である。該遺伝子配列を含有するプラスミドからＲＮＡを調製するためには、キットが入手可能である。ｃＲＮＡを調製するためには、典型的には、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プライマーを使用する。得られたｃＲＮＡが、抽出ＲＮＡの混合物中に存在するサンプルＲＮＡと同じ効率で転写され増幅されるか否かを判定するために、ＲＴおよびＰＣＲ反応において該ｃＲＮＡを調べる必要がある。
【０１６１】
他の重要な対照は非増幅対照（ＮＡＣ）および非鋳型対照（ＮＴＣ）である。ＮＡＣはゲノムＤＮＡによるＲＮＡの汚染に関して試験するものである。ＮＴＣはアッセイ試薬の汚染に関して試験するものである。
【０１６２】
いくつかのタイプの反応混合物が入手可能である。ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘは、使用し易い２×溶液中に主要試薬を含有する。ＴａｑＭａｎ  Ｇｏｌｄ  ＲＴ−ＰＣＲキットは１工程または２工程のＲＴ−ＰＣＲを可能にする。１工程法を選択すると、研究者は、チューブを開くことなくＲＴ工程およびＰＣＲ工程を準備することが可能となり、２工程法を選択すると、ＲＴ工程がＰＣＲから分離される。また、分子生物学試薬を提供する多数の他の企業からＮＴＰ、バッファー、Ｍｇ２＋およびＴａｑポリメラーゼのような種々の成分を購入することにより、マスター混合物を調製することができる。
【０１６３】
プライマーおよびプローブは注意深く設計しなければならない。プライマーおよびプローブを選択するために特別に設計されたＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアは、良く設計されたプライマーおよびプローブのための必要パラメーターを考慮する。これらのパラメーターには、プライマーより１０℃高いプローブのＴｍ、５８℃〜６０℃のプライマーのＴｍ、５０〜１５０塩基のアンプリコンサイズ、５’Ｇの不存在、およびプライマーの長さが含まれる。
【０１６４】
ＲＮＡ発現の定量に使用するプライマーおよびプローブの最良の設計のためには、ウイルスの保存領域中に、あるいは遺伝子試験の場合にはイントロンにわたり、プライマーまたはプローブが配置される必要がある。
【０１６５】
ＶＩＩ．キット
また、本発明は、オリゴヌクレオチドの混合物、検出可能なシグナルをウイルス核酸の転写の際に与える少なくとも１つの第１プライマーおよび／またはプローブセット、および第２の検出可能なシグナルを宿主核酸の転写の際に与える少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブセットを含む、効力に関するウイルスアッセイの実施に使用するキットを提供する。
【０１６６】
本発明はまた、オリゴヌクレオチドの混合物、検出可能なシグナルを宿主ミトコンドリア核酸の転写の際に与える少なくとも１つの第１プライマーおよび／またはプローブセット、および第２の検出可能なシグナルを宿主核核酸の転写の際に与える少なくとも１つのプライマーおよび／またはプローブセットを含む、効力に関する毒性アッセイの実施に使用するキットを提供する。
【０１６７】
特に、該キットは、該プライマーが配列番号１および２により与えられ、該プローブが蛍光色素および消光色素と共に配列番号３により与えられる配列である、宿主核酸用のプライマー／プローブセットを含む。
【０１６８】
特に、該キットは、該プライマーが配列番号４および５により与えられ、該プローブが蛍光色素および消光色素と共に配列番号６により与えられる配列である、ＨＩＶ−１のウイルス核酸用のプライマー／プローブセットを含む。
【０１６９】
特に、該キットは、該プライマーが配列番号７および８により与えられ、該プローブが蛍光色素および消光色素と共に配列番号９により与えられる配列である、ＨＣＶのウイルス核酸用のプライマー／プローブセットを含む。
【０１７０】
特に、該キットは、該プライマーが配列番号１０および１１により与えられ、該プローブが蛍光色素および消光色素と共に配列番号１２により与えられる配列である、ＢＶＤＶのウイルス核酸用のプライマー／プローブセットを含む。
【０１７１】
特に、該キットは、該プライマーが配列番号１３および１４により与えられ、該プローブが蛍光色素および消光色素と共に配列番号５により与えられる配列である、ＨＢＶのウイルス核酸用のプライマー／プローブセットを含む。
【０１７２】
特に、該キットは、該プライマーが配列番号１６および１７により与えられ、該プローブが蛍光色素および消光色素と共に配列番号１８により与えられる配列である、ＲＳＶのウイルス核酸用のプライマー／プローブセットを含む。
【０１７３】
特に、該キットは、該プライマーが配列番号１９および２０により与えられ、該プローブが蛍光色素および消光色素と共に配列番号２１により与えられる配列である、ＲＳＶのウイルス核酸用のプライマー／プローブセットを含む。
【０１７４】
以下の節で本発明を更に詳しく説明する。その節に含まれる実施例は、本発明の理解を助けるために記載されている。以下の実施例は本発明の方法および産物を例示するものであり、この節は、特許請求の範囲に記載の発明を何ら限定するものではなく、本発明を限定すると解釈されるべきではない。該方法の全般的範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の特定の溶媒、試薬または反応条件の代わりに、同等な、類似した又は適当な溶媒、試薬または反応条件を用いることが可能である。
【０１７５】
（実施例）
実施例１
ＨＩＶ−１細胞培養
ヒトＰＢＭＣ（１×１０６細胞／Ｔ２５フラスコ）をＰＨＡで２日間刺激し、それに感受性（ｘｘＢＲＵ）または３ＴＣ−耐性（１８４Ｖ）ＨＩＶ−１株を１００  ＴＣＩＤ５０で感染させた。系列１−ｌｏｇ希釈の試験抗ウイルス化合物の存在下、該培養を５日間維持した。ついで遠心分離（１０分間，４００×ｇ，４℃）によりヒトＰＢＭＣを該培養上清から除去した。この清澄化上清をＲＴアッセイまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて試験した。
【０１７６】
実施例２
逆転写（ＲＴ）アッセイ
培養上清の１ｍｌ  アリコート中に存在するウイルス粒子を遠心分離（２時間，２０，０００×ｇ，４℃）により濃縮した。２時間の遠心後、上清流体を完全に除去し、該ウイルスペレットを１００μＬのウイルス可溶化バッファー（Ｖｉｒｕｓ  Ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）（ＶＳＢ：０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００；０．８Ｍ  ＮａＣｌ，０．５Ｍ  フェニルメチルスルホニル，２０％  グリセロール，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．８）中に分注した。ＲＴ−ＶＳＢの１０μＬ  アリコートを７５μＬのＲＴ反応混液（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ｐＨ７．８，１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，６ｍＭ  ＤＴＴ，６μｇ／ｍＬ  ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ），１．２ｍＭ  ｄＡＴＰおよび８０μＣｉ／ｍＬ  Ｈ３−ＴＴＰ）と混合し、３７℃で２時間インキュベートした。ついで１００μＬの１０％  ＴＣＡを加え、取込まれたＨ３−ＴＴＰの全量を計数した。
【０１７７】
実施例３
ＲＴ−ＰＣＲのプライマーおよびプローブの評価
ＴａｑＭａｎプローブおよびプライマーを、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）を使用することにより設計した。該プローブおよびプライマーは、ＨＩＶ−１  ＲＮＡ中に存在するＤＮＡ配列に相補的な高度に保存された配列を含む。若干の可変性しか含有しない領域に関してＭ群の種々の遺伝子型を走査することにより、保存ドメインを見出した。その結果、コドン２００〜２８０のＨＩＶ−１  ＲＴドメイン中の領域が、要求される基準を満足し、したがって、この領域を、リアルタイムＰＣＲ（「ＲＴ−ＰＣＲ」）において機能しうるプライマーおよびプローブの適当なセットを設計するために使用した。プライマー配列は以下のとおりである：センス  ５’−ＴＧＧＧＴＴＡＴＧＡＡＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号）および５’−ＴＧＴＣＡＴＴＧＡＣＡＧＴＣＣＡＧＣＴＧＴＣＴ−３’（配列番号）。該プローブ配列は、５’−蛍光色素−ＴＴＴＣＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＡＴＡＧＧＣＴＧＴＡＣＴＧＴＣＣＡＴＴ−消光色素−３’（配列番号）である。この特定の場合においては、該プローブを５’末端においてＦＡＭで標識し、消光分子は、３’末端に付与されるＴＡＭＡＲＡである。レポーター色素とクエンチャー（消光）色素との任意の他の組合せも用いることが可能である。
【０１７８】
該プライマーおよびプローブセットは、培養ウイルスの系列１−ｌｏｇ希釈上で試験した場合、６ｌｏｇにわたる直線範囲を与えた。このプライマー／プローブセットを、ＦＤＡにより承認されたウイルス負荷測定方法で評価するために、臨床ＨＩＶ−１遺伝子型Ｂ分離体（高いウイルス負荷を得るためにインビトロで弱毒化されている）の１−ｌｏｇ希釈系列を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲおよびＲｏｃｈｅ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＩＶ−１  Ｍｏｎｉｔｏｒにより試験した（図１）。この実験においては、１０−６希釈サンプルが閾値サイクル（Ｃｔ＝３５．５２）（これは、ＲｏｃｈｅモニターＨＩＶ−１バージョンＩＩアッセイにおける１４１０コピー／ｍＬに対応する）において陽性になった。ウイルスの３  ｌｏｇのダイナミックレンジにわたり正当性を確認したところ、それらの２つの方法の間には完全な相関性が認められ（図１）、該リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイは、１４１コピー／ｍＬ（Ｃｔ＝３８．８５）の、より低い検出限界を有していた。
【０１７９】
実施例４
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ
該リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ技術を、ＮＡＳＢＡ  ＨＩＶ−１ウイルス負荷アッセイと比較して評価した。前記のとおりの設計されたプローブおよびプライマーを使用して、ＨＩＶ−１核酸配列を増幅した。該培養上清中に存在するウイルスＲＮＡを、商業的に入手可能なカラム（ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を使用して調製した。該増幅反応混合物を５０℃で２分間、ついで９５℃で１０分間インキュベートした。ついで、９５℃で１５分間、ついで６０℃で６０秒間の２工程増幅反応の４０サイクルを用いて、該混合物を増幅した。増幅されたウイルスＤＮＡへのプローブのハイブリダイゼーションの後の消光蛍光プローブ分子の分解から生じた蛍光シグナルの増加をモニターすることにより、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで増幅されたＲＮＡをリアルタイムで検出した（ＴａｑＭａｎ  ７７００  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）。
【０１８０】
製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）が記載している試薬および条件を用いて、合計５μＬのＲＮＡをＲＴ増幅した。標準曲線は１．４１×１０２コピー／ｍＬ〜１．４１×１０８コピー／ｍＬ以上の範囲にわたるものであった。Ｒｏｃｈｅ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＩＶ−１  Ｍｏｎｉｔｏｒ  ｔｅｓｔ（商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）またはＮＡＳＢＡ  ＨＩＶ−１ウイルス負荷アッセイ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｋａ）を使用して、ウイルスコピー数を較正（検量）した。
【０１８１】
３  ｌｏｇ（５×１０３〜５×１０６コピー／ｍＬ）の範囲にわたりＨＩＶ−１（遺伝子型Ｂ）を含有するサンプルを、両方の方法で試験した。それらの２つの方法の間の相関性を図２に示す。試験したすべてのサンプルは９５％信頼区間内にあると認められ、２つのサンプルのみが９９％信頼区間から外れた。本発明で設計されたプライマーおよびプローブセットは、臨床サンプルおよびＨＩＶ−１インビトロウイルス調製物の両方の信頼しうる定量を可能にしたと結論づけることができる。該リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、１４１コピー／ｍＬの、より低い検出限界を有し、６−ｌｏｇのウイルス希釈にわたり線形性を示した。
【０１８２】
実施例５
最適化
ＰＣＲ反応の最適化が各プライマーおよびプローブセットに要求される。最適なＭｇ２＋濃度は通常は４〜６ｍＭであるが、時には僅か２ｍＭとなることもある。最適なプライマー濃度は通常は１００〜８００ｎＭである。最適化のためには、一方のプライマーに対する他方のプライマーの濃度を様々に変化させることが必要である。なぜなら、両方の最適濃度は同じでないかもしれないからである。最適なプローブ濃度は僅か５０ｎＭとなることがあり、あるいは２００ｎＭにもなることがある。また、最適なＭｇ２＋濃度およびリバースプライマー濃度をＲＴ工程に適したものにする必要がある。
【０１８３】
潜在的な汚染
該検出系は、１０コピー未満のＤＮＡを検出しうるほどに高感度である。ＤＮＡが抽出されている実験室内でサンプルを調製する場合には、プライマーおよびプローブのエーロゾル汚染が潜在的な問題となる。
【０１８４】
サンプルの調製
病原体の判定のためには、全核酸を単離する。ＰＣＲ反応において同じリバースプライマーを使用することにより特異的ｃＤＮＡを産生させたり、あるいはランダムヘキサマープライマーを使用して或る範囲のｃＤＮＡ産物を得ることが可能である。ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）からのＲＮＡＥａｓｙおよびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）からのＴｒｉａｚｏｌのようなキットを使用して容易に調製することができる。
【０１８５】
対照
チューブ１本当たり２以上の蛍光色素を使用することによる多重（マルチプレックス）定量ＰＣＲ反応が、内部チューブ対照に利用可能となった。対照としてのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）または１８ＳリボソームＲＮＡのためのキットが入手可能である。これらの２つの蛍光色素は、該プローブ上で使用するレポーターであるＦＡＭと共に使用するのに好ましい。
【０１８６】
コピー数が要求される場合には、プラスミドＤＮＡの標準曲線を作成し、毎回、標的遺伝子配列を含有するサンプルでアッセイすることが可能である。出発分子がＲＮＡである場合には、ｃＲＮＡを調製し、標準体として使用することが可能である。該遺伝子配列を含有するプラスミドからＲＮＡを調製するためには、キットが利用可能である。ｃＲＮＡを調製するためには、典型的には、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６プライマーを使用する。得られたｃＲＮＡが、抽出ＲＮＡの混合物中に存在するサンプルＲＮＡと同じ効率で転写され増幅されるか否かを判定するために、ＲＴおよびＰＣＲ反応において該ｃＲＮＡを調べる必要がある。
【０１８７】
他の重要な対照は非増幅対照（ＮＡＣ）および非鋳型対照（ＮＴＣ）である。ＮＡＣはゲノムＤＮＡによるＲＮＡの汚染に関して試験するものである。ＮＴＣはアッセイ試薬の汚染に関して試験するものである。
【０１８８】
反応混合物
いくつかのタイプの反応混合物が入手可能である。ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘは、使用し易い２×溶液中に主要試薬を含有する。ＴａｑＭａｎ  Ｇｏｌｄ  ＲＴ−ＰＣＲキットは１工程または２工程のＲＴ−ＰＣＲを可能にする。１工程法を選択すると、研究者は、チューブを開くことなくＲＴ工程およびＰＣＲ工程を準備することが可能となり、２工程法を選択すると、ＲＴ工程がＰＣＲから分離される。また、分子生物学試薬を提供する多数の他の企業からＮＴＰ、バッファー、Ｍｇ２＋およびＴａｑポリメラーゼのような種々の成分を購入することにより、マスター混合物を調製することができる。
【０１８９】
プライマーおよびプローブの設計
プライマーおよびプローブは注意深く設計しなければならない。プライマーおよびプローブを選択するために特別に設計されたＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアは、良く設計されたプライマーおよびプローブのための必要パラメーターを考慮する。これらのパラメーターには、プライマーより１０℃高いプローブのＴｍ、５８℃〜６０℃のプライマーのＴｍ、５０〜１５０塩基のアンプリコンサイズ、５’Ｇの不存在、およびプライマーの長さが含まれる。
【０１９０】
ＲＮＡ発現の定量に使用するプライマーおよびプローブの最良の設計のためには、ウイルスの保存領域中に、あるいは遺伝子試験の場合にはイントロンにわたり、プライマーまたはプローブが配置される必要がある。
【０１９１】
リアルタイムＰＣＲのためのプロトコールは、当技術分野で公知の任意の手段により達成されうる。例えば、以下を参照されたい。
【表３】
2004533805.tif 000009
2004533805.tif 000010
2004533805.tif 000011
2004533805.tif 000012
2004533805.tif 000013
【０１９２】
実施例６
ＨＩＶ−１に関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ
ヒトＰＢＭ細胞を使用して、ＨＩＶ−１粒子を培養した。商業的に入手可能なカラム（ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を使用して、該培養上清中に存在するウイルスＲＮＡを調製した。ＲＴ−ＰＣＲにより増幅されたＲＮＡを、蛍光シグナルの増加をモニターすることによりリアルタイムで検出した。製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）が記載している試薬および条件を用いて、合計５ＬのＲＮＡをＲＴ増幅した。標準曲線は１．４１×１０２コピー／ｍＬ〜１．４１×１０８コピー／ｍＬ以上の範囲にわたるものであった。Ｒｏｃｈｅ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＩＶ−１  Ｍｏｎｉｔｏｒ  ｔｅｓｔ（商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）またはＮＡＳＢＡ  ＨＩＶ−１ウイルス負荷アッセイ（Ｏｒｇａｎｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｋａ）を使用して、コピー数を較正（検量）した。相関係数は、すべての実験において、０．９９を超えている（図１）。
【０１９３】
実施例７
ＨＣＶに関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ
現在のところ、ＨＣＶ  ＲＮＡの複製のための唯一の信頼しうる且つ入手可能な系は、Ｈｕｈ７細胞におけるレプリコン系である。該細胞を数日間培養し、該培養内に存在する全ＲＮＡを、商業的に入手可能なカラム（ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を使用して調製した。ＲＴ−ＰＣＲにより増幅されたＲＮＡを、蛍光シグナルの増加をモニターすることによりリアルタイムで検出した。製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）が記載している試薬および条件を用いて、合計５ＬのＲＮＡをＲＴ増幅した。標準曲線は４５  ＩＵ／ｍＬ〜４．７×１０７  ＩＵ／ｍＬ以上の範囲にわたるものであった。Ｒｏｃｈｅ  Ａｍｐｌｉｃｏｒ  ＨＣＶ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  ｔｅｓｔ（商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ）を使用して、コピー数を較正（検量）した。相関係数は、すべての実験において、０．９９を超えている（図２）。
【０１９４】
実施例８
ＨＢＶに関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ
ＨＢＶウイルス粒子は、少なくとも３つの異なる細胞系（ＨｅｐＧ２．２．１．５、ＨＥＰＡＤ３８およびＨｅｐＡＤ７９細胞系）から放出される。該細胞を数日間培養し、該培養上清中または該細胞中に存在する全核酸を、商業的に入手可能なカラム（ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を使用して調製した。ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡを、蛍光シグナルの増加をモニターすることによりリアルタイムで検出した。製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）が記載している試薬および条件を用いて、合計５ＬのＤＮＡをＲＴ増幅した。標準曲線は２コピー〜２×１０７  コピー／反応混合物以上の範囲にわたるものであった。ＨＢＶ標準体から得たＯＤ２６０値から、コピー数を計算した。相関係数は、すべての実験において、０．９９を超えている。
【０１９５】
実施例９
ＢＶＤＶに関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ
ＢＶＤＶウイルス粒子は、ＭＤＢＫ細胞上で株ＮＡＤＬ（共にＡＴＣＣから入手可能である）を使用する感染実験から放出される。感染後、該細胞を数日間培養し、該培養上清中または該細胞中に存在する全核酸を、商業的に入手可能なカラム（ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を使用して調製した。ＲＴ−ＰＣＲにより増幅されたＲＮＡを、蛍光シグナルの増加をモニターすることによりリアルタイムで検出した。製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）が記載している試薬および条件を用いて、合計５ＬのＤＮＡをＲＴ増幅した。標準曲線は０．６プラーク形成単位〜６×１０３  プラーク形成単位／反応混合物以上の範囲にわたるものであった。プラーク形成単位は、伝統的なプラークアッセイから求めた。相関係数は、すべての実験において、０．９９を超えている。
【０１９６】
実施例１０
ＲＳＶに関するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲアッセイ
ＲＳＶウイルス粒子は、臨床サンプルに由来する入手可能なウイルス株をＡ５４９またはＨｅｐ２細胞上で使用する感染実験から放出される。感染後、該細胞を数日間培養し、該培養上清中または該細胞中に存在する全核酸を、商業的に入手可能なカラム（ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を使用して調製した。ＲＴ−ＰＣＲにより増幅されたＲＮＡを、蛍光シグナルの増加をモニターすることによりリアルタイムで検出した。製造業者（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）が記載している試薬および条件を用いて、合計５ＬのＤＮＡをＲＴ増幅した。標準曲線は７０プラーク形成単位〜７×１０３  プラーク形成単位／ｍＬ以上の範囲にわたるものであった。プラーク形成単位は、伝統的なプラークアッセイから求めた。相関係数は、すべての実験において、０．９９を超えている。Ｈｅｐ２細胞は、７２時間のインキュベーションの後に最高のウイルス力価を与え、細胞の使用量は１０，０００〜５０，０００細胞／ウェルと様々であったが、７２時間の時点でのウイルス産生の全量における相違は認められなかった。
【０１９７】
実施例１１
ヒトミトコンドリアＤＮＡおよびβ−アクチンＤＮＡに関するリアルタイムＰＣＲアッセイ
本発明は、ミトコンドリア毒性試験のためのこれらの２つの遺伝子標的の増幅を含む。したがって、ミトコンドリアおよび核の両方のＤＮＡまたはＲＮＡのためのプライマーおよび蛍光プローブのセットを設計した。
【０１９８】
この方法の一例として、第１工程において、１０μＭの１組の候補抗ウイルス剤の存在下、ＨｅｐＧ２細胞を培養内に維持する。ついで、商業的に入手可能なカラム（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）を使用して、全ＤＮＡを、培養されたＨｅｐＧ２細胞から単離する。全ＤＮＡを２００Ｌの水中でカラムから溶出した。ついで該ミトコンドリア遺伝子および核遺伝子を、適当なプライマーおよびプローブを使用する定量的リアルタイムＰＣＲプロトコールで増幅する。定量的ＰＣＲにおいて使用する試薬および条件はＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。
【０１９９】
別の実験において、両方の標的の増幅効率を評価した。希釈された全細胞ＤＮＡを使用して作成した標準曲線は、４  ｌｏｇにわたり線形性を示した［図３］。さらに、図３は、ΔＣｔ（Ｃｔβアクチン−Ｃｔミトコンドリア；Ｃｔ＝サンプルが検出可能になったＰＣＲサイクル閾値）に対する投入量の傾きの値が０．１未満であるため、標的および参照増幅の効率がほぼ等しいことを示している。
【０２００】
正確な定量を得るためには少なくとも２つの方法がある。１つの方法は標準曲線を使用するものであり、もう１つの方法は比較サイクル閾値法として公知である。それらの２つの方法の基礎は、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＵｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２に説明されている。標的であるミトコンドリア内および核内内因性対照遺伝子は共に、記載されているプライマー−プローブセットを使用して、ほぼ同じ効率で増幅されるため、どちらの方法も、抗ウイルス剤により誘発されるミトコンドリア毒性を測定するために用いることが可能である。好ましくは、比較Ｃｔ法を用いる。この方法は、相対的定量に関して、標準曲線法により得られたのと同じ結果を得るために数式を使用する（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２；ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを参照されたい）。この数式においては、標的（ミトコンドリアＤＮＡ）の量が較正体（核遺伝子）に対して正規化され、内因性参照体（実験の計画に応じて第７または１４日における無薬物対照）と関連づけられる。この数式は２−Ｃｔで与えられる。
【０２０１】
抗ウイルス化合物がミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼγに対して抑制効果を与えるか否かを見出すために、ミトコンドリアＣＯＸＩＩ遺伝子および核アクチン遺伝子を同時に増幅した。２つの抗ウイルス化合物（−）−ＦＴＣおよびＤ−ＤＤＣの相対ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼγ毒性を幾つかの候補新規抗ウイルス化合物と比較した。図４は、これらの抗ウイルス剤に関して得た結果を示す。（−）−ＦＴＣは、該無薬物対照と比較して、有意なミトコンドリアＤＮＡの減少を何ら誘発しないことが、この図から明らかである。その代わりに、１および１０μＭ濃度のＤ−ＤＤＣに関して重要な相違が観察された。ＤＤＣの場合におけるミトコンドリアＤＮＡの観察された減少は、分子毒性学における２以上の異なる標的の同時増幅の有用性を例示している。
【０２０２】
また、この技術を定量的逆転写ＰＣＲプロトコールにおいて行った場合にも、同様の結果が得られた。このアプローチは、核ＲＮＡポリメラーゼＩ（主としてｒＲＮＡ転写産物を産生する）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（主としてｍＲＮＡ転写産物を産生する）またはそれらより重要性は低いがＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（主としてｔＲＮＡ転写産物を産生する）に対する場合と比較して、ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼに対する抗ウイルス化合物の潜在的抑制を測定するものである。そのような結果を得るためには、ｒＲＮＡまたはアクチンｍＲＮＡ（較正体として）の増幅が必要である。これらの実験において並びに関連核ＲＮＡポリメラーゼ転写産物に対する較正および未処理に対する正規化の後、ＤＤＣはまた、ミトコンドリアＲＮＡレベルの有意な減少を示したが、（−）ＦＴＣはＣＯＸＩＩ  ＲＮＡレベルに影響を及ぼさなかった。
【０２０３】
このアプローチは、任意の細胞型において試験される任意の候補抗ウイルス化合物の分子毒性レベルを評価するために用いることが可能である。
【０２０４】
全ＤＮＡを、商業的に入手可能なカラム（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）により培養ＨｅｐＧ２細胞から単離する。全ＤＮＡは、２００μＬの水中でカラムから溶出した。ついで、適当なプローブおよびプローブを使用して、該ミトコンドリア遺伝子および核遺伝子を定量的リアルタイムＰＣＲプロトコールで増幅する。核およびミトコンドリアの両方のＤＮＡまたはＲＮＡのためのプライマーおよび蛍光プローブのセットを設計した。内因性対照ＤＮＡプライマーセットは、５’−ＧＣＧ  ＣＧＧ  ＣＴＡ  ＣＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡ−３’（配列番号）および５’−ＴＣＴ  ＣＣＴ  ＴＡＡ  ＴＧＴ  ＣＡＣ  ＧＣＡ  ＣＧＡ  Ｔ−３’（配列番号）で示される。ミトコンドリアＤＮＡプライマーセットは、５’−ＴＧＣ  ＣＣＧ  ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＴＣＣ  ＴＡ−３’（配列番号）および５’−ＴＣＧ  ＴＣＴ  ＧＴＴ  ＡＴＧ  ＴＡＡ  ＡＧＧ  ＡＴＧ  ＣＧＴ−３’（配列番号）で示される。核遺伝子用のプローブは、５’−蛍光色素−ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＧＧＣ  ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＧＧＡ−蛍光クエンチャー−３’（配列番号）で示される。ミトコンドリアゲノム用の蛍光標識プローブは、５’−蛍光色素−ＴＣＣ  ＴＣＡ  ＴＣＧ  ＣＣＣ  ＴＣＣ  ＣＡＴ  ＣＣＣ−蛍光クエンチャー−３’（配列番号）で示される。定量的ＰＣＲにおいて使用した試薬および条件はＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。
【０２０５】
希釈された全細胞ＤＮＡを使用して作成した標準曲線は、４  ｌｏｇにわたり線形性を示した［図４］。さらに、図４は、ΔＣｔ（Ｃｔβアクチン−Ｃｔミトコンドリア；Ｃｔ＝サンプルが検出可能になったＰＣＲサイクル閾値）に対する投入量の傾きの値が０．１未満であるため、標的および参照増幅の効率がほぼ等しいことを示している。
【０２０６】
正確な定量を得るためには少なくとも２つの方法がある。１つの方法は標準曲線を使用するものであり、もう１つの方法は比較サイクル閾値法として公知である。それらの２つの方法の基礎は、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＵｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２に説明されている。標的であるミトコンドリア内および核内内因性対照遺伝子は共に、記載されているプライマー−プローブセットを使用して、ほぼ同じ効率で増幅されるため、どちらの方法も、抗ウイルス剤により誘発されるミトコンドリア毒性を測定するために用いることが可能である。好ましくは、比較Ｃｔ法を用いる。この方法は、相対的定量に関して、標準曲線法により得られたのと同じ結果を得るために数式を使用する（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２；ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを参照されたい）。この数式においては、標的（ミトコンドリアＤＮＡ）の量が較正体（核遺伝子）に対して正規化され、内因性参照体（実験の計画に応じて第７または１４日における無薬物対照）と関連づけられる。この数式は２−ΔΔＣｔで与えられる。
【０２０７】
実施例１２
ＨＣＶ  ＲＮＡおよび細胞標的の同時増幅
ＨＣＶレプリコンを保持するＨｕｈ７細胞は、１０％  ウシ胎仔血清、１×非必須アミノ酸、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｇｌｕ（それぞれ、１００単位／リットル、１００マイクログラム／リットルおよび２．９２ｍｇ／リットル）および５００〜１０００マイクログラム／ミリリットル  Ｇ４１８を含有するＤＭＥＭ培地（高グルコース、無ピルビン酸）中で培養することができる。以下のとおりに、Ｇ４１８を含有しない同じ培地中で抗ウイルススクリーニングアッセイを行うことができる。細胞を対数増殖期に維持するためには、細胞を９６ウェルプレートに低密度（例えば、１０００細胞／ウェル）で播く。該細胞を播いた直後に、該試験化合物を加え、インキュベーター中、３７℃で３〜７日間インキュベートする。ついで培地を除去し、該細胞を全核酸抽出（レプリコンＲＮＡおよび宿主ＲＮＡを含む）のために調製する。ついでレプリコンＲＮＡをＱ−ＲＴ−ＰＣＲプロトコールで増幅し、それに従い定量する。レプリコンＲＮＡの定量における観察された相違が、該試験化合物の抗ウイルス効力を表すための１つの方法である。典型的な実験は、陰性対照において及び非活性化合物の場合において、比較しうる量のレプリコンが産生されることを示している。このように結論づけることができるのは、両方の場合におけるＨＣＶ  ＲＴ−ＰＣＲに関する測定された閾値サイクルが互いに近いからである。そのような実験において、化合物の抗ウイルス有効性を表すための１つの方法は、該試験化合物の閾値ＲＴ−ＰＣＲサイクルを陰性対照の平均閾値ＲＴ−ＰＣＲサイクルで差し引くことである。この値はデルタＣｔ（Ｃｔ）と称される。３．３のＣｔは、レプリコン産生における１−ｌｏｇの減少（ＥＣ９０に等しい）に等しい。１．５Ｃｔ値より大きな、より好ましくは、２Ｃｔ値（レプリコンＲＮＡの７５％の減少）より大きなＨＣＶレプリコンＲＮＡレベルの減少を引き起こす化合物は、抗ウイルス療法のための候補化合物である。しかし、このＨＣＶ  Ｃｔ値は、レプリコンコード化ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに関するいずれの特異性パラメーターをも含まない。典型的な場合には、化合物は、宿主ＲＮＡポリメラーゼ活性およびレプリコンコード化ポリメラーゼ活性の両方を減少させうるであろう。したがって、ｒＲＮＡ（または任意の他の宿主ＲＮＡポリメラーゼＩ産物）またはβ−アクチンｍＲＮＡ（または任意の他の宿主ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）の定量および無薬物対照のＲＮＡレベルとの比較が、宿主ＲＮＡポリメラーゼに対する試験化合物の効果の相対的測定となる。
【０２０８】
ＨＣＶ  ΔＣｔデータおよびｒＲＮＡ  ΔＣｔの両方が入手可能であれば、特異性パラメーターを導くことができる。このパラメーターは、両方のΔＣｔ値をお互いから差し引くことにより得られる。これはΔΔＣｔ値を与え、０を超える値は、該レプリコンコード化ポリメラーゼに対して、より抑制性の効果が存在することを意味し、０未満のΔΔＣｔ値は、該宿主ｒＲＮＡレベルが該レプリコンレベルより影響されることを意味する。この技術の一例として、ΔΔＣｔ値として表された試験化合物の抗ウイルス活性を図５に示す。一般則としては、２を超えるΔΔＣｔ値は、無薬物処理対照と有意に異なるとみなされ、したがって、更なる評価のために関心が持たれる化合物である。しかし、２未満のΔΔＣｔ値を有するが限られた分子細胞毒性データ（０〜２のｒＲＮＡ  ΔＣＴ）しか示さない化合物も、更なる評価のための見込みのある活性候補化合物である。
【０２０９】
もう１つの典型的な場合には、化合物は、宿主ＲＮＡポリメラーゼ活性を減少させうるが、宿主ＤＮＡポリメラーゼ活性を減少させないであろう。したがって、ｒＤＮＡまたはβ−アクチンＤＮＡ（または任意の他の宿主ＤＮＡ断片）の定量および無薬物対照のＤＮＡレベルとの比較が、細胞ＤＮＡポリメラーゼに対する試験化合物の抑制効果の相対的測定となる。ＨＣＶ  ΔＣｔデータおよびｒＤＮＡ  ΔＣｔの両方が入手可能であれば、特異性パラメーターを導くことができる。このパラメーターは、両方のΔＣｔ値をお互いから差し引くことにより得られる。これはΔΔＣｔ値を与え、０を超える値は、該レプリコンコード化ポリメラーゼに対して、より抑制性の効果が存在することを意味し、０未満のΔΔＣｔ値は、該宿主ｒＤＮＡレベルが該レプリコンレベルより影響されることを意味する。一般則としては、２を超えるΔΔＣｔ値は、無薬物処理対照と有意に異なるとみなされ、したがって、更なる評価のために関心が持たれる化合物である。しかし、２未満のΔΔＣｔ値を有するが限られた分子細胞毒性データ（０〜２のｒＤＮＡ  ΔＣＴ）しか示さない化合物も、更なる評価のための見込みのある活性候補化合物である。
【０２１０】
定量的リアルタイムＰＣＲ抗ウイルススクリーニングは、以下の場合において核ＲＮＡ標的（ＲＴ−ＰＣＲの場合）に関する較正と組合せることができる。抗ＨＣＶ化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正またはアクチンｍＲＮＡ較正、または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗ＨＩＶ化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、アクチンｍＲＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗ＨＢＶ化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、アクチンｍＲＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗ＲＳＶ化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、アクチンｍＲＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗ＢＶＤＶ化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、アクチンｍＲＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗レンチウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、アクチンｍＲＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗フラビウイルス科（フラビウイルス属、ヘパシウイルス属、ペスチウイルス属）ウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、アクチンｍＲＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗ヘパドナウイルス科ウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、アクチンｍＲＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗ピコナウイルス科ウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、アクチンｍＲＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗ヘルペトウイルス科ウイルス（ＨＳＶ、ＨＣＭＶ、ＥＢＶ）化合物のスクリーニングは、ｒＲＮＡ較正、アクチンｍＲＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。
【０２１１】
定量的リアルタイムＰＣＲ抗ウイルススクリーニングは、以下の条件において核ＤＮＡ標的（ＰＣＲの場合）に関する較正と組合せることができる。抗ＨＣＶ化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、またはアクチンＤＮＡ較正、または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗ＨＩＶ化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、アクチンＤＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗ＨＢＶ化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、アクチンＤＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗ＲＳＶ化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、アクチンＤＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗ＢＶＤＶ化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、アクチンＤＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗レンチウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、アクチンＤＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗フラビウイルス科（フラビウイルス属、ヘパシウイルス属、ペスチウイルス属）ウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、アクチンＤＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗ヘパドナウイルス科ウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、アクチンＤＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗ピコナウイルス科ウイルス化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、アクチンＤＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。抗ヘルペトウイルス科ウイルス（ＨＳＶ、ＨＣＭＶ、ＥＢＶ）化合物のスクリーニングは、ｒＤＮＡ較正、アクチンＤＮＡ較正または任意の他の核内もしくはミトコンドリア内遺伝子較正と組合せることができる。
【０２１２】
実施例１３
毒性アッセイ
ＨｅｐＧ２、ＶＥＲＯ（５×１０３細胞／ウェル）、ＣＥＭ（２．５×１０３／ウェル）およびＰＢＭＣ（５×１０４／ウェル）を、漸増量の試験化合物の存在下、９６ウェルプレートに播き、３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベーター中でインキュベートした。３日間またはＣＥＭについては４日間、ＰＢＭＣについては５日間のインキュベーションの後、細胞生存性およびミトコンドリア活性を、ＭＴＳまたはＭＴＴ色素（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）を使用する比色アッセイにおいて測定した。
【０２１３】
実施例１４
抗ウイルスＲＴ−ＰＣＲ対ＲＴアッセイ
２つのＨＩＶ−１ウイルス株（１８４Ｖ突然変異を有する３ＴＣ耐性ウイルス株および感受性株ｘｘＢＲＵ）に対して、２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロ−４’−チオ−シチジン［「ｄ４−２’−Ｆ−（４Ｓ−ペンテニル）−Ｃ」］のβ−Ｌおよびβ−Ｄ類似体を、ＦＤＡにより現在承認されている又は臨床試験中である抗ウイルス剤（例えば、ＡＺＴ、３ＴＣ、ｄ４Ｔおよび（−）−ＦＴＣ）の選択と比較した。ヒトＰＢＭＣを２日間にわたりＰＨＡで刺激し、ＨＩＶ−１に感染させ、種々の濃度の試験化合物の存在下で５日間にわたり培養内に維持した。ついで培養上清を清澄化し、２つの別々の方法により逆転写活性に関して試験した。第１の方法は、トリチウム標識ＴＴＰを取り込ませることによる、ｌｏｇ計数／分／ｍＬ（ＣＰＭ／ｍＬ）で表示される標準的な内因性ウイルスＲＴアッセイである。第２の方法は、本明細書に開示されているＲＴ−ＰＣＲ法であり、ｌｏｇコピー数／ｍＬで表示されるリアルタイムＰＣＲ定量アッセイを用いるＨＩＶ−１ウイルス負荷の定量方法である。図３は、両方のウイルス株に対する試験化合物のいくつかの結果を示す。それらの２つの方法は異なる項目（ウイルスＲＮＡ対活性ＲＴ酵素）を測定するものであるが、結果は互いに有意には異ならなかった（図３、表１）。半有効抗ウイルス濃度（ＥＣ５０）および９０％有効抗ウイルス濃度（ＥＣ９０）は、用いた２つの方法において合致した。
【０２１４】
この系における野生型ｘｘＢＲＵウイルス産生は非常に高く、未処理サンプルにおいては合計３×１０８コピー／ｍＬまでになった。該培地に抗ウイルス化合物を加えると、ウイルス産生の用量依存的減少が観察された。ウイルスの抑制の最大効果。
【０２１５】
【表４】
2004533805.tif 000014
【０２１６】
実施例１５
ＭＴＳ／ＭＴＴ毒性およびリアルタイムＰＣＲミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼ毒性
ミトコンドリア毒性（γ−ＤＮＡポリメラーゼ抑制）を、比較サイクル閾値（Ｃｔ）法を用いてリアルタイムＰＣＲにより評価した。β−アクチンを内因性参照体として使用した。すべての化合物は通常のＭＴＴまたはＭＴＳ毒性アッセイ（材料および方法）において試験した。これらの化合物がミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼγに対する抑制効果を有するか否かを見出すために、ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼ毒性に関するリアルタイムＰＣＲ技術を設計した。第１工程において、１−ｌｏｇ希釈全ＨｅｐＧ２  ＤＮＡを使用して標準曲線を作成し、それは少なくとも４  ｌｏｇにわたり線形性を示した（これらの標的に関しては４−ｌｏｇのみを試験した）。図４は、ΔＣｔ（Ｃｔβアクチン−Ｃｔミトコンドリア；ここで、Ｃｔは、サンプルが検出可能になったＰＣＲサイクル閾値である）に対する投入量の傾きの値が０．１未満であるため、標的および参照増幅の効率がほぼ等しいことを示している。
【０２１７】
さらに、抗ウイルス化合物の存在下で培養したＨｅｐＧ２細胞から全ＤＮＡを単離した。ついで該ミトコンドリア遺伝子および該β−アクチン遺伝子を増幅した。正確な定量を得るためには少なくとも２つの方法がある。１つの方法は標準曲線を使用するものであり、もう１つの方法は比較サイクル閾値法として公知である（Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ＃２；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＣＡ）。両方の標的（ミトコンドリアおよびβ−アクチン）、記載されているプライマー−プローブセットを使用して、ほぼ同じ効率で増幅されるため、どちらの方法も、抗ウイルス剤により誘発されるミトコンドリア毒性を測定するために用いることが可能である。本発明者らの実験においては、比較Ｃｔ法を用いた。この方法は数式を用いるものであり、この数式においては、標的（ミトコンドリアＤＮＡ）の量が内因性参照体（β−アクチン遺伝子）に対して正規化され、較正体（第７日における無薬物対照）と関連づけられる。この数式は２−ΔΔＣｔで与えられる。
【０２１８】
２つの抗ウイルス化合物（−）−ＦＴＣおよびＤ−ＤＤＣの相対ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼγ毒性を一緒に比較した。図５は、各抗ウイルス剤に関して得られた結果を示す。（−）−ＦＴＣは、無薬物対照と比較して、有意なミトコンドリアＤＮＡの減少を何ら誘発しないことが、この図から明らかである。その代わりに、１および１０μＭ濃度のＤ−ＤＤＣに関して重要な相違が観察された。Ｄ−ＤＤＣは、無薬物対照と比較して、ミトコンドリアＤＮＡ合成における用量依存的減少を示した。２’，３’−ジデヒドロ−２’，３’−ジデオキシ−２’−フルオロ−４’−チオ−シチジン［「ｄ４−２’−Ｆ−（４Ｓ−ペンテニル）−Ｃ」］のβ−Ｌおよびβ−Ｄ類似体は共に、このアプローチを用いて１０μＭまでの化合物と共に７日間インキュベートした後に毒性を示さなかった。同様に、ＭＴＳ色素アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）においては、ヒトＰＢＭＣ、ＶｅｒｏおよびＣＥＭ細胞において、これらの化合物についての細胞毒性は１００μＭまで評価した場合に観察されず、そのＣＣ５０値は、試験したすべての細胞型（ＨｅｐＧ２、ＶＥＲＯ、ＰＢＭＣおよびＣＥＭ）上で１００μＭより高かった。
【０２１９】
実施例１６
未修飾または修飾リボヌクレオシドの抗フラビウイルス科ウイルス活性を測定するために、細胞培養アッセイを用いた。
（ａ）ＲＮＡの単離および定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
宿主におけるウイルス負荷を定量するための有効な方法（リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（「ＲＴ−ＰＣＲ」））を提供する。該方法は、ウイルスＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズしうる消光された蛍光プローブ分子を使用することを含む。したがって、エキソヌクレアーゼ分解の後、検出可能な蛍光シグナルをモニターすることができる。したがって、ＲＴ−ＰＣＲで増幅されたＤＮＡまたはＲＮＡは、蛍光シグナルの存在をモニターすることによりリアルタイムで検出される。
【０２２０】
この方法の一例としては、ＭＤＢＫ細胞におけるＢＶＤＶの場合には、第１工程において、商業的に入手可能なカラム（Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ抽出キット，ＱｉａＧｅｎ，ＣＡ）により、１４０μＬの該細胞培養上清からウイルスＲＮＡを単離する。ついで該ウイルスＲＮＡを該カラムから溶出して総容積６０μＬを得、ついで、ＢＶＤＶ  ＮＡＤＬ株用の適当なプライマーを使用する定量的ＲＴ−ＰＣＲプロトコールで増幅する。消光された蛍光プローブ分子はＢＶＤＶ  ＤＮＡにハイブリダイズし、ついでそれはエキソヌクレアーゼ分解を受けて、検出可能な蛍光シグナルを与える。したがって、ＲＴ−ＰＣＲで増幅されたＤＮＡは、蛍光シグナルの存在をモニターすることによりリアルタイムで検出された。ＴａｑＭａｎプローブ分子（５’−６−ＦＡＭ−ＡＡＡＴＣＣＴＣＣＴＡＡＣＡＡＧＣＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧ−ＴＡＭＲＡ  ３’［配列番号］およびプライマー（センス  ５’−ＡＧＣＣＴＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴＧＣＴＧＡＴＧＴ−３’［配列番号］およびアンチセンス  ５’−ＴＧＴＴＧＣＧＡＡＡＧＣＡＣＣＡＡＣＡＧ−３’［配列番号］）を、ＢＶＤＶ  ＮＡＤＬ  ＮＳ５Ｂ領域に相補的となるよう、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェア（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して設計した。合計１０μＬのＲＮＡを５０μＬのＲＴ−ＰＣＲ混合物中で分析した。定量的ＰＣＲにおいて用いた試薬および条件はＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手した。未希釈接種ウイルスを使用して作成した標準曲線は、６０００プラーク形成単位（ＰＦＵ）〜０．６  ＰＦＵ／ＲＴ−ＰＣＲ混合物の範囲に及ぶものであった。４−ｌｏｇにわたる直線範囲が通常に得られた。
【０２２１】
臨床サンプルまたは組織培養サンプル中の他のフラビウイルス科ウイルス（より重要なのは、ＨＣＶ、ＹＦＶ、デングウイルス、ウエストナイルウイルスなどである）の量を測定するために、比較アプローチを採用することができる。例えば、以下のプライマー（５’−ＴＴＣＣＧＣＡＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧＧ−３’［配列番号］および５’−ＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴ−３’［配列番号］）およびプローブ（５’−６−ＦＡＭ−ＣＣＴＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣ−ＴＡＭＲＡ−３’［配列番号］）を使用するリアルタイムＲＴ−ＰＣＲとＨＣＶ  ＲＮＡ精製との組合せは、ウイルス負荷検出の７−ｌｏｇの直線範囲を与えた。
【０２２２】
（ｂ）細胞／ウイルス物質
最も良く特徴づけられているペスチウイルス属メンバーの１つはＢＶＤＶである。ＢＶＤＶおよびＨＣＶは、以下の少なくとも３つの共通の特徴を有する：（１）それらは共に、ＩＲＥＳ媒介翻訳を受ける；（２）それらのＮＳ３セリンプロテアーゼにより、ＮＳ４Ａ補因子が要求される；および（３）それらは、非構造領域内、特にＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂ結合部位において、同様のポリタンパク質プロセシングを受ける。
【０２２３】
抗フラビウイルス科ウイルス化合物を見出すために、ＢＶＤＶ複製系を使用した。本明細書に記載の化合物はペスチウイルス属、ヘパシウイルス属および／またはフラビウイルス属に対して活性である。
【０２２４】
Ｍａｌｄｉｎ−Ｄａｒｂｙウシ腎（ＭＤＢＫ）細胞を、１０％  熱不活性化ウシ血清で補足された変法イーグル培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２；ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中、加湿５％  ＣＯ２インキュベーター内で３７℃で増殖させ維持した。
【０２２５】
ウシ下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）株ＮＡＤＬは、これらの細胞の感染後に細胞変性効果（ＣＰＥ）を引き起こす。
【０２２６】
（ｃ）抗ウイルスアッセイ
ＤＭＥＭ／Ｆ２−１０％  ウシ血清（ＨＳ）中で増殖させたＭＤＢＫ細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを使用する標準技術で単離した。細胞を９６ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルで、試験化合物（２０マイクロモル濃度（μＭ））と共に播いて、１００マイクロリットル（μＬ）の総容積とした。１時間後、該培地を除去し、５０μＬの総容積中で４５分間にわたり０．０２または０．００２の感染多重度（ＭＯＩ）で該細胞に感染させた。ついで該ウイルスを除去し、該細胞を１００μＬのアッセイ培地で２回洗浄した。最後に該感染細胞を、１０、４０および１００μＭの濃度で該試験化合物を含有する１００μＬの総容積中でインキュベートした。２２時間後、該細胞上清を、低速度遠心分離により細胞残渣を除去することにより集め、ついでウイルスの存在に関して定量的に試験した。
【０２２７】
（ｄ）候補抗フラビウイルス科ウイルス化合物の細胞毒性試験
ここで行った細胞毒性試験は標準的な技術である。簡単に説明すると、漸増濃度の試験化合物（０、１、３、１０、３３および１００μＭ）の存在下、細胞を種々の濃度（細胞型、アッセイ持続時間に応じて典型的には５×１０３細胞／ウェル）で９６ウェルプレートに播いた。３日間のインキュベーションの後、ＭＴＳ色素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え次いで３時間インキュベートすることにより、細胞生存度およびミトコンドリア活性を測定する。ついで、該色素を含有するプレートを４９０ｎｍで読み取る。そのような方法論は十分に記載されており、製造業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）から入手可能である。
【０２２８】
実施例１７
ＢＶＤＶ  ＲＴ−ＰＣＲ定量標準曲線
標準ＢＶＤＶウイルスストックは、通常のプラークアッセイ（Ｍｅｎｄｅｚ，Ｅ．ら  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８，７２，４７３７）による測定で２×１０６  ＰＦＵ／ｍＬを含有していた。ウイルスＲＮＡを１４０μＬのこの接種物質から抽出し、６０μＬの溶出バッファーを使用してカラムから溶出した。ついで、この精製ＲＮＡ物質を１０−１から１０−５まで段階的に希釈した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ増幅技術を用いて、１０μＬの各希釈物を試験した。この希釈系列の結果を、ＰＦＵを標準物の濃度に関連づけている図１にプロットする。この実験から、この技術がウイルスの４−ｌｏｇ（６０００から０．６ＰＦＵ／増幅混合物中投入量まで）にわたる信頼しうる定量を可能にすることが明らかである。この実験における検出下限は０．６  ＰＦＵまたは−０．２２  ｌｏｇ  ＰＦＵである。したがって、この検出限界未満の試験サンプルのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ定量値は信頼し得ないとみなされた。
【０２２９】
実施例１８
ＭＤＢＫ細胞におけるＢＶＤＶ複製サイクル
ＭＢＫ細胞におけるＢＶＤＶ産生を測定するために及び或る期間にわたる最適回収時点を判定するために、細胞を５×１０４細胞／ウェルで播き、ＭＯＩ＝０．０２またはＭＯＩ＝０．００２で感染させた。感染後、該接種物を除去し、該細胞を培地で２回洗浄した。種々の時点で、該細胞上清を回収し、ウイルスの量を測定し、元の接種物および細胞洗液と比較した。図２に示すとおり、該接種物ウイルスを除去するためには、少なくとも２回の洗浄工程が必要であった。感染の２２時間後に産生したウイルスの量は、該細胞に接種するために使用したウイルスの量とほぼ等しい。これらの結果に基づけば、ＭＤＢＫ細胞におけるＢＶＤＶの１複製サイクルに要する時間は２２時間であった。これらの実験において設定された検出レベルは、該標準曲線により測定された下限に基づくものであったことに注目されたい。
【０２３０】
実施例１９
ＲＴ−ＰＣＲを使用する候補抗ウイルス化合物の評価
ＭＤＢＫ細胞を５×１０４細胞／ウェルで播き、０．０２に等しい感染多重度（ＭＯＩ）でＢＶＤＶに感染させ、試験化合物の存在下で２２時間増殖させた。試験化合物で処理していない化合物を陰性対照とみなし、リバビリンを陽性対照として使用した。ウイルスＲＮＡを抽出し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより分析した。図３に示す典型的な実験は、該陰性対照および該処理細胞の大多数が、比較しうる量（１．５〜２  ｌｏｇ  ＰＦＵ／投入）のウイルスを産生したことを示しており、該試験化合物が不活性であることを有効に示している。しかし、陽性対照リバビリン（ＲＩＢ）または５−ヒドロキシウリジン（Ｉ−ａ−４５）で処理した細胞は、ウイルスＲＮＡのほとんど完全な不存在を示している。ＲＩＢおよびＩ−ａ−４５は、２２時間の再生時間におけるウイルス産生を約２  ｌｏｇ  ＰＦＵ、すなわち９９％減少させる。これらの化合物の厳密な効力は、この種の実験からは推定することができない。なぜなら、この実験の検出限界は−０．２２  ｌｏｇ  ＰＦＵに設定されており、記載されている実験条件下では１サイクルのウイルス複製しか生じないからである。
【０２３１】
抗ＢＶＤＶ化合物の効力、すなわち、ウイルス産生を５０％または９０％抑制する化合物の有効濃度（それぞれＥＣ５０またはＥＣ９０値）を、同様の一連の実験において、広範な試験化合物濃度（０、１、３、１０、３３、１００μＭ）にわたり測定した。該ＥＣ９０値は、２２時間以内にウイルス産生における１−ｌｏｇの減少を得るのに必要な濃度を意味する。
【０２３２】
本発明は、種々の特定かつ好ましい実施形態および技術に関して記載されている。しかし、多数の変更および修飾が、前記の発明の詳細な記載から当業者に明らかであり、本発明の精神および範囲内で施されうると理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
ＨＩＶ−１ＲＴ−ＰＣＲに関する標準曲線の較正を示す。
【図１Ｂ】
ＨＣＶＲＴ−ＰＣＲに関する標準曲線の較正を示す。
【図１Ｃ】
ＢＶＤＶＲＴ−ＰＣＲに関する標準曲線の較正を示す。
【図１Ｄ】
ミトコンドリアＤＮＡＲＴ−ＰＣＲに関する標準曲線の較正を示す。
【図１Ｅ】
分子毒性ＲＴ−ＰＣＲに関する標準曲線の較正を示す。
【図２】
ＨＩＶ−１のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲとＮＡＳＢＡ  ＨＩＶ−１技術との相関を示すグラフである。
【図３】
培養上清中のＲＴ活性およびウイルス負荷に対する抗ウイルス化合物の効果を示す。
【図４】
ＲＴ−ＰＣＲ標準曲線および相対効率プロットを示す。
【図５】
ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼγに対する抗ウイルス化合物の効果を示す。
【図６】
リアルタイムＰＣＲによるウイルス核酸の定量的検出を示す。
【図７】
Ｃ型肝炎ウイルスレプリコンと比較してＨＣＶゲノムの体制を示し、非翻訳領域（ＮＴＲ）およびポリタンパク質中の切断部位の位置を示す。
【図８】
Ｈｕｈ７／ＨＣＶレプリコン細胞内の７日間のインキュベーション期間にわたる細胞およびウイルス核酸の量の変化のグラフを示す。
【図９】
Ｈｕｈ７  ＨＣＶレプリコン系におけるＨＣＶ  ＲＮＡレベルに対する試験化合物の効果の棒グラフを示す。
【図１０】
種々の薬物と共に７日間インキュベートした後の、それぞれ、ミトコンドリアＲＮＡの量に関するＨｕｈ７細胞内の核酸レベルの変化、およびミトコンドリアＤＮＡにおける変化を示す２種類の棒グラフを示す。
【図１Ａ】
2004533805.tif 000015
【図１Ｂ】
2004533805.tif 000016
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2004533805.tif 000023
【図６】
2004533805.tif 000024
【図７】
2004533805.tif 000025
【図８】
2004533805.tif 000026
【図９】
2004533805.tif 000027
【図１０】
2004533805.tif 000028
【国際公開パンフレット】
2004533805.tif 000029
2004533805.tif 000030
2004533805.tif 000031
2004533805.tif 000032
2004533805.tif 000033
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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