(57)【要約】組換え微生物はプロテアーゼ酵素をコードする遺伝子をダウンレギュレート又は不活化した胞子非形成バシラス・サチリス株を含む。特に、株が胞子非形成性となるようにσ因子ｓｐｏＩＩＡＣを不活化する。これらの株はバシラス・アンスラシスの防御抗原（ＰＡ）等のタンパク質の発現ベクターとして特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテアーゼ酵素をコードする少なくとも１種の遺伝子をダウンレギュレートした又は不活化したバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の胞子非形成株を含む組換え微生物。
【請求項２】
前記プロテアーゼ酵素がセリンアルカリプロテアーゼＥ（ａｐｒＥ）、バシロペプチダーゼＦ（ｂｐｒ）、細胞外セリンプロテアーゼ（ｅｐｒ）、細胞外メタロプロテアーゼ（ｍｐｒ）、細胞外中性プロテアーゼ（ｎｐｒＢ）又は細胞外中性メタロプロテアーゼ（ｎｐｒＥ）である請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記プロテアーゼ酵素遺伝子の全部が不活化されている請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記プロテアーゼ酵素遺伝子が欠失している請求項１から３のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項５】
株を胞子非形成性にするようにσ因子ｓｐｏＩＩＡＣをコードする遺伝子を不活化した請求項１から４のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項６】
σ因子ｓｐｏＩＩＡＣをコードする遺伝子を、部分的又は完全に欠失しているか、及び／又は挿入突然変異誘発した請求項５に記載の組換え微生物。
【請求項７】
バシラス・サチリス１６８の突然変異形を含む請求項１から６のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項８】
異種遺伝子を発現するように配置された前記異種遺伝子を含むように形質転換した請求項１から７のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記異種遺伝子が病原体に対する防御免疫応答を発生するのに有用な抗原又はタンパク質をコードする請求項８に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記異種遺伝子がバシラス・アンスラシスのＰＡ又はその免疫原性フラグメントもしくはドメイン又はそのいずれかの変異体をコードする請求項９に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
前記異種遺伝子が全長配列のバシラス・アンスラシスのＰＡ又はそのドメイン１及び４もしくは防御領域の１個以上をコードする請求項１０に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
ターゲットタンパク質の生産方法であって、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を用いて請求項１から１１のいずれか一項に記載の組換え微生物を形質転換すること、前記形質転換株を培養すること、および前記ターゲットタンパク質を培養物から回収することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来するタンパク質群の生産に有用な発現システムに関する。更に、本発明はワクチンで使用される抗原（例えばバシラス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の組換え防御抗原（ＰＡ））等のタンパク質の生産におけるこのシステムの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭疽病の原因物質であるバシラス・アンスラシスの防御抗原（ＰＡ）は現行英国ヒト炭疽病ワクチンの主成分である（Ｈａｍｂｌｅｔｏｎ，Ｐ．ら，（１９８４）Ａｎｔｈｒａｘ：ｔｈｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２；１２５−１３２）。バシラス・アンスラシスの取扱いに関する安全性の問題により、多種多様の宿主からＰＡを発現させる試みが行われている。これらの例としてはバシラス・アンスラシス（Ｂｅｌｔｏｎ，Ｆ．Ｃ．ら，（１９５４）Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，３５；１４４−１５２及びＴｕｒｎｂｕｌｌ，Ｐ．Ｃ．Ｂ．（１９９１）Ｖａｃｃｉｎｅ  ９，５３３−５３９）、バシラス・サチリス（Ｉｖｉｎｓ，Ｂ．Ｅ．ら，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９８６），５４；５３７−５４２，Ｂａｉｌｌｉｅ，Ｌ．Ｗ．Ｊ．ら，（１９９４）Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １９；２２５−２２７，Ｂａｉｌｌｉｅ，Ｌ．Ｗ．Ｊ．ら，（１９９６）Ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ａｎｔｈｒａｘ，１９−２１  Ｓｅｐｔ  １９９５，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ．Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  １９９６，８７（Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｓｕｐｐｌ．）１３３−１３５及びＢａｉｌｌｉｅ，Ｌ．Ｗ．Ｊ．ら，（１９９８）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ８４；７４１−７４６）、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ（Ｃｈ，Ｈ−Ｂ．，ら，（１９９８）Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ３ｒｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ａｎｔｒａｘ，７−１０ｔｈ  Ｓｅｐｔ，１９９８）、ワクシニア（Ｉａｎｃｏｎｏ−Ｃｏｎｎｏｒｓ，Ｌ．Ｃ．，ら（１９９０）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８；３６６−３７２）、バキュロウイルス（Ｉａｎｃｏｎｏ−Ｃｏｎｎｏｒｓ，Ｌ．Ｃ．ら，（１９９０）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８；３６６−３７２）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（Ｃｏｕｌｓｏｎ  Ｎ．Ｍ．ら，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９４）１２；１３９５−１４０１）及びエシリヒア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｓｉｎｇｈ，Ｙ．ら（１９８９），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４；１１０９９−１１１０２及びＶｏｄｋｉｎ  Ｍ．Ｈ．ら，（１９９３）Ｃｅｌｌ，３４；６９３−６９７）の弱毒株が挙げられる。
【０００３】
これらのシステムのうちで現在まで理想的なものはないが、バシラス種を使用して最良の収率が達せられている。バシラス種は食品と産業の両者で安全使用の前歴がある。バシラス種の多数の製品が米国食品医薬品局により特定用途に安全であると一般に認められている。これらの製品には食品加工用酵素や微生物（バシラス・サチリス・ナット）（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｎａｔｔｏ）から製造した自然食品が含まれる。
【０００４】
ＰＡ遺伝子はバシラス・サチリスで良好に発現され、現行バシラス・アンスラシスシステムで得られるよりも高い発現レベルに達している（Ｉｖｉｎｓ，Ｂ．Ｅ．ら，（１９８６），前出）。更に、タンパク質を培養上清中に分泌させると、後期精製プロトコールが簡単になる（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．ら（１９９８）Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２６；５６−６０）。
【０００５】
バシラス種の使用に伴う欠点は分解性プロテアーゼ（Ｂａｉｌｌｉｅ，Ｌ．Ｗ．Ｊ．ら，（１９９４）前出）と耐性胞子（Ｄｒｉｋｓ，Ａ．（１９９９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６３；１−２０）の産生能をもつことである。
【０００６】
発現されるタンパク質のタンパク分解の問題を解決するためにバシラス・サチリス株が作製されている。ＷＢ６００株はこのような株の１例である（Ｘｕ−Ｃｈｕ，Ｗｕら，（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ．１７３，４９５２−４９５８）。
【０００７】
この株を使用して純ｒＰＡを生産するために高レベル実験室規模発現及び精製システムが開発されている（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．ら，（１９９８）Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２６；５６−６０）。
【０００８】
動物試験によると、ｒＰＡはバシラス・アンスラシスワクチン耐性株の胞子を用いるエアゾール攻撃に対して完全防御を誘発した（ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｂ．Ｗ．，ら（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ  １６；８，８１０−８１７）。
【０００９】
産生株ＷＢ６００は耐性胞子を形成することができるので、発酵槽のように株を多数に増殖させる場合に環境汚染の可能性がある。この可能性は他の製品による二次汚染の危険を与えてはならない産業に特に問題となる。従って、このようなシステムは専用生産プラントを使用することが必要になる。
【００１０】
胞子形成はカスケードとして機能する遺伝子の複雑なネットワークにより調節されている（Ｈｏｃｈ，Ｊ．Ａ．ｓｐｏＯ  Ｇｅｎｅｓ，ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｅｌａｙ，ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ．Ｉｎ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ，Ａ．Ｌ．ら編，第５１章；７４７−７５５，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．）。ｓｐｏ０Ａ等の初期胞子形成遺伝子の標的不活化の結果、胞子を形成できない株が得られるであろう。しかし、初期胞子形成遺伝子ｓｐｏ０Ａを欠損する胞子形成欠損株は生理的に支障を生じる恐れがある。従って、他の遺伝子改変の効果に耐えられず、株が生存できなくなる恐れがある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
これに対して、本発明者らは胞子非形成性であると同時にプロテアーゼ欠損性のバシラス・サチリス株を生産できることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明はプロテアーゼ酵素をコードする少なくとも１種の遺伝子をダウンレギュレートした又は不活化したバシラス・サチリスの胞子非形成株を含む組換え微生物を提供する。
【００１３】
この種の株は良好な収率で異種タンパク質を産生し、前記タンパク質を発現するように構築でき、胞子形成に付随する問題を生じない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
不活化又はダウンレギュレートすることができる、バシラス・サチリス株に加えるのに適したプロテアーゼ酵素遺伝子としてはセリンアルカリプロテアーゼＥ（スブチリシン１１４３ｂｐ）（ａｐｒＥ）、バシロペプチダーゼＦ（ｂｐｒ）、細胞外セリンプロテアーゼ（ｅｐｒ）（１９３５ｂｐ）、細胞外メタロプロテアーゼ（ｍｐｒ）（９３９ｂｐ）、細胞外中性プロテアーゼ（ｎｐｒＢ）（６１４ｂｐ）及び細胞外中性メタロプロテアーゼ（ｎｐｒＥ）（１５６３ｂｐ）が挙げられる。
【００１５】
これらの遺伝子の配列は文献から決定することができる（特にＫｕｎｓｔら，Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３９０：２４９−２５６参照）。
【００１６】
好ましくはこれらの遺伝子の２種以上、より好ましくは少なくとも３種、最も好ましくは全部を不活化する。
【００１７】
ターゲット配列の不活化又はダウンレギュレーションは任意公知方法を使用して実施することができる。例えば、配列を部分的又は完全に欠失させ、更に対立遺伝子置換するか、又はコードされたプロテアーゼ酵素を不活化するように挿入置換を含む突然変異を導入することができる。あるいは、遺伝子配列が転写されないようにセンス又はアンチセンスＲＮＡ構築物を使用する等の遺伝子不活化法も利用できる。
【００１８】
特に、σ因子ｓｐｏＩＩＡＣをコードする配列の不活化により株を胞子非形成性にする。本発明者らはステージＩＩ胞子形成遺伝子のこの特定フラグメントを不活化することにより丈夫でワクチンの生産に特に有用な安定な胞子非形成組換え株が生産されることを見出した。
【００１９】
ｓｐｏＩＩＡ遺伝子は９個の公知ステージＩＩ遺伝子座の１つである。この遺伝子を突然変異させると胞子形成の隔壁形成段階の進展を阻止することができる（Ｌｏｓｉｃｋら，前出）。この遺伝子はクローニング及び配列決定され、１３、１６及び２９ｋｄのタンパク質をコードする３個のシストロンのポリシストロン単位として転写されることが分かっている。これらは夫々ｓｐｏＩＩＡＡ、ｓｐｏＩＩＡＢ及びｓｐｏＩＩＡＣと呼ぶ領域によりコードされている。
【００２０】
σ因子ｓｐｏＩＩＡＣをコードする遺伝子は、プロテアーゼ酵素遺伝子の不活化又はダウンレギュレーションについて上述した方法を使用して適切に不活化される。しかし、バシラス・サチリスゲノム内のσ因子ｓｐｏＩＩＡＣをコードする核酸配列を部分的又は完全に欠失させ、場合により別の配列で置換することが好ましい。この別の配列は例えば形質転換プロセスで形質転換クローンの選択に有用な抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子を含むことができる。
【００２１】
所望によりｓｐｏＩＩＡ遺伝子の他の領域も欠失させてもよい。
【００２２】
１特定方法では、欠失させようとするターゲット配列の５’及び３’フランキング領域を２つの別々の反応でバシラス・サチリス染色体ＤＮＡから増幅する。５ＸＢＡ−５ＸＨＯ及び３ＸＨＯ−３ＸＢＡプライマー対を使用して１回目の増幅反応（例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））を実施する。次に増幅した２つのフランキング領域を使用して相互に自己プライミングさせ、ターゲット配列を欠失する遺伝子座を作製する。次に２回目の増幅（ＰＣＲ）反応で外部プライマーによりこの切断配列を増幅することができる。
【００２３】
あるいは、１回目の反応からの２つのフランキング産物を適当な制限エンドヌクレアーゼ（例えばＸｈｏＩ）で切断し、混合し、連結してよい。５’フランキングアンプリコンを７００塩基対長までとし、３’フランキングアンプリコンを８００塩基対長以上とするようにプライマーを設計すると適切である。こうすると、例えばゲルクロマトグラフィーを使用して連結を明瞭に確認することができる。連結産物をゲル上で泳動させると、３つのバンドが得られる。ターゲットバンドは約１．５ｋｂ長である。
【００２４】
このスキームを図１に模式的に示し、以下に説明する。
【００２５】
こうして得られた連結又は２回目のＰＣＲ反応の産物は適切な欠失プラスミドを形成するために後で使用することができる欠失遺伝子座を形成する。例えば、欠失遺伝子座をＸｂａＩ等の制限酵素で切断し、ｐＵＣ１８にクローニングすることができる。適当な宿主（例えば大腸菌ＤＨ５α）を初期クローニング用宿主として使用することができるが、低コピー数で高コピー数プラスミドを複製するＴＧ９０が有用な場合もある。
【００２６】
次に、欠失プラスミドを形成するのに適したプラスミドにこれをサブクローニングする。
【００２７】
特に適切なプラスミドはバシラス・サチリスで有効に機能することが示されているｐＯＲ１２０（図２参照）（Ｌｅｅｈｏｕｔｓら，１９９６，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５３：２１７−２２４）であり、細菌染色体に未標識遺伝子欠失又は置換を導入することができる。このプラスミドはｒｅｐＡ遺伝子（複製開始タンパク質）を欠失するためにＰｅｐＡをトランス発現する株（例えば大腸菌ＥＣ１０００）でしか複製しないラクトコッカスプラスミドｐＷＶ）１に由来する。このプラスミドは組換え体の選択を可能にするテトラサイクリン耐性遺伝子（ｔｅｔ）と青／白選択による復帰突然変異体の同定を可能にするβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）を含む。ｌａｃＺは（グラム陽性とグラム陰性の両者の細菌での発現を可能にする）ｐ３２プロモーターの制御下におかれている。
【００２８】
次に欠失遺伝子座をｐＯＲＩ２４０プラスミドにサブクローニングし、エシエリヒア・コルＥＣ１０００等の適当な宿主株でテトラサイクリン耐性により形質転換体を選択することができる。その後、このプラスミドを使用してバシラス・サチリス、好ましくは公知起源の株（例えばバシラス・サチリス１６８）を形質転換し、形質転換体をテトラサイクリンで選択することができる。（バシラス・サチリス１６８は完全ゲノムシーケンシング計画で使用される株であり［Ｋｕｎｓｔら，前出参照］、Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒから入手することができる（ＣＩＰ番号１０６３０９））。また、この方法を使用してバシラス・サチリスＷＢ６００を改良することもできる。
【００２９】
プラスミドはこの株で複製できないので、形質転換体は染色体組込を有する。
【００３０】
その後、２回目の組換えイベント（共組込み体の分離）が行われると、存在するＸ−ｇａｌと共に白色コロニーを生じる（組込み体は青色のまま残る）ので容易に選択することができる。
【００３１】
図２はｐＯＲＩ２４０を使用した遺伝子欠失ストラテジーを示し、図中、＊記号はターゲット遺伝子（Ｌｅｅｎｈｏｕｔｓらの変形）の欠失を示す。この方法を使用して野生型遺伝子を復元するか、又は組込んだプラスミドの分離後に欠失コピーをその場所に挿入する。
【００３２】
復帰突然変異体クローンを遺伝子型によりＰＣＲ選別して欠失を確認することができる。Ｚｙｍｏｇｒａｍゲル分析（Ｎｏｖｅｘ）を使用してプロテアーゼ活性の低下を表現型により確認し、プロテアーゼ活性の低下を確認することができる。
【００３３】
遺伝子欠失を作製する他のストラテジーを使用することもできる。
【００３４】
同様にプロテアーゼ欠損性胞子非形成株を作製し、選択遺伝子、特に異種遺伝子を発現するように慣用法を使用して形質転換することができる。この株は上述のようにバシラス・アンスラシスのＰＡ等のワクチンとして有用な抗原もしくはタンパク質又はその免疫原性フラグメント又はドメイン又は変異体の発現に特に適しているが、多種多様なタンパク質の発現ベクターとして使用することができる。この株は非常に一般的な発現宿主（例えばエシエリヒア・コリ）が例えばエシエリヒア・コリに対するタンパク質の毒性により特定ターゲット遺伝子の発現に適していない場合に特に有用であると思われる。
【００３５】
従って、別の側面では本発明は異種遺伝子を発現するように前記異種遺伝子を配置するように形質転換した上記のような組換え胞子非形成バシラス・サチリス株を提供する。
【００３６】
上述のように、異種遺伝子は広範な所望タンパク質をコードすることができ、例えば医薬又は農薬タンパク質又はペプチド又は他の商業用タンパク質（例えば製紙や洗剤製造で使用されるセルラーゼやアミラーゼ等の酵素）が挙げられる。特定形態又は医薬タンパク質の１例はワクチンとしての使用を目的とした抗原等の免疫原性タンパク質又はペプチドである。別の形態としてはヒト成長ホルモン等のホルモンが挙げられる。
【００３７】
特に好ましい異種遺伝子は上記のようなバシラス・アンスラシスのＰＡ又は防御免疫応答を発生するその免疫原性フラグメント又は変異体をコードする。
【００３８】
本明細書で使用する「変異体」なる用語は配列内の１個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されているという点で元の塩基配列と異なるアミノ酸配列を意味する。アミノ酸を広義の類似特性をもつ別のアミノ酸で置換する場合にはアミノ酸置換を「保存性」とみなすことができる。アミノ酸を異なる型のアミノ酸で置換する場合には非保存置換である。一般に、ポリペプチドの生物活性を変えない非保存置換は殆ど不可能である。変異体は塩基配列に少なくとも６０％一致していると適切であり、少なくとも７５％一致していることが好ましく、少なくとも９０％一致しているとより好ましい。
【００３９】
特に、特定配列と元の配列との一致度はＬｉｐｍａｎとＰｅａｒｓｏｎ（Ｌｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．＆  Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．（１９８５）Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  Ｓｅａｒｃｈｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ  ２２７，ｐｐ１４３５−１４４１）に記載されている多重アラインメント法を使用して評価することができる。「最適化」百分率スコアはＬｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎアルゴリズムのパラメーターであるｋｔｕｐ＝１、ギャップペナルティ＝４及びギャップペナルティ長＝１２を使用して計算すべきである。類似度を評価する配列を「試験配列」として使用すべきであり、即ち比較用塩基配列（例えばバシラス・アンスラシスのＰＡの配列）を最初にアルゴリズムに入力すべきである。
【００４０】
本明細書で使用する「フラグメント」なる用語は全長配列に比較して１個以上のアミノ酸を欠失するが、防御免疫応答を発生する切断領域を意味する。これらの領域はドメインを含むことができる。
【００４１】
バシラス・アンスラシスのＰＡの特定防御ドメインは全長配列のドメイン１もしくは４又はこれらのドメインの防御領域を含む。これらのドメインは下表１に示す配列を含む。
【００４２】
【表１】
2004534545.tif 000002
【００４３】
これらのアミノ酸番号はＷｅｌｋｏｓら，Ｇｅｎｅ  ６９（１９８８）２８７−３００に示す配列を意味する。ドメイン１は２個の領域１ａ及び１ｂを含む。領域１ａはアミノ酸１〜１６９を含み、領域１ｂはアミノ酸１７０〜２５８を含む。領域１ａは良好な防御応答の発生に重要であると思われる。
【００４４】
特に好ましい態様では、バシラス・アンスラシスに対して防御性の免疫応答を発生する免疫原性試薬としてドメイン１及び４又はその防御領域の組合せを使用する。例えば融合ペプチドとしてのこの組合せは本発明の発現システムを使用して発現することができる。
【００４５】
別の態様では、本発明はターゲットタンパク質の生産方法を含み、前記方法は前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列で上記組換え胞子非形成バシラス・サチリス株を形質転換し、前記形質転換株を培養し、前記ターゲットタンパク質を培養物から回収することを含む。
【００４６】
微生物の形質転換や培養に一般に使用されている方法等の慣用方法を使用すると適切である。
【００４７】
以下、添付図面を参考に本発明を実施例により具体的に説明する。
【実施例１】
【００４８】
バシラス・サチリス１６８のプロテアーゼ欠損胞子非形成株の構築
ｓｐｏＩＩＡＡとｓｐｏＩＩＡＢの両者をコードする上流フランキングＤＮＡと下流フランキングＤＮＡを使用してσ因子ｓｐｏＩＩＡＣをコードする遺伝子をＰＣＲ増幅した。得られた２．６６３ｋｂのＤＮＡセグメントにＨｉｇｕｃｈｉら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８８），１６，７３５１の方法によりＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を付加した。この部位は７６０ｂｐ  ｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子の４６０ｂｐに配置した。ＰＣＲフラグメントを汎用クローニングベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、プラスミドｐＡＵＳ−Ｙを構築した。
【００４９】
プラスミドｐＤＧ６４６（Ｇｕｅｒｏｔ−Ｆｌｅｕｒｙら，１９９５．Ｇｅｎｅ，１６７：３３５）からのエリスロマイシン耐性カセット （ｅｒｍ）の消化と挿入によりｐＡＵＳ−Ｙから更に２個のプラスミドを構築した。これらのプラスミドの一方であるｐＤＩＮＧＯはｐＡＵＳ−ＹをＸｈｏＩで消化し、ＸｈｏＩで消化したｅｒｍフラグメントを挿入することにより作製した。第２のプラスミドであるｐＲＥＥＦはｐＡＵＳ−ＹをＸｈｏＩとＣｌａＩで消化してｓｐｏＩＩＡＢの最後から９０ｂｐとｓｐｏＩＩＡＣの最初から４６０ｂｐを除去することにより作製した。ＳａｌＩ／ＣｌａＩ消化ｅｒｍフラグメントを挿入した。
【００５０】
両者プラスミドをＳｃａＩ消化により直鎖化した後、このＤＮＡを使用してバシラス・サチリスＷＢ６００のコンピテント細胞を形質転換した。形質転換クローンをエリスロマイシン／リンコマイシンで選択し、これらのクローンから単離したゲノムＤＮＡをサザンハイブリダイゼーションにより分析した。ｓｐｏＩＩＡＣ：：ｅｒｍ遺伝子座からのジゴキシゲニン標識ＤＮＡプローブを使用してｓｐｏＩＩＡＣのｅｒｍ含有対立遺伝子置換を含むクローンを同定した。
【００５１】
この方法を使用したＤＮＡの遺伝子挿入は安定で非復帰突然変異性であることが判明した。ｓｐｏＩＩＡＣ：：ｅｒｍ株では（胞子形成の不在により測定した場合に）復帰突然変異は認められなかった。
【実施例２】
【００５２】
バシラス・サチリスのプロテアーゼ欠損株の生産
図１に要約する方法を使用してバシラス・サチリス１６８のプロテアーゼ欠損胞子非形成株の構築に適した一連のプライマーを作製した。
【００５３】
具体的には、欠失させる遺伝子の５’及び３’末端フランキング領域を増幅するようにプライマーを設計した。外部プライマー（５ＸＢＡと３ＸＢＡ）は２５〜２６ヌクレオチドとし、５’末端にＸｂａＩ部位を付加した。内部プライマー（５ＸＨＯと３ＸＨＯ）は４１〜４３ヌクレオチド長とし、その３’末端のみをターゲット部位に相同とし、従ってＸｈｏＩ部位を付加し、５’末端はターゲット部位ではなく他方のプライマーに相同とした。２４種のプロテアーゼ遺伝子欠失用プライマーを下記に５’→３’方向で示す。
【００５４】
【表２】
2004534545.tif 000003
2004534545.tif 000004
2004534545.tif 000005
【００５５】
上記プライマーセットの一部又は全部を使用して上記と図１及び２に要約したようにＰＣＲ後にライゲーション又は処理すると、バシラス・サチリスのプロテアーゼ欠損株が得られる。
【００５６】
ｓｐｏＩＩＡＣ遺伝子を欠失させるのに適したプライマーを使用して上記工程を繰返してもよいし、胞子非形成株が得られるまで実施例１に要約したストラテジーを繰返してもよい。
【００５７】
欠失は任意順序で実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】遺伝子欠失に使用する遺伝子座を作製するためのストラテジーを示す。
【図２】ｐＯＲＩ２４０を使用した遺伝子欠失ストラテジーを示す。
【図１】
2004534545.tif 000006
【図２】
2004534545.tif 000007
【国際公開パンフレット】
2004534545.tif 000008
2004534545.tif 000009
2004534545.tif 000010
2004534545.tif 000011
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月12日(2003.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
セリンアルカリプロテアーゼＥ（ａｐｒＥ）、バシロペプチダーゼＦ（ｂｐｒ）、細胞外セリンプロテアーゼ（ｅｐｒ）、細胞外メタロプロテアーゼ（ｍｐｒ）、細胞外中性プロテアーゼ（ｎｐｒＢ）又は細胞外中性メタロプロテアーゼ（ｎｐｒＥ）から選択されるプロテアーゼ酵素をコードする少なくとも３種の遺伝子をダウンレギュレートした又は不活化したバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の胞子非形成株を含み、
σ因子ｓｐｏＩＩＡＣをコードする遺伝子が、上記バシラス・サチラス株が胞子非形成性となるように不活性化されている、組換え微生物。
【請求項２】
前記プロテアーゼ酵素遺伝子の全部が不活化されている請求項１に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記プロテアーゼ酵素遺伝子が欠失している請求項１から２のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項４】
σ因子ｓｐｏＩＩＡＣをコードする遺伝子を、部分的に又は完全に欠失させたか、及び／又は挿入突然変異誘発した請求項１から３のいずれかに記載の組換え微生物。
【請求項５】
バシラス・サチリス１６８の突然変異形を含む請求項１から４のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項６】
異種遺伝子を発現するように配置された前記異種遺伝子を含むように形質転換した請求項１から５のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記異種遺伝子が病原体に対する防御免疫応答を発生するのに有用な抗原又はタンパク質をコードする請求項６に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記異種遺伝子がバシラス・アンスラシスのＰＡ又はその免疫原性フラグメントもしくはドメイン又はそのいずれかの変異体をコードする請求項７に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記異種遺伝子が全長配列のバシラス・アンスラシスのＰＡ又はそのドメイン１及び４もしくは防御領域の１個以上をコードする請求項８に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
ターゲットタンパク質の生産方法であって、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を用いて請求項１から９のいずれか一項に記載の組換え微生物を形質転換すること、前記形質転換株を培養すること、および前記ターゲットタンパク質を培養物から回収することを含む前記方法。
【国際調査報告】
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