(57)【要約】本発明は、哺乳動物の体液を、インター−アルファ−トリプシンインヒビター（ＩＴＩ）ポリペプチドに結合するリガンドに、ＩＴＩ−リガンド複合体を形成させるのに十分な条件下で接触させる段階、およびこの複合体を検出する段階によって、哺乳動物における敗血症を診断する方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における敗血症を診断または予後診断する方法であって、該哺乳動物の体液と、インター−アルファ−トリプシンインヒビター（ＩＴＩ）ポリペプチドに結合するリガンドを、ＩＴＩ−リガンド複合体を形成するのに十分な条件下で接触させる段階、および該複合体を検出する段階を含む方法。
【請求項２】
哺乳動物がヒトである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物がヒト乳児である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
体液が血液である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
体液が血漿である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
体液が血清である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
リガンドが抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
モノクローナル抗体が６９．３１である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
以下の段階を含む、哺乳動物の敗血症を予後診断する方法であって、
（ａ）該哺乳動物の体液と、ＩＴＩポリペプチドに結合するリガンドを、ＩＴＩ−リガンド複合体を形成するのに十分な条件下で接触させる段階、
（ｂ）複合体の量を定量して、該体液中のＩＴＩ量を測定する段階、および、
（ｃ）該体液中のＩＴＩ量を長時間比較する段階であって、ＩＴＩ量の長時間にわたる減少が予後不良を示す段階。
【請求項１１】
体液が血液である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
体液が血漿または血清である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
リガンドが抗体である、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
モノクローナル抗体が６９．３１である、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物における敗血症を診断または予後診断するキットであって、インター−アルファ−トリプシンインヒビター（ＩＴＩ）ポリペプチドに結合するリガンド、および該ＩＴＩポリペプチドに結合した該リガンドを検出する手段を含むキット。
【請求項１７】
哺乳動物における敗血症を診断または予後診断するキットであって、ＩＴＩポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を含むキット。
【請求項１８】
抗体がモノクローナル抗体６９．３１である、請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
抗体が固相に固定されている、請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
固相が、測定用プレート、測定用ウエル、ニトロセルロース膜、ビーズ、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、および溶出用カラムの成分からなる群より選択される、請求項１９記載のキット。
【請求項２１】
哺乳動物における敗血症を治療する方法であって、敗血症に罹患しているか、敗血症を発症する危険性のある哺乳動物を同定する段階、および該哺乳動物にＩＴＩ組成物を投与する段階を含む方法。
【請求項２２】
ＩＴＩ組成物がＩＴＩポリペプチドである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ＩＴＩ組成物がＩＴＩ軽鎖ポリペプチドおよびＩＴＩ重鎖ポリペプチドを含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
敗血症に罹患した哺乳動物の死亡率を低下させる方法であって、ＩＴＩ組成物を該哺乳動物に投与する段階を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、細菌感染症に関する。
【０００２】
背景
敗血症は、例えば、細菌感染などの感染症に全身性の応答である。グラム陰性細菌に由来するエンドトキシン、またはグラム陽性細菌に由来するエキソトキシン（エンドトキシン様の応答を開始させることができる）によって広く引き起こされる。この全身応答によって敗血性ショックが起きることがあるが、これは、血圧の急激な低下、心臓血管の崩壊、および／または多臓器障害などの特徴を有する。敗血性ショックと診断された患者の死亡率は、３５〜４５％にもなることがある。これまでの診断手段を用いては、迅速かつ確実に敗血症を検出することは困難であった。
【０００３】
概要
本発明は、哺乳動物において敗血症を診断する方法を提供する。本方法は、敗血症と診断され、敗血症の治療を受けているヒトの結果を予測する予後手段としても有用である。
【０００４】
哺乳動物に由来する、例えば、血液、血漿、または血清などの体液と、インター−アルファ−トリプシンインヒビター（ＩＴＩ）ポリペプチドに結合するリガンドを、ＩＴＩ−リガンド複合体を形成させるのに十分な条件下で接触させる段階、およびこの複合体を検出する段階によって、哺乳動物における敗血症を診断または予後診断する方法を提供する。哺乳動物は、好ましくは、ヒト患者であるが、本アッセイ法は、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシなどの動物における敗血症を診断または予後診断するために、獣医学的用途に応用することもできる。好ましくは、リガンドは、ヒトＩＴＩ軽鎖のエピトープに結合する。哺乳動物の成体だけでなく、新生児などの乳児における敗血症を診断または予後診断するために、ＩＴＩをマーカーとして使用する。
【０００５】
ＩＴＩの正常値と比較して、被検試料におけるＩＴＩ量が低下していれば、敗血症の診断が下されることを示している。ＩＴＩの正常値よりも少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも３５％、最も好ましくは少なくとも５０％減少したＩＴＩ量であれば、敗血症の診断下されることを示している。例えば、正常なＩＴＩ量は、血漿中のＩＴＩが約１．２ ｍｇ／ｍｌであるから、ＩＴＩ量が０．６ ｍｇ／ｍｌ（または、それ以下）であれば敗血症の診断が下される。予後目的では、ＩＴＩの診断値よりも少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２５％、さらに好ましくは少なくとも３５％、最も好ましくは少なくとも５０％減少したＩＴＩ量であれば、死亡する危険性が高い（すなわち、予後が悪い）ことを示している。例えば、ＩＴＩの診断値は、血漿中でＩＴＩが０．６ ｍｇ／ｍｌであるから、ＩＴＩが０．３ ｍｇ／ｍｌ（または、それ以下）という値であれば、予後が不良であると予測する、例えば、敗血性ショックおよび／または死に至ると予想されることになる。
【０００６】
本方法で用いられるＩＴＩ−リガンドは、体液の中でＩＴＩと検出可能な複合体を形成するものである。例えば、リガンドは、抗体またはＩＴＩ−結合抗体断片であり、例えば、Ｆａｂもしくは（Ｆａｂ）２断片；操作された一本鎖Ｆｖ分子；または、例えばマウスに由来する、ある抗体の結合特異性と、例えばヒトに由来する別の抗体が残りの部分になっているものとを含む抗体などのキメラ分子である。好ましくは、この抗体は、ｍＡｂ６９．３１などのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。あるいは、リガンドは、合成またはタンパク質分解によって生成された、ＩＴＩ軽鎖に結合するペプチドである。検出を行うためには、例えばＩＴＩ特異的抗体などのリガンドを、例えば比色マーカーまたは放射性同位体マーカーを用いて、直接または間接的に標識する。（ＩＴＩ−特異的抗体に結合したＩＴＩ抗原を含む）免疫複合体の量を定量して、液体中のＩＴＩ量を決定し、液体中のＩＴＩ量を正常な対照用ＩＴＩ量（例えば、以前決定された基準値、または健常であることが分かっている被験者のＩＴＩ量）と比較する。本発明で主張されるアッセイ法は、迅速に（これまでの菌血症や敗血症の精密検査から結果を得るよりも短い時間で）、正確かつ確実に敗血症を診断する。
【０００７】
敗血症の予後も、ＩＴＩを長期間にわたって測定することにより判定する。例えば、本方法は、（ａ）哺乳動物の体液を、ＩＴＩ−リガンド複合体を形成させるのに十分な条件下で、ＩＴＩポリペプチドに結合するリガンドに接触させる段階、およびこの複合体を検出する段階；（ｂ）複合体の量を定量して、体液中のＩＴＩ量を測定する段階；および（ｃ）体液中のＩＴＩ量を長期間にわたって比較する段階であって、長時間にわたって採取された被検試料中のＩＴＩ濃度が低下していれば予後不良を示すという段階を含んでいる。患者の体液中におけるＩＴＩ量の長時間にわたる変化を比較することによって、敗血症の重篤度の変化を監視する。このような一時的なデータを用いて、患者の治療コースを決定する。
【０００８】
例えば、ｍＡｂ６９．３１のようなＩＴＩ−特異的抗体など、診断または予後のアッセイ法を実施するための試薬をまとめてパッケージングしてキットとすることもできる。哺乳動物における敗血症を診断または予後診断するためのキットには、例えば、ＩＴＩ軽鎖に結合する抗体または抗体断片などのリガンド、およびＩＴＩ軽鎖に結合したリガンドを含む複合体を検出する手段が含まれる。検出手段は、好ましくは、比色マーカーまたは放射線同位体マーカーである。例えば、固相上に抗体を固定して、ＩＴＩ−リガンド複合体を検出するのに適した他の試薬とともにパッケージングする。酵素に結合した試薬をキットに入れることも可能である。いくつかの態様において、抗体またはＩＴＩリガンドを、測定プレート、測定ウエル、ニトロセルロース膜、ビーズ、ディップスティック（ｄｉｐｓｔｉｃｋ）、または溶出用カラムの成分などのような固相上に固定する。固定された抗体は捕捉抗体として作用するので、二次抗体を用いて免疫複合体（例えば、ｍＡｂ６９．３１に結合しているＩＴＩ抗原）を検出する。このキットは、精製したＩＴＩポリペプチドまたは精製したＩＴＩ複合体を対照として任意に含むことができる。ポリペプチドまたは複合体は、天然源から精製するか、または組換えによって生産される。また、キットは、二次抗体、または上記のような他の検出マーカーを含んでもよい。例えば、二次抗体またはマーカーは、例えば放射性同位元素、蛍光色素、またはその他の検出手段を用いて標識される。
【０００９】
敗血症を治療する方法、または敗血症に伴う死の危険を低下させる方法も本発明に含まれる。哺乳動物において敗血症を治療する方法には、敗血症を罹患する哺乳動物または敗血症を発症する危険性を有する哺乳動物を同定する段階、および哺乳動物にＩＴＩ組成物を投与する段階が含まれる。ＩＴＩ組成物は、ＩＴＩ軽鎖ポリペプチド、またはＩＴＩ軽鎖ポリペプチドとＩＴＩ重鎖ポリペプチドとの複合体を含む。あるいは、ＩＴＩ組成物は、例えば、ＩＴＩポリペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドなどのＩＴＩポリペプチドをコードする核酸を含む。ＩＴＩ組成物は、好ましくは、静脈内に投与される。
【００１０】
本発明の上記以外の特徴、目的、および利点は、明細書および図面、ならびに特許請求の範囲の記載より明らかであると思われる。
【００１１】
詳細な説明
迅速かつ確実に敗血症を検出することが、敗血性ショックおよび死を防止すべく適時に介入するために重要となる。本明細書に記載する方法を用いて、敗血症を発症しているか、その危険性があると思われる個体の体液中のＩＴＩを検出する。このような個体とは、尿生殖管、肝臓または胆（肝臓分泌）管、消化管、および肺に感染症を有する個体である。入院している個体もまた、敗血症を発症する危険性がある。例えば、静脈ライン、手術による創傷、外科的排出、または例えば、皮膚の潰瘍や褥瘡のような皮膚の損傷などの部位から発生する院内感染によって敗血症になることがある。高齢の患者や免疫力のない患者は、特にこの危険性が高い。
【００１２】
敗血症に関係するリスク因子には、近年の細菌性肺炎、髄膜炎、抗生物質に反応しない尿道感染症、骨髄炎、細菌性腹膜炎、近年の歯科処置、近年の内視鏡処置、近年の心臓血管処置、留置導尿カテーテル、近年の大手術、セリュライト（ｃｅｌｌｕｌｉｔｅ）、または近年の抗体による治療法が含まれる。
【００１３】
ＩＴＩは敗血症に対する診断および予後マーカーである
ヒトＩＴＩは、比較的高濃度（約０．８ ｍｇ／ｍｌ）で血漿内に存在する複合糖タンパク質である。これは、グリコアミノグリカン結合で共有結合した１つの軽鎖ポリペプチドと２つの重鎖ポリペプチドからなる。軽鎖は、ビクニン（ｂｉｋｕｎｉｎ）と呼ばれ、エラスターゼ、プラスミン、およびカテプシンＧなど、凝血や炎症のネットワークに関係するさまざまなセリンプロテアーゼを阻害する。ビクニンは、セリンプロテアーゼによる活性化を受けると、ＩＴＩ複合体から切り出されて、直ちに腎臓から分泌される。例えばｍＡｂ６９．３１などのヒトＩＴＩに対して特異的なモノクローナル抗体を用いて、競合的ＥＬＩＳＡアッセイ法を開発した。このアッセイ法は、体液中のヒトＩＴＩ量を定量的に測定するために使用される。
【００１４】
２５人の敗血症患者から血液試料を採集して、ＩＴＩ量を測定するために血漿を分離した。その結果、敗血症患者の血漿ＩＴＩ量は、健常な自発的提供者の血漿ＩＴＩ量に較べて２０〜９０％減少していた。血漿ＩＴＩ量の減少度は患者の死亡率と相関していた。ＩＴＩ量が大きく減少している患者（血漿中濃度＜０．３ ｍｇ／ｍｌ）ほど死亡率が高かった。ＩＴＩ量の平均値±ＳＤは、生存者（０．５８±０．１３ ｍｇ／ｍｌ）に比べ、非生存者（０．３５±０．２０ ｍｇ／ｍｌ）では有意に低かった。このような違いは、重度の敗血症を起こしてから７日後まで続いた（ｐ＜０．０５）。
【００１５】
本明細書に記載されたアッセイ法は、敗血症を診断するために用いられ、且つ敗血症に伴う死亡の危険性を低下させるためにより積極的な治療を要する敗血症患者の亜集団を識別するための予後マーカーとして用いられる。ＩＴＩは、治療において敗血症による死亡率を低下させるために投与される。例えば、臨床転帰を向上させるための代償療法において、血漿ＩＴＩ量が低い敗血症患者にＩＴＩが投与される。
【００１６】
ＩＴＩの治療目的での投与は、ラット盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）による複数菌敗血症モデルを用いて評価された。その結果、ＣＬＰを行なった１時間後に体重１ｋｇ当たり３０ ｍｇ用量のＩＴＩを静脈内投与した場合に、溶媒処理した敗血症ラットで生存率が３０％であったものが８９％（ｐ＜０．０５； ｎ＝９〜１０）に上昇することが示された。この結果は、血漿ＩＴＩ量の減少が敗血症患者の高死亡率に関係しており、ＩＴＩ投与によって、敗血症が原因となる致死率が低下することが示された。
【００１７】
新生児敗血症
成人または新生児の敗血症の診断は、一般的には、例えば、新生児の血液を採取して、細菌細胞を培養し、血液細胞数を数えるなど、標準的な菌血症の診断検査法を用いて実施される。ヒト新生児敗血症は、Ｂ群連鎖球菌、大腸菌、リステリア菌、およびウイルスを含む、さまざまな病原菌によって起こりうる。
【００１８】
通常の新生児敗血症の精密検査には、いくつか不利な点がある。乳児から採取できる血液容量は、通常の検査を行なうには最適とはいえないことが多く（成人から採取できる血液容量の５〜１０倍少ない）、精密検査には３日かかることがある。母親が抗生物質による治療を受けているときには、新生児に細菌が存在したとしても、その細菌培養の結果が陰性になることがある。
【００１９】
ヒトの乳児患者の敗血症を検出するには、常法を用いて、乳児から血液試料を採取する。新生児にとっては、採取できる血液試料の量は一般的には２００ μｌである。標準的な医療行為によって、乳児の大きさおよび年齢を考慮しながら、試料の量を増加させることができる。２００ μｌ前後の血液試料の量を用いることができる。母親に、新生児敗血症に対する臨床的なリスク因子があることが分かっている場合には、乳児の生まれた後、簡単な検査を行なうために、乳児から血液試料を採取する。母親によるリスク因子には、母親の発熱、胎児頻脈、出産１２時間より前の羊膜破裂、羊水の悪臭（ｆｏｕｌ ｓｍｅｌｌｉｎｇ ａｍｎｉｏｔｉｃ ｆｌｕｉｄ）、子宮圧痛、白血球数の増加、および胎便汚染羊水が含まれる。
【００２０】
母親によるリスク因子の存在が知られていない場合には、乳児が感染の徴候を示したところで血液試料を採取する。乳児感染の徴候は、当技術分野において周知であり、呼吸困難、無呼吸、点状出血（皮下の小さな挫傷）、不規則な心拍、呼吸促迫、頻呼吸、大泉門の隆起、低血糖、および低核心温が含まれる。
【００２１】
本明細書記載の方法は迅速で（すなわち、１日のうちに、大抵は数時間で結果を得ることができる）、患者血漿が少量あれば実施することができる（複数回の検査をするために４〜５ Ｔｌよりも少ない血清または血漿）。
【００２２】
ＩＴＩ特異的抗体の作製
標準的なサブトラクション免疫（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）プロトコールを用いて、２種類の異なるヒト血漿由来ヒト第ＶＩＩ因子調製物に対するｍＡｂのパネルを作製した。まず、非滅菌調製物（ＩＴＩを含む）でマウスを免疫し、シクロフォスファミドで処理し、さらに、低温滅菌した調製物を注射した。このマウスを屠殺して、ハイブリドーマを作製し、周知の方法によってスクリーニングを行なった。一つの抗体（ｍＡｂ６９．３１）が、何種類かのポリペプチド鎖を含む複合糖タンパク質に結合することが分かった。固定したｍＡｂ６９．３１と抗原との複合体をアフィニティークロマトグラフィーによって精製したところ、２５０ ｋＤａと１２５ ｋＤａの大きさのポリペプチド抗原が単離された。Ｎ−末端アミノ酸配列解析によって、このバンド（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）がＩＴＩであることが確認された。
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アフィニティー精製されたＩＴＩは、トリプシン、プラスミン、エラスターゼなどのセリンプロテアーゼを阻害した。
【００２３】
ヒト被験者の血清または血漿に存在するＩＴＩには、コンドロイチン硫酸鎖で共有結合した１個の軽鎖と２個の重鎖ポリペプチド鎖が含まれている。軽鎖（見かけの分子量３０ ｋＤａ）は、トリプシン、ヒト白血球エラスターゼ（ＨＬＥ）、プラスミン、カテプシンＧなど、炎症、ショック、腫瘍侵襲、および転移形成に関与する、いくつかのセリンプロテアーゼを阻害する。天然および組換えによるＩＴＩ軽鎖を６９．３１などのＩＴＩ ｍＡｂによって精製する。精製されたＩＴＩ軽鎖は、セリンプロテアーゼを治療上阻害するのに役立つ。
【００２４】
寄託
ｍＡｂ６９．３１を産生するハイブリドーマ細胞株ＲＩ ６９．３１は１９９９年１２月１６日に、特許手続上の目的のために微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約の条項に従って、アメリカン・タイプカルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ））に寄託され、特許寄託番号ＰＴＡ−１０６６を得た。本出願人の指定代理人は、本件に付与された特許の期間が満了するまでは、寄託機関が試料を提供することができなくなった場合に、寄託条件にしたがって請求を受けたときには、寄託物を差し替える義務があること、および、本出願に対する特許が付与されたときには、その旨をＡＴＣＣに通知し、寄託物を一般に利用可能なものにする責任を負うことを承認するものである。それ以前は、本寄託は連邦法施行規則１．１４条および特許法１１２条の規定に基づいて、特許庁長官が利用できるものとする。
【００２５】
ＩＴＩ特異的抗体の結合特性
ｍＡｂ６９．３１は、ＩＴＩ軽鎖に対して反応性があった。ｍＡｂ６９．３１を用いて、ヒト血清からＩＴＩを精製し、０、１、５および１０ ｇのヒアルロニダーゼで処理して、ＩＴＩの重鎖と軽鎖を切断した。この試料を１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウエスタンブロットで解析するためにニトロセルロース膜に移行させた。ヒアルロニダーゼを入れなかった場合には、ｍＡｂ６９．３１によって２つの主要なバンド（２５０ ｋＤａと１２５ ｋＤａ）が検出された。ヒアルロニダーゼの量を増加させるとともに、分子量の低い別のバンド（約２５〜３０ ｋＤａ）が、この抗体によって検出された。この低分子のバンドは、ＩＴＩ軽鎖に相当する。ＩＴＩ軽鎖とＩＴＩ重鎖はグリコアミノグリカンによって結合している。ヒアルロニダーゼは、ＩＴＩ複合体の重鎖と軽鎖を結合しているグリコアミノグリカン（コンドロイチン硫酸）鎖を切断して、２種類の鎖を放出する。これらの結果は、ｍＡｂ６９．３１がＩＴＩの軽鎖上に存在するエピトープに結合することを示すものである。
【００２６】
ｍＡｂ６９．３１をＩＴＩに添加すると、ＩＴＩのセリンプロテアーゼ阻害活性を遮断した（抗体存在下ではＩＴＩのトリプシン阻害活性が減少するという観察結果と同様である）。これらのデータは、ｍＡｂ６９．３１のエピトープがＩＴＩ分子の活性部位中か、その近辺にあること、すなわち、６９．３１抗体がＩＴＩ軽鎖分子に結合すると、この分子は基体に結合できなくなることを示している。あるいは、抗体結合によってＩＴＩの三次元構造が変化し、その結果、セリンプロテアーゼ阻害活性が低下する。ｍＡｂ６９．３１の結合特性をもつ別のモノクローナル抗体を、例えば、競合結合アッセイ法のような、当技術分野において周知の方法を用いて作製・同定した。例えば、ＩＴＩ軽鎖の活性部位は、配列番号：５に記載の２０〜３２位、２４１〜２４２位、または２９７〜２９８位の残基を含む（表１）。
【表１】ヒトＩＴＩ軽鎖のアミノ酸配列
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【００２７】
診断／予後アッセイ法およびキット
本明細書に記載されたデータによって、敗血症を罹患していない患者に対して有意に低いＩＴＩ量が、敗血症患者の血漿または血清で検出されたことが明らかになった。ウエスタンブロットアッセイ法は、ＩＴＩを検出する際に高度の特異性を備えているが、体液中のＩＴＩ量を定量化するには、ＥＬＩＳＡ法のような定量アッセイ法の方が好適である。正常な個体（例えば、健常な自発的提供者）の有するＩＴＩ量の正常値範囲を基準として測定した。
【００２８】
正常な基準となるデータの収集は、通常の解析技術と公知の統計解析法を用いて実施する。ＩＴＩの「正常値」とは、敗血症に罹っていない個体集団について、一定の体液中におけるＩＴＩ量の平均値を意味する。正常範囲は、敗血症でない個体の集団内における平均値を１０％増減したものか、平均値からの標準偏差の２つ分を増減させたものである。正常範囲は、年齢に適合したものであることが好ましい。すなわち、新生児のＩＴＩ量の正常範囲は、敗血症でない新生児の平均値であり、また、成人のＩＴＩ量の正常範囲は、敗血症でない成人の平均値であることが好ましい。
【００２９】
アフィニティー精製されたヒトＩＴＩおよびｍＡｂ６９．３１を用いる標準的な競合的ＥＬＩＳＡ法を用いて、患者のＩＴＩ量を定量化する。あるいは、捕捉抗体（ｍＡｂ６９．３１）、およびＩＴＩに対する酵素標識したウサギポリクローナル二次抗体を検出抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いる。
【００３０】
体液中のＩＴＩ量を検出する方法は、体液成分を、微量滴定用プレート、ビーズ、ディップスティックなどの固形基体上に結合させたＩＴＩ特異的抗体に接触させる段階を含む。例えば、患者に由来する体液試料中に固形基体を浸し、洗浄後、この固形基体を試薬に曝して固形基体上に存在する免疫複合体の存在を検出する。
【００３１】
被検試料中のタンパク質を固形基体上に固定する（結合させる）。タンパク質を共有結合的または非共有結合的に固形基体上に結合させる方法および手段は、当技術分野において周知されている。固相表面の性質は、測定方式によってさまざまである。微量滴定用プレート上で行なわれるアッセイ法では、固相の表面はウエルまたはカップの壁である。ビーズを用いるアッセイ法では、固相の表面はビーズの表面である。ディップスティック（すなわち、布や紙などの多孔性または繊維性の材料から作られた固形物）を用いるアッセイ法においては、ディップスティックが作られた材料の表面が固相表面である。有用な固形支持体の例には、ニトロセルロース（例えば、膜や微量滴定用ウエルの状態）、ポリ塩化ビニール（例えば、シート状または微量滴定用ウエル）、ポリスチレンラテックス（例えば、ビーズまたは微量滴定用プレート）、ポリビニリジンフルオリド（登録商標ＩＭＭＵＬＯＮとして知られている）、ジアゾ化ペーパー、ナイロン膜、活性化ビーズ、プロテインＡビーズなどがある。微量滴定用プレートを活性化して（例えば、化学的に処理またはコートして）タンパク質を共有結合させることができる。一般的には、被検試料と接触させた後、結合した免疫複合体を検出する前に、抗体を含む固形支持体を洗浄する。
【００３２】
これらのアッセイ法すべてに共通する特徴は、ＩＴＩが抗体に結合して、ＩＴＩ特異的抗体に結合した患者のＩＴＩを含む免疫複合体が形成される条件下で、ＩＴＩ特異的抗体を体液に接触させる点である。このような条件は、一般的に、生理学的な温度、ｐＨ、およびイオン強度である。抗体と被検試料のインキュベーションを行なった後、検出可能な標識により免疫複合体の検出を行なう。例えば、標識は、酵素、蛍光、化学発光、放射性の標識、または色素である。例えば、ビオチンとアビジンを利用するアッセイ法など、免疫複合体からのシグナルを増強するアッセイ法も当技術分野において知られている。
【００３３】
例えば、抗体などのＩＴＩ検出用試薬をパッケージングしてキットの形にする。キットには、抗体（固形基体にすでに結合しているもの、または、それらを基体に結合する試薬と分離してパッケージングしたもの）、対照用調製物（陽性および／または陰性）、および／または検出用標識が別々の容器に入れられている。アッセイ法を実施するための使用説明書（例えば、書面、テープ、ＶＣＲ、ＣＤ ＲＯＭなど）をキットに入れることができる。アッセイ法は、当技術分野において既知の標準的サンドイッチＥＬＩＳＡ法の方式で行なうことができる。
【００３４】
例えば、ｍＡｂ６９．３１のようなＩＴＩ捕捉抗体を、多孔性ストリップなどの固形基体に固定して、少なくとも１つの検出部位を作り出す。多孔性ストリップの測定または検出用領域には、固定された抗体を含む部位を複数置くことができる。また、試験用ストリップには、陰性対照および／または陽性対照のための部位を置くこともできる。あるいは、対照用部位を、試験用ストリップとは別のストリップ上に置くこともできる。選択的には、最初の検出用部位には多量の抗体を固定し、量を減らしながら、その後に続く部位に固定するというように、さまざまな量の固定化した抗体をそれぞれの検出部位に置くことも可能である。例えば、２０ナノグラムの抗体が１ ｎｍｏｌ／分／ｍｌのＩＴＩに相当するものを捕捉し、アッセイ装置の最初の部位が５０ナノグラムの抗体を含み、その後の部位が１０、２０、３０ナノグラムなどの抗体を含むことができると思われる。被検試料を加えたとき検出シグナルを示した部位の数が、試料中に存在するＩＴＩ量を定量的に示す。検出用部位は、検出に適した如何なる形にも配置することができるが、一般的には、試験用ストリップの幅をもつ棒の形になっている。
【００３５】
被検試料中に閾値となる量のＩＴＩが含まれていないときには、実質的に全てのＩＴＩが最初の捕捉部位に存在する抗体に結合して、その部位に固定されるように、複数捕捉測定の構成を作成することができる。被検試料に閾値量よりも多くのＩＴＩが含まれているときには、残りのＩＴＩは、試験用ストリップの長辺に沿って固定された抗体の下流にある検出用領域に結合する。被検試料中に含まれるＩＴＩの量が多くなるほど、ＩＴＩの存在すると検出シグナルを表示する捕捉部位の数は増加する。
【００３６】
ＩＴＩの治療のための投与
敗血症の治療、敗血症の発症予防、または敗血症による死亡率の低下のためにＩＴＩを投与する。ＩＴＩポリペプチド、またはＩＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡを投与して、重度の細菌感染症患者や以前に敗血症と診断された患者におけるＩＴＩ量を上昇させる。常法を用いて生理食塩水などの薬学的に許容される担体の中に入れて、常法を用いてＩＴＩポリペプチドを患者に投与する。血漿血清量を、例えば、ＩＴＩ濃度の正常な範囲に持ち込むためにＩＴＩを投与する。下記のラットモデルにおいて、３０ ｍｇ／ｋｇのＩＴＩを一用量とした。ヒト患者に対する用量は、当技術分野において既知の方法を用いて、動物モデルから推定される。一日当たり体重１ ｋｇにつき、本発明に係るポリペプチドを約１〜１００モルの用量で静脈内投与することが予想される。本発明に係る組成物は、静脈、皮下、筋肉内、および腹腔内などの非経口で投与するのに有用である。
【００３７】
治療用ＩＴＩポリペプチドは、例えば、配列番号：５などの天然に存在するＩＴＩアミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列をもつ。より好ましくは、天然に存在するＩＴＩ配列と少なくとも７５％、さらに好ましくは８５％、より好ましくは９５％、なおより好ましくは９９％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。
【００３８】
レーザージーンソフトウェアパッケージ（Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｐａｃｋａｇｅ）（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて塩基配列とアミノ酸配列の比較を行なう。使用したメグアライン（ＭｅｇＡｌｉｇｎ）モジュールは、クラスタルＶ法（Ｃｌｕｓｔａｌ Ｖ）（Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９８９， ＣＡＢＩＯＳ ５（２）： １５１−１５３）によるものであった。使用したパラメータは、ギャップペナルティが１０、ギャップ長ペナルティが１０であった。
【００３９】
投与されるＩＴＩ断片は、天然に存在するＩＴＩ配列と少なくとも５０％（より好ましくは９９％、最も好ましくは１００％）の同一性を有し、天然に存在するＩＴＩポリペプチドの生物活性を有する。例えば、ＩＴＩの生物活性は、セリンプロテアーゼ活性の低下、または、例えば、本明細書に記載された３−Ｄ細胞侵襲アッセイ法で測定されるように、癌細胞の転移や侵襲性を阻害する。治療用ポリペプチドは、好ましくは、配列番号：５に記載の２０〜３２位、２４１〜２４２位、または２９７〜２９８位の残基を含む（表１）。このポリペプチドは、好ましくは、コンドロイチン硫酸によるＩＴＩ重鎖への結合に関与する２１５位の残基を含む。
【００４０】
治療のために投与されるＩＴＩは実質的に純粋である。好ましくは、ＩＴＩポリペプチドは成熟した形態のポリペプチド、すなわち、シグナルペプチドを含まないものである。重量（乾燥重量）にして少なくとも６０％が目的化合物である調製物中にある場合に、そのポリペプチドは「実質的に純粋」である。調製物は、重量にして、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９９％が目的化合物である。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ解析によって測定される。
【００４１】
治療用ペプチドが、ペプチダーゼによる切断に対してより感受性が低くなるように、ペプチドのペプチド結合を別の型の共有結合に置き換えることができる（「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ）」）。被験者に注射した後にペプチドがタンパク質分解されることが問題である場合には、特定の感受性ペプチド結合を切断不能のペプチド模倣物と置換することで、得られたペプチドはより安定となり、そのため、治療薬としてより有用である。このような模倣物、およびそれらをポリペプチドに取り込ませる方法は、当技術分野において周知である。同様に、Ｌ−アミノ酸残基をＤ−アミノ酸に置き換えることも、ポリペプチドのタンパク質分解に対する感受性を低下させる標準的な方法である。また、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、アセチル基、チエニル（ｔｈｅｙｌ）基、スクシニル基、メトキシスクシニル基、サブエリル（ｓｕｂｅｒｙｌ）基、アジピル（ａｄｉｐｙｌ）基、アゼライル（ａｚｅｌａｙｌ）基、ダンシル基、ベンジルオキシカルボニル基、フルオルエニルメトキシカルボニル基、メトキシアゼライル（ｍｅｔｈｏｘｙａｚｅｌａｙｌ）基、メトキシアジピル（ｍｅｔｈｏｘｙ ａｄｉｐｙｌ）基、メトキシサブエリル（ｍｅｔｈｏｘｙｓｕｂｅｒｙｌ）基、および２，４，−ジニトロフェニル基などのアミノ末端保護基も有用である。
【００４２】
標準的なベクターおよび／または遺伝子送達法によって、ＩＴＩポリペプチドをコードするＤＮＡを患者の標的細胞に導入する。適当な遺伝子送達法には、リポソーム法、レセプターを介する送達系、裸のＤＮＡ、ならびに、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、およびアデノウイルスなどのウイルスベクターなどがある。
【００４３】
実施例１：敗血症のマーカーとしての血漿ＩＴＩ量
ヒトＩＴＩに結合する特異的なモノクローナル抗体（例えば、ｍＡｂ６９．３１）を用いて、競合的ＥＬＩＳＡ法によって、健常者と敗血症患者の血漿中におけるＩＴＩ量を測定した。既知量の精製ＩＴＩの連続希釈を用いて、免疫アッセイ法の標準曲線を確定した（図１）。このアッセイ法を利用して、０．１〜２．５μｇ／ｍＬの範囲で正確かつ確実に血漿中のＩＴＩ量を測定することができる。被検血漿または血清試料中のＩＴＩ量を測定するために、試料をＰＢＳで１：１０００から１：２５００に希釈して、標準曲線に基づいてＩＴＩの濃度を計算した。
【００４４】
健常個体、敗血症に罹患していることが分かっている個体（通常の臨床パラメータによって判定された）、敗血症に罹患した生存者、および敗血症による死亡者における血漿中のＩＴＩ量を測定した。競合的ＥＬＩＳＡ法を用いて、健常個体群（ｎ＝１７）の血漿ＩＴＩ量と敗血症患者（ｎ＝５２）の血漿ＩＴＩ量とを比較した。その結果（図２）、健常個体の平均ＩＴＩ量は、敗血症患者群の平均値に較べて有意に高いことが示された（０．４９８±０．１６５ ｍｇ／ｍｌに対し１．２６６±０．５１９ ｍｇ／ｍｌ）。この差は統計学的に有意である（ｐ＝＜０．０００１）。
【００４５】
この結果に基づいて敗血症患者からの２５の血漿試料をさらに解析したところ、生存者グループが、敗血症で死亡した患者（非生存者）に較べて高いＩＴＩ量を示した。平均ＩＴＩ量は、それぞれ、０．５８±０．１３ ｍｇ／ｍｌと０．３５±０．２０ｍｇ／ｍｌであった。各グループ間のＩＴＩ量の違いは統計的に有意なものであった（ｐ＝０．０３１）。これらの結果は、ＩＴＩの減少量（正常で敗血症でないものと較べたときの量）が、敗血症による死亡率の上昇と相関していることを示している。図２に示した結果を、３２人の生存者と２０人の非生存者を含む、より多数の敗血症患者における研究によってさらに確認した。その結果（図３）は、図２に示すデータに矛盾しなかった。
【００４６】
実施例２：血漿中のＩＴＩ量は死亡を予後診断となる
血漿の低ＩＴＩ量と死亡率との相関関係を図４Ａ〜Ｂに示す。死亡した敗血症患者の６０％（１０人のうち６人）は、血漿においてＩＴＩ量の大きな減少を示した（＜０．３ ｍｇ／ｍｌ）。これに対して、死亡した敗血症患者の１９％（４２人のうち８人）でＩＴＩ量の増加（ＩＴＩ量が＞０．３ ｍｇ／ｍｌ）が検出された。この差は、ｐ＝０．０１６で統計的に有意であった。
【００４７】
長時間にわたって患者を追跡調査すると、ＩＴＩ量の低い患者は、高いＩＴＩ量をもつ患者によりも高い死亡率を示した（図４Ｂ）。これらの違いは、重度の敗血症が開始してから７日目まで続いた（ｐ＜０．０５）。
【００４８】
これらのデータは、血清または血漿のＩＴＩ量が感染症患者（例えば、敗血症を発症する危険性のある人、または敗血症の治療を受けている人）の予後を判定するのに役立つことを示している。例えば、本明細書に記載したアッセイ法は、敗血症の診断および予後診断の手段として使用するだけでなく、特定の治療法（感染および／または敗血症）を受けている人の進行状況を監視して、定められた治療計画を変更するための基礎を提供する上で有用である。
【００４９】
実施例３：ＩＴＩの治療目的での投与は敗血症による死亡率を低下させた
当技術分野において認められているインビボ敗血症動物モデルを用いて、ＩＴＩによる治療法の死亡率に対する効果を評価した。このラットモデルは、複数細菌性敗血症の盲腸結紮穿刺（ＣＬＰ）および盲腸切除（ＣＬＰＥ）モデルである。常法を用いて、ＣＰＬとＣＰＬＥによって、オスの成獣スプレーグ−ドーリーラットを敗血症にした。ＣＬＰの開始後１時間経過してから、精製ＩＴＩ（体重１ ｋｇ当たり生理食塩水１ ｍＬ中３０ ｍｇ）の静脈からの灌流を開始して３０分間続けた。対照用ラットにはＩＴＩの代わりに生理食塩水だけを与えた。ＣＬＰ後２０時間目に壊死した盲腸を切除し、死亡率を１０日間観察した。
【００５０】
その結果、ＣＬＰ後１時間してから体重１ ｋｇ当たり３０ ｍｇのＩＴＩ処理を一用量として静脈から投与すると、生存率が、生理食塩水対照用敗血症ラットの３０％から８９％に上昇した（ｐ＜０．０５；ｎ＝９〜１０）。これらのデータは、血漿のＩＴＩ量の減少と、敗血症患者の高い死亡率が関連していることを示しており、また、敗血症患者または敗血症を発症する危険性のある人にＩＴＩ組成物を投与すれば、例えば、敗血症による致死率が低下するなど、臨床上の恩典がもたらされることを示している。ヒトＩＴＩポリペプチドの投与は、敗血症による死亡率を低下させるのに役立つ。
【００５１】
本発明の態様をいくつか説明してきたが、本明細書に記載した方法および組成物の改変を、本発明の精神と範囲から逸脱することなく行なうことができる。この他の態様も特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】競合的ＥＬＩＳＡアッセイ法を用いて、ｍＡｂ６９．３１の結合特異性を示した線グラフである。
【図２】ヒト患者における血漿中のＩＴＩ量の範囲を示す線グラフである。図２Ａは、敗血症に罹った患者と健常患者における血漿ＩＴＩ量の比較を示したものであり、図２Ｂは、敗血症で死亡した者と生き残った者の血漿ＩＴＩ量を示したものである。
【図３】患者の数を増加させた集団におけるヒト患者の血漿ＩＴＩ量の範囲を示す線グラフである。検出された量を、敗血症で生き残った者と死亡した者とで比較すると、図２Ｂにおいて示されたデータが確認される。
【図４】血漿ＩＴＩ量と死亡率との相関関係を示す棒グラフである。図４Ａにプロットされたデータは、血漿ＩＴＩ量が高い患者に較べて、血漿ＩＴＩ量の低い患者の死亡率が高いことを示している。図４Ｂは、患者のＩＴＩ量を長時間追跡調査した結果を示している。
【図５】ＣＬＰおよび盲腸切除後の死亡率に与えるＩＴＩの影響を示す線グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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