(57)【要約】Ｔｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６を含む単離されたタンパク質複合体を提供する。タンパク質複合体は、タンパク質複合体内でのＴｓｇ１０１−ＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６相互作用の調整に有効な化合物を選択するためのスクリーニングアッセイで有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含むレトロウイルスＧＡＧポリペプチドまたは前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントである第２のタンパク質と相互作用するＴｓｇ１０１またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントである第１のタンパク質を含む、単離されたタンパク質複合体。
【請求項２】
前記第１のタンパク質が、
（ｉ）Ｔｓｇ１０１タンパク質と、
（ｉｉ）前記Ｔｓｇ１０１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することができるＴｓｇ１０１タンパク質ホモログと、
（ｉｉｉ）Ｔｓｇ１０１  ＵＥＶドメインを含むＴｓｇ１０１タンパク質フラグメントと、
（ｉｖ）前記Ｔｓｇ１０１タンパク質、前記Ｔｓｇ１０１タンパク質のホモログ、または前記Ｔｓｇ１０１タンパク質のフラグメントを含む融合タンパク質と
からなる群から選択される、請求項１に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項３】
前記第２のタンパク質が、
（１）Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを有するレトロウイルスＧＡＧポリペプチドと、
（２）前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができる前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドのホモログと、
（３）Ｔｓｇ１０１と相互作用することができる前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドのフラグメントと、
（４）前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチド、前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドホモログ、または前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドフラグメントを含む融合タンパク質と
からなる群から選択される、請求項１または請求項２に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項４】
前記レトロウイルスがレンチウイルスである、請求項１、請求項２、または請求項３に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項５】
前記レンチウイルスが霊長類レンチウイルスである、請求項４に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項６】
前記霊長類レンチウイルスが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、およびサル免疫不全ウイルス類からなる群から選択される、請求項５に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項７】
前記レンチウイルスが、ウシレンチウイルス類、ネコレンチウイルス類、およびヒツジ／ヤギレンチウイルス類からなる群から選択される非霊長類レンチウイルスである、請求項４に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項８】
前記第２のタンパク質が、ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドまたはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントである、請求項１〜６のいずれかに記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項９】
前記第２のタンパク質が（ａ）ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドまたは（ｂ）ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドフラグメントを含む融合タンパク質である、請求項１〜６および８のいずれかに記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１０】
前記第２のタンパク質が、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントである、請求項１〜６、８、および９のいずれかに記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１１】
前記第２のタンパク質が、（ａ）ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６ポリペプチドまたは（ｂ）ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６フラグメントを含む融合タンパク質である、請求項１〜６、８、９、および１０のいずれかに記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１２】
前記ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６フラグメントが配列番号３１または配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項１０または請求項１１に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１３】
前記ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６フラグメントが、天然に存在するＨＩＶ  ＧＡＧｐ６の少なくとも１０アミノ酸残基の連続スパンを有し、該連続スパンがＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含む、請求項１０または１１に記載の単離されたタンパク質複合体。
【請求項１４】
前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質を得るステップと、
該第１のタンパク質に該第２のタンパク質を接触させるステップと
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質複合体の産生方法。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質複合体を含むタンパク質マイクロアレイ。
【請求項１６】
第２のポリペプチドに共有結合した第１のポリペプチドを有し、前記第１のポリペプチドがＴｓｇ１０１またはそのホモログもしくはフラグメントであり、前記第２のポリペプチドがＨＩＶ  ＧＡＧまたはそのホモログもしくはフラグメントである、融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１６に記載の融合タンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項１８】
タンパク質複合体を得るステップと、
前記タンパク質複合体に試験化合物を接触させるステップと、
前記試験化合物の前記タンパク質複合体への結合の有無を決定するステップと
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質複合体のモジュレーターの選択方法。
【請求項１９】
１つまたは複数の試験化合物の存在下で前記第１のタンパク質に前記第２のタンパク質を接触させるステップと、
前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用を検出するステップと
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質複合体のモジュレーターの選択方法。
【請求項２０】
前記タンパク質複合体に試験化合物を接触させるステップと、
前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用を検出するステップとを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質複合体のモジュレーターの選択方法。
【請求項２１】
前記第１のタンパク質および第２のタンパク質の少なくとも１つが検出可能なタグを有する融合タンパク質である、請求項１８、１９、または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記接触ステップを実質的に無細胞の環境下で行う、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記接触ステップを宿主細胞において行う、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
宿主細胞中に前記第１のタンパク質を有する第１の融合タンパク質と、第２のタンパク質を有する第２の融合タンパク質とを得るステップであって、ＤＮＡ結合ドメインが前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との一方に融合し、転写活性化ドメインが前記第１のタンパク質と第２のタンパク質との他方に融合しており、
前記宿主細胞中にレポーター遺伝子を得るステップであって、該レポーター遺伝子の転写を、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用によって決定し、
試験化合物の存在下、前記宿主細胞内において、前記第１の融合タンパク質と前記第２の融合タンパク質とを相互作用させるステップと、
前記レポーター遺伝子発現の有無を決定するステップと
を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載のタンパク質複合体の第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用のモジュレーターを選択する方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の前記第１のタンパク質をコードする核酸を有する第１の発現ベクターと、
（ｂ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の前記第２のタンパク質をコードする核酸を有する第２の発現ベクターと
を含む組成物。
【請求項２８】
請求項２７に記載の前記第１の発現ベクターと前記第２の発現ベクターとを含む宿主細胞。
【請求項２９】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の前記第１のタンパク質をコードする第１の核酸に作動可能に連結された第１のプロモーターを有する第１の発現カセットと、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の前記第２のタンパク質をコードする第２の核酸に作動可能に連結された第２のプロモーターを有する第２の発現カセットと
を含む宿主細胞。
【請求項３０】
前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項２８または２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記第１の核酸および第２の核酸の一方がＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸に連結され、前記第１の核酸および第２の核酸の他方が転写活性化ドメインをコードする核酸に連結され、それにより２つの融合タンパク質を前記宿主細胞中において産生することができる、請求項２８、２９、または３０の宿主細胞。
【請求項３２】
レポーター遺伝子をさらに含み、該レポーター遺伝子の発現を前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用によって決定する、請求項３１の宿主細胞。
【請求項３３】
タンパク質複合体の三次元構造を定義する原子座標を得るステップと、
該原子座標に基づいて、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を妨害することができる化合物を設計または選択するステップと
を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のタンパク質複合体中の第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を妨害することができる化合物を得る方法。
【請求項３４】
試験化合物に、
（ｉ）Ｔｓｇ１０１タンパク質と、
（ｉｉ）Ｔｓｇ１０１と少なくと９０％同一のアミノ酸配列を有し、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することができるＴｓｇ１０１タンパク質ホモログと、
（ｉｉｉ）Ｔｓｇ１０１  ＵＥＶドメインを含むＴｓｇ１０１タンパク質フラグメントと、
（ｉｖ）前記Ｔｓｇ１０１タンパク質、前記Ｔｓｇ１０１タンパク質ホモログ、またはＴｓｇ１０１タンパク質フラグメントを含む融合タンパク質と
からなる群から選択されるタンパク質を接触させるステップと、
前記試験化合物が前記タンパク質に結合することができるかどうかを決定するステップと
を含む、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧｐ６との間のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害することができる化合物の選択方法。
【請求項３５】
前記タンパク質に結合することができる試験化合物の、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧｐ６との間のタンパク質−タンパク質相互作用を妨害する能力を試験するステップをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記タンパク質に結合することができる試験化合物の、ＨＩＶに感染した宿主細胞からのＨＩＶウイルスの出芽を阻害する能力を試験するステップをさらに含む、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
（ｉ）Ｔｓｇ１０１タンパク質と、
（ｉｉ）Ｔｓｇ１０１と少なくと９０％同一のアミノ酸配列を有し、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することができるＴｓｇ１０１タンパク質ホモログと、
（ｉｉｉ）Ｔｓｇ１０１  ＵＥＶドメインを含むＴｓｇ１０１タンパク質フラグメントと、
（ｉｖ）前記Ｔｓｇ１０１タンパク質、前記Ｔｓｇ１０１タンパク質ホモログ、またはＴｓｇ１０１タンパク質フラグメントを含む融合タンパク質と
からなる群から選択されるタンパク質の三次元構造を定義する原子座標を得るステップと、
該原子座標に基づいて、前記タンパク質と相互作用することができる化合物を設計または選択するステップと
を含む、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧｐ６との間のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害することができる化合物の選択方法。
【請求項３８】
前記タンパク質と相互作用することができる化合物の、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧｐ６との間のタンパク質−タンパク質相互作用を妨害する能力を試験するステップをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記タンパク質と相互作用することができる試験化合物の、ＨＩＶに感染した宿主細胞からのＨＩＶウイルスの出芽を阻害する能力を試験するステップをさらに含む、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１〜１３のいずれかに記載のタンパク質複合体と選択的に免疫反応性を示す単離された抗体。
【請求項４１】
細胞中のタンパク質複合体の濃度を減少させるステップを含む、ＨＩＶ  ＧＡＧである第２のタンパク質と相互作用するＴｓｇ１０１である第１のタンパク質を有するタンパク質複合体を調整する方法。
【請求項４２】
前記減少させるステップが前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用を妨害するステップを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記減少させるステップが前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用を妨害することができる化合物を前記細胞に投与するステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記化合物がＴｓｇ１０１に結合することができる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記化合物がＴｓｇ１０１タンパク質のＵＥＶドメインに結合することができる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記化合物がＴｓｇ１０１に免疫反応性を示す抗体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記化合物がＴｓｇ１０１に免疫反応性を示す抗体をコードする核酸である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体が一本鎖抗体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記化合物が前記タンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記化合物が、前記タンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体をコードする核酸である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体が一本鎖抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記減少させるステップが、前記細胞中のＴｇｓ１０１濃度を減少させるステップを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞中のＴｇｓ１０１濃度を減少させるステップが、Ｔｓｇ１０１核酸と特異的にハイブリッド形成するアンチセンス化合物を該細胞に投与するステップを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞中のＴｇｓ１０１濃度を減少させるステップが、Ｔｓｇ１０１核酸と特異的にハイブリッド形成するリボザイム化合物を該細胞に投与するステップを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
宿主細胞中のＴｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧとの間の相互作用を妨害するステップを含む、宿主細胞からのＨＩＶウイルスの出芽を阻害する方法。
【請求項５６】
前記妨害するステップが、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧとの間の相互作用を妨害することができる化合物を宿主細胞に投与するステップを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記妨害するステップが、Ｔｓｇ１０１タンパク質に結合することができる化合物を前記宿主細胞に投与するステップを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記化合物がＴｓｇ１０１に免疫反応性を示す抗体である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記化合物がＴｓｇ１０１に免疫反応性を示す抗体であり、該抗体がＴｓｇ１０１のＵＥＶドメインに結合することができる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用するＴｓｇ１０１を含むタンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体を前記宿主細胞に投与するステップを含む、宿主細胞からのＨＩＶウイルスの出芽を阻害する方法。
【請求項６１】
Ｔｓｇ１０１免疫反応性を示す抗体をコードする核酸を宿主細胞に投与するステップを含む、宿主細胞からのＨＩＶウイルスの出芽を阻害する方法。
【請求項６２】
前記抗体が一本鎖抗体である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用するＴｓｇ１０１を含むタンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体をコードする核酸を前記宿主細胞に投与するステップを含む、宿主細胞からのＨＩＶウイルスの出芽を阻害する方法。
【請求項６４】
前記抗体が一本鎖抗体である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ＨＩＶ出芽の阻害、ＨＩＶ感染の治療、またはＡＩＤＳの予防における、Ｔｓｇ１０１核酸と特異的にハイブリッド形成するアンチセンス化合物の使用。
【請求項６６】
ＨＩＶ出芽の阻害、ＨＩＶ感染の治療、またはＡＩＤＳの予防における、Ｔｓｇ１０１核酸と特異的にハイブリッド形成するリボザイム化合物の使用。
【請求項６７】
ＨＩＶ出芽の阻害、ＨＩＶ感染の治療、またはＡＩＤＳの予防における、Ｔｓｇ１０１タンパク質に結合することができる化合物の使用。
【請求項６８】
ＨＩＶ出芽の阻害、ＨＩＶ感染の治療、またはＡＩＤＳの予防における、Ｔｓｇ１０１に免疫反応性を示す抗体の使用。
【請求項６９】
ＨＩＶ出芽の阻害、ＨＩＶ感染の治療、またはＡＩＤＳの予防における、Ｔｓｇ１０１のＵＥＶドメインに結合することができる抗体の使用。
【請求項７０】
ＨＩＶ出芽の阻害、ＨＩＶ感染の治療、またはＡＩＤＳの予防における、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧとの間の相互作用を妨害することができる化合物の使用。
【請求項７１】
ＨＩＶ出芽の阻害、ＨＩＶ感染の治療、またはＡＩＤＳの予防における、ＨＩＶ  ＧＡＧと相互作用するＴｓｇ１０１を含むタンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体の使用。
【請求項７２】
ＨＩＶ出芽の阻害、ＨＩＶ感染の治療、またはＡＩＤＳの予防における、Ｔｓｇ１０１に免疫反応性を示す抗体をコードする核酸の使用。
【請求項７３】
ＨＩＶ出芽の阻害、ＨＩＶ感染の治療、またはＡＩＤＳの予防における、ＨＩＶ  ＧＡＧと相互作用するＴｓｇ１０１を含むタンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体をコードする核酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、タンパク質−タンパク質相互作用と、薬物スクリーニングおよび疾患治療におけるその使用とに関する。
【背景技術】
【０００２】
１つのタンパク質分子の作用に注目する伝統的なタンパク質機能の所見と対照的に、タンパク質機能についての現代の幅広い所見では、タンパク質を相互作用ネットワークの構成要素と考える。Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ，４０５，８２３〜８２６（２０００）を参照のこと。すなわち、タンパク質機能の完全な理解には、タンパク質自体の特徴だけでなく、同一の相互作用ネットワーク中での他のタンパク質との相互作用または関連についての知識が必要である。本質的に、タンパク質−タンパク質相互作用はほとんど全ての生物学的プロセスの基本を形成し、各生物学的プロセスがタンパク質相互作用ネットワークの構成要素である。例えば、細胞骨格、核孔、中心体、および動原体などの細胞構造は、多数のタンパク質の間の複雑な相互作用によって形成される。多数の酵素反応は、酵素、タンパク質基質、およびタンパク質モジュレーターの間の相互作用によって形成された巨大タンパク質複合体に関連する。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用はまた、シグナル伝達ならびにＤＮＡ複製、転写、および翻訳などの他の基本的細胞機能の機構の一部である。例えば、複雑な転写阻害プロセスには、一般に、多数の転写因子、ＲＮＡポリメラーゼ、および他のタンパク質との間のタンパク質−タンパク質相互作用が必要である。例えば、Ｔｊｉａｎ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｃｅｌｌ，７７，５〜８，１９９４を参照のこと。
【０００３】
ほとんどのタンパク質は他のタンパク質との相互作用を介して機能するので、試験タンパク質が公知のタンパク質と相互作用する場合、試験タンパク質は、例えば、公知のタンパク質と同一の構造または同一の細胞プロセスにおいて公知のタンパク質の機能に関連することを合理的に予想することができる。したがって、相互作用パターンにより、相互作用タンパク質の機能を迅速且つ確実に理解することができる。相互作用タンパク質の同定により、疾患経路および細胞プロセスがより良好に理解され、それにより疾患を克服し、疾患経路における重要なレギュレーターおよび潜在的な薬物標識を同定することができる。
【０００４】
プロテオミクス分野ではタンパク質−タンパク質相互作用に非常に関心が寄せられている。多数の生化学的アプローチを使用して、タンパク質相互作用が同定されている。これらのアプローチは、一般に、束縛状態のタンパク質を単離するために相互作用タンパク質間の親和性を使用する。このような方法の例には、任意選択的に結合を安定化させるための架橋と組み合わせた免疫共沈および同時精製が含まれる。パートナーと相互作用する単離されたタンパク質の同一性を、例えば、質量分析法によって特徴付けることができる。例えば、Ｒｏｕｔら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４８、６３５〜６５１、２０００；Ｈｏｕｒｙら、Ｎａｔｕｒｅ、４０２、１４７〜１５４、１９９９；Ｗｉｎｔｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，７、５１７〜５２９、１９９７を参照のこと。大規模スクリーニングで有用な一般的アプローチは、バクテリオファージのキャプシドおよび外殻タンパク質に融合した目的のペプチドまたはタンパク質を発現するために組換えＤＮＡ技術によって繊維状バクテリオファージ粒子を作製するファージディスプレイ法である。目的のペプチドまたはタンパク質の全ライブラリーを発現させ、ベイトタンパク質をラブラリーのスクリーニングに使用して、該ベイトタンパク質に結合することができるペプチドまたはタンパク質を同定することができる。例えば、米国特許第５，２２３，４０９号、米国特許第５，４０３，４８４号、米国特許第５，５７１，６９８号、および米国特許第５，８３７，５００号を参照のこと。とりわけ、ファージディスプレイ法のみによりインビトロ環境で相互作用することができるタンパク質が同定され、免疫共沈および同時精製法はハイスループットスクリーニングを行うことができない。
【０００５】
酵母２ハイブリッドシステムは、上記アプローチの一定の欠点を克服する遺伝的方法である。酵母２ハイブリッドシステムは、インビボでの特定のタンパク質の発見に強力な方法であることが証明された。一般に、Ｂａｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ編、「酵母２ハイブリッドシステム」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９７を参照のこと。酵母２ハイブリッド技術は、異なる融合タンパク質中に含まれるＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインは、互いに接近している場合依然として遺伝子を活性化することができるという事実に基づいている。酵母２ハイブリッドシステムでは、酵母細胞中で２つの融合タンパク質を発現させる。一方は、試験タンパク質に融合した転写アクチベーターのＤＮＡ結合ドメインを有する。それに対して、他方は、別の試験タンパク質に融合した転写アクチベーターの転写活性化ドメインを含む。２つの試験タンパク質がインビボで相互作用する場合、転写アクチベーターの２つのドメインは互いに転写アクチベーターを構築し、転写アクチベーターによって制御されるレポーター遺伝子を活性化する。例えば、米国特許第５，２８３，１７３号を参照のこと。
【０００６】
酵母２ハイブリッドシステムは、その簡便さ、有効性、および信頼性のために、多数の研究領域で非常に支持されてきた。さらに、酵母細胞は真核細胞である。酵母２ハイブリッドシステムで検出される哺乳動物タンパク質間の相互作用は、典型的には、生理学的条件下で哺乳動物細胞において生ずる正真正銘の相互作用である。事実上、酵母２ハイブリッドシステムを使用して多数の哺乳動物タンパク質−タンパク質相互作用が同定されている。同定されたタンパク質は、多数のシグナル伝達経路および他の生物学的プロセスの理解に大いに役立っている。例えば、複雑な細胞周期調節で重要な多数の新規の哺乳動物細胞周期調節の同定に酵母２ハイブリッドシステムが首尾よく使用されている。細胞周期調節に重要な公知のタンパク質をベイトとして使用して、そのベイトと相互作用する能力によって細胞周期制御に関連する他のタンパク質を同定した。一般に、Ｈａｎｎｏｎら、「酵素２ハイブリッドシステム」、Ｂａｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ編、１８３〜１９６、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９７を参照のこと。酵母２ハイブリッドシステムによって同定された哺乳動物細胞周期レギュレーターの例には、ＣＤＫ４／ＣＤＫ６インヒビター（例えば、ｐ１６、ｐ１５、ｐ１８、およびｐ１９）、Ｒｂファミリーメンバー（例えば、ｐ１３０）、Ｒｂホスファターゼ（例えば、ＰＰ１−α２）、Ｒｂ結合転写因子（例えば、Ｅ２Ｆ−４およびＥ２Ｆ−５）、一般的なＣＤＫインヒビター（例えば、ｐ２１およびｐ２７）、ＣＡＫサイクリン（例えば、サイクリンＨ）、およびＣＤＫ  Ｔｈｒ１６１ホスファターゼ（例えば、ＫＡＰおよびＣＤ１１）が含まれる。前出、１９２頁を参照のこと。「２ハイブリッドアプローチは細胞サイクルパズルの新規断片について、我々の継続中の研究における有用なツールであることが約束されている」、前出、１９３頁を参照のこと。
【０００７】
酵母２ハイブリッドシステムを使用して、疾患経路に関連する特定の公知のタンパク質と相互作用するタンパク質を同定し、それにより疾患機構に関する貴重な理解を得ることができる。同定されたタンパク質および関与するタンパク質−タンパク質相互作用は、疾患治療用の新規薬物選択のための潜在的な薬物標的である。
【０００８】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染は、後天性免疫不全症候群（一般に、ＡＩＤＳとして公知）を引き起こす。ＨＩＶは、ヘルパーＴ細胞としても公知のＣＤ４糖タンパク質を発現するＴ細胞（すなわち、ＣＤ４+Ｔ細胞）に主に感染するレトロウイルスである。ＨＩＶウイルスは、ヘルパーＴ細胞中で増殖し、宿主ヘルパーＴ細胞を急速に破壊して細胞性免疫を低下させ、日和見感染症、悪性疾患、および種々の他の病態に感受性を示す感染患者が発生する。最終的に、ＨＩＶ感染により、ヘルパーＴ細胞が枯渇し、患者の免疫防御が崩壊する。当然のことではあるが、ＨＩＶ感染個体およびＡＩＤＳ患者は、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）、進行性全身性リンパ節腫脹症（ＰＧＬ）、痴呆、熱帯性不全対麻痺、カポジ肉腫、血小板減少性紫斑病、ヘルペス感染、サイトメガロウイルス感染、エプスタイン−バーウイルス関連リンパ腫などのＡＩＤＳ関連病態を発症する。任意の場合では、感染個体のＨＩＶウイルスは感染性であり、輸血または性的接触を介して他のヒトに伝播し得る。
【０００９】
過去１５年間またはＨＩＶ感染およびＡＩＤＳ治療のための方法および薬学的化合物の開発に多大な努力が払われてきた。治療アプローチのほとんどが限られた数の薬物標的（すなわち、ＨＩＶ逆転写酵素、ＨＩＶプロテアーゼ、およびＨＩＶインテグラーゼ）に注目している。多数の逆転写酵素インヒビターおよびプロテアーゼインヒビターが開発または市場に出されている。ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターの例には、Ｚｉｄｏｖｕｄｉｎｅ、Ｓｔａｖｕｄｉｎｅ、Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ、およびｄｄＩが含まれる。非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビターの例には、Ｅｆａｖｉｒｅｎｚ、Ｄｅｌａｖｉｒｄｉｎｅ、およびＡｂａｃａｖｉｒが含まれる。さらに、Ｒｉｔｏｎａｖｉｒ、Ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ、Ｉｎｄｉｎａｖｉｒ、およびＳａｑｕｉｎａｖｉｒを含む多数のＨＩＶプロテアーゼインヒビターが市販されている。
【００１０】
しかし、ＨＩＶは、典型的には、増殖するにつれて活発に変異する。さらに、高い変異率によって、部分的に、ＨＩＶにおいて広範な遺伝子変異が存在する。したがって、感染患者でＨＩＶ逆転写酵素およびプロテアーゼの変異が頻繁に起こり、ウイルスは患者に投与したインヒビターに耐性を示す。異なる抗ＨＩＶインヒビターの組み合わせを患者に投与するＨＡＡＲＴ（高活性抗レトロウイルス療法）と呼ばれる併用療法が開発されている。しかし、併用療法に対するウイルス耐性も頻繁に高められる。
【００１１】
さらに、当分野で公知の多数の抗ＨＩＶ化合物は、他の重大な欠点を有する。例えば、ＡＺＴおよびｄｄＩなどの逆転写酵素インヒビターは非常に有毒であり、このような化合物で治療した患者は重篤な副作用を起こす。したがって、以前に開発された抗ＨＩＶ化合物ではＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの制御は限られているので、現在利用可能な薬物の欠点を克服する別の治療アプローチが必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
ヒト腫瘍感受性遺伝子１０１（「Ｔｓｇ１０１」）はＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することが発見された。特に、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧとの相互作用は、宿主細胞からのＨＩＶ出芽に不可欠である。従って、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６によって形成されたタンパク質複合体ならびにＴｓｇ１０１のみをスクリーニングアッセイで使用して、Ｔｓｇ１０１ならびにＴｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６とを含むタンパク質複合体の機能および活性を調整することができる化合物を選択することができる。同定された化合物は、レンチウイルス増殖（特に、ＨＩＶ増殖）の阻害ならびにＨＩＶ感染およびＡＩＤＳ治療に有用であり得る。
【００１３】
したがって、本発明の第１の態様によれば、ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドまたはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントである第２のタンパク質と相互作用するＴｓｇ１０１またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントである第１のタンパク質を有する単離されたタンパク質複合体が得られる。好ましい実施形態では、第１のタンパク質は、（ａ）Ｔｓｇ１０１、または（ｂ）Ｔｓｇ１０１ホモログ、または（ｃ）Ｔｓｇ１０１フラグメントを含む融合タンパク質である。別の好ましい実施形態では、第２のタンパク質は、（ａ）ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチド、または（ｂ）ＨＩＶ  ＧＡＧホモログ、または（ｃ）ＨＩＶ  ＧＡＧフラグメントを含む融合タンパク質であり得る。
【００１４】
本発明の別の態様では、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６ポリペプチドまたはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントである第２のタンパク質と相互作用するＴｓｇ１０１またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントである第１のタンパク質を有する単離されたタンパク質複合体が得られる。好ましい実施形態では、第１のタンパク質は、（ａ）Ｔｓｇ１０１、または（ｂ）Ｔｓｇ１０１ホモログ、または（ｃ）Ｔｓｇ１０１フラグメントを含む融合タンパク質である。別の好ましい実施形態では、第２のタンパク質は、（ａ）ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６ポリペプチド、または（ｂ）ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６ホモログ、または（ｃ）ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６フラグメントを含む融合タンパク質であり得る。
【００１５】
本発明はまた、（ａ）（ｉ）Ｔｓｇ１０１タンパク質、（ｉｉ）前記Ｔｓｇ１０１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することができるＴｓｇ１０１タンパク質ホモログ、（ｉｉｉ）Ｔｓｇ１０１  ＵＥＶドメインを含むＴｓｇ１０１タンパク質フラグメント、および（ｉｖ）前記Ｔｓｇ１０１タンパク質、前記Ｔｓｇ１０１タンパク質のホモログ、または前記Ｔｓｇ１０１タンパク質のフラグメントを含む融合タンパク質からなる群から選択される第１のタンパク質、および（ｂ）（１）ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチド、（２）前記ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができる前記ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドのホモログ、（３）ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６、（４）ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６ポリペプチドと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができるＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のホモログ、（５）Ｔｓｇ１０１と相互作用することができるＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のフラグメント、および（６）前記ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチド、前記ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドのホモログ、前記ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６タンパク質、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のホモログ、またはＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のフラグメントを含む融合タンパク質からなる群から選択される第２のタンパク質を含む単離されたタンパク質複合体を提供する。特定の実施形態では、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のフラグメントは、天然に存在するＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含む少なくとも１０アミノ酸残基の連続スパンを有する。好ましくは、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のフラグメントは、配列番号２５〜３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
本発明は、さらに、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含むレトロウイルスＧＡＧポリペプチドまたは前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントである第２のタンパク質と相互作用するＴｓｇ１０１またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントである第１のタンパク質を含む単離されたタンパク質複合体を提供する。好ましくは、レトロウイルスはレンチウイルスである。より好ましくは、レトロウイルスは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、およびサル免疫不全ウイルスからなる群から選択されるウイルスなどの霊長類レンチウイルスである。レンチウイルスはまた、ウシレンチウイルス、ネコレンチウイルス、およびヒツジ／ヤギレンチウイルスからなる群から選択される非霊長類レンチウイルスであり得る。したがって、単離されたタンパク質複合体には、
（ａ）  （ｉ）Ｔｓｇ１０１タンパク質、
（ｉｉ）前記Ｔｓｇ１０１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することができるＴｓｇ１０１タンパク質ホモログ、
（ｉｉｉ）Ｔｓｇ１０１  ＵＥＶドメインを含むＴｓｇ１０１タンパク質フラグメント、および
（ｉｖ）前記Ｔｓｇ１０１タンパク質、前記Ｔｓｇ１０１タンパク質のホモログ、または前記Ｔｓｇ１０１タンパク質のフラグメントを含む融合タンパク質からなる群から選択される第１のタンパク質；および
（ｂ）  （１）Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを有するレトロウイルスＧＡＧポリペプチド、
（２）前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができる前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドのホモログ、
（３）Ｔｓｇ１０１と相互作用することができる前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドのフラグメント、および
（４）前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチド、前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドホモログ、または前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドフラグメントを含む融合タンパク質からなる群から選択される第２のタンパク質を含み得る。
別の特定の実施形態では、単離されたタンパク質複合体には、
（ａ）  （ｉ）Ｔｓｇ１０１タンパク質、
（ｉｉ）前記Ｔｓｇ１０１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することができるＴｓｇ１０１タンパク質ホモログ、
（ｉｉｉ）Ｔｓｇ１０１  ＵＥＶドメインを含むＴｓｇ１０１タンパク質フラグメント、および
（ｉｖ）前記Ｔｓｇ１０１タンパク質、前記Ｔｓｇ１０１タンパク質のホモログ、または前記Ｔｓｇ１０１タンパク質のフラグメントを含む融合タンパク質からなる群から選択される第１のタンパク質；および
（ｂ）  （１）霊長類レンチウイルスＧＡＧポリペプチド、
（２）霊長類レンチウイルスＧＡＧポリペプチドと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができる霊長類レンチウイルスＧＡＧポリペプチドのホモログ、
（３）霊長類レンチウイルスＧＡＧｐ６タンパク質、
（４）ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６ポリペプチドと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができる霊長類レンチウイルスＧＡＧｐ６のホモログ、
（５）Ｔｓｇ１０１と相互作用することができる霊長類レンチウイルスＧＡＧｐ６のフラグメント、
（６）霊長類レンチウイルスＧＡＧポリペプチド、霊長類レンチウイルスＧＡＧポリペプチドのホモログ、霊長類レンチウイルスＧＡＧｐ６タンパク質、霊長類レンチウイルスＧＡＧｐ６のホモログ、または霊長類レンチウイルスＧＡＧｐ６のフラグメントを含む融合タンパク質からなる群から選択される第２のタンパク質を含み得る。
【００１７】
さらに別の態様では、本発明は、本発明のタンパク質複合体の産生方法を提供する。本方法は、本発明のタンパク質複合体中に第１のタンパク質および第２のタンパク質を得るステップと、前記第１のタンパク質を前記第２のタンパク質に接触させるステップとを含む。さらに、タンパク質複合体を、組織および細胞からの単離または精製によって調製するか、そのタンパク質メンバーの組換え発現によって産生することができる。
【００１８】
本発明は、さらに、第２のポリペプチドの共有結合した第１のポリペプチドを有し、前記第１のポリペプチドがＴｓｇ１０１またはそのホモログもしくはフラグメントであり、前記第２のポリペプチドがＨＩＶ  ＧＡＧまたはそのホモログもしくはフラグメントである融合タンパク質に関する。融合タンパク質をコードする単離された核酸もまた提供する。
【００１９】
本発明のさらに別の態様では、本発明のタンパク質複合体に免疫反応性を示す抗体が得られる。１つの実施形態では、抗体は本発明のタンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す。別の実施形態では、２つの異なる抗原結合部位を有し、それぞれ本発明のタンパク質複合体中の異なる相互作用タンパク質メンバーに特異的な二機能性抗体が得られる。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ’フラグメント、およびＦ（ａｂ）’フラグメントのような抗体フラグメントを含む種々の形態を取ることができる。好ましくは、抗体は、部分的または完全にヒト化された抗体である。本発明の抗体を、当分野で一般的に公知の手順を使用して容易に調製することができる。例えば、ファージディスプレイライブラリーおよびリボソームディスプレイライブラリーなどの組換えライブラリーを使用して、所望の特異性を有する抗体をスクリーニングすることができる。さらに、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ多様化などの種々の変異誘発技術を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用することができる。
【００２０】
本発明は、さらに、１つまたは複数の本発明のタンパク質複合体および／または１つまたは複数の本発明の抗体を含むタンパク質マイクロチップに関する。このようなタンパク質マイクロチップは、タンパク質複合体を含む大規模ハイスループットスクリーニングアッセイで有用であり得る。
【００２１】
本発明のさらに別の態様では、Ｔｓｇ１０１またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントと、ＨＩＶ  ＧＡＧまたはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントとの間に形成されたタンパク質複合体のモジュレーターを選択するためのスクリーニング法が得られる。Ｔｓｇ１０１のモジュレーターを選択するためのスクリーニング法もまた得られる。本発明のスクリーニング法で同定された化合物は、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧとの間の相互作用の研究ならびにＨＩＶウイルス増殖機構の理解で使用することができる。選択された化合物はまた、ウイルス感染、特異ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳなどの疾患または障害の予防または改善に有用であり得る。
【００２２】
したがって、本発明のタンパク質複合体またはＴｓｇ１０１に結合することができる化合物を選択するためのインビトロ結合アッセイで、試験化合物をスクリーニングすることができる。さらに、インビトロ解離アッセイを使用して、本発明によって同定されたタンパク質複合体を解離することができる化合物を選択することもできる。インビトロスクリーニングアッセイを使用して、本発明のタンパク質複合体の形成を誘発、または開始させるか本発明のタンパク質複合体を安定化する化合物を選択することもできる。好ましい実施形態では、酵母２ハイブリッドアッセイおよびその種々の派生アッセイ（好ましくは、逆２ハイブリッドアッセイ）などのインビボアッセイを、Ｔｓｇ１０１またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントとＨＩＶ  ＧＡＧｐ６またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントとの間のタンパク質−タンパク質相互作用を妨害または破壊する化合物の選択に使用する。さらに、酵母２ハイブリッドアッセイなどの系はまた、Ｔｓｇ１０１またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントとＨＩＶ  ＧＡＧｐ６またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントとの間のタンパク質−タンパク質相互作用を誘発もしくは開始または増強もしくは安定化することができる化合物の選択に有用である。
【００２３】
したがって、１つの実施形態では、スクリーニング法には、１つまたは複数の試験化合物の存在下で本発明のタンパク質複合体の第１のタンパク質および第２のタンパク質を接触させるステップと、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用を検出するステップとを含む。好ましくは、第１のタンパク質および第２のタンパク質は、検出可能なタグを有する融合タンパク質である。実質的に無細胞の環境下または宿主細胞、好ましくは酵母細胞中で本発明の方法を行うことができる。
【００２４】
好ましい実施形態では、スクリーニング法は、（ａ）Ｔｓｇ１０１またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントを有する第１の融合タンパク質およびレトロウイルスＧＡＧ（例えば、ＨＩＶ  ＧＡＧ）またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントを有する第２の融合タンパク質を宿主細胞中に得るステップであって、ＤＮＡ結合ドメインが一方の前記第１のタンパク質および第２のタンパク質と融合する一方で、転写活性化ドメインが他方の前記第１のタンパク質および第２のタンパク質に融合することと、（ｂ）前記宿主細胞中にレポーター遺伝子を得るステップであって、レポーター遺伝子の転写を第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用によって決定するステップと、（ｃ）前記第１および第２の融合タンパク質を試験化合物の存在下で前記宿主内で相互作用させるステップと、（ｄ）前記レポーター遺伝子発現の有無を決定するステップとを含む。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、
（ａ）  （ｉ）Ｔｓｇ１０１タンパク質、
（ｉｉ）前記Ｔｓｇ１０１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することができるＴｓｇ１０１タンパク質ホモログ、
（ｉｉｉ）Ｔｓｇ１０１  ＵＥＶドメインを含むＴｓｇ１０１タンパク質フラグメント、および
（ｉｖ）前記Ｔｓｇ１０１タンパク質、前記Ｔｓｇ１０１タンパク質のホモログ、または前記Ｔｓｇ１０１タンパク質のフラグメントを含む融合タンパク質からなる群から選択される第１のタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを有する第１の発現カセットと、および
（ｂ）  （１）Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを有するレトロウイルスＧＡＧポリペプチド、
（２）前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができる前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドのホモログ、
（３）Ｔｓｇ１０１と相互作用することができる前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドのフラグメント、および
（４）前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチド、前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドホモログ、または前記レトロウイルスＧＡＧポリペプチドフラグメントを含む融合タンパク質からなる群から選択される第２のタンパク質をコードする核酸に作動可能に連結されたプロモーターを有する第２の発現カセットとを含む宿主が得られる。
好ましい実施形態では、第２のタンパク質は、
（１）ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチド、
（２）ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができるＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドのホモログ、
（３）ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６タンパク質、
（４）ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６ポリペプチドと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができるＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のホモログ、
（５）Ｔｓｇ１０１と相互作用することができるＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のフラグメント、
（６）前記ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチド、前記ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドのホモログ、前記ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６タンパク質、前記ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のホモログ、または前記ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のフラグメントを含む融合タンパク質からなる群から選択される。
【００２６】
本発明の宿主細胞の別の好ましい実施形態では、前記第１の核酸および第２の核酸の一方を、ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸に連結し、第１の核酸および第２の核酸の他方を、転写活性化ドメインをコードする核酸に連結させ、それにより前記宿主細胞中に２つの融合タンパク質を産生することができる。好ましくは、宿主細胞はレポーター遺伝子をさらに含み、レポーター遺伝子の発現を第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用によって決定する。
【００２７】
本発明は、さらに、タンパク質複合体の三次元構造を定義する原子座標を得るステップと、該原子座標に基づいて前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質との間の相互作用を妨害することができる化合物を設計または選択するステップとを含む、本発明のタンパク質複合体中における第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の相互作用を妨害することができる化合物を得る方法に関する。
【００２８】
さらに、本発明はまた、試験化合物に、
（ｉ）Ｔｓｇ１０１タンパク質、
（ｉｉ）前記Ｔｓｇ１０１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することができるＴｓｇ１０１タンパク質ホモログ、
（ｉｉｉ）Ｔｓｇ１０１  ＵＥＶドメインを含むＴｓｇ１０１タンパク質フラグメント、
（ｉｖ）前記Ｔｓｇ１０１タンパク質であって、前記Ｔｓｇ１０１タンパク質のホモログ、または前記Ｔｓｇ１０１タンパク質のフラグメントを含む融合タンパク質と
からなる群から選択されるタンパク質を接触させるステップと、
前記試験化合物が前記タンパク質に結合することができるかどうかを決定するステップとを含む、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧｐ６との間のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害することができる化合物を選択する方法を提供する。好ましい実施形態では、本方法は、さらに、タンパク質に結合することができる試験化合物のＴｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧｐ６との間のタンパク質−タンパク質相互作用を妨害する能力を試験するステップと、任意選択的に、タンパク質に結合することができる選択された試験化合物のＨＩＶに感染した宿主細胞からのＨＩＶウイルスの出芽を阻害する能力を試験するステップをさらに含む。
【００２９】
本発明は、さらに、Ｔｓｇ１０１とレトロウイルスＧＡＧ含有Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフとの間のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害することができる化合物を選択する方法を提供する。本方法は、（ａ）（ｉ）Ｔｓｇ１０１タンパク質、（ｉｉ）前記Ｔｓｇ１０１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有し、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することができるＴｓｇ１０１タンパク質ホモログ、（ｉｉｉ）Ｔｓｇ１０１  ＵＥＶドメインを含むＴｓｇ１０１タンパク質フラグメント、および（ｉｖ）前記Ｔｓｇ１０１タンパク質、前記Ｔｓｇ１０１タンパク質のホモログ、または前記Ｔｓｇ１０１タンパク質のフラグメントを含む融合タンパク質からなる群から選択されるタンパク質の三次元構造を定義する原子座標を得るステップと、（ｂ）該原子座標に基づいて前記タンパク質に相互作用することができる化合物を設計または選択するステップとを含む。好ましい実施形態では、本方法は、さらに、前記タンパク質と相互作用することができる選択された化合物のＴｓｇ１０１とレトロウイルスＧＡＧとの間のタンパク質−タンパク質相互作用を妨害する能力を試験するステップと、任意選択的に、前記タンパク質と相互作用することができる選択された化合物のウイルス出芽、特にＨＩＶに感染した宿主細胞からのＨＩＶウイルスの出芽を阻害する能力を試験するステップとを含む。
【００３０】
本発明はまた、哺乳動物細胞中でＴｓｇ１０１およびＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含むレトロウイルスＧＡＧを含むタンパク質複合体を調整する方法を提供する。特別な実施形態では、レトロウイルスＧＡＧはＨＩＶ  ＧＡＧである。本方法を使用して、ウイルス出芽、特に、感染宿主細胞からのＨＩＶウイルスの出芽を阻害することができる。ウイルス出芽の阻害により、感染宿主細胞からのウイルスの放出が防止され、それによりさらなるウイルス増殖が抑制される。したがって、本発明はまた、ウイルス感染、特にＨＩＶ感染を治療する方法および患者のＡＩＤＳを予防する方法を含む。
【００３１】
１つの実施形態では、細胞中のレトロウイルスＧＡＧと相互作用するＴｓｇ１０１を有するタンパク質複合体の濃度を減少させる。種々の方法を使用して、タンパク質複合体濃度を減少させることができる。タンパク質複合体濃度を、Ｔｓｇ１０１とレトロウイルスＧＡＧ（例えば、ＨＩＶ  ＧＡＧ）との間の相互作用の妨害によって減少させることができる。例えば、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧとの間の相互作用を妨害することができる化合物を、患者の細胞にインビトロまたはインビボで投与することができる。このような化合物は、Ｔｓｇ１０１タンパク質、特に、Ｔｓｇ１０１タンパク質のＵＥＶドメイン、またはＨＩＶ  ＧＡＧｐ６に結合することができる有機小分子であり得る。これらはまた、Ｔｓｇ１０１タンパク質またはＨＩＶ  ＧＡＧｐ６に免疫反応性を示す抗体であり得る。好ましくは、Ｔｓｇ１０１タンパク質のＵＥＶドメインに結合する抗体を使用する。また、化合物は、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６タンパク質に由来する小ペプチドもしくはＴｓｇ１０１に結合することができるその模倣物またはＴｓｇ１０１タンパク質由来の小ペプチドもしくはＨＩＶ  ＧＡＧｐ６に結合することができるその模倣物であり得る。
【００３２】
別の実施形態では、本方法は、Ｔｓｇ１０１タンパク質および／またはＨＩＶ  ＧＡＧタンパク質の発現を阻害するステップを含む。阻害は、転写、翻訳、または翻訳後レベルであり得る。例えば、アンチセンス化合物およびリボザイム化合物を、インビトロでヒト細胞に投与するかヒトの身体に投与することができる。
【００３３】
さらに別の実施形態では、レトロウイルスＧＡＧ（例えば、ＨＩＶ  ＧＡＧ）と相互作用するＴｓｇ１０１を有するタンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体を、インビトロで細胞に投与するか、ヒトの身体に投与して、タンパク質複合体の活性を阻害し、及び／または細胞もしくは患者中のタンパク質複合体濃度を減少させる。
【００３４】
本発明は、当分野でこれまでに公知の治療アプローチとは異なるＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの治療方法を提供する。本方法は、宿主細胞の細胞タンパク質およびウイルスタンパク質とのその相互作用を標的する。相互作用には、感染宿主細胞からのＨＩＶの出芽が必要である。したがって、ＨＩＶが本発明の治療に対してウイルス耐性を高める可能性は低い。
【００３５】
本発明の上記の利点、他の利点および特徴、ならびにこれらの利点が達成される形態は、添付の実施例と併せて以下の本発明の詳細の説明を考慮することにより、さらに容易に明らかとなるが、これらは好ましい、例示的な実施形態を示すものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
１．定義
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」は、本明細書中で、ペプチド結合または修飾ペプチド結合によってアミノ酸残基が結合したアミノ酸鎖をいうために、同じ意味で使用される。アミノ酸鎖は、２個を超えるアミノ酸の任意の長さであり得る。特記しない限り、用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」はまた、これらの種々の修飾形態を含む。このような修飾形態は、天然に存在する修飾形態または化学修飾形態であり得る。修飾形態の例には、グリコシル化形態、リン酸化形態、ミリストイル化形態、パルミトイル化形態、リボシル化形態、アセチル化形態、ユビキチン化形態などが含まれるが、これらに限定されない。修飾には、分子内の架橋および脂質、フラビン、ビオチン、ポリエチレングリコールまたは誘導体などの様々な分子に対する共有結合も含まれる。また修飾には、環状化、分岐、および架橋も含まれる。さらに、遺伝子によってコードされる通常の２０個のアミノ酸以外のアミノ酸もまたポリペプチドに含めることができる。
【００３７】
本明細書中で使用される、用語「タンパク質フラグメント」は、タンパク質の一部を示すポリペプチドを意味する。タンパク質フラグメントが別のタンパク質またはタンパク質フラグメントとの相互作用を示す場合、２つの単位（entities）は、単位内に含まれる相互作用ドメインによって相互作用するという。
【００３８】
本明細書中で使用される、用語「相互作用する」は、２つのタンパク質のドメイン、フラグメント、または完全なタンパク質が、２つの「相互作用」タンパク質ドメインまたはタンパク質が互いに物理的に密接なように互いに十分に物理的な親和性を示すことを意味する。相互作用の極端な例は、２つのドメインが連続するか、安定に近位である化学結合の形成である。通常、化学結合相互作用よりも動的であるにもかかわらず、物理的親和性のみに基づく相互作用は、同時局在化している２つのタンパク質に等しく有効であり得る。物理的親和性および化学結合の例には、電荷の相違、疎水性、水素結合、ファンデルワールス力、イオン力、共有結合、およびそれらの組み合わせによって生じる力が含まれるが、これらに限定されない。相互作用ドメインまたは単位間の近位の状態は、一過性もしくは不変または可逆性もしくは不可逆性であり得る。任意の事象では、これは２つの単位の天然の無作為な移動に起因する接触と対照的であるか異なる。必ずしもそうでないが、典型的には、「相互作用」は、相互作用ドメインまたは単位との間の結合によって示される。相互作用の例には、抗原と抗体との間、リガンドと受容体との間、酵素と基質との間などの特定の相互作用が含まれる。
【００３９】
２つのタンパク質ドメイン、フラグメント、または完全なタンパク質間の「相互作用」を、多数の方法によって決定することができる。例えば、相互作用を、２ハイブリッドシステムなどの機能アッセイによって決定することができる。タンパク質−タンパク質相互作用を、２つの相互作用パートナー間の親和性結合に基づいた種々の生化学的アプローチによっても決定することができる。一般に当分野で公知のこのような生化学的方法には、タンパク質親和性クロマトグラフィー、親和性ブロッティング、免疫沈降などが含まれるが、これらに限定されない。相互作用の強度または質を反映する２つの相互作用タンパク質の結合定数を、当分野で公知の方法を使用して決定することもできる。Ｐｈｉｚｉｃｋｙ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５９、９４〜１２３、１９９５を参照のこと。
【００４０】
本明細書中で使用される、用語「ドメイン」は、タンパク質またはポリペプチドの機能的部分、セグメント、または領域を意味する。「相互作用ドメイン」は、特に、別のタンパク質、タンパク質フラグメント、または単離されたドメインに対するタンパク質、タンパク質フラグメント、または単離されたドメインの物理的親和性を担うタンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質フラグメントの一部、セグメント、または領域をいう。
【００４１】
本明細書中で使用される、用語「タンパク質複合体」は、タンパク質間の相互作用によって形成された２つまたはそれ以上のタンパク質の組み合わせである複合単位を意味する。典型的には、「タンパク質複合体」は、特異的非共有結合親和性による２つまたはそれ以上のタンパク質の相互の結合によって形成されるが、必ずしもそうでない。しかし、相互作用パートナーとの間に共有結合も存在し得る。例えば、２つの相互作用するパートナーを、タンパク質複合体がより安定化するように共有結合で架橋することができる。
【００４２】
用語「単離されたタンパク質複合体」は、天然または元の細胞または体内環境で天然に見出されるものと異なる組成物または環境下で存在するタンパク質複合体を意味する。好ましくは、「単離されたタンパク質複合体」は、他の天然に共存する細胞または組織成分から少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％分離されている。したがって、「単離されたタンパク質複合体」はまた、人工調製物または非天然宿主細胞中に天然に存在するタンパク質複合体であり得る。「単離されたタンパク質複合体」はまた、「精製されたタンパク質複合体」（すなわち、他の細胞成分、他のポリペプチド、ウイルス物質、もしくは培養培地またはタンパク質複合体中のタンパク質成分が化学合成されている場合は、タンパク質合成に関連する化合物前駆体もしくは副産物を実質的に含まない実質的に均一な調製物中の実質的に精製された形態）であり得る。「精製されたタンパク質複合体」は、典型的には、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも９５％の特定のタンパク質複合体を含む調製物を意味する。「精製されたタンパク質複合体」を、標準的な精製技術によって天然もしくは組換え宿主細胞もしくは体内サンプルから得るか化学合成によって得ることができる。
【００４３】
用語「ハイブリッドタンパク質」、「ハイブリッドポリペプチド」、「ハイブリッドペプチド」、「融合タンパク質」、「融合ポリペプチド」、および「融合ペプチド」を、本明細書中では、天然には特定のポリペプチドと結合しない１つまたは複数のポリペプチド分子に共有結合する該特定のポリペプチド分子を有する天然に存在しないタンパク質を意味するために交換可能に使用する。したがって、「ハイブリッドタンパク質」は、共有結合によって結合した天然に存在するタンパク質またはそのフラグメントであり得る。「ハイブリッドタンパク質」はまた、２つの人工ポリペプチドの相互の共有結合によって形成されたタンパク質であり得る。必ずしもそうでないが、典型的には、２つまたはそれ以上のポリペプチド分子は、ペプチド結合によって互いに「融合」し、分枝状ではない１つのポリペプチド鎖を形成する。
【００４４】
本明細書中で使用される、用語「ホモログ」は、本発明によって第２の天然のタンパク質またはそのフラグメントと相互作用することが発見された第１の天然のタンパク質またはそのフラグメントに関して使用する場合、第１の天然の相互作用タンパク質または第２の天然のタンパク質に相互作用することができるように第１の天然のタンパク質の相互作用ドメインの１つにアミノ酸配列が相同であり、及び／または構造が類似するポリペプチドを意味する。典型的には、天然のタンパク質のタンパク質ホモログは、天然のタンパク質と少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、および最も好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を有し得る。ホモログの例は、動物、植物、酵母、および細菌などを含む他の種のオルソログタンパク質であり得る。ホモログを、例えば、天然のタンパク質の変異誘発によって選択することもできる。例えば、ホモログを、本発明に属する当業者には明らかなタンパク質−タンパク質相互作用の検出アッセイ（例えば、下記の酵母２ハイブリッドシステム）と組み合わせた部位特異的変異誘発によって同定することができる。
【００４５】
２つの異なる核酸またはポリペプチド配列を比較するために、１つの配列（試験配列）を、本明細書中に開示の他の配列（基準配列）との特定の「％同一」と記載することができる。これに関して、試験配列の長さが基準配列の長さの９０％未満である場合、同一％を、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ、Ｂｕｌｌ．Ｍａｔｈ．Ｂｉｏｌ．，５１、５〜３７、１９８９およびＭｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４（１）、１１〜７、１９８８のアルゴリズムによって決定する。特に、同一性を、ＩＧＨ、Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、ＦＲＡＮＣＥによって継続されるｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｉｇｈ．ｃｎｒｓ．ｆｒで利用可能なＡＬＩＧＮプログラムによって決定する。典型的には、デフォルトパラメータを使用すべきである。ＡＬＩＧＮプログラムの改変形態を使用することもできる。
【００４６】
試験配列の長さが基準配列の長さの少なくとも９０％である場合、同一％を、種々のＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれているＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、５８７３〜７７、１９９３のアルゴリズムによって決定する。特に、同一％を、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍで利用可能な「ＢＬＡＳＴ２配列」ツールによって決定する。Ｔａｔｕｓｏｖａ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，１７４（２）：２４７〜５０、１９９９を参照のこと。ペアワイズＤＮＡ−ＤＮＡ比較のために、ＢＬＡＳＴＮ２．１．２プログラムをデフォルトパラメータ（マッチ：１；ミスマッチ：−２；オープンギャップ：５、ペナルティー；伸長ギャップ：２ペナルティ；ギャップｘ＿ドロップオフ：５０；排除：１０；ワードサイズ：１１（フィルターあり））で使用する。ペアワイズタンパク質−タンパク質配列比較のために、デフォルトパラメータ（行列：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１１；ギャップ伸長：１；ｘ＿ドロップオフ：１５；排除：１０．０；およびワードサイズ：３（フィルターあり））を使用したＢＬＡＳＴＰ２．１．２プログラムを使用する。
【００４７】
用語「誘導体」は、本発明によって第２の天然のタンパク質（またはそのフラグメント）と相互作用することが発見された第１の天然のタンパク質（またはそのフラグメント）に関して使用する場合、第１の天然のタンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく第１の天然のタンパク質の側鎖群の修飾によって調整された第１の天然のタンパク質の修飾形態を意味する。修飾形態（すなわち、誘導体）は、第２の天然のタンパク質と相互作用することができるはずである。修飾形態の例には、グリコシル化形態、リン酸化形態、ミリストイル化形態、リボシル化形態、およびユビキチン化形態などが含まれる。誘導体には、天然のタンパク質またはそのフラグメントを含む融合タンパク質のハイブリッドも含まれる。公知の技術を使用して誘導体を調整するか、第２の天然のタンパク質との相互作用を試験することができる。
【００４８】
本明細書中で使用される、用語「抗体」は、任意の抗体クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ）またはその誘導体に含まれるモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方を含む。用語「抗体」には、抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2が含まれるがこれらに限定されない）、このようなフラグメントの結合体、および抗原認識エピトープを含む一本鎖抗体も含まれる。さらに、用語「抗体」はまた、部分的または完全なヒト化抗体を含むヒト化抗体を意味する。抗体を、動物またはモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株から得るか、特定の抗体をコードする遺伝子を組換えによって発現する細胞またはライブラリーから得ることができる。
【００４９】
本明細書中で使用される、用語「選択的に免疫反応性を示す」とは、抗体が反応性を示すことにより特定のタンパク質またはタンパク質複合体に結合するが、他の類似のタンパク質またはそのフラグメントもしくは成分に結合しないことを意味する。
【００５０】
本明細書中で使用される、用語「化合物」は、全ての有機または無機分子型（タンパク質、ペプチド、多糖類、脂質、核酸、有機小分子、無機小化合物、およびこれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない）を含む。
【００５１】
特記しない限り、本明細書中で使用される、用語「Ｔｓｇ１０１」は、ヒトＴｓｇ１０１を意味する。特記しない限り、本明細書中で使用される、用語「ＨＩＶ  ＧＡＧ」は、ＨＩＶ  ＧＡＧタンパク質を意味する。特記しない限り、本明細書中で使用される、用語「ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６」は、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６タンパク質を意味する。
【００５２】
本明細書中で使用される、用語「ＨＩＶ感染」は、一般に、レトロウイルスのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ファミリー（ＨＩＶ  Ｉ、ＨＩＶ  ＩＩ、およびＨＩＶ  ＩＩＩなどが含まれるが、これらに限定されない）による宿主動物（特に、ヒト宿主）の感染を含む。したがって、ＨＩＶ感染の治療は、任意のレトロウイルスＨＩＶファミリーを保有する患者およびＡＩＤＳが活性と診断された患者の治療ならびにこのような患者のＡＩＤＳ関連病態の治療もしくは予防を含む。ＨＩＶキャリアを、当分野で公知の任意の方法によって同定することができる。例えば、患者が抗ＨＩＶ抗体陽性であるか、ＨＩＶ陽性であるか、ＡＩＤＳの症状が現れていることを基本として患者をＨＩＶキャリアと同定することができる。すなわち、「ＨＩＶ感染の治療」は、ＨＩＶ感染のいくつかの進行度（例えば、急性一次感染症候群（無症状または熱、倦怠、下痢、および頭痛などの神経学的症状を示すインフルエンザ様疾患に関連し得る）、無症状感染（循環しているＣＤ４+Ｔ細胞が段階的に減少する長期の潜伏期間を有する）、およびＡＩＤＳ（より重篤なＡＩＤＳに特徴的な疾患および／または有効な免疫機能と適合するレベル未満の循環しているＣＤ４細胞の減少によって定義される）が含まれる）の任意の１つである患者の治療と理解すべきである。さらに、「ＨＩＶ感染の治療または予防」はまた、例えば、輸血、体液の交換、刺傷、不測の針の突き刺し、または手術による患者の血液に対する曝露による疑わしい過去のＨＩＶへの曝露後の疑わしいＨＩＶ感染の治療を含む。
【００５３】
用語「ＡＩＤの治療」は、より重篤なＡＩＤＳに特徴的な疾患および／または有効な免疫機能と適合するレベル未満の循環しているＣＤ４細胞の減少を示す患者の治療を意味する。用語「ＡＩＤＳの治療」はまた、ＡＩＤＳ関連症候群（ＡＲＣ）、進行性全身性リンパ節腫脹症（ＰＧＬ）、抗ＨＩＶ抗体陽性病態、およびＨＩＶ陽性病態、ＡＩＤＳ関連神経病態（痴呆または熱帯性不全対麻痺など）、カポジ肉腫、血小板減少性紫斑病、およびニューモシスチティスカリニ肺炎、ヒト型結核菌などの関連日和見感染、脳のトキソプラズマ症、ＣＭＶ網膜炎、ＨＩＶ関連脳症、ＨＩＶ関連消耗症候群などのＡＩＤＳまたはＨＩＶ感染に付随するか関連する障害および疾患を意味するＡＩＤＳ関連病態の治療を含む。
【００５４】
したがって、本明細書中で使用される、用語「ＡＩＤＳの予防」は、ＨＩＶに感染しているかＨＩＶ感染の疑いがあるか、ＡＩＤＳ発症由来のＨＩＶ感染の危険性があるか（より重篤なＡＩＤＳに特徴的な疾患および／または有効な免疫機能と適合するレベル未満の循環しているＣＤ４細胞の減少によって特徴付けられる）、および／またはＡＩＤＳ関連病態を示す患者の予防を意味する。
【００５５】
２．タンパク質複合体
酵母２ハイブリッドシステムを使用して新規のタンパク質−タンパク質相互作用を発見および確認した。特に、Ｔｓｇ１０１はＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することが発見された。酵母２ハイブリッドシステムで発見されたＴｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧｐ６の結合領域を表１に示す。Ｔｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧｐ６の遺伝子配列およびアミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号を、以下の表１に示す。
【００５６】
【表１】
2004533815.tif 000002
【００５７】
２．１  Ｔｓｇ１０１はＨＩＶウイルス出芽に関連する
腫瘍感受性遺伝子１０１（Ｔｓｇ１０１）は、当初、腫瘍形成に関連する３８１アミノ酸ポリペプチドと同定された。Ｔｓｇ１０１を、細胞周期の段階に依存して核内および細胞質に局在化することができる。Ｔｓｇ１０１は、スタスミン（腫瘍形成に関与する細胞質リンタンパク質）と相互作用し、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞中でのＴｓｇ１０１抗センス転写物の過剰発現により細胞が形質転換される。Ｌｉ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ、Ｃｅｌｌ、８５（３）、３１９〜２９、１９９６を参照のこと。さらに、乳癌腫瘍形成および／または乳癌進行の間にＴｓｇ１０１の欠損が起こり得ることが示唆されている。Ｌｉら、Ｃｅｌｌ、８８（１）、１４３〜５４、１９９７。Ｔｓｇ１０１は、ユビキチン結合酵素Ｅ２触媒ドメインを含む。最近、ユビキチン／プロテアソーム分解経路の可能な成分としてＴｓｇ１０１が注目されている。データベースでの検索および比較により、Ｎ末端Ｔｓｇ１０１は、Ｅ２ユビキチン結合（Ｕｂｃ）酵素に関連するドメインを含むが、活性部位のシステインを欠くことが見出された。Ｋｏｏｎｉｎ  ａｎｄ  Ａｂａｇｙａｎ、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１６（４）、３３０〜１、１９９７を参照のこと。したがって、Ｔｓｇ１０１は、明らかに不活性なＵｂｃ酵素のホモログ群に属し得る。前出を参照のこと。Ｅ２ユビキチン結合（Ｕｂｃ）酵素に関連するドメインを、ユビキチンＥ２変異（ＵＥＶ）ドメインという。
【００５８】
本発明によれば、ＨＩＶ−１のＧＡＧポリタンパク質（アミノ酸４４９〜５００、ｐ６ドメイン、すなわち「ＧＡＧｐ６」）を使用したヒト脾臓ライブラリーの検索により、腫瘍感受性ＴＳＧ１０１タンパク質（Ｔｓｇ１０１、アミノ酸７〜３９０）が単離された。本明細書中で使用したＧＡＧｐ６ベイトは、後期ドメインモチーフ（−ＰＴＡＰ−）を含む。レトロウイルスのＧＡＧポリタンパク質により、内部ビリオンコアを産生する成熟タンパク質セット（基質、キャプシド、およびヌクレオキャプシド）が得られる。さらに、ＧＡＧはまた、ｐ６と呼ばれるＣ末端部分を含む。ＨＩＶ１の場合、ＧＡＧｐ６は、宿主細胞表面からのＨＩＶウイルスの出芽の後期段階に必要であるので後期ドメインと呼ばれる配列を含む。後期ドメインは、ウイルスの出芽で後期ドメインが必要であるという点で、ユビキチンと機能的に関連し、遊離ユビキチンの細胞内プールは類似の後期表現型を産生する。Ｐａｔｎａｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７（２４）、１３０６９〜７４、２０００；Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７（２４）、１３０５７〜６２、２０００；Ｓｔｒａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７（２４）、１３０６３〜８、２０００。後期ドメインは、ユビキチン化機構のドッキング部位を示すと考えられている。
【００５９】
当分野で公知のように、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフは、公知の全霊長類レンチウイルスのＧＡＧｐ６ドメイン間で保存される。ＧＡＧｐ６ドメインを欠く非霊長類レンチウイルスでは、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフは、ＧＡＧポリタンパク質のＣ末端近傍に存在する。Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフには宿主細胞表面からのウイルス出芽の後期段階が必要であることが示された。これは、レンチウイルス、特にＨＩＶの粒子産生に重要である。Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９、６８１０〜６８１８、１９９５を参照のこと。詳細には、ＰＴＡＰモチーフの欠失により、ウイルス粒子産生が劇的に減少する。さらに、ＰＴＡＰ欠損ウイルスは、典型的な形態形成段階を介して進行するが、プロセスを完了することができない。むしろ、このウイルスは、原形質膜に拘束されたままであり、したがって非感染性となる。すなわち、ウイルス出芽プロセスが引き止められる。Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９、６８１０〜６８１８、１９９５を参照のこと。
【００６０】
本発明によれば、異なるＧＡＧｐ６の点変異（Ｅ６Ｇ、Ｐ７Ｌ、Ａ９Ｒ、またはＰ１０Ｌ）を作製し、Ｔｓｇ１０１タンパク質の結合する能力について試験した。以下の実施例２を参照のこと。野生型ＧＡＧｐ６ペプチドおよびＥ６Ｇ  ＧＡＧｐ６変異体は、Ｔｓｇ１０１タンパク質に結合することができ、Ｐ７Ｌ、Ａ９Ｒ、およびＰ１０Ｌの各点変異によりＴｓｇ１０１に対するＧＡＧｐ６結合親和性が破壊される。Ｐ７Ｌ、Ａ９Ｒ、およびＰ１０Ｌの点変異により、ＧＡＧｐ６ペプチドのＰＴＡＰモチーフが変化する。ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６  ｇａｇタンパク質のＰＴＡＰモチーフの点変異により、ＨＩＶ粒子の宿主細胞からの出芽が防止される。Ｈｕａｎｇら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９、６８１０〜６８１８、１９９５を参照のこと。さらに、以下の実施例３に示すように、本発明者らは、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６の最初の１４アミノ酸残基（ＰＴＡＰ後期ドメインモチーフを含む）がＴｓｇ１０１のＮ末端部分（Ｔｓｇ１０１  ＵＥＶドメインを含むアミノ酸残基１〜２０７）への結合に十分であることを発見した。
【００６１】
Ｔｓｇ１０１は、エンドサイトーシス、細胞内小胞の輸送、および液胞タンパク質選別（ＶＰＳ）に密接に関連する。ＶＰＳ経路は、リソソーム（酵母中の空胞）での最終的な分解のための膜結合タンパク質を選別する。Ｌｅｍｍｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｕｂ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２、４５７〜６６、２０００を参照のこと。２つの別のＶＰＳ経路への侵入は、ゴルジ装置からの小胞輸送を介するか（例えば、異常な折り畳み構造の膜タンパク質の分解）、原形質膜からのエンドサイトーシス（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のような表面タンパク質のダウンレギュレーション）を介する。いずれかの供給源からの小胞輸送タンパク質は、エンドソームとの融合によってＶＰＳ経路に入ることができる。これらのエンドソームが成熟するにつれて、多小胞体（ＭＶＢ）と呼ばれる構造の形成を介したリソソーム分解についてこれらの積荷が選別される。後期エンドソーム上の表面パッチが区画に出芽した場合にＭＶＢが作製されて、小胞（約５０〜１００ｎｍ）が形成される。成熟ＭＶＢは、数百個のこれらの小胞を含む。次いで、ＭＶＢをリソソームに融合した場合、この加水分解性のオルガネラの分解のための小胞が遊離する。
【００６２】
酵母２ハイブリッドアッセイで単離されたＴｓｇ１０１プレイフラグメントは、ユビキチンＥ２変異型（ＵＥＶ）ドメインを含み、これは、ＵＥＶドメインがＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰドメインへの結合に関与することを示す。Ｔｓｇ１０１  ＵＥＶドメインの関連は、ユビキチンがレトロウイルス出芽に必要であり、プロテオソーム阻害によりＨＩＶ−１感染細胞中の遊離ユビキチンレベルを減少させ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の放出および成熟を妨害するという事実と一致する。Ｐａｔｎａｉｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７（２４）、１３０６９〜７４、２０００；Ｓｃｈｕｂｅｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７（２４）、１３０５７〜６２、２０００；Ｓｔｒａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７（２４）１３０６３〜８、２０００を参照のこと。
【００６３】
Ｕｂの短い鎖（１〜３分子）がリソソーム中でのエンドサイトーシスおよび分解のための表面受容体を「標識」することができることが公知である。Ｈｉｃｋｅ、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９、１０７〜１１２、１９９９；Ｒｏｔｉｎら、Ｊ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．，１７６、１〜１７、２０００。Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフを保有するいくつかのタンパク質のクラスは、ＶＰＳ経路を介して分解され、ＶＰＳ経路で機能することが公知の表面受容体である。Ｆａｒｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３４５（３）、５０３〜５０９、２０００；Ｓｔａｕｂ  ａｎｄ  Ｒｏｔｉｎ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、４、４９５〜４９９、１９９６を参照のこと。Ｔｓｇ１０１がユビキチンリガーゼ活性を欠くかどうかは知られていないにもかかわらず、本発明で発見された多数のＴｓｇ１０１相互作用物質に基づいて、ＶＰＳ経路におけるＴｓｇ１０１のもっともらしい役割はＰ（Ｔ／）ＡＰモチーフを保有し、ＭＶＢに出芽する小胞への組み込みの調整を援助するユビキチン化タンパク質を認識することであると考えられる。
【００６４】
ＭＶＢの形成は、細胞が細胞質から別の区画に小胞を出芽する唯一公知の細胞プロセスであるので、これは特に魅力的である。この出芽は、原形質膜で細胞質から細胞外の空間にウイルスを出芽するウイルス出芽と位相的に等しい。したがって、いかなる理論にも拘束されることを望まないが、レンチウイルスＧＡＧポリタンパク質中でのＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフの細胞タンパク質Ｔｓｇ１０１への結合により、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフを有するレンチウイルスが通常ＭＶＢ形成に使用される細胞機構を侵害し、原形質膜からウイルスを出芽すると考えられる。レンチウイルス感染細胞でのＴｓｇ１０１の欠失またはＴｓｇ１０１とＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフとの相互作用の妨害により細胞からのレンチウイルスの出芽が防止されるとも考えられる。
【００６５】
さらに、ウイルス出芽を容易にする細胞機構の漸増は一般的な現象のようであり、他の封入ウイルスの構造タンパク質中で異なる後期ドメインが同定されている。Ｖｏｇｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、１２９４５〜１２９４７、２０００を参照のこと。２つの十分に特徴付けられた後期ドメインは、一定の封入ウイルス由来の膜結合タンパク質中で見出された「ＰＹ」モチーフ（コンセンサス配列：ＰＰＸＹ；Ｘ＝任意のアミノ酸）である。Ｃｒａｖｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３、３３５９〜３３６５、１９９９；Ｈａｒｔｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、１３８７１〜１３８７６、２０００；Ｈａｒｔｙら、Ｊ．ｖｉｒｏｌ．，７３、２９２１〜２９２９、１９９９；およびＪａｙａｋａｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４、９８１８〜９８２７、２０００を参照のこと。ＰＹモチーフの細胞標的は、ＨｅｃｔユビキチンＥ３リガーゼドメインも含むＮｅｄｄ４である。ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）のＧＡＧタンパク質中に「ＹＬ」モチーフ（ＹＸＸＬ）が見出された。Ｐｕｆｆｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１、６５４１〜６５４６、１９９７；Ｐｕｆｆｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２、１０２１８〜１０２２１、１９９８。「ＹＬ」モチーフの細胞受容体は、ＡＰ−２のＡＰ−５０サブユニットであるようである。Ｐｕｆｆｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２、１０２１８〜１０２２１、１９９８。興味深いことに、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフ、ＰＹモチーフ、およびＹＬモチーフなどの後期ドメインは、レトロウイルスＧＡＧタンパク質内の異なる位置に移動した場合でも依然として機能することができ、これにより、これらは構造エレメントよりもむしろ細胞因子のドッキング部位であることが示唆される。Ｐａｒｅｎｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９、５４５５〜５４６０、１９９５；Ｙｕａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８、４７００〜４７１０、２０００。さらに、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフ、ＰＹモチーフ、およびＹＬモチーフなどの後期ドメインは、交換可能に機能することができる。すなわち、ある後期ドメインモチーフをウイルス出芽に影響を与えることなく別の後期ドメインの代わりに使用することができる。Ｐａｒｅｎｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６９、５４５５〜５４６０、１９９５；Ｙｕａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，１８、４７００〜４７１０、２０００；Ｓｔｒａｃｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、１３０６３〜１３０６８、２０００。
【００６６】
したがって、いかなる理論に拘束されることも望まないが、図１に示すように、３つの後期ドメインモチーフは異なる細胞標的に結合するにもかかわらず、ウイルス出芽に影響を与える共通の細胞経路を利用すると考えられる。特に、ウイルス後期ドメインモチーフの異なる細胞受容体が液胞タンパク質選別（ＶＰＳ）およびＭＶＢ経路の共通の下流ステップに送られると考えられる。上記で考察したように、Ｔｓｇ１０１はＶＰＳ経路で機能する。別のタンパク質Ｖｐｓ４は、Ｔｓｇ１０１循環およびエンドソーム輸送で機能する。特に、Ｖｐｓ４変異体は、正常なＴｓｇ１０１輸送を防止し、エンドサイトーシス基質の選別および再利用を欠損した異常な高度に空胞のあるエンドソームの形成を誘導する。Ｂａｂｓｔら、Ｔｒａｆｆｉｃ、１、２４８〜２５８、２０００を参照のこと。
【００６７】
興味深いことに、腫瘍感受性タンパク質Ｔｓｇ１０１を使用した脾臓ライブラリーの検索によっても、成長停止タンパク質ＧＡＳ７ｂとの相互作用が同定される。さらに、同一出願人による米国特許仮出願番号第６０／３１１，５２８号で開示されるように、ＧＡＳ７ｂは、ＨＩＶ  ＧＡＧポリタンパク質のキャプシド領域の相互作用物質である。静止状態に入る細胞でＧＡＳ７ｂが発現することが好ましい。マウス胚小脳の最終的に分化した培養物でのＧＡＳ７ｂ発現の阻害により神経突起伸長が遅延し、未分化の神経芽細胞培養物の過剰発現により神経突起様伸長が劇的に促進される。Ｊｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（１９），１１４２３〜８，１９９８；Ｌａｚａｋｏｖｉｔｃｈら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６１（３），２９８〜３０６，１９９９。これらの所見により最終的な細胞分化の調節におけるＧＡＳ７ｂの役割が示唆され、ＧＡＳ７ｂのドメイン構造によりこのドメイン構造が細胞骨格の制御によってこれを行うことができることが示唆される。さらに、ＧＡＳ７ｂはまた、アクチン細胞骨格を調節する小ＧＴパーゼの２つの異なるレギュレーターと相互作用する。ＧＡＳ７ｂのＨＩＶキャプシドおよびＴｓｇ１０１との相互作用により（その後ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６タンパク質と相互作用する）、これらのタンパク質がウイルスの構築および出芽の後期に関連する多細胞複合体を形成することが強く示唆される。
【００６８】
２．２．タンパク質複合体
上記で考察するように、Ｔｓｇ１０１タンパク質のＵＥＶドメインおよびＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のＰＴＡＰモチーフは相互作用を担う。さらに、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を使用した本発明者らによるＧｅｎＢａｎｋでのＨＩＶアミノ酸配列実験によりモチーフの変異体で置換された標準的なＰＴＡＰモチーフを有する多数のＨＩＶ株が同定され、このような変異体もまたウイルス出芽が可能であり、このような変異体を含むペプチドもまたＴｓｇ１０１に結合することができることが示された。このような同定された変異体には、ＰＳＡＰモチーフ、ＰＩＡＰモチーフ（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．ｖｉｒｏｌ．，７１、６６６２〜６６７０、１９９７；Ｆａｒｒａｒら、Ｊ．Ｎｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，３４、１０４〜１１３、１９９１を参照のこと）、およびＰＴＴＰモチーフ（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．ｖｉｒｏｌ．，７１、６６６２〜６６７０、１９９７を参照のこと）が含まれる。
【００６９】
したがって、本発明は、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドとの間の相互作用によって形成されたタンパク質複合体を提供する。本発明はまた、ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドと相互作用するＴｓｇ１０１のホモログ、誘導体、またはフラグメントを有するタンパク質複合体を提供する。さらに、本発明はまた、ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドのホモログ、誘導体、またはフラグメントと相互作用するＴｓｇ１０１を有するタンパク質複合体を含む。さらに異なる実施形態では、Ｔｓｇ１０１のホモログ、誘導体、またはフラグメントおよびＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドのホモログ、誘導体、またはフラグメントを有するタンパク質複合体が得られる。言い換えれば、１つまたは複数の本発明のタンパク質複合体の相互作用タンパク質メンバーは、天然のタンパク質または天然のタンパク質のホモログ、誘導体、もしくはフラグメントであり得る。上記のセクション１．で定義されるように、Ｔｓｇ１０１のホモログおよび誘導体は、ＨＩＶ  ＧＡＧと（ＧＡＧｐ６領域を介して）相互作用することができるはずである。ＨＩＶ  ＧＡＧのホモログおよび誘導体は、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができる。好ましくは、ホモログのアミノ酸配列は、対応する天然のタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、または９５％同一である。
【００７０】
したがって、例えば、タンパク質複合体中の１つの相互作用パートナーは、完全な天然のＴｓｇ１０１、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することができるＴｓｇ１０１のホモログ、Ｔｓｇ１０１の誘導体、Ｔｓｇ１０１ホモログの誘導体、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することができるＴｓｇ１０１のフラグメント（例えば、Ｔｓｇ１０１タンパク質のＵＥＶドメイン、特にアミノ酸残基１〜２０７、アミノ酸残基１〜１４７などを含むフラグメント）、Ｔｓｇ１０１フラグメントの誘導体、または（１）完全な天然のＴｓｇ１０１、（２）ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することができるＴｓｇ１０１のホモログ、または（３）ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することができるＴｓｇ１０１フラグメントを含む融合タンパク質であり得る。
【００７１】
他のパートナーは、（１）ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチド、（２）ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドと少なくとも８５％、９０％、または９５％同一のアミノ酸配列を有し、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができるＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドのホモログ、（３）ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６タンパク質、（４）ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％同一のアミノ酸配列を有し、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができるＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のホモログ、（５）Ｔｓｇ１０１と相互作用することができるＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のフラグメント、（６）ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチド、ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドのホモログ、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のホモログ、またはＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のフラグメントを含む融合タンパク質であり得る。
【００７２】
本発明のタンパク質複合体は、相互作用パートナーとしてＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドを含む。さらに、Ｐ（Ｔ／Ｓ／Ｉ）（Ａ／Ｔ）Ｐ（配列番号１〜６）を含む他のレトロウイルス由来のＧＡＧポリペプチドおよびそのフラグメントは、ＨＩＶ  ＧＡＧポリペプチドと同一の様式でＴｓｇ１０１とも相互作用すると考えられる。したがって、これらを、Ｔｓｇ１０１またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントを使用したタンパク質複合体の形成に使用することができる。好ましくは、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインを含むレンチウイルスのＧＡＧポリペプチドまたはフラグメントを使用して、タンパク質複合体を形成する。このようなＧＡＧポリペプチドまたはフラグメントは、ウシレンチウイルス（例えば、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、Ｊｅｍｂｒａｎａ病ウイルス）、ネコレンチウイルス（例えば、ネコの免疫不全、消耗性疾患、および脳炎を発症するネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））、およびヒツジ／ヤギレンチウイルス（例えば、ヤギの貧血および消耗性疾患を発症するヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ヒツジレンチウイルス、肺炎、消耗性疾患、脳炎、および関節炎を発症するビスナウイルス）を含む非霊長類レンチウイルスに由来し得る。好ましくは、ＧＡＧポリペプチドまたはそのフラグメントは、霊長類レンチウイルス（ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）、ヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）、ヒト免疫不全ウイルス３（ＨＩＶ−３）（これらは全てＡＩＤＳを発症する）、チンパンジー、マンガベー、サバンナモンキー、マンドリル、Ｌ’Ｈｏｅｓｔ、サイクスモンキー、またはＧｕｅｒｅｚａ  Ｃｏｌｏｂｕｓモンキーなどの宿主に感染する種々のサル免疫不全ウイルスが含まれるが、これらに限定されない）に由来する。
【００７３】
天然のレトロウイルスＧＡＧポリペプチドに加えて、Ｔｓｇ１０１またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントの有用な相互作用パートナーには、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができる天然のレトロウイルスＧＡＧポリペプチドのホモログ、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができる天然の誘導体またはホモログＧＡＧポリペプチド、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができるＧＡＧポリペプチドのフラグメント（例えばＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフを含むフラグメント）、ＧＡＧポリペプチドフラグメントの誘導体、または（１）完全なＧＡＧポリペプチド、（２）Ｔｓｇ１０１と相互作用することができるＧＡＧポリペプチドのホモログ、もしくは（３）Ｔｓｇ１０１と相互作用することができるＧＡＧポリペプチドのフラグメントを含む融合タンパク質が含まれる。
【００７４】
ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することができるＴｓｇ１０１のフラグメントは、Ｔｓｇ１０１をコードする核酸とタンパク質−タンパク質相互作用試験との分子光学（molecular engineering）の組み合わせであり得る。例えば、表１の座標を開始点として使用し、座標範囲内の種々のＴｓｇ１０１フラグメントを、座標の片方または両方の末端からの欠失によって作製することができる。得られたフラグメントを、タンパク質−タンパク質相互作用の検出に関して当分野で公知の任意の方法（例えば、酵母２ハイブリッド法）を使用してＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用する能力を試験することができる。同様に、Ｔｓｇ１０１と同語作用することができるＨＩＶ  ＧＡＧのフラグメント、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のフラグメント、および他のレトロウイルスＧＡＧポリペプチドのフラグメントを、同様の様式で同定することもできる。
【００７５】
特定の実施形態では、本発明のタンパク質複合体は、天然に存在するＨＩＶ  ＧＡＧ配列の少なくとも７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上のアミノ酸残基の連続スパンを含むポリペプチドを含む。好ましくは、ポリペプチドは、天然に存在するＨＩＶ  ＧＡＧ配列の１０と２０との間の連続スパンを含む。連続スパンは、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフまたはその変異体（例えば、ＰＩＡＰモチーフおよびＰＴＴＰモチーフ）であり得るＨＩＶ後期ドメインモチーフに及ぶ。好ましくは、連続スパン中の後期ドメインモチーフは、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフである。他の特定の実施形態では、タンパク質複合体は、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含む他のレトロウイルス由来の天然に存在するＧＡＧポリペプチド配列の少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、またはそれ以上のアミノ酸残基の連続スパンを含むポリペプチドを含む。連続スパンは、レトロウイルス後期ドメインモチーフに及ぶはずである。好ましい実施形態では、このような他のレトロウイルスは、霊長類レンチウイルスまたは非霊長類レンチウイルス（ＥＩＡＶ以外）である。特定の実施形態では、本発明のタンパク質複合体には、ＥＰＴＡＰ（配列番号７）、ＥＰＳＡＰ（配列番号８）、ＰＴＡＰＰ（配列番号９）、ＰＳＡＰＰ（配列番号１０）、ＥＰＴＡＰＰ（配列番号１１）、ＥＰＳＡＰＰ（配列番号１２）、ＰＥＰＴＡＰ（配列番号１３）、ＰＥＰＳＡＰ（配列番号１４）、ＲＰＥＰＴＡＰ（配列番号１５）、ＲＰＥＰＳＡＰ（配列番号１６）、ＰＥＰＴＡＰＰ（配列番号１７）、ＰＥＰＳＡＰＰ（配列番号１８）、ＥＰＴＡＰＰＥＥ（配列番号１９）、ＥＰＳＡＰＰＥＥ（配列番号２０）、ＥＰＴＡＰＰＡＥ（配列番号２１）、ＰＥＰＴＡＰＰＥＥ（配列番号２２）、ＰＥＰＴＡＰＰＡＥ（配列番号２３）、ＰＥＰＳＡＰＰＥＥ（配列番号２４）、ＲＰＥＰＴＡＰＰＥＥ（配列番号２５）、ＲＰＥＰＳＡＰＰＥＥ（配列番号２６）、ＲＰＥＰＴＡＰＰＡＥ（配列番号２７）、ＲＰＥＰＳＡＰＰＡＥ（配列番号２８）、ＬＱＳＲＰＥＰＴＡＰＰＥＥ（配列番号２９）、ＬＱＳＲＰＥＰＳＡＰＰＥＥ（配列番号３０）、ＬＱＳＲＰＥＰＴＡＰＰＥＥＳ（配列番号３１）、およびＬＱＳＲＰＥＰＳＡＰＰＥＥＳ（配列番号３２）の群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。
【００７６】
さらに、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ、ＰＩＡＰ、またはＰＴＴＰモチーフ自体でＴｓｇ１０１結合に十分であり得ると考えられる。したがって、本質的にＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ、ＰＩＡＰ、またはＰＴＴＰモチーフを含むポリペプチド（すなわち、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ、ＰＩＡＰ、またはＰＴＴＰモチーフおよびいくつかの隣接アミノ酸を有するポリペプチド）と相互作用するＴｓｇ１０１タンパク質またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントを含むタンパク質複合体も得られる。
【００７７】
本発明のタンパク質複合体の特定の実施形態では、２つまたはそれ以上の相互作用パートナー（Ｔｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧｐ６またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメント）を、直接互いに融合させるか、ペプチドリンカーによって互いに共有結合させて、１つの分枝状でないポリペプチド鎖を有するハイブリッドタンパク質を形成する。従って、タンパク質複合体を、ハイブリッドタンパク質の２つの部分の間の「分子内」相互作用によって形成することができる。また、このタンパク質複合体中の融合または結合相互作用パートナーの一方または両方は、天然のタンパク質または天然のタンパク質のそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントであり得る。
【００７８】
本発明のタンパク質複合体は、修飾形態であり得る。例えば、タンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体を、タンパク質複合体に結合させることができる。別の実施形態では、タンパク質複合体中の相互作用パートナー間の相互作用を増強することができる非抗体モジュレーターを含み得る。あるいは、安定化のためにタンパク質複合体中のタンパク質メンバーを架橋することができる。種々の架橋方法を使用することができる。例えば、Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ’の形態（ＲおよびＲ’基はタンパク質複合体中の一定のアミノ酸鎖と反応して共有結合を形成することができる）の二価性試薬を使用することができる。例えば、Ｔｒａｕｔら、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編、「タンパク質機能：実践アプローチ」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８９；Ｂａｉｒｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５１，６９５３〜６９６２，１９７６を参照のこと。他の有用な架橋剤には、例えば、Ｄｅｎｎｙ−Ｊａｆｆｅｅ試薬（アゾ結合によって切断可能な異種生体機能性光反応性部分）（Ｄｅｎｎｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５２８６〜５２９０，１９８４を参照のこと）および125Ｉ−｛Ｓ−［Ｎ−（３−ヨード−４−アジドサリチル）システアミニル］−２−チオピリジン｝、システイン特異的光架橋試薬（Ｃｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６５，９０〜９２，１９９４を参照のこと）が含まれる。
【００７９】
上記のタンパク質複合体には、任意のさらなる成分（例えば、他のタンパク質、核酸、脂質分子、単糖類もしくは多糖類、イオン、または他の分子）をさらに含み得る。
【００８０】
２．３．タンパク質複合体の調製方法
本発明のタンパク質複合体を、種々の方法によって調製することができる。詳細には、タンパク質複合体を、動物組織サンプル、好ましくはタンパク質複合体を含むヒト組織サンプルから直接単離することができる。あるいは、タンパク質複合体を、タンパク質複合体を組換えによって発現する宿主細胞から精製することができる。当業者に明らかなように、タンパク質複合体を、相互作用タンパク質パートナーに免疫反応性を示す抗体、好ましくは以下に詳細に考察したタンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体を使用した免疫共沈によって組織サンプルまたは組換え宿主細胞から調製することができる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。免疫共沈は、結合タンパク質の単離または検出のために当分野で一般に使用されている方法である。この手順では、一般に、血清サンプルまたは組織もしくは細胞の溶解物を適切な抗体と混合する。抗体に結合したタンパク質複合体を、沈殿および洗浄する。次いで、結合タンパク質複合体を溶出する。
【００８１】
あるいは、相互作用タンパク質パートナーに免疫反応性を示す抗体、または好ましくはタンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体を使用した天然の組織サンプルまたは組換え宿主細胞からのタンパク質複合体の単離で免疫親和性クロマトグラフィーおよび免疫ブロッティング技術を使用することもできる。例えば、タンパク質免疫親和性クロマトグラフィーでは、抗体を、例えば、カラム中のＳｅｐｈａｒｏｓｅなどのマトリクスに共有結合または非共有結合させることができる。次いで、組換え細胞由来の組織サンプルまたは細胞を、抗体またはマトリクスに接触させることができる。次いで、カラムを低塩溶液で洗浄して、非結合成分を洗い流す。次いで、カラムに保持されたタンパク質複合体を、高塩溶液、抗体の競合抗原、カオトロピック剤、またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などを使用してカラムから溶出することができる。免疫ブロッティングでは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびその後の例えばニトロセルロースメンブレンへの移行により組織サンプルまたは組換え宿主細胞溶解物から粗タンパク質を分画することができる。メンブレン上のタンパク質複合体の位置を、特異的抗体を使用して同定し、その後タンパク質複合体を単離することができる。
【００８２】
別の実施形態では、各相互作用タンパク質パートナーを、上記の類似の方法を使用して組織サンプルまたは組換え宿主細胞から独立して単離または精製することができる。次いで、各相互作用タンパク質パートナーを、相互作用を誘導する条件下で互いに接触させて、本発明のタンパク質複合体を形成させる。異なるタンパク質相互作用には異なる条件が必要であり得ることに留意すべきである。出発点では、例えば、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）および５００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液を使用することができる。温度、ｐＨ、塩濃度、還元剤などを含むいくつかの異なるパラメータを評価することができる。最適なインキュベーション条件を決定するためにいくつかの小規模実験が必要であり得るが、これは、本開示を参照すれば、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００８３】
さらに別の実施形態では、本発明のタンパク質複合体を、タンパク質親和性クロマトグラフィーまたは親和性ブロッティングによって組織サンプル、または組換え宿主細胞、または他の適切な供給源から調製することができる。すなわち、１つの相互作用タンパク質パートナーを使用して、結合親和性により他の相互作用タンパク質パートナーを単離し、タンパク質複合体を形成させる。したがって、精製によって組織サンプルからまたは組換え発現もしくは化学合成によって調製された相互作用タンパク質パートナーを、例えば、クロマトグラフィーカラム中のＳｅｐｈａｒｏｓｅなどのマトリクスに共有結合または非共有結合させることができる。次いで、組換え細胞由来の組織サンプルまたは細胞溶解物を、マトリクス上の結合タンパク質に接触させることができる。低塩溶液を使用して非結合成分を洗い流し、高塩溶液を使用してカラム中の結合タンパク質複合体を溶出する。親和性ブロッティングでは、組織サンプルまたは組換え宿主細胞溶解物由来のタンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）で分画し、例えば、ニトロセルロースメンブレンに移すことができる。次いで、精製された相互作用タンパク質メンバーを、メンブレン上の相互作用タンパク質パートナーに結合させて、タンパク質複合体を形成し、メンブレンから単離する。
【００８４】
本発明においてタンパク質複合体または各相互作用タンパク質の組換え発現の目的で任意の組換え発現法を使用することができることが当業者に明らかである。一般に、相互作用タンパク質メンバーをコードする核酸を、適切な宿主細胞に移入することができる。宿主細胞内でタンパク質複合体を組換えで形成する目的のために、２つまたはそれ以上の相互作用タンパク質メンバーをコードする核酸を、宿主細胞に移入すべきである。
【００８５】
典型的には、核酸、好ましくはＤＮＡの形態の核酸をベクターに組み込んで、ひとたび宿主細胞に移入されると相互作用タンパク質メンバーを発現することができる発現ベクターを形成する。本発明に多数のベクター型を使用することができる。本発明の目的のための発現ベクターの構築方法は、本発明を知らされた当業者で明白である。一般に、「現代の分子生物学プロトコール」、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ，Ａｓｓｏｃ．＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、第１３章、１９８８；Ｇｌｏｖｅｒ、「ＤＮＡクローニング」、第ＩＩ巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，第３章、１９８６；Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３、５１６〜５４４、１９８７；「酵母サッカロミセスの分子生物学」、Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、１９８２；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと。
【００８６】
一般に、発現ベクターには、相互作用タンパク質パートナーをコードするＤＮＡに作動可能に連結されたプロモーターを有する発現カセットが含まれる。プロモーターは、天然のプロモーター（すなわち、細胞中での相互作用タンパク質発現を担うための天然に存在する細胞中で見出されるプロモーター）であり得る。あるいは、発現カセットは、キメラな発現カセット（すなわち、天然に存在する細胞中での相互作用タンパク質メンバーの発現を担う天然のプロモーターではない異種プロモーター）であり得る。発現ベクターには、宿主細胞中でのベクター複製のためのＤＮＡ複製起点をさらに含み得る。好ましくは、発現ベクターには、例えば、大腸菌中でのベクター複製用の複製起点、ならびに発現ベクターを保有する宿主細胞のみを選択および維持するための選択マーカーも含まれる。さらに、発現カセットは、好ましくは、相互作用タンパク質メンバーをコードするＤＮＡ由来の転写を調節するように機能する誘導エレメントも含む。転写エンハンサー配列および転写調節配列（例えば、シャイン・ダルカルノ配列）など他の調節配列を、発現カセット中で作動可能に含むこともできる。ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナルなどの末端配列（ＳＶ４０、ｌａｃＺ、およびＡｃＭＮＰＶ多面体タンパク質遺伝子）を、発現カセット中の相互作用タンパク質メンバーをコードするＤＮＡに作動可能に連結させることもできる。発現したタンパク質の検出および／または精製のためのエピトープタグコード配列を、融合タンパク質が発現されるように相互作用タンパク質メンバーをコードするＤＮＡに作動可能に連結させることもできる。有用なエピトープタグの例には、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）、サルウイルス５（Ｖ５）、ポリヒスチジン（６ｘＨｉｓ）、ｃ−ｍｙｃ、ｌａｃＺ、およびＧＳＴなどが含まれるが、これらに限定されない。ポリヒスチジンタグを有するタンパク質を、Ｎｉ親和性カラムを使用して容易に検出および／または精製することができ、多数のエピトープタグに免疫反応性を示す特異的抗体は、市販されている。発現ベクターはまた、細胞外に発現したタンパク質または特定の細胞内区画に指向する成分を含み得る。シグナルペプチド、核局在化配列、小胞体保持シグナル、ミトコンドリア局在化配列、ミリストイル化シグナル、パルミトイル化シグナル、膜貫通配列は、発現タンパク質の運命を決定することができる任意選択的なベクター成分の例である。１つの宿主細胞中で２つまたはそれ以上の相互作用タンパク質メンバーを発現することが望ましい場合、相互作用タンパク質メンバーをコードするＤＮＡフラグメントを、１つのベクターまたは異なるベクターに組み込むことができる。
【００８７】
従って、構築された発現ベクターを、当分野で公知の任意の技術（例えば、直接的ＤＮＡ形質転換、微量注入、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リポフェクション、および遺伝子銃など）によって宿主細胞に移入することができる。相互作用タンパク質メンバーの発現は、一過性であっても安定していても良い。発現ベクターを染色体外状態（すなわち、自己複製プラスミドまたはウイルス）で宿主細胞中に維持することができる。あるいは、発現ベクターを、安定な細胞株の選択または部位特異的組換えなどの従来技術によって宿主細胞の染色体に組み込むことができる。安定な細胞株では、発現ベクターの少なくとも発現カセット部分を、宿主細胞の染色体に組み込む。
【００８８】
ベクター構築物を、種々の宿主細胞（細菌、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞ならびに哺乳動物およびヒト細胞が含まれるが、これらに限定されない）での発現に適切なように設計することができる。異なる宿主細胞中での発現用の発現ベクターの調製方法は、当業者に明らかなはずである。
【００８９】
天然の相互作用タンパク質メンバーのホモログおよびフラグメントを、上記の組換え法を使用して容易に発現させることもできる。例えば、タンパク質のフラグメントを発現させるために、発現ベクターに組み込まれたＤＮＡフラグメントを、タンパク質のフラグメントのみをコードするように選択することができる。同様に、特定のハイブリッドタンパク質を、ハイブリッドタンパク質をコードする組換えＤＮＡを使用して発現することができる。同様に、ホモログタンパク質を、ホモログタンパク質またはタンパク質フラグメントをコードするＤＮＡ配列から発現させることができる。ホモログコードＤＮＡ配列を、組換えＤＮＡ技術を使用した天然タンパク質コード配列の操作によって得ることができる。この目的のために、一般に当分野で公知の技術を使用して、無作為または部位特異的変異誘発を行うことができる。タンパク質誘導体を作製するために、例えば、天然の相互作用タンパク質メンバーのアミノ酸配列を、予め決定した様式で、例えば、タンパク質キナーゼのリン酸化、グリコシル化、リボシル化、ミリストイル化、およびパルミトイル化などによるコンセンサス配列を作製するかまたは除去するために部位特異的ＤＮＡ変異誘発によって変化させることができる。あるいは、非天然のアミノ酸を、組換え宿主細胞におけるタンパク質合成の間に相互作用タンパク質メンバーに組み込むことができる。例えば、光反応性リジン誘導体を、修飾リシル（lysyl）ｔＲＮＡの使用により相互作用タンパク質メンバーに組み込むことができる。例えば、Ｗｉｅｄｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３２８、８３０〜８３３、１９８９；Ｍｕｓｃｈら、Ｃｅｌｌ、６９、３４３〜３５２、１９９２を参照のこと。他の光反応性アミノ酸誘導体を、類似の様式で組み込むこともできる。例えば、Ｈｉｇｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３６８、２８７４５〜２８７５１、１９９３を参照のこと。実際、相互作用タンパク質メンバーに組み込まれた光反応性アミノ酸誘導体は、所定の条件下でタンパク質複合体中での相互作用タンパク質パートナーにタンパク質が架橋するように機能することができる。
【００９０】
さらに、本発明の天然の相互作用タンパク質メンバーの誘導体を、天然のタンパク質のアミノ酸側鎖への一定の部分の化学結合によって調製することもできる。
【００９１】
所望の場合、このようにして作製したホモログおよび誘導体を、意図する相互作用パートナーと相互作用させてタンパク質複合体を形成することができるかどうかを決定するために試験することができる。例えば、酵母２ハイブリッドシステムまたはタンパク質−タンパク質相互作用の検出のための当分野で公知の他の方法によって試験を行うことができる。
【００９２】
ペプチド結合およびペプチドリンカーによってＨＩＶ  ＧＡＧもしくはＨＩＶ  ＧＡＧｐ６またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントに共有結合したＴｓｇ１０１またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントを有する上記のハイブリッドタンパク質を、キメラ核酸（例えば、融合タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡフラグメント）から組換えによって発現することができる。したがって、本発明はまた、本発明のハイブリッドタンパク質をコードする核酸を提供する。さらに、本発明のハイブリッドタンパク質をコードする核酸が組み込まれた発現ベクターも提供する。キメラ核酸およびこれを含む発現ベクターの産生方法は、本発明を開示された当業者に明らかであるはずである。
【００９３】
２．４．タンパク質マイクロチップ
本発明の別の実施形態によれば、１つまたは複数のタンパク質複合体および／または本発明のタンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体を有するタンパク質マイクロチップまたはマイクロアレイが得られる。タンパク質マイクロアレイは、プロテオミクス研究ならびに疾患のタンパク質ベースの検出および診断で重要となりつつある。本発明のこの実施形態のタンパク質マイクロアレイは、種々の適用（例えば、タンパク質複合体に結合してタンパク質複合体中の相互作用タンパク質メンバー間の相互作用を調整することができる化合物の大規模またはハイスループットスクリーニングが含まれる）に有用である。
【００９４】
本発明のタンパク質マイクロアレイを、当分野で公知の多数の方法で調製することができる。適切な方法の例は、ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８９、１７６０〜１７６３、２０００で開示されている方法である。本質的に、ガラス製の顕微鏡スライドを、アルデヒド含有シラン試薬（ＴｅｌｅＣｈｅｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから購入したＳｕｐｅｒＡｌｄｅｈｙｄｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）で処理する。４０％のグリセロールを含むリン酸緩衝化生理食塩水中のｎｌ体積のタンパク質サンプルを、高精度密着印画ロボットを用いて処理したスライドにスポットする。インキュベーション後、スライドをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有緩衝液中に浸漬し、次のマイクロチップへの適用において非特異的タンパク質結合を防止するように機能するＢＳＡ層を形成させる。あるいは、ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒで開示のように、本発明のタンパク質またはタンパク質複合体に、共有結合によってＢＳＡ−ＮＨＳスライドを結合させることができる。ＢＳＡの分子層のガラススライドへの第１の結合およびＮ，Ｎ’−ジスクシニミジルカーボネートでのＢＳＡ活性化によってＢＳＡ−ＮＨＳスライドを組み立てる。結果として、ＢＳＡ上のリジン、アスパラギン酸、およびグルタミン酸残基のアミノ酸残基が活性化され、尿素またはアミドがスライドにスポットしたタンパク質サンプルと共有結合を形成することができる。ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８９、１７６０〜１７６３、２０００を参照のこと。
【００９５】
本発明のタンパク質マイクロチップの有用な調製方法の別の例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／４３８９Ａ２およびＷＯ００／０４３８２（共にＺｙｍｙｘに譲渡されており、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示の方法である。第１に、基質またはチップベースを薄い有機フィルムの１つまたは複数の層で覆って、任意の表面の血管を排除し、ベース材料からタンパク質を隔離し、均一なタンパク質アレイを確保する。次に、複数のタンパク質捕捉剤（例えば、抗体、ペプチドなど）を配列し、薄いフィルムで覆ったベースに結合させる。次いで、タンパク質またはタンパク質複合体を捕捉剤に結合させてタンパク質マイクロアレイを形成することができる。タンパク質マイクロチップを、水溶液を含むフローチャンバー中で保持する。
【００９６】
本発明のタンパク質マイクロアレイを、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙに譲渡されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／３６５７６（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）で開示の方法によって作製することもできる。例えば、三次元親水性ポリマーマトリクス（すなわち、ゲル）を、最初にガラススライドなどの個体基質上の配置する。ポリマーマトリクスゲルは、伸縮し、アミン基と反応するカップリング試薬を含む。従って、タンパク質およびタンパク質複合体を、膨張させた水性で多孔質状態のマトリクスゲルと接触させて、カップリング剤によりタンパク質またはタンパク質複合体上のアミン基を反応させて基質上にタンパク質およびタンパク質複合体を固定することができる。その後、ゲルをマトリクスゲル中に浸漬した結合タンパク質およびタンパク質複合体に接触させる。
【００９７】
あるいは、本発明のタンパク質およびタンパク質複合体を、市販のタンパク質マイクロチップ（例えばＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡのＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐシステム）に組み込むことができる。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐシステムは、タンパク質と相互作用する処理表面を有する金属チップを含む。基本的には、金属チップ表面が、二酸化ケイ素フィルムで覆われている。タンパク質およびタンパク質複合体などの目的の分子を、シランカップリング剤を介してチップ表面に共有結合することができる。
【００９８】
本発明のタンパク質マイクロチップを、例えば、米国特許第６，０８７，１０２号、米国特許第６，１３９，８３１号、米国特許第６，０８７，１０３号、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／６０１５６、ＷＯ９９／３９２１０、ＷＯ００／５４０４６、ＷＯ００／５３６２５、ＷＯ９９／５１７７３、ＷＯ９９／３５２８９、ＷＯ９７／４２５０７、ＷＯ０１／０１１４２、ＷＯ００／６３６９４、ＷＯ００／６１８０６、ＷＯ９９／６１１４８、ＷＯ９９／４０４３４（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示の当分野で公知の他の方法を使用して調製することもできる。
【００９９】
３．抗体
本発明の別の態様によれば、本発明のタンパク質複合体に対して免疫反応性を示す抗体が得られる。１つの実施形態では、抗体は、本発明のタンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す。詳細には、本明細書中で使用される、句「タンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す」は、本発明の抗体のタンパク質複合体との免疫反応性は、実質的にタンパク質複合体の各相互作用メンバーよりも高く、その結果タンパク質複合体への抗体の結合を、結合親和性の強度に基づいてタンパク質の各相互作用メンバーへの抗体の結合と容易に区別することができることを意味する。好ましくは、結合定数は、少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも５倍、さらにより好ましくは少なくとも１０倍、最も好ましくは少なくとも１００倍異なる。特定の実施形態では、抗体は、タンパク質複合体の相互作用タンパク質メンバーに実質的に免疫反応性を示さない。
【０１００】
本発明の抗体を、当分野で一般に公知の手順を使用して容易に調製することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、「抗体：実験マニュアル」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８を参照のこと。典型的には、作製された抗体が免疫反応性を示すタンパク質複合体を、宿主動物における免疫応答の誘導のための抗原として使用する。１つの実施形態では、使用したタンパク質複合体は、天然のタンパク質からなる。好ましくは、タンパク質複合体には、Ｔｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧｐ６の結合ドメインのみをそれぞれ含む。結果として、全抗体のより大きな部分がタンパク質複合体に選択的に免疫反応を示すことができる。結合ドメインを、例えば、表１でまとめたものから選択することができる。さらに、エピトープ予測のための当分野で公知の種々の技術を使用して、本発明のタンパク質複合体中での相互作用タンパク質メンバーに基づいて、タンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体が作製される可能性が増加するように抗原ペプチドを設計することもできる。適切なエピトープ予測コンピュータプログラムには、例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．のＭａｃＶｅｃｔｏｒおよびＤＮＡＳｔａｒのＰｒｏｔｅａｎが含まれる。
【０１０１】
特定の実施形態では、上記セクション２のハイブリッドタンパク質を、ペプチド結合またはペプチドリンカーによってＨＩＶ  ＧＡＧもしくはＨＩＶ  ＧＡＧｐ６またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントに共有結合したＴｓｇ１０１またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントを有する抗原として使用する。好ましい実施形態では、ハイブリッドタンパク質は、ペプチド結合またはリンカー分子によって互いに共有結合した表１から選択した２つの相互作用結合ドメインまたはそのホモログもしくは誘導体からなる。
【０１０２】
本発明の抗体は、本発明のタンパク質複合体に対するポリクローナル抗体であり得る。ポリクローナル抗体を産生するために、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、モルモット、およびハムスターなどの種々の動物宿主を使用することができる。上記の本発明のタンパク質複合体またはその誘導体である適切な抗原を、免疫反応を惹起するために宿主動物に直接投与することができる。あるいは、抗原を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン、および破傷風トキソイドなどのキャリアと共に投与することができる。任意選択的に、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、およびＭＢＳなどのカップリング剤によって抗原をキャリアに結合させることができる。従来のアジュバントを使用して、タンパク質複合体抗原に対する宿主動物の免疫応答を増強することができる。当分野で公知の適切なアジュバントには、フロイント完全アジュバント（死滅させた細菌細胞および鉱物油を含む）、フロイント不完全アジュバント（細胞成分を欠く）、アルミニウム塩、ＢｉｏｃｉｎｅのＭＦ５９、モノリン脂質、合成トレハロースジコリノミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）（共にＲＩＢＩ  ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、Ｐｒｏｔｅｕｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＬＣ、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、Ｕ．Ｋ．の非イオン性界面活性剤小胞（ＮＩＳＶ）、およびサポニンが含まれるが、これらに限定されない。抗原調製物を、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内注射、またはリンパ器官への注射によって宿主動物に投与することができる。
【０１０３】
本発明の抗体はまた、モノクローナルであり得る。このようなモノクローナル抗体を、当分野で公知の任意の従来の技術を使用して開発することができる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６、４９５〜４９７、１９７５に開示の一般的なハイブリドーマ法は、現在本発明で使用することができる十分に開発された技術である。米国特許第４，３７６，１１０号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと。本質的に、本発明のタンパク質複合体に対してポリクローナル抗体を産生するＢリンパ球を骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマクローンのライブラリーを作製することができる。次いで、ハイブリドーマ集団を、抗原結合特異性および免疫グロブリンクラス（イソ型）についてスクリーニングする。この様式では、特定の均一な抗体を産生する純粋なハイブリドーマクローンを選択することができる。一般に、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，「抗体：実験マニュアル」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照のこと。あるいは、当分野で公知の他の技術（ＥＢＶハイブリドーマ技術、ヒトＮ細胞ハイブリドーマ技術、およびトリオーマ技術が含まれるが、これらに限定されない）を使用して、モノクローナル抗体を調製することもできる。
【０１０４】
さらに、本発明のタンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体を、組換えによって産生することもできる。例えば、ＰＣＲ増幅によって活性化Ｂリンパ球またはハイブリドーマから調製したｃＤＮＡを、発現ベクターにクローニングしてｃＤＮＡライブラリーを形成し、その後組換え発現のために宿主細胞に移入する。次いで、特定の所望のタンパク質をコードするｃＤＮＡを、ライブラリーから単離することができる。タンパク質発現のために、単離されたｃＤＮＡを適切な宿主細胞に移入することができる。したがって、組換え技術を使用して、特定の天然抗体、一以上の抗原と同時に反応することができるハイブリッド抗体、キメラ抗体（例えば、定常領域および可変領域が異なる供給源に由来する）、第３の（重）鎖のＦｃ領域に結合した１つの重鎖および軽鎖の対を含む一価抗体、Ｆａｂタンパク質などを産生することができる。米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願番号００８８９９４号；Ｍｕｎｒｏ，Ｎａｔｕｒｅ，３１２，５９７，１９８４；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９，１２０２，１９８５；Ｏｉら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４，２１４，１９８６；およびＷｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４、４４６〜４４９，１９８５（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと。Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ’フラグメント、およびＦ（ａｂ’）2フラグメントなどの抗体フラグメントを、例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、Ｓｋｅｒｒａ  ＆  Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｍ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０，１０３８〜１０４１，１９８８；Ｂｅｔｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０、１０４１〜１０４３、１９８８；およびＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３〜４２６，１９８８（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示の方法よる組換えによって産生することもできる。
【０１０５】
好ましい実施形態では、本は明によって得られた抗体は、部分的にまたは完全にヒト化された抗体である。この目的のために、当分野で公知の任意の方法を使用することができる。例えば、腫瘍特異的マウスモノクローナル抗体に由来するＶ領域を有するがヒトＣ領域を含まない部分的にヒト化されたキメラ抗体が、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｉ，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４４、６５〜９２、１９８９で開示されている。さらに、トランスジェニック非ヒト動物を使用して、十分にヒト化された抗体を作製することができる。例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子を抑制または欠失し、ゲノムに組換えによって移入された外因性免疫グロブリン遺伝子、好ましくはヒト免疫グロブリン遺伝子によって異種抗体全体をコードする、トランスジェニックマウスなどのトランスジェニック非ヒト動物を産生することができる。例えば、米国特許第５，５３０，１０１号；米国特許第５，５４５，８０６号；米国特許第６，０７５，１８１号；ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／０２６０２；Ｇｒｅｅｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７、１３〜２１，１９９４；およびＬｏｎｂｅｒｇら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８、８５６〜８５９，１９９４（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと。トランスジェニック非ヒト宿主動物を、特定の免役応答を惹起するために本発明のタンパク質複合体または１つまたは複数の相互作用タンパク質メンバーなどの適切な抗原で免役化して、ヒト化抗体を産生することができる。さらに、特定のヒト化抗体を産生する細胞株はまた、免役化トランスジェニック非ヒト動物に由来し得る。例えば、ヒト化抗体を産生するトランスジェニック動物から得た成熟Ｂリンパ球を骨髄腫細胞に融合し、得られたハイブリドーマクローンを、所望の結合親和性を有する特定のヒト化抗体について選択することができる。あるいは、ｃＤＮＡを成熟Ｂリンパ球から抽出し、所望の結合親和性を有するヒト化抗体をコードするクローンをスクリーニングするライブラリーの確立で使用することができる。
【０１０６】
さらに別の実施形態では、２つの異なる抗原結合部位（それぞれ本発明のタンパク質複合体中の異なる相互作用タンパク質メンバーに特異的である）を有する二機能性抗体が得られる。当分野で公知の種々の方法を使用して、二機能性抗体を産生することができる。例えば、２つの異なるモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを互いに融合することができる。２つのハイブリドーマのうちの１つは、本発明のタンパク質複合体の相互作用タンパク質メンバーに特異的なモノクローナル抗体を産生することができ、他方のハイブリドーマはタンパク質複合体の別の相互作用タンパク質メンバーに免疫反応性を示すモノクローナル抗体を作製する。このようにして形成された新規のハイブリドーマは、所望の二機能性抗体（すなわち、相互作用タンパク質メンバーの両方に免疫反応性を示す抗体）を含む異なる抗体を産生する。二機能性抗体を容易に精製することができる。Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３０５、５３７〜５４０、１９８３を参照のこと。
【０１０７】
あるいは、２つの異なるモノクローナル抗体（それぞれタンパク質複合体の異なる相互作用タンパク質メンバーに免疫反応性を示す）を化学結合するためのヘテロ二機能性架橋剤を使用して二機能性抗体を産生することもできる。したがって、凝集体が、タンパク質複合体の２つの相互作用タンパク質メンバーに結合する。Ｓｔａｅｒｚら、Ｎａｔｕｒｅ、３１４、６２８〜６３１、１９８５；Ｐｅｒｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ、３１６、３５４〜３５６、１９８５を参照のこと。
【０１０８】
さらに、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ中の軽鎖および重鎖遺伝子の組換え発現によって、二機能性抗体を産生することもできる。結果として、二機能性抗体を含む抗体混合物が産生される。ＤｅＭｏｎｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７、２９４１〜２９４５、１９９０；Ｌｅｎｚ  ａｎｄ  Ｗｅｉｄｌｅ、Ｇｅｎｅ、８７、２１３〜２１８、１９９０を参照のこと。
【０１０９】
好ましくは、米国特許第５，５８２，９９６号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示の方法によって本発明の二官能性抗体を産生する。例えば、２つの異なるＦａｂを得ることができ、これらを混合する。第１のＦａｂはタンパク質複合体の相互作用タンパク質メンバーに結合することができ、Ｆａｂ中に天然に存在しないが第２の相補ドメインに結合することができる第１の相補ドメインを有する重鎖定常領域を有する。第２のＦａｂは、タンパク質複合体の別の相互作用タンパク質メンバーに結合することができ、Ｆａｂ中に天然に存在しないが、第１の相補ドメインに結合することができる第２の相補ドメインを含む重鎖定常領域を有する。２つの各相補ドメインは、他のドメインに安定に結合することができるが、これら自体と結合しない。例えば、ｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎ癌遺伝子のロイシンジッパー領域を、第１および第２の相補ドメインとして使用することができる。結果として、第１および第２の相補ドメインが互いに相互作用してロイシンジッパーを形成し、それにより２つの異なるＦａｂが２つの抗原部位に結合することができる１つの抗原構築物に結合する。
【０１１０】
二機能性抗体の産生のための当分野で公知の他の適切な方法（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、６４４４〜６４４８、１９９３；ｄｅ  Ｋｒｕｉｆら、Ｊ．Ｂｉｏｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１、７６３０〜７６３４、１９９６；Ｃｏｌｏｍａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５、１５９〜１６３、１９９７；Ｍｕｌｌｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２２、２５９〜２６４、１９９８；およびＭｕｌｌｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４３２、４５〜４９、１９９８（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示の方法が含まれる）を使用することもできる。
【０１１１】
４．スクリーニングアッセイ
本発明のタンパク質複合体（Ｔｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧまたはＨＩＶ  ＧＡＧｐ６）をスクリーニングアッセイで使用して、Ｔｓｇ１０１、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６、および本発明のタンパク質複合体のモジュレーターを選択することができる。さらに、Ｔｓｇ１０１、ＨＩＶ  ＧＡＧ、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６ｎホモログ、誘導体、およびフラグメントならびにこのようなホモログ、誘導体、およびフラグメントを含むタンパク質複合体を、スクリーニングアッセイで使用することもできる。本明細書中で使用される、用語「モジュレーター」は、タンパク質またはタンパク質複合体の性質、生物活性、または機能が変化した（例えば、生物活性の増減、安定性の増減、一定の他の生体分子に対する親和性または特異性の変化など）任意の形態を得ることができる任意の化合物を含む。さらに、本明細書中で使用される、用語「モジュレーター」もまた、Ｔｓｇ１０１、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６、および／または本発明のタンパク質複合体に単純に結合する任意の化合物を含む。例えば、モジュレーターは、Ｔｓｇ１０１またはそのホモログもしくは誘導体とＨＩＶ  ＧＡＧｐ６またはそのホモログもしくは誘導体との間のタンパク質−タンパク質相互作用を妨害するか、破壊するか、解離することができる相互作用アンタゴニストであってもよい。
【０１１２】
同様に、ＨＩＶ  ＧＡＧまたはＨＩＶ  ＧＡＧｐ６の代わりに、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフまたはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントを含む他のレトロウイルスＧＡＧポリペプチドをスクリーニングアッセイに使用することもできる。言い換えれば、本発明（例えばセクション２．に記載）によって得られたタンパク質複合体の任意の相互作用メンバーを、スクリーニングアッセイに使用することができる。
【０１１３】
本明細書中で使用される、用語「相互作用アンタゴニスト」は、タンパク質−タンパク質相互作用を妨害、遮断、破壊、または不安定化し、タンパク質複合体形成を遮断または妨害し、または既存のタンパク質複合体を不安定化、破壊、または解離する化合物を意味する。
【０１１４】
本明細書中で使用される、用語「相互作用アゴニスト」は、タンパク質−タンパク質相互作用の形成を開始するか、拡大するか、凝集するか、増強し、タンパク質複合体形成を誘発、開始、拡大、凝集するか、増強し、または既存のタンパク質複合体を安定化する化合物を意味する。
【０１１５】
従って、本発明は、Ｔｓｇ１０１、またはＨＩＶ  ＧＡＧｐ６、その変異形態またはＴｓｇ１０１またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントとＨＩＶ  ＧＡもしくはＨＩＶ  ＧＡＧｐ６またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントとの間に形成されたタンパク質複合体のモジュレーターを選択するためのスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング法に適切な標的には、セクション２．に記載の本発明のタンパク質複合体の任意の実施形態を含み得る。好ましくは、タンパク質複合体の形成でタンパク質フラグメントを使用する。例えば、好ましい標的タンパク質複合体には、ＵＥＶドメインを含むＴｓｇ１０１タンパク質フラグメントを含み得る。また、例えば、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６またはそのフラグメントを、標的タンパク質複合体の形成に使用することができる。特定の実施形態では、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６の第１の１４アミノ酸を、標的タンパク質複合体形成で使用する。別の実施形態では、検出可能なエピトープタグがＴｓｇ１０１タンパク質またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントならびに／またはＨＩＶ  ＧＡＧｐ６ポリペプチドまたはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントに融合された融合タンパク質を使用する。このようなエピトープタグの適切な例には、例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）、サルウイルス５（Ｖ５）、ポリヒスチジン（６ｘＨｉｓ）、ｃ−ｍｙｃ、ｌａｃＺ、およびＧＳＴなどに由来する配列が含まれる。
【０１１６】
Ｔｓｇ１０１タンパク質またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントを本発明のスクリーニング法での標的タンパク質として使用する場合、Ｔｓｇ１０１タンパク質またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメント中にＴｓｇ１０１  ＵＥＶドメインが含まれることが好ましい。Ｔｓｇ１０１タンパク質またはそのホモログ、誘導体、もしくはフラグメントを、例えばインフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）、サルウイルス５（Ｖ５）、ポリヒスチジン（６ｘＨｉｓ）、ｃ−ｍｙｃ、ｌａｃＺ、およびＧＳＴなどに由来する配列などの検出可能なタグに融合させることが好ましい。これに関して、Ｔｓｇ１０１タンパク質、好ましくはＴｓｇ１０１タンパク質のＵＥＶドメインに結合することができる方法によって選択された化合物を、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧｐ６との間の相互作用を阻害または妨害する能力について試験することができる。化合物のＨＩＶウイルス出芽またはＨＩＶ増殖を阻害する能力も試験することができる。このような試験のための適切な方法は、本発明を開示された当業者には明らかなはずである。
【０１１７】
本発明のスクリーニング法によって選択されたモジュレーターは、Ｔｓｇ１０１、ＨＩＶ  ＧＡＧ、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフを含む他のレトロウイルスＧＡＧポリペプチド、または本発明のタンパク質複合体の機能または活性の調整で有効であり得る。例えば、タンパク質複合体に結合することができる化合物は、タンパク質複合体の機能を調整することができる。さらに、タンパク質複合体の相互作用タンパク質メンバーの間のタンパク質−タンパク質相互作用を妨害するか、弱めるか、解離するか、破壊するか、あるいは開始するか、促進するか、安定化する化合物もまた、タンパク質複合体の機能または活性の調整で有効であり得る。したがって、本発明のスクリーニング法で同定された化合物から、タンパク質複合体、Ｔｓｇ１０１、ＨＩＶ  ＧＡＧ、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６、または他のレトロウイルスＧＡＧポリペプチドに起因するか関連する疾患、障害、または症状を予防または改善するための治療または予防に有効な薬物を産生することができる。あるいは、化合物を、本発明のタンパク質複合体またはその相互作用メンバーに起因するか関連する疾患、障害、または症状のための治療または予防に有効な化合物の設計および同定を補助するためにリードとして使用することができる。本発明のタンパク質複合体および／またはその相互作用タンパク質メンバーを、任意の種々の薬物スクリーニング技術で使用することができる。薬物スクリーニングを本明細書中に記載のように行うか、周知の技術（米国特許第５，８００，９９８号および米国特許第５，８９１，６２８号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載の技術など）を使用して行うことができる。
【０１１８】
４．１．試験化合物
本発明のスクリーニングアッセイで任意の試験化合物をスクリーニングして、本発明のＴｓｇ１０１含有タンパク質複合体またはその相互作用メンバーを選択することができる。用語モジュレーターの「選択」または「選択する」は、（ａ）本発明のＴｓｇ１０１含有タンパク質複合体および／またはその相互作用メンバーのモジュレーターであることが以前に知られていない群からの化合物の選択、および（ｂ）本発明のＴｓｇ１０１含有タンパク質複合体および／またはその相互作用メンバーに結合するか、機能および活性を調整することができることが公知の化合物の試験の両方を含むことを意図する。両化合物型を、本明細書中で一般に、「試験化合物」という。試験化合物には、例として、タンパク質（例えば、抗体、小ペプチド、人工または天然タンパク質）、核酸、ならびにその誘導体、模倣物、および類似体、１０，０００ダルトン以下、より好ましくは５，０００未満の分子量の有機小分子が含まれる。好ましくは、当分野で公知のライブラリー形式（例えば、化学合成ライブラリー、組換え発現ラブラリー（例えば、ファージディスプレイライブラリー）、およびインビトロ翻訳ベースのライブラリー（例えば、リボゾームディスプレイライブラリー））で試験化合物が得られる。
【０１１９】
例えば、本明細書のセクション３．に記載の抗体産生プロセスで本発明のスクリーニングアッセイを使用して、所望の特異性を有する抗体を選択することができる。種々の抗体または誘導体形態（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二機能性抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆｖフラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ’フラグメント、およびＦ（ａｂ’）2フラグメントなどの抗体フラグメント、ならびに触媒抗体、毒素または薬物に結合した抗体などの種々の修飾形態が含まれるが、これらに限定されない）をスクリーニングすることができる。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＭなどの任意の形態であり得る。ヒト化抗体が特に好ましい。好ましくは、大規模ハイスループットスクリーニングが可能なライブラリーで種々の抗体および抗体フラグメントを得ることができる。例えば、抗体または抗体フラグメントを発現する発現ライブラリーを、例えば、Ｈｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６、１２７５〜１２８１、１９８９（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示の方法によって構築することができる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体は、診断および治療への適用において特に興味深い。抗体ライブラリーの製造方法もまた、米国特許第６，０９６，５５１号、米国特許第５，８４４，０９３号、５，８３７，４６０号、米国特許第５，７８９，２０８号、および米国特許第５，６６７，９８８号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）で得られる。
【０１２０】
ペプチド試験化合物は、Ｌアミノ酸および／またはＤアミノ酸、リンペプチド、および他のペプチド型を有するペプチドであり得る。スクリーニングされたペプチドは、任意のサイズであり得るが、好ましくは約５０アミノ酸未満である。ペプチドが小さいほど患者の体内への送達が容易である。種々の修飾ペプチド形態をスクリーニングすることができる。抗体と同様に、ペプチドも例えば組み合わせライブラリーで得ることができる。一般に、Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７，１２３３〜１２５１，１９９４を参照のこと。無作為なペプチドライブラリーの製造方法は、例えば、Ｄｅｖｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９、４０４〜４０６、１９９０に開示されている。ペプチドライブラリーの構築およびライブラリーからのペプチドのスクリーニングのための他の適切な方法は、例えば、Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３８６〜３９０，１９９０；Ｍｏｒａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７、１０７８７〜１０７８８、１９９５（電気的にタグ化した合成ペプチドのライブラリー）；Ｓｔａｃｈｅｌｈａｕｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９、６９〜７２、１９９５；米国特許第６，１５６，５１１号、米国特許第６，１０７，０５９号、米国特許第６，１０５，５６１号、米国特許第５，７５０，３４４号、米国特許第５，８３４，３１８号、米国特許第５，７５０，３４４号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている。例えば、大腸菌繊維状ファージの第ＩＩＩ遺伝子または第ＶＩＩＩ遺伝子への合成オリゴヌクレオチドのクローニングによって無作為配列ペプチドファージディスプレイライブラリーを作製することができる。このようにして作製したファージは、大腸菌中で増殖し、ファージ表面上で融合タンパク質としてオリゴヌクレオチドによってコードされるペプチドを発現することができる。Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９，３６８〜３９０，１９９０。あるいは、「プラスミド上のペプチド」法を使用してペプチドライブラリーを形成することもできる。この方法では、組換え技術によって無作為ペプチドを大腸菌のＣ末端に融合し、Ｌａｃリプレッサー結合部位も含むプラスミドから発現することができる。結果として、ペプチド融合物は、それをコードする同一のプラスミドに結合する。
【０１２１】
５，０００ダルトン未満の分子量の小有機または無機非ペプチドまたは非ヌクレオチド化合物が、本発明のスクリーニングアッセイ用の好ましい試験化合物である。これらは、ライブラリー形式でも得ることができる。一般に、Ｇｏｒｄａｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７、１３８５〜１４０１、１９９４を参照のこと。例えば、Ｂｕｎｉｎ  ａｎｄ  Ｅｌｌｍａｎ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１４、１０９９７〜１０９９８、１９９２（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）でベンゾジアゼピンライブラリーが得られている。ペプトイドライブラリーの構築およびスクリーニング法は、Ｓｉｍｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、９３６７〜９３７１、１９９２に開示されている。ライブラリー形式での新規のポリケチドの生合成方法は、ＭｃＤａｎｉｅｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２、１５４６〜１５５０、１９９３およびＫａｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５、５０９〜５１２、１９９４に記載されている。小有機分子の種々のライブラリーおよびその構築方法は、米国特許第６，１６２，９２６号（多置換フラーレン誘導体）；米国特許第６，０９３，７９８号（ヒドロキサム酸誘導体）；米国特許第５，９６２，３３７号（コンビナトリアル１，４−ベンゾジアゼピン−２，５−ジオンライブラリー）；米国特許第５，８７７，２７８号（Ｎ置換オリゴマーの合成）；米国特許第５，８６６，３４１号（組成物および薬物ライブラリーのスクリーニング法）；米国特許第５，７９２，８２１号（重合可能なシクロデキストリン誘導体）；米国特許第５，７６６，９６３号（ヒドロキシプロピルアミンライブラリー）；および米国特許第５，６９８，６８５号（モルホリノサブユニットコンビナトリアルライブラリー）（その全てが引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている。
【０１２２】
オリゴヌクレオチドならびにペプチド核酸（ＰＮＡ）、その類似体および誘導体などの他の化合物をスクリーニングして臨床的に有用な化合物を選択することもできる。オリゴ類の組み合わせライブラリーもまた、当分野で公知である。Ｇｏｌｄら、Ｊ．ＢＩｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０、１３５８１〜１３５８４、１９９５を参照のこと。
【０１２３】
４．２．インビボスクリーングアッセイ
試験化合物をインビトロアッセイでスクリーニングして本発明のタンパク質複合体またはその相互作用タンパク質メンバーに結合することができる化合物を選択することができる。この目的のために、試験化合物と標的化合物との間に特定の相互作用が生じ、それにより化合物が複合体を形成する標的に結合する条件および十分な時間、試験化合物をタンパク質複合体またはその相互作用タンパク質メンバーに接触させる。その後、結合事象を検出する。
【０１２４】
当分野で公知の種々のスクリーニング技術を、本発明で使用することができる。タンパク質複合体およびその相互作用タンパク質メンバーを、任意の適切な方法（例えば、組換え発現および精製）によって調製することができる。タンパク質複合体および／またはその相互作用タンパク質メンバー（このセクションでは、以後、これらを共に「標的」という）は、溶液または細胞抽出物中に含まれない。試験化合物を標的と混合して液体混合物を形成することができる。化合物を、検出可能なマーカーで標識することができる。安定な条件下での混合の際、化合物および標的を含む結合複合体を免役共沈し、洗浄することができる。沈殿した複合体中の化合物を、化合物に対するマーカーに基づいて検出することができる。
【０１２５】
好ましい実施形態では、標的を固体支持体または細胞表面に固定する。好ましくは、セクション２．に記載の方法で、標的をタンパク質マイクロチップに整列させることができる。例えば、標的を、ガラススライドなどのマイクロチップ基質または非中和抗体（すなわち、標的に結合することができるが、生物活性に実質的に影響を与えない抗体）を使用したマルチウェルプレートに直接固定することができる。スクリーニングを実施するために、試験化合物を、固定化標的と接触させて標準的な結合アッセイ条件かで複合体を形成するように結合させることができる。周知の標識技術を使用して、標的または試験化合物のいずれかを検出可能なマーカーで標識する。例えば、米国特許第５，７４１，７１３号は、ＮＭＲ活性同位体で標識した生化学的化合物の組み合わせライブラリーを開示している。結合化合物を選択するために、標的−試験化合物複合体の形成またはその形成速度を測定することができる。有機非ペプチド非核酸化合物の組み合わせライブラリーをスクリーニングする場合、標識またはコード化（または「タグ化」）組み合わせライブラリーを使用して、リード構造を迅速に解読することができることが好ましい。生物学的ライブラリーと異なる、化学的ライブラリーで見出された各化合物を自己複製によって増幅することができないので、これは特に重要である。タグ化組み合わせライブラリーは、例えば、Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ  ａｎｄ  Ｓｔｉｌｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１６，３７３〜３７４，１９９４およびＭｏｒａｎら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７，１０７８７〜１０７８８，１９９５（共に引用することにより本明細書の一部をなすものとする）で得られる。
【０１２６】
あるいは、試験化合物を固体支持体上に固定して、例えば試験化合物のマイクロアレイを形成することができる。次いで、標的タンパク質またはタンパク質複合体を、試験化合物に接触させる。標的を、任意の適切な検出マーカーで標識することができる。例えば、結合反応が起こる前に、標的を放射性同位体または蛍光マーカーで標識することができる。あるいは、結合反応後、標的に免疫反応性を示し、放射性物質、蛍光マーカー、酵素、または標識二次抗Ｉｇ抗体で標識された抗体を使用して、任意の結合した標的を検出し、それにより結合化合物を選択することができる。この実施形態の１つの例は、タンパク質探索法である。すなわち、本発明によって得られた標的をプローブとして使用して、タンパク質または無作為ペプチドの発現ライブラリーをスクリーニングする。発現ライブラリーは、ファージディスプレイライブラリー、インビトロ翻訳ベースのライブラリー、または通常の発現ｃＤＮＡライブラリーであり得る。ライブラリーを、ニトロセルロースフィルターなどの固体支持体上に固定することができる。例えば、Ｓｉｋｅｌａ  ａｎｄ  Ｈａｈｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、３０３８〜３０４２、１９８７を参照のこと。放射性同位体または蛍光マーカーによってプローブを標識することができる。あるいは、プローブをビオチン化して、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ結合体で検出することができる。より好都合には、結合したプローブを、抗体で検出することができる。
【０１２７】
さらに別の実施形態では、標的に結合することができる既知のリガンドを、競合結合アッセイで使用することができる。既知のリガンドと標的との間の複合体を形成し、試験化合物と接触させることができる。試験化合物の標的と既知のリガンドとの間の相互作用を妨害する能力を測定する。リガンドの１つの例は、標的に特異的に結合することができる抗体である。特に、このような抗体は、標的複合体またはその相互作用タンパク質メンバーの１つまたは複数の抗原決定基を共有するペプチドの同定で特に有用である。
【０１２８】
特定の実施形態では、スクリーニングアッセイで使用されるタンパク質複合体には、２つの相互作用タンパク質メンバーまたはそのフラグメントもしくはドメインの融合によって形成される、セクション２．に記載のハイブリッドタンパク質が含まれる。ハイブリッドタンパク質はまた、これに融合した検出可能なエピトープタグを含むように設計することもできる。このようなエピトープタグの適切な例には、例えば、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）、サルウイルス５（Ｖ５）、ポリヒスチジン（６ｘＨｉｓ）、ｃ−ｍｙｃ、ｌａｃＺ、およびＧＳＴなどに由来する配列が含まれる。
【０１２９】
試験化合物をインビトロアッセイでスクリーニングして本発明によって同定されたタンパク質複合体の相互作用アンタゴニストを選択することもできる。したがって、Ｔｓｇ１０１−ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６タンパク質複合体を試験化合物と接触させて、タンパク質複合体の破壊または不安定化を検出することができる。
【０１３０】
上記の結合アッセイと類似の様式でアッセイを行うことができる。例えば、特定のタンパク質複合体の有無を、タンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体によって検出することができる。したがって、タンパク質複合体の試験化合物とのインキュベーション後、抗体を使用して免役沈降アッセイを行うことができる。試験化合物がタンパク質複合体を破壊する場合、このアッセイにおける免役沈降タンパク質複合体の量は、同一のタンパク質複合体を試験化合物に接触させないコントロールアッセイにおける量よりも有意に少ない。本発明を開示された当業者に明らかであるように、種々の他の検出法が解離アッセイで有用であり得る。１つの実施形態では、融合する検出可能なマーカーを含む相互作用パートナーの１つを、固体支持体に固定する。例えば、ＧＳＴ−ＧＡＧｐ６融合タンパク質を、固体支持体に結合させる。次いで、融合する検出可能なマーカーを有する他の相互作用パートナー（例えば、ＵＥＶドメインを含むｍｙｃタグ化Ｔｓｇ１０１フラグメント）を１つまたは複数の試験化合物の存在下で固定した第１の相互作用パートナーに接触させる。２つの相互作用パートナーが結合する場合、ｍｙｃタグ化Ｔｓｇ１０１フラグメントも固定され、反応混合物を洗浄して非結合ｍｙｃタグ化Ｔｓｇ１０１フラグメントを除去した後に抗ｍｙｃ抗体を使用して検出することができる。
【０１３１】
４．３．インビボスクリーニングアッセイ
任意のインビボアッセイで試験化合物を使用して、本発明のタンパク質複合体または相互作用タンパク質メンバーのモジュレーターを選択することもできる。例えば、本発明のタンパク質複合体の安定性を増強または妨害することができる化合物の選択に有用な当分野で公知の任意のインビボアッセイを使用することができる。
【０１３２】
４．３．１．２ハイブリッドアッセイ
好ましい実施形態では、酵母２ハイブリッドシステムまたはその類似体もしくは派生系の１つを使用する。当分野で公知の適切な２ハイブリッドシステムの例には、米国特許第５，２８３，１７３号；米国特許第５，５２５，４９０号、米国特許第５，５８５，２４５号、米国特許第５，６３７，４６３号、米国特許第５，６９５，９４１号、米国特許第５，７３３，７２６号、米国特許第５，７７６，６８９号、米国特許第５，８８５，７７９号、米国特許第５，９０５，０２５号、米国特許第６，０３７，１３６号、米国特許第６，０５７，１０１号、米国特許第６，１１４，１１１号、およびＢａｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ編、「酵母２ハイブリッドシステム」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９７（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３３】
典型的には、古典的な転写ベースの２ハイブリッドシステムでは、２つの融合タンパク質（一方は本発明のタンパク質複合体の相互作用タンパク質メンバーまたは相互作用タンパク質メンバーの相互作用ドメインに融合した転写活性化ドメインを含み、他方の融合タンパク質はタンパク質複合体の別の相互作用タンパク質メンバーまたはその相互作用ドメインに融合したＤＮＡ結合ドメインを含む）をコードする２つのキメラ遺伝子を調製する。便宜上、２つの相互作用タンパク質メンバーまたはその相互作用ドメインをそれぞれ「ベイト（bait）融合タンパク質」および「プレイ（prey）融合タンパク質」と呼ぶ。融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子を、それぞれ「ベイトキメラ遺伝子」および「プレイキメラ遺伝子」と呼ぶ。典型的には、それぞれベイトキメラ遺伝子およびプレイキメラ遺伝子の発現のために「ベイトベクター」および「プレイベクター」を得る。
【０１３４】
４．３．１．１．ベクター
転写ベースの２ハイブリッドアッセイでは多数のベクター型を使用することができる。ベイトベクターおよびプレイベクターの構築方法は、本発明を開示された当業者に明らかである。一般に、「現代の分子生物学プロトコール」、第２版、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．Ａｓｓｏｃ．＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、第１３章、１９８８；Ｇｌｏｖｅｒ、「ＤＮＡクローニング」、第ＩＩ巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，第３章、１９８６；Ｂｉｔｔｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５３、５１６〜５４４、１９８７；「酵母サッカロミセスの分子生物学」、Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、１９８２；およびＲｏｔｈｓｔｅｉｎ、「ＤＮＡクローニング：実践アプローチ」、第１１巻、ＤＭ  Ｇｌｏｖｅｒ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈ．，Ｄ．Ｃ．，１９８６を参照のこと。
【０１３５】
一般に、ベイトベクターおよびプレイベクターは、キメラ遺伝子の転写のためにキメラ遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを有する発現カセットを含む。ベクターはまた、宿主細胞中でのベクター複製のためのＤＮＡ複製起点、例えば、大腸菌でのベクター複製のための複製起点、およびベクターを保有する宿主細胞のみを選択および維持するための選択マーカーを含む。さらに、発現カセットは、好ましくは、キメラ遺伝子の発現を調節するように機能する誘導エレメントも含む。誘導性および調節可能なキメラ遺伝子発現の作製は、融合タンパク質またはその成分が宿主に対して有毒である事象で特に重要である。転写エンハンサー配列および翻訳調節配列（例えば、シャイン・ダルカルノ配列）などの他の調節配列もまた、発現カセットに含むことができる。ウシ成長ホルモン、ＳＶ４０、ｌａｃＺ、およびＡｃＭＮＰＶ多面体ポリアデニル化シグナルなどの終結配列を、発現カセット中のキメラ遺伝子に作動可能に連結させることもできる。融合タンパク質の検出および／または精製のためのエピトープタグコード配列を、発現かセット中のキメラ遺伝子に作動可能に連結させることもできる。有用なエピトープタグの例には、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）、サルウイルス５（Ｖ５）、ポリヒスチジン（６ｘＨｉｓ）、ｃ−ｍｙｃ、ｌａｃＺ、およびＧＳＴなどが含まれるが、これらに限定されない。ポリヒスチジンタグを有するタンパク質を、Ｎｉ親和性カラムを使用して容易に検出および／または精製することができ、多数のエピトープタグに対する特異的抗体は、一般に市販されている。ベクターを、当分野で公知の任意の技術（例えば、直接的ＤＮＡ形質転換、微量注入、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リポフェクション、および遺伝子銃など）によって宿主細胞に移入することができる。ベイトおよびプレイベクターを、染色体外状態（すなわち、自己複製プラスミドまたはウイルス）で宿主細胞中に維持することができる。あるいは、両ベクターのうちの１つを、安定な細胞株の選択または部位特異的組換えなどの従来技術によって宿主細胞の染色体に組み込むことができる。
【０１３６】
本発明のインビボアッセイを、多数の異なる宿主細胞（細菌、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞ならびに哺乳動物細胞が含まれるが、これらに限定されない）で行うことができる。当業者は、ベクター設計は、使用する宿主細胞によって変化し得ることを認識している。１つの実施形態では、大腸菌、サルモネラ菌、クレブシエラ菌、シュードモナス、カウロバクター、およびリゾビウムなどの原核細胞でアッセイを行う。本発明のこの実施形態で有用な発現ベクターの適切な複製起点には、例えば、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、およびＭ１３複製起点が含まれる。適切なプロモーターの例には、例えば、Ｔ７プロモーターおよびｌａｃＺプロモーターなどが含まれる。さらに、キメラ遺伝子発現の調整に誘導性プロモーターも有用である。例えば、バクテリオファージλｐｌａｃ５由来のｌａｃオペロンは、当分野で周知であり、成長培地へのＩＰＴＧの添加によって誘導可能である。細菌発現系で有用な他の公知のプロモーターには、λバクテリオファージのｐＬ、ｔｒｐプロモーター、およびｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターなどが含まれる。
【０１３７】
さらに、所望の融合タンパク質を発現する細胞のみを選択および維持するための選択マーカー配列も発現ベクターに組み込むべきである。栄養要求性マーカーおよび抗生物質耐性マーカーを含む多数の選択マーカーが当分野で公知であり、これら全てが本発明の目的で有用であり得る。例えば、アンピシリン耐性を付与するｂｌａ遺伝子は、原核生物発現ベクターで最も一般的に使用されている選択マーカーである。他の適切なマーカーには、宿主細胞にネオマイシン、カナマイシン、またはハイグロマイシン耐性を付与する遺伝子が含まれる。実際、多数のベクターが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｆ．）、ＢＲＬ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、およびＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎ．）などの業者から市販されている。これらの市販の全ベクター（例えばｐＢＲ３２２、ｐＳＰＯＲＴ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ、ｐｃＤＮＡＩ、およびｐｃＤＮＡＩＩ）は、従来の組換え技術を使用して本発明のキメラ遺伝子を都合よく挿入することができるマルチクローニング部位を有する。構築した発現ベクターを、当分野で一般に公知の種々の形質転換またはトランスフェクション技術によって宿主細胞に移入することができる。
【０１３８】
別の実施形態では、哺乳動物細胞を、融合タンパク質の発現およびタンパク質−タンパク質相互作用の検出用の宿主細胞として使用する。この目的のために、実質的に任意の哺乳動物細胞（正常な組織細胞、安定な細胞株、および形質転換腫瘍細胞が含まれる）を使用することができる。都合よく、ＣＨＯ細胞、ＪｕｒｋａｔＴ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＣＶ−１細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＭＤＣＫ細胞、およびＷＩ３８細胞などの哺乳動物細胞株を使用する。哺乳動物発現ベクターは当分野で周知であり、多数が市販されている。哺乳動物細胞中でのキメラ遺伝子の転写に適切なプロモーターの例には、アデノウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ：例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（例えば、長末端反復（ＬＴＲ））、ワクシニアウイルス（例えば、７．５Ｋプロモーター）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（例えば、チミジンキナーゼプロモーター）由来のウイルス転写プロモーターが含まれる。誘導性プロモーターを使用することもできる。適切な誘導性プロモーターには、例えば、テトラサイクリン応答性エレメント（ＴＲＥ）（Ｇｏｓｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８、５５４７〜５５５１、１９９２を参照のこと）、メタロチオネインＩＩＡプロモーター、エクジソン応答性プロモーター、および熱ショックプロモーターが含まれる。哺乳動物細胞中での発現ベクターの複製および維持のために適切な複製起点には、例えば、エプスタイン−バー核抗原の存在下でのエプスタイン−バー複製起点（Ｓｕｇｄｅｎら、Ｍｏｌｅ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５、４１０〜４１３、１９８５を参照のこと）、およびＳＶ４０  Ｔ抗原の存在下でのＳＶ４０複製起点（ＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞中に存在する）（Ｍａｒｇｏｌｓｋｅｅら、Ｍｏｌｅ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８、２８３７、１９８８を参照のこと）が含まれる。適切な選択マーカーには、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびゼオシンなどへの耐性を付与する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。多数の市販の哺乳動物発現ベクター（例えば、ｐＣＥＰ４、ｐｃＤＮＡ、ｐＩＮＤ、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＶＡＸ１、ｐｃＤＮＡ３．１、およびｐＢＩ−ＥＧＦＰ、およびｐＤｉｓｐｌａｙ）が本発明で有用であり得る。リン酸カルシウム沈殿、リポフェクチン、およびエレクトロポレーションなどの任意の公知の技術を使用して、ベクターを哺乳動物細胞に移入することができる。ベイトベクターおよびプレイベクターを、同一の細胞に同時形質転換するか、あるいは２つの異なる細胞に移入してその後細胞融合または他の適切な技術によって融合することができる。
【０１３９】
ウイルス感染によって組換え遺伝子を細胞に移入することができるウイルス発現ベクターを、融合タンパク質の発現に使用することもできる。ウイルス発現ベクターは当分野で一般に公知であり、これには、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、マウス肝細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、ＭＧＦウイルス、およびレトロウイルスを基本としたウイルスベクターが含まれる。Ｓａｒｖｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１、４８６、１９８１；Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１、３６５５〜３６５９、１９８４；Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、７４１５〜７４１９、１９８２；Ｍａｃｋｅｔｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，４９、８５７〜８６４、１９８４；Ｐａｎｉｃａｌｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９、４９２７〜４９３１、１９８２；Ｃｏｎｅ  ＆  Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１、６３４９〜６３５３、１９８４；Ｍａｎｎら、Ｃｅｌｌ、３３、１５３〜１５９、１９９３；Ｐｅａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０、８３９２〜８３９６、１９９３；Ｋｉｔａｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、９１４６〜９１５０、１９９５；Ｋｉｎｓｅｌｌａら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、７、１４０５〜１４１３、１９９６；Ｈｏｆｍａｎｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、５１８５〜５１９０、１９９６；Ｃｈｏａｔｅら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、７、２２４７、１９９６；ＷＯ９４／１９４７８；Ｈａｗｌｅｙら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１．１３６、１９９４；およびＲｉｖｅｒｅら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、９２、６７３３，１９９５（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと。
【０１４０】
一般に、ウイルスベクターを構築するために、本発明のキメラ遺伝子を適切なプロモーターに作動可能に連結することができる。次いで、プロモーター・キメラ遺伝子構築物を、ウイルスベクターの非必須領域、典型的には修飾ウイルスゲノムに挿入する。これにより、感染宿主細胞中でキメラ遺伝子によってコードされた融合タンパク質を発現することができる生存可能な組換えウイルスが得られる。組換えウイルスは、一旦宿主細胞中で得られると、典型的には、宿主細胞ゲノムに組み込まれる。しかし、組換えウシ乳頭腫ウイルスは、典型的には、染色体外エレメントとして複製および維持される。
【０１４１】
別の実施形態では、植物細胞系で本発明の検出アッセイを行う。植物細胞中での外因性タンパク質の発現方法は、当分野で周知である。一般に、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ＆  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ、「植物分子生物学」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８８；Ｇｒｉｅｒｓｏｎ  ＆  Ｃｏｒｅｙ、「植物分子生物学」、第２版、Ｂｌａｃｋｉｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８８を参照のこと。例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）またはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）に基づいた組換えウイルス発現ベクターの全てを使用することができる。あるいは、ＴｉプラスミドベクターおよびＲｉプラスミドベクターなどの組換えプラスミド発現ベクターも有用である。本発明の融合タンパク質をコードするキメラ遺伝子を、発現ベクターに都合よくクローン化し、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡおよび１９Ｓ  ＲＮＡプロモーターもしくはＴＭＶの外殻タンパク質プロモーターなどのウイルスプロモーターまたは植物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのプロモーターおよび熱ショックプロモーター（例えば、ダイズｈｓｐ１７．５−Ｅまたはｈｓｐ１７．３−Ｂプロモーター））の調節下に置く。
【０１４２】
さらに、バキュロウイルス発現系を使用して昆虫細胞（例えば、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細）中で本発明のインビボアッセイも行うことができる。この系で有用な発現ベクターおよび宿主細胞は、当分野で周知であり、一般に種々の業者から市販されている。例えば、本発明のキメラ遺伝子を、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）ベクターの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に都合よくクローン化して、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の調節下に置くことができる。このようにして作製された非閉塞組換えウイルスを使用して、キメラ遺伝子を発現するＳｐｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞などの宿主細胞に感染させることができる。米国特許第４，２１５，０５１号を参照のこと。
【０１４３】
本発明の好ましい実施形態では、サッカロミセス・セレビジエ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、およびＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅなどの酵母を宿主として使用して、融合タンパク質を酵母発現系中で発現させる。酵母中での組換えタンパク質の発現は、十分に発展した分野であり、これに関して有用な技術は、「酵母サッカロミセスの分子生物学」、Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌら、「現代の分子生物学プロトコール」、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｗｉｌｅｙ、１９９４；およびＧｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ、「酵母遺伝学および分子生物学ガイド」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１９４巻、１９９１（これら全てが本明細書中で参考として組み込まれる）に詳細に開示されている。Ｓｕｄｂｅｒｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，７、５１７〜５２４、１９９６は、当分野での種々の酵母種中での組換えタンパク質発現の成功を概説している（全内容および論文中に引用された参考文献は引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。さらに、Ｂａｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ編、「酵母２ハイブリッドシステム」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９７は、種々の酵母２ハブリッド系の文脈中で酵母中での融合タンパク質の組換え発現を広範に考察し、多数の関連する参考文献を引用している。これらおよび当分野で公知の他の方法の全てを、本発明の目的に使用することができる。このような方法の本発明への適用は、本発明を開示された当業者に明らかなはずである。
【０１４４】
一般に、２つのキメラ遺伝子はそれぞれ異なる発現ベクターに含まれる（ベイトベクターおよびプレイベクター）。両ベクターを、１つの酵母宿主細胞に同時形質転換することができる。当業者に明らかなように、１つのベクターから両方のキメラ遺伝子を発現することが可能である。好ましい実施形態では、ベイトベクターおよびプレイベクターを、反対の交配型（例えば、それぞれａ型およびα型）の２つの半数体酵母細胞に移入する。２つの半数体細胞を、所望の時間交配して、両方のキメラ遺伝子を発現する二倍体細胞を形成することができる。
【０１４５】
一般に、酵母中での組換え発現用のベイトおよびプレイベクターは、酵母細胞中でのベクターの複製および維持のための２μ起点またはＡＲＳＨ４配列などの酵母複製起点を含む。好ましくは、ベクターはまた、細菌の複製起点（例えば、ＣｏｌＥ１）および細菌の選択マーカー（例えば、ａｍｐRマーカー、すなわちｂｌａ遺伝子）を有する。任意選択的に、酵母細胞中でのベクター複製の調節のためのＣＥＮ６セントロメア配列を含む。酵母細胞中で遺伝子転写を駆動することができる任意の構成性または誘導性プロモーターを使用して、キメラ遺伝子発現を調節することができる。このようなプロモーターを、キメラ遺伝子に作動可能に連結させる。適切な構成性プロモーターの例には、酵母ＡＤＨ１、ＰＧＫ１、ＴＥＦ２、ＧＰＤ１、ＨＩＳ３、およびＣＹＣ１プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。適切な誘導性プロモーターの例には、酵母ＧＡＬ１（ガラクトースによって誘導可能）、ＣＵＰ１（Ｃｕ++によって誘導可能）、およびＦＵＳ１（フェロモンによって誘導可能）プロモーター；Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａおよびＰ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のＡＯＸ／ＭＯＸプロモーター（グルコースまたはエタノールによって抑制され、メタノールによって誘導される）；キメラプロモーター（Ｌｅｘオペレーターを含むキメラプロモーターなど。ＬｅｘＡ含有転写因子によって誘導可能）などが含まれるが、これらに限定されない。キメラ遺伝子によってコードされた融合タンパク質が宿主細胞に対して有毒である場合、誘導性プロモーターが好ましい。所望ならば、ＳＰＯ１３プロモーター由来の上流抑制配列（ＵＲＳ）などの一定の転写抑制配列を、プロモーター配列（例えば、プロモーター領域の５’末端）に作動可能に連結することができる。このような上流抑制配列は、キメラ遺伝子の発現レベルを微調整するように機能する。
【０１４６】
好ましくは、転写終結シグナルを、ベクター中のキメラ遺伝子に作動可能に連結させる。一般に、例えば、ＣＹＣ１およびＡＤＨ１遺伝子由来の転写終結シグナル配列を使用することができる。
【０１４７】
さらに、ベイトベクターおよびプレイベクターがキメラ遺伝子を保有する酵母細胞のみの選択および維持のために１つまたは複数の選択マーカーを含むことが好ましい。キメラ遺伝子を積極的に識別する（positively identified）か、消極的に選択する(negatively selected)ことができる限り、本発明の目的のために当分野で公知の任意の選択マーカー使用することができる。積極的に識別ことができるマーカーの例は、βガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、分泌性アルカリホスファターゼ遺伝子、西洋ワサビペルオキシダーゼ遺伝子、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）遺伝子、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含む呈色アッセイを基本とするマーカーである（Ｃｕｂｉｔｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０、４４８〜４５５、１９９５を参照のこと）。他のマーカー（蛍光発光、下悪発光、ＵＶ吸収、および赤外線など）を使用することもできる。そのうちで選択することができるマーカーは、栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、およびＡＤＥ２などが含まれるが、これらに限定されない）である。典型的には、栄養要求性選択の目的のために、ベイトベクターおよび／またはプレイベクターで形質転換した酵母宿主細胞を、特定の栄養素を欠く培地中で培養する。他の選択マーカーは、栄養要求性ではなく、むしろ抗生物質または他の生体異物への耐性または感受性に基づく。このようなマーカーの例には、クロラムフェニコール耐性を付与するクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子；アルギニンパーミアーゼをコードし、それにより細胞にカナバニン感受性が付与されるＣＡＮ１遺伝子（Ｓｉｋｏｒｓｋｉら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４、３０２〜３１８、１９９１を参照のこと）；真核細胞にアミノグリコシドＧ４１８耐性を付与する細菌カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎR）（Ｗａｃｈら、Ｙｅａｓｔ、１０、１７９３〜１８０８、１９９４を参照のこと）；およびシクロヘキシミド耐性を付与するＣＹＨ２遺伝子（Ｓｉｋｏｒｓｋｉら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４、３０２〜３１８、１９９１を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、メタロチオネインをコードし、それにより銅耐性が付与されるＣＵＰ１遺伝子もまた、適切な選択マーカーである。上記各選択マーカーを、単独または組み合わせて使用することができる。１つまたは複数の選択マーカーを、特定のベイトまたはプレイベクターに含めることができる。ベイトベクターおよびプレイベクターは、同一または異なる選択マーカーを有することができる。さらに、半数体酵母細胞の交配前または交配後のいずれかで形質転換宿主細胞に選択圧をかけることができる。
【０１４８】
明らかなように、使用した選択マーカーは、ベイトおよび／またはプレイベクターが発現する宿主株を補足すべきである。言い換えれば、選択マーカー遺伝子として遺伝子を使用する場合、選択マーカー遺伝子を欠く（または対応する遺伝子が変異した）酵母株を、宿主細胞として使用すべきである。多数の選択マーカーに対応する多数の酵母株または誘導株が、当分野で公知である。これらの多数を、所定の酵母２ハイブリッドシステムのために特別に開発した。本発明に関するこのような株の適用および最適な修飾は、本発明を開示された当業者には明らかなはずである。遺伝子交差または組換え変異誘発を使用した酵母株の遺伝子操作方法は、当分野で周知である。例えば、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０１、２０２〜２１１、１９８３を参照のこと。例として、以下の酵母株が当分野で周知であり、修飾および調整が必要な際に本発明で使用することができる。
【０１４９】
遺伝子型ＭＡＴａｈｉｓ３Δ２００ｔｒｐ１−９０１ｌｅｕ２−３，１１２ａｄｅ２ＬＹＳ２：：（ｌｅｘＡｏｐ）４−ＨＩＳ３  ＵＲＡ３：：（ｌｅｘＡｏｐ）８−ｌａｃＺを有するＬ４０；
遺伝子型ＭＡＴａｔｒｐ１ｈｉｓ３ｕｒａ３６ｏｐｓ−ＬＥＵ２を有するＥＧＹ４８株；および
遺伝子型ＭＡＴａｕｒａ３−５２ｌｅｕ２−３，１１２ｔｒｐ１−９０１ｈｉｓ３Δ２００ａｄｅ２−１０１ｇａｌ４Δｇａｌ８０ΔＳＰＡＬ１０：：ＵＲＡ３  ＧＡＬ１：：ＨＩＳ３：：ｌｙｓ２を有するＭａＶ１０３（Ｋｕｍａｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２、１３５４８〜１３５５４、１９９７；Ｖｉｄａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１０３１５〜１０３２０、１９９６を参照のこと）。このような株は、一般に、研究団体で利用可能であり、簡単な酵母遺伝子操作によって得ることもできる。例えば、「酵母２ハイブリッドシステム」、Ｂａｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ編、１７３〜１８２、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９７を参照のこと。
【０１５０】
さらに、以下の酵母株が市販されている：
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から利用可能であり、遺伝子型ＭＡＴａｇａｌ４ｇａｌ８０ｈｉｓ３Δ２００ｔｒｐ１−９０１ａｄｅ２−１０１ｕｒａ３−５２ｌｅｕ２−３，１１２ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１−ｌａｃＺＬＹＳ２：：ＧＡＬ１−ＨＩＳ３ｃｙｈ’を有するＹ１９０；および
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から利用可能であり、遺伝子型ＭＡＴａｕｒａ３−５２ｈｉｓ３−２００ａｄｅ２−１０１ｌｙｓ２−８０１ｔｒｐ１−９０１ｌｅｕ２−３，１１２ｇａｌ４−５４２ｇａｌ８０−５３８ＬＹＳ２：：ＧＡＬ１−ＨＩＳ３ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１／ＣＹＣ１−ｌａｃＺを有するＹＲＧ−２。
【０１５１】
実際、酵母２ハイブリッドシステム分析のために特に設計されたベクターおよび宿主細胞の異なる種類は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などの業者から市販されているキットを利用することができ、これらは全て本発明用に改変することができる。
【０１５２】
４．３．１．２．レポーター
一般に、転写ベースの２ハイブリッドシステムでは、ベイト融合タンパク質とプレイ融合タンパク質との間の相互作用は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを接近させて、特定のプロモーターに対してレポータータンパク質発現を駆動するように作用する機能的転写因子を形成する。転写活性ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインを、種々の公知の転写アクチベーター（例えば、ＧＡＬ４、ＧＣＮ４、ＡＲＤ１、ヒトエストロゲン受容体、大腸菌ＬｅｘＡタンパク質、単純ヘルペスウイルスＶＰ１６（Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２、７１８〜７２９、１９８８）、大腸菌Ｂ４２タンパク質（酸のブロッブ、Ｇｙｕｒｉｓら、Ｃｅｌｌ、７５、７９１から８０３、１９９３を参照のこと）、ＮＦ−ｋＢ  ｐ６５など）から選択することができる。レポーター遺伝子およびその転写を駆動するプロモーターを、異なるレポーターベクターに組み込む。あるいは、宿主細胞を、このようなプロモーター・レポーター遺伝子配列がその染色体に含まれるように操作する。したがって、タンパク質複合体の２つの相互作用タンパク質メンバー間の相互作用または相互作用の欠失を、アッセイ系でのレポーターの変化の検出または測定によって決定することができる。レポーターおよび選択マーカーが類似の型であり、本発明で類似の様式で使用されるにもかかわらず、レポーターおよび選択マーカーを、互いに区別し互いの機能を妨害しないように特定の検出アッセイで慎重に選択しなければならない。
【０１５３】
多数の異なるレポーター型がスクリーングアッセイにおいて有用である。例えば、レポータータンパク質は、タンパク質に融合したエピトープタグを有する融合タンパク質であり得る。共通に使用され、且つ市販されているエピトープタグには、例えばインフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡ）、サルウイルス５（Ｖ５）、ポリヒスチジン（６ｘＨｉｓ）、ｃ−ｍｙｃ、ｌａｃＺ、およびＧＳＴなど由来の配列が含まれる。これらのエピトープタグに特異的な抗体は、一般に、市販されている。したがって、発現したレポーターを、免役アッセイでエピトープ特異的抗体を使用して検出することができる。
【０１５４】
別の実施形態では、呈色ベースのアッセイで検出できるようにレポーターを選択する。このようなレポーターの例には、例えば、ｌａｃＺタンパク質（βガラクトシダーゼ）、蛍光アッセイで検出し、フローセルソーター（ＦＡＣＳ）で選別することができる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Ｃｕｂｉｔｔら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０、４４８〜４５５、１９９５を参照のこと）、分泌性アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、エクオリン、オベリン、ムネミオプシン、およびベロビンなどのルシフェラーゼリンタンパク質（米国特許第６，０８７，４７６号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと）が含まれる。
【０１５５】
あるいは、栄養要求性因子を、栄養要求性因子欠損宿主株のレポーターとして使用する。したがって、適切な栄養要求性レポーター遺伝子には、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、およびＡＤＥ２などが含まれるが、これらに限定されない。例えば、変異ＵＲＡ３遺伝子を含む酵母細胞を、宿主細胞（Ｕｒａ-表現型）として使用することができる。このような細胞は、ＵＲＡ３コード機能性オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ウラシルの生合成のために酵母細胞が必要とする酵素）を欠く。結果として、細胞は、ウラシルを欠く培地で成長できない。しかし、野生型オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼは、非毒性化合物５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）の有毒産物５−フルオロウラシルへの変換を触媒する。したがって、野生型ＵＲＡ３遺伝子を含む酵母細胞は、５−ＦＯＡに感受性を示し、５−ＦＯＡ含有培地で成長できない。したがって、融合タンパク質中での相互作用タンパク質メンバー間の相互作用により、活性オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼが発現し、Ｕｒａ-（ＦｏａR）酵母細胞は、ウラシル欠損培地（ＳＣ−Ｕｒａプレート）上で成長することができる。しかし、このような細胞は５−ＦＯＡ含有培地では生存しない。したがって、タンパク質−タンパク質相互作用を、細胞成長に基づいて検出することができる。
【０１５６】
さらに、同様の様式で、抗生物質耐性レポーターを使用することもできる。これに関して、特定の抗生物質に感受性を示す宿主細胞を使用する。抗生物質耐性レポーターには、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子および真核細胞中でＧ４１８耐性を付与し、原核細胞中でカナマイシン耐性を付与するｋａｎ（登録商標）遺伝子が含まれる。
【０１５７】
４．３．１．３．相互作用アンタゴニストのスクリーニングアッセイ
本発明のスクリーニングアッセイは、本発明のタンパク質複合体中のタンパク質−タンパク質相互作用（すなわち、Ｔｓｇ１０１またはそのホモログもしくは誘導体とＨＩＶ  ＧＡＧ、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含む他のレトロウイルスＧＡＧ、またはこれらのホモログもしくは誘導体との間の相互作用）を妨害、破壊、または解離することができる化合物の選択で有用である。例えば、Ｔｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧは、ＨＩＶ増殖で役割を果たすので、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳに関連する。Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧとの間の正常な相互作用の妨害または解離によって患者の疾患または障害を改善または緩和することが可能である。あるいは、疾患または障害が本発明のＴｓｇ１０１および／またはＨＩＶ  ＧＡＧの発現の増加に関連する場合、患者のＴｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧとの間の相互作用の低下または解離によって疾患を治療または予防することができる。さらに、疾患または障害がタンパク質−タンパク質相互作用を増強するＴｓｇ１０１および／またはＨＩＶ  ＧＡＧの変異形態に関連する場合、Ｔｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧの変異形態の間の相互作用を低下または分離する化合物を使用して治療することができる。
【０１５８】
相互作用アンタゴニストのスクリーニングアッセイでは、例えば、Ｔｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６を、２ハイブリッドアッセイの目的のために上記の融合タンパク質の形態で発現する試験タンパク質として使用する。宿主細胞中に融合タンパク質が発現し、１つまたは複数の試験化合物の存在下で互いに相互作用する。
【０１５９】
好ましい実施形態では、試験化合物が２つの試験タンパク質の間の相互作用を妨害することができる場合のみに検出可能なシグナル（例えば、色素もしくは蛍光の外観または細胞生存）が存在するように対抗選択マーカーをレポーターとして使用する。これに関して、当分野で公知の種々の「逆２ハイブリッドシステム」で使用したレポーターを使用することができる。逆２ハイブリッドシステムは、例えば、米国特許第５，５２５，４９０号、米国特許第５，７３３，７２６号、米国特許第５，８８５，７７９号；Ｖｉｄａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１０３１５〜１０３２０、１９９６；およびＶｉｄａｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１０３２１〜１０３２６、１９９６（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）で開示されている。
【０１６０】
酵母系で有用な適切な対抗選択レポーターの例には、ＵＲＡ３遺伝子（５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を有毒な代謝産物５−フルオロウラシルに変換するオロチジン−５’−デカルボキシラーゼをコードする）、ＣＡＮ１遺伝子（有毒なアルギニン類似体であるカナバニンを酵母細胞に輸送するアルギニンパーミアーゼをコードする）、ＧＡＬ１遺伝子（２−デオキシガラクトースの有毒な２−デオキシガラクトース−１−リン酸への変換を触媒するガラクトキナーゼをコードする）、ＬＹＳ２遺伝子（唯一の窒素源としてαアミノアジピン酸を含む培地で酵母細胞を成長できなくするα−アミノアジピン酸レダクターゼをコードする）、ＭＥＴ１５遺伝子（酵母細胞にメチル水銀感受性を付与するＯ−アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼをコードする）、およびＣＹＨ２遺伝子（シクロヘキシミド感受性を付与するＬ２９リボゾームタンパク質をコードする）が含まれる。さらに、ジフテリア毒素（ＤＴＡ）触媒ドメインなどの細胞傷害性タンパク質を含む任意の公知の細胞障害剤を、対抗選択レポーターとして使用することもできる。米国特許第５，７３３，７２６号を参照のこと。ＤＴＡは、伸長因子２のＡＤＰリボシル化引き起こし、それによりタンパク質合成が阻害され、細胞が死滅する。細胞傷害剤の他の例には、リシン、シガ毒素、および緑膿菌のエンドトキシンＡが含まれる。
【０１６１】
例えば、対抗選択レポーター遺伝子としてＵＲＡ３遺伝子を使用する場合、インビボアッセイでの宿主細胞（Ｕｒａ-ＦｏａR表現型）として変異ＵＲＡ３を含む酵母細胞を使用することができる。このような細胞は、ＵＲＡ３コード機能的オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ（ウラシルの生合成に必要な酵素）を欠く。結果として、細胞はウラシルを欠く培地で成長することができない。しかし、野生型オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼが存在しないので、酵母細胞は、非毒性５−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を有毒な産物５−フルオロウラシルに変換することができない。したがって、このような酵母細胞は、５−ＦＯＡに耐性を示し、５−ＦＯＡ含有培地で成長することができる。したがって、例えば、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧｐ６との間の相互作用を破壊することができる化合物をスクリーニングするために、Ｔｓｇ１０１を、適切な転写アクチベーターのＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質として発現することができる一方で、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６を適切な転写アクチベーターの転写活性化ドメインとの融合タンパク質として発現する。宿主株では、レポーターＵＲＡ３遺伝子を、転写活性化ドメインとＤＮＡ結合ドメインとの会合に特異的に反応性を示すプロモーターに作動可能に連結させることができる。Ｕｒａ-Ｆｏａ（登録商標）酵母細胞中で融合タンパク質を発現させた後、試験化合物の存在下でインビボスクリーニングアッセイを行い、酵母細胞をウラシルおよび５−ＦＯＡ含有培地で培養することができる。試験化合物がＴｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６との間の相互作用を破壊しない場合、活性ＵＲＡ３遺伝子産物（すなわち、５−ＦＯＡを有毒な５−フルオロウラシルに変換するオロチジン−５’−デカルボキシラーゼ）を発現する。結果として、酵母細胞は成長できない。それに対して、試験化合物がＴｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６との間の相互作用を破壊する場合、宿主酵母細胞中に活性オロチジン−５’−デカルボキシラーゼは産生されない。したがって、酵母細胞は生存し、５−ＦＯＡ含有培地で成長する。したがって、コロニー形成に基づいてＴｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６との間の相互作用を妨害または解離することができる化合物を同定することができる。
【０１６２】
明らかなように、本発明のスクリーニングアッセイを、大規模スクリーングに適切な形式で適用することができる。例えば、組み合わせ技術を使用して、有機小分子または小ペプチドの組み合わせライブラリーを構築することができる。一般に、例えば、Ｋｅｎａｎら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃ．，１９、５７〜６４、１９９４；Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７、１２３３〜１２５１、１９９４；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７、１３８５〜１４０１、１９９４；Ｅｃｋｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３、３５１〜３６０、１９９５を参照のこと。化合物のこのような組み合わせライブラリーを、本発明のスクリーニングアッセイに適用して、特定のタンパク質−タンパク質相互作用の特定のモジュレーターを単離することができる。無作為ペプチドライブラリーの場合、無作為ペプチドを宿主細胞中で本発明の融合タンパク質と同時発現し、インビボでアッセイすることができる。例えば、Ｙａｎｇら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２３、１１５２〜１１５６、１９９５を参照のこと。あるいは、宿主細胞による取り込みのために無作為ペプチドを培養培地に添加することができる。
【０１６３】
都合よいことに、インビボスクリーニングアッセイで酵母交配を使用する。例えば、上記の１つの融合タンパク質を発現するａ交配型の半数体細胞を、他の融合タンパク質を発現するα交配型の半数体細胞と交配する。交配の際、二倍体細胞を適切な培地に塗布して菌叢を形成させる。試験化合物の液滴を異なる菌叢領域にのせる。菌叢を適切な期間培養した後、融合タンパク質中の特定の試験タンパク質間の相互作用を調整することができる化合物を、液滴近傍の成長の刺激または阻害によって検出することができる。
【０１６４】
タンパク質−タンパク質相互作用を調整することができる化合物の選択のための本発明のスクリーニングアッセイを、正および負の選択の閾値または感度を調整するための種々の技術によって微調整することもできる。レポータータンパク質を変異して活性を調整することができる。宿主細胞による試験化合物の取り込むも調整することができる。例えば、ｅｒｇ６変異株などの酵母による高い変異体の取り込みにより、試験化合物の酵母取り込みを容易にすることができる。Ｇａｂｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９、３４４７〜３４５６、１９８９を参照のこと。同様に、５−ＦＯＡ、２−デオキシガラクトース、シクロヘキシミド、およびα−アミノアジピン酸などの選択化合物の取り込みを微調整することもできる。
【０１６５】
４．４．ウイルススクリーニングおよび化合物の最適化
本発明のタンパク質複合体の相互作用パートナー間のタンパク質−タンパク質相互作用を調整することができる試験化合物が、一旦選択されると、試験化合物の同一性または特徴を定義するデータを含むデータセットを作成することができる。データセットは、選択された試験化合物の性質に関する情報（例えば、化学構造、キラリティー、分子量、および融点など）を含み得る。あるいは、データセットは、スクリーニングを行う研究者および／または特定の試験化合物を示すデータセットを受け取る研究者によって理解される、指定された識別番号を含み得る。他の研究者、特に異なる国の研究者に連絡または送信することができる送信可能な形態でデータまたは情報を与えることができる。このような送信可能な形態は変化することができ、有形でも無形でも良い。例えば、１つまたは複数の選択された試験化合物を定義したデータセットを、文字、表、図、分子構造、写真、チャート、画像、または任意の他の視覚可能な形態に具体化することができる。データまたは情報を、紙などの有形の媒体に記録するか、コンピュータ読取可能な形態（例えば、電子、電磁気、光学、または他のシグナル）に具体化することができる。コンピュータ読取可能な形態中のデータを、コンピュータ利用可能な記憶媒体（例えば、フロッピーディスク、磁気テープ、および光ディスクなど）に保存するか、通信基盤を介して直接送信することができる。特に、電子シグナルで具体化されたデータを、電子メールの形態で送信するか、インターネットまたはイントラネットのウェブサイトにメールを送ることができる。さらに、選択された試験化合物に関する情報またはデータを、音声形態で記録して、任意の適切な媒体（例えば、アナログもしくはデジタルケーブルラインおよび光ファイバーケーブルなど）、電話、ファクシミリ、携帯電話、インターネット電話などによって送信することもできる。
【０１６６】
したがって、上記のスクリーニングアッセイまたは下記の仮想スクリーニングによって選択された試験化合物に関する情報およびデータを、世界中のどこででも作成し、異なる場所へ送信することができる。例えば、スクリーニングアッセイを海外で行った場合、選択された試験化合物に関する情報およびデータを作成し、上記の送信可能な形態に記録することができる。したがって、送信可能な形態でのデータおよび情報を、米国に輸入し、任意の他の国に送信し、その国で試験化合物のさらなる試験および／または選択された試験化合物の調整および最適化においてデータおよび情報を使用して、臨床試験での試験用のリード化合物を開発することができる。
【０１６７】
例えば、仮想スクリーニングによる標的タンパク質またはタンパク質複合体および／または試験化合物の構造モデルに基づいて化合物を選択することもできる。さらに、一旦有効な化合物が同定されると、薬物の有効性および安定性の改良および副作用の低減を目的とする合理的な薬物設計に基づいて、その構造類似体または模倣物を作製することができる。ウイルススクリーニングおよび合理的な薬物設計のための当分野で公知の方法を、本発明で使用することができる。例えば、Ｈｏｄｇｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、１９〜２１、１９９０；米国特許第５，８００，９９８号および米国特許第第５，８９１，６２８号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと。合理的な薬物設計の例は、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターの開発である。Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９、５２７〜５３３、１９９０を参照のこと。
【０１６８】
これに関して、標的タンパク質またはタンパク質複合体に関する構造の情報を得る。好ましくは、標的タンパク質またはタンパク質複合体の三次元構造を定義する原子座標を得る。例えば、各相互作用対を発現および精製することができる。次いで、精製相互作用タンパク質対を、適切な条件下で互いにインビボで相互作用させる。任意選択的に、相互作用タンパク質複合体を、架橋または他の技術によって安定化することができる。相互作用複合体を、種々の生物物理学的技術（例えば、Ｘ線結晶学、ＮＭＲ、コンピュータモデリング、および質量分析などが含まれる）を使用して研究することができる。Ｘ線結晶学およびＮＭＲなどによってこのような原子座標を得る方法は当分野で公知であり、本発明の標的タンパク質またはタンパク質複合体への適用は、構造生物学分野の当業者に明らかなはずである。Ｓｍｙｔｈ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ、Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．，５３、８〜１４、２０００；Ｏａｋｌｅｙ  ａｎｄ  Ｗｉｌｃｅ、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７（３）、１４５〜１５１、２０００；Ｆｅｒｅｎｔｚ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ、Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３３、２９〜６５、２０００；およびＲｏｂｅｒｔ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０、４２〜４７、１９９９を参照のこと。
【０１６９】
さらに、モジュレーター化合物の存在下または非存在下での目的のタンパク質間の相互作用の理解は、酵母２ハイブリッドシステムを使用した変異誘発またはタンパク質−タンパク質相互作用の検出のための他の方法から導くこともできる。これに関して、相互作用タンパク質に種々の変異を導入し、タンパク質−タンパク質相互作用に対する変異の効果を、酵母２ハイブリッドシステムなどの適切な方法によって試験する。
【０１７０】
アミノ酸の置換、欠失、および挿入を含む種々の変異を、従来の組換えＤＮＡ技術を使用してタンパク質配列に導入することができる。一般に、結合部位を解読することが特に好ましい。したがって、導入された変異は、タンパク質−タンパク質相互作用またはタンパク質−化合物相互作用に影響を与え、構造の乱れが最小であることが重要である。好ましくは、相互作用タンパク質の三次元構造の知識に基づいて変異を設計する。好ましくは、イオン相互作用および疎水性相互作用はしばしばタンパク質−タンパク質相互作用に関連するので、タンパク質表面に曝露した荷電アミノ酸または疎水性アミノ酸を変化させるように変異を導入する。あるいは、「アラニンスキャニング変異誘発」技術を使用する。Ｗｅｌｌｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２０２、３０１〜３０６、１９９１；Ｂａｓｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、４４９８〜４５０２、１９９１；Ｂｅｎｎｅｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６、５１９１〜５２０１、１９９１；Ｄｉａｍｏｎｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６８、８６３〜８７６、１９９４を参照のこと。この技術を使用して、相互作用タンパク質の荷電または疎水性アミノ酸残基をアラニンに置換し、例えば、酵母２ハイブリッドシステムを使用して、タンパク質間の相互作用に及ぼす影響を分析する。例えば、５つのアミノ酸ウィンドウで全タンパク質配列をスキャニングすることができる。２つまたはそれ以上の荷電または疎水性アミノ酸がウィンドウに出現した場合、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して荷電または疎水性アミノ酸をアラニンに置換する。したがって、変異タンパク質を上記の２ハイブリッドアッセイでの「試験タンパク質」として使用し、タンパク質−タンパク質相互作用に及ぼす変異の影響を試験する。好ましくは、同定したモジュレーター化合物の存在下または非存在下で変異誘発分析を行う。この様式では、タンパク質−タンパク質相互作用および／または分子化合物とタンパク質との間の相互作用に重要なタンパク質のドメインまたは残基を同定することができる。同様に、選択した化合物と標的タンパク質（例えば、Ｔｓｇ１０１）との間の相互作用を、標的タンパク質の変異誘発によって研究することもできる。
【０１７１】
得られた構造情報に基づいて、相互作用タンパク質の間、選択された化合物と相互作用タンパク質との間、または選択された化合物と標的タンパク質との間の構造の関係を解明する。目的のタンパク質の相互作用または標的タンパク質に対する調整効果に重要な選択された化合物の一部および三次元構造を明らかにする。次いで、医薬品化学者は、類似の部分および構造を有する類似体化合物を設計することができる。
【０１７２】
さらに、特定のタンパク質−タンパク質相互作用または特定の標的タンパク質を調整することができる同定されたペプチド化合物を、アラニンスキャニング技術および／またはスクリーニングアッセイによって分析して、特定のタンパク質−タンパク質相互作用または特定の標的タンパク質に対する調整効果に重要なペプチドのドメインまたは残基を決定することもできる。ペプチド化合物を、有機小分子またはペプチド模倣物の合理的な設計のためのリード分子として使用することができる。Ｈｕｂｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１、１３〜３４、１９９４を参照のこと。
【０１７３】
同定された化合物の調整効果に重要な残基またはドメインは、「ファーマコフォア」として公知の化合物のアッセイ領域を構成する。一旦ファーマコフォアが解明されると、ＮＭＲ分析、Ｘ線回折データ、アラニンスキャニング、分光学的技術由来のデータを組み込むことができるモデリングプロセスによって構造モデルを確立することができる。コンピュータ分析および類似性マッピングなどを含む全ての種々の技術を、このモデリングプロセスで使用することができる。例えば、Ｐｅｒｒｙら、「ＯＳＡＲ：薬物設計における定量的構造−活性関係」、ｐ．１８９〜１９３、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８９；Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら、Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｅｎｎｉｃａ、９７、１５９〜１６６、１９８８；Ｌｅｗｉｓら、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ、２３６、１２５〜１４０、１９８９；ＭｃＫｉｎａｌｙら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｉｏｌ．，２９、１１１〜１２２、１９８９を参照のこと。Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡから市販されている分子モデリングシステムはエネルギー最小化および分子の力学的関数を実行するＣＨＡＲＭｍプログラム、および分子構造の構築、画像モデリング、および分析を実行するＱＵＡＮＴＡプログラムを含む。このようなプログラムにより、分子の相互作用構造、視覚化、および修飾が得られる。他のコンピュータモデリングプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．（Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）、Ｈｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｏｎｔａｒｉｏ）、およびＡｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ）からも市販されている。
【０１７４】
確立されたモデルに基づいてテンプレートを形成することができる。次いで、テンプレートへの種々の化学官能基または一部の結合によって種々の化合物を設計することができる。種々のテンプレート部分を置換することもできる。さらに、ペプチドリード化合物の場合、Ｎ末端およびＣ末端の結合によってペプチドまたはその模倣物を環状化して、安定性を増大させることができる。これらの合理的に設計された化合物を、さらに試験する。この様式では、有効性が改良され、副作用が低減した薬理学的に許容可能且つ安定な化合物を開発することができる。本発明によって同定された化合物を、個体への投与に適切な薬学的処方物に組み込むことができる。
【０１７５】
さらに、標的タンパク質またはタンパク質複合体の三次元構造を定義する構造モデルまたは原子座標をウイルススクリーニングで使用して、標的タンパク質またはタンパク質複合体を調整することができる化合物を選択することもできる。原子座標を使用したコンピュータベースの種々のウイルススクリーニング法は、当分野で一般に公知である。例えば、米国特許第５，７９８，２４７号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）は、有機化合物と標的タンパク質内の結合空洞の結合部位との間の結合相互作用の決定による化合物（特に、インターロイキン変換酵素インヒビター）の同定方法を開示している。結合部位を、原子座標によって定義する。
【０１７６】
したがって、当業者に明らかなように、本発明の標的タンパク質またはタンパク質複合体の三次元構造を定義する原子座標を、当分野で公知の任意の方法によって得ることができる。次いで、原子座標に基づいて化合物を設計または選択することができる。
【０１７７】
５．治療への適用
本発明の別の態様によれば、ヒト細胞中でのＴｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６を含むタンパク質複合体の調整方法が得られる。ヒト細胞は、インビトロ細胞または組織培養物であり得る。本方法は、患者のヒト細胞に適用することもできる。
【０１７８】
１つの実施形態では、細胞中のＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６と相互作用するＴｓｇ１０１を有するタンパク質複合体の濃度を減少させる。種々の方法を使用して、タンパク質複合体濃度を減少させることができる。タンパク質複合体濃度を、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６との間の相互作用の妨害によって減少させることができる。例えば、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６との間の相互作用を妨害することができる化合物を、インビトロで細胞に投与するか、インビボで患者に投与することができる。このような化合物は、Ｔｓｇ１０１タンパク質（特に、Ｔｓｇ１０１のＵＥＶドメイン）またはＨＩＶ  ＧＡＧもしくはＧＡＧｐ６に結合することができる化合物であり得る。これらの化合物はまた、Ｔｓｇ１０１タンパク質またはＨＩＶ  ＧＡＧもしくはＧＡＧｐ６に免役反応性を示す抗体であり得る。好ましくは、Ｔｓｇ１０１のＵＥＶドメインに結合する抗体を使用する。また、化合物は、ＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６タンパク質もしくはＴｓｇ１０１に結合することができるその模倣物由来の小ペプチド、Ｔｓｇ１０１タンパク質またはＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６に結合することができるその模倣物由来の小ペプチドであり得る。
【０１７９】
別の実施形態では、タンパク質複合体の調整方法は、Ｔｓｇ１０１タンパク質および／またはＨＩＶ  ＧＡＧもしくはＧＡＧｐ６タンパク質の発現を阻害するステップを含む。阻害は、転写、翻訳、または翻訳後レベルであり得る。例えば、アンチセンス化合物およびリボザイム化合物を、培養物中のヒト細胞またはヒトの身体に投与することができる。
【０１８０】
上記の種々の実施形態では、好ましくは、Ｔｓｇ１０１タンパク質およびＨＩＧＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６の濃度または活性を、減少させるか阻害する。
【０１８１】
さらに別の実施形態では、ＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６と相互作用するＴｓｇ１０１を有するタンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体を、インビトロで細胞に投与するかヒトの身体に投与して、タンパク質複合体活性を阻害し、及び／または細胞または患者中のタンパク質複合体濃度を減少させる。
【０１８２】
本発明によって得られたＴｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６を含むタンパク質複合体の調整方法を使用して、感染宿主からのＨＩＶウイルスの出芽を阻害することができる。例えば、細胞培養物または患者の身体中に複数の細胞が存在する場合、ウイルス出芽の阻害により、感染宿主細胞からのウイルスの放出が防止され、それによりさらなるウイルス増殖が抑制される。したがって、本発明はまた、Ｔｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６を有するタンパク質複合体の濃度の現象もしくは活性の阻害またはＴｓｇ１０１またはＨＩＶ  ＧＡＧもしくはＧＡＧｐ６の濃度の現象もしくは活性の阻害によって患者のＨＩＶ感染を治療し、ＡＩＤＳを予防する方法を含む。
【０１８３】
さらに、Ｔｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６を含むタンパク質複合体の調整方法は、多数の他のウイルス（特に、感染宿主細胞空の出芽が後期ドメインモチーフＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰに依存するウイルス）の出芽の阻害に有用であり得る。上記のように、Ｔｓｇ１０１とのＨＩＶ  ＧＡＧｐ６の相互作用を担うＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフは、全ての公知の霊長類レンチウイルスのＧＡＧｐ６ドメインで保存されている。ＧＡＧｐ６ドメインを欠く非霊長類レンチウイルスでは、Ｐ（Ｔ／Ｓ）ＡＰモチーフは、ＧＡＧポリタンパク質の即時型Ｃ末端である。さらに、多数の他のレトロウイルスはまた、そのＧＡＧポリペプチド中に、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６タンパク質と同一の様式でＴｓｇ１０１と相互作用すると考えられているＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含む。
【０１８４】
したがって、本発明はまた、Ｔｓｇ１０１タンパク質およびヒトレンチウイルス（ＨＩＶ以外）ＧＡＧポリペプチドまたはＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含むそのフラグメントを含むタンパク質複合体の調整方法を提供する。このような調整方法は、感染宿主細胞からのこのようなウイルスの出芽の阻害および患者におけるこのようなウイルスによる感染の治療で使用することができる。
【０１８５】
さらに、本発明はまた、Ｔｓｇ１０１タンパク質オルソログおよび非ヒトレトロウイルスＧＡＧポリペプチドまたはＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含むそのフラグメントを含むタンパク質複合体の調整方法を含む。このような調整方法を、感染動物宿主細胞からのこのような非ヒトレトロウイルスの阻害および動物中のこのようなウイルスによる感染の治療で使用することができる。
【０１８６】
このような非ヒトレトロウイルスの例には、ＨＩＶ以外の霊長類レンチウイルスおよび非霊長類レンチウイルス（ＥＩＡＶ以外）が含まれるが、これらに限定されない。当分野で公知のように、レンチウイルスは、脊椎細胞の長期感染可能なレトロウイルス群である。活性化された場合のみ、宿主細胞中で複製される。レンチウイルスは、典型的には、外殻を有するビリオンを有する。非霊長類レンチウイルスには、ウシレンチウイルス（例えば、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、Ｊｅｍｂｒａｎａ病ウイルス）、ネコレンチウイルス（例えば、ネコの免疫不全、消耗性疾患、および脳炎を発症するネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ））、ヒツジ／ヤギレンチウイルス（例えば、ヤギの貧血および消耗性疾患を発症するヤギ関節炎−脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）、ヒツジレンチウイルス、肺炎、消耗性疾患、脳炎、および関節炎を発症するビスナウイルス）、およびウマレンチウイルス（例えば炎症および脳炎を引き起こすウマに感染するウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ））が含まれる。非ヒト霊長類レンチウイルスの例には、チンパンジー、マンガベー、サバンナモンキー、マンドリル、Ｌ’Ｈｏｅｓｔ、サイクスモンキー、またはＧｕｅｒｅｚａ  Ｃｏｌｏｂｕｓモンキーなどの宿主を感染させる種々のサル免疫不全が含まれる。
【０１８７】
Ｔｓｇ１０１タンパク質およびヒトレトロウイルスＧＡＧポリペプチドまたはＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含むそのフラグメントを含むタンパク質複合体の調整方法およびＴｓｇ１０１オルソログおよび非ヒトレトロウイルスＧＡＧポリペプチドまたはＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含むそのフラグメントを含むタンパク質複合体の調整方法を、Ｔｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６のタンパク質複合体の調整の文脈で上記と類似の様式行うべきである。同様に、このような他のヒトまたは非ヒトウイルスによる感染の治療方法は、ＨＩＶ感染の治療方法と類似しているべきであり、本発明を開示された当業者に明らかである。
【０１８８】
詳細には、種々の方法によって、細胞中のタンパク質複合体濃度を減少させることができる。例えば、タンパク質複合体濃度を、Ｔｓｇ１０１タンパク質とヒトレトロウイルスＧＡＧポリペプチドまたはＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含むそのフラグメントとの間の相互作用またはＴｓｇ１０１タンパク質オルソログと非ヒトレトロウイルスＧＡＧポリペプチドまたはＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含むそのフラグメントとの間の相互作用の妨害によって減少させることができる。このような化合物は、Ｔｓｇ１０１タンパク質またはＴｓｇ１０１タンパク質オルソログ、特にＴｓｇ１０１タンパク質またはＴｓｇ１０１タンパク質オルソログのＵＥＶドメインに結合することができる化合物であり得る。化合物はまた、Ｔｓｇ１０１タンパク質またはＴｓｇ１０１タンパク質オルソログに免疫反応性を示す抗体であり得る。好ましくは、Ｔｓｇ１０１タンパク質またはＴｓｇ１０１タンパク質オルソログのＵＥＶドメインに結合する抗体を使用する。また、化合物は、好ましくはＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフにわたるアミノ酸残基を含むレトロウイルスＧＡＧポリペプチド由来の小ペプチドであり得る。さらに、タンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体を投与することができる。他の実施形態では、Ｔｓｇ１０１タンパク質またはＴｓｇ１０１オルソログの発現を阻害する。阻害は、転写、翻訳、または翻訳後レベルであり得る。例えば、アンチセンス化合物およびリボザイム化合物を、培養物中の細胞または治療すべき被験体に投与することができる。
【０１８９】
タンパク質複合体またはタンパク質−タンパク質相互作用の種々の調整方法およびウイルス感染の治療方法の詳細を以下に記載する。このような詳細はＴｓｇ１０１タンパク質とＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６との間の相互作用ならびにヒト細胞のＨＩＶ感染の文脈で記載されているが、他のウイルスによる感染に関する類似の方法は、本発明を開示された当業者に明らかなはずである。
【０１９０】
５．１．抗体療法
１つの実施形態では、抗体を、インビトロで細胞または組織に投与するか、患者に投与することができる。投与した抗体は、Ｔｓｇ１０１またはＨＩＶ  ＧＡＧもしくはＧＡＧｐ６に免疫反応性を示し得る。適切な抗体は、任意の抗体クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡなど）に含まれるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。本発明に適切な抗体はまた、種々の抗体フラグメント形態をとることができ、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）2、一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）（「一本鎖抗体」）などが含まれるが、これらに限定されない。１つの実施形態では、本発明のＴｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６から形成されたタンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体を、インビトロで細胞もしくは組織に投与するか患者に投与する。別の実施形態では、Ｔｓｇ１０１に特異的な抗体を、インビトロで細胞に投与するか患者に投与する。好ましくは、Ｔｓｇ１０１のＵＥＶドメインに特異的な抗体を、インビトロで細胞もしくは組織に投与するか患者に投与する。本発明の抗体の産生方法は、特に、上記のセクション３．における考察の観点から当業者に明らかなはずである。抗体を、以下のセクション６．に記載の任意の適切な形態および経路で投与することができる。好ましくは、薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物中の抗体を投与する。
【０１９１】
あるいは、遺伝子治療アプローチによって抗体を送達させることができる。すなわち、所望の抗体がインビボでの核酸からの組換え発現によって産生することができるように、抗体、特に一本鎖フラグメント（ｓｃＦｖ）をコードする核酸を、インビトロで細胞もしくは組織に移入するか、患者に移入することができる。この目的のために、適切な転写および翻訳調節配列を含む核酸を、患者に直接投与することができる。あるいは、セクション４．およびセクション５．５に記載のように、核酸を適切なベクターに組み込んで、インビトロで細胞もしくは組織に送達させるベクターを使用して患者に送達させることができる。核酸を含む発現ベクターを、患者に直接投与することができる。発現ベクターを、細胞、好ましくは治療すべき患者由来の細胞に移入し、その後細胞移植によって患者に送達させることもできる。以下のセクション５．５を参照のこと。
【０１９２】
５．２．アンチセンス療法
別の実施形態では、本発明で同定されたタンパク質複合体の１つまたは複数の相互作用タンパク質メンバーをコードする核酸に特異的なアンチセンス化合物を、インビトロで細胞もしくは組織に投与するか、治療または予防すべき患者に投与する。アンチセンス化合物は、１つまたは複数の相互作用タンパク質メンバーの発現を特異的に阻害するはずである。好ましい実施形態では、Ｔｓｇ１０１核酸と特異的にハイブリッド形成するアンチセンス化合物を投与する。当分野で公知のように、アンチセンス薬は、一般に、特定の標的核酸とのハイブリッド形成およびそれによる遺伝子発現の遮断によって作用する。アンチセンス化合物の設計方法および疾患治療におけるこのような化合物の使用方法は当分野で周知であり、十分に開発されている。例えば、アンチセンス薬Ｖｉｔｒａｖｅｎｅ（登録商標）（ｆｏｍｉｖｉｒｓｅｎ）（２１塩基長のオリゴヌクレオチド）が首尾よく開発されており、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）誘導性網膜炎治療用としてＩｓｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から市販されている。
【０１９３】
アンチセンス化合物の任意の設計および産生方法を、本発明の目的で使用することができる。一般に、Ｓａｎｇｈｖｉら編、「アンチセンス研究と適用」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９９３を参照のこと。典型的には、アンチセンス化合物は、本発明の特定のタンパク質複合体の１つまたは複数の相互作用タンパク質メンバーのｍＲＮＡまたは遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドである。特に、アンチセンス化合物を、調整（増加または減少）、複製、転写、または翻訳するための１つまたは複数の相互作用タンパク質メンバーの遺伝子配列またはｍＲＮＡの特定の領域と特異的にハイブリッド形成するように設計することができる。本明細書中で使用される用語「特異的にハイブリッド形成する」またはその言い換えは、安定且つ特定の結合が得られるようにアンチセンスオリゴと標的ＤＮＡまたはｍＲＮＡとの間の十分な相補性または対合の程度を意味する。特に、１００％相補性または対合は必要ない。所定の条件下（例えばインビボ治療のため）、好ましくは生理学的条件下で非標的配列へのアンチセンス化合物の非特異的結合が実質的に存在しない時のアンチセンス化合物とその意図する標的核酸との間で十分にハイブリッド形成される場合に、特異的にハイブリッド形成する。好ましくは、特異的ハイブリッド形成により、標的ＤＮＡまたはｍＲＮＡの正常な発現が妨害される。
【０１９４】
例えば、アンチセンスオリゴを、標的遺伝子の複製もしくは転写調節領域、翻訳開始領域およびエクソン／イントロン連結点などの翻訳調節領域、または標的ｍＲＮＡのコード領域と特異的にハイブリッド形成するように設計することができる。好ましくは、Ｔｓｇ１０１遺伝子またはＴｓｇ１０１ｍＲＮＡを、標的として使用する。
【０１９５】
当分野で一般的に公知のように、一般的に使用されるオリゴヌクレオチドは、天然に存在するヌクレオチド塩基、糖、およびリン酸基を含むヌクレオチド塩基と糖との間の共有結合の組み合わせを有するリボ核酸またはデオキシリボ核酸のオリゴマーまたはポリマーである。しかし、用語「オリゴヌクレオチド」はまた、下記の天然に存在するオリゴヌクレオチドの種々の天然に存在しない模倣物および誘導体（すなわち、修飾形態）を含むことに留意すべきである。典型的には、本発明のアンチセンス化合物は、約６〜約２００、好ましくは約８〜約３０ヌクレオシド塩基を有するオリゴヌクレオチドである。
【０１９６】
アンチセンス化合物は、好ましくは、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間結合（モルホリノ骨格、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホナート、スルホンアミド、およびスルファマート骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；アルケン含有骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；アミド骨格などの修飾リン含有骨格および非リン骨格が含まれるが、これらに限定されない）を含む。
【０１９７】
修飾リン酸含有骨格の例には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、アルキルリン酸、チオノアルキルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホトリエステル、およびボラノホスフェート、ならびにその種々の塩形態が含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，４６９，８６３号、米国特許第４，４７６，３０１号、米国特許第５，０２３，２４３号、米国特許第５，１７７，１９６号、米国特許第５，１８８，８９７号、米国特許第５，２６４，４２３号、米国特許第５，２７６，０１９号、米国特許第５，２７８，３０２号、米国特許第５，２８６，７１７号、米国特許第５，３２１，１３１号、米国特許第５，３９９，６７６号、米国特許第５，４０５，９３９号、米国特許第５，４５３，４９６号、米国特許第５，４５５，２３３号、米国特許第５，４６６，６７７号、米国特許第５，４７６，９２５号、米国特許第５，５１９，１２６号、米国特許第５，５３６，８２１号、米国特許第５，５４１，３０６号、米国特許第５，５５０，１１１号、米国特許第５，５６３，２５３号、米国特許第５，５７１，７９９号、米国特許第５，５８７，３６１号、および米国特許第５，６２５，０５０号（それぞれ、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと。
【０１９８】
上記の非リン含有骨格の例は、米国特許第５，０３４，５０６号、米国特許第５，１８５，４４４号、米国特許第５，２１４，１３４号、米国特許第５，２１６，１４１号、米国特許第５，２３５，０３３号、米国特許第５，２６４，５６２号、米国特許第５，２６４，５６４号、米国特許第５，４０５，９３８号、米国特許第５，４３４，２５７号、米国特許第５，４７０，９６７号、米国特許第５，４８９，６７７号、米国特許第５，５４１，３０７号、米国特許第５，５６１，２２５号、米国特許第５，５９６，０８６号、米国特許第５，６１０，２８９号、米国特許第５，６０２，２４０号、米国特許第５，６０８，０４６号、米国特許第５，６１０，２８９号、米国特許第５，６１８，７０４号、米国特許第５，６２３，０７０号、米国特許第５，６６３，３１２号、米国特許第５，６７７，４３７号、および米国特許第５，６７７，４３９号（それぞれ、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載されている。
【０１９９】
別の有用な修飾オリゴヌクレオチオは、オリゴヌクレオチドの糖骨格がアミノ含有骨格（例えば、アミノエチルグリシン骨格）に置換されたペプチド核酸（ＰＮＡ）である。米国特許第５，５３９，０８２号、米国特許第５，７１４，３３１号、およびＮｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４、１４９７〜１５００、１９９１（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと。ＰＮＡアンチセンス化合物は、ＲＮアーゼＨ消化物に耐性を示し、それにより半減期が長い。さらに、より良好な安定性、薬物取り込みの増加、標的核酸に対するより高い親和性などの所望の薬物プロフィールを付与するために、ＰＮＡ骨格を様々に修飾することができる。
【０２００】
あるいは、アンチセンス化合物は、修飾ヌクレオチド（すなわち、修飾プリンまたはピリミジン塩基（例えば５置換ピリミジン、６−アザピリミジン、およびＮ−２、Ｎ−６、およびＯ置換プリン）など）を含むオリゴヌクレオチドである。例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、米国特許第４，８４５，２０５号、米国特許第５，１３０，３０２号、米国特許第５，１７５，２７３号、米国特許第５，３６７，０６６号、米国特許第５，４３２，２７２号、米国特許第５，４５９，２５５号、米国特許第５，４８４，９０８号、米国特許第５，５０２，１７７号、米国特許第５，５２５，７１１号、米国特許第５，５８７，４６９号、米国特許第５，５９４，１２１号、米国特許第５，５９６，０９１号、米国特許第５，６８１，９４１号、および米国特許第５，７５０，６９２号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと。
【０２０１】
さらに、置換または修飾糖部分を有するオリゴヌクレオチドも使用することができる。例えば、アンチセンス化合物は、１つまたは複数の２’−Ｏ−メトキシエチル糖部分を有し得る。例えば、米国特許第４，９８１，９５７号、米国特許第５，１１８，８００号、米国特許第５，３１９，０８０号、米国特許第５，３９３，８７８号、米国特許第５，４４６，１３７号、米国特許第５，４６６，７８６号、米国特許第５，５１４，７８５号、米国特許第５，５６７，８１１号、米国特許第５，５７６，４２７号、米国特許第５，５９１，７２２号、米国特許第５，６１０，３００号、米国特許第５，６２７，０５３１号、米国特許第５，６３９，８７３号、米国特許第５，６４６，２６５号、米国特許第５，６５８，８７３号、米国特許第５，６７０，６３３号、および米国特許第５，７００，９２０号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと。
【０２０２】
脂質、リン脂質、またはコレステロール部分、コール酸、チオエーテル、脂肪族の鎖、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはタンパク質もしくはペプチドにオリゴヌクレオチドが結合した他のオリゴヌクレオチド修飾型もまた有用である。修飾オリゴヌクレオチドにより、細胞への取り込みが増加し、安定性を改良することができる（すなわち、ヌクレアーゼ消化および他の生分解への耐性）。例えば、米国特許第４，５２２，８１１号、Ｂｕｒｎｈａｍ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．，１５、２１０〜２１８、１９９４を参照のこと。
【０２０３】
アンチセンス化合物を、当分野で公知の任意の適切な方法を使用して合成することができる。実際は、アンチセンス化合物は、業者による特注品であり得る。あるいは、アンチセンス化合物を、種々の業者（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｇｒｏｕｐ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＣＴ）から市販されているＤＮＡ合成機を使用して調製することができる。
【０２０４】
アンチセンス化合物を適切なキャリアを含む医薬組成物に処方し、任意の適切な投与経路を使用してインビトロで細胞または組織に投与するか患者に投与することができる。あるいは、「遺伝子治療」アプローチでアンチセンス化合物を使用することもできる。すなわち、オリゴヌクレオチドを適切なベクターにサブクローン化し、ヒト細胞に形質転換する。次いで、アンチセンスオリゴヌクレオチドを転写によってインビボで産生させる。遺伝子治療法は、以下のセクション６．３．２に開示している。
【０２０５】
５．３．リボザイム療法
別の実施形態では、酵素ＲＮＡまたはリボザイムを、本発明のタンパク質複合体の１つまたは複数の相互作用タンパク質メンバーをコードする核酸を標識するように設計する。好ましい実施形態では、Ｔｓｇ１０１核酸を標的する。リボザイムは、酵素活性を有し、ヌクレオチド塩基配列に特異的な様式で他の異なるＲＮＡ分子を繰り返し切断することができるＲＮＡ分子である。Ｋｉｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ｏｆ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４、８７８８、１９８７；Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ、Ｎａｔｕｒｅ、３３４、５８５、１９８８；およびＪｅｆｆｅｒｉｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１７、１３７１、１９８９を参照のこと。リボザイムは、典型的には、以下の２つの部分を有する：相補的塩基対合による標的ＲＮＡへのリボザイムの結合をガイドする触媒部分および結合配列。一旦リボザイムが標的ＲＮＡに結合すると、リボザイムは標的ＲＮＡを酵素切断し、典型的には、コードタンパク質の翻訳を指示する能力破壊する。リボザイムがそのＲＮＡ標的を切断した後、標的ＲＮＡから遊離し、その後別の標的と結合および切断することができる。すなわち、１つのリボザイム分子は新規の標的に対して繰り返し結合および切断することができる。したがって、リボザイム治療の１つの利点は、従来のアンチセンス療法と比較して少量の外因性ＲＮＡしか必要でないことである。さらに、リボザイムは、ＤＮＡベースのアンチセンスオリゴよりもｍＲＮＡ標的への親和性が低いので、間違った標的に結合する傾向が低い。
【０２０６】
本発明によれば、リボザイムは、Ｔｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧを含む１つまたは複数の相互作用タンパク質メンバーの任意のｍＲＮＡ部分を標的することができる。リボザイム標的配列の選択方法ならびにリボザイムの設計および産生方法は、一般に、当分野で公知である。例えば、米国特許第４，９８７，０７１号、米国特許第５，４９６，６９８号、米国特許第５，５２５，４６８号、米国特許第５，６３１，３５９号、米国特許第５，６４６，０２０号、米国特許第５，６７２，５１１号、および米国特許第６，１４０，４９１号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）を参照のこと。例えば、適切なリボザイムを、ハンマーモチーフ、ヘアピンモチーフ、肝炎δウイルスモチーフ、第Ｉ群イントロンモチーフ、またはＲＮアーゼ  ＰＤＮＡモチーフなどの種々の構成で設計することができる。米国特許第４，９８７，０７１号、米国特許第５，４９６，６９８号、米国特許第５，５２５，４６８号、米国特許第５，６３１，３５９号、米国特許第５，６４６，０２０号、米国特許第５，６７２，５１１号、および米国特許第６，１４０，４９１号；Ｒｏｓｓｉら、ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ、８、１８３、１９９２；Ｈａｍｐｅｌ  ａｎｄ  Ｔｒｉｔｚ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８、４９２９、１９８９；Ｈａｍｐｅｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８、２９９、１９９０；Ｐｅｒｒｏｔｔａ  ａｎｄ  Ｂｅｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、１６、１９９２；およびＧｕｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら、Ｃｅｌｌ、３５、８４９、１９８３を参照のこと。
【０２０７】
リボザイムを、通常のＲＮＡ合成で使用する同一の方法によって合成することができる。例えば、このような方法は、Ｕｓｍａｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０９，７８４５〜７８５４，１９８７およびＳｃａｒｉｎｇｅら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１８，５４３３〜５４４１，１９９０に開示されている。修飾リボザイムを、米国特許第５，６５２，０９４号；国際出願番号ＷＯ９１／０３１６２；ＷＯ９２／０７０６５、およびＷＯ９３／１５１８７；欧州特許出願番号９２１１０２９８．４；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、Ｎａｔｕｒｅ，３４４、５６５，１９９０；Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３，３１４，１９９１；およびＵｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１７，３３４，１９９２に開示の方法によって合成することができる。
【０２０８】
本発明のリボザイムを、例えば、国際公開番号ＷＯ９４／０２５９５に開示の、任意の公知の方法によって細胞に投与することができる。例えば、リボザイムをインビトロで細胞もしくは組織に直接投与するか、任意の適切な経路（例えば、静脈内注射）で患者に投与することができる。あるいは、リボザイムを、イオン導入によるか、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体接着ミクロスフェアなどの他の小胞への組み込みによってリポソーム中にカプセル化して送達することができる。さらに、リボザイムを、リボザイムＲＮＡを直接転写することができるＤＮＡベクターを使用した遺伝子治療アプローチによって送達することもできる。遺伝子治療は、セクション６．３．２．で詳細に開示されている。
【０２０９】
５．４．競合阻害
本発明によって同定された特定のタンパク質複合体およびその相互作用タンパク質メンバーの濃度および活性を、種々の他の方法によって阻害することもできる。例えば、タンパク質複合体の相互作用タンパク質メンバーの間のタンパク質−タンパク質相互作用を妨害または解離することができるセクション４．に記載の本発明によって同定された化合物を、インビトロで細胞もしくは組織に投与するか患者に投与することができる。Ｔｓｇ１０１含有タンパク質複合体またはその相互作用メンバーに結合するセクション４．に記載のインビトロ結合アッセイで同定された化合物を、治療で使用することもできる。
【０２１０】
さらに、有用な作用因子は、不完全なタンパク質（すなわち、タンパク質複合体中の各結合パートナーに結合することができるがその細胞機能が欠損している相互作用タンパク質メンバーのフラグメント）を含む。例えば、タンパク質複合体の相互作用メンバータンパク質の結合ドメインを、タンパク質複合体活性の競合インヒビターとして使用することができる。当業者に明らかであるように、結合ドメインの誘導体またはホモログを使用することもできる。結合ドメインを、分子生物学的技術（例えば、酵母２ハイブリッドアッセイと組み合わせた変異誘発）を使用して容易に同定することができる。好ましくは、使用したタンパク質フラグメントは、全長タンパク質メンバーの９０％、８０％未満、より好ましくは７５％、６５％、５０％未満または４０％未満の長さの相互作用タンパク質メンバーのフラグメントである。１つの実施形態では、Ｔｓｇ１０１に結合することができるＨＩＶ  ＧＡＧｐ６タンパク質フラグメントを投与する。例えば、適切なタンパク質フラグメントは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、２０、または２５、好ましくは４〜３０、４０、または５０個のアミノ酸またはそれ以上ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６配列の連続スパンを有し、Ｔｓｇ１０１と相互作用することができるポリペプチドを含むことができる。また、適切なタンパク質フラグメントはまた、Ｔｓｇ１０１に結合することができ、同一の長さのＨＩＶ  ＧＡＧまたはＧＡＧｐ６のアミノ酸の連続スパンと少なくとも７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９５％、またはそれ以上同一の４〜３０個のアミノ酸のアミノ酸配列を有するペプチドを含む。あるいは、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６と相互作用することができ、Ｔｓｇ１０１のアミノ酸配列の４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、２０、または２５個、好ましくは４〜３０、４０、または５０またはそれ以上のアミノ酸の連続スパンを有するポリペプチドを、投与することができる。また、適切な化合物の他の例には、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６に結合することができ、同一の長さのＴｓｇ１０１アミノ酸配列の連続スパンに少なくとも７５％、８０％、８２％、８５％、８７％、９０％、９５％、またはそれ以上同一の４〜３０、４０、５０個のアミノ酸のアミノ酸配列を有するペプチドが含まれる。さらに、投与した化合物はまた、本発明のＴｓｇ１０１、またはＨＩＶ  ＧＡＧｐ６、またはタンパク質複合体に免疫反応性を示す抗体または抗体フラグメント、好ましくは一本鎖抗体であり得る。
【０２１１】
競合インヒビターとして適切なタンパク質フラグメントを、直接的細胞内在化、受容体媒介エンドサイトーシス、または「輸送体」を介して細胞に送達させることができる。調整すべき標的タンパク質またはタンパク質複合体が細胞内に存在する場合、本発明の方法においてインビトロまたはインビボで細胞に投与した化合物は、最適な結果を得るために細胞に送達されることが好ましいことに留意すべきである。したがって、好ましくは、送達されるべき化合物を、標的タンパク質またはタンパク質複合体を有する細胞によって化合物の取り込みを増加させることができる輸送体と会合する。本明細書中で使用される、用語「輸送体」は、動物細胞、特にヒト細胞によって本発明の化合物の取り込みを促進することができ単位（例えば、化合物、化合物もしくは多数の異なる化合物の複数のコピーから形成された組成物または物理的構築物）をいう。典型的には、「輸送体」の存在下での本発明の化合物の細胞取り込みは、「輸送体」の非存在下での化合物の細胞取り込みの少なくとも２０％以上、好ましくは少なくとも４０％、５０％、７５％、より好ましくは少なくとも１００％高い。
【０２１２】
当分野で公知の多数の分子および構造を、「輸送体」として使用することができる。
【０２１３】
１つの実施形態では、輸送体としてペネトラチンを使用する。例えば、アンテナペディアのホメオドメイン（ショウジョウバエ転写因子）を、本発明の化合物を送達させるための輸送体として使用することができる。実際に、ペプチドのペネトラチンクラスの任意の適切なメンバーを使用して、本発明の化合物を細胞に輸送することができる。ペネトラチン類は、例えば、Ｄｅｒｏｓｓｉら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，８、８４〜８７、１９９８（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている。ペネトラチンは、受容体依存性、エネルギー依存性、および細胞型依存性様式において有効に原形質膜または核膜を有効を通過して結合する分子を輸送する。オリゴヌクレオチドおよびポリペプチドを輸送するためのキャリアとしてのペネトラチンの使用方法もまた、米国特許第６，０８０，７２４号；Ｐｏｏｇａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６、８５７、１９９８；およびＳｃｈｕｔｚｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７、６５０、１９９６（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている。米国特許第６，０８０，７２４号は、ペネトラチンの最低要件を、１６個のアミノ酸からなり、そのうちの６〜１０個が疎水性であるペプチドと定義している。Ｎ末端またはＣ末端のいずれかから計算して第６位のアミノ酸はトリプトファンであり、Ｎ末端またはＣ末端のいずれかから計算して第３位および第５位のアミノ酸は、共にバリンである。好ましくは、ショウジョウバエアンテナペディアのホメオドメインのヘリックス３を、輸送体として使用する。より好ましくは、ホメオドメインアンテナペディアのアミノ酸４３〜５８の配列を有するペプチドを、輸送体として使用する。さらに、ショウジョウバエアンテナペディアのホメオドメインのヘリックス３の他の天然に存在するホモログを使用することもできる。例えば、Ｆｕｓｈｉ−ｔａｒａｚｕ  ａｎｄ  Ｅｎｇｒａｉｌｅｄのホメオドメインは、細胞内にペプチドを輸送することができると示されている。Ｈａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ、１０、７２８〜３２、２０００を参照のこと。本明細書中で使用される、用語「ペネトラチン」はまた、ペネトラチンペプチドのペプトイド類似体を含む。典型的には、ペネトラチンペプチドおよびそのペプトイド類似体を、細胞に送達されるべき化合物と共有結合して、化合物の細胞取り込みを増大させる。
【０２１４】
別の実施形態では、ＨＩＶ−１  ｔａｔタンパク質およびその誘導体を、本発明の化合物と共有結合した「輸送体」として使用する。高分子を細胞に送達させるためのＨＩＶ−１  ｔａｔタンパク質およびその誘導体の使用は、当分野で公知である。Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｌｏｅｗｅｎｓｔｅｉｎ、Ｃｅｌｌ、５５、１１７９、１９８８；Ｆｒａｎｋｅｌ  ａｎｄ  Ｐａｂｏ、Ｃｅｌｌ、５５、１１８９、１９８８；Ｖｉｖｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２、１６０１０〜１６０１７、１９９７；Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５、１５６９〜１５７２、１９９９を参照のこと。細胞取り込みを担う配列は、高度に塩基性の領域（アミノ酸残基４９〜５７）からなることが公知である。例えば、Ｖｉｖｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２、１６０１０〜１６０１７、１９９７；Ｗｅｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、１３００３〜１３００８、２０００を参照のこと。塩基性ドメインにより、細胞膜の脂質二重層成分を標的化すると考えられる。このドメインにより、細胞型依存性様式で迅速に細胞膜を通過するためにタンパク質または核酸に共有結合する。この技術を使用して、インビトロおよびインビボの両方で種々の細胞型に１５〜１２０ｋＤの範囲のタンパク質を送達させた。Ｓｃｈｗａｒｚｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５、１５６９〜１５７２、１９９９を参照のこと。ペプチドなどの高分子を輸送することができる任意のＨＩＶｔａｔ由来のペプチドまたはそのペプトイド類似体を、本発明の目的に使用することができる。例えば、高度に塩基性の領域（アミノ酸残基４９〜５７）を有する任意の天然のｔａｔペプチドを、送達すべき化合物への共有結合による輸送体として使用することができる。さらに、アミノ酸残基４９〜５７のｔａｔペプチドの種々の類似体もまた、本発明の目的のための有用な輸送体であり得る。このような種々の類似体の例は、Ｗｅｎｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、１３００３〜１３００８、２０００（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）で開示されており、例えば、ｄ−Ｔａｔ49〜57、ｌ−またはｄ−Ｔａｔ49〜57のレトロインベルソイソ型（すなわち、ｌ−Ｔａｔ57〜49およびｄ−Ｔａｔ57〜49）、Ｌ−アルギニンオリゴマー、Ｄ−アルギニンオリゴマー、Ｌ−リジンオリゴマー、Ｄ−リジンオリゴマー、Ｌ−ヒスチジンオリゴマー、Ｄ−ヒスチジンオリゴマー、Ｌ−オルニチンオリゴマー、Ｄ−オルニチンオリゴマー、ならびのその種々のホモログ、誘導体（例えば、小ペプチドと結合した結合体を含む修飾形態）、およびペプトイド類似体が含まれる。
【０２１５】
当分野で公知の他の有用な輸送体には、線維芽細胞成長因子由来の短ペプチド配列（Ｌｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０、１４２５５〜１４２５８、１９９８を参照のこと）、ガルパラン（Ｐｏｏｇａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１２、６７〜７７、１９９８を参照のこと）、およびＨＳＶ−１構造タンパク質ＶＰ２２（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ａｎｄ  Ｏ’Ｈａｒｅ、Ｃｅｌｌ、８８、２２３〜２３３、１９９７を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１６】
上記の種々の輸送体は、一般にペプチドであるので、競合タンパク質フラグメントに結合するペプチドに共有結合する輸送体ペプチドを含むような組換え発現によって都合よく融合タンパク質を作製することができる。あるいは、従来の方法を使用して、輸送体ペプチドまたは本発明のペプチドの両方を化学合成することができる。
【０２１７】
セクション５．に記載のように、ハイブリッドペプチドを含む適切な医薬組成物をインビトロで細胞に投与するか患者に投与することができる。
【０２１８】
ペプチドベースの輸送体に加えて、種々の他の輸送体型（カチオン性リポソーム（Ｒｕｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０、１１２１３〜１１２１８、１９９８）、デンドリマー（Ｋｏｎｏら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，１０、１１１５〜１１２１、１９９９）、シデロフフォア（Ｇｈｏｓｈら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，３、１０１１〜１０１９、１９９６）などが含まれるが、これらに限定されない）を使用することもできる。特定の実施形態では、本発明の化合物を、細胞送達用のリポソームにカプセル化する。
【０２１９】
あるいは、本発明の化合物がペプチドである場合、これを遺伝子治療法によって細胞に投与することができる。すなわち、ペプチドをコードする核酸を、インビトロで細胞に投与するか、インビボでヒトもしくは動物の身体に投与することができる。任意の適切な遺伝子治療法を、本発明の目的に使用することができる。種々の遺伝子治療法が当分野で周知であり、以下のセクション６．３．２．に記載している。最近、遺伝子治療の成功が報告された。例えば、Ｋａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，２４、２５７〜６１、２０００；Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８、６６９、２０００；およびＢｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０、４７５、１９９５；Ｋａｎｔｏｆｆら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６、２１９、１９８７を参照のこと。
【０２２０】
５．５．遺伝子治療
さらに別の実施形態では、遺伝子治療アプローチは、Ｔｓｇ１０１をコードする遺伝子を「ノックアウト」するため、または遺伝子発現を減少するために使用する。例えば、遺伝子を、相同組換えによって異なる遺伝子配列または非機能性配列に置換するか、単純に欠失させることができる。別の遺伝子治療実施形態では、米国特許第５，６４１，６７０号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示の方法を使用して、Ｔｓｇ１０１遺伝子発現を減少させることができる。本質的には、ＤＮＡ構築物が外因性遺伝子に作動可能に連結されるように、少なくとも調節配列、エクソン、およびスプライスドナー部位を有する外因性ＤＮＡを相同組換えによってＴｓｇ１０１をコードする内因性遺伝子に移入することができる。結果として、内因性遺伝子の発現は、新規に移入した外因性調節配列によって調節される。したがって、外因性調節配列が強力な遺伝子発現リプレッサーである場合、相互作用タンパク質メンバーをコードする内因性遺伝子の発現が減少または遮断される。米国特許第５，６４１，６７０号、を参照のこと。
【０２２１】
種々の遺伝子治療法が、当分野で周知である。最近、遺伝子治療の成功が報告された。例えば、Ｋａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，２４、２５７〜６１、２０００；Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８、６６９、２０００；およびＢｌａｅｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０、４７５、１９９５；Ｋａｎｔｏｆｆら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６６、２１９、１９８７を参照のこと。
【０２２２】
任意の適切な遺伝子治療法を、本発明の目的に使用することができる。一般に、遺伝子治療ベクターを使用して、内因性Ｔｓｇ１０１遺伝子の修飾に有用な核酸（外因性核酸）を輸送する。典型的には、ベクターは、部位特異的相同組換えを指示することができる核酸配列を含む。例えば、欠損Ｔｓｇ１０１タンパク質（例えば、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６に結合できない）をコードする外因性核酸を、遺伝子治療ベクター内に輸送することが好ましい。あるいは、ベクターは、相同組換えを行って内因性Ｔｓｇ１０１遺伝子を「ノックアウト」することができる内因性Ｔｓｇ１０１遺伝子の２つの末端に対応する配列を含み得る。
【０２２３】
１つの実施形態では、外因性核酸（遺伝子）を、プラスミドＤＮＡベクターに組み込む。本発明で多数の市販の発現ベクターが有用であり得る（例えば、ｐＣＥＰ４、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＩＮＤ、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＶＡＸ１、ｐｃＤＮＡ３．１、およびｐＢＩ−ＥＧＦＰ、およびｐＤｉｓｐｌａｙを含む）。
【０２２４】
種々のウイルスベクターも使用することができる。典型的には、ウイルスベクターでは、ウイルスゲノムは、疾患を発症させる能力（例えば、宿主細胞中で複製する能力）を排除するように操作されている。患者に移入されるべき外因性核酸を、例えば、ウイルス感染性に不可欠でないウイルス遺伝子への挿入によって操作したウイルスゲノムに組み込むことができる。感染によって組織細胞に容易に移入することができるので、ウイルスベクターは扱いやすい。一旦宿主細胞に移入されると、組み合えウイルスは、典型的には、宿主細胞のゲノムに組み込まれる。珍しいことであるが、組換えウイルスは複製して染色体外エレメントとして保持される場合がある。
【０２２５】
遺伝子治療用の多数のレトロウイルスベクターが開発されている。これらには、オンコレトロウイルス（例えば、ＭＬＶ）、レンチウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＳＩＶ）、および他のレトロウイルスが含まれる。例えば、遺伝子治療ベクターは、マウス白血病ウイルス（Ｃｅｐｋｏら、Ｃｅｌｌ、３７、１０５３〜１０６２、１９８４；Ｃｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１、６３４９〜６３５３、１９８４を参照のこと）、マウス乳癌ウイルス（Ｓａｌｍｏｎｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１５９、１１９１〜１１９８、１９８４を参照のこと）、テナガザル白血病ウイルス（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６５、２２２０〜２２２４、１９９１を参照のこと）に、ＨＩＶ（Ｓｈｉｍａｄａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８８、１０４３〜１０４７、１９９１を参照のこと）、トリレトロウイルス（Ｃｏｓｓｅｔら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６４、１０７０〜１０７８、１９９０を参照のこと）に基づいて開発された。さらに、種々のレトロウイルスベクターは、米国特許第６，１６８，９１６号、米国特許第６，１４０，１１１号、米国特許第６，０９６，５３４号、米国特許第５，９８５，６５５号、米国特許第５，９１１，９８３号、米国特許第４，９８０，２８６号、および米国特許第４，８６８，１１６号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）にも記載されている。
【０２２６】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、臨床試験で首尾よく試験されている。例えば、Ｋａｙら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，２４、２５７〜６１、２０００を参照のこと。ＡＡＶは、ヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの他のウイルスを必要とする天然に存在する欠損ウイルスである。Ｍｕｚｙｃｚｋａ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｇｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．，１５８、９７、１９９２を参照のこと。遺伝子治療ベクターとして有用な組換えＡＡＶウイルスは、米国特許第６，１５３，４３６号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）で開示されている。
【０２２７】
アデノウイルスベクターはまた、本発明の遺伝子治療の目的に有用であり得る。例えば、米国特許第６，００１，８１６号は、肥満治療のために哺乳動物に静脈内からレプチン遺伝子を送達させるために使用するアデノウイルスベクターを開示している。他の組換えアデノウイルスベクターを使用することもできる（米国特許第６，１７１，８５５号、米国特許第６，１４０，０８７号、米国特許第６，０６３，６２２号、米国特許第６，０３３，９０８号、および米国特許第５，９３２，２１０号、およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２、４３１、４３４、１９９１；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ、６８、１４３〜１５５、１９９２に開示のベクターを含む）。
【０２２８】
他の有用なウイルスベクターには、組換えヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，９８１，２７４号を参照のこと）および組換えエントモポックスウイルス（例えば、米国特許第５，７２１，３５２号および米国特許第５，７５３，２５８号を参照のこと）が含まれる。非伝統的ベクターを、本発明の目的で使用することもできる。例えば、国際公開番号ＷＯ９４／１８８３４は、送達すべきＤＮＡの多価電解質との結合による複合体形成により哺乳動物細胞にＤＮＡを送達する方法を開示している。複合体を、細胞に微量注入するか、細胞に取り込ませることができる。
【０２２９】
外因性核酸を、受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞に移入することもできる。例えば、米国特許第６，０９０，６１９号；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３、１４６２１、１９８８；Ｃｕｒｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８、８８５０、１９９１を参照のこと。例えば、米国特許第６，０８３，７４１号は、インテグリン受容体結合部分（例えば、配列ＲＧＤを有する環状ペプチド）に結合するポリカチオン部分（例えば、３〜１００個のリジン残基を有するポリＬ−リジン）への核酸の会合による哺乳動物細胞への外因性核酸の移入を開示している。
【０２３０】
あるいは、外因性核酸またはこれを含むベクターを、両親媒性物質を介して細胞に送達させることもできる。例えば、米国特許第６，０７１，８９０号を参照のこと。典型的には、外因性核酸または核酸を含むベクターは、カチオン性両親媒性物質と複合体を形成する。複合体に接触した哺乳動物細胞は、容易に複合体を取り込むことができる。
【０２３１】
外因性核酸を、当分野で公知の種々の方法によって遺伝子治療目的の患者に移入することができる。例えば、外因性遺伝子配列のみ、上記の複合体形態と組み合わせたもの、またはウイルスまたはＤＮＡベクターに組み込んだものを、患者の適切な組織または器官への注射によって直接投与することができる。あるいは、カテーテルまたは類似のデバイスを、標的器官または組織への送達に使用することができる。適切なカテーテルは、米国特許第４，１８６，４７５号；米国特許第５，３９７，３０７号；米国特許第５，５４７，４７２号；米国特許第５，６７４，１９２号；および米国特許第６，１２９，７０５号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）で開示されている。
【０２３２】
さらに、外因性核酸または核酸を含むベクターを、リン酸カルシウム沈殿、微量注入、リポフェクション、エレクトロポレーション、遺伝子銃、受容体媒介エンドサイトーシスなどの公知の任意の技術を使用して単離細胞に移入することができる。外因性核酸を発現する細胞を選択し、例えば、注射または細胞移植によって患者に戻すことができる。患者に送達させる適量の細胞は、患者の条件、所望の効果によって変化し、これは当業者が決定することができる。例えば、米国特許第６，０５４，２８８号；米国特許第６，０４８，５２４号；および米国特許第６，０４８，７２９号を参照のこと。好ましくは、使用細胞は、自系である（すなわち、治療を受けた患者から得た細胞）。
【０２３３】
６．医薬組成物および処方物
本発明の別の態様では、本発明のセクション６．に記載のように得た１つまたは複数の治療薬を含む医薬組成物も得られる。例えば、このような治療薬には、（１）Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧもしくはＧＡＧｐ６またはＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含む別のレトロウイルスＧＡＧとの間の相互作用を妨害することができる本発明のスクリーニング法に基づいて選択した有機小化合物、（２）Ｔｓｇ１０１核酸（遺伝子またはｍＲＮＡ）と特異的にハイブリッド形成するアンチセンス化合、（３）Ｔｓｇ１０１核酸（遺伝子またはｍＲＮＡ）に特異的なリボザイム化合物、（４）Ｔｓｇ１０１またはＨＩＶ  ＧＡＧもしくはＧＡＧｐ６またはＰ（Ｔ／Ｓ）ＡＰ後期ドメインモチーフを含む別のレトロウイルスＧＡＧに免疫反応性を示す抗体、（５）本発明のタンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体、（６）本発明のタンパク質複合体に結合することができる小有機化合物、（７）Ｔｓｇ１０１またはレトロウイルスＧＡＧポリペプチドと相互作用することができる上記の（輸送体と作動可能に連結された）小ペプチド化合物、（８）抗体またはペプチドをコードする核酸が含まれるが、これらに限定されない。患者への投与に適切な薬学的処方物として組成物を調製する。したがって、本発明はまた、１つまたは複数の本発明の治療薬を含む医薬組成物、医薬品、薬物、または他の組成物にまで及ぶ。
【０２３４】
医薬組成物では、本発明によって同定された活性化合物は、薬学的に許容可能な塩形態であり得る。本明細書中で使用される、用語「薬学的に許容可能な塩」は、化合物の無機または有機酸付加塩を含む本発明の化合物の比較的無毒の有機または無機塩をいう。このような塩には、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、硝酸塩、酢酸塩、リン酸塩、ホスホブロミド塩、ラウリル硫酸塩、グルコヘプトネート塩、シュウ酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、ステアリン酸塩、パルミチン酸塩、吉草酸塩、安息香酸塩、ナフチレート塩、メシル酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩が含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｂｅｒｇｅら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，６６、１〜１９、１９７７を参照のこと。
【０２３５】
経口送達のために、活性化合物を、薬学的に許容可能なキャリア（結合剤（例えば、ゼラチン、セルロース、トラガカントゴム）、賦形剤（例えば、デンプン、ラクトース）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素）、崩壊剤（例えば、アルギニン酸塩、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、およびコーンスターチ）、および甘味料または香料（例えば、グルコース、スクロース、サッカリン、サリチル酸メチル、およびペパーミント）など）を含む処方物に組み込むことができる。処方物を、封入したゼラチンカプセルまたは打錠の形態で経口投与することができる。任意の従来の技術でカプセルおよび錠剤を調製することができる。カプセルおよび錠剤を、風味、味、色、ならびにカプセルおよび錠剤の形態を変更するための当分野で公知の種々のコーティングでコートすることができる。さらに、脂肪油などの液体キャリアを、カプセルに封入することもできる。
【０２３６】
適切な経口処方物はまた、懸濁液、シロップ、チューインガム、ウエハー、およびエリキシルなどの形態であり得る。所望ならば、風味、味、色、ならびに特別な形態に変更するための従来の薬剤も含めることができる。さらに、嚥下が不可能な患者における経腸栄養チューブによる従来の投与のために、活性化合物を、オリーブ油、トウモロコシ油、およびヒマワリ油などの許容可能な新油性植物油賦形剤中に溶解することができる。
【０２３７】
活性化合物を、溶液もしくは懸濁液の形態、または使用前に溶液または懸濁液に変換することができる凍結乾燥形態で腹腔内投与することもできる。このような処方物では、滅菌水および生理食塩水緩衝液などの希釈剤または薬学的に許容可能なキャリアを使用することができる。他の従来の溶剤、ｐＨ緩衝液、安定剤、抗菌薬、界面活性剤、および抗酸化剤も全て含めることができる。例えば、有用な成分には、塩化ナトリウム、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸緩衝液、グリセリン、デキストロース、不揮発油、メチルパラベン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、重硫酸ナトリウム、ベンジルアルコール、およびアスコルビン酸などが含まれる。非経口処方物を、バイアルおよびアンプルなどの従来の容器で保存することができる。
【０２３８】
局所投与経路には、鼻腔、口腔内、粘膜、直腸、または膣投与が含まれる。局所投与のために、活性化合物を、ローション、クリーム、軟膏、ゲル、粉末、ペースト、スプレー、懸濁液、ドロップ、およびエーロゾルに処方することができる。したがって、処方物に１つまたは複数の増粘剤、保湿剤、および安定剤を含めることができる。このような薬剤の例には、ポリエチレングリコール、ソルビトール、キサンタンガム、ペトロラタム、蜜蝋、または鉱物油、ラノリン、およびスクアレンなどが含まれるが、これらに限定されない。局所投与の特異的形態は、経皮パッチによる送達である。経皮パッチの調製方法は、例えば、Ｂｒｏｗｎら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３９，２２１〜２２９，１９８８（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている。
【０２３９】
活性化合物の徐放のための皮下移植は、適切な投与経路であり得る。これは、皮下空間（例えば腹部前壁の真下）に活性化合物を含む任意の適切な処方物を移植するために手術を要する。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈ．，４５，２４２〜２４７，１９８４を参照のこと。活性化合物徐放のためのキャリアとしてヒドロゲルを使用することができる。ヒドロゲルは、一般に当分野で公知である。典型的には、高分子量の生体適合性ポリマーのネットワークへの架橋および水への浸漬によるゲル様材料の形成によってヒドロゲルを作製する。好ましくは、ヒドロゲルは、生体分解性または生体吸収性である。本発明の目的のために、ポリエチレングリコール、コラーゲン、またはポリ（グリコール酸−コ−Ｌ−乳酸）で作製したヒドロゲルが有用であり得る。例えば、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．，７３、１７１８〜１７２０，１９８４を参照のこと。
【０２４０】
活性化合物を、水溶性非免疫原性非ペプチド高分子量ポリマーと結合させて、ポリマー結合体を形成することもできる。例えば、活性化合物を、ポリエチレングリコールと共有結合させて結合体を形成する。典型的には、このような結合体は、溶解性および安定性が向上し、毒性および免疫原性が減少する。したがって、患者に投与した場合、結合体中の活性化合物の体内半減期は延長され、より良好な有効性を示す。一般に、Ｂｕｒｎｈａｍ、Ａｍ．Ｊ．Ｈｏｓｐ．Ｐｈａｒｍ．，１５，２１０〜２１８，１９９４を参照のこと。現在、タンパク質置換治療および他の治療のためにＰＥＧ化タンパク質が使用されている。例えば、ＰＥＧ化インターフェロン（ＰＥＧｋ−ＩＮＴＲＯＮ（登録商標））は、Ｂ型肝炎治療に臨床的に使用されている。ＰＥＧ化アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＧＥＮ（登録商標））は、重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤＳ）の治療で使用されている。ＰＥＧ化Ｌ−アスパラギナーゼ（ＯＮＣＡＰＳＰＡＲ（登録商標））は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の治療で使用されている。ポリマーと活性化合物および／またはポリマー自体との共有結合は、生理学的条件下で加水分解することが好ましい。「プロドラッグ」としても公知のこのような化合物は、体内で活性化合物を容易に放出することができる。活性化合物の徐放を、活性成分の当分野で一般に公知のマクロカプセル、ナノカプセル、またはヒドロゲルへの組み込みによって行うことができる。
【０２４１】
本発明の活性化合物のキャリアとしてリポソームを使用することもできる。リポソームは、コレステロール、リン脂質、脂肪酸、およびその誘導体などの種々の脂質から作製されたミセルである。種々の修飾脂質も使用することができる。リポソームは、活性化合物の毒性を軽減し、安定性を増大させることができる。有効成分を含むリポソーム懸濁液の調製方法は、当分野で一般に公知である。例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；Ｐｒｅｓｃｏｔｔ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第ＸＩＶ巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．，１９７６を参照のこと。
【０２４２】
他の有効成分が本発明の活性化合物の効果を妨害するか悪影響を与えない限り、活性化合物を、同一の症状を相乗的に治療または予防し、治療を受ける患者の別の疾患または症状に有効な別の有効成分と組み合わせて投与することができる。このような他の有効成分には、抗炎症薬、抗ウイルス薬、抗菌薬、抗真菌薬、抗凝固薬、心血管薬、コレステロール低下薬、抗癌薬、および高血圧薬などが含まれるが、これらに限定されない。
【０２４３】
一般に、治療薬の毒性プロフィールおよび治療有効性を、細胞モデルまたは動物モデルにおける標準的な薬学的手順（例えば、セクション７．に記載の手順）によって決定することができる。当分野で公知のように、ＬＤ50は、試験集団の約５０％が死亡する用量を示し、ＥＤ50は、試験集団の約５０％で治療が有効な用量を示すパラメータである。ＬＤ50およびＥＤ50を、細胞モデルおよび動物モデルで決定することができる。さらに、疾患または障害の症状の最大阻害の約５０％を達成する有効性を示す循環血漿濃度を示すＩＣ50を細胞モデルおよび動物モデルで得ることもできる。ヒト臨床試験用の投薬量範囲の設計でこのようなデータを使用することができる。典型的には、当業者に明らかであるように、ヒトの投薬量範囲を、投薬範囲の中央値をおおよそＥＤ50および／またはＩＣ５0とするが、ＬＤ50は細胞または動物モデルから得られた値より有意に低くなるように設計すべきである。本発明の医薬組成物に含められる各活性化合物の治療有効量は、要因（使用化合物の活性、患者の体内での活性化合物の安定性、緩和すべき病態の重症度、患者の総体重、投与経路、吸収しやすさ、活性化合物の体内での分布および排泄、年齢、および患者の治療感受性などが含まれるが、これらに限定されない）によって変化し得ることが当業者に明らかである。長期間で種々の要因が変化するにつれて、投与量を調整することもできる。
【実施例１】
【０２４４】
［１．酵母２ハイブリッドシステム］
酵母２ハイブリッドシステムの原理および方法は、「酵母２ハイブリッドシステム」、Ｂａｒｔｅｌ  ａｎｄ  Ｆｉｅｌｄｓ編、ｐ．１３８〜１９６、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９７に詳述されている。したがって、以下は、本発明者らは使用した特定の手順の記載である。
【０２４５】
ベイトタンパク質ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６をコードするｃＤＮＡは、ＨＩＶ−１  ＮＹ５／ＢＲＵ単離物に由来していた。次いで、ｃＤＮＡ産物を、組換えによって酵母発現ベクターｐＧＢＴ．Ｑ（ポリリンカー部位をＭ１３配列決定部位を含むように改変したｐＧＢＴ．Ｃ（Ｂａｒｔｅｒｌら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，１２、７２〜７７、１９９６を参照のこと）の密接な誘導体である）に移入した。新規の構築物を、トリプトファン合成を駆動する能力について酵母ＰＮＹ２００株（この株の遺伝子型；ＭＡＴαｔｒｐ１−９０１ｌｅｕ２−３，１１２ｕｒａ３−５２ｈｉｓ３−２００ａｄｅ２ｇａｌ４Δｇａｌ８０）で直接選択した。これらの酵母細胞では、転写因子Ｇａｌ４（アミノ酸１〜１４７）のＤＮＡ結合ドメインを含むＣ末端融合タンパク質としてベイトを産生した。
【０２４６】
プレイライブラリー（例えば、ヒト脾臓ｃＤＮＡライブラリー）を、酵母ＢＫ１００株（この株の遺伝子型：ＭＡＴａｔｒｐ１−９０１ｌｅｕ２−３，１１２ｕｒａ３−５２ｈｉｓ３−２００ｇａｌ４Δｇａｌ８０ＬＹＳ２：：ＧＡＬ−ＨＩＳ３ＧＡＬ２−ＡＤＥ２ｍｅｔ２：：ＧＡＬ７−ｌａｃＺ）に形質転換し、ロイシン合成を駆動する能力について選択した。これらの酵母細胞では、転写因子Ｇａｌ４（アミノ酸７６８〜８８１）の転写活性化ドメインおよび９アミノ酸血球凝集素エピトープタグを含む融合タンパク質として各ｃＤＮＡを発現した。ベイトを発現するＰＮＹ２００細胞（ＭＡＴα交配型）を、プレイライブラリーからプレイタンパク質を発現するＢＫ１００細胞（ＭＡＴａ交配型）交配させた。ベイトタンパク質と相互作用するタンパク質を発現する得られた二倍体酵母細胞を、トリプトファン、ロイシン、ヒスチジン、およびアデニンを合成する能力について選択した。各クローンからＤＮＡを調製し、エレクトロポレーションによって大腸菌ＫＣ８株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＫＣ８エレクトロコンピテント細胞、カタログ番号Ｃ２０２３−１）に形質転換し、トリプトファン（ベイトプラスミド選択用）またはロイシン（ライブラリープラスミド選択用）のいずれかが存在しないアンピシリン含有プレートで細胞を選択した。両プラスミドのＤＮＡを調製し、ジデオキシヌクレオチド鎖末端法によって配列決定した。ベイトｃＤＮＡインサートの同一性を確認し、プレイライブラリープラスミド由来のｃＤＮＡインサートを、公的なヌクレオチドおよびタンパク質データベースの検索用のＢＬＡＳＴプログラムを使用して同定した。次いで、プレイライブラリー由来のプラスミドを、ラミンおよびＧａｌ４  ＤＮＡ結合ドメインにそれぞれ融合した５つの他の試験タンパク質の合成を駆動するプラスミドと共にそれぞれ酵母細胞に形質転換した。β−ガラクトシダーゼアッセイで正のシグナルを発したクローンを、偽陽性とみなし、破棄した。残りのクローンのプラスミドを、元のベイトプラスミドと共に酵母細胞に形質転換した。β−ガラクトシダーゼアッセイで正のシグナルを発したクローンを真の陽性とみなした。
【０２４７】
表１に示したＨＩＶ  ＧＡＧｐ６配列を、上記の酵母２ハイブリッドシステムで使用した。単離したＴｓｇ１０１プレイ配列を、表１にまとめる。ベイトおよびプレイタンパク質のＧｅｎＢａｎｋ寄託番号も表１に示し、その際にベイト配列とプレイ配列を並べた。
【実施例２】
【０２４８】
［２．タンパク質複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体の産生］
ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６およびＴｓｇ１０１のＵＥＶドメインを、ヒト宿主細胞中で組換えによって発現させ、単離および精製する。２つの精製された相互作用タンパク質（フラグメント）の混合によってタンパク質複合体を形成する。組換え発現したインタクトな完全Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧｐ６との混合によって、タンパク質複合体も形成する。２つのタンパク質複合体を、免役化マウスにおける抗原として使用する。免役化マウス脾臓細胞からｍＲＮＡを単離し、第１のｃＤＮＡ鎖をｍＲＮＡに基づいて合成する。適切なプライマーを使用したＰＣＲによって合成したｃＤＮＡからＶHおよびＶK遺伝子を増幅させる。
【０２４９】
増幅ＶHおよびＶK遺伝子を互いにライゲートし、ファージディスプレイライブラリーの構築のためにファージミドベクターにサブクローン化する。大腸菌細胞をライゲーション混合物で形質転換し、ファージディスプレイライブラリーを確立する。あるいは、ライゲートしたＶHおよびＶK遺伝子を、ＶHおよびＶK配列がＴ７プロモーターの調節下におかれるリボゾームディスプレイに適切なベクターにサブクローン化する。Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．，２３１、１１９〜１３５、１９９９を参照のこと。
【０２５０】
Ｔｓｇ１０１−ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６複合体ならびに各Ｔｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧｐ６でライブラリーをスクリーニングする。数ラウンドのスクリーニングを行うことが好ましい。Ｔｓｇ１０１−ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６複合体に結合するが、各Ｔｓｇ１０１およびＨＩＶ  ＧＡＧｐ６に結合しないｓｃＦｖフラグメントに対応するクローンを選択および精製する。１つの精製クローンを使用して、Ｔｓｇ１０１−ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６複合体に選択的に免疫反応性を示す抗体を調製する。次いで、抗体を、ＲＩＡおよびＥＬＩＳＡなどの免役化学的方法によって評価する。
【０２５１】
さらに、Ｔｓｇ１０１−ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６複合体に結合し、Ｔｓｇ１０１および／またはＨＩＶ  ＧＡＧｐ６にも結合するｓｃＦｖフラグメントに対応するクローンを選択することができる。クローン中のｓｃＦｖ遺伝子を、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発、変異性ＰＣＲ（Ｌｉｎ−Ｇｏｅｒｋｅら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２３、４０９、１９９７を参照のこと）、ｄＮＴＰ類似体（Ｚａｃｃｏｌｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５５、５８９、１９９６を参照のこと）などの変異誘発、および他の方法によって変異させる。変化クローンを、ファージディスプレイまたはリボゾームディスプレイライブラリーでさらにスクリーニングする。この様式では、Ｔｓｇ１０１−ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６複合体に選択的に免疫反応性を示すｓｃＦｖフラグメントを得ることができる。
【実施例３】
【０２５２】
［３．Ｔｓｇ１０１−ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６相互作用とＨＩＶ出芽との相関関係］
酵母２ハイブリッドシステムを使用して、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧｐ６との間の相互作用に及ぼすＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のＰＴＡＰモチーフ中でのアミノ酸置換変異の影響を決定した。酵母２ハイブリッド活性化ドメイン（Ｔｓｇ１０１構築物）を調製するために、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲによってＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ８２１３０によるＴｓｇ１０１の全長コード配列を含むＤＮＡフラグメントを獲得し、活性化ドメイン親プラスミドＧＡＤｐＮ２のＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ部位（ＬＥＵ２、ＣＥＮ４、ＡＲＳ１、ＡＤＨ１ｐ−ＳＶ４０ＮＬＳ−ＧＡＬ４（７６８−８８１）−ＭＣＳ（多クローニング部位）−ＰＧＫ１ｔ、ＡｍｐＲ、ＣｏｌＥ１＿ｏｒｉ）にクローン化する。
【０２５３】
酵母２ハイブリッドＤＮＡ結合ドメイン（ＨＩＶ１  ＧＡＧｐ６構築物）を調製するために、ＨＩＶ１．ＮＬ４３株ＧＡＧタンパク質由来のＨＩＶ１  ＧＡＧｐ６ペプチドに対応するＤＮＡフラグメントを、ＮＬ４３含有プラスミドＲ９ΔａｐａからＰＣＲによって獲得し、結合ドメイン親プラスミドｐＧＢＴ．ＱのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位にクローン化した。
【０２５４】
以下のアミノ酸置換変異を、ＰＣＲによって上記の酵母２ハイブリッド結合ドメイン（ＨＩＶ１  ＧＡＧｐ６構築物）中のＨＩＶ１  ＧＡＧｐ６配列に移入した。変異体を、ＤＮＡ配列分析によって評価した。このような変異を、以下の表２にまとめる。
【０２５５】
【表２】
2004533815.tif 000003
【０２５６】
変異の効果を試験するために、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入した酵母Ｙ１８９株細胞（ｕｒａ３−５２ｈｉｓ３*２００ａｄｅ２−１０１ｔｒｐ１−９０１ｌｅｕ２−３，１１２ｍｅｔｇａｌ４ｇａｌ８０ＵＲＡ３：：ＧＡＬ１ｐ−ｌａｃＺ）を、活性化ドメインＴｓｇ１０１構築物および結合ドメイン（変異ＧＡＧｐ６構築物）または結合ドメイン（野生型ＧＡＧｐ６構築物）のいずれか１つと同時形質転換した。フィルターを使用した形質転換酵母コロニーのリフティングによってβ−Ｇａｌ活性についてのフィルターリフトアッセイを行い、凍結融解によって酵母細胞を溶解し、溶解細胞をＸ−Ｇａｌに接触させた。陽性β−Ｇａｌ活性は、ＧＡＧｐ６野生型または変異タンパク質がＴｓｇ１０１と相互作用することを示す。全結合ドメイン構築物もβ−Ｇａｌ活性の自己活性化について試験した。結果を、以下の表３に示す。
【０２５７】
【表３】
2004533815.tif 000004
【０２５８】
したがって、表３で明らかなように、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６のＰＴＡＰモチーフの変異により、Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  ＧＡＧｐ６との間の相互作用が破壊される一方で、ＰＴＡＰモチーフの外側のＰ６／Ｅ６Ｇ変異によりＴｓｇ１０１−ＧＡＧｐ６相互作用は排除されなかった。
【０２５９】
Ｔｓｇ１０１とＨＩＶ  野生型ＧＡＧｐ６（ＷＴ）またはＧＡＧｐ６  ＰＴＡＰ変異体との間の相互作用を、液体培養β−ガラクトシダーゼアッセイによってさらに定量した。培養物を９６ウェルプレートの合成培地（−Ｌｅｕ、−Ｔｒｐ、＋グルコース）中で一晩成長させ、光学密度を標準化し、６×溶解／基質溶液を含む６×Ｚ緩衝液（６０ｍＭのＫＣｌ、６ｍＭのＭｇＳＯ4、３６０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4、２４０ｍＭおＮａＨ2ＰＯ4、６ｍｇ／ｍｌのＣＰＲＧ、０．１２Ｕ／ｍｌのリガーゼ、０．０７５％のＮＰ−４０）の添加によって溶解した。培養物を、３７℃で２時間インキュベートし、遠心分離によって清澄化し、各上清の光学密度を測定した（５７５ｎｍ）。２ハイブリッド液体培養アッセイでの全長Ｔｓｇ１０１結合野生型ｐ６により、高レベルのβ−ガラクトシダーゼ活性（バックグラウンドの３００倍超）が得られた。３つの異なるｐ６点変異を使用して、Ｔｓｇ１０１結合相互作用がＨＩＶ−１ｐ６内のＰＴＡＰ後期ドメインモチーフを必要とするかどうか、および３つ全て（Ｐ６Ｌ、Ａ９Ｒ、およびＰ１０Ｌ）が、バックグラウンドレベルまでβ−ガラクトシダーゼ活性を減少させるかどうかを試験した。これらの各点変異により、後期のＨＩＶ−１出芽を停止させる（Ｈｕａｎｇら、１９９５）。これらの結果は、ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６とヒト細胞タンパク質Ｔｓｇ１０１との間の相互作用がウイルス出芽に不可欠であるという仮説と一致する。
【実施例４】
【０２６０】
［４．インビトロ結合アッセイ］
ＨＩＶ−１  ＧＡＧｐ６ドメインに融合したＧＳＴタグを含む融合タンパク質を、組換えによって発現し、クロマトグラフィーによって精製した。さらに、第１の１４アミノ酸残基を含むＧＡＧｐ６ペプチド（「ｐ６（１−１４）」）を、標準的なペプチド合成法によって化学合成した。ペプチドを、従来のタンパク質精製技術（例えば、クロマトグラフィー）によって精製した。
【０２６１】
Ｎｕｎｃ／Ｎａｌｇｅｎｅ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、精製ＧＳＴ−ｐ６および５０ｍＭの炭酸塩（ｐＨ＝９．６）を含む１００μｌのタンパク質結合溶液４℃で一晩または室温で１〜２時間インキュベートした。これにより、ＧＳＴ−ｐ６融合タンパク質がプレートに付着する。プレート中の液体を空にし、ウェルの４００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ；Ｐｉｅｃｅ−Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）で満たした。室温で１時間のインキュベーション後、ショウジョウバエＳ２細胞溶解物ｍｙｃタグ化Ｔｓｇ１０１（残基１〜２０７）および所定量のｐ６（１〜１４）ペプチドを含む１００μｌの混合物を、プレートのウェルに適用した。この混合物を室温で２時間反応させて、ｐ６：Ｔｓｇ１０１タンパク質−タンパク質複合体を形成させた。次いで、プレートを、１００μｌの１×ＰＢＳＴ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で４回洗浄した。洗浄後、１μｇ／ｍｌの抗ｍｙｃ−モノクローナル抗体（Ｃｌｏｎｅ９Ｅ１０；Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）を含む１×ＰＢＳＴ溶液を１００μｌプレートのウェルに添加して、Ｔｓｇ１０１タンパク質に対してｍｙｃ−エピトープタグを検出した。次いで、プレートを、１００μｌの１×ＰＢＳＴ溶液で４回洗浄し、１００μｌの１μｌ／ｍｌ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ；Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）の１×ＰＢＳＴ溶液を、プレートのウェルに添加して、結合したマウス抗ｍｙｃ−抗体を検出した。次いで、プレートを、１００μｌの１×ＰＢＳＴ溶液で４回洗浄し、１００μｌの蛍光基質（ＱｕａｎｔａＢｌｅ；Ｐｉｅｒｃｅ−Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を、全ウェルに添加した。３０分後、１００μｌの停止溶液を各ウェルに添加して、ＨＲＰ機能を阻害した。次いで、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｆｕｓｉｏｎ装置にて励起波長３２５ｎｍおよび発光波長４２０ｎｍでプレートを測定した。蛍光シグナルが存在することは、固定したＧＳＴ−ｐ６とＴｓｇ１０１の結合を示す。対照的に、蛍光シグナルが存在しないことは、ＰＸ1ＰＸ2Ｐ含有短ペプチドがＴｓｇ１０１とＨＩＶｐ６との間の相互作用を破壊することができることを示す。
【０２６２】
異なる濃度のｐ６（１〜１４）ペプチドを試験し、異なる濃度のこれらから得られた蛍光シグナルの強度を、ペプチド濃度に対してプロットした。競合阻害曲線を、図２に示す。２つのＤｉｘｏｎプロットを、それぞれ図３および図４に示す。
【実施例５】
【０２６３】
［５．ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６とＴｓｇ１０１との間の相互作用の小分子インヒビターを同定するための酵母スクリーニング］
β−ガラクトシダーゼを、サッカロミセス・セレビジエにおけるプラスミドから発現した酵母２ハイブリッドタンパク質対の間の相互作用を示すためのレポーター酵素として使用する。プラスミドＭｐ３６４（ＬＥＵ２ＣＥＮ４ＡＲＳ１ＡＤＨ１ｐ−ＳＶ４０ＮＬＳ−ＧＡＬ４（７６８−８８１）−Ｔｓｇ１０１（１−３９０）−ＰＧＫ１ｔＡｍｐＲＣｏｌＥ１＿ｏｒｉ）およびＭｐ２０６（ＴＲＰ１ＣＥＮ４ＡＲＳＡＤＨ１ｐ−ＧＡＬ４（１−１４７）−ＨＩＶ１＿ｇａｇ（４４８−５００）−ＡＤＨ１ｔＡｍｐＲＣｏｌＥ１＿ｏｒｉ）を保有する酵母ＭＹ２０９株（ａｄｅ２ｈｉｓ３ｌｅｕ２ｔｒｐ１ｃｙｈ２ｕｒａ３：：ＧＡＬ１ｐ−ｌａｃＺｇａｌ４ｇａｌ８０ｌｙｓ２：：ＧＡＬ１ｐ−ＨＩＳ３）を、ロイシンおよびトリプトファンを欠く合成完全培地（ＳＣ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ）中、３０℃で一晩培養する。この培養物を、ＳＣ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ培地を使用してＯＤ630が０．０１になるまで希釈する。希釈されたＭＹ２０９培養物を、９６ウェルマイクロプレートに分注する。小分子ライブラリー由来の化合物をマイクロプレートに添加し、試験化合物の最終濃度は、約６０μＭである。アッセイプレートを３０℃で一晩インキュベートする。翌日、濃縮基質／溶解緩衝液のアリコートを、各ウェルに添加し、３７℃で１〜２時間インキュベートする。適当な時間で、停止溶液のアリコートを各ウェルに添加して、β−ガラクトシダーゼ反応を停止させる。全マイクロプレートについて吸光度を測定して、酵素基質由来の産物の産生をアッセイする。ＨＩＶｐ６およびＴｓｇ１０１との間の相互作用の推定インヒビターの存在により、ＭＹ２０９によって産生されたβ−ガラクトシダーゼシグナルが阻害された。さらなる試験により、酵母細胞成長への影響によりβ−ガラクトシダーゼ発現を減少させた化合物および無関係なタンパク質対の相互作用によって発生したβ−グルコシダーゼシグナルに影響を与えた非特異的インヒビターを排除する。
【０２６４】
ヒット（すなわち、ウイルスと細胞タンパク質との間の相互作用を阻害する化合物）が一旦得られると、化合物を同定し、化合物をいくつかの濃度でアッセイして、ＩＣ50値（これは、本実施例に記載の２ハイブリッドアッセイで認められたシグナルがインヒビターの非存在下で認められるシグナルの５０％である化合物の濃度である）を決定する。
【０２６５】
本明細書中に記載の全ての刊行物および特許出願は、本発明に属する当業者の水準を示す。全ての刊行物および特許出願が、各刊行物または特許出願が明確に且つ個別に参考として組み込まれるのと同程度に、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０２６６】
上記の発現は、理解を明白にするための例示および実施例によって幾らか詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲の範囲内で一定の変更および修正を行うことができることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０２６７】
【図１】異なる後期ドメインモチーフを使用したウイルスによる出芽についての提案された経路をまとめた図である。
【図２】ＨＩＶ  ＧＡＧｐ６の最初の１４アミノ酸残基を有するｐ６（１〜１４）ペプチドがＧＳＴ−ｐ６とｍｙｃ−Ｔｓｇ１０１（１〜２０７）との間のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害することができることを示す競合阻害曲線を示す図である。
【図３】ＧＳＴ−ｐ６とｍｙｃ−Ｔｓｇ１０１（１〜２０７）との間の相互作用のｐ６（１〜１４）阻害を示すＤｉｘｏｎプロットを示す図である。
【図４】ＧＳＴ−ｐ６とｍｙｃ−Ｔｓｇ１０１（１〜２０７）との間の相互作用のｐ６（１〜１４）阻害を示す別のＤｉｘｏｎプロットを示す図である。
【図１】
2004533815.tif 000005
【図２】
2004533815.tif 000006
【図３】
2004533815.tif 000007
【図４】
2004533815.tif 000008
【国際公開パンフレット】
2004533815.tif 000009
2004533815.tif 000010
2004533815.tif 000011
2004533815.tif 000012
2004533815.tif 000013
2004533815.tif 000014
2004533815.tif 000015
2004533815.tif 000016
2004533815.tif 000017
2004533815.tif 000018
2004533815.tif 000019
2004533815.tif 000020
2004533815.tif 000021
2004533815.tif 000022
2004533815.tif 000023
2004533815.tif 000024
2004533815.tif 000025
2004533815.tif 000026
2004533815.tif 000027
2004533815.tif 000028
2004533815.tif 000029
2004533815.tif 000030
2004533815.tif 000031
2004533815.tif 000032
2004533815.tif 000033
2004533815.tif 000034
2004533815.tif 000035
2004533815.tif 000036
2004533815.tif 000037
2004533815.tif 000038
2004533815.tif 000039
2004533815.tif 000040
2004533815.tif 000041
2004533815.tif 000042
2004533815.tif 000043
2004533815.tif 000044
2004533815.tif 000045
2004533815.tif 000046
2004533815.tif 000047
2004533815.tif 000048
2004533815.tif 000049
2004533815.tif 000050
2004533815.tif 000051
2004533815.tif 000052
2004533815.tif 000053
2004533815.tif 000054
2004533815.tif 000055
2004533815.tif 000056
2004533815.tif 000057
2004533815.tif 000058
2004533815.tif 000059
2004533815.tif 000060
2004533815.tif 000061
2004533815.tif 000062
2004533815.tif 000063
2004533815.tif 000064
2004533815.tif 000065
2004533815.tif 000066
2004533815.tif 000067
2004533815.tif 000068
2004533815.tif 000069
2004533815.tif 000070
2004533815.tif 000071
2004533815.tif 000072
2004533815.tif 000073
2004533815.tif 000074
2004533815.tif 000075
2004533815.tif 000076
2004533815.tif 000077
2004533815.tif 000078
2004533815.tif 000079
2004533815.tif 000080
2004533815.tif 000081
2004533815.tif 000082
2004533815.tif 000083
2004533815.tif 000084
2004533815.tif 000085
2004533815.tif 000086
2004533815.tif 000087
2004533815.tif 000088
2004533815.tif 000089
2004533815.tif 000090
2004533815.tif 000091
2004533815.tif 000092
2004533815.tif 000093
2004533815.tif 000094
2004533815.tif 000095
2004533815.tif 000096
2004533815.tif 000097
2004533815.tif 000098
2004533815.tif 000099
2004533815.tif 000100
2004533815.tif 000101
2004533815.tif 000102
2004533815.tif 000103
2004533815.tif 000104
2004533815.tif 000105
2004533815.tif 000106
2004533815.tif 000107
2004533815.tif 000108
2004533815.tif 000109
2004533815.tif 000110
2004533815.tif 000111
2004533815.tif 000112
2004533815.tif 000113
2004533815.tif 000114
2004533815.tif 000115
2004533815.tif 000116
2004533815.tif 000117
2004533815.tif 000118
2004533815.tif 000119
2004533815.tif 000120
2004533815.tif 000121
2004533815.tif 000122
2004533815.tif 000123
2004533815.tif 000124
2004533815.tif 000125
2004533815.tif 000126
2004533815.tif 000127
2004533815.tif 000128
2004533815.tif 000129
2004533815.tif 000130
2004533815.tif 000131
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533815.tif 000132
【国際調査報告】
2004533815.tif 000133
2004533815.tif 000134
2004533815.tif 000135
2004533815.tif 000136
2004533815.tif 000137