(57)【要約】本発明は前立腺癌、良性前立腺増殖、及び陰性診断の識別に使用される血清サンプル、その他の種類のサンプル中のＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＰＳＭＡ’（前立腺特異的膜抗原の切形種）、及びその他のマーカーの検出及び定量方法及び装置を提供する。細胞溶解物及びその他のサンプル源中の前立腺マーカーをコード化するｍＲＮＡのような核酸の診断的検出方法及び装置も提供する。これら蛋白質系及び核酸系マーカーの多様化検出／定量方法及び装置の他、本発明はバイオチップ、キット及び総合システムも含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）サンプルを、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲する少なくとも１つの、基体に結合した吸着剤に曝し、これによりサンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲する工程、及び
（ｂ）この捕獲したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’をガス相イオン分光測定により定量する工程、
を含む、サンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の定量方法。
【請求項２】
前記サンプルが血清である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、体液、細胞溶解物、精液、精液プラズマ、前立腺液、唾液、血液、リンパ液、肺／気管支洗浄物、粘液、糞、乳首分泌物、つば、涙、又は尿；の１つ以上を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞溶解物が、前立腺組織又は細胞から誘導される請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞溶解物が、一次組織又は細胞、培養組織又は細胞、正常組織又は細胞、病的組織又は細胞、良性組織又は細胞、癌組織又は細胞、唾液腺組織又は細胞、腸組織又は細胞、神経組織又は細胞、腎臓組織又は細胞、リンパ組織又は細胞、ぼうこう組織又は細胞、尿生殖組織又は細胞、腫瘍組織又は細胞、又は腫瘍新生脈管構造組織又は細胞；の１つ以上から誘導される請求項３に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）のサンプルとして使用されるＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’含有サンプル分画を採集するため、サンプル中のバイオ分子を分画する工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオ分子が、電気泳動、透析、ろ過、又は遠心；の１つ以上により分画される請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオ分子が、高性能液体クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、又は大きさ排除クロマトグラフィー；の１つ以上により分画される請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオ分子が、
（ｉ）サンプル中のバイオ分子を、各スポットが１つ以上のバイオ分子を含む一次元又は二次元のスポット配列に分離する工程、及び
（ｉｉ）ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を含むと思われる配列からスポットを選択、除去する工程、
により分画される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
該方法が、前記選択されたスポットをガス相イオン分光測定により分析する前に該選択スポット中のバイオ分子を酵素で消化する工程を更に含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
検出されたＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の量を対照と比較する工程を更に含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記捕獲したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’以外の材料を除去する工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記材料が、１つ以上の洗浄により除去される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
各洗浄が、少なくとも１つの前の洗浄に対し、同一又は異なる溶離条件を有する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
溶離条件が、ｐＨ、緩衝能力、イオン強度、水構造特性、洗剤の種類、洗浄強度、疎水性、誘電率、又は少なくとも１つの溶質の濃度；に応じて異なる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの基体結合吸着剤が、少なくとも１つのクロマトグラフィー吸着剤を含む請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのクロマトグラフィー吸着剤が、アニオン性吸着剤、カチオン性吸着剤、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、又は金属キレート化性吸着剤；の１つ以上を含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記金属キレート化性吸着剤が、ニッケル又はコバルトを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記親水性相互作用吸着剤が酸化珪素を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの基体結合吸着剤が、少なくとも１つのバイオ分子相互作用吸着剤を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのバイオ分子相互作用吸着剤が、親和性吸着剤、ポリペプチド、酵素、前立腺マーカー基体、受容体、又は抗体；の１つ以上を含む請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのバイオ分子相互作用吸着剤が、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を特異的に捕獲するモノクローナル抗体を含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの基体結合吸着剤が、基体に結合した該少なくとも１つの基体結合吸着剤を有する少なくとも１つの表面機構付きの基体を備えたバイオチップとして供給される請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つの基体結合吸着剤が、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を特異的に捕獲する少なくとも１つのモノクローナル抗体を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの基体結合吸着剤は、免疫グロブリンに特異的に結合する少なくとも１つの蛋白質を含み、また該方法は、サンプルを、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’に特異的に結合し、これによりＰＳＭＡ−又はＰＳＭＡ’−錯体を形成する免疫グロブリンに曝す工程、及び該錯体を前記少なくとも１つの基体結合吸着剤に曝す工程を含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの基体結合吸着剤が、少なくとも１つの吸着剤で誘導体化したビーズ又は樹脂を含む請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
定量したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の量を対照と比較する工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記サンプル中のＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の両方を定量する工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
定量したＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の量を互いに比較するか又は対照と比較する工程を更に含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
定量したＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の量比を対照と比較する工程を更に含む請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記サンプル中の少なくとも１つの他の前立腺マーカーを定量する工程を更に含み、工程（ａ）が該サンプルを、該少なくとも１つの他の前立腺マーカーを捕獲する少なくとも１つの基体結合吸着剤に曝す工程を更に含む請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
定量したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’及び前記少なくとも１つの他の前立腺マーカーの量を互いに比較するか、又は対照と比較する工程を更に含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの基体結合吸着剤が、基体に結合した該少なくとも１つの基体結合吸着剤を有する少なくとも１つの表面機構付きの基体を備えたバイオチップとして供給され、かつ前立腺マーカーが該少なくとも１つの表面機構上で捕獲される請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの基体結合吸着剤が複数の免疫グロブリンに特異的に結合し、また該方法がサンプルを、各々前記前立腺バイオマーカーの１つに特異的に結合する該複数の免疫グロブリンに曝し、これにより前立腺マーカーと錯体を形成する工程、及び該錯体を前記少なくとも１つの基体結合吸着剤に曝す工程を含む請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
定量したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’と前記少なくとも１つの他の前立腺マーカーとの量比を対照と比較する工程を更に含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの他の前立腺マーカーが、ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’、ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、錯化ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＰ９４、又はＰＳＣＡ；の１つ以上を含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記ガス相イオン分光測定がレーザー脱着／イオン化質量分析法である請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
（ｉ）１つ以上の質量／電荷比に対し信号の強度を表示する質量分析計により前記サンプルに関するデータを生成する工程、
（ｉｉ）該データをコンピュータ読み取り可能なフォームに変形する工程、及び
（ｉｉｉ）プログラム可能なデジタルコンピュータを操作して、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を表わす該コンピュータ読み取り可能なデータ中の信号を検出するアルゴリズムを実行する工程、
を含む請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記レーザー脱着／イオン化質量分析法が、
（ｉ）吸着剤を付着させた質量分析計との併用に適合したプローブを供給する工程、
（ｉｉ）前記サンプルを該吸着剤と接触させる工程、及び
（ｉｉｉ）該プローブからＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を脱着、イオン化して、該脱着／イオン化したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を質量分析計で検出する工程、
を含む請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記基体が、質量分析計との併用に適合したプローブ上に置くのに好適である請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記レーザー脱着／イオン化質量分析法が、
（ｉ）吸着剤を付着させた基体を供給する工程、
（ｉｉ）前記サンプルを該基体と接触させる工程、
（ｉｉｉ）前記基体を、吸着剤を付着させた質量分析計との併用に適合したプローブ上に置く工程、及び
（ｉｖ）該プローブからＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を脱着、イオン化して、該脱着／イオン化したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を質量分析計で検出する工程、
を含む請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記基体が、吸着剤で誘導体化したビーズ又は樹脂を含む請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
（ａ）被検者からのサンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を検出する工程、及び
（ｂ）この検出されたＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を前立腺癌、良性前立腺増殖、又は陰性診断の蓋然的診断と相関させる工程、
を含む、前立腺癌又は良性前立腺増殖の診断援助方法。
【請求項４４】
前記相関が、サンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の存在又は不存在と対照中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’検出頻度とを考慮する請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記相関が、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の対照量に対するサンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の量を考慮する請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
対照量を越えるＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’量が、前立腺癌の陽性診断と明確に相関され、一方、対照量未満のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’量が、良性前立腺増殖の陽性診断と明確に相関する請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記サンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の検出に、免疫アッセイが使用される請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記サンプルが血清である請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記サンプルが、体液、細胞溶解物、精液、精液プラズマ、前立腺液、唾液、血液、リンパ液、肺／気管支洗浄物、粘液、糞、乳首分泌物、つば、涙、及び尿よりなる群から選ばれる請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞溶解物が前立腺組織又は細胞から誘導される請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞溶解物が、一次組織又は細胞、培養組織又は細胞、正常組織又は細胞、病的組織又は細胞、良性組織又は細胞、癌組織又は細胞、前立腺組織又は細胞、唾液腺組織又は細胞、腸組織又は細胞、神経組織又は細胞、腎臓組織又は細胞、リンパ組織又は細胞、腫瘍組織又は細胞、又は腫瘍新生脈管構造組織又は細胞；の１つ以上から誘導される請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’をガス相イオン分光測定により検出する工程を含む請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記ガス相イオン分光測定がレーザー脱着／イオン化質量分析法である請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記レーザー脱着／イオン化質量分析法が表面強化される請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
（ｉ）１つ以上の質量／電荷比に対し信号の強度を表示する質量分析計により前記サンプルに関するデータを生成する工程、
（ｉｉ）該データをコンピュータ読み取り可能なフォームに変形する工程、及び
（ｉｉｉ）プログラム可能なデジタルコンピュータを操作して、該コンピュータ読み取り可能なデータと前立腺癌、良性前立腺増殖、又は陰性診断についての診断を示すデータとの間の適合近似性を決定するアルゴリズムを実行する工程、
を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記アルゴリズムが人工知能アルゴリズム又は発見的学習アルゴリズムを含む請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記人工知能アルゴリズムが、ファジィ論理命令セット、クラスタ分析命令セット、神経ネットワーク、又は総称アルゴリズム；の１つ以上を含む請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記レーザー脱着／イオン化質量分析法が、
（ｉ）少なくとも１つの吸着剤を付着させた基体を供給する工程、
（ｉｉ）前記サンプルを該少なくとも１つの吸着剤と接触させる工程、及び
（ｉｉｉ）該基体からＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を脱着、イオン化して、該脱着／イオン化したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を質量分析計で検出する工程、
を含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５９】
前記基体が、質量分析計との併用に適合したプローブである請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記基体が、質量分析計との併用に適合したプローブ上に置くのに好適である請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記少なくとも１つの吸着剤が、少なくとも１つのクロマトグラフィー吸着剤を含む請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記少なくとも１つのクロマトグラフィー吸着剤が、アニオン性吸着剤、カチオン性吸着剤、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、又は金属キレート化性吸着剤；の１つ以上を含む請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記金属キレート化性吸着剤が、ニッケル又はコバルトを含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記親水性相互作用吸着剤が酸化珪素を含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記少なくとも１つの吸着剤が、少なくとも１つのバイオ分子相互作用吸着剤を含む請求項５８に記載の方法。
【請求項６６】
前記少なくとも１つのバイオ分子相互作用吸着剤が、親和性吸着剤、ポリペプチド、酵素、前立腺マーカー基体、受容体、又は抗体；の１つ以上を含む請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記少なくとも１つのバイオ分子相互作用吸着剤が、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を特異的に捕獲するモノクローナル抗体を含む請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
該方法が前記サンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の両方を検出し、相関させる工程を含む請求項４３に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の存在の検出が、前立腺癌又は良性前立腺増殖の陽性診断と相関する請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記相関が、サンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の存在又は不存在と対照中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’検出頻度とを考慮する請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記相関が、ＰＳＭＡの対照量及びＰＳＭＡ’の対照量、又はそれらの比率に対するサンプル中のＰＳＭＡ量及びＰＳＭＡ’の量、又はそれらの比率を更に考慮する請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
該方法が、サンプル中の少なくとも１つの他の前立腺マーカーを検出し、相関させる工程を含む請求項４３に記載の方法。
【請求項７３】
前記少なくとも１つの他の前立腺マーカーが、ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’、ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、錯化ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＰ９４、又はＰＳＣＡ；の１つ以上を含む請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
前記ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’及び少なくとも１つの他の前立腺マーカーの存在の検出が、前立腺癌又は良性前立腺増殖の陽性診断と相関する請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記相関が、サンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’及び少なくとも１つの他の前立腺マーカーの存在又は不存在と、対照中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’及び少なくとも１つの他の前立腺マーカーの検出頻度とを考慮する請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記相関が、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’及び少なくとも１つの他の前立腺マーカーの対照量又は対照比率に対するサンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’及び少なくとも１つの他の前立腺マーカーの量又は比率を更に考慮する請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
基体に結合した少なくとも１つの吸着剤を有する少なくとも１つの表面機構付きの基体を備えたガス相イオン分光計に脱着可能に挿入できるバイオチップ。
【請求項７８】
前記基体が、ガラス、セラミック、プラスチック、磁性材料、ポリマー、有機ポリマー、導電性ポリマー、天然バイオポリマー、金属、メタロイド、合金、又は有機ポリマー塗布金属；の１つ以上を含む請求項７７に記載のバイオチップ。
【請求項７９】
前記少なくとも１つの吸着剤が、少なくとも１つの溶離条件下でサンプルからＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を分離できる請求項７７に記載のバイオチップ。
【請求項８０】
前記少なくとも１つの吸着剤が、少なくとも１つのクロマトグラフィー吸着剤を含む請求項７７に記載のバイオチップ。
【請求項８１】
前記少なくとも１つのクロマトグラフィー吸着剤が、アニオン性吸着剤、カチオン性吸着剤、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、又は金属キレート化性吸着剤；の１つ以上を含む請求項８０に記載のバイオチップ。
【請求項８２】
前記金属キレート化性吸着剤が、ニッケル又はコバルトを含む請求項８１に記載のバイオチップ。
【請求項８３】
前記親水性相互作用吸着剤が酸化珪素を含む請求項８１に記載のバイオチップ。
【請求項８４】
前記少なくとも１つの基体結合吸着剤が、少なくとも１つのバイオ分子相互作用吸着剤を含む請求項７７に記載のバイオチップ。
【請求項８５】
前記少なくとも１つのバイオ分子相互作用吸着剤が、親和性吸着剤、ポリペプチド、酵素、前立腺マーカー基体、受容体、又は抗体；の１つ以上を含む請求項８４に記載のバイオチップ。
【請求項８６】
前記少なくとも１つのバイオ分子相互作用吸着剤が、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を特異的に捕獲するモノクローナル抗体を含む請求項８４に記載のバイオチップ。
【請求項８７】
前記少なくとも１つの表面機構が、複数の表面機構を含む請求項７７に記載のバイオチップ。
【請求項８８】
前記複数の表面機構が、一列、直交配列、円形、又はｎ角形（但し、ｎは３以上）に配置される請求項８７に記載のバイオチップ。
【請求項８９】
前記複数の表面機構が論理配列又は空間配列を含む請求項８７に記載のバイオチップ。
【請求項９０】
前記複数の表面機構の各々が、同一又は異なる吸着剤もしくはそれらの１つ以上の組合せを含む請求項８７に記載のバイオチップ。
【請求項９１】
前記複数の表面機構の中の少なくとも２つが、同一又は異なる吸着剤もしくはそれらの１つ以上の組合せを含む請求項８７に記載のバイオチップ。
【請求項９２】
ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲できる前記少なくとも１つの吸着剤の他に、該複数の表面機構の１つ以上の所で基体に結合する少なくとも１つの他の吸着剤を更に含む請求項８７に記載のバイオチップ。
【請求項９３】
前記少なくとも１つの他の吸着剤が、少なくとも１つの他の前立腺マーカーを捕獲できる請求項９２に記載のバイオチップ。
【請求項９４】
前記少なくとも１つの他の前立腺マーカーが、ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’、ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、錯化ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＰ９４、又はＰＳＣＡ；の１つ以上を含む請求項９３に記載のバイオチップ。
【請求項９５】
（ａ）ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲する少なくとも１つの吸着剤、
（ｂ）該吸着剤にサンプルを曝すことによりサンプルからＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲し、この捕獲したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’をガス相イオン分光測定により定量するための命令セット、及び
（ｃ）前記吸着剤及び命令セットを収納するための少なくとも１つの容器、
を含むキット。
【請求項９６】
前記吸着剤を洗浄して前記捕獲したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’以外の材料を除去するための少なくとも１つの溶離剤を更に含む請求項９５に記載のキット。
【請求項９７】
前記少なくとも１つの吸着剤が、少なくとも１つの固体相吸着剤を含む請求項９５に記載のキット。
【請求項９８】
前記少なくとも１つの固体相吸着剤が、基体に結合した該少なくとも１つの固体相吸着剤を有する少なくとも１つの表面機構付きの基体を備えたバイオチップとして供給される請求項９７に記載のキット。
【請求項９９】
前記基体が、ガス相イオン分光計との併用に適合したプローブである請求項９８に記載のキット。
【請求項１００】
該キットが、ガス相イオン分光計との併用に適合した前記プローブを更に含む請求項９９に記載のキット。
【請求項１０１】
前記プローブが、複数の表面機構付きの基体を含む請求項１００に記載のキット。
【請求項１０２】
前記複数の表面機構の各々が、前記基体に結合した１つ以上の吸着剤を含む請求項１０１に記載のキット。
【請求項１０３】
前記複数の表面機構が、一列、直交配列、円形、又はｎ角形（但し、ｎは３以上）に配置される請求項１０１に記載のキット。
【請求項１０４】
前記複数の表面機構が論理配列又は空間配列を含む請求項１０１に記載のキット。
【請求項１０５】
前記少なくとも１つの固体相吸着剤が、少なくとも１つの吸着剤で誘導体化したビーズ又は樹脂を含む請求項９７に記載のキット。
【請求項１０６】
前記少なくとも１つの吸着剤で誘導体化したビーズ又は樹脂が、ガス相イオン分光計との併用に適合したプローブ上に置くのに好適である請求項１０５に記載のキット。
【請求項１０７】
該キットが、ガス相イオン分光計との併用に適合したプローブを更に含む請求項１０６に記載のキット。
【請求項１０８】
該キットが、少なくとも１つの基準又は対照を更に含む請求項９５に記載のキット。
【請求項１０９】
前記少なくとも１つの吸着剤が少なくとも１つのクロマトグラフィー吸着剤を含む請求項９５に記載のキット。
【請求項１１０】
前記少なくとも１つのクロマトグラフィー吸着剤が、アニオン性吸着剤、カチオン性吸着剤、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、又は金属キレート化性吸着剤；の１つ以上を含む請求項１０９に記載のキット。
【請求項１１１】
前記金属キレート化性吸着剤が、ニッケル又はコバルトを含む請求項１１０に記載のキット。
【請求項１１２】
前記親水性相互作用吸着剤が酸化珪素を含む請求項１１０に記載のキット。
【請求項１１３】
前記少なくとも１つの吸着剤が、少なくとも１つのバイオ分子相互作用吸着剤を含む請求項９５に記載のキット。
【請求項１１４】
前記少なくとも１つのバイオ分子相互作用吸着剤が、親和性吸着剤、ポリペプチド、酵素、前立腺マーカー基体、受容体、又は抗体；の１つ以上を含む請求項１１３に記載のキット。
【請求項１１５】
前記少なくとも１つのバイオ分子相互作用吸着剤が、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を特異的に捕獲するモノクローナル抗体を含む請求項１１３に記載のキット。
【請求項１１６】
該キットが、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲する前記少なくとも１つの吸着剤の他に、少なくとも１つの他の吸着剤を更に含む請求項９５に記載のキット。
【請求項１１７】
前記少なくとも１つの他の吸着剤が、少なくとも１つの他の前立腺マーカーを捕獲できる請求項１１６に記載のキット。
【請求項１１８】
前記少なくとも１つの他の前立腺マーカーが、ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’、ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、錯化ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＰ９４、又はＰＳＣＡ；の１つ以上を含む請求項１１７に記載のキット。
【請求項１１９】
（１）溶離剤で洗浄した時、前記ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ或いは少なくとも１つの他の前立腺マーカーを前記少なくとも１つの吸着剤上に保持する溶離剤、又は（２）前記少なくとも１つの吸着剤をサンプルと接触させた後、該吸着剤を溶離剤で洗浄するための命令を更に含む請求項９５に記載のキット。
【請求項１２０】
（ａ）少なくとも１つのサンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲できる少なくとも１つの吸着剤、及び
（ｂ）前記少なくとも１つの吸着剤上に捕獲したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を定量するためのガス相イオン分光計、
を備えた、少なくとも１つのサンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を定量する装置又は総合システム。
【請求項１２１】
前記ガス相イオン分光計がレーザー脱着／イオン化質量分析計である請求項１２０に記載の装置又は総合システム。
【請求項１２２】
前記ガス相イオン分光計に操作可能に接続したコンピュータ又はコンピュータ読み取り可能な媒体であって、
（ｉ）該ガス相イオン分光計により定量されたデータを分析又は処理するための少なくとも１つの命令セット、
（ｉｉ）データをデータベースに入れるための少なくとも１つの命令セット、又は
（ｉｉｉ）少なくとも１つの定量された前立腺マーカー又は定量された前立腺マーカーの組合せと、前立腺癌、良性前立腺増殖、又は陰性診断、についての診断との相関を決めるための少なくとも１つの命令セット；
の１つ以上を有する少なくとも１つのコンピュータプログラムを含む該コンピュータ又はコンピュータ読み取り可能な媒体を更に備える請求項１２０に記載の装置又は総合システム。
【請求項１２３】
前記少なくとも１つの吸着剤が少なくとも１つの固体相吸着剤を含む請求項１２０に記載の装置又は総合システム。
【請求項１２４】
前記少なくとも１つの固体相吸着剤が、基体に結合した該少なくとも１つの固体相吸着剤を有する少なくとも１つの表面機構付きの基体を備えたバイオチップとして供給される請求項１２３に記載の装置又は総合システム。
【請求項１２５】
前記基体が、ガス相イオン分光計との併用に適合したプローブである請求項１２４に記載の装置又は総合システム。
【請求項１２６】
前記基体が複数の表面機構を有する請求項１２４に記載の装置又は総合システム。
【請求項１２７】
前記複数の表面機構が、一列、直交配列、円形、又はｎ角形（但し、ｎは３以上）に配置される請求項１２６に記載の装置又は総合システム。
【請求項１２８】
前記複数の表面機構が論理配列又は空間配列を含む請求項１２６に記載の装置又は総合システム。
【請求項１２９】
前記少なくとも１つの固体相吸着剤が、少なくとも１つの吸着剤で誘導体化したビーズ又は樹脂を含む請求項１２３に記載の装置又は総合システム。
【請求項１３０】
前記少なくとも１つの吸着剤で誘導体化したビーズ又は樹脂が、ガス相イオン分光計との併用に適合したプローブ上に置くのに好適である請求項１２９に記載の装置又は総合システム。
【請求項１３１】
（ａ）サンプルを、前立腺マーカーｍＲＮＡを捕獲する少なくとも１つの吸着剤に曝し、これによりサンプル中の前立腺マーカーｍＲＮＡを捕獲する工程、及び
（ｂ）この捕獲した前立腺マーカーｍＲＮＡをガス相イオン分光測定により定量する工程、
を含む、サンプル中の前立腺マーカーｍＲＮＡの定量方法。
【請求項１３２】
前記サンプルが、前立腺組織又は細胞から誘導された細胞溶解物を含む請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記ガス相イオン分光測定がレーザー脱着／イオン化質量分析法である請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３４】
前記捕獲した前立腺マーカーｍＲＮＡの量を対照と比較する工程を更に含む請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３５】
複数の異なる前立腺マーカーｍＲＮを定量する工程を更に含む請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３６】
前記少なくとも１つの吸着剤が少なくとも１つのバイオ分子相互作用吸着剤を含む請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３７】
前記少なくとも１つのバイオ分子相互作用吸着剤が少なくとも１つの前立腺マーカーｃＤＮＡを含む請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３８】
（ａ）被検者からのサンプル中の少なくとも１つの前立腺マーカーｍＲＮＡを検出する工程、及び
（ｂ）この検出された前立腺マーカーｍＲＮＡを前立腺癌、良性前立腺増殖、又は陰性診断の蓋然的診断と相関させる工程、
を含む、前立腺癌又は良性前立腺増殖の診断援助方法。
【請求項１３９】
基体に結合した少なくとも１つの吸着剤を有する少なくとも１つの表面機構付きの基体を備えたバイオチップであって、該少なくとも１つの吸着剤は１つ以上の前立腺マーカーｍＲＮＡを捕獲できる該バイオチップ。
【請求項１４０】
（ａ）前立腺マーカーｍＲＮＡを捕獲する少なくとも１つの吸着剤、
（ｂ）該吸着剤にサンプルを曝すことによりサンプルから前立腺マーカーｍＲＮＡを捕獲し、この捕獲した前立腺マーカーｍＲＮＡをガス相イオン分光測定により定量するための命令セット、及び
（ｃ）前記吸着剤及び命令セットを収納するための少なくとも１つの容器、
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
著作権通知
３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．  １．７１（ｅ）に従って、出願人は、この開示の一部が著作権の保護を受ける資料を含むことを通知する。著作権所有者は、特許庁の特許ファイル又は記録にあるような該特許文書又は特許開示のファクシミリ複写する誰にも反対しないが、さもなければ、全ての著作権の権利を保有する。
【０００２】
関連出願への相互参照
３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．  １１９及び／又は１２０並びにその他の適用可能な法令又は規則に従って、本出願は２０００年１１月２０日出願の米国特許出願Ｎｏ．６０／２５２，４５２による利益及び優先権を主張し、この出願の開示をここに援用する。
【０００３】
連邦政府主催研究開発の下でなされた本発明に対する権利の声明
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＡ８５０６７）及びＶｉｒｇｉｎｉａ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃｅｎｔｅｒにより支持される。政府は、本発明における特定の権利を保有することができる。
【０００４】
発明の背景
前立腺癌は、男性での最も普通の非皮膚性の癌である。非組織幽閉形（ｎｏｎ−ｏｒｇａｎ−ｃｏｎｆｉｎｅｄ）の病気とは異なる非転移形の前立腺癌に対しては、特に男性ホルモン欠乏治療ができない場合、一般に、有効な治療の選択が存在する（Ｃｒａｗｆｏｒｄ等，（１９８９年）“Ａ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ａｎｄ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｆｌｕｔａｍｉｄｅ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ”，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：４１９−４２４及びＬｅｐｏｒ等，（１９８２年）“Ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｏｒｍｏｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１２８：３３５−３４０）。したがって、この病気の早期診断は必須である。
【０００５】
現在使用されている特定の前立腺癌スクリーンは、正常組織に対し非常に侵襲的（ｉｎｖａｓｉｖｅ）で、一般に早期検出するのに充分な感度に欠けている。例えばデジタル直腸検査中、内科医は直腸壁を通して前立腺を感じ取ることにより、塊状又は肥大した前立腺のような前立腺の異常を発見しようと試みる。ぼうこう鏡検査は、他の普通の侵襲的前立腺癌診断法であり、この方法も通常、早期前立腺癌の検出に充分な感度に欠けている。
【０００６】
侵襲の少ない前立腺癌診断法は、各種体液中で前立腺特異抗原（ＰＳＡ）バイオマーカーのようなマーカーの存在差を検出するというものである。診断アッセイの有効性は一般に、その特異性及び選択性による。いかなる条件に対しても真の陽性診断率及び真の陰性診断率を向上する方法は、望ましい医療目的である。前立腺癌の場合、これらの診断試験は、かなり多くの誤った陽性結果及び陰性結果を与える点で充分満足するものではない。例えばＰＳＡによるアッセイは、現在入手可能な最善のマーカーの一つと広く考えられているが、良性の前立腺疾患（例えば良性前立腺増殖（ＢＰＨ））と悪性前立腺疾患とを必ずしも正確に識別しないので、幾つかの重大な前立腺癌について誤った陰性結果を生じる可能性がある（Ｏｓｔｅｒｌｉｎｇ（１９９１年）“Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｕｓｅｆｕｌ  ｔｕｍｏｒ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ”，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１４５：９０７−９２３及びＰａｎｎｅｋ  ａｎｄ  Ｐａｒｔｉｎ（１９９８年）“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＰＳＡ  ａｎｄ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｏｆ  ｆｒｅｅ  ＰＳＡ  ｆｏｒ  ｓｔａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｓｅｍ．Ｕｒｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１６：１００−１０５）。実際に、検出、診断及び予後の向上に単一マーカーは有効ではないと、証拠は示唆している。
【０００７】
例えば一次及び転移前立腺癌における前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のような他のマーカーの存在差から、単独で又は他のマーカー（例えばＰＳＡ）と組合せて検出された前者のマーカーが前立腺癌の診断に利用できることを示している。ＰＳＭＡは、１００ｋＤａ膜貫通糖蛋白質である７５０−アミノ酸である（Ｉｓｒａｅｌｉ等，（１９９３年）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２２７−３０）である。例えば高度のＰＳＭＡ発現は前立腺組織中で検出され、一方、弱い発現は例えば免疫組織化学、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット法、及びＲＴ−ＰＣＲにより例えば脳、唾液腺、小腸、及び循環腫瘍細胞中に検出されている。例えばＩｓｒａｅｌｉ等（１９９４年）“Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｎｅｓｔｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙｓ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：６３０６−６３１０及びＷｒｉｇｈｔ等（１９９５年）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ，ｂｅｎｉｇｎ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ”，Ｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １：１８−２８参照。ＰＳＭＡは、各種サンプル中で酵素抗体法（ＥＬＩＳＡ法）を用いても検出されている。Ｓｏｋｏｌｏｆｆ等（２０００年）“Ａ  ｄｕａｌ−ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｓａｎｄｗｉｃｈ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ：ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ，ｓｅｍｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  ｕｒｉｎｅ”，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４３：１５０−１５７参照。更に、Ｎ−末端配列又は膜張り領域（ｓｐａｎｎｉｎｇ  ａｒｅａ）を欠くＰＳＭＡの切形種、即ちＰＳＭＡ’も同定されている（Ｓｕ等（１９９５年）“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＲＮＡ：ｒａｔｉｏ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：１４４１−１４４３参照。しかし、これらの方法を用いて血清中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を正確に定量するか、或いはＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’水準と前立腺癌又はＢＰＨとの相関を明確に規定するのに成功していない。
【０００８】
診断又は予後のバイオマーカーとしてのＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の臨床実用性を決めようとする努力は、体液中のＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の定量に敏感な免疫アッセイができないため、阻止されてきた。本発明は、ＰＳＭＡ及び／又はＰＳＭＡ’蛋白質、或いはコード化用核酸を定量すると共に、これら蛋白質又は核酸の電位を前立腺癌及びＢＰＨ用の診断／予後マーカーとしてアドレスする信頼性のあるシステムを提供する。本発明は更に、ＰＳＭＡ及び／又はＰＳＭＡ’の他、その他のマーカーを迅速かつ同時に検出する革新的プラットホームを提供する。これら及び他の特徴は、以下の開示について充分検討することにより明らかとなろう。
【０００９】
発明の概要
ＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’のような蛋白質及び／又はこれら蛋白質をコード化する核酸（例えばｍＲＮＡ類）は、陰性診断に対する前立腺癌（ＣａＰ）又は良性前立腺増殖においてマーカーとして機能することが発見された。陰性診断と比べてこれらマーカーは、多様に、一層頻度多く又は一層頻度少なく検出されるか、或いは示差的に検出される。患者サンプル中の単独又は組合せのこれらのマーカーを測定することにより、診断者は、前立腺癌、良性前立腺増殖又は陰性診断（例えば正常又は病気なし）と相関可能な情報が得られる。更に詳しくは、正常範囲を越えるＰＳＭＡ／ＰＳＭＡ’量ならば、前立腺癌の診断と明確に相関され、一方、正常範囲未満のＰＳＭＡ／ＰＳＭＡ’量ならば、良性前立腺増殖又は前立腺炎と明確に相関する。これらマーカーは、分子量を特徴とし、サンプルのその他の成分、例えば他の蛋白質から、例えば質量分析計と結合させたクロマトグラフィー分離により分離（ｒｅｓｏｌｖｅ）できる。好ましい実施態様では、この分離方法は、表面強化レーザー脱着／イオン化（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＳＥＬＤＩ）質量分析法を含む。この分析法では、質量分析プローブの表面は、アナライトの脱着及びイオン化用エネルギー源にアナライトを提示する際、有効な役割を演ずる。親和性捕獲表面強化レーザー脱着／イオン化による免疫アッセイは、ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’、関連する核酸の他、その他の蛋白質系前立腺マーカーを定量する能力や、多様なＰＳＭＡイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）及びその他の前立腺マーカーを同時に検出、測定する能力等、臨床診断アッセイの発展に大きな利益を与える。
【００１０】
一面では本発明は、サンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を定量する方法を提供する。この方法は、試験サンプルを分画して、ＰＳＭＡ／ＰＳＭＡ’を含むサンプルを単離する工程、及びガス相イオン分光測定を用いてこのサンプルからＰＳＭＡ／ＰＳＭＡ’を検出する工程を含む。一実施態様では、この方法は、（ａ）サンプルを、サンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲する基体結合吸着剤（基体に結合した吸着剤）に曝す工程、及び
（ｂ）この捕獲したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’をガス相イオン分光測定により定量する工程を含む。多数の異種サンプルが任意に使用されるが、好ましいサンプルとしては、血清及び細胞溶解物（例えば前立腺組織又は細胞から誘導したもの）が挙げられる。
【００１１】
一実施態様では、この方法は、工程（ａ）でサンプルとして使用されるＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’含有サンプル分画を採集するため、サンプル中のバイオ分子を分画する工程を更に含む。例えばこれらのバイオ分子は、例えば電気泳動、透析、ろ過、又は遠心等により任意に分画する。他の実施態様では、これらのバイオ分子は、高性能液体クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、又は大きさ排除（ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー等により分画する。別の実施態様ではバイオ分子は、（ｉ）サンプル中のバイオ分子を、各スポットが１つ以上のバイオ分子を含む一次元又は二次元のスポット配列に分離する工程、及び（ｉｉ）ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を含むと思われる配列からスポットを選択、除去する工程により分画する。任意にこの方法は、選択されたスポットをガス相イオン分光測定により分析する前に該選択スポット中のバイオ分子を酵素で消化する工程を更に含む。更にこの方法は通常、検出又は定量されたＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の量を対照と比較する工程を含む。
【００１２】
ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の定量方法は、その他のサンプル調製又は予備分画技術も含む。例えば（ａ）サンプルを吸着剤に曝す前に、例えば前記捕獲したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’以外の材料を除去する工程を更に任意に含む。この実施態様では、材料は通常、１つ以上の洗浄により除去される。各洗浄は、前の洗浄と同一又は異なる溶離条件を有する。例えば溶離条件は一般に、ｐＨ、緩衝能力、イオン強度、水構造特性、洗剤の種類、洗浄強度、疎水性、誘電率、又は溶質の濃度等に応じて異なる。
【００１３】
本発明は、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’のような標的とする前立腺マーカーを捕獲するため、各種の基体結合吸着剤を利用する。この基体結合吸着剤は、基体に結合した基体結合吸着剤を有する少なくとも１つの表面機構（ｆｅａｔｕｒｅ）付きの基体を備えたバイオチップとして任意に供給される。特定の実施態様では、基体結合吸着剤は、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を特異的に捕獲するモノクロナール抗体を含む。他の実施態様では、基体結合吸着剤は、免疫グロブリンに特異的に結合する少なくとも１つの蛋白質を含む。これらの実施態様では、この方法は、サンプルを、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’に特異的に結合してＰＳＭＡ−又はＰＳＭＡ’−錯体を形成する免疫グロブリンに曝す工程、及びこの錯体を基体結合吸着剤に曝す工程を含む。或いは基体結合吸着剤は、この吸着剤で誘導体化した（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）ビーズ又は樹脂を含む。
【００１４】
特定の実施態様では、この方法は、サンプル中のＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の両方を定量する工程を含む。ＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の両方をサンプル中で定量する際、この方法は通常、定量したＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の量を互いに又は対照と比較する工程も含む。この方法は、定量したＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の量比を対照と比較する工程を任意に含む。
【００１５】
他の実施態様では、この方法は、サンプル中の少なくとも１つの他の前立腺マーカーを定量する工程を更に含み、この場合、工程（ａ）も、該他の前立腺マーカーを捕獲する少なくとも１つの基体結合吸着剤にサンプルを曝す工程を含む。基体結合吸着剤は、基体に結合した該基体結合吸着剤を有する少なくとも１つの表面機構付きの基体を備えたバイオチップとして任意に供給される。ここで前立腺マーカーは、この少なくとも１つの表面機構上に捕獲される。別の実施態様では、基体結合吸着剤は、免疫グロブリンに特異的に結合する蛋白質を含む。これらの実施態様では、この方法は、サンプルを免疫グロブリンに曝す工程を含み、ここで各免疫グロブリンは前立腺マーカーの１つに特異的に結合して、前立腺マーカーと錯体を形成するものであり、更にこれらの錯体を基体結合吸着剤に曝す工程を含む。その他の前立腺マーカーとしては通常、例えばＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、遊離ＰＳＡ、錯化ＰＳＡ、前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異的ペプチド９４（ＰＳＰ９４）、又は前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）等が挙げられる。この実施態様では、該方法は一般に、定量したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’及び他の前立腺マーカーの量を互いに又は対照と比較する工程を含む。或いはこの方法は、定量したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の量と他の前立腺マーカーの量との比を対照と比較する工程を更に含む。
【００１６】
好ましい実施態様では、ガス相イオン分光測定は、レーザー脱着／イオン化質量分析法、例えば表面強化レーザー脱着／イオン化質量分析法である。例えばこの方法は、（ｉ）１つ以上の質量／電荷比に対し信号の強度を表示する質量分析計により前記サンプルに関するデータを生成する工程、（ｉｉ）このデータをコンピュータ読み取り可能なフォームに変形する工程、及び（ｉｉｉ）プログラム可能なデジタルコンピュータを操作して、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を表わすコンピュータ読み取り可能なデータ中の信号を検出するアルゴリズムを実行する工程を含む。
【００１７】
一実施態様では、レーザー脱着／イオン化質量分析法は、（ｉ）吸着剤を付着させた質量分析計との併用に適合したプローブを供給する工程、（ｉｉ）サンプルをこの吸着剤と接触させる工程、及び（ｉｉｉ）プローブからＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を脱着、イオン化して、この脱着／イオン化したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を質量分析計で検出する工程を含む。基体は任意に、質量分析計との併用に適合したプローブを有するか、或いは質量分析計との併用に適合したプローブ上に置くのに好適である。
【００１８】
別の実施態様では、レーザー脱着／イオン化質量分析法は、（ｉ）吸着剤を付着させた基体を供給する工程、（ｉｉ）サンプルをこの吸着剤と接触させる工程、（ｉｉｉ）この基体を、吸着剤を付着させた質量分析計との併用に適合したプローブ上に置く工程、及び（ｉｖ）プローブからＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を脱着、イオン化して、この脱着／イオン化したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を質量分析計で検出する工程を含む。例えば基体は通常、吸着剤で誘導体化したビーズ又は樹脂を含む。
【００１９】
本発明は、前立腺癌又は良性前立腺増殖の診断の際の援助方法にも関する。この方法は、（ａ）被検者からのサンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を検出する工程、及び（ｂ）この検出されたＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を前立腺癌、良性前立腺増殖、又は陰性診断の蓋然的診断と相関させる工程を含む。この相関は一般に、サンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の存在又は不存在と対照中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の検出頻度とを考慮する。更にこの相関は通常、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の対照量に対するサンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の量も考慮する。例えば対照量を越えるＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’量ならば、前立腺癌の陽性診断と明確に相関され、一方、対照量未満のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’量ならば、良性前立腺増殖の陽性診断と明確に相関する。他の実施態様では、サンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の検出に免疫アッセイが使用される。
【００２０】
特定の実施態様では、この方法は、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’をガス相イオン分光測定により検出する工程を含む。好ましい実施態様では、ガス相イオン分光測定は、レーザー脱着／イオン化質量分析法、例えば表面強化レーザー脱着／イオン化質量分析法である。この方法は通常、（ｉ）１つ以上の質量／電荷比に対し信号の強度を表示する質量分析計により前記サンプルに関するデータを生成する工程、（ｉｉ）このデータをコンピュータ読み取り可能なフォームに変形する工程、及び（ｉｉｉ）プログラム可能なデジタルコンピュータを操作して、コンピュータ読み取り可能なデータと前立腺癌、良性前立腺増殖、又は陰性診断についての診断を示すデータとの間の適合近似性を決定するアルゴリズムを実行する工程を含む。このアルゴリズムは、人工知能アルゴリズム又は発見的学習アルゴリズムを任意に含む。例えば人工知能アルゴリズムは通常、ファジィ論理命令セット、クラスタ分析命令セット、神経ネットワーク、又は総称アルゴリズム等を含む。
【００２１】
一面では、レーザー脱着／イオン化質量分析法は、（ｉ）少なくとも１つの吸着剤を付着させた基体を供給する工程、（ｉｉ）サンプルをこの吸着剤と接触させる工程、及び（ｉｉｉ）基体からＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を脱着、イオン化して、この脱着／イオン化したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を質量分析計で検出する工程を含む。一実施態様では、基体は質量分析計との併用に適合したプローブである。別の実施態様では、基体は、質量分析計との併用に適合したプローブ、例えば吸着剤で誘導体化したビーズ又は樹脂上に置くのに好適である。各種のクロマトグラフィー吸着剤又はバイオ分子相互作用吸着剤が任意に利用される。
【００２２】
一実施態様では、この方法は、サンプル中のＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の両方を検出し、相関させる工程を含む。検出されたＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の存在は通常、例えば前立腺癌又は良性前立腺増殖の陽性診断と相関する。別の実施態様では、この相関は、サンプル中のＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の存在又は不存在と対照中のＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の検出頻度とを考慮する。この実施態様では、相関は、ＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の対照量又は量比に対するサンプル中のＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の量又は量比を考慮する。
【００２３】
別の実施態様では、この方法は、サンプル中の少なくとも１つの他の前立腺マーカーを検出し、相関させる工程を含む。他の前立腺マーカーとしては通常、例えばＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’、ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、錯化ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＰ９４、又はＰＳＣＡ等が挙げられる。例えば検出されたＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’及び他の前立腺マーカーの存在は通常、例えば前立腺癌又は良性前立腺増殖の陽性診断と相関する。一面では、この相関は、サンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’及び他の前立腺マーカーの存在又は不存在と対照中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’及び他の前立腺マーカーの検出頻度とを考慮する。この相関は任意に、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’及び他の前立腺マーカーの対照量又は量比に対するサンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’及び他の前立腺マーカーの量又は量比も考慮する。
【００２４】
本発明は、基体に結合した少なくとも１つの吸着剤を有する少なくとも１つの表面機構付きの基体を備えたガス相イオン分光計に脱着可能に挿入できるバイオチップも提供する。この吸着剤は、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲可能でる。吸着剤は通常、少なくとも１つの溶離条件下でサンプルからＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を分離できる。各種のクロマトグラフィー吸着剤又はバイオ分子相互作用吸着剤が任意に利用される。一実施態様では、バイオチップの少なくとも１つの表面機構は、複数の表面機構を有する。例えば複数の表面機構は、一列、直交配列、円形、又はｎ角形（但し、ｎは３以上）に配置される。複数の表面機構は通常、論理配列又は空間配列を有する。複数の表面機構の各々は、同一又は異なる吸着剤もしくはそれらの１つ以上の組合せを任意に含む。例えば複数の表面機構の中の少なくとも２つは、同一又は異なる吸着剤もしくはそれらの１つ以上の組合せを任意に有する。特定の実施態様では、バイオチップは、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲できる吸着剤の他に、少なくとも１つの他の吸着剤を更に有する。ここで他の吸着剤は、複数の表面機構の１つ以上の所で基体に結合している。他の吸着剤は通常、少なくとも１つの他の前立腺マーカー、例えばＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’、ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、錯化ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＰ９４、又はＰＳＣＡ等を捕獲できる。
【００２５】
本発明は、（ａ）ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲する少なくとも１つの吸着剤、（ｂ）この吸着剤にサンプルを曝すことによりサンプルからＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲し、この捕獲したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’をガス相イオン分光測定により定量するための命令セット、及び（ｃ）前記吸着剤及び命令セットを収納するための少なくとも１つの容器を含むキットも提供する。このキットは、吸着剤を洗浄して前記捕獲したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’以外の材料を除去するための少なくとも１つの溶離剤も任意に含む。吸着剤は通常、少なくとも１つの固体相吸着剤を含む。一実施態様では、固体相吸着剤は、基体に結合した該固体相吸着剤を有する少なくとも１つの表面機構付きの基体を備えたバイオチップとして供給される。この基体は一般に、ガス相イオン分光計との併用に適合したプローブである。キットは、このプローブを任意に有する。特定の実施態様では、プローブは、複数の表面機構付きの基体を有する。例えば複数の表面機構の各々は、基体に結合した１つ以上の吸着剤を任意に有する。他の実施態様では、固体相吸着剤は、吸着剤で誘導体化したビーズ又は樹脂を含む。例えば、吸着剤で誘導体化したビーズ又は樹脂は通常、ガス相イオン分光計との併用に適合したプローブ上に置くのに好適である。キットは、このプローブも任意に含む。他の選択として、キットは少なくとも１つの基準又は対照を含む。
【００２６】
本発明は、（ａ）少なくとも１つのサンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲できる少なくとも１つの吸着剤、及び（ｂ）この吸着剤上に捕獲したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を定量するためのガス相イオン分光計を備えた、少なくとも１つのサンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を定量する装置又は総合システムも提供する。ガス相イオン分光計は任意に、レーザー脱着／イオン化質量分析計である。この装置又は総合システムは通常、ガス相イオン分光計に操作可能に接続したコンピュータ又はコンピュータ読み取り可能な媒体であって、例えば（ｉ）ガス相イオン分光計により定量されたデータを分析又は処理するための少なくとも１つの命令セット、（ｉｉ）データをデータベースに入れるための少なくとも１つの命令セット、又は（ｉｉｉ）少なくとも１つの定量された前立腺マーカー又は定量された前立腺マーカーの組合せと、前立腺癌、良性前立腺増殖、又は陰性診断、についての診断との相関を決めるための少なくとも１つの命令セット；の１つ以上を有する少なくとも１つのコンピュータプログラムを含む該コンピュータ又はコンピュータ読み取り可能な媒体も備える。
【００２７】
本発明は、サンプル中の前立腺マーカーｍＲＮＡの定量方法も提供する。この方法は、（ａ）サンプルを、前立腺マーカーｍＲＮＡを捕獲する少なくとも１つの吸着剤に曝し、これによりサンプル中の前立腺マーカーｍＲＮＡを捕獲する工程、及び（ｂ）この捕獲した前立腺マーカーｍＲＮＡをガス相イオン分光測定により定量する工程を含む。サンプルとしては、例えば前立腺組織又は細胞から誘導された細胞溶解物があり、一方、吸着剤（例えばバイオ分子相互作用吸着剤）としては一般に、例えば前立腺マーカーｍＲＮＡに対応する前立腺マーカーｃＲＮＡがある。好ましい実施態様では、ガス相イオン分光測定は、レーザー脱着／イオン化質量分析法である。更にこの方法は通常、捕獲した前立腺マーカーｍＲＮＡの量を対照と比較する工程も含む。この方法は任意に、複数の異なる前立腺マーカーｍＲＮを定量する工程を含む。
【００２８】
本発明は、前立腺マーカーｍＲＮＡの検出、定量に関連する別の方法、バイオチップ、及びキットにも関する。例えば（ａ）被検者からのサンプル中の少なくとも１つの前立腺マーカーｍＲＮＡを検出する工程、及び（ｂ）この検出された少なくとも１つの前立腺マーカーｍＲＮＡを前立腺癌、良性前立腺増殖、又は陰性診断の蓋然的診断と相関させる工程を含む。バイオチップは、基体に結合した少なくとも１つの吸着剤を有する少なくとも１つの表面機構付きの基体を含むもので、この吸着剤は、１つ以上の前立腺マーカーｍＲＮＡを捕獲できる。キットは、（ａ）前立腺マーカーｍＲＮＡを捕獲する少なくとも１つの吸着剤、（ｂ）この吸着剤にサンプルを曝すことによりサンプルから前立腺マーカーｍＲＮＡを捕獲し、この捕獲した前立腺マーカーｍＲＮＡをガス相イオン分光測定により定量するための命令セット、及び（ｃ）前記吸着剤及び命令セットを収納するための少なくとも１つの容器を含む。
【００２９】
図面の簡単な説明
図１は、表面強化レーザー脱着／イオン化用に構成した表面強化レーザー脱着／イオン化飛行時間（ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ）質量分析システムの概略図である。
【００３０】
図２は、ＰＳＭＡ表面強化レーザー脱着／イオン化質量分析免疫アッセイを概略的に示す。
【００３１】
図３は、表面強化レーザー脱着／イオン化飛行時間質量分析技術の概略説明図である。
【００３２】
図４Ａ〜Ｃは、血清中のＰＳＭＡを定量するための表面強化レーザー脱着／イオン化質量分析免疫アッセイを示す。結合したＭｏＡｂ  ７Ｅ１１を含む予め活性化したＰＳ−１  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）配列に各種濃度のｒＰＳＭＡ又は血清を塗布（ａｐｐｌｙ）した後、これらのチップを洗浄し、表面強化レーザー脱着／イオン化質量分析を行った。図４Ａは、強度及びピークの両面積の増大が蛋白質濃度の増大と相関したことを示す各種ｒＰＳＭＡ濃度（１〜５０ｎｇ／μｌ）でのスペクトル図である。図４Ｂは、ｒＰＳＭＡの標準曲線を示す。図４Ａに示した各スペクトルの組換えＰＳＭＡ信号強度は、内標準（β−ガラクトグロブリン、２５ｆｍｏｌ／μｌ）に正規化した。このピーク比（ｒＰＳＭＡ／内標準）対ｒＰＳＭＡ蛋白質濃度をプロットすることにより、直線的は曲線が得られた。３つの別個の質量スペクトルの平均及び標準偏差を示す。図４Ｃは、前立腺癌（ＰＣＡ）と診断された患者からの血清サンプル中に検出されたＰＳＭＡを示す。この分析法は、正規化のための内標準として１００ｆｍｏｌ／μｌのβ−ガラクトグロブリンをスパイク（ｓｐｉｋｅ）した他は、ｒＰＳＭＡ標準曲線の形成に用いた方法と同じである。全血清蛋白の倍加（ｄｏｕｂｌｉｎｇ）希釈（即ち１０、２０、４０μｇ／μｌ）は、直線的回帰（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）を示す。３つの別個の質量スペクトルの平均及び標準偏差を示す。
【００３３】
図５は、前立腺炎、前立腺癌（ＰＣＡ）、良性前立腺増殖（ＢＰＨ）、及び正常又は陰性診断のいずれかの患者から取ったサンプルについて、親和性捕獲表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイにより測定した血清ＰＳＭＡ水準を示す図である。陰性診断の患者は、５０才未満（＜５０）の男性及び５０才を越える男性（＞５０）という年齢を基準とした２つの下位グループに分けた。各患者グループについて示した棒線は、当該グループについての平均ＰＳＭＡ水準を表す。
【００３４】
図６Ａ、６Ｂは、ヒトの男性ホルモン依存前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）からの全細胞溶解物における親和性捕獲表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイによるＰＳＭＡイソフォーム（ｉｓｏｆｏｒｍ）の検出を示す質量スペクトル図である。図６Ａは、ＬＮＣａＰ全細胞溶解物（Ａｇ）＋：添加したＬＮＣａＰ全細胞溶解物；−：希釈緩衝液のみ（ＰＢＳ中０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中のＰＳＭＡを捕獲するため、７Ｅ１１又は１０７抗体を用いて得られたスペクトルを示す。図６Ｂは、ＰＳ−１表面上とＰＳ−２表面上とのＰＳＭＡイソフォームの標準曲線の比較を示す。くさび形は、使用したＬＮＣａＰ全細胞溶解物（６ｎｇ／μｌ、１２ｎｇ／μｌ、２５ｎｇ／μｌから５０ｎｇ／μｌまで）の相対量を表す。高い方の質量／電荷比での矢印は、１００ｋＤのＰＳＭＡイソフォームを表し、一方、低い質量／電荷比での矢印は、８９ｋＤのＰＳＭＡ’イソフォームを表す。
【００３５】
図７Ａ〜Ｈは精液プラズマ中のＰＳＭＡ及びＰＳＡを検出するための複合（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）免疫アッセイを示す。
【００３６】
定義
特に定義しない限り、ここで使用した科学技術用語は、本発明の技術分野に属する当業者ならば普通に理解される意味を有する。以下の文献は、本発明で使用される多数の用語についての一般的な定義を当業者に与えるものである。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ等，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（第２編、１９９４年）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８年）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，第５編、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ等（編），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１年）；及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１年）。ここで使用した以下の用語は、特に規定しない限り、これらの文献によるものである。
【００３７】
“前立腺癌”とは、男性前立腺における細胞の制御不能（悪性）の成長を云う。前立腺は、ぼうこうの基部において尿道を囲み、排尿の制御を助けると共に、精液中の幾つかの成分を形成する責任がある。前立腺癌は通常、その攻撃性及び周囲の前立腺組織とは異なる程度を基準にして分類又は段階化（ｓｔａｇｅ）される。腫瘍の病期分類（ｓｔａｇｅ）には、Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−Ｊｅｗｅｔｔシステム、Ｔ分類、Ｇｌｅａｓｏｎスコア等の数種の異なる方法がある。例えばＺｅｇａｒｓ等（１９９４年）“Ｔｈｅ  Ｔ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．  Ａｎ  ａｐｐｒａｉｓａｌ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｃａｎｃｅｒ  ７３（７）：１９０４−１９１２参照。Ｗｈｉｔｍｏｒｅ−Ｊｅｗｅｔｔシステムに従って説明すると、前立腺癌は、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ病期システムを用いて病期分類される。この病期システムは、幾つかの下位病期分類を含むが、基本的には腫瘍を規模：（Ａ）触診できないが、顕微鏡生態組織検査で検出可能な腫瘍、（Ｂ）前立腺に限定された触診可能な腫瘍、（Ｃ）離れた転移はないが、前立腺を越えて広がった腫瘍、及び（Ｄ）局部リンパ節まで広がった腫瘍を用いて分類される。前立腺癌は通常、精液小胞、ぼうこう、及び腹腔凹みに拡大することにより広がり、リンパ節、骨、肺、肝臓、及び腎臓に転移する。前立腺癌に対する治療の選択には一般に、放射線療法、外科手術、ホルモン療法、及び化学療法がある。
【００３８】
“良性前立腺増殖”又は“ＢＰＨ”とは、前立腺の悪性ではない（癌性ではない）拡大をいう。前立腺肥大や、前立腺結節性過形成としても知られている。ＢＰＨでは、前立腺の正常エレメントは、大きさ及び数が増大する。癌の切り立った塊は、尿道を含み、ぼうこうからの尿の流れを邪魔する。これにより尿が残留し、瀕尿となる。ひどい場合は、完全な閉塞が起こる可能性がある。ＢＰＨの医学療法は、フィナステライド（ｆｉｎａｓｔｅｒｉｄｅ）やテラゾシン（ｔｅｒａｚｏｓｉｎ）のような薬剤を含む。ＢＰＨでの前立腺拡大は、前立腺中の主な男性ホルモンであるジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に直接依存する。フィナステライド（ＰＲＯＳＣＡＲ（登録商標））は、ＤＨＴを作るのに必要な酵素を遮断して、血液及び組織のＤＨＴ水準を低下させると共に、前立腺の大きさ減少を助ける。テラゾシン（ＨＹＴＲＩＮ（登録商標））は、動脈、前立腺、及びぼうこう頚部の平滑筋を和らげるアルファ１遮断薬と呼ばれる投薬の部類に属する。ぼうこう頚部周囲の平滑筋を和らげると、ＢＰＨの拡大した前立腺による尿閉塞を軽減する働きがある。
【００３９】
“血清”又は“血液血清”とは、凝固後に残る身体の液体（例えば血液から）の水部分を云う。例えば通常、プラズマから例えば凝血形成によりフィブリノゲン、プロトロンビン、及びその他の凝血因子を除去した後に残存する透明な淡黄色液体である。
【００４０】
本発明で“マーカー”又は“バイオマーカー”とは、陰性診断又は検出不能の癌を持った人のような対照被験者（例えば正常又は健康な被験者）から取った比較用サンプルと比べて、前立腺癌又は良性前立腺増殖の患者から取ったサンプル中に示差的に存在する有機バイオ分子、例えばポリペプチド又は核酸（例えばｍＲＮＡ等）を云う。例えばマーカーは、陰性診断の患者のサンプルに比べて、前立腺癌患者のサンプル中に高いか低い水準で存在するポリペプチド又は核酸（特定の明確な分子量を有する）であってよい。
【００４１】
語句“示差的に存在する”とは、前立腺癌のない患者（例えば良性前立腺増殖又は陰性診断の患者）から取った比較用サンプルに比べて、前立腺癌の患者から取ったサンプル中に存在するマーカー、例えばポリペプチド又は核酸（例えば特定の明確な分子量のもの）の量及び／又は頻度についての相違を云う。例えばマーカーは、対照被験者からのサンプルに比べて、前立腺癌又はＢＰＨ患者からのサンプル中に高いか低い水準で存在するポリペプチド又は核酸（例えばｍＲＮＡ等）であってよい。或いはマーカーは、対照被験者からのサンプルに比べて、前立腺癌又はＢＰＨ患者からのサンプル中に高い頻度又は低い頻度で検出されるポリペプチド又は核酸であってよい。マーカーは、量、頻度又はその両方に換算して示差的に存在してよい。
【００４２】
２つのサンプル（例えば２セットのサンプル）の一方のサンプル中にバイオマーカー、例えばポリペプチド又は核酸の検出頻度が、他方のサンプル（又は他方のセットのサンプル）及び／又は対照サンプル中のポリペプチド又は核酸の検出頻度よりも充分、有意差がある（高いか低い）ならば、２つのサンプル間にマーカーが示差的に存在する。２セットのサンプルは、例えば学生のｔ−試験を用いて比較でき、Ｐ＜０．０５では有意差ありとみなし得る。別の例では、一方のセットのサンプル中のポリペプチド又は核酸が、他方のセットのサンプルよりも少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％、多い頻度又は少ない頻度で検出されれば、これら２セットのサンプル間にポリペプチド又は核酸が示差的に存在する。
【００４３】
或いは又は更に、一方のサンプル中のポリペプチド又は核酸の量が、他方のサンプル中のポリペプチド又は核酸の量と充分、有意差があれば、これら２つのサンプル間にポリペプチド又は核酸が示差的に存在する。例えば一方のサンプル中にポリペプチド又は核酸が、他方のサンプル中に存在するポリペプチド又は核酸よりも少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％、多く存在するか、或いはポリペプチド又は核酸が一方のサンプル中に検出できるが、他方のサンプル中に検出できないならば、これら２つのサンプル間にポリペプチド又は核酸が示差的に存在する。前立腺癌のない被験者（例えば良性前立腺増殖患者）に比べて、前立腺癌の患者から取ったサンプル中に示差的に存在するいかなるポリペプチド又は核酸もマーカーとして使用できる。
【００４４】
“診断”とは、病理学条件の存在又は性質を同定することを意味する。診断方法は、感度及び特異性が異なる。診断アッセイの“感度”は、陽性の試験を受ける疾病個人の百分率（“真陽性”の百分率）である。診断アッセイで検出されなかった疾病個人は、“偽陰性”である。疾病がなく、かつ診断アッセイで陰性の試験を受ける被験者は、“真陰性”と云う。診断アッセイの“特異性”は、１−偽陽性率である。ここで“偽陽性”率は、陽性の試験を受ける疾病のない被験者の割合と定義する。特定の診断方法は、条件の最終的な診断を与えないかも知れないが、診断の助けとなる明確な指示を与えるならば充分である。
【００４５】
マーカーの“試験量”とは、試験するサンプル中に存在するマーカーの量を云う。試験量は、絶対量（例えばμｇ／ｍｌ）、相対量（例えば信号の相対強度）のいずれでもよい。
【００４６】
マーカーの“診断量”とは、前立腺癌又は良性前立腺増殖の診断と一致する被験者サンプル中のマーカーの量である。診断量は、絶対量（例えばμｇ／ｍｌ）、相対量（例えば信号の相対強度）のいずれでもよい。
【００４７】
マーカーの“対照量”は、マーカーの試験量に対して比較すべきいかなる量又は量範囲であってもよい。例えばマーカーの対照量は、前立腺癌患者、ＢＰＨ患者或いは前立腺癌又はＢＰＨのない者中のマーカー（例えばＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’、又はＰＳＭＡ  ｍＲＮＡ等）の量であってよい。対照量は、絶対量（例えばμｇ／ｍｌ）、相対量（例えば信号の相対強度）のいずれでもよい。
【００４８】
“プローブ”とは、ガス相イオン分光計に脱着可能に挿入できる装置であって、検出用のマーカーを提示（ｐｒｅｓｅｎｔ）するための表面又は１つ以上の表面機構を有する基体を含む該装置を云う。プローブは、単一基体又は複数の基体を含むことができる。ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）配列、バイオチップ、又はチップのような用語も特定種類のプローブと称して、ここで使用される。
【００４９】
“基体”又は“プローブ基体”とは、（例えば付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、又は堆積等により）相表面に吸着剤を付与できる固体相を云う。“表面機構”とは、基体表面に吸着剤を付与できる基体又はプローブ基体の特定の部分、区画（ｓｅｃｔｉｏｎ）、又は領域（ａｒｅａ）を云う。
【００５０】
“吸着剤”とは、マーカーを吸着できるあらゆる材料を云う。用語“吸着剤”は、マーカーを曝す単一材料（“単独吸着剤”）（例えば１つの化合物又は官能基）と称し、またマーカーを曝す複数の異なる材料（“複合吸着剤”）と称して、ここで使用される。複合吸着剤での吸着材料は、“吸着剤種”と云う。例えばプローブ基体上の表面機構は、異なる結合特性を有する多数の異なる吸着剤種（例えばイオン交換材料、金属キレート化剤、抗体、又はｃＤＮＡ等）を特徴とする複合吸着剤を含有してよい。基体材料自体もマーカーの吸着に寄与することができ、“吸着剤”の一部とみなしてよい。親和性吸着剤、ポリペプチド、酵素、前立腺マーカー基体、受容体、又は抗体（例えばモノクローナル抗体等）等のような“バイオ分子相互作用吸着剤”又は“バイオ特異的吸着剤”は通常、例えばアニオン性吸着剤、カチオン性吸着剤、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、又は金属キレート化性吸着剤等を含む“クロマトグラフィー吸着剤”よりも、標的マーカーに対し高度の特異性を有する。
【００５１】
“吸着”、“捕獲”、又は“保持（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）”は、溶離剤（ｅｌｕａｎｔ）（選択率限界改質剤）又は洗浄溶液で洗浄する前又は後の吸着剤とマーカーとの検出可能な結合を云う。
【００５２】
“溶離剤”又は“洗浄溶液”とは、マーカーの吸着剤への吸着を解消する（ｍｅｄｉａｔｅ）ために使用できる試剤を云う。溶離剤及び洗浄溶液は、“（選択率限界改質剤）”とも云う。溶離剤及び洗浄溶液は、プローブ基体表面から未結合の材料を洗浄、除去するために使用できる。
【００５３】
“分離する”、“分離性（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）”、又は“マーカーの分離性”とは、サンプル中の少なくとも１つのマーカーの検出を云う。分離性は、分離及び引き続く示差検出によりサンプル中の複数のマーカーを検出することを含む。分離性は、混合物中の他の全てのマーカーから１つのマーカーを完全に分離することを必要としない。むしろ、少なくとも２つのマーカー間の識別が可能な分離ならばいかなる分離でも充分である。
【００５４】
“ガス相イオン分光計”とは、サンプルを揮発させ、イオン化する時に形成されたイオンの質量対電荷比に翻訳可能なパラメーターを測定する装置を云う。一般に関連するイオンは、単一の電荷を持ち、質量対電荷比は、単に質量と云うことが多い。ガス相イオン分光計としては、例えば質量分析計、イオン易動度分光計、及び全イオン流測定装置が挙げられる。
【００５５】
“質量分析計”とは、入口システム、イオン化源、イオン光学アッセンブリー、質量解析器、及び検出器を備えたガス相イオン分光計を云う。
【００５６】
“レーザー脱着質量分析計”とは、アナライトを脱着し、揮発させ、イオン化する手段としてレーザーを用いる質量分析計を云う。
【００５７】
“検出する”とは、検出すべき対象物の存在、不存在又は量を同定することを云う。
【００５８】
用語“ポリペプチド”、“ペプチド”及び“蛋白質”は、アミノ酸残留物のポリマーと称して、ここでは交換可能に使用される。これらの用語は、天然産のポリマーに適用するばかりでなく、１つ以上のアミノ酸残留物が、相当する天然産のアミノ酸の類似体、誘導体又は模倣品（ｍｉｍｅｔｉｃ）であるアミノ酸ポリマーにも適用する。例えばポリペプチドは、例えば炭水化物残留物の付加により変性又は誘導して糖蛋白質を形成することができる。用語“ポリペプチド”、“ペプチド”及び“蛋白質”は、非糖蛋白質ばかりでなく、糖蛋白質も含む。
【００５９】
“誘導体”とは、構造的に他の１つの物質に関連する化学物質、或いは例えば化学的又は酵素的変性により、他の１つの物質から作る（即ち、この物質から誘導する）ことができる化学物質を云う。
【００６０】
用語“核酸”とは、ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ等）及びＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ等）を云う。これらは、それぞれデオキシリボ核酸及びリボヌクレオチド（又はそれらの誘導体）のポリマー又はオリゴマーである。２つの核酸配列は、同じ配列を持つか、或いは一方の核酸配列が少なくとも他方の核酸配列に対し相補的な関係にあれば、“相当する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ）”。例えばＰＳＭＡをコード化するｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより得られるｃＤＮＡは、このｍＲＮＡに相当する。
【００６１】
“前立腺マーカーｃＤＮＡ”とは、ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’、ＰＳＡ、前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異的ペプチド９４（ＰＳＰ９４）、又は前立腺幹細胞抗原等の前立腺マーカーをコード化するｍＲＮＡに相当するｃＤＮＡを云う。本発明では前立腺マーカーｃＤＮＡは通常、選択されたサンプル源からガス相イオン分光測定（例えば表面強化レーザー脱着／イオン化）により、相当するｍＲＮＡを検出、定量するための吸着剤として使用する。前立腺マーカーｃＤＮＡは通常、ＲＴ−ＰＣＲ等を用いて生成させる。
【００６２】
“検出可能部分”又は“標識”とは、分光測定、光化学、生化学、免疫化学、又は化学手段により検出可能な組成を云う。例えば有用な標識としては、３２Ｐ、３５Ｓ、蛍光染料、高電子密度試薬、酵素（例えばＥＬＩＳＡに普通用いられているような酵素）、ビオチン−ストレプトアバジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａｄｉｎ）、ジオキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）、抗血清又はモノクローナル抗体が役立つハプテン及び蛋白質、又は標的に対し相補的配列を有する核酸分子が挙げられる。検出可能部分は、放射性、色原体、又は蛍光の信号のような測定可能又は検出可能な信号を発生することが多い。これらの信号は、サンプル中の結合した検出可能部分を定量するために使用される。検出可能部分は、共有結合により、或いはイオン結合、ファンデルワールス結合又は水素結合によりプライマー又はプローブに導入又は付着させることができる（例えば放射性ヌクレオチドの導入、又はストレプトアバジンにより認識されるビオチニル化ヌクレオチドの導入）。検出可能部分は、直接又は間接的に検出可能にしてよい。間接的検出は、検出可能部分への第二の直接又は間接的検出部分の結合を含む。例えば検出可能部分は、ストレプトアバジン用の結合パートナーであるビオチン、又は相補的配列用の結合パートナーであるヌクレオチド配列のような結合パートナーのリガンドであってよく、このような結合パートナーに特異的にハイブリダイズできる。結合パートナー自体、直接検出可能であってもよく、例えば抗体自体、蛍光分子で標識してよい。結合パートナーは、間接的に検出可能でもよく、例えば相補的配列を有する核酸は、分岐したＤＮＡ分子の一部であってよく、他の標識した核酸分子とのハイブリダイズ化により同様に検出可能である。（例えばＰ．Ｄ．Ｆａｈｒｌａｎｄｅｒ及びＡ．Ｋｌａｕｓｎｅｒ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１６５（１９８８年）参照。）信号の定量は、例えばシンチレーションカウント、デンシトメトリー、又はフロー（ｆｌｏｗ）サイトメトリーにより実施される。
【００６３】
“抗体”とは、エピトープ（例えば抗原）に特異的に結合し、認識する１つ又は複数の免疫グロブリン遺伝子、或いはそれらの断片により実質的にコード化されたポリペプチドリガンドを云う。認識された免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ及びラムダ軽鎖一定（ｃｏｎｓｔａｎｔ）領域遺伝子；アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー重鎖一定領域遺伝子；及び無数の免疫グロブリン可変（ｖａｒｉａｂｌｅ）領域遺伝子が挙げられる。抗体は、例えば完全な免疫グロブリンとして存在するか、或いは各種ペプチダーゼの消化により得られる多数の適切に特徴化された断片として存在する。断片としては、例えばＦａｂ’及びＦ（ａｂ）’２ 断片がある。ここで使用した用語“抗体”は、全抗体の変性により得られる抗体断片、又は組換え型ＤＮＡ方法論を用いて新生合成した抗体断片も含む。また、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、人間化した抗体、又は単鎖抗体も含む。抗体の“Ｆｃ”部分とは、１つ以上の重鎖一定領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むが、重鎖可変領域を含まない免疫グロブリン重鎖の部分を云う。
【００６４】
“免疫アッセイ”は、特異的に抗原に結合させるために抗体を用いるアッセイである。免疫アッセイの特徴は、抗原を単離し、標的とし、及び／又は定量するため、特定抗体の特異的結合特性を使用することである。
【００６５】
蛋白質又はペプチドに言及する際、抗体に語句“特異的に（又は選択的に）結合する”又は“特異的に（又は選択的に）免疫反応する”とは、蛋白質及び他の生化学的薬剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃ）の不均質なグループにおいて、蛋白質の存在に決定力がある結合反応を云う。したがって、指定された免疫アッセイ条件下では、特異抗体は、バックグラウンドの少なくとも約２倍、特定の蛋白質に結合し、サンプル中に存在する他の蛋白質には実質的に有意な量で結合しない。このような条件下での抗体への特異的結合には、特定の蛋白質に対する特異性のために選択された抗体が必要である。ラット、マウス、又はヒトのような特異種から、例えばＰＳＭＡ、又はＰＳＭＡ’等に対し提起されたポリクローナル抗体は、例えばＰＳＭＡ、又はＰＳＭＡ’等と特異的に免疫反応するが、精液塩基性蛋白質の多形変種及び対立遺伝子を除く、他の蛋白質とは特異的に免疫反応しないポリクローナル抗体だけを得るように選択できる。この選択は、他の種から、例えばＰＳＭＡ、又はＰＳＭＡ’等と相互（ｃｒｏｓｓ）反応する抗体を控除することにより実施できる。特定の蛋白質と特異的に免疫反応する抗体を選択するため、各種の免疫アッセイフォーマットが使用できる。例えば蛋白質と特異的に免疫反応する抗体を選択するため、固体相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが日常的に使用される（特異的免疫反応性の測定に使用できる免疫アッセイフォーマット及び条件の説明については、例えばＨａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９８年）参照）。通常、特異的又は選択的反応は、バックグラウンド信号又はノイズの少なくとも２倍、更には約１０〜約１００倍を越える。
【００６６】
“エネルギー吸収性分子”又は“ＥＡＭ”とは、質量分析計のイオン化源からエネルギーを吸収し、これによりプローブ表面からマーカーのようなアナライトの吸着を助ける分子を云う。アナライトの大きさ及び性質に従って、エネルギー吸収性分子は、任意に使用できる。ＭＡＬＤＩ（母材援助レーザー脱着／イオン化）で使用されるエネルギー吸収性分子は、“母材”と云うことが多い。桂皮酸誘導体、シナピン酸（“ＳＰＡ”）、シアノヒドロキシ桂皮酸（“ＣＨＣＡ”）及びジヒドロキシ安息香酸は、生物有機化学分子のレーザー脱着におけるエネルギー吸収性分子として使用することが多い。
【００６７】
発明の詳細な説明
Ｉ．序論
過去２０年に亘る蛋白質化学の大きな技術的進歩は、蛋白質の研究に不可欠な手段として質量分析法を確立した（Ｃａｒｒ等，（１９９１年）“Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３（２４）：２８０２−２８２４；Ｃａｒｒ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｕｎｉｔ  １０．２１，ｐｐ．１０．２１．１−１０．２１，２７（１９９８年）；Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｕｎｉｔ  １０．２２，ｐｐ．１０．２２．１−１０．２２，２４（１９９８年）；及びＳｉｕｚｄａｋ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９６年））。更に、質量分析法は、核酸の分析を容易にする（Ｋｒａｈｍｅｒ等，（２０００年）“ＭＳ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  ＭＳ／ＭＳ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｏｍｅｒｉｃ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２（１７）：４０３３−４０４０及びＫｏｏｍｅｎ等，（２０００年）“Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｍａｓｓ  ａｃｃｕｒａｃｙ，ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ｒｅｆｌｅｃｔｅｄ  ｍｏｄｅ  ＤＥ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｕｓｉｎｇ  ｆａｓｔ  ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ−ｏｖｅｒｌａｙｅｒ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ”，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７２（１６）：３８６０−３８６６）。クロマトグラフィーや電気泳動による分離での分離力（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｐｏｗｅｒ）は、分析的に有用であるが、質量分析法の高い感度、速度、及び再現性は、発見、同定（例えばペプチド遺伝地図作成、配列分析等）、定量及び構造的特徴化等、蛋白質及び核酸の分析におけるあらゆる面で利用を増大させている。
【００６８】
遺伝子発現プロファイルの研究を可能にするオリゴヌクレオチドチップ技術と同様に、蛋白質を質量分析法により分析用プローブの表面機構上に捕獲する蛋白質バイオチップ技術が発展して来た。このような技術は、複雑な生物学的混合物の蛋白質及び核酸の両プロファイルを容易にるため、表面強化レーザー脱着／イオン化飛行時間質量分析法を利用する。この技術、即ち親和性質量分析法の説明（ｖｅｒｓｉｏｎ）では、基体に結合した親和性試薬は、クロマトグラフィー試薬でもバイオ特異的試薬であってもサンプルからアナライトを捕獲する。次に、捕獲されたアナライトは、基体から脱着及び／又はイオン化され、質量分析法により検出される。（例えばＨｕｔｃｈｅｎｓ及びＹｉｐ（１９９３年）“Ｎｅｗ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ”，Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．７：５７６−５８０，Ｋｕｗａｔａ等，（１９９８年）“Ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｃｉｎ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ  ｂｙ  ＳＥＬＤＩ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”，Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２４５：７６１−７７３，Ｈｕｔｃｈｅｎｓ及びＹｉｐのＵＳＰ  ５，７１９，０６０、及びＷＯ  ９８／５９３６０（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ及びＹｉｐ）参照。）この革新的な技術は、２Ｄ−ＰＡＧＥのような他の技術に比べて多くの利点を有する。例えば高速であり、高スループットを有し、低いオーダーのサンプル量で済み、アナライトをピコモル〜アトモルの範囲で検出する感度を有し、約２ｋＤＡ〜約２０ｋＤＡの範囲の質量を有する蛋白質、核酸及び他の成分を効果的に分離でき、また臨床アッセイの発展に直接利用できる。
【００６９】
本発明者及び協力者は、特に、血清、血清プラズマ及び細胞抽出物中の前立腺癌蛋白質マーカーを発見し、定量するための表面強化レーザー脱着／イオン化技術及び親和性質量分析法についての効果を示すと共に、既知の前立腺癌マーカーを検出するための免疫アッセイを発展させた（Ｗｒｉｇｈｔ等，（１９９９年）“ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（Ｒ） −ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＳＥＬＤＩ）  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｃｈｉｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ”，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２：２６４−２７６；Ｘｉａｏ等，（２０００年）“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｃｈｉｐ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．，１９（１）：１２−２１；及びＰａｗｅｌｅｔｚ等，（２０００年）“Ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｃｈｉｐ”，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４９：３４−４２）。本発明は、血清サンプル、その他の種類のサンプル中の、ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’、及びその他の前立腺マーカーの検出及び定量、並びに前立腺癌又は良性前立腺増殖の診断のためのこれらバイオマーカーを評価する方法について説明する。また本発明は、細胞溶解物及びその他の供給源中の前立腺マーカーをコード化する核酸（例えばｍＲＮＡ等）の検出及び定量を含む診断方法も提供する。これら蛋白質系及び核酸系マーカーの複合した検出／定量の他、本発明はバイオチップ、キット及び総合システムも包含する。
【００７０】
ＩＩ．マーカーの特徴化
本発明は、前立腺バイオマーカーであるＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の検出／定量に関する。これら前立腺マーカーの２つの一般的な部類は、（１）蛋白質系マーカー、及び（２）核酸系マーカーである。更に本発明は、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の他、その他のバイオマーカーを検出及び／又は定量する複合アッセイを提供する。これら他の蛋白質系マーカーとしては、例えばＰＳＡ、前立腺酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）、前立腺特異的ペプチド９４（ＰＳＰ９４）、又は前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）等が挙げられる。核酸系マーカーは通常、蛋白質系マーカーをコード化するｍＲＮＡのような核酸配列を有する。アミノ酸配列、及びこれらマーカー及び他の関心のあるマーカーに関連するマーカーをコード化するｍＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）及びＥｎｔｒｅｚ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎデータベース等の各種公共のデータベースから容易に確認できる。以下、関心のあるバイオマーカーについて説明する。
【００７１】
Ａ．蛋白質系マーカー
ＰＳＭＡは最初、モノクローナル抗体７Ｅ１１．Ｃ５を用いて同定され（Ｈｏｒｏｓｚｅｗｉｃｚ等，（１９８７年）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ａ  ｎｅｗ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｍａｒｋｅｒ  ｉｎ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ”，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７：９２７−９３６）、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット法により細胞溶解物及び精液プラズマ中に１００ｋＤａとして検出された（Ｆｅｎｇ等，（１９９１年）“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ７Ｅ１１−Ｃ５  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ”，Ｐｒｏｃ．ＡＡＣＲ  ３２（ａｂｓ．１４１８）：２３９；Ｔｒｏｙｅｒ等，（１９９３年）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ７Ｅ１１−Ｃ５  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ”，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１４７（ａｂｓ．４８２）：３３３Ａ；及びＴｒｏｙｅｒ等，（１９９５年）“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ７Ｅ１１−Ｃ５．３  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ”，Ｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １：２９−３７）。ＰＳＭＡは、７５０−アミノ酸である、約８０〜８５ｋＤａの非グリコシル化分子量を有するタイプＩＩ膜貫通糖蛋白質として同定された（Ｉｓｒａｅｌｉ等（１９９３年）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：２２７−２３０及びＩｓｒａｅｌｉ等のＵＳＰ  ５，５３８，８６６“ＰＲＯＳＴＡＴＥ−ＳＰＥＣＩＦＩＣ  ＭＥＭＢＲＡＮＥ  ＡＮＴＩＧＥＮ”）。更に、ＰＳＭＡをコード化する遺伝子は、染色体１１にマップされた（Ｒｉｎｋｅｒ−Ｓｃｈａｅｆｆｅｒ等，（１９９５年）“Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭ）ｇｅｎｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１”，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３０：１０５）。ＰＳＭＡは、グルタメート優先ニューロカルボキシペプチダーゼ／新規葉酸ヒドロラーゼでもある（Ｐｉｎｔｏ等，（１９９６年）“Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｏｌａｔｅ  ｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ”，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２：１１４４５−１１４５１）。
【００７２】
ＰＳＭＡの発現は、進行及びホルモン−難治性前立腺癌と関連して増加する（Ｉｓｒａｅｌｉ等，（１９９４年）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１８０７−１８１１）。前立腺組織中での高度のＰＳＭＡ発現は、脳、唾液腺、小腸での弱い発現と共に、免疫組織化学、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット法及びＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて検出された（Ｗｒｉｇｈｔ等（１９９５年）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ，ｂｅｎｉｇｎ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ”，Ｕｒｏｌｏｇｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １：１８−２８及び上記のＩｓｒａｅｌｉ等，（１９９４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１８０７−１８１１）。他の幾つかの組織は、このＰＳＭＡ  ｍＲＮＡを発現するが、この蛋白質を発現しない。ＰＳＭＡは、ヒトの各種癌の新生脈管構造上でも発現する（Ｌｉｕ等，（１９９７年）“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｌｓｏ  ｒｅａｃｔ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３６２９−３６３４）。
【００７３】
ＰＳＭＡ’は、Ｎ−末端配列（即ち、膜張り領域）を欠くＰＳＭＡの切形種である。Ｓｕ等（１９９５年）“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  ｓｐｌｉｃｅｄ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＲＮＡ：ｒａｔｉｏ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：１４４１−１４４３参照。ＰＳＭＡ’中のアミノ酸の配列は、ＰＳＭＡ中のアミノ酸５７−７５０を含み、したがって細胞質ゾルであり、７Ｅ１１−Ｃ５抗体で検出されない。全長のＰＳＭＡは、ＲＮａｚｅ保護アッセイを用いて腫瘍から抽出したＲＮＡ中の切形ＰＳＭＡ’よりも１０倍多く発現し、ＢＰＨ組織から抽出したＲＮＡ中の両形態とほぼ同等の発現、及び正常な前立腺組織から抽出したＲＮＡ中のＰＳＭＡ’と同程度のＰＳＭＡの１／１０倍発現することが判った（上記のＳｕ等（１９９５年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：１４４１−１４４３参照）。２つの蛋白質は、ＬＮＣａＰ細胞溶解物及び血清中に見い出された。一方の蛋白質は、全長１００ｋＤＡ  ＰＳＭＡであり、他方の小さい方の８９ｋＤａ蛋白質は、ＰＳＭＡ’であると思われる。
【００７４】
ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’及びその他の前立腺マーカーの臨床有用性を診断又は予後のバイオマーカーとして決める努力は、これらマーカーを体液中で定量するための免疫アッセイ感度が欠けることにより、阻止されてきた。本発明は、新規のＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）表面強化レーザー脱着／イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析システム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）を用いてＰＳＭＡ及びその他のマーカーを定量する免疫アッセイを包含する。一実施態様では、説明のため、ネズミ科の抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体７Ｅ１１−Ｃ５を蛋白質Ｇ塗布ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）配列上に固定化し、例えばＥＬＩＳＡ、その他の免疫アッセイフォーマット用に通常使用されているような第二のＰＳＭＡ抗体又は標識を使用することなく、表面強化レーザー脱着／イオン化（ＳＥＬＤＩ）質量分析法を用いて、サンプル中の１００ｋＤａ  ＰＳＭＡを直接、同定し、定量する。本発明は、例えば血清中のＰＳＭＡ定量に成功する技術を提供する。
【００７５】
ＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の他、本発明は、その他の前立腺バイオマーカーの複合アッセイも提供する。これらは、以下のマーカーを含むが、限定されるものではない。
【００７６】
前立腺特異抗原は、ここに記載した診断アッセイに従って任意に定量される別の前立腺マーカーの一例である。これは、前立腺癌用に充分、特徴化したマーカーである。ＰＳＡは、生化学的には、前立腺の上皮細胞により分泌される３３−ｋＤａセリンプロテアーゼである。ＰＳＡに関する他の詳細は、種々の刊行物、例えばＣａｒｄｕｃｃｉ等，（１９９９年）“Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ”，Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．２６（２）：２９１−３０２；Ｈｅｎｋｅｌ，（１９９８年）“Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ”，ＦＤＡ  Ｃｏｎｓｕｍ．３２（５）：２２−２７；Ｈｅｎｒｙ及びＯ’Ｍａｈｏｎｙ（１９９９年）“Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．２４（２）：９３−１０２；及びＣｈｕ（１９９７年）“Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｅａｒｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ．１８（２）：１２３−１３４等に記載される。
【００７７】
前立腺酸ホスファターゼは、ここに記載した方法に従って任意に検出、定量される別の前立腺マーカーである。男性ホルモンは、ヒトのＰＡＰ及びＰＳＡの両方の発現を調節する。これらは両方とも主な前立腺上皮−特異的識別抗原である。ＰＡＰに関する詳細な論文としては、例えばＡｈｍａｎｎ及びＳｃｈｉｆｍａｎ（１９８７年）“Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｓｅｒｕｍ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１３７：４３１−４３４；Ｅｒｃｏｌｅ等，（１９８７年）“Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｔａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１３８：１１８１−１１８４；Ｇｉｔｔｅｓ（１９９１年）“Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ”，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２４：２３６−２４５；Ｈｅｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎ等（１９８８年）“Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ，ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｅｕｒ．Ｕｒｏｌ．１４：１−５；及びＭｅｙｅｒｓ及びＧｒｉｚｚｌｅ（１９９７年）“Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ”，Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．７２（２）８６−９５がある。
【００７８】
９４アミノ酸の前立腺分泌蛋白質も、例えば本発明の複合実施態様での前立腺マーカーとして任意に利用される。ベータ−ミクロセミノ蛋白質とも云われるＰＳＰ９４は、ヒト前立腺により分泌される主な蛋白質の一つである。これは、ヒトの精液プラズマから主な蛋白質として、最初に単離された、システイン残留物に富む小さい非グリコシル化蛋白質である。続いて、その同族蛋白質が同定され、またそれらのｃＤＮＡ又は遺伝子が霊長動物、ブタ、及びげっし動物中でクローン化された。ＰＳＰ９４についての更なる情報は、例えばＫｗｏｎｇ等（２０００年）“ＰＳＰ９４（ｏｒ  ｂｅｔａ−ｍｉｃｒｏｓｅｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ａ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌａｔｅｒａｌ  ｌｏｂｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ）”，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４２（３）：２１９−２９及びＣｈａｎ（１９９９年）“Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＰＳＰ９４（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ９４  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅｓ”，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４１（２）：９９−１０９に見られる。
【００７９】
前立腺幹細胞抗原は、ガス相イオン分光測定によりサンプル中に任意に検出／定量される他のマーカー例である。ＰＳＣＡは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）定着細胞表面抗原のＴｈｙ−１／Ｌｙ−６ファミリーの同族体である。この抗原をコード化する遺伝子は、染色体領域８ｑ２４．２にマップする。ＰＳＣＡ  ｍＲＮＡは、正常な前立腺及び８０％を越える前立腺癌中に発現する。ＰＳＣＡについての他の詳細は、例えばＤａｎｎｕｌｌ等，（２０００年）“Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｓ  ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｃａｎｄｉｄａｔｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０（１９）：５５２２−５５２８；Ｇｕ等、（２０００年）“Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＣＡ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ｇｌｅａｓｏｎ  ｓｃｏｒｅ，ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｔａｇｅ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ９（１０）：１２８８−１２９６；及びＲｅｉｔｅｒ等，（２０００年）“Ｃｏａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＣＡ）ａｎｄ  ＭＹＣ  ｉｎ  ｌｏｃａｌｌｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｇｅｎｅｓ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ２７（１）：９５−１０３に記載される。
【００８０】
本質的にいかなるマーカーも、ここに記載した方法に従って任意に検出、定量される。特に上記の他、その他、多数の前立腺マーカーも知られている。これらマーカーの他の特性を以下の例示項で説明する。
【００８１】
Ｂ．核酸系マーカー
前立腺癌の実質的にいかなる核酸マーカーもここに記載した分析に好適である。従って、既知の全ての核酸を同定する計画は行っていない。関心のある特定の好ましい核酸マーカーとしては、例えばＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’、ＰＡＰ、ＰＳＰ９４、又はＰＳＣＡ等をコード化するｍＲＮＡ類がある。これらのｍＲＮＡに相当する核酸、又はこれらのｍＲＮＡを確認できる核酸は、ＧｅｎＢａｎｋのような公共のデータベースから得ることができる。ＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’をコード化するＲＮＡ類は、例えば上記のＳｕ等，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：１４４１−１４４３に記載される。その他のｍＲＮＡについての更なる情報は、各種取り揃えた有用な刊行物、例えばＺｅｌｉｖｉａｎｓｋｉ等，（１９９８年）“Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｇｅｎｅ”，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４５（１）：１０８−１２；Ｍａｇｋｌａｒａ等，（２０００年）“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｌａｎｄｕｌａｒ  ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ  ２  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｇｌａｎｄ”，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ３００（１−２）：１７１−８０；Ｘｕａｎ等，（１９９５年）“Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｏｆ  ＰＳＰ９４（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ９４  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｔｉｓｓｕｅ”，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １１（６）：１０４１−１０４７；及びＲｅｉｔｅｒ等，（１９９８年）“Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ：ａ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ，Ｓ．Ａ．９５（４）：１７３５−４０がある。
【００８２】
特定の実施態様では、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’ｍＲＮＡは、例えば細胞溶解物由来のサンプル中で個々に定量される。他の実施態様では、サンプル中のこれらｍＲＮＡ及び／又はその他のｍＲＮＡの選択された組合せは、この選択されたｍＲＮＡの組合せに相当するように選択されたｃＤＮＡを用いて、複合化フォーマット中で同時に検出、定量できる。
【００８３】
ＩＩＩ．マーカーの検出及び定量
本発明は、ガス相イオン分光測定、特にレーザー脱着／イオン化質量分析法によるＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の検出及び／又は定量方法を提供する。この方法は、ＰＳＭＡ／ＰＳＭＡ’の存在について試験するサンプルを分画して、サンプルから他の成分を少なくとも部分的に除去する工程、及びこの分画したＰＳＭＡ／ＰＳＭＡ’をガス相イオン分光測定により分析する工程を含む。ＬＤＩ−ＭＳは、慣用のＭＡＬＤＩであってよいし、或いはアナライトをエネルギー源に提示する際、プローブのサンプル提示表面が積極的に関与する（ａｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｖｏｌｖｅ）プローブを使用して表面強化できる。
【００８４】
一実施態様では、ＬＤＩ（レーザー脱着／イオン化）−ＭＳ（質量分析）法は、サンプルからアナライトを捕獲し、次いで固体相からアナライトを検出／イオン化する、固体相に結合した吸着剤を使用することにより表面強化される。この方法の一実施態様では、固体相結合吸着剤は、特異的にＰＳＭＡ／ＰＳＭＡ’に結合する抗体である。他の実施態様では、固体相結合吸着剤は、免疫グロブリン、例えばＦｃ部分に特異的に結合する蛋白質Ｇのような蛋白質である。この実施態様では、サンプルは、特異的にＰＳＭＡ’／ＰＳＭＡ’に結合する抗体と接触させる。次いで固体相結合吸着剤を使用して、この抗原に結合した抗体によりサンプルからＰＳＭＡ／ＰＳＭＡ’を捕獲する。複合アッセイでは、サンプルは、捕獲を望む全てのバイオマーカーに特異的に結合する抗体と接触させることができる。一実施態様では、固体相結合吸着剤は、ガス相イオン分光計への挿入に適合したバイオチップの形で供給される。このようなチップは、表面機構付き表面を有する金属のような基体を備える。各機構は吸着剤を有する。この実施態様では、サンプルは、所望のサンプル成分を捕獲するため、表面機構に塗布し、結合していない成分は洗浄する。次いでバイオチップは、ガス相イオン分光計中に挿入し、アナライトは、エネルギー源により脱着／イオン化され、検出される。
【００８５】
マーカーは、多数の生物学的サンプル中で検出できる。サンプルは、好ましくは生物学的液体サンプルである。本発明に有用な生物学的液体サンプルは、体液、細胞溶解物、精液、精液プラズマ、前立腺液、唾液、血液、リンパ液、肺／気管支洗浄物、粘液、糞、乳首分泌物、つば、涙、又は尿等である。血清は、本発明の特定の実施態様に好ましいサンプル源である。細胞溶解物は、一次組織又は細胞、培養組織又は細胞、正常組織又は細胞、病的組織又は細胞、良性組織又は細胞、癌組織又は細胞、唾液腺組織又は細胞、腸組織又は細胞、神経組織又は細胞、腎臓組織又は細胞、リンパ組織又は細胞、ぼうこう組織又は細胞、尿生殖組織又は細胞、腫瘍組織又は細胞、又は腫瘍新生脈管構造組織又は細胞等から任意に誘導される。生物学的サンプルは、静脈穿刺、又は生体組織検査のようなあらゆる公知技術に従って任意に採集される。組織又は細胞の培養方法は、各種刊行物、例えばＡｕｓｕｂｅｌ等編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．とＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９年補足）との合弁；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第３編，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４年）；及びＨｕｍａｓｏｎ，Ａｎｎｉｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第４編，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９年），及びそこで引用された文献等に記載される。
【００８６】
ここに記載したマーカーの１つ以上を検出し、定量するため、いかなる好適な方法も使用できる。例えばガス相イオン分光測定が使用できる。この技術は、例えばレーザー脱着／イオン化質量分析法を含む。幾つかの実施態様では、サンプルは、マーカーの検出を助けるため、ガス相イオン分光測定、例えば予備分画、二次元ゲルクロマトグラフィー、又は高性能液体クロマトグラフィー等を行う前に調製できる。マーカーの検出は、ガス相イオン分光測定以外の方法を用いて実施できる。サンプル中のマーカーを検出するため、例えば慣用の免疫アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット法等）が使用できる。これらの検出方法を以下に詳細に説明する。
【００８７】
Ａ．ガス相イオン分光測定
好ましい実施態様では、サンプル中に存在するマーカーは、ガス相イオン分光測定を用いて、更に好ましくは質量分析法を用いて検出する。一実施態様では、母材援助レーザー脱着／イオン化（“ＭＡＬＤＩ”）質量分析法が使用できる。ＭＡＬＤＩでは、サンプルは通常、例えば二次元ゲルクロマトグラフィー又は高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような蛋白質分離方法を用いて本質的に１つ又は複数のマーカーからなる分画を得るため、準精製する。ＭＡＬＤＩについての他の詳細は、例えばＳｋｏｏｇ等，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，第５編，Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９８年）及び上記のＳｉｕｚｄａｋ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに記載される。
【００８８】
他の実施態様では、表面強化レーザー脱着／イオン化質量分析法（“ＳＥＬＤＩ”）が使用できる。表面強化レーザー脱着／イオン化には、マーカーを捕獲するため吸着剤含有基体を使用する。質量分析中、マーカーは直接、基体表面から脱着、イオン化される。表面強化レーザー脱着／イオン化では基体表面がマーカーを捕獲するので、サンプルは、ＭＡＬＤＩの場合のように準精製する必要はない。しかし、サンプルの複雑性及び使用する吸着剤の種類によっては、表面強化レーザー脱着／イオン化分析の前に、その複雑性を低減するようにサンプルを調製することが望ましいことがある。
【００８９】
図１は、表面強化レーザー脱着／イオン化ＴＯＦ−ＭＳ総合システム１００の概略図である。図示のように、レーザー光源１０２で生成した光子エネルギーは、表面機構１０６の所でバイオチップ１０４に衝突する。表面機構は、捕獲したマーカーを有する選択された吸着剤を含む。光子エネルギーは、表面機構１０６で捕獲したマーカーを脱着し、イオン化する。次いで脱着されたイオンは、飛行管／質量分析計１０８を通って加速される。図示のように、複数のイオンは、質量／電荷比（各イオンは荷電しているだけなので、単にイオン種の中の質量だけである）に従って分離される。更に図示するように、小さいイオンは、大きいイオンよりも速く移行し、これにより質量に従ってこのイオン種を分離する。イオンは、検出器１１０の所で検出可能な信号を生成し、この信号は、データ分析ワークステーション１１２によって処理され、質量スペクトル１１４を発生する。以下、総合システムについて更に説明する。
【００９０】
図２は、バイオチップ２０２上に、２００で示した固定化蛋白質Ｇを有するＰＳＭＡ表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイを概略的に示す。更に図示するように、捕獲されたＰＳＭＡ２０４は、固定化蛋白質Ｇ２００に結合した抗体吸着剤２０６により保持されている。レーザー２０８からの入射光子エネルギーは、吸着剤及びＰＳＭＡを脱着、イオン化し、ＰＳＭＡは、ＴＯＦ質量分析計で検出され、質量スペクトル２１０を生成する。図３も、表面強化レーザー脱着／イオン化ＴＯＦ−ＭＳ技術の特定面についての概略説明図である。図示のように、サンプル３００は、表面機構３０６に結合した吸着剤３０４を有するバイオチップ３０２に塗布される。吸着剤３０４によって吸着されないサンプル３００の成分は、質量分析の前に、バイオチップ３０２から任意に洗浄除去（例えば溶離等）する。他の実施態様では、サンプル３００は、洗浄することなく、直接、分析する。サンプル３００中のマーカー３０８の捕獲（例えば親和性捕獲等）に続いて、バイオチップ３０２にエネルギー吸収性分子３１０を添加して、イオン化源３１２（即ち、レーザー）からのエネルギーを吸収させ、こうしてバイオチップ３０２の表面からのマーカー３０８の脱着を助ける。質量スペクトル３１４は、脱着／イオン化したマーカー３０８の質量スペクトル分析により得られる。
【００９１】
サンプル中のマーカーの検出を助ける各種のサンプル調製方法及びガス相イオン分光測定方法を以下に詳細に説明する。
【００９２】
１．ガス相イオン分光測定前のサンプル調製
サンプル中のマーカーの検出及び特徴化を更に助けるため、サンプルの調製には、以下に記載の方法又は当業界に公知の他の方法の１つ又は組合せが任意に使用できる。幾つかの実施態様では、サンプルは、ガス相イオン分光測定分析の前に、複雑なサンプルを簡素化するため、予備分画できる。例えば血清サンプルは、サンプル中の蛋白質の複雑性を低下させるため、蛋白質の大きさに従って予備分画できる。更に、予備分画プロトコールは、マーカーの物理的及び化学的特性に関する別の情報を付与できる。例えばサンプルがアニオン交換スピンカラムを用いて予備分画されたものであり、またマーカーが特定のｐＨで溶離されれば、この溶離特性により、マーカーの結合特性に関する情報が得られる。別の例では、サンプル中に多量に存在するか又はサンプル中のマーカーの検出を妨害する可能性がある蛋白質、その他の分子を除去することにより予備処理できる。他の好適なサンプル調製プロトコールは、当業者ならば明白であろうし、また本発明の実施態様に従って適用できよう。
【００９３】
ａ）大きさ排除（ｓｉｚｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー
一実施態様では、サンプルは、大きさ排除クロマトグラフィーを用いてサンプル中の例えば蛋白質の大きさに従って予備分画できる。使用可能なサンプル量が少ないサンプルでは、大きさ選択スピンカラムを用いることが好ましい。例えばＫ−３０スピンカラム（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）が使用できる。一般に、カラムから溶離される最初のフラクション（“フラクション１”と呼ばれる）は、最高％割合の高分子量蛋白質を有し、フラクション２は、％割合の低い高分子量蛋白質を有し、フラクション３は更に％割合の低い高分子量蛋白質を有し、フラクション４は最低量の大きい蛋白質を有する等である。次に各フラクションは、マーカー検出のため、ガス相イオン分光測定により分析できる。
【００９４】
ｂ）ゲル電気泳動によるバイオ分子の分離
別の実施態様では、サンプル中のバイオ分子（例えば蛋白質、核酸等）は、高分離性電気泳動、例えば一次又は二次元ゲル電気泳動、又はＮｏｒｔｈｅｒｎブロット法等により分離できる。マーカー含有フラクションは、単離して、ガス相イオン分光測定により更に分析できる。１つ以上のマーカーを含むバイオ分子スポットの二次元配列を生成させるため、二次元ゲル電気泳動を用いることが好ましい。例えばＪｕｎｇｂｌｕｔ及びＴｈｉｅｄｅ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒ．Ｒｅｖ．１６：１４５−１６２（１９９７年）参照。
【００９５】
二次元ゲル電気泳動は、当業界に公知の方法を用いて実施できる。例えばＤｅｕｔｓｃｈｅｒ編，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１８２巻参照。通常、サンプル中のバイオ分子は、例えば等電集束（ｆｏｃｕｓｉｎｇ）により分離される。集束中、サンプル中のバイオ分子は、該分子の正味電荷がゼロ（即ち、等電点）のスポットに達するまでｐＨ勾配に従って分離される。この第一分離工程により、バイオ分子の一次元配列が得られる。この一次元配列のバイオ分子は、第一分離工程で用いた技術とは一般に異なる技術を用いて更に分離される。等電集束で分離されたバイオ分子は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の存在下にポリアクリルアミドゲル電気泳動のようなポリアクリルアミドゲルを用いて第二次元で更に分離される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、バイオ分子の分子質量により更に分離される。通常、二次元ゲル電気泳動は、複雑な混合物内の分子質量範囲１０００〜２００，０００Ｄａの化学的に異なるバイオ分子を分離できる。
【００９６】
二次元配列のバイオ分子は、当業界で公知の好適ないかなる方法を用いても検出できる。例えばゲル中のバイオ分子は、標識又は着色（例えばＣｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ又は銀着色）できる。ゲル電気泳動が本発明における１つ以上のマーカーの分子量（例えば１００ｋＤａ  ＰＳＭＡ）に相当するスポットを発生すれば、このスポットは、更にガス相イオン分光測定により分析できる。例えばスポットは、ゲルから切り取ってガス相イオン分光測定により分析できる。或いはバイオ分子含有ゲルは電場を印加することにより不活性膜に移行できる。マーカーの分子量にほぼ相当する膜上のスポットは、ガス相イオン分光測定により分析できる。ガス相イオン分光測定では、これらのスポットは、以下に詳細に説明するＭＡＬＤＩ又は表面強化レーザー脱着／イオン化のような好適ないかなる技術（例えばＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）配列）を用いても分析できる。
【００９７】
ガス相イオン分光測定分析の前に、スポット中のバイオ分子をプロテアーゼ（例えばトリプシン）又はヌクレアーゼのような切断試薬を用いて小さな断片に切断することが望ましい。バイオ分子を小断片に消化することにより、スポット中のバイオ分子の質量の指紋又は特徴が得られ、所望ならばこれを用いてマーカーの同一性を決定ことができる。
【００９８】
ｃ）高性能液体クロマトグラフィー
更に別の実施態様では、極性、電荷及び大きさのような異なる物性によりサンプル中のバイオ分子混合物を分離するために、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用できる。ＨＰＬＣ機器は通常、移動相のリザーバー、ポンプ、注入器、分離カラム、及び検出器で構成される。サンプル中のバイオ分子は、サンプルのアリコートをカラムに注入することにより分離される。混合物中の各種バイオ分子は、移動液相と定常相とを区分けする（ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）挙動の相違により、異なる速度でカラムを通過する。１つ以上のマーカーの分子量及び／又は物性に相当するフラクションは収集できる。次にこのフラクションをガス相イオン分光測定により分析して、マーカーを検出できる。例えばこれらのスポットは、以下に詳細に説明するようなＭＡＬＤＩ又は表面強化レーザー脱着／イオン化（例えばＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）配列）を用いて分析できる。
【００９９】
ｄ）分析前のマーカーの変性
マーカーは、分離性を改善するか又は同一性を決定するため、分析前に任意に変性できる。例えば、分析前にマーカーに蛋白質分解消化を行ってもよい。いかなるプロテアーゼも使用できる。複数のマーカーを別個の多数の断片に切断し易いトリプシンのようなプロテアーゼは、特に有用である。消化により生じた断片は、マーカー用の指紋として機能し、これにより間接的にマーカーの検出を可能にする。これは、問題のマーカーと混同する恐れのある類似の分子質量を有するマーカーがある場合、特に有用である。また、低分子量のマーカーは質量分析により容易に分離されるので、蛋白質分解断片化は、特に高分子量のマーカーに対し有用である。標的マーカーがｍＲＮＡのような核酸であれば、質量分光分析の前にマーカーを変性するため、ヌクレアーゼが任意に使用できる。別の実施例では、バイオ分子は、検出分離性を改善するために変性できる。例えばニューラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ）は、糖蛋白質（例えばＰＳＭＡ、又はＰＳＭＡ’等）から末端シアル（ｓｉａｌｉｃ）酸残部を除去して、アニオン吸着剤（例えばカチオン交換ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）配列）への結合を改善すると共に、検出分離性を改善するために使用できる。別の例では、分子マーカーに特異的に結合し、更にこれらマーカーを識別する特定分子量のタグ（ｔａｇ）を付着させることにより変性できる。このような変性マーカーを検出後は任意に、蛋白質データベース（例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯ）に変性マーカーの物理的及び化学的特性を合わせることにより、更にマーカーの同一性を決定できる。
【０１００】
２．ガス相イオン分光測定分析のためのサンプルと基体との接触
前述のようにして作製したサンプル又はサンプル（例えば予備分画したサンプル）は、基体と接触できる。基体は、ガス相イオン分光計との併用に適合したプローブ（例えばバイオチップ）であってよい。本発明では、バイオチップは通常、基体に結合した少なくとも１つの吸着剤を有する少なくとも１つの表面機構付きの基体を有する。ここで吸着剤は、例えばＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’、前立腺マーカーｍＲＮＡ、及び／又はその他のマーカーを捕獲することができる。或いは基体は、ガス相イオン分光計との併用に適合したプローブ上に置くことができる別個の材料であってもよい。例えば基体は、例えばマーカー結合用の官能基を有する、高分子常磁性の、ラテックス又はガラスビーズもしくは樹脂であってよい。次に基体はプローブ上に置くことができる。
【０１０１】
プローブ（例えばバイオチップ）は、ガス相イオン分光計との併用に適合する（例えばガス相イオン分光計に脱着可能に挿入できる）限り、いかなる好適な形状でもよい。例えばプローブは、所定のアドレス可能な位置に一連の壁を持った、細片、板、又は皿の形状であってもよいし、或いはその他の表面機能を持っていてもよい。またプローブは、ガス相イオン分光計の入口システム及び検出器と併用するような形状であってもよい。例えばプローブは、人手で再配置する必要なく、プローブを次の位置に水平又は垂直に移動させる水平及び／又は垂直に移動可能なカートリッジ内に載荷するように適合させてもよい。
【０１０２】
プローブ又はバイオチップの表面機構には種々の実施態様がある。例えばバイオチップは、複数の表面機構を任意に有する。複数の表面機構は、例えば一列、直交配列、円形、又はｎ角形（但し、ｎは３以上）に配置される。複数の表面機構は通常、論理配列又は空間配列を含む。複数の表面機構の各々は、同一又は異なる吸着剤もしくはそれらの１つ以上の組合せを任意に有する。例えば複数の表面機構の中の少なくとも２つは、同一又は異なる吸着剤もしくはそれらの１つ以上の組合せを有する。特定の実施態様では、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲できる少なくとも１つの吸着剤の他に、複数の表面機構の１つ以上の所で基体に結合する少なくとも１つの他の吸着剤を更に有する。他の吸着剤は通常、ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’、ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、錯化ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＰ９４、又はＰＳＣＡ等の１つ以上の他の前立腺マーカーを捕獲できる。以下、好適な吸着剤について詳細に説明する。
【０１０３】
プローブの基体は、いかなる好適な材料からも作ることができる。例えばプローブの基体材料としては、限定されるものではないが、絶縁材料（例えば二酸化珪素のようなガラス、プラスチック、セラミック）、磁性材料、半導体材料（例えばシリコンウエーハ）又は導電材料（例えばニッケルのような金属、黄銅、鋼、アルミニウム、金、メタロイド、合金又は導電性ポリマー）、ポリマー、有機ポリマー、導電性ポリマー、バイオポリマー、天然バイオポリマー、有機ポリマー塗布金属、又はそれらのいずれかの組合せが挙げられる。プローブ基体材料は、固定であっても多孔質であってもよい。本発明の実施態様に好適なプローブは、例えばＵＳＰ５，６１７，０６０（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ及びＹｉｐ）やＷＯ９８／５９３６０（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ及びＹｉｐ）に記載される。
【０１０４】
ａ）不活性基体上のサンプルの分析
サンプルの複雑性が上記調製法を用いてほぼ低下したならば、サンプルは、ガス相イオン分光測定に好適ないかなる基体とも接触できる。マーカーからの他のバイオ分子の分離は必要ないので、例えば基体表面は不活性であってよく、またマーカー結合用の吸着剤を含む必要はない。幾つかの実施態様では、マーカー含有フラクションを基体と接触させる前に、マーカー含有フラクションを得るため、サンプルは、２次元ゲル電気泳動又はＨＰＬＣにより調製することが好ましい。次にスポット又はフラクション中のマーカーは、更に分画することなく、ガス相イオン分光測定（例えば慣用のＭＡＬＤＩ）を用いるか、又は当業界に公知の方法を用いて分離できる。
【０１０５】
ガス相イオン分光測定分析の前に、エネルギー吸収性分子（“ＥＡＭ”）又は母材材料を通常、基体表面上のマーカーに塗布する。エネルギー吸収性分子は、ガス相イオン分光計のエネルギー源からのエネルギーの吸収を助けると共に、プローブ表面からのマーカーの脱着を助けることができる。好例のエネルギー吸収性分子としては、桂皮酸誘導体、シナピン酸（“ＳＰＡ”）、シアノヒドロキシ桂皮酸（“ＣＨＣＡ”）及びジヒドロキシ安息香酸が挙げられる。他の好適なエネルギー吸収性分子は、当業者に公知である。エネルギー吸収性分子の更なる説明については、例えばＵＳＰ５，７１９，０６０（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ及びＹｉｐ）参照。
【０１０６】
エネルギー吸収性分子及びマーカー含有サンプルは、いかなる好適な方法で接触させてもよい。例えばエネルギー吸収性分子は、マーカー含有サンプルと混合し、混合物は、慣用のＭＡＬＤＩ法と同様、基体表面上に置く。別の例では、エネルギー吸収性分子は、基体表面をサンプルと接触させる前に、基体表面上に置くことができる。他の例では、サンプルは、基体表面をエネルギー吸収性分子と接触させる前に、基体表面に置くことができる。次にマーカーは、以下に詳細に説明するように、脱着し、イオン化し、検出することができる。
【０１０７】
ｂ）吸着剤を含有する基体表面上のサンプルの分析
幾つかの実施態様では、サンプルの複雑性は、１つ以上のマーカーに結合可能な吸着剤を含有する基体を用いて更に低下させることができる。吸着剤は、マーカーの結合に好適な結合特性を備える限り、マーカー（例えば特異的にマーカーに結合する抗体）に対しバイオ特異的（例えばバイオ分子相互作用吸着剤）である必要はない。例えば吸着剤は、疎水性相互作用吸着剤又は基、親水性相互作用吸着剤又は基、カチオン性吸着剤又は基、アニオン性吸着剤又は基、金属キレート化性吸着剤又は基（例えばニッケル、コバルト等）、レクチン、ヘパリン、又はそれらのいずれかの組合せのようなクロマトグラフィー吸着剤を含むことができる。他の実施態様では、吸着剤としては、親和性吸着剤、ポリペプチド、酵素、前立腺マーカー基体、受容体、又は抗体等のバイオ分子相互作用吸着剤が挙げられる。好ましい実施態様では、バイオ分子相互作用吸着剤としては、例えばＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’及び任意にその他の前立腺マーカー（例えばＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’、ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、錯化ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＰ９４、ＰＳＣＡ、又はこれらもしくは他の前立腺マーカーをコード化するｍＲＮＡ）を特異的に捕獲するモノクローナル抗体が挙げられる。
【０１０８】
各種タイプの吸着剤の例は、当業界に周知である。例えば疎水性基を含む吸着剤としては、脂肪族炭化水素、例えばＣ１ 〜Ｃ１８脂肪族炭化水素を有する母材及びフェニル基のような芳香族炭化水素官能基を有する母材が挙げられる。親水性基を含む吸着剤としては、ガラス（例えば二酸化珪素）、又はポリエチレングリコール、デキストラン、アガロース、又はセルロースのような親水性ポリマーが挙げられる。カチオン基を含む吸着剤としては、例えば硫酸塩アニオン（ＳＯ３ − ）の母材及びカルボン酸アニオン（ＣＯＯ− ）又は燐酸塩アニオン（ＯＰＯ３ − ）の母材が挙げられる。金属キレート基を含む吸着剤としては、例えば銅、ニッケル、コバルト、亜鉛、鉄のような金属イオンやアルミニウム及びカルシウムのようなその他の金属イオンと配位共有結合を形成する１つ以上の電子供与体基を有する有機分子が挙げられる。抗体を含む吸着剤としては、例えば前述したマーカーのいずれか１つに特異的に結合する抗体が挙げられる。これら吸着剤の幾つかを持ったプローブは、市販品としても入手し得る（例えばＮｏｒｍａｌ  Ｐｈａｓｅ  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）配列、ＳＡＸ２  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）配列、ＩＭＡＣ３  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）配列等は全て、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から入手可能）。好ましい実施態様では、吸着剤は、尿サンプルのマーカーを富化し同定するために初期に使用した吸着剤とほぼ同様か又は同じである（例えばＳＡＸ２  ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）配列）。
【０１０９】
サンプル中のｍＲＮＡの検出及び／又は定量を含む本発明の実施態様では、選択された吸着剤は通常、標的の前立腺マーカーｍＲＮＡに相当するＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）を含む。核酸吸着剤は、市販の源から任意に合成又は購入される。例えば吸着剤として使用されるオリゴ−又はポリ−ヌクレオチド配列は、当業者に周知の技術により容易に合成できる。更に本質的には、いかなる核酸もＴｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｍｅｒｃ＠ｏｌｉｇｏｓ．ｃｏｍ），Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ｗｗｗ．ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍ），ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍ），Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ｗｗｗ．ｏｐｅｒｏｎ．ｃｏｍ），その他、多数の市販の各種供給源のいずれかから任意に顧客注文される。
【０１１０】
調査可能な配列情報は、例えばＧｅｎＢａｎｋのような各種公共の核酸データベースから入手できる。例えばＰＳＭＡ及び／又はＰＳＭＡ’吸着剤は、ＮＭ−００６１０２，ＡＦ１１９３８６，ＡＦ００７５４４，ＡＦ０６１５７１，Ｓ７６９７８，ＡＦ２５４３５８，ＡＦ２５４３５７，ＡＷ６２０３３８，ＡＷ４７３０８７，ＡＦ１０７２１４，ＮＭ−００４４７６，ＡＷ２７８８１９，ＡＷ２７７４３７，ＡＷ１６８９１５，ＡＷ０００９２６，ＡＩ８７２１０４，ＡＩ７９１１５４，ＡＩ７６８５０８，ＡＩ７６６４２７，ＡＪ００７３１８，ＡＩ６９０６６７，ＡＩ６７２４０８，ＡＩ６４８７０２，ＡＩ４７８２０７，ＡＩ４７４４９２，ＡＩ４２４５８９，ＡＩ３５６７１８，ＡＩ０９４６５８，ＡＩ０５０８７１，ＡＦ０１６８３２，ＡＦ０１６８３０，ＡＦ０１６８２９，ＡＦ０１６８２８，ＡＦ０１６８２７，ＡＦ０１６８２６，ＡＦ０１１８９６，ＡＦ００７４１３，ＡＦ００７４１２，ＡＦ００７４１，ＡＦ００６６０４，ＡＡ８９７６６８，ＡＡ８７９０２８，ＡＦ０４４６８４，ＡＡ６５２９１７，ＡＡ４３５８００，ＡＡ６３１３０３，ＡＦ００８９３４，ＡＡ３７１４５０，ＡＡ３７０３３７，Ｎ７５６９１，Ｎ６４８４０，６４８４０，Ｉ２３８１３，Ｉ２３８１２，Ｉ２３８１１，，Ｉ２３８１０，Ｉ２３８０９，Ｉ２３８０８，Ｉ２３８０７，Ｉ２３８０６，Ｉ２３８０５，Ｉ２３８０４，Ｉ２３８０３，Ｉ２３８０２，Ｉ２３８０１，Ｉ２３８００，Ｉ２３７９９，Ｉ２３７９８，Ｉ２３７９７，Ｉ２３７９６，Ｉ２３７９５，Ｉ２３７９４及び／又はＭ９９４８７のようなアクセス（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ）番号に相当する配列に基づいて設計できる。これらの配列は一般に、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’吸着剤としての使用に適切な配列を確認するために単独で又は組合せて使用できるＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’に関する一部長さ又は全長の核酸配列（例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、遺伝子等）に相当する。同様な配列情報は、例えばＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＰ９４、又はＰＳＣＡ等の他の前立腺マーカーについても入手できる。
【０１１１】
プローブは、基体材料及び／又は吸着剤の選択に応じた、いかなる好適な方法を用いても製造できる。例えば金属表面には、酸化珪素、酸化チタン又は金を塗布でき、またこの塗布表面は、例えば吸着剤を結合、付着させる二官能性結合剤（ｌｉｎｋｅｒ）で誘導体化できる。例えば二官能性結合剤の一端は、塗布表面上の官能基と共有結合でき、他端は、吸着剤として機能する基で更に誘導体化できる。別の例では、結晶性シリコンから生成した多孔質シリコン表面は、マーカー結合用吸着剤を含有するように化学的に変性できる。別の例では、現場でモノマー溶液を重合することにより、基体表面上に直接、吸着剤を形成できる。このモノマー溶液は、例えば吸着剤として選り抜きの官能基を有する、置換アクリルアミドモノマー、置換アクリレートモノマー、又はそれらの誘導体を含有する。モノマー溶液の重合により、バイオ分子の結合に一層大きな能力を持ったヒドロゲル吸着剤が得られる。核酸系吸着剤（例えばＤＮＡ、ｃＤＮＡ等）の沈着については、更に例えばＢｒｏｗｎ等のＵＳＰ５，８０７，５２２“ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＦＡＢＲＩＣＡＴＩＮＧ  ＭＩＣＲＯＡＲＲＡＹＳ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＳＡＭＰＬＥＳ”及びＰｅａｓｅ等，（１９９４年）“Ｌｉｇｈｔ−ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ”，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：５０２２−５０２６に記載される。
【０１１２】
マーカーに結合する吸着剤は、いかなる好適なパターン（例えば連続又は不連続）でも基体に塗布できる。例えば基体表面に１つ以上の吸着剤が存在し得る。各種タイプの吸着剤を使用する場合は、基体表面は、１つ以上の結合特性が一次元又は二次元勾配で変化するように塗布できる。不連続の場合は、複数の吸着剤は、基体表面上の所定のアドレス可能な位置に配置できる。アドレス可能な位置は、いかなるパターンで配置してもよいが、好ましくは列、直交配列、又は規則的な曲線（例えば円）のような規則的なパターンであることが好ましい。プローブは、例えば不連続な吸着剤スポットを含むことができる。各アドレス可能な位置は、同一又は異なる吸着剤を含んでいてよい。これらのスポットは、質量分析中、レーザーのようなエネルギー源がマーカーを脱着、イオン化するために各スポットに向けられるか又は“アドレスする”点で“アドレス可能”である。
【０１１３】
サンプルは、浴漬け、浸透（ｓｏａｋｉｎｇ）、浸漬、噴霧、洗い流し（ｗａｓｈｉｎｇ  ｏｖｅｒ）、又はピペット滴下（ｐｉｐｅｔｔｉｎｇ）等、いずれかの好適な方法で吸着剤含有基体と接触させる。一般に吸着剤の結合には、約１μｌ〜５００μｌ中にマーカーを数アトモル〜１００ピコモル含むサンプル量で充分である。サンプルは、マーカーを吸着剤に結合させるのに充分な時間、吸着剤含有プローブ基体と接触できる。サンプルと吸着剤含有基体とは通常、約３０秒〜約１２時間、好ましくは約３０秒〜約１５分の間、接触させる。サンプルは通常、周囲の温度及び圧力条件下でプローブ基体に接触させる。しかし、幾つかのサンプルに対しては、変更した温度（通常、４℃〜３７℃）及び圧力条件が望ましいことがあり、これらの条件は当業者ならば決定できる。
【０１１４】
基体がサンプル又はサンプル溶液と接触した後、基体表面上に結合した材料だけが残るように、基体表面上の解放された材料は洗浄する。基体表面の洗浄は、例えば溶離剤による基体表面の、浴漬け、浸透、浸漬、すすぎ、噴霧、又は洗浄により実施できる。溶離剤をプローブ上の吸着剤の小スポットに導入する際は、ミクロフルイディクス法を使用することが好ましい。溶離剤の温度は通常、０℃〜１００℃、好ましくは４℃〜３７℃でよい。幾つかの実施態様では、プローブ表面に結合したマーカーが洗浄なしでガス相イオン分光測定により分離可能であれば、プローブ表面から解放された材料の洗浄は、必要ないかも知れない。
【０１１５】
基体表面の洗浄には、いかなる好適な溶離剤（例えば有機又は水性）も使用できる。水溶液を使用することが好ましい。好例の水溶液としては、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、又はホスフェート緩衝塩水等が挙げられる。これら緩衝液の洗浄力（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）を増大させるため、緩衝液には添加剤を導入できる。添加剤としては、限定されるものではないが、イオン相互作用改質剤（イオン強度及びｐＨの両方）、水構造改質剤、疎水性相互作用改質剤、チャオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）試薬、親水性相互作用置換剤（ｄｉｓｐｌａｃｅｒ）が挙げられる。これら添加剤の特定例は、例えばＰＣＴ公開ＷＯ９８／５９３６０（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ及びＹｉｐ）に見られる。特定溶離剤又はその添加剤の選択は、他の実験条件（例えば、使用される吸着剤又は検出すべきマーカーの種類）によるもので、当業者ならば決定できる。
【０１１６】
プローブ表面からマーカー含有バイオ分子を脱着、イオン化する前に、エネルギー吸収性分子（“ＥＡＭ”）又は母材材料を通常、この基体表面上のマーカーに塗布する。ＥＡＭの種類及び塗布方法は、前述の通りであり、ここでは繰り返さない。
【０１１７】
３．脱着／イオン化及び検出
基体表面上のマーカーは、ガス相イオン分光測定を用いて脱着、イオン化できる。基体上のマーカーを分離できる限り、いかなる好適なガス相イオン分光計も使用できる。ガス相イオン分光計は、マーカーを定量できることが好ましい。
【０１１８】
一実施態様では、ガス相イオン分光計は、質量分析計である。通常の質量分析計には、その入口システムに基体、又は基体表面上にマーカーを含有するプローブが導入されている。次にこれらのマーカーは、レーザー、高速原子衝撃、高エネルギープラズマ、電子噴射イオン化、熱噴射イオン化、液体二次イオンＭＳ、フィールド脱着等の脱着源により脱着される。発生する脱着、揮発した種は、脱着の直接の結果としてイオン化される、プレフォーム化イオン又は中性点（ｎｅｕｔｒａｌ）で構成される。発生したイオンは、イオン光学アッセンブリーにより収集され、次いで質量分析計は、通過するイオンを分散し、分析する。質量分析計を励起するイオンは、検出器により検出される。次いで検出器は、検出されたイオンの情報を質量対電荷比に翻訳する。マーカー又はその他の物質の存在の検出には、通常、信号強度の検出が含まれる。これにより、今度は基体に結合したマーカーの量及び特性を反映できる。質量分析計構成成分のいずれか（例えば脱着源、質量分析部、検出器等）は、ここで説明したその他の好適な構成成分又は本発明の実施態様における当業界に公知のその他の構成成分と組合せることができる。
【０１１９】
本発明の実施態様では、レーザー脱着飛行時間質量分析計を用いることが好ましい。レーザー脱着質量分析法では、基体又はマーカー含有プローブは、入口システムに導入される。イオン化源からのレーザーによりマーカーは、ガス相中に脱着、イオン化される。発生したイオンは、イオン光学アッセンブリーにより収集され、次いで飛行時間質量分析部中でイオンは、短い高電圧場を通って加速され、高真空室中に吹き流される。高真空室の遥かな端部において、複数の加速イオンは、異なる時間で敏感な検出器表面に当たる。この飛行時間は、イオンの質量の関数なので、イオンの形成からイオンの検出器衝突までの経過時間は、特定の質量対電荷比を持ったマーカーの存在又は不存在の確認に使用できる。
【０１２０】
別の実施態様では、マーカーの検出にイオン移動度分光計が使用できる。イオン移動度分光測定の原理は、イオンの異なる移動度に基づくものである。詳しくは、イオン化により生成したサンプルの複数のイオンは、電場の影響を受けて管内を、例えば質量、電荷、又は形状の相違により、異なる速度で移動する。これらのイオン（通常は電流（ｃｕｒｒｅｎｔ）の形態で）は、検出器で表示され（ｒｅｇｉｓｔｅｒ）、次に検出器はサンプル中のマーカー又はその他の物質の同定に使用できる。イオン移動度分光測定の１つの利点は、大気圧で操作できることである。
【０１２１】
更に別の実施態様では、マーカーの検出及び特徴化に全イオン測定装置が使用できる。この装置は、基体が単一種のマーカーしか持たない場合に使用できる。単一種のマーカーが基体上にある場合、イオン化マーカーから発生した全イオン流は、このマーカーの量及びその他の特性を反映する。次にこのマーカーで発生した全イオン流は、対照（例えば既知化合物の全イオン流）と比較できる。次に、マーカーの量及び特性を測定できる。
【０１２２】
４．データの分析
マーカーの脱着及び検出により生じたデータは、いかなる好適な手段を用いても分析できる。一実施態様では、例えば総合システムの一部としてのプログラム可能なデジタルコンピュータを用いて分析できる。コンピュータプログラムは一般に、コードを記憶する読み取り可能な媒体を有する。プローブ上の各機構の位置、該機構における吸着剤の同一性、及び該吸着剤の洗浄に使用される溶離条件を含むメモリーに特定のコードを充てることができる。コンピュータは、プローブ上の特定のアドレス可能な位置から受けた各種分子の質量での信号強度に関するデータを入力として受けるコードも含有する。このデータは、検出したマーカーの数を表示し、各マーカーにより発生した信号の強度を含むことができる。
【０１２３】
本発明は特に、選択したサンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’及び任意に他の前立腺マーカーを定量する装置又は総合システムを含む。この装置又はシステムは通常、サンプル中の例えばＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲できる吸着剤（例えばバイオチップのような固体相吸着剤）と、例えば吸着剤上に捕獲したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を定量するためのガス相イオン分光計とを備える。この装置又はシステムは通常、ガス相イオン分光計に操作可能に接続したコンピュータ又はコンピュータ読み取り可能な媒体であって、例えば（ｉ）ガス相イオン分光計により定量されたデータを分析又は処理するための命令セット、（ｉｉ）データをデータベースに入れるための命令セット、又は（ｉｉｉ）少なくとも１つの定量された前立腺マーカー又は定量された前立腺マーカーの組合せと、前立腺癌、良性前立腺増殖、又は陰性診断、についての診断との相関を決めるための命令セット；の１つ以上を有するコンピュータプログラムを含む該コンピュータ又はコンピュータ読み取り可能な媒体も備える。
【０１２４】
データの分析は通常、検出したマーカーの信号強度（例えばピークの高さ）を測定する工程及び“孤立値”（所定の統計的分布から外れたデータ）を除去する工程を含む。観察されたピークは、正規化でき、この方法により或る対照に対する各ピークの高さが計算される。例えば対照は、計器及び薬品（例えばエネルギー吸収性分子）によって生じたバックグラウンドノイズであってよく、これは目盛でゼロと設定される。次に、各マーカー又はその他のバイオ分子について検出された信号強度は、所望の目盛（例えば１００）に相対強度の形態で表示できる。或いは、検出した各マーカー又はその他のマーカーについて観察された信号の相対強度を計算するため、標準（例えばウシ血清アルブミン）のピークが基準として使用できるように、サンプルによって標準が認められる。
【０１２５】
コンピュータは、得られたデータを表示用の各種フォーマットに変形できる。“スペクトル図（ｖｉｅｗ）又は保存（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）マップ”と云われる或るフォーマットでは、標準スペクトル図が表示できる。このスペクトル図は、検出器を各特定の分子量の所に到達させるマーカーの量を描写する。“ピークマット”と云われる別のフォーマットでは、このスペクトル図からピークの高さ及び質量の情報だけが保存され、更に明瞭な画像が得られる上、殆ど同じ分子量を持ったマーカーを一層容易に見ることができる。“ゲル図”と云われる更に別のフォーマットでは、ピーク図の各質量が、各ピークの高さに基づいて無彩色スケール画像に変換でき、電気泳動ゲル上のバンドと同様な外観が得られる。“３−Ｄオーバレイ”と云われる更に別のフォーマットでは、相対ピーク高さの微妙な変化を研究するため、数個のスペクトルを重ねることができる。“差異マップ図”と云われる更に別のフォーマットでは、２つ以上のスペクトルが比較でき、特有のマーカーや、サンプル間で上下に調節されるマーカーを目立たせるのに便利である。いずれか２つのサンプルからのマーカーの輪郭（スペクトル）を視覚的に比較してもよい。更に別のフォーマットでは、スポットファイアー・スカッター図（Ｓｐｏｔｆｉｒｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ  Ｐｌｏｔ）が使用できる。この図は、検出したマーカーを点（ｄｏｔ）としてプロットしたもので、一方の軸は、検出したマーカーの見掛けの（ａｐｐａｒｅｎｔ）分子を表し、他方の軸は、検出したマーカーの信号強度を表す。コンピュータ読み取り可能な媒体には、各サンプルについて、検出するマーカー及びこのサンプル中に存在するマーカーの量が保管できる。このデータは、次に対照（例えば、前立腺癌又はＢＰＨが検出できない被験者のような対照中に検出したマーカーの輪郭又は量）と比較できる。
【０１２６】
Ｂ．免疫アッセイによる検出
別の実施態様では、サンプル中のマーカー（例えばＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’等）を検出し、分析するため、免疫アッセイが使用できる。この方法は、（ａ）マーカーに特異的に結合する抗体を供給する工程、（ｂ）サンプルをこの抗体と接触させる工程、及び（ｃ）サンプル中のマーカーに結合した抗体の錯体の存在を検出する工程を含む。
【０１２７】
マーカーに特異的に結合する抗体を調製するには、精製マーカー又はその核酸配列が使用できる。マーカー用の核酸及びアミノ酸配列は、更にこれらのマーカーを特徴化することにより得られる。例えば各マーカーは、多数の酵素（例えばトリプシン、Ｖ８プロテアーゼ等）とペプチドマップできる。各種酵素によって生じた消化断片の分子量に合う配列用のデータベース、例えばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯデータベースを探索するため、各マーカーからの消化断片の分子量が使用できる。他のマーカーがデータベース中の既知の蛋白質であれば、この方法を用いて、他のマーカーの核酸及びアミノ酸配列が同定できる。
【０１２８】
或いはこれらの蛋白質は、蛋白質梯子配列を用いて順番に配列できる。蛋白質梯子は、例えば分子をばらばらに切断し、これらの断片を酵素消化する方法、或いはその他、断片の末端から連続的に単一アミノ酸を除去する方法により生成できる。蛋白質梯子の調製方法については、例えば国際公開ＷＯ９３／２４８３４（Ｃｈａｉｔ等）及びＵＳＰ５，７９２，６６４（Ｃｈａｉｔ等）に記載される。次いで蛋白質梯子は、質量分析法により分析される。これら梯子断片の質量差により、分子末端から除去されたアミノ酸が同定される。
【０１２９】
マーカーがデータベース中の既知蛋白質でなくても、このマーカーのアミノ酸配列の一部さえ認識されれば、核酸及びアミノ酸配列は決定できる。例えばこのマーカーのＮ−末端アミノ酸配列に基づいて、退化（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プローブを作ることができる。次にこれらのプローブは、最初にマーカーが検出されたサンプルから作ったゲノム又はｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするために使用できる。陽性クローンは、同定、増幅し、それらの組み換え配列は、周知の技術を用いて分割（ｓｕｂ）クローン化できる。例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ等，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９年補足））及びＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２編（Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９年））参照。
【０１３０】
マーカーに特異的に結合する抗体は、精製マーカー又はその核酸配列を用いることにより、当業界に好適ないかなる方法を用いても調製できる。例えばＣｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１年）；Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｌａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８年）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２編１９８６年）；及びＫｏｈｌｅｒ  ＆  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５年）参照。このような技術には、限定されるものではないが、ファージ又は同様なベクター中の組み換え抗体のライブラリーから抗体を選択することによる抗体の調製や、ウサギ又はネズミを免疫化することによるポリクローナル及びモノクローナル抗体の調製が含まれる（例えばＨｕｓｅ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１（１９８９年）；Ｗａｒｄ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９年）参照）。
【０１３１】
抗体を供給後、マーカーは、当業界に公知の好適な免疫学的結合アッセイのいずれを用いても検出及び／又は定量できる（例えばＵＳＰ４，３６６，２４１、同４，３７６，１１０、同４，５１７，２８８及び同４，８３７，１６８参照）。有用なアッセイとしては、例えば酵素結合免疫溶剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、Ｗｅｓｔｅｒｎブロットアッセイ、又はスロットブロットアッセイのような酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）が挙げられる。これらの方法は、例えばＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３７巻（Ａｓａｉ編，１９９３年）；Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓｔｉｔｅｓ  ＆  Ｔｅｒｒ編，第７編１９９１年；及び上記Ｈａｒｌｏｗ  ＆  Ｌａｎｅにも記載される。
【０１３２】
一般に被験者から得られたサンプルは、マーカーに特異的に結合する抗体と接触できる。抗体は、洗浄及び次の錯体単離を容易にするため、サンプルとの接触前に固形支持体に任意に固定できる。固形支持体の例としては、例えばミクロタイタープレート、棒、ビーズ、又はミクロビーズの形態のガラス又はプラスチックが挙げられる。抗体は、プローブ基体又はＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）配列に付着させることも可能であり、また前述のようにガス相イオン分光測定により分析可能である。サンプルは、被験者から取った生物学的液体サンプルであることが好ましい。生物学的サンプルの例としては、尿、血液、血清、プラズマ、涙、唾液、組織等が挙げられる。好ましい実施態様では、生物学的液体は血清を含む。サンプルは、抗体と接触させる前に好適な溶離剤で希釈できる。
【０１３３】
サンプルを抗体と温置後、この混合物を洗浄すると、形成された抗体−マーカー錯体を検出できる。検出は、洗浄した混合物を検出試薬と温置することにより実施できる。この検出試薬は、例えば検出可能な標識で標識した第二抗体であってよい。好例の検出可能な標識としては、磁性ビーズ（例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標））、蛍光染料、放射性標識、酵素（例えばセイヨウワサビ過酸化物、アルカリ性ホスフェート、及びその他、ＥＬＩＳＡで普通に使用されているもの）、及びコロイド状金、着色ガラス又はプラスチックビーズのような比色標識が挙げられる。或いは、サンプル中のマーカーは、例えば第二の標識した抗体を用いて、マーカー−特異的抗体結合を検出する間接アッセイを用い、及び／又は例えばマーカーの明瞭なエピトープに結合するモノクローナル抗体を同時に混合物と温置する競争又は抑制アッセイで検出できる。
【０１３４】
アッセイ中、試薬の各組合せ後に温置及び／又は洗浄工程を必要とするかも知れない。温置工程は、約５秒〜数時間、好ましくは約５分〜約２４時間であってよい。しかし温置時間は、アッセイフォーマット、マーカー、溶液量、及び濃度等に依存する。アッセイは通常、周囲温度で行われるが、１０℃〜４０℃のような温度範囲を越えて行うこともできる。
【０１３５】
免疫アッセイは、サンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’のようなマーカーの存在又は不存在やサンプル中のマーカーの量を測定するために使用できる。まず、サンプル中のマーカーの試験量は、上記免疫アッセイを用いて検出できる。サンプル中にマーカーが存在すれば、上記好適な温置条件下でマーカーに特異的に結合する抗体と抗体−マーカー錯体を形成する。抗体−マーカー錯体の量は、標準と比べることにより測定できる。標準は、例えば既知の化合物、又はサンプル中に存在することが知られている他の蛋白質であってよい。前述のように、マーカーの試験量は、測定の単位が対照と比較できる限り、絶対単位で測定する必要はない。
【０１３６】
サンプル中のこれらマーカーを検出する方法は、多くの用途を持っている。例えば１つ以上のマーカーを測定して、前立腺癌又はＢＰＨの診断又は予後を援助できる。別の例では、これらのマーカー検出法は、癌治療に対する被験者の応答をモニターするために使用できる。別の例では、マーカー検出法は、生体内又は試験管内でこれらマーカーの発現を調節する化合物及び該化合物についてアッセイし、同定するために使用できる。
【０１３７】
ＩＶ．前立腺癌又は良性前立腺増殖の診断
実験では、正常な被験者（例えば前立腺癌又は良性前立腺増殖に対し陰性診断の被験者）と比較すると、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’は、前立腺癌では正常者に比べて上方（ｕｐ−）調節され、良性前立腺増殖では下方（ｄｏｗｎ−）調節されることを示している。したがって本発明は、ここで説明した前立腺マーカーを用いて前立腺癌又は良性前立腺増殖の診断を援助する方法も提供する。これらのマーカーは、単独で又は他のマーカーと組合せて使用できる。例えばＰＳＭＡは、通常、サンプル（例えば血清サンプル）中に前立腺癌又はＢＰＨの患者や前立腺癌又はＢＰＨを検出できない正常被験者とは示差的に存在する。したがって、ここで説明したマーカーの１つ以上を人で検出すれば、その人が前立腺癌又はＢＰＨである蓋然性に関する有効な情報となる。以下の実施例で更に説明するように、前立腺癌の患者は、正常な患者よりも血清ＰＳＭＡの濃度が高い可能性がある。
【０１３８】
特に本発明は、被検者からのサンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を（例えばガス相イオン分光測定により）検出する工程、及びこの検出されたＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を前立腺癌、良性前立腺増殖、又は陰性診断の蓋然的診断と相関させる工程を含む、前立腺癌又は良性前立腺増殖の診断援助方法に関する。この相関は一般に、サンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の存在又は不存在と対照中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’検出頻度とを考慮する。更にこの相関は通常、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の対照量に対するサンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の量も考慮する。特定の実施態様では、サンプル中のＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’の検出に、免疫アッセイが使用される。幾つかの実施態様では、ＰＳＭＡ及びＰＳＭＡ’の両方が検出、相関され、一方、他の実施態様では、ＰＳＭＡをコード化する核酸又はその他の前立腺マーカーのような他のマーカーが使用される。更に詳しくは、正常範囲を越えるＰＳＭＡ／ＰＳＭＡ’の量は、前立腺癌の診断と明確に相関し、一方、正常範囲未満のＰＳＭＡ／ＰＳＭＡ’量は、良性前立腺増殖の診断と明確に相関する。
【０１３９】
マーカーを検出するため、患者からはいかなる好適なサンプルも得られる。好ましくはサンプルは、患者からの血清である。所望ならば、マーカーの検出性を高めるため、前述のようにサンプルを調製することができる。例えばＰＳＭＡのようなマーカーの検出性を増大させるため、例えば被験者からの血清サンプルは、大きさ排除クロマトグラフィーにより任意に分画できる。予備分画プロトコールのようなサンプル調製は任意であり、使用する検出方法によっては、マーカーの検出性を高める必要はないかも知れない。例えばサンプル中のマーカーの存在を検出するためマーカーに特異的に結合する抗体を使用すれば、サンプル調製は不必要かも知れない。
【０１４０】
サンプル中のマーカーの検出には、いずれかの好適な検出法が任意に使用される。例えば前述のように、又は当業界で知られているように、ガス相イオン分光測定又は慣用の免疫アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット）が使用できる。これらの方法を用いて、１つ以上のマーカーが検出できる。好ましくはサンプルは、複数のマーカーの存在について試験する。単一のマーカーだけよりも複数のマーカーの存在を検出する方が、診断医に多くの情報を与える。即ち、サンプル中の複数のマーカーを検出すると、真の陽性及び陰性診断率（％）が向上し、偽の陽性及び陰性診断率が減少する。
【０１４１】
次に１つ又は複数のマーカーの検出を前立腺癌又はＢＰＨの蓋然的診断と相関させる。幾つかの実施態様では、マーカーを定量することなく、単にマーカーの存在又は不存在を検出することだけが有用で、前立腺癌又はＢＰＨの蓋然的診断と相関できる。例えば試験された被験者中の１つ以上のマーカーの検出だけで被験者が前立腺癌又はＢＰＨであるか一層高い蓋然性で判る可能性がある。他の実施態様では、マーカーの検出を前立腺癌又はＢＰＨの蓋然的診断と相関させるため、マーカーを定量する工程を含むことができる。例えば前立腺癌又はＢＰＨ被験者の血清サンプル中には、幾つか又は全部のマーカーが、正常被験者の血清サンプル中よりも多量に存在するかも知れない。したがって被験者で検出されたマーカー量が対照量よりも多ければ、試験された被験者は、前立腺癌又はＢＰＨである蓋然性が高い可能性がある。
【０１４２】
マーカーを定量すると、対照と比較できる。対照は、例えば前立腺癌又はＢＰＨを検出できない正常被験者の同等のサンプル中に存在するマーカーの平均又は中間量であってよい。この対照量は、試験量の測定条件と同じか又は実質的に同様な実験条件下で測定する。例えば試験サンプルが被験者の尿サンプルから得られ、またマーカーが特定のプローブを用いて検出された場合は、このマーカーの対照量は、好ましくは同じプローブを用いて患者の血清サンプルから決定する。マーカーの対照量は、そのグループ中のマーカー量の変化を反映しないように、前立腺癌又はＢＰＨのない正常被験者から有意数のサンプルを基準にして決定することが好ましい。
【０１４３】
次に質量分析で得られたデータは、コンピュータソフトウエアで分析できる。このソフトウエアは、質量分析計からの信号をコンピュータ読み取り可能なフォームに変換するコードを含んでよい。ソフトウエアは、信号が本発明のマーカーに対応する信号の“ピーク”又は他の有用なマーカーを表すかどうかを決定するため、アルゴリズムを信号の分析に適用するコードも含んでよい。ソフトウエアは、試験サンプルからの信号を“正常”及び前立腺癌又はＢＰＨの信号の通常の特徴と比較し、これら２つの信号間の適合近似性（ｃｌｏｓｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｆｉｔ）を決定するアルゴリズムを実行するコードも含んでよい。例えば人工知能アルゴリズム又は発見的学習アルゴリズム等のようないかなる好適なアルゴリズムも使用できる。例えばファジィ論理命令セット、クラスタ分析命令セット、神経ネットワーク、又は総称アルゴリズム等を含む人工知能アルゴリズムが使用できる。例えばＱｕｒｅｓｈｉ等、Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１６３：６３０−６３３（２０００年）；Ｓｎｏｗ等、Ｊ．Ｕｒｏｌ．，１５２：１９２３（１９９４年）参照。ソフトウエアは、試験サンプルが最も近似し、これにより蓋然的診断を与えることを示すコードを含んでもよい。
【０１４４】
Ｖ．キット
別の面では、本発明は、本発明のマーカーの検出に使用できる、前立腺癌又はＢＰＨの診断援助用キットを提供する。例えばキットは、前述のようなマーカーのいずれか１つ以上を検出するため使用できる。これらのマーカーは、前立腺癌又はＢＰＨ患者及び正常被験者のサンプル中に示差的に存在する。本発明のキットは、多くの用途を持っている。例えばこれらのキットは、被験者が前立腺癌又はＢＰＨか、或いは陰性診断かどうかを識別し、これにより前立腺癌又はＢＰＨ診断を援助するために使用できる。別の例では、これらのキットは、前立腺癌又はＢＰＨ用の生体内又は試験管内動物標本中のマーカーの１つ以上の発現を調節する化合物を同定するために使用できる。
【０１４５】
一実施態様では、キットは（ａ）ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲する少なくとも１つの吸着剤、（ｂ）該吸着剤にサンプルを曝すことによりサンプルからＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲し、この捕獲したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’をガス相イオン分光測定により定量するための命令セット、及び（ｃ）前記吸着剤及び命令セットを収納するための少なくとも１つの容器を含む。このキットは、捕獲したＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’以外の材料を除去するため、吸着剤を洗浄するための少なくとも１つの溶離剤も任意に含む。吸着剤は通常、固体相吸着剤を含む。一実施態様では、固体相吸着剤は、基体に結合した固体相吸着剤を有する少なくとも１つの表面機構付きの基体を備えたバイオチップとして供給される。この基体は一般に、ガス相イオン分光計との併用に適合したプローブである。キットは、このプローブを任意に含む。
【０１４６】
特定の実施態様では、プローブは、複数の表面機構を付けた基体を有する。例えば複数の表面機構の各々は、基体に結合した１つ以上の吸着剤を任意に有する。複数の表面機構は、一列、直交配列、円形、又はｎ角形（但し、ｎは３以上）に配置される。複数の表面機構は、論理配列又は空間配列を任意に有する。他の実施態様では、固体相吸着剤は、少なくとも１つの吸着剤で誘導体化したビーズ又は樹脂を有する。この吸着剤で誘導体化したビーズ又は樹脂は、例えばガス相イオン分光計との併用に適合したプローブ上に置くのに通常、好適である。キットは、任意にこのプローブも含む。別の選択として、キットは少なくとも１つの基準又は対照も含む。更に別の実施態様では、キットは更に予備分画スピンカラム（例えばＫ−３０大きさ排除カラム）を含んでよい。
【０１４７】
本発明のキットは、各種タイプの吸着剤を含有する。例えば幾つかの実施態様では、吸着剤は、アニオン性吸着剤、カチオン性吸着剤、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤（例えば二酸化珪素等）、又は金属キレート化性吸着剤（例えばニッケル、コバルト等）等のクロマトグラフィー吸着剤を含む。他の実施態様では、吸着剤は、親和性吸着剤、ポリペプチド、酵素、前立腺マーカー基体、受容体、又は抗体等のバイオ分子相互作用吸着剤を含む。好ましい実施態様では、バイオ分子相互作用吸着剤は、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を特異的に捕獲するモノクローナル抗体を含む。更に他の実施態様では、キットは、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を捕獲する吸着剤の他に、少なくとも１つの他の吸着剤を更に含む。他の吸着剤は一般に、ＰＳＭＡ、ＰＳＭＡ’、ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、錯化ＰＳＡ、ＰＡＰ、ＰＳＰ９４、又はＰＳＣＡ等の少なくとも１つの他の前立腺マーカーを捕獲できる。別の選択として、キットは、（１）溶離剤で洗浄した時、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ或いは少なくとも１つの他の前立腺マーカーを吸着剤上に保持する溶離剤、又は（２）吸着剤をサンプルと接触させた後、該吸着剤を溶離剤で洗浄するための命令も更に含む。
【０１４８】
本発明の他の実施態様では、キットは（ａ）前立腺マーカーｍＲＮＡを捕獲する少なくとも１つの吸着剤、（ｂ）サンプルをこの吸着剤に曝すことによりサンプルから前立腺マーカーｍＲＮＡを捕獲し、この捕獲した前立腺マーカーｍＲＮＡをガス相イオン分光測定により定量するための命令セット、及び（ｃ）’この吸着剤及び命令セットを収納するための少なくとも１つの容器を含む。
【０１４９】
キットは、標識又は別個のインサートの形態で好適な操作パラメーターのための命令を更に任意に含むことができる。例えばキットは、例えば血清サンプルがプローブ上に接触した後、プローブを洗浄する方法を消費者に知らせる標準命令を持っていてよい。別の例では、キットは、サンプルを予備分画して、サンプル中の蛋白質又は核酸の複雑さを低減するための命令を持っていてよい。
【０１５０】
別の実施態様では、キットは、（ａ）マーカーに特異的に結合する抗体、及び（ｂ）検出試薬を含む。このようなキットは、上記説明した材料から製造できる。これらの材料（例えば抗体、検出試薬、固定化支持体等）に関する前記説明は、ここでも充分適用できるので繰り返さない。キットは、更に任意に予備分画スピンカラムを含んでよい。幾つかの実施態様では、キットは、標識又は別個のインサートの形態で好適な操作パラメーターのための命令を更に含んでよい。
【０１５１】
キットは、試験サンプルを対照情報標準と比較して、サンプル中に検出されたマーカーの試験量が前立腺癌又はＢＰＨの診断と一致した診断量であるかどうかを決定できるように、標準又は対照情報を更に任意に含んでいてよい。例えば標準は、ウシインスリン、ウシ血清アルブミン等であってよい。
【０１５２】
ＶＩ．実施例
以下に、単なる説明のため、非限定的実施例を提供する。
【０１５３】
Ａ．概説
ＰＳＭＡの臨床利用性を診断又は前立腺バイオマーカーとして決める努力は、体液中のＰＳＭＡの定量に対する免疫アッセイの感度に欠けることにより阻害されてきた。これら研究の目的は、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）の新規なＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）技術を用いたＰＳＭＡ免疫アッセイ（表面強化レーザー脱着／イオン化飛行時間質量分析法を使用）を発展させることであった。一面では、ネズミ科の抗ＰＳＭＡモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）７Ｅ１１−Ｃ５．３を蛋白質Ｇ塗布バイオチップ配列上に固定化し、サンプルを添加し、次にこれらのチップに表面強化レーザー脱着／イオン化質量分析を行った。ＥＬＩＳＡやその他の免疫アッセイフォーマットでは必要とした第二ＰＳＭＡ抗体又は標識を必要とせずに、直接、１００ｋＤａＰＳＭＡが正確に同定された。濃度を変化させた（０．５−５０ｎｇ／μｌ）精製組み換えＰＳＭＡ（ｒＰＳＭＡ）を用いて直線的標準曲線（Ｒ２ ＝０．９８５）が得られた。図４参照。血清及び血清プラズマ中のＰＳＭＡのナノモル水準での定量は、正規化質量信号積分（ｉｎｔｅｇｒａｌ）により決定した。２つのＭｏＡｂ（一方はＰＳＭＡに、他方はＰＳＡに）を同じバイオチップ配列に結合した表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイの複合バージョンは、両前立腺癌マーカーの迅速同時定量用システムの多才性を示した。予備表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイの結果、正常なドナーと前立腺癌患者との間、次に例えばＷｅｓｔｅｒｎ分析により癌と良性前立腺状態との間が一層良好に識別され、両者は統計的に有意（ｐ＜０．００１）であることが示された。これらの研究前に、免疫ブロット及びサンドイッチ免疫アッセイを用いて体液中のＰＳＭＡ、特に血清中のＰＳＭＡの場合はあやふやな信頼性で検出した。表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイは、ＰＳＭＡ又はＰＳＭＡ’を定量するため、及びそれらの生存能力を前立腺癌用の診断／予後バイオマーカーとしてアドレスするために、信頼性のあるシステムを提供する。更に表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイは、多数のバイオマーカーを迅速、かつ同時に測定するために、革新的なプラットホームを提供する。
【０１５４】
Ｂ．組み換え前立腺特異的膜抗原蛋白質
組み換え前立腺特異的膜抗原蛋白質の発生及び精製方法については、Ｘｉａｏ等，（２０００年）“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｏｃｈｉｐ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ”，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  １９：１２−２１に詳細に説明されている。精製ｒＰＳＭＡ蛋白質は、ＢＣＡ蛋白質アッセイ（Ｐｉｅｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により定量され、使用するまで−２０℃で保存される。
【０１５５】
Ｃ．患者及び血清サンプル
これらの研究で使用した血清サンプルは全て、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ＭｅｄｉｃａｌのＳｃｈｏｏｌ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃｅｎｔｅｒから入手し、Ｗｅｓｔｅｒｎブロット法により予めＰＳＭＡの血清水準を分析するために使用した同じグループのサンプルである（Ｂｅｃｋｅｔｔ等，（１９９９年）“Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＭＡ）ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｓｅｒａ  ｆｒｏｍ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｍｅｎ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｂｅｎｉｇｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ  ｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ”，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：４０３４−４０４０）。正常な男性グループは、陰性デジタル検査及びＰＳＡ＜４．０ｎｇ／ｍｌにより規定される。５０才未満の正常男性の年齢範囲は、２５〜３９才で平均は３４才であるのに対し、５０才を越える正常男性の年齢範囲は、５１〜７３才で平均は６０才であった。良性前立腺増殖患者は、ぼうこう出口障害の症状を有し、ＰＳＡ水準が増加（＞４ｎｇ／ｍｌ）し、また直腸横断（ｔｒａｎｓｒｅｃｔａｌ）超音波生検でＢＰＨを現わした患者である。血清採集時には、これらの患者は治療を受けなかった。前立腺炎のグループは、前立腺源による慢性症状複合体を持った患者を構成し、閉塞、尿培養による感染、膿瘍、又は癌等、その他の前立腺異常はなかった。Ｔ１及びＴ２の治療段階の患者から前立腺癌（ＰＣＡ）の血清を採集した。
【０１５６】
Ｄ．ＰＳＭＡへの表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイ
表面強化レーザー脱着／イオン化ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）技術を用いて血清中のＰＳＭＡ検出及び定量に免疫アッセイを展開した。以下の改良法は、前述のＸｉａｏ等，（２０００年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  １９：１２−２１に基づいて行った。スポットに１μｇの蛋白質Ｇを塗布後、バイオチップ全体をｐＨ８．０の１Ｍエタノールアミン中に撹拌しながら３０分間温置することにより残部の活性部位を閉鎖した。次いでこのバイオチップを０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ）のＰＢＳで２×５分、更にＰＢＳで２×５分洗浄した。これらのスポットにＭｏＡｂ  ７Ｅ１１又は１０７−１Ａ４（１．５μｇ）を加え、室温で３時間温置した。このバイオチップを０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のＰＢＳに２×５分、更にＰＢＳに２×５分温置することにより、未結合の抗体を洗浄した。これらのバイオチップ上に９６−ウエルプロセッサーを組み立て、９６−ウエルプレートのフォーマット中に多数のサンプルホルダーを作った。標準曲線を得るため、３０μｌの希釈ｒＰＳＭＡ（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のＰＢＳに０．５、１、３ｎｇ／μｌで）をこれらのスポットに塗布した。図４参照。血清中のＰＳＭＡを検出するため、これらのスポットに４００μｌの血清サンプル（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のＰＢＳで１：１に希釈）を塗布した。これらのサンプルを激しく攪拌しながら４℃で一夜温置した。次にバイオチップは、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００のＰＢＳで２×５分、ＰＢＳで２×５分、更に簡単にＨＰＬＣ  Ｈ２ Ｏで洗浄した。５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸及び０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中に飽和させたシナピン酸（Ｓｉｇｍａ）を母材溶液として使用し、また正規化のため内部標準（ＩＳ）としてβ−ガラクトグロブリン（分子量１８，３６３．３Ｄａ）を添加した。これらのスポットに母材溶液（２×０．５μｌ）を塗布し、チップは室温で空気乾燥した。血清ＰＳＭＡの検出は、レーザー強度６０のＰＢＳ質量分析計（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）を用いて行った。各スペクトルでのデータは、１２０のレーザースポットから平均化し、１つのサンプルに付き総計３つのスペクトルを集めた。ＰＳＭＡの正規化ピーク面積比及び内標準を血清ＰＳＭＡ及びｒＰＳＭＡの両方について計算した。図４参照。血清ＰＳＭＡの水準は、血清ＰＳＭＡ／ＩＳピーク面積比を標準曲線のｒＰＳＭＡ／ＩＳ面積比と比較することにより求めた。
【０１５７】
Ｅ．結果
１．血清ＰＳＭＡ水準の測定
血清ＰＳＭＡの定量に表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイの使用可能性を試験するため、合計６０のサンプルについて予備研究を行った。これらのサンプルは、正常男性２４（５０才未満１２、５０才超１２）、ＢＰＨ１０、ＰＣＡ（段階Ｔ１及びＴ２）１０、及び前立腺炎９を含む。研究の結果を図５及び表１に纏めた。ＰＳＭＡの水準は、ＢＰＨの患者及び前立腺炎の患者では低く（それぞれ平均１１７．１ｎｇ／ｍｌ、平均１１９．９ｎｇ／ｍｌ）、正常な男性では中間（５０才未満のグループ及び５０才超のグループではそれぞれ平均２７２．９ｎｇ／ｍｌ、平均３５９．４ｎｇ／ｍｌ）、ＰＣＡの患者では高かった（平均６２３．１ｎｇ／ｍｌ）。変動率（ＣＶ％）は、１．２〜２０．１の範囲、平均１０．１を含んでいた。
統計的分析（即ち、学生のＴ−試験）から、５０才未満の正常男性の平均血清ＰＳＭＡ水準は、５０才超の正常男性で得られた値と有意差がなかった（ｐ＝０．１６）のに対し、正常グループ対ＰＣＡ、正常グループ対ＢＰＨ、及びＢＰＨ対ＰＣＡのいずれの平均ＰＳＭＡ水準を比較しても、有意差がある（それぞれｐ＜０．００１、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．００１）ことが判った。更に、前立腺炎患者の血清ＰＳＭＡの平均水準は、正常グループ及びＰＣＡグループの平均水準と差があった（ｐ＜０．００１）が、ＢＰＨグループとは差がなかった（ｐ＝０．９５）。同様に差がある傾向は、正常、ＢＰＨ及びＰＣＡのグループ間にも先のＷｅｓｔｅｒｎブロット分析（前述のＢｅｃｋｅｔｔ等，（１９９９年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：４０３４−４０４０）で観察されたので、この予備研究は、血清中のＰＳＭＡの検出及び相対定量に表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイが特異的かつ実行可能であることを示した。
【０１５８】
【表１】
2004536278.tif 000002
【０１５９】
２．推定ＰＳＭＡイソフォームの検出
先の研究では、ＬＮＣａＰ細胞溶解物中にＰＳＭＡ蛋白質イソフォーム（即ち、ＰＳＭＡ’又はＰＳＭ’）が存在することを報告したが、このイソフォームはＰＳＭＡの細胞外ドメインに特異的な抗体でのみ検出でき、７Ｅ１１のような細胞間ドメインへの抗体では検出できない（Ｇｒａｕｅｒ等，（１９９８年）“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＰＳＭ’  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＬＮＣａＰ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｒｃｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ”，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４７８７−４７８９）。ＰＳＭＡの細胞外ドメインを認識するＭｏＡｂであるＭｏＡｂ  １０７−１Ａ４を使用した。図６Ａに示すように、このＭｏＡｂを使用して１００ｋＤａ全長ＰＳＭＡと８９ｋＤａでの余分のピークをＬＮＣａＰ細胞溶解物中で観察した。この小さい方の蛋白質は、７Ｅ１１では検出されなかった。８９ｋＤａ蛋白質は、ＰＳＭＡ’イソフォームである可能性がある。しかし、ＰＳＭＡ’は、先にＷｅｓｔｅｒｎブロット法により９５ｋＤａの質量と同定された（前述のＧｒａｕｅｒ等，（１９９８年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４７８７−４７８９）ので、８９ｋＤａのピークは、実際にＰＳＭＡのイソフォームであるかどうか決定するために単離したり、順番に配列する必要はない。
【０１６０】
ＰＳＭＡ表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイに最良の予備活性化チップ化学を決定するため、両蛋白質の標準曲線を得るための抗体源としてＬＮＣａＰ溶解物を用いた。２つの異なる予備活性化チップ表面であるＰＳ−１及びＰＳ−２（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）をＭｏＡｂ、７Ｅ１１及び１０７を用いて比較した。図６Ｂに示すように、ＰＳ−１表面は、ＰＳ−２表面よりも全体に良好なＰＳＭＡ蛋白質捕獲性能を持っていた。ＭｏＡｂ  ７Ｅ１１の場合、１００ｋＤａのＰＳＭＡ（矢印で示す）は、ＬＮＣａＰ細胞溶解物の濃度に関係なく、ＰＳ−２の表面上に殆ど捕獲されなかった。これに対し、ＰＳ−１の表面上のＰＳ−１により捕獲されたＰＳＭＡのピーク領域及び強度は、ＬＮＣａＰ細胞溶解物の濃度と相関し、抗原回収で特異性及び効率が向上したことが示唆された。ＭｏＡｂ  １０７を用いると、８９ｋＤａ（２箇所の質量／電荷位置の低い方の矢印）及び１００ｋＤａ（２箇所の質量／電荷位置の高い方の矢印）の蛋白質は、両表面で捕獲された。図示しなかったが、両蛋白質の標準曲線は、抗原供給源としてＬＮＣａＰ溶解物をＭｏＡｂ  １０７と併用して得るのに成功した。アッセイの最適化は、ＭｏＡｂ  １０７とＰＢＳ−ＩＩ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）及び質量分析グレードＳＰＡとの併用を含んでよい。この最適化アッセイは、血清中のＰＳＭＡ及び８９ｋＤａの両方を定量し、その結果を血清ＰＳＡ水準と比較するために使用される。最初の結果は、血清及び血清プラズマ中に１００ｋＤａ及び８９ｋＤａの蛋白質が異なる量（データは示さない）で存在することを示す。血清プラズマ及び尿中のＰＳＭＡを定量するため別途の研究も行なう。
【０１６１】
３．ＰＳＭＡ及びＰＳＡ用複合表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイ
表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイシステムを用いて複合アッセイを発展させるのは比較的容易である。例えば図７のＡ〜Ｈは、血清プラズマ中のＰＳＭＡ及びＰＳＡを検出するための複合アッセイを示す。ＰＳＡ及びＰＳＭＡに対するＭｏＡｂ又は２つの抗体の組合せは、蛋白質Ｇの結合後、予備活性化（ＰＳ−１）表面に結合した。パネルＡは、ＰＳＭＡに相当するピーク（９９，９２０．８）が抗ＰＳＡ（７Ｅ１１−Ｃ５．３）抗体単独を用いて同定されたことを示す。パネルＢは、抗ＰＳＡ抗体単独を用いた、遊離ＰＳＡ（２８，４３０Ｄａ）の検出を示す。パネルＣは、ＰＳＡ及びＰＳＭＡの両方に対するＭｏＡｂを含む単一チップ配列を用いた表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイによる遊離ＰＳＡ及びＰＳＭＡの両方の検出を示す。パネルＤは、バイオマーカー特異的ＭｏＡｂの代りにイソ型適合対照免疫グロブリンを使用すると、遊離ＰＳＡ及びＰＳＭＡが検出されなかったことを示す。特異的ＭｏＡｂ又は対照ＩｇＧのいずれかを用いると（パネルＡ〜Ｄ）２重荷電免疫グロブリン（７３．１〜７３．４ｋＤａ）が観察される。複合アッセイを用いた場合、パネルＡ〜Ｄに示すＰＳＭＡについて得られた幅広のピークは、パネルＥ〜Ｈに示すように、ＰＳＭＡ用の最適強度を選択し、更に質量軸を調節することにより、強化できることに注目されたい。この分析については、更にＷｒｉｇｈｔ等，（１９９９年）“ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐィ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ（ＳＥＬＤＩ）  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｉｐ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ”，Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２：２６４−２７６に記載される。マーカーのいかなる組合せも、例えば遊離−及び錯化−ＰＳＡ並びにＰＳＭＡの同時検出／定量等のこれら複合免疫アッセイフォーマットに従って本質的に任意に検出される。
【０１６２】
本発明は、前立腺癌患者及び前立腺癌を持たない正常被験者のサンプル中に示差的に存在するマーカーを用いて前立腺癌の診断を援助する新規な材料及び方法を提供する。特定の実施例を提供したが、上記説明は概略であり、限定されるものではない。先に説明した実施態様の１つ以上の特徴は、本発明のその他の実施態様の１つ以上の特徴とどのようにして組合せてもよい。更に本発明は、本明細書の検討により多数変化することは当業者ならば明白であろう。したがって本発明の範囲は、上記説明に対して決定すべきではなく、代りに付属の特許請求の範囲に対し、均等物の全範囲に沿って決定すべきである。
【０１６３】
この出願で引用した全ての刊行物、特許、特許出願、又はその他の文献は、各々の刊行物、特許、特許出願、又はその他の文献をあらゆる目的のため援用するため個々に指定したのと同程度に、ここにその全体をあらゆる目的のため援用した。この文献に各種参考資料を引用しても、出願人は、特定の参考資料のいずれも本発明の“従来技術”であるとは認めない。
【図面の簡単な説明】
【図１】表面強化レーザー脱着／イオン化用に構成した表面強化レーザー脱着／イオン化飛行時間質量分析システムの概略図。
【図２】ＰＳＭＡ表面強化レーザー脱着／イオン化質量分析免疫アッセイの概略図。
【図３】表面強化レーザー脱着／イオン化飛行時間質量分析技術の概略説明図。
【図４】図４Ａ〜Ｃは各々、血清中のＰＳＭＡを定量するための表面強化レーザー脱着／イオン化質量分析免疫アッセイの説明図。
【図５】前立腺炎、前立腺癌（ＰＣＡ）、良性前立腺増殖（ＢＰＨ）、及び正常又は陰性診断のいずれかの患者から取ったサンプルについて、親和性捕獲表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイにより測定した血清ＰＳＭＡ水準を示す図。
【図６】図６Ａ、６Ｂは各々、ヒトの男性ホルモン依存前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）からの全細胞溶解物における親和性捕獲表面強化レーザー脱着／イオン化免疫アッセイによるＰＳＭＡイソフォームの検出を示す質量スペクトル図。
【図７】図７のＡ〜Ｈは各々、精液プラズマ中のＰＳＭＡ及びＰＳＡを検出するための複合免疫アッセイの説明図。
【符号の説明】
１００‥‥表面強化レーザー脱着／イオン化ＴＯＦ−ＭＳ総合システム
１０２、２０８、３１２‥‥レーザー光源又はイオン化源
１０４、２０２、３０２‥‥バイオチップ
１０６、３０６‥‥表面機構
１０８‥‥飛行管／質量分析計
１１０‥‥検出器
１１２‥‥データ分析ワークステーション
１１４、２１０、３１４‥‥質量スペクトル
２００‥‥固定化蛋白質Ｇ
２０４‥‥捕獲されたＰＳＭＡ
２０６、３０４‥‥抗体吸着剤
３００‥‥サンプル
３０８‥‥マーカー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004536278.tif 000094
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