(57)【要約】本発明は３−ＨＰおよび他の有機化合物の生産に関する方法および材料を提供する。具体的には、本発明は３−ＨＰおよび他の有機化合物の生産のための単離された核酸、ポリペプチド、宿主細胞、ならびに方法および材料を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性および３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を含む細胞。
【請求項２】
Ｅ１活性化因子活性、Ｅ２α活性、およびＥ２β活性からなる群から選択される活性を含む、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を含む、請求項１記載の細胞。
【請求項４】
ＣｏＡ転移酵素活性を含む、請求項１記載の細胞。
【請求項５】
（ａ） 配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、もしくは１６３に定められる配列；または
（２）配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる配列と少なくとも６５パーセントの配列の同一性を持つ核酸配列、
を含む外因性核酸を含む、請求項１記載の細胞。
【請求項６】
細胞が３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ加水分解酵素活性または３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素活性を含む、請求項１記載の細胞。
【請求項７】
脂肪分解酵素活性を含む、請求項１記載の細胞。
【請求項８】
３−ＨＰを生産する、請求項１記載の細胞。
【請求項９】
３−ＨＰのエステルを生産する、請求項１記載の細胞。
【請求項１０】
エステルが、メチル３−ヒドロキシプロピオネート、エチル３−ヒドロキシプロピオネート、プロピル３−ヒドロキシプロピオネート、ブチル３−ヒドロキシプロピオネート、および２−エチルヘキシル３−ヒドロキシプロピオネートからなる群より選択される、請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
ＣｏＡ合成酵素活性を含む、請求項１記載の細胞。
【請求項１２】
ポリヒドロキシ酸合成酵素活性を含む、請求項１記載の細胞。
【請求項１３】
重合３−ＨＰを生産する、請求項１記載の細胞。
【請求項１４】
原核細胞である、請求項１記載の細胞。
【請求項１５】
酵母、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項１記載の細胞。
【請求項１６】
ＣｏＡ合成酵素活性、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性、およびポリヒドロキシ酸合成酵素活性を含む細胞。
【請求項１７】
Ｅ１活性化因子活性、Ｅ２α活性、およびＥ２β活性からなる群から選択される活性を含む、請求項１６記載の細胞。
【請求項１８】
重合アクリレートを生産する、請求項１６記載の細胞。
【請求項１９】
原核細胞である、請求項１６記載の細胞。
【請求項２０】
酵母、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項１６記載の細胞。
【請求項２１】
ＣｏＡ転移酵素活性、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性、および脂肪分解酵素活性を含む細胞。
【請求項２２】
Ｅ１活性化因子活性、Ｅ２α活性、およびＥ２β活性からなる群から選択される活性を含む、請求項２１記載の細胞。
【請求項２３】
アクリル酸のエステルを生産する、請求項２１記載の細胞。
【請求項２４】
エステルが、メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート、およびブチルアクリレートからなる群より選択される、請求項２３記載の細胞。
【請求項２５】
原核細胞である、請求項２１記載の細胞。
【請求項２６】
酵母、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項２１記載の細胞。
【請求項２７】
（ａ） 配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる配列；
（ｂ） 配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる配列の少なくとも１０の連続するアミノ酸残基を持つ配列；
（ｃ） 配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる配列と少なくとも６５％の配列の同一性を持つ配列；
（ｄ） 配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる配列の少なくとも１０の連続するアミノ酸残基と少なくとも６５％の配列の同一性を持つ配列；および
（ｅ） 少なくとも１つの保存的置換を含む配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を持つポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２７記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項２９】
請求項２７記載のポリペプチドをコードする核酸配列を含む外因性核酸分子を少なくとも１つ含む形質転換細胞。
【請求項３０】
３−ＨＰを生産する請求項２９記載の細胞。
【請求項３１】
外因性核酸分子がラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ酵素のＥ２αポリペプチドをコードする、請求項２９記載の細胞。
【請求項３２】
外因性核酸分子がラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ酵素のＥ２βポリペプチドをコードする、請求項２９記載の細胞。
【請求項３３】
外因性核酸分子が３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性またはＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドをコードする、請求項２９記載の細胞。
【請求項３４】
外因性核酸分子が３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性または３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素活性を持つポリペプチドをコードする、請求項２９記載の細胞。
【請求項３５】
脂肪分解酵素活性を含む、請求項２９記載の細胞。
【請求項３６】
３−ＨＰのエステルを生産する、請求項２９記載の細胞。
【請求項３７】
エステルがメチル３−ヒドロキシプロピオネート、エチル３−ヒドロキシプロピオネート、プロピル３−ヒドロキシプロピオネート、ブチル３−ヒドロキシプロピオネート、および２−エチルヘキシル３−ヒドロキシプロピオネートからなる群より選択される、請求項３６記載の細胞。
【請求項３８】
ＣｏＡ合成酵素活性を含む、請求項２９記載の細胞。
【請求項３９】
重合３−ＨＰを生産する、請求項２９記載の細胞。
【請求項４０】
原核細胞である、請求項２９記載の細胞。
【請求項４１】
乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項２９記載の細胞。
【請求項４２】
酵母細胞である、請求項２９記載の細胞。
【請求項４３】
請求項２７のポリペプチドに特異的に結合する、特異的結合剤。
【請求項４４】
（ａ） 配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる配列；
（ｂ）配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる配列の少なくとも１０の連続するヌクレオチドを持つ配列；
（ｃ）配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる配列と少なくとも６５％配列の同一性を持つ配列；
（ｄ）配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる配列の少なくとも１０の連続するヌクレオチドと少なくとも６５％の配列の同一性を持つ配列；
（ｅ）配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる配列に、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列、
からなる群より選択される、核酸配列を含む単離された核酸分子。
【請求項４５】
生産細胞にとって外因性である、請求項４４記載の単離された核酸分子を含む、生産細胞。
【請求項４６】
単離された核酸分子が、ＣｏＡ転移酵素活性、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性、ＣｏＡ合成酵素活性、ＣｏＡ脱水酵素活性、脱水素酵素活性、マロニルＣｏＡ還元酵素活性、およびヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性からなる群より選択される酵素活性を持つポリペプチドをコードする、請求項４５記載の細胞。
【請求項４７】
細胞がポリペプチドを生産できる条件下で請求項４５記載の細胞を培養し、ポリペプチドが生産される段階を含む、ポリペプチドを生産する方法。
【請求項４８】
３−ＨＰが生産される条件下で、ＰＥＰから３−ＨＰを生産する能力のある少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を含む少なくとも１つの細胞を培養する段階を含む、３−ＨＰの生産方法。
【請求項４９】
細胞が、酵母、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
３−ＨＰがβアラニン中間体を用いる生合成経路によって生産される、請求項４８記載の方法。
【請求項５１】
３−ＨＰがマロニルＣｏＡ中間体を用いる生合成経路によって生産される、請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
３−ＨＰがラクテート中間体を用いる生合成経路によって生産される、請求項４８記載の方法。
【請求項５３】
３−ＨＰが生産される条件下で、ラクテートから３−ＨＰを生産する能力のある少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸分子を含む少なくとも１つの細胞を培養する段階を含む、３−ＨＰの生産方法。
【請求項５４】
細胞が、酵母、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性および３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を含む細胞が３−ＨＰを生産する条件下で、少なくとも１つの細胞を培養する段階を含む、３−ＨＰの生産方法。
【請求項５６】
細胞が、酵母、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
細胞がＣｏＡ転移酵素活性を持つ、請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
細胞が３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ加水分解酵素活性または３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素活性を含む、請求項５５記載の方法。
【請求項５９】
（ａ） ＣｏＡ転移酵素活性を持つ第１のポリペプチドをラクテートに接触させてラクチルＣｏＡを形成する段階；
（ｂ） ラクチルＣｏＡにラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ第２のポリペプチドを接触させてアクリリルＣｏＡを形成する段階；
（ｃ） アクリリルＣｏＡに３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ第３のポリペプチドを接触させて３−ＨＰ−ＣｏＡを形成する段階；および
（ｄ） ３−ＨＰ−ＣｏＡに第１のポリペプチドを接触させて３−ＨＰを形成する、または３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ加水分解酵素活性もしくは３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素活性を持つ第４のポリペプチドを接触させて該３−ＨＰを形成する段階を含む、３−ＨＰの生産方法。
【請求項６０】
ラクチルＣｏＡ加水分解酵素活性および３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を含む細胞を、該細胞が重合３−ＨＰを生産する条件下で培養する段階を含む、重合３−ＨＰの生産方法。
【請求項６１】
細胞が、酵母、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
細胞がＣｏＡ合成酵素活性を含む、請求項６０記載の方法。
【請求項６３】
細胞がポリヒドロキシ酸合成酵素活性を含む、請求項６０記載の方法。
【請求項６４】
（ａ） ＣｏＡ合成酵素活性を持つ第１のポリペプチドをラクテートに接触させてラクチルＣｏＡを形成する段階；
（ｂ） ラクチルＣｏＡにラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ第２のポリペプチドを接触させてアクリリルＣｏＡを形成する段階；
（ｃ） アクリリルＣｏＡに３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ第３のポリペプチドを接触させて３−ヒドロキシプロピオン酸ＣｏＡを形成する段階；および
（ｄ） ３−ヒドロキシプロピオン酸ＣｏＡにポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つ第４のポリペプチドを接触させて重合３−ＨＰを形成する段階、
を含む、重合３−ＨＰの生産方法。
【請求項６５】
ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性および３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を含む細胞を、細胞がエステルを生産する条件下で培養する段階を含む、３−ＨＰのエステルの生産方法。
【請求項６６】
細胞が、酵母、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
細胞がＣｏＡ転移酵素活性を含む、請求項６５記載の方法。
【請求項６８】
細胞が３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ加水分解酵素活性または３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素活性を含む、請求項６５記載の方法。
【請求項６９】
（ａ） ＣｏＡ転移酵素活性を持つ第１のポリペプチドをラクテートに接触させてラクチルＣｏＡを形成する段階；
（ｂ） ラクチルＣｏＡにラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ第２のポリペプチドを接触させてアクリリルＣｏＡを形成する段階；
（ｃ） アクリリルＣｏＡに３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ第３のポリペプチドを接触させて３−ヒドロキシプロピオン酸ＣｏＡを形成する段階；
（ｄ） ３−ヒドロキシプロピオン酸ＣｏＡに第１のポリペプチドを接触させて３−ＨＰを形成する、または３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ加水分解酵素活性もしくは３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素活性を持つ第４のポリペプチドを接触させて３−ＨＰを形成する段階；および
（ｅ） ３−ＨＰに脂肪分解酵素活性を持つ第５のポリペプチドを接触させてエステルを形成する段階、
を含む、３−ＨＰのエステル生産方法。
【請求項７０】
ＣｏＡ合成酵素活性およびラクチルＣｏＡ加水分解酵素活性を含む細胞を、該細胞が重合アクリレートを生産する条件下で培養する段階を含む、重合アクリレートの生産方法。
【請求項７１】
細胞が、酵母、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
細胞がポリヒドロキシ酸合成酵素活性を含む、請求項７０記載の方法。
【請求項７３】
（ａ） ＣｏＡ合成酵素活性を持つ第１のポリペプチドをラクテートに接触させてラクチルＣｏＡを形成する段階；
（ｂ） ラクチルＣｏＡにラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ第２のポリペプチドを接触させてアクリリルＣｏＡを形成する段階；および
（ｃ） アクリリルＣｏＡにポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つ第３のポリペプチドを接触させて重合アクリレートを形成する段階、
を含む、重合アクリレートの生産方法。
【請求項７４】
ＣｏＡ転移酵素活性およびラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を含む細胞を、該細胞がエステルを生産する条件下で培養する段階を含む、アクリル酸のエステルの生産方法。
【請求項７５】
細胞が、酵母、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
細胞が脂肪分解酵素活性を含む、請求項７４記載の方法。
【請求項７７】
（ａ） ＣｏＡ転移酵素活性を持つ第１のポリペプチドをラクテートに接触させてラクチルＣｏＡを形成する段階；
（ｂ） ラクチルＣｏＡにラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ第２のポリペプチドを接触させてアクリリルＣｏＡを形成する段階；
（ｃ） アクリリルＣｏＡに第１のポリペプチドを接触させてアクリレートを形成する段階；および
（ｄ） アクリレートに脂肪分解酵素活性を持つ第３のポリペプチドを接触させてエステルを形成する段階、
を含む、アクリル酸のエステル生産方法。
【請求項７８】
細胞が３−ＨＰを生産する条件下で細胞を培養する段階を含む３−ＨＰの生産方法であって、該細胞が少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むため、該３−ＨＰが生産される条件下で、該３−ＨＰがアセチルＣｏＡから生産される方法。
【請求項７９】
細胞が、酵母、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
細胞が３−ＨＰを生産する条件下で細胞を培養する段階を含む３−ＨＰの生産方法であって、該細胞が少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むため、該３−ＨＰが生産される条件下で、該３−ＨＰがマロニルＣｏＡから生産される方法。
【請求項８１】
細胞が、酵母、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
細胞が３−ＨＰを生産する条件下で細胞を培養する段階を含む３−ＨＰの生産方法であって、該細胞が少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸を含むため、該３−ＨＰが生産される条件下で、該３−ＨＰがβアラニンから生産される方法。
【請求項８３】
細胞が、酵母、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
アセチルＣｏＡから３−ＨＰを生産する能力のあるポリペプチドをコードする外因性核酸を含む細胞を、３−ＨＰが生産される条件下で培養する段階を含む、３−ＨＰの生産方法。
【請求項８５】
細胞が、酵母、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
マロニルＣｏＡから３−ＨＰを生産する能力のあるポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む細胞を、該３−ＨＰが生産される条件下で培養する段階を含む、３−ＨＰの生産方法。
【請求項８７】
細胞が、酵母、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、および大腸菌細胞からなる群より選択される、請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
（ａ） アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を持つ第１のポリペプチドをアセチルＣｏＡに接触させて、マロニルＣｏＡを形成する段階；および
（ｂ） マロニルＣｏＡにマロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つ第２のポリペプチドを接触させて３−ＨＰを形成する段階を含む、３−ＨＰの生産方法。
【請求項８９】
マロニルＣｏＡにマロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドを接触させて３−ＨＰを形成する段階を含む、３−ＨＰの生産方法。
【請求項９０】
（ａ） βアラニンＣｏＡにβアラニルＣｏＡアンモニアリアーゼ活性を持つ第１のポリペプチドを接触させてアクリリルＣｏＡを形成する段階；
（ｂ） アクリリルＣｏＡに３−ＨＰ−ＣｏＡ脱水酵素活性を持つ第２のポリペプチドを接触させて３−ＨＰ−ＣｏＡを形成する段階；
（ｃ） ３−ＨＰ−ＣｏＡにグルタミン酸脱水素酵素活性を持つ第３のポリペプチドを接触させて３−ＨＰを形成する段階
を含む３−ＨＰの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は有機酸および関連産物を生産するための酵素および方法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、参照として本明細書に組み入れられる以下の米国特許仮出願に基づく優先権を主張するものである：２０００年１１月２０日出願米国特許仮出願第６０／２５２，１２３号；２００１年４月２０日出願米国特許仮出願第６０／２８５，４７８号；２００１年７月２０日出願米国特許仮出願第６０／３０６，７２７号；２００１年９月７日出願米国特許仮出願第６０／３１７，８４７号。
【０００３】
背景
有機酸、エステル、およびポリオールのような有機化合物は、プラスチック材料および他の製品の合成に使用できる。有機化合物の需要の増加に応えるために、炭化水素ではなく炭水化物に基づく原料を使用した、より効率の良い費用効果の高い生産方法が開発されている。例えば、特定の細菌は、ポリ乳酸の生産に使用する乳酸の大量生産に使用されてきた。
【０００４】
３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）は、有機酸である。３−ＨＰの生産には、いくつかの化学合成経路が記述されているが、生体触媒経路は現在までに１つ開示されているのみである（国際公開公報第０１／１６３４６号、Ｓｕｔｈｅｒｓら）。３−ＨＰは特殊品の合成に使用でき、化学産業で周知の市販の重要な中間体、例えば、脱水によりアクリル酸に、酸化によりマロン酸に、アルコールとのエステル化反応によりエステルに、および還元により１，３プロパンジオールに転換できる。
【０００５】
概要
本発明は３−ヒドロキシプロピオン酸および他の有機化合物（例えば、１，３−プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸のエステル、重合３−ＨＰ、３−ＨＰのエステル、およびマロン酸およびそのエステル）の生産に関する方法および材料に関する。具体的には、本発明は、３−ＨＰおよび１，３−プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸のエステル、重合３−ＨＰ、３−ＨＰのエステル、およびマロン酸およびそのエステルのような他の有機化合物を生産するために使用できる、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞、および方法を提供する。３−ＨＰは生物学的および商業的に重要である可能性がある。例えば、栄養産業は３−ＨＰを食品、飼料添加物、または保存剤として使用でき、また３−ＨＰから上述の誘導体も生産できる。本明細書に記述される核酸分子は、３−ＨＰならびに１，３−プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸のエステル、重合３−ＨＰ、および３−ＨＰのエステルのような他の有機化合物を生産する能力を持つ宿主細胞の組換えに使用できる。本明細書に記述されるポリペプチドは、無細胞系に使用して、３−ＨＰならびに１，３−プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸のエステル、重合３−ＨＰ、および３−ＨＰのエステルのような他の有機化合物を生産できる。本明細書に記述される宿主細胞は、培養系に使用して、３−ＨＰならびに１，３−プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸のエステル、重合３−ＨＰ、３−ＨＰのエステルのような他の有機化合物を大量に生産することができる。
【０００６】
本発明の１つの局面では、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性および３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ細胞、およびラクチルＣｏＡ脱水酵素活性および３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ少なくとも１つの細胞を培養することによって、本明細書に記述されるような産物を生産する方法が提供される。いくつかの態様では、細胞は以下のポリペプチドを１つまたは複数コードする外因性核酸分子も含む場合がある：Ｅ１活性化因子活性を持つポリペプチド；ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ酵素のサブユニットであるＥ２αポリペプチド；ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ酵素のサブユニットであるＥ２βポリペプチド；および３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチド。また、細胞はＣｏＡ転移酵素活性、ＣｏＡ合成酵素活性、ポリヒドロキシ酸合成酵素活性、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ加水分解酵素活性、３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素活性、および／または脂肪分解酵素活性を持つ場合がある。さらに細胞は、ＣｏＡ転移酵素活性、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ加水分解酵素活性、３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素活性、ＣｏＡ合成酵素活性、ポリヒドロキシ酸合成酵素活性、および／または脂肪分解酵素活性を持つ１つまたは複数のポリペプチドを発現する少なくとも１つの外因性核酸分子を含む場合がある。
【０００７】
本発明の別の態様では、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性および３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ細胞は、例えば、３−ＨＰ、重合３−ＨＰ，および／またはメチルヒドロキシプロピオネート、エチルヒドロキシプロピオネート、プロピルヒドロキシプロピオネート、および／またはブチルヒドロキシプロピオネートのような３−ＨＰのエステルのような産物を生産する。したがって、本発明はこれらの産物を１つまたは複数生産する方法も提供する。これらの方法には、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性および３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ細胞を、産物が生産されるような条件下で培養する段階が含まれる。これらの細胞は、ＣｏＡ合成酵素活性および／またはポリヒドロキシ酸合成酵素活性も持ち得る。
【０００８】
本発明の別の局面では、ＣｏＡ合成酵素活性、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性、およびポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つ細胞が提供される。いくつかの態様では、これらの細胞は、以下のポリペプチドを１つまたは複数コードする外因性核酸分子も含むことができる：Ｅ１活性化因子活性を持つポリペプチド；ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ酵素のサブユニットであるＥ２αポリペプチド；ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ酵素のサブユニットであるＥ２βポリペプチド；ＣｏＡ合成酵素活性を持つポリペプチド；およびポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つポリペプチド。
【０００９】
本発明の別の態様では、ＣｏＡ合成酵素活性、ラクチルＣｏＡで脱水酵素活性、およびポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つ細胞は、例えば、重合アクリレートのような産物を生産することができる。
【００１０】
本発明の別の局面は、ＣｏＡ転移酵素活性、ラクチルＣｏＡで加水酵素活性、および脂肪分解酵素活性を含む細胞を提供する。いくつかの態様では、細胞は以下のポリペプチドを１つまたは複数コードする外因性核酸分子も含むことができる：ＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチド；Ｅ１活性化因子活性を持つポリペプチド；ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ酵素のサブユニットであるＥ２αポリペプチド；ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ酵素のサブユニットであるＥ２βポリペプチド；および脂肪分解酵素活性を持つポリペプチド。この細胞は、特に、アクリル酸のエステル（例えば、メチルアクリレート、エチルアクリレート、プロピルアクリレート、およびブチルアクリレート）のような産物の生産に使用できる。
【００１１】
いくつかの態様では、３−ＨＰ−ＣｏＡまたは３−ＨＰから、酵素活性を持つポリペプチドを用いることによって、１，３プロパンジオールが作製できる。これらのポリペプチドは、インビトロまたはインビボのいずれでも使用できる。３−ＨＰ−ＣｏＡを１，３プロパンジオールに変換する場合には、オキシド還元酵素活性または還元酵素活性を持つポリペプチド（例えば、１．１．１−クラスの酵素）が使用できる。または、３−ＨＰから１，３プロパンジオールを作製する場合には、（１） アルデヒド脱水素酵素活性を持つポリペプチド（例えば、１．１．１．３４クラスの酵素）および （２） アルコール脱水素酵素活性を持つポリペプチド（例えば、１．１．１．３２クラスの酵素）の組み合せが使用できる。
【００１２】
本発明のいくつかの態様では、産物はインビトロ（細胞外）で生産される。本発明の別の態様では、産物はインビトロおよびインビボ（細胞内）の方法の組み合せを用いて生産される。本発明のまた別の態様では、産物はインビボで生産される。インビボ段階を含む方法では、細胞は、単離された培養細胞、またはトランスジェニック植物、非ヒト哺乳類、もしくは酵母および細菌（例えば、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ））のような単細胞生物のような生物全体でよい。以下では、そのような細胞は生産細胞と呼ばれる。これらの生産細胞によって生産された産物は、３−ＨＰのような有機産物、および／または本発明に記述される核酸分子およびポリペプチドであり得る。
【００１３】
本発明の別の局面では、（１） 配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められるアミノ酸配列、（２） 配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる配列の少なくとも１０の連続するアミノ酸残基を持つアミノ酸配列、（３） 配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる配列の少なくとも１０の連続するアミノ酸残基と少なくとも６５％の配列の同一性を持つアミノ酸配列、（４） 保存的なアミノ酸置換を持つ配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる配列を持つアミノ酸配列、または（５） 配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる配列と少なくとも６５％の配列の同一性を持つアミノ酸配列を持つポリペプチドが提供される。したがって、本発明は本明細書に記述される任意のポリペプチドをコードする核酸配列、および本明細書に記述される任意のポリペプチドに結合する特異的な結合剤も提供する。同様に、本発明は本明細書に記述される任意のポリペプチドをコードする任意の核酸配列を含む形質転換細胞も提供する。これらの細胞を用いて、核酸分子、ポリペプチド、および有機化合物が生産できる。ポリペプチドは有機化合物の形成の触媒、または特異的な結合剤を生産するための抗原として使用できる。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は以下の核酸配列を少なくとも１つ含む単離された核酸分子を提供する：（１） 配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる核酸配列；（２）配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる配列の少なくとも１０の連続するヌクレオチドを持つ核酸配列；（３）配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる核酸配列にハイブリダイゼーション条件下（例えば、中程度または高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）でハイブリダイズする核酸配列；（４）配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる配列の少なくとも１０の連続するヌクレオチドと６５％の配列の同一性を持つ核酸配列；および（５）配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる核酸配列と少なくとも６５％配列の同一性を持つ核酸配列。したがって、本発明は上記の任意の核酸配列を持つ、少なくとも１つの外因性核酸を含む生産細胞も提供する。生産細胞は、ＣｏＡ転移酵素活性、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性、ＣｏＡ合成酵素活性、脱水酵素活性、脱水素酵素活性、マロニルＣｏＡ還元酵素活性、βアラニンアンモニアリアーゼ活性、および／または３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性のような酵素活性を持つポリペプチドを発現するために使用できる。したがって、本発明は上述の核酸配列によってコードされるポリペプチドの生産方法も提供する。
【００１５】
本発明は、ラクテート、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）、またはピルベートから３−ＨＰを作製する方法のような、いくつかの方法も提供する。いくつかの態様では、ラクテート、ＰＥＰ、またはピルベートから３−ＨＰを作製する方法は、細胞が３−ＨＰを生産できる条件下で、少なくとも１つの外因性核酸を含む細胞を培養する段階を含む。これらの方法は、本明細書に記述される種々の生産細胞を用いて実施できる。いくつかの態様では、生産細胞は、以下の活性を１つまたは複数持つことができる：ＣｏＡ転移酵素活性、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ加水分解酵素活性、３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素活性、脱水酵素活性、および／またはマロニルＣｏＡ還元酵素活性。
【００１６】
別の態様では、本方法はＣｏＡ転移酵素活性またはＣｏＡ合成酵素活性を持つ第１のポリペプチドをラクテートに接触させてラクチルＣｏＡを形成し、ラクチルＣｏＡにラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ第２のポリペプチドを接触させてアクリリルＣｏＡを形成させ、その後、アクリリルＣｏＡに３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ第３のポリペプチドを接触させて３−ヒドロキシプロピオン酸ＣｏＡを形成させ、その後、３−ヒドロキシプロピオン酸ＣｏＡに第１のポリペプチドを接触させて３−ＨＰを形成するか、または３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ加水分解酵素活性もしくは３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素活性を持つ第４のポリペプチドを接触させて３−ＨＰを形成する、３−ＨＰの作製方法に関する。
【００１７】
本発明の別の局面では、重合３−ＨＰの作製方法が提供される。これらの方法は、３−ヒドロキシプロピオン酸ＣｏＡを上述のようにして作製し、３−ヒドロキシプロピオン酸ＣｏＡにポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つポリペプチドを接触させて重合３−ＨＰを形成させることに関する。
【００１８】
本発明のさらに別の態様では、３−ＨＰのエステルの作製方法が提供される。これらの方法では、上述のようにして３−ＨＰを作製し、さらに３−ＨＰに脂肪分解酵素活性を持つ第５のポリペプチドを接触させてエステルを形成する。
【００１９】
本発明は重合アクリレートの作製方法も提供する。これらの方法では、ＣｏＡ合成酵素活性、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性、およびポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つ細胞を培養し、重合アクリレートが作製される段階を含む。したがって、本発明は、ＣｏＡ合成酵素活性を持つ第１のポリペプチドをラクテートに接触させてラクチルＣｏＡを形成させ、ラクチルＣｏＡにラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ第２のポリペプチドを接触させてアクリリルＣｏＡを形成させ、その後、アクリリルＣｏＡにポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つ第３のポリペプチドを接触させて重合アクリレートを形成する、重合アクリレートの作製方法も提供する。
【００２０】
本発明はアクリル酸のエステルの作製方法も提供する。これらの方法では、細胞がエステルの生産を行なえるような条件下で、ＣｏＡ転移酵素活性、脂肪分解酵素活性、およびラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ細胞を培養する段階を含む。
【００２１】
別の態様では、本発明は、アクリリルＣｏＡを上述のようにして形成し、その後、アクリリルＣｏＡにＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドを接触させてアクリレートを形成し、アクリレートに脂肪分解酵素活性を持つポリペプチドを接触させてエステルを形成する、アクリル酸のエステルの作製方法を提供する。
【００２２】
本発明は、３−ＨＰを作製する方法も提供する。これらの方法では、少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの外因性核酸を含む細胞を培養して、アセチルＣｏＡまたはマロニルＣｏＡから３−ＨＰを生産する段階を含む。
【００２３】
別の態様では、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を持つ第１のポリペプチドをアセチルＣｏＡに接触させてマロニルＣｏＡを形成し、マロニルＣｏＡにマロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つ第２のポリペプチドを接触させて３−ＨＰを形成させる、３−ＨＰの作製方法が提供される。
【００２４】
別の態様では、マロニルＣｏＡにマロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドを接触させて３−ＨＰを作製できる。
【００２５】
別の態様では、本発明はβアラニン中間体を用いた３−ＨＰの作製方法を提供する。この方法では、βアラニンＣｏＡにβアラニルＣｏＡアンモニアリアーゼ活性（配列番号：１６０または１６１に定められるアミノ酸配列を持つポリペプチドなど）を持つ第１のポリペプチドを接触させてアクリリルＣｏＡを形成させ、アクリリルＣｏＡに３−ＨＰ−ＣｏＡ脱水酵素活性を持つ第２のポリペプチドを接触させて３−ＨＰ−ＣｏＡを形成させ、３−ＨＰ−ＣｏＡにグルタミン酸脱水素酵素活性を持つ第３のポリペプチドを接触させて３−ＨＰを作製することによって、実施できる。
【００２６】
特に記載のないかぎり、本明細書で使用される全ての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が共通して理解するのと同じ意味を持つ。本明細書に記述されたものと同様または同等な方法および材料が、本発明の実施または検証に使用できるが、適当な方法および材料は以下に説明される。本明細書に引用される全ての出版物、特許出願、特許、および他の参照文献は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。矛盾がある場合には、定義を含めて本明細書が優先される。また、材料、方法、および実施例は説明のみのためであり、限定する意図はない。
【００２７】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求項から明らかであると思われる。
【００２８】
詳細な説明
Ｉ． 用語
核酸：
本明細書で使用される「核酸」という用語は、ＲＮＡ、ならびにｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成（例えば、化学合成）ＤＮＡを含むがこれらに限定されないＤＮＡの両方を含む。核酸は二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖の場合は、核酸はセンス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。また、核酸は環状または線状であり得る。
【００２９】
単離された：
核酸に関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、それが由来する生物の天然に存在するゲノムにおいて、直接隣接している配列の両方（５’末端１つと３’末端１つ）と直接隣接していない、天然に存在する核酸を指す。例えば、単離された核酸は、天然に存在するゲノムでその組換えＤＮＡ分子に通常見出される直接隣接している核酸配列の１つが除去されたまたは存在しない場合、任意の長さの組換えＤＮＡ分子であり得るが、これに限定されない。したがって、単離された核酸は、他の配列とは独立して別の分子として存在する組換えＤＮＡ（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理で作製されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）、ならびにベクター、自律複製するプラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス）、または原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた組換えＤＮＡを含むが、これらに限定されない。また、単離された核酸は、ハイブリッドまたは融合核酸配列の一部である組換えＤＮＡ分子も含み得る。
【００３０】
非天然核酸は、天然に存在せず、天然に存在するゲノムで直接隣接する配列を持たないため、核酸に関して本明細書で使用される「単離された」という用語は、任意の非天然核酸も含む。例えば、組換え核酸のような非天然核酸は、単離された核酸と考えられる。組換え核酸は、通常の分子クローニングまたは核酸の化学合成によって作製される。単離された非天然核酸は、他の配列とは独立しているか、またはベクター、自律複製プラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、もしくはヘルペスウイルス）、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれている可能性がある。また、非天然核酸にはハイブリッドまたは融合核酸配列の一部である核酸分子も含まれ得る。
【００３１】
例えばｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーの中で数百から数百万の他の核酸分子中に存在する核酸、またはゲノムＤＮＡの制限消化物を含むゲルスライスは単離された核酸と考えられないことは、当業者には明らかであると思われる。
【００３２】
外因性の：
核酸および特定の細胞に関して本明細書で使用される「外因性の」という用語は、天然に存在するその特定の細胞からは生じない任意の核酸を指す。したがって、非天然核酸は、細胞中に導入されるとその細胞にとって外因性であると考えられる。天然に存在する核酸も、特定の細胞にとって外因性であり得る。例えば、ヒトＸの細胞から単離された染色体全体は、その染色体がヒトＹの細胞に導入されると、Ｙの細胞にとっては外因性の核酸である。
【００３３】
ハイブリダイゼーション：
本明細書で使用される「ハイブリダイゼーション」という用語は、２つの核酸分子のヌクレオチド配列中の相補性を検定する方法であり、相補的な一本鎖ＤＮＡおよび／またはＲＮＡが二本鎖分子を形成する能力に基づく。核酸ハイブリダイゼーション技術は、本発明の範囲内の単離された核酸を得るために使用できる。簡単に述べると、配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる配列にある程度の相同性を持つ任意の核酸をプローブとして使用して、中等度から高度にストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションによって類似した核酸を同定することができる。同定されると、核酸を精製、配列決定、および分析して、それが本明細書に記述される発明の範囲内かどうかを決定できる。
【００３４】
ハイブリダイゼーションは、プローブにハイブリダイズするそれぞれＤＮＡまたはＲＮＡ配列を同定するサザンまたはノーザン分析によって行なえる。プローブはビオチン、ジゴキシゲニン、酵素、または３２Ｐのような放射性同位元素で標識できる。分析するＤＮＡまたはＲＮＡは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル上で電気泳動により分離し、ニトロセルロース、ナイロン、または他の適当な膜に転写し、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、（１９８９） 「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、ＮＹのセクション７．３９−７．５２に説明されるような、当技術分野で周知の標準的な手法を用いてプローブとハイブリダイズさせることができる。通常は、プローブは少なくとも約２０ヌクレオチドの長さである。例えば、配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、または１４２に定められる２０ヌクレオチドの配列に対応するプローブを用いて、同一または類似した核酸を同定できる。また、２０ヌクレオチドよりも長いまたは短いプローブも使用できる。
【００３５】
本発明は、長さが少なくとも約１２塩基（例えば、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００塩基）で、ハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる配列を持つ核酸のセンスまたはアンチセンス鎖にハイブリダイズする、単離された核酸配列も提供する。ハイブリダイゼーション条件は、中等度または高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件であり得る。
【００３６】
本発明の目的のためには、中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４２℃で、２５ ｍＭ ＫＰＯ４ （ｐＨ ７．４）、５Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ デンハルト溶液、５０μｇ／ｍＬ超音波処理した変性サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、および１−１５ ｎｇ／ｍＬプローブ（約５ ｘ １０７ ｃｐｍ／μｇ）を含むハイブリダイゼーション溶液中でハイブリダイゼーションが行われ、２Ｘ ＳＳＣおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄溶液を用いて約５０℃で洗浄することを意味する。
【００３７】
かなりストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、約４２℃で、２５ ｍＭ ＫＰＯ４ （ｐＨ ７．４）、５Ｘ ＳＳＣ、５Ｘ デンハルト溶液、５０μｇ／ｍＬ超音波処理した変性サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、および１−１５ ｎｇ／ｍＬプローブ（約５ ｘ １０７ ｃｐｍ／μｇ）を含むハイブリダイゼーション溶液中でハイブリダイゼーションが行われ、０．２Ｘ ＳＳＣおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄溶液を用いて約６５℃で洗浄することを意味する。
【００３８】
精製した：
本明細書で使用される「精製した」という用語は、絶対的な純度を必要とせず、相対的な用語と意図される。したがって、例えば、精製したポリペプチドまたは核酸調製物は、それぞれ対象のポリペプチドまたは核酸が、生物の中の天然の環境におけるポリペプチドまたは核酸よりも、高い濃度であるもので良い。例えば、ポリペプチド調製物は、そのポリペプチド含量が、調製物の総タンパク質含量の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％であれば、精製されていると考えられる。
【００３９】
形質転換された：
「形質転換された」細胞は、例えば、分子生物学の手法によって核酸分子が導入された細胞である。本明細書で使用される「形質転換」という用語は、核酸分子をそのような細胞に導入するための全ての手法を含み、ウイルスベクターを用いたトランスフェクション、接合、プラスミドベクターを用いた形質転換、ならびに電気穿孔、リポフェクション、およびパーティクルガン法による裸のＤＮＡの導入を含むが、これらに限定されない。
【００４０】
組換え：
「組換え」核酸は、（１） それが発現される生物中に天然には存在しない配列、または（２） ２つの別々の、より短い配列の人工的な組み合せによって作製される配列を持つものである。この人工的な組み合せは、しばしば化学合成、またはより一般的には核酸の単離されたセグメントの人工的な操作、例えば、遺伝子組換え手法によって、実行される。「組換え」は、人工的に操作されたが、核酸が単離された生物に見られるものと同じ調節配列およびコード領域を含む核酸分子の記述にも使用される。
【００４１】
特異的結合剤：
「特異的結合剤」は、本明細書に記述される任意のポリペプチドに特異的に結合する能力がある物質で、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ヒト化モノクローナル抗体を含む）、およびＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片のようなモノクローナル抗体の断片、ならびにそのようなポリペプチドのエピトープに特異的に結合できる任意の他の物質を含み得る。
【００４２】
本明細書に提供されるポリペプチドに対する抗体（またはその断片）は、そのようなポリペプチドの精製または同定に使用できる。本明細書に提供されるアミノ酸および核酸配列を用いて、本明細書に記述されるポリペプチドを認識する、特異的な抗体に基づく結合剤を生産できる。
【００４３】
ポリペプチド、ポリペプチドの一部、またはその変異型に対してモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体が作製できる。選択的に、ポリペプチド抗原上の１つまたは複数のエピトープに対して作製された抗体は、そのポリペプチドを特異的に検出する。すなわち、１つの特定のポリペプチドに対して作製された抗体は、その特定のポリペプチドを認識し、結合するが、他のポリペプチドを実質的に認識または結合しない。抗体が特定のポリペプチドに特異的に結合するという決定は、例えば、ウェスタンブロッティング（Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９参照）のような、いくつかの標準的な免疫アッセイ法の任意のものを用いてできる。
【００４４】
所定の抗体調製物（配列番号：２に定められるアミノ酸配列を持つポリペプチドに対してマウスで作製された調製物）が適当なポリペプチド（例えば、配列番号：２に定められるアミノ酸配列を持つポリペプチド）を特異的に検出することをウェスタンブロッティングによって決定するために、細胞の全タンパク質を細胞から抽出し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離する。分離した細胞の全タンパク質を膜（例えば、ニトロセルロース）に転写し、膜と抗体調製物をインキュベーションすることができる。膜を洗って非特異的に結合した抗体を除去した後、特異的に結合した抗体の存在を、アルカリホスファターゼのような抗体に結合した適当な２次抗体（例えば、抗マウス抗体）を用いて検出できる。５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウムを適用すると免疫局在したアルカリホスファターゼによって濃青色の化合物が生産されるためである。
【００４５】
免疫原として使用するのに適した実質的に純粋なポリペプチドを、トランスフェクトされた細胞、形質転換細胞、または野生型細胞から得ることができる。最終調整物中のポリペプチド濃度は、例えば、アミコンフィルター装置で濃縮することにより、１ミリリットル当たり数マイクログラムのレベルに調整できる。また、全長のポリペプチドからわずか９アミノ酸残基のポリペプチドまでの範囲のサイズのポリペプチドが免疫原として使用できる。そのようなポリペプチドは、細胞培養での生産、標準的な方法を用いた化学合成、または大きなポリペプチドを精製可能なより小さなポリペプチドに切断することによって得られる。長さわずか９アミノ酸残基のポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子のような主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と共に提示されると、免疫原性を持つ。したがって、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、９００、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、またはそれ以上の、本明細書に開示される任意のアミノ酸配列の連続するアミノ酸残基を持つポリペプチドは、抗体を生産するための免疫原として使用できる。
【００４６】
本明細書に開示される任意のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ） （Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５ （１９７５））の古典的方法またはそれから派生する方法にしたがって、マウスハイブリドーマから調製できる。
【００４７】
本明細書に開示される任意のポリペプチドの異質性エピトープに対する抗体を含むポリクローナル抗血清は、免疫原性を増強するために改変したまたは改変していない、ポリペプチド（またはその断片）によって適当な動物を免疫することによって調製できる。ウサギの効果的な免疫プロトコールは、バイタカイティス（Ｖａｉｔｕｋａｉｔｉｓ）ら（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． Ｍｅｔａｂ． ３３：９８８−９９１ （１９７１））に記述されている。
【００４８】
抗体全体の代わりに抗体断片も使用でき、これは原核宿主細胞中で容易に発現できる。「抗体断片」とも呼ばれる、モノクローナル抗体の免疫学的に有効な部分の作製および使用方法は、当技術分野で周知であり、ベター（Ｂｅｔｔｅｒ）およびホロウィッツ（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ） （ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １７８：４７６−４９６ （１９８９））、グロッックシュバー（Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒ）ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：１３６２−１３６７ （１９９０）、米国特許第５，６４８，２３７号（「機能的抗体断片の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」）、米国特許第４，９４６，７７８号（「一本鎖ポリペプチド結合分子（Ｓｉｎｇｌｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈａｉｎ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」）、米国特許第５，４５５，０３０号（「一本鎖ポリペプチド結合分子を用いた免疫療法（Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｕｓｉｎｇ Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｈａｉｎ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）」）、および本明細書に引用された参照文献を含む。
【００４９】
機能的に結合：
第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合に、第１の核酸は第２の核酸配列と「機能的に結合」しているという。例えば、プロモーターは、コード配列の転写に影響を与える場合、そのコード配列に機能的に連結している。一般に、機能的に連結したＤＮＡ配列は連続しており、２つのポリペプチドコード領域を結合させる必要がある場合には、同じリーディングフレームにある。
【００５０】
プローブおよびプライマー：核酸プローブおよびプライマーは、本明細書に提供されるアミノ酸配列および核酸配列に基づいて、容易に調製できる。「プローブ」には、検出可能な標識またはレポーター分子を含む単離された核酸が含まれる。代表的な標識には、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、および酵素が含まれる。標識の方法、および種々の目的に適した標識の選択のガイドは、例えば、サムブルックら編、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９、およびアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編、「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（定期的に改定）、１９８７に記述されている。
【００５１】
「プライマー」は、通常は１０またはそれ以上のヌクレオチドの核酸分子である（例えば、約１０ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドの間の核酸分子）。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的核酸鎖とアニーリングさせ、プライマーと標的核酸鎖の間のハイブリッドを形成させ、その後、例えばＤＮＡポリメラーゼ酵素によって標的核酸鎖に沿って延長できる。プライマー対は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または当技術分野で周知の他の核酸増幅法による、核酸配列の増幅に使用できる。
【００５２】
プローブおよびプライマーの調製および使用法は、例えば、サムブルックら編、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；アウスベルら編、「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（定期的に改定）、１９８７；イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら編、「ＰＣＲプロトコール、方法と適用のガイド （ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９９０のような参照文献に記述されている。ＰＣＲプライマー対は、例えば、プライマー（Ｐｒｉｍｅｒ）バージョン０．５、．ＣＯＰＹＲＧＴ． １９９１、Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）のような、その目的のためのコンピュータプログラムを用いて、既知の配列から導き得る。当業者は、特定のプローブまたはプライマーの特異性は、長さとともに上昇するが、プローブまたはプライマーの長さは全長の配列からわずか５つの連続するヌクレオチドの範囲であり得ることを理解できると思われる。したがって、例えば、２０の連続するヌクレオチドのプライマーは、１５ヌクレオチドのみの対応するプライマーよりも、高い特異性で標的にアニーリングし得る。したがって、特異性を高くするためには、例えば、１０、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、２０００、２０５０、２１００、２１５０、２２００、２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２６００、２６５０、２７００、２７５０、２８００、２８５０、２９００、３０００、３０５０、３１００、３１５０、３２００、３２５０、３３００、３３５０、３４００、３４５０、３５５０、３６００、３６５０、３７００、３７５０、３８００、３８５０、３９００、４０００、４０５０、４１００、４１５０、４２００、４２５０、４３００、４３５０、４４００、４４５０、４５００、４５５０、４６００、４６５０、４７００、４７５０、４８００、４８５０、４９００、５０００、５０５０、５１５０、５２００、５２５０、５３００、５３５０、５４００、５４５０、またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含むプローブおよびプライマーが選択できる。
【００５３】
配列同一性のパーセント：
特定の核酸またはアミノ酸配列と、特定の配列同定番号で参照される配列との「配列同一性のパーセント」は、以下のように決定される。まず、ＢＬＡＳＴＮバージョン２．０．１４およびＢＬＡＳＴＰバージョン２．０．１４を含むＢＬＡＳＴＺの独立型のＢＬＡＳＴ ２シーケンシーズ（ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ） （Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを用いて、核酸またはアミノ酸配列を、特定の配列同定番号で定められる配列と比較する。この独立型ＢＬＡＳＴＺは、フィッシュ（Ｆｉｓｈ）およびリチャードソン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）のウェブサイト（ｗｗｗ．ｆｒ．ｃｏｍ）または米国政府の国立バイオテクノロジー情報（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）ウェブサイト（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）から入手できる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムの使用方法は、ＢＬＡＳＴＺに同梱のリードミー（ｒｅａｄｍｅ）ファイルに記載されている。Ｂｌ２ｓｅｑはＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを用いて２つの配列の比較を行なう。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列の比較に使用され、ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列の比較に使用される。２つの核酸配列を比較するには、以下のようにオプションを設定する。−ｉは比較する第１の核酸配列を含むファイルに設定し（例えば、 Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）；−ｊは比較する第２の核酸配列を含むファイルに設定し（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）；−ｐはｂｌａｓｔｎに設定し；−ｏは任意の所望のファイル名に設定し（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）；−ｑは−１に設定し；−ｒは２に設定し；他の全てのオプションは、初期設定のままにする。例えば、２つの配列の間の比較を含むアウトプットファイルを作製するためには、以下のようなコマンドが使用できる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ −ｉ ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ−ｊ ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ −ｐ ｂｌａｓｔｎ −ｏ ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ −ｑ −１−ｒ ２。２つのアミノ酸配列を比較するためには、Ｂｌ２ｓｅｑのオプションは、以下のように設定する。−ｉは比較する第１のアミノ酸配列を含むファイルに設定し（例えば、 Ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ）；−ｊは比較する第２のアミノ酸配列を含むファイルに設定し（例えば、Ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ）；−ｐはｂｌａｓｔｐに設定し；−ｏは任意の所望のファイル名に設定し（例えば、Ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ）；他の全てのオプションは、初期設定のままにする。例えば、２つのアミノ酸配列の間の比較を含むアウトプットファイルを作製するためには、以下のようなコマンドが使用できる：Ｃ：＼Ｂｌ２ｓｅｑ −ｉ ｃ：＼ｓｅｑ１．ｔｘｔ −ｊ ｃ：＼ｓｅｑ２．ｔｘｔ −ｐ ｂｌａｓｔｐ −ｏ ｃ：＼ｏｕｔｐｕｔ．ｔｘｔ。２つの比較された配列が相同性を持つならば、指定されたアウトプットファイルは、整列された配列として、相同な領域を示す。２つの比較された配列が、相同性を持たないならば、指定されたアウトプットファイルは、整列された配列を提示しない。
【００５４】
整列がされたら、両方の配列で同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が示されている位置の数を数えることによって、一致した数が決定できる。配列同一性パーセントは、一致した数を同定された配列（例えば、配列番号：１）に定められる配列の長さ、または区切られた長さ（例えば、同定された配列中で定められる配列における１００の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基）で割り、その値を１００倍することで、得られる。例えば、配列番号：１に定められる配列と整列すると１１６６の一致を持つ核酸配列は、配列番号：１に定められる配列と７５．０パーセント同一である（すなわち、１１６６÷１１５５‡１００＝７５．０）。配列同一性パーセントは、０．１の位に四捨五入する。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３および７５．１４は四捨五入で７５．１になり、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８および７５．１９は四捨五入で７５．２になる。また、長さの値は必ず整数である。別の例では、以下のような同定された配列の２０の連続するヌクレオチドと整列された２０ヌクレオチドの領域を含む標的配列は、その同定された配列に対して７５パーセントの配列同一性を持つ（すなわち、１５÷２０‡１００＝７５）領域を含む。
2004514431.tif 000002
【００５５】
保存的置換：
本明細書で使用される「保存的置換」という用語は、表１に定められる任意のアミノ酸置換を指す。典型的には、保存的置換は、ポリペプチドの活性に影響をほとんどまたは全く持たない。例えば部位特異的突然変異導入法またはＰＣＲのような標準的な手法を用いて、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって、１つまたは複数の保存的置換を持つポリペプチドが生産できる。
【表１】
2004514431.tif 000003
【００５６】
ＩＩ． 代謝経路
本発明は、３−ＨＰおよび他の有機化合物（例えば、１，３−プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸エステル、重合３−ＨＰ，および３−ＨＰのエステル）の生産に関する方法および材料を提供する。特に、本発明は３−ＨＰの生産のための単離された核酸、ポリペプチド、宿主細胞、および方法および材料、ならびに１，３−プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸エステル、重合３−ＨＰ，および３−ＨＰのエステルのような他の有機化合物を提供する。
【００５７】
したがって、本発明はＰＥＰから有機化合物を生産するために使用できるいくつかの代謝経路を提供する（図１−５、４３−４４、５４，および５５）。図１に示されるように、乳酸はＣｏＡ転移酵素活性（ＥＣ ２．８．３．１）を持つポリペプチドによってラクチルＣｏＡに変換される。得られたラクチルＣｏＡはラクチルＣｏＡ脱水酵素活性（ＥＣ ４．２．１．５４）を持つポリペプチド（または活性化Ｅ２αおよびＥ２β複合体のような複数のポリペプチドの複合体）によって、アクリリルＣｏＡに変換される。得られたアクリリルＣｏＡは３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性（ＥＣ ４．２．１．−）を持つポリペプチドによって、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ（３−ＨＰ−ＣｏＡ）に変換される、得られた３ＨＰ−ＣｏＡはＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチド、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ加水分解酵素活性（ＥＣ ３．１．２．−）を持つポリペプチド、または３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素活性（ＥＣ ３．１．２．４）を持つポリペプチドによって３−ＨＰに変換され得る。
【００５８】
ＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、メガスフェラ・エルスデニ（Ｍａｇａｓｐｈａｅｒａ ｅｌｓｄｅｎｉｉ）、クロストリジウム・プロピオニクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、クロストリジウム・クルイベリ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、および大腸菌を含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、ＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸は、実施例１のようにしてメガスフェラ・エルスデニから得られ、配列番号：１に定められるような配列を持ち得る。また、ＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に記述されるようにして得られる。例えば、本明細書に提供される配列番号：１の変形は、ＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドをコードするために使用できる。
【００５９】
ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチド（または活性化Ｅ２αおよびＥ２β複合体のような複数のポリペプチドの複合体のポリペプチド）、およびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、メガスフェラ・エルスデニおよびクロストリジウム・プロピオニクムを含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ複数のポリペプチドの複合体を形成し得るＥ１活性化因子、Ｅ２αサブユニット、およびＥ２βサブユニットをコードする核酸は、実施例２に記述されるようにしてメガスフェラ・エルスデニから得られる。Ｅ１活性化因子をコードする核酸は、配列番号：９に定められる配列を含み得る。Ｅ２αサブユニットをコードする核酸は、配列番号：１７に定められる配列を含み得る。およびＥ２βサブユニットをコードする核酸は、配列番号：２５に定められる配列を含み得る。また、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチド（または複数のポリペプチドの複合体のポリペプチド）、およびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に記載されるようにして得られる。例えば、本明細書に提供される配列番号：９、１７、および２５の変形は、ＣｏＡ転移酵素活性を持つ複数のポリペプチドの複合体のポリペプチドをコードするために使用できる。
【００６０】
３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、クロロフレクサス・オーランチアクス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）、カンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）、ロードスピリリウム・ラブラム（Ｒｈｏｄｏｓｐｒｉｌｌｉｕｍ ｒｕｂｒｕｍ）、およびロドバクター・カプスレーテス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｅｓ）を含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチドは、実施例３のようにしてクロロフレクサス・オーランチアクスから得られ、配列番号：４０に定められるような配列を持ち得る。また３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に記述されるようにして得られる。例えば、本明細書に提供される配列番号：４０の変形は、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチドをコードするために使用できる。
【００６１】
３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ加水分解酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、カンジダ・ルゴーサを含むがこれに限定されない様々な種から得られる。３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、クマネズミ（ｒａｔｔｕｓ）、およびヒト（ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）を含む様々な種から得られる。例えば、３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸は、ヒトから得られ、ゲンバンク（登録商標）アクセッション番号Ｕ６６６６９に定められる配列を持ち得る。
【００６２】
本明細書で使用する「酵素活性を持つポリペプチド」という用語は、反応の完了時にそれ自身が破壊または変化することなく、他の基質の化学反応を触媒する任意のポリペプチドを指す。典型的には、酵素活性を持つポリペプチドは、１つまたは複数の基質からの１つまたは複数の産物の形成を触媒する。そのようなポリペプチドは、脱水酵素／加水酵素、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素／加水酵素、ＣｏＡ転移酵素、ラクチルＣｏＡ脱水酵素、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ加水分解酵素、３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素、ポリヒドロキシ酸合成酵素、ＣｏＡ合成酵素、マロニルＣｏＡ還元酵素、βアラニンアンモニアリアーゼ、および脂肪分解酵素のような酵素に伴う酵素活性を含むがこれらに規定されない任意の種類の酵素活性を持ち得る。
【００６３】
図２に示すように、ラクテートはＣｏＡ合成酵素活性（ＥＣ ６．２．１．−）を持つポリペプチドによってラクチルＣｏＡに変換される。得られたラクチルＣｏＡはラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチド（または複数のポリペプチドの複合体）によって、アクリリルＣｏＡに変換される。得られたアクリリルＣｏＡは３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチドによって、３−ＨＰ−ＣｏＡに変換され、得られた３−ＨＰ−ＣｏＡはポリヒドロキシ酸合成酵素活性（ＥＣ ２．３．１．−）を持つポリペプチドによって重合３−ＨＰに変換される。ＣｏＡ合成酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、大腸菌、ロドバクター・スファロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、および腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｃａ）を含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、ＣｏＡ合成酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸は、大腸菌から得られ、ゲンバンク（登録商標）アクセッション番号Ｕ００００６に定められる配列を持ち得る。ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチド（または複数のポリペプチドの複合体）、およびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に提供されるようにして得られる。３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸はまた、本明細書に提供されるようにして得られる。ポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、ロドバクター・スファロイデス、コマモナス・アシドロランス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ａｃｉｄｏｒｏｒａｎｓ）、ラストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａ）、およびシュードモナス・オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）を含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、ポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸はロドバクター・スファロイデスから得られ、ゲンバンク（登録商標）アクセッション番号Ｘ９７２００に定められる配列を持ち得る。
【００６４】
図３に示すように、ラクテートはＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドによってラクチルＣｏＡに変換される。得られたラクチルＣｏＡはラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチド（または複数のポリペプチドの複合体）によって、アクリリルＣｏＡに変換される。得られたアクリリルＣｏＡは３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチドによって、３−ＨＰ−ＣｏＡに変換される。得られた３−ＨＰ−ＣｏＡはＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチド、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ加水分解酵素活性を持つポリペプチド、または３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素活性を持つポリペプチドによって３−ＨＰに変換され、得られた３−ＨＰは脂肪分解酵素活性（ＥＣ ３．１．１．−）を持つポリペプチドによって、３−ＨＰのエステルに変換される。脂肪分解酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、カンジダ・ルゴーサ、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）を含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、脂肪分解酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸は、カンジダ・ルゴーサから得られ、ゲンバンク（登録商標）アクセッション番号Ａ８１１７１に定められる配列を持ち得る。
【００６５】
図４に示すように、ラクテートはＣｏＡ合成酵素活性（ＥＣ ６．２．１．−）を持つポリペプチドによってラクチルＣｏＡに変換される。得られたラクチルＣｏＡはラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチド（または複数のポリペプチドの複合体）によって、アクリリルＣｏＡに変換される。得られたアクリリルＣｏＡはポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つポリペプチドによって重合アクリレートに変換されることができる。
【００６６】
図５に示すように、ラクテートはＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドによってラクチルＣｏＡに変換される。得られたラクチルＣｏＡはラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチド（または複数のポリペプチドの複合体）によって、アクリリルＣｏＡに変換される。得られたアクリリルＣｏＡはＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドによってアクリレートに変換される。得られたアクリレートは脂肪分解酵素活性を持つポリペプチドによってアクリル酸のエステルに変換され得る。
【００６７】
図４４に示すように、アセチルＣｏＡはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチドによってマロニルＣｏＡに変換され、得られたマロニルＣｏＡはマロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドによって３−ＨＰに変換される。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、大腸菌およびクロロフレクサス・オーランチアクスを含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチドをコードする核酸は、大腸菌から得られ、ゲンバンク（登録商標）アクセッション番号Ｍ９６３９４またはＵ１８９９７に定められる配列を持ち得る。マロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、クロロフレクサス・オーランチアクス、スルフォロブス・メタシラス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｍｅｔａｃｉｌｌｕｓ）、およびアシディアナス・ブリアレイ（Ａｃｉｄｉａｎｕｓ ｂｒｉｅｒｌｅｙｉ）を含むがこれらに限定されない様々な種から得られる。例えば、マロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に記述されるようにして得られ、配列番号：１４０に定められる配列と類似した配列を持ち得る。また、マロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸は、本明細書に記述されるようにして得られる。例えば、本明細書に提供される配列番号：１４０の変形は、マロニルＣｏＡ還元酵素を持つポリペプチドをコードするために使用できる。
【００６８】
マロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドは、ＮＡＤＰＨを補因子として使用する場合がある。例えば、配列番号：１４１に定められるアミノ酸配列を持つポリペプチドは、マロニルＣｏＡを３−ＨＰに変換する際に、ＮＡＤＰＨを補因子として使用する、マロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドである。同様に、マロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドは、ＮＡＤＨを補因子として使用する場合がある。そのようなポリペプチドは、マロニルＣｏＡ還元酵素活性を持ちＮＡＤＰＨを補因子として使用するポリペプチドを、マロニルＣｏＡ還元酵素活性を持ち、ＮＡＤＨを補因子として使用するポリペプチドに変換することによって得られ得る。ＮＡＤＰＨを補因子として使用するポリペプチドを、ＮＡＤＨを補因子として使用するポリペプチドに変換するためには、他の研究者によって記述されたような（Ｅｐｐｉｎｋら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２９２（１）：８７−９６ （１９９９）、ＨａｌｌおよびＴｏｍｓｅｔｔ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４６（Ｐｔ ６）：１３９９−４０６ （２０００）、およびＤｏｈｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、９８（１）：８１−８６ （２００１））、任意の方法が使用できる。例えば、配列番号：１４０に定められる核酸配列によってコードされるポリペプチドを、マロニルＣｏＡを３−ＨＰに変換する際にＮＡＤＰＨの代わりにＮＡＤＨを補因子として使用するポリペプチドに変換するために、変異誘発が使用できる。
【００６９】
図４３に示すように、プロピオネートは、配列番号：３９に定められる配列を持つポリペプチドのような、ＣｏＡ合成酵素活性を持つポリペプチドによって、プロピオニルＣｏＡに変換される。得られたプロピオニルＣｏＡは、配列番号：３９に定められるような配列を持つポリペプチドのような、脱水素酵素活性を持つポリペプチドによって、アクリリルＣｏＡに変換される。得られたアクリリルＣｏＡは、（１） ＣｏＡ転移酵素活性またはＣｏＡ加水分解酵素活性を持つポリペプチドによってアクリレートに、（２） 配列番号：３９に定められるような配列を持つポリペプチドのような、３−ＨＰ脱水酵素（アクリリルＣｏＡ加水酵素または単に加水酵素とも呼ばれる）活性を持つポリペプチドによって３−ＨＰ−ＣｏＡに、または （３） ポリヒドロキシ酸合成酵素活性を持つポリペプチドによって重合アクリレートに、変換され得る。得られたアクリレートは、脂肪分解酵素活性を持つポリペプチドによって、アクリル酸のエステルに変換される。得られた３−ＨＰ−ＣｏＡは、（１） ＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチド、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ加水分解酵素活性（ＥＣ ３．１．２．−）を持つポリペプチド、もしくは３−ヒドロキシイソブトリルＣｏＡ加水分解酵素活性（ＥＣ ３．１．２．４）によって３−ＨＰに、またはポリヒドロキシ酸合成酵素活性（ＥＣ ２．３．１．−）を持つポリペプチドによって重合３−ＨＰに変換され得る。
【００７０】
図５４に示すように、ＰＥＰはβアラニンに変換できる。βアラニンは、ＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドを使用してβアラニルＣｏＡに変換できる。次に、βアラニルＣｏＡは、βアラニルＣｏＡアンモニアリアーゼ活性を持つポリペプチドを使用して、アクリリルＣｏＡに変換できる。その後、アクリリルＣｏＡは、３−ＨＰ−ＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチドを使用して、３−ＨＰ−ＣｏＡに変換でき、グルタミン酸脱水素酵素活性を持つポリペプチドを使用して、３−ＨＰ−ＣｏＡを３−ＨＰに変換できる。
【００７１】
図５５に示すように、３−ＨＰはβアラニンから生産することができ、まずβアラニンに４，４−アミノブチレートアミノ転移酵素活性を持つポリペプチドを接触させて、マロン酸セミアルデヒドを生成する。マロン酸セミアルデヒドは、３−ＨＰ脱水素酵素活性を持つポリペプチド、または３−ヒドロキシイソブチレート脱水素酵素活性を持つポリペプチドを用いて、３−ＨＰに変換できる。
【００７２】
ＩＩＩ． 核酸分子およびポリペプチド
本発明は、配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる核酸配列全体を含む単離された核酸を提供する。また、本発明は配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる核酸配列の一部を含む単離された核酸を提供する。例えば、本発明は配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる任意の１５ヌクレオチドの配列と同一の１５ヌクレオチドの配列を含む単離された核酸を提供し、これにはヌクレオチド番号１から始まりヌクレオチド番号１５で終わる配列、ヌクレオチド番号２から始まりヌクレオチド番号１６で終わる配列、ヌクレオチド番号３から始まりヌクレオチド番号１７で終わる配列等が含まれるがこれらに限定されない。本発明が、１５ヌクレオチドより長く（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のヌクレオチド）、配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる配列の任意の部分と同一のヌクレオチド配列を含む単離された核酸も提供することは理解されると思われる。例えば、本発明は配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる任意の２５ヌクレオチドの配列と同一の２５ヌクレオチドの配列を含む単離された核酸を提供し、これにはヌクレオチド番号１から始まりヌクレオチド番号２５で終わる配列、ヌクレオチド番号２から始まりヌクレオチド番号２６で終わる配列、ヌクレオチド番号３から始まりヌクレオチド番号２７で終わる配列等が含まれるがこれらに限定されない。別の例には、長さが５０またはそれ以上のヌクレオチド（例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、またはそれ以上のヌクレオチド）で、配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる配列の任意の部分と同一のヌクレオチド配列を含む単離された核酸が含まれるが、これらに限定されない。そのような単離された核酸には、図６、１０、１４、１８、２２、２３、２５、２７、２９、３１、３９、４９、または５１に示される一行の配列の核酸配列を含む単離された核酸が含まれ、これは、これらの図に示される一行の配列は、最後の行を可能な例外として、少なくとも５０塩基を含むヌクレオチド配列を提供するためであるが、これらに限定されない。
【００７３】
また、本発明は配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる核酸配列の変異型を含む単離された核酸を提供する。例えば、本発明は、単一の挿入、単一の欠失、単一の置換、複数の挿入、複数の欠失、複数の置換、またはその任意の組み合せ（例えば、単一の欠失と複数の挿入）を含む、配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる核酸配列を含む単離された核酸を提供する。そのような単離された核酸分子は、配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる配列と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、または９９パーセントの配列同一性を持つことができる。
【００７４】
本発明は、配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる核酸配列の変異型を含む単離された核酸の複数の例を提供する。例えば、図８は配列番号：１に定められる配列と他の３つの核酸配列を整列させたものである。配列番号：１に定められる配列の変異型の例には、図８に提供される配列番号：１に定められる配列の任意の変異型が含まれるが、これらに限定されない。配列番号：１に定められる配列の特定の位置におけるヌクレオチド（またはその欠如）と、図８に示される他の３つのヌクレオチド配列（配列番号：３、４、および５）の任意のものの整列した同じ位置におけるヌクレオチド（またはその欠如）を比較すると、配列番号：１に定められる配列の特異的な変化のリストが提供されるので、そのような変異型は、図８に提供されていることになる。例えば、配列番号：１の４９番目の位置の「ａ」は、図８に示されるように「ｃ」で置換できる。また図８に示されるように、配列番号：１の５９０番目の位置の「ａ」は、「ａｔｇｇ」と置換でき、配列番号：１の３９３番目の位置の「ｇ」の」前に「ａａａｃ」が挿入でき；または配列番号：１の７３６番目の位置の「ｇａａ」は削除できる。配列番号：１に定められる配列は、任意の数の変異および変異のタイプの任意の組み合せを含み得る。例えば、配列番号：１に定められる配列は、図８に提供される１つの変異または図８に提供される複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、またはそれ以上）の変異を含み得る。図８に提供される核酸配列は、ＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドをコードし得る。本発明は、図８に示され、本明細書に記述されるように、配列番号：１に定められる配列の一部の変異型を含む単離された核酸も提供する。
【００７５】
同様に、図１２は配列番号：９の変異型およびその一部を提供する。図１６は配列番号：１７の変異型およびその一部を提供する。図２０は配列番号：２５の変異型およびその一部を提供する。図３２は配列番号：４０の変異型およびその一部を提供する。および図５３は配列番号：１４０の変異型を提供する。
【００７６】
本発明は配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められるアミノ酸配列全体をコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。また、本発明は配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められるアミノ酸配列の一部をコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。例えば、本発明は、配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる任意の１５アミノ酸の配列と同一の１５アミノ酸をコードするの核酸配列を含む単離された核酸を提供し、このアミノ酸配列にはアミノ酸残基番号１から始まりアミノ酸残基番号１５で終わる配列、アミノ酸残基番号２から始まりアミノ酸残基番号１６で終わる配列、アミノ酸残基番号３から始まりアミノ酸残基番号１７で終わる配列等が含まれるがこれらに限定されない。本発明が、１５アミノ酸残基より長く（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、 またはそれ以上のアミノ酸残基）、配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる配列の任意の部分と同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸も提供することは理解されると思われる。例えば、本発明は配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる任意の２５アミノ酸の配列と同一の２５アミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供し、このアミノ酸配列にはアミノ酸残基番号１から始まりアミノ酸残基番号２５で終わる配列、アミノ酸残基番号２から始まりアミノ酸残基番号２６で終わる配列、アミノ酸残基番号３から始まりアミノ酸残基番号２７で終わる配列等が含まれるがこれらに限定されない。別の例には、長さが５０またはそれ以上のアミノ酸残基（例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、またはそれ以上のアミノ酸残基）で、配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる配列の任意の部分と同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸が含まれるが、これらに限定されない。そのような単離された核酸には、図７、１１、１５、１９、２４、２６、２８、３０、または５０に示される一行の配列のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸が含まれ、これは、これらの図に示される一行の配列は、最後の行を可能な例外として、少なくとも５０残基を含むアミノ酸配列を提供するためであるが、これらに限定されない。
【００７７】
また、本発明は配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められるアミノ酸配列の変異型を持つアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。例えば、本発明は、単一の挿入、単一の欠失、単一の置換、複数の挿入、複数の欠失、複数の置換、またはその任意の組み合せ（例えば、単一の欠失と複数の挿入）を含む、配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸を提供する。そのような単離された核酸分子は、配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる配列と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、または９９パーセントの配列同一性を持つアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むことができる。
【００７８】
本発明は配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められるアミノ酸配列の変異型を持つアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸の例を複数提供する。例えば、図９は配列番号：２に定められるアミノ酸配列を、他の３つのアミノ酸配列と整列させたものである。配列番号：２に定められる配列の変異型の例には、図９に提供される配列番号：２に定められる配列の任意の変異型が含まれるが、これらに限定されない。配列番号：２に定められる配列の特定の位置におけるアミノ酸残基（またはその欠如）と、図９に示される他の３つのアミノ酸配列（配列番号：６、７、および８）の任意のものの整列した同じ位置におけるアミノ酸残基（またはその欠如）を比較すると、配列番号：２に定められる配列の特異的な変化のリストが提供されるので、そのような変異型は、図９に提供されていることになる。例えば、図９に示されるように、配列番号：２の１７の位置の「ｋ」は、「ｐ」または「ｈ」で置換できる。また図９に示されるように、配列番号：２の１２５の位置の「ｖ」は、「ｉ」または「ｆ」で置換できる。配列番号：２に定められる配列は、任意の数の変異および変異のタイプの任意の組み合せを含み得ることは理解されると思われる。例えば、配列番号：２に定められる配列は、図９に提供される１つの変異または図９に提供される複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、またはそれ以上）の変異を含み得る。図９に提供されるアミノ酸配列は、ＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドであり得ることに留意すること。
【００７９】
本発明は、図９に示され、本明細書に記述されるように、配列番号：２に定められる配列の一部の変異型を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む単離された核酸も提供する。
【００８０】
同様に、図１３は配列番号：１０の変異型およびその一部を提供する。図１７は配列番号：１８の変異型およびその一部を提供する。図２１は配列番号：２６の変異型およびその一部を提供する。図３３は配列番号：４１の変異型およびその一部を提供する。図４０、４１、および４２は配列番号：３９の変異型を提供する。および図５２は配列番号：１４１の変異型およびその一部を提供する。
【００８１】
特定の種のコドンの優先順位およびコドンの使用頻度の表を用いて、その特定の種のコドンの使用頻度を使用して、単離された核酸分子を遺伝子操作することができる。例えば、本明細書に提供される単離された核酸は、関心のある特定の生物によって優先的に使用されるコドンを持つように設計できる。
【００８２】
長さが少なくとも約１２塩基（例えば、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００塩基）で、ハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１、９、１７、２５、３３、３４、３６、３８、４０、４２、１２９、１４０、１４２、１６２、または１６３に定められる配列を持つ核酸のセンスまたはアンチセンス鎖にハイブリダイズする、単離された核酸配列も、本発明は提供する。ハイブリダイゼーション条件は、中等度または高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件であり得る。
【００８３】
本発明は、配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められるアミノ酸配列全体を含むポリペプチドを提供する。また、本発明は配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められるアミノ酸配列の一部を含むポリペプチドを提供する。例えば、本発明は配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる任意の１５アミノ酸の配列と同一の１５アミノ酸の配列を含むポリペプチドを提供し、これにはアミノ酸残基番号１から始まりアミノ酸残基番号１５で終わる配列、アミノ酸残基番号２から始まりアミノ酸残基番号１６で終わる配列、アミノ酸残基番号３から始まりアミノ酸残基番号１７で終わる配列等が含まれるがこれらに限定されない。本発明が、１５アミノ酸残基より長く（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のアミノ酸残基）、配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる配列の任意の部分と同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供することは理解されると思われる。例えば、本発明は配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる任意の２５アミノ酸の配列と同一の２５アミノ酸の配列を含むポリペプチドを提供し、これにはアミノ酸残基番号１から始まりアミノ酸残基番号２５で終わる配列、アミノ酸残基番号２から始まりアミノ酸残基番号２６で終わる配列、アミノ酸残基番号３から始まりアミノ酸残基番号２７で終わる配列等が含まれるがこれらに限定されない。別の例には、長さが５０またはそれ以上のアミノ酸残基（例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、またはそれ以上のアミノ酸残基）で、配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる配列の任意の部分と同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。そのようなポリペプチドには、図７、１１、１５、１９、２４、２６、２８、３０、または５０に示される一行の配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドが含まれ、これは、これらの図に示される一行の配列は、最後の行を例外として、少なくとも５０残基を含むアミノ酸配列を提供するためであるが、これらに限定されない。
【００８４】
また、本発明は配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められるアミノ酸配列の変異型を持つアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。例えば、本発明は、単一の挿入、単一の欠失、単一の置換、複数の挿入、複数の欠失、複数の置換、またはその任意の組み合せ（例えば、単一の欠失と複数の挿入）を含む、配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められるアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。そのようなポリペプチドは、配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められる配列と、少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、または９９パーセントの配列同一性を持つアミノ酸配列を含む。
【００８５】
本発明は配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められるアミノ酸配列の変異型を持つアミノ酸配列を含むポリペプチドの例を複数提供する。例えば、図９は配列番号：２に定められるアミノ酸配列を、他の３つのアミノ酸配列と整列させたものである。配列番号：２に定められる配列の変異型の例には、図９に提供される配列番号：２に定められる配列の任意の変異型が含まれるが、これらに限定されない。配列番号：２に定められる配列の特定の位置におけるアミノ酸残基（またはその欠如）と、図９に示される他の３つのアミノ酸配列（配列番号：６、７、および８）の任意のものの同じ整列した位置におけるアミノ酸残基（またはその欠如）を比較すると、配列番号：２に定められる配列の特異的な変化のリストが提供されるので、そのような変異型は、図９に提供されていることになる。例えば図９に示されるように、配列番号：２の１７の位置の「ｋ」は、「ｐ」または「ｈ」で置換できる。また図９に示されるように、配列番号：２の１２５の位置の「ｖ」は、「ｉ」または「ｆ」で置換できる。配列番号：２に定められる配列は、任意の数の変異および変異のタイプの任意の組み合せを含み得ることは理解されると思われる。例えば、配列番号：２に定められる配列は、図９に提供される１つの変異または図９に提供される複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０、１００、またはそれ以上）の変異を含み得る。図９に提供されるアミノ酸配列は、ＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドであり得ることに留意すること。
【００８６】
本発明は、図９に示され、本明細書に記述されるように、配列番号：２に定められる配列の一部の変異型を含むアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供する。
【００８７】
同様に、図１３は配列番号：１０の変異型およびその一部を提供する。図１７は配列番号：１８の変異型およびその一部を提供する。図２１は配列番号：２６の変異型およびその一部を提供する。図３３は配列番号：４１の変異型およびその一部を提供する。図４０、４１、および４２は配列番号：３９の変異型を提供する。および図５２は配列番号：１４１の変異型およびその一部を提供する。
【００８８】
変異型のアミノ酸配列を持つポリペプチドは、酵素活性を保持する可能性がある。そのようなポリペプチドは、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲのような標準的な手順を用いて、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって、生産できる。改変の１つのタイプは、同様な生化学的特性を持つアミノ酸残基で、１つまたは複数のアミノ酸残基を置換することを含む。例えば、ポリペプチドは、１つまたは複数の保存的置換を持った配列番号：２、１０、１８、２６、３５、３７、３９、４１、１４１、１６０、または１６１に定められるアミノ酸配列を持ち得る。
【００８９】
表１のものよりも保存的ではない置換、すなわち、（ａ） 置換する部分のポリペプチド骨格の構造、例えば、シートまたはらせんの立体構造；（ｂ） 標的部位におけるポリペプチドの電荷または疎水性度；または （ｃ） 側鎖の大きさの維持に対する効果がより大きく異なる残基を選択することによって、より実質的な変化を起こすことができる。一般的にポリペプチド機能に最大の変化を起こすと期待される置換は、（ａ） 例えばセリンもしくはスレオニンのような親水性残基が、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、もしくはアラニンのような疎水性残基を置換している（もしくは置換されている）；（ｂ） システインもしくはプロリンが任意の他の残基を置換している（もしくは任意の他の残基によて置換されている）；（ｃ） 例えばリジン、アルギニン、もしくはヒスチジンのような正の電荷を持つ側鎖が、例えばグルタミン酸もしくはアスパラギン酸のような負の電荷を持つ側鎖を置換している（もしくは負の電荷を持つ側鎖によって置換されている）；または （ｄ） 例えばフェニルアラニンのような大きな側鎖を持つ残基が、例えばグリシンのような側鎖を持たない残基を置換している（もしくはこの残基によって置換されている）ものである。酵素活性を持つポリペプチドに関して、これらのアミノ酸置換（または他の欠失もしくは付加）の効果は、関連する天然のポリペプチドと同一の基質の、関連する天然のポリペプチドと同一の産物への変換を、そのポリペプチドが触媒する能力を分析することによって、評価できる。したがって、５、１０、２０、３０、４０、５０、またはそれ以下の保存的置換を持つポリペプチドは、本発明によって提供される。
【００９０】
ポリペプチドおよびポリペプチドをコードする核酸は、たとえばＭ１３プライマー変異誘発のような標準的なＤＮＡ変異誘発技術によって、生産される。これらの技術の詳細は、サムブルックら編、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」第２版、１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９、Ｃｈ．１５に提供されている。核酸分子は、その分子が導入される特定の生物のコドン使用頻度に合うように、コード領域に変化を含み得る。
【００９１】
または、遺伝コードの縮重を使用して、核酸配列は実質的に変化しているが、天然のアミノ酸配列と同一または実質的に類似したアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードするように、コード配列を変化させることができる。例えば、配列番号：２に定められる配列の９番目のアミノ酸残基はアラニンであり、ヌクレオチドの３連コドンＧＣＴによって、オープンリーディングフレーム中にコードされている。遺伝コードの縮重のために、３つの他の３連ヌクレオチドコドン、ＧＣＡ、ＧＣＣ、およびＧＣＧもアラニンをコードする。したがって、オープンリーディングフレームの核酸配列は、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列またはポリペプチドの特性に影響を与えることなく、この位置でこれらの３つのコドンの任意のものに、変化させることができる。遺伝コードの縮重に基づいて、本明細書に記述される標準的なＤＮＡ変異誘発技術を用いて、または核酸配列の合成によって、本明細書に開示される核酸配列から、核酸変異型を得ることができる。したがって、本発明は同一のポリペプチドをコードするが、遺伝コードの縮重のために核酸配列が異なる、核酸分子も含む。
【００９２】
ＩＶ． ３−ＨＰおよび他の有機酸を作製する方法
図１−５、４３−４４、５４、および５５に示される経路の各段階は、細胞内（インビボ）または細胞外（インビトロ、例えば、容器またはカラム内）で実行できる。また、有機酸産物は、インビボ合成およびインビトロ合成の組み合せで生産できる。さらに、インビトロ合成の段階は、化学反応または酵素反応でよい。
【００９３】
例えば、図１に提供される段階を実行するために本明細書に提供される微生物を使用するか、示された酵素活性を持つポリペプチドを含む抽出物を用いて図１に提供される段階を実行できる。また、図１−５、４３−４４、５４、および５５に提供される変換を実行するために、化学処理も使用できる。例えば、アクリリルＣｏＡは加水分解によってアクリレートに変換できる。他の化学処理には、アクリレートをアクリル酸エステルに変換するトランスエステル化が含まれるが、これに限定されない。
【００９４】
生物変換の開始点として適した炭素源には、炭水化物および合成中間体が含まれる。細胞がピルベートに代謝可能な炭水化物の例には、デキストロースのような糖、トリグリセリド、および脂肪酸が含まれる。
【００９５】
さらに、中間体化学物質も、開始点となり得る。例えば、酢酸および二酸化炭素は発酵培養液に導入できる。アセチルＣｏＡ、マロニルＣｏＡ，および３−ＨＰはＣｏＡ合成酵素活性を持つポリペプチド、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチド、およびマロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドを用いて、順次生産できる。他の有用な中間体出発物質には、プロピオン酸、アクリル酸、乳酸、ピルビン酸、およびβアラニンが含まれる。
【００９６】
Ａ． ポリペプチドの発現
本明細書に記述されるポリペプチドは、宿主細胞中で個別に生産できるか、宿主細胞中で組み合せて生産できる。また、特定の酵素活性を持つポリペプチドは、天然に存在するか、天然に存在しないポリペプチドである。天然に存在するポリペプチドは、野生型および多型性ポリペプチドを含め、天然に見られるようなアミノ酸配列を持つ任意のポリペプチドである。そのような天然に存在するポリペプチドは、動物（例えば、哺乳類）、植物、真菌、および細菌種を含むがこれらに限定されない、任意の種から得られる。天然に存在しないポリペプチドは、天然に見られないアミノ酸配列を持つ任意のポリペプチドである。したがって、天然に存在しないポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドの変異型、または組換えポリペプチドであり得る。例えば、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ天然に存在しないポリペプチドは、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ天然に存在するポリペプチドの、少なくともいくらかの３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を保持した変異型である可能性がある。ポリペプチドは、配列の付加、欠失、置換、またはその組み合せによって変異できる。
【００９７】
本発明は本明細書に記述される代謝経路の段階のうち、１つまたは複数の段階を行なうために使用できる遺伝子組換え細胞、またはインビトロでその後に使用するための開示されたポリペプチドを生産するために使用できる遺伝子組換え細胞を提供する。例えば、個々の微生物は、図１、２、３、４、５、４３、４４、５４、または５５に示される段階を実行するために必要な各ポリペプチドが発現されるように、外因性核酸を含む可能性がある。そのような細胞は、任意の数の外因性核酸分子を含み得ることは重要である。例えば、特定の細胞は、図１に示されるように乳酸を３−ＨＰに変換するために必要な６つのポリペプチドの１つを各々コードするような６つの外因性核酸分子を含んでもよく、または特定の細胞が乳酸をアクリリルＣｏＡに変換するために必要なポリペプチドを内因性で生産し、かつアクリリルＣｏＡを３−ＨＰに変換するために必要なポリペプチドをコードする外因性核酸を含んでもよい。
【００９８】
さらに、１つの外因性核酸分子は、１つまたは複数のポリペプチドをコードできる。例えば、１つの外因性核酸分子は、３つの異なるポリペプチドをコードする配列を含み得る。また、本明細書に記述される細胞は、特定の外因性核酸分子を１コピー、または複数コピー（例えば、約５、１０、２０、３５、５０、７５、１００、または１５０コピー）含み得る。例えば、特定の細胞は図３４、３５、３６、３７、３８、または４５に示される構築物を約５０コピー含む可能性がある。また、本明細書に記述される細胞は、複数の外因性核酸分子を含む可能性がある。例えば、特定の細胞は、外因性核酸分子Ｘを約５０コピー、および外因性核酸分子Ｙを約７５コピー含む可能性がある。
【００９９】
別の態様では、本発明の範囲内の細胞は、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含み得る。そのような細胞は、任意のレベルの３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持ち得る。例えば、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含む細胞は、１時間に乾燥細胞重量１グラムあたり約１ｍｇを超える３−ＨＰ−ＣｏＡ（例えば、１時間に乾燥重量１グラムあたり約１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、６０ｍｇ、７０ｍｇ、８０ｍｇ、９０ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、３５０ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、またはそれ以上のｍｇの３−ＨＰ−ＣｏＡ）の比活性を持つ３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持ち得る。または、細胞は、１ ｘ １０６細胞からの細胞抽出物が、細胞は１０分間につき総タンパク質１ ｍｇあたり約１μｇを超える３−ＨＰ−ＣｏＡが形成される（１０分間につき総タンパク質１ ｍｇあたり約約１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ、１００μｇ、１２５μｇ、１５０μｇ、２００μｇ、２５０μｇ、３００μｇ、３５０μｇ、４００μｇ、５００μｇ、またはそれ以上の３−ＨＰ−ＣｏＡが形成される）比活性を持つような、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持ち得る。
【０１００】
酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸分子は、本明細書に記述されるような任意の方法を用いて、同定および入手できる。例えば、酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸分子は、ＰＣＲを含め、通常の分子クローニングまたは化学的核酸合成手順および手法を用いて、同定および入手できる。また、標準的な核酸配列決定手法、および遺伝コードに基づいて核酸配列をアミノ酸配列に翻訳するソフトウェアプログラムを用いて、特定の核酸が既知の酵素ポリペプチドと配列の相同性を持つかどうかを決定できる。ＭＥＧＡＬＩＧＮ（登録商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、１９９７）のような配列整列ソフトウェアは、種々の配列の比較に使用できる。また、既知の酵素ポリペプチドをコードする核酸分子は、標準的な分子クローニング手法（例えば、部位特異的変異誘発）を用いて、変異できる。可能な変異には、欠失、挿入、および塩基置換、ならびに欠失、挿入、および塩基置換の組み合せが含まれるが、これらに限定されない。さらに、核酸およびアミノ酸データベース（例えば、ゲンバンク（登録商標））を用いて酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列を同定できる。簡単に述べると、酵素活性を持つポリペプチドといくらかの相同性を持つ任意のアミノ酸配列、または酵素活性を持つポリペプチドをコードする配列にいくらかの相同性を持つ任意の核酸配列を、ゲンバンク（登録商標）の検索のクエリーに使用できる。同定されたポリペプチドを分析して、これが酵素活性を示すかどうかを決定できる。
【０１０１】
また、核酸ハイブリダイゼーション法を用いて、酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸分子を同定および入手できる。簡単に述べると、既知の酵素ポリペプチドをコードする任意の核酸分子、またはその断片をプローブとして用いて、中等度から高度にストリンジェントな条件のハイブリダイゼーションによって、類似した核酸分子を同定できる。そのような類似した核酸分子は、単離し、配列決定をし、分析して、コードされているポリペプチドが酵素活性を持つかどうかを決定できる。
【０１０２】
発現クローニング法を用いて、酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸分子の同定および入手ができる。例えば、特定の酵素ポリペプチドと相互作用することが既知の基質を用いて、酵素ポリペプチドを含むファージディスプレイライブラリーのスクリーニングができる。ファージディスプレイライブラリーは、他の文献（Ｂｕｒｒｉｔｔら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３８：１−１３ （１９９０））に記述されるようにして作製するか、ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ） （ウィスコンシン州マディソン）のような市販の製造元から入手できる。
【０１０３】
さらに、ポリペプチド配列決定法を用いて、酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸分子を同定および入手できる。例えば、精製されたポリペプチドをゲル電気泳動で分離し、例えば、アミノ酸微量配列決定法によりそのアミノ酸配列を決定できる。決定すると、アミノ酸配列を用いて縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを設計できる。縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＰＣＲによりポリペプチドをコードする核酸を得られる。得られたら、核酸の配列決定をして、適当な発現ベクターにクローニングし、微生物に導入できる。
【０１０４】
外因性核酸分子を細胞に導入するためには任意の方法が使用できる。実際、細菌および酵母のような微生物に核酸を導入する多くの方法が当技術分野で周知である。例えば、ヒートショック、リポフェクション、電気穿孔法、接合、プロトプラストの融合、遺伝子銃送達が、細菌および酵母細胞に核酸を導入するための一般的な方法である。イトー（Ｉｔｏ）ら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｏｌ． １５３：１６３−１６８ （１９８３）； ダレンス（Ｄｕｒｒｅｎｓ）ら、Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １８：７−１２ （１９９０）； およびベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）およびガレンテ（Ｇｕａｒｅｎｔｅ）、「酵素学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」 １９４：１８２−１８７ （１９９１）参照。
【０１０５】
本発明の特定の細胞内に含まれる外因性核酸分子は、任意の形で細胞内で維持され得る。例えば、外因性核酸分子は、細胞のゲノムに組み込まれたり、またはエピソーム状態で維持され得る。すなわち、本発明の細胞は、安定または一過性の形質転換体である。また、本明細書に記載される微生物は、本明細に記載される特定の外因性核酸分子を単一のコピーまたは複数のコピー（例えば、約５コピー、１０コピー、２０コピー、３５コピー、５０コピー、７５コピー、１００コピー、または１５０コピー）含み得る。
【０１０６】
外因性核酸分子からアミノ酸配列を発現する方法は、当技術分野で周知である。そのような方法には、調節領域がポリペプチドをコードする核酸配列の発現を促進するような核酸を作製する段階が含まれるが、これに限定されない。通常は、調節領域は転写レベルで他のＤＮＡ配列の発現を調節するＤＮＡ配列である。したがって、調節領域には、プロモーター、およびエンハンサー等が含まれるが、これらに限定されない。外因性核酸分子からのアミノ酸配列の発現には、任意の種類のプロモーターが使用できる。プロモーターの例には、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、および特定の刺激（例えば、光、酸素、およびｓ化学物質の濃度等）に応答するまたは応答しないプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。さらに、細菌細胞および酵母細胞のような細胞中での外因性核酸分子からのポリペプチドの発現方法は、当技術分野で周知である。例えば、大腸菌中で外因性ポリペプチドを発現する能力のある核酸構築物は、周知である。サムブルックら編、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、ＵＳＡ、第２版、１９８９参照。
【０１０７】
Ｂ． 宿主細胞を介した有機酸および関連産物の生産
本明細書に提供される核酸およびアミノ酸配列を細胞とともに使用して、３−ＨＰおよび／または１，３−プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸エステル、３−ＨＰのエステル、および重合３−ＨＰのような他の有機化合物を生産できる。そのような細胞は、米国政府の主催する国立衛生研究所の分類学ウェブページ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）に列挙されるものを含めた任意の種でよい。細胞は、真核細胞または原核細胞でよい。例えば、本発明の遺伝子組換え細胞は、哺乳類細胞（例えば、ヒト、マウス、およびウシの細胞）、植物細胞（例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、およびダイズ細胞）、真菌細胞（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）およびクモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）細胞）、酵母細胞、または細菌細胞（例えば、乳酸桿菌、ラクトコッカス、バチルス、エッシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）細胞）でよい。本発明の細胞は、微生物でもよい。本明細書で使用される「微生物」という用語は、細菌、藻類、真菌、原虫類を含めこれらに限定されない任意の顕微鏡的生物を指す。したがって、大腸菌、出芽酵母、クルベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、カンジダ・ブランキ（Ｃａｎｄｉｄａ ｂｌａｎｋｉｉ）、カンジダ・ルゴーサ、およびピキア・ポストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐｏｓｔｏｒｉｓ）は微生物と考えられ、本明細書に記述されるように使用できる。
【０１０８】
通常は、本発明の細胞は特定の有機化合物が生産されるように遺伝子組換えされる。１つの態様では、本発明はＰＥＰから３−ＨＰを生産する細胞を提供する。細胞が３−ＨＰを生産するために使用できる生合成経路の例は、図１−５、４３−４４、５４、および５５に示されている。
【０１０９】
一般に、特定の有機化合物を生産するように遺伝子組換えされる細胞は、特定の酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸分子を１つまたは複数含む。例えば、微生物は、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸を含み得る。この場合、アクリリルＣｏＡは３−ヒドロキシプロピオン酸ＣｏＡに変換され、これが３−ＨＰの生産に至る。細胞が、その細胞が通常生産しない化合物の生産を触媒する酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸分子を持つことができることに留意のこと。または、細胞は、その細胞が通常生産する化合物の生産を触媒する酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸分子を持つことができる。この場合、遺伝子組換え細胞は、遺伝子組換えをしない同様の細胞よりも、その化合物を大量に、またはより効率良く生産できる。
【０１１０】
１つの態様では、本発明は３−ＨＰの形成に至る酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含む細胞を提供する。生産された３−ＨＰが細胞から分泌され、その有機化合物を回収するために細胞膜を破壊する必要がない場合もあることに留意のこと。通常は、本発明の細胞は１リットル当たり少なくとも約１００ ｍｇ（例えば、少なくとも約１ ｇ／Ｌ、５ ｇ／Ｌ、１０ ｇ／Ｌ、２５ ｇ／Ｌ、５０ ｇ／Ｌ、７５ ｇ／Ｌ、８０ ｇ／Ｌ、９０ ｇ／Ｌ、１００ ｇ／Ｌ、または１２０ ｇ／Ｌ）の濃度で３−ＨＰを生産する。特定の細胞について３−ＨＰのような有機化合物の収率を決定する場合には、任意の方法が使用できる。応用環境微生物学（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）５９（１２）：４２６１−４２６５ （１９９３）参照。通常は、微生物のような本発明の範囲内の細胞は、グルコースのようなヘキソースの炭素源を触媒する。しかし、細胞はペントース（例えば、リボース、アラビノース、キシロース、およびリキソース）、脂肪酸、アセテート、またはグリセロールのような種々の炭素源を触媒し得る。すなわち、本発明の範囲内の細胞は種々の炭素源を使用し得る。
【０１１１】
本明細書に記述されるように、本発明の範囲内の細胞は、３−ＨＰまたは１，３−プロパンジオール、アクリル酸、ポリアクリレート、アクリル酸のエステル、３−ＨＰのエステル、重合３−ＨＰのような他の有機化合物の形成に至る酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸分子を含み得る。外因性核酸を含む細胞の同定方法は、当技術分野で周知である。そのような方法には、ＰＣＲならびにノーザンおよびサザン分析のような核酸ハイブリダイゼーション法（本明細書に記載のハイブリダイゼーション参照）が含まれるがこれらに限定されない。場合によっては、免疫組織化学および生化学的手法を用いて特定の核酸分子によってコードされるポリペプチドの発現を検出することによって、細胞が特定の核酸を含むかどうかが決定され得る。例えば、ポリペプチドに対する特異性を持つ抗体は、特定の細胞がそのポリペプチドをコードする核酸を含むかどうかの決定に使用できる。さらに、生化学的手法を用いて、酵素活性を持つポリペプチドの発現の結果として生産される有機化合物を検出することによって、酵素活性を持つポリペプチドをコードする特定の核酸分子を細胞が含むかどうかを決定できる。例えば、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチドをコードする外因性核酸を、通常はそのようなポリペプチドを発現しない細胞に導入した後で３−ＨＰを検出すると、細胞が導入された核酸分子を含むのみならず、導入された外因性核酸分子からコードされているポリペプチドを発現することも示すことができる。特定の酵素活性または特定の有機化合物の存在の検出方法は、当技術分野で周知である。例えば、３−ＨＰのような有機化合物の存在は、文献に記述されたようにして決定できる。サリバン（Ｓｕｌｌｉｖａｎ）およびクラーケ（Ｃｌａｒｋｅ）、Ｊ． Ａｓｓｏｃ． Ｏｆｆｉｃ． Ａｇｒ． Ｃｈｅｍｉｓｔｓ、３８：５１４−５１８（１９５５）参照。
【０１１２】
Ｃ． ポリペプチド活性の低下した細胞
本発明は低下したポリペプチド活性を持つ遺伝子組換え細胞も提供する。本明細書で細胞および特定のポリペプチド活性に関して使用される「低下した」という用語は、同一の種の同等の細胞で測定された活性よりも低いレベルを指す。例えば、酵素活性Ｘを持たない特定の微生物は、同等な微生物が少なくともいくらかの酵素活性Ｘを持っていれば、酵素活性Ｘが低下していると考えられる。細胞は、酵素、転写因子、トランスポーター、受容体、およびシグナル分子等を含むがこれらに限定されない、任意の種類のポリペプチドの活性が低下する可能性があることに留意のこと。例えば細胞は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性またはアルコール脱水素酵素活性を持つポリペプチドの調節配列および／またはコード配列を破壊する外因性核酸分子を含む可能性がある。ピルビン酸デカルボキシラーゼおよび／またはアルコール脱水素酵素発現を破壊すると、ラクテートおよび３−ＨＰ、１，３−プロパンジオール、アクリル酸、ポリアクリレート、アクリル酸のエステル、３−ＨＰのエステル、重合３−ＨＰのようなラクテートから生産される産物の蓄積が起こる。また、ポリペプチド活性の低下は、ポリペプチド濃度の低下、ポリペプチドの比活性の低下、またはその組み合せの結果であり得る。ポリペプチド活性の低下した細胞を作製するためには、多くの異なる方法が使用できる。例えば、通常の変異誘発またはノックアウト技術を用いて、細胞が破壊された調節配列またはポリペプチドコード配列を持つように操作できる。「酵母遺伝学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」 （１９９７版）、アダムス（Ａｄａｍｓ）、ゴッチャリング（Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ）、カイザー（Ｋａｉｓｅｒ）、およびスターンズ（Ｓｔｅｒｎｓ）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９９８）参照。または、アンチセンス技術を用いて特定のポリペプチドの活性を低下させることができる。例えば、細胞がポリペプチドの翻訳を阻害するようなアンチセンス分子をコードするｃＤＮＡを含むように、操作できる。本発明で使用される「アンチセンス分子」という用語は、内因性ポリペプチドのコード鎖に対応する配列を含む任意の核酸分子または核酸アナログ（例えば、ペプチド核酸）を含む。アンチセンス分子は、隣接配列（例えば、調節配列）を持つ場合もある。したがって、アンチセンス分子はリボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。リボザイムは、ＲＮＡを切断する場合には、ヘアピン、ハンマーヘッド、またはアックスヘッド構造を含むがこれらに限定されない任意の一般的な構造を持ち得る。遺伝子サイレンシングを用いて特定のポリペプチドの活性を低下させることができる。
【０１１３】
ポリペプチド活性の低下した細胞は、任意の方法を用いて同定できる。例えば、本明細書で記述されたような酵素活性アッセイ法を用いて、酵素活性の低下した細胞を同定できる。
【０１１４】
（１） 配列番号：３９（ＯＳ１７ポリペプチド）に定められるアミノ酸配列を持つポリペプチド、または （２） 配列番号：３９に定められるアミノ酸配列と少なくとも約６０パーセントの配列の同一性を持つアミノ酸配列を持つポリペプチドは、３つの機能的ドメインを持つ可能性がある：ＣｏＡ合成酵素活性を持つドメイン、３−ＨＰ−ＣｏＡ脱水酵素活性を持つドメイン、およびＣｏＡ還元酵素活性を持つドメインである。そのようなポリペプチドは、１つまたは２つの酵素活性が低下するように、変異誘発および／またはドメインの削除を行なうことにより、選択的に改変できる。ＯＳ１７ポリペプチドの脱水酵素活性を低下させると、プロピオニルＣｏＡからアクリリルＣｏＡが生産され得る。その次に、アクリリルＣｏＡをＣｏＡ加水分解酵素活性を持つポリペプチドに接触させ、プロピオネートからアクリレートを生産できる（図４３）。同様に、例えば還元酵素活性の低下したＯＳ１７ポリペプチドを用いて、３−ＨＰからアクリリルＣｏＡが生産できる。
【０１１５】
Ｄ． インビトロ法による有機酸および関連産物の生産
また、酵素活性を持つ精製ポリペプチドを単独または細胞と組み合せて使用して、３−ＨＰまたは１，３−プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸のエステル、３−ＨＰのエステル、重合３−ＨＰのような他の有機化合物を生産することができる。例えば、３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ実質的に純粋なポリペプチドを含む調製物を用いて、３−ＨＰの前駆体である３−ＨＰ−ＣｏＡの形成を触媒できる。さらに、酵素活性を持つポリペプチドを含む無細胞抽出物を単独または精製ポリペプチドおよび／または細胞と組み合せて用いて、３−ＨＰを生産できる。例えば、ＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドを含む無細胞抽出物は、ラクチルＣｏＡの生産に使用でき、ラクチルＣｏＡから３−ＨＰを形成するために必要な反応を触媒するために必要な酵素活性を持つポリペプチドを含む微生物は、３−ＨＰの生産に使用できる。無細胞抽出物の生産には、任意の方法が使用できる。例えば、浸透圧ショック、超音波処理、および／または凍結融解の繰り返し後の濾過および／または遠心を用いて、無傷細胞から無細胞抽出物を作製できる。
【０１１６】
細胞、精製ポリペプチド、および／または無細胞抽出物は３−ＨＰの生産に使用でき、３−ＨＰを化学的に処理して、別の化合物を生産できることに留意のこと。例えば、微生物を用いて３−ＨＰを生産し、化学的過程を用いて３−ＨＰを修飾して重合３−ＨＰまたは３−ＨＰのエステルのような誘導体にする。同様に、本発明に記述される細胞、実質的に純粋なポリペプチド、および／または無細胞抽出物を用いて３−ＨＰまたは他の有機化合物（例えば、１，３−プロパンジオール、アクリル酸、重合アクリレート、アクリル酸のエステル、３−ＨＰのエステル、重合３−ＨＰ）に変換できる特定の化合物を、化学的過程によって生産できる。たとえば、化学的過程を用いてアクリリルＣｏＡを生産し、微生物を用いてアクリリルＣｏＡを３−ＨＰに変換できる。
【０１１７】
Ｅ． 有機酸を生産するための細菌の発酵
通常は、微生物のような生産細胞を提供し、３−ＨＰが生産されるようにその微生物を培地とともに培養することにより、３−ＨＰは生産される。一般に、培地および／または培養条件は、微生物が適当な濃度まで増殖し、効率良く３−ＨＰを生産できるようなものであることができる。大量の生産過程では、文献に記述されるような任意の方法が使用できる（「産業微生物学およびバイオテクノロジーのマニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、第２版、Ａ． Ｌ． ＤｅｍａｉｎおよびＪ． Ｅ． Ｄａｖｉｅｓ、ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ；および「発酵技術の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｐ． Ｆ． ＳｔａｎｂｕｒｙおよびＡ． Ｗｈｉｔａｋｅｒ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ参照）。簡単に述べると、例えば、炭素源のグルコースを含む適当な培地を入れた大型タンク（例えば、１００ガロン、２００ガロン、５００ガロンまたはそれ以上のタンク）に、特定の微生物を接種する。接種後、微生物をインキュベーションして、バイオマスを生産する。所望のバイオマスに到達したら、微生物を含む培養液を第２のタンクに移す。この第２のタンクは任意のサイズでよい。例えば、第２のタンクは第１のタンクよりも大きくても、小さくても、同じでもよい。通常は、第１のタンクの培養液に培地を追加できるように、第２のタンクは第１のタンクよりも大きい。また、第２のタンク内の培地は、第１のタンクに使用したものと同じでも異なっていてもよい。例えば、第１のタンクはキシロースを含む培地を含み、第２のタンクはグルコース入りの培地を含んでもよい。
【０１１８】
移したら、微生物をインキュベーションして、３−ＨＰを生産させる。生産したら、任意の方法を用いて３−ＨＰを単離する。例えば、通常の分離法で培養液からバイオマスを取り除き、通常の分離手法（例えば、抽出、蒸留、およびイオン交換手法）を用いて微生物を含まない培養液から３−ＨＰを得ることができる。また、３−ＨＰは生産しながら単離しても、生産段階が終了してから培養液から単離してもよい。
【０１１９】
Ｆ． 開示された生合成経路で生産される産物
図１−５、４３−４４、５４、および５５に提供される任意の段階で生産される有機化合物は、他の有機化合物に化学的に変換できる。例えば、３−ＨＰは水素化して貴重なポリエステルモノマーである１，３プロパンジオールを形成できる。３−ＨＰのような有機酸の水素化は、琥珀酸および／または乳酸の水素化に使用される方法のような任意の方法を用いて行なえる。例えば、３−ＨＰは金属触媒を用いて水素化できる。別の実施例では、３−ＨＰを脱水してアクリル酸を形成できる。脱水反応には任意の方法が使用できる。例えば、３−ＨＰは触媒（例えば、金属または鉱酸触媒）の存在下で加熱してアクリル酸を形成できる。プロパンジオールは、オキシド還元酵素活性を持つポリペプチド（例えば、１．１．１．クラスの酵素）を用いて、インビトロまたはインビボで生産できる。
【０１２０】
Ｖ． ＰＥＰから３−ＨＰを生産する生合成経路を作製するために使用される方法の概要
本発明は生合成経路を用いることによりＰＥＰから３−ＨＰおよび関連産物を作製する方法を提供する。実例となる実施例には、乳酸中間体、マロニルＣｏＡ中間体、およびβアラニン中間体を介して３−ＨＰを生産する方法が含まれる。
【０１２１】
Ａ． 乳酸中間体を介して３−ＨＰを生産する生合成経路
ＰＥＰから３−ＨＰを生産できるような生合成経路が作製された（図１）。この経路は、本明細書に記述されるようにクローニングされ発現されたいくつかのポリペプチドを使用することを含む。ゲノムＤＮＡの供給源にはメガスフェラ・エルスデニ細胞（ＡＴＣＣ １７７５３）が使用された。プライマーを使用して、ＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列（配列番号：１）が同定およびクローニングされた。ポリペプチドはその後酵素活性の検定を行ない、ＣｏＡ転移酵素活性を持つことがわかった。
【０１２２】
同様に、ＰＣＲプライマーを用いて、メガスフェラ・エルスデニゲノムＤＮＡからＥ１活性化因子、Ｅ２α、およびＥ２βポリペプチドをコードする核酸配列（それぞれ、配列番号：９、１７、および２５）が同定された。これらのポリペプチドはその後ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つことが示された。
【０１２３】
ゲノムＤＮＡの供給源にはクロロフレクサス・オーランチアクス細胞（ＡＴＣＣ ２９３６５）が使用された。最初のクローニングで核酸配列ＯＳ１７（配列番号：１２９）およびＯＳ１９（配列番号：４０）が同定された。その後の解析で、ＯＳ１７がＣｏＡ合成酵素活性、脱水酵素活性、および脱水素酵素活性（プロピオニルＣｏＡ合成酵素）を持つポリペプチドをコードすることがわかった。その後の解析で、ＯＳ１９が３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性（アクリリルＣｏＡ加水酵素活性とも呼ばれる）を持つポリペプチドコードすることがわかった。
【０１２４】
大腸菌で使用するために、いくつかのオペロンが作製された。これらのオペロンは、細菌細胞中で３−ＨＰの生産を可能にする。別の実験で、これらのポリペプチドが酵母でも発現され、酵母は３−ＨＰの生産に使用できる。
【０１２５】
Ｂ． マロニルＣｏＡ中間体を介して３−ＨＰを生産する生合成経路
ＰＥＰから３−ＨＰを生産するための別の経路が構築された。この経路は、大腸菌から単離されたアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチド（実施例９）、およびクロロフレクサス・オーランタシアス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔａｃｉｕｓ）から単離されたマロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチド（実施例１０）を使用した。これらの２つのポリペプチドの組み合せで、アセチルＣｏＡから３−ＨＰの生産が可能になる（図４４）。
【０１２６】
マロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸（配列番号：１４０）がクローニング、配列決定、および発現された。マロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドは、その後３−ＨＰの生産に使用された。
【０１２７】
Ｃ． βアラニン中間体を介して３−ＨＰを生産する生合成経路
一般に、原核生物および真核生物は、グルコースを、エムデン‐マイヤーホフ‐パルナス経路を介して、炭素代謝の中心代謝物であるＰＥＰに代謝する。グルコースから生産されたＰＥＰは、カルボキシル化されてオキサロアセテートになるか、ピルベートに変換される。ＰＥＰのオキサロアセテートへのカルボキシル化は、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチド、ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性を持つポリペプチド、またはＰＥＰトランスカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチドによって触媒され得る。ピルビン酸キナーゼ活性を持つポリペプチドによってＰＥＰから生産されるピルベートも、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を持つポリペプチドによってオキサロアセテートに変換され得る。
【０１２８】
ＰＥＰまたはピルベートから生成したオキサロアセテートは、アスパラギン酸の生産の前駆体となる。この変換は、アスパラギン酸アミノ転移酵素活性を持つポリペプチドによって行われ、グルタメートのアミノ基がオキサロアセテートに転移する。この反応で消費されるグルタメートはグルタミン酸脱水素酵素活性を持つポリペプチドの作用、または４，４−アミノブチレートアミノ転移酵素活性を持つポリペプチドの作用によって、再生され得る。アスパルテートのβアラニンへの脱カルボキシル化は、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性を持つポリペプチドによって触媒される。この生化学によって生産されるβアラニンは、２つの可能な経路で３−ＨＰに変換され得る。これらの経路は図５４および図５５に提供される。
【０１２９】
βアラニンの生産に関与する段階は、いずれの経路も同じであり得る。これらの段階は、ＰＥＰをβアラニンに変換する宿主細胞中の内因性ポリペプチドで行われるか、ＰＥＰ−カルボキシキナーゼ活性（４．１．１．３２）、アスパラギン酸アミノ転移酵素活性（２．６．１．１）、およびアスパラギン酸αデカルボキシラーゼ活性（４．１．１．１１）を持つポリペプチドのような、既知のポリペプチドを用いた組換えＤＮＡ技術によって実施できる。
【０１３０】
図５４に示すように、ＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチド（例えば、配列番号：２に定められる配列を持つポリペプチド）を用いて、βアラニンをβアラニルＣｏＡに変換できる。βアラニルＣｏＡは、βアラニルＣｏＡアンモニアリアーゼ活性を持つポリペプチド（例えば、配列番号：１６０に定められる配列を持つポリペプチド）によってアクリリルＣｏＡに変換できる。アクリリルＣｏＡは、３−ＨＰ−ＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチド（例えば、配列番号：４０に定められる配列を持つポリペプチド）によって、３−ＨＰ−ＣｏＡに変換できる。３−ＨＰ−ＣｏＡはＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチド（例えば、配列番号：２に定められる配列を持つポリペプチド）によって３−ＨＰに変換できる。
【０１３１】
図５５に示すように、４，４−アミノブチレートアミノ転移酵素活性（２．６．１．１９）を持つポリペプチドを用いて、βアラニンをマロン酸セミアルデヒドに変換できる。マロン酸セミアルデヒドは、３−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素活性（１．１．１．５９）を持つポリペプチドまたは３−ヒドロキシイソブチレート脱水素酵素活性を持つポリペプチドのいずれかを用いて、３−ＨＰに変換できる。
【０１３２】
実施例
実施例１−ＣｏＡ転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子のクローニング
ゲノムＤＮＡを、回転管で１０５３強化クロストリジウム培地中、嫌気性条件下、３７℃で１２〜１４時間増殖させたメガスフェラ・エルスデニ細胞（ＡＴＣＣ １７７５３）から単離した。増殖後、細胞をペレット化し、１０ｍＭトリス溶液５ｍＬで洗浄し、再度ペレット化した。ペレットを、リゾチーム１４．２ｍｇおよび２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ溶液４μＬを加えたジェントラ細胞懸濁液（Ｇｅｎｔｒａ Ｃｅｌｌ Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１ｍＬに再懸濁した。細胞懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、ゲノムＤＮＡをジェントラゲノムＤＮＡ単離キット（Ｇｅｎｔｒａ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）を用い、提供されたプロトコルに従って単離した。沈殿したゲノムＤＮＡを巻き取り、１０分間風乾した。ゲノムＤＮＡを１０ｍＭトリス溶液５００μＬに懸濁し、４℃で保存した。
【０１３３】
二つの変性順方向（ＣｏＡＦ１およびＣｏＡＦ２）および三つの変性逆方向（ＣｏＡＲ１、ＣｏＡＲ２、およびＣｏＡＲ３）ＰＣＲプライマーを、アセトアセチルＣｏＡ転移酵素およびプロピオン酸ＣｏＡ転移酵素の保存配列に基づいて設計した
2004514431.tif 000004
。これらのプライマーを、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）および反応混合物１μＬあたり１ｎｇのゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲにおいて、すべての論理的組み合わせで用いた。ＰＣＲを、アニーリング温度５９℃で４サイクル、５７℃で４サイクル、５５℃で４サイクル、および５２℃で１８サイクルのタッチダウンＰＣＲプログラムを用いて実施した。各サイクルは最初に９４℃で３０秒間の変性段階および７２℃で３分間の伸長を用いた。プログラムには９４℃で２分間の最初の変性段階および７２℃で４分間の最終伸長段階が含まれていた。アニーリングのための時間は４５秒であった。反応に用いたＰＣＲプライマーの量は、プライマーの３’末端の縮重の量に応じて、典型的なＰＣＲの量よりも２〜８倍増量した。加えて、それぞれ個々のプライマーを含む別々のＰＣＲ反応を行って、単一の変性プライマーから生じるＰＣＲ産物を同定した。各ＰＣＲ産物（２５μＬ）を、１％ＴＡＥ（トリス−酢酸−ＥＤＴＡ）アガロースゲルを用いた電気泳動により分離した。
【０１３４】
ＣｏＡＦｌ−ＣｏＡＲ２、ＣｏＡＦｌ−ＣｏＡＲ３、ＣｏＡＦ２−ＣｏＡＲ２、およびＣｏＡＦ２−ＣｏＡＲ３の組み合わせにより、それぞれ４２３ｂｐ、４７４ｂｐ、１７７ｂｐ、および２２８ｂｐのバンドが認められた。これらのバンドは他のＣｏＡ転移酵素配列に基づくサイズに一致していた。個々のプライマー対照反応からは、バンドはまったく見られなかった。ＣｏＡＦｌ−ＣｏＡＲ３断片（４７４ｂｐ）をキアゲンゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離および精製した。精製したバンド４μＬをｐＣＲＩＩベクターにライゲーションし、ＴＯＰＯクローニング法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いた熱ショックにより、ＴＯＰ１０大腸菌細胞に形質転換した。形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐ）および５０μｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を含むＬＢ培地にプレーティングした。白色単コロニーを新鮮培地にプレーティングし、ＣｏＡＦ１およびＣｏＡＲ３プライマーを用いたＰＣＲ反応でスクリーニングして挿入断片の存在を確認した。
【０１３５】
キアプレップスピンミニプレップキット（ＱｉａＰｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ）を用いて得たプラスミドＤＮＡを定量し、Ｍ１３ＲおよびＭ１３Ｆプライマーを用いてのＤＮＡ配列決定に用いた。配列解析により、ＣｏＡＦ１−ＣｏＡＲ３断片はアセトアセチルＣｏＡ転移酵素配列と配列類似性を有することが判明した。
【０１３６】
完全なコード配列を得るために、ゲノムウォーキングを実施した。上流および下流両方向のゲノムウォーキングのために、変性プライマー内部の４７４ｂｐのＣｏＡＦｌ−ＣｏＡＲ３断片配列の一部を用いて、下記のプライマーを設計した
2004514431.tif 000005
。ＣＯＡＧＳＰ１ＦおよびＣＯＡＧＳＰ２Ｆプライマーは下流向きで、ＣＯＡＧＳＰ１ＲおよびＣＯＡＧＳＰ２Ｒプライマーは上流向きであった。加えて、ＣＯＡＧＳＰ２ＦおよびＣＯＡＧＳＰ２ＲプライマーはＣＯＡＧＳＰ１ＦおよびＣＯＡＧＳＰ１Ｒプライマーの内側における入れ子状態である。ゲノムウォーキングは、追加のライブラリを酵素Ｎｒｕ Ｉ、Ｓｃａ ＩおよびＨｉｎｃ ＩＩで作製した他は、ユニバーサルゲノムウォーキングキット（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｉｎｇ ｋｉｔ）（ＣｌｏｎＴｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州パロアルト）を用いて行った。第一ラウンドＰＣＲは、パーキンエルマー２４００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ２４００ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）で、９４℃で２秒間および７２℃で３分間を７サイクル、９４℃で２秒間および６５℃で３分間を３６サイクルと、６５℃で４分間の最終伸長によって実施した。第二ラウンドＰＣＲは、９４℃で２秒間および７２℃で３分間を５サイクル、９４℃で２秒間および６５℃で３分間を２０サイクルと、６５℃で４分間の最終伸長を用いた。第一および第二ラウンドの産物（２０μＬ）を１％ＴＡＥアガロースゲル電気泳動で分離した。Ｓｔｕ Ｉライブラリから逆方向で増幅産物が得られた。このライブラリからの１．５Ｋｂの第二ラウンド産物を、ゲル精製し、クローニングし、配列決定した。配列解析により、ゲノムウォーキングから導出された配列はＣｏＡＦ１−ＣｏＡＲ３断片と重なっており、アセトアセチルＣｏＡ転移酵素配列などの他の配列と配列類似性を有することが判明した（図８〜９）。
【０１３７】
メガスフェラ・エルスデニ由来のＣｏＡ転移酵素（プロピオニルＣｏＡ転移酵素すなわちｐｃｔ）をコードする核酸を、下記のＰＣＲプログラムを用いて染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅した：変性のために９５℃で３０秒間、アニーリングのために５０℃で３０秒間、および伸長のために７２℃で３分間を２５サイクル（プラス各サイクル毎に２秒間）。用いたプライマーはＰＣＴ−１．１１４
2004514431.tif 000006
およびＰＣＴ−２．２０４５
2004514431.tif 000007
と命名した。得られたＰＣＲ産物（アガロースゲル電気泳動から判断して約２ｋｂ）をキアゲンＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。精製産物をパーフェクトリーブラント（Ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ Ｂｌｕｎｔ）クローニングキット（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）を用いてｐＥＴＢｌｕｅ−１にライゲーションした。ライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（ＮｏｖａＢｌｕｅ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、これを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン、４０μｇ／ｍＬのＩＰＴＧ、および４０μｇ／ｍＬのＸ−Ｇａｌを補足したＬＢ寒天プレート上に拡げた。白色コロニーを単離し、制限酵素マッピングにより、挿入断片の存在についてスクリーニングした。正しい制限酵素切断パターンを有する単離物を、ｐＥＴＢｌｕｅＵＰおよびｐＥＴＢｌｕｅＤＯＷＮプライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて各末端から配列決定し、ライゲーション点の配列を確認した。
【０１３８】
プラスミドをチューナー（Ｔｕｎｅｒ）（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、構築物からの発現を試験した。要するに、培養物を飽和するまで終夜増殖させ、次の朝、適当な抗生物質を含む新鮮ＬＢ培地で１：２０に希釈した。培養物を通気しながら３７℃でＯＤ６００が約０．６になるまで増殖させた。培養物を最終濃度１００μＭのＩＰＴＧで誘導した。培養物を通気しながら３７℃でさらに２時間インキュベートした。誘導前および誘導後２時間の時点でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために一定量を採取した。ＩＰＴＧ処理後に、予想される分子量（配列から予測して５５，６５３ダルトン）のバンドが観察された。このバンドは、転移酵素をコードする核酸が欠損しているプラスミドを含む細胞では観察されなかった。
【０１３９】
酵素活性を評価するために無細胞抽出物を調製した。要するに、細胞を遠心沈降により回収し、超音波処理により破砕した。超音波処理した細胞懸濁液を遠心沈降して細胞片を除去し、上清をアッセイで用いた。
【０１４０】
転移酵素活性を下記のアッセイ法で測定した。用いたアッセイ混合物は１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、２００ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭジチオビスニトロ安息香酸（ＤＴＮＢ）、５００μＭオキサロ酢酸、２５μＭ ＣｏＡエステル基質、および３μｇ／ｍＬクエン酸合成酵素を含んでいた。存在する場合には、ＣｏＡ転移酵素はＣｏＡエステルからＣｏＡをアセテートに転移させてアセチルＣｏＡを生成する。添加したクエン酸合成酵素はオキサロアセテートとアセチルＣｏＡを縮合してシトレートおよび遊離のＣｏＡＳＨを生成する。遊離ＣｏＡＳＨはＤＴＮＢと複合体を形成し、この複合体形成を４１２ｎｍの光学密度の変化によって測定することができる。ＣｏＡ転移酵素の活性を、下記の基質を用いて測定した：ラクチルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ、アクリリルＣｏＡ、および３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ。タンパク質の単位／ｍｇを下記の式を用いて計算した：
（ΔＥ／分 ‡ Ｖｆ ‡ 希釈率）／（Ｖｓ ‡ １４．２）＝単位／ｍＬ
式中、ΔＥ／分は４１２ｎｍの吸光度の１分あたりの変化であり、Ｖｆは反応物の最終体積であり、Ｖｓは加えた試料の体積である。無細胞抽出物の全タンパク質濃度は約１ｍｇ／ｍＬであったため、単位／ｍＬは単位／ｍｇに等しい。
【０１４１】
ＣｏＡ転移酵素をコードする核酸を含む細胞からの無細胞抽出物はＣｏＡ転移酵素活性を示した（表２）。観察されたＣｏＡ転移酵素活性はラクチルＣｏＡ、プロピオニルＣｏＡ、アクリリルＣｏＡ、および３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ基質で検出された（表２）。最も高いＣｏＡ転移酵素活性はラクチルＣｏＡおよびプロピオニルＣｏＡで検出された。
【０１４２】
【表２】
2004514431.tif 000008
【０１４３】
下記のアッセイ法を実施して、ＣｏＡ転移酵素活性がＣｏＡ基質の受容体と同じ供与体を用いることができるかどうかを調べた。具体的には、ＣｏＡ転移酵素活性をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）ボイジャー（Ｖｏｙａｇｅｒ） ＲＰワークステーション（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて評価した。下記の五つの反応を解析した：
１）　アセテート＋ラクチルＣｏＡ→ラクテート＋アセチルＣｏＡ
２）　アセテート＋プロピオニルＣｏＡ→プロピオネート＋アセチルＣｏＡ
３）　ラクテート＋アセチルＣｏＡ→アセテート＋ラクチルＣｏＡ
４）　ラクテート＋アクリリルＣｏＡ→アクリレート＋ラクチルＣｏＡ
５）　３−ヒドロキシプロピオネート＋ラクチルＣｏＡ→ラクテート＋３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ
【０１４４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて、生成物ＣｏＡエステルの出現と、供与体ＣｏＡエステルの消失を同時に測定した。アッセイ緩衝液は５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＣｏＡエステル、および１００ｍＭのそれぞれの酸の塩を含んでいた。前述のとおりに調製した無細胞抽出物からのタンパク質を、最終濃度０．００５ｍｇ／ｍＬまで加えた。対照反応を、ＣｏＡ転移酵素をコードする核酸を含む構築物を欠損している細胞から調製した無細胞抽出物から調製した。各反応に対し、無細胞抽出物を最後に加えて、反応を開始した。反応を室温で進行させ、１倍量の１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えることによって停止した。反応混合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析前に、セプパックバック（Ｓｅｐ Ｐａｋ Ｖａｃ）Ｃ１８ ５０ｍｇのカラム（Ｗａｔｅｒｓ， Ｉｎｃ．）を用いて精製した。カラムをメタノール１ｍＬでコンディショニングし、０．１％ＴＦＡ １ｍＬで二回洗浄して平衡化した。各試料をカラムに添加し、素通り画分は廃棄した。カラムを０．１％ＴＦＡ １ｍＬで二回洗浄した。試料は４０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ ２００μＬ中に溶出した。アセトニトリルを減圧遠心分離により除去した。試料を１１０ｍＭシナピン酸／０．１％ＴＦＡ、６７％アセトニトリルと１：１で混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析のために調製した。試料を風乾した。
【０１４５】
反応＃１において、対照試料はラクチルＣｏＡ（ＭＷ８４１）に対応する分子量に主ピークを示した。アセチルＣｏＡ（ＭＷ８１１）に対応する分子量に小さいピークが見られた。この小ピークはラクチルＣｏＡの合成から残留したアセチルＣｏＡであると判定された。反応＃１のＣｏＡ転移酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、ラクチルＣｏＡのアセチルＣｏＡへの完全な変換を示した。ラクチルＣｏＡのピークはまったく見られなかった。この結果は、ＣｏＡ転移酵素活性はＣｏＡをラクチルＣｏＡからアセテートに転移させてアセチルＣｏＡを生成しうることを示している。
【０１４６】
反応＃２において、対照試料はプロピオニルＣｏＡ（ＭＷ８２５）に対応する分子量に主ピークを示した。反応＃２のＣｏＡ転移酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、アセチルＣｏＡ（ＭＷ８１１）に対応する分子量に主ピークを示した。プロピオニルＣｏＡのピークはまったく見られなかった。この結果は、ＣｏＡ転移酵素活性はＣｏＡをプロピオニルＣｏＡからアセテートに転移させてアセチルＣｏＡを生成しうることを示している。
【０１４７】
反応＃３において、対照試料はアセチルＣｏＡ（ＭＷ８１１）に対応する分子量に主ピークを示した。反応＃３のＣｏＡ転移酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、ラクチルＣｏＡ（ＭＷ８４１）に対応するピークを示した。アセチルＣｏＡに対応するピークは消失しなかった。事実、二つのピークのサイズ比は約１：１であった。ラクチルＣｏＡに対応するピークの出現が観察されたことは、ＣｏＡ転移酵素活性が反応＃３を触媒することを示している。
【０１４８】
反応＃４において、対照試料はアクリリルＣｏＡ（ＭＷ８２３）に対応する分子量に主ピークを示した。反応＃４のＣｏＡ転移酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、ラクチルＣｏＡ（ＭＷ８４１）に対応する主ピークを示した。この結果は、ＣｏＡ転移酵素活性が反応＃４を触媒することを示している。
【０１４９】
反応＃５において、乳酸および３−ＨＰはそれぞれのＣｏＡエステルと同様に同じ分子量を有するため、ＣｏＡのラクテートから３−ヒドロキシプロピオネートへの転移を検出するために重水素化ラクチルＣｏＡを用いた。重水素化ラクチルＣｏＡを用いることで、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いてのラクチルＣｏＡと３−ヒドロキシプロピオネートとの間の区別が可能となった。対照試料は、重水素原子で置換された水素原子の量にばらつきがあったため、ＭＷ８４１からＭＷ８４５の範囲の分子量に広範なピーク群を示した。加えて、アセチルＣｏＡ（ＭＷ８１１）に対応する分子量に顕著なピークが認められた。このピークはラクチルＣｏＡの合成から残留したアセチルＣｏＡであると判定された。反応＃５のＣｏＡ転移酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、ＭＷ８４１からＭＷ８４５の範囲のピーク群とは対照的に、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ（ＭＷ８４１）に対応する分子量に主ピークを示した。この結果は、ＣｏＡ転移酵素活性が反応＃５を触媒することを示している。
【０１５０】
実施例２−ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を有する複数のポリペプチド複合体をコードする核酸分子のクローニング
Ｅ１活性化因子ポリペプチドをクローニングするために下記の方法を用いた。要するに、四つの変性順方向および五つの変性逆方向ＰＣＲプライマーを、Ｅ１活性化因子タンパク質相同体の保存配列に基づいて設計した
2004514431.tif 000009
。
【０１５１】
これらのプライマーを、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）および反応混合物１μＬあたり１ｎｇのゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲにおいて、すべての論理的組み合わせで用いた。ＰＣＲを、アニーリング温度６０℃で４サイクル、５８℃で４サイクル、５６℃で４サイクル、および５４℃で１８サイクルのタッチダウンＰＣＲプログラムを用いて実施した。各サイクルは最初に９４℃で３０秒間の変性段階および７２℃で３分間の伸長段階を用いた。プログラムには９４℃で２分間の最初の変性段階および７２℃で４分間の最終伸長段階が含まれていた。アニーリングのための時間は４５秒であった。反応に用いたＰＣＲプライマーの量は、プライマーの３’末端の縮重の量に応じて、典型的なＰＣＲの量よりも２〜１０倍増量した。加えて、それぞれ個々のプライマーを含む別々のＰＣＲ反応を行って、単一の変性プライマーから生じるＰＣＲ産物を同定した。各ＰＣＲ産物（２５μＬ）を、１％ＴＡＥ（トリス−酢酸−ＥＤＴＡ）アガロースゲルを用いた電気泳動により分離した。
【０１５２】
Ｅ１Ｆ２−ＥｌＲ４、Ｅ１Ｆ２−Ｅ１Ｒ５、Ｅ１Ｆ３−ＥｌＲ４、Ｅ１Ｆ３−Ｅ１Ｒ５、およびＥｌＦ４−Ｅ１Ｒ４Ｒ２の組み合わせにより、それぞれ１９５ｂｐ、２０７ｂｐ、１４４ｂｐ、１５６ｂｐ、および１４４ｂｐのバンドが認められた。これらのバンドは他の種由来のＥ１活性化因子配列に基づいて予想されたサイズに一致していた。個々のプライマー対照反応では、バンドはまったく見られなかった。Ｅ１Ｆ２−Ｅ１Ｒ５断片（２０７ｂｐ）をキアゲンゲル抽出法（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離および精製した。精製したバンド（４μＬ）をｐＣＲＩＩベクターにライゲーションし、これを次いでＴＯＰＯクローニング法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いた熱ショックにより、ＴＯＰ１０大腸菌細胞に形質転換した。形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐ）および５０μｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を含むＬＢ培地にプレーティングした。白色単コロニーを新鮮培地にプレーティングし、Ｅ１Ｆ２およびＥ１Ｒ５プライマーを用いたＰＣＲ反応でスクリーニングして挿入断片の存在を確認した。プラスミドＤＮＡをキアプレップスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ）を用いて複数のコロニーから得た。プラスミドＤＮＡを得た後、これを定量し、Ｍ１３ＲおよびＭ１３ＦプライマーによるＤＮＡ配列決定に用いた。配列解析により、ポリペプチドをコードする核酸配列が明らかとなり、Ｅ１Ｆ２−Ｅ１Ｒ５断片はＥ１活性化因子配列と配列類似性を有することが判明した（図１２〜１３）。
【０１５３】
Ｅ２αおよびβサブユニットの完全なコード配列を得るために、ゲノムウォーキングを実施した。要するに、上流および下流両方向のゲノムウォーキングを実施するために、Ｅ１Ｆ２およびＥ１Ｒ５変性プライマー内部の２０７ｂｐのＥ１Ｆ２−Ｅ１Ｒ５断片配列の一部を用いて、四つのプライマーを設計した
2004514431.tif 000010
。Ｅ１ＧＳＰ１ＦおよびＥ１ＧＳＰ２Ｆプライマーは下流向きで、Ｅ１ＧＳＰ１ＲおよびＥ１２ＧＳＰ２Ｒプライマーは上流向きであった。加えて、Ｅ１ＧＳＰ２ＦおよびＥ１ＧＳＰ２ＲプライマーはＥ１ＧＳＰ１ＦおよびＥ１ＧＳＰ１Ｒプライマーの内側に入れ子状態である。
【０１５４】
ゲノムウォーキングは、追加のライブラリを酵素Ｎｒｕ Ｉ、Ｓｃａ ＩおよびＨｉｎｃ ＩＩで作製した他は、ユニバーサルゲノムウォーキングキット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州パロアルト）を用いて行った。第一ラウンドＰＣＲは、パーキンエルマー２４００サーモサイクラーで、９４℃で２秒間および７２℃で３分間を７サイクル、９４℃で２秒間および６５℃で３分間を３６サイクルと、６５℃で４分間の最終伸長によって実施した。第二ラウンドＰＣＲは、９４℃で２秒間および７２℃で３分間を５サイクル、９４℃で２秒間および６５℃で３分間を２０サイクルと、６５℃で４分間の最終伸長を用いた。第一および第二ラウンド産物（２０μＬ）を１％ＴＡＥアガロースゲルを用いての電気泳動で分離した。Ｓｔｕ Ｉライブラリから順方向および逆方向の両方で増幅産物が得られた。Ｓｔｕ Ｉライブラリからの、順方向は約１．５ｋｂ、逆方向は３ｋｂの第二ラウンド産物を、ゲル精製し、クローニングし、配列決定した。配列解析により、ゲノムウォーキングから導出された配列はＥ１Ｆ２−Ｅ１Ｒ５断片と重なっていることが判明した。
【０１５５】
さらなる配列を得るために、第二のゲノムウォーキングを、第一ラウンドのプライマー
2004514431.tif 000011
および第二ラウンドのプライマー
2004514431.tif 000012
を用いて実施した。ゲノムウォーキングをＮｒｕＩ、ＳｃａＩ、およびＨｉｎｃＩＩライブラリを用いて行った。加えて、クロンテック（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）のアドバンテージゲノミックポリメラーゼ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ−Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）をＰＣＲに用いた。第一ラウンドＰＣＲは、パーキンエルマー２４００サーモサイクラーで、９４℃で２分間の最初の変性段階、９４℃で２秒間および７２℃で３分間を７サイクル、９４℃で２秒間および６５℃で３分間を３６サイクルと、６５℃で４分間の最終伸長によって実施した。第二ラウンドＰＣＲは、９４℃で２秒間および７２℃で３分間を５サイクル、９４℃で２秒間および６５℃で３分間を２０サイクルと、６５℃で４分間の最終伸長を用いた。第一および第二ラウンド産物（２０μＬ）を１％アガロースゲル上での電気泳動で分離した。ＨｉｎｃＩＩライブラリの第二ラウンドＰＣＲからは約１．５ｋｂの増幅産物が得られた。このバンドをゲル精製し、クローニングし、配列決定した。配列解析により、これは前に得られたゲノムウォーキング断片と重なっていることが判明した。加えて、配列解析により、他の配列と配列類似性を有する、Ｅ２αサブユニットをコードする核酸配列が明らかとなった（図１６〜１７）。さらに、配列解析により、他の配列と配列類似性を有する、Ｅ２βサブユニットをコードする核酸配列も明らかとなった（図２０〜２１）。
【０１５６】
さらなるＰＣＲおよび配列解析により、ラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする配列を含む領域内の、ポリペプチドをコードする配列の順序が明らかとなった。具体的には、Ｅ１ＧＳＰ１ＦおよびＣＯＡＧＳＰ１Ｒプライマー対およびＣＯＡＧＳＰ１ＦおよびＥ１ＧＳＰ１Ｒプライマー対を用いて、ＣｏＡ転移酵素およびＥ１活性化因子ポリペプチドの両方をコードする断片を増幅した。要するに、Ｍ．エルスデニゲノムＤＮＡ（１ｎｇ）を鋳型として用いた。ＰＣＲはパーキンエルマー２４００サーモサイクラーで、ロングテンプレートポリメラーゼ（Ｌｏｎｇ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）を用いて行った。用いたＰＣＲプログラムは下記のとおりであった：９４℃で２分間；９４℃で３０秒間、６１℃で４５秒間、および７２℃で６分間を２９サイクル；ならびに７２℃で１０分間の最終伸長。両方のＰＣＲ産物（２０μＬ）を１％アガロースゲル上で分離した。増幅産物（約１．５ｋｂ）が、ＣＯＡＧＳＰ１ＦおよびＥ１ＧＳＰ１Ｒプライマー対を用いて得られた。この産物を、ゲル精製し、クローニングし、配列決定した（図２２）。
【０１５７】
ラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする配列を含むＭ．エルスデニオペロンの編成は、下記のポリペプチドをコードする配列を下記の順に含むと判定された：ＣｏＡ転移酵素（図６）、ＯＲＦＸ（図２３）、ラクチルＣｏＡ脱水酵素のＥ１活性化因子タンパク質（図１０）、ラクチルＣｏＡ脱水酵素のＥ２αサブユニット（図１４）、ラクチルＣｏＡ脱水酵素のＥ２βサブユニット（図１８）、および切断型ＣｏＡ脱水素酵素（図２５）。
【０１５８】
Ｍ．エルスデニ由来ラクチルＣｏＡ脱水酵素（ｌａｃｔｙｌ−ＣｏＡ ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅの頭文字でｌｃｄ）を、下記のプログラムを用いて染色体ＤＮＡからＰＣＲ増幅した：９４℃で２分間；９４℃で３０秒間、４７℃で４５秒間、および７２℃で３分間を７サイクル；９４℃で３０秒間、５４℃で４５秒間、および７２℃で３分間を２５サイクル；ならびに７２℃で７分間。一つのプライマー対を用いた
2004514431.tif 000013
。増幅産物（約３．２ｋｂ）を１％アガロースゲル上で分離し、ゲルから切り出し、キアゲンゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。精製産物をＮｄｅ ＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、同じ酵素で消化したｐＥＴ１１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にライゲーションした。ライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、これを次いで５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補足したＬＢ寒天プレート上に拡げた。単離した個々のコロニーを、制限酵素マッピングにより、挿入断片の存在についてスクリーニングした。正しい制限酵素切断パターンを有する単離物を、ノバジェンプライマー（Ｔ７プロモータープライマー＃６９３４８−３およびＴ７ターミネータープライマー＃６９３３７−３）を用いて各末端から配列決定し、ライゲーション点の配列を確認した。
【０１５９】
正しい挿入断片を有するプラスミドを、チューナー（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）に形質転換した。この構築物からの発現を下記のとおりに試験した。培養物を飽和するまで終夜増殖させ、次の朝、適当な抗生物質を含む新鮮ＬＢ培地で１：２０に希釈した。培養物を通気しながら３７℃でＯＤ６００が約０．６になるまで増殖させた。培養物を最終濃度１００μＭのＩＰＴＧで誘導した。培養物を通気しながら３７℃でさらに２時間インキュベートした。誘導前および誘導後２時間の時点でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために一定量を採取した。予想される分子量（Ｅ１サブユニットについては２７，０２４ダルトン、Ｅ２αサブユニットについては４８，０８８ダルトン、およびＥ２βサブユニットについては４２，５１７ダルトン−すべて配列から予測）のバンドが観察された。これらのバンドは、ラクチルＣｏＡ脱水酵素の三つの成分をコードする核酸が欠損しているプラスミドを含む細胞では観察されなかった。
【０１６０】
細胞を密封血清容器内、３７℃で終夜培養することにより、無細胞抽出物を調製した。終夜培養後、培養物を１ｍＭ ＩＰＴＧ（嫌気性手法を用いて添加）で誘導し、３７℃でさらに２時間インキュベートした。細胞をストリンジェントな嫌気性条件下で遠心沈降により回収し、超音波処理により破砕した。超音波処理した細胞懸濁液を遠心沈降して細胞片を除去し、上清をアッセイ法で用いた。細胞の再懸濁／超音波処理に用いた緩衝液は、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２００μＭ ＡＴＰ、７ｍＭ Ｍｇ（ＳＯ４）、４ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ 亜ジチオン酸、および１００μＭ ＮＡＤＨであった。
【０１６１】
脱水酵素活性をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳで検出した。アッセイ法は前述のものと同じ緩衝液中に１ｍＭラクチルＣｏＡまたは１ｍＭアクリリルＣｏＡを加え、約５ｍｇ／ｍＬ無細胞抽出物で行った。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析の前に、試料を実施例１に記載のとおりにセプパックバック Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ， Ｉｎｃ．）を用いて精製した。下記の二つの反応を解析した：
１）　アクリリルＣｏＡ→ラクチルＣｏＡ
２）　ラクチルＣｏＡ→アクリリルＣｏＡ
【０１６２】
反応＃１において、対照試料はアクリリルＣｏＡ（ＭＷ８２３）に対応する分子量にピークを示した。反応＃１の脱水酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、ラクチルＣｏＡ（ＭＷ８４１）に対応する分子量に主ピークを示した。この結果は、脱水酵素活性はアクリリルＣｏＡをラクチルＣｏＡに変換しうることを示している。
【０１６３】
ラクチルＣｏＡに対する脱水酵素活性を検出するために、反応＃２を８０％Ｄ２Ｏ中で実施した。対照試料はラクチルＣｏＡ（ＭＷ８４１）に対応する分子量にピークを示した。反応＃２の脱水酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、重水素置換型にシフトしたラクチルＣｏＡのピークを示した。この結果は、脱水酵素はラクチルＣｏＡに対して活性であることを示している。加えて、両方の反応の結果は、脱水酵素がラクチルＣｏＡ←→アクリリルＣｏＡ反応を両方向に触媒することを示している。
【０１６４】
実施例３−３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子のクローニング
ゲノムＤＮＡをクロロフレクサス・オーランチアクス細胞（ＡＴＣＣ２９３６５）から単離した。要するに、９２０ クロロフレクサス培地中のＣ．オーランチアクス細胞を、イノーバ４２３０インキュベーター振盪機（Ｉｎｎｏｖａ ４２３０ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ， Ｓｈａｋｅｒ）（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ニュージャージー州エジソン）を用い、５０℃、内部照明下、５０ｍＬ培養物（Ｆａｌｃｏｎ ２０７０ポリプロピレンチューブ）中で増殖させた。培養後、細胞をペレット化し、１０ｍＭトリス溶液５ｍＬで洗浄し、再度ペレット化した。ゲノムＤＮＡをペレット化した細胞からジェントラゲノム「ピュアジーン」ＤＮＡ単離キット（Ｇｅｎｔｒａ Ｇｅｎｏｍｉｃ ”Ｐｕｒｅｇｅｎｅ” ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ミネソタ州ミネアポリス）を用いて単離した。要するに、ペレット化した細胞をジェントラ細胞懸濁液 １ｍＬに再懸濁し、これにリゾチーム１４．２ｍｇおよび２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ溶液４μＬを加えた。細胞懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートした。沈殿したゲノムＤＮＡを３５００×ｇ、２５分間の遠心沈降で回収し、１０分間風乾した。ゲノムＤＮＡを１０ｍＭトリス溶液３００μＬに懸濁し、４℃で保存した。
【０１６５】
ゲノムＤＮＡを、クロトナーゼ相同体の保存ドメインおよびクロロフレクサス・オーランチアクスコドン使用頻度表に基づいて設計したプライマーによるＰＣＲ増幅反応における鋳型として用いた。要するに、二つの変性順方向（ＣＲＦ１およびＣＲＦ２）および三つの変性逆方向（ＣＲＲ１、ＣＲＲ２、およびＣＲＲ３）ＰＣＲプライマーを設計した
2004514431.tif 000014
。
【０１６６】
これらのプライマーを、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）および反応混合物１μＬあたり１ｎｇのゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲにおいて、すべての論理的組み合わせで用いた。ＰＣＲを、アニーリング温度６１℃で４サイクル、５９℃で４サイクル、５７℃で４サイクル、５５℃で４サイクル、および５２℃で１６サイクルのタッチダウンＰＣＲプログラムを用いて実施した。各サイクルは最初に９４℃で３０秒間の変性段階および７２℃で３分間の伸長段階を用いた。プログラムには９４℃で２分間の最初の変性段階および７２℃で４分間の最終伸長段階も含まれていた。アニーリングのための時間は４５秒であった。反応に用いたＰＣＲプライマーの量は、プライマーの３’末端の縮重の量に応じて、典型的なＰＣＲの量よりも４〜１２倍増量した。加えて、それぞれ個々のプライマーを含む別々のＰＣＲ反応を行って、単一の変性プライマーから生じる増幅産物を同定した。各ＰＣＲ産物（２５μＬ）を、１％ＴＡＥ（トリス−酢酸−ＥＤＴＡ）アガロースゲルを用いた電気泳動により分離した。
【０１６７】
ＣＲＦｌ−ＣＲＲｌおよびＣＲＦ２−ＣＲＲ２の組み合わせにより、それぞれ約１２０ｂｐおよび約１５０ｂｐの特有のバンドが認められた。これらのバンドは他の種由来のクロトナーゼ遺伝子に基づいて予想されたサイズに一致していた。個々のプライマー対照反応では、１２０ｂｐまたは１５０ｂｐのバンドは見られなかった。両断片（すなわち、１２０ｂｐおよび１５０ｂｐのバンド）をキアゲンゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離および精製した。各精製断片（４μＬ）をｐＣＲＩＩベクターにライゲーションし、これを次いでＴＯＰＯクローニング法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いた熱ショック法により、ＴＯＰ１０大腸菌細胞に形質転換した。形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐ）および５０μｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を含むＬＢ培地にプレーティングした。白色単コロニーを新鮮培地にプレーティングし、ＣＲＦ１およびＣＲＲ１プライマーならびにＣＲＦ２およびＣＲＲ２プライマーを用いたＰＣＲ反応でスクリーニングして、所望の挿入断片の存在を確認した。プラスミドＤＮＡをキアプレップスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ）を用いて所望の挿入断片を含む複数のコロニーから得た。プラスミドＤＮＡを得た後、これを定量し、Ｍ１３ＲおよびＭ１３Ｆプライマーを用いてのＤＮＡ配列決定に用いた。配列解析により、約１５０ｂｐのＰＣＲ産物から二つの異なるクローンの存在が明らかとなった。それぞれはクロトナーゼおよび水添加酵素配列と配列類似性を有していた。二つのクローンをＯＳ１７（１５７ｂｐのＰＣＲ産物）およびＯＳ１９（１５１ｂｐのＰＣＲ産物）と命名した。
【０１６８】
ＯＳ１７の完全なコード配列を得るために、ゲノムウォーキングを実施した。要するに、ＣＲＦ２およびＣＲＲ２変性プライマー内部の１５７ｂｐのＣＲＦ２−ＣＲＲ２断片配列の一部を用いて、上流および下流両方向のゲノムウォーキングを実施するためのプライマーを設計した
2004514431.tif 000015
。ＯＳ１７Ｆ１、ＯＳ１７Ｆ３、およびＯＳ１７Ｆ２プライマーは下流向きで、ＯＳ１７Ｒ２、ＯＳ１７Ｒ３、およびＯＳ１７Ｒ１プライマーは上流向きであった。
【０１６９】
ゲノムウォーキングは、追加のライブラリを酵素Ｎｒｕ Ｉ、Ｆｓｐ ＩおよびＨｉｎｃ ＩＩで作製した他は、ユニバーサルゲノムウォーキングキット（ＣｌｏｎＴｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州パロアルト）を用いて行った。第一ラウンドＰＣＲは、パーキンエルマー２４００サーモサイクラーで、９４℃で２秒間および７２℃で３分間を７サイクル、９４℃で２秒間および６６℃で３分間を３６サイクルと、６６℃で４分間の最終伸長によって実施した。第二ラウンドＰＣＲは、９４℃で２秒間および７２℃で３分間を５サイクル、９４℃で２秒間および６６℃で３分間を２０サイクルと、６６℃で４分間の最終伸長を用いた。第一および第二ラウンド増幅産物（５μＬ）を１％ＴＡＥアガロースゲル上での電気泳動で分離した。第二ラウンドＰＣＲの後、Ｆｓｐ Ｉライブラリで、ＯＳ１７Ｒ１プライマーを逆方向で用いた場合には約０．４ｋｂの増幅産物が得られ、Ｈｉｎｃ ＩＩライブラリで、ＯＳ１７Ｆ２プライマーを順方向で用いた場合には約０．６ｋｂの増幅産物が得られた。これらのＰＣＲ産物をクローニングして配列決定した。
【０１７０】
配列解析により、ゲノムウォーキングから導出された配列はＣＲＦ２−ＣＲＲ２断片と重なっており、クロトナーゼおよび水添加酵素配列と配列類似性を有することが判明した。
【０１７１】
さらなる配列を得るために、第二のゲノムウォーキングを実施した。この第二のゲノムウォーキングのために、六つのプライマーを設計した
2004514431.tif 000016
。ＯＳ１７Ｆ４、ＯＳ１７Ｆ５、およびＯＳ１７Ｆ６プライマーは下流向きで、ＯＳ１７Ｒ４、ＯＳ１７Ｒ５、およびＯＳ１７Ｒ６プライマーは上流向きであった。
【０１７２】
第二のゲノムウォーキングは、第一のゲノムウォーキングについて記載したのと同じ方法を用いて実施した。第二ラウンドのゲノムウォーキング後、Ｈｉｎｃ ＩＩライブラリで、ＯＳ１７Ｒ５プライマーを逆方向で用いた場合には約２．３ｋｂの増幅産物が得られ、Ｐｖｕ ＩＩライブラリで、ＯＳ１７Ｆ５プライマーを順方向で用いた場合には約０．６ｋｂの増幅産物が得られた。これらのＰＣＲ産物をクローニングして配列決定した。配列解析により、第二のゲノムウォーキングから導出された配列は第一のゲノムウォーキング中に得られた配列と重なっていることが判明した。加えて、配列解析により、３５７２ｂｐの配列が明らかとなった。
【０１７３】
ＢＬＡＳＴ検索により、この配列によってコードされるポリペプチドは、三つの異なる活性を持つポリペプチドと配列類似性を有することが判明した。具体的には、ＯＳ１７がコードするポリペプチドの始端部分はＣｏＡ合成酵素と配列類似性を有し、ＯＳ１７がコードするポリペプチドの中央領域はエノイル−ＣｏＡ水添加酵素と配列類似性を有し、ＯＳ１７がコードするポリペプチドの終端領域はＣｏＡ還元酵素と配列類似性を有する。
【０１７４】
第三のゲノムウォーキングを四つのプライマーを用いて実施した
2004514431.tif 000017
。ＯＳ１７ＵＰ−６およびＯＳ１７ＵＰ−７プライマーは上流向きで、ＯＳ１７ＤＮ−１およびＯＳ１７ＤＮ−２プライマーは下流向きであった。第三のゲノムウォーキングにより、Ｎｒｕ Ｉライブラリで、ＯＳ１７ＵＰ−７プライマーを逆方向で用いた場合には約１．２ｋｂの増幅産物が得られた。加えて、Ｈｉｎｃ ＩＩおよびＦｓｐ Ｉライブラリで、ＯＳ１７ＤＮ−２プライマーを順方向で用いた場合には、それぞれ約４ｋｂおよび約１．１ｋｂの増幅産物が得られた。配列解析により、ポリペプチドをコードする核酸配列が明らかとなった（図２７〜２８）。完全なＯＳ１７遺伝子は５４６６ヌクレオチドを有し、１８２２アミノ酸のポリペプチドをコードしていた。配列から計算したＯＳ１７ポリペプチドの分子量は２０１，３４６（ｐＩ＝５．７１）であった。
【０１７５】
ＢＬＡＳＴ検索の解析により、ＯＳ１７核酸の産物は、（１）ＯＳ１７配列始端部のＣｏＡ合成酵素、（２）ＯＳ１７配列中央部の３−ＨＰ脱水酵素、および（３）ＯＳ１７配列終端部のＣｏＡ還元酵素に対する配列類似性に基づき、三つの異なる活性を有することが判明した。したがって、ＯＳ１７クローンは、３−ヒドロキシプロピオネートのプロピオニルＣｏＡへの直接変換につながる三つの異なる反応：３−ＨＰ→３−ＨＰ−ＣｏＡ→アクリリルＣｏＡ→プロピオニルＣｏＡを触媒することができる一つの酵素をコードすると考えられた。
【０１７６】
Ｃ．オーランチアクス由来のＯＳ１７遺伝子を、染色体ＤＮＡから下記の条件を用いてＰＣＲ増幅した：９４℃で３分間；変性のために９４℃で３０秒間、アニーリングのために５４℃で３０秒間、および伸長のために６８℃で６分間を２５サイクル；続いて最終伸長のために６８℃で１０分間。二つのプライマーを用いた
2004514431.tif 000018
。得られたＰＣＲ産物（約５．６ｋｂ）をキアゲン ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。精製産物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、８０℃で２０分間加熱して酵素を不活化し、キアゲンＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ酵素であらかじめ消化したｐＥＴ１１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）にライゲーションした。ライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、これを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補足したＬＢ寒天プレート上に拡げた。コロニー細胞から直接、個々の形質転換体を、ＯＳ１７ＦおよびＯＳ１７Ｒプライマー、および前述の条件を用いたＯＳ１７ ＤＮＡのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。５．６ｋｂの産物を生じるクローンを用いて、キアゲンキアプレップスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ ＱｉａＰｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ）によるプラスミド精製を行った。得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換し、ＯＳ１７ポリペプチドの発現を誘導した。ＳＤＳゲル電気泳動によるＯＳ１７ポリペプチドの見かけの分子量は約１９０，０００Ｄａであった。
【０１７７】
ＯＳ１７ポリペプチドの機能を解析するために、ＢＬ２１−ＤＥ３／ｐＥＴｌｌａ−ＯＳ１７細胞の１００ｍＬ培養を、終夜増殖させた培養物１ｍＬを接種物として用いて開始した。培養物をＯＤ ０．５〜０．６になるまで増殖させ、１００μＭ ＩＰＴＧで誘導した。２．５時間誘導した後、細胞を床置き型遠心分離器で８０００ｒｐｍで遠心分離することにより回収した。細胞を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）で洗浄し、フレンチプレス（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓ）をゲージ圧１０００ｐｓｉで二回通過させた。細胞片を１５，０００ｒｐｍの遠心分離により除去した。ＯＳ１７ポリペプチドの活性を分光光度的に測定し、この酵素形質転換中に生じた産物をＬＣ／ＭＳで検出した。アッセイ混合物は下記のとおりであった（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１：１０８８〜１０９８（１９９９））：
2004514431.tif 000019
【０１７８】
初期反応速度を、３４０ｎｍでＮＡＤ（Ｐ）Ｈの消失をモニターすることにより測定した。ＯＳ１７ポリペプチドの活性を３−ＨＰを基質に用いて測定した。合計タンパク質の単位／ｍＬを、実施例１に示した式を用いて計算した。発現されたＯＳ１７ポリペプチドの活性は、合計タンパク質１ｍＬあたり０．０６１単位と計算された。反応生成物をセプパックバックカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて精製した。カラムをメタノール１ｍＬでコンディショニングし、０．１％ＴＦＡ ０．５ｍＬで二回洗浄した。次いで、試料をカラムに添加し、カラムを０．１％ＴＦＡ ０．５ｍＬでさらに二回洗浄した。試料を４０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ ２００μＬで溶出した。試料からアセトニトリルを減圧遠心分離により除去した。反応生成物をＬＣ／ＭＳで分析した。
【０１７９】
前述の反応からのチオエステル、すなわちプロピオニルＣｏＡ、アクリリルＣｏＡ、および３ＨＰ ＣｏＡの分析を、ウォーターズ２６９０液体クロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ ２６９０ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ）と、クロマトグラフおよび単一の四重極質量分析計との間に直列に設置されたウォーターズ９９６フォトダイオードアレイ（Ｗａｔｅｒｓ ９９６ Ｐｈｏｔｏ−Ｄｉｏｄｅ Ａｒｒａｙ）（ＰＤＡ）を有するウォーターズ／マイクロマス（Ｗａｔｅｒｓ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）ＺＱ ＬＣ／ＭＳ装置を用いて実施した。ＬＣ分離は、４．６×１５０ｍｍのＹＭＣ ｏｄｓ−ＡＱ（粒径３μｍ、孔径１２０Å）逆相クロマトグラフィカラムを用いて室温で行った。ＣｏＡエステルは緩衝液Ａ（２５ｍＭ酢酸アンモニウム、０．５％酢酸）および緩衝液Ｂ（アセトニトリル、０．５％酢酸）の直線勾配中に溶出された。流速０．２５ｍＬ／分を用い、フォトダイオードアレイＵＶ吸光度を２００ｎｍから４００ｎｍでモニターした。エレクトロスプレーＭＳシステムのすべてのパラメーターを、対象分析物のプロトン化分子イオン（［Ｍ＋Ｈ］＋）の生成および特徴的なフラグメントイオンの生成に基づいて最適化し、選択した。ＣｏＡおよび有機酸ＣｏＡチオエステルの陽イオンモードでのＥＳＩ−ＭＳ検出のために、下記の装置パラメーターを用いた；抽出器：１Ｖ；ＲＦレンズ：０Ｖ；ソース温度：１００℃；脱溶媒温度；３００℃；脱溶媒ガス：５００Ｌ／時間；コーンガス：４０Ｌ／時間；低質量分解能：１３．０；高質量分解能：１４．５；イオンエネルギー：０．５；増倍管：６５０。質量／電荷比（ｍ／ｚ）および分子質量の不確定性は±０．０１％である。
【０１８０】
ＯＳ１７ポリペプチドを発現している株からの酵素アッセイ混合物は、プロピオニルＣｏＡ、アクリリルＣｏＡ、および３−ＨＰ ＣｏＡのピークを示し、プロピオニルＣｏＡのピークが主ピークであった。これらのピークは、挿入断片を含まないベクターｐＥＴ１１ａを有する対照株から得た酵素アッセイ混合物中では消失している。これらの結果は、ＯＳ１７ポリペプチドがＣｏＡ合成酵素活性、ＣｏＡ水添加酵素活性、および脱水素酵素活性を有することを示している。
【０１８１】
ＯＳ１９の完全なコード配列を得るためのゲノムウォーキングも実施した。要するに、ＣＲＦ２およびＣＲＲ２変性プライマー内部の１５１ｂｐのＣＲＦ２−ＣＲＲ２断片配列の一部を用いて、上流および下流両方向のゲノムウォーキングを実施するためのプライマーを設計した
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。ＯＳ１９Ｆ１、ＯＳ１９Ｆ２、およびＯＳ１９Ｆ３プライマーは下流向きで、ＯＳ１９Ｒ１、ＯＳ１９Ｒ２、およびＯＳ１９Ｒ３プライマーは上流向きであった。
【０１８２】
Ｆｓｐ Ｉライブラリで、ＯＳ１９Ｒ１プライマーを用いた場合には約０．２５ｋｂの増幅産物が得られ、Ｐｖｕ ＩＩライブラリで、ＯＳ１９Ｒ１プライマーを用いた場合には約０．６５ｋｂの増幅産物が得られた。加えて、Ｐｖｕ ＩＩライブラリで、ＯＳ１９Ｆ３プライマーを用いた場合には約０．４ｋｂの増幅産物が得られた。これらのＰＣＲ産物をクローニングして配列決定した。配列解析により、ゲノムウォーキングから導出された配列はＣＲＦ２−ＣＲＲ２断片と重なっており、クロトナーゼおよび水添加酵素配列と配列類似性を有することが判明した。得られた配列は開始コドンコード配列のほとんどに相当していた。
【０１８３】
さらなる配列を得るために、二つのプライマーを用いて第二のゲノムウォーキングを実施した
2004514431.tif 000021
。ＯＳ１９Ｆ７およびＯＳ１９Ｆ８プライマーは下流向きであった。
【０１８４】
Ｐｖｕ ＩＩライブラリから得た増幅産物（約０．７ｋｂ）をクローニングして配列決定した。配列解析により、第二のゲノムウォーキングから導出された配列は第一のゲノムウォーキングから得られた配列と重なっており、停止コドンを含むことが判明した。完全長のＯＳ１９クローンは、クロトナーゼおよびエノイルＣｏＡ水添加酵素配列などの他の配列と配列類似性を有することが判明した（図３２〜３３）。
【０１８５】
ＯＳ１９クローンは、アクリリルＣｏＡ水添加酵素活性とも呼ばれる３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素活性を有するポリペプチドをコードすることが明らかとなった。Ｃ．オーランチアクス由来のＯＳ１９脱水酵素をコードする核酸を、染色体ＤＮＡから下記の条件を用いてＰＣＲ増幅した：９４℃で３分間；変性のために９４℃で３０秒間、アニーリングのために５６℃で３０秒間、および伸長のために６８℃で１分間を２５サイクル；ならびに最終伸長のために６８℃で５分間。二つのプライマーを用いた
2004514431.tif 000022
。
【０１８６】
得られたＰＣＲ産物（約１．２ｋｂ）をアガロースゲル電気泳動で分離し、キアゲン ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。精製産物をパーフェクトリーブラントクローニングキット（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）を用いてｐＥＴＢｌｕｅ−１にライゲーションした。ライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、これを５０μｇ／ｍＬのカルベニシリン、４０μｇ／ｍＬ ＩＰＴＧ、および４０μｇ／ｍＬ Ｘ−Ｇａｌを補足したＬＢ寒天プレート上に拡げた。白色コロニーを単離し、制限酵素マッピングにより、挿入断片の存在についてスクリーニングした。正しい制限酵素切断パターンを有する単離物を、ｐＥＴＢｌｕｅＵＰおよびｐＥＴＢｌｕｅＤＯＷＮプライマー（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて各末端から配列決定し、ライゲーション点の配列を確認した。
【０１８７】
ＯＳ１９脱水酵素をコードする配列を含むプラスミドを、チューナー（ＤＥ３）ｐＬａｃＩ化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、この構築物からの発現を試験した。要するに、培養物を飽和するまで終夜増殖させ、次の朝、適当な抗生物質を含む新鮮ＬＢ培地で１：２０に希釈した。培養物を３７℃、２５０ｒｐｍでＯＤ６００が約０．６になるまで増殖させた。この時点で、培養物を最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。培養物を３７℃、２５０ｒｐｍでさらに２時間インキュベートした。誘導前および誘導後２時間の時点でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために一定量を採取した。予想される分子量（配列から予測して２７，３３６ダルトン）のバンドが観察された。このバンドは、水添加酵素をコードする核酸が欠損しているプラスミドを含む細胞では観察されなかった。
【０１８８】
細胞を前述のとおりに培養して、無細胞抽出物を調製した。細胞を遠心沈降により回収し、超音波処理により破砕した。超音波処理した細胞懸濁液を遠心分離して細胞片を除去し、上清をアッセイ法で用いた。３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素の下記の三つの反応を行う能力を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いて測定した：
１）　アクリリルＣｏＡ→３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ
３）　３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ→アクリリルＣｏＡ
２）　クロトニルＣｏＡ→３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ
【０１８９】
アッセイ混合物は５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＣｏＡエステル、および約１μｇの無細胞抽出物を含んでいた。反応を室温で進行させ、１倍量の１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えることによって停止した。反応混合物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析前に、セプパックバック Ｃ１８ ５０ｍｇのカラム（Ｗａｔｅｒｓ， Ｉｎｃ．）を用いて精製した。カラムをメタノール１ｍＬでコンディショニングし、０．１％ＴＦＡ １ｍＬで二回洗浄して平衡化した。試料をカラムに添加し、素通り画分は廃棄した。カラムを０．１％ＴＦＡ １ｍＬで二回洗浄した。試料は４０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ ２００μＬ中に溶出した。アセトニトリルを減圧遠心分離により除去した。試料を１１０ｍＭシナピン酸／０．１％ＴＦＡ、６７％アセトニトリルと１：１で混合し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ分析のために調製した。試料を風乾した。
【０１９０】
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素によって触媒されるアクリリルＣｏＡの３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡへの変換を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ法を用いて検出した。反応＃１において、対照試料はアクリリルＣｏＡ（ＭＷ８２３）に対応する分子量に主ピークを示した。反応＃１の３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ（ＭＷ８４１）に対応する主ピークを示した。この結果は、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素活性が反応＃１を触媒することを示している。
【０１９１】
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡのアクリリルＣｏＡへの変換を検出するために、反応＃２を８０％Ｄ２Ｏ中で実施した。反応＃２の３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料から、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ分子に重水素が取り込まれていることが判明した。この結果は、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素が反応＃２を触媒することを示している。加えて、＃１および＃２両方の反応の結果は、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素が３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ←→アクリリルＣｏＡの両方向の反応を触媒しうることも示している。＃１および＃２両方の反応で、ＭＷ８１１にピークが観察され、これは３−ヒドロキシプロピオネートおよびアセチルＣｏＡから３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡの合成からのアセチルＣｏＡの残留によるものであることに留意のこと。
【０１９２】
クロトニルＣｏＡの３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの変換を評価するアッセイ法も８０％Ｄ２Ｏ中で実施した。反応＃３において、対照試料はクロトニルＣｏＡ（ＭＷ８３７）に対応する分子量に主ピークを示した。この結果は、クロトニルＣｏＡが他の生成物に変換されないことを示していた。反応＃３の３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞由来の細胞抽出物を含む試料は、重水素化３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ（ＭＷ８５５からＭＷ８５７）に対応する広範なピーク群を示した。この結果は、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素活性が反応＃３を触媒することを示している。
【０１９３】
一連の対照反応を、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素の特異性を確認するために実施した。ラクチルＣｏＡ（１ｍＭ）を、１００ｍＭトリス（ｐＨ７．０）を含む反応混合物に、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素存在下および非存在下の両方で加えた。いずれの場合にも、観察された主ピークはラクチルＣｏＡ（ＭＷ８４１）に対応する分子量を有していた。この結果は、ラクチルＣｏＡが、Ｄ２Ｏ存在下でも、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素の存在によって影響を受けないことを示しており、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素がα炭素の位置にヒドロキシル基を結合しないことを意味している。８０％Ｄ２Ｏ反応混合物中に３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡが存在することで、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素活性の添加によりピークのシフトが起こった。３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素活性非存在下では、ＭＷ８１１のピークに加えて３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡに対応するピークが観察された。ＭＷ８１１のピークは３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡの合成からの残留アセチルＣｏＡによるものであった。３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素活性存在下では、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡのアクリリルＣｏＡへの変換およびその逆の間のヒドロキシル基の交換により、重水素化３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡに対応するピークが観察された（ＭＷ８４２）。これらの対照反応は、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素が３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡに対して活性であり、ラクチルＣｏＡに対しては活性がないことを示している。加えて、これらの結果は、アクリリルＣｏＡ反応の生成物はラクチルＣｏＡではなく３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡであることを示している。
【０１９４】
実施例４−オペロン＃１の構築
下記のオペロンを構築し、大腸菌において３−ＨＰを産生するために用いることができた（図３４）。要するに、オペロンをＴ７プロモーター（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）の制御下でｐＥＴ−１１発現ベクターにクローニングした。ｐＥＴ−１１発現ベクターは、挿入された下流配列のための開始コドンとしてＮｄｅＩ制限酵素切断部位のＡＴＧ配列を用いる５６７７ｂｐのプラスミドである。
【０１９５】
ＣｏＡ転移酵素およびラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする核酸分子を、メガスフェラ・エルスデニゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。二つのプライマーを用いてＣｏＡ転移酵素をコードする配列を増幅し
2004514431.tif 000023
、二つのプライマーを用いてラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする配列を増幅した
2004514431.tif 000024
。３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素をコードする核酸分子をクロロフレクサス・オーランチアクスゲノムＤＮＡから、二つのプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した
2004514431.tif 000025
。
【０１９６】
ＰＣＲはパーキンエルマー２４００サーモサイクラーで、ゲノムＤＮＡ １００ｎｇおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カリフォルニア州フォスターシティ）およびＰｆｕターボポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；カリフォルニア州ラホイヤ）の８：１比の混合物を用いて行った。ポリメラーゼ混合物はＰＣＲ反応のより高い忠実度を確実にした。次のＰＣＲ条件を用いた：９４℃で２分間の最初の変性段階；９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、および６８℃で２分間を２０サイクル；ならびに６８℃で５分間の最終伸長。得られたＰＣＲ産物を、キアゲンゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．；カリフォルニア州バレンシア）を用いてゲル精製した。
【０１９７】
ＣｏＡ転移酵素、ラクチルＣｏＡ脱水酵素（Ｅ１、Ｅ２αサブユニット、およびＥ２βサブユニット）、および３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素ＰＣＲ産物を、ＰＣＲを用いてアセンブルした。ＯＳＣＴＥ−１およびＯＳＣＴＥ−２プライマーならびにＯＳＥＢＨ−１およびＯＳＥＢＨ−２プライマーは互いに相補的であった。したがって、相補的ＤＮＡ末端はＰＣＲ反応中に互いにアニーリングして、ＤＮＡを両方向に伸長することができた。アセンブルの有効性を確実にするために、二つの末端プライマー（ＯＳＮＢｐｃｔＦおよびＯＳＨＢＲ）を、各ＰＣＲ産物（すなわち、ＣｏＡ転移酵素、ラクチルＣｏＡ脱水酵素、および３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素反応からのＰＣＲ産物）１００ｎｇならびに前述のｒＴｔｈポリメラーゼ／Ｐｆｕターボポリメラーゼ混合物を含む、アセンブルＰＣＲ混合物に加えた。産物をアセンブルするために下記のＰＣＲ条件を用いた：９４℃で１分間；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および６８℃で６分間を２５サイクル；ならびに６８℃で７分間の最終伸長。アセンブルしたＰＣＲ産物をゲル精製し、制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）で消化した。これらの制限酵素部位を、ＯＳＮＢｐｃｔＦ（ＮｄｅＩ）およびＯＳＨＢＲ（ＢａｍＨＩ）プライマーを用いてアセンブルしたＰＣＲ産物に導入した。消化したＰＣＲ産物を８０℃で３０分間加熱して制限酵素を不活化し、ｐＥＴ−１１ａベクターへのライゲーションに直接用いた。
【０１９８】
ｐＥＴ−１１ａベクターをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、キアゲンゲル抽出キットを用いてゲル精製し、エビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）で処理し、アセンブルしたＰＣＲ産物とのライゲーション反応に用いた。ライゲーションはＴ４リガーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）を用いて１６℃で終夜実施した。得られたライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）に熱ショック法を用いて形質転換した。熱ショックを与えた後、細胞を５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補足したＬＢプレート上にプレーティングした。プラスミドＤＮＡを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を用いた消化によって解析した。
【０１９９】
実施例５−オペロン＃２の構築
下記のオペロンを構築し、大腸菌において３−ＨＰを産生するために用いることができた（図３５ＡおよびＢ）。ＣｏＡ転移酵素およびラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする核酸分子を、メガスフェラ・エルスデニゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。二つのプライマーを用いてＣｏＡ転移酵素をコードする配列を増幅し（ＯＳＮＢｐｃｔＦおよびＯＳＣＴＥ−２）、二つのプライマーを用いてラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする配列を増幅した
2004514431.tif 000026
。３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素をコードする核酸分子をクロロフレクサス・オーランチアクスゲノムＤＮＡから、二つのプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した
2004514431.tif 000027
。
【０２００】
ＰＣＲはパーキンエルマー２４００サーモサイクラーで、ゲノムＤＮＡ １００ｎｇおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カリフォルニア州フォスターシティ）およびＰｆｕターボポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；カリフォルニア州ラホイヤ）の８：１比の混合物を用いて行った。ポリメラーゼ混合物はＰＣＲ反応のより高い忠実度を確実にした。次のＰＣＲ条件を用いた：９４℃で２分間の最初の変性段階；９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、および６８℃で２分間を２０サイクル；ならびに６８℃で５分間の最終伸長。得られたＰＣＲ産物を、キアゲンゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．；カリフォルニア州バレンシア）を用いてゲル精製した。
【０２０１】
ＣｏＡ転移酵素およびラクチルＣｏＡ脱水酵素（Ｅ１、Ｅ２αサブユニット、およびＥ２βサブユニット）ＰＣＲ産物を、ＰＣＲを用いてアセンブルした。ＯＳＣＴＥ−１およびＯＳＣＴＥ−２プライマーは互いに相補的であった。したがって、ＣｏＡ転移酵素配列末端の２２ヌクレオチドとラクチルＣｏＡ脱水酵素の始端部の２２ヌクレオチドとはＰＣＲ反応中に互いにアニーリングして、ＤＮＡを両方向に伸長することができた。アセンブルの有効性を確実にするために、二つの末端プライマー（ＯＳＮＢｐｃｔＦおよびＯＳＮＢｅＩＲ）を、ＣｏＡ転移酵素ＰＣＲ産物１００ｎｇ、ラクチルＣｏＡ脱水酵素ＰＣＲ産物１００ｎｇ、および前述のｒＴｔｈポリメラーゼ／Ｐｆｕターボポリメラーゼ混合物を含む、アセンブルＰＣＲ混合物に加えた。産物をアセンブルするために下記のＰＣＲ条件を用いた：９４℃で１分間；９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、および６８℃で５分間を２０サイクル；ならびに６８℃で６分間の最終伸長。
【０２０２】
アセンブルしたＰＣＲ産物をゲル精製し、制限酵素（ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ）で消化した。これらの制限酵素部位を、ＯＳＮＢｐｃｔＦ（ＮｄｅＩ）およびＯＳＮＢｅＩＲ（ＢａｍＨＩ）プライマーを用いてアセンブルしたＰＣＲ産物に導入した。消化したＰＣＲ産物を８０℃で３０分間加熱して制限酵素を不活化し、ｐＥＴ−１１ａベクターへのライゲーションに直接用いた。
【０２０３】
ｐＥＴ−１１ａベクターをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、キアゲンゲル抽出キットを用いてゲル精製し、エビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）で処理し、アセンブルしたＰＣＲ産物とのライゲーション反応に用いた。ライゲーションはＴ４リガーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）を用いて１６℃で終夜実施した。得られたライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）に熱ショック法を用いて形質転換した。熱ショックを与えた後、細胞を５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補足したＬＢプレート上にプレーティングした。プラスミドＤＮＡを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を用いた消化によって解析した。消化により、ＣｏＡ転移酵素をコードする配列およびラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする配列を含むＤＮＡ断片がｐＥＴ−１１ａベクターにクローニングされたことが判明した。
【０２０４】
ＣｏＡ転移酵素をコードする配列およびラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする配列を有するプラスミド（ｐＴＤ）をＸｂａＩおよびＮｄｅＩ制限酵素で消化し、ゲル精製し、ＣｏＡ転移酵素をコードする配列の上流の３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素をコードする産物のクローニングに用いた。このＸｂａＩおよびＮｄｅＩ消化によってｐＥＴ−１１ａベクターからリボソーム結合部位（ＲＢＳ）が除去されたため、新しい相同性ＲＢＳを３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素をコードする産物と共にプラスミドにクローニングした。要するに、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素をコードするＰＣＲ産物をＸｂａＩおよびＮｄｅＩ制限酵素で消化し、６５℃で３０分間加熱して制限酵素を不活化し、ｐＴＤにライゲーションした。ライゲーション混合物を化学的コンピテントノバブルー細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、これを次いで５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補足したＬＢプレート上にプレーティングした。
【０２０５】
個々のコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡをキアゲンスピンミニプレップキットを用いて得た。得られたプラスミドをＸｂａＩおよびＮｄｅＩ制限酵素で消化し、ゲル電気泳動により解析した。挿入された３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素をコードするＰＣＲ産物を含むｐＴＤプラスミドをｐＨＴＤと命名した。ｐＨＴＤからのラクチルＣｏＡ脱水酵素、ＣｏＡ転移酵素、および３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素配列の発現は、単一のＴ７プロモーターによって支配されていたが、各コード配列はそれらの開始コドン上流の個々のＲＢＳを有していた。
【０２０６】
ラクチルＣｏＡ脱水酵素、ＣｏＡ転移酵素、および３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素配列の一つのオペロンへの正しいアセンブルおよびクローニングを確実にするために、オペロンの両端およびコード配列の間のすべての連結部を配列決定した。このＤＮＡ解析により、オペロンが正しくアセンブルされたことが判明した。
【０２０７】
ｐＨＴＤプラスミドをＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換して、コードされた配列の発現を試験した。
【０２０８】
実施例６−オペロン＃３および＃４の構築
オペロン＃３（図３６ＡおよびＢ）およびオペロン＃４（図３７ＡおよびＢ）はそれぞれＥ１活性化因子をオペロンの末端に配置している。オペロン＃３は３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素をコードする配列とＥ１活性化因子をコードする配列との間にＲＢＳを含む。しかし、オペロン＃４においては、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素をコードする配列の停止コドンはＥ１活性化因子をコードする配列の開始コドンと次のとおりに融合している：ＴＡＧＴＧ。オペロン＃４にはＲＢＳがないため、Ｅ１活性化因子の発現レベルが低下しうる。
【０２０９】
オペロン＃３を構築するために、ＣｏＡ転移酵素およびラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする核酸分子を、メガスフェラ・エルスデニゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。二つのプライマーを用いてＣｏＡ転移酵素をコードする配列を増幅し
2004514431.tif 000028
、二つのプライマーを用いてラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする配列のＥ２αおよびβサブユニットを増幅し
2004514431.tif 000029
、二つのプライマーを用いてラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする配列のＥ１活性化因子を増幅した
2004514431.tif 000030
。３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素をコードする核酸分子をクロロフレクサス・オーランチアクスゲノムＤＮＡから、二つのプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した
2004514431.tif 000031
。
【０２１０】
ＰＣＲはパーキンエルマー２４００サーモサイクラーで、ゲノムＤＮＡ １００ｎｇおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カリフォルニア州フォスターシティ）およびＰｆｕターボポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；カリフォルニア州ラホイヤ）の８：１比の混合物を用いて行った。ポリメラーゼ混合物はＰＣＲ反応のより高い忠実度を確実にした。次のＰＣＲ条件を用いた：９４℃で２分間の最初の変性段階；９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、および６８℃で２分間を２０サイクル；ならびに６８℃で５分間の最終伸長。得られたＰＣＲ産物を、キアゲンゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．；カリフォルニア州バレンシア）を用いてゲル精製した。
【０２１１】
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素およびＥ１活性化因子ＰＣＲ産物を、ＰＣＲを用いてアセンブルした。ＯＳＨｒＥ１ＦおよびＯＳＥＩｒＨＲプライマーは互いに相補的であった。したがって、プライマーはＰＣＲ反応中に互いにアニーリングして、ＤＮＡを両方向に伸長することができた。アセンブルの有効性を確実にするために、二つの末端プライマー（ＯＳＴＨＦおよびＯＳＥ１ＢＲ）を、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素ＰＣＲ産物１００ｎｇ、Ｅ１活性化因子ＰＣＲ産物１００ｎｇ、および前述のｒＴｔｈポリメラーゼ／Ｐｆｕターボポリメラーゼ混合物を含む、アセンブルＰＣＲ混合物に加えた。産物をアセンブルするために下記のＰＣＲ条件を用いた：９４℃で１分間；９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、および６８℃で１．５分間を２０サイクル；ならびに６８℃で５分間の最終伸長。
【０２１２】
アセンブルしたＰＣＲ産物をゲル精製し、ゲル精製したＣｏＡ転移酵素ＰＣＲ産物との第二のアセンブルＰＣＲに用いた。ＯＳＴＨＦおよびＯＳＨＴＲプライマーは互いに相補的であった。したがって、相補的なＤＮＡ末端はＰＣＲ反応中に互いにアニーリングして、ＤＮＡを両方向に伸長することができた。アセンブルの有効性を確実にするために、二つの末端プライマー（ＯＳＮＢｐｃｔＦおよびＯＳＥ１ＢＲ）を、精製した３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素／ＥＩ ＰＣＲアセンブル体１００ｎｇ、精製したＣｏＡ転移酵素ＰＣＲ産物１００ｎｇ、および前述のポリメラーゼ混合物を含む、第二のアセンブルＰＣＲ混合物に加えた。産物をアセンブルするために下記のＰＣＲ条件を用いた：９４℃で１分間；９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、および６８℃で３分間を２０サイクル；ならびに６８℃で５分間の最終伸長。
【０２１３】
アセンブルしたＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。これらの制限酵素部位を、ＯＳＮＢｐｃｔＦ（ＮｄｅＩ）およびＯＳＥＩＢＲ（ＢａｍＨＩ）プライマーを用いてアセンブルしたＰＣＲ産物に導入した。消化したＰＣＲ産物を８０℃で３０分間加熱して制限酵素を不活化し、ｐＥＴ１１ａベクターへのライゲーションに直接用いた。
【０２１４】
ｐＥＴ−１１ａベクターをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、キアゲンゲル抽出キットを用いてゲル精製し、エビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）で処理し、アセンブルしたＰＣＲ産物とのライゲーション反応に用いた。ライゲーションはＴ４リガーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）を用いて１６℃で終夜実施した。得られたライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）に熱ショック法を用いて形質転換した。熱ショックを与えた後、細胞を５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補足したＬＢプレート上にプレーティングした。プラスミドＤＮＡを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。得られた、ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素、およびＥＩ活性化因子配列を有するプラスミド（ｐＴＨｒＥＩ）をＸｂａＩおよびＮｄｅＩで消化し、ゲル電気泳動およびキアゲンゲル抽出キットを用いて精製し、Ｅ２αサブユニット／Ｅ２βサブユニットＰＣＲ産物のクローニングのためのベクターとして用いた。
【０２１５】
Ｅ２αサブユニット／Ｅ２βサブユニットＰＣＲ産物を同じ酵素で消化し、ｐＴＨｒＥＩベクターにライゲーションした。ライゲーション反応はＴ４リガーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）を用いて１６℃で終夜実施した。ライゲーション混合物を化学的コンピテントノバブルー細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、これを次いで５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補足したＬＢプレート上にプレーティングした。プラスミドＤＮＡを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、ゲル電気泳動解析のためにＸｂａＩおよびＮｄｅＩ制限酵素で消化した。得られた、構築されたオペロン＃３を有するプラスミド（ｐＥＩＩＴＨｒＥＩ）をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換して、クローニングした配列の発現を試験した。エレクトロスプレー質量分析により、これらの細胞からの抽出物はＣｏＡ転移酵素活性および３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素活性を有することが確認された。同様の解析を用いて、これらの細胞からの抽出物がラクチルＣｏＡ脱水酵素活性も有することを確認する。
【０２１６】
オペロン＃４を構築するために、ＣｏＡ転移酵素およびラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする核酸分子を、メガスフェラ・エルスデニゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。二つのプライマーを用いてＣｏＡ転移酵素をコードする配列を増幅し（ＯＳＮＢｐｃｔＦおよびＯＳＨＴＲ）、二つのプライマーを用いてラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする配列のＥ２αおよびβサブユニットを増幅し（ＯＳＥＩＩＸＮＦおよびＯＳＥＩＩＸＮＲ）、二つのプライマーを用いてラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする配列のＥ１活性化因子を増幅した
2004514431.tif 000032
。３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素をコードする核酸分子をクロロフレクサス・オーランチアクスゲノムＤＮＡから、二つのプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した
2004514431.tif 000033
。
【０２１７】
ＰＣＲはパーキンエルマー２４００サーモサイクラーで、ゲノムＤＮＡ １００ｎｇおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カリフォルニア州フォスターシティ）およびＰｆｕターボポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；カリフォルニア州ラホイヤ）の８：１比の混合物を用いて行った。ポリメラーゼ混合物はＰＣＲ反応のより高い忠実度を確実にした。次のＰＣＲ条件を用いた：９４℃で２分間の最初の変性段階；９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、および６８℃で２分間を２０サイクル；ならびに６８℃で５分間の最終伸長。得られたＰＣＲ産物を、キアゲンゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．；カリフォルニア州バレンシア）を用いてゲル精製した。
【０２１８】
３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素およびＥ１活性化因子ＰＣＲ産物を、ＰＣＲを用いてアセンブルした。ＯＳＨＥＩＦおよびＯＳＥＩＨＲプライマーは互いに相補的であった。したがって、プライマーはＰＣＲ反応中に互いにアニーリングして、ＤＮＡを両方向に伸長することができた。アセンブルの有効性を確実にするために、二つの末端プライマー（ＯＳＴＨＦおよびＯＳＥ１ＢＲ）を、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素ＰＣＲ産物１００ｎｇ、Ｅ１活性化因子ＰＣＲ産物１００ｎｇ、および前述のｒＴｔｈポリメラーゼ／Ｐｆｕターボポリメラーゼ混合物を含む、アセンブルＰＣＲ混合物に加えた。産物をアセンブルするために下記のＰＣＲ条件を用いた：９４℃で１分間；９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、および６８℃で１．５分間を２０サイクル；ならびに６８℃で５分間の最終伸長。
【０２１９】
アセンブルしたＰＣＲ産物をゲル精製し、ゲル精製したＣｏＡ転移酵素ＰＣＲ産物との第二のアセンブルＰＣＲに用いた。ＯＳＴＨＦおよびＯＳＨＴＲプライマーは互いに相補的であった。したがって、相補的なＤＮＡ末端はＰＣＲ反応中に互いにアニーリングして、ＤＮＡを両方向に伸長することができた。アセンブルの有効性を確実にするために、二つの末端プライマー（ＯＳＮＢｐｃｔＦおよびＯＳＥ１ＢＲ）を、精製した３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素／ＥＩ ＰＣＲアセンブル体１００ｎｇ、精製したＣｏＡ転移酵素ＰＣＲ産物１００ｎｇ、および前述のポリメラーゼ混合物を含む、第二のアセンブルＰＣＲ混合物に加えた。産物をアセンブルするために下記のＰＣＲ条件を用いた：９４℃で１分間；９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、および６８℃で３分間を２０サイクル；ならびに６８℃で５分間の最終伸長。
【０２２０】
アセンブルしたＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。これらの制限酵素部位を、ＯＳＮＢｐｃｔＦ（ＮｄｅＩ）およびＯＳＥＩＢＲ（ＢａｍＨＩ）プライマーを用いてアセンブルしたＰＣＲ産物に導入した。消化したＰＣＲ産物を８０℃で３０分間加熱して制限酵素を不活化し、ｐＥＴ１１ａベクターへのライゲーションに直接用いた。
【０２２１】
ｐＥＴ−１１ａベクターをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、キアゲンゲル抽出キットを用いてゲル精製し、エビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）で処理し、アセンブルしたＰＣＲ産物とのライゲーション反応に用いた。ライゲーションはＴ４リガーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）を用いて１６℃で終夜実施した。得られたライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）に熱ショック法を用いて形質転換した。熱ショックを与えた後、細胞を５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補足したＬＢプレート上にプレーティングした。プラスミドＤＮＡを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。得られた、ＣｏＡ転移酵素、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素、およびＥＩ活性化因子配列を有するプラスミド（ｐＴＨＥ１）をＸｂａＩおよびＮｄｅＩで消化し、ゲル電気泳動およびキアゲンゲル抽出キットを用いて精製し、Ｅ２αサブユニット／Ｅ２βサブユニットＰＣＲ産物のクローニングのためのベクターとして用いた。
【０２２２】
Ｅ２αサブユニット／Ｅ２βサブユニットＰＣＲ産物を同じ酵素で消化し、ｐＴＨＥ１ベクターにライゲーションした。ライゲーション反応はＴ４リガーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）を用いて１６℃で終夜実施した。ライゲーション混合物を化学的コンピテントノバブルー細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、これを次いで５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補足したＬＢプレート上にプレーティングした。プラスミドＤＮＡを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、ゲル電気泳動解析のためにＸｂａＩおよびＮｄｅＩ制限酵素で消化した。得られた、構築されたオペロン＃４を有するプラスミド（ｐＥＩＩＴＨＥＩ）をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換して、クローニングした配列の発現を試験した。エレクトロスプレー質量分析により、これらの細胞からの抽出物はＣｏＡ転移酵素活性および３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素活性を有することが確認された。同様の解析を用いて、これらの細胞からの抽出物がラクチルＣｏＡ脱水酵素活性も有することを確認する。
【０２２３】
合成３−ＨＰオペロンを有する大腸菌プラスミドｐＥＩＩＴＨｒＥＩを、ＮｒｕＩ、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ ＤＮＡ断片をキアゲンゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いてゲル精製し、バチル（Ｂａｃｉｌｌｕ）ベクターｐＷＨ１５２０（ＭｏＢｉＴｅｃ ＢｍＢＨ、ドイツ、ゴッティンゲン）にさらにクローニングするために用いた。ベクターｐＷＨ１５２０をＳｐｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、キアゲンゲル抽出キットを用いてゲル精製した。３−ＨＰオペロンを有するＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片をＷＨ１５２０ベクターにＴ４リガーゼを用いて１６℃で終夜ライゲーションした。ライゲーション混合物を化学的コンピテントＴＯＰ１０細胞に形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補足したＬＢプレート上にプレーティングした。Ｂ．メガテリウム（ｐＢＰＯ２６）なる名称の一つのクローンをＣｏＡ形質転換酵素およびＣｏＡ水添加酵素活性のアッセイ法に用いた。アッセイ法は大腸菌について前述したとおりに行った。酵素活性はそれぞれ５Ｕ／ｍｇおよび１３Ｕ／ｍｇであった。
【０２２４】
実施例７−二つのプラスミド系の構築
下記の構築物を構築し、大腸菌において３−ＨＰを産生するために用いることができた（図３８ＡおよびＢ）。ＣｏＡ転移酵素およびラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする核酸分子を、メガスフェラ・エルスデニゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。二つのプライマーを用いてＣｏＡ転移酵素をコードする配列を増幅し（ＯＳＮＢｐｃｔＦおよびＯＳＨＴＲ）、二つのプライマーを用いてラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする配列のＥ２αおよびβサブユニットを増幅し（ＯＳＥＩＩＸＮＦおよびＯＳＥＩＩＸＮＲ）、二つのプライマーを用いてラクチルＣｏＡ脱水酵素をコードする配列のＥ１活性化因子を増幅した
2004514431.tif 000034
。３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素をコードする核酸分子をクロロフレクサス・オーランチアクスゲノムＤＮＡから、二つのプライマーを用いるＰＣＲによって増幅した
2004514431.tif 000035
。
【０２２５】
ＰＣＲはパーキンエルマー２４００サーモサイクラーで、ゲノムＤＮＡ １００ｎｇおよびｒＴｔｈポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；カリフォルニア州フォスターシティ）およびＰｆｕターボポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；カリフォルニア州ラホイヤ）の８：１比の混合物を用いて行った。ポリメラーゼ混合物はＰＣＲ反応のより高い忠実度を確実にした。次のＰＣＲ条件を用いた：９４℃で２分間の最初の変性段階；９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、および６８℃で２分間を２０サイクル；ならびに６８℃で５分間の最終伸長。得られたＰＣＲ産物を、キアゲンゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．；カリフォルニア州バレンシア）を用いてゲル精製した。
【０２２６】
ＣｏＡ転移酵素ＰＣＲ産物および３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素ＰＣＲ産物を、ＰＣＲを用いてアセンブルした。ＯＳＴＨＦおよびＯＳＨＴＲプライマーは互いに相補的であった。したがって、相補的ＤＮＡの末端はＰＣＲ反応中に互いにアニーリングして、ＤＮＡを両方向に伸長することができた。アセンブルの有効性を確実にするために、二つの末端プライマー（ＯＳＮＢｐｃｔＦおよびＯＳＨＢＲ）を、ＣｏＡ転移酵素ＰＣＲ産物１００ｎｇ、精製した３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素ＰＣＲ産物１００ｎｇ、および前述のポリメラーゼ混合物を含む、アセンブルＰＣＲ混合物に加えた。産物をアセンブルするために下記のＰＣＲ条件を用いた：９４℃で１分間；９４℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、および６８℃で２．５分間を２０サイクル；ならびに６８℃で５分間の最終伸長。
【０２２７】
アセンブルしたＰＣＲ産物をゲル精製し、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。これらの制限酵素部位を、ＯＳＮＢｐｃｔＦ（ＮｄｅＩ）およびＯＳＨＢＲ（ＢａｍＨＩ）プライマーを用いてアセンブルしたＰＣＲ産物に導入した。消化したＰＣＲ産物を８０℃で３０分間加熱して制限酵素を不活化し、ｐＥＴ１１ａベクターへのライゲーションに直接用いた。
【０２２８】
ｐＥＴ−１１ａベクターをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、キアゲンゲル抽出キットを用いてゲル精製し、エビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）で処理し、アセンブルしたＰＣＲ産物とのライゲーション反応に用いた。ライゲーションはＴ４リガーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）を用いて１６℃で終夜実施した。得られたライゲーション反応物をノバブルー化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）に熱ショック法を用いて形質転換した。熱ショックを与えた後、細胞を５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補足したＬＢプレート上にプレーティングした。プラスミドＤＮＡを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、ゲル電気泳動解析のためにＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を用いて消化した。得られた、ＣｏＡ転移酵素および３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素を有するプラスミド（ｐＴＨ）をＸｂａＩおよびＮｄｅＩで消化し、ゲル電気泳動およびキアゲンゲル抽出キットを用いて精製し、Ｅ２αサブユニット／Ｅ２βサブユニットＰＣＲ産物のクローニングのためのベクターとして用いた。
【０２２９】
同じ酵素で消化したＥ２αサブユニット／Ｅ２βサブユニットＰＣＲ産物を、ｐＴＨベクターにライゲーションした。ライゲーション反応はＴ４リガーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）を用いて１６℃で終夜実施した。ライゲーション混合物を化学的コンピテントノバブルー細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換し、これを次いで５０μｇ／ｍＬのカルベニシリンを補足したＬＢプレート上にプレーティングした。プラスミドＤＮＡを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、ゲル電気泳動解析のためにＸｂａＩおよびＮｄｅＩ制限酵素で消化した。得られた、ラクチルＣｏＡ脱水酵素のＥ２αおよびβサブユニット、ＣｏＡ転移酵素、および３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ脱水酵素を有するプラスミド（ｐＥＩＩＴＨ）をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換して、クローニングした配列の発現を試験した。
【０２３０】
ゲル精製したＥ１活性化因子ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ制限酵素で消化し、６５℃で３０分間加熱して、これをＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ制限酵素で消化し、キアゲンゲル抽出キットを用いてゲル精製し、エビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）で処理したベクター（ｐＰＲＯＬａｒ．Ａ）にライゲーションした。ライゲーションはＴ４リガーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；インディアナ州インディアナポリス）を用いて１６℃で終夜実施した。得られたライゲーション反応物をＤＨ１０Ｂ電気的コンピテント細胞（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；メリーランド州ゲイザースバーグ）に電気穿孔法を用いて形質転換した。電気穿孔した後、細胞を２５μｇ／ｍＬのカナマイシンを補足したＬＢプレート上にプレーティングした。プラスミドＤＮＡを個々のコロニーからキアプレップスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、ゲル電気泳動解析のためにＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ制限酵素を用いて消化した。得られた、Ｅ１活性化因子を有するプラスミド（ｐＰＲＯＥＩ）をＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換して、クローニングした配列の発現を試験した。
【０２３１】
ｐＰＲＯＥＩおよびｐＥＩＩＴＨプラスミドは同じ細菌宿主細胞で用いることができる互換性プラスミドである。加えて、ｐＰＲＯＥＩおよびｐＥＩＩＴＨプラスミドからの発現は、ＩＰＴＧおよびアラビノースを用いて異なるレベルで誘導することができ、クローニングした配列の発現の微調整を可能にする。
【０２３２】
実施例８−３−ＨＰの産生
組換え大腸菌を用いて小規模バッチ発酵反応で３−ＨＰを産生した。誘導型Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを有するＡＬＳ８４８株（ＴＡ３４７６とも命名されている（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１４３：１０８１〜１０８５（１９８０）））の構築を、λＤＥ３溶原化キット（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、製造者の指示に従って実施した。構築した株をＡＬＳ４８４（ＤＥ３）と命名した。ＡＬＳ４８４（ＤＥ３）株をｐＥＩＩＴＨｒＥＩプラスミドで標準の電気穿孔法を用いて形質転換した。形質転換体をＬＢ／カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）プレート上で選択した。単コロニーを用いて１５ｍＬ培養管中の４ｍＬ培養物に接種した。ベクターｐＥＴ１１ａを有するＡＬＳ４８４（ＤＥ３）株を対照として用いた。細胞をイノーバ４２３０インキュベーター振盪機（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュージャージー州エジソン）中、３７℃、２５０ｒｐｍで８〜９時間培養した。この培養物（３ｍＬ）を用いて嫌気性発酵を開始した。ＡＬＳ（ＤＥ３）／ｐＥＴ１１ａおよびＡＬＳ（ＤＥ３）ｐＥＩＩＴＨｒＥＩの二つの１００ｍＬ嫌気性培養物を、０．４％グルコース、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン、および１００ｍＭ ＭＯＰＳを補足したＬＢ培地を用いて血清瓶中で培養した。培養物を振盪せずに３７℃で終夜増殖させた。終夜増殖培養物を、０．４％グルコース、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン、および１００ｍＭ ＭＯＰＳを補足した新鮮ＬＢ培地を用いて血清瓶中で継代培養した。これらの培養物の開始時ＯＤ（６００）を０．３に調節した。これらの血清瓶を振盪せずに３７℃でインキュベートした。１時間のインキュベーション後、培養物を１００μＭ ＩＰＴＧで誘導した。３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、および２４時間の時点で試料３ｍＬを各血清瓶から採取した。試料を二つの適当に標識した２ｍＬ微量遠沈管に移し、それぞれ１．５ｍＬの試料を含んでいた。試料を微量遠沈管内、１４０００ｇで３分間遠心沈降した。上清を０．４５μシリンジフィルターを通過させ、得られたろ液をさらに分析するまで−２０℃で保存した。発酵産物、主にラクテートおよび３−ヒドロキシプロピオネートの生成を、ＬＣ／ＭＳを用いて乳酸および３−ＨＰの誘導体化ＣｏＡエステルを検出することにより測定した。
【０２３３】
乳酸および３−ＨＰをそれぞれのＣｏＡエステルに変換するために、下記の方法を実施した。要するに、ろ液をＣｏＡ反応緩衝液（２００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、２ｍＭアセチルＣｏＡ、および０．１ｍｇ／ｍＬ精製転移酵素）と１：１比で混合した。反応を室温で２０分間進行させた。１倍量の１０％ＴＦＡを加えることによって反応を停止した。試料をセプパックバックカラム（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて精製した。カラムをメタノールでコンディショニングし、０．１％ＴＦＡで二回洗浄した。次いで、試料をカラムに添加し、カラムを０．１％ＴＦＡでさらに二回洗浄した。試料を４０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡで溶出した。アセトニトリルを試料から減圧遠心分離により除去した。試料をＬＣ／ＭＳで分析した。
【０２３４】
標準ＣｏＡ／ＣｏＡチオエステル混合物および発酵ブロスからのＣｏＡチオエステル混合物の分析を、ウォーターズ２６９０液体クロマトグラフと、クロマトグラフおよび単一の四重極質量分析計との間に直列に設置されたウォーターズ９９６フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）吸光度モニターを有するウォーターズ／マイクロマス ＺＱ ＬＣ／ＭＳ装置を用いて実施した。ＬＣ分離は、４．６×１５０ｍｍのＹＭＣ ＯＤＳ−ＡＱ（粒径３μｍ、孔径１２０Å）逆相クロマトグラフィカラムを用いて室温で行った。ＣｏＡエステルの分離のために、異なる移動相を用いて二つの勾配溶出系を開発した。これら二つの系を表３にまとめている。溶出系１はＣｏＡ／ＣｏＡチオエステル混合物の５成分（ＣｏＡ、アセチルＣｏＡ、ラクチルＣｏＡ、アクリリルＣｏＡ、およびプロピオニルＣｏＡ）の最も迅速で効率的な分離を提供するために開発し、一方、溶出系２は構造異性エステルのラクチルＣｏＡおよび３ＨＰ−ＣｏＡの基線分離ならびに前述の残りのエステルの分離を提供するために開発した。すべての場合に、流速は０．２５０ｍＬ／分で、フォトダイオードアレイＵＶ吸光度は２００ｎｍから４００ｎｍでモニターした。エレクトロスプレーＭＳシステムのすべてのパラメーターを、対象分析物のプロトン化分子イオン（［Ｍ＋Ｈ］＋）の生成および特徴的なフラグメントイオンの生成に基づいて最適化し、選択した。ＣｏＡおよび有機酸ＣｏＡチオエステルの陽イオンモードでのＥＳＩ−ＭＳ検出のために、下記の装置パラメーターを用いた：キャピラリー：４．０Ｖ；コーン：５６Ｖ；抽出器：１Ｖ；ＲＦレンズ：０Ｖ；ソース温度：１００℃；脱溶媒温度；３００℃；脱溶媒ガス：５００Ｌ／時間；コーンガス：４０Ｌ／時間；低質量分解能：１３．０；高質量分解能：１４．５；イオンエネルギー：０．５；増倍管：６５０。報告された質量／電荷比（ｍ／ｚ）および分子質量の不確定性は±０．０１％である。表３は有機酸−補酵素Ａチオエステル分離のための勾配溶出系の概要を示している。
【０２３５】
【表３】
2004514431.tif 000036
【０２３６】
下記の方法を用いて、３−ＨＰから生成した誘導体化３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡを、ラクテートから生成した２−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡ（すなわち、ラクチルＣｏＡ）から分離した。これらの構造異性体は同じ質量および質量分析でのフラグメント化挙動を有するため、混合物中のこれらの分析物の分離および同定は、それらのクロマトグラフィによる分離に依存する。溶出系１は試験したＣｏＡチオエステルのすぐれた分離を提供した（図４６）が、３−ＨＰ−ＣｏＡとラクチルＣｏＡとを分離することはできなかった。別のＬＣ溶出系を酢酸アンモニウムおよびトリエチルアミンを用いて開発した（系２；表３）。
【０２３７】
系２の３−ＨＰ−ＣｏＡとラクチルＣｏＡとを分離する能力を、これら二つの化合物の混合物で試験した。３−ＨＰ−ＣｏＡおよびラクチルＣｏＡの混合物からの結果（図４７、パネルＡ）とラクチルＣｏＡのみからの結果（図４７、パネルＢ）との比較により、系２は３−ＨＰ−ＣｏＡおよびラクチルＣｏＡを分離しうることが判明した。図４６、パネルＣと比較した場合に、ピーク１の下で記録された質量スペクトル（図４７、パネルＡの挿入図）を用いて、ピーク１をヒドロキシプロピオニルＣｏＡチオエステルであると同定した。加えて、図４７のパネルＡおよびＢならびに各ピークに対応する質量スペクトルの結果の比較により、ピーク１は３−ＨＰ−ＣｏＡに対応し、ピーク２はラクチルＣｏＡに対応することが明らかとなった。
【０２３８】
系２を用いて、３−ＨＰ−ＣｏＡが検出されたため、ｐＥＩＩＴＨｒＥＩでトランスフェクトされた大腸菌が３−ＨＰを産生することが確認された。具体的には、ｐＥＩＩＴＨｒＥＩを含む大腸菌の培養物からＣｏＡ転移酵素処理した発酵ブロスの一定量を採取し、その分析におけるｍ／ｚ＝８４０のイオンクロマトグラムから、３−ＨＰ−ＣｏＡの存在が明らかとなった（図４８、パネルＡ）。ｐＥＩＩＴＨｒＥＩを含まない大腸菌の培養物から採取した、ＣｏＡ転移酵素処理した発酵ブロスの一定量は、３−ＨＰ−ＣｏＡに対応するピークを示さなかった（図４８、パネルＢ）。したがって、これらの結果は、ｐＥＩＩＴＨｒＥＩプラスミドがプロピオニルＣｏＡ転移酵素活性、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性、およびアクリリルＣｏＡ水添加酵素活性を有するポリペプチドの発現を支配していることを示している。これらの結果は、これらのポリペプチドの発現が３−ＨＰの生成につながることも示している。
【０２３９】
実施例９−アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子のクローニング
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、アセチルＣｏＡをマロニルＣｏＡにカルボキシル化することにより、脂肪酸合成に関連する第一の段階を触媒する。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、適当な細胞機能に要求される超長鎖脂肪酸生合成のためのマロニルＣｏＡの提供も担っている。アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、補因子であるビオチンが翻訳後に特定のリシン残基に結合される、ビオチン依存酵素でありうる。そのようなポリペプチドによって触媒される反応は、二つの異なる半反応からなる。第一の半反応において、ＡＴＰ依存反応でビオチンは重炭酸塩によってカルボキシル化されてカルボキシビオチンを生じる。第二の半反応において、カルボキシル基はアセチルＣｏＡに転移してマロニルＣｏＡを生じる。
【０２４０】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有する原核細胞および真核細胞のポリペプチドが存在する。原核細胞ポリペプチドは多サブユニット酵素（四つのサブユニット）で、各サブユニットは異なる核酸配列によってコードされる。例えば、大腸菌において、下記の遺伝子がアセチルＣｏＡカルボキシラーゼの四つのサブユニットをコードする：
ａｃｃＡ：アセチル−補酵素ａカルボキシラーゼカルボキシル転移酵素サブユニットα（ゲンバンク（登録商標）、アクセッション番号Ｍ９６３９４）
ａｃｃＢ：ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ゲンバンク（登録商標）、アクセッション番号Ｕ１８９９７）
ａｃｃＣ：ビオチンカルボキシラーゼ（ゲンバンク（登録商標）、アクセッション番号Ｕ１８９９７）
ａｃｃＤ：アセチル−補酵素ａカルボキシラーゼカルボキシル転移酵素サブユニットベータ（ゲンバンク（登録商標）、アクセッション番号Ｍ６８９３４）
【０２４１】
真核細胞ポリペプチドは単一の遺伝子によってコードされる高分子量多機能酵素である。例えば、出芽酵母において、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼはゲンバンク（登録商標）、アクセッション番号Ｍ９２１５６に示した配列を有しうる。
【０２４２】
大腸菌由来の原核細胞型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを、別に記載のＴ７プロモーターベクターｐＦＮ４７６（デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７５：２８５９３〜２８５９８（２０００））を用いて過剰発現させた。真核細胞型アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子を、出芽酵母ゲノムＤＮＡから増幅した。出芽酵母からａｃｃ１遺伝子を増幅するために、二つのプライマーを設計した
2004514431.tif 000037
ただし、太字は相同配列であり、イタリックはＮｏｔ Ｉ部位であり、下線はＲＢＳであり、小文字は余分である。および
2004514431.tif 000038
ただし、太字は相同配列であり、イタリックはＸｈｏ Ｉ部位であり、下線はＲＢＳであり、小文字は余分である）。下記のＰＣＲ混合物を用いてａｃｃ１遺伝子を増幅した：１０×ｐｆｕ緩衝液（１０μＬ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ；２μＬ）、ｃＤＮＡ（２μＬ）、ａｃｃ１Ｆ（１００μＭ；１μＬ）、ａｃｃ１Ｒ（１００μＭ；１μＬ）、ｐｆｕ酵素（２．５単位；２μＬ）、および脱イオン水（８２μＬ）。下記のプロトコルを用いてａｃｃ１遺伝子を増幅した。ＰＣＲ実施後、ＰＣＲ産物をゲル上で分離し、ａｃｃ１核酸（約６．７ｋｂ）に対応するバンドをキアゲンゲル単離キットを用いてゲル単離した。ＰＣＲ断片をＮｏｔ ＩおよびＸｈｏ Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂ）制限酵素で消化した。消化したＰＣＲ断片を次いで、Ｎｏｔ ＩおよびＸｈｏ Ｉで切断し、ＳＡＰ酵素で脱リン酸化したｐＥＴ３０ａにライゲーションした。大腸菌ＤＨ１０Ｂ株をライゲーション混合物１μＬで形質転換し、細胞をＳＯＣ培地１ｍＬ中で回復させた。形質転換細胞をＬＢ／カナマイシン（５０μｇ／μＬ）プレート上で選択した。八つの単コロニーを選択し、ＰＣＲを用いて正しい挿入断片についてスクリーニングした。正しい挿入断片を有するプラスミドを、キアゲンスピンミニプレップキットを用いて単離した。
【０２４３】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドを得るために、大腸菌または出芽酵母アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを過剰発現しているプラスミドｐＭＳＤ８またはｐＥＴ３０ａ／ａｃｃ１をチューナー ｐＬａｃＩ化学的コンピテント細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）に形質転換した。形質転換細胞をＬＢ／クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）＋カルベニシリン（５０μｇ／ｍＬ）またはカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）上で選択した。
【０２４４】
この株の粗抽出物を下記の様式で調製することができる。チューナー ｐＬａｃＩのｐＭＳＤ８との終夜培養物を、０．４％グルコース、１μｇ／ｍＬチアミン、０．１％カザミノ酸、ならびに５０μｇ／ｍＬカルベニシリンまたは５０μｇ／ｍＬカナマイシンおよび２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補足した新鮮Ｍ９培地２００ｍＬ（１リットルのバッフル培養フラスコ内）に継代培養する。培養物を振盪機内、２５０ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で６００ｎｍの光学密度約０．６に達するまで増殖させる。次いで、ＩＰＴＧを最終濃度１００μＭまで加える。次いで、培養物を振盪速度２５０ｒｐｍ、３７℃でさらに３時間インキュベートする。細胞を８０００×ｇでの遠心分離によって回収し、０．８５％ＮａＣｌで一回洗浄する。細胞ペレットを最少量の５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣＩ、２ｍＭ ＤＴＴ、および５％グリセロールに再懸濁した。細胞をフレンチプレッシャー細胞（Ｆｒｅｎｃｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｃｅｌｌ）を１０００ｐｓｉｇの圧で二回通過させることにより溶解する。細胞片を３０，０００×ｇで２０分間遠心分離して除去した。
【０２４５】
酵素をデービスら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７５：２８５９３〜２８５９８（２０００））からの方法を用いてアッセイすることができる。
【０２４６】
実施例１０−クロロフレクサス・オーランチアクス由来マロニルＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子のクローニング
マロニルＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドを、クロロフレクサス・オーランチアクスから部分精製し、アミノ酸微量配列決定の結果を得るために用いた。アミノ酸配列決定の結果を用いて、マロニルＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする核酸を同定およびクローニングした。
【０２４７】
タンパク質精製に必要なバイオマスを、ビーブラウンバイオスタット発酵槽（Ｂ． Ｂｒａｕｎ ＢＩＯＳＴＡＴ Ｂ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒｓ）（Ｂ． Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＧｍｂＨ、ドイツ、メルスンゲン）内で培養した。加熱用の水ジャケットを備えたガラス容器を用いて、必要とされるバイオマスを増殖させた。ガラス容器をそれ自体の制御装置に連結した。液体の可使容積は４Ｌで、発酵槽は５５℃、７５ｒｐｍの撹拌で操作した。二酸化炭素を発酵槽の上部空間を通して随時通気し、嫌気性条件を維持した。培養物のｐＨを標準のｐＨプローブを用いてモニターし、８．０から８．３の間に維持した。発酵槽用の接種材料を、イノーバ４２３０インキュベーター振盪機（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュージャージー州エジソン）内、５５℃、内部照明下、二つの２５０ｍＬボトルで培養した。発酵槽を三つの６５Ｗプラント用光反射ランプ（ｐｌａｎｔ ｌｉｇｈｔ ｒｅｆｌｅｃｔｏｒ ｌａｍｐ）（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ、オハイオ州クリーブランド）で照明した。各ランプをガラス容器から約５０ｃｍ離して設置した。接種材料および発酵槽培養物用に用いた培地は１リットルあたり次のとおりであった：０．０７ｇ ＥＤＴＡ、１ｍＬ 微量栄養素溶液、１ｍＬ ＦｅＣｌ３溶液、０．０６ｇ ＣａＳ０４・２Ｈ２０、０．１ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０、０．００８ｇ ＮａＣｌ、０．０７５ｇ ＫＣ１、０．１０３ｇ ＫＮＯ３、０．６８ｇ ＮａＮ０３、０．１１１ｇ Ｎａ２ＨＰ０４、０．２ｇ ＮＨ４Ｃｌ、１ｇ酵母抽出物、２．５ｇカザミノ酸、０．５ｇ グリシル−グリシン、および９００ｍＬ脱イオン水。微量栄養素溶液は１リットルあたり下記を含んでいた：０．５ｍＬ 濃Ｈ２Ｓ０４、２．２８ｇ ＭｎＳ０４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ ＺｎＳ０４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ Ｈ３ＢＯ３、０．０２５ｇ ＣｕＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．０２５ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、および０．０４５ｇ ＣｏＣ１２・６Ｈ２０。ＦｅＣｌ３溶液は１リットルあたり０．２９０５ｇ ＦｅＣｌ３を含んでいた。培地のｐＨを８．２から８．４に調節した後、０．７５ｇ／ＬのＮａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを加え、ｐＨを８．２から８．４に再度調節し、培地を０．２２μフィルターを通してフィルター滅菌した。
【０２４８】
発酵槽に増殖培養物５００ｍＬを接種した。細胞密度が６００ｎｍで約０．５から０．６になった後、発酵を停止し、バイオマスを回収した。
【０２４９】
細胞を４℃、５０００×ｇの遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ ＪＬＡ ８．１０００ローター）によって回収し、１倍量の氷冷０．８５％ＮａＣｌで洗浄し、再度遠心分離した。細胞ペレットを氷冷した２ｍＭ ＤＴＴ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．４ｍＭ ＰＥＦＡＢＬＯＣ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）、１％硫酸ストレプトマイシン、およびコンプリートＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）２錠（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）を補足した１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）緩衝液３０ｍＬに再懸濁した。細胞懸濁液を１６００ｐｓｉ（ゲージ読みとリ値）で操作した５０ｍＬのフレンチプレッシャー細胞を三回通過させて溶解した。細胞片を３０，０００×ｇの遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ ＪＡ ２５．５０ローター）で除去した。粗抽出物をクロマトグラフィ前に０．２μｍ ＨＴ Ｔｕｆｆｒｙｎ膜シリンジフィルター（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．、ミシガン州アンアーバー）を用いてろ過した。粗抽出物のタンパク質濃度は２９ｍｇ／ｍＬで、これはバイオラッド蛋白質あアッセイ（ＢｉｏＲａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）を製造者のマイクロアッセイプロトコルに従って用いて定量した。標準曲線の定量にはウシγグロブリンを用いた。このアッセイ法はブラッドフォードの色素結合法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｄｙｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）（ブラッドフォード、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２：２４８（１９７６））に基づいていた。
【０２５０】
タンパク質精製を始める前に、下記のアッセイ法を用いて粗抽出物中のマロニルＣｏＡ還元酵素の活性を定量した。細胞抽出物（２９ｍｇ／ｍＬ）の一部５０μＬを、９６穴ＵＶ透過プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ニューヨーク）中、１Ｍトリス−ＨＣｌ １０μＬ（アッセイ中の最終濃度１００ｍＭ）、１０ｍＭマロニルＣｏＡ １０μＬ（アッセイ中の最終濃度１ｍＭ）、５．５ｍＭ ＮＡＤＰＨ ５．５μＬ（アッセイ中の最終濃度０．３ｍＭ）、および脱イオン水２４．５μＬに加えた。酵素活性を、スペクトラマックスプラス９６穴プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ Ｐｌｕｓ ９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ、カリフォルニア州サニーベール）を用いて４５℃で測定した。マロニルＣｏＡ還元酵素の活性を、３４０ｎｍの波長でＮＡＤＰＨの消失を測定することによってモニターした。粗抽出物はマロニルＣｏＡ還元酵素活性を示した。
【０２５１】
タンパク質細胞抽出物５ｍＬ（全１４５ｍｇ）を緩衝液Ａ（２０ｍＭエタノールアミン（ｐＨ９．０）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴ）２０ｍＬで希釈した。クロマトグラフィによるタンパク質精製を、バイオロジックタンパク質精製システム（ＢｉｏＬｏｇｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて行った。細胞懸濁液２５ｍＬを、緩衝液Ａ（１ｍＬ／分）で平衡化しておいたＵＮＯ Ｑ−６イオン交換カラムに添加した。試料添加後、カラムをカラム容積の２．５倍の緩衝液Ａ（２ｍＬ／分）で洗浄した。タンパク質を、カラム容積の２５倍の緩衝液Ａ中ＮａＣｌ ０〜０．３３Ｍの直線勾配で溶出した。全クロマトグラフィ分離中、３ｍＬ画分を分取した。溶出された試料のｐＨが約ｐＨ７に低下するように、分取チューブにはトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）５０μＬが含まれていた。主なクロマトグラフィピークは、画分１８から２１および画分２３から３０に対応する領域で検出された。これらの画分から２００μＬの試料を取り、マイクロコン（Ｍｉｃｒｏｃｏｎ）ＹＭ−１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ベッドフォード）を製造者の指示どおりに用いて、微量遠心分離機中、４℃で濃縮した。濃縮した各画分に、緩衝液Ａ−トリス（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．８）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴ）を加えて、全量１００μＬとした。これらの各画分を、前述の分光光度アッセイ法を用いてマロニルＣｏＡ還元酵素活性について試験した。マロニルＣｏＡの比活性の大部分は画分１８から２１に認められた。これらの画分を集め、集めた試料をＰＤ−１０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を製造者の指示どおりに用いて脱塩した。
【０２５２】
脱塩したタンパク質抽出物１０．５ｍＬを緩衝液Ａ−トリスで体積２５ｍＬまで希釈した。この脱塩希釈試料を、緩衝液Ａ−トリスで平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｂｌｕｅカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａニュージャージー州ピスカタウェイ）に添加した。試料は０．１ｍＬ／分の速度で添加した。未結合のタンパク質をカラム容積の２．５倍の緩衝液Ａ−トリスで洗浄した。タンパク質を１００Ｍｍトリス（ｐＨ７．８）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、および１Ｍ ＮａＣｌで溶出した。この分離工程中、１ｍＬの画分を分取した。試料２００μＬを画分４９から５４から取り、濃縮した。緩衝液Ａ−トリスを濃縮した各画分に加えて、全量１００μＬとした。画分を、前述のとおりに酵素活性について解析した。最も高い比活性は画分５１で認められた。画分５１をすべて前述のとおりに濃縮し、濃縮した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。
【０２５３】
バイオラッドプロテアンＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅａｎ ＩＩ）ミニゲルシステムおよび成型済みＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜１５％）、またはプロテアンＩＩ ＸＩシステムおよび１６ｃｍ×２０ｃｍ×ｌｍｍのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０％）型を製造者の指示どおりに用いて、電気泳動を行った。ゲルを製造者に指示に従い、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１９２ｍＭグリシン、および０．１％ＳＤＳの泳動緩衝液で泳動した。
【０２５４】
１ｍｍのゲル厚を用いて画分５１からの試料を泳動した。画分５１からのタンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加した（３レーン、それぞれ全７５μｇのタンパク質を含む）。ゲルをクーマシーブルー（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）で短時間染色し、次いで１０％酢酸および２０％メタノール溶液でバックグラウンドが澄明になるように脱染した。染色により、約１３０〜１４０ＫＤａのバンドが明らかとなった。
【０２５５】
約１３０〜１４０ＫＤａのタンパク質バンドを、過剰の未染色ゲルがないように切り出した。タンパク質を含まない等面積のゲルを陰性対照として切り出した。ゲル切片を、ＨＰＬＣ等級の水中５０％アセトニトリルで予備洗浄した無色の微量遠沈管に入れ、５０％アセトニトリルで二回洗浄し、ドライアイス上でハーバードマイクロケミストリーシーケンシングファクトリー（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｉｃｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）、マサチューセッツ州ケンブリッジに送った。
【０２５６】
ポリペプチド試料のトリプシンによるインサイチュー酵素消化後、得られたポリペプチドをマイクロキャピラリー逆相ＨＰＬＣで分離した。ＨＰＬＣをファニガン（Ｆｉｎｎｉｇａｎ）ＬＣＱ四重極イオントラップ質量分析計のナノ−エレクトロスプレーイオン化源に直接連結した（μＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）。個々の配列スペクトル（ＭＳ／ＭＳ）を、クロマトグラフィ実施中に分離された複数のポリペプチドについて、オンラインで高感度で得た。ポリペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを、ワシントン大学で開発されたアルゴリズムシークエスト（Ｓｅｑｕｅｓｔ）（エング（Ｅｎｇ）ら、Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、５：９７６（１９９４））およびハーバードで開発されたプログラム（チタム（Ｃｈｉｔｔｕｍ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７：１０８６６（１９９８））を用いて、既知の配列で補正した。結果を既知のタンパク質との一致について、および忠実度の手動確認について見直した。
【０２５７】
同様の精製法を用いてもう一つの試料（タンパク質１の試料）を得、これを画分５１の試料を評価するために用いたものと同じ分析にかけた。
【０２５８】
ポリペプチド配列の結果は、画分５１の試料およびタンパク質１の試料の両方から得たポリペプチドは、Ｃ．オーランチアクスゲノムから配列決定され、ジョイントゲノムインスチュテート（Ｊｏｉｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）のウェブサイト（ｈｔｔｐ ：／／ｗｗｗ．ｊｇｉ．ｄｏｅ．ｇｏｖ／）に載せられている六つのコンティグ（７６４、７９９、８５９、９２３、１０９０、１０２４）と類似性を有することを示していた。７６４コンティグは約４０のペプチド配列が類似性を示し、六つの中で最も顕著であった。ゲンバンクのウェブサイト上でのこれらの各コンティグのＢＬＡＳＴＸ解析（ｈｔｔｐ ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）は、７６４コンティグ（４２０１塩基）のＤＮＡ配列が脱水素酵素／還元酵素型の活性を有するポリペプチドをコードすることを示していた。しかし、７６４コンティグを厳密に調べると、このコンティグは１３０〜１４０ＫＤａのポリペプチドをコードする適当なＯＲＦを持っていないことが明らかとなった。
【０２５９】
ＢＬＡＳＴＸ解析を、他の五つのコンティグを用いても実施した。この解析の結果は下記のとおりであった。７９９コンティグ（３１７３塩基）は、リン酸および脱水素酵素型の活性を有するポリペプチドをコードすると考えられた。８５９コンティグ（５８６５塩基）は合成酵素型の活性を有するポリペプチドをコードすると考えられた。９２３コンティグ（５６６０塩基）は延長因子および合成酵素型の活性を有するポリペプチドをコードすると考えられた。１０９０コンティグ（１５２０１塩基）は脱水素酵素／還元酵素ならびにチトクロームおよびσ因子活性を有するポリペプチドをコードすると考えられた。１０２４コンティグ（１２２７６塩基）は脱水素酵素および脱カルボキシル酵素および合成酵素型の活性を有するポリペプチドをコードすると考えられた。したがって、８５９および９２３コンティグはこれ以上のいかなる解析からも除外した。
【０２６０】
ＢＬＡＳＴＸ解析の結果より、１０２４コンティグで見いだされた脱水素酵素は、イノシトール一リン酸脱水素酵素である可能性が高いことも判明した。したがって、１０２４コンティグは、マロニルＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードする可能性のある候補として除外した。７９９コンティグは前述のＯＳ１７ポリペプチドの一部であるため、このコンティグも除外した。
【０２６１】
これにより、検索は７６４コンティグおよび１０９０コンティグの２つのコンティグに限定された。コンティグは同じタンパク質試料を用いて同定され、これらのコンティグで認められた脱水素酵素活性からは非常に類似したＢＬＡＳＴＸ結果が得られたため、これらは同じポリペプチドの一部であるとの仮説が立てられた。この仮説を裏付けるさらなる証拠が、ジョイントゲノムインスチュテートによって提供された骨格データの解析によって明らかになった、Ｃ．オーランチアクスゲノムにおいて７６４コンティグおよび１０９０コンティグが互いに隣接しているという発見から得られた。しかし、配列類似性およびアセンブル解析からは、これら二つのコンティグの間には重なりがないことが判明し、これはゲノム配列決定にギャップがあったことによると考えられる。
【０２６２】
７６４コンティグおよび１０９０コンティグに属するポリペプチド配列をマッピングした。この解析に基づき、適当なコード枠および可能性のある開始および停止コドンを同定した。マロニルＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードしていた断片をＰＣＲ増幅するために、下記のＰＣＲプライマーを設計した：
2004514431.tif 000039
ＰＲＯ１４０Ｆプライマーは１０９０コンティグの配列に基づいて設計し、可能性のある開始コドンの開始部に対応している。プライマー−ダイマー形成を避けるために、１２番目の塩基をＧからＣに変更した。この変更は、コドンによってコードされるアミノ酸を変更しない。ＰＲＯ１４０Ｒプライマーは７６４コンティグの配列に基づいて設計し、可能性のある停止コドンから約１ｋＢ下流に位置する領域に対応している。ＰＲＯ１４０ＵＰＦプライマーは１０９０コンティグの配列に基づいて設計し、可能性のある開始コドンの約３００塩基上流に位置する領域に対応している。
【０２６３】
ゲノムＣ．オーランチアクス ＤＮＡを得た。要するに、Ｃ．オーランチアクスを５０ｍＬ培養液中で３〜４日間培養した。細胞をペレット化し、１０ｍＭトリス溶液５ｍＬで洗浄した。次いで、ゲノムＤＮＡをジェントラゲノム「ピュアジーン」ＤＮＡ単離キット（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）と共に提供されているグラム陽性菌プロトコルを用いて単離した。細胞ペレットをジェントラ細胞懸濁液 １ｍＬに再懸濁し、これにリゾチーム１４．２ｍｇおよび２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ溶液４μＬを加えた。細胞懸濁液を３７℃で３０分間インキュベートした。沈殿したゲノムＤＮＡを３５００ｇ、２５分間の遠心分離によって回収し、１０分間風乾した。ゲノムＤＮＡを１０ｍＭトリス溶液適量に懸濁し、４℃で保存した。
【０２６４】
二つのＰＣＲ反応を、Ｃ．オーランチアクスゲノムＤＮＡを鋳型として用い、下記のとおりに計画した：
2004514431.tif 000040
【０２６５】
両ＰＣＲ反応からの産物を０．８％ＴＡＥゲル上で分離した。両ＰＣＲ反応はサイズ４．７〜５Ｋｂの産物を生成した。これはマロニルＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドをコードしうる核酸分子の予測サイズにほぼ一致していた。
【０２６６】
両ＰＣＲ反応を配列決定プライマーを用いて配列決定した
2004514431.tif 000041
。配列解析により、７６４コンティグおよび１０９０コンティグの間のギャップが明らかとなった。７６４コンティグおよび１０９０コンティグからの配列の間の核酸配列は、長さが３００塩基対よりも大きかった（図５１）。加えて、配列解析により、脱水素酵素／還元酵素型の酵素に類似性を示す３６７８塩基のＯＲＦが明らかとなった（図５２）。このＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列は長さ１２２５アミノ酸である（図５０）。また、このＯＲＦによってコードされるアミノ酸配列のＢＬＡＳＴＰ解析により、二つの短鎖脱水素酵素ドメイン（ａｄｈ型）も明らかとなった。そのような酵素はマロニルＣｏＡの３−ＨＰへの変換のために二つの還元段階を含むため、これらの結果はマロニルＣｏＡ還元酵素活性を有するポリペプチドと一致している。さらに、ポリペプチドのコンピューターによって計算したＭＷは約１３４ＫＤａと決定された。
【０２６７】
ＰＣＲをＰＲ０１４０Ｆ／ＰＲ０１４０Ｒプライマー対、Ｃ．オーランチアクスゲノムＤＮＡ、およびＰＣＲ反応＃１として前述のプロトコルを用いて行った。ＰＣＲ完了後、Ｔａｑポリメラーゼ０．２５Ｕ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）をＰＣＲ混合物に加え、次いでこれを７２℃で１０分間インキュベートした。ＰＣＲ産物をキアゲンＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いてカラム精製した。次いで、精製ＰＣＲ産物を発現ベクターｐＣＲＴ７／ＣＴに、製造者の指示どおりに（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）ＴＯＰＯクローニングした。ＴＯＰ１０Ｆ’化学的コンピテント細胞をＴＯＰＯライゲーションミックスで、製造者の指示どおりに（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）形質転換した。細胞を半時間回復させ、形質転換体をＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）プレート上で選択した。２０の単コロニーを選択し、プラスミドＤＮＡをキアゲンスピンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．、カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離した。
【０２６８】
これら２０のクローンそれぞれを、ＰＣＲにより正しい配向および正しい挿入断片サイズについて試験した。要するに、ＰＣＲ増幅においてプラスミドＤＮＡを鋳型として用い、下記の二つのプライマーを用いた：
2004514431.tif 000042
。下記のＰＣＲ反応混合物およびプログラムを用いた：
2004514431.tif 000043
【０２６９】
試験した２０のクローンのうち、一つのクローンのみが正しい挿入断片を示した（クローン＃Ｐ−１０）。ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）をＰ−１０プラスミドＤＮＡ ２μＬで、製造者の指示どおりに形質転換した。細胞を３７℃で３０分間回復させ、ＬＢ／アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）上にプレーティングした。
【０２７０】
ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／Ｐ−１０の２０ｍＬ培養物およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳの２０ｍＬ対照培養物を終夜インキュベートした。終夜培養物を接種材料として用い、二つの１００ｍＬ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／Ｐ−１０クローン培養および二つの対照株培養（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）を開始した。すべての培養物のＯＤが６００ｎｍで約０．５に達した時、これらをＩＰＴＧで誘導した。対照株培養物は１０μＭ ＩＰＴＧまたは１００μＭ ＩＰＴＧで誘導した一方で、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／Ｐ−１０クローン培養物の一つは１０μＭ ＩＰＴＧで誘導し、他の一つは１００μＭ ＩＰＴＧで誘導した。培養物を誘導後２．５時間増殖させた。誘導前とその２．５時間後に、各培養フラスコから一定量を取り、ポリペプチド発現を試験するために４〜１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離した。誘導したＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／Ｐ−１０試料において、約１３５ＫＤａの分子量を有するポリペプチドに対応するバンドが観察された。このバンドは対照株試料およびＩＰＴＧ誘導前に採取した試料には認められなかった。
【０２７１】
マロニルＣｏＡ還元酵素活性を評価するために、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／Ｐ−１０およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞を培養し、次いで８，０００×ｇの遠心分離（Ｒｏｔｏｒ ＪＡ １６．２５０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州フラートン）によって回収した。 回収後、細胞を等量の０．８５％ＮａＣｌ溶液で一回洗浄した。細胞ペレットを、５ｍＭ ＭｇＣｌ２および２ｍＭ ＤＴＴを補足した１００ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液に再懸濁した。細胞を１，０００ｐｓｉ圧（ゲージ値）でフレンチプレス細胞を二回通過させることにより破砕した。細胞片を３０，０００×ｇの遠心分離（Ｒｏｔｏｒ ＪＡ ２５．５０、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、カリフォルニア州フラートン）によって除去した。細胞抽出物を次に使用するまで４℃または氷上で維持した。
【０２７２】
対照細胞およびＩＰＴＧ誘導細胞の両方でマロニルＣｏＡ還元酵素の活性を３７℃で測定した。マロニルＣｏＡ還元酵素の活性は、前述のとおり添加したＮＡＤＰＨの消失を観察することによってモニターした。対照株の細胞抽出物では活性は認められなかったが、ＩＰＴＧ誘導したＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／Ｐ−１０細胞からの細胞抽出物はマロニルＣｏＡ還元酵素活性を示し、比活性計算値は全タンパク質１ｍｇあたり約０．０９４２μｍｏｌｅ／分であった。
【０２７３】
マロニルＣｏＡ還元酵素活性を、下記の反応を３７℃で実施して、マロニルＣｏＡからの３−ＨＰ生成を分析することによっても測定した：
2004514431.tif 000044
【０２７４】
反応を３７℃で３０分間実施した。対照反応において、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳからの細胞抽出物を全タンパク質３２２ｍｇの最終濃度まで加えた。実験反応混合物において、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ／Ｐ−１０からの細胞抽出物を全タンパク質２２６ｍｇの最終濃度まで加えた。反応混合物を次に分析するまで−２０℃で凍結した。
【０２７５】
反応混合物中の成分のクロマトグラフィによる分離を、ＨＰＸ−８７Ｈ（７．８×３００ｍｍ）有機酸ＨＰＬＣカラム（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて実施した。カラムは６０℃に維持した。移動相の組成はＨＰＬＣ等級の水をトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）でｐＨ２．５とし、流速０．６ｍＬ／分で供給した。
【０２７６】
反応試料中の３−ＨＰの検出は、ウォーターズ２６９０液体クロマトグラフ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．、マサチューセッツ州ミルフォード）と、クロマトグラフおよび単一の四重極質量分析計との間に直列に設置されたウォーターズ９９６フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）吸光度モニターからなるウォーターズ／マイクロマス ＺＱ ＬＣ／ＭＳ装置を用いて実施した。イオン化源は大気圧化学的イオン化法（Ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＡＰＣＩ）イオン化源であった。ＡＰＣＩ−ＭＳシステムのすべてのパラメーターを、３−ＨＰのプロトン化分子イオン（［Ｍ＋Ｈ］＋）の生成に基づいて最適化した。３−ＨＰを陽イオンモードで検出するために、下記のパラメーターを用いた：コロナ：１０μＡ；コーン：２０Ｖ；抽出器：２Ｖ；ＲＦレンズ：０．２Ｖ；ソース温度：１００℃；ＡＰＣＩプローブ温度：３００℃；脱溶媒ガス：５００Ｌ／時間；コーンガス：５０Ｌ／時間；低質量分解能：１５；高質量分解能：１５；イオンエネルギー：１．０；増倍管：６５０。データはｍ／ｚ＝９０．９に設定した選択的イオン検出（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｉｏｎ Ｒｅｐｏｒｔｉｎｇ）（ＳＩＲ）モードで補正した。
【０２７７】
対照反応試料および実験反応試料の両方を、ＨＰＬＣ質量分析法を用いて３−ＨＰの存在について調べた。対照試料では、３−ＨＰのピークは観察されなかったが、実験試料は３−ＨＰの保持時間および質量に一致するピークを示した。
【０２７８】
実施例１１−３−ＨＰを産生する組換え細胞の構築
グルコースからアセチルＣｏＡを介して３−ヒドロキシプロピオネートを直接生成する経路を図４４に示している。大腸菌、バチルス、および酵母などのほとんどの微生物は、グルコースから解糖およびピルビン酸脱水素酵素の作用を介してアセチルＣｏＡを産生する。グルコースから生じたアセチルＣｏＡを転用するために、二つの遺伝子、すなわち一つはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードするもの、および他の一つはマロニルＣｏＡ還元酵素をコードするものを過剰発現することが望ましい。一例として、これらの遺伝子はベクターｐＥＴ３０ａおよびｐＦＮ４７６を用い、Ｔ７プロモーターを通じて大腸菌で発現される。ベクターｐＥＴ３０ａはｐＢＲ ｏｒｉおよびカナマイシン耐性を有する一方、ｐＦＮ４７６はｐＳＣ１０１ ｏｒｉを有し、カルベニシリン耐性を選択に用いる。これら二つのベクターは互換性のｏｒｉおよび異なるマーカーを有するため、これらは大腸菌で同時に維持することができる。したがって、グルコースから３−ヒドロキシプロピオネートを直接産生するための大腸菌操作に用いられる構築物はｐＭＳＤ８（ｐＦＮ４７６／ａｃｃＡＢＣＤ）（デービスら、Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７５：２８５９３〜２８５９８、２０００）およびｐＥＴ３０ａ／マロニルＣｏＡ還元酵素またはｐＥＴ３０ａ／ａｃｃ１およびｐＦＮ４７６／マロニルＣｏＡ還元酵素である。構築物を図４５に示している。
【０２７９】
グルコースからの３−ヒドロキシプロピオネートの産生を試験するために、プラスミドｐＭＳＤ８（ｐＦＮ４７６／ａｃｃＡＢＣＤ）およびｐＥＴ３０ａ／マロニルＣｏＡ還元酵素またはｐＥＴ３０ａ／ａｃｃ１およびｐＦＮ４７６／マロニルＣｏＡ還元酵素を有する大腸菌株チューナー ｐＬａｃＩをビーブラウンバイオスタット発酵槽にて培養する。加熱のための水ジャケットを備えたガラス容器を用いてこの実験を行う。発酵槽の可使容積は１．５Ｌで、３７℃で操作する。発酵槽に１ｖｖｍの速度で滅菌空気をバブリングすることにより、酸素を継続的に供給する。撹拌は溶解酸素濃度に合わせて段階的に行い、４０％ＤＯに維持する。液体培地のｐＨは２Ｎ ＮａＯＨを用いて７に維持する。大腸菌株を１％グルコース、１μｇ／ｍＬチアミン、０．１％カザミノ酸、１０μｇ／ｍＬビオチン、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、および２５μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを補足したＭ９培地中で培養する。細胞密度が０．５ＯＤ（６００ｎｍ）に達すれば、１００μＭ ＩＰＴＧを加えることによって遺伝子の発現を誘導する。誘導後、１時間、２時間、３時間、４時間、および８時間の時点で２ｍＬ量の試料を採取する。加えて、誘導後３時間の時点で、細胞抽出物を作成するために２００ｍＬの試料を採取する。２ｍＬ試料を遠心分離にかけ、上清を用いてＬＣ／ＭＳ法により生成物を分析する。上清を次の分析まで−２０℃で保存する。
【０２８０】
細胞懸濁液２００ｍＬを８０００ｇで遠心分離し、細胞ペレットを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、および５％グリセロール５０ｍＬで洗浄して、抽出物を調製する。細胞懸濁液を８０００ｇで再度遠心分離し、ペレットを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、および５％グリセロール５ｍＬに再懸濁する。細胞を１００ｐｓｉｇでフレンチプレスを二回通過させることにより破砕した。細胞片を３０，０００ｇで２０分間の遠心分離によって除去する。操作はすべて４℃で行う。この組換え細胞抽出物を用いての３−ヒドロキシプロピオネートのインビトロ生成を示すために、下記の２００μＬの反応を３７℃で行う。反応混合物は以下のとおりである：トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０；１００ｍＭ）、ＡＴＰ（１ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（５ｍＭ）、ＫＣｌ（１００ｍＭ）、ＤＴＴ（５ｍＭ）、ＮａＨＣＯ３（４０ｍＭ）、ＮＡＤＰＨ（０．５ｍＭ）、アセチルＣｏＡ（０．５ｍＭ）、および細胞抽出物（０．２ｍｇ）。１５分後に１倍量の１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を加えることにより、反応を停止する。この反応の生成物をＬＣ／ＭＳ法を用いて検出する。
【０２８１】
上清およびインビトロ反応混合物中の３−ヒドロキシプロピオネートの存在についての検出および分析は、ウォーターズ／マイクロマス ＺＱ ＬＣ／ＭＳ装置を用いて実施する。 この装置は、ウォーターズ２６９０液体クロマトグラフと、クロマトグラフおよび単一の四重極質量分析計との間に直列に設置されたウォーターズ ２４１０屈折率検出器からなっている。ＬＣ分離は、バイオラッドアミネックス８７−Ｈイオン交換カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ８７−Ｈ ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｏｌｕｍｎ）を４５℃で用いて行う。糖、アルコール、および有機酸生成物は０．０１５％ＴＦＡ緩衝液で溶出する。溶出のために、緩衝液を流速０．６ｍＬ／分で通過させる。３−ヒドロキシプロピオネートの検出および定量のために、米国ＴＣＩ（オレゴン州ポートランド）から得た試料を標準として用いる。
【０２８２】
実施例１２　出芽酵母における発現のためのプロピオニルＣｏＡ転移酵素、ラクチルＣｏＡ脱水酵素（ＬＤＨ）、および水添加酵素（ＯＳ１９）のクローニング
乳酸を介しての３−ヒドロキシプロピオン酸の産生に関与する遺伝子のクローニングにおいて、ｐＥＳＣ酵母エピトープタギングベクターシステム（ｐＥＳＣ Ｙｅａｓｔ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州ラホイヤ）を用いた。ｐＥＳＣベクターはそれぞれＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターを反対方向に含み、各ベクターから二つの遺伝子の発現を可能にしている。ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プロモーターはグルコースによって抑制され、ガラクトースによって誘導される。四つの利用可能なｐＥＳＣベクターはそれぞれ異なる酵母選択可能マーカー（ＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３）を有しているため、複数のプラスミドを単一の菌株中で維持することができる。各クローニング領域は、発現されたタンパク質のＣ−末端またはＮ−末端エピトープタギングのための遺伝子挿入、転写終結信号、およびエピトープコード配列用のポリリンカー部位を有している。ｐＥＳＣベクターは大腸菌における複製および選択を可能にする、ＣｏｌＥ１複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子も有している。下記のベクター／プロモーター／核酸の組み合わせを構築した：
2004514431.tif 000045
用いたプロモーターは下記のとおりであった：
2004514431.tif 000046
【０２８３】
制限酵素はすべてニューイングランドバイオラボズ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、マサチューセッツ州ベバリーから入手した。プラスミドＤＮＡの調製はすべて、キアプレップスピンミニプレップキットを用いて行い、ゲル精製はすべてキアクイックゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔｓ）（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて行った。
【０２８４】
Ａ．　ｐＥＳＣ−Ｔｒｐ／ＯＳ１９水添加酵素ベクターの構築
ｐＥＳＣ−Ｔｒｐにおける二つの構築物を、Ｃ．オーランチアクス由来ＯＳ１９核酸のために作製した。これらの構築物の一つはＧＡＬ１マルチクローニング部位のＡｐａ ＩおよびＳａｌ Ｉ制限酵素部位を用い、ｃ−ｍｙｃエピトープを含むように設計された。第二の構築物は、Ａｐａ ＩおよびＫｐｎ Ｉ部位を用い、したがってｃ−ｍｙｃエピトープ配列を含んでいなかった。
【０２８５】
ｐＥＳＣ−ＴｒｐベクターＤＮＡ ６μｇを制限酵素Ａｐａ Ｉで消化し、消化物をキアクイックＰＣＲ精製カラム（ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏｌｕｍｎ）を用いて精製した。次いで、Ａｐａ Ｉで消化したベクターＤＮＡ ３μｇを制限酵素Ｋｐｎ Ｉで消化し、３μｇをＳａｌ Ｉで消化した。二重消化したベクターＤＮＡを１％ＴＡＥ−アガロースゲル上で分離し、精製し、エビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、インディアナ州インディアナポリス）で脱リン酸化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムで精製した。
【０２８６】
水添加酵素活性を有するクロロフレクサス・オーランチアクスポリペプチドをコードする核酸（ＯＳ１９）を、ゲノムＤＮＡから、ＰＣＲプライマー対ＯＳ１９ＡＰＡＦおよびＯＳ１９ＳＡＬＲならびにプライマー対ＯＳ１９ＡＰＡＦおよびＯＳ１９ＫＰＮＲを用いて増幅した。ＯＳ１９ＡＰＡＦは増幅断片の始端部にＡｐａ Ｉ制限酵素部位および翻訳開始部位（ＡＣＣＡＴＧＧ）を導入するように設計した。ＯＳ１９ＫＰＮＲプライマーは増幅断片の終端部にＫｐｎ Ｉ制限酵素部位を導入し、水添加酵素遺伝子の翻訳停止コドンを含むように設計した。ＯＳ１９ＳＡＬＲは増幅断片の終端部にＳａｌ Ｉ部位を導入し、変更された停止コドンを有するため、翻訳がベクターｃ−ｍｙｃエピトープを通じてインフレームで続く。ＰＣＲ混合物は以下を含んでいた：最終量１００μＬ中に、１×エキスパンドＰＣＲ緩衝液（Ｅｘｐａｎｄ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ）、Ｃ．オーランチアクスゲノムＤＮＡ １００ｎｇ、０．２μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、およびエキスパンドＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｘｐａｎｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）（Ｒｏｃｈｅ）５．２５単位。ＰＣＲ反応をＭＪリサーチＰＴＣ１００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＰＴＣ１００）で、以下の条件下で行った：９４℃で１分間の最初の変性；９４℃で３０秒間、５７℃で１分間、および７２℃で２．２５分間を８サイクル；９４℃で３０秒間、６２℃で１分間、および７２℃で２．２５分間を２４サイクル；ならびに７２℃で７分間の最終伸長。次いで、増幅産物を１％ＴＡＥ−アガロースゲルを用いたゲル電気泳動により分離した。ゲルから０．８Ｋｂの断片を切り出し、各プライマー対について精製した。精製した断片をＫｐｎ ＩまたはＳａｌ Ｉ制限酵素で消化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムで精製し、Ａｐａ Ｉ制限酵素で消化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムで再度精製し、ミニゲル上で定量した。
【０２８７】
水添加酵素活性を有するＣ．オーランチアクスポリペプチドをコードする核酸（ＯＳ１９）を含む、消化したＰＣＲ産物５０〜６０ｎｇ、および調製したｐＥＳＣ−Ｔｒｐベクター５０ｎｇをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で１６時間ライゲーションした。ライゲーション反応物１μＬを用いて、大腸菌エレクトロマックス（Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ）（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）細胞４０μＬを電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含むＬＢプレート（ＬＢＣ）にプレーティングした。個々のコロニーを適当なＰＣＲプライマーによるコロニーＰＣＲを用いてスクリーニングした。個々のコロニーを１０ｍＭトリス約２５μＬに懸濁し、懸濁液２μＬをＬＢＣ培地にプレーティングした。残りの懸濁液を９５℃で１０分間加熱して細菌細胞を破砕し、加熱細胞２μＬを２５μＬ ＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ混合物は以下を含んでいた：反応毎に、１×Ｔａｑ緩衝液、０．２μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１単位。用いたＰＣＲプログラムは、ゲノムＤＮＡからの核酸の増幅について前述したものと同じであった。
【０２８８】
プラスミドＤＮＡを、所望の挿入断片を有するコロニー培養物から単離し、配列決定してＰＣＲからのヌクレオチドのエラーがないことを確認した。配列を確認した構築物を、フローズンＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ Ｙｅａｓｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＩＩ Ｋｉｔ）（商標）（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州オレンジ）を用いて出芽酵母ＹＰＨ５００株に形質転換した。形質転換反応物をＳＣ−Ｔｒｐ培地にプレーティングした（培地調製法についてはストラタジーンｐＥＳＣベクター取扱説明書マニュアル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ｐＥＳＣ Ｖｅｃｔｏｒ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ）を参照されたい）。個々の酵母コロニーをコロニーＰＣＲでＯＳ１９核酸の存在についてスクリーニングした。コロニーを、ザイモリエース（ｚｙｍｏｌａｓｅ） ５単位を含むＹ溶解緩衝液（Ｙ−Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２０μＬに懸濁し、３７℃で１０分間加温した。この懸濁液３μＬを、大腸菌形質転換体のコロニースクリーニングについて記載したＰＣＲ反応混合物およびプログラムを用いての２５μＬ ＰＣＲ反応に用いた。水添加酵素アッセイ法の対照として用いるために、ｐＥＳＣ−ＴｒｐベクターもＹＰＨ５００に形質転換し、形質転換体をＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プライマーを用いてのＰＣＲによってスクリーニングした。
【０２８９】
Ｂ．　ｐＥＳＣ−Ｔｒｐ／ＯＳ１９／ＥＩ水添加酵素ベクターの構築
ＧＡＬ１０プロモーターの下流のＭ．エルスデニ Ｅ１活性化因子ポリペプチドに対する核酸挿入のために、配列を確認し、アッセイ結果が陽性であったｐＥＳＣ−Ｔｒｐ／ＯＳ１９構築物のプラスミドＤＮＡ（Ａｐａ Ｉ−Ｓａｌ Ｉ制限酵素部位）を用いた。プラスミドＤＮＡ ３μｇを制限酵素Ｃｌａ Ｉで消化し、消化物をキアクイックＰＣＲ精製カラムを用いて精製した。次いで、ベクターＤＮＡを制限酵素Ｎｏｔ Ｉで消化し、消化物を６５℃で２０分間加熱することにより不活化した。二重消化したベクターＤＮＡをエビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）で脱リン酸化し、１％ＴＡＥ−アガロースゲル上で分離し、ゲル精製した。
【０２９０】
Ｍ．エルスデニＥ１活性化因子ポリペプチドをコードする核酸を、ゲノムＤＮＡから、ＰＣＲプライマー対ＥＩＮＯＴＦおよびＥＩＣＬＡＲを用いて増幅した。ＥＩＮＯＴＦは増幅断片の始端部にＮｏｔ Ｉ制限酵素部位および翻訳開始部位を導入するように設計した。ＥＩＣＬＡＲプライマーは増幅断片の終端部にＣｌａ Ｉ制限酵素部位を導入し、ＦＬＡＧエピトープのインフレーム翻訳を可能にするための変更された翻訳停止コドンを含むように設計した。ＰＣＲ混合物は以下を含んでいた：最終量１００μＬ中に、１×エキスパンド ＰＣＲ緩衝液、Ｍ．エルスデニゲノムＤＮＡ １００ｎｇ、０．２μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、およびエキスパンドＤＮＡポリメラーゼ ５．２５単位。ＰＣＲ反応をＭＪリサーチＰＴＣ１００で、以下の条件下で行った：９４℃で１分間の最初の変性；９４℃で３０秒間、５５℃で４５秒間、および７２℃で３分間を８サイクル；９４℃で３０秒間、６２℃で４５秒間、および７２℃で３分間を２４サイクル；ならびに７２℃で７分間の最終伸長。次いで、増幅産物を１％ＴＡＥ−アガロースゲルを用いたゲル電気泳動により分離し、０．８Ｋｂの断片を切り出して精製した。精製した断片をＣｌａ Ｉ制限酵素で消化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムで精製し、Ｎｏｔ Ｉ制限酵素で消化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムで再度精製し、ミニゲル上で定量した。
【０２９１】
Ｍ．エルスデニＥ１活性化因子ポリペプチドに対する核酸を含む、消化したＰＣＲ産物６０ｎｇ、および調製したｐＥＳＣ−Ｔｒｐ／ＯＳ１９水添加酵素ベクター７０ｎｇをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で１６時間ライゲーションした。ライゲーション反応物１μＬを用いて、大腸菌エレクトロマックス（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）細胞４０μＬを電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、ＬＢＣ培地にプレーティングした。個々のコロニーをＥＩＮＯＴＦおよびＥＩＣＬＡＲプライマーによるコロニーＰＣＲを用いてスクリーニングした。個々のコロニーを１０ｍＭトリス約２５μＬに懸濁し、懸濁液２μＬをＬＢＣ培地にプレーティングした。残りの懸濁液を９５℃で１０分間加熱して細菌細胞を破砕し、加熱細胞２μＬを２５μＬ ＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ混合物は以下を含んでいた：反応毎に、１×Ｔａｑ緩衝液、０．２μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１単位。用いたＰＣＲプログラムは、ゲノムＤＮＡからの遺伝子の増幅について前述したものと同じであった。プラスミドＤＮＡを、所望の挿入断片を有するコロニー培養物から単離し、配列決定してＰＣＲからのヌクレオチドのエラーがないことを確認した。
【０２９２】
Ｃ．　ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ／ＥＩＩα／ＥＩＩβ水添加酵素ベクターの構築
ベクターｐＥＳＣ−ＬｅｕのＤＮＡ ３μｇを制限酵素Ａｐａ Ｉで消化し、消化物をキアクイックＰＣＲ精製カラムを用いて精製した。次いで、ベクターＤＮＡを制限酵素Ｓａｌ Ｉで消化し、消化物を６５℃で２０分間加熱することにより不活化した。二重消化したベクターＤＮＡをエビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）で脱リン酸化し、１％ＴＡＥ−アガロースゲル上で分離し、ゲル精製した。
【０２９３】
Ｍ．エルスデニＥ２αポリペプチドをコードする核酸を、ゲノムＤＮＡから、ＰＣＲプライマー対ＥＩＩαＡＰＡＦおよびＥＩＩａαＳＡＬＲを用いて増幅した。ＥＩＩαＡＰＡＦは増幅断片の始端部にＡｐａ Ｉ制限酵素部位および翻訳開始部位を導入するように設計した。ＥＩＩαＳＡＬＲプライマーは増幅断片の終端部にＳａｌ Ｉ制限酵素部位を導入し、ｃ−ｍｙｃエピトープのインフレーム翻訳を可能にするための変更された翻訳停止コドンを含むように設計した。ＰＣＲ混合物は以下を含んでいた：最終量１００μＬ中に、１×エキスパンド ＰＣＲ緩衝液、Ｍ．エルスデニゲノムＤＮＡ １００ｎｇ、０．２μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、およびエキスパンドＤＮＡポリメラーゼ ５．２５単位。ＰＣＲ反応をＭＪリサーチＰＴＣ１００で、以下の条件下で行った：９４℃で１分間の最初の変性；９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、および７２℃で３分間を８サイクル；９４℃で３０秒間、６２℃で１分間、および７２℃で３分間を２４サイクル；ならびに７２℃で７分間の最終伸長。次いで、増幅産物を１％ＴＡＥ−アガロースゲルを用いたゲル電気泳動により分離し、１．３Ｋｂの断片を切り出して精製した。精製した断片をＡｐａ Ｉ制限酵素で消化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムで精製し、Ｓａｌ Ｉ制限酵素で消化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムで再度精製し、ミニゲル上で定量した。
【０２９４】
Ｍ．エルスデニＥ２αポリペプチドをコードする核酸を含む、消化したＰＣＲ産物８０ｎｇ、および調製したｐＥＳＣ−Ｌｅｕベクター８０ｎｇをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で１６時間ライゲーションした。ライゲーション反応物１μＬを用いて、大腸菌エレクトロマックス（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）細胞４０μＬを電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、ＬＢＣ培地にプレーティングした。個々のコロニーをＥＩＩαＡＰＡＦおよびＥＩＩαＳＡＬＲプライマーによるコロニーＰＣＲを用いてスクリーニングした。個々のコロニーを１０ｍＭトリス約２５μＬに懸濁し、懸濁液２μＬをＬＢＣ培地にプレーティングした。残りの懸濁液を９５℃で１０分間加熱して細菌細胞を破砕し、加熱細胞２μＬを２５μＬ ＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ混合物は以下を含んでいた：反応毎に、１×Ｔａｑ緩衝液、０．２μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１単位。用いたＰＣＲプログラムは、ゲノムＤＮＡからの遺伝子の増幅について前述したものと同じであった。プラスミドＤＮＡを、所望の挿入断片を有するコロニー培養物から単離し、配列決定してＰＣＲからのヌクレオチドのエラーがないことを確認した。
【０２９５】
Ｍ．エルスデニＥ２βポリペプチドをコードする核酸挿入のために、配列を確認したｐＥＳＣ−Ｌｅｕ／ＥＩＩαベクターのプラスミドＤＮＡを用いた。プラスミドＤＮＡ ３μｇを制限酵素Ｓｐｅ Ｉで消化し、消化物をキアクイックＰＣＲ精製カラムを用いて精製した。次いで、ベクターＤＮＡを制限酵素Ｎｏｔ Ｉで消化し、１％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製した。二重消化したベクターＤＮＡをエビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）で脱リン酸化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムで精製した。
【０２９６】
Ｍ．エルスデニＥ２βポリペプチドをコードする核酸を、ゲノムＤＮＡから、ＰＣＲプライマー対ＥＩＩβＮＯＴＦおよびＥＩＩβＳＰＥＲを用いて増幅した。ＥＩＩβＮＯＴＦプライマーは増幅断片の始端部にＮｏｔ Ｉ制限酵素部位および翻訳開始部位を導入するように設計した。ＥＩＩβＳＰＥＲプライマーは増幅断片の終端部にＳｐｅ Ｉ制限酵素部位を導入し、ＦＬＡＧエピトープのインフレーム翻訳を可能にするための変更された翻訳停止コドンを含むように設計した。ＰＣＲ混合物は以下を含んでいた：最終量１００μＬ中に、１×エキスパンド ＰＣＲ緩衝液、Ｍ．エルスデニゲノムＤＮＡ １００ｎｇ、０．２μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、およびエキスパンドＤＮＡポリメラーゼ ５．２５単位。ＰＣＲ反応をＭＪリサーチＰＴＣ１００で、以下の条件下で行った：９４℃で１分間の最初の変性；９４℃で３０秒間、５５℃で４５秒間、および７２℃で３分間を８サイクル；９４℃で３０秒間、６２℃で４５秒間、および７２℃で３分間を２４サイクル；ならびに７２℃で７分間の最終伸長。増幅産物を１％ＴＡＥ−アガロースゲルを用いたゲル電気泳動により分離し、１．１Ｋｂの断片を切り出して精製した。精製した断片をＳｐｅ Ｉ制限酵素で消化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムで精製し、Ｎｏｔ Ｉ制限酵素で消化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムで再度精製し、ミニゲル上で定量した。
【０２９７】
Ｍ．エルスデニＥ２βポリペプチドをコードする核酸を含む、消化したＰＣＲ産物３８ｎｇ、および調製したｐＥＳＣ−Ｌｅｕ／ＥＩＩαベクター５０ｎｇをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で１６時間ライゲーションした。ライゲーション反応物１μＬを用いて、大腸菌エレクトロマックス（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）細胞４０μＬを電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、ＬＢＣプレート上にプレーティングした。個々のコロニーをＥＩＩβＮＯＴＦおよびＥＩＩβＳＰＥＲプライマーによるコロニーＰＣＲを用いてスクリーニングした。個々のコロニーを１０ｍＭトリス約２５μＬに懸濁し、懸濁液２μＬをＬＢＣ培地にプレーティングした。残りの懸濁液を９５℃で１０分間加熱して細菌細胞を破砕し、加熱細胞２μＬを２５μＬ ＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ混合物は以下を含んでいた：反応毎に、１×Ｔａｑ緩衝液、０．２μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１単位。用いたＰＣＲプログラムは、ゲノムＤＮＡからの遺伝子の増幅について前述したものと同じであった。
【０２９８】
プラスミドＤＮＡを、所望の挿入断片を有するコロニー培養物から単離し、配列決定してＰＣＲからのヌクレオチドのエラーがないことを確認した。配列を確認したｐＥＳＣ−Ｌｅｕ／ＥＩＩα／ＥＩＩβ構築物を、ｐＥＳＣ−Ｔｒｐ／ＯＳ１９／ＥＩベクターと共に、フローズンＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（商標）（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州オレンジ）を用いて出芽酵母ＹＰＨ５００株に同時形質転換した。形質転換反応物をＳＣ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ培地にプレーティングした。個々の酵母コロニーをコロニーＰＣＲによりＯＳ１９、Ｅ１、Ｅ２α、およびＥ２β核酸の有無についてスクリーニングした。コロニーを、ザイモリエース ５単位を含むＹ溶解緩衝液（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２０μＬに懸濁し、３７℃で１０分間加温した。この懸濁液３μＬを、大腸菌形質転換体のコロニースクリーニングについて記載したＰＣＲ反応混合物およびプログラムを用いての２５μＬ ＰＣＲ反応に用いた。ラクチルＣｏＡ脱水酵素アッセイ法の対照として用いるために、ｐＥＳＣ−Ｔｒｐ／ＯＳ１９およびｐＥＳＣ−ＬｅｕベクターもＹＰＨ５００に同時形質転換した。これらの形質転換体をＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プライマーを用いてコロニースクリーニングした（Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍａｎｕａｌ、ｐＥＳＣ Ｙｅａｓｔ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｔａｇｇｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。
【０２９９】
Ｄ．　ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨ／ＰＣＴベクターの構築
ベクターｐＥＳＣ−ＨｉｓのＤＮＡ ３μｇを制限酵素Ｘｈｏ Ｉで消化し、消化物をキアクイックＰＣＲ精製カラムを用いて精製した。次いで、ベクターＤＮＡを制限酵素Ａｐａ Ｉで消化し、１％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製した。二重消化したベクターＤＮＡをエビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）で脱リン酸化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムを用いて精製した。
【０３００】
大腸菌Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を、ＤＨ１０Ｂ株のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲプライマー対ＬＤＨＡＰＡＦおよびＬＤＨＸＨＯＲを用いて増幅した。ＬＤＨＡＰＡＦは増幅断片の始端部にＡｐａ Ｉ制限酵素部位および翻訳開始部位を導入するように設計した。ＬＤＨＸＨＯＲプライマーは増幅断片の終端部にＸｈｏ Ｉ制限酵素部位を導入し、Ｄ−ＬＤＨ遺伝子のための翻訳停止コドンを含むように設計した。ＰＣＲ混合物は以下を含んでいた：最終量１００μＬ中に、１×エキスパンド ＰＣＲ緩衝液、大腸菌ゲノムＤＮＡ １００ｎｇ、０．２μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、およびエキスパンドＤＮＡポリメラーゼ ５．２５単位。ＰＣＲ反応をＭＪリサーチ ＰＴＣ１００で、以下の条件下で行った：９４℃で１分間の最初の変性；９４℃で３０秒間、５９℃で４５秒間、および７２℃で２分間を８サイクル；９４℃で３０秒間、６４℃で４５秒間、および７２℃で２分間を２４サイクル；ならびに７２℃で７分間の最終伸長。増幅産物を１％ＴＡＥ−アガロースゲルを用いたゲル電気泳動により分離し、１．０Ｋｂの断片を切り出して精製した。精製した断片をＡｐａ Ｉ制限酵素で消化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムで精製し、Ｘｈｏ Ｉ制限酵素で消化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムで再度精製し、ミニゲル上で定量した。
【０３０１】
大腸菌Ｄ−ＬＤＨ遺伝子を含む、消化したＰＣＲ産物８０ｎｇ、および調製したｐＥＳＣ−Ｈｉｓベクター８０ｎｇをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で１６時間ライゲーションした。ライゲーション反応物１μＬを用いて、大腸菌エレクトロマックス（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）細胞４０μＬを電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、ＬＢＣ培地にプレーティングした。個々のコロニーをＬＤＨＡＰＡＦおよびＬＤＨＸＨＯＲプライマーによるコロニーＰＣＲを用いてスクリーニングした。個々のコロニーを１０ｍＭトリス約２５μＬに懸濁し、懸濁液２μＬをＬＢＣ培地にプレーティングした。残りの懸濁液を９５℃で１０分間加熱して細菌細胞を破砕し、加熱細胞２μＬを２５μＬ ＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ混合物は以下を含んでいた：反応毎に、１×Ｔａｑ緩衝液、０．２μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１単位。用いたＰＣＲプログラムは、ゲノムＤＮＡからの遺伝子の増幅について前述したものと同じであった。プラスミドＤＮＡを、所望の挿入断片を有するコロニー培養物から単離し、配列決定してＰＣＲからのヌクレオチドのエラーがないことを確認した。
【０３０２】
Ｍ．エルスデニＰＣＴポリペプチドをコードする核酸挿入のために、配列を確認したｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨ構築物のプラスミドＤＮＡを用いた。プラスミドＤＮＡ ３μｇを制限酵素Ｐａｃ Ｉで消化し、消化物をキアクイックＰＣＲ精製カラムを用いて精製した。次いで、ベクターＤＮＡを制限酵素Ｓｐｅ Ｉで消化し、１％ＴＡＥ−アガロースゲルからゲル精製した。二重消化したベクターＤＮＡをエビアルカリホスファターゼ（Ｒｏｃｈｅ）で脱リン酸化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムで精製した。
【０３０３】
Ｍ．エルスデニＰＣＴポリペプチドをコードする核酸を、ゲノムＤＮＡから、ＰＣＲプライマー対ＰＣＴＳＰＥＦおよびＰＣＴＰＡＣＲを用いて増幅した。ＰＣＴＳＰＥＦは増幅断片の始端部にＳｐｅ Ｉ制限酵素部位および翻訳開始部位を導入するように設計した。ＰＣＴＰＡＣＲプライマーは増幅断片の終端部にＰａｃ Ｉ制限酵素部位を導入し、ＰＣＴ遺伝子のための翻訳停止コドンを含むように設計した。ＰＣＲ混合物は以下を含んでいた：最終量１００μＬ中に、１×エキスパンド ＰＣＲ緩衝液、Ｍ．エルスデニゲノムＤＮＡ １００ｎｇ、０．２μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、およびエキスパンドＤＮＡポリメラーゼ ５．２５単位。ＰＣＲ反応をＭＪリサーチ ＰＴＣ１００で、以下の条件下で行った：９４℃で１分間の最初の変性；９４℃で３０秒間、５６℃で４５秒間、および７２℃で２．５分間を８サイクル；９４℃で３０秒間、６４℃で４５秒間、および７２℃で２．５分間を２４サイクル；ならびに７２℃で７分間の最終伸長。増幅産物を１％ＴＡＥ−アガロースゲルを用いたゲル電気泳動により分離し、１．５５Ｋｂの断片を切り出して精製した。精製した断片をＰａｃ Ｉ制限酵素で消化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムで精製し、Ｓｐｅ Ｉ制限酵素で消化し、キアクイックＰＣＲ精製カラムで再度精製し、ミニゲル上で定量した。
【０３０４】
Ｍ．エルスデニＰＣＴポリペプチドをコードする核酸を含む、消化したＰＣＲ産物９５ｎｇ、および調製したｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨベクター７５ｎｇをＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１６℃で１６時間ライゲーションした。ライゲーション反応物１μＬを用いて、大腸菌エレクトロマックス（商標）ＤＨ１０Ｂ（商標）細胞４０μＬを電気穿孔した。電気穿孔した細胞を、ＬＢＣプレート上にプレーティングした。個々のコロニーをＰＣＴＳＰＥＦおよびＰＣＴＰＡＣＲプライマーによるコロニーＰＣＲを用いてスクリーニングした。個々のコロニーを１０ｍＭトリス約２５μＬに懸濁し、懸濁液２μＬをＬＢＣ培地にプレーティングした。残りの懸濁液を９５℃で１０分間加熱して細菌細胞を破砕し、加熱細胞２μＬを２５μＬ ＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ混合物は以下を含んでいた：反応毎に、１×Ｔａｑ緩衝液、０．２μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１単位。用いたＰＣＲプログラムは、ゲノムＤＮＡからの遺伝子の増幅について前述したものと同じであった。
【０３０５】
プラスミドＤＮＡを、所望の挿入断片を有するコロニー培養物から単離し、配列決定してＰＣＲからのヌクレオチドのエラーがないことを確認した。配列を確認した構築物を、フローズンＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（商標）（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州オレンジ）を用いて出芽酵母ＹＰＨ５００株に形質転換した。形質転換反応物をＳＣ−Ｈｉｓ培地にプレーティングした。個々の酵母コロニーをコロニーＰＣＲによりＤ−ＬＤＨおよびＰＣＴ遺伝子の有無についてスクリーニングした。コロニーを、ザイモリエース ５単位を含むＹ溶解緩衝液（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）２０μＬに懸濁し、３７℃で１０分間加温した。次いで、この懸濁液３μＬを、大腸菌形質転換体のコロニースクリーニングについて記載したＰＣＲ反応混合物およびプログラムを用いての２５μＬ ＰＣＲ反応に用いた。アッセイ対照として用いるために、ｐＥＳＣ−ＨｉｓベクターもＹＰＨ５００に形質転換し、形質転換体をＧＡＬ１およびＧＡＬ１０プライマーを用いてのＰＣＲによりスクリーニングした。
【０３０６】
実施例１３−出芽酵母における酵素の発現
Ａ．　形質転換酵母における水添加酵素活性
ｐＥＳＣ−Ｔｒｐ／ＯＳ１９構築物またはｐＥＳＣ−Ｔｒｐベクター（陰性対照）を有する個々のコロニーを用いて、２％グルコースを含むＳＣ−Ｔｒｐ培地の５ｍＬ培養物に接種した。これらの培養物を３０℃で１６時間増殖させ、同じ培地３５ｍＬに接種するために用いた。継代培養物を３０℃で７時間増殖させ、ＯＤ６００を求めた。ＯＤ×体積が４０となる量の細胞をペレット化し、炭素源を含まないＳＣ−Ｔｒｐ培地で洗浄し、再度ペレット化した。細胞を２％ガラクトースを含むＳＣ−Ｔｒｐ培地５ｍＬに懸濁し、全量１００ｍＬのこの培地に接種するために用いた。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで１７．５時間増殖させた。次いで、細胞をペレット化し、０．８５％ＮａＣｌ中で洗浄し、再度ペレット化した。細胞ペレット（７０ｍｇ）を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５ １４０μＬに懸濁し、等量（ペレットプラス緩衝液）のあらかじめ洗浄したガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ、１５０〜２１２μｍ）を加えた。この混合物を３０秒間ボルテックスにかけ、氷上に１分間置き、ボルテックス／冷却サイクルをさらに８回繰り返した。次いで、細胞を５，０００ｇで６分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。ビーズ／ペレットを緩衝液２５０μＬで二回洗浄し、遠心分離し、上清を最初の上清と合わせた。
【０３０７】
前述のｐＥＴＢｌｕｅ−１／ＯＳ１９構築物を有する大腸菌株を、水添加酵素アッセイ法の陽性対照として用いた。この菌株の培養物を飽和するまで終夜増殖させ、次の朝、新鮮ＬＢＣ培地で１：２０に希釈した。培養物を３７℃、２５０ｒｐｍでＯＤ６００が０．６になるまで増殖させ、この時点で、培養物を最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。培養物を３７℃、２５０ｒｐｍでさらに２時間インキュベートした。細胞をペレット化し、０．８５％ＮａＣｌ中で洗浄し、再度ペレット化した。細胞をバクバスタータンパク質抽出試薬（ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ）（商標）およびベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）（登録商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を製造者の指示どおりに用い、室温で２０分間インキュベートして破砕した。１６，０００ｇ、４℃で遠心分離した後、上清を新しいチューブに移し、活性アッセイ法に用いた。
【０３０８】
前述の出芽酵母から得た細胞抽出物の全タンパク質含量を、マイクロプレートバイオラッドタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて定量した。ＹＰＨ５００中のＯＳ１９構築物（Ａｐａ Ｉ−Ｓａｌ ＩおよびＡｐａ Ｉ−Ｋｐｎ Ｉ部位両方）、ＹＰＨ５００中のｐＥＳＣ−Ｔｒｐ陰性対照、および大腸菌中のｐＥＴＢｌｕｅ−１／ＯＳ１９構築物を、それらがアクリリルＣｏＡを３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡに変換する能力について試験した。アッセイ法は、大腸菌チューナー株中のｐＥＴＢｌｕｅ−１／ＯＳ１９構築物について前述したとおりに実施した。陰性対照株の細胞抽出物を、アクリリルＣｏＡを含む反応混合物に加えた場合、一つのＭＷ８２３の主ピークが認められた。このピークはアクリリルＣｏＡに対応し、アクリリルＣｏＡがいかなる他の生成物にも変換されなかったことを示している。ｐＥＳＣ−Ｔｒｐ／ＯＳ１９構築物（Ａｐａ Ｉ−Ｓａｌ ＩまたはＡｐａ Ｉ−Ｋｐｎ Ｉ部位いずれか）を有する菌株の細胞抽出物を反応混合物に加えた場合、主ピークはＭＷ８４１にシフトし、これは３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡに対応している。大腸菌対照からの反応混合物も、ＭＷ８４１のピークを示した。経時試験をｐＥＳＣ−Ｔｒｐ／ＯＳ１９（Ａｐａ Ｉ−Ｓａｌ Ｉ）構築物について実施し、反応時間０分、１分、３分、７分、１５分、３０分、および６０分後のＭＷ８４１およびＭＷ８２３のピークの出現を測定した。この構築物および大腸菌対照両方からの細胞抽出物で、３−ヒドロキシプロピオニル−ＣｏＡピークの増加が経時的に認められたが、ベクターだけのＹＰＨ５００株からの細胞抽出物は、アクリリルＣｏＡの主ピークのみを示した。
【０３０９】
Ｂ．　形質転換酵母におけるプロピオニルＣｏＡ転移酵素活性
ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨもしくはｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨ／ＰＣＴ構築物または挿入断片を含まないｐＥＳＣ−Ｈｉｓベクター（陰性対照）を有する出芽酵母ＹＰＨ５００株の個々のコロニーを用いて、２％グルコースを含むＳＣ−Ｈｉｓ培地の５ｍＬ培養物に接種した。これらの培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで１６時間増殖させ、次いで同じ培地３５ｍＬに接種するために用いた。継代培養物を３０℃で７時間増殖させ、ＯＤ６００を求めた。各株について、ＯＤ×体積が４０となる量の細胞をペレット化し、炭素源を含まないＳＣ−Ｈｉｓ培地で洗浄し、再度ペレット化した。細胞を２％ガラクトースを含むＳＣ−Ｈｉｓ培地５ｍＬに懸濁し、全量１００ｍＬのこの培地に接種するために用いた。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで１６．７５時間増殖させた。次いで、細胞をペレット化し、０．８５％ＮａＣｌ中で洗浄し、再度ペレット化した。細胞ペレット（７０ｍｇ）を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５ １４０μＬに懸濁し、等量（ペレットプラス緩衝液）のあらかじめ洗浄したガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ、１５０〜２１２μｍ）を加えた。この混合物を３０秒間ボルテックスにかけ、氷上に１分間置き、ボルテックス／冷却サイクルをさらに８回繰り返した。次いで、細胞を５，０００ｇで６分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。ビーズ／ペレットを緩衝液２５０μＬで二回洗浄して遠心分離し、上清を最初の上清と合わせた。
【０３１０】
前述のｐＥＴＢｌｕｅ−１／ＰＣＴ構築物を有する大腸菌株を、プロピオニルＣｏＡ転移酵素アッセイ法の陽性対照として用いた。この菌株の培養物を飽和するまで終夜増殖させ、次の朝、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含む新鮮ＬＢ培地で１：２０に希釈した。培養物を３７℃、２５０ｒｐｍでＯＤ６００が０．６になるまで増殖させ、この時点で、培養物を最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。培養物を３７℃、２５０ｒｐｍでさらに２時間インキュベートした。細胞をペレット化し、０．８５％ＮａＣｌ中で洗浄し、再度ペレット化した。細胞をバクバスタータンパク質抽出試薬（商標）およびベンゾナーゼ（登録商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を製造者の指示どおりに用い、室温で２０分間インキュベートして破砕した。１６，０００ｇ、４℃で遠心分離した後、上清を新しいチューブに移し、活性アッセイ法に用いた。
【０３１１】
細胞抽出物の全タンパク質含量を、マイクロプレートバイオラッドタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて定量した。出芽酵母ＹＰＨ５００株中のＤ−ＬＤＨおよびＤ−ＬＤＨ／ＰＣＴ構築物、ＹＰＨ５００中のｐＥＳＣ−Ｈｉｓ陰性対照、および大腸菌中のｐＥＴＢｌｕｅ−１／ＰＣＴ構築物を、それらがプロピオニルＣｏＡおよびアセテートのアセチルＣｏＡおよびプロピオネートへの変換を触媒する能力について試験した。用いたアッセイ混合物は、大腸菌チューナー株中のｐＥＴＢｌｕｅ−１／ＰＣＴ構築物について前述したものであった。
【０３１２】
陰性対照株またはＹＰＨ５００／ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨ株の全細胞抽出タンパク質１μｇを反応混合物に加えた場合、１１分間で吸光度の上昇は見られなかった（０．００から０．００）。ＹＰＨ５００／ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨ／ＰＣＴ株および大腸菌／ＰＣＴ株からの細胞抽出タンパク質１μｇでは、それぞれ０．００から０．０４および０．００から０．０６への吸光度の上昇が見られた。全細胞抽出タンパク質２ｍｇでは、陰性対照株およびＹＰＨ５００／ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨ株は１１分間で０．００から０．０１への吸光度の上昇を示したが、ＹＰＨ５００／ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨ／ＰＣＴ株および大腸菌／ＰＣＴ株ではそれぞれ０．００から０．１０および０．００から０．０８への上昇が認められた。
【０３１３】
Ｃ．　形質転換酵母におけるラクチルＣｏＡ脱水酵素活性
ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨもしくはｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨ／ＰＣＴ構築物または挿入断片を含まないｐＥＳＣ−Ｈｉｓベクター（陰性対照）を有する出芽酵母ＹＰＨ５００株の個々のコロニーを用いて、４％グルコースを含むＳＣ−Ｈｉｓ培地の５ｍＬ培養物に接種した。これらの培養物を３０℃で２３時間増殖させ、２％ラフィノースを含むＳＣ−Ｈｉｓ培地３５ｍＬに接種するために用いた。継代培養物を３０℃で８時間増殖させ、ＯＤ６００を求めた。各株について、ＯＤ×体積が４０となる量の細胞をペレット化し、２％ガラクトースを含むＳＣ−Ｈｉｓ培地１０ｍＬに再懸濁し、全量１００ｍＬのこの培地に接種するために用いた。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで１７時間増殖させた。次いで、細胞をペレット化し、０．８５％ＮａＣｌ中で洗浄し、再度ペレット化した。細胞ペレット（１９０ｍｇ）を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５ ３８０μＬに懸濁し、等量（ペレットプラス緩衝液）のあらかじめ洗浄したガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ、１５０〜２１２μｍ）を加えた。この混合物を３０秒間ボルテックスにかけ、氷上に１分間置き、ボルテックス／冷却サイクルをさらに７回繰り返した。次いで、細胞を５，０００ｇで６分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。ビーズ／ペレットを緩衝液３００μＬで二回洗浄して遠心分離し、上清を最初の上清と合わせた。
【０３１４】
大腸菌ＤＨ１０Ｂ株の嫌気的培養物を、Ｄ−ＬＤＨアッセイ法の陽性対照として用いた。この菌株の培養物を飽和するまで終夜増殖させ、次の朝、新鮮ＬＢ培地で１：２０に希釈した。培養物を３７℃で７．５時間嫌気的に増殖させた。細胞をペレット化し、０．８５％ＮａＣｌ中で洗浄し、再度ペレット化した。細胞をバクバスタータンパク質抽出試薬（商標）およびベンゾナーゼ（登録商標）（Ｎｏｖａｇｅｎ）を製造者の指示どおりに用い、室温で２０分間インキュベートして破砕した。１６，０００ｇ、４℃で遠心分離した後、上清を新しいチューブに移し、活性アッセイ法に用いた。
【０３１５】
細胞抽出物の全タンパク質含量を、マイクロプレートバイオラッドタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を用いて定量した。ＹＰＨ５００中のＤ−ＬＤＨおよびＤ−ＬＤＨ／ＰＣＴ構築物、ＹＰＨ５００中のｐＥＳＣ−Ｈｉｓ陰性対照、および嫌気的に培養した大腸菌株を、それらがピルベートのラクテートへの変換を触媒する能力について、同時に起こるＮＡＤＰＨのＮＡＤへの変換をアッセイすることにより試験した。アッセイ混合物は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５、０．２ｍＭ ＮＡＤＨ、および０．５〜１．０μｇの細胞抽出物を含んでいた。反応を、ピルビン酸ナトリウムを最終濃度５ｍＭまで加えることによって開始し、３４０ｎｍの吸光度の低下を１０分間測定した。陰性対照株の全細胞抽出タンパク質０．５μｇを加えた場合、２００秒間で−０．０１から−０．０２への吸光度の低下が見られた。ＹＰＨ５００／ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨまたはＹＰＨ５００／ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨ／ＰＣＴ株からの細胞抽出物では、２００秒間でそれぞれ−０．２１から−０．４７および−０．２０から−０．４７への吸光度の低下が見られた。嫌気的に培養した大腸菌株からの細胞抽出物０．５μＬ（７．８５μｇ）は、ＹＰＨ５００／ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨ／ＰＣＴ株の細胞抽出物１μｇと非常に類似した吸光度の低下を示した。細胞抽出物４μｇを用いた場合、ＹＰＨ５００／ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨ／ＰＣＴ株は１０分間で−０．１８から−０．６０への吸光度の低下を示したが、陰性対照株は吸光度の低下を示さなかった（−０．０８から−０．０８）。
【０３１６】
Ｄ．　出芽酵母における３−ＨＰ産生の証明
ｐＥＳＣ−Ｔｒｐ／ＯＳ１９／ＥＩ、ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ／ＥＩＩａ／ＥＩＩＢ、およびｐＥＳＣ−Ｈｉｓ／Ｄ−ＬＤＨ／ＰＣＴ構築物を、フローズンＥＺ酵母形質転換ＩＩキット（商標）（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州オレンジ）を用いて出芽酵母ＹＰＨ５００の単一株に同時形質転換した。陰性対照株も、ｐＥＳＣ−Ｔｒｐ、ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ、およびｐＥＳＣ−ＨｉｓベクターのＹＰＨ５００株への形質転換によって発生させた。形質転換反応物をＳＣ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ培地にプレーティングした。個々の酵母コロニーを、各構築物に対応する核酸の有無についてコロニーＰＣＲによってスクリーニングした。
【０３１７】
六つの遺伝子すべてを有する株および陰性対照株を、２％グルコースを含むＳＣ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ培地５ｍＬ中で培養した。これらの培養物を３０℃で３１時間増殖させ、２ｍＬを用いて同じ培地５０ｍＬに接種した。継代培養物を３０℃で１９時間増殖させ、ＯＤ６００を求めた。各株について、ＯＤ×体積が１００となる量の細胞をペレット化し、炭素源を含まないＳＣ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ培地で洗浄し、再度ペレット化した。細胞を２％ガラクトースおよび２％ラフィノースを含むＳＣ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ培地１０ｍＬに懸濁し、全量２５０ｍＬのこの培地に接種するために用いた。培養物を３０℃のボトル中で振盪せずに増殖させ、試料を０時間、４．５時間、２０時間、２８．５時間、および７０時間の時点で採取した。試料を遠心沈降にかけて細胞を除去し、上清を０．４５μｍのアクロディスクシリンジフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ Ｓｙｒｉｇｅ Ｆｉｌｔｅｒｓ） （Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ミシガン州アンアーバー）を用いてろ過した。
【０３１８】
ろ過したブロス１００マイクロリットルを用いて、精製プロピオニルＣｏＡ転移酵素６マイクログラム、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、および１ｍＭアセチルＣｏＡによりブロス中のいかなる乳酸または３−ＨＰのＣｏＡエステルをも誘導した。反応を室温で１５分間進行させ、１倍量の１０％トリフルオロ酢酸を加えることによって停止した。反応混合物をセプパック Ｃ１８カラムを前述のとおりに用いて精製し、ＬＣ／ＭＳで分析した。
【０３１９】
実施例１４　β−アラニンから有機酸を産生する生合成経路の構築
β−アラニンから３−ＨＰへの可能性のある一つの経路は、ＣｏＡ転移酵素活性を有するポリペプチド（例えば、ＣｏＡ基を一つの代謝物から他の代謝物に転移させる酵素類からの酵素）の使用を含む。図５４に示すとおり、β−アラニンは、ＣｏＡ転移酵素活性を有するポリペプチドおよびアセチルＣｏＡまたはプロピオニルＣｏＡなどのＣｏＡ供与体を用いてβ−アラニル−ＣｏＡに変換することができる。または、β−アラニル−ＣｏＡは、ＣｏＡ合成酵素活性を有するポリペプチドの作用によって生成することもできる。β−アラニル−ＣｏＡは、β−アラニル−ＣｏＡアンモニア脱離酵素活性を有するポリペプチドにより脱アミノ化してアクリリルＣｏＡを生成することができる。３−ＨＰ−ＣｏＡを生成するためのアクリリルＣｏＡのβ位での水添加は、３−ＨＰ−ＣｏＡ脱水酵素活性を有するポリペプチドによって実施することができる。３−ＨＰ−ＣｏＡは、β−アラニンのＣｏＡ供与体としてはたらくことができ、ＣｏＡ転移酵素活性を有するポリペプチドによって触媒されうる反応はしたがって、生成物として３−ＨＰを生ずる。または、特定のＣｏＡ加水分解酵素活性を有するポリペプチドにより、３−ＨＰ−ＣｏＡを加水分解して３−ＨＰを生成することもできる。
【０３２０】
ＣｏＡ転移酵素活性を有するポリペプチドの単離、配列決定、発現、および活性試験法は本明細書に記載されている。
【０３２１】
Ａ．　β−アラニル−ＣｏＡアンモニア脱離酵素活性を有するポリペプチドの単離
β−アラニル−ＣｏＡアンモニア脱離酵素活性を有するポリペプチドは、β−アラニル−ＣｏＡのアクリリルＣｏＡへの変換を触媒することができる。そのようなポリペプチドの活性がクロストリジウム・プロピオニクムにおいてベイジロス（Ｖａｇｅｌｏｓ）ら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２３４：４９０〜４９７（１９５９））によって記載されている。このポリペプチドをプロピオン酸を産生するためにクロストリジウム・プロピオニクムにおけるアクリレート経路の一部として用いることができる。
【０３２２】
Ｃ．プロピオニクムを、０．２％酵母抽出物、０．２％トリプチケースペプトン、０．０５％システイン、０．５％ｂ−アラニン、０．４％ＶＲＢ−塩、５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０を含む無酸素培地中３７℃で培養した。１２時間後に細胞を回収し、５０ｍＭリン酸カリウム（Ｋｐｉ）、ｐＨ７．０で二回洗浄した。湿パック細胞約２ｇをＫｐｉ ４０ｍＬ、ｐＨ７．０、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１ｍＭ ＤＴＴ（緩衝液Ａ）４０ｍＬに再懸濁し、３ｍｍチップ（Ｂｒａｎｓｏｎ ｓｏｎｉｆｉｅｒ ２５０）を用いた約８５〜１００Ｗでの超音波処理によりホモジナイズした。細胞片を、セントリコンＴ−１０８０超遠心分離機（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ Ｔ−１０８０ Ｕｌｔｒａ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）で、１００，０００ｇ、４５分間の遠心分離によって除去し、無細胞抽出物（活性約１１０Ｕ／ｍｇ）をソース−１５Ｑ−マテリアル（Ｓｏｕｒｃｅ−１５Ｑ−ｍｅｔｅｒｉａｌ）上のアニオン交換クロマトグラフィにかけた。ソース−１５Ｑカラムに無細胞抽出物３２ｍＬを添加した。カラムをカラムの１０倍量以内の０Ｍから０．５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配によって展開した。ポリペプチドは７０〜１１０ｍＭ ＮａＣｌの間で溶出した。
【０３２３】
溶液を１Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４の最終濃度に調節し、緩衝液Ａ中１Ｍ （ＮＨ４）２ＳＯ４で平衡化しリソース−Ｐｈｅ（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ−Ｐｈｅ）カラムに添加した。ポリペプチドはこのカラムに結合しなかった。
【０３２４】
アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）チャンバー（フィルターカットオフ３０ｋＤａ）での濃縮後に最終調製物を得た。機能性ポリペプチドは、それぞれ１６ｋＤａの分子質量を有する四つのポリペプチドサブユニットからなっていた。ポリペプチドは標準アッセイ法（下記参照）で１０３３Ｕ／ｍｇの最終比活性を有していた。
【０３２５】
すべての精製段階後のポリペプチド試料を、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。ゲルを０．１％クーマシーＲ２５０で染色し、７．１％酢酸／５％エタノール溶液を用いて脱染色を行った。
【０３２６】
ポリペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣで脱塩し、気相エドマン分解によるＮ−末端配列決定にかけた。この解析の結果から、３５アミノ酸のポリペプチドＮ−末端配列が得られた。配列は下記のとおりであった：
2004514431.tif 000047
【０３２７】
Ｂ．　遺伝子断片の増幅
β−アラニル−ＣｏＡアンモニア脱離酵素活性を有するポリペプチドの３５アミノ酸配列を用いて、Ｃ．プロピオニクムのゲノム由来の対応するＤＮＡを増幅するためのプライマーを設計した。Ｃ．プロピオニクム由来のゲノムＤＮＡを、ジェントラゲノムＤＮＡ単離キット（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス）をグラム陽性菌のためのゲノムＤＮＡプロトコルどおりに用いて単離した。クロストリジウム・プロピオニクムのコドン使用頻度表を用いて、アミノ酸配列のいずれかの末端の７アミノ酸を逆翻訳し、２０−ヌクレオチド変性プライマーを得た：
2004514431.tif 000048
【０３２８】
これらのプライマーを、１×Ｔａｑ ＰＣＲ緩衝液、０．６μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、インディアナ州インディアナポリス）２単位、２．５体積％ＤＭＳＯ、およびゲノムＤＮＡ １００ｎｇを含む５０μＬのＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲは、アニーリング温度５８℃で４サイクル、５６℃で４サイクル、５４℃で４サイクル、および５２℃で２４サイクルのタッチダウンＰＣＲプログラムを用いて実施した。各サイクルは９４℃で３０秒の最初の変性段階、および７２℃で１．２５分の伸長を用い、プログラムには９４℃で２分間の最初の変性段階および７２℃で５分間の最終伸長が含まれていた。反応に用いたＰＣＲプライマーの量は、プライマーの３’末端の縮重の量に応じて、典型的なＰＣＲの量よりも３倍増量した。加えて、それぞれ個々のプライマーを含む別々のＰＣＲ反応を行って、単一の変性プライマーから生じるＰＣＲ産物を同定した。各ＰＣＲ産物２０μＬを、２．０％ＴＡＥ（トリス−酢酸−ＥＤＴＡ）アガロースゲル上で分離した。
【０３２９】
順方向および逆方向両方のプライマーを含む反応によって、約１００ｂｐのバンドが生じたが、個々の順方向および逆方向プライマー対照反応では認められなかった。この断片を切り出し、キアクイックゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製した。精製したバンド４マイクロリットルをｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにライゲーションし、ＴＯＰＯクローニング法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いてＴＯＰ１０大腸菌細胞に熱ショック法により形質転換した。形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび５０μｇ／ｍＬの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−Ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ）を含むＬＢ培地上にプレーティングした。個々の白色コロニーを１０ｍＭトリス２５μＬに再懸濁し、９５℃で１０分間加熱して細菌細胞を破砕した。加熱細胞２μＬを、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターに相同性のＭ１３ＲおよびＭ１３Ｆ汎用プライマーを用いての２５μＬ ＰＣＲ反応に用いた。ＰＣＲ混合物は以下を含んでいた：反応毎に、１×Ｔａｑ ＰＣＲ緩衝液、０．２μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、およびＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ１単位。ＰＣＲ反応をＭＪリサーチＰＴＣ１００で、以下の条件下で行った：９４℃で２分間の最初の変性；９４℃で３０秒間、５２℃で１分間、および７２℃で１．２５分間を３０サイクル；ならびに７２℃で７分間の最終伸長。所望の挿入断片を示すコロニーの培養物からプラスミドＤＮＡを得（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、Ｍ１３Ｒ汎用プライマーを用いたＤＮＡ配列決定に用いた。下記の核酸配列は変性プライマーの内部で、３５アミノ酸残基配列の部分に対応している：
2004514431.tif 000049
【０３３０】
Ｃ．　完全なコード配列を得るためのゲノムウォーキング
上流および下流両方向のゲノムウォーキングを行うためのプライマーを、変性プライマー内部の核酸配列の一部を用いて設計した。プライマーの配列は下記のとおりであった：
2004514431.tif 000050
【０３３１】
ＧＳＰ１ＦおよびＧＳＰ２Ｆは下流向きのプライマーで、ＧＳＰ１ＲおよびＧＳＰ２Ｒは上流向きのプライマーであり、ＧＳＰ２ＦおよびＧＳＰ２ＲはそれぞれＧＳＰ１ＦおよびＧＳＰ１Ｒの内側に入れ子状態である。ゲノムウォーキングライブラリを、制限酵素Ｄｒａ Ｉ、ＥｃｏＲ Ｖ、およびＰｖｕ ＩＩに加えてＳｓｐ ＩおよびＨｉｎｃ ＩＩを用いた以外は、クロンテック（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）のユニバーサルゲノムウォーキングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州パロアルト）のマニュアルに従って構築した。ＰＣＲをパーキンエルマー９７００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９７００ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）で、下記の反応混合物を用いて行った：反応物５０μＬ中に、１×ＸＬ緩衝液ＩＩ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、１．２５ｍＭ Ｍｇ（ＯＡｃ）２、０．２μＭの各プライマー、ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼＸＬ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）２単位、およびライブラリ１μＬ。第一ラウンドＰＣＲは、９４℃で５秒間の最初の変性；９４℃で２秒間および７２℃で３分間からなる７サイクル；９４℃で２秒間および６４℃で３分間からなる３２サイクル；ならびに６４℃で４分間の最終伸長を用いた。第二ラウンドＰＣＲは、９４℃で１５秒間の最初の変性；９４℃で５秒間および７０℃で３分間からなる５サイクル；９４℃で５秒間および６４℃で３分間からなる２６サイクル；ならびに６６℃で７分間の最終伸長を用いた。第一および第二ラウンド産物各２０μＬを１％ＴＡＥアガロースゲル上で泳動した。順方向反応の第二ラウンドＰＣＲにおいて、Ｄｒａ Ｉでは１．４Ｋｂのバンドが得られ、Ｈｉｎｃ ＩＩでは１．５Ｋｂのバンド、Ｐｖｕ ＩＩでは４．０Ｋｂのバンド、ならびにＳｓｐ Ｉでは２．０および２．２Ｋｂのバンドが得られた。逆方向反応の第二ラウンドＰＣＲにおいて、Ｄｒａ Ｉでは１．５Ｋｂのバンドが得られ、ＥｃｏＲ Ｖでは０．８Ｋｂのバンド、Ｈｉｎｃ ＩＩでは２．０Ｋｂのバンド、Ｐｖｕ ＩＩでは２．９Ｋｂのバンド、およびＳｓｐ Ｉでは１．５Ｋｂのバンドが得られた。これらの断片のいくつかをゲル精製し、クローニングし、配列決定した。
【０３３２】
β−アラニル−ＣｏＡアンモニア脱離酵素活性を有するポリペプチドのコード配列を配列番号：１６２に示す。このコード配列は配列番号：１６０に示すアミノ酸配列をコードする。コード配列をクローニングし、細菌細胞内で発現させた。予想されたサイズのポリペプチドを単離し、酵素活性を試験した。
【０３３３】
３−ＨＰ−ＣｏＡ脱水酵素活性（例えば、図５４の第七の酵素活性で、配列番号：４１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドによって達成することができる）を有するポリペプチドをコードする核酸分子の単離は、本明細書に記載されている。このポリペプチドをＣｏＡ転移酵素活性を有するポリペプチド（例えば、配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド）およびβ−アラニル−ＣｏＡアンモニア脱離酵素活性を有するポリペプチド（例えば、配列番号：１６０に示すアミノ酸配列を有するポリペプチド）と組み合わせることにより、β−アラニンから３−ＨＰを製造する一方法が提供される。
【０３３４】
実施例１５　β−アラニンから有機酸を産生する生合成経路の構築
もう一つの経路において、アスパルテートから生じたβ−アラニンを、４，４−アミノ酪酸アミノ基転移酵素活性を有するポリペプチドによって脱アミノ化することができる（図５５）。この反応はアスパルテートの生成中に消費されるグルタメートを再生成することもできる。β−アラニンの脱アミノ化はマロン酸セミアルデヒドを生成することができ、これは３−ヒドロキシプロピオン酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドまたは３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドによって３−ＨＰへとさらに還元することができる。そのようなポリペプチドは下記のとおりに得ることができる。
【０３３５】
Ａ．　Ｃ．アセトブチシリクム由来のｇａｂＴ（４−アミノ酪酸アミノ基転移酵素）のクローニング
下記のＰＣＲプライマーを、クロストリジウム・アセトブチシリクム由来のｇａｂＴ遺伝子（ゲンバンク＃ＡＥ００７６５４）について報告されている配列に基づき設計した：
2004514431.tif 000051
【０３３６】
このプライマーは５’末端にＮｃｏ Ｉ部位および３’末端にＢａｍＨ Ｉ部位を導入した。ＰＣＲ反応を、Ｃ．アセトブチシリクム由来染色体ＤＮＡを鋳型として用いて計画した。
【０３３７】
2004514431.tif 000052
【０３３８】
アガロースゲル解析後、サイズ約１．３Ｋｂの単一のバンドが観察された。この断片をキアクイックＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、ＴＯＰＯゼロブラントＰＣＲクローニングキット（ＴＯＰＯ Ｚｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いてｐＣＲＩＩ ＴＯＰＯにクローニングした。ｐＣＲＩＩ ＴＯＰＯライゲーション混合物１μＬを用いて化学的コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞を形質転換した。細胞をＳＯＣ培地中に１時間置き、形質転換体をＬＢ／カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）プレート上で選択した。ＬＢ／カナマイシン培地中で終夜培養した形質転換体の単コロニー、およびプラスミドＤＮＡをミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて抽出した。スーパーコイルプラスミドＤＮＡを１％アガロースゲル上で分離して消化し、挿入断片を含むコロニーを選択した。挿入断片を配列決定して、配列およびその品質を確認した。
【０３３９】
正しい挿入断片を有するプラスミドを制限酵素Ｎｃｏ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで消化した。消化した挿入断片をゲル単離し、同じくＮｃｏ ＩおよびＢａｍＨ Ｉ酵素で消化したｐＥＴ２８ｂ発現ベクターにライゲーションした。ライゲーション混合物１μＬを用いて、化学的コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞を形質転換した。細胞をＳＯＣ培地中で１時間回復させ、形質転換体をＬＢ／カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）プレート上で選択した。スーパーコイルプラスミドＤＮＡを１％アガロースゲル上で分離して消化し、挿入断片を含むコロニーを選択した。挿入断片を含むプラスミドをミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離し、このプラスミドＤＮＡ １μＬを用いて、電気的コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）を形質転換した。これらの細胞を用いて、４−アミノ酪酸アミノ基転移酵素活性を有するポリペプチドの発現をチェックした。
【０３４０】
Ｂ．　緑膿菌（Ｐ． ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のｍｍｓＢ（３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素）のクローニング
下記のＰＣＲプライマーを、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）由来のｍｍｓＢ遺伝子（ゲンバンク＃Ｍ８４９１１）について報告されている配列に基づき設計した：
2004514431.tif 000053
【０３４１】
このプライマーは５’末端にＮｄｅ Ｉ部位および３’末端にＢａｍＨ Ｉ部位を導入した。
2004514431.tif 000054
【０３４２】
ＰＣＲ反応を、緑膿菌由来染色体ＤＮＡを鋳型として用いて計画した。染色体ＤＮＡはＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）緑膿菌１７９３３Ｄから得た。
【０３４３】
アガロースゲル解析後、サイズ約１．６Ｋｂの単一のバンドが観察された。この断片をキアクイックＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて精製し、ＴＯＰＯゼロブラントＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバッド）を用いてｐＣＲＩＩ ＴＯＰＯにクローニングした。ｐＣＲＩＩ ＴＯＰＯライゲーション混合物１μＬを用いて化学的コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞を形質転換した。細胞をＳＯＣ培地中で１時間回復させ、形質転換体をＬＢ／カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）プレート上で選択した。ＬＢ／カナマイシン培地中で終夜培養した形質転換体の単コロニー、およびプラスミドＤＮＡをミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて抽出した。スーパーコイルプラスミドＤＮＡを１％アガロースゲル上で分離して消化し、挿入断片を含むコロニーを選択した。挿入断片を配列決定して、配列およびその品質を確認した。
【０３４４】
正しい挿入断片を有するプラスミドを制限酵素Ｎｄｅ ＩおよびＢａｍＨ Ｉで消化した。消化した挿入断片をゲル単離し、同じくＮｄｅ ＩおよびＢａｍＨ Ｉ酵素で消化したｐＥＴ３０ａ発現ベクターにライゲーションした。ライゲーション混合物１μＬを用いて、化学的コンピテントＴＯＰ１０大腸菌細胞を形質転換した。細胞をＳＯＣ培地中で１時間回復させ、形質転換体をＬＢ／カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）プレート上で選択した。スーパーコイルプラスミドＤＮＡを１％アガロースゲル上で分離して消化し、挿入断片を含むコロニーを選択した。挿入断片を含むプラスミドをミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州バレンシア）を用いて単離し、このプラスミドＤＮＡ １μＬを用いて、電気的コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ、ウィスコンシン州マディソン）を形質転換した。これらの細胞を用いて、３−ヒドロキシイソ酪酸脱水素酵素活性を有するポリペプチドの発現をチェックした。
【０３４５】
他の態様
本発明をその詳細な説明と共に記載してきたが、前述の説明は例示を意図しており、本発明の範囲を制限するものではなく、本発明は添付の特許請求の範囲によって定義されることが理解されるべきである。他の局面、利点、および変更は添付の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【図１】３−ＨＰを作製する経路の模式図である。
【図２】重合３−ＨＰを作製する経路の模式図である。
【図３】３−ＨＰのエステルを作製する経路の模式図である。
【図４】重合アクリレートを作製する経路の模式図である。
【図５】アクリル酸のエステルを作製する経路の模式図である。
【図６】ＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：１）。
【図７】ＣｏＡ転移酵素活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：２）。
【図８】配列番号：１、３、４、および５に定められる核酸配列のアライメントである。
【図９】配列番号：２、６、７、および８に定められるアミノ酸配列のアライメントである。
【図１０】Ｅ１活性化因子活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：９）。
【図１１】Ｅ１活性化因子活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：１０）。
【図１２】配列番号：９、１１、１２、および１３に定められる核酸配列のアライメントである。
【図１３】配列番号：１０、１４、１５、および１６に定められるアミノ酸配列のアライメントである。
【図１４】ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ酵素のＥ２αサブユニットをコードする核酸配列のリストである（配列番号：１７）。
【図１５】ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ酵素のＥ２αサブユニットのアミノ酸配列のリストである（配列番号：１８）。
【図１６】配列番号：１７、１９、２０、および２１に定められる核酸配列のアライメントである。
【図１７】配列番号：１８、２２、２３、および２４に定められるアミノ酸配列のアライメントである。
【図１８】ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ酵素のＥ２βサブユニットをコードする核酸配列のリストである（配列番号：２５）。４４３の位置の「Ｇ」は「Ａ」でもあり得、５７１の位置の「Ａ」は「Ｇ」でもあり得る。
【図１９】ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性を持つ酵素のＥ２βサブユニットのアミノ酸配列のリストである（配列番号：２６）。
【図２０】配列番号：２５、２７、２８、および２９に定められる核酸配列のアライメントである。
【図２１】配列番号：２６、３０、３１、および３２に定められるアミノ酸配列のアライメントである。
【図２２】メガスフェラ・エルスデニのゲノムＤＮＡの核酸配列のリストである（配列番号：３３）。
【図２３】メガスフェラ・エルスデニ由来のポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：３４）。
【図２４】メガスフェラ・エルスデニ由来のポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：３５）。
【図２５】酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：３６）。
【図２６】酵素活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：３７）。
【図２７】ＣｏＡ合成酵素、脱水酵素、および脱水素酵素活性を持つポリペプチドのコード配列および非コード配列を含む核酸配列のリストである（配列番号：３８）。コード配列の開始部位は、４８０の位置で、リボソーム結合部位は４６６−４７３の位置、停止コドンは５９４６の位置である。
【図２８】ＣｏＡ合成酵素、脱水酵素、および脱水素酵素活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：３９）。
【図２９】３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：４０）。
【図３０】３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：４１）。
【図３１】３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性を持つポリペプチドのコード配列および非コード配列を含む核酸配列のリストである（配列番号：４２）。
【図３２】配列番号：４０、４３、４４、および４５に定められる核酸配列のアライメントである。
【図３３】配列番号：４１、４６、４７、および４８に定められるアミノ酸配列のアライメントである。
【図３４】ＣｏＡ転移酵素活性、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性（Ｅ１、Ｅ２α、およびＥ２β）、および３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性（３−ＨＰ−ＣｏＡ脱水酵素）を持つポリペプチドをコードする合成オペロン（ｐＴＤＨ）の構築の模式図である。
【図３５】ＣｏＡ転移酵素活性、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性（Ｅ１、Ｅ２α、およびＥ２β）、および３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性（３−ＨＰ−ＣｏＡ脱水酵素）を持つポリペプチドをコードする合成オペロン（ｐＨＴＤ）の構築の模式図である。
【図３６】ＣｏＡ転移酵素活性、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性（Ｅ１、Ｅ２α、およびＥ２β）、および３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性（３−ＨＰ−ＣｏＡ脱水酵素）を持つポリペプチドをコードする合成オペロン（ｐＥＩＩＴＨｒＥＩ）の構築の模式図である。
【図３７】ＣｏＡ転移酵素活性、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性（Ｅ１、Ｅ２α、およびＥ２β）、および３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性（３−ＨＰ−ＣｏＡ脱水酵素）を持つポリペプチドをコードする合成オペロン（ｐＥＩＩＴＨＥＩ）の構築の模式図である。
【図３８】２つのプラスミドｐＥＩＩＴＨおよびｐＰＲＯＥＩの構築の模式図である。ｐＥＩＩＴＨプラスミドは、ＣｏＡ転移酵素活性、ラクチルＣｏＡ脱水酵素活性（Ｅ２αおよびＥ２β）、および３−ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ脱水酵素活性（３−ＨＰ−ＣｏＡ脱水酵素）を持つポリペプチドをコードし、ｐＰＲＯＥＩプラスミドはＥＩ活性化因子活性を持つポリペプチドをコードする。
【図３９】ＣｏＡ合成酵素、脱水酵素、および脱水素酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：１２９）。
【図４０】配列番号：３９、１３０、および１３１に定められるアミノ酸配列のアライメントである。大文字のアミノ酸残基は、そのアミノ酸残基が２つまたはそれ以上の配列でその位置に存在することを示す。
【図４１】配列番号：３９、１３２、および１３３に定められるアミノ酸配列のアライメントである。大文字のアミノ酸残基は、そのアミノ酸残基が２つまたはそれ以上の配列でその位置に存在することを示す。
【図４２】配列番号：３９、１３４、および１３５に定められるアミノ酸配列のアライメントである。大文字のアミノ酸残基は、そのアミノ酸残基が２つまたはそれ以上の配列でその位置に存在することを示す。
【図４３】多機能酵素ＯＳ１７を用いて有機化合物を作製するいくつかの経路を示す模式図である。
【図４４】アセチルＣｏＡおよびマロニルＣｏＡを介して３−ＨＰを作製する経路の模式図である。
【図４５】ｐＭＳＤ８、ｐＥＴ３０ａ／ａｃｃ１、ｐＦＮ４７６、およびＰＥＴ２８６構築物の模式図である。
【図４６】補酵素Ａチオエステルの全イオンクロマトグラムおよび５つの質量スペクトルを示す。パネルＡは補酵素Ａと４つのＣｏＡ有機チオエステルの分離を示す全イオンクロマトグラムである：１＝補酵素Ａ、２＝ラクチルＣｏＡ、３＝アセチルＣｏＡ、４＝アクリリルＣｏＡ、５＝プロピオニルＣｏＡ。パネルＢは補酵素Ａの質量スペクトルである。パネルＣはラクチルＣｏＡの質量スペクトルである。パネルＤはアセチルＣｏＡの質量スペクトルである。パネルＥはアクリリルＣｏＡの質量スペクトルである。パネルＦはプロピオニルＣｏＡの質量スペクトルである。
【図４７】イオンクロマトグラムおよび質量スペクトルを示す。パネルＡはラクチルＣｏＡおよび３−ＨＰ−ＣｏＡの混合物の全イオンクロマトグラムである。パネルＡの挿入図はピーク１で記録された質量スペクトルである。パネルＢはラクチルＣｏＡの全イオンクロマトグラムである。パネルＢの挿入図はピーク２で記録された質量スペクトルである。各パネルでピーク１は３−ＨＰ−ＣｏＡ、ピーク２はラクチルＣｏＡである。アスタリスクのついたピークはＣｏＡエステルではないことが確認された。
【図４８】イオンクロマトグラムと質量スペクトルを示す。パネルＡはｐＥＩＩＴＨｒＥＩでトランスフェクトされた大腸菌の培養液より得られたＣｏＡエステルの全イオンクロマトグラムである。パネルＡの挿入図は、ピーク１で記録された質量スペクトルである。パネルＢはｐＥＩＩＴＨｒＥＩでトランスフェクトされなかった対照大腸菌の培養液より得られたＣｏＡエステルの全イオンクロマトグラムである。パネルＢの挿入図は、ピーク２で記録された質量スペクトルである。各パネルでピーク１は３−ＨＰ−ＣｏＡ、ピーク２はラクチルＣｏＡである。アスタリスクのついたピークはＣｏＡエステルではないことが確認された。
【図４９】マロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：１４０）。
【図５０】マロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：１４１）。
【図５１】マロニルＣｏＡ還元酵素活性を持つポリペプチドの一部をコードする核酸配列のリストである（配列番号：１４２）。
【図５２】配列番号：１４１、１４３、１４４、１４５、１４６、および１４７に定められるアミノ酸配列のアライメントである。
【図５３】配列番号：１４０、１４８、１４９、１５０、１５１、および１５２に定められる核酸配列のアライメントである。
【図５４】βアラニン中間体を介して３−ＨＰを作製する経路の模式図である。
【図５５】βアラニン中間体を介して３−ＨＰを作製する経路の模式図である。
【図５６】βアラニルＣｏＡアンモニアリアーゼ活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：１６０）。
【図５７】βアラニルＣｏＡアンモニアリアーゼ活性を持つポリペプチドのアミノ酸配列のリストである（配列番号：１６１）。
【図５８】βアラニルＣｏＡアンモニアリアーゼ活性を持つポリペプチドをコードする核酸配列のリストである（配列番号：１６２）。
【図５９】βアラニルＣｏＡアンモニアリアーゼ活性を持つポリペプチドをコードできる核酸配列のリストである（配列番号：１６３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４６Ｃ】
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【図４６Ｄ】
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【図４６Ｅ】
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【図４６Ｆ】
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【図４７Ａ】
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【図４７Ｂ】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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