(57)【要約】標的ポリヌクレオチドまたはそれらに由来する増幅産物についてサンプルをアッセイするための方法、組成物および製造物品が提供される。この方法は、標的ポリヌクレオチドを含むと疑われるサンプルと、これに特異的に結合するポリヌクレオチドを接触させる工程を包含し、このポリヌクレオチドは、基材、好ましくはコードされたビーズ結合体である。増幅反応は、最初に、これが標的ポリヌクレオチドについての間接的にアッセイするために使用され得るように、この標的ポリヌクレオチドゆらいの増幅産物を生成するために使用され得る。増幅産物検出複合体およびこれを形成する方法もまた、提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
コードされたビーズ結合体であって、以下：
スペクトルコードを含むミクロスフェアであって、該スペクトルコードが、第１の蛍光特性を有する第１の半導体ナノクリスタルを含む、ミクロスフェア；ならびに
近位端および少なくとも１つの遠位端を有する第１のポリヌクレオチドであって、ここで、該第１のポリヌクレオチドが、該近位端で該ミクロスフェアに連結する、第１のポリヌクレオチド、
を含む、コードされたビーズ結合体。
【請求項２】
前記スペクトルコードが、第２の蛍光特性を有する第２の半導体ナノクリスタルをさらに含む、請求項１に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項３】
前記第１の半導体ナノクリスタルが、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＭｇＴｅ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＡｌＡｓ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、ＡｌＳ、Ｇｅ、Ｓｉ、Ｐｂ、ＰｂＳｅ、それらの合金、およびそれらの混合物からなる群から選択されるコアを含む、請求項１に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項４】
前記コアがＣｄＳｅである、請求項３に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項５】
前記半導体ナノクリスタルが、外殻を含む、請求項１に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドの５’末端が前記近位端である、請求項１に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドの３’末端が前記近位端である、請求項１に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドの内部位置が前記近位端であり、そして該ポリヌクレオチドが複数の遠位端を有する、請求項１に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項９】
請求項１に記載のコードされたビーズ結合体であって、ここで、前記第１のポリヌクレオチドが、第１および第２の相補領域ならびに該第１および第２の相補領域の間に位置する第３の領域を含み、
ここで、該第１のポリヌクレオチドが、ステム−ループ構造を形成し得、ここで、該第１および第２の相補領域が互いにハイブリダイズしてステムを形成し、そして第３の領域がループを形成し、
ここで、該第３の領域の少なくとも一部が、第１の標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、そしてここで、該第１のポリヌクレオチドが、該第１の標的ポリヌクレオチドに優先的にハイブリダイズし得、これによって少なくとも１つのセットのハイブリダイゼーション条件下で該ステム−ループ構造の形成を中断する、
コードされたビーズ結合体。
【請求項１０】
請求項９に記載のコードされたビーズ結合体であって、以下：
（ｉ）第１のクエンチャー；および
（ｉｉ）第１の発蛍光団、
をさらに含み、ここで、該第１のクエンチャーおよび第１の発蛍光団は、前記第１のポリヌクレオチドが前記第１の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない場合の第１のハイブリダイゼーション状態下で、または該第１のポリヌクレオチドが該第１の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合の第２のハイブリダイゼーション状態下でのいずれかで、該第１のクエンチャーが該第１の発蛍光団からの蛍光発光を消光するが、両方のハイブリダイゼーション状態下では消光しないように、該結合体中に位置する、コードされたビーズ結合体。
【請求項１１】
前記第１の発蛍光団が、第３の蛍光特性を有する第３の半導体ナノクリスタルである、請求項１０に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項１２】
前記第１の発蛍光団が色素である、請求項１０に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項１３】
前記第１の発蛍光団がまたクエンチャーであり、前記第１のポリヌクレオチドが前記第１の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない場合に自己消光する、請求項１２に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項１４】
前記第１のクエンチャーが、前記ミクロスフェアに連結され、そして前記第１の発蛍光団が、前記遠位端または該遠位端より近くで前記第１のポリヌクレオチドに連結される、請求項１０に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項１５】
前記第１のクエンチャーが、前記近位端または該近位端より近くで前記第１のポリヌクレオチドに連結される、請求項１０に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項１６】
前記第１のクエンチャーが、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、金属ナノ粒子、および半導体ナノクリスタルから選択される、請求項１０に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項１７】
前記第１のクエンチャーが、前記第１のハイブリダイゼーション状態下で前記第１の発蛍光団からの蛍光発光を消光する、請求項１０に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項１８】
前記第１のクエンチャーが、前記第２のハイブリダイゼーション状態下で前記第１の発蛍光団からの蛍光発光を消光する、請求項１０に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項１９】
請求項１０に記載のコードされたビーズ結合体であって、近位端および少なくとも１つの遠位端を有する第２のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで前記第２のポリヌクレオチドが、その近位端で前記ミクロスフェアに連結され、そしてここで、該第２のポリヌクレオチドは、第２の発蛍光団に連結され、
ここで、該第２のポリヌクレオチドは、第１および第２の相補領域ならびに該第１および第２の相補領域の間に位置する第３の領域を含み、
ここで、該第２のポリヌクレオチドの該第３の領域の少なくとも一部が、第２の標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、
ここで、該第２のポリヌクレオチドがステム−ループ構造を形成し得、ここで、該第２の標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの非存在下で、該第１および第２の相補領域が互いにハイブリダイズしてステムを形成し、そして該第３の領域がループを形成し、
ここで、該第２のポリヌクレオチドが、該第２の標的ポリヌクレオチドに優先的にハイブリダイズし得、そして該ステム−ループ構造が、少なくとも１つのセットのハイブリダイゼーション条件下で形成されず、
そしてここで、該第２の発蛍光団からの蛍光発光は、該第２のポリヌクレオチドが該第２の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない場合の第３のハイブリダイゼーション状態下で、または該第２のポリヌクレオチドが該第２の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合の第４のハイブリダイゼーション状態下でのいずれかで消光するが、第３および第４の両方のハイブリダイゼーション状態下では消光しない、
コードされたビーズ結合体。
【請求項２０】
前記第２の発蛍光団が、自己消光する色素であり、そして該色素が前記第３および第４のハイブリダイゼーション状態下の１つでは消光するが両方の状態下では消光しないように、前記第２のポリヌクレオチドに連結される、請求項１９に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項２１】
前記第２の発蛍光団が、その遠位端または該遠位端より近くで前記第２のポリヌクレオチドに連結される、請求項１９に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項２２】
前記第１のクエンチャーが、前記ミクロスフェアに連結され、そして前記第１および第２のポリヌクレオチドがそのそれぞれの標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない場合に、前記第１および第２の発蛍光団の両方を消光し得る、請求項２１に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項２３】
第２のクエンチャーが、その近位端または該近位端より近くで前記第２のポリヌクレオチドに連結される、請求項２１に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項２４】
前記第２の発蛍光団が、その近位端または該近位端より近くで前記第２のポリヌクレオチドに連結される、請求項１９に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項２５】
第２のクエンチャーが、その遠位端または該遠位端より近くで、該第２のポリヌクレオチドに連結される、請求項２４に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項２６】
前記第１のポリヌクレオチドが分枝している、請求項１に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項２７】
前記第１のポリヌクレオチドがマルチマーである、請求項１に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項２８】
前記第１のポリヌクレオチドが環を含む、請求項１に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項２９】
前記ポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドに対する３’相補領域、および該標的ポリヌクレオチドに対する５’非相補領域を含む、請求項１に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項３０】
前記相補領域が前記発蛍光団と前記近位端との間に位置するように前記第１のポリヌクレオチドに連結された発蛍光団をさらに含む、請求項２９に記載のコードされたビーズ結合体。
【請求項３１】
サンプル中の第１の標的ポリヌクレオチドをアッセイするための方法であって、該方法は、以下：
該第１の標的ポリヌクレオチドを含むと思われる該サンプルを、第１のポリヌクレオチドが該第１の標的ヌクレオチドにハイブリダイズし得る第１のセットのハイブリダイゼーション条件下で、請求項１に記載のコードされたビーズ結合体と接触させる工程であって、
ここで、該結合体の蛍光特性における変化が、該第１の標的ポリヌクレオチドの第１のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの際に生じる、工程；
該コードされたビーズ結合体を、そのスペクトルコードによって同定する工程；および
該結合体の蛍光特性における変化が、該ハイブリダイゼーションから生じたか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３２】
前記コードされたビーズ結合体をそのスペクトルコードによって同定する工程が、蛍光特性における変化が生じたか否かを決定する工程の前に起こる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記コードされたビーズ結合体をそのスペクトルコードによって同定する工程が、蛍光特性における変化が生じたか否かを決定する工程に続いて起こる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記コードされたビーズ結合体をそのスペクトルコードによって同定する工程が、蛍光特性における変化が生じたか否かを決定する工程と同時に起こる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記サンプルが、前記標的ポリヌクレオチドの存在についてアッセイされる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記サンプルが、前記標的ポリヌクレオチドの量についてアッセイされる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
蛍光特性における前記変化が、前記結合体への発蛍光団の付加からなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
蛍光特定における前記変化が、前記結合体からの発蛍光団の除去からなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
蛍光特性における前記変化が、発蛍光団の消光からなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
蛍光特性における前記変化が、発蛍光団からの消光の除去からなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
請求項３１に記載の方法であって、ここで、前記第１のポリヌクレオチドが、第１および第２の相補領域ならびに該第１および第２の相補領域の間に位置する第３の領域を含み、
ここで、該第３の領域の少なくとも一部が、前記第１の標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、
ここで、該第１のポリヌクレオチドが、ステム−ループ構造を形成し得、ここで、該第１の標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの非存在下で、該第１および第２の相補領域が互いにハイブリダイズしてステムを形成し、そして該第３の領域がループを形成し、
そしてここで、該第１のポリヌクレオチドが、該第１の標的ポリヌクレオチドに優先的にハイブリダイズし、そして該ステム−ループ構造が、第１のセットのハイブリダイゼーション条件下で形成しない、
方法。
【請求項４２】
前記標的ポリヌクレオチドが、発蛍光団で標識され、該発蛍光団が、該標的ポリヌクレオチドの前記第１のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの際に、蛍光発光を加えることによって前記コードされたビーズ結合体の前記蛍光特性を変化する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記コードされたビーズ結合体が、クエンチャーおよび発蛍光団をさらに含み、ここで、該クエンチャーおよび発蛍光団は、前記第１のポリヌクレオチドが前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない場合の第１のハイブリダイゼーション状態下で、または該第１のポリヌクレオチドが該第標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合の第２のハイブリダイゼーション状態下でのいずれかで、該クエンチャーが該発蛍光団からの蛍光発光を消光し得るが、両方のハイブリダイゼーション状態下では消光しないように、該結合体中に位置する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記クエンチャーおよび発蛍光団のうちの一方が、前記第１のポリヌクレオチドの前記近位端または前記少なくとも１つの遠位端のいずれか、またはこのいずれかより近くに連結され、そして該クエンチャーおよび発蛍光団の他方が、他方の末端または該他方の末端より近くに連結される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記クエンチャーが前記ミクロスフェアに連結され、そして前記発蛍光団が、前記少なくとも１つの遠位端または該遠位端よりも近くで前記第１のポリヌクレオチドに連結される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記発蛍光団が前記ミクロスフェアに連結され、そして前記クエンチャーが、前記少なくとも１つの遠位端または該遠位端よりも近くで前記第１のポリヌクレオチドに連結される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
請求項４３に記載の方法であって、前記コードされたビーズ結合体が、近位端および少なくとも１つの遠位端を有する第２のポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、該第２のポリヌクレオチドが、その近位端で前記ミクロスフェアに連結され、
ここで、該第２のポリヌクレオチドは、第１および第２の相補領域ならびに該第１および第２の相補領域の間に位置する第３の領域を含み、
ここで、該第２のポリヌクレオチドの該第３の領域の少なくとも一部が、第２の標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、
ここで、該第２の標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの非存在下で、該第２のポリヌクレオチドは、内部ステム−ループ構造を形成し得、ここで、該第１および第２の相補領域が互いにハイブリダイズしてステムを形成し、そして第３の領域がループを形成し、
ここで、該第２のポリヌクレオチドが、該第２の標的ポリヌクレオチドに優先的にハイブリダイズし、これによって、該ステム−ループ構造は、第１のセットのハイブリダイゼーション条件下で形成されず、
ここで、該第１のポリヌクレオチドが、第１の発蛍光団に連結され、
ここで、該第２のポリヌクレオチドが、該第１の発蛍光団とは検出可能に異なる蛍光特性を有する第２の発蛍光団に連結され、そして
ここで、該第１および第２の発蛍光団の各々の蛍光発光が、独立して、これらが連結する該ポリヌクレオチドが該ステム−ループ構造を形成する場合に消光され、そしてこれらが連結する該ポリヌクレオチドがそのそれぞれの標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に消光されない、
方法。
【請求項４８】
請求項３１に記載の方法であって、ここで、前記第１のポリヌクレオチドが、前記標的ポリヌクレオチドに対する３’相補領域および該標的ポリヌクレオチドに対する５’非相補領域を含み、
ここで、前記サンプルは、フラップエンドヌクレアーゼおよび第１の侵入ポリヌクレオチドの存在下で、前記コードされたビーズ結合体に接触され、
ここで、該第１の侵入ポリヌクレオチドは、該第１の侵入ポリヌクレオチドの３’塩基または３’から２番目の塩基のいずれかから伸長する前記標的ポリヌクレオチドに相補的な第２の領域を含み、
該第１のポリヌクレオチドおよび該第１の侵入ポリヌクレオチドの両方は、第１のセットのハイブリダイゼーション条件下で、それぞれ、該３’相補領域および前記第２の相補領域を介して該標的ポリヌクレオチドに同時にハイブリダイズし得、
ここで、該第１の侵入ポリヌクレオチドは、該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に、該第１のポリヌクレオチドよりも高い融解温度を有し、
ここで、該第１の侵入ポリヌクレオチドの少なくとも３’塩基が、前記第１のセットのハイブリダイゼーション条件下で該第１のポリヌクレオチドおよび該第１の侵入ポリヌクレオチドの両方が該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に、該第１のポリヌクレオチドの３’相補領域の５’末端由来の少なくとも１つの塩基を、該標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイズから防止し、そして
ここで、該フラップエンドヌクレアーゼは、該第１のポリヌクレオチドの３’相補領域における塩基に対して３’である切断部位で、該第１のポリヌクレオチドを優先的に切断し、これが該第１の侵入ポリヌクレオチドの３’塩基によって置き換わる、
方法。
【請求項４９】
前記第１のポリヌクレオチドが、前記フラップエンドヌクレアーゼによる切断の際に前記コードされたビーズ結合体から前記発蛍光団が放出されるように、前記ミクロスフェアから前記切断部位に対して遠位で該ミクロスフェアに連結される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記フラップエンドヌクレアーゼによる切断後に、前記第１のポリヌクレオチドに標識が組み込まれる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記標識が発蛍光団である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記標識が、標識されたポリヌクレオチドを前記第１のポリヌクレオチドの切断された末端に連結することによって組み込まれる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記標識が、前記切断部位から前記第１のポリヌクレオチドを伸長することによって生成される伸長産物に、標識されたヌクレオチドを組み込むことによって組み込まれる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
前記第１のポリヌクレオチドを環状テンプレートにハイブリダイズする工程、および前記３’末端を前記切断部位から伸長して標識されたヌクレオチドを組み込む工程、を包含する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記第１のポリヌクレオチドが、前記フラップエンドヌクレアーゼによる切断の前には接近可能な３’ヒドロキシル基を有さず、そしてここで、前記標識が、末端転移酵素を使用して前記第１のポリヌクレオチドの前記切断部位に標識されたヌクレオチドを付加することによって組み込まれる、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１の侵入ポリヌクレオチドの３’塩基によって置き換えられた前記第１のポリヌクレオチドの３’相補領域における塩基が、前記標的ポリヌクレオチドの第１の対立遺伝子に対して相補的であり、そして該標的ポリヌクレオチドの第２の対立遺伝子に対しては相補的ではない、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
請求項４８に記載の方法であって、ここで、前記第１の侵入ポリヌクレオチドが、第３の標的ポリヌクレオチドに対する５’非相補領域および該第３の標的ポリヌクレオチドに対する３’相補領域を含む第３のポリヌクレオチドから生成され、
ここで、該第１の侵入ポリヌクレオチドが、該第３のポリヌクレオチドおよび第２の侵入ポリヌクレオチドの両方が該第３の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされる場合に、フラップエンドヌクレアーゼによる切断を介して該第３のポリヌクレオチドの５’末端から生成され、
ここで、該第２の侵入ポリヌクレオチドが、該第２の侵入ポリヌクレオチドの３’塩基または３’から２番目の塩基のいずれかに伸長する第３の標的ポリヌクレオチドに対する第３の相補領域を含み、
ここで、該第２の侵入ポリヌクレオチドが、該第３の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に、該第３のポリヌクレオチドよりも高い融解温度を有し、
ここで、該第２の侵入ポリヌクレオチドの少なくとも３’塩基が、該第３のポリヌクレオチドおよび該第２の侵入ポリヌクレオチドの両方が該第３の標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に、該第３のポリヌクレオチドの３’相補領域の５’末端由来の少なくとも１つの塩基を、該第３の標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイズから防止し、そして
ここで、該フラップエンドヌクレアーゼは、該第３のポリヌクレオチドの３’相補領域における塩基に対して３’である切断部位で、該第３のポリヌクレオチドを優先的に切断し、これが該第２の侵入ポリヌクレオチドの３’塩基によって置き換わる、
方法。
【請求項５８】
キットであって、以下：
ミクロスフェアおよび第１のポリヌクレオチドを含む第１のコードされたビーズ結合体であって、該ミクロスフェアは第１の蛍光特性を有する第１の半導体ナノクリスタルを含むスペクトルコードを含み、そして該第１のポリヌクレオチドは、近位端および少なくとも１つの遠位端を有し、ここで、該第１のポリヌクレオチドが、該近位端で該ミクロスフェアに連結される、ビーズ結合体；
該コードされたビーズ結合体を保持するためのハウジング；ならびに
該ハウジングと共に提供される指示書であって、標的ポリヌクレオチドについてサンプルをアッセイするために該キットの構成要素を使用する方法を記載する、指示書、
を備える、キット。
【請求項５９】
前記第１のポリヌクレオチドが、標的ポリヌクレオチドに対する３’相補領域および該標的ポリヌクレオチドに対する５’非相補領域を含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
請求項５９に記載のキットであって、侵入ポリヌクレオチドおよびフラップエンドヌクレアーゼをさらに備え、ここで、該第１の侵入ポリヌクレオチドは、該第１の侵入ポリヌクレオチドの３’塩基または３’から２番目の塩基のいずれかへと伸長する前記標的ポリヌクレオチドに対する第２の相補領域を含み、
ここで、該第１のポリヌクレオチドおよび該第１の侵入ポリヌクレオチドの両方は、第１のセットのハイブリダイゼーション条件下で、それぞれ、前記３’相補領域および前記第２の相補領域を介して該標的ポリヌクレオチドに同時にハイブリダイズし得、
ここで、該第１の侵入ポリヌクレオチドは、該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に、該第１のポリヌクレオチドよりも高い融解温度を有し、
ここで、該第１の侵入ポリヌクレオチドの少なくとも３’塩基が、該第１のセットのハイブリダイゼーション条件下で該第１のポリヌクレオチドおよび該第１の侵入ポリヌクレオチドの両方が該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合に、該第１のポリヌクレオチドの３’相補領域の５’末端由来の少なくとも１つの塩基を、該標的ポリヌクレオチドとのハイブリダイズから防止し、そして　ここで、前記ハウジングが、該標的ポリヌクレオチドおよび該第１の侵入ポリヌクレオチドをさらに保持する、
キット。
【請求項６１】
請求項５８に記載のキットであって、ここで、前記第１のポリヌクレオチドが、第１および第２の相補領域ならびに該第１および第２の相補領域の間に位置する第３の領域を含み、
ここで、該第１のポリヌクレオチドが、ステム−ループ構造を形成し得、ここで、該第１および第２の相補領域が互いにハイブリダイズしてステムを形成し、そして該第３の領域がループを形成し、
ここで、該第３の領域の少なくとも一部が、前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも一部に相補的であり、そしてここで、該第１のポリヌクレオチドが、該標的ポリヌクレオチドに優先的にハイブリダイズし得、これによって少なくとも１つのセットのハイブリダイゼーション条件下で該ステム−ループ構造の形成を中断する、
キット。
【請求項６２】
請求項６１に記載のキットであって、ここで、前記コードされたビーズ結合体が、以下：
（ｉ）第１のクエンチャー；および
（ｉｉ）第１の発蛍光団、
さらに含み、ここで、該第１のクエンチャーおよび第１の発蛍光団は、前記第１のポリヌクレオチドが前記標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしない場合の第１のハイブリダイゼーション状態下で、または該第１のポリヌクレオチドが該標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合の第２のハイブリダイゼーション状態下でのいずれかで、該第１のクエンチャーが該第１の発蛍光団からの蛍光発光を消光するが、両方のハイブリダイゼーション状態下では消光しないように、該結合体中に位置する、
キット。
【請求項６３】
請求項５８に記載のキットであって、複数の異なるコードされたビーズ結合体を含み、ここで、該異なるコードされたビーズ結合体の各々が、対応する異なる第１のポリヌクレオチドおよび異なるスペクトルコードを含み、ここで、該異なる第１のポリヌクレオチドの各々が、対応する異なる標的ポリヌクレオチドについてサンプルをアッセイするために使用され得、
ここで、前記ハウジングは、該複数の異なるコードされたビーズ結合体をさらに保持し、
ここで、前記指示書は、該対応する異なる標的ポリヌクレオチドについて該サンプルをアッセイするために該複数の異なるコードされたビーズ結合体の各々を使用する方法をさらに記載する、
キット。
【請求項６４】
前記第１のポリヌクレオチドが、標識を含む、請求項５８に記載のキット。
【請求項６５】
前記第１のポリヌクレオチドが標識されていない、請求項５８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本願は、２０００年３月２２日提出の米国仮特許出願番号６０／１９１，２２７号、および２０００年９月２９日提出の米国仮特許出願番号６０／２３７，０００号に対する優先権の利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、サンプル中のポリヌクレオチドの解析のための方法、物品、組成物に関する。
【０００３】
（発明の背景）
Ｍｉｃｈａｅｌ　Ａｄａｍｓ−Ｃｏｎｒｏｙは、記録上、以前知られていたいかなる量よりも７倍高いＰｒｏｚａｃ（登録商標）の最高過量によって、９歳の時に死亡した。彼の両親は、殺人について調査され、そして彼の２人の兄弟は、社会福祉事業家による保護から除外された。しかし、検死結果は、彼の血液中に見出された薬物レベルに達するために彼が常態で莫大な量を摂取しなければならなかったにもかかわらず、彼の胃の中には丸剤が全くないことを示した。
【０００４】
急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）は、米国において各年、数千人の子供に発症する。化学療法剤での処置が、現在９０％を超える症例で寛解を導いている。６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）は、ＡＬＬを処置するために使用される１つの薬剤である。しかし、６−ＭＰの通常の処置用量は、３００人の患者あたり１人に対して有害であり、そして治療ではなく殺傷し得る。
【０００５】
治療薬物に対する有害反応は、米国において各年、１００，０００人を超す入院患者を殺傷すると推定されている（Ｌａｚａｒｏｕら、ＪＡＭＡ　１９９８　Ａｐｒ．１５：２７９（１５）：１２００−５）。この数値は、最後に致死とわかる入院へ導く意図的な過量を含まない。さらに２，２００，０００の重篤な非致死性の有害薬物反応が起こっていると推定されている。
【０００６】
特定の薬物治療に対する個々の患者の様々な応答の問題は、周知であるが、処置前に患者の様々な薬物代謝を予測することに対して、ほとんど進歩はしていない。薬物の投与における標準的なアプローチは、所定の状態（いくつかの場合、患者の体重に対して調整される）に対して推奨される投与量を罹患患者に処方することである。患者が改善されない場合、投与量は増加されるかまたは、代替の薬物が試みられる。逆に、有害な副作用が起こる場合、投与量は、低くされ得るかまたは、代替の薬物が使用され得る。
【０００７】
重篤な副作用を示す薬物は、規制当局によって決して承認され得ないか、またはこのような副作用が同定される前に承認された場合、たとえ低い割合の処置患者がその様に影響を及ぼされる場合でさえ、この薬物は、市場から回収される可能性がある。このことは、このような薬物が大多数の患者にすばらしい治療利益を有し得るという事実があるにしても起こり得る。
【０００８】
稀なＡＬＬ患者によって示される６−ＭＰ感受性は、チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ（ＴＰＭＴ）活性における欠損に関連付けられている（Ｋｒｙｎｅｔｓｋｉら、Ｐｈａｒｍ　Ｒｅｓ　１９９９　１６（３）：３４２−９）。この酵素を欠損する患者は、処方医師が代謝欠損に気づいている場合、より低い用量の６−ＭＰで処置されて、有害な毒性を回避しつつ同じ治療血漿レベルを達成し得る。同様の薬物（例えば、慢性関節リウマチ、白血病およびクローン病の処置に使用されるアザチオプリンおよびチオグアニン）の代謝もまた、ＴＰＭＴを欠損する患者に影響を及ぼす。
【０００９】
シトクロムｐ−４５０　ＣＹＰ２Ｄ６（デブリソキンヒドロキシラーゼ）は、フルオキセチン（Ｐｒｏｚａｃ（登録商標））、ならびにコデイン、アンフェタミン、メタドン、ならびにいくつかの抗うつ薬および神経弛緩薬のヒト代謝を担う主要酵素である。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の少なくとも２０個の改変体は、Ｐｒｏｚａｃ（登録商標）および他の薬物の不十分な代謝を生じることが現在知られている（Ｗｏｎｇら、Ａｎｎ　Ａｃａｄ　Ｍｅｄ　Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ　２０００　２９（３）：４０１−６）。約７〜１０％のカフカス人は、Ｐｒｏｚａｃ（登録商標）の代謝を十分にできない人種（ｐｏｏｒ　ｍｅｔａｂｏｌｉｚｅｒ）であり、そして標準的な投与量で処置される場合、予測された血漿レベルより高いレベルに達する。
【００１０】
Ｍｉｃｈａｅｌ　Ａｄａｍｓ−Ｃｏｎｒｏｙは、このような患者の１人であったが、彼は、Ｐｒｏｚａｃの遅い代謝を生じるＣＹＰ２Ｄ６改変体のいずれかを有しているか否かを一度も試験されなかった。代わりに、Ｐｒｏｚａｃ（登録商標）に対する彼の低下した応答（慢性使用で代表的に生じる）が理由で、彼の投与量は、彼の症状に対する制御を維持するために、徐々に増加された。Ｐｒｏｚａｃ（登録商標）毒性に付随する副作用（例えば、悪心およびめまい感）は、それよりも片頭痛にあるとされた。Ｍｉｃｈａｅｌの死亡後になってようやく、彼の組織が試験され、そしてＰｒｏｚａｃ（登録商標）およびその代謝物の毒性蓄積の一因となったＣＹＰ２Ｄ６改変体を血液中に含むことが示された（Ｓａｌｌｅｅら、Ｊ．Ｃｈｉｌｄ　Ａｄｏｌｅｓｃ．Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０００　Ｓｐｒｉｎｇ；１０（１）：２７−３４）。
【００１１】
潜在的に致命的な有害な薬物反応は、患者が多くの遺伝子中（イソニアジド代謝に影響を及ぼすＮＡＴ２遺伝子中、ワルファリン代謝に影響を及ぼすＣＹＰ２Ｃ９遺伝子中、５−フルオロウラシル代謝に影響を及ぼすＤＰＤ遺伝子中、およびクラリスロマイシン代謝に影響を及ぼすＫＣＮＥ２遺伝子を含む）に改変を有することによって変更された代謝に関連することが、現在、公知である（Ｇｒａｎｔら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　２０００　６１（３）：２０４−１１；Ｔａｕｂｅら、Ｂｌｏｏｄ　２０００　９６（５）：１８１６−９；Ｍｅｉｎｓｍａら、ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏ　１９９５　１４（１）：１−６；Ｓｅｓｔｉら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　２０００　９７（１９）：１０６１３−８）。
【００１２】
特定のポリヌクレオチドについてサンプルを解析する方法、ならびにこのような方法において有用なデバイス製品、組成物製品および物品製品が当該分野において必要である。
【００１３】
（発明の要旨）
標的ポリヌクレオチドまたはそれらに由来する増幅産物についてサンプルをアッセイするための方法、組成物および物品が提供される。この方法は、標的ポリヌクレオチドを含むと疑われるサンプルと、プローブポリヌクレオチドおよび、半導体ナノ結晶を含むスペクトルコードを含むコードされたビーズ結合体とを接触させる工程を包含する。このプローブポリヌクレオチドは、クリベース（ｃｌｅａｖａｓｅ）アッセイの実施に適切な形態であり得るか、または、分子ビーコンであり得るか、または、未標識ステムループ構造を有し得る。プローブポリヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドへの結合は、コードされたビーズ結合体の蛍光特性に変化を生じる。増幅反応は、この方法に組み込まれ得る。
【００１４】
この方法の１つの変形物において、ステムループ構造を形成し得る未標識プローブポリヌクレオチドが、使用される。この未標識プローブポリヌクレオチドは、基質の任意の形態に結合体化され、そして使用されて標識増幅産物についてアッセイし得る。プローブポリヌクレオチドの標識増幅産物への結合は、ステムループ構造を開き、そして増幅産物アッセイ複合体の生成を生じる。複数の異なる未標識プローブポリヌクレオチドが、基質に付着する場合、複数の対応する異なる標識増幅産物の結合は、増幅産物のアッセイアレイの形成を生じる。
【００１５】
本発明の方法を実施するのに有用な試薬を含むキットもまた、提供される。
【００１６】
この方法は、複雑な設定に特に有用である。この設定条件下では、複数の異なる結合体が使用されて、複数の異なる標識ポリヌクレオチドについてアッセイする。大多数の識別可能な半導体ナノ結晶標識は、複数の異なるコードされたビーズ結合体と共に複数の標識標的ポリヌクレオチドの同時解析を可能にする。
【００１７】
本発明の方法は、必要に応じて、均質なフォーマットにおいて実行され得る。このことは、サンプルの操作がほとんどないこと、ならびに、より信頼のおけるアッセイおよび相互汚染による停止時間の短縮を生じる相互汚染の減少に起因する、より高いアッセイスループットを可能にする。実時間モニタリングが使用される場合、全体のアッセイは、密閉されたアッセイチャンバ（例えば、密閉されたマイクロプレート）を開けることなしに処理され、従って、相互汚染の危険を減少し得る。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
遺伝子改変体は、有害な薬物副作用に関連するだけではない。患者の薬物応答を制御する遺伝子における改変はまた、薬物が首尾良い治療結果を生じることができないことにも関連し得る。例えば、ＡｐｏＥ　Ｅ４サブタイプを有するアルツハイマー患者は、薬物タクリンからの利益をあまり得られないようである（ＰＮＡＳ　１９９５：１２２６０〜４，Ｐｏｉｒｉｅｒら）。
【００１９】
特定のポリヌクレオチド配列についてアッセイするのに有用な発明（ＳＮＰ、保存的配列、または他の特徴に基づくかどうかに関わらない）は、種々多様な異なる適用において用途を有する。遺伝薬理学試験に加えて、このような方法は、法医学的な状況において使用されて、法医学的標本の供給源であった種または個体を同定し得る。ポリヌクレオチド分析方法はまた、人類学的な状況において使用され得る。親子鑑定が、このような発明が使用され得る別の領域であり、予想される組織ドナーまたは血液ドナーとそれらが必要な患者との間の適合性についての試験、および遺伝性障害についてのスクリーニングも同様である。
【００２０】
本発明を使用して、刺激に応答する遺伝子発現の変化を研究し得る。他の応用としては、ヒト集団遺伝学、ヒト進化の歴史の分析、およびヒトハプロタイプの多様性の特徴づけが挙げられる。
【００２１】
本発明はまた、免疫グロブリンクラスの変換および免疫グロブリンの超可変変異を検出するため；汚染物質または病原体（細菌、酵母およびウイルスを含む）からポリヌクレオチド配列を検出するため；個体に感染している特定の株または特定の株の相対量を決定するためのＨＩＶのサブタイプ分類のために使用され得、そして、本発明は、個体の優勢なＨＩＶにおける変化（例えば、薬物耐性の発生またはＴ細胞親和性）をモニターするために繰り返し行われ得、そして単一ヌクレオチド多型（これは、特定の対立遺伝子または対立遺伝子のサブセットに関連し得る）を検出するために使用され得る。ヒト集団において、１４０万を越える単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が、同定されている（Ｎａｔｕｒｅ　２００１　４０９：９２８〜９３３）。
【００２２】
本発明は、ミニ配列決定（ｍｉｎｉ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）および変異の検出のために使用され得る。任意の型の変異（ＳＮＰ、挿入、欠失、変異、転換、逆位、フレームシフト、トリプレットリピート伸長、および染色体再配置を含むが限定されない）が、検出され得る。本発明を使用して、疾患または障害（嚢胞性線維症、テイ・サックス病、鎌状赤血球貧血などを含む）の危険の増加に関連するヌクレオチド配列を検出し得る。
【００２３】
本明細書中に記載される発明は、標的ポリヌクレオチド、またはそれからの増幅産物に関してサンプルが問い合わされるいかなるアッセイのためにも使用され得る。代表的なアッセイは、サンプル中の標的ポリヌクレオチドもしくはそれからの増幅産物の存在、またはその相対量を決定することを包含するか、あるいは定量的であってもまたは半定量的であっても良い。本発明は、スペクトルコードを含みかつ第１蛍光特徴を有するミクロスフェアに連結した第１ポリヌクレオチドを含む、コードされたビーズ結合体を提供する。この連結は、直接的であっても間接的であってもよく、そしてこの結合体がアッセイ条件下で使用され得る限り、このポリヌクレオチド中の任意の点で連結され得る。このスペクトルコードは、半導体ナノクリスタルを含み、この半導体ナノクリスタルは、このミクロスフェアに取り込まれても良いし、またはこのミクロスフェアに直接的もしくは間接的に付着されても良い。高密度スペクトルコードスキームが使用され得る。
【００２４】
多重化しやすい方法（例えば、本明細書中に教示される方法）は、より小さな標本からより大きな量の情報の取得を可能にする。より小さな標本の必要性は、より侵襲性でない技術しか必要でないので、新しいアッセイを確認するため、または単にデータを獲得するために、集団におけるより多数の個体からサンプルを得る研究者の能力を増加する。
【００２５】
スペクトルコードビーズ結合体の１つ以上の異なる集団が作製され、それぞれの集団は、１つ以上の半導体ナノクリスタルを含む既知であるかもしくは決定可能なスペクトルコードを含むミクロスフェアに結合した、既知のプローブポリヌクレオチドを、含む。この結合体の異なる集団、従って異なるアッセイは、一緒に混合され得、そしてこのアッセイがこの混合された集団の存在下で実行され得る。個々の結合体は、その結合体のスペクトル特性についてスキャンされ、それによって、スペクトルコード可能になり、従ってこのビーズが同定され、従ってそのビーズが結合したポリヌクレオチドが同定される。
【００２６】
多くの異なる半導体ナノクリスタルおよび区別され得るその混合体に起因して、多くの異なるプローブポリヌクレオチドおよび標的ポリヌクレオチドが、同時に問合せられ得る。多重方法はまた、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００、２００、５００、１０００またはそれ以上の異なるプローブポリヌクレオチド（これは、対応する異なる標的ポリヌクレオチド（例えば、マイクロアレイ形式であるかまたはＳＣＮＣとスペクトルにコードされるミクロスフェアに結合している）と同時に使用され得る）を使用して提供される。
【００２７】
本発明の１つの方法は、コードビーズ結合体を、サンプル中の標的ポリヌクレオチドについてアッセイを実施する基材として使用する。この第１ポリヌクレオチドは、標識されていても標識されていなくても良い。第１ポリヌクレオチド（少なくとも一部分は、標的ポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドからの増幅産物の少なくとも一部分と相補的である）に対する標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの際、この結合体の蛍光特徴における変化が生じる。
【００２８】
この第１ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドについての切断アッセイにおいて使用され得るように設計され得る。フラップ（ｆｌａｐ）エンドヌクレアーゼの存在下において、標的ヌクレオチドに対する第１ポリヌクレオチドおよび侵入（ｉｎｖａｄｅｒ）ヌクレオチドの結合は、この標的ヌクレオチドと相補的な第１ポリヌクレオチドにおける少なくとも１つのヌクレオチドの、侵入ポリヌクレオチドによる置換の際に、この第１ヌクレオチドの切断を生じる。この第１ヌクレオチドが発蛍光団によって標識された場合、その標識は切断の際に失われ、この結合体の蛍光特徴における対応する変化が生じる。
【００２９】
逆に、この第１ポリヌクレオチドがもともと標識されていなかった場合、フラップエンドヌクレアーゼによる切断は、例えば標識されたポリヌクレオチドへの連結を介してか、または標識されたヌクレオチドの存在下での末端トランスフェラーゼもしくはポリメラーゼの活性を介して、、蛍光標識が取り込まれることを可能にする第１ポリヌクレオチドの残基を露出し、それによりこの結合体の蛍光特徴における対応する変化を生じる。
【００３０】
この第１ポリヌクレオチドはまた、ステムループ構造を形成し得る。この第１ポリヌクレオチドが標識を含まない場合、この第１ポリヌクレオチドは、任意の基材と結合され得、そしてループ部分の少なくとも一部分に結合し得、それによりそのステムループの形成を破壊し、対応する標識された標的ポリヌクレオチドに結合するために使用され得る。この第１ポリヌクレオチドのこのバリエーションがコードビーズと結合される場合、蛍光標識された増幅産物の結合は、同様に、この結合体の蛍光特徴における変化を生じる。
【００３１】
この第１ポリヌクレオチドがステムループ構造を含む場合、この第１ポリヌクレオチドは、分子ビーコンの形態であり得る。このバリエーションにおいて、この結合体はクエンチャーおよび発蛍光団を含み、少なくともその１つは、この第１ポリヌクレオチドの遠位端にかまたはより遠位端の近くに、直接的もしくは間接的に連結されている。そのクエンチャーおよび発蛍光団のもう一方は、この第１ポリヌクレオチドの近位端にかまたはより近位端の近くに、直接的もしくは間接的に連結される。この配置にあるこのクエンチャーおよび発蛍光団が、代表的であり、そして、ステムループ構造が形成される場合に発蛍光団からの蛍光の発光が消光され、そしてこの第１ポリヌクレオチドがこの標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされる場合には発蛍光団からの蛍光発光が消光されないように、位置する。１つのバリエーションにおいて、自己消光色素が使用され得る。この自己消光色素は、発蛍光団およびクエンチャーの両方であり、そしてステムループ構造におけるこの自己消光色素の位置が、所望されるように改変され得、それによってステムループ構造が形成される場合に蛍光発光が消光されるか消光されないかのいずれかであり、標的ポリヌクレオチドが結合する場合に逆が生じる。
【００３２】
この第１ポリヌクレオチドが標識されず、そしてステムループを形成する場合、この第１ポリヌクレオチドは、プローブポリヌクレオチドとして呼ばれ得、そして任意の基材と結合して製品を形成し得る。次いで、標識された増幅産物の第１ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションが、この標識が基材に結合しているか否かを決定することによって検出され得る；このようなハイブリダイゼーションは、増幅産物アッセイ複合体を形成する。このようなハイブリダイゼーションを介してこのような複合体を作製する方法もまた、提供される。対応する異なる標識された増幅産物にハイブリダイズした、異なる配列を有する複数の異なるプローブポリヌクレオチドを含む増幅産物アッセイアレイもまた、提供される。
【００３３】
本発明の方法は、全て多重形式で実行され得る。対応する異なる標的ポリヌクレオチドまたはそれからの増幅産物に優先的にハイブリダイズする、複数の異なる第１ポリヌクレオチドまたはプローブポリヌクレオチドは、同じ基材に結合され得る。その対応する第１ポリヌクレオチドもしくはプローブポリヌクレオチドへの異なる増幅産物各々の分離結合は、それぞれの異なる増幅産物上に異なる標識を使用することによってか、それぞれのプローブポリヌクレオチドが位置する基材上の位置によってか、またはそれぞれの増幅産物が結合する条件によって、あるいはそれらの組み合わせによって、検出され得る。
【００３４】
増幅反応の１つ以上のサイクルが、この方法に組み込まれ得、この標的ポリヌクレオチドのコピー数を増加し、それによって感度を増加し得る。
【００３５】
本発明が詳細に記載される前に、この発明は、記載される特定の方法論、デバイス、溶液または装置に限定されず、従ってこのような方法、デバイス、溶液または装置はもちろん変化し得ることが理解される。本明細書中で使用される用語は、特定の実施形態を記載することのみ目的とし、そして本発明の範囲を限定するように意図されないこともまた、理解されるべきである。
【００３６】
単数型「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の使用は、文脈が明らかに他のように指示しない限り複数の言及を含む。従って、例えば、「標的（ａ　ｔａｒｇｅｔ）」という言及は、複数の標的（ｔａｒｇｅｔｓ）を含み、「基材（ａ　ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」という言及は、複数のこのような基材（ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）を含み、「プローブ（ａ　ｐｒｏｂｅ）」という言及は、複数のプローブ（ｐｒｏｂｅｓ）を含む、などである。
【００３７】
「接続された（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」、「付着された（ａｔｔａｃｈｅｄ）」、「連結された（ｌｉｎｋｅｄ）」および「結合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）」のような用語は、本明細書中で交換可能に使用され、そして文脈が明らかに他のように指示しない限り、直接的ならびに間接的な、接続（ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）、付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）、連結（ｌｉｎｋａｇｅ）または結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を包含する。値の範囲が示される場合、その範囲の示された上限と下限との間の、介在する整数値各々、およびそのそれぞれの有理数もまた、そのような値の間の各部分範囲とともに、特に開示されることが、理解されるべきである。いずれの範囲の上限および下限も、独立してその範囲の中に含まれ得るか、またはその範囲から除外され得、そしていずれかの限界が含まれるそれぞれの範囲、いずれの限界も含まれないそれぞれの範囲、または両方の限界が含まれるそれぞれの範囲もまた、本発明に含まれる。議論される値が固有の限界を有する場合、例えば、成分が０〜１００％の濃度で存在し得る場合、または水溶液のｐＨが１〜１４の範囲であり得る場合、これらの固有の限界は具体的に開示される。値が明白に示される場合、示される値とほぼ同じ量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）または量（ａｍｏｕｎｔ）の値もまた、本発明の範囲内であることが理解されるべきである。組み合わせが開示される場合、その組み合わせの要素のそれぞれのサブコンビネーション（ｓｕｂｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）もまた具体的に開示され、そして本発明の範囲内である。本発明の任意の要素が、複数の選択肢を有するとして開示される場合、それぞれの選択肢が単一で除外されるか、または他の選択肢との任意の組み合わせで除外される、その発明の例もまた、本明細書により開示される；発明の１つよりも多くの要素が、このような除外を有し得、そしてこのような除外を有する全ての要素の組み合わせは、本明細書中により開示される。
【００３８】
他のように定義されるか、または文脈が明らかに他のように示さない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味である。本明細書に記載される方法および材料と類似するか、もしくは等価である方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得、好ましい方法および材料がここに記載される。
【００３９】
本明細書中で言及される全ての刊行物は、その文献が引用された特定の材料および方法を開示および記載する目的で、参考として本明細書中で援用される。本明細書中で議論される刊行物は、本出願の出願日よりも前のその開示のためだけに提供される。本明細書中のいかなることも、本発明が、先行発明に基づいてこのような開示に先立つ権利がないという承認として理解されるべきではない。
【００４０】
（定義）
本発明の記載において、以下の用語が使用され、そして以下に示すように規定されると意図される。
【００４１】
用語「半導体ナノクリスタル」「ＳＣＮＣ」「量子ドット（ｑｕａｎｔｕｍ　ｄｏｔ）」および「ＳＣＮＣＴＭナノクリスタル」は、本明細書中で交換可能に使用され、そして直径が約１ｎｍ以上および約１０００ｎｍ以下またはその間の任意の整数もしくは整数の有理数、好ましくは、直径少なくとも約２ｎｍおよび約５０ｎｍ以下またはその間の任意の整数もしくは整数の有理数、より好ましくは、直径が少なくとも約２ｎｍおよび約２０ｎｍ以下（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ｎｍ）の無機結晶をいう。ＳＣＮＳは、その均一なナノメーターサイズによって特徴付けられる。ＳＣＮＣは、励起の際、電磁放射を放出し得（すなわち、ＳＣＮＣが発光である）、そして１つ以上の第１半導体材料の「コア」を含み、そして第２半導体材料の「殻（ｓｈｅｌｌ）」によって囲まれ得る。半導体殻によって囲まれたＳＣＮＣコアは、「コア／殻」ＳＣＮＣと称される。この周囲の「殻」材料は、好ましくは、コア材料のバンドギャップエネルギーよりも大きいバンドギャップエネルギーを有し、そして「コア」基材の原子間隔に近い原子間隔を有するように選択され得る。このコアおよび／または殻は、ＩＩ〜ＶＩ族の半導体材料（ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅなど）、およびＩＩＩ〜Ｖ族（ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂなど）およびＩＶ族（Ｇｅ、Ｓｉ、など）の材料、ＰｂＳｅ、ならびに合金またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない半導体材料であり得る。好ましい殻材料としては、ＣｄＳおよびＺｎＳが挙げられる。
【００４２】
ＳＣＮＣは、有機キャッピング剤の「コート」によって、必要に応じて囲まれる。この有機キャッピング剤は、多数の材料であり得、しかしＳＣＮＡ表面に対して親和性を有する。一般に、このキャッピング剤は、単離された有機分子、ポリマー（または重合反応のためのモノマー）、無機複合体、または結晶構造であり得る。このコートを使用して、溶解度（例えば、コートされたＳＣＮＣを選択した溶媒中に均一に分散させる能力）、官能基、結合特性などを伝達し得る。さらに、このコートは、ＳＣＮＣの光学特性を変更するために使用され得る。
【００４３】
従って、本明細書中で使用される用語「半導体ナノクリスタル」「ＳＣＮＣ」「量子ドット」および「ＳＣＮＣＴＭナノクリスタル」は、コートされたＳＣＮＣコア、ならびにコア／殻ＳＣＮＣを含む。
【００４４】
「単分散粒子」は、集団中の粒子の少なくとも６０％、より好ましくはその集団中の粒子の約７５〜９０％、またはその間の任意の整数％が、特定の粒子サイズ範囲に入る、粒子の集団を含む。単分散粒子の集団は、直径において１０％ｒｍｓ（平方自乗平均）未満偏向し、そして好ましくは５％ｒｍｓ未満偏向する。
【００４５】
句「１以上のサイズのＳＣＮＣ」は、句「１以上の粒子サイズ分布のＳＣＮＣ」と同義的に使用される。当業者は、特定の粒子サイズのＳＣＮＣが、実際には粒子サイズの分布として得られることを理解する。
【００４６】
用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、本明細書中で交換可能に使用されて、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態をいい、そしてリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、これらのアナログ、またはこれらの混合物を含み得る。この用語は、分子の一次構造のみをいう。従って、この用語は、三本鎖、二本鎖、および一本鎖のデオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）ならびに三本鎖、二本鎖、および一本鎖のリボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。また、ポリヌクレオチドの改変形態（例えば、アルキル化および／またはキャッピングによる）ならびに非改変形態が含まれる。より詳細には、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）（これらは、スプライシングされたかまたはスプライスシングされていない、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡおよびｍＲＮＡを含む）、（プリン塩基またはピリミジン塩基のＮ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである）任意の他の型のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー（例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルフォリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、ＯｒｅｇｏｎからＮｅｕｇｅｎｅとして市販される）ポリマー）、ならびに他の合成配列特異的核酸ポリマー（ただし、これらのポリマーは、ＤＮＡおよびＲＮＡに見出されるような塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする配置で核酸塩基を含む）を含む。用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」の間には、長さの区別は意図されておらず、これらの用語は、本明細書中で交換可能に使用される。これらの用語は、分子の一次構造のみをいう。従って、これらの用語は、例えば、３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’Ｐ５’ホスホラミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、２’−Ｏ−アルキル置換ＲＮＡ、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡ、そしてこれらのハイブリッド（例えば、ＤＮＡとＲＮＡとの間のハイブリッドあるいはＰＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間のハイブリッドを含む）を含み、また、既知の型の改変（例えば、標識、アルキル化、「キャップ」、アナログによる１以上のヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間の改変（例えば、非荷電連結（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホラミダート、カルバメートなど）による改変、負荷電連結（例えば、ホスホロチオン酸塩、ホスホロジチオン酸塩など）による改変、正荷電連結（例えば、アミノアルキルホスホラミダート、アミノアルキルホスホトリエステル）による改変）、ペンダント部分（例えば、タンパク質（酵素（例えば、ヌクレアーゼ）、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む）を含む改変、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有する改変、キレート（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属などの）を含む改変、アルキル化剤を含む改変、改変された連結（例えば、αアノマー化核酸など）を有する改変、ならびにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの非改変形態を含む。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、既知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、改変された他の複素環式塩基もまた含むこれらの部分を含むことが明らかである。このような改変としては、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、あるいは他の複素環式が挙げられる。改変ヌクレオチドまたはヌクレオシドはまた、糖部分への改変を含み得る（例えば、ここで、１以上の水酸基が、ハロゲン、脂肪族基で置換されるか、またはエーテル、アミンとして官能化される、など）。用語「ヌクレオチド単位」は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを含むことが意図される。
【００４８】
さらに、ヌクレオチド単位に対する改変としては、それぞれの相補的ピリミジンまたはプリンに対する水素結合を形成するプリンまたはピリミジン塩基上の官能基の、再編成、付加、置換または他の変更が含まれる。生じた改変ヌクレオチド単位は、必要に応じて、他のこのような改変ヌクレオチド単位と塩基対を形成し得るが、Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵとは塩基対を形成しなくてもよい。そのポリヌクレオチドの機能を妨げない塩基部位が、組み込まれ得る。このヌクレオチドにおけるこれらの残基のいくつかまたは全ては、必要に応じて、１以上の方法で改変される。
【００４９】
標準的なＡ−Ｔ塩基対およびＣ−Ｇ塩基対は、それぞれ、チミジンのＮ３−ＨおよびＣ４−オキシとアデノシンのＮ１およびＣ６−ＮＨ２との間で、ならびにそれぞれ、シチジンのＣ２−オキシ、Ｎ３およびＣ４−ＮＨ２とグアノシンのＣ２−ＮＨ２、Ｎ’−ＨおよびＣ６−オキシとの間で水素結合の形成を可能にする条件下で、形成する。従って、例えば、グアノシン（２−アミノ−６−オキシ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）は、改変されて、イソグアノシン（２−オキシ−６−アミノ−９−β−Ｄ−リボフラノシル−プリン）を形成し得る。このような改変は、もはやシトシンとの標準的な塩基対を効果的に形成しない、ヌクレオシド塩基を生じる。しかし、イソシトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−アミノ−４−オキシ−ピリミジン）を形成するシトシン（１−β−Ｄ−リボフラノシル−２−オキシ−４−アミノ−ピリミジン）の改変は、グアノシンと効果的に塩基対を形成しないがイソグアノシンと塩基対を形成する、改変ヌクレオチドを生じる。イソシトシンは、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手可能であり；イソシチジンは、Ｓｗｉｔｚｅｒら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３２：１０４８９−１０４９６およびそこで引用される参考文献に記載の方法によって調製され得；２’−デオキシ−５−メチル−イソシチジンは、Ｔｏｒら（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：４４６１−４４６７およびそこで引用される参考文献の方法によって調製され得；そしてイソグアニンヌクレオチドは、Ｓｗｉｔｚｅｒら（１９９３）（前出）およびＭａｎｔｓｃｈら（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５９３−５６０１に記載の方法またはＣｏｌｌｉｎｓらに対する米国特許第５，７８０，６１０号に記載の方法を使用して調製され得る。他の非天然の塩基対は、２，６−ジアミノピリミジンおよびその相補体（１−メチルピラゾール−［４，３］ピリミジン−５，７−（４Ｈ，６Ｈ）−ジオン）の合成のためのＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ　３４３：３３−３７に記載の方法によって合成され得る。固有の塩基対を形成する他のこのような改変ヌクレオチド単位（例えば、Ｌｅａｃｈら（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：３６７５−３６８３およびＳｗｉｔｚｅｒら（前出）に記載のヌクレオチド単位）は、公知である。
【００５０】
「核酸プローブ」および「プローブ」は、交換可能に使用され、そして上に定義されたようなポリヌクレオチドを含む構造をいい、これは、対応する標的に結合し得る核酸配列を含む。プローブのポリヌクレオチド領域は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、ならびに／あるいは合成ヌクレオチドアナログによって構成され得る。
【００５１】
「相補的」または「実質的に相補的」は、ヌクレオチド間または核酸間（例えば、二本鎖ＤＮＡ分子のその２本の鎖の間、あるいはヌクレオチドプライマーと配列決定または増幅される一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間）で、ハイブリダイズまたは塩基対形成する能力をいう。相補的なヌクレオチドは、一般的に、ＡおよびＴ（または、ＡおよびＵ）、またはＣおよびＧである。２本の一本鎖ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子は、一方の鎖のヌクレオチドが、適切なヌクレオチド挿入または欠失と共に最適に整列化および比較されて、もう一方の鎖のヌクレオチドの少なくとも約８０％、通常には、少なくとも約９０％〜９５％、そしてより好ましくは、約９８％〜１００％と対形成する場合に、実質的に相補的であるといわれる。
【００５２】
あるいは、実質的な相補性は、ＲＮＡ鎖またはＤＮＡ鎖がその相補体に対して選択的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合に存在する。代表的には、選択的なハイブリダイゼーションは、少なくとも１４〜２５ヌクレオチドのストレッチにわたって少なくとも約６５％相補的であり、好ましくは、少なくとも約７５％、より好ましくは、少なくとも約９０％相補的である場合に生じる。Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２：２０３（１９８４）を参照のこと。
【００５３】
「優先的な結合」または「優先的なハイブリダイゼーション」とは、少なくとも１組のハイブリダイゼーション条件下での、あるポリヌクレオチドがサンプル中の非相補的ポリヌクレオチドと比較してそのサンプル中の相補的な標的ポリヌクレオチドに結合する傾向の増加、またはそのあるポリヌクレオチドが内部二次構造（例えば、ヘアピン構造またはステム−ループ構造）を形成する傾向と比較してそのサンプル中の相補的な標的ポリヌクレオチドに結合する傾向の増加をいう。
【００５４】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、代表的に、約１Ｍ未満、より通常には、約５００ｍＭ未満、そして好ましくは、約２００ｍＭ未満の塩濃度を含む。ハイブリダイゼーション温度は、５℃程度に低くあり得るが、代表的には、２２℃より高く、より代表的には、約３０℃より高く、そして好ましくは、約３７℃を超える。より長いフラグメントほど、特異的なハイブリダイゼーションのためにより高いハイブリダイゼーション温度を必要とし得る。他の因子が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響し得る。これらの因子としては、相補鎖の塩基の組成および長さ、有機溶媒の存在、ならびに塩基ミスマッチの程度が挙げられ、そして、使用されるパラメーターの組み合わせが、任意の１つパラメーター単独の完全な尺度よりも重要である。制御され得る他のハイブリダイゼーション条件としては、緩衝液の型および濃度、溶液のｐＨ、バックグラウンドの結合を減少させるブロッキング剤（例えば、反復配列）またはブロッキングタンパク質溶液の存在および濃度、界面活性剤の型および濃度、ポリヌクレオチドの相対濃度を増大させるポリマーのような分子、金属イオンおよびそれらの濃度、キレート剤およびその濃度、ならびに当該分野で公知の他の条件が挙げられる。より低いストリンジェンシーの、そして／またはより生理学的な、ハイブリダイゼーション条件は、標識されたポリヌクレオチド増幅産物が、ＰＣＲ増幅中にモニターされるリアルタイムアッセイ（例えば、分子ビーコンアッセイ）の間に、相補的なプローブポリヌクレオチドが連結した基板に、周期的に結合および解離（ｃｙｃｌｅ　ｏｎ　ａｎｄ　ｏｆｆ）する場合に使用される。このような、ストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件もまた、本方法の他の局面（例えば、逆転写またはＰＣＲ）に効果的な溶液条件を含み得る。
【００５５】
用語「アプタマー」（または「核酸抗体」）とは、その形状によって所望の標的分子を認識して結合する一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドをいうために、本明細書中で使用される。例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／１４８４３、ＷＯ９１／１９８１３およびＷＯ９２／０５２８５を参照のこと。
【００５６】
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で交換可能に使用され、そしてペプチド結合を介して連結したアミノ酸の分子鎖を含む。これらの用語は、特定の長さの産物を言及しない。従って、「ペプチド」、「オリゴペプチド」および「タンパク質」は、ポリペプチドの定義の範囲内に含まれる。これらの用語には、［転写後の］ポリペプチドの改変（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、および硫酸化）を含むポリペプチドが含まれる。さらに、タンパク質フラグメント、アナログ（遺伝コードによってコードされないアミノ酸（例えば、ホモシステイン、オルニチン、Ｄ−アミノ酸、およびクレアチン）を含む）、天然または人工の変異体または改変体あるいはこれらの組み合わせ、融合タンパク質、誘導体化残基（例えば、アミノ基のアルキル化、カルボキシル基のアセチル化またはエステル化）などが、ポリペプチドの意味の範囲内に含まれる。
【００５７】
用語「基材」および「支持体」は、交換可能に使用されて、硬質または半硬質の表面を有する材料をいう。
【００５８】
本明細書中で使用される場合、用語「結合対」は、サンプル中の他の成分に対してよりも高い親和性で互いに特異的に結合する第一の分子および第二の分子をいう。結合対のメンバー間の結合は、代表的には、非共有結合的である。例示的な結合対としては、免疫学的結合対（例えば、対応する抗体または結合部分もしくはこれらのフラグメントと組み合わせた、任意のハプテン化合物または抗原性化合物（例えば、ジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン、フルオレセインおよび抗フルオレセイン、ジニトロフェノールおよび抗ジニトロフェノール、ブロモデオキシウリジンおよび抗ブロモデオキシウリジン、マウス免疫グロブリンおよびヤギ抗マウス免疫グロブリン））ならびに非免疫学的結合対（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、ホルモン［例えば、チロキシンおよびコルチゾール］−ホルモン結合タンパク質、レセプター−レセプターアゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、アセチルコリンレセプター−アセチルコリンまたはそのアナログ）、ＩｇＧ−プロテインＡ、レクチン−糖質、酵素−酵素補因子、酵素−酵素インヒビター、そして核酸二重鎖を形成し得る相補的ポリヌクレオチド対）などが挙げられる。結合対のメンバーの一方または両方は、さらなる分子に結合体化され得る。
【００５９】
「ＳＣＮＣ結合体」は、上記で定義したように、オリゴヌクレオチドに連結されたＳＣＮＣである。
【００６０】
ＳＣＮＣが、ポリヌクレオチドに結合されているかまたは物理的に会合されている場合、ＳＣＮＣは、ポリヌクレオチドに「連結されている」かまたは「結合体化されている」、あるいは化学的に「会合されている（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」る。従って、これらの用語は、ＳＣＮＣが、ポリヌクレオチドに直接連結され得るかまたはリンカー部分を介して（例えば、化学的リンカーを介して）連結され得ることを意図する。これらの用語は、例えば、共有化学結合、物理的力（例えば、ファンデルワールスまたは疎水性相互作用）、カプセル化、包埋などによって物理的に連結されるものを示す。例えば、ナノクリスタルは、ビオチンと会合され得、これが、タンパク質（アビジンおよびストレプトアビジン）に結合し得る。
【００６１】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」としては、ポリクローナルおよびモノクローナル調製物の両方から得られる抗体、ならびに：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えば、Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３４９：２９３−２９９；および米国特許第４，８１６，５６７号を参照のこと）；Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）フラグメント；Ｆｖ分子（非共有結合へテロ二量体、例えば、Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　６９：２６５９−２６６２；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９：４０９１−４０９６を参照のこと）；単鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば、Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８５：５８７９−５８８３を参照のこと）；二量体および三量体抗体フラグメント構築物；ミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）（例えば、Ｐａｃｋら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ　３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒら（１９９２）Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１４９Ｂ：１２０−１２６を参照のこと）；ヒト化抗体分子（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４−１５３６；および１９９４年９月２１日に公開された英国特許公開番号ＧＢ２，２７６，１６９を参照のこと）；およびこのような分子から得られる任意の機能的フラグメントが挙げられ、ここで、このようなフラグメントは、親抗体分子の特異的結合特性を保持する。
【００６２】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、均質な抗体集団を有する抗体組成物をいう。この用語は、抗体の種または供給源に関して限定されず、また作製される様式によっても限定されないことが意図される。従って、この用語は、マウスハイブリドーマから得られた抗体、およびヒトハイブリドーマを使用して得られたヒトモノクローナル抗体またはヒト免疫グロブリン鎖遺伝子もしくはその部分を発現するマウスから作製されたマウスハイブリドーマから得られたヒトモノクローナル抗体を含む。例えば、Ｃｏｔｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ、１９８５、７７頁を参照のこと。
【００６３】
「均質なアッセイ」は、移動工程、分離工程または洗浄工程なしに実行されるアッセイの１つである。従って、例えば、均質な高スループットスクリーニング（「ＨＴＳ」）アッセイは、容器（例えば、試験管またはサンプルウェル）への試薬の最初の添加、その後のこの容器からの結果物の検出を含む。均質なＨＴＳアッセイは、容器中の任意の場所（例えば、溶液中、容器の表面、または容器中に配置されたビーズ上もしくは表面上）で実施され得る。代表的に使用される検出システムは、蛍光、化学ルミネセンス、またはシンチレーション検出システムである。
【００６４】
本明細書中の「多重化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｉｎｇ）」とは、複数のプローブポリヌクレオチドが１より多いＳＣＮＣを使用して同時にアッセイされ得る、アッセイまたは他の分析方法をいい、これらのＳＣＮＣの各々は、少なくとも１つの異なる蛍光特徴（例えば、励起波長、発光波長、発光強度、ＦＷＨＭ（半波高全幅値）または蛍光寿命）を有する。多重化はまた、１より多いＳＣＮＣの組み合わせが、単一のプローブポリヌクレオチドを検出するために使用され得る、アッセイまたは方法を含む。
【００６５】
例えば、２つの異なるＳＣＮＣの調製物は、同じ組成を有し得るが、粒子のサイズが異なり得、したがって、励起波長および／または発光波長において、異なり得る。または、２つの異なる調製物は、同じ粒子サイズであるか、または同じ粒子サイズ分布であり得るが、組成が異なり得、したがってまた、励起波長および／または発光波長において、異なり得る。異なるＳＣＮＣの成分を有する異なる調製物は、異なる蛍光の生存期間を有し得、したがって、これらの発光スペクトルは、これらが同じ発光波長および強度を有する場合でも、例えば、励起後異なる時点でコードされた物質からの発光をサンプリングすることにより区別され得る。ＦＷＨＭにおける違いは、例えば、異なる組成のＳＣＮＣまたは同じ組成であるが別々に合成されたＳＣＮＣを用いることによって達せられ得るか、または共にオーバーラップする発光ピークを有する異なるＳＣＮＣ「調製物」を混合して新たな調製物を形成することにより、達せられ得る。
【００６６】
公知の発光波長および／または強度を有するＳＣＮＣは、本明細書で規定されるポリヌクレオチドに結合したＳＣＮＣを含み得て、結合体において利用される他のＳＣＮＣの波長および／または強度を較正するための内部標準を提供する。
【００６７】
「任意の」または「必要に応じて」は、引き続いて記載される事象または環境が、生じ得るか、生じ得ないことを意味し、この記載は、事象または環境が生じる場合、および生じない場合を含む。例えば、ＳＣＮＣに関して、句「有機キャップ因子の「コート」によって必要に応じて囲まれる」は、ＳＣＮＣがこのようなコートを有し、そしてＳＣＮＣがこのようなコートを欠くことを含む。
【００６８】
（基材）
基材は、広範囲の物質（生物学的物質、非生物学的物質、有機物質、無機物質、またはこれらの任意の組み合せのいずれか）を含み得る。例えば、基材は、ポリマー化したＬａｎｇｍｕｉｒ　Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム、機能性ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、ＳｉＯ２、ＳｉＮ４、改変シリコン、あるいは（ポリ）テトラフルオロエタン、（ポリ）ビニリデンジフルオロキシド、ポリスチレン、架橋したポリスチレン、ポリアクリル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチドコグリコリド（ｌａｃｔｉｄｅ　ｃｏｇｌｙｃｏｌｉｄｅ））、ポリ無水物、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチレン−コ−ビニル（ｃｏ−ｖｉｎｙｌ）酢酸）、ポリシロキサン、シリカポリマー、ラテックス、デキストランポリマー、エポキシ、ポリ炭酸、またはこれらの組み合せのような広範な種々のゲルまたはポリマーのうちいずれか１つであり得る。
【００６９】
基材は、平面の結晶性基材（例えば、シリカベースの基材（例えば、ガラス、石英等）、または例えば、半導体産業およびマイクロプロセッサ産業において使用されるような結晶性基材（例えば、シリコン、ヒ化ガリウムなど）であり得る。
【００７０】
シリカエアロゲルはまた、基材として利用され得、そして当該分野で公知の方法によって調製され得る。エアロゲル基材は、独立した状態の基材としてか、または別の基材材料についての表面被覆として利用され得る。
【００７１】
基材は、任意の形態をとり得て、代表的には、プレート、スライド、ビーズ、ペレット、ディスク、粒子、鎖、沈殿物、必要に応じて、多孔性ゲル、シート、チューブ、球、容器、キャピラリー、パッド、スライス、フィルム、チップ、マルチウェルプレートもしくはディシュ、光ファイバーなどである。代表的に基材は、イナニメイトの形態をとるが、いくつかの適用（例えば、フローサイトメトリーまたはインサイチュハイブリダイゼーション）について、基材は、剛体または半剛体である任意の形態（例えば、細胞、組織、器官または核）をとり得、そして必要に応じて、固定され得る。基材は、プローブポリヌクレオチドが位置する、惹起された領域または抑制された領域を含み得る。基材の表面は、周知の技術を用いてエッチングされて、所望される表面特性（例えば、トレンチ構造、Ｖ−溝構造、中間構造等）を提供し得る。
【００７２】
基材の表面は、基材と同じ材料から構成され得るか、または異なる材料から作られ得、そして化学的方法または物理的方法によって基材に結合され得る。このような結合した表面は、任意の広範な種々の材料（例えば、ポリマー、プラスチック、樹脂、ポリサッカライド、シリカ、もしくはシリカベースの材料、炭素、金属、無機ガラス、膜、または任意の上に挙げた基材材料から構成され得る。１つの実施形態において、表面は、光学的に透明であり、表面にＳｉ−ＯＨ官能基（例えば、シリカ表面に見出される）を有する。
【００７３】
基材および／またはその光学的表面は、利用される合成方法および／または検出方法について適切な光学的特性を提供するよう選択する。基材および／または表面は、透明であり得、複数の方向から適用される光によって基材の露出を可能にする。基材および／または表面は、反射する「鏡」構造を提供されて、半導体ナノ結晶によって、発せられる光の回収率を増大する。
【００７４】
基材および／またはその表面は、一般に使用の際に露出される状態に対して抵抗性であるか、抵抗するよう処理されて、このような状況に露出された後、任意の抵抗性材料を除去するように必要に応じて処置されえる。
【００７５】
標的は、任意の適切な方法（例えば、米国特許第５，１４３，８５４号、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９２／１００９２、１９９０年１２月６日に提出された米国特許出願番号０７／６２４，１２０（現在、放棄されている）、Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５１：７６７〜７７７（１９９１）、およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１５０７０に開示の方法）で基材上に組みたてられ得るか、または付着され得る。機械的合成ストラテジーを用いたこれらのアレイの合成についての技術は、例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９３／０９６６８および米国特許第５，３８４，２６１号に記載される。
【００７６】
なおさらなる技術は、ビーズベースの技術（例えば、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／０４１４５に記載される）およびピンベースの方法（例えば、米国特許第５，２８８，５１４号に記載される）を含む。
【００７７】
基材への標的の接着に適用可能なさらなるフローチャネルまたはスポッティングの方法は、１９９２年１１月２０日に提出された米国特許出願番号０７／９８０，５２３および米国特許第５，３８４，２６１号に記載される。試薬は、（１）前に規定された範囲で規定されるチャネル内の流れ、または（２）前に規定された範囲の「スポッティング」、のいずれかによって基材に送達される。保護被覆（例えば、親水性または疎水性被覆（溶媒の性質に依存する））を、時々、他の領域において反応溶液によって浸潤を容易にする材料の組み合せにおいて、保護すべき基材の部分にわたって用い得る。この様式において、流れる溶液はさらに、設計されたフロー経路の外を通過するのを防ぐ。
【００７８】
代表的な分注器は、マイクロピペット（必要に応じてロボット制御される）、インクジェットプリンター、一連のチューブ、多枝管、ピペットのアレイ等を含み、その結果、種々の試薬は、連続してまたは同時に反応領域に送達され得る。
【００７９】
（ミクロスフェア基材）
好ましい実施形態において、基材は、ミクロスフェアの形態であり得る。ポリマー化ミクロスフェアまたはビーズは、種々の異なるポリマーから調製され得、このポリマーには、以下を含むがこれらに限定されない；ポリスチレン、架橋したポリスチレン、ポリアクリル、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（ラクチドコグリコシド）、ポリ無水物、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（エチレン−コ−ビニル酢酸）、ポリシロキサン、シリカポリマー、ラテックス、デキストランポリマー、およびエポキシ。この材料は、膨潤および間隙率に関する種々の異なる特性を有し、これは、当該分野で周知である。好ましくは、ビーズは、約１０ｎｍ〜１ｍｍの範囲のサイズであり、溶液に懸濁される場合、通常の溶液技術を用いて操作され得る。用語「ビーズ」、「球」、「マイクロビーズ」および「ミクロスフェア」は、本明細書で交換可能に使用される。
【００８０】
複数のこのようなビーズまたは異なるビーズ集団の混合物は、平面表面に固定され得、その結果、これらは、任意の適切な方法を用いて、選択された位置にきちんと配置される。例えば、特定の位置において架橋された１つのビーズに対して、ビーズは、マイクロマシニングウェルによって、固定され得るか（ここでビーズは、表面に包括され得る）、または光での活性化を用いて表面上でパターン化された活性化ポリマーによって固定され得る。適切なウェルは、焦点レーザーを用いてガラス表面上に沈着されたポリエチレン層においての切断サイクルによって産生され得る。ウェルの大きさは、１つのビーズがウェル単位で捕捉され得るよう選ばれ、横方向に流れる流体の流れが表面にわたって通過する場合、捕獲されつづける。例えば、７マイクロのウェルは、直径約４μｍ〜６μｍのビーズの分析のために容易に利用され得る。これは光ファイバーの末端上で実施され得る。
【００８１】
（スペクトルについてコードされたミクロスフェア）
ミクロスフェアは、ＳＣＮＣの取りこみを介してスペクトルについてコードされる。所望されるミクロスフェアの蛍光特性は、異なるサイズおよび／または組成物のＳＣＮＣを、固定された量および割合で混合することによって得られ得て、所望のスペクトルを得ることができ、これは、ミクロスフェアと結合する前に決定され得る。染色溶液を用いたミクロスフェアの引き続く処理（例えば、共有結合、共重合化、または受動性の吸着、もしくは吸収を介する）は、設計された蛍光特性を有する材料を生じる。
【００８２】
必要とされる蛍光特性に達するように多くのＳＣＮＣ溶液（各々サイズおよび組成の異なる分布を有する各々）が、調製され得る。これらの溶液は、既定された割合を有するスペクトルおよび溶液に懸濁された異なるＳＣＮＣからの発光強度に達するように固定された比率で混合される。光源に対するこの溶液の曝露の際、発光スペクトルが、当該分野で周知の技術によって測定され得る。スペクトルが所望のスペクトルでない場合、所望のスペクトルに達するのに必要とされるさらなるＳＣＮＣ溶液が、添加され得、この溶液は「適定されて」、正しい発光スペクトルを有することができる。これらの溶液は、溶媒に分散したＳＣＮＣのコロイド溶液であり得るか、またはこれらは、重合される前のコロイド溶液であり得、含まれるＳＣＮＣを用いてマトリックスを形成するよう重合され得る。
【００８３】
染色溶液の組成は、調整されて、（好ましくは、解読に使用され得る正しい励起源のもとで）所望の蛍光特性を有し得る。フィードバック回路につながれたマルチチャネルの自動ピペッタ−を用いて、上記の所望のスペクトル特性を有するＳＣＮＣ溶液を調製し得る。適定装置／ピペッターのいくつかのチャネルは、いくつかの独特のＳＣＮＣ溶液（各々、独特の励起スペクトルおよび発光スペクトルを有する）で充填され、ついでこれらは、貯蔵溶液の添加によって段階的に組み合され得る。
【００８４】
一旦、染色溶液が調製されると、これを用いて、所定のビーズ集団に独特のスペクトルコードを取りこみ得る。ビーズにＳＣＮＣを取り込む方法が吸着または、吸収である場合、染色溶液に使用される溶媒は、膨潤ミクロスフェアに適切であり、そしてミクロスフェアの組成に基づいて選択され得る溶媒である。膨潤ミクロスフェアに対する代表的な溶媒は、ミクロスフェア材料がより可溶性であるもの（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム、ジメチルホルアミド、テトラヒドロフランなど）を含む。これらは、ミクロスフェアが可溶性を損なう溶媒（例えば、メタノール、またはエタノール）と混合され得、材料への染色溶液の取りこみの程度および割合を調節し得る。
【００８５】
染色溶液が添加され、比例して、染色溶液に存在する複数のＳＣＮＣが取りこまれる場合、ミクロスフェアは膨潤する。材料から染色溶液を除去した後、非膨潤溶媒が、添加され、材料は縮小されるか膨潤せず、従って、材料中でＳＣＮＣを捕獲する。あるいは、ＳＣＮＣは、材料から膨潤溶媒のエバポレーションによって捕獲され得る。ＳＣＮＣが懸濁され得る非膨潤溶媒で洗浄された後、ＳＣＮＣは、材料中に捕獲され、そして非膨潤溶媒のさらなる使用によって維持され得る。代表的に、非膨潤溶媒はヘキサンおよびトルエンを含む。このようなコードされたビーズは、光源の下での発光スペクトルに変化なく分離され得、そして種々の溶媒に曝露され得る。使用される材料がポリマービーズの場合、材料は、適切な任意の技術（例えば、遠心、蒸発、流動層乾燥など）または手順の組み合せによって洗浄溶媒から分離され得、そして懸濁緩衝液中で界面活性剤の使用を介して、水性溶媒および緩衝液中に分散され得る。
【００８６】
染色の工程はまた、連続した手順で実施され得る。第１の染色溶液を用いて、ＳＣＮＣの１つの集団でビーズを染色し得る。ビーズは、第１の染色溶液から分離され得、そして第２の染色溶液に添加されて、第２のＳＣＮＣ集団でビーズを染色する。これらの工程は、光源によって励起される場合、所望のスペクトル特性が材料から得られるまで繰り返され得る。
【００８７】
ＳＣＮＣは、共有結合によって、および膨潤したビーズに取りこまれることによってビーズに接着され得るか、または結合対の１つの部分をビーズに結合した他の部分に結合し得る。例えば、ＳＣＮＣは、多くの技術によって調製され得、ＳＣＮＣの表面上で反応基を生じる。例えば、Ｂｒｕｃｈｅｚｔら、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８１：２０１６〜２０１８、Ｃｈａｎら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８１：２０１６〜２０１８、Ｃｏｌｖｉｎｔら、（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：５２２１〜５２３０、Ｋａｔａｒｉら、（１９９４）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．９８：４１０９〜４１１７、Ｓｔｅｉｇｅｒｗａｌｄら、（１９８７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：３０４６を参照のこと。ＳＣＮＣの表面上に存在する反応基は、材料の表面上に存在する反応基に結合し得る。例えば、これらの表面上に存在するカルボキシ基を有するＳＣＮＣは、カルボジイミド活性化工程を用いてアミノ基をビーズに結合し得る。
【００８８】
ＳＣＮＣをビーズに結合し、ＳＣＮＣまたはビーズの特性に悪影響しない任意の架橋方法を用い得る。架橋方法において、異なるＳＣＮＣの相対量を用いて、相対的強度を制御し得、一方、絶対的強度は、反応時間を制御することによって制御されて、合計の反応部位の数を制御し得る。ビーズがＳＣＮＣに架橋された後、ビーズは、必要に応じて洗浄され、未反応のＳＣＮＣを洗い流す。
【００８９】
ビーズをコードするのに十分な量の発蛍光団を使用しなければならず、その結果発蛍光団からの発光強度は、利用される検出系によって検出され得、異なる強度レベルは、識別可能であるはずであり、ここで強度は、コードスキームにおいて利用可能であるが、ビーズをコードするのに用いられるＳＣＮＣまたは他の発蛍光団からの蛍光発光は、強くなく、スキームを解読するのに用いられる検出器を飽和させないはずである。
【００９０】
（コードするスキーム）
１つ以上の異なる既知の捕獲プローブが結合されるビーズまたは他の基材は、コードされて、ビーズの迅速な分析を可能にし、したがって、プローブの捕獲、同定、および多重化を可能にする。コードするスキームは、好ましくは、１つ以上の異なるＳＣＮＣを用いるが、種々の添加される因子（発色団、発蛍光団、ならびに色素、およびこれらの組み合せを含む）は、代替的かまたはＳＣＮＣとの組み合わせにおいて利用され得る。有機色素について区別可能な蛍光特性を有する異なる色素を使用し得る。十分なスペクトルデータが集められ、集団の区別を可能にし得る場合に、同じピークの発光波長を有するがピーク幅が異なる、異なるＳＣＮＣ集団を用いて、異なるコードを作り得る。このような異なる集団はまた、混合され、中間のライン幅を生じ得、したがってより特有のコードを生じ得る。
【００９１】
１つのビーズまたは基材の位置をコードするのに利用されるＳＣＮＣの数は、特定の適用に基づいて選択され得る。１つのＳＣＮＣは、検出され得るが；しかし所定の集団由来の複数のＳＣＮＣは、１つのビーズにおいて好ましく取りこまれ、各ビーズからのより強い、より持続的な発光シグナルを提供し、従って、短い分析時間を可能にする。
【００９２】
約１ｎｍ離れたピーク波長を有する異なるＳＣＮＣ集団が調製され得、そして個々のＳＣＮＣのピーク波長は、１ｎｍの正確さで容易に決定され得る。単一ピークのスペクトルコードの場合には、各波長は異なるコードである。例えば、ＣｄＳｅ　ＳＣＮＣは、約４９０〜６４０ｎｍの発光波長の範囲を有し、従って、１ｎｍの分解能で約１５０の単一ピークコードを発生させるために使用され得る。
【００９３】
最小のスペクトルオーバーラップを有する高度に分離されたスペクトルピークのみを使用し、そしてこれらのピークにおける厳密な強度調節を必要としない、スペクトルコーディングシステムは、異なるスキームにおいて、約１００，０００〜１０，０００，０００以上の独自のコードを可能にする。
【００９４】
４９０〜５６５ｎｍのチャネル内の発光波長を有する第１のＳＣＮＣ集団と、５７５〜６５０ｎｍのチャネル内の第２のＳＣＮＣ集団とを組み合わせる、二進化スキームは、７５ｎｍの最小ピーク分離が使用される場合には、１ｎｍで分解されたＳＣＮＣ集団を使用して、３０００の妥当なコードを生じる。このシステムは、多くのピークを含むと説明され得、唯一の要件は、妥当なコードにおけるピーク波長間の最小の分離が、その適用において使用される検出方法によるそれらの分解を可能にするに十分であることである。
【００９５】
３００ｎｍのスペクトル帯域幅、４ｎｍのコーディングピーク分解（すなわち、単一のチャネル内のピークに対する最小ステップサイズ）、５０ｎｍの最小ピーク間間隔、および各コードにおいて６ピークの最大値を使用する二進化は、約２００，０００の異なるコードを生じる。これは、各チャネル内のピークが「オン」または「オフ」のいずれかである、純粋な二進コードを仮定する。第２の「オン」強度を追加すること（すなわち、ここで強度は０、１または２である）によって、潜在的なコードの数は約５百万に増加する。コーディングピーク分解が１ｎｍまで低下する場合には、コードの数は約１×１０１０まで増加する。
【００９６】
所定のコーディングスキームにおける妥当なコードは、アルゴリズムを使用して同定され得る。潜在的なコードは、異なるピーク波長を有する異なるＳＣＮＣ集団の総数に対応するコードにおける数字の数を、コーディングスキームのために使用して、二進コードとして表現される。例えば、１６ビットコードは、５００ｎｍ〜５７５ｎｍまでのピーク発光波長を５ｎｍの間隔で有する、１６の異なるＳＣＮＣ集団を表現し得る。このスキームにおける二進コード１０００　００００　００００　０００１は、５００ｎｍ〜５７５ｎｍまでのピークの存在を表現する。これらの１６ビット数の各々が、隣接するピーク間に必要とされる間隔に依存して、妥当性について評価され得る；例えば、００１０　０１００　００００　００００は、１５ｎｍ以上の間隔を空けたピークが分解され得る場合には妥当なコードであるが、隣接するピーク間の最小の間隔が２０ｎｍでなければならない場合には、妥当ではない。５００〜５７５ｎｍの範囲およびピーク間の５ｎｍの間隔を用いる１６ビットコードを使用して、隣接ピーク間の異なる最小スペクトル間隔に対する異なる数の可能な妥当なコードを、表１に示す。
【００９７】
【表１】
2004500109.tif 000002
区別可能な異なる強度が使用される場合には、妥当なコードの数は劇的に増加する。例えば、コードにおいて隣接ピーク間の１５ｎｍの最小間隔を用いる上記１６ビットコードを使用すると、２つの強度（すなわち、三進化システム）が各ピークに関して使用される場合には、７，３７２の異なる妥当なコードが可能であり、そして四進化システム（すなわち、ここでは３つの「オン」強度が区別可能である）については、３８，１５４の異なる妥当なコードが可能である。
【００９８】
強度を利用するコードは、異なる波長によって励起される場合の個々のＳＣＮＣによって示される吸光率係数の変動に起因して、励起源の正確な合致またはビーズへの内部強度標準の組み込みのいずれかを必要とする。
【００９９】
コーディング手順のために使用される光源が、デコーディングのために使用される光源と可能な限り類似していること（好ましくは、同じ波長および強度のもの）が好ましい。光源は、最終物質の発光スペクトルが染色溶液のスペクトルから推定され得るように、定量的な様式で関連し得る。
【０１００】
（コードされたビーズ結合体）
コードされたビーズ結合体は、第１の蛍光特性を有する第１の半導体ナノクリスタルを含む第１のスペクトルコードを含む、第１のミクロスフィアと結合体化した、第１のポリヌクレオチドを含む。
【０１０１】
第１のポリヌクレオチドは、基材上で直接合成され得るか、または基材とは別に合成されて次いで基材に結合され得る。基材上での直接合成は、プローブポリヌクレオチドのサブユニットと結合したモノマーを、基材を形成するポリマーまたは基材上に堆積したかもしくは結合したポリマーに組み込むこと、次いでプローブポリヌクレオチドの残りの部分をこのサブユニット上に合成することによって、達成され得る。あるいは、この基質もしくはそのコーティングは、合成のために、プローブポリヌクレオチドのサブユニットに結合し得る官能基を含むか、もしくはこの官能基を含むよう誘導体化され得るか、または完全な捕獲プローブに直接結合し得る。適切な結合技術は、当該分野において公知である。
【０１０２】
第１のポリヌクレオチドは、標識され得るかまたは標識され得ない。第１のポリヌクレオチドへの標的ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションの際に、第１のポリヌクレオチドの少なくとも一部は、標的ポリヌクレオチドまたはそこからの増幅産物の少なくとも一部に相補的であり、これは、結合体が生じたことの特徴である、蛍光の変化である。
【０１０３】
第１のポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに対する切断アッセイにおいて使用され得るように、設計され得る。従って、第１のポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに相補的な３’領域、および標的ポリヌクレオチドに相補的でない５’領域を有さなければならないが、コードされたビーズに任意の配向で結合され得る。標的ポリヌクレオチドと相補的な領域および第１のポリヌクレオチドの相補的領域とのオーバーラップを含む、侵入ポリヌクレオチドもまた使用され得る。侵入ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドに対して第１のポリヌクレオチドより高い融解温度を有し、その結果、侵入ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの３’相補的領域の５’末端から少なくとも１つの塩基を移動させ、これによって、第１のポリヌクレオチドがフラップエンドヌクレアーゼによって切断されることを可能にする。フラップエンドヌクレアーゼの存在下での、第１のポリヌクレオチドおよび侵入ポリヌクレオチドの、標的ポリヌクレオチドへの結合は、標的ポリヌクレオチドと相補的な第１のポリヌクレオチドの少なくとも１つのヌクレオチドの、侵入ポリヌクレオチドによる置換の際に、第１のポリヌクレオチドの切断を生じる。第１のポリヌクレオチドが、例えば発蛍光団で遠位端において標識された場合には、このラベルは切断の際に失われ、それに対応する変化をこの結合体の蛍光特性に生じる。その結果、第１のポリヌクレオチドが最初は標識されていない場合には、フラップエンドヌクレアーゼによる切断は、第１のポリヌクレオチドの残基を露出させ得、このことは、蛍光標識が例えば標識されたポリヌクレオチドへの連結を介してかまたは標識されたヌクレオチドの存在下での末端トランスフェラーゼもしくはポリメラーゼの活性を介して、組み込まれることを可能にし、これによって、これに対応する変化をこの結合体の蛍光特性に生じる。ポリメラーゼが使用される位置で「転がる円（ｒｏｌｌｉｎｇ　ｃｉｒｃｌｅ）」型のテンプレートを使用して、切断された第１のポリヌクレオチドの露出した端部から伸長させ得、これが次いで、このテンプレートにハイブリダイズし得る。異なる標的ポリヌクレオチドが関与する切断反応によって侵入ポリヌクレオチド自体が産生される、「侵入自乗（ｉｎｖａｄｅｒ−ｓｑｕａｒｅｄ）」形式を使用して、異なる標的ポリヌクレオチドからのシグナルを増幅することを可能にし得る。このような増幅のさらなる回が可能である。
【０１０４】
第１のポリヌクレオチドはまた、ステム−ループ構造を形成し得る。代表的に、ステム領域は、約４〜７のヌクレオチドを含むが、重要な因子は、第１のポリヌクレオチドが、所望のアッセイ条件下で、標的ポリヌクレオチドの非存在下でステム−ループ構造を形成することである；適切なアッセイ条件は、コンピュータプログラムを使用して予測され得、そして有用なアッセイ条件範囲は、実験的に決定され得る。同様に、ループ領域は、約１５以上のヌクレオチド、代表的には約１５〜１８ヌクレオチドの範囲であるが、再度、重要な因子は、標的ポリヌクレオチドおよび／または増幅産物が、ループ領域の少なくとも一部に結合し得、これによってステム−ループ構造を破壊することである。
【０１０５】
第１のポリヌクレオチドがステム−ループ構造を形成し得、そして標識を含まない場合には、この第１のポリヌクレオチドはプローブポリヌクレオチドと称され得、そして任意の基質と結合体化して、物品を形成し得る。このプローブポリヌクレオチドを使用して、ループプローブのループ部分の少なくとも一部にハイブリダイズすることによって、標的ポリヌクレオチド由来の対応する標識された増幅産物に結合し得、そしてこれによって、ステム−ループの形成を妨害する。次いで、標識された増幅産物の、第１のポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションが、この標識が基質に会合しているか否かを決定することによって、検出され得る；このようなハイブリダイゼーションは、増幅産物アッセイ複合体を形成する。対応する異なる標識された増幅産物にハイブリダイズした異なる配列を有する、複数の異なるプローブポリヌクレオチドを含む増幅産物アッセイアレイもまた、調製され得る。このプローブポリヌクレオチドがコードされたビーズに結合体化する場合には、蛍光標識された増幅産物の結合は、この結合体の蛍光特徴に変化を生じさせる。
【０１０６】
（ステム−ループ構造）
第１のポリヌクレオチドまたはプローブポリヌクレオチドは、ステム−ループ構造を形成し得、ここで、第１および第２の相補的な配列が互いにハイブリダイズして、ステムを形成し、そしてこれらの間に位置する第３の配列が、少なくとも１セットのハイブリダイゼーション条件下で、ループを形成する。第３の配列は、この配列の少なくとも一部が増幅産物の少なくとも一部と相補的であるように設計され、その結果、プローブポリヌクレオチドの増幅産物へのハイブリダイゼーションの際に、ステム−ループ構造がアンフォールドする。増幅産物に相補的なプローブポリヌクレオチドの部分は、第１および第２の相補配列のいずれかまたは両方の部分をさらに含み得るか、または全体がループ配列の内部に存在し得、そしてループ配列全体またはその一部のみであり得る。増幅産物に相補的なプローブポリヌクレオチドの部分は、増幅産物の全てまたは一部と相補的であり得る。プローブポリヌクレオチドに対する唯一の要件は、少なくとも１セットのハイブリダイゼーション条件下でステム−ループ構造が形成されることであるが、このプローブポリヌクレオチドは、実施されているアッセイの間のある時点において起こる少なくとも１セットのハイブリダイゼーション条件下でステム−ループ構造を形成するよりむしろ、増幅産物と優先的にハイブリダイズする。
【０１０７】
（分子ビーコン）
第１のポリヌクレオチドがステム−ループ構造を含む場合には、この第１のポリヌクレオチドは、分子ビーコンの形態であり得る。この改変物において、結合体は、クエンチャーおよび発蛍光団を含み、これらのうちの少なくとも一方は、第１のポリヌクレオチドの遠位端またはその近くに、直接的にかまたは間接的に結合している。これらのクエンチャーおよび発蛍光団の他方は、第１のポリヌクレオチドの近位端またはその近く、あるいはビーズの表面に、直接的にかまたは間接的に結合する。この配置におけるクエンチャーおよび発蛍光団は、ステム−ループ構造が形成される場合にこの発蛍光団からの蛍光発光が消光され、そして第１のポリヌクレオチドが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする場合にはこの発蛍光団から放出される蛍光発光が消光されないような型のものであり、そしてこのように配置される。１つの改変物において、発蛍光団とクエンチャーとの両方である、自己消光色素を使用し得、そしてステム−ループ構造におけるその位置は、所望のように変化し得、その結果、その蛍光発光は、ステム−ループ構造が形成される場合に、消光されるかまたは消光されないかのいずれかであり、標的ポリヌクレオチドが結合する場合に、その逆が起こる。
【０１０８】
あるいは、消光可能な色素を使用し得、これは、分子ビーコンにおける別個のクエンチャーの必要性を排除する（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／１１８１３（１９９９年３月１１日公開））。消光可能な色素の蛍光は、この色素が結合するヌクレオチドが二重鎖の一部である場合（例えば、ＢＯＤＩＰＹ）に、本質的に完全に消光され得る。消光可能な色素がステム−ループ構造のステム領域に位置するかループ領域に位置するかに依存して、その標的ポリヌクレオチドに結合する場合かまたは増幅産物に結合する場合かのいずれかに、消光されてもよいし消光されなくてもよい。
【０１０９】
（サンプル）
標的ポリヌクレオチドを含むかまたは含むと疑われるサンプルの一部は、ポリヌクレオチドを含む生物学的物質の任意の供給源であり得、これは、生存生物から直接的にかまたは間接的に入手され、細胞、組織または流体、およびその生物によって残された沈着物（ウイルス、マイコプラスマおよび化石を含む）を含む。このサンプルはまた、全体的にかまたは部分的に合成的手段によって調製されたポリヌクレオチドを含み得る。代表的に、サンプルは、優先的に水性の培地としてかまたはこの培地に分散されて、得られる。サンプルの非限定的な例としては、血液、尿、精液、乳汁、痰、粘液、頬スワブ、膣スワブ、直腸スワブ、吸引液、針生検、例えば手術または検死によって得られた組織の切片、血漿、血清、髄液、リンパ液、皮膚、気道、腸管、および尿生殖器道の外分泌物、涙、唾液、腫瘍、器官、インビトロ細胞培養成分のサンプル（細胞培養培地における細胞の増殖から得られる馴化培地、ウイルス感染したと推定される細胞、組換え細胞、および細胞成分が挙げられるが、これらに限定されない）、ならびにポリヌクレオチド配列を含む組換えライブラリーが挙げられる。
【０１１０】
サンプルは、標的ポリヌクレオチドを含むことが既知である陽性コントロールサンプルであり得る。陰性コントロールサンプルもまた使用され得、これは、標的ポリヌクレオチドを含むと予測されないが、それを含むことが疑われ、そして所定のアッセイにおいて使用される試薬の標的ポリヌクレオチドによる汚染を欠くことを確認するため、および所定のセットのアッセイ条件が誤った陽性（サンプル中に標的ポリヌクレオチドが存在する場合でさえの陽性シグナル）を生じるか否かを決定するために試験される。
【０１１１】
サンプルは、希釈されるか、溶解されるか、懸濁されるか、抽出されるか、または他の様式で処理されて、存在する任意の標的ポリヌクレオチドを可溶化し得るか、または増幅スキームにおいて使用される試薬もしくは検出試薬に接近可能にし得る。サンプルが細胞を含む場合には、これらの細胞は溶解されるかまたは透過性を上げられて、細胞内のポリヌクレオチドを放出し得る。１工程の透過性を上げる緩衝液を使用して、細胞を溶解し得、このことは、溶解の直後にさらなる工程（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応）が実施されることを可能にする。
【０１１２】
（標的ポリヌクレオチドおよびそれから生成される増幅産物）
標的ポリヌクレオチドは、一本鎖、二本鎖、またはより高次であり得、そして線状または環状であり得る。例示的な一本鎖標的ポリヌクレオチドとしては、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡウイルスゲノムが挙げられるが、これらのポリヌクレオチドは、内部で相補的な配列および有意な二次構造を含み得る。例示的な二本鎖標的ポリヌクレオチドとしては、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＤＮＡウイルスゲノム、プラスミド、ファージ、およびウイロイドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドは、合成的に調製され得るか、または生物学的供給源から精製され得る。標的ポリヌクレオチドは、１つ以上の所望でないサンプル成分を除去するかまたは減少させるため、あるいは標的ポリヌクレオチドを濃縮するために、精製され得る。逆に、標的ポリヌクレオチドが特定のアッセイのためには濃縮されすぎた場合には、この標的ポリヌクレオチドは、希釈され得る。
【０１１３】
サンプル収集および任意の核酸抽出後、標的ポリヌクレオチドを含むサンプルの核酸部分を１つ以上の調製反応に供し得る。これらの調製反応は、インビトロ転写（ＩＶＴ）、標識、断片化、増幅および他の反応を含み得る。ｍＲＮＡは、逆転写酵素およびプライマーで最初に処理されて、検出および／または増幅の前にｃＤＮＡを生成し得る。；これは、精製したｍＲＮＡを用いてインビトロで、またはインサイチュで（例えば、スライドに固定された細胞または組織中で）なされ得る。核酸増幅は、目的の配列のコピー数を増大し、そして標識されたプライマーまたは標識されたヌクレオチドを用いて標的ポリヌクレオチドから生成された増幅産物中に標識を組み込むために使用され得る。多様な増幅方法は、特に、標識増幅生成物が、本明細書中に教示された方法において産生、および利用され得る場合の使用に適切であり、これらの増幅方法としてはポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）、自己持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列基礎増幅（ＮＡＳＢＡ）、Ｑベータレプリカーゼの使用、逆転写、ニックトランスレーション、などが挙げられる。
【０１１４】
標的ポリヌクレオチドが、１本鎖である場合、増幅の第一サイクルは、標的ポリヌクレオチドに対して相補的なプライマー伸長産物を形成する。標的ポリヌクレオチドが、１本鎖ＲＮＡである場合、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼは、ＲＮＡをＤＮＡに逆転写するための第一増幅において使用され、そして追加増幅サイクルは、プライマー伸長産物をコピーするために実行され得る。標的ポリヌクレオチドが２本鎖であり、そして２つのプライマーが使用される場合、両方のプライマー伸長産物は、第一増幅サイクル中に生成される。しかし、基質に付着したポリヌクレオチドに結合し得るプライマー伸長産物のみが、検出可能な結果を生じる。ＰＣＲのためのプライマーは、もちろん増幅可能なセグメントを生する、対応する鋳型における領域をハイブリダイズするように設計されなければならない；従って、各々のプライマーは、ハイブリダイズしなければならず、その結果３’ヌクレオチドは、相補的な鋳型鎖を形成するために使用されるプライマーの３’ヌクレオチドから３’に位置される相補的な鋳型鎖におけるヌクレオチドと対になる。
【０１１５】
標的ポリヌクレオチドは代表的に、プライマー、およびそのプライマーを伸長し、そして標的ポリヌクレオチドをコピーするための適切な活性を有するポリメラーゼと１以上の標的ポリヌクレオチドを接触させることによって増幅されて、全長の相補的なポリヌクレオチド、またはそのより小さい部分を生成する。標的ポリヌクレオチドをコピーし得るポリメラーゼ活性を有する任意の酵素が使用され得、こららとしては、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、１より多くの型のポリメラーゼ活性を有する酵素が挙げられ、そして酵素は、不耐熱性または耐熱性であり得る。酵素の混合物はまた、使用され得る。例示的な酵素としては、ＤＮＡポリメラーゼＩ（「ＰｏｌＩ」）、ＰｏｌＩのクレノウフラグメント（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商法）Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商法）バージョン２．０Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、ＴｕｂＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＴｓｐＤＮＡポリメラーゼ、ＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ、ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ　ＧＢ−Ｄ　ＤＮＡポリメラーゼのようなＤＮＡポリメラーゼ；Ｅ．ｃｏｌｉＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼのようなＲＮＡポリメラーゼ；およびＡＭＶ逆転写酵素、Ｍ−ＭｕＬＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＲＮＡｓｅＨ−ＭＭＬＶ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商法））逆転写酵素、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商法）ＩＩ逆転写酵素、ＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ（登録商法）逆転写酵素、ＨＩＶ−１逆転写酵素およびＲＡＶ２逆転写酵素のような逆転写酵素が挙げられる。これらの全ての酵素は、市販されている。複数の特異性を有する例示的なポリメラーゼとしては、ＲＡＶ２ポリメラーゼおよびＴｌｉ（ｅｘｏ−）ポリメラーゼが挙げられる。例示的な耐熱性ポリメラーゼは、ＴｕｂＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｘＤＮＡポリメラーゼ、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ、ＴｓｐＤＮＡポリメラーゼ、ＴｆｌＤＮＡポリメラーゼ、ＴｌｉＤＮＡポリメラーゼおよびＰｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ　ＧＢ−Ｄ　ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【０１１６】
適切な反応条件は、標的ポリヌクレオチドの増幅を可能にするように選択され、これらの反応条件としては、ｐＨ、緩衝液、イオン強度、１以上の塩の存在および濃度、反応物の存在および濃度、ならびにヌクレオチドのような補因子、ならびにマグネシウム、および／または他の金属イオンの存在および濃度、任意の共溶媒、温度、ポリメラーゼ連鎖反応を含む増幅スキームのための熱サイクルプロファイルが挙げられ、そして使用されるポリメラーゼ、ならびにサンプルの性質に一部依存し得る。共溶媒としては、ホルムアミド（代表的には、約２〜約１０％）、グリセロール（代表的には、約５〜約１０％）、およびＤＭＳＯ（代表的には、約０．９〜約１０％）が挙げられる。技術は、増幅中に生成される擬陽性またはアーティファクトの生成を最小にするために、増幅スキームにおいて使用され得る。これらは、「タッチダウン（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）」ＰＣＲ、ホットスタート（ｈｏｔ−ｓｔａｒｔ）技術、入れ子状プライマーの使用、または、プライマーダイマー形成の現象におけるステム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を形成し、それにより増幅されないように設計されたＰＣＲプライマーを含み。ＰＣＲを促進する技術（例えば、遠心ＰＣＲサンプル中での対流をより大きくすることを可能ににし、そして迅速なサンプルの加熱および冷却のための赤外線加熱工程を含む）が使用され得る。１以上の増幅サイクルは、実行され得る。過剰の１つのプライマーは、ＰＣＲ中に過剰の１つのプライマー伸長産物を産生するために使用され得る；好ましくは、過剰に産生されたプライマー伸長産物は、検出されるべき増幅産物である。複数の異なるプライマーを使用して、サンプル中の特定のポリヌクレオチドの異なる領域を増幅し得る。
【０１１７】
増幅された標的ポリヌクレオチドは、増幅後処理に供され得る。例えば、いくつかの場合において、標的ポリヌクレオチドに対してより容易に接近し、そしてルーピングおよび／または複数のプローブに対してのハイブリダイゼーションを避けるセグメントを提供するために、ポリヌクレオチドアレイを用いたハイブリダイゼーション前に標的ポリヌクレオチドを断片化することは望ましくあり得る。核酸の断片化は、実行されるアッセイにおいて有用なサイズのフラグメントを生成する任意の方法によって実行され得る；適切な物理的、化学的、および酵素的な方法は、当該分野で公知である。
【０１１８】
増幅反応は、少なくとも一部の増幅サイクル中に、プローブポリヌクレオチドを増幅産物にハイブリダイズし得る条件下で実行され得る。そのアッセイが、このように実行されると、このハイブリダイゼーションの現象のリアルタイム検出は、増幅中のそのようなハイブリダイゼーションの際に起こる基質の蛍光特性の変化についてモニタリングすることによって起こり得る。あるいは、その増幅反応は、サイクル中のそのような結合が可能でない条件下（例えば、高温、またはプローブポリヌクレオチドの非存在下において）で起こり得、そしてサンプルの条件を、例えば、温度を下げること、もしくはサンプルと第一ポリヌクレオチドまたはプローブポリヌクレオチドとを接触結合させることによって起こる検出を可能にするために変更されなければならない。そのステム−ループ構造は、増幅サイクル中にハイブリダイズするか否かを考慮した増幅反応条件を用いて設計され得る。
【０１１９】
（標識）
本明細書中に記載される発明において有用な標識は、標識がを結合される分子が、基質に結合されるポリヌクレオチドに対して直接的、または間接的にハイブリダイズされる場合に、基質と関連して検出され得る任意の物質を含む。任意の効果的な検出方法が使用され得、これらとしては、光学的方法、分光学的方法、電気的方法、圧電気的方法、磁気的方法、ラマン散乱方法、表面プラズモン共鳴方法、Ｘ線撮影方法、比色分析方法、熱量測定方法、などが挙げられる。
【０１２０】
その標識は、発色団、発光団、蛍光団、色素体、ハプテン、抗原、放射性同位体、磁性粒子、金ナノ粒子または銀ナノ粒子のような金属ナノ粒子、酵素、抗体またはそれらの結合部分もしくは等価体、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、および結合対の１メンバーから選択される因子を含む。
【０１２１】
蛍光団は、ある波長の光を吸収し、そして異なる波長の光を放射する任意の物質であり得る。代表的な蛍光団は、蛍光色素、半導体ナノクリスタル、ランタニドキレート、および緑色蛍光タンパク質を含む。
【０１２２】
例示的な半導体ナノクリスタルは、上記のこれらのＳＣＮＣを含む。例示的な蛍光色素としては、フルオレセイン、６−ＦＡＭ、ローダミン、テキサスレッド、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシロードル、カルボキシローダミン１１０、カスケードブルー、カスケードイエロー、クマリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ２、ＪＯＥ、ＮＥＤ、ＲＯＸ、ＨＥＸ、ルシファーイエロー、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ　ＦＬ−Ｂｒ２、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ　Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ　ＴＭＲ、およびＢＯＤＩＰＹ　ＴＲが挙げられる。例示的なランタニドキレートとしては、ユーロピアムキレート、テルビウムキレート、およびサマリウムキレートが挙げられる。
【０１２３】
用語「緑色蛍光タンパク質」とは、変更された蛍光特性（変更された励起極大波長、および発光極大波長、ならびに異なる形の励起スペクトルおよび異なる形の発光スペクトルを含む）示すことが同定されているネイティブおよび変異形の両方のＡｅｑｕｏｒｅａ緑色蛍光タンパク質をいう（Ｄｅｌａｇｒａｖｅ，Ｓ．ら（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１３：１５１−１５４；Ｈｅｉｍ，Ｒ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１２５０１−１２５０４；Ｈｅｉｍ，Ｒ．ら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ　３７３：６６３−６６４）。Ｄｅｌａｇｒａｖｅらは、レッドシフトした励起スペクトルを有するクローン化したＡｅｑｕｏｒｅａ　ｖｉｃｔｏｒｉａＧＦＰの変異体を単離した。Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１３：１５１−１５４（１９９５）。Ｈｅｉｍ，Ｒらは、青色蛍光を有する変異体（Ｔｙｒ６６〜Ｈｉｓ）を報告した（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４）ＵＳＡ９１：１２５０１−１２５０４）。
【０１２４】
例示的な酵素としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、細菌ルシフェラーゼ、昆虫ルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｅｎｉｌｌａ　ｋｏｅｌｌｉｋｅｒｉ）が挙げられ、これらは、適切な基質の存在下、および当該分野に公知のアッセイ条件下において検出可能なシグナルを生じ得る。
【０１２５】
例示的なハプテンおよび／または結合対のメンバーとしては、アビジン、ストレプトアビジン、ジゴキシゲニン、ビオチン、および上記のものが挙げられる。
【０１２６】
（クエンチャー）
クエンチャーは、アッセイにおいて使用されている励起された発蛍光団からの少なくとも１つの蛍光発光を消光し得る任意の材料であり得る。多くの適切なクエンチャーは、当該分野で公知であり、そして市販されている。代表的なクエンチャーとしては、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３、金属ナノ粒子、ならびに幅広い吸光度スペクトルおよび実行中のアッセイにおいて検出される範囲外の発光波長を有する半導体ナノクリスタル、または検出可能な発光を有さない半導体ナノクリスタルが挙げられる。
【０１２７】
（ＳＣＮＣの生成）
本方法における使用のためのＳＣＮＣは、本明細書中で教示される方法、物品、および組成物において有用な発光特性を有するＳＣＮＣを生成する任意の材料から、および任意の技術によって作られ得る。ＳＣＮＣは、それらのサイズ、サイズ分布、および組成に依存した吸収スペクトル、および発光スペクトルを有する。適切な製造方法は、米国特許第６，０４８，６１６号；同第５，９９０，４７９号；同第５，６９０，８０７号；同第５，５０５，９２８号；同第５，２６２，３５７号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／２６２９９（１９９９年５月２７日公開；発明者Ｂａｗｅｎｄｉら）；Ｍｕｒｒａｙら（１９９３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１５：８７０６−８７１５；およびＧｕｚｅｌｉａｎら（１９９６）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１００：７２１２−７２１９において開示される。
【０１２８】
ＳＣＮＣが形成され得る材料の例としては、ＩＩ−ＶＩ族半導体、ＩＩＩ−Ｖ族半導体、およびＩＶ族半導体が挙げられる（例えば、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＡｌＳ、ＡｌＰ、ＡｌＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、Ｇｅ、Ｓｉ、およびそれらの３元混合物および４元混合物）。
【０１２９】
半導体ナノクリスタルの組成、サイズ、およびサイズ分布は、その吸光スペクトル、および発光スペクトルに影響する。可視範囲のエネルギーを放射する例示的なＳＣＮＣとしては、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＧａＰ、およびＧａＡｓが挙げられる。近ＩＲ範囲のエネルギーを放射する例示的なＳＣＮＣとしては、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＰｂＳ、およびＰｂＳｅが挙げられる。青〜近紫外のエネルギーを放射する例示的なＳＣＮＣとしては、ＺｎＳおよびＧａＮが挙げられる。所定の集団におけるＳＣＮＣのサイズは、使用される合成スキームによって、および／または例えば、サイズ選択的沈降および／または遠心分離を含む。分離スキームの使用により決定され得る。その分離工程は、合成スキームにおける中間ステップ、または合成が完了した後で用いられ得る。所定の組成のために、より大きいＳＣＮＣは、より小さいＳＣＮＣより長い波長の光を吸収、および発光する。ＳＣＮＣは、可視およびＵＶにおいて強く吸収し、そしてそれらの発光ピークより短い波長で効果的に励起され得る。この特性により励起光源が、混合物の中の最も短いＳＣＮＣ発光波長より短い波長を有する場合、全てのＳＣＮＣを励起するための単一励起光源のＳＣＮＣの混合集団での使用が可能となる；それはまた、励起波長の賢明な選択による混合物中のＳＣＮＣの部分集団（単数または複数）を選択的に励起するための能力を付与する。
【０１３０】
ＳＣＮＣの表面は、好ましくは、オーバーコーティング層を付加して「コア（Ｃｏｒｅ）」ＳＣＮＣの周辺の「殻（ｓｈｅｌｌ）」を形成することによって発光効率を増大させるように改変される。なぜならコアＳＣＮＣの表面における欠陥が、電子または正孔を補足し得、そしてその電子的特性または光学的特性を低下させるからである。遮断する殻層の付加は、励起されたコアからの無放射緩和経路を取り除き、より高い発光効率を生じる。殻のために適切な材料は、コアより高いハンドギャップエネルギーを有し、そして好ましくは良好な伝導性および価電子帯オフセットもまた有する半導体材料を含む。従って、殻の伝導帯は、より高いエネルギーが望ましく、そして価電子帯は、コアの価電子帯より低いエネルギーが望ましい。可視範囲（例えば、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＧａＰ、ＧａＡｓ）、または近ＩＲ範囲（例えば、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ）のエネルギーを放射するＳＣＮＣコアには、材料が紫外部のバンドギャップエネルギーを有する（例えば、ＺｎＳ、ＧａＮ、およびマグネシウムカルコゲニド（例えば、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、およびＭｇＴｅ））が、殻のために使用され得る。近ＩＲにおいて発光するＳＣＮＣコアには、ＣｄＳまたはＣｄＳｅのような可視部または紫外部のバンドギャップエネルギーを有する材料が使用され得る。コア−殻ＳＣＮＣの調製は、例えば、Ｄａｂｂｏｕｓｉら（１９９７）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ１０１：９４６３；Ｋｕｎｏら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１０６：９８６９（１９９７）；Ｈｉｎｅｓら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１００：４６８；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／２６２９９に記載される。ＳＣＮＣは、Ｄａｎｅｋら（１９９６）Ｃｈｅｍ．Ｍａｔ．８（１）：１７３−１８０、およびＰｅｎｇら（１９９７）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：７０１９−７０２９に記載されるようなオーバーコーティング手順によりさらに発光され得る。
【０１３１】
ほとんどのＳＣＮＣは、代表的にＴＯＰＯおよびトリオクチルホスフィン（ＴＯＰ）のような配位中で調製され、殻を有するＳＣＮＣおよび殻を有さないＳＣＮＣの表面上の不活性化有機層の形成を生じる。そのような不活性化ＳＣＮＣは、有機溶媒（例えば、トルエン、クロロホルム、およびヘキサン）中で容易に可溶化し得る。不活性化層における分子は、他の溶媒系（例えば、水系）における使用にＳＣＮＣを適合させ最外コーティングを提供するために置換、または改変され得る。
【０１３２】
あるいは、シリカのような無機材料の最外層は、ＳＣＮＣの水性分散性を改善するために殻の周辺に付加され得、そしてシリカの表面は、必要に応じて誘導体化され得る（Ｂｒｕｃｈｅｚら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１：２０１３（１９９８））。
【０１３３】
置換反応はまた、特定の有機溶媒中の溶解度を改善するためにＳＣＮＣを改変するために用いられ得る。例えば、ＳＣＮＣと特定の溶解または液体（例えば、ピリジン）との結合が望まれる場合、その表面は、溶媒和を確実にするために可溶性またはピリジンとの混和性があるピリジンまたはピリジン様部分を用いて特定的に改変され得る。水分散可能なＳＣＮＣは、Ｂａｗｅｎｄｉら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／１７６５５（２０００年３月３０日公開）において記載されるように調製され得る。
【０１３４】
ＳＣＮＣの表面層は、特定のカップリング反応のためにＳＣＮＣを反応性にするための置換によって改変され得る。例えば、カルボン酸部分を含む基でトリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＴＯ）部分を置換することにより、アミド結合を提供するアミン含有部分との改変されたＳＣＮＣの反応を可能にして、これらの連反応の詳細な記述については、例えば、米国特許第５，９９０，４７９号；Ｂｒｕｃｈｅｚら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１：２０１３−２０１６、Ｃｈａｎら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２８１：２０１６−２０１８，Ｂｒｕｃｈｅｚ「Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　ＳＣＮＣｓ：Ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ　Ｂｅｈａｖｉｏｒ　ａｎｄ　ｕｓｅ　ａｓ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｐｒｏｂｅｓ」（１９９８）博士学位論文、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、および　Ｍｉｋｕｌｅｃ「ＳＣＮＣ　Ｃｏｌｌｏｉｄｓ：Ｍａｎｇａｎｓｅ　Ｄｏｐｅｄ　Ｃａｄｍｉｕｍ　Ｓｅｌｅｎｉｄｅ，（Ｃｏｒｅ）Ｓｈｅｌｌ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ，ａｎｄ　Ｈｉｇｈｌｙ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｃａｄｍｉｕｍ　Ｔｅｌｌｕｒｉｄｅ」（１９９９）博士学位論文，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを参照のこと。ＳＣＮＣは、リンカーにより直接的または間接的に他の部分と結合され得る。
【０１３５】
適切なスペーサーまたはリンカーの例は、ポリエチレングリコール、ジカルボン酸、ポリアミンおよびアルキレンである。スペーサーまたはリンカーは、官能基（例えば、アミン、カルボン酸およびアルコールのような親水性基またはメトキシ基およびエトキシ基のような低級アルコキシ基）で必要に応じて置換される。さらに、スペーサーは、遠位端上または遠位端の近くに活性部位を有する。活性部位は、最初に保護基によって必要に応じて保護される。有用である幅広い種々の保護基には、ＦＭＯＣ、ＢＯＣ、ｔ−ブチルエステル、ｔ−ブチルエーテルなどがある。種々の例示的な保護基は、例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載される。
【０１３６】
（励起源）
上のように調製され記載されるコードされたビーズまたは他の基板を励起源の光に曝露することによって、材料中に配置されるＳＣＮＣは、励起されて光を発する。この励起源は、光を発するためにこの実験において使用されるＳＣＮＣの少なくとも１つの集団を励起し得るエネルギーの励起源であり、そして好ましくは使用されたＳＣＮＣの最も短い発光波長よりも高いエネルギーの励起源であるように選択される。さらに、励起源は、検出可能な光を生成するためにサンプル中の最小の数のＳＣＮＣを励起するように選択され得る。好ましくは、励起源は、この実験において使用されるコードされた材料全ての独特の同定を可能にするためにＳＣＮＣの十分な数の異なる集団を励起する。例えば、赤色ＳＣＮＣ対青色ＳＣＮＣの異なる比を有するビーズの２つの異なる集団を使用して、ビーズをデコードするために、例えば、緑色光または黄色光を使用することよってサンプルの赤色発光ＳＣＮＣを励起することのみでは、十分ではない。青色発光ＳＣＮＣおよび赤色発光ＳＣＮＣを同時に発光し得る少なくとも１つの波長（例えば、紫色または紫外）を含む光源を使用することが必要である。異なる集団のＳＣＮＣを同時にまたは連続的に励起するために使用される１つ以上の光源があり得るが、所与の光源は、ＳＣＮＣの吸収スペクトルに起因して光源よりも低いエネルギーで発光するＳＣＮＣの亜集団のみを励起する。
【０１３７】
さらに、ランプ供給源が使用される場合、ランプの劣化（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）は、励起源における変化を生じ得、これによってコードに欠陥を生じさせる。
【０１３８】
（ＳＣＮＣ発光の検出）
本方法を用いる使用のための自動化検出のための画像化システムの例は、励起源、モノクロメーター（または画像をスペクトル的に分解し得る任意のデバイス、または１セットのナローバンドフィルター）および検出器アレイを含む。励起源は、検出される発光波長よりも短い青色波長またはＵＶ波長を含み得る。これは、以下であり得る：ブロードバンドＵＶ光源（例えば、前面にフィルターを備える重水素ランプ；所望の波長を抽出するためにモノクロメーターを通過した後のキセノンランプまたは重水素ランプのような白色光光源の出力；または多数の持続波（ｃｗ）ガスレーザーの任意（限定しないが、アルゴンイオンレーザー線（４５７ｎｍ、４８８ｎｍ、５１４ｎｍなど）またはＨｅＣｄレーザーの任意を含む）；ＧａＮおよびＧａＡｓ（二倍）に基づくレーザーまたは二倍または三倍出力のＹＡＧまたはＹＬＦに基づくレーザーのような青色で固体状態のダイオードレーザー；または青色での出力を有する任意のパルスレーザー。
【０１３９】
放出された光を、基板についてのスペクトル的情報を提供するデバイス（例えば、格子分光器、プリズム分光器、画像化分光器など）を用いて、または干渉（バンドパス）フィルターを使用して検出し得る。ＣＣＤカメラのような二次元領域画像装置を使用して、多くの物体を同時に画像化し得る。スペクトル的情報は、異なるバンドパスフィルター、ロングパスフィルターまたはショートパスフィルター（干渉フィルター、または電気的に整調可能なフィルターが適切である）によって１つより多くの画像を集めることによって生成され得る。１つより多くの画像装置を使用して、専用フィルターを通して同時にデータを集め得るか、またはフィルターは、単一の画像装置の前で変換され得る。生物測定画像化システムのような画像化に基づくシステムは、蛍光シグナルを見出すために表面を走査する。
【０１４０】
分析されるサンプルが顕微鏡の対物レンズに関して走査される走査システムが使用され得る。ルミネセンスは、単一のモノクロメーターまたは格子またはプリズムを通して入れられてスペクトル的に色を分解する。検出器は、ダイオードアレイであり、これは、次いで、特定の空間的位置において発光される色を記録する。次いで、ソフトウェアは、走査された画像を再び作製する。
【０１４１】
（複数蛍光発光のデコード）
画像化サンプルが複数の蛍光団で標識される場合、サンプル内の各々別個の領域由来の蛍光をスペクトル的に分解することが望ましい。このようなサンプルは、例えば、ビーズをコード化するために使用される複数のタイプのＳＣＮＣ（および／または他の蛍光団）から、ビーズをコード化するために使用されるが異なる蛍光団で標識された分子に結合される単一の型のＳＣＮＣから、あるいは単一の位置で結合される異なるタイプの蛍光団で標識された複数の分子化ら生じ得る。
【０１４２】
多くの技術（フーリエ変換スペクトル画像化（Ｍａｌｉｋ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｉｃｒｏｓｃ．１８２：１３３；Ｂｒｅｎａｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ａｐｐｌ．Ｏｐｔ．３３：７５２０）およびＨａｄａｍａｒｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍ　ｓｐｅｃｔｒａｌ　ｉｍａｇｉｎｇ（Ｔｒｅａｄｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６１：７３２Ａ；Ｔｒｅａｄｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０）Ａｐｐｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．４４：１−４；Ｔｒｅａｄｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０）Ａｐｐｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．４４：１２７０；Ｈａｍｍａｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．３４８：１３５；Ｍｅｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３５４：２５０；Ｆｌａｔｅｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ．（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．４７：１４６４）、可変の干渉による画像化（Ｙｏｕｖａｎ　（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ　３６９：７９；Ｇｏｌｄｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０：１５５７）、聴覚光学（Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）ＩＥＥＥ　Ｔｒａｎｓ．Ｉｎｓｔ．Ｍｅａｓ．４５：３９４；Ｔｕｒｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ａｐｐｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．５０：２７７）または液晶フィルター（Ｍｏｒｒｉｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）Ａｐｐｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．４８：８５７）またはサンプル表面を横切るスリットまたは点の単純な走査（Ｃｏｌａｒｕｓｓｏ　ｅｔ　ａｌ．（１９９８）Ａｐｐｌ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．５２：１０６Ａ）（これらのすべてがサンプルの二次元領域を横切るスペクトル的および空間的情報を生成し得る）を含む）がこの問題を解決するために開発された。
【０１４３】
一次元スペクトル画像化は、線型分光器の入口スリット上に蛍光画像を投射することによって容易に達成され得る。この構成において、空間的情報は、ｙ軸に沿って保持されるが、スペクトル的情報は、ｘ軸に沿って分散する（Ｅｍｐｅｄｏｃｌｅｓ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．７７（１８）：３８７３）。入口スリットは、分光器に入る光の空間的位置を制限し、各スペクトルについての較正を規定する。入口スリットの幅は、システムのスペクトル的分解を一部規定する。
【０１４４】
二次元画像は、入口スリットを除き、そして個々の点由来の別個の画像が分光器に入る光の空間的位置を規定し得ることによって得られ得る。この場合、システムのスペクトル的分解は、別個の画像のサイズによって一部規定される。しかし、各点からの光の空間的位置がｘ軸を横切って変化するので、各スペクトルについての較正は異なり、絶対的なエネルギー値の誤差を生じる。もとの画像を分割し、そして半分を分散格子に通して別の画像およびスペクトルを作製することは、この較正誤差を除外し得る。適切に整列して、空間的位置と絶対的スペクトルエネルギーとの間に関係が作られ得る。
【０１４５】
同じ水平線に沿って入る画像間のあいまいさを避けるために、第２のビームスプリッターが加えられ得、第２の分散要素がもとに対して９０°に向く。２つの直交方向に沿った画像を分散することによって、画像内の各々別個の点由来のスペクトルをあいまいなく区別することができる。スペクトル分散は、格子（例えば、ホログラフィー伝達格子または標準的反射格子）を使用して実行され得る。例えば、ホログラフィー伝達格子を使用して、もとの画像を、空間的に分散された画像（いくつかの光源の損失を有する）に対して直接的画像よりも多くの光を提供する比で２（または３）の画像に分割する。
【０１４６】
この方法は、例えば、基板上に固定された単一分子または一そろいの分子のような別個のスペクトル的画像の高スループットスクリーニングにおいて、およびスペクトル的にコードされたビーズを高度に平行して読み取るために、別個の点シグナルを含むサンプルをスペクトル的に画像化するために使用され得る。次いで、この画像は、検出器上に投射され、そしてシグナルは再結合されて各々のバンドパス内の光の量についての情報を含む画像を生成する。
【０１４７】
あるいは、二次元画像内の点スペクトルを較正するための技術は、内部波長参照（「参照チャネル」）がスペクトル的にコードされた物質内に含まれる場合、必要ではない。参照チャネルは、好ましくは、コード内で最も長いかまたは最も短いかのいずれかである波長を発する蛍光団である。参照チャネルの既知の発光波長によって、分散したスペクトルコード画像内の蛍光団の発光波長の決定が可能である。波長較正に加えて、参照チャネルは、単一の発光波長における複数の強度を用いるコードスキームが使用される強度較正として役立ち得る。さらに、参照チャネルの固定された強度はまた、各々のビーズの表面に結合した標識の量についての内部較正標準として使用され得る。
【０１４８】
スペクトル的にコードされたビーズまたは材料を読み取るための一つのシステムにおいて、共焦点励起源は、サンプルの表面にわたって走査される。供給源がコードされるビーズの上を通過するとき、蛍光スペクトルが獲得される。サンプル上の点励起源をラスター走査することによって、サンプル内の全てのビーズが連続的に読み取られ得る。
【０１４９】
光ピンセットを必要に応じて使用して、ビーズが読み取られたときに、スペクトル的にコードされたビーズまたは任意の他のタイプのビーズを順序付けられたアレイに「掃引」し得る。「ピンセット」は、ビーズ内の任意の蛍光団を励起しない赤外レーザー、またはビーズを同時に捕捉しそして蛍光団もまた励起する赤色レーザーのいずれかであり得る。
【０１５０】
光ピンセットは、「光圧（ｌｉｇｈｔ　ｐｒｅｓｓｕｒｅｒ）」によってこのスポットの中心においてミクロンサイズのビーズを保持するために密なスポットに焦点を合わせられ得る。焦点スポットと接触する約１０μｍの直径よりも小さい任意のビーズが、最も高い強度の点に引き込められる。約０．５μｍよりも大きいビーズについて、一つだけのビーズが一時に「トラップ」内に存在し得る。例えば、Ａｓｈｋｉｎ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９４：４８５３−４８６０；Ｈｅｌｍｅｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３：３７９−３８３；Ｑｕａｋｅ　ｅｔ　ａｌ．（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３８８：１５１−１５４；Ａｓｈｋｉｎ（１９７２）Ｓｃｉ．Ａｍｅｒ．２２６：６３−７１；Ａｓｈｋｉｎ（１９７０）Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ｌｅｔｔ．２４：１５６−１５９を参照のこと。
【０１５１】
光ピンセットを使用してスペクトル的にコードされたビーズを保持しそして読み取るためにそれらを整理し得る。ピンセットは、点走査読み取り器（これは、同じ光路を使用し得る）の検出領域の中心に配置されたウェルの底近くに焦点を合わせられ得る。読み取り器およびピンセットは、それらが互いに関して同じ位置にいつもあるように一緒に走査され得る。
【０１５２】
例えば、ピンセットがスポット−１でオンにされる場合、ピンセットによって接触する任意のビーズは、トラップの中心に引き込まれ、アッセイ標識強度の正確な定量的測定を保証する。第１のビーズを読み取ったのちに、ピンセットをオフにしてそれを離し、そしてスキャナーは、ピンセットが再びオンにされ、次いですぐにスポット−２に移動する前に第一のビーズが再び補足されることを防ぐのに十分遠く右に進む。このプロセスにおいて、ピンセットによって接触される任意のビーズが補足され、そしてそれが読み取られるスポット−２に持って来られる。平均ビーズ間間隔に対応する走査距離を選択することは、サンプリング点間に生じる複数のビーズからのビーズ損失を最小化し得る。
【０１５３】
あるいは、光ピンセットは、ウェルの表面から離れた溶液内に焦点を合わせられ得る。ピンセットがオンおよびオフにされるとき、溶液は混合され、その結果異なるビーズは検出領域に持って来られ、これらが走査される間、保持される。
【０１５４】
別の代替において、光ピンセットは、一次元のみで、すなわちスポットよりもむしろ線に焦点を合わせられ得、従って、直線捕捉領域を作製する。このタイプのシステムを使用して「ライン走査」ビーズ読み取り器により走査され得る別の線にビーズを掃引し得る。
【０１５５】
（ビーズ上の分子ビーコン）
Ｔｙａｇｉ　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．３０３−３０８は、溶液において光学的にサイレントであるが相補的標的とのハイブリダイゼーション時に蛍光を発するオリゴヌクレオチドプローブを記載する。プローブは、ステムアンドループ（ｓｔｅｍ−ａｎｄ−ｌｏｏｐ）構造を有する一本鎖オリゴヌクレオチドである。ループは、少なくとも一部が標的の少なくとも一部に相補的な配列である。ステムの一つのアームは、蛍光性部分が取り付けられ、そして他のアームは非蛍光のクエンチング部分が取り付けられる。二つのアームは、互いに相補的である。非ハイブリット状態において、ステムは、二つの部分が十分に近位に保持され、その結果、非蛍光性部分が蛍光性部分をクエンチする。ハイブリダイゼーションにおいて、プローブにおける調和したコンフォメーショナン変化は、アーム配列を離れさせ、そして蛍光部分の検出を可能にする。
【０１５６】
分子ビーコン（ＭＢ）は、均質な溶液中で特定の核酸の検出のために使用されるオリゴヌクレオチドプローブである。これらのオリゴヌクレオチドは、ループ部分（代表的には、１５〜３０ヌクレオチド長）が標的核酸分子に相補的なプローブ配列であるヘアピン型である。ステム部分（代表的には４〜７ヌクレオチド）は、ポリヌクレオチドの相補的なアーム配列（３’および５’）をアニーリングすることによって形成される。蛍光団は、ＭＢの一端に取り付けられ得、そしてＤＡＢＣＹＬのようなクエンチャーが他端に取り付けられる（図１ａを参照のこと）。標的核酸の非存在下において、ステムは、二つの部分を互いに近位に維持し、エネルギー移動によって蛍光をクエンチする。ループに対する相補的な標的が存在する場合、ループ配列は、ステムよりも長く安定な標的核酸とのハイブリッドを形成する。従って、ＭＢは、直線化され、蛍光団およびクエンチャーが互いに離れ、蛍光の回復を導く（図１ｂを参照のこと）。従って、利用可能な非重複色素の数は、均質な溶液中のＭＢの使用をかなり制限する。
【０１５７】
本明細書中に記載される発明は、一つ以上の異なる種類のＳＣＮＣの色素で染色されたコードされたミクロスフェア上へのＭＢの取り付けである。この方法を使用して特定の核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）配列（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）、異なる細菌の菌株、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、変異などを検出し得る。
【０１５８】
この方法は、異なるコードされたミクロスフェアの数によってのみ限定される１つのウェル内で使用され得るＭＢの数で有利に多重化され得る（図４を参照のこと）。この方法は、定量的であり得る。従来の色素と比較して、ＳＣＮＣは、高度に光安定性であり、高い量子収量および狭い発光スペクトルを有する。このアッセイが多重化され得そしてシグナルがビーズ上で濃縮され得るので、各アッセイに少量のサンプルが必要とされる。ＳＣＮＣがレポーターとクエンチャーとの両方のために使用される場合、複数の異なるＳＣＮＣが同じビーズ上のレポーターとして使用され得、このように同じビーズ上で２つ以上の結果を提供する。
【０１５９】
ＭＢは、２つの約４〜７塩基対の相補配列からなり、その結果、通常の条件下で、それは、ヘアピンステムループを形成する。各ＭＢループは、１５以上のヌクレオチド長を含む。クエンチャー染料またはＳＣＮＣは、オリゴヌクレオチドの一方の末端かまたはその近傍に付着され、そして別の染料またはＳＣＮＣレポーターが、ＭＢの他方の末端に付着される。これらの付着の各々は、直接的または間接的であり得る。クエンチャーおよびレポーターのうちの一方は、ビーズ上で見出され得る。クエンチャーＳＣＮＣおよびレポーターＳＣＮＣの位置が、交換され得る（例えば、図４〜６を参照のこと）。「スペーサー」（例えば、ヌクレオチドまたは炭素鎖のストリング）は、好ましくは、クエンチャー種と連結される。このアッセイのための標的ポリヌクレオチドは、好ましくは、標識されていないＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＤＮＡである。試料またはサンプル中の相補的標的の存在下で、オリゴヌクレオチドのループ部分が標的にハイブリダイズするとき、ヘアピンオリゴヌクレオチドが線状化される。次いで、このクエンチャー種が、レポーター種から離れて、蛍光シグナルが、定量的に検出されることが可能となる。
【０１６０】
異なるＭＢは、多重化のために異なる色または色の組み合わせのＳＣＮＣがコードされたマイクロスフィア（任意のサイズ）上に結合され得る。このコードされたマイクロスフィアのサインが、このマイクロスフィア上のＭＢの性質を同定するために検出される。ＭＢのステムは、その２つのメンバーの間の相互作用が、効率的な蛍光の消光のためのヘアピン構造を形成するためには十分強力であるが、このループに相補的であるポリヌクレオチドが検体またはサンプル中に存在する場合に解離するに十分に弱いように、設計され得る。
【０１６１】
あるいは、異なるマイクロスフィアは、ＳＣＮＣクエンチャー（例えば、広範な発光スペクトルおよび目的のスペクトル領域において低い量子収量を有するＳＣＮＣ）の層を、このマイクロスフィアの外側表面上に、またはビーズの外側に有して埋め込まれ得る。各オリゴヌクレオチドは、両方の末端に相補配列を有し、その結果、通常の条件下で、ヘアピンループを形成する（図４を参照のこと）。
【０１６２】
異なる色のＳＣＮＣレポーターは、同じビーズ上の異なるＭＢ（１つより多いアッセイが試験されている場合）の末端に付着され得る。このことは、核酸配列における異なる変異を検出するために有用であり得る（図３を参照のこと）。
【０１６３】
クエンチャーＳＣＮＣ−１は、オリゴヌクレオチドの一方の末端に付着され、そしてＳＣＮＳ−２レポーターは、スペーサーとＭＢとの間の連結部分に付着され得る（図２および５を参照のこと）。クエンチャーＳＣＮＣ−１およびレポーターＳＣＮＳ−２の位置は、交換可能である。例えば、このＳＣＮＣ−２レポーターは、オリゴヌクレオチドの末端（３’または５’）に存在し得、そしてクエンチャーＳＣＮＣ−１は、スペーサーとＭＢとの間の連結部に位置し得る。あるいは、ビオチン化ＭＢが、スレプトアビジンでコートされたコードされたマイクロスフィアに共有結合され得る。この場合、付加ビオチンは、ＭＢのステムに配置され得るか、またはスペーサーの末端に配置され得る。
【０１６４】
コードされたマイクロスフィアはまた、ビーズの外側に、ＳＣＮＣ−１クエンチャー−ストレプトアビジン結合体の層を用いて、コーティングされ得る。これは、例えば、ビオチン化されたコードされたマイクロスフィアを用いて行われ得る。この改変されたＭＢは、ヘアピンループの形成のために、オリゴヌクレオチドの両方の末端に相補配列を有し、ここで、ビオチンがビーズから離れたオリゴヌクレオチドの一方の末端に付着され、そしてＳＣＮＳ−２または染料レポーターが、ビーズから離れたオリゴヌクレオチドの他の末端に付着される。標的核酸の非存在において、レポーターＳＣＮＳ−２または染料シグナルは、ビーズの表面上で、ＳＣＮＣ−１クエンチャーによって消光される。試料またはサンプルにおける相補標的の存在下で、ヘアピンオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドのループ部分が標的にハイブリダイズするとき、線状化される。次いで、クエンチャー種が、ＳＣＮＣレポーターから移動して、蛍光シグナルが、定量的に検出されることを可能にする（図４を参照のこと）。
【０１６５】
（クリベース（ｃｌｅａｖａｓｅ）アッセイ）
クリベースは、「フラップ」構造を認識し、そして核酸の非相補的オーバーハンギング部分を切断するフラップエンドヌクレアーゼである。ＤＮＡまたはＲＮＡ基質のために最適化されたクリベース酵素が入手可能である。この切断されたプローブは、ＦＲＥＴを使用してアッセイされ得るかまたはここで切断された（ｎｏｗ−ｃｌｅａｖｅｄ）プライマーの伸長によってアッセイされ得る（例えば、Ｌｙａｍｉｃｈｅｖら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：２９２−２９６；Ｇｒｉｆｆｉｎら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６：６３０１−６３０３）。先の実施形態において、クリベースアッセイは、多重化され得ない。本発明は、クリベースアッセイが、多重化様式で実施され得ることを可能にし、そして任意のシグナル増幅工程を使用して、非常に感度の高い測定がなされることを可能にする。
【０１６６】
オリゴヌクレオチドは、上記のようにスペクトル的にコードされたマイクロスフィアに付着され、ここで、オリゴヌクレオチドの５’末端は、マイクロスフィア、３’アッセイ特異的オリゴヌクレオチドに繋がれ、そして隣接し、それによってリンカーに繋がれる。異なるアッセイ特異的オリゴヌクレオチドは、特定のおよび別個のスペクトル的にコードされたビーズに付着される。このアッセイは、スペクトルコードを解読しそしてアッセイシグナルを生成する、好ましくは、アッセイシグナルの感度のある検出を可能にする、いくつかの異なるデバイスのうちの１つを使用して、読まれる。
【０１６７】
図７は、単一アッセイがどのように進行するかの模式図を示す、ビーズが、同じ配列のオリゴヌクレオチドでコーティングされる。このオリゴヌクレオチドの５’末端は、このビーズに繋がれる。このオリゴヌクレオチドの３’部分（約５〜２０塩基）は、標的オリゴヌクレオチドの一部分に相補的である。別の「侵入（ｉｎｖａｄｅｒ）」オリゴヌクレオチドはまた、標的オリゴヌクレオチドに相補的であるように設計され、そして溶液中には存在しない。この侵入オリゴヌクレオチドは、ビーズに繋がれたオリゴヌクレオチドの５’オリゴヌクレオチド特異的な部分と一塩基重複する３’末端を有するように設計される。これらの２つのオリゴヌクレオチドが、クリベース酵素の存在下、適切な緩衝液および温度の条件下で、テンプレートにハイブリダイズする場合、この酵素は、ビーズに繋がれたオリゴヌクレオチドを切断する。テンプレートになおも結合するオリゴヌクレオチドの切断部分は、侵入オリゴヌクレオチドより低いＴｍを有し、その結果、これは、侵入オリゴヌクレオチドよりも高い速度でテンプレートから変性する。この侵入オリゴヌクレオチドおよびテンプレートは、次いで、自由にビーズから解離し、そして未反応のビーズに繋がれたオリゴヌクレオチドに結合するようになり、等温的な様式でこのプロセスを繰り返す。各個々のビーズについて、切断の量の測定は、存在するテンプレートの量の基準を与える。
【０１６８】
多重アッセイ（１つより多いテンプレートオリゴヌクレオチドを同時に定量すること）は、異なるスペクトル的にコードされたビーズに、異なるテンプレート特異的オリゴヌクレオチドを付着することによって実施され得る。異なる侵入オリゴヌクレオチドは、多重化される場合、各異なるテンプレート配列について合成されなくてはならない。各々の異なるスペクトル的にコードされたビーズについての切断は、ビーズに付着されるオリゴヌクレオチドに相補的な、存在するテンプレートの量に依存する。各スペクトル的にコードされたビーズからの切断の定量は、存在する相補的なテンプレートの量の基準を与える。
【０１６９】
この切断は、フラップ構造の領域の完全に対形成した塩基に依存することが公知である。テンプレートと侵入オリゴヌクレオチドに接する位置にあるかまたはその位置に近いビーズに繋がれたオリゴヌクレオチドとの間に１以上の塩基の差異が存在する場合、このクリベースは、切断するとしても、かなり減少した割合で切断する。テンプレートと侵入オリゴヌクレオチドの３’末端近傍との間のミスマッチは、同じ効果を有する。このことは、このアッセイを、単一のヌクレオチド多型を遺伝子型決定するために使用することを可能にする。
【０１７０】
これらのビーズベースのアッセイの場合において、対立遺伝子特異的切断が、１つより多い対立遺伝子について、同時に実施され得る。このことは、ビーズに繋がれたオリゴヌクレオチドが対立遺伝子特異的であるように設計することによってなされ得（図８を参照のこと）、その結果、１つの対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドが１つのスペクトル的にコードされたビーズに付着され、そして別の対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオチドが異なるスペクトル的にコードされたビーズに付着される。対立遺伝子特異的とは、１つの対立遺伝子に完全に相補的であるが、他の対立遺伝子にはそうではないことを意味する。ビーズに繋がれたオリゴヌクレオチドは、多型性塩基が、オリゴヌクレオチドのテンプレート特異的部分の５’末端にあるかまたはその近傍にあるように設計される。これは、侵入反応における対立遺伝子特異的な切断を生成する。複数のスペクトル的にコードされたビーズ（各々は、異なる対立遺伝子特異的配列に結合される）が、アッセイにおいて一緒に混合される場合、切断の相対量の定量が、対立遺伝子の存在／非存在を示し、そして遺伝子型データを生成するために使用される。あるいは、この多型配列は、その３’末端にあるかまたはその近傍で侵入オリゴヌクレオチドと対形成し得る。この場合において、同じコードされたビーズが使用され得るが、別の反応が各対立遺伝子に対して実施される。
【０１７１】
図９に示されるように、検出可能な標識が、ビーズに繋がれたオリゴヌクレオチドのテンプレート特異的部分に組み込まれるか、またはこのテンプレート特異的部分の末端に組み込まれた場合、この部分は、切断（および引き続く任意の洗浄）に続いて、ビーズから脱離するようになる。適切な検出可能な部分は、有機発蛍光団（これは、スペクトルコードとスペクトル的に重複しない）、ＳＣＮＣＴＭ半導体ナノクリスタル（ＳＣＮＣ）、およびハプテン様ビオチン（これは、ストレプトアビジン−発蛍光団、ストレプトアビジン−ＳＣＮＣＴＭＳＣＮＣまたは他のシグナル生成化合物に結合され得る）を含む。このシグナルの減少（ネガティブコントロールと比較しての）の測定は、生じた切断の量の指標を与える。
【０１７２】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は、レポーター（蛍光染料、ＳＣＮＣＴＭＳＣＮＣなど）およびクエンチャーが、最初に切断部位のいずれかの側面に結合される場合に使用され得る。一旦切断が起こると、このクエンチャーは、レポーターの近傍から取り除かれ、そしてこのレポーターは、ビーズに結合したまま残る。従って、増加した切断は、増加した発光を導き、これは、蛍光レポーターについて、適切な波長で発光を測定することによって検出される。
【０１７３】
図１０は、この方法の概念を示す。ここで、ビーズに結合したまま残る切断されたプローブの一部分が、３’−ＯＨ基を有し、それによってｄＮＴＰを用いる伸長または標識された５’リン酸化オリゴヌクレオチドとのライゲーションに従順となる。
【０１７４】
切断されたプローブは、多くの標識されたヌクレオチドを組み込むために、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して検出され得る。この未切断のビーズに繋がれたオリゴヌクレオチドは、伸長されることを防ぐためにその３’末端で改変されなくてはならない。これは、種々の方法（ＣＰＧ合成支持体（例えば、３’Ｃ３スペーサー）または３’−リン酸化（Ｇｌｅｎｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）（伸長され得ない３’末端を離す）を使用するか、または３’−ＯＨをリン酸化する合成後方法を使用することを含む）で、あるいはこのアッセイを行う前にオリゴヌクレオチドの３’末端でｄｄＮＴＰを組み込むために末端トランスフェラーゼを使用することによって実施され得る。最も良い感度のために、（１）１００％（または１００％に近い）完全に残しそして（２）伸長を１００％（または１００％に近く）阻害する改変が必要とされる。プローブに対するこの改変は、末端トランスフェラーゼ法を使用する場合に必要とされ、そしてテンプレートへのハイブリダイゼーションを必要とする他の方法（以下）を使用する場合に所望され得る。
【０１７５】
切断を検出するためにプライマー伸長を使用する場合、第二のテンプレート（試験されるサンプルとは異なる）が使用され、この第二のテンプレートは、適切なポリメラーゼ、緩衝液、温度などの存在下で、切断されたプローブにハイブリダイズし、そしてそれが伸長し、そして標識されたヌクレオチドを組み込むことを可能にする。切断されていないオリゴヌクレオチドは伸長しない。なぜならこれは、その３’末端において、この第二のテンプレートに相補的ではないからである。組み込まれたシグナルの測定は、従って、生じた切断の量の基準を与える。熱環化反応は、切断生成されたプライマーのより完全な切断を可能にする。切断と伸長との間のビーズの洗浄は、第一のテンプレートでの非特異的な伸長を減少することが必要とされ得る。
【０１７６】
使用される第二のテンプレートは、ローリングサークル複製を開始し、従って、多数の標識されたヌクレオチドを組み込むために、環化されたテンプレートであり得る（Ｌｉｚａｒｄｉら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１９：２２５−２３２を参照のこと）。
【０１７７】
ライゲーションは、切断されたオリゴヌクレオチドを検出するための方法として使用され得る。第二のテンプレートは、検出部分で標識された別のオリゴヌクレオチドへの切断されたプローブのライゲーションを調節するために使用される。この反応は、第二のテンプレートとしての未切断のプローブの非特異的なライゲーションに感受性ではないようであり、そして標識されたオリゴヌクレオチドが、非常に特異的であるように選択され得る。この未切断のビーズ結合オリゴヌクレオチドはまた、上記のように、その３’末端で改変されて、ライゲーション反応における任意の活性を防止し得る。
【０１７８】
「侵入自乗（ｉｎｖａｄｅｒ　ｓｑｕａｒｅｄ）」と呼ばれる二重アッセイ様式は、異なるテンプレートに対する異なるクリベース反応における侵入プローブとして切断プローブの３’部分を使用する。これらの反応は、同じ反応チューブにおいて同時に進行し、そして幾何的な増幅を提供する。溶液相アッセイで使用されるＦＲＥＴベースの検出様式において、このことは、一般的なＦＲＥＴプローブを、多くのアッセイで使用することを可能にする。なぜなら、このＦＲＥＴプローブの切断は、ＦＲＥＴプローブの人工的（サンプルの一部ではない）テンプレートへのハイブリダイゼーションおよびアッセイ特異的反応からの侵入プローブの作製に起因して実施されるからである。一般的なビーズ（すなわち、人工的に導入されたテンプレートに特異的であるがサンプルには特異的ではない核酸配列を有するオリゴヌクレオチドが結合されている）は、これらのビーズに対する特異的な侵入プローブの生成に起因して、多くの異なるプローブの特異的切断を検出するために作製され得る。
【０１７９】
（ループプローブアッセイ）
図１１に示されるループプローブハイブリダイゼーションアッセイにおいて、分子ビーコンに類似するオリゴヌクレオチドヘアピン構造が、設計および合成される。このオリゴヌクレオチドは、好ましくは、このオリゴヌクレオチドの３’末端と５’末端との間に４〜７塩基の相補配列を含んで、ステム−ループ二次構造を形成する。ステム配列の間には、ポリヌクレオチド標的の少なくとも一部分に相補的である配列が配置される。このオリゴヌクレオチドの５’末端は、固体支持体に結合し得るリンカー（例えば、アミノリンカー）で標識される。レポーターもクエンチャー色素もいずれも必要とされない。
【０１８０】
このオリゴヌクレオチドは、多くの標準的なカップリング化学のいずれか１つを介して、基質に結合され、この基質は、マイクロスフィアである必要はない。未結合のオリゴヌクレオチドプローブが、洗浄される。このオリゴヌクレオチドプローブは折り畳まれ、オリゴヌクレオチドフォールディングプログラムを使用して予測されたヘアピン二次構造を形成する。
【０１８１】
標識されたプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標識されたポリヌクレオチド標的を生成するために実施され得、この標的は、ビーズの表面の捕捉プローブに相補的である。このＰＣＲ増幅ＤＮＡ標的は、熱処理または塩基処理によって、変性されるかまたは一本鎖にされる。単一の塩基相補的標的を含むこの溶液は、次いで、捕捉プローブに結合されたビーズを用いて溶液に配置される。この標的鎖は、捕捉プローブ配列に相補的であり、そしてこの捕捉プローブ配列にハイブリダイズする。
【０１８２】
捕捉プローブ内の二次構造は、この完全に相補的な標的が、二次構造を開け、そして特異的に結合することのみを可能にする。単一のヌクレチド多型は、結合を乱し、そしてミスマッチしたプローブが、ハイブリダイゼーションにアクセスすることを防止するに十分である。
【０１８３】
このアッセイの最適化のための因子としては、ステム長およびＧＣの内容、プローブループ長およびＧＣ内容、プローブループオリゴヌクレオチドスペーサー長、標的濃度、標的アプリコン長、アッセイ温度、アッセイ塩濃度、ならびにアッセイインキュベート時間が挙げられる。
【０１８４】
１つの好ましい多重実施形態において、２つのプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅標的を生成する。捕捉される鎖を形成するように伸長するプライマーが、オリゴヌクレオチド合成の間に、フルオロセインで５’末端標識される。これらの２つのプライマーは、ＳＮＰに隣接する領域を増幅するために選択される。
【０１８５】
２つの捕捉プローブ配列が選択され、各々は、ＳＮＰの２つの対立遺伝子に相補的である。これらのプローブは、分子ビーコンの配列を設計するために使用されたのと同じオリゴヌクレオチドフォールディングプログラムを使用して、選択される。ステム長は、代表的に、４〜７ヌクレオチド長で変化する。各オリゴヌクレオチドの５’末端は、アミノリンカーを化学的に結合している。
【０１８６】
２つの異なるスペクトルでコードされるミクロスフェアを作製した。これら２セットのビーズは、スペクトルが異なる。このミクロスフェアの表面は、カルボキシル基を含む。各アミノ化したオリゴヌクレオチド捕獲プローブを、標準的なＥＤＣカップリング反応を介してスペクトルでコードされるカルボキシルビーズのうちの１つに結合体化させる。結合していないオリゴヌクレオチドを、洗浄除去する。蛍光標識したプライマーを用いたＰＣＲ反応を実行して、いくつかのＤＮＡ標的（これは、その配列内にＳＮＰを含む）を作製する。このＰＣＲ増幅したＤＮＡ標的を変性させるか、または熱もしくは塩基処理によって一本鎖にする。次いで、相補的標的を含む溶液を、ビーズに結合された捕獲プローブを含む溶液に置く。この捕獲プローブ配列に相補的である標的鎖は、ループを開き、そして結合する。この捕獲プローブ配列に相補的でない標的は、ループを開かず、そして結合しない。この特異性は、広範な範囲の最適な温度（代表的に約３０〜４５℃）にわたって達成され得る。
【０１８７】
あるいは、ＰＣＲプライマーは、フルオレセイン標識される（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎａｔｅ）代わりにビオチン化される。捕獲反応を実行した後、結合していない標的を洗浄除去し、そして検出反応を、ストレプトアビジンに結合体化された発蛍光団を介して実行した。この発蛍光団は、レポーターとしての半導体ナノクリスタルであり得る。
【０１８８】
（マイクロアレイを用いた方法の使用）
ポリヌクレオチドに結合したマイクロアレイスライドガラスを、ｗｗｗ．ｎｈｇｒｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＤＩＲ／Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ／ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌに記載され、Ｅｍｐｅｄｏｃｌｅｓらによる米国特許出願第０９／６７５，５２８号（表題「Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ　Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ　Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ」（２０００年９月２９日出願）にもまた示されるように調製し得る。マイクロアレイを用いたハイブリダイゼーションのための構成、サンプル標識および条件に関するさらなるガイダンスは、例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ　Ｍ．ら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ　４０６：５３６−５４０；Ｋｈａｎ　Ｊ．ら（１９９９）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　２０：２２３−９；Ｄｕｇｇａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８３：８３−８７；およびＤｅＲｉｓｉ，Ｊ．ら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．１４：４５７−６０によって提供される。
【０１８９】
代表的なマイクロアレイ実験において、標的ポリヌクレオチドを含むことが疑われるサンプルは、標識された増幅産物を形成するように処理される。増幅産物は、必要に応じて、阻害因子（ｂｌｏｃｋｅｒ）（例えば、ｔＲＮＡ、Ｃｏｔ１　ＤＮＡ）、または精製した反復配列（例えば、ＬＩＮＥまたはＡｌｕ配列）、またはこれらの混合物と混合される。非ヌクレオチドのブロッキング剤（タンパク質（例えば、ＢＳＡ）および界面活性剤を含む）がまた、使用され得る。次いで、この混合物がマイクロアレイスライドガラスと共にインキュベートされる。過剰のプローブが取り除かれ、そしてスライドガラスがスキャンされる。
【０１９０】
この後、マイクロアレイは、励起源および特定のＳＣＮＣもしくは使用される他の発蛍光団に適切な発光フィルターを有するレーザースキャナーを用いてスキャンされるか、またはマイクロアレイは、適切な励起フィルターおよび発光フィルターを有する広視野の画像スキャナを用いてスキャンされ得る。
【０１９１】
（キット）
本発明の方法を実行するのに有用な試薬を含むキットがまた、提供される。１つの実施形態において、キットは、ポリヌクレオチドに結合した基材を含む。この基材は、第１の半導体ナノクリスタルおよび第１の蛍光特徴を含む第１のスペクトルコードを含む、コードされるビーズ結合体であり得る。
【０１９２】
ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドのクリベースアッセイを実行するのに適切な配列を有し得るか、またはステム−ループ（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ）構造を形成し得る。ポリヌクレオチドは、上記のように、利用される特定のバリエーションに依存して、標識されても標識されなくてもよい。ポリヌクレオチドがステム−ループ構造を形成し得る場合、このポリヌクレオチドは、標識された標的ポリヌクレオチドまたはこの標的ポリヌクレオチド由来の増幅産物に結合するために使用される場合に標識され得るか、あるいはこのポリヌクレオチドは、分子ビーコンの形態であり得、そして標識を必要としない標的ポリヌクレオチドまたはこの標的ポリヌクレオチド由来の増幅産物に結合するために使用され得る。
【０１９３】
このポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチドまたはこの標的ポリヌクレオチドから産生される増幅産物を結合し得、そしてサンプルは、このキットの成分を用いて、このような標的ポリヌクレオチドまたはこの標的ポリヌクレオチドから産生される増幅産物の存在に関してアッセイされ得る。
【０１９４】
標識を増幅産物に組込むための試薬（例えば、標識プライマーまたはヌクレオチド）は、このキットに含まれ得る。キットの成分は、ハウジングによって保持される。本発明の方法を実行するためにこのキットを使用するための指示書は、このハウジングと共に提供され、そして、このハウジングの中またはハウジングの外に配置され得、そしてこのハウジングを形成する任意の表面の内部または外部に印刷され得る（これによって、指示を読み易くする）。侵入ポリヌクレオチドおよび／またはフラップエンドヌクレアーゼは、必要に応じて、クリベースアッセイを実施するためにこのキットに含まれ得る。このキットは、１つ以上の異なる基材またはコードされるビーズ結合体、および／または侵入ポリヌクレオチドの複数を含む複合形態であり得る。基材は、その基材（例えば、マイクロアレイ）上で複数の個々のアッセイを実行するために、複数の異なる配列のポリヌクレオチドを含み得るか、または複数の異なるビーズが、複合アッセイに提供され得る（ここで、この異なるビーズの各々は、対応する異なる標的ポリヌクレオチドおよび／または増幅産物への結合のための異なるポリヌクレオチドを含む）。
【０１９５】
（実施例）
以下の実施例は、本発明を行いそして使用する方法の完全な説明と共に、当業者に提供するために示され、そして本発明としてみなされる範囲を限定することが意図されるものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関する精度を確実にするための努力がなされるが、いくらかの実験誤差および偏差が、計上されるべきである。他に示されない限り、部は、重量部であり、温度は、セ氏温度であり、圧力は大気圧であるかもしくは大気圧付近であり、そして全ての材料は、市販されている。
【０１９６】
本発明は本発明の好ましい特定の実施形態と組合わせて記載されるが、上記の説明ならびに以下の実施例は、例示することが意図され、そして本発明の範囲を限定することが意図されることが、理解される。本発明の範囲内の他の局面、利点および改変は、本発明が属する当業者に明らかである。
【０１９７】
（実施例１．ミクロスフェアのスペクトルでのコード化、および、官能基化）　以下の実施例を、熱−膨張方法およびデキストランビオチンコーティングを介して、コードされかつ官能基化されたミクロスフェアを調製するために実行した。
【０１９８】
（材料）
ａ．１０ｕｍ　Ｂａｎｇｓ　ＣＯＯＨ　官能基化ビーズ　１０％固体（Ｂａｎｇｓ　Ｌａｂ）
ｂ．１０ｍＭ　ＰＢＳ、ｐＨ　７．４（Ｓｉｇｍａ）
ｃ．１０ｍＭ　ＰＢＳ／１％　ＢＳＡ
ｄ．ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）−誘導体化ＳＣＮＣ（Ｂａｗｅｎｄｉら、ＰＣＴ公開番号ＷＯ　００／１７６５５）
ｅ．デキストラン　ビオチン１０ｍｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ）；カタログ番号Ｂ５５１２、ロット番号８１Ｈ００８０
ｆ．ストレプトアビジン　１０ｍｇ／ｍＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）；カタログ番号２１　１２５Ｂ、ロット番号ＡＨ４１６６１。
【０１９９】
（プロトコール）
ｉ．ＰＢＳ緩衝液を用いて３回ビーズを洗浄し、ＰＢＳに再懸濁して、５％ビーズ溶液を作製する。
ｉｉ．ヒートブロック中のビーズ溶液を、一定に混合しながら６０〜６０℃まで加熱する。
ｉｉｉ．ＤＨＬＡ　ＳＣＮＣを添加する（添加する量は、特定のビーズに対する意図される強度に依存し、経験的に決定される）
ｉｖ．このビーズ混合物およびＳＣＮＳを５〜１０分間、６０℃でインキュベートする。
ｖ．コードされるビーズをＰＢＳを用いて３回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁する。Ｆａｃｓｃａｎおよび顕微鏡を用いてコードされるビーズの強度および均一性を調べる。
ｖｉ．デキストラン　ビオチン（１０ｍｇ／ｍＬ）をコードされるビーズ溶液に添加し、そして室温で一晩、一定に混合しながらインキュベートする。
ｖｉｉ．ビオチン　デキストランでコーティングされたコードされるビーズを、ＰＢＳを用いて洗浄し、そしてＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁する。
ｖｉｉｉ．ストレプトアビジン（５ｍｇ／ｍｌの終濃度）を、ビオチンデキストランでコーティングされたコードされるビーズに添加し、そして室温で３〜４時間インキュベートする。
ｉｘ．ＳＡコードされるビーズを、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁する。
【０２００】
ＳＡコードされるビーズは、選択したビオチン化分子ビーコンの結合の準備が整っている。
【０２０１】
（２．ＢＳＡ吸収を用いたＤＨＬＡ　ＳＣＮＣでのビーズのコード化およびマレイミド結合体化によるストレプトアビジンでのビーズの官能基化）
＊ビーズに吸収されたＢＳＡは、ＤＨＬＡ　ＳＣＮＣの引続く吸収およびストレプトアビジンの結合体化のための官能基のための表面を提供する。
【０２０２】
（材料：）
ａ．１０ｕｍ　Ｂａｎｇｓ　ＣＯＯＨビーズ　１０％固体（Ｂａｎｇｓ　Ｌａｂ）
ｂ．１０ｍＭ　ＰＢＳ／１％　ＢＳＡ、ｐＨ７．４
ｃ．ＤＨＬＡ　ＳＣＮＣ（複数形）（異なる色）
ｄ．Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ；カタログ番号２２３２２、ロット番号ＡＦ４０３０１、またはＳｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ（Ｐｉｅｒｃｅ）
ｅ．ＮＡＰ５カラムのための結合体化緩衝液および溶出緩衝液：０．１Ｍ　リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２
ｆ．ＮＡＰ５カラム平衡化緩衝液：１０ｍＭ　リン酸ナトリウム、ｐＨ６．８
ｇ．ＮＡＰ５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５樹脂、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；カタログ番号１７−０８５３−０２、ロット番号２７８６９４
ｈ．ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）；カタログ番号２１１２５Ｂ、ロット番号ＡＨ４１６６１
ｉ．２−イミノチオレーン（２−Ｉｍｉｎｏｔｈｉｏｌａｎｅ）（Ｓｉｇｍａ）；カタログ番号Ｉ−６２５６、ロット番号１２８Ｈ１０８５。
【０２０３】
（プロトコール）
１．ＰＢＳ緩衝液を用いて３回ビーズを洗浄する。
２．１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液を添加し、そして一定に混合しながら室温で一晩インキュベートする。
３．ＢＳＡでコーティングされたビーズをＰＢＳを用いて３回洗浄する。
４．ＤＨＬＡ　ＳＣＮＣを添加し、そして一定に混合しながら室温で１５〜３０分間インキュベートする。
５．ＰＢＳを用いて過剰のＤＨＬＡ　ＳＣＮＣを洗浄除去し、そして結合体化緩衝液に（ＢＳＡコードされたビーズを）再懸濁する。
＊注意：（ＢＳＡコードされたビーズ）は、これらのビーズを１％　ＢＳＡを用いて数時間インキュベートすることによって、別のＢＳＡ層でコーティングされ得る。
６．ｉ．２−イミノチオレーン（２０ｍｇ／ｍＬ）を（ＢＳＡコードされたビーズ）溶液に添加する。一定に混合しながら室温で１〜２時間反応させる。３回洗浄し、そして結合体化緩衝液を用いて再懸濁する。
ｉｉ．ストレプトアビジンのマレイミド活性化：Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣまたはＳｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ（６ｍｇ／ｍＬ）をストレプトアビジンの２０ｍｇ／ｍＬ溶液（結合体化緩衝液中）に添加する。＊注意：ストレプトアビジン溶液に添加する前にＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを少量のｄＨ２Ｏに溶解する。室温で３０分間反応させる。（精製された生成物を同時に得るために、この反応と上記のイミノチオレーン反応とのタイミングを計る）。マレイミド活性化されたストレプトアビジンを、１０〜１５ｍＬの平衡化緩衝液（充填前）および１〜２ｍＬの溶出緩衝液（充填後）を用いるＮＡＰ５カラムを使用して精製する。
【０２０４】
上記の２つの反応からの精製生成物を混合し、室温で２〜３時間反応させる。ＳＡコードされるビーズを、ＰＢＳで洗浄し、そしてＰＢＳ／ＢＳＡに再懸濁する。
【０２０５】
（実施例２．ビーズアッセイに対する複合分子ビーコン）
ＤＮＡアッセイがコードされたビーズに対して複合され得ることを実証するために、４つの分子ビーコン（各々は、異なるスペクトルでコードされるビーズに付着されている）を選択した。
【０２０６】
（分子ビーコンの調製）
５または６塩基対のステムを有する２５〜２７塩基長の４つの分子ビーコンを調製した；各々は、異なる標的を認識するように設計した。ビオチン分子を、ストレプトアビジンでコーティングされたスペクトルでコードされるビーズ上に固定するために、各ステム領域の中心に配置した。フルオレセイン発蛍光団を、５’末端に付着させ、そして［４−（４−ジメチルアミノフェリルアゾ）安息香酸］（ＤＡＢＣＹＬ）を各分子ビーコンの３’末端に付着させた。分子ビーコンおよびそれらの相補鎖を形成するポリヌクレオチドを、Ｍｉｄｌａｎｄ　Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙによって調製し、そしてこれらを以下に示す。文字「ｃ」は、この表示の直ぐ前に挙げられるオリゴヌクレオチドに対する相補鎖を示す。
【０２０７】
【表２】
2004500109.tif 000003
（分子ビーコンのストレプトアビジンコーティングされたコードされるビーズに対する付着）
表１に示されるように、ｍｂＤ７Ｓ８Ａを、５７２ｎｍで発光するＳＣＮＣを用いてコードされるビーズに結合させ、ｍｂＷＮＴ５Ａを、５９０ｎｍで発光するＳＣＮＣを用いてコードされるビーズに結合させ、ｍｂＧを、６２０ｎｍで発光するＳＣＮＣを用いてコードされるビーズに結合させ、そしてｍｂＴを５７２ｎｍおよび６１６ｎｍで発光するＳＣＮＣを用いてコードされる混合ビーズに結合させた。約５×１０５個のストレプトアビジンコーティングされたビーズを、７５μＬの１×ＰＢＳ、１％　ＢＳＡ、２μＭの分子ビーコン中で、連続的に２時間混合した。ＳＣＮＣを、ＰＢＳを用いて洗浄し、過剰の結合していない分子ビーコンを除去し、次いでＭＢアッセイ緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ、５０ｍＭ　ＫＣｌ、５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．０）に最懸濁した。
【０２０８】
（ビーズアッセイでの分子ビーコン）
それぞれの分子ビーコンに結合体化された１０４個の４種の異なるコードされたミクロスフェアのそれぞれを有する５０μＬのＭＢアッセイ緩衝液をそれぞれ含む、２本の管を調製した。４種の分子ビーコンの各々に対して２μＭの相補的なオリゴを、ハイブリダイゼーションによって分子ビーコンを開くために、一方のチューブに添加した。このチューブを、３０分間、３５℃のインキュベーター中で連続的に混合し、そして分子ビーコン緩衝液で一回洗浄した。各チューブ由来の約２０，０００〜３０，０００個のビーズを、３８４ウェルプレート中のウェルに移し、そして少なくとも１０分間静置させた。各ウェル中のコードされたビーズをデコードし、そして各ビーズ上のシグナル強度を測定した。それぞれのタイプの１２〜９６個のビーズを分析した。図１１は、プレートリーダーで測定されるように、この分子ビーコンが閉じられるか、またはヘアピン形態にあり、そして相補的なオリゴの存在中で開かれる場合の、コードされたビーズの各集団の平均シグナル強度を示す。あるいは、これらのコードされたビーズはまた、フローサイトメーターで分析され得る。
【０２０９】
結果は、コードされたビーズ上で標識されていないＤＮＡを検出するための単純な４重アッセイが、分子ビーコンに結合体化したことを実証する。このハイブリダイゼーションは、高速であり、そしてこのアッセイは、コードされたビーズ結合体の数を容易に増加させることによって、より多くの数のＤＮＡプローブをモニターするために使用され得る。
【０２１０】
（実施例３．コードされたビーズ上でのループプローブハイブリダイゼーション）
ビーズにハイブリダイズされたループプローブを使用する理由は、ＳＮＰ検出のための対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションの特異性を増大させるためであった。この特異性を増大させるために、本発明者は、ループプローブオリゴヌクレオチドの二次構造を利用し、このハイブリダイゼーションアッセイにおいて、単一塩基の識別するために、この特異性を増大させた。
【０２１１】
【化１】
2004500109.tif 000004
ループオリゴハイブリダイゼーションによる単一塩基の不一致検出の特異性を、ループプローブオリゴに結合体化させたコートされたビーズへのフルオレセインで標識した相補的標的オリゴのハイブリダイゼーションにより試験した。このループプローブおよび相補的オリゴ配列を、上に示した。２μｌの５’アミノ改変オリゴ溶液（１００ｕＭ）と２００ｍＭのＥＤＣ中の約１００万個の６ｕまたは１０ｕのいずれかのカルボン酸改変ビーズとを室温で４時間インキュベートすることによって、従来のＥＤＣ結合体化方法により、このビーズをオリゴと結合体化した。次いで、この結合体化されていないオリゴを、２×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳを用いて洗浄除去した。２．５μｌの５’フルオレセイン改変相補的オリゴおよび１μｌの１０ｕ結合体化ビーズ（約５０，０００）を４０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　Ｔｒｉｐ　ｐＨ８．０、５０ｍＭ　ＫＣｌ）に添加することによって、このハイブリダイゼーションを、実施した。このビーズを、４５℃で２時間、オリゴと共にインキュベートした。次いで、相補的オリゴを含むビーズを、遠心沈殿し、そして４００μｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。このサンプルをＰＢＳ中でフローサイトメーター上で読取った。この結果は、図１２において見られ得る。相補的フルオレセイン改変オリゴ結合体化ビーズアッセイのハイブリダイゼーションにおいて、１個の塩基の不一致は、Ａ対立遺伝子とＢ対立遺伝子とを識別するのに十分であった。
【０２１２】
目的のＳＮＰを含むゲノムの領域を、ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲプライマーの配列を、上に示した。ＰＣＲ産物を、上記と同一のループオリゴ結合体化ビーズにハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーションを、２．５μｌのアンプリコンを、４０μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ　Ｔｒｉｐ　ｐＨ８．５０ｍＭ　ＫＣｌ）に添加することにより実施し、そしてこれを、９５℃で３分間加熱して変性させた。このアンプリコンを、１０μ結合体化ビーズ（約５０，０００個）（１μｌ）に添加する前に、５分間、氷上に置くことによって、スナップ冷却した。このビーズを、２時間４５℃でこのアンプリコンと共にインキュベートした。次いで、アンプリコンを有するビーズを、遠心沈殿させ、そして１００μｌのＰＢＳ／ＢＳＡ中に再懸濁させた。０．１ｍｇ／ｍｌのＳＡ−ＰＥのＰＢＳ／ＢＳＡ（１μ）に添加し、そして室温で３０分間インキュベートした。このビーズの全てを遠心沈殿し、この上清を取り除き、そしてこのサンプルを、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。サンプルを４００μｌのＰＢＳ中でフローサイトメーター上で読取った。図１３は、適切な対立遺伝子の識別が野生型遺伝子型サンプルおよび変異体遺伝子型サンプルの両方で見出されることを示す。
【０２１３】
（実施例４．ビーズ上で分子ビーコンを使用する、Ｄ７Ｓ８　ＳＮＰの検出）　この実験は、染色体部位のヒトゲノムＤ７Ｓ８遺伝子座：７ｑ２２−３１．１（嚢胞性線維症関連遺伝子）でのＳＮＰの検出を実証するために実施した。
【０２１４】
【化２】
2004500109.tif 000005
Ｘ：ＳＮＰの位置
Ｘ＝Ｃ／Ｇ：対立遺伝子Ａ
Ｘ−Ｔ／Ａ：対立遺伝子Ｂ。
【０２１５】
材料：
１．遺伝子ＤＮＡ：ＧＭ０９９４７Ａ、ＧＭ０９９４８Ａ、ＳＳ
２．４％　アガロース（＿ＥｔＢｒ）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；カタログ番号４５−０００９、ロット番号Ｆ２４０２０
３．１０ｋＤのＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ｐａｌｌ　Ｆｉｌｔｒｏｎ）；カタログ番号ＯＤＯ１０Ｃ３３、ロット番号９２５２Ｄ
４．ストレプトアビジンでコートされたビーズ（ＢＳＡ／ＤＨＬＡＳＣＮＣ／マレイミド結合体化方法を使用して調製）
５．７６ｂｐのフラグメントＰＣＲプライマー：
順方向プライマー：５’−ビオチン−Ｇ　ＧＧＡ　ＣＣＣ　ＴＧＡ　ＣＣＴ　ＴＡＴ　ＴＧＣ−３’
逆方向プライマー：３’−ＴＣＧ　ＡＧＡ　ＣＴＣ　ＴＴＣ　ＣＧＴ　ＣＧＧ　Ｔ−ビオチン−５’
６．１５１　ｂｐフラグメントＰＣＲプライマー：
順方向プライマー：５’−ビオチン−ＣＴＡ　ＧＧＧ　ＡＴＧ　ＴＴＣ　ＣＴＧ　ＴＣＴ　ＣＡＧ−３’
逆方向プライマー：３’−Ａ　ＧＣＧ　ＴＣＴ　ＴＧＴ　ＣＣＣ　ＧＡＡ　ＣＣＧ　Ｔ−ビオチン−５’
７．ｍｂＤ７Ｓ８Ａ（Ｍｉｄｌａｎｄ　Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ）
【０２１６】
【化３】
2004500109.tif 000006
５’−ＴＡＴ　ＧＡＣ　ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＴＣＣ　ＧＧＧ　ＡＡＡ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ−３’相補的Ｄ７Ｓ８Ｂ：
５’−ＴＡＴ　ＧＡＣ　ＣＡＧ　ＣＡＴ　ＴＣＣ　ＡＧＧ　ＡＡＡ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＡＡＡ−３’
８．ビーズ上のオリゴの共有結合体についての線状プローブ：
アミノＤ７Ｓ８Ａ：５’ＮＨ２−ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＡＣＣ　ＡＧＣ　ＡＴＴ　ＣＣＧ　ＧＧＡ　ＡＡＧ−３’
アミノＤ７Ｓ８Ｂ：５’ＮＨ２−ＴＴＴ　ＴＴＴ　ＡＣＣ　ＡＧＣ　ＡＴＴ　ＣＣＡ　ＧＧＡ　ＡＡＧ−３’
９．ＰＣＲ反応混合物：
ａ．　Ａｍｐｌｉ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ５Ｕ／μＬ
ｂ．ｄＮＴＰ混合物　１０ｍＭ
ｃ．１０×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ
ｄ．ＭｇＣ１２溶液（２５ｍＭ）。
【０２１７】
全ての成分は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒからのものである。
ＰＣＲ反応混合物の調製：
３９９μＬのオートクレーブした水
１５μＬの５Ｕ／μＬのＡｍｐｌｉＴａｑ
６０μＬの１０Ｘ　ＰＣＲ緩衝液ＩＩ
９６μＬの２５ｍＭ　ＭｇＣ１２
３０μＬの１０ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物
総容量：６００μＬ。
【０２１８】
ＰＣＲ条件：
対称ＰＣＲ反応の容量および内容物：
・　　　　　　　１０μＬのＤＮＡ（０．５ｎｇ／μＬ）
・　　　　　　　２０μＬのＰＣＲ反応混合物
・　　　　　　　１０μＬの順方向プライマー（２．５ｕＭ）
・　　　　　　　１０μＬの逆方向プライマー（２．５ｕＭ）。
【０２１９】
変性：９５℃（１分）
３６サイクル（９５℃で３０秒、６３℃（１５１ｂｐ　ＰＣＲついて）または５８℃（７６ｂｐ　ＰＣＲについて）で３０秒、７２℃で３０秒）。
【０２２０】
終結：７２℃で１０分、次いで４℃まで冷却。
【０２２１】
１５１ｂｐおよび７６ｂｐの二重鎖産物を、２０ｂｐラダー標準（ｌａｄｄｅｒ　ｓｔａｎｄａｒｄ）を含むゲルによって確認する。
【０２２２】
（Ｂ．非対称的ＰＣＲ反応の容量および含有物）
・１０μＬの１／１０希釈の精製された７６ｂｐフラグメント（１０ｋＤ）Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ’ｓ　ｒｅｔｅｎｔａｔｅ
・２０μＬのＰＣＲ反応ミックス
・２０μＬの逆方向プライマー（２．５μＭ）
変性：１時間９５℃
４０サイクルの（３０秒間９５℃、３０秒間５０℃、３０秒間７２℃）
終結：１０分間７２℃。次いで４℃に冷却する。
【０２２３】
一本鎖ＰＣＲ産物を、７６ｂｐフラグメントのＰＣＲ正方向プライマーを使用する非対称性ＰＣＲ産物を用いて、４％アガロースゲルアッセイならびにアミノＤ７Ｓ８ＡおよびアミノＤ７Ｓ８Ｂの共有結合したビーズの直鎖状プローブアッセイの両方によって確認した。
【０２２４】
ｍｂＤ７Ｓ８Ａを、ストレプトアビジン−ビオチン連結を介してオレンジ色コードビーズに付着させた。ｍｂＤ７Ｓ８Ｂを、ストレプトアビジン−ビオチン連結を介して赤色コードビーズに付着させた。
【０２２５】
ｍｂＤ７Ｓ８Ａのオレンジ色コードビーズを、異なる濃度のＤ７Ｓ８ＡおよびＤ７Ｓ８Ｂで力価決定し、アッセイの動的範囲を決定した。０．１μＭのより大きな単位複製配列（アッセイの動的範囲）は、バックグラウンドを有意に超える十分なシグナルを生成するのに必要であった。
【０２２６】
（Ｄ７Ｓ８座位での３つのゲノムＤＮＡの対立遺伝子の識別）
アッセイ条件：
・ｍｂＤ７Ｓ８Ａオレンジ色コードビーズおよびｍｂＤ７Ｓ８Ｂ赤色コードビーズの３つの５０μＬ混合物を、５分間３５℃でインキュベートした（１チューブ当り合計約２０，０００のビーズ）。
・０９９４７Ａまたは０９９４８ＡまたはＳＳの濃縮された（非対称的なＰＣＲ産物の５つのチューブ）７６ｂ単位複製配列を、各チューブに別々に添加する。１５分間３５℃でインキュベートする。
・各チューブに、３００μＬのＭＢアッセイ緩衝液を添加する。各チューブからの２０００ビーズをＦＡＣＳＣＡＮで別々に読み取る。３つのＤＮＡサンプルについての赤色ビーズおよびオレンジ色ビーズ由来のＦＬ１シグナルをプロットする。
【０２２７】
結果を図１４に示す。
【０２２８】
結論：
コードされたビーズアッセイ上の分子ビーコンは、対立遺伝子特異性を伴ってＤ７Ｓ８座位においてＳＮＰを検出し得、そして利用可能なＳＣＮＣコードの広範な範囲に起因して行われる多重アッセイを可能にするＳＮＰ検出のための代替的なアッセイを提供する。コードされたビーズアッセイ上の分子ビーコンは、短いアッセイ時間を有する、リアルタイムの、低温度の、かつ一工程のアッセイを可能にする。このアッセイ形式の別の特別な特徴は、ＰＣＲの間に標識を取り込む必要が全くないことである。
【０２２９】
本発明は、好ましい実施形態を参照して、いくらか詳細に記載されているが、当業者は、本明細書中の教示を考慮して、特定の変化および改変が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく行なわれ得ることを理解する。従って、本発明は、特許請求の範囲のみによって制限される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、ヘアピンまたはステムループ構造を有するポリヌクレオチドを含む分子ビーコンを描く。この分子ビーコンは、ポリヌクレオチドの１つの末端に位置するクエンチャーおよびこのポリヌクレオチドの反対の末端に位置する発蛍光団を有する。その結果、分子ビーコンがステムループ構造を形成する場合、クエンチャーが、発蛍光団からの蛍光放射をクエンチし得る。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる図１Ａに示される分子ビーコンを描く。ハイブリダイズの結果、分子ビーコンは、ステム−ループ構造を形成せず、従って、クエンチャーは、発蛍光団からの蛍光放射をクエンチしない。
【図２】
図２は、半導体ナノ結晶を含むスペクトルコードでコードされるミクロスフェアにスペーサーを介して結合される分子ビーコンを示す。ここで、この分子ビーコンは、ステム−ループ構造を形成し、そして発蛍光団が、標的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの非存在下でクエンチされ、そしてここで、標的オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、分子ビーコンが標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズされる場合、発蛍光団からの蛍光が検出されることを可能にする。発蛍光団はまた、自己クエンチし得、そして分子ビーコンに配置され得、その結果、その蛍光放射が、ステムループ構造が形成される場合か、または分子ビーコンが標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズされ得る場合のいずれかで、クエンチされるが、両方の状態下ではクエンチされないということに留意のこと。
【図３】
図３は、図２に示される種々の分子ビーコンを示す。クエンチャーは、分子ビーコンの遠位末端に付着され、レポーター発蛍光団は、分子ビーコンとミクロスフェアを架橋する。分子ビーコンのその標的ポリヌクレオチドへの結合は、レポーターからクエンチャーを離し、それによって励起に基づいてその蛍光放射を増加する。
【図４】
図４は、クエンチャーがコードされるミクロスフェアの表面上にストレプトアビジンと共に配置される別の変形物を示す。そして、分子ビーコンは、１つの末端でビオチン分子および別の末端でレポーター発蛍光団に連結される。このビオチン分子は、ストレプトアビジンに結合し、そして分子ビーコンをビーズの表面へ配置し、ここで、このクエンチャーは、標的ポリヌクレオチドが存在しない場合、レポーターからの蛍光放射をクエンチし得る。しかし、標的ポリヌクレオチドへハイブリダイズされる場合、このレポーターは、クエンチャーから離れて、そしてその蛍光放射が増加する。
【図５】
図５は、図４に示されるものと逆の変形物を示す。ここで、クエンチャーは分子ビーコンの遠位末端で配置され、そしてレポーター発蛍光団がミクロスフェアの表面上にストレプトアビジンと共に配置される。分子ビーコンは、再びビオチン分子を介してミクロスフェアに連結される。分子ビーコンの標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションは、ミクロスフェアの表面からクエンチャーを離し、そして、ビーズの表面上の発蛍光団が増加した蛍光放射を有することを可能にする。
【図６】
図６は、図５に示されるものと類似の変形物を示す。しかし、ミクロスフェアの表面は、異なる色のＳＣＮＣでコーティングされる。その結果、この分子ビーコンの標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションに際して、複数の蛍光放射がミクロスフェアの表面から増加する。
【図７Ａ】
図７Ａは、コードされたビーズの表面上で実施されるクリベースアッセイを示す。ビーズへ連結されたオリゴヌクレオチドプローブは、切断前に標識され得るか、または未標識であり得る。標的核酸は、ビーズに連結された１つのオリゴヌクレオチドプローブへのハイブリダイズされるように示される。侵入オリゴヌクレオチドもまた、標的核酸へ同時にハイブリダイズされるように示される。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、クリベースアッセイを実施した後のビーズを示す；ビーズへ連結されたオリゴヌクレオチドのいくつかは、切断として示され、そしていくつかは切断されない。切断の量は、サンプルに存在する標的核酸の量に比例する。
【図８Ａ】
図８Ａは、単一の塩基によって異なる標的ヌクレオチド配列の２つの異なる改変体に相補的な２つの異なるオリゴヌクレオチドプローブと結合体化された２つの異なるスペクトルでそれぞれコードされたビーズを示す。この塩基の違いは、侵入オリゴヌクレオチドによって置換されるヌクレオチドに十分に近く配置される。その結果、クリベース酵素は、不適切な標的核酸にハイブリダイズした場合、オリゴヌクレオチドプローブを切断しない：ビーズ１上のオリゴヌクレオチドは、Ｔが存在する場合にのみ切断され、一方、ビーズ２上のオリゴヌクレオチドは、Ａが存在する場合にのみ切断される。１より多い対立遺伝子は、同じ単一ヌクレオチド多型を有し得、その結果、単一アッセイはいずれも複数の対立遺伝子を検出する。
【図８Ｂ】
図８Ｂは、単一の塩基によって異なる標的ヌクレオチド配列の２つの異なる改変体に相補的な２つの異なるオリゴヌクレオチドプローブと結合体化された２つの異なるスペクトルでそれぞれコードされたビーズを示す。この塩基の違いは、侵入オリゴヌクレオチドによって置換されるヌクレオチドに十分に近く配置される。その結果、クリベース酵素は、不適切な標的核酸にハイブリダイズした場合、オリゴヌクレオチドプローブを切断しない：ビーズ１上のオリゴヌクレオチドは、Ｔが存在する場合にのみ切断され、一方、ビーズ２上のオリゴヌクレオチドは、Ａが存在する場合にのみ切断される。１より多い対立遺伝子は、同じ単一ヌクレオチド多型を有し得、その結果、単一アッセイはいずれも複数の対立遺伝子を検出する。
【図９】
図９は、ビーズアッセイにおけるクリベースの１つの変形物を示す。ビーズに連結されたオリゴヌクレオチドは、初めはその近位末端で標識化され、そして標的核酸の存在下での切断は、ビーズに結合された標識において減少を導く。
【図１０】
図１０は、ビーズアッセイにおけるクリベースの別の変形物を示す。オリゴヌクレオチドは、初めは未標識であり、そして標識の付着のための遊離遠位末端を欠く；標的核酸の存在下でのオリゴヌクレオチドの切断は、種々の方法を介して標識に連結され得る遊離遠位末端を現す。
【図１１】
図１１は、ＳＮＰ対立遺伝子を選択的に検出するために使用されるループプローブアッセイの描画である。
【図１２】
図１２は、相補的配列（クローズされ、そしてクエンチされたＭＢ）の添加なし、ならびに相補的配列（オープンされ、そしてクエンチされないＭＢ）ありの、異なる型のコードされたビーズ上の４つの分子ビーコンが、アッセイされた。各チューブ内のコードされたビーズ結合体は、プレートリーダーを使用して解析された。各チューブ由来の各型の結合体の１２〜９６が、読まれた。各バーは、任意の単位でのビーズの強度を示し、上の区画は標準偏差を示す。
【図１３】
図１３は、スペクトルでコードされた１０ミクロンのミクロスフェアに結合体化される対応するループプローブへの単一のヌクレオチド多型を示す正しい標的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを示す。対立遺伝子に特異的な優先的なハイブリダイゼーションが観察された。
【図１４】
図１４は、１０μビーズまたは１６μビーズのいずれかのビーズ上での、図１２に示されるＳＮＰを示すゲノム遺伝子座からのＰＣＲ産物のハイブリダイゼーションのグラフ結果を示す。標的遺伝子型の対立遺伝子の特異的検出が観察された。
【図１５】
図１５は、ビーズアッセイにおける分子ビーコンのグラフ結果を示す。このビーズアッセイは、対立遺伝子に特異的な分子ビーコンを使用してゲノム遺伝子座からＳＮＰの２つの対立遺伝子を識別する検出を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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