(57)【要約】本発明は、ｐＤＰ２１４を同定かつコード化するポリヌクレオチドを開示すると同時に、発達する膵臓の間充織、肺、胃、腎臓、および外胚葉性頂堤や毛包等の外胚葉の特定の領域において特異的に発現するＤＰ２１４遺伝子系（ｐＤＰ２１４）の新規機能を開示する。本発明はまた、遺伝子操作された発現ベクター、ｐＤＰ２１４をコード化する核酸配列を含む宿主細胞、およびｐＤＰ２１４の生産方法も提供する。本発明はまた、アゴニスト（作用薬）、抗体、または特異的にｐＤＰ２１４を結合するアンタゴニスト（拮抗薬）も提供し、またｐＤＰ２１４の発現に関連する疾患の予防と治療におけるその利用法をも提供する。さらに本発明は、ｐＤＰ２１４の発現に関連する疾病の治療のため、ｐＤＰ２１４をコード化するポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子の利用法を提供する。本発明はまた、ポリヌクレオチドまたはその補体の断片、特異的にｐＤＰ２１４を結合する抗体を利用する診断アッセイ（検定）も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＰ２１４遺伝子ファミリーの核酸分子またはそれによってコード化されたポリペプチドまたは当該核酸分子または当該ポリペプチドの断片または変異型、またはＤＰ２１４遺伝子ファミリーの核酸分子またはそれによってコード化されたポリペプチドを認識する抗体、アプタマーまたは他の受容体を活性薬剤として含む医薬品組成物。
【請求項２】
核酸がニワトリＤＰ２１４核酸またはそのヒト相同体またはその断片またはその変異型である請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
核酸分子が図３でＣＬＴ１として指定されている配列を有するＣ−型レクチンドメインまたはそのヒト相同体またはその断片またはその変異型である請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
核酸分子が特定の組織で発現されたポリペプチドをコード化する請求項１から３までのいずれか１項に記載の組成物において、当該核酸分子が
（ａ）　１ｘＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを含む溶液中で配列番号１のアミノ酸配列をコード化する核酸分子またはその相補鎖と５５℃でハイブリダイズするか、
（ｂ）　核酸分子（ａ）に対して縮重しているか、
（ｃ）　配列番号２の配列に対して少なくとも８５％、望ましくは少なくとも９０％、より望ましくは少なくとも９５％、より望ましくは少なくとも９８％および９９．６％まで同一であるポリペプチドをコード化するか、あるいは
（ｄ）　コード化されたポリペプチドにおいて改変、削除、複製または早期停止を生じるような突然変異によって（ａ）〜（ｃ）の核酸分子と異なっている、請求項１から３までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
核酸分子がＤＮＡ分子、特にｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡである請求項１から４までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
核酸分子が分化調節または発生調節に関連し、特に膵臓の発達、さらには哺乳動物における膵臓の発達に原因となって関連する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
核酸分子が、発達する膵臓の間充織、肺、胃、腎臓または／および外胚葉性頂堤や毛包等の外胚葉の特定の領域で発現されるタンパク質をコード化する請求項１から６までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
核酸分子が、組換え核酸分子または合成核酸分子、場合によっては修飾された核酸分子である請求項１から７までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
組換え核酸分子がベクター、特に発現ベクターである請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
活性成分が、ＤＰ２１４ファミリーの核酸分子またはそれによってコード化されたポリペプチドを特異的に認識する抗体、断片またはその誘導体またはアプタマーまたは受容体である請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
当該ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項１から１０までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
当該ポリペプチドが融合ポリペプチドである請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
当該核酸分子がハイブリダイゼーションプローブ、プライマーおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される請求項１から１０までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
診断適用のための請求項１から１３までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
治療適用のための請求項１から１３までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
特に哺乳動物における膵臓、肺、胃、腎臓、皮膚、および／または付属物の疾病または障害を診断、監視、予防または治療するための薬剤を製造するための請求項１から１５までのいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
疾病または障害が、糖尿病または肥満症等の内分泌機能障害に関連する代謝障害を含む膵臓疾病または障害である請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項９のベクターでトランスフェクトされた請求項１１のポリペプチドまたは請求項１２の融合タンパク質を発現するか、あるいは請求項１から８までのいずれか１項に記載の核酸分子を含有する非ヒト動物。
【請求項１９】
ＤＰ２１４ポリペプチドの発現が修飾、例えば増大また減少された請求項１８に記載の動物。
【請求項２０】
修飾、例えば増大または減少されたＤＰ２１４ポリペプチドの発現を示す組換え宿主細胞。
【請求項２１】
ヒト細胞である請求項２０の細胞。
【請求項２２】
ＤＰ２１４ポリペプチドによって影響および／または修飾される遺伝子および／または遺伝子産物の機能を制御するための、請求項１から８までのいずれか１項に記載の核酸分子、請求項９に記載のベクター、請求項１８から２１までのいずれか１項に記載の宿主または宿主細胞、請求項１１に記載のポリペプチド、請求項１２に記載の融合タンパク質、請求項１０に記載の抗体、断片またはその誘導体またはアプタマーまたは受容体、または請求項１３のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２３】
検出および／または確認のための薬剤の製造、膵臓の疾患または障害（例えば糖尿病）の治療、緩和および／または予防、および、肺、胃、腎臓、皮膚および細胞、細胞塊、器官および／または対象物中の付属物等の関連した疾患および障害（例えば肥満症）の治療、緩和および／または予防のための、請求項１から１７までのいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項２４】
ＤＰ２１４ポリペプチドと相互作用する能力のある物質を同定するための、請求項１から８までのいずれか１項に記載の核酸分子、請求項９に記載のベクター、請求項１８から２１までのいずれか１項に記載の宿主または宿主細胞、請求項１１に記載のポリペプチド、請求項１２に記載の融合タンパク質、請求項１０に記載の抗体、断片またはその誘導体、アプタマーまたは受容体、または請求項１３のアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２５】
疾患および障害、例えば、膵臓の疾病や障害（例えば糖尿病）、および膵臓、肺、胃、腎臓、皮膚、または哺乳動物における付属物等の関連する疾病または障害（例えば肥満症）に関与するポリペプチドを同定する方法において、
（ａ）　当該（ポリ）ペプチドの結合を可能にする条件下で、（ポリ）ペプチドのコレクションとＤＰ２１４ポリペプチドまたはその断片とを接触させ、
（ｂ）　工程 （ａ）において結合しない（ポリ）ペプチドを、当該（ポリ）ペプチドのコレクションから除去し、かつ、
（ｃ）　当該ＤＰ２１４ポリペプチドまたはその断片に結合する（ポリ）ペプチドを同定する工程を含むことを特徴とする、ポリペプチドを同定する方法。
【請求項２６】
ＤＰ２１４ポリペプチドと、結合標的／薬剤との相互作用を調整する薬剤をスクリーニングする方法において、
（ａ）　（ａａ）　ＤＰ２１４ポリペプチドまたはその断片；
（ａｂ）　当該ＤＰ２１４ポリペプチドまたはその断片の結合標的／薬剤；および
（ａｃ）　候補薬剤
を含有する混合物を、対照親和性で、当該ポリペプチドまたはその断片が、特異的に当該結合標的／薬剤と結合する条件下でインキュベートし、
（ｂ）　（候補）薬剤偏向親和性を決定するために、当該結合標的に対する当該ＤＰ２１４ポリペプチドまたはその断片の結合親和性を検出し；かつ、
（ｃ）　（候補）薬剤偏向親和性と対照親和性との間の差異を測定する工程を含むことを特徴とする、ＤＰ２１４ポリペプチドと、結合標的／薬剤との相互作用を調整する薬剤をスクリーニングする方法。
【請求項２７】
製薬学的認容性のキャリアおよび／または希釈剤を有する、請求項２５の方法によって同定された（ポリ）ペプチド、または請求項２６の方法によって同定された薬剤を含む組成物の製造方法。
【請求項２８】
当該組成物が、肺、胃、腎臓、皮膚および細胞、細胞塊、器官および／または対象物の付属物等の疾病および障害（たとえば肥満症）、および特に請求項２５で同定されている疾患および障害を予防、緩和または治療するための医薬品組成物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
膵臓の疾患または障害（例えば糖尿病）、および肺、胃、腎臓、皮膚および細胞、細胞塊、器官および／または対象物中での付属物等の関連する疾病または障害（例えば肥満症）を予防、緩和および／または治療するための医薬品組成物の製造のための、請求項２５において同定された（ポリ）ペプチドまたは請求項２６に記載の方法によって同定された薬剤の使用。
【請求項３０】
対応する遺伝子産物またはその断片を過剰発現または過少発現する非ヒト−トランスジェニック動物を製造するための、配列番号１に示された核酸分子またはその相同体またはその断片の使用。
【請求項３１】
（ａ）請求項１から８までのいずれか１項に記載の核酸分子、
（ｂ）請求項９に記載のベクター、
（ｃ）請求項１８から２１までのいずれか１項に記載の宿主または宿主細胞、
（ｄ）請求項１１に記載のポリペプチド、
（ｅ）請求項１２に記載の融合タンパク質、
（ｆ）請求項１０に記載の抗体、断片、その誘導体、抗血清、アプタマーまたは受受容体、および
（ｇ）請求項１３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド
の少なくとも１つを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、発達する膵臓の間充織、肺、胃、腎臓、外胚葉性頂堤や毛包等の外胚葉の特定の領域において特異的に発現する、核酸配列およびＤＰ２１４様タンパク質のアミノ酸配列に関するものであり、また診断、研究、予防、疾病や障害（例えば糖尿病等の膵臓の疾病や障害が挙げられるが、これらに限定されるものではない）の治療、および肺、胃、腎臓、皮膚、四肢や毛髪等等の付属器に関連する疾病や障害（肥満症等）における、これら配列の使用に関するものである。
【０００２】
背景技術
本発明に記載されたタンパク質は、仮想ヒトタンパク質（例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ６６９１３またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ７６５９４）に対して有意な相同性を示す。疾病や障害、特に膵臓（例えば糖尿病）、および肺、胃、腎臓、その他に関連する疾病や障害（例えば肥満症）の調節における本ヒトタンパク質の機能は、従来の技術には記載されていない。本発明では、膵臓、肺、胃、腎臓、皮膚および四肢や毛髪等の付属器の発達に関与するＤＰ２１４遺伝子系の新規機能が記述されている。
【０００３】
発達する膵臓の間充織、肺、胃、腎臓、および外胚葉性頂堤や毛包等の外胚葉の特定の領域において、特異的に発現する分子をコード化するポリヌクレオチドの発見は、糖尿病および肥満症等の膵臓の疾病および障害を調査研究する機会を提示する。さらに本発見は、肺、胃腸路、尿生殖路に影響をおよぼす疾病および障害を調査研究する機会を提示する同時に、四肢や毛髪等の発達する付属器をも調査研究する機会を提示する。ＤＰ２１４タンパク質に関する分子の発見は、診断、予防、治療、および疾病や障害（例えば糖尿病等のような膵臓の疾病や障害が挙げられるがこれらに限定されるものではない）の予後、および肺、胃、腎臓、皮膚および他の付属器の関連疾病や障害（肥満症等）において有用なに新規成分を提供することにより、当分野における要求を満たす。
【０００４】
発明の開示
本発明は、発達する膵臓の間充織、肺、胃、腎臓、および外胚葉性頂堤や毛包等の外胚葉の特定の領域において特異的に発現するＤＰ２１４様タンパク質を特徴とする。本発明のタンパク質は、仮想ヒトタンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ６６９１３、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ７６５９４およびＩｎｃｙｔｅのＷ０００／６８３８０、またはＣｕｒａｇｅｎのＷＯ００／５８４７３）に類似性を有することでさらに特徴付けられている。
【０００５】
故に、本発明は、分化遺伝子または配列番号１に示したヌクレオチド配列を含む発生調節遺伝子等の、単離されて実質的に精製された核酸分子、その誘導体または断片、またはそれに対してハイブリダイズする配列、またはその補体に関するものである。望ましくは、核酸分子は膵臓の発達に関連する配列を含む。ニワトリまたはヒト相同体に由来する配列番号１の配列に加えて、本発明は、特に配列番号１の配列と同一または類似の調節機能を有する修飾配列を包含する。
【０００６】
本発明はさらに、ＤＰ２１４タンパク質（ｐＤＰ２１４）をコード化する、単離され実質的に精製されたポリヌクレオチドを特徴とする。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号１のヌクレオチド配列である。本発明はまた、配列番号１の補体を含むポリヌクレオチド配列に関するものである。本発明はさらに、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、固定核酸（ＬＮＡ）、モルフォリノ核酸、断片、その部分またはアンチセンス分子、発現ベクター、およびｐＤＰ２１４をコード化するポリヌクレオチドを含む宿主細胞、またはその断片、特に診断および／または治療適用例に好適な断片等の核酸配列を特徴とする。
【０００７】
さらに、本発明は上述のように核酸分子によってコード化された任意のポリペプチドまたはペプチドを特徴とする。特に、本発明は配列番号２に示したアミノ酸配列を有する、実質上精製されたｐＤＰ２１４に関するものである。
【０００８】
本発明はまた、ｐＤＰ２１４のアゴニスト（作用薬）およびアンタゴニスト（拮抗薬）の識別および使用を特徴とする。本発明はまた、ｐＤＰ２１４のアゴニスト（作用薬）およびアンタゴニスト（拮抗薬）の識別および使用を特徴とする。
【０００９】
最終的に、本発明はＤＰ２１４の核酸、タンパク質、抗体および／またはアプタマーを活性成分として含む医薬品成分に関するものである。
【００１０】
図面の詳細な説明
図１：ニワトリＤＰ２１４のＤＰ２１４様タンパク質をコード化する核酸配列（配列番号１）。
【００１１】
図２：図１に示されるコーディング配列によってコード化されたタンパク質の配列（配列番号２）。
【００１２】
図３Ａ：ニワトリＤＰ２１４様タンパク質（ヌクレオチド１７７８〜２１６４、３８７塩基対）のＣ型レクチンドメインをコード化する核酸配列（配列番号３）。
【００１３】
図３Ｂ：ニワトリＤＰ２１４様タンパク質（１２９アミノ酸）のＣ型レクチンドメインのアミノ酸配列（配列番号４）。
【００１４】
図４：本発明のＤＰ２１４様タンパク質に対する原位置ハイブリッド形成法の成果。
【００１５】
図４Ａでは、ニワトリ胚上の全載原位置ハイブリッド形成法が示されている。
【００１６】
図４Ｂでは、同ニワトリ胚（５日目）の筋節背側図が示されている。
【００１７】
図４Ｃおよび図４Ｄでは、膵芽組織断面図（５日目の胚）上の原位置ハイブリッド形成法が示されている。
【００１８】
図４Ｅでは、矢状切断面（５日目の胚）上の位置ハイブリッド形成法が、間葉背側膵芽でＤＰ２１４ｍＲＮＡの発現を検出していることが示されている（ＤＰ２１４は青色で示され、インスリンは茶色で示されている）。
【００１９】
図５では、ニワトリＤＰ２１４タンパク質（図１）およびヒトＤＰ２１４相同体（「ＣｕｒａｇｅｎＤＰ２１４」および「ＩｎｃｙｔｅＤＰ２１４」）間の比較が示されている。
【００２０】
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列および方法について説明するが、その前に、説明した特定の方法論、プロトコル、細胞株、ベクター、および試薬に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、本詳細書で使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも当然のことである。
【００２１】
本明細書および請求の範囲で使用された単数形の表記は、文脈から明らかに単数であることが示されている場合を除いては複数も含めて言及されていることに注意しなくてはならない。従って、例えば「宿主細胞」は複数の宿主細胞も含んで言及し、「抗体」は１つ以上の抗体および当業者に公知の抗体等価物についても言及しており、その他に関しても同様に言及するものとする。本明細書中で用いる全ての専門用語および科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料および方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本明細書で言及する全ての刊行物は、本発明に関係があるであろう刊行物中で報告されている細胞株、ベクターおよび方法論について説明および開示する目的で、ここに引用することをもって本明細書の一部となす。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００２２】
本発明は従って、ＤＰ２１４様タンパク質の新規機能および核酸コーディングの発見に基づく。本発明では、ＤＰ２１４様タンパク質が、発達する膵臓の間充織、肺、胃、腎臓、および外胚葉性頂堤や毛包等の外胚葉の特定の領域において特異的に発現されることが記載されている。本発明は、診断、研究、予防、または該細胞に関連した疾病および障害（例えば糖尿病等のような膵臓の疾病および障害が挙げられるが、これらに限定されるものではない）の治療、および特に哺乳動物において、肺、胃、腎臓、皮膚、付属物、およびその他の関連疾病および障害（例えば肥満症）等に対する、ｐＤＰ２１４をコード化するポリヌクレオチドの使用に基づく。
【００２３】
本発明のニワトリｐＤＰ２１４をコード化する核酸は、胚の膵芽において発現される遺伝子の全載原位置スクリーンを通して、膵臓組織ｃＤＮＡライブラリ（６日目）からの「ＤｅｖｅｌｏＧｅｎクローンＤＰ２１４」において先ず識別された。一実施例において、本発明には、発達する膵臓の間充織、肺、胃、腎臓および外胚葉性頂堤や毛包のような外胚葉の特定の領域、図２の１文字コードを使用して示した配列番号２のアミノ酸配列を包含するポリペプチドにおいて、ＤＰ２１４様タンパク質が特異的に包含されている。ｐＤＰ２１４は長さが４６３のアミノ酸である。オープン・リーディングは、ヌクレオチド７７６においてＡＴＰ開始コドンを発端とし、ヌクレオチド２１６７においてＴＧＡ終止コドンで終了することが識別された（図２に示されている）。本発明のタンパク質の計算分子量は５２３９７ドルトンである。
【００２４】
予想されたアミノ酸配列は、公的に利用できるＧｅｎＢａｎｋデータベースにおいて検索された。配列データベースの検索において、例えばｐＤＰ２１４は、仮想ヒトタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ６６９１３およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ７６５９４）と相同性を共有することが発見された。相同性に基づいて、ｐＤＰ２１４タンパク質および各相同タンパク質またはペプチドは、少なくとも類似の活性を有する。
【００２５】
複数の配列アライメントは、ライン１に本発明のタンパク質が示されている図５の、本発明のタンパク質（ライン１、「ニワトリＤＰ２１４」）を関連ヒトタンパク質の配列（ライン２、「ＣｕｒａｇｅｎＤＰ２１４」、ライン３、「ＩｎｃｙｔｅＤＰ２１４」）と比較するＣｌｕｓｔａｌＸ分析に記載されている。
【００２６】
発現
ＤＰ２１４ｍＲＮＡｓに補遺的なアンチセンスＲＮＡプローブを使用する原位置ハイブリッド形成法実験は、４日目（図４Ａ）および５日目のニワトリ胚（図４Ｂおよび図４Ｃ）、および切断された膵芽組織（図４Ｄおよび図４Ｅ）および切断神経組織の全載で行なった。ハイブリダイゼーションでは、本発明の転写が発達する膵臓の間充織、肺、胃、腎臓、および外胚葉性頂堤や毛包のような外胚葉の特定の領域においてのみ発現されることが示されている（矢印、図４Ｄおよび図４Ｅ）。
【００２７】
本発明には、ｐＤＰ２１４をコード化するポリヌクレオチドも包含される。それ故に、ｐＤＰ２１４のアミノ酸配列をコード化する任意の核酸配列を用いて、ｐＤＰ２１４を発現する組換え分子を生成することができる。特定の実施例では、本発明には、図１Ａに示したように核酸配列の配列番号１を含むポリヌクレオチドが包含される。
【００２８】
当業者であれば、遺伝子コードの縮重によって、既知の遺伝子および天然遺伝子のヌクレオチド配列とは異なる、ｐＤＰ２１４をコード化するヌクレオチド配列が産出され得ることが理解できよう。したがって本発明では、可能コドン選択に基づく組み合わせの選択によって作製し得るような、ありとあらゆる可能性のあるヌクレオチド配列変異体が考慮されている。この組み合わせは、天然のｐＤＰ２１４のヌクレオチド配列に適用されるような標準トリプレット遺伝暗号に従って作製されるものであり、このような変異は全て特異的に開示されているものと考慮される。ｐＤＰ２１４およびその変異体をコード化するヌクレオチド配列は、望ましくは好適に選択されたストリンジェントな条件下で天然のｐＤＰ２１４のヌクレオチド配列に対してハイブリダイズ可能ではあるが、ｐＤＰ２１４をコード化するヌクレオチド配列、または実質上異なるコドンの使用法を有する誘導体を産出することは有益であり得る。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核または原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コード化されたアミノ酸配列を変更することなく、ｐＤＰ２１４およびその誘導体をコード化するヌクレオチド配列を実質上変更する別の理由には、天然の配列から産出される転写物より望ましい、例えば半減期が長いなどの特性を有するＲＮＡ転写物の産出がある。
【００２９】
本発明には、ｐＤＰ２１４およびその誘導体をコード化する、ＤＮＡ配列またはその部分を全て合成化学によって産出することも包含される。その産出後には、この合成配列は、本適用例の出願時に当分野で周知の試薬を用いて、いかなる入手可能な発現ベクターおよび細胞系にも挿入することができる。さらに、合成化学を用いて、ｐＤＰ２１４またはその任意の部分をコードする配列の中に突然変異体を導入することも可能である。
【００３０】
さらに本発明に包含されるのは、種々のストリンジェントな条件下で、請求項に記載のヌクレオチド配列、特に配列番号２で示される配列にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列である。ハイブリダイゼーション条件は、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．およびＳ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ　（１９８７：ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９−４０７）およびＫｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｐ．（１９８７；ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７−５１１）で教示されたように、核酸結合複合体またはプローブの溶解温度（Ｔｍ）に基づいており、定義されたストリンジェントでの使用が可能である。通常、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションは、５５℃にて１ｘＳＳＣバッファおよび０．１％ＳＤＳ、望ましくは６２℃にて、そして最も望ましくは６８℃にて１時間洗浄後、特には、５５℃にて０．２ｘＳＳＣバッファおよび０．１％ＳＤＳ、望ましくは６２℃にて、そして最も望ましくは６８℃にて、１時間洗浄後に正のハイブリダイゼーションシグナルが認められることを示す。
【００３１】
本発明に包含されているｐＤＰ２１４をコード化する変異核酸配列には、異なるヌクレオチドの欠損、挿入、または代替が含まれており、同一物または機能に同等なＤＰ２１４をコード化するポリペプチドを結果としてもたらす。コードされたタンパク質には、サイレント変化を産出し、機能的に等価なｐＤＰ２１４をもたらすアミノ酸残基の欠損、挿入または代替が含まれ得る。計画的アミノ酸代替は、ｐＤＰ２１４の生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性特性の類似性に基づいて行うことができる。例えば、負に帯電したアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正に帯電したアミノ酸にはリジンおよびアルギニンが含まれ；および類似の親水性値を有する非荷電極性ヘッドグループを有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、およびグリシン、アラニン、およびアスバラギン、グルタミン、およびセリン、トレオニン、およびフェニルアラニン、チロシンが含まれる。
【００３２】
また本発明の範囲内には、ｐＤＰ２１４をコード化する遺伝子の対立遺伝子も含まれている。本明細書で使用されているように、「対立遺伝子」または「対立遺伝子配列」は、核酸配列において少なくとも１つの突然変異から生じ得る遺伝子の代替形態である。対立遺伝子は、変異ｍＲＮＡ、または構造や機能が変異するかどうかわからないポリペプチドを生じ得る。任意の遺伝子は、無、単一、または多くの対立遺伝子形態を有し得る。一般に対立遺伝子を生じさせる通常の突然変異性変化は、ヌクレオチドの自然欠損、付加または代替に帰するものである。この各変化は、単独または他の変化と共に所定の配列内で１回または数回生じ得る。
【００３３】
当分野で公知であり、一般に入手可能なＤＮＡシークエンシングの方法は、本発明の任意の実施例を実行するために使用することができる。ｐＤＰ２１４をコードする核酸配列は、部分的ヌクレオチド配列を利用したり、当分野で周知である種々の方法を用いることによって伸長させ、プロモーターおよび調節要素等の上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る方法の１つである「制限部位ＰＣＲ法」は、ユニバーサルプライマーを用いて既知の遺伝子座に対して近傍する未知の配列を読み出す方法である（Ｓａｒｋａｒ，Ｇ．（１９９３）ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌｉｃ．２：３１８−３２２）。具体的には、先ず最初にプライマー存在下でゲノムＤＮＡをリンカー配列および既知の領域に対する特異プライマーに対して増幅する。増幅された配列は、同リンカープライマーおよび最初の領域に内在する別の特異プライマーと共にＰＣＲの第二ラウンドの対象となる。ＰＣＲの各ラウンド産生物は、適切なＲＮＡポリメラーゼで転写され、逆転写酵素を使用して配列される。逆ＰＣＲも、既知の領域に基づいた異なるプライマーを使用して、配列を増幅または伸長するために使用することができる（Ｔｒｉｇｌｉａ，Ｔ．らの（１９８８）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６：８１８６）。プライマーは、オリゴ４．０６プライマー分析ソフトウェア（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓＩｎｃ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、Ｍｉｎｎ．）、または別の適切なプログラムを使用して、長さが２２〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が５０％以上、そして温度約６８〜７２℃で標的配列にアニールするように設計することができる。本発明の方法は、好適な断片を生成するために制限酵素を使用する。断片は、その時点で分子内の連結反応によって環状化され、ＰＣＲ鋳型として使用される。
【００３４】
使用できる別の方法としては、キャプチャＰＣＲ法があり、この法にはヒトおよび酵母菌人工染色体ＤＮＡにおける既知の配列に近傍するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する方法が含まれる（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍ，Ｍ．らのＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓＡｐｐｌｉｃ．１：１１１−１１９）。この方法では、ＰＣＲを行う前に複数の制限酵素の消化および連結反応をも使用してＤＮＡ分子の未知の部分に組換え二本鎖配列を配置することができる。未知の配列を読み出すために使用することが可能な別の方法としては、Ｐａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｄ．らの方法が挙げられる（１９９１；ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９：３０５５−３０６０）。さらに、ＰＣＲライブラリ、ネステッドプライマーライブラリ、ＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒライブラリを用いてゲノムＤＮＡ内に入ることができる（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）。このプロセスでは、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン接合部およびエキソン接合部を見つけるのに有用である。完全長ｃＤＮＡをスクリーニングする際には、より大きなｃＤＮＡを含むようにサイズ選択されたライブラリを使用するのが望ましい。また、ランダムプライムライブラリには、遺伝子の５′領域を含む多くの配列が含まれているので望ましい。ランダムプライムライブラリの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリが完全長ｃＤＮＡを産しない状況に対して特に好適である。ゲノムライブラリは、５′および３′非転写調節領域への配列の伸長に有用であり得る。市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシング産物またはＰＣＲ産物のサイズを分析したり、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマー、レーザー駆動の４つの異なる蛍光色素（各ヌクレオチドあたり１個）、およびＣＣＤカメラによる発光波長の検出を利用することが可能である。出力と光の強度は、適切なソフトウェア（例えばＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社のＧＥＮＯＴＹＰＥＲおよびＳＥＱＵＥＮＣＥＮＡＶＩＧＡＴＯＲ）を使用して電気信号に変換することができ、サンプルの取り込みからコンピュータ分析までの全プロセス、および電子データ表示は、コンピュータ制御が可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなＤＮＡ小片のシークエンシングに特に適している。
【００３５】
本発明の別の実施例では、ｐＤＰ２１４をコードするポリヌクレオチド配列、または融合タンパク質またはその機能的等価物またはその断片は、適切な宿主細胞内でｐＤＰ２１４の発現をさせるような組換えＤＮＡ分子内で使用することが可能である。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じあるいは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のＤＮＡ配列を産出することができ、これらの配列はｐＤＰ２１４をクローン化および発現するために利用することが可能である。当事者にとっては当然なことだが、非天然コドンを有するｐＤＰ２１４がコード化するヌクレオチド配列を産出することは有益であろう。例えば、特定の真核宿主または原核宿主によって好適とされるコドンは、タンパク質の発現率を高めるために、または天然配列から生成された転写物のそれよりも長い半減期等の望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写を産出するするために、選択することができる。本発明のヌクレオチド配列は、種々の目的でｐＤＰ２１４のコード化する配列を変えるために、当分野で公知の方法を使用して組換えることができ、この目的には、遺伝子産物のクローン化、処理、および／または発現等が含まれるが、これらに限定されるものではない。遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーションおよびＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、部位特異的変異誘導を用いて、新規制限部位を挿入、グリコシル化のパターンを改変、コドン優先の変更、スプライス変異体の産出、または突然変異の導入、等々を行い得る。本発明の別の実施例では、天然の核酸配列、修飾核酸配列またはｐＤＰ２１４をコード化する組換え核酸配列を異種配列に連結反応させ、融合タンパク質をコード化することができる。例えば、ペプチドライブラリをｐＤＰ２１４活性ののインヒビターに対してスクリーニングする際には、市販の抗体によって認識できるキメラｐＤＰ２１４タンパク質をコード化することは有用であろう。また、ｐＤＰ２１４が異種部分から切断および精製され得るようにするため、融合タンパク質が、ｐＤＰ２１４のコード化する配列と異種タンパク質配列との間にある切断部位を含むように遺伝子操作することが可能である。別の実施例によれば、当分野で周知である化学的方法を用いて、ｐＤＰ２１４をコードする配列の全部または一部を合成することが可能である（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．らの（１９８０）　Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７：２１５−２２３，Ｈｏｒｎ，Ｔ．らの（１９８０）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７：２２５−２３２を参照）。
【００３６】
あるいは、化学的な方法を用いてｐＤＰ２１４のアミノ酸配列またはその一部分を合成するためにタンパク質自体を産出することが可能である。例えば、種々の固相技術を用いてペプチド合成を行うことができ（Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｙ．らの（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９：２０２−２０４）、例えばＡＢＩ４３１Ａペプチドシンセサイザ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて自動合成を達成することが可能である。新規に合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質上精製することが可能である（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ、およびＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏ．，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．等）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することが可能である（Ｅｄｍａｎｄｅｇｒａｄａｔイオンｐｒｏｃｅｄｕｒｅ；前出のＣｒｅｉｇｈｔｏｎ等）。さらに、ｐＤＰ２１４のアミノ酸配列またはその任意の一部は、直接合成中に変異させることができ、および／または変異型ポリペプチドを産出するために、化学的方法を使用して、別のタンパク質またはその任意の一部から得た配列と結合させることが可能である。
【００３７】
生物学的に活性なｐＤＰ２１４を発現するために、ｐＤＰ２１４をコードするヌクレオチド配列または機能的な等価物を好適な発現ベクターに挿入することができ、その発現ベクターとは、挿入されたコーディング配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターを指す。当業者に周知の方法を用いて、ｐＤＰ２１４をコード化する配列と、好適な転写および翻訳調節要素とを含む発現ベクターを構築することが可能である。これらの方法には、生体外組換えＤＮＡ技術、合成技術、および生体内遺伝子組換え技術が含まれる。そのような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．らの（１９８９）　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．、およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．らの（１９８９）　ＣｕｒｒｅｎｔプロトコルｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に記載されている。種々の発現ベクターと宿主系を利用して、ｐＤＰ２１４をコードする配列を保持および発現することが可能である。発現ベクターと宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶまたはタバコモザイクウイルスＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換させた植物細胞系、または動物細胞系の微生物等がが含まれているが、これらに限定されるものではない。「調節要素」または「調節配列」は、ベクター・エンハンサーの非翻訳領域、プロモーター、転写および翻訳を行なうために宿主細胞タンパク質と相互作用する５′および３′非翻訳領域である。このような要素の強度および特異性は様々である。利用されたベクター系および宿主にもよるが、構成型プロモーターおよび誘導型プロモーターを含んだ、任意数の適切な転写および翻訳要素を使用することができる。例えば、細菌システムにおいてクローニングを行なう場合、ハイブリッドＩａｃＺプロモーターのＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）その他の誘導型プロモーターを使用することが可能である。バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターは、昆虫細胞において使用することが可能である。植物細胞のゲノム（例えば、熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および保管タンパク質遺伝子）または植物ウィルス（例えば、ウィルスプロモーターおよびリーダー配列）に由来するプロモーターおよびエンハンサーは、ベクターにクローニングすることが可能である。哺乳動物の遺伝子または哺乳動物のウィルスからの哺乳動物の細胞系、プロモーターが望ましいとされる。ｐＤＰ２１４をコード化する配列の複数のコピーを含む細胞株を生成する必要がある場合には、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づいたベクターが、適切な選択可能マーカーと共に使用することが可能である。
【００３８】
細菌系では、多数の発現ベクターがｐＤＰ２１４の使用目的に応じて選択することが可能である。例えば、抗体の誘発のために多量のｐＤＰ２１４が必要とされる場合は、容易に精製できる融合タンパク質の発現をハイレベルで誘導するベクターを使用することが可能である。そのようなベクターには、多機能大腸菌クローニング、ｐＤＰ２１４をコード化する配列が、ハイブリッドタンパク質が産生されるようにアミノ末端Ｍｅｔおよびその結果生じた７つのＢ−ガラクトシダーゼの残基に対する配列を有するベクターフレームに結合することが可能であるＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような発現ベクター、ｐＩＮベクター（ＶａｎＨｅｅｋｅ，Ｇ．およびＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ　（１９８９）　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）、その他が含まれているが、それらに限定されるものではない。また、ＰＧＥＸベクター　（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）　を用い、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として発現するために使用することが可能である。一般に、そのような融合タンパク質は可溶であり、グルタチオンアガロースビーズに対する吸着作用によって溶解された後に遊離グルタチオンの存在下で溶出され、細胞から容易に精製することが可能である。そのようなシステムで作製されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、またはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計することができ、目的のクローン化ポリペプチドをＧＳＴ部分から意のままに開放することができる。
【００３９】
酵母菌、例えばサッカロミセスセレビジエにおいて、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨ等の構成型プロモーターまたは誘導型のプロモーターを含む幾つかのベクターを使用することが可能である。論評に関しては、前出のＡｕｓｕｂｅｌら、およびＧｒａｎｔらの（１９８７）　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ１５３：５１６−５４４を参照。
【００４０】
植物発現ベクターが使用される場合には、ｐＤＰ２１４をコード化する配列の発現は、任意の数のプロモーターによって駆動されることが可能である。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウィルスプロモーターを単独またはＴＭＶからのオメガリーダー配列（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．　（１９８７）　ＥＭＢＯＪ．６：３０７−３１１）と共に使用することが可能である。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することが可能である（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．らの（１９８４）　ＥＭＢＯＪ．３：１６７１−１６８０、Ｂｒｏｇｌｉｅ，Ｒ．らの（１９８４）　Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４：８３８−８４３、およびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．らの（１９９１）　ＲｅｓｕｌｔｓＰｒｏｂｌ．細胞Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５）。これらの構成物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である。そのような技術は、幾つかの一般に入手できる論評に記載されている（例えば、『マグローヒル科学技術年鑑』（ＴｈｅＭｃＧｒａｗＨｉｌｌＹｅａｒｂｏｏｋｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　（１９９２）　ＭｃＧｒａｗＨｉｌｌＮｅｗＹｏｒｋＮＹのＨｏｂｂｓ，Ｓ．またはＭｕｒｒｙ，Ｌ．Ｅ．を参照、ページ番号１９１−１９６）。
【００４１】
昆虫システムもｐＤＰ２１４を発現するために使用することが可能である。例えば、昆虫システムの１つでは、オートグラファカリフォルニアニュークレアの多面性ウィルス（ＡｃＮＰＶ）がベクターとして使用され、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫における外来遺伝子を発現している。ｐＤＰ２１４をコード化する配列は、ポリヘドリン遺伝子等のウィルスの不必須領域へクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれることが可能である。ｐＤＰ２１４の首尾良い挿入は、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、外殻タンパク質に欠ける組換えウィルスを産出する。その場合、組換えウィルスを用いて、ｐＤＰ２１４が発現され得るＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫のＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染することが可能である（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．らの　（１９９４）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）。
【００４２】
種々の発現ベクターと宿主系を利用して、ｐＤＰ２１４をコードする配列を保持および発現することが可能である。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合、ｐＤＰ２１４をコード化する配列は、後発プロモーターおよび３連リーダー配列から成るアデノウイルス転写と翻訳複合体に連結反応されることが可能である。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域への挿入により、感染した宿主細胞においてｐＤＰ２１４を発現する能力のある生ウイルスを得ることが可能である　（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．　（１９８４）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。加えて、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させることが可能である。特定の開始シグナルを用いて、ｐＤＰ２１４をコード化する配列をより効果的に翻訳することも可能である。そのようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび近傍する配列が含まれる。
【００４３】
ｐＤｐ２１４をコード化する配列の場合、その開始コドンおよび上流配列が好適な発現ベクターに挿入され、追加の転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要とされないであろう。しかしながら、コーディング配列またはその部分のみが挿入される場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外来性の翻訳調節シグナルが提供される必要がある。さらには、開始コドンは全挿入の翻訳を確実にするために正しい読み取りフレーム中に存在する必要がある。外来性の翻訳要素および開始コドンは、様々な天然物および合成物をその起源とすることができる。発現の効率は、文献に記載されたように、用いられる特定の細胞系に好適なエンハンサーの抱合によって高めることができる（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．らの（１９９４）　ＲｅｓｕｌｔｓＰｒｏｂｌ．細胞Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）。加えて、宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節する能力、または発現したタンパク質を所望の形態で処理する能力に対して選択することができる。このようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化等があるが、それらに限定されるものではない。タンパク質の「プレプロ」形を切断する翻訳後の処理を用いて、正しい挿入、折りたたみ、および／または機能を促進することが可能である。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷＩ３８等の翻訳後の活性のための固有の細胞装置および特徴のある機構を有する種々の宿主細胞は、外来タンパク質の正しい修飾および処理を確実にするように選択することが可能である。
【００４４】
組換えタンパク質の長期にわたる高歩留産生、安定発現が望ましい。例えば。ｐＤＰ２１４を安定して発現する細胞株は、複製発現因子および／または内在性発現因子のウイルス起源を含み得る発現ベクター、および同一ベクターまたは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子を使用して転換することが可能である。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は、選択への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列を首尾良く発現するような細胞の成長および回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖することが可能である。幾つもの選択系を用いて形質転換細胞株を回収することが可能である。この選択系には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．らの（１９８０）　細胞２２：８１７−２３）、およびｔｋ−細胞またはａｐｒｔ−細胞にそれぞれ用いることができるアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．らの（１９８０）　細胞２２：８１７−２３）遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤の耐性は、選択の基準として用いることができ、例としてはメトトレキセートに耐性を与えるｄｈｆｒ　（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．らの（１９８０）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０）、アミノグリコシッドネオマイシンおよびＧ−４１８に耐性を与えるｎｐｔ　（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．らの（１９８１）　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４）、およびクロルスルフロン（ｃｈｌｏｒｓｕｌｆｕｒｏｎ）とホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）にそれぞれ耐性を与えるａｌｓまたはｐａｔ（前出のＭｕｒｒｙ）等が挙げられる。細胞がヒスチダインの代替としてヒスチノルを利用することを可能にするトリプトファンまたはｈｉｓＤの代替としての他の選択可能な遺伝子（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ　（１９８８）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）．最近、可視マーカーは人気を増しており、アントシアニン、Ｂグルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリン等のようなマーカーは、形質転換体を同定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性または安定したタンパク質発現を定量化するためにも広く利用されている。（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．らの（１９９５）　ＭｅｔｈｏｄｓＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
【００４５】
マーカー遺伝子発現の存在や不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その存在および発現の確認が必要な場合もある。例えば、ｐＤＰ２１４をコード化する配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、ｐＤＰ２１４をコードする配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定することが可能である。あるいは、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子がｐＤＰ２１４をコードする配列と一列に配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子の発現も示す。
【００４６】
あるいは、ｐＤｐ２１４をコード化する核酸配列を含み、ｐＤＰ２１４を発現する宿主細胞は、当業者に周知の種々の方法を用いて同定することが可能である。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、核酸またはタンパク質の検出および／または数量化のための膜系、溶液ベース、またはチップベースの技術を含むタンパク質生物学的試験法または免疫学的アッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。ｐＤＰ２１４をコード化するポリヌクレオチド配列の存在は、プローブ、またはｐＤＰ２１４をコード化するポリヌクレオチドの部分または断片を用いて、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド形成法、または増幅によって検出することが可能である。核酸の増幅基調アッセイは、オリゴヌクレオチドの使用、またはｐＤＰ２１４をコード化するＤＮＡまたはＲＮＡを含んだ形質転換体を検出するためにｐＤＰ２１４をコード化する配列に基づいたオリゴマーに関与する。本詳細書で使用された「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、最低約１０ヌクレオチド、および約６０ほどのヌクレオチド、望ましくは約１５〜３０ヌクレオチド、およびより望ましくは約２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列を言及し、プローブまたはアンプリマーとして使用されることが可能である。
【００４７】
タンパク質に固有のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるｐＤＰ２１４の発現を検出および計測のためのさまざまなプロトコルは、当分野で周知である。実施例には、酵素に結合したイムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）などがある。ｐＤＰ２１４上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが望ましいが、競合結合アッセイを用いることもできる。これらのアッセイおよびその他のアッセイは、他の箇所Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒ．らの（１９９０；ＳｅｒｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓ，ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＡＰＳＰｒｅｓｓ，ＳｔＰａｕｌ，Ｍｉｎｎ．）　およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．らの（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２６）に記載されている。
【００４８】
多岐にわたる標識方法および抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を使用することができる。ｐＤＰ２１４をコード化するポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、末端標識化、または標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅が含まれる。あるいは、ｐＤＰ２１４をコード化する配列またはその任意の部分を、ｍＲＮＡプローブを産出するためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、Ｔ７、Ｔ３またはＳＰ６等の好適なＲＮＡ　ポリメラーゼおよび標識されたヌクレオチドを加えて、生体外でＲＮＡプローブの合成に用いることが可能である。このような方法は、市販されている種々のキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ，Ｋａｌａｍａｚｏｏ，Ｍｉｃｈ．）、Ｐｒｏｍｅｇａ　（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、およびＵ．Ｓ．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＣｏｒｐ．，　（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）を用いて実行することができる。用いることができる好適なレポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤と同時に、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子等もある。
【００４９】
ｐＤＰ２１４をコードするヌクレオチド配列を用いて形質転換した宿主細胞は、細胞培地からのタンパク質の回収および発現に適した条件下で培養することが可能である。組換え細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に含まれるかは、使用される配列、ベクター、またはその両者に依存する。当業者であれば理解し得るように、ｐＤＰ２１４をコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞膜または真核細胞膜を透過するｐＤＰ２１４の直接分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計することが可能である。別の組換え構造を用いて、ｐＤＰ２１４をコード化する配列を、水溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコード化するヌクレオチド配列に結合することが可能である。そのような精製を促進するドメインには、固定化金属上での精製を可能にするヒスチダイントライトファン分子等の金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上の精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、およびＦＬＡＧ伸長・親和性精製システム（ＩｍｍｕｎｅｘＣｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）で利用されるドメイン等が含まれるが、これらによって限定されるものではない。ＸＡ因子または精製ドメインとｐＤＰ２１４間のエンテロキナーゼ（腸活素）　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，Ｃａｌｌｉｆ．）等に対して特異的な切断可能リンカー配列の抱合は、精製を促進するために使用することが可能である。そのような単一発現ベクターは、ｐＤＰ２１４を含む融合タンパク質の発現、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ（腸活素）切断部位に先行する、６ヒスチダイン残基をコード化する核酸を提供する。エンテロキナーゼ（腸活素）切断部位は、融合タンパク質からｐＤＰ２１４を精製する手段を提供する一方、ヒスチダイン残基は、Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．らの（１９９２），Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１に記載されたとおりＩＭＩＡＣ　（固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー）上での精製を促進する。融合タンパク質を含むベクターの論考は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．らの（１９９３；ＤＮＡ細胞Ｂｉｏｌ．１２：４４１−４５３）に提供されている。組換え産出に加えてｐＤＰ２１４の断片は、固相技術　（ＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄＪ．　（１９６３）　Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）を用いてペプチド合成を誘導することによって産生することができる。タンパク質合成は、手動または自動の何れの技術によっても実行することができます。自動合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓの４３１Ａペプチドシンセサイザ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて行なうことができます。ｐＤＰ２１４の種々の断片は、完全長分子産出するために、個々および結合して化学的に合成することが可能である。
【００５０】
診断および治療
原位置発現パターンによれば、ＤＰ２１４タンパク質が、発達する膵臓の間充織、肺、胃、腎臓、および外胚葉性頂堤や毛包等の外胚葉の特定の領域において特異的に発現されることが記載されている。故に、本発明の核酸およびタンパク質は医療有用であり、例としては膵臓の疾患および障害（例えば糖尿病）、および肺、胃、腎臓、皮膚、四肢や毛髪の付属物、その他の関連疾患および障害（例えば肥満症）を抱合する診断適用例または治療適用例が挙げられる。従って、タンパク質の発明は、診断マーカーとして、または予防標的として、または上記の疾患および障害の治療に有用である。
【００５１】
本発明の治療を目的とした用途は、例えば下記が挙げられるが、これらに限定されるものではない：（ｉ）タンパク質治療、（ｉｉ）小分子薬剤標的、（ｉｉｉ）抗体標的（治療、診断、薬剤標的と細胞毒性抗体）、（ｉｖ）診断および／または予後マーカー、（ｖ）遺伝子療法（遺伝子導入と遺伝子除去）、（ｖｉ）研究ツール、および（ｖｉｉ）生体外および生体内における組織再生（これらの組織に由来する組織および細胞型を含む全ての組織および細胞型の再生）。
【００５２】
本発明の核酸およびタンパク質は、上述のとおり種々の疾患および障害に関与する治療適用例、および／または他の病理学および障害において有用である。例えば、これらに限られるものではないが、本発明のＤＰ２１４をコード化するｃＤＮＡ様タンパク質は、遺伝子療法に有用であり、本発明のＤＰ２１４様タンパク質は、その必要とする被験者に投与された場合に有用である。例証として、本発明は上述の疾患および障害の予防、またはその患者の治療に対して有効性を有する構成になっている。
【００５３】
本発明のＤＰ２１４様タンパク質ををコード化する核酸またはその断片は、核酸またはタンパク質の存在や量を算定する場合の診断適用例にも有用である。さらにこれらの材料は、治療法または診断法における使用のため、ＤＰ２１４様タンパク質を免疫特異的に結合する抗体を生成するのに有用である。
【００５４】
本発明の他の実施例では、ｐＤＰ２１４またはその断片を治療目的で使用することができる。原位置ハイブリッド形成法実験およびＲＴ−ＰＣＲ分析の成果（図４、５および６）の基準に基づくと、ｐＤＰ２１４は膵臓において機能すると信じられており、その例として膵臓の島細胞、腸の陰窩細胞、脂肪組織が挙げられる。
【００５５】
例えば一実施態様においては、アンタゴニストとして直接的に、またはｐＤＰ２１４を発現する細胞や組織に薬剤をもたらす標的または輸送機構として間接的に、ｐＤＰ２１４に特異な抗体を用いることができる。その抗体は、当分野で一般的な方法を用いて産出することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂ断片、およびＦａｂ発現ライブラリによって産出された断片が含まれるが、これらに限定されるものではない。中和抗体（即ち二量体の形成を抑制する抗体）は特に治療用に好適である。
【００５６】
抗体の産出のためには、ヤギ、ウサギ、ウサギ、マウス、ヒト、その他を含む種々の宿主は、ｐＤＰ２１４、またはＣＹＡＰの任意の断片またはオリゴペプチドであって免疫抗原性の特性を有するものを注入することによって免疫化することができる。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。このようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがあるが、これらに限定されるものではない。ヒトに用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ　（カルメット−ゲラン杆菌）およびコリネバクテリウムパルヴムが特に望ましい。
【００５７】
ＤＰ２１４に対する抗体を誘導するために用いるペプチド、断片またはオリゴペプチドは、少なくとも約５のアミノ酸からなり、より望ましくは少なくとも約１０のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有するものが望ましい。これらは、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、そして小さな天然分子の全アミノ酸配列を含み得ることが望ましい。ｐＤＰ２１４アミノ酸の短い伸長部は、キメラ分子に対して産生されたキーホールリンペットヘモシニアンおよび抗体等の、別のタンパク質の伸長部と融合することができる。
【００５８】
ｐＤＰ２１４に対するモノクローナル抗体は、抗体分子を産出する任意の技術を用いて、培養液内の連続した細胞株によって調製することができる。これらには、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．らの　（１９７５）　Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７、Ｋｏｚｂｏｒ，Ｄ．らの　（１９８５）　Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ８１：３１−４２、Ｃｏｔｅ，Ｒ．Ｊ．らのＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２０２６−２０３０、ＣｏｌｅＳ．Ｐ．らの　（１９８４）　Ｍｏｌ．細胞Ｂｉｏｌ．６２：１０９−１２０）が含まれるが、これらに限定されるものではない。加えて、「キメラ抗体」を産出するために開発された技術、好適な抗原特異性および生物学的活性を有する分子を得るためにマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子に対するスプライシングを使用することが可能である　（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．らの　（１９８４）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔａｌ　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａ，Ｓ．らの　（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ３１４：４５２−４５４）。あるいは、一本鎖抗体を産出するために記述された技術を適用し、当分野で周知の方法を使用して、ｐＤＰ２１４特異性一本鎖抗体を産出することができる。関連特異性を有するが独特なイディオタイプ組成を持つ抗体は、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産出することができる　（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．　（１９９１）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：１１１２０−３）。抗体の産出は、リンパ球集団における生体内の産生の誘導によって、または組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングまたは文献に開示されているような高特異結合試薬パネルのスクリーニングによっても行なうことが可能である（Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．らの　（１９８９）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：３８３３−３８３７、Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．らの　（１９９１）　Ｎａｔｕｒｅ３４９：２９３−２９９）。
【００５９】
ｐＤＰ２１４のための特異結合部位を有する抗体を産出することも可能である。例えばこのような断片には、抗体分子のペプシン消化によって産出し得るＦ　（ａｂ′）２断片、およびＦ（ａｂ′）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって産出し得るＦａｂ断片等があげられるが、これらに限定するものではない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を行なうことができる（Ｈｕｓｅ，Ｗ．Ｄ．らの（１９８９）　Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４：１２７５−１２８１）。
【００６０】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。既存の特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを用いる競合結合および免疫放射線活性のための数々のプロトコルは、当分野のおいて周知である。このようなイムノアッセイには通常、ｐＤＰ２１４とその特異性抗体との間にある錯生成の計測が関与する。２つの非干渉性ｐＤＰ２１４エピトープに反応するモノクローナル抗体を利用する２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが望ましいが、競合結合アッセイを用いることもできる（前出のＭａｄｄｏｘ）。
【００６１】
本発明の別の実施例では、ｐＤＰ２１４をコード化するポリヌクレオチドまたはその断片またはアンチセンス分子を治療目的で使用することが可能である。一実施態様において、ｐＤＰ２１４をコード化するアンチセンスは、ｍＲＮＡの転写を阻止することが望ましい状況において使用することができる。具体的には、ｐＤＰ２１４をコード化するポリヌクレオチドに補遺的な配列を利用して細胞を形質転換することができる。このようにアンチセンス分子を用いてｐＤＰ２１４活性を調節すること、または遺伝子機能を調節することができる。今このような技術は当分野では周知であり、センスまたはアンチセンスのオリゴマーまたは大きな断片を、ｐＤＰ２１４をコード化する配列のコード領域または制御領域に沿ったさまざまな位置から設計することが可能である。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスまたはワクシニウィルス、または種々の細菌プラスミドに由来する発現ベクターを用いて、ポリヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる。当業者に周知の方法を用いて、ｐＤＰ２１４をコード化する遺伝子のポリヌクレオチドに補遺的なアンチセンス分子を発現する組換えベクターを構築することが可能である。これらの技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）およびＡｕｓｕｂｅｌら（前出）の両方の文献に記載されている。ｐＤＰ２１４をコード化する遺伝子は、ハイレベルのポリヌクレオチドを発現する発現ベクターまたはｐＤＰ２１４をコード化するその断片を用いて、細胞または組織を形質転換することによって、オフにすることがでる。そのような構成物をを用いて、翻訳不可能なセンス配列またはアンチセンス配列を細胞に導入することができる。ＤＮＡへの組み込みが不在下でも、そのようなベクターは、内在性ヌクレアーゼ（核酸分解酵素）によって使用不可能になるまでＲＮＡ分子を継続して転写する場合がある。一過性の発現は、非複製ベクターを用いると１ヶ月以上持続する場合があり、さらに適切な複製要素がベクター系の一部にある場合には、より長く持続する場合がある。
【００６２】
上述のように、プロモーター、エンハンサー、イントロン等のｐＤＰ２１４をコード化する遺伝子の制御領域に対して、アンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＰＮＡを設計することによって遺伝子発現を修飾することができる。転写開始部位（例えば始動部位から−１０と＋１０の間）由来のオリゴヌクレオチドが望ましい。同様に、「三重らせん」塩基対の形成方法を用いて抑制が可能となる。
【００６３】
三重らせん塩基対形成が有用なのは、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために、十分に開くような二重らせんの能力を抑制するためである。三重らせんＤＮＡを用いる最近の治療の進歩は文献に記載されている（Ｇｅｅ，Ｊ．Ｅ．らの（１９９４）Ｉｎ；Ｈｕｂｅｒ，Ｂ．Ｅ．ａｎｄＢ．Ｉ．Ｃａｒｒ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃＡｐｐｒｏａｃｈｅｓ，ＦｕｔｕｒａＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ，Ｎ．Ｙ．）。アンチセンスもまた、転写物がリボソームに結合するのを防止することによってｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計することができる。
【００６４】
酵素性ＲＮＡ分子であるリボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒するために使用することが可能である。リボザイム作用のメカニズムは、内ヌクレオチド結合分解性の切断に先立つ相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションに関与している。使用できる実施例には、ｐＤＰ２１４をコード化する配列の内ヌクレオチド結合分解性の切断を特異的且つ効果的に触媒する組換え型のハンマーヘッド型リボザイム分子が含まれる。任意のＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、ＧＵＡ、ＧＵＵ、ＧＵＣ配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドを機能不全にするような二次構造の機能に対して評価することができる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの実施容易性をテストすることによって行うことができる。
【００６５】
本発明のアンチセンスおよびリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて調製することができる。これらの方法には、固相フォスフォアミダイト化合合成等のオリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法が含まれる。あるいは、ｐＤＰ２１４をコード化するＤＮＡ配列の生体外および生体内における転写によってＲＮＡ分子を生成することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７やＳＰ６等の好適なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いて、種々のベクター内に組み込むことができる。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構成的または誘導的に合成するこれらｃＤＮＡ構成物は、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。ＲＮＡ分子は、細胞内安定性および半減期を向上するために修飾することができる。可能な修飾には、分子の５′端および／または３′端でのフランキング配列の追加、または分子のバックボーン内においてホスホジエステラーゼの連鎖ではなくホスホロチオネートまたは２′のＯ−メチルの使用が含まれるが、それらに限定されるものではない。この概念はＰＮＡの産出に固有のものであり、イノシン、クエオシン、ワイブトシンのほかに、アセチル系、メチル系、チオ系、および内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、ウリジンの類似の変形態様等も含めた非従来型塩基の抱合によって、これら全ての分子にこの概念を適用することができる。ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法は、利用可能であり、生体内、生体外、および生体内外交通での使用に対して等しく適している。生体内外交通治療では、ベクターは、患者から採取した幹細胞内に導入し、同一患者に自家移植で戻すためにクローン増殖することが可能である。形質移入およびリポソーム注入による送達は、当分野で周知である方法用いて達成することができる。上述のいかなる治療方法は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて、治療が必要な全ての対象に適用できる。
【００６６】
本発明の追加実施例は、上述のいかなる治療効果に対する医薬用に許容できるキャリアとともに、医薬品成分の投与に関するものである。このような医薬品成分は、ＤＰ２１４核酸、ＤＰ２１４タンパク質、ＤＰ２１４に対する抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、または活性剤としてのＤＰ２１４インヒビターを抱合することができる。本成分は単独で投与することができるが、少なくとも１つの安定化化合物等の他剤と共に投与することもでき、その場合には、例えば生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロースおよび水等（これらに限定されない）の消毒した生物学的に適合な医薬品キャリアを用いて投与ができる。本成分は単独で患者に投与することができるが、他剤、薬剤、またはホルモンと共に投与することもできる。本発明に用いられる医薬品成分は、幾つもの経路によって投与することができ、その経路には経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸があるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
活性成分に加えて、これらの医薬品成分には、活性化合物を医薬用に使用できる製剤にする処理を促進する賦形剤および助剤を含む好適な医薬用に許容できるキャリアを収納し得る。製剤および投与に関する技術の詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ　（ＭａａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．）の最新版に記載されている。
【００６８】
経口投与に関する医薬品成分は、当分野で公知の医薬用に許容できるキャリアを用いて、経口投与に好適な投薬量で製剤することが可能である。そのようなキャリアを用いると、医薬品成分を患者による摂取のために、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル剤、シロップ剤、懸濁液、検査液、その他に製剤することが可能です。経口用医薬品の製剤は、固形賦形剤、オプションとして粉砕する得られた混合物、所望であれば、錠剤または糖衣錠の核を得るための好適な助剤を加えた後の顆粒混合物の処理を用いた活性化合物の組み合わせを介して得ることが可能である。好適な賦形剤としては、炭水化物またはタンパク質の充填剤、ラクトース（乳糖）、サッカロース（蔗糖）、マニトール，またはソルビトールを含む糖等；トウモロコシ、小麦、米、ポテト、または他の植物からのでんぷん；メチルセルロース、ハイドロキシプロピルメチル−セルロース、またはナトリウムカルボキシメチルセルロース等のセルロース；アラビアおよびトラガカントを含むゴム；およびゼラチンおよびコラーゲン等のタンパク質などが挙げられる。所望であれば、相互リンクされたポリビニールピロリドン、寒天、アルギン酸等、またはアルギン酸ナトリウム等のその塩等のような崩壊剤または可溶化剤を加えることができる。糖衣錠核は、濃縮砂糖水等のような好適なコーティングと共に使用することができ、そのコーティングには、アラビア産ゴム、タルク、ポリビニールピロリドン、ｃａｒｂｏｐｏｌゲル、ポリエチレングリコール、および／またはチタニウム酸化物、漆液、および好適な有機溶剤または混合溶剤を含み得る。製品を識別するためや、活性化合物の量（投薬量）を特徴付けるために、色素または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに添加することができる。経口剤として使用できる医薬品製剤には、ゼラチン製の押しバメ式カプセルと同様に、ゼラチン製のソフトでシールされたカプセル、そしてグリセロームまたはソルビトール等のコーティングも含まれている。押しバメ式のカプセルには、ラクトース（乳糖）またはでんぷん、滑剤等、タルクまたはステアリン酸マグネシウム等のような充填剤または結着剤、そしてオプションとして安定剤等と混合された活性成分が含まれ得る。ソフトカプセルの場合に活性化合物は、脂肪油、液体，または液体ポリエチレングリコール等の好適な液剤物に、安定剤の有無に係わらず溶解または懸濁することができる。
【００６９】
非経口的投与に好適な医薬品の製剤は水溶液中で行なうことができるが、望ましくはＨａｎｋの溶液のような、生理学的に適合性のあるバッファー（緩衝液）中で行なう。Ｒｉｎｇｅｒの溶液、または生理学的緩衝生理食塩水。水溶性注射剤の懸濁液には、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン等の懸濁液の粘度を増大させる物質を保持し得る。加えて、活性化合物の懸濁液は、適切な油質の注射剤懸濁液として調製することができる。好適な脂肪親和性溶剤または媒介物には、ごま油、または合成脂肪酸エステル等、エチルオレイン酸塩またはトリグリセリド（中性脂肪）、またはリポソーム等のような脂肪油が含まれる。オプションとして、懸濁液には、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、化合物の溶解度を増大させる試薬の好適な安定剤も保持させることができる。局所投与または鼻用投与に関しては、浸透される特定の障壁に対して適切な浸透剤を製剤おいて使用する。そのような浸透剤は当分野で公知である。
【００７０】
本発明の医薬品成分は、当分野で周知であるような方法で製造することができ、それらの手段としては、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠製造、研和、乳化、カプセル化、取り込み、または凍結乾燥工程等があげられる。医薬品成分は、塩として供給することが可能であり、多くの酸と共に形成することができ、例としては、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。塩は、対応する遊離塩基形態に比べて、水溶液または他のプロトン溶剤に可溶し易い傾向がある。他の場合における好適な調製は、下記のいずれかを保持する凍結乾燥粉末であろう：１〜５０ｍＭヒスチダイン、０．１〜２％サッカロース（蔗糖）、および２〜７％マニトール、ｐＨ範囲４．５〜５．５、これらは使用前にバッファと結合させるものとする。医薬品成分の調製後、適切な容器に充填し、適応条件の治療のために標識する。ｐＤＰ２１４の投与に対する標識には、投与の量、頻度、および方法が明記される。
【００７１】
本発明における使用に好適な医薬品成分には、所望の目的を達成するための活性成分が効果的な量で保持する成分が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行うものとする。任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えばｐｒｅａｄｉｐｏｃｔｉｃ細胞株の細胞培養アッセイにおいて、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌまたはブタ等において、先ず治療の有効投薬量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲および投与経路を決定するためにも使用することができる。このような情報を用いて、次にはヒトに対する有益な投薬量および投与経路を決定することができる。治療的に効果的な投薬量は、例えばｐＤＰ２１４またはその断片、ｐＤＰ２１４の抗体、条件等の活性処方成分の量に関連する。治療有効度および（ｃａｎ）毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な医療品手法によって決定することができ、その例としては、ＥＤ５０（集団の５０％の治療的有効量）およびＬＤ５０（集団の５０％の致死量）などが挙げられる。治療効果と毒性効果の間の投薬量の比は、治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。高い治療指数を示す医薬品成分が望ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるためのさまざまな投薬量を製剤するのに用いられる。このような組成物に含まれる投薬量は、毒性を殆ど持たないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性および投与の経路によって、投薬量はこの範囲内で様々に変わる。正確な投薬量は、治療が必要な被験者に関する要因を考慮して、現場の医師が決定する。充分なレベルの活性部を提供し、または所望の効果を維持するために、投薬量および投与を調節する。配慮されるべき要因には、疾患の重症度、患者の身体全体の健康状態、患者の年齢、患者の体重および性別、食習慣、投与の時間と頻度、薬剤の組み合わせ、反応感受性、および治療に対する耐性と反応が含まれる。長時間効果のある医薬品成分は、特定製剤の半減期およびクリアランス率に依り、３〜４日毎に１回、１週間に１回、または２週間に１回の間隔で投与することができる。通常の投薬量は投与経路に依って変動し、約０．１〜１００，０００マイクログラムから１グラムまでを合計投薬量とする。特定の投薬量および送達の方法に関する指針は文献に記載されており、当分野の実務者はそれを利用することができる。当業者がヌクレオチドに対して用いる製剤は、タンパク質またはインヒビターに対して用いる製剤とは異なる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に対して特異的なものとなる。
【００７２】
別の実施例では、ｐＤＰ２１４を特異的に結合する抗体は、ｐＤＰ２１４の発現によって特徴付けられる状態または疾患の診断、またはｐＤＰ２１４、アゴニストまたはインヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療で記載した方法と同じ方法で調製することが可能である。ｐＤＰ２１４の診断アッセイには、抗体および標識を利用してヒトの体液、または細胞や組織の抽出物にあるｐＤＰ２１４を検出する方法が含まれる。抗体は、その修飾の有無に拘わらず使用することができ、その結合性の共有、非共有に拘わらずにレポーター分子で結合して標識化することができる。本分野で周知の種々のレポーター分子を使用することができ、それら幾つかのレポーター分子は上記されている。
【００７３】
ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、およびＤＰ２１４を測定するためのＦＡＣＳを含む種々のプロトコルは当分野では周知であり、改変または異常レベルのｐＤＰ２１４の発現を診断する基準を提供する。ｐＤＰ２１４発現の正常値または標準値は、複合体の形成に適した条件下で、正常な哺乳動物から、望ましくはヒトから採取した体液または細胞をｐＤＰ２１４に対する抗体と結合させて確定する。標準複合体形成量は、種々の方法によって定量化できるが、測光的な手段を用いることが望ましい。生検細胞の制御サンプルおよび疾患サンプル中に発現したｐＤＰ２１４の量を標準値と比較する。標準値と被験者値の偏差は、疾患の診断に対するパラメータを確立する。
【００７４】
別の実施例によれば、ｐＤＰ２１４をコード化するポリヌクレオチドを診断目的に使用することが可能である。使用可能なポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子、およびＰＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドを用いて、ｐＤＰ２１４の発現と相関関係にあり得る生検組織内の遺伝子発現を検出し、定量化することができる。診断アッセイを用いて、ｐＤＰ２１４の不在、存在および過剰発現を区別すること、および治療介入中にｐＤＰ２１４レベルの調節を監視することが可能である。
【００７５】
一実施形態では、ｐＤＰ２１４または近縁の分子をコード化するゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出することが可能なＰＣＲプローブを用いたハイブリダイゼーションを使用して、ｐＤＰ２１４をコード化する核酸配列を同定することが可能である。プローブの特異性（その作成が高特異領域または低特異領域のいずれなのかによって変わる）、およびハイブリダイゼーションのストリンジェンシー、または増幅（高、中、または低）は、プローブの同定するものがｐＤＰ２１４をコード化する天然配列のみなのか、対立遺伝子なのか、それとも関連する配列であるのかどうかを決定する。プローブはまた、関連する配列の検出にも用いることができ、プローブにはｐＤＰ２１４コード化配列の任意の配列からのヌクレオチドの少なくとも５０％が含まれていることが望ましい。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡあるいはＲＮＡであり得て、配列番号１のヌクレオチド配列、またはゲノム配列、またはプロモーター、エンハンサーエレメント、および天然ｐＤＰ２１４のイントロン等を含むヒト相同体に由来する。ｐＤＰ２１４をコード化するＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブを産出する手段には、ｐＤＰ２１４およびｐＤＰ２１４誘導体をコードするヌクレオチド配列のｍＲＮＡプローブの産出のためのベクターへのクローニングが含まれる。当分野で知られかつ市販されているそのようなベクターを用いて、適切なＲＮＡポリメラーゼを追加する手段にって、および適切に標識されたヌクレオチドによって、生体外ＲＮＡプローブを合成することができる。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーター集団によって標識することができ、その例としては３２Ｐまたは３５Ｓ等の放射性核種、またはアビジン結合系やビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識等が挙げられる。ｐＤＰ２１４をコード化するポリヌクレオチド配列は、条件の診断、またはｐＤＰ２１４の発現に関係する疾患のために使用することができる。そのような条件または疾患の実例は、上述の通りである。
【００７６】
ｐＤＰ２１４をコード化するポリヌクレオチド配列を用い、疾病や障害に対して治療を受けている患者の進歩状況を監視することができ、例えば、膵臓の疾病や障害（例えば糖尿病）、および肺、胃、腎臓、その他の関連疾病や障害（例えば肥満症）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００７７】
ｐＤＰ２１４をコードするポリヌクレオチド配列は、変異ｐＤＰ２１４の発現を検出するために患者の生検から採取した体液または組織を利用して、サザン法、ノーザン法、ドットブロット法またはその他の膜ベースの技術、およびＰＣＲ法、またはディップスティック法、ピンＥＬＩＳＡ法またはチップアッセイにおいて使用することができる。このような定量方法または定性方法は当分野で公知である。特定の実施形態では、ｐＤＰ２１４をコード化するヌクレオチド配列は、種々の疾病や障害の活性化または誘導を検出するアッセイにおいて有用であり得、その例としては、膵臓の疾病や障害（例えば糖尿病）、および肺、腎臓、その他の関連疾病や障害（例えば肥満症）が挙げられるが、これらにげんていされるものではない。ｐＤＰ２１４をコードするヌクレオチド配列は、標準法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で患者から採取した体液または組織サンプルに添加することができる。好適なインキュベーション期間の後、サンプルを洗浄して、そのシグナルを定量し、標準値と比較する。生検サンプルまたは抽出サンプルにおけるシグナル量が類似サンプルのシグナル量と比べて著しく変化している場合は、サンプル内のヌクレオチド配列でハイブリダイゼーションを行なうと、そのサンプル中のｐＤＰ２１４をコード化するヌクレオチド配列の変異レベルの存在は、関連疾患の存在を示す。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験、または個々の患者の治療の監視において、特定の治療上の処置方式の有効性を評価するために用いることもできる。
【００７８】
ｐＤＰ２１４の発現に関連する疾患の診断基準を提供するため、発現に対する正常概要または標準概要を確定する。これを達成するには、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、動物またはヒトの正常な被験者から抽出した体液または細胞を、ｐＤＰ２１４をコード化する配列またはその断片と結合させることがでる。標準ハイブリダイゼーションの定量化は、正常な被験者から得た値を、既知量の実質的に精製されたポリヌクレオチドを使用する実験から得た値に対して比較することによって行なうことができる。正常サンプルから得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルからの値と比較することができる。標準値と被験者値間の偏差を用いて疾患の存在を確定する。一旦疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、ハイブリダイゼーションアッセイを通常ベースで繰り返して、患者の発現レベルが正常な患者に観察されるレベルへ近づき始めたかどうかを評価することができる。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示すことができる。
【００７９】
疾病や障害に関して、例えば膵臓の疾病や障害（例えば糖尿病）、および肺、胃、腎臓、その他の関連疾病や障害（例えば肥満症）をあげることができるが、これらに限定されない。個人の生検組織における比較的大きい量の転写物の存在は、疾患の発生に対する素因を示すか、または実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する手段を提供することができる。この種のより明確な診断により、予防手段または積極的な早期治療を施して膵臓の疾病と障害の発達またはさらなる進行を防止することが可能となる。
【００８０】
ｐＤＰ２１４をコード化する配列から設計されたオリゴヌクレオチド（オリゴマー）に対するその他の診断用途には、ＰＣＲ等の増幅作用が含まれ得る。このオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素的に生成するか、または組換えソースから産出することができる。オリゴマーは望ましくは２つのヌクレオチド配列から構成され、１つはセンス方向（５′．ｆｗｄａｒｗ．３′）、他の１つアンチセンス方向（３′．ｒａｒｗ．５′）で、特定遺伝子または条件の識別のために、最適化された条件下で用いられる。また２つの同一のオリゴマー（ネスト化したオリゴマーのセット、または縮重オリゴマーの集積）を、あまりストリンジェントでない条件下で用い、近縁のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の検出あるいは（または）定量化を行なうことができる。ｐＤＰ２１３の発現を定量するために用いことができる方法には、放射標識またはビオチンヌクレオチド、調節核酸の相互増幅、および実験結果が補間された標準曲線等が含まれる（Ｍｅｌｂｙ，Ｐ．Ｃ．らの　（１９９３）　Ｊ．ＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，１５９：２３５−２４４；Ｄｕｐｌａａ，Ｃ．らの　（１９９３）　Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：２２９−２３６）。複数サンプルの定量速度を加速するには、目的のオリゴマーが種々の希釈液中に存在し、そして分光光度法または非色応答が迅速な定量に関与するような状態にある、ＥＬＳＡ形態のアッセイを実行することができる。
【００８１】
本発明の別の実施例では、ｐＤＰ２１４をコード化する核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有効なハイブリダイゼーションプローブを生成することも可能である。その配列は、特定の染色体にマッピングするか、または公知の方法を使用して染色体の特定領域にマッピングすることができます。そのような技術にはＦＩＳＨ、ＦＡＣＳ、または人工染色体、細菌人工染色体、細菌Ｐ１構築物または単一染色体ｃＤＮＡライブラリがあり、以下の文献で論評されている：Ｐｒｉｃｅ，Ｃ．Ｍ．　（１９９３）　ＢｌｏｏｄＲｅｖ．７：１２７−１３４，およびＴｒａｓｋ，Ｂ．Ｊ．　（１９９１）　ＴｒｅｎｄｓＧｅｎｅｔ．７：１４９−１５４．ＦＩＳＨ　（Ｖｅｒｍａらによって記述されているとおり、（１９８８）　ＨｕｍａｎＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：ＡＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＰｅｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）　は、他の物理的な染色体のマッピング技術および遺伝地図データと相関する。遺伝地図データの例は、１９９４ＧｅｎｏｍｅＩｓｓｕｅｏｆＳｃｉｅｎｃｅ　（２６５：１９８１ｆ）に見出すことができます。物理的染色体地図上のｐＤＰ２１４をコードする遺伝子の位置と、特定の疾患または特定の疾患に対する素因との間にある相関性は、遺伝子の疾病に関連するＤＮＡの領域を画定するのに役立ち得るものである。
【００８２】
本発明のヌクレオチド配列を用いて、健常者、保有者、感染者の三者間における遺伝子配列の相違を検出することができる。確定した染色体マーカーを用いた染色体標本および結合分析等の物理的マッピング技術の原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物種の染色体上に遺伝子を置くことにより、特定のヒト染色体の数またはアームが分かっていない場合でも、関連するマーカーを明らかにすることができる。新配列を物理的マッピングによって、染色体アーム、またはその部分に指定することができる。これは、位置クローニングまたはその他の遺伝子発見技術を用いて疾病遺伝子を調査する研究者にとって貴重な情報を提供する。一旦疾患または症候群が、例えばＡＴｔｏ１１ｑ２２−２３　（Ｇａｔｔｉ，Ｒ．Ａ．らの（１９９８）　Ｎａｔｕｒｅ３３６：５７７−５８０）等の特定ゲノム領域への遺伝的結合によって大まかに位置決めがされると、その領域に対してマッピングする全ての配列は、さらなる究明用の関連遺伝子または調節遺伝子に相当することになる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を検出することができる。
【００８３】
本発明の別の実施例では、ｐＤＰ２１４、触媒作用断片または免疫原断片またはそのオリゴペプチドを用いて、あらゆる薬剤スクリーニング技術を利用して化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。そのスクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離していても、固体支持物に付着していても、細胞表面上にあっても、細胞内にあっても、一向に差し支えない。ｐＤＰ２１４とテストされる薬剤との間の結合複合物の形成は測定することができる。
【００８４】
使用可能な別の薬剤スクリーニング方法においては、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ８４／０３５６４に記載されているように、目的タンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物の高処理能力スクリーニングが提供されている。この方法においては、ｐＤＰ２１４に適用されたように、多数の異なる小さな試験用化合物を、プラスチックピンまたはその他の表面上等の固体基質上で合成する。試験用化合物は、ｐＤＰ２１４またはその断片と反応さしめ、洗浄する。次に、結合されたｐＤＰ２１４を、当分野で周知の方法によって検出する。精製されたｐＤＰ２１４はまた、前記の薬剤スクリーニング技術において使用できるように、プレート上へ直接被覆することもできる。あるいは、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物上に固定することもできる。別の実施例では、競合薬スクリーニングアッセイを用いることができ、このアッセイ中では、ｐＤＰ２１４を結合する能力を持つ中和抗体が、ｐＤＰ２１４結合用の試験化合物と特異的に競合する。この方法では抗体を用いて、ｐＤＰ２１４と１つ以上の抗原決定因子を共有する全てのペプチドの存在を検出することができる。また別の実施例では、ｐＤＰ２１４をコードするヌクレオチド配列は、いかなる分子生物学技術においても使用することができるが、但し、これらの技術がヌクレオチドの特性に依存している場合に限られる。その特性に含まれるのは、トリプレット遺伝暗号および特異的塩基対の相互作用等であるが、これらに限定されるものではない。
【００８５】
下記の実施例は、本発明を説明するために提供されており、本発明を限定するものではない。
【００８６】
実施例
例１．ＤＰｄ６ニワトリのｃＤＮＡライブラリ構造
ニワトリＤＰｄ６のｃＤＮＡライブラリは、６日目のニワトリ胚から採取した背側膵芽を使用して構築したものである。凍結組織はホモジナイズかつ溶解した。ＢｒｉｎｋｍａｎＰＯＬＹＴＲＯＮｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒＰＴ−３０００　（ＢｒｉｎｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，Ｎ．Ｊ．）をグラニジウムイソチオシアネート溶液において使用した。溶解物に遠心力５．７ＭＣｓＣｌ以上をかける。ＢｅｃｋｍａｎＳＷ２８ローター、ＢｅｃｋｍａｎＬ８−７０Ｍ超遠心分離機　（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、Ｃａｌｉｆ．）使用。１８時間、２５，０００ｒｐｍ、室温。ＲＮＡを、４．７ｐＨ酸フェノールで抽出し、０．３Ｍ酢酸ナトリウムと容積２．５のエタノール沈殿させ、無ＲＮＡ水で再懸濁し、３７℃にてＤｎａｓｅ処理した。以前の通りＲＮＡを４．７ｐＨ酸フェノールで繰返し抽出し、酢酸ナトリウムおよびエタノールで沈殿させた。その後、Ｍｉｃｒｏ−ＦａｓｔＴｒａｃｋ２．０ｍＲＮＡ分離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用してｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡライブラリを構築するために使用した。ｍＲＮＡｓの取り扱いは、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴｃＤＮＡｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｐｌａｓｍｉｄｃｌｏｎｉｎｇｓｙｓｔｅｍ　（Ｃａｔ．＃１８２４８−０１３．Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）の推奨プロトコルに従って行なった。ＤＨ１０Ｖ宿主細胞への形質転換に続いて、単一コロニーを摘出し、ＰＣＲ法を用いてクローン化されたｃＤＮＡインサートを増幅した。単一ｃＤＮＡインサートを代表するＰＣＲ法によって増幅された断片を、その後に生体外転写し、Ｄｉｇｏｘｙｇｅｎｉｎ標識ＲＮＡプローブ（Ｒｏｃｈｅ）を生成した。ＲＮＡプローブを全載原位置スクリーンにおいて使用して初期のニワトリ胚におけるそれぞれの遺伝子産物の発現を確定した。膵臓上皮組織における印象的な発現のおかげで、ニワトリＤＰ２１４様遺伝子を含むプラスミドＤＰ２１４が識別された。
【００８７】
例２．原位置ハイブリッド形成法およびＲＴ−ＰＣＲ分析
標準プロトコルおよび以前に説明した（Ｐｅｌｔｏｎ，Ｒ．Ｗ．らの（１９９０）　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１１０，６０９−６２０、Ｂｅｌｏ，Ｊ．Ａ．らの（１９９７）　Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．６８，４５−５７）に従って原位置ハイブリッド形成法を実行した。ＴＲＩＺＯＬ；　（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて全ＲＮＡ細胞構造の分離を行なった。
【００８８】
例３．分離およびｃＤＮＡクローンのシークエンシング
ＲＥＡＬＰＲＥＰ９６ウェルのプラスミド分離キット（Ｃａｔａｌｏｇ＃２６１７３、ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、プラスミドＤＮＡを細胞から開放し精製した。このキットは、多重試薬ディスペンサーを使用した９６ウェルブロックにおいて、９６個のサンプルの同時精製を可能にした。
【００８９】
下記の変更を除いて推奨プロトコルを使用した。変更−１：細菌を１ｍｌの消毒したＴｅｒｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ　（Ｃａｔａｌｏｇ＃２２７１１、ＬＩＦＥＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ．ＴＭ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）でカルベニシリンを２５ｍｇ／Ｌで、グリセロームを０．４％で用いて培養した。変更−２：接種後、培養を１９時間インキュベートした後、細胞を０．３ｍｌ溶解バッファで溶解した。変更−３：イソプロパノール沈殿に続いて、プラスミドＤＮＡペレットを０．１ｍｌの蒸留水で再懸濁した。プロトコルの最後のステップの後、サンプルを４℃にて保管する９６ウェルブロックへ移した。ｃＤＮＡをＧＡＴＣＢｉｏｔｅｃｈＡＧ　（Ｋｏｎｓｔａｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、当業者であれば既知の標準プロトコルに従って配列せしめた。
【００９０】
例４．ｃＤＮＡクローンの相同性の検索およびその演繹タンパク質
リーディングフレームを決定した後、配列表およびその演繹アミノ酸配列のヌクレオチド配列を、ＧｅｎＢａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ，およびＰｉｍａＩＩ等のようなデータベースに対する問い合わせ配列として使用した。以前に識別され注釈された配列を含むこれらのデータベースで、相同性（類似性）の領域を検索した。使用したのはＢＬＡＳＴ（ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌの略語、ＡｌｔｓｃｈｕｌＳ．Ｆ．　（１９９３）　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．らの（１９９０）　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）である。ＢＬＡＳＴは、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列両方のアライメントを産生し、配列類似性を決定した。ローカル特性をもつアライメントのおかげで、ＢＬＡＳＴは、完全なマッチの決定において、または相同体真核（細菌）または原核（動物、カビ、植物）の起源の識別に特に有用である。ここに引用として取り込まれたＳｍｉｔｈらの（１９９２，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ５：３５−５１）において説明されたような他のアルゴリズムは、一次配列パターンおよび二次構造ギャップのペナルティーを取り扱う場合に使用された。本出願において開示された配列は、最低の長さ４９のヌクレオチド、および１２％以下の不要塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ，またはＴではなく、むしろＮが記録されている）を有する。ＢＬＡＳＴの方法は、Ｋａｒｌｉｎらの（前出）で詳細に説明したように、ここに引用として取り込まれ、問い合わせ配列とデータベース配列との間のマッチを検索した。ＢＬＡＳＴによって、発見された任意のマッチの統計的な重要性が評価され、重要性をもつユーザ選択限界を満足するマッチのみが報告された。本出願において、限界値はヌクレオチドに対して１０〜２５、およびペプチドに対して１０−１４と設定された。Ｉｎｃｙｔｅヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースの霊長類（ｐｒｉ）、げっ歯類（ｒｏｄ）、および他の哺乳動物の配列（ヒト）に対して検索され、それから同一クローンからの演繹アミノ酸配列が、ＧｅｎＢａｎｋの機能的タンパク質データベースの哺乳動物（ｍａｍｐ）、脊椎（ｖｒｔｐ）、真核生物（ｅｕｋｐ）の相同性に対して検索された。特定のマッチに対する関連データベースは、Ｇｌｘｘｘ？｝ｐ　（ｘｘｘはｐｒｉ；ｒｏｄ；等で、ペプチドが存在する場合は、ｐ＝として報告された。プロダクトスコアは、下記のとおり計算された：ＢＬＡＳＴにおけるヌクレオチドまたはアミノ酸識別（問い合わせ配列とリファレンス配列との間）の％に、ＢＬＡＳＴの最大可能スコアー％を乗じ、［問い合わせ配列長とリファレンス配列長に基づいて］、その結果を１００で割る。Ｉｎｃｙｔｅクローンが幾つかの配列に対して相同性を持つ場合には、関連スコアーと共に最大５までのマッチが提供されている。ラボで使用されたハイブリダイゼーション手順の分析では、完全マッチに対する電子的ストリンジェンシーは７０と設定され、完全マッチの保守的な低限は約４０と設定された（不必要な塩基のための誤差許容率は１〜２％）。
【００９１】
例５．ｐＤＰ２１４−コード化ポリヌクレオチドの全長への伸長または調節配列の復元　全長ｐＤＰ２１４−コード化核酸配列｛配列番号２｝を用い、部分的ヌクレオチド配列を全長に拡張するため、またはゲノムライブラリから５′または３′イントロンまたは他の調節配列を取得するために、オリゴヌクレオチドプライマーをデザインする。単一プライマーを合成してアンチセンス方向（ＸＬＲ）における伸長を開始し、他を合成してセンス方向（ＸＬＦ）における配列を伸長する。プライマーを用い、領域目的に対して新規ヌクレオチド配列、未知ヌクレオチド配列を含む既知の配列「ｏｕｔｗａｒｄ」生成ａｍｐｌｉｃｏｎｓの伸長を促進する。初期プライマーは、オリゴ４．０６プライマー分析ソフトウェア（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、または別の適切なプログラムを用いて、ヌクレオチド長が２２〜３０となるように、ＧＣ含有率が５０％以上を有するように、および温度約６８〜７２℃で標的配列にアニールするようにｃＤＮＡからデザインされた。ヘアピン二量化をもたらすようなヌクレオチドは避けた。元の選択されたｃＤＮＡライブラリ、またはヒトゲノムライブラリを用い、配列を伸長した。後者（ヒトゲノムライブラリ）は５′上流領域を取得するために最も有用である。より多くの伸長または所望の必要な場合は、追加プライマーセットをデザインして既知領域を伸長する。ＸＬ−ＰＣＲキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）の指示に従い、充分に酵素および反応混合液を攪拌することによって、高い忠実度と増幅が得られた。４０ｐｍｏｌ　の各プライマーおよび推奨濃度の他の全ての成分キットの準備を発端として、Ｐｅｌｔｉｅｒｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ　（Ｐｅｌｔｉｅｒｔｈｅｒｍａｌｃｙｃｌｅｒ　（ＰＴＣ２００；Ｍ．Ｊ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ、水ｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ．）および下記のパラメータを用いて、ＰＣＲ法を実行した。
【００９２】
ステップ１　　９４℃。１分間（初めの変性）
ステップ２　　６５℃。１分間
ステップ３　　６８℃。６分間
ステップ４　　９４℃。１５秒間
ステップ５　　６５℃。１分間
ステップ６　　６８℃。７分間
ステップ７　　ステップ４〜６は１５の追加サイクルに対して繰返す。
【００９３】
ステップ８　　９４℃。２５秒間
ステップ９　　６５℃。１分間
ステップ１０　　６８℃。７〜１５分間
ステップ１１　　ステップ８〜１０は１２サイクルに対して繰返す。
【００９４】
ステップ１２　　７２℃。８分間
ステップ１３　　４℃。（保持）
５〜１０マイクロリットルの反応混合物を、低濃度（約０．６〜０．８％）のアガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。最も大きな産生物を保持すると思われた領域を選択して、ゲルから除去した。さらなる精製には、ＱＩＡＱＵＩＣＫＤＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）等のような商業用ゲル抽出方法が必要とされる。ＤＮＡの回収後、クレノウ酵素を用い、一本鎖、ヌクレオチド張出部をトリムし、再連結反応およびクローニングを促進する鈍端を作った。エタノール沈殿の後、産生物を１３マイクロリットルの連結反応バッファに再溶解し、１マイクロリットルのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）および１マイクロリットルのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加え、そして混合物を室温で２〜３時間または１６℃で一晩インキュベートした。適格大腸菌細胞（４０マイクロリットルの適切な培地中）を３マイクロリットルの連結反応混合物で形質転換し、８０マイクロリットルのＳＯＣ媒体（前出のＳａｍｂｒｏｏｋらの）で培養せしめた。３７℃にて１時間インキュベーションした後、全形質転換混合液を、２ｘ炭水化物を含むＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ　（ＬＢ）−寒天（前出のＳａｍｂｒｏｏｋらの）上にプレートする。次の日、各プレートから幾つかのコロニーをランダムに摘出し、適切な市販の個別ウェルに配置された１５０マイクロリットルの液体ＬＢ／２ｘ炭水化物媒体で培養する。
【００９５】
消毒済９６ウェルマイクロタイタープレート。次の日、一晩培養された５マイクロリットルの各培養を無償毒９６ウェルプレートに移し、１：１０に水で希釈後、５マイクロリットルの各サンプルをＰＣＲ法アレーへ移す。ＰＣＲ法の増幅は、４単位のｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ベクタープライマー、および１つまたは両方の伸長反応に使用された遺伝子特定プライマーを含む１８マイクロリットルの濃縮ＰＣＲ法反応混合液（３．３ｘ）を各ウェルに加える。増幅は、下記の条件を用いて実行する：
ステップ１　　９４℃。６０秒間
ステップ２　　９４℃。２０秒間
ステップ３　　５５℃。３０秒間
ステップ４　　７２℃。９０秒間
ステップ５　　ステップ２〜４は２９の追加サイクルに対して繰返す。
【００９６】
ステップ６　　７２℃。１８０秒間
ステップ７　　４℃。（保持）
ＰＣＲ法反応のアリコットを分子量マーカーと共に寒天ゲル剤上で実行する。ＰＣＲ産物の寸法を元の部分的ｃＤＮＡｓ　に比較し、適切なクローンを選択し、プラスミドに連結反応して配列する。
【００９７】
例６．ハイブリダイゼーションプローブの標識および使用
配列番号２から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０塩基対から成るオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなｃＤＮＡ断片に対しても実質的には同手順が用いられる。オリゴヌクレオチドを、ＯＬＩＧＯ４．０６プライマー分析ソフトウェア（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、５０ｐｍｏｌ　の各オリゴマーおよび２５０マイクロＣｉの［．ｇａｍｍａ．−３２Ｐ］アデノシン三リン酸（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ　（ＤｕＰｏｎｔＮｅｎ（ｒ），Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）とを組み合わせることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、ＳＥＰＨＡＤＥＸＧ−２５超細繊分子樹脂カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆Ｕｐｊｏｈｎ）を用いて十分に精製する。毎分１０７カウントの各センスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む部分を、（ＡｓｅＩ，ＢｇｌＩＩ，ＥｃｏＲｌ，ＰｓｔＩ，Ｘｂａ１，ｏｒＰｖｕＩＩ；ＤｕｐｏｎｔＮＥＮ（ｒ））の１つの膜で消化されたヒトゲノムＤＮＡの典型的膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。各消化物から得たＤＮＡは、０．７％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（ＮＹＴＲＡＮＰＬＵＳｍｅｍｂｒａｎｅ，Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｄｕｒｈａｍ，Ｎ．Ｈ．）に移す。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くため、最大０．１ｘクエン酸食塩水および０．５％ドデシル硫酸ナトリウムの一層ストリンジェントな条件の下、ブロットを順次室温にて洗浄する。ＸＯＭＡＩＡＲオートラジオグラフィーフィルム　（ＫｏｄａｋＲｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎ．Ｙ．）をブロットに晒した後、またはブロットをＰＨＯＳＰＨＯＩＭＡＧＥＲ　（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，Ｃａｌｉｆ．）に数時間置いた後にオートラジオグラフィーパターンを肉眼で比較する。
【００９８】
例７．アンチセンス分子
ｐＤＰ２１４−コード配列またはその一部に対するアンチセンス分子を用い、生体内または生体外の天然ｐＤＰ２１４の発現を抑制する。約２０塩基対を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、特に記載するが、より大きなｃＤＮＡ断片に使用される手順と本質的に同一である。ｐＤＰ２１４のコーディング配列に基づいたオリゴヌクレオチドは、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示されるように、天然ｐＤＰ２１４の発現を抑制するために使用される。相補的オリゴヌクレオチドは、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示されたように最もユニークな５′配列からデザインされ、プロモーターがｐＤＰ２１４コード化転写物の翻訳に対して、上流非翻訳配列に結合することを防止することによって、またはリボソームを結合からを防止することによって、転写を抑制するために使用されるシグナルの適切な部分および配列番号２の５′配列の使用、効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドには、図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示されたように、ポリペプチドシグナルまたは５′コーディング配列に翻訳する任意の１５〜２０ヌクレオチドがその領域にわたって含まれている。
【００９９】
例８．ｐＤＰ２１４の発現
ｐＤＰ２１４の発現は、ｃＤＮＡｓを適切なベクターにサブクローニングし、そのベクターを宿主細胞に形質転換することによって達成される。この場合、以前にｃＤＮＡライブラリの生成に使用された、クローニングベクターであるＰＳＰＯＲＴ１が、ｐＤＰ２１４を大腸菌において発現するために使用される。クローニング部位の上流である本ベクターには、６２−ガラクトシダーゼに対するプロモーター、続いてアミノ末端Ｍｅｔを含む配列、およびそれに続くβ−ガラクトシダーゼの７つの残基が含まれる。これらの８つの残基の直後に続くのは、転写に有用なバクテリオファージプロモーター、および多数のユニークな制限部位を含むリンカーである。標準方法を使用するＩＰＴＧを有する単離形質転換細菌株の誘発は、β−ガラクトシダーゼの最初の８つの残基から成る融合タンパク質、約５〜１５のリンカー残基、および全長タンパク質を産出する。シグナル残基は、活性化のため下記のアッセイで直接使用することができる細菌の成長培地中にｐＤＰ２１４の分泌物を誘導する。
【０１００】
例９．ｐＤＰ２１４特定抗体の産出
ＰＡＧＥ電気泳動法（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ）または他の精製技術を用いて実質上精製されたｐＤＰ２１４を用いて、標準プロトコルでウサギを免疫化して抗体を産出する。配列番号２から演繹されたアミノ酸配列をＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲＩｎｃ）を用いて解析し、免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成して、これを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。Ｃ末端に近傍するエピトープ、または親水性領域内のエピトープ等の適切なエピトープの選択については前出のＡｕｓｕｂｅｌら、その他によって説明されている。
【０１０１】
通常は、オリゴペプチドの長さは約１５残基であり、Ｆｍｏｃ化学反応を用いるＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１Ａｐｅｐｔｉｄｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ４３１Ａを用いて合成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ）を用いた反応によってキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）　に結合せしめる。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＭ複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性に対する検査は例えば、ペプチドをプラスチックに結合し、１％ＢＳＡを用いてブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、そして放射性ヨウ化されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応して行なう。
【０１０２】
例１０．ｐＤＰ２１４と相互作用する分子の同定
ｐＤＰ２１４または生物学的に活性なその断片を、１２５Ｉボルトンハンター試薬　（Ｂｏｌｔｏｎらの　（１９７３）　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１３３：５２９）で標識する。マルチウェルプレートのウェルに予め配置された候補分子を、標識されたｐＤＰ２１４でインキュベートし、洗浄し、そして標識されたｐＤＰ２１４複合体を有する全てのウェルをアッセイする。異なる濃度のｐＤＰ２１４を使用して得たデータを用いて、数値、親和性の値、およびｐＤＰ２１４の候補分子との会合値を計算する。本明細書において開示した全ての刊行物および特許を言及することをもって本明細書の一部となす。
【０１０３】
本発明の方法およびシステムの種々の修正および改変は当業者に当然のことであり、本発明の範囲および精神から逸脱しない限り行い得るものとする。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことは当然のことである。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明によるニワトリＤＰ２１４タンパク質をコードする核酸配列を示す図
【図２】
本発明によるＤＰ２１４のアミノ酸配列を示す図
【図３】
Ａは本発明によるＤＰ２１４のＣ−型レクチンドメインの核酸配列を示す図であり、Ｂは本発明によるＤＰ２１４のＣ−型レクチンドメインアミノ酸配列を示す図
【図４】
Ａは本発明のＤＰ２１４様タンパク質に対するニワトリ胚上の全載原位置ハイブリッド形成法を示す図、Ｂは本発明のＤＰ２１４様タンパク質に対するニワトリ胚（５日目）の筋節背側図を示す図、Ｃは本発明のＤＰ２１４様タンパク質に対する膵芽組織断面図（５日目の胚）上の原位置ハイブリッド形成法を示す図、Ｄは本発明のＤＰ２１４様タンパク質に対する膵芽組織断面図（５日目の胚）上の原位置ハイブリッド形成法を示す図、Ｅは本発明による間葉背側膵芽でのＤＰ２１４ｍＲＮＡの発現を示す図
【図５】
本発明によるニワトリＤＰ２１４タンパク質配列とヒト相同体との比較を示す図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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