(57)【要約】本発明は、ポリマー材料からなる担体上に固定されていてもよいリパーゼの存在下ｐＨ値６〜８で有機ケイ素化合物を重縮合する方法に関する。好適な重縮合可能な有機ケイ素化合物は、（ＲＯ）（Ｒ１Ｏ）（Ｒ２Ｏ）（Ｒ３Ｏ）Ｓｉ、（ＲＯ）（Ｒ１Ｏ）（Ｒ２Ｏ）（Ｒ３Ｏ）ＳｉＲ３、（ＲＯ）（Ｒ１Ｏ）Ｓｉ（Ｒ２）（Ｒ３）および（ＲＯ）ＳｉＲ１Ｒ２Ｒ３である（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立してＣ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ４〜Ｃ２０アルキルシクロアルキル、アリール、Ｃ６〜Ｃ１６アルキルアリールであり、該アルキル基は直鎖状または分岐状である）。前記リパーゼは大型規模の発酵方法により比較的容易に得ることができるので有利である。シュードモナス種由来のリパーゼが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素の存在下ｐＨ６〜８の溶液中で有機ケイ素化合物を重縮合する方法において、該酵素がリパーゼであることを特徴とする上記方法。
【請求項２】
前記リパーゼが担体上に固定されていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記溶液が水および／または緩衝物質を含むことを特徴とする、請求項１または２のいずれかに記載の方法。
【請求項４】
前記溶液が有機溶剤を含むことを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記担体物質が、ポリプロピレン、ポリスチレンおよび／またはポリウレタンフォームからなることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
シュードモナス種由来のリパーゼを用いる段階を有してなる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記得られる重縮合生成物をリパーゼから分離し、生成物を透析により精製する段階を有してなる、請求項１、３または６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記有機ケイ素化合物が、
（ＲＯ）（Ｒ１Ｏ）（Ｒ２Ｏ）（Ｒ３Ｏ）Ｓｉ、
（ＲＯ）（Ｒ１Ｏ）（Ｒ２Ｏ）ＳｉＲ３、
（ＲＯ）（Ｒ１Ｏ）Ｓｉ（Ｒ２）（Ｒ３）および
（ＲＯ）ＳｉＲ１Ｒ２Ｒ３、
［ここでＲ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は互いに独立してＣ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ４〜Ｃ２０アルキルシクロアルキル、アリール、Ｃ６〜Ｃ１６アルキルアリールであり、該アルキル基は直鎖状または分岐状である］
からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、酵素の存在下で有機ケイ素化合物を重縮合する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
シリコーンおよびシリケートは工業用途においては重要である。シリケートは、例えばクロマトグラフィで相物質として用いられる。その製造には多くの方法がある。例えばアモルファスシリケートを得る方法は、オルトケイ酸から出発し、これを水溶液中酸または塩基触媒で縮合する（Ａ． Ｆ． Ｈｏｌｌｅｍａｎ、Ｅ． Ｗｉｂｅｒｇ、Ｌｅｈｒｂｕｃｈ ｄｅｒ Ａｎｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ［Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］、Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８５、９１ｓｔ−１００ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐｐ．７５７−７６４）。ケイ素は、シラノール、シランジオールおよびシラントリオールの縮合によって製造することができる（Ａ． Ｆ． Ｈｏｌｌｅｍａｎ、Ｅ． Ｗｉｂｅｒｇ、Ｌｅｈｒｂｕｃｈ ｄｅｒ Ａｎｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ、Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８３、９１ｓｔ−１００ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、ｐｐ．７８６−７８８）。最近の数年で開発された新規な方法では、温和な条件下で有機ケイ素化合物を縮合することが可能である。触媒として酵素が用いられる。その反応はｐＨ６〜８で行なわれる。１９９８年に好適な酵素が初めて海洋海綿動物から単離されたが、これは、Ｊ． Ｎ． Ｃｈａ、Ｋ． Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ｙ． Ｚｈｏｕ、Ｓ． Ｃ． Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎ、Ｂ． Ｆ． Ｃｈｍｅｌｋａ、Ｇ． Ｄ． Ｓｔｕｃｋｙ、Ｄ． Ｅ． Ｍｏｒｓｅ、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、１９９９、９６、３６１−３６５、に記載されている。この酵素は三つのサブユニット、いわゆるシリカテイン（ｓｉｌｉｃａｔｅｉｎ）から構成される。この酵素を抽出するのは比較的割高である。緩衝溶液中での重縮合以外に、有機ケイ素化合物（ＥｔＯ）４Ｓｉおよび（ＥｔＯ）３ＳｉＰｈが空気乾燥された酵素を用いて直接変換されている。さらに、ＷＯ ００／３５９９３は、ケイ素アルコキシド、金属アルコキシドならびにその誘導体の、シリケート、ポリシロキサンおよびポリメタロキサンへの重縮合に、システインからなる合成ホモポリマーならびにリシンおよびシステインからなるブロックポリペプチドを用いることを記載している。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、ｐＨ６〜８で行うことができる有機ケイ素化合物の新規な重縮合方法を提供することと、この重縮合反応に好適な触媒を見出すことである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、酵素の存在下ｐＨ６〜８の溶液中で有機ケイ素化合物を重縮合する公知の方法から出発することで達成される。本発明の方法は、その酵素としてリパーゼを用いる段階を有する。リパーゼは、例えばシリカテインのようなこれまで用いられてきた酵素とは構造的類似性をもたないので、これは驚くべきことである。
【０００５】
【発明の実施の形態】
一般論として、全てのリパーゼが本発明の方法に好適である；シュードモナス種由来のリパーゼが好ましく、バークホルデリア プランタリー リパーゼ ［Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉ ｌｉｐａｓｅ］（イネ苗立枯細菌病菌リパーゼ）（ＥＣ ３．１．１．３； ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ： Ｑ０５４８９； Ｌ． Ｇ． Ｊ． Ｆｒｅｎｋｅｎ、Ｍ． Ｒ． Ｅｇｍｏｎｄ、Ａ． Ｍ． Ｂａｔｅｎｂｕｒｇ、Ｊ． Ｗ． Ｂｏｓ、Ｃ． Ｖｉｓｓｅｒ、Ｃ． Ｔ． Ｖｅｒｒｉｐｓ、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９２、５８、３７８７−３７９１）、バークホルデリア セパシア リパーゼ Ａ ［Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ ｌｉｐａｓｅ Ａ］（ＥＣ ３．１．１．３； ＳＷＩＳＳ− ＰＲＯＴ： Ｐ２２０８８； ５． Ｊｏｅｒｇｅｎｓｅｎ、Ｋ． Ｗ． Ｓｋｏｖ、Ｂ． Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９９１、１７３、５５９−５６７）およびシュードモナス アエルギノーザ リパーゼ Ａ ［Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｌｉｐａｓｅ Ａ］（ＥＣ ３．１．１．３； ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ： Ｐ２６８７６； Ｓ． Ｗｏｈｌｆａｒｔｈ、Ｃ． Ｈｏｅｓｃｈｅ、Ｃ． Ｓｔｒｕｎｋ、Ｕ． Ｋ． Ｗｉｎｋｌｅｒ、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １９９２、１３８、１３２５−１３３５）が特に好ましく；バークホルデリア プランタリー リパーゼがなかでも特に好ましい。
【０００６】
発酵法により大型規模でリパーゼを製造するのが有利であり、また可能である。細菌由来のリパーゼは、例えば、酵母エキス、ダイズ油ならびに無機塩類および微量元素のような通常の添加剤ならびに、適切な場合は緩衝物質を含む培養液中で、所望のリパーゼを分泌する細菌の発酵によって製造することができる。発酵が完了したあと、例えば遠心分離または濾過によりリパーゼを細菌菌体および細胞構成物質から分離し、例えばイオン交換クロマトグラフィ、モレキュラーシーブクロマトグラフィ、疎水性クロマトグラフィおよび沈降法のような方法によって精製することができる。このリパーゼの精製は、リパーゼが、細菌細胞および細胞構成物質から分離されたあと、例えばポリオレフィン粒子およびポリウレタンフォームのような担体に固定される場合は必要ない。固定とは、無水溶液または水溶液中の酵素が、特に、大きな表面積を有している非極性のマトリックスに永久的に、且つ触媒活性を維持したまま結合されていることを意味する。固定は、仕上げ工程段階の際のリパーゼのロスを少なくし、遊離のリパーゼが溶けない有機溶媒中でも有機ケイ素化合物の重縮合を行うことを可能とする。さらに、重縮合生成物は担体上に成長する可能性があるので、その結果マイクロエレクトロニクスの部品を製造するための新規な用途を生む可能性がある。
【０００７】
ポリウレタンフォームを担体として用いる場合は、酵素をポリウレタンフォームの表面の反応基と反応させることで酵素が担体上に固定される。酵素は表面に共有結合される。そのような反応基は、ＮＣＯ基、エポキシド基、ＣＯ２Ｈ基および／またはフェノールＯＨ基でよいが、これらは適宜重合が終わったあとで初めてポリウレタンフォーム表面につけられる。
【０００８】
ポリオレフィン粒子を担体として用いる場合は、酵素と担体間の結合はなかんずく疎水性相互作用に基づいている。好適なポリオレフィンは、例えばエチレン、プロピレン、ブタジエン、ブテン、オクテンまたはスチレンのような置換されていないもしくは置換されているオレフィンからなるホモポリマーもしくはコポリマーであり；ポリプロピレンを担体として用いるのが好ましい。
【０００９】
細菌の発酵により得られる溶液、即ち発酵槽溶液中に存在するリパーゼは、通常以下のようにしてポリオレフィン粒子上に固定される。細菌細胞および細胞構成物質を、例えば遠心分離により発酵槽溶液から除去する。残っている溶液を水で希釈し、ポリオレフィン粒子を、リパーゼを含んでいるこの溶液と接触させる。この接触は、例えばそのポリオレフィン粒子をそのリパーゼ含有溶液に加えることで行う。リパーゼ含有溶液がポリオレフィン粒子に接触すると、リパーゼがポリオレフィン粒子上に吸着される。ポリオレフィン粒子はリパーゼに対し非常に高い選択性を有している。リパーゼおよび、該当する場合はそれの断片のみが、ポリオレフィン粒子上に優先的に吸着される。リパーゼ含有溶液からポリオレフィン粒子上に吸着される他のタンパク質の割合は通常２重量％未満である。従ってこの吸着は、リパーゼ含有溶液中の他のタンパク質および酵素からリパーゼを精製する工程でもある。
【００１０】
ポリオレフィン粒子の粒子径および空隙率は臨界的ではない。好ましいポリオレフィン粒子は粒径が１００μｍ〜２０００μｍであり、特に好ましいポリオレフィン粒子は粒径が２００μｍ〜１０００μｍである。ポリオレフィン粒子の空隙率は好ましくは４０％〜８０％、特に好ましくは６０％〜７０％、とりわけ特に好ましいのは６５％である。ポリオレフィン粒子の孔径は好ましくは０．０１μｍ〜１μｍ、特に好ましくは０．０５〜０．５μｍである。
【００１１】
本発明の１つの実施形態では、粒子径が４００μｍ未満の（Ａｃｃｕｒｅｌ １００４）、４００〜１０００μｍの（Ａｃｃｕｒｅｌ １００１）ならびに１０００μｍより大きい（ペレット形態にある）、Ａｋｚｏ社のプロピレン担体Ａｃｃｕｒｅｌ（登録商標）が担体として用いられ；Ａｃｃｕｒｅｌ １００４およびＡｃｃｕｒｅｌ １００１を用いるのが好ましい。
【００１２】
ポリオレフィン粒子上へのリパーゼ固定の最適期間はリパーゼにまたポリオレフィン粒子のタイプに依存し、通常行われる検査により測定することができる。通常、固定は１０分〜２４時間、好ましくは４〜２４時間、特に好ましくは４〜６時間続く。
【００１３】
通常、固定はｐＨ ４．０〜８．８、好ましくは４．５〜７．８、特に好ましくは４．５〜６．０で行われる。
【００１４】
伝導度測定により測定し得るイオン強度は通常０．５ Ｍ未満、好ましくは０．３ Ｍ未満でなければならない。
【００１５】
ポリオレフィン粒子上へリパーゼを固定するのはまたポリオレフィン粒子にリパーゼを詰め込むとも呼ばれる。最大量のリパーゼが吸着され最小量のリパーゼが溶液中に残る好ましい詰め込みはポリオレフィンのタイプに依存し、通常行われる検査により決定することができる。通常、ポリオレフィン粒子上に固定されるリパーゼの量は担体１ ｇ当たりリパーゼ０．１〜５０ ｍｇ、好ましくは担体１ ｇ当たりリパーゼ０．５〜２０ ｍｇ、特に好ましくは担体１ ｇ当たりリパーゼ２〜６ ｍｇである。本発明のとりわけ特に好ましい実施形態ではかかる量は担体１ ｇ当たりリパーゼ ４．２ ｍｇである。
【００１６】
触媒として使用する前に、例えば水のような適当な溶媒で洗浄することにより固定されたリパーゼを吸着されなかった物質から精製するのが有利である。固定されたリパーゼはそのあと、適切な場合は空気中で乾燥する。残留水分は通常４％未満である。
【００１７】
リパーゼをポリオレフィン粒子上に固定するのに説明した上記方法は、発酵により得られる溶液中に存在するリパーゼのみならず、通常水性または有機溶媒中（例えばハロゲン化または非ハロゲン化脂肪族および芳香族炭化水素中）または緩衝水溶液中に存在するリパーゼに関しても行い得る。この方法はまた固定化の前に精製されたリパーゼに関しても行い得るが、この場合精製は必要ない。当業者に公知の他の方法もリパーゼを固定化するのに用いることもできる。
【００１８】
固定されたリパーゼは遊離のリパーゼと同じように触媒として有機ケイ素化合物の重縮合に用いることができる。遊離リパーゼと比較して、固定リパーゼは、重縮合を連続的にまたバッチ式に行うことに関しての高められた安定性と有効寿命ならびにバッチ式重縮合において触媒的に活性な化学種を容易に回収できることに特徴がある。
【００１９】
本発明の方法に好適であり且つ重縮合可能な有機ケイ素化合物は、
（ＲＯ）（Ｒ１Ｏ）（Ｒ２Ｏ）（Ｒ３Ｏ）Ｓｉ（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３ は互いに独立してＣ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ４〜Ｃ２０アルキルシクロアルキル、アリール、Ｃ６〜Ｃ１６アルキルアリールであり、該アルキル基は直鎖状または分岐状であり得る）、
（ＲＯ）（Ｒ１Ｏ）（Ｒ２Ｏ）ＳｉＲ３（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３ は互いに独立してＣ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ４〜Ｃ２０アルキルシクロアルキル、アリール、Ｃ６〜Ｃ１６アルキルアリールであり、該アルキル基は直鎖状または分岐状であり得る）、
（ＲＯ）（Ｒ１Ｏ）Ｓｉ（Ｒ２）（Ｒ３）（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３ は互いに独立してＣ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ４〜Ｃ２０アルキルシクロアルキル、アリール、Ｃ６〜Ｃ１６アルキルアリールであり、該アルキル基は直鎖状または分岐状であり得る）、
（ＲＯ）ＳｉＲ１Ｒ２Ｒ３（式中、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３ は互いに独立してＣ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ４〜Ｃ２０アルキルシクロアルキル、アリール、Ｃ６〜Ｃ１６アルキルアリールであり、該アルキル基は直鎖状または分岐状であり得る）、
である。
【００２０】
テトラアルコキシシラン（ＲＯ）４Ｓｉおよびトリアルコキシアリールシラン（Ｒ１Ｏ）３ＳｉＲ２（ここで、Ｒ、Ｒ１ ＝ Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、ｉＰｒ、ＢｕならびにＲ２ ＝ アリール）を用いるのが好ましい。シランをアリール基と反応させるのは、アリール基がＵＶ光を吸収するので、また従ってそのようなシランはＵＶ検出器で検出可能なので有利である。
【００２１】
重縮合にテトラアルコキシシランおよびトリアルコキシアルキルシランを用いる場合は、反応がどのように行われるかに応じて、表面にヒドロキシ、アルコキシ、アルキル、シクロアルキル、アルキルシクロアルキル、アリール、およびアルキルアリール基を有する直鎖状、分岐状および架橋したシリケートが得られる。
【００２２】
ジアルコキシジアルキルシランの重縮合によりケイ素が得られる。
【００２３】
テトラアルコキシシランの重縮合にジアルコキシジアルキルシランおよびアルコキシトリアルキルシランを用いると、これらは調節剤として働きその結果得られるオリゴシリケートおよびポリシリケートの分子量を低くする。
【００２４】
遊離または固定のリパーゼを用いる場合は、溶媒として、リパーゼが容易に溶解する水または緩衝溶液を用いることができる。緩衝溶液は緩衝物質を水に溶解することにより調製することができる。好適な緩衝物質はグッド［Ｇｏｏｄ］緩衝剤として知られる有機緩衝物質である。アミノ基をもつ緩衝物質が好ましく、特にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ緩衝剤と呼ばれる）が好ましい。ｐＨ ６．５〜ｐＨ ７．４で緩衝するさらなる好適な緩衝物質は標準的な参考書物に載っている。
【００２５】
用いる緩衝溶液のイオン濃度は通常１ ｍＭ〜１００ ｍＭ、好ましくは５ ｍＭ〜５０ ｍＭ、特に好ましくは１０ ｍＭ〜２０ ｍＭである。１００ ｍＭより高いイオン濃度は有機ケイ素化合物の制御されない重縮合を起こす可能性がある。例えば、ｐＨ ７近辺で緩衝するＨ２ＰＯ４−／ＨＰＯ４２−緩衝剤のようなリン酸緩衝溶液は、イオン濃度１００ ｍＭより上では用いる有機ケイ素化合物と反応する可能性がある。
【００２６】
有機ケイ素化合物は水または希薄緩衝水溶液には少ししか溶けないので、反応溶液はよく混ぜなければならない。
【００２７】
固定リパーゼを用いる場合は、例えば最高８個までの炭素をもつ高級アルコール類、脂肪族および芳香族炭化水素類ならびにエーテル類のような有機溶媒を用いることもできる。例としてはメチルｔｅｒｔブチルエーテル、シクロヘキサンおよびシクロヘキサノールがある。有機ケイ素化合物は水よりもこれらの溶媒によく溶けるので、縮合反応は普通水溶液中よりも有機溶媒中で速く進む。有機溶媒溶液はそれでも、アルコキシ基の加水分解従って重縮合を促進するために反応混合物中のアルコキシ基と少なくとも等モルの残留水分量を含んでいなけらばならない。
【００２８】
重縮合は通常ｐＨ ６〜８、好ましくはｐＨ ６．５〜７．４、特に好ましくはｐＨ ６．８〜７．２で行う。
【００２９】
一般に本反応は０〜６０ ℃、好ましくは１０〜４０ ℃、特に好ましくは２０〜３０ ℃で行うことができる。
【００３０】
本反応は大気圧および２ ｂａｒまでの加圧下で行うことができるが、大気圧が好ましい。
【００３１】
反応は通常１ 時間〜２４ 時間続く。
【００３２】
本発明の１つの実施形態では、有機ケイ素化合物を撹拌下でリパーゼ含有溶液に加えることにより本反応が行われる。本発明の別の実施形態ではリパーゼ含有溶液が撹拌下で有機ケイ素化合物に加えられる。反応用物質の添加は連続的またバッチ式であってよいが、バッチ式が好ましい。
【００３３】
本有機ケイ素化合物は、純粋な形態でまた上記の有機溶媒中に溶解させて加えてもよい。
【００３４】
水中および／または緩衝物質含有溶液中の遊離リパーゼを用いる場合は、リパーゼ含有溶液と有機ケイ素化合物の混合は通常エマルジョンを形成する。固定リパーゼを用いると、サスペンジョンが形成される。生成物は大抵の場合析出物の形態で生じる。
【００３５】
用いるリパーゼの量は、溶媒１ ｍｌ当たりの単位［Ｕ］で記載されている。水溶液中の２０〜２３ ℃におけるリパーゼの活性は、リパーゼによりグリセロールと酪酸に開裂される基質トリブチリン（＝ グリセリルトリス（ブタノエート））の変換によって決定される。酪酸の濃度はＮａＯＨ（１ Ｎ）による滴定により測定することができる。これより、１ Ｕ ＝ 基質変換［μモル］／時間［分］ となる。
【００３６】
１５ ℃〜３０ ℃ではリパーゼ活性に変化はない。例えば、リパーゼ８．３ ｍｇは２５０，０００単位の活性を有する。
【００３７】
モルで表した有機ケイ素化合物の量に対するＨ２Ｏ １ ｍｌ当たりの単位数で表した遊離リパーゼの量の割合は通常Ｈ２Ｏ １ ｍｌおよび有機ケイ素化合物４ ミリモル当たり２００〜５０００ 単位であり、好ましくはＨ２Ｏ １ ｍｌおよび有機ケイ素化合物４ ミリモル当たり４００〜２０００ 単位である。
【００３８】
モルで表した有機ケイ素化合物の量に対する単位数で表した固定リパーゼの量の割合は、例えば溶媒としてＨ２Ｏ １ ｍｌ中で、有機ケイ素化合物４ ミリモル当たり１００〜２００００ 単位であり、好ましくは有機ケイ素化合物４ ミリモル当たり１００〜１００００ 単位である。
【００３９】
遊離リパーゼを使用する場合は、仕上げ工程は通常その有機−水性相を除去することで行い、該当する場合は、好ましくは遠心分離により、有機相を生成物含有析出物から分離することで行う。析出物は次に有機溶媒に対して透析される。好適な溶媒は、例えば、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨ、ｉＰｒＯＨおよびｎＰｒＯＨのような全ての水混和性アルコールである。ＥｔＯＨを使用するのが好ましい。
【００４０】
反応生成物はまた、モレキュラーシーブクロマトグラフィによりまた（十分に高い分子量では）遠心分離により、あるいは（十分に疎水性の反応生成物に対しては）非極性溶媒による抽出により分離することもできる。
【００４１】
有機−水性相中にあるリパーゼは、例えば限外濾過およびクロマトグラフィにより回収することができる。
【００４２】
固定リパーゼを使用する場合は、シリケートが担体上に成長する。反応生成物は、反応が行われた溶液から濾過により分離することができる。
【００４３】
生成物の分子量はゲルパーミエーションクロマトグラフィにより通常測定する。しかしながら、例えばＭＡＬＤＩ−ＭＳ（ＭＡＬＤＩ ＝ ｍａｔｒｉｘ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｌａｓｅｒ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ：マトリックス支援レーザー発散）あるいはＥＳＩ−ＭＳ（ＥＳＩ ＝ ｅｌｅｃｔｒｏｎｓｐｒａｙ ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ：電子噴霧イオン化）のようなマススペクトル分析法により分子量を測定することも可能である。
【００４４】
【実施例】
以下の実施例により本発明をより詳細に説明する。
【００４５】
実施例１：バークホルデリア プランタリー［Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉ］リパーゼの発酵
水１ Ｌ当たり１ ｇのＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、３．５ ｇのＫＨ２ＰＯ４、３．５ ｇのＫ２ＨＰＯ４、５．０ ｇの（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、０．０２ ｇのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏおよび１０ ｇの酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）を含有する前培養物２００ ｍＬを、２つの底面バッフルを有する１ Ｌ振盪フラスコ中１２１ ℃で３０分間滅菌し、そのあと通常の添加剤（微量元素）を加えた。
【００４６】
この振盪フラスコ２個の内容物、即ち４００ ｍｌを、アンプル１本分のバークホルデリア プランタリーと共に３０ ℃で９ 時間インキュベートすることにより前培養物を得た。
【００４７】
１１０ ｇの酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、３８．５ ｇのＫ２ＨＰＯ４、３８．５ ｇのＫＨ２ＰＯ４、５５ ｇの（ＮＨ４）Ｈ２ＰＯ４、１１ ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２２ ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含有する培養液を脱イオン水で１１ Ｌに希釈し、１２１ ℃で３０分滅菌して、通常の添加物（微量元素）を加えた。この培養液を次に１４ Ｌ発酵槽中に投入した。
【００４８】
発酵は３０ ℃、ｐＨ ６．５で、また１０００ｒｐｍおよび毎分１１ ＬのＯ２ を流入させながら３日間行った。発酵期間中大豆油を連続的に添加した。添加速度は式 Ｉにより計算した。前培養物は反応の開始後半時間に加えた。
Ｓ ＝ Ｖ＊ＳＦ＊（ｅ（ＳＴ＊ｔ） −１）／ｔ　　（式 Ｉ）
ここで、
Ｓ ＝ 計量量 ［ｇ／ｈ］、
Ｖ ＝ 発酵容量 ［Ｌ］、
ＳＦ ＝ １１０ ［ｇ／Ｌｈ］、
ＳＴ ＝ ０．０１ ［１／ｈ］、
ｔ ＝ 開始後の時間 ［ｈ］。
【００４９】
微生物は周囲培地中にリパーゼを分泌した。発酵が終ったあとまた１５ ℃に冷却させたあと、発酵溶液を取り出した。リパーゼ活性は８９００ Ｕ／ｍＬであり、遠心分離により１０，５００ Ｕ／ｍＬに高められた。
【００５０】
実施例２：固定化
上記の発酵で得られた発酵溶液を、開き式［ｓｗｉｎｇ−ｏｕｔ］遠心分離機ＲＣ−３Ｂ中５０００〜６０００ｒｐｍで、１ Ｌ容器に入れて遠心分離して細胞を分離した。リパーゼ濃度は１ ｍＬ当たり約１０，０００ 単位であった。この発酵溶液２５ ｍＬを７５ ｍＬの水で希釈しＡｃｃｕｒｅｌ １００１ １ ｇと共にインキュベートした。最終リパーゼ濃度はＡｃｃｕｒｅｌ １００１ １ ｇ当たり２５０，０００単位であった。Ａｃｃｕｒｅｌ １ ｇにリパーゼ８．３ ｍｇが固定された。Ａｃｃｕｒｅｌ １００４を使用しても同じ結果が得られた。
【００５１】
実施例３：遊離リパーゼ存在下の有機ケイ素化合物の重縮合
フェニルトリエトキシシランＰｈ（ＥｔＯ）３Ｓｉ（有機相）２５ ｍＬを、遊離Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉリパーゼ５０，０００ 単位を含有する水（水相）２５ ｍＬに室温および大気圧で加え、激しく撹拌しながら混合することで、エマルジョンが形成され、シリケートが有機相中で白色析出物の形態で生成した。２４時間後この２つの相を遠心分離により分離した。有機相の上澄み溶液を除去し、残った白色析出物を２ Ｌのエタノールに対して一晩透析した。透析膜の排除容積は１０，０００ Ｄａであった。２４時間後透析バッグからサンプルを取り出し、不溶解性の析出物を遠心分離により分離した。析出物をＧＰＣにより分析した。ポリスチレンを検量物質として使用した。生成した重縮合混合物のポリマーの分子量は８００〜２４００ Ｄａであった。従って、調製されたポリマーは４〜４０ 単位を含む。
【００５２】
図１は、実施例３の重縮合生成物の分子量分布を示す。
【００５３】
実施例４：ゲルパーミエーションクロマトグラフィによる分子量の測定
２２ ｍｇ／ｍＬの溶液（実施例３の全サンプル）の２０μＬを取り出し、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＳＲＰ ２５（０．２μｍ）を通して濾過した。ＧＰＣには内径４．６ ｍｍ、長さ２５ ｃｍのＳ−６２８カラムを用いた。ＰＬ ゲル Ｍｉｘｅｄ Ｂ ［５μｍ］を分離物質として用いた。溶離液としてＴＨＦまた０．３ ｍＬ／ｍｉｎの流速を用いてカラム温度３０ ℃で分離を行った。この流速においてはカラムの理論段数は７０００であった。ポリスチレンの排除限界は約１０７であった。検出器としては２５４ ｎｍにおけるＨＰ １１００ ＶＷＤ ＵＶ分光分析器およびＥＬＳ−１０００蒸発型光散乱検出器［ｅｖａｐｏｒａｔｉｖｅ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｏｒ］を用いた。
【００５４】
分子量５８０〜７．５×１０６のＰｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手の狭い分子量範囲のポリスチレン標準品およびヘキシルベンゼン（分子量 １６２）を検量用に用いた。この間隔の外側の溶出ゾーンは外挿により推算した。結果を図１に示す。
【００５５】
実施例５：固定リパーゼ存在下の有機ケイ素化合物の重縮合
テトラブトキシシランを水溶液中のＡｃｃｕｒｅｌ １００１上に固定されたリパーゼに加え、そして室温で３週間放置した。担体上に、特にリパーゼで占められている場所に結晶成長が形成された。図２および３は担体上の結晶成長を明白に示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】
実施例３の重縮合生成物の分子量分布を示す。
【図２】
担体上の結晶成長を示す。
【図３】
担体上の結晶成長を示す。
【図１】
2004508830.tif 000002
【図２】
2004508830.tif 000003
【図３】
2004508830.tif 000004
【国際公開パンフレット】
2004508830.tif 000005
2004508830.tif 000006
2004508830.tif 000007
2004508830.tif 000008
2004508830.tif 000009
2004508830.tif 000010
2004508830.tif 000011
2004508830.tif 000012
2004508830.tif 000013
2004508830.tif 000014
2004508830.tif 000015
2004508830.tif 000016
2004508830.tif 000017
2004508830.tif 000018
2004508830.tif 000019
2004508830.tif 000020
2004508830.tif 000021
2004508830.tif 000022
2004508830.tif 000023
【国際調査報告】
2004508830.tif 000024
2004508830.tif 000025