(57)【要約】本発明は、腫瘍細胞の増殖因子―依存性の阻害のためへのプロゲステロン受容体インヒビターの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞への及び／又は腫瘍への増殖因子の結合の阻害のための剤の生成のためへのプロゲステロン受容体のインヒビターの使用。
【請求項２】
前記増殖因子により生成される腫瘍細胞の及び／又は腫瘍の増殖が阻害されることを特徴とする請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記プロゲステロン受容体のインヒビターが、下記一般式Ｉ：
【化１】
2004513094.tif 000004
［式中、Ｒ１は、メチル又はエチル基を表し、
Ｒ２は、式ＣｎＦｍＨｏで表される基を表し、ここでｎは２，３，４，５又は６であり、ｍ＞１であり、そしてｍ＋ｏ＝２ｎ＋１であり、
Ｒ３は、遊離、エーテル化された又はエステル化されたヒドロキシ基を表し、
Ｒ４及びＲ５は、追加の結合又はメチレン基と共に、水素原子をそれぞれ表し、
Ｓｔは、下記部分式Ａ， Ｂ又はＣ：
【化２】
2004513094.tif 000005
で表されるステロイド性ＡＢＣ−環システムを表し、
前記式中、Ｒ６は、水素原子、直鎖Ｃ１−Ｃ１アルキル基もしくは枝分かれ鎖Ｃ３−Ｃ４アルキル基、又はハロゲン原子を意味し、
Ｒ７は、水素原子、直鎖Ｃ１−Ｃ４アルキル基もしくは枝分かれ鎖Ｃ３−Ｃ４アルキル基、又はＳｔがステロイド性ＡＢＣ−環システムＡ又はＢを表す場合、さらにＲ６及びＲ７は一緒に、追加の結合を意味し、
Ｘは、酸素原子、ヒドロキシアミノ基＝Ｎ−ＯＨ又は２個の水素原子を意味し、
Ｒ８は、基Ｙ、又はいくつかの位置で基Ｙにより任意に置換されるアリール基を意味し、ここでＹは水素原子、ハロゲン原子、−ＨＯ， −ＮＯ２， −Ｎ３， −ＣＮ， −ＮＲ９ａＲ９ｂ， −ＮＨＳＯ２Ｒ９， −ＣＯ２Ｒ９， Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１０アルカノイルオキシ、ベンゾイルオキシ−Ｃ１−Ｃ１０アルカノイル、Ｃ１−Ｃ１０ヒドロキシアルキル又はベンゾイル基であり、そしてＲ９ａ及びＲ９ｂは同じか又は異なり、そしてＲ９のように、水素原子又はＣ１−Ｃ１０アルキル基を表す］で表される１７α−フルオロアルキルステロイド類、及び基−ＮＲ９ａＲ９ｂに関しては、酸とのそれらの生理学的に適合できる塩、及び基−ＣＯ２Ｒ９（Ｒ９は水素である）に関しては、塩基とのそれらの生理学的に適合できる塩から選択される請求項又は２記載の使用。
【請求項４】
前記プロゲステロン受容体のインヒビターが、化合物１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）エストラ−４，９−ジエン−３−オンである請求項３記載の使用。
【請求項５】
前記腫瘍細胞が、高い及び／又は構成的なプロゲステロン受容体発現を有する請求項１〜４のいずれか１項記載の使用。
【請求項６】
前記腫瘍細胞が、乳癌細胞である請求項１〜５のいずれか１項記載の使用。
【請求項７】
ＥＧＦ、及び／又は前記ＥＧＦ受容体に結合する他の因子の結合が、腫瘍細胞において阻害される請求項１〜６のいずれか１項記載の使用。
【請求項８】
前記ＥＧＦ受容体とｅｒｂＢ２との間でのヘテロダイマーの形成が阻害される請求項１〜７のいずれか１項記載の使用。
【請求項９】
腫瘍治療のためへの請求項１〜８のいずれか１項記載の使用。
【請求項１０】
増殖因子−依存性増殖へのステロイド−依存性増殖の腫瘍の進行を阻害するためへの請求項９記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、腫瘍細胞の増殖因子依存性を阻害するためへのプロゲステロン受容体インヒビターの使用に関する。
エストラジオール及びプロゲステロンは、乳癌の成長に関与している。しかしながら、診断の時点で、腫瘍のわずか約１／３が、ステロイドホルモン依存性を示す。大部分のステロイドホルモン−耐性腫瘍においては、局部−作用性オートクライン又は傍分泌ペプチド増殖因子についての増殖制御が引き継がれることが仮定される。この場合、増殖因子−受容体−陽性及びステロイドホルモン−耐性である、非常に不良な予後を伴なう侵襲性腫瘍が生じる（Ｅｌｌｅｄｇｅ など．， Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｋｏｌ． １９ （１９９２）， ２４４−２５３）。
【０００２】
増殖因子は、細胞表面上の高い親和性のチロシンキナーゼ受容体に結合した後、細胞内シグナルトランスダクション経路の活性化により細胞増殖を調節する。つい最近の発見は、乳癌細胞ＥＧＦのミトゲン作用のためにプロゲスチンにより感作され得ることを示している（Ｇｒｏｓｈｏｎｇなど．， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １１ （１９９７）， １５９３−１６０７）。従って、例えばヒト乳癌細胞系Ｔ４７Ｄにおけるプロゲステロンが、サイクリン１Ｄ及びサイクリン−依存性キナーゼ４の活性の一時的な上昇により付随される、Ｓ期における細胞の攻撃を誘発することは可能である。
【０００３】
しかしながら増殖刺激は、１回の周期に制限され、そして続いて、２回目の周期のＧ１／Ｓ−遷移での増殖阻止が伴う（Ｇｒｏｓｈｏｎｇなど．， （１９９７）， 前記；Ｍｕｓｇｒｏｖｅなど．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３ （１９９３）， ３５７７−３５８７）。プロゲステロンにより停止されるその条件下で、細胞は、ＥＧＦの増殖作用に対して敏感である。さらに、プロゲステロンが、ＥＧＦＲ、Ｅｒｂ２及びＥｒｂ３を高めることによって、Ｔ４７Ｄ細胞に対するＥＧＦの作用を増強し、そしてシグナル分子のチロシンリン酸化を高めることが示されている（Ｌａｎｇｅなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３ （１９９８）， ３１３０８−３１３１６； Ｒｉｃｈｅｒなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３ （１９９８）， ３１３１７−３１３２６）。対照的にプロゲステロン受容体に影響を及ぼすことによって、腫瘍細胞に対するＥＧＦの作用の阻害性を示すことはまだ不可能である。
【０００４】
本発明を導く試験の範囲内で、プロゲステロン受容体、例えば１７α−フルオロアルキルステロイドのインヒビターが、腫瘍細胞、特に、プロゲステロン受容体の高い及び／又は構造的発現を有する腫瘍細胞経の増殖因子の結合を少なくとも部分的に阻害することができることが、驚くべきことには十分に見出された。
【０００５】
従って、本発明の目的は、腫瘍細への増殖因子の結合を阻害し、そして特に、増殖因子により生成される腫瘍細胞又は腫瘍の増殖を阻害するための剤の生成のためへのプロゲステロン受容体のインヒビターの使用である。本発明に関するプロゲステロン受容体のインヒビターは好ましくは、プロゲステロンのその受容体への結合を競争的に阻害する物質である。この場合、プロゲステロン受容体のインヒビターは好ましくは、例えばＷＯ９８／３４９４７号に開示されるように、１７α−フルオロアルキルステロイド類から選択される。それらの１７α−フルオロアルキルステロイド類は、下記一般式Ｉ：
下記一般式Ｉ：
【０００６】
【化３】
2004513094.tif 000002
【０００７】
［式中、Ｒ１は、メチル又はエチル基を表し、
Ｒ２は、式ＣｎＦｍＨｏで表される基を表し、ここでｎは２，３，４，５又は６であり、ｍ＞１であり、そしてｍ＋ｏ＝２ｎ＋１であり、
Ｒ３は、遊離、エーテル化された又はエステル化されたヒドロキシ基を表し、
Ｒ４及びＲ５は、追加の結合又はメチレン基と共に、水素原子をそれぞれ表し、
Ｓｔは、下記部分式Ａ， Ｂ又はＣ：
【０００８】
【化４】
2004513094.tif 000003
【０００９】
で表されるステロイド性ＡＢＣ−環システムを表し、
前記式中、Ｒ６は、水素原子、直鎖Ｃ１−Ｃ１アルキル基もしくは枝分かれ鎖Ｃ３−Ｃ４アルキル基、又はハロゲン原子を意味し、
Ｒ７は、水素原子、直鎖Ｃ１−Ｃ４アルキル基もしくは枝分かれ鎖Ｃ３−Ｃ４アルキル基、又はＳｔがステロイド性ＡＢＣ−環システムＡ又はＢを表す場合、さらにＲ６及びＲ７は一緒に、追加の結合を意味し、
Ｘは、酸素原子、ヒドロキシアミノ基＝Ｎ−ＯＨ又は２個の水素原子を意味し、
【００１０】
Ｒ８は、基Ｙ、又はいくつかの位置で基Ｙにより任意に置換されるアリール基を意味し、ここでＹは水素原子、ハロゲン原子、−ＨＯ， −ＮＯ２， −Ｎ３， −ＣＮ， −ＮＲ９ａＲ９ｂ， −ＮＨＳＯ２Ｒ９， −ＣＯ２Ｒ９， Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１０アルカノイルオキシ、ベンゾイルオキシ−Ｃ１−Ｃ１０アルカノイル、Ｃ１−Ｃ１０ヒドロキシアルキル又はベンゾイル基であり、そしてＲ９ａ及びＲ９ｂは同じか又は異なり、そしてＲ９のように、水素原子又はＣ１−Ｃ１０アルキル基を表す］で表される１７α−フルオロアルキルステロイド類、及び基−ＮＲ９ａＲ９ｂに関しては、酸とのそれらの生理学的に適合できる塩、及び基−ＣＯ２Ｒ９（Ｒ９は水素である）に関しては、塩基とのそれらの生理学的に適合できる塩を示す。
【００１１】
そのようなプロゲステロン受容体のインヒビターの特に好ましい例は、化合物１１β−（４−アセチルフェニル）−１７β−ヒドロキシ−１７α−（１，１，２，２，２−ペンタフルオロエチル）−エストラ−４，９−ジエン−３−オン（下記化合物Ａ）である。さらに、他の抗黄体ホルモン、例えばオナプリストン（１１β−［ｐ−（ジメチルアミノ）フェニル］−１７α−ヒドロキシ−１７−（３−ヒドロキシプロピル）−１３α−エストラ−４，９−ジエン−３−オン）がまた、適切である。
【００１２】
プロゲステロン受容体インヒビターの作用が、高い及び／又は構成的プロゲステロン受容体発現を有する腫瘍細胞、例えばプロゲステロン受容体−陽性乳癌細胞系Ｔ４７Ｄの場合に特に見出されている（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓなど．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４ （１９９４）， ３６６８−３８７７）。
プロゲステロン受容体インヒビターは、増殖因子、特にＥＧＦ受容体ファミリー、例えばＥＧＦ受容体の増殖因子に結合するそれらの因子の発現のプロゲステロン−誘発された増強を阻害する。前記インヒビターは特に好ましくは、ヒト乳癌細胞へのＥＧＦの結合を阻害する。
【００１３】
従って本発明によれば、プロゲステロン受容体インヒビターは、哺乳類及び好ましくはヒトにおける腫瘍治療のために、特にステロイド−依存性増殖の増殖因子−依存性増殖への腫瘍、特に乳癌の進行を阻止するために使用され得る。この場合、腫瘍の効果的処理は、患者についての予後の相当な悪化に関連する増殖因子−依存性増殖の段階において進行できる腫瘍を伴なわないで、例えば抗エストロゲンによるステロイド−依存性増殖の段階において生じることができる。プロゲステロン受容体インヒビターの投与はまた、増殖因子−依存性増殖の段階における腫瘍増殖を遅延することができる。
【００１４】
このためには、非ステロイド性抗エストロゲン、例えばタモキシフェン及びナフォキシジン、及びラロキシフェン及びＥＭ８００が使用され得る。前記言及された最後の２種の抗エストロゲンは、前記言及されたＳＥＲＭ（選択的エストロゲン受容体モジュレーター）の代表であり；また、ＳＥＲＭの作用のプロフィールを有する他の化合物、例えばＰＣＴ／ＥＰ９９／０５０９３号に言及される化合物が本発明に従って使用され得、そして後者の化合物は、特に化合物５−（４−｛５−［（ＲＳ−４，４，５，５，５−ペンタフルオロペンチル）スルフィニル］−ペンチルオキシ｝フェニル）−６−フェニル−８，９−ジヒドロ−７Ｈ−ベンゾシクロヘプテン−２−オールである。
【００１５】
ステロイド性抗エストロゲンの例は、ＥＰ０３４８３４１Ａ号に開示されるそれら、特にファスロデック（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）、及びＷＯ９８／０７７４０号に開示されるそれら、特に１１β−フルオロ−７α−｛５−［Ｎ−メチル−Ｎ−３−（４，４，５，５，５−ペンタフルオロペンチルチオ−プロピル）アミノ］ペンチル｝−エストラ−１，３，５（１０）トリエン−３，１７β−ジオール、又はＷＯ９９／３３８５５号に記載されるそれら、特に１１β−フルオロ−７α−｛５−［メチル−（７，７，８，８，９，９，１０，１０，１０−ノナフルオロ−デシル）−アミノ］ペンチル｝−エストラ−１，３，５（１０）トリエン−３，１７β−ジオール、又は医薬的に適合できるそれらの誘導体又は類似体である。抗エストロゲン効果を有するアロマターゼインヒビター、例えばＥＰ０４９５８２５Ｂ１のページ７〜８から知られているそれらが、抗エストロゲンとして、同様に使用され得る。
【００１６】
プロゲステロン受容体インヒビターの投与は、通常使用される方法に従って、例えば局部的に、皮下的に、経腸的に又は非経口的に行われ得る。経腸投与に関しては、特に錠剤、被覆された錠剤、カプセル、ピル、懸濁液又は溶液（生薬において知られている添加剤及びビークルにより、通常の手段で生成され得る）が適切である。局部的使用に関しては、膣用坐剤又は経皮用システム、例えば皮膚パッチが適切である。皮下投与は、油溶液と共に注射することにより行われ得る。
用量単位は、例えば０．１〜１００ｍｇの活性化合物（プロゲステロン受容体のインヒビター）を含むことができる。ヒトへの投与に関しては、活性化合物の毎日の用量は、約０．１〜４００ｍｇ、好ましくは約１０〜１００ｍｇ及び特に約５０ｍｇである。
【００１７】
さらに、本発明は次の例により説明される。
実施例
１．材料及び方法：
材料：
１２５Ｉ−ＥＧＦ（１００ｍＣｉ／ｍモル）を、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｕｃｋｌｅｒにより得た。化合物Ａ、ヒドロタモキシフェン（４−ＯＨ−Ｔａｍ）、ＺＭ１Ｂ２７８０及びエストラジオールを、既知方法に従って、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅａｔｉｃａｌ Ａｇｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙにおいて合成した。
【００１８】
細胞系：
ヒトエストロゲン受容体（ＥＲ）−及びプロゲステロン受容体（ＰＲ）−陽性乳癌細胞系Ｔ４７Ｄ（Ｆｒｅａｋなど．， ＢＢＲＣ１０１ （１９８１）， １１３１−１１３８）を使用した。
増殖研究：
腫瘍細胞を、個々の場合に示される化合物の存在下で、１０％ウシ血清、２００ｎＭのインスリン及び０．１ｎＭのエストラジオールを含むＲＰＭＩ培地を含む９６−ウェルプレートにおいて、５０００個の細胞／ウェルで６日間、培養し、そして増殖を、結晶バイオレットによる染色により決定した。
【００１９】
ＰＲ及びＥＲタンパク質の量：
細胞溶解物におけるＰＲ及びＥＲの量を、Ｆｕｈｒｍａｎｎなど．， （Ｃｏｎｔｒａｃｅｐｔｉｏｎ５４ （１９９６）， ２４３−２５１） に記載される方法に従って、放射性ラベルされたプロゲステロン又はエストラジオールによるステロイド結合アッセイの使用により決定する。
腫瘍細胞への１２５Ｉ−ＥＧＦの結合：
Ｒ５０２０−前処理されたＴ４７Ｄ細胞を、１２５Ｉ−ＥＧＦと共に４℃で２時間インキュベートした。非特異的結合は常に、合計結合の１０％以下であった。
【００２０】
トランス活性化アッセイ：
Ｔ４７Ｄ細胞を、ＭＴＶ−ＬＵＣ（Ｃａｔｏなど．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ９： ２２３７−４０）により、一時的にトランス固定化し、そして１ｎＭのＲ５０２０の不在又は存在下で培養した。ＰＲ−介在性拮抗作用に対する試験においては、その一時的にトランス固定化されたＴ４７Ｄ細胞を、Ｒ５０２０により、及びさらに、上昇する濃度の化合物Ａ又はＲＵ４８６により処理した。２４時間後、ルシフェラーゼ試験を行った。
【００２１】
２．結果：
図１は、種々の試験物質の抗増殖作用を示す。Ｔ４７Ｄ細胞を、０．１ｎＭのＥ２及び上昇する濃度の化合物Ａ（黒三角）、オナプリストン（黒正方形）、ＺＫ１９１７０３（●）又は４−ＯＨ−Ｔａｍ（◆）の存在（上方の陰影部）又は不在（下方の陰影部）下で培養した。Ｔ４７Ｄ細胞の場合、化合物Ａはまた、非常に低い濃度で有意な抗増殖作用を示す。
図２は、Ｔ４７Ｄ細胞におけるＰＲ−及びＥＲ−タンパク質の量を示す。
図３は、Ｔ４７Ｄ細胞におけるＰＲの転写活性を示し、それにより、それぞれの細胞はＭＴＶ−ＬＵＣにより一時的にトランス固定化され、そして（Ｃｏ）の不在下又は１ｎＭのＲ５０２０の存在下で培養された（ａ）。ＰＲ−介在性拮抗性についての試験においては、その一時的にトランス固定化されたＴ４７Ｄ細胞は、０．１ｎＭのＲ５０２０、及び上昇する濃度の化合物Ａ又はＲＵ４６８１により処理された（ｂ）。
【００２２】
図４においては、Ｔ４７Ｄ細胞への１２５Ｉ−ＥＧＦ結合のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析が示されている。細胞は、２０ｎＭの化合物Ａを伴なって又はそれを伴なわないで、２０ｎＭのＲ５０２０の存在下で４８時間、培養され、そして次に、洗浄された。次に、ＥＧＦの０．２５〜１５０ｎｇ／ｍｌの濃度範囲にわたってのＥＧＦ−結合が、４℃での２時間のインキュベーションに決定された。挿入は、遊離リガンド濃度の対数に対する結合されたリガンドの量を示す。化合物Ａ（下方の図）が添加される場合、モニターリング（上方の図）に関して、Ｒ５０２０（中間の図）により引き起こされるＥＧＦ結合の上昇を阻止することが可能であったことは明確である。
【００２３】
図５においては、損なわれていないＴ４７Ｄ細胞への１２５Ｉ−ＥＧＦの結合が示される。このためには、細胞は、２又は２０ｎＭのＲ５０２０＋化合物Ａ又はオナプリストン、又は化合物Ａのみにより４８時間、処理された。化合物ＡはＲ５０２０により引き起こされるＴ４７Ｄ細胞へのＥＧＦ−結合の上昇を阻止することがまた見出され得る。相当に弱い効果であるが、同様のことがまた、オナプリストンに関しても見出される。
【００２４】
議論：
上記結果は、高い及び構成的なＰＲ接触を伴なって、Ｔ４７Ｄ細胞のエストラジオール−刺激された増殖が化合物Ａにより効果的に阻止されたことを示す。
トランス活性化アッセイにより、ＰＲはＴ４７Ｄ細胞において転写的に活性的であり、そして化合物１により阻止され得ることを示すことが可能であった。
【００２５】
Ｒ５０２０によるＴ４７Ｄ細胞の刺激は、化合物Ａにより阻止される、２〜３倍に高められたＥＧＦ−受容体発現をもたらした。同時に、細胞へのＥＧＦの結合が２〜３倍に高められ、そして化合物Ａにより妨げられ、そしてオナプリストンによっては、低いが、効果的に妨げられ得た。Ｒ５０２０処理された細胞への高められたＥＧＦ−結合が、増強されたＥＧＦ−受容体発現、又はＥＧＦ受容体とｅｒｂＢ２との間で高められたヘテロダイマー形成により生成され得た。
【００２６】
それらの結果は、ヒト乳癌細胞におけるＰＲ−シグナルシステムと増殖因子−シグナルシステムとの間の相互作用を示す。抗黄体ホルモンの使用により、ステロイド−依存性増殖からの腫瘍細胞の増殖因子―依存性増殖への進行が阻害されるか又は妨げられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、乳癌細胞系Ｔ４７Ｄに対する試験物質の抗増殖作用を示す。
【図２】
図２は、乳癌細胞系Ｔ４７Ｄにおけるプロゲステロン受容体（ＰＲ）及びエストロゲン受容体（ＥＲ）のタンパク質の量を示す。
【図３】
図３は、Ｔ４７Ｄ細胞におけるプロゲステロン受容体の転写活性を示す。
【図４】
図４は、試験物質の存在の関数としてのＴ４７Ｄ細胞へのＥＧＦの結合のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析を示す。
【図５】
図５は、試験物質の存在に対するＴ４７Ｄ細胞へのＥＧＦの結合の存在性を示す。
【図１】
2004513094.tif 000006
【図２】
2004513094.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
2004513094.tif 000011
2004513094.tif 000012
2004513094.tif 000013
2004513094.tif 000014
2004513094.tif 000015
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2004513094.tif 000019
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