(57)【要約】本発明は、悪性腫瘍を治療するための薬剤としての、異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドに関する。さらに本発明は、悪性腫瘍を治療するための医薬の製造における、前記異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性腫瘍を治療するための医薬の製造方法において、異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドを全身投与可能な形にすることを特徴とする、悪性腫瘍を製造するための医薬の製造方法。
【請求項２】
異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドを、治療すべき腫瘍細胞との複合体の形で使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、治療すべき腫瘍細胞と一緒にインキュベートし、得られた培養物を作用物質として使用する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
生理学的に許容可能な担持剤、助剤、希釈剤および／または添加剤を添加する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
作用物質が、動物組織、植物および／または単細胞からのオリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドを含む、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
作用物質が、酵母細胞からのオリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
作用物質が、異種ｔＲＮＡを含む、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
作用物質が、フェノール抽出によって得られた異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドを含む、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドが、治療すべき生物とは発生歴史学的に遠く離れた生物に由来するものである、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
悪性腫瘍を治療するための、オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドの使用。
【請求項１１】
異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドを治療すべき腫瘍細胞との複合体の形で使用する、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
治療すべき悪性腫瘍細胞と一緒にｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートされた、異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドを使用する、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
悪性腫瘍を治療するための方法において、治療を必要とする患者または動物に、異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドをｔＲＮＡ  ５０〜１００ｍｇの有効量で全身投与することを特徴とする、悪性腫瘍を治療するための方法。
【請求項１４】
治療すべき腫瘍を有する腫瘍細胞との複合体の形でｔＲＮＡを投与する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１０５〜１０８腫瘍細胞とｔＲＮＡ  ５０〜１００ｍｇとから成るｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートされた混合物を、全身的に１回または数回投与する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性腫瘍を治療するための薬剤としての異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドに関する。さらに、本発明は、悪性腫瘍治療用医薬を製造するための、前記異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドの使用に関する。
背景技術
６０年代の終わりから７０年代の初めにおいて、移植研究の分野で、異種ヘテロ遺伝子核酸を用いて予め処理された組織または弱い抗原が、種々の免疫学的試験法において、本質的に高い抗体価（Antititer）を示すことが見出された。これらの結果は、いくらかの異なる抗原を用いてのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験およびｉｎ  ｖｉｖｏ試験で、さらに確認された。しかしながら、異種由来の核酸および特にオリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドが、悪性腫瘍の治療に適しているかもしれないということに関する示唆は存在しなかった。
【０００２】
特に、米国においては、同時期に、定義されたような合成ポリヌクレオチドおよびオリゴリボヌクレオチド、特にリボヌクレオチドを用いての試験がおこなわれたが、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの高い毒性の理由からさらに追求されることはなかった。
【０００３】
したがって、本発明の課題は、悪性腫瘍の治療に適した医薬を製造することである。本発明の範囲内での悪性腫瘍とは、悪性の皮膚障害（maligne Hauterkrankungen）を含まない。
【０００４】
この課題は、本発明によれば、作用物質として異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドを、好ましくは、治療すべき腫瘍細胞との複合体（Konjugate）形で含有する、悪性腫瘍を治療するための医薬を製造するための方法によって解決される。
【０００５】
本発明の範囲内において異種（遺伝子）（xonogen）とは、治療すべき生物以外の生物に由来するリボ核酸を意味し、したがって、治療すべき生物には由来しないオリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドを用いて医薬を製造する。好ましくは、本発明で使用される異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドは、動物細胞（たとえば、ウシ組織、ウシ胎児組織）、植物および単細胞、特に、酵母細胞（特に、サッカロミセス  セレビジエ）由来のものである。好ましくは、治療すべき生物に対して、可能な限り発生歴史学的に（entwicklugsgeschichtlich）遠く離れた生物に由来するオリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドを使用する。したがって、ヒト医薬の場合には、動物組織または特に好ましくは、植物または単細胞、たとえば、酵母からのＲＮＡを使用する。
【０００６】
本発明によって使用されるオリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドは、無毒であり、かつそれ単独では抗原ではない。
【０００７】
全−ＲＮＡの調製物およびその塩およびその化合物を、効果的に使用することができる。特にｔＲＮＡが好ましい。本発明で使用されるＲＮＡｓの製造方法としては、殊に、フェノール抽出が好ましく、特に、本明細書中において方法ＩおよびＩＩとして記載された方法が好ましい。
【０００８】
さらに、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質と結合した異種リボ核酸（ＲＮＡ）が、その抗原性を有することが見出された。これらの観察に基づいて、該当する患者の腫瘍組織を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏならびにｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異種ＲＮＡを用いて処理した。特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで異種ＲＮＡ、好ましくはｔＲＮＡを用いて、患者の腫瘍組織の細胞の処理をおこなった。その後に、この混合物を、患者に対して全身投与をおこなった。表面的悪性腫瘍の場合は、ＲＮＡをさらに、適した生薬（ガレヌス製剤）の形で局所的に使用することができる。
【０００９】
異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドを用いてのヒトへの治療に加えて、本発明は同様に、温血動物、たとえばウマ、ウシ、ヒツジ等を治療することができる。
【００１０】
本発明は、さらに以下の実施例および試験によって説明される。
実施例
例１
本発明で使用されるオリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドの製造
関連文献には、核酸、ヌクレオチドおよびヌクレオシドを製造するための多くの方法が記載されているが、この場合、これらは、それぞれ当業者に公知である。わずかに改変が加えられたフェノール抽出法に基づく２種の方法は、本明細書中においては、好ましくは、全−ＲＮＡを製造するために方法Ｉ（Georgiev, G. P. und Mantieva, V.L., Biochem. Biophys. Acta 61, 153 (1962)）を、かつ、ｔＲＮＡを製造するために方法ＩＩ（Bauer, S. et al., Biotechnology and bioengineering 15, 1081 (1973)）を使用する。双方の方法は、大量抽出に有用である。
方法Ｉ
ビール酵母（サッカロミセス  セレビジエ）１５％懸濁液を、バッファー（Ａ）［０．００１Ｍ  ＥＤＴＡ、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ５〜６、２５％スクロース、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、０．３％Ｎａ−デスオキシコレート］中で、ワーリングブレンダーで、１０℃で、３０００ＵＰＭで、３分間に亘ってホモジネートした。このホモジネートに、同量の溶液（Ｂ）［バッファー（Ａ）中の８０％再結晶フェノール、０．１％  ８−ヒドロキシキノリン、１．２％  ジエチルピロカーボネート］を添加し、その後に、６０℃で３０分に亘ってゆっくりと撹拌した。すべてのバッファー溶液は、脱イオン水で製造されており、この場合、これらは、予めベントナイトに通されたものである。その後に、フェノール添加ホモジネートを、室温、約２０℃で、１５分に亘って、１００００ｇで遠心分離をおこなった。この水相を取り出し、フェノール相および中間相を排除した。この水相に、溶剤（Ｂ）とクロロホルム−イソアミルアルコール（９６：４）との混合物を１：１で同量で添加し、前記のようにして抽出した。この水相を、半量のジエチルエーテルで３回に亘ってシェイクし、残りのフェノールを除去した。この溶剤に２％酢酸ナトリウムを添加し、かつＲＮＡを２．５容量の無水エタノールで沈殿させた。
【００１１】
沈殿させたＲＮＡを、０℃で、５０００ＵＰＭで遠心分離し、かつ、氷冷した０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー  ｐＨ７．０および０．００１Ｍ  ＭｇＣｌ２中に入れた。場合によるＤＮＡの分解のために、溶剤に、電気泳動法により精製された膵臓ＤＮａｓｅ（４μｇ／ｍｌ）を添加し、かつ、２２℃で３時間に亘ってインキュベートした。その後に、タンパク質残留物、この場合、ＤｎａｓｅおよびＲｎａｓｅを、プロナーゼ（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、３７℃で３時間に亘って消化させた。この時間中に、プロナーゼもまた自己消化によって分解された。このＲＮＡ−溶液を、前記に示したように溶液（Ｂ）を用いて、６０℃で２０分に亘って、穏やかに撹拌しながら抽出し、相を遠心分離し、この水相を取り出し、ジエチルエーテルで洗浄した。酢酸ナトリウムを添加した後に（最終濃度２％）、ＲＮＡを２．５容量のエタノールで沈殿させ、かつ遠心分離した。沈殿物を冷却した２％酢酸ナトリウム中に入れ、２．５容量のエチルアルコールで沈殿させ、かつ、一晩に亘って、−２０℃でアルコール混合物中で放置した。その後に、沈殿物を遠心分離により取り出し、７５％エタノールで２回、無水アルコールで２回、さらにジエチルエーテルで２回洗浄した。加温箱中で乾燥させた後に、ルーズな乾燥したＲＮＡが得られ、この場合、これらは、室温で、遮光ガラス容器中で保存した。
方法ＩＩ
これらの方法は、さらに多量の酵母量での抽出の（ｋｇ量）。
【００１２】
与えられた質量の酵母を、４倍量のバッファー（Ａ）（方法Ｉと同様）中で、低温室でホモジネートした。このホモジネートに、４０％体積／体積のフェノール溶液（Ｂ）および５％質量／体積の脱イオン水から成るアイスキューブを添加し、かつ３０分に亘って撹拌した。この上清を吸い出し、さらに２回に亘って、方法Ｉで記載されたようにフェノール抽出した。これらの水性上清を容器に捕集し、この容器中には、捕集された上清の半分の体積に相当するＤＥＡＥ−セルロース−膨潤体（Aufschwemmung）（約１０％質量／体積  Ｗｈａｔｍａｎ  ＤＥ−２２）が装填されていた。ＤＥＡＥ膨潤体は、懸濁液中で３０分に亘って撹拌しながら保持された。その後に、ＤＥＡＥを１時間に亘って沈殿させた。上清を吸引除去した。その間に、中間相およびフェノール相は、さらに溶液（Ｃ）のアリコート（８３％  脱イオン水、１５％質量／体積のアイスキューブ、２％  Ｍｇ−アセテート−濃縮物［０．２５メルカプトエタノール中０．５Ｍ  Ｍｇ−アセテート］）を用いて２回、３０分に亘ってゆっくりと撹拌し、その後に７０〜８０分に亘って分離させた。得られる水性上清を、ＤＥＡＥを含む容器に移し、さらに撹拌し、沈殿させた。上清を吸引除去し、かつ、ＤＥＡＥを前記に示したように、最初に溶剤Ｃで２回に亘って、その後に溶剤（Ｄ）（２容量のＭｇ−アセテート濃縮物、２容量のＮａＣｌ−濃縮物［水中３．７５Ｍ  ＮａＣｌ］、０．２容量のＴｒｉｓ−ＨＣｌ  濃縮物［２．５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５  水中、９６容量の水］）でさらにもう１回洗浄した。
【００１３】
その後にＤＥＡＥ−セルロースをカラム中に装填し、この場合、塔底部は閉じられていた。すべての他の工程は、低温室で４℃でおこなった。カラムを、カラム容積量の１２容量の溶剤（Ｄ）で、流量１．４ｌ／ｈ（単に重力による）で洗浄した。その後に、ｔＲＮＡを溶剤Ｅ［２容量のＭｇ−アセテート−濃縮物、０．２容量のＴｒｉｓ−ＨＣｌ−濃縮物、１４容量のＮａ−Ｃｌ濃縮物および８４容量の水、最終濃度０．５２５ＭのＮａＣｌ］を用いて、３ｌ／ｈの流れで溶離させた。Ａ２６０ｎｍ  ３５単位／ｍｌ以上を有する画分を一つにまとめ、かつ１．５容量のエタノールで沈殿させた。他のプロセスは方法Ｉと同様である。
【００１４】
二者択一的に、水中に最終的な沈殿物を装入し、かつ凍結乾燥させてもよい。
【００１５】
これらの方法の改法は、出発材料の通常のフェノール抽出である：この場合、これは、上相からの粗−ｔＲＮＡをイソプロパノールで沈殿させる。沈殿物は、遠心分離後に、酢酸ナトリウムバッファーを用いて抽出し、かつ、ＤＥＡＥ−セルロース上でクロマトグラフィーをおこなった。溶離は、酢酸ナトリウム／塩化ナトリウム−勾配を用いておこない、この場合、これは、当業者に公知である。前記に示したような適した画分は、比率測定により定め一つにまとめた。ｔＲＮＡをエタノールで沈殿させ、前記に示したように沈殿物を取り出し、好ましくは凍結乾燥させた。
【００１６】
以下の試験は、全−ＲＮＡおよびｔＲＮＡの純度を試験し、かつ特徴付けのためにおこなった：
タンパク質は、Ｌｏｗｒｙ，Ｏ．Ｈ．ら（J. Biol. Chem. 193, 265 (1951)）にしたがって、かつ、
【００１７】
【化１】
2004536833.tif 000002
で、ＤＮＡはＤｉｓｃｈｅ（Mikrochemie 8,4 (1930)）、全−ＲＮＡはＭｅｊｂａｕｍ（Physiol. Chem. 258, 117 (1939)）、ｔＲＮＡおよびアミノ酸取り込みの定量的測定はＳｐｒｉｎｚｌおよびＳｔｅｒｎｂａｃｈ（Methods in Enzymology 59, 182 (1979)）、毒性試験はＭ．Ｍｏｅｌｄｎｅｒ（persoenliche Mitteilung）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発熱物質不含性はＤＡＢ１９９７（LAL-test）およびｉｎ  ｖｉｖｏではＰｈ．Ｅｕｒ．／ＤＡＢ  １９９７にしたがって測定した。
試験結果：
（全−ＲＮＡおよびｔＲＮＡの特性／性質、１０個の検体からの平均値）
吸光度
【００１８】
【化２】
2004536833.tif 000003
【００１９】
【化３】
2004536833.tif 000004
種々の全−ＲＮＡおよびｔＲＮＡｓの値と一致する。
ＵＶおよびＩＲスペクトル
ＵＶおよびＩＲ−スペクトルは、生物学的物質に応じて、同一ではないがほぼ同様に変化した。
分子量
酵母からの全−ＲＮＡおよびｔＲＮＡ
【００２０】
【化４】
2004536833.tif 000005
種々の標本により異なる。
タンパク質                ＤＮＡ（全内容物）
２．３％                  不含  全−ＲＮＡサッカロミセス  セレビジエ
１．９％                  不含  ｔＲＮＡ  サッカロミセス  セレビジエ
０．９％                  不含  全−ＲＮＡウシ由来
平均してそれぞれ通常の質である。過度に高い費用を費やして改善された純度であっても、顕著な治療的効果をもたらすことはなかった。
ｔＲＮＡによるアミノ酸の取り込み、１０個の試験体による平均値
Ｌｙｓｉｎ  ６９−８５      ｐＭｏｌ／Ａ２６０  単位
Ｐｈｅ      ４１−５５
Ｓｅｒ      ３９−５０
Ｖａｌ      ７７−９０
これらの平均値は、酵母の異なるロットで、記載の範囲内で異なる。
毒性
マウスにおける急性毒性試験
動物：      ＮＭＲＩ  マウス、雄、Ｆａ．Ｊａｎｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｌｒｅｉｃｈ
適用：      尾部静脈での静脈内注射
観察期間：      ２４時間
無作為試験範囲：ｎ＝１０（最も高い濃度で）
試験物質：ａ．ウシ全ＲＮＡ
ｂ．ビール酵母（サッカロミセス  セレビジエ）からのｔＲＮＡ
溶剤：水中０．９％ＮａＣｌ  ｐ．ｉ．
結果：１ｇ／ｋｇ／１０ｍｌの静脈内注射による最大投与量まで、試験動物は２４時間に亘っての観察時間内において、いかなる著しい変化もみられなかった。
発熱物質の不含
Ａ．前記の全−ＲＮＡならびにｔ−ＲＮＡの双方に関する発熱物質の含有については、ＤＡＢ１９９７（ＬＡＬ試験）によるエンドトキシンのｉｎ−ｖｉｔｒｏ試験およびＰｈ．Ｅｕｒ．／ＤＡＢ１９９７によるウサギでの試験を用いて測定された。
１．全−ＲＮＡ
エンドトキシン  スタンダード  ＥＣ５
変形細胞溶解物
表示感度：０．０６ＥＵ／ｍｌ
実測感度：０．０６ＥＵ／ｍｌ
試験溶液：水−ＬＡＬ中に溶解された１００ｍｇのＲＮＡ（０．５％）
結果：０．５％試験溶液のエンドトキシン含量  水−ＬＡＬで１：５希釈＜０．０３ＥＵ／ｍｌ
２．ｔＲＮＡ
エンドトキシン  スタンダード  ＥＣ５
変形細胞溶解物
表示感度：０．０６ＥＵ／ｍｌ
実測感度：０．０６ＥＵ／ｍｌ
試験溶液：水−ＬＡＬ  ２０ｍｌ中に溶解されたＲＮＡ  １００ｍｇ（０．５％）
結果：０．５％試験溶液のエンドトキシン含量  水−ＬＡＬで１：１０で希釈：＜０．０３ＥＵ／ｍｌ。
Ｂ．ＤＡＢ／Ｐｈ．Ｅｕｂ．，Ｓｔａｎｄ  ２０００による発熱物質の不含に関するｉｎ  ｖｉｖｏ試験
１．全−ＲＮＡ
試験溶液：発熱物質不含の水ｐ．ｉ中の１％試験物質
投与：１．０ｍｌ／動物
動物：３個体のウサギ  ＤＡＢ／Ｐｈ．Ｅｕｂ．，Ｓｔａｎｄ２０００による
結果：
３個体のウサギにおける温度差の合計は１．０５℃であり、したがって、発熱物質は検出されなかった。
２．ｔＲＮＡ
試験溶液：発熱物質不含の水ｐ．ｉ．中の１％試験物質
投与量：１．０ｍｌ／動物
動物：６個体のウサギ２群  ＤＡＢ／Ｐｈ．Ｅｕｂ．，Ｓｔａｎｄ２０００による
結果：
ａ．６個体のウザギにおける温度差の合計：１．０２℃
ｂ．６個体のウサギにおける温度差の合計：１．０６℃
発熱物質は検出されなかった。
実施例２
本発明の物質の腫瘍に対する有効性試験
種々の癌を患う１０人の患者を処置したが、これらの患者の体には多くの転移が生じており、もはや化学療法に反応せず、生存期間は数週間であると診療にあたった腫瘍学者により判断されているものであって、約３０分に亘ってインキュベーションされたｔＲＮＡ／腫瘍細胞−複合体を用いて、６ｘ１０６腫瘍細胞と一緒に５０〜１００ｍｇ  ｔＲＮＡを、全身的に、１４日間内に２回に亘って投与した。
【００２１】
患者の一人は、これらの治療の後に、さらに数週間に亘って、弱い化学療法を補助的におこなった。ほぼ２年の後に、この患者はその病原とは無関係に死亡した。
【００２２】
他の治療を受けたすべての患者は、化学療法なしで＞１〜２年生存し、その際、副作用の発症なく良好な生命の質を有していた。
【００２３】
これらの結果が、患者へのＲＮＡの使用であることは明らかであり、特に、これは、もはや化学療法を必要とせず、独力であって、かつ、その延命期間において、いかなる副作用または毒性の発現も観察されなかった。
【国際公開パンフレット】
2004536833.tif 000006
2004536833.tif 000007
2004536833.tif 000008
2004536833.tif 000009
2004536833.tif 000010
2004536833.tif 000011
2004536833.tif 000012
2004536833.tif 000013
2004536833.tif 000014
2004536833.tif 000015
2004536833.tif 000016
2004536833.tif 000017
2004536833.tif 000018
2004536833.tif 000019
2004536833.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成15年4月1日(2003.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
悪性皮膚疾病を除く悪性腫瘍を治療するための医薬の製造方法において、
異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドを全身投与可能な形にすることを特徴とする、悪性皮膚疾病を除く悪性腫瘍を治療するための医薬の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
悪性皮膚疾病を除く悪性腫瘍を治療するための、異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドの使用。
【手続補正３】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１３】
悪性皮膚疾病を除く悪性腫瘍を治療するための方法において、治療を必要とする患者または動物に、異種オリゴリボヌクレオチドおよび／またはポリリボヌクレオチドをｔＲＮＡ  ５０〜１００ｍｇの有効量で全身投与することを特徴とする、悪性皮膚疾病を除く悪性腫瘍を治療するための方法。
【国際調査報告】
2004536833.tif 000021
2004536833.tif 000022
2004536833.tif 000023
2004536833.tif 000024
2004536833.tif 000025
2004536833.tif 000026