(57)【要約】本発明は、式Ｉ【化１】2004508360.tif 000065式中、Ｙは、【化２】2004508360.tif 000066または【化３】2004508360.tif 000067であり、Ａｒ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、前に定義した通りである、で表される化合物およびこれらの塩および溶媒和化合物、並びにＮＨＥ−３阻害剤としてのこれらの使用に関する。
2004508360.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ
【化１】
2004508360.tif 000061
式中、
Ｙは、
【化２】
2004508360.tif 000062
であり、
Ａｒは、フェニルまたはナフチルであり、この各々は、非置換またはＲ３および／またはＲ４により一置換されており、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、各々、互いに独立して、Ｈ、Ａ、ＯＡ、Ｈａｌ、ＣＦ３、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＨＡ、ＮＡ２、ＮＨ−ＣＯ−Ａ、ＮＨ−ＣＯ−Ｐｈ、ＳＡ、ＳＯ−Ａ、ＳＯ２−Ａ、ＳＯ２−Ｐｈ、ＣＮ、ＯＣＦ３、ＣＯ−Ａ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ａ、ＣＯ−ＮＨ２、ＣＯ−ＮＨＡ、ＣＯ−ＮＡ２、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＡ、ＳＯ２ＮＡ２、または非置換若しくはＡ、ＯＡ、ＨａｌまたはＣＦ３により一置換または多置換されているフェニルであり、
Ａは、１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有するアルキルであり、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、各々、互いに独立して、Ｈ、Ａ、または非置換若しくはＡ、ＯＡ、ＨａｌまたはＣＦ３により一置換または多置換されているフェニルであり、ここで、Ｒ５およびＲ７、Ｒ５およびＲ６、並びにＲ７およびＲ８は、５〜７員環を形成することができる、
で表されるが、ただし、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が、同時にＨであり、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のいずれも、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＨＡ、ＮＡ２、ＮＨ−ＣＯ−Ａ、ＮＨ−ＣＯ−Ｐｈ、ＳＡ、ＳＯ−Ａ、ＳＯ２−Ａ、ＳＯ２−Ｐｈ、ＣＮ、ＯＣＦ３、ＣＯ−Ａ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ａ、ＣＯ−ＮＨ２、ＣＯ−ＮＨＡ、ＣＯ−ＮＡ２、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＡ、ＳＯ２ＮＡ２、または非置換若しくはＡ、ＯＡ、ＨａｌまたはＣＦ３により一置換または多置換されているフェニルではない化合物を除く、化合物並びにこれらの塩および溶媒和化合物。
【請求項２】
ＮＨＥ−３阻害剤としての、請求項１の式Ｉで表される化合物並びにこれらの塩および溶媒和化合物。
【請求項３】
疾患への対抗において用いるための、請求項１の式Ｉで表される化合物並びにこれらの生理学的に許容し得る塩または溶媒和化合物。
【請求項４】
請求項１の式Ｉで表される化合物および／またはこれらの生理学的に許容し得る塩若しくは溶媒和化合物の、医薬の製造のための使用。
【請求項５】
請求項１の式Ｉで表される化合物並びにこれらの生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和化合物の、高血圧、血栓症、心臓、末梢および中枢神経系の虚血状態、並びに発作、末梢器官および四肢の虚血状態の治療、並びにショック状態の治療のための医薬の製造のための使用。
【請求項６】
請求項１の式Ｉで表される化合物並びにこれらの生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和化合物の、外科的手術および器官移植において用いるための、並びに外科的手段のための移植片の保存および貯蔵のための医薬の製造のための使用。
【請求項７】
請求項１の式Ｉで表される化合物並びにこれらの生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和化合物の、細胞増殖が一次的または二次的原因を示す疾患の治療のための、脂肪代謝の障害または妨害された呼吸欲動の治療または予防のための医薬の製造のための使用。
【請求項８】
請求項１の式Ｉで表される化合物並びにこれらの生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和化合物の、腎性虚血、虚血性腸疾患の治療のための、または急性または慢性腎疾患の予防のための医薬の製造のための使用。
【請求項９】
請求項１の式Ｉで表される化合物並びにこれらの生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和化合物の、細菌性および寄生虫性疾患の治療のための医薬の製造のための使用。
【請求項１０】
請求項１に記載の少なくとも１種のＮＨＥ−３阻害剤および／またはこの生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和化合物の１種を含むことを特徴とする、医薬製剤。
【請求項１１】
化合物Ｉ１〜Ｉ１０：
Ｎ−（６−クロロ−４−フェニルキナゾリン−２−イル）−Ｎ’−メチルグアニジン　Ｉ１
Ｎ−（６−クロロ−４−ｐ−トリルキナゾリン−２−イル）−Ｎ’−メチルグアニジン　Ｉ２
Ｎ−［６−クロロ−４−（２−ニトロフェニル）キナゾリン−２−イル］−Ｎ’−メチルグアニジン　Ｉ３
Ｎ−［４−（２−アミノフェニル）−６−クロロキナゾリン−２−イル］−Ｎ’−メチルグアニジン　Ｉ４
Ｎ−［６−クロロ−４−（４−メチル−２−ニトロフェニル）キナゾリン−２−イル］−Ｎ’−メチルグアニジン　Ｉ５
Ｎ−［４−（２−アミノ−４−メチルフェニル）−６−クロロキナゾリン−２−イル］−Ｎ’−メチルグアニジン　Ｉ６
Ｎ−［６−クロロ−４−（２−ニトロフェニル）キナゾリン−２−イル］グアニジン　Ｉ７
Ｎ−［４−（２−アミノフェニル）−６−クロロキナゾリン−２−イル］グアニジン　Ｉ８
Ｎ−［６−クロロ−４−（４−メチル−２−ニトロフェニル）キナゾリン−２−イル］グアニジン　Ｉ９
Ｎ−［４−（２−アミノ−４−メチルフェニル）−６−クロロキナゾリン−２−イル］グアニジン　Ｉ１０
からなる群から選択された化合物並びにこれらの塩および溶媒和化合物。
【請求項１２】
医薬活性成分としての、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
式Ｉで表される２−グアニジノ−４−アリールキナゾリン並びにこれらの塩および溶媒和化合物の製造方法であって、
（ａ）式ＩＩ
【化３】
2004508360.tif 000063
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＡｒは、前に定義した通りである、
で表される化合物を、１−シアノグアニジンまたは、式ＮＣ−Ｙ、式中、Ｙが請求項１において定義した通りである、で表される対応してＮ−アルキル化された、またはＮ−アリール化されたシアノグアニジンと反応させるか、または
（ｂ）式ＮＣ−Ｙで表される化合物の代わりに、式ＩＩＩ
ＨＮ＝ＣＸ−Ｙ　　　ＩＩＩ
式中、Ｘは、−Ｓ−ａｌｋｙｌ、−Ｓ−ａｒｙｌ、−Ｏ−ａｌｋｙｌまたは−Ｏ−ａｒｙｌである、
で表される化合物を、式ＩＩで表される化合物と反応させるか、または
（ｃ）式ＩＶ
【化４】
2004508360.tif 000064
式中、Ａｒ、Ｒ１およびＲ２は、請求項１において定義した通りである、
で表される２−クロロ−４−アリールキナゾリンを、式ＨＹ、式中、Ｙが請求項１において定義した通りである、で表される化合物と反応させ、
および随意に、工程（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の後に、式Ｉで表される塩基性または酸性化合物を、この塩または溶媒和化合物の１種に、酸または塩基で処理することにより変換することを特徴とする、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、式Ｉ
【化５】
2004508360.tif 000003
式中、
Ｙは、
【化６】
2004508360.tif 000004
であり、
【０００２】
Ａｒは、フェニルまたはナフチルであり、この各々は、非置換またはＲ３および／またはＲ４により一置換されており、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、各々、互いに独立して、Ｈ、Ａ、ＯＡ、Ｈａｌ、ＣＦ３、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＨＡ、ＮＡ２、ＮＨ−ＣＯ−Ａ、ＮＨ−ＣＯ−Ｐｈ、ＳＡ、ＳＯ−Ａ、ＳＯ２−Ａ、ＳＯ２−Ｐｈ、ＣＮ、ＯＣＦ３、ＣＯ−Ａ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ａ、ＣＯ−ＮＨ２、ＣＯ−ＮＨＡ、ＣＯ−ＮＡ２、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＡ、ＳＯ２ＮＡ２、または非置換若しくはＡ、ＯＡ、ＨａｌまたはＣＦ３により一置換または多置換されているフェニルであり、
【０００３】
Ａは、１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有するアルキルであり、
Ｈａｌは、Ｆ、Ｃｌ、ＢｒまたはＩであり、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、各々、互いに独立して、Ｈ、Ａまたは非置換若しくはＡ、ＯＡ、ＨａｌまたはＣＦ３により一置換または多置換されているフェニルであり、
ここで、Ｒ５およびＲ７、Ｒ５およびＲ６、並びにＲ７およびＲ８は、５〜７員環を形成することができる、
【０００４】
で表されるが、ただし、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が、同時にＨであり、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のいずれも、ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＨＡ、ＮＡ２、ＮＨ−ＣＯ−Ａ、ＮＨ−ＣＯ−Ｐｈ、ＳＡ、ＳＯ−Ａ、ＳＯ２−Ａ、ＳＯ２−Ｐｈ、ＣＮ、ＯＣＦ３、ＣＯ−Ａ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ａ、ＣＯ−ＮＨ２、ＣＯ−ＮＨＡ、ＣＯ−ＮＡ２、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＡ、ＳＯ２ＮＡ２、または非置換若しくはＡ、ＯＡ、ＨａｌまたはＣＦ３により一置換または多置換されているフェニルではない化合物を除く、化合物並びにこれらの塩および溶媒和化合物に関する。
【０００５】
本発明は、同様に、ＮＨＥ−３阻害剤としての、式Ｉで表される化合物並びにこれらの塩および溶媒和化合物の使用に関する。
【０００６】
ナトリウム／プロトン交換体サブタイプ３の他の阻害剤は、すでに、例えばＥＰ ０ ８２５ １７８中に記載されている。
ただし書きにより除かれた化合物は、すでに、他の目的へのこれらの使用を備えるように、ＵＳ ３，１３１，１８７中に記載されている。
キナゾリニルグアニジン誘導体は、Ｖ．Ｉ． Ｓｈｖｅｄｏｖ ｅｔ ａｌ．によりＰｈａｒｍ． Ｃｈｅｍ． Ｊ． （英訳）１９８０， １４， ５３２−５３８またはＫｈｉｍ． Ｆａｒｍ． Ｚｈ． １９８０， １４， ３８−４３中に、およびＳ．Ｃ． Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．によりＪ． Ｍｅｄ． Ｐｈａｒｍ． Ｃｈｅｍ． １９６２， ５， ６３−６９中に記載された。
【０００７】
本発明は、価値ある特性を有する新規な化合物、特に医薬の製造に用いることができる化合物を見出すことを目的とした。
驚くべきことに、式Ｉで表される化合物およびこれらの塩は、良好に許容され、ナトリウム／プロトン交換体サブタイプ３を阻害することが見出された。
式Ｉで表される化合物を、ヒト医学および獣医学において、医薬活性成分として用いることができる。
【０００８】
Ｎａ＋／Ｈ＋交換体は、少なくとも６種の異なるアイソフォーム（ＮＨＥ−１〜ＮＨＥ−６）を有し、これらすべてが、すでにクローン化されているファミリーを示すことは、知られている。サブタイプＮＨＥ−１が、体中のすべての組織中に遍在して分布する一方、他のＮＨＥサブタイプは、特定の器官中、例えば腎臓中または小腸の管腔壁および反管腔（ｃｏｎｔｒａｌｕｍｉｎａｌ）壁中に、選択的に発現される。この分布は、種々のアイソフォームが作用する特定の機能、即ち一方で細胞内ｐＨおよび細胞容積のサブタイプＮＨＥ−１による調節および、他方で腸および腎臓におけるアイソフォームＮＨＥ−２およびＮＨＥ−３によるＮａ＋吸収および再吸収を反映する。アイソフォームＮＨＥ−４は、原則的に胃において見出された。ＮＨＥ−５の発現は、脳および神経組織に制限される。ＮＨＥ−６は、ミトコンドリア中のナトリウム／プロトン交換体を形成するアイソフォームである。
【０００９】
アイソフォームＮＨＥ−３は、特に、近位の腎臓の細管の先端の膜において発現される；従って、ＮＨＥ−３阻害剤は、特に、腎臓における保護的作用を奏する。
【００１０】
ＮＨＥ−３アイソフォームのための選択的阻害剤の治療的使用は、種々である。ＮＨＥ−３阻害剤は、腎性虚血の間、または腎臓輸送の間の腎臓の除去、輸送および再灌流の間の場合であるように、病態生理学的低酸素症の後の組織損傷および細胞壊死並びに、ＮＨＥ活性の活性化の結果生じる虚血事象を阻害または低減する。式Ｉで表される化合物は、これらが、ナトリウムおよび水の、酸素が供給不足である器官の細胞中への過剰の吸収を防止するため、細胞保護作用を有する。
【００１１】
式Ｉで表される化合物は、降圧作用を有し、高血圧の治療のための医薬活性成分として適する。これらは、さらに、利尿薬として適する。
式Ｉで表される化合物は、単独で、または他のサブタイプ特異性のＮＨＥ阻害剤と組み合わせて、抗虚血作用を有し、血栓症、アテローム硬化症、血管痙攣の場合において、手術前および手術中の器官、例えば腎臓および肝臓の保護のために、および慢性または急性腎臓損傷の場合において、用いることができる。
【００１２】
これらは、さらに、発作、脳水腫、神経系の虚血、ショックの種々の形態、例えばアレルギー性、心臓学的、循環血液量減少関連または細菌性ショックの治療のために、および例えば以下の状態：中枢性睡眠時無呼吸、コット死、術後低酸素症および他の呼吸障害における呼吸欲動を改善するために、用いることができる。
【００１３】
カルボアンヒドラーゼ（ｃａｒｂｏａｎｈｙｄｒａｓｅ）阻害剤と組み合わせることにより、呼吸活性を、さらに改善することができる。
式Ｉで表される化合物は、細胞の増殖、例えば線維芽細胞増殖および平滑筋細胞の増殖に対する阻害効果を有し、従って細胞増殖が一次的または二次的要因である疾患の治療のために用いることができる。
式Ｉで表される化合物は、糖尿病、癌疾患、線維症性疾患、内皮機能障害、器官肥大および過形成、特に前立腺過形成または前立腺肥大の遅延された合併症に対して、用いることができる。
【００１４】
これらは、さらに、高血圧、アテローム硬化症、糖尿病および増殖性疾患のある形態の決定および区別のための診断剤として適する。
式Ｉで表される化合物はまた、血清リポタンパク質のレベルに対する有利な効果を有するため、これらを、単独で、または他の医薬と組み合わせて、増大した血液脂肪レベルの治療に用いることができる。
【００１５】
本発明は、請求項１の式Ｉで表される化合物並びにこれらの生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和化合物の、血栓症、心臓、末梢および中枢神経系の虚血状態および発作、末梢器官および四肢の虚血状態の治療のため、およびショック状態の治療のための医薬の製造のための使用に関する。
【００１６】
本発明は、さらに、請求項１の式Ｉで表される化合物並びにこれらの生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和化合物の、外科的手術および器官移植において用いるための、並びに外科的手段のための移植片の保存および貯蔵のための医薬の製造のための使用に関する。
【００１７】
本発明はまた、請求項１の式Ｉで表される化合物並びにこれらの生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和化合物の、細胞増殖が一次的または二次的原因である疾患の治療のための、脂肪代謝の障害または妨害された呼吸欲動の治療または予防のための医薬の製造のための使用に関する。
【００１８】
本発明は、さらに、請求項１の式Ｉで表される化合物並びにこれらの生理学的に許容し得る塩および／または溶媒和化合物の、腎性虚血、虚血性腸疾患の治療のための、または急性または慢性腎疾患の予防のための医薬の製造のための使用に関する。
【００１９】
ナトリウム／プロトン交換体サブタイプ３を阻害する物質の同定のための方法は、例えば、ＵＳ ５，８７１，９１９に記載されている。
式Ｉで表される化合物は、さらに、細菌性および寄生虫性疾患の治療に適する。
【００２０】
再三出てくる式Ｉで表される化合物中のすべての基、例えばＡについて、これらの意味は、互いに独立している。
水和物との用語は、例えば、１／２水塩、一水塩または二水塩を意味するものとされ、溶媒和化合物との用語は、例えば、アルコール付加化合物、例えばメタノールまたはエタノールを含むことを意味するものとされる。
【００２１】
前述の式において、Ａは、アルキルであり、直鎖状または分枝状であり、１、２、３、４、５または６個の炭素原子を有する。Ａは、好ましくは、メチル、さらにエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチルまたはｔｅｒｔ−ブチル、さらにまたペンチル、１−、２−または３−メチルブチル、１，１−、１，２−または２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、１−、２−、３−または４−メチルペンチル、１，１−、１，２−、１，３−、２，２−、２，３−または３，３−ジメチルブチル、１−または２−エチルブチル、１−エチル−１−メチルプロピル、１−エチル−２−メチルプロピル、あるいは１，１，２−または１，２，２−トリメチルプロピルである。
【００２２】
ＯＡは、好ましくは、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシまたはブトキシである。
Ｈａｌは、好ましくは、Ｆ、ＣｌまたはＢｒ、さらにＩ、特にＦ、ＣｌまたはＢｒである。
本明細書中、Ｐｈは、他に述べない限り、非置換フェニル基である。
【００２３】
Ａｒは、好ましくは、非置換フェニルまたはナフチル、さらに好ましくは、例えばＡ、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシまたはＣＦ３により一置換されたフェニルまたはナフチルである。Ａｒは、特に好ましくは、非置換あるいは、Ａ、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシまたはＣＦ３により一置換されているフェニルである。
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、好ましくは、前に定義したように、同時にＨであるか、あるいは、互いに独立して、ＨまたはＡである。
【００２４】
Ｒ５およびＲ７が、一緒に環を形成する場合には、Ｙは、好ましくは、以下の構造：
【化７】
2004508360.tif 000005
式中、Ｒ６およびＲ８は、前に定義した通りであり、ｎは、１、２または３、好ましくは１または２である、
の１つを採用する。
【００２５】
Ｒ７およびＲ８が、一緒に環を形成する場合には、Ｙは、好ましくは、以下の構造：
【化８】
2004508360.tif 000006
式中、Ｒ５およびＲ６は、前に定義した通りであり、ｎは、１、２または３、好ましくは１または２である、
の１つを採用する。
【００２６】
Ｒ５およびＲ６が、一緒に環を形成する場合には、Ｙは、好ましくは、以下の構造：
【化９】
2004508360.tif 000007
式中、Ｒ７およびＲ８は、前に定義した通りであり、ｎは、１、２または３、好ましくは１または２である、
の１つを採用する。
【００２７】
従って、本発明は、特に、前述の基の少なくとも１つが、前に示した好ましい意味の１つを有する、式Ｉで表される化合物の使用に関する。化合物のいくつかの好ましい群を、以下の従属式Ｉａ〜Ｉｅにより表すことができ、これは、式Ｉに適合し、ここで、一層詳細には示していない基は、式Ｉにおいて示す意味を有するが、ここで、
【００２８】
Ｉａにおいて、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ＯＡ、ＳＡまたはＨａｌ、特にＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３またはＣＨ３であり；
Ｉｂにおいて、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ＯＡ、ＳＡまたはＨａｌ、特にＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３またはＣＨ３であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｈａｌ、ＯＨ、Ａ、ＮＨ２、ＮＯ２またはＣＮ、特にＨ、Ｃｌ、ＯＨ、ＣＨ３またはＮＨ２であり；
【００２９】
Ｉｃにおいて、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ＯＡ、ＳＡまたはＨａｌ、特にＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３またはＣＨ３であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｈａｌ、ＯＨ、Ａ、ＮＨ２、ＮＯ２またはＣＮ、特にＨ、Ｃｌ、ＯＨ、ＣＨ３またはＮＨ２であり、
Ａｒは、フェニルであり；
Ｉｄにおいて、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ＯＡ、ＳＡまたはＨａｌ、特にＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３またはＣＨ３であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｈａｌ、ＯＨ、Ａ、ＮＨ２、ＮＯ２またはＣＮ、特にＨ、Ｃｌ、ＯＨ、ＣＨ３またはＮＨ２であり、
Ａｒは、フェニルであり、
Ｒ３は、Ｈ、Ａ、ＮＨ２またはＳＡ、特にＨまたはＣＨ３であり；
【００３０】
Ｉｅにおいて、Ｒ１は、Ｈ、ＯＨ、ＯＡ、ＳＡまたはＨａｌ、特にＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３またはＣＨ３であり、
Ｒ２は、Ｈ、Ｈａｌ、ＯＨ、Ａ、ＮＨ２、ＮＯ２またはＣＮ、特にＨ、Ｃｌ、ＯＨ、ＣＨ３またはＮＨ２であり、
Ａｒは、フェニルであり、
Ｒ３は、Ｈ、Ａ、ＮＨ２またはＳＡ、特にＨまたはＣＨ３であり、
Ｒ４は、Ｈ、Ｈａｌ、ＮＨ２またはＮＯ２、特にＨまたはＮＨ２である。
【００３１】
好ましいのは、さらに、Ｒが、同時にＨであり、Ａｒが、フェニルであり、基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４の少なくとも１つが、以下の意味の１つ：ＯＨ、ＮＯ２、ＮＨ２、ＮＨＡ、ＮＡ２、ＮＨ−ＣＯ−Ａ、ＮＨ−ＣＯ−Ｐｈ、ＳＡ、ＳＯ−Ａ、ＳＯ２−Ａ、ＳＯ２−Ｐｈ、ＣＮ、ＯＣＦ３、ＣＯ−Ａ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２Ａ、ＣＯ−ＮＨ２、ＣＯ−ＮＨＡ、ＣＯ−ＮＡ２、ＳＯ２ＮＨ２、ＳＯ２ＮＨＡ、ＳＯ２ＮＡ２、あるいは、非置換であるか、またはＡ、ＯＡ、ＨａｌまたはＣＦ３により一置換または多置換されているフェニルを有する、式Ｉで表される化合物並びにこれらの塩および溶媒和化合物である。これらの化合物の中で、特に好ましいのは、特に６位における基Ｒ１がＣｌである化合物および特に４’位における基Ｒ３がメチルである化合物である。
【００３２】
また、好ましいのは、基Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８が、同時にＨである、式Ｉで表される化合物並びにこれらの塩および溶媒和化合物である。これらの化合物の中で、特に好ましいのは、特に６位における基Ｒ１がＣｌである化合物および特に４’位における基Ｒ３がメチルである化合物および特に２’位における基Ｒ４がＮＨ２である化合物である。
【００３３】
特に４’位における基Ｒ３がメチルである、式Ｉで表される化合物は、ＮＨＥ−３レセプターへの結合の特に顕著な選択性を有する。
特に２’位における基Ｒ４がＮＨ２である、式Ｉで表される化合物は、水性溶液への特に良好な溶解度を示す。
Ｒ１がＨであり、６位におけるＲ２がＣｌであり、４’位におけるＲ３がメチルである、式Ｉで表される化合物が、好ましい。極めて特に好ましいのは、さらに２’位における基Ｒ４がＮＨ２である、式Ｉで表される化合物である。
【００３４】
特に好ましいのは、式Ｉｆ〜Ｉｋで表される化合物である：
【化１０】
2004508360.tif 000008
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＹは、前に定義した通りであり、Ｒ１は、好ましくは、Ｈ、ＯＨ、ＯＡ、ＳＡまたはＦ、特にＨ、ＯＨ、ＯＣＨ３またはＣＨ３である。式Ｉｆ〜ＩｋにおけるＲ１は、極めて特に好ましくはＨである。
【００３５】
Ｒ２は、好ましくは、Ｈ、Ｃｌ、Ａ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＳＣＨ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＨ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３またはＦ、特にＨ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、ＯＨ、ＣＨ３、ＮＯ２またはＮＨ２である。式Ｉｆ〜ＩｋにおけるＲ２は、極めて特に好ましくは、Ｃｌである。
【００３６】
Ｒ３は、好ましくは、Ｈ、Ｃｌ、Ａ、ＮＨ２、ＮＯ２、ＳＣＨ３、ＣＮ、Ｃ２Ｈ５、ＯＣＦ３またはＣ６Ｈ５、特にＨ、ＡまたはＣＨ３である。式Ｉｆ〜ＩｋにおけるＲ３は、極めて特に好ましくは、ＣＨ３である。
Ｒ４は、好ましくは、Ｈ、Ｆ、ＮＨ２またはＮＯ２、特にＨまたはＮＨ２である。式Ｉｆ〜ＩｋにおけるＲ４は、極めて特に好ましくは、ＮＨ２である。
【００３７】
式Ｉｆ〜ＩｋにおけるＹは、前に定義した通りである。ここで、Ｙは、好ましくは、以下の意味の１つを採用する：
【化１１】
2004508360.tif 000009
【００３８】
Ｙは、特に好ましくは、以下の意味の１つを有する：
【化１２】
2004508360.tif 000010
【００３９】
特に好ましいのは、さらに、以下の化合物Ｉ１〜Ｉ１０並びにこれらの塩および溶媒和化合物である：
Ｎ−（６−クロロ−４−フェニルキナゾリン−２−イル）−Ｎ’−メチルグアニジン　Ｉ１
Ｎ−（６−クロロ−４−ｐ−トリルキナゾリン−２−イル）−Ｎ’−メチルグアニジン　Ｉ２
Ｎ−［６−クロロ−４−（２−ニトロフェニル）キナゾリン−２−イル］−Ｎ’−メチルグアニジン　Ｉ３
Ｎ−［４−（２−アミノフェニル）−６−クロロキナゾリン−２−イル］−Ｎ’−メチルグアニジン　Ｉ４
Ｎ−［６−クロロ−４−（４−メチル−２−ニトロフェニル）キナゾリン−２−イル］−Ｎ’−メチルグアニジン　Ｉ５
【００４０】
Ｎ−［４−（２−アミノ−４−メチルフェニル）−６−クロロキナゾリン−２−イル］−Ｎ’−メチルグアニジン　Ｉ６
Ｎ−［６−クロロ−４−（２−ニトロフェニル）キナゾリン−２−イル］グアニジン　Ｉ７
Ｎ−［４−（２−アミノフェニル）−６−クロロキナゾリン−２−イル］グアニジン　Ｉ８
Ｎ−［６−クロロ−４−（４−メチル−２−ニトロフェニル）キナゾリン−２−イル］グアニジン　Ｉ９
Ｎ−［４−（２−アミノ−４−メチルフェニル）−６−クロロキナゾリン−２−イル］グアニジン　Ｉ１０
【００４１】
式Ｉ１〜Ｉ１０で表される化合物の塩酸塩およびｐ−トルエンスルホン酸塩が、極めて特に好ましい。
【００４２】
式Ｉで表される化合物およびまたこれらの製造のための出発物質は、さらに、文献（例えば、Ｈｏｕｂｅｎ−Ｗｅｙｌ， Ｍｅｔｈｏｄｅｎ ｄｅｒ ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ Ｃｈｅｍｉｅ ［有機化学の方法］、Ｇｅｏｒｇ−Ｔｈｉｅｍｅ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ等の標準的学術書）に記載されているようなそれ自体知られている方法により、正確には、知られており、前述の反応に適する反応条件の下で、製造される。また、ここで、それ自体知られているが、本明細書にはより詳細には記載しない変法を用いることができる。
【００４３】
所望により、出発物質をまた、インサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で生成して、これらが、反応混合物から単離されず、代わりに直ちにさらに、式Ｉで表される化合物に変換するようにすることができる。
【００４４】
式Ｉで表される２−グアニジノ−４−アリールキナゾリンは、好ましくは、ｏ−アミノフェニルケトン、例えば、式ＩＩ
【化１３】
2004508360.tif 000011
式中、Ｒ１、Ｒ２およびＡｒは、請求項１において定義した通りである、
で表されるｏ−アミノフェニルケトンを、式ＮＣ−Ｙ、式中、Ｙは、前に定義した通りである、で表される１−シアノグアニジンまたは対応したＮ−アルキル化またはＮ−アリール化された１−シアノグアニジンと反応させることにより、製造する。
反応を、不活性溶媒中で実施することができる。
【００４５】
好適な不活性溶媒の例は、炭化水素、例えばヘキサン、石油エーテル、ベンゼン、トルエンまたはキシレン；塩素化炭化水素、例えばトリクロロエチレン、１，２−ジクロロエタン、テトラクロロメタン、クロロホルムまたはジクロロメタン；アルコール、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−プロパノール、ｎ−ブタノールまたはｔｅｒｔ−ブタノール；エーテル、例えばジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）またはジオキサン；グリコールエーテル、例えばエチレングリコールモノメチルまたはモノエチルエーテル、エチレングリコールジメチルエーテル（ジグリム（ｄｉｇｌｙｍｅ））；ケトン、例えばアセトンまたはブタノン；アミド、例えばアセトアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）；ニトリル、例えばアセトニトリル；スルホキシド、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；二硫化炭素；カルボン酸、例えばギ酸または酢酸；ニトロ化合物、例えばニトロメタンまたはニトロベンゼン；エステル、例えば酢酸エチルあるいは前述の溶媒の混合物である。
【００４６】
ＤＭＦ、水またはアルコールが、好ましく用いられる。
反応を、極めて特に好ましくは、溶媒を用いずに、即ち溶融において、１００〜２００℃の温度において実施する。
【００４７】
有利なのは、酸性触媒、例えば、ＡｌＣｌ３、ＴｉＣｌ４、ｐ−トルエンスルホン酸、ＢＦ３、酢酸、硫酸、シュウ酸、ＰＯＣｌ３または五酸化リンの存在である。
好ましい変法は、すでに塩、例えば塩酸塩として、反応体の１種を用いることを含む。
【００４８】
式Ｉで表される化合物の製造のためのさらに価値ある方法は、式ＮＣ−Ｙで表される化合物の代わりに、式ＩＩＩ
ＨＮ＝ＣＸ−Ｙ　　　ＩＩＩ
式中、
Ｘは、−Ｓ−ａｌｋｙｌ、−Ｓ−ａｒｙｌ、Ｏ−ａｌｋｙｌまたはＯ−ａｒｙｌであり、ａｌｋｙｌは、好ましくは前にＡについて定義した通りであり、ａｒｙｌは、好ましくは前にＡｒについて定義した通りである、
で表される化合物を、式ＩＩで表される化合物と反応させることを含む。
【００４９】
最後に、式Ｉで表される化合物を、式ＩＶ
【化１４】
2004508360.tif 000012
式中、Ａｒ、Ｒ１およびＲ２は、前に定義した通りである、
で表される２−クロロ−４−アリールキナゾリンの、Ｙが前に定義した通りである、式ＨＹで表される化合物との反応により製造することができる。ＨＹは、特に好ましくは、グアニジンである。
【００５０】
式Ｉで表される塩基を、酸を用いて関連する酸付加塩に、例えば等量の塩基および酸の不活性溶媒、例えばエタノール中での反応、続いて蒸発により変換することができる。この反応のために、好適な酸は、特に、生理学的に許容し得る塩を生成する酸である。従って、無機酸、例えば硫酸、硝酸、ハロゲン化水素酸、例えば塩酸または臭化水素酸、リン酸、例えばオルトリン酸、またはスルファミン酸、さらに有機酸、特に脂肪族、脂環式、アラリファティック（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）、芳香族または複素環式一塩基または多塩基カルボン酸、スルホン酸または硫酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、ピバリン酸、ジエチル酢酸、マロン酸、コハク酸、ピメリン酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、クエン酸、グルコン酸、アスコルビン酸、ニコチン酸、イソニコチン酸、メタンまたはエタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンモノおよびジスルホン酸およびラウリル硫酸を用いることができる。生理学的に許容し得ない酸との塩、例えばピクリン酸塩を、式Ｉで表される化合物の単離および／または精製のために用いることができる。
【００５１】
本発明は、さらに、ＮＨＥ−３阻害剤としての式Ｉで表される化合物および／またはこれらの生理学的に許容し得る塩の、医薬製剤の製造への、特に非化学的方法による使用に関する。この場合において、これらを、少なくとも１種の固体、液体および／または半液体補形剤または補助剤と共に、および、所望により、１種または２種以上の他の活性成分と組み合わせて、好適な投与量形態に変換することができる。
【００５２】
本発明はさらに、式Ｉで表される少なくとも１種のＮＨＥ−３阻害剤および／またはこの生理学的に許容し得る塩および溶媒和化合物の１種を含む医薬製剤に関する。
【００５３】
これらの製剤を、ヒト医学または獣医学における医薬として用いることができる。好適な補形剤は、腸内（例えば経口）、非経口または局所的投与に適し、新規な化合物と反応しない有機または無機物質、例えば水、植物油、ベンジルアルコール、アルキレングリコール、ポリエチレングリコール、三酢酸グリセロール、ゼラチン、炭水化物、例えばラクトースまたはデンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはワセリンである。経口投与に好適なものは、特に、錠剤、ピル、被覆錠剤、カプセル、粉末、顆粒、シロップ、果汁またはドロップであり、直腸内投与に好適なのは、座剤であり、非経口投与に好適なのは、溶液、好ましくは油を基剤とする、または水性溶液、さらに懸濁液、エマルジョンまたは移植片であり、局所的適用に好適なのは、軟膏、クリームまたは粉末であり、あるいは経皮的には、パッチにおいてである。
【００５４】
新規な化合物はまた、凍結乾燥することができ、得られた凍結乾燥物を、例えば注入製剤を製造するために用いる。示した製剤を、滅菌することができ、および／または補助剤、例えば潤滑剤、保存剤、安定剤および／または湿潤剤、乳化剤、浸透圧を改変するための塩、緩衝物質、着色剤および調味剤および／または複数の他の活性成分、例えば１種または２種以上のビタミンを含むことができる。
【００５５】
エーロゾルまたはスプレーの形態で投与するのに好適な医薬製剤は、例えば、式Ｉで表される活性成分の、薬学的に許容し得る溶媒中への溶液、懸濁液またはエマルジョンである。
式Ｉで表される化合物およびこれらの生理学的に許容し得る塩および溶媒和化合物を、前に記載した疾患または疾患状態の治療および／または予防に用いることができる。
【００５６】
一般的に、本発明の物質を、好ましくは、投与量単位あたり約０．１〜５００ｍｇ、特に１〜１０ｍｇの用量で投与する。毎日の用量は、好ましくは、約０．００１〜１０ｍｇ／体重１ｋｇである。しかし、各々の患者への特定の用量は、広範囲の因子、例えば用いる特定の化合物の効率、年齢、体重、健康の一般的状態、性別、食物、投与の時間および方法、排出速度、薬学的組み合わせおよび療法を適用する特定の疾患の重篤度に依存する。経口投与が好ましい。
【００５７】
例：
例１：
１．００ｇの２−アミノ−５−クロロ−２’−ニトロベンゾフェノン、０．６０ｇの１−シアノグアニジンおよび２．００ｇのｐ−トルエンスルホン酸一水和物の混合物を、１５０℃で２時間溶融させた。メタノールを、冷却した溶融物に加え、混合物を、６５℃で３０分間かきまぜた。濾過後に得られた残留物を廃棄し、水を、濾液に加えた。溶液を、その後、アルカリ性とし、酢酸エチルで抽出した。抽出物を蒸発させ、アセトニトリルから結晶させ、遊離塩基Ｎ−［６−クロロ−４−（２−ニトロフェニル）キナゾリン−２−イル］グアニジンが得られた。
【００５８】
酸付加塩を形成するために、塩基を、メタノールに溶解し、混合物を、ＨＣｌ含有イソプロパノールを用いて酸性化し、溶媒を、その後除去した。Ｎ−［６−クロロ−４−（２−ニトロフェニル）キナゾリン−２−イル］グアニジニウムクロリドの結晶が、アセトニトリルから得られた。
【００５９】
例２：
１．２０ｇのＮ−（５−メトキシ−４−フェニルキナゾリン−２−イル）グアニジニウムクロリドを、１７０℃で６時間、８．００ｇのピリジニウムクロリドと共にかきまぜた。冷却した溶融物を、その後２０ｍｌのＮａ２Ｓ２Ｏ４溶液で処理した。得られた沈殿物を単離し、メタノールに溶解し、溶液を、ＨＣｌ含有イソプロパノールを用いて酸性化した。溶媒を除去した後、残留物を、アセトニトリルから結晶化し、Ｎ−（５−ヒドロキシ−４−フェニルキナゾリン−２−イル）グアニジニウムクロリド（融点３１０℃）が得られた。
【００６０】
例３：
３．０１ｇの２−アミノ−５−クロロベンゾフェノン、２．５５ｇのＮ−シアノ−Ｎ’−メチルグアニジンおよび７．４２ｇのｐ−トルエンスルホン酸一水和物の混合物を、溶融において１５０〜１６０℃で２時間かきまぜた。メタノールを、冷却した溶融物に加え、混合物を、６５℃で３０分間かきまぜた。濾過後に得られた残留物を廃棄し、水および酢酸エチルを、濾液に加え、混合物を、再び６５℃で３０分間かきまぜた。その後、生成物を、氷浴中でかきまぜながら放置して結晶化し、Ｎ−（６−クロロ−４−フェニルキナゾリン−２−イル）−Ｎ’−メチルグアニジニウムｐ−トルエンスルホネート（融点２６８〜２６９℃）が得られた。
【００６１】
例４：
３００ｍｇのＮ−［６−クロロ−４−（２−ニトロフェニル）キナゾリン−２−イル］グアニジニウムｐ−トルエンスルホネートを、５０ｍｌのメタノールに溶解し、ＲＴで２１時間にわたり、周囲圧で、３００ｍｇのラネーニッケルの圧力の下で水素化した。濾過し、溶媒を除去することにより、Ｎ−［６−クロロ−４−（２−アミノフェニル）キナゾリン−２−イル］グアニジニウムｐ−トルエンスルホネートが、濾液から得られた（融点２５０℃）。
【００６２】
例５：
５ｍｌの酢酸中の０．３５０ｇのＮ−（６−メチルスルファニル−４−フェニルキナゾリン−２−イル）グアニジニウムクロリドおよび０．１４０ｇの過ホウ酸ナトリウム三水和物の混合物を、８０℃で３０分間かきまぜた。この溶液を、その後蒸発させ、水を加えた。水性溶液を、ｐＨ１２に調整し、酢酸エチルで抽出した。抽出物の蒸発により、Ｎ−（６−メタンスルフィニル−４−フェニルキナゾリン−２−イル）グアニジンが、結晶形態で得られた（融点１７５〜１８０℃）。
【００６３】
例６：
５ｍｌの酢酸中の１．２００ｇのＮ−（６−メチルスルファニル−４−フェニルキナゾリン−２−イル）グアニジニウムクロリドおよび０．１５４ｇの過ホウ酸ナトリウム三水和物の混合物を、８０℃で１時間かきまぜた。この反応混合物を、その後蒸発させ、水を加えた。得られた溶液を、ｐＨ１２に調整し、酢酸エチルで抽出した。抽出物の蒸発により、Ｎ−（６−メタンスルホニル−４−フェニルキナゾリン−２−イル）グアニジンが、結晶形態で得られた（融点１８０〜１８５℃）。
酸付加塩を形成するために、０．８０ｇのＮ−（６−メタンスルホニル−４−フェニルキナゾリン−２−イル）グアニジンを、水性１Ｎ　ＨＣｌ溶液で処理し、得られた結晶を、エタノールから再結晶した。
【００６４】
例７：
２．７０ｇの２−アミノ−５−クロロベンゾフェノンの塩酸塩および１．７０ｇのＮ−シアノ−Ｎ’，Ｎ”−ジメチルグアニジンを混合し、１５０℃で３時間加熱した。反応生成物を、メタノールに吸収させ、濾過した。濾液を蒸発させた。残留物を、イソプロパノールおよびジエチルエーテルの混合物から再結晶し、Ｎ−（６−クロロ−４−フェニルキナゾリン−２−イル）−Ｎ’，Ｎ”−ジメチルグアニジニウムクロリド（融点２６４〜２６７℃）が得られた。
【００６５】
例８：
５００ｍｇの２−アミノ−５−クロロ−２’−ニトロベンゾフェノン、４０６ｍｇのＮ−シアノ−Ｎ’−エチルグアニジンおよび１．０３ｇのｐ−トルエンスルホン酸一水和物の混合物を、溶融において１５０〜１６０℃で２時間かきまぜ、例３のようにして精製操作し、Ｎ−［６−クロロ−４−（２−ニトロフェニル）キナゾリン−２−イル］−Ｎ’−エチルグアニジニウムｐ−トルエンスルホネート（融点２９８〜３００℃）が得られた。
【００６６】
例９：
５００ｍｇの２−アミノ−５−クロロ−２’−ニトロベンゾフェノン、５８０ｍｇのＮ−シアノ−Ｎ−フェニルグアニジンおよび１．０３ｇのｐ−トルエンスルホン酸一水和物の混合物を、溶融において１５０〜１６０℃で２時間かきまぜ、例３のようにして精製操作し、Ｎ−［６−クロロ−４−（２−ニトロフェニル）キナゾリン−２−イル］−Ｎ’−フェニルグアニジニウムｐ−トルエンスルホネート（融点２６１〜２６３℃）が得られた。
【００６７】
ＮＨＥ−３阻害剤として好ましい以下の酸付加塩を、対応する前駆体を用いて、前述の方法と同様にして得た：
ｐＴｓＯＨは、ｐ−トルエンスルホン酸を示す。
【００６８】
例１０〜１０１：
【化１５】
2004508360.tif 000013
【００６９】
【表１】
2004508360.tif 000014
【００７０】
【表２】
2004508360.tif 000015
【００７１】
【表３】
2004508360.tif 000016
【００７２】
【表４】
2004508360.tif 000017
【００７３】
例１０２〜１５４：
【化１６】
2004508360.tif 000018
【００７４】
【表５】
2004508360.tif 000019
【００７５】
【表６】
2004508360.tif 000020
【００７６】
例１５５〜２０５：
【化１７】
2004508360.tif 000021
【００７７】
【表７】
2004508360.tif 000022
【００７８】
【表８】
2004508360.tif 000023
【００７９】
例２０６〜２９２：
【化１８】
2004508360.tif 000024
【００８０】
【表９】
2004508360.tif 000025
【００８１】
【表１０】
2004508360.tif 000026
【００８２】
【表１１】
2004508360.tif 000027
【００８３】
例２９３〜３７９：
【化１９】
2004508360.tif 000028
【００８４】
【表１２】
2004508360.tif 000029
【００８５】
【表１３】
2004508360.tif 000030
【００８６】
【表１４】
2004508360.tif 000031
【００８７】
例３８０〜４６５：
【化２０】
2004508360.tif 000032
【００８８】
【表１５】
2004508360.tif 000033
【００８９】
【表１６】
2004508360.tif 000034
【００９０】
【表１７】
2004508360.tif 000035
【００９１】
例４６６〜５５２：
【化２１】
2004508360.tif 000036
【００９２】
【表１８】
2004508360.tif 000037
【００９３】
【表１９】
2004508360.tif 000038
【００９４】
【表２０】
2004508360.tif 000039
【００９５】
例５５３〜６３９：
【化２２】
2004508360.tif 000040
【００９６】
【表２１】
2004508360.tif 000041
【００９７】
【表２２】
2004508360.tif 000042
【００９８】
【表２３】
2004508360.tif 000043
【００９９】
例６４０〜７２６：
【化２３】
2004508360.tif 000044
【０１００】
【表２４】
2004508360.tif 000045
【０１０１】
【表２５】
2004508360.tif 000046
【０１０２】
【表２６】
2004508360.tif 000047
【０１０３】
例７２７〜８１３：
【化２４】
2004508360.tif 000048
【０１０４】
【表２７】
2004508360.tif 000049
【０１０５】
【表２８】
2004508360.tif 000050
【０１０６】
【表２９】
2004508360.tif 000051
【０１０７】
例８１４〜９００：
【化２５】
2004508360.tif 000052
【０１０８】
【表３０】
2004508360.tif 000053
【０１０９】
【表３１】
2004508360.tif 000054
【０１１０】
【表３２】
2004508360.tif 000055
【０１１１】
例９０１〜９６１：
【化２６】
2004508360.tif 000056
【０１１２】
【表３３】
2004508360.tif 000057
【０１１３】
【表３４】
2004508360.tif 000058
【０１１４】
【表３５】
2004508360.tif 000059
【０１１５】
薬理学的試験
ＮＨＥ−３阻害剤としての式Ｉで表される化合物の特徴づけに用いた方法を、以下に記載する。
式Ｉで表される化合物を、ＮＨＥ−１〜ＮＨＥ−３アイソフォームについてのこれらの選択性に関して特徴づけした。３種のアイソフォームを、マウス線維芽細胞系中で、安定な形態で発現させた。化合物の阻害作用を、２２Ｎａ＋の細胞内アシドーシスの後の細胞中へのＥＩＰＡ感受性吸収の決定により、評価した。
【０１１６】
材料および方法
異なるＮＨＥアイソフォームを発現するＬＡＰ１細胞系
ＮＨＥ−１、−２および−３アイソフォーム（マウス線維芽細胞系）を発現するＬＡＰ１細胞系を、Ｐｒｏｆ． Ｊ． Ｐｏｕｙｓｓｅｇｕｒ （Ｎｉｃｅ， Ｆｒａｎｃｅ）から得た。トランスフェクションを、Ｆｒａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９８６）の方法により実施した。細胞を、１０％の不活性化胎児ウシ血清（ＦＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ＮＨＥ発現細胞の選択のために、Ｓａｒｄｅｔ ｅｔ ａｌ． （１９８９）のいわゆる「酸絶命方法（ａｃｉｄ ｋｉｌｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄ）」を用いた。細胞を、先ずＮＨ４Ｃｌ含有重炭酸塩およびナトリウム非含有緩衝液中で、３０分間インキュベートした。次に、細胞外ＮＨ４Ｃｌを、重炭酸塩、ＮＨ４Ｃｌおよびナトリウム非含有緩衝液で洗浄することにより、除去した。細胞を、その後、重炭酸塩非含有ＮａＣｌ含有緩衝液中でインキュベートした。ＮＨＥを機能的に発現するこれらの細胞のみが、これらに施した細胞内酸性化において生存することができた。
【０１１７】
アイソフォーム選択性に関するＮＨＥ阻害剤の特徴づけ
ＮＨＥ−１、ＮＨＥ−２およびＮＨＥ−３アイソフォームを発現する前述のマウス線維芽細胞系を用いて、化合物を、Ｃｏｕｎｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９３）およびＳｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ． （１９９５）により記載された手順により、アイソフォームに関する選択性について試験した。細胞を、ＮＨ４Ｃｌプレパルス方法およびその後重炭酸塩非含有２２Ｎａ＋含有緩衝液中でのインキュベーションにより、細胞内で酸性化した。細胞内酸性化により、ＮＨＥは、活性化され、ナトリウムは、細胞中に吸収された。試験化合物の効果を、ＥＩＰＡ（エチルイソプロピルアミロリド）感受性２２Ｎａ＋吸収の阻害として表した。
【０１１８】
ＮＨＥ−１、ＮＨＥ−２およびＮＨＥ−３を発現した細胞を、５〜７．５×１０４細胞／ウェルの密度で、２４ウェルマイクロタイタープレート中にまき、２４〜４８時間の間培養して合流させた。培地を、吸引により除去し、細胞を、ＮＨ４Ｃｌ緩衝液（５０ｍＭ　ＮＨ４Ｃｌ、７０ｍＭ塩化コリン、１５ｍＭ　ＭＯＰＳ、ｐＨ７．０）中で３７℃で６０分間インキュベートした。その後、緩衝液を除去し、細胞を、塩化コリン洗浄緩衝液（１２０ｍＭ塩化コリン、１５ｍＭ　ＰＩＰＥＳ／トリス、０．１ｍＭウワバイン、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２ｍＭ　ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）で、２回迅速に覆い、吸引により濾過して除去した。
【０１１９】
細胞を、その後塩化コリンチャージング緩衝液（ｃｈａｒｇｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）（１２０ｍＭ塩化コリン、１５ｍＭ　ＰＩＰＥＳ／トリス、０．１ｍＭ　ＰＩＰＥＳ／トリス、０．１ｍＭウワバイン、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２ｍＭ　ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４、２２Ｎａ±（０．９２５ｋＢｇ／１００ｍｌのチャージング緩衝液））で覆い、次に、この緩衝液中で６分間インキュベートした。インキュベーション時間の終了の後に、インキュベーション緩衝液を、吸引により除去した。細胞外放射活性を除去するために、細胞を、氷冷リン酸緩衝食塩水溶液（ＰＢＳ）で４回迅速に洗浄した。
【０１２０】
次に、細胞を、ウェルあたり０．３ｍｌの０．１Ｎ　ＮａＯＨを加えることにより可溶化した。細胞フラグメント含有溶液を、シンチレーション管中に移送した。次に、各々のウェルを、０．３ｍｌの０．１Ｎ　ＮａＯＨで２回洗浄し、洗浄溶液を、同様に対応するシンチレーション管中に導入した。シンチレーションカクテルを、細胞可溶化液を含む管に加え、細胞中に吸収された放射活性を、β放射線の決定により決定した。
【０１２１】
文献：
【外１】
2004508360.tif 000060
【０１２２】
以下の例は、医薬製剤に関する：
例Ａ：注射バイアル瓶
１００ｇの式Ｉで表されるＮＨＥ−３阻害剤および５ｇのリン酸水素二ナトリウムを３ｌの２回蒸留水に溶解した溶液を、２Ｎ塩酸を用いてｐＨ６．５に調整し、滅菌濾過し、注射バイアル瓶中に移送し、滅菌条件下で凍結乾燥し、滅菌条件下で密封した。各々の注射バイアル瓶は、５ｍｇの活性成分を含む。
【０１２３】
例Ｂ：座剤
２０ｇの式Ｉで表されるＮＨＥ−３阻害剤の混合物を、１００ｇの大豆レシチンおよび１４００ｇのココアバターと共に溶融し、型中に注入し、放冷した。各々の座剤は、２０ｍｇの活性成分を含む。
【０１２４】
例Ｃ：溶液
１ｇの式Ｉで表されるＮＨＥ−３阻害剤、９．３８ｇのＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ、２８．４８ｇのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏおよび０．１ｇの塩化ベンザルコニウムから、９４０ｍｌの２回蒸留水中に溶液を調製した。ｐＨを、６．８に調整し、溶液を１ｌに作成し、放射線により滅菌した。この溶液を、点眼剤の形態で用いることができる。
【０１２５】
例Ｄ：軟膏
５００ｍｇの式Ｉで表されるＮＨＥ−３阻害剤を、９９．５ｇのワセリンと、無菌条件下で混合した。
【０１２６】
例Ｅ：錠剤
１ｋｇの式Ｉで表されるＮＨＥ−３阻害剤、４ｋｇのラクトース、１．２ｋｇのジャガイモデンプン、０．２ｋｇのタルクおよび０．１ｋｇのステアリン酸マグネシウムの混合物を、慣用の方法で圧縮して、錠剤を得、各々の錠剤が１０ｍｇの活性成分を含むようにした。
【０１２７】
例Ｆ：被覆した錠剤
例Ｅと同様にして、錠剤を圧縮し、これを次に、慣用の方法で、スクロース、ジャガイモデンプン、タルク、トラガカントおよび染料の被膜で被覆した。
【０１２８】
例Ｇ：カプセル
２ｋｇの式Ｉで表されるＮＨＥ−３阻害剤を、硬質ゼラチンカプセル中に、慣用の方法で導入して、各々のカプセルが、２０ｍｇの活性成分を含むようにした。
【０１２９】
例Ｈ：アンプル
１ｋｇの式Ｉで表されるＮＨＥ−３阻害剤を６０ｌの２回蒸留水に溶解した溶液を、滅菌濾過し、アンプル中に移送し、滅菌条件下で凍結乾燥し、滅菌条件下で密封した。各々のアンプルは、１０ｍｇの活性成分を含む。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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