(57)【要約】臨床現場および薬物探索の状況において、逆転写酵素（ＲＴ）に影響を及ぼす薬剤の作用を測定することが可能であり、定量することさえも可能である。その手法は、ＲＴを含みうるサンプルと、ＲＮＡ鋳型、ＲＮＡ鋳型に相補的なプライマー、および適切なオリゴヌクレオチド特異的プライマーとを、それらがＲＴの存在下で反応して、薬剤の作用に逆比例してｃＤＮＡ産物を形成するような条件下で、接触させることを含む。その後、得られたｃＤＮＡ産物の量を測定する。この手法は、ＲＴ活性についてのリアルタイムの定量速度論的アッセイとして簡単に実施することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写酵素を含む可能性のあるサンプルに影響を及ぼす薬剤の逆転写酵素に対する作用を測定する方法であって、
（ａ） 該サンプルと、鋳型ＲＮＡ、該鋳型ＲＮＡに相補的なプライマー、および複数のオリゴヌクレオチド特異的プライマーとを、それらが逆転写酵素の存在下で反応して、該薬剤の作用に逆比例してｃＤＮＡ産物を形成する条件下で接触させ、
（ｂ） 該ｃＤＮＡ産物の量を測定する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
鋳型ＲＮＡがポリアデニル化ＲＮＡであり、鋳型ＲＮＡに相補的なプライマーがオリゴｄＴプライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）が、ｃＤＮＡ産物を増幅し、次いで前記薬剤の不在下で得られたｃＤＮＡ産物に関連させて前記量を測定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ポリアデニル化ＲＮＡがヒトＲＮＡである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記条件が３７℃またはそれ以下の反応温度を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
逆転写酵素がＨＩＶ逆転写酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
逆転写酵素が組換えＨＩＶ逆転写酵素である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルがＨＩＶに感染した生物学的物質を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）に先立って、患者から前記サンプルを採取する、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ（ａ）に先立って、患者から前記サンプルを採取する、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＩＶ逆転写酵素を含む可能性のあるサンプル中の逆転写酵素を測定する方法であって、
（ａ） 該サンプルと、鋳型ＲＮＡ、該鋳型ＲＮＡに相補的なプライマー、および複数のオリゴヌクレオチド特異的プライマーとを、それらが逆転写酵素の存在下で反応してｃＤＮＡ産物を形成する条件下で接触させ、その際、前記条件は逆転写酵素の失活温度より低い反応温度を含むものであり、
（ｂ） ｃＤＮＡ産物の存在を検出する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項１２】
鋳型ＲＮＡがポリアデニル化ＲＮＡであり、鋳型ＲＮＡに相補的なプライマーがオリゴｄＴプライマーである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
反応温度が約３７℃以下である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）がｃＤＮＡ産物を増幅してから該産物を測定することを含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に逆転写酵素活性の検出に関し、さらに詳細には、臨床試験ならびに薬物スクリーニング状況において、リアルタイムにウイルス逆転写酵素を定量的に測定することに関する。
【０００２】
発明の背景
Ｓｉｌｖｅｒら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２１： ３５９３（１９９３）は、ウイルス逆転写酵素（ＲＴ）のｃＤＮＡ産物のＰＣＲ増幅によって、生物学的サンプル中のレトロウイルスを検出する手法を開示する。この手法によって、ウイルスＲＴが存在する場合にのみ、ｃＤＮＡ産物が合成され、次いでＤＮＡの存在を同定するための通常の技法によって、このｃＤＮＡは検出される。この目的のための技法には、例えばサザンブロットハイブリダイゼーション、臭化エチジウム染色による視覚化、取り込まれた放射性標識ヌクレオチドの測定、および増幅ＤＮＡに結合した検出可能な成分に対する免疫検定が挙げられる。
【０００３】
またレトロウイルス混入を検出するために、産物−増強逆転写酵素アッセイ（ｐｒｏｄｕｃｔ−ｅｎｈａｎｃｅｄ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ａｓｓａｙ： ＰＥＲＴ、ａ／ｋ／ａ「Ａｍｐ−ＲＴ」）およびポリメラーゼ連鎖反応に基づく逆転写酵素アッセイ（ＰＢＲＴ）が用いられている。これらは、通常のＲＴアッセイと比較して、１０８倍に増強された感度を提供する。ＦＤＡの生物学的製剤評価研究センター（ＣＢＥＲ）は、ＲＴの存在について患者をスクリーニングするのに、さらにＲＴ混入についてウイルスワクチンおよび遺伝子治療製剤をスクリーニングするのにＰＥＲＴアッセイを推奨している。また、米国特許第５，８４９，４９４号は、これらの方法を使用して生物学的サンプル中のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の存在をアッセイすることに関して記載する。他方で、ＰＥＲＴおよびＰＢＲＴは、臨床現場では重大な欠点がある。なぜなら、これらの方法は煩雑で、リアルタイムには達成することができないからである。
【０００４】
ＲＴの存在についての標準的ＰＣＲ−ＲＴプロトコールと連携したＴａｑＭａｎ（登録商標）技法（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を適用することは、逆転写酵素の定量的測定に関しては十分に確立されている。Ｒｉｎｇｅｌら， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ＆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ８４： ４０３７ （１９９９）を参照されたい。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技法を用いたＲＴ活性の検出は、迅速で、かつ比較的安全に行なうことができる。さらに、ＴａｑＭａｎ（登録商標）技法は、以前の方法論を上回る進歩を示す。これは、放射性同位元素および臭化エチジウムなどの毒性化学物質の必要性を排除する一方で、従来のＲＴアッセイを上回るかなり向上した感度を示し、測定時間を６時間以内に短縮できることによるものである。
【０００５】
Ｌｏｖａｔｔら， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８２： １８５ （１９９９）は、研究現場において、未知のサンプル中のウイルスの混入を検出および定量化するためのＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ技術の使用について報告する。ＴａｑＭａｎ（登録商標）技法は、研究現場において用いられるが、ＨＩＶ逆転写酵素の検出には用いられていないようである。さらに、逆転写酵素は種々の薬剤によって阻害されることが知られているが、ＲＴをアッセイすることによってかかる薬剤の有効性をモニタリングする方法が、臨床現場においては欠けている。
【０００６】
発明の概要
従って、本発明の目的は、臨床的な使用に容易に適応されるウイルスＲＴの検出手法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、例えば高スループットスクリーニング環境において、特にＲＴに影響を及ぼす活性に関して薬剤を試験するのに適した方法による、ＲＴ増幅産物のリアルタイムモニタリングを提供することである。
【０００８】
さらなる本発明の目的は、ウイルスＲＴ活性のモニタリングを介して、抗ＨＩＶ薬もしくは他の抗ウイルス薬または推定上の治療薬の有効性を評価することである。
【０００９】
同様に、一般的に医学的関心がもたれている、ある範囲の病原体を同定するための、臨床現場において迅速にかつ安全に行なうことができる診断技法を提供することも本発明の目的である。
【００１０】
また別の本発明の目的は、既知のＲＴ阻害剤に耐性であるＲＴの存在を検出すること、または既知のＲＴ阻害剤に対する耐性レベルを測定することである。
【００１１】
これらの目的および他の目的を達成する上で、本発明の一態様に従って、サンプル中のＲＴの存在を測定する方法が提供される。好ましくはＲＴの失活温度より低い温度付近（典型的には、ＨＩＶ ＲＴについては約３７℃の範囲である）で、サンプルと、（ｉ）ポリアデニル化ＲＮＡのような鋳型ＲＮＡ、（ｉｉ） 鋳型ＲＮＡに相補的なプライマー（例えば、オリゴｄＴ）、および（ｉｉｉ）複数のオリゴヌクレオチド特異的プライマーとを接触させることによって、ＲＴの存在についてサンプルを試験する。ＲＴがサンプル中に存在する場合は、ｃＤＮＡが産生され、それに応じて検出され得る。
【００１２】
本発明の他の実施形態では、サンプル中のＲＴの活性における試験薬剤の影響を測定する方法が提供される。ＲＴを含む可能性のあるサンプルと、鋳型ＲＮＡ（好ましくはヒトの鋳型ＲＮＡ）、相補的なプライマー、および複数のオリゴヌクレオチド特異的プライマーとを、サンプル中にＲＴが存在する場合にのみ試験薬剤の作用に逆比例する量のｃＤＮＡを形成するように、接触させる。サンプルは、ヒト患者から採取することが好ましく、かつサンプルをＨＩＶ ＲＴの存在下で、臨床的環境においてリアルタイムで試験することが好ましい。
【００１３】
このように、サンプル（好ましくは患者から得たもの）中のＲＴを試験して、サンプル中のＲＴが既知のＲＴ阻害試験薬剤に対する耐性を獲得しているか否かを判定することが可能であることを当業者は理解できるであろう。これは、サンプル中のＲＴの活性における既知のＲＴ阻害試験薬剤の作用を測定し、その活性を、既知のＲＴ阻害剤の不在下でのＲＴの活性および／またはサンプルのＲＴ活性を完全に阻害することが知られているＲＴ阻害剤の存在下でのＲＴの活性に対して比較することにより、達成することができる。
【００１４】
本発明の他の目的および利点は、好ましい実施形態の詳細な説明の項を参照することにより、明らかとなるであろう。
【００１５】
好ましい実施形態の詳細な説明
本発明の好ましい実施形態では、患者から得た生物学的サンプルなどのサンプル中のＲＴの存在を測定するには、ヒト心臓全ポリアデニル化ＲＮＡ、オリゴｄＴプライマーおよびｄＮＴＰを含有する反応混合物にサンプルを導入することが必要である。ＲＴがサンプル中に存在するならば、該ＲＴがヒト心臓全ポリＡ−ＲＮＡに対応するｃＤＮＡを転写するであろう。逆に、サンプル中にＲＴが存在していなければ、ｃＤＮＡ産物は形成されないであろう。あらゆるｃＤＮＡの形成は、サンプル中に存在するあらゆる活性ＲＴの濃度に比例するであろう。
【００１６】
本発明では、サンプル中にＲＴが存在することによるｃＤＮＡの形成に続いて、ｃＤＮＡの増幅および検出（好ましくは当技術分野でよく知られているＴａｑｍａｎ（登録商標）技法による）を行う。当技術分野で公知の他の技法によっても、増幅されたｃＤＮＡ産物を検出することが可能である。その技法の例としては、限定はされないが、サザンブロットハイブリダイゼーション、臭化エチジウム染色、放射性標識ヌクレオチドの取込みの測定、増幅されたＤＮＡに結合した検出可能な成分についてのイムノアッセイ、および蛍光測定などが挙げられる。
【００１７】
本発明は、広範にわたる病原体についてのＲＴ酵素の測定に適用可能である。従って、レトロウイルス、フラビウイルスおよび黄熱病ウイルスを含む（これらに限定はされない）全てのＲＮＡウイルスについて、この方法を用いることができる。この点に関するフラビウイルスの例示としては、西ナイルウイルス（Ｗｅｓｔ Ｎｉｌｅ ｖｉｒｕｓ）および脳炎ウイルス（セントルイス脳炎、西部ウマ脊髄脳炎、日本ウマ脊髄脳炎、およびダニ媒介脳炎に関連する脳炎ウイルス株など）が挙げられる。
【００１８】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイは、わずか１０コピーのＤＮＡに至るまでの感度があるため、その感度は、ＰＣＲの増幅産物をゲルを利用して分離することを含む従来のＰＣＲ法に比べて、１０の数乗倍高い。さらに、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイは、高速な処理量（スループット）に適応でき、かつ後述のように、ＲＴ活性およびＲＴ活性阻害の両方の測定を可能とする。
【００１９】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）アッセイは、ｔａｑポリメラーゼがエンドヌクレアーゼ活性とポリメラーゼ活性の両方を有していることに基づいている。ＲＴの作用によりｃＤＮＡが形成すると、オリゴヌクレオチド特異的プライマーがＰＣＲ増幅のために用いられる。ｃＤＮＡ上のプライマー「間」にハイブリダイズし、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プローブは、レポーターの蛍光物質（ＦＡＭであってよい）をオリゴヌクレオチド５’末端に含有しており、かつ消光色素（ＴＡＭＲＡであってよい）をプローブの３’末端に含有している。分子内で蛍光が消光されるため、プローブそのものには蛍光性がない。即ち、プローブが完全な形である場合、レポーター蛍光物質が消光色素に接近しているためにレポーターの蛍光は抑制される（主に、フォルスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）型エネルギー転移による）。ＰＣＲ反応が進行するにつれて、標的ｃＤＮＡの増幅が起こり、プライマー配列の伸長の際にＤＮＡポリメラーゼがプローブレポーターの５’部分の切断に作用し、その結果、レポーターの蛍光の消光が取り除かれ、このことにより、ｃＤＮＡ産物の蛍光シグナルの測定が可能となる。
【００２０】
ＰＣＲ反応の蛍光放射がバックグランドの蛍光レベルを超える時点のサイクル数を閾値サイクル（ＣＴ）値と呼び、リアルタイムで算出される。該ＣＴ値は、反応混合物中に存在するＰＣＲ鋳型の量とｃＤＮＡの量の両方に依存する。従って、サンプル中のＲＴ活性は、測定した未知のサンプルのＣＴ値を、同じ条件下で実施した場合の、既知量のｃＤＮＡを含むサンプルのＣＴ値と比較することにより、定量可能である。
【００２１】
好ましい実施形態においては、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プロトコールを使用して、組換えＨＩＶ（ｒＨＩＶ）ＲＴの存在を検出する。この点に関して、ｒＨＩＶ ＲＴの鋳型としてオリゴｄＴを使用する。オリゴｄＴは、反応混合物中に存在するヒト心臓の全ＲＮＡのうちのポリアデニル化ＲＮＡ成分と相補的である。ｒＨＩＶ ＲＴは、ｄＮＴＰヌクレオチドの存在下にてオリゴｄＴ／ＲＮＡ複合体からｃＤＮＡを生成する。患者のサンプルをＨＩＶ ＲＴの存在に関して試験しようとする場合には、該患者サンプルから調製した抽出物をｒＨＩＶ−ＲＴの代わりに添加する。
【００２２】
数種のＲＴは熱感受性を示しやすく、そのため上記反応は、例えばｒＨＩＶ ＲＴでは約３７℃の温度で起こるＲＴ活性が失活しないサイクル条件下にて実施する必要がある。従って、ｒＨＩＶ ＲＴのための温度サイクル条件は、約２５℃にて１０分、続いて約３７℃にて６０分、最後に９５℃にて５分とした。９５℃においてｒＨＩＶ ＲＴ活性は失活した。標準的なＴａｑｍａｎ（登録商標）温度サイクル条件もまたｒＨＩＶ ＲＴ活性を失活しうることに留意されたい。典型的には、上記プロトコールの態様は、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）計器以外のプログラム可能なＰＣＲサーモサイクラーにおいて行う。
【００２３】
次に、上記ＲＴステップで生成したｃＤＮＡのアリコートを、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）計器（ＰＥ Ｍｏｄｅｌ ７７００）に導入し、Ｔａｑｍａｎ（登録商標）ユニバーサルマスターミックス（バッファーに溶解したｔａｑポリメラーゼ）、βアクチン特異的順方向プライマー、βアクチン特異的逆方向プライマー、およびβアクチンＴａｑｍａｎ（登録商標）プローブを含む反応混合物中に入れる。ＰＣＲステップは、標準的なＴａｑｍａｎ（登録商標）ＰＣＲ条件の計器にて行う。上述したように、本方法を２つの試験管反応として説明したが、当業者であれば、これらのステップを単一の反応容器中で組み合わせ得ることを理解するだろう。
【００２４】
本発明の他の実施形態においては、ＲＴ活性を阻害しうる試験薬剤に関してその効力を確認する。この点に関して、鋳型ＲＮＡ、該鋳型ＲＮＡと相補的なプライマー、およびｄＮＴＰをサンプルの存在下で混合する際に、試験薬剤を添加することが好ましい。従って、サンプルが活性ＲＴを含有する可能性はあるが、ＲＴによるｃＤＮＡ転写は、反応混合物中の試験薬剤の存在により阻害されうる。
【００２５】
試験薬剤の阻害特性は、試験薬剤を含有するサンプルのＣＴ値の増加に反映される。試験薬剤によるＲＴ活性の阻害効力が大きくなるほど、試験薬剤を含有しない対照反応に対して測定したＴａｑｍａｎ（登録商標）アッセイから得られるＣＴ値は高くなる。ＲＴ阻害はリアルタイムで測定することが可能であるため、本発明は、潜在的なＲＴ阻害特性を有する可能性のある試験薬剤のリアルタイムな薬剤スクリーニングに最適である。さらに、本方法は、種々の既知ＲＴ阻害剤（例えばヌクレオシドおよびヌクレオチド類似体）、ならびに非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、またはそれらの組み合わせと共に、患者由来の生物学的サンプルを利用して行うことにより、患者のＲＴをこれらのＲＴ阻害剤に対する耐性に関してリアルタイムでスクリーニングしかつ測定することができ、これにより薬物投与量および調剤に関する情報が多く得られる。
【００２６】
臨床現場では、試験薬剤の効力のｉｎ ｓｉｔｕ測定によって、サンプルのさらにハイスループットな処理が可能になり、続いて阻害活性を示す有望な試験薬剤のターゲティングが効率的になる。従って、阻害剤の特異的活性の測定および定量に加えて、阻害剤の純化を追跡することができる。同様に、特定の薬剤に対する耐性ができた可能性のある患者のための薬剤選択は、患者が耐性を明らかに示すかどうかを調べるための薬剤実験により生じ得る処置時間の浪費を伴うことなくアッセイしうる。阻害剤の投与量試験を行なって該阻害剤の最適投与量を決定することが可能であるため、薬剤が患者に及ぼす毒性および副作用をさらに制限しうる。
【００２７】
さらに本発明は、臨床現場においてヒト患者に対してｅｘ ｖｉｖｏで行なうことができる。本発明はｅｘ ｖｉｖｏで行うことが可能であるため、ＲＴ活性および試験薬剤の効力は、患者に対し毒性がない方法で決定される。上述したように、本発明はＲＴ活性またはそれらの阻害をリアルタイムで測定するので、非常に迅速に、典型的には１時間未満で、特定の病原体の存在に関して患者サンプルをアッセイすることができる。
【００２８】
以下に記載する非限定的な実施例により本発明の利点をさらに説明する。これらの解決手段は以下のプロトコールで実施した：
１．ＴａｑＭａｎ（登録商標） ＲＴ試薬キット（１０×反応バッファー、塩化マグネシウムストック溶液、およびＲＮＡｓｅ阻害剤を含有する；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号Ｎ８０８−０２３４）；
２．ｒＨＩＶ ＲＴ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌカタログ番号５００６（１２．５Ｕ／μＬで５００Ｕ））；
３．ヒト心臓全ＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎカタログ番号７９６６（１ｍｇ／ｍｌで１００μｇ）；
４．１００ｍＭ ｄＮＴＰミックス（各ＮＴＰ ２５ｍＭ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号Ｎ８０８−０２６１）；
５．オリゴｄＴ（１７ｍｅｒ）；
６．ランダムヘキサマー（オリゴ（ｄＮＴＰ）６）；
７．２×ＴａｑＭａｎ（登録商標）ユニバーサルマスターミックス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号ＰＥ４３０４４３７）；
８．ＴａｑＭａｎ（登録商標） βアクチン試薬（βアクチン特異的順方向および逆方向オリゴヌクレオチドプライマー＋βアクチン用ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒカタログ番号４０１８４６）；ならびに
９．βアクチンプラスミドＤＮＡ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅカタログ番号７６９５５９Ｒ）。
【００２９】
１０ ｍＭ ｄＮＴＰ溶液は、希釈剤として水を使用して１００ ｍＭ ｄＮＴＰ溶液を１：１０に希釈することにより調製した。オリゴｄＴの５０μＭストック水溶液も調製した。
【００３０】
ｒＨＩＶ ＲＴ溶液（マスターミックス溶液）は、１０×ＲＴ反応バッファー ５μＬ、２５ ｍＭ ＭｇＣｌ２１１μＬ、上記１０ ｍＭ ｄＮＴＰストック溶液 １０μＬ、５０μＭ オリゴｄＴ ２．５μＬ、ＲＮアーゼ阻害剤 １μＬ、およびｒＨＩＶ ＲＴ １．２５μＬを含むように調製した。マスターミックス溶液の総量は３０．７５μＬであった。あるいは、オリゴｄＴの代わりにランダムヘキサマーを添加してもよい。しかしながら、オリゴｄＴが好適なプライマーである。
【００３１】
水＋試験薬剤（合計で１８．２５μＬ）＋１μＬのヒト心臓全ＲＮＡ、例えば：
試験薬剤 １μＬ＋水 １７．２５μＬ＋ヒト心臓全ＲＮＡ １μＬ；
試験薬剤 ２μＬ＋水 １６．２５μＬ＋ヒト心臓全ＲＮＡ １μＬ；
試験薬剤 ５μＬ＋水 １３．２５μＬ＋ヒト心臓全ＲＮＡ １μＬ；
試験薬剤 １０μＬ＋水 ８．２５μＬ＋ヒト心臓全ＲＮＡ １μＬ；
試験薬剤 １５μＬ＋水 ３．２５μＬ＋ヒト心臓全ＲＮＡ １μＬ、
を３０．７５μＬのマスターミックス溶液に添加した。したがって、反応混合物は５０μＬの溶液総量を含むものとなった。
【００３２】
本実施例の対照としては、水 １８．２５μＬ＋ＲＮＡ １μＬを含む陽性対照、および水 １９．２５μＬを含む陰性対照が含まれる。
【００３３】
転写酵素反応は、反応混合物を、ＭＷＧサーモサイクラーまたはその同等の機器中に、２５℃で１０分、続いて３７℃で６０分、および最後に９５℃で５分の熱サイクル条件下に配置することによって開始された。この最後の熱サイクル段階によって、ｒＨＩＶ ＲＴが失活された。次に、熱サイクル後のＲＴ反応混合物 ５μＬ（ｃＤＮＡを含むと推定される）を、マスターミックス溶液 ４５μＬに添加した。このマスターミックス溶液は、２×Ｔａｑｍａｎユニバーサルマスターミックス ２５μＬ、βアクチン順方向プライマー ５μＬ、βアクチン逆方向プライマー ５μＬ、および水 ５μＬを含んでいた。したがって、総ＰＣＲ反応混合物は５０μＬを含むものとなった。
【００３４】
ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ７７００ ＴａｑＭａｎ機器にて、製造業者の推奨通りに、以下の条件で実施した：５０℃で２分、続いて９５℃で１０分。次に、９５℃で１５秒、続いて６０℃で１分のサイクルを、４０サイクル行った。反応が完了し次第、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ７７００ ＴａｑＭａｎ機器マニュアルの記載通りに、データをプロットし視覚化した。
【００３５】
蛍光の増加は、サイクル数の関数としてモニターした。データはＣＴに対する相対蛍光量として表した。ＣＴ値とＤＮＡのコピー数との間の相関は、既知量のＤＮＡを用いて作成した検量線から決定した。この決定のために、ＰＣＲ反応工程において、ＲＴ反応混合物の代わりにβアクチンＤＮＡを用いた。検量線を作成するために用いるβアクチンＤＮＡの有用な量的範囲は、約１コピーのＤＮＡに相当する５ ａｇ（アトグラム）から９．５×１０４コピーのＤＮＡに相当する５００ ｆｇ（フェムトグラム）であった。
【００３６】
ＤＮＡのコピー数は、１マイクログラム（１μｇ）のＰＢＲ３２２プラスミドＤＮＡが、３６ ｐｍｏｌのＰＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ（２．２×１０１１コピーのＤＮＡ）に相当する、との報告に基づくものであった。ＰＢＲ３２２プラスミドＤＮＡは、４３６０ｂｐからなる。βアクチンプラスミドＤＮＡは５０００ｂｐからなる。
【００３７】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）検量線を、図１に示す。この図では、既知量（既知コピー数）のβ−アクチンＤＮＡを上記アッセイプロトコールのＰＣＲ成分として使用して、観察される閾値（ＣＴ）を記録した。コピー数が減少するにつれて、ＣＴ値が高くなることに注目されたい。この検量線アッセイは、少なくとも１コピーのＤＮＡまで線形であり、少なくとも１００，０００コピーのＤＮＡにまで及んでいる。この曲線は見かけ上の線形回帰に適合され（これは線形／対数プロットである）、０．９９の回帰適合度を示す。この線形の式は Ｙ＝−３．１２（Ｘ）＋３６で表され、この式中、ＸはＤＮＡコピー数であり、３６は無限に低いコピー数（１未満）のＤＮＡの場合のＣＴ値である。
【００３８】
以下の実施例においては上記のプロトコールを用いたが、わずかな改変は当業者には自明であろう。
【００３９】
実施例Ｉ
実施例Ｉは、次第に増加する最終濃度０％、１％、５％、１０％（ｖ／ｖ）の試験薬剤を用いて、蛍光の増加をサイクル数の関数として示す。陽性対照のＣＴ値は水平方向の黒線で示す。このＣＴ値は、バックグラウンドを差し引いた蛍光の増大量の中間値である。図２に示す通り、陽性対照サンプルは、２４サイクルというＣＴ値を示した。図２の残りの曲線は、出願人が所有する試験薬剤の存在下でｒＨＩＶ ＲＴが阻害されることを示している。試験薬剤が高濃度であるほどＣＴ値はますます大きくなったが、このことはｒＨＩＶ ＲＴ活性が漸増的に阻害されることを示している。
【００４０】
実施例ＩＩ
本発明の第２の抗ウイルス試験薬剤の存在下での、ｒＨＩＶ ＲＴ阻害の別の例。図３に示す通り、ＣＴ２６で閾値を超えたサンプルは、ＲＴ ＰＣＲ対照（試験薬剤なし）および１％（ｖ／ｖ）試験薬剤（ＲＴ反応混合物中での最終濃度として）である。５％（ｖ／ｖ）試験薬剤サンプルは３３サイクルで閾値を超えた。また１０％（ｖ／ｖ）試験薬剤は閾値を超えず、ｒＨＩＶ ＲＴ活性が１００％阻害されたことを示した。
【００４１】
試験薬剤によって生じる阻害は、ＰＣＲ反応混合物中に存在するＤＮＡのコピー数により表すことができる。
【００４２】
2004500896.tif 000002
【００４３】
実施例ＩＩＩ
以下の実施例は、ｒＨＩＶ ＲＴを含むサンプルに対する、ＡＺＴの阻害効率を示す。    ２５０μＭ〜１．２５ｍＭの範囲にあるＡＺＴ（ｄＴのヌクレオチド類似体）を、ｄＴに代えてｒＨＩＶ ＲＴ反応混合物に添加した。ＡＺＴを添加した場合には、ＰＣＲステップの後にｃＤＮＡの増幅は見られなかった。同様に、ＡＺＴをｄＴに代えてＰＣＲ反応混合物に含めた場合にも、ＰＣＲステップの後にｃＤＮＡの増幅は見られなかった。
最後に、ＡＺＴの濃度を減少させながら、一定濃度のｄＴの存在下でＲＴ反応混合物に添加した。ＡＺＴの最終濃度は１．２５ｍＭから２５０μＭまでの範囲であった。全てのＡＺＴ濃度で、観察されたＣＴは４０サイクルを超え、活性の１００％の阻害を示した。
【００４４】
好ましい実施形態を説明、記述してきたが、特許請求の範囲で定義されるより広い態様で、本発明から逸脱することなく、当業者によって変更および修飾がなされ得ることは理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はｃＤＮＡ検量線を示す。
【図２】
図２は、試験薬剤の濃度の増加による、ｒＨＩＶ ＲＴの阻害を示している。
【図３】
図３は、図２と同様に、試験薬剤の濃度の増加による、ｒＨＩＶ ＲＴの阻害を示している。
【図１】
2004500896.tif 000003
【図２】
2004500896.tif 000004
【図３】
2004500896.tif 000005
【国際公開パンフレット】
2004500896.tif 000006
2004500896.tif 000007
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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