(57)【要約】本発明は、新規なタイプの改善された性質を有するペプチド核酸類（ＰＮＡ類）に関する。特に、本発明は、主鎖と核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）との間にエチレンリンカーを有する正電荷を有するＰＮＡ単位、これらの単位を含有するオリゴヌクレオチド類縁体、これらの単位を含むオリゴマー、及びアンチセンス治療用を包含する治療及び診断への応用を含む、新規な送達薬剤としての正電荷を有するＰＮＡ類の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）：
2004520261.tif 000024
ここで、Ｒ１は水素又はアミノ基を保護するのに好適な保護基であり；Ｒ２は水素又はカルボキシル基を保護するのに好適な保護基であり；そしてＢｎはチミン以外の保護された又は保護されていない天然又は非天然の核酸塩基である；
で表される化合物。
【請求項２】
Ｒ１が水素又はモノメトキシトリチル（ＭＭＴ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、フルオレニロキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、フタルイミド（Ｐｈｔ）及びテトラクロロフタルイミド（ＴＰｈｔ）から成るグループから選ばれる保護基であり；そしてＲ２が水素又はメチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（Ｐｒｏｐ）、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、ベンジル（Ｂｎｚ）及びモノメトキシトリチル（ＭＭＴ）から成るグループから選ばれる保護基である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｂｎがグアニン又は保護されたグアニン；擬似グアニン又は保護された擬似グアニン（２，６−ジアミノプリン）；アデニン又は保護されたアデニン；シトシン又は保護されたシトシン；擬似シトシン又は保護された擬似シトシン、擬似イソシトシン又は保護された擬似イソシトシン；ウラシル又は保護されたウラシルから成るグループから選ばれる、請求項１記載の化合物。
【請求項４】
Ｂｎがグアニン又は擬似グアニンである、請求項３記載の化合物。
【請求項５】
グアニンのアミノ基に対する保護基がイソブチリル（ｉＢｕ）、アセチル（Ａｃ）及びベンゾイル（Ｂｚ）から成るグループから選ばれ、そしてヒドロキシルに対する保護基がジフェニルカルバモイル（ＤＰＣ）及びベンジル（Ｂｎｚ）から成るグループから選ばれる、請求項４記載の化合物。
【請求項６】
Ｂｎがアデニンである、請求項３記載の化合物。
【請求項７】
核酸塩基に対する保護基がベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）及びジフェニルアセチル（ＤＰＡ）から選ばれる、請求項６記載の化合物。
【請求項８】
Ｂｎがシトシン又はシトシン類縁体である、請求項３記載の化合物。
【請求項９】
核酸塩基に対する保護基がベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）及びジフェニルアセチル（ＤＰＡ）から成るグループから選ばれる、請求項９記載の化合物。
【請求項１０】
Ｂｎがウラシルである、請求項３記載の化合物。
【請求項１１】
保護基がベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）及びジフェニルアセチル（ＤＰＡ）から選ばれる、請求項１０記載の化合物。
【請求項１２】
一般式（Ｉ）：
2004520261.tif 000025
ここで、Ｒ１は水素又はアミノ基を保護するのに好適な保護基であり；Ｒ２は水素又はカルボキシル基を保護するのに好適な保護基であり；そしてＢｎは保護された又は保護されていない天然の又は非天然の核酸塩基である；
で表される少なくとも一つのペプチド核酸類縁体を含むオリゴマー。
【請求項１３】
オリゴマーがポリエチレングリコールに結合している、請求項１３記載のオリゴマー。
【請求項１４】
約５から１０個のＩＰ−ＰＮＡモノマーが約１０から３０個の通常のＰＮＡ単位を含むオリゴマーに一端又は両端で組み込まれている、請求項１３記載のオリゴマー。
【請求項１５】
以下の配列：
Ａ−Ａ−Ａ（ｎ）−Ａ−Ａ−ＩＰ−ＰＮＡ−ＩＰ−ＰＮＡ−ＩＰ−ＰＮＡ−Ｘ
ここで、Ａはポリアミド核酸モノマーであり；ｎは約５から２５の数であり；ＩＰ−ＰＮＡは、全ての保護基が除去されそしてＲ１とＲ２が隣接モノマーとの間の共有結合によって置き換えられた一般式（Ｉ）の化合物であり；そしてＸは遊離のカルボン酸、還元されたカルボキシル基（アルコール）又はポリエチレングリコールから成るグループから選ばれる；
を含む、請求項１５記載のオリゴマー。
【請求項１６】
約１０から約３０個の核酸塩基の配列に組み込まれたＩＰ−ＰＮＡ単位を含む、請求項１３記載のオリゴマー。
【請求項１７】
以下の配列：
ＩＰ−ＰＮＡ−ＩＰ−ＰＮＡ−ＩＰ−ＰＮＡ（ｍ）−ＩＰ−ＰＮＡ−Ｘ
ここで、ｍは約６から２６の数であり；ＩＰ−ＰＮＡは、全ての保護基が除去されそしてＲ１とＲ２が隣接モノマーとの間の共有結合によって置き換えられた一般式（Ｉ）の化合物であり；そしてＸは遊離のカルボン酸、還元されたカルボキシル基（アルコール）又はポリエチレングリコールから成るグループから選ばれる；
を含む、請求項１７記載のオリゴマー。
【請求項１８】
ＩＰ−ＰＮＡモノマー及びＰＮＡモノマーが交互に繰り返される単位を含む、請求項１３記載のオリゴマー。
【請求項１９】
以下の配列：
Ａ−ＩＰ−ＰＮＡ−Ａ−ＩＰ−ＰＮＡ−（Ａ−ＩＰ−ＰＮＡ）ｍ−Ａ−ＩＰ−ＰＮＡ−Ｘ
ここで、Ａはポリアミド核酸モノマーであり；ｎは約５から２５の数であり；ＩＰ−ＰＮＡは、全ての保護基が除去されそしてＲ１とＲ２が隣接モノマーとの間の共有結合によって置き換えられた一般式（Ｉ）の化合物であり；そしてＸは遊離のカルボン酸、還元されたカルボキシル基（アルコール）又はポリエチレングリコールから成るグループから選ばれる；
を含む、請求項１９記載のオリゴマー。
【請求項２０】
一般式（Ｉ）：
2004520261.tif 000026
ここで、Ｒ１は水素又はアミノ基を保護するのに好適な保護基であり；Ｒ２は水素又はカルボキシル基を保護するのに好適な保護基であり；Ｂｎは保護された又は保護されていない天然の又は非天然の核酸塩基である；
で表される化合物を有効成分として含み；そして薬剤として許容されるいずれかの希釈剤又は賦形剤を更に含む薬剤組成物。
【請求項２１】
有効成分として少なくとも一つのＩＰ−ＰＮＡモノマーを含むオリゴマーを含み、そして薬剤として許容されるいずれかの希釈剤又は賦形剤を更に含む薬剤組成物。
【請求項２２】
有効成分として複数のＩＰ−ＰＮＡ単位を含むオリゴマーを含み、そして薬剤として許容されるいずれかの希釈剤又は賦形剤を更に含む薬剤組成物。
【請求項２３】
アンチセンス分子のＣＮＳ特定ターゲッティングのための正電荷を有するＰＮＡ単位の使用。
【請求項２４】
アンチセンス分子のＣＮＳ特定ターゲッティングのための正電荷を有するＰＮＡ単位を含むオリゴマーの使用。
【請求項２５】
アンチセンス分子の細胞ターゲッティングのための正電荷を有するＰＮＡ単位の使用。
【請求項２６】
アンチセンス分子の細胞ターゲッティングのための正電荷を有するＰＮＡ単位を含むオリゴマーの使用。
【請求項２７】
アンチセンス分子のＣＮＳ特定ターゲッティングのためのＩＰ−ＰＮＡモノマーを含むオリゴマーの、請求項２４記載の使用。
【請求項２８】
アンチセンス分子の神経ターゲッティングのためのＩＰ−ＰＮＡモノマーを含むオリゴマーの使用。
【請求項２９】
アンチセンス分子としてのＩＰ−ＰＮＡモノマーを含むオリゴマーの使用。
【請求項３０】
翻訳阻止のためのＩＰ−ＰＮＡモノマーを含むオリゴマーの使用。
【請求項３１】
ＢＢＢを通過する輸送と神経内送達のためのベクターとしての、ＩＰ−ＰＮＡモノマーを含むオリゴマーの使用。
【請求項３２】
アンチセンス分子の細胞ターゲッティングのための、ＩＰ−ＰＮＡモノマーのオリゴマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、新規なタイプの改善された性質を有するペプチド核酸類（ＰＮＡ類）に関する。特に、本発明は、主鎖と核酸塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）との間にエチレンリンカーを有する正電荷を有するＰＮＡ単位、これらの単位を含有するオリゴヌクレオチド類縁体、これらの単位を含むオリゴマー、及びアンチセンス治療用を包含する治療及び診断への応用を含む、新規な送達薬剤としての正電荷を有するＰＮＡ類の使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
合成アンチセンスオリゴヌクレオチドは、非常に高い特異性を持ってＤＮＡ複製及びタンパク質合成を阻害するために使用されてきた（１，２）。以下を包含する種々の阻害機構が提案されている：
１．リボソーム複合体構築或いはｍＲＮＡ翻訳の妨害（アンチセンスオリゴヌクレオチドの標的ＲＮＡ分子へのハイブリッド形成による）。
２．結果として起こるＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖のＲＮａｓｅＨによる分解。
３．プレｍＲＮＡスプライシングの阻害。
４．三重らせんＤＮＡ構造の生成。
【０００３】
アンチセンス技術における最近の進歩は、改善されたヌクレアーゼ耐性及び増加した結合親和性を与えるためにオリゴヌクレオチドを修飾することに焦点が当てられてきた。これらの取り組み方は、（ａ）主鎖の修飾、（ｂ）糖の修飾、及び（ｃ）塩基の修飾、を包含している。第一世代のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、主鎖のホスホジエステル結合が、（ａ）ホスホロチオエート類、（ｂ）ホスホロジチオエート類、（ｃ）ホスホン酸メチルエステル類、（ｄ）ホスホトリエステル類及び（ｅ）ホスホロアミデート類、によって置換された、主鎖の修飾に基づいたものであった。
【０００４】
ホスホロチオエート（３）類縁体は、（ｉ）ＲＮＡと比較的安定な二本鎖を形成し（一修飾当り−０．１０から１０）；（ｉｉ）ＲＮａｓｅＨ分解を活性化し；（ｉｉｉ）ヌクレアーゼによる切断に対して安定であり、そして（ｉｖ）塩基で触媒される加水分解に対して安定であるので、幾分潜在的な利点を有している。ホスホロジチオエートは、又、ヌクレアーゼ活性に対して極めて耐性があるが、しかし、アンチセンスの応用に対するホスホロチオエート誘導体よりは利点が少ない（５）。ホスホロチオエートのように、メチルホスホネートは通常混合物として得られる。メチルホスホネートはＲＮａｓｅＨを活性化しないが（４）、電荷を有さず、（ｉ）疎水性の増加、（ｉｉ）細胞膜透過性の増加、及び（ｉｉｉ）ヌクレアーゼ耐性、を示す。Ｏ−アルキルホスホトリエステル（Ｏ−Ｅｔ）（６）に関して、これらのオリゴマーはＲＮＡと強くハイブリダイズし、天然のベータ−ホスホジエステルＤＮＡのらせん配位に厳密に適合する（自家相補性二本鎖は実質的により不安定である（７））。細胞培養系において後者の分子（ホスホン酸エステル及びトリエステル）を使用することは、以下の欠点を有するので限定される：（ｉ）低い水溶性；（ｉｉ）キラルリン原子（ホスホネート）により形成する多くのジアステレオアイソマーによるハイブリッド形成性の減少；（ｉｉｉ）増強された親油性により、恐らく細胞内脂質粒子及び膜を標的にする；及び（ｉｖ）塩基により触媒される加水分解に対して感受性が高い。ホスホルアミデートは、ヌクレアーゼに対して極めて耐性があるが、しかしＤＮＡとはむしろ乏しいハイブリッド形成性を示す。このようなことは、Ｔｍの実質的な増加がみられる３’−ＮＨホスホルアミデートの場合には見られない。
【０００５】
ＤＮＡ及びＲＮＡ認識用のアンチセンス薬剤の開発における興味深い取り組み方は、ポリアミド（ペプチドとしても知られている）核酸類（ＰＮＡ類）の代替である。ＰＮＡ類は、天然のＤＮＡ又はＲＮＡと等しいか、又は、よりよい結合親和性を示す糖−リン酸主鎖に対する最初の成功した置換体である（８）。種々の主鎖単位に対比して、ＰＮＡ類は天然のオリゴヌクレオチドに対していかなる構造類似性も有していない。ＰＮＡ類は、ＰＮＡアミノ末端がＤＮＡの５’端と並列している平行様式、又は反平行様式（３’端と並列している）のいずれかを経由してオリゴヌクレオチド配列と結合する。反平行様式を通じたハイブリッド形成は、対応する平行ハイブリッドよりも有意により安定であることが判っており、ＰＮＡ−ＲＮＡ及びＰＮＡ−ＤＮＡ二本鎖について、それぞれ、１．４５０／修飾及び１０〜１．２０／修飾の特別なＴｍ安定性を与える。別の平行結合様式は、ＤＮＡ二本鎖から伸張したホモピリミジンＤＮＡと置換することによって形成した、ＤＮＡ−ＲＮＡ又はＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のように、依然安定である（９）。
【０００６】
ＰＮＡ類による転写阻害は、三重らせん形成によるか、ＰＮＡがＤＮＡ二本鎖において一つのＤＮＡ鎖を置換してＰＮＡ−ＤＮＡハイブリッドを形成することによって起こすことができる。これに次いで、更にＰＮＡオリゴマーに結合することによって、局部的な（ＰＮＡ）２−ＤＮＡ三重らせんを、ある種の配列に対して形成することができる。両ＰＮＡ鎖は、ＤＮＡ鎖に対して平行（パラレル）又は逆平行（アンチパラレル）である。
【０００７】
二つの重要な障害、すなわち、ｉ）低い溶解性、及びｉｉ）細胞への取り込みの減少、がＰＮＡシステムの応用に関係している。これに関して、そしてこれらのハードルに対処するために、ポリアミド構築ブロックの新しい型をもたらすいくつかの修飾が、以下の式で示されるように導入された。
【０００８】
2004520261.tif 000002
【０００９】
化合物Ａは、ＰＮＡ単位の最初の構造（ニールセン）を示し、ここでは主鎖の部分はＮ−（２−アミノエチル）グリシン鎖から成り立っており、核酸塩基はアミド結合を通して分子内のアミノ基につながっている。そのような高疎水性系はもちろん低溶解性であり、その結果として細胞透過性が減少している。化合物Ｂ、Ｃ及びＤは新しいポリアミド主鎖を示し、ここでは、カルボン酸部分は、ヌクレアーゼ分解に耐性を有する、より親水性のリボンコードを形成するホスホノ基（Ｂ、Ｃ）及びホスホロ基（Ｄ）によって置換されている（１０）。Ｂとは対照的に、化合物Ｃ及びＤは、デルタ−ヒドロキシ酸主鎖から構成されている。このことは、オリゴヌクレオチドの固相合成を採用した方法によって鎖の延長を可能にする。デルタ−アミノ酸からなる化合物Ｅ（ＯＰＮＡ）は、主鎖の充分なフレキシビリティ及び改善された水溶性を与えるエーテル類縁体として設計された（１０）。
一方、主鎖構造にキラル中心が存在すると、化学的多様性が拡大する。構造式Ｆ〜Ｈは、エチレン鎖を経てグリシンのＣ−１及びアミノ基Ｎ、並びにプロリンのＣ−４（トランス）に、それぞれＦ、Ｇ、Ｈにおいて結合している核酸塩基を有する真のペプチド核酸類縁体である（１１）。核酸塩基のキャリアーとしてのポリペプチド鎖の欠点の一つは、ＰＮＡの空間的なハイブリッド形成を邪魔する増加した硬さに帰せられる。化合物Ｉは、シクロヘキシル部分に由来する部分的な立体配座で束縛された主鎖を有するキラルデルタ−アミノ酸ＰＮＡである（１２）。
【００１０】
ＰＮＡ単位の分子内アミノ基に対する核酸塩基の結合がエチレンブリッジを介している一つの特別なＰＮＡ類縁体は、チミンについてこれまでに記載されている（１３）。この誘導体の合成は、保護されたＮ，Ｎ−ビス−２−エチルアミノグリシン及びアシルイソシアネートから達成されたが、この方法は別の単位を合成する一般的方法を提供するものではない。より重要なことは、正電荷を有するＰＮＡ類縁体は、通常のＰＮＡ単位と比較してより劣った性質を有しているということが、その研究において実証されたことである（Ｆａｌｋｉｅｗｉｃｚによる総説、１９９９、文献１４）。この開示は、総じて正電荷を有するＰＮＡ類縁体の使用からの乖離を教示している。
【００１１】
（発明の概要）
本発明の一つの目的は、正電荷を有するオリゴヌクレオチド類縁体を供することである。本発明のより特定の目的は、正電荷を有するペプチド核酸（ＰＮＡ）類縁体を供することである。本発明の更なる目的は、正電荷を有するオリゴヌクレオチド類縁体を含むアンチセンス分子を供することである。本発明の又更なる目的は、脳送達技術を含む治療薬及び診断薬のための新規送達剤として、正電荷を有するＰＮＡを使用することである。
【００１２】
本発明の原理に従い、我々は、ＰＮＡ単位の内部アミノ基への核酸塩基の結合がエチレンブリッジを介したものである新規ＰＮＡ類縁体の合成を本明細書で報告する（スキーム１）。この修飾によりリボン鎖に沿って正の電荷が導入される。
【００１３】
ここで、これらの正電荷を有する配列が、高められた水溶性及び負電荷を有するＤＮＡ二重鎖への高められた親和性を示すことが開示される。更に、公知であるが、この修飾により正規のＰＮＡ（メチレンアミド）置換体と比べて側鎖の柔軟性が増大する。
【００１４】
2004520261.tif 000003
【００１５】
本発明の原理に従い、我々は市販品として入手できる出発物質から４つの塩基全てを合成する一般的手順を供する。
【００１６】
本発明の第一の態様に従い、一般式（Ｉ）：
2004520261.tif 000004
ここで、Ｒ１は水素又はアミノ基を保護するのに好適な保護基であり；Ｒ２は水素又はカルボキシル基を保護するのに好適な保護基であり；そしてＢｎはチミン以外の保護された又は保護されていない天然又は非天然の核酸塩基である；
で表される化合物が供される。
【００１７】
現時点でより好ましい本発明の態様は、Ｒ１が水素又はモノメトキシトリチル（ＭＭＴ）、ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、フルオレニロキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）、フタルイミド（Ｐｈｔ）及びテトラクロロフタルイミド（ＴＰｈｔ）から成るグループから選ばれる保護基であり；そしてＲ２が水素又はメチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（Ｐｒｏｐ）、ｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、ベンジル（Ｂｎｚ）及びモノメトキシトリチル（ＭＭＴ）から成るグループから選ばれる保護基である、一般式（Ｉ）の化合物である。
【００１８】
本発明に従う更により好ましい態様は、Ｂｎがグアニン又は保護されたグアニン（Ｇｕ）；擬似グアニン又は保護された擬似グアニン（２，６−ジアミノプリン）；アデニン又は保護されたアデニン（Ａｄ）；シトシン又は保護されたシトシン（Ｃ）；擬似シトシン又は保護された擬似シトシン、擬似イソシトシン又は保護された擬似イソシトシン；ウラシル又は保護されたウラシル（Ｕ）及び保護されたチミン（Ｔ）から成るグループから選ばれる、一般式（Ｉ）の化合物である。
【００１９】
シトシン及びシトシン類縁体に対する好適な保護基にはＲ３＝ベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）及びジフェニルアセチル（ＤＰＡ）が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００２０】
アデニンに対する好適な保護基にはＲ４＝ベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）及びジフェニルアセチル（ＤＰＡ）が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００２１】
グアニン及び疑似グアニンに対する好適な保護基には、ヒドロキシル（Ｒ５）に対する保護基がジフェニルカルバモイル（ＤＰＣ）及びベンジル（Ｂｎｚ）から成るグループから選ばれ、そしてグアニン（Ｒ６）のアミノ基に対する保護基がイソブチリル（ｉＢｕ）、アセチル（Ａｃ）及びベンゾイル（Ｂｚ）から成るグループから選ばれるものが含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００２２】
ウラシル又はチミンに対する好適な保護基にはＲ７＝ベンゾイル（Ｂｚ）、アセチル（Ａｃ）及びジフェニルアセチル（ＤＰＡ）が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００２３】
2004520261.tif 000005
【００２４】
本発明に従う最も好ましい化合物は、Ｂｎがアデニン又は保護されたアデニン；シトシン又は保護されたシトシン；グアニン又は保護されたグアニンから成るグループから選ばれる一般式（Ｉ）の化合物である。
【００２５】
保護基を有する又は有しない一般式（Ｉ）の化合物は、主鎖と核酸塩基の間にエチレンリンカーを有する正電荷を有するＰＮＡ単位を含み、本明細書及び特許請求の範囲の中でＩＰ−ＰＮＡと総称され、既知のポリアミド（ペプチド）核酸類縁体と比べて改良された性質を有する。
【００２６】
本発明の第二の態様に従い、少なくとも一つの一般式（Ｉ）のペプチド核酸類縁体を含むオリゴマーが供される。そのようなオリゴマーにおいて、Ｒ１及びＲ２基が隣接モノマー単位の間の共有結合によって置き換えることができることは当業者には理解されであろう。
【００２７】
本発明のもう一つの態様に従い、Ｂｎがいずれかの天然又は非天然の核酸塩基である、チミンを含む一般式（Ｉ）の複数のペプチド核酸類縁体を含むオリゴマーが開示され、そして特許請求される。そのようなオリゴマーにおいては、Ｒ１及びＲ２基が隣接モノマー単位の間の共有結合によって置き換えることができることは当業者には理解されであろう。
【００２８】
それぞれの場合、あるモノマーの核酸塩基はオリゴマーの他の任意の位置で使用される核酸塩基とは独立であることが理解される。特定の好ましい態様に従えば、有利な点として、これらのオリゴマーはポリエチレングリコールに結合して薬物動態を改善する。
【００２９】
現時点で好ましいタイプのオリゴマーには、本発明の範囲内で以下のものが含まれる：
ａ）：ＩＰ−ＰＮＡ単位の短い配列が約１０個から３０個の通常のＰＮＡ単位を含むオリゴマーに一端又は両端（３’及び／又は５’）で組み込まれている、以下の配列で表されるオリゴマー：
Ａ−Ａ−Ａ（ｎ）−Ａ−Ａ−ＩＰ−ＰＮＡ−ＩＰ−ＰＮＡ−ＩＰ−ＰＮＡ−Ｘ
ここで、Ａはいずれかの既知のＰＮＡモノマーであり；ｎは約５から２５の数であり；ＩＰ−ＰＮＡは、全ての保護基が除去された一般式（Ｉ）の化合物であり；そしてＸは遊離のカルボン酸、還元されたカルボキシル基（アルコール）又はＰＥＧから成るグループから選ばれる。
ｂ）：約１０個から約３０個の核酸塩基の配列中に組み込まれたＩＰ−ＰＮＡ単位のみを含む、以下の配列で表されるオリゴマー：
ＩＰ−ＰＮＡ−ＩＰ−ＰＮＡ−ＩＰ−ＰＮＡ（ｍ）−ＩＰ−ＰＮＡ−Ｘ
ここで、ｍは約６から約２６の数であり；そしてＸは上に定義された通りである；
ｃ）：ＩＰ−ＰＮＡモノマーとＰＮＡモノマーとの交互単位を含み、以下の配列で表されるオリゴマー：
Ａ−ＩＰ−ＰＮＡ−Ａ−ＩＰ−ＰＮＡ−（Ａ−ＩＰ−ＰＮＡ）ｍ−Ａ−ＩＰ−ＰＮＡ−Ｘ
ここでＡ、ＩＰ−ＰＮＡ、ｍ及びＸは上に定義された通りである。
【００３０】
本発明のもう一つの態様は、有効成分として複数のＩＰ−ＰＮＡ単位を含むオリゴマーを含む薬剤組成物に関する。
【００３１】
本発明のもう一つの態様は、アンチセンス分子としてのＩＰ−ＰＮＡ単位を含むオリゴマーの使用に関する。
【００３２】
本発明のもう一つの態様は、翻訳阻止のためのＩＰ−ＰＮＡモノマーを含むオリゴマーの使用に関する。
【００３３】
本発明のもう一つの態様は、アンチセンス分子のＣＮＳ特定ターゲッティングのための、ＩＰ−ＰＮＡ単位を含むオリゴマーの使用に関する。
【００３４】
本発明のもう一つの態様は、アンチセンス分子の神経ターゲッティングのための、ＩＰ−ＰＮＡモノマーを含むオリゴマーの使用に関する。
【００３５】
ここで、ＩＰ−ＰＮＡ類はこれまでに知られているペプチド核酸（ＰＮＡ）と比べて改善された性質を有することが開示される。ＩＰ−ＰＮＡ類は、正電荷を有する、改良された細胞取り込み性並びに生物学的性質を高めるリソソーム的性質を有する水溶性分子である。
【００３６】
送達システムが必要なこれまでに知られているＰＮＡと比べ、ＩＰ−ＰＮＡはリソソーム的性質を有するカチオン性分子であるため、ＢＢＢを通過する輸送及び神経内送達のためのベクターとして独特の価値を供することができる。
【００３７】
（発明の詳細な説明）
脳への薬物送達技術
低い生体膜透過性及び比較的急速な分解の故に、ポリペプチド及びオリゴヌクレオチドは、一般的に治療価値が限られていると考えられている。このことは、生体医学研究及び薬品産業の両者において障害となっている。最近まで、生理活性分子の細胞内投与は小さな疎水性分子に限られ、そして親水性の高分子の投与は原形質膜の破壊を必要としていた。
【００３８】
血液脳関門（ＢＢＢ）は、非常に複雑な内皮境界面を表し、血液の区画を脳実質の細胞外液区画から分離している。ＢＢＢは、複雑な密着結合によって結合した分極性の内皮細胞の単層からなる（１５）。いくつかの因子が、どの程度の分子が血液から脳へと送達されるかに影響を与えていることが知られている。即ち、（１）脂質溶解性：薬物の脂質溶解性とＢＢＢを超えて透過又は拡散するその能力との間には良好な相関がある１６。（２）大きさ：ＢＢＢは、５００Ｄａ以上の分子量を有するイオン化した水溶性分子の通過を防止し、脳への薬物の９５％の送達を妨げる。このＢＢＢの効率的なろ過活性の故に、多くの薬物が必要な治療的レベルにまで脳に到達できないので、脳腫瘍やその他の神経変性疾患の治療は比較的非効率であった。この問題を克服するため、ＢＢＢ透過性を達成する異なった方法が開発されている１７：（１）高張液（マンニトール）の注入によって、又はブラジキニン、アンギオテンシン及びＲＭＰ−７のような生理活性剤の投与によって誘導された、高浸透圧性ショックによるＢＢＢの破壊。（２）脳室内への薬物の直接投与。（３）薬物の修飾：能動的拡散による薬物のＢＢを通過する能力は、親油性の機能及び水素結合ポテンシャルの関数であると信じられている１８。いくつかの戦略、例えば薬物の脂質化（薬物への脂質様分子の付加）及び化学薬品送達システム（ＣＤＳ）への連結が、それ故に利用されてきた。（４）アミノ酸及びビタミンのような必須化合物のＢＢＢキャリアー依存性輸送システムの使用。（５）吸着依存性経細胞輸送（トランスサイトーシス）によるＢＢＢを通過するカチオン修飾（例えば、カチオン化タンパク質）（総説は、２４、 ２５を参照）。（６）受容体依存性経細胞輸送：治療分子の薬剤輸送ベクター（ＯＸ２６）への結合。
【００３９】
神経薬物の輸送への別の取り組みは、細胞膜を効率的に通過することのできる小さな合成ペプチドの使用である（ペゲリン、ペネトラチン）。過去５年間において、いくつかのペプチドが見かけはエネルギー非依存性経路によって真核細胞の原形質膜を通過して移動することが実証された。これらのペプチドは、それら自体よりも数倍大きな分子量の高分子の細胞内送達に成功裏に使用された。例えば、Ｔａｔは、ＨＩＶの複製に関与する転写因子である。その機能的領域（４９〜５８アミノ酸）の一つは、核の移入に関係していることが見出された。Ｔａｔは分泌型で出現し、やがて、濃度依存的に生細胞によって再取り込みされる。細胞膜を通過する能力に加えて、Ｔａｔ由来の小ペプチドは血液脳関門を通過することができ、活性タンパク質を脳に送達することができた。ＢＢＢを通過して薬物を輸送するための有効な送達システムとしての、この方法（ペプチド−ベクター戦略）の可能性は、ラットにおけるその場脳灌流モデルによって、及びマウスへの静脈内注射によって実証されている１９，２０。
【００４０】
脳へのアンチセンス送達
アンチセンス・オリゴデオキシヌクレオチド類（ＯＤＮ類）は、負の電荷を有する高分子量の分子（１４核酸の分子量は、約５Ｋｄａである）である。非修飾（ありのままの）ＯＤＮ類及びＰＮＡ類は、イン・ビボでＢＢＢを通過することはできない。それ故、それらを直接脳室又は特定の大脳内部位のいずれかに投与する必要がある。大きな技術的制限（侵襲処置）とは別に、非修飾ＯＤＮ類は脳において急速に分解されるが、ホスホロチオエート（ＰＳ）−ＯＤＮ類は、脳脊髄液の大部分の流れを経て急速に消失するので、治療濃度（１μＭ２４，２５より大）では神経毒性であると考えられる。それ故、アンチセンス分子がＣＮＳ疾患のための有効な治療薬であるためには、送達システムに結合することが必要である。
【００４１】
これまでに開発された送達システムは、以下のように限定されていた：
１．イン・ビボでの低効率（ＯＤＮ−カプセル化リポソーム）。２．ＯＤＮ−ポリリジン複合体の場合における細胞毒性及びイン・ビボ不安定性の組み合わせ。４．急速な分解。５．急速な血漿クリアランス速度。大きな分子を脳に送達するために最近開発された戦略は、アビジンカチオン化アルブミンの複合体、或いはトランスフェリン受容体に向けられたＯＸ２６モノクローナル抗体に基づいている２１−２２。ＰＮＡは、又、ＯＸ２６／ストレプトアビジンベクターに結合する２３。この修飾により、脳へのペプチドの進入は少なくとも２８倍まで増加し、神経刺激性の小分子であるモルヒネに匹敵するレベルに達する（脳１ｇ当り０．１％の投与量）。更に、ＰＮＡ類は、ＢＢＢ薬物標的システムに結合するにもかかわらず、標的ＲＮＡに対し親和性を保持している。そのようなベクターの複雑性及び潜在的な免疫原性とは別に、この方法は、ベクター内に構築されたエンドソーム放出機能がなく、イン・ビボでは活性がないようである２６。
【００４２】
他の新しい技術は、まだいくつかの主要な障害を克服する必要がある。もしアンチセンス治療剤の見込みが神経薬理学の現実となるならば、代謝安定性、血漿タンパク質結合、細胞内分画及び細胞膜輸送のような因子が考慮される必要がある。
【００４３】
脳特異的アンチセンス
ＣＮＳ指向性遺伝子阻止技術の開発を目指す我々の方法は、いくつかの所見を基礎としている（ＢＢＢ輸送に関する追加文献：２７〜３１を参照）：
１．ＰＮＡを基本とするアンチセンスは、吸着依存性経細胞輸送を経由する、或いはキャリアーペプチド（修飾／又は非修飾）を経由する、のいずれかによって脳に送達されるべきである。
２．正電荷を有する表面タンパク質は、負電荷を有する細胞表面に接着し、改善された輸送効率をもたらす。カチオン分子は、エンドソームからの漏出を誘導することができ、それ故に核酸標的を含有する細胞下区画への膜貫通透過及び局在を増強する。
３．単一の毛細血管を通過する間の血漿から器官への抽出率が２０％以下であるような低透過性薬物については、取り込みは血流によって制限されない。それ故、単一方向性取り込みの相における脳組織蓄積は以下で表される：
Ｃｂｒａｉｎ  ＝  ＰＳ  ×  ＡＵＣ
（ＰＳ＝脳毛細血管透過性表面領域積。ＡＵＣ＝血中濃度時間曲線下面積）。
４．薬物動態学的性質（腎及び肝による取り込みの減少は、高い血漿ＡＵＣの結果となりＣｂｒａｉｎを増加させる）、及びマスクされた／減少した免疫原性を改善するためには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）との結合が必要である。
５．アンチセンス分子のほんの限られた数だけがＢＢＢを通過する。それ故、治療効果を達成するためには、アンチセンス力価を増加することが必要である。
６．最終産物は、合成及び修飾が簡単でなければならない。
７．相対的特異性：ある種の小分子に類似して、そして、もしＢＢＢ侵入を最適化する努力がなされれば、最終産物（リード化合物）は元のＰＮＡよりは特異性がないとしても、治療的には十分特異的である。
【００４４】
改良されたＰＮＡに基づくアンチセンス分子（ＩＰアンチセンス）
本発明の原理に従って、我々は、ＰＮＡ単位の分子内アミノ基と核酸塩基の結合がエチレンブリッジを介している改良されたＰＮＡ類縁体を提供する。この修飾はリボン延長に沿って正電荷を導入する。これらの正電荷を有する配列は、増強された水溶性を示す。更に、この修飾は、メチレンアミド置換体と比較して側鎖のフレキシビリティを増加させる。
【００４５】
カチオン性アルブミンに関して、この分子は吸着依存性経細胞輸送機構を経てＢＢＢを通過するであろうことが予期される（文献３１を参照）。チミン誘導体は、既に保護されたＮ，Ｎ−ビス−２−エチルアミノグリシン及びアシルイソシアナートからＨｙｒｕｐらによって合成された１４。次章において、我々は、市販の出発物質から４つの塩基全ての合成に関する一般的方法を概説する。
【００４６】
第三級アミン修飾ＰＮＡ（ｅｔｈＴ）のハイブリッド形成性は、一部Ｈｙｒｕｐらによって試験された１４。修飾ＰＮＡは、ＰＮＡデカマーの中央に取り込まれ、二本鎖モチーフ及び三本鎖モチーフでのこの修飾の効果が試験された。この修飾ＰＮＡは、ＰＮＡ−ＤＮＡ複合体の安定性を減少させた。しかしながら、低い安定性にもかかわらず、ｅｔｈＴ類縁体中のチミンは、ミスマッチがＴｍにおける更なる減少の原因となるので、ＤＮＡ鎖の相補性アデニンを特異的に認識した。我々は、同様に他のヌクレオチドを合成し、これら修飾ＰＮＡ類を合成する簡単な方法を開発した。
【００４７】
正電荷を有する第三級アミンは、吸着依存性経細胞輸送によって多分ＢＢＢを通過するであろうことが認められる。これら修飾ＰＮＡ（ＩＰ−ＰＮＡ）は、非修飾ＰＮＡ（Ａ）の「特異的キャリアー」として使用されるであろうし、又、分子の水溶性を改良するであろう。カチオン性分子は、肝臓によって急速に正常にクリアされる。それ故、薬物動態学的性質を改善するためには、アンチセンスがポリエチレングリコールと複合体化される（ＰＥＧ化される）ことにより有利になる。本発明の一実施態様によれば、別の範囲のものも又利用し得るが、２，０００〜３，４００の範囲の分子量を有するＰＥＧを使用することが好ましい。このことは、肝クリアランスを減少するための公知の技術である。その他の複合体又は技術も、クリアランスを減少する同じ目的を達成するのに使用することができる。
【００４８】
目下のところ、三つの特別な実施態様が最も好ましい。
１．フラッグ（Ｆｌａｇ）法：ＩＰ−ＰＮＡ単位の小配列（５〜１０）が５〜２５マーＰＮＡ配列の３’及び／又は５’位に取り込まれる。ＩＰ−ＰＮＡはこれらの位置に存在して、ＰＮＡ−ｍＲＮＡ／ＤＮＡ安定性に影響する可能性を減少する。
Ａ−Ａ−Ａ−Ａ．．．．Ａ−Ａ−ＩＰ−ＰＮＡ−ＩＰ−ＰＮＡ−ＩＰ−ＰＮＡ−Ｘ
【００４９】
２．荷電法：完全なＩＰ−ＰＮＡ配列及びそのハイブリッド形成性は、過去に試みられたことはなかった。しかしながら、我々のコンピューターによるモデリングに基づくと、この修飾ＰＮＡはアンチセンス性を有している。
ＩＰ−ＰＮＡ−ＩＰ−ＰＮＡ−ＩＰ−ＰＮＡ．．．．ＩＰ−ＰＮＡ−Ｘ
【００５０】
３．交互法：交互法では、ＩＰ−ＰＮＡがＰＮＡ配列に交互に取り込まれる。
Ａ−ＩＰ−ＰＮＡ−Ａ−ＩＰ−ＰＮＡ−Ａ．．．．Ａ−ＩＰ−ＰＮＡ−Ａ−ＩＰ−ＰＮＡ−Ｘ
【００５１】
（主鎖の誘導体化）
正規のＰＮＡ主鎖を利用する合成手順は文献によく報告されている。新しいタイプのＰＮＡを調製する場合、我々は、保護された主鎖、Ｎ−２−モノメトキシトリチル、２−アミノエチル、グリシンエチルの内部第二級アミンを、塩基性条件下においてヨードエタノール及びブロモエタノールによってアルキル化することを試みた。反応物質の比、塩基、反応温度を変えると、より悪い結果が得られた。そこで我々は市販品として入手できるもう一つの出発物質：二つのアミノ基（第一級及び第二級）と拘束されたヒドロキシル半体を含むＮ，Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエチルアミン（以下のスキーム２の化合物３）を採用した。主鎖（以下のスキーム２の化合物５）を構築する合成的観点の第一は離れたアミノ基を保護し、続いてブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルにより内部アミンをアルキル化することである。
【００５２】
ＢＯＣは第二級アミンに比べて第一級アミンに対する低い選択性のみを示し、そして４（以下のスキーム２の化合物４）の遠いアミノ基を保護する反応によって、モノ及びジ−ＢＯＣ生成物の混合物が得られた。Ｆｍｏｃ保護基は第一級アミンに対して非常に選択的であるが、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ反応条件下で開裂した。第一級アミンに対する高い選択性があり、そして導入し易いことが証明された二つの保護基は、モノメトキシトリチル（ＭＭＴ又はＭＭｔ）及びフタルイミド（Ｐｈｔ）保護基である。ＭＭＴは低濃度のＴＦＡによって数分以内に高収率で開裂する一方、Ｐｈｔｈ基はヒドラジン（又はヒドラジン誘導体）又は（メチルアミン又はエチルアミンのような）第一級アミンによって、低温にて長時間かけ（室温で２４〜４８時間）又は高温にてより短時間（６０〜７０℃で２〜３時間）で開裂する。
【００５３】
我々はこれらの現時点で好ましい保護基の両者を用いて進めることを決定した。
【００５４】
ＰＮＡ単位の合成がスキーム２に示されている。最初に、３の末端アミノ基をモノメトキシトリチル（ＭＭＴ）によって保護して化合物４を得た。次いで化合物４の内部アミノ基をブロモ酢酸エチル（ｔ−Ｂｕ）によってアルキル化して５を得た。
【００５５】
2004520261.tif 000006
【００５６】
ブロモ酢酸エチル（Ｒ＝Ｅｔ）による４のアルキル化は、側鎖上及びカルボニル基上に存在する遊離のヒドロキシル基の親核攻撃によって誘導される実質的量の副生成物を伴い６員環のラクトンを形成する。この反応を克服するためにｔ−ブチルエステルが導入された。
【００５７】
この分子内エステル交換は１Ｈ−ＮＭＲを用いて証明された。この望ましい主鎖のエチルエステル（−ＯＣＨ２−ＣＨ３）に特徴的な化学シフトが消え、そしてＨＯ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎのメチレン基の化学シフトが３．７から４．３ｐｐｍに移動した。この副反応故に、第二級アミンのアルキル化のためにブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルを使用した。所望の主鎖（５）をシリカゲル・カラムクロマトグラフィーで精製した。ｔ−ブチルエステルの安定性を、１Ｈ−ＮＭＲによって室温にて数日間追跡した。
【００５８】
核酸塩基の誘導体化
本質的に、核酸塩基は設計された主鎖に以下の三つの方法で結合させ得る：
ｉ）主鎖構造上に結合されたヒドロキシル基をブロミド基によって置換し、次いで乾燥ＤＭＦを中心とする乾燥溶媒中でＮａＨ、Ｋ２ＣＯ３、又はＣｓＣＯ３のような強塩基を使用して適切な位置で核酸塩基をアルキル化すること、ｉｉ）アルキルブロミド修飾を使用することを除いて上記と類似の手順を適用して、ヒドロキシル基をメシラートエステルに変換すること、及びｉｉｉ）保護された核酸塩基を、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ反応条件を用いて化合物（５）の２−ヒドロキシエチル基でアルキル化すること。これら三つの方法では、いずれも核酸塩基の反応サイト上に特別な保護基が必要である。我々の主鎖は実験条件下でアルキル化できる第三級アミンから成るため、我々は単にＭｉｔｓｕｎｏｂｕ反応を採用することを決めた。最初の三つの核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｇ）を結合させるための条件はよく報告されている。
【００５９】
このことに関して、Ｎ６環外アミンを保護せずにアデニン（Ａ）を使用した。この位置での保護がＭｉｔｓｕｎｏｂｕ条件下でのＮ９の位置選択的アルキル化を低下させるためである。保護されていないアデニンの溶解度を増すために、この反応混合物を４０℃に加温した。この環外アミンがカップリング反応を干渉し得るため、鎖の組み合せの前にアデニンのＮ６を保護すべきである。このように、保護されていないアデニンの結合の後で、ベンゾイル基をこの目的で使用した。
【００６０】
チミン（Ｔ）の場合、Ｎ１のアルキル化を導くためにＮ３を保護すべきである。ピリジン中で２４時間、過剰の塩化ベンゾイルを用いた（Ｔ）の処理によってチミン（Ｔ）をＮ３−Ｂｚ−Ｔ（８）に変換した。この結果、実際にＮ１，Ｎ３−ジベンゾイル化生成物（７）が得られた。
【００６１】
穏やかな塩基性条件を用いて、反応容器への水のその場添加によってＮ１−ベンゾイル基を選択的に開裂させた。この水溶液を８〜１０時間撹拌し、最終的に全てのＮ１−ベンゾイル基を開裂させ化合物（８）を得た（スキーム３）。過剰の安息香酸をエーテルで洗浄した後、所望のモノ保護Ｎ３−ベンゾイルチミン（８）を高収率で得た。
【００６２】
2004520261.tif 000007
【００６３】
グアニンもＮ２位置のアミノ基上で保護すべきである。この位置は反応性がなくそしてＭｉｔｓｕｎｏｂｕ反応に干渉し得ないが、その保護により有機溶媒中への核酸塩基の溶解性が改善できる。更に加えて、グアニンのＯ６部位はＭｉｔｓｕｎｏｂｕ条件下で非常に反応性があるため保護すべきである。この認識に従って、Ｎ２アミノ基を無水酢酸を用いたアシル化によって保護した。この処理によって、Ｎ９，Ｎ２−ジアセチル化グアニン（生成物９）を得た。
【００６４】
Ｎ２のアシル化はＯ６のカルバモイル化ステップより前に行わなければならない。何故ならば、保護されていないグアニン上での後者の反応により、実質的に不適切なジフェニルウレア保護基類縁体（Ｎ２上）が得られ、それが濃縮水酸化アンモニウム溶液の条件下で複雑な開裂性を示すためである。
【００６５】
2004520261.tif 000008
【００６６】
生成物（９）を収集し、続いてＯ６カルボニルを塩化ジフェニルカルバモイルによってカルバモイル化した。溶媒を蒸発しそして残留物を還流下でエタノール−水混合物（１：１）で処理してＮ９アセトアミド基を加水分解した後、最終生成物（１０）を得た。
【００６７】
シトシンの場合、通常使用される手順は、上記方法（１）を用いてハロゲン化アルキル（我々の場合、モノマー主鎖上のエチルブロミド残基）のベンゾイル化を介してＮ４位置を保護した後、シトシンのＮ１位置をＮａＨ又は炭酸セシウムのような強塩基によってアルキル化することである。Ｋｕｗａｈａｒａ及び彼の共同研究者ら１０ｂは、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ反応をＮ４−ベンゾイル化シトシンに応用しようと試みたが成功しなかった。与えられた説明の一部として、乾燥ＴＨＦ中へのＮ４−ベンゾイル化シトシンの純粋な溶解性に触れている。我々は、より親油性の保護基を使用することによってこの障害を解決することを図った。この目的のためにジフェニルアセチル（ＤＡＰ）を選んだ。これに関連して、シトシン（Ｃ）のＮ４アミノ基をピリジン中、塩化ジフェニルアセチルによって高収率、高純度で保護した（スキーム５）。
【００６８】
2004520261.tif 000009
【００６９】
全ての保護された塩基（Ｇ、Ｔ及びＣ）を標準Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ条件下でアルコール（５）と反応して、生成物１２Ｇ、１２Ｔ及び１２Ｃが得られた。Ｎ４−ＤＰＡ−シトシンの結合は高収率で成功裡に達成された。アデニンが全く保護なしでＭｉｔｓｕｎｏｂｕ反応に採用された。ＰＮＡ主鎖へのアデニンの結合に続いてアデニンのＮ４アミノ基のアシル化が起こった。
【００７０】
2004520261.tif 000010
【００７１】
化合物１２Ａ、１２Ｔ、１２Ｇ及び１２ＣのＭＭＴ及びｔｅｒｔ−ブチル保護基をクロロホルム又はＤＣＭ中のＴＦＡ又は１０％臭化水素／酢酸によって除去し、続いてクロロぎ酸−９−フルオレニルメチル（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）又は炭酸−（９−フルオレニルメチル）スクシンイミジル（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）で処理することによって、遊離酸のＦｍｏｃ誘導体が得られた。
【００７２】
2004520261.tif 000011
【００７３】
２％のＴＦＡを３０分間適用することにより、ｔｅｒｔ−ブチルエステルを除去せずに１２（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）のＭＭＴ開裂が起こった。
【００７４】
2004520261.tif 000012
【００７５】
全ての中間体と最終生成物を１Ｈ−ＮＭＲ及び高分解能質量スペクトル分析によって解析した。
【００７６】
（実施例）
合成例
Ｉ）ＰＮＡ主鎖の合成：
Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリス（２−ヒドロキシエチル）−（２−（モノメトキシトリチル）アミノエチル）グリシンｔｅｒｔ−ブチル（５）：
Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−（２−（モノメトキシトリチル）アミノ）エタン（４）：
２０ｍｌ（２００ｍｍｏｌ）の（２−ヒドロキシエチル）エチレンジアミン（ＨＥＥＤ）（３）と３０ｍｌ（０．２ｍｏｌ）のトリエチルアミン（ＴＥＡ）を１００ｍｌのジクロロメタンに溶解した。この混合物を塩化ナトリウム氷浴中で０℃に冷却した。激しく撹拌しながら、塩化メチレン（ＤＣＭ）５０ｍｌ中１５ｇ、（４８．５７ｍｍｏｌ）のＭＭＴ−Ｃｌを１時間かけて滴下しながら添加した。この混合物を更に０℃で２時間撹拌し、次いで室温まで昇温して更に２０時間撹拌した。過剰のＨＥＥＤを除去するため、有機層を３×１００ｍｌの水で洗浄した。この有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、固形分を濾過し溶媒を蒸発乾固した。この黄色油状物を更に精製することなく使用した。
【００７７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ：
７．４９−７．１５（ｍ、１２Ｈ、ＭＭＴ）；７．１４−６．７９（ｄｄ、２Ｈ、ＭＭＴ）；３．７６（ｓ、３Ｈ、−ＯＣＨ３）；３．６１−３．５８（ｔ、２Ｈ、ＨＯ−ＣＨ２−）；２．７５−２．６８（ｍ、４Ｈ、−（ＣＨ２）２−ＮＨ）；２．３−２．２６（ｔ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＮＨ−ＭＭＴ）。
【００７８】
上記生成物を１００ｍｌのジクロルメタンに溶解し、そして７ｍｌ（５０ｍｍｏｌ）のトリエチルアミンを添加した。この混合物を０℃に冷却し、そして塩化メチレン２０ｍｌ中８．５７ｍｌ（５８ｍｍｏｌ）のブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチルを滴下しながら添加した。この混合物を室温で２４時間撹拌した。有機相を３×１００ｍｌの水で水洗し、硫酸ナトリウム上で乾燥した。固形分を濾過した後、溶媒を減圧下で蒸発乾固した。黄色の高粘度生成物をシリカゲル・カラムクロマトグラフィーで精製した。所望の生成物が無色高粘度油状物として得られた。溶出溶媒：石油エーテル中３０〜５０％のエーテル。
【００７９】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
７．４８−７．４５（ｄｄ、Ｊ１−３＝８．４，Ｊ１−４＝１．２Ｈｚ、２Ｈ、ＭＭＴ）；７．３８−７．３６（ｄ、Ｊ＝７．８Ｈｚ、２Ｈ、ＭＭＴ）；７．３０−７．１４（ｍ、８Ｈ、ＭＭＴ）；６．８５−６．７９（ｄｄ、Ｊ１−３＝１５．３Ｈｚ、Ｊ１−４＝２．１Ｈｚ，２Ｈ、ＭＭＴ）；３．７７（ｓ、３Ｈ、Ｈ３ＣＯ−）；３．５９−３．５６（ｔ、Ｊ＝５．１Ｈｚ、２Ｈ、ＨＯ−ＣＨ２−）；３．１３（ｓ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−ＣＯＯ−）；２．７９−２．７１（ｍ、４Ｈ、Ｎ（ＣＨ２）２−）；２．２２−２．１８（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ，−ＣＨ２−ＮＨ−ＭＭＴ）；１．４１（ｓ，９Ｈ，ｔｅｒｔ−Ｂｕｔ）。
【００８０】
ＩＩ）核酸塩基の保護：
（１）チミン：
４０ｍｌの乾燥ピリジン中５ｇ（４０ｍｍｏｌ）のチミン（Ｔ）の懸濁液に、１５ｍｌ（１３０ｍｍｏｌ）のＢｚ−Ｃｌを添加し、そしてこの反応混合物を一晩室温で撹拌した。ＴＬＣによって反応の終点が示唆された。この反応混合物を０℃に冷却し、そして３０ｇの氷を数回に分けて添加した。反応温度を室温まで上げ、更に８〜１０時間撹拌を続けた。溶媒を減圧下で除去し、高粘度残留物に激しく撹拌しながら２００ｍｌのエーテル及び１００ｍｌの水を添加した。白色の沈殿を濾過し、そして１００ｍｌのエーテルで洗浄した。
【００８１】
ＴＬＣ（１０％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ３）ｄｉＢｚ−Ｔ  ＲＦ＝０．９５
Ｂｚ−Ｔ  ＲＦ＝０．５
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
７．９６−７．９３（ｄｄ、Ｊ１−３＝１１．４Ｈｚ、Ｊ１−４＝１．２Ｈｚ、２Ｈ、２Ｈ、ＣＯに対してｏ（オルト））；７．７０−７．６５（ｍ、１Ｈ、Ｈ、ＣＯに対してｐ（パラ））；７．５４−７．４９（ｍ、２Ｈ、Ｈ２、ＣＯに対してｍ（メタ））；７．０３（ｓ，１Ｈ，Ｈ−（Ｃ６））；１．９１（ｓ，３Ｈ，Ｈ３Ｃ−（Ｃ５））。
【００８２】
（２）グアニン：
１００ｍｌのＮ−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）及び２０ｍｌの無水酢酸中５ｇ（３３ｍｍｏｌ）のグアニンの懸濁液を３時間、１５０℃に加熱した。この透明な溶液を室温で２４時間撹拌した。沈殿物を濾過して収集し、そしてアセトンで洗浄した。Ｎ９，Ｎ２−ジアセチル化グアニン（９）を乾燥し、そして１Ｈ−ＮＭＲで同定した。
【００８３】
Ｍ．Ｐ．＝分解、２７０℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：
１２．１（ｂｓ、１Ｈ−（Ｎ））；８．５３（ｓ、１Ｈ，Ｈ−（Ｃ８））；２．９１（ｓ、３Ｈ，Ａｃ−（Ｎ９））；２．３１（ｓ、３Ｈ，−（Ｎ２−ＣＯＣＨ３））。
【００８４】
５ｇ（２１．２５ｍｍｏｌ）の（９）を、１００ｍｌの乾燥ピリジン及び過剰のジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）中に懸濁した。次いで、５．９１ｇ（２５．５１ｍｍｏｌ）の塩化ジフェニルカルバモイルを数回に分けて添加した。この反応混合物は直ちに橙色に変わった。撹拌を室温で２時間続け、次いで２０ｍｌの氷冷水を添加した。この混合物を更に１０分間撹拌して、減圧下で溶媒を除去した。１００ｍｌのエタノール及び１００ｍｌの水を添加し、そしてこの混合物を１．５時間還流した。室温まで冷却後、激しい撹拌を一晩中続けた。所望の生成物（１０）を濾過して集め、そして５０ｍｌのエタノールで洗浄し、乾燥後解析した。
【００８５】
Ｍ．Ｐ．＝１８５℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：
１０．７（ｓ、１Ｈ、Ｈ−（Ｎ２））；８．５５（ｓ、１Ｈ、Ｈ−（Ｃ８））；７．６１−７．３８（ｍ、１０Ｈ、芳香族）；２．２８（ｓ、３Ｈ、−ＣＯＣＨ３）。
【００８６】
（３）シトシン：
Ｎ４−（ジフェニルアセチル）シトシン：
３０ｍｌの乾燥ピリジン中３ｇ（２７ｍｍｏｌ）のシトシン（Ｃ）の攪拌懸濁液に、室温で６．８５ｇ（２９．７ｍｍｏｌ）の塩化ジフェニルアセチルを数回に分けて添加した。この反応混合物を室温で一晩中撹拌した。ＴＬＣが反応の終点を示唆した。２ｍｌの水を添加し、そして減圧下で溶媒を蒸発させた。残留物に１００ｍｌの水を添加し、そしてこの混合物を３０分間激しく撹拌した。所望の生成物（１１）を沈殿させ濾過した。白色沈殿を１００ｍｌのエーテルで洗浄しそして乾燥した。
【００８７】
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：
１１．４３（ｂｓ、１Ｈ、Ｈ−（Ｎ４））；７．９５−７．９３（ｄ、Ｊ＝６．９Ｈｚ，１Ｈ、Ｈ−（Ｃ５））；７．４４−７．４２（ｍ、１０Ｈ、芳香族）；７．２６−７．２４（ｄ、１Ｈ、Ｈ−（Ｃ６））；５．４８（ｓ、１Ｈ、Ｈ−（Ｃ−ジフェニル））。
【００８８】
ＩＩＩ）核酸塩基の結合
Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ条件を用いて、三つの核酸塩基（Ｏ６−ＤＰＣ、Ｎ２−Ａｃ−Ｇ；Ｎ３−Ｂｚ−Ｔ；Ａ；及びＮ４−ＤＰＡ−Ｃ）を主鎖に結合した。これらの核酸塩基を、真空下、デシケータ中のＰ２Ｏ５とＫＯＨ上で乾燥した。
【００８９】
核酸塩基の結合のための一般的手順
（２０ｍｍｏｌ）の主鎖を、３×５０ｍｌの乾燥トルエンによる連続共蒸留（ｃｏ−ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）によって乾燥した。この乾燥した主鎖を２００ｍｌの乾燥した新しいＴＨＦに溶解した。この反応容器に、（１８．３ｍｍｏｌ）の適切な核酸塩基（Ｏ６−ＤＰＣ、Ｎ２−Ａｃ−Ｇ；Ｎ３−Ｂｚ−Ｔ；Ａ；及びＮ４−ＤＰＡ−Ｃ）及び２０ｍｍｏｌのトリフェニルホスフィン（ＴＰＰ）を不活性雰囲気下で添加した。この混合物を０℃に冷却した。この撹拌した混合物に、１．１当量のジエチルアゾジカルボキシレート（ＤＥＡＤ）を１時間かけて滴下しながら添加した。この混合物を室温（アデニンに対しては４０℃）で２４時間撹拌し、そして溶媒を蒸発乾固した。所望の生成物をシリカゲル・カラムクロマトグラフィーで精製した。溶出溶媒：Ｎ３−Ｂｚ−Ｔに対しては：石油エーテル→２７％エーテル／石油エーテル；Ａに対する溶出溶媒：エーテル→２６％メタノール／エーテル；Ｇに対しては：エーテル→４％メタノール／エーテル；そしてＤＰＡ−Ｃに対しては：石油エーテル→２７％エーテル／石油エーテル。
【００９０】
１２（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）から１３（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）への変換のための一般的手順
ａ）０．１ｍｏｌのＴＦＡを、５ｍｌＤＣＭ中２．５ｍｍｏｌの１２（ＡＣＧＴ）及び０．２５ｍｌのトリイソプロピルシランの溶液に滴下しながら添加する。この反応混合物を室温で４８時間攪拌し、蒸発し冷却して乾固する。残留物を、ＮａＨＣＯ３（１５ｍｌ）及びアセトニトリル（１５ｍｌ）の１０％水溶液に溶解する。この溶液を氷浴中で冷却し、続いてアセトニトリル中（７ｍｌ）の３．０ｍｍｏｌの炭酸−（９−フルオレニルメチル）スクシンイミジル（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）又はクロロぎ酸−９−フルオレニル（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）を添加する。この反応混合物を室温で１２時間撹拌し、蒸発乾固する。残留物を水（１０ｍｌ）に溶解し、そして水層をジエチルエーテルで洗浄（３×１０ｍｌ）し、１０％のＫＨＳＯ４を用いてｐＨ７に調整する。その結果二つの層が形成される。この上部水層を捨て下の層を水（５ｍｌ）で洗浄し、乾燥して白色固体を得る。Ｎ３ベンゾイルチミンの場合は、ＴＦＡが一部のベンゾイル保護基を開裂させ、そして、形成したこの二つの生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、溶出液３〜５％エタノール／ジエチルエーテル）で分離した。
【００９１】
二つの代替方法も効果的である。ｂ）１０％の臭化水素／酢酸と１時間反応させることによって保護基（ＭＭＴ及びｔｅｒｔ−Ｂｕｔ）を開裂させる、及びｃ）相分離の後、下層をＤＣＭで抽出する。
【００９２】
１２（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）から１２（ＡＮ、ＣＮ、ＧＮ、ＴＮ）への変換のための一般的手順
２．０ｍｍｏｌの１２（ＡＣＧＴ）及び０．２５ｍｌのトリイソプロピルシランに、ＴＦＡのＤＣＭ溶液２０ｍｌ（２％）を冷却しながら（氷浴）滴下して添加する。この反応混合物を３０分間撹拌し、蒸発し冷却して乾固する。残留物を２０ｍｌのＤＣＮに溶解し、１０％のＮａＨＣＯ３水溶液（１５ｍｌ）、続いて５ｍｌの水で洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し蒸発する。残留固形分をカラムクロマトグラフィー（シリカ、溶出液：酢酸エチル〜１０％メタノール／酢酸エチル）にかける。１２ＧＮの場合、数回ジエチルエーテルで粉末化して純粋な生成物を得る。
【００９３】
Ｎ−｛（３−Ｎ−ベンゾイルチミン−１−イル）エチル｝−Ｎ−（２−Ｍｍｔ−アミノエチル）グリシンｔｅｒｔ−ブチル（１２Ｔ）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
７．９３−７．９１（ｄ、２Ｈ、Ｎ３−Ｂｅｎｚ）；７．５９−７．６１（ｔ、１Ｈ、Ｎ３−Ｂｅｎｚ）；７．４７−７．７１（ｍ、１５Ｈ、ＭＭＴ＋Ｎ３−Ｂｅｎｚ＋１Ｈ−（Ｃ６））；６．８１−６．７８（ｄ、２Ｈ、ＭＭＴ）；３．７６（ｓ、３Ｈ、−ＯＣＨ３）；３．６９−３．６８（ｔ、２Ｈ、−ＣＨ２−（Ｎ１−Ｔ）；３．０７（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２−ＣＯＯ−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔ）；２．８８−２．７（ｍ、４Ｈ、Ｎ−（ＣＨ２）２−）；２．２４−２．２３（ｍ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＮＨ−ＭＭＴ）；１．７５（ｓ、３Ｈ、Ｃ（４）ＣＨ３）；１．４１（ｓ、９Ｈ、ｔｅｒｔ−Ｂｕｔ）。
ＭＳ、ｍ／ｅ：７０２．９（Ｍ＋）、計算値：７０２．８５
Ｍ．Ｐ．＝１２２℃
ＴＬＣ（５％メタノール／塩化メチレン）  ＲＦ＝０．７５
【００９４】
Ｎ−｛（６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−３−Ｎ−アセチルグアニン−９−イル）エチル｝−Ｎ−（２−Ｍｍｔ−アミノエチル）グリシンｔｅｒｔ−ブチル（１２Ｇ）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
８．０３（ｓ、１Ｈ、Ｈ−（Ｃ８））；７．７−７．１３（ｍ、２２Ｈ、ＭＭＴ＋ＤＰＣ）；６．７９−６．７６（ｄ、２Ｈ、ＭＭＴ）；４．１２−４．０６（ｔ、２Ｈ、ＣＨ２−（Ｎ９））；３．７４（ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ３）；３．０７（ｓ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯＯ−）；２．９９−２．９５（ｔ、２Ｈ、−ＣＨ２−Ｎ−）；２．８３−２．７９（ｔ、２Ｈ、−ＣＨ２−Ｎ−）；２．５３（ｓ、３Ｈ、Ｎ２−Ａｃ）；２．２１−２．１７（ｔ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＮＨ−ＭＭＴ）；１．４２（ｓ、９Ｈ、ｔｅｒｔ−Ｂｕｔ）。
ＭＳ、ｍ／ｅ：８６１（Ｍ＋）、計算値：８６１．０１
ＴＬＣ（５％メタノール／塩化メチレン）  ＲＦ＝０．６４
Ｍ．Ｐ．＝５０−５３℃
【００９５】
Ｎ−（２−Ｍｍｔ−アミノエチル）−Ｎ−（アデニン−９−イル−エチル）グリシンｔｅｒｔ−ブチル（１２Ａ）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
８．２７（ｓ、１Ｈ、Ｈ−（Ｃ８））；７．８７（ｓ、１Ｈ、Ｈ−（Ｃ２））；７．４３−７．１３（ｍ、１２Ｈ、ＭＭＴ）；６．７９−６．７６（ｄ、２Ｈ、ＭＭＴ）；５．７（ｂｓ、２Ｈ、Ｈ２−（Ｎ２））；４．１５−４．１１（ｔ、２Ｈ、−ＣＨ２−（Ｎ９））；３．７６（ｓ、３Ｈ、−ＯＣＨ３）；３．０（ｓ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯＯ−）；３．０−２．９６（ｔ、２Ｈ、−ＣＨ２−Ｎ−）；２．８２−２．７８（ｔ、２Ｈ、−Ｎ−ＣＨ２−）；２．１９−２．１６（ｔ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＮＨ−ＭＭＴ）；２．０６（ｂｓ、１Ｈ、−ＮＨ−ＭＭＴ）；１．３９（ｓ、９Ｈ、ｔｅｒｔ−Ｂｕｔ）。
ＭＳ、ｍ／ｅ：６０７．９（Ｍ＋）、計算値：６０７．７５
ＴＬＣ（５％メタノール／塩化メチレン）  ＲＦ＝０．４
Ｍ．Ｐ．＝６０−６２℃
【００９６】
Ｎ−｛（４−Ｎ−（ジフェニルアセチル）シトシン−１−イル）エチル｝−Ｎ−（２−Ｍｍｔ−アミノエチル）グリシンｔｅｒｔ−ブチル（１２Ｃ）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：
１１．４（ｂｓ、１Ｈ、Ｈ−（Ｎ４））；８．０３−７．９５（ｄ、１Ｈ、Ｈ−（Ｃ６））；７．８−６．７５（ｍ、１４Ｈ、ＭＭＴ）；６．７５（ｍ、１０Ｈ、ＤＰＡ＋Ｈ−（Ｃ５））；５．６５（ｓ、１Ｈ、Ｈ−（ＤＰＡ））；３．９５−３．９（ｔ、２Ｈ、−ＣＨ２−（Ｎ１））；３．７６（ｓ、３Ｈ、−ＯＣＨ３）；３．０（ｓ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯＯ−）；２．８３−２．７９（ｔ、２Ｈ、−ＣＨ２−Ｎ）；２．７６−２．７４（ｔ、２Ｈ、−Ｎ−ＣＨ２）；２．１９−２．１６（ｔ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＮＨ−ＭＭＴ）；１．３９（ｓ、９Ｈ、ｔｅｒｔ−Ｂｕｔ）。
ＭＳ、ｍ／ｅ：７７８．１（Ｍ＋）、計算値：７７７．９６
ＴＬＣ（５％メタノール／塩化メチレン）  ＲＦ＝０．６７
【００９７】
Ｎ−｛（３−Ｎ−ベンゾイルチミン−１−イル）エチル｝−Ｎ−（２−Ｆｍｏｃ−アミノエチル）グリシン（１３Ｔ）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
７．９−７．９０（ｄ、２Ｈ、Ｂｚ）；７．２−７．６７（ｍ、８Ｈ、Ｆｍｏｃ＋３ＨＢｚ）；７．１２（ｓ、１Ｈ、Ｈ−Ｃ６）；４．３８（ｂｄ、２Ｈ、Ｆｌｕｏ−ＣＨ２）；４．１９（ｂｔ、１Ｈ、Ｆｌｕｏ−Ｈ）；３．４（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２−ＣＯＯＨ）；３．７９（ｂｔ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２）；３．２２（ｂｔ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２）；２．９０（ｂｔ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＣＨ２）；２．７９（ｂｔ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＣＨ２）；１．８４（ｓ、３Ｈ、Ｃ５−ＣＨ３）。
ＭＳ、ｍ／ｅ：５９６（Ｍ＋）、計算値：５９６．２３
Ｍ．Ｐ．＝１１３℃
【００９８】
Ｎ−｛（４−Ｎ−（ジフェニルアセチル）シトシン−１−イル）エチル｝−Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン（１３Ｃ）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：
８．０２−７．１９（ｍ、１９Ｈ、Ｈ−Ｃ６＋Ｆｍｏｃ＋ＤＰＡ）；５．６５（ｂｄ、１Ｈ、Ｃ５−Ｈ）；５．１９（ｓ、１Ｈ、（Ｐｈ）２−ＣＨ）；４．２５（ｂｄ、２Ｈ、Ｆｌｕｏ−ＣＨ２）；４．１９（ｂｔ、１Ｈ、Ｆｌｕｏ−Ｈ）；３．８３（ｂｔ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２）；３．５０（ｂｔ、２Ｈ、Ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２）；３．４１（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２−ＣＯＯＨ）；２．８８（ｂｔ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＣＨ２）；２．６６（ｂｔ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＣＨ２）。
ＭＳ、ｍ／ｅ：６７２（Ｍ＋）、計算値：６７１．７４
Ｍ．Ｐ．＝１４４〜１５０℃
【００９９】
Ｎ−｛（６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−３−Ｎ−アセチルグアニン−９−イル）エチル｝−Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンｔｅｒｔ−ブチル（１２ＧＮ）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
７．５８（ｓ、１Ｈ、Ｃ８−Ｈ）；７．４０−７．２０（ｍ、１０Ｈ、ＤＰＣ）；４．１８（ｂｔ、２Ｈ、Ｎ９−ＣＨ２）；３．６０（ｂｍ、２Ｈ、ＮＨ２−ＣＨ２）；３．２０（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２−ＣＯＯＨ）；２．９８（ｂｔ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＣＨ２）；２．６０（ｂｔ、２Ｈ、ＣＨ２ＮＣＨ２）；１．６２（ｓ、３Ｈ、Ｃ２ＮＨＣＯＣＨ３）；１．１９（ｓ、９Ｈ、ｔ−Ｂｕｔ）。
ＭＳ、ｍ／ｅ：５８９（Ｍ＋）、計算値：５８８．８６
【０１００】
2004520261.tif 000013
【０１０１】
代替保護基及び合成スキーム
モノマー主鎖の末端アミノ成分に導入されたその他の保護基はフタルイミド基であった。一般的合成方法を以下のスキームに示す。
【０１０２】
2004520261.tif 000014
Ｒ＝（ａ）−メチル（Ｍｅ）、（ｂ）−エチル（Ｅｔ）、（ｃ）−プロピル（Ｐｒｏｐ）、（ｄ）−ｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、（ｅ）−ベンジル（Ｂｎｚ）、（ｆ）−ＭＭＴ、（ｇ）水素（Ｈ）、Ｘ＝Ｈ、Ｃｌ
【０１０３】
三ステップの反応を介して最終生成物を得た。第一ステップは１４を得るためのアミノエチルアミノエタノールの外側のアミノ基へのフタルイミド保護基の結合を表している。
【０１０４】
第二ステップには、（Ｒ）−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−（２−フタルイミドアミノエチル）グリシンアルキル（１５）を形成するための、１４と臭化酢酸アルキル（Ｒ）との反応が含まれる。第三ステップは、化合物１６（ＡＴＣＧ）を得るための保護された核酸塩基の１５へのカップリングを表す。
【０１０５】
２−（２−フタルイミドエチルアミノ）エタノール（１４）の一般的調製方法：
１０．４ｇ（０．１ｍｏｌ）のＮ，Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）エチルアミン及び２２ｇ（０．１ｍｏｌ）のＮ−エトキシカルボニルフタルイミドを５０ｍｌの水に溶解して２時間撹拌した。この反応混合物を凍結乾燥し、そして固体生成物をメタノール（４０ｍｌ）で洗浄した。残留する白色固体（化合物１４）を収集し乾燥した。
【０１０６】
（Ｒ）−Ｎ−（２−フタルイミドアミノエチル）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）グリシンアルキル（１５）の一般的調製方法：
１００ｍｌのＤＭＦ中１１．７ｇ（５０ｍｍｏｌ）の２−（２−フタルイミドエチルアミノ）エタノールに８．７５ｍｌ（５８ｍｍｏｌ）の臭化酢酸ｔｅｒｔ−ブチルを添加した。この反応混合物を１週間激しく撹拌した。次いで、真空下で溶媒を除去し、残留した高粘度油状物を２００ｍｌのクロロホルムに溶解し、それを水で二回洗浄した。水相を２００ｍｌのクロロホルムで抽出し、そして有機相を集めて硫酸ナトリウムを用いて乾燥し、濾過、蒸発して淡黄色油状物を得た。精製はクロマトグラフィーによって行った（固相：シリカ、溶出液：クロロホルム）。収率６０％。
【０１０７】
核酸塩基の結合
上記のとおりＭｉｔｓｕｎｏｂｕ反応を介して、４つの核酸塩基（Ｏ６−ＤＰＣ，Ｎ２−Ａｚ−Ｇ；Ｎ３−Ｂｚ−Ｔ；Ａ；及びＮ４−ＤＰＡ−Ｃ）を主鎖（１５）に結合した。
Ｎ−｛（３−Ｎ−ベンゾイルチミン−１−イル）エチル｝−Ｎ−（２−フタルイミドアミノエチル）グリシンｔｅｒｔ−ブチル（１６Ｔ）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
７．９９−７．４８（ｍ、９Ｈ、Ａｒ）；７．２５（ｓ、１Ｈ−（Ｃ６））；３．７８（ｂｔ、４Ｈ、−ＣＨ２−（Ｎ１−Ｔ）＋ＣＨ２−（Ｐｈｔ−Ｎ−）；３．３５（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２−ＣＯＯ−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔ）；２．９８（ｍ、４Ｈ、（ＣＨ２）Ｎ−（ＣＨ２））；１．７９（ｓ、３Ｈ、Ｃ（４）ＣＨ３）；１．４１（ｓ、９Ｈ、ｔｅｒｔ−Ｂｕｔ）。
ＭＳ、ｍ／ｅ：５６１．１（Ｍ＋）、計算値：５６０．６
Ｍ．Ｐ．＝１５２℃
【０１０８】
Ｎ−｛（６−Ｏ−ジフェニルカルバモイル−３−Ｎ−アセチルグアニン−９−イル）エチル｝−Ｎ−（２−フタルイミドアミノエチル）グリシンｔｅｒｔ−ブチル（１６Ｇ）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
８．１９（ｂｓ、１Ｈ、Ｃ２−ＮＨ）；７．９８（ｓ、１Ｈ、Ｈ−（Ｃ８））；７．７８−７．３２（ｍ、１４Ｈ、ＤＰＣ＋Ｐｈｔ）；４．１９（ｂｔ、２Ｈ、ＣＨ２−（Ｎ９））；３．７０（ｂｔ、２Ｈ、ＰｈｔＮＣＨ２）；３．１９（ｂｔ、２Ｈ、−ＣＨ２−Ｎ−）；３．０２（ｂｔ、２Ｈ、−ＣＨ２−Ｎ−）；２．６０（ｓ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯＯ−）；１．６４（ｓ、３Ｈ、Ｎ２−Ａｃ）；１．２２（ｓ、９Ｈ、ｔｅｒｔ−Ｂｕｔ）。
ＭＳ、ｍ／ｅ：７１９．２（Ｍ＋）、計算値：７１８．２９
Ｍ．Ｐ．＝分解
【０１０９】
Ｎ−（２−フタルイミドアミノエチル）−Ｎ−（アデニン−９−イル−エチル）グリシンｔｅｒｔ−ブチル（１６Ａ）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
８．１４（ｓ、１Ｈ、Ｈ−（Ｃ２））；７．８８（ｓ、１Ｈ、Ｈ−（Ｃ８））；７．８−７．７１（ｍ、１４Ｈ、Ｐｈｔ）；５．８５（ｂｓ、２Ｈ、Ｃ６−ＮＨ２）；４．２０（ｔ、２Ｈ、−ＣＨ２−（Ｎ９））；３．６９（ｂｔ、２Ｈ、ＰｈｔＮＣＨ２）；３．３５（ｓ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯＯ−）；３．１９（ｔ、２Ｈ、ＣＨ２−Ｎ−）；３．０１（ｔ、２Ｈ、−Ｎ−ＣＨ２−）；１．４２（ｓ、９Ｈ、ｔｅｒｔ−Ｂｕｔ）。
ＭＳ、ｍ／ｅ：４６６．２（Ｍ＋）、計算値：４６５．２１
Ｍ．Ｐ．＝１５１℃
【０１１０】
Ｎ−｛（４−Ｎ−（ジフェニルアセチル）シトシン−１−イル）エチル｝−Ｎ−（２−フタルイミドアミノエチル）グリシンｔｅｒｔ−ブチル（１６Ｃ）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
９．９２（ｂｓ、１Ｈ、Ｃ４−ＮＨ）；７．１５（ｂｄ、１Ｈ、Ｈ−（Ｃ６））；７．９２−７．２１（ｍ、１４Ｈ、Ｐｈｔ＋ＤＰＡ）；３．８５と３．７２（ｄｔ、４Ｈ、ＣＨ２−（Ｎ１）＋Ｐｈｔ−ＣＨ２）；３．０（ｓ、２Ｈ、−ＣＨ２−ＣＯＯ−）；３．０９−２．９２（ｍ、４Ｈ、−ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ２）；１．３９（ｓ、９Ｈ、ｔｅｒｔ−Ｂｕｔ）。
ＭＳ、ｍ／ｅ：６３６．２（Ｍ＋）、計算値：６３５．７１
Ｍ．Ｐ．＝分解
【０１１１】
Ｎ−（２−フタルイミドアミノエチル）−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）グリシンｔｅｒｔ−ブチル（１５）：
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
７．８４（ｍ、２Ｈ、Ａｒ）；７．６８（ｍ、２Ｈ−Ａｒ）；３．７５（ｔ、２Ｈ、ＣＨ２−（Ｐｈｔ−Ｎ）；３．４８（ｔ、２Ｈ、ＣＨ２−ＯＨ）；３．２９（ｓ、２Ｈ、ＣＨ２−ＣＯＯ−ｔｅｒｔ−Ｂｕｔ）；２．９４−２．８０（ｍ、４Ｈ、（ＣＨ２）Ｎ−（ＣＨ２））；１．３９（ｓ、９Ｈ、ｔｅｒｔ−Ｂｕｔ）。
ＭＳ、ｍ／ｅ：３４９．１（Ｍ＋）、計算値：３４８．７
Ｍ．Ｐ．＝１５８℃
【０１１２】
2004520261.tif 000015
【０１１３】
正電荷を有するＰＮＡを含むペプチド核酸類縁体類（ＰＮＡオリゴマー類）
「フラッグ（ｆｌａｇ）法」を用いたオリゴマ−状ＰＮＡを、本発明の正電荷を有するＰＮＡ類縁体類の鎖を組み込むことによって合成した。太字の配列の左に（ＣからＣまで）、本発明の正電荷を有するＰＮＡで構築される配列の画分がある。ＮＨ２半体は配列の末端である。配列の反対側の部分（ＣＯＯＨで始まるＧからＴ）は、標準の（正規の）ＰＮＡ類から構築された。樹脂上のＰＮＡ集合体はアミノ酸リシンから始まる。この樹脂はＷｏｎｇ樹脂であり、そして本実施例で使用される方法はＦｍｏｃ法である。
【０１１４】
2004520261.tif 000016
【０１１５】
全ての手順は、当業者には公知のカップリング法によって実施された。
【０１１６】
2004520261.tif 000017
【０１１７】
上記の実施例は本質的に非限定的なものであり、そして単に本発明の原理を例示することを意図したものである。以下の特許請求の範囲に定義されている本発明の範囲を逸脱することなく、これら特定態様の多くの変更、改良及び修正が可能であることを当業者は理解するであろう。
【０１１８】
2004520261.tif 000018
2004520261.tif 000019
2004520261.tif 000020
2004520261.tif 000021
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2004520261.tif 000023
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＤＮＡにアニーリングするＰＮＡ及びＩＰ−ＰＮＡの分子モデリング。
【図１】
2004520261.tif 000027
【国際公開パンフレット】
2004520261.tif 000028
2004520261.tif 000029
2004520261.tif 000030
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2004520261.tif 000074
2004520261.tif 000075
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520261.tif 000076
【国際調査報告】
2004520261.tif 000077