(57)【要約】ヌクレオチド配列中に突然変異を検出するための方法本発明は、異なるヌクレオチド配列中に並行的に突然変異を検出ために使用可能な方法であって、当該方法で追加的に、変異および非変異ヌクレオチド配列の転写速度を決定することを可能にする、前記方法に関する。本方法は、一本鎖試料ヌクレオチド配列を一本鎖基準ヌクレオチド配列とハイブリッド形成させること、当該ハイブリッド形成の前または間に一本鎖基準ヌクレオチド配列または一本鎖試料ヌクレオチド配列を、または当該ハイブリッド形成の後または間に基準および試料ヌクレオチド配列から成るヘテロ二本鎖を、電子的にアドレス可能な表面上に固定すること、ヘテロ二本鎖誤対合を認識する基質とインキュベートすること、そして当該基質結合を検出すること、の手順工程を含む。
2004520010.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一本鎖試料ヌクレオチド配列を一本鎖基準ヌクレオチド配列とハイブリッド形成させること；当該ハイブリッド形成の前もしくは間に一本鎖基準ヌクレオチド配列または一本鎖試料ヌクレオチド配列を、または当該ハイブリッド形成の後もしくは間に基準および試料ヌクレオチド配列から成るヘテロ二本鎖を、位置分離的な仕方で支持体上に固定すること；ヘテロ二本鎖誤対合を認識する基質とインキュベートすること；そして当該基質結合を検出すること；の手順工程を含む、ヌクレオチド配列中の変異を検出するための方法。
【請求項２】
ヌクレオチド配列中の変異を検出するための方法であって、
ａ）定義済みの一本鎖ヌクレオチド配列をヌクレオチドチップ上にロードする、
ｂ）変異について調べる予定であり、そして既知ヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を、前記チップ上に同様にロードし、そして当該２つの配列をハイブリッド形成させることにより、ヘテロ二本鎖を産生する、
ｃ）当該ヘテロ二本鎖を、誤対合を認識する標識された基質とインキュベートする、そして
ｄ）当該誤対合を、それらに付着した前記標識基質を検出することにより検出する、前記方法。
【請求項３】
支持体上に固定され、そしてハイブリッド形成されない一本鎖ヌクレオチド配列を、ヌクレアーゼを加えることにより分解する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
用いられるヌクレアーゼがマングマメヌクレアーゼまたはＳ１ヌクレアーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
用いられる支持体が電子的にアドレス可能な表面である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記固定および／またはハイブリッド形成が電子的に加速された仕方で果される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
位置分離的、電子的に加速されたハイブリッド形成が、それぞれの部位で個別に設定されるハイブリッド形成条件で行われる、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
ハイブリッド形成条件の個々の設定が、それぞれの位置で適用される電流強度、それぞれの位置で適用される電圧、または電子的アドレシングの持続時間により果される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
用いられる電子的にアドレス可能な表面がヌクレオチドチップである、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
透過層でコートされた電子的にアドレス可能な表面が使用される、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
当該透過層が、ヌクレオチド配列および、ヘテロ二本鎖誤対合を認識する基質に対して高度の透過性をもつ、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
用いられる透過層がヒドロゲル層である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
基質とのインキュベーションが低塩条件下で果される、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
基質とのインキュベーションが２５ｍＭおよび７５ｍＭの間の塩濃度で果される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
誤対合認識基質とのインキュベーションの前にＢＳＡが添加される、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
誤対合認識基質とのインキュベーションの前にＳＳＢが添加される、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
誤対合結合タンパク質類より成る群から選択される誤対合認識基質を使用する、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
用いられる誤対合認識基質が、ｍｕｔＳタンパク質類、ｍｕｔＹタンパク質類、ＭＳＨ１から６タンパク質類、Ｓ１ヌクレアーゼ，Ｔ４エンドヌクレアーゼ、チミングリコシラーゼまたはクリーバーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）、またはこれらのタンパク質の混合物より成る群から選択されるタンパク質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
誤対合結合タンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉからの、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓからの、またはＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓからのｍｕｔＳタンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
誤対合を認識する標識された基質が用いられる、請求項１から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
誤対合を認識する放射性標識された、発光性、色素標識された、または蛍光標識された基質、または誤対合を認識し、そして量子ドットまたはポリマー性標識もしくは金属標識を備える基質を使用する、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
用いられる基質が、ＣｙＴＭ３，ＣｙＴＭ５，Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７，Ｂｏｄｉｐｙ  ５５８／５６８，Ｂｏｄｉｐｙ  ６５０／６６５，Ｂｏｄｉｐｙ  ５６４／５７０，Ｓ  ０５３５，Ｓ  ０５３６，Ｄｙ−６３０−ＮＨＳ，Ｄｙ−６３５−ＮＨＳ，ＥＶＯｂｌｕｅ３０−ＮＨＳ，ＦＡＲ−Ｂｌｕｅ，ＦＡＲ−Ｆｕｃｈｓｉａ，Ａｔｔｏ  ６５０，ＦＩＴＣまたはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄで標識された、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
誤対合を認識する基質融合タンパク質が用いられる、請求項１から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
用いられる基質融合タンパク質の融合ドメインが、抗体結合のためのエピトープである、または酵素活性をもつ、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
基準ヌクレオチド配列および／または試料ヌクレオチド配列が、放射性標識された、発光標識された、色素標識された、蛍光標識された、量子ドット標識された、ポリマー性標識された、または金属標識された、請求項１から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
誤対合認識基質により弱く結合される塩基誤対合の代わりに、それらの対応誤対合を使用する、請求項１から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
相互に対応する誤対合を含むヘテロ二本鎖の混合物を、誤対合認識基質とインキュベートする、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ｍｕｔＳタンパク質が誤対合認識基質として使われる場合、当該基質結合のために、誤対合ＣＣの代わりに誤対合ＧＧを、誤対合ＴＴの代わりに誤対合ＡＡを、および／または誤対合ＡＣの代わりに誤対合ＧＴを、または相互に対応するこの群からの誤対合をもつヘテロ二本鎖の混合物を、使用する、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
誤対合認識基質の結合の検出が、蛍光標識基質の蛍光を測定することにより光学的に、または電気的リードアウトにより、またはインピーダンス測定により、または表面プラスモン共鳴測定により、または重量測定により、またはカンチレバーもしくはミクロカンチレバーにより、または音響方法により果される、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
検討されるヌクレオチド配列のハブリッド形成の成功が、蛍光色素により、または電子的検出により、またはインピーダンス測定により、または表面プラスモン共鳴測定により、または重量測定的に、またはカンチレバーもしくはミクロカンチレバーを用いて、または音響方法の手段により検出される、請求項１から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
試料ヌクレオチド配列および／または基準ヌクレオチド配列および／または誤対合認識基質が異なるように標識される、請求項１から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
電子的にアドレス可能な表面上へのヌクレオチド配列の固定、基準ヌクレオチド配列と試料ヌクレオチド配列とのハブリッド形成および基質結合が測定される、請求項１から３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
結合した基質の量が定量的に決定される、請求項１から３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
異なる細胞または組織中のｍＲＮＡの発現を定量的に検出するための、請求項３３に記載の方法であって、
ａ）既知一本鎖ヌクレオチド配列をヌクレオチドチップ上にロードする、
ｂ）異なる細胞または組織から得られている標識ｃＤＮＡを、同様に当該チップ上にロードし、そしてヘテロ二本鎖が当該２つの配列のハブリッド形成により産生される、そして
ｃ）当該ｍＲＮＡの量を当該ラベリングを定量的に測定することにより決定する、前記方法。
【請求項３５】
色素標識ｃＤＮＡが使用され、そして当該ハブリッド形成中に生成された色が光学的に定量的に測定される、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
当該タンパク質を、エステルとして存在する色素と、水溶液中でそして光の排除下でインキュベートする、色素標識誤対合認識タンパク質を調製するための方法。
【請求項３７】
前記エステルが１μＭから１００μＭの間の濃度で用いられる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
用いられるエステルが色素−スクシンイミジルエステルである、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
蒸溜水中５ｍＭから５０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ´−２−エタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ），ｐＨ７．５から８．５，５０から５００ｍＭ  ＫＣｌ，１から１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５から１５％グリセロール、から成るＨＥＰＥＳ緩衝液を使用する、請求項３６から３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１８に記載の誤対合結合タンパク質が標識される、請求項３６から３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項２２に記載の色素で前記誤対合結合タンパク質が標識される、請求項３６から４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
検出可能な、酵素性、抗体結合性、発光性、放射性、色素所持性または蛍光性の基に連結することにより標識される、誤対合認識タンパク質。
【請求項４３】
ｍｕｔＳ、ｍｕｔＹ、ＭＳＨ１からＭＳＨ６、Ｓ１ヌクレアーゼ，Ｔ４エンドヌクレアーゼ、チミングリコシラーゼおよびクリーバーゼより成る群から選択されるタンパク質である、請求項４２に記載の誤対合認識タンパク質。
【請求項４４】
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼおよびペルオキシダーゼより成る群から選択される酵素群で標識される、請求項４２または４３に記載の誤対合認識タンパク質。
【請求項４５】
ＣｙＴＭ３，ＣｙＴＭ５，Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７，Ｂｏｄｉｐｙ  ５５８／５６８，Ｂｏｄｉｐｙ  ６５０／６６５，Ｂｏｄｉｐｙ  ５６４／５７０，Ｓ  ０５３５，Ｓ  ０５３６，Ｄｙ−６３０−ＮＨＳ，Ｄｙ−６３５−ＮＨＳ，ＥＶＯｂｌｕｅ３０−ＮＨＳ，ＦＡＲ−Ｂｌｕｅ，ＦＡＲ−Ｆｕｃｈｓｉａ，Ａｔｔｏ  ６５０，ＦＩＴＣおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄより成る群から選択される蛍光色素で標識された、請求項４２または４３に記載の誤対合認識タンパク質。
【請求項４６】
支持体上のヌクレオチド配列中の変異の位置分離的検出のための方法に対するｍｕｔＳの使用。
【請求項４７】
電子的にアドレス可能な表面上のヌクレオチド配列中の突然変異の検出のための方法に対するｍｕｔＳの使用。
【請求項４８】
電子的にアドレス可能なチップ、基準ヌクレオチド配列、一本鎖核酸を分解するヌクレアーゼ、および誤対合を特異的に認識する少なくとも１つの基質を含むキット。
【請求項４９】
インキュベーション緩衝液、ブロッキング緩衝液および洗浄緩衝液を含む、請求項４８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
説明：
本発明は、さまざまなヌクレオチド配列中に並行に突然変異を検出ために使用可能な方法であって、当該方法で追加的に、変異および非変異ヌクレオチド配列の転写速度を決定することを可能にする、前記方法に関する。
【０００２】
ヒト身体中の遺伝子の大部分のＤＮＡ配列は、タンパク質配列へ転写されることがわかっている。この点について、さまざまな個人または細胞型におけるタンパク質、例えば酵素、の活性は、いくつかの要因により決定される。第一に、一定の遺伝子の転写活性は、当該タンパク質のいくつのコピーが細胞中に存在するかを決定する。第二に、突然変異はタンパク質の活性に影響することがある。したがって、転写速度の減少または抑制性突然変異は、タンパク質活性の低減（「機能喪失」）をもたらし、一方、転写速度の増加または稀に起る活性化突然変異の１つは、タンパク質活性の増加（「機能獲得」）をもたらすことも可能である。翻訳調節および翻訳後修飾のような他の要因も、これに加えてタンパク質の活性に、同様に影響することがある。２つの個体または細胞型はゲノムレベルではほとんど同一であるが、これらの要因は、解剖、生理、病理および医薬的に活性な化合物に対する反応に関して、大きな差異を最終的に決定する。大部分の疾患はタンパク質活性の変化が原因であり、そして医薬的に活性な化合物が特定のタンパク質の活性を調節するので、「転写」および「突然変異」要因の研究は、臨床診断のために、および医薬標的を同定するためにも、きわめて適している。それゆえ、特定の遺伝子が発現されるレベルにおける差異は、さまざまな患者における薬剤に対するさまざまな反応を決定する可能性がある。しかし、ＭＤＲ遺伝子（多剤耐性遺伝子）（Ｓ．Ａｋａｙａｍａら，Ｈｕｍ．Ｃｅｌｌ  １２，９５−１０２，１９９９）のようなごく少数の遺伝子が、これまでこの目的のために詳細に研究されているに過ぎない。それに反して、特定の遺伝子における突然変異が、ある薬剤を許容されなくしたり、あるいは当該治療を失敗に帰したりする、多数の薬剤が知られている（Ｗ．Ｈ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ７，２６２−２６９，１９９９）。それゆえ、間違った投薬が起らないようにするため、これらの活性化合物での治療の前に、該当する変異の有無について患者を調べる必要がある。しかし今日、これは限られた場合にのみ可能で、特定の遺伝子型へある薬剤の不和合性を明示することは、めったに成功しないからである。これは特に、高処理能力プロセスでしかも妥当な時間で、遺伝子型分析を行うのに使用可能な適当な試験方法がない、ことによる。しかし、例えば米国だけでも約１０万人が薬物不耐性の結果として毎年死亡しているので、そうした試験法を開発することは非常に望ましいはずである。これに加えて、そうした試験法を一貫して使用すれば、ある患者群における失敗を特定の変異に指定できる薬剤を示すことが可能になるだろう。このために、その種の試験法は、本薬剤の当該患者群への投与を全く避けることができるように、本患者群を確実に同定しなければならない。このために、多くの患者からの候補遺伝子を、ある薬剤に対する不耐性または当該薬剤を不活性にすることと相関する任意の変異の存否について、先を見越して調べる必要があるだろう。したがって、突然変異および転写速度の決定は、ある活性化合物による治療をやるかやらないかを決める場合の、重要な道具になる可能性がある。治療または医療検査との関連での個人の遺伝子型特性の検討または研究は、「薬物ゲノミクス」と呼ばれ、これからの医療活動の非常に大切な部分になると思われる。この意味において、一方で妥当な時間での高試料処理を確実にし、他方で極めて確実な試験結果を供給する試験方法を確立できることは、非常に重要であろう。
【０００３】
従来、特定遺伝子の転写速度の変化は、ノーザンブロット法、ＲＮアーゼプロテクション、ＲＴ−ＰＣＲおよび高密度フィルターアレイのようなＲＮＡを検出するためのさまざまな方法を用い、または形成されるタンパク質を検出するための、ウェスタンブロット法、ＲＩＡまたはエライザ（ＥＬＩＳＡ）のような方法を間接的に用いて、決定されてきた。これらの方法はいずれも、単一試料の検査には適することが明らかになっているが、どのような高試料処理にも不向きである。
【０００４】
複数遺伝子の発現プロファイルの高度並行分析のための、ＤＮＡチップテクノロジーに基づく新しい方法が、高速試料処理の目的のために開発されてきた（Ｄ．Ｊ．ＬｏｃｋｈａｒｔおよびＥ．Ａ．Ｗｉｎｚｅｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ４０５，８２７ｆｆ，２０００）。本法では、生体試料からのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡが配列特異的にハイブリッド形成し、次いで容易に検出できる、ＤＮＡ配列がチップ表面へ適用される。
【０００５】
Ｎａｎｏｇｅｎ社（サンディエゴ／米国）は、ヌクレオチド配列の加速ハイブリッド形成、および結果として測定時間の短縮を達成するためのいくつかの方法を、既に開発し、公開しており、これらの方法を用いてユーザーは、ＤＮＡ配列を電子的にアドレスすることによって、ユーザー限定ＤＮＡチップを調製可能である（Ｒ．Ｇ．Ｓｏｓｎｏｗｓｋｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１１１９−１１２３，１９９７）（米国特許第６，０６８，８１８号；米国特許第６，０５１，３８０号；米国特許第６，０１７，６９６号；米国特許第５，９６５，４５２号；米国特許第５，８４９，４８６号；米国特許第５，６３２，９５７号；米国特許第５，６０５，６６２号）。これらの方法では、通常、ビオチンと共役しているＤＮＡは、電場を通って試験電極上へ動かされ、そして当該で、電極のその真上に位置する浸透層中に存在するストレプトアビジンに高い親和性で結合する。それに続くハイブリッド形成は、可及的最短時間内に電子アドレシングにより、同様に行うことができる。その種のチップ中に、通常９９個ある、試験電極の各１つ１つは、個別に作動可能で；他のチップテクノロジーと違って、これが、いくつかの試料を相互に独立に処理することを可能にしている。文献の方法は試料中のヌクレオチド配列を保護するのには適しているが、上の公刊物に記載された方法そのものを使っては、高試料処理で突然変異を検出することは可能ではない。
【０００６】
突然変異を同定するための新しい試験方法を開発する場合、点突然変異を検出することが主に考慮される。点変異（一塩基多型、ＳＮＰｓ）は、ヒト集団内での遺伝的変異の最も頻繁な原因になっており、１０００塩基対当り０．５から１０までの頻度で生じる（Ａ．Ｊ．ＳｃｈａｆｅｒおよびＪ．Ｒ．Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１６，３３−３９，１９９８）。しかしＳＮＰｓを現象学的作用と相関させることはまだ難しい。それゆえ、多くのＳＮＰｓが見い出されているにもかかわらず、これまでのところそれらのうちの少数を特定の薬物不耐性反応に割当てることができたに過ぎない（Ｗ．Ｈ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｈｏｒｉｚｏｎｓ  ７，２６２−２６９，１９９９）。既知の例はＩＸ因子プロペプチド中の突然変異で、その変異は、クマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）による抗凝血剤治療と関係する重度の出血をもたらす（Ｊ．Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．９８（１９９７），２４０−２４４）。ところが、ヒトゲノムプロジェクトの過程で得られた配列データは、今日では、同定されたＳＮＰを特定の薬物不耐性に迅速に割当てることを、原理的に可能にしている。こうした理由で、従来未知のＳＮＰｓを検出するためのさまざまな方法が開発されてきた（Ｄ．Ｊ．Ｆｕら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８，１６，３８１−３８４；Ｆａｎら，Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．２８８（１９９３），８５−９２；Ｎ．Ｆ．ＣａｒｉｅｌｌｏおよびＴ．Ｒ．Ｓｋｏｐｅｋ，Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．２８８（１９９３），１０３−１１２；Ｐ．Ｍ．ＳｍｏｏｋｅｒおよびＲ．Ｇ．Ｃｏｔｔｏｎ，Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．２８８（１９９３），６５−７７）。しかしこれらの方法は、高試料処理には適しておらず；また臨床診断に必要な精度も示さない（Ｅ．Ｐ．ＬｅｓｓａおよびＧ．Ａｐｐｌｅｂａｕｍ，Ｍｏｌ．Ｅｃｏｌ．２（１９９３），１１９−１２９）。これらの化学的または物理的方法に加えて、いくつかの生物学的方法（Ｇ．Ｒ．ＴａｙｌｏｒおよびＪ．Ｄｅｅｂｌｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１４（１９９９），１８１−１８６）も開発されている。これらの生物学的方法の多くは、ｍｕｔＳファミリーのタンパク質がもつ性質、すなわち、変異決定塩基誤対合（ｍｕｔａｔｉｏｎ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂａｓｅ  ｍｉｓｐａｉｒｉｎｇｓ）に選択的に結合する性質を用いる（Ｐ．Ｓａｃｈａｄｙｎら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（２０００）ｅ３６；Ａ．Ｌｉｓｈａｎｓｋｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１（１９９４），２６７４−２６７８；国際特許出願公開ＷＯ９９／０６５９１，米国特許第６０３３６８１号，国際特許出願公開ＷＯ  ９９／４１４１４，国際特許出願公開ＷＯ  ９９／３９００３および国際特許出願公開ＷＯ  ９３／２２４６２）。しかし、その複雑性のため、これらの方法はこれまでのところ実用的には受容されていない（Ｇ．Ｒ．ＴａｙｌｏｒおよびＪ．Ｄｅｅｂｌｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１４（１９９９），１８１−１８６）。その一部は１９８０年代初期に開発された、文献中の方法では、ヘテロ二本鎖は、既知配列のＤＮＡの鎖からと、未知配列をもつ相補鎖から産生される（例えば、Ａ．Ｌ．Ｌｕら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０，ｐ４６３９−４６４３，１９８３）。もし当該未知配列が、当該相補既知配列に比較して、突然変異をもつならば、その結果生じる誤対合は、ｍｕｔＳのような修復タンパク質により結合されることが可能で、それにより当該変異を検出することが可能になる（Ｓ．Ｓ．ＳｕおよびＰ．Ｍｏｄｒｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，ｐ５０５７−５０６１，１９８６）。このようにして形成される複合体は、直接的に（例えば、国際特許出願公開ＷＯ  ９５／１２６８８）間接的に（例えば、国際特許出願公開ＷＯ  ９３／０２２１６）または付加的な酵素処理により（例えば、国際特許出願公開ＷＯ  ９５／２９２５８）検出可能で、その場合もｍｕｔＳタンパク質は固定化された形で存在することが可能である（国際特許出願公開ＷＯ  ９５／１２６８９）。
【０００７】
以前に公表されているすべての方法で、ＤＮＡヘテロ二本鎖は、適当な緩衝系中で受動ハイブリッド形成により産生される（例えば、Ｃ．Ｂｅｌｌａｎｎｅ−Ｃｈａｎｔｅｌｏｔら，Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３８２，３５−４３，（１９９７））。試料処理能力を増加させるために、いくつかの個体のものでなく、いくつかの遺伝子のヘテロ二本鎖をアレイ上で受動ハイブリッド形成により産生することが可能である（国際特許出願公開ＷＯ  ９９／０６５９１）。しかし、いくつかの配列を受動的にハイブリッド形成させると、多少とも、重度のクロスハイブリッド形成が起る。これは必然的に塩基誤対合の形成をもたらし、それらは次いで、突然変異をもつ参加配列のいずれがなくとも、ｍｕｔＳにより結合される。これは、「おおい隠された」突然変異をもつ、高いバックグラウンドをもたらすことになる。今のところ、この問題は、一本鎖結合（ＳＳＢ）タンパク質を用いることにより一部解決されているに過ぎない（Ｇｏｔｏｈら，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  １４，４７−５０（１９９７））。さらに、薬物ゲノミクス研究に関連すると思われるような、いくつかの個体からの個々の遺伝子配列を突然変異について並行して調べるために、慣用的な受動アレイを使うことは可能ではない。加えて、受動ＤＮＡアレイと組合わせた、ｍｕｔＳ技術のさらに重大な欠点は、すなわち１４時間までにもおよぶハイブリッド形成の長い時間である（国際特許出願公開ＷＯ  ９９／０６５９１）。
【０００８】
それゆえ、ＳＮＰｓ，特に未知ＳＮＰｓを、高度に並行化された試料処理能力で、同定するために適当な方法は何も知られていない。特に、ＤＮＡチップテクノロジーを用いて、未知ＳＮＰｓを迅速に同定するために適用可能な方法は何も知られていない。しかし、その高試料処理能力を考えると、そうした検出システムは、薬剤不耐性に対する、または薬剤不活性に対する遺伝子型の、またそれに関連する、臨床治験およびその割当に参加する試験被験者の日常的検査に特に望ましいであろう。例えば、乳癌を抗エストロゲン剤で治療する場合のように、副作用または治療不全が頻繁に起る活性化合物を大勢の患者に投薬する際には、なお一層高い試料処理能力が要求される。
【０００９】
最後に、遺伝子が発現される強度を分析するとともに、ＤＮＡ試料中の従来未知のＳＮＰｓを同時に同定するために使用可能な方法があれば、便利であろう。これは、標的確認および患者スクリーニングのような個別の調査には特に有用である。
【００１０】
それゆえ、本発明は、ヌクレオチド配列中の突然変異を検出するための方法であって、短時間でしかも高度の確実性もつ高試料処理能力を可能にする当該方法を使用可能にすることの目的に基づく。
【００１１】
そのような方法をアレイの形で提供し、それとともに当該ハイブリッド形成反応を並行化することは、意外にも可能であった。
一本鎖試料ヌクレオチド配列を、一本鎖基準ヌクレオチド配列と対合（ハイブリッド形成）させる方法であって、ハイブリッド形成の前または間に固定される当該一本鎖基準ヌクレオチド配列または一本鎖試料ヌクレオチド配列、またはハイブリッド形成の後または間に固定される基準および試料ヌクレオチド配列から成るヘテロ二本鎖、および、部位分離的な仕方で支持体上において、そしてそのときに起るヘテロ二本鎖誤対合を認識する基質とのインキュベーションによって、それに伴って当該基質の結合が検出できる、ヌクレオチド配列中の突然変異を検出するための方法により、当該目的を達成する。
【００１２】
ヌクレオチド配列中の突然変異を検出するための好ましい方法では、
ａ）  一定の一本鎖ヌクレオチド配列をヌクレオチドチップ上に負荷する、
ｂ）  突然変異について調べる予定の、そして既知ヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を、同様に当該チップ上に負荷し、それら２つの配列を対合させることにより、ヘテロ二本鎖を調製する、
ｃ）  当該ヘテロ二本鎖は次いで、誤対合を認識する基質、好ましくは標識された基質とインキュベートする、そして
ｄ）  誤対合に付着している当該基質を検出することにより当該誤対合を検出する。
【００１３】
支持体上に固定されている任意の一本鎖ヌクレオチド配列を、ハイブリッド形成後に、ヌクレアーゼ、好ましくはマングマメのヌクレアーゼまたはＳ１ヌクレアーゼを加えることにより、分解する方法は、特に信頼でき、それだけに特に適している。これは特に驚くべきことで、何故なら例えば、タンパク質結合一本鎖核酸として、ＳＳＢの添加は、ハイブリッド形成後に誤対合を認識する基質の結合にほとんど影響しないからである。
【００１４】
誤対合を認識する基質と組合わせて、電子的にアドレス可能な表面の基盤上での試料処理能力を増加することに関して、特に適当な方法であって、それによって、突然変異特異的誤対合を、慣用的な受動ハイブリッド形成技術を用いる場合より、確実にしかも相当に迅速に見い出すことが可能な前記方法を、意外にも提供することが可能であった。
【００１５】
これに関連して、一本鎖または二本鎖ヌクレオチド配列の固定化およびハイブリッド形成は、電子的に制御、特に電子的に加速することが可能である。
本発明方法の特に好ましい実施態様は、適用される電流強度、適用される電圧、または電子アドレシングの持続時間が、それぞれの部位で個別に設定されるようなハイブリッド形成条件をもつ、部位分離的電子加速化ハイブリッド形成を特徴とする。当該ハイブリッド形成と同時に、またはその後に、塩基誤対合は、誤対合を認識する基質を加えることにより検出可能である。
【００１６】
これらの方法は、既知および未知点変異、さらには挿入および欠失変異も、迅速かつ簡便に同定するために使用可能である。もし当該固定化ヌクレオチド配列と調べる予定のヌクレオチド配列との間に誤対合が生じたならば、これらは次に、例えば、標識塩基誤対合結合タンパク質を用いるか、電子検出を用いて、認識される。その結果、チップ上に誤対合を拾い上げることが可能である。当該ＳＮＰｓは検出可能な誤対合の例である。特に、上記の方法を用いる場合、いくつかの個体を１つのチップ上で突然変異について並行して調べることが可能である。
【００１７】
本発明のさらなる説明のために、以下の用語定義を紹介する：
本発明に従う検出方法の説明に関連して、表現「ヌクレオチド配列」は、ＲＮＡまたは化学的に修飾されたポリヌクレオチドならびにデオキシリボ核酸に対して使われ、またｃＤＮＡも用語デオキシリボ核酸内に含まれる；
表現「基準ヌクレオチド配列」は、比較配列として使われるヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列を指す；
「試料ヌクレオチド配列」は、突然変異について調べる予定の標識ヌクレオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列である；
「ヌクレオチドチップ」は、試料、または好ましくは基準、ヌクレオチド配列が各ケースで適用されるゾーンへ分割されたチップ表面を特徴とする；
「遺伝子発現」は、遺伝情報のＲＮＡまたはタンパク質中への伝達である。
【００１８】
電子アドレシングは、電場、好ましくは１．５Ｖと２．５Ｖとの間を、１から３分間の間のアドレシング持続時間と組合せて、適用することにより行う。アドレスされるヌクレオチド配列上の電荷のために、それらの移動は、加えられる電場により著しく加速される。これに関連して、アドレシングは部位分離的に行うことも可能である；この場合、アドレシングは、チップ表面上の異なるゾーンへ連続的に起る。同時に、異なるアドレシングおよびハイブリッド形成条件を、個々の部位に設定することも可能である。
【００１９】
本発明に従う検出方法を実行する場合、予定のヌクレオチド配列、すなわち基準ヌクレオチド配列と、生理的試料からの相補的ヌクレオチド配列、すなわち試料ヌクレオチド配列とから成るヌクレオチド配列ヘテロ二本鎖を、電子アドレシングを用いてチップ表面上にまず産生する。これに関連して形成される誤対合は、当該試料ヌクレオチド配列中のＳＮＰを示しており、当該誤対合部位に結合する基質を用いて検出可能である。塩基誤対合に結合するタンパク質は、この目的に適している。塩基誤対合結合タンパク質は、例えば、好ましくはＥ．ｃｏｌｉ，Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のｍｕｔＳまたはｍｕｔＹ、好ましくはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＭＳＨ１から６、Ｓ１ヌクレアーゼ，Ｔ４エンドヌクレアーゼ、チミングリコシラーゼ、クリーバーゼ（ｃｌｅａｖａｓｅ）またはこれらの塩基誤対合結合タンパク質からのドメインを含む融合タンパク質類が可能性がある。しかし、他のタンパク質または基質も、ヌクレオチド配列二本鎖中の塩基誤対合を特異的に認識し、それに結合することができなら、本目的のために使用可能である。
【００２０】
本発明に従う方法では、基準ヌクレオチド配列は、例えば、そのうちの１つが５´端でビオチニル化されている、配列特異的オリゴヌクレオチドを用いる増幅により、合成または調製されるビオチニル化オリゴヌクレオチドとして採用されてもよい。その後で、当該基準ヌクレオチド配列は、融解、好ましくは低塩類含量の緩衝液中での融解により、一本鎖状態へ変換され、電子アドレシングによりチップ上の予定の位置に適用される。適当なチップの例は、Ｎａｎｏｇｅｎ（サンディエゴ／米国）により市販されているものである。基準ヌクレオチド配列は、例えば、Ｎａｎｏｇｅｎ分子生物学ワークステーションを用いて、好ましくは当該製造会社により指定されたパラメーターを用いて、適用可能である。特に指定しない限り、Ｎａｎｏｇｅｎのチップおよび／またはそれらの分子生物学ワークステーションは、それらとともに供給されるマニュアルに従って使用される；使用法はＲａｄｔｋｅｙら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８，２０００，ｅ１７にも記載されている。
【００２１】
既にチップに適用されている配列に相補的な試料ヌクレオチド配列は、このようにして調製された当該チップ上へここで負荷（ロード）してもよい。この目的のために、色素標識オリゴヌクレオチドは、そのうちの１つが５´端で色素標識されている、配列特異的オリゴヌクレオチドを用いる増幅により、合成または調製される。この点について、試料ヌクレオチド配列中の色素標識ヌクレオチドは、基準ヌクレオチド配列のビオチニル化鎖に対して相補的な対向鎖を構成する。試料ヌクレオチド配列も、例えば、低塩類含量の緩衝液中で、融解されて一本鎖状態へ予め変換され、それから電子アドレシングにより当該ビオチニル化基準ヌクレオチド配列に適用されなければならない。これは、当該基準ヌクレオチド配列および当該試料ヌクレオチド配列から成るヌクレオチド配列ヘテロ二本鎖の、ハイブリダイゼーションによる、形成をもたらす。当該ヘテロ二本鎖は、例えば、Ｎａｎｏｇｅｎ分子生物学ワークステーションを用い、および当該製造会社により指定されたパラメーターを採用して、電子的にアドレス可能な表面上に調製してもよい。ハイブリッド形成の成否は、光学的にモニター可能で、また同時に、当該ヘテロ二本鎖へ共役する色素を検出することにより、定量的に測定可能である。
【００２２】
あるいは、試料ヌクレオチド配列も、上に記したように、ビオチニル化して電子的にアドレスしてもよい。溶液中でハイブリッド形成し、引続き電子アドレシング、およびヘテロ二本鎖の２つのヌクレオチド配列の１つをビオチニル化することも可能である。ビオチンで誘導体化する代わりに、ヌクレオチド配列を固定するために、電子的にアドレス可能な表面上に結合する他の分子基を使用することも可能である。したがって、例えば、導入されたチオール基、ヒドラジン基またはアルデヒド基を用いて固定を行うことも、同様に可能である。
【００２３】
もし試料ヌクレオチド配列が基準ヌクレオチド配列に比較してここで突然変異を示すとすれば、そのときには、当該ヘテロ二本鎖中に誤対合があるだろう。そのような誤対合を同定するためには、それらのタンパク質が高度の特異性でこれらの誤対合を認識するｍｕｔＳファミリーのタンパク質を使うことが、優先される。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の誤対合認識ｍｕｔＳタンパク質、およびＭＢＰ−ｍｕｔＳのようなｍｕｔＳ融合タンパク質は、本目的に特に適している。誤対合認識基質は、過剰に添加するのが好ましく、その場合、非結合基質を洗浄により除去することが可能である。
【００２４】
色素含有、発光および蛍光基に加えて、誤対合認識タンパク質は、ポリマー性ラベル（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３５，１６５−１８９，１９９４）、金属ラベル、酵素性または放射性ラベリングまたは量子ドット（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１巻，２０１６，９月２５日号，１９９８）を含むことも可能である。これに関連して、酵素ラベリングには、例えば、直接酵素カプリングまたは酵素基質移行または酵素補完があり得る。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼおよびペルオキシダーゼは、酵素性ラベリングには特に適している。４００から８００ｎｍの範囲の光を吸収または放出する色素を用いる基質ラベリングは特に好ましい。ラベリングには適しており、好ましい蛍光色素は、特にＣｙＴＭ３，ＣｙＴＭ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ製），Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７，Ｂｏｄｉｐｙ  ５５８／５６８，Ｂｏｄｉｐｙ  ６５０／６６５，Ｂｏｄｉｐｙ  ５６４／５７０（例えば、Ｍｏｂｉｔｅｃ製，ドイツ）Ｓ  ０５３５，  Ｓ  ０５３６（例えば、ＦＥＷ製，ドイツ），Ｄｙ−６３０−ＮＨＳ，Ｄｙ−６３５−ＮＨＳ，ＥＶＯｂｌｕｅ３０−ＮＨＳ（例えば、Ｄｙｎｏｍｉｃｓ製，ドイツ），ＦＡＲ−Ｂｌｕｅ，ＦＡＲ−Ｆｕｃｈｓｉａ（例えば、Ｍｅｄｗａｙ製，スイス）Ａｔｔｏ  ６５０（Ａｔｔｏ  Ｔｅｃｈ製，ドイツ），ＦＩＴＣおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄである。直接標識される基質に加えて、ｍｕｔＳに対してまたはＭＢＰのような融合ペプチドドメインに対して直接向けられる標識抗体を使用することも可能である。
【００２５】
例えば、色素標識ｍｕｔＳタンパク質が、チップ表面上に結合されているヘテロ二本鎖ヌクレオチド配列とここでインキュベートされると、当該タンパク質は次いで、当該ヘテロ二本鎖内に誤対合が形成されているチップ上の位置に選択的に結合する。その結合された色素標識ｍｕｔＳタンパク質は、次に、光学センサーを用いて、例えば、適当な分析ソフトウエアと組合せてＮａｎｏｇｅｎ分子生物学ワークステーションを用いて、定量的に測定可能である。
【００２６】
あるいは、誤対合を認識する基質の結合は、サイクロボルタンメトリーまたはインピーダンススペクトロメトリーのような電気的方法を用いて行うことも可能である（例えば、国際特許出願公開ＷＯ  ９７／３４１４０に記載）。ヌクレオチドチップを読み取るためのこれらの電気的方法は、標識された誤対合認識基質を使う必要がないことが、特に特徴である。電気的検出方法は、ヘテロ二本鎖の形成を検出するためにも適している。それゆえ、個々の処置工程をモニターするのに、電気的方法と光学的方法とを組合わせるのが有利なこともある。誤対合を認識する基質を検出するための別の方法は、表面プラズモン共鳴の測定（例えば、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．２２（６），１０３７−１０４５，２０００中），カンチレバー技術（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  １９９５  ６月１５日号，３７５（６５３２），５３２中またはＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９９，７６（６），２９２２−３３中に記載）またはミクロカンチレバー技術（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８，３１６−３１８，２０００中に記載）または音響法を用いる（例えば、国際特許出願公開ＷＯ  ９７／４３６３１に記載のように）または重量法を用いる検出である。
【００２７】
本発明に従う方法は、遺伝子突然変異を検出するために適しているだけでなく；さまざまな細胞または組織中で発現されるｍＲＮＡの発現のレベルにおける差異を示すことも可能である。このために、好ましい実施態様では、当該ｍＲＮＡがｃＤＮＡへ変換され、そして生じたｃＤＮＡが測定に使われる。検出は、当該試料ヌクレオチド配列に共役し、そして光学的に検出される色素によって、好ましくは実施される。あるチップ位置に存在する色素の量は、当該ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの量と相関するので、いくつかのチップ位置で当該色素強度を分析すれば、さまざまな細胞または組織中の発現レベルの差を定量することが可能になる。同時に、異なる試料中のある遺伝子の、または異なる遺伝子類の、発現のレベルを並行して定量可能である。同じ試料中の突然変異および遺伝子発現における差異の並行検出は、当該二検出系で当該試料が均質に扱われるため、時間の節約になるだけでなく、エラーも起きにくくなる。
【００２８】
１つの手順で集中した仕方で、遺伝子発現の定量と同時に突然変異の検出とを並行して行う可能性は、本発明のもう１つの重要な長所になっている。
誤対合に特異的に結合している蛍光標識ｍｕｔＳを、例えば、光学的に検出することとは別に、基質結合は電気的方法を用いても検出可能である。インピーダンススペクトロメトリーは本目的に特に適しており、結合した基質の量に依存する変化で、測定部位における交流抵抗の変化を定量する。しかし、当該ヌクレオチドに、および当該基質の結合により電子流が変化する電気的伝導性表面に、結合する電子供与体または受容体間の電位差を測定する、サイクロボルタンメトリーを使うことを考えるのも可能である。
【００２９】
本発明に従う方法の好ましい実施態様で、当該電子アドレシングは、透過層でコートされたチップ表面で起る。当該透過層は、小イオン類をチップの電気的伝導性表面へ流れることを可能にし、結果として、当該ヌクレオチド配列または当該基質がチップ表面と接触して、そこで自身が酸化または還元されたりせずに、当該回路の閉鎖をもたらす。好ましい適当な透過層は、ヌクレオチド配列と電子的にアドレシングした時、または誤対合を認識する基質とインキュベートした時、透過層の良好な浸透が達成されるような、当該ヌクレオチド配列および採用された基質に対して高い透過性をもつ非イオン性ポリマー材料またはゼラチン質材料である。したがって、例えば、ｍｕｔＳが基質として使われる場合、電子的にアドレス可能なチップは、アガロースよりもヒドロゲルでコートすることが好ましい。このように、アガロースチップと比較した場合、ヒドロゲルチップは、より高い感度および誤対合および完全対合ＤＮＡ間のより優れた識別という利点をもたらす。透過層の構成が検出の感度にそれほど大きな影響をもつとは予測できなかっただけに、これは驚きである。
【００３０】
さらに、低塩条件は、本方法を履行する場合に有利であることが明らかになった。意外にも、塩基誤対合に結合するｍｕｔＳ基質の能力は、当該低塩条件により悪影響を受けない。基質としてｍｕｔＳの使用に基づく場合、誤対合結合は、１０から３００ｍＭまでの塩濃度、好ましくは１０から１５０ｍＭまでで行うべきである；２５から７５ｍＭまでの塩濃度が特に好ましいことが明らかになった。他の基質による誤対合認識のための最適塩濃度は、当該履行例と同じように容易に確認可能である。さらに、誤対合認識基質による透過層の浸透は、Ｔｗｅｅｎ−２０のような界面活性剤を添加することにより、増加させることも可能である。意外にも、界面活性剤を添加した場合も、ｍｕｔＳは誤対合に結合するその能力を失わない。
【００３１】
もう１つの好ましい実施態様で、本方法の測定精度は、非特定結合部位を遮断するＢＳＡのような物質を添加することにより、増加する。これに加えて、ＳＳＢの添加は、例えばｍｕｔＳによる場合のように、一本鎖核酸断片が使われる誤対合認識基質により結合されるのであれば、測定精度に正の効果をもつ可能性がある。しかし、ｍｕｔＳが基質として使われた場合、測定精度に僅かな改善が達成できたに過ぎなかった。
【００３２】
電子ハイブリッド形成後で、誤対合認識基質を添加する前に、一本鎖ヌクレオチド配列を分解すると、測定精度に相当増加をもたらすことは、全く驚きである。本効果は、電子的にアドレス可能なチップと組合わせても、アレイ表面上での受動ハイブリッド形成を用いる手順配置と組合わせても、利用可能である。これに関連して、当該一本鎖ヌクレオチド配列は、マングマメのヌクレアーゼまたはＳ１ヌクレアーゼのようなヌクレアーゼ類を用いて酵素的に分解可能である。本測定の信頼性は、当該検定にそのようなヌクレアーゼ消化を導入することにより、大幅に増加する。
【００３３】
異なる突然変異を並行して検出すること、すなわち、誤対合ＡＡ，ＡＧ，ＡＣ，ＧＧ，ＧＴ，ＣＴ，ＣＣおよびＴＴ、および個々のヌクレオチドの欠失または挿入による誤対合、に伴う問題は、誤対合認識基質が、ある突然変異を他のものよりよく認識することである。したがって、例えばｍｕｔＳは、誤対合ＴＴ，ＣＣ，およびＡＣを認識するより、誤対合ＧＴ，ＧＧおよびＡＡをよく認識する。
【００３４】
これに関して、塩基交換変異の生成をもたらす重要な機構は、５−メチルシトシンの脱アミノ化であることに留意すべきである。哺乳動物では、すべてのシトシンの約３−５％がメチル化されており（この修飾は遺伝子の不活性化の一因となる）、また、そうしたメチルシトシンが自然に脱アミノすると、塩基チミンが生成する。当該ＤＮＡ二本鎖中に生じたＧＴ誤対合を認識し、そして修復する特定の修復酵素が存在するが、それにもかかわらず当該変異は、場合によっては認識されずに残り、そしてさらに、次のＤＮＡ複製サイクルで、本来のＣＧ塩基対のＴＡ塩基対への変換をもたらす。本機構の重要性は、ヒトで遺伝的に決まる疾患に見い出されたすべての点変異のほとんど３分の１（３１．７％）が、５−メチルシトシンの脱アミノ化の結果として生じたという事実により、明らかにされている（Ｒａｍｓａｈｏｙｅら，Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖｉｅｗｓ（１９９６）１０，２４９−２６１）。
【００３５】
本明細書に記載の本法は、この非常に頻繁に生じる塩基交換変異を特によく、特異的に検出する。
基質としてｍｕｔＳを使うことの特別な長所は、ｍｕｔＳが認識しにくいすべての誤対合を、ｍｕｔＳが特によく認識するそれらの対応する誤対合へ変換できることである。
【００３６】
シトシン残基がチミンに変異されているＤＮＡ鎖が、例えば電子的にアドレス可能なチップ上で、非変異基準対向鎖とハイブリッド形成されると、これは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｍｕｔＳタンパク質を用いて容易に検出できるＧＴ誤対合を生じる。しかし加えて、本明細書で紹介された本法を、他の突然変異、特に、変異ＤＮＡ鎖が非変異基準対向鎖とハイブリッド形成される場合に、Ｇ：Ｇ，Ｃ：ＴまたはＡ：Ａ誤対合をもたらすような点変異、を検出するためにも使用可能である。ｍｕｔＳは同様に１つまたは２つの塩基の挿入または欠失を検出するのに使用可能である。さらに、本明細書に記載されている方法を用いて明らかにできる突然変異の比率は、試験予定のＤＮＡの両鎖をそれぞれの基準対向鎖とハイブリッド形成させることにより、増加する可能性がある。これは次の事例で例証可能である：すなわち、それが調製されないとすると、グアニンがシトシンにより置換される塩基交換は、本来のＧ：Ｃ塩基対のＣ：Ｇ塩基対への変換をもたらす。
2004520010.tif 000003
【００３７】
もし試験予定のＤＮＡの鎖（ａｍｕｔ）が、基準ＤＮＡの対向鎖（ｂ）とここでハイブリッド形成されるとすると、これはＣＣ誤対合を生じ、それはｍｕｔＳによりごく弱く結合される。他方、変異型対向鎖（ｂｍｕｔ）が基準鎖（ａ）とハイブリッド形成すると、これは対応するＧＧ誤対合の形成をもたらし、それをｍｕｔＳはずっと容易に検出できる。この状況は、アデニンがチミンにより置換されている点変異の場合に似ている。もしそのような変異型のＤＮＡの両鎖が、いずれの場合も、相補性の非変異型基準鎖であるものとハイブリッド形成すると、一方これは、ＴＴ誤対合をもたらし、それはｍｕｔＳによりごく弱く結合され、そして他方、対応するＡＡ誤対合では、それをｍｕｔＳはよりよく検出できる。同様に、ＡＣ誤対合は、対応するＴＧ誤対合により置換可能である。
【００３８】
対応する塩基誤対合が使われる場合、ヌクレオチド配列の両鎖は別々の部位で電子的にハイブリッド形成させることも可能であり、あるいはまた、二本の単鎖の混合物がチップ表面上に固定される。
【００３９】
Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｕｔＳは、個々のヌクレオチド、好ましくは１つから３つのヌクレオチドの挿入または欠失を検出するのに特に適していることが、意外にも明らかになった。したがって、個々の誤対合認識基質を組合わせることにより、当該方法を所定の必要条件に適応させることも可能である。
【００４０】
ヌクレオチド配列Ａ，Ｂ，Ｃ，．．．，Ｎが、群Ａ｀，Ｂ｀，Ｃ｀，．．．，Ｎ｀からのヌクレオチド配列を含む混合物を用いて、部位ａ，ｂ，ｃ，からｎに既に固定されている、例えばチップ上で、電子アドレシングを実施可能である。この場合、ヌクレオチド配列Ａ／Ａ｀からＮ／Ｎ｀は、基準および試料ヌクレオチド配列ペアを各ケースで構成する。電子的に加速されたハイブリッド形成後に、当該ハイブリッド形成条件の厳密性は、例えば、電場の極性を逆転させることにより、増加可能である。これは部位分離的な仕方で実施可能であり、したがって各部位のケースごとに個々に調整可能である。
【００４１】
特に好ましい実施態様では、チップ表面上での電子アドレシングは、整然と連続的に行われる。もし同一のまたは異なる基準ヌクレオチド配列が部位分離的な仕方で電子的にアドレス可能なチップ上に固定されるならば、試験予定の一定の試料ヌクレオチド配列との電子的に加速されたハイブリッド形成は、次いで部位特異的にかつ連続的に実施される。もし例えば、異なる基準ヌクレオチド配列Ａ，Ｂ，Ｃ，．．．，Ｎが、部位ａ，ｂ，ｃ，からｎに付着されるならば、次いで試料Ａ｀，Ｂ｀，Ｃ｀，．．．，Ｎ｀とのハイブリッド形成は、ヘテロ二本鎖ＡＡ｀が部位ａに、ヘテロ二本鎖ＢＢ｀が部位ｂに、ヘテロ二本鎖ＣＣ｀が部位ｃに、さらにヘテロ二本鎖ＮＮ｀が部位ｎにまで形成できるようように、連続的にかつ部位特異的に実施される。あるいは、試料ヌクレオチド配列ももちろんチップ表面に付着可能で、電子的に加速されたハイブリッド形成は、次いでそれぞれの基準ヌクレオチド配列と連続的に実施される。異なる起源、例えば異なる患者由来の試料ヌクレオチド配列の、基準ヌクレオチド配列と常に同じであるものとのハイブリッド形成も、上記の手順概要を用いて好ましくは実行される。本発明に従う方法の本実施態様は、高度の確実性が特徴である。しかし連続プロセスとしての測定の配置は、電子的にアドレス可能な表面を用いることによってのみ可能になる。その結果、本発明に従う方法は、電子的にアドレス可能な表面上で高度に並行的な仕方で実行可能であり；これが高試料処理の達成を可能にする。この場合にも、電場の極性を逆転することにより、ハイブリッド形成条件を変える可能性はある。通常は数時間にも及ぶハイブリッド形成工程の長い時間のため、また当該ハイブリッド形成の不正確性があまりにも高いという事実のために、受動ハイブリッド形成法は、そのような作用過程には適当でない。
【００４２】
そのような方法は、先行技術で知られる受動ハイブリッド形成技術よりも、突然変異の検出に格段と信頼性が高いだけでなく、格段に迅速である。このように、１００並行測定が部位分離的に実行可能な１０ｘ１０アレイ表面をもつチップは、記載されている最後の方法を用いた場合、４から８時間で読取られる。受動法では、個々の検定が約１４時間を要するものを、１００回も別々のハイブリッド形成検定を実施する必要があることになる（例えば国際特許出願公開ＷＯ  ９９／０６５９１に記載されている）。それゆえ、そのような方法はほとんど実用性はない。
【００４３】
当該発明の方法のもう１つの長所は、突然変異の存在を定性的に検出できることに加えて、変異核酸配列の転写を定量的にも測定可能なことである。例えば、異型接合遺伝子型を分析する場合に、これは興味深い。これに関連して、誤対合を特異的に認識する結合基質の量は、ほんの概算で、当該変異ヌクレオチド配列が転写される速度の目安である。特に変異ヌクレオチド配列を定量的に測定する場合には、標準化が役立つ。そのために、基準または試料ヌクレオチド配列は、例えば、色素で標識してもよい。このようにして、実際の測定の部位におけるのと同じ量のヌクレオチド配列が、標準測定の部位においても固定化されることを、光学的にチェック可能である。次に、完全に相補的なヌクレオチド配列を、すべての固定されたヌクレオチド配列が如何なる誤対合もなくハイブリッド形成されるように、標準測定の部位に過剰に添加する。処置配置によっては、ＢＳＡ，ＳＳＢ，界面活性剤などのような別の添加物を、次いで加える。誤対合を認識する基質を添加した後で、次に比較値を測定し、この値を標準とする。変異型ヌクレオチド配列は、誤対合認識基質を同様に加えて、並行して定量的に測定する。当該標準値と実験値との間の差は、当該変異型ヌクレオチド配列が転写される速度の定量的査定の提供を可能にする。定量的測定をより正確に行うには、当該変異型ヌクレオチド配列のさまざまな濃度を用いて、校正曲線を作製するのが適切であるが、それは例えば、生じる塩基誤対合の数に伴う、ヘテロ二本鎖へのｍｕｔＳの結合の増加が、直線的ではなく、むしろ僅かに平らになるからである。この理由として、測定部位における大量移行効果が考えられる。本方法のさらなる利点はこれに伴う。誤対合がまれにしか起らない場合、基質結合は急速に増加するので、測定は非常に敏感になる；多数の誤対合が存在する場合には、基質結合はずっとゆっくり増加し、広い測定範囲の達成が結果として生じる。このように、１００ｐＭから１００μＭまで、好ましくは１ｎＭから１μＭまでの濃度をもつ個々のヌクレオチド配列が、電子アドレシングには好ましくは使われる。この範囲では、生成した誤対合をもつヘテロ二本鎖を定量的に測定することは難しくない。
【００４４】
本明細書に記載されている当該方法が、患者試料から増幅されたＤＮＡを用いて行われるならば、本源から得られるＤＮＡの量は、通常、限られている。それだからこそ、強力過ぎる増幅は、ポリメラーゼのエラー速度のために、変異鎖の蓄積をもたらすであろうし、それゆえバックグラウンドの増加をもたらすであろう。これに加えて、患者ＤＮＡが使われる場合、異なる患者試料間のＤＮＡの濃度の変動が見込まれるはずである。これらの変動は、ｍｕｔＳシグナルに変動を起す可能性があり、極端な場合には、変異の検出を妨げる恐れもある。誤対合を認識する基質としてｍｕｔＳを用いる場合は特に、本発明に従う方法は、たとえＤＮＡ濃度が低いおよび／または変動する場合でも、突然変異を確実にそして定量的に認識するのに適することが、意外にも見い出されている。これは、用いられるＤＮＡの濃度における比較的大きな変動が、ｍｕｔＳの結合に同じようには大きな変動をもたらさないことによる。さらに、本発明に従う方法は、特に実用に関係するＤＮＡ濃度の範囲、すなわち、患者由来の試料を研究するときに得られるような場合に、突然変異の検出に高度の確実性を示す。さらに、当該請求方法は、調製されたヌクレオチド配列の量における変動に対して高度の堅固さを意外にも示す。その結果、たとえ個々の試料が正確に同じ濃度のＤＮＡをもたなくても、異なる患者試料を比較することが可能である。
【００４５】
本発明に従う方法は、結果として突然変異を迅速かつ確実に検出するのに適している。それゆえ、多数の試料を並行して調べることが可能である。これは、それによって、従来未知の突然変異についての遺伝子型スクリーニングを改良する。だから、例えば、ヒトゲノムプロジェクトの経過中に大量のヒトゲノム配列データが利用可能になっており、それに伴って、異なる個人から得られた試料のヌクレオチド配列に対して試験することができる電子的にアドレス可能なチップを構築するために、これらのデータを使用することが可能である。このアプローチは、必ずしも表現型的に発現される必然性のない多数の突然変異を迅速に同定するために、使用可能である。
【００４６】
同様に、優性的にまたは劣性的に遺伝される突然変異の存在について、特定の生物の細胞から得られている試料を調べることが可能である。これに関連して、その大試料処理能力は、大群の人々、例えば新生児について、特定の遺伝子における突然変異の存否をスクリーンすることを可能にする。これは、いずれも特定の既知突然変異に起因する、のう胞性繊維症、ハンチントン舞踏病、鎌状赤血球貧血のような疾患体質の早期識別および遺伝性の遺伝子欠陥の早期治療を容易にする。同様に、ある患者における、ある薬剤に対する何らかの潜在的な不耐性、またはタモキシフェンに対する抵抗性のような、ある薬剤の不活性を研究するために、当該不耐性が既知突然変異に相関するか、あるいはそれが、相関関係をつくることができる分析そのものである限りにおいて、そうした方法を使用することも可能である。
【００４７】
本方法の高速によって、また達成可能な高度の並行性によって、高試料処理能力を用いて、遺伝性疾患を患っている患者からの多くの異なる試料を調べることが可能である。これは、臨床症候群と特定の突然変異との相関関係を明らかにする作業を容易にする。これに加えて、生活の過程で獲得され、そして特定の疾患と相関する可能性がある突然変異について、より効率良くスクリーンすることが可能である。それゆえ、例えば、さまざまな腫瘍試料中に癌抑制遺伝子ｐ５３（エキソン８）のＤＮＡ結合ドメイン中の変異を迅速にしかも容易に検出することが可能である。
【００４８】
加えて、基準ヌクレオチド配列の選択に依存して、多くの異なる検定法の開発が可能であり、それによって、これらの検定を迅速かつ確実に行うために本請求方法を使用可能なことを指摘するべきである。このように、遺伝子の個々のエキソンは、例えば、相互に独立に基準ヌクレオチド配列として使用可能である。これは、突然変異が存在することだけでなく、そのような変異がどこに位置するかも証明できるようにする。当該全配列が調べられることに基づいて各ケースごとに１つのヌクレオチドに置換された断片を使用するならば、適切な遺伝子断片を基準ヌクレオチド配列として選ぶことによって、当該変異の部位を正確に決定さえできる。特に、個々のタンパク質ドメインをコードする遺伝子領域を別々に使用することは、さまざまな疑問に答える多くの異なる可能性を提供する。したがって、個々のタンパク質ドメインに、酵素活性、調節作用をもつ結合部位、または細胞膜中へ取込まれる能力のような、タンパク質内の生体機能を割当てることが、今ではしばしば可能である。これらのドメインをコードする個々の核酸セグメントが別々にチップ表面に固定されるならば、次には変異を特定のタンパク質性質の変化と直接相関させることが可能である。このアプローチは、いくつかのタンパク質が関与する代謝経路を調べるのには、特に適している。
【００４９】
本発明に従う方法に加えて、本発明はまた、キットと形での検定パックにも関する。本キットは、電子的にアドレス可能なチップ、遊離型またはチップ表面に既に固定されて存在してもよい基準ヌクレオチド配列、および誤対合を特異的に認識する少なくとも１つの基質を含む。含まれる基準ヌクレオチド配列は、各ケースで当該検定の意図される目的に適切でなければならない。誤対合認識基質としてＥ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳを使用することが好ましい。しかし、特定の問題に対しては、ヌクレオチド挿入または欠失を検出するためのＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｕｔＳのように、キット中に他の基質を含むことも可能である。
【００５０】
色素で直接標識され、そして誤対合を認識するタンパク質、特に標識ｍｕｔＳは、従来記載されたことはない。そのような直接的に標識された基質を、結合特異性を何ら喪失せずに調製することが、意外にも可能であった。
【００５１】
その結果、本発明はまた、誤対合を認識する色素標識タンパク質を、低濃度、好ましくは１μＭと１００μＭとの間で、温和な条件および遮光下において、反応される当該色素のエステル、好ましくはサクシニミジルエステルによって、誤対合を認識するタンパク質、好ましくはｍｕｔＹ，ＭＳＨ１からＭＳＨ６，Ｓ１ヌクレアーゼ，Ｔ４エンドヌクレアーゼ、チミングリコラーゼまたはクリーバーゼおよび特に好ましくはｍｕｔＳとともに、調製するための方法に関する。加えて、蒸留水中５ｍＭから５０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ´−２−エタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ），ｐＨ７．５から８．５，５０から５００ｍＭ  ＫＣｌ，１から１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，５から１５％グリセロールから成るＨＥＰＥＳ緩衝液の使用が有益なことが明らかになっている。
【００５２】
本法を用いて、誤対合認識タンパク質を、それらの特異的結合活性を当該タンパク質が消失せずに、色素で直接標識することが可能である。その結果、本発明はさらに、誤対合認識タンパク質、色素標識された、好ましくはｍｕｔＹ，ＭＳＨ１からＭＳＨ６，Ｓ１ヌクレアーゼ，Ｔ４エンドヌクレアーゼ、チミングリコラーゼまたはクリーバーゼおよび、特に好ましくはｍｕｔＳに関する。これに関連して、ラベリングに特に適している色素は、ＣｙＴＭ３，ＣｙＴＭ５，Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７，Ｂｏｄｉｐｙ  ５５８／５６８，Ｂｏｄｉｐｙ  ６５０／６６５，Ｂｏｄｉｐｙ  ５６４／５７０，Ｓ  ０５３５，  Ｓ  ０５３６，Ｄｙ−６３０−ＮＨＳ，Ｄｙ−６３５−ＮＨＳ，ＥＶＯｂｌｕｅ３０−ＮＨＳ，ＦＡＲ−Ｂｌｕｅ，ＦＡＲ−Ｆｕｃｈｓｉａ，Ａｔｔｏ  ６５０，ＦＩＴＣおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄである。
【００５３】
同様に、本発明は、誤対合を認識し、そして例えば、ＭＢＰのような抗体結合エピトープで、または酵素基で、好ましくはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼまたはペルオキシダーゼで、標識可能な融合タンパク質に関する。しかし、当該標識は、発光または放射性基であってもよい。
【００５４】
本発明はまた、部位分離的な仕方で、支持体上、好ましくは電子的にアドレス可能な表面上のヌクレオチド配列中に、突然変異を検出するための方法についてｍｕｔＳの使用に関する。これに関連して、直接的に蛍光標識されるｍｕｔＳを使用することは、特に有益である。
【００５５】
【実施例】
一般的注釈：
真核生物、細菌および古細菌でＤＮＡ損傷の認識および修復に重要な役割を果すことが知られるｍｕｔＳファミリーのタンパク質（Ｒ．Ｆｉｓｈｅｌ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２（１９９８），２０９６−２１０１）が、塩基誤対合結合タンパク質として使われる。これらのタンパク質は、塩基誤対合を含むＤＮＡのセグメントに特異的に結合し、酵素類を補給することにより、損傷の修復を開始する。
【００５６】
それらの特異的な結合性質のため、これらのタンパク質は突然変異を検出するために使用可能である（Ｇ．Ｒ．ＴａｙｌｏｒおよびＪ．Ｄｅｅｂｌｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１４（１９９９），１８１−１８６）。
【００５７】
提示される実施例では、突然変異は、基準ＤＮＡと試験されるＤＮＡとの電子的に加速されたハイブリッド形成により、新規の色素標識ｍｕｔＳタンパク質と組合わせて、検出される。Ｎａｎｏｇｅｎからの分子生物学ワークステーションがこの目的のために使用される。実施例中に特に記載しない限り、測定は製造会社の説明書（Ｎａｎｏｇｅｎの分子生物学ワークステーションについてのマニュアル）に従って実施する。当該測定法の説明は、例えば、Ｒａｄｔｋｅｙら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８，２０００，ｅ１７中にも見られる。
【００５８】
図１は、突然変異の並行検出のダイアグラムを示し、そして下記のものを図解する：
（１）  遺伝子Ａ−Ｅの断片を、一本鎖基準ＤＮＡとして、ＮａｎｏｇｅｎＴＭチップ（Ｎａｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ，サンディエゴ、米国）上の個々の位置に、電子的にアドレスする、そして
（２）  電子的に加速されそして部位分離的な仕方で、色素標識試験ＤＮＡとハイブリッド形成させる。
【００５９】
（３）  生じたヘテロ二本鎖中の塩基誤対合は、基準ＤＮＡと比較した場合、当該試験ＤＮＡ中の突然変異を反映しており、例えば、色素標識ｍｕｔＳタンパク質を用いて、位置決め可能である。
【００６０】
（４）  引続き、当該チップの光学分析により、変異を遺伝子断片に割当てることが可能である。
各場合ごとに指摘するように、下記の実施例は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳ，Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｕｔＳ，Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳまたは融合タンパク質ＭＢＰ−ｍｕｔＳを使用している。標識ｍｕｔＳタンパク質の機能活性をチェックした後、得られた色素標識ｍｕｔＳタンパク質を、電子的にアドレスされたＤＮＡヘテロ二本鎖中の突然変異を検出するために、次の工程で使用した。
【００６１】
ヌクレオチドチップを構築するのに使用したヌクレオチド配列を、それぞれの標識とともに、次の表に示す。
【００６２】
【表１】
2004520010.tif 000004
【００６３】
実施例：Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳのクローニング、発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅し、標準法を用いて単離した。５´プライマー（配列番号１）は開始コドンの直接上流にＢａｍＨＩ切断部位を導入し、一方３´プライマー（配列番号２）は終止コドンの下流にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を生成する。ＰＣＲは当業者には知られており、次の概要に従って行った：
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１Ｂｌｕｅのツースピックティップ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ  Ｚｕｉｄｏｏｓｔ，オランダ）を、７１μｌのＨ２Ｏおよび１０μｌの１０μＭ５´プライマー，１０μｌの１０μＭ３´プライマー，１０μｌのＭｇＳＯ４含有１０ｘＰＣＲ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ），２μｌのＤＭＳＯ，１μｌのｄＮＴＰ´ｓ（いずれの場合も２５μＭ）および２μｌのＰｗｏポリメラーゼ（＝１０Ｕ）を含む、１００μｌ  ＰＣＲ混合液に添加する。ＰＣＲは次のプログラムに従って行う：９４℃で５分間と９４℃で０．５分間の３０連続サイクル、５５℃で０．５分間および７２℃で２．５分間。当該ＰＣＲの終了後、続いて７２℃で７分間インキュベーションする。
【００６４】
当該ｍｕｔＳ  ＰＣＲ産物（配列番号３）を、１％ＴＡＥアガロースゲル上で精製し、所望のＤＮＡを、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン、ドイツ）を用いて、切取ったアガロースブロックから単離する。
【００６５】
その単離されたＤＮＡはゲル上で定量し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断する。６０μｌの混合液中で、１０μｌのｍｕｔＳ  ＰＣＲ産物（約２μｇ）を、３０ＵのＢａｍＨＩ（３μｌ，ＮＥＢ、ハイデルベルク），３０ＵのＨｉｎｄＩＩＩ（３μｌ，ＮＥＢ、ハイデルベルク），６μｌの１０ｘＮＥＢ２緩衝液（ＮＥＢ、ハイデルベルク），０．６μｌの１００ｘＢＳＡ（ＮＥＢ、ハイデルベルク）および３７．４μｌのＨ２０と合一し、そしてその全体を３７℃で４時間インキュベートする。次いで、当該酵素類を７０℃で１０分間不活性化する。６μｌの酢酸ナトリウム，ｐＨ４．９および１６５μｌのエタノールを加えた後、当該ＤＮＡを４℃で一晩沈澱させる。当該ペレットを７０％エタノール中で洗浄後、空気中で乾燥する。当該ＤＮＡを３０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  ｔｒｉｓＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８）中に取込む。
【００６６】
Ｅ．ｃｏｌｉ発現プラスミドｐＱＥ３０（配列番号４）（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン）を、同様にＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断する。６０μｌの混合液中で、１０μｌのｐＱＥ３０を、３０ＵのＢａｍＨＩ（３μｌ，ＮＥＢ、ハイデルベルク），３０ＵのＨｉｎｄＩＩＩ（３μｌ，ＮＥＢ、ハイデルベルク），６μｌの１０ｘＮＥＢ２緩衝液（ＮＥＢ、ハイデルベルク），０．６μｌの１００ｘＢＳＡ（ＮＥＢ、ハイデルベルク）および３７．４μｌのＨ２０と合一し、そしてその全体を３７℃で４時間インキュベートする。次いで、当該酵素類を７０℃で１０分間不活性化する。６μｌの酢酸ナトリウム，ｐＨ４．９および１６５μｌのエタノールを加えた後、当該ＤＮＡを４℃で一晩沈澱させる。当該ペレットを７０％エタノールで洗浄後、空気中で乾燥する。当該ＤＮＡを３０μｌのＴＥ（１０ｍＭ  ｔｒｉｓＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８）中に取込む。
【００６７】
ｐＱＥ３０およびｍｕｔＳの量をアガロースゲル上で比較し、そして１００ｎｇのプラスミド（２μｌ）および１５０ｎｇ（５μｌ）のｍｕｔＳ  ＤＮＡを、２０μｌライゲーション混合液中、２μｌの１０ｘリガーゼ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，マンハイム），２μｌのリガーゼ（２Ｕ，Ｒｏｃｈｅ，マンハイム）および９μｌのＨ２０と合一し、そしてその全体を３７℃で２時間インキュベートする。次に、当該ライゲーション混合物を、ＣａＣｌ２法を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ製，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，サンディエゴ、米国）中へ形質転換する（Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，１巻，ＥＤ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２０００）。当該細胞を、アンピシリンに対する抵抗性について選択し、そして陽性クローンの当該プラスミド含量をミニプレップ分析により調べる。所望のｐＱＥ３０−ｍｕｔＳ（配列番号５）プラスミドが見られたクローンについてタンパク質誘導を実施した。
【００６８】
プラスミドｐＱＥ３０−ｍｕｔＳをもつＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０の５ｍｌ  ＬＢ（１００μｇのアンピシリン／ｍｌを含む）一晩培養物を、続く１００ｍｌＬＢ培養物（１００μｇのアンピシリン／ｍｌ）中で０．０５のＯＤ５９５が得られるように、希釈する。当該細胞は、０．２５のＯＤ５９５が得られるまで、震盪（２４０ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベートする。続いて、１ｍＭの濃度になるようにＩＰＴＧを当該培養物に加え、そして当該細胞をさらに４時間インキュベートする。当該細胞を遠心分離（５０００ｘｇ  １０分間）により収穫する。当該細胞ペレットを、０．１ｇのリゾチーム（Ｓｉｇｍａ，ダイセンドルフ）および２５０Ｕのベンゾナーゼ（Ｍｅｒｃｋ，ダルムスタット）を含む１０ｍｌのＰＢＳ緩衝液中に取込み、そしてその全体を３７℃で６０分間インキュベートする。
【００６９】
図２は、誘導後（レイン１および２）および誘導前（レイン３）に、ｍｕｔＳ（矢印）発現Ｅ．ｃｏｌｉ株について行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
その後で、１００μｌのＰＭＳＦ（イソプロパノール中１００ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ，ダイセンドルフ）および１００μｌのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ，ダイセンドルフ）を加えた。当該細胞が溶解した後、細胞残物を１０，０００ｘｇで１０分間、遠沈させた。２ｍｌのニッケル−ＮＴＡ−アガロース（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン）を１０ｍｌのｂｕｆｆｅｒ１７（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン）で３回平衡化する。平衡化されたニッケル−ＮＴＡ−アガロースを次いで前記ライゼートに添加する。それからその全体を４℃で１時間インキュベートする。結合されたｍｕｔＳタンパク質を含む当該材料を、ガラスフリットをもつミニカラム（Ｂｉｏｒａｄ，ミュンヘン）を通して分離し、ｂｕｆｆｅｒ  Ａで３回（４ｍｌ，２ｍｌ，および２ｍｌ）洗浄する。当該タンパク質は、次いで２ｘ２ｍｌのｂｕｆｆｅｒ  Ｂ（Ｑｉａｇｅｎ）で溶出する。
【００７０】
実施例：Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳおよびＥ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの色素によるラベリングおよびそれらについて機能性試験を実施すること
ａ）ＣｙＴＭ３によるＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳの非特異的ラベリング
それらの蛍光性質のために、色素ＣｙＴＭ３およびＣｙＴＭ５（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，英国）は、生体分子の蛍光ラベリングによく使われる（Ｍｕｊｕｍｄａｒ，Ｒ．Ｂ．ら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４（１９９３）１０５−１１１；Ｙｕ，Ｈ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２２（１９９４）３２２６−３２３２）。これについては、対応するサクシニミジルエステルが、求核置換反応によって、タンパク質のリシン残基に非特異的にそして共有的に、共役のために、普通は結合される。この情況でのタンパク質の最適蛍光ラベリングでは、Ｐｈａｒｍａｃｉａが作製したプロトコール（ＦｌｕｏｒｏＬｉｎｋＴＭ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，英国）は、比較的強い塩基性（０．１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３，ｐＨ９．３）である条件下で、大過剰の発蛍光団と当該タンパク質とのインキュベーションをすることとしている。そこでまず第一に、熱に安定なＴｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳを、本プロトコールに従ってＣｙＴＭ３で蛍光標識した。ゲル透過クロマトグラフィーによる精製およびそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後に、ＣｙＴＭ３で標識されたｍｕｔＳタンパク質に、その分子量からして、間違いなく相当する強い蛍光性タンパク質バンドを検出することが可能であった（図３）。レイン１はｍｕｔＳ−ＣｙＴＭ３（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）を示し、一方レイン２から４はｍｕｔＳ−ＣｙＴＭ５（Ｅ．ｃｏｌｉ）を示す。
【００７１】
しかし、それに続く活性試験（バンドシフト検定）は、当該標識タンパク質が、もはや何らの活性ももっておらず、したがってＧ／Ｔ誤対合を含むオリゴマーを結合できないことを、示した（図７参照）。本実験は、当該ｍｕｔＳタンパク質をラベリングする場合に、前記色素製造会社により提案されたラベリング処置は実用的でなく、当該活性タンパク質を保持するためには、洗練されそして最適化されたラベリングプロトコールを確立しなければならないことを、証明している。
【００７２】
ｂ）ＣｙＴＭ５によるＥ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳおよびＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳの非特異的ラベリング
当該タンパク質の蛍光ラベリングのために、ラベリング緩衝液（蒸留水中２０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ´−２−エタンスルフォン酸（ＨＥＰＥＳ），ｐＨ７．９，１５０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ），１０％グリセロール）中で濃度を次第に増加させたラベリング試薬を用いて、蛍光標識ｍｕｔＳの異なる集団を得るために、４回のラベリング検定を行った。次いで、ラベリングの程度が異なるこれらのタンパク質の活性を、バンドシフト検定で調べた。
【００７３】
ラベリング反応は、室温で３０分間、そして暗所で、ラベリング緩衝液中、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳタンパク質（５０μｇ，１．０５μＭ）および濃度を次第に増加させたＣｙＴＭ５サクシニミジルエステル（１２μＭ，２０μＭ，５０μＭおよび１００μＭ）から成る混合液（５００μｌ）中で行った。当該色素標識ｍｕｔＳタンパク質を精製するために、ＮＡＰ−５ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｐｐｓａｌａ，スエーデン）を、３カラム容量の溶出緩衝液（蒸溜水中、２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６，１５０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ），１０％グリセロール）で平衡化した。溶出緩衝液（５００μｌ）をそれに加えた後、全ラベリング反応溶液を当該カラム上にロードし、そして、蛍光色素でさまざまな程度に標識された当該タンパク質を、溶出緩衝液で溶出することにより単離した。次いで、蛍光タンパク質画分を、ＵＶスペクトロメトリー（図４）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルクロマトグラフィー（図５）により、さらに詳しく調べた。
【００７４】
図４は、前記ラベリング反応で得られた異なる程度の蛍光ラベリング（Ｄ／Ｐ比）をもつｍｕｔＳ−ＣｙＴＭ５（Ｅ．ｃｏｌｉ）共役体の異なる画分のＵＶスペクトルの例を示す。スペクトル１から４は、次の程度の蛍光ラベリングを示す：１．Ｄ／Ｐ＝０．５（２０μＭ  ＣｙＴＭ５），２．Ｄ／Ｐ＝１．０（５０μＭ  ＣｙＴＭ５），３．Ｄ／Ｐ＝２．０（１００μＭ  ＣｙＴＭ５），および４．Ｄ／Ｐ＝３．０（１００μＭ  ＣｙＴＭ５）。
【００７５】
図５は、異なる程度の蛍光ラベリング（Ｄ／Ｐ比）をもつ異なるｍｕｔＳ−ＣｙＴＭ５（Ｅ．ｃｏｌｉ）画分について行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥの例を示す。レイン１から７は、次の程度の蛍光ラベリングを示す：１．Ｄ／Ｐ＝０．５（２０μＭ  ＣｙＴＭ５），２．Ｄ／Ｐ＝０．５（２０μＭ  ＣｙＴＭ５），３．Ｄ／Ｐ＝１．５（５０μＭ  ＣｙＴＭ５），４．Ｄ／Ｐ＝１．０（５０μＭ  ＣｙＴＭ５），５．Ｄ／Ｐ＝２．０（１００μＭ  ＣｙＴＭ５），６．Ｄ／Ｐ＝３．０（１００μＭ  ＣｙＴＭ５），７．Ｄ／Ｐ＝２．５（１００μＭ  ＣｙＴＭ５）。
【００７６】
引続き、ＣｙＴＭ５共役ｍｕｔＳタンパク質が機能的に活性かどうか、すなわち、それらが塩基誤対合に特異的に結合できるかどうか、をチェックするために、バンドシフトを用いた。このために、オリゴヌクレオチド「ＡＴ」（配列番号６）および「ＧＴ」（配列番号７）をそれぞれ、「センス」オリゴヌクレオチド（配列番号１１）と、１０Ｍ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，中、９５℃で５分間加熱することによりハイブリッド形成させて、、次いでゆっくりと室温まで冷却することによりヘテロ二本鎖を作製した。当該「ＧＴ」オリゴヌクレオチドは、当該「ＡＴ」オリゴヌクレオチドに比較した場合、突然変異をもっている。Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，フランクフルト）を用いて、「ＡＴ」および「ＧＴ」オリゴヌクレオチドを用いて産生した前記２ヘテロ二本鎖の各１０ｐｍｏｌを、１５０μＣｉの３２Ｐ−ＡＴＰによりそれらの５´末端で、製造会社の説明書に従って、放射性標識し、そして製造会社の説明書に従って、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スエーデン）を通して精製した。バンドシフト検定のためには、１７ｆｍｏｌの前記それぞれのヘテロ二本鎖を、１０μｌの反応緩衝液（蒸溜水中、２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６，１５０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ），１００μｇのＢＳＡ画分ＶＩＩ／ｍｌ，１５％グリセロール）中に取込み、そしてこの溶液を、１０μｌのＣｙＴＭ５共役ｍｕｔＳタンパク質または商業的に入手できるｍｕｔＳタンパク質の５．０μｇに相当する１０μｌとともに、室温で２０分間インキュベートした。非共役Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳ（Ｇｅｎｅ  Ｃｈｅｃｋ，Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，米国）およびＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，米国）を使用し、そしてＣｙＴＭ５共役Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳを、比較のために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳ用に確立されたプロトコールを用いて、調製した。前記インキュベーション後、当該混合物を６％ポリアクリルアミドゲル上にロードし、２５ｍＡで９０分間分離した。ゲルおよび泳動緩衝液系は、４０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ホウ酸，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  ＥＤＴＡであった。泳動後、ゲルを乾燥し、オートラジオグラフィーにより分析した（図６）。
【００７７】
図６は、商業的に入手できる非標識タンパク質（Ｇｅｎｅ  Ｃｈｅｃｋ，Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，米国、レイン２および７）と比較した場合、活性の消失を全く示さない、ＣｙＴＭ５共役Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳ（レイン４および９）を示す。同じことが、ＣｙＴＭ５共役Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，米国、レイン３および８非共役、レイン５および１０共役）。レイン１および６は何らのタンパク質も含まない。両共役および非共役タンパク質は、塩基誤対合（Ｇ／Ｔ）を含むオリゴヌクレオチド（レイン６および１０）に、何らの誤対合もない（Ａ／Ｔ）オリゴヌクレオチド（レイン１および５）よりも、顕著にずっと強く結合した。ここで採用された共役条件下では、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳもＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳも活性の消失を全く示さなかった。
【００７８】
上述の共役プロトコールに対して、当該色素の製造会社により推奨されている条件で、例えば、抗体については適切である前記条件を用いる、ＣｙＴＭ３によるＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳの共役が、当該共役タンパク質の活性の完全消失をもたらす（図７）ことは、この場合に本標準プロトコールを用いることが可能でなかったことを意味する。
【００７９】
図７は、非共役Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳ（レイン２および７：０．１６μｇ，レイン５および１０：０．６４μｇ）を示し、そしてそれは、標準条件下でＣｙＴＭ３と共役しているタンパク質（レイン４および９：０．１６μｇ，レイン５および１０：０．６４μｇ）と違って、ＤＮＡに結合するが、この場合、塩基誤対合を含むＤＮＡ（レイン６から１０）は、正確に対合しているＤＮＡ（レイン１から５）よりずっと効率良く結合される。レイン１および６は何らのタンパク質も含まない。
【００８０】
実施例：活性ｍｕｔＳを発現させるための代替法
Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）ＴＯＰ１０におけるｍｕｔＳの過剰発現は、不溶性タンパク質の形成をもたらした。封入体形成とも呼ばれるこの問題は、Ｅ．ｃｏｌｉでは頻繁に起る。図８は、さまざまな温度で増殖され、ｍｕｔＳを過剰発現したｐＱＥ３０−ｍｕｔＳ形質転換培養物から得られ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分画されたＥ．ｃｏｌｉライゼートを示す。その目的は、低インキュベーション温度（それぞれ３０℃および２５℃）を用いることにより、封入体の形成を避けることであった。しかし、もし当該ライゼートの可溶性画分を考えると、それはごく少量のｍｕｔＳタンパク質を含むに過ぎないことがわかる。他方、非常に大量のｍｕｔＳタンパク質を、当該不溶性画分（封入体）に見い出すことができる。
【００８１】
封入体から可溶性の、したがって機能性のタンパク質を単離するのは、非常に手間のかかる処理なので、より多くの可溶性タンパク質を産生する別の発現系を見つける必要があった。
【００８２】
図８は、Ｅ．ｃｏｌｉライゼートのクーマシー染色１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レイン１：２５℃培養物からの、不溶性画分、レイン２可溶性画分。レイン３：３０℃培養物からの、不溶性画分、レイン４可溶性画分。レイン５：３７℃培養物からの、不溶性画分、レイン６可溶性画分。すべてのｐＱＥ３０−ｍｕｔＳ形質転換培養物は０．３ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、所定の温度で３時間増殖させた。
【００８３】
この理由のため、以下の工程では、発現されたタンパク質のアミノ酸配列における変化が、その溶解性質を改善するかどうかを決めるためのチェックを行った。先ず第一に、Ｅ．ｃｏｌｉマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびＥ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳから成る融合タンパク質が、改善された溶解性質を示すかどうかを試験した。このために、ｍｕｔＳコードＤＮＡをベクターｐＭＡＬｃ２ｘ（ＮＥＢ，フランクフルト、配列番号８）に挿入し、その結果、プラスミドｐＭＡＬｃ２ｘ−ｍｕｔＳ（配列番号９）を得た。慣用のｍｕｔＳタンパク質と比較した場合、この融合タンパク質のもう１つの長所は、当該融合タンパク質の検出を可能にする、抗ＭＢＰ抗体の商業的入手しやすさにある。抗ｍｕｔＳ抗体は、現在、商業的には入手できない。
【００８４】
本研究で試験した融合タンパク質は、４２ｋＤａマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）および９２ｋＤａ  ｍｕｔＳタンパク質より成る。
このために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳをコードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲにより増幅し、標準法を用いて単離した。５´ＢａｍＨＩプライマー（配列番号５２）は、開始コドンの上流にＢａｍＨＩ切断部位を導入する。同時に、当該開始コドンの直ぐ上流に位置するヌクレオチド配列を、当該開始コドン機能が消失するように変異させる。この目的は、当該開始コドンにおいて短小化したポリペプチドの生成を、タンパク質生合成機械装置が始動するのを避けることである。３´ＨｉｎｄＩＩＩリバースプライマー（配列番号２）は、終止コドンの下流にＨｉｎｄＩＩＩ切断部位を導入する。ＰＣＲは当業者には知られており、そして次の概要に従って行った：
４μｌのＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔｉｐ  ｓｙｓｔｅｍ  ２０／Ｇ  ｆｒｏｍ  Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデンを用い、製造会社の説明書に従って調製した）を、６１μｌのＨ２Ｏ，１０μｌの１０μＭ５´プライマー，１０μｌの１０μＭ３´プライマー，ＭｇＳＯ４（Ｒｏｃｈｅ，マンハイム）、２μｌのＤＭＳＯ，１μｌのｄＮＴＰ´ｓ（いずれの場合も２５ｍＭ）を含む１０μｌの１０ｘＰＣＲ緩衝液、および２μｌのＰｗｏポリメラーゼ（＝１０Ｕ）を含む１００μｌ  ＰＣＲ混合液に添加する。当該ＰＣＲは次のプログラムに従って行う：９５℃で５分間、次いで９５℃で０．５分間の３０サイクル、５５℃で０．５分間および７２℃で２．５分間。当該ＰＣＲの終了後、続いて７２℃で７分間インキュベーションを行う。当該ｍｕｔＳ  ＰＣＲ産物を、次に、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン、ドイツ）を用いて単離し、塩類、プライマー類およびタンパク類を除去する。単離されたＤＮＡはゲル上で定量し、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断する。：
このために、４１μｌのｍｕｔＳ  ＰＣＲ産物（約２μｇ）を、５０μｌ混合液中で、２０ＵのＢａｍＨＩ（２μｌ，ＮＥＢ、フランクフルト），２０ＵのＨｉｎｄＩＩＩ（２μｌ，ＮＥＢ、フランクフルト），および５μｌ１０ｘＮＥＢ２緩衝液（ＮＥＢ、フランクフルト）と合一し、そしてその全体を３７℃で一晩インキュベートする。これに並行して、１０μｌのベクターｐＭＡＬｃ２ｘ（２μｇ、ＮＥＢ製，フランクフルト）を、２０ＵのＢａｍＨＩ（２μｌ，ＮＥＢ、フランクフルト），２０ＵのＨｉｎｄＩＩＩ（２μｌ，ＮＥＢ、フランクフルト），５μｌの１０ｘＮＥＢ２緩衝液（ＮＥＢ、フランクフルト）および３１μｌの水と合一し、そしてその全体を３７℃で一晩インキュベートする。次いで、当該ＤＮＡ断片を１％ＴＢＥアガロースゲル上で精製し、ＱｉａＱｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン）を用いてアガロース残渣を除く。当該ＤＮＡ断片は、いずれの場合も５０μｌの水に取込んだ。
【００８５】
ｐＭＡＬｃ２ｘおよびｍｕｔＳの量を、アガロースゲル上で比較し、そして２００ｎｇのプラスミド（３μｌ）および４００ｎｇ（１４μｌ）のｍｕｔＳ  ＤＮＡを、２μｌの１０ｘリガーゼ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，マンハイム）および１μｌのＴ４ＤＮＡリガーゼ（２Ｕ，Ｒｏｃｈｅ，マンハイム）を含む２０μｌライゲーション混合液中で合一し、そしてその全体を室温で３時間インキュベートする。形質転換のために、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｋ１２株“Ｇｏｌｄｓｔａｒ”（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，サンディエゴ、米国）を、１００μｇのアンピシリン／ｍｌを含むＬＢ培地中、３７℃一晩、２００ｒｐｍで震盪し、増殖させた。翌朝、１ｍｌの当該細菌培養物を２００ｍｌの新しい培地中へ転種し、５９５ｎｍにおいて０．５６５の吸光度が得られるまで、２００ｒｐｍおよび３７℃で震盪した。当該培養物を、次いで、４℃まで冷却し、そして２５００ｘｇで遠沈した。上清を捨て、ペレット化した細菌を、１０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール６０００，５％ジメチルスルフォキシド，１０ｍＭ  ＭｇＳＯ４，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，米国），ｐＨ６．８を含む７．５ｍｌのＬＢ培地に取込み、次いでこの懸濁液を氷上１時間でインキュベートし、次いで液体窒素中でショック凍結し、そしてー８０℃で貯蔵した。形質転換のために、１０μｌの当該ライゲーション混合液を、１００μｌの１００ｍＭ  ＫＣｌ，３０ｍＭ  ＣａＣｌ２，５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２に取込み、そして１００μｌの前記融解細菌とともに氷上で２０分間インキュベートした。室温で１０分間インキュベーションの後、１ｍｌのＬＢ培地を、当該細菌に加え、そしてその後者を次いで３７℃で１時間震盪しながらインキュベートした。その後、当該混合液を、１００μｇのアンピシリン／ｍｌを含むＬＢ寒天プレート上にストリークし、そしてこれらのプレートを３７℃で一晩インキュベートした。個々のコロニーを単離し、そして１００μｇのアンピシリン／ｍｌを含む３ｍｌのＬＢ中で３７℃で一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを当該細菌から単離し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ／ヒルデン）を用いて製造会社の説明書に従って、精製した。陽性クローンのプラスミド含量を、ミニプレ分析により調べた。タンパク誘導は、所望のｐＭＡＬｃ２ｘ−ｍｕｔＳプラスミド（配列番号９）をもつ、４つの独立に単離したクローンについて実施した。プラスミドｐＭＡＬｃ２ｘ−ｍｕｔＳをもつＥ．ｃｏｌｉ  Ｇｏｌｄｓｔａｒの５ｍｌ  ＬＢ（１００μｇのアンピシリン／ｍｌを含む）一晩培養物を１：５０に希釈し、そして３７℃で震盪（２４０ｒｐｍ）しながら、ＯＤ５９５＝０．５まで増殖させる。引続き、Ｌａｍｍｌｉ試料緩衝液をアリコットの各培養物に添加する；ＩＰＴＧを次いで当該培養物に加え、０．３ｍＭの濃度とし、そして当該細胞を３７℃でさらに２時間インキュベートする。Ｌａｍｍｌｉ試料緩衝液を続いて当該培養物に加え、そして後者を、非誘導試料とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分画する。当該ゲルのクーマシー染色は、クローン１および６に約１４０ｋＤａ（４２ｋＤａ  ＭＢＰ＋９３ｋＤａ  ｍｕｔＳ）タンパク質の発現を証明する（図９Ａ）。同じ試料類とともにロードされ、そして並行して分画されたＳＤＳゲルは、第一抗ＭＢＰ抗体を用いるウェスタンブロットにより分析された（ｐＭＡＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ＮＥＢ，フランクフルト：中に試薬および方法論が記載）。これに関連して、クローン１および６の場合には、大きさが約１４０ｋＤのタンパク質を検出することができた（図９Ｂ）が、このタンパク質はしたがってＭＢＰ／ｍｕｔＳ融合タンパク質である。しかし初期の実験は、本発現系でも、大部分の発現ｍｕｔＳ融合タンパク質が不溶性の封入体中に存在することを示しており、この場合に採用された細胞の何かに起因すると思われる（データ不掲示）。この理由のため、プラスミドｐＭＡＬｃ２ｘ−ｍｕｔＳを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉ−Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，ヒルデン）を用いてクローン２から単離し、上記のように、適格なＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ６００細胞中へ形質転換した。この株は封入体を形成する傾向が低い。新たに形質転換されたクローンを、０．２％グルコース，２ｍＭ  ＭｇＣｌ２，および１００μｇのアンピシリン／ｍｌを含む１００ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で一晩増殖させた。本培養物の５０ｍｌを遠心分離により収穫し、３Ｌの本培地中３７℃で、ＯＤ５９５＝０．６まで増殖させた。ＩＰＴＧを０．３ｍＭの濃度まで加えた後、当該細胞を３０℃で３時間震盪しながら引続きインキュベートし、次いで遠心分離により収穫し、１００ｍｌのカラム緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９，１５０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭジチオスレイトール，０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ）中に再懸濁した。その後、当該細胞を超音波処理により溶解し、そして細胞残渣は９０００ｘｇで遠心分離することにより分離した。
【００８６】
当該ＭＢＰ−ｍｕｔＳ融合タンパク質は、次いでアミロースカラム上でアフィニティークロマトグラフィーにより精製し、そして１０ｍＭマルトースを含むカラム緩衝液（上記参照）で溶出した（ｐＭＡＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ＮＥＢ，フランクフルト：中に記載）。その後で、溶出液中のタンパク質濃度を定量するために、Ｂｒａｄｆｏｒｄ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｒａｄ，ミュンヘン）を使用した。２μｇの溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。これに関連して、当該融合タンパク質はごく僅かの夾雑タンパク質を含むことが見い出された（図９Ｃ）。当該ＭＢＰ−ｍｕｔＳ融合タンパク質は、グリセロールで１：１（ｖ／ｖ）に処理し、−２０℃に貯蔵した。当該タンパク質の活性は、「バンド・シフト」法および表面プラスモン共鳴技術（下記参照）も用いて、立証した。
【００８７】
図９Ａは、ｐＭＡＬｃ２ｘ−ｍｕｔＳ形質転換細胞由来のＥ．ｃｏｌｉライゼート（溶菌液）のクーマシー染色５％−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。レイン１および２：クローン１。レイン３および４：クローン４。レイン５および６：クローン５。レイン７および８：クローン６。溶菌に先立って、当該細胞を、０．３ｍＭ  ＩＰＴＧで、誘導しなかった（レイン１、３、５および７）、あるいは誘導した（レイン２、４、６および８）。クローン１および６では、１４０ｋＤａの予想サイズのタンパクが形成されている（矢印）。図９Ｂ：ｐＭＡＬｃ２ｘ−ｍｕｔＳ形質転換細胞由来のＥ．ｃｏｌｉライゼートの５％−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥのウェスタンブロット分析。レイン１および５：クローン１。レイン２および６：クローン４。レイン３および７：クローン５。レイン４および８：クローン６。溶菌に先立って、当該細胞を、０．３ｍＭ  ＩＰＴＧで、誘導しなかった（レイン１−４）、あるいは誘導した（レイン５−８）。クローン１および６の場合には、１４０ｋＤａの予想サイズのタンパク質が抗ＭＢＰ抗体により認識された（矢印）。クローン４および５の場合には、ＭＢＰ（約４０ｋＤａ）のサイズのタンパクが認識される。図９Ｃ：精製ＭＢＰ−ｍｕｔＳ融合タンパク質のクーマシー染色５％−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。２つの独立の調製物からのアフィニティークロマトグラフィー精製ＭＢＰ−ｍｕｔＳを、ゲル電気泳動により調べた。レイン１：マーカー。レイン２：調製物１。レイン３：調製物２。
【００８８】
実施例：他のラベリング法
２ｍｇのｍｕｔＳタンパク質（ＭＢＳ融合タンパク質または非融合変異体、Ｇｅｎｅｓｃａｎ製（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，米国）、商業的に入手したＥ．ｃｏｌｉタンパク質，またはＢｉｏｚｙｍ，Ｈｅｓｓ，Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆから入手したＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳ）を、１８ｍｌの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１５０ｍＭ  ＫＣｌ，１０％（ｖ／ｖ）グリセロールに溶解した。２５０ｎｍｏｌのＣｙＴＭ５−サクシニミジルエステルを２ｍｌの同緩衝液に溶解し、次にこの溶液を当該タンパク質の溶液と徹底的に混合し、そしてその全体を室温で３０分間インキュベートした。続いて、２ｍｌの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１５０ｍＭ  ＫＣｌ，１００ｍＭアデノシン三リン酸，１０ｍＭジチオスレイトール，１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを当該反応物に添加した。当該タンパク質含有溶液を、１０ｋＤａのカットオフをもつ透析バッグ中で、いずれの場合も、２ｌの２０ｍＭ  ｔｒｉｓ  ｐＨ７．６，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１５０ｍＭ  ＫＣｌ，１ｍＭ  ＤＴＴ，１０％（ｖ／ｖ）グリセロールに対して、４℃で３時間を２回、およびさらに一晩１回、透析した。その後で、等容量のグリセロールを当該タンパク質に加え、そしてその全体をー２０℃で貯蔵した。
【００８９】
実施例：電子的にアドレス可能なＤＮＡチップ上での点変異の検出
機能性色素標識Ｅ．ｃｏｌｉおよびＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳタンパク質をここで、電子的にアドレス可能なＤＮＡチップ上で点変異を検出するために使用した。このために、５´端でビオチニル化されている「センス」オリゴヌクレオチド（配列番号１０）の１００ｎＭ溶液を、まず第一に、Ｎａｎｏｇｏｎ（Ｒａｄｔｋｅｙら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８，２０００，ｅ１７；Ｒ．Ｇ．Ｓｏｎｏｗｓｋｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１１９−１１２３  １９９４；Ｐ．Ｎ．Ｇｉｌｌｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７，３６５−３７０，１９９９中に記載のように）により供給された１００位置ＤＮＡチップの列１−５および７−１０の全位置に、２Ｖを用いて６０秒間電子的にアドレスした（これに関するダイアグラムは図１０に示すが、それはＤＮＡをもつ１００位置チップをロードするための電子アドレシングの使用を示す）。位置当りの電流強度は、列１−８では２６２ｎＡと３６４ｎＡとの間を変動し、列９および１０では２１ｎＡと２７ｎＡとの間を変動したが、その結果これらの位置へは、より少量のＤＮＡがアドレスされた（図１０、左側マトリックス、２下列）。続いて、前記「センス」オリゴヌクレオチド（配列番号１０）に完全に相補的であり、そして５´端でＣｙＴＭ３により標識されているオリゴヌクレオチド配列番号６を、上記の条件下に当該チップの列１、３、７および９に適用し、その結果、「ＡＴ」と呼ばれる、完全に対合した二本鎖がこれらの位置に形成された（表１および図１０、右側マトリックス、暗影されている）。続く工程で、ＣｙＴＭ３標識オリゴヌクレオチド配列番号７を、上記のように、当該チップの列２、４、８および１０に適用した。前にアドレスされた「センス」オリゴヌクレオチドとともに、このオリゴヌクレオチドは、単一のＧ／Ｔ塩基誤対合をもつ二本鎖を形成し、そのため、生じる二本鎖オリゴヌクレオチドは、「ＧＴ」と呼ばれる（表１、図１０、右側マトリックス、明影されている）。列５（表１、図１０）は、したがって、一本鎖「センス」ＤＮＡを含み、一方列６（表１、図１０）はＤＮＡを全く含まない。
【００９０】
各５０μｌの上記ＣｙＴＭ５標識ｍｕｔＳタンパク質を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０スピンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，スエーデン）上で、製造会社の説明書に従って精製し、そしてその結果として、非共役色素を完全に除去した。当該カラムは５００μｌの緩衝液（２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６，１５０ｍＭ  ＫＣｌ，１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））で予め平衡化し、一方当該精製タンパク質をチップ表面上へ添加し、そして室温で２０分間インキュベートした。続いて、ＣｙＴＭ３蛍光の強度を、製造会社の（すなわちＮａｎｏｇｅｎの）説明書に従い、当該チップ表面上で測定した（表１）。列１から４および７および８における数値の小変動は、二本鎖ＡＴおよびＧＴオリゴヌクレオチドの均質なハイブリッド形成を明示している。列９および１０における比較的低い値は、電流強度のより低いアドレシングの結果として、これらの列でのより少ない量のＤＮＡを反映している。列５における低値は、蛍光標識ＤＮＡを本列にはアドレスしなかったので、バックグラウンドシグナルを成すものである。対照として、列６は、一本鎖「センス」ＤＮＡのみを含む。
【００９１】
【表２】
2004520010.tif 000005
【００９２】
表１：電子的にアドレスされた１００位置チップ上のＣｙＴＭ３標識ＤＮＡの５７５ｎｍにおける蛍光強度の定量。表は、チップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度、およびこれらの位置にアドレスされたＤＮＡ（外部右側欄）も、示す。
【００９３】
ＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳタンパク質の蛍光のそれに続く測定は、当該タンパク質がＧＴオリゴヌクレオチドに好んで結合することを明らかに示す（表２）。たとえＤＮＡの量が非常に少ない場合でも（表２、列９および１０）、完全に対合しているオリゴヌクレオチド（ＡＴ）と塩基誤対合を生成するオリゴヌクレオチド（ＧＴ）とを識別するために、当該色素標識タンパク質を用いることが可能で、この識別は、ＤＮＡ量が多くなればなるほど、一層明瞭になる（列１−４および７および８、表１を比較）。低バックグラウンド値も顕著である（表２、列５および６）。Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳタンパク質のような他の塩基誤対合結合タンパク質も、電子的にアドレス可能なチップ上の突然変異を迅速に検出するために使用可能かどうかを確かめるために、Ｎａｎｏｇｅｎからの１００位置チップを、上記のようにまず第一に、正確にアドレスした。引続き、ＣｙＴＭ５標識Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳタンパク質を、上記のように、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０スピンカラム上でさらに精製し、そしてそれからチップ表面上で２０分間インキュベートした。続いて、当該チップ表面上のＣｙＴＭ３蛍光の強度を、製造会社の、すなわちＮａｎｏｇｅｎの説明書に従い、測定した（表３）。列１から４および７および８における数値の小変動は、二本鎖ＡＴおよびＧＴオリゴヌクレオチドの均質なハイブリッド形成を、この場合も明示している。列９および１０における比較的低い値は、採用された電流強度の低いアドレシングのために、これらの列でＤＮＡの量が少ない事実を、反映している（上記参照）。列５および６における低値は、蛍光標識ＤＮＡをこれらの列にはアドレスしなかったので、バックグラウンドシグナルを成すものである。ＣｙＴＭ５標識Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳタンパク質の蛍光のそれに続く測定は、このタンパク質もＧＴオリゴヌクレオチドに優先的に結合することを明らかに示しており（表４）、そしてその結果として、電子的にアドレス可能なＤＮＡチップ上の突然変異を検出するために適切である。
【００９４】
【表３】
2004520010.tif 000006
【００９５】
表２：電子的にアドレスされた１００位置チップ上のＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳタンパク質の６７０ｎｍにおける蛍光の強度の定量。表は、チップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度、およびこれらの位置にアドレスされるＤＮＡ（外部右側欄）も、示す。
【００９６】
【表４】
2004520010.tif 000007
【００９７】
表３：電子的にアドレスされた１００位置チップ上のＣｙＴＭ３標識ＤＮＡの５７５ｎｍにおける蛍光の強度の定量。表は、チップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度、およびこれらの位置にアドレスされるＤＮＡ（外部右側欄）も、示す。
【００９８】
【表５】
2004520010.tif 000008
【００９９】
表４：電子的にアドレスされた１００位置チップ上のＣｙＴＭ５標識Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳタンパク質の６７０ｎｍにおける蛍光の強度の定量。表は、チップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度、およびこれらの位置にアドレスされるＤＮＡ（外部右側欄）も、示す。
【０１００】
実施例：電子的にアドレス可能なチップ上のＤＮＡ分子中の突然変異の塩条件に依存した検出
高塩条件および低塩条件下における塩基誤対合へのＥ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合の比較：
測定精度を改良するために、電子的にアドレス可能なチップの表面上の塩基誤対合をさらに一層効率的に認識することを確実にするように、色素標識ｍｕｔＳタンパク質の結合条件を検討し、そして最適化した。
【０１０１】
このために、Ｎａｎｏｇｅｎにより供給され、そしてその表面が、ストレプタビジン分子が包埋されたアガロース層から成る、２つの電子的にアドレス可能なチップを、まず第一に、ビオチニル化された「センス」オリゴヌクレオチド（配列番号１０）でロードし、そして次に、ＣｙＴＭ３標識「ＡＴ」（配列番号１２、完全塩基対合のための対向鎖）またはＧＴ（配列番号１３、ＧＴ塩基誤対合のための対向鎖）オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成した。続いて、得られたＤＮＡ二本鎖へのｍｕｔＳの結合を、２つの異なる塩濃度で試験した。このために、当該オリゴヌクレオチドを、まず第一に、１００ｎＭの濃度でヒスチジン緩衝液中に溶解し、そしてこの溶液を９５℃で５分間インキュベートする。当該「センス」オリゴヌクレオチドを、Ｎａｎｏｇｅｎワークステーションローディング器具中で２．０Ｖの電圧で６０秒間、両アガロースチップ上の所定の位置に電子的にアドレスした；「ＡＴ」または「ＧＴ」第２鎖オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、同様に、しかし２．０Ｖで１２０秒間実施した。両チップについて同一であったローディング概要を表５に示す。ロードされた後、当該チップをローディング器具から取出し、そしていずれの場合も、非特異的タンパク質結合部位を飽和するため、１ｍｌのリン酸塩遮断緩衝液で充たし、そして室温で４５分間インキュベートした。
【０１０２】
当該チップの１つ（以下チップＡと呼称）を、次いで０．５ｍｌの高塩緩衝液で洗い、そして２０μｌ  ＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＢＰ−ｍｕｔＳ（濃度：０．４５μｇ／μｌ）＋７９μｌの高塩緩衝液＋１μｌの１００ｘＢＳＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  ａｍ  Ｍａｉｎ）から成る混合液と３７℃で２０分間インキュベートした。その後で、当該チップを、１３５ｍｌの高塩緩衝液で室温で手によって洗った。第二チップ（チップＢ）を、同じプロトコールに従うが、高塩緩衝液の代わりに低塩緩衝液を用いて処理した。
【０１０３】
最後に、当該２チップの表面上のＣｙＴＭ５蛍光強度をＮａｎｏｇｅｎリーダー中で測定した。当該測定には、次の器具設定を用いた：高感度（「高ゲイン」）；２５６μｓ積算時間。測定値は、（チップＡについては）表６に、そして（チップＢについては）表７に示し、結果の統計分析を表８に示す。
【０１０４】
ヒスチジン緩衝液：５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ，ダイセンホフェン）；この溶液を０．２μｍの細孔サイズをもつ膜を通じて濾過し、そして陰圧下で脱気した
リン酸塩遮断緩衝液：５０ｍＭ  ＮａＰＯ４，ｐＨ７．４／５００ｍＭ  ＮａＣｌ／３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Ｓｅｒｖａ製、ハイデルベルグ）
低塩緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／１ｍＭ  ＤＴＴ
高塩緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／３００ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／１ｍＭ  ＤＴＴ
【０１０５】
【表６】
2004520010.tif 000009
【０１０６】
表５：チップＡおよびＢをローディングするための概要：「ＡＴ」：完全対合。位置をセンスでアドレスし、そして続いて「ＡＴ」とハイブリッド形成させた：ＧＴ：ＧＴ誤対合。位置をセンスでアドレスし、そして次いでＧＴとハイブリッド形成させた：センス：一本鎖センス。位置をセンスでアドレスしたが、どの対向鎖ともハイブリッド形成させなかった。ＳＳ「ＡＴ」：一本鎖「ＡＴ」。位置を「ＡＴ」だけでロードした：そこではビオチニル化第１鎖は全くない。
【０１０７】
【表７】
2004520010.tif 000010
【０１０８】
表６：高塩条件下でのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＢＰ−ｍｕｔＳの完全に対合したまたはＧＴ誤対合したＤＮＡ二本鎖への結合を検出するためのチップＡの赤色蛍光強度の測定。表は、チップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０１０９】
【表８】
2004520010.tif 000011
【０１１０】
表７：低塩条件下でのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＢＰ−ｍｕｔＳの完全に対合したまたはＧＴ誤対合したＤＮＡ二本鎖への結合を検出するためのチップＢの赤色蛍光強度の測定。表は、チップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０１１１】
【表９】
2004520010.tif 000012
【０１１２】
表８：チップＡおよびチップＢで得られた結果の統計分析。同じローディングをもつ全位置における蛍光強度の平均値および標準偏差を、各場合で計算した。
低塩条件（５０ｍＭ  ＫＣＬ）下では、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＢＰ−ｍｕｔＳは、完全に対合した二本鎖に、または一本鎖ＤＮＡに対するより、ＧＴ誤対合したＤＮＡ二本鎖へより強く結合することが、表８から明白である。他方、高塩濃度（３００ｍＭ  ＫＣＬ）では、当該ｍｕｔＳタンパク質の誤対合したＤＮＡ二本鎖への多少優先的結合を証明できるに過ぎなかった。ｍｕｔＳの結合については文献では通常比較的高塩濃度が採用されていることから、これは意外である。しかし、本例で使われるチップの場合、恐らく当該タンパク質と当該チップのアガロース透過層との間に非特異的な疎水性相互作用があり、この非特異的な疎水性相互作用が高塩条件下では、チップの良好な浸透性を妨げているのであろう。この理由のため、すべての以下の実験では低塩濃度を含む緩衝液を使用した。
【０１１３】
実施例：異なる塩基誤対合を認識するためのｍｕｔＳの使用
本実験は、ｍｕｔＳタンパク質が、ＤＮＡチップ上の他の塩基誤対合または挿入／欠失を検出するためにも採用可能なことを証明する。このために、次の型のＤＮＡ二本鎖を、Ｎａｎｏｇｅｎにより供給された電子的にアドレス可能なアガロースチップ上の異なる位置でのハイブリッド形成により作製した：
‐  完全に相補的な二本鎖
‐  ８つの可能性のある塩基誤対合（ＡＡ，ＡＧ，ＣＡ，ＣＣ，ＣＴ，ＧＧ，ＧＴ，ＴＴ）の１つを含む二本鎖
‐  １つの鎖が１、２または３つの塩基の挿入を含む二本鎖
得られたＤＮＡ二本鎖に結合するためのＥ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの能力を次に試験した。このために、第１および第２鎖オリゴヌクレオチドを、１００ｎＭの濃度でヒスチジン緩衝液中にまず溶解し、そして９５℃で５分間変性した。ビオチニル化「センス」オリゴヌクレオチド（配列番号１０）を、Ｎａｎｏｇｅｎワークステーションのローディング器具中で、２．０Ｖの電圧で６０秒間アガロースチップ上の個々の位置に電子的にアドレスした。「ＡＴ」（配列番号１２），ＧＴ（配列番号１３），ＡＡ（配列番号１４），ＡＧ（配列番号１５），ＣＡ（配列番号１６），ＣＣ（配列番号１７），ＣＴ（配列番号１８），ＧＧ（配列番号１９），ＴＴ（配列番号２０），ｉｎｓ（挿入）＋１Ｔ（配列番号２１），ｉｎｓ＋２Ｔ（配列番号２２）およびｉｎｓ＋３Ｔ（配列番号２３）第２鎖ヌクレオチドとのハイブリッド形成は、２．０Ｖで１２０秒間行った。そのローディング概要を表９に示す。各第２鎖オリゴヌクレオチドの名称は、当該ハイブリッド形成中に生じる誤対合または挿入（「ｉｎｓ」）を示す。
【０１１４】
ローディング後、当該チップをローディング器具から取出し、非特異的タンパク質結合部位を飽和するため、１ｍｌの遮断緩衝液で充たし、そして室温で６０分間インキュベートした。続いて、当該チップを、９０μｌのインキュベーション緩衝液中、１０μｌのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳ（濃度：５０ｎｇ／μｌ）とともに室温で６０分間インキュベートした。このインキュベーション後、当該チップを、１ｍｌのインキュベーション緩衝液で手によって洗い、そして次いでＮａｎｏｇｅｎリーダー中に挿入し、そして３７℃の温度で、いずれの場合も、０．５ｍｌの洗浄緩衝液で７０回洗浄した。最後に、当該チップ上の個々の位置でのＣｙＴＭ５蛍光強度を、下記の器具設定を用いて、Ｎａｎｏｇｅｎリーダー中で測定した：高感度（「高ゲイン」）；２５６μｓ積算時間。測定された相対蛍光強度は表１０に；測定データの統計分析の結果は、表１１および図１１に示す。
【０１１５】
ヒスチジン緩衝液：５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；この溶液を０．２μｍの細孔サイズをもつ膜を通じて濾過し、そして陰圧により脱気した
遮断緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／３％ＢＳＡ（Ｓｅｒｖａ、ハイデルベルグ）
インキュベーション緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／１％ＢＳＡ
洗浄緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０
【０１１６】
【表１０】
2004520010.tif 000013
【０１１７】
表９：ＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの異なる誤対合への結合を検出するためのチップをローディングするための概要：「Ｎｅｇ」：ＤＮＡでロードされていない位置。「ｓｓＤＮＡ」：「センス」一本鎖でのみロードされている位置。すべての残る位置は、まず第一に、「センス」オリゴヌクレオチドでアドレスし、そして次いで表中に示した第２鎖とハイブリッド形成した。
【０１１８】
【表１１】
2004520010.tif 000014
【０１１９】
表１０：ＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの異なる誤対合を含むＤＮＡ二本鎖への結合を検出するためのアガロースチップ上の赤色蛍光強度の測定。表は、チップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０１２０】
【表１２】
2004520010.tif 000015
【０１２１】
表１１：異なる誤対合を含むアガロースチップからの結果の統計分析。同じローディングをもつ全位置における蛍光強度についての平均値および標準偏差を、各場合で計算した。さらに、対応する平均値と、完全に対合したＤＮＡ（「ＡＴ」）を用いて得られた値との商を、各誤対合について決定した。
【０１２２】
図１１は、電子的にアドレス可能なアガロースチップ上でハイブリッド形成させることにより作製された誤対合ＤＮＡ二本鎖へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を示す。いずれの場合も、図は、異なる塩基誤対合および挿入について、平均赤色蛍光強度を標準偏差とともに示す。
【０１２３】
試験したすべての誤対合および挿入の場合で、蛍光強度についての平均値は、完全に対合した二本鎖で得られた値より大きいことが、表１１から明らかである。ＧＴ誤対合は、ｍｕｔＳにより最も効率的に結合される１つであり；これらの位置で測定された蛍光値は、完全に対合したＤＮＡの場合に測定された値より、約７のファクターで高い。他方、ｍｕｔＳは、ＣＣおよびＴＴ誤対合を弱く認識するに過ぎない。さまざまな塩基誤対合に加えて、本明細書に記載の方法は、１つまたは２つの塩基の挿入を検出するのにも使用可能である（図１１）。
【０１２４】
実施例：電子的にアドレス可能なヒドロゲルチップ上で点変異を検出するためのｍｕｔＳの使用
さまざまな点変異を認識するためにｍｕｔＳを使用することについての前節に記載の実験を、アガロース層の代わりに、その中に包埋されているストレプタビジン分子とともに、ヒドロゲルマトリクッスをそのチップが含む、Ｎａｎｏｇｅｎにより供給されるもう１つのタイプの電子的にアドレス可能なチップを用いて、繰返した。本明細書に提示された点変異を認識するための方法に、どちらのタイプのチップ表面が最も適するかを試験するために、前記２チップタイプで得られた結果を、次に相互に比較した。
【０１２５】
実験実施：
「異なる塩基誤対合を認識するためのｍｕｔＳの使用」の標題の実施例に記載されているプロトコールを用いて、ヒドロゲルチップをロードした；ただし、「センス」第１鎖オリゴヌクレオチドのヒドロゲルチップ上へのアドレシングおよびさまざまな第２鎖とのハイブリッド形成は、両方とも、２．１Ｖの電圧で行った。ローディング概要は表９に示す。
【０１２６】
「異なる塩基誤対合を認識するためのｍｕｔＳの使用」の標題の節に示されたプロトコールに従って、ロードされたヒドロゲルチップを、ＢＳＡで飽和し、ＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳとインキュベートし、そして洗浄した。個々の位置に結合したｍｕｔＳタンパク質を、次に赤色蛍光強度を測定することにより検出した。前記アガロースチップを測定するために使用したのと同じ、器具設定をこれに用いた（「高ゲイン」）、積算時間、２５６μｓ）。測定された相対蛍光強度は表１２に示す；測定データの統計分析の結果は、表１３および図１２に示す。
【０１２７】
【表１３】
2004520010.tif 000016
【０１２８】
表１２：ＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの異なる誤対合を含むＤＮＡ二本鎖への結合を検出するためのヒドロゲルチップの赤色蛍光強度の測定。表は、チップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０１２９】
【表１４】
2004520010.tif 000017
【０１３０】
表１３：異なる誤対合を含むヒドロゲルチップで得られた結果の統計分析。同じローディングをもつ全位置の蛍光強度についての平均値および標準偏差を、各場合で計算した。対応する平均値と、完全に対合したＤＮＡで得られた値との商も、各誤対合について決定した。
【０１３１】
図１２は、電子的にアドレス可能なヒドロゲルチップ上でハイブリッド形成させることにより作製された誤対合ＤＮＡ二本鎖へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を示す。いずれの場合も、図は、異なる塩基誤対合および挿入について、平均赤色蛍光強度を標準偏差とともに示す。
【０１３２】
表１３および図１２から明らかなように、アガロースチップで得られたのと同じような画像が、ヒドロゲルチップを用いている場合に得られている：ＧＴ誤対合は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳにより最も効率的に認識されるものであるが、それに対してＣＣおよびＴＴ誤対合を含むＤＮＡ二本鎖は、完全に対合された二本鎖に比べて、当該タンパク質により、ほとんど強くは結合されない。しかし全体として、誤対合ＤＮＡで得られた蛍光値と、完全に対合したＤＮＡでの値との間の商は、アガロースチップの場合（表１１）におけるより、ヒドロゲルチップの場合（表１３）における方が、多少高い。それゆえ、ヒドロゲルチップを用いたときの方が、変異および非変異ＤＮＡ間で、よりよい区別を得ることが可能である。これに加えて、当該測定機器を最高感度（「高ゲイン」）の同じ設定に調整するとき、ヒドロゲルチップの場合に測定される絶対値は、アガロースチップで得られたものより４−５のファクターで高く、それにより、測定範囲をより効率的に利用することが可能になる。ヒドロゲルチップの場合、ＧＴ誤対合で得られた蛍光強度は、飽和範囲にさえなる（＞１０４９）。ヒドロゲルチップ上のより高い蛍光についての可能性のある説明は、比較的大きなｍｕｔＳタンパク質が、アガロースマトリクッス中へより、ヒドロゲル層の細孔中へよりよく浸透できることである。
【０１３３】
要するに、アガロースチップとヒドロゲルチップとの間で比較することにより、両タイプのチップは、ｍｕｔＳに基づく突然変異検出に適していることを、証明できた。しかし、アガロースチップと比較した場合、ヒドロゲルチップは、より高い感度、および誤対合したＤＮＡと完全に対合したＤＮＡとの間のよりよい識別、という利点を提供する。
【０１３４】
比較実施例：色素標識ｍｕｔＳタンパク質を用いる塩基誤対合の認識
多様な塩基誤対合に対するｍｕｔＳタンパク質の結合を、表面プラスモン共鳴技術を用いて検討した。全塩基誤対合が当該タンパク質により、本当に特異的に結合されるかどうかをチェックするのに、本法が必要であった。既に説明してきたバンドシフト検定法に比べて、表面プラスモン共鳴技術は、結合事象をより正確に定量することを可能にする。
【０１３５】
５´端でビオチニル化されている「センス」オリゴヌクレオチド（配列番号１１）、およびこのオリゴヌクレオチドに部分的に相補的なオリゴヌクレオチド（配列番号１２−２２）を、本目的のために合成した（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ／Ｍａｉｎ）。これら後者のオリゴヌクレオチドが当該「センス」オリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成した場合には、するとこれは、完全に対合した二本鎖ＤＮＡ（ＡＴ）、塩基誤対合（ＡＡ，ＡＣ，ＡＧ，ＣＣ，ＣＴ，ＧＧ，ＧＴ，ＴＴ）を含む二本鎖ＤＮＡまたは１、２または３つのチミジン残基の挿入を含む二本鎖ＤＮＡを生じることになる（表１４）。
【０１３６】
当該オリゴヌクレオチド類は、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．００５％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中、２ｐｍｏｌ／μｌの濃度まで取込んだ。次に当該「センス」オリゴヌクレオチドを、図１３に例として示すように、飽和に達するまで、ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＡチップの表面のストレプタビジンロードチャンネルに、５μｌ／分の流速で適用した。このオリゴヌクレオチドに部分的に相補的なオリゴヌクレオチドを、表１４に示す二本鎖ＤＮＡ分子種を得るために、実施例「電子的にアドレス可能なヒドロゲルチップ上で点変異を検出するためのｍｕｔＳの使用」におけるように、当該チップのそれぞれのチャンネルに対して、同一の緩衝液条件下で、適用した。当該二本鎖オリゴヌクレオチド類が導入された後、当該チップ表面を、２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６，５０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０，１０％（ｖ／ｖ）グリセロールで平衡化した。ＣｙＴＭ５標識ｍｕｔＳ−マルトース結合タンパク質融合タンパク質を、同じ緩衝液中に０．１μｇ／μｌの濃度に取込み、そして５μｌ／分の流速で当該チップ上にロードした。当該チップのチャンネルを、次に１００μｌの当該緩衝液２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６，５０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０，１０％（ｖ／ｖ）グリセロールでリンスし、それによって、非特異的に結合したタンパク質を洗い去った。リンスの後、各それぞれの二本鎖オリゴヌクレオチドに結合した（共鳴単位として表された）タンパク質の量を定量した（表１４）。これが行われたとき、大体において、当該標識融合タンパク質は、完全に対合した「ＡＴ」オリゴヌクレオチドに結合するより、ＣＣ塩基誤対合を別にして、すべての塩基誤対合および挿入によく結合することが、わかった（表１４）。その結果として、われわれが思量しそして調製した蛍光色素標識ｍｕｔＳタンパク質は、任意の可能性がある突然変異を位置決めすることができる。当該著者らは、本明細書に記載されている当該タンパク質についての場合のように、ラベリング後にそのＤＮＡ結合性質が保存されたままである、どのような他の蛍光色素標識タンパク質をも、承知していない。
【０１３７】
図１３は、ｍｕｔＳ結合のセンソグラムの一例を示す。本センソグラムは、Ｂｉａｃｏｒｅ−ＳＡチップの４チャンネル中の質量（ＲＵ、共鳴単位）における時空的変化を示す。完全に対合した二本鎖（「ＡＴ」、チャンネル４）およびＧＴ（チャンネル１），ＣＣ（チャンネル３）およびＧＧ（チャンネル２）塩基誤対合を含むＤＮＡを作製するために、ビオチニル化「センス」オリゴヌクレオチドをチャンネル１−４に適用し、そしてそれぞれの対向鎖とハイブリッド形成させた。当該タンパク質を次いでロードオンした（ｔ＝４６３８からｔ＝５２３９まで）。非結合タンパク質は洗浄により除去した（ｔ＝５３７８からｔ＝６５７９まで）。当該タンパク質ローディング前の共鳴（ｔ＝４５０２）は、洗浄後に測定した共鳴（ｔ＝６５７９）から差引いた。その差が結合したｍｕｔＳタンパク質の質量に相当する。
【０１３８】
【表１５】
2004520010.tif 000018
【０１３９】
表１４：本表は、ＢｉａｃｏｒｅＴＭＳＡチップの表面に結合し、そして塩基誤対合（下線塩基）を含む、二本鎖オリゴヌクレオチドへのＭＢＰ−ｍｕｔＳ融合タンパク質の結合を示す。
【０１４０】
実施例：異なるオリゴヌクレオチド中のＧＴ誤対合の検出
ｍｕｔＳによる点変異の認識は、形成されている誤対合の性質に依存するだけでなく、当該誤対合の周囲のヌクレオチド配列によっても影響される（Ｍ．Ｊｏｎｅｓら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１５（１９８７），５０５−６１０）。それゆえ、本明細書に記載されている方法を、特定の配列情況に関係なく、ＧＴ誤対合を確実に検出するために、使用することが可能かどうかを決定するために、試験を行った。この実験のために、さまざまな塩基配列をもつ８つの異なる第１鎖オリゴヌクレオチドを、アガロースチップ上およびヒドロゲルチップ上の所定の位置にアドレスし、そして各場合で、完全対合（「ＡＴ」）のためのおよびＧＴ誤対合のための相補的対向鎖とハイブリッド形成させた。次いで、それらの異なる二本鎖へのＥ．ｃｏｌｉ−ｍｕｔＳの結合を調べた。
【０１４１】
実験実施：すべての当該オリゴヌクレオチドを、１００ｎＭの濃度で、ヒスチジン緩衝液中に溶解し、そして９５℃で５分間変性させた。ビオチニル化第１鎖「センス」オリゴヌクレオチド（配列番号１０）、ＡＰＣ  ｓｅ（配列番号２４），ｂｃｌ  ｓｅ（配列番号２７），Ｂｒｃ  ｓｅ（配列番号３０），Ｍｅｔ  ｓｅ（配列番号３３），ＭＳＨ  ｓｅ（配列番号３６），ｐ５３  ｓｅ（配列番号３９）およびＲｂ  ｓｅ（配列番号４２）を、Ｎａｎｏｇｅｎワークステーションローディング器具中で、（アガロースチップの場合には）２．０Ｖの電圧で６０秒間、そして（ヒドロゲルチップの場合には）２．１Ｖで、個々の位置に電子的にアドレスした。ＣｙＴＭ３標識対向鎖とのハイブリッド形成は、（アガロースチップの場合には）２．０Ｖで１２０秒間、そして（ヒドロゲルチップの場合には）２．１Ｖで行った。アガロースチップについてのローディング概要は表１５に示し、一方ヒドロゲルチップについてのローディング概要は表１９に示す。次の第２鎖オリゴヌクレオチドを用いた：
‐  完全対合について：ＡＴ（配列番号１２），ＡＰＣ  ＡＴ（配列番号２５），ｂｃｌ  ＡＴ（配列番号２８），Ｂｒｃ  ＡＴ（配列番号３１），Ｍｅｔ  ＡＴ（配列番号３４），ＭＳＨ  ＡＴ（配列番号３７），ｐ５３  ＡＴ（配列番号４０），Ｒｂ  ＡＴ（配列番号４３）
‐  ＧＴ誤対合について：ＧＴ（配列番号１３），ＡＰＣ  ＧＴ（配列番号２６），ｂｃｌ  ＧＴ（配列番号２９），Ｂｒｃ  ＧＴ（配列番号３２），Ｍｅｔ  ＧＴ（配列番号３５），ＭＳＨ  ＧＴ（配列番号３８），ｐ５３  ＧＴ（配列番号４１），Ｒｂ  ＧＴ（配列番号４４）
ローディング後、当該チップをローディング器具から取出し、非特異的タンパク質結合部位を飽和するため、１ｍｌの遮断緩衝液で充たし、そして室温で６０分間インキュベートした。当該チップを、次に、９０μｌのインキュベーション緩衝液中、１０μｌのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳ（濃度：５０ｎｇ／μｌ）とともに室温で６０分間インキュベートした。このインキュベーション後、当該チップを、１ｍｌのインキュベーション緩衝液で手によって洗い、次いでＮａｎｏｇｅｎリーダー中に挿入し、そして３７℃の温度で、いずれの場合も、０．５ｍｌの洗浄緩衝液で７０回リーダー中で洗浄した。
【０１４２】
最後に、当該チップ上の個々の位置でＣｙＴＭ５およびＣｙＴＭ３蛍光強度を、下記の器具設定を用いて、Ｎａｎｏｇｅｎリーダー中で測定した：
赤色蛍光（ＣｙＴＭ５）：高感度（「高ゲイン」）；２５６μｓ積算時間
緑色蛍光（ＣｙＴＭ３）：低感度（「低ゲイン」）；２５６μｓ積算時間
ヒスチジン緩衝液：５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；この溶液を０．２μｍの細孔サイズをもつ膜を通じて濾過し、そして陰圧により脱気した。
【０１４３】
遮断緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／３％ＢＳＡ
インキュベーション緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／１％ＢＳＡ
洗浄緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０
【０１４４】
アガロースチップ上で行われた実験の場合、測定された緑色蛍光強度は表１６に示し、一方赤色蛍光強度は表１７に示す。負の対照として、ＤＮＡでロードされなかったチップ上の位置に加えて、いくつかの他のコンパートメント（位置１／１０、２／４、２／５、２／６、２／１０および３／２）も僅かな緑色蛍光を示すだけであった。ＣｙＴＭ３標識第２鎖でのローディングはこれらの位置で恐らく機能しなかったので、それらは、以降の分析には含めなかった。当該赤色蛍光強度の統計分析の結果は、表１８中および図１４に示す。
【０１４５】
ヒドロゲルチップ上で行われた実験の場合、測定された緑色蛍光強度は表２０に表示し、一方赤色蛍光強度は表２１に表示する。当該緑色蛍光強度は、いずれもアガロースチップの場合におけるより低かった。当該赤色蛍光強度の統計分析の結果は、表２２中および図１５に示す。その非常に低い緑色蛍光のため、チップ位置９／６は、当該分析に含めなかった。
【０１４６】
【表１６】
2004520010.tif 000019
【０１４７】
表１５：異なるＤＮＡ二本鎖中のＧＴ塩基誤対合へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を検出するためのアガロースチップをローディングするための概要。空ボックスは、ＤＮＡでロードされない位置を表す。すべての残る位置は、まず第一に、上列に指名したオリゴヌクレオチドでアドレスし、そしてその後で、下列に挙げた第２鎖とハイブリッド形成した。
【０１４８】
【表１７】
2004520010.tif 000020
【０１４９】
表１６：ＣｙＴＭ３標識第２鎖オリゴヌクレオチドでのローディングをチェックするためのアガロースチップ上の緑色蛍光強度の測定。表はチップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０１５０】
【表１８】
2004520010.tif 000021
【０１５１】
表１７：異なるＤＮＡ二本鎖中のＧＴ塩基誤対合へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を検出するためのアガロースチップ上の赤色蛍光強度の測定。表はチップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０１５２】
【表１９】
2004520010.tif 000022
【０１５３】
表１８：異なる完全に対合したおよびＧＴ誤対合したＤＮＡ二本鎖を含むアガロースチップの統計分析。同じローディングをもつ全位置における赤色蛍光強度の平均値および標準偏差を、各場合で計算した。さらに、対応するＧＴ誤対合第２鎖を加えた後に得た蛍光と、完全に相補的な第２鎖を加えて後に得た蛍光との商を、各第１鎖について決定した。緑色蛍光のそれらの低レベルのために、位置１／１０、２／４、２／５、２／６、２／１０および３／２は、当該分析に含めなかった。
【０１５４】
図１４は、電子的にアドレス可能なアガロースチップ上でハイブリッド形成させることにより作製された、種々の完全に対合した（ＡＴ）およびＧＴ誤対合したＤＮＡ二本鎖へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を示す。図は、いずれの場合も、異なる二本鎖について、平均赤色蛍光強度を標準偏差とともに示す。
【０１５５】
【表２０】
2004520010.tif 000023
【０１５６】
表１９：異なるＤＮＡ二本鎖中のＧＴ塩基誤対合へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を検出するためのヒドロゲルチップをローディングするための概要。空ボックスは、ＤＮＡでロードされなかった位置を表す。すべての残る位置は、まず第一に、上列に指名したオリゴヌクレオチドでアドレスし、そしてその後で、下列に挙げた第２鎖とハイブリッド形成した。
【０１５７】
【表２１】
2004520010.tif 000024
【０１５８】
表２０：ＣｙＴＭ３標識第２鎖オリゴヌクレオチドでのローディングをチェックするためのヒドロゲルチップの緑色蛍光強度の測定。表はチップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０１５９】
【表２２】
2004520010.tif 000025
【０１６０】
表２１：異なるＤＮＡ二本鎖中のＧＴ塩基誤対合へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を検出するためのヒドロゲルチップ上の赤色蛍光強度の測定。表はチップ上の位置とともに付属の蛍光強度を示す。
【０１６１】
【表２３】
2004520010.tif 000026
【０１６２】
表２２：種々の完全に対合したおよびＧＴ誤対合したＤＮＡ二本鎖を含むヒドロゲルチップの統計分析。同じローディングをもつ全位置における赤色蛍光強度の平均値および標準偏差を、各場合で計算した。さらに、対応するＧＴ誤対合第２鎖を加えた後の蛍光と、完全に相補的な第２鎖を加えて後の蛍光との商を、各第１鎖について決定した。緑色蛍光のその低レベルのために、位置９／６は、当該分析に含めなかった。
【０１６３】
図１５は、電子的にアドレス可能なヒドロゲルチップ上でハイブリッド形成させることにより作製された、種々の完全に対合した（ＡＴ）およびＧＴ誤対合したＤＮＡ二本鎖へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を示す。図は、いずれの場合も、異なる二本鎖について、平均赤色蛍光強度を標準偏差とともに示す。
【０１６４】
当該実験の分析は、本明細書に記載されている方法を用いて、アガロースチップ上（表１８、図１４）およびヒドロゲルチップ上（表２２、図１５）の両方で、すべての試験したＧＴ誤対合を検出することが可能なことを示した：すべての場合で、当該ｍｕｔＳタンパク質は、それぞれの完全に対合した二本鎖へよりも、誤対合へもっと強く結合した。ＧＴ誤対合したおよび完全に対合したＤＮＡで得られた測定値間の商は、付近のＤＮＡ配列により確かに影響されるものの、
ＧＴ塩基誤対合を確実に検出するために、ｍｕｔＳを使うことは、したがって、可能である。
【０１６５】
前記２つの異なるチップタイプで得られた結果間の比較（表１８および表２２）は、完全に対合したＤＮＡおよび誤対合したＤＮＡ間のよりよい識別が、アガロースチップ上よりヒドロゲルチップ上で得られることを、この場合にも示している：その試験した配列のうち５つの場合、誤対合したおよび完全に対合したＤＮＡの場合における測定値間の商（ＧＴ／ＡＴ）は、ヒドロゲルチップで高い値を与えた。残る３つのＤＮＡ配列（「センス」，ｂｃｌ  ｓｅおよびＡＰＣ  ｓｅ）に関する限り、ＧＴ誤対合について測定された蛍光は、ヒドロゲルチップの場合、飽和範囲（＞１０４９）にあった、それは、これらの場合には商について何ら信頼できる値を決定できないことを意味した。
【０１６６】
実施例：完全に対合したおよび誤対合したＤＮＡ二本鎖の混合物中のＧＴ誤対合の認識
もしＤＮＡまたはｃＤＮＡがヒトまたは動物組織から単離されるなら、当該単離鎖は、すべてが必ずしも同じヌクレオチド配列を示すとは限らない。これは、当該供与生物が、ある突然変異について異型接合である（すなわち、各細胞中で、当該変異が２つの相同染色体の１つの上にのみ存在する）という事実または
当該組織中の細胞の一部のみが特定の変異を示すという事実から生じる可能性がある。この情況は、腫瘍で、特に腫瘍細胞は一般に不安定であるために、頻繁に起る。そうした不均一の患者ＤＮＡが基準ＤＮＡとハイブリッド形成する場合には、誤対合したおよび完全に対合した二本鎖の混合物が次いで形成されるであろう。
【０１６７】
次の実験では、突然変異がＥ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳタンパク質により検出されることをなお確実にするためには、混合物中で誤対合ＤＮＡの割合がどのくらい高くなければならないかを決定するために、試験を行った。このために、アガロースチップ上にアドレスされた「センス」（配列番号１０）およびｐ５３  ｓｅ（配列番号３９）第１鎖オリゴヌクレオチドを、完全に対合したおよびＧＴ誤対合した第２鎖のさまざまな混合物と、各場合でハイブリッド形成させた。
【０１６８】
ＡＴ（配列番号１２）およびＧＴ（配列番号１３）オリゴヌクレオチドの以下の混合物を、第１鎖「センス」ＤＮＡとハイブリッド形成させるための第２鎖として使用した：
ＡＴ：ハイブリッド形成は１００ｎＭ  ＡＴを用いて行った
ＧＴ：ハイブリッド形成は１００ｎＭ  ＧＴを用いて行った
３％ＧＴ：ハイブリッド形成は３ｎＭ  ＧＴ＋９７ｎＭ  ＡＴから成る混合物を用いて行った
１０％ＧＴ：ハイブリッド形成は１０ｎＭ  ＧＴ＋９０ｎＭ  ＡＴから成る混合物を用いて行った
２５％ＧＴ：ハイブリッド形成は２５ｎＭ  ＧＴ＋７５ｎＭ  ＡＴから成る混合物を用いて行った
５０％ＧＴ：ハイブリッド形成は５０ｎＭ  ＧＴ＋５０ｎＭ  ＡＴから成る混合物を用いて行った
７５％ＧＴ：ハイブリッド形成は７５ｎＭ  ＧＴ＋２５ｎＭ  ＡＴから成る混合物を用いて行った
ｐ５３  ＡＴ（配列番号４０）およびｐ５３  ＧＴ（配列番号４１）オリゴヌクレオチドの相当混合物を、ｐ５３  ｓｅ第１鎖とハイブリッド形成させるために採用した。
【０１６９】
実験実施：第１鎖および第２鎖オリゴヌクレオチドを、ヒスチジン緩衝液（総濃度：いずれの場合も１００ｎＭ）に溶解し、そして９５℃で５分間変性した。ビオチニル化「センス」およびｐ５３  ｓｅオリゴヌクレオチドを、Ｎａｎｏｇｅｎワークステーションチャージングセット中で、２．０Ｖの電圧で６０秒間、Ｎａｎｏｇｅｎアガロースチップ上の個々の位置に電子的にアドレスした。さまざまな第２鎖混合物とのハイブリッド形成は２．０Ｖで１２０秒間行った。当該ローディング概要は表２３に示す。ローディング後、当該チップをローディング器具から取出し、非特異的タンパク質結合部位を飽和するため、１ｍｌの遮断緩衝液で充たし、そして室温で６０分間インキュベートした。当該チップを、次に、９０μｌのインキュベーション緩衝液中、１０μｌのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳ（濃度：５０ｎｇ／μｌ）とともに室温で６０分間インキュベートした。このインキュベーション後、当該チップを、１ｍｌのインキュベーション緩衝液で手によって洗い、次いでＮａｎｏｇｅｎリーダー中に挿入し、そして３７℃の温度で、いずれの場合も、０．５ｍｌの洗浄緩衝液で７０回リーダー中で洗浄した。最後に、当該チップ上の個々の位置でのＣｙＴＭ５蛍光強度を、下記の器具設定を用いて、Ｎａｎｏｇｅｎリーダー中で測定した：高感度（「高ゲイン」）；２５６μｓ積算時間。測定された相対蛍光強度は表２４に示す：測定データの統計分析の結果は、表２５および図１６Ａおよび図１６Ｂに示す。
【０１７０】
ヒスチジン緩衝液：５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；この溶液を０．２μｍの細孔サイズをもつ膜を通じて濾過し、そして脱気した。
遮断緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／３％ＢＳＡ
インキュベーション緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／１％ＢＳＡ
洗浄緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０
【０１７１】
【表２４】
2004520010.tif 000027
【０１７２】
表２３：完全に対合したおよびＧＴ誤対合したＤＮＡ二本鎖のさまざまな混合物へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を検出するためのアガロースチップをローディングするための概要。空ボックスは、ＤＮＡでロードされなかった位置を表す（負の対照）。太文字のあるボックスは、１つのＤＮＡでロードされただけの位置を明らかにしている（単一鎖対照）。すべての残る位置は、まず第一に、上列に指名されているビオチニル化されたオリゴヌクレオチドでアドレスし、そしてその後で、第２列に挙げられた第２鎖混合物とハイブリッド形成した。追加の対照として、斜体文字により明示された位置は、第１鎖および非相補的第２鎖の組合わせでロードされた；これらの位置では、何らのハイブリッド形成もないはずである。
【０１７３】
【表２５】
2004520010.tif 000028
【０１７４】
表２４：完全に対合したおよびＧＴ誤対合したＤＮＡ二本鎖のさまざまな混合物へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を検出するためのアガロースチップ上の赤色蛍光強度の測定。表はチップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０１７５】
【表２６】
2004520010.tif 000029
【０１７６】
表２５：完全に対合したおよびＧＴ誤対合したＤＮＡ二本鎖のさまざまな混合物を含むアガロースチップの統計分析。同じローディングをもつ全位置における赤色蛍光強度の平均値および標準偏差を、各場合で計算した。
【０１７７】
図１６は、電子的にアドレス可能なアガロースチップ上でハイブリッド形成させることにより作製された、完全に対合したおよびＧＴ誤対合したＤＮＡ二本鎖のさまざまな混合物へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を示す。図は、いずれの場合も、異なる二本鎖について、平均赤色蛍光強度を標準偏差とともに示す。図１６Ａは、「センス」第１鎖およびその相補的ＡＴ（完全に対合）およびＧＴ（誤対合）オリゴヌクレオチドを用いて得た二本鎖へのｍｕｔＳの結合を示す。図１６Ｂは、ｐ５３  ｓｅオリゴヌクレオチドおよびその相補的ｐ５３  ＡＴ（完全に対合）およびｐ５３  ＧＴ（誤対合）対向鎖を用いて得られる二本鎖へのｍｕｔＳの結合を示す。
【０１７８】
試験した両ＤＮＡ配列の場合、１００％完全に対合したＤＮＡより成る試料へｍｕｔＳが結合するより、９０％完全に対合した二本鎖および１０％だけのＧＴ誤対合した鎖を含むＤＮＡ混合物へ対してさえ、ｍｕｔＳがよりよく結合したことを、首尾一貫した仕方で示すことが可能であった（表２５；図１６）。ｐ５３  ｓｅ第１鎖配列の場合、測定されたＣｙＴＭ５蛍光は、誤対合したＤＮＡの割合が僅か３％であった場合でも、１００％完全に対合したＤＮＡで得られた値より高かった。従って、本明細書に記載されている方法は、試験されるＤＮＡ鎖のごく僅かの割合が、相当する塩基置換を含む場合でも、突然変異を検出するために使用可能である。
【０１７９】
実施例：ゲノムＤＮＡ中の突然変異の検出
次の実験では、臨床的に関係がある遺伝子中の突然変異を検出するのにｍｕｔＳを使用することが可能かどうか、そして突然変異の存在について患者試料からの遺伝子のＰＣＲ産物を実例とするために本発明を使用することが可能かどうかを決めるために、チェックを行った。
【０１８０】
癌抑制遺伝子ｐ５３は癌の発生で重要な役割を果している（Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｗ．Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｃｅｌｌ  ７０（１９９２），５２３−５２６）；従って、ｐ５３における突然変異は、腫瘍の発生の予後マーカーとして使うことも可能である。ｐ５３におけるすべての既知突然変異の９０％以上は、当該遺伝子のＥｘｏｎ５からＥｘｏｎ９までの領域に位置し（Ｍ．Ｈｏｌｌｓｔｅｉｎ，Ｄ．Ｓｉｄｒａｎｓｋｙ，Ｂ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．Ｃ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３，４９−５３（１９９１））、そしてその領域は当該タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードする。
【０１８１】
ここで、電子的にアドレス可能なＤＮＡマイクロチップ上で、ヒト細胞株中のｐ５３遺伝子のＥｘｏｎ８中の突然変異を検出するのに、色素標識ｍｕｔＳを使用することが可能かどうかを決めるチェックをした。このために、次の４つのヒト腫瘍細胞株由来のゲノムＤＮＡを、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）（微生物および細胞培養のドイツコレクション），Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ドイツ、から入手した：当該細胞株の番号付けは、ＤＳＭＺにより与えられたラベリングに従う。
【０１８２】
ＭＣＦ−７（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  １１５）は、乳腺上皮起源の腺癌細胞株である；ｐ５３に突然変異が存在することは知られていない（Ｌａｎｄｅｒｓ  ＪＥら、安定化した野生型ｐ５３タンパク質を含むヒト腫瘍細胞中のｍｄｍ２癌遺伝子発現の翻訳増強。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：３５６２−３５６８，１９９７）
ＳＷ−４８０（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ３１３）：ヒト結腸直腸腺癌から確立され、ｐ５３遺伝子中のＥｘｏｎ８のコドン２７３にＧｔｏＡ（ＧからＡへの）変異を含む（Ｗｅｉｓｓ  Ｊら、悪性黒色腫細胞株におけるｐ５３遺伝子の突然変異および発現。Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５４：６９３−６９９，１９９３）
ＭＯＬＴ−４（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ３６２）：ヒトＴリンパ芽球細胞株、ｐ５３中のＥｘｏｎ７のコドン２４８にＧｔｏＡ変異を含む（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ＮＲら、結腸直腸癌におけるｐ５３変異。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：７５５５−７５５９，１９９０）
２９３（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ  ３０５）は、ｐ５３Ｅｘｏｎ８に突然変異が報告されていない、アデノウイルス形質転換ヒト胚性腎上皮細胞株である。
【０１８３】
従って、細胞株ＳＷ−４８０だけが、そして細胞株２９３も可能性はあるが、ｐ５３遺伝子のＥｘｏｎ８に突然変異を含む。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、上記細胞株のゲノムＤＮＡからのＥｘｏｎ８を増幅するために使用した。それぞれのＰＣＲ産物（長さ：２３７ｂｐ）を次いで、調べる領域の野生型配列にその配列が相当する、合成オリゴヌクレオチド（長さ：７３塩基）と、ヒドロゲルチップ上でハイブリッド形成させた。当該ＰＣＲ産物の突出した一本鎖端にｍｕｔＳが結合するのを防ぐために、そして結果として非特異的バックグラウンド蛍光の増加を防ぐために、当該チップを一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ（マングマメヌクレアーゼ）および一本鎖結合タンパク質で処理した。それから、異なる当該二本鎖への色素標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を調べた。
【０１８４】
ポリメラーゼ連鎖反応の実施：
細胞株当りの混合物：８４．２μｌの  Ｈ２Ｏ
１０μｌの    １０ｘクローン化Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，アムステルダム、オランダ）
０．８μｌの  ｄＮＴＰ（いずれの場合も２５ｍＭ）
２ｍｌの      ゲノムＤＮＡ（１５０ｎｇ／μｌ）
０．５μｌの  Ｅｘｏｎ８ｆｏｒプライマー（配列番号４５），１００μＭ
０．５μｌの  プライマーＥｘｏｎ８ｒｅｖ（配列番号４６），１００μＭ，Ｃｙ３−標識
２μｌの      Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
増幅は、次の条件下、Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｌａｎｇｅｎ，ドイツ）中で行った：
初期変性：９５℃、２分間
３１増幅サイクル、いずれの場合も：９５℃、３０秒間／６２℃、３０秒間／７２℃、１分間
終結伸長：７２℃、１０分間
【０１８５】
ＰＣＲ産物は、続いて、ＱＩＡＧＥＮにより供給されたＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。本精製は、製造会社の説明書に従って行ったが、ＤＮＡを溶出する前に、７５％エタノールでの追加の洗浄工程を行った。当該ＤＮＡは５０μｌの水で最終的に溶出した。１．８％アガロースゲル上での当該ＤＮＡの分析は、ほぼ同じ量のＰＣＲ産物が、すべての細胞株について得られたことを、示した。
【０１８６】
チップのローディング
第１鎖として使われたビオチニル化ｃＥｘｏｎ８（配列番号４７）オリゴヌクレオチド、および正および負の対照として使われた「センス」、「ＡＴ」および「ＧＴ」オリゴヌクレオチドを、１００ｎＭの濃度で５０ｍＭヒスチジン緩衝液に溶解した。第２鎖として使われた精製ＰＣＲ産物を、いずれの場合も等容量の１００ｎＭヒスチジン緩衝液と混合した。すべてのＤＮＡ鎖は、次いで９５℃で５分間変性した。当該ｃＥｘｏｎ８および「センス」第１鎖は、Ｎａｎｏｇｅｎワークステーションローディング器具中で、２．１Ｖの電圧で６０秒間、ヒドロゲルチップ上の所定の位置に電子的にアドレスした。ＣｙＴＭ３標識ＰＣＲ産物または「ＡＴ」および「ＧＴ」オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、２．１Ｖで１８０秒間行った。当該ローディング概要は表２７に示す。
【０１８７】
ローディング後、当該チップをローディング器具から取出し、そして平衡緩衝液で充たした；当該チップ位置の緑色蛍光を、次いで、Ｎａｎｏｇｅｎリーダー中で測定した（器具設定：中ゲイン；２５６μｓ積算時間）。測定の結果は表２８に示す。続いて、当該チップを、１μｌのマングマメヌクレアーゼ（ＮＥＢ，フランクフルト）＋８９μｌの１ｘマングマメヌクレアーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と３０℃で４５分間インキュベートした。そのヌクレアーゼ消化後、当該チップを２０ｍｌの平衡緩衝液で洗浄し、そして緑色蛍光をもう一度測定した。表２９はこの測定の結果を示す。当該チップは次いで、遮断緩衝液と室温で４５分間インキュベートし、そして続いて、インキュベーション緩衝液中、２２ｎｇのＳＳＢ（一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質，ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，米国）／μｌの溶液と、３０分間インキュベートした。最後に、当該チップを、９０μｌのインキュベーション緩衝液中、１０μｌのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳ（濃度：５０ｎｇ／μｌ）とともに室温で６０分間インキュベートした。その後で、当該チップを、１ｍｌのインキュベーション緩衝液で手によって洗い、Ｎａｎｏｇｅｎリーダー中に挿入し、そしてリーダー中でそして３７℃の温度で、いずれの場合も０．２５ｍｌの洗浄緩衝液で５０回洗浄した。最後に、当該チップ上の個々の位置でのＣｙＴＭ５蛍光強度を、次ぎの器具設定で測定した：高感度（「高ゲイン」）；２５６μｓ積算時間。
【０１８８】
測定された赤色蛍光強度は表３０に示す；統計分析の結果は表３１および図１７に示す。
使用緩衝液類：
５０ｍＭヒスチジン緩衝液：５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン（Ｓｉｇｍａ）；この溶液を０．２μｍメンブランを通じて濾過し、そして陰圧により脱気した：
１００ｍＭヒスチジン緩衝液：１００ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、０．２μｍメンブランを通じて濾過
平衡緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０
遮断緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／３％ＢＳＡ
インキュベーション緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／１％ＢＳＡ
洗浄緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０
【０１８９】
【表２７】
2004520010.tif 000030
【０１９０】
表２７：ヒト細胞株におけるｐ５３遺伝子のＥｘｏｎ８中の突然変異を検出するためのヒドロゲルチップをローディングするための概要。個々の位置は、まず第一に、上列に指名されているオリゴヌクレオチドでアドレスし、そして続いて、異なる細胞株（ＭＣＦ−７，ＭＯＬＴ−４，ＳＷ−４８０および２９３）のＰＣＲ産物と、またはそのＰＣＲ産物またはオリゴヌクレオチドが第２列に指名されているＡＴまたはＧＴオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成した。いくつかの位置は、対照として第１鎖または第２鎖でのみロードされた：空ボックスはＤＮＡでロードされなかった位置を表す。
【０１９１】
【表２８】
2004520010.tif 000031
【０１９２】
表２８：マングマメヌクレアーゼで処理する前のヒドロゲルチップ上の緑色蛍光強度の測定。表はチップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０１９３】
【表２９】
2004520010.tif 000032
【０１９４】
表２９：マングマメヌクレアーゼで処理した後のヒドロゲルチップ上の緑色蛍光強度の測定。表はチップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０１９５】
【表３０】
2004520010.tif 000033
【０１９６】
表３０：合成オリゴヌクレオチドおよび異なる細胞株からのＰＣＲ産物から成る二本鎖へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を検出するための赤色蛍光強度の測定。表は当該チップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０１９７】
【表３１】
2004520010.tif 000034
【０１９８】
表３１：さまざまな細胞株中のｐ５３遺伝子のＥｘｏｎ８中の突然変異を検出するために使われたヒドロゲルチップからの結果の統計分析。同じローディングをもつ全位置における赤色蛍光強度の平均値および標準偏差を、各場合で計算した。
【０１９９】
図１７は、ｐ５３遺伝子のＥｘｏｎ８中の突然変異を検出するための、合成オリゴヌクレオチドおよび異なる細胞株からのＰＣＲ産物から成る二本鎖へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を示す。いずれの場合も、図は個々の細胞株についての平均赤色蛍光強度とともに標準偏差を示す。
【０２００】
表２８から明らかなように、異なるＰＣＲ断片とハイブリッド形成したすべての位置は、同じような程度の緑色蛍光を示した；したがって、ほぼ同量のＰＣＲ産物がこれらの位置のそれぞれに結合した。当該緑色蛍光強度は、ヌクレアーゼ消化前よりも、当該消化後に（表２９）顕著に低かった。これは、当該チップ上の一本鎖ＤＮＡ領域の分解がうまくいったことを示唆している。
【０２０１】
赤色蛍光を分析した場合（表３１、図１７）、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳは、ｃＥｘｏｎ８オリゴヌクレオチドがＳＷ−４８０細胞株からのＰＣＲ産物とハイブリッド形成された、当該チップ上のそれらの位置へ優先的に結合することが、見い出された：これらの場合、当該蛍光強度は、細胞株ＭＣＦ−７，ＭＯＬＴ−４または２９３のＰＣＲ産物とのハイブリッド形成が行われた位置におけるよりも、約６．５倍高かった。本明細書に記載された方法は、したがって、ｐ５３遺伝子のコドン２７３中に、細胞株ＳＷ−４８０で存在することが知られている、塩基置換変異を検出することに成功した。前記の選択された実験条件下で、本塩基置換は、色素標識ｍｕｔＳにより容易に認識されたＧＴ誤対合をもたらした。それに対して、ｐ５３遺伝子中に何らの突然変異も含まない株ＭＣＦ−７の場合に測定されたのと、ｐ５３中に何かの可能性ある変異に関して何の情報もない、細胞株２９３の場合に、非常に似た蛍光強度が測定された。これは、細胞株２９３が、調べられた領域中に何の塩基置換もやはり含まないことを示唆している。
【０２０２】
要するに、本明細書に記載されている方法は、患者試料から単離されたＤＮＡ中の突然変異を検出するために、よく適合していることが、本実験により証明することができた。その結果、突然変異の並行高処理検出に適したＤＮＡチップ基盤システムが、本発明において始めて公表された。
【０２０３】
実施例：ゲノムＤＮＡ中の突然変異を検出するための代替法
ゲノムＤＮＡ中の突然変異のｍｕｔＳ仲介検出のための前述の方法が、（「捕捉剤」）ビオチニル化ＰＣＲ産物を、合成オリゴヌクレオチドの代わりに、第１鎖として使用する場合にも、機能するかどうかを明らかにするために、続いて検討を行った。「捕捉剤」としてのＰＣＲ産物の使用は、突然変異の存在についてより長いＤＮＡ断片を調べることを可能にするはずである。
【０２０４】
しかしこれに関連して、合成オリゴヌクレオチドと違って、ＰＣＲ産物は二本鎖として当初存在しているという事実を、考慮しなければならない。そうしたＰＣＲ産物を、さらに精製を何もせずにマイクロチップにアドレスしたとすると、相補的な対向鎖が次に直ちに当該ビオチニル化「捕捉剤」鎖を攻撃し、そしてそれにより、試験予定の（「標的」）ＤＮＡとのそれに続くハイブリッド形成を妨害することになろう。この問題を避けるために、第１鎖で使われる当該ビオチニル化鎖を、当該相補的対向鎖からまず分離した。
【０２０５】
突然変異を検出するための前記２方法の比較を可能にするために、電子的にアドレス可能なヒドロゲルチップ上の異なる位置に、野生型細胞株ＭＣＦ−７からの一本鎖ビオチニル化ＰＣＲ産物または合成オリゴヌクレオチドｃＥｘｏｎ８を、第１鎖としてまず第一にアドレスし、そして続いて異なる細胞株からのＰＣＲ産物を、「標的」としてハイブリッド形成させた。
【０２０６】
これに並行して、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼおよびＳＳＢ（一本鎖結合タンパク質）での当該チップの処理が、ゲノムＤＮＡ中の突然変異を認識するために有利かどうか、またはこれらのインキュベーション工程は、感度の何らの損失もなく、省略可能なのかどうかを、もっと正確に試験することも望まれた。これを検討するために、４つのヒドロゲルチップを、同じ概要に従って第１および第２鎖でロードし、そして続いて、異なるインキュベーションプロトコールに従って処理した。
【０２０７】
一本鎖ビオチニル化ＰＣＲ産物を、次の概要に従って調製した：ｐ５３遺伝子中に何らの突然変異も含まない細胞株ＭＣＦ−７からのゲノムＤＮＡを、ＰＣＲのための出発材料として使用した。
【０２０８】
ＰＣＲ混合物：      ８４．２μｌの  Ｈ２Ｏ
１０μｌの    １０ｘクローン化Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ反応緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，アムステルダム、オランダ）
０．８μｌの  ｄＮＴＰ（いずれの場合も２５ｍＭ）
２μｌの      細胞株ＭＣＦ−７からのゲノムＤＮＡ（１５０ｎｇ／μｌ）
０．５μｌの  Ｅｘｏｎ８ｆｏｒ＿ｂｉｏ  プライマー（配列番号４８），１００μＭ、ビオチニル化
０．５μｌの  Ｅｘｏｎ８ｒｅｖ＿ｂ  プライマー（配列番号４９），１００μＭ
２μｌの      Ｐｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  Ｈｏｔｓｔａｒｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ／μｌ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
増幅は、次の条件下、サーモサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｌａｎｇｅｎ，ドイツ）中で行った：
初期変性（９５℃、２分間）、続いて３１増幅サイクル（いずれの場合も９５℃、３０秒間／６２℃、３０秒間／７２℃、１分間）そして終結伸長（７２℃、１０分間）
【０２０９】
過剰のビオチニル化プライマーを分離・除去するため、当該ＰＣＲ産物を次いで、ＱＩＡＧＥＮにより供給されたＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。本精製は、製造会社の説明書に従って行ったが、ＤＮＡを溶出する前に、７５％エタノールでの追加の洗浄工程を行った。当該ＤＮＡは５０μｌの水で最終的に溶出した。当該ビオチニル化一本鎖は、ＤＹＮＡＬ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ハンブルグ）により供給されたストレプタビジン・コート磁気ビーズを用いて単離した。このために、当該ＰＣＲ産物を等容量の２ｘＢ＆Ｗ緩衝液（１０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，２Ｍ  ＮａＣｌ）で希釈し、この溶液を次いでＤｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２８０ストレプタビジンとを混合し、そして当該ビオチニル化ＤＮＡ鎖が当該ストレプタビジンに結合できるようにするため、慎重に震盪しながら、室温で１５分間インキュベートした。当該ビーズを、次いで、磁石（ＤＹＮＡＬ  ＭＰＣ−Ｓ）中で濃縮し、そしてその上清を捨てた；当該ビーズを次いで１ｘＢ＆Ｗ緩衝液で洗浄した。非ビオチニル化対向鎖を分離・除去するため、当該ビーズを次いで０．１Ｍ  ＮａＯＨ中に懸濁し、そして室温で５分間インキュベートした；その後で、それらは、いずれの場合も１回、０．１Ｍ  ＮａＯＨ、１ｘＢ＆Ｗ緩衝液および水で洗浄した。当該ビオチニル化一本鎖をストレプタビジンから遊離させるために、当該ビーズを最終的に９５％ホルムアミド／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０中に懸濁し、そして６５℃で４分間インキュベートした。当該ビオチニル化一本鎖を含む上清を、まだ熱いうちに取出し、そして続いてＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。
【０２１０】
「標的」は、「ゲノムＤＮＡ中の突然変異の検出」の標題の実施例中の「ポリメラーゼ連鎖反応の実施」に記載されているように調製した。
ヒドロゲルチップのローディング：前記一本鎖ビオチニル化ＰＣＲ産物（「ｓｓＰＣＲ」）を等容量の１００ｍＭヒスチジン緩衝液で希釈した。ビオチニル化ｃＥｘｏｎ８オリゴヌクレオチド（配列番号４７）、および正および負の対照として使われた「ＡＰＣ  ｓｅ」（配列番号２４）、「ＡＰＣ  ＡＴ」（配列番号２５）および「ＡＰＣ  ＧＴ」（配列番号２６）オリゴヌクレオチドも、１００ｍＭの濃度で５０ｍＭヒスチジン緩衝液に溶解した。第２鎖として使われた精製ＰＣＲ産物を、いずれの場合も等容量の１００ｍＭヒスチジン緩衝液と混合した。すべてのＤＮＡ鎖は、次いで９５℃で５分間変性した。ヒドロゲルチップ上の所定の位置への異なる第１鎖の電子的アドレッシングは、Ｎａｎｏｇｅｎワークステーションローディング器具中で、２．１Ｖの電圧で６０秒間行った。ＣｙＴＭ３標識ＰＣＲ産物および「ＡＰＣ  ＡＴ」および「ＡＰＣ  ＧＴ」オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、２．１Ｖで１８０秒間行った。全４チップについて同じであったローディング概要は、表３２に示す。
【０２１１】
使用緩衝液類：
５０ｍＭヒスチジン緩衝液：５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、０．２μｍメンブランを通じて濾過し、そして脱気した
１００ｍＭヒスチジン緩衝液：１００ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、０．２μｍメンブランを通じて濾過
当該チップのさらなる処理：
ロードした後、前記ヒドロゲルチップの２つ（以下チップＡおよびＢと呼称）を、遮断緩衝液とともに室温で７０分間インキュベートした。チップＢは次いで、インキュベーション緩衝液中２２ｎｇ／μｌ  ＳＳＢ（一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質，ＵＳＢ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，米国）とともに、４５分間さらにインキュベートした。最後に、両チップはいずれの場合も、９７μｌのインキュベーション緩衝液中３μｌのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ−ＭＢＰ  ｍｕｔＳ（濃度：４５０ｎｇ／μｌ）とともに、室温で６０分間インキュベートした。その後で、当該チップを、１ｍｌのインキュベーション緩衝液で手によって洗い、Ｎａｎｏｇｅｎリーダー中に挿入し、そしてリーダー中で３７℃の温度で、いずれの場合も０．２５ｍｌの洗浄緩衝液で５０回洗浄した。最後に、当該チップ上の個々の位置での蛍光強度を測定した（器具設定：赤色蛍光について「高ゲイン」、２５６μｓ積算時間；緑色蛍光について「中ゲイン」、２５６μｓ。
【０２１２】
ロードした後、チップＣおよびＤを平衡緩衝液で充たし、そして当該チップ上の当該位置での緑色蛍光をＮａｎｏｇｅｎリーダー中で測定した（「中ゲイン」、２５６μｓ積算時間）。続いて、当該チップを、１μｌのマングマメヌクレアーゼ（ＮＥＢ，フランクフルト）＋８９μｌの１ｘマングマメヌクレアーゼ緩衝液（ＮＥＢ）と３０℃で４５分間インキュベートした。そのヌクレアーゼ消化後、当該チップを２０ｍｌの平衡緩衝液で洗浄し、そして次いで、遮断緩衝液と室温で７０分間インキュベートした。その後でチップＤは、インキュベーション緩衝液中、２２ｎｇ／μｌのＳＳＢ（一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）と、４５分間さらにインキュベートした。最後に、両チップをいずれの場合も、９７μｌのインキュベーション緩衝液中、３μｌのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ−ＭＢＰ  ｍｕｔＳ（濃度：４５０ｎｇ／μｌ）とともに室温で６分間インキュベートした。その後で、当該チップをいずれの場合も、１ｍｌのインキュベーション緩衝液で洗い、そして次にＮａｎｏｇｅｎリーダー中で、３７℃の温度で、いずれの場合も０．２５ｍｌの洗浄緩衝液で５０回洗浄した。最後に、当該チップ上の個々の位置での蛍光強度を測定した（赤色蛍光：「高ゲイン」、２５６μｓ；緑色蛍光：「中ゲイン」、２５６μｓ）。
【０２１３】
使用緩衝液類：
平衡緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０
遮断緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／３％ＢＳＡ
インキュベーション緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／１％ＢＳＡ
洗浄緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０
チップＡ（ヌクレアーゼ無およびＳＳＢ有）の場合に測定された緑色および赤色蛍光値は、表３３および３４にリストし、一方チップＢ（ヌクレアーゼ無およびＳＳＢ有）の場合の値は、表３５および３６にリストする。ヌクレアーゼ消化前にチップＣ（ヌクレアーゼ有およびＳＳＢ無）上で行われた緑色蛍光測定の結果は、表３７にリストし、一方ｍｕｔＳとのインキュベーション後の緑色および赤色蛍光値は、表３８および３９に見られる。ヌクレアーゼ処理前にチップＤ（ヌクレアーゼ有およびＳＳＢ有）について得た緑色蛍光は、表４０に挙げ、そしてｍｕｔＳとのインキュベーション後の緑色および赤色蛍光の測定から得た結果は、表４１および４２に挙げる。
【０２１４】
全４チップの統計分析の結果は表４３にまとめてある。図１８および１９はさらに、ヒストグラムの形でチップＤについて得た結果を示す。
【０２１５】
【表３２】
2004520010.tif 000035
【０２１６】
表３２：ｐ５３遺伝子のＥｘｏｎ８中の突然変異を検出するための異なる方法を比較するための４種ヒドロゲルチップをローディングするための概要。ヒドロゲルチップ上の個々の位置を、上列に指名されているｃＥｘｏｎ８またはＡＰＣ  ｓｅオリゴヌクレオチドで、またはビオチニル化一本鎖ＰＣＲ産物（「ｓｓＰＣＲ」）で、まずアドレスした。引続き、第２列に指名されている、異なる細胞株（ＭＣＦ−７，ＭＯＬＴ−４，ＳＷ−４８０および２９３）からのＰＣＲ産物と、またはＡＰＣ  ＡＴまたはＡＰＣ  ＧＴオリゴヌクレオチドと，ハイブリッド形成を行った。いくつかの位置は、対照として第１または第２鎖でのみロードされた。空ボックスはＤＮＡでロードされなかった位置を表す。
【０２１７】
【表３３】
2004520010.tif 000036
【０２１８】
表３３：チップＡ（ヌクレアーゼ無およびＳＳＢ無）の緑色蛍光の測定。表はチップ上の位置とともにｍｕｔＳとのインキュベーション後の付属の相対蛍光強度を示す。
【０２１９】
【表３４】
2004520010.tif 000037
【０２２０】
表３４：ＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＢＰ  ｍｕｔＳの結合を検出するためのチップＡ（ヌクレアーゼ無およびＳＳＢ無）の赤色蛍光の測定。表はチップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０２２１】
【表３５】
2004520010.tif 000038
【０２２２】
表３５：チップＢ（ヌクレアーゼ無しかしＳＳＢ有）の緑色蛍光の測定。表はチップ上の位置とともにｍｕｔＳとのインキュベーション後の付属の相対蛍光強度を示す。
【０２２３】
【表３６】
2004520010.tif 000039
【０２２４】
表３６：ＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＢＰ  ｍｕｔＳの結合を検出するためのチップＢ（ヌクレアーゼ無しかしＳＳＢ有）の赤色蛍光の測定。表はチップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０２２５】
【表３７】
2004520010.tif 000040
【０２２６】
表３７：ヌクレアーゼ消化前のチップＣの相対緑色蛍光強度の測定。
【０２２７】
【表３８】
2004520010.tif 000041
【０２２８】
表３８：ｍｕｔＳとのインキュベーション後のチップＣ（ヌクレアーゼ有しかしＳＳＢ無）の相対緑色蛍光強度の測定。
【０２２９】
【表３９】
2004520010.tif 000042
【０２３０】
表３９：ＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＢＰ  ｍｕｔＳの結合を検出するためのチップＣ（ヌクレアーゼ有しかしＳＳＢ無）の赤色蛍光の測定。表はチップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０２３１】
【表４０】
2004520010.tif 000043
【０２３２】
表４０：ヌクレアーゼ消化前のチップＤの相対緑色蛍光強度の測定。
【０２３３】
【表４１】
2004520010.tif 000044
【０２３４】
表４１：ｍｕｔＳとのインキュベーション後のチップＤ（ヌクレアーゼ有およびＳＳＢ有）の相対緑色蛍光強度の測定。
【０２３５】
【表４２】
2004520010.tif 000045
【０２３６】
表４２：ＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＢＰ  ｍｕｔＳの結合を検出するためのチップＤ（ヌクレアーゼ有およびＳＳＢ有）の赤色蛍光の測定。表はチップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０２３７】
【表４３】
2004520010.tif 000046
【０２３８】
表４３：ヒドロゲルチップＡ−Ｄで得られた結果の統計分析。同じローディングをもつ全位置における赤色蛍光強度の平均値および標準偏差を、各場合で各チップについて計算した。
【０２３９】
図１８は、第１鎖として合成オリゴヌクレオチドｃＥｘｏｎ８を使った場合、ヒドロゲルチップＤ（ヌクレアーゼ有およびＳＳＢ有）で得られた結果を示す。図は、いずれの場合も、個々の細胞株についての平均赤色蛍光強度とともに標準偏差を示す。
【０２４０】
図１９は、第１鎖として一本鎖ＰＣＲ産物「ｓｓＰＣＲ」を使った場合、ヒドロゲルチップＤ（ヌクレアーゼ有およびＳＳＢ有）で得られた結果を示す。図は、いずれの場合も、個々の細胞株についての平均赤色蛍光強度とともに標準偏差を示す。
【０２４１】
第１鎖として、合成７３−ｍｅｒ（メル；部分）オリゴヌクレオチドがアドレスされている位置、および一本鎖ＰＣＲ産物でロードされた位置での緑色蛍光強度間の比較は、両方の場合でほぼ同量のＣｙＴＭ３標識第２鎖が結合したことを示す。全体として、細胞株ＭＯＬＴ−４からのＰＣＲ産物でロードされた位置は、他の細胞株からのＰＣＲ産物でロードされた位置が示すより、やや低い緑色蛍光を示した。これは、当該チップのローディングに用いられた細胞株ＭＯＬＴ−４からのＰＣＲ材料が、その他の細胞からのＰＣＲ産物が含んでいたより、少ないＤＮＡを含んでいたということに帰する可能性がある。一本鎖特異的ヌクレアーゼによる処理後に、チップＣおよびＤで測定された緑色蛍光値の顕著な減少は、その突出している一本鎖端の分解がうまくいったことを示している。
【０２４２】
当該赤色蛍光値（表４３）を分析した際、細胞株ＳＷ−４８０からのｐ５３遺伝子のＥｘｏｎ８中の突然変異は、ヌクレアーゼで、または一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）でのいずれによっても処理されていないチップＡの場合には、非常に弱く認識されるだけであることが、わかった。赤色バックグラウンド蛍光における顕著な減少、および改善された変異認識は、ＳＳＢで処理されたチップＢで既に達成された。
【０２４３】
しかし、比較してみると、マングマメヌクレアーゼによる処理を受けたチップＣおよびＤは、はるかに低いバックグラウンド蛍光およびかなりさらによい変異認識を示した：これらのチップについては、ｐ５３のＥｘｏｎ８に野生型配列を示す細胞株ＭＣＦ−７，ＭＯＬＴ−４および２９３ついてあった蛍光より、当該変異含有細胞株ＳＷ−４８０については４から５倍高い蛍光が得られた（表４３、図１８および１９）。ＳＳＢによる追加の処理（チップＤ）は、当該結果にさらに若干の改善をもたらした（表４３）。要するに、本実験は、マングマメヌクレアーゼによる処理が、電子的にアドレス可能なマイクロチップ上でのゲノムＤＮＡ中の突然変異のｍｕｔＳ仲介検出のために、非常に有益なことを示した。これに加えて、ＳＳＢとのインキュベーションも、変異認識へ正の効果をもっている。
【０２４４】
ｍｕｔＳ仲介突然変異認識のための、本明細書に記載されている、前記２つの方法の比較は、両方法とも、ゲノムＤＮＡ中の突然変異を検出するために非常によく適合することを、示している。一本鎖ＰＣＲ産物を「捕捉剤」として使った場合（図１９）、より短い合成オリゴヌクレオチドを第１鎖として使った場合（図１８）に得られたものより、多少強くさえあるｍｕｔＳシグナルが得られた。
【０２４５】
「捕捉剤」としてビオチニル化一本鎖ＰＣＲ産物使う場合の最大の長所は、合成オリゴヌクレオチドを使う場合に試験できるより、突然変異についてもっと長いＤＮＡ領域を試験することが、このようにして、可能であるという事実にある。これに加えて、２個人からの遺伝子またはエキソンを、直接にしかも予め配列決定せずに、すなわち、当該個人のひとりからのＤＮＡを「捕捉剤」として、そしてもうひとりの個人からの配列を「標的」として使うことにより、相互に比較することが可能なのは、本方法を用いる場合だけである。このようにして、例えば、特定の病気に罹っている患者からのＤＮＡ配列を、健康な対照被験者からのＤＮＡ配列と、直接比較することが可能である。しかし他方で、第１鎖としての合成オリゴヌクレオチドの使用も、いくつかの利点をもつ：その種のオリゴヌクレオチドは、比較的多量に、またどのような任意の配列をもつものも、調製可能である；加えて、合成オリゴヌクレオチドは既に一本鎖であり、それは、相補鎖を分離・除去する必要がないことを意味する。これに加えて、比較的短いオリゴヌクレオチドは、第１鎖として比較的長いＰＣＲ産物を使うときの場合よりも、存在する可能性がある突然変異の位置をもっと正確に範囲限定するために使用可能である。
【０２４６】
それゆえ、本明細書に記載されているゲノムＤＮＡ中の突然変異のｍｕｔＳ仲介検出のための前記２つのプロトコールの一方または他方は、特定の問題の性質によっては、特に適することが判明する可能性がある。
【０２４７】
実施例：塩基誤対合を光学的に認識するためのｍｕｔＳの使用
本実験は、ＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳを用いる突然変異の検出が、いかによく光学的にモニターできるかを証明する。このことは、複数の遺伝子または患者における突然変異を検出するために当該技術を使用するという考えの場合には大切である。これに関して、良好なパターン認識は、突然変異の検出を顕著に容易にする。突然変異のチップに基づく検出のために、次のタイプのＤＮＡ二本鎖を、Ｎａｎｏｇｅｎにより供給された電子的にアドレス可能なヒドロゲルチップの異なる位置上にハイブリッド形成により作製した：
‐  完全に相補的な二本鎖
‐  ＧＴ塩基誤対合を含む二本鎖
【０２４８】
このために、第１鎖および第２鎖オリゴヌクレオチドを、１００ｎＭの濃度で、ヒスチジン緩衝液中にまず溶解し、そして９５℃で５分間変性した。ビオチニル化「センス」オリゴヌクレオチド（配列番号１０）を、Ｎａｎｏｇｅｎワークステーションローディング器具中で、２．１Ｖの電圧で６０秒間、ヒドロゲルチップ上の個々の位置に電子的にアドレスした。第２鎖ＡＴ（配列番号１２）およびＧＴ（配列番号１３）オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、２．１Ｖで１２０秒間行った。当該ローディング概要は表４４に示す；各第２鎖オリゴヌクレオチドの名前はハイブリッド形成で生成する誤対合を示す。
【０２４９】
ローディング後、当該チップをローディング器具から取出し、非特異的タンパク質結合部位を飽和させるため、１ｍｌの遮断緩衝液で充たし、そして室温で６０分間インキュベートした。当該チップは続いて、１００μｌのインキュベーション緩衝液中１０μｌのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ−ｍｕｔＳ（濃度：５０ｎｇ／μｌ）とともに、室温で６０分間インキュベートした。このインキュベーション後、当該チップを、１０ｍｌの洗浄緩衝液で手によって洗い、そして次にＮａｎｏｇｅｎリーダー中に挿入した。このリーダー中３７℃の温度で、いずれの場合も０．５ｍｌの洗浄緩衝液で、それを７０回洗浄した。
【０２５０】
最後に、当該チップ上の個々の位置でのＣｙＴＭ３およびＣｙＴＭ５蛍光強度を、次の器具設定を用い、Ｎａｎｏｇｅｎリーダー中で測定した：ＣｙＴＭ５については高感度（「高ゲイン」）、ＣｙＴＭ３については低感度（「低ゲイン」）；２５６μｓ積算時間。当該蛍光強度の光学的ディスプレイは、当該測定後に、ｅ−Ｌａｂプログラムを用いてＮａｎｏｇｅｎワークステーション上で、自動的に起った。
【０２５１】
当該チップはＤＮＡで均一にロードされたことが、図２０Ａから容易にわかる。当該突然変異は明瞭に認識できる（図２０Ｂ）。したがって、当該ｍｕｔＳチップシステムは、突然変異の迅速光学検出に適している。
【０２５２】
ヒスチジン緩衝液：５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；この溶液を０．２μｍの細孔サイズをもつ膜を通じて濾過し、そして陰圧により脱気した
遮断緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／３％ＢＳＡ（Ｓｅｒｖａ，ハイデルベルグ）
インキュベーション緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／１％ＢＳＡ
洗浄緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０
【０２５３】
【表４４】
2004520010.tif 000047
【０２５４】
表４４：誤対合へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を光学的に検出するためのチップをローディングするための概要。すべての位置は、「センス」オリゴヌクレオチド（配列番号１０）でまずアドレスし、そして次いで、「ＡＴ」（配列番号１２）および「ＧＴ」（配列番号１３）オリゴヌクレオチドを、指示された位置にアドレスした。
【０２５５】
図２０は、電子的にアドレスされたＤＮＡチップ上の突然変異の光学的検出を示す：図２０Ａ、ＣｙＴＭ３蛍光はＤＮＡでの当該チップの均一ローディングを示す、図２０Ｂ、ＣｙＴＭ５蛍光が、塩基誤対合をもつ位置で明瞭に見ることができ（表４４参照）、そのバックグラウンドとよくコントラストしている。
【０２５６】
実施例：異なるｍｕｔＳタンパク質による塩基誤対合の認識
本実験は、本出願の情況において調製されたＭＢＰ−ＭｕｔＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳ（Ｇｅｎｅ  Ｃｈｅｃｋ，Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ，米国から入手）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳ（Ｉ．ＢｉｓｗａｓおよびＰ．Ｈｓｉｅｈ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１，５０４０−５０４８（１９９６），Ｂｉｏｚｙｍ（Ｈｅｓｓ．−Ｏｌｄｅｎｄｏｒｆ，ドイツ）から購入）およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＨＢ８  ｍｕｔＳタンパク質（Ｓ．Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｒ．ＫａｔｏおよびＳ．Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４，６４０−６４７（１９９６），日本、大阪大学、Ｋｕｒａｍｉｔｓｕ教授のご好意で提供される）いずれの場合も、ＤＮＡ分子中の可能性がある異なる塩基誤対合および挿入を認識することに関して他の性質をもつかどうかを、調べた。例えば、もしそれらのタンパク質の１つが優先的に、ある塩基誤対合に結合するならば、未知配列への結合は、当該塩基誤対合の性質を制限することになるだろうか。
【０２５７】
これをチェックするために、異なる蛍光色素標識ｍｕｔＳタンパク質が、特定の塩基誤対合または挿入および欠失に優先的に結合するかどうかを明らかにするために、検討を行った。このために、いずれの場合も、１ｍｇのタンパク質を、１０ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９，５０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０％グリセロール，０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ中、１２５ｎｍｏｌ  ＣｙＴＭ５サクシニミジルエステルと、室温で３０分間、暗所でインキュベートした。続いて、当該タンパク質を、いずれの場合も、１０ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９，５０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０％グリセロール，０．１ｍＭ  ＰＭＳＦで平衡化した１ｍｌ  ＤＥＡＥ−セファロース高流速カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，スエーデン）上にロードした。遊離の活性色素エステルを、当該カラムを２０ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９，５０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０％グリセロール，０．１ｍＭ  ＰＭＳＦですすぐことにより除き、そして当該タンパク質を、４ｍｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９，５００ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０％グリセロール，０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ中に溶出した。当該精製後、当該タンパク質の完全性をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。クロマトグラフィー精製後、当該タンパク質を、２ｌの１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９，５０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０％グリセロール，０．１ｍＭ  ＰＭＳＦに対して少なくとも３時間、２回透析し、そして次いで２５μｌアリコットでー８０℃に貯蔵した。
【０２５８】
前記の異なるＣｙＴＭ５標識ｍｕｔＳタンパク質の蛍光ラベリングの程度（Ｄ／Ｐ比）を定量するために、異なるｍｕｔＳタンパク質のタンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法を用いて、まず第一に測定した。タンパク質濃度（０．１−１ｍｇ／ｍｌ）に応じて、当該タンパク質溶液（１−１０μｌ）を水で定容し（総容量＝１００μｌ）、その後でＢｒａｄｆｏｒｄ試薬（９００μｌ，ＢｉｏＲａｄ）を加える。タンパク質・色素複合体の形成は、室温で１５分間後に完了する。λ＝５９５ｎｍで吸光値を測定後、タンパク質濃度を検量線（ＢＳＡを用いて構築）を使って決定する。
【０２５９】
個々のｍｕｔＳ分子種について得られた値を、次表にまとめる：
【０２６０】
【表４５】
2004520010.tif 000048
【０２６１】
ＣｙＴＭ５色素の濃度は、次いで、紫外分光測定により定量した。このために、緩衝液（９５０μｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．９，５０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０％グリセロール，０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ）を、当該タンパク質溶液（５０μｌ）に加え、そしてＣｙＴＭ５吸光値を、λ＝６５０ｎｍで次に測定した。ＣｙＴＭ５色素の濃度をここで次のように計算する：
ｃ（ＣｙＴＭ５）＝（Ａ６５０）／２５００００Ｍ−１ｃｍ−１（Ａ６５０＝６５０ｎｍにおける吸光値）。
【０２６２】
蛍光ラベリングの程度（Ｄ／Ｐ比；Ｄ＝色素、Ｐ＝タンパク質）をここで次のように計算する：
Ｄ／Ｐ＝ｃ（ＣｙＴＭ５）／ｃ（ｍｕｔＳ）。
【０２６３】
個々のｍｕｔＳ分子種について得られた値を、次表にまとめる：
【０２６４】
【表４６】
2004520010.tif 000049
【０２６５】
ラベリング効率は１桁のサイズ内で変動する。
当該４種の異なる色素標識ｍｕｔＳタンパク質が、どのようによく異なる塩基誤対合または挿入を認識するかを明らかにするために、次いでチェックを行った。このために、次のタイプのＤＮＡ二本鎖を、Ｎａｎｏｇｅｎにより供給された電子的にアドレス可能なヒドロゲルチップの異なる位置上にハイブリッド形成により作製した：
‐  完全に相補的な二本鎖、
‐  ８つの可能性ある塩基誤対合（ＡＡ，ＡＧ，ＣＡ，ＣＣ，ＣＴ，ＧＧ，ＧＴ，ＴＴ）の１つを含む二本鎖、
‐  １つの鎖が１、２または３つの塩基の挿入を含む二本鎖。
【０２６６】
このために、第１鎖および第２鎖オリゴヌクレオチドを、１００ｎＭの濃度で、ヒスチジン緩衝液中にまず第一に溶解し、そして９５℃で５分間変性した。ビオチニル化「センス」オリゴヌクレオチド（配列番号１０）を、Ｎａｎｏｇｅｎワークステーションローディング器具中で、２．１Ｖの電圧で６０秒間、ヒドロゲルチップ上の個々の位置に電子的にアドレスした。第２鎖「ＡＴ」（配列番号１２），ＧＴ（配列番号１３），ＡＡ（配列番号１４），ＡＧ（配列番号１５），ＣＡ（配列番号１６），ＣＣ（配列番号１７），ＣＴ（配列番号１８），ＧＧ（配列番号１９），ＴＴ（配列番号２０），ｉｎｓ＋１Ｔ（配列番号２１），ｉｎｓ＋２Ｔ（配列番号２２）およびｉｎｓ＋３Ｔ（配列番号２３）オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、２．１Ｖで１２０秒間行った。そのローディング概要を表４５に示す；各第２鎖オリゴヌクレオチドの名称は、ハイブリッド形成中の際に形成される誤対合または挿入（「ｉｎｓ」）を指す。
【０２６７】
ローディング後、当該チップをローディング器具から取出し、非特異的タンパク質結合部位を飽和させるため、１ｍｌの遮断緩衝液で充たし、そして室温で６０分間インキュベートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳ（チップＡ），ＭＢＰ−ＭｕｔＳ（チップＢ），Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳ（チップＣ）およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｕｔＳ（チップＤ）の得られたＤＮＡ二本鎖への結合を、次いで試験した。このために、当該チップ類は、１００μｌのインキュベーション緩衝液中いずれの場合も、２−３μｇのＣｙＴＭ５標識ｍｕｔＳタンパク質とともに、６０分間インキュベートした。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳおよびＭＢＰ−ｍｕｔＳとインキュベートしたチップは、室温でインキュベートし、一方、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｕｔＳとインキュベートしたチップは、３７℃でインキュベートした。このインキュベーション後、当該チップ類を、１０ｍｌのインキュベーション緩衝液で手によって洗い、そしてＮａｎｏｇｅｎリーダー中に挿入した。そのリーダー中で、当該チップを３７℃（Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳおよびＭＢＰ−ｍｕｔＳ）または５０℃（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｕｔＳ）の温度で、いずれの場合も０．２５ｍｌの洗浄緩衝液で、７０−８０回洗浄した。
【０２６８】
最後に、当該チップ類上の個々の位置でのＣｙＴＭ３およびＣｙＴＭ５蛍光強度を、次の器具設定を用い、Ｎａｎｏｇｅｎリーダー中で測定した：ＣｙＴＭ５の場合には高感度（「高ゲイン」）、ＣｙＴＭ３の場合には低感度（「低ゲイン」）；２５６μｓ積算時間。チップＡ−ＤについてのＣｙＴＭ５蛍光の値は表４６−４９に示す。ＣｙＴＭ３蛍光強度がチップ表面の上に均一に分布することを確実にするように、注意を払った。それぞれの塩基誤対合に特異的であったＣｙＴＭ５蛍光の平均値は表５０に示す。
【０２６９】
個々のタンパク質が、どのようによく個々の誤対合を，完全に対合したＤＮＡ（「ＡＴ」）を認識するのと比較した場合、認識するかを明らかにするために、この後者のＤＮＡに帰属されたＣｙＴＭ５蛍光を任意に１に設定し、そして他の蛍光をこれに基づいて計算した（表５０および５１）。
【０２７０】
これに関連して、前記２つの好熱性タンパク質は、意外にも、挿入変異に特によく結合することが、見い出された。それらはしたがって、挿入／欠失変異およびＧ／Ｔ塩基誤対合を専ら検出するための系での使用に適している。
【０２７１】
要するに、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳおよびＭＢＰ−ｍｕｔＳは両方とも、広いスペクトルの塩基誤対合を検出するのに適していると、言うことができる。これに加えて、当該Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質は、絶対値換算で、最も強力なシグナルを与える。興味深いことに、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＴ．ａｑｕａｔｉｃｕｓからのタンパク質は、挿入／欠失から生じる誤対合に優先的に結合する。これは、この変異サブタイプを迅速に検出するのに使用可能である。
【０２７２】
ヒスチジン緩衝液：５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン；この溶液を０．２μｍの細孔サイズをもつ膜を通じて濾過し、そして陰圧により脱気した
遮断緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／３％ＢＳＡ（Ｓｅｒｖａ，ハイデルベルグ）
インキュベーション緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／１％ＢＳＡ
洗浄緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  Ｍ  ｇＣｌ２／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０
【０２７３】
【表４７】
2004520010.tif 000050
【０２７４】
表４５：異なる塩基誤対合へのＣｙＴＭ５標識ｍｕｔＳの結合を検出するためのチップをローディングするための概要。「Ｎｅｇ」：ＤＮＡでロードされなかった位置。「ｓｓＤＮＡ」：「センス」一本鎖でロードされただけの位置。残るすべての位置は、「センス」オリゴヌクレオチドでまず第一にアドレスし、そして次いで、表に挙げた第２鎖でハイブリッド形成した。
【０２７５】
【表４８】
2004520010.tif 000051
【０２７６】
表４６：異なる塩基誤対合へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を検出するためのチップＡの赤色蛍光の測定。表は当該チップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０２７７】
【表４９】
2004520010.tif 000052
【０２７８】
表４７：異なる塩基誤対合へのＣｙＴＭ５標識ＭＢＰ−ｍｕｔＳの結合を検出するためのチップＢの赤色蛍光の測定。表は当該チップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０２７９】
【表５０】
2004520010.tif 000053
【０２８０】
表４８：異なる塩基誤対合へのＣｙＴＭ５標識Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳの結合を検出するためのチップＣの赤色蛍光の測定。表は当該チップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０２８１】
【表５１】
2004520010.tif 000054
【０２８２】
表４９：異なる塩基誤対合へのＣｙＴＭ５標識Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｕｔＳの結合を検出するためのチップＤの赤色蛍光の測定。表は当該チップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０２８３】
【表５２】
2004520010.tif 000055
【０２８４】
表５０：個々のｍｕｔＳタンパク質の、それぞれの塩基誤対合に特異的である、ＣｙＴＭ５蛍光値の平均値。表はチップＡ−Ｄについての平均値を示す。
【０２８５】
【表５３】
2004520010.tif 000056
【０２８６】
表５１：異なる塩基誤対合への異なるｍｕｔＳタンパク質の結合についての相対蛍光値。本表は、「ＡＴ」完全対合（＝１．００）に相対させた場合の、表５０に挙げた値を示す。
【０２８７】
比較実施例：異なるｍｕｔＳタンパク質による塩基誤対合の認識を検討するための、ＤＮＡ／タンパク質相互作用のＢｉａｃｏｒｅ測定の使用
異なる生物由来のｍｕｔＳのＤＮＡ結合を検討するため、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓおよびＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のｍｕｔＳ、およびＭＢＰ−ｍｕｔＳ融合タンパク質を、Ｂｉａｃｏｒｅ測定を実施することにより試験した。このために、表４５に示すチップ上にロードされたようなヘテロ二本鎖を調製するために、ヌクレオチド配列、配列番号１１から２３、を使用した。個々の塩基誤対合に特有のＫｄ値を、表面プラスモン共鳴を用いて、次いで定量した。
【０２８８】
分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００  ＳＰＲ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）上、２２℃で、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），５０ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０（タンパク質級，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から成るランニング緩衝液中で行った。前記ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、ＳＡセンサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）のストレプタビジン・コート表面へ、７０  ＲＵの表面密度まで、固定化した。ＤＮＡなしのＳＡ表面を対照表面とした。それぞれのタンパク質の８種の異なる濃度の濃度系列を得るため、当該タンパク質類をランニング緩衝液中で希釈し、それらの濃度の順序でセンサー表面へ導入した。ＤＮＡへの当該タンパク質の結合、ならびに解離は、いずれの場合にも、１０μｌ／分の流速で５分間検出した。各結合操作の後、当該タンパク質の次の濃度を注入する前に、当該表面を、０．１％  ＳＤＳの２回連続注入（いずれの場合も０．５分間，流速３０μｌ／分）で再生した。データはＢｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウエア  バージョン３．１を用いて分析した。対照表面のシグナルを、個々の表面のシグナルから差引き、そしてカーブはインジェクションスタートに標準化した。会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）および解離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）は、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １：１結合モデルを用い、別々に、またはグローバルフィットによるいずれかで、定量した。親和度（ＫＤ値）は、式ＫＤ＝Ｋｄｉｓｓ／Ｋａｓｓから計算した。平衡が極めて迅速に確立された反応速度の場合、平衡でのシグナル（Ｒｅｑ）を、当該タンパク質の濃度に対してプロットし、そしてＫＤ値を、双曲フィットにより定量した。
【０２８９】
Ｂｉａｃｏｒｅ測定から定量された共鳴値は、例外なく、前記チップ実験からの結果と一致した（表５０および５１）。例として、前記４種ｍｕｔＳ変異体（Ａ：Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂ：Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｃ：Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓおよびＤ：ＭＢＰ−ｍｕｔＳ）の場合におけるＧＴ誤対合の結合を、図２１Ａ−Ｄに示し、一方、当該会合および結合定数のグラフ表示を図２２に示す。ＭＢＰ−ｍｕｔＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ）融合タンパク質（図２３Ａ，２５Ａおよび２７Ａ）と比較した場合の、＋１Ｔに対する（図２３Ｂ），＋２Ｔに対する（図２５Ｂ）および＋３Ｔに対する（図２７Ｂ）Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｕｔＳタンパク質の高い特異性を図２３、２５および２７に示す；図２４は、＋１Ｔ挿入の場合に定量された定数のグラフ表示を示し、一方、図２６は、＋２Ｔ挿入の場合のグラフ表示を示し、そして図２８は、＋３Ｔ挿入の場合のものを示す。
【０２９０】
下から上へ、測定されたグラフは次のｍｕｔＳ濃度で記録された：
図２１Ａ：２．５ｎＭ，５ｎＭ，１０ｎＭ，２０ｎＭ，３９ｎＭ，７９ｎＭ，１５８ｎＭ
図２１Ｂ：３．５ｎＭ，７ｎＭ，１４ｎＭ，２７ｎＭ，５５ｎＭ，１１０ｎＭ，２１９ｎＭ，４３８ｎＭ
図２１Ｃ：３．４ｎＭ，７ｎＭ，１４ｎＭ，２８ｎＭ，５５ｎＭ，１１０ｎＭ，２２１ｎＭ，４４１ｎＭ
図２１Ｄ：２．８ｎＭ，５．７ｎＭ，１１ｎＭ，２３ｎＭ，４５ｎＭ，９１ｎＭ，１８２ｎＭ，３６３ｎＭ
図２３Ａ，２５Ａ，２７Ａ：５．７ｎＭ，１１ｎＭ，２３ｎＭ，４５ｎＭ，９１ｎＭ，１８２ｎＭ，３６３ｎＭ，７２６ｎＭ
図２３Ｂ，２５Ｂ，２７Ｂ：３．５ｎＭ，７ｎＭ，１４ｎＭ，２７ｎＭ，５５ｎＭ，１１０ｎＭ，２１９ｎＭ，４３８ｎＭ
【０２９１】
実施例：ｄｓ（二本鎖）オリゴヌクレオチド単分子層へのｍｕｔＳタンパク質の結合を検出するためのインピーダンス分光法の使用
１．  金電極の予備処理
Ａｕ電極（ＣＨ−Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｎｔｓ，Ａｕｓｔｉｎ，米国）を、０．３μｍアルミナ懸濁液（ＬＥＣＯ，Ｓｔ．Ｊｏｓｅｐｈ，米国）で電極表面を磨き、そして続いてミリポア水（１０ＭΩ  ｃｍ）ですすぐことにより、浄化した。当該電極のその後の電気化学的浄化は、当該電極をまず第一に、−０．５および−１．８Ｖの電位の間で（Ａｇ／ＡｇＣｌ基準電極（Ｍｅｔｒｏｈｍ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ，Ｆｉｌｄｅｒｓｔａｄｔ，ドイツ）３Ｍ  ＮａＣｌに対して）５回サイクルし、そして次に−０．３および１．１Ｖの間で３回サイクルすることを、０．２Ｍ  ＮａＯＨ中、サイクロボルタメトリー（ｃｙｃｌｏｖｏｌｔａｍｅｔｒｙ）（ｐｏｔｅｎｔｉｏｓｔａｔ：ＥＧ＆Ｇ  ＰＡＲ  ２７３Ａ，英国）（フィード量５０ｍＶ／秒）により行った。当該サイクロボルタメトリーでは白金ロッド（Ｍｅｔｒｏｈｍ）を対向電極として使用した。
【０２９２】
２．  金表面への５´−ＳＨ−オリゴヌクレオチドの結合
５´−ＳＨ−修飾オリゴヌクレオチドヘアピン類（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖａ，Ｕｌｍ，ドイツ）（配列番号５０および配列番号５１）を、０．９Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．６，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；０．５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ，ドイツ）の添加）中、対応するチオール修飾オリゴヌクレオチドの１００μＭ溶液と、前記の浄化したＡｕ電極を６．５時間インキュベートすることにより結合した。
【０２９３】
生じたオリゴヌクレオチド単分子層の特徴は、サイクリック  ボルタメトリー（ＣＶ）を用いて、Ｋ３／Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６（Ｍｅｒｃｋ製の塩，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）水溶液（２０ｍＭリン酸緩衝液，ｐＨ７中２０ｍＭ）中で、拡散をコントロールしたＦｅ（ＩＩ／ＩＩＩ）酸化還元反応を遮断することにより、チェックした。
【０２９４】
３．  １．６−メルカプトヘキサノールによる単分子層隙間の充填
当該単分子層上の個々のオリゴヌクレオチド分子間の隙間は、ミリポア水（脱気ずみ）中６−メルカプトヘキサノール（Ａｌｄｒｉｃｈ，米国）の１ｍＭ溶液中で、当該電極を室温で６０−９０分間インキュベートすることにより、充填した。実際の測定まで、当該電極は１Ｍリン酸緩衝液中４℃で貯蔵した。
【０２９５】
４．  ｍｕｔＳタンパク質とのインキュベーション
このために、ヘアピンオリゴヌクレオチドでコートされた個々の電極を、約２０μｌの２０ｍＭ  ｔｒｉｓ緩衝液（１００ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２，ｐＨ７．６）と、室温で３０分間以上インキュベートした。適用前に、当該緩衝液容量の１／５を、ｍｕｔＳ濃縮物（０．５ｍｇ／ｍｌ）と交換した。
【０２９６】
５．  電気化学実験
個々の電極は、ｍｕｔＳとのインキュベーションの前後で、１００ｍＨｚから１ＭＨｚへ１００ｍＨｚへの周波数範囲で、Ｋ３／Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，ドイツ）水溶液（２０ｍＭ  ｔｒｉｓ緩衝液、１００ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中２０ｍＭ）中で測定した。測定値はＢｏｄｅダイアグラムで示す。測定は、Ｚａｈｎｅｒ  Ｍｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋにより供給された  ＩＭ  ６ｅ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｄｅｓｋ上で室温で行った。
【０２９７】
核酸配列：５´−３´  Ｘ＝アミノモディファイヤーｄＴ  ｍｕｔＳ基質
配列番号５０  ＡＴＴＣＧＡＴＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＣＴＴＴＴＸＧＣＴＣＧＣＣＴＴＧＣＣＣＣＧＡＴＣＧＡＡＴ
配列番号５１  ＡＴＴＣＧＡＴＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＡＧＣＴＴＸＴＴＧＣＴＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＡＴＣＧＡＡＴ
【０２９８】
インピーダンス分光法
インピーダンス分光法を当該電気化学研究に使用した。研究の本方法では、周波数が変わる交流電圧を、検討する系にかけ、そして同時にそのインピーダンスを測定する。当該検討の管理および操作性を単純化するコンピューター・アシステッド測定デスク、およびコストの削減は、特に、これらの測定方法に検討表面の拡大をもたらした。本法の利点は、試料を破壊せずに、また標識を使わずに、試料についての測定を行うことが可能なことである。変異認識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳタンパク質を、誤対合認識基質の結合のためのモデル系として使用し、一方、配列番号５０および５１を二重鎖形成オリゴヌクレオチドとして使用した。当該ヘアピンループ中へアミノモディファイヤー  ビルディングブロックを導入することにより、この部位に結合するためのｍｕｔＳの親和性を選択的に抑圧した。測定の結果は図２９Ａおよび２９Ｂに示す。破線はｍｕｔＳを添加する前のインピーダンスを示し、一方、連続線はｍｕｔＳを添加した後のインピーダンスを示す（位相曲線は約１０００Ｈｚのところに極小値をもつ）。図２９Ａは、２つのＧＴ誤対合を含む配列、配列番号５０、の２測定を示し、一方図２９Ｂは、これら２つの塩基誤対合を含まない配列番号５１を用いて行った２測定を示す。本例では、当該測定で興味がある、１００Ｈｚより下の範囲でのインピーダンスの減少は、ｍｕｔＳ結合が増加したことを示す。予想されたように、図２９Ａは、ｍｕｔＳの結合の結果としてインピーダンスに減少を示す；皆無またはごく僅かのｍｕｔＳの結合が、図２９Ｂに見ることができる。
【０２９９】
実施例：ｍｕｔＳ仲介突然変異検出で用いられるオリゴヌクレオチドの濃度の影響：
本実施例は、蛍光色素標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳを誤対合認識基質として用いる突然変異の検出が、広いＤＮＡ濃度範囲にわたって機能することを証明するために、意図される。このために、ヒドロゲルチップ上の個々の位置を、異なる濃度の完全対合またはＧＴ誤対合第１鎖および第２鎖オリゴヌクレオチドを含む溶液でロードし、そしてそれぞれの位置に対するｍｕｔＳの結合を次いで定量した。
【０３００】
実験実施：
使用したオリゴヌクレオチドを、いずれの場合も、いくつかの異なる濃度（１００ｎＭ，３３ｎＭ，１０ｎＭ，１ｎＭおよび０．３３ｎＭ）でヒスチジン緩衝液に溶解し、そして９５℃で５分間変性した。ビオチニル化「センス」第１鎖オリゴヌクレオチド（配列番号１０）の異なる濃度の溶液を、Ｎａｎｏｇｅｎワークステーションローディング器具中で、２．１Ｖの電圧で６０秒間、ヒドロゲルチップ上の個々の位置に電子的にアドレスした。ＡＴ（配列番号１２）およびＧＴ（配列番号１３）対向鎖の異なる濃度の溶液とのハイブリッド形成は、２．１Ｖで１２０秒間行った。そのローディング概要を表５２に示す。
【０３０１】
ローディング後、当該チップをローディング器具から取出し、非特異的タンパク質結合部位を飽和させるため、１ｍｌの遮断緩衝液で充たし、そして室温で６０分間インキュベートした。当該チップ類は次いで、９０μｌのインキュベーション緩衝液中１０μｇのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳタンパク質（濃度：５０ｎｇ／μｌ）とともに、室温で６０分間インキュベートした。この工程の後で、当該チップを１ｍｌのインキュベーション緩衝液で手によって洗い、次いでＮａｎｏｇｅｎリーダー中に挿入し、当該リーダー中で、３７℃の温度でいずれの場合も２５０μｌの洗浄緩衝液で、５０回洗浄した。最後に、当該チップ上の個々の位置でのＣｙＴＭ５蛍光強度を、次の器具設定を用い、Ｎａｎｏｇｅｎリーダー中で測定した：高感度（「高ゲイン」）；２５６μｓ積算時間。
【０３０２】
ヒスチジン緩衝液：５０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン、０．２μｍメンブランを通じて濾過し、脱気した
遮断緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／３％ＢＳＡ
インキュベーション緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／１％ＢＳＡ
洗浄緩衝液：２０ｍＭ  ｔｒｉｓ，ｐＨ７．６／５０ｍＭ  ＫＣｌ／５ｍＭ  ＭｇＣｌ２／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０
測定された赤色蛍光強度は表５３に表示する。測定値の統計分析の結果は、表５４に要約し、そして図３０−３２に図示する。
【０３０３】
【表５４】
2004520010.tif 000057
【０３０４】
表５２：異なる濃度の第１および第２鎖でヒドロゲルチップをローディングするための概要。個々の位置を、いずれの場合にも指示されている当該濃度のビオチニル化「センス」オリゴヌクレオチドで、まずアドレスし、そして次いで表示されている濃度で、第２鎖「ＡＴ」または「ＧＴ」オリゴヌクレオチドと，ハイブリッド形成した。対照として、いくつかの位置は、第１または第２鎖でのみロードされた；標準電極として、位置６／２は空のままにした。
【０３０５】
【表５５】
2004520010.tif 000058
【０３０６】
表５３：ＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を検出する目的ための、異なる濃度のオリゴヌクレオチドでロードされたヒドロゲルチップの赤色蛍光強度の測定。表はチップ上の位置とともに付属の相対蛍光強度を示す。
【０３０７】
【表５６】
2004520010.tif 000059
【０３０８】
表５４：異なる濃度のオリゴヌクレオチドでロードされたヒドロゲルチップへのｍｕｔＳの結合の統計分析。同じローディングをもつ全位置における赤色蛍光強度の平均値および標準偏差を、各場合で計算した。
【０３０９】
図３０は、第２鎖希釈系列を示す。第１鎖として使われた「センス」オリゴヌクレオチドの濃度は、いずれの場合も１００ｎＭ；第２鎖として使われたＡＴまたはＧＴオリゴヌクレオチドは、ダイアグラムに挙げた濃度で用いられた。いずれの場合の数字も、個々の第２鎖濃度について、ｍｕｔＳの結合後の、平均赤色蛍光強度を示す。
【０３１０】
図３１は、第１鎖希釈系列を示す。第１鎖として使われた「センス」オリゴヌクレオチドは、ダイアグラムに挙げた濃度で用いられた。第２鎖として使われたＡＴまたはＧＴオリゴヌクレオチドの濃度は、いずれの場合も１００ｎＭであった。数字は、個々の第１鎖濃度について、ｍｕｔＳ結合後の、平均赤色蛍光強度を示す。
【０３１１】
図３２は、第１および第２鎖の同時希釈を示す。第１鎖として使われた「センス」オリゴヌクレオチド、および第２鎖として使われたＡＴまたはＧＴオリゴヌクレオチドも、等しく希釈した；用いられた濃度はダイアグラムに挙げる。数字は、個々のオリゴヌクレオチド濃度について、ｍｕｔＳ結合後の、平均赤色蛍光強度を示す。
【０３１２】
用いらる第２鎖オリゴヌクレオチドの濃度は、既述の実験で使われた１００ｎＭの濃度に比較した場合、相当低下させてもよいことが、図３０から明白である：３３ｎＭ第２鎖溶液を使う場合、ｍｕｔＳは、完全対合（ＡＴ）へ結合するより、ＧＴ誤対合へずっと強く７．５のファクターにより結合し、そしてＧＴ誤対合は、１０ｎＭ第２鎖溶液を使う場合、完全対合と比較して、１．７のファクターによりなお認識される。他方、第２鎖濃度を１００ｎＭに一定にして、用いる第１鎖の濃度を低下させても、僅か１ｎＭの第１鎖濃度であっても、ｍｕｔＳはなお、完全対合へ結合するより、ＧＴ誤対合へずっと強く２．３のファクターにより結合する（図３１）。これに加えて、ＧＴ誤対合の明瞭なｍｕｔＳ仲介認識は、第１鎖ＤＮＡおよび第２鎖ＤＮＡの濃度を同時に３３ｎＭに低下させた後でも、なお達成された（図３２）。
【０３１３】
用いられるＤＮＡの濃度の比較的大きな変動も、ｍｕｔＳ結合において相当する大きな変動をもたらさないことを、このように証明可能である。このことは、患者由来の試料を調べるときに得られるような、実用的に関係するＤＮＡ濃度の範囲では、特に、本明細書に記載されている突然変異を検出ための方法の、高度の信頼性を証明している。さらに本実施例は、異なる患者試料の比較が、個々の試料が正確に同じＤＮＡ濃度をもたない場合でも可能なことを、示している。加えて、当該実験は、極少量のＤＮＡであっても、ｍｕｔＳ仲介突然変異を検出するために適切なことを、証明した。
【図面の簡単な説明】
【図１】１は、突然変異の並行検出のダイアグラムを示す。
【図２】図２は、誘導後（レイン１および２）および誘導前（レイン３）に、ｍｕｔＳ（矢印）発現Ｅ．ｃｏｌｉ株について行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図３】図３は、ゲル透過クロマトグラフィーによる精製およびそれに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後に、ＣｙＴＭ３で標識されたｍｕｔＳタンパク質に相当する強い蛍光性タンパク質バンドが検出されることを示す。
【図４】図４は、ラベリング反応で得られた異なる程度の蛍光ラベリング（Ｄ／Ｐ比）をもつｍｕｔＳ−ＣｙＴＭ５（Ｅ．ｃｏｌｉ）共役体の異なる画分のＵＶスペクトルの例を示す。
【図５】図５は、異なる程度の蛍光ラベリング（Ｄ／Ｐ比）をもつ異なるｍｕｔＳ−ＣｙＴＭ５（Ｅ．ｃｏｌｉ）画分について行われたＳＤＳ−ＰＡＧＥの例を示す。
【図６】図６は、商業的に入手できる非標識タンパク質（Ｇｅｎｅ  Ｃｈｅｃｋ，Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，米国、レイン２および７）と比較した場合、活性の消失を全く示さない、ＣｙＴＭ５共役Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳ（レイン４および９）を示す。
【図７】図７は、非共役Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ  ｍｕｔＳ（レイン２および７：０．１６μｇ，レイン５および１０：０．６４μｇ）は、標準条件下でＣｙＴＭ３と共役しているタンパク質（レイン４および９：０．１６μｇ，レイン５および１０：０．６４μｇ）と違って、ＤＮＡに結合するが、この場合、塩基誤対合を含むＤＮＡ（レイン６から１０）は、正確に対合しているＤＮＡ（レイン１から５）よりずっと効率良く結合されることを示す。
【図８】図８は、Ｅ．ｃｏｌｉライゼートのクーマシー染色１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図９】図９Ａは、ｐＭＡＬｃ２ｘ−ｍｕｔＳ形質転換細胞由来のＥ．ｃｏｌｉライゼート（溶菌液）のクーマシー染色５％−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図９Ｂは、ＭＡＬｃ２ｘ−ｍｕｔＳ形質転換細胞由来のＥ．ｃｏｌｉライゼートの５％−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥのウェスタンブロット分析を示す。図９Ｃは、精製ＭＢＰ−ｍｕｔＳ融合タンパク質のクーマシー染色５％−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図１０】図１０は、ＤＮＡをもつ１００位置チップをロードするための電子アドレシングの使用を示す。
【図１１】図１１は、電子的にアドレス可能なアガロースチップ上でハイブリッド形成させることにより作製された誤対合ＤＮＡ二本鎖へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を示す。
【図１２】図１２は、電子的にアドレス可能なヒドロゲルチップ上でハイブリッド形成させることにより作製された誤対合ＤＮＡ二本鎖へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を示す。
【図１３】図１３は、ｍｕｔＳ結合のセンソグラムの一例を示す。
【図１４】図１４は、電子的にアドレス可能なアガロースチップ上でハイブリッド形成させることにより作製された、種々の完全に対合した（ＡＴ）およびＧＴ誤対合したＤＮＡ二本鎖へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を示す。
【図１５】図１５は、電子的にアドレス可能なヒドロゲルチップ上でハイブリッド形成させることにより作製された、種々の完全に対合した（ＡＴ）およびＧＴ誤対合したＤＮＡ二本鎖へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を示す。
【図１６】図１６は、電子的にアドレス可能なアガロースチップ上でハイブリッド形成させることにより作製された、完全に対合したおよびＧＴ誤対合したＤＮＡ二本鎖のさまざまな混合物へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を示す。
【図１７】図１７は、ｐ５３遺伝子のＥｘｏｎ８中の突然変異を検出するための、合成オリゴヌクレオチドおよび異なる細胞株からのＰＣＲ産物から成る二本鎖へのＣｙＴＭ５標識Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳの結合を示す。
【図１８】図１８は、第１鎖として合成オリゴヌクレオチドｃＥｘｏｎ８を使った場合、ヒドロゲルチップＤ（ヌクレアーゼ有およびＳＳＢ有）で得られた結果を示す。
【図１９】図１９は、第１鎖として一本鎖ＰＣＲ産物「ｓｓＰＣＲ」を使った場合、ヒドロゲルチップＤ（ヌクレアーゼ有およびＳＳＢ有）で得られた結果を示す。
【図２０】図２０は、電子的にアドレスされたＤＮＡチップ上の突然変異の光学的検出を示す：図２０Ａ、ＣｙＴＭ３蛍光はＤＮＡでの当該チップの均一ローディングを示す、図２０Ｂ、ＣｙＴＭ５蛍光が、塩基誤対合をもつ位置で明瞭に見ることができ（表４４参照）、そのバックグラウンドとよくコントラストしていることを示す。
【図２１】図２１は、４種ｍｕｔＳ変異体（Ａ：Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂ：Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｃ：Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓおよびＤ：ＭＢＰ−ｍｕｔＳ）の場合におけるＧＴ誤対合の結合を示す。測定されたグラフは次のｍｕｔＳ濃度で記録された：
図２１Ａ：２．５ｎＭ，５ｎＭ，１０ｎＭ，２０ｎＭ，３９ｎＭ，７９ｎＭ，１５８ｎＭ、
図２１Ｂ：３．５ｎＭ，７ｎＭ，１４ｎＭ，２７ｎＭ，５５ｎＭ，１１０ｎＭ，２１９ｎＭ，４３８ｎＭ、
図２１Ｃ：３．４ｎＭ，７ｎＭ，１４ｎＭ，２８ｎＭ，５５ｎＭ，１１０ｎＭ，２２１ｎＭ，４４１ｎＭ、
図２１Ｄ：２．８ｎＭ，５．７ｎＭ，１１ｎＭ，２３ｎＭ，４５ｎＭ，９１ｎＭ，１８２ｎＭ，３６３ｎＭ。
【図２２】図２２は、図２１における会合および結合定数のグラフ表示を示す。
【図２３】図２３は、ＭＢＰ−ｍｕｔＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ）融合タンパク質（図２３Ａ）と比較した場合の、＋１Ｔに対する（図２３Ｂ）Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｕｔＳタンパク質の高い特異性を示す。
【図２４】図２４は、＋１Ｔ挿入の場合に定量された定数のグラフ表示を示す。
【図２５】図２５は、ＭＢＰ−ｍｕｔＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ）融合タンパク質（図２５Ａ）と比較した場合の、＋２Ｔに対する（図２５Ｂ）Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｕｔＳタンパク質の高い特異性を示す。
【図２６】図２６は、＋２Ｔ挿入の場合のグラフ表示を示す。
【図２７】図２７は、ＭＢＰ−ｍｕｔＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ）融合タンパク質（図２７Ａ）と比較した場合の、＋３Ｔに対する（図２７Ｂ）Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｕｔＳタンパク質の高い特異性を示す。
【図２８】図２８は、＋３Ｔ挿入の場合のものを示す。
【図２９】本発明の電気化学研究にインピーダンス分光法を使用した測定の結果である。図２９Ａは、２つのＧＴ誤対合を含む配列、配列番号５０、の２測定を示し、一方図２９Ｂは、これら２つの塩基誤対合を含まない配列番号５１を用いて行った２測定を示す。
【図３０】ｍｕｔＳ仲介突然変異検出で用いられるオリゴヌクレオチドの濃度の影響を、第２鎖希釈系列で調べた結果を示す。
【図３１】ｍｕｔＳ仲介突然変異検出で用いられるオリゴヌクレオチドの濃度の影響を、第１鎖希釈系列で調べた結果を示す。
【図３２】ｍｕｔＳ仲介突然変異検出で用いられるオリゴヌクレオチドの濃度の影響、第１鎖および第２鎖の同時希釈系列で調べた結果を示す。
【図４】
2004520010.tif 000060
【図５】
2004520010.tif 000061
【図６】
2004520010.tif 000062
【図７】
2004520010.tif 000063
【図１３】
2004520010.tif 000064
【図１８】
2004520010.tif 000065
【図１９】
2004520010.tif 000066
【図２１】
2004520010.tif 000067
【図２２】
2004520010.tif 000068
【図２３】
2004520010.tif 000069
【図２４】
2004520010.tif 000070
【図２５】
2004520010.tif 000071
【図２６】
2004520010.tif 000072
【図２７】
2004520010.tif 000073
【図２８】
2004520010.tif 000074
【図２９】
2004520010.tif 000075
【図３０】
2004520010.tif 000076
【図３１】
2004520010.tif 000077
【図３２】
2004520010.tif 000078
【国際公開パンフレット】
2004520010.tif 000079
2004520010.tif 000080
2004520010.tif 000081
2004520010.tif 000082
2004520010.tif 000083
2004520010.tif 000084
2004520010.tif 000085
2004520010.tif 000086
2004520010.tif 000087
2004520010.tif 000088
2004520010.tif 000089
2004520010.tif 000090
2004520010.tif 000091
2004520010.tif 000092
2004520010.tif 000093
2004520010.tif 000094
2004520010.tif 000095
2004520010.tif 000096
2004520010.tif 000097
2004520010.tif 000098
2004520010.tif 000099
2004520010.tif 000100
2004520010.tif 000101
2004520010.tif 000102
2004520010.tif 000103
2004520010.tif 000104
2004520010.tif 000105
2004520010.tif 000106
2004520010.tif 000107
2004520010.tif 000108
2004520010.tif 000109
2004520010.tif 000110
2004520010.tif 000111
2004520010.tif 000112
2004520010.tif 000113
2004520010.tif 000114
2004520010.tif 000115
2004520010.tif 000116
2004520010.tif 000117
2004520010.tif 000118
2004520010.tif 000119
2004520010.tif 000120
2004520010.tif 000121
2004520010.tif 000122
2004520010.tif 000123
2004520010.tif 000124
2004520010.tif 000125
2004520010.tif 000126
2004520010.tif 000127
2004520010.tif 000128
2004520010.tif 000129
2004520010.tif 000130
2004520010.tif 000131
2004520010.tif 000132
2004520010.tif 000133
2004520010.tif 000134
2004520010.tif 000135
2004520010.tif 000136
2004520010.tif 000137
2004520010.tif 000138
2004520010.tif 000139
2004520010.tif 000140
2004520010.tif 000141
2004520010.tif 000142
2004520010.tif 000143
2004520010.tif 000144
2004520010.tif 000145
2004520010.tif 000146
2004520010.tif 000147
2004520010.tif 000148
2004520010.tif 000149
2004520010.tif 000150
2004520010.tif 000151
2004520010.tif 000152
2004520010.tif 000153
2004520010.tif 000154
2004520010.tif 000155
2004520010.tif 000156
2004520010.tif 000157
2004520010.tif 000158
2004520010.tif 000159
2004520010.tif 000160
2004520010.tif 000161
2004520010.tif 000162
2004520010.tif 000163
2004520010.tif 000164
2004520010.tif 000165
2004520010.tif 000166
2004520010.tif 000167
2004520010.tif 000168
2004520010.tif 000169
2004520010.tif 000170
2004520010.tif 000171
2004520010.tif 000172
2004520010.tif 000173
2004520010.tif 000174
2004520010.tif 000175
2004520010.tif 000176
2004520010.tif 000177
2004520010.tif 000178
2004520010.tif 000179
2004520010.tif 000180
2004520010.tif 000181
2004520010.tif 000182
2004520010.tif 000183
2004520010.tif 000184
2004520010.tif 000185
2004520010.tif 000186
2004520010.tif 000187
2004520010.tif 000188
2004520010.tif 000189
2004520010.tif 000190
2004520010.tif 000191
2004520010.tif 000192
2004520010.tif 000193
2004520010.tif 000194
2004520010.tif 000195
2004520010.tif 000196
2004520010.tif 000197
2004520010.tif 000198
2004520010.tif 000199
2004520010.tif 000200
2004520010.tif 000201
2004520010.tif 000202
2004520010.tif 000203
2004520010.tif 000204
2004520010.tif 000205
2004520010.tif 000206
2004520010.tif 000207
2004520010.tif 000208
2004520010.tif 000209
2004520010.tif 000210
2004520010.tif 000211
2004520010.tif 000212
2004520010.tif 000213
2004520010.tif 000214
2004520010.tif 000215
2004520010.tif 000216
2004520010.tif 000217
2004520010.tif 000218
2004520010.tif 000219
2004520010.tif 000220
2004520010.tif 000221
2004520010.tif 000222
2004520010.tif 000223
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520010.tif 000224
2004520010.tif 000225
【国際調査報告】
2004520010.tif 000226
2004520010.tif 000227
2004520010.tif 000228
2004520010.tif 000229
2004520010.tif 000230
2004520010.tif 000231
2004520010.tif 000232
2004520010.tif 000233
2004520010.tif 000234
2004520010.tif 000235
2004520010.tif 000236
2004520010.tif 000237
2004520010.tif 000238
2004520010.tif 000239
2004520010.tif 000240
2004520010.tif 000241
2004520010.tif 000242
2004520010.tif 000243
2004520010.tif 000244
2004520010.tif 000245
2004520010.tif 000246