(57)【要約】結合アッセイにおいて特に有用な、ルシフェラーゼ生物発光反応から発光放射を誘導する方法を提供する。ルシフェラーゼ生物発光混合物、および補因子などの不活性であるケージドトリガ化合物に光子放射を施して、活性形であるトリガ化合物を放出させ、これによってこのように放出された活性トリガ化合物とルシフェラーゼ混合物のほぼ同時の反応を引き起こして、検出および測定することができる光子放射を誘導する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ルシフェラーゼ生物発光反応混合物から発光放射を誘導する方法であって、
特異的ルシフェラーゼ生物発光反応に必要とされる成分を含む反応混合物を調製し、ここで該成分はルシフェラーゼ、ルシフェラーゼとの特異的な相互作用用に選択されたルシフェリン、および少なくとも一つのこれらのための補因子を包含し、該成分の一つは不活性であるケージド形態で反応混合物中に当初含まれており、
適切に選択した性質の光子放射を反応混合物に施し該成分の一つをそのケージド形態から活性形として放出させて生物発光反応を誘発し、
および斯くして引き起こされた光子放射を検出することを含み構成される方法。
【請求項２】
当初ケージド形態である反応成分が補因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
当初ケージド形態である反応成分がルシフェリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼまたは真菌ルシフェラーゼである、請求項１及至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
補因子がアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）およびフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）から選択される、請求項１及至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼであり、ルシフェリンがＤ−ルシフェリンである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
ケージド化合物がケージドＡＴＰである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ケージド化合物がケージドＤ−ルシフェリンである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
反応混合物を利用して、結合反応によって生物学的流体中の検体の存在を検出する、請求項１及至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
生物学的流体中の検体の存在を検出する反応混合物が、検体に特異的に結合することができ固相に固定される第一結合パートナー、および検体に対する適切な選択性を有しており且つルシフェラーゼが接合する第二結合パートナーをさらに含み、したがってケージド化合物を活性形として放出することによって開始される生物発光反応を利用して検体をアッセイする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
反応混合物が分析中の検体、検体に特異的に結合することができ固相に固定され、これによって検体−第一結合パートナー複合体を形成する第一結合パートナー−検体に特異的に結合して第一結合パートナー−検体−第二結合パートナー複合体を形成する第二結合パートナー、およびルシフェラーゼが接合し、第二結合パートナーに特異的に結合して第一結合パートナー−検体−第二結合パートナー−第三結合パートナー−ルシフェラーゼ複合体を形成する第三結合パートナーをさらに含み、したがってケージド化合物を活性形として放出することによって開始される生物発光反応を利用して検体をアッセイする、請求項１及至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ルシフェラーゼ生物発光反応からの発光放射を誘導する方法であって、適切に選択した不活性でありケージド形態のトリガ化合物の存在下で、活性形であるトリガ化合物を放出させるように適合させた光子放射をルシフェラーゼ／ルシフェラーゼ放射体に施し、このようにして放出された活性トリガ化合物とルシフェラーゼ／ルシフェラーゼ放射体のほぼ同時の反応を引き起こして、そこから光子放射を誘導することを含む方法。
【請求項１３】
ルシフェラーゼ／ルシフェラーゼ放射体と、適切な光子エネルギーを供給したとき活性形の補因子を放出するように適合させられた光反応性のケージド補因子である化合物とを包含しており、且つ、補因子がその活性形として光子的に放出されるときルシフェラーゼ／ルシフェラーゼ放射体の組合せと相互作用して生物発光を開始するように選択されている、組成物。
【請求項１４】
検体を含んでいる疑いがある流体中の前記検体の存在を検出し、異種の結合アッセイに適用される方法であって、
流体を検体に特異的な第一結合パートナーと接触させることであって、第一結合パートナーが適切な固相に固定されており、第一結合パートナーが検体に特異的に結合して検体−第一結合パートナー複合体を形成すること、
このようにして形成された複合体と第二結合パートナーを接触させて第一結合パートナー−検体−第二結合パートナー複合体を形成することであって、第二結合パートナーが検体に対する適切な選択性を有しており、第二結合パートナーにルシフェラーゼ酵素が直接接触すること、
過剰なルシフェラーゼ接合型第２結合パートナーをこのようにして形成された複合体から分離させること、
形成された複合体を、光反応性トリガ化合物を含めた発光反応に必要とされる残りのすべての成分と混合させること、
光子エネルギーのパルスを混合物に照射することであって、前記パルスは時間および波長の点でいくつかの性質に関して選択したものであり、したがって前記パルスは活性形のトリガ化合物をケージド化合物から分離させること、
トリガ化合物を検体−結合パートナー複合体に接合したルシフェラーゼと相互作用させて複合体から発光放射を引き起こすことであって、このようにして生み出された放射が測定可能な生物発光のシグナルを生成することおよび
このようにして生み出された放射光子を検出すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
間接的なルシフェラーゼ媒介生物発光アッセイを行うことによって、検体を含んでいる疑いがある流体中の前記検体の存在を検出する方法であって、
流体を適切な固相に固定された第一結合パートナーと接触させることであって、前記第一結合パートナーが検体に特異的に結合して検体−第一結合パートナー複合体を形成すること、
前記検体−第一結合パートナー複合体と第二結合パートナーと接触させることであって、前記第二結合パートナーが検体に特異的に結合して第一結合パートナー−検体−第二結合パートナー複合体を形成すること、
過剰な第二結合パートナーをこのようにして形成された第一結合パートナー−検体−第二結合パートナー複合体から分離させること、
このようにして形成された複合体に、ルシフェラーゼ酵素に直接接合し、第二結合パートナーに特異的に結合する第三結合パートナーを加えて、第一結合パートナー−検体−第二結合パートナー第三結合パートナー複合体を形成すること、
過剰な第三結合パートナーをこのようにして形成された複合体から分離させること、
このようにして形成された複合体を、光反応性のトリガ化合物を含めた生物発光反応に必要とされる残りのすべての成分と混合させること、
光子エネルギーのパルスを混合物に照射することであって、前記パルスは時間および波長に関するいくつかの特性について選択したものであり、したがって前記パルスは活性形のトリガ化合物をケージド化合物から分離させること、
トリガ化合物を検体−結合パートナー複合体に結合したルシフェラーゼと相互作用させて複合体から発光放射を引き起こすことであってこのようにして生み出された放射が測定可能な生物発光のシグナルを生成すること、および
放射光子を検出および分析すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
光反応性のケージド化合物から放出される光放出性トリガ化合物によって誘発されるルシフェラーゼ生物発光反応を利用する、分離競合アッセイを行うことによって、検体を含んでいる疑いがある流体中の前記検体の存在を検出する方法であって、
標的検体の類似体をルシフェラーゼ酵素に接合させること、および
接合を固相に固定された特異的な結合パートナーと接触させることであって、したがって検体類似体が限られた量の特異的な結合パートナーへの結合に関して検体と競合して、特異的な結合パートナー−検体複合体または特異的な結合パートナー−検体類似体複合体を形成すること、
固相を利用して結合画分と非結合画分を分離すること、
光反応性のトリガ化合物を含めたルシフェラーゼ媒介生物発光反応及び結合画分または非結合画分中のケージドトリガ化合物の光放出による誘発反応に必要とされる残りの成分を加えて検体の存在および濃度が検出すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
光反応性のケージド化合物から放出される光放出性トリガ化合物によって誘発されるルシフェリン−ルシフェラーゼ生物発光反応を利用する、非分離エネルギー輸送アッセイを行うことによって、検体を含んでいる疑いがある流体中の前記検体の存在を検出する方法であって、
検体を第一結合パートナーおよび第二結合パートナーに結合させて、第一結合パートナー−検体−第二結合パートナー複合体を形成することであって、第一結合パートナーがルシフェラーゼ酵素に接合し、第二結合パートナーが蛍光化合物に接合すること、
ケージドトリガ化合物を光放出してルシフェラーゼの生物発光媒介で光生成を誘発し、第二結合パートナーに接合した蛍光化合物の励起およびその後の光放射を引き起こすこと、および
前記光放射を検出すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
競合または非競合形式を使用する受容体−リガンド結合アッセイにおいて受容体の収容能力を検出する方法であって、
細胞受容体用のリガンドをルシフェラーゼに接合させること、
競合リガンドの存在下または不在下で前記リガンドをそのそれぞれの細胞受容体と混合させること、
結合した受容体−リガンド複合体を分離させること、
ケージドトリガ化合物を含めたルシフェラーゼ反応試薬を受容体−リガンド複合体に加えること、
ケージドトリガ化合物の光放出によって結合画分または非結合画分中でルシフェラーゼ生物発光を開始させて、活性形のトリガ化合物を放出させること、および
放射された生物発光光子を測定すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、化学発光の方法および反応、および生物学的分析アッセイにおけるそれらの使用に関する。より詳細には本発明は、試験流体中の標的検体の存在および量の指標としてルシフェラーゼ酵素の生物発光を必要とする、イムノアッセイおよび核酸ハイブリダイゼーションアッセイなどの生物分析アッセイに関する。
【０００２】
（発明の背景）
古典的には、液体中の物質は、検出される物質が必要な反応物である反応機構に基づいて検出され、通常その存在は反応生成物の出現または既知の反応物の消失によって示される。多くの生化学系および生物系における結合の高い特異性が、よく知られている結合反応に基づく多くのアッセイ法および系の開発を実現してきた。生体親和性の原理に基づく結合反応および／または酵素に触媒される反応が、生物学的源および環境的源からの重要な化合物を分析、検出および定量化するために開発されてきている。これらの生体親和性結合アッセイは、さまざまな検出原理を使用する非常にさまざまな形式で、研究および臨床診断における非常に貴重なツールとなっている。
【０００３】
望ましい化学的および生物学的情報を得るための、イムノアッセイ、受容体−リガンド結合アッセイおよびプローブのハイブリダイゼーションアッセイを含めた、さまざまなアッセイ法および系が知られている。これらの結合アッセイは、特異的な生体親和性の認識反応を利用するものであり、この反応では天然の生物学的結合性成分（抗体、天然のホルモン結合タンパク質、レクチン、酵素、受容体、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）など）、または人工的に生成された結合性化合物（遺伝的あるいは化学的に工学処理した抗体、または核酸プローブなど）が、調査中の検体に対する特異的な結合パートナーを形成する。一般にこのようなアッセイは、標識を利用して、過剰な試薬から適切に分離した後の結合産物を定量化する。
【０００４】
アッセイの設計および特異的な必要性に従って、多くの標識技法が施される。アッセイは、基質または最終産物のいずれかの測定を容易にする単純な標識された基質を利用することができ、あるいはアッセイは、加水分解の直接的情報（たとえば、内部の反応停止またはエネルギー移動）を与えるような様式で定義することができる。
【０００５】
発光標識の使用は、生体親和性アッセイの分野では充分認識されている。ルミネセンスとは、物質による光の放射（白熱によるもの以外）に適用される用語である。発光標識を作製して、光化学的、化学的および電気化学的手段によって発光させることができる。「光ルミネセンス」とは、電磁放射を吸収した際に、物質が発光するように誘導されるプロセスである。蛍光発光およびリン光発光は、このような光ルミネセンスのタイプである。化学発光は、化学反応中の単一光子形態の、エネルギーの化学的な移動による発光種の生成を伴うプロセスである。化学発光標識は、バイオアッセイの分野では充分認識されている。一般に化学発光の放射は、放射された光を検出または測定できるほど充分に持続し、これによって検体の検出または定量化が可能になる。
【０００６】
生物発光は化学発光の１タイプであり、その化学発光反応の成分の一つは生物起源のものである。ルミネセンスすなわち化学発光または生物発光を、イムノアッセイ、および多くの他の生体親和性結合アッセイにおけるシグナル生成機構として使用することは知られている。生物発光は、補因子の存在を伴うかあるいは伴わずに、真の酵素（ルシフェラーゼ）または非酵素タンパク質（発光タンパク質）のいずれかの触媒の存在下での、酸素またはその代謝産物の一つによる有機分子「ルシフェリン」の酸化から生じ、その結果として光が生成する。発光タンパク質触媒の発光反応の場合、ルシフェリンは、その触媒反応が反応媒質中に酸化ルシフェリンを放出することなく光の放射をもたらすように、発光タンパク質に結合する。ルシフェラーゼ媒介生物発光反応の場合、ルシフェリンはルシフェラーゼに強く結合することはなく、その触媒反応がルシフェリン基質の酸化、および形成された酸化ルシフェリンの複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）から媒質への解離をもたらし、その結果光が放射される。
【０００７】
いくつかのタイプのルシフェラーゼを利用する、多数の生物発光反応が知られている。これらの発光反応を媒介するルシフェラーゼは、数多くあり多様である。生物発光を生成させるための結合アッセイにおいて、最も一般的に使用されるルシフェラーゼは、ホタル、細菌、およびレニラすなわちウミシイタケ起源のルシフェラーゼである。これらのルシフェラーゼは、それぞれ異なるルシフェリンおよび異なる補因子を利用する。ホタルルシフェラーゼは、そのルシフェリンの酸化および光の放射のためにアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）をその補因子として利用する。細菌ルシフェラーゼは、そのルシフェリンを酸化させて発光反応を生み出すために、ニコチンアミド−アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤ（Ｐ））またはフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）を補因子として使用する。
【０００８】
（従来技術）
化学発光反応を利用する結合アッセイでは、ルシフェラーゼの使用に関する広範囲の従来技術が存在する。いくつかのグループは、ホタル、細菌、またはレニラのルシフェラーゼを抗体に結合させており、それらを結合アッセイにおいて使用している。たとえば、ホタルルシフェラーゼ結合アッセイ法に関しては、米国特許第５，２８３，１７９号、第５，６４１，６４１号および第５，６５０，２８９号がＰｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに発行されている。これらのアッセイは市販のものであり、これらのアッセイを使用することによって生物発光の強度が実証されている。
【０００９】
通常、広範囲の従来技術では、生物発光アッセイでは、いくつかの化学試薬を特定の順序で添加して、光生成の最終反応を誘発することが必要である。生物発光アッセイ全体の最終工程として、特定の時間に他のすべての反応成分にトリガ化合物を加えて、光生成反応を誘導する。
【００１０】
結合アッセイにおける生物発光の利点は充分認識されているが、このようなアッセイの自動化は、このような反応の誘発に関する多数の工程によって複雑である。手動または自動注入器が、個々の反応工程で試薬を供給するために必要とされる。これらの要件が、生物発光アッセイの広範囲の使用を妨げている。自動注入器を有する器具が開発されており、現在入手可能であるが、器具は大部分は手動で操作されている。
【００１１】
光放射の時間的経過のために、光放射の時間を延長するため、あるいは精確な時間でトリガ化合物を送達して光放射および回収を最大にするための、当分野の体系が開発されてきている。詳細には、多数のサンプルを処理するとき、トリガ化合物を適切な時間で送達して、その結果光の検出を最大にすることが必要不可欠である。典型的には、ルシフェラーゼ触媒の光子生成は数秒以内に停止し、放射された光のこの閃光性のために、この短い閃光を捉える生物発光アッセイの信頼性は限られている。さらに、生物発光反応の成分を送達するために使用する機械的手段が不精確であるために、これらのアッセイの高い変動性によって、高価な機器が必要となる。これに加えて、生物発光反応混合物への化学試薬の添加に関する多くの工程は、これらの反応の自動化を困難にしており、非常に精巧で非常に高価な機器を開発することが必要となる。さらに、ルシフェラーゼの触媒的ターンオーバーによって、安定した発光強度が生み出されると思われるが、実際には酵素アッセイでは、基質を加えたときに短時間の光のみが生成する。細菌ルシフェラーゼを使用するアッセイでは、還元されたＦＭＮが水溶液中で急速に自動酸化され、したがって持続的触媒作用には利用できない。このことは、細菌ルシフェラーゼが代替品、最も顕著にはホタルルシフェラーゼよりも、生物発光試薬として一般的に好まれない理由の一つである。
【００１２】
これらの欠点のいくつかに取り組むための試みでは、ルシフェラーゼ反応の性能を最適化するために、広範囲の従来技術が進展させられている。ホタルルシフェラーゼアッセイを改善することを試みたので、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡され、先に確認した特許のいくつかは、光放射の速度を改善することによって、従来のアッセイと比べて、より大きな光の出力を与えてこれらのアッセイを最適化し、アッセイの感度を最大にすることを報告した。米国特許第４，２８６，０５７号は、アデノシン５’一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、スルフヒドリル化合物およびアルブミンの試薬組成物への取り込みを教示している。この試薬組成物によって、ホタルルシフェラーゼの閃光の時間が延長されて、ＡＴＰを加えたときに光放射の時間が最適になる。さらに、ＰＣＴ特許出願第９９／３８９９９号中に開示されているように、レニラルシフェラーゼの光放射を改善するために同じ試薬組成物が利用された。
【００１３】
ＡＴＰを時期尚早の加水分解から守り、反応媒質へのＡＴＰの送達を最適化するための試みでは、Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎは米国特許第４，７０４，３５５号中で、結合アッセイ中のホタルルシフェラーゼ生物発光の誘発において、リポソーム被包性ＡＴＰを使用するための方法を開示している。米国特許第５，７８６，１５１号でもＳａｎｄｅｒｓが、ホタルルシフェラーゼを利用する生物発光アッセイ中の、ＡＴＰのリポソーム被包という他の方法を開示している。このような被包およびアッセイによって、抗原およびＤＮＡプローブなどの検体の存在を検出する非常に感度の高い方法が提供されるが、被包は、ＡＴＰの放出前に化学的な加水分解を必要とするリポソーム内で行われる。このプロセスは遅く、結果としてＡＴＰが反応媒質中に長時間かけてゆっくりと漏出し、これにより長時間にわたって光放射が弱くなる結果になる。
【００１４】
しかしながら、多数のサンプルを処理することが必要であるときは特に、現在の生物発光結合アッセイに関する重大な欠点は依然として存在する。光放射の時間の不適切な延長は、他のサンプルのシグナル測定を害する可能性がある。さらに、アッセイ試薬を最適化することによって、アッセイ媒質を害する可能性がある。生物発光結合アッセイにおいて異なるルシフェラーゼを使用する際の主な制約の一つとして、光子生成の時間が短いことがあり、誘発試薬の添加は、反応成分が検出器の測定チャンバ内にあるときに行わなければならない。さらに、これらの試薬を用いた一貫した光生成のためには、試薬を適切に混合することが必要不可欠である。光子生成の時間を延長するための手段、または光生成の速度を最適化するための手段が、切に求められている。
これらの化学反応の自動化を可能にするための技術を開発することによって、アッセイ手順が簡潔になると思われる。さらに、試薬を精確に利用することによって、光の検出が最大になるであろう。
【００１５】
本発明の目的は、ルシフェラーゼを使用して生物発光反応を行うための、新規な方法を提供することである。
本発明の他の目的およびより具体的な目的は、このようなルシフェラーゼ系の生物発光反応をインビトロでの生物発光結合アッセイに適用する方法を提供することである。
他の目的は、生物発光反応において使用するための新規な組成物を提供することである。
【００１６】
（発明の概要）
本発明は、結合アッセイを行うのに有用な、ルシフェラーゼ酵素およびそれらと関連があるルシフェリンの生物発光反応を誘導するための、新規な方法を提供する。本発明の方法は、インビトロでのバイオアッセイ法を行うのに非常に適しているだけでなく、他の技術分野においても有用性がある。
【００１７】
本発明の方法は、ルシフェラーゼ媒介生物発光反応に必要な最終試薬として、活性形トリガ化合物のケージド不活性形からの光化学的放出を利用する。ケージド化合物（ｃａｇｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）は、ＵＶ光のパルスなどの照射が不活性状態から活性状態に分子を転換させる光化学反応を誘導するまで、その生物学的機能が遮蔽されている分子である。これらの化合物の活性化は、化合物の光への暴露を制限することによって、時間的および空間的に精確に調節することができる。（トリガ化合物がほぼ瞬間的に放出され、発光を生み出すルシフェラーゼ反応に必要な既に存在する他のすべての成分と相互作用するように）、トリガ化合物の光駆動放出を誘導することによって検出可能であり測定可能である発光シグナルが再現的に生成され、容易に検出される。最初は、トリガ化合物は、不活性である光反応性のケージド形態で存在する。この不活性である前駆体化合物に、適切に選択した所定の特性の光子エネルギーの非常に短いパルスを当てると、トリガ化合物がその活性形で放出される。
【００１８】
本発明の方法によって、生物発光反応の開始に関する、緻密で厳密な調節が可能になる。活性形であるトリガ化合物の反応混合物への導入を完全に調節することによって、生成時間およびその生成量の両方に関して、本発明の方法により、反応媒質中に放出されるトリガ化合物の量、したがって生物発光アッセイ中に発生する閃光の量を最適化することが可能になる。本発明の方法によって、さまざまな異なるトリガ化合物を使用することが可能になり、これらの化合物は、選択したルシフェラーゼとの生物発光反応に関するそれらの特異性に基づいて選択される。
【００１９】
本発明の方法は、ケージド不活性形化合物から光子放出によって、反応開始に必要な必須補因子を供給することによって、ルシフェラーゼ酵素の生物発光反応を開始させるための明確なトリガ化合物の光放出に関する。本発明の方法によって、このような結合アッセイにおける、ルシフェラーゼ酵素による光子の生成速度に関して調節することも可能である。これらすべての特徴により作業者は、ルシフェラーゼ酵素およびその特異的なトリガ化合物の適切な選択に基づいて、放射された発光シグナルを増幅することなどによって、本方法の感度を最大にすることができ、生成した発光シグナルの収集時間を最適化することができる。
【００２０】
したがって、本発明に従って一態様から、ルシフェラーゼ生物発光の反応混合物から発光放射を誘導する方法であって、
特異的なルシフェラーゼ生物発光反応に必要とされる成分を含む反応混合物を調製することであって、前記成分がルシフェラーゼ、前記ルシフェラーゼとの特異的な相互作用用に選択されたルシフェリン、および少なくとも一つのこれらの補因子を含み、前記成分の一つがケージド不活性形で反応混合物中に最初に含まれていること、
適切に選択した性質の光子放射を反応混合物に施して、前記成分の一つをそのケージド形態から活性形として放出させ、これによって生物発光反応を誘発すること、
および、このようにして引き起こされた光子放射を検出すること
を含む方法を提供する。
【００２１】
本発明の方法は、所定量のトリガ化合物を放出させるために送達される光子エネルギーの量を変えることによって、放出されるトリガ化合物の量に関する非常に緻密な調節を可能にし、したがって生物発光ルシフェリン−ルシフェラーゼ反応による光生成を最適化する。
【００２２】
本発明の他の態様は、本明細書で定義するルシフェラーゼ−ルシフェラーゼ放射体、およびトリガ化合物を含む組成物を含み、このトリガ化合物は、それに適切な光子エネルギーの入力で活性形の補因子を放出するように適合させられており、補因子が活性形として光子により放出されるとき、ルシフェラーゼ−ルシフェラーゼ放射体と相互作用させて生物発光を開始させるために選択されている、光反応性ケージド不活性補因子である。
【００２３】
（好ましい実施形態の説明）
本明細書でその用語を使用するように、ルシフェラーゼは、ルシフェリンの酸化ルシフェリンへの酸化を触媒する酵素であり、これによって生物発光反応において光が生成され、その結果酸化ルシフェリンがルシフェリン−ルシフェラーゼ複合体から反応媒質に放出される。光を生成させるためのこれらのルシフェラーゼの反応には、ＡＴＰ、ＮＡＤ／ＮＡＤＰまたはＦＭＮなどの一つまたは複数の補因子の存在が必要である。このようなルシフェラーゼの例は、ホタル、細菌および真菌ルシフェラーゼである。
【００２４】
本明細書で定義するように、発光タンパク質は、生物発光反応においてルシフェリンの酸化を触媒して光を生成させるタンパク質であり、形成された酸化ルシフェリンが複合体から反応媒質に放出されることはない。発光タンパク質は、カルシウムなどの二価カチオンを、光を放射するための唯一のトリガ化合物として利用する。このような発光タンパク質の例は、エクオリンおよびオベリンであり、これらはセレンテラジン（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）をルシフェリンとしＣａ＋＋をトリガ化合物として利用する。発光タンパク質は、本明細書でその用語を使用するように、ルシフェラーゼとは区別され異なるものである。
【００２５】
本明細書で使用する「ルシフェリン」という用語は、適切に選択したルシフェラーゼ酵素で酸化すると、生物発光を生み出す任意の基質を指す。ルシフェリンは天然化合物または合成化合物であってよい。異なる生物種から単離したルシフェリンは構造が大きく異なる可能性があるが、多くの場合は広く多用な種で同一の構造が発見されている。構造的にルシフェリンは、いくつかのアルデヒド、イミダゾロピラジン、ベンゾチアゾール、直鎖状テトラピロールおよびフラビンの形をとることができる。ホタルルシフェリンは、たとえば（Ｓ）−４，５−ジヒドロ−２−（６−ヒドロキシ−２−ベンゾチアゾリル）−４−チアゾールカルボン酸であり、元々は、活発なホタルから単離された。これは市販されている。海洋細菌のルシフェリンは、還元型リン酸リボフラビンＦＭＮＨ２である。ゴニオラクス属からの双鞭毛類ルシフェリンは、クロロフィルの構造と非常に類似した化学構造を有している。貝虫亜綱Ｖａｒｇｕｌａ中およびイサリビガマアンコウ属Ｐｏｒｙｃｈｔｈｙｓ中で発見されたルシフェリンＶａｒｇｕｌｉｎは、末端アルキレン−グアニジン基を有するベンザゾール−ジアジン化合物である。最もよく知られており最も広く研究されている、天然に存在するルシフェリンは、ウミシイタケＲｅｎｉｌｌａ　ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓから、貝虫亜綱Ｃｙｐｒｉｄｉｎａ　ｈｉｌｇｅｎｄｏｒｆｉｉから、カサガイＬａｔｉａ　ｎｅｒｉｔｏｉｄｅｓから、およびホタルＰｈｏｔｉｎｕｓ　ｐｙｒａｌｉｓから単離されるルシフェリンである。
【００２６】
いくつかのルシフェリン−ルシフェラーゼの組合せは、酸化したとき生物発光を生み出すために、補因子の存在も必要とする。たとえば、ホタルルシフェリン／ルシフェラーゼは、その酸化生物発光反応のために補因子ＡＴＰの存在を必要とする。
【００２７】
本明細書で言及するルシフェラーゼ／ルシフェラーゼ放射体の組合せとは、生物発光反応を開始させるのに必要とされる他のすべての特異的な補因子の存在下でのルシフェラーゼとその適切なルシフェリンの任意の組合せを意味する。ただし、本明細書で定義したトリガ化合物以外である。多数のルシフェラーゼ／ルシフェラーゼ放射体の組合せが存在し、それぞれのルシフェラーゼが特異的なルシフェリンおよび補因子を使用する。ルシフェラーゼ／ルシフェラーゼ放射体の組合せは任意のこのような組合せであってよいが、ただしトリガ化合物をその活性形で導入することによって、生物発光反応が開始され、光が生成されるものとする。
【００２８】
トリガ化合物は、ルシフェリン−ルシフェラーゼの組合せに加えるときは、ルシフェラーゼ媒介生物発光反応の開始に必要とされる補因子（二価カチオン以外）である。このようなトリガ化合物の例は、ＡＴＰ、ＮＡＤ／ＮＡＤＰおよびＦＭＮである。適切に選択した他の成分（多価カチオンを含んでよい）の存在下で、ルシフェラーゼ／ルシフェラーゼ放射体の組合せと相互作用して、生物発光反応を誘発することができる、トリガ化合物が選択される。
【００２９】
光反応性のケージド化合物は、活性分子の不活性誘導体であり、特定のエネルギーの光のパルスを照射すると、これが誘導されて活性種を放出する。遊離分子の放出もほぼ同時である。光反応性のケージドトリガ化合物は、それがルシフェラーゼ／ルシフェラーゼ放射体の組合せに不活性前駆体として導入され、光子エネルギーで照射したとき活性化されるように、単一成分の複合体からなっていてよい。光反応性のケージドトリガ化合物は、そのトリガ化合物が光反応性の担体中で反応混合物から物理的に分離し、特定のエネルギーの光のパルスが誘導されて活性トリガ化合物が物理的障壁から放出されるような、２成分系であってもよい。本発明の方法では、光ルミネセンス反応に関する必須成分のいずれか一つを、ケージド不活性化合物として最初に導入することができる。ケージド化合物は、ケージド補因子またはケージドルシフェリンのいずれかであることが好ましい。
【００３０】
異種の結合アッセイに適用されるので、本発明の方法は、トリガ化合物の光化学的放出を利用して、このようなアッセイのシグナル生成機構としてのルシフェラーゼ媒介生物発光反応を開始させる。光子エネルギーを使用するトリガ化合物のこの光放出によって、生物発光反応を開始させるために必要とされる最終成分が与えられる。このようなトリガ化合物は、発光タンパク質に必要とされるタイプの二価カチオンではない。ルシフェラーゼ駆動型の生物発光反応の他の必須成分の存在下では、トリガ化合物の放出によって、発光反応がほぼ同時に開始され、それぞれの異なるルシフェラーゼ反応に特異的な波長で光子放射が引き起こされる。ルシフェラーゼ酵素は、結合パートナーに直接的あるいは間接的に結合することができ、アッセイする検体または特異的結合パートナーへの結合に関して検体と競合する検体類似体に特異的に結合し、その結果、誘発される光子放射の検出および定量化によって検体の検出および定量化が可能になる。
【００３１】
したがって、好ましい一実施形態において本発明は、異種の結合アッセイにおいてルシフェラーゼ媒介生物発光を使用して、検体を含んでいる疑いがある流体中の検体の存在を検出しその量を決定する方法を提供する。
【００３２】
第一のこのような手順では、流体を検体に特異的な第一結合パートナーと接触させ、適切な固相に固定する。この第一結合パートナーは検体に特異的に結合して、検体−第一結合パートナー複合体を形成する。このようにして形成された複合体を、この検体に対して適切な選択性がある第二結合パートナーと接触させ、これに直接ルシフェラーゼ酵素を接合させて、第一結合パートナー−検体−第二結合パートナー複合体を形成する。過剰なルシフェラーゼ結合型の第二結合パートナーを、標準的な物理的手段によって、たとえば洗浄によって、形成された第一結合パートナー−検体−第二結合パートナー複合体から分離させ、形成された複合体を、光反応性のトリガ化合物を含めた発光反応に必要とされるすべての成分と混合させる。次いでこの混合物に、光子エネルギーのパルスを照射する。このパルスは時間および波長の点でいくつかの性質に関して選択したものであり、したがってパルスは、活性形のトリガ化合物をケージド化合物から分離させ、トリガ化合物を検体−結合パートナー複合体に結合したルシフェラーゼと相互作用させて、複合体からの発光放射を引き起こす。このようにして生み出される光子放射によって、検出および分析して検体の存在および濃度を決定することができる、測定可能な生物発光の光子シグナルが生成する。
【００３３】
本発明の他の好ましい実施形態は、流体中の検体の存在を検出するため、あるいはそれを定量化するための、間接的なルシフェラーゼ媒介生物発光アッセイを利用する。この手順は、流体を適切な固相に固定された第一結合パートナーと接触させることを含み、したがって第一結合パートナーが検体に特異的に結合して、検体−第一結合パートナー複合体を形成する。次いで検体−第一結合パートナー複合体を、検体に特異的に結合する第二結合パートナーと接触させて、第一結合パートナー−検体−第二結合パートナー複合体を形成する。過剰な第二結合パートナーを、このようにして形成された第一結合パートナー−検体−第二結合パートナー複合体から分離させ、次に前記形成された複合体に第三結合パートナーを加え、これに直接ルシフェラーゼ酵素が接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）し、これが第二結合パートナーに特異的に結合して、第一結合パートナー−検体−第二結合パートナー−第三結合パートナー複合体を形成する。過剰な第三結合パートナーをこのようにして形成された複合体から分離させ、形成された複合体を、光反応性のトリガ化合物を含めた発光反応に必要とされる追加的な成分と混合させる。次いでこの混合物に、光子エネルギーのパルスを照射する。このパルスは時間および波長の点でいくつかの性質に関して選択したものであり、したがって活性形のトリガ化合物がケージド化合物から分離し、トリガ化合物を検体−結合パートナー複合体に結合したルシフェラーゼと相互作用させて、複合体からの発光放射を引き起こす。このようにして生み出される光子放射によって、検出および分析して検体の存在および濃度を決定することができる、測定可能な生物発光の光子シグナルが生成する。
【００３４】
他の好ましい実施形態では本発明は、光反応性のケージド化合物から放出される光放出型トリガ化合物によって誘発される、ルシフェラーゼ生物発光反応を利用して、分離競合アッセイを行うことにより、検体を含んでいる疑いがある流体中の検体の存在を検出および定量化する方法を提供する。このような好ましい実施形態に従って、標的検体類似体をルシフェラーゼ酵素に接合させ、この類似体が、結合画分および非結合画分の分離を容易にするために固相に固定されている特異的な結合パートナーへの結合に関して、検体と競合する。検体類似体は、限られた量の特異的な結合パートナーへの結合に関して検体と競合して、特異的な結合パートナー−検体複合体または特異的な結合パートナー−検体類似体複合体を形成する。結合画分および非結合画分が分離され、ルシフェラーゼ媒介生物発光反応が、結合画分または非結合画分中のケージドトリガ化合物の光放出によって誘発され、したがって、検体の存在および濃度が検出される。
【００３５】
さらに他の好ましい実施形態では、本発明の方法によって、光反応性のケージド化合物から放出される光放出型トリガ化合物によって誘発されるルシフェラーゼ生物発光反応を利用する、非分離エネルギー輸送アッセイが提供される。流体中の検体の存在を検出するこのような手順では、検体を第一結合パートナーおよび第二結合パートナーに結合させて、第一結合パートナー−検体−第二結合パートナー複合体を形成する。第一結合パートナーはルシフェラーゼ酵素に接合させ、第二結合パートナーは蛍光化合物に接合させる。ケージドトリガ化合物の光放出によって、ルシフェラーゼ酵素による生物発光媒介光生成が誘発される。このようにして生成した発光シグナルは、第二結合パートナーに接合した蛍光化合物の励起、および光放射をもたらす。ルシフェラーゼ反応からの生物発光による放射によって、第二結合パートナーに接合した蛍光タグを励起することができるように、ルシフェラーゼおよび蛍光化合物を選択する。ルシフェラーゼ反応混合物付近の蛍光タグのみが励起され、したがって分離工程なしでアッセイを行うことができる。
【００３６】
このような細菌ルシフェラーゼの組合せの例は、ウミシイタケＲｅｎｉｌｌａ　ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼが第一結合パートナーに接合するとき、およびＲｅｎｉｌｌａ緑色蛍光タンパク質が第二結合パートナーに接合するときに出現する。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼによって生み出される発光放射によって、Ｒｅｎｉｌｌａの緑色蛍光タンパク質が励起される。誘発されたルシフェラーゼは、蛍光タンパク質の近くに酸化ルシフェリンを放射し、この時だけこれらは複合体として結びつく。蛍光タンパク質は、それが複合体に結合するときのみ励起状態になる。遊離ルシフェラーゼも励起状態になるが、蛍光放射は受けない。他の例は、細菌ルシフェラーゼを第一結合パートナーに接合させること、および黄色蛍光タンパク質を第二結合パートナーに接合させることである。
【００３７】
他の好ましい実施形態では、本発明の方法によって、競合または非競合形式を使用する受容体−リガンド結合アッセイにおいて、受容体の収容能力を検出するための方法が提供される。このようなアッセイでは、細胞受容体用のリガンドをルシフェラーゼに接合させ、競合リガンドの存在下または不在下でそのそれぞれの細胞受容体を混合させる。結合した受容体−リガンド複合体を分離させ、ルシフェラーゼ生物発光を、ケージドトリガ化合物の光放出によって結合画分または非結合画分中で誘発して、活性形のトリガ化合物を放出させ、生物発光を測定する。
【００３８】
本発明で使用するために選択するルシフェラーゼおよびケージドトリガ化合物は、発光放射を引き起こすためのそれらの相互特異性に基づいて選択する必要がある。たとえば、選択するルシフェラーゼがホタルルシフェラーゼ酵素である場合、ケージドトリガ化合物はケージドＡＴＰまたはケージドルシフェリンである。本発明の好ましい実施形態で使用するのに適切なトリガ化合物の他の例には、細菌ルシフェラーゼに対するケージドＮＡＤおよびＮＡＤＰである。
【００３９】
ケージドＡＴＰまたはケージドルシフェリンなどのケージドトリガ化合物は、発光放射を誘発するために必要とされる成分すべてが存在するにもかかわらず、ホタルルシフェラーゼの発光反応を誘発することはできない。しかしながら、特定の波長を光子パルスで刺激すると、その結果生じるほぼ同時の活性ＡＴＰまたはルシフェリンの放出によって、発光反応を誘発することができる。このような場合、発光による光子放射はすべて、添加される不活性で光反応性のケージドトリガ化合物から放出されるトリガ化合物から誘導される。これによって、検体−結合パートナー複合体中のルシフェラーゼ酵素の量から推測されるように、サンプル中に存在する検体の量を精確に監視することができる。
【００４０】
本発明において有用なケージドトリガ化合物には、さまざまなケージド基を利用する化合物がある。したがってトリガ化合物は、光反応性の化学的連結を介して化学的に結合しているか、あるいは担体化合物に結合しているか、あるいは光反応性の担体中に物理的に捕えられていてよい。非常にさまざまなこのような結合、たとえばペプチドの化学合成において光反応性の保護基として使用される基および結合が、当分野では知られている。
【００４１】
「ケージド化合物」という用語は、ＡＴＰなどの本来の基質の光反応性誘導体に関して新造された。Ｋａｐｌａｎ，Ｊ．Ｈ．、Ｆｏｒｂｕｓｈ，Ｇ．ａｎｄ　Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｊ．Ｆ．「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｖｏｌｕｍｅ１７、ｐａｇｅｓ　１９２０−１９３５（１９７８）を参照のこと。首尾良いケージド基の必要な性質は、Ｇｉｖｅｎｓ、Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｓ．、Ｗｅｂｅｒ、Ｊｏｒｇ　Ｆ．Ｗ．、Ｊｏｎｇ、Ａｎｄｒｅａｓ　Ｈ．ａｎｄ　Ｐａｒｋ　Ｃｈａｎ−Ｈｏ、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、Ｖｏｌｕｍｅ　２９１、ｐａｇｅｓ　１−２９（１９９８）によって論じられている。これらの参照文献の両方の開示は、その全容を本明細書に組み込まれる。
【００４２】
ＡＴＰに関しては、本発明において「ケージドＡＴＰ化合物」として使用するのに適した前駆体化合物の例には、２−ニトロベンジルＡＴＰおよび２−ニトロフェネチル−ＡＴＰなどの、ｏ−ニトロベンジル基を利用する化合物がある。ＡＴＰおよび他のヌクレオチド様トリガ化合物に関する他の適切な光反応基には、デシル（ジフェニルエチルケトニル）およびｐ−ヒドロキシフェナシルがある。使用する光反応基を光開裂性親和性タグとして使用して、分子による標的からの親和性標識のその後の光放出を可能にすることもできる。その開示を参照によって本明細書に組み込んである、Ｏｌｅｊｎｉｋ，Ｊｅｒｚｙ；Ｋｒｚｙｍａｎｓｋａ−Ｏｌｅｊｎｉｋ、Ｅｄｙｔａ；ａｎｄ　Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄ，Ｋｅｎｎｅｔｈ　Ｊ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」Ｖｏｌｕｍｅ　２９１、ｐａｇｅｓ　１３５−１５４（１９９８）を参照のこと。
【００４３】
さまざまなケージド基を有するこのような前駆体ＡＴＰは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ　Ｉｎｃ．（Ｅｕｇｅｎｅ　Ｏｒｅｇｏｎ）から、二ナトリウム塩として市販されている（ＤＭＮＰＥ−ケージドＡＴＰおよびＮＰＥ−ケージドＡＴＰ、それぞれカタログ番号Ａ−１０４９およびＡ−１０４８）。さらに、ケージドＤ−ルシフェリンが市販されている（カタログ番号Ｌ−７０８５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ　Ｏｒｅｇｏｎ）。細菌ルシフェラーゼに関しては、米国特許第６，０２０，４８０号中でＣｏｈｅｎが、光反応基としてＤＭＮＰＥおよびＣＮＢを使用するケージドＮＡＤおよびＮＡＤＰの２つの異なるセットを開示しており、これらは本明細書において使用することができる。
【００４４】
トリガ化合物は、光子パルスでほぼ同時にトリガ化合物を放出する粒子中に物理的に捕えられていてもよい。光反応性の化学結合の代わりに、参照によって本明細書に組み込んだＭｏｒｇａｎ　ＣＧ（Ｍｏｒｇａｎ他、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ　Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ、Ｖｏｌ．６２、２４−２９、１９９５）によって教示される、たとえば光感受性の脂質膜中のトリガ化合物の光反応性のリポソーム被包と同様に、トリガ化合物と担体化合物の光反応性の物理的会合を使用することができる。さらに、このような光反応性の担体は、参照によって本明細書に組み込んだ米国特許第５，７９５，５８１号（Ｓｅｇａｌｍａｎ）中に開示されたような、光反応性のデンダイマー（ｄｅｎｄｉｍｅｒ）であってよい。これら２つの担体中で利用される光反応基は異なる。
【００４５】
担体化合物からの活性形であるトリガ化合物の光放出は、好ましくはほぼ同時であるべきである。これには、トリガ化合物と担体化合物の間の適切な光反応性の連結を選択することが必要であり、したがってこれは、それぞれ個々の成分の化学的性質、および適切な周波数の入射線の付与、および必要な放出を引き起こすエネルギーレベルにも依存する。
【００４６】
付随の例示的であるが非制限的な実験実施例を参照しながら、本発明をさらに記載する。
反応の必須成分の一つが当初はケージド形態である、ルシフェラーゼによる化学発光反応の実験を行うことによって、本発明の方法を実証した。充分な強度のＵＶ光パルスを当てると、ケージド化合物を非ケージド形態にし、活性化合物の放出が同時に引き起こされて、反応が誘発される。典型的なルシフェラーゼによる化学発光反応には、酸素の存在下で以下の必須成分；ルシフェラーゼ酵素、ルシフェリン、マグネシウムおよびＡＴＰが必要であり、以下の反応式に従って光が生成される：
2004514460.tif 000002
この反応のすべての成分は、光反応性の結合を利用するケージド化に応じやすく、これによって成分は最初は不活性になる。ルシフェラーゼによる化学発光反応を誘発するための必須成分のＵＶによる非ケージド化という、本発明の実施形態を、以下の実施例を行うことによって実証した。
【００４７】
実施例１
この実験では、ケージドＡＴＰを利用して反応を調節した。反応成分をＵＶ光のパルスに暴露させると、機能的ＡＴＰがケージドＡＴＰから反応混合物に送達された。
試薬：
・凍結乾燥させたルシフェラーゼ／凍結乾燥させたＤ−ルシフェリンを、トリシン緩衝液［５０ｍＭのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．８に調整した、Ｌｏｔ１４１８］いずれもＫｉｋｋｏｍａｎによってアッセイ用キット、ＣｈｅｃｋＬｉｔｅ　ＨＳ　Ｐｌｕｓ、カタログ番号６０３４２として提供された）中に溶かした。
・リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中クエン酸マグネシウム　５ｍＭ
・メタノール中ケージドＡＴＰ（ｐ−（１−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）エーテル、ケージドアデノシン−５−三リン酸）二ナトリウム塩、３００μＬ中に５ｍｇ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ａ−１０４９）。
２０μＬの合計反応容積で、適切な反応セル中において、以下のものを混合させた。
・ルシフェラーゼ／Ｄ−ルシフェリン溶液混合物１０μＬ
・ＰＢＳ中クエン酸マグネシウム５ｍＭ５μＬ
・ケージドＡＴＰ溶液　５μＬ
このセルおよび成分を、ＵＶのパルス（キセノンランプ、Ｒａｐｐ　Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃによる１ミリセカンド単位のパルス）に暴露させた。ＵＶパルスの強度はさまざまであった（１パルス当たり４０、６０、８０ｍＪ）。反応混合物から放出される光の量は、ＵＶパルスの強度の増大と共に増大した。この反応では、ＡＴＰは限定因子であり、ＵＶパルスの強度の増大と共に、放出されるＡＴＰの量は増大し、したがって放出される光の量が増大した。
【００４８】
実施例２
この実験では、ケージドＤ−ルシフェリンを利用して反応を調節した。反応成分を適切な強度のＵＶ光のパルスに暴露させると、機能的Ｄ−ルシフェリンがケージドＤ−ルシフェリンからの反応に送達された。
試薬：
・ホタルルシフェラーゼ酵素を、ＫｉｋｋｏｍａｎカタログＬＵＣＴによって提供されＮａＯＨを用いて調整した、ｐＨ７．８のトリシン緩衝液（５０ｍＭのＮ−トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン）中に溶かしたもの
・ＰＢＳ中クエン酸マグネシウム５ｍＭ、ｐＨ７．４
・１−（４，５−ジメトキシ−２−ニトロフェニル）エチルエステル−ケージドＤ−ルシフェリン、５ｍｇを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｌ−７０８５）からのジメチルスルホキシドＤＭＳＯ３００μＬ中に溶かしたもの
・１００ｍＭのＡＴＰ溶液、ｐＨ７．５（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ、カタログ番号２７２０５６）。
２５μＬの合計反応容積で、以下の成分を溶液として適切なセル加えた：
・ルシフェラーゼ溶液１０μＬ
・ＰＢＳ中クエン酸マグネシウム５ｍＭ５μＬ
・１ｍＭＡＴＰ溶液５μＬ
・ケージドＤ−ルシフェリン溶液５μＬ。
【００４９】
このセルおよび成分を、ＵＶのパルス（キセノンランプ、Ｒａｐｐ　Ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃによる１ミリセカンド単位のパルス）に暴露させた。ＵＶパルスの強度はさまざまであった（１パルス当たり４０、６０、８０ｍＪ）。反応混合物から放出される光の量は、ＵＶパルスの強度の増大と共に増大した。この反応では、Ｄ−ルシフェリンは限定因子であり、ＵＶパルスの強度の増大と共に放出される活性Ｄ−ルシフェリンの量は増大し、したがって放出される光の量が増大した。
さらに、前述の実験実施例の両方で、同じ強度の多数のパルスを使用した（１パルス当たり４０ｍＪ）。このケースで、第１のパルスによって、ケージド成分の限定的な放出がもたらされ、これがルシフェラーゼ化学発光反応および光の放射の開始を誘発した。第２のパルスによって、安定して放出される光の強度のピークがもたらされた。
【国際公開パンフレット】
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2004514460.tif 000004
2004514460.tif 000005
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2004514460.tif 000029
2004514460.tif 000030
2004514460.tif 000031
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004514460.tif 000032
【国際調査報告】
2004514460.tif 000033
2004514460.tif 000034
2004514460.tif 000035