(57)【要約】本発明は、最適化された触媒を生成するための方法に関する。その触媒は、所望の触媒特性、または多数の特性に関して、前記生成方法の間に最適化される。合成金属含有若しくは金属を含有しない触媒は、分子生物学的に生成された酵素若しくは蛋白質突然変異体に化学的に結合し、前記生成された触媒が、分子生物学の方法を使用した最適化プロセスを受け、若しくは酵素の定方向進化を受ける。本発明は、前記方法によって得られる触媒にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成金属含有若しくは金属を含有しない触媒の生成プロセスであって、
その触媒は、酵素若しくは蛋白質に結合し、１以上の触媒特性に関し、最適化され、
そして、そのプロセスは酵素若しくは蛋白質を最適化するための定方向進化の方法を使用して、
金属含有若しくは金属を含有しない開始触媒を酵素又は蛋白質に結合し、若しくは触媒を酵素若しくは蛋白質で修飾し、
更に、触媒特性に関して適切なスクリーニングシステムで得られた触媒ライブラリーをスクリーニングする、ことからなるプロセス。
【請求項２】
請求項１記載のプロセスであって、野生種の酵素若しくは蛋白質をコード化する遺伝子から進行するプロセスであって、下記の工程を備える。
（１）突然変異した遺伝子のライブラリーが突然変異生成によって生成し、これから
（２）酵素若しくは蛋白質のライブラリーが発現系（expression system）によって生成し、
（３）前記触媒のライブラリーが、酵素若しくは蛋白質を金属含有若しくは金属を含有しない合成開始触媒に化学的に結合することにより生成し、
（４）所望の触媒特性に関して適切な触媒を選択するために用いられるスクリーニングシステムを利用し、及び任意に、
（５）段階（１）から（４）若しくは（１）から（５）が、先行する段階（４）において選択された酵素若しくは蛋白質に対応する突然変異した遺伝子から出発するプロセスを、再び進行する。
【請求項３】
請求項２記載のプロセスであって、段階（１−５）で述べたサイクルが、触媒特性の所望の最適化が達成されるのに必要な回数繰り返されるプロセス。
【請求項４】
請求項１から３の１以上に記載されたプロセスであって、酵素突然変異体若しくは蛋白質突然変異体が、変異性のポリメラーゼ連鎖反応（ｅｐＰＣＲ）、飽和突然変異生成、カセット突然変異生成、若しくは部位特異的突然変異生成によって生成し、若しくは組み替え方法によって、若しくはこれらの方法の結合によって生成するプロセス。
【請求項５】
請求項４記載のプロセスであって、ＤＮＡシャッフリング若しくは複数のカセット突然変異生成を組み合わせたもの（ＣＭＣＭ）が、酵素突然変異体若しくは蛋白質突然変異体の生成のための組み替え方法として使用されるプロセス。
【請求項６】
請求項１から３の１以上に記載されたプロセスであって、合成金属含有開始触媒を酵素若しくは蛋白質突然変異体で化学修飾し、及び／又は触媒を酵素若しくは蛋白質突然変異体に結合させる方法が、金属と直接共有結合を生成することにより、配位により、又は金属含有若しくは金属を含有しない開始触媒と共有結合を生成し、その後金属を配位させることによって、若しくは金属含有リガンドシステムとの共有結合によって達成されるプロセス。
【請求項７】
請求項１から６の１以上に記載されたプロセスであって、合成の金属を含有しない開始触媒を酵素若しくは蛋白質突然変異体で化学修飾し、及び／又は前記触媒を酵素若しくは蛋白質突然変異体と結合し、共有結合生成の手段によって達成するプロセス。
【請求項８】
請求項７記載のプロセスであって、共有結合が、酵素突然変異体若しくは蛋白質突然変異体中のアミノ酸側鎖の官能基の場所で生じるプロセス。
【請求項９】
請求項８記載のプロセスであって、アミノ酸が、システイン、シスチン、リジン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン若しくはアスパラテートであるプロセス。
【請求項１０】
請求項９記載のプロセスであって、システインが、合成リガンド若しくは合成の金属含有若しくは金属を含有しない触媒とともに求核置換若しくはＭｉｃｈａｅｌ付加のいずれかに入り、適切に化学修飾された酵素若しくは蛋白質突然変異体を生じるプロセス。
【請求項１１】
請求項１−３の１以上に記載されたプロセスであって、高い生産性のあるスクリーニングシステムが用いられるプロセス。
【請求項１２】
請求項１１に記載されたプロセスであって、高い生産性のあるスクリーニングシステムは、活性、化学選択性、位置選択性若しくは立体選択性、若しくはこれら触媒活性の全て若しくはいくつかを決定するプロセス。
【請求項１３】
請求項１−１２のいずれかのプロセスにより、合成金属含有触媒若しくは金属を含有しない触媒的活性中心を、化学的に、酵素若しくは蛋白質突然変異体に結合することによって得られる触媒。
【請求項１４】
金属含有若しくは金属を含有しない触媒に結合するのに適した、最適化された酵素若しくは蛋白質の識別のための定方向進化方法の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、触媒を突然変異した酵素又は蛋白質に結合する手段により、金属含有及び金属を含有しない触媒の特性を、最適化するための定方向進化方法を使用することに関する。本発明は、さらにそのようにして得られることが可能な触媒にも関する。
【背景技術】
【０００２】
工業の実務における均一触媒の重要性は、着実に増加している。なぜなら、ひとたび開発されれば、効果的な触媒は、環境的及び経済的に魅力のある工業的な化学変換を達成することを可能にするからである。最も重要な均一触媒は、遷移金属錯体を含む。この関連に用いられるリガンドには二つの機能が想定される。すなわち、金属を安定させる機能と、触媒による変換の化学選択性、位置選択性及び立体選択性を規制する機能である。最も一般的なリガンドのタイプは、金属錯体のためのドナー原子、例えば窒素、酸素、硫黄、リン等を１以上を含む化合物を含む。
【０００３】
遷移金属触媒プロセスはより多く実施され、水中又は二相系（例えば有機溶媒／水）で行われるので、工業的に魅力的である。水溶性リガンドはこの目的に必要である。ところが、現在知られているリガンドによって、金属の安定させることは、一般的に十分であるとされるが、均一遷移金属触媒の最近１０年の研究は、適切なリガンドを調整することにより、いかに工業的に興味深い選択性や活性が達成されるかという論題に関するものであった（均一触媒の有機金属化合物への適用（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）、B．Ｃｏｒｎｉｌｓ，Ｗ．Ａ．Ｈｅｒｍａｎｎ編，１巻，２巻，VCH，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  １９９６；水相有機金属触媒，考え方と応用（Ａｑｕｅｏｕｓ−Ｐｈａｓｅ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ），B.Ｃｏｒｎｉｌｓ，Ｗ．Ａ．Ｈｅｒｍａｎｎ編，VCH，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９９８；非対称触媒総覧（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ），I―III巻，E．N．Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ａ．Ｐｆａｌｔｚ，Ｈ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，ベルリン，１９９９）。
【０００４】
こうして、非対称触媒変換のための効果的なキラルリガンドの開発は、例えば特に難しい挑戦とされる。例えばアリルアルコールのシャープレス（Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ）非対称エポキシ化、同じ研究者のオレフィンの二水酸基化、野依のオレフィンとケトンの水素化、Ｊａｃｏｂｓｅｎのシスオレフィンのエポキシ化等の重要な進歩があった。一方で、これらのプロセスは、その他全てのように、決して一般に適用されていない。つまり、特定の工業的規模の変換Ａ→Ｂのために、この反応を高い活性と立体選択性で触媒として機能するキラル触媒で入手可能なものは、恐らく一つもないであろう。
【０００５】
金属触媒はさておき、合成有機化学においては、予備的に重要な金属を含有しない触媒系が存在する（Ｆ．Ａ． Ｃａｒｅｙ，Ｒ．Ｊ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，有機化学，Ｈ．Ｊ．Ｓｃｈａeｆｅｒ，Ｄ．Ｈｏｐｐｅ，Ｇ．Ｅｒｋｅｒ編，ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９９５）。例えば、塩基又は酸、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ２類似物（ＮＡＤ＝ニコチン酸アデニンジヌクレオチド）及びチアゾリウム塩、及び相間移動触媒も挙げられる。この場合も、立体関連の変換の場合にキラル種が生じる。
【０００６】
顕著な例は、Ｓｔｅｇｌｉｃｈに基づく、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン触媒によるアルコールのアシル化である（Ｇ．Ｈｏeｆｌｅ，Ｗ．Ｓｔｅｇｌｉｃｈ，Ｈ．Ｖｏｒｂｒｕeｇｇｅｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９７８，９０，６０２）。キラル修飾されたピリジン及びホスフィンキラルアルコールのエナンチオ選択性アシル化を触媒することを、ＦｕとＶｅｄｅｊｓが実証した（Ｊ．Ｃ．Ｒｕｂｌｅ，Ｊ．Ｔｗｅｄｄｅｌ，Ｇ．Ｃ．Ｆｕ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６３，２７９４；Ｅ．Ｖｅｄｅｊｓ，Ｏ．Ｄａｕｇｕｌｉｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，５８１３）。
【０００７】
しかし、これらと他の金属を含有しない触媒系もまた制限を受ける。つまり、この場合もまた、特定の工業的規模の反応Ａ→Ｂが決して十分に高いエナンチオ選択性で進まない可能性がある。化学選択性及び位置選択性、及びオレフィン合成のＺ／Ｅ選択性についても、同じ制限が適用される。
【０００８】
特殊な酵素における生体触媒は、代替物を提供する（Ａ．Ｌｉｅｓｅ，Ｋ．Ｓｅｅｂａｃｈ，Ｃ．Ｗａｎｄｒｅｙ，工業的生体形質変換（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ），ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２０００）。自然界に存在している比較的多くの数の酵素（野生種酵素）が工業的規模の変換を触媒することがわかった。酵素触媒の大量化学の工場製品の最適な例は、Ｎｉｔｔｏ法に従って、ニトリル加水分解酵素が触媒するアクリロニトリルの加水分解で、アクリルアミドを生成するものである。酵素もまた、特に、精密な化学製品の分野で、化学選択的、位置選択的、エナンチオ選択的触媒である。
【０００９】
上記合成金属触媒及び金属を含有しない触媒に適用される制限は、この現存する事例にも当然適用される。すなわち確実性はないが、特定の工業的に関連する変換Ａ‘→Ｂ’の場合に、酵素触媒が高い選択性を示すことが当然に予想される。この性質の問題は、定方向進化といわれる新しい方法を用いて解決され、酵素の工業的適用の新しい見通しが、最近明らかになったのである（Ｆ．Ｈ．Ａｒｎｏｌｄ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９８，３１，１２５；Ｍ．Ｔ．Ｒｅｅｔｚ，Ｋ．−Ｅ．Ｊａｅｇｅｒ，Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．１９９９，２００，３１）。
【００１０】
出発点は変換Ａ‘→Ｂ’であり，それは自然界に存在する酵素（野生種酵素）が触媒するが、活性及び／又は選択性は大変低い。酵素をコード化する対応する遺伝子（ＤＮＡ断片）は突然変異生成を受け、それは突然変異遺伝子ライブラリーを生成する。その後、突然変異した遺伝子を適したバクテリアの中に挿入し、コード化された酵素を生成する（発現法）。これは処理したバクテリアを寒天プレートの上にプレートアウトすることによってなされ、バクテリアコロニーが形成され、おのおの集められ、マイクロタイタープレートの底部に加えられ、栄養溶液を与えられる。
【００１１】
それぞれのコロニーは単細胞に由来し、それゆえ単一の変異酵素を生じる。こうして何千もの異なって変異した酵素が生成し、その中で蛋白質鎖の１以上のアミノ酸がランダムに置き換わっている。適したスクリーニングシステムは、酵素突然変異体を試験するのに用いられ、特定の反応Ａ‘→Ｂ’におけるその触媒特性から、文献でよく変種と言われる（活性、化学選択性、位置選択性及び立体選択性）（図１参照）。
【００１２】
最もよい突然変異体（若しくはよりよい突然変異体の１つ）は、突然変異体の最初の生成に識別され、対応する変異した遺伝子がもう一度突然変異生成を受け、進化圧力の発展という結果になる。貧弱な酵素突然変異体、若しくはあまり活性でない若しくは選択的でないものは、除かれる。変換Ａ‘→Ｂ’における酵素の目的とする触媒特性に進化するまで、突然変異生成／スクリーニング（選別）を何回か繰り返す。こうして活性度、基質の受容及び立体選択性を最適化することが可能である。
【００１３】
そのようなダーウィニスティック（Ｄａｒｗｉｎｉｓｔｉｃ）概念の非常な利点の一つは、選択的にアミノ酸を置換するために、部位特異的突然変異を使用することとは対象的に、理論的な予測は、正確とは言えないが、このタイプの場合の酵素の最適化に不必要である。進化圧力のみが、確実に、必然的に最適化をもたらす（図２参照）。エナンチオ選択的酵素の定方向進化は、特に興味深い。（Ｍ．Ｔ．Ｒｅｅｔｚ，Ｋ．−Ｅ．Ｊａｅｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．−Ｅｕｒ．Ｊ．２０００，６，４０７）
【００１４】
突然変異生成法は、変異性のポリメラーゼ連鎖反応（epPCR）、飽和突然変異生成、カセット突然変異生成、適当であれば、部位特異的突然変異生成、及びDNA移し替えのような組み替え法、複数のカセット突然変異生成の組み合わせ（CMCM）及び段階法（F．H．Ａｒｎｏｌｄ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９８，３１，１２５；Ｍ．Ｔ．Ｒｅｅｔｚ，Ｋ．−Ｅ．Ｊａｅｇｅｒ，Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．１９９９，２００，３１）を含む。異なった方法の組み合わせは、触媒の特性に関して、蛋白質列の拡張のスクリーニングに多くの場合、都合がよい。
【００１５】
例えばエナンチオ選択性の分野においても（Ｍ．Ｔ．Ｒｅｅｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００１，１１３，２９２）高い生産性のあるスクリーニングシステムの早い発展は（Ｂ．Ｊａｎｄｅｌｅｉｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９９９，１１１，２６４８）、この方法の使用において、重要な役割を果たす。酵素の定方向進化の方法は、そういった確実な手段を構成するにもかかわらず、全体としてこの方法は、一つの重大な不都合がある。即ち、この変換は酵素に触媒された反応に限定されることである。
【００１６】
均一遷移金属触媒の分野と、他方合成有機化学における金属を含有しない触媒の分野を特徴づける広範囲の工業的に興味深い反応分野は、酵素触媒の分野には見つからず、それゆえこの分野は除外される。従って、例えば、ロジウム触媒、ルテニウム触媒又はイリジウム触媒によるオレフィンの水素化、オレフィンのロジウム触媒ヒドロホルミル化、パラジウム触媒炭素―炭素結合生成、オレフィンのニッケル触媒ヒドロシアン化、ルテニウム触媒オレフィン転移、パラジウム触媒オレフィンのチーグラー―ナッタ（Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｎａｔｔａ）重合といった重要な工業プロセスには、ほんの数例であるが、酵素による触媒反応は存在しない。それゆえ、定方向進化は、これらの触媒プロセスの最適化に使用することはできないのである。
【００１７】
【非特許文献１】
均一触媒の有機金属化合物への適用（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ），B．Ｃｏｒｎｉｌｓ，Ｗ．Ａ．Ｈｅｒｍａｎｎ編，１巻，２巻，VCH，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ  １９９６
【非特許文献２】
水相有機金属触媒，考え方と応用（Ａｑｕｅｏｕｓ−Ｐｈａｓｅ  Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ），B.Ｃｏｒｎｉｌｓ，Ｗ．Ａ．Ｈｅｒｍａｎｎ編，VCH，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９９８
【非特許文献３】
非対称触媒総覧（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ），I―III巻，E．N．Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ａ．Ｐｆａｌｔｚ，Ｈ．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ編，ベルリン，１９９９
【非特許文献４】
Ｆ．Ａ．Ｃａｒｅｙ，Ｒ．Ｊ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，有機化学，Ｈ．Ｊ．Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｄ．Ｈｏｐｐｅ，Ｇ．Ｅｒｋｅｒ編，ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，１９９５
【非特許文献５】
Ｇ．Ｈｏｆｌｅ，Ｗ．Ｓｔｅｇｌｉｃｈ，Ｈ．Ｖｏｒｂｒｕｇｇｅｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９７８，９０，６０２
【非特許文献６】
Ｊ．Ｃ．Ｒｕｂｌｅ，Ｊ．Ｔｗｅｄｄｅｌ，Ｇ．Ｃ．Ｆｕ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９８，６３，２７９４
【非特許文献７】
Ｅ．Ｖｅｄｅｊｓ，Ｏ．Ｄａｕｇｕｌｉｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９９，１２１，５８１３
【非特許文献８】
Ａ．Ｌｉｅｓｅ，Ｋ．Ｓｅｅｂａｃｈ，Ｃ．Ｗａｎｄｒｅｙ，工業的生体形質変換（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ），ＷＩＬＥＹ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２０００
【非特許文献９】
Ｆ．Ｈ．Ａｒｎｏｌｄ，Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９８，３１，１２５
【非特許文献１０】
Ｍ．Ｔ．Ｒｅｅｔｚ，Ｋ．−Ｅ．Ｊａｅｇｅｒ，Ｔｏｐ．Ｃｕｒｒ．Ｃｈｅｍ．１９９９，２００，３１
【非特許文献１１】
Ｍ．Ｔ．Ｒｅｅｔｚ，Ｋ．−Ｅ．Ｊａｅｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．−Ｅｕｒ．Ｊ．２０００，６，４０７
【非特許文献１２】
Ｍ．Ｔ．Ｒｅｅｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００１，１１３，２９２
【非特許文献１３】
Ｂ．Ｊａｎｄｅｌｅｉｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９９９，１１１，２６４８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明はこの問題の解決を目的とする。本発明は，熟練した化学者が合成金属触媒及び／又は金属を含有しない触媒の触媒特性の、信頼性のある最適化に使用することができる全く新規な手段を提供する。それに加えて、酵素突然変異体若しくは蛋白質突然変異体から生成し、金属含有又は金属を含有しない合成触媒である触媒は、新規な触媒分野を構成する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
それゆえ、本発明は、下記のプロセスに関する。
・  合成金属含有若しくは金属を含有しない触媒であって、酵素若しくは蛋白質に結合し、１以上の所望の触媒特性に関して最適化された触媒の生成のためのプロセスである。更に、そのプロセスは、酵素又は蛋白質を最適化する定方向進化（directed evolution）の一般的方法を含み、金属含有若しくは金属を含有しない開始触媒を酵素若しくは蛋白質に結合し、若しくは触媒を酵素若しくは蛋白質で化学修飾し、触媒特性に関して適したスクリーニングシステムで生じた触媒ライブラリーのスクリーニングをするプロセスである。
【００２０】
・  （１）のプロセスに従って、合成金属含有触媒若しくは金属を含有しない触媒活性中心を化学的に酵素突然変異体若しくは蛋白質突然変異体に結合させることにより得られる触媒に関する。
・  金属含有若しくは金属を含有しない触媒に結合するのに適した最適化された酵素又は蛋白質を識別するための定方向進化の方法の使用方法に関する。
【００２１】
本発明は以下に図の助けを借りてさらに詳しく説明する。
【００２２】
本発明の基本は、それには酵素の定方向進化のアイデアに基づき、遺伝子情報の変化が、合成金属触媒若しくは合成金属を含有しない触媒の最適化に関して用いることができるとの発想に基づくものである。
【００２３】
本発明の態様（１）は、従って、１以上の所望の触媒特性に関する最適化された触媒の〔くぼみ（lacuna）〕プロセスに関し、それは酵素若しくは蛋白質を用い、また定方向進化の方法及び酵素若しくは蛋白質のライブラリーから好適な酵素若しくは蛋白質をそれぞれ選択するのに用いられるスクリーニングシステムを用いる方法である。
【００２４】
本発明の態様（１）において、「酵素若しくは蛋白質の定方向進化の方法」とは、野生種酵素若しくは蛋白質をコード化した遺伝子が、突然変異生成を受けることをいう。各々の突然変異した遺伝子の遺伝子情報の流れは、ＲＮＡへの転写及び酵素若しくは蛋白質への翻訳の間に形成される非常に多くの数の突然変異した酵素（若しくは蛋白質）又はその変種が、発現系（expression system）中にもたらされる。本発明の意味において酵素（若しくは蛋白質）「突然変異体」若しくは「変種」は、開始酵素若しくは開始蛋白質と異なっており、最初にそのアミノ酸配列によって開始酵素若しくは開始蛋白質からの少なくとも一アミノ酸残基によって異なっている。これに加え、変異体若しくは変種は、他の化学修飾を示す（変異体のアルキル化若しくはアシル化）。
【００２５】
これらの酵素変異体は通常、高い生産性のあるスクリーニングシステムの中で、通常、酵素活性と選択性を試される、それは、本発明において、最初に生じるものは化学過程であり、突然変異体酵素若しくは蛋白質に結合している合成金属含有若しくは金属を含有しない開始触媒（「金属含有若しくは金属を含有しない中心」ともいう）ことを含む。これはそれゆえ、本発明において、実際の「合成金属含有若しくは金属を含有しない触媒」を生成する（「混成触媒」ともいい、対応する開始触媒と異なり、１以上の酵素若しくは蛋白質に結合している）。
【００２６】
もし、例えば、特定のリガンドを、特定した金属とともに、変異した酵素（若しくは蛋白質）に共有結合させて取り入れると、全てが同じ触媒活性中心を含む一方、触媒全体の酵素若しくは蛋白質部位中に異なったアミノ酸配列を有する多くの新しい触媒を生成する結果になる。
【００２７】
そういった触媒ライブラリーを構成する触媒は、それゆえ異なった触媒特性を有する。その中に人工的な触媒活性金属中心、若しくは金属を含有しない触媒中心を化学的に移植した蛋白質（若しくは「前」酵素）は、分子ホストとしての役割を果たす。研究されている実際の変換は、移植された金属を含有しない触媒又は導入された金属の場所において進行する。酵素のアミノ酸若しくは蛋白質の骨格は立体的、静電気的及び化学的に（例えば水素結合によって）、反応基質ばかりでなく、リガンドシステム及び金属（若しくは金属を含有しない触媒中心）に影響するので、酵素又は蛋白質骨格は、触媒全体の活性度や選択性を規制する要素として作用する。また、更に触媒的に活性な金属を付加的に安定化させるためにも作用する。
【００２８】
本発明の態様（１）において、「スクリーニング」とは結果的に、少なくても１つの望ましい（すなわち最適化された）触媒特性のために、異なった酵素若しくは蛋白質変異体に結合している触媒のライブラリーをスキャンすることをいう。
【００２９】
最初の突然変異生成サイクルと、これに続いて合成リガンド／金属中心若しくは触媒的に活性な金属を含有しない中心を化学的挿入することで、多くの数の新しい触媒が形成される。そしてこれらの新しい触媒は、特定の反応Ａ→Ｂに非常に適した１個の触媒（１個以上）を含む。考えられる場合として、もし最良の触媒の場合でさえ、活性度と選択性の条件を満たさない場合、対応する突然変異酵素（若しくは蛋白質）をコード化する突然変異した遺伝子は、再度突然変異生成を受ける。
【００３０】
突然変異酵素（又は蛋白質）の新しい生成が発現された後、同じ人工的な触媒的活性中心がもう一度全ての酵素（又は蛋白質）の突然変異体に化学的に導入され、触媒の第二世代を生成することになる。もし、これらの変種や突然変異体が変換Ａ→Ｂにおいてもう一度触媒としてスクリーンされると、進化圧力を生じる。突然変異生成／化学修飾／スクリーニングのサイクルを繰り返すことで、必然的に金属触媒や金属を含有しない触媒が特定の変換Ａ→Ｂのために最適化される（図４）。
【００３１】
突然変異生成の全体の範囲にわたって、頼りと手法を利用することができる。例えば、epPCR、飽和突然変異体生成、カセット突然変異体生成、部位特異的突然変異体生成、ＤＮＡシャッフリングのような組み替え方法、又は通常、酵素の定方向進化と関連づけて用いられる他の突然変異体生成方法が挙げられる。
【００３２】
関連したケースと同様に、どんなスクリーニング方法も適用できる（Ｂ．Ｊａｎｄｅｌｅｉｔ，  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９９９，１１１，２６４８）。例えば、関連したケースと同様にエナンチオ選択性のための高い生産性のある検定法が利用できる（Ｍ．Ｔ．Ｒｅｅｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００１，１１３，２９２）。触媒の活性の最適化に加え、この方法は、例えば化学選択性、位置選択性及び立体選択性を最適化するのにも使用されることができる。立体選択性の場合は、考慮されるのは、主にエナンチオ選択性とジアステレオ選択性（オレフィン合成の場合のＺ／Ｅ選択性を含む）である。
【００３３】
従って、このプロセスは、最適化された触媒の生成プロセスであり、生成プロセスにおいて、望ましい触媒特性又はさまざまな特性に関し、最適化される生成プロセスである。それは、合成金属含有触媒及び／又は金属を含有しない触媒が化学的に分子生物学により生じた酵素若しくは蛋白質突然変異体に結合し、生じた触媒が分子生物学の方法若しくは酵素の定方向進化を用いた最適化プロセスを受けることを伴う。
【００３４】
酵素若しくは蛋白質の選択は、事実上任意である；原則として、たとえ蛋白質自身が触媒特性を全く有していなくても、どんな酵素も蛋白質も合成すなわち人工的な触媒のホストとして作用する。しかしながら、本発明においては、好ましく順守されるべき、実際的なガイドラインがある。酵素（若しくは蛋白質）に機能的な発現法システムが好ましく利用できる。なぜなら、さもなければ、遺伝子に突然変異を起こさせることが可能であるにもかかわらず、突然変異酵素（若しくは蛋白質）を生成するのは不可能であるからである。さらに、酵素（若しくは蛋白質）は、好ましくは十分に高い熱的及び化学的安定を有するべきである。
【００３５】
多くのケースにおいて、十分に大きい酵素（若しくは蛋白質）ポケットがあり、その中に人工的な活性中心が、存在することができる若しくは化学的に結合することができる酵素（若しくは蛋白質）を選択するのが有用である。こうして酵素（若しくは蛋白質）骨格と変換により含まれる人工的な活性中心及び／又は基質との相互作用を最大にする。しかしながら、例えば、酵素（若しくは蛋白質）の表面上で、合成触媒に化学的に結合させるために、酵素の他の部位を選択することも可能である。なぜなら、進化プロセスの間、酵素（若しくは蛋白質）の折り畳みは極めて変化するので、結果的に触媒全体の触媒特性に非常な影響を及ぼす。
【００３６】
本発明の進行の間に、好ましくは、ただ一つの合成の触媒的な活性中心を酵素（若しくは蛋白質）に導入する。この導入はイオン結合によって、しかし好ましくは共有結合によって行われる。このために、酵素（若しくは蛋白質）の反応部位は、常にではないが、酵素の触媒活性中心であってもよく、望ましいリガンドシステム若しくは触媒活性中心を含む好適な反応物質と反応して、安定な共有結合を生成する。酵素の活性部位と反応性有機化合物間の共有結合の生成は、原則として知られている。こうして、半合成酵素が生成する、例えば、置換反応やＭｉｃｈａｅｌ付加を利用して、酵素中のシスティンチオール基において無関係の補助因子を取り込むことが挙げられる。（Ｅ．Ｔ．Ｋａｉｓｅｒ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９９８，１００，９４５）。
【００３７】
本発明において、酵素（若しくは蛋白質）中のシステイン単位は、化学的に同様な方法で使用されることができる。もし酵素（若しくは蛋白質）がシステインを全く含まなければ、部位特異的突然変異生成を使用して、酵素（若しくは蛋白質）の任意の位置にアミノ酸を挿入することができる。もし酵素（若しくは蛋白質）がアミノ酸鎖に１以上のシステインを含むとき、適当であれば、部位特異的突然変異生成を使用して、最初に望ましくないシステイン単位を他の天然のアミノ酸で置き換えることができる。
【００３８】
いずれの経路を選択しても（ただ一つのシステインを含む酵素又は蛋白質を使用する選択をするとき）、本発明のプロセスは、システインが反応部位であり、金属を含む触媒中心が使用されるとき、概要的に二配位リガンドシステムとして記述することができる。そして、突然変異体ａから進行し、変異体はそれぞれチオール基を含んでおり、ドナー部位Ｄを有する化学的に修飾された酵素（若しくは蛋白質）の突然変異体ｂを経由して、金属Ｍを含む金属複合体ｃになる（図５参照）。
【００３９】
本発明に従ったプロセスは、この例を使用して説明されるであろう。野生種の酵素（若しくは蛋白質）の前記遺伝子は、例えば、ただ一つのシステイン単位しか含まないものが、突然変異を受け、突然変異遺伝子のライブラリー（特別な場合ただ一つの遺伝子が、部位特異的突然変異生成によって突然変異を受ける）が好適な発現法システムで発現され、突然変異を受けた酵素（若しくは蛋白質）が化学的に修飾され、更に、金属を与えられ、適切なスクリーニングを使用して変換A→Bにおいて触媒として試される。
【００４０】
酵素（若しくは蛋白質）の基礎をなす遺伝子を使用して、それぞれの場合に最もよいものが望みの触媒特性が進化するまで、突然変異のサイクルを繰り返す。全ての段階は、商業的に入手可能なロボットステーションを用いて、マイクロタイタープレートの上で小さいスケールで行われる。手順は金属を含有しない触媒の場合に類似している。
【００４１】
酵素（若しくは蛋白質）を選択する際の多くの可能性のうち、一つの例は、周知であり、商業的に得られるパパイン（ＥＣ番号４．３．２２．２）である。；パパインは化学的に安定であり（水溶液は９０℃でも安定である）、一つのシステイン単位を含み、このシステインは異なったリガンドを受け入れるのに十分大きい空間的に相対的に広い酵素ポケット中に存在する。
【００４２】
しかしながら、パパインは説明のために使用され、本発明に従った手段を限定するものでない。他の酵素は、例えば好熱性の酵素と呼ばれるものも、触媒特性をもたない蛋白質も、金属含有若しくは金属を含有しない触媒中心のための分子ホスト（「ハウジング」）として使用されることができる。
【００４３】
本発明は、金属を含む触媒的に活性な中心を使用することに限定するものでない；金属を含有しない触媒を盛り込むこともできる（金属複合体なしで済ませる結果となる）。塩基性触媒のための塩基性の中心（例えばピリジン、ホスフィン、第四級アミン）及び酸触媒のための酸性の中心（例えばスルホン酸）、アシロイン反応を触媒するためのチアゾリウムカチオン、酸化反応を触媒するためのフラビン単位、触媒レドックス過程のためのＮＡＤ／ＮＡＤＨ中心、が例として挙げられるが、これらは一例にすぎない。
【００４４】
チオール基をリガンド搭載（若しくは触媒搭載）の有機分子に結合させる二つの重要な経路は、置換反応（アルキル化）ａ）及びＭｉｃｈａｅｌ付加ｂ）を利用する。ここでＸはハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ若しくはI）若しくはトシル単位（ＯＴｓ）及びＡは活性化された官能基である（例えばカルボニル基）。
【００４５】
（式１）
2004533254.tif 000002
【００４６】
これらは、それ故、有機合成化学において一般的な反応のタイプである。ａ）の場合、ＳＮ２活性アルキルハライド（又はトシレート）を使用する。望ましくはスペーサが反応性ＸＣＨ２基とリガンドの間に存在する。他のタイプの反応を使用して触媒的活性中心若しくはリガンドを導入することもできる。例えば、芳香環上の慣習的な付加／脱離反応が挙げられる。
【００４７】
本発明に従って、金属含有触媒の場合に非常に幅広い種類のリガンドが適している、そしてこれらのリガンドを金属と錯体化し、又、安定化させたりする。有機金属化学、特に金属触媒の分野の熟練者であれば、中性及びアニオンのリガンドのいずれも使用されるのを知っている（Ｊ．Ｐ．Ｃｏｌｌｍａｎ，Ｌ．Ｓ．Ｈｅｇｅｄｕｓ，Ｊ．Ｒ．Ｎｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｇ．Ｆｉｎｋｅ，有機遷移金属化学の基礎と応用（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｏｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，Ｍｉｌｌ  Ｖａｌｌｅｙ，１９８７）。
【００４８】
アニオンリガンドは、例えばカルボキシレートアニオン、チオレート、アミド、セミコリン、ホスホネート及びシクロペンタジエニルアニオンを含む。最も重要な中性のリガンドは、ホスフィン、ホスファイト、ホスホナイト及びホスフィナイトといったリン含有の化合物、ニトリル、ピリジン、アミン、ケチミン及びオキサゾリンといった窒素含有化合物、及びドナー原子として酸素若しくは硫黄を含むもの（例えばエーテル、エステル及びチオエーテル）である。
【００４９】
最も良く知られているものは、一つのドナー部位を有する一配座のリガンド、二つ以上のドナー原子を有する二配座若しくは多配座のリガンドである。こうして、ジホスフィン、ジピリジン、ジオキサゾリン、ジケチミン及びジアミンが最もよく用いられている二配座のリガンドの例である。これに加え、多くの混合した二配座のリガンドであって、二つの異なったドナー部位を有するものが知られている。多くの場合において、例えば鉄―硫黄若しくはマンガン―硫黄クラスターの場合のように、いくつかの金属がリガンド／金属システムに存在する。これら後者も、本発明に従って使用される。
【００５０】
こうして、どんなリガンドのタイプでも、これらのリガンドを、チオール基の場所で、機能的なシステイン含有酵素（若しくは蛋白質）を、例えば、ハロゲン化アルキル単位若しくはＭｉｃｈａｅｌ受容体といった反応基に結合して、それらは結合反応が生じることを可能にする。同様のことが、金属を含有しない触媒を導入することにも適用される。どの場合においても、アキラルリガンドの導入に選択がなされる。しかしながら、所望の場合には、キラル類似物が導入される。置換反応の間、システイン含有酵素（若しくは蛋白質）のチオール基と反応する化合物１―３を、説明のために挙げる。
【００５１】
【化１】
2004533254.tif 000003
【００５２】
これら若しくは、関連のアルキル化剤と反応したシステイン含有酵素（若しくは蛋白質）の突然変異体は、例えばアルコールアシル化反応若しくはＭｉｃｈａｅｌ付加のための金属を含有しない触媒であろう。なぜなら、ピリジン、ホスフィン及びアミンは、そういった反応における周知の求核試薬だからである（上記参照）。酵素（若しくは蛋白質）の突然変異体が化学的に修飾された後に、金属がピリジン、ホスフィン若しくはオキサゾリン中心において適切に錯体を形成し、こうして多くの反応を触媒する金属触媒を生成することもまた可能である。アシロイン反応若しくは酸化及び還元は、合成的に組み込んだチアゾリウム基、フラビン基若しくはＮＡＤ／ＮＡＤＨ２単位を有する酵素（若しくは蛋白質）によって触媒されることができる。これらの例は説明の目的のためだけであり、本発明に従う手段を限定するものではない。
【００５３】
化合物４−８は、単純なＳＮ２反応で、システイン含有酵素（若しくは蛋白質）突然変異体に、共有結合することができる化合物であり、二配座リガンドを説明する目的で参照する。この場合も、金属を含有しない及び金属含有触媒が適切な方法で得られる。
【００５４】
【化２】
2004533254.tif 000004
【００５５】
これら及びその他のリガンドのタイプもまた、他の合成方法を用いてシステイン含有酵素（若しくは蛋白質）突然変異体の中へ挿入できる、例えばＭｉｃｈａｅｌ付加のプロセスが挙げられる。これは対応する、反応性のＭｉｃｈａｅｌ受容体を必要とし、それらの部分を、合成の慣用方法を用いて得ることができる。化合物９−１４は、チオール基と直接Ｍｉｃｈａｅｌ付加に入るが、説明の目的で参照する。
【００５６】
【化３】
2004533254.tif 000005
【００５７】
化合物１−１４は、ただ説明の目的のために利用し、決して発明に従った可能性を限定するものではない。こうして、リガンド／金属錯体全体を直接酵素（若しくは蛋白質）突然変異体に一段階で導入することができ、例えば鉄錯体のシステイン含有酵素若しくは蛋白質への共有結合の場合が挙げられる。これは周知の反応のタイプである。（Ｊ．Ｍ．Ｍａｚｚａｒｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｍｉｓｔｒｙ  １９９３，３２，２７７９）．
【００５８】
【化４】
2004533254.tif 000006
【００５９】
この場合もまた、例は単に説明としてであり、決して発明の可能性を限定するものではない。
【００６０】
システインも、側鎖に反応性官能基を有する唯一のアミノ酸ではない。リジン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン及びアスパラテートは触媒的に活性な中心を酵素に挿入するのにさらなる機会を提供する。システインも同様である。
【００６１】
当業者は、これらアミノ酸の反応性側鎖それぞれを、リガンド若しくは触媒的に活性な中心に結合させるための多くの可能性に精通している。こうしてリジン側鎖中の第一級アミノ基は、例えば、下記の通り使用される。第一級アミノ基のホスフィノメチレーションを周知の反応として行う（Ｍ．Ｔ．Ｒｅｅｔｚ，Ｇ．Ｌｏｈｍｅｒ，Ｒ．Ｓｃｈｗｉｃｋａｒｄｉ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１９９７，１０９，１５５９）
【００６２】
【化５】
2004533254.tif 000007
【００６３】
リガンドを挿入することなく、突然変異酵素若しくは蛋白質中のアミノ酸の側鎖中の官能基を使用することは可能である。例えばシステイン、アスパラギン、グルタミン、アスパラテートが挙げられ、好ましくはアニオンリガンドとして作用する（例えばロジウムや鉄と組み合わせる）アミノ酸側鎖の官能基を用いて、金属配位の目的に直接用いられる。
【００６４】
ピリジン、アミン、ホスフィン、アミノアルコールといった基本的な官能基が、金属を含有しないシステムの場合に考慮される。なぜなら、周知のようにこれらの基は、アルコールのアシル化、Ｍｉｃｈａｅｌ付加、アルデヒドのシアノヒドリン形成反応、Ｂａｙｌｉｓ−Ｈｉｌｌｍａｎ反応といった反応を触媒するからである。しかし、酸もまた金属を含有しない触媒として知られる；酸はそれゆえそういった官能基を酵素（若しくは蛋白質）の突然変異体に選択的に挿入するのに役立つ、例えば、スルホン酸基の形式又はホスホン酸基の形式、例えば：
【００６５】
【化６】
2004533254.tif 000008
【００６６】
重要な、金属を含有しないシステムもまたチアゾリウムカチオン、フラビン単位及び／又はＮＡＤ／ＮＡＤＨ２単位、及び関連のレドックスシステムの挿入を含む、なぜなら、それは酸化プロセス及び還元プロセスと同じくアシロイン反応を触媒することができるからである。
【００６７】
金属含有システムに関する限り、特に遷移金属のＩＩＩｂ族、ＩＶｂ族、Ｖｂ族、ＶＩｂ族、ＶＩＩｂ族、ＶＩＩＩ族，Ｉｂ族及びＩＩｂ族が適する、ホウ素、アルミニウム、インジウム及びスズ、ランタニド、セリウム若しくはガドリニウム、及びトリウムといったアクチニドが挙げられる。
【００６８】
本発明は金属を含有しない及び金属含有触媒プロセスに関するものであり、非常に多くの反応のタイプが考慮されている。これらは還元と酸化を含み、それに加え、Ｃ−Ｃ結合生成及び付加反応、異性化反応、置換反応も含む。本発明においては、最適化に用いられる触媒特性には活性、安定性、化学選択性、位置選択性、エナンチオ選択性、ジアステレオ選択性が含まれる。
【００６９】
反応は例えば、水中、有機溶媒中、二相系中（例えば有機溶媒／水、相間移動触媒としても働く最適化された触媒）、臨界ＣＯ２中、若しくはイオン化溶媒中で行われる。触媒は溶解特性により、均一若しくは不均一である。
【００７０】
発明が用いられることができる背景で最適化される触媒は、とりわけ、大量の化学品やアキラル及びキラルな精密化学品の工場での生産において、例えば製薬の分野における活性化合物、香料、植物保護成分の生産に用いることができる。それらは、染料、ミクロ電子工学の部品、ポリマーの生成にも使用される。それらは、有毒若しくは環境的に害のある化学化合物の触媒分解にも使用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】遺伝子ライブラリーの中で特定の突然変異体を識別するための概念図を示す。
【図２】開始遺伝子の特定の突然変異体を識別するために、ランダム突然変異体生成を使用するための概念図である。
【図３】遺伝子情報の流れを示す概念図である。
【図４】最適化された触媒を生成するための本発明によるプロセスの概念図である。
【図５】その中で金属含有触媒中心がリガンドに結合できる触媒のダイアグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年1月13日(2003.1.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成金属含有若しくは金属を含有しない触媒の生成プロセスであって、
その触媒は、酵素若しくは蛋白質に結合し、１以上の触媒特性に関し、最適化され、
そして、そのプロセスは、酵素若しくは蛋白質を最適化するための定方向進化の方法を使用して、
金属含有若しくは金属を含有しない開始触媒を酵素又は蛋白質に結合し、
更に、触媒特性に関して適切なスクリーニングシステムで得られた触媒ライブラリーをスクリーニングする、ことからなる野生種の酵素若しくは蛋白質をコード化する遺伝子から進行するプロセスであって、
（１）突然変異した遺伝子のライブラリーが突然変異生成によって生成し、これから
（２）酵素若しくは蛋白質のライブラリーが発現系（expression system）によって生成し、
（３）前記触媒のライブラリーが、酵素若しくは蛋白質を金属含有若しくは金属を含有しない合成開始触媒に化学的に結合することにより生成し、
（４）所望の触媒特性に関して適切な触媒を選択するために用いられるスクリーニングシステムを利用する。
【請求項２】
請求項１記載のプロセスであって、（５）段階（１）から（４）を、先行する段階（４）において選択された酵素若しくは蛋白質に対応する突然変異した遺伝子から出発するプロセスを、再び一循環するプロセス。
【請求項３】
請求項２記載のプロセスであって、段階（１−５）で述べたサイクルが、触媒特性の所望の最適化が達成されるのに必要な回数繰り返されるプロセス。
【請求項４】
請求項１から３の１以上に記載されたプロセスであって、酵素突然変異体若しくは蛋白質突然変異体が、変異性のポリメラーゼ連鎖反応（ｅｐＰＣＲ）、飽和突然変異生成、カセット突然変異生成、若しくは部位特異的突然変異生成によって生成し、若しくは組み替え方法によって、若しくはこれらの方法の結合によって生成するプロセス。
【請求項５】
請求項４記載のプロセスであって、ＤＮＡシャッフリング若しくは複数のカセット突然変異生成を組み合わせたもの（ＣＭＣＭ）が、酵素突然変異体若しくは蛋白質突然変異体の生成のための組み替え方法として使用されるプロセス。
【請求項６】
請求項１から３の１以上に記載されたプロセスであって、合成金属含有開始触媒を酵素若しくは蛋白質突然変異体で化学修飾し、及び／又は触媒を酵素若しくは蛋白質突然変異体に結合させる方法が、金属と直接共有結合を生成することにより、配位により、又は金属含有若しくは金属を含有しない開始触媒と共有結合を生成し、その後金属を配意させることによって、若しくは金属含有リガンドシステムとの共有結合によって達成されるプロセス。
【請求項７】
請求項１から６の１以上に記載されたプロセスであって、合成の金属を含有しない開始触媒を酵素若しくは蛋白質突然変異体で化学修飾し、及び／又は前記触媒を酵素若しくは蛋白質突然変異体と結合し、共有結合生成の手段によって達成するプロセス。
【請求項８】
請求項７記載のプロセスであって、共有結合が、酵素突然変異体若しくは蛋白質突然変異体中のアミノ酸側鎖の官能基の場所で生じるプロセス。
【請求項９】
請求項８記載のプロセスであって、アミノ酸が、システイン、シスチン、リジン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、グルタミン若しくはアスパラテートであるプロセス。
【請求項１０】
請求項９記載のプロセスであって、システインが、合成リガンド若しくは合成の金属含有若しくは金属を含有しない触媒とともに求核置換若しくはＭｉｃｈａｅｌ付加のいずれかに入り、適切に化学修飾された酵素若しくは蛋白質突然変異体を生じるプロセス。
【請求項１１】
請求項１−３の１以上に記載されたプロセスであって、高い生産性のあるスクリーニングシステムが用いられるプロセス。
【請求項１２】
請求項１１に記載されたプロセスであって、高い生産性のあるスクリーニングシステムは、活性、化学選択性、位置選択性若しくは立体選択性、若しくはこれら触媒活性の全て若しくはいくつかを決定するプロセス。
【請求項１３】
請求項１−１２のいずれかのプロセスにより、合成金属含有触媒若しくは金属を含有しない触媒的活性中心を、化学的に、酵素若しくは蛋白質突然変異体に結合することによって得られる触媒。
【国際調査報告】
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