(57)【要約】遺伝子産物をコードする核酸を選択する方法であって、該遺伝子産物をコードする核酸は、遺伝子自体または遺伝子産物の活性に応じて選択的かつ定量的に増幅する、上記方法を提供する。本方法は、例えば、分子ライブラリーの試験管内進化により生じる遺伝子産物を選択するために使用され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の活性を有する遺伝子産物をコードする１つ以上の遺伝子エレメントを選択する方法であって、
(i)遺伝子産物を任意にコードする核酸を含む複数の遺伝子エレメントを用意すること；
(ii)該核酸を任意に発現させて、該遺伝子産物を生成し、該核酸または遺伝子産物の所望の活性により、それらを含むかまたはコードする遺伝子エレメントを直接的または間接的に改変させること；
(iii)核酸複製系の１つ以上のモジュレーターを、遺伝子産物により改変された遺伝子エレメントと会合させること；および
(iv)該遺伝子産物により改変された遺伝子エレメントの核酸成分を選択的に増幅させること、
を含む、上記方法。
【請求項２】
遺伝子産物をコードする複数の遺伝子エレメントから核酸配列を選択的に増幅する方法であって、
(i)遺伝子産物を任意にコードする核酸を含む複数の遺伝子エレメントを用意すること；
(ii)該核酸を任意に発現させて、該遺伝子産物を生成し、該核酸または遺伝子産物の所望の活性により、それらを含むかまたはコードする遺伝子エレメントを直接的または間接的に改変させること；
(iii)該改変された遺伝子エレメントに、核酸分子の増幅を可能にする少なくとも１つの第１の成分を選択的に付着させること；
(iv)該複数の遺伝子エレメントを、多数の個別の区画に分けること；
(v)各区画中に、核酸増幅用の別の成分を加えて、該第１の成分が付着した改変された遺伝子エレメントに連結した核酸分子だけが増幅されるようにすること；および
(vi)該第１の成分が付着した遺伝子エレメントの該核酸成分の該区画において増幅を生じさせること、
を含む、上記方法。
【請求項３】
遺伝子産物をコードする複数の遺伝子エレメントから核酸配列を選択的に増幅させる方法であって、
(i)遺伝子産物を任意にコードする核酸を含む複数の遺伝子エレメントを用意すること；
(ii)該核酸を任意に発現させて、該遺伝子産物を生成し、該核酸または遺伝子産物の所望の活性により、それらを含むかまたはコードする遺伝子エレメントを直接的または間接的に改変させること；
(iii)該遺伝子エレメントの改変されていない成分に、該遺伝子エレメントに含まれる該核酸分子の増幅に阻害をもたらす少なくとも１つの第１の成分を選択的に付着させること；
(iv)該複数の遺伝子エレメントを、多数の個別の区画に分けること；
(v)各区画中に、核酸増幅用の別の成分を加えること；および
(vi)該区画において核酸増幅を生じさせること、
を含む、上記方法。
【請求項４】
実質的に全ての区画が、１つの遺伝子エレメントしか含まない、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記所望の活性が、結合活性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記所望の活性が、化学基質を生成物に変換する能力である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記所望の活性が、触媒活性である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記所望の活性が、調節活性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記発現された遺伝子産物が、前記遺伝子エレメントと物理的に連結されて、複合体を形成する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複合体をさらに反応させて、該複合体中での前記所望の活性を有する遺伝子産物の存在に応じて、前記遺伝子エレメントにおいて条件付き変化を誘導する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記核酸増幅用の別の成分は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)もしくはその変形版、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換型増幅(SDA)、核酸配列利用型増幅(NASBA)または自己持続性配列複製(3SR)、転写仲介型増幅(TMA)、およびローリング・サークル増幅(RCA)の成分からなる群より選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の成分が、オリゴヌクレオチドプライマーを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１の成分が、核酸ポリメラーゼを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の成分が、増幅において前記遺伝子エレメントに含まれる前記核酸と競合する核酸を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の成分が、前記遺伝子エレメントに含まれる前記核酸と、PCRプライマーアニーリング部位を共有する核酸を含み、従って、該第１の成分は、PCR増幅において該遺伝子エレメントに含まれる該核酸と競合することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
核酸複製後に、一本鎖核酸生成物を除去する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１の成分は、改変した遺伝子エレメントには結合可能であるが、改変されていない遺伝子エレメントには結合しない部分を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記部分は抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ステップ(ii)が、
(a)前記遺伝子エレメントを任意に発現させて、発現される遺伝子産物が、該遺伝子産物をコードする遺伝子を含む該遺伝子エレメントの成分となる遺伝子エレメントを生成するステップ；
(b)該遺伝子エレメントを微小カプセルに入れて区画化するステップ；および
(c)該核酸または遺伝子産物の所望の活性により、それらを含む/コードする該遺伝子エレメントを直接的にまたは間接的に改変させるステップ
を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ステップ(ii)が、
(a)前記遺伝子エレメントを微小カプセルに区画化するステップ；
(b)該遺伝子エレメントを発現させて、それぞれの遺伝子産物を該微小カプセル内で生成するステップ；および
(c)該遺伝子または遺伝子産物の所望の活性により、それらを含む/コードする該遺伝子エレメントを直接的にまたは間接的に改変させるステップ
を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記区画化は、前記遺伝子エレメント、前記結合した第１の成分、および前記増幅用の別の成分を含む水相が、油性媒体に入った、油中水型エマルジョンを形成することにより、微小カプセル中への乳化を含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記遺伝子エレメントが、固相に付着した遺伝子を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記固相が微小球である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数の核酸分子は、遺伝子産物およびその変異体をコードするヌクレオチド配列のライブラリーから得られるものである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数の核酸分子はヌクレオチド配列ライブラリーから得られるものであり、該複数のヌクレオチド分子中のヌクレオチド分子の数は、ライブラリーの多様性を有意に上回らない数である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ライブラリーが、PCRでアセンブルされたコンビナトリアルライブラリーである、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
(i)請求項１〜２６のいずれか1項の遺伝子エレメントに含まれる核酸のライブラリーから、１つ以上の核酸を選択するステップ；
(ii)該選択した核酸の突然変異および/または組換えにより、遺伝子産物のレパートリーを任意にコードする核酸の別のライブラリーを作製するステップ；
(iii)ステップ(i)および(ii)を繰り返して、活性が増強した遺伝子または遺伝子産物を得るステップ
を含む、試験管内進化の方法。
【請求項２８】
前記増幅された核酸分子を１つ以上回収し、それらのヌクレオチド配列の全体または一部を決定することをさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
(i)複数の遺伝子産物を任意にコードする複数の遺伝子エレメント、ここで、該遺伝子エレメントは、コード配列にコードされた遺伝子産物の発現を指令可能な調節配列に作用可能に連結した該コード配列をそれぞれ含み、かつ、該核酸または該遺伝子産物の所望の活性により、それらを含む/コードする該遺伝子エレメントを直接的にまたは間接的に改変させるものである；および
(ii)該遺伝子または該遺伝子産物の作用により改変された遺伝子エレメントには選択的に結合可能であるが、改変されていない遺伝子エレメントには結合しない、該核酸構築物の増幅のために必要な第１の成分；
を含む、キット。
【請求項３０】
前記遺伝子エレメントが、微小球等の固相に付着している遺伝子を含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
所望の活性を有する核酸、または所望の活性を有する遺伝子産物をコードする核酸を選択する方法であって、複数の遺伝子産物を任意にコードする複数の核酸分子を、請求項１〜２８のいずれか1項の方法による選択的増幅に供し、１つ以上の増幅された核酸分子を選択することを含む、上記方法。
【請求項３２】
遺伝子または遺伝子産物と比べて活性が変化した該遺伝子または該遺伝子産物の変異体を選択する方法であって、該遺伝子産物およびその変異体を任意にコードする複数の核酸分子およびその変異体を、請求項１〜２８のいずれか1項の方法による選択的増幅に供し、該遺伝子産物をコードする核酸分子とは異なる程度に増幅された該遺伝子産物の変異体をコードする核酸分子を選択することを含む、上記方法。
【請求項３３】
請求項３１または３２に記載の方法により選択される、遺伝子または遺伝子変異体。
【請求項３４】
請求項３１または３２に記載の方法により選択される、遺伝子産物または遺伝子産物変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子ライブラリーの選択および試験管内進化において使用する方法に関する。特に、本発明は、遺伝子産物をコードする核酸を選択する方法であって、該遺伝子産物をコードする核酸が、該遺伝子産物の活性に応じて選択的かつ定量的に増幅される、上記方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
進化は、遺伝子多様性(核酸の多様性)の作製、そしてその後、都合の良い特徴をコードする核酸の選択を必要とする。核酸およびそれらがコードする遺伝子産物は一緒に生物学的生物中に維持されるため(核酸は、収容されている細胞の分子設計図をコードする)、表現型の適応変化を生じる遺伝子型の変化は、該生物に利益をもたらし、競合的優位を介して正の選択をされる。従って、複数回の突然変異および選択により、所与の選択的条件に対する適応性が高い生物(およびコードする遺伝子型)の進歩的な富化がもたらされ得る。
【０００３】
ダーウィンの進化論の原理をも、研究において応用して、特別製の結合、触媒および調節活性を有する新規タンパク質および核酸を生成することができる。これを行うためには、指向型または試験管内進化系が３つの重要な構成要素を有する必要がある：すなわち
１．遺伝子多様性を作製する方法；
２．遺伝子型と表現型とを連結する手法；および
３．所望の表現型を生じる遺伝子の優先的な複製を可能にする、所望の活性についての選択。
【０００４】
現在、遺伝子多様性を作製するためには、ランダム点突然変異誘発および組換えを含む様々な異なる手法があり、例えば、(MinshullおよびStemmer, 1999；Ostermeierら, 1999)を参照のこと。
【０００５】
また、現在、遺伝子型と表現型とをin vitroおよびin vivoで連結するいくつかの手法がある。これらのアプローチは、以下に説明するように、２つの主要なタイプに分類できる(すなわち、物理的タイプおよび区画化タイプ)。
【０００６】
物理的な遺伝子型-表現型連結    核酸では、同じ分子が、遺伝子型(複製可能な配列)および表現型(結合または触媒活性等の機能的特性)の両方を含み得る。これによって、SELEX等の技術により、所与のリガンドに結合可能なRNAおよびDNA分子(アプタマー)の選択が可能になった。同様に、タンパク質とそれをコードする遺伝子とを物理的に連結することにより、結合活性を有するタンパク質を選択できる。後者は、最初は、繊維状バクテリオファージのコートタンパク質に融合したタンパク質を提示することにより達成され(SmithおよびPetrenko, 1997)、その後、リボソーム提示、mRNA-ペプチド融合、プラスミド提示、細菌提示および酵母提示を含む様々な他の方法(BorderおよびWittrup, 1997；Georgiouら, 1997；Jermutusら, 1998；Roberts, 1999；Schatzら, 1996)により達成された。全ての場合において、結合についての選択は、アフィニティー精製または蛍光標示式細胞分取により、in vitroで行われる。次に、保持されるかまたは分取された種を、増幅およびクローン化、またはその後数回の突然変異および選択に供する。遷移状態類似体およびメカニズム利用型阻害剤(mechanism-based-inhibitor)への結合を使用して、触媒活性を有する核酸またはタンパク質について(間接的に)選択することもできる(ArkinおよびWells, 1998；Jandaら, 1997；Pollackら, 1986；Tramontanoら, 1986)。
【０００７】
物理的遺伝子型-表現型連結戦略を使用して、「分子内単一代謝回転(single-turnover)」モードの「触媒」を選択することもできる。この戦略は、核酸で(SELEX)(RobertsおよびJa, 1999；SzostakおよびWilson, 1999)、そして、最近はファージ上で提示されるタンパク質で(AtwellおよびWells, 1999；Demartisら；Jestinら, 1999；Pedersenら, 1998)常套的に使用されてきた。基本的には、上述した他の物理的連結にまで広げることができる。これらの選択のために、基質を、ライブラリー中の全ての核酸またはタンパク質と連結させる(そして、タンパク質は、それをコードする遺伝子に物理的に連結される)。その後、反応生成物は、触媒をコードする遺伝子に連結したままで、従って、基質ではなく生成物に結合する試薬を介して単離が可能になる。通常の分子内複数代謝回転(multiple turnover)モードにある触媒タンパク質を、細菌細胞の表面上に提示し、細胞表面と会合して蛍光生成物で被覆された細胞の蛍光標示式細胞分取を可能にする蛍光発生基質を使用することにより、選択することが可能であることも証明されている(Olsenら, 2000)。
【０００８】
区画化(compartmentalisation)による遺伝子型-表現型連結    物理的遺伝子型-表現型連結の人為的な戦略は、自然のものと根本的に異なる。自然では、遺伝子型-表現型連結は区画化により得られる。遺伝子、それらがコードするタンパク質、およびそれらの活性の生成物は、全て一緒にされ、細胞中で区画化されている。この種の連結は、核酸およびタンパク質の両方の選択を可能にする。さらに、構造、結合、触媒または調節等、全ての生物学的機能について選択できる。さらに、直接的な物理的連結とは対照的に、選択される表現型は、単一のタンパク質、または単独で作用する核酸の活性の結果に限定されず、２つ以上の遺伝子およびタンパク質にわたりそれらが協調的に作用して、代謝経路、シグナル伝達カスケードおよび生命に重要な全ての他のプロセスをもたらし得る。
【０００９】
指向型進化のために区画化を採用する１つの明確な手法は、細胞を使用して、in vivoで選択を行うことである。in vivo選択は、古典的に、元来、機能を欠く株において機能を補足するか(栄養要求株)、毒性もしくは成長を阻害する物質を中和するか、または成長に必須な物質を提供し(Fastrez, 1997)、このアプローチは、多数のケースにおいて可能である場合には有用であることが証明されている。
【００１０】
遺伝子型と表現型とを連結するために区画化を使用するin vitro選択系も、WO99/02671、WO00/40712ならびに(TawfikおよびGriffiths, 1998)に記載されている。所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを、微小カプセル(典型的に、油中水型エマルジョン中の水性小滴)に区画化し、次いで、転写および/または翻訳させて、微小カプセル中でそれぞれの遺伝子産物(RNAまたはタンパク質)を生成させる。所望の活性を有する遺伝子産物を生成する遺伝子エレメントを、その後分取する。このアプローチは、様々な手段により所望の活性を検出することで目的の遺伝子産物を選択する。
【００１１】
区画化自己複製は、やはり油中水型エマルジョン中で形成された微小カプセル中への区画化を使用する、本系の変形版である(Ghadessyら, 2001)。酵素の指向型進化のための本アプローチは、区画化により個々の自己複製反応が互いから隔たれるために、コードしている遺伝子のみを複製するポリメラーゼからなるフィードバックループに依存する。ポリメラーゼ以外の酵素も、遺伝子重合化に必要な生成物を生成するのであれば選択され得る。
【００１２】
上記したように、特別製の結合、触媒および調節活性を有する新規タンパク質および核酸の研究所における選択および指向型進化のために多数の異なる方法が存在する。これらのほとんどが、核酸(DNAまたはRNA)遺伝子、そして任意に各種他の分子を含む「遺伝子エレメント」の作製に依存する。遺伝子エレメントは、遺伝子自体(DNAまたはRNA)の所望の活性により、または転写、翻訳もしくは転写/翻訳後に遺伝子にコードされるRNAもしくはタンパク質(「遺伝子産物」)の所望の活性により、改変される。遺伝子エレメントの選択的改変により、これらの遺伝子エレメントを、改変されていない遺伝子エレメントから分離すること(または少なくとも選択的に富化させること)が可能になる。
【００１３】
in vitro選択および進化のための多くの方法は、物理的な遺伝子型-表現型連結を作製することに基づいている。表現型特性が、核酸により直接発揮される場合、遺伝子エレメントは単純にDNAまたはRNAであり得る。なぜなら、同じ分子により、遺伝子型(複製可能な配列)および表現型(結合または触媒活性等の機能的特性)の両方を含むことができるからである。表現型がタンパク質により発揮されるされる場合、遺伝子(DNAまたはRNA)、および該遺伝子にコードされるタンパク質は、ファージ提示、リボソーム提示、mRNA-ペプチド融合、プラスミド提示、細菌提示および酵母提示等の各種手法により物理的に連結され得る(BoderおよびWittrup, 1997；Georgiouら, 1997；Jermutusら, 1998；Roberts, 1999；Schatzら, 1996)。これらの系を使用して、結合活性について選択できる：結合タンパク質を含む遺伝子エレメントは、標的リガンドと結合することにより選択的に改変され、これは、例えば、アフィニティー精製または蛍光標示式細胞分取による遺伝子エレメントの精製を可能にする。
【００１４】
核酸またはタンパク質の活性(結合、触媒または調節)により改変された遺伝子エレメントは、WO99/02671、WO00/40712ならびに(TawfikおよびGriffiths, 1998)に記載されているように遺伝子型を表現型に連結するために区画化を使用するin vitro系において選択され得る。
【発明の開示】
【００１５】
本発明は、区画化in vitro選択系を用いて、所望の活性を有するかまたはコードする遺伝子を選択するための改善された手段を提供する。特に、本発明は、所望の活性により改変された遺伝子エレメントにおいて、遺伝子を特異的に複製して、これらの遺伝子を富化させる新規手段を提供する。特に有利なのは、遺伝子の富化の程度が、遺伝子を含む遺伝子エレメントの改変の程度と直接比例するため、遺伝子エレメント中の遺伝子または遺伝子産物の活性のレベルを厳密に反映することである。これは、まず、例えば上記方法のいずれかにより、遺伝子エレメントを形成することにより達成される。遺伝子エレメントは、遺伝子または遺伝子産物の作用(構造、結合、触媒、調節または他の作用であり得る)により、直接的または間接的に改変され得る、遺伝子(核酸分子)および任意に各種他の分子を含む。例えば、遺伝子エレメントは、(遺伝子に加えて)、遺伝子産物の作用により、生成物に変換され得るか、改変され得るか、または変化し得る１つ以上の基質を含み得る。所与の遺伝子エレメントに含まれる遺伝子の増幅の程度(すなわち、遺伝子の新規コピー数)は、従って、該遺伝子エレメントの改変の程度に関係する。例えば、遺伝子自体の作用または遺伝子産物の作用により(遺伝子エレメントの成分のまま)生成物に変換される基質分子を含む遺伝子エレメントの場合、その遺伝子エレメントに含まれる遺伝子は、形成される生成物分子の量に関係する程度まで増幅される。本方法は、複製される能力として測定される遺伝子の適応度を、それがコードする遺伝子産物の活性(例えば、生成物形成の触媒)と直接関連させる。換言すれば、選択後の遺伝子集合中の所与の遺伝子のコピー数は、コードされる遺伝子産物の活性に比例する。このような選択方法は、生物の自然選択の強力なプロセスをより厳密に分子レベルで模倣するために、代替的なin vitro選択戦略よりも、都合が良い。
【００１６】
本発明による技術は、低い代謝回転を示す遺伝子産物に対して、および変異体の最初の世代が最高でも低い活性レベルを示す可能性が高い場合に新規触媒機能について酵素を選択する方法において、特に有用である。
【００１７】
従って、第１の態様では、本発明は、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする１つ以上の遺伝子エレメントを選択する方法であって、
(i)遺伝子産物を任意にコードする核酸を含む複数の遺伝子エレメントを用意すること；
(ii)該核酸を任意に発現させて、該遺伝子産物を生成し、該核酸または遺伝子産物の所望の活性により、それらを含むかまたはコードする遺伝子エレメントにおいて直接的または間接的に改変を生じさせること；
(iii)核酸複製系の１つ以上のモジュレーターを、該遺伝子産物により改変された遺伝子エレメントと会合させること；
(iv)該遺伝子産物により改変された遺伝子エレメントの核酸成分を選択的に増幅させること、
を含む方法を提供する。
【００１８】
本発明に関しては、遺伝子産物は遺伝子エレメント中の核酸の一部または全てによりコードされ得る。典型的に、核酸は、１つ以上が所望である活性を有する遺伝子産物分子のレパートリーをコードする。本手順は、遺伝子またはそれらがコードする遺伝子産物の所望の活性についてアッセイすることで、このような核酸を選択するように構成されている。
【００１９】
特に、本発明は、遺伝子産物をコードする複数の遺伝子エレメントから核酸配列を選択的に増幅する方法であって、
(i)遺伝子産物を任意にコードする核酸を含む複数の遺伝子エレメントを用意すること；
(ii)該核酸を任意に発現させて、該遺伝子産物を生成し、該核酸または遺伝子産物の所望の活性により、それらを含むかまたはコードする遺伝子エレメントを直接的または間接的に改変させること；
(iii)該改変された遺伝子エレメントに、核酸分子の増幅を可能にする少なくとも１つの第１の成分を選択的に付着させること；
(iv)該複数の遺伝子エレメントを、多数の個別の区画に分けること；
(v)各区画中に、核酸増幅用の別の成分を加えて、該第１の成分が付着した改変された遺伝子エレメントに連結した核酸分子だけが増幅されるようにすること；および
(vi)該第１の成分が付着した遺伝子エレメントの該核酸成分の該区画において増幅を生じさせること、
を含む、上記方法を提供する。
【００２０】
代替的な実施形態では、本発明は、遺伝子産物をコードする複数の遺伝子エレメントから核酸配列を選択的に増幅させる方法であって、
(i)遺伝子産物を任意にコードする核酸を含む複数の遺伝子エレメントを用意すること；
(ii)該核酸を任意に発現させて、該遺伝子産物を生成し、該核酸または遺伝子産物の所望の活性により、それらを含むかまたはコードする遺伝子エレメントを直接的または間接的に改変させること；
(iii)該遺伝子エレメントの改変されていない成分に、該遺伝子エレメントに含まれる該核酸分子の増幅に阻害をもたらす少なくとも１つの第１の成分を選択的に付着させること；
(iv)該複数の遺伝子エレメントを、多数の個別の区画に分けること；
(v)各区画中に、核酸増幅用の別の成分を加えること；および
(vi)該区画において核酸増幅を生じさせること、
を含む、上記方法を提供する。
【００２１】
一実施形態では、核酸増幅のための別の成分が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の成分(Saikiら, 1988)もしくはその変異体から選択される。代替的な増幅系を利用してもよく、リガーゼ連鎖反応(LCR)(WuおよびWallace, 1989)、鎖置換型増幅(SDA)(Walkerら, 1992a)、および核酸配列利用型増幅(NASBA)(Compton, 1991)、または自己持続性配列複製(3SR)(Guatelliら, 1990)、転写仲介型増幅(TMA)(米国特許第5,399,491号)、ならびにローリング・サークル増幅(RCA)(Lizardiら, 1998)が挙げられる。
【００２２】
核酸分子の増幅を可能にするかまたは阻害する、核酸増幅系の第１の成分またはモジュレーターは、例えば、核酸複製系自体の成分(プライマーもしくは酵素、またはそれらの補因子等)であり得る。成分が複製にとって阻害的である場合、増幅系の成分に対する競合相手(ジデオキシ停止プライマー等)、または核酸分子の競合相手であることが都合がよい。
【００２３】
本発明に関しては、増幅は核酸の複製を必要とすることが理解されよう。
【００２４】
前記第１の成分は、改変した遺伝子エレメントには結合可能であるが改変されていない遺伝子エレメントには結合しない部分を含むかさもなくば付着していることが好ましい。
【００２５】
本発明では、複製系の成分が、改変された遺伝子エレメントから改変されていない遺伝子エレメントに移動することを実質的に防止しなければならない。これは、様々な手法により達成され得る。例えば、プライマー等の成分が、複製系で機能するために遺伝子エレメントから分離されなければならない場合、遺伝子エレメントおよび成分は、拡散を制限する媒体(ゲル等)に入れられ得る；あるいはまた、例えば、本明細書でより詳細に説明するように、エマルジョン小胞等の微小カプセルを使用して区画化され得る。
【００２６】
あるいはまた、成分は遺伝子エレメントに繋げられて、繋げられたエレメントとのみ有効に相互作用するようにし得る。プライマーを固相に付着させるために使用するリンカーは、例えば架橋増幅(米国特許第5,641,658号)等において公知である。リンカーは柔軟性があることが好ましい。
【００２７】
非常に好適な実施形態では、遺伝子エレメントは、区画化されている。区画化は、油中水型エマルジョンを使用することにより達成される(すなわち、上記した本発明のステップ(iv)は、増幅のための第１の成分および別の成分に結合した遺伝子エレメントを含む水溶液が油性媒体に入った油中水型エマルジョンを形成することを含む)ことが好ましい。
【００２８】
前記複数の核酸分子は、遺伝子産物およびその変異体をコードするヌクレオチド配列のライブラリーであるか、またはそこから得られるものであることが好ましい。
【００２９】
任意に、本発明の方法は、１つ以上の増幅核酸を回収すること、およびそれらのヌクレオチド配列の全体または一部を決定することをさらに含む。
【００３０】
さらなる態様では、本発明は、上記方法において使用され得るキットを提供する。このキットは、
(i)複数の遺伝子産物を任意にコードする複数の遺伝子エレメント、ここで、該遺伝子エレメントは、配列にコードされた遺伝子産物の発現を指令可能な調節配列に任意に作用可能に連結した該核酸配列をそれぞれ含み、該核酸または該遺伝子産物の所望の活性により、それらを含む/コードする該遺伝子エレメントを直接的にまたは間接的に改変させるものである；および
(ii)該遺伝子または該遺伝子産物の作用により改変された遺伝子エレメントには選択的に結合可能であるが、改変されていない遺伝子エレメントには結合しない、該核酸構築物の増幅をモジュレートする第１の成分
を含む。
【００３１】
本発明は、改善されたかまたは新しい性質を有する遺伝子産物を選択することに関するため、別の態様では、本発明は、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする核酸を選択する方法であって、複数の遺伝子産物をコードする複数の核酸分子を、本発明の上記方法による選択増幅に供すること、および所望の程度まで増幅された１つ以上の核酸分子を選択すること、を含む方法も提供する。本方法により選択された遺伝子産物も提供する。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、元の遺伝子と比べて活性が変化した遺伝子変異体を選択する方法を提供する。この方法は、複数の核酸分子およびその変異体を、本発明の上記方法による選択的増幅に供し、元の遺伝子と異なる程度に増幅された核酸分子を選択することを含む。この方法で選択される遺伝子も提供する。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は、元の遺伝子産物と比べて活性が変化した該遺伝子産物の変異体を選択する方法であって、該遺伝子産物および変異体をコードする複数の核酸分子を、本発明の上記方法による選択的増幅に供し、該元の遺伝子産物をコードする核酸分子とは異なる程度に増幅された該遺伝子産物の変異体をコードする核酸分子を選択することを含む、上記方法を提供する。この方法により選択される遺伝子および遺伝子産物も提供する。
【００３４】
本発明の別の態様によれば、
(a)本発明による核酸ライブラリーから１つ以上の核酸を選択するステップ；
(b)選択した核酸の突然変異および/または組み換えにより、遺伝子産物のレパートリーを任意にコードするさらなる核酸ライブラリーを生成するステップ；
(c)ステップ(a)および(b)を繰り返して、活性が増強した遺伝子または遺伝子産物を得るステップ、
を含む、試験管内進化の方法を提供する。
【００３５】
好適な実施形態では、遺伝子または遺伝子産物の活性に応じて条件付きで改変された遺伝子エレメントは、WO99/02671、WO00/40712ならびに(TawfikおよびGriffiths, 1998)に記載される方法を用いて作製される。これは、遺伝子型を表現型と連結させるために区画化を使用するin vitro系である。遺伝子エレメントは、微小カプセル(典型的に、油中水型エマルジョン中の水滴)に区画化され、その後転写および/または翻訳されて、該微小カプセル中でそれぞれの遺伝子産物(RNAまたはタンパク質)を産生する。所望の活性を有する遺伝子産物を生成する遺伝子エレメントは、微小カプセル中で改変される。非常に好適な実施形態では、遺伝子エレメントは、微小球等の固相に付着した遺伝子、および任意に各種他の分子を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
特に定義しない限り、本明細書中で使用する技術的および科学的用語は全て、(例えば、細胞培養、分子遺伝子学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術、および生化学の)当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。分子的、遺伝子的および生化学的方法については、標準的な技術(Sambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版 (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.、およびAusubelら, Short Protocols in Molecular Biology (1999)第四版, John Wiley and Sons, Inc.、ならびにCurrent Protocols in Molecular Biologyの完全版を全般的に参照のこと(これらは、参照により本明細書に全体的に援用する))、ならびに化学的方法を使用している。
【００３７】
選択は、進化のメカニズムであり、in vitroおよびin vivoで遺伝子およびタンパク質に選択圧をかける強力な新規技術により、生物学者らは、酵素および他の有用な分子について(天然型および操作型)タンパク質のライブラリーを篩い分けする各種手順を開発した。このような選択方法は、２つの非常に有用な新しい能力を提供する。第一に、タンパク質技術者は、自然進化のプロセスを模倣することにより、既存のタンパク質骨格から新しい機能を発達させ始めた；第二に、生物学者らは、ゲノムおよびcDNAライブラリーから天然型タンパク質をそれらの活性に基づいて単離するための迅速な方法を開発している。
【００３８】
「理想的な」選択系は、以下の特徴を含むことで特徴付けられ得る：
１．低い代謝回転を有するタンパク質の効率的な選択を可能にする；
２．代謝回転の小さな差も区別でき、例えば徐々に改善することにより触媒活性の進化を可能にする；
３．例えば大量の基質を短時間で生成物に変換可能な酵素が望ましい場合に、高い生成物代謝回転も効率的に選択できる。
【００３９】
これらの全ての特徴により、理想的な選択系は、例えば、低い活性を示すタンパク質から開始し、所望のレベルの活性に到達するまでその性能を改善する新規の形質転換を触媒する酵素を進化させることが原理的に可能である。
【００４０】
本発明は、遺伝子産物の活性に直接比例する量で遺伝子が選択的に増幅される新規技術を提供する。
【００４１】
特別製の結合、触媒および調節活性を有する新規タンパク質および核酸の研究においては、選択および指向型進化のための多数の異なる方法が存在する。これらのほとんどは、核酸(DNAまたはRNA)遺伝子、および任意に様々な他の分子を含む「遺伝子エレメント」の作製に依存する。遺伝子エレメントは、遺伝子自体(DNAもしくはRNA)の所望の活性により、または転写、翻訳もしくは転写/翻訳後に、該遺伝子によりコードされるRNAもしくはタンパク質(「遺伝子産物」)の所望の活性により、改変される。遺伝子エレメントの選択的改変により、それらを、改変されなかった遺伝子エレメントから分離すること(または少なくとも選択的に富化されること)が可能になる。
【００４２】
in vitro選択および進化のための多くの方法が、物理的な遺伝子型-表現型連結を作製することに基づいている。核酸では、遺伝子エレメントは、単純にDNAまたはRNAであり得る。なぜなら、同じ分子は、遺伝子型(複製可能な配列)および表現型(結合または触媒活性等の機能的特性)の両方を含むことができるからである。タンパク質では、遺伝子(DNAまたはRNA)および該遺伝子にコードされるタンパク質は、様々な手法(ファージ提示、リボソーム提示、mRNA-ペプチド融合、プラスミド提示、細菌提示および酵母提示が挙げられる(BoderおよびWittrup, 1997；Georgiouら, 1997；Jermutusら, 1998；Roberts, 1999；Schatzら, 1996；SmithおよびPetrenko, 1997))により物理的に連結され得る。これらの系は、結合活性について選択するために使用され得る：結合タンパク質を含む遺伝子エレメントは、例えばアフィニティー精製または蛍光標示式細胞分取(FACS)により遺伝子エレメントの精製を可能にする標的リガンドと結合することにより、選択的に改変される。
【００４３】
本明細書で使用する遺伝子エレメントは、核酸を含む分子または分子構築物である。本発明の遺伝子エレメントは、あらゆる核酸(例えば、DNA、RNAまたはそれらの任意の天然型もしくは人為型の類似体)を含み得る。遺伝子エレメントの核酸成分は、さらに、共有結合的または非共有結合的に、１つ以上の分子または構造(タンパク質、化学物質および化学基、磁気ビーズ等の固相支持体等が挙げられる)に連結され得る。本発明の方法においては、これらの構造または分子は、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントの分取および/または単離において有用であるように設計され得る。
【００４４】
遺伝子エレメントは、遷移状態類似体(TSA)またはメカニズム利用型阻害剤に結合させることにより、触媒核酸およびタンパク質を(間接的に)選択するためにも使用できる(ArkinおよびWells, 1998；Jandaら, 1997；Pollackら, 1986；Tramontanoら, 1986)。「触媒」核酸またはタンパク質を含む遺伝子エレメントも、上述したように「分子内単一代謝回転」モードまたは分子内複数代謝回転モードで選択され得る。この場合、「触媒」核酸またはタンパク質を含む遺伝子エレメントは、遺伝子エレメントの成分であるか、または遺伝子エレメントの成分となる「触媒」反応の生成物の生成により改変される。
【００４５】
これらのほとんどの場合、所望の活性により改変された遺伝子エレメント中の遺伝子の富化はアフィニティー精製またはFACSにより行われる。
【００４６】
本発明は、区画化in vitro選択系を用いて、所望の活性を有するかまたはコードする遺伝子を選択する改善された手段を提供する。特に、本発明は、所望の活性により改変された遺伝子エレメント中の遺伝子を特異的に複製して、これらの遺伝子を富化させる新規手法を提供する。特に都合が良いのは、遺伝子の富化の程度が、該遺伝子を含む遺伝子エレメントの改変の程度に直接比例し、従って、遺伝子エレメント中の遺伝子または遺伝子産物の活性レベルを厳密に反映することである。これは、まず、例えば上記方法のいずれかにより、遺伝子エレメントを形成することにより達成される。遺伝子エレメントは、遺伝子または遺伝子産物の作用(構造、結合、触媒、調節または他の作用であり得る)により直接的または間接的に改変され得る遺伝子(核酸分子)および任意に様々な他の分子を含む。例えば、遺伝子エレメントは、(遺伝子に加えて)、遺伝子産物の作用により生成物に変換され得る基質を含み得る。すると、所与の遺伝子エレメントに含まれる遺伝子の増幅の程度(すなわち、遺伝子の新規コピー数)は、該遺伝子エレメントの改変の程度に関連付けられる。例えば、遺伝子自体の作用または遺伝子産物の作用により(遺伝子エレメントの成分のままで)生成物に変換される基質分子を含む遺伝子エレメントの場合、その遺伝子エレメントに含まれる遺伝子は、形成される生成物分子の量に関係する程度まで増幅される。本方法は、複製される能力として測定される遺伝子の適応度を、それがコードする遺伝子産物の活性(例えば、生成物形成の触媒)と直接関連させる。換言すれば、選択後の遺伝子集合中の所与の遺伝子のコピー数は、コードされる遺伝子産物の活性に比例する。このような選択方法は、生物の自然選択の強力なプロセスをより厳密に分子レベルで模倣するために、代替的なin vitro選択戦略よりも都合が良い。
【００４７】
遺伝子エレメントの作製
遺伝子エレメントの形成のために様々な方法が存在する。全ての場合において、遺伝子エレメントは、少なくとも１つの核酸分子を含む。
【００４８】
本発明の方法において使用する核酸分子は、典型的にDNAまたはRNAである。これらは、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。一本鎖分子は、例えば分子内塩基対合により、二本鎖領域を含み得る。核酸分子は、典型的に線状または環状である。
【００４９】
核酸分子は、遺伝子産物を任意にコードする配列を含み、この場合、該配列は、典型的に、適切な発現系中でのコード配列の発現を提供可能な調節制御配列に作用可能に連結した事実上のコード配列を含む。「作用可能に連結」という用語は、記載する成分が、意図する様式で機能するような関係にあることを意味する。コード配列に「作用可能に連結した」調節配列は、制御配列に適合する条件下でコード配列の発現が達成されるようにライゲートされる。核酸分子は、例えば、プラスミド、ファージまたはウイルスベクターの一部であり得る。
【００５０】
調節制御配列は、転写/翻訳系において機能する、転写ターミネーターおよび翻訳制御配列等のプロモーター/エンハンサーおよび他の発現調節シグナルを含む。これらの制御配列は、一般的に、核酸分子をその中で使用することが意図される発現系に適合するように選択される。「プロモーター」という用語は、当該分野で周知であり、最小限のプロモーターから、上流エレメントおよびエンハンサーを含むプロモーターまで、様々な大きさおよび複雑度にわたる核酸領域を含む。
【００５１】
本発明によりスクリーニングするヌクレオチド配列は、典型的に、目的の活性を有するか、または目的の活性を有するRNA分子もしくはポリペプチドをコードする。活性は、触媒、結合、調節または任意の他の活性であり得る。
【００５２】
目的の活性を有するポリペプチドとしては、抗体、抗原、酵素、リガンド(成長因子等)、受容体(細胞表面受容体等)、細胞シグナル伝達経路の他の成分、核酸結合タンパク質(核酸修復酵素等)、ポリメラーゼ、リコンビナーゼおよび転写因子、ならびに構造タンパク質が挙げられる。ポリペプチドとしては、上記の断片、および単一のポリペプチド中の異なるタンパク質由来の断片をコードする融合構築物も挙げられる。
【００５３】
核酸またはポリペプチドは、非ランダム化(例えば、天然型核酸もしくはポリペプチドの「野生型」もしくは対立遺伝子変異体)もしくは特異的な変異体、または完全もしくは部分的にランダム化されていてもよい。従って、核酸分子は、典型的に、ランダム化配列ライブラリーのメンバー等の異なる遺伝子産物をそれぞれ任意にコードする複数の核酸分子として提供される。ライブラリー中には、少なくとも50、100、500または1000の異なる配列が存在することが好ましい。核酸分子のライブラリーは、遺伝子産物のレパートリーを都合良くコードする。
【００５４】
レパートリーとは、例えばアミノ酸配列の異なるポリペプチド変異体等の多様な変異体の集合である。アミノ酸配列の違いは、典型的に、核酸突然変異誘発によりDNAレベルで導入される。
【００５５】
ランダム化は、任意の適切な突然変異誘発手段によりヌクレオチドレベルで達成される。突然変異誘発は、例えば、変異型遺伝子産物を任意にコードする新規遺伝子を合成し、任意にこれらを発現して多様な異なる遺伝子産物を得ることにより行われ得る。あるいはまた、部位特異的またはランダム突然変異誘発等により、既存の遺伝子自体を突然変異させて、所望の変異型遺伝子を得ることができる。
【００５６】
突然変異は、当業者に公知の任意の方法により導入され得る。M13等の一本鎖ファージを採用する方法からPCR利用型技術まで、多数の部位特異的突然変異誘発法が当該分野で公知である((Innisら, 1990)を参照)。
【００５７】
目的の遺伝子産物をコードする複数のヌクレオチド配列は、クローン化ゲノムDNAまたはcDNAから得ることができる。遺伝子の全体(例えば(ParmleyおよびSmith, 1988を参照))または遺伝子の一部(例えば(Lowmanら, 1991)を参照)、または遺伝子のプール(例えば(Nissimら, 1994)を参照)をコードする遺伝子ライブラリーも作製できる。
【００５８】
複数のヌクレオチド配列は、様々なin vivo技術(大腸菌mutD5等の細菌の「突然変異誘発株」の使用(Lowら, 1996)；およびＢリンパ球の抗体過剰変異系の使用(Yelamosら, 1995)が挙げられる)により、ヌクレオチド配列またはヌクレオチド配列のプールに「ランダムに」突然変異を導入することでも作製され得る。ランダム突然変異は、化学突然変異誘発物質およびイオン化もしくはUV照射(Friedbergら, 1995)、または突然変異誘発物質利用型類似体の取込み(Zaccoloら, 1996)により、in vivoおよびin vitroの両方で導入されてもよい。「ランダム」突然変異は、例えば変異原性(すなわち、読み間違いの多い：error-prone)ポリメラーゼを使用することにより、重合化の間にin vitroで遺伝子に導入することもできる(Leungら, 1989)。
【００５９】
in vivo(Kowalczykowskiら, 1994)またはin vitro(Stemmer, 1994a；Stemmer, 1994b；Zhaoら, 1998)のいずれかでの相同組換え、または非相同組換え(Ostermeierら, 1999)を用いてさらなる多様化も導入できる。
【００６０】
本発明で使用できるヌクレオチド配列の別のライブラリーは、PCRでアセンブルされたコンビナトリアルライブラリーである。この場合、ライブラリーのDNA断片は、例えば、重複伸長(Hoら, 1989；Hortonら, 1989)等のPCR、またはリガーゼ連鎖反応(Barany, 1991；Landegrenら, 1988);(米国特許第4,883,750号)によりin vitroで完全な大きさの構築物にアセンブルされる。
【００６１】
理論的および実験的な研究から、コンビナトリアルライブラリーにおいてスクリーニングされる核酸分子変異体の数が多い程、所望の特性を有する分子が作製される可能性が高いことが示されている(Lancetら, 1993；PerelsonおよびOster, 1979；Vargaら, 1991)。従って、確実に、稀な変異体が生成されることにより選択可能であるためには、ライブラリーのサイズは大きい方が望ましい。他方で、cDNAライブラリーの場合にはこのような必要はない。完全に基準化された酵母（S.cerevisiae）cDNAライブラリーでは、約6000遺伝子しか含まないアリコートで、完全な多様性がサンプリングできる。一方、各遺伝子に由来する転写産物を少なくとも１つ表すヒト（H.sapiens）cDNAライブラリーは、約30000〜40000の遺伝子しか必要としない。実際には、由来源が完全に配列化(arrayed)および注解(annotated)されている場合以外は、遺伝子の統計的な表現を見込むために余裕が必要である。
【００６２】
全体的に、複数の核酸分子は、少なくとも50、100、500または1000の異なる分子を含むことが好ましい。
【００６３】
各核酸分子は、各種異なる手法(SELEX(RobertsおよびJa, 1999；SzostakおよびWilson, 1999)、ファージ提示(SmithおよびPetrenko, 1997)、リボソーム提示、mRNA-ペプチド融合、プラスミド提示、細菌提示、および酵母提示(BoderおよびWittrup, 1997；Georgiouら, 1997；Jermutusら, 1998；Roberts, 1999；Schatzら, 1996)、または微小カプセル化(WO99/02671、WO00/40712ならびに(TawfikおよびGriffiths, 1998))が挙げられるがこれらに限らない)により作製され得る遺伝子エレメントの一部を形成し得る。遺伝子エレメントの作製には、遺伝子産物の発現が伴いうる。
【００６４】
SELEX
核酸分子は、それ自体で所望の活性を所有し得る；このような場合、遺伝子エレメントは、核酸分子(DNAまたはRNA)および任意に各種の他の分子を含み得る。例えば、基質を核酸と連結させて、「触媒」(または、より厳密には、分子内単一代謝回転反応での生成物形成)についての選択を可能にしてもよい(RobertsおよびJa, 1999；SzostakおよびWilson, 1999)。
【００６５】
ファージ提示
遺伝子エレメントは、繊維状バクテリオファージのコートタンパク質に融合した遺伝子産物を提示することで形成され得る(SmithおよびPetrenko, 1997)。任意に、基質等としての別の分子を、このように形成されたファージ粒子に連結してもよい(AtwellおよびWells, 1999；Demartisら, 1999；Jestinら, 1999；Pedersenら, 1998)。
【００６６】
リボソーム提示
遺伝子エレメントは、典型的に3'側端部において停止コドンを含まないことにより、mRNAの翻訳を完成させる際にリボソームを停止(stall)させることにより、in vitro翻訳系において形成され得る。発生するペプチド鎖は、リボソームから出てき、遺伝子産物と遺伝子との物理的連結を形成する；遺伝子エレメントは、このように形成されたペプチド-遺伝子複合体を含む(Mattheakisら, 1994)。
【００６７】
RNA-ペプチド融合
ペプチドは、mRNA-DNA-ピューロマイシン共役体から翻訳される。リボソームは、RNA-DNA接合部位に到達すると、一時的に停止するため、ピューロマイシンがペプチジルトランスフェラーゼ中心に入ることが可能になり、そこで発生ペプチド鎖と共有結合を形成する。遺伝子産物(ペプチド)と遺伝子(mRNA)との共有結合が生じる；遺伝子エレメントはこの複合体を含む(RobertsおよびSzostak, 1997)。
【００６８】
プラスミド提示
プラスミドは、細胞内で、in vivoで個別のDNA結合タンパク質に融合したランダムなペプチドを発現する；融合タンパク質は、プラスミド中に存在する配列に特異的に結合することで、遺伝子(プラスミド)と遺伝子産物(融合タンパク質)との物理的連結を作製する。遺伝子エレメントは、これらのプラスミド-融合タンパク質複合体を含む(Schatzら, 1996)。
【００６９】
細胞表面提示
遺伝子エレメントは、遺伝子産物が細胞表面上で提示されるように、生存細胞内(大腸菌または酵母細胞が挙げられるがこれらに限定されない)で遺伝子を発現させることにより形成され得る。すると、遺伝子エレメントは、遺伝子および表面提示された遺伝子産物を含む細胞、ならびに任意に細胞表面に付着し得る各種の他の分子を含む(Georgiouら, 1997)。
【００７０】
In vitro区画化
好適な実施形態では、WO99/02671、WO00/40712ならびに(TawfikおよびGriffiths, 1998)に記載されるように、遺伝子エレメントは微小カプセル内で形成される。任意に、このように形成された遺伝子エレメントは、遺伝子に物理的に連結された遺伝子産物を含む。
【００７１】
遺伝子エレメントの改変
遺伝子エレメントは、所望の活性を有するかまたはコードする遺伝子エレメントの単離および/または選択を促進する様々な手法により改変され得る。このような方法としては、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない。
【００７２】
物理的遺伝子型-表現型連結
遺伝子エレメントが、遺伝子と遺伝子産物との物理的連結を含む場合、または遺伝子自体が所望の活性を有し得る場合、所望の活性を有するかまたはコードする遺伝子エレメントが単離または選択され得るように、遺伝子エレメントは改変され得る。このような方法としては、以下のものが挙げられるがこれらに限定されない：
リガンド結合
所望の活性が結合活性の場合、遺伝子エレメントは、リガンドと混合されて、所望の結合活性を有するかまたはコードする遺伝子エレメントはリガンドの結合により改変され、所望の結合活性を持たないかまたはコードしない遺伝子エレメントはそのように改変されないようにする。
【００７３】
遷移状態類似体(TSA)またはメカニズム利用型阻害剤への結合
場合によっては、触媒が求められている反応の遷移状態の類似体に結合する遺伝子もしくは遺伝子産物を選択することにより、またはメカニズム利用型阻害剤に結合する遺伝子もしくは遺伝子産物を選択することにより、所望の触媒活性について間接的に選択することが可能である。このような場合、遺伝子エレメントは、TSAまたはメカニズム利用型阻害剤と混合されて、該TSAまたはメカニズム利用型阻害剤に対する結合活性を有するかまたはコードする遺伝子エレメントが、該TSAまたはメカニズム利用型阻害剤との結合により改変されるようにされ得る。
【００７４】
分子内触媒または単一代謝回転生成物形成
場合よっては、触媒する反応用の基質で遺伝子エレメントを改変することにより、所望の触媒活性を有する遺伝子または遺伝子産物を選択することが可能である。所望の触媒活性を有するかまたはコードする遺伝子エレメント内の遺伝子または遺伝子産物は、付着した基質の生成物への変化を触媒し得る。同様に、単一代謝回転生成物形成もこのように選択され得る。
【００７５】
分子内触媒
例えば、細胞表面提示遺伝子産物を含む遺伝子エレメントは、同じ細胞表面への基質分子の付着によりさらに改変され得る。所望の触媒活性を有する遺伝子産物は、付着した基質分子の一部または全部の変化を触媒して、付着した基質分子の変化により、所望の活性を有する遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントを改変し得る。
【００７６】
In vitro区画化
遺伝子エレメントを改変する好適な方法としては、WO99/02671、WO00/40712ならびにTawfikおよびGriffiths, 1998に記載されている方法を使用してそれらを区画化することである。遺伝子エレメントが形成され得る方法としては、上記方法(物理的遺伝子型-表現型連結)が挙げられるがこれらに限定されない。好適な実施形態では、遺伝子エレメントは、転写または転写/翻訳、微小カプセル中に区画化され、WO99/02671、WO00/40712ならびに(TawfikおよびGriffiths, 1998)に記載されている方法を使用して、遺伝子産物の活性により、直接的または間接的に、同じ微小カプセル内の遺伝子エレメントが改変される。
【００７７】
所望の活性が結合活性の場合、遺伝子産物が遺伝子エレメントに構成的に連結され、従って特異的な相互作用を介してリガンドが遺伝子エレメントと結合し得る；あるいはまた、リガンドは、遺伝子エレメントに物理的に連結されて、遺伝子産物が所望の結合活性を有する場合のみ(この場合、遺伝子産物は、抗体等の分子により特異的に結合され得るエピトープ等の「タグ」を含む)、遺伝子産物が遺伝子エレメントと会合するようにする。
【００７８】
所望の活性が触媒活性の(または触媒活性と共役している)場合、基質が遺伝子エレメントに連結されて、所望の活性を有するかまたはコードする遺伝子エレメントは、基質が生成物へと変化することにより改変されるようにしてもよい。あるいはまた、基質分子は溶液中に存在してもよく、その後、生成物に変換後に遺伝子エレメントと会合し得る。例えば、基質分子は、(例えば、pH等の)特定の誘導条件下で遺伝子エレメントと結合し得る部分を含むか、一旦脱保護すると遺伝子エレメントに結合する保護部分を含み得る(例えば、閉じ込められた(caged)ビオチン基(PirrungおよびHuang, 1996；Sundbergら, 1995))。所望の活性をコードする遺伝子エレメントを含む区画内では、基質分子の一部または全部が生成物に変換され、その後、残った基質分子および生成物分子の両方が遺伝子エレメントと会合され得る。あるいはまた、遺伝子産物の活性により直接的または間接的に形成された生成物分子は、例えば特異的な抗生成物抗体により、遺伝子エレメントに特異的に結合され得る。このような場合、基質(および生成物)は、抗体等の分子により特異的に結合され得る部分を含み得るが、生成物分子しか遺伝子エレメントと会合しない。
【００７９】
さらなる実施形態では、遺伝子に物理的に連結した遺伝子産物および任意に各種の他の分子を含む遺伝子エレメントが区画内で形成され得、このように形成された遺伝子エレメントは、さらなる区画に再区画化され、そこで、遺伝子産物の活性が直接的または間接的に遺伝子エレメントの改変を生じる。
【００８０】
遺伝子または遺伝子産物の活性の間接的な結果生じる遺伝子エレメントに対する改変は、WO99/02671に記載されるように、第１の反応を、同じ区画内で生じるその後の反応と共役させることにより達成され得る。
【００８１】
さらなる実施形態では、WO99/02671およびWO00/40712に記載されている方法を使用して、遺伝子自体の性質により、改変された遺伝子エレメントを条件付きで作製して、例えば、プロモーター/エンハンサー等の調節制御配列、ならびに転写/翻訳系で機能する転写ターミネーターおよび翻訳制御配列等の他の発現調節シグナルを選択する。
【００８２】
遺伝子増幅
本発明は、改変された遺伝子エレメント中の遺伝子を選択的に増幅する方法を提供する。改変された遺伝子エレメントは、各種手法により形成され得る(上述したものが挙げられるがこれらに限定されない)。核酸複製系の１つ以上の成分は、改変された遺伝子エレメントに採用されるが、改変されていない遺伝子エレメントには採用されず、その後遺伝子エレメントは多数の個別の区画に分けられ得る。改変された遺伝子エレメント内に含まれる遺伝子は、区画内の核酸複製系を使用して増幅される。
【００８３】
増幅
「増幅」とは、特定の核酸断片(またはその一部分)のコピー数の増加を指す。この増加は、酵素連鎖反応(ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)もしくはその改変版、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換型増幅(SDA)、および核酸配列利用型増幅(NASBA)、または自己持続性配列複製(3SR))により生じ得る。本発明による増幅は、例えばポリメラーゼ連鎖反応に示されるように、指数的増幅であることが好ましい。
【００８４】
多くの標的およびシグナル増幅方法が文献に記載されており、例えば、これらの方法の総説が(Landegrenら, 1988；SchweitzerおよびKingsmore, 2001)に記載されている。これらの増幅方法は、本発明の方法において使用してもよく、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)もしくはその改変版、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換型増幅(SDA)、および核酸配列利用型増幅(NASBA)、または自己持続性配列複製(3SR)が挙げられる。
【００８５】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
PCRは、米国特許第4,683,195号および同第4,683,202号に記載されている核酸増幅方法である。PCRは、DNAポリメラーゼで生成されるプライマー伸長反応のサイクルの繰返しからなる。標的DNAを熱変性させ、増幅するDNAの反対の鎖上の標的配列を挟む２つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせる。これらのオリゴヌクレオチドは、DNAポリメラーゼと共に使用するプライマーとなる。DNAは、プライマー伸長によりコピーされ、両方の鎖の第二のコピーを作製する。熱変性、プライマーハイブリダイゼーションおよび伸長のサイクルを繰り返すことにより、標的DNAは、約２〜４時間で百万倍以上増幅される。PCRの利点は、約４時間で、標的DNAの量を百万から十億倍にまで増幅することである。
【００８６】
増幅において各区画は、PCR反応のための成分(例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)、緩衝液、マグネシウム、およびオリゴヌクレオチドプライマー)を含む。しかし、改変された基質を欠く区画は、PCR成分の１つを欠く。これは、プライマー、ポリメラーゼ、または他の成分であり得る。第１の成分がプライマーの場合、PCRプロセスに必要なプライマーの１つは、制限試薬(limiting reagent)であり、増幅の程度は、区画内のプライマーの数に主に依存する。これは、非対称PCR(Innisら, 1990)と呼ばれ、本発明の方法による好ましい増幅技術である。この形式のように、あるオリゴヌクレオチドプライマーが第１の成分である場合、その後の第２のプライマーの伸長により形成される任意の一本鎖核酸生成物を除去することが都合良くあり得る。
【００８７】
第１の成分が存在する区画では、PCRプロセスに必要な全ての成分が存在し、従って、増幅が生じ得る。例えば、遺伝子産物が酵素の場合、生成物の分子の数、従って第１の生成物の数は、選択方法の初期段階における遺伝子産物の活性に依存する。特に、第１の成分がプライマーである場合、PCR反応は、非対称PCRと呼ばれる。従って、増幅の程度は第１の成分の量に応じて変わり、該第１の成分の量は遺伝子産物の活性に依存する。
【００８８】
さらなる増幅が、両方のプライマーを同等の濃度で使用する、後続する対称PCRにより達成され得る。後続する増幅についてのプライマーは、第１のプライマー内に存在する核酸配列上の初めに存在することが好ましい(実施例で実証するような、ネスティッドPCR)。他の増幅技術も使用できる。
【００８９】
逆転写酵素PCR
RT-PCRを使用して、RNA標的を増幅する(Wangら, 1989)。このプロセスでは、逆転写酵素を使用して、RNAを相補的DNA(cDNA)に変換し、これはその後PCRを用いて増幅できる。本方法は、RNAウイルスの検出のために有用であることが証明されている。
【００９０】
本発明の方法は、増幅ステップにおいてRT-PCRを採用し得る。従って、レプリカーゼまたはその変異体をコードする核酸のプールは、RNAライブラリーの形態で得られ得る。このようなライブラリーは、区画化された細菌、哺乳動物細胞、酵母等においてin vivoで、または区画化されたDNAのin vitro転写により、生成され得る。増幅に必要な他の成分(ポリメラーゼおよび/または逆転写酵素、dNTP、プライマー)も、PCRについて上述したように区画化される。RT-PCR成分の第１の成分が存在する区画においてのみ、増幅が生じる。
【００９１】
核酸配列利用型増幅(NASBA)または自己持続性配列複製(3SR)
自己持続性配列複製(3SRまたはNASBA)は、酵素カクテルおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマーにより媒介される、逆転写酵素(RT)、ポリメラーゼおよびヌクレアーゼ活性の一連のラウンドを介する核酸鋳型の等温増幅を伴う(Guatelliら, 1990)。熱変性の代わりに、RNA/DNAヘテロ二重らせんのRNAの酵素的分解を使用する。RNアーゼHおよび全ての他の酵素を反応に加え、それ以上試薬を添加すことなく、全てのステップを同じ温度で生じさせる。このプロセスを経ると、106〜109の増幅が１時間で42℃にて達成できる。
【００９２】
従って、本発明の方法は、3SR等温増幅(Guatelliら, 1990)を、増幅ステップとして、PCR熱サイクリングの代わりに使用し得る。上述したように、3SRは、２つの酵素の協調作用を伴う；RNAポリメラーゼおよび逆転写酵素は、転写および逆転写の共役反応において協調し、RNAおよびDNAの両方の同時増幅を生じる。
【００９３】
リガーゼ連鎖反応(LCR)
リガーゼ連鎖反応またはライゲーション増幅系は、DNAリガーゼおよび４つのオリゴヌクレオチド(１本の標的鎖につき２つ)を使用する(WuおよびWallace, 1989)。オリゴヌクレオチドは、標的DNA上の隣接配列にハイブリダイズし、リガーゼにより連結される。反応は、熱変性され、このサイクルを繰り返す。
【００９４】
代替的増幅方法
本発明は、当業者に利用可能な任意の増幅技術の使用をさらに含む。このような技術としては、ローリングサークル増幅(Lizardiら, 1998)および鎖置換型増幅(SDA)(Walkerら, 1992b)が挙げられるがこれらに限定されない。これらの開示は、参照により本明細書に全体的に援用される。
【００９５】
核酸のエマルジョン増幅に関しては、上記プロトコールを改変することが都合が良いかもしれず、これは本発明の範囲内にあると想定される。例えば、本発明者らは、PCR増幅混合液にBSAを添加することにより、増幅の収率が向上することを見出した。従って、本発明は、タンパク質、核酸および他の成分を使用して、エマルジョン中の増幅反応の性能を高めることを含む。
【００９６】
核酸複製系のモジュレーター
本明細書で用いる「モジュレーション」とは、核酸複製系の活性を増加および減少させ、核酸をより多くまたはより少なく複製することを指す。複製系の活性は、特定の核酸(遺伝子エレメントに含まれる核酸であることが都合がよい)に関してモジュレートされることが好ましい。
【００９７】
モジュレーターは、複製反応を増強し得る；例えば、モジュレーターは、複製率を10％、20％、30％、40％、50％以上高めることができる。100％、200％以上の増加が都合がよい。同様に、複製反応に阻害をもたらすモジュレーターは、同様の量だけ複製率を減少させ得る。
【００９８】
広い実施形態において、核酸複製系のモジュレーターは、系の機能に必要な系の成分、または複製系の成分の活性を増加もしくは減少可能な試薬である。例えば、モジュレーターは、核酸増幅反応を生じさせる、核酸用のプライマーであり得る。核酸複製系は、典型的に、いくつかの成分を含み、その１つ以上が改変された遺伝子エレメントへの採用に適しうる。好適な実施形態では、所与の遺伝子エレメントに採用された成分のコピー数は、遺伝子エレメントに含まれる遺伝子の複製を限定して、複製される遺伝子の新しいコピー数を遺伝子エレメントの改変の程度に関連させる。
【００９９】
採用に適し得る成分の例としては、オリゴヌクレオチドおよびポリメラーゼ分子が挙げられるがこれらに限定されない。しかし、第１の成分は、別の核酸、塩、タンパク質または酵素等の他の成分であり得る。
【０１００】
核酸複製系に阻害をもたらすモジュレーターとしては、一般的に、複製系の活性成分と競合して、従って遺伝子エレメントに含まれる核酸に関して活性を低下させる分子が挙げられる。例えば、ジデオキシ停止プライマーまたは不活性ポリメラーゼ分子を使用し得る。
【０１０１】
好適な実施形態では、遺伝子エレメントの核酸成分を模倣し、従って競合によりその複製の程度を減少させる「ダミー」遺伝子を、改変されていない遺伝子エレメントに採用する。遺伝子エレメントに含まれる遺伝子と同じプライマー結合部位を含むダミー遺伝子は、改変されていない遺伝子エレメント(例えば、基質分子)に採用されることが都合が良い。(例えば、PCRにより)遺伝子を増幅する場合、ダミー遺伝子は、遺伝子エレメントに含まれる実際の遺伝子と、ヌクレオチドおよびプライマーについて競合する。
【０１０２】
遺伝子エレメント内に過剰量の改変されていない基質分子が存在する場合、過剰量のダミー遺伝子を採用し、ダミーおよび実際の遺伝子がヌクレオチドおよびプライマーについて競合するPCRにおいて、ダミー遺伝子が優先的に増幅される。一方、改変されていない基質分子が遺伝子エレメントに残っていない場合には、遺伝子エレメントに含まれる遺伝子は、ダミー遺伝子と競合することなくPCRにより効率的に増幅される。
【０１０３】
例えば、特定の配列上に作用する制限酵素を選択するために、変異型制限酵素をコードする遺伝子、および切断用に選択したい配列を含む多数のダミー遺伝子の両方でビーズを被覆する；この場合、ダミー遺伝子は、そのまま用いるのではなく基質を含むものとする。活性制限酵素はダミー遺伝子を切断するが、不活性酵素は切断しない。従って、活性制限酵素をコードする遺伝子は、ダミー遺伝子に妨害されずに増幅され、不活性酵素をコードする遺伝子は過剰量のダミー遺伝子との競合の中で増幅される。
【０１０４】
本発明は、遺伝子、ヌクレオチド、酵素等の成分(これらは、何らかにより、遺伝子エレメントに含まれる遺伝子の増幅に阻害を及ぼし、負の選択圧を発揮する)の使用をさらに想定する。
【０１０５】
核酸複製系の成分の使用
成分自体が、改変された遺伝子エレメントに結合できない場合には、改変された遺伝子エレメントに結合可能な結合部分に連結される。例えば、第１の成分がオリゴヌクレオチドプライマーである場合、プライマーは、改変された遺伝子エレメントに特異的に結合する抗体に連結され得る。成分と抗体との共有結合の場合のように、連結は直接的であってもよいし、または、成分は１つ以上の他の分子を介して抗体(もしくは改変された遺伝子エレメントに結合する他の部分)と連結され得る。例えば、成分がオリゴヌクレオチドプライマーである場合、ビオチン-アビジン架橋を介してビオチン化抗体に連結され得る。
【０１０６】
連結は、結合部分を第１の成分から分離させるように設計されてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドプライマーを、核酸増幅の直前に還元剤により切断され得るジスルフィド結合を介して抗体に連結し得る。別の例では、オリゴヌクレオチドプライマーを、抗体に直接連結した相補的オリゴヌクレオチドにアニールすることにより、抗体に連結させ得る；この場合、オリゴヌクレオチドの配列は、プライマーが、核酸増幅に必要な温度にて、(抗体に直接連結したオリゴヌクレオチドではなく)遺伝子エレメントに含まれる核酸遺伝子に優先的にアニールするように設計する。
【０１０７】
プライマーを抗体に結合させることにより、PCRプライマーを、抗原被覆プレートのウェルに特異的に採用する原理を、免疫ポリメラーゼ連鎖反応(免疫PCR)に使用して、抗原検出の感度が非常に高い手段を得る(Sanoら, 1992；Schweitzerら, 2000)。
【０１０８】
代替的な実施形態では、遺伝子エレメント中の遺伝子または遺伝子産物の所望の活性により、核酸複製系の１つ以上の成分が、遺伝子エレメントに直接付着し得る。例えば、二分子反応では、１つの基質が核酸複製系の成分を含むかまたはこれに連結して、該基質の反応により、核酸複製系の成分を含む生成物分子が生じ得る。核酸複製系の成分に連結していない基質は、遺伝子エレメントに、直接もしくはそれに結合する１つ以上の分子を介して連結し得るか、または遺伝子エレメントに連結されるようにし得る；例えば、脱保護された場合には遺伝子エレメントに結合する保護部分に連結され得る。
【０１０９】
区画化
増幅系の第１の成分を改変された遺伝子エレメントに選択的に付着した後、次の段階では、改変された遺伝子エレメントに含まれる核酸分子の増幅を行う。選択的増幅は、区画に、第１の成分の不在下では機能せず核酸分子を増幅しない増幅系の残った成分を加えることで達成される。説明としては、例えば、PCRは２つ(１つの「順方向」および１つの「逆方向」)のオリゴヌクレオチドプライマーを必要とする。第１の成分が順方向プライマーで、区画に加える増幅系が逆方向プライマー、ポリメラーゼおよびdNTPである(ただし、第１の成分ではない)第２のプライマーを含む場合、増幅は、遺伝子エレメントと会合した第１のプライマーを含む区画でのみ生じる。
【０１１０】
従って、明らかに、増幅ステップの前に、結合していない第１の成分を除去することが典型的に必要である。
【０１１１】
遺伝子エレメントは、その後、個別の区画に分けられる。区画に、核酸増幅に必要な(ただし第１の成分ではない)さらなる成分を付加する。これは、区画形成の前、途中または後に、適切な混合物を加えることにより達成され得る。
【０１１２】
好適な実施形態では、区画化は、例えばWO99/02671およびWO00/40712に記載されるように、複数の遺伝子エレメントを微小カプセル化することにより達成される。
【０１１３】
微小カプセルは、適切な物理的特性を必要とする。まず、遺伝子エレメントと核酸複製系の成分とが、微小カプセル間で確実に拡散しないように、各微小カプセルの内容物は、周囲の微小カプセルの内容物から単離されて、従って、実験の時間内で微小カプセル間で、遺伝子エレメントまたは核酸複製系の成分の交換が全くまたはほとんどないようにしなければならない。
【０１１４】
第二に、本発明の方法は、微小カプセルあたりの遺伝子エレメントの数が限られていることを必要とする。これにより、核酸複製系の結合した第１の成分が、改変された遺伝子エレメント内に含まれた遺伝子と会合したままで、かつ(改変されていてもいなくてもよい)他の遺伝子エレメントからは単離されることを確実にする。従って、改変された遺伝子エレメントに特異的に結合した核酸複製系の成分は、(改変されていてもいなくてもよい)他の遺伝子エレメントの増幅を生じない。富化係数(enrichment factor)は、微小カプセルにつき平均で１つ以下の遺伝子エレメントにおいて最大である。しかし、微小カプセルにつき平均で１つ以下の核酸分子という理論的に最適な状況を採用しない場合でも、微小カプセルにつき５、10、50、100または1000以上の遺伝子エレメントの比率は、大規模なライブラリーを分取する際に有益であり得る。異なる遺伝子エレメント分布での再度新たなカプセル化を含むその後の分取のラウンドにより、遺伝子エレメントのよりストリンジェントな分取が可能になる。微小カプセルにつき１つ以下の遺伝子エレメントであることが好ましい。各遺伝子エレメントは、１つの遺伝子、または同じ遺伝子の複数コピーしか含まないことが好ましい。
【０１１５】
第三に、微小カプセルの形成および組成によって、核酸複製系が機能可能にならなければならない。
【０１１６】
その結果、使用する全ての微小カプセル化系は、これらの要件を満たさなければならない。適切な系は、当業者には明らかであるように、本発明の各用途における要件の厳密な性質に応じて変化し得る。
【０１１７】
様々な種の微小カプセル化手順が利用可能であり(Benita, 1996)、本発明で使用する微小カプセルを作成するために使用してもよい。実際、200以上の微小カプセル方法が文献で明らかにされている(Finch, 1993)。
【０１１８】
これらとしては、脂質小胞(リポソーム)(New, 1990)および非イオン界面活性剤小胞(van Halら, 1996)等の膜エンベロープ化水性小胞、が挙げられる。これらは、単一または複数の二重層の非共有結合アセンブル分子の密封膜カプセルであり、各二重層は水性区画により隣と分離されている。リポソームの場合、膜は脂質分子からなる；これらは、通常リン酸脂質であるが、コレステロールなどのステロールも膜に採用され得る(New, 1990)。
【０１１９】
微小カプセルは、界面重合化および界面複合化によっても作製され得る(Whateley, 1996)。このような微小カプセルは、堅い、非浸透性膜、または半浸透性膜を有し得る。硝酸セルロース膜、ポリアミド膜および脂質-ポリアミド膜により境を接する半浸透性微小カプセルは全て、生化学的反応を支持できる。非常に穏やかな条件下で形成され得るアルギン酸塩/ポリリシン微小カプセル(LimおよびSun, 1980)も、非常に生適合性があり、例えば生存細胞および組織をカプセル化する有効な方法を提供することが証明されている。
【０１２０】
エマルジョン等のコロイド系中の水性環境の相分離に基づく非膜型微小カプセル化系も使用できる。
【０１２１】
本発明の微小カプセルは、エマルジョン（一方の相が、他方の中で顕微鏡またはコロイド状サイズの小滴として拡散している、２つの不混和性液体相の異種系(Becher, 1957；Lissant, 1974；Sherman, 1968)）から形成されることが好ましい。
【０１２２】
エマルジョンは、任意の適切な組み合わせの不混和性液体から生成され得る。本発明で使用するエマルジョンは、細かく分離された小滴の形態で存在する相(拡散、内部または非連続的な相)として(核酸複製系の生化学成分を含む)水、およびこれらの小滴が懸濁されるマトリックス(非拡散、連続的または外部の相)としての疎水性不混和性液体(「油」)を有することが好ましい。このようなエマルジョンは、「油中水型」(W/O)と称される。これは、生化学成分を含む水相全体が、見えない小滴(内部相)に区画化されるという利点を有する。外部相は、疎水性油であるため、通常、生化学成分は全く含まず、従って不活性である。
【０１２３】
エマルジョンは、１つ以上の表面活性剤(界面活性剤)を添加することで安定化され得る。これらの界面活性剤は、乳化剤と呼ばれ、水/油界面において、相が分離するのを防ぐ(または少なくとも遅らせる)ように作用する。多くの油および多くの乳化剤が、油中水型エマルジョンの生成のために使用できる；最近の開示では16,000を超える界面活性剤が列挙されており、その多くが乳化剤として使用されている(AshおよびAsh, 1993)。適切な油としては、白色軽鉱油、およびモノオレイン酸ソルビタン(SpanTM80；ICI)、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン(TweenTM80；ICI)、およびオクチフェノキシエトキシエタノール(Triton X-100)等の非イオン界面活性剤が挙げられる。
【０１２４】
陰イオン界面活性剤の使用も有益であり得る。適切な界面活性剤としては、コール酸ナトリウムおよびタウロコール酸ナトリウムが挙げられる。好ましくは0.5％ w/vの濃度以下のデオキシコール酸ナトリウムが特に好ましい。
【０１２５】
例えば、BSA等の他のタンパク質分子の添加も有益であり得る。例えば、PCRの効率は、10 mg/mlまでのBSA濃度の増加と共に高まることが認められた(実施例を参照)。
【０１２６】
エマルジョンの作製は、通常、相を強制的に混ぜるために、機械的なエネルギーの適用を必要とする。これを行うには、攪拌機(磁気攪拌棒、プロペラおよびタービン攪拌機、パドル装置、ならびにウィスク等)、ホモゲナイザー(ロータステータホモゲナイザー、高圧弁ホモゲナイザー、およびジェットホモゲナイザー)、コロイドミル、超音波および「膜乳化」装置を含む各種機械的装置を利用する様々な手法がある(Becher, 1957)。
【０１２７】
油中水エマルジョン中で形成される水性微小カプセルは、微小カプセル間の核酸分子またはポリペプチドの交換が少しあったとしても全般的に安定している。さらに、DNA複製を含むいくつかの生化学反応が、エマルジョン微小カプセル中で進行することが実証されている(WO99/02671、WO00/40712ならびに(Ghadessyら, 2001；TawfikおよびGriffiths, 1998))。さらに、複雑な生化学プロセス(とりわけ遺伝子転写および翻訳)も、エマルジョン微小カプセル中で活性である(WO99/02671、WO00/40712ならびに(TawfikおよびGriffiths, 1998)を参照)。何千リットルの産業的規模までもの容量でエマルジョンを作製する技術が存在する(Becher, 1957；Lissant, 1974；Sherman, 1968)。
【０１２８】
好ましい微小カプセルの大きさは、本発明に従って行う任意の個別の核酸複製プロセスの厳密な要件に応じて異なる。
【０１２９】
核酸複製のプロセスは、本発明で得る個別の微小カプセル内で生じなければならない。
【０１３０】
各微小カプセル中に存在するDNA分子の数は限定されるという要件のために、微小カプセルの大きさにより、選択され得るレパートリーの大きさが決定される。微小カプセルの大きさが大きいほど、所与の遺伝子エレメントライブラリーをカプセル化するのに必要な容量が大きくなる。なぜなら、最終的に限定する要因は、微小カプセルの大きさ、つまり１ユニット容量あたりに可能な微小カプセルの数であるからである。微小カプセルの平均容量は、5.2×10-13m3(直径100μm未満の球形微小カプセルに対応)であることが好ましく、5.2×10-16m3未満(直径10μm未満の球形微小カプセルに対応)であることがより好ましい。直径100μmの微小カプセルでは、1010区画(すなわち、1010遺伝子ライブラリーの選択に十分)は、合計カプセル化容量が5.2リットルとなる。直径10μmの微小カプセルでは、1010区画(すなわち、1010遺伝子ライブラリーの選択に十分)は、合計カプセル化容量が5.2 mlとなる。
【０１３１】
微小カプセル中の有効なDNAまたはRNAの濃度は、当業者に周知の様々な方法により人為的に増加することができる。これらには、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)等の化学物質を除いた量の増加が挙げられる。
【０１３２】
エマルジョンが熱安定性であること、好ましくは熱増幅手順で使用する温度(すなわち、約95〜100℃)までそしてそれ以上において熱安定性であることが、特に、使用する核酸複製系が高温度を必要とする場合には必要である。このような熱安定性エマルジョンの例は、実施例において挙げる(鉱油、Span-80、Tween-80およびTriton X-100を含む油中水型エマルジョン)。
【０１３３】
微小カプセルの大きさは、微小カプセル内において生じる必要がある生化学反応の必要とされる成分全てを収容するのに十分に大きくなければならない。
【０１３４】
スクリーニングする複数の核酸分子の複雑度および大きさに応じて、微小カプセル等の１区画につき１つまたは１つ未満の核酸分子がカプセル化されるようにカプセル化手順を設定することが有益かもしれない。これにより、最強の分解能(resolution)が得られる。しかし、ライブラリーがより大きくかつ/またはより複雑である場合、これは実行不可能であり得る；いくつかの核酸分子を共に区画化/カプセル化して、本発明の方法を繰り返し適用することによって、所望の結合活性の分取を達成することが好ましいかもしれない。区画化/カプセル化手順の組み合わせを使用して、所望の富化が得られ得る。
【０１３５】
特定の系の要件のために、核酸複製用の成分を以下から選択する；すなわち、適切な緩衝液、必要な成分、酵素および補因子を全て含む核酸複製系、核酸ポリメラーゼ、ヌクレオチド、(天然型または合成型)核酸、オリゴヌクレオチド、ならびに核酸改変酵素(ただし、改変された遺伝子エレメントに採用される第１の成分はこの中に含まれない)。
【０１３６】
適切な緩衝液は、その中で生物学的系の所望の成分の全てが活性であるもので、従って各特定の反応系の要件に依存する。生物学的および/または化学的反応に適した緩衝液は、当該分野で公知であり、(Sambrookら, 1989)等の様々な実験文献に手法が記載されている。
【０１３７】
遺伝子エレメントおよび核酸複製系の必要な成分を、個別の区画に分けた後、区画の温度を上昇(または低下)させて、核酸複製系が遺伝子エレメント内で遺伝子を複製可能にすることが必要となり得る。例えば、使用する核酸複製系がポリメラーゼ連鎖反応である場合、区画を温度サイクルに曝し、二重らせんDNAの溶解、プライマーアニーリングおよび伸長を促進することが必要である。さらなる例として、使用する核酸複製系が自己持続性配列複製(3SR)系の場合、区画の温度を37℃またはその付近で維持することが好ましい。
【０１３８】
核酸複製ステップ終了後、このように生成された核酸をプールする。例えば、区画が油中水型エマルジョン中の水滴からなる場合、これは、エマルジョンを適切な試薬(水飽和エーテル等)で分解し、水相を保持することにより達成される。
【０１３９】
非常に好適な実施形態では、使用する核酸複製系は、一方のプライマーを、改変された遺伝子エレメントに採用する第１の成分として使用するポリメラーゼ連鎖反応系である。例えば、遺伝子産物に触媒される反応により、基質が生成物に変換されて該生成物が遺伝子エレメントと会合する(またはしたままである)ような場合、プライマー成分は、抗生成物抗体-プライマー共役体(プライマーと抗体とが物理的に連結されている)により、改変された遺伝子エレメントに採用され得る。プライマーは、抗体(もしくは、生成物に特異的な任意の他のリガンド)に共有結合され得るか、または１つ以上の他の成分を介して(例えば、第１の抗体を認識する第２の抗体を介して、またはビオチンとアビジンもしくはストレプトアビジンとの相互作用、またはプライマー内の相補的配列と抗体に連結したオリゴヌクレオチドとの相互作用等の別の相互作用を介して)非共有結合的に会合される。この例では、区画において単離された遺伝子エレメント中の遺伝子の核酸複製は、遺伝子エレメントと会合した生成物分子の量に比例する量だけ遺伝子の増幅を生じる。
【０１４０】
第１の成分は、核酸複製の直前または途中で、結合部分から分離されることが望ましいかもしれない。例えば、プライマーは、ジスルフィド結合を介して抗体に連結されてもよく、これは、核酸増幅の直前に還元剤により、または過ヨウ素酸塩切断可能シス-ジオールを含む酒石酸ジスクシンイミジル(disuccinimidyl tartarate)等の架橋剤を介して、切断され得る。さらなる例として、オリゴヌクレオチドプライマーは、抗体に直接連結した相補的オリゴヌクレオチドへのアニーリングを介して抗体に連結し得る。オリゴヌクレオチドの配列は、核酸増幅に必要な温度において、プライマーが、(抗体に直接連結したオリゴヌクレオチドではなく)遺伝子エレメントに含まれる核酸遺伝子に優先的にアニール可能なように設計される；これは、核酸遺伝子(該核酸遺伝子とは、プライマーはその全長にわたり相補的である)よりも、抗体に連結したオリゴヌクレオチドが、プライマーとの短い相補領域を含むように設計することにより達成できる。
【０１４１】
さらに非常に好適な実施形態では、遺伝子エレメントは、改変された遺伝子エレメントに結合するプライマー分子を除くPCR核酸複製系の全ての成分と共に、熱安定性エマルジョンの個別の区画に分けられる。従って、遺伝子の二重らせんDNAコピーを生じる遺伝子の増幅は、第１の成分(プライマー)が結合する改変された遺伝子エレメントを含む区画以外では進行不可能である。改変された遺伝子エレメントを含む区画では、遺伝子エレメントに含まれる遺伝子は、改変の量に比例する量だけ増幅される。
【０１４２】
この手順により得られる遺伝子は、以下を含む(ただしこれらに限定されない)様々な手法において使用され得る。
【０１４３】
遺伝子は、任意の技術によりさらに増幅され、任意の技術によりクローニングされ、配列決定，発現もしくは任意の他の技術により特徴決定され、または任意の技術によりさらなる選択ラウンドに供され得る。これらはまた、以下を含む(ただしこれらに限定されない)任意の技術により突然変異され得る。すなわち、各種in vivo技術によるランダム突然変異誘発(大腸菌mutD5等の細菌の「突然変異誘発遺伝子株」の使用(Lowら, 1996)；およびＢリンパ球の抗体高度免疫系の使用(Yelamosら, 1995)が挙げられる)。ランダム突然変異はまた、化学突然変異誘発物質およびイオン化またはUV照射(Friedbergら, 1995)、または突然変異誘発物質塩基類似体の取り込み(Zaccoloら, 1996)により、in vivoおよびin vitroの両方において導入され得る。「ランダム」突然変異は、重合化の途中で、例えば変異性(error-prone)ポリメラーゼによりin vitroでも遺伝子に導入できる(Leungら, 1989)。さらなる多様化は、in vivo(Kowalczykowskiら, 1994)もしくはin vitro(Stemmer, 1994a；Stemmer, 1994b；Zhaoら, 1998)のいずれかでの相同組換え、または非相同組換え(Ostermeierら, 1999)を使用することにより導入され得る。このような突然変異は、遺伝子のさらなる増幅の前、後または途中に導入され得る。
【０１４４】
本発明の別の態様によれば、
(a)本発明により、核酸ライブラリーから１つ以上の核酸を選択するステップ；
(b)選択した核酸の突然変異および/または組み換えにより、遺伝子産物のレパートリーを任意にコードするさらなる核酸ライブラリーを生成するステップ；
(c)ステップ(a)および(b)を繰り返して、活性が増強した遺伝子または遺伝子産物を得るステップ、
を含む、試験管内進化の方法を提供する。
【０１４５】
使用
本発明の選択的増幅方法は、遺伝子産物をコードする核酸分子の定量的増幅を達成するために全般的な意味で使用され得る。従って、一態様では、本発明は、
(i)  遺伝子産物を任意にコードする核酸分子を含む遺伝子エレメントを用意すること；
(ii)  該核酸分子を任意に発現させて、該遺伝子産物を生成し、該遺伝子または遺伝子産物に該遺伝子エレメントを改変させること；
(iii)  改変された遺伝子エレメントに、該核酸分子の増幅に必要な少なくとも第１の成分を選択的に付着させること；
(iv)  核酸増幅用のさらなる成分を得て、該第１の成分が付着した改変された遺伝子エレメントに連結されている場合にのみ該核酸分子が増幅されるようにすること；
(v)  該遺伝子エレメントを多数の個別の区画に分けること；および
(vi)  核酸増幅を生じさせること、
を含む、遺伝子産物をコードする核酸配列を増幅する方法を提供する。
【０１４６】
しかし、本発明は、任意に遺伝子産物をコードする複数の核酸分子から、所望の特性を有する遺伝子産物を選択するのに最も有用である。特に、本発明の方法は、in vitro指向型進化技術に使用し得る。
【０１４７】
例えば、本発明の方法を使用して、所望の改変された遺伝子エレメントを選択的に認識する増幅系の第１の成分に連結する結合部分を得ることにより、それ自体が所望の活性を有するかまたは所望の活性(これは新規活性であり得る)を有する遺伝子産物をコードする核酸を選択し得る。核酸分子のライブラリーを、本発明の選択的増幅方法に供する場合、所望の改変を生じるかまたはコードする遺伝子産物が所望の改変を生じる核酸分子のみが増幅される。さらに、所望の改変を最も効率的に生じる核酸分子またはそれらがコードする遺伝子産物が最も増幅される。従って、所望の遺伝子産物が、選択的に増幅された遺伝子集合から単離され得る。
【０１４８】
別の実施形態では、選択的遺伝子増幅系を、特徴決定された遺伝子産物の指向型試験管内進化と共に使用して、その特性を改善または改変してもよい。この場合、複数の核酸分子は、部位特異的突然変異誘発に供されて遺伝子産物の特異的な領域を標的化しているか、またはコード配列全体にわたり完全にランダムな突然変異誘発に供されていてもよい。複数の核酸分子はまた、相同組換えまたは非相同組換えに供されていてもよい。次いで、遺伝子産物およびその変形体(変異体)をコードするライブラリーを、本発明の選択的増幅系を使用してテストし得る。すると、元の突然変異していない遺伝子産物とは異なる程度まで増幅されている変異体を選択し得る。例えば、元の突然変異していない遺伝子産物よりも活性的な変異体は、増幅が高いために選択され得る。
【０１４９】
複数ラウンドの選択/増幅を使用して、所望の遺伝子を富化させ、選択/増幅ラウンドの間に、該遺伝子をさらなるラウンドの突然変異および/または組換えに供してもよい。従って、比較的適度な活性の増加により、数ラウンドにわたり迅速に大量の遺伝子産物が増幅され得る。
【０１５０】
本発明はまた、本発明の方法を実施するためのキットを提供する。本発明のキットは、典型的に：(i)配列にコードされた遺伝子産物の発現を指令可能な調節配列に作用可能に連結されたコード配列をそれぞれ含む、複数の遺伝子産物を任意にコードする複数の遺伝子エレメントであって、該遺伝子または遺伝子産物の所望の活性は、直接的または間接的に、それらを含む/コードする遺伝子エレメントの改変を生じる、複数の遺伝子エレメント；(ii)該遺伝子または遺伝子産物の作用により改変された遺伝子エレメントに選択的に結合可能であるが、改変されていない遺伝子エレメントには結合しない核酸構築物の増幅に必要な第１の成分、を含む。
【０１５１】
典型的に、第１の成分は、核酸構築物からポリヌクレオチド重合化を開始可能な核酸プライマーである。複数の核酸構築物は、上述したように、典型的に、複数の核酸分子からなる。例えば、複数の核酸構築物は、所与の活性についてテストする遺伝子産物およびその変異体をコードし得る。好適な実施形態では、遺伝子エレメントは、微小球等の固相に付着した遺伝子、および任意に各種他の分子を含む。
【０１５２】
キットは、適切な緩衝液、パッケージング、およびキットを使用する際の指示書も含み得る。
【０１５３】
以下、本発明を、例示のみのものであり限定するものではない以下の実施例により説明する。
【０１５４】
本発明の全般的な実施例では、エマルジョン中の区画中の活性変異型酵素は、特定の数の基質分子を生成物分子に形質転換するのを触媒しており、これらは、図１に示すように、変異体をコードする遺伝子と共に微小球の表面上に固定化されている。数コピーのプライマーＡ(鋳型遺伝子の配列内(遺伝子の外側の保存された配列領域)で開始する)にそれぞれ連結した抗生成物抗体を、各微小球の表面に提示された生成物分子に(エマルジョンを分解した後)結合させる(ステップ１)。従って、生成物分子の数に比例する特定の数のプライマーが、各微小球に採用される。次いで、微小球を、プライマーＢのみを含むPCR反応混合液と混合し、少なくとも94℃の温度まで熱安定性であるエマルジョンの小滴に拡散させる(ステップ２)。プライマーＡおよびＢは一緒になって、遺伝子の増幅を可能にする。次いで、エマルジョンの温度をサイクルして、安定し癒着しないエマルジョンの区画内でPCR反応を生じさせる。各区画内で非対称PCRが生じる(ステップ３)；作製される遺伝子のコピー数は、存在するプライマーＡのコピー数により限定される。換言すると、作製される遺伝子の最大コピー数は、コードするタンパク質により形成される生成物分子の数の固定した倍数である。サイクリング後、エマルジョンを分解し(ステップ４)、必要であれば、ネスティングPCRプロセスにおいて遺伝子をさらに増幅させる。
【０１５５】
例えば、仮説的な状況において、１つの「+ve」遺伝子毎に100の「-ve」遺伝子が存在し得る(ここで、-ve遺伝子は、触媒的に不活性な変異体をコートし、+ve遺伝子は触媒的に活性な変異体をコードする)。+ve遺伝子によりコードされる酵素は、100分子の生成物の形成を触媒し、-ve遺伝子によりコードされるタンパク質はバックグラウンドに対する生成物の割合を増加せず、おそらく５分子の生成物を提供する。上記概説したPCR手順の後、各+ve遺伝子は100倍増幅され(各抗生成物抗体が単一コピーのプライマーＡを担持する場合)、各-ve遺伝子は５倍増幅される。従って、-ve対+ve遺伝子の新しい比率は100:1(20倍の富化)ではなく、5:1となり、これは、触媒代謝回転、対、非触媒代謝回転の比率に対応する。
【０１５６】
このスキームは、遺伝子の適応度(すなわち、再生の成功、または子孫の数)を、それがコードする酵素の代謝回転に直接関連させ、従って、自然選択が生物全体に働きかけるのと同様の様式で、遺伝子に直接選択の焦点を当てる。
【０１５７】
ここで検証するモデル系では、ビオチン化プライマーを、(活性酵素をコードする遺伝子を表す)「正の」遺伝子を担持するストレプトアビジン被覆微小球の表面上に固定化させる。(活性酵素をコードしない遺伝子を表す)「負の」遺伝子を担持する微小球を、正に対して負が100倍多くなるように、これらの「正の」微小球と混合させる。
【０１５８】
初期の実験は、所望の遺伝子の100倍富化が、１つの「正の」微小球につき、5,000〜10,000の固定化されたプライマーを使用して得られ得ることを示す。エマルジョンの区画内でのPCRの効率を高めるためにさらなる最適化を行う。さらに、例えば、多数のプライマー分子と共に、抗生成物抗体自体を非常に小さい微小球(直径0.1μm未満)に固定化することにより、１つの固定化生成物の分子につきより多くのプライマーを導入することが可能であるかもしれない。
【０１５９】
材料および方法
プライマー
T7プロモーターの上流にアニールするプライマー、pIVEXベクター
(T7プロモーターの上流に距離が近づいていく順番)
Imb2-1         5'ビオチン-CAGGCGCCATTCGCCATT3'
Imb2-5         5'ビオチン-CCAGCTGGCGAAAGGGGG3'
Imb2-7         5'ビオチン-AAGTTGGGTAACGCCAGG3'
Imb2-7sul      5'チオール-AAGTTGGGTAACGCCAGG3'
発現遺伝子の下流にアニールするプライマー(pIVBシリーズ)、pIVEXベクター
(遺伝子の下流から距離が離れていく順番)
pIVB9       5'TATCCGGATATAGTTCC
pIVB8       5'CACACCCGTCCTGTGGA
pIVB7       5'GTCGCCATGATCGCGTA3'
pIVB5       5'CCTGCTCGCTTCGCTAC3'
pIVB1       5'AGAAATTGCATCAACGC3'
微小球-特性および扱い
本明細書で使用する微小球は２種類ある：磁性微小球(直径2.8μm、Dynal)および非磁性ポリスチレン微小球(直径0.96μm、Bangs Laboratories)。両方のタイプともコロイド状懸濁液の形態であり、微小球は緩やかなピペッティングにより水相中に簡単に拡散される。磁性微小球は、磁石により水相から簡単に分離されるが、ポリスチレン微小球は、水相(上清)を除去する前に緩やかに遠心分離されてペレットを形成させなければならない。
【０１６０】
微小球のサンプルの濃度を測定するために、1 ml PBSの容量中の微小球の適切な希釈液のOD600を、Pharmacia Biotech Ultrospec 3000分光光度計を用いて測定する。標準曲線に対する比較により、濃度が測定される。
【０１６１】
微小球の洗浄
ポリスチレン微小球を洗浄するために、MSE Micro Centaur可変速度微小遠心分離機中で5,000rpmにて２分間懸濁液を遠心分離する。上清をピペットで除去し、ペレットを洗浄緩衝液中に再懸濁させる。
【０１６２】
一部の緩衝液は、その中で微小球が特に効果的に沈降できないという点で問題がある。このような緩衝液としては、洗浄および結合緩衝液(5 mM Tris(pH 7.4)；0.5 mM EDTA；1M NaCl)等、塩濃度の高いものが挙げられる。これらの場合、微小球と簡単にインキュベートした後、懸濁液を水に５倍希釈してもよい。すると、ほとんどの場合、微小球は普通に扱えるようになる。
【０１６３】
ビオチン化DNAおよびタンパク質を、ストレプトアビジン被覆微小球上に固定化する
ビオチン化DNAを、適切な濃度にて、TNT緩衝液(0.1 M Tris(pH 7.5)；0.15 M NaCl；0.05% Tween-20)中で微小球と、１時間室温にてインキュベートする。ストレプトアビジンで被覆した微小球が、DNAと結合する効率は約50％である；従って、１つの微小球につき１遺伝子の最終的な濃度のために、微小球を、２倍モル過剰量のビオチン化遺伝子とインキュベートする。
【０１６４】
PCR
PCR反応混合液は、各プライマーを500 nMずつ；dNTPをそれぞれ250μM；１×SuperTaq緩衝液；2.5ユニットSuperTaq(HT Biotechnology)を含んだ。小規模プラスミド調製物を、水にほぼ100倍または500倍希釈し、20×鋳型濃縮液として使用した。
【０１６５】
各PCRサイクルは、以下のステップから概して構成された：94℃にて１分間；55℃にて１分間；72℃にて２分間。反応は、通常25回サイクルされ、その後さらに５分間の伸長期(72℃にて)が続く。
【０１６６】
PCR生成物の濃度は、Pharmacia Biotech Ultrospec 3000分光光度計を使用して、OD260を測定することにより決定した。
【０１６７】
エマルジョン-Span/Tween
95 ml鉱油、4.5 ml Span-80(Fluka)および0.5 ml Tween-80を混合し、透明になるまで攪拌または振とうさせることにより油混合液を調製する。1 mlを、小型磁気攪拌棒を含む2 ml Biofreeze管(Corning)に分注し、エマルジョンを作製する前に氷上で少なくとも15分間冷やす。エマルジョン作製のために、5×10μlアリコートの水相を、それぞれのアリコート間で間髪あけず、油にピペットで入れて、その間1400 rpmにて攪拌する。最後のアリコートを油混合液に添加した後、攪拌を１分間続ける。それ以上は攪拌しないこと。エマルジョンが形成されると、混合液は不透明になるはずである。
【０１６８】
エマルジョン-Span/Triton
38 mlの鉱油、1.8 g Span-80(Fluka)および0.2 g Triton X-100(Fisher)を混合し、透明になるまで攪拌または振とうさせることにより油混合液を調製する。500μlの油混合液を、小型磁気攪拌棒を含む2 ml Biofreeze管(Corning)に分注し、エマルジョンを作製する前に氷上で少なくとも15分間冷やす。エマルジョン作製のために、50μlの水相を、エマルジョンに直接(すなわち、アリコートでではなく)ピペットで入れて、その間1000 rpmにて攪拌する。攪拌を５分間続ける。それ以上は攪拌しないこと。
【０１６９】
エマルジョンを分解する(Span/TweenおよびSpan/Triton)
エマルジョンを適切な試験管に移す。微小遠心分離機にて最高速度にて１分間沈降させる；透明な方の画分を可能なだけ除去する。(不透明なままであるはずである)残りを、200μl洗浄緩衝液(TNT)に再懸濁させる。1 mlヘキサンを添加する。激しく振とうする。微小遠心分離機にて最高速度にて約10秒間回転させる。透明な方の上層を除去する。1 mlヘキサンを添加し、繰り返す。このプロセスを、低層が不透明でなくなるまで繰り返す。十分な数の微小球が存在する場合には、ペレットが目に見えるであろう。最後に、試験管をSpeedvac中で回転させることにより残ったヘキサンを除去する。
【０１７０】
エマルジョン-熱安定性
95 ml鉱油、4.5 ml Span-80(Fluka)、0.4 ml Tween-80、および0.05 ml Triton X-100(Fisher)を混合し、透明になるまで攪拌または振とうさせることにより油混合液を調製する。400μlの油混合液を、小型磁気攪拌棒を含む2 ml Biofreeze管(Corning)に分注する。冷さないこと；室温のままでおくこと。エマルジョン作製のために、200μlの水相を、1.5分間かけて滴下し、1000 rpmにて攪拌する。その後、５分間攪拌を続ける。それ以上長くは攪拌しない。
【０１７１】
エマルジョンを分解する(熱安定性)
２容量(1.2 ml)のエーテルを、適切な試験管に入った油混合液に添加し、攪拌し、微小遠心分離機中で１分間最高速度にて回転させる。上相を除去し；低相を残す。
【０１７２】
エマルジョン区画中でのPCR
鋳型として使用したOPD-HA遺伝子を、プライマー1mb2-1およびpIVB1を用いて、ベクターpIVEX-OPD-HAから増幅した。
【０１７３】
PCR反応混合液を、合計容量250μlで調製する。200μlを使用して、上記節に記載したように、熱安定性油中水型エマルジョンを形成する。エマルジョンを形成した後、マイクロタイタープレートのウェルに等分(各ウェルにつき約90μl)し、各アリコートに鉱油を被せる。エマルジョンが鉱油から主に構成されている事実に関わらず、油を被せることが重要である；さらに上層を添加すること無しに、熱サイクリングの間にエマルジョンの最上部分は分解する。
【０１７４】
エマルジョンをサイクルにかける。各サイクルは以下のステップから構成される：94℃にて１分間；55℃にて１分間；72℃にて４分間。反応を25回サイクルさせ、その後さらに５分間の伸長期(72℃にて)が続く。アリコートをプレートから除去し、プールし、上述したように分解する。
【実施例】
【０１７５】
実施例１
微小球に固定化されたビオチン化プライマーおよび鋳型を用いた、溶液中での非対称PCR
非対称PCR
エマルジョン中の区画内での非対称PCRの成功の実行可能性を検証するために、単純なPCR実験を(溶液中で)行う。ここで、第２のプライマーの濃度は維持したまま、他方のプライマーの濃度を徐々に低下させる。ゲル電気泳動により、伸長される限定プライマーのパーセンテージを推定したところ、限定プライマーが低い濃度において、該プライマーが高い割合で伸長されることが示された(図２)。従って、このような非対称PCRは、エマルジョン-PCR選択スキームにおいて想定される低プライマー濃度においてもプライマー伸長を生じる。
【０１７６】
モデル系-アビジン-ビオチンを介して採用されるプライマー
本発明者らは、微小球上に固定化されたストレプトアビジンが、90℃にて加熱した際に、ビオチン化DNAを放出することを発見した。従って、上述した系に対する１つのアプローチとしては、図３に示すように、プライマーを、アビジン架橋を介して、ビオチン化抗生成物抗体に結合させることである。
【０１７７】
PCR反応の変性サイクルの間、このように固定化したプライマーは、抗体から解離しやすい；たとえそれが不可能であっても、抗体は生成物から解離し、変性し、プライマーを遺伝子と会合させる。
【０１７８】
モデル系として、ビオチン化プライマーを、１コピーの遺伝子と共に、ストレプトアビジン被覆微小球上に直接固定化させる。
【０１７９】
微小球上に固定化されたビオチン化プライマーを溶液PCR反応液中で伸長させる
プライマーＡ(lmb2-1.bio)を、飽和濃度にてストレプトアビジン被覆微小球上に固定化させる。微小球を、高塩濃度緩衝液で洗浄して、非結合プライマーを確実に除去する。PCR反応液を調製する。ここで(微小球が存在しない)溶液中に、１つは109の微小球を含み、１つは108の微小球を含み、１つはlmb2-1.bioプライマーを含む。全ての反応液は50μlの容量である。プライマーＡ(lmb2-1.bio)およびプライマーＢ(pIV-B1)でベクターpIVEX-OPD-HAから増幅された遺伝子OPD-HAを鋳型として、0.02 nMの濃度で導入する。反応液を、標準的なPCRプロトコールでサイクルにかける。生成物を、ゲル電気泳動により可視化する(図４)。
【０１８０】
この実験により、固定化ビオチン化プライマーがPCR反応液において伸長可能であること、およびプライマーが反応の間に放出されること(微小球はアガロースゲル中で移動しない)が確認される。
【０１８１】
実施例２
エマルジョン区画中でのPCR
エマルジョン反応液中で、OPD-HA遺伝子を鋳型として使用する。プライマーＡおよびＢの両方が溶液に入ったPCR反応液を用意し、乳化し、僅かに長い伸長期を含むように改変した(エマルジョンは所望の温度まで上昇するのに時間がかかり得る)プロトコールを使用したサイクルにかけた(様々な濃度のBSAを含めた)。生成物をゲル電気泳動により可視化する(図５)。PCRの効率は、BSAの濃度が10 mg/ml(使用した最高濃度)まで上昇すると共に高まる。
【０１８２】
モデル選択
OPD-HA遺伝子を+ve遺伝子として、DHFR遺伝子を-veとして選択した。４つの微小球の集合を以下の通りに調製した：
１．それぞれ１つのDHFR遺伝子を担持する微小球；
２．それぞれ１つのOPD-HA遺伝子を担持する微小球；
３．それぞれ１つのOPD-HA遺伝子を担持し、その後1000倍モル過剰量のビオチン化プライマーＡ(lmb2-1)とインキュベートされた(１微小球あたり500〜1000のプライマーを産生する可能性が高い)微小球。
【０１８３】
４．上記(３)と同様、ただし10,000倍モル過剰量とインキュベートされた(１微小球あたり5000〜10,000のプライマーを産生する可能性が高い)微小球。
【０１８４】
従って、OPD-HA遺伝子およびプライマーの両方で被覆された微小球は、プライマーを担持する抗生成物抗体が微小球に結合したケースを表す。
【０１８５】
1:100の比率でOPD-HA担持微小球およびDHFR担持微小球をそれぞれ含む３つの混合した集合を調製する；１つの混合集合はOPD-HA遺伝子のみを有する微小球を含み、他の２つはOPD-HA遺伝子および固定化プライマーＡの両方を、上記(３)および(４)に記載した２つの異なる濃度で有する微小球を含む。各混合集合から得た108微小球を、プライマーＡを欠くがプライマーＢおよび10 mg/ml BSAを含むPCR反応混合液に再懸濁させる。各PCR混合液をその後２つのアリコートに分ける；一方のアリコートは上述したように乳化してサイクルにかけ、他方はバルク溶液のまま同じようにサイクルにかける。その後、エマルジョンを分解し、溶液に入ったプライマーlmb2-5.bioおよびpIV-B7を使用し、鋳型として1μlの回収エマルジョン-PCR反応液または1μlのバルク溶液PCR反応液を使用して、ネスティングPCR反応を行う。生成物を、ゲル電気泳動で可視化する(図６Ａおよび６Ｂ)。
【０１８６】
溶液中でPCR反応を行った場合(図６Ａ)、DHFR遺伝子に対応するPCR生成物のみが目に見え、OPD-HA遺伝子の富化は見とめられない。しかし、熱安定性エマルジョンの区画中で行われたPCR反応の場合(図６Ｂ)、OPD-HA遺伝子に加えてプライマーlmb2-1.bioを担持する微小球を含む２つの反応液のそれぞれにおいてOPD-HA遺伝子の富化が見とめられ、これは5,000〜10,000のプライマーで被覆された微小球の場合のほぼ100倍である。プライマーを担持しない微小球上にOPD-HA遺伝子が固定化されている場合、富化はない。
【０１８７】
バルク溶液中では、DNAポリメラーゼで伸長されたプライマーは、反応液容積全体に自由に拡散でき、従って、OPD-HA遺伝子と同時固定化したプライマーは拡散してしまいDHFR遺伝子を発生(prime off)し得る。一方、エマルジョンの区画中では、プライマーは他の区画に拡散できないので、共に固定化されているOPD-HA遺伝子のみが増幅され、OPD-HA遺伝子の選択的富化が生じる。実験結果は、区画化が、熱安定性エマルジョン内で生じていることを実証する。5,000〜10,000のプライマーで被覆された微小球の場合には、ほぼ100倍の富化が得られた。さらなる最適化により、富化の効率を高めることができる；例えば、熱安定性エマルジョン中で形成された小滴は、先の実験で使用されたエマルジョン中で形成されたものよりも大きく、所与の微小球付近の局所的なプライマー濃度が、エマルジョン小滴の平均直径を小さくすることで高められ得ることを示した。
【０１８８】
実施例３
様々な量の限定プライマーがビーズ上に固定化されたエマルジョン中での非対称PCRの定量
N-FLAG-OPD-HA遺伝子をコードするビオチン化DNAを、直径1μmのストレプトアビジンで被覆された微小球上に、１微小球につき１遺伝子の濃度にて固定化する。次いで、ビオチン化プライマーlmb2-7を、様々な濃度で微小球上に固定化する。微小球を洗浄し、その後107微小球を200μlPCR反応液に移し、次いでこれを、先の実施例のように、乳化し、サイクルにかける。エマルジョンを分解し、200μl 25μg/ml酵母tRNA(Sigma)を添加してDNAのキャリアとして作用させ、水相を回収する。
PCRにより増幅可能なDNAの量を、原則的に(Gillilandら, 1990)に記載されているように、(プライマーlmb2-5およびpIVB5で、ベクターpIVEX-DHFR-HAから増幅された)遺伝子DHFR-HAを競合体とし、プライマーlmb2-7およびpIVB9を使用して、競合PCRにより定量する。図７に結果を示す。
【０１８９】
実施例４
ビオチン化プライマーを取り入れるための抗体-ニュートラビジン(neutravidin)共役体の調製
ビオチン化プライマーを抗体に取り入れる(そして、生成物特異的抗体に採り入れる)手段を得るために、化学的に架橋した抗体-ニュートラビジン共役体を以下のように調製する。
【０１９０】
１．5 mg/mlでDMFに入ったイミノチオレン(iminothiolane)(Sigma)を50μl、1 mlヤギ抗ウサギIgG(ヒト、マウスおよびラット血清タンパク質とは最小限の交差反応；Jackson)に、0.01 Mリン酸塩、0.25 M NaCl(pH 7.6)中に1.8 mg/mlの濃度にて添加し、混ぜながら30分間37℃にてインキュベートする。抗体を、PD-10カラム(AP Biotech)にかけ、PBS中に溶出させて精製する。
【０１９１】
２．2.5 mgスルホ-SMCC(Pierce)を、50μl DMSOに溶解し、10 mg/mlで水に入った750μlニュートラビジン(Pierce)に添加する。１時間室温にて混ぜながら反応させる。PD-10カラムにかけ、PBSに溶出させて精製する。
【０１９２】
３．ニュートラビジンおよび抗体を5:1または10:1モル比で(ニュートラビジンを過剰量にて)一緒に混合し、37℃にて１時間、その後４℃にて一晩反応させた。
【０１９３】
４．FreeZyme共役精製キット(Pierce)を用いて、製造元の指示に従って精製する。
【０１９４】
５．1 mg/ml BSAを添加して共役体を安定化させ、グリセロールを50％まで添加し、等分し、-20℃で保存する。
【０１９５】
実施例５
抗体-ニュートラビジン共役体でのビオチン化プライマーの採入れ
選択の一形式では、抗体に連結したプライマーを、活性酵素をコードする遺伝子を担持する微小球には連結しているが、不活性酵素をコードする遺伝子を担持する微小球に連結した基質分子には連結していない生成物分子に採り入れる。ここで、このプロセスをシミュレートする。
【０１９６】
酵素ホスホトリエステラーゼは、EtNP-Bz-Glu-ビオチン(WO00/40712に記載されるように原則的に調製されたビオチン化基質分子)の加水分解を触媒する。微小球に連結した生成物分子は、WO00/40712に記載されるようにウサギにおいて生じる蛍光抗生成物抗体により検出され得る。あるいはまた、生成物分子に結合した非蛍光ウサギ抗体は、抗ウサギIgG分子(AffiniPureヤギ抗ウサギIgG、ヒト、マウスおよびラット血清タンパク質とは最小限の交差反応性；Jackson Immuno Research)を添加することにより、検出し得る。
【０１９７】
抗体-ニュートラビジン-プライマー複合体を調製するために、13μlのプライマーlmb2-7(10μM濃度)を、30μl抗体-ニュートラビジンストック(実施例４のように調製)に添加し、45分間室温にてインキュベートする。１μlのＤ-ビオチン(500μMの濃度)を添加して、残っている全てのビオチン結合部位をブロックし、混合液をさらに30分間室温にてインキュベートする。
【０１９８】
微小球を、(プライマーlmb2-1およびpIVB1で、ベクターpIVEX-N-FLAG-OPD-HAから増幅した)遺伝子N-FLAG-OPD-HAで、１微小球につき１つの遺伝子の濃度にて被覆する。微小球を、１微小球につき、約3×106分子のビオチン化基質、ビオチン化生成物、またはビオチンと、さらにインキュベートする。次いで、微小球をPBS/T(0.1％ Tween-20を含むPBS)で３回洗浄し、最後に元の容量の10倍のPBS/Tに再懸濁させる。COVAp緩衝液(2M NaCl、0.04％ Tween-20、10 mMリン酸塩、0.1 mM p-ニトロフェノール(pH 6.5))に入った1:30希釈のウサギ血清(抗生成物抗体を含む)を、1.5 mg/ml BSAと共に、等量にて微小球に添加する。振とうしながら１時間室温にてインキュベートした後、PBS/T中で微小球を３回洗浄し、元の容量の10倍のPBS/Tに再懸濁させる。微小球を、超音波水浴に１分間入れる。次いで、１μlＤ-ビオチンを、108微小球ごとに添加し、混合液を室温にて10分間振とうしながらインキュベートする。108微小球につき、13μlの抗体-ニュートラビジン-プライマー混合液を、50μlの合計容量で、COVApに、1.5 mg/ml BSAと共に添加する。微小球を振とうしながら１時間室温にてインキュベートし、PBS/T中で３回洗浄し、SuperTaq緩衝液(HT Biotechnology)で１回洗浄し、最後に108微小球につき50μl SuperTaq緩衝液に再懸濁させる。
【０１９９】
1.25×107微小球を、プライマーpIVB8(lmb2-7を含まない)を含むPCR反応混合液に、容量250μlで添加する。それぞれ200μlのPCR混合液を、熱安定性エマルジョン中の水相(上記参照)として使用し、25回のサイクルにかける。エマルジョンを分解し、水相を回収し、N-FLAG-OPD-HA遺伝子の増幅の程度を、(Gillilandら, 1990)に原則的に記載されるように、(プライマーlmb2-5およびpIVB5で、ベクターpIVEX-DHFR-HAから増幅する)遺伝子DHFR-HAを競合体として、プライマーlmb2-7およびpIVB9を使用して、競合PCRにより評価する。図８に示す結果は、ビオチン化生成物を担持する微小球に連結したN-FLAG-OPD-HA遺伝子が、ビオチン化基質またはビオチンを担持する微小球に連結したものよりも多く増幅されたことを示す。これは、抗体-ニュートラビジン-プライマー複合体を使用して、生成物分子にプライマーを特異的に採用し得ることを示唆する。
【０２００】
実施例６
抗体-オリゴヌクレオチド共役体の調製
抗体に直接連結したオリゴヌクレオチドを以下の通りに調製した。
【０２０１】
１．1.5 mgスルホ-SMCC(Pierce)を、4.5 mg AffiniPureヤギ抗マウスIgG(Jackson Immuno Research)に、2.5 mlの容量で(0.01 Mリン酸塩、0.25 M NaCl(pH7.6))添加し、混合しながら１時間室温にてインキュベートする。
【０２０２】
２．PD-10カラム(AP Biotech)を使用し、3.5 ml PBSに溶出して、未反応SMCCを除去する。
【０２０３】
３．約140ナノモルのチオ化(thiolated)オリゴヌクレオチド(lmb2-7sul)を添加し、溶液を混合しながら２時間室温にて、その後一晩４℃にてインキュベートする。
【０２０４】
４．共役体を、FreeZyme共役体精製カラム(Pierce)上で、製造元の指示に従って精製する。
【０２０５】
５．共役体を、PD-10カラム(AP Biotech)にかけ、3.5 ml TBS中に溶出させてさらに精製する。
【０２０６】
６．オリゴヌクレオチドの連結を可視化するために、精製した共役体を、100 mlゲルにつき0.5μl GelStar(BMA Products)と共に、1.5％アガロース/TBEゲル上にかけ、オリゴヌクレオチドlmb-2-7およびlmb2-7sul、ならびに非共役抗体と比較する(図９)。
【０２０７】
実施例７
遺伝子の選択的増幅
ここで、生成物分子と会合した遺伝子を、基質分子と会合した過剰量の遺伝子から富化させる。
【０２０８】
最初、微小球を2500分子のビオチン化抗HA抗体(Roche, 3F10)で被覆し、遺伝子でコードされた酵素が微小球の表面上に捕捉される選択をシミュレートする。
【０２０９】
微小球を、(プライマーlmb2-5およびpIVB5で、ベクターpIVEX-DHFR-HAから増幅した)遺伝子DHFR-HAで１微小球につき１遺伝子の濃度にて、または遺伝子N-FLAG-OPD-HAで同じ濃度にて、さらに被覆する。DHFR-HA遺伝子で被覆した微小球を、１微小球につき約3×106分子のビオチン化基質と、さらにインキュベートする。一方、N-FLAG-OPD-HA遺伝子で被覆した微小球は、同量のビオチン化生成物とさらにインキュベートする。
【０２１０】
次に、微小球を、PBS/T(0.1％ Tween-20を含むPBS)で３回洗浄し、最終的に元の容量の10倍のPBS/Tに再懸濁させる。COVAp緩衝液(2M NaCl、0.04％ Tween-20、10 mMリン酸塩、0.1 mM p-ニトロフェノール(pH 6.5))に入った1:30希釈のウサギ血清(抗生成物抗体を含む)を、1.5 mg/ml BSAと共に、等量で微小球と添加する。振とうしながら室温にて１時間インキュベーションした後、微小球をPBS/T中で３回洗浄し、元の容量の10倍のPBS/Tに再懸濁させる。微小球を、超音波水浴に１分間入れる。次に、108微小球につき１μl D-ビオチンを添加し、混合液を振とうしながら室温にて10分間インキュベートする。108微小球につき、13μlの抗体-ニュートラビジン-プライマー混合液(実施例５を参照)を、1.5 mg/ml BSAと共に、合計容量50μlでCOVApに添加する。微小球を振とうしながら室温にて１時間インキュベートし、PBS/T中で３回、SuperTaq緩衝液(HT Biotechnology)中で１回洗浄し、最終的に108微小球につき50μl SuperTaq緩衝液中に再懸濁させる。
【０２１１】
微小球を1:10、1:100および1:1000の比率で混合する(N-FLAG-OPD-HA遺伝子被覆微小球：DHFR-HA遺伝子被覆微小球)。
【０２１２】
1.25×107微小球を、(lmb2-7は含んでいない)プライマーpIVB8を含むPCR反応混合液に、250μlの容量で添加する。それぞれ200μlのPCR混合液を、熱安定性エマルジョンの水相として使用し(上記参照)、25回のサイクルにかける。エマルジョンを分解し、水相を回収し、プライマーlmb2-7およびpIVB9を用いたその後のPCR反応の鋳型としてアリコートを採取する。比較のために、微小球混合液のアリコートを、同様のPCR反応液に直接入れる(最初はエマルジョン中で増幅させない)。
【０２１３】
これらのPCR反応液のアリコートを、アガロースゲル電気泳動により図１０に示すように可視化する。乳化PCR反応で使用した1:10微小球混合液の場合、(エマルジョン中での区画化無しに)直接増幅された1:10微小球混合液との比較により見とめられるように、DHFR-HA遺伝子と比べて、N-FLAG-OPD-HA遺伝子が明らかに富化されていた。
【０２１４】
上記明細書で言及した全ての文献は、参照により本明細書に援用する。本発明の範囲および思想から逸脱することなく、本発明の記載した方法および系の様々な改変および変更が、当業者には明らかであろう。本発明は、具体的な好適な実施形態に関連して説明してきたが、主張する本発明は、これらの具体的な実施形態に不当に限定されるべきではない。実際、分子生物学または関連する分野の当業者には容易に明らかな、記載した本発明を実施するためのモードの様々な改変が、請求の範囲の範囲内にあることを意図する。
【０２１５】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０２１６】
【図１】図１は、エマルジョン-PCR選択スキームを示す。
【図２】図２は、非対称PCR-様々な濃度にて伸長された限定プライマーの量のグラフである。
【図３】図３は、アビジン架橋および抗生成物抗体を介した、ビオチン化プライマーと微小球に固定化された生成物との付着を示すスキームを示す。
【図４】図４は、１つのプライマーが微小球上に固定化された、PCRの結果を示すゲルの写真。
【図５】図５は、様々な濃度のBSAでの、エマルジョン中でのPCRの結果を示すゲルの写真である。
【図６】図６は、(A)２ラウンドの(ネスティング)増幅後のエマルジョン-PCR反応生成物、(B)２ラウンドの(ネスティング)増幅後の溶液PCR反応生成物、を示すゲルの写真である。
【図７】図７は、エマルジョン中での遺伝子増幅の程度、対、プライマー分子の数のグラフである。
【図８】図８は、微小球上の生成物分子にプライマーを採り入れた遺伝子増幅の競合PCRによる推定を示すゲルの写真である。
【図９】図９は、オリゴヌクレオチドと抗体との連結を示すゲルの写真である。
【図１０】図１０は、過剰量のDHFR-HA遺伝子からの、N-FLAG-OPD-HA遺伝子の富化を示すゲルの写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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