(57)【要約】本発明はヒト由来遺伝子の先導配列、遺伝子ベクター及び遺伝子の表現する方法に関する。以下のものが含まれている：（１）ヒトＤ、Ｇ群染色体の短腕に重要な生理機能のないＤＮＡ配列、或いは該ＤＮＡ配列と５０％またはそれより高い相同性があるＤＮＡ配列を遺伝子の先導配列とする。（２）上記の先導配列を含んでいる遺伝子ベクターを構築する。（３）（１）に述べたＤ、Ｇ群染色体の核小体形成領域を標的部位とし、目的遺伝子を人体細胞のＤ、Ｇ群染色体の短腕に表現が活躍的な区域に導入する。本発明は一種新たな遺伝子の先導配列、また、それによって構築した遺伝子ベクター及び遺伝子の表現する方法を提供した。その遺伝子の表現する方法は人体遺伝子の治療及び蛋白質の調製に用いる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
重要な生理機能のある遺伝子配列が存在しないヒトのＤ、Ｇ群染色体の短腕のＤＮＡ配列、或いは、該ＤＮＡ配列と５０％またはそれより高い相同性のあるＤＮＡ配列から選ばれるヒト由来遺伝子先導配列。
【請求項２】
該配列が配列表１に示すＤＮＡ配列、或いは配列表１のＤＮＡ配列と５０％またはそれより高い相同性のあるＤＮＡ配列から選ばれることを特徴とする、請求項１記載のヒト由来遺伝子先導配列。
【請求項３】
配列表１の７５５９０位から７９４４８位まで、或いはそれと５０％またはそれより高い相同性のあるＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求項２記載のヒト遺伝子の先導配列。
【請求項４】
用いた遺伝子先導配列が請求項１或いは２で提供された先導配列であることを特徴とする、遺伝子ベクター。
【請求項５】
先導配列が配列表１の７５５９０位から７９４４８位まで、或いはそれと５０％またはそれより高い相同性があるＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求項４に記載の遺伝子ベクター。
【請求項６】
正及び負のスクリーニング遺伝子を含んでいることを特徴とする、請求項５に記載の遺伝子ベクター。
【請求項７】
そのＤＮＡ配列が配列表２に示されるものであり、ＴＫを負のスクリーニング遺伝子とし、正のスクリーニング遺伝子ＮｅｏをＧＬＳの１５００位に挿入し、ＧＬＳを１．５ｋｂと２．３ｋｂの両腕に分けて遺伝子ベクターを構築し、目的遺伝子の挿入部位は５９１０位であることを特徴とする、請求項６に記載の遺伝子ベクター。
【請求項８】
（１）ヒトＤ、Ｇ群染色体の短腕の上の重要な生理機能に関与しないＤＮＡ配列或いは該ＤＮＡ配列と５０％またはそれより高い相同性があるＤＮＡ配列を目的遺伝子の先導配列とし、遺伝子ベクターを構築する；
（２）目的遺伝子を上記の遺伝子ベクターに入れる；
（３）目的遺伝子を人体細胞のＤ、Ｇ群染色体の短腕の核小体形成領域の標的部位に導入する；
（４）目的遺伝子が体内或いは体外で細胞内に発現する、
からなる、遺伝子を発現する方法。
【請求項９】
その目的遺伝子の先導配列が配列表１に示されているＤＮＡ配列、或いはそれと５０％またはそれより高い相同性があるＤＮＡ配列から選ばれることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
その目的遺伝子の先導配列が配列表１の７５５９０位から７９４４８位まで、或いはそれと５０％またはそれより高い相同性があるＤＮＡ配列であることを特徴とする、請求項９に記載の遺伝子発現の方法。
【請求項１１】
その遺伝子ベクターが正と負のスクリーニング遺伝子を含んでいることを特徴とする、請求項１０に記載の遺伝子発現の方法。
【請求項１２】
その遺伝子ベクターのＤＮＡ配列が配列表２に示されているものであり、先導配列が配列表１の７５５９０位から７９４４８位までであり、ＴＫを負のスクリーニング遺伝子とし、正のスクリーニング遺伝子ＮｅｏをＧＬＳの１５００位に挿入し、ＧＬＳを１．５ｋｂと２．３ｋｂの両腕に分けて遺伝子ベクターを構築し、目的遺伝子の挿入部位は５９１０位であることを特徴とする、請求項１１に記載の遺伝子発現の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術の領域】
本発明は遺伝子の先導配列、その配列によって遺伝子ベクターを構築する方法、またそのベクターによって目的遺伝子をヒトの体内或いは体外の細胞に導入して遺伝子を発現させる方法に関する。
【０００２】
【技術の背景】
ヒトのメンデル性遺伝病の統計資料で、２０００年６月３０日まで確認された単一遺伝子による疾病が１６６０種あり、クローン化された疾病の遺伝子は９８９種ある。その中、劣性の遺伝病の多くは正常の遺伝子を患者の細胞に導入する方法で、遺伝子治療が行える可能性がある。研究が進むにつれて、優性遺伝病及び体細胞の突然変異による腫瘍にも遺伝子治療が採用され始めた。１９９５年に、アメリカの学者Ｅ．Ｍａｒｓｈａｌｌは雑誌Ｓｃｉｅｎｃｅに、新たなベクターの研究と発見が遺伝子治療を研究する核心問題であると発表したが、５年後の今日まで、遺伝子治療のベクター問題はまだ解決されていない。その主な原因は、研究者が今でもウイルス性エレメントでベクターを構築することから抜け出せないことにある。目下使用されているウイルス性ベクターは一般的に以下のような問題がある：
（１）不安定性：遺伝子の挿入効率が高くないので、一部のベクターは付加体の形で細胞の核内に存在し、細胞の分裂に伴って安定に遺伝することができない。それゆえ治療遺伝子は長く安定に発現することができない。
（２）安全性がよくない：例えば、無作為な挿入による突然変異は組み込み部位の正常な遺伝子の機能に影響したり、癌遺伝子を活性化する可能性があり、それによりほかの疾病或いは腫瘍を引き起こす。また、ウイルス性ベクターは複製能力のある野生型の組み換えウイルスを生じる可能性があり、生体に危害を加える可能性がある。近年、アメリカで行われている遺伝子治療の中、アデノウイルスベクターにより患者が死亡したという報道があった。
（３）免疫原性：ウイルス遺伝子による背景蛋白とウイルスベクターの精製過程で混入した蛋白質はどちらも生体に免疫反応を引き起こすことがあり、それにより治療遺伝子の発現に影響する。
【０００３】
８０年代の中期、相同性組換えの原理に基づく遺伝子標的ベクターが、部位特異的導入を行うために開発された。このベクターは免疫原性と無作為の組込みを避けることができるが、遺伝子治療および欠陥遺伝子修復に用いられる遺伝子の標的ベクターは、かならずその遺伝子の両側にある特定のＤＮＡ断片を先導配列として用いなければならない。それゆえ、その適用には制限があり、しかも導入の効率が非常に低い。通常は胚性幹（ＥＳ）細胞或いは受精卵細胞の遺伝子をノックアウトする（取り除くこと）には適しているが、成熟体細胞の部位特異的組込みには適していない（Ｇａｌｌｉ−Ｔａｌｉａｄｏｒｏｓ ＬＡ， Ｓｅｄｇｗｉｃｋ ＪＤ， Ｗｏｏｄ ＳＡ， ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １９９５， １８１：１−１５； Ｈａｓｔｙ Ｐ， Ｒｉｖｅｒａ−Ｐｅｒｅｚ Ｊ， Ｃｈａｎｇ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９１， １１（９）：４５０９−４５１７）。したがって、アメリカ人類遺伝子学会の前会長、エール大学医学部の学長Ｌｅｏｎ． Ｅ． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇは遺伝子治療の現状に対して、「数百の遺伝子治療実験の中で、今までしっかりした治療効果があるものは一例もない。」という結論を出した。（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ Ｌ Ｅ ＆ Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ Ａ．Ｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０００；２８７：１７５１）。
【０００４】
したがって、安定に遺伝でき、人体にどんな危害もなく、体外で操作できる遺伝子ベクターを発見、開発することは遺伝子治療にとって早急に解決されるべき問題である。
【０００５】
【発明の内容】
当出願人は１９８１年に、特別な双サテライト微小染色体（ｂｉ−ｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｍｉｃｒｏｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）（ＢＭ）を持つが、表現形は正常な２家系を発見した。該ＢＭは二つの家系でそれぞれ二世代と三世代の間安定に遺伝し、且つ人体にどんな危害もない。当時、国際的資料を調べたところ、欧米諸国でもこういう家系についての報告が７つあることが分かった。今まで報告されたこのような家系は１７あるが、該染色体を材料として、ヒト由来遺伝子ベクターを組み立てようという構想を出した人は一人もいない。当発明人は１９９１年に該微小染色体のエレメントを分離して、ヒト由来遺伝子ベクターを組み立てようという構想をたて、１９９４年にプロジェクトを立ち上げ、１９９５年に具体的にプロジェクトを実施し始めた。研究の中、ＦＩＳＨ技術を用い、該ＢＭがヒトのＤ、Ｇ群染色体即ち１３、１４、１５、２１、２２番染色体の短腕に由来することが明らかになった。Ｄ、Ｇ群染色体短腕は核小体形成領域を有し、リボゾームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）が豊富である。該領域は集団中で長さが多型（即ちｒＤＮＡの含有量が異なる）であって、且つ細胞分裂期には該領域の遺伝子の転写が非常に活発である。したがって、当出願人はＢＭから特異性のあるＤＮＡ断片をクローン化したものを目的遺伝子の先導配列にして、目的遺伝子を人体Ｄ、Ｇ群染色体短腕の核小体形成領域に部位特異的に導入（定点導入）すれば、該遺伝子の発現は効果的、安定かつ無害であると推測した。その後に続く実験はこれをはっきりと証明した。
【０００６】
ＢＭ染色体を発見し、ヒトＤ、Ｇ群染色体短腕の核小体形成領域と相同性のある特異的ＤＮＡ断片をクローン化することは非常に意義があるものである。
【０００７】
当発明人はまず、顕微解剖法を用いて、ＢＭ特異的ｐＵＣ１９ライブラリーを構築し、それをスクリーニングしてシングルコピーの断片を選び出した。このシングルコピー断片がＤ、Ｇ群染色体短腕に由来することが、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により明らかになった。さらに、このシングルコピー断片をプローブとして、ヒトのＰＡＣゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、約１２０ｋｂのＢＭ特異的ＤＮＡ断片（ＢＭＳＦ）を取得した（配列１）。これはＦＩＳＨでＢＭとＤ、Ｇ群染色体の短腕からきたことが証明された（図１）。配列決定し、ＢＭＳＦの配列の特性を分析したところ、重要な生理機能とかかわっている遺伝子は見出されなかった。それゆえ、これは標的部位として安全である。
【０００８】
したがって、当出願人は下記のように考えている：ヒトＤ、Ｇ群染色体の短腕上の重要な生理機能がない遺伝子のＤＮＡ 配列、或いは該ＤＮＡ 配列と５０％またはそれより高い相同性があるＤＮＡ 配列から選んだ先導配列を目的遺伝子の先導配列とするのは発明の目的にかなっている。例えば、遺伝子の先導配列を配列表１に示したＤＮＡ配列から選ぶ。配列表１に記載されたＤＮＡ配列はヒト由来である。
【０００９】
上記の約１２０ｋｂのＤＮＡ断片、或いは上述の特性をもつ約１２０ｋｂのＤＮＡ断片の中からもっと小さくて特異性のよいＤＮＡ断片を選んで遺伝子の先導配列とすることができる。例えば、実施例では配列表１から７５５９０位から７９４４８位までの、長さ３．８ｋｂのＤＮＡ断片を選んで遺伝子先導配列（ＧＬＳ）とした。遺伝子ベクターを構築するために、遺伝子ベクター中に正、負のスクリーニング遺伝子を含むことができる。
【００１０】
さらに具体的には、配列表１中７５５９０位から７９４４８位までの、長さ３．８ｋｂのＤＮＡ断片を遺伝子の先導配列（ＧＬＳ）として、ｐＧＥＭ−ＴＫベクターに導入し、ＴＫを負のスクリーニング遺伝子とし、正のスクリーニング遺伝子としてＮｅｏ遺伝子をＧＬＳの１５００位に挿入し、ＧＬＳを１．５ｋｂと２．３ｋｂの両腕に分け、遺伝子ベクターを構築する。遺伝子ベクターを含む菌株は２０００年９月２９日にすでに中国典型培養物保蔵中心（中国、武漢、武漢大学内、郵便番号４３００７２）に保存された。保存番号：ＣＣＴＣＣＭ２０００３０、保存機関が指定した分類名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ＪＨ−４／ｐＮＳ２。図２に示すようにそのＤＮＡ配列は配列表２に記載されている。
【００１１】
本発明の提供する、配列表１から選ばれたＤＮＡ先導配列はＤ、Ｇ群の染色体短腕の特定部位に由来するので、それによって構築された遺伝子ベクターは目的遺伝子を上述の特定部位に導入することができることに疑いなく、さらに該特定部位のＤＮＡ断片は重要な生理機能に関係する遺伝子を含まないので、目的遺伝子の導入は安全である。
【００１２】
上記の発明技術の計画に基づき、当出願人がさらに提出する遺伝子発現方法は次の手順を含む：
（１）ヒトＤ、Ｇ群染色体の短腕上にあって重要な生理機能に関わらない遺伝子のＤＮＡ 配列、或いは該ＤＮＡ 配列と５０％またはそれより高い相同性があるＤＮＡ 配列を、目的遺伝子の先導配列とし、遺伝子ベクターを構築する。
（２）目的遺伝子を上記の遺伝子ベクターに入れる。
（３）目的遺伝子を宿主細胞のＤ、Ｇ群染色体の核小体形成領域の標的部位に導入する。
（４）目的遺伝子を体外または体内の細胞で発現させる。
【００１３】
上述の手順の中、遺伝子ベクターの構築、目的遺伝子を遺伝子ベクターに入れること、目的遺伝子を宿主細胞に導入すること、及び目的遺伝子の発現過程を実現することは現有の技術によってできる。
【００１４】
その中で、目的遺伝子の先導配列は配列表１に示すＤＮＡ配列から選ぶことができる。さらに、目的遺伝子の先導配列は配列表１中の７５５９０位から７９４４８位までである。
【００１５】
上述の遺伝子先導配列を用いて、正と負のスクリーニング遺伝子を含むベクターを構築することができる。
本発明の実施例２、３は上述の過程を説明している：
▲１▼ＴＫを負のスクリーニング遺伝子として、約１２０ｋｂのＢＭＳＦ選択特異性の高い３．８ｋｂのＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−ＴＫプラスミドベクターにサブクローニングし、同時に３．８ｋｂのＤＮＡ断片の中に正のスクリーニング遺伝子Ｎｅｏを挿入して、遺伝子ベクターを構築する。
▲２▼目的遺伝子を選んで酵素で切断した後、Ｎｅｏ遺伝子の端にある外来遺伝子のクローン部位に連結する。ＰＣＲで、各部分の存在と方向を証明する。
▲３▼ｐＧＥＭベクターから単一酵素切断部位を選んで遺伝子ベクターを線状化し、電気穿孔或いはリポソームトランスフェクションの方法で標的細胞に導入する。▲４▼Ｇ４１８とＧＣＶを使って、形質転換された標的細胞に対して、正と負のスクリーニングを行い、定点組込みの陽性細胞クローンを得る。
▲５▼陽性細胞クローンについて、目的遺伝子の発現を検出して、最終的にＤ、Ｇ群染色体の短腕への目的遺伝子の定点組込み、安定発現を達成する。
【００１６】
スクリーニングで得られた目的遺伝子の発現が陽性の細胞を皮下包埋或いは静脈注射の方法で患者に体内に導入する、或いは目的遺伝子のベクターをリポソ−ムで包んで直接患者の体内に注入して、目的遺伝子を患者の体内に長く且つ安定に発現させ欠陥遺伝子による臨床症状を直す。
【００１７】
本発明の実施例の中に提供した遺伝子ベクターのＤＮＡ配列は配列表２のようである。その中、先導配列が配列表１の７５５９０位〜７９４４８位であり、ＴＫを負のスクリーニング遺伝子として、正のスクリーニング遺伝子をＧＬＳの１５００位に挿入し、ＧＬＳを１．５ｋｂと２．３ｋｂの２つに分け、遺伝子ベクターを構築する。目的遺伝子の挿入部位は５９１０位である。本発明の実施例では、目的遺伝子として血栓性疾病の治療に用いられる組織型プラスミノゲンアクチベーター遺伝子（ＴＰＡ）および血友病Ｂの凝血因子ＩＸ遺伝子（ＦＩＸ）のＨＴ１０８０細胞内でのインビトロ発現を公開した。実験はその発現が有効且つ安定であることを証明した。
【００１８】
したがって、本発明が提供する遺伝子の発現方法は応用面で非常に有望である。薬用蛋白質の製造に用いるだけでなく、遺伝子治療の有効な方法を提供するものである。
【００１９】
本発明人は新規な、人体に無害な染色体を独特な材料として、まったく新しい研究路線に出ることになった。該発見は世界ではじめてヒトＤ、Ｇ群染色体短腕核小体形成領域がヒトの遺伝子治療と遺伝子発現の一番よい標的部位（１３、１４、１５、２１、２２号の染色体短腕核小体形成領域の１０個の標的部位）であることを発見し、一種の目的遺伝子をこれらの標的部位に定点導入することができる新たなベクター―ヒト由来遺伝子ベクター―を構築した。
【００２０】
本発明は従来技術と比べて下記の著しいメリットを持っている：
１．安定性がよい：請求項１或いは２に示したＤＮＡ配列を遺伝子の先導配列としてベクターを構築することにより、ヒト由来遺伝子ベクターは目的遺伝子をヒト体細胞のＤ群とＧ群の染色体短腕上に定点挿入でき、目的遺伝子を染色体によって安定に遺伝させることができる。
２．安全性がよい：標的部位に重要な生理機能に関わる遺伝子がないため、該標的部位が安全だということは証明された。同時にＦＩＳＨでベクターが目的遺伝子を部位特異的に細胞中の安全な標的部位に挿入できることも確認した（図３、４）。これにより無作為の挿入による突然変異を除外し、野生型ウイルスの危害も存在しない。目的遺伝子は標的部位での発現は安全である。本発明は遺伝子の発現方法の臨床証明を提供しなかったが、出願人及び国内外の研究者たちの発見した実例はほかの角度からその安全性を証明した。（実施例４）
３．発現の効率が高い：第一に、本発明の提供した遺伝子ベクターはＤ、Ｇ群染色体短腕に由来する先導配列を含む。それゆえに、対応して人体細胞の中には１０個の標的部位が存在し、挿入効率はほかのベクターより少なくとも５〜１０倍高くなる。第二に、先導配列は遺伝子の転写が活発なＤ、Ｇ群染色体の短腕からきたため、標的部位へ導入された目的遺伝子は効率よく発現される。
４．免疫原性がない：該ベクターはヒト由来なので、人体に用いても免疫原性を生じることはない。
【００２１】
【実施例】
本発明が提供する実施例は本発明を実施する方法の１つであって，本発明を限定するものではない。
【００２２】
実施例１
本発明が提供する遺伝子先導配列の調製：
１．遺伝子先導配列を含むＰＡＣクローンの取得
１．１　顕微分割、ＰＣＲ、マイクロクローニングでＢＭ特異的ｐＵＣ１９ライブラリーを構築する（Ｄｅｎｇ Ｈ−Ｘ， Ｙｏｓｈｉｕｒａ Ｋ， Ｄｉｒｋｓ ＲＷ， ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． １９９２、８９：１３）
１．２　ＢＭ特異的シングルコピーＤＮＡの取得及び鑑定
（１）コロニー点陣膜の調製：２枚のナイロン膜の上に１４×１４の格子模様を画き、それぞれＡ、Ｂと表記し、ＬＢ固形培地の入った２枚のシャーレに置く。そして、ライブラリーのシャーレから無作為に白いクローンを１４×１２個選び、それぞれ座標が同じになるように２枚の膜に移植する。第１３行の点には１００ｎｇのシングルコピーＤＮＡを陽性対照として置き、第１４行の点には１００ ｎｇのｇＤＮＡを陰性対照としておく。２つのシャーレはそれぞれ３７℃で１０〜１２時間培養する。Ｂ膜は４℃で保存し、Ａ膜はシャーレから取り出し、以下の溶液に浸した濾紙で順次処理する。１０％ＳＤＳ、５分間、０．５ＮＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌ、３分間、１．５Ｍ ＮａＣｌ／０．５Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ 、３分間、２×ＳＳＣ／０．２Ｍ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ、１０分間。 ８０℃真空の状態で２時間乾燥し、３７℃で保存する。
【００２３】
（２）ｇＤＮＡプローブの調製
ｇＤＮＡ を５０〜７５ｎｇ取り、無菌水を加えて１１ｍｌにし、１００℃で１０分間沸騰させて変性させる。下記の系でランダムプライマー標識反応を行う。
２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ−）　　　　　　３ μｌ
プライマー混合物　　　　　 ２ μｌ
クレノウ酵素　　　　　　　 １ μｌ
α−３２ｐ−ｄＡＴＰ　　　　　　　　 ３ μｌ
均一に混ぜて、３７℃で３０分インキュベートする。停止混合物（Ｓｔｏｐｍｉｘｔｕｒｅ）を８μｌ加え、Ｇ−５０カラムを通してプローブを精製し、１／１０を取って液体シンチレーションを測定する。
【００２４】
（３）交雑（ハイブリダイゼーション）：
コロニー点陣膜を２×ＳＳＣの中に１０分間浸して、そっと表面のコロニー残渣をふき取る。そして、６５℃の状態で５ｍｌの交雑液中３０分以上予備交雑する。液体シンチレーション値によって、１．２×１０６ ｃｐｍ／ｍｌ交雑液となるような量のプローブ液を取って、１００℃の状態で１０分間沸騰させ変性させる。それから、新鮮な交雑液５ｍｌを加え、６５℃の状態で、コロニー点陣膜と１２時間以上交雑する。以下の条件で膜を洗う：２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、室温１０分間、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃の状態で１０分間、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃の状態で１０分間、−７０℃でオートラジオグラフィ―を行う。交雑の信号がない、或いは弱い場合は一応シングルコピーだと考えられる。
【００２５】
（４）配列の測定およびサザンハイブリダイゼーション検定：
交雑信号のないクローンをＢ膜の対応位置からとり，少量を増殖させてプラスミドＤＮＡを抽出して配列を決定する。それをＧｅｎＢａｎｋデータベースと比べて、類似性がないならシングルコピーだと思われる。最後に、ＥｃｏＲＩ酵素で挿入ＤＮＡを切り出して、ランダムプライマー法によりα−３２Ｐ−ｄＡＴＰ標識してＥｃｏＲＩ消化したｇＤＮＡとナイロン膜転移交雑させる。方法は上記と同じである。交雑帯が１本か２本あるものを、シングルコピーとする。
【００２６】
１．３　ＢＭ及びＤ、Ｇ群染色体短腕特異的ＰＡＣクローンの取得と鑑定：
（１）ヒトＰＡＣｇＤＮＡライブラリーをスクリーニングし、陽性クローンの番号を得る
２６０ｂｐのシングルコピーのプローブＰ８−７をランダムプライマー法によりα−３２Ｐ−ｄＡＴＰで標識する→Ｇ−５０カラム（中粒度）で精製→４℃に保つ→７枚のＰＡＣ膜を２×ＳＳＣの中に１０分間浸す→５５℃で、３時間予備交雑をする→プローブを１００℃で１０分間変性させる。→４．６×１０５ｃｐｍ／ｍｌになるよう５０ｍｌの市販の交雑液を加え、ＰＡＣ膜と６５℃で一時間交雑させる→膜の洗浄：２×ＳＳＣ、室温で１０分間１回、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃で１０分間２回→Ｘ線フィルムをのせ−７０℃で１２時間オートラジオグラフィーをする→Ｘ線フィルムを現像する→取り扱い説明書によって陽性のクローンの番号を読み取る。
【００２７】
（２）５つの別々のプレートから無作為に陽性のクローンの番号を選び出し、それらのＰＡＣクローンを購入する。
１．４　ＰＡＣＤＮＡとＭ期細胞のＦＩＳＨ交雑は、Ｄ、Ｇ群染色体短腕由来であることを証明する。図１参照。
上記の実験の方法は《分子クローニング実験ガイドブック》（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．１９８９）を参照。
【００２８】
２．遺伝子先導配列ＤＮＡの取得
主要材料：β−アガロース（Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）　ＮｏｔＩ アガロース
▲１▼　　Ｎｏｔ Ｉ酵素でＰＡＣ１６９プラスミドを切断。
▲２▼　　ＰＦＧＥで約１２０Ｋｂの挿入ＤＮＡを分離する。
バルス電気泳動の条件：電極の緩衝液：０．５×ＴＢＥ、高強度分析用アガロース： （Ｂｉｏ−Ｒａｄ， 低融点アガロース ＬＭＰ）１％、切り替え時間：２〜１５秒；電気泳動の時間：１８時間；電圧：６Ｖ／ｃｍ；角度：１２０°温度：１４℃
▲３▼　　電気泳動が終わった後、ＥＢで３０分間染色する（０．２ μｇ／ｍｌ）。マーカーに基づいて、無菌の安全かみそりで約１２０ｋｂのバンドを切り取る。
▲４▼　　切り出したゲルをβ−アガラーゼで処理し、エチルアルコールで沈殿させる。
【００２９】
実施例２
本発明が提供する遺伝子ベクターの調製：
１．遺伝子ベクターの構築及び目的遺伝子の導入
１．１．　ベクターの構築
１．１．１　ＮｓｉＩとＳｔｕＩ（平滑末端酵素）でＰＡＣ ＤＮＡを切る。普通のアガロースゲルを用いて３．８ｋｂのＤＮＡ断片を回収する。電気溶出し精製する。
１．１．２　ＨｉｎｄＩＩＩ酵素でｐＧＥＭ−ＴＫのベクターＤＮＡを切る。クレノウ酵素で平滑にする。平滑末端が１つできる。
１．１．３　さらに、ｐＧＥＭ−ＴＫ／ＨｉｎｄＩＩＩ平滑化産物をＮｓｉＩ酵素で切る。
１．１．４　３．８ｋｂ／ＮｓｉＩ＋ＳｔｕＩ精製産物とｐＧＥＭ−ＴＫ／ＨＫ＋ＮｓｉＩ酵素切断産物とを１６℃で１７時間連結させる。
【００３０】
１．１．５　連結産物でＪＭ１０９コンピテント細菌を形質転換し、アンピシリンシャーレで３７℃、１８時間培養する。
１．１．６　無作為にシングルクローンを選び、ＮｓｉＩ及びＮｈｅＩの酵素で切断して、陽性のクローンを鑑定する。
１．１．７　ＸｂａＩとＮｈｅＩの２酵素でｐＣＤＮ−ＧＰＲプラスミドを切り、Ｎｅｏ／ＸｂａＩ＋ＮｈｅＩを取得する。
１．１．８　Ｎｅｏ／ＸｂａＩ＋ＮｈｅＩをｐＧＥＭ−ＴＫ−３．８ｋｂ／ＮｈｅＩに連結し、ＰＮＳ２遺伝子のベクターを構築する。
【００３１】
２．１　ＴＰＡ／ＦＩＸの導入：
２．１．１　ＴＰＡ／ＦＩＸ（ＣＤＳ）をｐｃＤＮＡ３．１（−）にクローニングする。
２．１．２　プライマーＴＰＣＦとＴＰＣＲを設計し、ＴＰＡ／ＦＩＸ遺伝子及び発現エレメント（ＣＭＶプロモーターとＢＧＨ ポリＡシグナル）を増幅し、両脇にＡｖｒＩＩ酵素の切断部位を導入する。プライマーの配列は：
2004508046.tif 000002
【００３２】
２．１．３　ＡｖｒＩＩ酵素で遺伝子ＴＰＡ／ＦＩＸ及び発現エレメント（ＣＭＶプロモーターとＢＧＨ　ｐｏｌｙ Ａ 信号）を切る。それをＮｈｅＩ酵素で切断したｐＮＳ２ベクターに連接する。
上記の実験の方法は《分子クローニング実験ガイドブック》に詳しい。（Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ． Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．１９８９）
【００３３】
２．遺伝子ベクターＤＮＡの抽出
２．１　材料
２．１．１　ＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ
２．１．２　培地：ＬＢ液体培地
トリプトン　　　５ｇ
イーストエキス　２．５ｇ
ＮａＣｌ　　　　２．５ｇ
ｄｄＨ２Ｏで５００ｍｌに
高圧蒸気滅菌
【００３４】
２．１．３　アンピシリン（ＡＭＰ）：１００ｍｇ／ｍｌ　（１０００×）
２．２　方法：
１）陽性シングルクローンを選び３ｍｌのＬＢ（Ａｍｐ＋）で３７℃、２５０ｒｐｍで１時間培養する。
２）上記の初代培養物を１００μｌ取り、１００ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋）の中に入れ、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養する。
３）　４℃で、６０００×ｇで１５分間遠心し、細菌を取得する。
４）　１０ｍｌのバッファーＰ１に菌体を再懸濁する。
５）　１０ｍｌのバッファーＰ２を入れ、軽く６回反転し、均一に混合させる。室温で５分間放置。
６）　氷上で予備冷却したバッファーＰ３を１０ｍｌ入れ、軽くて６回反転し、均一に混合させる。氷上で２０分間。
７）　４℃で、２００００×ｇで３０ 分間遠心する。
８）　上澄み液をもう一つの４０ｍｌ高速遠心管に速やかに移し、４℃、２００００×ｇで再び遠心する。
９）　１０ｍｌのバッファーＱＢＴ でＱＩＡＧＥＮ ｔｉｐ ５００を平衡化する。
１０）　上澄み液をＱＩＡＧＥＮ ｔｉｐ ５００に移し、カラムを通過させる。
１１）　２×３０ｍｌのバッファーＱＣでカラムを洗う。
１２）　１５ｍｌのバッファーＱＦで溶出し、溶出液を集める。
１３）　溶出液に（０．７倍の容積の）１０．７ｍｌのイソプロパノ−ルを入れ、均一に混合させる。
１４）１５０００×ｇ、４℃で３０分間遠心する。
１５）　上澄み液を取り除いて、ＤＮＡ沈殿物に５ｍｌの７０％エチルアルコールを入れて洗浄，１５０００ｇ、４℃で１０分間遠心する。
１６）　７０％エチルアルコールを取り除いて、空気の中で１０分間乾燥した後、適量のＴＥでＤＮＡ沈殿を溶解する。
【００３５】
実施例３
実施例２で得た目的遺伝子ＴＰＡとＦＩＸを有するベクターを利用して、それぞれ宿主細胞に目的遺伝子を導入し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に発現させる。
１．材料：
１．１　細胞：ＨＴ１０８０
培地：（高濃度糖含有）ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（ＨＴ１０８０）ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
１．２　電気穿孔機：Ｂｉｏ−Ｒａｄ社
【００３６】
２．方法：
１）　７５ｃｍ２の培養瓶の内で、底が７０％〜８０％まで覆われる（集密になる）まで細胞を増殖させる。
２）　細胞を取り出してＨｅＢｓの緩衝液で２回洗い、細胞の数を計算する。
３）　１５０００ ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心する。
４）　適量のＨｅＢｓに再懸濁し、細胞の濃度を１０６〜１０７／ｍｌとする。
５）　０．４ｍｌの電気穿孔用キュベットに細胞懸濁液を０．８ｍｌとベクターＤＮＡ約１０μｇを入れる。
【００３７】
６）電気穿孔機で電気ショックを与える。電圧２６０Ｖ、電気容量５５０μＦ、時間１１〜１３ｍｓという電撃条件を設定する。
７）　電撃された細胞を７５ ｃｍ２の培養瓶に移し、２種の抗生物質を含んでいる培地１４ｍｌ入れ、３７℃で、５％ＣＯ２中２４〜４８時間培養する。
８）　培地に最終濃度３００μｌのＧ４１８を入れてスクリーニングする。２〜３日経ってから液を取り替える。そして再度Ｇ４１８を入れる。同時に正常の細胞を対照として用いる。
９）　約７〜１０日後には正常細胞はすべて死んだ。トランスフェクション細胞で残っているクローンの数を計算する。そして維持量のＧ４１８１５０μｇ／ｍｌを使用する。
１０）続いて最終濃度５００ｎｇ／ｍｌのＧＣＶでトランスフェクション細胞をスクリーニングする。
１１）７〜１０日を経って大部分のクローンは死に、生き残っている細胞に維持量のＧＣＶ２５０μｇ／ｍｌを使用する、或いは加えない。スクリーニングを受けた細胞を底の７０〜８０％まで覆うように増殖させ、導入された遺伝子の発現活性を測定する。
【００３８】
３．結果：
該ベクターを利用し、電気穿孔の方法で、ＴＰＡとＦＩＸ遺伝子をそれぞれＨＴ１０８０細胞に導入する。正のスクリーニングと負のスクリーニングによって、陽性細胞株を取得した。定点に挿入されることをＦＩＳＨで確認した（図３、図４参照）。ＴＰＡ活性の測定結果は詳しくは表１を見よ。
【００３９】
ＨＴ１０８０細胞の陰性対照のＴＰＡ活性は０Ｕ／１０６細胞／２４時間で、導入後のＴＰＡ活性は４０８Ｕ／１０６細胞／２４時間である。形質転換９５日後の発現量は４０７で、発現は非常に安定である。表１参照。ＦＩＸ活性も陰性対照の０．５μｇ／ｍｌから２．５ μｇ／ｍｌに上がり、形質転換１０９日後でも発現量がまだ２．６μｇ／ｍｌである。表２参照。二つの発現産物はすべてウェスタンハイブリダイゼーションによって証明された。（図５、図６）。ＴＰＡの発現産物はすでに純化されている。
【００４０】
【表１】
ＴＰＡで形質転換された陽性細胞とＴＰＡ活性の測定（μｇ／１０６細胞／２４時間）
2004508046.tif 000003
（Ｔ１とＴ１５はともにＴＰＡ陽性細胞株である。）
【００４１】
【表２】ＦＩＸ活性の測定（μｇ／１０６細胞／２４時間）
2004508046.tif 000004
【００４２】
実施例４
ヒトでの安全性の実例：
夏家輝は１９７３年から人類遺伝学と医学細胞遺伝学についての研究をしており、全国から１８９個所の実験室の４７０人の臨床細胞遺伝学者が報告した７３２種の世界で初めて報告された核型のうち、４１種の核型がＤ、Ｇ群の染色体の短腕に関連し、Ｄ、Ｇ群染色体の短腕に転位した断片が１−２２番のどの染色体からきたかにかかわらずあるいは同じ番号の染色体に由来してもサイズが違い、含まれた遺伝子が一つから千以上であるにもかかわらず、保有者本人の表現型は正常であることを見出し鑑定した。このことはＤ、Ｇ群染色体の短腕に転位した遺伝子が正常に発現できることを示した。したがって、Ｄ、Ｇ群染色体の短腕は遺伝子治療の標的部位としては安全である。
【００４３】
１．核型：４６，ＸＸ，ｔ（１；１２；２２；１５；１１；８）（１ｑｔｅｒ→１ｐ１１：：８ｐ２３→８ｐｔｅｒ；１２ｐｔｅｒ→　　 １２ｑｌｌ：：１ｐ１１→１ｐｔｅｒ；　２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１１：：１２ｑ１１→１２ｑｔｅｒ；　１５ｐｔｅｒ→１５ｑ１５：：２２ｐ１１→２２ｐｔｅｒ；　１１ｐｔｅｒ→１１ｑ２１：：１５ｑ１５→１５ｑｔｅｒ；　８ｑｔｅｒ→８ｐ２３：：１１ｑ２１→１１ｑｔｅｒ）．　　　表現型：　女、２８歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：　呉素彬、広東省広州市、中山医科大学付属一院産婦人科の細胞遺伝室、郵便番号：５１００８０
【００４４】
２．核型：４６、ＸＹ、ｔ（１；１３）（１ｐｔｅｒ→１ｑ３２：：１３ｐ１１→１３ｐｔｅｒ；１３ｑｔｅｒ→１３ｐ１１：：１ｑ３２→１ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２４歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：　肖晟、ハルビン医科大学生物教研室、郵便番号：１５００８６
【００４５】
３．核型：４６、ＸＸ、ｔ（２；１５）（２ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→１５ｑｔｅｒ；　２ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１５ｐｔｅｒ）．
表現型：女、２６歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：郭裕萍等、江西省南昌市、江西省産婦人科病院の細胞遺伝室、郵便番号：３３０００６
【００４６】
４．核型：４６、ＸＹ、ｔ（２；２１）（２ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→２１ｐｔｅｒ； ２ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２１ｑｔｅｒ）．　　　表現型：男、３２歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：　康過秦等、山西省太原市、山西医学院付属二院遺伝研究室、郵便番号：０３０００１
【００４７】
５．核型：４６、ＸＹ、ｔ（３；２２）（３ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２２ｐｔｅｒ； ３ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→２２ｐｔｅｒ）．　　　表現型：男、２６歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：　高永、山東省濱州市医学院毒理室、郵便番号：２５６６０３
【００４８】
６．核型：４６、ＸＹ、ｔ（３；２２）（３ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→２２ｑｔｅｒ； ３ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２２ｐｔｅｒ）．　　　表現型：男、２９歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：石化金等、遼寧錦州市婦人幼児の病院遺伝室、郵便番号：１２１０００
【００４９】
７．核型：４６、ＸＸ、ｔ（４；１５）（４ｑｔｅｒ→４Ｐ１３：：１５ｐ１３→１５ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→１５ｐ１３：：４ｐ１３→４ｐｔｅｒ）．
表現型：女、２８歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：周玲など、湖北省武漢市、武漢市児童病院遺伝実験室、郵便番号：４３００１６
【００５０】
８．核型：４６、ＸＹ、ｔ（４；２１）（４ｑｔｅｒ→４Ｐ１５：：２１ｐ１１→２１ｐｔｅｒ；２１ｑｔｅｒ→２１ｐ１１：：４ｐ１５→４ｐｔｅｒ）．
表現型：男、２５歳、表現型が正常な保有者
資料提供者：　徐競芳等、上海市第六人民病院遺伝室、郵便番号：２０００００
【００５１】
９．核型：４６、ＸＹ、ｔ（４；１４）（４ｐｔｅｒ→４ｑ３１：：１４ｐ１１→１４ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→１４ｐ１１：：４ｑ３１→４ｑｔｅｒ）．
表現型：男、表現型が正常な保有者
資料提供者：　周明君等、河志省許昌市中心病院、郵便番号：１６１０００
【００５２】
１０．核型：４６、ＸＹ、ｔ（４；１４）（４ｐｔｅｒ→４ｑ３５：：１４ｐ１１→１４ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→１４ｐ１１：：４ｑ３５→４ｑｔｅｒ）．
表現型：男、２７歳、表現型が正常な保有者
資料提供者：張秀泉等、広東省佛山市、佛山市婦人幼児保健院、郵便番号：５２８０００
【００５３】
１１．核型：４６、ＸＸ、ｔ（５；２２）（５ｐｔｅｒ→５ｑ１３：：２２ｐ１１→２２ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１１：：５ｑ１３→５ｑｔｅｒ）．
表現型：女、３２歳、表現型が正常な保有者
資料提供者：曹建萍 、河南省安陽市婦人児童保健院遺伝室、郵便番号：４５５０００
【００５４】
１２．核型：４６、ＸＹ、ｔ（６；２２）（６ｐｔｅｒ→ｃｅｎ６→２２ｑｔｅｒ；６ｑｔｅｒ→ｃｅｎ２２→２２ｐｔｅｒ）　　　表現型：男、２５歳、表現型が正常な保有者
資料提供者：祝新霞等、山東省泰安市、山東第８８病院産婦人科細胞遺伝室、郵便番号：２７１０００
【００５５】
１３．核型：４６、ＸＹ、ｔ（６；２２）（６ ｑｔｅｒ→６ｐ２１ ：：２２ｐ１１．２→２２ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ２２ｐ１１．２：：６ｐ２１→６ｐｔｅｒ）
表現型：男、３３歳、表現型が正常な保有者
資料提供者：楊蘭青、山東省濱州市濱州医学院付属病院産婦人科、郵便番号：２５６６０３
【００５６】
１４．核型：４５、ＸＸ、ｔ（７；２１）（７ｑｔｅｒ→７ｐ２２：：２１ｐ１２→２１ｑｔｅｒ）
表現型：女、２３歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：孫吉慶等、湖北省武漢市、湖北省武漢市児童病院遺伝実験市室、郵便番号：４３００１６
【００５７】
１５．核型：４６、ＸＹ／４６、ＸＹ、ｔ（７；１４）（７ｐｔｅｒ→７ｑ１１：：１４ｐ１１→１４ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→１４ｐ１１：：７ｑ１１→７ｑｔｅｒ）
表現型：男、２８歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学研究室　郵便番号：４１００７８
【００５８】
１６．核型：４６、ＸＹ、ｔ（８；１４）（８ｑｔｅｒ→８Ｐ２１：：１４Ｐ１２→１４ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→１４ｐ１２：：８ｐ２１→８ｐｔｅｒ）
表現型：男、２７歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：石化金等、遼寧錦州市婦人幼児病院遺伝室、郵便番号：１２１０００
【００５９】
１７．核型：４６、ＸＹ、ｔ（９；１４）（９ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→１４ｐｔｅｒ；９ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１４ｑｔｅｒ）
表現型：男、２８歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：程秋雲等、衡陽医学院附一生殖医学研究室、郵便番号：４２１００１
【００６０】
１８．核型：４６，ＸＹ，ｔ（９；２２）（９ｐｔｅｒ→９ｐ１３：：２２ｐ１２→２２ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１２：：９ｐ１３→９ｐｔｅｒ）ｍａｔ
表現型：女、３１歳、その母、妹一人、弟一人、息子一人も同じ核型が有し、同じく表現型が正常な保有者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学研究室　郵便番号：４１００７８
【００６１】
１９．核型：４６，ＸＹ，ｔ（９；１４）（９ｐｔｅｒ→９ｑ１２：：１４ｐ１２→１４ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→１４ｐ１２：：９ｑ１２→９ｑｔｅｒ）
表現型：女、３２歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：孫艶陽等、黒龍江省ハルビン市、ハルビン医科大学生物教研室、郵便番号：１５００８６
【００６２】
２０．核型：４６，ＸＹ，ｔ（９；１５）（９ｐｔｅｒ→９ｑ２１：：１５ｐ１２→１５ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→１５ｐ１２：；９ｑ２１→９ｑｔｅｒ）ｍａｔ
表現型：女、３６歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：朱桂珍等、山東省泰安市、山東第８８病院産婦人科細胞遺伝室、郵便番号：２７１０００
【００６３】
２１．核型：４６，ＸＸ，ｔ（１０；１３）（１０ｐｔｅｒ→１０ｑ２４：：１３ｐ１１→１３ｐｔｅｒ；　１３ｑｔｅｒ→１３ｐ１１：：１０ｑ２４→１０ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２８歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：厳敦清、青島医学院付属病院産婦人科研究室、郵便番号：２６６０３３
【００６４】
２２．核型：４６，ＸＸ，ｔ（１０；１３）（１０ｐｔｅｒ→１０ｑ２４：：１３ｐ１２→１３ｐｔｅｒ；　１３ｑｔｅｒ→１３ｐ１２：：１０ｑ２４→１０ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２９歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：張影如等、広東省広州市、中山医科大学付属一院神経科、郵便番号：５１００８０
【００６５】
２３．核型：４６，ＸＸ，ｔ（１１；１４）（１１ｐｔｅｒ→ｃｅｎ →１４ｐｔｅｒ；１１ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１４ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：王志勇、河南省 柘城県、柘城県人民病院遺伝室、郵便番号：４７６２００
【００６６】
２４．核型：４６，ＸＸ，ｔ（１１；２１）（１１ｐｔｅｒ→１１ｐ１１：：２１ｐ１１→２１ｐｔｅｒ；２１ｑｔｅｒ→２１ｐ１１：：１１ｐ１１→１１ｐｔｅｒ）．
表現型：女、２６歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：鄭軍等、陝西省西安市、陝西省婦人児童保健院医学遺伝実験室、郵便番号：７１０００３
【００６７】
２５．核型：４６，ＸＹ，ｔ（１１；１５）（１１ｐｔｅｒ→１１ｑ１３：：１５ｐ１２→１５ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→１５ｐ１２：：１１ｑ１３→１１ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２３歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：楊瑞芳等、山東医科大学付属病院囲産医学センター、郵便番号：２５００１２
【００６８】
２６．核型：４６，ＸＸ，ｔ（１２；１４）（１２ｐｔｅｒ→ｃｅｎ →１４ｐｔｅｒ；１２ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１４ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２８歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：韓維田等、遼寧省計画生育科研所優生研究室、郵便番号：１１００３１
【００６９】
２７．核型：４６，ＸＸ，ｔ（１３；１６）（１３ｑｔｅｒ→１３ｐ１１：：１６ｐ１１．２→１６ｐｔｅｒ；１６ｑｔｅｒ→１６ｐ１１．２：：１３ｐ１１→１３ｐｔｅｒ）．
表現型：女、２７歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：　安松蘭、遼寧省大連市、大連市産婦人科病院遺伝室、郵便番号：１１００７８
【００７０】
２８．核型：４６，ＸＹ／４５，ＸＹ，ｔ（１３；１３）（１３ｑｔｅｒ→１３ｐ１２：：１３ｐ１２→１３ｑｔｅｒ）．
表現型：男、３９歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学研究室　郵便番号：４１００７８
【００７１】
２９．核型：４６，ＸＹ，ｔ（１４；１８）（１４ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→１８ｐｔｅｒ；１４ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１８ｑｔｅｒ）．
表現型：男、３０歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：王素桂等、北京計画生育技術指導所、郵便番号：１００００６
【００７２】
３０．核型：４６，ＸＸ，ｔ（１４；１５）（１４ｐｔｅｒ→１４ｑ１３：：１５ｐ１３→１５ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→１５ｐ１３：：１４ｑ１３→１４ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２８歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：李麓芸、夏家輝等、湖南省長沙市、湖南医科大学医学遺伝学研究室　郵便番号：４１００７８
【００７３】
３１．核型：４５，ＸＸ，ｔ（１５ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２２ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２７歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：夏家輝等、湖南医科大学医学遺伝学国家重点研究室　郵便番号：４１００７８
【００７４】
３２．核型：４６，ＸＹ，ｔ（１５；１８）（１５ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→１８ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→１８ｑｔｅｒ）．
表現型：男、３０歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：任国慶等、北京市計画生育技術指導所、郵便番号：１００００６
【００７５】
３３．核型：４６，ＸＸ，ｔ（１５；２０）（１５ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→２ｐｔｅｒ；１５ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２６歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：王新等、湖南医科大学付属二病院産婦人科遺伝科室、郵便番号：４１００１１
【００７６】
３４、核型：４６，ＸＸ，ｔ（１５；２２）（１５ｐｔｅｒ→１５ｑ１１：：２２ｐ１３→２２ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１３：：１５ｑ１１→１５ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２７歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：符生苗、海南省海口市、海南省人民病院遺伝室、郵便番号：５７００１１
【００７７】
３５．核型：４６，ＸＸ，ｔ（１５；２２）（１５ｐｔｅｒ→１５ｑ２２：：２２ｐ１１→２２ｐｔｅｒ；２２ｑｔｅｒ→２２ｐ１１：：１５ｑ２２→ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２９歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：李牧尭等、新疆ウルムチ、新疆医学院医学遺伝室、郵便番号：８３００５４
【００７８】
３６．核型：：４６，ＸＹ，ｔ（１６；２１）（１６ｐｔｅｒ→１６ｑ２１：：２１ｐ１１→２１ｐｔｅｒ；２１ｑｔｅｒ→２１ｐ１１：：１６ｑ１２→１６ｑｔｅｒ）．
表現型：男、２９歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：張恵芳等、広東省計画生育科学技術研究所、郵便番号：５１００８０
【００７９】
３７．核型：４６，ＸＸ，ｔ（１８；２１）（１８ｑｔｅｒ→ｃｅｎ→２１ｑｔｅｒ；１８ｐｔｅｒ→ｃｅｎ→２１ｐｔｅｒ）．
表現型：女、表現型が正常な保有者
資料の提供者：石化金等、遼寧錦州市婦人児童病院遺伝室、郵便番号：１２１０００
【００８０】
３８．核型：４６，Ｘｘ，ｔ（１８；２１）（１８ｐｔｅｒ→１８ｑ１１：：２１ｐ１２→２１ｐｔｅｒ；２１ｑｔｅｒ→２１ｐ１２：：１８ｑ１１→１８ｑｔｅｒ）．
表現型：女、２６歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：李修林等、遼寧省沈陽市、中国医科大学付属一院小児科遺伝室、郵便番号：１１０００１
【００８１】
３９．核型：４５ ，Ｘ，ｄｉｃ（Ｙ；１３）（Ｙｐｔｅｒ→Ｙｑ１２００：：１３ｐ１１→ｃｅｎ→１３ｑｔｅｒ）
表現型：男、４歳、表現型が正常な保有者
資料の提供者：夏家輝等、湖南医科大学医学遺伝学国家重点研究室　郵便番号：４１００７８
【００８２】
４０、核型：４６，ＸＹ，ｔ（Ｙ；１５）（１５ｑｔｅｒ→１５ｐ１２：：Ｙｑ１２→Ｙｐｔｅｒ）ｐａｔ．
表現型：男、新生児、表現型が正常な保有者
資料の提供者：夏家輝等、湖南医科大学医学遺伝学国家重点研究室　郵便番号：４１００７８
【００８３】
上述の染色体の異常な保有者はすべて何らかの異常な身体の特徴も発見されていない。したがって、核小体形成領域が外来遺伝子を受け取れることだけでなく、外来遺伝子を正常に発現させることも証明されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は１２０ｋｂＰＡＣクローンＤＮＡのＦＩＳＨ定位図である。
【図２】
図２は本発明が提供する一種の遺伝子ベクターの構造図である（遺伝子ベクター配列の全長：１１１６２ｂｐ）、その中ｐＧＥＭ−７（８２６７−１１１６２）はベクターの複製エレメント及び原核細胞用のスクリーニングシステムである；ＴＫ（１−２８４０）は真核細胞用の負のスクリーニング遺伝子でＴＫプロモーターとＴＫｐｏｌｙＡシグナルを用いる、；Ｎｅｏ（４３４２−５９１０）は真核細胞用の正のスクリーニング遺伝子で、ｓｖ４０プロモーターとｓｖ４０のｐｏｌｙＡ シグナルを用いる；ＧＬＳ（２８４１−４３４１、５９１１−８２６７）は目的遺伝子の先導配列である；クローニング部位（５９１０）は目的遺伝子の挿入部位である。
【図３】
図３は外来性ｔＰＡ遺伝子の陽性細胞クローン中でのＦＩＳＨ定位であり、該ベクターによりｔＰＡがＤ、Ｇ群染色体の短腕に定点導入されたことを示す。
【図４】
図４は外来性ＦＩＸ遺伝子の陽性細胞クローン中でのＦＩＳＨによる位置決めであり、該ベクターがｔＰＡをＤ、Ｇ群の染色体短腕に定点導入できたことを示す。
【図５】
図５は精製ｔＰＡのウェスタンブロットの結果であり、レーン１〜４が精製ｔＰＡで、“−”は陰性対照である。
【図６】
図６はＦＩＸ陽性細胞のウェスタンブロットの結果である。Ｆ３〜Ｆ２３は６つの異なる陽性細胞株であり、“−”は陰性対照である。
【図１】
2004508046.tif 000005
【図２】
2004508046.tif 000006
【図３】
2004508046.tif 000007
【図４】
2004508046.tif 000008
【図５】
2004508046.tif 000009
【図６】
2004508046.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004508046.tif 000011
2004508046.tif 000012
2004508046.tif 000013
2004508046.tif 000014
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2004508046.tif 000016
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2004508046.tif 000018
2004508046.tif 000019
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【国際調査報告】
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