(57)【要約】バクテリオファージのシグナルペプチドをコードする発現ベクターについて記載されている。ベクターは、細菌宿主細胞中で抗体などのポリペプチドを異種発現及び分泌させるために使用することができる。
2004533264.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体鎖又はその抗原結合フラグメントを作成する方法であって、発現カセットを含む宿主細胞を、その発現カセットから抗体鎖又はそのフラグメントの発現が得られる条件下で培養することを含み、前記発現カセットが、抗体鎖又はその抗原結合フラグメントをコードする第２の核酸と作動的にかつ読み枠を合わせて連結された、バクテリオファージのシグナルペプチド又はその変異体をコードする第１の核酸を含む方法。
【請求項２】
前記第１の核酸が、バクテリオファージＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチド又はその変異体をコードする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記第１の核酸が、バクテリオファージＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドとの同一性が７０％よりも高いＭ１３主要コートタンパク質シグナルペプチドの変異体をコードする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記第１の核酸が、バクテリオファージＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドとの同一性が７５％のＭ１３主要コートタンパク質シグナルペプチドの変異体をコードする請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記第１の核酸が、バクテリオファージＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドとの同一性が８０％よりも高いＭ１３主要コートタンパク質シグナルペプチドの変異体をコードする請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記第１の核酸が、バクテリオファージＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドとの同一性が９０％よりも高いＭ１３主要コートタンパク質シグナルペプチドの変異体をコードする請求項２記載の方法。
【請求項７】
本来備わっているバクテリオファージＭ１３主要コートタンパク質シグナルペプチドのアミノ酸配列をコードする前記第１の核酸が、ヌクレオチド配列の点で本来備わっているＭ１３ヌクレオチド配列と異なる請求項２記載の方法。
【請求項８】
前記第１の核酸が、ＭＣＰ１、ＭＣＰ３、ＭＣＰ４、ＭＣＰ５、ＭＣＰ６、ＭＣＰ７、ＭＣＰ８、又はＭＣＰ９のヌクレオチド配列を有する請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記第１の核酸が、ＭＣＰ１、ＭＣＰ３、ＭＣＰ４、又はＭＣＰ８のヌクレオチド配列を有する請求項７記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９に記載の抗体重鎖及び軽鎖を産生させること並びにこれらの鎖を結合させることを含む、完全な抗体又はそのフラグメントを産生させる方法。
【請求項１１】
前記重鎖及び軽鎖が、同じ宿主細胞中で別々の発現カセットから産生される請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
それぞれの発現カセットが、単一プロモーター／オペレーターの制御下にある請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
それぞれのシグナルペプチドが、平衡した重鎖及び軽鎖の発現が得られるように選択される請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）任意選択で、抗体、抗体フラグメント、抗体鎖又は抗原結合フラグメントを蓄積させること、及びｂ）抗体、抗体フラグメント、抗体鎖又は抗原結合フラグメントを単離することをさらに含む請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
原核宿主細胞の細胞質からの抗体鎖又はその抗原結合フラグメントの分泌を指令するのに使用される、バクテリオファージＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチド又はその変異体をコードする核酸。
【請求項１６】
バクテリオファージＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドとの同一性が７０％より高いシグナルペプチドをコードする請求項１５記載の核酸。
【請求項１７】
バクテリオファージＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドとの同一性が７５％より高いシグナルペプチドをコードする請求項１５記載の核酸。
【請求項１８】
バクテリオファージＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドとの同一性が８０％より高いシグナルペプチドをコードする請求項１５記載の核酸。
【請求項１９】
バクテリオファージＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドとの同一性が９０％より高いシグナルペプチドをコードする請求項１５記載の核酸。
【請求項２０】
ヌクレオチド配列が野生型核酸配列と異なるが、アミノ酸配列は異ならない、バクテリオファージＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドをコードする核酸。
【請求項２１】
前記ヌクレオチド配列が、ＭＣＰ１、ＭＣＰ３、ＭＣＰ４、ＭＣＰ５、ＭＣＰ６、ＭＣＰ７、ＭＣＰ８、又はＭＣＰ９から選択される請求項２０記載の核酸。
【請求項２２】
Ｍ１３主要コートタンパク質シグナルペプチドの前記ヌクレオチド配列が、ＭＣＰ１、ＭＣＰ３、ＭＣＰ４、又はＭＣＰ８から選択される請求項２１記載の核酸。
【請求項２３】
抗体鎖又はその抗原結合フラグメントをコードする第２の核酸と作動的にかつ読み枠を合わせて連結された、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の第１の核酸を含む発現カセット。
【請求項２４】
請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の核酸を含むベクター又は請求項２３記載の１又は２個の発現カセット。
【請求項２５】
請求項２３記載の発現カセット又は請求項２４記載のベクターを含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バクテリオファージのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列、こうした配列を含む発現ベクター、並びに細菌系でポリペプチド、特に抗体を異種発現及び分泌させるためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願の全体にわたって、著者ごと年度ごとに様々な文献を参照している。これらの文献の完全な引用リストを、本発明の詳細な説明及び実施例の後に提供する。
【０００３】
組換えタンパク質の産生は、目的のタンパク質を、それが発現される細胞から搬出することのできる発現系の構築によって、大幅に容易になってきた。宿主細胞から組換え産物を分泌させるために、これらの発現系は、アミノ末端ペプチドの伸展、又は真核及び原核生物のタンパク質の大部分に見られる、細胞質からの搬出用のシグナルペプチドを利用する。多様な起源由来のいくつかのシグナルペプチドの特徴付けにより、それらのシグナルペプチド間での配列相同性はわずかであるが、ある機能特性がそれらに共通することが明らかになった。これらの共通の特徴は、正に帯電したアミノ末端領域、中心の疎水性コア、及び通常はシグナルペプチダーゼ切断部位で終端する、より極性のＣ末端領域である。
【０００４】
こうした発現系で使用するシグナルペプチドが発現宿主に本来備わっているものであることは、極めて一般的である。例えば、その生物の周辺質にポリペプチドを分泌させるために、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のＰｈｏＡ、ＭａｌＢ及びＯｍｐＡシグナルペプチドが広範に使用されている。しかし、シグナルペプチドには、種間で移動させた場合でも働く能力を有するものもある。例えば、大腸菌周辺質へのヒト成長ホルモンの分泌は、本来備わっているシグナルペプチドを使用した場合により効率的であり（Ｇｒａｙら、１９８５）、イネのα−アミラーゼは、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からそれに本来備わっているシグナル配列を使用して効率的に分泌される（Ｋｕｍａｇａｉら、１９９０）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
遺憾ながら、個々のシグナルペプチドの異なる系での有効性は予測できない。このプロセスはしばしば非効率的であり、通常低収率である。さらに、誤って排除あるいは不完全に切断され得るシグナルペプチドのミスプロセシングによって問題が生じることもある。したがって、効率的で一般的な方法で常に分泌を指令できる、すなわち高収率及び／又は正確な切断を実現できるシグナルペプチドが求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明者らは、意外にも、分泌プロセスを媒介するのにバクテリオファージのシグナル配列（例えば、バクテリオファージＭ１３の主要コートタンパク質のシグナル配列）を使用すると、原核細胞から高レベルの可溶性ポリペプチド、特に抗体又はその抗原結合フラグメントが得られることを発見した。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
したがって、本発明の第１の態様によれば、抗体鎖、又はその抗原結合フラグメントをコードする第２の核酸と作動的にかつ読み枠を合わせて連結された、バクテリオファージのシグナルペプチド又はその変異体をコードする第１の核酸を含む発現カセットを含む宿主細胞を、その発現カセットから抗体鎖又はその抗原結合フラグメントの発現が得られる条件下で培養することを含む、抗体鎖又はその抗原結合フラグメントを産生させる方法が提供される。
【０００８】
抗体は、ジスルフィド結合によって互いに結合している２つの軽鎖及び２つの重鎖ポリペプチドから組み立てられている。したがって、本明細書で使用する「抗体鎖」という用語は、抗体軽鎖ポリペプチド又は抗体重鎖ポリペプチドのどちらかを意味する。
【０００９】
抗体鎖に適用される「抗原結合フラグメント」という用語は、本明細書では、抗原と独立的かつ選択的に結合できる、抗体鎖の任意のフラグメント又はドメインとして定義する。本発明の方法によって発現及び分泌され得るこうした抗原結合フラグメントの例には、例えば、ＶH及びＶLフラグメント、並びに例えばｓｃＦｖなどの単鎖抗体がある。
【００１０】
別の態様によれば、本発明の方法を使用して、完全長の重鎖及び軽鎖、又は例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、及びＦｖフラグメントを含めたフラグメントを含む完全な抗体を産生させることができる。これは、本発明の方法に従って異なる宿主細胞中で抗体軽鎖及び重鎖又はその適切なフラグメントを産生させ、次いでこれらの鎖が発現された後、適切な鎖又はそのフラグメントを互いに結合させて、完全な抗体又は抗体フラグメントを形成させることによって実現することができる。
【００１１】
あるいは、完全な抗体又はそのフラグメントは、少なくとも２個の発現カセットを同じ宿主細胞に導入することによって産生させることもできる。それぞれの発現カセットは、バクテリオファージのシグナルペプチド（又はその変異体）をコードする第１の核酸を含む。これは、一方の発現カセット中で抗体重鎖又は適切な重鎖フラグメントをコードし他方の発現カセット中で抗体軽鎖又は適切な軽鎖フラグメントをコードする第２の核酸と作動的にかつ読み枠を合わせて連結されている。したがって、重鎖及び軽鎖又はそのフラグメントが同じ細胞内で同時に発現され、それぞれの分泌がバクテリオファージのシグナルペプチドによって媒介され得る。こうした発現カセットを、１個の核酸分子内に組み込まれた異なる実体として宿主細胞中に導入することができ、あるいは別々の核酸分子に導入することもできる。
【００１２】
上記のように産生され得る完全な抗体には、多量体の単一特異性抗体、並びに二重特異性又は多重特異性抗体がある。
【００１３】
本発明の任意の態様に従って発現又は分泌される抗体又はその抗原結合フラグメントは、ポリクローナル、あるいは特にモノクローナルでよい。それは、どの免疫グロブリンクラスに属するものでもよく、例えばＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４）、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＡ抗体でよい。それは、動物、例えば哺乳動物由来のものでもよく、例えばラット（ｍｕｒｉｎｅ  ｒａｔ）又はヒト抗体あるいはそれら由来の抗原結合フラグメントでもよい。あるいは、抗体又は抗原結合フラグメントは、キメラ、すなわち異なる動物種由来の部分を含むものであってもよい。具体的な例は文献に詳しく記載されており、ＣＤＲ移植抗体及び抗原結合フラグメントも含まれる。
【００１４】
バクテリオファージ由来のどんなシグナルペプチドも本発明で使用できるが、第１の核酸が、バクテリオファージＭ１３の主要コートタンパク質又はその変異体由来のシグナルペプチドをコードすることが好ましい。本明細書で使用する「変異体」という用語は、後述のＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドとほぼ同じアミノ酸配列を有し、少なくとも本来備わっているＭ１３シグナルペプチドと同じくらい効率的に機能できるシグナルペプチドを意味する。これには、例えば、シグナルペプチダーゼ認識部位などの特定の特徴を変える又は高めるように改変されたものであり得るＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチド誘導体も含まれる。「ほぼ同じアミノ酸配列」を有するシグナルペプチドは、Ｍ１３主要コートタンパク質シグナルのアミノ酸配列との同一性が７０％より高いものである。好ましい変異体は、Ｍ１３主要コートタンパク質由来のシグナルペプチドとの同一性が７５％より高く、同一性が８０％より高いことがより好ましく、同一性が９０％より高いことが最も好ましい。
【００１５】
変異体Ｍ１３主要コートシグナルペプチドの有効性を評価するためには、それらを使用して標準ポリペプチド、例えば、β−ラクタマーゼ又はアルカリホスファターゼの分泌を指令することができる。次いで、以下のパラメーター、すなわち収率、蓄積速度、切断の正確さのいずれかを測定し、同じモデルポリペプチドの分泌を指令するのに使用したときに本来備わっているＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドによって得られる結果と比較することができる。これは、本来備わっているＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドと少なくとも同じくらい効率的に、あるいはより効率的に機能することのできるシグナルペプチドに適したスクリーンの基礎を提供する。収率及び／又は蓄積速度を推定する方法は、当業者には自明のはずであり、ポリペプチド産物の直接測定を利用でき、あるいはポリペプチドの任意の固有酵素活性を利用することもできる。このような方法の具体例は、本明細書において、好ましい実施形態の詳細な説明により詳細に記載されている。
【００１６】
本来備わっているバクテリオファージＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドは、２３アミノ酸長であり、アミノ酸配列「ＭＫＫＳＬＶＬＫＡＳＶＡＶＡＴＬＶＰＭＬＳＦＡ」を有する。遺伝暗号の縮退により、いくつかのヌクレオチド配列のうちのどれもこの配列をもつシグナルペプチドをコードすることができる。本来備わっているバクテリオファージＭ１３配列を含むこれらの核酸のどれでも、本発明で使用することができる。実際に、バクテリオファージＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドのアミノ酸配列ではなくヌクレオチド配列を変えることによって、大腸菌中での可溶性タンパク質の発現及び分泌を最適化することができる。こうした可溶性タンパク質の例には、酵素（アルカリホスファターゼなど）、タンパク質ホルモン又はタンパク質毒、可溶性の輸送タンパク質、構造タンパク質、又は収縮タンパク質、特に抗体がある。
【００１７】
したがって、野生型Ｍ１３バクテリオファージ核酸配列とヌクレオチド配列は異なるが、それがコードするアミノ酸配列は異ならない、Ｍ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドをコードする核酸は、さらに本発明のさらなる態様を形成し、やはり本明細書に記載の本発明の方法に使用することができる。本発明のこの態様による核酸によってコードされるＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドを、所望に応じて使用して、完全長の可溶性タンパク質、あるいはそのフラグメント又はドメインの分泌を指令させることができる。
【００１８】
本発明のこの態様による核酸は、コードされるアミノ酸配列が変化していないことを条件として、Ｍ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドをコードする野生型ヌクレオチド配列と任意の数のヌクレオチド位置で異なってよい。したがって、本発明のこの態様による核酸は、ただ１個の位置だけで配列が異なっているものでもよく、あるいは最大で約３１個の位置で（野生型と）配列が異なっていてもよい。こうした核酸は、ヌクレオチド配列が野生型と約１８〜２５個の位置で異なっていることが好ましい。本発明のこの態様による核酸は、配列が野生型と合計で２０、２１、２２、又は２３個のヌクレオチド位置で異なっていることがより好ましい。
【００１９】
本発明の様々な態様で使用するＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドをコードする好ましい核酸配列の例には、本来備わっているＭ１３ヌクレオチド配列（ＭＣＰｎ）、及び下記の表１に示した新規なヌクレオチド配列ＭＣＰ１〜ＭＣＰ９がある。ＭＣＰｎ、ＭＣＰ１、ＭＣＰ３、ＭＣＰ４、又はＭＣＰ８のいずれかに相当するヌクレオチド配列の使用が特に好ましい。
【００２０】
【表１】
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【００２１】
少なくとも２個のポリペプチドが細胞から産生及び分泌されることが望まれる場合には、上記の表１に記載の少なくとも２個、すなわちそれぞれのポリペプチドごとに１個のシグナルペプチドコード配列を使用することが好ましい。シグナルペプチドコード配列は同じでよく、又分泌すべきそれぞれのポリペプチドごとに異なっていてもよい。さらに本発明のさらなる態様によれば、シグナルペプチドコード配列のランダムな組合せを含むライブラリが提供される。実施例５に、このようなライブラリをより詳細に記載する。
【００２２】
「作動的に連結」という用語は、シグナルペプチドと分泌されるポリペプチドの両方をコードする核酸が、単一のプロモーター／オペレーター領域の制御下にあり、かつ単一メッセージとして転写されることを意味する。したがって、本発明に使用する発現カセットは、その最も単純な形態として、重要なポリペプチドの発現及び分泌を媒介し得る最も小さい遺伝子単位であってよい。発現カセットは一般に、適当なプロモーター／オペレーター領域（例えば、大腸菌で使用するｔａｃ又はｌａｃ又はＴ７又はバクテリオファージλプロモーター／オペレーター、哺乳動物細胞で使用するエクジソン応答性プロモーター又はヒトサイトメガロウィルスプロモーター又はＳＶ４０プロモーター、酵母菌で使用するＧａｌ１又はＣｕｐ１又はＡＯＸ１プロモーター、並びにバキュロウィルスで使用する多角体プロモーターを含む）を５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の上流に含む。５’非翻訳領域の後に、シグナルペプチド及び分泌されるポリペプチドをコードする核酸が続く。発現カセットにはさらに、必要に応じて本発明の核酸分子と読み枠を合わせて連結された、又は核酸分子内に含まれる、適切な転写及び翻訳制御配列、例えば、転写促進因子、転写終結配列、ｍＲＮＡ安定化配列、開始及び終止コドン又はリボソーム結合部位を組み込むこともできる。発現カセットが、細胞内でエピソーム形態のままであることが望ましいかもしれない。あるいは、宿主細胞のゲノム内に組み込むこともできる。後者が望ましい場合、ゲノムとの組換えを促進する配列が発現カセットに含まれることになる。したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書に記載の核酸もしくは発現カセットを含む、かつ／又は本明細書に記載の方法によるポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。
【００２３】
Ｍ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチド又はその変異体をコードする核酸配列は、どんな宿主中でも有用であり得る。例えば、このようなバクテリオファージ由来のシグナル配列は、例えばバキュロウィルスなど他のウィルス系発現系で有用かもしれない。しかし、放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種、桿菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、大腸菌などの原核生物が、好ましい発現宿主である。大腸菌が特に好ましい宿主である。発現宿主が原核生物の場合には、発現カセットのプロモーター／オペレーター領域は、原核生物の宿主内で発現を調節できるものになる。当業者には自明なように、シグナルペプチドを他の（例えば真核生物の）発現系で使用する場合、プロモーター／オペレーター領域が、特異的な宿主内での発現を調節できるはずである。
【００２４】
本発明の方法はさらに、分泌されたポリペプチドを回収することを含むことができる。発現宿主がグラム陰性菌の場合、分泌プロセスでは、ポリペプチドは細胞膜周辺腔の所までしか運ばれない。そうであるならば、どんな回収手順でも第１段階は、細胞を（例えば遠心分離によって）回収し、細胞膜周辺腔からポリペプチドを放出することであろう。これは、例えば浸透圧ショック又は他の任意の適当な物理的破壊手段によって、外膜を破壊することによって、あるいは遺伝的に易感染性で「漏出性」の外膜を有する宿主菌株（例えば大腸菌Ｋ１２のある種の菌株、Ａｔｌａｎ＆Ｐｏｒｔａｒｌｉｅｒ、１９８４；Ｆｏｇｎｉｎｉ  Ｌｅｆｅｂｖｒｅ＆Ｐｏｒｔａｒｌｉｅｒ、１９８４を参照）を利用することによって達成することができる。外膜を欠く他の発現宿主では、ポリペプチド産物が培地中に直接分泌されることもある。
【００２５】
細胞膜周辺腔から放出された、又は培地に分泌されたポリペプチドは、任意の適当な方法を使用してさらに回収及び精製することができる。これには、精製を助けるために、例えば、溶解度の差、例えば溶媒を用いた塩析及び沈殿、又は分子量の差、例えば限外ろ過及びゲル電気泳動、又は電荷の差、例えばイオン交換クロマトグラフィー、又は特異的な親和性、例えばアフィニティークロマトグラフィー、又は疎水性の差、例えば逆相高速液体クロマトグラフィー、又は等電点の差、例えば等電点電気泳動を利用する任意の方法が含まれる。適当な単離手順及びタンパク質精製戦略のさらなる詳細は当業者によく知られており、当技術分野で十分に文献に記載されている。
【００２６】
当業者には明らかなように、本明細書で使用する核酸は、どんな標準的な分子生物学及び／又は化学手順を用いて生成することもできる。特に適した技法には、Ｍ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドをコードする本来備わっている核酸のオリゴヌクレオチド特異的突然変異導入、オリゴヌクレオチド特異的合成技法、及びギャップのあるオリゴヌクレオチドの酵素的切断又は酵素的充填がある。こうした技法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｆｒｉｔｓｃｈ、１９８９に記載されており、以下に含まれる実施例にも記載されている。
【００２７】
さらなる態様では、本発明の核酸又は発現カセットを担体と共に使用することができる。この担体は、宿主細胞への核酸／発現カセットの導入に適したベクター又は他の担体でよい。標準的な分子生物学的技法を用いて、核酸／発現カセットを市販されている任意の適当なベクター（例えば大腸菌で使用するｐＵＣ又はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズのベクター）中にサブクローニングすることができる。このようなベクターには、プラスミド、ファージミド及びウィルス（バクテリオファージと真核生物ウィルスのどちらも含む）が含まれ得る。本発明は、本発明の核酸及び／又は発現カセットを含むクローニングベクター及び発現ベクターを含む。必要に応じて、このようなベクター又は担体は、本発明による発現カセットを２個以上含むこともできる。例えば、Ｆａｂ’発現ベクターは、抗体軽鎖をコードする１個の発現カセット及び抗体重鎖をコードする１個の発現カセットを含むことができる（例えば図１Ｃを参照）。
【００２８】
宿主細胞中への核酸又は発現カセットの導入には、どんな利用可能な技法も使用することができる。細菌細胞の場合、適当な技法には、塩化カルシウム形質転換、電気穿孔法又はバクテリオファージを用いた形質移入が含まれ得る。真核細胞の場合、適当な技法には、塩化カルシウム形質転換、ＤＥＡＥデキストラン法、電気穿孔法、微粒子銃、リポソーム媒介形質移入、あるいはレトロウィルス、アデノウィルス、もしくはワクシニアなど他のウィルスを用いた、又昆虫細胞にはバキュロウィルスを用いた形質導入が含まれ得る。
【００２９】
宿主細胞への核酸の導入に続いて、宿主を増殖させるのに適したそれ自体既知の培地（例えば大腸菌用の２ｘＹＴ又はＬＢブロス）上で細胞を培養することができる。どんな適当な培地も、通常少なくとも１種の吸収可能な炭水化物、１種の窒素源及び必須ミネラルを含むことになる。炭水化物は通常ラクトース又はグルコースなど単糖の形であり、窒素源には酵母エキス、又はトリプトン、カゼイン、フィトン、ペプトン、牛肉エキスなど他の吸収可能なアミノ酸の供給源が含まれ得る。必須ミネラルは、発現宿主間で異なり得るが、一般に、微量のマンガン塩やマグネシウム塩などの遷移金属塩が含まれ得る。培地は、宿主生物内でベクター又は担体の存在を維持するために、例えば、抗生物質もしくは他の化学物質の添加、又は特定の栄養素の排除によって改変してもよい。
【００３０】
増殖条件（例えば増殖培地、温度、時間、並びにプロモーターが誘導性の場合の誘導時間及び誘導化学物質の量）は、使用する個々の発現系により様々であるが、一般に、組換えポリペプチドの発現を高めるために最適化される。例えば、それらを操作して、発現されたポリペプチドを例えば細胞膜周辺腔又は培地中に蓄積させることができる。発現の後にポリペプチド産物を蓄積させることを、本発明の方法の任意選択のステップとすることができる。組換えポリペプチドの発現に適した、増殖及び誘導条件に関する一般的な指針は、当技術分野で見つけることができ（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｆｒｉｔｓｃｈ、１９８９；Ｇｌｏｖｅｒ、１９９５ａ、ｂを参照）、細胞培養条件及び誘導計画の具体例は、本明細書の以下の実施例に記載されている。
【００３１】
次に、本発明の様々な態様及び実施形態を実施例によってより詳細に例示する。本発明の範囲から逸脱することなく詳細の変更を行うことができることが理解されよう。
【実施例１】
【００３２】
アルカリホスファターゼ遺伝子のクローニング
ＰＣＲによって、プライマーＰｈｏＡ１
2004533264.tif 000004
を用いてそれ自体のシグナルペプチドで、ｐｈｏＡ遺伝子を大腸菌株Ｗ３１１０からクローン化した。本来備わっているアルカリホスファターゼ遺伝子の開始コドンを、ＧＴＧからより一般的な開始コドンであるＡＴＧに変えた。ＰｈｏＡ１プライマーは、その５’末端にＰｓｔ  Ｉ制限酵素部位を含み、それに「５’ＵＴＲ」領域、変化した開始コドン及びさらに２３塩基のｐｈｏＡ遺伝子が続く。ＰｈｏＡ２プライマーは、ｐｈｏＡのＰＣＲ産物の３’末端にＮｏｔ  Ｉ制限酵素部位を含む。これにより、任意の適当なプロモーターの後にあるＰｓｔ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉ二重消化ＰＣＲ産物のクローニングが可能になり、本来備わっているアルカリホスファターゼシグナルペプチドをもつ発現カセットが形成される。
【００３３】
プライマーＰｈｏＡ３（５’ＣＧＧＡＣＡＣＣＡＧＡＡＡＴＧＣＣＴＧＴＴＣＴＧＧＡＡＡＡＣ  ３’）及びＰｈｏＡ２（上記の通り）を用いて大腸菌株Ｗ３１１０から成熟ｐｈｏＡ遺伝子（そのシグナルペプチドを含まない）をクローン化した。これにより、本明細書に記載された任意のシグナルペプチドカセットの後にある成熟アルカリホスファターゼ遺伝子の、平滑末端／Ｎｏｔ  Ｉフラグメントとしてのクローニングが可能になる。したがって、変異体のシグナルペプチド及び／又は同じシグナルペプチドのアミノ酸配列をコードする異なる核酸の有効性を、標準タンパク質としてアルカリホスファターゼを用いて比較することができる。
【実施例２】
【００３４】
Ｍ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドカセットの構築
沸騰した水浴中で５分間加熱し、次いでそれらを室温まで徐々に冷却させることにより、緩衝液（２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１２．５ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．２５ｍＭ  ＤＴＥ、ｐＨ７．５）中１ｐｍｏｌｅ／μｌの濃度でアニールした１対の長い相補オリゴヌクレオチドから、表１に示したＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドをコードする核酸カセットを構築した。
【００３５】
これらのオリゴヌクレオチドの設計は、分泌されるべきポリペプチドをコードする遺伝子の手前にある発現カセットにシグナルペプチドを続けてクローニングできるようにするために、３つの要素、すなわち上流の５’ＵＴＲ領域、シグナルペプチドをコードするコア及び下流のリンカー領域からなる。当業者には理解されるように、このリンカーの配列は、これらのシグナルペプチドカセットを他のポリペプチドに使用できるように適合させるために、様々であってよい。アルカリホスファターゼの分泌を指令するために使用したシグナルペプチドをコードするカセットは、下流のリンカーを欠いており、５’ＵＴＲ及びコアのシグナルペプチドコード領域だけからなっていた。
【実施例３】
【００３６】
異なる核酸によってコードされるＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドを含む発現ベクターの構築
アルカリホスファターゼ発現ベクター：オリゴヌクレオチドをアニールすることによって構築したシグナルペプチドカセット（上記の実施例２を参照）を、Ｎｏｔ  Ｉ消化成熟ＰｈｏＡ  ＰＣＲ産物（上記の実施例１に記載）に連結して、Ｐｓｔ  Ｉ−Ｎｏｔ  Ｉフラグメントを生成した。次いで、これをｔａｃプロモーターの後に連結した（図１Ａを参照）。
【００３７】
ｓｃＦｖ発現ベクター：新しいシグナルペプチドコード領域を容易に導入できるようにするために、既存のｓｃＦｖ発現プラスミドのＶLドメインの初めの２つのコドンにＥｃｏＲ  Ｖ制限酵素部位を導入した［例えば国際特許明細書ＷＯ０１／９４５８５を参照］。このプラスミドは、ＶL−ＶH−Ｈｉｓ機構に、ｔａｃプロモーターの制御下にある、ヒトサイトカインに特異的なｓｃＦｖを含む。このｓｃＦｖは、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）4リンカーも含む。次いで、オリゴヌクレオチドをアニールすることによって構築したシグナルペプチドカセット（上記の実施例２を参照）を、Ｐｓｔ  Ｉ−ＥｃｏＲ  Ｖ二重消化ｓｃＦｖ発現ベクター中に連結した（図１Ｂを参照）。
【００３８】
Ｆａｂ’発現ベクター：ｔａｃプロモーターの二重制御下でＦａｂ’軽鎖及び重鎖を発現するベクターを以下のように構築した。既存のＦａｂ’発現ベクター内のＶL発現カセット［例えば国際特許明細書ＷＯ０１／９４５８５を参照］を、Ｐｓｔ  Ｉ及びＳｐｌ  Ｉ制限酵素を用いた二重消化によって切り出し、上記のｓｃＦｖ発現ベクターから同様に切り出したＳＰ−ＶLカセットと置き換えた。ＳＰ−ＶHフラグメントを作成し、ＣH1領域にアニールする短いリバース３’オリゴヌクレオチド及びシグナルペプチドをコードする長い５’フォワードオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲフラグメントとして導入した。これにより、４０．４軽鎖及び重鎖の手前に異なるシグナルペプチドを含むＦａｂ’４０．４発現ベクターのシリーズが得られた。これらのベクターは、有利には、ＶL及びＶH領域の５’及び３’の境界にそれぞれ特異的な制限部位（ＥｃｏＲ  Ｖ−Ｓｐｌ  Ｉ、Ｐｖｕ  ＩＩ−Ａｐａ  Ｉ）があるように設計されており、したがって、可変ドメイン及び／又はシグナルペプチドコード領域の迅速な交換が可能になる（図１Ｃを参照）。
【００３９】
Ｍ１３シグナルペプチドを大腸菌ＯｍｐＡシグナルペプチドと置き換えることによって、Ｆａｂ’及びｓｃＦｖの両方に対する対照発現ベクターを構築した。
【実施例４】
【００４０】
Ｍ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドを用いた異種ポリペプチド発現及び分泌
ａ）方法
液体培養でのポリペプチド産生−振盪フラスコ中でのアルカリホスファターゼ及びｓｃＦｖの産生
テトラサイクリンを増殖培地中の最終濃度１０μｇ／ｍｌで使用して、振盪フラスコ実験及び周辺質画分の抽出を、基本的に既に記載されているように実施した（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、１９９６）。ポリペプチド発現を、ＩＰＴＧを０．２ｍＭまで加えることによって誘導し、誘導後０〜５時間の間の時点で適宜酵素検定又はＥＬＩＳＡによって検定した。
【００４１】
ポリペプチド発現液体培養−発酵によるＦａｂ’の産生
培地「ＳＭ６Ｅ」：
2004533264.tif 000005
中で発酵を行った。消泡剤として０．０２％（ｖ／ｖ）のＭＡＺＵ  ＤＦ８４３を含み、ＮＨ4ＯＨでｐＨを６．９５にした。発酵槽（Ｂｒａｕｎ  ＢｉｏｓｔａｔＢ  ２．５Ｌ）に十分な種培養物（１０μｇｍｌ-1でテトラサイクリンを補充したＳＭ６Ｅ培地中）を播種して、初期ＯＤ600が０．２になるようにした。必要に応じて５０％（ｖ／ｖ）ＮＨ4ＯＨ及び１．８Ｍ  Ｈ2ＳＯ4を加えることによってｐＨを制御し、可変の攪拌及び気流によって溶存酸素を３０％で維持した。培養物に８０％（ｗ／ｗ）グリセロールを２×４５ｍｌで、ＯＤ600がそれぞれ２０及び４０のときにバッチ供給した。ＯＤ600が約８０のとき、グリセロールの消耗と、炭素源としてのラクトースの置換によってＦａｂ’発現を誘導した。産生期間中ラクトース濃度を２０〜５０ｇＬ-1に維持し、誘導後２４〜３６時間後に細胞を回収した。
【００４２】
発酵細胞ペーストを、１／２回収体積の１００ｍＭトリスＨＣｌ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．４に再懸濁させ、３０℃で１６時間、２５０ｒｐｍで攪拌した。既に記載されているように（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、１９９８）、周辺質抽出物を２５，０００ｇで３０分間遠心分離することによって清澄にし、０．２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通してからプロテインＧセファロース（ＧａｍｍａＢｉｎｄ  Ｐｌｕｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で精製した。
【００４３】
アルカリホスファターゼ活性の検定
以下の変更を加えて、基本的に既に記載されているように（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、１９９５）検定を行った。すなわち、発現を０．２ｍＭ  ＩＰＴＧによって誘導し、誘導後約３時間後に培養物２０μｌの検定を行った。アルカリホスファターゼ活性をΔＡ420ＯＤ600-1ｍｉｎ-1として表した。
【００４４】
振盪フラスコ並びに発酵周辺質抽出物中のｓｃＦｖ及びＦａｂ’濃度のＥＬＩＳＡ
ｓｃＦｖのＥＬＩＳＡのために、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートに１００ｍＭ重炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．０中０．５μｇｍｌ-1の抗原（ヒトサイトカイン）を、４℃で１６時間コーティングした。ブロッキングバッファー（ＰＢＳ中０．１％ｗ／ｖＢＳＡ）中で４回、グレージング（ｇｌａｚｉｎｇ）バッファー（ＰＢＳ中１０％ｗ／ｖトレハロース、０．１％ｗ／ｖＢＳＡ）中で２回洗浄した後、プレートを空気乾燥し、封止した箔パウチ中で４℃で貯蔵した。精製した標準物質をＰＢＳ中１％ｗ／ｖＢＳＡ中で２５０ｎｇｍｌ-1に希釈し、続いて連続２倍希釈した。それぞれのウェルを試料又は標準物質１００μｌと共にインキュベートし、室温で１時間攪拌した。ＰＢＳ中０．０００２％ｗ／ｖツイーン２０で２回洗浄した後、それぞれのウェルをＰＢＳ中１％ｗ／ｖＢＳＡで１／５００に希釈したウサギ抗ヒスタグ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号ＳＣ−８０３）１００μｌと共にインキュベートし、室温で３０分間攪拌した。ＰＢＳ中０．０００２％ｗ／ｖツイーン２０で２回洗浄した後、それぞれのウェルをＰＢＳ中１％ｗ／ｖＢＳＡで１／５０００に希釈したロバ抗ウサギＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ、カタログ番号７１１０３５−１５２）１００μｌと共にインキュベートし、室温で３０分間攪拌した。次いで、プレートをＰＢＳ中０．０００２％ツイーン２０で４回洗浄し、既に記載のように（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら、１９９６）発展させた。Ｆａｂ’濃度を評価するＥＬＩＳＡを、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓら（１９９６）に記載されているように行った。
【００４５】
アルカリホスファターゼの手前にあるシグナルペプチドの切断の正確さ
ＭＣＰ３シグナルペプチドを用いてアルカリホスファターゼを発現し分泌する大腸菌から周辺質抽出物を産生した。これらの抽出物を、製造メーカーの指示に従って４〜２０％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。１０ｍＭ  ＣＡＰＳ（３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸、Ｓｉｇｍａ）ｐＨ１１．０中でエレクトロブロットすることによって、タンパク質をポリアクリルアミドゲルからＰＶＤＦ膜（ＰＳＱ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に移し、次いでポンソーＳで染色した。アルカリホスファターゼに相当するバンドを切り出し、タンパク質を溶出してＮ末端配列分析を行った。
【００４６】
ｂ）結果
アルカリホスファターゼの発現及び分泌
【表２】
2004533264.tif 000006
【００４７】
Ｍ１３シグナルペプチドが核酸変異体によってコードされている構築体間で発現のレベルに差が多少認められたが、１０個すべてのＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチド構築体からアルカリホスファターゼ発現が認められた。一般に、認められた発現のレベルは、対照のシグナルペプチドＯｍｐＡで得られたものと類似していた（上記の表２を参照）。
【００４８】
アルカリホスファターゼを発現するＭＣＰ３含有クローンを任意に選択して、上記の実施例４で記載したようにシグナルペプチド切断の正確さを評価した。Ｎ末端配列決定により、シグナルペプチド切断部位が正確に認識され、成熟アルカリホスファターゼの正確なＮ末端配列がもたらされたことが明らかになった。
【００４９】
ｓｃＦｖの発現及び分泌
４つの変異体並びに本来備わっているＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドの能力について、ＥＬＩＳＡによって大腸菌の周辺質にｓｃＦｖを分泌できるかどうか評価した。比較目的でＯｍｐＡシグナルペプチドも使用した。この結果を以下の表３に示す。
【００５０】
【表３】
2004533264.tif 000007
【００５１】
Ｆａｂ’の発現及び分泌
ｓｃＦｖを分泌できるかどうか評価した４つの変異体、並びに本来備わっているＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドの能力について、大腸菌の周辺質にＦａｂ’を分泌できるかどうか評価した。上記の発酵条件下でクローンを増殖させ発現を誘導した。精製したＦａｂ’の収率をＥＬＩＳＡによって評価し、その結果を以下の表４に示す。
【００５２】
【表４】
2004533264.tif 000008
【００５３】
この場合も、Ｍ１３主要コートタンパク質が、高レベルのＦａｂ’の発現及び分泌に成功したことを示した。驚くべきことに、いくつかの核酸変異体がＯｍｐＡ対照よりも有効なことが示された。この結果から、この場合にＭＣＰ４変異体核酸を使用してＭ１３主要コートタンパク質のシグナルペプチドをコードすることによって、対照のシグナルペプチドによって産生されたものに比べて発現のレベルを約５倍増大させることができることが実証された。
【００５４】
異なるＦａｂ’分子の発現及び分泌
Ｍ１３バクテリオファージシグナルペプチドは、異なるＦａｂ’分子の分泌を指令するのに使用することができる。これを実証するために、ＭＣＰ１、ＭＣＰ３、ＭＣＰ４及びＭＣＰ８Ｆａｂ’４０．４構築体のそれぞれのＶＨ及びＶＬ領域を、それぞれＥｃｏ  ＲＶ−Ｓｐｌ  Ｉ及びＰｖｕ  ＩＩ−Ａｐａ  Ｉフラグメントとして切り出し、Ｆａｂ’４０．４によって認識される抗原と異なる抗原を認識する抗体から同様に消化したＶH及びＶL領域と置き換えた。新しいＦａｂ’の発現を可能にするために、４つのマスター構築体をこのように生成した。それぞれの構築体は異なるヌクレオチド配列を使用して軽鎖及び重鎖の手前にあるＭ１３バクテリオファージのシグナルペプチドをコードしており（単一構築体内で軽鎖及び重鎖に同じヌクレオチド配列を使用したことに注意せよ）、それぞれ軽鎖発現カセットとそれに続く重鎖発現カセットを含んでいた（図１Ｃを参照）。
【００５５】
上記の実施例４で記載した発酵条件下で、Ｆａｂ’分子（Ｆａｂ’１６５）の発現及び分泌を評価した。精製したＦａｂ’の収率をＥＬＩＳＡによって評価し、その結果を以下の表５に示す。
【００５６】
【表５】
2004533264.tif 000009
【実施例５】
【００５７】
Ｆａｂ’発現の最適化
上記の実施例では、Ｍ１３バクテリオファージのシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列が、それぞれのＦａｂ’発現構築体中の軽鎖及び重鎖の両方について同じである。発現及び分泌に対する、同じ構築体内のヌクレオチド配列をコードする異なるシグナルペプチドの組合せの影響を評価するために、２つのプラスミドライブラリを構築した。それぞれのライブラリは、Ｆａｂ’１６５の軽鎖及び重鎖の手前にあるＭＣＰ１、ＭＣＰ３、ＭＣＰ４及びＭＣＰ８配列の考えられる１６個すべての組合せを含む。
【００５８】
ａ）ＶＬ発現カセットとそれに続くＶＨ発現カセットを含むＦａｂ’プラスミドライブラリの構築
表６．考えられる１６個の異なるシグナルペプチドコード配列の組合せを以下の行列に示す。第１の発現カセットを１行目に沿って示し、第２の発現カセットを１列目に沿って示す。これらの構築体は全て軽鎖発現カセットとそれに続く重鎖発現カセットを有する。
【表６】
2004533264.tif 000010
【００５９】
上記の実施例４に記載した４つのマスターＦａｂ’１６５構築体を初めとして、これらをＰｓｔ  Ｉ及びＭｆｅ  Ｉで消化し、フラグメント及びベクター骨格をランダムに再結合させ、それによって表６に示したように、考えられる１６個すべてのシグナルペプチドコード配列の組合せが得られた。
【００６０】
ｂ）ＶＨ発現カセットとそれに続くＶＬ発現カセットを含むＦａｂ’プラスミドライブラリの構築
Ｐｓｔ  ＩがＮｓｉ  Ｉと適合性があり、Ｍｆｅ  ＩがＥｃｏ  ＲＩと適合性があるので（図２参照のこと）、上記の実施例４で生成した４つのＦａｂ’１６５マスター構築体をそれぞれ以下のように処理した。それぞれの構築体の第１の試料をＮｓｉ  Ｉ及びＥｃｏ  ＲＩで消化し、シグナルペプチドコード配列及び重鎖フラグメントを単離した。それぞれの構築体の第２の試料をＰｓｔ  Ｉ及びＭｆｅ  Ｉで消化し、両方のフラグメントを単離し精製した。第１の消化から得られた重鎖フラグメントを、第２の消化から得られたベクター骨格（軽鎖フラグメントを欠いている）に連結して、２つの重鎖を含む構築体を生成した。次いで、この構築体をＮｓｉ  Ｉ及びＥｃｏ  ＲＩで消化して、第２のシグナルペプチドコード配列及び重鎖を除去した。小さい重鎖フラグメントを廃棄し、残りのベクター骨格（５’重鎖フラグメントを含む）を第２の消化から得られたシグナルペプチド及び軽鎖フラグメントの混合物に連結した。
【００６１】
表７．考えられる１６個の異なるシグナルペプチドコード配列の組合せを以下の行列に示す。第１の発現カセットを１行目に沿って示し、第２の発現カセットを１列目に沿って示す。これらの構築体は全て軽鎖発現カセットとそれに続く重鎖発現カセットを有する。
【表７】
2004533264.tif 000011
【００６２】
したがって、軽鎖及び重鎖発現カセットの順番が上記ａ）で記載したライブラリのものと逆の１６個の構築体のライブラリが生成された。表７は、このライブラリに存在するシグナルペプチドの組合せを示す。
【００６３】
ｃ）Ｆａｂ’１６５発現の分析
前述のように少量振盪フラスコ中での発現試験を実施した。このスケールで得られた結果から続けて、この場合も前述のように、発酵でのいくつかの異なるクローンのＦａｂ’を発現する能力を評価した。軽鎖、重鎖及び全Ｆａｂ’の発現レベルを、表面プラズモン共鳴及び／又はＥＬＩＳＡを用いて評価した。
【００６４】
表面プラズモン共鳴結合アッセイをＢＩＡｃｏｒｅ（商標）２０００測定器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行った。ハイブリドーマＨＰ６０４５（ＡＴＣＣ）から得られたネズミＩｇＧ２ａモノクローナル抗ヒトＩｇＧ  Ｐａｎ  Ｆｄ（ＣＨ１）及びハイブリドーマＨＰ６０５３（ＡＴＣＣ）から得られたネズミＩｇＧ２ａモノクローナル抗ヒトκ軽鎖定常ドメイン（Ｃκ）を、標準ＮＨＳ／ＥＤＣ化学的手法を用いてＣＭ５センサーチップ上に固定化した。残留ＮＨＳエステルをエタノールアミン塩酸塩（１Ｍ）で不活性化した。
【００６５】
Ｆａｂ’フラグメントは、固定化したモノクローナル抗重鎖抗体又は固定化したモノクローナル抗軽鎖抗体のいずれかによって別々のフローセルに捕獲された。結合したＦａｂ’の存在が、第２ステップの相補モノクローナル抗体（抗軽鎖又は抗重鎖）の結合によって明らかになった。固定化した抗体が高レベルであったことから、結合への会合速度定数の寄与が試料中のＦａｂ’濃度による寄与と比べて低い大量輸送制限条件（ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ−ｌｉｍｉｔｅｄ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）下で測定が行われたことが確実である。この相互作用の会合速度定数によって結合が制限されないように、第２ステップで使用した溶液相モノクローナル抗体は高濃度で表面上を通過させている。
【００６６】
第１の捕獲ステップ中に、構築されたＦａｂ’フラグメント及び正確に折り畳まれた未構築の鎖の両方が検出される。第２の抗体の結合は、完全なＦａｂ’フラグメントだけに起こる。したがって、第１及び第２段階における相対的な結合の分析から、Ｆａｂ’試料中の過剰な未構築の軽鎖、又は過剰な未構築の重鎖のいずれかの存在が明らかになり、構築の化学量論についての情報が提供される。
【００６７】
それぞれの試料の両方の構造について検定を行い、それぞれの試料を２通りにランダムな順番で実施した。
（ｉ）構築されたＦａｂ’の濃度を軽鎖捕獲によって決定する場合、試料及び標準物質（１０μｌ／分で１０μｌ）を固定化したＨＰ６０５３上に注入し、続いてその表面上に溶液相の３００μｇ／ｍｌＨＰ６０４５を通過させる第２ステップを行った。
（ｉｉ）構築されたＦａｂ’の濃度を重鎖捕獲によって決定する場合、試料及び標準物質（１０μｌ／分で１０μｌ）を固定化したＨＰ６０４５上に注入し、続いてその表面上に溶液相の５００μｇ／ｍｌＨＰ６０５３を通過させる第２ステップを行った。いずれの場合でも、３０ｍＭ  ＨＣｌ１０μｌを用いて３０μｌ／分で表面を再生させた。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ＡＢ）を用いて決定した共鳴単位の数を、検量線に対して読み取った。精製したＦａｂ’標準物質は２μｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌの直線反応を示した。
【００６８】
図３は、重鎖−軽鎖の順番で発現カセットを有する異なる構築体間でＦａｂ’発現のレベルが著しく変わることを示す。同様の結果が軽鎖−重鎖ライブラリについて得られた（データを図示せず）。したがって、シグナルペプチドコード配列の異なる組合せを含む２つのライブラリを使用して、Ｆａｂ’発現を最適化することができる。Ｅｃｏ  ＲＶ−Ｓｐｌ  Ｉ及びＰｖｕ  ＩＩ−Ａｐａ  Ｉ二重消化を用いると、他の抗体の軽鎖及び重鎖を、Ｆａｂ’１６５のそれらの代わりに使用することができ、したがってライブラリを使用して任意のＦａｂ’分子の発現を最適化することができる。
【００６９】
図４では、シグナルペプチドコード配列の様々な組合せについて実施した発酵過程中の、それぞれの鎖及び全Ｆａｂ’の収率を比較している。重鎖及び軽鎖の発現レベルが密接に平衡した場合に、全Ｆａｂ’の収率が最大であることは驚くべきことである。したがって、シグナルペプチドライブラリを用いて軽鎖及び重鎖発現間の平衡を達成することによって、Ｆａｂ’発現を最適化することができ、これは特にそれぞれのシグナル配列がそれ自体のプロモーター／オペレーターの制御下にある場合に、本発明のさらなる態様を形成する。
【００７０】
（参考文献）
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【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】アルカリホスファターゼ、ｓｃＦｖ及びＦａｂ’発現カセットの概略図である。Ａ）部では、アルカリホスファターゼ発現カセットの構成が示されており、シグナルペプチドコード領域（ＳＰ）が、アルカリホスファターゼ構造遺伝子に読み枠を合わせて連結されている。これらはｔａｃプロモーター（ｐＴａｃ）の制御下にある。５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の位置も示されている。Ｂ）部では、ｓｃＦｖ発現カセットの構成が示されている。シグナルペプチド（ＳＰ）が、ＶLコード配列の手前に読み枠を合わせて連結されており、続いてＶLコード配列が、（Ｇｌｙ4Ｓｅｒ）4リンカー（図示せず）を介してＶHコード配列に読み枠を合わせて連結されている。発現は、ｔａｃプロモーター（ｐＴａｃ）によって制御されており、５’非翻訳領域の位置も示されている。Ｃ）部では、Ｆａｂ’４０．４発現構築体中の発現カセットの配列が示されている。ＶL及びＶHコード配列のどちらも、それぞれ同じシグナルペプチド（ＳＰ）コード配列に読み枠を合わせて融合されている。これらは別々のｔａｃプロモーター（ｐＴａｃ）の制御下にある。２つの５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）の位置が示されており、軽鎖と重鎖の発現を分離するｃＫａｐｐａ遺伝子間スペーサー（Ｃκ）の位置も同様に示されている。ＣH1コード領域が、ＶHコード領域に読み枠を合わせてその下流に融合されていることが示されている。
【図２】Ｆａｂ’−シグナルペプチドライブラリの作成を可能にする構築体の図である。Ａ］ｔａｃプロモーターの第２のコピーをＸｈｏ  Ｉ−Ｘｂａ  Ｉフラグメントとして除去し、内部Ｐｓｔ  Ｉを除去しＭｆｅ  Ｉ及びＮｓｉ  Ｉ部位を含むように改変したｔａｃプロモーターを含むＸｈｏ  Ｉ−Ｘｂａ  Ｉフラグメントで置き換えた。Ｂ］は改変した構築体を示す。
【図３】重鎖及び軽鎖の手前に異なるシグナルペプチドコード配列を含む構築体からのＦａｂ’の収率を示すグラフである。重鎖発現カセットとそれに続く軽鎖発現カセットを有するシグナルペプチドライブラリの様々なメンバーからのＦａｂ’１６５の収率を、発現を誘導してから２時間後にＥＬＩＳＡによって評価した。示した結果は、３つの少量振盪フラスコ実験の平均値±ＳＤである。
【図４】発酵における、重鎖、軽鎖及び全Ｆａｂ’収率に対する異なるシグナルペプチドコード領域の影響を示すグラフである。発現を誘導してから２、１３、２０及び３８時間後に採取した試料について表面プラズモン共鳴によって収率を評価し、共鳴単位（ＲＵ）で表した。データは、２つのシグナルペプチドライブラリの様々なメンバー、すなわち軽鎖発現カセットとそれに続く重鎖発現カセットを含むライブラリのメンバー（ＬＣ：ＨＣ）並びに重鎖発現カセットとそれに続く軽鎖発現カセットを含むライブラリのメンバー（ＨＣ：ＬＣ）について示されている。ＳＰ  ＣＤＳ＝シグナルペプチドコード配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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2004533264.tif 000048
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533264.tif 000049
【国際調査報告】
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2004533264.tif 000051
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