(57)【要約】本発明は、バイオアフィニティー結合固相としての微粒子、二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素で標識化された生物特異的二次試薬を含有する生物学的液体または懸濁液から検体を測定するための分離フリーバイオ分析的アッセイ法であって、レーザーを反応懸濁液に集め、個々の微粒子が、レーザービームの焦点体積を通って無作為に浮遊または励起レーザーの放射圧により誘導される場合に、二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素を用いて個々の微粒子から二光子励起蛍光を測定する方法に関する。該色素は、構造（II）を有する。【化１】2004533626.tif 000015そして、置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つが、他の分子への選択的共有結合に使用され得る化学的反応性基を得るために置換され、置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つが、水溶性基を得るために置換される。
2004533626.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオアフィニティー結合固相としての微粒子、二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素で標識化された生物特異的二次試薬を含有する生物学的液体または懸濁液から検体を測定するための分離フリーバイオ分析的アッセイ法であって、レーザーを反応懸濁液に集め、個々の微粒子が、レーザービームの焦点体積を通って無作為に浮遊または励起レーザーの放射圧により誘導される場合に個々の微粒子から二光子励起蛍光を測定する方法であって、該二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素が、構造（II）
【化１】
2004533626.tif 000012
（式中、置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つは、置換または非置換のフェニル、チエニル、ピロリル、フラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、インドリル、共役エテニル、ジエニルまたはトリエニル基であり；かつ置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つは、他の分子への選択的共有結合に使用され得る化学的反応基を得るために置換されており；そして置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つは、水溶性基を得るために置換されており；そしてＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7の残りの置換基は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シアノおよびカルボキシからなる群（各置換基は任意に置換され得る）より選択される）
を有することを特徴とするアッセイ法。
【請求項２】
バイオアフィニティー結合固相としての微粒子、二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素で標識化された生物特異的二次試薬を含有する生物学的液体または懸濁液から検体を測定するための分離フリーバイオ分析的アッセイ法であって、レーザーを反応懸濁液に集め、個々の微粒子が、レーザービームの焦点体積を通って無作為に浮遊または励起レーザーの放射圧により誘導される場合に個々の微粒子から二光子励起蛍光を測定する方法であって、該二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素が、構造（II）
【化２】
2004533626.tif 000013
（式中、置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7は、置換または非置換のアルキル基であり；Ｒ4は水素、または置換もしくは非置換のアルキル基であり；そして置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つは、他の分子への選択的共有結合に使用され得る化学的反応基を得るために置換されており；そして置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つは、水溶性基を得るために置換されている）
を有することを特徴とするアッセイ法。
【請求項３】
化学的反応基がカルボン酸、カルボン酸反応性エステル、カルボン酸無水物、マレイミド、塩化スルホニル、フッ化スルホニル、ヒドラジン、アミン、アルコール、アシルアジド、イソシアネート、アルデヒド、ハロアセトアミド、トリアジンまたはイソチオシアネートであることを特徴とする請求項１または２記載のアッセイ法。
【請求項４】
前記化学的反応基がスクシンイミジルエステルであることを特徴とする請求項３記載のアッセイ法。
【請求項５】
水溶性基が、スルホン酸またはカルボン酸のアンモニウムまたはアルカリ金属塩、アンモニウム基、またはヒドロキシル基であることを特徴とする請求項１、２、３または４記載のアッセイ法。
【請求項６】
Ｒ1が、置換または非置換の２−チエニル、２−ピロリル、フェニルまたはフェニルエテニルであり、かつ置換基Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つが
【化３】
2004533626.tif 000014
（式中、Ｘ＋はカチオン）であり；そしてＲ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の残りの置換基は、それぞれ相互に独立して水素またはアルキルのいずれかであることを特徴とする請求項１記載のアッセイ法。
【請求項７】
前記生物特異的二次試薬が、ハプテン、生物学的に活性なリガンド、薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、ポリペプチド、タンパク質、抗体および抗体のフラグメントからなる群より選択される生物学的に活性な分子であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５または６記載のアッセイ法。
【請求項８】
前記検体が、ハプテン、生物学的に活性なリガンド、薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、ポリペプチド、タンパク質、抗体および抗体のフラグメントからなる群より選択される生物学的に活性な分子であることを特徴とする請求項１、２、３、４、５、６または７記載のアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ジピロメテンボロンジフルオリド色素および二光子励起に基づくこれら色素の使用。また、本発明は、二光子励起に基づくバイオ分析的アッセイにおけるジピロメテンボロンジフルオリド色素およびそれらの複合体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書において本発明の背景を説明するために使用される刊行物およびその他の資料は、特に実施に関する付加的な詳細を提供する場合、参考として組み込まれる。
【０００３】
ジピロメテンボロンジフルオリド色素
ジピロメテンボロンジフルオリド色素は、最初にトレイブス（Treibs）およびクロイザー（Kreuzer）によってLiebigs Ann. Chem. 718 (1968) 208 に、そしてウォリエス  エイチ  ジェイ（Wories H.J.）らによってRecl. Trav. Chim. Pays-Bas 104 (1985) 288に記載された。それ以来、ジピロメテンボロンジフルオリド色素は種々の適用が見出されている。ジピロメテンボロンジフルオリド色素は、スペクトルの可視領域に強い蛍光を示す。ジピロメテンボロンジフルオリド色素は、以下の一般的な特徴：高い量子効率、鋭い吸収および発光バンド、ならびに高い吸収係数を有する。今日では、広範囲の種々のジピロメテンボロンジフルオリド色素が市販されている（Haugland R.P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 6th ed, Molecular Probes, Eugene, OR, 1996）。これらの色素の様々な誘導体の合成および蛍光特性は、複数の刊行物や特許に記載されている。
【０００４】
モーガン（Morgan）およびボーヤー（Boyer）による米国特許第４，９１６，７１１号明細書、同第５，１８９，０２９号明細書、同第５，４４６，１５７号明細書および欧州特許出願第０３６１９３６号公報には、光線力学的療法（ＰＤＴ）およびレーザー光の生産におけるジピロメテンボロンジフルオリド色素の使用が記載されている。モーガンおよびボーヤーによれば、ジピロメテンボロンジフルオリド色素は、低い三重項−三重項吸収を有し、これは低いレーザー作用閾値と共に、従来のレーザー色素を用いるより、より強い強度を有するレーザービームの生産を可能にする。さらに、これらの色素の高い光安定性は、結果として色素材料の分解を減少させる。
【０００５】
蛍光色素は、蛍光顕微鏡による生物学的構造物の位置決定用トレーサーとして、蛍光イムノアッセイによる被検体の定量のためのトレーサーとして、細胞のフローサイトメトリー分析のためのトレーサーとしておよびそのほかの多くの応用のために広く使用されている。通常、これらの蛍光色素は、共有結合を介して生体分子に結合される。この結合（標識化）のため、これらの色素は生体分子上のもう１つの官能基と反応し得る官能基を必要とする。よく使用される反応性官能基としては、反応性カルボン酸エステル、酸無水物、ヒドラジンおよびイソチオシアネートがあげられる。米国特許第４，７７４，３３９号明細書には、ジピロメテンボロンジフルオリド色素の蛍光ラベルとしての使用が記載されている。米国特許第４，７７４，３３９号明細書によれば、ジピロメテンボロンジフルオリド色素の蛍光特性は、溶媒またはｐＨに影響を受けにくい。これらの色素はまた、狭い吸収および発光バンド幅、高い量子収率および高い光安定性を有する。
【０００６】
ジピロメテンボロンジフルオリド色素の基本発光団（Ｉ）は、５００ｎｍあたりに吸収および発光極大を有する。
【０００７】
【化１】
2004533626.tif 000003
【０００８】
ジピロメテンボロンジフルオリド色素の吸収および発光波長は、通常発光団の置換基を変化させることによって変えることができる。π電子共役の延長は、発光および吸収バンドのより長波長側へのシフトを導く。π電子共役の延長は、光安定性、溶解性および蛍光量子収率にも影響を及ぼす。米国特許第５，２７４，１１３号明細書、同第５，４５１，６６３号明細書および国際公開第９３／０９１８５号パンフレットは、５２５ｎｍおよび６５０ｎｍの間に吸収極大を有するジピロメテンボロンジフルオリド標識化試薬を記載している。吸収および発光波長におけるこのシフトは、発光団中に不飽和有機基を付加することによって達成されている。これらの特許は、π電子共役経路を延長するためのアリール、ヘテロアリールおよびアルケニル置換基の使用を記載している。米国特許第５，２４８，７８２号明細書は、ヘテロアリール置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を開示しており、そして米国特許第５，１８７，２８８号明細書は、５５０ｎｍおよび６７０ｎｍの間に吸収極大を有するエテニル置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を開示している。吸収および発光波長におけるシフトは、多くの場合、吸収係数と光安定性の増加を伴った。π電子共役経路の延長は、Chen J. et al., J. Org. Chem., 65 (2000) 2900.にも記載されている。チェン  ジェイ（Chen J.）らは、６２０ｎｍおよび６６０ｎｍの間に吸収極大を有し、６３０ｎｍおよび６８０ｎｍの間に蛍光発光を有するアリール置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を記載している。米国特許第５，４３３，８９６号明細書は、融合アリール置換基を含有するジピロメテンボロンジフルオリド色素を記載している。これらのジベンゾピロメテンボロンジフルオリド色素は、６００ｎｍおよび７４０ｎｍの間に吸収および発光極大を有する。これらの色素のモル吸収係数は、ほとんどの場合１００，０００ｃｍ-1Ｍ-1以上であった。
【０００９】
Wories H.J. et al., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 104 (1985) 28 は、スルホン酸基をジピロメテンボロンジフルオリド色素に導入し、それによりこれらの色素の親水性を増加させる方法を記載している。彼らは、モノ−およびジスルホネートジピロメテンボロンジフルオリド色素（４９５ｎｍおよび４９１ｎｍに吸収極大を有し、５１５ｎｍおよび５１０ｎｍに発光極大を有する）を報告している。
【００１０】
ジピロメテンボロンジフルオリド色素は、蛍光ラベルとして種々の適用が見出されている。これらの色素の合成および汎用性は先に引用した刊行物および特許に報告されている。しかしながら、これらの色素のほとんどは、本質的に疎水性であり、それにより生体分子の蛍光標識化に対するそれらの使用が制限される。それは、特にアリール置換基を有するジピロメテンボロンジフルオリド色素の場合である。
【００１１】
ジピロメテンボロンジフルオリド色素は、蛍光マーカーとしてのみならずレーザー色素として、また腫瘍の治療のための光線力学的療法におけるプローブとしても使用され得る。これらの色素はまた、微粒子の染色における適用（米国特許第５，７２３，２１８号明細書）や光学記録媒体としての適用（米国特許第６，０６０，６０６号明細書）が見出されている。
【００１２】
二光子励起
１９３１年には、マリア  ゲペルト−メイヤー（Maria Goeppert-Mayer）（Ann. Phys.9 (1931) 273）が、分子は同時に２つの光子を吸収することができると仮定した。この現象は、強いレーザー光源が利用可能となるまで長い間実用化されていなかった。二光子励起は、強い光源を集中することにより、単位体積および単位時間当たりの光子密度が充分高くなり２つの光子が同じ発光団に同時に吸収される場合に引き起こされる。吸収されたエネルギーは、２つの光子のエネルギーの和である。二光子励起の可能性は、光子密度の二乗寡（2nd power）に依存する。２つの光子の吸収は、したがって二次の非線形過程である。１つの発光団による２つの光子の同時吸収は、発光団を励起状態にする。この励起状態は、照明レーザーの光子よりも高いエネルギーの光子の放出によって緩和され得る。この文脈において、二光子励起とその後の発光緩和を含む過程を二光子蛍光と呼ぶ。二光子蛍光は、通常同じ発光団の１光子で励起された蛍光と同様のスペクトル特性を有する（Xu C. and Webb W.W., J. Opt. Soc. Am. B, 13 (1996) 481）。２つの同時吸収光子で励起ることができ、その励起状態緩和が蛍光発光を伴う分子は、この文脈において二光子蛍光色素と呼ぶ。
【００１３】
二光子励起の重要な性質の１つは、励起が、焦点の明確に制限された３次元（３Ｄ）的周辺でのみ生じるということである。この性質の結果、生じる蛍光発光は、非常に３Ｄ空間的に局在化する。励起の非線形性により、試料の周辺において、および光学における、焦点の外側に最小のバックグラウンド蛍光が生じる。二光子励起のもう１つの重要な性質は、照明および発光が、本質的に異なる波長域で生じることである。この特性の結果、検出チャネルに散乱された照明光の漏出が、低流路（low-pass）フィルターを用いることにより容易に減じられ得る（少なくとも１０桁の減少）。励起体積は非常に小さいので、二光子励起は小さな試料体積および小さな試料構造物の観察に最も適している。
【００１４】
二光子励起の本来の性質である、低バックグラウンドおよび小さな励起体積は、二光子励起が小さな体積からの蛍光検出を必要とする適用に最も適しているということを示唆している。実際、二光子励起体積は、フェムトリットルまたはそれ以下の範囲であり、システムの光学パラメーターに依存する。そのような小さな励起体積には、僅かな蛍光分子のみが、所定の時点で存在する。二光子励起技術に関する固有な特徴の１つは、発蛍光団の低い吸収断面（absorption cross-section）である。もう１つの特徴は、二光子励起は通常パルス状のレーザーで行なわれ、従来のレーザーによる中間パルスの時間は、励起速度を減少させる発蛍光団の寿命より長いということである。これらの特徴は、小さな励起体積と共に結果として相対的に低いシグナルレベルを生じる。もう１つの問題は、予期せぬ効果を引き起こし得る強い照明強度に関する。この効果は２つの異なるタイプ：累積多重パルス効果（cumulative multiple pulse effect）（エネルギーの蓄積）および単一パルス効果（二次または高次の直接非線形吸収）に分類され得る。累積多重パルス効果は、特に高い繰り返し率（repetition rate）を有するパルスレーザー（ほぼ１００ ＭＨｚ程度の繰り返し率を有するサブ−ピコ秒パルスレーザー）を使用する場合に該当する。そのような、高い繰り返し率のもとで、エネルギーは色素分子の長い寿命の三重項状態に蓄積される。三重項状態は、通常非発光であり、したがってこれらの状態へのエネルギーの蓄積は二光子蛍光収率を減少させる。二光子励起効率（Ｅｘ2ph）は、最大出力（Ｐp）およびレーザー光のパルス持続時間（τpulse）に比例する（Ｅｘ2ph∝Ｐp2×τpulse）。これによると、高い最大出力と中程度の繰り返し率を有するパルスレーザー（ｋＨｚの繰り返し率を有するピコ秒〜ナノ秒パルスレーザー）の使用が、高い二光子励起効率を誘導する。この文脈における高い二光子励起効率とは、レーザービームの焦点においてほとんどすべての色素分子が単一レーザーパルスによって励起されることを意味している。図１は、照明強度に対する色素分子の二光子励起を表わしている。理想的なケースでは、発光対照明強度曲線は、二光子励起対照明曲線と一致する。通常、照明強度が明らかに、飽和レベルに達するために要求される強度以下（Ａ、図１）のケースであり、したがって、二光子励起蛍光は、照明強度に二次的相関関係（quadratic dependence）で追随する。飽和レベル（Ｃ、図１）で、または飽和レベル付近（Ｂ、図１）で（二光子励起蛍光を最大化するために高い二光子励起効率レーザーを使用する場合）、単一パルス効果が部分的に該当する。そのような場合、励起状態吸収および刺激発光は、二光子蛍光収率を減少させ、照明強度に関する発光の二次的相関関係からの逸脱を生じる。試料に応じて、これらの効果の出現は、最大使用照明強度を制限し得る。
【００１５】
Ehrlich J.E. et al. Opt. Lett. 22 (1997) 1843, Baur J.W. et al., Chem. Mater. 11 (1999) 2899 および Kim O.-K. et al. Chem. Mater. 12 (2000) 284 は、二光子吸収係数は、非常に顕著に、レーザービームの強度レベルおよびパルス持続時間などの測定条件に依存する。非常に強いレーザー照明が、二光子吸収断面または二光子蛍光収率を測定するために使用される場合は、いくつかの線形過程が役割を果たし得るということが指摘されている。励起状態吸収のような現象は、二光子励起のもとでの蛍光の消光原因であるということが提案されている（Fischer A. et al., Appl. Opt. 34 (1995) 1989）。
【００１６】
Xu C. and Webb W.W., J. Opt. Soc. Am. B, 13 (1996) 481は、Wories H.J. et al., Recl. Trav. Chim. Pays-Bas 104 (1985) 288に記載されているジピロメテンボロンジフルオリド色素などの様々な蛍光色素の二光子吸収断面を報告している。クウ（Xu）およびウェブ（Webb）によって研究されているジピロメテンボロンジフルオリド色素は、４９５ｎｍで一光子吸収極大を有し、５１５ｎｍで発光極大を有する。二光子励起スペクトルは、６９０および１０５０ｎｍの間で記録された。この研究では、光源は、８０フェムト秒の正常パルス長を有するＴｉ：サファイアレーザーであった。クウおよびウェブによると、ジピロメテンボロンジフルオリド色素の二光子吸収断面は、ローダミンＢよりも約一桁低い。クウおよびウェブは、高い強度のレーザー発光下でのローダミンＢの消光の観察、または照明強度に関する発光の二次的依存性からの逸脱については、何も報告されていない。しかしながら、ローダミンＢの消光は、以前にFischer A. et al., Appl. Opt. 34 (1995) 1989に報告されている。フィッシャー（Fischer）らによれば、二光子励起における消光効果は、二光子顕微鏡において三次元分解能をより低下させる。
【００１７】
二光子励起蛍光のバイオ分析的（bioanalytical）適用
蛍光は、バイオ分析学の分野において種々の適用が見出されている。検出方法として蛍光を用いたイムノアッセイ、ＤＮＡ−ハイブリダイゼーションアッセイおよび受容体結合アッセイなどの適用は、この３０年のあいだに導入されてきた。これらのアッセイは、試料中の検体量の測定において特異的なバイオアフィニティー反応を利用している。検体の量は、結合した検体の量に依存する蛍光シグナルのモニタリングによって測定される。これらのアッセイは、特異的結合反応の際の蛍光特性変化のモニタリングに基づいてもいる。この蛍光特性の変化は、蛍光強度の変化、発光波長の変化、減衰時間の変化、または蛍光偏光の変化のいずれかであり得る。
【００１８】
イムノアッセイは、特定の疾患または病理学的状態を決定するための臨床診断において広く使用されている。イムノアッセイは、２つの異なるタイプのアッセイ、競争アッセイと非競争アッセイとに分類することができる。競争的な方法において、標識抗原（二次生物特異的試薬）は、限られた量の抗体（一次生物特異的試薬）と結合するために検体と競争する。検体の濃度は、抗体に結合された標識抗原の割合から、または標識抗原の遊離画分の割合から決定され得る。非競争的方法（免疫的方法）において、検体は、過剰量の結合抗体（一次生体特異的試薬）に結合される。過剰の標識抗体（二次生体特異的試薬）は検体の他の部分に結合する。検体の量は、検体に結合した標識抗体の画分をもとに決定され得る。それらのアッセイ方法はまた、異種法と同種法（分離フリー）とに分けられ得る。結合画分と遊離画分との分離は、異種アッセイにおいて必要であるが、同種アッセイにおいては必要とされない（Miyai K., Principles and Practice of Immunoassay, （ed. Price C.P. and Newman D.J.） Stockton Press, New York 1991, 246 and Hemmilae I.A., Applications of Fluorescence in Immunoassays,（ed. Winefordner J.D.） John Wiley & Sons, New York 1991）。
【００１９】
二光子励起の分析的適用に関する初期の報告の１つは、セパニーク（Sepaniak）らによりAnal. Chem., 49 (1977) 1554 に発表されている。彼らは、ＨＰＬＣ検出に対する二光子蛍光励起の使用の可能性を議論している。低いバックグラウンドとシステムの単純さが証明された。
【００２０】
レーザー走査顕微鏡における二光子蛍光励起の有用性は、デニク（Denk）らによりScience, 248 (1990) 73 に最初に示された。彼らは、８０ ＭＨｚの繰り返し率でフェムト秒パルスのストリームを提供するモード固定色素レーザーを使用した。Ｔｉ：サファイアレーザーの出現は、標準レーザー走査蛍光顕微鏡における二光子励起の実現を促進した。二光子蛍光励起は、過去１０年の間、文献において頻繁に議論されている。多くの二光子励起蛍光イメージング技術に関連する研究の寄稿が刊行されている。開発の結果、二光子レーザー走査顕微鏡システムの産業製品をもたらしている。
【００２１】
Lakowicz et al., J. Biomolec. Screening 4 (1999) 355 は、ＤＮＡおよびカルシウム−依存発蛍光団に結合したＤＡＰＩ（４，６−ジアミニジノ−２−フェニルインドール）の時間依存的強度減衰が、二光子蛍光励起により測定され得るということが示されている。ラコヴィッツ（Lakowicz）らは、ハイスループットスクリーニング適用における多重励起の使用を報告した。彼らは、フルオレセインの二光子誘導蛍光が高密度多重壁プレートにおいて確実に測定され得ることを示している。
【００２２】
文献に記載されている二光子励起蛍光のほとんどのバイオ分析的適用は、二光子イメージング顕微鏡に関するものである（Denk W. et al. 米国特許第５，０３４，６１３号明細書、Denk W. et al., Science 248 (1990) 73）。レーザー走査顕微鏡における二光子蛍光励起の使用は、共焦点顕微鏡において必須であるピンホールを使用せずに固有の３Ｄ空間分解能を提供する。単純な光学的デザインを有する二光子励起顕微鏡は、普通の一光子励起共焦点顕微鏡に匹敵する３Ｄ空間分解能を提供する。二光子励起技術の欠点は、高い繰り返し周波数を有する強い超短レーザーを生成できる高価なレーザーの必要性である。
【００２３】
もう少し安いレーザー技術の最近の発展は、ルーチンなバイオ分析的適用における二光子蛍光励起技術の有用性に関して非常に激励している（Haenninen P. et al., Nat. Biotechnol. 18 (2000) 548; Soini J.T. et al. Single Nol. 1 (2000) 203; 国際公開第９８／２５１４３号パンフレットおよび同第９９／６３３４４号パンフレット）。国際公開第９８／２５１４３号パンフレットおよび同第９９／６３３４４号パンフレットによれば、高価なモード固定レーザーの代わりに、受動Ｑ−スイッチダイオード−ポンプマイクロチップレーザー（passively Q-switched diode-pumped microchip lasers）が二光子励起に使用され得る。これらのレーザーは、モノリシックで、小さく、単純で、安価である。国際公開第９８／２５１４３号パンフレットおよび同第９９／６３３４４号パンフレットは、バイオ分析的アッセイ法における二光子励起の使用を記載している。このバイオ分析的アッセイ法は、溶液中または生物学的懸濁液中の検体に対して使用され得る。そしてそれは、バイオアフィニティー結合固相として微粒子を用い、そこに一次生物特異的試薬が結合される。このバイオ分析的アッセイ法は、二光子蛍光色素で標識された生物特異的二次試薬を利用する。国際公開第９８／２５１４３号パンフレットおよび同第９９／６３３４４号パンフレットによれば、反応体積中における微粒子と検体および生物特異的二次試薬との接触により、二光子励起に基づく蛍光検出の使用が分離フリーアッセイ法を可能とする。一次生物特異的試薬と微粒子に結合した検体の量は、標識二次生物特異的試薬に起因する二光子励起蛍光シグナルによって検出される。標識二次生物特異的試薬は、検体に（非競争的、免疫的方法）または一次生物特異的試薬（競争法）のいずれかに結合し得る。一次および二次生物特異的試薬は、ハプテン、生物学的に活性なリガンド、薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、ポリペプチド、タンパク質、抗体または抗体のフラグメントなどの生物学的に活性な分子である。国際公開第９８／２５１４３号パンフレットおよび同第９９／６３３４４号パンフレットによれば、高い二光子励起効率を有するレーザーが反応懸濁液に集められ、二光子励起蛍光が、レーザービームの焦点体積を通って浮遊している場合、個々の微粒子（single microparticles）から測定される。あるいは、微粒子は蛍光検出の期間、レーザービームにより誘導される光学的トラップにより捕捉され得る。レーザービームの焦点への微粒子の捕捉は、照明レーザーによって微粒子状に生成される光学的圧力に基づいている。国際公開第９８／２５１４３号パンフレットによれば、光学的捕捉は、レーザービームの焦点での粒子の持続時間を増加させ、そして測定の不感時間を減少させる。国際公開第９８／２５１４３号パンフレットによれば、光学的捕捉は、相対的に高いレーザー平均出力（laser average power）と照明強度とを必要とする。この場合、レーザーの平均出力は、捕捉の効率を決定する。マイクロチップレーザーの繰り返し率は比較的低く、したがって、光学的捕捉に充分なレーザーの平均出力を得るために高いパルスエネルギーとその結果としての照明レーザーの高い最大出力を使用することが必要である。高い最大出力、および高い二光子励起効率を有す��レーザーの使用により、二光子励起蛍光収率は減少され得、また単一パルス効果により分離フリーアッセイにおけるシグナル対バックグラウンド比が減少され得る。しかしながら、実際には、蛍光シグナルを最大化するために可能な限り高い二光子励起効率を有するレーザーを使用することが多くの場合妥当である。
【発明の開示】
【００２４】
本発明の目的は、生物学的液体または懸濁液から検体を測定するための改良された分離フリーバイオ分析的アッセイ法を提供することである。
【００２５】
本発明は、バイオアフィニティー結合固相としての微粒子、二光子蛍光色素で標識化された生物特異的二次試薬を含有する生物学的液体または懸濁液から検体を測定するための分離フリーバイオ分析的アッセイ法であって、レーザーを反応懸濁液に集め、個々の微粒子が、レーザービームの焦点体積を通って無作為に浮遊または励起レーザーの放射圧により誘導される場合に個々の微粒子から二光子励起蛍光を測定する方法に関する。二光子蛍光色素は構造（II）を有する。
【００２６】
【化２】
2004533626.tif 000004
【００２７】
置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7のいずれかの少なくとも１つは、置換または非置換のフェニル、チエニル、ピロリル、フラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、インドリル、共役エテニル、ジエニルまたはトリエニル基であり、かつ置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つは、他の分子への選択的共有結合に使用され得る化学的反応基を得るために置換されており、そして置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つは、水溶性基を得るために置換されており、そしてＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7の残りの置換基は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シアノ、カルボキシからなる群（各基は任意に置換され得る）より選択され；または置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は、置換または非置換のアルキル基であり、Ｒ4は水素、または置換もしくは非置換のアルキル基であり、かつ置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つは、他の分子への選択的共有結合に使用され得る化学的反応基を得るために置換されており、そして置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つは、水溶性基を得るために置換される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
この出願において使用する用語は以下のように定義される。
・二光子蛍光：同じ発光団への２つの光子の同時吸収とそれに続く励起状態の発光緩和を含むプロセス。
・二光子蛍光色素：２つの同時吸収される光子により励起され得る分子であって、励起された状態の緩和が蛍光発光を伴う分子。
・累積多重パルス効果：長い寿命の三重項状態への励起エネルギーの蓄積により生じる効果。この効果は、二光子励起に対して１００ ＭＨｚの桁の繰り返し率を有するサブピコ秒レーザーを用いる場合、蛍光収率の減少を引き起こす。この効果は、色素の飽和レベルに達する前に、照明強度に対する二光子蛍光の二次的相関関係からの逸脱を引き起こす。
・単一パルス効果：二次または高次の直接的非線形吸収により生じる効果。この効果は、二光子励起に対して高いパルス最大出力（Ｐp）とｋＨｚの繰り返し率のピコ秒〜ナノ秒の通常パルス長（τpulse）とを有するレーザーを用いる場合、蛍光収率の減少を引き起こす。この効果は、色素の飽和レベルに達する前に、照明強度に対する二光子蛍光の二次的相関関係からの逸脱引き起こす。
・二光子励起効率：時間単位当たりの励起の数。二光子励起効率（Ｅｘ2ph）は、レーザー光の最大出力（Ｐp）およびパルス持続時間（τpulse）に比例する（Ｅｘ2ph∝Ｐp2×τpulse）。
・高い二光子励起効率を有するレーザー：飽和レベル付近（Ｂ、図１）まで二光子蛍光を励起することが可能なレーザー。
・シグナル対バックグラウンド比：粒子表面上の色素から得られるシグナルと溶液中の色素から得られるシグナルとの比。
・照明強度：ビーム断面領域単位当たりのレーザーパルス最大出力。
・平均出力（average power）：１秒間に発光されるレーザービームエネルギー。
・微粒子：球状または非球状の個体物体であって、化学的または生物学的種（species）に対して固相担体として使用され得る。微粒子は、通常０．０１〜１００μｍのものとされ、ポリマー、ガラス、シリカまたは他の材料で構成され得る。
【００２９】
本発明は、高い二光子励起蛍光収率を有し、高い強度のレーザー照明のもとでさえ、単一パルス効果による例外的に低い消光を示す二光子吸収発蛍光団に関する。この発明は、高い二光子励起効率を有するレーザーの使用に基づく分離フリーバイオ分析的アッセイ法に使用され得る二光子蛍光色素を提供する。本発明の目的物（object）であるジピロメテンボロンジフルオリド色素および該色素の複合体が、格別に高い二光子励起蛍光収率を提供することを見出した。本発明の目的物である二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素および該色素の複合体は、微粒子に基づくバイオ分析的アッセイシステムに理想的に適している。それは、ジピロメテンボロンジフルオリド色素および該色素の複合体が、微粒子の光学的捕捉に必要とされるレーザーの高い平均出力のもとでさえも単一パルス効果による例外的に低い消光を示すからである。本発明は、特に生体分子の標識化に好適である新規な二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素を導入する。これらの二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素は、本質的に親水性であり、水溶液に溶解する。これらの色素の水溶液への溶解性により、バイオ分析的アッセイ法において使用されるのに理想的に適している。
【００３０】
図１は、照明強度に対する二光子励起のプロットである。低い照明強度（Ａ）では、励起は照明強度の二次相関関係に従う。二光子励起蛍光を最大化するために、色素は飽和レベル付近（Ｂ）まで励起されるべきである。飽和レベル（Ｃ）では、ほとんどすべての色素分子が励起される。図２ａは、実施例１〜３において化合物１〜３として記載されるアルキル置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を表わす。図２ｂおよび２ｃは、実施例４〜９において化合物４〜９として記載されるヘテロアリール置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を表わす。Ｘ+は、カチオン性カウンターイオンである。図２ｄは、実施例１０および１１おいて化合物１０および１１として記載されるフェニル置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を表わす。Ｘ+は、カチオン性カウンターイオンである。図２ｅおよび２ｆは、実施例１２および１３において化合物１２および１３として記載されるフェニルエテニル置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を表わす。Ｘ+は、カチオン性カウンターイオンである。図２ｇおよび２ｈは、実施例１４〜１７において化合物１４〜１７として記載される、アミノ−、アリールアミノ−、マレイミド−およびイソチオシアネート反応基を有するチエニル置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を表わす。Ｘ+は、カチオン性カウンターイオンである。図３は、水溶液における色素の溶解性を増加させるために使用されるリンカー化合物１８を表わす。Ｘ+は、カチオン性カウンターイオンである。図４は、実施例２１に記載されるような二光子蛍光に基づくイムノアッセイにおける二光子蛍光シグナル対検体（ＡＦＰ）濃度のプロットである。ＡＦＰ濃度０ｎｇ／ｍｌは、図４において対数スケールが使用されるため、０．１ｎｇ／ｍｌの濃度として表わされる。図５は、二光子蛍光測定に使用される装置の光学的スキームである。受動的ＱスイッチＮｄ:ＹＡＧマイクロチップレーザー１は、二光子励起蛍光のための照明光源として使用される。レーザーの波長は１０６４ｎｍであり、パルス持続時間は１ｎｓで、繰り返し率は２０ｋＨｚである。自然に拡散するレーザー光ビームは、ダイクロイックミラー２により光学スキャナーユニット３を通して対物レンズ４の入口アパーチァー（entrance aperture）に向けられる。入口アパーチャーでの照明は、全アパーチャーの約７０％にガウスフィッティングする。対物レンズは、ついで照明光を、薄い光学的底（optical bottom）（厚さ０．２ｍｍ）を有する特定のキュベット５に集める。試料に到達する平均の光学的出力は５０ｍＷである。焦点体積の大きさは、約１フェムトリットルである。５４０〜７００ｎｍの範囲での二光子励起蛍光シグナルが、対物レンズ４の全アパーチャーから集められ、ジクロイックミラー２およびバンド通過フィルター６を通して、光電子増倍管７に向けられる。粒子測定の場合、二光子励起蛍光光と微粒子後方散乱（反射された）レーザー光の両方が測定される。ダイクロイックミラー２および２％のビーム分割ウィンドウ（beam splitting window）８は、分割シグナル共焦点の検出を行なうピンホール９へ後方散乱光を偏向させる。分割シグナルの検出器は、近赤外ＧａＡｓピンフォトダイオード１０である。粒子は、三次元ビー��スキャナー３を使用することにより連続的に監視される。ｘｙ−スキャナーは、オプトメカニカルであり、可能な限り対物レンズの入口アパーチャーの近くに位置させる。対物レンズの入口アパーチャーの部分的な照明により、ｘｙ−スキャナーの全偏角でのビームの偏向は、アパーチャー端によるビームの有意な切断を生じない。後方散乱シグナルの振幅が前もってセットされた閾値レベルを上回った場合、微粒子が焦点体積の近傍に現れ、ｘ−およびｙ−スキャナーミラーが停止される。照明レーザービームにより生じる光学圧力は、粒子を捕捉し、その粒子をレーザービームの焦点の中心を通して誘導する。蛍光シグナルは、粒子が焦点にいる間に、すなわち後方拡散シグナルが前もって設定された閾値を上回ている場合に測定される。ｘｙ−スキャニングに加えて、さらなるｚ−スキャニング移動が、軸方向でゆっくりと対物レンズを移動させることにより行なわれる。この移動の振幅は１５０μｍであり、移動は粒子測定の間停止されない。ゆっくりとしたｚ−スキャニングにもかかわらず、粒子は、光学捕捉力に基づき焦点に留まる。
【００３１】
高い二光子励起効率を有するレーザーと組合わせて使用される二光子蛍光色素は、発蛍光団が単一パルス効果による最小の消光を有するように選択されなければならない。これは、ほぼ飽和レベルの発蛍光団集団の励起を可能とし、したがって二光子蛍光シグナルの最大化を可能とする。蛍光色素の適切な選択は、国際公開第９８／２５１４３号パンフレットおよび国際公開第９９／６３３４４号パンフレットに記載されている二光子励起と固体担体としての微粒子の使用とに基づくバイオ分析的アッセイにおける微粒子の光学的捕捉の活用を可能とする。高い繰り返し率のレーザーが使用される場合、一重項−三重項交差の発生も、適切な発蛍光団の選択のための重要なパラメーターとなる。遅い一重項−三重項交差速度を有する発蛍光団を用いる場合、非発光三重項状態へのエネルギーの蓄積が回避される。本発明の目的物である二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素は、２つの必須要件を共に満たしている。さらに、二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素の吸収および発光バンドの位置は、基本発光団を適宜置換することにより変化させることができる。この特性は、ある特定のレーザーに適した発光団の特性を変化させる場合に、本質的に重要である。ジピロメテンボロンジフルオリド色素の蛍光量子収率は、通常７０％以上である。単一パルス効果による低い消光速度と共に高い量子収率は、照明源として高い二光子励起効率を有するレーザーを使用する場合、高い二光子励起蛍光を提供する。この発明によるジピロメテンボロンジフルオリド色素の二光子励起蛍光収率は、驚くほど高い。以前に報告されたデータ（Xu C. and Webb W.W., J. Opt. Soc. Am. B, 13 (1996) 481）に反して、我々は、ジピロメテンボロンジフルオリド色素の二光子励起蛍光収率がローダミンＢの二光子励起蛍光収率よりさらに高いということを見出した。さらに、単一パルス効果による二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素の最小消光が、システムの３Ｄ空間分解能を有意に損失させることなく照明源として高い二光子励起効率を有するレーザーを利用することを可能とする。二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素はまた、水溶液および有機媒体の両方における使用のために、適切な側鎖置換によって修飾されてもよい。
【００３２】
この本発明は、Haenninen P. et al., Nat. Biotechnol. 18 (2000) 548; Soini J.T. et al. Single Mol. 1 (2000) 203; 国際公開第９８／２５１４３号パンフレットおよび同第９９／６３３４４号パンフレットに記載されているバイオ分析的アッセイ法に関する。本発明は、Haenninen P. et al., Nat. Biotechnol. 18 (2000) 548; Soini J.T. et al. Single Mol. 1 (2000) 203; 国際公開第９８／２５１４３号パンフレットおよび同第９９／６３３４４号パンフレットに記載されているバイオ分析的アッセイ法と組合わせて高い能力を提供する二光子蛍光色素を提供する。本発明の目的物である二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素および該色素の複合体は、シグナル対バックグラウンド比のいかなる有意な減少をも伴わずに、高い二光子励起効率を有するレーザーの使用に基づく分離フリーバイオ分析的アッセイ法において使用され得る。
【００３３】
本発明によれば、二次生物特異的試薬は二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素で標識される。二次生物特異的試薬は、ハプテン、生物学的に活性なリガンド、薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、ポリペプチド、タンパク質、抗体または抗体のフラグメントなどの生物学的に活性な分子である。二光子蛍光ジピエオメテンボロンジフルオリド色素で標識された二次生物特異的試薬は、検体（非競争アッセイ）または一次生物特異的試薬（競争結合アッセイ）のいずれかに結合し得る。微粒子上の一次生物特異的試薬に結合した検体の量は、二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素で標識されている二次生物特異的試薬に起因する二光子励起蛍光シグナルによって検出される。
【００３４】
レーザービームの焦点での粒子の持続時間を増加させ、測定の不感時間を減少させる光学的捕捉（国際公開第９８／２５１４３号パンフレットに記載されている）は、比較的高いレーザー平均出力を必要とする。低いパルス周波数での高い平均出力は、単一パルス効果による蛍光の消光を引き起し得る高いパルスエネルギーの原因となる。本発明によれば、二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素は、微粒子に基づくバイオ分析的アッセイシステムに理想的に適している。これらの色素は、微粒子の光学的捕捉に要求されるレーザーの高い平均出力のもとでさえ、単一パルス効果による例外的に低い消光を示す。
【００３５】
本発明の目的物である二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素および該色素の複合体は、結合していない生物特異的試薬の二光子励起蛍光のモニタリングに基づく分離フリーバイオ分析的アッセイ法においても使用し得る。一次生物特異的試薬は、微粒子、またはキュベットの壁面のいずれかに結合される。二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素で標識された二次生物特異的試薬は、検体（非競争アッセイ）または一次生物特異的試薬（競争結合アッセイ）のいずれかに結合し得る。一次生物特異的試薬を介して微粒子またはキュベットの壁面に結合された検体の量は、二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素で標識された非結合二次生物特異的試薬に起因する二光子励起蛍光シグナルに基づき決定される。
【００３６】
本発明の目的物である二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素は、以下の一般構造（II）を有する。
【００３７】
【化３】
2004533626.tif 000005
【００３８】
この構造において、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アリールアルケニル、アリール、アルキルアリール、ヘテロアリール、アシル、アルコキシ、シアノ、カルボキシ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシカルボニル、ニトロ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノおよびスルホの置換基のうちから単独で、または組合わせて選択される。さらに、発光団上の置換基は、化学的反応性官能基を提供するためにさらに修飾され得る。他の分子への選択的共有結合に使用され得る化学的反応基は、カルボン酸、カルボン酸反応性エステル、カルボン酸無水物マレイミド、塩化スルホニル、フッ化スルホニル、ヒドラジン、アミン、アルコール、アシルアジド、イソシアネート、アルデヒド、ハロアセトアミド、トリアジンまたはイソチオシアネートの誘導体が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００３９】
吸収および発光を長波長側へシフトするために使用され得る置換基は、ある特定のレーザーに好適な基本発光団の特徴を変化させる際に、本質的に重要である。たとえば、１０６４ｎｍの波長でのＮｄ：ＹＡＧレーザーによる二光子励起においては、蛍光発光バンドは５３２ｎｍ以上であるべきである（２つの１０６４ｎｍ光子のエネルギーの和）。ジピロメテンボロンジフルオリド基本発光団の吸収および発光バンドを長波長側にシフトするための従来の方法は、π電子共役を延ばすことである。これは、たとえば基本発光団に不飽和有機基を付加することによりなされ得る。これによれば、本発明の好ましい化合物は、置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7の少なくとも１つが、フェニル、チエニル、ピロリル、フラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、インドリル、共役エテニル、ジエニル、トリエニル、および１つまたはいくつかの置換基で任意に置換された前記いずれかの置換基からなる群より選択される構造を有する。任意の置換基は、好ましくは、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、シアノ、ニトロ、カルボキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホ、および好ましくは１〜１０個の炭素を含有し、ヘテロ原子、置換ヘテロ原子または側鎖を有するヘテロ原子を含有してもよい直鎖または分岐鎖状のアルキルからなる群より選択される。残りの置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は、水素、ハロゲン、アルコキシ、シアノ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ニトロ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、スルホ、および好ましくは１〜１０個の炭素を含有し、ヘテロ原子、置換ヘテロ原子または側鎖を有するヘテロ原子を含有してもよい直鎖または分岐鎖状のアルキルからなる群よりそれぞれ独立して選択される。このうち最も好ましい化合物は、Ｒ1が置換もしくは非置換のフェニル、チエニル、ピロリルまたはフェニルエテニルであり；Ｒ2、Ｒ3およびＲ4が水素であり；Ｒ5、Ｒ6およびＲ7が、それぞれ独立して水素、アルキルまたは置換アルキルのいずれかである化合物である。
【００４０】
本発明の好ましい化合物は、置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つが−ＹＺであり、−Ｙ−がリンカー単位であり、かつＺが、生体分子などの他の分子への発光団の共有結合に使用され得る化学的反応基である構造を有することもできる。リンカー単位−Ｙ−は、１つの共有結合、またはＣ1〜Ｃ20の直鎖または分岐鎖状のアルキレン、アリールエン、アルカリルエン、アラルキルエン基またはこれらの組合わせのいずれかである。リンカー単位−Ｙ−は、ヘテロ原子、置換ヘテロ原子または側鎖を有するヘテロ原子、または環状残基を有してもよい。リンカー単位−Ｙ−は、ポリマーの残基、好ましくはポリペプチド、多糖、ポリヌクレオチド、ポリエーテルなどのポリマーの残基を含有してもよく、またはポリマーの残基、好ましくはポリペプチド、多糖、ポリエーテルなどのポリマーの残基からなっていてもよい。残りの置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルケニルアリール、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、アシル、アルコキシ、シアノ、カルボキシ、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシカルボニル、ニトロ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノおよびスルホなどの置換基から、それぞれ独立して選択され、それらは任意に置換されている。好ましい置換基は前記と同じである。
【００４１】
ジピロメテンボロンジフルオリド色素は、通常、有機溶媒に溶解する。特に、アリール置換基を有するジピロメテンボロンジフルオリド色素は、元来疎水性であり、水溶液に溶解しない。しかしながら、水溶性は、通常バイオ分析的適用に要求される。蛍光ラベルの親水性および水溶液への溶解性は、多くの場合、非特異的結合の減少、標識生体分子におけるラベルの光物理的特性の保持、および標識生体分子の生物学的特性の保持という点において絶対不可欠である。水性溶解性は、基本発光団に適切な水溶性基を付加することにより得られる。水溶性基は、好ましくは、スルホン酸またはカルボン酸のアンモニウムまたはアルカリ金属の塩、アンモニウムまたはヒドロキシル基を含む。水性溶解性は、ペプチドまたはカルボヒドレート部分を色素に付加することにより得ることもできる。
【００４２】
これによれば、本発明の好ましい化合物は、吸収および発光バンドが適宜変化される構造を有する。その化合物は、該化合物を他の分子に共有結合させるために使用され得る反応性側鎖を含有し、そしてその化合物は、水溶液への溶解性を増加させる基も含有する。これによれば、本発明の好ましい化合物は、置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つが、置換もしくは非置換のフェニル、チエニル、ピロリル、フラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、フェニルエテニルまたはインドリルであり；置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つが、他の分子への選択的共有結合および／またはさらなる化学的修飾のために使用され得る化学性反応基を得るために置換され；そして置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つが、水溶性基を得るために置換される。これによれば、最も好ましい化合物は、Ｒ1が置換もしくは非置換のフェニル、チエニル、ピロリルまたはフェニルエテニルであり；Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5が、それぞれ独立して水素またはアルキルのいずれかであり；Ｒ6またはＲ7が、最も好ましくは、式：
【００４３】
【化４】
2004533626.tif 000006
【００４４】
（式中、Ｘ＋はカチオン）を有し、および残りの置換基Ｒ6またはＲ7は水素またはアルキルのいずれかである構造を有する。本発明の好ましい化合物は、置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7が置換または非置換のアルキル基であり、Ｒ4が水素または置換もしくは非置換のアルキル基であり；そして置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つが、他の分子への選択的共有結合および／またはさらなる化学的修飾のために使用され得る化学性反応基を得るために置換され；そして置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つが、水溶性基を得るために置換される構造を有することができる。好ましい置換基は、前記と同じである。水溶性であり、したがって生体分子の標識化に特に好適な二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素の例は、実施例３および８〜１７に示す。これらの二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素は水溶性であり、それらは、高い二光子零基効率レーザーによる照明のもとでさえも単一パルス効果による例外的に低い消光を有する。
【００４５】
本発明の二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素は、二光子蛍光複合体を得るために生物特異的分子に結合され得る。生物特異的分子は、ハプテン、生物学的に活性なリガンド、薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、ポリペプチド、タンパク質、抗体または抗体のフラグメントなどの生物学的に活性な分子である。二光子蛍光複合体は、特定のシグナルが該複合体の二光子励起蛍光を介して得られるバイオ分析的アッセイシステムにおいて使用され得る。本発明の二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素および複合体は、細胞および組織の染色のためにも使用することができる。
【００４６】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに説明することを目的としている。実施例以下において、化合物１〜１８として引用される化合物は、図２ａ〜２ｈおよび３に開示している。
【実施例１】
【００４７】
３，３′，５，５′−テトラメチル−４，４′−カルボキシエチル−２，２′−ジピリルメテンヒドロブロミド（１）
２−エトキシカルボニル−３，５−ジメチル−４−メトキシカルボニルエチルピロール（１．０ｇ、３．３５ ｍｍｏｌ）をギ酸（３ｍｌ）に添加し、臭化水素酸（４８％、３ｍｌ）を添加した。反応混合物を１００℃で２．５時間攪拌した。混合物を室温まで冷却した後、室温で一晩静置した。生成物を反応混合物から、小さなオレンジ色の針状結晶として結晶化した。反応混合物をろ過し、結晶の生成物を水で洗浄した。生成物、化合物１を真空デシケーターで乾燥した。収量は６７７ｍｇ（８４％）であった。追加量の生成物（４３ｍｇ）を、ろ液から＋４℃で２日間静置したのちに得た。全収量は７２０ｍｇ（８６％）であった。
【００４８】
２−エトキシカルボニル−３，５−ジメチル−４−メトキシカルボニルエチルピロールはBullock E. et al., J. Chem. Soc. (1958) 1430 に記載されているように製造した。
【実施例２】
【００４９】
４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２，６−ジプロピオン酸（２）
ジピリルメテンヒドロブロミド（化合物１）（５００ｍｇ、１．１７ ｍｍｏｌ）をクロロホルム（２０ｍｌ）に懸濁し、トリエチルアミン（４．３ｍｌ、３１ ｍｍｏｌ）を添加した。開始ジピリルメテンは、トリエチルアミン（４．３ｍｌ、３１ ｍｍｏｌ）添加直後に溶解した。ボロントリフルオリドエチルエーテレート（５ｍｌ、３１ ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２．５時間攪拌した。反応混合物をクロロホルム（５０ｍｌ）で希釈し、希ＨＣｌ（５％、３０ｍｌ）および水（３０ｍｌ）で洗浄した。少量のエタノール（５％）を効果的な抽出を行なうために添加した。クロロホルム層をロータリーエバポレーターで乾固するまで蒸発させ、生成物（化合物２）をエタノール／水から沈殿させ（＋４℃で７日）、茶色−オレンジの粉末を得た。生成物（化合物２）を真空デシケーター中で乾燥した後の収量は４２０ｍｇ（９２％）であった。
1HNMR (JEOL JNM-LA400, DMSO-d6, 400MHz, δppm): 2.19(s, 6H, 2×-CH3), 2.29(t, 4H, 2×-CH2-), 2.38(s, 6H, 2×-CH3), 2.57(t, 4H, 2×-CH2-), 7.53(s, 1H, Ar-CH=).
【実施例３】
【００５０】
４，４−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−６−カルボキシエチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸スクシンイミジルエステル（３）
４，４′−ジフルオロ−１，３，５，７−テトラメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２，６−ジプロピオン酸（化合物２）（１０２ｍｇ、０．２６ ｍｍｏｌ）をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２．５ｍｌ、乾燥）に溶解した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（９０ｍｇ、０．７８ ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（５４ｍｇ、０．２６ ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で２４時間攪拌した。Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを蒸発させ（５ｍｂａｒ、４０〜５０℃）、生成物を、カラムクロマトグラフィーにより精製した。シリカを固定相に、ジクロロメタン：アセトン：酢酸（１００：８：１、ｖ：ｖ：ｖ）を溶離液に使用した。目的のモノ−スクシンイミジルエステル（化合物３）を含む画分を集め、乾固するまで蒸発させた。残渣を少量のジクロロメタンに溶解した。石油エーテル（ｂｐ ４０〜６０℃）を添加し、生成物を沈殿させた。溶液をろ過し、沈殿した生成物（化合物３）をオレンジ色の固体として得た。収量は５０ｍｇ（３９％）であった。
1HNMR (JEOL JNM-LA400, DMSO-d6, 400MHz, δppm): 2.21(s, 3H, CH3), 2.22(s, 3H, CH3), 2.36(t, 2H, -CH2-), 2.40(s, 3H, CH3), 2.41(s, 3H, CH3), 2.59(t, 2H, -CH2-), 2.72(t, 2H, -CH2-), 2.80(s, 4H, 2×-CH2-), 2.85(t, 2H, -CH2-), 7.60(s, 1H, Ar-CH=).
UV-VIS (Ocean Optics SD2000, MeOH): λmax=523 nm (ε=91000).
【実施例４】
【００５１】
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸メチルエステル（４）
２−ホルミル−５−（２−チエニル）ピロール（１５０ｍｇ、０．８４ ｍｍｏｌ）および２，４−ジメチル−３−カルボキシエチルピロール（１４０ｍｇ、０．８４ ｍｍｏｌ）をジクロロメタン：メタノール（１０：１、３０ｍｌ）に溶解した。オキシ塩化リン（７７μｌ、０．８４ ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で１８時間攪拌した。反応混合物を乾固するまで蒸発させ、残渣をジクロロメタン（１５０ｍｌ）に溶解した。Ｎ−エチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミン（１．４４ｍｌ、８．４ ｍｍｏｌ）およびボロントリフルオリドエチルエーテレート（１．０６ｍｌ、８．４ ｍｍｏｌ）を添加した。ボロントリフルオリドエチルエーテレートの添加直後に強いオレンジの蛍光が観察された。反応混合物を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、乾固するまで蒸発させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した。シリカを固定相に、ジクロロメタンを溶離液に使用した。目的の生成物を含む画分をプールし、乾固するまで蒸発させ、３０４ｍｇ（９３％）の４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸メチルエステル（化合物４）を得た。
1HNMR (Bruker AM200, CDCl3, 200MHz, δppm): 2.21(s, 3H, Ar-CH3), 2.47(t, 2H, -CH2-), 2.59(s, 3H, Ar-CH3), 2.74(t, 2H, -CH2-), 3.68(s, 3H, -COOCH3), 6.70(d, 1H, ArH), 6.91(d, 1H, ArH), 7.05(s, 1H, Ar-CH=), 7.15(d, 1H, ArH), 7.40(d, 1H, ArH), 8.04(d, 1H, ArH).
FAB-MS: MH+ 389.
UV-VIS (Ocean Optics SD2000, MeOH): λmax=560 nm (ε=82000).
【００５２】
２−（２−チエニル）ピロールは、Kruse C.G. et al, Heterocycles 26 (1985) 3141にしたがって製造し、Bullock E. et al. J. Chem. Soc. (1963) 2326 にしたがってホルミル化して２−ホルミル−５−（２−チエニル）ピロールを得た。
【００５３】
２，４−ジメチル−３−カルボキシエチルピロールは以下の通り製造した。２−エトキシカルボニル−３，５−ジメチル−４−メトキシカルボニルエチルピロール（１．５ｇ、５．９ ｍｍｏｌ）および水酸化カリウム（６．６ｇ）をエチレングリコール（５０ｍｌ）に溶解した。反応混合物を窒素雰囲気下で３時間還流した（１９０℃）。水（１０ｍｌ）を添加し、混合物をさらに２時間還流した。冷却した反応混合物を水（２００ｍｌ）で希釈し、濃塩酸で酸性とし、ジエチルエーテルで抽出した。オレンジ色の抽出物をプールし、硫酸ナトリウムで乾燥し、乾固するまで蒸発させた。生成物をカラムクロマトグラフィーで精製した。シリカを固定相に、ジクロロメタン：メタノール（１０：１、ｖ：ｖ）を溶離液に使用した。生成物を含む画分をプールし、乾固するまで蒸発させ、７２０ｍｇ（７２％）の２，４−ジメチル−３−カルボキシエチルピロールを得た。
【実施例５】
【００５４】
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸（５）
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸メチルエステル（化合物４）（１０７ｍｇ、０．２７ ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン：水（３：２、５０ｍｌ）に溶解した。リン酸（８５％、３ｍｌ）を添加し、混合物を５日間還流した。反応混合物を水で希釈し、生成物をジクロロメタンで抽出した。オレンジ色の層を硫酸ナトリウムで乾燥し、乾固するまで蒸発させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した。シリカを固定相に、ジクロロメタン：メタノール（１０：１）を溶離液に使用した。目的の生成物を含む画分をプールし、乾固するまで蒸発させた。生成物をジクロロメタン：石油エーテルから結晶化し、６８ｍｇ（６６％）の４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸（化合物５）を得た。
1HNMR (Bruker AM200, DMSO-d6, 200MHz, δppm): 2.22(s, 3H, Ar-CH3), 2.40(t, 2H, -CH2-), 2.51(s, 3H, Ar-CH3), 2.63(t, 2H, -CH2-), 6.80(d, 1H, ArH), 7.11(d, 1H, ArH), 7.19(d, 1H, ArH), 7.69(s, 1H, Ar-CH=), 7.73(d, 1H, ArH), 7.88(d, 1H, ArH).
【実施例６】
【００５５】
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸スクシンイミジルエステル（６）
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸（化合物５）（５７ｍｇ、０．１５ ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）に溶解した。Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（４７ｍｇ、０．２３ ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５２ｍｇ、０．４５ ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で２０時間攪拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、沈殿したＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルウレアをろ過し除去した。ろ液を乾固するまで蒸発させ、生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した。シリカを固定相に、ジクロロメタン：アセトン：酢酸（１００：８：１、ｖ：ｖ：ｖ）を溶離液に使用した。生成物を含む画分を一緒にし、乾固するまで蒸発させた。生成物をさらに真空デシケーター中で乾燥させ、３５ｍｇ（７５％）の４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸スクシンイミジルエステル（化合物６）を得た。
1HNMR (Bruker AM200, CDCl3, 200MHz, δppm): 2.23(s, 3H, Ar-CH3), 2.61(s, 3H, Ar-CH3), 2.74-2.82(2t, 4H, 2×-CH2-), 2.86(s, 4H, -CH2-), 6.72(d, 1H, ArH), 6.93(d, 1H, ArH), 7.08(s, 1H, Ar-CH=), 7.15(dd, 1H, ArH), 7.41(d, 1H, ArH), 8.06(d, 1H, ArH).
【実施例７】
【００５６】
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−誘導体（７）
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸スクシンイミジルエステル（化合物６）（３５ｍｇ、０．０７４ ｍｍｏｌ）およびＧｌｕ−Ｔａｕ−リンカー（化合物１８）（１９ｍｇ、０．０７４ ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１ｍｌ）に溶解した。無水トリエチルアミン（３１μｌ、０．２２ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で３０分攪拌した。反応混合物を減圧下で乾固するまで蒸発させた。粗生成物はさらに精製することなく使用した。
ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ、パーセプティブ  バイオシステムズ（PerSeptive Biosystems）、α−シアノ−４−桂皮酸マトリクス、ネガティブモード）：計算値  ６０９（Ｍ−１）、実測値  ６０９（Ｍ−１）。
【実施例８】
【００５７】
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−スクシンイミド誘導体（８）
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−誘導体（化合物７）（０．０７４ ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２ｍｌ）に溶解した。Ｎ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカルボジイミド（４６ｍｇ、０．２２ ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（２６ｍｇ、０．２２ ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で４８時間攪拌した。沈殿したＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルウレアをろ過して除去し、ろ液を乾固するまで蒸発させた。生成物をさらに真空デシケーター中で乾燥させ、さらに精製することなく使用した。
ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ、パーセプティブ  バイオシステムズ、α−シアノ−４−桂皮酸マトリクス、ネガティブモード）：計算値  ７０６（Ｍ−１）、実測値  ７０６（Ｍ−１）。
【実施例９】
【００５８】
４，４−ジフルオロ−５−（２−ピロリル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−スクシンイミド誘導体（９）
４，４−ジフルオロ−５−（２−ピロリル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−スクシンイミド誘導体、化合物９は、実施例７および８に記載されているのと同じ方法で、４，４−ジフルオロ−５−（ピロリル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸スクシンイミジルエステルを出発物質として使用して製造した。
ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ、パーセプティブ  バイオシステムズ、α−シアノ−４−桂皮酸マトリクス、ネガティブモード）：計算値  ６８９（Ｍ−１）、実測値  ６８９（Ｍ−１）。
【実施例１０】
【００５９】
４，４−ジフルオロ−５−フェニル−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−スクシンイミド誘導体（１０）
４，４−ジフルオロ−５−フェニル−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−スクシンイミド誘導体、化合物１０は、実施例７および８に記載されているのと同じ方法で、４，４−ジフルオロ−５−フェニル−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸スクシンイミジルエステルを出発物質として使用して製造した。
ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ、パーセプティブ  バイオシステムズ、α−シアノ−４−桂皮酸マトリクス、ネガティブモード）：計算値  ７００（Ｍ−１）、実測値  ７００（Ｍ−１）。
【実施例１１】
【００６０】
４，４−ジフルオロ−５−（４−メトキシフェニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−スクシンイミド誘導体（１１）
４，４−ジフルオロ−５−（４−メトキシフェニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−スクシンイミド誘導体、化合物１１は、実施例７および８に記載されているのと同じ方法で、４，４−ジフルオロ−５（４−メトキシフェニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸スクシンイミジルエステルを出発物質として使用して製造した。
ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ、パーセプティブ  バイオシステムズ、α−シアノ−４−桂皮酸マトリクス、ネガティブモード）：計算値  ７３０（Ｍ−１）、実測値  ７３０（Ｍ−１）。
【実施例１２】
【００６１】
４，４−ジフルオロ−５−スチリル−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−スクシンイミド誘導体（１２）
４，４−ジフルオロ−５−スチリル−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−スクシンイミド誘導体、化合物１２は、実施例７および８に記載されているのと同じ方法で、４，４−ジフルオロ−５−スチリル−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸スクシンイミジルエステルを出発物質として使用して製造した。
ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ、パーセプティブ  バイオシステムズ、α−シアノ−４−桂皮酸マトリクス、ネガティブモード）：計算値  ７２６（Ｍ−１）、実測値  ７２６（Ｍ−１）。
【実施例１３】
【００６２】
４，４−ジフルオロ−５−（４−メトキシスチリル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−スクシンイミド誘導体（１３）
４，４−ジフルオロ−５−（４−メトキシスチリル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−スクシンイミド誘導体、化合物１３は、実施例７および８に記載されているのと同じ方法で、４，４−ジフルオロ−５−（４−メトキシスチリル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸スクシンイミジルエステルを出発物質として使用して製造した。
ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ、パーセプティブ  バイオシステムズ、α−シアノ−４−桂皮酸マトリクス、ネガティブモード）：計算値  ７５６（Ｍ−１）、実測値  ７５６（Ｍ−１）。
【実施例１４】
【００６３】
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−アミノ誘導体（１４）
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−スクシンイミド誘導体（化合物８）（０．０６２ ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）に溶解した。トリエチルアミン（２６μｌ、０．１８５ ｍｍｏｌ）およびエチレンジアミン（４２μｌ、０．６２ ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で３０分間攪拌した。反応混合物を乾固するまで蒸発させ、生成物をジクロロメタン−四塩化炭素から沈殿させた。生成物、化合物１４をさらに真空デシケーター中で乾燥させ、さらに精製することなく使用した。
ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ、パーセプティブ  バイオシステムズ、α−シアノ−４−桂皮酸マトリクス、ネガティブモード）：計算値  ６５１（Ｍ−１）、実測値  ６５１（Ｍ−１）。
【実施例１５】
【００６４】
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−アリールアミノ誘導体（１５）
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕスクシンイミド誘導体（化合物８）（０．０７４ ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）に溶解した。トリエチルアミン（３１μｌ、０．２２ ｍｍｏｌ）および４−（２−アミノエチル）アニリン（１５ｍｇ、０．１１ ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で３時間攪拌した。反応混合物を乾固するまで蒸発させ、生成物をジクロロメタン／四塩化炭素から沈殿させた。生成物、化合物１５をさらに真空デシケーター中で乾燥させ、さらに精製することなく使用した。
ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ、パーセプティブ  バイオシステムズ、α−シアノ−４−桂皮酸マトリクス、ネガティブモード）：計算値  ７２７（Ｍ−１）、実測値  ７２７（Ｍ−１）。
【実施例１６】
【００６５】
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−イソチオシアネート誘導体（１６）
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−アリールアミノ誘導体（化合物１５）（０．０４８ ｍｍｏｌ）を、アセトン（９ｍｌ）およびＮａＨＣＯ3（９ｍｌ、飽和水溶液）の混合液中に溶解した。チオホスゲン（１８３μｌ、２．４ ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で１．５時間攪拌した。反応混合物を水（５０ｍｌ）およびジクロロメタン（５０ｍｌ）で希釈した。水層を２回ジクロロメタン（４０ｍｌ）で洗浄した。生成物を含有する水層をフェノール（２×２０ｍｌ）で抽出した。生成物を含有するフェノール層を水（４０ｍｌ）で洗浄し、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）で希釈した。フェノール／ジエチルエーテル層を水（４×３０ｍｌ）で抽出し、あわせた水層をジエチルエーテル（３０ｍｌ）で２回洗浄した。生成物を含有する水層を乾固するまで蒸発させ、そして生成物をジクロロメタン−四塩化炭素から沈殿させた。生成物、化合物１６を真空デシケーター中でさらに乾燥させ、保管した。
ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ、パーセプティブ  バイオシステムズ、α−シアノ−４−桂皮酸マトリクス、ネガティブモード）：計算値  ７６９（Ｍ−１）、実測値  ７６９（Ｍ−１）。
【実施例１７】
【００６６】
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−マレイミド誘導体（１７）
４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−１，３−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオン酸のＧｌｕ−Ｔａｕ−アミノ誘導体（化合物１４）（０．０１５ ｍｍｏｌ）を、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３ｍｌ）に溶解した。トリエチルアミン（２．１μｌ、０．０１５ ｍｍｏｌ）およびＮ−スクシンイミジル  ４−マレイミドブチレート（３．２ｍｇ、０．０２０ ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を室温で２時間攪拌した。反応混合物を乾固するまで蒸発させ、生成物をジクロロメタン／四塩化炭素から沈殿させた。生成物、化合物１７をさらに真空デシケーター中で乾燥させ、保管した。
ＭＳ（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ−ＰＲＯ、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ、パーセプティブ  バイオシステムズ、α−シアノ−４−桂皮酸マトリクス、ネガティブモード）：計算値  ８１６（Ｍ−１）、実測値  ８１６（Ｍ−１）。
【実施例１８】
【００６７】
Ｇｌｕ−Ｔａｕリンカーの合成（１８）
グルタミン酸誘導体、ＢＯＣ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＳｕ（ノボ  バイオケム（NovaBiochem）、５００ｍｇ、１．２５ ｍｍｏｌ）を、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５ｍｌ）に溶解した。タウリン（７８２ｍｇ、６．２５ ｍｍｏｌ）を、トリエチルアミン（１．２０ｍｌ、８．７５ ｍｍｏｌ）と水（１０ｍｌ）との溶液に溶解した。そのタウリン溶液を、ＢＯＣ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＳｕの溶液に添加し、反応混合物を室温で３０分間攪拌した。エタノールを添加し、沈殿したタウリンをろ過して除去し、ろ液を乾固するまで蒸発させた。残渣をトリフルオロ酢酸（２ｍｌ）に溶解し、室温で２時間攪拌した。反応混合物を乾固するまで蒸発させ、残渣をジクロロメタン：メタノールに溶解した。生成物（化合物１８）を、ロータリーエバポレーターにおいてメタノールをゆっくり蒸発させることにより、白色固体として沈殿させた。目的のＧｌｕ−Ｔａｕリンカー（化合物１８）を、６４％の収率（２０４ｍｇ）で得た。
ＭＳ（ＺＡＢＳｐｅｃ−ｏａＴＯＦ、ファイソンズ  インスツルメント（Fisons Lnstruments）、グリセロールマトリクス）：計算値  ２５５（Ｍ＋１）、実測値  ２５５（Ｍ＋１）。
【実施例１９】
【００６８】
高い二光子励起効率を有するレーザーを使用する、選択された二光子蛍光色素の二光子蛍光収率の測定
二光子蛍光収率は、図５に概略的に示す実験的装置を用いて測定した。蛍光特性が良く特徴付けられているため、ローダミンＢ（イーストマン  コダック（Eastman Kodak））を対照標準として使用した。ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８およびＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７６と名付けられている３つのジピロメテンボロンジフルオリド色素とＲ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）をモレキュラー  プローブズから購入した。すべての有機色素をＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解し、無水エタノールで１００ ｎＭの濃度まで希釈した。ストック溶液のＲ−ＰＥをリン酸緩衝整理食塩水（５０／１５０ ｍＭ、ｐＨ ７．４）で希釈した。結果を表１にまとめる。結果はローダミンＢのシグナル（１００）で規格化した。表１からわかるように、ジピロメテンボロンジフルオリド色素の蛍光収率は、ローダミンＢの蛍光収率と同じ程度であった。ジピロメテンボロンジフルオリド色素の高い蛍光収率により、それらはローダミン型の色素の興味深い代替物である。Ｒ−フィコエリトリンは本明細書で示された色素の中で最も高い蛍光収率を有する。しかしながら、Ｒ−ＰＥの適用は、その大きいサイズのために制限されている。Ｒ−ＰＥの選択的活性化の複雑さもラベルとしてのその使用を制限している。
【００６９】
【表１】
2004533626.tif 000007
【実施例２０】
【００７０】
二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素３によるマウスＩｇＧ抗−ＡＦＰの標識化
１．５ｍｇ（９．３ ｎｍｏｌ）のマウスＩｇＧ抗−ＡＦＰ（クローンＡ）を４００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（１０／１５０ ｍＭ、ｐＨ ７．４）に溶解した溶液に、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した２０倍過剰量の化合物３（２５μｌ、ｃ＝７．５ ｍＭ）を添加した。４０μｌのＮａＨＣＯ3（１ Ｍ、水溶液）を添加し、混合物を室温で２時間インキュベートした。生成物を、ＮＡＰ−５ゲルろ過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテック、ウプサラ、スウェーデン）により、リン酸緩衝生理食塩水（５０／１５０、１０ ｍＭ ＮａＮ3、ｐＨ ７．４）を溶離液として用いて精製した。最初に移動するオレンジ色の画分を収集し、標識化の程度を、吸光分光分析的に測定した。タンパク質当たり５個の発蛍光団の標識化度が得られた。
【実施例２１】
【００７１】
微粒子に基づくイムノアッセイにおけるＲ−ＰＥ、Ａｌｅｘａ５３２（モレキュラー  プローブズ）およびジピロメテンボロンジフルオリド色素（３）の比較
モデルアッセイは、固相として３．１μｍのアミノ修飾ポリスチレン微粒子（アミノ修飾ミクロスフィア  ＰＡ０５Ｎ、バンクス  ラボラトリー  インク（Bangs Laboratories, Inc.）、フィッシャーズ、ＩＮ、Ｕ.Ｓ.Ａ.）を利用する分離フリーイムノアッセイである。マウスモノクローナル抗−ＡＦＰ  ＩｇＧ  Ｆａｂ′フラグメント（クローンＢ）を、ヘテロ二官能性ε−マレイミドカプロイルオキシスクシンイミドリンカー試薬を用いて微粒子に共有結合させた。微粒子にコートさせた抗−ＡＦＰのストック懸濁液をＴＲＩＳ  ｐＨ ８．０アッセイ緩衝液で希釈し、粒子濃度を０．０５％にした。マウスモノクローナルＩｇＧ抗−ＡＦＰ（クローンＡ）をジピロメテンボロンジフルオリド色素（化合物３）、Ａｌｅｘａ  ５３２（モレキュラー  プローブズ、ユージーン、オレゴン）またはＲ−ＰＥ（モレキュラー  プローブズ、ユージーン、オレゴン）で標識し、トレーサーとして使用した。そのトレーサーをアッセイ緩衝液で希釈し、最終濃度を１．５８ ｎＭ（化合物３）、１．４５ ｎＭ（Ａｌｅｘａ  ５３２）および０．７８ ｎＭ（Ｒ−ＰＥ、モレキュラー  プローブズ）とした。５μｌの微粒子懸濁液と１０μｌのトレーサーとを、１０μｌのアルファ−１−フェトプロテイン  標準物質（Ｘ０９００、ダコ  Ａ／Ｓ（Dako A/S）、デンマーク）と一緒に混合した。反応混合物を３７℃で２時間インキュベートし、図５に概略的に示した実験装置を用いて、同じ反応キュベットで測定した。結果を表２および図４にまとめる。
【００７２】
トレーサー濃度は、トレーサーごとに独立して最適化した。ジピロメテンボロンジフルオリドトレーサーは、Ｒ−ＰＥまたはＡｌｅｘａ  ５３２より高い濃度で使用しているにもかかわらず、最も低いバックグラウンドシグナルを与えた。アッセイのバックグラウンドシグナルは、アッセイの感度の点から重要である。バックグラウンドシグナルの最も本質的な原因は、反応懸濁液における標識化された抗体（トレーサー）の遊離のフラクションである。３つの異なるトレーサーのバックグラウンドのレベルを表２および図４に示す。これらの結果は、明らかに、ジピロメテンボロンジフルオリド標識トレーサーによって最も良いシグナル対バックグラウンド比が得られるということを示している。さらに、このアッセイの結果を溶液測定の結果（実施例１９、表１）と比較すると、Ｒ−ＰＥと化合物３との二光子蛍光シグナル比は劇的に変化していると理解され得る。溶液測定（表１）では、Ｒ−ＰＥ：化合物３のシグナル比は３４（６１８／１８＝３４）でＲ−ＰＥに優勢で、一方粒子測定（表２）では、その比はたった３．２（２５．６／８＝３．２）でＲ−ＰＥが優勢である。
【００７３】
【表２】
2004533626.tif 000008
【実施例２２】
【００７４】
単一パルス効果の測定
単一パルス効果による消光の直接測定は難しい。しかしながら、単一パルス効果による消光は、色素溶液における距離分解能（axial resolution）を決定することにより間接的に測定され得る。奥行き成分（depth component）（Ｚ−応答）が最も分解能を変化しやすい。Ｚ−応答を図５に記載した装置を用いて測定した。図５の試料キュベットを一対の顕微鏡スライドに置き換えた。色素溶液をこれらの２つの顕微鏡スライドの間に置いた。色素溶液試料がゆっくりと焦点まで移動されるにつれて、増加するシグナルの傾斜（ramp）が記録される。焦点の体積が試料と完全に重複した場合に最大シグナルが生じる。蛍光強度が２０％から８０％までの距離が様々な色素について記録され、表３に示される。ジピロメテンボロンジフルオリド色素に対する蛍光強度２０％から８０％までの距離（distance values）はＲ−フィコエリトリンまたはローダミンＢの同じ値より小さい。したがって、ジピロメテンボロンジフルオリド色素は、高い二光子励起効率を有するレーザーによる二光子励起システムにおいてローダミンまたはＲ−ＰＥよりも良い空間分解能と良いシグナル対バックグラウンド比を提供する。この結果は、実施例２１に記載された微粒子測定の結果と良く一致している。
【００７５】
【表３】
2004533626.tif 000009
【実施例２３】
【００７６】
化合物６および化合物８によるオリゴヌクレオチドの標識化
５′−アミノ修飾オリゴヌクレオチド（１７塩基、２８μｇ、５ ｎｍｏｌ）をカルボン酸緩衝液（２００μｌ、１００ ｍＭ、ｐＨ ８．５）に溶解した溶液に、無水ＤＭＦ（５０μｌ）に溶解した４０倍過剰量の標識化試薬（化合物６または８）を添加した。反応混合物を２２℃で２０時間インキュベーションした。標識オリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−１８カラム）およびグラジエント溶出技術を用いて精製した。溶媒は、Ａ：２％アセトニトリル  トリエチルアンモニウム酢酸緩衝液（５０ ｍＭ、ｐＨ ７）およびＢ：７０％アセトニトリル  トリエチルアンモニウム酢酸緩衝液（５０ ｍＭ、ｐＨ ７）であった。グラジエントは溶媒Ｂの５％から開始し、溶媒Ｂの量を直線的に２５分間で４０％まで上昇させた。両方の色素−オリゴヌクレオチド複合体（化合物６または化合物８で標識化された）を、１８〜２２分の間に溶出し、非標識オリゴヌクレオチドは１０分の時点で溶出した。非結合標識化試薬は、溶媒Ｂの量を１００％まで増加することによってカラムから除去された。
【００７７】
標識オリゴヌクレオチドの濃度は吸光分光分析的に決定された。２５％（化合物６）および２０％（化合物８）の標識化収率が得られた。標識オリゴヌクレオチドを等モル濃度に希釈し、一光子および二光子励起技術の双方により蛍光収率を測定した。結果として、化合物８で標識化されたオリゴヌクレオチドの蛍光収率は、化合物６で標識化されたオリゴヌクレオチドと比較して１桁以上大きいものであることがわかった。一光子および二光子励起技術の両方で同じ結果が得られた。化合物８で標識化されたオリゴヌクレオチドのより高い蛍光収率は、ラベル化合物の親水性の増加およびラベルとオリゴヌクレオチドとの間の距離の増加によって説明され得る。
【実施例２４】
【００７８】
蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素（６および８）によるマウスＩｇＧ抗−ＡＦＰの標識化
０．２ｍｇ（１．２５ ｎｍｏｌ）のマウスＩｇＧ抗−ＡＦＰ（クローンＡ）を４０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（１０／１５０ ｍＭ、ｐＨ ７．４）に溶解した溶液に、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解した５倍過剰量（６．２５ ｎｍｏｌ）の化合物６または８を添加した。４μｌのＮａＨＣＯ3（１ Ｍ、水溶液）を添加し、混合物を室温で３時間インキュベートした。生成物を、ＮＡＰ−５ゲルろ過カラム（アマシャム  ファルマシア  バイオテック、ウプサラ、スウェーデン）により、リン酸緩衝生理食塩水（５０／１５０、１０ ｍＭ ＮａＮ3、ｐＨ ７．４）を溶離液として用いて精製した。最初に移動する着色している画分を収集した。これらのタンパク質複合体の標識化（化合物６および８）の程度は、吸光分光分析的に測定した。タンパク質当たり２．３（化合物６）および２．５（化合物８）の発蛍光団の標識化度が得られた。
【実施例２５】
【００７９】
微粒子に基づくイムノアッセイにおける化合物６および化合物８で標識化された抗体トレーサーの比較
ＡＦＰアッセイは、固相として３．２μｍのカルボキシ修飾ポリスチレン微粒子（カルボキシ修飾ミクロスフィア  ＰＣ０５Ｎ、バンクス  ラボラトリー  インク、フィッシャーズ、ＩＮ、Ｕ.Ｓ.Ａ.）を用いて行なった。マウスモノクローナル抗−ＡＦＰ  ＩｇＧ（クローンＢ）を、ＥＤＡＣ（１−エチル−３−（ジメチル−アミノプロピル）カルボジイミド）結合法（ＴｅｃｈＮｏｔｅ ＃２０５、バンクス  ラボラトリー  インク、フィッシャーズ、ＩＮ、Ｕ.Ｓ.Ａ.）を用いて微粒子に共有結合させた。微粒子にコートさせた抗−ＡＦＰのストック懸濁液をＴＲＩＳ  ｐＨ ８．０アッセイ緩衝液で希釈し、粒子濃度を１．５×１０7粒子／ｍｌとした。マウスモノクローナルＩｇＧ抗−ＡＦＰ（クローンＡ）をジピロメテンボロンジフルオリド色素（化合物６または８）で標識し、トレーサーとして使用した。そのトレーサーをアッセイ緩衝液で希釈し、濃度を１６ ｎＭとした。５μｌの微粒子懸濁液と５μｌのトレーサーとを、１０μｌのアルファ−１−フェトプロテイン  標準物質（Ｘ０９００、ダコ  Ａ／Ｓ、デンマーク）と一緒に混合した。反応混合物を３７℃で２時間インキュベートし、図５に概略的に示した実験装置を用いて、同じ反応キュベットで測定した。結果を表４および５にまとめる。
【００８０】
【表４】
2004533626.tif 000010
【００８１】
アッセイの感度は、多くの場合、ゼロ検体濃度での並列試料のシグナルの標準偏差（ＳＤ）を計算することによって決定される。３ＳＤ（因子３を乗じたゼロ検体濃度での標準偏差）より大きなシグナルを与える最も低い検体濃度は、通常、アッセイの感度を定めるために使用される。
【００８２】
アッセイの感度は、実施例２１に記載されたようにバックグラウンドシグナル（シグナル対バックグラウンド比）によって、そして測定の再現性によって非常に影響を受ける。
【００８３】
【表５】
2004533626.tif 000011
【００８４】
表４および５に示される結果は、明らかに、親水性ジピロメテンボロンジフルオリド色素（化合物８）で標識化されたトレーサーによってより感度の高いアッセイが提供されることを示している。２つのトレーサー間の３ＳＤ値の違いは、驚くほど大きく、１桁以上大きい（３ＳＤ  化合物８＝０．８４  対  ３ＳＤ  化合物６＝２７）。これは、親水性ジピロメテンボロンジフルオリド色素（化合物８）で標識化されたトレーサーは、疎水性ジピロメテンボロンジフルオリド色素（化合物６）で標識化されたトレーサーより１桁以上良いアッセイ感度を提供することを意味している。平均して、トレーサーは両方とも、検体濃度に依存する応答を与え、親水性ジピロメテンボロンジフルオリド色素（化合物８）で標識化されたトレーサーは、いくぶん高いシグナルレベルを示す。さらに、親水性ジピロメテンボロンジフルオリド色素（化合物８）で標識化されたトレーサーは、疎水性色素（化合物６）で標識化されたトレーサーと比較してアッセイ範囲全体に渡って、非常に小さなシグナル変動（変動係数）を提供する。
【００８５】
本発明の方法は、実施態様を多様な形式で包含することができ、それらのほんの僅かな実施態様が本明細書に開示されていることは理解されるであろう。他の実施態様が存在し、本発明の精神から逸脱するものではないことは、当業者には明らかであろう。したがって、記載した実施態様は例証であり、制限的なものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】照明強度に対する二光子励起のプロットである。
【図２ａ】アルキル置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を示す。
【図２ｂ】ヘテロアリール置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を示す。
【図２ｃ】ヘテロアリール置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を示す。
【図２ｄ】アリール置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を示す。
【図２ｅ】フェニルエテニル置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を示す。
【図２ｆ】フェニルエテニル置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を示す。
【図２ｇ】異なる反応基を有するチエニル置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を示す。
【図２ｈ】異なる反応基を有するチエニル置換ジピロメテンボロンジフルオリド色素を示す。
【図３】リンカー化合物を示す。
【図４】イムノアッセイにおける検体（ＡＦＰ）濃度に対する二光子蛍光シグナルのプロットである。
【図５】二光子蛍光測定に使用される装置の視覚的スキームである。
【図１】
2004533626.tif 000016
【図２ａ】
2004533626.tif 000017
【図２ｂ】
2004533626.tif 000018
【図２ｃ】
2004533626.tif 000019
【図２ｄ】
2004533626.tif 000020
【図２ｅ】
2004533626.tif 000021
【図２ｆ】
2004533626.tif 000022
【図２ｇ】
2004533626.tif 000023
【図２ｈ】
2004533626.tif 000024
【図３】
2004533626.tif 000025
【図４】
2004533626.tif 000026
【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月7日(2003.8.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオアフィニティー結合固相としての微粒子、二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素で標識化された生物特異的二次試薬を含有する生物学的液体または懸濁液から検体を測定するための分離フリーバイオ分析的アッセイ法であって、レーザーを反応懸濁液に集め、個々の微粒子が、レーザービームの焦点体積を通って無作為に浮遊または励起レーザーの放射圧により誘導される場合に個々の微粒子から二光子励起蛍光を測定する方法であって、該二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素が、構造（II）
【化１】
2004533626.tif 000087
（式中、置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つは、置換または非置換のフェニル、チエニル、ピロリル、フラニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、イミダゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾフラニル、インドリル、共役エテニル、ジエニルまたはトリエニル基であり；かつ置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つは、カルボン酸、カルボン酸反応性エステル、カルボン酸無水物、マレイミド、塩化スルホニル、フッ化スルホニル、ヒドラジン、アミン、アルコール、アシルアジド、イソシアネート、アルデヒド、ハロアセトアミド、トリアジンおよびイソチオシアネートからなる群より選択される化学的反応基を得るために置換されており；そして置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つは、スルホン酸またはカルボン酸のアンモニウムまたはアルカリ金属塩、アンモニウム基、またはヒドロキシル基からなる群より選択される水溶性基を得るために置換されており；そしてＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6およびＲ7の残りの置換基は、それぞれ独立して、水素、ハロゲン、アルキル、シアノおよびカルボキシからなる群（各置換基は任意に置換され得る）より選択される）
を有することを特徴とするアッセイ法。
【請求項２】
バイオアフィニティー結合固相としての微粒子、二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素で標識化された生物特異的二次試薬を含有する生物学的液体または懸濁液から検体を測定するための分離フリーバイオ分析的アッセイ法であって、レーザーを反応懸濁液に集め、個々の微粒子が、レーザービームの焦点体積を通って無作為に浮遊または励起レーザーの放射圧により誘導される場合に個々の微粒子から二光子励起蛍光を測定する方法であって、該二光子蛍光ジピロメテンボロンジフルオリド色素が、構造（II）
【化２】
2004533626.tif 000088
（式中、置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7は、置換または非置換のアルキル基であり；Ｒ4は水素、または置換もしくは非置換のアルキル基であり；そして置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つは、カルボン酸、カルボン酸反応性エステル、カルボン酸無水物、マレイミド、塩化スルホニル、フッ化スルホニル、ヒドラジン、アミン、アルコール、アシルアジド、イソシアネート、アルデヒド、ハロアセトアミド、トリアジンおよびイソチオシアネートからなる群より選択される化学的反応基を得るために置換されており；そして置換基Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つは、スルホン酸またはカルボン酸のアンモニウムまたはアルカリ金属塩、アンモニウム基、またはヒドロキシル基からなる群より選択される水溶性基を得るために置換されている）
を有することを特徴とするアッセイ法。 
【請求項３】
前記化学的反応基がスクシンイミジルエステルであることを特徴とする請求項１または２記載のアッセイ法。 
【請求項４】
Ｒ1が、置換または非置換の２−チエニル、２−ピロリル、フェニルまたはフェニルエテニルであり、かつ置換基Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の少なくとも１つが
【化３】
2004533626.tif 000089
（式中、Ｘ＋はカチオン）であり；そしてＲ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ6またはＲ7の残りの置換基は、それぞれ相互に独立して水素またはアルキルのいずれかであることを特徴とする請求項１記載のアッセイ法。
【請求項５】
前記生物特異的二次試薬が、ハプテン、生物学的に活性なリガンド、薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、ポリペプチド、タンパク質、抗体および抗体のフラグメントからなる群より選択される生物学的に活性な分子であることを特徴とする請求項１、２、３または４記載のアッセイ法。
【請求項６】
前記検体が、ハプテン、生物学的に活性なリガンド、薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸、ポリペプチド、タンパク質、抗体および抗体のフラグメントからなる群より選択される生物学的に活性な分子であることを特徴とする請求項１、２、３、４または５記載のアッセイ法。
【国際調査報告】
2004533626.tif 000090
2004533626.tif 000091
2004533626.tif 000092
2004533626.tif 000093
2004533626.tif 000094