(57)【要約】本発明は、アレルギー性疾患の治療、予防、または改善のための新規な薬剤の提供に関する。とくに、新規な薬剤は、ＩｇＥに由来するエピトープまたはミモトープである。提供される新規な領域は、受動的および能動的な免疫防御または免疫治療のいずれの標的にもなりうる。本発明はさらに、該薬剤の製造方法、それを含有する医薬組成物、および医療におけるその使用に関する。このほかに本発明の態様を構成するのは、本発明に係るＩｇＥ領域に結合することのできるリガンド、とくにモノクロナール抗体、および受動的な免疫治療または免疫防御としての医療におけるその使用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２９、１〜２８および３０〜３４に示される配列のうちのいずれか１つを有するペプチドまたはそのミモトープ。
【請求項２】
ペプチドである、請求項１に記載のミモトープ。
【請求項３】
請求項１または２に記載のペプチドまたはミモトープと、任意に担体分子とを含む、アレルギー治療用の免疫原。
【請求項４】
前記担体分子がプロテインＤまたはＢ型肝炎コア抗原から選択される、請求項３に記載の免疫原。
【請求項５】
前記ペプチドもしくはミモトープと前記担体分子との化学的コンジュゲートであるか、または前記担体分子との融合タンパク質として発現されるものである、請求項３または４に記載の免疫原。
【請求項６】
前記ペプチドまたはペプチドミモトープが前記担体の一次配列内に提供される、請求項３〜５のいずれか１項に記載の免疫原。
【請求項７】
前記ペプチドまたはミモトープが構造的に束縛されている、請求項３〜６のいずれか１項に記載の免疫原。
【請求項８】
前記ペプチドまたはミモトープがその両末端を連結する共有結合により環化されている、請求項７に記載の免疫原。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のペプチドまたはミモトープまたは免疫原と、任意にアジュバントとを含む、ワクチン。
【請求項１０】
請求項１に記載のペプチドを認識することのできる、リガンド。
【請求項１１】
請求項１０に記載のリガンドを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
医療に使用するための、請求項１に記載のペプチドまたは請求項３〜８のいずれか１項に記載の免疫原または請求項９に記載のワクチンまたは請求項１０に記載のリガンド。
【請求項１３】
アレルギーを治療または予防するための薬剤の製造における、請求項１に記載のペプチドもしくはミモトープまたは請求項３〜８のいずれか１項に記載の免疫原または請求項９に記載のワクチンまたは請求項１０に記載のリガンドの使用。
【請求項１４】
請求項３〜８のいずれか１項に記載の免疫原を製造することと、該免疫原を賦形剤および／またはアジュバントと共に製剤化することとを含む、ワクチンの製造方法。
【請求項１５】
アレルギーに罹患しているかまたは罹患しやすい患者を治療する方法であって、請求項９に記載のワクチンまたは請求項１１に記載の医薬組成物を該患者に投与することを含む、上記方法。
【請求項１６】
請求項１に記載のペプチド、請求項２に記載のミモトープ、または請求項３〜６のいずれか１項に記載の免疫原をコードする、単離された核酸分子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アレルギー性疾患の治療、予防、または改善のための新規な薬剤の提供に関する。とくに、新規な薬剤は、ＩｇＥに由来するエピトープまたはミモトープである。これらの新規な領域は、受動的および能動的な免疫防御または免疫治療のいずれの標的にもなりうる。本発明はさらに、該薬剤の製造方法、それを含有する医薬組成物、および医療におけるその使用に関する。このほかに本発明の態様を構成するのは、本発明に係るＩｇＥ領域に結合することのできるリガンド、とくにモノクロナール抗体、および受動的な免疫治療または免疫防御としての医療におけるその使用である。
【０００２】
アレルギー性応答において、アレルギーに関連する共通した症状は、ヒスタミンのようなアレルギー性メディエーターが免疫細胞から周囲組織中および脈管構造中に放出されることにより引き起こされる。アレルゲン特異的ＩｇＥとの相互作用により放出が誘発される時点まで、ヒスタミンは、通常、マスト細胞および好塩基球に貯蔵されている。喘息、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、Ｉ型過敏症、およびアレルギー性鼻炎のようなアレルギー性応答を媒介する際のＩｇＥの役割は周知である。花粉またはチリダニアレルゲンのような抗原に遭遇すると、Ｂ細胞はアレルゲン特異的ＩｇＥの合成を開始する。次いで、アレルゲン特異的ＩｇＥは、好塩基球上およびマスト細胞上のＦｃεＲＩレセプター（高親和性ＩｇＥレセプター）に結合する。続いて、アレルゲンとの遭遇が起これば、隣接したＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体の架橋によりマスト細胞または好塩基球からのヒスタミン放出が誘発される（Ｓｕｔｔｏｎ ａｎｄ Ｇｏｕｌｄ， Ｎａｔｕｒｅ， １９９３， ３６６： ４２１−４２８； ＥＰ ０ ４７７ ２３１ Ｂ１）。
【０００３】
すべての免疫グロブリンに見られるように、ＩｇＥは、２本の重鎖と２本の軽鎖とを含む。ε重鎖は、５つのドメイン、すなわち、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と４つの定常ドメイン（Ｃε１〜Ｃε４）とからなる。ＩｇＥの分子量は、約１９０，０００Ｄａであり、重鎖は約５５０アミノ酸の長さである。ＩｇＥの構造については、ＰａｄｌａｎおよびＤａｖｉｓ（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ２３ １０６３−７５， １９８６）ならびにＨｅｌｍｅｔら（１９９０年１０月２日付でＰＤＢに寄託された２ＩｇＥモデル構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ， Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂａｒｏｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ； ｈｔｔｐ：／／ｐｄｂ−ｂｒｏｗｓｅｒｓ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ））の文献に論じられている。ＩｇＥドメインのそれぞれは、２つのβシートに分類されるａ〜ｆと名づけられた伸長（β）ポリペプチドセグメントの７本の逆平行ストランドを有する潰れたバレルからなる。４本のβストランド（ａ、ｂ、ｄ、およびｅ）が１つのシートを形成し、３本のストランド（ｃ、ｆ、およびｇ）からなる第２のシートに積重ねられている。各βシートの形状は、各シート内の隣接した逆平行ストランドのアミノ酸残基の側鎖が横方向に充填されることにより保持されている（そして、これらのストランド間で主鎖が水素結合することによりさらに安定化されている）。非伸長（非β）コンホメーションを形成する残基のループは、１つのシート内または対向するシート間に逆平行βストランドを拘束する。ａストランドからｂストランドへの結合はＡ−Ｂループと名づけられ、他も同様である。Ａ−Ｂおよびｄ−ｅループは、トポロジー的には四本鎖シートに属し、ループｆ−ｇは、三本鎖シートに属する。対をなす対向シート間の境界は、球形ドメインの疎水的内部を形成する。水の進入が不可能なこの主に疎水性のコアは、対向するβシートに由来する互に向かい合った残基の側鎖の稠密充填により生ずる。
【０００４】
過去において、ＩｇＥ媒介ヒスタミン放出機序を妨害するようにデザインされたいくつかの受動的または能動的な免疫治療法の研究がなされてきた。これらの方法としては、受動的に投与される抗体を用いるかまたはレセプターに競合的に結合するＩｇＥ由来ペプチドの受動的投与を用いて、ＦｃεＲＩまたはＦｃεＲＩＩ（低親和性ＩｇＥレセプター）レセプターに結合するＩｇＥまたはアレルゲン／ＩｇＥ複合体を妨害する方法が挙げられる。このほか、ヒスタミン放出抑制性免疫応答を刺激する能動免疫におけるＩｇＥ由来の特異的ペプチドの使用について記載している研究者もいる。
【０００５】
この分野のこれまでの研究者は、彼らの研究の過程において、新たな抗アレルギー治療をデザインする際に考慮に入れなければならないいくつかの要件および問題に遭遇してきた。最も危険性の高い問題の１つは、ヒスタミン放出シグナルへのＩｇＥ架橋の関与に関するものである。ほとんどの場合、能動的ワクチン接種時に抗ＩｇＥ抗体が生成されると隣接するＩｇＥ−レセプター複合体の架橋によりアレルゲンの不在下でヒスタミン放出自体が誘発される可能性がある。この現象はアナフィラキシー誘発性と呼ばれる。ＩｇＥ検出アッセイに一般に使用されるかなり多くの市販の抗ＩｇＥモノクローナル抗体がアナフィラキシー誘発性であり、したがって、役に立たず患者に投与すると危険であると思われる。
【０００６】
抗体がアナフィラキシー誘発性であるか否は、ＩｇＥ分子上の標的エピトープの位置に依存する。しかしながら、この分野の現状の知識に基づいて、多大な科学的関心をもち労力をかけたとしても、抗体もしくはエピトープがどんな特性を有しているかまたは患者に対して正もしくは負の臨床効果を有しているか否についてほとんどまたはまったく予測することができない。
【０００７】
したがって、安全かつ効果的なものとするために、受動的に投与されるかまたはワクチンにより誘導される抗体は、それ自体アナフィラキシー性を有することなく、ヒスタミン誘導経路を妨害することのできるＩｇＥの領域に結合しなければならない。本発明は、これらの目的をすべて達成し、ヒスタミン放出を阻害する非アナフィラキシー性抗体を生成させることのできる薬剤を提供する。これらの薬剤は、能動的ワクチンのベースを形成するかもしくは受動的免疫治療に適した抗体を生成させるために利用してもよいし、または治療効果を得るためにそれ自体を受動的に投与してもよい。
【０００８】
ＩｇＥ媒介アレルギー性応答に対してなんらかの有益な効果を有する特異的抗ＩｇＥ抗体を同定するために、多くの研究が当業者により行われてきた（ＷＯ９０／１５８７８、ＷＯ ８９／０４８３４、ＷＯ ９３／０５８１０）。これらの有益な抗体により認識されるエピトープを同定し、そのようなエピトープのペプチドミモトープを作成し、それらを免疫原として用いて抗ＩｇＥ抗体を産生するという試みもなされてきた。
【０００９】
ＷＯ ９７／３１９４８には、このタイプの研究の例が記載されており、さらに、能動的ワクチン接種を目的として担体分子にコンジュゲートされたＣε３およびＣε４ドメイン由来のＩｇＥペプチドが記載されている。これらの免疫原はワクチン接種の研究に使用することが可能であり、抗体生成の結果としてｉｎ ｖｉｖｏでヒスタミン放出を抑制できると言われている。この文献には、Ｃε３ドメインに含まれ能動的ワクチン接種の目的に有用なＩｇＥペプチドに結合できると言われているモノクローナル抗体（ＢＳＷ１７）が記載されている。
【００１０】
ＥＰ ０ ４７７ ２３１ Ｂ１には、能動的ワクチン接種による免疫防御に使用されるキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートされたＩｇＥのＣε４ドメイン由来の免疫原（残基４９７〜５０６、Ｓｔａｎｗｏｒｔｈデカペプチドとしても知られる）が記載されている。ＷＯ ９６／１４３３３は、ＥＰ ０ ４７７ ２３１ Ｂ１に記載された研究の継続である。
【００１１】
ＷＯ ９９／６７２９３、ＷＯ ００／５０４６０、およびＷＯ ００／５０４６１にはいずれにも、ワクチン接種によりアレルギーの能動的免疫治療を行うためのＩｇＥ免疫原が記載されている。
【００１２】
他の方法は、Ｃε３およびＣε４に由来するペプチドの同定に基づくものであり、これらのペプチドは、それ自体、好塩基球上またはマスト細胞上の高親和性または低親和性レセプターに結合するＩｇＥと競合する（ＷＯ ９３／０４１７３、ＷＯ ９８／２４８０８、ＥＰ ０ ３０３ ６２５ Ｂ１、ＥＰ ０ ３４１ ２９０）。
【００１３】
本発明は、受動的または能動的な免疫防御または治療に使用されるＩｇＥの新規な配列の同定である。これらの配列は、これまで、抗アレルギー治療剤に関連づけられなかった。本発明は、表面に露出されるものとして同定されたＩｇＥの連続部分から単離された特異的エピトープが組み込まれたペプチドそれ自体を提供し、さらに、これらの新たに同定されたエピトープのミモトープを提供する。これらのペプチドまたはミモトープは、アレルギーの治療に単独で使用してもよいし、またはワクチン接種された被験者のアレルギー症状を抑制、軽減、もしくは除去するためのアレルギーの能動的な免疫防御もしくは免疫治療を行う際に自己抗ＩｇＥ抗体を誘導すべく使用されるワクチンであってもよい。
【００１４】
驚くべきことに、本発明のペプチドにより誘導される抗ＩｇＥ抗体は、非アナフィラキシー誘発性であり、マスト細胞および好塩基球からのＩｇＥ媒介ヒスタミン放出を阻止することができる。
【００１５】
本発明のペプチドでありかつペプチド改変のベースとして役立ちうるヒトＩｇＥの領域は、以下のとおりである：
【表１】
2004520817.tif 000002
これらのうちで、とくに好ましいペプチドは、以下のリストから選択される。
Ｃｙｓ （３５９）−ＬＶＶＤＬＡＰＳＫＧＴＶＮ−（３７１）Ｃｙｓ
Ｃｙｓ−（３９１）−ＫＱＲＮＧＴＬ−（３９７）−Ｃｙｓ
Ｃｙｓ−（３８９）−ＥＥＫＱＲＮＧＴＬＴＶ−（３９８）−Ｃｙｓ
Ｃｙｓ−（４２２）−ＨＰＨＬＰＲ−（４２７）−Ｃｙｓ
Ｃｙｓ−（４２１）−ＴＨＰＨＬＰＲＡ−（４２８）−Ｃｙｓ
Ｃｙｓ−（４２０）−ＶＴＨＰＨＬＰＲＡＬ−（４２９）−Ｃｙｓ
Ｃｙｓ−（４１９）−ＲＶＴＨＰＨＬＰＲＡＬＭ−（４３０）−Ｃｙｓ
Ｃｙｓ−（４１８）−ｃＲＶＴＨＰＨＬＰＲＡＬＭＲ−（４３１）−Ｃｙｓ
Ｃｙｓ−（４１７）−ＱｃＲＶＴＨＰＨＬＰＲＡＬＭＲＳ−（４３０）−Ｃｙｓ
Ｃｙｓ−（４１６）−ＹＱｃＲＶＴＨＰＨＬＰＲＡＬＭＲＳＴ−（４３１）−Ｃｙｓ  ［←特に好ましい］
Ｃｙｓ−（４５１）−ＰＥＷＰＧＳＲＤＫＲ−（４６０）−Ｃｙｓ
ここで、上記のペプチド配列中の小文字ｃ（または表１中のＸ）は、場合により任意の他のアミノ酸残基で置換されていてもよい天然システインを示すが、この点に関しては、メチオニンによる置換が好ましい。好ましくは、置換する残基はセリンではない。括弧中の数字は、ＩｇＥ分子内のアミノ酸位置を示す。プロテインＤもしくはＢＳＡにコンジュゲートされているかまたはＨｅｐＢコアタンパク質内で発現されるこれらのペプチドを含む免疫原は、本発明の好ましい態様を構成する。
【００１６】
これらのエピトープが組み込まれたペプチドは、本発明の好ましい態様を構成する。したがって、本発明のペプチドは、本明細書に列挙されているいずれのペプチドよりも長いこともある。たとえば、本発明のそのようなペプチドは、列挙されたペプチドを含み、列挙されたペプチドの一方または両方の末端にアミノ酸が付加されたものであってもよい。これに関連して、追加の残基は、ＩｇＥの天然配列に由来するものであってもなくてもよい。ペプチドはまた、いずれか一方の末端からアミノ酸を除去することにより、列挙されたペプチドよりも短くしてもよい。本発明のこれらの態様のいずれにおいても、残基の付加または除去には、好ましくは１０個未満のアミノ酸、より好ましくは５個未満のアミノ酸、より好ましくは３個未満のアミノ酸が関与し、最も好ましくは２個以下のアミノ酸が関与する。これらのアミノ酸は、列挙されたペプチドの一方または両方の末端に付加させるかまたは該末端から除去することが可能である。
【００１７】
これらのエピトープと同一の特性を有するミモトープ、および免疫応答を生じ、ＩｇＥ分子の一部をなすＩｇＥエピトープと交差反応するそのようなミモトープを含む免疫原もまた、本発明の一部を構成する。
【００１８】
したがって、本発明は、これらのＩｇＥエピトープそのものおよびそれらの任意のミモトープを含む単離されたペプチドを包含する。ミモトープの意味は、天然ＩｇＥエピトープを認識する抗体により認識されうる程度に；（Ｇｈｅｙｓｅｎ， Ｈ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｗｉｌｅｙ， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ， Ｃｉｂａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ １１９， ｐ１３０−１４９； Ｇｈｅｙｓｅｎ， Ｈ．Ｍ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２３， ７， ７０９−７１５）；または適切な担体と組み合わせたときに天然ＩｇＥエピトープと交差反応する抗体を生成することができる程度に、天然ＩｇＥと十分に類似した物質として定義される。
【００１９】
本発明のミモトープは、ＩｇＥ構造の表面露出領域を模擬するものであるが、それらの領域内の主要な特徴部分は、ループ構造に関連した表面露出範囲内のそれらの領域であると発明者らは考えている。ＩｇＥのドメイン構造については、”Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ” （ｐａｇｅ ３０４， ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｂｒａｎｄｅｎ ａｎｄ Ｔｏｏｚｅ， Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＩＳＢＮ ０ ８１５３ ２３０５−０）に記載されており、２つの対向する逆平行βシートから構成されたβバレルの形態をとる（図８参照）。したがって、ミモトープには、隣接するシートに由来する天然アミノ酸残基であってもよいＮまたはＣ末端の伸長部を有するループが含まれる可能性があり、Ｃε２−３リンカーであるＨｅｌｉｘ ３も含まれうる。この例として、Ｐ１００はＣε３のＡ−Ｂループを含有し；Ｃａｒｌ４はＣε３のＢ−Ｃループを含有し；Ｃａｒｌ５はＣε３のＤ−Ｅループを含有し；Ｃａｒｌ７はＣε３のＦ−Ｇループを含有し；Ｐ８はＣε４のＡ−Ｂループを含有し；Ｐ５はＣε３のＣ−Ｄループを含有し；Ｐ１１０はＣε４のＣ−Ｄループを含有する。したがって、これらのループのミモトープは、本発明の態様を構成する。
【００２０】
本発明のワクチンに製剤化するのに最も好ましいループは、Ｃε３のＢ−Ｃループ、Ｃε３のＤ−Ｅループ、およびＣε３のＦ−Ｇループである。本発明のとくに好ましいペプチドを形成するのは、Ｃε２−３リンカーである。それゆえ、ペプチドおよびそれらを含む免疫原は、単独で使用することが可能である。このほか、これらの最も好ましい免疫原を含む組合せワクチンは、アレルギーの治療にとくに有用である。
【００２１】
先に同定されたＩｇＥエピトープのペプチドミモトープは、選択されたアミノ酸の付加、欠失、または置換により、特定の目的に合わせてデザインすることが可能である。それゆえ、本発明のペプチド免疫原は、本明細書に列挙されているペプチド配列の任意の残基の付加、欠失、または置換の結果として、改変することが可能である。改変が付加または置換である場合、天然または非天然のアミノ酸が含まれてもよく、さらに、ＩｇＥの対応する領域から誘導されたアミノ酸残基の付加が含まれてもよい。ペプチド配列の改変には、好ましくは１０個未満のアミノ酸残基、より好ましくは５個未満の残基、より好ましくは３個未満の残基が関与し、最も好ましくは２個以下のアミノ酸残基が関与する。このようにして、本発明のペプチドは、たとえば、末端システインの付加により、あるいはダブルグリシンヘッドもしくはテールのようなリンカー配列またはリシン残基で終端するリンカーの付加により、タンパク質担体へのコンジュゲーションを容易にする目的で改変することが可能である。他の選択肢として、たとえば、ペプチドの安定性を向上させるために、Ｄ−立体異性体形の１個以上のアミノ酸の付加または置換を行って有益な誘導体を形成することも可能である。そのような改変されたペプチドまたはミモトープが、成分残基を天然に存在する２０個のアミノ酸に必ずしも限定する必要のない完全にまたは部分的に非ペプチドのミモトープであってもよいことは、当業者であれば理解されよう。
【００２２】
好ましくは、ペプチド配列が全ＩｇＥ分子の一部をなすときの形状によく類似したコンホメーションになるようにペプチドを拘束すべく、当技術分野で公知の技術を用いてペプチドを環化させる。ペプチドを環化させる好ましい方法には、ジスルフィド架橋が形成されるように１組のシステイン残基を付加することが含まれる。
【００２３】
ペプチドミモトープは、配列の方向が逆になっているという点で天然ＩｇＥ配列のレトロ配列であってもよいし；またはその代わりに、配列は、全部もしくは少なくとも一部分がＤ−立体異性体アミノ酸（インベルソ配列）から構成されていてもよい。また、ペプチド配列は、配列方向が逆になっておりかつアミノ酸がＤ−立体異性体形であるという点でレトロ−インベルソの性質をもつものであってもよい。このようなレトロペプチドまたはレトロ−インベルソペプチドは、非自己であるという利点を有し、免疫系における自己寛容の問題を克服することが可能である。
【００２４】
マルチペプチド免疫原（好ましくは、上述したように環化／拘束されたもの）は、列挙されたペプチド配列またはそのミモトープから形成することが可能であり、それらは免疫応答の誘導に有利であると思われる。たとえば、Ｈｅｌｉｘ ３は、配列内に含まれる反復ペプチドエピトープが存在するように二量体ペプチドリピートとして構築することのできるペプチドの例である。たとえば、ＢＯＡは、それぞれの末端に２つのシステインを付加してそれぞれの末端に二量体を拘束することによりペプチドの構造の自由度が制限されたＨｅｌｉｘ ３タンデムリピートを含む。このようにして、それぞれの単量体単位を構造中に拘束することが可能であり、しかも依然として天然状態に類似の伸長構造（たとえば、ヘリックス−ターン）に折畳める可能性を有する。そのようなマルチペプチド免疫原は、本発明の好ましい免疫原である。
【００２５】
他の選択肢として、ペプチドミモトープは、本発明のＩｇＥエピトープに結合できる抗体を用いてファージディスプレイ法（ＥＰ ０ ５５２ ２６７ Ｂ１）のような技術により同定することが可能である。この技術により、天然ペプチドの構造を模擬するゆえに抗天然ペプチド抗体に結合できる多数のペプチド配列が生成されるが、それらはそれ自体、天然ＩｇＥペプチドとの顕著な配列相同性を必ずしも共有する必要はない。この手法は、増強された免疫原性（たとえば、ＩｇＥレセプターもしくは抗ＩｇＥ抗体に対するより高い親和結合特性、またはより高い親和度でＩｇＥに結合するポリクローナル免疫応答を誘導できる性質）を有するペプチドの同定が可能であるという意味で顕著な利点をもつ可能性があるか、または天然ペプチド配列の使用に伴って生じるおそれのある潜在的な自己抗原寛容の問題を完全に克服できる可能性がある。さらに、この技術を用いれば、認識されたミモトープ配列間で共有される化学的性質により各天然ペプチドについて認識パターンの同定が可能となる。
【００２６】
他の選択肢として、ペプチドミモトープは、抗ＩｇＥペプチドポリクローナル抗体に対する親和性の増大によりペプチドの免疫原性を増加させるという目的で生成させることが可能であり、その効果は、（バイオコア実験）のように当分野で公知の技術により測定可能である。これを達成するために、以下の一般規則に従ってペプチド配列を選択的に変化させることが可能である。
＊構造的な束縛を保つために、プロリンおよびグリシンは置換してはならない。
＊他の位置は、類似の物理化学的性質を有するアミノ酸で置換することができる。
したがって、各アミノ酸残基は、そのアミノ酸に最もよく似ているアミノ酸で置換することができる。
【００２７】
したがって、本発明は、新規のエピトープおよびそのミモトープならびにアレルギーの防御または治療のための医薬組成物の製造におけるそれらの使用を提供する。本発明のエピトープまたはミモトープのうちの少なくとも一方と担体分子とを含む免疫原もまた、アレルギーの免疫防御または治療のためのワクチンに使用するために提供される。したがって、本発明のエピトープ、ミモトープ、または免疫原は、医療におよびアレルギー性疾患の医学的治療または防御に使用するために提供される。
【００２８】
本発明のミモトープのサイズは、天然エピトープが見いだされる全ＩｇＥドメインから選択された領域を模擬する程度に小さいと予想される。したがって、ペプチド性ミモトープは、全長が１００アミノ酸未満であり、好ましくは７５アミノ酸よりも短く、より好ましくは５０アミノ酸未満であり、最も好ましいのは長さが４〜２５アミノ酸の範囲である。好ましいペプチドミモトープの具体例は、Ｐ１４およびＰ１１であり、それらの長さはそれぞれ１３および２３アミノ酸である。非ペプチド性ミモトープは、分子容に関して、対応するペプチド性ミモトープと類似の大きさであると予想される。
【００２９】
どの技術を用いれば本発明の範囲内に含まれるミモトープとして特定の構築物の状態を確認しうるかは、当業者には明白であろう。そのような技術としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。推定ミモトープにより生成される抗血清が天然ＩｇＥ分子と交差反応するとともにアレルギー性エフェクター細胞からのアレルギー性メディエーター放出を阻止する機能をもつという点に関して構築物の免疫原性を確認するために、推定ミモトープのアッセイを行うことが可能である。これらの応答の特異性は、ミモトープそれ自体もしくは天然ＩｇＥ、および／またはＩｇＥ内のエピトープに結合することが知られている特異的モノクローナル抗体を用いて抗血清の活性を阻害することによる競合実験により確認することができる。
【００３０】
本発明の一実施形態では、少なくとも１つのＩｇＥエピトープまたはミモトープを担体分子に連結させてワクチン接種プロトコールに適合した免疫原を形成するが、好ましくは担体分子は天然ＩｇＥ分子に関係しないものである。ミモトープは、任意にリンカー配列を介して、化学共有結合を用いたコンジュゲーションによりまたは遺伝子工学処理の施された融合パートナーの発現により、連結させることが可能である。一実施形態として、本発明のペプチドは、そのペプチド配列が融合パートナーの一次配列内に見いだされる形で融合パートナーとの融合分子として発現される。
【００３１】
免疫原性担体へのペプチドの共有結合は、当技術分野で周知の方法により実施することができる。このように、たとえば、直接共有結合させるために、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、または（Ｎ−［γ−マレイミドブチリルオキシ］スクシンイミドエステルを利用することが可能であり、その際、ＣＤＡＰおよびＳＰＤＰのような一般的な市販のヘテロ二官能性リンカーが利用できる（製造者の説明書を用いて）。結合反応の後、透析法、ゲル濾過法、分別法などにより、免疫原を容易に分離および精製することができる。
【００３２】
好ましい実施形態において、本発明者らは、アシルヒドラジンペプチド誘導体を調製することによりペプチドとくに環化ペプチドを担体にコンジュゲートさせることが可能であるを見いだした。
【００３３】
ペプチド／タンパク質担体構築物は、以下のように作製することができる。アシルヒドラジンペプチド誘導体は、以下のスキーム１の固相ペプチド合成に示されるように固相で調製することができる。
2004520817.tif 000003
【００３４】
これらのペプチド誘導体は、当技術分野で周知の技術により、完全自動装置で、ポリアミド担体またはポリエチレングリコール−ポリスチレン（ＰＥＧ−ＰＳ）担体のいずれかを利用して、周知の「Ｆｍｏｃ」手順を用いて、容易に調製することができる［固相合成のための技術および手順については、’Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ’、Ｅ． ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ．Ｃ． Ｓｈｅｐｐａｒｄ著、ＩＲＬ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ刊（１９８９）に記載されている］。酸媒介開裂により、線状脱保護改変ペプチドを得た。これは、’Ｍｅｔｈｏｄ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．３５： Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ （Ｍ．Ｗ． Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ および Ｂ．Ｍ． Ｄｕｎｎ編）、第７章、第９１−１７１頁、Ｄ． Ａｎｄｒｅａｕら著に概説されている方法を用いて、容易に酸化および精製することが可能であり、これによりジスルフィド架橋改変エピトープが得られる。
【００３５】
このように合成されたペプチドは、次に、以下の技術を用いてタンパク質担体にコンジュゲートさせることができる：
【００３６】
アリールアルデヒド官能基の導入では、スキーム２に示されるように調製したスクシンイミド活性エステル（ＢＡＬ−ＯＳｕ）を利用した（詳細についてはＷＯ ９８／１７６２８を参照されたい）。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などの担体のアミノ官能基の約５０％までの置換では、通常、可溶性改変ペプチドが得られる。ＢＳＡの置換をさらに多くすると、不溶性構築物になる。ＢＳＡおよびＢＡＬ−ＯＳｕを等モル濃度でＤＭＳＯ／緩衝液（スキーム参照）中で２時間混合した。以下のスキーム２／３−改変担体調製における遊離アミノ基に対するフルオレスカミン試験により判定した場合、実験的に得られたこのプロトコールではＢＳＡの約５０％が置換される。
2004520817.tif 000004
【００３７】
改変ペプチドと誘導体化担体とを単純に組合せると、透析により容易に単離されるペプチド担体構築物が得られる−スキーム４−ペプチド／担体コンジュゲート。
2004520817.tif 000005
【００３８】
本発明の免疫原で使用される担体のタイプについては、当業者であれば容易にわかるであろう。担体の機能は、ＩｇＥペプチドに対する免疫応答の誘導を助長するサイトカイン介助を提供することである。本発明に使用しうる担体としては、すべてを網羅するものではないが、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような血清アルブミン、破傷風毒素もしくはジフテリア毒素（ＴＴおよびＤＴ）もしくはＣＲＭ１９７のような不活化細菌毒素またはそれらの組換えフラグメント（たとえば、ＴＴのフラグメントＣのドメイン１、またはＤＴのトランスロケーションドメイン）、あるいはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）が挙げられる。他の選択肢として、Ｔ細胞介助を提供できる免疫原をさらに含んでいてもよいリポソーム担体にミモトープまたはエピトープを直接コンジュゲートすることも可能である。好ましくは、ミモトープと担体との比は、１：１〜２０：１程度であり、好ましくは、各担体は、３〜１５個のペプチドを保持していなければならない。
【００３９】
本発明の実施形態では、好ましい担体は、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来のプロテインＤである（ＥＰ ０ ５９４ ６１０ Ｂ１）。プロテインＤは、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）由来のＩｇＤ結合性タンパク質であり、Ｆｏｒｓｇｒｅｎが特許を取得している（ＷＯ ９１／１８９２６、承認されたＥＰ ０ ５９４ ６１０ Ｂ１）。ある状況下では、たとえば、組換え免疫原発現系では、プロテインＤのフラグメント、たとえば、プロテインＤ １／３ｒｄ（プロテインＤのＮ末端の１００〜１１０個のアミノ酸を含む（ＧＢ ９７１７９５３．５））を使用することが望ましい場合もある。
【００４０】
本発明のＩｇＥペプチドを提供する他の好ましい方法は、組換え融合分子に組み込まれた形で提供する方法である。たとえば、ＥＰ ０ ４２１ ６３５ Ｂには、ウイルス様粒子中に外来ペプチド配列を提供するためのキメラヘパドナウイルスコア抗原粒子の使用が記載されている。したがって、本発明の免疫原は、Ｂ型肝炎コア抗原からなるキメラ粒子中に提供されたＩｇＥペプチドを含有しうる。さらに、組換え融合タンパク質は、本発明のミモトープと、インフルエンザウイルスのＮＳ１のような担体タンパク質とを含有しうる。本発明の一部を構成する任意の組換え発現タンパク質に対して、該免疫原をコードする核酸もまた本発明の一態様を構成し、同様に、該核酸を含有する発現ベクターおよび該発現ベクターを含有する宿主細胞（自律的にまたは染色体中に挿入）もまた、本発明の一態様を構成する。上記の宿主細胞中で発現させることにより組換え的に免疫原を産生し、そこから免疫原を単離する方法は、本発明のさらなる態様である。全長天然ＩｇＥ分子またはそれをコードする全長天然ＤＮＡ配列は、本発明の範囲には含まれない。
【００４１】
本発明で使用されるペプチドは、当技術分野で周知の固相法により容易に合成することができる。「Ｔ−ｂｏｃ」法または「Ｆ−ｍｏｃ」法を利用することにより、適切な合成を行うことが可能である。環状ペプチドは、周知の「Ｆ−ｍｏｃ」法およびポリアミド樹脂を利用した固相法により完全自動装置で合成することができる。他の選択肢として、このプロセスを手動で行うために必要な実験手順については、当業者であればわかるであろう。固相合成に関する技術および手順については、’Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ’、Ｅ． ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ． Ｃ． Ｓｈｅｐｐａｒｄ著、ＩＲＬ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ刊（１９８９年）に記載されている。他の選択肢として、ミモトープをコードする核酸分子を細菌または哺乳動物の細胞系で発現させてから発現されたミモトープを精製することを含む組換え法により、ペプチドを産生することが可能である。ペプチドおよびタンパク質の組換え発現の技術については、当技術分野で周知であり、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ．Ｆ． ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｒｏｋ （１９８９）に記載されている。本発明の一部を構成する任意の組換え発現タンパク質に対して、該免疫原をコードする核酸もまた本発明の一態様を構成し、同様に、該核酸を含有する発現ベクターおよび該発現ベクターを含有する宿主細胞（自律的にまたは染色体中に挿入）もまた、本発明の一態様を構成する。
【００４２】
本発明の免疫原は、先に記載したようなペプチド（それらのミモトープおよび類似体を含む）を含有するものであってもよいしまたはそれらの免疫交差反応性の誘導体もしくはフラグメントであってもよい。同様に本発明の一部を構成するのは、本発明の免疫原またはペプチド、それらのミモトープもしくは誘導体をコードする核酸部分である。
【００４３】
したがって、本発明は、アレルギーを防御または治療するための医薬組成物の製造における新規なエピトープまたはミモトープ（先に定義したとおり）の使用を提供する。本発明のミモトープまたはペプチドと担体分子とを含む免疫原もまた、アレルギーを免疫防御または治療するためのワクチンに使用するために提供される。したがって、本発明のミモトープ、ペプチド、または免疫原は、医療におよびアレルギー性疾患の医学的治療または防御に使用するために提供される。
【００４４】
本発明のワクチンには、有利にはアジュバントが含まれていてもよい。本発明のワクチンに好適なアジュバントには、ＩｇＥペプチド免疫原に対する抗体応答を増強しうるアジュバントが包含される。アジュバントは、当技術分野で周知である（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ − Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ， １９９５， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ６， Ｅｄｓ． Ｐｏｗｅｌｌ， Ｍ．Ｆ．， ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ， Ｍ．Ｊ．， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ， ＩＳＢＮ ０−３０６−４４８６７−Ｘ）。本発明の免疫原と併用するのに好ましいアジュバントとしては、アルミニウム塩またはカルシウム塩（水酸化物またはリン酸塩）が挙げられる。
【００４５】
本発明のワクチンは、一般的には、初回抗原刺激用量および追加抗原刺激用量で投与されるであろう。追加抗原刺激用量は、適切な間隔でまたは好ましくは年１回または循環抗体のレベルが所望のレベルを下回った時に与えられるであろうと想定される。追加抗原刺激用量は、最初の担体分子を存在させずにペプチドから構成してもよい。そのように追加抗原刺激構築物は、別の担体を含んでいてもよいし、担体がまったく存在しない状態であってもよい。
【００４６】
本発明のさらなる態様において、本明細書に記載の免疫原またはワクチンを医療に使用するために提供する。
【００４７】
本発明のワクチン調製物は、全身的または経粘膜的経路を介して該ワクチンを投与することにより、アレルギーに罹患しやすいかまたは罹患している哺乳動物を保護または治療するために使用することが可能である。これらの投与としては、筋肉内、腹腔内、皮内、もしくは皮下経路を介した注射；または口腔／消化管、気道、尿生殖路などへの経粘膜投与が挙げられる。好ましい投与経路は、経皮的経路、たとえば、皮膚貼付剤によるものである。したがって、アレルギーに罹患しているかまたは罹患しやすい患者に本発明のペプチド、免疫原、またはリガンドを投与することを含むアレルギーの治療方法が提供される。
【００４８】
各ワクチン用量中のタンパクの量は、典型的なワクチン被接種者において有意な有害副作用を伴うことなく免疫防御応答を誘発する量として選択される。そのような量は、どの特異的免疫原を利用するかまたはどのように該抗原を提供するかによって変化するであろう。一般的には、各用量には１〜１０００μｇのタンパク質が含まれるであろうと推定されるが、好ましくは１〜５００μｇ、より好ましくは１〜１００μｇであり、なかでも１〜５０μｇが最も好ましい範囲である。特定のワクチンに対する最適量は、被験者の適切な免疫応答を観測することを含む標準的試験により確認することができる。最初のワクチン接種に続いて、適当な間隔をおいて１回または数回の追加免疫を患者に施すことが可能である。
【００４９】
本発明の関連態様には、本発明のペプチドに結合することのできるリガンドがある。そのようなリガンドの例は、抗体（またはＦａｂフラグメント）である。また、医療におけるおよびアレルギーを治療するための薬剤の製造におけるリガンドの使用も提供される。本明細書中の「抗体」という用語は、有用な抗原結合特異性を有する分子という意味で使用されている。抗体のフラグメントまたは誘導体でありかつ同一のまたはよく似た機能を呈しうるポリペプチドがこの用語に包含されうることは、当業者であれば容易に理解されよう。そのような抗体のフラグメントまたは誘導体は、本明細書で使用される抗体という用語に包含されるものとみなされる。
【００５０】
さらに、本発明のペプチドまたは免疫原を用いてワクチン接種することにより動物中で誘導された抗体を精製し、アレルギーを防御または治療するために別の動物に受動的に投与することも可能である。本発明のペプチドは、当技術分野で公知の技術により、モノクローナル抗体ハイブリドーマ（たとえば、Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， １９７５， ２５６， ｐ４９５に記載の公知の技術を使用して）、ヒト化モノクローナル抗体、またはＣＤＲグラフト化モノクロナールを生産するために使用することも可能である。そのような抗体は、受動的な免疫防御もしくは免疫治療に使用することが可能であるかまたはＩｇＥペプチドミモトープの同定に使用することが可能である。
【００５１】
本発明のリガンドはアレルギーの防御または治療に使用しうるので、本発明のリガンドを含む医薬組成物が提供される。
【００５２】
本発明の態様は、診断アッセイに使用することも可能である。たとえば、患者から採取した血清中に存在する抗ＩｇＥの力価をアッセイする際、本発明の種々のペプチドを認識する一群のリガンドを使用することが可能である。さらに、ペプチドそれ自体を用いて、循環抗ＩｇＥをタイプ分けすることも可能である。ある状況下では、たとえばアトピー患者において、循環抗ＩｇＥレベルをアッセイすることが適切な場合もありうるので、本発明のペプチドおよびポリ／モノクローナル抗体は、アトピーの診断に使用することも可能である。さらに、患者に血液を再注入する前に親和性を利用して循環ＩｇＥを患者の血液から除去するために、ペプチドを使用することも可能である。
【００５３】
ワクチンの調製については、Ｎｅｗ Ｔｒｅｎｄｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｖｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｕｎｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， Ｕ．Ｓ．Ａ． １９７８に概説されている。巨大分子へのタンパク質のコンジュゲーションについては、Ｌｉｋｈｉｔｅの米国特許第４，３７２，９４５号およびＡｒｍｏｒらの米国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。
【００５４】
本出願で参照した引用文献中に含まれる情報は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００５５】
実施例
以下の実施例により本発明について説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００５６】
実施例１： ｆｇｌｏｏｐ１（Ｃａｒｌ２１／配列番号２０）およびｆｇｌｏｏｐ２（Ｃａｒｌ３０／配列番号２９）ペプチドに対するマウス血清を用いた抗ＩｇＥ ＥＬＩＳＡ試験
目的： 高親和性レセプターＦｃεＲＩへの循環ＩｇＥの結合を阻止することのできる抗体を上記ペプチドにより誘導することができるかを試験する。
【００５７】
Ｃ末端にリンカーペプチドをもたせてＣａｒｌ２１およびＣａｒｌ３０ペプチドを合成し、ｆｇｌｏｏｐ１（配列： ＣＲＶＴＨＰＨＬＰＲＡＬＭＣＧＳＫ）およびｆｇｌｏｏｐ２（配列： ＣＹＱＭＲＶＴＨＰＨＬＰＲＡＬＭＲＳＴＣＧＳＫ）ペプチドを形成した。それらをＢＳＡにコンジュゲートさせ、マウス免疫原性を評価した。
【００５８】
免疫化：
水中油型エマルジョン／３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１アジュバント中に製剤化された２５μｇのペプチド−ＢＳＡコンジュゲートを０、１４、および２８日目に筋肉内投与することにより、６〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫化した。２８および４２日目（２および３回目の注射の１４日後）にマウスから採血した。ｆｇｌｏｏｐ２で免疫化されたマウスのグループは、３回目の注射の４９日後に４回目の注射を受けた。
【００５９】
ＥＬＩＳＡ：
最初に、ペプチド（コンジュゲート対照）およびヒトＩｇＥの認識に関してマウス血清を試験した。これは古典的ＥＬＩＳＡ法により行った。簡潔に述べると、５０μｌのペプチドまたはヒトＩｇＥ（１００μｇ／ｍｌ、炭酸塩緩衝液中またはＰＢＳ中）のいずれかを用いて＋４℃で一晩かけて９６ウェルプレートをコーティングした。
【００６０】
洗浄し飽和させた後（ＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ−５％粉乳）、５０μｌのマウス血清を１／５００から始めて二倍段階希釈で添加した。モノクロナールマウスＩｇＧ１ Ａｂ， ＰＴ０１１を標準として使用することにより、μｇ／ｍｌ ｍＡｂ当量としてポリクロナール抗ＩｇＥ応答を計算できるようにした。このｍＡｂは、コーティングされたＩｇＥ、可溶性のＩｇＥ（ＩｇＥ−ＦｃεＲＩα相互作用を阻害する）、およびレセプターに結合されたＩｇＥを認識する。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを洗浄し、ビオチン化抗マウスＡｂにより続いて過酸化ストレプトアビジン複合体により、結合されたマウス抗体を検出した。結合されたペルオキシダーゼをＴＭＢ（ＢｉｏＲａｄ）と反応させ、その反応をＨ２Ｓ０４で停止させ、そして４５０〜６３０ｎｍで読み取った。
【００６１】
ＦｃεＲＩαへの可溶性ＩｇＥの結合を阻害する能力に関して、コーティングされたヒトＩｇＥに陽性の血清を試験した。このために、４℃で一晩かけてＦｃεＲＩα鎖（高親和性レセプターのＩｇＥ結合鎖）を０．５μｇ／ｍｌ（５０μ／ウェル）で９６ウェルプレート上にコーティングした。上述したようにプレートを洗浄し飽和させた。二倍段階希釈のマウス血清（１／５０から始める）を一定用量１０μｇ／ｍｌのキメラマウス／ヒトＩｇＥ（ＩｇＥ抗ＮＰ、Ｓｅｒｏｔｅｃ）と混合した。ＦｃεＲＩαでコーティングされたプレートに添加する前に、この混合物を３７℃で１時間インキュベートした。上述したように過酸化抗マウスλ軽鎖（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）により続いてＴＭＢおよびＨ２Ｓ０４により、結合されたキメラＩｇＥを検出した。
【００６２】
この場合、光学濃度の減少（キメラＩｇＥ単独と比較して）は、レセプターへのＩｇＥの結合の低下を示す。すなわち、可溶性ＩｇＥに結合してＦｃεＲＩαへの可溶性ＩｇＥの結合を阻害するペプチド誘導マウス血清の能力を示す。
【００６３】
結果：
ｆｇ ｌｏｏｐ １およびｆｇ ｌｏｏｐ ２のいずれを用いても、抗ＩｇＥ応答を誘発することができた（表２）。ｆｇ ｌｏｏｐ ２で免疫化されたマウスは１０匹中１０匹が抗ＩｇＥ応答を示したのに対して、ｆｇ ｌｏｏｐ １で免疫化されたマウスは１０匹中４匹だけが抗ＩｇＥ応答を生じたにすぎなかった。
【００６４】
ｆｇ ｌｏｏｐ ２で免疫化されたマウスは、１０匹中１匹が、４回目の注射（３回目の注射の４９日後、採血は４回目の注射の１４日後）の後、高い抗ＩｇＥ力価（４５０μｇ／ｍｌ当量ｍＡｂ ＰＴＯ１１）を示した−図１および表３のマウス９を参照されたい。このマウスから採取した血清（サンプル３．９）でも、ＥＬＩＳＡ条件下でレセプターへのＩｇＥの結合を阻害することができた（図２）。
【００６５】
【表２】
表２： ３回目の注射の後におけるｆｇｌｏｏｐ １および２コンジュゲートに対する免疫応答
抗ペプチドについての中点値力価の結果
抗ＩｇＥについてのμｇ／ｍＬ ｍＡｂ ＰＴ１１当量の結果
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【００６６】
【表３】
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【００６７】
実施例２： ｆｇｌｏｏｐ２に対するマウス血清を用いたアカゲザルにおけるＰＣＡ研究
キメラＩｇＥ抗ＮＰを、実施例１の抗ｆｇ ｌｏｏｐ ２マウス血清の２つの希釈液（３．７および３．９ ＝ ＥＬＩＳＡで非阻害性および阻害性）またはペプチドなしのＢＳＡコンジュゲートに対する血清（対照血清）と混合した。陽性対照は、ｍＡｂ ＰＴ１１であった。
【００６８】
１００μｌのＩｇＥ／抗ＩｇＥ混合物を皮内注射し、２４時間後、６ｍｇのＢＳＡ−ＮＰを静脈内注射して、皮内注射部位でアレルギー反応を引き起こした。
【００６９】
静脈内注射の約１５分後、膨疹反応（ｃｍ単位で測定した）を測定した。互いに直交する２つの直径を求めた。
【００７０】
【表４】
表４： マウス７（３．７）およびマウス９（３．９）に由来する実施例１のｆｇｌｏｏｐ２マウス血清を用いたアカゲザルＰＣＡ研究。抗体用量は、最終注射用量として示されている。ＰＢＳ−１％ ＢＳＡ中の希釈液として１００μｌを注射した。両方のサルに同じように注射した。実験プロトコール： ＩｇＥ抗ＮＰ＋抗ＩｇＥ ＜−−−−−−−−−−２４時間−−−−−−−−−−＞「アレルゲン」
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ｆｇ ｌｏｏｐ ２で免疫化されたマウスの抗ＩｇＥ力価を示す。
【図２】
図２は、抗体（ＦＧＬＯＯＰ２に対するもの）によるＩｇＥ受容体へのキメラＩｇＥの結合の阻害を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004520817.tif 000040
2004520817.tif 000041
2004520817.tif 000042