(57)【要約】本発明は、エプスタイン−バーウイルスの感染を予防または処置するためのサブユニットワクチンの同定に関する。特に、ＥＢＮＡ−１を、ワクチン抗原として同定した。特定の実施形態では、ＥＢＮＡ−１に対応する精製タンパク質が、強力なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発した。応答性ＣＤ４＋Ｔ細胞は、機能において主にＴＨ１である。特にＥＢＮＡ−１を負荷した樹状細胞で、ＥＢＮＡ−１は、ＥＢＶに対する防御ワクチンのため、およびＥＢＶの感染および新生物の免疫療法のための魅力的な候補である。
2004500335.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫原性ＥＢＮＡ−１ポリペプチドおよびヒトにおける使用に受容可能なアジュバントを含む、ワクチン。
【請求項２】
前記免疫原性ポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉにおいて発現される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記免疫原性ポリペプチドが、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターを使用して発現される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記免疫原性ポリペプチドが、ＥＢＮＡ−１のアミノ酸配列および異種アミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
ヒトにおける発現のための発現ベクターであって、発現制御配列に作動可能に連結された、免疫原性ＥＢＮＡ−１ポリペプチドをコードする配列を含む、発現ベクター。
【請求項６】
樹状細胞を優先的に標的化する、請求項６に記載のベクター。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、ＥＢＮＡ−１のアミノ酸配列および異種アミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
ウイルスベクターである、請求項６に記載のベクター。
【請求項９】
前記ウイルスベクターが遺伝子操作されたワクシニアウイルスである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
被験体をエプスタイン−バーウイルスによる感染から防御するための方法であって、免疫原性ＥＢＮＡ−１ポリペプチドの免疫学的に有効な量を該被験体に送達する工程を包含する、方法。
【請求項１１】
免疫活性化サイトカインまたは炎症性サイトカインの免疫刺激量を前記被験体に送達する工程をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
被験体をエプスタイン−バーウイルスによる感染から防御するための方法であって、請求項５に記載の発現ベクターの免疫防御量を該被験体に送達する工程を包含する、方法。
【請求項１３】
免疫活性化サイトカインまたは炎症性サイトカインの免疫刺激量を前記被験体に送達する工程をさらに包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記発現ベクターを送達する工程が、該発現ベクターを保有する樹状細胞を前記被験体に移植する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記発現ベクターが、インビボにおいて樹状細胞を標的化する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
ＥＢＶ関連新生物を予防または処置するための、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記新生物が上咽頭癌である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＥＢＶ関連新生物を予防または処置するための、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記新生物が上咽頭癌である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本研究は、国立衛生研究所助成金番号ＫＩ２−ＨＤ００８５０、ならびにＮＩＡＩＤ助成金番号ＡＩ４００４５およびＡＩ４０８７４によって一部支援された。従って、米国政府は、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、エプスタイン−バーウイルス感染を予防または処置するためのワクチンの同定に関する。特に、ＥＢＮＡ−１抗原を、ワクチン抗原として同定した。ＥＢＮＡ−１への暴露が、ヒトおよび動物におけるその免疫防御効果について開発され得る。
【０００３】
（発明の背景）
ＥＢＶは、Ｂリンパ球に対する親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を有する、ヒトγヘルペスウイルスである（ＫｉｅｆｆおよびＬｉｅｂｏｗｉｔｚ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ら編，１８８９−１９１９頁，Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９０）。成体集団のうちの９５％より多くが、一生無症候性の感染としてＥＢＶを保有する。しかし、ＥＢＶは、強力な増殖トランスフォーミング能力を有し（Ｋｌｅｉｎ，Ｃｅｌｌ，７７：７９１−３，１９９４）、ホジキンリンパ腫、上咽頭癌、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、および子宮平滑筋肉腫を含む、一定範囲のＥＢＶ関連悪性疾患において、Ｂ細胞そしておそらく他の細胞型をトランスフォームする。
【０００４】
３つの特定のＥＢＶ遺伝子が、腫瘍形成のために重要であり、そして細胞増殖ならびにアポトーシスに対する耐性を誘導する（Ｇｒｅｇｏｒｙら，Ｎａｔｕｒｅ，３４９：６１２−４，１９９１）。ＥＢＮＡ−１は、ダイマーとして、ウイルス複製起点と宿主細胞ＤＮＡとを連結し、そしてＢ細胞増殖の間のエピソーム性の複製を保証する（Ｂｏｃｈｋａｒｅｖら，Ｃｅｌｌ，８４：７９１−８００；Ｓｈａｈら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：３３５５−６２，１９９２）。この２つの潜伏性膜タンパク質（ＬＭＰ）は、異なる役割を有する。ＬＭＰ１のＣ末端部分は、ＣＤ４０媒介性Ｂ細胞活性化を模擬することによって、直接的なオンコジーンとして作用し得る（Ｗａｎｇら，Ｃｅｌｌ，４３：８３１−４０，１９８５）（ＢｕｓｃｈおよびＢｉｓｈｏｐ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：２５５５−２５６１、１９９９）。従って、ＬＭＰ１は、腫瘍壊死因子レセプターファミリーについてのシグナル伝達タンパク質に関与し（Ｍｏｓｉａｌｏｓら，Ｃｅｌｌ，８０：３８９−９９，１９９５）、そしてｂｃｌ−２の誘導によるアポトーシスに対して防御する（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら，Ｃｅｌｌ，６５：１１０７−１５，１９９１）。ＬＭＰ２は、ｓｙｋおよびｌｙｎ、タンパク質チロシンキナーゼを構成的に保証（ｅｎｇａｇｅ）することによって、Ｂ細胞レセプターシグナル伝達を模擬する（Ｃａｌｄｗｅｌｌら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，９：４０５−１１，１９９８）。これらの３つのタンパク質は、大半のＥＢＶ誘導性腫瘍において発現される排他的なＥＢＶ遺伝子であるようである（Ｍｉｌｌｅｒら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．，Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ら編，１９２１−１９５８頁，Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９０）。バーキットリンパ腫では、ＥＢＮＡ−１のみがＥＢＶの永続性に必要とされる。なぜなら、トランスフォーメーションが、染色体転座を通したｃ−ｍｙｃの開放を含むさらなる機構によって達成されるからである（Ｋｌｅｉｎ、前出）。
【０００５】
大半のＥＢＶキャリアがトランスフォーメーションを回避する理由は、未だ解明されていない。経験的にＥＢＮＡ−１に対する免疫は、トランスフォーム細胞に対する耐性を提供し得るが、ＥＢＶの永続性のためのこの必須のタンパク質に対する特異的Ｔ細胞応答を検出することは困難であることが証明されている。実際、ＥＢＮＡ−１は、ＭＨＣクラスＩ提示のためのその自己のプロセシングをブロックする（Ｂｌａｋｅら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，７：７９１−８０２，１９９７）。これは、Ｎ末端ＧＡ反復ドメインによって引き起こされる、そのプロテアソームのプロセシングにおける欠損に起因していた（Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａら，Ｎａｔｕｒｅ，３７５：６８５０８，１９９５）。同様のＧＡストレッチは、プロテアソームによるＩκＢα分解を妨げる（Ｓｈａｒｉｐｏら，Ｎａｔ　Ｍｅｄ．，４：９３９−４４，１９９８）。他のＥＢＶ潜伏遺伝子産物は、強力なＭＨＣクラスＩ拘束ＣＴＬ応答、特にＥＢＮＡ３Ａ、３Ｂおよび３Ｃに集中する（Ｓｔｅｖｅｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８４：１８０１−１３，１９９６）。しかし、ＥＢＮＡ３タンパク質は、上記で言及したＥＢＶ関連腫瘍の大半において発現されず、そして代わりに、培養されたトランスフォーム株（Ｂ−ＬＣＬ）および免疫抑制された患者における免疫細胞増殖性症候群（ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ　ｓｙｎｄｒｏｍｅ）において発現される。腫瘍関連ＬＭＰ１タンパク質（Ｋｈａｎｎａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２８：４５１−８，１９９８）およびＬＭＰ２タンパク質（Ｌｅｅら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：１８７５−８３，１９９６）に対するＣＤ８＋ＣＴＬ応答が検出されたが、時折のみであった。
【０００６】
有効なＣＤ８＋ＣＴＬの発達および持続は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の補助に依存することが明らかとなりつつある（ＫａｌａｍｓおよびＷａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：２１９９−２０４，１９９８）。ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＥＢＶ産物の認識は、ＣＤ８＋応答と同じように詳細には研究されていなかった（ＲｉｃｋｉｎｓｏｎおよびＭｏｓｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：４０５−３１，１９９７）。樹状細胞（ＤＣ）は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞免疫に対する強力な抗原提示細胞である（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ，Ｎａｔｕｒｅ，３９２：２４５−５２，１９９８）。
【０００７】
従って、エプスタイン−バーウイルスにおける防御抗原を同定する試みは、結論に達しておらず、そして感染からの完全な防御を提供するために、単一の抗原が必要とされるのか、または、複数の抗原が必要とされるのかは、未だ知られていない。さらに、ＥＢＮＡ−１は、このウイルスに対する防御免疫を誘発するとは考えられない。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、ＥＢＶ由来の免疫防御抗原を有利に同定し、これは、ヒトにおけるＥＢＶ感染を予防または処置するためのワクチンおよび免疫療法アプローチにおいて使用され得る。
【０００９】
１つの実施形態では、本発明は、免疫原性ＥＢＮＡ−１ポリペプチドおよびヒトにおける使用に受容可能なアジュバントを含むワクチンを提供する。この免疫原性ＥＢＮＡ−１ポリペプチドは、ＥＢＮＡ−１と異種アミノ酸配列との融合タンパク質であり得る。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、発現制御配列に作動可能に連結された、免疫原性ＥＢＮＡ−１ポリペプチドをコードする配列を含む、ヒトにおける発現のための発現ベクターを提供する。本発明の好ましいベクターは、好ましくは、樹状細胞を標的化する。本発明は、詳細には、ウイルスベクター、例えば、ワクシニアウイルスベクター、鶏痘、ＡＶ−ポックス、および改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ウイルスを意図する。
【００１１】
また、エプスタイン−バーウイルスによる感染から被験体を防御するための方法を提供する。１つのこのような方法は、免疫学的に有効な量の免疫原性ＥＢＮＡ−１ポリペプチドを被験体に送達する工程を包含する。別のこのような方法は、免疫学的に防御する量の本発明の発現ベクターを被験体に送達する工程を包含する。好ましくは、このような発現ベクターは、インビボで樹状細胞を標的化する。これらの方法は、ＥＢＶ関連新生物（例えば、上咽頭癌（しかし、これに限定されない））を予防または処置するために有用である。
【００１２】
本発明をさらに、以下の詳細な説明の節および実施例の節において説明および例示する。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の防御抗原に関する予想外の発見に一部基づく。大半のＥＢＶセロポジティブ成体において、強力なＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答が示された（Ｍｕｒｒａｙら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９２，１７６：１５７−１６８）。しかし、これらは、核抗原、ＥＢＮＡ３Ａ、３Ｂ、および３Ｃに対して優先的に指向され（Ｋｉｅｆｆ，Ｅ．，Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｉｎ　Ｆｉｅｌｄｓ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，およびＰ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ編．１９９６，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．２３４３−２３９６；Ｋｈａｎｎａら　Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９２，１７６：１６９−１７６）、これらは、多くのＥＢＶ関連悪性疾患では発現されない。ＥＢＶトランスフォーム細胞は、発現されたＥＢＶ抗原のパネルによって互いから識別可能な３つの潜伏表現型のうちの１つを示す（Ｍｕｒｒａｙら，１９９２，前出）。潜伏Ｉ（例えば、バーキットリンパ腫）では、ＥＢＮＡ−１のみが発現される。潜伏ＩＩ（ホジキンリンパ腫によって例示される）では、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２、ならびにＥＢＮＡ−１が発現される。潜伏ＩＩＩの免疫芽球性リンパ腫においてのみ、高度に免疫原性なＥＢＮＡ３遺伝子が発現される。従って、多くのＥＢＶ関連悪性疾患は、ＥＢＶ潜伏遺伝子産物に対するヒトＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対する良好な標的を提供しないようである。
【００１４】
本発明における証拠は、予想外に、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）がコードする核抗原（ＥＢＮＡ−１）がＥＢＶワクチン、特に抗腫瘍ワクチンを開発するための有効な抗原であることを示唆する。ＥＢＮＡ−１免疫は、ウイルス複製を顕著に減少させる。なぜなら、この抗原は、ＥＢＶトランスフォームされたヒトＢ細胞を複製するにおいてＥＢＶエピソームの維持のために重要であるからである（Ｙａｔｅｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１２−５，１９８５）。従って、すべてのＥＢＶ誘導された腫瘍は、この外来抗原を発現する。しかし、ＥＢＮＡ−１タンパク質は、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に対しては不可視である。ｇｌｙ−ａｌａ反復ドメインは、プロテアソーム依存性プロセシングを防ぎ、従って、ＭＨＣクラスＩにおける提示を防ぐ（Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａ，ｅｔ　ａｌ．，前出）。今や、ほとんどの個体からのＣＤ４＋Ｔ細胞がＥＢＮＡ−１に応答することが見出された。実際、ＣＤ４＋細胞を刺激するＥＢＶ潜在抗原のうち、ＥＢＮＡ−１が優先的に認識される。認識は、樹状細胞（ＤＣ）のＭＨＣクラスＩＩ分子におけるＥＢＮＡ−１の内因的および外因的プロセシングを介して生じ得る。ＣＤ４＋の応答としては、トランスフォームされたＢリンパ球細胞株（Ｂ−ＬＣＬ）の直接の細胞溶解が包含される。従って、この免疫系は、ＥＢＶ維持のために重要であるＥＢＮＡ−１タンパク質を認識し得る。
【００１５】
この型のＣＤ４＋Ｔ細胞もまたこの応答に影響を与える（以下に概説される：Ｏ’Ｇａｒｒａ，ａｎｄ　Ｍｕｒｐｈｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，６：４５８−６６．２０）。ＴＨ１　ＣＤ４＋細胞は、ＩＦＮγを分泌し、そして細胞性免疫の発達を支援する。これには、マクロファージの活性化が含まれる。ＴＨ２　ＣＤ４＋細胞は、ＩＬ−４およびＩＬ−５を分泌し、それにより、好酸球および抗体産生を刺激する。ＴＨ１細胞における特定のケモカインレセプターの発現は、ＴＨ１細胞の炎症の正常部位への移動を生じる。ＴＨ２細胞は、アレルギー性の応答により密接に関連する部位に移動する。ＣＤ４＋Ｔ細胞はまた、標的を殺傷し得（以下に概説される：Ｈａｈｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｒｅｖ．，１９９５．，１４６：５７−７９）、これは主に、Ｆａｓ−ＦａｓＬ相互作用を介する。細胞傷害性は、ＴＨ１　ＣＤ４＋細胞とともに見い出されている（Ｅｒｂ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，１３５：２３２−４４；　Ｅｒｂ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９０，１４４：７９０−７９５；　Ｄｅｌ　Ｐｒｅｔｅ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９１，１７４：８０９−１３；　Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９９９，１９０：６１７−６２８．）が、限定された数の細胞傷害性ＴＨ２　ＣＤ４＋クローンが報告されている（Ｌａｎｃｋｉ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，１４６：３２４２−９）。
【００１６】
血液から直接単離された細胞におけるＥＢＮＡ−１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は主にＴＨ１応答であるということが証拠により示唆されている。さらに、ＥＢＮＡ−１抗体応答のアイソタイプは、ＩｇＧ１サブクラスについて非対称性であり、これは、インビボでのＴＨ１局在化を反映する。この結果は、ウイルスおよび腫瘍に対する抵抗性についてＴＨ１細胞が重要であり、従って長期免疫にとって鍵であるという新たな証拠に基づくＥＢＮＡ−１に対する治療ワクチンについての重要な含意を有する。
【００１７】
ＥＢＮＡ−１とＥＢＶとの免疫療法により、安全性および有効性に顕著な利点が提供される。サブユニットワクチンは、最大程度の安全性を確実にする。なぜなら、病原体による感染の機会がないからである。これは、殺傷されたかまたは弱毒化されたウイルスで免役するときに何らかの問題が常にある。さらに、単一の成分は、ウイルスワクチン全体における無関連の抗原から生じ得る、有害な副作用（例えば、アナフィラキシーまたは抗原交叉反応）を最小限にする。ＥＢＮＡ−１が充填された樹状細胞には、実質的に治療上の可能性がある。さらに、ＥＢＮＡ−１は、ＥＢＮ感染および腫瘍原性に関与することから、ＥＢＮＡ−１は、最も防御的な免疫応答を惹起して、ＥＢＶ感染および関連する疾患もしくは障害を予防または処置する。別の代替のワクチンアプローチは、ＥＢＮＡ−１タンパク質におけるＤＲ特異的ペプチドを規定することである。これらのペプチドを用いて樹状細胞を適用刺激すること、次いで被験体をその適用刺激された樹状細胞に感染させることにより、そのワクチン戦略の防御的効果が確立される。
【００１８】
用語「ワクチン」とは、レシピエントにおける防御的免疫を惹起するために使用され得る組成物（タンパク質またはベクター；後者はまた、おおまかに「ＤＮＡワクチン」と呼ばれ得るが、ＲＮＡベクターもまた使用され得る）をいう。有効であるためには、本発明のワクチンは、その集団の一部における免疫を惹起し得ることに留意すべきである。なぜなら、いくつかの個体は、強力なまたは防御的な免疫応答を惹起しないかもしれず、あるいは、いくつかの場合では、まったく免疫応答を惹起しないかもしれないからである。この惹起できないことは、個体の遺伝的背景に起因し得るか、または免疫不全状態（後天性または先天性のいずれか）もしくは免疫抑制（例えば、臓器拒絶を予防するかもしくは自己免疫状態を抑制ための免疫抑制薬物での処置）に起因し得る。効力は、動物モデルにおいて決定され得る。
【００１９】
用語「免疫療法（治療）」とは、病原特異的免疫応答の活性化に基づく、処置レジメンをいう。ワクチンは、免疫療法の１つの形態であり得る。樹状細胞にＥＢＮＡ−１抗原を、好ましくは、刺激性サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦもしくはＦｌｔ３リガンド）とともに、エキソビボ（続いて被験体への移植）またはインビボで充填することもまた、免疫療法の形態である。
【００２０】
本明細書において用いられる用語「防御（する）」とは、被験体におけるＥＢＮＶ感染を、予防もしくは処置、または適切な場合その療法を行うことを意味する。従って、そのワクチンの予防的投与は、ＥＢＶ感染からレシピエント被験体を防御し得る（例えば、感染性単核球症またはリンパ増殖性疾患を予防し得る）。そのワクチンまたは免疫療法の治療上の投与は、ＥＢＶ感染が媒介する病因からそのレシピエントを防御して、例えば、ＥＢＶ関連新生物のような疾患または障害を処置し得る。ＥＢＶ関連としては、以下が挙げられる：ホジキンリンパ腫、流行性バーキットリンパ腫、上咽頭癌、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、および子宮平滑筋肉腫。
【００２１】
本明細書において用いられる用語「被験体（被検体）」は、ＥＢＶを支持する動物をいう。特に、この用語は、ヒトをいう。
【００２２】
本明細書において用いられる用語「ヒトにおける発現のためのベクター」は、そのベクターがヒト細胞において有効であるプロモーターを少なくとも含むこと、そして好ましくはそのベクターがヒトにおいて安全かつ有効であることを意味する。そのようなベクターは、例えば、免疫を発達することには関与しない外因性遺伝子を排除する。それがウイルスベクターである場合、そのベクターは、強力な感染の複製および発達を許容する領域を除外し、そしてインビボでの複製能の発達を回避するように操作される。そのようなベクターは、好ましくは、ヒトにおける使用に関して好ましくは安全であり；より好ましい実施形態において、そのベクターは、政府の規制機関（例えば、ヒトにおける臨床試験または使用については食品医薬品局（ＦＤＡ））によって承認されている。特定のベクターを、以下により詳細に記載する。
【００２３】
「アジュバント」は、免疫原に対する免疫応答を惹起する分子または組成物である。アジュバントは、それが以下に規定するように薬学的に受容可能である場合、「ヒトにおける使用に受容可能」である。アジュバントの例は、以下に提供される。
【００２４】
（エプスタインバーウイルスの免疫防御抗原）
本発明は、ＥＢＶ感染を予防もしくは処置するために、エプスタインバーウイルスの免疫防御抗原、防御性または治療性のタンパク質もしくはＤＮＡワクチン、およびＥＢＮＡ−１が充填された樹状細胞を用いた免疫療法を提供する。免疫防御抗原は、免疫原性ＥＢＮＡ−１ポリペプチドである。以下により詳細に考察するように、ＥＢＮＡ−１ポリペプチドは、ＥＢＮＡ−１タンパク質、アミノ酸配列を含む融合タンパク質、または免疫防御エピトープを含むＥＢＮＡ−１のフラグメントであり得る。
【００２５】
用語「免疫原性ＥＢＮＡ−１ポリペプチド」とは、ＥＢＮＡ−１タンパク質、またはその一部であって、免疫原性であり、かつ、動物に投与されるときに防御的免疫応答を惹起するものをいう。従って、ＥＢＮＡ−１免疫防御抗原は、タンパク質全体である必要はない。防御免疫応答は、概して、ＣＤ４＋Ｔ細胞レベルでの細胞免疫を包含する。
【００２６】
その免疫原性ポリペプチドは、上咽頭癌および感染した個体において見出されるような、エプスタインバーウイルスの任意の株由来の、免疫防御ＥＢＮＡ−１抗原、またはＥＢＮＡ−１の配列改変体を含み得る（Ｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８０：４４７，１９９９；　Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７８：１６６３，１９９７）。
【００２７】
本明細書において用いられる用語「免疫原性」とは、そのポリペプチドが体液性または細胞性、好ましくはその両方の免疫応答を惹起し得ることを意味する。免疫原性ポリペプチドはまた、抗原性である。分子は、それが免疫グロブリン（抗体）またはＴ細胞抗原レセプターのような免疫系の抗原認識分子と特異的に相互作用し得る場合に「抗原性」である。抗原性ポリペプチドは、少なくとも約５つの、そして好ましくは少なくとも１０の、アミノ酸のエピトープを含む。あるポリペプチドの抗原性部分（本明細書においてまたエピトープとも呼ばれる）は、抗体またはＴ細胞レセプターの認識のために免疫優勢である部分であり得るか、またはそれは、免疫のためのキャリアポリペプチドとその抗原性部分とを結合体化することによってその分子に対する抗体を作製するために使用される部分であり得る。抗原性である分子は、それ自身が免疫原性である（すなわち、キャリアなしに免疫応答を惹起し得る）必要はない。
【００２８】
本明細書において使用される用語「キャリアポリペプチド」とは、そのポリペプチドの免疫原性を増強するために免疫原性ＥＢＮＡ−１と結合体化または結合され得る、タンパク質またはその免疫原性フラグメントをいう。キャリアタンパク質の例としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：スカシガイヘモシアニン（ＫＬＹ）、アルブミン、コレラ毒素（以下により詳細に考察する）、熱不安定性腸毒素（ＬＴ）など。ＥＢＮＡ−１の免疫防御エピトープを含むペプチドとキャリアポリペプチドとの化学架橋を使用して、免疫原性ポリペプチドを調製し得、好ましくはこの２つの成分は、融合ポリペプチドとして発現するためのキメラ構築物として調製される。
【００２９】
さらに、免疫原性ポリペプチドと精製ハンドル（例えば、ＦＬＡＧまたはＧＳＴ（免疫精製のため）、またはＨＩＳタグ（Ｎｉキレート精製のため）のキメラ融合ポリペプチドが企図される。
【００３０】
全長組換えＥＢＮＡ−１が免疫原性ポリペプチドとして使用される場合、好ましくは、それは、ウイルス成分（例えば、殺傷または弱毒化されたウイルス全体を含むワクチンとの差別化という意味で）を含まない。ＥＢＮＡ−１ポリペプチドは、組換え発現後に精製され得るか、またはそれは、インサイチュでの発現により送達され得る（すなわち、ベクター（ＤＮＡワクチン）からの発現による）。
【００３１】
さらに、本発明は、ＥＢＮＡ−１の、種々の変異体、配列保存改変体、および機能保存改変体の使用を、すべてのそのような改変体が要求される免疫防御成功かを保持する限り許容する。
【００３２】
用語「変異体」および「変異」は、遺伝的材料における任意の検出可能な変化（例えば、ＤＮＡまたは任意のプロセス、機構、あるいはそのような変化の結果）を意味する。これは、遺伝子の構造（例えば、ＤＮＡ配列）が変化した遺伝子変異、任意の変異プロセスから生じる任意の遺伝子またはＤＮＡ，および改変された遺伝子もしくはＤＮＡ配列によって発現される任意の発現産物（例えば、タンパク質）を包含する。用語「改変体」もまた、改変または変化した遺伝子、ＤＮＡ配列、酵素、細胞など（すなわち、任意の種類の変異体）を意味するために使用され得る。
【００３３】
ポリヌクレオチド配列の「配列保存改変体」とは、所定のコドン位置における１つ以上のヌクレオチドの変化がその位置においてコードされるアミノ酸においてなんら変化を生じない改変体である。対立遺伝子変異体は、配列保存改変体であり得る。
【００３４】
「機能保存改変体」とは、タンパク質または酵素における所定のアミノ酸残基が、そのポリペプチドの全体のコンフォメーションおよび機能を変更することなく改変された改変体をいう。ここで、そのような変化としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：あるアミノ酸を類似の特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香性など）に置換すること。いくつかの対立遺伝子変異体は、アミノ酸置換は、タンパク質機能に劇的な影響を与えないような機能保存改変体を生じる。同様に、相同なタンパク質は、機能保存改変体であり得る。類似の特性を有するアミノ酸は、当該分野において周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリジンは、親水性塩基性アミノ酸であり、そして互換性であり得る同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニンまたはバリンと置換され得る。そのような変化は、そのタンパク質またはポリペプチドの見かけ上の分子量または等電点に対して効果をほとんどまたはまったく有しないと予測される。保存的であると指摘されるもの以外のアミノ酸は、タンパク質または酵素において異なり得、その結果、類似の機能の任意の２つのタンパク質の間のタンパク質またはアミノ酸配列の類似性％は、変動し得、そして例えば、Ｃｌｕｓｔｅｒ　Ｍｅｔｈｏｄなどによるアラインメントスキームに従って決定されるように７０％〜９９％であり得る。Ｃｌｕｓｔｅｒ　Ｍｅｔｈｏｄでは、類似性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく。「機能保存改変体」はまた、ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムによって決定されるように少なくとも６０％のアミノ酸同一性、好ましくは少なくとも７５％、もっとも好ましくは少なくとも８５％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９０％を有し、そしてそれが比較されるネイティブもしくは元のタンパク質または酵素と同じまたは実質的に類似する特性もしくは機能を有する、ポリペプチドまたは酵素を包含する。
【００３５】
本明細書において使用される用語「相同（だ）」は、そのすべての文法的形態およびスペリングの改変において、「共通の進化的起源」を有するタンパク質間の関係をいう。これには、以下が含まれる：スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）および異なる種由来の相同タンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）（Ｒｅｅｃｋ，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　５０：６６７，１９８７）。そのようなタンパク質（およびそれをコードする遺伝子）は、その配列類似性に反映されるように、％類似性に関してであれ、特定の残基またはモチーフの存在に関してであれ、配列相同性を有する。
【００３６】
従って、用語「配列類似性」とは、そのすべての文法的形態において、共通の進化的起源（Ｒｅｅｃｋ　Ｒｅｅｃｋ，ｅｔ　ａｌ．、前出）を共有してもよく、しなくてもよいタンパク質の、核酸またはアミノ酸の配列の間の同一性もしくは対応の程度をいう。しかし、一般的な使用においておよび本願においては、用語「相同性」は、「高度に」のような副詞によって修飾される場合、配列類似性をいい得、そして共通の進化的起源に関連してもしなくてもよい。
【００３７】
特定の実施形態において、２つのＤＮＡ配列は、配列比較アルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡＳｔｒｉｄｅｒなど）によって決定されるときに、他の配列からその配列を識別するために、そのＤＮＡ配列の規定された長さに亘って十分な数のヌクレオチドが適合する場合、「実質的に相同性」または「実質的に類似する」。実質的に相同である配列は、配列データバンクにおいて利用可能な標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することによるか、または例えば、その特定の系について規定されるようなストリンジェント条件下でのサザンハイブリダイゼーションにおいて同定され得る。
【００３８】
同様に、特定の実施形態において、２つのアミノ酸配列は、他の配列からその配列を識別するために、そのアミノ酸の十分量が、規定された長さにわたって同一または類似（機能的に同一）する場合、「実質的に相同」または「実質的に類似する」。好ましくは、類似するまたは相同の配列は、例えば、以下を使用するアラインメントによって同定される：ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｐｒｏｇｒａｍ　Ｍａｎｕａｌ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ＧＣＧ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　７，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラム、または上記の任意のプログラム（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）。
【００３９】
さらに、使用する発現系に依存して、発現されたタンパク質は、コード配列によってコードされる推定アミノ酸配列とは異なり得ることに留意すべきである。例えば、免疫原性ポリペプチドの発現のための構築物は、細胞プロセシングの間に切断されてもよくされなくてもよい、シグナル配列を含むタンパク質を発現し得る。さらに、他のタンパク質分解切断が発現の間に生じ得る。そのポリペプチドが真核生物細胞において発現される場合、そのポリペプチドがグリコシル化部位を含む場合そのポリペプチドはグリコシル化され得る。他の可能な変化は、Ｎメチル化などを包含する。
【００４０】
本明細書において使用される用語「単離される（た）」は、その参照される材料がそのネイティブな環境（例えば、細胞）から取り出されることを意味する。従って、単離された生物学的材料は、いくつかまたはすべての細胞成分（すなわち、そのネイティブな材料が天然に生じる細胞の成分（例えば、細胞質または膜成分））を含まなくあり得る。材料は、それが細胞抽出物中に存在する場合か、あるいはそれが異種細胞または細胞抽出物中に存在する場合、単離されたとみなされる。核酸分子の場合において、単離された核酸としては以下が挙げられる」ＰＣＲ産物、単離されたｍＲＮＡ，ｃＤＮＡまたは制限フラグメント別の実施形態において、単離された核酸は、好ましくは、それが見出され得る染色体から切り出され、そしてより好ましくは、非コード領域にもはや結合しなくあり得、近位にもなくあり得（しかし、そのネイティブの制御領域またはその一部には結合され得る）、その染色体において見出される場合に単離される核酸分子に含まれる遺伝子の上流または下流に位置する他の遺伝子にも結合しなくあり得る。なお別の実施形態において、単離された核酸は、１つ以上のイントロンを欠如する。単離された核酸分子は、プラスミド、コスミド、人工染色体などに挿入された配列（すなわち、それがキメラ組換え核酸構築物の部分を形成する場合）を含む。従って、特定の実施形態において、組換え核酸は、単離された核酸である。単離されたタンパク質には、そのタンパク質が細胞において随伴する、他のタンパク質または核酸あるいはその両方が、あるいはそれが膜結合型タンパク質意であるときは細胞膜が付随し得る。単離されたオルガネラ、細胞、または組織は、それが生物において見出される、解剖学的部位から取り出される。単離された材料は、精製されてもよいが、必ずしも必要ではない。
【００４１】
本明細書において使用される用語「精製される（た）」とは、無関連の材料（すなわち、夾雑物）の存在を減少または除去する条件下で単離された材料をいう。例えば、精製されたタンパク質は、好ましくは、そのタンパク質と細胞中で一緒に存在する他のタンパク質も他の核酸も実質的に含まない。精製された核酸分子は、好ましくは、それとともに細胞中に見出され得るタンパク質も他の無関連の核酸分子も実質的に含まない。本明細書において使用される用語「実質的に含まない」とは、その材料の分析試験の文脈において、機能的に使用される。好ましくは、夾雑物を実質的に含まない精製された材料は、少なくとも５０％純粋であり；より好ましくは少なくとも９０％純粋であり、そしてより好ましくはなお少なくとも９９％純粋である。純度は、クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、免疫アッセイ、組成分析、生物学的アッセイ、および当該分野において公知の他の方法によって評価され得る。
【００４２】
精製のための方法は、当該分野において周知である。例えば、核酸は、以下によって精製され得る：沈降、クロマトグラフィー（限外調製固相クロマトグラフィー、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、および三重鎖螺旋クロマトグラフィーを含むがこれに限定されない）、超遠心分離など。ポリペプチドおよびタンパク質は、種々の方法によって精製され得、これには、以下が含まれるがそれらに限定されない：調製用ディスクゲル電気泳動および等電点電気泳動；アフィニティークロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、逆相ＨＰＬＣ、ゲル濾過クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび分配クロマトグラフィー；沈降および塩出クロマトグラフィー；抽出；ならびに対電流分配。いくつかの目的のために、そのタンパク質が以下を含むがそれらに限定されない、精製を容易にするさらなる配列タグを含む組換え系においてポリペプチドを生産することが好ましい：ポリヒスチジン配列、抗体に特異的に結合する配列（例えば、ＦＬＡＧおよびＧＳＴ）。ついで、このポリペプチドは、その宿主細胞の租溶解物から、適切な固相材料上のクロマトグラフィーによって精製され得る。あるいは、そのタンパク質に対して生成されたか、またはそれに由来するペプチドに対して生成された抗体は、精製試薬として使用され得る。細胞は、以下を含む種々の技術によって精製され得る：遠心分離、マトリクス分離（例えば、ナイロンウール分離）、パニングおよび他の免疫選択技術、枯渇（例えば、夾雑細胞の相補枯渇）、および細胞ソーティング（例えば、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ））。他の精製方法が可能であり、そして本明細書において企図される。精製された材料は、約５０％未満の、好ましくは約７５％未満の、そしてもっとも好ましくは約９０％未満の、その材料がもともと一緒に存在していた細胞成分、培地、タンパク質または他の所望されない成分もしくは不純物（文脈に応じて）を含み得る。用語「実質的に純粋」とは、当該分野において公知の慣用される精製技術を用いて達成され得る純度の最高の程度をいう。
【００４３】
特定の実施形態において、用語「約」または「およそ」とは、所定の値または範囲の、２０％以内、好ましくは１０％以内、そしてより好ましくは５％以内を意味する。あるいは、生物学において使用される対数用語では、用語「約
は、所定の値と同じ桁内にあること、より好ましくはその値の桁の２分の１以内の範囲にあることを意味する。
【００４４】
（組換え発現系）
本発明は、本明細書に記載される免疫原性ポリペプチドの発現のための種々のクローニングおよび発現のベクターを企図する。そのような発現ベクターを用いて、細胞をインビトロで形質転換してタンパク質ワクチンのための免疫原性タンパク質を生成し得るか、またはＤＮＡワクチンのためにインビボで免疫原性ポリペプチドを発現させ得る。
【００４５】
免疫原性ポリペプチドのためのコード配列は、シグナル配列を含み得るか、または好ましくは含む。このシグナル配列は、異種シグナル配列（例えば、細菌、酵母、昆虫、または哺乳動物の細胞における最適化されたシグナル配列プロセシングのために）であり得る。本明細書において用いられる用語「シグナル配列」は、分泌タンパク質をその細胞からの分泌のためのプロセシングのために識別する、ほとんどの分泌タンパク質に見出されるＮ末端の疎水性配列をいう。一般に、そのシグナル配列は、プロセシングの間に切断される。しかし、本発明の種々の構築物としては、部分的シグナル配列が挙げられる。その部分シグナル配列が正常にプロセシングされること、またはそれが発現の間に例えば細菌の周辺質にまでトランスロケーションを提供さえすることは、必ずしも正しくない。
【００４６】
本発明に従って、当該分野の技術範囲内の従来の分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が使用され得る。このような技術は、文献中に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ　＆　Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第二版（１９８９）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（本明細書中「Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９」）；ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８５）］；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編（１９８４）］；Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８６）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅｌｌｓ　Ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ　ＰｒａｔｉｃａｌＧｕｉｄｅ　Ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）。
【００４７】
（分子生物学的定義）
「核酸分子」（あるいは「核酸」）とは、単鎖形態または二重鎖ヘリックス形態のいずれかのリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシン、ウリジンまたはシチジン；「ＲＮＡ分子」）またはデオキシリボヌクレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはデオキシシチジン；「ＤＮＡ分子」）または任意のそれらのリン酸エステルアナログ（例えば、ホスホロチオエートおよびチオエステル）のリン酸エステルポリマー形態をいう。二重鎖ＤＮＡ−ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡヘリックスがあり得る。この用語は、特に、直鎖状（例えば、制限フラグメント）または環状ＤＮＡ分子、プラスミド、および染色体において見出される二重鎖ＤＮＡを含む。特定の二重鎖ＤＮＡ分子の構造を議論することにおいて、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（すなわち、ｍＲＮＡに対して相同な配列を有する鎖）に沿って、５’から３’方向においてのみ配列を与えるという通常の慣習に従って本明細書中で記載され得る。「組換えＤＮＡ分子」は、分子生物学的操作を受けたＤＮＡ分子である。
【００４８】
「コード配列」または発現産物（例えば、ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素）を「コードする」配列は、発現される場合に、そのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産物を生じるヌクレオチド配列である（すなわち、そのヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質または酵素のアミノ酸配列をコードする）。タンパク質についてのコード配列は、開始コドン（通常は、ＡＴＧ）および終止コドンを含み得る。
【００４９】
本明細書中のコード配列は、天然の調節（発現制御）配列に隣接していてもよいし、異種配列（プロモーター、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答エレメント、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’非コード領域および３’非コード領域などを含む）に関連していてもよい。
【００５０】
用語「遺伝子」（「構造遺伝子」ともいわれる）は、１以上のタンパク質の全てもしくは一部を含むアミノ酸の特定の配列をコードするかまたはこの特定の配列に対応するＤＮＡ配列を意味し、そして例えば、遺伝子が発現される条件を決定する調節ＤＮＡ配列（例えば、プロモーター配列）を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
【００５１】
導入された遺伝子またはコード配列はまた、「クローニングされた」、「外来」、または「異種」の遺伝子または配列といわれ得、そして細胞の遺伝的機構により用いられる調節配列または制御配列を含み得る。この遺伝子または配列は、非機能的配列または未知の機能を有する配列を含み得る。
【００５２】
用語「宿主細胞」は、細胞による物質の生成（例えば、遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、タンパク質または酵素の細胞による発現）のために、選択されたか、改変されたか、形質転換されたか、増殖されたか、または使用されたかもしくはいずれかの方法において操作された任意の生物の任意の細胞を意味する。宿主細胞は、外因性または異種のＤＮＡが細胞内部に導入されている場合、このようなＤＮＡによりトランスフェクトされている。細胞は、トランスフェクトされたＤＮＡが発現され、そしてこれらのＤＮＡが発現される細胞に対して機能または表現型をもたらす場合、外因性または異種のＤＮＡにより形質転換されている。用語「発現系」は、適合性の発現ベクターにより形質転換され、そして例えば、ベクターにより保有される外来ＤＮＡによりコードされ、かつ宿主細胞に導入されたタンパク質の発現のために適切な条件下で培養される宿主細胞を意味する。
【００５３】
タンパク質およびポリペプチドは、組換えＤＮＡの発現により宿主細胞において生成され得る。本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸ベースのポリマー（これは、核酸によりコードされ得るか、または合成により調製され得る）をいう。ポリペプチドは、タンパク質、タンパク質フラグメント、キメラタンパク質などであり得る。一般に、用語「タンパク質」とは、細胞内で内因的に発現されたポリペプチド（例えば、天然に存在する形態のアミノ酸ベースのポリマー）をいう。一般に、特定のタンパク質または酵素についての指示を有するＤＮＡは、対応するＲＮＡの配列に「転写」される。このＲＮＡ配列は、続いて、タンパク質または酵素を形成するアミノ酸配列に翻訳される。「アミノ酸配列」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖である。
【００５４】
「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼを結合し得、かつ下流の（３’方向の）コード配列の転写を開始し得るＤＮＡ調節領域である。本発明を規定する目的で、このプロモーター配列は、転写開始部位の近くのその３’末端が境界であり、そしてバックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始するに必要な塩基またはエレメントの最小数を含むように上流（５’方向）まで伸長する。プロモーター配列内で、転写開始部位（簡便には、例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングにより規定される）ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。
【００５５】
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがｍＲＮＡにコード配列を転写する場合、細胞において転写制御配列および翻訳（発現）制御配列の「制御下にある」か、またはこれらの配列と「作動可能に会合（連結）」しており、コード配列は次いで、トランスＲＮＡスプライスされ（イントロンを含む場合）、そしてこのコード配列によりコードされるタンパク質に翻訳される。
【００５６】
用語「発現する」および「発現」は、遺伝子またはＤＮＡ配列における情報を顕在化させる（例えば、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化させることによりタンパク質を生成する）ことを意味する。ＤＮＡ配列は、細胞において発現されるか、または細胞により発現されて、タンパク質のような「発現産物」を形成する。発現産物自体（例えば、得られたタンパク質）はまた、細胞により「発現された」といわれ得る。発現産物は、細胞内、細胞外または分泌されたと特徴付けられ得る。用語「細胞内」は、細胞内部に存在する何かを意味する。用語「細胞外」は、細胞外部に存在する（細胞膜中にあるかまたは細胞から分泌されたかのいずれかの）何かを意味する。物質は、この物質が細胞の外部の外部媒体において、細胞上のどこかもしくは細胞内部より有意な尺度で発生するならば、細胞により「分泌」されている。
【００５７】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、ＤＮＡもしくはＲＮＡの配列（例えば、外来遺伝子）が、宿主を形質転換し、かつ導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するように宿主細胞に導入され得るビヒクルを意味する。ベクターとしては、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが挙げられる。「カセット」とは、規定された制限部位においてベクターに挿入され得る発現産物をコードするＤＮＡコード配列またはＤＮＡのセグメントをいう。カセット制限部位は、適切なリーディングフレーム中にカセットを確実に挿入するように設計される。一般に、外来ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１以上の制限部位に挿入され、次いで、このベクターにより、遺伝性の（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ）ベクターＤＮＡとともに宿主細胞に運ばれる。挿入されたか、もしくは付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメントまたは配列（例えば、発現ベクター）はまた、「ＤＮＡ構築物」とよばれ得る。多数のベクター（プラスミドおよび真菌ベクターを含む）は、種々の真核生物宿主および原核生物宿主における複製および／または発現について記載されている。限定しない例としては、ｐＫＫプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＲＳＥＴもしくはｐＲＥＰプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、またはｐＭＡＬプラスミド（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、および多数の適切な宿主細胞が挙げられ、本明細書中に開示または引用された方法または当業者に公知の他の方法が用いられる。組換えクローニングベクターは、しばしば、クローニングもしくは発現のための１以上の複製系、宿主における選択のための１以上のマーカー（例えば、抗生物質耐性）、および１以上の発現カセットを含む。
【００５８】
用語「発現系」は、例えば、ベクターが保有し、かつ宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによりコードされたタンパク質の発現について適切な条件下での宿主細胞および適合性のベクターを意味する。発現系は、細菌、昆虫、または哺乳動物の宿主細胞およびベクターを含む。細菌細胞および昆虫細胞の発現は、以下に例示される。適切な哺乳動物細胞としては、Ｃ１２細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、２９３細胞および２９３Ｔ細胞（ヒト腎臓細胞）、ＣＯＳ細胞、マウス初代筋細胞、およびＮＩＨ　３Ｔ３細胞が挙げられる。
【００５９】
用語「異種」とは、天然に存在しないエレメントの組合わせをいう。例えば、異種ＤＮＡは、細胞においてまたは細胞の染色体部位に天然に位置しないＤＮＡをいう。好ましくは、異種ＤＮＡは、細胞に対して外来の遺伝子を含む。異種発現調節エレメントは、天然において作動可能に会合している遺伝子ではなく、異なる遺伝子と作動可能に会合しているようなエレメントである。本発明の状況において、遺伝子は、クローニングまたは発現のために挿入される組換えベクターＤＮＡに対して異種であり、そして遺伝子が発現されるこのようなベクターを含む宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）に対して異種である。
【００６０】
核酸分子は、単鎖形態の核酸分子が温度および溶液イオン強度の適切な条件（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）を参照のこと）下で他の核酸分子にアニールし得る場合、別の核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ）にハイブリダイズし得る。１００ヌクレオチド長を超えるハイブリッドについて、Ｔｍを計算するための式が得られる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）、９．５０〜９．５１を参照のこと）。より短い核酸（すなわち、オリゴヌクレオチド）とのハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置がより重要になり、そしてオリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）１１．７〜１１．８を参照のこと）。ハイブリダイズ可能な核酸についての最小の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドであり；好ましくは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり；そしてより好ましくは、長さが約２０ヌクレオチドである。
【００６１】
（発現ベクター）
広範に種々の宿主／発現ベクターの組合わせ（すなわち、発現系）は、本発明の免疫原性ポリペプチドを発現することにおいて用いられ得る。例えば、有用な発現ベクターは、染色体配列、非染色体配列および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなり得る。適切なベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体および公知の細菌プラスミド（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドｃｏｌＥｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ＳＶ４０およびｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ　６７：３１−４０，１９８８）、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、ＰＲ４のようなプラスミド）；グラム陽性ベクター（例えば、Ｓｔｒｅｐ．ｇａｒｄｏｎｉｉ）；ファージＤＮＡＳ（例えば、ファージ１の多くの誘導体（例えば、ＮＭ９８９））および他のファージＤＮＡ（例えば、Ｍ１３および糸状単鎖ファージＤＮＡ）；酵母プラスミド（例えば、２ｍプラスミドまたはその誘導体）；真核生物細胞において有用なベクター（例えば、昆虫もしくは哺乳動物細胞において有用なベクター）；プラスミドおよびファージＤＮＡの組合わせに由来するベクター（例えば、ファージＤＮＡもしくは他の発現制御配列を用いるように改変されたプラスミド）などが挙げられる。
【００６２】
タンパク質またはポリペプチドの発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントにより制御され得るが、これらの調節エレメントは、発現のために選択された宿主において機能的でなければならない。遺伝子発現を制御するために用いられ得るプロモーターとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号および同第５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ　２９０：３０４−３１０，１９８１）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，Ｃｅｌｌ　２２：７８７−７９７、１９８０）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７８：１４４１−１４４５，１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　２９６：３９−４２、１９８２）；原核生物発現ベクター（例えば、β−ラクタマーゼプロモーター）（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７５：３７２７−３７３１，１９８３）またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：２１−２５，１９８３）；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４２：７４−９４，１９８０の「Ｕｓｅｆｕｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａ」もまた参照のこと；酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント（例えば、Ｇａｌ４プロモーター、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター）；および造血組織特異性を示す制御領域（特に、リンパ球において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域）（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、Ｃｅｌｌ，３８：６４７，１９８４；Ａｄａｍｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３１８：５３３，１９８５；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．７：１４３６、１９８７）；骨髄細胞において活性なβグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、Ｎａｔｕｒｅ　３１５：３３８−３４０，１９８５；Ｋｏｌｌｉａｓら、Ｃｅｌｌ　４６：８９−９４，１９８６）、造血幹細胞分化因子プロモーター；エリスロポエチンレセプタープロモーター（Ｍａｏｕｃｈｅら、Ｂｌｏｏｄ，１５：２５５７，１９９１）など；および粘膜上皮細胞特異性を示す制御領域。
【００６３】
好ましいベクター（特に、インビトロでの細胞アッセイおよびインビボもしくはエキソビボでのワクチン接種のため）は、レンチウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、鶏痘、ＡＶ−ポックス、改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｖａｃｃｉｎｉａ　Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）のようなウイルスベクターおよび所望の細胞向性を有する他の組換えウイルスである。特定の実施形態において、ワクシニアウイルスベクターは、樹状細胞に感染させるために用いられる。別の特定の実施形態において、ＥＢＮＡ−ｌを発現するバキュロウイルスベクターが調製される。従って、免疫原性ポリペプチドをコードするベクターは、ウイルスベクターを用いて、またはＤＮＡの直接導入によりインビボ、エキソビボ、またはインビトロで導入され得る。標的化された組織における発現は、トランスジェニックベクターを特定の細胞に標的化する（例えば、ウイルスベクターもしくはレセプターリガンドを用いるか、組織特異的プロモーターを用いることによるか、またはその両方を用いる）ことにより、もたらされ得る。標的化された遺伝子送達は、国際特許出願ＷＯ９５／２８４９４（１９９５年１０月公開）に記載される。
【００６４】
インビボまたはエキソビボ標的化およびワクチン接種手順のために一般に用いられるウイルスベクターは、ＤＮＡベースのベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターを構築し、そして用いるための方法は、当該分野で公知である（例えば、ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ，Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、７：９８０−９９０，１９９２を参照のこと）。好ましくは、このウイルスベクターは、複製欠損である（すなわち、このベクターは、標的細胞において自律的に複製できない）。好ましくは、複製欠損ウイルスは、最小のウイルスである（すなわち、このウイルスは、ゲノムをキャプシド化してウイルス粒子を生成するために必要なそのゲノムの配列のみを保持する）。
【００６５】
ＤＮＡウイルスベクターとしては、弱毒化ＤＮＡウイルスまたは欠損ＤＮＡウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、パピロマウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルスなどが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられる。特定のベクターの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：欠損ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔら、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：３２０−３３０，１９９１；国際特許公開番号ＷＯ９４／２１８０７（１９９４年９月２９日公開）；国際特許公開番号ＷＯ９２／０５２６３（１９９４年４月２日公開））；弱毒化アデノウイルスベクター（例えば、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：６２６−６３０，１９９２により記載される；Ｌａ　Ｓａｌｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：９８８−９９０，１９９３もまた参照のこと）；および欠損アデノ随伴ウイルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３０９６−３１０１，１９８７；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．．６３：３８２２−３８２８，１９８９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６，１９８８）。
【００６６】
種々の仲間が市販のウイルスベクターを生成し、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｖｉｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ；ＡＡＶベクター）、Ｃｅｌｌ　Ｇｅｎｅｓｙｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ；レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶのベクターおよびレンチウイルスベクター）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（レトロウイルスおよびバキュウロウイルスのベクター）、Ｇｅｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．（Ｓｈａｒｏｎ　Ｈｉｌｌ，ＰＡ；アデノウイルスおよびＡＡＶのベクター）、Ｇｅｎｖｅｃ（アデノウイルスベクター）、ＩｎｔｒｏＧｅｎｅ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；アデノウイルスベクター）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ、およびヘルペスウイルスベクター）、Ｎｏｒｇｅｎ（アデノウイルスベクター）、Ｏｘｆｏｒｄ　ＢｉｏＭｅｄｉｃａ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ；レンチウイルスベクター）、およびＴｒａｎｓｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ；アデノウイルス、ワクシニア、レトロウイルス、およびレンチウイルスのベクター）。
【００６７】
（アデノウイルスベクター）
アデノウイルスは、真核生物ＤＮＡウイルスであって、本発明の核酸を種々の細胞型に効率的に送達するように改変され得る。種々の血清型のアデノウイルスが存在する。これらの血清型のうち、本発明の範囲内で２型もしくは５型のヒトアデノウイルス（Ａｄ２もしくはＡｄ５）または動物起源のアデノウイルス（ＷＯ９４／２６９１４を参照のこと）を用いて、性能が与えられる。本発明の範囲内で用いられ得る動物起源のそれらのアデノウイルスとしては、イヌ、ウシ、マウス起源のアデノウイルス（例：Ｍａｖ１、Ｂｅａｒｄら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　７５（１９９０）：８１）、ヒツジ、ブタ、トリおよびサル起源のアデノウイルス（例：ＳＡＶ）が挙げられる。好ましくは、動物起源のアデノウイルスは、イヌアデノウイルス、より好ましくは、例えば、ＣＡＶ２アデノウイルス（例えば、ＭａｎｈａｔｔａｎまたはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣ　ＶＲ−８００））である。種々の複製欠損アデノウイルスおよび最小アデノウイルスベクターが記載されている（ＷＯ９４／２６９１４、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９４／２８１５２、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９５／０２６９７、ＷＯ９６／２２３７８）。本発明に従う複製欠損組換えアデノウイルスは、当業者に公知の任意の技術により調製され得る（Ｌｅｖｒｅｒｏら、Ｇｅｎｅ　１０１：１９５　１９９１；ＥＰ　１８５８７３；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ　Ｊ．３：２９１７，１９８４；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９　１９７７）。組換えアデノウイルスは、ヒト樹状細胞に対して効率的かつ混乱させない（ｎｏｎ−ｐｕｒｔｕｒｂｉｎｇ）ベクターである（Ｚｈｏｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：９６４，１９９９；ＤｉＮｉｃｏｌａら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．５：３５０−６，１９９８）。組換えアデノウイルスは、当業者に周知の標準的な分子生物学的技術を用いて回収および精製される。
【００６８】
（アデノ随伴ウイルス）
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、安定かつ部位特異的様式で、これらのウイルスが感染する細胞のゲノムに組み込まれ得る比較的小さなサイズのＤＮＡウイルスである。これらは、細胞増殖、細胞形態または細胞分化に対していずれの影響も誘導することなく広範なスペクトルの細胞に感染し得、そしてそれらは、ヒトの病状に関与しないと思われる。ＡＡＶゲノムは、クローニングされ、配列決定され、かつ特徴付けられている。インビトロおよびインビボで遺伝子を移入するためのＡＡＶに由来するベクターの使用が記載されている（ＷＯ９１／１８０８８；ＷＯ９３／０９２３９；米国特許第４，７９７，３６８号、同第５，１３９，９４１号、ＥＰ　４８８５２８を参照のこと）。本発明に従う複製欠損組換えＡＡＶは、２つのＡＡＶ逆末端反復（ＩＴＲ）領域に隣接する目的の核酸配列を含むプラスミドおよびＡＡＶキャプシド化遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子）を有するプラスミドを、ヒトヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）に感染する細胞株に同時トランスフェクトすることにより調製され得る。次いで、生成されたこのＡＡＶ組換え体は、標準的技術により精製され得る。これらのウイルスベクターはまた、ヒト樹状細胞に遺伝子を移入するために効率的である（ＤｉＮｉｃｏｌａら（前出））。
【００６９】
（レトロウイルスベクター）
別の実施形態において、遺伝子は、例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、米国特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎら、１９８３，Ｃｅｌｌ　３３：１５３；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１１２０；Ｔｅｍｉｎら、米国特許第５，１２４，２６３号；ＥＰ　４５３２４２、ＥＰ１７８２２０；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．７（１９８５）２３５；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３（１９８５）６８９；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙらによる国際特許公開番号ＷＯ９５／０７３５８（１９９５年３月１６日公開）；およびＫｕｏら、１９９３、Ｂｌｏｏｄ　８２：８４５に記載されるように、レトロウイルスベクターに導入され得る。レトロウイルスは、分裂している細胞に感染する組み込みウイルスである。レトロウイルスゲノムは、２つのＬＴＲ、キャプシド化配列および３つのコード領域（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。組換えレトロウイルスベクターにおいて、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖの遺伝子は、一般に、全体または一部が欠失され、そして目的の異種核酸配列で置換される。これらのベクターは、異なる型のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＭｏＭｕＬＶ（「マウスモロニー白血病ウイルス」）、ＭＳＶ（「マウスモロニー肉腫ウイルス」）、ＨａＳＶ（「ハーベイ肉腫ウイルス」）；ＳＮＶ（「脾臓壊死ウイルス」）；ＲＳＶ（「ラウス肉腫ウイルス」）およびフレンドウイルス）から構築され得る。適切なパッケージング細胞株は、従来技術において記載され、特に細胞株ＰＡ３１７（ＵＳ４，８６１，７１９）；ＰｓｉＣＲＩＰ細胞株（ＷＯ９０／０２８０６）およびＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞株（ＷＯ８９／０７１５０）に記載されている。さらに、組換えレトロウイルスベクターは、転写活性を抑制するためのＬＴＲおよびｇａｇ遺伝子の一部を含み得る広範なキャプシド化配列内に改変を含み得る（Ｂｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：１６３９，１９８７）。組換えレトロウイルスベクターは、当業者に公知の標準的な技術により精製される。
【００７０】
レトロウイルスベクターはまた、１サイクルのレトロウイルス複製を可能にし、そしてトランスフェクション効率を拡大するＤＮＡウイルスにより導入され得る（ＷＯ９５／２２６１７、ＷＯ９５／２６４１１、ＷＯ９６／３９０３６、ＷＯ９７／１９１８２を参照のこと）。
【００７１】
（レンチウイルスベクター）
別の実施形態において、次いで、レンチウイルスベクターは、いくつかの組織型（脳、網膜、筋肉、肝臓および血液を含む）における導入遺伝子の直接送達および持続的発現のための因子として用いられ得る。このベクターは、これらの組織において分裂細胞および非分裂細胞を効率的に形質導入し得、そして目的の遺伝子の長期発現を維持し得る。総説については、Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４５７−６３，１９９８を参照のこと；Ｚｕｆｆｅｒｅｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−８０，１９９８もまた参照のこと。レンチウイルスパッケージング細胞株は当該分野で利用可能であり、一般に公知である。これらの細胞株は、遺伝子治療のための高力価レンチウイルスベクターの生成を容易にする。例は、少なくとも３〜４日間にわたり１０６ＩＵ／ｍｌより高い力価でウイルス粒子を生成し得るテトラサイクリン誘導性ＶＳＶ−Ｇ偽型化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）レンチウイルスパッケージング細胞株である（Ｋａｆｒｉら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：５７６−５８７，１９９９）。誘導性細胞株により生成されるベクターは、インビトロおよびインビボで非分裂細胞を効率的に形質導入するために必要であるように濃縮され得る。
【００７２】
（ワクシニアウイルスベクター）
ワクシニアウイルスは、ポックスウイルスファミリーのメンバーであり、そしてそのサイズの大きさおよび複雑性によって特徴付けられている。ワクシニアウイルスＤＮＡは、二本鎖であり、そして末端架橋されていて、その結果、一本鎖環が、ＤＮＡの変性に基いて形成される。このウイルスは、約２００年間、痘瘡に対するワクチンとして用いられており、ワクチンとして用いた場合のこのウイルスの特徴は公知である（Ｐａｏｌｅｔｔｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：１１３４９〜５３，１９９６；およびＥｌｌｈｎｅｒ，Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，２６：２６３〜９，１９９８）。ワクシニアウイルスを用いたワクチン接種の危険性は、周知で、十分規定されており、そしてこのウイルスは、比較的良性であるとみなされている。ワクシニアウイルスベクターは、外来遺伝子の挿入および発現のために用いられ得る。ワクシニアベクターに外来遺伝子を挿入して、ワクシニアウイルスの合成組換え体を作成する基礎的な技術は、記載されている（米国特許第４，６０３，１１２号、米国特許第４，７２２，８４８号、米国特許第４，７６９，３３０号、および米国特許第５，３６４，７７３号を参照のこと）。多数の外来（すなわち、非ワクシニア）遺伝子が、ワクシニア中で発現されており、これは、しばしば、防御免疫を生じる（以下によって概説されている：Ｙａｍａｎｏｕｃｈｉ，Ｂａｒｎｅｔｔ、およびＫａｉ、Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．，１７：６４１〜５３，１９９８；Ｙｏｋｏｙａｍａら、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．５９：３１１〜２２，１９９７；そして以下を参照のこと：Ｏｓｔｅｒｈａｕｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１６：１４７９〜８１　１９９８：およびＧｈｅｒａｒｄｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：６７４２〜３３，１９９９）。ワクシニアウイルスは、免疫無防備状態の個体または免疫抑制状態の個体への投与には適していないかもしれない。本発明において用いられ得る別のポックスウイルスとしては、家禽ポックス（Ｆｏｗｌ　ｐｏｘ）、ＡＶポックス（ＡＶ−ｐｏｘ）、および改変ワクシニアアンカラ（Ａｎｋａｒａ）（ＭＶＡ）ウイルスが挙げられる。これらの別のウイルスの免疫原としての能力を改善するために好ましい実施形態は、ＥＢＮＡ−１を含有するウイルスを直接、樹状細胞に送達すること、次いで樹状細胞を成熟させることである。
【００７３】
（非ウイルスベクター）
別の実施形態において、このベクターは、裸のＤＮＡとして、リポフェクチンによって、または他のトランスフェクション達成剤（ペプチド、ポリマーなど）を用いて、インビトロで導入され得る。合成のカチオン性脂質は、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製するのに用いられ得る（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３〜７４１７，１９８７；ＦｅｌｇｎｅｒおよびＲｉｎｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　３３７：３８７〜３８８，１９８９；以下を参照のこと：Ｍａｃｋｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：８０２７〜８０３１、１９８８；Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：１７４５〜１７４８，１９９３）。核酸の移入のために有用な脂質化合物および脂質組成物は、以下に記載されている：国際特許出願ＷＯ９５／１８８６３およびＷＯ９６／１７８２３、ならびに米国特許第５，４５９，１２７号。脂質は、標的化の目的のため、他の分子に化学的に結合され得る（Ｍａｃｋｅｙら、（前出）を参照のこと）。標的化ペプチド（例えば、ホルモンまたは神経伝達物質、および抗体などのタンパク質、または非ペプチド分子）は、リポソームに化学的に結合され得る。
【００７４】
カチオン性オリゴペプチド（例えば、国際特許公開ＷＯ９５／２１９３１）、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド（例えば、国際特許公開ＷＯ９６／２５５０８）、またはカチオン性ポリマー（例えば、国際特許公開ＷＯ９５／２１９３１）のような、他の分子がまた、インビボで核酸のトランスフェクションを容易にするために有用であり得る。
【００７５】
あるいは、遺伝子治療のための非ウイルス性ＤＮＡベクターが、当該分野で公知の方法（例えば、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用（弾道トランスフェクション；例えば米国特許第５，２０４，２５３号；同第５，８５３，６６３号；同第５，８８５，７９５号；同第５，７０２，３８４号を参照のこと、そして以下を参照のこと：Ｓａｎｆｏｒｄ，ＴＩＢ−ＴＥＣＨ，６：２９９〜３０２，１９８８；Ｆｙｎａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：１１４７８〜１１４８２，１９９３；およびＹａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１５６８〜９５７２，１９９０）、またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用（例えば、以下を参照のこと：Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７，１９９２；ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１〜１４６２４，１９８８；Ｈａｒｔｍｕｔら、１９９０年３月１５日出願、カナダ特許出願番号２，０１２，３１１号；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：２７２６〜２７３０，１９９１））によって所望の宿主細胞に導入され得る。レセプター媒介ＤＮＡ送達アプローチがまた用いられ得る（Ｃｕｒｉｅｌら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．３：１４７〜１５４，１９９２；ＷｕおよびＷｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２，１９８７）。米国特許第５，５８０，８５９号および米国特許第５，５８９，４６６号は、哺乳動物において、トランスフェクション促進剤を使わない、内因性ＤＮＡ配列の送達を開示している。近年、比較的低い電圧の、高い効率のインビボＤＮＡ移入技術（電気移入（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）と名付けられる）が記載されている（Ｍｉｒら、Ｃ．Ｐ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３２１：８９３，１９９８；ＷＯ　９９／０１１５７；ＷＯ　９９／０１１５８；ＷＯ　９９／０１１７５）。
【００７６】
（ワクチン技術および免疫療法）
上記のように、本発明は、エプスタイン−バーウイルス感染、または関連の疾患（例えば、感染性単球増加、風土性バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、上咽頭癌、Ｔ細胞リンパ腫、胃癌、および平滑筋肉腫、ならびに慢性疲労症状のような潜在的な慢性疾患）を予防または処置するための、ポリペプチドワクチン、および免疫原性ＥＢＮＡ−１ポリペプチドを送達するＤＮＡワクチンに関する。
【００７７】
本発明のワクチンは、エプスタイン−バーウイルスによる感染から動物を防御するために広範に適用可能である。用語「防御（ｐｒｏｔｅｃｔ）」は、エプスタイン−バーウイルス感染の処置または予防を意味するとして、本明細書において用いられる。従って、このタイプの感染に感受性の任意の動物がワクチン接種され得る。ＥＢＶは、γヘルペスウイルス（ｇａｍｍａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ　ｓａｉｍｉｒｉ、およびウシ４型へルペスウイルスに対して、他のクラスのヘルペスよりも系統学的に大きい類似性を示す（Ｋａｒｌｉｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１８８６；９０２，１９９４；およびＢｕｂｌｏｔら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９０：６５４〜６５，１９９２）。ＥＢＶについての動物モデルは、同じ種の新世界ザル（Ｎｅｗ　Ｗｏｒｌｄ　ｍｏｎｋｅｙ）において（Ｆｒａｎｋｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：８０１１〜９，１９９５）、ならびにマウスにおいて（ＭｉｓｔｒｉｋｏｖａおよびＭｒｍｕｓｏｖａ，Ａｃｔａ．Ｖｉｒｏｌ．，４２：７９〜８２，１９９８，Ｗｅｃｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：４６５１〜６１，１９９９；ならびにＳｉｍａｓおよびＥｆｓｔａｔｈｉｏｕ、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６：２７６〜８２，１９９８）およびウサギにおいて（Ｗｕｔｚｌｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４０：１９７９〜９５，１９９５；およびＨａｎｄｌｅｙら、Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４７：１６７〜８１，１９９５）存在する。サルに感染する、少なくとも１つのＥＢＶ様ヘルペスウイルスは、ＥＢＮＡ−１に相同である遺伝子を含む（Ｌｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５９：２８７〜９５，１９９４）。ＥＢＶ様ウイルスに感染した動物は、疾患を予防または処置するための本発明のワクチンで処置され得る。
【００７８】
（ポリペプチドワクチン）
本明細書において用いる場合、用語「ポリペプチドワクチン」は、免疫原性ポリペプチドおよび一般にはアジュバントを含むワクチンをいう。用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物をいう。アジュバントは、抗原を緩徐に放出する組織デポ（貯蔵）として、そしてまた免疫応答を非特異的に増強するリンパ系アクチベータとして働き得る（Ｈｏｏｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第２版、１９８４、Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ：Ｍｅｎｌｏ　Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ｐ３８４）。しばしば、抗原のみ（アジュバントなし）での初回チャレンジは、体液性免疫応答または細胞性免疫応答を惹起し得ない。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチンのような表面活性化物質、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリマー、ポリアニオン、ペプチド、オイル、または炭水化物エマルジョン、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント（例えば、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）が挙げられるがこれらに限定されない。好ましい合成アジュバントの例はＱＳ−２１である。あるいは、またはさらに、以下に記載するような、免疫刺激的タンパク質が、アジュバントとして、またはワクチンに対する免疫応答を増大するために、提供され得る。好ましくは、このアジュバントは、薬学的に受容可能である。
【００７９】
句「薬学的に受容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ　ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」とは、ヒトに投与された場合、生理学的に耐性であり、そして代表的には、アレルギー反応または類似の不都合な反応（例えば、異常亢進、眩暈など）を生じない分子および組成物をいう。好ましくは、本明細書において用いる場合、用語「薬学的に受容可能な」とは、連邦もしくは合衆国政府の監督官庁によって承認されたか、または米国薬局方もしくは動物、およびより詳細にはヒトにおける使用のための他の一般的に認識される薬局方に列挙されることを意味する。用語「キャリア」とは、この化合物と一緒に投与される稀釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。滅菌水または生理食塩水水溶液およびデキストラン水溶液およびグリセロール水溶液は、特に注射用溶液のために、好ましくはキャリアとして使用される。適切な薬学的キャリアは、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによって「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。
【００８０】
上記の特定のアジュバント（特に鉱物油および鉱物油を含むアジュバント（例えば、フロイントのアジュバント））は、ヒトでの使用には受容できない。
【００８１】
（「ＤＮＡ」ワクチン）
用語「ＤＮＡワクチン」は、当該分野では非公式な用語であり、そして組換えベクターの手段によって送達されるワクチンをいうために、本明細書において用いられる。本明細書において用いられる別の、そしてより説明的な用語は、「ベクターワクチン」である（なぜなら、いくつかの可能性のあるベクター（例えば、レトロウイルスおよびレンチウイルス）は、ＲＮＡウイルスであるからであり、そしてある場合には、ＤＮＡの代わりに非ウイルスＲＮＡが細胞に送達され得るからである）。一般に、このベクターは、インビボで投与されるが、インビボで形質導入された細胞の投与を伴う、適切な抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）のエキソビボ導入がまた、意図される。上記のベクター系は、本発明の免疫原性ポリペプチドの発現のためのベクターの送達にとって理想的である。
【００８２】
（ワクチン接種および免疫療法のストラテジー）
エプスタイン−バーウイルス感染に対して被験体をワクチン接種するために、種々のストラテジーを用い得る。ポリペプチドワクチン処方物は、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）（ｓ．ｃ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）（ｓ．ｄ．）、皮内（ｉ．ｄ．）の投与によって、またはエキソビボでの抗原提示細胞への投与とそれに続くこの細胞の被験体への投与によって送達され得る。被験体への投与の前に、抗原提示細胞は、成熟させられてもよい。
【００８３】
同様に、上記の任意の遺伝子送達方法は、被験体にベクターワクチンを投与するために用いられ得る（例えば、遺伝子銃または直接注射による、裸のＤＮＡおよびＲＮＡの送達）。
【００８４】
ワクチン接種の有効性は、免疫刺激、免疫増強または炎症促進性のサイトカイン、リンホカイン、またはケモカインのような免疫刺激性分子（ＳａｌｇａｌｌｅｒおよびＬｏｄｇｅ、Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．６８：１２２，１９８８）と、ワクチン（特にベクターワクチン）との同時投与によって増強され得る。例えば、サイトカインまたはサイトカイン遺伝子（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、顆粒球マクロファージ（ＧＭ）コロニー刺激因子（ＣＳＦ）および他のコロニー刺激因子、マクロファージ炎症因子、Ｆｌｔ３リガンド（Ｌｙｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．５：１９２，１９９８））、ならびにいくつかの重要な同時刺激分子またはそれらの遺伝子（例えば、Ｂ７．１，Ｂ７．２）が用いられ得る。これらの免疫刺激分子は、タンパク質として全身もしくは局所的に送達され得るか、またはこの分子の発現をコードするベクターの発現によって、送達され得る。免疫原性ポリペプチドの送達のための上記の技術はまた、免疫刺激分子に対して使用され得る。
【００８５】
（樹状細胞標的化）
ワクチン接種および特に免疫療法は、樹状細胞の標的化を通じて達成され得る（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１２８：５３１，１９９６；Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：８５９，１９９６；Ｔａｉｔｅら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１３：６５３，１９９９；Ａｖｉｇａｎ，Ｂｌｏｏｄ　Ｒｅｖ．，１３：５１，１９９９；ＤｉＮｉｃｏｌａら．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ　Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：２６５，１９９８）。樹状細胞は、Ｔ細胞依存性免疫の活性化に重要な役割を果たす。増殖する樹状細胞は、インサイチュで免疫原性形態でタンパク質抗原を捕獲し、次いでこれらの抗原を認識され得る形態で提示してＴ細胞を刺激するために用いられ得る（例えば、Ｓｔｅｉｎｍａｎ、Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：８５９〜８６２，１９９６；Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２１６３〜７３，１９９８および米国特許第５，８５１，７５６号を参照のこと）。エキソビボ刺激のために、樹状細胞を培養皿中にプレートし、そして抗原が樹状細胞に結合することを可能にするのに十分な量および十分な時間で、抗原に曝露（抗原を適用）する。さらに、樹状細胞は、Ｚｈｏｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：９６４〜７２，１９９９；Ｖａｎ　Ｔｅｎｄｅｌｏｏら、Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．，５：７００〜７，１９９８；Ｄｉｅｂｏｌｄら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．１０：７７５〜８６，１９９９；ＦｒａｎｃｏｔｔｅおよびＵｒｂａｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：８１４９，１９８５および米国特許第５，８９１，４３２号（Ｃａｓａｒｅｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１４８１〜６，１９９７）に記載のように種々の物理的または化学的手段を用いてＤＮＡでトランスフェクトされ得る。次いで、適用した細胞を、処置を受けている被験体に、例えば静脈内注射によって、移植して戻し得る。好ましくは、自己樹状細胞（すなわち、処置を受けている被験体から得た樹状細胞）を用いるが、ＭＨＣクラスＩＩ適合樹状細胞を使用することも可能である。この樹状細胞は、型適合ドナーから、または樹状細胞の遺伝子操作によって獲得され、所望のＭＨＣ分子を発現（そして好ましくは所望されないＭＨＣ分子の発現を抑制）し得る。
【００８６】
好ましくは、樹状細胞は、ＥＢＮＡ−１の発現のためにインビボで特に標的される。抗原提示を媒介するレセプター（例えば、ＤＥＣ−２０５）（Ｓｗｉｇｇａｒｄら、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：３０２〜１１，１９９５；Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：８５９，１９９６）およびＦｃレセプターを使用することによって、種々のストラテジーが、インビボで樹状細胞を標的化するのに利用可能である。上記で考察した標的化ウイルスベクターがまた用いられ得る。さらに、樹状細胞は、ウイルスベクターによる感染後、インビボでの移植の前に、成熟するようにインビトロで誘導され得る。
【００８７】
（粘膜ワクチン接種）
粘膜ワクチンストラテジーは、多くの病原性ウイルスにとって特に有効である。なぜなら、感染は、しばしば粘膜を介して起こるからである。さらに、組換えワクシニアウイルスワクチンの粘膜送達は、以前の痘瘡ワクチン接種に起因する痘瘡ウイルスに対するもともと存在する免疫を克服することができる（Ｂｅｌｙａｋｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６：４５１２〜７，１９９９）。粘膜は、ＥＢＮＡ−１ワクチンおよび免疫療法の重要な標的である樹状細胞を覆ってしまう。従って、ポリペプチドワクチンおよびＤＮＡワクチンの両方について粘膜ワクチン接種ストラテジーが意図される。粘膜はワクチンの局所送達によって標的化され得るが、粘膜に免疫原性タンパク質を送達するため、種々のストラテジーが使用されてきた（これらのストラテジーは、例えば、ベクター標的タンパク質として特異的粘膜標的タンパク質を用いることによる、または粘膜標的タンパク質との混合物としてワクチンベクターを送達することによる、ＤＮＡワクチンの送達を含む）。
【００８８】
例えば、特定の実施形態において、免疫原性ポリペプチドまたはベクターワクチンは、コレラ毒素（例えば、コレラ毒素Ｂまたはコレラ毒素Ａ／Ｂキメラ）との混合物として、またはコレラ毒素との結合体もしくはキメラ融合タンパク質として、投与され得る（Ｈａｊｉｓｈｅｎｇａｌｌｉｓ．，Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：４３２２〜３２，１９９５；ＪｏｂｌｉｎｇおよびＨｏｌｍｅｓ、Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ．，６０：４９１５〜２４，１９９２）。コレラ毒素Ｂサブユニットの使用に基く粘膜ワクチンが記載されている（ＬｅｂｅｎｓおよびＨｏｌｍｇｒｅｎ，Ｄｅｖ　Ｂｉｏｌ　Ｓｔａｎｄ　８２：２１５〜２７，１９９４）。別の実施形態において、熱不安定性エンテロトキシン（ＬＴ）との混合物が粘膜ワクチン接種のために調製され得る。
【００８９】
他の粘膜免疫ストラテジーとしては、マイクロカプセル中の免疫原のカプセル化（米国特許第５，０７５，１０９号、同第５，８２０，８８３号、および同第５，８５３，７６３号）、および免疫増強膜性キャリアの使用（ＷＯ　９８／０５５８）が挙げられる。経口投与された免疫原の免疫原性は、赤血球（ｒｂｃ）またはｒｂｃゴースト（米国特許第５，６４３，５７７号）を用いることによって、またはブルータング抗原（米国特許第５，６９０，９３８号）を用いることによって増強され得る。標的化免疫原の全身投与はまた、粘膜免疫を生じ得る（米国特許第５，５１８，７２５号を参照のこと）。
【００９０】
種々のストラテジーを用いて、粘膜組織における発現のための遺伝子を送達し得る（これには、例えば、キメラレトロウイルス（米国特許第５，７１４，３７４号）、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、または核酸の特異的標的化（ＷＯ　９７／０５２６７）を使用する）。
【００９１】
（実施例）
本発明は、以下の実施例に対する言及によってより良好に理解される。以下の実施例は、例示の目的のためであって、本発明の限定を意図しない。
【００９２】
（実施例１：個々の潜在性ＥＢＶ産物に対するＣＤ４＋反応陽性の同定）
ＥＢＮＡ−１について、本発明者らは、この抗原を組換えタンパク質として、外因的に（Ｚｈａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２６：６３１〜７，１９９８；ＦｒａｐｐｉｅｒおよびＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：７８１９〜２６，１９９１）か、または組換えワクシニアウイルス構築物を介して内因的にのいずれかで送達した。本発明者は、Ｔ細胞活性化および増殖、ＩＦＮγ分泌、ならびにＣＴＬ活性によってモニターされるように、いずれかの経路によって提示されたＥＮＢＡ−１に対する強力なＣＤ４＋Ｔ細胞応答を発見した。この免疫応答は、ＥＢＶ感染およびＥＢＶ関連悪性疾患に抵抗するために利用され得る。
【００９３】
（材料および方法）
（細胞株）
ＥＢＶトランスフォームしたＢ細胞株であるＬＲＭ（ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＯＡ１＊０３、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１、ＨＬＡ−ＤＰ４）（Ｆｒｉｅｄｅら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１３１６：８５〜１０１，１９９６）およびＬＧ２（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＱＡ＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０１、ＨＬＡ−ＤＰＡ１＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１＊０２０１）（Ｇｏｒｇａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６：１６０８７〜９４，１９８７）を用いた。Ｂ−ＬＣＬを、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％ＦＣＳ＋５ｍＭグルタミン＋２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン中で培養した。ＬＣＬ−ＢＭ（ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３，ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｃｗ６、ＨＬＡ−Ｃｗ７、ＨＬＡ−ＤＲ４、ＨＬＡ−ＤＲｗ１４、ＨＬＡ−ＤＲｗ５２、ＨＬＡ−ＤＲｗ５３、ＨＬＡ−ＤＱｗ３）およびＬＣＬ−ＤＣ（ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ２４、ＨＬＡ−Ｂ３８、ＨＬＡ−Ｂ４６、ＨＬＡ−Ｃｗ１、ＨＬＡ−Ｃｗ７、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０９０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ４＊０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０５０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０３）を、ＲＰＭＩ−１６４０＋２０％ＦＣＳ＋５ｍＭグルタミン＋２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン＋１μｇ／ｍｌサイクロスポリンＡの中で、マーモセット細胞株Ｂ９５．８の上清を用いて、ＰＢＭＣの健常型ドナーを培養することによって生成した。ＢＳＣ４０サル腎臓細胞株をＤＭＥＭ＋５％ＦＣＳ＋５ｍＭグルタミン＋２０μｇ／ｍｌゲンタマイシン中で増殖させ、そして組換えＶＶストックを力価測定するためのプラークアッセイに用いた。
【００９４】
（樹状細胞（ＤＣ）およびＰＢＭＣ調製物）
Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｅｎｔｅｒの白血球濃縮物（バフィーコート）、およびＰＢＭＣの供給源として役立った実験室のドナーからの白血球（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上の密度勾配遠心分離によって単離された）．ＣＤ２＋ＰＢＭＣを、ノイラミニダーゼ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）処理ヒツジ赤血球（Ｃｏｌｏｒａｄｏ　Ｓｅｒｕｍ　Ｃｏｍｐａｎｙ）を用いてロゼット化すること、次いで１．６６６％塩化アンモニウムを用いる赤血球溶解によって分離した。指示された場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｌｅｕ２ａ抗体もしくはＯＫＴ８抗体（ＣＤ８について）、またはＨＰ２／６抗体（ＣＤ４について）を用いて枯渇させ、続いて、ヒツジαマウスＩｇＧ　Ｄｙｎａｂｅａｄおよび磁性粒子濃縮器ＭＣＰ−１（Ｄｙｎａｌ，Ｎｏｒｗａｙ）を用いてインキュベーションした。ＤＣを記載（Ｂｅｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９６１２１〜３５，１９９６；Ｒｏｍａｎｉら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９６：１３７〜５１，１９９６）のように、ＣＤ２−ＰＢＭＣから生成した。１０６ＣＤ２＋ＰＢＭＣ／ｍｌを、ＲＰＭＩ−１６４０＋１％単一ドナー血漿＋１０００Ｕ／ｍｌ　ｒｈＩＬ−４＋１０００Ｕ／ｍｌ　ｒｈＧＭ−ＣＳＦ＋５ｍＭグルタミン＋２０μｇ／ｍｌゲンタマイシンとともに６ウェルプレート中にプレーティングした。１００μｌを、２００μｌ／ｍｌ　ＲＰＭＩ−１６４０＋１％単一ドナー血漿＋５ｍＭグルタミン＋２０μｇ／ｍｌゲンタマイシンで置換し、そして１０００Ｕ／ｍｌ　ｒｈＩＬ−４、および１０００Ｕ／ｍｌ　ｒｈＧＭ−ＣＳＦを、２日目、４日目および６日目に添加した。７日目、浮遊している未熟なＤＣを、新しいプレートに３×１０５細胞／ｍｌに移し、そして培地の半分を単球馴化培地で置換し、２日間、ＤＣを成熟した。
【００９５】
（ワクシニアウイルスストック生成およびＤＣの感染）
組換えワクシニアウイルスを、ウサギ腎臓ＲＫ１３細胞中で増殖した。成熟ＤＣを３７℃で１時間２のＭＯＩで感染させ、そして３回洗浄した。感染の効率を、記載のように、ＶＶ１−６Ｂ６抗体を用いた２９ｋＤのワクシニア早期タンパク質の細胞内染色を用いたＦＡＣＳによって、６〜１２時間後にチエックした。
【００９６】
（ＣＤ４＋Ｔ細胞株およびクローンの生成）
ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣを、３０：１（Ｔ：ＤＣ）の比で成熟ＤＣを用いて刺激した。ＣＭ１７１１９８細胞株について、健常ドナーＣＭのＴ細胞（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１、ＨＬＡ−Ａ＊６８０１、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０２、ＨＬＡ−Ｂ＊４４０２、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２、ＨＬＡ−Ｃ＊０５０１、ＨＬＡ−Ｃ＊０７０２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１５０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１、ＨＬＡ−ＤＲＢ５＊０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ４＊０１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０６０２、ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１）を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染自己成熟ＤＣを用いて４週間刺激し、これにはフィーダーとして自己ＣＤ２＋ＰＢＭＣを含む毎週の再刺激を伴い、そして次いで、ＥＢＶでトランスフォームしたＨＬＡ−ＤＲがマッチした細胞株ＬＲＭまたはｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣを用いた変更を行う。ＣＭ１１０１９９細胞株を、１０μＭの組換えＥＢＮＡ−１タンパク質（成熟刺激薬と一緒に７日目に添加した）とともにインキュベートしたＤＣを用いることによって、ドナーＣＭのＴ細胞から生成した。Ｅ．ｃｏｌｉおよびバキュロウイルス／昆虫細胞の発現系から精製したｒＥＢＮＡ−１を代わりに用いた（Ｚｈａｎｇら（前出）１９９８；ＦｒａｐｐｉｅｒおよびＯ’Ｄｏｎｎｅｌｌ（前出））。指示された場合、Ｅ．ｃｏｌｉ誘導ＤＮＡ−Ｃをコントロールタンパク質（Ｅ．ｃｏｌｉコントロール）として用いた。ＤＭＥＭ＋５％ＨＳ中の刺激の１４日後、５０Ｕ／ｍｌ　ｒＩＬ−２を補充した。自己Ｂ−ＬＣＬでの刺激のために、健常ドナーＪＴのＣＤ２＋ＰＢＭＣを、ＤＭＥＭ＋５％ヒト血清＋１０Ｕ／ｍｌ　ＩＬ−２（Ｌｙｍｐｈｏｃｕｌｔ，Ｄｒｅｉｅｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で、１：１０のＢ細胞対Ｔ細胞の比で、照射した自己ＬＣＬ−ＪＴを用いて、１４日間刺激した。指示された場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させた。
【００９７】
ＥＢＮＡ−１特異的ＣＤ４＋ＣＴＬを、９６ウェルプレート中で、白血球濃縮物由来の１０４の自己Ｂ−ＬＣＬを用いて１０５のＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣを、１４日間、刺激すること（７日目での再刺激を伴う）によって、限界希釈条件下でクローニングした。ＩＬ−２を、再刺激の間、最終濃度１０Ｕ／ｍｌ（Ｌｙｍｐｈｏｃｕｌｔ）に、培養に添加した。微量培養物をｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡまたはｖｖＴＫ−に感染した自己ＤＣ、自己Ｂ−ＬＣＬまたはＬＣＬ７２１．２２１に対して、スプリットウェル５１Ｃｒ放出アッセイにおいて試験した。この最初のＴ細胞数で、ウェルの３０％未満がＣＴＬを発生し、このことは、レスポンダーのクローン性について９０％を超える可能性を示した（Ｔａｓｗｅｌｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５１：１３７２〜８５，１９８０）。
【００９８】
（刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞集団およびＰＢＭＣのＦＡＣＳ分析）
ＲＰＭＩ−１６４０＋５％ＨＳ中で、３７℃１時間、２のＭＯＩで組換えＶＶを用いて、または０．５のＭＯＩでインフルエンザウイルス（ＰＲ８，ＰｕｅｒｔｏＲｉｃｏ／８／３４，Ｓｐａｆａｓ Ｉｎｃ．，Ｓｔｏｒｒｓ，ＣＴ）を用いて、成熟ＤＣを感染した。ＤＣを２回洗浄し、そして３×１０３を、７日間９６ウェルプレート中の１０５のＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣに添加した。７日目に、培養物を１ウェルあたり、１０５のＰＢＭＣおよび３×１０３ＤＣを用いて再刺激し、そしてさらに７日間インキュベートした。１ウェルあたり、１０５の照射した（３０００ｒａｄ）ＰＢＭＣおよび３×１０３のＤＣを用いて、培養物を再刺激し、さらに７日間インキュベートした。１４日後、１μｌのＳｉｍｕｌｔｅｓｔ　ＣＤ４−ＦＩＴＣ／ＣＤ８−ＰＥ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）含有１００μｌ　ＰＢＳ＋１％ＦＣＳ＋０．００５％アジ化ナトリウムを用いて氷上で３０分間、培養物を染色した。３回の洗浄後、培養物をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。ＣＤ５６抗体染色（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）には、二次抗体としてＰＥ−ヤギαマウス−ＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いた。ＰＢＭＣを、一次抗体としてＨＬＡ−ＤＲ４抗体（Ａｃｃｕｒａｔｅ）、および二次抗体としてＦＩＴＣ−ヤギα−マウスＩｇＧ抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を用いて、ＨＬＡ−ＤＲ４について分類した。
【００９９】
（ＩＦＮγ分泌細胞についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
１０μｇ／ｍｌのαＩＦＮγ抗体１−Ｄ１Ｋ（ＭＡＢＴＥＣＨ）を含有する５０μｌ／ウェルの５０ｍＭ　Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ９．５）を用いて、ＭＡＨＡ　Ｓ４５プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、４℃で一晩、コートした。プレートをＰＢＳで４回洗浄して、ＤＭＥＭ＋５％　ＨＳを用いて３７℃で１時間ブロックした。その後、１０５のキラーＴ細胞（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ　Ｔ　ｃｅｌｌ）および３×１０３〜１０４の刺激因子ＤＣを１ウェルあたりに添加して、３７℃で１〜２日間インキュベートした。ついで、このプレートをＰＢＳ＋０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０を用いて４回洗浄し、そして１μｇ／ｍｌのビオチン化αＩＦＮγ抗体７−Ｂ６−１（ＭＡＢＴＥＣＨ）を含有するＰＢＳを１ウェルあたり５０μｌを用いて、３７℃で２時間インキュベートした。その後、このプレートを再度、ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０で４回洗浄し、そして室温で１時間事前準備したアビジン−ペルオキシダーゼ複合体ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、室温で２０分インキュベートした。ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０でのさらに４回の洗浄後、５０μｌ／ウェルの安定なＤＡＢ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を室温で５分間添加した。プレートを水で３回洗浄し、そして風乾した。１０５細胞あたりのＳＦＣを、実体顕微鏡を用いてカウントした（トリプレットの平均カウント）。指示された場合、αＨＬＡ−ＤＲ抗体Ｌ２４３（Ｌａｍｐｓｏｎ，およびＬｅｖｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：２９３〜９，１９８０）またはαＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃ抗体Ｂ−Ｈ９（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を５μｇ／ｍｌに添加した。
【０１００】
（増殖アッセイ）
ＤＭＥＭ＋５％ＨＳ中で５日間、３×１０３〜１０４の刺激因子ＤＣとともにキラーＴ細胞（１０５）をインキュベートした。１ウェルあたり、１μＣｉの３Ｈ−チミジンを一晩添加し、そして自動デバイス（Ｓｋａｔｒｏｎ）によって回収し、そしてＢｅｔａｐｌａｔｅ　１２０５（ＬＫＢ　Ｗａｌｌａｃ）中でカウントした。カウントは、三連の平均値を示す。
【０１０１】
（５１Ｃｒ放出アッセイ）
５０μＣｉ　Ｎａ２５１ＣｒＯ４を用いて３７℃で４５分間、標的を標識した。標識した標的をＣＴＬを含有するＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳ＋２ｍＭグルタミンを用いて４時間インキュベートした。上清をＳｋａｔｒｏｎ収集システムを用いて収集し、そして放射線活性をγカウンター（１４７０　Ｗｉｚａｒｄ，Ｗａｌｌａｃ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）中で測定した。比溶解性のパーセントは、以下である：（［実験ウェルのｃｐｍ−自発的放出のｃｐｍ］／［最大放出のｃｐｍ−自発的放出のｃｐｍ］）×１００％。培地を用いて標識した標的をインキュベートすることによって自発的放出を決定し、そして１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００溶液中で標的をインキュベートすることにより最大放出を決定した。
【０１０２】
（結果）
ＣＤ４＋Ｔ細胞により認識される潜伏的ＥＢＶ抗原を同定するために、ＣＤ８−ＣＤ２＋末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ＥＢＶ潜伏抗原（ＥＢＮＡ−１、３Ａ、３Ｂ、３ＣおよびＬＭＰ１、２）を発現する組換えワクシニアウイルス構築物で感染した自己ＤＣを用いて２週間刺激した。ＤＣを用いた２つのシュミレーションの際に、増殖したＣＤ４＋Ｔ細胞（「芽細胞（ｂｌａｓｔ）」）の存在によって、応答を評価した。詳細には、ＥＢＶ組換え体のパネルのうち１つを用いて、培養の最初の週にＣＤ＋Ｔ細胞を刺激し、次いで、この培養物を２つに分け、第２週に、元来の組換えワクシニアウイルスを用いて、またはコントロールとしてｖｖＴＫ−を用いて再刺激した。本発明者らは、初代ＥＢＶ組換え体に対する特異的な，幼若化反応を見出した。７つ全てのドナーが、ｖｖＥＢＮＡ−１に対する強力な応答を示した（表１；図１Ａ、Ｂ）。陰性コントロール（ｖｖＴＫ−）に対する応答は、表１から除外された１例のドナー以外は、全てにおいて弱かった（図１Ｅ）。全てのドナーは、インフルエンザ感染ＤＣ（陽性コントロールとして用いた）に応答した（図１Ｆ）。７つのドナーのうち、他のｖｖＥＢＶ構築物に反応したのはより少ない比率であった（すなわち、ＥＢＮＡ３Ｂ（４／７）、ＥＢＮＡ３Ａ（１／７）、およびＬＭＰ１（３／７）（表１Ａ））。組換えワクシニアウイルスが成熟ＤＣのかなりの比率に感染することを確実にするため、２９ｋＤのワクシニアの初期タンパク質の細胞内発現を、フローサイトメトリーによって測定した。再現可能に、４０〜６０％のＤＣを、組換えワクシニアウイルスで感染させた。ＥＢＮＡ−１のＣＤ４＋認識の信頼性は、ＩＦＮγ分泌についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて確認し得る。ここで、ＥＢＮＡ−１は、優先的に認識されたＥＢＶ潜伏遺伝子であった（表１Ｂ）。本発明者らは、インビトロにおけるＥＢＮＡ−１に対するこれらのＣＤ４＋Ｔ細胞反応が、インビボにおける血液ドナーのＥＢＶ感染による最初のプライミングを反映しているとみなす。なぜなら、本発明者らは、ＥＢＮＡ−１を用いて臍帯血標品由来の新生児のＴ細胞を刺激した場合、２週内には幼若化反応を見出さなかったからである。本発明者らは、７つの発現されたＨＬＡ−ＤＲ４のうちの２つのみから、本発明者らのドナーがＨＬＡクラスＩＩ多様性を示したことを証明した。
【０１０３】
【表１】
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次に、本発明者らは、必須のＭＨＣ拘束エレメントおよび細胞株（ＨＬＡ−ＤＲ４＋ドナーに最初に由来する）ＣＭを生成することによる経路のプロセシングを追及した。次いで、本発明者らは、ＥＢＮＡ−１を発現する組換えワクシニアウイルスで感染した、または可溶性ＥＢＮＡ−１タンパク質を適用した、ＤＣとのＴ細胞株の反応性を試験した。内因性にプロセシングしたＥＢＮＡ−１を用いてＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣを刺激することによって、１つの株、ＣＭ１７１１９８を、確立した。従って、ＡＰＣは、ＤＲ４−マッチしたＢ−ＬＣＬ　ＬＲＭ、またはｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡで感染した自己ＤＣのいずれかであった。後者の構築物は、ＭＨＣＩ提示をブロックし、そしてまたＥＢＮＡ−１の発現を減じる、ＧＡ反復を欠失していた。他の株、ＣＭ１１０１９９を、外因的に供給したＥＢＮＡ−１を用いて刺激した。従ってそれらの最終成熟の間、ＤＣを、Ｅ．ｃｏｌｉ、またはバキュロウイルス−昆虫細胞系のいずれかにおいて発現した組換えＥＢＮＡ−１タンパク質に暴露した。１ヶ月の培養の後、両方の株は、優先的にＣＤ４＋Ｔ細胞を含んだ（ＣＭ１７１１９８においては９０％（図２Ａ）、およびＣＭ１１０１９９においては７６％）。両方の株は以下のアッセイにおいて同様に実施した。従ってＣＭ１７１１９８のデータのみを示す。
【０１０４】
ＣＤ４＋Ｔ細胞株は、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡで感染されるか、または組換えＥＢＮＡ−１を外因的に供給されたＤＣを認識した（図２Ｃ、３Ａ）。反応性は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＩＦＮγ分泌として測定できる（図２）か、または増殖アッセイにおいて測定できる（図３）。Ｔ細胞応答は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体（Ｌ２４３）の添加によってブロックされたが、抗ＨＬＡクラスＩ抗体（Ｂ−Ｈ９）によってはブロックされなかった（図２Ｄ）。予想どおり、ＧＡ反復ドメインの存在は、このＨＬＡ−ＤＲ拘束提示に対して影響を有さなかった。なぜなら、全長ｖｖＥＢＮＡ−１で感染したＤＣはまた、ＥＢＮＡ−１発現がｖｖＴ７との同時感染によって増強され、この構築物におけるＥＢＮＡ−１についてのＴ７プロモーターを駆動する限り、ＣＭ１７１１９８によって認識される（図２Ｄ）からである。全長ＥＢＮＡ−１発現ワクシニアウイルスで感染したＤＣにおけるＥＢＮＡ−１のｇｌｙ／ａｌａマイナス形態が存在し得るが、本発明者らはまた、Ｂ−ＬＣＬの特異的Ｔ細胞認識を観察する（図３）。ここで、全長のＥＢＮＡ−１のみが検出される（Ｂｌａｋｅら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１９９７，７：７９１〜８０２を参照のこと）。これは、ｇｌｙ／ａｌａ反復が、ＭＨＣクラスＩＩプロセシングおよび提示に影響を有さないことをさらに示唆する。
【０１０５】
さらに、ＥＢＶ陰性ラモス（Ｒａｍｏｓ）バーキットリンパ球細胞株は、ワクシニアＥＢＮＡ−１で感染したＤＣに匹敵するレベルでＥＢＮＡ−１特異的Ｔ細胞を刺激した。しかしラモス細胞は、同種異系のＬＣＬ由来のＥＢＮＡ−１、または高用量のＥＢＮＡ−１タンパク質由来のＥＮＢＡ−１を捕獲できなかった。このデータは、ＥＢＮＡ−１が、Ｂ細胞株中で内因的にプロセシングされるという知見をさらに支持する。
【０１０６】
ＥＢＮＡ−１でチャージしたＤＣに加えて、ＣＭ１７１１９８細胞株は、さらなる抗原の追加なしに、ＥＢＶでトランスフォームしたＢ−ＬＣＬを認識した。しかし、ＬＣＬ標的は、ＤＲ４対立遺伝子と適合されなければならない。従って、ＤＲ４＋ＬＣＬ（ＬＲＭおよびＬＣＬ−ＢＭ）は、増殖を誘導したが、ＤＲ４―細胞（ＬＧ２およびＬＣＬ−ＤＣ）は、誘導しなかった（図３Ｂ）。従って、ＥＢＮＡ−１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＥＢＶでトランスフォームされたＢ細胞を認識するようである。
【０１０７】
ＥＢＮＡ−１がまたＣＤ４＋ＣＴＬ応答のための抗原であるか否かを決定するため、本発明者らは、別の（ただし、ＨＬＡ−ＤＲ４−ではない）健常ドナーＪＴ由来のＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣを、照射した自己Ｂ−ＬＣＬ（全ての公知の潜伏性ＥＢＶ抗原を発現する（ＫｉｅｆｆおよびＬｉｅｂｏｗｉｔｚ（前出））を用いて、１４日間刺激した（これには、７日後に再刺激１回を伴う）。ＣＤ８−ＣＤ２＋Ｔ細胞の刺激に平行して、本発明者らは、バルクＣＤ２＋Ｔ細胞およびＣＤ４−ＣＤ２＋Ｔ細胞におけるＢ−ＬＣＬに対する応答を追跡した。５１Ｃｒ放出アッセイをまず実施し、自己Ｂ−ＬＣＬに対する溶解活性を実証し、次いで異なる組換えＥＢＶ構築物で感染したＤＣ標的を用いて、ＥＢＶ特異性を評価した。刺激されたＴ細胞集団の内容を、ＦＡＣＳによって決定した。ＣＤ８−枯渇レスポンダーを、ＣＤ４＋細胞について富化し（図４Ｂ）、ＣＤ４−枯渇レスポンダーを、ＣＤ８＋細胞について富化し（図４Ｃ）、そしてバルクＴ細胞は、１：２のＣＤ４／ＣＤ８比を有した（図４Ａ〜Ｃ）。全てが、約２５％のＣＤ５６＋ＮＫ細胞を含んだ。刺激された集団の全て（すなわち、バルクＴ細胞（図４Ｄ）およびＣＤ４（図４Ｅ）またはＣＤ８（図４Ｆ））が、細胞を富化し、自己Ｂ−ＬＣＬを殺傷し、そしてＴ２細胞株の認識の乏しさを示した。後者は、おそらく、ＮＫ細胞が混入することが原因であり得る。しかし、著しいことに、異なるＴ細胞レスポンダーのＥＢＶ標的は、全く異なった（図４、Ｇ〜Ｉ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、好ましくは、ＥＢＮＡ−１、ＥＢＮＡ３ＣおよびＬＭＰ１（図４Ｈ）を認識したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＬＭＰ２ａを認識した（図４Ｉ）。バルクＴ細胞は、ＥＢＮＡ３Ｃ（このドナーにおけるＣＤ４＋細胞の優勢抗原）、およびＬＭＰ２ａ（ＣＤ８＋Ｔ細胞の優勢抗原）を認識した（図４Ｇ）。
【０１０８】
刺激された細胞のＣＴＬ機能をさらに評価した。期待どおり、自己Ｂ−ＬＣＬの殺傷は、ＣＤ４富化集団を試験した場合のみ、Ｌ２４３抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体によって完全にブロックされた（図５Ｂ）。ＣＤ８富化培養物によるＬＣＬ−ＪＴ殺傷は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体によってブロックされず（図５Ｃ）、そしてバルクＴ細胞による殺傷は部分的阻害のみであった（図５Ａ）。ＣＤ４富化Ｔ細胞はまたＥＢＮＡ−１適用したＤＣを溶解した（図５Ｅ）が、ＣＤ８富化培養物は、溶解せず（図５Ｆ）、そしてバルクＴ細胞はわずかに溶解した（図５Ｄ）。従って、ＣＤ４　Ｔ細胞は、自己Ｂ−ＬＣＬを溶解し得、そしてＥＢＶコード標的のうち１つがＥＢＮＡ−１潜伏遺伝子である。
【０１０９】
個々のＣＤ４＋Ｔ細胞がＥＢＮＡ−１および内因性にＥＢＮＡ−１を発現するＢ−ＬＣＬでチャージしたＤＣを溶解したことを証明するため、本発明者らは、自己Ｂ−ＬＣＬで刺激した低温保存Ｔ細胞からの限界稀釈によってクローニングしたＣＤ４＋ＣＴＬを研究した。ＤＣ、Ｔ細胞および自己Ｂ−ＬＣＬを白血球濃縮物から誘導した。全てのＥＢＮＡ−１特異的ＣＤ４＋ＣＴＬは、自己Ｂ−ＬＣＬを殺傷し得る（図６Ａ、６Ｂ）。ｖｖＴＫ−コントロールベクターまたはＬＣＬ７２１．２２１（ＨＬＡクラスＩ　ＮＫ標的）で感染したＤＣの認識は、これらのクローンには欠しかった（図６Ａ、６Ｂ）。従って、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、自己Ｂ−ＬＣＬを溶解し得、そして標的の１つはＥＢＮＡ−１である。
【０１１０】
これらの知見は、ＥＢＶが潜伏的に感染したＢ細胞に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の反応性を実証する。核抗原ＥＢＮＡ−１は、健常成人由来のＣＤ４＋Ｔ細胞によって繰り返し認識される。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、増殖、サイトカイン分泌、および細胞障害性の活性を有し得る。本発明者らが試験した他のＥＢＶ潜伏抗原（ＥＢＮＡ３Ａ、３Ｂ、３Ｃ；ＬＭＰ１、２；表１）はＣＤ＋Ｔ細胞によって認識され得るが、ＥＢＮＡ−１よりも確実性が劣った。一つのＥＢＮＡ−１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンは、以前に記載されている（Ｋｈａｎｎａら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：１５３７〜４３，１９９７）。このクローンのみが、おそらく低親和性によって、内因性にプロセシングされたＥＢＮＡ−１を用いて標的を殺傷した。本明細書において記載されたＣＤ４＋Ｔ細胞は、トランスフォームされたＢ−ＬＣＬのＨＬＡ−ＤＲ産物に存在するような生理学的な濃度でさえ、バルク培養物中で容易に同定され、そして外因性経路および内因性経路によってプロセシングされたＥＢＮＡ−１を認識する。しかし、より一般的な場合、ＭＨＣクラスＩＩ上への内因性核抗原の首尾良いプロセシングは、通常ではない。ペプチドがＢ細胞のＭＨＣクラスＩＩ分子から溶出した場合、同定されたペプチドの約２０％のみが外因性起源である（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、ＭＨＣ　ｌｉｇａｎｄｓ　ａｎｄ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｍｏｔｉｆｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ：Ｌａｎｄｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｕｓｔｅｉｎ，１９９７）。内因性に誘導されたペプチドはまた、Ｈ２−Ａｄ上に核抗原様ＣＢＦ３５９〜７４（Ｒｕｄｅｎｓｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３５３：６２２〜７，１９９１）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０５上にヒストンＨ３１１０〜１２７（Ｆｒｉｅｄｅら、前出、１９９６）、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０８０１上にｃ−ｍｙｃ３７１〜３８５（Ｃｈｉｃｚら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２７〜４７，１９９３）、およびＨＬＡ−ＤＲＢ１＊１４０１上にヒストンＨ４３１〜４５（Ｈａｒｒｉｓら、Ｂｌｏｏｄ，８７：５１０４〜１２，１９９６）を含む。
【０１１１】
ＥＢＮＡ−１特異的ＣＤ＋Ｔ細胞は、ＥＢＶトランスフォーム細胞に対して（例えば、その溶解性機能によって、またはＬＭＰ−１およびＬＭＰ−２のような他のリンパ腫関連ＥＢＶ産物に対するＣＤ８＋ＣＴＬ応答を維持することによって）直接の抵抗性を提供する。γヘルペスウイルスに対するＣＤ４＋Ｔ細胞防御についての環境的な証拠が文献としてかなりの量存在する。
【０１１２】
ａ）ワタの先端部のタマリンＳａｎｇｕｉｎｉｓ　ｏｅｄｉｐｕｓにおけるＥＢＶに対するＣＴＬ応答（Ｃｌｅａｒｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：７２２０４，１９８５）は、高い程度のＭＨＣクラスＩＩ拘束に対する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１０３：１９９〜２０５，１９９６）。ＭＨＣクラスＩ拘束された、ＥＢＶ特異的ＣＴＬは、今日まで、この新世界ザルにおいて見出されておらず、そしてこの種は古典的なＭＨＣクラスを欠く（しかし、これはＨＬＡ−ＧおよびＨＬＡ−Ｆのような非古典的なクラスＩ遺伝子の相同体を発現する（Ｗａｔｋｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３４６：６０〜３，１９９０））。
【０１１３】
ｂ）ＭＨＶ−６８による、マウスでのγ−ヘルペスウイルス感染は、ＩＦＮγを分泌するＣＤ４＋Ｔ細胞によって制御され得る（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６：５１３５〜５１４０，１９９９）。
【０１１４】
ｃ）ＣＤ４＋Ｔ細胞によるバーキットリンパ腫細胞の増殖の制御は、培養物中で記載されており（Ｓｃｈａｔｔｎｅｒら、Ｂｌｏｏｄ，８８：１３７５〜８２）、そしてこのリンパ腫は、単一のＥＢＶ遺伝子（ＥＢＮＡ−１）だけを発現する。
【０１１５】
ｄ）ＨＩＶ−１感染の初期において、ＣＤ４＋Ｔ細胞カウントが依然として高いが、ＣＤ４＋Ｔ細胞機能が損なわれ始めた場合、患者は、単球増加ではなくバーキットリンパ腫を発生し得る（Ｌｅｖｉｎｅ，Ｂｌｏｏｄ，８０：８〜２０，１９９２）。
【０１１６】
ｅ）ＣＤ４＋反応の重要性は、ＳＡＰ（Ｔ細胞同時刺激分子ＳＬＡＭもしくはＣＤｗ１５０のインヒビター）の変異体または欠失を有する、Ｘ連鎖リンパ球増殖疾患患者においてみられるＥＢＶ誘導の感染性単球増加の原因であると考えられる（Ｓａｙｏｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３９５：４６２〜９，１９９８）。
【０１１７】
ｆ）ＥＢＮＡ−１に対する抗体応答は、ほとんどのドナーにおいて検出可能である（Ｒｏｗｅら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６９：１２１７〜２８，１９８８）。このことは、本発明者が観察した、ＣＤ４＋ヘルパー細胞の存在、およびＥＢＮＡ−１がＣＤ４＋応答について単一の確実なＥＢＶ抗原であるということと整合性がある。
【０１１８】
これらの観察は、本明細書に記載される、ＥＢＮＡ−１に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答についての直接の証拠とともに、後期Ｔ細胞が、ほとんどの健常なＥＢＶ感染個体において、バーキット、ホジキン、および他のＥＢＶ関連悪性腫瘍に対する抵抗性を提供し得ることを示唆する。本発明者らのデータはまた、ＥＢＮＡ−１がこのような悪性腫瘍を予防および処置するための抗原として用いられ得ることを示唆する。
【０１１９】
例えば、ＥＢＮＡ−１を適用した樹状細胞を用いた上咽頭癌の免疫療法は、寛解を生じるはずである。免疫療法は、上咽頭癌を効果的に処置するのに重要であると考えられる（Ｔｓｕｋｕｄａら、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２０：１１５，１９９３）。
【０１２０】
上咽頭癌を処置する能力は、この疾患を管理するのに重要な進歩を示す。今までの処置としては、放射線療法、外科切除、および化学療法が挙げられる（ＳａｎｇｕｒｉｎｅｔｉおよびＣｏｒｖｏ，Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．，６：３７７，１９９９）。しかし、この形態の癌は、処置が困難であり、そして処置レジメン（特に放射線療法）は、脳に対して付随する重大な損傷（例えば、放射線誘導両側性視覚神経障害）を引き起こす（Ｗｉｊｅｒｓら、Ｓｔｏｈｌｅｎｔｈｅｒ．Ｏｎｃｏｌ．，１７５：２１，１９９９）。
【０１２１】
（実施例２：ＥＢＮＡ−１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、機能において主にＴＨ１である）
実施例１は、健常ドナー由来の血液細胞における、構成的なＥＢＮＡ−１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を開示する。これらのＣＤ４＋Ｔ細胞（そのいくつかは、ＩＦＮγを分泌する）を検出するため、２週刺激培養を用いた。ここでは、ＤＣが抗原提示細胞であり、そして精製されたＣＤ４＋Ｔ細胞がレスポンダーであった。本実施例は、ＥＢＮＡ−１特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴＨ１表現型に傾斜していること、およびこの応答がインビボで検出され得ることを確立する。
【０１２２】
（材料および方法）
（樹状細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の調製）
ＤＣの生成については、上記実施例１を参照のこと。いくつかの実験では、ｒＥＢＮＡ−１タンパク質またはｒＰＣＮＡコントロールタンパク質を、成熟刺激薬とともに、示した濃度でＤＣ細胞培養物に添加した。５１Ｃｒ放出アッセイにおける標的としての使用のために、標的としての使用の前に、ＤＣを１μｇ／ｍｌのｒＥＢＮＡ−１タンパク質または１μｇ／ｍｌのｒＰＣＮＡコントロールのいずれかを用いて適用した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の陽性選択のために、ＣＤ１４−細胞を、磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）に結合体化したモノクローナル抗ヒトＣＤ４抗体で処理した。Ｔ細胞およびＤＣは、新鮮に、またはＦＣＳおよび５％ＤＭＳＯ中での低温保存後に用いた。
【０１２３】
（組換えワクシニアウイルスワクチンでのＤＣ感染）
ウイルスは以前に記載されている（Ｓｕｂｋｌｅｗｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９，２９：３９９５〜４００１）。成熟ＤＣを、ネガティブコントロールとしてチミジンキナーゼ（ｖｖＴＫ−）発現組換えワクシニアベクター、またはｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ発現組換えワクシニアベクターを用いて、２のＭＯＩで３７℃で１時間感染させた、そして５％ヒト血清を有する培地中で３回洗浄した。感染を、以前に記載のように（ｓｕｂｋｌｅｗｅら、１９９９、前出）、ワクシニア早期タンパク質に対するＶＶ１−６Ｂ６抗体を用いて、細胞内染色によって、続いてＦＡＣＳ分析によって、６〜１２時間で検証した。ＤＣの感染は、均一に４０〜６０％であった。
【０１２４】
（組換えＥＢＮＡ−１およびＰＣＮＡコントロールタンパク質の発現および精製）
ＥＢＮＡ−１４５８〜６４１を発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に挿入した。このベクターをＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞中にトランスフォーメーションした。増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）がＥ．ｃｏｌｉ　ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｍｉｎｇ　Ｇｕｏ（コーネル医科大学、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）より寄贈）において発現した。細菌培養物を、３７℃で０．８のＯＤ５９５まで増殖した。次いで、ＥＢＮＡ−１またはＰＣＮＡ発現を１ｍＭ　ＩＰＴＧで３時間誘導した（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）。遠心分離による回収後、細胞を５０ｍＭ　Ｎａ２ＰＯ４、３００ｍＭ　ＮａＣｌおよび１０ｍＭイミダゾールに、５ｍｌ／ｇの細胞ペレットの容量まで、再懸濁した。リゾチームを氷上に３０分間で１ｍｇ／ｍｌまで添加し、この懸濁液を超音波処理して完全に溶解した。４℃で３０分間２０，０００×ｇの遠心分離後、透明な上清を０．４５μｍフィルターを通して濾過し、そして溶解液１０ｍｌあたり、１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉｏ、ＣＡ）を添加した。この懸濁液を４℃で１時間回転させ、そしてカラム（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）に充填した。このマトリックスを、流出液のＯＤ２８０が０．０１未満になるまで、５０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ　ＮａＣｌおよび２０ｍＭイミダゾールで洗浄した。次いで組換えタンパク質を５０ｍＭ　Ｎａ２ＰＯ４、３００ｍＭ　ＮａＣｌおよび２５０ｍＭイミダゾールで溶出した。タンパク質含有画分をプールし、そしてＰＢＳに対して４℃で一晩透析した。このタンパク質濃度を、ＯＤ２８０で決定し、純度をＳＤＳ　ＰＡＧＥで決定し、そしてＥＢＮＡ−１特異的抗体（ＭＡＢ８１７３）（ＣＨＥＭＩＣＯＮ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）または６ｘＨ特異的抗体（ＡＤ１．１．１０）（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍ）を用いたウエスタンブロットによって同一性を決定した。
【０１２５】
（ＩＦＮγおよびＩＬ４を分泌する細胞のＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを上記のように実施した。ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ応答は、それがネガティブコントロール（ｖｖＴＫ−）よりも１０スポット多く、かつネガティブコントロールのスポットの少なくとも２倍である場合に、有意であるとみなされた。
【０１２６】
（ＥＢＮＡ−１特異的ＥＬＩＳＰＯＴを産生する、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖）
陽性選択されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、５％ＰＨＳを補充した培地中で、ＤＣ：Ｔ細胞比１：３０で、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣまたはｖｖＴＫ−感染ＤＣとともに、７日間増殖した。いくつかの実験では、５μｇ／ｍｌのＷ６／３２抗ＭＨＣクラスＩまたはＬ２４３抗ＭＨＣクラスＩＩのブロッキング抗体を、０日目、３日目、および７日目に添加した。７日目、増殖した細胞を、１μｇ／ｍｌのｒＥＢＮＡ−１またはコントロールタンパク質であるｒＰＣＮＡを適用したＤＣを用いて再刺激し、そしてＩＦＮγまたはＩＬ−４　ＥＬＩＳＰＯＴについてアッセイした。他の実験では、ワクシニア増殖Ｔ細胞を、７日目に、ｒＥＢＮＡ−１タンパク質またはＰＣＮＡコントロールタンパク質のいずれかの示された容量を適用したＤＣを用いて再刺激した。
【０１２７】
（新たに刺激されたＰＢＭＣにおけるサイトカイン分泌によるＥＢＮＡ−１特異的細胞株の生成）
７５×１０６個のＰＢＭＣを、５％ＰＨＳを補充した培地において、３０：１の比率で、自己ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣを用いて、７時間（ＩＦＮγ）または１８時間（ＩＬ−４）のいずれかにわたって刺激した。次いで、この細胞をＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして１０７細胞／８０μｌ培地の濃度で、１０％の胎仔ウシ血清（Ｒ１０）を含む冷ＲＰＭＩに再懸濁させた。次いで、抗ＩＦＮγまたは抗ＩＬ−４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）のいずれかに結合体化した一次抗ＣＤ４５抗体を、１０７細胞当たり抗体１０μｌの比率で加えた。次いで、この細胞を５分間氷上に置き、引き続いて、温めたＲ１０を、５×１０６細胞／ｍｌの濃度まで加え、そして連続回転下で、３７℃にて４５分間インキュベートした。このインキュベーションに続いて、細胞をＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、そして遠心分離した。このペレットを、ＭＡＣＳ緩衝液８０μｌ／１０７細胞で再懸濁し、そしてＰＥ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で標識されたＩＦＮγまたはＩＬ−４のいずれかに対する二次抗体１０μｌを、１０７細胞につき加えた。この細胞を、１０分間氷上に置き、次いで、ＭＡＣＳ緩衝液で洗浄し、そして遠心分離した。常磁性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で標識された最後の抗ＰＥ抗体を、１０μｌ／１０７細胞の比率で、４℃にて１５分間加えた。上記のように磁性分離を行い、そして回収される細胞の純度を高めるために繰り返した。次いで、この細胞を遠心分離し、そして９６ウェルプレートの１つのウェルにおいて、５％ＰＨＳおよび１０５個の照射ＣＤ１４−フィーダー細胞を含む培地で培養した。この細胞を、毎週再刺激し；成熟刺激の時（５〜７日目）に、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣを、２μｇ／ｍｌのｒＥＢＮＡ−１を適用したＤＣと交替させる。３週間後、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｌｙｍｐｈｏｃｕｌｔ、Ｂｉｏｔｅｓｔ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を加えた。このようにして、本発明者らは、ＥＢＮＡ−１適用ＤＣに反応してＩＦＮγおよびＩＬ−４を分泌する新鮮な血液中の細胞から株を調製し得た。
【０１２８】
（ＩＦＮγおよびＩＬ−４細胞株のＦＡＣＳ分析および機能的分析）
上記のような株で開始してから３週間後、１０４個の細胞を、１：５０のＳｉｍｕｌｔｅｓｔ（ＣＤ４およびＣＤ８、ＢＤ　ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）またはＰＥ標識ＣＤ５６抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）によって、氷上で１５分間染色した。３回の洗浄および４％のパラホルムアルデヒドによる固定後に、細胞をＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）で分析した。細胞傷害活性について、三連のこの細胞株を、指示されたエフェクター：標的の比率で、１０４個の標的に、５時間または２４時間加えた。この標的を、５０μＣｉ　Ｎａ２５１ＣｒＯ４を用いて、３７℃で１時間標識し、そしてＲ１０で３回洗浄した。細胞溶解を測定するために、５０μｌの培養上清を、９６ウェルサンプルプレートにおいて、シンチレーション流体（Ｗａｌｌａｃ、Ｆｉｎｌａｎｄ）１００μｌに加え、そしてγカウンター（１４５０　Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ　ｃｏｕｎｔｅｒ、Ｗａｌｌａｃ）において放射能を測定した。特異的溶解のパーセントを以下の式によって計算した：（［ｃｐｍ実験的ウェル−ｃｐｍ自発的放出］／［ｃｐｍ全放出−ｃｐｍ自発的放出］）×１００％。自発的放出は、標識された標的を培地のみでインキュベートすることによって決定し；全放出は、標的を１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００と共にインキュベートすることによって決定した。
【０１２９】
（ＩｇＧサブクラスについてのＥＬＩＳＡ）
９６ウェルのポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を、ＰＢＳ中のｒＥＥＢＮＡ−１タンパク質、マンプス皮膚抗原ＵＳＰ（Ｐａｓｔｅｕｒ　Ｍｅｒｉｅｕｘ　Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ、Ｓｗｉｆｔｗａｔｅｒ、ＰＡ）、破傷風トキソイド（Ｌｅｄｅｒｌｅ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）、ＰＢＳ中のカンジダアルビカンス細胞溶解産物（Ａｌｌｅｒｍｅｄ　Ｌａｂ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）１μｇ／ウェル、またはＰＢＳのみで４℃で一晩コーティングした。プレートを３％の脱脂粉乳５０μｌ／ウェルで３０分間ブロックし、引き続いて、３％のＢＳＡを含むＰＢＳ中で３０分間処理した。３％のＢＳＡにおいて１：１０または１：１００に希釈された試験血漿サンプルを、ＲＴにて２０分間加えた。プレートをＴＢＳＴ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ　２０）で３回洗浄した。ビオチンマウス抗ヒトＩｇＧ１抗体、ビオチンマウス抗ヒトＩｇＧ２抗体、ビオチンマウス抗ヒトＩｇＧ３抗体、ビオチンマウス抗ヒトＩｇＧ４抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を１：１０００でＲＴにて２０分間加えた。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、アビジン結合ビオチン化ＨＲＰをＲＴにて２０分間加え、引き続いて、ＴＭＢ基質（Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）を加え、ＲＴにてこの応答を１０分間展開し、そして１ＭのＨ２（ＳＯ４）を加え、この応答を停止させ、そしてこのプレートをマイクロプレートリーダー（Ｄｙｎｅｘ、Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）で読み取った。
【０１３０】
（結果）
（培養されたＰＢＭＣにおけるＥＢＮＡ−１に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、主にＩＦＮγＴＨ１細胞に関係する）
実施例１において、本発明者らは、組換えワクシニアＥＢＮＡ−１ウイルス（ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ）で感染させたＤＣによる２つの週の長さの刺激を用いて、ＥＢＮＡ−１特異的なＩＦＮγ分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞を同定した。本明細書中で、本発明者らは、この応答が１日間および１週間の培養で検出され得るか評価し、そして本発明者らは、ＩＦＮγ分泌細胞およびＩＬ−４分泌細胞の両方を数えあげた。コントロールワクシニアウイルス（ｖｖＴＫ−）で感染させたＤＣで刺激した培養において、両方の時点で、ＥＢＮＡ−１依存性Ｔ細胞が全く検出され得なかった。ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡを発現するＤＣで、本発明者らは、培養１日後に、３／９の正常ドナーにおいてＴＨ１細胞を見出したが、どのドナーにおいてもＴＨ２細胞を見出さなかった（図７Ａ、Ｂ）。培養１週間で、８／９のドナーが、ＩＦＮγ細胞の増大を示したが、１／９のみがＥＢＮＡ−１依存性ＩＬ−４分泌を有した（図７Ａ、Ｂ）。１つのＩＬ−４分泌において、ＩＦＮγ　ＥＬＩＳＰＯＴＳの数はＩＬ−４　ＥＬＩＳＰＯＴＳより３倍多かった。従って、ほとんどのドナーにおいて、ＥＢＮＡ−１応答性ＣＤ４＋Ｔ細胞がＴＨ１表現型を有し、ＩＦＮγを分泌し、そしてＩＬ−４を分泌しない。他者らが、ＥＢＮＡ−１特異的Ｔ細胞応答が、表現型においてＴＨ１でなくＴＨ２であると見出した（Ｓｔｅｉｇｅｒｗａｌｄ−Ｍｕｌｌｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、２０００、７４：６７４８−６７５９を参照のこと）ことを考えると、これは、驚くべき予想外の結果である。
【０１３１】
これらのＣＤ４＋Ｔ細胞応答がＭＨＣクラスＩＩ拘束されたことを確証するために、本発明者らは、ＭＨＣクラスＩ（Ｗ６／３２）またはＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３）に対するブロッキング抗体の非存在下、あるいは存在下で、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣを用いてＴ細胞を１週間刺激した。ＩＦＮγ分泌細胞をＥＬＩＳＰＯＴによって数えあげた場合、３つの実験において、８８〜１００％の範囲で、Ｌ２４３モノクローナル抗体のみが応答を減少させた。本発明者らは、ＥＢＮＡ−１に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、主にＭＨＣＩＩ拘束され、そしてＴＨ１型であると結論付ける。
【０１３２】
図７のおける実験は、ＥＢＮＡ−１特異的細胞を１週間増大させるためとＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける１日間の再刺激ための両方のために、ワクシニアベクターを用いた。従って、次いで、本発明者らは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける抗原としての精製されたＥＢＮＡ−１タンパク質の効力を試験した。ＩＰＴＧ誘導後に、ＥＢＮＡ−１配列のアミノ酸４５８〜６４１からなる組換えＥＢＮＡ−１タンパク質、またはコントロールタンパク質としてのｒＰＣＮＡ、形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ培養物から抽出した。この抽出物を、ＰＢＳに対して一晩透析し、そしてＳＤＳ　ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによって、純度および特異性について調べた（図８Ａ）。これらのタンパク質を、濃度を変える際に、ＤＣに対して適用させ、そして、一週間の増大の後、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣを用いてＩＦＮγ　ＥＬＩＳＰＯＴを読み取るために使用した。図８Ｂは、ＰＣＮＡコントロールと比較した場合の、ｒＥＢＮＡ−１タンパク質の滴定を用いて観察された用量応答曲線を示す。差し込みグラフは、ｖｖＴＫ−またはｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡで再刺激されたｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ増大細胞の応答を比較する。ＤＣに対して適用されたｒＥＢＮＡ−１タンパク質の１μｇ／ｍｌのみの用量が、組換えワクシニアＥＢＮＡ−１の応答に匹敵する応答を与えた。この結果は、ＥＢＮＡ−１特異的ＴＨ１細胞が、とても低い用量のＥＢＮＡ−１に対応し得ることを示す。
【０１３３】
（エキソビボで直接単離された、ＥＢＮＡ−１特異的なサイトカイン分泌細胞は主にＣＤ４＋である）
大半のドナーからのＥＢＮＡ−１特異的ＥＬＩＳＰＯＴ応答は、ＴＨ１非対称（ｓｋｅｗｉｎｇ）サイトカインＩＬ−１２（Ｃｅｌｌａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９６、１８４：７４７−７５２；Ｋｏｃｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９６、１８４：７４１−７４６）の高いレベルを作製する、ＤＣとのＣＤ４＋Ｔ細胞の１週間の培養を必要とするので、本発明者らは、ＥＢＮＡ−１特異的細胞をエキソビボで直接単離した。６つのドナー由来の新鮮なＰＢＭＣを、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣを用いて、７時間（ＩＦＮγ）または１８時間（ＩＬ−４）刺激した。次いで、この細胞を抗ＩＦＮγまたはＩＬ−４抗体のいずれかに結合体化した抗ＣＤ４５抗体で標識した。このようにして、サイトカインを分泌した細胞は、ＰＥで標識された、ＩＦＮγまたはＩＬ−４の別のエピトープに特異的な二次抗体を捕捉する。磁性マイクロビーズに結合体化した最後の抗ＰＥ抗体を加え、そしてこの細胞を磁場において選択した。この回収した細胞を、毎週の再刺激によって増大させ、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣをｒＥＢＮＡ−１タンパク質を適用されたＤＣと交替させた。
【０１３４】
６つ全てのドナーにおいて、ＥＢＮＡ−１特異的なＩＦＮγ分泌細胞株を確立し、そして３／６のドナーにおいて、ＩＬ−４分泌株を確立した。これらの株を（ＣＤ５６、ＣＤ４またはＣＤ８について）ＦＡＣＳによって分析すると、ＩＦＮγ株とＩＬ−４株の両方は、主にＣＤ４＋細胞からなっていた。図９は、３つのドナー由来のＩＦＮγ分泌株（すなわち、９０％より多くのＣＤ４を発現した細胞、および２％未満がＣＤ８またはＣＤ５６（データは示さず））を示す。同様に、ＥＢＮＡ−１特異的ＩＬ−４分泌株は、９０％より多くのＣＤ４および２％未満のＣＤ８またはＣＤ５６細胞からなる（データは示さず）。本発明者らは、健康な成体におけるＥＢＮＡ−１特異的なサイトカイン分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞は、すでにインビボで分化されている（図９）が、これらの細胞は、代表的に、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイで検出されるため、インビトロで自己ＤＣによって１週間増大させなくてはならない（図７）と結論付ける。
【０１３５】
（ＥＢＮＡ−１特異的ＴＨ２　ＣＤ４　Ｔ細胞ではなくＥＢＮＡ−１特異的ＴＨ１　ＣＤ　Ｔ４細胞は、ＥＢＮＡ−１発現ＤＣを溶解し得る）
本発明者らは、ＥＢＮＡ−１特異的Ｔ細胞株は、ＥＢＮＡ−１タンパク質の異なる供給源を適用された自己Ｂ−ＬＣＬおよびＤＣを殺傷し得ることを示した。本発明者らは、他の抗原に対して特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞によって観察されたように（Ｅｒｂら、ＣｅｌｌＩｍｍｕｎｏｌ．、１９９１、１３５：２３２−４４；Ｅｒｂら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９０、１４４：７９０−７９５；Ｄｅｌ　Ｐｒｅｔｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９１、１７４、８０９−１３；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９９、１９０、６１７−６２８）、この機能が、主にＴＨ１株にって発現されるかについて評価した。５つのドナーからのＩＦＮγ細胞株および３つのドナーからのＩＬ−４株を、細胞傷害性およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて同時に研究した。ＥＢＮＡ−１依存性のＩＦＮγまたはＩＬ−４産生に基づいて、新鮮なＰＢＭＣから単離された細胞株は、外因性のＩＬ−１２またはＩＬ−４の非存在下における数週間の刺激の後、ＴＨ１またはＴＨ２極性を維持した（図１０Ａ、Ｂ）。本発明者らが、５１Ｃｒ放出アッセイによって、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣ、ｒＥＢＮＡ−１タンパク質を負荷したＤＣ、または自己Ｂ−ＬＣＬの溶解を試験すると、ＴＨ１株のみが、コントロールに対して、ＥＢＮＡ−１発現標的を溶解し、一方、ＴＨ２細胞株はＩＬ−４の分泌を有するＥＢＮＡ−１発現ＤＣを認識した。図１０Ｃ、Ｄは、段階的なエフェクター（Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）：標的（Ｔａｒｇｅｔ）比率でのこのデータを示し、一方、図１０Ｅは、Ｅ：Ｔ比率が１０：１でのいくつかの株についての殺傷をまとめる。ＴＨ２でなくＴＨ１細胞株が、細胞溶解活性を有した（図１０Ｅ）。
【０１３６】
（インビボのＥＢＮＡ−１特異的ＩｇＧサブクラスはＴＨ１免疫を反映する）
インビボでＥＢＮＡ−１特異的なＴＨ１およびＴＨ２細胞の相対的活性を評価するために、本発明者らは、抗体応答のＩｇＧサブクラスをモニターした。ＴＨ１サイトカインは、ＩｇＧ１アイソタイプに対して抗体応答をゆがめ、そしてＴＨ２はＩｇＧ４に対してゆがめたが、ヒトにおけるＩｇＧサブクラスの分布は、マウスについて記載されたのと同じ程度厳密に偏向されない可能性がある（Ｂｏｎｉｆａｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、１６３、５２５−３２；Ｓｏｕｓａら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８、１１１、４８−５５；Ｈｕｓｓａｉｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．、１９９９、９８、２３８−４３）。ＩｇＧサブクラスに対するＥＬＩＳＡアッセイを用いて、７つのドナーにおけるＥＢＮＡ−１特異的ＩｇＧ抗体のアイソタイプを記載した。抗原として、本発明者らは、市販で入手可能なＥＢＮＡ−１由来のｇｌｙ−ａｌａ反復配列またはＥ．ｃｏｌｉベクターによって発現されたＣ末端ｒＥＢＮＡ−１タンパク質のいずれかを用いた。７つ全てのドナーが、それらのＥＢＮＡ−１応答において、ＩｇＧ１抗体の明確な優性を示した（図１１）。これは、本発明者らが試験した３つの他の抗原（マンプス皮膚抗原、破傷風トキソイドおよびカンジダ溶解産物；図１１）に対する応答と対照的であるが、２つのドナーは破傷風トキソイドに対して強いＩｇＧ１応答を示した。ＰＢＭＣの新鮮および１週間の培養物おけるＩＦＮγ分泌Ｔ細胞の即座の検出と組み合わせられた、抗体データは、健康なＥＢＶキャリアにおけるインビボのＥＢＮＡ−１に対する応答は、一貫してＴＨ１型であることを示す。
【０１３７】
（考察）
新しいデータは、健康なＥＢＶキャリアが、インビボでＥＢＮＡ−１に対して、一貫してＴＨ１型応答をなすことを示す。これらのＴ細胞は、血液中に存在し、そしてＩｇＧ１アイソタイプに対するＥＢＮＡ−１抗体応答の明白な偏りの原因となる可能性がある（図１０）。Ｂ細胞およびＢ細胞株は、ＩＬ−１２を活発に産生することも、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答をＴＨ１に偏向させることも知られていないので、本発明者らは、この様式において、ＤＣがＴ細胞をゆがめるのを担うと推測する。ヒトＤＣは、瀕死のＥＢＶ感染Ｂ細胞由来のＥＢＮＡ−１を効率的にプロセシングすること（Ｍｅｎｚら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０００、１９１、１６４９−６０）、そしてマウスのＤＣはインビボでＴＨ１型にＴ細胞をゆがめること（Ｐｕｌｅｎｄｒａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９９、９６：１０３６−１０４１；Ｍａｌｄｏｎａｄｏ−Ｌｏｐｅｚら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９９、１８９：５８７−５９２）は現在公知である。ヒトのＢ細胞が、ＤＣをインビボでＥＢＮＡ−１を提示させるために、溶解性感染を受けなければならない場合、ＥＢＶ感染に典型的である（ＲｉｃｋｉｎｓｏｎおよびＫｉｅｆｆ、Ｅｓｐｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ．Ｉｎ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｄ．Ｍ．ＫｎｉｐｅおよびＰ．Ｍ．Ｈｏｗｌｅｙ編　１９９６、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．２３９７−２４４６）ように、ＥＢＮＡ−１特異的抗体の開発において遅延が予期される。従って、本発明者らは、ＥＢＮＡ−１に対するＴＨ１の応答が、ＥＢＮＡ−１免疫の直接誘発物質として、感染Ｂ細胞と比べたＤＣについての優勢的役割を反映すると示唆する。
【０１３８】
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ウイルス感染および腫瘍に対する耐性において重要である。ＨＩＶ−１感染において、強力なＣＤ４＋Ｔ細胞応答が、長い期間の非プログレッサー（ｎｏｎｐｒｏｇｒｅｓｓｏｒ）で見出される（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７、２７８：１４４７−１４５０）。ＨＩＶ感染患者のこの少数派は、抗レトロウイルス治療なしで、高いＣＤ４＋Ｔ細胞数および低いウイルス負荷を有する。これらはまた、ＨＩＶｐ２４およびｇｐ１６０タンパク質に対してより強力なＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖応答を示す。慢性的ウイルス感染におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の役割は、マウスでより直接的に評価された（Ｃａｒｄｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９６、１８４：８６３−８７１）。マウスのＭＨＶ−６８γ−ヘルペスウイルスによる１次感染は、ＭＨＣクラスＩＩ−／−および＋／＋マウスにおいて同様に消散する。しかし、初期感染から３週間後に、このウイルスは、ＭＨＣ　ＩＩノックアウトマウスにおいて再発し、次いでるいそうを発症し、そして４週間以内にこのマウスの大部分が死滅する。これは、初期ウイルスクリアランスが起こるという事実にもかかわらず、明らかにＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞傷害性を通じて起こる。類似の知見が、ＣＤ４−／−マウスおよび野生型マウスにおけるＬＣＭＶ感染に対するＣＤ８＋エフェクター機能の研究においてなされた（Ｚａｊａｃら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９８、１８８、２２０５−２２１３）。ＣＤ４−／−マウスは、より広範かつ慢性的な感染を引き起こすＬＣＭＶ改変体を排除するのに失敗し、そしてこの改変体特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、リンパ球の活性マーカーの発現にもかかわらず、（ＩＦＮγ分泌によって測定される場合）非機能的である。総合して、これらの結果は、ＣＤ４＋Ｔ細胞がウイルス（ＫａｌａｍｓおよびＷａｌｋｅｒ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９８、１８８：２１９９−２２０４に概説される）および腫瘍（Ｔｏｅｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９９、１８９：７５３−７５６に概説される）に対して有効なＣＤ８＋Ｔ細胞機能を維持するという新たな総意の一部である。
【０１３９】
ＣＤ４＋Ｔ細胞についてのこの役割の基礎をなす機構は、抗原発現細胞、特にＤＣの機能改善を伴う可能性がある（Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９３：４８０−４８３；Ｒｉｄｇｅら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９３：４７４−４７８；Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９３：４７８−４８０）。ＣＤ４＋Ｔ細胞との相互作用に引き続いて、ＤＣは、それらの最初の増大と維持の両方において、ＣＤ８＋Ｔ細胞のより有効な刺激物質となり得る。ＣＤ８＋Ｔ細胞より活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞において大量に発現する、ＣＤ４０Ｌは、ＤＣに対する刺激物として、強く意図される。ＣＤ４は、ＤＣにおいて豊富で、そしてその連結は、ＤＣの発生および機能におけるいくつかの重要な工程を媒介する。これは、ＣＤ３４＋前駆体からのそれらの発生（Ｆｌｏｒｅｓ−Ｒｏｍｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８５：３４１−３４９）、末梢組織からの動員（Ｍｏｏｄｙｃｌｉｆｆｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０００、１９１：２０１１−２０）、成熟（Ｃａｕｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９４、１８０：１２６３−１２７２）、生存（Ｊｏｓｉｅｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０００、１９１：４９５−５０１）およびサイトカイン分泌（特に、ＩＬ−１２）（Ｃｅｌｌａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９６、１８４：７４７−７５２；Ｋｏｃｈら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９６、１８４：７４１−７４６）を包含する。
【０１４０】
ＴＨ１は、ウイルスおよび腫瘍に対する耐性においてＴＨ２　ＣＤ４＋細胞より重要である。ヒトにおいて、ＴＨ１　ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、腎臓移植レシピエントにおいて一次ＣＭＶ感染に耐性であるということが提案されている（Ｒｅｎｔｅｎａａｒら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、２０００、１０５：５４１−８）。ＣＭＶポジティブ腎臓のＣＭＶセロネガティブレシピエントを、移植後ＣＭＶ特異的免疫応答についてモニターした。評価された全ての患者において、分極されたＴＨ１応答が観察された。これらの患者は、免疫抑制性療法にもかかわらず、慢性のＣＭＶ疾患の徴候なしに、急性感染から回復した。さらに、マウスモデルの研究は、免疫学的耐性におけるＴＨ１　ＣＤ４＋細胞の重要性を強調する。オボアルブミンが代理抗原として腫瘍において発現される場合、オボアルブミン特異的ＴＨ１細胞の養子移入が、この抗原に対する同一のＴ細胞レセプターによるＴＨ２細胞の養子移入よりも強いＣＤ８＋Ｔ細胞記憶を導いた（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら、１９９９、上記）。ＩＬ−１２と組み合わせたインフルエンザサブユニットワクチンで免疫された新生児マウスは、増強されたＴＨ１サイトカイン発現を示し、そしてインフルエンザウイルスによるチャレンジ後に、インフルエンザサブユニットワクチンのみで免疫された新生児マウス間での５５％の生存率と比較して、１００％の生存を示した（Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０００、１６４：３６９８−７０４）。最近の研究は、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質に対して特異的な同一のＴＣＲ導入遺伝子を発現するＴＨ１細胞およびＴＨ２細胞のＴＣＲβ−／−δ−／−マウスへの養子移入を利用した（Ｍａｌｏｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２０００、１９１：２１５９−７０）。ＴＨ１とＴＨ２の両方のＴ細胞は、ほぼおそらく、中和抗体の生成を通じて、ＶＳＶ感染に対して組織的防御を与えた。しかし、ＴＨ１　ＣＤ４＋Ｔ細胞のみは、致死的な鼻腔内感染に対して防御し得、そしてＤＴＨ応答を誘発し得た。これらの例は、一次ウイルス感染の制御、ならびに免疫的記憶の発生および維持におけるＴＨ１　ＣＤ４＋Ｔ細胞の重要な役割を示す。
【０１４１】
ＴＨ１　ＣＤ４＋Ｔ細胞の防御的機能について可能な機構がいくつか存在する。ＩＦＮγ分泌は、Ｂ細胞を含む種々の細胞の型に影響を及ぼし、ここでは、ＩｇＧサブクラスを、マウスにおいてＩｇＧ２ａに（Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍら、２０００、上記）、およびヒトにおいてＩｇＧ１に（Ｂｏｎｉｆａｃｉｏら、１９９９、上記；Ｓｏｕｓａら、１９９８、上記；Ｈｕｓｓａｉｎら、１９９９、上記）、変更することに影響を及ぼす。これらの抗体は、オプソニン作用の有効性および補体の固定を増強し得る。インフルエンザに対するワクチン接種の前にＩＬ−１２を与えられた、新生児マウス由来の血清は、高められたレベルのインフルエンザ特異的なＴＨ１依存性ＩｇＧ２ａ抗体を示した（Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍら、２０００、上記）。これらのマウスからＢ細胞欠損マウスへの血清の受動移入は、生きたインフルエンザのチャレンジに対して、ＩＬ−１２なしでワクチン接種されたマウス（これは、主にＩｇＧ１インフルエンザ特異的抗体を有する）由来の血清より良好な防御を与えた。しかし、他の研究において、サブクラスでなく、ＩｇＧ抗体の量がウイルスチャレンジに対して防御を与えるのに重要であった（Ｂａｃｋｍａｎｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７、２７６：２０２４−２０２７）。ＴＨ１またはＴＨ２のいずれかのトランスジェニックＶＳＶ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を注射されたＴＣＲβ−／−δ−／−マウスは、ＶＳＶに対して分極されたＩｇＧ抗体を生成し、この両方が、防御免疫を与えた（Ｍａｌｏｙら、２０００、上記）。興味深いことに、本発明者らは、Ｂ細胞からの強い産生応答を指揮するＤＣの能力（Ｆａｙｅｔｔｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８５：１９０９−１９１８；Ｄｕｂｏｉｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８５：９４１−９５１）と一致して、ＥＢＮＡ−１に対するヒトのＩｇＧ，ＴＨ１型抗体応答は、他の抗体応答に大変大きく相関することを発見する（図１１）。
【０１４２】
ＴＨ１　ＣＤ４＋Ｔ細胞はまた、細胞傷害性を通じてウイルス感染を制御し得る。本研究において、ＴＨ１細胞のみが、ＥＢＮＡ−１発現標的を溶解し得る（図１０）。ＴＨ１細胞に対する細胞傷害性の制御は、以前に記載された（Ｂｏｎｉｆａｃｉｏら、１９９９、上記；Ｓｏｕｓａら、１９９８、上記；Ｈｕｓｓａｉｎら、１９９９、上記）。同様に、オボアルブミン特異的ＴＨ１およびＴＨ２細胞がＴＣＲトランスジェニックマウスから生成され、そしてオボアルブミンを発現するマウスの腫瘍細胞を溶解するそれらの能力について試験したモデルにおいて、ＩＦＮγ分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞のみが、腫瘍細胞を溶解した（Ｈｕｓｓａｉｎら、１９９９、上記）。
【０１４３】
重要なことに、ＴＨ１細胞およびＴＨ２細胞は、感染部位へホーミングする能力が異なる（Ａｕｓｔｒｕｐら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７、３８５：８１−８３；Ｏ’Ｇａｒｒａら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ、１９９８、８：Ｒ６４６−９）。ＴＨ２細胞でなくＴＨ１細胞は、感染組織で産生される対応するケモカイン（ＭＣＰ−１、ＭｉｇおよびＩＰ−１０）に応答して移動する（Ｍａｌｏｙら、２０００、上記）。これは、ケモカインレセプターの異なった発現（ＣＣＲ２、ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ３を発現するＴＨ１細胞、ならびにＣＣＲ４を発現するＴＨ２細胞）に起因する。
【０１４４】
上述されるように、腫瘍免疫のマウスのモデルにおいて、ＴＨ１またはＴＨ２のいずれかの細胞の養子移入は、腫瘍を根絶するが、ＴＨ１細胞のみが腫瘍の再チャレンジに対して免疫記憶を発生させた（Ｈｕｓｓａｉｎら、１９９９、上記）。興味深いことに、腫瘍根絶の機構は、２つの型のヘルパー細胞の間で大変異なっているように思われた。ＴＨ１細胞を受けたマウスにおいて、腫瘍は、主にリンパ球によって浸潤された。逆に、ＴＨ２細胞を受けたマウスは、好酸球および好中球によって特徴付けられた腫瘍浸潤を示した。
【０１４５】
ＥＢＮＡ−１タンパク質は、ＥＢＶ関連の癌の全ての型において発現される単独のＥＢＶ潜伏タンパク質であり、そしてＴＨ１　ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発するので、このタンパク質は、ワクチン接種（特に、小児におけて）に対して、そしてＥＢＶ関連悪性疾患のための免疫療法に対して、新たな焦点を提供する。さらに、ＴＨ１応答に対する分極したＥＢＮＡ−１特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球を標的とする療法は、免疫原性ＤＣへのＥＢＮＡ−１の標的化に最も関与する。
【０１４６】
本発明は、本明細書中に記載される特定の実施形態によって範囲を限定されない。実際、本発明の種々の改変は、本明細書中で記載される改変に加えて、前述の記載および添付の図面から、当業者に明らかである。このような改変は、添付の特許請求の範囲内にあることを意図する。
【０１４７】
さらに、全ての値はおよそであり、そして説明のために提供されることが理解されるべきである。
【０１４８】
本明細書中で引用される、全ての特許、特許出願、刊行物、および他のものは、それら全体において、ここに本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＥＢＮＡ−１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって優先的に認識される。ＣＤ４＋Ｔ細胞による芽球形成（ｂｌａｓｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＣＤ４−ＦＩＴＣ）を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己ＤＣで刺激した、ＣＤ２＋ＣＤ８−Ｔ細胞の培養物を分析した。Ａ．培養物を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＴＫ−感染ＤＣで再刺激した。Ｂ．培養物の芽球化を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで再刺激した。Ｃ．培養物を、ｖｖＥＢＮＡ３Ａ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＴＫ−感染ＤＣで再刺激した。Ｄ．Ｔ細胞を、ｖｖＥＢＮＡ３Ａ感染ＤＣで刺激および再刺激した。Ｅ．ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、ｖｖＴＫ−感染ＤＣで刺激および再刺激した。Ｆ．陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染ＤＣに応答するＣＤ２＋ＣＤ８−Ｔ細胞。すべての培養物を同じドナー（表１における番号５）から調製した。芽球化部分集団のパーセント（矢印）を示す。
【図１Ｂ】ＥＢＮＡ−１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって優先的に認識される。ＣＤ４＋Ｔ細胞による芽球形成（ｂｌａｓｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＣＤ４−ＦＩＴＣ）を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己ＤＣで刺激した、ＣＤ２＋ＣＤ８−Ｔ細胞の培養物を分析した。Ａ．培養物を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＴＫ−感染ＤＣで再刺激した。Ｂ．培養物の芽球化を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで再刺激した。Ｃ．培養物を、ｖｖＥＢＮＡ３Ａ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＴＫ−感染ＤＣで再刺激した。Ｄ．Ｔ細胞を、ｖｖＥＢＮＡ３Ａ感染ＤＣで刺激および再刺激した。Ｅ．ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、ｖｖＴＫ−感染ＤＣで刺激および再刺激した。Ｆ．陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染ＤＣに応答するＣＤ２＋ＣＤ８−Ｔ細胞。すべての培養物を同じドナー（表１における番号５）から調製した。芽球化部分集団のパーセント（矢印）を示す。
【図１Ｃ】ＥＢＮＡ−１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって優先的に認識される。ＣＤ４＋Ｔ細胞による芽球形成（ｂｌａｓｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＣＤ４−ＦＩＴＣ）を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己ＤＣで刺激した、ＣＤ２＋ＣＤ８−Ｔ細胞の培養物を分析した。Ａ．培養物を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＴＫ−感染ＤＣで再刺激した。Ｂ．培養物の芽球化を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで再刺激した。Ｃ．培養物を、ｖｖＥＢＮＡ３Ａ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＴＫ−感染ＤＣで再刺激した。Ｄ．Ｔ細胞を、ｖｖＥＢＮＡ３Ａ感染ＤＣで刺激および再刺激した。Ｅ．ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、ｖｖＴＫ−感染ＤＣで刺激および再刺激した。Ｆ．陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染ＤＣに応答するＣＤ２＋ＣＤ８−Ｔ細胞。すべての培養物を同じドナー（表１における番号５）から調製した。芽球化部分集団のパーセント（矢印）を示す。
【図１Ｄ】ＥＢＮＡ−１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって優先的に認識される。ＣＤ４＋Ｔ細胞による芽球形成（ｂｌａｓｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＣＤ４−ＦＩＴＣ）を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己ＤＣで刺激した、ＣＤ２＋ＣＤ８−Ｔ細胞の培養物を分析した。Ａ．培養物を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＴＫ−感染ＤＣで再刺激した。Ｂ．培養物の芽球化を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで再刺激した。Ｃ．培養物を、ｖｖＥＢＮＡ３Ａ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＴＫ−感染ＤＣで再刺激した。Ｄ．Ｔ細胞を、ｖｖＥＢＮＡ３Ａ感染ＤＣで刺激および再刺激した。Ｅ．ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、ｖｖＴＫ−感染ＤＣで刺激および再刺激した。Ｆ．陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染ＤＣに応答するＣＤ２＋ＣＤ８−Ｔ細胞。すべての培養物を同じドナー（表１における番号５）から調製した。芽球化部分集団のパーセント（矢印）を示す。
【図１Ｅ】ＥＢＮＡ−１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって優先的に認識される。ＣＤ４＋Ｔ細胞による芽球形成（ｂｌａｓｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＣＤ４−ＦＩＴＣ）を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己ＤＣで刺激した、ＣＤ２＋ＣＤ８−Ｔ細胞の培養物を分析した。Ａ．培養物を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＴＫ−感染ＤＣで再刺激した。Ｂ．培養物の芽球化を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで再刺激した。Ｃ．培養物を、ｖｖＥＢＮＡ３Ａ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＴＫ−感染ＤＣで再刺激した。Ｄ．Ｔ細胞を、ｖｖＥＢＮＡ３Ａ感染ＤＣで刺激および再刺激した。Ｅ．ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、ｖｖＴＫ−感染ＤＣで刺激および再刺激した。Ｆ．陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染ＤＣに応答するＣＤ２＋ＣＤ８−Ｔ細胞。すべての培養物を同じドナー（表１における番号５）から調製した。芽球化部分集団のパーセント（矢印）を示す。
【図１Ｆ】ＥＢＮＡ−１は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によって優先的に認識される。ＣＤ４＋Ｔ細胞による芽球形成（ｂｌａｓｔ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＣＤ４−ＦＩＴＣ）を、フローサイトメトリーによってモニターした。前方散乱は、細胞サイズを示す。ワクシニアウイルス構築物に感染させた自己ＤＣで刺激した、ＣＤ２＋ＣＤ８−Ｔ細胞の培養物を分析した。Ａ．培養物を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＴＫ−感染ＤＣで再刺激した。Ｂ．培養物の芽球化を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで再刺激した。Ｃ．培養物を、ｖｖＥＢＮＡ３Ａ感染ＤＣで刺激し、そしてｖｖＴＫ−感染ＤＣで再刺激した。Ｄ．Ｔ細胞を、ｖｖＥＢＮＡ３Ａ感染ＤＣで刺激および再刺激した。Ｅ．ワクシニア刺激のバックグラウンドを評価するために、培養物を、ｖｖＴＫ−感染ＤＣで刺激および再刺激した。Ｆ．陽性コントロールとしてのインフルエンザウイルス感染ＤＣに応答するＣＤ２＋ＣＤ８−Ｔ細胞。すべての培養物を同じドナー（表１における番号５）から調製した。芽球化部分集団のパーセント（矢印）を示す。
【図２Ａ】内因性経路および外因性経路による、ＤＣに与えられるＥＢＮＡ−１の認識。Ａ．ＣＤ４＋（ＣＤ４−ＦＩＴＣ）対ＣＤ８＋（ＣＤ８−ＰＥ）含量。Ｂ．ＣＤ８＋（ＣＤ５６−ＰＥ）含量。Ｃ．組換えバキュロウイルス発現ＥＢＮＡ−１タンパク質を負荷したＤＣで刺激した（ＤＣ＋ｂＥＢＮＡ−１）か、または負荷なしで刺激した（ＤＣ）ＩＦＮγスポット形成細胞（ｓｐｏｔ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｃｅｌｌ）／１０５細胞。Ｄ．ｖｖＴＫ−感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＴＫ−），ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ），ｖｖＴ７感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＴ７），ｖｖＥＢＮＡ−１感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＥＢＮＡ−１）およびｖｖＥＢＮＡ−１／ｖｖＴ７二重感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＥＢＮＡ−１　＋ｖｖＴ７）とのインキュベーションにおける株のスポット形成。同じ図において、ブロッキングのために抗体Ｌ２４３，αＨＬＡ−ＤＲ，（＋Ｌ２４３）およびＢ−Ｈ９，αＨＬＡクラスＩ（＋Ｂ−Ｈ９）を使用して、ＭＨＣ拘束を分析する。さらに、ＨＬＡ−ＤＲ４＋　Ｂ−ＬＣＬ，ＬＲＭ（ＬＲＭ）対ＨＬＡ−ＤＲ４−　Ｂ−ＬＣＬ，ＬＧ２（ＬＧ２）での刺激に際したスポット形成を示す。
【図２Ｂ】内因性経路および外因性経路による、ＤＣに与えられるＥＢＮＡ−１の認識。Ａ．ＣＤ４＋（ＣＤ４−ＦＩＴＣ）対ＣＤ８＋（ＣＤ８−ＰＥ）含量。Ｂ．ＣＤ８＋（ＣＤ５６−ＰＥ）含量。Ｃ．組換えバキュロウイルス発現ＥＢＮＡ−１タンパク質を負荷したＤＣで刺激した（ＤＣ＋ｂＥＢＮＡ−１）か、または負荷なしで刺激した（ＤＣ）ＩＦＮγスポット形成細胞（ｓｐｏｔ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｃｅｌｌ）／１０５細胞。Ｄ．ｖｖＴＫ−感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＴＫ−），ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ），ｖｖＴ７感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＴ７），ｖｖＥＢＮＡ−１感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＥＢＮＡ−１）およびｖｖＥＢＮＡ−１／ｖｖＴ７二重感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＥＢＮＡ−１　＋ｖｖＴ７）とのインキュベーションにおける株のスポット形成。同じ図において、ブロッキングのために抗体Ｌ２４３，αＨＬＡ−ＤＲ，（＋Ｌ２４３）およびＢ−Ｈ９，αＨＬＡクラスＩ（＋Ｂ−Ｈ９）を使用して、ＭＨＣ拘束を分析する。さらに、ＨＬＡ−ＤＲ４＋　Ｂ−ＬＣＬ，ＬＲＭ（ＬＲＭ）対ＨＬＡ−ＤＲ４−　Ｂ−ＬＣＬ，ＬＧ２（ＬＧ２）での刺激に際したスポット形成を示す。
【図２Ｃ】内因性経路および外因性経路による、ＤＣに与えられるＥＢＮＡ−１の認識。Ａ．ＣＤ４＋（ＣＤ４−ＦＩＴＣ）対ＣＤ８＋（ＣＤ８−ＰＥ）含量。Ｂ．ＣＤ８＋（ＣＤ５６−ＰＥ）含量。Ｃ．組換えバキュロウイルス発現ＥＢＮＡ−１タンパク質を負荷したＤＣで刺激した（ＤＣ＋ｂＥＢＮＡ−１）か、または負荷なしで刺激した（ＤＣ）ＩＦＮγスポット形成細胞（ｓｐｏｔ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｃｅｌｌ）／１０５細胞。Ｄ．ｖｖＴＫ−感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＴＫ−），ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ），ｖｖＴ７感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＴ７），ｖｖＥＢＮＡ−１感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＥＢＮＡ−１）およびｖｖＥＢＮＡ−１／ｖｖＴ７二重感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＥＢＮＡ−１　＋ｖｖＴ７）とのインキュベーションにおける株のスポット形成。同じ図において、ブロッキングのために抗体Ｌ２４３，αＨＬＡ−ＤＲ，（＋Ｌ２４３）およびＢ−Ｈ９，αＨＬＡクラスＩ（＋Ｂ−Ｈ９）を使用して、ＭＨＣ拘束を分析する。さらに、ＨＬＡ−ＤＲ４＋　Ｂ−ＬＣＬ，ＬＲＭ（ＬＲＭ）対ＨＬＡ−ＤＲ４−　Ｂ−ＬＣＬ，ＬＧ２（ＬＧ２）での刺激に際したスポット形成を示す。
【図２Ｄ】内因性経路および外因性経路による、ＤＣに与えられるＥＢＮＡ−１の認識。Ａ．ＣＤ４＋（ＣＤ４−ＦＩＴＣ）対ＣＤ８＋（ＣＤ８−ＰＥ）含量。Ｂ．ＣＤ８＋（ＣＤ５６−ＰＥ）含量。Ｃ．組換えバキュロウイルス発現ＥＢＮＡ−１タンパク質を負荷したＤＣで刺激した（ＤＣ＋ｂＥＢＮＡ−１）か、または負荷なしで刺激した（ＤＣ）ＩＦＮγスポット形成細胞（ｓｐｏｔ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｃｅｌｌ）／１０５細胞。Ｄ．ｖｖＴＫ−感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＴＫ−），ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ），ｖｖＴ７感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＴ７），ｖｖＥＢＮＡ−１感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＥＢＮＡ−１）およびｖｖＥＢＮＡ−１／ｖｖＴ７二重感染ＤＣ（ＤＣ　＋　ｖｖＥＢＮＡ−１　＋ｖｖＴ７）とのインキュベーションにおける株のスポット形成。同じ図において、ブロッキングのために抗体Ｌ２４３，αＨＬＡ−ＤＲ，（＋Ｌ２４３）およびＢ−Ｈ９，αＨＬＡクラスＩ（＋Ｂ−Ｈ９）を使用して、ＭＨＣ拘束を分析する。さらに、ＨＬＡ−ＤＲ４＋　Ｂ−ＬＣＬ，ＬＲＭ（ＬＲＭ）対ＨＬＡ−ＤＲ４−　Ｂ−ＬＣＬ，ＬＧ２（ＬＧ２）での刺激に際したスポット形成を示す。
【図３】種々のＥＢＮＡ−１発現標的に対するＣＭ１７１１９８細胞株の増殖応答。Ａ：ＤＣ（ＤＣのみ）およびＴ細胞（Ｔ細胞のみ）は、低いバックグラウンド増殖を示す。混合された場合（０）、ベクター単独（ｖｖＴＫ−）ではなくＥＢＮＡ−１を発現する組換えワクシニアウイルス構築物（ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ）での感染に際して増加され得るいくらかの増殖が存在する。Ｅ．ｃｏｌｉ（ｅＥＢＮＡ−１）およびバキュロウイルス／昆虫細胞（ｂＥＢＮＡ−１）発現系由来の組換えＥＢＮＡ−１タンパク質でのＤＣの外部負荷もまた、増殖を強めたが、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のコントロールタンパク質（ｅコントロール）に対する反応性はなかった。Ｂ：ＣＭ１７１１９８細胞株とＨＬＡ−ＤＲ４対立遺伝子を共有するＢ−ＬＣＬは増殖を誘導する（ＬＲＭおよびＬＣＬ−ＢＭ）が、ＨＬＡ−ＤＲ４が一致しないＢ−ＬＣＬは誘導しない（ＬＧ２およびＬＣＬ−ＤＣ）。
【図４Ａ】Ｔ細胞サブセットの細胞傷害活性およびＥＢＶ潜伏抗原特異性。左側の欄（Ａ〜Ｃ）は、３つのＰＢＭＣ応答動物集団のＣＤ８対ＣＤ４　ＦＡＣＳ染色を示す：（Ａ）ＣＤ２＋ＰＢＭＣ，（Ｂ）ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣおよび（Ｃ）ＣＤ４−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ。中間の欄（Ｄ〜Ｆ）は、これらの応答動物による自己ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ；黒色丸）およびＴ２細胞（Ｔ２；白色丸）に関して観察された溶解を示す。右側の欄（Ｇ〜Ｉ）は、３つの応答動物集団のＥＢＶ潜伏抗原特異性を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて研究した（Ｅ１：ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ，Ｅ２：ｖｖＥＢＮＡ２，Ｅ３Ｂ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｂ，Ｅ３Ｃ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｃ，Ｌ１：ｖｖＬＭＰ１，Ｌ２ａ：ｖｖＬＭＰ２Ａ，Ｂ１：ｖｖＢＭＬＦ１，ＬＣＬ：ＬＣＬ−ＪＴ）。
【図４Ｂ】Ｔ細胞サブセットの細胞傷害活性およびＥＢＶ潜伏抗原特異性。左側の欄（Ａ〜Ｃ）は、３つのＰＢＭＣ応答動物集団のＣＤ８対ＣＤ４　ＦＡＣＳ染色を示す：（Ａ）ＣＤ２＋ＰＢＭＣ，（Ｂ）ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣおよび（Ｃ）ＣＤ４−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ。中間の欄（Ｄ〜Ｆ）は、これらの応答動物による自己ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ；黒色丸）およびＴ２細胞（Ｔ２；白色丸）に関して観察された溶解を示す。右側の欄（Ｇ〜Ｉ）は、３つの応答動物集団のＥＢＶ潜伏抗原特異性を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて研究した（Ｅ１：ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ，Ｅ２：ｖｖＥＢＮＡ２，Ｅ３Ｂ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｂ，Ｅ３Ｃ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｃ，Ｌ１：ｖｖＬＭＰ１，Ｌ２ａ：ｖｖＬＭＰ２Ａ，Ｂ１：ｖｖＢＭＬＦ１，ＬＣＬ：ＬＣＬ−ＪＴ）。
【図４Ｃ】Ｔ細胞サブセットの細胞傷害活性およびＥＢＶ潜伏抗原特異性。左側の欄（Ａ〜Ｃ）は、３つのＰＢＭＣ応答動物集団のＣＤ８対ＣＤ４　ＦＡＣＳ染色を示す：（Ａ）ＣＤ２＋ＰＢＭＣ，（Ｂ）ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣおよび（Ｃ）ＣＤ４−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ。中間の欄（Ｄ〜Ｆ）は、これらの応答動物による自己ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ；黒色丸）およびＴ２細胞（Ｔ２；白色丸）に関して観察された溶解を示す。右側の欄（Ｇ〜Ｉ）は、３つの応答動物集団のＥＢＶ潜伏抗原特異性を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて研究した（Ｅ１：ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ，Ｅ２：ｖｖＥＢＮＡ２，Ｅ３Ｂ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｂ，Ｅ３Ｃ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｃ，Ｌ１：ｖｖＬＭＰ１，Ｌ２ａ：ｖｖＬＭＰ２Ａ，Ｂ１：ｖｖＢＭＬＦ１，ＬＣＬ：ＬＣＬ−ＪＴ）。
【図４Ｄ】Ｔ細胞サブセットの細胞傷害活性およびＥＢＶ潜伏抗原特異性。左側の欄（Ａ〜Ｃ）は、３つのＰＢＭＣ応答動物集団のＣＤ８対ＣＤ４　ＦＡＣＳ染色を示す：（Ａ）ＣＤ２＋ＰＢＭＣ，（Ｂ）ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣおよび（Ｃ）ＣＤ４−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ。中間の欄（Ｄ〜Ｆ）は、これらの応答動物による自己ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ；黒色丸）およびＴ２細胞（Ｔ２；白色丸）に関して観察された溶解を示す。右側の欄（Ｇ〜Ｉ）は、３つの応答動物集団のＥＢＶ潜伏抗原特異性を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて研究した（Ｅ１：ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ，Ｅ２：ｖｖＥＢＮＡ２，Ｅ３Ｂ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｂ，Ｅ３Ｃ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｃ，Ｌ１：ｖｖＬＭＰ１，Ｌ２ａ：ｖｖＬＭＰ２Ａ，Ｂ１：ｖｖＢＭＬＦ１，ＬＣＬ：ＬＣＬ−ＪＴ）。
【図４Ｅ】Ｔ細胞サブセットの細胞傷害活性およびＥＢＶ潜伏抗原特異性。左側の欄（Ａ〜Ｃ）は、３つのＰＢＭＣ応答動物集団のＣＤ８対ＣＤ４　ＦＡＣＳ染色を示す：（Ａ）ＣＤ２＋ＰＢＭＣ，（Ｂ）ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣおよび（Ｃ）ＣＤ４−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ。中間の欄（Ｄ〜Ｆ）は、これらの応答動物による自己ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ；黒色丸）およびＴ２細胞（Ｔ２；白色丸）に関して観察された溶解を示す。右側の欄（Ｇ〜Ｉ）は、３つの応答動物集団のＥＢＶ潜伏抗原特異性を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて研究した（Ｅ１：ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ，Ｅ２：ｖｖＥＢＮＡ２，Ｅ３Ｂ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｂ，Ｅ３Ｃ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｃ，Ｌ１：ｖｖＬＭＰ１，Ｌ２ａ：ｖｖＬＭＰ２Ａ，Ｂ１：ｖｖＢＭＬＦ１，ＬＣＬ：ＬＣＬ−ＪＴ）。
【図４Ｆ】Ｔ細胞サブセットの細胞傷害活性およびＥＢＶ潜伏抗原特異性。左側の欄（Ａ〜Ｃ）は、３つのＰＢＭＣ応答動物集団のＣＤ８対ＣＤ４　ＦＡＣＳ染色を示す：（Ａ）ＣＤ２＋ＰＢＭＣ，（Ｂ）ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣおよび（Ｃ）ＣＤ４−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ。中間の欄（Ｄ〜Ｆ）は、これらの応答動物による自己ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ；黒色丸）およびＴ２細胞（Ｔ２；白色丸）に関して観察された溶解を示す。右側の欄（Ｇ〜Ｉ）は、３つの応答動物集団のＥＢＶ潜伏抗原特異性を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて研究した（Ｅ１：ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ，Ｅ２：ｖｖＥＢＮＡ２，Ｅ３Ｂ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｂ，Ｅ３Ｃ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｃ，Ｌ１：ｖｖＬＭＰ１，Ｌ２ａ：ｖｖＬＭＰ２Ａ，Ｂ１：ｖｖＢＭＬＦ１，ＬＣＬ：ＬＣＬ−ＪＴ）。
【図４Ｇ】Ｔ細胞サブセットの細胞傷害活性およびＥＢＶ潜伏抗原特異性。左側の欄（Ａ〜Ｃ）は、３つのＰＢＭＣ応答動物集団のＣＤ８対ＣＤ４　ＦＡＣＳ染色を示す：（Ａ）ＣＤ２＋ＰＢＭＣ，（Ｂ）ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣおよび（Ｃ）ＣＤ４−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ。中間の欄（Ｄ〜Ｆ）は、これらの応答動物による自己ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ；黒色丸）およびＴ２細胞（Ｔ２；白色丸）に関して観察された溶解を示す。右側の欄（Ｇ〜Ｉ）は、３つの応答動物集団のＥＢＶ潜伏抗原特異性を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて研究した（Ｅ１：ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ，Ｅ２：ｖｖＥＢＮＡ２，Ｅ３Ｂ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｂ，Ｅ３Ｃ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｃ，Ｌ１：ｖｖＬＭＰ１，Ｌ２ａ：ｖｖＬＭＰ２Ａ，Ｂ１：ｖｖＢＭＬＦ１，ＬＣＬ：ＬＣＬ−ＪＴ）。
【図４Ｈ】Ｔ細胞サブセットの細胞傷害活性およびＥＢＶ潜伏抗原特異性。左側の欄（Ａ〜Ｃ）は、３つのＰＢＭＣ応答動物集団のＣＤ８対ＣＤ４　ＦＡＣＳ染色を示す：（Ａ）ＣＤ２＋ＰＢＭＣ，（Ｂ）ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣおよび（Ｃ）ＣＤ４−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ。中間の欄（Ｄ〜Ｆ）は、これらの応答動物による自己ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ；黒色丸）およびＴ２細胞（Ｔ２；白色丸）に関して観察された溶解を示す。右側の欄（Ｇ〜Ｉ）は、３つの応答動物集団のＥＢＶ潜伏抗原特異性を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて研究した（Ｅ１：ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ，Ｅ２：ｖｖＥＢＮＡ２，Ｅ３Ｂ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｂ，Ｅ３Ｃ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｃ，Ｌ１：ｖｖＬＭＰ１，Ｌ２ａ：ｖｖＬＭＰ２Ａ，Ｂ１：ｖｖＢＭＬＦ１，ＬＣＬ：ＬＣＬ−ＪＴ）。
【図４Ｉ】Ｔ細胞サブセットの細胞傷害活性およびＥＢＶ潜伏抗原特異性。左側の欄（Ａ〜Ｃ）は、３つのＰＢＭＣ応答動物集団のＣＤ８対ＣＤ４　ＦＡＣＳ染色を示す：（Ａ）ＣＤ２＋ＰＢＭＣ，（Ｂ）ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣおよび（Ｃ）ＣＤ４−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ。中間の欄（Ｄ〜Ｆ）は、これらの応答動物による自己ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ；黒色丸）およびＴ２細胞（Ｔ２；白色丸）に関して観察された溶解を示す。右側の欄（Ｇ〜Ｉ）は、３つの応答動物集団のＥＢＶ潜伏抗原特異性を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて研究した（Ｅ１：ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ，Ｅ２：ｖｖＥＢＮＡ２，Ｅ３Ｂ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｂ，Ｅ３Ｃ：ｖｖＥＢＮＡ３Ｃ，Ｌ１：ｖｖＬＭＰ１，Ｌ２ａ：ｖｖＬＭＰ２Ａ，Ｂ１：ｖｖＢＭＬＦ１，ＬＣＬ：ＬＣＬ−ＪＴ）。
【図５Ａ】ＣＴＬサブセットによるＨＬＡ−ＤＲ拘束およびＥＢＮＡ−１認識。上部に示されるエフェクターは、ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ａ，Ｄ），ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ｂ，Ｅ）またはＣＤ４−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ｃ，Ｆ）のいずれかであった。上部の列（Ａ〜Ｃ）は、５μｇ／ｍｌのＬ２４３，αＨＬＡ−ＤＲ抗体（ＬＣＬ−ＪＴ　＋　Ｌ２４３）の存在下（白色丸、点線）または不在下（黒色丸）における自己Ｂ−ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ）の細胞溶解性を示す。Ｔ２細胞（黒色三角）をコントロールとして使用した。下部の列（Ｄ〜Ｆ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のコントロールタンパク質を適用（ｐｕｌｓｅ）された自己ＤＣ（ｅコントロール；黒色丸）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＥＢＮＡ−１タンパク質（ｅＥＢＮＡ−１；白色丸）、またはバキュロウイルス／昆虫細胞由来のＥＢＮＡ−１タンパク質（ｂＥＢＮＡ−１；黒色三角）に対する比較における、自己Ｂ−ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ；白色三角）に対する溶解活性を示す。
【図５Ｂ】ＣＴＬサブセットによるＨＬＡ−ＤＲ拘束およびＥＢＮＡ−１認識。上部に示されるエフェクターは、ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ａ，Ｄ），ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ｂ，Ｅ）またはＣＤ４−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ｃ，Ｆ）のいずれかであった。上部の列（Ａ〜Ｃ）は、５μｇ／ｍｌのＬ２４３，αＨＬＡ−ＤＲ抗体（ＬＣＬ−ＪＴ　＋　Ｌ２４３）の存在下（白色丸、点線）または不在下（黒色丸）における自己Ｂ−ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ）の細胞溶解性を示す。Ｔ２細胞（黒色三角）をコントロールとして使用した。下部の列（Ｄ〜Ｆ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のコントロールタンパク質を適用（ｐｕｌｓｅ）された自己ＤＣ（ｅコントロール；黒色丸）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＥＢＮＡ−１タンパク質（ｅＥＢＮＡ−１；白色丸）、またはバキュロウイルス／昆虫細胞由来のＥＢＮＡ−１タンパク質（ｂＥＢＮＡ−１；黒色三角）に対する比較における、自己Ｂ−ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ；白色三角）に対する溶解活性を示す。
【図５Ｃ】ＣＴＬサブセットによるＨＬＡ−ＤＲ拘束およびＥＢＮＡ−１認識。上部に示されるエフェクターは、ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ａ，Ｄ），ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ｂ，Ｅ）またはＣＤ４−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ｃ，Ｆ）のいずれかであった。上部の列（Ａ〜Ｃ）は、５μｇ／ｍｌのＬ２４３，αＨＬＡ−ＤＲ抗体（ＬＣＬ−ＪＴ　＋　Ｌ２４３）の存在下（白色丸、点線）または不在下（黒色丸）における自己Ｂ−ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ）の細胞溶解性を示す。Ｔ２細胞（黒色三角）をコントロールとして使用した。下部の列（Ｄ〜Ｆ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のコントロールタンパク質を適用（ｐｕｌｓｅ）された自己ＤＣ（ｅコントロール；黒色丸）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＥＢＮＡ−１タンパク質（ｅＥＢＮＡ−１；白色丸）、またはバキュロウイルス／昆虫細胞由来のＥＢＮＡ−１タンパク質（ｂＥＢＮＡ−１；黒色三角）に対する比較における、自己Ｂ−ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ；白色三角）に対する溶解活性を示す。
【図５Ｄ】ＣＴＬサブセットによるＨＬＡ−ＤＲ拘束およびＥＢＮＡ−１認識。上部に示されるエフェクターは、ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ａ，Ｄ），ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ｂ，Ｅ）またはＣＤ４−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ｃ，Ｆ）のいずれかであった。上部の列（Ａ〜Ｃ）は、５μｇ／ｍｌのＬ２４３，αＨＬＡ−ＤＲ抗体（ＬＣＬ−ＪＴ　＋　Ｌ２４３）の存在下（白色丸、点線）または不在下（黒色丸）における自己Ｂ−ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ）の細胞溶解性を示す。Ｔ２細胞（黒色三角）をコントロールとして使用した。下部の列（Ｄ〜Ｆ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のコントロールタンパク質を適用（ｐｕｌｓｅ）された自己ＤＣ（ｅコントロール；黒色丸）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＥＢＮＡ−１タンパク質（ｅＥＢＮＡ−１；白色丸）、またはバキュロウイルス／昆虫細胞由来のＥＢＮＡ−１タンパク質（ｂＥＢＮＡ−１；黒色三角）に対する比較における、自己Ｂ−ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ；白色三角）に対する溶解活性を示す。
【図５Ｅ】ＣＴＬサブセットによるＨＬＡ−ＤＲ拘束およびＥＢＮＡ−１認識。上部に示されるエフェクターは、ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ａ，Ｄ），ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ｂ，Ｅ）またはＣＤ４−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ｃ，Ｆ）のいずれかであった。上部の列（Ａ〜Ｃ）は、５μｇ／ｍｌのＬ２４３，αＨＬＡ−ＤＲ抗体（ＬＣＬ−ＪＴ　＋　Ｌ２４３）の存在下（白色丸、点線）または不在下（黒色丸）における自己Ｂ−ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ）の細胞溶解性を示す。Ｔ２細胞（黒色三角）をコントロールとして使用した。下部の列（Ｄ〜Ｆ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のコントロールタンパク質を適用（ｐｕｌｓｅ）された自己ＤＣ（ｅコントロール；黒色丸）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＥＢＮＡ−１タンパク質（ｅＥＢＮＡ−１；白色丸）、またはバキュロウイルス／昆虫細胞由来のＥＢＮＡ−１タンパク質（ｂＥＢＮＡ−１；黒色三角）に対する比較における、自己Ｂ−ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ；白色三角）に対する溶解活性を示す。
【図５Ｆ】ＣＴＬサブセットによるＨＬＡ−ＤＲ拘束およびＥＢＮＡ−１認識。上部に示されるエフェクターは、ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ａ，Ｄ），ＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ｂ，Ｅ）またはＣＤ４−ＣＤ２＋ＰＢＭＣ（Ｃ，Ｆ）のいずれかであった。上部の列（Ａ〜Ｃ）は、５μｇ／ｍｌのＬ２４３，αＨＬＡ−ＤＲ抗体（ＬＣＬ−ＪＴ　＋　Ｌ２４３）の存在下（白色丸、点線）または不在下（黒色丸）における自己Ｂ−ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ）の細胞溶解性を示す。Ｔ２細胞（黒色三角）をコントロールとして使用した。下部の列（Ｄ〜Ｆ）は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のコントロールタンパク質を適用（ｐｕｌｓｅ）された自己ＤＣ（ｅコントロール；黒色丸）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＥＢＮＡ−１タンパク質（ｅＥＢＮＡ−１；白色丸）、またはバキュロウイルス／昆虫細胞由来のＥＢＮＡ−１タンパク質（ｂＥＢＮＡ−１；黒色三角）に対する比較における、自己Ｂ−ＬＣＬ（ＬＣＬ−ＪＴ；白色三角）に対する溶解活性を示す。
【図６Ａ】ＣＤ４＋ＣＴＬクローンの特異性。Ｂ−ＬＣＬを、２つの白血球濃縮物のサンプルから生成した。次いで、低温保存されたＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣを、限界希釈下でこれらの自己Ｂ−ＬＣＬで２週間刺激した。その後、ウェルを分割し、そしてｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ（白色棒）またはｖｖＴＫ−（黒色棒）感染ＤＣ、ならびに自己Ｂ−ＬＣＬ（灰色棒）およびＬＣＬ７２１．２２１（第２の白色棒）、ＨＬＡクラスＩ　ＮＫ標的に対する５１Ｃｒ放出アッセイにおいて試験した。ＥＢＶトランスフォームＢ細胞上のＥＢＮＡ−１エピトープを認識する１１個のクローンを示す。これらは、２回の独立した実験（Ａ，Ｂ）において２つの白血球濃縮物に由来した。
【図６Ｂ】ＣＤ４＋ＣＴＬクローンの特異性。Ｂ−ＬＣＬを、２つの白血球濃縮物のサンプルから生成した。次いで、低温保存されたＣＤ８−ＣＤ２＋ＰＢＭＣを、限界希釈下でこれらの自己Ｂ−ＬＣＬで２週間刺激した。その後、ウェルを分割し、そしてｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ（白色棒）またはｖｖＴＫ−（黒色棒）感染ＤＣ、ならびに自己Ｂ−ＬＣＬ（灰色棒）およびＬＣＬ７２１．２２１（第２の白色棒）、ＨＬＡクラスＩ　ＮＫ標的に対する５１Ｃｒ放出アッセイにおいて試験した。ＥＢＶトランスフォームＢ細胞上のＥＢＮＡ−１エピトープを認識する１１個のクローンを示す。これらは、２回の独立した実験（Ａ，Ｂ）において２つの白血球濃縮物に由来した。
【図７】ＥＢＮＡ−１特異的Ｔ細胞応答は、ＴＨ１サイトカイン分泌によって支配される。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡまたはｖｖＴＫ−（ネガティブコントロール）に感染させた樹状細胞で刺激し、そしてＴ細胞単離の日（１日目）および１週間の増大後（７日目）におけるＩＦＮ−γ（Ａ）またはＩＬ−４（Ｂ）のその分泌を試験した。示される値は、三連の平均であり、そしてＥＢＮＡ−１特異的スポットの数からネガティブコントロールを差し引くことによって導き出された。ｖｖＴＫ−コントロールの値は、０〜１０５の範囲であった。ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ応答は、それがｖｖＴＫ−ネガティブコントロールよりも少なくとも１０スポット多く、かつネガティブコントロールのスポットの少なくとも２倍である場合に、有意とみなした。
【図８Ａ】ＥＢＮＡ−１特異的応答は、非常に低い用量の抗原で検出され得る。組換えＥＢＮＡ−１タンパク質またはコントロール増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターから溶出した。Ａ．タンパク質を、一晩透析し、そしてＳＤＳ　ＰＡＧＥで純度について試験した。回収されたｒＥＢＮＡ−１タンパク質を、抗ＥＢＮＡ−１抗体ＭＡＢ８１７３を使用するウェスタンブロッティングによって、特異性について試験した。抗体ＡＤ１．１．１０は、ｒＥＢＮＡ−１タンパク質に含まれるヒスチジンタグを認識する。Ｂ．ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣを使用して、１週間の培養においてＣＤ４＋Ｔ細胞を増大させた。増大させたＴ細胞を、示される濃度のｒＥＢＮＡ−１タンパク質またはｒＰＣＮＡコントロールタンパク質を適用したＤＣを用いて最刺激し、そしてＥＬＩＳＰＯＴで読み取った。ｒＥＢＮＡ−１タンパク質を、ＤＣ培養の成熟相（６〜８日目）の間にＤＣに添加した。差込みグラフは、１週間ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで増大され、そしてｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣまたはｖｖＴＫ−コントロールのいずれかで再刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞に関するＥＬＩＳＰＯＴ結果を示す。
【図８Ｂ】ＥＢＮＡ−１特異的応答は、非常に低い用量の抗原で検出され得る。組換えＥＢＮＡ−１タンパク質またはコントロール増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターから溶出した。Ａ．タンパク質を、一晩透析し、そしてＳＤＳ　ＰＡＧＥで純度について試験した。回収されたｒＥＢＮＡ−１タンパク質を、抗ＥＢＮＡ−１抗体ＭＡＢ８１７３を使用するウェスタンブロッティングによって、特異性について試験した。抗体ＡＤ１．１．１０は、ｒＥＢＮＡ−１タンパク質に含まれるヒスチジンタグを認識する。Ｂ．ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣを使用して、１週間の培養においてＣＤ４＋Ｔ細胞を増大させた。増大させたＴ細胞を、示される濃度のｒＥＢＮＡ−１タンパク質またはｒＰＣＮＡコントロールタンパク質を適用したＤＣを用いて最刺激し、そしてＥＬＩＳＰＯＴで読み取った。ｒＥＢＮＡ−１タンパク質を、ＤＣ培養の成熟相（６〜８日目）の間にＤＣに添加した。差込みグラフは、１週間ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで増大され、そしてｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣまたはｖｖＴＫ−コントロールのいずれかで再刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞に関するＥＬＩＳＰＯＴ結果を示す。
【図８Ｃ】ＥＢＮＡ−１特異的応答は、非常に低い用量の抗原で検出され得る。組換えＥＢＮＡ−１タンパク質またはコントロール増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターから溶出した。Ａ．タンパク質を、一晩透析し、そしてＳＤＳ　ＰＡＧＥで純度について試験した。回収されたｒＥＢＮＡ−１タンパク質を、抗ＥＢＮＡ−１抗体ＭＡＢ８１７３を使用するウェスタンブロッティングによって、特異性について試験した。抗体ＡＤ１．１．１０は、ｒＥＢＮＡ−１タンパク質に含まれるヒスチジンタグを認識する。Ｂ．ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣを使用して、１週間の培養においてＣＤ４＋Ｔ細胞を増大させた。増大させたＴ細胞を、示される濃度のｒＥＢＮＡ−１タンパク質またはｒＰＣＮＡコントロールタンパク質を適用したＤＣを用いて最刺激し、そしてＥＬＩＳＰＯＴで読み取った。ｒＥＢＮＡ−１タンパク質を、ＤＣ培養の成熟相（６〜８日目）の間にＤＣに添加した。差込みグラフは、１週間ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで増大され、そしてｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣまたはｖｖＴＫ−コントロールのいずれかで再刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞に関するＥＬＩＳＰＯＴ結果を示す。
【図９】新鮮な血液由来のＥＢＮＡ−１特異的細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。新鮮な単離されたＰＢＭＣを、ＩＦＮγの最大産生のための７時間か、またはＩＬ−４のための１８時間のいずれかにわたって、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染樹状細胞で刺激した。次いで、これらを、ＩＦＮγまたはＩＬ−４のいずれかの選択に基づいて、陽性選択した。ＩＦＮγ細胞株を、６／６のドナーにおいて確立し、そしてＩＬ−４細胞株を３／６のドナーにおいて確立した。示されるのは、ＦＡＣＳによって分析された３つのＩＦＮγ株のコントロール株（Ａ，Ｂ，Ｃ）ＣＤ４およびＣＤ８株（Ｄ，Ｅ，Ｆ）である。ゲート（ｇａｔｅ）を、ヨウ化プロピジウム染色によって決定されるような、リンパ球集団および生細胞に対して設定した。
【図１０Ａ】ＥＢＮＡ−１特異的ＴＨ２細胞ではなく、ＥＢＮＡ−１特異的ＴＨ１細胞は、ＥＢＮＡ−１発現ＤＣを溶解する。７時間（ＩＦＮγ）または１８時間（ＩＬ−４）のいずれかにわたってｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激されたＰＢＭＣから細胞株を単離した。次いで、これらの細胞を、ＩＦＮγまたはＩＬ−４の分泌に基づいて陽性選択した。ＥＢＮＡ−１特異的ＩＦＮγおよびＩＬ−４産生細胞を、それぞれ、６／６のドナーおよび３／６のドナーから単離した。これらの細胞を、ｒＥＢＮＡ−１タンパク質を適用したＤＣと交替する照射ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣの毎週の再刺激によって増大させた。Ａ，Ｂ．細胞を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染（白色棒）またはｖｖＴＫ−感染（黒色棒）ＤＣで再刺激し、そして３週間の増大後に、ＩＦＮγまたはＩＬ−４のいずれかの分泌について試験した。ＴＨ１細胞株の代表であるＬＤ０３から単離されたＩＦＮγ分泌細胞株を、パネルＡに示し、そしてＬＤ０１由来の代表的なＥＢＮＡ−１特異的ＩＬ−４分泌細胞株をパネルＢに例示する。Ｃ，Ｄ．次いで、細胞を、５１Ｃｒ放出アッセイによって、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣを溶解するその能力について試験した。Ｃ．ＬＤ０３細胞株からの５１Ｃｒ放出の結果を、標的に対する類別したエフェクターの比率で示す。これらは、６つ全ての確立されたＩＦＮγ細胞株の代表である。Ｄ．示される結果は、ＬＤ０１から確立された細胞株からの結果である。これらは、単離されたすべてのＩＬ−４分泌細胞株の代表である。Ｅ．１０：１の比率のエフェクター：標的でのＣＴＬアッセイの結果を、コントロール（それぞれ、ｖｖＴＫ，ｒＰＣＮＡコントロールタンパク質，Ｔ２細胞）と比較した場合の、ＥＢＮＡ−１抗原（ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ，ｒＥＢＮＡ−１またはＢＬＣＬにおいて生理的に発現されるタンパク質）の３つの供給源についての５つのＩＦＮγ細胞株および３つのＩＬ−４株に関して示す。異なる記号は、各細胞株の代表であり、白色がＴＨ１細胞株そして黒色がＴＨ２細胞株である。同一ドナーから単離されたＴＨ１細胞株およびＴＨ２細胞株は、記号の形状を共有する。
【図１０Ｂ】ＥＢＮＡ−１特異的ＴＨ２細胞ではなく、ＥＢＮＡ−１特異的ＴＨ１細胞は、ＥＢＮＡ−１発現ＤＣを溶解する。７時間（ＩＦＮγ）または１８時間（ＩＬ−４）のいずれかにわたってｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激されたＰＢＭＣから細胞株を単離した。次いで、これらの細胞を、ＩＦＮγまたはＩＬ−４の分泌に基づいて陽性選択した。ＥＢＮＡ−１特異的ＩＦＮγおよびＩＬ−４産生細胞を、それぞれ、６／６のドナーおよび３／６のドナーから単離した。これらの細胞を、ｒＥＢＮＡ−１タンパク質を適用したＤＣと交替する照射ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣの毎週の再刺激によって増大させた。Ａ，Ｂ．細胞を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染（白色棒）またはｖｖＴＫ−感染（黒色棒）ＤＣで再刺激し、そして３週間の増大後に、ＩＦＮγまたはＩＬ−４のいずれかの分泌について試験した。ＴＨ１細胞株の代表であるＬＤ０３から単離されたＩＦＮγ分泌細胞株を、パネルＡに示し、そしてＬＤ０１由来の代表的なＥＢＮＡ−１特異的ＩＬ−４分泌細胞株をパネルＢに例示する。Ｃ，Ｄ．次いで、細胞を、５１Ｃｒ放出アッセイによって、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣを溶解するその能力について試験した。Ｃ．ＬＤ０３細胞株からの５１Ｃｒ放出の結果を、標的に対する類別したエフェクターの比率で示す。これらは、６つ全ての確立されたＩＦＮγ細胞株の代表である。Ｄ．示される結果は、ＬＤ０１から確立された細胞株からの結果である。これらは、単離されたすべてのＩＬ−４分泌細胞株の代表である。Ｅ．１０：１の比率のエフェクター：標的でのＣＴＬアッセイの結果を、コントロール（それぞれ、ｖｖＴＫ，ｒＰＣＮＡコントロールタンパク質，Ｔ２細胞）と比較した場合の、ＥＢＮＡ−１抗原（ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ，ｒＥＢＮＡ−１またはＢＬＣＬにおいて生理的に発現されるタンパク質）の３つの供給源についての５つのＩＦＮγ細胞株および３つのＩＬ−４株に関して示す。異なる記号は、各細胞株の代表であり、白色がＴＨ１細胞株そして黒色がＴＨ２細胞株である。同一ドナーから単離されたＴＨ１細胞株およびＴＨ２細胞株は、記号の形状を共有する。
【図１０Ｃ】ＥＢＮＡ−１特異的ＴＨ２細胞ではなく、ＥＢＮＡ−１特異的ＴＨ１細胞は、ＥＢＮＡ−１発現ＤＣを溶解する。７時間（ＩＦＮγ）または１８時間（ＩＬ−４）のいずれかにわたってｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激されたＰＢＭＣから細胞株を単離した。次いで、これらの細胞を、ＩＦＮγまたはＩＬ−４の分泌に基づいて陽性選択した。ＥＢＮＡ−１特異的ＩＦＮγおよびＩＬ−４産生細胞を、それぞれ、６／６のドナーおよび３／６のドナーから単離した。これらの細胞を、ｒＥＢＮＡ−１タンパク質を適用したＤＣと交替する照射ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣの毎週の再刺激によって増大させた。Ａ，Ｂ．細胞を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染（白色棒）またはｖｖＴＫ−感染（黒色棒）ＤＣで再刺激し、そして３週間の増大後に、ＩＦＮγまたはＩＬ−４のいずれかの分泌について試験した。ＴＨ１細胞株の代表であるＬＤ０３から単離されたＩＦＮγ分泌細胞株を、パネルＡに示し、そしてＬＤ０１由来の代表的なＥＢＮＡ−１特異的ＩＬ−４分泌細胞株をパネルＢに例示する。Ｃ，Ｄ．次いで、細胞を、５１Ｃｒ放出アッセイによって、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣを溶解するその能力について試験した。Ｃ．ＬＤ０３細胞株からの５１Ｃｒ放出の結果を、標的に対する類別したエフェクターの比率で示す。これらは、６つ全ての確立されたＩＦＮγ細胞株の代表である。Ｄ．示される結果は、ＬＤ０１から確立された細胞株からの結果である。これらは、単離されたすべてのＩＬ−４分泌細胞株の代表である。Ｅ．１０：１の比率のエフェクター：標的でのＣＴＬアッセイの結果を、コントロール（それぞれ、ｖｖＴＫ，ｒＰＣＮＡコントロールタンパク質，Ｔ２細胞）と比較した場合の、ＥＢＮＡ−１抗原（ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ，ｒＥＢＮＡ−１またはＢＬＣＬにおいて生理的に発現されるタンパク質）の３つの供給源についての５つのＩＦＮγ細胞株および３つのＩＬ−４株に関して示す。異なる記号は、各細胞株の代表であり、白色がＴＨ１細胞株そして黒色がＴＨ２細胞株である。同一ドナーから単離されたＴＨ１細胞株およびＴＨ２細胞株は、記号の形状を共有する。
【図１０Ｄ】ＥＢＮＡ−１特異的ＴＨ２細胞ではなく、ＥＢＮＡ−１特異的ＴＨ１細胞は、ＥＢＮＡ−１発現ＤＣを溶解する。７時間（ＩＦＮγ）または１８時間（ＩＬ−４）のいずれかにわたってｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激されたＰＢＭＣから細胞株を単離した。次いで、これらの細胞を、ＩＦＮγまたはＩＬ−４の分泌に基づいて陽性選択した。ＥＢＮＡ−１特異的ＩＦＮγおよびＩＬ−４産生細胞を、それぞれ、６／６のドナーおよび３／６のドナーから単離した。これらの細胞を、ｒＥＢＮＡ−１タンパク質を適用したＤＣと交替する照射ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣの毎週の再刺激によって増大させた。Ａ，Ｂ．細胞を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染（白色棒）またはｖｖＴＫ−感染（黒色棒）ＤＣで再刺激し、そして３週間の増大後に、ＩＦＮγまたはＩＬ−４のいずれかの分泌について試験した。ＴＨ１細胞株の代表であるＬＤ０３から単離されたＩＦＮγ分泌細胞株を、パネルＡに示し、そしてＬＤ０１由来の代表的なＥＢＮＡ−１特異的ＩＬ−４分泌細胞株をパネルＢに例示する。Ｃ，Ｄ．次いで、細胞を、５１Ｃｒ放出アッセイによって、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣを溶解するその能力について試験した。Ｃ．ＬＤ０３細胞株からの５１Ｃｒ放出の結果を、標的に対する類別したエフェクターの比率で示す。これらは、６つ全ての確立されたＩＦＮγ細胞株の代表である。Ｄ．示される結果は、ＬＤ０１から確立された細胞株からの結果である。これらは、単離されたすべてのＩＬ−４分泌細胞株の代表である。Ｅ．１０：１の比率のエフェクター：標的でのＣＴＬアッセイの結果を、コントロール（それぞれ、ｖｖＴＫ，ｒＰＣＮＡコントロールタンパク質，Ｔ２細胞）と比較した場合の、ＥＢＮＡ−１抗原（ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ，ｒＥＢＮＡ−１またはＢＬＣＬにおいて生理的に発現されるタンパク質）の３つの供給源についての５つのＩＦＮγ細胞株および３つのＩＬ−４株に関して示す。異なる記号は、各細胞株の代表であり、白色がＴＨ１細胞株そして黒色がＴＨ２細胞株である。同一ドナーから単離されたＴＨ１細胞株およびＴＨ２細胞株は、記号の形状を共有する。
【図１０Ｅ】ＥＢＮＡ−１特異的ＴＨ２細胞ではなく、ＥＢＮＡ−１特異的ＴＨ１細胞は、ＥＢＮＡ−１発現ＤＣを溶解する。７時間（ＩＦＮγ）または１８時間（ＩＬ−４）のいずれかにわたってｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣで刺激されたＰＢＭＣから細胞株を単離した。次いで、これらの細胞を、ＩＦＮγまたはＩＬ−４の分泌に基づいて陽性選択した。ＥＢＮＡ−１特異的ＩＦＮγおよびＩＬ−４産生細胞を、それぞれ、６／６のドナーおよび３／６のドナーから単離した。これらの細胞を、ｒＥＢＮＡ−１タンパク質を適用したＤＣと交替する照射ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣの毎週の再刺激によって増大させた。Ａ，Ｂ．細胞を、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染（白色棒）またはｖｖＴＫ−感染（黒色棒）ＤＣで再刺激し、そして３週間の増大後に、ＩＦＮγまたはＩＬ−４のいずれかの分泌について試験した。ＴＨ１細胞株の代表であるＬＤ０３から単離されたＩＦＮγ分泌細胞株を、パネルＡに示し、そしてＬＤ０１由来の代表的なＥＢＮＡ−１特異的ＩＬ−４分泌細胞株をパネルＢに例示する。Ｃ，Ｄ．次いで、細胞を、５１Ｃｒ放出アッセイによって、ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ感染ＤＣを溶解するその能力について試験した。Ｃ．ＬＤ０３細胞株からの５１Ｃｒ放出の結果を、標的に対する類別したエフェクターの比率で示す。これらは、６つ全ての確立されたＩＦＮγ細胞株の代表である。Ｄ．示される結果は、ＬＤ０１から確立された細胞株からの結果である。これらは、単離されたすべてのＩＬ−４分泌細胞株の代表である。Ｅ．１０：１の比率のエフェクター：標的でのＣＴＬアッセイの結果を、コントロール（それぞれ、ｖｖＴＫ，ｒＰＣＮＡコントロールタンパク質，Ｔ２細胞）と比較した場合の、ＥＢＮＡ−１抗原（ｖｖＥＢＮＡ−１ΔＧＡ，ｒＥＢＮＡ−１またはＢＬＣＬにおいて生理的に発現されるタンパク質）の３つの供給源についての５つのＩＦＮγ細胞株および３つのＩＬ−４株に関して示す。異なる記号は、各細胞株の代表であり、白色がＴＨ１細胞株そして黒色がＴＨ２細胞株である。同一ドナーから単離されたＴＨ１細胞株およびＴＨ２細胞株は、記号の形状を共有する。
【図１１Ａ】ＥＢＮＡ−１特異的抗体は、主にＩｇＧ１である。値を各ドナーについて示し、平均値を黒色棒で示す。各ＩｇＧサブクラスについての抗原の不在下におけるバックグラウンドレベル（Ａ）を、微生物タンパク質での結果から差し引いた。ｒＥＢＮＡ−１タンパク質に対して特異的な抗体のＩｇＧサブクラス分配を示し（Ｂ）、同様に、破傷風トキソイド（Ｃ）、カンジダ属（Ｄ）およびマンプス（Ｅ）に対するＩｇＧサブクラス分配を示す。
【図１１Ｂ】ＥＢＮＡ−１特異的抗体は、主にＩｇＧ１である。値を各ドナーについて示し、平均値を黒色棒で示す。各ＩｇＧサブクラスについての抗原の不在下におけるバックグラウンドレベル（Ａ）を、微生物タンパク質での結果から差し引いた。ｒＥＢＮＡ−１タンパク質に対して特異的な抗体のＩｇＧサブクラス分配を示し（Ｂ）、同様に、破傷風トキソイド（Ｃ）、カンジダ属（Ｄ）およびマンプス（Ｅ）に対するＩｇＧサブクラス分配を示す。
【図１１Ｃ】ＥＢＮＡ−１特異的抗体は、主にＩｇＧ１である。値を各ドナーについて示し、平均値を黒色棒で示す。各ＩｇＧサブクラスについての抗原の不在下におけるバックグラウンドレベル（Ａ）を、微生物タンパク質での結果から差し引いた。ｒＥＢＮＡ−１タンパク質に対して特異的な抗体のＩｇＧサブクラス分配を示し（Ｂ）、同様に、破傷風トキソイド（Ｃ）、カンジダ属（Ｄ）およびマンプス（Ｅ）に対するＩｇＧサブクラス分配を示す。
【図１１Ｄ】ＥＢＮＡ−１特異的抗体は、主にＩｇＧ１である。値を各ドナーについて示し、平均値を黒色棒で示す。各ＩｇＧサブクラスについての抗原の不在下におけるバックグラウンドレベル（Ａ）を、微生物タンパク質での結果から差し引いた。ｒＥＢＮＡ−１タンパク質に対して特異的な抗体のＩｇＧサブクラス分配を示し（Ｂ）、同様に、破傷風トキソイド（Ｃ）、カンジダ属（Ｄ）およびマンプス（Ｅ）に対するＩｇＧサブクラス分配を示す。
【図１１Ｅ】ＥＢＮＡ−１特異的抗体は、主にＩｇＧ１である。値を各ドナーについて示し、平均値を黒色棒で示す。各ＩｇＧサブクラスについての抗原の不在下におけるバックグラウンドレベル（Ａ）を、微生物タンパク質での結果から差し引いた。ｒＥＢＮＡ−１タンパク質に対して特異的な抗体のＩｇＧサブクラス分配を示し（Ｂ）、同様に、破傷風トキソイド（Ｃ）、カンジダ属（Ｄ）およびマンプス（Ｅ）に対するＩｇＧサブクラス分配を示す。
【図１Ｆ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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