(57)【要約】本発明は、哺乳動物の細胞にタンパク質を加えた後にその細胞の表面に提示されるペプチドを決定する方法に関する。本発明はまた、このようなペプチドの決定、またはこのようなペプチドの決定によって生み出された薬剤実体などの修飾された分子に基づく診断のための検査に関する。このような分子は特定の生物活性を有し、修飾されていない対応する分子に比べてより低い免疫原性またはより高い免疫原性を有することが好ましい。本発明に基づく方法は、質量分光法（ＭＳ）を使用したツールを用いて確立されることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の生物活性を有し、かつ同じ生物活性を有する非修飾タンパク質またはポリペプチドよりも低い免疫原性または高い免疫原性を有する薬剤タンパク質またはポリペプチド、あるいはワクチン抗原を開発する方法であって、
（ｉ）前記タンパク質またはポリペプチドと細胞とを接触させ、接触させなかった基準細胞上に表示される表面ペプチドのレパートリーとは異なる細胞またはそのエキソソームビヒクル上の表面ペプチドのレパートリーを生成させ、
（ｉｉ）前記細胞またはそのエキソソームベシクルの表面に結合されたペプチドに関して、前記細胞またはそのエキソソームベシクルを分析し、
（ｉｉｉ）前記ペプチドを、薬剤タンパク質またはポリペプチド、あるいはワクチン抗原の配列に標準の方法に従って割り当てる
ことによって実行される方法。
【請求項２】
（ｉｖ）前記ペプチドを修飾して、前記ペプチドのＭＨＣ分子への結合が変更されるようにする段階と、
（ｖ）修飾した１つまたは複数のペプチド配列を、タンパク質またはポリペプチド分子配列内に標準の方法に従って組み込むことによって、最終的な薬剤タンパク質またはポリペプチドの配列変異体を構築する段階と
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｉｉ）の前記細胞またはそのエキソソームビヒクルの分析が、質量分光法（ＭＳ）を使用して実行される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＡＬＤＩ−ＭＳが使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＥＳＩ−ＭＳが使用される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
薬剤タンパク質またはポリペプチドが、前記タンパク質またはポリペプチドと細胞を接触させた後に１つまたは複数の前記ペプチドがもはや結合しないように修飾される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
段階（ｉ）に基づいて細胞またはエキソソームベシクルの表面に結合されたペプチドがＭＨＣ分子と結合し、段階（ｉｉ）に基づく前記細胞またはそのエキソソームベシクルの分析がＭＳを使用して実行される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
段階（ｉ）に基づいて細胞またはエキソソームベシクルの表面に結合されたペプチドが、細胞内ペプチダーゼおよび転送経路の生成物である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
より低い免疫原性を有する薬剤タンパク質またはポリペプチドを開発するための請求項１から８のいずれか一項に記載の方法であって、免疫原性ペプチドの修飾が、ペプチドのＭＨＣ分子への結合を排除または低減させ、任意選択で、請求項１に指示された細胞表面への結合に関して修飾したペプチドをテストすることによって実行される方法。
【請求項１０】
ＭＨＣ分子に対するペプチドの結合の排除または低減が、薬剤タンパク質またはポリペプチド中のペプチドの配列領域内の１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、挿入しまたは削除することによって実行される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
より高い免疫原性を有する薬剤タンパク質またはポリペプチドを開発するための請求項１から８のいずれか一項に記載の方法であって、ペプチドの修飾が、ペプチドのＭＨＣ分子への結合を強化し、任意選択で、請求項１に指示された細胞表面への結合に関して修飾したペプチドをテストすることによって実行される方法。
【請求項１２】
ＭＨＣ分子へのペプチドの結合の強化が、ペプチドの配列領域内の１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、挿入しまたは削除し、Ｔ細胞エピトープとして機能するペプチドの活性を増大させ、および／またはＴ細胞エピトープが拘束されるＭＨＣタイプの範囲を広げ、および／またはいくつかの異なるエピトープを単一の実体に結合することによって実行される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ワクチンの開発方法であって、
（ｉ）免疫原活性を有するタンパク質またはポリペプチドあるいは微生物と細胞とを接触させ、接触させなかった基準細胞上に表示される表面ペプチドのレパートリーとは異なる前記細胞またはそのエキソソームベシクル上の表面ペプチドのレパートリーを生成させ、
（ｉｉ）ペプチドが結合した表面に関して前記細胞またはそのエキソソームベシクルを分析し、
（ｉｉｉ）前記ペプチドを、タンパク質またはポリペプチドの配列に標準の方法に従って割り当て、
（ｉｖ）１つまたは複数のペプチドを、ワクチン分子配列内に標準の方法に従って組み込むことによって、最終的な薬剤ワクチンの配列変異体を構築し、
前記細胞またはその中のエキソソームベシクルの分析がＭＳを使用して実行される
方法。
【請求項１４】
ＭＨＣ分子を産生するように操作されたヒト細胞系統を使用する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
親（非操作）細胞系統がＭＨＣ分子を産生しない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
親細胞系統がＭＨＣクラスＩ分子を産生しない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
親細胞系統がＭＨＣクラスＩＩ分子を産生しない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
それ自体のＭＨＣ分子を産生しない非ヒト細胞がＭＨＣ分子を産生するように操作され、指示されるように使用される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩＩに由来する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＨＣ分子がＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩに由来する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
さまざまなＭＨＣアロタイプおよび遺伝子型の包括的な混合物を提供する細胞系統または細胞試料の組合せが使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
ペプチドが外因性タンパク質または微生物を起源とする、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ペプチドが内因性タンパク質を起源とする、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
タンパク質、ポリペプチドまたは微生物を加えた後にＭＨＣ分子上にペプチドを提示するヒト樹状細胞またはそのエキソソームベシクルが使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
タンパク質またはポリペプチドを加えた後にＭＨＣ分子上にペプチドを提示するヒト抗原提示細胞またはそのエキソソームベシクルが使用される、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ペプチド分析の前にＭＨＣ分子が濃縮される、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
分析の前にペプチドが細胞表面から溶離される、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
分析の前にペプチドがＭＨＣ分子から溶離される、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
診断のための検査を開発する方法であって、
（ｉ）表面ペプチドに対して適当なヒト細胞を分析し、
（ｉｉ）（ａ）細胞表面に現れたペプチドのプロファイルを作成し、任意選択で、ヒト細胞に関連した異常または病気を識別するために他のプロファイルと比較し、または（ｂ）細胞表面上に特異的なペプチドの配列を、ヒト細胞に関連した異常または病気を識別するのに使用することができる特異的なペプチドを決定する手段として決定する
ことによって実行される方法。
【請求項３１】
請求項１から８のいずれか一項に記載の方法によって得られたタンパク質またはポリペプチドを薬剤治療実体として使用すること。
【請求項３２】
請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法によって得られたタンパク質またはポリペプチドをワクチンとして使用すること。
【請求項３３】
請求項９または１０に記載の方法によって得られたタンパク質またはポリペプチドを、より低いイモノゲニシティを有する薬剤治療実体として使用すること。
【請求項３４】
タンパク質またはポリペプチドに由来する、細胞またはそのエキソソームベシクルの表面のペプチドを検出する方法であって、
（ｉ）前記タンパク質またはポリペプチド、あるいはこのタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子と細胞を接触させ、接触させなかった基準細胞上に表示される表面ペプチドのレパートリーとは異なる細胞またはそのエキソソームベシクル上の表面ペプチドのレパートリーを生成させ、
（ｉｉ）ペプチドが結合した表面に関して前記細胞またはそのエキソソームベシクルを分析し、
（ｉｉｉ）前記ペプチドを、タンパク質またはポリペプチドの配列に標準の方法に従って割り当て、
細胞またはエキソソームベシクルの分析がＭＳ、好ましくはＭＡＬＤＩ−ＭＳによって実行される
方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、哺乳動物の細胞にタンパク質を加えた後に細胞の表面に提示されるペプチドを決定する方法に関する。本発明はさらに、このようなペプチドの決定に基づく診断のための検査、またはこのようなペプチドの決定によって生み出された、例えば薬剤実体などの、好ましくは特定の生物活性を有し、修飾されていない対応する分子に比べてより低い免疫原性またはより高い免疫原性を有する、修飾された分子に関する。本発明に基づく方法は、質量分光法（ＭＳ）を使用したツールを用いて確立されることが好ましい。
【０００２】
哺乳動物の細胞によるタンパク質の取込み（または細胞内での特定のタンパク質の産生）の後、これらのタンパク質は分解され、一般に、このようなタンパク質のペプチド断片が、しばしば他のタンパク質と結合して細胞の表面に現れる。具体的には、タンパク質のペプチド断片は分解され、ある種のペプチドは続いて、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子と結合する。多くの場合、これはＴ細胞によって認識されて免疫応答が開始される。例えば、そこからペプチド断片が誘導される特定のタンパク質を産生する細胞に免疫系が対抗する場合、このような免疫応答は有益であり、例えば、特定のタンパク質に結合しその活性を制限する抗体を産生する場合、免疫系は有害である（例えば薬剤タンパク質の場合など）。
【０００３】
現在までのところ所与のタンパク質について、その分解がタンパク質のどの位置で起こるかを正確に予測することは不可能であり、そのため、細胞表面に現れる正確なペプチドを確実に予測することはできない。ＭＨＣ分子の場合、ＭＨＣに結合するペプチドのモチーフの予測においてはある程度成功したものもあったが、実際には、ＭＨＣ分子に到達する前にこれらのペプチドの一部は分解し、どのペプチドが分解されるかの予測の信頼度は高くない。したがって、細胞表面上のペプチドを検出する標準の方法は、このようなペプチドを溶離させ、その後にその配列を決定する方法である。このような方法はルーチンの方法とは言えず、さらに、複数の細胞タイプまたは複数のＭＨＣ分子上の細胞表面ペプチドの分析が必要な場合には非実用的である。
【０００４】
本発明の目的は、特に複数のＭＨＣ分子によって提示された細胞の表面のペプチドを検出する方法を提供することにある。さらに本発明の目的は、このような情報を、薬剤分子の設計、ワクチン分子の設計または診断のための検査に使用することにある。
【０００５】
薬剤分子に関する本発明の特定の目的は、細胞によるタンパク質の取込みまたは産生の後にＭＨＣ分子によって提示されるペプチドを識別し、この情報を使用して、このようなペプチドがもはや提示されないようにタンパク質を改変することにある。
【０００６】
ワクチン分子に関する本発明の特定の目的は、細胞によるタンパク質の取込みまたは産生の後にＭＨＣ分子によって提示されるペプチドを識別し、１つまたは複数のこのようなペプチドをワクチン分子中で使用して免疫系を刺激することにある。
【０００７】
薬剤分子とワクチン分子の両方に関する本発明の特定の目的は、さまざまな集団全体を通じて異なるアロタイプおよび遺伝子型バリアントを包含する多くの異なるＭＨＣ分子によって提示されるペプチドを識別することにある。
【０００８】
診断のための検査に関する本発明の特定の目的は、細胞によるタンパク質の取込みまたは産生の後にＭＨＣ分子によって提示されるペプチドを決定し、このような決定を、生物学的または生理学的な事象、例えば感染、を検出するための検査の基礎として使用することにある。
【０００９】
診断のための検査に関する特定の目的は、検査個体の細胞によって提示されるペプチドを識別することにある。
【００１０】
本発明は、細胞表面のペプチド、特に結合ＭＨＣ分子中のペプチドの正確かつ包括的な分析を提供する。細胞表面のペプチドの特性または同一性の決定は特に質量分析法（ＭＳ）で行なわれた。
【００１１】
かつて、特定の目的のためにＭＨＣ／ペプチド複合体が精製された。実際、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子に関して、これらを免疫学的に濃縮し精製する方法は、ペプチド−ＭＨＣ結合相互作用の解明を可能にするのに役立ち、ＭＨＣ結合モチーフの解明を可能にした。関連する例には、ＵＳ５９８９５６５およびＵＳ６０７７５１９などがある。これらには、患者の腫瘍細胞または樹状細胞集団の表面からペプチドを酸溶離させることによって、自己由来Ｔ細胞エピトープを識別する方法が提供されている。溶離されたペプチド配列は、ワクチンを産生するための合成ペプチドの設計に利用することができる。
【００１２】
同様に、Ｓａｌｔｅｒ他［ＵＳ５４８７９８２］は、突然変異ＭＨＣクラスＩ分子に結合したペプチドを、イン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で成長させた遺伝子操作した細胞から容易に除去することができる遺伝子操作した温度感受性ＭＨＣクラスＩ分子を提供している。
【００１３】
この技術の他の例にはＬａｎｇｌａｄｅ−Ｄｅｍｏｙｅｎ他［ＷＯ９７４４６６７］が含まれる。これは、腫瘍の免疫治療用の腫瘍特異的Ｔ細胞のｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏでの濃縮、および他の応用のために、精製されたＭＨＣ−ペプチド複合体を親和性試薬として利用する。同様にＵＳ５７６３５８５、ＵＳ５７３４０２３他は、治療用実体として例えば自己免疫性疾患の治療で使用するための特定のＭＨＣペプチド複合体の精製方法を提供しており、Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ他［ＷＯ９７４０８５２］は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質への結合が強化された修飾ペプチドを開示している。全ての複合体が組換え融合タンパク質として提供される場合には、自己反応性Ｔ細胞に関連した疾患の治療に使用される。
【００１４】
ＷＯ９７３４１４３およびＵＳ５７９２６０４は、細胞の分泌経路によって内因的にプロセシングされたＭＨＣクラスＩ拘束抗原を識別する方法を提供している。この生物学的アッセイは、初回刺激を受けた細胞障害性Ｔ細胞と、培地に分泌されたプロセシングされたペプチドの存在によって細胞溶解がその上に導かれる「インジケータ」標的細胞源と、を必要とする。この方式は、ドナー細胞の内因性プロセシング経路に影響を及ぼすことができる物質の識別に利用することができる。識別ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ拘束Ｔ細胞エピトープのための、生物学的に複合体に基づく他の方式には、ＷＯ００／６７７６１が含まれる。これには、遺伝学的なワクチン接種ならびに樹状細胞および脾細胞の分離を利用して生物学的Ｔ細胞活性化検定をｉｎ　ｖｉｔｒｏで実施する方法が提供されている。
【００１５】
本発明の発明者は、ＭＳベースの機器を完全な細胞または細胞抽出物の分析に適用し、そのデータを、治療用分子または診断のための検定の合理的な開発のための経路に組み込むことができることを認めた。
【００１６】
生物起源の大きくかつ複雑な分子は質量分光法（ＭＳ）を使用した分析に適している。ただし分子はイオン化されていなければならない。ＭＳのために生体分子をイオン化する２つの代替方法が、この技術分野では認められた技術となっている。これらは、エレクトロスプレーイオン化（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ　ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ：ＥＳＩ）およびマトリックス支援レーザ脱着イオン化（ｍａｔｒｉｘ　ａｓｓｉｓｔｅｄ　ｌａｓｅｒ　ｄｅ−ｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ：ＭＡＬＤＩ）である。ＥＳＩでは、帯電させた細い毛細管を通して試料をポンピングし、静電的な反発によって最終的に検体イオンの脱着が生じるまで平行ガス流によって質量分析計の中へ噴霧する。ＥＳＩは連続流技法であり、そのため、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）またはキャピラリー電気泳動法（ＣＥ）などの上流側試料分離技術に容易に接続される［Ｃａｏ　＆　Ｍｏｉｎｉ（１９９８）Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｒｏｍ．９：１０８１−１０８８］。これらの特徴は、機器の試料プレート上に付着させた結晶性基質物質中に試料が埋め込まれるＭＡＬＤＩ−ＭＳ技法とは対照的である。イオン化は基質のレーザ励起によって達成され、脱着した検体イオンは質量分析器に向かって加速される。したがってＭＡＬＤＩは非連続プロセスであり、複数のレーザパルスを使用してイオンが生み出され、データは質量分析器に累積的に集められる。
【００１７】
ＭＡＬＤＩでは質量分析は通常、イオン化レーザパルスから検出までの飛行時間を測定し質量電荷比（ｍ／ｚ）を計算することができる飛行時間（ＴＯＦ）機器によって実施される。このような検出器は、さまざまな市販の機器で複数の技術的な改良を受けている。いくつかのモデルは、ペプチド配列の導出および他の構造決定のために源崩壊後のイオン断片の分析を可能にする。ＥＳＩベースの機器の連続流機器としての性質のため、走査分析器（例えば４倍または磁気セクタ質量分析器）が使用される。ただし、他の機器形式を利用することもできる。一般的なフォーマットは、２つの質量分析器が直列に配置され、不活性ガス分子を含む「衝突セル」を介してそれらが相互接続されるタンデムＭＳシステムである。後者の特徴は、衝突誘導崩壊イオンの発生および所与の入力試料からのペプチド配列の決定を可能にする。複数のハイブリッド機器フォーマットを配置し、細胞表面（ＭＨＣ）と結合したペプチドの分析に利用することができる。
【００１８】
Ｃｏｘ他［Ｃｏｘ，Ａ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ（１９９７），「ＭＨＣ１：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ」，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ　Ｎ．，　＆　Ｂｕｔｃｈｅｒ　Ｇ．編，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，英の１４１−１６０ページ］によって概説されているように、ＭＨＣ分子、具体的にはＭＨＣクラスＩ分子から溶離されたペプチドの分析にＭＳが使用されている。この技術分野のより最近の概説がＤｅ　Ｊｏｎｇによって提供されている［Ｄｅ　Ｊｏｎｇ，Ａ．（１９９８），Ｍａｓｓ　Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ，１７，３１１−３３５］。Ｏｖｙｓｙａｎｎｉｋｏｖａ他［Ｏｖｙｓｙａｎｎｉｋｏｖａ　ｅｔ　ａｌ（２００１），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４６：１−１２］は、細胞を麻疹ウイルスワクチンで処理した後にＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子ＤＲＢ１＊０４０１から酸溶離した自己ペプチドの分析でＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを利用している。同様に、Ｓｉｃｋｍａｎ他［Ｓｉｃｋｍａｎ，Ａ　ｅｔ　ａｌ（２０００），Ａｎａｌｙｓｔ，１２５：５６９−５７３］は、ＬＣ技法とＭＡＬＤＩ−ＭＳ技法の組合せを使用した、ＭＨＣクラスＩＩに結合したラットのランゲルハンス細胞由来のペプチドの識別を記載している。
【００１９】
しかし本発明は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するペプチド化学種をＭＳベースの機器を使用して解明するための一般化された方式を初めて提供することによって、このような全ての従来技術を組み込み、拡張する。第１の実施形態において本発明は、対象、最も好ましくはヒト対象へ投与したときにＭＨＣ媒介性の免疫応答を誘起する能力が低い、またはそのような能力を欠いた治療用タンパク質を開発する目的で、ペプチド配列内のアミノ酸置換によって結合相互作用を排除する方法を提供する。本発明の目的は、対象に投与したときに免疫応答を引き起こす能力が低い治療用分子を開発する方法を提供することにある。
【００２０】
本発明の目的は、細胞の表面のペプチドを検出する方法、特にペプチドがＭＨＣ分子と結合している場合にペプチドを検出する方法を提供することにある。
【００２１】
本発明の目的は、細胞の表面に存在するＭＨＣ分子と形式上結合したペプチドを検出する方法を提供することにある。
【００２２】
本発明の目的は、細胞の表面に存在する複数の異なるＭＨＣ分子と結合したペプチドを検出する方法を提供することにある。
【００２３】
本発明の目的は、ＭＨＣ分子と結合した外因性タンパク質起源のペプチドを検出する方法を提供することにある。
【００２４】
本発明の目的は、ＭＨＣ分子に関連した内因性タンパク質起源のペプチドを検出する方法を提供することにある。
【００２５】
本発明の目的は、対象とする細胞を外因性タンパク質または外因性マイクローガニズムと接触させて、対象とする細胞の表面ペプチドのレパートリーが、外因性タンパク質と接触させない同一の基準細胞に表示されるレパートリーとは異なったものになるようにするプロセスの後に、細胞の表面のペプチドを検出する方法を提供することにある。
【００２６】
外因性タンパク質は、ｅｘ　ｖｉｖｏの細胞系統、組織などの、哺乳動物源から抽出した精製調製物、または前記タンパク質を発現するように操作された任意の生体源由来の精製組換え調製物とすることができる。外因性タンパク質は、天然のタンパク質、または１つまたは複数の天然タンパク質の融合を表わすことができる。外因性タンパク質はｉｎ　ｖｉｔｒｏで誘導したタンパク質、天然の要素の集合または完全に合成されまたは設計されたタンパク質とすることができ、自然界に対応するものがない。
【００２７】
外因性タンパク質は、抗体分子およびそれらの誘導体、サイトカイン、成長因子、ロイコトリン、止血因子などのタンパク質クラスを代表することができ、あるいは細胞毒素であることができ、あるいは酵素能力または酵素機能を有することができる。このタンパク質が治療用タンパク質であることが最も好ましい。
【００２８】
いくつかの治療用タンパク質の効果は、治療用タンパク質に対する不必要な免疫反応の誘起によって制限されることが認識されている。この例には、モノクローナル抗体［Ｓｃｈｒｏｆｆ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ　ａｌ（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４５：８７９−８８５；Ｓｈａｗｌｅｒ，Ｄ．Ｌ．ｅｔ　ａｌ（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５３０−１５３５］、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子などのヒト起源のいくつかのタンパク質［Ｗａｄｈｗａ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５：１３５３−１３６１］、インターフェロンα２［Ｒｕｓｓｏ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ（１９９６）Ｂｒｉ．Ｊ．Ｈａｅｍ．９４：３００−３０５；Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ（１９８８）Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１８：１４０９−１４１３］などが含まれる。したがって、治療用タンパク質に対する免疫応答の誘起に関与する決定基を識別することができる方法が強く求められている。
【００２９】
免疫応答を誘起する主たる要因は、ＭＨＣクラスＩＩ分子、いわゆるＴ細胞エピトープ上での提示によってＴ細胞の活性を刺激することができるペプチドがタンパク質中に存在することである。免疫原性を排除しまたは低減するためには、Ｔ細胞エピトープを識別しタンパク質から除去することが望ましい。本発明の目的は、Ｔ細胞エピトープの検出および識別を可能にする方法を提供することにある。
【００３０】
外因性タンパク質は取り込まれプロセシングされて、ＤＲ、ＤＱまたはＤＰ型のＭＨＣクラスＩＩ分子と結合して提示される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、マクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞によって発現される。所与のＭＨＣクラスＩＩ分子と結合してＡＰＣの表面に提示されるペプチドの能力はいくつかの因子、特にその一次配列によって決まる。一次配列は、そのタンパク分解による切断に対する傾向と、ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチド結合裂内の結合に対するその親和性の両方に影響を与える。ＡＰＣ表面のＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体は、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩ分子の両方の露出した残基によって提供される決定基を認識することができる特定のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対して結合面を提示する。当技術分野では、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することができる合成ペプチドを識別する手順が存在している。このようなペプチドは、プロセシング経路または他の現象のため、全ての状況、特にｉｎ　ｖｉｖｏで、Ｔ細胞エピトープとして機能しない。さらに当技術分野には、潜在的なＴ細胞エピトープを予測し、または経験に基づいて決定されたＴ細胞エピトープ中の配列モチーフを認識する計算方法が存在している。方式には、計算スレッディング方法が、可能なヒトＭＨＣクラスＩＩ　ＤＲアロタイプのサブセットとだけ結合する潜在能力を有するペプチド配列を識別する、ＷＯ９８／５２９７６に提供されているようにＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドを予測する技法が含まれる。
【００３１】
ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７で認識されているとおり、Ｔ細胞エピトープ排除の最初の段階はエピトープの識別である。これらの教示では、治療用タンパク質の一次配列内のアミノ酸を慎重に置換することによって、予測したＴ細胞エピトープを除去する。本発明の目的は、潜在的なＴ細胞エピトープの数を減らすことによって免疫特性が変更された修飾タンパク質を開発する方法を提供することにある。自然の細胞内プロセシング事象の後にＭＨＣを含む細胞の表面に存在し、またはＭＨＣ製剤に結合した識別された配列は、任意のコンピテントなＡＰＣまたは同種の細胞の範囲内で提示する。さらに、本発明の方式の下で識別されるペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩに関してはＤＲ、ＤＱまたはＤＰのアロタイプを含む、任意のＭＨＣアロタイプまたはアロタイプの混合物から検出することができる。
【００３２】
本発明は、特にＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子と結合して細胞の表面に表示されるペプチドの検出を可能にするが、完全な細胞に限定されるものではなく、エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）の表面のペプチドの分析を含む。ペプチド−ＭＨＣ複合体は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を通常発現している細胞に由来するエキソソームベシクル（ｅｘｏｓｏｍａｌ　ｖｅｓｉｃｌｅ）の表面に高い濃度で存在する。ある種の状況下では、ＡＰＣの表面からのエキソソームの排出量を増大させることができ、エキソソームを濃縮または分離する、認められた手順も存在する［Ｒａｐｏｓｏ，Ｇ．ｅｔ　ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１１６１−１１７２；Ｃｌａｙｔｏｎ，Ａ．ｅｔ　ａｌ（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２４７：１６３−１７４］。したがって、ＡＰＣ製剤およびＡＰＣに由来するエキソソーム粒子製剤の分析は本発明の範囲に同じように含まれる。
【００３３】
まとめると、本発明は以下の事項に関係する。
【００３４】
・特定の生物活性を有し、かつ同じ生物活性を有する非修飾タンパク質またはポリペプチドよりも低い免疫原性または高い免疫原性を有する薬剤タンパク質またはポリペプチド、あるいはワクチン抗原を開発する方法であって、
（ｉ）前記タンパク質またはポリペプチドと細胞とを接触させ、接触させなかった基準細胞上に表示される表面ペプチドのレパートリーとは異なる細胞またはそのエキソソームビヒクル上の表面ペプチドのレパートリーを生成させ、
（ｉｉ）前記細胞またはそのエキソソームベシクルの表面に結合されたペプチドに関して、前記細胞またはそのエキソソームベシクルを分析し、
（ｉｉｉ）前記ペプチドを、薬剤タンパク質またはポリペプチド、あるいはワクチン抗原の配列に標準の方法に従って割り当てることによって実行される方法。
【００３５】
・（ｉｖ）前記ペプチドを修飾して、前記ペプチドのＭＨＣ分子への結合が変更されるようにする段階と、
（ｖ）修飾した１つまたは複数のペプチド配列を、タンパク質またはポリペプチド分子配列内に標準の方法に従って組み込むことによって、最終的な薬剤タンパク質またはポリペプチドの配列変異体を構築する段階と
をさらに含む、対応する方法。
【００３６】
・段階（ｉｉ）の前記細胞またはそのエキソソームビヒクルの分析が、質量分光法（ＭＳ）、好ましくはＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳを使用して実行される、対応する方法。
【００３７】
・薬剤タンパク質またはポリペプチドが、前記タンパク質またはポリペプチドと細胞を接触させた後に１つまたは複数の前記ペプチドがもはや結合しないように修飾される、対応する方法。
【００３８】
・段階（ｉ）に基づいて細胞またはエキソソームベシクルの表面に結合されたペプチドがＭＨＣ分子と結合し、段階（ｉｉ）に基づく前記細胞またはそのエキソソームベシクルの分析がＭＳを使用して実行される、対応する方法。
【００３９】
・段階（ｉ）に基づいて細胞またはエキソソームベシクルの表面に結合されたペプチドが、細胞内ペプチダーゼおよび転送経路の生成物である、対応する方法。
【００４０】
・より低い免疫原性を有する薬剤タンパク質またはポリペプチドを開発するための対応する方法であって、免疫原性ペプチドの修飾が、ペプチドのＭＨＣ分子への結合を排除または低減させ、任意選択で、請求項１に指示された細胞表面への結合に関して修飾したペプチドをテストすることによって実行される方法。
【００４１】
・ＭＨＣ分子に対するペプチドの結合の排除または低減が、薬剤タンパク質またはポリペプチド中のペプチドの配列領域内の１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、挿入しまたは削除することによって実行される、対応する方法。
【００４２】
・より高い免疫原性を有する薬剤タンパク質またはポリペプチドを開発するための方法であって、ペプチドの修飾が、ペプチドのＭＨＣ分子への結合を強化し、任意選択で、請求項１に指示された細胞表面への結合に関して修飾したペプチドをテストすることによって実行される方法。
【００４３】
・ＭＨＣ分子へのペプチドの結合の強化が、ペプチドの配列領域内の１つまたは複数のアミノ酸残基を置換し、挿入しまたは削除し、Ｔ細胞エピトープとして機能するペプチドの活性を増大させ、および／またはＴ細胞エピトープが拘束されるＭＨＣタイプの範囲を広げ、および／またはいくつかの異なるエピトープを単一の実体に結合することによって実行される、対応する方法。
【００４４】
・ワクチンの開発方法であって、
（ｉ）免疫原活性を有するタンパク質またはポリペプチドあるいは微生物と細胞とを接触させ、接触させなかった基準細胞上に表示される表面ペプチドのレパートリーとは異なる前記細胞またはそのエキソソームベシクル上の表面ペプチドのレパートリーを生成させ、
（ｉｉ）ペプチドが結合した表面に関して前記細胞またはそのエキソソームベシクルを分析し、
（ｉｉｉ）前記ペプチドを、タンパク質またはポリペプチドの配列に標準の方法に従って割り当て、
（ｉｖ）１つまたは複数のペプチドを、ワクチン分子配列内に標準の方法に従って組み込むことによって、最終的な薬剤ワクチンの配列変異体を構築することによって実行され、
前記細胞またはその中のエキソソームベシクルの分析がＭＳを使用して実行される
方法。
【００４５】
・ＭＨＣ分子を産生するように操作されたヒト細胞系統を使用する、対応する方法
・親（非操作）細胞系統がＭＨＣ分子を産生しない、対応する方法
・親細胞系統がＭＨＣクラスＩ分子を産生しない、対応する方法
・親細胞系統がＭＨＣクラスＩＩ分子を産生しない、対応する方法。
【００４６】
・それ自体のＭＨＣ分子を産生しない非ヒト細胞がＭＨＣ分子を産生するように操作され、指示されるように使用される、対応する方法
・ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩＩに由来する、対応する方法
・ＭＨＣ分子がＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰである、対応する方法。
【００４７】
・ＭＨＣ分子がＭＨＣクラスＩに由来する、対応する方法
・さまざまなＭＨＣアロタイプおよび遺伝子型の包括的な混合物を提供する細胞系統または細胞試料の組合せが使用される、対応する方法
・ペプチドが外因性タンパク質または微生物を起源とする、対応する方法
・ペプチドが内因性タンパク質を起源とする、対応する方法。
【００４８】
・タンパク質、ポリペプチドまたは微生物を加えた後にＭＨＣ分子上にペプチドを提示するヒト樹状細胞またはそのエキソソームベシクルが使用される、対応する方法
・タンパク質またはポリペプチドを加えた後にＭＨＣ分子上にペプチドを提示するヒト抗原提示細胞またはそのエキソソームベシクルが使用される、対応する方法。
【００４９】
・ペプチド分析の前にＭＨＣ分子が濃縮される、対応する方法
・分析の前にペプチドが細胞表面から溶離される、対応する方法
・分析の前にペプチドがＭＨＣ分子から溶離される、対応する方法
・ＭＡＬＤＩ−ＭＳが使用される、対応する方法
・ＥＳＩ−ＭＳが使用される、対応する方法。
【００５０】
・診断のための検査を開発する方法であって、
（ｉ）表面ペプチドに対して適当なヒト細胞を分析し、
（ｉｉ）（ａ）細胞表面に現れたあるペプチドの特性を作成し、任意選択で、ヒト細胞に関連した異常または病気を識別するために他の特性と比較し、または（ｂ）細胞表面上に特異的なペプチドの配列を、ヒト細胞に関連した異常または病気を識別するのに使用することができる特異的なペプチドを決定する手段として決定する
ことによって実行される方法。
【００５１】
・以上に記載のいずれかの方法によって得られたタンパク質またはポリペプチドを薬剤治療実体として使用すること
・以上に記載のいずれかの方法によって得られたタンパク質またはポリペプチドをワクチンとして使用すること
・以上に記載のいずれかの方法によって得られたタンパク質またはポリペプチドを、より低い免疫原性を有する薬剤治療実体として使用すること。
【００５２】
タンパク質またはポリペプチドに由来する、細胞またはそのエキソソームベシクルの表面のペプチドを検出する方法であって、
（ｉ）前記タンパク質またはポリペプチド、あるいはこのタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子と細胞とを接触させ、接触させなかった基準細胞上に表示される表面ペプチドのレパートリーとは異なる細胞またはそのエキソソームベシクル上の表面ペプチドのレパートリーを生成させ、
（ｉｉ）ペプチドが結合した表面に関して前記細胞またはそのエキソソームベシクルを分析し、
（ｉｉｉ）前記ペプチドを、タンパク質またはポリペプチドの配列に標準の方法に従って割り当てることによって実行され、
細胞またはエキソソームベシクルの分析がＭＳ、好ましくはＭＡＬＤＩ−ＭＳによって実行される
方法。
【００５３】
したがって、本発明の第１の主要な実施形態に基づく方式によるプロセスは、本明細書に記載の方法を適用して以下のことを実行する。
【００５４】
１．標的タンパク質のアミノ酸配列内のプロセシングされた１つまたは複数のＴ細胞エピトープを識別する
２．識別された潜在的なＴ細胞エピトープ内の１つまたは複数のアミノ酸が、ＭＨＣ分子または完全な細胞へのペプチドの結合、あるいは他の手段によって決定されるＴ細胞エピトープの活性が実質的に低減され、または排除されるように修飾された、標的タンパク質の新規の配列変異体を設計する。重要なのはこのような配列変異体が、配列変異による新規の潜在的なＴ細胞エピトープの生成が回避されるような方法で生み出されることである。ただし、このような新規の潜在的なＴ細胞エピトープが、Ｔ細胞エピトープの活性を実質的に低減しまたは排除するような方法で修飾される場合にはその限りではない
３．このような配列変異体を構築し、望ましい特性を有する１つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体をテストする。
【００５５】
この方式によれば、いくつかの変異体タンパク質が、好ましくは組換えＤＮＡ技術によって産生されテストされる。ただし、化学合成を含む他の手順を企図することもできる。所与の潜在的なＴ細胞エピトープ内の単一のアミノ酸置換を実行してエピトープを排除することが予想される。単一のエピトープ内の置換の組合せを企図することもできる。
【００５６】
本発明の主要な一態様では、哺乳動物の細胞の集団をテストタンパク質とともに培養し、またはテストタンパク質をコードする遺伝子を用いてトランスフェクションし、タンパク質の取込みまたは発現およびその分解に続いて、細胞表面のペプチドの特性または同一性を決定する。具体的にはＭＨＣ分子、特に複数のＭＨＣ分子がこのようなペプチドを提示する。この実施形態の１つの態様として、多くの異なるＭＨＣ分子上に提示されるペプチドを分析することが重要であり、したがって分析は、世界の集団で遭遇するＭＨＣアロタイプおよび遺伝子型の非常に高い割合を包含する複数の細胞集団に関して取り組むことが好ましい。このような細胞集団は、世界の集団から複数の細胞集団をサンプリングすることによって、または複数のＭＨＣ型を産生するように操作された細胞を使用することによって得ることができる。内因性ＭＨＣ分子が産生されず、細胞表面に低い背景のペプチドしか表示しない細胞系統は特に役立つ。
【００５７】
ヒトＭＨＣアロタイプおよび遺伝子型の数は多く、それぞれが所与のタンパク質の異なる特性のペプチドに結合する能力を有するため、Ｔ細胞エピトープを包括的に識別する先に説明した以前の方法は、生化学的な方法（ペプチドが多数のＭＨＣタイプに結合するかをテストする）でも、または生物学的な方法（主としてペプチドがＴ細胞を活性化または刺激するかをテストする）でもなく、主に予測的な方法を含む。ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドに対してはこのような予測的方法が、後に続く他のペプチドの予測的分析のために多数のＴ細胞エピトープ配列を分析してこれらのエピトープに共通するアミノ酸の特定の組合せを決定する、モチーフおよび人工ニューラルネットワーク技法を含む。しかし、ＭＨＣクラスＩＩに関してはこのような予測的な方法が制限され、しばしばある割合のＴ細胞エピトープが見落とされ（偽陰性）、または実際にはこのような活性を欠くにもかかわらずあるペプチドをＴ細胞エピトープと判定する（偽陽性）。予測的な方法、ならびに合成ペプチドを用いる生化学的および生物学的方法の他の主な限界は、ペプチドがＭＨＣ分子によって存在することにより影響しうる所与のタンパク質のプロセシングを考慮できないことである。したがって、偽陰性または偽陽性をそれほど生じさせずにＴ細胞エピトープを正確かつ包括的に識別する改良式の方法が求められており、本発明はこのような改良を提供する。
【００５８】
本発明の第１の実施形態に基づくヒト薬剤タンパク質の開発に関する特定の応用は、それによってヘルパーＴ細胞を活性化させおよび／または刺激するエピトープが除去されるタンパク質を生成することである。この場合、第一の関心事は、ＭＨＣクラスＩＩによって提示されるペプチドである。高い割合のヒトに対して有効な薬剤タンパク質を開発するためには、多数のＭＨＣアロタイプのうちの１つまたは複数のアロタイプによって提示されるタンパク質内のペプチドを識別し、次いでこれらのペプチドを改変してＭＨＣ結合に対する能力を除去することが必要である。以前には、ＭＨＣクラスＩＩによって提示されるペプチドの包括的な識別は、このようなペプチドを正確に予測することが難しく、多数の異なるアロタイプおよび遺伝子型のヒトＭＨＣクラスＩＩ分子のうちの１つまたは複数の分子に結合するペプチドを予測することが難しいために制限された。予測の信頼度がより高いＭＨＣクラスＩに結合するペプチドに比べて、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドは長さが多様であり、ペプチド結合に対してより大きな影響を有する主要な結合ポケットの外側にアミノ酸を有する。したがって、ＭＨＣクラスＩＩに対しては、潜在的なＴ細胞エピトープを包括的に識別するために、多数のＭＨＣクラスＩＩアロタイプおよび遺伝子型のうちの１つまたは複数に結合するペプチドを予測しまたは検出するのに現在使用可能な方法よりも正確かつ包括的な方法が求められている。このような方法を使用できる主な利益は、全ての主要なＴ細胞エピトープ（または全てのＴ細胞エピトープ）が識別され除去された薬剤が生成されることにある。
【００５９】
本発明を使用して薬剤を開発する好ましい１つの方法は以下の段階を含む：
１．薬剤として潜在的に使用するためのテストタンパク質に関し、選択したヒト細胞系統またはヒト細胞試料にこのタンパク質を加える段階
２．適当な期間の後、表面ペプチドについて細胞を分析する段階。具体的には、細胞に直接にＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用し、または細胞画分、特にＭＨＣ画分にＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用し、あるいは特にＭＡＬＤＩ−ＭＳまたはＥＳＩ−ＭＳによる分析の前に細胞表面からペプチドを溶離して分析する
３．所与のタンパク質から、細胞表面に現れたペプチドをテストタンパク質に割り当てる段階
４．（２）で細胞表面に現れたペプチドを修飾してＭＨＣ分子への結合を排除する段階。いくつかのケースでは、修飾されたペプチドを細胞表面への結合に関してテストする（上記）
５．タンパク質配列中の１つまたは複数のペプチドに適当な修飾を組み込んでＭＨＣ分子への結合を排除することによって、最終的な薬剤タンパク質分子を生成する段階。
【００６０】
本発明の第２の主要な実施形態によれば、ワクチン分子またはワクチンとして機能することができる分子を開発することができる方式が提供される。ヒトに使用されるワクチンが最も好ましいが、この方式は、ヒト以外の種の病気の治療または予防のためのワクチン分子の開発にも同じように適用することができる。本発明を使用したワクチンの開発に関する特定の応用は、それによってＴ細胞を活性化させ、および／または刺激する主要なエピトープ、主にヘルパーＴ細胞に対するエピトープが存在し、さらに細胞殺滅を必要とする応用に対しては細胞障害性Ｔ細胞に対するエピトープ（主にＭＨＣクラスＩ拘束）が存在するペプチドまたはタンパク質を生成することである。高い割合のヒトに対して有効なワクチンを開発するためには、多数のＭＨＣアロタイプおよび遺伝子型のうちの１つまたは複数によって提示されるタンパク質内のペプチドを識別し、次いでこれらのペプチドの中から、最終的なワクチン分子に含める１つまたは複数のエピトープを選択することが必要である。このようなエピトープは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ、あるいはその両方によって拘束されたペプチドを含むことができる。本発明は、ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩによって提示されるペプチドのこのような識別を提供し、したがって本発明は、より有効なワクチンを開発する基礎となる。
【００６１】
ＭＨＣクラスＩエピトープとＭＨＣクラスＩＩエピトープの主な違いは、ＭＨＣ−ペプチド複合体中のペプチドが通常それから誘導されるタンパク質の主な起源にある。外因性タンパク質は主に、ＭＨＣクラスＩＩと結合したペプチドを生じ、細胞内から発現される内因性タンパク質は、異なるペプチダーゼおよび細胞内転送経路に従ってプロセシングされて、細胞表面のＭＨＣクラスＩ分子と主に結合する。外因性タンパク質でも、または内因性タンパク質でも、一連のプロセシング段階の間に、通常ならＭＨＣに結合するタンパク質由来のあるペプチド配列が破壊される可能性があり、そのため、あるＴ細胞エピトープはイン・ビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で産生されない。このようなペプチドに関して予測的（または生化学的／生物学的）方法は、Ｔ細胞エピトープの識別におけるプロセシングを考慮することができない。本発明の特徴は、細胞表面から識別されるペプチドが、細胞内処理および転送経路を介して通過することができるとしてＡＰＣ（または他の細胞）によって選択されたペプチドであることである。本発明はプロセシング事象の真の産物の識別に集中するので、本発明では、エピトープ識別の予測的またはイン・ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）方法を使用して識別される偽陽性および偽陰性エピトープの割合が低減する。
【００６２】
したがって、本発明の第２の主要な実施形態に基づく方式によるプロセスは、本明細書に記載の方法を適用して以下のことを実行する。
【００６３】
１．標的タンパク質のアミノ酸配列内の１つまたは複数のＴ細胞エピトープを識別する
２．１つまたは複数のアミノ酸が修飾された標的タンパク質の新規の配列変異体を、以下のいずれかの方法で設計する
ｉ）Ｔ細胞エピトープの活性を増大させ、および／または
ｉｉ）ＭＨＣ分子または完全な細胞へのペプチドの結合あるいは他の手段によって決定されるようにＴ細胞エピトープが拘束されるＭＨＣタイプの範囲を広げ、および／または
ｉｉｉ）いくつかの異なるエピトープを単一の（より小さな）実体に結合する
３．このような配列変異体を構築し、望ましい特性を有する１つまたは複数の変異体を識別するために前記変異体をテストする。
【００６４】
この方式によれば、いくつかの変異体タンパク質が、好ましく組換えＤＮＡ技術によって産生されテストされる。ただし、化学合成を含む他の手順を企図することもできる。
【００６５】
したがって、本発明を使用してワクチンを開発する好ましい１つの方法は以下の段階を含む
１．ワクチンとして潜在的に使用するためのタンパク質に関し、選択したヒト細胞系統またはヒト細胞試料にこのタンパク質を加える段階
２．適当な期間の後、表面ペプチドに関して細胞を分析する段階。具体的には、細胞に直接にＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用し、または細胞画分、特にＭＨＣ画分にＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用し、あるいは特にＭＡＬＤＩ−ＭＳまたはＥＳＩ−ＭＳによる分析の前に細胞表面からペプチドを溶離して分析する
３．所与のタンパク質から、細胞表面に現れるペプチドをテストタンパク質に割り当てる段階
４．（２）で細胞表面に現れた１つまたは複数のペプチドを、最終的なワクチン分子で使用するために選択する段階。
【００６６】
薬剤またはワクチンとして使用する細胞表面ペプチドの分析に関しては、異なるＭＨＣアロタイプおよび遺伝子型の包括的な混合物を提供する細胞系統またはヒト細胞試料の組合せを使用することができること、およびこのような天然の細胞試料が、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ拘束エピトープの包括的な混合物を提供することを理解されたい。テストタンパク質の添加後に活性化してＭＨＣ分子上に効率的にペプチドを提示することができるヒト樹状細胞（またはエキソソーム）は特に役立つ。あるいは、主にもう１つのＭＨＣタイプをこれらの細胞にコードする遺伝子のトランスフェクションによって、それらのＭＨＣレパートリーを拡張するようにヒト細胞系統を操作することができ、したがって細胞表面ペプチドの分析に関して複数のＭＨＣタイプを有する細胞が産生される。マウスＭＨＣ遺伝子が削除されまたはその他の方法で無能にされたマウス細胞など、それ自体のＭＨＣ分子を産生しない非ヒト細胞が特に役立つ。細胞表面ペプチドの分析はさらに、ペプチド分析の前にＭＨＣ分子を例えば免疫アフィニティカラムを使用して濃縮する任意選択の段階を含む。ＭＨＣクラスＩＩに関しては、細胞表面ペプチドの分析のための本発明の方法は、ＤＲ以外のアロタイプへの結合の分析を提供するという特定の利点を有する。（ＤＲのβ鎖とは対照的に）ＭＨＣ分子の両方の鎖が結合に寄与すると考えられるＤＱに対して使用可能な予測的な方法がないため、ＤＱ、ＤＰなどのアロタイプによるペプチド提示の分析は非常に困難であった。
【００６７】
本発明の主要な第３の態様によれば、診断のための検査の開発に本発明を適用する方式が提供される。この実施形態の特定の応用は、特定の病気または細胞の傷害を指示するペプチドの異常な存在、不在またはパターンを識別するために、細胞表面に提示されたペプチドの特性を生成することである。
【００６８】
したがって本発明の目的は、対象とする細胞を外因性タンパク質または生物、あるいは他の作用因子と接触させて、対象とする細胞の表面ペプチドのレパートリーが、外因性タンパク質または生物と接触させない同一の細胞に表示されるレパートリーとは異なったものになるようにするプロセスの後に、細胞の表面のペプチドを検出する方法を提供することにある。本発明の実施では、「診断ペプチド」または「インジケータペプチド」の存在を、ＭＳ機器の質量スペクトル中のインジケータペプチド質量のレジストレーションによって、またはＣＩＤ（または同種の）スペクトル中のインジケータペプチド配列の記録によって分離することができる。同様に、インジケータペプチドの存在を、外因性タンパク質または作用因子と接触させない基準試料に由来する質量スペクトルに関して指示することができる。このような比較分析は、インジケータペプチドの質量が知られておらず、またはどのようにしても予測できない場合に特に価値がある。比較分析は、同一の質量ピークの減算によってｉｎ　ｓｉｌｉｃｏで実施することができ、特定の質量ピークの損失が診断インジケータである場合に特定の価値がある。生体試料の比較分析でＭＳ技法が利用されている。しかし、Ｌｉｏｔｔａ他［ＷＯ００４９４１０］の場合には、このような比較分析を、レーザ捕獲マイクロ切開によって得られた個々の細胞のタンパク含量に焦点を置く。これは、診断（比較、減法など）が、表面から検出されたペプチド、特に細胞表面のＭＨＣ分子と結合したペプチドに基づく本発明とは異なる。
【００６９】
ＭＳ技術を使用する他の診断技法には、Ｌｉｔｔｌｅ他［ＵＳ６２０７３７０］の技法が含まれる。Ｌｉｔｔｌｅ他は、獲得した状態ではない個体の体質的特徴である遺伝子病の識別を対象とするＭＳベースの診断手順を開示している。この手順では、個体の遺伝的素質に依存する集団内で可変である標的タンパク質の質量を識別することができる。他の診断方式が、Ｇｅｎｇ他によって開示されている［Ｇｅｎｇ，Ｍ．（２０００）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ａ．８７０：２９５−３１３］。Ｇｅｎｇ他は、血清タンパク試料のトリプシン分解物から得られたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルを分析した。そのプロセスは、複雑な混合物中に存在する検体タンパク質の存在の徴候を示す「シグネチャペプチド（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ　ｐｅｐｔｉｄｅ）」を検出する。これも、診断（比較、減法など）が、表面から検出されたペプチド、特に細胞表面のＭＨＣ分子と結合したペプチドに基づく本発明とは異なる。
【００７０】
したがって、本発明の方式によれば、診断のための検査を開発する好ましい１つの方法は以下の段階を含む
１．表面ペプチドに関して適当なヒト細胞を分析する段階。具体的には、細胞に直接にＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用し、または細胞画分、特にＭＨＣ画分にＭＡＬＤＩ−ＭＳを使用し、あるいは特にＭＡＬＤＩ−ＭＳまたはＥＳＩ−ＭＳによる分析の前に細胞表面からペプチドを溶離して分析する
２．細胞表面に現れたあるペプチドの特性を産生し、必要ならば、ヒト細胞に関連した異常または病気を識別するために他の特性と比較し、または細胞表面上に特異的なペプチドの配列を、ヒト細胞に関連した異常または病気を識別するのに使用することができる特異的なペプチドを決定する手段として決定する段階。
【００７１】
本発明の全ての実施形態に関して、さまざまなタンパク質配列データベースへの容易なアクセスおよび増大するその内容のため、ペプチドの同一性を決定するために完全な配列を得ることはそれほど重要ではない。親イオンの既知の質量に対して少量の内部配列情報（２〜３残基とすることができる）だけで、ペプチド化学種を特徴づけるのに十分であることもある。連続するフラグメントのイオンデータセットのデータベースを検索するアルゴリズムが使用可能であることを認識されたい。これらの例には、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ　Ｇｌｏｂａｌ　Ｓｅｒｖｅｒサーチアルゴリズム（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社，Ｗｙｔｈｅｎｓｈａｗｅ，英）、Ｍａｔｒｉｘ　Ｓｃｉｅｎｃｅ社のＭａｓｃｏｔ［ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘ．ｃｏｍ］、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒのプログラムセット［ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ］などが含まれる。このようなプログラムは、対象とするペプチドの質量を有するデータベースの配列エントリの断片化をシミュレートする。
【００７２】
以下の非限定的な例によって本発明をさらに説明する。
【００７３】
実施例１
細胞表面ＨＬＡ　ＤＲに結合したペプチドをＭＡＬＤＩ−ｔｏｆを使用して検出する方法
ＥＢＶで形質転換したヒトＢ細胞系統ＪＥＳＴＨＯＭおよびＢＳＭを、ＥＣＡＣＣ社（Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ，英）から入手した。Ｂ細胞系統ＪＥＳＴＨＯＭはＨＬＡ−ＤＲ１＊０１０１に対して同型接合性、系統ＢＳＭはＤＲＢ１＊０４０１に対して同型接合性である。細胞系統は、供給業者が推奨する条件を使用してｉｎ　ｖｉｔｒｏで培養した。供給業者が推奨する条件を使用して培養したマウスＮＳＯ細胞（ＥＣＡＣＣ＃８５１１０５０３）を陰性の対照細胞系統として使用した。
【００７４】
合成ペプチドは、Ｚｅｎｅｃａ社から入手した（Ｚｅｎｅｃａ　ＬＳＭ，Ｎｏｒｔｈｗｉｃｈ，英）。ペプチドＨＡ１は、インフルエンザウイルス血球凝集素タンパクの残基３０７〜３１９に対応する１３量体である（Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ　ａｌ（１９８８）Ｃｅｌｌ　５２：５１５）。ペプチドＭＰ１は、インフルエンザウイルス基質タンパク質の残基１７〜２９に対応する１３量体である［Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｊ．Ｂ．ｅｔ　ａｌ（１９８８）ｉｂｉｄ］。これらのペプチドはともに、特異的にいくつかの異なるＨＬＡ−ＤＲと結合することが知られているが、ＤＲ４アロタイプとの差動結合が見られる。ＭＰ１はＤＲ４に結合するが、ＭＰ１は、ＤＲ４にあまり結合しない［Ｂｕｓｃｈ　Ｒ．ｅｔ　ａｌ（１９９０）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４３］。
【００７５】
いくつかの実験に関しては、不安定なビオチンリンカー部分を含む類似体ペプチドを使用した。これらに関しては、リンカービオチン−ＨＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ社，Ｃｈｅｓｔｅｒ，英）をＮ末端システイン残基に結合させて、ペプチドＨＡ１ＢおよびＭＰ１Ｂを得た。追加のシステイン残基を除いてこの配列はＨＡ１およびＭＰ１と同一である。結合は、ビオチン−ＨＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ社，Ｃｈｅｓｔｅｒ，英）とともに提供されたプロトコルを使用して行なった。ただし、結合させたペプチドの精製は、ＨＰＬＣおよび標準溶離プロフィールを使用して実施した。精製されたモノクローナル抗体ＬＢ３．１［ＡＴＣＣナンバーＨＢ−２９８］を使用して阻害実験を実施した。抗体は、プロテインＡセファロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社，Ｃｏｎｓｅｔ，英）アフィニティークロマトグラフィーおよび供給業者が推奨する手順を使用してハイブリドーマＬＢ３．１調整培地から精製した。ハイブリドーマは標準条件を使用して維持した。ＬＢ３．１は、ペプチドおよび細胞とともに最高濃度１０μｇ／ｍｌで培養した。
【００７６】
細胞は、テストおよび対照実験で異なる合成ペプチドで処理する前にパラホルムアルデヒドで固定した。実験は、最終濃度５０μＭのペプチドを含むペプチド結合緩衝液（ｐＨ４．０のリン酸クエン酸塩緩衝液５０ｍＭ；０．１％ＮＰ４Ｏ）１５０μｌに加えた完全培地５０μｌ中の３×１０６個の細胞を使用して実施した。培養は３７℃で２４時間実施した。検定に関しては、ペプチド処理した細胞を遠心分離によって回収し、それらをＰＢＳで３回洗浄した。細胞は、５０％アセトニトリル−０．１％トリフルオロ酢酸１０μｌの入った０．５ｍｌ微量遠心管に入れた。続いてそれぞれの試料を５秒間激しく混合し、その後、ＭＡＬＤＩ機器の試料プレートに試料をスポッティングした。２層試料スポッティング法を使用した。この方法では、酸基質溶液［アセトニトリル、メタノールおよび水の１：１：１混合物に溶解した０．１Ｍシナピン酸］１μｌをＭＳ試料プレート上で乾燥させる。続いて細胞１μｌおよびシナピン酸基質溶液１μｌをスポットした。
【００７７】
不安定なリンカー質量−タグを含む合成ペプチドを使用する実験では、１００ｍＭ　β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を含むＰＢＳ中での細胞の培養によってリンカーの除去を達成した。ＢＭＥを用いた培養は３７℃で３０分間実施し、細胞はＰＢＳを使用して３回洗浄してから、先と同じようにＭＡＬＤＩ試料プレートへ適用した。
【００７８】
Ｖｏｙａｇｅｒ　ＤＥ質量分析計（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，米カリフォルニア州）は陽イオンモードで使用した。この機器は、ウマ心臓アポミグロビンとウシ血清アルブミンの混合物（Ｓｉｇｍａ社，Ｐｏｏｌｅ，英）で較正し、それぞれの分析前３０分以内に、質量の正確さがそれぞれの標準に対して０．１％以内であることをチェックした。試料スポットは空気乾燥し、陽イオンモードで分析した。遅延抽出は２５ｋＶ、１５０ナノ秒にセットした。低質量ゲートは６００Ｄａにセットした。それぞれの試料から合計１２５レーザショット分を累積した。
【００７９】
ＪＥＳＴＨＯＭ細胞から生み出されたスペクトル中に、ペプチドＨＡ１およびＭＰ１の予測された質量ピークが識別された。対照的に、ＨＬＡ　ＤＲ４を発現するＢＳＭ細胞からはペプチドＨＡ１だけしか識別できなかった。標識化したペプチドを使用した実験では、ＢＭＥ処理した細胞のスペクトル中にペプチドピークの質量シフトが識別された。ＬＢ１．１培養細胞（阻害実験）からのスペクトルは、抗体処理によってペプチド結合をなくすことがことができなかったことを示した。ただし、ペプチド、標識化したペプチドおよびＬＢ１．１抗体を使用した三者間の競合検定では、低減された相対的なイオン存在度のいくつかの証拠を見つけることができた。ペプチドまたはペプチドの組合せで処理したマウスＮＳＯ細胞からのスペクトルは、標的イオンピークの非常に低い存在度を示し、細胞処理中の非特異的相互作用および／または不十分な洗浄を示唆している。
【００８０】
実施例２
ＭＨＣ　ＤＲに結合したペプチドをＭＡＬＤＩ−ｔｏｆを使用して分析する方法
免疫アフィニティークロマトグラフィーによって、ＪＥＳＴＨＯＭ細胞膜からＨＬＡ−ＤＲ１＊０１０１を精製した。ＢＳＭ細胞からＨＬＡ　ＤＲＢ１＊０４０１を精製した。可溶化された細胞膜は先に記載したとおりに準備し処理した［Ｇｏｒｇａ　ｅｔ　ａｌ（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６０８７−１６０９４、Ｓｅｔｔｅ　ｅｔ　ａｌ（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２：３５−４０］。抗ＤＲモノクローナル抗体ＬＢ３．１［ＡＴＣＣナンバーＨＢ−２９８］を免疫アフィニティ試薬として使用した。抗体は、プロテインＡセファロース（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社，Ｃｏｎｓｅｔ，英）アフィニティークロマトグラフィーおよび供給業者が推奨する手順を使用してハイブリドーマＬＢ３．１調整培地から精製した。ハイブリドーマは標準条件を使用して維持した。ＬＢ３．１抗体は、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ社（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，オランダ）によって提供されたＬｉｎｘシステムおよび供給業者が推奨する条件を使用して、セファロース４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ社，Ｓｔ．Ａｌｂａｎｓ，英）に結合させた。
【００８１】
実施例１で説明した合成ペプチドＨＡ１およびＭＰ１を、ＨＬＡ−ＤＲ１＊０１０１製剤５０μｌとともに培養した。ペプチドは、最終濃度５０μＭのペプチド結合緩衝液（ｐＨ４．０のリン酸クエン酸塩緩衝液５０ｍＭ；０．１％ＮＰ４Ｏ）中で３７℃で２６時間培養した。結合していないペプチドは、ｍｉｃｒｏｃｏｎ遠心ろ過セル（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，米）を使用した限外ろ過およびＰＢＳを用いた複数回の洗浄サイクル（最低４回）によって除去した。最終的な体積は２０μ１まで低減した。いくつかの実験では、ＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ分析の前にペプチドをＭＨＣから溶離させた。この場合、溶離は、０．１％ＴＦＡ水溶液を用いた抽出によって実施した。溶離液は蒸発乾固させ、実施例１で示したＭＡＬＤＩ基質溶液を使用して直接に再懸濁させた。他の実験では、基質溶液に再懸濁させたＭＨＣ−ペプチド複合体を機器試料プレートに適用した。
【００８２】
ＨＬＡ−ＤＲ１＊０１０１製剤から生み出されたスペクトル中に、ペプチドＨＡ１およびＭＰ１の予測された質量ピークが識別された。対照的に、ＤＲＢ１＊０４０１製剤のスペクトルではＨＡ１の質量ピークだけが識別できた。
【００８３】
実施例３
完全タンパク質を用いて細胞を処理した後に細胞表面ペプチドを分析するための方法
健康な供血者から得た末梢血試料４０ｍｌからヒト樹状細胞を濃縮した。血液は、ヘパリン、ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ１０７７（Ｓｉｇｍａ社，Ｐｏｏｌｅ，英）密度勾配培地を使用して調製した単核細胞画分および供給業者が推奨する条件を使用して凝固しないようにした。樹状細胞は、イムノマグネティック分離手順を使用したネガティブセレクションによって得た。試薬および条件は全てＭｉｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ社（Ｂｉｓｅｌｙ，英）によって提供されたものを使用した。樹状細胞は、タンパク質抗原で処理するため多穴式組織培養皿中に溶離させた。細胞は実験の進行中、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清および標準抗生物質を補ったＲＰＭＩ培地中に維持した。全ての試薬は全てＬｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｐａｉｓｌｅｙ，英）のものを使用した。
【００８４】
これらの研究では組換えスタフィロキナーゼ製剤を使用した。Ｇｅｎｏｓｙｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，英）による契約の下で野生型スタフィロキナーゼ遺伝子を合成した。この遺伝子は、オーバーラップ合成プライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応、およびＣｏｌｌｅｎ他によって与えられた配列［Ｃｏｌｌｅｎ　Ｄ．（１９９６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９４：１９７−２０６］によって構築した。合成遺伝子は、４５３ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎＤＩＩＩ制限断片として、細菌性発現ベクターｐＭＥＸ（ＭｏＢｉＴｅｃ社，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，独）にクローン化した。ｐＭＥＸ／スタフィロキナーゼ遺伝子は、標準技法によって適当な大腸菌株ＴＧ１を形質転換させ、活性スタフィロキナーゼを分泌している単一の形質転換クローンを、フィブリンプレート検定を使用して選択した［Ａｓｔｒｕｐ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ（１９５２）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４０：３４６−３５１、Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ（１９９２）Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　６：２０３−２１３］。最もよく発現したクローンを成長させ、シーケンシャルカラムクロマトグラフィーおよび先に記載した方法［Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．ｅｔ　ａｌ（１９９２）ｉｂｉｄ、Ｓｃｈｌｏｔｔ，Ｂ．ｅｔ　ａｌ（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１２：１８５−１８９］を使用して培養液上清から組換えタンパク質を精製した。
【００８５】
樹状細胞は、濃度１００μｇ／ｍｌの精製スタフィロキナーゼとともに一晩培養した。いくつかの実験では、培地に添加された阻害剤混液を使用して抗原プロセシングをブロックした。阻害剤は、テストタンパク質を加える１時間前に以下の濃度で加えた：塩化アンモニウム５０ｍＭ；アジ化ナトリウム１ｍｇ／ｍｌ；クロロキンおよびコルヒチン５００μＭ。化合物は全てＳｉｇｍａ社（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌｅ，英）のものを使用した。
【００８６】
タンパク質処理の後、培養皿から細胞を取り出し、３サイクルの遠心分離／ＰＢＳ処理を使用して洗浄して、全ての培地および外来性のタンパク質を除去した。細胞は、ＭＡＬＤＩ−ｔｏｆ分析のために実施例１に示したように処理した。スペクトルを集め、テストタンパク質に由来する存在ペプチドに関して分析した。これらは、スタフィロキナーゼで処理していない対照細胞から得られたスペクトルと比較することによって識別した。
【００８７】
スタフィロキナーゼによるものと考えられるイオンピークは、スタフィロキナーゼで処理した細胞から得られたスペクトル中で識別されたが、代謝阻害剤で処理した細胞のスペクトルおよびまたはスタフィロキナーゼで処理しなかった対照細胞では見られなかった。
【００８８】
実施例４
完全タンパク質を用いた細胞処理から得られたペプチド配列を決定する方法
対象とするタンパク質を用いて実施例３の方法に従って細胞を処理した。ペプチドは、５％アセトニトリル、０．１％蟻酸溶液を用いた多回抽出サイクル（４〜６回）によって細胞から溶離させた。テストタンパク質に由来する配列の存在はＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを使用して決定した。
【００８９】
溶離させた試料は乾燥し、０．１％蟻酸溶液中に再懸濁させた。未処理の溶離液全体を、質量分析計のＺスプレー源に直接に接続されたモジュラーＣａｐＬＣシステム（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社，Ｗｙｔｈｅｎｓｈａｗｅ，英）によって分離した。試料は、流量３０μＬ／分でＣ１８プレカラムにロードし、０．１％蟻酸溶液を使用して３分間脱塩した。流量を１μＬ／分まで低減させ、Ｃ１８　１８０ｍｍ　ｐｅｐｍａｐカラム上にリダイレクトした。カラムは、９５％Ｈ２Ｏ、５％アセトニトリル、０．１％蟻酸の溶媒溶液から５％Ｈ２Ｏ、９５％アセトニトリル、０．１％蟻酸の溶媒溶液までの標準溶離勾配を使用して溶離させた。
【００９０】
Ｚスプレーナノフローエレクトロスプレーイオン源が取り付けられたＭｉｃｒｏｍａｓｓ　Ｑ−Ｔｏｆ２機器（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社，Ｗｙｔｈｅｎｓｈａｗｅ，英）上でエレクトロスプレーＭＳおよびＭＳ／ＭＳデータを得た。装置は陽イオンモードで動作させ、源温度は８０℃、カウンターガス流量は４０Ｌ／時間とし、ナノスプレー連続ＬＣプローブには２８００Ｖの電位を印加した。データは全て、機器を自動データ依存スイッチングモードで動作させて得た。
【００９１】
機器は、グルフィブリノペプチドｂ（ｇｌｕｆｉｂｒｉｎｏｐｅｐｔｉｄｅ　ｂ）の衝突誘導分解に起因する２点較正被選択断片イオンを用いて較正した。データは全てＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘソフトウェアによって自動的に処理し、タンパク質識別は、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ　Ｇｌｏｂａｌ　Ｓｅｒｖｅｒサーチアルゴリズム（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社，Ｗｙｔｈｅｎｓｈａｗｅ，英）を用いた分析によって行なった。
【００９２】
ホウケイ酸塩針を通して生の試料を機器に注入することによって手動データ収集を実行した。試料を濃度約１μＭに調整した。試料は注入前に、使い捨てＣ１８　ＺｉｐＴｉｐミニカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社，米）を使用して脱塩した。
【００９３】
スペクトルを収集し、テストタンパク質に由来する存在ペプチド質量に関して分析した。これらは、抗原処理がブロックされた細胞を含む対照細胞から得られたスペクトルと比較することによって識別した。スタフィロキナーゼを用いた処理後に、スタフィロキナーゼによるものと考えられるペプチド質量が識別された。スタフィロキナーゼで処理しなかった細胞でも、または代謝阻害剤で処理した細胞でも等しいイオンピークは明らかでなかった。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004506202.tif 000036
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