(57)【要約】式ＩＶ（式中、Ｒ１はＲ’−Ｃ（＝Ｏ）−またはＲ’−Ｓ（＝Ｏ）２−、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ；Ｗ、Ｙ、Ｚ＝ＣＨ、Ｎ；Ｒ”＝下記より選ばれる単一または複数の環置換基の組み合わせ：Ｈ、Ｃ１−７−アルキル、Ｃ３−６−シクロアルキル、ＯＨ、ＳＨ、アミン、ハロゲン；Ｒ３＝Ｃ１−７−アルキル、Ｃ２−Ｃ７アルケニル、Ｃ３−７−シクロアルキル、Ａｒ、Ａｒ−Ｃ１−７−アルキルＣ３−６シクロアルキル；Ｒ４＝Ｈ、Ｃ１−７−アルキル、Ｃ３−７−シクロアルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ａｒ、Ａｒ−Ｃ１−Ｃ７−アルキル；Ｒ５＝Ｃ１−７−アルキル、ヒドロキシ−またはハロ−置換Ｃ１−Ｃ７アルキル、ハロゲン、Ａｒ−Ｃ１−７−アルキル、Ｃ０−３−アルキル−ＣＯＮＲ３Ｒ４または嵩張ったアミン官能基；Ｒ６＝Ｈ、Ｃ１−７−アルキル、Ａｒ−Ｃ１−７−アルキル、Ｃ１−３−アルキル−ＳＯ２−Ｒｉｘ、Ｃ１−３−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨＲｉｘまたはＣＨ２ＸＡｒ）で示される化合物および薬理学的に許容しうるその塩は、カテプシンＳやファルシパインなどのシステインプロテアーゼのインヒビターとして有用である。
2004513942.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩＶ：
【化１】
2004513942.tif 000050
（式中、
Ｒ１はＲ’−Ｃ（＝Ｏ）−またはＲ’−Ｓ（＝Ｏ）２−
ここでＲ’は、
【化２】
2004513942.tif 000051
（式中、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、
Ｗ、Ｙ、Ｚ＝ＣＨ、Ｎ、
Ｒ”＝下記より選ばれる単一または複数の環置換基の組み合わせ：
Ｈ、Ｃ１−７−アルキル、Ｃ３−６−シクロアルキル、ＯＨ、ＳＨ、アミン、ハロゲン）で示される基；
Ｒ３＝Ｃ１−７−アルキル、Ｃ２−Ｃ７アルケニル、Ｃ３−７−シクロアルキル、Ａｒ、Ａｒ−Ｃ１−７−アルキル；
Ｒ４＝Ｈ、Ｃ１−７−アルキル、Ｃ３−７−シクロアルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ａｒ、Ａｒ−Ｃ１−７−アルキル；
Ｒ５＝Ｃ１−７−アルキル、ヒドロキシ−またはハロ−置換Ｃ１−７アルキル、ハロゲン、Ａｒ−Ｃ１−７−アルキル、Ｃ０−３−アルキル−ＣＯＮＲ３Ｒ４またはＲｉｖ；
ここでＲｉｖは
【化３】
2004513942.tif 000052
（式中、ｎ＝１−３、ｍ＝１−３；
Ｒｖ、Ｒｖｉ＝Ｈ、Ｃ１−７−アルキル；
Ａ＝Ｎ、ＣＨ；
Ｂ＝Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ；
Ｒｖｉｉ＝ＢがＯ、Ｓのときは不在；またはＲｖｉ＝ＢがＮ、ＣＨのときはＨ、Ｃ１−７−アルキル；
Ｒｖｉｉｉ＝Ｏ、Ｃ１−７−アルキル）；
Ｒ６＝Ｈ、Ｃ１−７−アルキル、Ａｒ−Ｃ１−７−アルキル、Ｃ１−３−アルキル−ＳＯ２−Ｒｉｘ、Ｃ１−３−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨＲｉｘまたはＣＨ２ＸＡｒ（式中、ＲｉｘはＣ１−７−アルキル、Ａｒ−Ｃ１−７−アルキル、Ｃ３−Ｃ６−シクロアルキル））
で示される化合物および薬理学的に許容しうるその塩。
【請求項２】
Ｒ４が水素原子である請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１がＲ’Ｃ（Ｏ）（ここで、Ｒ’は式
【化４】
2004513942.tif 000053
で示される基）である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ’が、複数の置換基で置換されたフル−３−イル、チエン−３−イル、またはフェニルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ３が、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、３−（２，２−ジメチルプロピル）、４−（２−メチルブチル）、４−（３，３−ジメチルブチル）、４−（３，３−ジメチル−２−メチルブチル）、４−（３−メチル−２−メチルブチル）または５−（２−メチル−３−メチルペンチル）である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ３が、ｔ−ブチル、３−（２，２−ジメチルプロピル）、または４−（３，３−ジメチル−２−メチルブチル）である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ３がＣ３−Ｃ６シクロアルキルである請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ３が、Ｌ−シクロヘキシルアラニンまたはＬ−シクロペンチルアラニンの側鎖である、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ５が、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ａｒ、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２、式：
【化５】
2004513942.tif 000054
で示される基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ５が、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３またはＣＨ２ＯＨである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
好ましくはＣ４結合もまた（Ｓ）立体化学である場合にＲ５が（Ｓ）立体化学を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
好ましくはＣ４結合もまた（Ｒ）立体化学である場合にＲ５が（Ｒ）立体化学を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ１がＲ’Ｃ（Ｏ）（ここで、Ｒ’は式
【化６】
2004513942.tif 000055
で示される基）であり、
Ｒ４およびＲ６＝Ｈ；
Ｒ３＝ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、３−（２，２−ジメチルプロピル）、４−（２−メチルブチル）、４−（３，３−ジメチルブチル）、４−（３，３−ジメチル−２−メチルブチル）、４−（３−メチル−２−メチルブチル）、５−（２−メチル−３−メチルペンチル）；
Ｒ５＝ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２Ａｒ、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２、式：
【化７】
2004513942.tif 000056
で示される基である、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
以下よりなる群から選ばれた化合物：
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［３，３−ジメチル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−アミドフラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［２−シクロヘキシル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−アミド
（１Ｓ）−Ｎ−［３，３−ジメチル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロヘキシル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［３，３−ジメチル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロヘキシル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［２−シクロペンチル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−アミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロペンチル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロペンチル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［３，３−ジメチル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−アミド
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［２−シクロヘキシル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−アミド
（１Ｓ）−Ｎ−［３，３−ジメチル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロヘキシル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［３，３−ジメチル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロヘキシル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［２−シクロペンチル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−アミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロペンチル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロペンチル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［３，３−ジメチル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−アミド
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［２−シクロヘキシル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−アミド
（１Ｓ）−Ｎ−［３，３−ジメチル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロヘキシル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［３，３−ジメチル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロヘキシル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［２−シクロペンチル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−アミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロペンチル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロペンチル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
および薬理学的に許容しうるその塩。
【請求項１５】
請求項１ないし１４に記載の化合物および薬理学的に許容しうる担体を含む医薬組成物。
【請求項１６】
必要とする患者に請求項１ないし１３のいずれかに記載の化合物の有効量を投与することを含む、システインプロテアーゼカテプシンＳｎｏ阻害方法。
【請求項１７】
必要とする患者に請求項１５に記載の組成物の有効量を投与することを含む、システインプロテアーゼカテプシンＳの阻害方法。
【請求項１８】
カテプシンＳシステインプロテアーゼ活性の阻害によって緩解または緩和される疾患の治療用医薬の製造における請求項１ないし１３のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項１９】
請求項１に記載の化合物の製造方法であって、適当に保護した炭水化物誘導体上の保護基を操作してアノマー位で脱酸素を行い、たとえばウィッティッヒ化学によりケトン官能基を介してＲ５置換基を導入し、Ｃ４第二級アルコール官能基のさらなる操作により４−アミノ基を導入して保護した４−アミノ−５−置換ピラノールを生成し、ペプチド化学を用いてアミン官能基をＮ伸長し、ついでＲ’Ｃ（＝Ｏ）またはＲ’Ｓ（Ｃ＝Ｏ）２キャッピング基を付加する工程を含み、さらにＮ伸長および／またはキャッピングの前または後にピラノールをピラノンに酸化する工程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の化合物の製造方法であって、適当に誘導体化した３−アミノ−４−置換ラクトンのＯ保護した非環状カルボン酸誘導体をジアゾ化し、生成したジアゾメチルケトンを環化して保護した４−アミノ−５−置換ピラノンを生成し、ペプチド化学を用いてアミン官能基をＮ伸長し、ついでＲ’Ｃ（＝Ｏ）またはＲ’Ｓ（Ｃ＝Ｏ）２キャッピング基を付加する工程を含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、システインプロテアーゼのインヒビター、とりわけパパインスーパーファミリーのインヒビターに関する。本発明は、カテプシンＦまたはＳなどの生理的プロテアーゼのアンバランス、またはマラリアファルシパイン（ｆａｌｃｉｐａｉｎ）などの病原性プロテアーゼによる疾患の予防または治療に有用な新規な化合物を提供する。
【０００２】
（背景技術）
システインプロテアーゼのパパインスーパーファミリーは、哺乳動物、脊椎動物、原生生物、植物および細菌を含む広範な種にわたって広く分布している。カテプシンＢ、Ｆ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、ＮおよびＳを含む多くの哺乳動物カテプシン酵素はこのスーパーファミリーに入れられており、その活性の不適切な制御は、関節炎、筋ジストロフィー、炎症、糸球体腎炎および腫瘍の侵襲を含む多くの代謝性疾患への関与が示唆されている。病原性カテプシン様酵素としては、細菌のジンジパイン（ｇｉｎｇｉｐａｉｎｓ）、マラリアのファルシパインＩ、ＩＩ、ＩＩＩ以下、およびＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｅｉおよびｂｒｕｃｅｉ、Ｃｒｉｔｈｉｄｉａ ｆｕｓｉｃｕｌａｔａ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ種からのシステインプロテアーゼが挙げられる。
【０００３】
ＷＯ９７／４００６６には、カテプシンＳに対するインヒビターの使用が記載されている。この酵素の阻害は、プロテアーゼ活性によって引き起こされる疾患を予防または治療することが示唆されている。カテプシンＳは、パパインスーパーファミリーに属する高度に活性なシステインプロテアーゼである。その一次構造は、カテプシンＢとは３１％しか相同にすぎないが、ヒトカテプシンＬおよびＨおよび植物システインプロテアーゼのパパインとはそれぞれ５７％、４１％および４５％相同である。カテプシンＳは主としてリンパ節、脾臓およびマクロファージに見出されており、この限局された存在はこの酵素が変性疾患の病因に関与している可能性を示唆している。さらに、ＭＨＣクラスＩＩ分子の抗原ペプチドへの結合、およびその結果生成する複合体の細胞表面への輸送には、タンパク質加水分解によるＩｉの破壊が必要であることがわかっている。さらに、カテプシンＳは、クラスＩＩ分子がペプチドと結合できるようにするのに必要な有効なＩｉタンパク質加水分解のためにＢ細胞において必須であることがわかっている。それゆえ、この酵素の阻害は、クラスＩＩ拘束免疫応答を変調するうえで有用である（ＷＯ９７／４００６６）。カテプシンＳの関与が示唆される他の疾患は、慢性閉塞性肺疾患および子宮内膜症である。
【０００４】
（発明の開示）
（発明が解決しようとする技術的課題）
ＷＯ９８／５０５３３は、式Ｉ：
【化８】
2004513942.tif 000003
で示される化合物の使用を記載している。
この式の化合物は、プロテアーゼ、とりわけパパインスーパーファミリー、とりわけカテプシンファミリー、およびとりわけカテプシンＫに対するインヒビターとして有用であることが示唆されている。これら化合物におけるケトン含有環は自然にラセミ化する傾向があり、その臨床的な有用性を制限している。ケトンカテプシンＫインヒビターを記載する他のＳＫＢ出願としては、ＷＯ９８／４６５８２、ＷＯ９９／６４３９９、ＷＯ００／２９４０８、ＷＯ００／３８６８７およびＷＯ００／４９０１１が挙げられる。しかしながら、これら出願のいずれも、ペプチドミメチック鎖への結合に近接したα−環置換基を記載していない。
【０００５】
Ｓｈｅｎａｉら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５ ３７ ２９０００−２９０１０）は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの栄養体からのファルシパイン２として示される、主要なシステインプロテアーゼの単離を記載している。この酵素はとりわけ、酸性食胞中で赤血球ヘモグロビンを加水分解すると思われる。この刊行物はまた、Ｎ末端タグ（折り畳みの際に自触媒により除かれる）を用いた対応遺伝子の単離をも記載している。
【０００６】
ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ ＢｅｅｃｈａｍのＷＯ９９／５３０３９は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍからの栄養体調製物に対する広範な範囲のペプチドミメチックのシステインプロテアーゼ阻害活性を記載している。どのシステインプロテアーゼが阻害されるかについて手引きは提供されていない。殆どのペプチドミメチックは線状の構造であるが、一つの化合物（Ｒ，Ｓ）−３−［Ｎ−（３−ベンジルオキシベンゾイル）−Ｌ−ロイシニルアミノ］テトラヒドロフラン−４−オンは上記式Ｉのフラノンに属する。そのようなキラル的に不安定な構造で予期されるように、ケトン含有環はラセミ体である。
【０００７】
（その解決方法）
本発明の第一の側面は、式ＩＶ：
【化９】
2004513942.tif 000004
（式中、
Ｒ１はＲ’−Ｃ（＝Ｏ）−またはＲ’−Ｓ（＝Ｏ）２−
ここでＲ’は、式：
【化１０】
2004513942.tif 000005
（式中、Ｘ＝Ｏ、Ｓ、ＮＨ、
Ｗ、Ｙ、Ｚ＝ＣＨ、Ｎ、
Ｒ”＝下記より選ばれる単一または複数の環置換基の組み合わせ：
Ｈ、Ｃ１−７−アルキル、Ｃ３−６−シクロアルキル、ＯＨ、ＳＨ、アミン、ハロゲン）で示される基；
Ｒ３＝Ｃ１−７−アルキル、Ｃ２−Ｃ７アルケニル、Ｃ２−Ｃ７アルケニル、Ｃ３−７−シクロアルキル、Ａｒ、Ａｒ−Ｃ１−７アルキル；
Ｒ４＝Ｈ、Ｃ１−７−アルキル、Ｃ３−７−シクロアルキル、Ｃ２−７アルケニル、Ａｒ、Ａｒ−Ｃ１−７−アルキル；
Ｒ５＝Ｃ１−７−アルキル、ヒドロキシ−またはハロ−置換Ｃ１−７アルキル、ハロゲン、Ａｒ−Ｃ１−７−アルキル、Ｃ０−３−アルキル−ＣＯＮＲ３Ｒ４またはＲｉｖ；
ここでＲｉｖは式：
【化１１】
2004513942.tif 000006
（式中、ｎ＝１−３、ｍ＝１−３；
Ｒｖ、Ｒｖｉ＝Ｈ、Ｃ１−７−アルキル；
Ａ＝Ｎ、ＣＨ；
Ｂ＝Ｎ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ；
Ｒｖｉｉ＝ＢがＯ、Ｓのときは不在；またはＲｖｉｉ＝ＢがＮ、ＣＨのときはＨ、Ｃ１−７−アルキル；
Ｒｖｉｉｉ＝Ｏ、Ｃ１−７−アルキル）で示される基；
Ｒ６＝Ｈ、Ｃ１−７−アルキル、Ａｒ−Ｃ１−７−アルキル、Ｃ１−３−アルキル−ＳＯ２−Ｒｉｘ、Ｃ１−３−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨＲｉｘまたはＣＨ２ＸＡｒ（式中、ＲｉｘはＣ１−７−アルキル、Ａｒ−Ｃ１−７−アルキルまたはＣ３−Ｃ６−シクロアルキル））
で示される化合物を提供する。
【０００８】
本明細書において「Ｃ１−７−アルキル」は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシル、ヘプチルおよびその簡単な異性体などの直鎖および分枝鎖脂肪族炭素鎖を含む。さらに、Ｃ１−７−アルキルは任意に１または２のハロゲンおよび／またはへテロ原子のＳ、Ｏ、ＮＨで置換されていてよい。へテロ原子が鎖の末端に位置する場合は該原子は１または２の水素原子、たとえばヒドロキシメチルで適当に置換されている。Ｓへテロ原子は、とりわけＲ３がＣ１−７アルキルまたはＡｒＣ１−７アルキルの場合にスルホン（ｓｕｌｐｈｏｎｅ）に酸化されていてよい。
【０００９】
本明細書において「Ｃ１−３−アルキル」は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル（これらのいずれも上記と同様に任意に置換されていてよい）を含む。
「アミン」は、ＮＨ２、ＮＨＣ１−３−アルキルまたはＮ（Ｃ１−３−アルキル）２を含む。
本明細書において「ハロゲン」は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉを含み、とりわけクロロ、好ましくはフルオロである。
【００１０】
本明細書において「Ｃ３−６−シクロアルキル」（またはＣ３−Ｃ７シクロアルキル）は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ３−６（またはＣ３−７）炭素環をさらに含む「Ｃ１−７−アルキル」のあらゆる変形物を含む。あるいは、Ｃ３−６またはＣ３−７シクロプロピルは、介在するＣ１−Ｃ７アルキルなしに隣接する炭素原子にスピロ結合していてよい。
【００１１】
本明細書において「Ａｒ−Ｃ１−７−アルキル」は、「Ｃ１−７−アルキル」（上記に定義）を介してジヒドロ−（３Ｈ）−フラノン環系に結合しているかまたはＲ２、Ｒ３またはＲ４の場合は該分子骨格に直接結合している、フェニル、ピラゾリル、ピリジル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソキサゾリル、チアジノリル、イソチアジノリル、チアゾリル、オキサジアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、フラニルまたはチエニル芳香環（Ａｒ）を含む。任意に、芳香環Ａｒは、ハロゲン、Ｃ１−３−アルキル、ＯＨ、ＯＣ１−３−アルキル、ＳＨ、ＳＣ１−３−アルキル、アミンなどで置換されていてよい。
【００１２】
本明細書において「Ｃ１−３−アルキル−ＣＯＮＲ”’，Ｒｉｖ」は、１°、２°または３°のカルボキサミドで置換された直鎖または分枝鎖炭素鎖を含み、その際、Ｒ”’、ＲｉｖはＨおよびＭｅを含む。
本明細書において「Ｃ１−３−アルキル−ＳＯ２−Ｒｉｘ」は、スルホンで置換された直鎖または分枝鎖炭素鎖を含み、その際、Ｒｉｘは「Ｃ１−７−アルキル」、「Ａｒ−Ｃ１−７−アルキル」、「Ｃ３−６−シクロアルキル」を含む。
本明細書において「Ｃ１−３−アルキル−Ｃ（Ｏ）−ＮＨＲｉｘ」は、第二級カルボキサミドで置換された直鎖または分枝鎖炭素鎖を含み、その際、Ｒｉｘは、「Ｃ１−７−アルキル」、「Ａｒ−Ｃ１−７−アルキル」、「Ｃ３−６−シクロアルキル」を含む。
【００１３】
キラル中心が存在する場合は、全ての異性体が包含されることを意図している。ピラノンの５位に対応する位置（すなわち、ペプチドミメチック鎖への結合に隣接するＲ５）の（Ｒ）および（Ｓ）の両立体化学が本発明により包含され、ある場合、たとえばカテプシンＳインヒビターの場合には（Ｓ）が好ましい。カテプシンＫやファルシパインなどの他のシステインプロテアーゼはこの位置でのＲ立体異性体に有利に思われるが、Ｓ立体異性体も許容しうる。
【００１４】
本発明の化合物は、特にパパインスーパーファミリーのカテプシンまたはカテプシン様プロテアーゼに対するシステインプロテアーゼインヒビターである。典型的に本発明の化合物は、生理環境の特徴であるタンパク質加水分解酵素の複合混合物中の単一のプロテアーゼに対する選択的阻害、たとえば１０倍の選択性、好ましくは１００倍以上の選択性を示す。タンパク質分解活性の不正確な制御は、高血圧、血液凝固やもっと悪い状態などの不必要な病理学的状態に導くので、阻害特異性は、最も好ましくはカテプシンファミリーなどの同じ酵素のクラスまたはファミリーの他の成員（高度のホモロジーを有する）に対して示される。このことは、薬剤の投与が長引きやすい自己免疫疾患などの疾患において特に望ましいことである。
【００１５】
しかしながら、それにも拘わらず、生理的プロテアーゼの阻害に関してある程度の無差別さ（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）を示す化合物も有用でありうる。たとえば、多くのカテプシンの生理機能は重複している、すなわち、ある特定のシステインプロテアーゼの阻害は、他の阻害されていないプロテアーゼまたは別の代謝経路の存在またはアップレギュレーションによって代償されることができる。あるいは、短期間の処置は一過性の毒性または他の副作用としかならないこともある。
【００１６】
所定の推定インヒビターについてのシステインプロテアーゼの交差特異性（すなわち、インヒビターであれば選択性）は、たとえばカテプシンＳ、ＫおよびＬに関連して実施例に記載するように、通常の酵素および細胞培養アッセイによって容易に確認することができる。
【００１７】
本発明のさらなる側面は、カテプシンＳが要因である疾患、すなわち、好ましくはパパインスーパーファミリーの他の成員の実質的な同時阻害をもたらすことなく、カテプシンＳの阻害によって緩和または修飾される疾患または状態の治療に式ＩＶの化合物を使用する方法を包含する。
【００１８】
そのような疾患または状態の例としては、ＷＯ９７／４００６６に列挙されているもの、たとえば、自己免疫疾患、アレルギー、多発性硬化症、慢性関節リウマチなどが挙げられる。本発明はさらに、カテプシンＳの阻害によって緩和または軽減される疾患または状態の治療および治療用医薬の製造における式ＩＶの化合物の使用を提供する。
【００１９】
一つの好ましい態様において、カテプシンＳインヒビターは、
Ｒ１＝Ｒ’Ｃ（Ｏ）
（式中、Ｒ’＝式：
【化１２】
2004513942.tif 000007
で示される基）
Ｒ４およびＲ６＝Ｈ；
Ｒ３＝ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、３−（２，２−ジメチルプロピル）、４−（２−メチルブチル）、４−（３，３−ジメチルブチル）、４−（３，３−ジメチル−２−メチルブチル）、４−（３−メチル−２−メチルブチル）、５−（２−メチル−３−メチルペンチル、シクロヘキシルメチル、シクロペンチルメチル）；
Ｒ５＝ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２Ａｒ、ＣＨ２ＣＯＮＨ２、（ＣＨ２）２ＣＯＮＨ２、式：
【化１３】
2004513942.tif 000008
で示される基、またはその置換体である。
【００２０】
カテプシンＳインヒビターの好ましいグループは、Ｒ５がメチル、エチル、プロピルまたはヒドロキシメチルである他は上記［００１９］の定義と同じである化合物を包含する。カテプシンインヒビターのさらなるグループは、上記［００１９］の定義と同じであるが、フェニルとしてのＲ’が複数の置換基（たとえば、Ｃ−Ｃ７アルキル、ヒドロキシ、ハロなど）を典型的には３位および４位に有する化合物を包含する。
【００２１】
式ＩＶにおけるＲ３のさらなる好ましい定義としては、スルホン置換Ｃ１−７アルキルおよび特にスルホン置換ＡｒＣ１−７アルキル、たとえば、ベンゼンスルホニルメチル、フェニルスルホニルメチルおよびフェニルエチルスルホニルメチルが挙げられる。これらＲ３基は、上記［００１９］および［００２０］に記載の好ましい変数と都合よく組み合わされる。
【００２２】
本発明のさらなる側面は、治療または予防を必要とする哺乳動物に式ＩＶの化合物を投与することを含む、原生動物または細菌感染症などの寄生虫性感染症の治療または予防方法を提供する。さらに別の側面は、無脊椎動物ベクターおよび／またはそのようなベクターの侵入しやすい部位に式ＩＶの化合物を投与することを含む、原生動物寄生虫の制御方法を提供する。
都合よくは、原生動物または細菌寄生虫は、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ種、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ種、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ種、Ｇｉａｒｄｉａ種、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ種、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種、Ｃｒｉｔｈｉｄｉａ種、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ種またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ種である。
【００２３】
Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍの治療または予防は、ファルシパインＩＩ酵素の阻害を含むのが適している。
寄生虫の治療および予防に好ましいＲ３基としては、２−メチルプロペン−１−イル、イソブチルおよびベンジル、とりわけＬ−ロイシンまたはＬ−フェニルアラニンの側鎖を定めるエナンシオマーが挙げられる。
【００２４】
本発明の化合物は塩を形成することができ、該塩は本発明の他の側面を構成する。式ＩＶの化合物の適当な薬理学的に許容しうる塩としては、有機酸の塩、とりわけカルボン酸の塩が挙げられ、酢酸、トリフルオロ酢酸、乳酸、グルコン酸、クエン酸、酒石酸、マレイン酸、リンゴ酸、パントテン酸、イセチオン酸、アジピン酸、アルギン酸、アスパラギン酸、安息香酸、酪酸、ジグルコン酸、シクロペンタン酸、グルコヘプタン酸、グリセロリン酸、シュウ酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、フマール酸、ニコチン酸、パルミチン酸（ｐａｌｍｏａｔｅ）、ペクチン酸、３−フェニルプロピオン酸、ピクリン酸、ピバル酸、プロピオン酸、酒石酸、ラクトビオン酸、ピボル酸（ｐｉｖｏｌａｔｅ）、ショウノウ酸、ウンデカン酸およびコハク酸の塩を含むがこれらに限られるものではない、有機スルホン酸の塩、たとえばメタンスルホン酸、エタンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ショウノウスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸の塩；および無機酸の塩、たとえば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、重硫酸、ヘミ硫酸（ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅ）、チオシアン酸、過硫酸、リン酸およびスルホン酸の塩が挙げられる。式ＩＶの化合物は、ある場合には水和物として単離できる。
【００２５】
本発明が式ＩＶの化合物をインビボで放出するプロドラッグ、溶媒和物、複合体その他の形態に及ぶことが評価されるであろう。
活性成分を単独で投与することも可能であるが、医薬製剤の一部として配合するのが好ましい。そのような製剤は、１またはそれ以上の許容しうる担体／賦形剤および任意に他の治療成分とともに上記活性成分を含むであろう。担体は、製剤の他の成分と相溶性で服用者に害を及ぼさないという意味で許容しうるものでなければならない。
【００２６】
該製剤には、直腸経由、鼻経由、局所的（口内および舌下を含む）、膣経由または非経口的（皮下、筋肉内、静脈内および皮内を含む）投与のものが含まれるが、好ましくは該製剤は経口で投与する製剤である。該製剤は、単位投与剤型、たとえば、錠剤や徐放カプセル剤にて都合よく提供でき、調剤の技術分野でよく知られた方法により調製できる。
【００２７】
そのような方法には、上記活性成分を担体と混合する工程が含まれる。一般に、製剤は、活性成分を液体担体または微細に破砕した固体担体または両担体と均一かつ充分に混合し、ついで必要なら製品に成型することにより調製する。本発明は、式ＩＶの化合物または薬理学的に許容しうるその塩を薬理学的に許容しうる担体またはビヒクルと混合することを含む、医薬組成物の製造方法をも包含する。医薬製剤の調製が医薬賦形剤と塩の形態の活性成分との充分な混合を含むなら、非塩基性、すなわち酸性かまたは中性の賦形剤を用いるのがしばしば好ましい。
【００２８】
本発明における経口投与のための製剤は、それぞれ所定量の活性成分を含有するカプセル剤、カシェ剤または錠剤などの個別の単位（ｄｉｓｃｒｅｔｅ ｕｎｉｔｓ）として；散剤または顆粒剤として；水性液体または非水性液体中の活性成分の液剤または懸濁剤として；または水中油液体エマルジョンまたは油中水液体エマルジョンとして、およびボーラスなどとして提供できる。
【００２９】
経口投与のための組成物（たとえば、錠剤やカプセル剤）に関しては、適当な担体なる語は、通常の賦形剤、たとえば結合剤（たとえばシロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントゴム、ポリビニルピロリドン（ポビドン）、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ショ糖およびデンプン）；充填剤および担体（たとえば、コーンスターチ、ゼラチン、乳糖、ショ糖、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カルシウム、塩化ナトリウムおよびアルギン酸）；および滑沢剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウムおよび他の金属性ステアリン酸塩、ステアリン酸グリセリンエステル、ステアリン酸、シリコーン液、タルクワックス、オイルおよびコロイド状シリカ）などのビヒクルを包含する。ペパーミント、冬緑油、チェリー香料などの香料剤も用いることができる。投与剤型を容易に識別できるように着色剤を添加するのが望ましい。錠剤はまた、当該技術分野でよく知られた方法によりコーティングすることもできる。
【００３０】
錠剤は、任意に１またはそれ以上の補助成分とともに圧縮または成型により製造できる。圧縮錠剤は、適当な機械で粉末や顆粒などの自由流動形態の活性成分を任意に結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、表面活性剤または分散剤と混合して圧縮することにより調製できる。成型錠剤は、適当な機械で不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を成型することにより調製できる。錠剤は、任意にコーティングしまたは刻み目を入れることができ、活性成分の緩やかなまたは制御された放出を可能とすべく調合することができる。
【００３１】
経口投与に適した他の製剤としては、着香基剤、通常、ショ糖およびアラビアゴムまたはトラガカントゴム中に活性成分を含むトローチ；ゼラチンやグリセリンなどの不活性基剤、またはショ糖およびアラビアゴム中に活性成分を含むパステル剤；および適当な液体担体中に活性成分を含む口内洗剤が挙げられる。
【００３２】
本発明の化合物または製剤の適当な投与量は適応症および患者に依存し、通常の動物試験により容易に決定される。０．０１〜１００μＭ、さらに好ましくは０．０１〜１０μＭ、たとえば０．１〜５μＭのオーダーの細胞内濃度（パパインスーパーファミリーの生理的プロテアーゼの阻害のために）を与える投与量が典型的に望ましく達成できる。寄生虫に対するイクスビボまたは局所投与では典型的に一層高い濃度が必要であろう。
【００３３】
本明細書において使用する「Ｎ−保護基」または「Ｎ−保護」なる語は、合成手順のあいだの所望でない反応からアミノ酸またはペプチドのＮ−末端を保護することまたはアミノ基を保護することを意味する。よく用いられるＮ−保護基はグリーン（Ｇｒｅｅｎｅ）の「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（ジョン・ウイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク、１９８１）（参照のため本明細書中に引用する）に記載されている。Ｎ−保護基としては、たとえばホルミル、アセチル、プロピオニル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタリル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、α−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、４−ニトロベンゾイルなどのアシル基；ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニルなどのスルホニル基；ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニリル）−１−メチルエトキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニルなどのカルバメート形成基；ベンジル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチルなどのアルキル基；およびトリメチルシリルなどのシリル基が挙げられる。好ましいＮ−保護基としては、ホルミル、アセチル、アリル、Ｆ−ｍｏｃ、ベンゾイル、ピバロイル、ｔ−ブチルアセチル、フェニルスルホニル、ベンジル、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）およびベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）などが挙げられる。
【００３４】
ヒドロキシおよび／またはカルボキシ保護基もまた上記グリーンの文献に広範囲に紹介されており、メチルエーテル、置換メチルエーテル、たとえば、メトキシメチル、メチルチオメチル、ベンジルオキシメチル、ｔ−ブトキシメチル、２−メトキシエトキシメチルなど、シリルエーテル、たとえば、トリメチルシリル（ＴＭＳ）、ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、トリベンジルシリル、トリフェニルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリイソプロピルシリルなど、置換エチルエーテル、たとえば、１−エトキシメチル、１−メチル−１−メトキシエチル、ｔ−ブチル、アリル、ベンジル、ｐ−メトキシベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチルなど、アラルキル基、たとえば、トリチル、およびピクシル（９−ヒドロキシ−９−フェニルキサンテン誘導体、とりわけクロライド）などのエーテルを含む。エステルヒドロキシ保護基としては、ギ酸エステル、ベンジルギ酸エステル、クロロ酢酸エステル、メトキシ酢酸エステル、フェノキシ酢酸エステル、ピバル酸エステル、アダマンタン酸エステル（ａｄａｍａｎｔｏａｔｅ）、メシト酸エステル、安息香酸エステルなどのエステルが挙げられる。カーボネートヒドロキシ保護基としては、メチルビニル、アリル、シンナミル、ベンジルなどが挙げられる。
【００３５】
化合物の合成は、溶液相または液相のいずれかで行う化学的方法の組み合わせにより行う。
Ｒ５置換基は、効力の改善を含む多くの有利な性質を一般式ＩＶの分子に付与し、インヒビター分子に溶解性および薬動力学的特性を改善する基本的な機能性（ｂａｓｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ）を追加する可能性を提供する。さらに、Ｒ５がアルキルまたは他の置換基であって単に水素原子でない式ＩＶの分子は、ピラノンアルファ炭素（文脈で特に断らない限り、本明細書では環の４位すなわちＣ４をいう）で良好なキラル安定性を示す。キラル安定性とは、本発明の化合物がＣ４における立体化学の異なる立体異性体の等量の混合物としてではなく優勢な立体異性体として存在することを意味する。本発明の化合物は、長期間の後に９０％を超えてジアステレオマーとして純粋であるのが好ましい。
【００３６】
ＷＯ９８／５０５３３、ＷＯ９８／４６５８２、ＷＯ９９／６４３９９、ＷＯ００／２９４０８、ＷＯ００／３８６８７およびＷＯ００／４９０１１では、式Ｉの同位置に置換基が存在しないのと比べて本発明の化合物ではＲ５置換基が存在する点に特に注目すべきである。
【００３７】
多くの活性なインヒビターは、Ｌ−ロイシン、Ｌ−ノルロイシンなどの市販のアミノ酸残基を含んでいる。あるいは、活性なインヒビターは新規な疎水性アミノ酸を含んでおり、該アミノ酸はスキーム７に詳記する化学的合成法に従って調製される。スキーム７に詳記した合成法はＤｅｘｔｅｒ， Ｃ． Ｓ．およびＪａｃｋｓｏｎ， Ｒ． Ｆ． Ｗ．、Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ． ７５−７６， １９９８から採用したものであり、式ＩＶでＲ３により示されるアナログに容易にアクセスすることを可能にする。本明細書において例示した新規で複数の分枝を有する幾つかのα−アミノ酸構築ブロックの側鎖は、たとえばノルロイシンとｔ−ブチルアラニンの組み合せのような他のアミノ酸側鎖の組み合せの特性のハイブリッドと考えることができる。この合成法はまた、２０００年１０月１７日に英国特許庁に出願した発明の名称が「分枝鎖アミノ酸」であるＧＢ０００２５３８６．４の優先権を主張するＭｅｄｉｖｉｒ ＵＫの同時継続ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ０１／０２１６２にも記載されている。
【００３８】
スルホニル含有Ｃ１−Ｃ７アルキルまたはＡｒＣ１−Ｃ７アルキルＲ３基、たとえばアリールアルキルＣ０−２スルホニルメチル官能基へのアクセスは、適当に保護したアミノ酸システインから得ることができる。システインのチオールとフェノールなどのアリールアルコールとのミツノブ（Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ）カップリングはフェニルチオメチルＲ３側鎖を含有する保護アミノ酸を生成し、これはｍ−クロロ過安息香酸を用いて容易に酸化してＲ３側鎖フェニルスルホニルメチルを得る。ベンジルスルホニルメチルおよびフェネチルスルホニルメチルＲ３側鎖を含有するアミノ酸は、システインのチオールを臭化ベンジルおよび臭化フェネチルでそれぞれ求核置換することにより調製できる。得られたスルフィドをｍ−クロロ過安息香酸で酸化すると、ベンジルスルホニルメチルおよびフェネチルスルホニルメチルＲ３側鎖を有する適当に保護されたアミノ酸が得られる。
【００３９】
ピラノンまたはＮ−保護アミノピラノン構築ブロック（合成はスキーム１〜５Ａに例示してある）は、スキーム８に詳記したインヒビター分子の固相合成（典型的に５〜２５ｍｇの生成物）に利用する。あるいは、大スケールの合成のためには、インヒビターの完全合成は液相化学により達成できる。
本発明の化合物は、下記スキーム１〜４の記載に従って調製できる。
【００４０】
スキーム１
【化１４】
2004513942.tif 000009
（ａ）ＯｓＯ４、ＮＭＭ；（ｂ）ＴＢＤＰＳＣｌ、イミダゾール、ＤＭＦ／ＣＨ２Ｃｌ２；（ｃ）アリルブロマイド、ＴＢＡＦ、Ｂｕ２ＳｎＯ；（ｄ）ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ中のＬｉＯＨ；（ｅ）ｉＢｕＯＣＯＣｌ、ＮＭＭ；（ｆ）Ｅｔ２Ｏ中のジアゾメタン；（ｇ）８０％酢酸中のＬｉＣｌ（１０当量）；（ｈ）（Ｐｈ３Ｐ）４Ｐｄ、ＣＨＣｌ３、ＡｃＯＨ、ＮＭＭ；（ｉ）（ＭｅＯ）３ＣＨ、ｐ−トルエンスルホン酸、ＭｅＯＨ；（ｊ）ＴｓＣｌ、ピリジン；（ｋ）Ｍｅ２ＣｕＣＮＬｉ２；（ｌ）１０％Ｐｄ／炭素、Ｈ２；（ｍ）Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−Ｏｐｆｐ、ＨＯＢｔ、ＮＭＭ、ＤＭＦ；（ｎ）ジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌ；（ｏ）Ｒ１キャッピング基、たとえば安息香酸、ＨＢＴＵ、ＨＯＢｔ、ＮＭＭ、ＤＭＦ；（ｐ）ＴＦＡ、ＮａＨＣＯ３
【００４１】
一般式ＩＶの化合物はスキーム１に示す方法により調製する。公知のＣｂｚ−エチルエステル１−スキーム−１を四酸化オスミウムおよび４−メチルモルホリンで処理してジオール２−スキーム−１を得る。第一級アルコールをｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリルクロライドおよびイミダゾールを用いて保護して３−スキーム−１を得る。第二級アルコール３−スキーム−１の保護をアリルブロマイドを用いて行い、その後にエチルエステルの塩基加水分解をして４−スキーム−１を得る。酸４−スキーム−１の活性化をクロロギ酸イソブチルおよび４−メチルモルホリンを用いて行って５−スキーム−１を得る。ついで５−スキーム−１をジアゾメタンで処理してジアゾケトン６−スキーム−１を得る。ジアゾケトン６−スキーム−１の環化を塩化リチウム／酢酸水溶液により行って３−ピラノン７−スキーム−１を得る。パラジウム（０）および酸で処理することによって７−スキーム−１からアリル保護基を除去してアルコール８−スキーム−１を得る。
【００４２】
ケトン８−スキーム−１からのケタール生成をオルトギ酸トリメチルおよびｐ−トルエンスルホン酸で処理することによって行って９−スキーム−１を得る。アルコール９−スキーム−１のメチル誘導体１０−スキーム−１への変換は、当該技術分野で知られた方法を用いて、たとえば塩化トシルおよびピリジンでトシル化した後、メチルリチウムから調製した高次クプラート（ｈｉｇｈ ｏｒｄｅｒ ｃｕｐｒａｔｅ）と反応させることにより達成できる。１０−スキーム−１からのＣｂｚ保護基の除去は、水素の存在下の１０％Ｐｄ／炭素を用いて行い、１１−スキーム−１を得る。アミン１１−スキーム−１をカルボン酸と当該技術分野で知られた方法、たとえばＨＯＢＴおよびＮＭＭの存在下でのペンタフルオロフェノール誘導体を用いたカップリングによりカップリングさせてアミド１２−スキーム−１を得ることができる。ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基を酸、たとえばジオキサン中の塩化水素で処理して除去し、ついでアミン塩をカルボン酸と当該技術分野で知られた方法、たとえばＨＢＴＵおよびＨＯＢＴの存在下での酸を用いたカップリングによりカップリングしてアミド１３−スキーム−１を得る。１３−スキーム−１からのケタール官能基の除去を炭酸水素ナトリウムの存在下のトリフルオロ酢酸で行って１４−スキーム−１を得る。
【００４３】
一般式ＩＶの化合物のための構築ブロックは、さらにスキーム２〜４により都合よく調製できる。
スキーム２
【化１５】
2004513942.tif 000010
（ａ）ピリジン、無水酢酸；（ｂ）トリエチルシラン、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル；（ｃ）ナトリウムメトキシド、メタノール；（ｄ）シクロヘキサノンジエチルアセタール；（ｅ）スワーン（Ｓｗｅｒｎ）酸化；（ｆ）ＰＰｈ３ＣＨＣＨ３、ＴＨＦ；（ｇ）Ｈ２、パラジウム／炭素、重炭酸ナトリウム；（ｈ）８０％酢酸水溶液；（ｉ）水素化ナトリウム、ベンジルブロマイド；（ｊ）塩化メシル、ピリジン；（ｋ）アジ化ナトリウム、ＤＭＦ；（ｌ）Ｈ２、パラジウム／炭素、ジ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシ）カルボニル；（ｍ）デス−マーチンパーヨーディナン（Ｄｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎ ｐｅｒｉｏｄｉｎａｎｅ）
【００４４】
リキソース１−スキーム−２をピリジン中の無水酢酸で室温にて一夜過アセチル化して２−スキーム−２を得ることができる。３−スキーム−２を与えるアノマー中心での還元は、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルの存在下でトリエチルシランを用いて行う。トリアセテート３−スキーム−２の加水分解は４−スキーム−２を与え、その際、ビシナルジオールはシクロヘキサノンアセタール５−スキーム−２として保護することができる。保護していないアルコール官能基のスワーン酸化は、必要とするＣ５ピラノン置換基の導入のための重要な中間体である６−スキーム−２を与える。ここでエチル置換を、ＴＨＦ中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシドとともにエチルトリフェニルホスホニウムブロマイドで０℃にて処理することにより行って、７−スキーム−２を得る。酢酸エチル中の７−スキーム−２を重炭酸ナトリウムで水素化すると、図示した立体化学を有するエチル誘導体８−スキーム−２を得る。
【００４５】
シクロヘキサノンアセタール８−スキーム−２の脱保護は、無水酢酸で一夜行うことができ、ジオール９−スキーム−２を得る。エクアトリアルヒドロキシル基の選択的ベンジル化は１０−スキーム−２を与え、ついでこれをピリジン中の塩化メシルを用いて５０℃でメシル化して１１−スキーム−２を得ることができる。８０℃のＤＭＦ中のアジ化ナトリウムを用いたメシラートアニオンのアジド置換は１２−スキーム−２を与え、これからＢＯＣ−無水物の存在下での水素化分解によりピラノール１３−スキーム−２を得ることができる。ピラノン１４−スキーム−２への酸化は、デス−マーチンパーヨーディナンを用いて行う。
【００４６】
スキーム２において、Ｃ５置換基の導入はウィッティッヒ化学、ついで水素化を用いて行うことができ、それゆえ化合物６−スキーム−２はＣ５エチル誘導体８−スキーム−２に変換することができる。他のＣ５置換はこの経路を用いて達成できる。たとえば、別のウィッティッヒまたはホルナー−エモンス化学は異なるアルキル置換基に導くであろう。同様の仕方でＣ５ヒドロキシメチル基を調製でき、これ自体をさらに他の基、たとえばハロゲン、アミノおよび他の塩基性基およびスルフヒドリルに誘導体化することができる。
【００４７】
Ｌ−リキソースを出発物質として、４位および５位における立体配置の４つの可能なすべての組み合わせ（すなわち４Ｓ，５Ｓ；４Ｓ，５Ｒ；４Ｒ，５Ｓおよび４Ｒ，５Ｒ）を有する種々の５−置換４−アミノ−３−ヒドロキシピラノールを調製するための一般的方法が確立されている。この方法をスキーム２Ａに例示する。ピラノールはついで本明細書に記載するようにＮ−伸長およびキャッピングし、その後、たとえばデス−マーチン過ヨウ素化反応によりケト化合物に酸化できる。
【化１６】
2004513942.tif 000011
【００４８】
Ｌ−リキソースは、ピリジンや他の混合有機溶媒などの有機溶媒中、酸無水物、ハロゲン化アシルなどの適当なアシル化剤を用いてアシル化し、過アシル化した化合物１−スキーム−２Ａを得ることができる。ついで、この化合物をルイス酸とともにトリアルキルシラン、たとえばトリエチルシランおよびトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリルを用いたアノマー還元に供することができる。該化合物を対応のハロ−、スルホ−またはチオカルボ−グリコシドに変換した後、公知の方法を用いてラジカル還元を行ってもアノマー還元をもたらすことができる。塩基性条件下で脱アシル化するとトリオール３−スキーム−２Ａが得られ、これを標準的な保護基法を用いて２，３−ヒドロキシル基を選択的に保護してケタール４−スキーム−２Ａを得ることができる。
【００４９】
４−ＯＨ基を酸化してケト官能基５−スキーム−２Ａとすることは、スワーン法、デス−マーチンまたは他の適当な酸化法を用いて行うことができる。種々の４−置換アルケン６−スキーム−２Ａは、適当なウィッティッヒ試薬、たとえばトリフェニルアルキルホスホニウムハライドまたはトリフェニルアルキルアリールホスホニウムハライドを塩基とともに用いて得ることができる。ウィッティッヒ生成物を緩衝液の存在下で接触水素化すると化合物８−スキーム−２Ａが優先的に得られる。あるいは、水素化の前にケタール保護基を除去することにより、この位置が他の立体配置である化合物１０−スキーム−２Ａを得ることができる。アルケン化合物はまたヒドロホウ素化（さらなる修飾に適したヒドロキシル基を導入する）に供することもできる。
【００５０】
４−アルキル化合物を得る他の可能性は、４−ＯＨ基を脱離基、たとえばスルホネートに変換した後、所望のアルキル基の銅（ｃｕｐｒｏｕｓ）またはグリニャール試薬により変換することである。
ケタール保護基は、１Ｍ ＨＣｌ／ＴＨＦ（１：１）などの酸性条件下に室温で、または酢酸水溶液中で８０℃に加熱することによって除去することができ、ジオール８−スキーム−２Ａを与える。２−ＯＨ基を塩基の存在下、ハロゲン化ベンジルなどのアルキル化剤または他の同様の試薬で選択的に保護すると２−Ｏ−保護化合物１１，１２−スキーム−２Ａのみをまたは優先的に得ることができる。
【００５１】
３−ＯＨはスルホネートなどの適当な脱離基に変換することができ、ついでこれを置換してアジド１３，１４−スキーム−２Ａとすることができる。別法として、ミツノブ反応を用いてアジド置換化合物を生成することができる。アジド化合物をジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネートなどのカルバモイル化試薬の存在下で水素化すると、所望の１，５−アンヒドロ−３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−３，４−ジデオキシ−４−エチル−Ｄ−キシリトールおよび１，５−アンヒドロ−３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−２，３−ジデオキシ−２−エチル−Ｌ−アラビニトールを得る。
【００５２】
炭素３が他の立体配置である一連の化合物は、当該技術分野で知られた方法により化合物１１，１２−スキーム−２Ａ中の３−ＯＨの立体配置を逆転させ、ついで上記手順、すなわち脱離基の生成およびアジド置換を行うことにより調製できる。該化合物はまた、以下の手順で調製できる。上記酸化試薬を用いた３−ＯＨのケトンへの酸化、ベンジルオキシアミンハライドなどの試薬を用いたケトンのオキシムへの変換、および最後にオキシムのアミノ官能基への還元。これは２つの異なる立体配置を有する化合物の混合物を与え、これらは公知の方法を用いて分離することができる。アミノ基のＢｏｃ保護およびベンジル保護基の還元的除去は、残りの２つの立体配置４Ｒ，５Ｓおよび４Ｒ，５Ｒを有する化合物を与える。
【００５３】
スキーム３
【化１７】
2004513942.tif 000012
（ａ）ＴＦＡ；（ｂ）Ｍｅ３Ａｌ、ＨＣｌ．ＨＮＭｅ（ＯＭｅ）、ＤＣＭ；（ｃ）ＣＣｌ３（ＮＨ）ＯｔＢｕ、ＢＦ３．Ｅｔ２Ｏ、ＤＣＭ、シクロヘキサン；（ｄ）Ｅｔ２Ｏ中のＬＡＨ；（ｅ）ｔＢｕＯＨ、２−メチル−２−ブテン、ＮａＣｌＯ２、ＮａＨ２ＰＯ４、Ｈ２Ｏ；（ｆ）ｔＢｕＯＫ、Ｅｔ２Ｏ、Ｈ２Ｏ；（ｇ）ｉＢｕＯＣＯＣｌ、ＮＭＭ、ＴＨＦ；（ｈ）Ｅｔ２Ｏ中のジアゾメタン；（ｉ）８０％酢酸中のＬｉＣｌ（１０当量）
【００５４】
一般式ＩＶの化合物はまた、スキーム３に示す方法により調製する。アルコール２−スキーム−３は、Ｊ． Ｅ． Ｂａｌｄｗｉｎらによって報告された文献記載の方法（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， １９９５， ５１（４３）， １１５８１）に従って調製することができる。２−スキーム−３からのエステル官能基の除去はトリフルオロ酢酸を用いて行い、ラクトン３−スキーム−３を得ることができる。ラクトン３−スキーム−３は、Ｍｅ３Ａｌの存在下でＭｅＯＮＨＭｅにより開環してアルコール４−スキーム−３を得ることができる。ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基をアルコール４−スキーム−３に導入して５−スキーム−３を得る。ついでワインレブ（Ｗｅｉｎｒｅｂ）アミド５−スキーム−３を水素化リチウムアルミニウムで処理してアルデヒド６−スキーム−３を得ることができる。
【００５５】
アルデヒド６−スキーム−３の酸化を次亜塩素酸ナトリウムにより行って酸７−スキーム−３を得ることができる。別法として、ワインレブアミド５−スキーム−３をついでカリウム−ｔｅｒｔ−ブトキシドで処理して酸７−スキーム−３を得ることができる。酸７−スキーム−３をクロロギ酸イソブチルおよび４−メチルモルホリンで活性化して８−スキーム−３を得る。ついで、８−スキーム−３をジアゾメタンで処理するとジアゾケトン９−スキーム−３を得る。ジアゾケトン９−スキーム−３を塩化リチウム／酢酸水溶液により環化してジヒドロ−３（２Ｈ）−フルオラン１０−スキーム−３を得ることができる。
【００５６】
スキーム４
【化１８】
2004513942.tif 000013
（ａ）（ＣＦ３ＳＯ２）２Ｏ、ピリジン、ＤＣＭ；（ｂ）（ｎＢｕ）４ＮＨ３、トルエン；（ｃ）Ｈ２、１０％Ｐｄ／Ｃ、ｐＴｓＯＨ、ＭｅＯＨ；（ｄ）Ｂｏｃ２Ｏ、ＮＥｔ３、ＴＨＦ；（ｅ）１Ｍ ＬｉＯＨ、ＴＨＦ；（ｆ）ＴＢＤＭＳＣｌ、ＮＥｔ３、触媒量ＤＭＡＰ、ＤＣＭ；（ｇ）ｉＢｕＯＣＯＣｌ、ＮＭＭ、ＴＨＦ；（ｈ）Ｅｔ２Ｏ中のジアゾメタン；（ｉ）８０％酢酸中のＬｉＣｌ（１０当量）
【００５７】
一般式ＩＶの化合物は、スキーム４に示すモデル化合物と同様にして調製することができる。
パントラクトン１−スキーム−４は市販されており、最初にトリフルオロメタンスルホン酸エステル２−スキーム−４に変換する。トリフルオロメタンスルホン酸エステル２−スキーム−４をアジ化テトラブチルアンモニウムで置換して対応アジド３−スキーム−４を得る。アジド３−スキーム−４を還元してアミン塩４−スキーム−４を得る。アミン塩４−スキーム−４を保護して５−スキーム−４を得る。ラクトン５−スキーム−４を水素化リチウムで開環して酸６−スキーム−４を得る。第一級アルコール６−スキーム−４を塩基の存在下、テトラブチルジメチルシリルクロライドで保護して酸７−スキーム−４を得る。酸７−スキーム−４をクロロギ酸イソブチルおよび４−メチルモルホリンで活性化して８−スキーム−４を得る。ついで、８−スキーム−４をジアゾメタンで処理してジアゾケトン９−スキーム−４を得る。ジアゾケトン９−スキーム−４の環化は塩化リチウム／酢酸水溶液により行い、モデル化合物のジヒドロ−３（２Ｈ）−ピラノン１０−スキーム−４を得ることができる。対応の閉環は、本発明のモノＲ５化合物で行うことができる。
【００５８】
スキーム１〜４を特定のＲ１〜Ｒ４値を参照して説明したが、これら方法は、必要ならＲ１〜Ｒ４上の官能基を常法で保護しながらこれら位置での請求の範囲に記載した他の値を有する前駆体にも一般的に適用できることが理解されるであろう。同様に、Ｒ５およびＲ６の他の値も類似の仕方で得ることができる。
【００５９】
特に断らない限り、分子中にキラル中心が存在する場合で指定されていないときは、Ｒ異性体およびＳ異性体の両者を意図している。好ましくは、Ｒ３での立体化学は対応のＬ−アミノ酸の立体化学である。最も好ましくは、Ｒ５での立体化学はＳであり、とりわけ環から骨格のアミンへの隣接する結合（すなわち、Ｃ４）もＳである場合に特にそうである。あるいは、本発明の化合物は後者の立体中心においてＲ，Ｒである。
【００６０】
現在のところ好ましい本発明の化合物としては以下の例が挙げられるが、これらに限られるものではない：
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［３，３−ジメチル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−アミド
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［２−シクロヘキシル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−アミド
（１Ｓ）−Ｎ−［３，３−ジメチル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロヘキシル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［３，３−ジメチル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロヘキシル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［２−シクロペンチル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−アミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロペンチル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロペンチル−１−（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
【００６１】
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［３，３−ジメチル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−アミド
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［２−シクロヘキシル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−アミド
（１Ｓ）−Ｎ−［３，３−ジメチル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロヘキシル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［３，３−ジメチル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロヘキシル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［２−シクロペンチル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−アミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロペンチル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロペンチル−１−（３−エチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
【００６２】
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［３，３−ジメチル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−アミド
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［２−シクロヘキシル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−アミド
（１Ｓ）−Ｎ−［３，３−ジメチル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロヘキシル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［３，３−ジメチル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−ブチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロヘキシル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド
フラン−３−カルボン酸（１Ｓ）−［２−シクロペンチル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−アミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロペンチル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−ベンズアミド
（１Ｓ）−Ｎ−［２−シクロペンチル−１−（３−プロピル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イルカルバモイル）−エチル］−４−ヒドロキシ−３−メチル−ベンズアミド、
とりわけ、各３Ｒ，４Ｒエナンシオマー、
最も好ましくは、各３Ｓ，４Ｓエナンシオマー；
および薬理学的に許容しうるその塩。
【００６３】
実験セクション
液相化学
実施例１
一般化学スキーム５および５Ａによる。
（ａ）１，５−アンヒドロ−３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−３，４−ジデオキシ−４−エチル−Ｄ−キシリトールを例とした、Ｎ−Ｂｏｃ保護した４−アミノピラノールの一般的合成法
【化１９】
2004513942.tif 000014
【００６４】
スキーム５Ａ
１，２，３，４−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−リキソピロアノース（１）
Ｌ−リキソピラノース（２５．０ｇ、１６６ミリモル）をピリジン（１５０ｍｌ）に溶解し、氷浴上で冷却し、無水酢酸（７５ｍｌ）を加え、溶液を室温で攪拌した。２時間後、ｔｌｃ（ペンタン：酢酸エチル１：１）は出発物質の一層高い移動スポットへの完全な変換を示した。溶液を濃縮し、トルエンとともに３回共蒸発させて薄黄色のシロップを得た。
【数１】
2004513942.tif 000015
【００６５】
２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−１，５−アンヒドロ−Ｌ−アラビニトール（２）
上記工程の収量を構成するアセトニトリル（２００ｍｌ）中の粗製の１，２，３，４−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｌ−リキソピロアノースの溶液にトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（６０ｍｌ、３３３ミリモル）を加え、溶液を氷浴上で冷却し、トリエチルシラン（８０ｍｌ、５００ミリモル）を滴下して加えた。溶液を室温で攪拌し、反応をＧＣによりモニターした。反応が完了したら（約３時間）、溶液を炭酸水素ナトリウムで中和し、ジクロロメタンで希釈し、水洗した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。得られた油状物をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（ペンタン：酢酸エチル５：１、４：１、３：１）により精製して還元化合物を３２ｇ、７４％（遊離のリキソースから）得た。
【数２】
2004513942.tif 000016
【００６６】
１，５−アンヒドロ−３，４−Ｏ−シクロヘキシリデン−Ｌ−アラビニトール（３）
メタノール（１２５ｍｌ）中の１−デオキシ−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−Ｌ−リキソピロアノース（２０．８ｇ、８０ミリモル）の溶液を触媒量の１Ｍメタノール性ナトリウムメトキシドで処理した。室温で１時間攪拌した後、ｔｌｃ（酢酸エチル：メタノール３：１）は一層低い移動スポットへの完全な変換を示していた。溶液をＤｏｗｅｘ Ｈ＋で中和し、濾過し、濃縮して無色油状物を得た。油状物をジクロロメタン（７０ｍｌ）に懸濁し、シクロヘキサノンジエチルケタール（４１ｇ、２４０ミリモル）を加え、ついで酸性ｐＨになるまでｐ−トルエンスルホン酸を加えた。数分後に懸濁液は透明な溶液となり、これを室温で攪拌した。１８時間後、ｔｌｃ（ペンタン：酢酸エチル１：２）が一層高い移動スポットへの完全な変換を示したら、溶液をトリエチルアミンで中和し、濃縮し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムクロマトグラフィー（トルエン：酢酸エチル３：２、１：１）により精製して標記化合物９．６ｇ、５６％を白色結晶として得た。
【数３】
2004513942.tif 000017
【００６７】
１，５−アンヒドロ−３，４−Ｏ−シクロヘキシリデン−Ｌ−リブロース（４）
ジクロロメタン（３０ｍｌ）中の塩化オキザリル（１．７９ｍｌ、２０．５ミリモル）の攪拌溶液に、ジクロロメタン（３０ｍｌ）中のジメチルスルホキシド（２．６５ｍｌ、３７．３ミリモル）の溶液を窒素下、−６０℃で１５分間かけて滴下して加えた。この溶液に、ジクロロメタン（２０ｍｌ）中の２，３−Ｏ−シクロヘキシリデン−１−デオキシ−Ｌ−リキソピロアノース（４ｇ、１８．７ミリモル）の溶液を５分間かけて滴下して加えた。白色懸濁液が得られ、ジクロロメタンをさらに２回（１０＋３０ｍｌ）加えた。温度を−２５℃に上げると懸濁液は無色溶液になった。温度を再び−４５℃に下げ、ジクロロメタン（２０ｍｌ）中のトリエチルアミン（１２．９ｍｌ、９３．３ミリモル）の溶液を加えた。１０分後、ｔｌｃ（トルエン：酢酸エチル１：１）がアルコールのケトンへの完全な変換を示したら、反応混合物を水（１００ｍｌ）中に注ぎ、水層をジクロロメタン（５０ｍｌ）で１回抽出し、コンバインした有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣のシリカゲル上でのフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出液、ペンタン：ジエチルエーテル１：１）は無色固体３．４ｇ、８６％を与えた。
【００６８】
酸化はまたデス−マーチン法によっても行った：
ジクロロメタン（５ｍｌ）中の２，３−Ｏ−シクロヘキシリデン−１−デオキシ−Ｌ−リキソピロアノース（０．５ｇ、２．３３ミリモル）およびおよびデス−マーチンパーヨーディナン（１．３９ｇ、３．２９ミリモル）の懸濁液を１０分間攪拌し、ついで「湿（ｗｅｔ）ジクロロメタン」（１０ｍｌのジクロロメタン中の４６μｌの水）を１５分かけて滴下して加えた。１時間後、ｔｌｃ（トルエン：酢酸エチル１：１）は出発物質の一層高い移動スポットへの完全な変換を示した。反応混合物をジエチルエーテル（１００ｍｌ）で希釈し、炭酸水素ナトリウム／チオ硫酸ナトリウム１：１の水溶液（５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出液、ペンタン：ジエチルエーテル１：１）により精製して標記化合物０．４２ｇ、８４％を結晶性固体として得た。
【数４】
2004513942.tif 000018
【００６９】
１，５−アンヒドロ−４−デオキシ−４−エチリデン−２，３−Ｏ−シクロヘキシリデン−Ｄ−エリスロ−ペンチトール（５）
ＴＨＦ（６０ｍｌ）中のエチルトリフェニルホスホニウムブロマイド（１１．９ｇ、３２．０ミリモル）の攪拌懸濁液に、カリウムｔ−ブトキシド（３．４１ｇ、３０．４ミリモル）を窒素下、−１０℃にて一度に加えた。得られたオレンジ−赤色の混合物を静置して室温とし、ついで再び−１０℃に冷却し、ＴＨＦ（４０ｍｌ）中の１，５−アンヒドロ−３，４−Ｏ−シクロヘキシリデン−Ｌ−リブロース（３．４ｇ、１６．０ミリモル）の溶液を滴下して加えた。混合物を静置して室温とした。最終添加の２０分後、ｔｌｃ（トルエン：酢酸エチル１：１）が出発物質の一層高い移動スポットへの完全な変換を示したら、反応混合物をジエチルエーテル（４００ｍｌ）と水（２００ｍｌ）とに分配した。有機層を水（１×２００ｍｌ）および食塩水（１×２００ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、１０ｍｌの残渣に濃縮した。残渣をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出液、ペンタン：酢酸エチル９５：５、９：１）により精製し、適当な画分を注意深く濃縮して（湯温２５℃）１０ｇを得、これを次の工程に直接用いた。
【００７０】
１，５−アンヒドロ−４−デオキシ−４−エチル−２，３−Ｏ−シクロヘキシリデン−Ｄ−リビトール（６）
上記溶液を酢酸エチル（３０ｍｌ）で希釈し、Ｐｄ／Ｃ（１０％、０．２ｇ）を加え、混合物を大気圧下で水素化した。４０分および９０分後にＰｄ／Ｃをさらに加えた（０．１６ｇ＋０．２０ｇ）。１００分後、ｔｌｃは出発物質の殆ど完全な消費を示した。反応混合物をセライト濾過し、液体（５ｍｌ）に濃縮し、シリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出液、ペンタン：酢酸エチル９５：５、９：１）により精製した。適当な画分を２．０８ｇに濃縮し、この溶液を次の工程に直接用いた。
【数５】
2004513942.tif 000019
【００７１】
１，５−アンヒドロ−４−デオキシ−４−エチル−Ｄ−リビトール（７）
上記１，５−アンヒドロ−４−デオキシ−４−エチル−２，３−Ｏ−シクロヘキシリデン−Ｄ−リビトールを酢酸水溶液（８０％、２５ｍｌ）に溶解し、溶液を７０℃で攪拌した。１８時間後、ｔｌｃ（ペンタン：酢酸エチル９：１および１：１）が出発物質の殆ど完全な消費（〜５％残留）を示したら、溶液を濃縮した。残渣をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出液、ペンタン：酢酸エチル１：１、２：３）により精製して０．９１ｇ、３９％（ケト化合物から）の無色固体を得た。
【数６】
2004513942.tif 000020
【００７２】
１，５−アンヒドロ−２−Ｏ−ベンジル−４−デオキシ−４−エチル−Ｄ−リビトール（８）
ジメチルホルムアミド（７ｍｌ）中の１，５−アンヒドロ−４−デオキシ−４−エチル−Ｄ−リビトール（０．５ｇ、３．４２ミリモル）の攪拌溶液に、水素化ナトリウム（６０％、０．２７ｇ、６．８４ミリモル）を窒素下、室温にて一度に加えた。３０分後、ベンジルブロマイド（０．５３ｍｌ、４．４５ミリモル）を３０分かけて滴下して加えた。２０分後、ｔｌｃ（石油エーテル：酢酸エチル４：１）がジオールの完全な変換を示したら、メタノール（１ｍｌ）を加え、混合物を２０分間攪拌した。反応混合物を酢酸エチル（１００ｍｌ）で希釈し、水（３×５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出液、ペンタン：酢酸エチル９：１、４：１）により精製して０．５２ｇ、６４％の無色固体を得た。
【数７】
2004513942.tif 000021
【００７３】
１，５−アンヒドロ−３−アジド−２−Ｏ−ベンジル−３，４−ジデオキシ−４−エチル−Ｄ−キシリトール（９）
ピリジン（５ｍｌ）中の１，５−アンヒドロ−２−Ｏ−ベンジル−４−デオキシ−４−エチル−Ｄ−リビトール（０．２８ｇ、１．１８ミリモル）の攪拌溶液に、メタンスルホニルクロライド（０．３４ｇ、２．９６ミリモル）を加えた。反応混合物を５０℃に温め、１時間攪拌した。ジクロロメタン（１００ｍｌ）を加え、反応混合物を１Ｍ硫酸水溶液（２×５０ｍｌ）、１Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液で順に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をジメチルホルムアミド（１０ｍｌ）に溶解し、アジ化ナトリウム（０．３１ｇ、４．７４ミリモル）を加えた。得られた混合物を８０℃で一夜攪拌し、酢酸エチル（１００ｍｌ）で希釈し、水（３×５０ｍｌ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出液、トルエン：酢酸エチル９５：５）により精製して０．２５ｇ、８１％の無色油状物を得た。
【数８】
2004513942.tif 000022
【００７４】
１，５−アンヒドロ−３−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］−３，４−ジデオキシ−４−エチル−Ｄ−キシリトール（１０）
酢酸エチル（４ｍｌ）中の１，５−アンヒドロ−３−アジド−２−Ｏ−ベンジル−３，４−ジデオキシ−４−エチル−Ｄ−キシリトール（８８ｍｇ、０．３４ミリモル）およびジ−ｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート（７７ｍｇ、０．３５ミリモル）の溶液にＰｄ／Ｃ（１０％、３０ｍｇ）を加え、混合物を水素下で攪拌した。１８時間後、ｔｌｃ（ペンタン：酢酸エチル９：１、ニンヒドライド（ｎｉｎｈｙｄｒｉｄｅ））が出発物質の完全な消費を示したら、混合物をセライト濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出液、トルエン：酢酸エチル４：１）により精製して無色固体を得たが、このものは１Ｈｎｍｒによりベンジル基を依然として含んでいた。この固体を酢酸エチル：エタノール１：１に溶解し、Ｐｄ／Ｃ（１０％、２０ｍｇ）で水素化した。１時間後、ｔｌｃ（トルエン：酢酸エチル１：１、ニンヒドライド）が出発物質の一層低い移動スポットへの完全な変換を示したら、混合物をセライト濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィー（溶出液、トルエン：酢酸エチル１：１、２：３）により精製して所望のモノオール５９ｍｇ、７１％を無色固体として得た。
【数９】
2004513942.tif 000023
【００７５】
構築ブロックとしての５−メチルピラノンおよび５−官能化ピラノンのための中間体の他の調製法
２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−ヒドロキシ−３−メチル酪酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
【化２０】
2004513942.tif 000024
２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−ヒドロキシ−３−メチル酪酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルは、Ｊ． Ｅ． Ｂａｌｄｗｉｎら（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９５， ５１（４２）， １１５８１）によって報告された方法に従って調製した。
【００７６】
（４−メチル−２−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３−イル）−カルバミン酸ベンジルエステル
【化２１】
2004513942.tif 000025
２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−ヒドロキシ−３−メチル酪酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル（１．００ｇ、３ミリモル）をＴＦＡ（３０ｍＬ）に溶解した。この溶液を４５分攪拌し、ついで真空濃縮した。残留ＴＦＡをトルエンで共沸除去した。この残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製して標記化合物を結晶性固体（７５０ｍｇ、８０％）として得た：ＭＳ（ＥＳ＋）２５０（Ｍ＋Ｈ）
【００７７】
［３−ヒドロキシ−１−（メトキシ−メチル−カルバモイル）−２−メチル−プロピル］−カルバミン酸ベンジルエステル４
【化２２】
2004513942.tif 000026
（４−メチル−２−オキソ−テトラヒドロ−フラン−３−イル）−カルバミン酸ベンジルエステルのラクトン環は、Ｍｅ３Ａｌの存在下、Ｎ，Ｏ−ジメチルヒドロキシルアミン塩酸塩を用いて開環することができ、標記化合物を得る。
【００７８】
［３−ｔｅｒｔ−ブトキシ−１−（メトキシ−メチル−カルバモイル）−２−メチル−プロピル］−カルバミン酸ベンジルエステル５
【化２３】
2004513942.tif 000027
［３−ヒドロキシ−１−（メトキシ−メチル−カルバモイル）−２−メチル−プロピル］−カルバミン酸ベンジルエステルの第一級アルコールは、ｔｅｒｔ−ブチル−２，２，２−トリクロロアセトイミデートおよび三フッ化ホウ素エーテレートを用いて保護することができ、標記化合物を得る。
【００７９】
（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ−１−ホルミル−２−メチル−プロピル）−カルバミン酸ベンジルエステル６
【化２４】
2004513942.tif 000028
［３−ｔｅｒｔ−ブトキシ−１−（メトキシ−メチル−カルバモイル）−２−メチル−プロピル］−カルバミン酸ベンジルエステルのワインレブアミド官能基は、エーテル中の水素化リチウムアルミニウムを用いて還元することができ、標記化合物を得る。
【００８０】
２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシ−３−メチル−酪酸７
【化２５】
2004513942.tif 000029
ｔｅｒｔ−ブチルアルコール中の（３−ｔｅｒｔ−ブトキシ−１−ホルミル−２−メチル−プロピル）−カルバミン酸ベンジルエステルは、２−メチル−２−ブテンの存在下、水中の次亜塩素酸ナトリウムおよび一塩基性リン酸ナトリウムの溶液を用いて酸化することができ、標記化合物を得る。
【００８１】
［３−ｔｅｒｔ−ブトキシ−１−（２−ジアゾ−アセチル）−２−メチル−プロピル］カルバミン酸ベンジルエステル９
【化２６】
2004513942.tif 000030
２−ベンジルオキシカルボニルアミノ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシ−３−メチル−酪酸をクロロギ酸イソブチルおよび４−メチルモルホリンで活性化し、ついで活性化した酸をジアゾメタンで処理すると標記化合物を調製することができる。
【００８２】
（３−メチル−５−オキソ−テトラヒドロ−ピラン−４−イル）カルバミン酸ベンジルエステル１０
【化２７】
2004513942.tif 000031
ｔｅｒｔ−ブトキシ−１−（２−ジアゾ−アセチル）−２−メチル−プロピル］カルバミン酸ベンジルエステルを酢酸水溶液中の塩化リチウムを用いて環化すると標記化合物を得る。ＣＢｚ保護基は通常の保護基操作によりＢｏｃやＦｍｏｃなどで容易に置換できる。
【００８３】
ピラノンまたはピラノール構築ブロックをスキーム５Ａに示すようにＮ末端伸長し、キャッピングする：
【化２８】
2004513942.tif 000032
スキーム５Ａ−Ｎ末端伸長＆キャッピング
【００８４】
（ｂ）Ｌ−ブチルアラニンの例による、Ｎ末端伸長のための一般法
工程（ａ）からのＮ−Ｂｏｃ−保護４−アミノピラノンを、ジオキサン（２５ｍＬ）中の４．０Ｍ ＨＣｌの溶液で室温にて１時間処理する。溶媒を真空除去し、残渣を２×トルエンで共沸して塩酸塩を得る。Ｂｏｃ−Ｌ−ｔｅｒｔ−ブチルアラニンペンタフルオロフェニルエステル（１．０５当量）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１．０５当量）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解し、５分後に上記塩に加える。ついで、この溶液をＮ−メチルモルホリン（１．１当量）で処理し、室温で２時間静置する。溶媒を真空除去し、粗製の生成物を、ＥｔＯＡｃ／ヘプタン（１：３、ｖ／ｖ）、ついでＥｔＯＡｃ／ヘプタン（１：２、ｖ／ｖ）で溶出するシリカゲル（５０ｇ）上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。フラクションをプールし、真空乾固して標記中間体を得る。
【００８５】
（ｃ）フリルカルボニルを例とする、キャッピング基の付加のための一般法
工程（ｂ）からのＮ−伸長アミノピラノンを、ジオキサン（２５ｍＬ）中の４．０Ｍ ＨＣｌの溶液で室温にて１時間処理する。溶媒を真空除去し、残渣を２×トルエンで共沸して塩酸塩を得る。フラン−３−カルボキシペンタフルオロフェニルエステル（１．０５当量）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（１．０５当量）をＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解し、５分後に上記塩に加える。ついで、この溶液をＮ−メチルモルホリン（１．１当量）で処理し、室温で２時間静置する。溶媒を真空除去し、粗製の生成物を、ＥｔＯＡｃ／ヘプタン（３：２、ｖ／ｖ）で溶出するシリカゲル（５０ｇ）上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。フラクションをプールし、真空乾固して標記化合物を得る。
【００８６】
実施例２
（ａ）スルホニルキャッピング基の付加のための一般法
実施例１工程（ｂ）からのＮ−伸長４−アミノピラノンを、ジオキサン（５ｍＬ）中の４．０Ｍ ＨＣｌの溶液で室温にて１時間処理する。溶媒を真空除去し、残渣を２×トルエンで共沸して塩酸塩を得る。塩酸塩を乾燥ＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、フラン−３−スルホニルクロライドを加え、ついでジイソプロピルエチルアミン（３当量）および触媒のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（２ｍｇ）を加えた。室温で２時間後、溶液をＤＣＭ（１５ｍＬ）で希釈し、０．１Ｎ ＨＣｌ（２５ｍＬ）、水（２×２５ｍＬ）および食塩水（２５ｍＬ）で順に洗浄し、ついで硫酸ナトリウムで乾燥する。溶媒を真空除去し、粗製の生成物を、ＥｔＯＡｃ／ヘプタン（１：１、ｖ／ｖ）で溶出するシリカゲル（１５ｇ）上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。フラクションをプールし、真空乾固して標記中間体を得、ＴＦＡ／アセトニトリルの０．１％水溶液から凍結乾燥する。
【００８７】
構築ブロック−リンカー構築物の調製
ピラノン−リンカー構築物の合成のための一般法（下記スキーム６）
【化２９】
2004513942.tif 000033
スキーム６−式ＩＶの化合物の固相合成
【００８８】
Ｎ−Ｆｍｏｃ−４−アミノ−５−エチルピラノン（１．０当量）を、酢酸ナトリウム三水和物（１．５当量）を含むエタノール／水（７：１ｖ／ｖ、化合物１ミリモル当たり１０ｍＬ）の混合物に溶解する。４−［［（ヒドラジノカルボニル）アミノ］メチル］シクロヘキサンカルボン酸トリフルオロアセテート（分子量３２９．３、１．０当量）（Ｍｕｒｐｈｙ， Ａ． Ｍ．ら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４， ３１５６−３１５７， １９９２を参照）を加え、混合物を２時間、還流下で加熱する。ついで混合物を冷却し、ジクロロメタン（化合物１ミリモル当たり１００ｍＬ）中に注ぎ、水（１００ｍＬ）を加える。有機層を分離し、飽和食塩水（１００ｍＬ）で逆流洗浄する。有機層を乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、濾過し、真空蒸発して標記構築物を得、これをさらに精製することなく用いる。
【００８９】
Ｐ２ハイブリッドアミノ酸のための化学
スキーム７に示す一般化学は、本発明者であるＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ、イングランドのＣＳ ＤｅｘｔｅｒおよびＲＦＷ Ｊａｃｋｓｏｎにより学術文献にまもなく完全な形で刊行されるであろう。
【化３０】
2004513942.tif 000034
スキーム７：Ｚｎ活性化β−ヨードアラニンとアリルブロマイドとのＣｕＣＮ触媒クロスカップリングによる新規なＰ２ハイブリッド
【００９０】
（ａ）亜鉛カップリング反応のための一般手順
（ｂ）亜鉛活性化
亜鉛末（１５０ｍｇ、２．３ミリモル、３．０当量、Ａｌｄｒｉｃｈ）を、サイドアームを備え３路蛇口（ｔｈｒｅｅ ｗａｙ ｔａｐ）に適合した２５ｍＬ容の丸底フラスコに秤量した。亜鉛末を真空下、熱線銃で加熱し、フラスコに窒素ガスを流し、ガスを抜き、さらに３回ガスを流した。窒素ガスを充填したフラスコに乾燥ＤＭＦ（１ｍＬ）を加えた。トリメチルシリルクロライド（３０μｌ、０．２３ミリモル、０．３当量）を加え、亜鉛スラリーをさらに３０分間激しく攪拌した。
【００９１】
（ｃ）亜鉛挿入；Ｎ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−３−ヨード亜鉛−Ｌ−アラニンメチルエステル（６１）
乾燥ＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解したＮ−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−３−ヨード−Ｌ−アラニンメチルエステル（２４７ｍｇ、０．７５ミリモル、１．０当量）を、上記で調製した０℃の活性化亜鉛スラリーにカニューレを用いて滴下して加えた。ついで、反応混合物を静置して室温に温め、１時間攪拌してオルガノ亜鉛試薬を得た。
【００９２】
（ｄ）ＣｕＢｒ．ＳＭｅ２調製物
亜鉛挿入反応が進行している間、ＣｕＢｒ．ＳＭｅ２（２０ｍｇ、０．１ミリモル、０．１３当量）を、３路蛇口に適合した２５ｍｌ容の丸底フラスコに秤量し、ＣｕＢｒ．ＳＭｅ２がその外見を褐色の粉末から変えて薄緑色の粉末を与えるまで、真空下、熱線銃で「穏やかに」乾燥した。ついで、乾燥ＤＭＦ（０．５ｍＬ）を加え、ついで親電子試薬（１−ブロモ−２−メチルブト−２−エン、トルエン−４−スルホン酸−（Ｅ）−２−メチル−ブト−２−エニルエステルまたは１−ブロモ−２，３−ジメチルブト−２−エン）（１．０ミリモル、１．３当量）を加えた。ついで、反応混合物を−１５℃に冷却した。
【００９３】
（ｅ）カップリング反応
オルガノ亜鉛試薬溶液の攪拌を停止して亜鉛末を沈殿させ、上澄み液をカニューレで注意深く取り（あまりにも多くの亜鉛末を移さないように注意が必要）、親電子試薬および銅触媒の溶液に滴下して加えた。冷浴を取り除き、溶液を室温で一夜攪拌した。酢酸エチル（２０ｍＬ）を加え、攪拌をさらに１５分間続けた。反応混合物を分別漏斗に移し、ＥｔＯＡｃ（３０ｍＬ）のさらなるアリコートを加えた。有機相を１Ｍ Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（２０ｍＬ）、水（２×２０ｍＬ）、食塩水（４０ｍＬ）で順に洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。溶媒を真空除去し、粗製の生成物を上記記載のシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【００９４】
（ｆ）アルケンの水素化
アルケン（１．０ミリモル）をエタノール（１０ｍＬ）に溶解し、１０％パラジウム／炭素（８０ｍｇ）を加え、水素ガスを導入した。反応が完了したと思われたら水素ガスを除き、反応液をセライト濾過し、触媒をエタノール（３０ｍＬ）で洗浄した。コンバインした有機濾液を真空濃縮し、得られたアルカンを直ちに次の反応に用いた。
【００９５】
（ｇ）メチルエステルの鹸化
メチルエステル（１．０ミリモル）をＴＨＦ（６ｍＬ）に溶解し、攪拌しながら水（６ｍＬ）中のＬｉＯＨ（１．２ミリモル、１．２当量）の溶液を滴下して加えた。反応が完了したと思われたら、ＴＨＦを真空除去し、残渣にジエチルエーテル（１０ｍＬ）を加えた。ついで、反応混合物を１．０Ｍ ＨＣｌでｐＨ＝３まで酸性にした。ついで、有機相を除去し、水性相をジエチルエーテル（２×１０ｍＬ）で抽出した。コンバインした有機抽出物を硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を真空除去してカルボン酸を得、これを直ちに次の反応に用いた。
【００９６】
（ｈ）Ｎ−Ｂｏｃ保護基の除去
Ｎ−Ｂｏｃ保護物質（１．０ミリモル）をＤＣＭ（２ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を滴下して加え、反応が完了したと思われたら溶媒を真空除去してアミンを得、これを直ちに次の反応に用いた。別法としては、Ｎ−Ｂｏｃ保護物質（１．０ミリモル）を０℃に冷却し、ジオキサン（５ｍＬ）中の４Ｍ ＨＣｌを滴下して加え、反応が完了したと思われたら溶媒を真空除去してアミンを得、これを直ちに次の反応に用いた。
【００９７】
（ｉ）アミンのＦｍｏｃ保護
１，４−ジオキサン（２ｍＬ）中のアミン（１．０ミリモル）を０℃に冷却し、１０％炭酸ナトリウム（２．２ミリモル、２．２当量、２ｍＬ）を加えた。２相反応混合物を激しく攪拌し、Ｆｍｏｃ−Ｃｌ（１．１ミリモル、１．１当量）を加えた。反応が完了したと思われたらジエチルエーテル（１０ｍＬ）を加え、反応混合物を１Ｍ ＨＣｌでｐＨ＝３の酸性にした。有機相を除去し、水性相をジエチルエーテル（２×１０ｍＬ）で抽出した。コンバインした有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を真空除去し、残渣をシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【００９８】
合成例１
２Ｓ−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−４，４−ジメチルヘキサン酸（６８）の調製
以下のスキームは、光学的に活性な（Ｓ）−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４，４−ジメチル−ヘキサ−５−エン酸メチルエステル（６２）がどのように調製および単離されるかを説明している。
【化３１】
2004513942.tif 000035
【００９９】
（ａ）２Ｓ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４，４−ジメチル−ヘキサ−５−エン酸メチルエステル（６２）、２Ｓ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−（２Ｓ−３，３−ジメチル−オキシラニル）−酪酸メチルエステル（６３）および２Ｓ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４−（２Ｒ−３，３−ジメチル−オキシラニル）−酪酸メチルエステル（６４）
亜鉛カップリング反応の一般手順に従い、１−ブロモ−３−メチルブト−２エン（１１５μＬ、１．０ミリモル）をＣｕＢｒ．ＳＭｅ２（２０ｍｇ、０．１ミリモル）の存在下で化合物（６１）（２４７ｍｇ、０．７５ミリモル）にカップリングさせて残渣を得、これをＥｔＯＡｃ／４０：６０石油エーテル（１：９、ｖ／ｖ）で溶出するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。フラクションをプールし、真空乾固してカラムクロマトグラフィーでは分離できない位置異性体の混合物（２：１正式のＳＮ２’ｖｓ ＳＮ２）を無色油状物として得た（収量１９０ｍｇ、９３％）。
【０１００】
クロロホルム（３ｍＬ）中の位置異性体の混合物（１９０ｍｇ、０．７ミリモル）にクロロホルム（２ｍＬ）中の３−クロロ過安息香酸（１５６ｍｇ、純度８５％、０．８ミリモル、１．１当量）を５分間かけて滴下して加えた。反応混合物を室温でさらに２時間攪拌した。ついで、反応混合物を１Ｍ Ｎａ２Ｓ２Ｏ５（５ｍＬ）、飽和重炭酸ナトリウム溶液（５ｍＬ）および食塩水（１０ｍＬ）で順に洗浄した。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を真空除去し、残渣をＥｔＯＡｃ／４０：６０石油エーテル（２：８、ｖ／ｖ）で溶出するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。３つの生成物が得られた；化合物（６２）は最初に溶出し、さらに溶出すると化合物（６３）と化合物（６４）との分離できない混合物が得られた。最初の成分のフラクションをプールし、真空乾固して２Ｓ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４，４−ジメチル−ヘキサ−５−エン酸メチルエステル（６２）を透明な油状物として得た（収量９３ｍｇ、４９％）。エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ２７２（ＭＨ＋）。分析的ＨＰＬＣ Ｒｔ＝２１．４５分（９５％）。
【０１０１】
【数１０】
2004513942.tif 000036
【０１０２】
（ｂ）２Ｓ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４，４−ジメチル−ヘキサン酸メチルエステル（６５）
アルケン水素化の一般手順に従い、化合物（６２）（９３ｍｇ、０．３ミリモル）から化合物（６５）を無色油状物として得（収量９０ｍｇ、９６％）、直ちに次の反応に用いた。エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ２７４（ＭＨ＋）。分析的ＨＰＬＣ Ｒｔ＝２２．５５分（１００％）。
【０１０３】
（ｃ）２Ｓ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４，４−ジメチル−ヘキサン酸（６６）
メチルエステル鹸化の一般手順に従い、化合物（６５）（９０ｍｇ、０．３ミリモル）から化合物（６６）を結晶として得（収量７９ｍｇ、９２％）、直ちに次の反応に用いた。エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ２６０（ＭＨ＋）。分析的ＨＰＬＣ Ｒｔ＝２０．９０分（１００％）。
【０１０４】
（ｄ）２Ｓ−２−アミノ−４，４−ジメチル−ヘキサン酸トリフルオロ酢酸塩（６７）
ＴＦＡを用いたＮ−Ｂｏｃ除去の一般手順に従い、化合物（６６）（７９ｍｇ、０．３ミリモル）から化合物（６７）を固体として得（収量８０ｍｇ、９６％）、直ちに次の反応に用いた。エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ２７４（ＭＨ＋）。
【０１０５】
（ｅ）２Ｓ−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−４，４−ジメチルヘキサン酸（６８）
アミンのＦｍｏｃ保護の一般手順に従い、化合物（６７）（８０ｍｇ、０．３ミリモル）からＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ（１００：０から９６：４、ｖ／ｖ）で溶出するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製後、２Ｓ−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−４，４−ジメチルヘキサン酸（６８）を固体として得た（６０ｍｇ、５４％）。エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ３８２（ＭＨ＋）。分析的ＨＰＬＣ Ｒｔ＝２３．６３分（１００％）；［α］Ｄ１７−１８．４（ｃ０．２５、ＥｔＯＨ中）。
【０１０６】
【数１１】
2004513942.tif 000037
【０１０７】
合成例２
２Ｓ，４ＲＳ−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−４，５−ジメチルヘキサン酸（７４）の調製
光学的に活性な２Ｓ，４Ｓ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４，５−ジメチル−ヘキサ−５−エン酸メチルエステル（６９）および２Ｓ，４Ｒ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４，５−ジメチル−ヘキサ−５−エン酸メチルエステル（７０）を、フラッシュクロマトグラフィーにより亜鉛カップリング反応後に直ちに得た。
【化３２】
2004513942.tif 000038
【０１０８】
（ａ）２Ｓ，４Ｓ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４，５−ジメチル−ヘキサ−５−エン酸メチルエステル（６９）および２Ｓ，４Ｒ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４，５−ジメチル−ヘキサ−５−エン酸メチルエステル（７０）
亜鉛カップリング反応の一般手順に従い、トルエン−４−スルホン酸（Ｅ）−２−メチル−ブト−２−エニルエステル（１．４５ｍＬ、１．０ミリモル）をＣｕＢｒ．ＳＭｅ２（２０ｍｇ、０．１０ミリモル）の存在下で化合物（６１）（２４７ｍｇ、０．７５ミリモル）にカップリングさせて残渣を得、ＥｔＯＡｃ／４０：６０石油エーテル（１：９、ｖ／ｖ）で溶出するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製して２つのジアステレオマーを得た。分析的ＨＰＬＣ Ｒｔ＝２２．４９分（６０％）およびＲｔ＝２２．５２分（４０％）。最初に溶出した成分のフラクションをプールしてジアステレオマーの一方を無色油状物として得た（収量３６ｍｇ、１８％）。次にジアステレオマーの混合物を無色油状物として得た（収量７５ｍｇ、３７％）。後に溶出する成分を含む純粋なフラクションをプールして他のジアステレオマーを無色油状物として得た（収量１９ｍｇ、９％）（４位での立体化学は調べなかった）。速やかに溶出するジアステレオマーで得られるスペクトルデータ：エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ２７２（ＭＨ＋）；［α］Ｄ２０＋１２．３（ｃ１．０６、ＣＨＣｌ３中）。
【０１０９】
【数１２】
2004513942.tif 000039
【０１１０】
ゆっくり溶出するジアステレオマーで得られるスペクトルデータ：エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ２７２（ＭＨ＋）；［α］Ｄ２０＋１６．０（ｃ０．６０、ＣＨＣｌ３中）。
【数１３】
2004513942.tif 000040
これらジアステレオマーは常法では分離されず、次の反応に混合物として用いた。
【０１１１】
（ｂ）２Ｓ，４ＲＳ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４，５−ジメチル−ヘキサン酸メチルエステル（７１）
アルケン水素化の一般手順に従い、化合物（６９）および化合物（７０）（１３０ｍｇ、０．４８ミリモル）から２つのジアステレオマー（７１）の混合物（分離できない）を無色油状物として得た（収量１２８ｍｇ、９８％）。分析的ＨＰＬＣ Ｒｔ＝２２．４９分、エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ２７４（ＭＨ＋）。
【０１１２】
（ｃ）２Ｓ，４ＲＳ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４，５−ジメチル−ヘキサン酸（７２）
メチルエステル鹸化の一般手順に従い、化合物（７１）（１２８ｍｇ、０．４７ミリモル）から化合物（７２）の分離できない混合物を無色油状物として得た（収量１０６ｍｇ、８７％）。エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ２６０（ＭＨ＋）、分析的ＨＰＬＣ Ｒｔ＝２０．６５分（１００％）。
【０１１３】
（ｄ）２Ｓ，４ＲＳ−２−アミノ−４，５−ジメチル−ヘキサン酸トリフルオロ酢酸塩（７３）
ＴＦＡを用いたＮ−Ｂｏｃ除去の一般手順に従い、化合物（７２）（１０６ｍｇ、０．４１ミリモル）から化合物（７３）の分離できない混合物を固体として得（収量１０７ｍｇ、９６％）、直ちに次の反応に用いた。エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ１６０（ＭＨ＋）。
【０１１４】
（ｅ）２Ｓ，４ＲＳ−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−４，５−ジメチル−ヘキサン酸（７４）
アミンのＦｍｏｃ保護の一般手順に従い、化合物（７３）（１０７ｍｇ、０．３９ミリモル）からＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ（１００：０から９５：５、ｖ／ｖ）で溶出するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製後、２Ｓ，４ＲＳ−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−４，５−ジメチル−ヘキサン酸（７４）を固体として２つのジアステレオマーの混合物として得た（収量６０ｍｇ、４０％）。分析的ＨＰＬＣ Ｒｔ＝２３．８３分（４０％）およびＲｔ＝２４．０６分（６０％）。最初に溶出したジアステレオマー：エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ３８２（ＭＨ＋）。後に溶出したジアステレオマー：エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ３８２（ＭＨ＋）。
【０１１５】
合成例３
２Ｓ，５ＲＳ−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−５，６−ジメチルヘプタン酸（８０）および２Ｓ−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−４，４，５−トリメチルヘキサン酸（８４）の調製
（Ｓ）−２−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ−５，６−ジメチル−ヘプト−５−エン酸メチルエステル（７５）および（Ｓ）−２−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ−４，４，５−トリメチル−ヘキサ−５−エン酸メチルエステル（７６）を、亜鉛カップリング反応後にフラッシュクロマトグラフィーにより直ちに得た。
【化３３】
2004513942.tif 000041
【０１１６】
（ａ）２Ｓ−２−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ−５，６−ジメチル−ヘプト−５−エン酸メチルエステル（７５）および２Ｓ−２−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ−４，４，５−トリメチル−ヘキサ−５−エン酸メチルエステル（７６）
亜鉛カップリング反応の一般手順に従い、１−ブロモ−２，３−ジメチル−ブト−２−エン（１６３ｍｇ、１．０ミリモル）をＣｕＢｒ．ＳＭｅ２（２０ｍｇ、０．１０ミリモル）の存在下で化合物（６１）（２４７ｍｇ、０．７５ミリモル）にカップリングさせて残渣を得、ＥｔＯＡｃ／４０：６０石油エーテル（１：９）で溶出するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製して２つの位置異性体を得た。最初に溶出した成分は無色油状物としての化合物（７５）であり（収量６０ｍｇ、２８％）、第二に溶出した成分は無色油状物としての化合物（７６）であった（収量５１ｍｇ、２４％）。
【０１１７】
化合物（７５）について得られたスペクトルデータ：エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ２８５（ＭＨ＋）、分析的ＨＰＬＣ Ｒｔ＝２２．８５分（１００％）；
【数１４】
2004513942.tif 000042
【０１１８】
化合物（７６）について得られたスペクトルデータ：エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ２８５（ＭＨ＋）、分析的ＨＰＬＣ Ｒｔ＝２２．９１分（１００％）；
【数１５】
2004513942.tif 000043
【０１１９】
（ｂ）２Ｓ，５ＲＳ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−５，６−ジメチル−ヘプタン酸メチルエステル（７７）
アルケン水素化の一般手順に従い、２Ｓ−２−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ−５，６−ジメチル−ヘプト−５−エン酸メチルエステル（７５）（６０ｍｇ、０．２１ミリモル）から化合物（７７）を無色油状物として得た（収量５４ｍｇ、８９％）。エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ２８８（ＭＨ＋）、分析的ＨＰＬＣ Ｒｔ＝２４．０６分（１００％）。
【０１２０】
（ｃ）２Ｓ，５ＲＳ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−５，６−ジメチル−ヘプタン酸（７８）
メチルエステル鹸化の一般手順に従い、化合物（７７）（５４ｍｇ、０．１９ミリモル）から化合物（７８）を無色油状物として得た（収量５４ｍｇ、１００％）。エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ２７４（ＭＨ＋）、分析的ＨＰＬＣ Ｒｔ＝２１．４４分（１００％）。
【０１２１】
（ｄ）２Ｓ，５ＲＳ−２−アミノ−５，６−ジメチル−ヘプタン酸塩酸塩（７９）　ジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌを用いたＮ−Ｂｏｃ除去の一般手順に従い、化合物（７８）（５４ｍｇ、０．２０ミリモル）から化合物（７９）を固体として得た（収量４０ｍｇ、９７％）。エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ１７４（ＭＨ＋）。
【０１２２】
（ｅ）２Ｓ，５ＲＳ−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−５，６−ジメチルヘプタン酸（８０）
アミンのＦｍｏｃ保護の一般手順に従い、化合物（７９）（４０ｍｇ、０．１９ミリモル）からＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ（１００：０から９５：５、ｖ／ｖ）で溶出するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製後、２Ｓ，５ＲＳ−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−５，６−ジメチル−ヘプタン酸（８０）を固体として得た（収量２７ｍｇ、３６％）。エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ３９５（ＭＨ＋）、分析的ＨＰＬＣ Ｒｔ＝２４．５２分（１００％）。
【０１２３】
【数１６】
2004513942.tif 000044
カルボン酸の四重シグナルは観察されなかった。
【０１２４】
（ｆ）２Ｓ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４，４，５−トリメチル−ヘキサン酸メチルエステル（８１）
アルケン水素化の一般手順に従い、２Ｓ−２−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ−４，４，５−トリメチル−ヘキサ−５−エン酸メチルエステル（７６）（５１ｍｇ、０．１８ミリモル）から化合物（８１）を無色油状物として得た（収量４６ｍｇ、９０％）。エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ２８８（ＭＨ＋）、分析的ＨＰＬＣ Ｒｔ＝２２．９１分（１００％）。
【０１２５】
（ｇ）２Ｓ−２−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ−４，４，５−トリメチル−ヘキサン酸（８２）
メチルエステル鹸化の一般手順に従い、化合物（８１）（４６ｍｇ、０．１６ミリモル）から化合物（８２）を無色油状物として得た（収量４４ｍｇ、１００％）。エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ２７４（ＭＨ＋）。
【０１２６】
（ｈ）２Ｓ−２−アミノ−４，４，５−トリメチル−ヘキサン酸塩酸塩（８３）
ジオキサン中の４Ｍ ＨＣｌを用いたＮ−Ｂｏｃ除去の一般手順に従い、化合物（８２）（４４ｍｇ、０．１６ミリモル）から化合物（８３）を固体として得た（収量３３ｍｇ、９９％）。エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ１７４（ＭＨ＋）。
【０１２７】
（ｉ）２Ｓ−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−４，４，５−トリメチルヘキサン酸（８４）
アミンのＦｍｏｃ保護の一般手順に従い、化合物（８３）（３３ｍｇ、０．１６ミリモル）からＣＨＣｌ３／ＣＨ３ＯＨ（１００：０から９５：５、ｖ／ｖ）で溶出するシリカゲル上のフラッシュクロマトグラフィーにより精製後、２Ｓ−２−（９Ｈ−フルオレン−９−イルメトキシカルボニルアミノ）−４，４，５−トリメチルヘキサン酸（８４）を固体として得た（２０ｍｇ、３２％）。エレクトロスプレー−ＭＳ ｍ／ｚ３９６（ＭＨ＋）、分析的ＨＰＬＣ Ｒｔ＝２４．２８分（１００％）。
【数１７】
2004513942.tif 000045
カルボン酸の四重シグナルは観察されなかった。
【０１２８】
一般的な固相法
上記で記載したピラノン構築ブロックおよび新規な保護アミノ酸を用い、Ｃｈｉｒｏｎマルチピンでそこに詳記されたプロトコールに従って分子を構築した。
【化３４】
2004513942.tif 000046
【０１２９】
クラウンアセンブリーの調製
化合物の合成を、適当に負荷したＦｍｏｃ−構築ブロック−リンカー−ＤＡ／ＭＤＡ誘導体化マクロクラウン（上記参照）（クラウン（ｃｒｏｗｎ）当たり約３．５〜９．１μモルで負荷）を用いて平行して行った。合成に先立って各クラウンをそれぞれのステムに連結させ、８×１２ステムホルダーに投入した。アミノ酸のカップリングには、“固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）”、Ｅ． ＡｔｈｅｒｔｏｎおよびＲ． Ｃ． Ｓｈｅｐｐａｒｄ， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ．、オックスフォード、英国、１９８９に記載された標準Ｆｍｏｃアミノ酸化学を用いる。
【０１３０】
Ｎα−Ｆｍｏｃ保護基の除去
２５０ｍＬ容の溶媒耐性浴に２００ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を入れる。マルチピンアセンブリーを加え、脱保護を３０分間行う。ついで、アセンブリーを取り、余分の溶媒を少し振盪して取り除く。ついで、アセンブリーをＤＭＦ（５分間）およびＭｅＯＨ（５分間、２分間、２分間）（各２００ｍＬ）で順に洗浄し、１５分間静置して空気乾燥させる。
【０１３１】
Ｆｍｏｃ発色団放出の定量的ＵＶ測定
１ｃｍ行路長のＵＶセルに１．２ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液を入れ、これを用いて２９０ｎｍの波長でのＵＶ分光計の吸光度を０とする。ついで、３．２ｍＬの２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液中の５．０ｍｇのＦｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｕｔ）−Ｐｅｐｓｙｎ ＫＡ（０．０８ミリモル／ｇ）からなるＵＶ標準を調製する。この標準はＡｂｓ２９０＝０．５５〜０．６５（室温）を与える。ついで、マルチピン脱保護溶液のアリコートを理論的Ａｂｓ２９０＝０．６となるように適当に希釈し、この値を実際に実験測定した吸光度と比較して上記カップリング反応の有効性を示すようにする。
【０１３２】
アミノ酸残基の標準カップリング
カップリング反応は、ポリプロピレン９６ウエルプレートの適当なウエルにカップリングの特定のラウンドの際に必要な活性化溶液のパターンを入れることにより行う。マクロクラウン標準カップリングはＤＭＦ（５００μｌ）中で行った。
【０１３３】
適当なウエルへのアミノ酸残基のカップリング
マルチピンアセンブリーを乾燥させる間に、カップリングの特定のラウンドに必要な適当なＮα−Ｆｍｏｃアミノ酸ｐｆｐエステル（各クラウンの負荷から計算して１０当量）およびＨＯＢｔ（１０当量）を適当な容器に正確に秤量する。あるいは、適当なＮα−Ｆｍｏｃアミノ酸（各クラウンの負荷から計算して１０当量）、所望のカップリング試薬、たとえばＨＢＴＵ（各クラウンの負荷から計算して９．９当量）、および活性化剤、たとえばＨＯＢｔ（各クラウンの負荷から計算して９．９当量）、ＮＭＭ（各クラウンの負荷から計算して１９．９当量）を適当な容器に正確に秤量する。
【０１３４】
ついで、保護し活性化したＦｍｏｃアミノ酸誘導体をＤＭＦ（各マクロクラウンについて５００μｌ、たとえば２０マクロクラウンでは２０×１０当量×７μモルの誘導体を１０ｍＬのＤＭＦに溶解）に溶解する。ついで、適当な誘導体を「カップリングサイクル」の開始の用意のできた適当なウエルに分配する。標準として、カップリング反応を６時間進行させる。ついで、カップリングしたアセンブリーを以下に詳記するように洗浄した。
【０１３５】
カップリング後の洗浄
２０％ピペリジン／ＤＭＦ脱保護をカップリングサイクルの直後に行うのであれば、マルチピンアセンブリーを簡単に振盪して余分の溶媒を取り除き、ＭｅＯＨ（５分間）およびＤＭＦ（５分間）（各２００ｍＬ）で順に洗浄し、脱保護する。マルチピンアセンブリーを貯蔵もしくはさらに反応させるのであれば、簡単な振盪についでＤＭＦ（５分間）およびＭｅＯＨ（５分間、２分間、２分間）で順に洗浄することからなる完全な洗浄サイクルを行う。
【０１３６】
キャッピング基の付加
マルチピンアセンブリーを乾燥させる間に、適当な酸キャッピング基（各クラウンの負荷から計算して１０当量）、所望のカップリング試薬、たとえばＨＢＴＵ（各クラウンの負荷から計算して９．９当量）、および活性化剤、たとえばＨＯＢｔ（各クラウンの負荷から計算して９．９当量）、ＮＭＭ（各クラウンの負荷から計算して１９．９当量）を適当な容器に正確に秤量する。ついで、酸誘導体／カップリング試薬をＤＭＦ（各マクロクラウンについて５００μｌ、たとえば２０マクロクラウンでは２０×１０当量の誘導体を１０ｍＬのＤＭＦに溶解）に溶解し、５分間静置して活性化する。ついで、適当な誘導体を「キャッピングサイクル」の開始の用意のできた適当なウエルに分配する。標準として、キャッピング反応を一夜、１８時間進行させる。ついで、キャッピングしたアセンブリーを上記に詳記したようにして洗浄した。
【０１３７】
分子−ピンアセンブリーの酸分解媒体開裂
酸媒体開裂プロトコールを換気フード（ｆｕｍｅ ｈｏｏｄ）内で厳密に行う。ポリスチレン９６ウエルプレート（１ｍＬ／ウエル）にラベルを付し、最も近いｍｇに秤量する。ついで、適当なウエルにトリフルオロ酢酸／水（９５：５、ｖ／ｖ、６００μｌ）開裂溶液を、開裂すべきマルチピンアセンブリーのパターンに対応するパターンにて入れる。マルチピンアセンブリーを加え、全構築物をスズ箔で覆い、２時間静置する。ついで、マルチピンアセンブリーをトリフルオロ酢酸／水（９５：５、ｖ／ｖ、６００μｌ）（上記）を入れた他のポリスチレン９６ウエルプレート（１ｍＬ／ウエル）に加える。
【０１３８】
開裂した分子の処理
ついで、一次ポリスチレン開裂プレート（２時間開裂）および二次ポリスチレンプレート（５分間洗浄）をＧｅｎｅＶａｃエバポレーターに入れ、溶媒を９０分間かけて除去した（最小の乾燥速度）。二次ポリスチレンプレートの中身をアセトニトリル／水（５０：５０ｖ／ｖ／ｖ）溶液（３×１５０μｌ）を用いて一次プレートの対応ウエルに移し、使用した二次プレートを廃棄する。アリコート（５〜２０μｌ）を分析のために取る。プレートをスズ箔で覆い、化合物を入れたウエルの上からピンで刺し、冷蔵庫に１時間入れ、ついで凍結乾燥した。
【０１３９】
分子の分析および精製
アリコート（５〜２０μｌ）を分析的ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレー−ＭＳにより分析する。実質的に全ての場合に、粗純度はＨＰＬＣにより＞９０％であり、標準ｍ／ｚを有する。試料を、Ｖｙｄａｃ Ｃ４を用いて半調製的逆相ＨＰＬＣにより精製した。適当なフラクションをコンバインし、燒結（ｔａｒｅｄ）１０ｍＬ容ガラスバイアル中で凍結乾燥し、ついで再度秤量する。分子を１５〜９０μモルのスケールで調製し、２．０〜２６．０ｍｇの精製生成物を得た。各生成物の純度は分析的ＨＰＬＣにより＞９５％（２１５ｎｍ ＵＶ検出）と確認され、エレクトロスプレー質量分析により凡その［ＭＨ］＋を与えた。
【０１４０】
構築物によるマクロクラウンの負荷
ピラノン−リンカー構築物によるマルチピンの負荷のための一般的方法
アミノ官能化ＤＡ／ＭＤＡマクロクラウン（たとえば、Ｃｈｉｒｏｎ Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ、オーストラリア、９．１μモル負荷）またはアミノ官能化ＨＥＭＡギア（ｇｅａｒｓ）（たとえば、Ｃｈｉｒｏｎ Ｍｉｍｏｔｏｐｅｓ、オーストラリア、１．３μモル負荷）を、全ての負荷およびその後の固相合成に用いる。
【０１４１】
ピラノン−リンカー構築物（クラウン／ギアの全表面官能化と比較して３当量）を、ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）中の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（３当量）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３当量）およびＮ−メチルモルホリン（６当量）を用いて５分間、カルボキシル活性化する。この混合物をクラウン／ギアに加え、さらにＤＭＦを加えて反応液の表面を覆い、混合物を一夜静置する。
標準洗浄およびＦｍｏｃ脱保護の読み取り（上記手順を参照）は、典型的に、実質的に定量的な負荷を示す。
【０１４２】
カテプシンＳ、ＬおよびＫに対するＫｉの決定
カテプシンＳ（哺乳動物、マウスおよびラット）
一般的記述
アッセイは１００ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５（緩衝液）中、白色３８４ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）で行った。プレート当たり８つのインヒビターをアッセイした。
【０１４３】
インヒビターの希釈
インヒビターの希釈を９６ウエルＶ底ポリプロピレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ）で行った。１００μｌの緩衝液を列Ａ、Ｂ、ＣおよびＤのウエル２〜５および７〜１２に入れた。ＤＭＳＯ中に１０ｍＭの各インヒビターを、ウエルの容量を緩衝液で２００μｌとしたときに所望の最終濃度が得られるに充分なように、ウエルＡ１〜Ｄ１およびＡ６〜Ｄ６に入れた。縦列１を緩衝液で２００μｌとし、吸引して混合し、ウエルに１００μｌを分配し、１００μｌを縦列２に移した。ピペットの先端を交換し、混合および移動を縦列５まで繰り返した。この操作を縦列６〜１０で繰り返した。
【０１４４】
基質の希釈
基質の希釈を９６ディープウエルポリプロピレンプレート（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で行った。２８０μｌの緩衝液を縦列１のウエルＢ〜Ｈに入れ、２．７０μｌの１０ｍＭ ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＡＭＣをＡ１およびＡ２に入れた。２×２５０μｌの緩衝液をウエルＡ１およびＡ２に加え、吸引により混合し、２８０μｌをウエルに分配し、２８０μｌを列Ｂに移した。ピペットの先端を交換し、このプロセスをプレートの列Ｈまで繰り返した。
【０１４５】
アッセイ
基質希釈プレートの縦列１をウエル当たり１μｌにて列Ａから開始して１つおきの列に分配した。縦列２を列Ｂから開始して１つおきの列に分配した。インヒビター希釈プレートの列Ａをウエル当たり１０μｌにてＡ１から開始して１つおきの列および縦列に分配した。列ＢをＡ２から開始して１つおきの列および縦列に分配した。列ＣをＢ１から開始して１つおきの列および縦列に分配し、列ＤをＢ２から開始して１つおきの列および縦列に分配した。１０ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む緩衝液中の２０ｎＭカテプシンＳをウエル当たり３０μｌ加えることによりアッセイを開始した。
データをテキストファイルで保存し、エクセルにインポートした。初期速度を線形回帰により決定し、ついでＳｉｇｍａＰｌｏｔを用いて競合阻害式に適合させた。
【０１４６】
カテプシンＬおよびＫ
アッセイを本質的に上記と同様にして行った。カテプシンＬについては、使用した緩衝液は１００ｍＭ酢酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ．５．５であり、基質はＤ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＡＭＣを１００μＭの最高濃度で用いた。カテプシンＫについては、使用した緩衝液は１００ｍＭ ＭＥＳ／トリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０であり、基質はＤ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＡＭＣを２５０μＭの最高濃度で用いた。
【０１４７】
カテプシンＫタンパク質加水分解触媒活性の決定
上記のようにヒト組換え酵素を用いてカテプシンＫの都合のよいアッセイを行った。動力学定数の決定のための標準アッセイ条件には蛍光原性のペプチド基質、典型的にはＨ−Ｄ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＡＭＣを用い、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭ Ｍｅｓ／トリス（ｐＨ７．０）か、または５ｍＭ ＥＤＴＡおよび２０ｍＭシステインを含む１００ｍＭ酢酸Ｎａ（ｐＨ５．５）のいずれかで決定した。使用した酵素濃度は５ｎＭであった。ストック基質溶液はＤＭＳＯ中で１０ｍＭにて調製した。スクリーニングを６０μＭの一定の基質濃度で行い、詳細な動力学研究を２５０μＭからの基質の２倍希釈で行った。アッセイでの全ＤＭＳＯ濃度は３％未満に保持した。アッセイは全て周囲温度にて行った。生成物の蛍光（３９０ｎｍで励起、４６０ｎｍで放射）のモニターは、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ蛍光プレートリーダーで行った。生成物の進行曲線（ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｃｕｒｖｅ）をＡＭＣ生成物の生成後１５分間かけて作製した。
【０１４８】
阻害研究
インヒビターの可能性のあるものを上記アッセイを種々の濃度の被験化合物で用いてスクリーニングする。基質およびインヒビターの緩衝溶液に酵素を加えることにより反応を開始した。Ｋｉ値は式１：
【数１８】
2004513942.tif 000047
（式中、ν０は反応速度、Ｖは最大速度、Ｓは基質濃度、ＫＭはミカエリス定数、Ｉはインヒビター濃度）により計算した。
【０１４９】
ファルシパイン（ｆａｌｃｉｐａｉｎ）２タンパク質加水分解触媒活性の決定
ファルシパイン２の生成
クローニング
デオキシオリゴヌクレオチドプライマー：
（配列番号１）５’ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＡＣＡＧＡＴＴＴＧＣＣＧＡＴ−３’および
（配列番号２）５’ＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＡＡＴＴＡＡＴＧＧＡＡＴＧＡＡＴＧＣＡＴＣＡＧＴ−３’を、Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ、ケンブリッジ、英国（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／Ｐｒｏｊｅｃｔｓ／Ｐ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ／ｂｌａｓｔ ｓｅｒｖｅｒ．ｓｈｔｍｌ）に寄託された配列に基づいてデザインした。これらプライマーは、現在ファルシパイン２として知られるシステイニルプロテイナーゼのｃＤＮＡ配列の部分を増幅し、関連する末端クローニング酵素部位および停止コドンのすぐ上流にあるカルボキシ末端のヘキサヒスチジンコード配列を含むようにデザインした。
【０１５０】
上記プライマーおよび鋳型としてＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍファージライブラリーＤＮＡを用い、以下の条件でポリメラーゼ連鎖反応を行った：９４℃で２分、ついで９４℃で１０秒を３５サイクル、５０℃で１分、および６０℃で２分、この次に６０℃で５分のインキュベーション。８８０ｂｐのＰＣＲアンプリコンを精製し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてリン酸化した。ついで、このＤＮＡを、ＥｃｏＲＶ開裂し脱リン酸化したＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩクローニングベクターにライゲートし、ＤＨ５アルファ大腸菌に形質転換した。単離した組換え大腸菌クローン中のプラスミド挿入物のＤＮＡ配列をＡｍｅｒｓｈａｍ Ｍｅｇａｂａｃｅシークエンシング装置を用いて決定した。真正のＯＲＦを生成するため、３方ライゲーションを行って、切断したファルシパイン２のＮ末端（ＮｃｏＩ／ＮｄｅＩ）、ファルシパイン２のＣ末端（ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ）およびベクターｐＱＥ−６０（ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ）を一緒に合わせた。
【０１５１】
ＴＦ２．１０のヌクレオチド配列（配列番号３）：
ＣＣＡＴＧＧＡＡＴＴＡＡＡＣＡＧＡＴＴＴＧＣＣＧＡＴＴＴＡＡＣＴＴＡＴＣＡＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＴＡＴＣＴＴＡＧＴＴＴＡＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＡＡＣＣＡＴＴＡＡＡＧＡＡＴＴＣＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＴＴＡＧＡＴＣＡＡＡＴＧＡＡＴＴＡＴＧＡＡＧＡＡＧＴＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＡＧＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＣＧＡＴＣＡＴＧＣＡＧＣＴＴＡＣＧＡＣＴＧＧＡＧＡＴＴＡＣＡＣＡＧＴＧＧＴＧＴＡＡＣＡＣＣＴＧＴＡＡＡＧＧＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＴＧＴＧＧＡＴＣＴＴＧＣＴＧＧＧＣＣＴＴＴＡＧＴＡＧＴＡＴＡＧＧＴＴＣＣＧＴＡＧＡＡＴＣＡＣＡＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＡＧＡＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＣＣＴＴＡＡＧＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＴＴＡＧＴＡＧＡＴＴＧＴＴＣＡＴＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＧＧＴＴＧＴＡＡＴＧＧＡＧＧＴＣＴＣＡＴＴＡＡＴＡＡＴＧＣＣＴＴＴＧＡＧＧＡＴＡＴＧＡＴＴＧＡＡＣＴＴＧＧＡＧＧＴＡＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＴＡＴＣＣＡＴＡＴＧＴＧＡＧＴＧＡＴＧＣＴＣＣＡＡＡＴＴＴＡＴＧＴＡＡＣＡＴＡＧＡＴＡＧＡＴＧＴＡＣＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＴＣＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＡＴＣＣＧＴＡＣＣＡＧＡＴＡＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＧＣＡＣＴＴＡＧＡＴＴＣＴＴＧＧＧＡＣＣＴＡＴＴＡＧＴＡＴＴＡＧＴＧＴＡＧＣＣＧＴＡＴＣＡＧＡＴＧＡＴＴＴＴＧＣＴＴＴＴＴＡＣＡＡＡＧＡＡＧＧＴＡＴＴＴＴＣＧＡＴＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＴＴＡＡＡＴＣＡＴＧＣＣＧＴＴＡＴＧＣＴＴＧＴＡＧＧＴＴＴＴＧＧＴＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＴＴＡＡＴＣＣＡＴＴＡＡＣＣＡＡＧＡＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＴＡＴＡＡＴＴＡＡＧＡＡＣＴＣＡＴＧＧＧＧＡＣＡＡＣＡＡＴＧＧＧＧＡＧＡＡＡＧＡＧＧＴＴＴＣＡＴＡＡＡＴＡＴＴＧＡＡＡＣＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＧＧＡＴＴＡＡＴＧＡＧＡＡＡＡＴＧＴＧＧＡＴＴＡＧＧＴＡＣＴＧＡＴＧＣＡＴＴＣＡＴＴＣＣＡＴＴＡＡＴＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＡＡＧＴＣＧＡＣＧＣＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣ
【０１５２】
タンパク質のコーティング配列（配列番号４）：
【化３５】
2004513942.tif 000048
【０１５３】
ＴＦ２．１０挿入物を制限酵素ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩを用いてｐＱＥ−６０ベクターから切り出し、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ切断した発現ベクターｐＥＴ−１１Ｄにライゲートし、ＤＨ５アルファ大腸菌に形質転換した。単離した大腸菌中の組換え発現プラスミド（ｐＥＴ−ＴＦ２．１０）の存在は、プラスミドＤＮＡの制限酵素消化物により確認した。ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌をｐＥＴ−ＴＦ２．１０で形質転換し、組換えシステイニルプロテイナーゼの発現に用いた。
【０１５４】
タンパク質の発現
ｐＥＴ−ＴＦ２．１０で形質転換したＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（ＢＬＴＦ２．１０）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むルリアブロス中、２００ｒｐｍ、３７℃にて一夜増殖させた。ついで新たな培地を接種し、１ｍＭ ＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘発する前に０．８のＯＤ６００ｎｍまで増殖させた。誘発を２００ｒｐｍ、３７℃で３時間行い、ついで細菌菌体を遠心分離により回収し、タンパク質精製を行うまで−８０℃で貯蔵した。
【０１５５】
タンパク質の精製およびリフォールディング
２５０ｍｌの培養液に相当する大腸菌菌体ペレットを可溶化緩衝液（６Ｍグアニジン塩酸塩、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）中に室温にて３０分間、再浮遊させることにより溶解した。１２０００ｇで４℃にて１０分間遠心分離した後、透明な溶解液を１ｍｌのニッケル−ＮＴＡアガロースに加え、室温で１時間振盪した。
【０１５６】
タンパク質のリフォールディング法１
ニッケル−ＮＴＡに結合したタンパク質を、６Ｍグアニジン塩酸塩、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５０ｍＭ ＮａＣｌついで８Ｍ尿素、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ ＮａＣｌついで８Ｍ尿素、トリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０（３０ｍＭイミダゾールを含む）でバッチ洗浄し、１Ｍイミダゾールとともに８Ｍ尿素、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を用いてタンパク質の溶出を行った。ついで、溶出したタンパク質をリフォールディング緩衝液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０％グリセリン、２５０ｍＭ Ｌ−アルギニン、１ｍＭ還元型グルタチオン、０．１ｍＭ酸化型グルタチオン、ｐＨ８．０）で１００倍に希釈し、４℃で攪拌しながら一夜静置した。ついで、フィルター遠心分離かまたはニッケル−アガロースカラムを用いた再精製（透析してＥＤＴＡを除いた後）によりタンパク質を濃縮することができた。
【０１５７】
タンパク質のリフォールディング法２
ニッケル−ＮＴＡに結合したタンパク質を、８Ｍ尿素、トリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０ついで８Ｍ尿素、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０（２０ｍＭイミダゾールを含む）、ついで２Ｍ尿素、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０でバッチ洗浄した。ついで、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２５０ｍＭ Ｌ−アルギニン、１ｍＭ還元型グルタチオン、０．１ｍＭ酸化型グルタミンを加えて４℃でインキュベーションすることによりタンパク質をカラム上でリフォールディングし、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を０．５Ｍイミダゾールとともに用いてタンパク質の溶出を行った。
【０１５８】
タンパク質のリフォールディング法１を用い、希釈したリフォールディング酵素をフィルター遠心分離により濃縮することによって直ちに活性な（成熟）プロテイナーゼが得られた。しかしながら、この方法では自己タンパク質加水分解のために多大な酵素損失という結果となった。方法１を用いてリフォールディングしたタンパク質のニッケルカラム精製による濃縮とリフォールディング法２の使用との両者は、酵素の安定な不活性プロ形での一層多くの回収という結果となった。プロ形はまた、３７℃でインキュベーションした後に活性な成熟ファルシパイン２を生成するのに用いることができた。
【０１５９】
ファルシパイン２の都合のよいアッセイは、上記組換え酵素を用いて行う。別法として、Ｓｉｊａｌｉら（Ｐｒｏｔ． Ｅｘｐ． Ｐｕｒｉｆ． ２２ １２８−１３４， ２００１）は有用なアッセイを記載している。動力学定数の決定のための標準アッセイ条件には、蛍光原性ペプチド基質、典型的にＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＡＭＣを用い、１００ｍＭ Ｍｅｓ／トリス／酢酸、ｐＨ７．０（１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含有）かまたは１００ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ５．５（１Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ２−メルカプトエタノールを含有）のいずれかで決定した。使用した酵素濃度は２ｎＭであった。ストック基質溶液はＤＭＳＯ中で１０ｍＭにて調製した。スクリーニングを８０μＭの一定の基質濃度で行い、詳細な動力学研究を２５０μＭからの基質の２倍希釈で行った。アッセイでの全ＤＭＳＯ濃度は３％未満に保持した。アッセイは全て周囲温度にて行った。生成物の蛍光（３９０ｎｍで励起、４６０ｎｍで放射）のモニターは、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ Ａｓｃｅｎｔ蛍光プレートリーダーで行った。生成物の進行曲線をＡＭＣ生成物の生成後１５分間かけて作製した。
【０１６０】
阻害研究
インヒビターの可能性のあるものを上記アッセイを種々の濃度の被験化合物で用いてスクリーニングした。基質およびインヒビターの緩衝溶液に酵素を加えることにより反応を開始した。Ｋｉ値は式１：
【数１９】
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（式中、ν０は反応速度、Ｖは最大速度、Ｓは基質濃度、ＫＭはミカエリス定数、Ｉはインヒビター濃度）により計算した。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004513942.tif 000129
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