(57)【要約】臍帯血、骨髄、末梢血からなる群から選ばれる核状化細胞を有する移植供給源からの造血幹細胞移植単位の移植細胞量を決定するための方法であって、−本質的に完全な赤血球溶解に供給源を付す段階、−白血球へ選択的に応答するシグナルを細胞計数器中で測定する段階、−全核状化細胞（ＮＣ）数の一部として、核状化赤血球（ＮＲＢＣ）数を本質的に定量的に評価する段階、−および、移植関連細胞として白血球（ＷＢＣ類）の数を決定する段階を含む方法。
2004513343.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血、骨髄、末梢血からなる群から選ばれる核状化細胞を有する移植供給源からの造血幹細胞移植単位の移植細胞量を決定するための方法であって、
−本質的に完全な赤血球溶解に供給源を付す段階、
−白血球へ選択的に応答するシグナルを細胞計数器中で測定する段階、
−全核状化細胞（ＮＣ）数の一部として、核状化赤血球（ＮＲＢＣ）数を本質的に定量的に評価する段階、
−および、移植関連細胞として白血球（ＷＢＣ類）の数を決定する段階
を含む方法。
【請求項２】
完全な溶解が、標準赤血球低張条件（長期低緊張）より長い十分な時間、移植供給源の試料を処理することによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
白血球に応答するシグナル（ＷＢＣ−シグナル）が、試料の光学測定によって生じる、請求項１および／または２に記載の方法。
【請求項４】
試料中の核状化細胞が、供給源を長期低緊張に付す前に濃縮される、請求項１〜３の１項に記載の方法。
【請求項５】
試料を濃度勾配遠心分離によって濃縮して濃縮された画分を得る、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
濃縮された画分が希釈される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
更にインピーダンスカウントが試料中で測定される、請求項１〜６の１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、核状化（ｎｕｃｌｅａｔｅｄ）細胞を有する移植供給源からの造血幹細胞移植単位の細胞量を決定するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景
臍帯血（ＣＢ）からの造血幹細胞および前駆細胞の移植は、親の受容者（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ）および親類でない受容者のいずれにおいても、骨髄の機能を回復させることができ、かつ、造血の回復を持続させることができる（グルックマン（Ｇｌｕｃｋｍａｎ）ら、１９８９； クツバーグ（Ｋｕｔｚｂｅｒｇ）ら、１９９６）。適当な親類のドナーを利用することができない患者のために、造血幹細胞のこの供給源は、大きな利点をもたらす。なぜなら、入手が比較的容易であり；ドナーに対する危険性がなく；サイトメガロウイルスおよびＥＢウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）（ＥＢＶ）のような、臨床的に重要な感染症の伝染の可能性が少なく；移植中心への胎盤血の利用を迅速に行うことができ；そして、親類でない骨髄の移植に比べて、重い移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の危険性が低いからである（グルックマン（Ｇｌｕｃｋｍａｎ）ら、１９９７； ルビンスタイン（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ）ら、１９９８）。危険性および過酷さの低減により、ＨＬＡが適合しない（ＨＬＡ−ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ）ＣＢ類からの移植を用いることが可能になり、かつ、珍しい組織タイプを有する患者のための移植単位の発見の可能性が高められる。
【０００３】
６００を超える評価できる（ｅｖａｌｕａｂｌｅ）ケースを含む、１９９８年までに行われた骨髄移植の多くの過去の研究は、キログラム当たりに注入された核状化細胞の数が、臨床的に関連する好中球および血小板の数の回復を予想する主要な因子であることを示した。移植片の白血球含有量は、主に、移植の速度および全体的な成功に関連し、第二に、移植に関連するイベントおよびイベントなしの（ｅｖｅｎｔ−ｆｒｅｅ）生存に関連する。従って、より大きな胎盤血液集合物からの白血球の量は、特により高齢の患者に対して、イベントなしの生存を改善し得る（グルックマン（Ｇｌｕｃｋｍａｎ）ら、１９９７； ルビンスタイン（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ）ら、１９９８）。このため、臍帯血移植の成功は、ＣＢ移植単位中の白血球ＷＢＣの数の正確な決定に臨床的に依存する。
【０００４】
生まれたばかりの患者について、核状化赤血球（ＮＲＢＣ）および溶解耐性赤血球が、臍帯血試料中での自動ＷＢＣ決定の質に良くない影響を与えていることが確かに立証されている（クラネンドンク（Ｃｒａｎｅｎｄｏｎｋ）ら、１９８５；ジョアネッセン（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ）ら、１９９０；ハニオン（Ｈａｎｉｏｎ）ら、１９９７；ワルカ（Ｗａｌｋａ）ら、１９９８）。
【０００５】
新生児の血液または臍帯血の試料の分析は、大人の血液試料より、常に困難である（ジョアネッセン（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ）ら、１９９０）。生まれたばかりの間の（ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｈｏｕｒｓ ｏｆ ｌｉｆｅ）対照の限界（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｌｉｍｉｔｓ）における顕著な変化のために、自動（ＷＢＣ）計数の結果の解明は、問題となり得る（ジョアネッセン（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ）ら、１９９０）。新生児の血液試料は、ＷＢＣ類、即ち、リンパ球として、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）の原則に基づくすべての血液分析機によって数えられる、ＷＢＣの数を時々超えることさえある、顕著な数の正赤芽球をしばしば含む（ニキシン（Ｎｉｋｉｓｃｈｉｎ）ら、１９９７；オサキ（Ｏｓｋｉ）ら、１９６６；ドーナー（Ｄｏｅｒｎｅｒ）ら、１９９５；リム（Ｌｉｍ）、１９９４）。更に、新生児の赤血球（ＲＢＣ）の小集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ）は、正常な大人のＲＢＣ類より高い浸透耐性（ｏｓｍｏｔｉｃ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を有する（セラニ（Ｓｅｒｒａｎｉ）ら、１９８９）。
【０００６】
発明の要約
同種異系の骨髄再構成のための臍帯血（ＣＢ）移植は、他の幹細胞供給源と同様に、ますます成功して（ｗｉｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｓｕｃｃｅｓｓ）使用される。同種異系移植における移植の速度は、移植細胞量に強く関連する。従って、真の前駆細胞数の含有量に関する臍帯血の品質の制御は、ＣＢバンキング（ｂａｎｋｉｎｇ）および移植のために、きわめて重要である。
【０００７】
ほとんどの臍帯血バンク（ｂａｎｋｓ）において、更に、骨髄移植および末梢血幹細胞センターにおいても、移植単位の説明のために使用される細胞数は、核状化赤血球（ＮＲＢＣ類）を含む核状化細胞（ＮＣ類）から得られる。臍帯血移植において、ＮＲＢＣ類は、手動のみに基づいて（ｏｎｌｙ ｏｎ ａ ｍａｎｕａｌ ｂａｓｉｓ）、確実に計数され得る（塗抹標本の差）。
【０００８】
従って、本発明の目的は、臍帯血移植ならびに骨髄および血漿交換生成物、細胞計数に基づく真の白血球を、正確に評価するための、信頼できる方法を提供することである。
本発明の別の目的は、本質的に自動で行われ得る方法を提供することである。
【０００９】
本発明は、臍帯血、骨髄、末梢血からなる群から選ばれる核状化細胞を有する移植供給源からの造血幹細胞移植単位の移植細胞量を決定するための方法であって、
−本質的に完全な赤血球溶解に供給源を付す段階、
−白血球（ＷＢＣ類）へ選択的に応答するシグナルを細胞計数器中で測定する段階、
−全核状化細胞（ＮＣ）数の一部として、核状化赤血球（ＮＲＢＣ）数を本質的に定量的に評価する段階、
−および、移植関連細胞として白血球（ＷＢＣ類）の数を決定する段階
を含む方法を提供する。
【００１０】
新生児からの血液試料は、時々白血球（ＷＢＣ）濃度を超えていることさえある、顕著な濃度の正赤芽球をしばしば含む。赤芽細胞なしで白血球として実際の移植細胞量を決定するために、核状化赤血球（ＮＲＢＣ）の含有量が決定された。核状化赤血球（ＮＲＢＣ）の濃度に関する核状化細胞（ＮＣ）数と白血球（ＷＢＣ）数の違いは、過去にＣＢ移植の成功が評価されていた場合は、考慮されない。インピーダンス計数法のみによる核状化細胞数の測定は、これらの冷凍保存されたＣＢ移植単位中の白血球量を系統的に過大に評価する。従って、臍帯血バンキング中の移植細胞量は、各ＣＢ調製物中の核状化赤血球の実際の量に対して、常に補正されるべきである。各患者の体重と相関する核状化細胞数に関する移植センターによるＣＢ単位の選択のために、この数は、ＣＢ移植単位の選択前に移植センターが利用できるべきである各臍帯血バンクの目録（ｉｎｖｅｎｔｏｒｙ）に常に記録されるべきである。
【００１１】
本発明は、ＣＢ移植に関する移植細胞量の決定についての異なる細胞計数法の効果（ｉｍｐａｃｔ）を使用する。
【００１２】
図面の簡単な説明
図１：ＣＤ３５００の典型的なＣＢ試料のスキャッタープロット。試料は、長期（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）溶解モードで測定した。ＮＲＢＣクラスターをマークして機器のダイナミックスレッシホルディング（ｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｉｎｇ）によってゲートを引いた（ｇａｔｅｄ）。
【００１３】
図２：セルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００において行われた未処理臍帯血（ｎ＝２１９２）の白血球（ＷＢＣ）と核状化細胞数（ＮＣ）との相関。
【００１４】
図３：新鮮な（ｎ＝３７）ＣＢおよび解凍されたＣＢ（ｎ＝１０）における赤血球溶解後のタークス（Ｔｕｒｋｓ）溶液を用いるチャンバーカウントによるセルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００装置において決定された白血球数の相関。
【００１５】
図４：ヘタスターチ（Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）（ヘスパン（Ｈｅｓｐａｎ））体積減少の前後でのＣＢ中の核状化赤血球（ＮＲＢＣ）の分布。
【００１６】
図５：異なる計数法による解凍されたＣＢ−ＭＮＣ細胞の回収の決定。冷凍前のＭＮＣ、解凍後のＭＮＣとして計算したＭＮＣ類の回収を、コールターＡＣＴレスプ・アボットセル・ダイン（Ｃｏｕｌｔｅｒ ＡＣＴ ｒｅｓｐ． ＡｂｏｔｔＣｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００装置によって決定した。
【００１７】
図６：未処理の体積が減少した臍帯血中での、インピーダンスに基づく細胞計数器コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＡＣＴおよびセルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００のインピーダンスチャンネルとの間の核状化細胞（ＮＣ）数の相関。
【００１８】
図７：アボット（Ａｂｏｔｔ）ＣＤ３５００（光学的測定、ＷＢＣ）およびコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＡＣＴ（インピーダンスカウント、ＮＣ）によって決定された移植細胞量の相関。
【００１９】
図８：ヘタスターチ（Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）（ヘスパン（Ｈｅｓｐａｎ））体積減少の前後でのＣＢ中のＷＢＣ１００個当たりのＮＲＢＣ類。
【００２０】
図９：ＣＢの質を制御した、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＡＣＴおよびアボット・セル・ダイン（Ａｂｏｔｔ Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００装置を用いたＷＢＣおよびＭＮＣの数の比較。
【００２１】
図１０：ＣＢのヘタスターチ（Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）体積減少によるＮＲＢＣの倍増（Ｆｏｌｄ Ｉｎｃｒｅａｓｅ）。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様によれば、本質的に完全な溶解は、標準赤血球低張条件（長期低緊張（ｈｙｐｏｔｏｎｙ））より長い十分な時間、移植供給源の試料を処理することによって達成される。これにより、細胞計数が達成される前に、赤血球の溶解、特に、正常な溶解耐性細胞の溶解が引き起こされる。
【００２３】
低緊張は、ＮＲＢＣの浸透性の衝撃および破壊を引き起こす、例えば細胞の周辺の低浸透圧の状態である。
【００２４】
特に、白血球に応答するシグナル（ＷＢＣ−シグナル）は、試料の光学的測定によって発生する。
【００２５】
この態様により、ＷＢＣからＮＲＢＣを区別することが可能になる。
【００２６】
本発明の別の態様では、試料を長期低緊張に付す前に、試料中に核状化細胞が濃縮されている（例えば、製造工程による）。
【００２７】
移植に適した細胞を濃縮した画分を得るためには、例えば濃度勾配遠心分離によって試料を濃縮することが有利であり得る。
【００２８】
濃縮化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）が行われたならば、特に、試料または画分の粘度を増加させる、濃縮化のための方法が使用される場合には、試料を再度希釈する必要があり得る。
【００２９】
ＮＲＢＣ類の正確な数を決定するために、対照として、更に試料のインビーダンスカウントが測定され得る。
【００３０】
核状化赤血球（ＮＲＢＣ）は、細胞分離器、好ましくは細胞計数器、例えば、セルダイン（ＣｅｌｌＤＹＮ） ３５００（商標）装置（アボット・ディアグノスティクス社（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）、ヴィースバーデン−デルクハイム（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ−Ｄｅｌｋｈｅｉｍ））、によって分離される。分離は、ドーナー（Ｄｏｅｒｎｅｒ）， Ｋ．ら（１９９５）によって開示された浮動閾値（ｆｌｏａｔｉｎｇ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を用いて、リンパ球から光学測定チャンバーにおいて自動で行われることが有利であり得る。“血液分析機セル−ダイン（ＣＥＬＬ−ＤＹＮ） ３５００によって達成された、新生児における改良された自動白血球計数および差（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｅｒ ＣＥＬＬ−ＤＹＮ ３５００）［コメント参照］。”Ｃｌｉｎ−Ｌａｂ−Ｈａｅｍａｔｏｌ １７（１）：２３−３０およびワルカ（Ｗａｌｋａ）， Ｍ． Ｍ．ら、（１９９８）。“２つの自動細胞計測器による健康期の新生児のへその緒からの完全な血液数（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｏｕｎｔｓ ｆｒｏｍ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｔｅｒｍ ｎｅｗｂｏｒｎｓ ｂｙ ｔｗｏ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ）。”Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ １００（４）： １６７−７３は、開示として援用される。長期溶解モードを使用する間、溶解耐性赤血球は破壊され、そのため、ＣＤ３５００ユニット（ドーナー（Ｄｏｅｒｎｅｒ）ら、１９９５）の光学的チャンネルにおいて細胞数に影響を与えることができない。同時に、これらのＮＲＢＣ類および他の白血球は、セルダイン（ＣｅｌｌＤｙｎ）３５００（商標）装置（ドーナー（Ｄｏｅｒｎｅｒ）ら、１９９５）のインピーダンスチャンネルにおいて一緒に検出されることが好ましい。従って、インピーダンスカウントから光学カウントを差し引くことにより、手動の分画（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｕｎｔｓ）によって示されるような、ＮＲＢＣ類の正確な数が得られる（ワルカ（Ｗａｌｋａ）ら、１９９８；ドーナー（Ｄｏｅｒｎｅｒ）ら、１９９５）。
【００３１】
２０００個を超える臍帯血単位が分析された。これらの試料では、核状化細胞の数は、へその緒の新たに生まれた部分の小さな血液抽出物（ｄｒａｗｓ）に基づく先に述べられているものより多い（１００個のＷＢＣ当たり１２．２個のＮＲＢＣ類（Ｑ５−９５％ ２．０６〜２６．２）（ハニオン・ルンドバーグ（Ｈａｎｉｏｎ Ｌｕｎｄｂｅｒｇ）ら、１９９７）。
【００３２】
他の研究（アンドリューズ（Ａｎｄｒｅｗｓ）ら、１９９５）によって明らかになったように、沈降による更なる体積の減少により、ＮＲＢＣＳの濃縮化が行われる（１００個のＷＢＣ当たり１８．１（Ｑ５−９５％ ９．０５〜３６．５）（アンドリューズ（Ａｎｄｒｅｗｓ）ら、１９９５）。この濃縮化は、体積減少工程によって、２１．７倍までの値に達し得る（メジアン１．４４）。冷凍解凍工程によって、ほとんどのＮＲＢＣ類が溶解されるのに対し、特に、高ＮＲＢＣ含有量を有する単位において、または、多量の（ｈｉｇｈ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ）赤芽球による体積減少後、ＮＣ数のみが考慮されるならば、ＮＣ類のわずかな回収がみられる。
【００３３】
それに対して、冷凍解凍工程後、収率計算のための基礎として光学カウントを用いて、ほぼすべてのＭＮＣ類を回収することができた。従って、移植の選択のための決定点として、体積減少前の核状化細胞数を採用することにより、移植細胞量の過大評価が引き起こされるであろう。
これをまとめて考えると、効果的な移植細胞量を、体積減少前のそれら赤芽球を含む、回収された核状化細胞数より、更に良好に評価するものは、処理後、解凍前のＮＲＢＣＳなしの白血球の数である。移植細胞量の完全に自動化された決定のためには、インピーダンスのみに基づくシステムは適当ではない。
【００３４】
【実施例】
本発明を、非限定的な実施例によって更に説明する。
方法：
ネットコード・バンク（ＮＥＴＣＯＲＤ Ｂａｎｋ）、ドイツ、デュッセルドルフ（Ｄｕｅｓｓｅｌｄｏｒｆ）において、２１９２個のＣＢ単位を回収、分析し、そして、冷凍保存した。各ＣＢ標本を、輸送後３６時間以内に、細胞計数のような主要な品質制御を含めて処理した。膣輸送中の子宮中の胎盤か、または臍静脈の穿刺による切開後の子宮外の胎盤のいずれかによって、抗凝血剤としてＡＣＤＡを用いて、細胞をまず回収した（コーグラー（Ｋｏｅｇｌｅｒ）ら、１９９６）。
それら２１９２個の単位の１４６４個の体積を、冷凍保存前に減少させた。体積減少は、Ｐ． ルビンスタイン（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ）らのプロトコルに従って、通常の試験のための大きな（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）アリコートを記載されているように（コーグラー（Ｋｏｅｇｌｅｒ）ら、１９９８）調製した点を修正して、ヘタスターチ沈降（ルビンスタイン（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ）ら、１９９５）を適用して行われた。
【００３５】
記載されているように（コーグラー（Ｋｏｅｇｌｅｒ）ら、１９９６）、７２８個のＣＢ単位を、全血液として冷凍保存した。
【００３６】
処理前のすべてのＣＢ単位において、細胞数を決定した。また、凍結防止剤の添加前に、体積減少単位に対して、細胞数を決定した。
【００３７】
全試料において、完全な血液細胞数を、セルダイン（ＣＥＬＬＤＹＮ）３５００（アボット・ディアグノスティクス社（Ａｂｂｏｔｔ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）、ヴィースバーデン−デルクハイム（Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ−Ｄｅｌｋｈｅｉｍ）） （ＣＤ３５００）において、ソフトウエアバージョン１．３５を操作して決定した。
【００３８】
ＣＤ３５００は、ＷＢＣ計数のために、異なる２つのチャンネル：希釈された血液の流体力学的フォーカシングならびにＷＢＣおよびそれらの光散乱性のレーザー光学測定を含むＷＢＣ光学チャンネル（ＷＯＣ）、そしてＮＣの計数を原則とする古典的なインビーダンス（コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ））を利用する、インピーダンスチャンネル（ＷＩＣ）、を使用する。
【００３９】
ＷＯＣチャンネルは、細胞を計数して差を生み出すために使用されるのに対して、ＷＩＣ（インピーダンス）チャンネルは、細胞を数えてそれらの体積を決定することにより、確認（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）チャンネルとして使用される。ＷＩＣチャンネルにおいて使用される溶解剤は、洗浄剤に基づいており、かつ、低張性かつ白血球保護性であるＷＯＣチャンネルのものより、ＲＢＣに対してより攻撃的である。ＷＯＣチャンネルに関する測定のための赤血球溶解時間を１５秒長くすることにより、新生児の血液試料では一般的である溶解耐性赤血球が効率的に除去される（ドーナー（Ｄｏｅｒｎｅｒ）ら、１９９５）。ＮＲＢＣは、ＷＯＣチャンネルにおいて高感度で検出され、ダイナミックスレッシホルディングによってＷＢＣ計数から除外される（ドーナー（Ｄｏｅｒｎｅｒ）ら、１９９５）（図１）。選択されれば、装置によって長期溶解がもたらされ得るので、全試料が長期溶解モードにおいて検出された。
【００４０】
全血液として冷凍された移植単位の３３個の試料を、先に述べられているように（ＡＡＢＢ１９９６）、０．９μｌの計数体積で、標準細胞計数器を用いて、赤血球溶解およびターク（Ｔｕｒｋ）溶液による染色によって、更に手動で計数した。
【００４１】
全血液冷凍単位としての１１個から、冷凍アリコートを解凍し、ＣＤ３５００によって、および記載されているように手動で、解凍後直ちに計数した。
【００４２】
全血液として冷凍された単位の１０６個の冷凍アリコートから、および、体積減少後に冷凍された１１５個の単位から、上記のように差異計数（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｕｎｔｓ）を行い、ＮＣおよびＭＮＣ回収を決定した。
【００４３】
７７個の体積を減少させたＣＢ単位において、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＡＣＴ装置を有するＣＤ３５００装置（べックマン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ） ／コールター・ディアグノスティクス（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、クレフェルド（Ｋｒｅｆｅｌｄ））に対して更に、すべての細胞計数を行った。コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＡＣＴにおける白血球計数により、インピーダンスチャンバー内で細胞計数が行われ、測定された細胞の核小体の体積が決定された。この装置の差異計数は、測定された核小体の体積に基づいている：体積の小さな核小体を有する細胞をリンパ球として、メジアンを単球として、そして高核小体体積を有する細胞を顆粒球として計数する。
【００４４】
ＣＤ３５００およびＡＣＴを、１２時間のスケジュールで連続的に運転させた。内部および外部品質制御を、ジャーマン・ブンデサルツテカマー（Ｇｅｒｍａｎ Ｂｕｎｄｅｓａｅｒｚｔｅｋａｍｍｅｒ）の規定に従って行った。
統計的な説明データを、正規分布データにおける算術平均値±標準偏差によって、そうでなければメジアンおよび変位値によって得る（５％−９５％）。
【００４５】
線形、ポテンシャル、対数、反比例相関を含む、最良適合モデルを用いて、回帰（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）分析を行った。分布のホップ（Ｆｏｐ）比較、ｔ−検定、どこかに示されたペアｔ−検定（ｗｈｅｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔｓ）が使用された。
【００４６】
結果
合計２１９２個の臍帯血単位の体積、光学カウントおよびインピーダンスカウントを、ＣＤ３５００において分析することができた。回収されたＣＢの平均体積は９８．３ｍｌ±２１．２ｍｌであり、抗凝血剤として、２１ｍｌのＡＣＤＡを含んでいた。
【００４７】
１０．６９±３．３０×１０９／リットルの細胞の平均は、回収後、更なる処理の前に、ＣＢ中で、アボット（Ａｂｂｏｔｔ）ＣＤ３５００の光学チャンネルによって検出され得た。１２．５±４．１×１０９核状化細胞／リットルは、システムのインピーダンスチャンネルによって決定された（表１）。最良適合相関（Ｂｅｓｔ ｆｉｔ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）では、インピーダンスカウントは、光学カウントと良好に相関する（ｒ２＝０．８４５１；ｐ＜０．０００１）。図２は、セルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００において行われた、未処理の臍帯血（ｎ＝２１９２）の白血球（ＷＢＣ）と核状化細胞数（ＮＣ）との相関を示す。線形、対数、ポテンシャル、および多項式アルゴリズムを含む、最良適合相関モデルにおけるポテンシャルの方式（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆａｓｈｉｏｎ）において、ＷＢＣ数は、ＮＣと相関し、特に、ＮＣ数が２０Ｇ／ｌを超える試料については、高ＮＣ数を有する試料中で、低ＮＣ濃度を有する試料中より高い割合の核状化赤血球が存在することを示す。光学チャンネルおよびインピーダンスチャンネルにおいてどの細胞が測定されるかを立証するために、３３個の未処理試料を、ＣＤ３５００装置によって、かつ、赤血球を溶解した後に、クリスタルバイオレットを用いてマニュアルチャンバーカウントによって、測定した。インピーダンスとチャンバーカウントとの間で、線形相関が観察され（ＷＩＣ＝１，００９×チャンバーカウント、ｒ２＝０．８３８９）、核状化赤血球が、核状化細胞（ＮＣ）として、インピーダンスチャンネルにおいて、白血球とともに計数されることを示す。図３は、新鮮な（ｎ＝３７）および解凍されたＣＢ（ｎ＝１０）中での赤血球溶解後の、タークス（Ｔｕｒｋｓ）溶液を用いたチャンバーカウントとの、セルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００において決定された白血球数の相関を示す。ＮＣ（インピーダンス）数は、新鮮な、および、解凍された試料中で、チャンバーカウントと線形方式で相関するのに対し、ＷＢＣ（光学）数は、新鮮な試料中ではポテンシャル方式で、解凍された試料中では線形方式で相関し、冷凍／解凍によって、ＮＲＢＣのほとんどが破壊されることを示す。
【００４８】
際立って対照的に、光学カウント（ＷＯＣ）は、チャンバーカウントと１：１相関より下の曲線で相関し、ＷＢＣ類のみが計数されることを示す。ＷＩＣ（ＮＣ）とＷＯＣ（ＷＢＣ）との間の観察された違いは、ＮＲＢＣ含有量によって生じる。興味深いことに、高ＮＣ濃度を有するＣＢ単位でも、より高いＮＲＢＣ濃度を得ることができる（図２および図３の左のパネル）。
【００４９】
解凍された試料中では、インピーダンスカウントおよび光学カウントのいずれも、チャンバーカウントと線形方式で相関し（ＷＩＣ＝１，１２５×チャンバーカウント、ｒ２＝０．９３６；ＷＯＣ＝１．００２×チャンバーカウント、ｒ２＝０．９９８）、ＮＲＢＣ類のほとんどが、冷凍／解凍工程によって溶解されることを示す（図３の右のパネル）。
【００５０】
２１９２個の試料の１４６４個の体積が、ヘタスターチ（Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）体積減少によって減少した。
【００５１】
体積が減少した単位のすべてから、ＷＢＣ（ＷＯＣ）およびＮＣ（ＷＩＣ）数を、ＣＤ３５００において再度決定した。ＮＣのＮＲＢＣの割合を、１００×（１−ＷＯＣ／ＷＩＣ）として計算した。処理前の試料中より更に多くのＮＲＢＣ類を、体積減少後に見出すことができた（ｐ＜０．００００１）。図４は、ヘスパン（Ｈｅｓｐａｎ）体積減少前後のＣＢ中での核状化赤血球（ＮＲＢＣ）の分布を示す。ＮＲＢＣ類を、ＮＣ数−ＷＢＣ−数として決定し、ＮＣ類の割合として算出した（ｎ＝１４６４）。体積が減少したＣＢ類中で、未処理のＣＢ中より、ＮＣに対してより高い割合のＮＲＢＣが見出され、ヘタスターチ（Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）（ヘスパン（Ｈｅｓｐａｎ））体積減少は、ＣＢ中のＲＲＢＣ類を多くすることを示す。全ＣＢ中では、ＮＣ類のメジアン１２．７５％は、ＮＲＢＣ類であり（Ｑ５−９５％、５．４１−２６．７３％、範囲 ０．８％−７５．１％）、ヘタスターチ（Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）体積減少後のＣＢ中では、１５．９８％である（Ｑ５−９５％、７，８９−２９，７２％、範囲 ０，２７−５８，９７％）。
【００５２】
全血液として冷凍したＣＢ単位の１０６個の解凍したアリコートにおいて、および体積を減少させた単位として冷凍したＣＢ類の１１５個のアリコートにおいて、ＭＮＣが光学計数によって決定されるならば、ＭＮＣの９５．３％±７．２％および９２．３％±６．５％を回収することができた。細胞が、インピーダンス法によって計数され、かつ区別されるならば、全血液として冷凍された単位中の６５．２％±２３．２％のＭＮＣ類および体積を減少させた生成物として冷凍された単位中の５０，４％±８．１％のみを回収することができた。このことは、ＮＲＢＣ類が、冷凍／解凍工程によって破壊されることを示唆する（図５）。
【００５３】
７７個の体積を減少させた単位によって得られた結果により示されたように、全臍帯血（ＮＣ（ＡＣＴ）＝０．９７１　ＷＩＣ，ｒ２＝０，９３１）において、および、ヘタスターチ（Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）体積減少単位（ＮＣ（ＡＣＴ）＝０，９９６×ＷＩＣ，ｒ２＝０，９９３）において、ＣＤ３５００のインピーダンスカウントとＡＣＴ装置から得られた評価されたＮＣ数との間で、非常に良好な線形相関が検出され、ＣＤ３５００のインピーダンスチャンネルによって計数されたすべてのＮＲＢＣが、ＡＣＴによっても検出されることを示す。図６は、未処理の、および、体積を減少させた臍帯血における、インピーダンスに基づく細胞計数器コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＡＣＴとセルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００のインピーダンスチャンネルとの間での核状化細胞（ＮＣ）の相関を示す。セルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００およびコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）装置のインピーダンス測定の間で、明らかな線形相関が見られる。最良適合の条件下で、ＷＩＣとＷＯＣチャンネルとの間、およびＷＯＣチャンネルとチャンバーカウントとの間の相関において見られるように、体積減少前の全単位のＣＤ３５００によって決定された総細胞含有量は、１：１相関より下の相関曲線により、ＡＣＴによって決定されたＮＣと、ポテンシャル方式で相関する（ｒ２＝０．９６４）。図７は、アボット（Ａｂｂｏｔｔ）ＣＤ３５００によって決定された移植細胞量（光学測定、ＷＢＣ）とコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＡＣＴ（インピーダンスカウント、ＮＣ）との相関を示す。アボット（Ａｂｏｔｔ）３５００によって決定された移植片のＷＢＣ含有量は、最良適合モデルにおいて、ポテンシャル方式で、ＡＣＴによって決定された含有量と相関し、高ＮＣ含有量を有する試料中には、低ＮＣ濃度を有する試料中より更に多い割合の核状化赤血球が存在することを示す。特に、高細胞含有量を有するＣＢ移植単位中では、より少ないＷＢＣ数を有する単位中よりＮＲＢＣ類の割合が高い。体積を減少させた生成物中では、特に、高細胞含有量を有する移植片について、１：１の関係より下のグラフで、ポテンシャル相関（ｒ２＝０．９６５）も見られる（最良適合モデル）。
【００５４】
ヘタスターチ（Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）体積減少により、１００個のＷＢＣ当たりのＮＲＢＣ類の数が、メジアン１２．２（Ｑ５−９５％　２．０６〜２６．２、範囲　０．５−３７）から１８．１（Ｑ５−９５％　９．０５〜３６．５、範囲　６．９−７１．０）へ増加する。図８は、ヘタスターチ（Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）体積減少前後のＣＢ中のＷＢＣ類１００個当たりのＮＲＢＣ類を示す。ＮＲＢＣ類は、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＡＣＴから生じたＮＣ類として決定され、ＷＢＣは、長期溶解モードの下で作動するセルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００によって決定された。体積減少後には、体積減少前より多数のＮＲＢＣ類を見出すことができる（ｎ＝７７）。
【００５５】
図９は、ＣＢ品質制御において、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＡＣＴおよびアボット・セルダイン（Ａｂｏｔｔ Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００を使用するＷＢＣとＭＮＣ数の比較を示す。
【００５６】
ＷＢＣおよびＭＮＣ数に関して、体積減少前後の、長期溶解および光学カウントを使用して、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＡＣＴおよびセルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００から得られた結果の間の違いをプロットする。それらの違いは、アボット（Ａｂｂｏｔｔ）装置のカウントに関連する（ｎ＝７７）。コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＡＣＴによって計数すると、差異計数法の場合は、ＭＮＣ類のメジアン数は、ＣＤ３５００を用いるよりも２２．２％高い（範囲 ０．５％〜７５．７％， Ｑ５−９５％ ７．５〜５０．８％）（図９）。この違いは、体積減少後には更に大きく、ＡＣＴによって計数したＭＮＣの場合は、光学チャンネルにおけるＣＤ３５００によって計数するより、１２０．７％まで大きい（メジアン　４０．６％、範囲　４．４％〜１２０．７％，　Ｑ５−９５％　１８．６〜１００．０％）（図９）。
【００５７】
よって、インピーダンス計数法によって得られた核状化細胞数を採用すると、これらＣＢ移植片の白血球量は、系統的に過大評価される。従って、臍帯血バンキング中の移植細胞量は、バンクの目録に記録されるべきであり、ならびに、移植センターに報告されるべきである、核状化赤血球の実際の量に対して補正されるべきである。
【００５８】
図１０は、ＣＢのヘタスターチ（Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）体積減少によるＮＲＢＣの倍増を示す。ＮＲＢＣの倍増は、体積減少前後のＮＲＢＣ濃度によって計算した（ｎ＝１４６４）。
【００５９】
ＮＲＢＣを含むＮＣ数としてＣＤ３５００のインピーダンスカウントを得て、かつ、ＮＲＢＣなしのＷＢＣ数としてＣＤ３５００の光学カウントを得ると、ヘタスターチ（Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）体積減少工程によって、ＮＲＢＣ類は、１．４４±１．２１倍増える（範囲 ０．１２〜２１．７倍）（図１９）。１４６４個の体積減少工程の７６．４％において、ＮＲＢＣの濃縮化を検出することができた。これらの体積減少単位の１１．４％では、相対的なＮＲＢＣ含有量の２倍を超える増加が観察された。
【００６０】
ＣＢ、骨髄移植片および血漿交換単位中のＮＲＢＣ含有量を、セルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００装置によって容易に検出することができ、メイ・グルーエンワルド（Ｍａｙ Ｇｒｕｅｎｗａｌｄ）染色後の白血球の差において、ＮＲＢＣ類のマニュアル計数によって立証することができた。セルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）４０００装置によって適用された方法により、骨髄および血漿交換移植片中の正確なＮＲＢＣ数が得られるのに対し、セルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）４０００装置は、ＣＢ移植単位中の正確なＮＲＢＣ数を決定することはできなかった。
【００６１】
【表１】
2004513343.tif 000003
【００６２】
セルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００において細胞計数を行った。長期溶解モードを使用する光学測定によって、ＷＢＣを決定し、インピーダンスチャンネルを使用することにより、ＮＣを決定した。
【００６３】
２１９２個のＣＢ単位の７２８個を、いかなる更なる体積減少もなしに冷凍保存した（処理後の体積 ９１．１±２１．３；１．７１±０．７８バッグ中に保存）。
【００６４】
文献
ＡＡＢＢ （１９９６）． 白血球−減少赤血球濃縮物中の残留白血球の計数（Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ）。 テクニカル・マニュアル（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ）。 Ｖ． ベンゲレン−タイラー（Ｖｅｎｇｅｌｅｎ−Ｔｙｌｅｒ）。 ベテスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、メリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）、米国、ＡＡＢＢ： ７２２−７２４。 アンドリューズ（Ａｎｄｒｅｗｓ）、Ｋ．、Ｊ． ワインバーグ（Ｗｉｅｎｂｅｒｇ）ら（１９９５）． “母親の血液からの胎児の核状化細胞の濃縮化（Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ｆｅｔａｌ ｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｍａｔｅｒｎａｌ ｂｌｏｏｄ）： 臍帯血を使用するモデルテストシステム（ｍｏｄｅｌ ｔｅｓｔ ｓｙｓｔｅｍ ｕｓｉｎｇ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）” Ｐｒｅｎａｔ−Ｄｉａｇｎ １５（１０）： ９１３−９。
クラネンドンク（Ｃｒａｎｅｎｄｏｎｋ）、Ｅ．、Ａ． Ｈ． ゲニイップ・ファン（Ｇｅｎｉｉｐ ｖａｎ）ら（１９８５）。 “０−１６歳の子供の白血球の自動細胞化学的差異係数に対する対照値（Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｕｎｔ ｏｆ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｃｈｉｌｄｒｅｎ ０ − １６ ｙｅａｒｓ ｏｌｄ）： ライト染色された塗抹標本からマニュアルで得られたカウントとの比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｍａｎｕａｌｌｙ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｃｏｕｎｔｓ ｆｒｏｍ Ｗｒｉｇｈｔ−ｓｔａｉｎｅｄ ｓｍｅａｒｓ）” ジャーナル・クリニカル・ケミストリー・アンド・クリニカル・バイオケミストリ−（Ｊｏｕｒｎａｌ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２３： ６６３−６６７。
ドーマー（Ｄｏｅｍｅｒ）， Ｋ．、Ｓ． シュルゼ（Ｓｃｈｕｌｚｅ）ら（１９９５）。 “血液分析機ＣＥＬＬ−ＤＹＮ ３５００ によって得られた新生児における改良された自動白血球計数および差（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｌｅｕｃｏｃｙｔｅ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｅｒ ＣＥＬＬ−ＤＹＮ ３５００）［コメント参照］．” Ｃｌｉｎ−Ｌａｂ−Ｈａｅｍａｔｏｌ １７（Ｉ）： ２３−３０。
グルックマン（Ｇｌｕｃｋｍａｎ）， Ｅ．、Ｈ． Ｅ． ブロクスマイヤー（Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ）ら（１９８９）。 “ＨＬＡが同じ兄弟からの臍帯血によるファンコーニ貧血の患者における血液再構築（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｐａｔｉｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｆａｎｃｏｎｉ’ｓ ａｎｅｍｉａ ｂｙ ｍｅａｎｓ ｏｆ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ−ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｆｒｏｍ ａｎ ＨＬＡ−ｉｄｅｎｔｉｃａｌ ｓｉｂｌｉｎｇ）” Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３２１： １１７４−１１７８。
グルックマン（Ｇｌｕｃｋｍａｎ）， Ｅ．、Ｒ．バンダーソン（Ｖａｎｄｅｒｓｏｎ）ら（１９９７）。“親類または親類でないドナーからの臍帯血移植の結果（Ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ ｃｏｒｄ−ｂｌｏｏｄ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｒｅｌａｔｅｄ ａｎｄ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｄｏｎｏｒｓ）” Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３７： ３７３−３８１。
ハニオン・ルンドバーグ（Ｈａｎｉｏｎ Ｌｕｎｄｂｅｒｇ）， Ｋ． Ｍ．、Ｒ． Ｓ． キルビー（Ｋｉｒｂｙ）ら（１９９７）。“ひとりっ子の新生児の臍帯血中の核状化赤血球（Ｎｕｃｌｅａｔｅｄ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｔｅｒｍ ｎｅｏｎａｔｅｓ）” Ａｍ−Ｊ−Ｏｂｓｔｅｔ − Ｇｙｎｅｃｏｌ １７６（６）： １１４９−５４； 議論１１５４−６。
ジョアネッセン（Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ）， Ｂ．、Ｔ． オムンドセン（Ｏｍｍｕｎｄｓｅｎ）ら（１９９０）。“生まれたばかりの赤ん坊における自動白血球差異計数（Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｃｏｕｎｔｓ ｉｎ ｎｅｗｂｏｒｎ ｉｎｆａｎｔｓ）。コールターＶＣＳとマニュアル計数によるテクニコンＨＩとの比較（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＶＣＳ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ Ｈｌ ｗｉｔｈ ｍａｎｕａｌ ｃｏｕｎｔｓ）。” Ｅｕｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ Ｓｕｐｐｌ ５３： ４１−４。
コーグラー（Ｋｏｅｇｌｅｒ）， Ｇ．、Ｊ． カレジャス（Ｃａｌｌｅｊａｓ）ら（１９９６）。“親類でない臍帯血の血液移植の可能性：重大な課題（Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ： Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｉｓｓｕｅｓ）” Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ ５： １０５−１１６。コーグラー（Ｋｏｅｇｌｅｒ）， Ｇ．、Ａ． サモウスキー（Ｓａｍｏｗｓｋｉ）ら（１９９８）。“長期幹細胞バンキングのためのヘタスターチによる体積減少（Ｖｏｌｕｍｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｂｙ Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ ｆｏｒ ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｂａｎｋｉｎｇ）” 骨髄移植（Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）２２（Ｉ）： Ｓ１４−５。
クルツバーグ（Ｋｕｒｔｚｂｅｒｇ）， Ｊ．、Ｍ． ラフリン（Ｌａｕｇｈｌｉｎ）ら（１９９６）。“親類でない受容者への移植のための造血幹細胞の供給源としての胎盤血液（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ ｂｌｏｏｄ ａｓ ａ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ）” Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３５− １５７−１６６。
リム（Ｌｉｍ）， Ｆ． Ｔ．、Ｌ． ファン・ビンセン（ｖａｎ Ｗｉｎｓｅｎ）ら（１９９４）。“ヒト臍帯血中の多数の白血球、白血球小集団、および造血前駆細胞への輸送の影響（Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ， ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ， ａｎｄ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）” ブラッド・セルズ（Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ） ２０（２−３）： ５４７−５８。
ニキシン（Ｎｉｋｉｓｃｈｉｎ）， Ｗ．、Ｍ． ペーター（Ｐｅｔｅｒ）ら（１９９７）。“臍静脈中の血液値への輸送方式の影響（Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｍｏｄｅ ｏｆ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｎ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ ｖａｌｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ）” Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｂｓｔｅｔ Ｉｎｖｅｓｔ ４３（２）： １０４−７。
オサキ（Ｏｓｋｉ）， Ｆ． Ａ．およびＬ． Ｊ． ナイマン（Ｎａｉｍａｎｎ）（１９６６）、新生児期における正常な血液値（Ｎｏｒｍａｌ ｂｌｏｏｄ ｖａｌｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｗｂｏｍ ｐｅｒｉｏｄ）。新生児における血液の問題（Ｈｅｍａｔｏｌｏｍｉｃ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｉｎ ｔｈｅ ｎｅｗｂｏｒｎ）。フィラデルフィア、米国、Ｗ．Ｂ：ソーンダズ（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）： １１−２１。
ルビンスタイン（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ）， Ｐ．、Ｃ． キャリアー（Ｃａｒｒｉｅｒ）ら（１９９８）。“親類でないドナーからの胎盤血移植の５６２人の受容者における結果（Ｏｕｔｃｏｍｅｓ ａｍｏｎｇ ５６２ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔｓ ｏｆ ｐｌａｃｅｎｔａｌ−ｂｌｏｏｄ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｄｏｎｏｒｓ）［コメント参照］” Ｎ−Ｅｎｇｌ−Ｊ−Ｍｅｄ ３３９（２２）： １５６５−７７。
ルビンスタイン（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ）， Ｐ．、Ｌ． ドブリラ（Ｄｏｂｒｉｌａ）ら（１９９５）。“親類でない骨髄再構築のための胎盤血／臍帯血の処理および冷凍保存（Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｃｅｎｔａｌ／ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ ｆｏｒ ｕｎｒｅｌａｔｅｄ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）” Ｐｒｏｃ−Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ−Ｓｃｉ−ＵＳＡ ９２（２２）： １０１１９−２２．
セラニ（Ｓｅｒｒａｎｉ）， Ｒ． Ｅ．、Ｄ． アロンソ（Ａｌｏｎｓｏ）ら（１９８９）。“ヒトの胎児および大人の赤血球における安定溶解の状態（Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｌｙｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｆｅｔａｌ ａｎｄ ａｄｕｌｔｓ ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）” Ａｒｃｈｉｖｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅｓ ｄｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｅ ｅｔ ｄｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ ９７： ３０９−３１６。
シルベスタイン（Ｓｉｌｂｅｒｓｔｅｉｎ）， Ｌ． Ｅ．およびＬ． Ｃ． ジェフェリーズ（Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ）（１９９６）。“胎盤血液バンキング−輸血医学におけるニューフロンティア（Ｐｌａｃｅｎｔａｌ−ｂｌｏｏｄ ｂａｎｋｉｎｇ − ａ ｎｅｗ ｆｒｏｎｔｉｅｒ ｉｎ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）” Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３３５： １９９−２０１。
ワルカ（Ｗａｌｋａ）， Ｍ． Ｍ．、Ｊ． ソンタグ（Ｓｏｎｎｔａｇ）ら（１９９８）。“２つの自動細胞計測器による健康期の新生児のへその緒からの完全な血液数（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｏｕｎｔｓ ｆｒｏｍ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄｓ ｏｆ ｈｅａｌｔｈｙ ｔｅｒｍ ｎｅｗｂｏｍｓ ｂｙ ｔｗｏ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓ”Ａｃｔａ Ｈａｅｍａｔｏｌ １００（４）： １６７−７３。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＤ３５００の典型的なＣＢ試料のスキャッタープロット。
【図２】セルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００において行われた未処理臍帯血（ｎ＝２１９２）の白血球（ＷＢＣ）と核状化細胞数（ＮＣ）との相関。
【図３】新鮮な（ｎ＝３７）ＣＢおよび解凍されたＣＢ（ｎ＝１０）における赤血球溶解後のタークス（Ｔｕｒｋｓ）溶液を用いるチャンバーカウントを有するセルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００装置において決定された白血球数の相関。
【図４】ヘタスターチ（Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）（ヘスパン（Ｈｅｓｐａｎ））体積減少の前後でのＣＢ中の核状化赤血球（ＮＲＢＣ）の分布。
【図５】異なる計数法による解凍されたＣＢ−ＭＮＣ細胞の回収の決定。
【図６】未処理の体積が減少した臍帯血中での、インピーダンスに基づく細胞計数器コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＡＣＴとセルダイン（Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００のインピーダンスチャンネルとの間の核状化細胞（ＮＣ）数の相関。
【図７】アボット（Ａｂｏｔｔ）ＣＤ３５００（光学的測定、ＷＢＣ）およびコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＡＣＴ（インピーダンスカウント、ＮＣ）によって決定された移植細胞量の相関。
【図８】ヘタスターチ（Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）（ヘスパン（Ｈｅｓｐａｎ））体積減少の前後でのＣＢ中のＷＢＣ１００個当たりのＮＲＢＣ類。
【図９】ＣＢの質を制御した、コールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）ＡＣＴおよびアボット・セル・ダイン（Ａｂｏｔｔ Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ）３５００装置を用いたＷＢＣおよびＭＮＣの数の比較。
【図１０】ＣＢのヘタスターチ（Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）体積減少によるＮＲＢＣの倍増。
【図１】
2004513343.tif 000004
【図２】
2004513343.tif 000005
【図３】
2004513343.tif 000006
【図４】
2004513343.tif 000007
【図５】
2004513343.tif 000008
【図６】
2004513343.tif 000009
【図７】
2004513343.tif 000010
【図８】
2004513343.tif 000011
【図９】
2004513343.tif 000012
【図１０】
2004513343.tif 000013
【国際公開パンフレット】
2004513343.tif 000014
2004513343.tif 000015
2004513343.tif 000016
2004513343.tif 000017
2004513343.tif 000018
2004513343.tif 000019
2004513343.tif 000020
2004513343.tif 000021
2004513343.tif 000022
2004513343.tif 000023
2004513343.tif 000024
2004513343.tif 000025
2004513343.tif 000026
2004513343.tif 000027
2004513343.tif 000028
2004513343.tif 000029
2004513343.tif 000030
2004513343.tif 000031
2004513343.tif 000032
2004513343.tif 000033
2004513343.tif 000034
2004513343.tif 000035
2004513343.tif 000036
2004513343.tif 000037
2004513343.tif 000038
2004513343.tif 000039
2004513343.tif 000040
2004513343.tif 000041
2004513343.tif 000042
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004513343.tif 000043
2004513343.tif 000044
【手続補正書】
【提出日】平成15年2月3日(2003.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血、骨髄、末梢血からなる群から選ばれる核状化細胞を有する供給源からの造血幹細胞移植物の移植細胞量を決定するための方法であって、
−核状化細胞を濃縮する段階、
−本質的に完全な赤血球溶解に供給源を付す段階、
−濃縮された試料を希釈する段階、
−白血球に選択的に応答するシグナルを細胞計数器中で測定する段階、
−核状化細胞数（ＮＣ）としての細胞核の数に選択的に応答するシグナルを、別の装置において同時に測定する段階、
−ＮＣ数の一部として、核状化赤血球（ＮＲＢＣ）数を本質的に定量的に評価する段階、
−移植関連細胞として白血球（ＷＢＣ類）の数を決定する段階
を含む方法。
【請求項２】
完全な溶解が、標準赤血球低張条件（長期低緊張）より長い十分な時間、移植供給源の試料を処理することによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
白血球に応答するシグナル（ＷＢＣ−シグナル）が、試料の光学測定によって生じる、請求項１および／または２に記載の方法。
【請求項４】
試料を濃度勾配遠心分離によって濃縮して、濃縮され、体積を減少させた画分を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
更にインピーダンスカウントが試料中で測定される、請求項１〜５の１項に記載の方法。
【国際調査報告】
2004513343.tif 000045
2004513343.tif 000046