(57)【要約】本発明は、培地での細胞培養物中の始原細胞の増幅および始原細胞の変異から選択される１つ又はいくつかの工程を含む、複数の始原細胞を含む細胞培養物の新規な培養方法に関する。これら特定の細胞の迅速かつ継続的な培養を確実にするために、凝集塊が単細胞に転換／変換される際に始原細胞の大部分に損傷を与えない培地への外的影響によってもたらされる、本質的に単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊の形状で提供される細胞培養物を使用することが提案される。該始原細胞の増幅および／又は変異は、細胞間の接着の原因となる細胞のレセプターを少なくとも部分的にブロックする細胞培養条件下で行われるのが好ましい。該培地は、細胞に特異的な膜と結合したレセプターの細胞同士の相互作用に重要な、０．５ｍｍｏｌ／ｌの濃度のＣａ2+イオンおよび／又は阻害剤を含むことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地での細胞培養物中の始原細胞の増幅および始原細胞の変異から選択される１つ又はいくつかの方法の工程を含み、該方法の工程において細胞培養物中の始原細胞が単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊の形状で相当な割合で存在し、該細胞同士の相互作用が、凝集塊から分離した単細胞への変換／転換中に大部分の始原細胞への損傷を与えることなく培地への外的影響により解除されうることを特徴とする、複数の始原細胞を含む細胞培養物の培養方法。
【請求項２】
始原細胞が、不可避的な量の異質細胞は別として、少なくとも部分的又は本質的に完全に神経始原細胞であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
始原細胞の増幅および変異から選択される方法の工程が、細胞間の接着の原因となる細胞レセプターを少なくとも部分的にブロックする細胞培養条件下で行われることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
増幅および変異から選択される方法の工程が、Ｃａ2+イオン濃度１．０ｍｍｏｌ／ｌ培地、好ましくは０．５ｍｍｏｌ／ｌ培地、より好ましくは０．１ｍｍｏｌ／ｌ培地を有する培地中で行われることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
培地のＭｇ2+濃度が２ｍｍｏｌ／ｌ培地、好ましくは０．６ｍｍｏｌ／ｌ培地であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
方法の工程が、細胞間の相互作用を形成する細胞レセプターに特異的な阻害剤の存在下で行われることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
方法の工程が、カドヘリン類、セレクチン類、インテグリン類および免疫グロブリン類から選択される少なくとも１つの物質に特異的な阻害剤の存在下で行われることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
方法の工程が、化合物ｅＮＣＡＭ、Ｌ１およびＮ−カドヘリンの１つ以上の存在下で行われることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
方法の工程が、活性テロメラーゼの存在下で行われることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
方法の工程が、血清を含まないおよび／又は血清抽出物を含まない増幅培地で行われることを特徴とする請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
スフェロイドの形状で存在する始原細胞が始原細胞の細胞間相互作用を少なくとも部分的に解除する培地に移され、該始原細胞が、好ましくは更なる方法の工程が行われる前に、十分に長い時間、始原細胞が主に単細胞又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊の形状で存在するまで該培地中に置かれることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
方法が、特に部分分化、サブクローニングおよびプライミングから選択される１つ以上の更なる方法の工程を含み、始原細胞が１つ以上の上記の更なる方法の工程に付されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
更なる方法の工程が、単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊を相当な割合で含む細胞培養物中で行われることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
次の方法の工程：
−哺乳動物からの脳部分の取得
−始原細胞の選択
−始原細胞の増幅
−始原細胞の部分分化
−必要に応じ、増幅、選択および／又は部分分化の１つ以上の工程の１回又は数回の反復を含み、増幅および／又は部分分化の方法の工程の少なくとも一工程において、細胞培養物中の始原細胞が単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊の形状で相当な割合で存在し、該細胞同士の相互作用が、始原細胞の凝集塊から単細胞への変換／転換中に大部分の始原細胞に損傷を与えることなく培地への外的影響によって解除されうることを特徴とする、増幅可能な始原細胞の細胞培養物の調製方法。
【請求項１５】
培地に導入される始原細胞の細胞同士の接着の原因となるレセプターが少なくとも部分的にブロックされるように培地が調整されることを特徴とする細胞培養物の培養のための培地。
【請求項１６】
Ｃａ2+イオン濃度が１．０ｍｍｏｌ／ｌ培地、好ましくは、０．５ｍｍｏｌ／ｌ培地、より好ましくは０．１ｍｍｏｌ／ｌ培地であることを特徴とする請求項１５に記載の培地。
【請求項１７】
培地が、カドヘリン類、特にＥ−、Ｐ−およびＮ−カドヘリン、セレクチン類、インテグリン類、免疫グロブリン類、特にＮＣＡＭ、中でもｅＮＣＡＭから選択される１つ以上の化合物に特異的な阻害剤を含むことを特徴とする請求項１５又は１６に記載の培地。
【請求項１８】
培地が本質的に血清を含まないおよび／又は血清抽出物を含まないことを特徴とする請求項１５〜１７のいずれかに記載の培地。
【請求項１９】
始原細胞である複数の細胞を含み、該始原細胞が単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊の形状で相当な割合で存在し、該細胞同士の相互作用が、凝集塊から単細胞への変換／転換中に大部分の始原細胞に損傷を与えることなく培地への外的影響によって解除されうることを特徴とする細胞培養物。
【請求項２０】
始原細胞が、不可避的な汚染は別として、少なくとも部分的に又は本質的に完全に神経始原細胞であることを特徴とする請求項１９に記載の細胞培養物。
【請求項２１】
ニューロン細胞である複数の細胞を含み、該ニューロン細胞が単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊の形状で相当な割合で存在し、該細胞同士の相互作用が、凝集塊から単細胞への変換／転換中に大部分のニューロン細胞に損傷を与えることなく培地への外的影響によって解除されうることを特徴とする細胞培養物。
【請求項２２】
始原細胞および／又はニューロン細胞が、単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊の形状で、少なくとも１０，０００細胞／ｍｌ培地の濃度で存在することを特徴とする請求項１９〜２１のいずれかに記載の細胞培養物。
【請求項２３】
請求項１〜１４の方法の工程の１つ以上および任意の更なる方法の工程の実施後に分離されることを特徴とする細胞培養物、特に請求項１９〜２２のいずれかに記載の細胞培養物。
【請求項２４】
ヒトを含む動物への投与に適切な形態であることを特徴とする請求項１９〜２３のいずれかに記載の細胞培養物。
【請求項２５】
請求項１９〜２４のいずれかによる細胞培養物の調製のための、請求項１５〜１８のいずれかに記載の培地の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培地中での細胞培養物の増幅および変異から選択される１つ又はいくつかの工程を含む細胞培養物の培養方法、特に複数の細胞を含む分離細胞培養物の調製方法に関する。また本発明は、複数の細胞を含む細胞培養物の増幅または変異のための培地に関する。更に本発明は、複数の細胞が増幅および／又は変異された培地から得られる複数の細胞を含有する細胞培養物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞培養物は培地中で増幅される。すなわち細胞培養物中の細胞は細胞増殖によって増加および／又は変異され、その際１個以上の細胞が、細胞の増幅又は変異を促すか又はそれに必須である成分を含む増幅培地中に置かれるのが従来の方法である。細胞培養においては、一旦ある細胞濃度に達すると培地中で細胞間の細胞同士の接触が発生し、それによって複数の細胞が結合して凝集塊を形成する。それはしばしば消化酵素の助けによってのみ分離でき、重大な細胞の損失となる。
【０００３】
特に、有糸分裂後のニューロン細胞又はそれらの前駆細胞（いわゆる始原細胞）によって形成された凝集塊は、それぞれニューロスフェアと呼ばれる。現在のところ、これらのニューロスフェアは神経始原細胞の最も広がった増幅形態である。このようなニューロスフェアは浮遊培養中で増殖するが、ここで本発明は特に、細胞増殖が特にＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）およびＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）および／又はＬＩＦ（白血病阻害因子）に依存しているがＣＥＥ（ニワトリ胎児抽出物）は細胞増殖に必要とされないニューロスフェアに関するものである。このような凝集塊又は“スフェア”はニューロスフェアに限って発生するのではなく、他の細胞型でも見られる。
【０００４】
始原細胞の増幅、特に神経始原細胞の増幅は、これまでこのような凝集塊の増幅によって行われてきた。これらの凝集塊（凝集塊の直径は一般的に０．０１〜５ｍｍ）は、数個から数百万個の接着細胞を含む比較的緻密な組織を形成し、特にこれらの凝集塊（又は細胞のスフェロイド）の中心部は分化又は壊死しやすい。概して、スフェロイドのこれら中央領域は、凝集塊の消化の初期段階で損なわれることが知られている。単細胞の浮遊をもたらすスフェロイドの減少は、多くの培養技術（例えばサブクローニング、トランスフェクション、細胞選別、細胞計数）にとって最も必要である。
更に、これら凝集塊の形成により、凝集塊中に存在しているため培地と直接接触しない膜レセプターには、アクセスがあまり容易ではない。このため、一方で栄養培地への接触が遮断されて細胞の増殖が妨げられ、加えて、細胞が例えば細胞の分化又は細胞の他の形質転換をひき起こす外因性因子による操作の影響をより受けにくくなる。
【０００５】
できる限り効率のよい細胞の増幅および／又は変異は、多くの応用領域、例えば国際特許公報ＷＯ ００／７８９３１に記載されているようなパーキンソン氏病、アルツハイマー病又はその他の神経疾患の回復療法のための資源としての神経始原細胞の調製などにとって重要な条件である。それゆえ、培地中の細胞に与える培養や操作媒体の効果を増強し、またより一定したものとして提供することが一般的に必要とされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明の技術的課題は、始原細胞の増幅および／又は変異を、培地に存在する細胞の全数についてより一定に起こす方法を提供することであった。本発明のもう１つの課題は、凝集塊を形成する傾向にある特に始原細胞のより迅速な増殖を促進し、また外因性因子の適用による細胞変異をより直接的にさせる細胞培養物を調製することであった。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前述の技術的課題は、増幅又は変異中に始原細胞が単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用、特に始原細胞間の細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊として有意な程度で存在し、結果として明らかな細胞同士の接触を有する始原細胞を含む凝集塊の形成が避けられる始原細胞の培養方法、特に始原細胞の分離細胞培養物の調製方法を提供することにより解決される。一方、これまでスフェロイドとして増幅されてきた細胞、特に始原細胞および／又はニューロン細胞は、本発明の栄養培地へ移す過程で単細胞の浮遊物へと変換させることができ、その際大部分の始原細胞が凝集塊から単細胞への移行中に損なわれることなく、培地への外的影響により凝集塊の接着細胞同士の相互作用を妨げることが出来る。
【０００８】
始原細胞および／又は神経細胞の増幅および／又は変異は、単細胞および／又は上記の弱い接着細胞同士の相互作用を有する凝集塊として存在する細胞で、より容易かつより一定して実施することができる。なぜなら栄養分および増殖因子、コエンザイム、プラスミド、ベクター等の他の活性成分がより容易に細胞に利用されうるからである。これは、スフェロイド中に存在する細胞と比較して、速度の速い細胞増殖の効果を得ることができる。同じことが、細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊に存在する細胞にも当てはまる。
【０００９】
本発明の細胞培養物又は本発明の方法で用いられる細胞培養物は特に、部分的に、好ましくは２５％以上又は５０％以上、特に好ましくは７５％以上又は９０％以上（全ての場合、培養物又は代表的なサンプルの全細胞数に対する適用）又は本質的に独占的に、すなわち９８％以上、始原細胞および／又はこれら始原細胞の更にあるいは最終的に分化した直近および／又は直近でない子孫の細胞を含む。
【００１０】
本発明による始原細胞は、全能性幹細胞ではなく、外因性因子の影響をうけて特定のまたは数種のみの細胞へ分化することができる、細胞分裂が可能な多分化能細胞である。様々な外因性因子の存在下又はそれらの適用条件下、定性的にまたは定量的に様々な分化を遂げた細胞は、限られた数の可能性のある細胞型を産生することができる。生じた細胞は、種々の外因性因子に曝露され、例えば最初の外因性因子の影響を受けた後に最初の細胞型が主として発生し、次に異なる外因性因子の影響を受けた後は主として異なる種類の細胞が発生するという具合に、定性的に又は定量的に組成を変えることができる。
【００１１】
特に、本発明の趣旨における神経始原細胞は、排他的に分化することができるか、又は特定の培養条件下で主に星状細胞又は希乏突起膠細胞等のニューロン細胞および／又はグリア細胞への分化が可能な細胞を包含する。ニューロン細胞は、排他的に又は好ましくはドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性および／又はＧＡＢＡ作動性ニューロンから選択される１種類以上のニューロン細胞を含んでもよく、細胞の種類の割合は外因性因子の働き又は適用される条件に応じて変化してもよい。本発明による細胞の増殖は、ＥＧＦ（上皮増殖因子）および／又はＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）および／又はＬＩＦ（白血病阻害因子）に依存してもよいが、該細胞は増殖のためにＣＥＥ（ニワトリ胎児抽出物）を必要としない。
【００１２】
始原細胞は、ヒトを含む宿主動物への移植後、又は培養皿用として一般的に使用されているガラス、プラスチック等の素材でできている容器との長時間の接触後、一般に用いられる栄養液の存在下で十分な時間をかけて分化する。
【００１３】
更に、神経始原細胞という用語は脳からの入手が可能なすべての始原細胞を含み、その際特定の適用では幹細胞、特に胎児の幹細胞が除外される。しかしながら、本発明では筋肉細胞、肝細胞又は皮膚細胞を産生させる細胞のような他の種類の始原細胞をも包含する。
【００１４】
本発明の範囲内の神経細胞は、好ましくは有糸分裂後の細胞である。神経細胞および神経始原細胞は、本発明の枠内ではそれぞれニューロン細胞およびニューロン始原細胞と称されてもよい。
【００１５】
本発明の方法で用いられる細胞培養物と利用可能となった本発明の細胞培養物は、それぞれそれらの増幅および／又は変異の方法の工程が腫瘍細胞に関係しないタイプであることが好ましい。好ましくは、本発明の細胞培養物および本発明の方法で用いられる培養物は、実質的に腫瘍細胞を含まない、すなわち、全細胞数に対して５％未満の腫瘍細胞を含むか又は検出されないものである。腫瘍細胞という用語は悪性（浸潤増殖性の転移腫瘍細胞）のみならず良性の腫瘍細胞を含む。
【００１６】
本発明の範囲内の細胞という用語は、明確に異なることが述べられているか又は文脈に現れていない限り、始原細胞、特に神経始原細胞を表す。
【００１７】
本発明の範囲内での細胞同士の接触という用語は、明確に異なることが述べられているか又は文脈に現れていない限り、始原細胞同士の接触又は始原細胞と他の細胞、特に更に分化したか又は完全に分化した細胞、特に更に分化したか又は完全に分化した神経細胞との接触、又は神経細胞同士の接触を表す。
【００１８】
本発明中の細胞変異という用語は、細胞の特性のいかなる変異をも包含し、特に、遺伝子発現に関する変化を含む、続いて起こる増幅および／又は分化に関する変異を含む。変異は、分化、特に部分分化、プライミング、トランスフェクションのような遺伝子操作又は同様に一般に知られている方法によって起こる。
【００１９】
本発明の範囲内の細胞同士の接触という用語は、直接の細胞同士の接触を含み、そこでは細胞は直接の細胞同士の相互作用により、例えば限定はされないがカドヘリン、セレクチンおよび／又は免疫グロブリン類等の接着タンパク質を介して互いに接着する。本発明による方法では、スフェロイドの形成を避けるため、同型での相互作用又は異型での相互作用による細胞同士の接触の取り消し／防止が結果的に起こる。ここにおいて、これらの細胞同士の接触は、組織を安定化させ、組成の交換を可能にし、又は細胞が密着結合、デスモソーム（desmosomes）又はギャップ結合等の互いに及ぼす作用や影響の補完を可能にさせる他の特徴を有する細胞結合に先行する、最初／初期の接触である。
【００２０】
更に、本発明の範囲内の細胞同士の接触はまた、細胞が細胞外マトリックスを介して互いに少なくとも部分的に結合している間接的な細胞同士の接触を含む。本発明による細胞外マトリックスは、動物組織の細胞間を満たしコラーゲンおよび／又はプロテオグリカンを含んでもよい、放出されたタンパク質や炭水化物の蓄積に代表される。一般的に言えば、培地や相分離によって培地から分割された物質と比較して構造安定性が向上した有機又は無機物質、例えば有機組織物質、特に動物細胞組織、あらゆる種類のガラス壁等の無機構造物質又は構造的物質は、マトリックスとみなされてもよい。
【００２１】
本発明の方法および細胞培養物中に存在、使用又は含まれる細胞の凝集塊は、１凝集塊につき好ましくは１００未満の細胞、中でも始原細胞、特に好ましくは２〜１６個の細胞、中でも始原細胞で構成される。凝集塊は弱い外的影響によって、中でも弱い機械的影響によって単細胞に分離されてもよい。弱い機械的影響による凝集塊の分離は、細胞培養物中の細胞、特に始原細胞の大部分が損傷を受けない条件で、単純なピペッティングや超音波や他の適切な手段による例えば５０〜２５０回転／分の範囲の低速度、必要に応じてより高速か低速での撹拌により達成されても良い。凝集塊を分離させるための外的影響は、好ましくは細胞、特に始原細胞の損傷が限定された範囲内（好ましくは細胞および始原細胞のそれぞれ２０％未満又は５〜１０％未満又は１％未満）であり、著しい細胞の損傷が無いのが特に好ましい。細胞が外的影響に反応してその増殖や分化に顕著な影響があるか、もしくは細胞膜が破壊される場合に、細胞の損傷があると考えられる。
【００２２】
培養、すなわち細胞培養物の増殖および／又は変異は、単細胞又は細胞同士の弱い相互作用を有する細胞凝集塊として存在する細胞の培養物中の、全細胞数に対する比率が２５％超、好ましくは５０％超、更に好ましくは７５％超、特に好ましくは９５％超又は９９％超の細胞培養物、又は実質的にすべての細胞培養物の細胞が単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊として存在する細胞培養物で起こるのが好ましい。
【００２３】
単細胞として存在する細胞の比率が２５％超、好ましくは５０％超、７５％超、特に９５％又は９８％〜ほぼ１００％である場合が特に好ましい。全細胞数に対する細胞の比率に関する上記の記述は、始原細胞の比率、同様に神経始原細胞の比率もしくはニューロン細胞の比率に関するものである。
【００２４】
単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有し凝集塊の形状で存在する細胞、特に始原細胞、特に神経始原細胞又はニューロン細胞は、培地１ｍｌ当り１００〜１０，０００，０００個以上、好ましくは１，０００〜１，０００，０００個以上、特に好ましくは１０，０００〜５００，０００個以上の細胞量で培地に存在してもよい。特に培地１ｍｌ当り１００，０００〜５００，０００個までの細胞が存在してもよい。
【００２５】
始原細胞および／又は神経細胞の培養は、少なくとも部分的に細胞間の接着の原因となる細胞レセプターがブロックされる条件下で行われるのが好ましい。例えば、前記ブロックは、レセプターの活性化に必要な物質を培地に添加しないことでその物質の利用を妨げるか、又はアクチベーターのレセプターへの結合を阻止する阻害剤を添加することにより、培養条件で細胞同士の接着の原因となるレセプターの発現又は活性化を防止して達成されても良い。追加的に又はその代用として、物質を培地に添加して直ちにレセプターをブロックする結果となってもよく、それは例えばそのような化合物が該レセプターと結合して細胞同士の接着を防ぐ場合である。更に、レセプターのブロックという用語は、レセプターの分解、特に選択的分解を導く手段も含む。
【００２６】
本発明による方法の工程、特に細胞又は始原細胞、中でも神経始原細胞それぞれの増幅および／又は変異は、適切な培養条件下、特にｅ−ＮＣＡＭ（ｐｓａ−ＮＣＡＭ）および／又はＮ−カドヘリンおよび／又はＬ１存在下で、接着分子の発現が可能な細胞段階で存在している細胞で優先的に起こる。したがって、本発明による細胞培養物は、適切な培養条件下、特にｅ−ＮＣＡＭ（ｐｓａ−ＮＣＡＭ）および／又はＮ−カドヘリンおよび／又はＬ１の存在下で、上記細胞が接着細胞の発現が可能な細胞段階で存在している培養物に関することが好ましい。
【００２７】
始原細胞および／又は神経細胞の処理は、細胞同士の接着および／又は多接着プロテインに特異的なレセプターの２５％超、好ましくは７５％超、特に好ましくは９５％超がブロックされる培養条件下で行われることが好ましい。特に、９９％を超えるか又は事実上すべてのレセプターがブロックされてもよい。
【００２８】
細胞培養物の処理は、接着分子に特異的で直接の細胞同士の接触を発生させる始原細胞および／又は神経細胞の細胞レセプターが、部分的に又は完全にブロックされる条件下で特に行われてもよい。それぞれの細胞の細胞膜内に一体化していてもよいこのような細胞レセプターは、特にカドヘリン類、セレクチン類、インテグリン類および／又は免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー、特にＮＣＡＭ、または特に胎児型ＮＣＡＭ（ｅ−ＮＣＡＭまたはｐｓａ−ＮＣＡＭ）および／又はＩＣＡＭおよび／又はＬ１のレセプターであってもよく、これらの例に限定されるものではない。
【００２９】
例えばｐｓａ−ＮＣＡＭは、それぞれエンドノイラミニダーゼ（endoneuraminidase）によって効果的に不活性化されることができ、その発現はＮＦκ−Ｂの多接着阻害によって抑えられうる。該培地は、ｐｓａ−ＮＣＡＭを１０％超、又は２５％超、好ましくは７５％超、そして特に好ましくは９９％超又は９８％超で事実上完全にブロックするために、エンドノイラミニダーゼ等の炭水化物を消化することができる酵素を効果的な量含むのが好ましい。上記の他の細胞レセプター、特にＮ−カドヘリンおよび／又はＬ１は、適切な阻害剤によって適宜ブロックされてもよい。
【００３０】
更に細胞培養物の処理は、代用的に又は追加的に、タンパク質に特異的な細胞レセプターが部分的又は完全にブロックされる条件下で行われてもよい。細胞外マトリックス中に存在し、コラーゲンやプロテオグリカンと反応することができるそのような多接着タンパク質には、例えば、特定のインテグリンによって細胞の表面への接着が可能となるフィブロネクチンがある。
【００３１】
分離された細胞培養物の製造のための本発明による方法の有利な態様は、効果的なＣａ2+イオン濃度、すなわち１．０ｍｍｏｌ／ｌ培地、好ましくは０．５ｍｍｏｌ／ｌ培地、より好ましくは０．１ｍｍｏｌ／ｌ培地を有する培地中でおこる始原細胞および／又は神経細胞の増幅および／又は処理を含む。培地中のＣａ2+イオンの全濃度が効果的な濃度と一致するのが好ましい。必要に応じて、細胞同士の接着の原因となるレセプターに結合可能な遊離Ｃａイオン濃度を減少させる適切なマスキング剤によって、Ｃａイオンをマスキングしてもよい。
【００３２】
この目的のため、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、クローネンエーテル(Kronenether)、その他のキレート剤が使用されてもよい。
【００３３】
必要に応じて、不可避的な汚染は別として、培地はＣａ2+イオンが存在しなくてもよい。０．００１〜０．１ｍｍｏｌ／ｌ培地、特に０．０１又は０．０５〜０．１ｍｍｏｌ／ｌ培地という最少量のＣａ2+イオンの存在が有利であるということが証明されている。
【００３４】
更に、不可避的な汚染は別として、培地は低濃度のみのＭｇイオンを含むか又はＭｇイオンが存在しないのが好ましい。培地のＭｇ濃度としては、２ｍｍｏｌ／ｌ培地、好ましくは０．６ｍｍｏｌ／ｌ培地、又は０．１ｍｍｏｌ／ｌ培地が可能である。
【００３５】
接着細胞同士の接触の発生に特異的なレセプターをブロックするため、細胞の増幅および／又は変異は、阻害剤（例えばレセプター拮抗剤、レセプターに対する抗体又は対応するレセプターＲＮＡに対するアンチセンス）の存在下で起こってもよい。
【００３６】
細胞培地の培養は、特に、効果的な量のカドヘリン類、セレクチン類、インテグリン類および／又は免疫グロブリン類（Ｉｇファミリー）、特にｅＮＣＡＭ、Ｎ−カドヘリンおよび／又はＬ１に特異性を有する１つ以上の阻害剤を含む培地で行われてもよい。これらの阻害剤は直接該レセプターに結合し、その結果細胞同士の接着をブロックする。Ｅ−、Ｐ−、Ｎ−カドヘリンに対して特異的な阻害剤が好ましいが、培地は他の種類のカドヘリン類に特異的な阻害剤もまた含有してもよい。該培地は代用的に又は追加的にＮＣＡＭレセプター（特にｅＮＣＡＭ）阻害剤および／又はＩＣＡＭファミリー阻害剤および／又はＬ１に対する阻害剤を含有してもよい。該阻害剤は、すべて又は望まれる比率のレセプターをブロックするのに十分な濃度で培地に存在してもよい。
【００３７】
前記阻害剤は、単独でおよび／又はいくつかの阻害剤の存在下で、全量として約０．００１〜約１０μＭ／ｌ培地、例えば０．０１〜１μＭ／ｌ又は、０．２〜１μＭ／ｌ培地の濃度で存在することができる。阻害剤は、レセプターが十分ブロックされる限り、必要に応じて、例えば培地中のＣａ2+イオン濃度に応じて、より高濃度又はより低濃度で存在することができる。
【００３８】
培地は、単細胞および／又は弱い接着細胞同士の相互作用を有する凝集塊の培地中の全細胞数に対する比率を調節するために、細胞同士の接着の原因となるレセプターに特異的な阻害剤の存在下、低濃度、例えば０．１ｍｍｏｌ／ｌ培地のＣａ2+イオンを含有してもよい。
【００３９】
単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊の処理は、高テロメラーゼ活性を有する細胞の存在下で行われることが特に好ましい。本発明による方法は、その他同条件下で、齧歯動物又はヒト組織から得られた始原細胞と比較して、少なくとも２倍のテロメラーゼ活性を許容する。そしてこの方法は更に、先行培養技術で観察されていたヒトの組織からの神経始原細胞におけるテロメラーゼ活性の減少を防止する。
【００４０】
カルシウム濃度が低い培地を使用するのがここでは特に有利である。なぜなら接着分子の活性がおこらないという点以外に、低カルシウム含量ではテロメラーゼ活性をほとんど阻害しないか又はまったく阻害しないからである。テロメラーゼ阻害は、培地中に存在する完全に活性化されたテロメラーゼに対して５０％、７５％、又は９０％未満、好ましくは２５％未満、より好ましくは１０％未満の阻害である。テロメラーゼは、細胞分裂中に消失していくｃＤＮＡのすべての３’末端のテロメア反復を触媒するリボヌクレオプロテインである。高いテロメラーゼ活性は細胞のサイクルを短縮し、同時に細胞の老化を防止するか又は減少させる。
【００４１】
例えば、テロメラーゼ活性は、“テロメア反復増幅プロトコール”(Telomeric RepeatAmplification Protocol(TRAP))に従い、ＰＣＲ  ＥＬＩＳＡを用いて測定することができる。図１で表されているように、本発明による０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／ｌ、特に０．０１〜０．１ｍｍｏｌ／ｌの範囲のＣａ濃度を有する細胞培養物のＴＲＡＰ分析は、腫瘍細胞株の対照サンプルに比べて明確なテロメラーゼ活性を示す。高濃度のＣａ2+イオンの存在下又はＣａ2+イオンの存在しない培地では、弱いテロメラーゼ活性が見られるのみであるか又はテロメラーゼ活性が観察されなかった。
【００４２】
テロメラーゼ活性は、好ましくは酵素による光度測定ＰＰＩ分析（ＥＬＩＰＡ） (Xu SQ ら、2002、テロメラーゼ活性検出のための生物発光法（Bioluminescent Method for Detecting Telomerase Activity）、Clinical Chemistry 48:7、1016〜1020頁)によって測定される。“テロメア反復配列の増幅法（Telomeric Repeat Amplification Protocol(TRAP)）”によるテロメラーゼ反復の延長は、１つのＴＴＡＧＧＧ反復のため６ＰＰＩを遊離するテロメラーゼによって触媒される。遊離されたＰＰＩは、ＡＴＰスルフリラーゼが添加されると、定量的にアデノシン−５’−ホスホ硫酸と結合してアデノシン−３−リン酸（ＡＴＰ）となる。ルシフェラーゼ発光システムは、ＡＴＰおよびルシフェリンのルシフェラーゼ触媒反応による発光量を測定することに基づいている。光の放射は、時間に依存せず生じたＡＴＰの量に比例する。
【００４３】
０．０１〜０．５ｍｍｏｌ／ｌ、特に０．０１〜０．１ｍｍｏｌ／ｌの範囲のＣａ2+イオン濃度を有する本発明の細胞培養物におけるテロメラーゼを用いたＥＬＩＰＡ分析では、腫瘍細胞株Ａ５４９(CA cells of the lung、Xuら、2002)の対照サンプルＣと比較して明確なテロメラーゼ活性が観察されている。
【００４４】
腫瘍細胞では明確なテロメラーゼ活性が観察される。しかしながら極めて高濃度のＣａ2+イオンが存在するか又はＣａ2+イオンが存在しない培地では、弱いテロメラーゼ活性があるか又はテロメラーゼ活性は観察されない。
【００４５】
Ｃａ2+イオン濃度を調整することによって又は他の適切な手段によって、本発明の方法では、腫瘍細胞株の対照サンプルと比較して２０％超、好ましくは３３％超、より好ましくは５０％超、更に好ましくは７５％超、極めて好ましくは９０％超のテロメラーゼ活性を有する哺乳類、特にヒトの始原細胞を得る事ができる。これらの細胞は、特に神経始原細胞であってもよい。
【００４６】
本発明の方法および本発明による培地は特に、培養物中にニューロン始原細胞を保持し増殖させるためのアプローチに基づく国際特許公報ＷＯ ００／７８９３１に記載の方法との組み合わせで使用されてもよいが、これに限定されない。十分な増幅後、適切な活性剤を用いることによって、これらの細胞はドーパミン作動性ニューロンのような特定のニューロンに二次的に分化されることができる。
【００４７】
上記とは別に、特に、引用することによりここに含まれる国際特許公報ＷＯ ００／７８９３１で開示されている分化条件をここに引用して含む部分的分化を行う場合、および／又は本発明による細胞の変異および／又は増幅および／又は選択を行う場合に、細胞培養物は本発明による方法の工程で使用されるかまたは得られてもよく、また細胞培養物中の全細胞数に対して望ましい神経細胞（１種類以上の神経細胞）又は直接の前駆細胞を２５％超又は５０％超、好ましくは７５％超または実質的に単独で含み、かつ他の細胞、特に免疫反応能のあるグリア細胞が９０％未満、９５％未満、９９％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは５％未満又は２％未満のみの比率で存在する本発明による細胞培養物又は細胞培養培地を得ることができる。
【００４８】
特に好ましいのは、もはや生理的効果を示さず、特に検出されない量のグリア細胞である。本発明の範囲内にある直接の前駆細胞は、宿主組織に移植直後に最終分化を受け、ガラス壁等の通常使用される組織培養皿の表面と接触しおよび／又は細胞の培養又は増殖用として通常使用される栄養培地へと移された細胞を含む。ここに記述された方法は、国際特許公報ＷＯ ００／７８９３１の方法を更に改良したものである。
【００４９】
特に、次の順序で次の方法の工程：
−哺乳動物の脳の一部の取得
−前駆細胞の選択
−前駆細胞の増幅（必要に応じて、選択後直ちに行う。）
−始原細胞の部分的分化（必要に応じて選択し、及び必要に応じて選択された細胞をその後増幅する。）および
−必要に応じて、増幅、選択および／又は部分分化の１つ以上の工程を１回以上反復
を含む前駆細胞から増殖可能な細胞培養物を調整する方法により、細胞培養物中の前駆細胞が、増幅および／又は部分的分化および／又は選択という上記方法の工程の１つ、好ましくはすべての工程中で、顕著な割合（すなわち２５％超、７５％超、９０％超、９５％超又は９８％超）で単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊として存在することが可能となる。該細胞同士の相互作用においては、細胞同士の相互作用は、凝集塊から単細胞への転換中に大部分の始原細胞が損傷を受けない程度の培地への外的影響の適用により解除されうる。特に、本発明の細胞は、増幅および部分分化の一連の工程直後、必要であればすぐ次の選択中にもまた、上記の単細胞または弱い細胞同士の凝集塊として存在する。最終の分化が上記工程の後になされてもよい。
【００５０】
本発明の方法により、更に容易かつ再生的な方法で細胞物質を得ることができる。つまり、ドーパミン作動性ニューロンおよび／又はコリン作動性ニューロンおよび／又はＧＡＢＡ作動性の線条体および／又はセロトニン作動性ニューロンを、単独又は組み合わせで２５％超又は５０％超又は７５％超又は実質的に全量含む本発明の細胞培養物を、それぞれ提供できるようになる。言い換えると、細胞物質に対する前記ニューロンの比率が９０％超、好ましくは９５％超又は９９％超であり、それぞれ生理活性量の他の細胞、特にグリア細胞を含まない。
【００５１】
増殖され、選択され、および初期には部分的でその後最終分化されることによって移植可能な細胞培養物および細胞物質の調製が可能となる本発明で使用される神経始原細胞は、ヒトを含む哺乳動物の成人のみならず胎児の神経細胞物質（脳、好ましくは中脳又は骨髄）から得ることができる。得られる脳部分は、始原細胞が部分的に又は完全に分化していくニューロンのタイプを含む脳部分、又は該始原細胞が脳の機能不全の治療のために適用される脳部分に由来してもよい。成人の細胞物質は脳室周辺切片から調製されるのが好都合である。胎児の物質は、受精後３〜２５週齢、好ましくは５〜１１週齢、又は６〜１２週齢の胎児から調製されてもよい。特に、胎児の組織は、胎児発生の完了から妊娠１２週後までの間に得られてもよい。通常、それはヒトの胎児由来のものではない。代用として間葉組織が使用された。ニューロン始原細胞は臍帯組織の血液の幹細胞から得られてもよい。細胞の分離又は培養に関する参照文献は次の通り−Daad, Weiss, J.Neursci, 1999;  Magrassi et al. Development 1998, 54: 105-115；  Ptak et al. Cell Transplant 1995, 4:299-310；  Liepelt et al. Brain Res.Dev.BrainRes 1990, 51:267-278, Buc-Caron, Neurobiol Dis 1995, 2: 37‐47；  Svendsen CN et. Al., Exp.Neurol 1997, 148:135-146；  Sah et al. Nat Biotechnol 1997, 15:574-580；  Chalmers-Redman et al. Neuroscience 1997, 76:1121-1128−であり、全て引用することによりここにその全体を包含する。
【００５２】
本発明によれば、移植可能な神経細胞物質は、ヒトを含む哺乳動物から直接又は間接的に得られたヒト始原細胞の増幅、部分的なインビトロ分化、および選択を含む方法によって得られてもよく、その際最終的に得られた神経培養物は、他の要因又は遺伝子操作を加えることなく、高い割合で最終の細胞型へと分化するか又は移植後分化する。必要に応じて、細胞物質の増幅の繰り返しが始原細胞の部分的分化および選択工程の後に行われてもよく、部分分化と選択の工程は数回繰り返すことができ、それによって分化のタイプを変化させることができる。
【００５３】
本発明によれば、１種類の特定な細胞を、栄養培地を添加し通常使用される培養皿の壁と接触させた後か又は移植後に主に生育させることで、神経始原細胞をある程度選択して分化させることが可能となる。
【００５４】
本発明の方法は、これに限定されることなく、例えば国際特許公報ＷＯ ００／７８９３１で明らかにされている方法の改良／更なる発展として、部分又は完全な分化および細胞選択の形で１つ又はいくつかの細胞変異の工程を含むことができる。
【００５５】
分化、特に部分分化および／又は選択の１つ、いくつか又はすべての方法の工程は、始原細胞、特に神経始原細胞を、部分的にもしくは実質上独占的に単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊の形状で含む培地で実施することができる。代用的に又は追加的に、１つ、いくつか又はすべての方法の工程は、分離された前駆細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊を全く含まないか、又は培地中の全細胞数に対して無視しうる量のみを含む培地中で実施されてもよい。
【００５６】
インビトロ条件下で発生してもよい部分的又は最終分化は、始原細胞、特にニューロン始原細胞中で起こってもよく、その際他の種類の細胞の始原細胞、例えば限定はされないが筋肉細胞、肝細胞又は皮膚細胞を生じさせる細胞が使用されてもよい。分化、特に部分的分化は、これらの培養条件下で有意に早く生じるのみならず、スフェアが存在している場合の最終分化又は部分分化と比較してより再生的かつより選択的に行われる。
【００５７】
始原細胞の部分分化中、プライミングおよび／又は遺伝子操作、特にトランスフェクション（例えば一過性および非一過性のトランスフェクション）に至るまで、単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊を含む本発明の培地を使用することが特に有益であり、それによって部分的および最終分化が下記の低酸素条件下で次に発生してもよい。
【００５８】
細胞の部分分化は、特に、プライミング段階で使用してもよいサイトカイン、増殖因子、転写因子、神経伝達物質、ホルモン、ガングリオシドから選択される１つ又はそれより多い化合物で処理することによって行われてもよい。ニューロン始原細胞の部分分化については特に国際特許公報ＷＯ ００／７９９３１中に記載されており、上記化合物に関するその記載内容は、引用することによりここに包含される。
【００５９】
使用することができる増殖因子は、それらのサブグループ又は同じ効果をもつ因子を含み、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、特にサブグループαおよびβを有するＥＧＦ１、ＥＧＦ２、ＥＧＦ３、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）αおよびβ、ＬＩＮ−３−タンパク、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来の神経栄養因子（ＢＮＤＦ）、ニューロトロフィン（ＮＴ）、特にＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、ＮＴ−６、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）、特にＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２、グリア細胞株由来の神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロチュリン（ＮＴＮ）、ペルセフィン（ＰＳＰ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）から選択される１つ以上を含む。
【００６０】
使用することができるサイトカインは、インターロイキン（ＩＬ１〜１６）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、特にＴＮＦアルファ、インターフェロン（ＩＦＮ）、特にＩＦＮアルファ、マクロファージ阻害又は刺激因子、特にマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、ミトコンドリア輸送促進因子（ＭＳＦ）およびレチン酸から選択される１つ以上を含む。
【００６１】
使用することができる神経伝達物質は、ドーパミン、アセチルコリン、ＧＡＢＡ、グルタメート、グリシン、タウリン、プロリン、ノルアドレナリン、セロトニンおよびニューロペプチド、特にサブスタンスＰおよびエンケファリンから選択される１つ以上を含む。
【００６２】
神経伝達物質は単独で使用されてもよく、又は増殖因子および／又はサイトカインの存在下で使用されてもよい。
【００６３】
増殖ホルモン、甲状腺ホルモン（特に始原細胞のドーパミン作動性ニューロンへの分化のためのもの）、ステロイドホルモン又はガングリオシド等と、それぞれの場合にそれらの誘導体を含むホルモン類は、単独又は上記作用物質および作用物質の混合物との組み合わせで使用されてもよい。
【００６４】
ドーパミン作動性ニューロン産生のため、特にＧＮＤＦ、ＬＩＦおよびＩＬ１〜１１のうち１つ以上が単独又は組み合わせで使用されてもよく、特にＩＬ−１、ＧＮＤＦ、ＬＩＦ、ＩＬ−１１およびそれら各々のサブグループの組み合わせで使用されてもよい。
【００６５】
外的因子は、単独又は組み合わせで、限定はされないがそれぞれ０．００５〜２５，０００ｎｇ／ｍｌ増幅液、好ましくは１〜１００ｎｇ／ｍｌ増幅液の濃度で使用されてもよい。分化には、ＩＬ−１が０．００５〜５０ｎｇ／ｍｌ又は０．００５〜１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．０１〜２５ｎｇ／ｍｌ又は０．０５〜０．２５ｎｇ／ｍｌの濃度で使用されるのが特に有用である。ＩＬ−１１およびＬＩＦが、同様に０．０１〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．５〜２．５ｎｇ／ｍｌの濃度で使用されてもよい。ＧＮＤＦは、１〜２５，０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１００〜２，５００ｎｇ／ｍｌの濃度で使用／添加されることができる。
【００６６】
該因子は、これらの濃度を用いて組み合わせで添加されてもよい。しかしながら、使用される濃度は上記の数値に限定されず、他の因子のうち使用される他の因子によって変化してもよい。
【００６７】
プライミングの形態での部分分化は、（モノクローナル）神経始原細胞を１つ以上の外因物質、特に増殖ホルモン、サイトカイン、神経伝達物質から選択される１つ以上の物質で処理することを含む方法を包含し、それによって始原細胞の更に分化した細胞型、すなわち細胞がある遺伝子の発現又はある細胞表面の特徴のような、最終分化された細胞の特徴を更に有する細胞型への部分分化が起こる。必要であれば、いわゆる調整培地、すなわち、ある望まれる神経細胞の個体数を有するニューロン（例えば、ドーパミン作動性ニューロン、コリン作動性ニューロン、ＧＡＢＡ作動性および／又はセロトニン作動性ニューロン又はグリア細胞）の培養のために特に使用される培地がまたここで使用されてもよい。これらの外的因子は、細胞分化がまだ可逆的である時点で除去され、このため細胞の更なる増幅が可能となる。細胞は、通常１〜１２時間、好ましくは３〜６時間、例外的な場合にはより短いか又はより長い間隔で、外的因子と接触する。
【００６８】
このような脱分化した（differentiation-reversed）始原細胞はプライミングされた細胞（primed cell）と呼ばれる。効果的な外的因子に新たに曝露−それは例えば脳等の組織への移植のような細胞の他の培地への移転を含んでもよい−している間、始原細胞のはるかに速い分化が起こる。プライミングされた細胞を新たに増幅させる過程で、より高い特異性が保証される遺伝子をすでに発現しているプライミングされたモノクローナル細胞株が得られる。
【００６９】
本発明の方法を実施するために、始原細胞、特に単細胞又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊の形状で、部分分化を生じさせた培地の除去後にプライミングされうる状態にある、すなわち部分的又は完全に可逆的であるように部分分化した始原細胞を用いるのが特に有利であり、その際部分分化の状態は、このようなプライミングが実際に完了したかどうかとは無関係である。そのため、ニューロン始原細胞は分化の特に早い段階で存在する。
【００７０】
特に本発明の方法によれば、単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊を含んでいる本発明の培地は、トランスフェクションによる部分分化にも使用することができる。このようなトランスフェクションは、上記プライミングにおいて、又はそれに代わるものとして使用することができる。トランスフェクション（形質転換又は形質導入とも呼ばれる）は、特別に用いられる方法とは別に、１つの遺伝子又は複数の遺伝子の細胞への挿入又は移送を含み、始原細胞が選択されるか又は望まれる細胞のタイプ、特に特定のニューロンのタイプへと分化するのを促進することができる。また、細胞の遺伝物質を変えず、また例えば脳等の組織への移植後に異質の遺伝子を受け入れず、一方で細胞のさらなる運命を決定するような、遺伝子の一過性発現もまた含まれる。
【００７１】
使用可能な遺伝子としては、ある神経細胞に特異的な遺伝子が含まれ、国際特許公報ＷＯ ００／７９９３１の”トランスフェクションによる部分分化（Partielle Differenzierung durch Transfektion）”の章に記載されている遺伝子が、引用することによりここに含まれる。例えば、ドーパミン作動性ニューロンの発生は、チロシンヒドロキシラーゼ又はＮｕｒｒ−１および／又はＮｕｒｒ−７７のレセプターのようなステロイド又は甲状腺ホルモンレセプターのファミリーをコードする遺伝子のトランスフェクションによって、又は、小胞性モノアミントランスポーター又はドーパミントランスポーターをコードする遺伝子、通常ドーパミン作動性ニューロンに特異的な遺伝子、によって導くことができる。コリン作動性ニューロンを選択するために、これらのニューロンに特異的な遺伝子、特にニコチンアセチルコリンレセプター、特にシナプス前部のアルファおよびベータサブユニット、特にアルファ−７、神経増殖因子（ＮＧＦ）レセプター又はコリンエステラーゼをコードする遺伝子が移入されてもよい。線条体ニューロンの部分分化は、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）トランスポーターをコードする遺伝子、ドーパミンレセプターをコードする遺伝子、グルタメートレセプター、エンケファリン又はサブスタンスＰをコードする遺伝子によって導くことができる。
【００７２】
一過性又は安定なトランスフェクションは、市販されているトランスフェクション試薬（例えば effectene、qiagen）により可能となる。対応するＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応でヒトゲノムから増幅される。トランスフェクションは文献記載の標準的な方法で起こる。これにより、始原細胞の一過性又は安定なトランスフェクションが可能となる。
【００７３】
細胞選択、特に始原細胞の選択の方法の工程は、好ましくは、サブクローニング工程又は他の適切な方法により行われてもよい。サブクローニングは、限定はされないが、特に最終希釈、特に単細胞のプレートアウト（plating out）によるサブクローニング；標識された生細胞の顕微操作によるサブクローニング；標識された生細胞の蛍光活性化細胞選別によるサブクローニング；磁気標識された細胞の磁気濃度によるサブクローニングから選ばれる１つ以上の方法を適時に用いて行われてもよい。それとは別に、選択の実施に関して、引用することによりここに含まれる国際特許公報ＷＯ ００／７８９３１の“サブクローニングによる選択（Selektion durch Subklonierung）”の章が参考される。
【００７４】
例えば標識された生細胞の顕微操作、標識された生細胞の蛍光活性化細胞選別によるサブクローニング、磁気標識された細胞の磁気濃度によるサブクローニング等による細胞プローブのスクリーニングを行うことで細胞培養物から類似の特徴を有する多数の細胞の選択が可能となる方法を含む細胞選別は、該方法の効率を高めるために、増幅又は部分分化の後および例えば最終希釈等による更なる選択の前に好都合に行うことができる。細胞選別は酸素欠乏条件下で実施することができる。複数の細胞選別の場合では異なる技術が異なる工程中で使用されてもよく、細胞の異なる特徴に応じて選別が行なわれる。例えば第１工程は、例えば特定のマーカーの発現について細胞の分化段階を決定するマーカーによる細胞選別が代表的である。第２の細胞選別段階では、例えば部分分化の後、例えばドーパミン作動性ニューロン指向の特定の細胞型のためのスキャニング工程を実施することができ、この２工程の順序を交換することも可能である。第２工程では、第１工程以外の他のマーカーによる選別をも包含することができる。細胞培養物の増幅後にＩＬ−１アルファ抗体（例えばＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１〜１０ μg/ml）で第１の細胞選別を行い、特にプライミングによる続いての部分分化後に、ＮＣＡＭ抗体（例えばＤＳＨＢ、１〜１０ μg/ml）を用いて第２の細胞選別を行うことが特に効果的であると証明されている。
【００７５】
細胞は、ビオチン化磁気粒子で標識された該抗体に負荷をかけることによって選別され、それらは次に磁気カラム（例えば Mylteni GmbH製）に吸着されてもよい。
【００７６】
始原細胞のサブクローニングは、特に選択された方法とは別に、細胞型に特異的なサブクローニングが例えば蛍光標識、ＦＡＣＳ、免疫磁気細胞選別（ＩＭＳ又はＭＡＣＳ）濃度と細胞型に特異的なマーカーとの組み合わせによって行なわれた場合に、特に最終希釈によるサブクローニング時に１個の細胞のみがそれぞれの培養皿に残るように、又は対応する使用される細胞に特異的なマーカーを選択することにより規定された１個又は数個の選ばれた細胞型が培養皿に残るようにして行うことができる。この方法でプレートアウトされる細胞がその後増幅されてもよく、それによってモノクローナル細胞株が得られる。単細胞の複数化させるために有糸分裂誘発物質（前記増殖因子を参照）が培地に添加されるのが好ましい。ポリクローン始原細胞浮遊物に関して上記に記載した方法と同様に、増幅、分化および特性化が更に起こる。これは選ばれたサブクローニング方法とは独立して特に有効である。
【００７７】
始原細胞のサブクローニングは、生細胞を目的細胞集団に特異的なマーカーで染色して生細胞の蛍光標識を行った後、顕微操作によって行われてもよいということが実施例によって記述されている。ドーパミン作動性細胞についてのマーカーとして、細胞は、例えば特定のドーパミン作動性プロモーター（チロシン、ヒドロキシラーゼおよび／又はドーパミントランスポーター プロモーター）の制御下で発現する強化緑色蛍光蛋白（ＥＧＦＰ、Clontech）をコードする遺伝子で標識することによって、一時的に固定することができる。緑色蛍光細胞は、その後記述されているようにクローンすることができる。同じアプローチが、コリン作動性の細胞についてはコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）のプロモーターを、ＧＡＢＡ作動性ニューロンについてはグルタミルデカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）のプロモーター又は他の適切なプロモーターを用いて行うことができる。国際特許公報ＷＯ ００／７８９３１には、他のサブクローニング方法により、どのように特定の細胞型、特にドーパミン作動性、コリン作動性又はＧＡＢＡ作動性細胞の選定が可能となり、特定の細胞型の単一細胞又はいくつかの細胞が存在する結果になるかについて記載されている。すべてのサブクローニング方法は、細胞の分化能力(TEILUNGSFAHIGKEIT)が減少することなく、できるだけ分化した細胞段階で行われるのが好ましい。これは、プライミング、遺伝子操作、空気の交換又は外因性因子での処理後を意味する。
【００７８】
上記の部分分化、選択（クローニング）および／又は増幅は、必要に応じて組み合わされてもよいし、繰り返し適用されてもよい。
【００７９】
始原細胞の選択に続き、始原細胞の増殖、始原細胞の部分および／又は完全分化又は始原細胞の更なる選択の１つ又はいくつかの方法の工程が続いてもよい。
【００８０】
始原細胞の最終分化のため、ポリ−Ｌ―リジンでコーティングされた４８穴を有する蓋つき皿又は平板（48-Lochplatten）上、神経細胞培養用基礎培地の中で培養することによって、細胞をインビトロで増やすことができる。ＦＣＳ、サイトカインおよび／又は線条体調製培地を加えることが可能である。例えば、サイトカインＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−４、ＩＬ−１１、ＬＩＦ、ＧＤＮＦ又は、“プライミング”のパラグラフで記載されているような他の外因性因子を用いることが可能である。細胞は、固定および他の調査の前に、加湿空気中３７℃で７〜１０日間分化を続ける。
【００８１】
ＤＡやＧＡＢＡニューロンのようなニューロンの機能の完全性は、トリヨード化神経伝達物質（triiodinated neurotransmitter）の取り込みを測定することにより測定されてもよい。１００μＭ パージリン、１ｍＭ アスコルベートおよび２μＭ β−アラニン（非特異的取り込みの測定には３μＭ ＧＢＲ１２９０９および１ｍＭ ２，４−ジアミノ−ｎ−ブチル酸、ＤＡＢＡを追加）を含む培養緩衝液中で１０分間前培養後、５０ｎＭ［3Ｈ］ＤＡ、［3Ｈ］コリン又は［3Ｈ］ＧＡＢＡが３７℃で１５分間添加されることができる。取り込みは冷ＰＢＳで培養皿を洗浄する工程によって停止し、溶解物の残存放射能が液体シンチレーションカウンターによって測定される。特異的な取り込みは、ＧＢＲ１２９０９およびＤＡＢＡ（非特異的）の非存在下（トータル）で起こる取り込みと存在下で起こる取り込みの差として測定される。更に、細胞培養物に関する本発明の方法は、例えば特に細胞のプライミングおよび／又は選択の形態または酸素欠乏条件下での１つ又はいくつかの他の方法での、部分分化による細胞の増幅および／又は変異を含むことができる。このような酸素欠乏条件は、標準条件（２１ｖ／ｖ％酸素）下の大気と比較して酸素活性を減少又は増加させるか、又は減少又は増加した酸素活性により誘導されうる条件を含むことができる。酸素活性は１５ｖ／ｖ％、好ましくは５ｖ／ｖ％又は、３ｖ／ｖ％、特に好ましくは１ｖ／ｖ％の大気の酸素濃度と対応することができる。必要に応じて、培地と交換されるガスの窒素濃度が標準条件下の大気と比較して同時に増加されてもよく、又は二酸化炭素のような追加のガスが加えられてもよく、その際二酸化炭素はこれらの数値にとらわれることなく１〜１３ｖ／ｖ％、好ましくは約５〜１０ｖ／ｖ％の濃度で存在してもよい。培地と交換されるガス中の酸素濃度低下の代わりもしくは追加として、エネルギー増加を抑えるか、又は減少した酸素濃度を再現する例えばロテノン（Ｒｏｔｅｎｏｎ）、ＭＰＰ、マロネートおよびその他のようなミトコンドリア呼吸阻害剤のような他の物質を使用することができる。これらの物質は、２１ｖ／ｖ％〜１５ｖ／ｖ％まで、好ましくは５ｖ／ｖ％まで又は３ｖ／ｖ％まで、特に好ましくは１ｖ／ｖ％までの大気中の酸素濃度の減少に対応する量で存在してもよい。
【００８２】
本発明は更に、複数の細胞を含む細胞培養物の増幅および／又は変異の際に用いられてもよい培地に関するものであり、細胞は培地中でスフェアを形成する傾向にあるのが好ましい。本発明によれば、培地は、スフェアを形成する傾向にある細胞、特に神経始原細胞のような前駆細胞又は神経細胞が、単細胞又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊として少なくとも部分的に培地に存在するような方法で調整されてもよい。培地は本発明の方法を実施するために用いられる培地について既に記述された特徴を有するのが好ましく、よって反復を避けるためにその記述を引用する。特に培地は、培地１ｍｌあたり１００〜１０００万個の神経前駆細胞等の前駆細胞又は神経細胞の存在下で、細胞が、単細胞として又は好ましくは３２個の細胞より小さいサイズである細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊として、少なくとも部分的に、好ましくは２５％未満、特に好ましくは事実上独占的に存在するように調整することができ、そこでは細胞同士の接着の原因となる細胞レセプターが少なくとも部分的にブロックされる。
【００８３】
特に、培地は０．５ｍｍｏｌ／ｌ培地未満、特に０．１ｍｍｏｌ／ｌ培地未満、特に好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／ｌ培地未満の濃度でＣａ2+イオンを含んでもよく、又は不可避的な混入は別として、カルシウムが含まれていなくてもよい。その代用又は追加的に、培地は上記した細胞同士の接着阻害剤を含んでもよい。
【００８４】
培地は、アミノ酸、核酸又はその前駆物質、塩類、ビタミン、プロビタミン、酵素補因子、ホルモン、増殖因子、生理的活性炭素源、生理的活性窒素源、微量成分および／又はそれぞれの前駆物質から選択される増幅促進物質および／又はそのために必須である物質を含んでもよい。望ましい培養条件に応じて、上記成分の１つ又はいくつかを培地に加えることは必ずしも必要ではなく、また培地が更なる成分を含むことも可能である。
【００８５】
培地は増幅を促進および／又はそれに必須である化合物を、限定はされないが１時間〜１０日以上、例えば少なくとも１〜３日又は５日間、好ましくは細胞の特性を損なうことなく、細胞を培地中で生存させることができる濃度で含んでもよく、および／又は１〜１０以上の分裂サイクル、好ましくは少なくとも３分裂サイクルを行ってもよい。
【００８６】
例えば、培地は約０．００００１ｍｍｏｌ／ｌの可溶性銅塩（例えばＣｕＳＯ4）、約０．００３ｍｍｏｌ／ｌの可溶性鉄塩（例えばＦｅＳＯ4）、約３〜４ｍｍｏｌ／ｌのＫＣｌ、約１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、約１５ｍｍｏｌ／ｌのＮａＨＣＯ3、約０．４５ｍｍｏｌ／ｌのＫＰＯ4、約０．９ｍｍｏｌ／ｌのＮａＨ2ＰＨ4、約０．０５ｍｍｏｌ／ｌのＺｎＳＯ3、セレン酸、約１〜２５、好ましくは３〜１５ｍｍｏｌ／ｌ、特に１０ｍｍｏｌ／ｌのグルコース（ここで、示されたグルコース含量は培地中の組成とは有利に無関係でありうる。）、約３０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、約０．０３ｍｍｏｌ／ｌのヒポキサンチンナトリウム、０．００１〜０．００３ｍｍｏｌ／ｌの各リポン酸、フェニールレッド、プトレシンナトリウム、約２ｍｍｏｌ／ｌピルビン酸ナトリウム、アミノ酸、ビオチン、ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ニコチン酸アミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、チミジン、ビタミンＢ12等のビタミンおよびプロビタミン；イノシトール又はＥＧＦ等の増殖因子；デキサメタゾン、ハイドロコルチゾン、コルチゾン等のコルチコイド、インシュリン、ヒトアルブミン、コレラトキシン、ホスホエタノールアミン、ＦＧＦ（例えばｂＦＧＦ）又はＬＩＦを含んでもよい。これらの成分のいくつかは、ある用途では必ずしも絶対に必要とされるものではないし、又は通常培地で使用される異なる成分が使用されてもよいということは理解される。しかし、コレラトキシン、コルチゾン、インシュリンおよびヒトアルブミンは、特別重要である。
【００８７】
本発明の培地は、保存目的のために細胞を含まなくてもよい。培地が部分的に又は完全に単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊を含む細胞培養物を含有する場合、遠心分離のような通常の方法や又は他の適切な方法により、細胞が分離され本質的に培地から分離され回収が可能となる。低カルシウム培地、すなわち０．５ｍｍｏｌ／ｌ未満のカルシウム濃度を有する培地で培養された物質は、高いテロメラーゼ活性によって特に特徴づけられる。
【００８８】
本発明の更なる態様は、本発明の細胞培養物の調製のための、本発明による培地の使用を含む。
【００８９】
本発明の細胞培養物中の始原細胞は、増幅中に起こる分化が少なくとも減少しているか又は完全に阻止されているという点で、通常の始原細胞と更に異なる。通常のスフェロイドで見られるニューロンおよびグリアマーカー（ＭＡＰ２、ＮｅｕＮ、ＮＣＡＭ、ＧＦＡＰ等）の発現は、ここでは大部分抑制される。
【００９０】
更に、通常のスフェロイドの５〜１０％で見られる初期アポトーシス中のＤＮＡの断片化は、本発明の細胞にはほとんどおこらない、すなわち２％未満、好ましくは１％未満〜０．５％未満、特に好ましくは測定不能値である。ＤＮＡ断片化定量は、公知の方法（ＴＵＮＥＬ染色、例えば細胞死検出キット、Roche Biochemicals製）を使用して測定されてもよい。
【００９１】
本発明の細胞培養物は、スフェロイドからなる培養物と比べてより容易に増幅および変異を受けやすいという特徴を有するばかりでなく、特定の細胞物質が患者に適用される治療方法でも有利に使用されることができる。このような適用は、例えば移植、注入又は他の適切な手段により実施されてもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９２】
本発明による方法および培地の適用は、このような適用に言及する次の実施例中で記述されている。更なる詳細は、国際特許公報ＷＯ ００／７８９３１の実施例のみならず“一般方法（Allgemeine Verfahrensdurchfuehrung）”章中に記載されており、引用することによりそれはここに含まれる。国際特許公報ＷＯ ００／７８９３１の実施例との主要な相違は下記に記述されている。
【実施例】
【００９３】
神経始原細胞を得るために、脳組織が通常の方法で調製され、その後脳組織がホモジナイズされる。このため組織は適切な濃度の例えばセリンプロテアーゼのようなタンパク分解酵素で処理され、組織の結合が緩和される。
【００９４】
その後、適切な濃度のＤＮＡ分解酵素溶液を調製された組織に加える。約１０分間の培養後、消化が始まった組織部分をパスツールピペットを通すことによってホモジナイズする。
【００９５】
次に、組織を０．０２ｍｍｏｌ／ｌのカルシウム（ＣａＣｌ2として）含量および０．４ｍｍｏｌ／ｌのマグネシウム（ＭｇＣｌ2又はＭｇＳＯ4として）含量を有する効果的な量の本発明の増幅培地と接触させる。更に増幅培地は、実例となる培地として、通常量の上記の組成物を更に含む。増殖因子としては、イノシトール、ＥＧＦ、ＦＧＦおよびＬＩＦが含まれた。更に、インシュリン、コルチゾン、ペニシリンおよびストレプトマイシン等の培地で通常使用される化合物が通常濃度で存在した。培地には、ヒトへの適用が認可されているヒトアルブミンは別として、血清および血清抽出物は含まれていない。
【００９６】
増幅は、０．１〜５ｖ／ｖ％（通常値は３％）の低酸素濃度、および５〜１０ｖ／ｖ％、好ましくは１〜５ｖ／ｖ％（通常値は５％）のＣＯ2濃度を有し、９０〜９４％Ｎ2（通常値９２％）を補った雰囲気下で行われる。
【００９７】
増幅された組織をエッペンドルフピペットを通すことによってホモジナイズし、細胞数を血球計により測定する。単細胞およびゆるい細胞凝集塊で実質的に独占される細胞浮遊物は、約３００，０００細胞／ｍｌの細胞数まで増幅培地で希釈される。この細胞浮遊物８ｍｌをピペットで２５ｃｂｍボトルに入れ、細胞は１〜５ｖ／ｖ％酸素、５〜１０％ＣＯ2および８４〜９４ｖ／ｖ％Ｎ2を含有する雰囲気中、３７℃で培養される。
【００９８】
細胞には約０．０５ｍｍｏｌ／ｌ増幅培地のカルシウム含量を有する本発明による増幅培地が新しく週１〜２回供給され、このため細胞をプラスチックチューブに移した後、遠心分離にかける。上澄み液を吸い取り、２ｍｌの新鮮な増幅培地を加えてホモジナイズする。ホモジナイズされた溶液はいくつかのサンプルに分割され、新しいボトルに入れられ、８ｍｌのカルシウム含量の低い増幅液が加えられる。
【００９９】
この方法で増幅された神経始原細胞は、通常の方法により液体窒素中で保存のため急速冷凍されてもよい。このため、細胞の調製が通常通り行われる（引用することにより全体がここに組み入れられる国際特許公報ＷＯ ００／７８９３１の記載がここで引用される）。それから細胞を約０．０５ｍｍｏｌ／ｌ培地のカルシウム含量を有する浮遊培地中に入れる。始原細胞の部分分化のために、冷凍された調製物は水浴中で解凍されてもよく、また冷凍チューブは７０％エタノールで消毒される。細胞浮遊物を、攪拌しながら約０．０５ｍｍｏｌ／ｌ増幅培地のＣａ2+イオン濃度を有する増幅培地にゆっくりと混合し、再び遠心分離にかけられ、増幅培地へと入れられる。次にサンプルは、培養ボトル中で５ｖ／ｖ％ＣＯ2−９５％空気（好ましくは、３％酸素および９２％窒素）の雰囲気下、３７℃で１週間培養される。更なる細胞の増幅が上記のようにおこる。
【０１００】
始原細胞の部分分化は、新たに増幅されたか又は解凍されたサンプルで行うことができる。解凍されたサンプルの取り扱いおよび培地の使用に関して、引用することによりここに全体が含まれる国際特許公報ＷＯ ００／７８９３１で記載されている“培地での添加１”が引用される。
【０１０１】
サンプルは、バリエーションａ）又はｂ）によって更に加工処理される。
バリエーション  ａ）
サンプルを２ｖ／ｖ％の酸素濃度を有する雰囲気下で７〜２１日間培養する。得られた細胞は５ｖ／ｖ％の酸素濃度を有する雰囲気下でサブクローニングによって選択され、上記増幅および部分分化の工程が繰り返される。
【０１０２】
得られた細胞浮遊物は、採取して移植用のリン酸緩衝塩溶液に入れることができる。
【０１０３】
本質的にグリア細胞を含まないドーパミン作動性ニューロン調製物を得た。細胞は順次移植することも可能である。
【０１０４】
上記実施例のバリエーションとして、約０．１ｍｍｏｌ／ｌ培地のＣａ濃度を有し、また１μｇ／ｍｌ培地のＮ−およびＥ−カドヘリンアンチセンスおよび抗体によるＮ−およびＥ−カドヘリン阻害の濃度を有する培地を細胞培養物の増幅のために使用した。該方法では本質的に同じ結果に導かれ、特に初期アポトーシスによる１％未満のＤＮＡ断片が見られた。
【０１０５】
バリエーション  ｂ）
サンプルをその後３ｖ／ｖ％の酸素含量を有する雰囲気下、ＩＬ−１アルファ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、プライミングによる部分分化のため６時間培養し、その後培地が部分分化のため除かれる。
【０１０６】
次に、生成した細胞は３ｖ／ｖ％の酸素含量を有する雰囲気下でサブクローニングによって選択される。その後、上記増幅および部分分化の工程を、本方法の効率向上のために繰り返すことができる。
【０１０７】
得られた細胞浮遊物は、移植用のリン酸緩衝塩溶液へ入れられてもよい。上記のように、分化用培地の存在下での１０日間の培養による最終分化の後、本質的にグリア細胞を含まないドーパミン作動性ニューロンの調製物を得た。
【０１０８】
この方法で、低酸素濃度下でのプライミングによる部分分化、選択およびそれに続く最終分化工程での増幅による部分分化の工程を１回実施した後は、約１５％の得られたモノクローナル細胞株がそれぞれ９０％を超えてドーパミン作動性ニューロンに分化し、また部分分化、選択および最終分化での増幅の方法の工程を繰り返し実施した後は、約２１％のモノクローナル細胞株は９５％までドーパミン作動性ニューロンに分化する。初期アポトーシスによるＤＮＡ断片は１％未満であった。対応するＣａ2+イオン濃度を用いて前記のように測定した細胞のテロメラーゼ活性は図１と一致した。
【０１０９】
本方法の特異性は、増幅（特にＩＬ−１アルファレセプター抗体を使用して）および部分分化（前記のように、特にＮＣＡＭ抗体を使用して）後、細胞選別工程を行うことにより更に強化することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、Ｃａ濃度を増加させた培地中での対照腫瘍組織（ポジティブコントロール）および神経始原細胞のＴＲＡＰ  ＥＬＩＳＡ分析を示す。神経始原細胞のテロメラーゼ活性は、０．０１ｍＭおよび０．０５ｍＭのＣａ濃度で最大になる。
【図２】図２はＥＬＩＰＡの作用原理を示す。テロメラーゼ反復の延長には、Ｔ１プライマー（５’ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ−３’）を用いた（Xuら、Clin Chem 2002にならって行った。）。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年12月1日(2003.12.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
０．００１〜０．５ｍｍｏｌ／ｌ培地のＣａ2+イオン濃度を有する培地中で行われる始原細胞の増幅を含み、前記増幅中、細胞培養物のニューロン始原細胞が単細胞および／又は１凝集塊につき１００未満の細胞を有する凝集塊の形状で相当な割合で存在し、該凝集塊が大部分のニューロン始原細胞に損傷を与えることなく培地への弱い機械的影響によって単細胞へと分離することができることを特徴とする、複数のニューロン始原細胞を含む細胞培養物の培養方法。
【請求項２】
培地のＭｇ2+濃度が２ｍｍｏｌ／ｌ培地、好ましくは０．６ｍｍｏｌ／ｌ培地であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
方法の工程が、細胞間の相互作用を生ずる細胞レセプターに特異的な阻害剤の存在下で行われることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
方法の工程が、カドヘリン類、セレクチン類、インテグリン類および免疫グロブリン類から選択される少なくとも１つの物質に特異的な阻害剤の存在下で行われることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
方法の工程が、化合物ｅＮＣＡＭ、Ｌ１およびＮ−カドヘリンの１つ以上の存在下で行われることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
方法の工程が、活性テロメラーゼの存在下で行われることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
方法の工程が、特に血清を含まないおよび／又は血清抽出物を含まない増幅培地で行われることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
最初の工程において、スフェロイドの形状で存在するニューロン始原細胞が０．００１〜０．５ｍｍｏｌのＣａ2+イオン濃度を有する培地に移され、該始原細胞が、好ましくは更なる方法の工程が行われる前に、十分に長い時間、始原細胞が単細胞又は１凝集塊につき１００未満の細胞を有し培地への弱い機械的な影響によって大部分の始原細胞に損傷を与えることなく単細胞へと分離することができる凝集塊の形状で存在するまで該培地中に置かれることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
方法が、特に部分分化、サブクローニングおよびプライミングから選択される１つ以上の更なる方法の工程を含み、始原細胞が１つ以上の上記の更なる方法の工程に付されることを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
更なる方法の工程が、単細胞および／又は細胞同士の弱い相互作用を有する凝集塊を相当な割合で含む細胞培養物で行われることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
次の方法の工程：
−哺乳動物からの脳部分の取得
−始原細胞の選択
−始原細胞の増幅
−始原細胞の部分分化
−必要に応じ、増幅、選択および／又は部分分化の１つ以上の工程の１回又は数回の反復を含み、増幅が０．００１〜０．５ｍｍｏｌ／ｌ培地のＣａ2+イオン濃度を有する培地で行われ、前記増幅中に細胞培養物のニューロン始原細胞が、単細胞および／又は１凝集塊につき１００未満の細胞を有し大部分の始原細胞に損傷を与えることなく培地への弱い機械的影響によって単細胞へと分離することができる凝集塊の形状で相当な割合で存在することを特徴とする、増幅可能な始原細胞の細胞培養物の調整方法。
【請求項１２】
始原細胞である複数の細胞を含み、該始原細胞が単細胞および／又は１凝集塊につき１００未満の細胞を有し大部分のニューロン始原細胞に損傷を与えることなく培地への弱い機械的影響によって単細胞へと分離することができる凝集塊の形状で相当な割合で存在し、培地におけるテロメラーゼ阻害が完全に活性なテロメラーゼと比較して９０％未満であることを特徴とする細胞培養物。
【請求項１３】
ニューロン始原細胞が、対照サンプルの腫瘍細胞株Ａ５４９のテロメラーゼ活性の２０％超のテロメラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１２に記載の細胞培養物。
【請求項１４】
ニューロン細胞である複数の細胞を含み、該ニューロン細胞が単細胞および／又は１凝集塊につき１００未満の細胞を有し大部分のニューロン始原細胞に損傷を与えることなく培地への弱い機械的影響によって単細胞へと分離することができる凝集塊の形状で相当な割合で存在し、培地におけるテロメラーゼ阻害が完全に活性なテロメラーゼと比較して９０％未満であることを特徴とする細胞培養物。
【請求項１５】
始原細胞および／又はニューロン細胞が、単細胞および／又は１凝集塊につき１００未満の細胞を有する凝集塊の形状で、少なくとも１０，０００細胞／ｍｌ培地の濃度で存在することを特徴とする請求項１２〜１４のいずれかに記載の細胞培養物。
【請求項１６】
請求項１〜１１の方法の工程の１つ以上および任意の更なる方法の工程を実施後に分離されることを特徴とする細胞培養物、特に請求項１２〜１５のいずれかに記載の細胞培養物。
【請求項１７】
ヒトを含む動物への投与に適切な形態であることを特徴とする請求項１２〜１６のいずれかに記載の細胞培養物。
【請求項１８】
請求項１２〜１７のいずれかによる細胞培養物の調整のための、Ｃａ2+イオン濃度０．００１〜０．５ｍｍｏｌ／ｌ培地を有する培地の使用。
【国際調査報告】
2004536606.tif 000043
2004536606.tif 000044
2004536606.tif 000045
2004536606.tif 000046
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2004536606.tif 000048