(57)【要約】本発明は、コアＲＮＡポリメラーゼとσ因子からホロ酵素が形成されるのを妨げる抑制剤の同定方法を提供する。
2004500122.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
σ因子が、コアＲＮＡポリメラーゼに対して、またはコアＲＮＡポリメラーゼのサブユニットに対して、またはそのサブユニットの一部に対して結合するのを抑制する薬剤を同定する方法であって、
ａ）その薬剤を、コアＲＮＡポリメラーゼに、またはＲＮＡポリメラーゼの単離されたサブユニットに、またはそのサブユニットの一部に接触させて複合体を形成し；
ｂ）その複合体を、σ因子またはその一部に接触させ；
ｃ）σ因子が、コアＲＮＡポリメラーゼに対して、またはコアＲＮＡポリメラーゼの単離されたサブユニットに対して、またはそのサブユニットの一部に対して結合するのを上記薬剤が抑制または阻止しているかどうかを検出または確認する操作を含む方法。
【請求項２】
σ因子が、コアＲＮＡポリメラーゼに対して、またはコアＲＮＡポリメラーゼのサブユニットに対して、またはそのサブユニットの一部に対して結合するのを抑制する薬剤を同定する方法であって、
ａ）その薬剤を、σ因子またはその一部に接触させて複合体を形成し；
ｂ）その複合体を、コアＲＮＡポリメラーゼに、またはＲＮＡポリメラーゼの単離されたサブユニットに、またはそのサブユニットの一部に接触させ；
ｃ）σ因子が、コアＲＮＡポリメラーゼに対して、またはコアＲＮＡポリメラーゼの単離されたサブユニットに対して、またはそのサブユニットの一部に対して結合するのを上記薬剤が抑制または阻止しているかどうかを検出または確認する操作を含む方法。
【請求項３】
ＲＮＡポリメラーゼの単離された上記サブユニット、またはコアＲＮＡポリメラーゼの上記一部が、β’サブユニットである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記β’サブユニットの一部が、そのβ’サブユニットの相互作用ドメインを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
β’サブユニットの上記一部が、そのβ’サブユニットの残基番号２７０〜３０９、そのβ’サブユニットの残基番号２６５〜３０９、そのβ’サブユニットの残基番号１００〜３０９、そのβ’サブユニットの残基番号２６０〜３０９のいずれかを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
単離された上記サブユニットが、融合タンパク質である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
σ因子が、同種σ因子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
σ因子が、異種σ因子である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
ＲＮＡポリメラーゼの単離された上記サブユニット、またはそのサブユニットの上記一部が、天然のサブユニットと比較して、置換された少なくとも１個のアミノ酸を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
コアＲＮＡポリメラーゼ、またはコアＲＮＡポリメラーゼの単離されたサブユニット、またはそのサブユニットの一部が、検出可能な標識で標識されているか、あるいは検出可能な標識と結合している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
σ因子が、検出可能な標識で標識されているか、あるいは検出可能な標識と結合しており、その検出可能な標識は、コアＲＮＡポリメラーゼに対する標識、またはコアＲＮＡポリメラーゼの単離されたサブユニットに対する標識、またはそのサブユニットの一部に対する標識とは異なっている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
β’サブユニットがＩＣ５で標識されており、σ因子がＥｕで標識されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
σ因子が、コアＲＮＡポリメラーゼに対して、またはコアＲＮＡポリメラーゼの単離されたサブユニットに対して、またはそのサブユニットの一部に対して結合するのを上記薬剤が抑制または阻止しているかどうかを検出または確認するのに、ルミネッセンス共鳴エネルギー移動を利用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
σ因子が、コアＲＮＡポリメラーゼに対して、またはコアＲＮＡポリメラーゼの単離されたサブユニットに対して、またはそのサブユニットの一部に対して結合するのを上記薬剤が抑制または阻止しているかどうかを検出または確認するのに、蛍光共鳴エネルギー移動を利用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１５】
ユーロピウムまたはテルビウムを利用する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ＩＣ５、Ｃｙ５、アロフィコシアニン、ＡＰＣ、ファロイジン−テトラメチルローダミンのうちのいずれかを用いる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
σ因子またはその一部が、検出可能な標識で標識されているか、あるいは検出可能な標識と結合している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
コアＲＮＡポリメラーゼ、またはコアＲＮＡポリメラーゼの単離されたサブユニット、またはそのサブユニットの一部が、検出可能な標識で標識されているか、あるいは検出可能な標識と結合しており、その検出可能な標識は、σ因子またはその一部に対する標識とは異なっている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１または２に記載の方法によって同定される薬剤。
【請求項２０】
σ因子がコアＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットに結合するのを抑制または阻止する薬剤を同定する方法であって、
ａ）原核細胞をその薬剤に接触させ；
ｂ）その薬剤が、その細胞内でσ因子がコアＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットに結合するのを抑制または阻止するかどうかを検出または確認する操作を含む方法。
【請求項２１】
上記細胞が、異なる２つの形態のβ’サブユニットをコードしている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
上記形態の一方が発現しない条件で、薬剤を上記細胞に接触させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
発現する形態が、発現しない形態と比較して、置換された少なくとも１個のアミノ酸を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記細胞の成長抑制を検出または確認する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
σ因子が、β’サブユニットの残基番号２７０〜３０９、そのβ’サブユニットの残基番号２６５〜３０９、そのβ’サブユニットの残基番号１００〜３０９、そのβ’サブユニットの残基番号２６０〜３０９のいずれかと結合するのを上記薬剤が抑制または阻止する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２０に記載の方法によって同定される薬剤。
【請求項２７】
原核細胞の成長を抑制する方法であって、その細胞を、請求項１９または２６に記載の薬剤の有効量と接触させる操作を含む方法。
【請求項２８】
組み換えＤＮＡ分子を含む宿主細胞であって、組み換えＤＮＡ分子はこの宿主細胞中で機能するプロモーターを含んでおり、このプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットをコードするＤＮＡ断片と機能上の関連がある宿主細胞。
【請求項２９】
上記ＤＮＡ断片が、内在性β’サブユニットと比較して置換された少なくとも１個のアミノ酸を有するβ’サブユニットをコードしている、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
上記ＤＮＡ断片が、Ｃ末端が欠失したβ’サブユニットをコードしている、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
上記組み換えＤＮＡ分子が、融合タンパク質をコードしている、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットの単離・精製された部分であって、インビボでσ因子と結合する、単離・精製された部分。
【請求項３３】
β’サブユニットの残基番号２７０〜３０９、残基番号２６５〜３０９、残基番号１００〜３０９、残基番号２６０〜３０９からなるグループの中から選択したいずれかの部分を含む、請求項３２に記載のβ’サブユニットの単離・精製された部分。
【請求項３４】
コアＲＮＡポリメラーゼのサブユニット上でσ因子と特異的に結合する領域を同定する方法であって、
ａ）天然のコアＲＮＡポリメラーゼと比較して置換された少なくとも１個のアミノ酸を有するコアＲＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡポリメラーゼの単離された天然のサブユニットと比較して置換された少なくとも１個のアミノ酸を有する単離されたサブユニット、またはその天然のサブユニットの一部と比較して置換された少なくとも１個のアミノ酸を有するサブユニットの一部を、σ因子またはその一部に接触させて複合体を形成し；そして
ｂ）その複合体の形成を検出または確認する操作を含む方法。
【請求項３５】
上記置換が、複合体の形成を抑制しない、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連する出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）のもとで２０００年３月３０日に出願されたアメリカ合衆国出願シリアル番号第６０／１９３，１１６号の出願日の恩恵を主張する。
【０００２】
政府が権利を有することの宣言
本発明は、少なくともその一部が、アメリカ合衆国政府の助成金によりなされた（国立保健研究所からの助成金ＧＭ２８５７５）。政府は、この発明に対して所定の権利を持つことができよう。
【０００３】
発明の背景
大腸菌ＲＮＡポリメラーゼは多数のサブユニットを有する大きな酵素であり、２つの形態で存在している。コア酵素は、βサブユニットと、β’サブユニットと、αサブユニット・ダイマーとで構成されており、プロセシングによる転写伸長の後、終結を行なう（Ｈｅｌｍａｎｎ他、１９８８年）。さまざまなσ因子のうちの１つがコアに結合するとホロ酵素が形成される（Ｂｕｒｇｅｓｓ他、１９６９年）。σ因子は、酵素に対し、プロモーター特異的なＤＮＡ結合能力と転写開始能力を与える（Ｈｅｌｍａｎｎ他、１９８８年；Ｂｕｒｇｅｓｓ他、１９６９年；Ｇｒｏｓｓ他、１９９６年；Ｇｒｏｓｓ他、１９９２年）。σ因子のうちで最初に報告され、特性が明らかにされたのは、大腸菌のσ７０だった（Ｂｕｒｇｅｓｓ他、１９６９年）。そのとき以来、多数のσ因子が真正細菌目の中から発見されている。その中には、大腸菌の他の６種類のσ因子が含まれる。それぞれのσ因子は、対応するコグネイト・ホロ酵素に命令し、そのσ因子によって特異的に認識されるＤＮＡ配列を含むプロモーターだけから転写を開始させる。したがって、それぞれのσ因子は、一般に、特定のプロモーター群から転写の開始を命令し、機能が互いに関連した遺伝子群を転写させる。この転写制御の一部は、個々のσ因子がコア酵素と競合することによって起こり、細菌における全体的な遺伝子調節は、主にこの転写制御による（Ｚｈｏｕ他、１９９２年）。
【０００４】
同定されるσ因子の数が増えるにつれ、σ因子同士がアミノ酸配列の似た領域をいくつか共有していることが明らかになってきた（Ｈｅｌｍａｎｎ他、１９８８年；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ他、１９８６年；Ｌｏｎｅｔｔｏ他、１９９２年）。その間、研究者は、保存されている領域の機能に興味を持ち続けてきた（Ｗａｌｄｂｕｒｇｅｒ他、１９９４年；Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ他、１９９３年；Ｓｉｅｇｅｌｅ他、１９８９年；Ｇａｒｄｅｌｌａ他、１９８９年；Ｌｅｓｌｅｙ他、１９８９年）。σ７０の欠失分析により、このタンパク質の重複している保存領域２．１（残基番号３６１−３９０）が、コアとの結合に必要かつ十分であることが明らかにされた（Ｌｅｓｌｅｙ他、１９８９年）。枯草菌のσＥの相同領域における突然変異がコアとの結合に影響を与えることも見いだされた（Ｓｈｕｌｅｒ他、１９９５年）。しかしσ３２の他の保存領域ならびに非保存領域においてコアと結合する突然変異に関する最近の知見をもとに、コア酵素上にはσ因子の結合部位が多数あるという考え方が生まれている（Ｊｏｏ他、１９９７年；Ｚｈｏｕ他、１９９２年；Ｊｏｏ他、１９９８年；Ｓｈａｒｐ他、１９９９年）。
【０００５】
βサブユニットとβ’サブユニットのそれぞれは、真核生物のポリメラーゼの最大の２つのサブユニットと高い配列相同性を有する領域を含んでいる（Ａｌｌｉｓｏｎ他、１９８５年；Ｓｗｅｅｔｓｅｒ他、１９８７年；Ｊｏｋｅｒｓｔ他、１９８９年）。これら保存領域のうちのいくつかは、相互作用ドメインとして機能している可能性がある。相互作用ドメインとは、タンパク質内にあって、他のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リガンドのいずれかと相互作用するのに必要な２次構造および３次構造を形成するために独立に折り畳むことができるという条件を満たす最小の領域のことである。相互作用ドメインは、アミノ酸によって形成されていて結合相手と直接接触する実際の結合部位よりも大きい。セヴェリノフら（Ｓｅｖｅｒｉｎｏｖ他、１９９２年、１９９５年、１９９６年）は、機能を有するＲＮＡポリメラーゼを断片化したβサブユニットとβ’サブユニットから再構成することにより、βサブユニットとβ’サブユニットがドメインに似た特性を持つことを明らかにした。したがって、ポリメーラーぜの特性が生まれるのにサブユニットの全長は必要とせず、それよりも短いドメイン・モジュールがあればよい。
【０００６】
βサブユニットまたはβ’サブユニットに欠失があると、コア酵素は形成できるが、ホロ酵素は形成できないという２つの観察結果が知られている。第１は、Ｃ末端の約２００個のアミノ酸が失われたβサブユニット断片は、グリセロール勾配遠心分離により他のコア・サブユニットとともに移動するが、σ因子を含む分画中には決して見られなかったというものである（Ｇｌａｓｓ他、１９８６年）。第２は、残基番号２０１−４７７のアミノ酸が失われたβ’サブユニット欠失突然変異体を含む再構成されたＲＮＡポリメラーゼを用いて免疫沈降アッセイを行なったところ、コア・サブユニットは同じ分画中に見いだされたが、σ因子は見当たらなかったというものである（Ｌｕｏ他、１９９６年）。しかしβ’サブユニットの欠失が非特異的であるかどうか、例えば相互作用ドメインの正しい形成がβ’サブユニットの欠失によって妨げられるかどうかははっきりしなかった。
【０００７】
βサブユニットのＣ末端とβ’サブユニットのＮ末端が乱れるとσ因子の結合に影響があるという考え方は、実験結果と整合性がある。その実験結果というのは、これら２つのサブユニットの端部は物理的に互いに近い位置にあるためフレキシブルなリンカーを通じて融合することが可能であり、その場合にも機能を有する酵素が形成されるというものである（Ｓｅｖｅｒｉｎｏｖ他、１９９７年）。タンパク質−タンパク質フットプリンティングに関する最近のデータから、β’サブユニット内の似た１つの領域と、βサブユニット内の２つの新しい部位が、σ７０と相互作用することが可能であることが明らかになった（Ｏｗｅｎｓ他、１９９８年）。オーエンスらは、β’サブユニットの残基番号２２８−４６１がσ因子と物理的に近い位置にあることを示したが、彼らは、β’サブユニットとσ因子の間に直接的な相互作用があるという結論は出さなかった。
【０００８】
バージスら（１９９８年）は、インビトロでのファー−ウエスタン・アッセイおよび同時固定化（ｃｏ−ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）アッセイに基づき、β’サブユニットの残基番号２６０〜３０９がσ因子と結合することを報告している。しかし無細胞系で結合させた結果によれば、インビトロで結合に関与する領域がインビボでも結合に関与することは明らかでない。例えば、β’サブユニットのこの領域（例えば疎水性領域）は天然の構造では隠れていて、インビボでは結合に関与しない可能性がある。構造分析プログラムによれば、β’サブユニットの残基番号２６０〜３０９は、ランダム・コイルによって結合した２つのαヘリックスを有すること、また、これら２つのヘリックスは両親媒性であり、７個からなる繰り返しモチーフに基づいたコイルドコイルを形成している可能性のあることが示唆される（Ｃｈａｏ他、１９９８年；Ｃｏｈｅｎ他、１９８６年；Ｌｕｐａｓ他、１９９１年）。中でも、コイルドコイルのモチーフ内にあるａおよびｄという特定の位置は疎水性であるため、天然のβ’サブユニットでは隠れている可能性がある。
【０００９】
そのため、必要とされているのは、コアＲＮＡポリメラーゼのサブユニット内にあって、インビボでσ因子と相互作用する領域を同定することである。また、σ因子がコアＲＮＡポリメラーゼに結合するのを妨げる特異的な抑制剤の同定方法も必要とされている。
【００１０】
発明の要約
本発明は、ＲＮＡポリメラーゼの単離・精製されたβ’サブユニットまたはその一部（すなわち断片）のうち、インビボでσ因子と特異的に結合するβ’サブユニットまたはその断片を提供する。この断片は、β’サブユニットを構成する残基の少なくとも３９個を含んでいることが好ましく、より好ましいのは少なくとも４４個を含んでいることであり、さらに好ましいのは少なくとも４９個含んでいることである。しかし、インビボでσ因子と特異的に結合するこれよりも小さな断片も可能である。また、β’サブユニットの単離・精製されたこの断片は、残基番号２７０〜３０９を含んでいることが好ましく、さらに好ましいのは残基番号２６０〜３０９を含んでいることである。以下に説明するように、ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニット内にあってσ因子と直接相互作用する領域（相互作用ドメイン）を同定した。β’サブユニット内にあってσ因子とインビトロで相互作用する相互作用ドメインは、ファー−ウエスタン・ブロット分析と同時固定化アッセイにより同定した。ファー−ウエスタン・ブロット分析は、１つのタンパク質上で、別のタンパク質と結合するのに必要なドメインの位置を特定する一般的な方法の１つである。
【００１１】
この明細書で用いる“相互作用ドメイン”は、タンパク質内にあって、他のタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リガンドのいずれかと相互作用するのに必要な２次構造および３次構造を形成するために独立に折り畳むことができるという条件を満たす最小の領域のことを意味する。β’サブユニット上でσ因子が結合する領域は、σ７０を始めとする大腸菌のσ因子群、Ｔ４ファージのσｇｐ５５、枯草菌のσＡなど、さまざまなσ因子と相互作用することがわかった。
【００１２】
やはり以下に説明することだが、β’サブユニットの残基番号２６０〜３０９に位置することが予測されるコイルドコイル内に点突然変異を有するタンパク質を調製した。これら突然変異体のうちのいくつかは、インビトロでσ７０と結合できなかった。これら突然変異体のうち、３つ（Ｒ２７５Ｑ、Ｅ２９５Ｋ、Ａ３０２Ｄであり、これらは、コイルドコイルとなることが予測されるβ’２６０−３０９のｅ残基とｇ残基の位置において電荷が変化した突然変異体である）は、突然変異したβ’サブユニットだけがβ’サブユニット源であるインビボ・アッセイでまったく成長できなかった。すべての突然変異体をコア酵素に組み込むことができたが、Ｒ２７５Ｑ、Ｅ２９５Ｋ、Ａ３０２Ｄは、Ｅσ７０−ホロ酵素を形成できなかった。突然変異体のうちのいくつかは、マイナーなさまざまなσ因子とホロ酵素を形成することがやはりできなかった。いくつかの突然変異は、あるアッセイでは機能しなかったが、別のアッセイでは機能した。これは、β’２６０−３０９の部位における結合がないことを、他の部位が結合することで補償した可能性のあることを示唆している。したがって、これらの結果は、β’サブユニットの残基番号２６０〜３０９がインビボでσ因子と特異的に結合すること、また、この領域における突然変異が、σ７０その他のマイナーなσ因子とコアの結合を顕著に減らす可能性のあることを示していた。最近発表された好熱菌テルムス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）のコアＲＮＡポリメラーゼの結晶構造（Ｚｈａｎｇ他、１９９９年）によれば、大腸菌のβ’２６０−３０９と相同な領域は、コイルドコイルを形成している。この明細書で説明するβ’サブユニットの突然変異をこのコイルドコイルと照らし合わせてみると、最も欠陥のある突然変異はヘリックスの一方の面に位置していることがわかる。これは、σ７０との接触面がたいていの場合にどこになるかを示唆している可能性がある。ＲＮＡポリメラーゼは多数のサブユニットを有する大きな複合体（約３３００個のアミノ酸）であり、ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットは大きなタンパク質（例えば大腸菌のβ’サブユニットは約１５５，０００ダルトン）であるため、コアＲＮＡポリメラーゼ内の領域のうちでσ因子とインビボで特異的に相互作用する領域を同定することは、非常に意味がある。というのも、その領域が、薬剤（例えばコアとσ因子の相互作用を特異的に妨げる薬剤）を発見するための特別な標的となるからである。
【００１３】
そこで本発明は、σ因子が、コアＲＮＡポリメラーゼ、そのサブユニット、そのサブユニットの一部のいずれかと結合するのを抑制または阻止する薬剤の同定方法を提供する。この方法は、薬剤をコアＲＮＡポリメラーゼ（例えば単離されたコアＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼの単離されたサブユニット、そのサブユニットの一部）に接触させて複合体を形成する操作を含んでいる。この明細書で用いる“単離および／または精製された”は、タンパク質または生体分子の複合体（例えばコアＲＮＡポリメラーゼ）をインビトロで調製し、単離および／または精製して、インビボの物質と会合しないようにすること、またはインビトロの物質から実質的に精製された状態にすることを意味する。サブユニットの上記一部は、β’サブユニットを構成する残基の少なくとも３９個を含んでいることが好ましく、より好ましいのは少なくとも４４個を含んでいることであり、さらに好ましいのは少なくとも４９個を含んでいることである。次に、複合体をσ因子またはその一部に接触させ、σ因子がコアＲＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡポリメラーゼの単離されたサブユニット、またはそのサブユニットの一部と結合するのを薬剤が抑制または阻止するかどうかを確認する。σ因子の一部は、σ因子を構成する残基の少なくとも３０個、好ましくは少なくとも５５個、より好ましくは少なくとも１００個、さらに好ましくは少なくとも１４０個を含んでいる。しかしインビボでβ’サブユニットと特異的に結合するこれよりも小さな断片も可能である。薬剤は、コアＲＮＡポリメラーゼ、そのサブユニットおよび／またはその一部、σ因子またはその一部と同時に接触させることもできる。σ因子は、同種σ因子が可能である。例えばコアＲＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼの単離されたサブユニットが大腸菌のものであるならば、σ因子は大腸菌のゲノムによってコードされたσ因子にする。また、σ因子を異種σ因子にすることもできる。それは例えば、ファージによってコードされたσ因子である。
【００１４】
薬剤を、単離されたσ因子またはその一部に接触させて複合体を形成する操作を含む方法がさらに提供される。この複合体は、次に、単離されたコアＲＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡポリメラーゼの単離されたサブユニット、またはそのサブユニットの一部と接触させ、σ因子がコアＲＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡポリメラーゼの単離されたサブユニット、またはそのサブユニットの一部と結合するのを薬剤が抑制または阻止するかどうかを確認する。
【００１５】
細菌における新しい転写抑制剤を見つけるため、蛍光標識したタンパク質σ７０とβ’サブユニットの断片（残基番号１００〜３０９）をもとにして、単色ルミネッセンス共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）に基づいたアッセイを開発した。アッセイを行なうため、ＬＲＥＴのドナーとしてのユーロピウム・キレート（Ｅｕ（ＩＩＩ）−ＤＴＰＡ−ＡＭＣＡ−マレイミド）でσ７０を標識し、アクセプターとしてのＩＣ５−マレイミドでβ’サブユニットを標識した。標識したタンパク質を用いて時間分解された蛍光を測定するにあたってＬＲＥＴアクセプター（ＩＣ５で標識したβ’サブユニットの断片）の発光を観測することにより、β’サブユニットに対するσ７０の結合を調べることができた。アクセプターの発光は、色素が互いに近づく（＜７５オングストローム）ときにＬＲＥＴドナー（ＤＴＰＡ−ＡＭＣＡ−Ｅｕ−複合体で標識したσ７０）からエネルギーが移動することによって増感される。ＩＣ５からの蛍光はもともと寿命が数ナノ秒と短いため、５０マイクロ秒後に得られる残留蛍光はＬＲＥＴだけによるものであり、そのためバックグラウンドの信号が最低になり、したがって信号対雑音比がよくなる。このアッセイを利用して、環境（溶媒、変性剤、塩）の影響を測定した。またこのアッセイは、σ７０がβ’サブユニットの断片に結合するのを妨げる可能性のある抑制剤候補の効果を測定するのに用いることもできる。このようなアッセイは、ハイスループット・スクリーニングに特に適している。
【００１６】
コアＲＮＡポリメラーゼのサブユニット上でσ因子と特異的に結合する領域を同定する方法も提供される。この方法は、コアＲＮＡポリメラーゼ（例えば単離されたコアＲＮＡポリメラーゼ、またはＲＮＡポリメラーゼの単離されたサブユニット、またはそのサブユニットの一部）をσ因子またはその一部に接触させ、複合体を形成する操作を含んでいる。コアＲＮＡポリメラーゼ、または単離されたサブユニット、またはそのサブユニットの一部は、置換されたアミノ酸を少なくとも１つ含んでいる。次に、この複合体の形成を検出または確認し、例えば、置換されたアミノ酸を含まないコアＲＮＡポリメラーゼ、または単離されたサブユニット、またはそのサブユニットの一部と、σ因子またはその一部との間の複合体形成と比較する。
【００１７】
本発明はさらに、コアＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットに対するσ因子の結合を抑制または阻止する薬剤の同定方法も提供する。この方法は、原核細胞を薬剤と接触させ、この細胞内でこの薬剤が、ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットに対するσ因子の結合を抑制または阻止しているかどうかを検出または確認する操作を含んでいる。細胞としては、組み換え細胞、すなわち、外部から例えば形質転換または形質導入によって核酸を導入することによって増強した細胞が可能である。したがって本発明により、ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットをコードしている組み換えＤＮＡを含む宿主細胞も提供される。
【００１８】
本発明はさらに、本発明の方法によって同定される薬剤、中でも病気と関係する原核細胞（例えば『ズィンサーの微生物学』（第１７版、アップルトン−センチュリー−クロフツ社、ニューヨーク、１９８０年）を参照のこと）の成長を抑制する薬剤も提供する。
【００１９】
発明の詳細な説明
細菌のＲＮＡポリメラーゼは、細胞遺伝子からＲＮＡを合成しているため、遺伝子の発現調節において中心的な役割を果たす。コアＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡを合成できるが、ＤＮＡをプロモーター部位に特異的に結合させることはできない。ＤＮＡを特異的に結合させて遺伝子の転写を開始させるため、σ因子をコアに結合させてホロ酵素を形成する。σ因子がコアＲＮＡポリメラーゼと結合するのを阻止する薬剤は、細胞の成長を阻止することになろう。インビトロでの方法（実施例２と、Ｂｕｒｇｅｓｓ他、１９９８年）により、σ因子が結合するのに重要な、コアＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットに含まれるアミノ酸４９個からなる領域が同定された。この領域は、細菌のポリメラーゼにおいて非常によく保存されている。しかしこの領域がインビボでσ因子の結合にとって重要であることを明確にするには、突然変異を用いた研究が必要であった（実施例３）。インビボでσ因子が結合するコアＲＮＡポリメラーゼの領域が同定されると、その結合を特異的に妨げる多彩な抗生物質（例えばペプチドその他の小分子）の同定が非常に容易になる。
本発明を以下の実施例に基づいてさらに説明するが、実施例がこれだけに限定されるわけではない。
【００２０】
実施例１
ファー−ウエスタン・ブロット・マッピング
ＳＤＳゲルから物質をニトロセルロース膜に移動させる（ブロッティング）というのが、広く用いられている方法になっている。この方法は、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動が高分解能であることを利用できるという利点だけでなく、ブロットされた標的物質にさまざまな相互作用プローブを用いてアクセスできるという利点を有する。ウエスタン・ブロット法では、一般に抗体を用いて調べたり検出したりするが、サウスウエスタン・ブロット法では、標識したＤＮＡを用いて調べる。ファー−ウエスタン・ブロット法では、抗体の代わりに別のタンパク質を用い、特異的なタンパク質−タンパク質相互作用を利用して調べる。この方法では、ブロットされた標的タンパク質の断片の少なくともある領域（相互作用ドメイン）が膜上で再度折り畳まれ、相互作用部位を含む三次元構造を形成できる必要がある。この方法は、多数のサブユニットからなる複合体のどのサブユニットがプローブのタンパク質との相互作用に関与するかを明らかにする上で、特に有効である。
【００２１】
整列断片ラダー・ファー−ウエスタン分析は、タグ（例えばヘキサヒスチジン・タグ（Ｈｉｓ６−タグ））をいずれかの末端部に有するハイブリッド・タンパク質を構成するのが容易であるという利点を活用している。ヘキサヒスチジン・タグが付いたタンパク質は、たとえ変性剤が存在していても、Ｎｉキレート・カラムと結合する。この方法は、タンパク質−タンパク質相互作用に関するあらゆる研究に適用できる可能性がある。ヘキサヒスチジン・タグを用いたこの方法の原理を図１に示す。
【００２２】
整列断片ラダー・ファー−ウエスタン分析には以下の操作が含まれる。
Ａ．興味の対象となるタンパク質に対してヘキサヒスチジン・タグがＮ末端またはＣ末端に融合したものをクローニングして精製する操作；
Ｂ．ヘキサヒスチジン・タグが付いたこのタンパク質の一部を化学的に切断することによって、または酵素を用いて切断することによって一連の断片を得る操作；
Ｃ．ヘキサヒスチジン・タグが付いた断片を変性条件下にてＮｉ−キレート・アフィニティ・カラムで精製し、どれにもヘキサヒスチジン・タグが付いた断片群を得る操作；
【００２３】
Ｄ．ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動によりこれら断片をサイズに基づいて分画し、整列断片ラダーを形成する操作；
Ｅ．タンパク質の断片群をゲルからニトロセルロース膜に移し、タンパク質のこれら断片群が膜上で再び折り畳まれるようにする操作；
Ｆ．３２Ｐで標識したタンパク質プローブを調製する操作（例えば心筋プロテインキナーゼ（ＨＭＫ）認識部位タグを付けたタンパク質に、γ３２Ｐ−ＡＴＰと心筋プロテインキナーゼで標識する）；
Ｇ．膜をこの標識したプローブで調べ、洗浄し、検出を行なう操作；
Ｈ．ファー−ウエスタン複合体を確認し、その特性を明らかにする操作。
【００２４】
Ａ．ヘキサヒスチジン・タグが付いたタンパク質のクローニングと精製
標準的なクローニング法を利用して興味の対象であるタンパク質を過剰発現ベクターに組み込み、このタンパク質のＮ末端またはＣ末端にヘキサヒスチジン・タグを付ける。さまざまなベクターが利用できる。例えばｐＥＴベクター（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、１９９０年）はＴ７ポリメラーゼをベースとした発現系であり、ノヴァジェン社（マディソン、ウィスコンシン州）から入手できる。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて適切な過剰発現菌株を誘導し、細胞を溶解させ、封入体を調製する（ＡｒｔｈｕｒとＢｕｒｇｅｓｓ、１９９８年）。再分散した封入体は１ｍｇずつのアリコートに分け、使用するときまで−７０℃に凍結する。
【００２５】
Ｂ．タンパク質の化学的切断および酵素による切断
過剰に産生されたヘキサヒスチジン・タグ付き標的タンパク質が化学的に切断される部位と酵素により切断される部位を予測するには、タンパク質の切断部位を予測するコンピュータ・プログラムに標的タンパク質のアミノ酸配列を入力するとよい（例えばそのようなプログラムとして、マックベクターまたはＤＮＡスターというパッケージがある）。予測される切断パターンに基づき、１つ以上の切断プロトコルを選択する。大腸菌ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットにおいて２種類の化学的切断剤に対して予測される切断部位の一例を図２Ａに示してある。
【００２６】
切断プロトコル
以下に説明する条件は一例であり、切断が特に容易だったり困難だったりするタンパク質に対しては、切断時間や切断剤の量を変えることによって条件をそのタンパク質に合うようにすることができる。切断条件は、断片の分布ができるだけ均一になるような条件であることが好ましい。これは、切断されないポリペプチドが１０〜３０％残る反応であることがしばしばある。
【００２７】
ヨードソ安息香酸による切断（Ｆｏｎｔａｎａ他、１９９３年）（トリプトファンの後ろで切断）
１）タンパク質１ｍｇを８ＭのＧｕＨＣｌ ２００μｌに溶かす。
２）１００％酢酸を８００μｌ、ｐ−クレゾールを３μｌ、ヨードソ安息香酸（ＩＢＡ；シグマ・カタログ＃Ｉ＝８０００）を２ｍｇ添加する。
３）室温で２０時間にわたってインキュベートする。
４）急激に真空にして乾燥させる（約１時間）。
５）１ｍｌの尿素緩衝液（緩衝液Ｂ＋８Ｍの尿素；緩衝液Ｂは、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９；５００ｍＭのＮａＣｌ；５ｍＭのイミダゾール（フィッシャー・カタログ＃ＢＰ３０５−５０）；０．１％（ｖ／ｖ）のトゥイーン２０；１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール）に再び分散させる。
６）Ｎｉ−カラムに充填する。
【００２８】
２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）による切断（Ｊａｃｏｂｓｏｎ他、１９７３年）（システインの前で切断）
１）タンパク質１ｍｇを、グリセロールなしの尿素緩衝液１ｍｌに溶かす。
２）作ったばかりのジチオトレイトール（ＤＴＴ）（１Ｍのストック）を、モル数が（タンパク質中のシステインと比べて）５倍過剰になるようにして添加する。
３）３７℃で１５分間インキュベートし、二硫化物を還元する。
４）（全システインと比べて）５倍過剰な量のＮＴＣＢ（シグマ・カタログ＃Ｎ＝７００９）を添加し、ＮａＯＨを用いてｐＨを９．５に調節する。
５）室温で２〜６時間にわたってインキュベートして部分的に切断するか、あるいは２４〜３０時間にわたってインキュベートして完全に切断する。
６）尿素緩衝液中に１：１０の割合になるよう希釈し、Ｎｉ−カラムに充填する。
【００２９】
ヒドロキシルアミンによる切断（ＢｏｒｎｓｔｅｉｎとＢｏｌｉａｎ、１９７０年）（アスパラギンとグリシンの間で切断）
１）タンパク質１ｍｇを尿素緩衝液１ｍｌに溶かす。
２）３７℃で１５分間にわたってインキュベートする。
３）タンパク質を溶かした尿素５００μｌにヒドロキシルアミン緩衝液５００μｌ（４００ｍＭのＣＨＥＳ緩衝液、ｐＨ９．５；４Ｍのヒドロキシルアミン−ヒドロクロリド（アルドリッチ・カタログ番号１５，９４１−７）；１０ＭのＮａＯＨを用いてｐＨを９．５に調節する）を添加し、４２℃で２時間にわたってインキュベートする。
４）２−メルカプトエタノール７μｌを添加し（０．１Ｍまで）、混合し、３７℃で１５分間にわたってインキュベートする。
５）尿素緩衝液中に１：１０になるように希釈し、Ｎｉ−カラムに充填する。
【００３０】
サーモリシンによる切断（Ｒａｏ他、１９９６年）（疎水性アミノ酸の前で切断）
１）１ｍｇの封入体タンパク質を１００μｌの尿素緩衝液の中に再び分散させる。
２）３７℃で１５分間にわたってインキュベートする。
３）サーモリシン（バチルス・テルモプロテオリティクスからのもの、ベーリンガー・マンハイム社）をタンパク質に添加する：プロテアーゼの比は、４，０００：１、８，０００：１、１６，０００：１（ｗ／ｗ）。
４）室温で３０分間消化させる。
５）Ｎｉ−カラムに充填する。
【００３１】
トリプシンによる切断（Ｒａｏ他、１９９６年）（アルギニンおよびリシンの後ろで切断）
１）１ｍｇの封入体タンパク質を１ｍｌの尿素緩衝液の中に再び分散させる。
２）３７℃で１５分間にわたってインキュベートする。
３）緩衝液Ｂを同じ容積添加することにより希釈して４Ｍの尿素にする。
４）トリプシンをタンパク質に添加する（ＴＰＣＫ処理したもの、ワーシントン・バイオケミカルズ社）：プロテアーゼの比は、４，０００：１、８，０００：１、１６，０００：１（ｗ／ｗ）。
５）室温で３０分間消化させる。
６）Ｎｉ−カラムに充填する。
【００３２】
化学的切断によるラダーは、断片の正確なサイズを決定するのに非常に役立つ。というのも、切断がどこで起こるかが正確にわかるからである。多くのタンパク質がＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動の際に異常な移動をするため、これは特に重要である。
【００３３】
たいていの化学的切断剤はポリペプチド鎖１本につき数箇所の切断しか行なわないため、化学的切断によって生まれる整列断片ラダーは、ラダーにほんのいくつかの“横棒”しか持っていない。したがって、１つ以上のプロテアーゼを用いて部分的切断を行なうことによってより多くの横棒を有するラダーを生み出すと、相互作用ドメインをより高精度にマッピングすることができる。わずかな切断が起こる反応、中程度の量の切断が起こる反応、多数の切断が起こる反応を、所定のプロテアーゼを用いて行なわせることができる。その結果得られる切断反応物を混合する前に、または混合した後に、Ｎｉ−キレート・カラムで精製する。これは、それぞれのサイズの断片を同じくらいの量含むラダーを得るのに役立つ。  部分的切断法ではよいラダーを得るのが難しいことが時々ある。その理由として、化学的切断部位の分布が少なかったり不均一だったりすること、またはタンパク質が加水分解に対して比較的抵抗力を持つことが挙げられる。これらのケースでは、端部が切断された個々の断片をクローニングすることによってラダーを作ることもできる。
【００３４】
Ｃ．Ｎｉ−キレート・カラムによるヘキサヒスチジン・タグ付き断片の精製
手順
１）Ｎｉ２＋−ＮＴＡ樹脂（Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロース、キアジェン社）のスラリーをバイオラド・ミニ・カラムに充填し、３００μｌのカラム床を作る。
２）５カラム分の容積のミリキュー（ＭｉｌｌｉＱ）水を用いて洗浄する。カラムに関わるすべての操作は室温で行なう。
３）５カラム分の容積の尿素緩衝液を用いて洗浄する。
４）切断反応物（上の説明を参照のこと）を充填し、ドレーンが樹脂の頂部に来るようにする。
５）１０カラム分の容積の尿素緩衝液を用いて洗浄し、ヒスチジン・タグの付いていない断片を除去する。
６）１０カラム分の容積の緩衝液Ｂを用いて洗浄し、尿素を除去する。
７）２００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ｂを５００μｌ用いて溶離させる。
８）ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより切断の程度を調べる。
９）断片を５０μｌのアリコートにして−２０℃で凍らせ、保存する。
【００３５】
Ｎｉ−キレート・カラムを用いて精製すると、ヒスチジン・タグ付きのタンパク質または断片は、８Ｍの尿素または６ＭのＧｕＨＣｌの存在下でさえ、Ｎｉ２＋−ＮＴＡカラムと結合できる。変性剤を含む溶液を用いて洗浄すると、疎水性タンパク質断片同士の相互作用が妨げられ、ヒスチジン・タグ付きの断片だけが精製されることが保証される。
【００３６】
整列した断片群が得られると、その断片群は、−２０℃または−７０℃で１年以上の期間にわたって保存することができる。そしてモノクローナル抗体または相互作用するタンパク質との結合をマッピングする必要があるとき、その断片群を使用する。
【００３７】
Ｄ．ゲル電気泳動
標準的なＳＤＳポリアクリルアミド・ゲル電気泳動の手順を利用する。着色したＭＷマーカー（例えば、ノヴェックス・マルチマーク・マルチカラー基準）は、ニトロセルロースへの移動が効果的に行なわれたかどうかを確認することと、いくつかの異なる放射性プローブまたは抗体で調べる場合にニトロセルロース・フィルタを切断することに役立つ可能性がある。８〜１６％の勾配のポリアクリルアミドをあらかじめ注いだトリス−グリシン・ゲル（ノヴェックス社）は、大きなポリペプチド（例えば、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニット）と、それよりも小さな断片（例えば部分的タンパク質分解による断片）の両方を同じゲル上で見えるようにするのに役立つ。
【００３８】
Ｅ．ＳＤＳゲルからニトロセルロース膜へのタンパク質断片の移動
ＳＤＳゲル電気泳動によって単離されたタンパク質またはペプチドは、以下に説明するようにして電気泳動によってニトロセルロース膜に移動させた後、ウエスタン分析またはファー−ウエスタン分析を行なう。
手順
１）１枚のニトロセルロースと２枚のホワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）紙（３ＭＭクロマトグラフィ紙、フィッシャー・カタログ＃０５−７１４−５）を、ゲルよりもわずかに大きなサイズに切断する。
２）スポンジ１個とホワットマン紙１枚を、タウビン緩衝液（ＴＢ）（Ｔｏｗｂｉｎ他、１９７９年）（２ｌ〜４００ｍｌのメタノール（最終濃度２０％）に対し；５００ｍｌの４×トリス−グリシン（１×最終；１ｌの４×トリス−グリシン、ｐＨ８．５に対し、５７．６ｇのグリシンと１２．０ｇのトリス塩基）；１０ｍｌの１０％ＳＤＳ（最終濃度０．０５％））であらかじめ濡らしておく。
３）ホワットマン紙をスポンジの上に置き、次いでゲルをホワットマン紙の上に置く。
４）ニトロセルロース（シュライヒャー＆シュエル・プロトラン０．０５μｍ、カタログ＃００８７０）を濡らしてゲルの上に置き（泡がゲルとニトロセルロースの間に入らないようにする）、その上に濡らしたホワットマン紙１枚とスポンジ２個を置く。
【００３９】
５）得られたサンドイッチ構造物をかごの中に入れ、そのかごを移動ボックスの中に入れる。そのとき、ニトロセルロース膜をプラス端子の方向に向けておく。
６）移動ボックスにＴＢを満たし、３時間にわたって２００ｍＡの定電流を流す（約６０ボルト）。
７）ニトロセルロース膜を取り出し、タンパク質の側を上にしてペトリ皿の中に置き、ブロットー（Ｂｌｏｔｔｏ：ＴＢＳＴ中に２％（ｗ／ｖ）のカーネーション脱脂粉乳；ＴＢＳＴ１ｌに対し、１Ｍのトリス−ＨＣｌを１０ｍｌ、ｐＨ７．９（最終濃度１０ｍＭ）；４ＭのＮａＣｌを３７．５ｍｌ（最終濃度１５０ｍＭ）；トゥイーン２０を１ｍｌ（最終濃度０．１％））を１０〜２５ｍｌ添加してブロットが覆われるようにし、室温で振動させながら１〜２時間にわたって、または４℃で一晩にわたって膜の反応を停止させる。
【００４０】
８）ウエスタン分析を行なうため：室温で約３０秒間にわたってＴＢＳＴで１回洗浄し；１：１０００に希釈した一次抗体を含む１０ｍｌのブロットーの中で室温にて１時間にわたってインキュベートし；１０ｍｌのＴＢＳＴで５分間ずつ３回にわたって洗浄し；セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）と結合した二次抗体を１：１０００に希釈したものを含む１０ｍｌのブロットーの中で室温にて１時間にわたってインキュベートし；１０ｍｌのＴＢＳＴで５分間ずつ３回にわたって洗浄し；適切な比色剤または化学発光検出剤を用いて現像する。
９）ファー−ウエスタン分析を行なうため：以下のセクションＧに記載した操作を行なう。
【００４１】
Ｆ．ファー−ウエスタン分析のための、プロテインキナーゼＡを用いた３２Ｐ標識タンパク質
クローニングされたタンパク質の端部に、心筋からのｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼＡ（ＲＲＡＳＶ）の触媒サブユニットに対する５アミノ酸認識部位が結合している場合には、このタンパク質は、γ３２Ｐ−ＡＴＰおよびプロテインキナーゼＡと反応させることにより容易に標識することができる（Ｌｉ他、１９８９年；Ｂｌａｎａｒ他、１９９２年；Ｄｅｓｔｋａ他、１９９９年）。ｐＥＴベクターであるｐＥＴ−２８ｂ（＋）（ノヴァジェン社）をベースとしたクローニング・ベクターを調製した。このｐＥＴ−２８ｂ（＋）はＨＭＫ認識部位を含んでおり、クローニングされたタンパク質のＮ末端に２５個のアミノ酸を付加する（ｄｅＡｒｒｕｄａとＢｕｒｇｅｓｓ、１９９６年）。このクローニング・ベクターは、ノヴァジェン社からｐＥＴ−３３ｂ（＋）として入手できる。ＨＭＫ部位がタグとして付いたタンパク質プローブを作るため、別のベクターもいくつか用意した。これらベクターは、プローブ用タンパク質のＮ末端にあるメチオニンをＮ末端のＨＭＫ−ヘキサヒスチジン・タグと融合させて抗生物質耐性マーカーであるｋａｎＲとａｍｐＲのいずれかを選択するＮｄｅＩクローニング部位またはＮｃｏＩクローニング部位を含んでいる。これらベクターに関するデータを以下の表１にまとめておく。
【００４２】
【表１】
2004500122.tif 000003
【００４３】
ＨＭＫ認識部位がタグとして付いたプローブ用タンパク質の調製
上に説明したベクターのうちの適切な１つのベクターの中にクローニングして入れたプローブ用タンパク質を含む大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、１９９０年）を培養し、誘導し、アーサーとバージス（１９９８年）が記載している方法で封入体を精製した。洗浄した封入体は、ＧｕＨＣｌまたは洗浄剤であるナトリウム−Ｎ−ラウロイル・サルコシン（サルコシル）を用いて溶解させ、バージス（１９９６年）とマーシャク他（１９９６年）が記載しているようにして再び折り畳ませることができる。洗浄した封入体は、８Ｍの尿素を用いて溶解させ、Ｎｉ−キレート・カラムでアフィニティ・クロマトグラフィによって精製する前または精製した後に、再び折り畳ませることがしばしばある（Ｂｕｒｇｅｓｓ他、１９９８年）。
【００４４】
手順
１）１．５ｍｌのマイクロ遠心管に、５μｌの１０×プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）緩衝液（ノヴァジェン社のＰｋａｓｅキット、カタログ＃７０５１０−３）（２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０；１．５ＭのＮａＣｌ；２００ｍＭのＭｇＣｌ２；１００μＭのＡＴＰ）を入れる。
２）標識するタンパク質（５０％グリコール中に保存することがしばしばある）を２０〜４０μｇ（約５００ピコモル）添加し、ミリキュー水を用いて全容積を４３μｌにする。グリセロールの最終濃度は２０〜２５％となっている必要がある。
３）５μｌのＰＫＡ（ノヴァジェン社；２０Ｕ／μｌのストック）と２μｌのγ３２Ｐ−ＡＴＰ（ＮＥＮ／デュポン社、６００Ｃｉ／ミリモル、５ｍＣｉ／３３μｌ；３００μＣｉ＝６．６×１０８ｄｍｐ）を添加し、混合し、室温で６０分間にわたってインキュベートする。
４）５０μｌの１×標識用緩衝液（１×ＬＢ）（２５％のグリセロール；４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；１００ｍＭのＮａＣｌ；１２ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＤＴＴ（新鮮なものを添加））を添加して反応させ、得られた反応物を希釈したもの１００μｌを、洗浄したスピン・カラム（バイオラド社のバイオスピンＰ６）に添加し、１０００×ｇで４分間にわたって回転させる。使用する直前に、カラムを撹拌して樹脂を再び分散させ、カラムの底を取り除いてカラムから排水されるようにする。１ｍｌの１×ＬＢを添加し、それが重力によって流れ出していくようにする。ベックマンＴＪ−６遠心分離機（ＴＨ−４スウィンギング・バケット・ローター）の中で、５０ｍｌの円錐形プラスチック管を１０００×ｇで室温にて２分間にわたって回転させ、流出液を捨てる。
５）流出液をマイクロ遠心管に回収する。
６）標識したプローブを−２０℃に凍らせ、使用するときまで保存する。３０日間保存しておくことができる。
【００４５】
標識の約３０〜５０％がタンパク質に組み込まれ、スピン・カラムでの処理後は標識の約９０％がタンパク質の中にある。５０μｌの反応物中でＨＭＫ−σ７０を３５μｇ標識するという典型例では、約１〜４×１０６ｃｐｍ／μｇとなる。上記のプロトコルにより、約１００μｌの材料が得られる。これだけの量あると、１０〜２０のファー−ウエスタン・ブロットを調べることができる。また、γ３３Ｐ−ＡＴＰで標識することもできる（ｄｅＡｒｒｕｄａとＢｕｒｇｅｓｓ、１９９６年）。こうすると比活性は低下し、したがって検出の感度も低下するが、標識したプローブの半減期がより長くなり、その結果、画像にしたときにより鋭いバンドが得られる。
【００４６】
Ｇ．３２Ｐで標識したタンパク質を用いたファー−ウエスタン・ブロットの検査
手順
１）タンパク質または断片を、ゲルまたはスポット状タンパク質からニトロセルロース膜に移動させる。
２）プローブ用緩衝液（ＰｒｏＢ；最終的に、ミリキュー水の中に、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２；２００ｍＭのＫＣｌ；２ｍＭのＭｇＣｌ２−６Ｈ２Ｏ；０．１ｍＭのＺｎＣｌ２；１ｍＭのＤＴＴ；０．５％のトゥイーン２０；１％の脱脂粉乳；１０％のグリセロールを含む）の中で振動させながら室温にて２時間（あるいは４℃で一晩）にわたってこの膜の反応を停止させる。
３）標識したプローブ（３２Ｐで標識したタンパク質）の溶液５〜１０μｌを１５ｍｌのＰｒｏＢに添加し、膜とともに室温で振動させながら２時間にわたってインキュベートする。
４）膜を１０ｍｌのＰｒｏＢを用いて３分間ずつ３回にわたって洗浄する。
５）膜を空気中で乾燥させ（約１５分間）、サランラップで包み、フィルムまたはフォスファーイメージャー・スクリーン（モレキュラー・ダイナミックス社）に曝露する。
【００４７】
Ｎ末端とＣ末端の両方にヘキサヒスチジン・タグを有する標的タンパク質の整列断片ラダーを生成させることができる場合には、この方法のほうが強力である。このようにして、両側から相互作用ドメインをマッピングすることができる。図２Ｂには、予想される断片パターンと、クーマシー・ブルー染色したＳＤＳゲルが示してある。整列断片ラダーについてのこのＳＤＳゲルは、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニットにおいてＮ末端（Ｎ）とＣ末端（Ｃ）の両方にヘキサヒスチジン・タグを付けたものをヒドロキシルアミン（ＮＨ２ＯＨ）またはＮＴＣＢを用いて切断して得られた。図２Ｂの右側には、同じゲルを３２Ｐで標識したσ７０で調べたファー−ウエスタン分析の結果を示してある（実施例２を参照のこと）。
【００４８】
整列断片ラダー・ファー−ウエスタン分析では、ブロットされた断片バンド中の分子の少なくとも一部が、三次元の相互作用面または相互作用部位を作り出すのに必要なポリペプチドの少なくとも一部（相互作用ドメイン）を再び折り畳めるようになっていなくてはならない。ブロットされた標的タンパク質を変性させた後に再生させて調べると、折り畳みが増加し、したがってファー−ウエスタン分析の感度が向上することが、多数の論文に報告されている（ＬｉｅｂｅｒｍａｎとＢｅｒｋ、１９９１年；Ｖｉｎｓｏｎ他、１９８８年）。おそらく、ブロットされたタンパク質とともに移動したＳＤＳが（プローブ用緩衝液中にはるかに過剰に存在しているカゼインと結合することによって）除去され、標的タンパク質が膜上で少なくとも部分的に再び折り畳めるようになるのであろう。
【００４９】
ニトロセルロースの孔のサイズは０．０５μｍよりも大きくすることができるが、０．０５μｍのほうが小さなタンパク質断片をよりよく保持できる。
標識した何種類かのプローブは、着色したＭＷマーカーに非特異的に結合する。それは、ヘキサヒスチジン・タグまたはＨＭＫタグと、マーカーに付着している色素との間の相互作用による可能性が最も大きい。しかしこれは、得られたデータの方向づけをするのに有効な標識付きマーカー群となる。
【００５０】
Ｈ．ファー−ウエスタン複合体の確認と特性決定
有望なシグナルがファー−ウエスタン分析で検出された場合、観測された結合が、問題にしている特異的な相互作用によるものであり、単なる非特異的なイオン性または疎水性の相互作用ではないことを示す追加の証拠が必要となろう。そのための方法として挙げられるのは、同時固定化アッセイ（実施例２；ＡｒｔｈｕｒとＢｕｒｇｅｓｓ、１９９８年；Ｂｕｒｇｅｓｓ他、１９９８年）、相互作用ドメインの位置指定突然変異誘発（実施例３）などである。同時固定化アッセイは、予想される相互作用ドメインをクローニングしてベクターに入れ（このベクターが、この相互作用ドメインをヘキサヒスチジン・タグと結合させる）、得られたタンパク質をＮｉ−キレート・カラムに移す操作を含んでいる。固定化された標的ドメインに（ヘキサヒスチジン・タグのない）プローブが結合し、この標的ドメインがイミダゾールで溶離するときにこのプローブがカラムから溶離する場合には、２つのタンパク質が相互作用していると推定することができる。より小さな標的ドメインを同時固定化アッセイで観測することができる。こうしたことが可能なのは、おそらく、再び折り畳まれた標的ドメインが端部のヘキサヒスチジン・タグの相互作用を通じてＮｉ−キレート・カラムと結合することで、この標的ドメインが最小の機能的相互作用ドメインとなりうるからであろう。これとは逆に、ブロットされた断片は、タンパク質と膜の間の少なくとも１つ以上の接点によって結合していなくてはならない。そのためには、膜上で最小の相互作用ドメインが再び折り畳まれるのを妨げることなく結合できるよう、余分なアミノ酸が存在している必要がある。
【００５１】
有意な非特異的相互作用を排除するには、標識付きプローブを用いて細菌抽出液中の多数のタンパク質（例えばＢＳＡ、または細菌の主要なタンパク質）のブロットを調べるとき、その標識付きプローブがバックグラウンドを超えるシグナルを出さないことを示すとよい。
【００５２】
プローブ−標的複合体の性質の一部は、整列断片ラダー・ファー−ウエスタン分析によって明らかにすることができる。これは、セクションＧに記載したようにして調べた後、膜をプローブ用緩衝液で時間をさまざまに変えて洗浄し、膜に結合したままになっている標識付きプローブの量を測定することによって実現できる。このようにして、膜上の複合体の大まかな半減期を決定することができる。例えば、σ７０とβ’サブユニットの複合体は、約２．５時間の半減期で解離する。同様に、洗浄する際の塩を変えて、塩が解離速度に及ぼす効果を明らかにすることもできる。
【００５３】
結論
有望な結果が特異的であることを示せるならば、その結果は有効である。これは、結合を検出し、相互作用ドメインを含む領域を特定するための迅速な方法である。この方法により、切断された個々の断片をクローニングしたり、多数の突然変異を作ったりするなどのより退屈なマッピング法の適用範囲を、標的ポリペプチドの比較的小さな断片に集中させることができる。３２Ｐで標識したタンパク質プローブを用いると、比較的弱い相互作用を検出することができる。プローブを１０６ｃｐｍ／μｇを超える状態に標識するのは容易であり、ブロットをプローブとともにインキュベートした後、フォスファーイメージングに曝露する前に最後の洗浄を行なうには、ほんの５〜１０分しかかからない。これとは逆に、結合したプローブを免疫学的方法で検出するには、一次抗体および二次抗体とともにインキュベートする必要があり、この場合には数時間またはそれ以上かかる可能性がある。インキュベーションと洗浄の時間が長いとプローブが標的から解離する可能性がある。
【００５４】
この方法では、相互作用部位をマッピングするのではなく、接触面または相互作用部位を形成するのに必要な全領域（相互作用ドメイン）をマッピングすることになる。相互作用ドメインが再び折り畳まれることが難しかったり、相互作用ドメインとプローブ・タンパク質の結合が弱すぎたりする場合には、重要な相互作用が検出されない可能性がある。結合を検出するためには、“アッセイの窓”の中にいる必要がある。つまり、半減期が洗浄時間よりも長くなっている必要がある。結合が弱く、任意のタンパク質またはバックグラウンドと非特異的に結合するようだと、納得のゆく結果は得られない。相互作用ドメインがサイズの異なる２つのポリペプチドからなる領域を含んでいる場合には、この方法は役に立たない。また、相互作用ドメインが同じポリペプチドの離れた２つの領域を含んでいる場合にも、この方法ではうまくいかない可能性がある。相互作用ドメインの中にニトロセルロース膜と強く結合する部位があって膜上で再び折り畳まれることが阻止される場合にも、この方法はうまくいかないであろう。
【００５５】
この方法は、抗体のエピトープのマッピング、タンパク質−タンパク質相互作用ドメインのマッピング、ＤＮＡまたはＲＮＡの結合部位のマッピング、リン酸化などにより修飾された部位（例えば放射線修飾部位）のマッピングに役立つほか、タッグが移動する切断可能な架橋剤（Ｃｈｅｎ他、１９９４年）から標識付きタグをポリペプチド上でマッピングするのに役に立つ。ヘキサヒスチジン・タグの付いたタンパク質から出発し、修飾させ、標的タンパク質を化学的に、または酵素を用いて切断し、ヘキサヒスチジン・タグの付いた断片をＮｉ−キレート・カラムで単離し、ＳＤＳゲル電気泳動によって分画し、膜に移動させ、フィルムまたはフォスファーイメージング・スクリーンに曝露することにより、整列断片ラダー上のどの地点まで来るともはや標識が検出されないかを確認することができよう。
【００５６】
実施例２
β’サブユニット、βサブユニット、σ因子のファー−ウエスタン・ブロット分析材料と方法
プラスミド
プラスミドの特性を以下の表２に示す。
【表２】
2004500122.tif 000004
【表３】
2004500122.tif 000005
【００５７】
プラスミドの構成
ｐＲＬ６６３からＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を取り出し、それをｐＥＴ２８ｂ（ノヴァジェン社）に組み込むことにより、Ｃ末端にヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ６）・タグを有するβ’サブユニットのための過剰発現ベクター（ｐＴＡ５００）を構成した（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、１９９０年）。ＰＣＲにより、ヘキサヒスチジン・タグをβ’サブユニットのＮｒｕＩ部位含有断片のＮ末端に置いたｐＴＡ４９９を構成し、このｐＴＡ４９９から、Ｎ末端にヘキサヒスチジン・タグが付いたβ’サブユニットを発現させた。この断片をｐＥＴ２８ｂベクターに組み込んだ後、遺伝子のＣ末端部分をｐＲＬ６６３からのＮｒｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に挿入した。ＲｓｒＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を野生型のＣ末端をコードするＰＣＲ産物で置換することにより、ｐＲＬ６６３断片からのＣ末端ヘキサヒスチジン・タグを除去した。ＰＣＲにより、ヘキサヒスチジン・タグをβサブユニットのＫｐｎＩ部位含有断片のＮ末端に付け、ｐＴＡ５０１を構成した。この断片をｐＥＴ２８ｂベクターに組み込んだ。遺伝子のＣ末端には、野生型コード配列を含むＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を挿入した。Ｃ末端にヘキサヒスチジン・タグが付いたβサブユニットをコードするｐＴＡ５０２は、ＰＣＲを利用してＫｐｎＩ含有断片のＮ末端にＮｃｏＩ部位を挿入することにより作製した。Ｃ末端にヘキサヒスチジン・タグを含む断片を、ｐＲＬ７０６（Ｓｅｖｅｒｉｎｏｖ他、１９９７年）からのＫｐｎＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に挿入した。
【００５８】
β’サブユニットの非修飾断片を発現するベクターは、望む断片をＰＣＲによりクローニングし、その断片を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩという制限部位を用いて、ｐＴＡ５２８、ｐＴＡ５３０、ｐＴＡ５３５、ｐＴＡ５３６に関してはｐＥＴ２１ａ（ノヴァジェン社）に、ｐＴＡ５１９に関しては ｐＥＴ２４ａ（ノヴァジェン社）に組み込むことによって得た。ｐＴＡ５２２−５２５、ｐＴＡ５３１、ｐＴＡ５３３はすべて、ＰＣＲ増幅したβ’サブユニットの特定の領域をｐＥＴ２１ａ誘導体に挿入することによって作製した。なおｐＥＴ２１ａ誘導体に対しては、あらかじめ、発現したタンパク質に対してＮ末端にヘキサヒスチジン・タグと心筋キナーゼ（ＨＭＫ）認識部位を融合させるという修飾をしておいた。ｐＴＡ５３２とｐＴＡ５３４も同様にして構成したが、ヘキサヒスチジン・タグ−ＨＭＫベクター誘導体をｐＥＴ２８ｂから構成した点が異なる。ｐＴＡ５４７−５４９は、β’サブユニットのＳｎａＢＩ部位を含むがＮ末端がＰＣＲにより切り取られた断片を、ｐＥＴ２４ａに導入することによって作製した。遺伝子のＣ末端をコードしている領域は、ｐＴＡ５００からのＳｎａＢＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に挿入した。ｐＴＡ５４６は、ＰＣＲによりＣ末端のヘキサヒスチジン・タグを残基番号３０９の後ろに直接融合させることによって作製した。この断片は、ＮｄｅＩ部位とＸｈｏＩ部位を用いてｐＥＴ２４ａベクターに組み込んだ。σ７０を放射性プローブとして用いるため、ＨＭＫ部位をσ７０のＮ末端およびヘキサヒスチジン精製タグと融合させた。Ｎ末端にヘキサヒスチジンとＨＭＫが融合したｐＥＴ２８ｂベクターの誘導体にσ７０遺伝子を組み込み、そのσ７０のＮ末端に１３個のアミノ酸（ＭＨＨＨＨＨＨＡＲＲＡＳＶ：配列ＩＤ番号５）を追加することにより、ｐＨＭＫ−ヘキサヒスチジン−σ７０を作製した。ＰＣＲにより生成されたすべての産物のシークエンシングを行ない、突然変異がまったく導入されていないことを確認した。
【００５９】
タンパク質の発現と精製
プラスミドを導入して発現用ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノヴァジェンン社）を形質転換した。この細胞を１リットルの培養物としてＬＢ培地中で３７℃にて成長させた。ＬＢ培地には、１００μｇ／ｍｌのアンピリシンまたは５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを入れた。培養物をＡ６００が０．６と０．８の間の値になるまで成長させた後、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘導した。誘導を開始してから３時間後、８，０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離することによって細胞を回収し、−２０℃で凍らせて使用するときまで保存した。
【００６０】
細胞を解凍して１０ｍｌの溶解用緩衝液（４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９；０．３ＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＥＤＴＡ；０．１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル）に再び分散させ、リゾチームを１００μｇ／ｍｌ添加した。細胞を氷の上で１５分間インキュベートし、６０秒間の超音波バーストで３回にわたって処理した。封入体の形態をした組み換えタンパク質を、２７，０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離することにより可溶性ライセートから分離した。超音波処理により封入体ペレットを１０ｍｌの溶解用緩衝液＋２％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウムの中に再び分散させた。この混合物を２７，０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離し、上澄みを捨てた。デオキシコール酸ナトリウムで洗浄した封入体を１０ｍｌの脱イオン水に再び分散させ、２７，０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離した。水による洗浄を繰り返し、封入体を１ｍｇのペレットに分割し、−２０℃で凍らせて使用するときまで保存した。
【００６１】
グリブスコフとバージスの方法（１９８３年）を変形した方法に従い、σ７０封入体を溶解させ、再び折り畳ませ、精製した。封入体を６ＭのグアニジンＨＣｌ（ＧｕＨＣｌ）の中に再び分散させた。変性剤を緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；０．５ｍＭのＥＤＴＡ；５％（ｖ／ｖ）のグリセロール）でもって２段階で２時間かけて６４倍に希釈することにより、タンパク質が再び折り畳まれるようにした。１ｇのＤＥ５２樹脂（ホワットマン社）を添加し、４℃でゆっくりと撹拌しながら２４時間にわたって混合した。次にこの樹脂を１０ｍｌのカラムの中に回収し、洗浄し、タンパク質を、ＮａＣｌの勾配を０．１〜１Ｍにした緩衝液Ａを用いて溶離させた。σ７０分画をプールし、１リットルの保存用緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ；０．５ｍＭのＥＤＴＡ；０．１ＭのＮａＣｌ；０．１ｍＭのＤＴＴ；５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール）を用いて一晩にわたって透析を行ない、−２０℃で保存した。
【００６２】
全細胞ライセートを以下のようにして調製した。先端が切断されたβ’サブユニットを発現するプラスミドを含む細胞を、Ａ６００が０．６と０．８の間の値になるまで成長させ、１ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドで誘導した。細胞をさらに３０分間成長させた。サンプル２００μｌを取り出し、３０秒間の超音波処理を３回行なった。グリセロール２０μｌとＳＤＳ−サンプル緩衝液２０μｌを添加し、９５℃で２分間にわたって加熱し、−２０℃で凍らせて使用するときまで保存した。
【００６３】
タンパク質の切断
以下に説明するように、βサブユニットとβ’サブユニットの封入体に対して化学的切断と酵素による切断（以下の説明を参照のこと）を行ない、ニッケル・アフィニティ・クロマトグラフィにより精製した。切断反応物を、バイオラド・ミニカラム内の３００μｌのＮｉ２＋−ＮＴＡ樹脂（キアジェン社）に充填した。この樹脂は、緩衝液Ｂ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９；５００ｍＭのＮａＣｌ；５ｍＭのイミダゾール；０．１％（ｖ／ｖ）のトゥイーン２０；１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール）＋８Ｍの尿素であらかじめ平衡させてある。樹脂と結合したタンパク質を１０カラム分の容積の緩衝液Ｂ＋８Ｍの尿素で洗浄し、次いで１０カラム分の容積の緩衝液Ｂで洗浄し、タンパク質が再び折り畳まれるようにした。次にこの樹脂を５００μｌの緩衝液Ｂ＋４０ｍＭのイミダゾールで洗浄した。タンパク質を５００μｌの緩衝液Ｂ＋２００ｍＭのイミダゾールで溶離させた。溶離した分画を−２０℃で保存した。
【００６４】
ＮＴＣＢによる切断（Ｊａｃｏｂｓｏｎ他、１９８３年）
１ｍｇの封入体タンパク質を１ｍｌの緩衝液Ｂ＋８Ｍの尿素の中に再び分散させた。チオ基がタンパク質中の５倍過剰なモル数になる量のＤＴＴを添加した。この混合物を３７℃で１５分間にわたってインキュベートし、二硫化結合をすべて還元した。全スルフヒドリル基の５倍過剰なモル数になる量のＮＴＣＢを添加した。ＮａＯＨを用いてｐＨを９．５に調節した。反応混合物を室温で２時間にわたってインキュベートした。切断混合物を緩衝液Ｂ＋８Ｍの尿素の中に１：１０になるように希釈し、上に説明したようにしてＮｉ２＋−ＮＴＡカラムに充填した。
【００６５】
ヒドロキシルアミンによる切断（Ｂｏｒｎｓｔｅｉｎ他、１９７０年）
１ｍｇの封入体タンパク質を１ｍｌの緩衝液Ｂ＋８Ｍの尿素の中に再び分散させた。溶解したタンパク質５００μｌを、切断用ヒドロキシルアミン溶液（０．４ＭのＣＨＥＳ、ｐＨ９．５；４ＭのヒドロキシルアミンＨＣｌ）５００μｌに添加し、４２℃で２時間にわたってインキュベートした。β−メルカプトエタノールを０．１Ｍになるまで添加し、３７℃で１０分間にわたってインキュベートした。この混合物を緩衝液Ｂ＋８Ｍの尿素の中に１：１０になるように希釈し、上に説明したようにしてＮｉ２＋−ＮＴＡカラムに充填した。
【００６６】
サーモリシンによる切断（Ｒａｏ他、１９９６年）
１ｍｇの封入体タンパク質を１００μｌの緩衝液Ｂ＋８Ｍの尿素の中に再び分散させ、３７℃で１５分間にわたってインキュベートした。サーモリシンをタンパク質に添加した：プロテアーゼの比は、４，０００：１、８，０００：１、１６，０００：１（ｗ／ｗ）である。室温で３０分間反応させた。反応物を上に説明したようにしてＮｉ２＋−ＮＴＡカラムに充填した。
【００６７】
トリプシンによる切断（Ｒａｏ他、１９９６年）
１ｍｇの封入体タンパク質を１００μｌの緩衝液Ｂ＋８Ｍの尿素の中に再び分散させ、３７℃で１５分間にわたってインキュベートした。等量の緩衝液Ｂを添加することにより、この混合物を尿素が４Ｍになるまで希釈した。トリプシンをタンパク質に添加した：プロテアーゼの比は、４，０００：１、８，０００：１、１６，０００：１（ｗ／ｗ）である。室温で３０分間反応させた。反応物を上に説明したようにしてＮｉ２＋−ＮＴＡカラムに充填した。
【００６８】
ファー−ウエスタン・ブロッティング
ドット・ブロット
シュライヒャー＆シュエル“ミニフォールド”ドット・ブロット装置を用い、ニトロセルロース膜（シュライヒャー＆シュエル社）上に、緩衝液Ｂ＋８Ｍの尿素の中に再び分散させた封入体タンパク質のスポットを直接形成した。ウエルは緩衝液Ｂで３回洗浄した。ＨＹＢ緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２；２００ｍＭのＫＣｌ；２ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＺｎＣｌ２；１ｍＭのＤＴＴ；０．５％（ｖ／ｖ）のトゥイーン２０；１％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳）の中で４℃で１６時間にわたってインキュベートすることにより、ニトロセルロースの反応を停止させた。
【００６９】
ゲル・ブロット
切断されたタンパク質断片または全細胞ライセートを、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離した。電気泳動によりタンパク質を０．０５μｍのニトロセルロースに移した。ＨＹＢ緩衝液の中で４℃で１６時間にわたってインキュベートすることにより、ニトロセルロースの反応を停止させた。
【００７０】
標識の付着
σ７０に標識を付ける操作は、１００μｌの反応容積の中で行なった。５０μｌのキナーゼ緩衝液（４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；２００ｍＭのＮａＣｌ；２４ｍＭのＭｇＣｌ２；２ｍＭのＤＴＴ；５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール）を５０μｇのσ７０タンパク質に添加した。２４０単位のｃＡＭＰ依存性キナーゼ触媒サブユニット（プロメガ社）を添加し、脱イオン水を用いて全容量を９９μｌにした。１μｌの［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（０．１５ｍＣｉ／μｌ）を添加した。この混合物を室温で３０分間にわたってインキュベートした。次に、この反応混合物を、１×キナーゼ緩衝液であらかじめ平衡させたバイオスピンＰ６カラム（バイオラド社）に充填し、１，１００×ｇで４分間にわたって回転させた。流出液を回収し、−２０℃で保存した。
【００７１】
プロービング
反応を停止させたニトロセルロースを、４×１０５ｃｐｍ／ｍｌの３２Ｐで標識したσ７０とともに、１０ｍｌのＨＹＢ緩衝液中で室温にて３時間にわたってインキュベートした。ブロットを１０ｍｌのＨＹＢ緩衝液でそれぞれ３分間ずつ３回にわたって洗浄した。次にブロットを乾燥させ、フィルムまたはフォスファーイメージャー（モレキュラー・ダイナミックス社）に曝露した。
【００７２】
同時固定化
ヘキサヒスチジン・タグを有する切断されたβ’サブユニット１ｍｇを１ｍｌの緩衝液Ｃ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９；２００ｍＭのＮａＣｌ；５ｍＭのイミダゾール；０．１％（ｖ／ｖ）のトゥイーン２０；１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール）＋８Ｍの尿素の中に溶かした。このタンパク質溶液２０μｇを１５０μｌのＮｉ２＋−ＮＴＡ樹脂に充填した。カラムを１５カラム分の容積の緩衝液Ｃ＋８Ｍの尿素で洗浄した後、１５カラム分の容積の緩衝液Ｃで洗浄し、タンパク質が再び折り畳まれるようにした。次に、３０μｇの天然のσ７０をカラムに充填した。カラムを２０カラム分の容積の緩衝液Ｃで洗浄した。結合したタンパク質を３００μｌの緩衝液Ｃ＋２５０ｍＭのイミダゾールで溶離させた。σ７０流出液からのサンプル、洗浄液、溶離した分画を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
【００７３】
結果
ファー−ウエスタン・ブロット分析において、σ７０はβ’サブユニットと強く相互作用し、βサブユニットと弱く相互作用する
ドット・ブロットに対してファー−ウエスタン・アッセイを行なうことにより、コア複合体の外で個々のβサブユニットおよびβ’サブユニットに結合するσ７０を評価した。βサブユニットおよびβ’サブユニットの封入体タンパク質を別々に尿素に溶かし、ニトロセルロース上にスポットにして載せた。非特異的結合をする対照として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をスポットにして載せた。ニトロセルロースの反応を停止させ、変性剤を洗浄して除去した。次に、３２Ｐで標識したσ７０を用いてブロットを調べた。βサブユニットとβ’サブユニットの両方ともσ７０と結合したが、対照であるＢＳＡは結合しなかった。同じドット・ブロットを、キナーゼまたはσ７０のいずれかが欠けている対照溶液を用いて調べ、シグナルが、ヌクレオチドの結合や、βサブユニットまたはβ’サブユニットのリン酸化によるものではないことを確認した。どの対照ブロットも検出可能なシグナルを出すことはなかった。したがって、βサブユニットとβ’サブユニットの両方とも、別々にσ７０と結合することができる。
【００７４】
ファー−ウエスタン・ブロット分析において、βサブユニット／β’サブユニットに対して特異的に相互作用するσ７０
別のテストを行ない、σ７０をプローブとして用いた場合のファー−ウエスタン・ブロット分析の特異性を評価した。対数増殖期の培養物からの細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースにブロットし、σ７０で調べた。発生した唯一の強いシグナルは、βサブユニットおよびβ’サブユニットと同じ移動度であった。他に強いシグナルがないという事実は、σ７０がβサブユニットおよび／またはβ’サブユニットに非特異的に結合しているのではないことを示唆している。σ７０と相互作用する他のタンパク質（アクティベータ、アンチσ因子など）があることがわかっているため（Ｉｓｈｉｈａｍａ、１９９３年；Ｊｉｓｈａｇｅ他、１９９８年）、予想通りマイナーなバンドが観測された。
【００７５】
σ７０に対する強くて特異的な結合部位は、β’サブユニットのＮ末端に位置する
βサブユニットおよびβ’サブユニット上におけるσ７０との相互作用部位をマッピングするため、これら２つの大きなサブユニットの化学的切断による産物について、ファー−ウエスタン分析を行なった。マックベクター・ソフトウエア（オックスフォード・モレキュラー・グループ）を用いて両者のアミノ酸配列を分析し、特異的な化学的切断部位を同定した。この分析に基づき、部分的消化の後にマッピングする上で最高の分解能を示した産物群を生み出した切断剤を選択した。βサブユニットおよびβ’サブユニットのＮ末端とＣ末端の両方にヘキサヒスチジン・タグを有する構造物を、変性条件のもとで切断した。切断反応による産物を変性条件下でＮｉ２＋−ＮＴＡを用いて精製し、ヘキサヒスチジン・タグを有する切断断片を単離した。次に、精製したこれら断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける移動度に基づいて同定し、これら断片を生み出した切断部位に基づいてその正確なサイズを決定した。切断断片は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分画化されるとき、共通の端部（ヘキサヒスチジン・タグの位置に応じてＮ末端またはＣ末端になる）を持っていてサイズが徐々に短くなる断片群からなるラダーが生まれる。Ｎ末端とＣ末端の両方にヘキサヒスチジン・タグを有する断片を用いると、相互作用ドメインのＮ末端とＣ末端の両方を積極的に同定することができる。σ７０プローブは、完全な相互作用ドメインを有する断片とだけ結合することになろう。Ｎ末端にヘキサヒスチジン・タグを有するβ’サブユニットのラダーは、ヒドロキシルアミンによる切断とＮＴＣＢによる切断のどちらで生成された場合も、σ７０に結合する能力を保持している断片をいくつか含んでいた。したがって、β’サブユニットのＣ末端にある大きな部分は、σ７０の結合に影響を与えることなく除去することができる。σ７０と結合する最小の断片は、ヒドロキシルアミンで切断したラダーにおける、β’サブユニットのアミノ酸番号１〜３０９からなる断片であった。Ｃ末端にヘキサヒスチジン・タグを有するラダーでは、完全長β’サブユニットだけがσ７０と結合した。これらの結果は、強くて特異的な結合部位が、β’サブユニットのアミノ酸番号１〜３０９（β’１−３０９）に位置していることを示唆していた。βサブユニットの断片群からなるラダーは、相互作用ドメインをマッピングするのに十分なほど強いシグナルを出さなかった。
【００７６】
化学的切断によるマッピングの精度は、利用できる試薬に対するβ’サブユニット上の切断部位の数が限られていたため、比較的低かった。マッピングにおいて利用できるタンパク質分解断片の数を増やすため、われわれは酵素による切断を利用した。多数のプロテアーゼによる切断の特異性の数は、化学的切断剤ほど限られてはいない。したがって切断部位がはるかに多くなり、生まれる断片もより多くなる。Ｎ末端とＣ末端にヘキサヒスチジン・タグを有するβ’サブユニットを部分的に消化させるのに、トリプシンとサーモリシンを用いた。断片を再度精製し、ブロットし、σ７０で調べた。しかし断片の数を増やしても、相互作用ドメインの範囲を上記のアミノ酸番号１〜３０９という長さより狭めることはできなかった。
【００７７】
切断された断片を用いたファー−ウエスタン・ブロッティングにより相互作用ドメインをアミノ酸番号６０〜３０９の範囲に狭める
この結合部位をより正確に決定するため、先端が切断されたさまざまな断片をＰＣＲを利用して作った。β’１−３０９という断片を出発点とし、Ｎ末端とＣ末端のいずれかが切断された構造物を作製した。切断された断片をコードしているＤＮＡをクローニングし、過剰発現プラスミドに組み込んだ。これらプラスミドを含む細胞を、Ａ６００が０．６になるまで成長させ、発現を誘導した。細胞は、誘導後に３０分間だけ成長させた。それぞれの培養物から全細胞ライセートを作り、それに対してファー−ウエスタン・ブロッティング・アッセイを行なった。発現時間を短くしたため、誘導されたタンパク質の発現レベルは、ライセート中の他のタンパク質と同じくらいに維持された。ファー−ウエスタン・ブロッティング・アッセイにおいて全細胞ライセートを内部対照として使用し、興味の対象であるタンパク質に関して結合が特異的であることを確認した。これは、さまざまなタンパク質を精製する必要はなく、精製タグなしでさまざまなタンパク質を発現させうることも意味していた。β’１−３０９のＣ末端においてアミノ酸番号３００から先が切り取られた構造物を作製した場合には、σ７０との結合は失われた。しかし同じ断片のＮ末端は、アミノ酸が６０個切り取られるまでシグナルが消えなかった。β’１００−３０９はまだ結合能力を持っていたが結合の程度は弱くなり、β’１５０−３０９はσ７０と結合しなかった。これらの結果により、σ７０の結合部位がβ’６０−３０９に狭まった。アンチβ’サブユニット・モノクローナル抗体を用いたウエスタン・ブロットの実験を行ない、タンパク質断片がニトロセルロースに移動したこと、また、その断片がβ’サブユニットの断片であることを確認した。
【００７８】
同時固定化アッセイにより、相互作用部位がβ’サブユニットの残基番号２６０〜３０９へとさらに狭まる
Ｎｉ２＋−ＮＴＡ同時固定化アッセイを利用することにより、ファー−ウエスタン・ブロッティングを用いて得られた結果を確認するとともに、その結果をさらに展開した。σ７０の結合を調べるタンパク質をヘキサヒスチジン精製タグと融合させ、封入体の形態で過剰発現させた。この封入体タンパク質を８Ｍの尿素を用いて溶かし、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ樹脂に充填した。変性剤を洗浄して除去するとタンパク質が再び折り畳まれるようになるが、タンパク質は樹脂に結合したままである。次に天然のσ７０をカラムに充填する。カラムを洗浄し、結合したタンパク質をイミダゾールを用いて溶離させる。切断されたタンパク質は、σ７０に対する相互作用ドメインを含んでいさえすればσ７０と結合するため、溶離された分画の中にσ７０が含まれることになろう。これら結合実験の結果は、相互作用ドメインのＣ末端側の境界を明らかにするファー−ウエスタン・ブロッティング実験の結果と整合性がある。β’１−３０９はσ７０と結合したが、β’１−３００とβ’１−２８０はσ７０と結合しなかった。再び折り畳まれたヘキサヒスチジン・タグなしのβ’１−３０９をσ７０と混合し、Ｎｉ２＋−ＮＴＡに移動させて、複合体がカラムと非特異的な結合をしないことを確認した。複合体はカラムを通過してしまい、溶離された分画中には見つからなかった。β’１−３０９を含むカラムに対照としてＢＳＡを充填した。ＢＳＡは、流出液の中にだけ見つかり、溶離された分画中には見つからなかった。これは、β’１−３０９がσ７０と特異的に結合していることを示唆する。
【００７９】
Ｎ末端側の境界に関しては、ファー−ウエスタン・アッセイにおけるよりもＮ末端を多く除去してもσ７０の結合に影響がないことがわかった。Ｎ末端が切断されたいくつかの断片（どれもＣ末端側の境界は残基番号３０９のアミノ酸であり、その後ろにヘキサヒスチジン・タグを有する）を構成し、同時固定化アッセイにおいて使用した。残基番号が３３、６０、１００、１７８、２００の位置で切断した断片もまだσ７０に結合できた。β’２６０−３０９を調製したところ、うまく取り扱うことができたが、このβ’２６０−３０９は、σ７０に結合する能力を保持していた。相互作用ドメインのＮ末端を見つけるため、残基番号が２４０よりも先の部分からなる切断物を完全長β’サブユニットから作った。β’サブユニットの頭部の２６０残基を取り除いた切断物（β’２６０−Ｃ）はσ７０と結合したが、β’２７０−Ｃは結合の程度が減り、β’２８０−Ｃはσ７０との結合が検出できなかった。これらの結果を合わせて考えると、コア・ポリメラーゼ上の強いσ７０結合部位がβ’サブユニットの残基番号２６０〜３０９に位置していることが示唆される。
【００８０】
考察
これまでのところ、生化学や遺伝子に関するいくつかの研究により、σ因子上にあるコアとの結合ドメインの推定位置に関する現在の知見がもたらされたが、コア上でσ因子と結合する部位に関しては、はるかに少ないことしかわかっていない（Ｇｒｏｓｓ他、１９９６年）。ホロ酵素が組み立てられるときには、β’サブユニットがα２β複合体に付加され、次いでσ因子が付加されてホロ酵素を形成する（Ｉｓｈｉｈａｍａ、１９８１年）。これは、σ因子と結合する主要な部位がβ’サブユニット上に位置するか、あるいはσ因子と結合する主要な部位が、β’サブユニットが付加されてコア酵素になるときにαサブユニットおよび／またはβサブユニットと共同して形成されることを示唆していよう。σ７０−β’サブユニット複合体の単離により、前者であることの証拠が得られる（Ｌｕｏ他、１９９６年）。上記の結果により、β’サブユニット上のσ７０に対する強い結合部位の位置が限定されるとともに、σ７０がβサブユニットに対して低い結合アフィニティを示すことが明らかにされた。したがって、ホロ酵素においてはβ’サブユニットがσ７０に対する主要な結合相互作用を提供するのに対し、βサブユニットは二次的な相互作用を与えるだけである。保存された領域２．１の外側におけるσ因子の突然変異がコアとの結合に明らかに影響を与えていることに基づき、σ因子上にはコアとの結合部位が多数あると考えられている（Ｊｏｏ他、１９９７年；Ｚｈｏｕ他、１９９２年；Ｊｏｏ他、１９９８年；Ｓｈａｒｐ他、１９９９年）。
【００８１】
σ７０に対する強い結合部位は、β’サブユニットの残基番号２６０〜３０９に位置する。β’サブユニットの残基番号２０１〜４７７を除去すると突然変異タンパク質が生まれ、その突然変異タンパク質はそれでもコアを形成することができるものの、ホロ酵素は形成できないことが、以前に報告されている（Ｌｕｏ他、１９９６年）。このような除去実験における問題点は、結合部位が除去した領域に位置することは結論できず、その領域が除去されたときに相互作用ドメインの正しい形成を妨げることしか結論できないことである。タンパク質−タンパク質フットプリンティング実験で得られた結果は、β’サブユニットの似た領域（残基番号２２８〜４６１）が、σ７０と物理的に近い位置にあることを示唆していた（Ｏｗｅｎｓ他、１９９８年）。このアッセイは、タンパク質同士が物理的に近い位置にあっても必ずしもタンパク質−タンパク質の結合に対応していないことを示唆しているため、この結果を解釈するのは難しい。この明細書に記載した知見から、σ７０との主要な結合部位がこれら領域に位置していることが結論できる。
【００８２】
β’サブユニット上のσ７０との相互作用ドメインは、保存された領域Ｂに位置するいくつかの残基を含んでいる（Ｊｏｋｅｒｓｔ他、１９８９年）。この領域の機能はまったく知られていない。ＰＨＤプログラム（Ｒｏｓｔ他、１９９４年）から残基番号２６０〜３０９に関して予想される二次構造は、残基番号２６４〜２８３のヘリックスが、ループによって、残基番号２９２〜３０９の第２のヘリックスと結合していることを示唆している。予想されるこれらのヘリックスがコイルドコイルを形成することも予想される（Ｌｕｐａｓ他、１９９１年）。これは特に興味深い。というのも、同様の予測がσ７０の残基番号３５５〜３９１に対してなされているからである。これら残基は、保存された領域２．１と重なっている。σ７０のプロテアーゼ耐性断片の結晶構造から、領域２．１を含むヘリックスが、保存された領域１．２と合わさってコイルドコイルを形成しているという予想が確認された（Ｍａｌｈｏｔｒａ他、１９９６年）。コイルドコイルは多くのタンパク質−タンパク質相互作用に関与していることがわかっているため（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ他、１９８８年；Ｇｅｎｔｚ他、１９８９年；Ｏ’Ｓｈｅａ他、１９８９年）、これは、β’２６０−３０９がσ７０の領域２．１と相互作用している可能性のあることを示唆していよう。
【００８３】
整列断片ラダー・ファー−ウエスタン・ブロッティングを利用して、β’サブユニット上のσ７０との結合部位がβ’６０−３０９であることを特定した。この方法は、変性剤を除去するとブロットされたタンパク質分画のどれかが再び折り畳まれ、プローブの結合にとって適切な立体配座を生み出すことができるという事実に基づいている。全細胞ライセートを調べ、β’サブユニットが主要な結合相互作用を行なうことを明らかにすることによって、このアッセイの特異性が明確になった。タンパク質の部位特異的な化学的切断とファー−ウエスタン・ブロッティングを組み合わせることにより、このタンパク質−タンパク質相互作用の位置を特定する非常に迅速で効果的な方法が提供される。切断された個々の断片をクローニングし、スクリーニングすることは、相互作用ドメインがわかった後に初めて必要になる。β’サブユニットの切断物をこのサブユニットの全長にわたって作製せねばならないというのは、時間のかかる退屈な作業であろう。タンパク質の切断とＮｉ２＋カラムでの精製は一日で行なうことができ、したがってこのアッセイはコストがより安く、退屈さもより少ない。
【００８４】
ファー−ウエスタン・ブロッティングで得られた結果を確認し、さらに展開するため、Ｎｉ２＋同時固定化アッセイを行なった。この実験により、Ｎ末端から残基番号３０９までの断片はまだσ７０と結合できるのに対し、Ｃ末端のほんの９個のアミノ酸を除去して残基番号３００までにすると結合性が失われることも明らかになった。これらアッセイにおいてＮ末端を切断した断片から得られた結果は、ファー−ウエスタン・ブロッティングから得られた結果よりも結合部位の位置に関して高精度であった。Ｎ末端からアミノ酸を２６０個まで除去してもσ７０の結合には影響がなかった。アミノ酸を２７０個除去すると、σ７０の結合が減ったが、完全になくなりはしなかった。これは、結合部位の一部が除去されたか、結合部位は完全なままであるが、上流の残基が失われたため、再び折り畳まれたときに結合部位が隠れてしまったかであることを示唆している。結合部位が実際にマッピングされた通りであり、実際の結合部位が適切に折り畳まれるのに必要な領域となっているだけではないことを確認するため、β’サブユニットの残基番号２６０〜３０９からタンパク質の断片を作り、その断片があれば結合に十分であることを示した。同定された相互作用ドメインのサイズの違いがファー−ウエスタン・アッセイ（β’６０−３０９）と同時固定化アッセイ（β’２６０−３０９）で見られることに、それぞれのアッセイの特徴が反映している。ファー−ウエスタン・アッセイは、タンパク質の一部がニトロセルロース膜に付着している状態で相互作用ドメインが再び折り畳まれて結合部位が適切に提示されることを要求している。このようになっていると、タンパク質は、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ同時固定化アッセイにおけるように一方の端部だけで結合しているタンパク質よりも立体配座が制限される。したがって、相互作用ドメインを膜の表面から離しておくための足場のような構造を形成するため、タンパク質がより長くなっている必要がある。複数のマッピング法を組み合わせることにより、タンパク質の相互作用ドメインを同定するための迅速で高精度の方法が提供される。
【００８５】
実施例３
β’２６０−３０９の突然変異分析
材料と方法
プラスミドの構成
プラスミドの特性は、図７と後掲の表３〜表４に示してある。プラスミドｐＴＡ５７７とｐＴＡ６００−６２０は、ベースとなるプラスミドｐＲＬ６６３（Ｗａｎｇ他、１９９５年）から作製した。サイレント突然変異誘発によりｐＲＬ６６３のｒｐｏＣ遺伝子にＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位を１つずつ挿入し、ｐＴＡ５７７を作製した。ｐＴＡ５６１は、もとになるプラスミドをｐＲＬ３０８（Ｗｅｉｌｂａｅｃｈｅｒ他、１９９４年）にした以外は、ｐＴＡ５７７と同様にして作製した。さまざまな突然変異を含むＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を挿入するのにＨｉｎｄＩＩＩ制限部位とＢａｍＨＩ制限部位を用い、ｐＴＡ６００−６０９を作製した。β’サブユニットの残基番号１〜３０９をコードしているｒｐｏＣ切断断片を含むｐＴＡ６２０に関しては、ｐＲＬ６６３をＸｂａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ＰＣＲ増幅したｒｐｏＣ断片を挿入した。σ７０の結合部位がβ’サブユニットの残基番号２６０〜３０９であることを特定したが、構造物のいくつかは残基番号３１９まで延びるようにした。これは、上記のＢａｍＨＩ部位が含まれるようにするためであった。このようにしてこれらのさまざまな突然変異を新しいプラスミドに組み込み、ｐＴＡ６１０−６１９を作製した。残基番号３０９で終わる断片と残基番号３１９で終わる断片では、性質に違いが見られなかった。
【００８６】
プラスミドｐＴＡ１４５、６５５、６５８、６６０、６６１は、野生型β’２４０−３０９またはさまざまな突然変異体β’２４０−３０９をコードしているＰＣＲ増幅したｒｐｏＣ断片をｐＥＴ２４ａのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ制限部位に挿入することにより構成した。Ｃ末端のヘキサヒスチジン・タグをこれら挿入物に対する逆プライマーに組み込み、発現したタンパク質に精製タグを融合した。
【００８７】
【表４】
2004500122.tif 000006
【表５】
2004500122.tif 000007
【００８８】
σ７０の発現と精製
細胞を１リットルの培養物として、Ａ６００が０．６〜０．８になるまで、１００μｇ／ｍｌのアンピリシンを入れたＬＢ培地中で３７℃にて成長させた。濃度が１ｍＭになるまでイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。誘導を開始してから３時間後、８，０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離することによって細胞を回収し、−２０℃で凍らせた。
【００８９】
１リットルの培養物からの細胞ペレットを解凍し、１０ｍｌの溶解用緩衝液（４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９；０．３ＭのＫＣｌ；１０ｍＭのＥＤＴＡ；０．１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル）に再び分散させ、リゾチームを０．１ｍｇ／ｍｌ添加した。細胞を氷の上で１５分間インキュベートし、６０秒間の超音波バーストで３回にわたって処理した。封入体の形態をした組み換えタンパク質を、２７，０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離することによって可溶性ライセートから分離した。超音波処理により封入体ペレットを１０ｍｌの溶解用緩衝液＋２％（ｗ／ｖ）デオキシコール酸ナトリウム（ＤＯＣ）の中に再び分散させた。この混合物を２７，０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離し、上澄みを捨てた。ＤＯＣで洗浄した封入体を１０ｍｌの脱イオン水に再び分散させ、２７，０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離した。水による洗浄を繰り返し、封入体を１ｍｇのペレットに分割し、−２０℃で凍らせて使用するときまで保存した。
グリブスコフとバージスの方法（１９８６年）を変形した方法に従い、σ７０封入体（１０ｍｇ）を溶解させ、再び折り畳ませ、精製した。封入体を６ＭのグアニジンＨＣｌ（ＧｕＨＣｌ）の中に再び分散させた。変性剤を緩衝液Ａ（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９；０．５ｍＭのＥＤＴＡ；５％（ｖ／ｖ）のグリセロール）でもって２段階で２時間かけて６４倍に希釈することにより、タンパク質が再び折り畳まれるようにした。１ｇの樹脂（ＤＥＡＥ−セルロース、ホワットマン社）を添加し、４℃でゆっくりと撹拌しながら２４時間にわたって混合した。次にこの樹脂を１０ｍｌのカラムの中に回収し、洗浄し、タンパク質を、ＮａＣｌの勾配を０．１〜１．０Ｍにした緩衝液Ａを用いて溶離させた。σ７０分画をプールし、１リットルの保存用緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９；０．５ｍＭのＥＤＴＡ；０．１ＭのＮａＣｌ；０．１ｍＭのＤＴＴ；５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール）を用いて一晩にわたって透析を行ない、−２０℃で保存した。
【００９０】
定量的ウエスタン・ブロッティング
定量測定するタンパク質サンプルに対してＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行なった。電気泳動によりタンパク質をルから０．０５μｍのニトロセルロースに移した。ブロットーの中でブロットの反応を停止させ、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）で調べた。ＥＬＣ＋システム（アマーシャム社）を用いてシグナルを発生させ、ストーム・フルオロイメージャー（Ｓｔｏｒｍ ＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｅｒ：モレキュラー・ダイナミクス社）で検出した。イメージクアント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）・ソフトウエア（モレキュラー・ダイナミクス社）を用いてシグナルを定量測定した。
【００９１】
ファー−ウエスタン・ブロッティング
切断されたβ’サブユニットを発現するプラスミドｐＴＡ６１０−６２０を含む細胞を、Ａ６００が０．６と０．８の間の値になるまで成長させ、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。細胞をさらに３０分間成長させた。サンプル２００μｌを取り出し、３０秒間の超音波処理を３回行なった。グリセロール２０μｌとＳＤＳ−サンプル緩衝液２０μｌを添加し、９５℃で２分間にわたって加熱し、−２０℃で凍らせて使用するときまで保存した。ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。タンパク質を電気泳動により０．０５μｍのニトロセルロースに移動させた。ＨＹＢ緩衝液（２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２；２００ｍＭのＫＣｌ；２ｍＭのＭｇＣｌ２；０．１ｍＭのＺｎＣｌ２；１ｍＭのＤＴＴ；０．５％（ｖ／ｖ）のトゥイーン２０；１％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳）の中で４℃で１６時間にわたってインキュベートすることにより、ニトロセルロースの反応を停止させた。
【００９２】
σ７０に標識を付ける操作を１００μｌの反応容積の中で行なった。５０μｌの２×キナーゼ緩衝液（４０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４；２００ｍＭのＮａＣｌ；２４ｍＭのＭｇＣｌ２；２ｍＭのＤＴＴ）を５０μｇのＨＭＫ−σ７０タンパク質に添加した。２４０単位のｃＡＭＰ依存性キナーゼ触媒性サブユニット（プロメガ社）を添加し、脱イオン水を用いて全容量を９９μｌにした。１μｌのγ−３２Ｐ−ＡＴＰ（０．１５ｍＣｉ／μｌ）を添加した。この混合物を室温で３０分間にわたってインキュベートした。次に、この反応混合物を、１×キナーゼ緩衝液であらかじめ平衡させたバイオスピンＰ６カラム（バイオラド社）に充填し、１，１００×ｇで４分間にわたって回転させた。流出液を回収し、−２０℃で保存した。
反応を停止させたニトロセルロースを、４×１０５ｃｐｍ／ｍｌの３２Ｐで標識したσ７０とともに、１０ｍｌのＨＹＢ緩衝液中で室温にて３時間にわたってインキュベートした。ブロットを１０ｍｌのＨＹＢ緩衝液でそれぞれ３分間ずつ３回にわたって洗浄した。次にブロットを乾燥させ、フォスファーイメージャー（ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ）を用いてシグナルが目に見えるようにし、イメージクアント・ソフトウエア（モレキュラー・ダイナミックス社）を用いてそのシグナルを定量測定した。
【００９３】
成長の評価
プラスミドｐＴＡ５７７、６００−６０９（０．１μｇ）を導入してＲＬ６０２菌株を形質転換した（Ｗｅｉｌｂａｅｃｈｅｒ他、１９９４年；Ｒｉｄｌｅｙ他、１９８２年）。熱ショックを与え、氷の上でインキュベートした後、３００μｌのＬＢを細胞混合物５０μｌに添加した。１０μｌの形質転換反応物を、アンピリシン（１００μｇ／ｍｌ）を加えたＬＢプレートの上にスポット状に載せ、３０℃でインキュベートした。さらに１０μｌをプレートの上にスポット状に載せ、４２℃でインキュベートした。プレートを２４〜４８時間にわたってインキュベートし、成長を評価した。
【００９４】
コア／ホロ酵素複合体の精製
アンピリシン（１００μｇ／ｍｌ）とＩＰＴＧ（０．１５ｍＭ）を加えた２００ｍｌ のＬＢを入れた１リットルのフラスコに、プラスミドｐＴＡ５６１、５７７、６００−６０９を含む細胞を一晩インキュベートした培養物から採取した２００μｌを接種した。この培養物を３７℃で振動させながらＡ６００が０．４になるまで成長させて対数増殖期アッセイ用にした。さらに２時間成長させたもの（Ａ６００が約２．０）は、初期定常期アッセイ用にした。６，０００ｒｐｍで１０分間にわたって遠心分離することにより細胞を回収し、使用するときまで−２０℃で保存した。細胞ペレットを、０．１５ＭのＮａＣｌとリゾチーム（０．１ｍｇ／ｍｌ）を添加した５ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９；０．１ｍＭのＥＤＴＡ）の中に再び分散させ、氷の上で１５分間インキュベートした。細胞を超音波で３０秒間ずつ２回にわたって処理し、２７，０００×ｇで２５分間にわたって遠心分離することにより、不溶性のペレットにした。上澄みを、ポリオール反応性アンチβ’モノクローナル抗体（ＭＡｂ）であるＮＴ７３（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、１９９２年）を含む１．５ｍｌのイムノアフィニティ・カラムに充填した。このカラムを、０．１５ＭのＮａＣｌを加えた１５ｍｌのＴＥで洗浄した後、０．５ＭのＮａＣｌを加えた１０ｍｌのＴＥで２回目の洗浄を行なった。０．７ＭのＮａＣｌと３０％のプロピレングリコールを加えた４ｍｌのＴＥを用いてタンパク質をカラムから溶離させた。溶離したサンプル（４ｍｌ）を６ｍｌの緩衝液Ｂ（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９；５００ｍＭのＮａＣｌ；５ｍＭのイミダゾール；０．１％（ｖ／ｖ）のトゥイーン２０；１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール）で希釈し、５００μｌのＮｉ２＋−ＮＴＡ樹脂に充填した（２回）。この樹脂を５ｍｌの緩衝液Ｂで洗浄し（２回）、０．２５Ｍのイミダゾールを加えた０．５ｍｌの緩衝液Ｂで溶離させた。溶離した分画からのサンプルを、それぞれのサブユニットまたはσ因子に対するＭａｂを用いて上記のようにしてウエスタン・ブロット法で調べた。二次抗体は、セイヨウワサビのペルオキシダーゼで標識したヤギの抗マウスＩｇＧ抗体であり、ＥＬＣ＋システム（アマーシャム社）を用いてシグナルを発生させ、ストーム・フルオロイメージャー（モレキュラー・ダイナミクス社）で検出した。イメージクアント・ソフトウエア（モレキュラー・ダイナミクス社）を用いてシグナルを定量測定した。
【００９５】
結果
突然変異の設計
コイル予測プログラム（Ｌｕｐａｓ他、１９９１年）は、β’２６０−３０９において予想される２つのαヘリックスが、両方ともコイルドコイルを形成する確率が高いことを示した（図３ａ）。この予測を確かめるため、プロリンをいずれかのヘリックスに挿入した２つのβ’サブユニット突然変異体を構成した。これらのβ’サブユニット突然変異体は、ヘリックスまたはコイルドコイルをもはや形成しないことが予想された。ファー−ウエスタン・アッセイとインビボ成長アッセイの両方でこれら２つの突然変異体の機能を調べたところ、どちらも機能を持たないことがわかった。これは、この領域におけるヘリックス／コイルドコイルの構造が機能にとって重要であることを示唆している。しかしこれら突然変異体タンパク質の溶解度は１００％ではなく、したがって機能の喪失は、単に折り畳みに大きな欠陥があることに起因している可能性がある。その後、主としてヘリックスの“ｅ”と“ｇ”の位置についてさらに分析を行なった。コイルドコイルのｅ残基とｇ残基は、イオン相互作用や塩の架橋形成といったヘリックス間相互作用に関係していることがしばしばある（Ｃｏｈｅｎ他、１９８６年；Ｃｈａｏ他、１９９８年）。今回のケースでは、このような相互作用は、σ因子が結合する上で必要なコイルドコイル構造を形成する（β’２６０−３０９の２つのヘリックス間の）分子内相互作用である可能性がある（図３ｂ）。また、β’２６０−３０９のｅ残基とｇ残基は、結合する際にσ因子のヘリックスと分子間接触する可能性もある。電荷が変化する突然変異をβ’サブユニットのこれら残基において起こさせ、その突然変異が結合に及ぼす影響を明らかにした（図３ｂ）。
【００９６】
図示した突然変異のうちの２つは、ｅ残基またはｇ残基と関係していない。チロシン残基とアルギニン残基がタンパク質−タンパク質相互作用の“ホット・スポット”に位置することがしばしばあるという知見（Ｂｏｇａｎ他、１９９８年）に基づき、残基番号２６９のチロシン残基をアラニンで置換し、残基番号２９７のアルギニン残基をセリンで置換した。残基番号２９７の位置にロイシンが挿入されると、σ７０が結合する上で機能しないβ’サブユニットが生まれることがすでに明らかにされていた（データは示さない）。したがって、この位置にこれほど劇的ではない突然変異が起こった場合にもσ因子の結合に影響が及ぶかどうかを明らかにすることは、興味深いことだった。β’２６０−３１９領域内にあるいくつかの突然変異は、ファー−ウエスタン・アッセイにおいてσ７０との相互作用を消失させる。
ファー−ウエスタン・ブロッティングは、β’サブユニットのＮ末端領域に対するσ７０の結合部位を特定するのに用いた（実際例２）。この方法は、もともとはβ’サブユニットの突然変異体の機能を検出するのに用いられた。突然変異体をクローニングして、β’サブユニットのアミノ酸残基番号１〜３１９をコードしている遺伝子断片に導入した。これら遺伝子を含む細胞を短時間誘導し、β’サブユニットの断片のレベルが、抽出液中の他のタンパク質と同程度になるようにした。ファー−ウエスタン分析により、サンプルに対するσ７０の結合について分析した。それぞれの突然変異体β’１−３１９断片が結合したσ７０プローブの量を、野生型β’１−３１９断片が結合した量と比較した。それぞれのシグナルを、ウエスタン・ブロッティングによって明らかになった上澄みに含まれるβ’１−３１９の量で規格化した。
【００９７】
突然変異体のうちの５つ（Ｒ２７５Ｑ、Ｒ２９３Ｑ、Ｅ２９５Ｋ、Ｒ２９７Ｓ、Ａ３０２Ｄ）は、σ７０との結合能力が大きく低下していた（図４）。突然変異体Ｑ３００ＥとＮ３０９Ｄは逆の効果を持ち、野生型β’１−３１９よりも多くのσ７０が結合した。Ｑ３００Ｅは、相対的な結合能力が７倍以上に増大した。突然変異体Ｎ２６６Ｄ、Ｙ２６９Ａ、Ｋ２８０Ｅでは結合に対する影響が見られなかった。
【００９８】
β’サブユニット突然変異体を用いた場合の成長
インビボにおけるσ７０結合部位の重要性を評価するため、β’サブユニット突然変異体が、細胞にとって唯一のβ’サブユニット源として機能する能力を評価した。突然変異体か野生型の完全長β’サブユニットを含むプラスミドを導入してＲＬ６０２菌株を形質転換した（Ｗｅｉｌｂａｅｃｈｅｒ他、１９９４年；Ｒｉｄｌｅｙ他、１９８２年）。ＲＬ６０２の染色体ｒｐｏＣ遺伝子は、サプレッサーｔＲＮＡの不在下で機能するβ’サブユニットの生成を阻止するアンバー突然変異を有する。ＲＬ６０２は、温度感受性のある染色体アンバー・サプレッサーも含んでいる。許容可能な温度（３０℃）では、アンバー・サプレッサーは活性で染色体β’サブユニットの生成が可能であり、細胞は成長することができる。アンバー・サプレッサーは、許容不能な温度（４２℃）では活性ではない。したがって、４２℃では、染色体β’サブユニットは生成されず、細胞は、別のβ’サブユニット源がないと成長できない。プラスミド由来のβ’サブユニットがβ’サブユニットの代わりになるのであれば、細胞は成長し、許容不能な温度でプレート上にコロニーを形成するであろう。β’サブユニット突然変異体が代役を務められない場合には、この温度においてプレート上で細胞が成長することはない。
【００９９】
ファー−ウエスタン・アッセイにおいてσ因子の結合に欠陥のあった３つの突然変異体（Ｒ２７５Ｑ、Ｅ２９５Ｋ、Ａ３０２Ｄ）は、許容不能な温度で成長を維持することはできなかった。これは、これら突然変異体がインビボでもσ因子の結合に関して欠陥を有することを示唆している（図５）。ファー−ウエスタン・アッセイにおいて検出可能な効果が見られなかった突然変異体であるＮ２６６Ｄの場合には、許容不能な温度で幾分か成長が可能であったが、野生型と見なせるほど十分ではなかった。逆に、ファー−ウエスタン・アッセイにおいてσ７０と結合しなかった突然変異体Ｒ２９３ＱとＲ２９７Ｓは、インビボでの成長を維持することができた。他の突然変異体（Ｙ２６９Ａ、Ｋ２８０Ｅ、Ｑ３００Ｅ、Ｎ３０９Ｄ）では、成長に対する効果が検出されなかった。機能しないβ’サブユニット突然変異体の発現レベルは、３７℃で成長させる場合、プラスミド由来の野生型β’サブユニットのレベルと同じであることがわかった（データは示さない）。
【０１００】
コア／ホロ集合体
上記のさまざまな突然変異体によって引き起こされる可能性のある集合体の欠陥を評価するため、ヘキサヒスチジン・タグ付きβ’サブユニット突然変異体を、野生型の染色体β’サブユニット・タンパク質も発現する細胞の中で発現させた。Ｎｉ２＋−ＮＴＡカラムを用い、β’サブユニット突然変異体を、付随する細胞タンパク質とともに精製した。イムノアフィニティ・カラムを用いてサンプルを取り除き、Ｎｉ２＋−ＮＴＡカラムへのあらゆる非特異的な結合を減らした。
テストしたすべてのβ’サブユニット突然変異体は、集合してコア酵素になる能力を保持していた。そのことは、精製の間を通じてαサブユニットとβサブユニットが会合していたことで証明される（図６ａと図６ｂ）。ここでも、突然変異体Ｒ２７５Ｑ、Ｅ２９５Ｋ、Ａ３０２Ｄは、対数増殖期のサンプルと定常期のサンプルの両方でσ７０の結合に欠陥をもたらした。Ｅσ７０の形成がやはり減ったのは、Ｎ２６６Ｄの対数増殖期のサンプルと定常期のサンプルの両方、およびＲ２９７Ｓの対数増殖期のサンプルである。Ｑ３００Ｅは、σ７０の結合が野生型よりも多いという性質を今回も示した。Ｙ２６９Ａ、Ｋ２８０Ｅ、Ｒ２９３Ｑ、Ｎ３０９Ｄでは、Ｅσ７０集合体に対する影響を検出できなかった。ヘキサヒスチジン・タグのないβ’サブユニットをプラスミドから発現させたとき、Ｎｉ２＋−ＮＴＡカラムへの非特異的結合は検出できなかった。
すべてのサンプル溶離液についても、マイナーなσ因子のどれかが存在しているかどうかを調べた。検出するのに十分の濃度があったマイナーなσ因子は、対数増殖期のσ３２サンプル、および定常期のσ３２サンプルとσＦサンプルだけであった。これらのσ因子に関する結果は、突然変異体Ｒ２９７ＳとＱ３００Ｅを除いてσ７０に関する結果と本質的に同じだった。定常期における突然変異体Ｑ３００Ｅからのサンプルでは、σ３２とσＦのレベルが大きく低下していたのに対し、σ７０のレベルは野生型よりも高かった。この突然変異体の対数増殖期のサンプルでも、含まれているσ３２の量が低下していた。これは、Ｅσ３２の形成に欠陥があるが、定常期におけるほど深刻ではないことを示唆している。
【０１０１】
分子モデリング
最近、ツァン他（１９９９年）がテルムス・アクアティクスのＲＮＡポリメラーゼの結晶構造を報告した。大腸菌ＲＮＡポリメラーゼのβ’２６０−３０９領域をテルムス・アクアティクスにおける相同領域と比べると、配列が高い割合で保存されている（図８ａ）。テルムス・アクアティクスのβ’サブユニットのこの領域は、“コイルドコイルのような”構造を形成する。この明細書で検討している突然変異をラスモル・ソフトウエア・プログラム（Ｓａｙｌｅ他、１９９８年）を用いてテルムス・アクアティクスに当てはめてみると、σ因子の結合に関して最も欠陥のある突然変異は、コイルドコイルの一方の面に集まっていることがわかる。あるアッセイでは欠陥のある表現型だが別のアッセイでは欠陥のない突然変異は、この面の外縁部にある。検出できる影響をもたらさなかった突然変異は、コイルドコイルの反対側の面に集まっている。ただしＮ３０９Ｄは例外で、“舵”のすぐ隣りにある、コイルドコイルのまさにＣ末端に位置している（図８ｂと図８ｃ）。
【０１０２】
考察
コア・ポリメラーゼに対してさまざまなσ因子が結合するというのは、遺伝子全体の発現と制御を行なうプロセスにおける１つの重要なステップである。このステップが、限られた数のコアに対して結合しようとして競合することによる制御の一部であるか、それとも自由なσ因子が過剰なコアに対して単純に結合するというものであるかはわかっていない。σ因子相互間で競合しながらコアに結合する場合には、その競合は、σ因子の結合特異性による影響を受ける可能性がある。たいていのσ因子で配列の保存性が高いことから、すべてのσ因子がコア酵素の同じ位置に結合すると考えられている（Ｈｅｌｍａｎｎ他、１９８８年）。この明細書に記載したように、ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニット上でσ７０がインビボで結合する部位を同定した。しかもこの結合部位は、少なくともいくつかのマイナーなσ因子の結合にも関係している。さらに、この明細書に記載した方法、組成物、化合物は、σ因子が結合するにあたって重要なコアＲＮＡポリメラーゼ中の残基を同定し、σ因子−コア相互作用の結合インターフェイス候補を明らかにするのに役立つ。
【０１０３】
予測されるコイルドコイル内のｅ位置またはｇ位置を占めることが明らかにされたβ’サブユニットの残基番号２６０〜３０９の領域を対象としてσ７０の結合の消失を探すことを目的とした突然変異分析法により、３つのタイプの突然変異が得られた。すなわち、行なったすべてのアッセイでσ因子の結合が機能しなかったタイプ；いくつかのアッセイでは機能しなかったが他のアッセイでは機能したタイプ；行なったすべてのアッセイで機能したタイプである。第１のグループは、突然変異体Ｒ２７５Ｑ、Ｅ２９５Ｋ、Ａ３０２Ｄを含んでいる。これら３つの突然変異体は、インビトロとインビボでσ７０の結合が機能しなかった。これは、これら突然変異体がσ７０の結合において非常に重要な役割を果たしていることを示唆する。アルギニン２７５は、予測される２つのヘリックスのうちの第１のヘリックスのＣ末端の近くに位置しているのに対し、グルタミン２９５は第２のヘリックスの中央部に、アラニン３０２は第２のヘリックスのＣ末端の近くに位置している。このことから、β’２６０−３０９において予測される２つのヘリックスの両方がσ７０の結合に関係していることが確認される。染色体β’サブユニットの発現を止めたとき、これら残基の位置における突然変異だけが、テストした突然変異のうちで検出可能な成長を維持できなかった。これらβ’サブユニット突然変異体も、ここでの研究でテストしたどの突然変異体も、コア酵素を形成するのに必要なαサブユニットとβサブユニットの間の相互作用に関しては検出可能な欠陥を持っていなかったという事実を考えると、これは重要である。したがって折り畳みに関しては、σ７０が結合しない原因となる大きな欠陥はない。
【０１０４】
これら突然変異体タンパク質の局所構造を乱すことが可能である。全部で１０個のサブユニット突然変異体の配列を分析したところ、野生型タンパク質と比べて二次構造に変化のないことが予測された（Ｒｏｓｔ他、１９９４年；Ｍｕｎｏｚ他、１９９４年）。しかしグループ１の突然変異体の中では、Ａ３０２Ｄという変化が局所構造を最も乱しやすいであろう。この変化により、１個のメチル基の代わりに帯電した大きな側鎖が導入されることになる。また、テルムス・アクアティクスのＲＮＡポリメラーゼの結晶構造（Ｚｈａｎｇ他、１９９９年）に基づくと、Ａ３０２α炭素のほうが、溶媒に曝露されるＲ２７５またはＥ２９５の側鎖よりも、コイルドコイルの反対側のヘリックスのほうを向くことになる。Ｒ２７５ＱとＥ２９５Ｋがβ’サブユニットの局所構造に影響を与えることがなければ、σ７０の結合を妨げる性質は、立体障害、電荷の反発、σ因子との特異的相互作用の欠如のいずれかに由来する可能性が非常に高い。
グループ２の突然変異体であるＮ２６６Ｄ、Ｒ２９３Ｑ、Ｒ２９７Ｓは、特に興味深い。というのも、これら突然変異体を分析したいくつかのアッセイで、これら突然変異体が何らかの機能を持っているらしいことがわかったからである。Ｒ２９３ＱとＲ２９７Ｓは、ファー−ウエスタン・アッセイではインビトロでσ７０の結合が機能しなかったが、成長を維持し、σ７０の結合が可能なコア酵素を形成することができた。ただしＲ２９７Ｓは、対数増殖期でコア酵素突然変異体の結合効率の低下を引き起こす。これら突然変異体に関してインビトロ・アッセイとインビボ・アッセイにおいて得られた結果の違いを説明できる方法は多数ある。第１に、ファー−ウエスタン・アッセイにおける決定的な結果は、β’サブユニットの断片（１〜３１９）が、このタンパク質の一部が膜に固定化されたままσ７０の結合に必要な二次構造を取るように折り畳まれると解釈せざるをえない。したがって、欠陥を生み出す突然変異は、インビトロで折り畳みの不足をもたらす可能性がある。第２に、インビボ・アッセイでは、多数のサブユニットからなるコア酵素へのσ因子の結合を分析しており、個々のサブユニットまたは断片だけについては分析しない。コアＲＮＡポリメラーゼにはσ因子のための多数の結合部位があるという多くの証拠が報告されている（Ｓｈａｒｐ他、１９９９年；Ｊｏｏ他、１９９８年；Ｎａｇａｉ他、１９９７年；Ｏｗｅｎｓ他、１９９８年）。したがって、これら部位のうちの１つが消失しても、残っている結合相互作用によってその消失を補償できる可能性がある。突然変異体Ｒ２９３ＱとＲ２９７Ｓは、β’２６０−３０９に対してσ因子を結合させないが、σ７０がコア・ポリメラーゼ上でこれ以外の接触をすることは妨げない。
【０１０５】
Ｎ２６６Ｄは、上に説明したグループ２の他の突然変異体とは異なり、β’サブユニットに対するσ７０の結合には影響を与えなかったが、Ｅσ７０の形成をグループ１の突然変異体と同じレベルまで低下させ、しかも成長不足は少なかった。Ｎ２６６Ｄは、コイルドコイルの底部に位置しているため、突然変異があると局所構造を変化させる可能性がある。この変化は、コイルドコイルの向きをコア酵素の残りの部分に対してずらしている可能性がある。このようになっていてもコイルドコイルに対するσ７０の結合が影響を受けることはないが、σ７０とコアの間に通常は存在している他の接触がなくなる可能性がある。
【０１０６】
グループ３の突然変異体であるＹ２６９Ａ、Ｋ２８０Ｅ、Ｑ３００Ｅ、Ｎ３０９Ｄは、どれも十分に機能した。これは、これら残基とσ７０の接触が決定的に重要ではないことを示唆している。Ｑ３００Ｅという変化はかなり興味深い。この突然変異により、β’サブユニットに対するσ７０の結合が増加するように見える。ファー−ウエスタン・アッセイにおいて見られた相対的結合の大幅な増加は、インビボではそれほど劇的なものではなかった。これは、おそらく、σ７０−コア相互作用のＫｅｑがσ７０−β’サブユニット相互作用のＫｅｑよりも大きいためであろう。しかし、この突然変異体を含むＥσ７０集合体はそれでも野生型のほぼ２倍であった。コイルドコイルの相互作用に基づく抑制剤は、細胞にウイルスが導入されるプロセスを妨げたりトポイソメラーゼ活性をなくしたりするのに有効であることがわかっている（Ｅｃｋｅｒｔ他、１９９９年；Ｗｉｌｄ他、１９９４年；Ｆｒｅｒｅ−Ｇａｌｌｏｉｓ他、１９９７年）。σ因子−コア相互作用の抑制剤は、抗菌療法と同様、有効であろう。中でも、Ｑ３００Ｅ突然変異体は、そのような抑制剤の結合定数を大きくすることに関する有効な情報を提供する可能性がある。
【０１０７】
他のσ因子群は、コアＲＮＡポリメラーゼ上でσ７０と同じ部位に結合すると考えられてきた。異なるσ因子の間で保存されている残基が突然変異すると、コアとの結合が失われるであろう（Ｓｈａｒｐ他、１９９９年）トラヴィーリャら（１９９９年）は、結合したＦｅ−ＥＤＴＡによる切断を利用して、大腸菌のマイナーなσ因子のいくつかが、Ｅσ複合体の中では、コアＲＮＡポリメラーゼにσ７０が結合している領域の極めて近くに位置していることを明らかにした。マイナーなσ因子は、少なくともσ３２とσＦに関しては、確かに、コア上でσ７０が結合しているのと同じ部位の１つと結合している。これらσ因子は同じ部位と結合しているが、結合の仕方には幾分か違いがある。σ７０の結合を増加させたＱ３００Ｅ突然変異体は、σ３２とσＦに関しては特に定常期で逆の効果を持っていた。Ｒ２９７Ｓも、σ因子ごとに異なる結合特性を持っていた。この突然変異は、マイナーなσ因子の結合を増加させたが、σ７０の結合を減少させた。これら２つの突然変異体がどちらもσ７０に対してとマイナーなσ因子に対してでは逆の効果を持つことは興味深い。もっとも、検出可能なレベルだったのは２つのマイナーなσ因子だけである。これは、局所的な環境の変化が、σ７０と比べた場合、マイナーなσ因子の結合全体に対してプラスやマイナスの影響を与え得ることを示唆している。
【０１０８】
最後に、テルムス・アクアティクスのＲＮＡポリメラーゼの結晶構造は、突然変異の結果を理解しようとする際に非常に役に立ってきた。コンピュータによる予測とこの明細書に記載した突然変異の結果だけに基づいたのでは、β’２６０−３０９がコイルドコイル構造を形成することは結論できなかったであろう。しかしこの情報を、テルムス・アクアティクスと大腸菌でβ’サブユニットの配列をアラインメントしたもの、ならびにテルムス・アクアティクスの結晶構造と組み合わせることで、β’２６０−３０９がコイルドコイル構造を取っていることが明らかになる。しかしσ因子が結合する際にこの領域がどのような構造を取るかははっきりしていない。コアの結合に関係するσ７０の保存領域２．１（Ｌｅｓｌｅｙ他、１９８９年）は、σ７０のプロテアーゼ耐性ドメインの結晶構造において、領域１．２と合わさってコイルドコイルを形成する（Ｍａｌｈｏｔｒａ他、１９９６年）。また、大腸菌のσ５４において予測されるコイルドコイルは、σ因子−コア相互作用にとって重要であることがわかっている（Ｈｓｉｅｈ他、１９９９年）。これらσ因子構造は、β’２６０−３０９と相互作用して、４つのヘリックスを有するコイルドコイルを形成している可能性がある。またσ因子は、コアと結合する際に立体配座が変化することも知られている（Ｎａｇａｉ他、１９９７年；Ｃａｌｌａｃｉ他、１９９８年；ＭｃＭａｈａｎ他、１９９９年）。これは、コイルドコイルが再配置されて新しい接触が生まれたことによって起こっている可能性がある（Ｇｒｕｍ他、１９９９年；Ｅｌ−Ｋｅｔｔａｎｉ他、１９９６年）。
【０１０９】
グループ１の突然変異がコイルドコイルの同じ面にクラスターを形成しており、グループ２の突然変異がこのクラスターの縁部にあり、グループ３の突然変異がこのコイルドコイルの反対側の面にあるという事実をもとにして、β’サブユニット上のσ７０に対する結合インターフェイスを明らかにした。最近の研究により、β’２６０−３０９と相互作用しているσ７０内の領域が、σ７０の非保存領域と領域２．１−２．２の一部とを含むペプチドであることが特定された（Ｂｕｒｇｅｓｓ他、１９９８年）。β’サブユニットの残基番号１９８〜２３７の領域は、ブロドリンら（２０００年）により、ｌａｃＵＶ５プロモーターの非鋳型鎖と相互作用していることが明らかにされた。ｌａｃＵＶ５プロモーターは、σ７０の領域２．４と接触していることも知られている（Ｓｉｅｇｅｌｅ他、１９８９年；Ｗａｌｄｂｕｒｇｅｒ他、１９９０年）。
【０１１０】
実施例４
σ７０とコアＲＮＡポリメラーゼの間の相互作用を調べるためのルミネッセンス共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）
細菌の転写機構は、薬剤を発見したり設計したりするための魅力的なターゲットを提供してくれるように思われる。というのも、細菌同士の間では転写機構が非常によく保存されているが、真核生物の転写機構とは大きく異なっているからである。σ因子の集合がコアＲＮＡポリメラーゼとホロ酵素を形成するのを妨げる抑制剤は、どのようなものであれ、一般に、転写の開始を抑制し、したがって細胞の成長や、場合によっては細胞の生存を妨げるであろう。細菌の転写因子（大腸菌のσ７０）がコアと結合する際に重要であると推定されている領域（領域２．１−２．２、図２０）は、相同性が顕著に大きく（＞８０％）、細菌のマイナーなσ因子とも非常によく似ている（ＬｅｓｌｅｙとＢｕｒｇｅｓｓ、１９８９年；Ｌｏｎｅｔｔｏ他、１９９８年）。さらに、コアＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニット（図２０）は、σ因子が結合する領域（大腸菌のβ’サブユニットの残基番号２６０〜３０９）において配列が非常によく保存されている（Ａｒｔｈｕｒ他、２０００年；ＡｒｔｈｕｒとＢｕｒｇｅｓｓ、１９９８年）。これらホモロジーは、コアＲＮＡポリメラーゼのホロ形態中に、高度に保存された構造があることを示唆している。このホロ形態が形成されることは、転写が正しく開始される上で極めて重要である。したがって、この相互作用を妨げるどのような抑制剤も、幅広いスペクトルの抗生物質であることが予想される。哺乳類の細胞では、σ７０のホモログは見つかっていない。例外として、ミトコンドリアのσ因子（ＴｒａｃｙとＳｔｅｒｎ、１９９５年）と、葉緑体のσ因子（Ａｌｌｉｓｏｎ、２０００年）があるが、これらは、原核生物における対応物とは有意な相同性を持っていない。この事実は、真核生物のＲＮＡポリメラーゼ群を抑制する新しい抗生物質の候補が見つかる可能性は非常に小さく、そのような抗生物質が見つからない場合にその抗生物質を薬剤として使用すると重大な副作用を引き起こす可能性があることを意味する。
【０１１１】
σ因子を用いてＲＮＡポリメラーゼ群の抑制剤をスクリーニングするため、σ７０−β’サブユニット複合体を形成するための単純で迅速かつ信頼性の高いアッセイが必要とされている。電気泳動移動度シフト（ＥＭＳ）アッセイとファー−ウエスタン・ブロットは、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ内の結合領域を同定するのに非常に有効であることがわかっている（Ｂｕｒｇｅｓｓ他、２０００年）が、強力なハイスループット・スクリーニングを行なうためには、信号対雑音比が非常に大きい、より高速で好ましくは均一なアッセイが望ましかろう。そこで蛍光を利用としたプローブによるアッセイを選択し、複合体の形成を調べることにした。この点に関し、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）は、複合体が形成されたときに望むシグナルを発生させることのできるシステムである（Ｓｅｌｖｉｎ、１９９５年；Ｓｅｌｖｉｎ、２０００年；Ｓｔｒｙｅｒ、１９７８年）。ＦＲＥＴは、色素のスペクトル特性により違いはあるが、２つの適切な色素が約７５オングストローム未満に接近したときに起こる。これら色素の間でのエネルギーの移動は、双極子−双極子相互作用による。するとアクセプターが増感し、特別な波長の蛍光を出せるようになる。２つの発光は波長が異なっているため、別々に感知することができる。ここから２つの色素の量と相互間の距離に関する情報が得られる。効果を定量的に記述するには、２つの色素間の距離の６乗に反比例してエネルギーの移動が減少するというフェルスター理論を利用する。したがって、エネルギーの移動と色素間の距離は、発光強度とその減衰を測定することによって決定できる。
【０１１２】
ＬＲＥＴ（ルミネッセンス共鳴エネルギー移動）は、この効果を変えたものである（Ｓｅｌｖｉｎ、１９９９年）。ＦＲＥＴとは異なり、ドナーは、ランタノイド複合体と結合した有機色素である。この違いが、分光分析における好ましい特徴となる。ストークス・シフト（励起振動数と発光振動数の差）が大きいことで、装置の励起源と発光の間の大きなクロストークが避けられる。発光線が狭いため、ドナーのシグナルとアクセプターのシグナルを正確に分離することができる。ＥｕやＴｂなど、たいていのランタノイドの寿命は、Ｃｙ５などの一般に使用される大部分の有機色素の寿命（ナノ秒）よりも有意に長い（ミリ秒）。時間分解蛍光モードで測定することにより、バックグラウンドの蛍光とアクセプターに固有の蛍光が減衰した後に、シグナルの取得を開始することができる。したがってドナーによって増感したアクセプターの発光だけが測定できるため、信号対雑音比が非常に大きくなる。アッセイに使用した２つの色素を図１０に示してある。
【０１１３】
ヘイドゥクとその共同研究者は、これと同じ色素ペアを用い、ＬＲＥＴを利用して、ホロ酵素におけるσ７０に対するＤＮＡの結合を測定した（ＨｅｙｄｕｋとＨｅｙｄｕｋ、１９９９年）。以下に説明するアッセイを行なうため、ＩＣ５で標識したβ’サブユニットの断片（残基番号１００〜３０９からなり、Ｎ末端に心筋キナーゼ（ＨＭＫ）認識部位とヘキサヒスチジン・タグが融合したもの）を、Ｃｙ５で標識したポリヌクレオチドで置換した。均一アッセイのため、σ７０をユーロピウム−ＤＴＰＡ−ＡＮＣＡ複合体で標識してドナーとし、ＨＭＫ−ヘキサヒスチジン・タグ−β’サブユニットの断片（１００〜３０９）をＣｙ５−アナログＩＣ５−マレイミド（同仁化学研究所、日本）で標識した。図１１にこのアッセイを示してある。複合体が形成されるとき、ＬＲＥＴが起こる。σ７０とβ’サブユニットの間で複合体が形成されたことは、単純に、複合体の形成を示す光学的に測定可能なシグナルとして、アクセプターの遅延した発光を観測するだけでモニターできる。アッセイはマルチウエル・プレートの中で実行できる。アッセイの結果は、任意の化合物ライブラリーからの多数のサンプルに対して自動化したハイスループット・アッセイを行なうためのマルチプレート読み取り装置で測定する。典型的な反応容積は１０〜２００μｌであり、テスト物質を含む成分をマルチウエル・プレートの中で直接混合した後、プレートを読み取り装置で読み取る。蛍光を利用したこのようなアッセイは非常に感度が高い（一般に数ナノモルのレベル）ため、精度と信号対雑音比に優れており、測定中に現われる偽のヒットを避けることができる。また、このアッセイでは標識したタンパク質と基質の使用量が少ないため、全体のコストが下げられる。
【０１１４】
方法
緩衝液
以下の緩衝液を使用した：ＮＴＧＥＤ緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９；５％のグリセロール；０．１ｍＭのＥＤＴＡ；０．１ｍＭのＤＤＴ）；ＴＧＥ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９；５％のグリセロール；０．１ｍＭのＥＤＴＡ）；ＮＴＧ緩衝液＝ＦＲＥＴ緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９；５％のグリセロール）；ＴＮＴｗＧｕ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９；５００ｍＭのＮａＣｌ；０．１（ｖ／ｖ）％のトゥイーン２０；６ＭのＧｕ−ＨＣｌ）；ネイティブ・サンプル緩衝液（２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８；２０（ｖ／ｖ）％のグリセロール；０．００５％のブロモフェノール・ブルー）；保存用緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ；５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．９；５０％のグリセロール；０．５ｍＭのＥＤＴＡ；０．１ｍＭのＤＤＴ）。
【０１１５】
ＨＭＫ−ヘキサヒスチジン・タグ−β’サブユニットの断片（１００〜３０９）とσ７０の過剰産生（Ｃ１３２Ｓ、Ｃ２９１Ｓ、Ｃ２９５Ｓ、Ｓ４４２Ｃ）
プラスミドｐＴＡ１３３（ＡｒｔｈｕｒとＢｕｒｇｅｓｓ、１９９８年；図１２）は、発現ベクターｐＥＴ２８ｂ（＋）の誘導体である。まず最初に、ＨＭＫ部位をＭＣＳの５’開始部に挿入し、得られたベクターにβ’サブユニット配列の一部をクローニングして組み込むことで、アミノ酸配列ＭＡＲＲＡＳＶＨＨＨＨＨＨＭ（配列ＩＤ番号１）がβ’サブユニット（１００〜３０９）の末端に融合したキメラ（２５ｋＤａ）を得た。ＨＭＫ認識部位を下線で示してある。
【０１１６】
プラスミドｐＳｉｇｍａ７０（４４２Ｃ）（ＨｅｙｄｕｋとＨｅｙｄｕｋ、１９９９年；図１３）を、σ７０発現系であるｐＧＥＭＤ（ＩｇａｒａｓｈｉとＩｓｈｉｈａｒａ、１９９１年；Ｎａｋａｍｕｒａ、１９８０年）から誘導した。このｐＧＥＭＤは、クローニングしてｐＧＥＭＸ−１（プロメガ社）ベクターに組み込んだ大腸菌からのｒｐｏＤ遺伝子を含むＨｉｎｄＩＩＩ断片を含んでいる。これは、ＩＰＴＧによる制御された誘導と、アンピリシンを用いた選択が可能なＴ７発現系である。このプラスミドを組み込んで発現用ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノヴァジェン社）を形質転換した。細胞を１リットルの培養物としてＬＢ培地中で３７℃にて成長させた。ＬＢ培地には、１００μｇ／ｍｌのアンピリシンを入れた。培養物をＯＤ６００が０．５と０．７の間の値になるまで成長させ、０．５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。誘導を開始してから２時間後、８，０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離することにより細胞を回収し、−２０℃で凍らせて使用するときまで保存した。
【０１１７】
封入体の精製
細胞ペレット（湿った状態の重量が１〜２ｇ）を、１０ｍＭのＥＤＴＡと１００μｇ／ｍｇのリゾチームを加えた１０ｍｌのＮＴＧＥＤ緩衝液の中に再び分散させた。細胞を氷の上で３０分間インキュベートし、次いで４℃にて６０秒間の超音波バーストで３回にわたって処理した。トリトンＸ−１００（１％ｖ／ｖ）を添加して撹拌した。封入体の形態をした組み換えタンパク質を、２５，０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離することによって可溶性ライセートから分離した。それぞれのステップでＳＤＳ−ＰＡＧＥ用にサンプルを１００μｌ採取した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１４に示してある。封入体ペレットを超音波処理により１０ｍｌのＮＴＧＥＤ緩衝液＋１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００の中に再び分散させた。この混合物を２５，０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離し、上澄みを捨てた。洗浄した封入体を１０ｍｌのＮＴＧＥＤ緩衝液＋０．１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００の中に再び分散させ、２５，０００×ｇで１５分間にわたって遠心分離した。１０ｍｌのＮＴＧＥＤ緩衝液＋０．０１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００による洗浄を繰り返し、封入体の分散液を５等分して２ｍｌの小容器に入れた後、ベックマン・マイクロフュージ（Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ：登録商標）１８遠心分離機を用いて最大速度で遠心分離した。上澄みをピペットで除去し、封入体を−２０℃で凍らせて使用するときまで保存した。
【０１１８】
β’サブユニットのＮｉ−ＮＴＡによる精製とＩＣ５による誘導体化
精製のさまざまな段階で採取したサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図１５に見ることができる（クーマシー染色とＩＣ５感受性スキャン）。β’サブユニット封入体を３ｍｌのＴＮＴｗＧｕ緩衝液＋５ｍＭのイミダゾールの中に再び分散させ、室温で１５分間にわたってインキュベートした。沈殿物をマイクロ遠心機の中で１８，０００×ｇ（１４，０００ｒｐｍ）で５分間にわたって回転させることにより沈殿させ、上澄みを、５ｍｌのＴＮＴｗＧｕ緩衝液＋５ｍＭのイミダゾールであらかじめ平衡させた約０．８ｍｌのＮｉ−ＮＴＡマトリックス（キアジェン社）とともにバイオラド・カラム（ポリプレップ（ＰｏｌｙＰｒｅｐ）１０ｍｌ、０．８×４ｃｍ）に充填した。結合しなかったタンパク質を除去するため、カラムを少なくとも３ｍｌのＴＮＴｗＧｕ緩衝液＋５ｍＭのイミダゾールで洗浄した。二硫化結合をすべて還元するため、カラムを調製したばかりの５ｍｌのＴＮＴｗＧｕ緩衝液＋２０ｍＭのイミダゾールと２ｍｌのトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）で洗浄した。Ｎ２が飽和した３ｍｌのＴＮＴｗＧｕ緩衝液＋２０ｍＭのイミダゾールで洗浄することにより、過剰なＴＣＥＰと非特異的な結合をしたタンパク質を除去した。結合したタンパク質は、調製したばかりの２ｍｌのＴＮＴｗＧｕ緩衝液＋２０ｍＭのイミダゾールと０．２ｍＭのＩＣ５を充填することにより、ＩＣ５−マレイミドで誘導体化した。流出液をカラムに２回にわたって充填した後、３ｍｌのＴＮＴｗＧｕ緩衝液＋２０ｍＭのイミダゾールで洗浄することにより過剰な色素を除去した。誘導体化したタンパク質は、ＴＮＴｗＧｕ緩衝液＋２００ｍＭのイミダゾールで溶離させ、変性した状態で−２０℃にて保存した。
【０１１９】
σ７０の精製と誘導体化
１アリコート分の封入体（１０ナノモルのタンパク質、０．７ｍｇ）を５ｍｌのＴＮＴｗＧｕ緩衝液＋６ＭのＧｕＨＣｌの中に再び分散させることにより溶解させた。タンパク質を折り畳ませるため、変性剤を１００倍に希釈した。希釈にあたっては、変性剤を氷の上でゆっくりと撹拌している冷たい５００ｍｌのＴＧＥ緩衝液＋０．０１％のトリトンＸ−１００の中に入れた。沈殿が起こる場合には、遠心分離機で４℃にて２５，０００×ｇ（１５，０００ｒｐｍ、ＳＳ−３４ローター）で１５分間にわたって回転させることにより沈殿物を沈殿させる。次に、ＰＯＲＯＳ ＨＱ５０（パーセプティヴ・バイオシステムズ社）という乾燥樹脂１ｇを分散させた５ｍｌのＴＧＥ緩衝液＋０．０１％のトリトンＸ−１００を混合物に直接添加することにより、再び折り畳まれたタンパク質を陰イオン交換樹脂に結合させた。３０分間にわたって撹拌した後、分散液を２５ｍｌのエコノ・パック・カラム（バイオラド社）の上に注ぎ、５ｍｌのＮＴＧ緩衝液で洗浄した。カラムに栓をし、樹脂を５ｍｌの保存用緩衝液の中に再び分散させ、１０のアリコートに等分し、ゆすいだ空のファルマシア・スピン・カラムに移し、−２０℃で保存した。使用する前に、卓上遠心分離機を用い、スピン・カラム内の緩衝液を、５０００×ｇ（４５００ｒｐｍ）で遠心分離することにより除去した。σ７０に標識するため、５００μｌのＮＴＧＥ緩衝液＋０．０１％のトリトンＸ−１００と０．１μモルのＤＴＰＡ−ＡＮＣＡ（ヘイドゥク研究室からの寄贈）を用いて樹脂を再び分散させ、室温で３０分間にわたってインキュベートした。５μＭのＥｕＣｌ３を誘導体化されたタンパク質とともに樹脂に充填することにより、Ｅｕ−複合を形成した。４５００ｒｐｍで遠心分離した後、カラムを５００μｌのＮＴＧＥ緩衝液＋０．０１％のトリトンＸ−１００で洗浄した。次に、１００μｌのＮＴＧＥ緩衝液＋５００ｍＭのＮａＣｌを用い、標識したタンパク質を溶離させた。流出液（標識したσ７０）をそのままアッセイで使用した。
【０１２０】
陰イオン交換樹脂ＰＯＲＯＳ ＨＱ５０（パーセプティヴ・バイオシステムズ社）の代わりにＤＥ５２（ホワットマン社）を用いることができる。さらに、標識操作は、イオン交換カラムからタンパク質溶液を精製・溶離した後、そのタンパク質溶液に色素のアリコートを添加するだけで実現することもできる（同じ緩衝液、同じ条件）。次に、ファルマシアＧ５０スピン・カラムを用いて過剰な標識とＥｕイオンを除去した。
【０１２１】
標識したσ７０とβ’サブユニットの間で複合体が形成されたことを確認するための電気泳動移動度シフト（ＥＭＳ）アッセイ
このアッセイは、２×天然サンプル緩衝液とＮＴＧ緩衝液（全量が２００μｌ；５％のグリセロール；５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８；５０ｍＭのＮａＣｌ；０．００５％（ｗ／ｖ）のブロモフェノール・ブルー；不溶性添加物を添加する場合に使用する２．５％のＤＭＳＯ）を用いることにより得られた緩衝液の中で実行した。標準的なタンパク質の濃度は、σ７０（標識したタンパク質）が２μＭ、β’サブユニット（標識したタンパク質）が２μＭであったが、それぞれ２００ｎＭと１００ｎＭまで少なくすることができる。テスト物質に対し、標識したσ７０を最初に添加し、次に抑制剤の候補を添加し、次いで変性した標識付きβ’サブユニットを添加する。それぞれの成分を添加した後、溶液をよく混合した。この混合物を室温で５分間にわたってインキュベートし、次にそこから１５μｌを採取して、成型したポリアクリルアミド・ゲル（１２ウエル、１２％、トリス／グリシン、ノヴェックス社）に充填した。温度の低い部屋（４℃）の中で、あらかじめ冷やした緩衝液、ゲル、装置を用い、１２０Ｖの定圧（５〜２０ｍＡ、可変）で２．５時間にわたって電気泳動を行なった。ＩＣ５の発光は、ストーム・システム（モレキュラー・ダイナミクス社）を赤色蛍光モードにして測定した。Ｅｕの発光は、ＵＶボックス（λ励起＝３１２ｎｍ、フォトダイン社）を用いて６秒間の取得時間で測定した。ゲル・コード染色溶液（ピアース社）を製造会社の指示に従って用いてすべてのタンパク質をクーマシー・ブルー色素で染色し、ヒューレット・パッカード社のスキャナーにオレンジ色のフィルタを付けて測定した。
【０１２２】
標識したσ７０とβ’サブユニットの間のタンパク質−タンパク質相互作用が抑制されたかどうかを調べるＦＲＥＴアッセイ
このアッセイは、ＮＴＧ緩衝液（合計２００μＬ）＋２．５％のＤＭＳＯ（不溶性添加物を用いる場合）に１０ｎＭのσ７０＊（標識したタンパク質）と５０ｎＭのβ’サブユニット＊（標識したタンパク質）を加えたものの中で行なった。テスト物質に対し、標識したσ７０をまず最初に添加し、次に抑制剤の候補を添加し、最後に変性した標識付きβ’サブユニットを添加した。それぞれの成分を添加した後、溶液をよく混合した。この混合物を室温で５分間にわたってインキュベートし、９６ウエル・プレート（コスター３６５０）の中でマルチプレート読み取り装置（ワラック社、ＶｉｃｔｏｒＶ２ １４２０）を用いて測定を行なった。この時間分解蛍光測定では、製造業者のプロトコル（ＬＡＮＣＥハイ・カウント６１５／６６５）を利用した（１０００フラッシュにより３２５ｎｍで励起し、測定は、１００マイクロ秒遅延させて行ない、６１５ｎｍと６６５ｎｍで５０マイクロ秒にわたってシグナルを取得した）。蛍光測定では、内部基準として二次発光の波長を用いるのが一般的である。こうすることにより、装置の雑音を補正することができるだけでなく、個々のケースにおけるドナーの実際の量に対して信号を規格化することもできる。こうしたことが可能なのは、ドナーの発光波長とアクセプターの発光波長がよく分離されており、マルチプレート読み取り装置で別々に測定できるからである。ＩＣ５の発光は、（基準のクロストークを測定することにより）Ｅｕ発光バンドからの非常に少量のシグナルに対して補正し、Ｅｕシグナルの強度で割る。規格化は測定プロトコルの中に組み込まれており、マルチプレート読み取り装置の製造業者（ワラック社）がそれについて説明している。この方法にはこのような特徴があるため、実際の抑制によるシグナルの低下と、検体からの内部フィルタ効果によって起こる単なる吸収とを区別することができる。これは、実際のハイスループット・スクリーニングにおける偽のシグナルを同定するのに役立つ。
【０１２３】
結果
標識したσ７０とβ’サブユニットの間で複合体が形成されたことを確認するための電気泳動移動度シフト（ＥＭＳ）アッセイ
ＥＭＳアッセイの結果は、標識したタンパク質も標識のないタンパク質も複合体を形成でき、天然ゲル中で単独のσ７０よりも高い位置に来ることをはっきりと示していた。別のいろいろな測定法によってもＥＭＳアッセイにおけるバンドが何であるかが確認された（図１１）。さらに、ＥＭＳアッセイにより、標識のないβ’サブユニットの断片が、標識したσ７０と競合できることが示された。したがって、標識のないβ’サブユニットの断片それ自体は、アッセイにおいて標識したβ’サブユニットの断片とσ７０の結合を妨げることのできる薬剤に対する正の調節物質となる。
【０１２４】
標識したσ７０とβ’サブユニットの間でタンパク質−タンパク質相互作用の抑制が起こるかどうかを調べるＬＲＥＴアッセイ
ＬＲＥＴアッセイはＥＭＳアッセイの代わりになる迅速で再現性のある方法であり、このＬＲＥＴアッセイにより、標識したσ７０とβ’サブユニットの間でのタンパク質−タンパク質相互作用の発生と抑制を調べることができる。ＥＭＳアッセイによるすべての結果は、ＬＲＥＴアッセイでも再現された。例えば、標識のないσ７０の量を増やすことにより、β’サブユニットに対する結合が、標識したσ７０と競合することが観測された（図１７）。さらに別の実験では、塩（ＮａＣｌ）と溶媒（ＤＭＳＯ）に対する依存性が明らかになった（図１８と図１９）。ＮａＣｌの濃度を１００ｍＭから４００ｍＭに増やすとシグナルが５０％に低下する。ＮａＣｌがアッセイに対してこのように影響を及ぼすことからわかるように、塩の濃度はシグナルに対して大きな効果を持つ。β’サブユニットとσ７０の間のこの相互作用は、ＮａＣｌの濃度を大きくすると弱くなることが知られている。他方、テストすべきエフェクターのための溶媒候補であるＤＭＳＯは、アッセイに対して有意な効果を及ぼさなかった。図１９からわかるように、ＬＲＥＴアッセイにおけるシグナルは、存在するＤＭＳＯの量が５％のところまで大きな影響を与えない。同じ実験において、エタノールは１〜５％の範囲で有意な効果を示した。このアッセイの信号対雑音比は７〜１０であった。このような値だと、より正確な読み取りによって偽のシグナルが除去されるので、ハイスループット・スクリーニングにとって特に望ましい。
【０１２５】
考察
細菌のコアＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）とσ因子の間の主要なタンパク質−タンパク質相互作用が薬剤発見のための第１の標的となると考えてよい理由がいくつかある。この標的に可能性があることを理解するためのカギは、転写が開始されるためにはσ因子がコアＲＮＡＰに結合することが絶対に必要だということにある。いかなる細菌の細胞も、この相互作用を効果的に妨げる抑制剤を取り込むと必ず死ぬからである。両方のタンパク質の結合領域は細菌間で非常によく保存されており（図２０）、既知のどの真核生物のホモログとも有意に異なっているので、生物活性が非常に大きいことに加え、特異性がよいことも期待される。これは、ヒトＲＮＡＰとの干渉によって副作用が起こる確率が非常に小さいことを意味する。
部位それ自体に、特異的な多数の標的候補よりも優れている別の点がある。ＲＮＡＰのβ’サブユニット上の結合部位は１つの細菌のすべてのσ因子と相互作用するため、結合部位でいずれか１つのσ因子と結合する抑制剤に対抗するのに点突然変異を通じて耐性を発達させることはありそうにない。それというのも、β’サブユニットとすべてのσ因子の両方で同時に耐性が生まれる必要があるからである。抗生物質に対する耐性が高まり、新しい抗生物質がますます要求されていることから、このことが、最近、薬剤発見における主要な問題となっている。
コアＲＮＡＰに対するσ因子の結合を測定するルミネセンス共鳴エネルギー移動（ＬＲＥＴ）アッセイは、ヘイドゥクとその共同研究者により、効果的で非常に感度のよい方法であることが示されている。上記のアッセイにおけるＬＲＥＴのドナーを調製するため、特性がよくわかったσ７０（４４２Ｃ）突然変異体を用いた。この突然変異体は、突然変異によりすべての天然のシステイン残基がセリン残基に代わったもので、ＤＴＰＡ−ＡＭＣＡ−マレイミド−Ｅｕ複合体を用いて誘導した。Ｎ末端にＨＭＫ部位とヘキサヒスチジン・タグが融合したＲＮＡＰのβ’サブユニットの断片（残基番号１００〜３０９）は、ＩＣ５−マレイミドを用いて誘導し、ＬＲＥＴのレセプターとした。この色素ペアについては、分光分析における特徴とＬＲＥＴ実験における挙動がよくわかっている。時間分解された蛍光に基づく比色測定とＥＭＳアッセイにより、標識したタンパク質が、標識があろうがなかろうがあらゆる組み合わせで互いに結合できることがわかった。対照として、標識のないタンパク質をテストし、標識のある対応物と競合できるかどうかを確認した。ＥＭＳとＬＲＥＴの両方のアッセイにおいて、標識のないβ’サブユニットまたはσ７０は、複合体内で標識のある対応物と結合を競合することができた。したがって、ＬＲＥＴアッセイを利用してσ７０のβ’サブユニットへの結合を調べるとともに、このタンパク質−タンパク質相互作用の抑制剤をスクリーニングすることができる。
【０１２６】
ＬＲＥＴアッセイは、この特定の複合体の形成に対する迅速で感度のよいプローブとなる。基質と材料は、容易に入手できるか、簡単で効率的な方法で調製することができる。標識したすべてのタンパク質は、保存中も非常に安定していた。これは、１０，０００〜１００，０００またはそれ以上の物質を含む大きなライブラリーのスクリーニングをするときに大きな利点となる。さらに、ＬＲＥＴアッセイは非常に高感度であるため、タンパク質の濃度が１〜１００ｎＭと非常に低い場合でも測定を行なうことができ、その結果としてスクリーニングする物質１つあたりのコストが非常に低くなる。
【０１２７】
ＬＲＥＴアッセイは、非常に感度がよいだけでなく、正確でもあることがわかった。偽のシグナルが正しいシグナルであるかのごとく読み取られるのを避ける上で、信号対雑音比が７〜１０と非常によいことと、テスト物質の内部フィルタ効果による蛍光のクエンチを結合の抑制から識別するのに有効な内部基準法とは、大いに役立つ。また、テスト物質に対する溶媒候補であるＤＭＳＯとこのアッセイは非常に相性がよいため、ハイスループット・スクリーニングへの適用可能性が大きくなる。多くの天然産物も、ライブラリーとコンビナトリアル・ライブラリーからのたいていのペプチドまたは小分子も水に溶けにくいため、有機溶媒を使う必要がある。この点に関し、ＤＭＳＯは最も柔軟性がある強力な溶媒である。また、ＤＭＳＯはいろいろなライブラリーでしばしば用いられているため、どのようなハイスループット・アッセイに対しても望ましい相溶性を示す。
【０１２８】
さらに、シグナルの特性を向上させるため、あるいは単により安くてより入手しやすい化合物を利用するため、ＤＴＰＡ−ＡＭＣＡ−ＥｕＩＩＩとＩＣ５以外でＦＲＥＴに基づくシグナルを出すプローブを用いることもできる。ＩＣ５（同仁化学研究所、日本）の代わりにＣｙ５（アマーシャム社）を用いるという単純な変更について上に説明したが、この変更がアッセイに影響しないことがわかっている。ＤＴＰＡ−ｃｓ１２４−ＲやＴＴＨＡ−ＡＭＣＡ−Ｒ（Ｓｅｌｖｉｎ、１９９９年）といった他のユーロピウム・キレートが適切であることが報告されている。パッカード社（（Ｅｕ）ＫまたはＸＬ６６５試薬、ＴＲＡＣＥ試薬）やワラック社（ＤＥＬＦＩＡ試薬とＬＡＮＣＥ試薬）などの会社は、プレート読み取り装置とともにこのような色素も提供している。例えば、アロフィコシアニンＡＰＣ（ＸＬ６６５のアナログ）（Ｂｏｉｓｃｌａｉｒ他、２０００年）をアクセプターとし、Ｅｕドナーと組み合わせて使用することができる。いずれの場合にも、色素は、標的タンパク質を認識する特異的抗体に付着させることができる。テルビウムという別の希土類金属は、同様の複合体中でＥｕに対する別のＬＲＥＴドナーとして機能することができる。ファロイジン−テトラメチルローダミンもＬＲＥＴアクセプターであることが報告されている。最近、標的タンパク質といろいろな緑色蛍光タンパク質が融合したさまざまな融合体を用いてインビボでＦＲＥＴを観測し（Ｈａｒｐｕｒ他、２００１年；ＰｏｌｌｏｋとＨｅｉｍ、１９９９年）、インビボでの条件下で化合物候補の抑制効果を測定することが可能になっている。この抑制効果では、薬剤を標的とする組織に運ぶことも考慮されている。色素ペアとしては、例えばＢＦＰ、ｅＧＦＰ、ＣＦＰ（シアン）、ＹＦＰ（イエロー）、ｅＹＦＰの中から選択したペアを用いることができよう。したがってタンパク質は、トランスフェクションまたは接合を通じて任意の細菌に届けることができよう。あるいはタンパク質を酵母の２ハイブリッド系で用い、インビボでの抑制性化合物候補をスクリーニングすることができよう。
【０１２９】
天然産物ライブラリーをハイスループット・アッセイでスクリーニングする場合には、決定的なヒットがあると、そのような活性モードの物質は知られていないため、新しい抗生物質である可能性がある。他方、スクリーニングが、活性モードがまだ同定されていなかったり、２つ以上の活性を持っていたりする既知の抗生物質を同定するのに役立つこともある。コンビナトリアル・ライブラリーからの決定的なヒットと合わせて考えることにより、これらの物質は、望ましい特性を有する新しい化合物を設計したり要求に合わせて作ったりするためのリード構造物として役に立つ可能性がある。なお望ましい特性としては、活性、特異性、安定性、細胞内に入る能力などが高いことのほか、副作用、コスト、耐性の発達可能性などが小さいことが挙げられる。さらに、このアッセイは、コアに対するさまざまなσ因子とσ因子突然変異体の相対的結合度を調べるための強力なツールとなりうる。
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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あらゆる出版物、特許、特許出願を、本明細書に援用する。ここまで本発明をいくつかの好ましい実施態様について説明するとともに、理解しやすくすることを目的として多くの細かい点を示してきたが、本発明にはさらに別の実施態様が可能であり、ここに説明した細かい点のいくつかを本発明の基本本質の範囲内で大幅に変更しうることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
整列断片ラダー（ｏｒｄｅｒｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌａｄｄｅｒ）・ファー−ウエスタン法の概略図。ヘキサヒスチジン・タグを付けた標的タンパク質を切断し、得られた断片をＮｉ２＋−ＮＴＡカラムで精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ニトロセルロース上で電気泳動にかける。ブロットされたタンパク質の断片を洗浄して変性剤を除去し、断片内の相互作用ドメインが再び折り畳まれるようにする。相互作用ドメインは、放射性標識したタンパク質をプローブとして用いることにより同定できる。相互作用ドメインのマッピングは、相互作用ドメインの一部が失われているためにプローブとはもはや結合しない断片を同定することにより行なう。
【図２】
整列断片ラダー・ファー−ウエスタン・ブロットの一例。Ａ）ヒドロキシルアミン（ＮＨ２ＯＨ、“Ｈｙｄ”）および２−ニトロ−５−チオシアノ安息香酸（ＮＴＣＢ）という化学的切断剤を用いた場合の、大腸菌ＲＮＡポリメラーゼのβ’サブユニット上にある化学的切断部位の位置を示す図。これら切断部位は、マックヴェクター（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ）プログラム（オックスフォード・モレキュラー・グループ）を用いてアミノ酸配列から予測した。数字は、左側のＮ末端から数えたアミノ酸の位置を示す。“１”は切断部位を、“２”は互いに非常に近接した２つの部位を示す。Ｂ）Ｃ末端にヘキサヒスチジン・タグが付いたβ’サブユニットをＮＨ２ＯＨまたはＮＴＣＢで切断した場合の整列断片ラダー。左側にはＳＤＳゲル上で予想されるバンドの図が示してある。中央にはクーマシー染色した実際のゲル、右側には、ニトロセルロース上にブロットし、３２Ｐで標識したσ７０をプローブとして調べた同じゲルが示してある。ＮＨ２ＯＨにより切断された断片の結果から、Ｎ末端にヘキサヒスチジン・タグが付いた断片のほとんどはプローブと結合するのに対し、Ｃ末端にヘキサヒスチジン・タグが付いたタンパク質は完全長のものだけがプローブと結合することがわかる。したがって相互作用ドメインは、β’サブユニットのアミノ酸番号１〜３０９の間の領域にある。
【図３ａ】
β’サブユニットの残基番号２６０〜３０９の領域。（Ａ）β’サブユニットの残基番号２６０〜３０９にある相互作用ドメインの概略図。文字が書かれている区画は、真核生物と原核生物のＲＮＡポリメラーゼの最大のサブユニット群の中にある保存された領域を示す（Ｊｏｋｅｒｓｔ他、１９８９年）。β’２６０−３０９という相互作用ドメインは、β’サブユニット内の保存された領域Ｂの一部と重なっている。相互作用ドメインの下には、予測されるαヘリックスとコイルドコイルが示してある。
【図３ｂ】
（Ｂ）β’２６０−３０９において予測されるコイルドコイルのヘリカル・ホイール図。予測される２つのヘリックスが互いに相互作用して逆平行のコイルドコイルを形成している様子が示してある。突然変異は、元の残基の隣りに残基番号とともに示してある。Ｎ末端は、右側のヘリックスのアミノ酸Ｎ２６６の位置にある。このヘリックスは紙面から手前に飛び出すように描かれているのに対し、左側のヘリックスは紙面の裏側に向かい、Ｎ３０９で終結している。
【図４】
野生型β’１−３１９または突然変異体β’１−３１９を含む細胞抽出液のウエスタン・ブロットおよびファー−ウエスタン・ブロット。細胞抽出液は、８〜１６％のトリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、ニトロセルロースにブロットし、プローブとして（Ａ）アンチβ’サブユニット抗体、または（Ｂ）３２Ｐで標識したσ７０を用いて調べた。（Ｃ）β’サブユニットの野生型断片とβ’サブユニットの突然変異体断片に対するσ７０の結合度の相対値。野生型β’１−３１９断片と突然変異体β’１−３１９断片に対するσ７０の結合をファー−ウエスタン・ブロット分析で測定した値の相対値は、使用したβ’１−３１９断片の量を定量的ウエスタン・ブロット分析により測定した値で規格化した（野生型＝１．０）。誤差棒は、標準偏差を表わす。結果は、別々に３回行なった実験の平均である。
【図５】
β’サブユニット源としてプラスミドに由来するβ’サブユニットの野生型または突然変異体だけを用いた場合の成長。野生型または突然変異体の完全長β’サブユニットをコードするプラスミドを用いて菌株ＲＬ６０２を形質転換した。次に、形質転換した細胞（１０μｌ）を２枚のプレート上にスポットになるように載せ、一方は３０℃（許容範囲内）で、他方は４２℃（許容範囲外）で２４〜４８時間にわたってインキュベートし、成長を評価した。
【図６Ａ】
できあがったコア酵素および／またはホロ酵素。成長した細胞を、野生型β’サブユニットまたは突然変異体β’サブユニットを発現したプラスミドとともに回収し、精製して、プラスミド由来のヘキサヒスチジン・タグ付きβ’サブユニットを単離するとともに、そのβ’サブユニットとの間のあらゆる複合体も単離した。Ｎｉ２＋−ＮＴＡで精製したサンプルからのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロースにブロットした。次にこのブロットを、指定された各サブユニットに対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を用いて調べた。（Ａ）対数増殖期のサンプル。
【図６Ｂ】
（Ｂ）定常期のサンプル。Ｈｉｓ６タグなし：ヘキサヒスチジン・タグなしでプラスミド由来の野生型β’サブユニットを発現している菌株。
【図６Ｃ】
（Ｃ）突然変異体β’サブユニットに対するσ７０の結合を野生型β’サブユニットに対するσ７０の結合と比較し、保持されているαサブユニットの量で規格化した値（野生型＝１．０）。結果は、別々に３回行なった実験の平均である。誤差棒は、標準偏差を表わす。
【図６Ｄ】
マイナーなσ因子について調べた場合の対数増殖期のサンプルと定常期のサンプル。
【図６Ｅ】
マイナーなσ因子について調べた場合の対数増殖期のサンプルと定常期のサンプル。
【図７】
突然変異体に関するデータのまとめ。
【図８ａ】
突然変異のモデリング。（Ａ）大腸菌のβ’２６０−３０９と、テルムス・アクアティクスにおける相同領域のタンパク質配列をアラインメントした図。白抜きの文字は、大腸菌とは一致しない文字を示す。
【図８ｂ】
ラスモル（Ｒａｓｍｏｌ）・ソフトウエア・プログラム（Ｓａｙｌｅ他、１９９５年）を利用してテルムス・アクアティクスのＲＮＡポリメラーゼの結晶構造（Ｚｈａｎｇ他、１９９９年）上に突然変異を配置したモデルに関する２つの図。（Ｂ）ポリメラーゼの方向を向いたコイルドコイルの中心を見下ろした図。
【図８ｃ】
（Ｃ）コイルドコイルの側面図。実行したすべてのアッセイで欠陥のあった突然変異は緑色にした。すべてではなくいくつかのアッセイで欠陥のあった突然変異はシアンに着色してある。常に機能した突然変異は紫色にしてある。この構造の向きを示すため、茶色の“方向標識”を付けてある。
【図９】
実施例４で説明するタンパク質結合アッセイで使用するσ７０とβ’サブユニットの断片の構造を示す。名称の下には、突然変異部位と誘導体化部位（太字）がそれぞれ示してある。ＨＭＫ−Ｈｉｓ６−β’−１００−３０９は、残基番号１００〜３０９を含むβ’サブユニットの断片であり、Ｎ末端に心筋キナーゼ（ＨＭＫ）認識部位とヘキサヒスチジン・タグが融合している。β’サブユニットの断片中にあるマゼンタに着色したコイルドコイルのαヘリックス構造は、ＲＮＡＰにおける主要なＧ結合エレメントであるらしい。ＩＣ５は、ピンク色にしてある。σ７０でコアＲＮＡＰと結合するのに中心的な役割を果たす領域は、領域２．１（緑色）と領域２．２（黄色）である。これ以外に着色してあるのは、σ７０構造の領域２．３（青色）、領域２．４（茶色）、非保存領域（白色）、Ｎ末端（赤色）である。Ｅｕ−ＤＴＰＡ−ＡＭＣＡ複合体は、濃い青色にしてある。
【図１０】
タンパク質を誘導体化するのに用い、ＬＲＥＴアッセイにおいて蛍光体となる色素。
【図１１】
標識したタンパク質β’１００−３０９とσ７０が結合するときにＬＲＥＴシグナルがどのようにして発生するかを示す図。ＩＣ５で標識したβ’サブユニットの断片の蛍光は、３２０ｎｍで励起してから５０マイクロ秒後にデータを取得するまでの遅延時間の間に減衰する。Ｅｕの発光は長くて１ミリ秒を超えるため、複合体からは、標識したσ７０のＥｕの発光と、増感したＩＣ５の発光だけが、遅延時間を経過した後に観測できる。このため、バックグラウンドの信号が最小になり、効率的なハイスループット・スクリーニング・アッセイにおいて望ましい信号対雑音比が得られる。
【図１２】
プラスミドｐＴＡ１３３のマップ。プラスミドｐＴＡ１３３は、発現ベクターｐＥＴ２８ｂ（＋）（ノヴァジェン社）に由来する。Ｎ末端のＨＭＫ部位とヘキサヒスチジン・タグ・コード配列を、β’サブユニットの残基番号１００〜３０９の領域とともに挿入した。このプラスミドは、大腸菌内でクローニングするためのｐＢＲ３２２複製起点と、選択のためのカナマイシン耐性遺伝子とを有する。ＩＰＴＧを通じた誘導をよく制御できるようにするため、ｌａｃＩリプレッサー遺伝子を含めてある。
【図１３】
発現プラスミドｐＳｉｇｍａ７０（４４２Ｃ）のプラスミド・マップ。このプラスミドはｐＧＥＭＸ−１（プロメガ社）由来であり、アンピリシン選択を伴ったＴ７発現系において発現させることができる。
【図１４】
封入体を精製したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。β’サブユニットの断片（左）とσ７０（右）についてのもの。ゲルは、ジェルコード（ＧＥＬＣＯＤＥ：ピアース社）とクーマシー・ブルーで染色した。ゲルは両方ともＮｕＰＡＧＥ（ノヴェックス社）だが、左のゲルは１２％のポリアクリルアミド、右のゲルは４〜１２％の勾配を有するポリアクリルアミドにした。
【図１５】
β’サブユニット精製ステップと、誘導体化ステップ（クーマシー染色とＩＣ５スキャン）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。ＩＣ５スキャンは、モレキュラー・ダイナミックス・ストーム・システムを赤色蛍光モードで用いて実施した。
【図１６】
２回のＥＭＳアッセイと３つの異なる取得方法による結果。右側の図から、標識したβ’サブユニットの断片の量を増やすと、複合体を表わす上方のバンドにすべてのσ因子をシフトさせうることが、クーマシー染色したゲルからわかる。同じゲルに関する下の写真は、ＵＶボックスで取得したものである。このＵＶボックスでは、カメラにオレンジ色のフィルタを付けて３１２ｎｍの波長で励起させるため、Ｅｕの発光だけを見えるようにすることができる。この写真により、両方のバンドがＥｕ標識したσ因子を含んでいることが確認される。両側の一番下には、上と同じゲルに関する別の写真がある。これは、ＩＣ５標識だけを見えるようにするストーム・イメージャー（Ｓｔｏｒｍ Ｉｍａｇｅｒ：モレキュラー・ダイナミックス社）を用いて取得したものである。この写真により、上方のバンドだけがβ’サブユニットの断片を含んでいることが確認される。結合していないβ’サブユニットの断片はほとんどゲルの中に移動せず、拡散バンドとなる（データは示さず）。
【図１７】
標識していないσ７０の量を増やしていったとき、β’サブユニットの断片に対する結合が、標識したσ７０との間で競合する様子。シグナルが低下していくのは、標識したβ’サブユニットの断片が競合により標識したσ７０から取り去られ、もはやＬＲＥＴを通じて増感されることがないからである。
【図１８】
ＬＲＥＴアッセイのＮａＣｌ濃度依存性。塩の量が増えるにつれ、ＬＲＥＴシグナルは有意に減少する。これは、σ７０／β’サブユニット複合体の形成量が減少しているためであるに違いない。
【図１９】
アッセイのＤＭＳＯ濃度依存性。タンパク質の添加前にアッセイ用緩衝液と混合するＤＭＳＯの量（０〜５％）を増やしても、シグナルには有意な影響が現われない。
【図２０】
Ａ）大腸菌のσ７０の構造領域と機能領域の図。Ｂ）σ７０の領域２．１−２．２のホモログの配列をアラインメントした図。Ｃ）大腸菌のσ因子をアラインメントした図。Ｄ）さまざまな細菌のβ’２６０−３０９の配列をアラインメントした図。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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