(57)【要約】本発明はワクチンとして医療に用いる際の、２個またはそれ以上のストレプトコッカス・ニュモニエ蛋白の組み合わせと、その製造法および使用に関するものである。これらの組み合わせは幼児や高齢者をストレプトコッカス感染から守るために特に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヒスチジントライアッドファミリー（ＰｈｔＸ）、コリン結合蛋白ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸ末端切断物、ＬｙｔＸファミリー、ＬｙｔＸ末端切断物、ＣｂｐＸ末端切断物―ＬｙｔＸ末端切断物キメラ蛋白、ニューモリシン（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５およびＳｐ１３３からなる群より選択される、少なくとも２つのストレプトコッカス・ニュモニエ蛋白を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
ポリヒスチジントライアッドファミリー（ＰｈｔＸ）から由来の１つの蛋白と、コリン結合蛋白ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸ末端切断物、ＬｙｔＸファミリー、ＬｙｔＸ末端切断物、ＣｂｐＸ末端切断物―ＬｙｔＸ末端切断物キメラ蛋白、ニューモリシン（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５およびＳｐ１３３からなる群より選択されるもう１つの蛋白とを含む、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
コリン結合蛋白ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸ末端切断物およびＣｂｐＸ末端切断物―ＬｙｔＸ末端切断物キメラ蛋白からなる群より選択される１つの蛋白と、ポリヒスチジントライアッドファミリー（ＰｈｔＸ）、ＬｙｔＸファミリー、ニューモリシン（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５およびＳｐ１３３からなる群より選択されるもう１つの蛋白とを含む、請求項１記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
ＰｈｔＸが、ＰｈｔＡ、ＰｈｔＢまたはＰｈｔＤである請求項１ないし３記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
ＣｂｐＸがＣｂｐＡまたはＣｂｐＣである請求項１ないし４記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
付加的にアジュバントを含む請求項１ないし５記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の免疫原性組成物を含むワクチン。
【請求項８】
請求項１ないし６に記載の免疫原性組成物で哺乳類を免疫化することにより、免疫反応を引き出す方法。
【請求項９】
年齢が５５歳より上の患者におけるストレプトコッカス感染を防止または改善する方法であって、安全かつ効果的な量の請求項７記載のワクチンを当該患者に投与することを含む方法。
【請求項１０】
年齢が５５歳より上の患者における肺炎の防止のための医薬を製造する際の、請求項７記載のワクチンの使用。
【請求項１１】
幼児における中耳炎を防止または改善する方法であって、安全かつ効果的な量の請求項７記載のワクチンを当該患者に投与することを含む方法。
【請求項１２】
２つの異なったストレプトコッカス・ニュモニエ蛋白を選択し、単離して、これらの蛋白を医薬上許容されるキャリアと混合する工程を含む、請求項７記載のワクチンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、２個またはそれ以上のエス・ニュモニエ（Ｓ． ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）蛋白の組み合わせ、その製造および医薬におけるワクチンとしての使用に関する。これらの組み合わせは幼児や高齢者をストレプトコッカス感染から保護するために特に有効である。
【０００２】
（従来技術）
ストレプトコッカス・ニュモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、（特に若年層と高齢者において）深刻な罹患率と死亡率の原因となっているグラム陽性菌であり、肺炎、菌血症、髄膜炎のような侵襲性疾患や、急性中耳炎のようにコロニー形成に付随する疾患を引き起こしている。アメリカでの６０歳を越える人々における肺炎球菌性肺炎の感染率は、１０万人当たり３〜８人と概算されている。これらのケースの２０％では、菌血症や髄膜炎のような症状に至り、抗生物質を用いているにも関わらず死亡率は３０％に近い。
【０００３】
肺炎球菌は血清型特異性を付与する化学結合した多糖体からなる莢膜を有している。肺炎球菌には９０種の公知の血清型があり、莢膜は補体から細菌の内面を保護するだけでなく、それ自体免疫原性に乏しいため、莢膜が肺炎球菌に対する主な病原性決定因子となっている。多糖体はＴ細胞非依存性抗原であるので、ＭＨＣ分子上でＴ細胞と相互作用するように抗原処理や抗原提示され得ない。しかしながら、多糖体はＢ細胞上の表面レセプターの架橋に関わる別の機構を通して、免疫系を刺激し得る。
侵襲性肺炎球菌による疾患の防御は、莢膜に特異的な抗原と最も強い相関関係があり、血清型に特異的であることがいくつかの実験により示されている。
【０００４】
ストレプトコッカス・ニュモニエは、幼児や小さい子供における侵襲性細菌疾患や中耳炎の原因では最も一般的である。同様に、高齢者は肺炎球菌ワクチンに僅かな反応しか示さず［Ｒｏｇｈｍａｎｎら、（１９８７）Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．４２：２６５−２７０］、それ故、この母集団では細菌性肺炎の発生率が増加している［ＶｅｒｇｈｅｓｅおよびＢｅｒｋ、（１９８３）Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）６２：２７１−２８５］。
２３価の非結合肺炎球菌ワクチンは０％〜８１％という広く多様な範囲で臨床的有効性を示した（Ｆｅｄｓｏｎら、（１９９４）Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． １５４：２５３１−２５３５）。その有効性は高齢者のホジキン病、脾臓摘出、鎌状赤血球、無ガンマグロブリン血症のような免疫処理されるべき、危険性のあるグループに関連しているようであり（Ｆｉｎｅら、（１９９４）、Ａｒｃｈ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． １５４：２６６６−２６７７）、さらには疾患の徴候にも関わっているように見える。その２３価のワクチンは（高齢者のような危険性の高いグループには）肺炎球菌性肺炎や中耳炎に対する防御を示さない。
【０００５】
幼児において、この免疫原性の欠損を解決するよう考えられた方法は、多糖体をラージ免疫原性蛋白に結合させることを含むものである。その蛋白は、バイスタンダー細胞である、Ｔ細胞の助けを与え、結合されている多糖体抗原に対する免疫学的記憶を誘導する。
しかしながら、依然として改良された肺炎球菌ワクチン組成物は必要であり、高齢者や児童における肺炎球菌による疾患（特に肺炎）の防止や改善に、より有効なものが特に必要とされている。
本発明はそのような改良ワクチンを与える。
【０００６】
（発明の開示）
一の態様において、本発明は、ポリヒスチジントライアッドファミリー（ＰｈｔＸ）、コリン結合蛋白ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸ末端切断物（ｔｒｕｎｃａｔｅ）、ＬｙｔＸファミリー、ＬｙｔＸ末端切断物、ＣｂｐＸ末端切断物―ＬｙｔＸ末端切断物キメラ蛋白、ニューモリシン（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１３３からなる群より選択される、少なくとも二つのエス・ニュモニエ蛋白を含む免疫原性組成物を提供する。好ましい具体例においては、蛋白のうち一つはポリヒスチジントライアッドファミリー（ＰｈｔＸ）より選ばれる。もう一つ他の好ましい具体例においては、蛋白のうち一つは、コリン結合蛋白ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸ末端切断物またはＣｂｐＸ末端切断物―ＬｙｔＸ末端切断物キメラ蛋白より選ばれる。
関連した態様において、本発明は幼児の中耳炎、高齢者の肺炎の治療や改善に用いるワクチンを提供する。所望により、ワクチンは、好ましくは、ＴＨ１反応の誘発因子であるアジュバントを付加的に含んでいてもよい。
さらにもう一つの関連した態様は、２つの異なったストレプトコッカス・ニュモニエ蛋白を選択かつ単離し、両方の蛋白を医薬上許容されるキャリアと混合することによる、本発明のワクチンの製造法である。
【０００７】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、肺炎球菌蛋白に基づく方法によって、高齢者の肺炎球菌感染（例えば肺炎）および／または幼児における感染（例えば中耳炎）の防止や改善のための改良ワクチンを与える。好ましい具体例の一つとしては、このワクチンは高齢者の肺炎球菌感染の防止や改善に適している。殆どの成人はストレプトコッカス・ニュモニエに曝されているので、このワクチンは、本発明で同定された、少なくとも２つの肺炎球菌蛋白を投与することにより、成人や高齢者の基本的な免疫反応を防御レベルまで押し上げることを意図としている。肺炎球菌蛋白がエス・ニュモニエ多糖体の不存在の下で投与される。
本発明に関連して，患者が５５歳またはそれ以上、典型的には６０歳以上、より一般的には６５歳以上なら高齢者と考える。かくして、一の具体例において、この発明は高齢者の肺炎の防止のための肺炎球菌蛋白よりなるワクチン組成物を与える。
もう一つ別の具体例において、本発明は、本発明により同定される２つまたはそれ以上の肺炎球菌蛋白を含む、幼児（典型的には０歳から２歳）による使用に適したワクチン組成物を提供する。
【０００８】
本発明の肺炎球菌蛋白
本発明のストレプトコッカス・ニュモニエ蛋白は、少なくとも肺炎球菌の生活環の一時期において表面が露出されているか、肺炎球菌から分泌または放出される蛋白である。好ましくは本発明の蛋白の組み合わせは、ＬＸＸＣ（Ｘはいずれかのアミノ酸であり、例えばポリヒスチジントライアッドファミリー（ＰｈｔＸ）のタイプＩＩシグナル配列モチーフをもつ蛋白、コリン結合蛋白ファミリー（ＣｂｐＸ）、タイプＩシグナル配列モチーフをもつ蛋白（例えばＳｐ１０１）、ＬＰＸＴＧモチーフ（Ｘはいずれかのアミノ酸であり、例えばＳｐ１２８，Ｓｐ１３０）を持つ蛋白、毒素（例えばＰｌｙ）などの２つの異なったカテゴリーから選ばれる。これらのカテゴリー（またはモチーフ）の中で好ましい例は、以下の蛋白またはその免疫学的機能等価物である。
本発明の免疫原性組成物は、ポリヒスチジントライアッドファミリー（ＰｈｔＸ）、コリン結合蛋白ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸ末端切断物、ＬｙｔＸファミリー、ＬｙｔＸ末端切断物、ＣｂｐＸ末端切断物―ＬｙｔＸ末端切断物キメラ蛋白（または融合蛋白）、ニューモリシン（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐ１２８、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１３０、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１３３からなる群より選択される、少なくとも２つの蛋白よりなる。しかしながら、ＣｂｐＸがＰｓｐＣなら、第二の蛋白はＰｓｐＡまたはＰｓａＡではない。好ましくは、免疫原性組成物はポリヒスチジントライアッドファミリー（ＰｈｔＸ）、コリン結合蛋白ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸ末端切断物、ＬｙｔＸファミリー、ＬｙｔＸ末端切断物、ＣｂｐＸ末端切断物―ＬｙｔＸ末端切断物キメラ蛋白（または融合蛋白）、ニューモリシン（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐ１２８からなる群より選択される２個またはそれ以上の蛋白を含む。さらに好ましくは、免疫原性組成物は、ポリヒスチジントライアッドファミリー（ＰｈｔＸ）、コリン結合蛋白ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸ末端切断物、ＬｙｔＸファミリー、ＬｙｔＸ末端切断物、ＣｂｐＸ末端切断物―ＬｙｔＸ末端切断物キメラ蛋白（または融合蛋白）、ニューモリシン（Ｐｌｙ）、Ｓｐ１２８からなる群より選択される２個またはそれ以上の蛋白を含む。
【０００９】
Ｐｈｔ（ポリヒスチジントライアッド）ファミリーはＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＥ蛋白を含む。このファミリーは、脂質化配列、プロリンに富む領域と金属またはヌクレオシドとの結合または酵素活性に関与している可能性のあるいくつかのヒスチジントライアッドにより分けられる二つのドメイン、（３−５）超らせん領域、保存されたＮ末端と異種Ｃ末端により特徴付けられている。これは検査された肺炎球菌の全ての系で存在した。同種の蛋白が、他の肺炎球菌とナイセリア属で発見された。このファミリーの好ましいメンバーはＰｈｔＡ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＤを含む。より好ましくはＰｈｔＡ、ＰｈｔＤを含む。しかしながら、ＰｈｔＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅなる語は、下記の引用文献に開示されている配列を有する蛋白、ならびに対象となる蛋白と少なくとも９０％同一である配列相同性を有するその天然に存在する（および人工的な）変異体をいう、と解釈される。好ましくは少なくとも９５％同一、最も好ましくは９７％同一である。
ＰｈｔＸ蛋白に関して、ＰｈｔＡはＷＯ ９８／１８９３０に開示されており、Ｓｐ３６とも言う。上記したように、これはポリヒスチジントライアッドファミリー由来の蛋白で、ＬＸＸＣのタイプＩＩシグナルモチーフを有する。
【００１０】
ＰｈｔＤはＷＯ ００／３７１０５に開示されており、Ｓｐ０３６Ｄとも言う。上記したように、これもまたポリヒスチジントライアッドファミリー由来の蛋白で、ＬＸＸＣのタイプＩＩシグナルモチーフを有する。
ＰｈｔＢはＷＯ ００／３７１０５に開示されており、Ｓｐ０３６Ｂとも言う。ＰｈｔＢファミリーのもう１つのメンバーはＣ３−分解ポリペプチドであり、ＷＯ ００／１７３７０に開示されている。この蛋白もまたポリヒスチジントライアッドファミリー由来で、ＬＸＸＣのタイプＩＩシグナルモチーフを有する。好ましい免疫学的機能等価物は、ＷＯ９８／１８９３０に開示されているＳｐ４２蛋白である。ＰｈｔＢ末端切断物（おおよそ７９ｋＤ）はＷＯ９９／１５６７５に開示されており、ＰｈｔＸファミリーのメンバーであると考えられる。
ＰｈｔＥはＷＯ ００／３０２９９に開示されており、ＢＶＨ−３と言う。
【００１１】
コリン結合蛋白ファミリー（ＣｂｐＸ）に関して、このファミリーのメンバーは、コリンアフィニティクロマトグラフィによって精製されることができた肺炎球菌蛋白として初めて同定された。コリン結合蛋白は全て、細胞壁のタイコ酸および細胞膜結合リポタイコ酸のホスホリルコリン部分と共有結合していない。構造的にこれらは、蛋白の正確な性質（アミノ酸配列、長さなど）は多様であるが、全てのファミリーに共通したいくつかの領域を有している。一般的に、コリン結合蛋白は、Ｎ末端領域、保存反復領域（Ｒ１および／またはＲ２）、プロリンに富む領域（Ｐ）、複数の反復配列で形成されており、この蛋白のおよそ二分の一を構成する保存コリン結合領域（Ｃ）を含む。本願明細書において使用されている「コリン結合蛋白ファミリー（ＣｂｐＸ）」なる語は、ＷＯ ９７／４１１５１で同定されているコリン結合蛋白であるＰｂｃＡ、ＳｐｓＡ、ＰｓｐＣ、ＣｂｐＡ、ＣｂｐＤ、ＣｂｐＧからなる群より選択される。ＣｂｐＡはＷＯ ９７／４１１５１に開示されている。ＣｂｐＤとＣｂｐＧはＷＯ ００／２９４３４に開示されている。ＰｓｐＣはＷＯ ９７／０９９９４に開示されている。ＰｂｃＡはＷＯ ９８／２１３３７に開示されている。ＳｐｓＡはＷＯ ９８／３９４５０に開示されているコリン結合蛋白である。好ましくは、コリン結合蛋白はＣｂｐＡ、ＰｂｃＡ、ＳｐｓＡ、ＰｓｐＣからなる群より選択される。
【００１２】
もう一つの好ましい具体例は、ＣｂｐＸ末端切断物であり、「ＣｂｐＸ」とは上記したとおりであり、「末端切断物」とはコリン結合領域（Ｃ）の５０％またはそれ以上を欠くＣｂｐＸ蛋白のことである。好ましくはそのような蛋白は全てのコリン結合領域を欠く。より好ましくは、そのような末端切断蛋白は（ｉ）コリン結合領域と（ｉｉ）蛋白のＮ末端半分の一部も欠くが、しかし少なくとも一つの反復領域を保持する（Ｒ１またはＲ２）。更に一層好ましくは、末端切断物は２つの反復領域を持つ（Ｒ１とＲ２）。そのような好ましい具体例は、ＷＯ ９９／５１２６６またはＷＯ ９９／５１１８８で説明されているＮＲ１ｘＲ２とＲ１ｘＲ２である。しかしながら類似のコリン結合領域を欠く他のコリン結合蛋白もまた、本発明の範囲内にあると考えられる。
ＬｙｔＸファミリーは細胞溶解と関連する細胞膜結合蛋白である。Ｎ末端ドメインはコリン結合ドメインを含む。しかしながら、ＬｙｔＸファミリーは、上記のようなＣｂｐＡファミリーで見られる特徴を全ては持っていない、そのため本発明に関してＬｙｔＸファミリーはＣｂｐＸファミリーと異なると考えられる。ＣｂｐＸファミリーとは対照的に、Ｃ末端ドメインはＬｙｔＸ蛋白ファミリーの触媒ドメインを含む。このファミリーはＬｙｔＡ、ＢおよびＣを含む。ＬｙｔＸファミリーに関して、ＬｙｔＡはＲｏｎｄａら，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１６４：６２１−６２４（１９８７）において開示されている。ＬｙｔＢはＷＯ ９８／１８９３０に開示されており、Ｓｐ４６とも言う。ＬｙｔＣもまたＷＯ ９８／１８９３０に開示されており、Ｓｐ９１とも言う。ファミリーの好ましいメンバーはＬｙｔＣである。
【００１３】
もう一つの好ましい具体例は、ＬｙｔＸ末端切断物であり、「ＬｙｔＸ」とは上記したとおりであり、「末端切断物」とはコリン結合領域の５０％またはそれ以上を欠くＬｙｔＸ蛋白のことである。好ましくはそのような蛋白は全てのコリン結合領域を欠く。そのような末端切断物の例は、本発明の実施例の項にある。
しかし、本発明のもう一つの好ましい具体例はＣｂｐＸ末端切断物―ＬｙｔＸ末端切断物キメラ蛋白（または融合蛋白）である。好ましくはこれは、ＣｂｐＸのＮＲ１ｘＲ２（Ｒ１ｘＲ２）と、ＬｙｔＸのＣ末端部分（Ｃ末端、すなわちコリン結合領域を欠いている）（例えばＬｙｔＣＣ末端またはＳｐ９１Ｃ末端）を含む。さらに好ましくは、ＣｂｐＸはＣｂｐＡ、ＰｂｃＡ、ＳｐｓＡ、ＰｓｐＣからなる群より選択される。さらに一層好ましくは、ＣｂｐＡである。好ましくは、ＬｙｔＸはＬｙｔＣ（Ｓｐ９１とも言う）である。
本発明のもう一つの具体例は、コリン結合領域（Ｃ）を欠くＰｓｐＡまたはＰｓａＡの末端切断物であり、ＬｙｔＸとの融合蛋白として発現される。好ましくは、ＬｙｔＸはＬｙｔＣである。
【００１４】
ニューモリシンは、別個の細胞溶解性（溶血性）と補体活性化活性を持つ、多機能的な毒素である（Ｒｕｂｅｎｓら、Ａｍ Ｒｅｓｐｉ Ｃｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ１５３：１３３９−１３４６（１９９６））。その毒素は肺炎球菌から分泌されるのではなく、自己溶解素の影響下で肺炎球菌が溶菌して放出される。この作用は、例えばヒト単球による炎症性サイトカインの産生を刺激、ヒト呼吸上皮の線毛運動抑制、殺菌活性と好中球の移動の減退などを含む。ニューモリシンの最も明らかな作用は、赤血球の溶菌作用においてであり、コレステロールへの結合を含む。これは毒素であるため、生体内に投与される前に無毒化（すなわち、防御に適した容量が与えられた際に人に無毒であること）される必要がある。野生型や自然のニューモリシンの発現やクローニングは当該分野にて知られている。例えば、Ｗａｌｋｅｒら（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎｅ，５５：１１８４−１１８９（１９８７））やＭｉｔｃｈｅｌｌら（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ、１００７：６７−７２（１９８９）およびＭｉｔｃｈｅｌｌら（ＮＡＲ，１８：４０１０（１９９０））を参照のこと。ｐｌｙの無毒化は、例えばホルマリンまたはグルタルアルデヒド処理に付したり、またはその両方を組み合わせるなどの化学的手段により行うことができる。そのような方法は多様な毒素に対して当該分野にて周知である。別法として、ｐｌｙを遺伝的に無毒化させることもできる。かくして、本発明は、例えば変異蛋白であってもよい肺炎球菌蛋白誘導体を包含する。「変異」なる語は、本明細書中、部位指定変異誘発に用いる周知技術や他の従来の方法を使って、一つまたはそれ以上のアミノ酸の欠失、挿入、置換を経た分子を意味するために用いられる。例えば、上記のように、変異体ｐｌｙ蛋白は、免疫原性エピトープを維持するも生物学的に不活性であるように変形することができる。例えば、ＷＯ ９０／０６９５１、Ｂｅｒｒｙら（Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ，６７：９８１−９８５（１９９９））、ＷＯ ９９／０３８８４を参照のこと。
【００１５】
本明細書中で使用される「ｐｌｙ」なる語は、医療での利用に適した（すなわち、無毒である）変異した、または無毒化されたニューモリシンをいうと解される。
ＰｓａＡとＰｓｐＡに関して、その両方が当該分野において知られている。例えば、ＰｓａＡおよびその貫膜欠失変異体が、ＢｅｒｒｙとＰａｔｏｎのＩｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ １９９６ Ｄｅｃ；６４（１２）：５２５５−６２に記載されている。ＰｓａＡおよびその貫膜欠失変異体が、例えばＵＳ５８０４１９３、ＷＯ ９２／１４４８８、ＷＯ ９９／５３９４０において開示されている。
Ｓｐ１２８とＳｐ１３０は、ＷＯ ００／７６５４０において開示されている。
Ｓｐ１２５はＬＰＸＴＧ（Ｘはいずれかのアミノ酸）の細胞壁固定モチーフを有する肺炎球菌表面蛋白の一例である。このモチーフを有する肺炎球菌表面蛋白のこの種の蛋白は全て、本発明の状況において有用であることが判り、そのため本発明の付加的な蛋白と見なされる。Ｓｐ１２５自体はＷＯ ９８／１８９３０に開示されており、ＺｍｐＢ−亜鉛金属プロテイナーゼとして知られている。
【００１６】
Ｓｐ１０１はＷＯ ９８／０６７３４（整理番号ｙ８５９９３）に開示されている。これはタイプＩシグナル配列によって特徴付けられる。
Ｓｐ１３３はＷＯ ９８／０６７３４（整理番号ｙ８５９９２）に開示されている。これもまたはタイプＩシグナル配列によって特徴付けられる。
本発明の蛋白はまた組み合わせることが有益である。好ましい組み合わせは、ＰｈｔＤ＋ＮＲ１ｘＲ２、ＰｈｔＤ＋ＮＲ１ｘＲ２−Ｓｐ９１Ｃ末端キメラまたは融合蛋白、ＰｈｔＤ＋Ｐｌｙ、ＰｈｔＤ＋Ｓｐ１２８、ＰｈｔＤ＋ＰｓａＡ、ＰｈｔＤ＋ＰｓｐＡ、ＰｈｔＡ＋ＮＲ１ｘＲ２、ＰｈｔＡ＋ＮＲ１ｘＲ２−Ｓｐ９１Ｃ末端キメラまたは融合蛋白、ＰｈｔＡ＋Ｐｌｙ、ＰｈｔＡ＋Ｓｐ１２８、ＰｈｔＡ＋ＰｓａＡ、ＰｈｔＡ＋ＰｓｐＡ、ＮＲ１ｘＲ２＋ＬｙｔＣ、ＮＲ１ｘＲ２＋ＰｓｐＡ、ＮＲ１ｘＲ２＋ＰｓａＡ、ＮＲ１ｘＲ２＋Ｓｐ１２８、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｈｔＤ、Ｒ１ｘＲ２＋ＰｈｔＡを含むが、この限りではない。好ましくは、ＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）はＣｂｐＡまたはＰｓｐＣ由来のものである。より好ましくは、ＣｂｐＡ由来のものである。
肺炎球菌蛋白の特に好ましい組み合わせはＰｌｙ（あるいはその末端切断物または免疫学的機能等価物）＋ＰｈｔＤ（あるいはその末端切断物または免疫学的機能等価物）＋ＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）を含む。好ましくは、ＮＲ１ｘＲ２（またはＲ１ｘＲ２）はＣｂｐＡまたはＰｓｐＣ由来のものである。より好ましくは、ＣｂｐＡ由来のものである。
【００１７】
本発明はまた、本発明の蛋白の「免疫学的機能等価物」を包含する。「免疫学的機能等価物」は、本発明の蛋白由来の少なくとも一つの防御エピトープを含むペプチドまたは蛋白として定義される。そのようなエピトープは、特徴的には、表面が露出されており、高度に保存され、宿主にて殺菌性の抗体反応を惹起しうるか、または毒性作用を妨げることができる。好ましくは、少なくとも１５個、好ましくは３０個またはそれ以上の本発明の蛋白由来の連続したアミノ酸を有している機能等価物を用いることができる；ただし、実質的に自然の蛋白と同じ免疫反応を惹起する能力を有していなければならない。蛋白配列中でＢ細胞エピトープの可能性のある位置は、２つの方法：２次元構造予測と抗原指標予測を組み合わせて用いて、表面が露出されており、抗原性であるペプチドを同定することで容易に決定される。２次元構造予測はＰＳＩＰＲＥＤプログラム（Ｂｒｕｎｅｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓグループ科、生物科学、Ｂｒｕｎｅｌ大学、Ｕｘｂｒｉｄｇｅ ＵＢ８ ３ＰＨ，ＵＫのＤａｖｉｄ Ｊｏｎｅｓにより作成）を用いて行うことができる。抗原指標予測は、ＪａｍｅｓｏｎとＷｏｌｆ（ＣＡＢＩＯＳ４：１８１−１８６［１９８８］）により記載された方法に基いて算出される。
複数のエス・ニュモニエ蛋白（免疫原性）組成物は、多くの血清型とより大きな交差防御を含むことができること、さらに粘着性とコロニー形成を阻害しうること、病原体の毒素／酵素機能を中和しうる抗体を潜在的に惹起しうる点で、本発明はエス・ニュモニエ多糖体ワクチンに対して有利である。その上、付加的表面抗原はオプソニン食菌作用をさらに刺激する手段を提供する。
【００１８】
本発明はまた、一連の異なる病原体に対して防御を与える混合ワクチンを意図する。多くの小児ワクチンは、現在、子供が受けねばならない注射の数を減らすために混合型ワクチンとして投与される。かくして、小児用ワクチンの場合、他の病原体由来の他の抗原を本発明のワクチンと共に処方することができる。例えば、本発明のワクチンは、ジフテリアトキソイド（ＤＴ）、テターヌストキソイド（ＴＴ）、百日咳菌成分［典型的には任意のペルタクチン（ＰＲＮ）および／または凝集素１＋２により無毒化された百日咳菌毒素（ＰＴ）と糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ）］を含む、例えばＤＴ、ＴＴ、ＰＴ、ＦＨＡおよびＰＲＮ抗原を含む市販ワクチンＩＮＦＡＮＲＩＸ−ＤＴＰａ（登録商標）（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）などの、周知の３価混合ワクチンと共に、または例えば、Ｔｒｉｔａｎｒｉｘ（登録商標）ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅＢｅｅｃｈａｍ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓにより市販されているような全細胞百日咳菌ワクチンと共に、処方（または別々ではあるが同時に投与）され得る。混合ワクチンはまた、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ポリオウイルス抗原（例えば不活化３価ポリオウイルスであるＩＰＶ）、モラクセラ　カタラーリス膜外蛋白、非型特異的ヘモフィルス　インフルエンザ蛋白、髄膜炎菌Ｂ膜外蛋白のような他の抗原も含むこともできる。
【００１９】
（特に中耳炎の予防の為の）混合ワクチンに配合することができるモラクセラ　カタラーリス蛋白抗原の好ましい例は、ＯＭＰ１０６［ＷＯ ９７／４１７３１（Ａｎｔｅｘ）とＷＯ ９６／３４９６０（ＰＭＣ）］、ＯＭＰ２１、ＬｂｐＡおよび、またはＬｂｐＢ［ＷＯ ９８／５５６０６（ＰＭＣ）］、ＴｂｐＡおよび、またはＴｂｐＢ［ＷＯ ９７／１３７８５とＷＯ ９７／３２９８０（ＰＭＣ）］、ＣｏｐＢ［Ｈｅｌｍｉｎｅｎ　ＭＥら（１９９３）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ６１：２００３−２０１０］、ＯｍｐＣＤ、ＨａｓＲ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２４）、ＰｉｌＱ（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２３）、ＯＭＰ８５（ＰＣＴ／ＥＰ００／０１４６８）、ｌｉｐｏ０６（ＧＢ９９１７９７７．２）、ｌｉｐｏ１０（ＧＢ９９１８２０８．１）、ｌｉｐｏ１１（ＧＢ９９１８３０２．２）、ｌｉｐｏ１８（ＧＢ９９１８０３８．２）、Ｐ６（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３２５７）、Ｄ１５（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３８２２）、Ｏｍｐ１Ａ１（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０６７８１）、Ｈｌｙ３（ＰＣＴ／ＥＰ９９／０３２５７）、ＯｍｐＥである。（特に中耳炎の予防の為の）混合ワクチンに配合することができる非特異的ヘモフィルス　インフルエンザ抗原の例は、フィンブリン蛋白［（ＵＳ５７６６６０８−オハイオ州研究財団）］とそこから得られるペプチドよりなる融合蛋白［例えばＬＢ１（ｆ）ペプチド融合蛋白；ＵＳ５８４３４６４（ＯＳＵ）またはＷＯ ９９／６４０６７］、ＯＭＰ２６［ＷＯ ９７／０１６３８（Ｃｏｒｔｅｘ）］、Ｐ６［ＥＰ２８１６７３（ニューヨーク州立大学）］、ＴｂｐＡおよび、またはＴｂｐＢ、Ｈｉａ、Ｈｓｆ、Ｈｉｎ４７、Ｈｉｆ、Ｈｍｗ１、Ｈｍｗ２、Ｈｍｗ３、Ｈｍｗ４、Ｈａｐ、Ｄ１５（ＷＯ ９４／１２６４１）、蛋白Ｄ（ＥＰ５９４６１０）、Ｐ２、Ｐ５（ＷＯ ９４／２６３０４）である。
【００２０】
他の具体例においては、上に列挙された多様な抗原は、それが由来する細菌から作られる膜外小胞（小気泡）の表面に存在する抗原として、本発明の免疫原性組成物に含めることができる。
他の組み合わせとして、本発明のエス・ニュモニエ蛋白と、例えばインフルエンザ（弱毒化された、スプリットまたはそのサブユニット［例えば、表面糖蛋白ノイラミニダーゼ（ＮＡ）と赤血球凝集素（ＨＡ）。例えばＣｈａｌｏｕｐｋａ ＩらＥｕｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１９９６，１５：１２１−１２７を参考のこと］）、ＲＳＶ（例えば、ＦとＧ抗原またはＦ／Ｇ融合蛋白。例えばＳｃｈｍｉｄｔ Ａ．Ｃら、Ｊ Ｖｉｒｏｌ，Ｍａｙ２００１，Ｐ４５９４−４６０３を参考のこと）、ＰＩＶ３（例えば、ＨＮとＦ蛋白。前掲のＳｃｈｍｉｄｔらを参考のこと）、水痘ウイルス（例えば弱毒化されたもの、糖蛋白Ｉ―Ｖなど）、ＭＭＲ（麻疹、おたふく風邪、風疹）のいずれかの（または全ての）成分からのウイルス性抗原との組み合わせが意図される。
【００２１】
本発明の多糖体抗原
本願はまた、エス・ニュモニエ由来ではない多糖体と組み合わせた２つまたはそれ以上のエス・ニュモニエ蛋白との混合ワクチンを意図している。そのような多糖体は、例えばヘモフィルス　インフルエンザ、ヘモフィルス　インフルエンザＢ型（Ｈｉｂ）、エヌ・メニンジティディス群Ａ、Ｃ、Ｗ、Ｙ、エス・ニュモニエ以外のストレプトコッカス（例えばＢ群ストレプトコッカス、エス・ピオゲネス等）、スタフィロコッカス（例えば、エス・アウレウス、エス・エピデルミディス）、イ・コリ、エンテロコッカス（例えば、イ・フェカーリスおよびイ・フェシウム）などから分離することができる。好ましくは、多糖体は、ヘモフィルス　インフルエンザＢ型（Ｈｉｂ）および、またはエヌ・メニンジティディス群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびまたはＹ由来である。
【００２２】
上記したように、ワクチン接種への多糖体の用い方に関連した問題は、多糖体それ自体は免疫原性に乏しいという事実である。これを解決するため、多糖体をバイスタンダー細胞であるＴ細胞の助けを付与する蛋白キャリアに結合させてもよい。そのため、本発明で利用される多糖体はそのような蛋白キャリアに結合されていることが好ましい。現在、一般的に多糖体の免疫原性を生むために使われる、そのような蛋白の例として、ジフテリアとテターヌストキソイド（ＤＴ、ＤＴ　ＣＲＭ１９７、他のＤＴ変異体、例えばＧｌｕ−１４８の位置の変異体など［例えば米国特許第４７０９０１７号、ＷＯ９３／２５２１０、ＷＯ９５／３３４８１等を参考のこと］、ＴＴ（およびＴＴフラグメントＣ）の各々）、キーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）、エヌ・メニンジティディス由来のＯＭＰＣ、ツボクラリンの精製蛋白誘導体（ＰＰＤ）が挙げられる。
多糖体に基材とする免疫原性組成物（またはワクチン）のための他のキャリアは、ヘモフィルス　インフルエンザ（ＥＰ５９４６１０−Ｂ）由来の蛋白Ｄ、またはそのフラグメントである。使用に適したフラグメントはヘルパーＴ細胞エピトープを含むフラグメントである。特に、蛋白Ｄフラグメントは、好ましいことに、蛋白のＮ末端側３分の１を含むであろう。
多糖体は、あらゆる既知の方法（例えば、Ｌｉｋｈｉｔｅによる米国特許第４３７２９４５号およびＡｒｍｏｒらによる米国特許第４４７４７５７号）によって、キャリア蛋白に結合させることができる。好ましくは、ＣＤＰＡ結合を行う（ＷＯ ９５／０８３４８）。免疫原性を強化するため、多糖体をある大きさにし（デポリメライズし）、アジュバント処理し、凍結乾燥し、異なるキャリア蛋白と結合させてもよい。
【００２３】
本発明のＴＨＩアジュバント
本発明のワクチンはアジュバント処理されていることが好ましい。適当なアジュバントは水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩を含むが、カルシウム、マグネシウム、鉄または亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化されたチロシン、アシル化された糖、陽イオンまたは陰イオンに誘導された多糖体、ポリフォスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。
アジュバントは、ＴＨ１型反応の優先的誘発因子であるよう選ばれることが好ましい。そのような高レベルなＴｈ１型サイトカインは、与えられた抗原に対して細胞性免疫反応の誘発を引き起こす傾向にあるが、高レベルなＴＨ２型サイトカインは、抗原に対して体液性免疫反応の誘発を引き起こす傾向にある。
【００２４】
Ｔｈ１型、Ｔｈ２型免疫反応の区別は確固としたものでないことを認識することが重要である。現実には、個人は、優勢的にＴｈ１であると、または優勢的にＴｈ２であるとして記載される免疫反応を支持する。しかしながら、ＭｏｓｍａｎｎとＣｏｆｆｍａｎにより、ネズミＣＤ４＋ｖｅＴ細胞クローンに記載されているサイトカインである点から、サイトカインファミリーを考察することが好都合であることが多い（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．ＲとＣｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｌ（１９８９）ＴＨ１ ａｎｄ ＴＨ２ ｃｅｌｌｓ： ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｌｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ． Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７、１４５‐１７３頁）。伝統的に、Ｔｈ１型反応は、Ｔリンパ球によるＩＮＦ−γとＩＬ−２サイトカインの産生と関連している。Ｔｈ１型免疫反応の誘発としばしば直接的に関連している、ＩＬ−１２のような他のサイトカインは、Ｔ細胞によって産生されない。対照的に、Ｔｈ２型反応は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０の分泌と関連している。Ｔｈ１反応を優勢的に促進する適当なアジュバントは、モノホスホリル脂質Ａまたはその誘導体、特に３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）（その調製についてのＧＢ２２２０２１１Ａを参考のこと）、およびモノホスホリル脂質Ａ、好ましくは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａと、アルミニウム塩（例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウム）または水中油型乳濁液の一方との組み合わせを包含する。そのような組み合わせにおいては、抗原と３Ｄ−ＭＰＬは同じ粒状構造物中に含まれ、抗原性シグナルと免疫刺激シグナルのより効率的なデリバリーを可能とする。研究によると、３Ｄ−ＭＰＬはミョウバン吸着抗原の免疫原性を一層亢進することができる。［Ｔｈｏｅｌｅｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９８）１６：７０８−１４；ＥＰ６８９４５４−Ｂ１］
【００２５】
亢進された系は、モノホスホリル脂質Ａとサポニン誘導体の組み合わせ、特にＷＯ ９４／００１５３に開示されているようにＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組み合わせ、またはＷＯ ９６／３３７３９に開示されているようにＱＳ２１がコレステロールでクエンチされた小さい反応原性組成物を包含する。
水中油型乳濁液中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に効力のあるアジュバントの処方は、ＷＯ ９５／１７２１０に記載されており、好ましい処方である。
好ましくは、ワクチンは付加的にサポニン、より好ましくはＱＳ２１を含む。処方はまた、水中油型乳濁液とトコフェロールを含む（ＷＯ ９５／１７２１０）。
【００２６】
本発明はまた、本発明の蛋白と３Ｄ−ＭＰＬのような医薬上許容される賦形剤とを混合することを含む、ワクチン処方の製造方法を提供する。
オリゴヌクレオチドを含有する非メチル化ＣｐＧ（ＷＯ９６／０２５５５）はまた、ＴＨ１反応の優先誘発因子であり、本発明の利用に適している。
本発明のさらなる態様において、医薬に用いられるワクチンが提供される。一の具体例では、安全かつ効果的な量の本発明のワクチンと、任意のＴｈ１アジュバントを高齢患者に投与することによって、高齢者の肺炎を防止または改善する方法が提供される。
さらなる具体例においては、安全かつ効果的な量の本発明のストレプトコッカス・ニュモニエ蛋白と、所望によりＴｈ１アジュバントとを含むワクチンを、幼児やよちよち歩きの小児に投与することを含む、幼児（２４ヶ月まで）またはよちよち歩きの小児（典型的には２４ヶ月から５歳）における中耳炎の防止または改善の方法が提供される。
【００２７】
本発明のワクチン調製物
本発明のワクチン調製物は、当該ワクチンを全身性または粘膜性経路を介して投与することにより、感染に感受性の哺乳類（好ましくはヒト患者）を保護または治療するために使われる。これらの投与は、筋肉内、腹腔内、皮内または皮下経路を介する注射、経口／食事、呼吸、尿生殖器への粘膜投与を含む。（肺炎球菌の鼻咽頭での運搬はより効果的に妨げられ、そのためその初期段階で感染を減衰できるため）肺炎または中耳炎を治療するのにワクチンを鼻内投与することが好ましい。本発明のワクチンは単回用量として投与されるが、その成分はまた同時に、または違う時に投与することもできる（例えば、もしワクチンの中に多糖体が存在するなら、これらは同時に別々に、またはお互いに免疫反応が最も良く協調する細菌蛋白の組み合わせの投与後１−２週間で投与されうる）。単一の投与経路に加えて、２つの異なる投与経路を利用してもよい。例えば、ウイルス性抗原はＩＤ（皮内）投与され、一方細菌蛋白はＩＭ（筋肉内）またはＩＮ（鼻内）投与することができる。もし多糖体が存在するなら、これらはＩＭ（またはＩＤ）投与され、細菌蛋白はＩＮ（またはＩＤ）投与することができる。加えて、本発明のワクチンは、初回抗原用量としてＩＭ投与され、追加抗原用量としてＩＮ投与され得る。
【００２８】
各ワクチン中の結合抗原の量は、典型的なワクチン中で有意な副作用がなく免疫防御反応を誘発する量として選ばれる。そのような量は、どの特定の免疫原が利用され、どのように提示されたかによって異なる。ワクチン中の蛋白抗原の含有量は、典型的には１−１００μｇ、好ましくは５−５０μｇ、最も典型的には５−２５μｇの範囲である。もし多糖体が含まれていれば、一般的には各用量は０．１−１００μｇの多糖体、好ましくは０．１−５０μｇ、さらに好ましくは０．１−１０μｇを含み、その中でも１−５μｇっが最も好ましい範囲である。
特定のワクチンの成分の最適量は、対象での適当な免疫反応を観察することを含む標準的な実験で確かめることができる。最初のワクチン接種に続いて、対象は適当に時間を置いて一つまたはいくつかの追加抗原免疫処置を受ける。典型的には、ワクチンは抗原（蛋白）、アジュバント、賦形剤または医薬上許容されるキャリアを含むであろう。
ワクチン調製物は一般的にＶａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎに記載されている（「Ｔｈｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐｏｗｅｒ Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ Ｍ．Ｊ．編）（１９９５）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。リポソーム内での莢膜化はＦｕｌｌｅｒｔｏｎの米国特許第４２３５８７７号に記載されている。
【００２９】
本発明のワクチンはどんな経路でも投与されるが、本発明のワクチンの皮膚への投与（ＩＤ）は、本発明の一つの具体例を形成している。ヒトの皮膚は、角質層と呼ばれる、外側の「角質」表皮を含み、それが表皮の表面を覆っている。この表皮の真下が真皮と呼ばれる層で、これが順次皮下組織を覆っている。研究者は、皮膚、特に真皮へのワクチンの注射は免疫反応を刺激し、それは多くの付加的な有利性と関連していることを示している。本明細書に記載のワクチンでの皮内へのワクチン接種は、本発明の好ましい特徴を形成している。
皮内注射の従来の技術である「マントー処置」は、皮膚の洗浄、そして一方の手を伸ばし、狭いゲージの針（２６−３１ゲージ）の斜面を上に向けて、１０−１５°の間の角度で針を挿入するという工程を含む。いったん針の斜面が挿入されたら、針の筒は押し下げ、針が皮下に入っていくように小さい圧力を与えつつさらに押し進める。それから液体を極めてゆっくりと注入し、それによって皮膚の表面に小気泡または衝撃を形成させ、続いて針をゆっくりと抜く。
【００３０】
さらに最近では、液体作用薬を皮膚中または皮膚を横切って投与するよう特別に設計された装置が記載されており、例えばＷＯ９９／３４８５０とＥＰ１０９２４４４で記載されている装置や、また例えばＷＯ０１／１３９７７、ＵＳ５，４８０，３８１、ＵＳ５，５９９，３０２、ＵＳ５，３３４，１４４、ＵＳ５，９９３，４１２、ＵＳ５，６４９，９１２、ＵＳ５，５６９，１８９、ＵＳ５，７０４，９１１、ＵＳ５，３８３，８５１、ＵＳ５，８９３，３９７、ＵＳ５，４６６，２２０、ＵＳ５，３３９，１６３、ＵＳ５，３１２，３３５、ＵＳ５，５０３，６２７、ＵＳ５，０６４，４１３、ＵＳ５，５２０，６３９、ＵＳ４，５９６，５５６、ＵＳ４，７９０，８２４、ＵＳ４，９４１，８８０、ＵＳ４，９４０，４６０、ＷＯ９７／３７７０５、ＷＯ９７／１３５３７で記載されているジェット式注射装置である。ワクチン調製物の皮内投与の代替的な方法は、従来のシリンジと針、固形ワクチンの弾道デリバリー（ＷＯ９９／２７９６１）のために設計された装置、経皮的なパッチ（ＷＯ ９７／４８４４０、ＷＯ９８／２８０３７）、皮膚の表面への塗布（経皮的デリバリー、ＷＯ９８／２０７３４、ＷＯ９８／２８０３７）を含む。
本発明のワクチンが皮膚に投与された場合、またはより具体的には真皮に投与された場合、ワクチンは、液体容量が小さく、特に約０．０５ｍｌと０．２ｍｌの間の容量である。
【００３１】
皮膚にある抗原の含量、または本発明の皮内用ワクチンの含量は、筋肉内ワクチンで見られる従来の用量と類似していてもよい。そのため、皮内用ワクチンに存在する蛋白抗原は、１−１００μｇ、好ましくは５−５０μｇの範囲にある。同様に、もし存在するなら、各ワクチン用量中の多糖体結合抗原は、一般に、０．１−１００μｇ、好ましくは０．１−５０μｇ、さらに好ましくは０．１−１０μｇの多糖体を含むと考えられ、１μｇと５μｇの間とすることができる。しかしながら、処方を「低用量」としうることが皮膚または皮内用ワクチンの特徴である。そのため、好ましくは「低用量」のワクチン中の蛋白抗原は、用量当たり０．１から１０μｇ、好ましくは０．１から５μｇとほとんど配合されない。もし存在するなら、多糖体結合抗原は用量当たり多糖体が０．０１−１μｇ、そして好ましくは０．０１μｇと０．５μｇの間の範囲で存在する。
本明細書で使用されるように、「皮内デリバリー」なる語は、皮膚の真皮の領域にワクチンをデリバリーすることを意味する。しかしながら、ワクチンは必ずしも真皮に独占的にある必要はない。真皮は、ヒトの皮膚の表面から約１．０ｍｍと約２．０ｍｍの間に位置する皮膚の層であるが、個体によって、および体の異なる部位によってある程度の違いがある。一般的に、皮膚の表面の下１．５ｍｍ行くことで真皮に達すると考えられる。真皮は、表面の角質層、表皮と下にある皮下層の間に位置する。デリバリーの形態によって、ワクチンは最終的に単独でまたは優位的に真皮内に位置し、または最終的に表皮と真皮内において分配される。
【００３２】
本発明のもう一つの態様において、本発明は、一つまたはそれ以上のストレプトコッカス・ニュモニエ蛋白がイン・サイチュにて生成されるように、かかる蛋白をコードするＤＮＡを含有していてもよい。ＤＮＡは、核酸発現系、細菌およびウイルス発現系を含む、当業者に公知の種々のデリバリー系のいずれの系の中に含めることもできる。多数の遺伝子デリバリー技術は、Ｒｏｌｌａｎｄ（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ１５：１４３−１９８，１９９８）に記載されている技術およびその文献中に引用されている参考文献により記載されている技術として周知である。適切な核酸発現系は、患者における発現に必要なＤＮＡ配列（適当なプロモーターおよび終止配列等）を含む。発現系が、ウイルスや細菌のような組換え微生物であるときは、目的とする遺伝子を、組換えウイルスまたは細菌生物のゲノムに挿入することができる。この生物のベクターを接種し、インビボにて感染させることで、抗原をインビボで発現させ、免疫反応を誘発させることができる。この目的のために用いられるウイルスと細菌は、例えば、ポックスウイルス（例えば種痘疹、鶏痘、カナリア痘）、アルファウイルス（シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ピコルナウイルス（ポリオウイルス、ライノウイルス）、ヘルペスウイルス（水痘帯状ヘルペスウイルスなど）、リステリア、サルモネラ、赤痢菌、ナイセリア、ＢＣＧである。これらのウイルスおよび細菌は毒性であってもよく、または生ワクチンを得るため様々な方法で弱毒化させることができる。そのような生ワクチンもまた本発明の一部を形成する。
本発明のさらなる態様において、本明細書に記載したように、ワクチン処方の製造方法が提供される。かかる方法は本発明に係る蛋白の組み合わせを混ぜることを含む。
【００３３】
好ましくは、上記した多糖体を含む抗原組成物（およびワクチン）は、使用直前まで凍結乾燥され、その時点で即時に希釈剤で復元される。より好ましくは、３Ｄ−ＭＰＬの存在下で凍結乾燥され、即時に食塩水溶液で復元される。
ワクチンの凍結乾燥は、当該分野においてよく知られている。典型的には、液体ワクチンは、例えばシュークロースやラクトースのような糖（初期濃度は１０−２００ｍｇ／ｍＬ）などの固化防止剤の存在下で凍結乾燥される。凍結乾燥は、典型的には、一連の工程、例えば、６９℃で始まり、徐々に３時間かけて−２４℃とし、それからこの温度を１８時間保持し、徐々に１時間かけて−１６℃とし、この温度を６時間保持し、徐々に３時間かけて＋３４℃とし、最終的にこの温度を９時間保持する、一のサイクルで起る。
【００３４】
本発明の免疫原性組成物およびワクチンは、多様な動物モデルまたはヒトの血清によって評価されうる。一例として、次の動物モデルを肺炎球菌感染を評価するため用いることができる。Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス（６から８週齢）を、５０μｌのＣＦＡでアジュバント処理された１５μｇの蛋白で皮下的に免疫処理し、続いて３−４週間後にＩＦＡと共に１５μｇの蛋白で追加抗原処理することができる。全身性の感染からの受動的または積極的防御を証明するため、マウスは８−１０週目に１５から９０のＬＤ５０肺炎球菌で腹腔内注射をすることで、攻撃する前に、免疫血清または蛋白を腹腔内投与されうる。付加的に、蛋白はマウスの鼻咽頭コロニー形成モデルで試験されうる（Ｗｕら、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ１９９７；２３：１２７−１３７）。
マウスに加えて、ラットの幼児はストレプトコッカス・ニュモニエのコロニー形成と感染に感受性である。受動的な防御研究において、生後２−５日のラットの幼児にマウス免疫血清（１００μｌ ｉ．ｐ．または１０μｌ ｉ．ｎ．）の投与を行い、ストレプトコッカス・ニュモニエ（１０μｌ）を鼻内投与して攻撃することができる。コロニー形成は、鼻の洗浄液（２０−４０μｌを注ぎ込み、１０μｌを回収する）を平板培養することで決定される。
混合ワクチンの蛋白成分間での有利な相互作用は、１価のワクチンではやや弱い防御力であろうワクチン中の各蛋白の用量を投与することで証明される。１価のワクチンに比べ、混合ワクチンの高い防御有効性は、成分間の有利な相互作用によるとすることができる。
本発明を以下の実施例を用いて説明する。これらの実施例は、別途詳細に記載されない限り、当業者に周知かつ慣用的な標準的技術を用いて実行される。これらの実施例は例示であって、本発明を制限するものではない。
【００３５】
ＥＸＡＭＰＬＥＳ
例１．抗原の構成と発現
ＮＲ１ｘＲ２
ＣｂｐＡは、いくつかの領域よりなる７５ｋＤａの表面が露出された蛋白である。Ｎ末端領域は２つの高度に保存された反復領域（Ｒ１およびＲ２）を含み、Ｃ末端領域は１０個の縦列で、２０個のアミノ酸の直接反復配列を含む。ＣｂｐＡ末端切断物、すなわち、コリン結合領域のない蛋白を調製し、ＮＲ１ＸＲ２を産生した。
エス・ニュモニエの血清型４系統（例えば、ＷＯ９７／４１１５７またはＷＯ９９／５１２６６を参考のこと）より得られたＤＮＡからの、ＮＲ１ＸＲ２遺伝子をＰＣＲを介して増幅した。ＰＣＲは、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ ＳｙｓｔｅｍまたはＨｉ−Ｆｉ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて行った。これは、Ｔａｑポリメラ―ゼとプルーフリーディングポリメラ―ゼを含有する混合物から構成される。固有の３’−５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性のために、Ｈｉ−Ｆｉを用いることで、Ｔａｑポリメラーゼと比べて、ＤＮＡ合成にて３倍増の正確性が得られる。
ＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から入手したｐＧＥＭ−Ｔベクターにてクローンした。この工程は、今後ライゲートされるＰＣＲ断片の制限酵素消化を促進するために必要とされる。ｐＧＥＭ−Ｔベクターは線状で提供され、３’−Ｔオーバーハングを含有する。これらのオーバーハングは、テンプレート非依存性のやり方で、増幅された断片の３’末端に一本鎖デオキシアデノシンを付加する熱安定性ポリメラ―ゼによって生成されるＰＣＲ産生物の挿入を促進する。
【００３６】
断片とベクターは、Ｂｅｎｏｒｅ−Ｐａｒｓｏｎｓらの論文（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ研究，２３，４９２６−４９２７，１９９５）に従って、酵素消化（ＮｄｅＩとＸｂａＩ消化）の後に精製された。アガローススライスは３−４時間の間で完全に凍結乾燥された。エタノール―ＴＥ（１：１）溶液を凍結乾燥されたゲルに加えた。そのサンプルを１時間静かに混合し、アガロースを遠心分離により圧縮し、完全に除去した。ＤＮＡをエタノール沈降によって溶出液から回収した。
ＮＲ１ｘＲ２をコードするＤＮＡをファージλ由来の長いプロモーターＬを含有するベクターにクローンした。目的とする蛋白は、ＡＲ５８イー・コリ菌株にある場合に加熱により、またはＡＲ１２０イー・コリ菌株にある場合にナリジクス酸により誘発されることができた。
細菌の前培養基を３０℃で一晩かけて作製した。この前培養基を総容量が２０ｍｌの約４０倍に希釈し、光学濃度が０．４−０．６になるまで３０℃で放置した。ついで、４２℃で加熱誘発を行った。サンプルを異なる時点で採取した。１ｍｌの培養基を５分間、７０００回転／分で遠心分離に付した。培養基の上澄みを−２０℃で保存し、ペレット（総抽出物）を５００μｌのサンプル緩衝剤中に再び懸濁させ（ウェスターンブロット法またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析）、または５００μｌの溶菌緩衝液中に懸濁させ、３７℃で３０分間インキュベートした（ＥＬＩＳＡ）。溶菌緩衝液の組成は、ＳＤＳが０．１％、デオキシコール酸塩が０．１％、クエン酸Ｎａが０．０１５Ｍである。
【００３７】
サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動に付し、４−２０％ゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にローディングさせた。２００Ｖで移動させた。クマシーブルー染色を行った。サンプルを、ウェスターンブロッティングのために４−２０％ゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にローディングさせた。２００Ｖで移動させた。ゲルをニトロセルロースに移し、スポットをウサギα−ＮＲ１ＸＲ２ポリクローナル抗体（一次抗体）およびアルカリホスファターゼ連結α−ウサギ抗体（二次抗体）を用いて明らかにした。
約５５ｋＤａのバンドが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析で観察された。２８Ｂ２のクローンをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基いて選択し、発酵に移した。このクローンを配列決定し、その配列を確認した（アミノ酸３９（すなわちシグナル配列の後）からアミノ酸４４６までの、４０６個のアミノ酸）。
一晩かけて誘発した細菌を溶菌に付し、続いて遠心分離した後に、ＮＲ１ＸＲ２の溶解度もまた研究した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析とＥＬＩＳＡ試験がなされた。ＮＲ１ＸＲ２は主に（＞９５％）可溶性フラクションに回収されたようであった。
【００３８】
Ｒ１ｘＲ２、 ＰｈｔＤ、Ｓｐ９１、（Ｎ）Ｒ１ｘＲ２−Ｓｐ９１［Ｃ末端領域］およびＰｌｙ
これらの遺伝子もまたＮＲ１ｘＲ２と同様の方法でクローン化し、配列決定し、発現させた。Ｒ１ｘＲ２は（エス・ニュモニエの血清型４Ｎの）ＣｂｐＡのアミノ酸１７７から４４３までを含み、ＰｈｔＤはアミノ酸２１（すなわち、シグナル配列の後）から最後のアミノ酸（エス・ニュモニエ血清型４Ｎのアミノ酸８３９）までを含み、Ｓｐ９１はアミノ酸２０（ＶＡＡ）から始まり最後までである。融合蛋白としては、Ｒ１ｘＲ２−Ｓｐ９１Ｃ末端は、ＣｂｐＡのアミノ酸１７７−４４６とアミノ酸２７１から翻訳停止コドンまでを含み、またＮＲ１ｘＲ２−Ｓｐ９１Ｃ末端は、ＣｂｐＡのアミノ酸３９から４４６までとアミノ酸２７１から翻訳停止コドンまでを含む。両方の融合蛋白にとって、２個の付加的アミノ酸（ＧＳ）は、（Ｎ）Ｒ１ｘＲ２とＳｐ９１Ｃ末端配列の間に見られる。全ての構築物にとって、転写および翻訳を可能とするように、遺伝子開始コドンの５’にＡＴＧが導入されており、このことは各上記した配列の前に付加的なＮ−末端メチオニンがあることを意味する。
【００３９】
実施例２．血清学
臨床研究による血清を利用して、自然とストレプトコッカス・ニュモニエ蛋白に発達する抗体反応についてエライザを測定した。
２．１実験手順
・血清サンプル
各々、２から４ヶ月と６から１２ヶ月の時に採取された幼児の一対の血清（Ｎ＝２０、ＤＴＰａＨＢＶを研究する）
約２０歳の成人の血清（Ｎ＝５０）
６５歳以上の成人の血清（Ｎ＝１４０）
【００４０】
ＥＬＩＳＡ操作
免疫プレートを一晩４℃で１μｇ／ｍｌの各蛋白で被覆した。ついで、連続した２倍希釈の血清（１／１０希釈で始まる）を振盪しながら室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。免疫検出を、４０００倍希釈のペルオキシダーゼ連結抗ヒトＩｇＧモノクローナル抗体（Ｓｔｒａｔｅｃｋ，ＨＰ６０４３）を利用して行い、振盪しながらＲＴで３０分間インキュベートした。レベレーションの後に、ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏによって中間力価を計算した。力価≧１０の血清は陽性とみなした。幾何平均計算のため、力価５（カットオフの半分）は任意で陰性血清とされた。
μｇ／ｍｌで表されるＩｇＧ濃度は、サンプル光学濃度（ＯＤ）を、ポリクローナル抗ヒトＩｇＧヤギ抗体によりプレートに捕らえられ、上記の同じペルオキシダーゼ標識抗体より明らかにされたクロモピュア（ｃｈｒｏｍｏｐｕｒｅ）ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）のＯＤ曲線と比較することにより確立された。
【００４１】
２．２結果
２．２．１　幼児におけるストレプトコッカス蛋白血清学
２から４ヶ月の幼児の血清において、最も高い抗体力価および血清陽性率が、ＰｈｔＤ、ＰｓａＡ、Ｓｐ１２８、ＮＲ１ｘＲ２で得られ、それより低い力価および陽性率がＳｐ９１およびＰｌｙで得られた。Ｓｐ１０１とＳｐ１３０に対しては全く無し、または低い反応が検出された。Ｓｐ４６とＰｈｔＡは試験されなかった（原料入手の問題）。
抗体反応は、一般に、６から１２ヶ月の時に採取された同じ対象の血清において減少するが、これは、高力価が主に受身伝達母性抗体によるものであることを示唆している。
しかしながら、ある幼児においては、おそらく肺炎球菌に自然に曝される結果として、いくつかの蛋白に対する免疫反応が年齢とともに上昇した。この血清変換と主に関係のある抗原は明らかにＰｓａＡであった。対象によって、ＰｈｔＤ、ＮＲ１ｘＲ２、Ｓｐ１２８、Ｓｐ９１およびＰｌｙへの抗体レベルの増強もまた示された。Ｓｐ１０１とＳｐ１３０に対する体液性反応においては取るに足らない変換しか観察されなかった。（図１および２を参照のこと）
【００４２】
２．２．２　青年におけるストレプトコッカス蛋白血清学
幾何平均力価によると、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＡおよびＮＲ１ｘＲ２が、評価された青年集団の中で最も免疫原性のある蛋白であり、それにＳｐ１２８、ＰｌｙおよびＳｐ９１が続く。全ての対象がこれらの蛋白に対して検出可能な抗原を有していた。これらより低い反応がＳｐ４６、特にＳｐ１３０とＳｐ１０１に対して観測された。ＰｓａＡは試験されなかった（十分な血清が利用できなかった）。（図３および４を参照のこと）
【００４３】
２．２．２　高齢者におけるストレプトコッカス蛋白血清学
青年に比べて高齢者においては、ストレプトコッカス蛋白に対する抗体のレベルが明らかに減少した。年配の人においては、最良の免疫原がＰｈｔＤであり、Ｓｐ１２８、ＮＲ１ｘＲ２、Ｓｐ９１、ＰｌｙおよびＰｓａＡが続く。Ｓｐ１０１とＳｐ１３０に対しては取るに足らない反応しか測定されなかった。Ｓｐ４６とＰｈｔＡは試験されなかった（原料入手の問題）。（図５および６を参照のこと）
【００４４】
【表１】
表１　高齢者における幾何平均ＩｇＧ濃度（ＧＭＣ）（μｇ／ｍｌ）
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【００４５】
特許および特許出願を含むがこれらに限らず、この明細書中で引用されている全ての刊行物は、たとえ、個々の刊行物が、その内容を十分に開示している場合に、出典を明示することにより明細書の一部とすることを、具体的かつ個別的に意図するものであったとしても、その出典を明示することにより本明細書の一部とする。
本発明の好ましい具体例が上記されているが、本発明はここに開示されている教示そのものに限定されるものではなく、上記した特許請求の範囲内にあるすべての修飾する権利も保存されていることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】幼児における血清反応陽性を示す。
【図２】幼児における加齢との血清変換を示す。
【図３】青年におけるストレプトコッカス蛋白の中点力価を示す。
【図４】青年における血清反応陽性を示す。
【図５】高齢者におけるストレプトコッカス蛋白の中点力価を示す。
【図６】高齢者における血清反応陽性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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