(57)【要約】本発明は、メタケイ酸ナトリウムおよびエーテルを含有する水溶性組成物、およびその組成物を、細胞、ウイルスまたは他の供給源から核酸を抽出するために使用する方法を提供する。抽出された核酸は、ポリメラーゼ連鎖反応のためのテンプレートＤＮＡの供給源として包含する、種々の目的のために使用され得る。本発明は、サンプル（代表的には、生物学的サンプル）から核酸を単離するための、単純、高速、かつ効率的な方法を提供する。この方法に従って、生物学的サンプルを、この生物学的サンプル中で細胞を溶解するのに十分な温度で、核酸抽出試薬と一定時間接触させる。溶解の後、代表的には、サンプルを遠心分離して細胞細片を小さく丸め、そして上清（これは、核酸を含有する）を回収することによって、この核酸を細胞細片から回収する。
2004534515.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
引き続く操作のために核酸を調製する方法であって、該核酸を含有することが疑われるサンプルを水性核酸抽出試薬と接触させる工程を包含する、方法。
【請求項２】
サンプルから核酸を単離する方法であって、以下：
核酸を含有することが疑われるサンプルを水性核酸抽出試薬と接触させる工程；および
該核酸を回収する工程、
を包含する、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、ここで、前記サンプルが、細胞またはウイルスを含有し、そして該サンプルが、該細胞または該ウイルスを溶解するために十分な時間、前記水性核酸抽出試薬と接触される、方法。
【請求項４】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記核酸抽出試薬が、約０．１重量％〜約１８重量％のメタケイ酸ナトリウム、および合計２個〜１２個の炭素原子を有する、約０．０５重量％〜８０重量％の水溶性置換エーテルを含有し、そして該核酸抽出試薬が約ｐＨ７〜約ｐＨ１０の範囲のｐＨを有する、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、ここで、前記水溶性置換エーテルが、アルコキシアルキルアルコール、アリールオキシアルキルアルコールまたはアルコキシアリールアルコールである、方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法であって、ここで、前記水溶性置換エーテルが、式ＣＨ３（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＣＨ２−ＯＨを有し、ここで、ｍおよびｎは、互いに独立して、０と６との間の整数である、方法。
【請求項７】
請求項４に記載の方法であって、ここで、置換エーテルが、２−ブトキシエタノール、２−メトキシエタノール、２−フェノキシエタノール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールジブチルエーテル、２−ブトキシエタノール、ジエチレングリコール−モノペンチルエーテル、ジエチレングリコール−ジエチルエーテル、エチレングリコール−モノエチルエーテル、エチレングリコール−モノエチルエーテル、エチレングリコール−モノブチルエーテル、エチレングリコール−ジメチルエーテルおよびエチレングリコール−ジエチルエーテルからなる群から選択される、方法。
【請求項８】
請求項４に記載の方法であって、ここで、置換エーテルに対するメタケイ酸ナトリウムの比率が、約１：１．１〜約１：１．５である、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、ここで、前記比率が、１：１．３である、方法。
【請求項１０】
請求項４に記載の方法であって、ここで、前記抽出試薬のｐＨが、約ｐＨ８〜ｐＨ９の間である、方法。
【請求項１１】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記接触工程が、約２５℃〜約１２０℃の範囲の温度で実施される、方法。
【請求項１２】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記接触工程が、約５分〜約３０分の間実施される、方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記サンプルが、食品サンプルである、方法。
【請求項１４】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記サンプルが、臨床的サンプルである、方法。
【請求項１５】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記サンプルが、法医学的サンプルである、方法。
【請求項１６】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記サンプルが、農業サンプルである、方法。
【請求項１７】
請求項１または２に記載の方法であって、ここで、前記サンプルが、環境的サンプルである、方法。
【請求項１８】
請求項１または請求項２に記載の方法であって、ここで、前記サンプルが、培養物中で増殖される微生物である、方法。
【請求項１９】
水性核酸抽出試薬であって、以下：
０．８重量％より高く５重量％より低いメタケイ酸ナトリウム；
１重量％より高く５重量％より低い水溶性置換エーテルであって、約ｐＨ７〜ｐＨ１０の範囲のｐＨを有する、水溶性置換エーテル、
を含む、水性核酸抽出試薬。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸抽出試薬であって、ここで、前記エーテルが、アルコキシアルキルアルコール、アリールオキシアルキルアルコールおよびアルキルオキシアリールアルコールからなる群から選択される、核酸抽出試薬。
【請求項２１】
請求項１９に記載の核酸抽出試薬であって、ここで、前記エーテルが、２−ブトキシエタノール、２−メトキシエタノール、２−フェノキシエタノール、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールジブチルエーテル、２−ブトキシエタノール、ジエチレングリコール−モノペンチルエーテル、ジエチレングリコール−ジエチルエーテル、エチレングリコール−モノメチルエーテル、エチレングリコール−モノエチルエーテル、エチレングリコール−モノブチルエーテル、エチレングリコール−ジメチルエーテルおよびエチレングリコール−ジエチルエーテルからなる群から選択される、核酸抽出試薬。
【請求項２２】
請求項１９に記載の核酸抽出試薬であって、クエン酸をさらに含有する、核酸抽出試薬。
【請求項２３】
請求項１９に記載の核酸抽出試薬であって、緩衝液をさらに含有する、核酸抽出試薬。
【請求項２４】
請求項１９に記載の核酸抽出試薬であって、キレート剤をさらに含有する、核酸抽出試薬。
【請求項２５】
請求項１９に記載の核酸抽出試薬であって、防腐剤をさらに含有する、核酸抽出試薬。
【請求項２６】
請求項１９に記載の核酸抽出試薬であって、安定剤をさらに含有する、核酸抽出試薬。
【請求項２７】
請求項１９に記載の核酸抽出試薬であって、ここで、前記エーテルの重量％に対するメタケイ酸ナトリウムの重量％の比率が、約１：１．３である、核酸抽出試薬。
【請求項２８】
核酸抽出試薬およびＰＣＲプライマーを含有する、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般に、生物学的サンプルから核酸を迅速かつ効率的に精製するための方法、組成物、およびキットに関する。
【０００２】
（背景）
現代の分子生物学および分子医学の技術の多くは、生物学的供給源からの、核酸の単離から始まる。代表的に、核酸は、細胞またはウイルスから抽出され、次いで、１つ以上の酵素で修飾または操作される。有用であるために、この抽出プロセスは、少なくとも３つの基準を満たさなければならない。第１に、抽出プロセスは、核酸を含有する細胞またはウイルスから核酸を取り出すことによって、その核酸を、操作者による操作に利用可能にしなければならない。第２に、抽出プロセスは、他でこの操作と干渉する酵素のインヒビターを、除去しなければならない。第３に、抽出プロセスは、他で核酸を破壊するヌクレアーゼを、除去しなければならない。核酸の供給源が、細胞またはウイルスの比較的純粋な培養物ではなく、その代わりに、他の混入物を含有する場合、これらの各基準を満たすことは特に困難である。核酸の供給源が、出発材料の微量成分そのものである場合、これらの問題は特に大きい。例えば、核酸が、食物サンプルの一部である食物病原体から抽出される場合が、そのような場合である。
【０００３】
殆どのＤＮＡ抽出方法は、少なくとも２つの工程を包含する。第１の工程において、細胞またはウイルスを、化学的処理、煮沸、細胞壁の酵素消化、または機械的な力によって溶解する。溶解によって、細胞またはウイルスからＤＮＡを放出させ、ＤＮＡを操作に利用可能にする。遠心分離または濾過によって、細胞細片またはウイルス細片を、ＤＮＡおよび不純物（例えば、酵素のインヒビターおよびヌクレアーゼ）を含有する粗製画分から分離する。第２の工程において、粗製画分からインヒビター、ヌクレアーゼおよび他の所望でないタンパク質を除去することによって、このＤＮＡを精製する。従来的に、この工程は、粗製画分をフェノールで抽出し、そしてエタノールまたはイソプロパノールを用いてＤＮＡを沈殿させることによって、達成されている。フェノール抽出により、タンパク質混入物を除去する。不運なことに、フェノールは、非常に毒性でかつ腐食性の化学物質であり、操作者が、防護服、手袋、安全眼鏡を着用すること、および、ドラフトを用いることを必要とする。フェノールは、ＤＮＡを抽出するために用いられ得る前に、７．８よりも高いｐＨに平衡化されなければならない。この平衡化プロセスは、フェノールを６８℃まで加熱することを必要とするので、時間がかかり、そして危険である。このフェノール抽出工程は、平衡化されたフェノールを、クロロホルムおよびイソアミルアルコールと、２５：２４：１の比率で組み合わせることによって、より効率的になる。しかし、この混合物は、４℃でわずか１ヶ月しか安定でなく、そしてクロロホルムは非常に毒性であり、疑わしい発癌性物質である。アルコール沈降は、微量のフェノールおよびクロロホルムを含む混入物を除去するために不可欠である。１回のフェノール抽出またはエタノール沈降は、代表的には、ＤＮＡからの不純物の除去において完全に有効ではないので、受容可能な純度のＤＮＡを得るために、これらの工程をしばしば数回繰り返さなければならない。しかし、各々の抽出および沈降で、ＤＮＡの一部が失われ、より低い収率を生じる。各々の沈降工程はまた、ＤＮＡから全ての微量のアルコールを除去するための、乾燥する工程を必要とする。アルコールは、周囲温度および周囲圧力で蒸発し得るか（これには時間がかかる）、または、加熱された真空密閉遠心分離器において、上昇した温度および減少した圧力で蒸発し得る（これは、それほど遅くはないが、高価かつ複雑な装置およびかなりの量の操作時間を必要とする）。
【０００４】
より最近では、従来のＤＮＡの単離方法に対する、フェノールまたはクロロホルムを用いない代替方法が、開発されている。これらの代替方法は、代表的に、ＤＮＡを固体基材（例えば、カラム、樹脂、フィルターまたはスラリー）に結合することによって、インヒビター、ヌクレアーゼおよび他のタンパク質を除去する工程を包含する。このＤＮＡを、１回以上洗浄して不純物を除去し、次いで、基材から溶出する。これらの代替方法は、従来の方法を上回るいくつかの利点を提供するが、必要とされる結合基材は、高価であり、かつ再利用することができない。さらに、これらの方法は、操作者がかなりの時間および労力を費やすことを必要とする。また、基材に結合したＤＮＡは、剪断によって破壊されやすくあり得る。
【０００５】
ＲＮＡの単離には、さらに大きな困難がある。単離の間に存在する微量のＲＮＡｓｅは、サンプル中の全てのＲＮＡを迅速に破壊し得る。操作者は、サンプル中に本来存在するＲＮＡｓｅを失活させ、かつ、外部供給源に由来するＲＮＡｓｅがこのサンプル中に導入されることを防止しなければならない。このことは、ＲＮＡｓｅが遍在性であり、豊富であり、かつ強力な酵素であるので、困難な課題である。ＲＮＡを単離する殆どの方法は、複雑であり、そして時間のかかる多くの工程を包含し、各工程は、所望のＲＮＡを破壊するＲＮＡｓｅによる、サンプルの汚染の機会である。
【０００６】
上記の核酸抽出方法の欠点は、出発材料が、比較的純粋な、研究室で増殖された培養物ではなく、その代わりに粗製サンプルである場合、非常に増大する。既存の核酸の単離方法を妨げている粗製サンプルの例としては、食物サンプル、臨床的サンプル、法医学的サンプル、農学的サンプル、および環境的サンプルが挙げられる。さらに悪いことに、核酸の供給源である細胞またはウイルスは、しばしば、サンプルの総質量の小さな画分である。この核酸を、細胞またはウイルスの細片からも、そしてサンプル中の他の材料からも、そしてこの核酸を含む、酵素のあらゆるヌクレアーゼまたはインヒビターからも、分離しなければならない。ＲＮＡはＲＮＡｓｅ触媒加水分解に対して鋭敏に感受性であるので、この問題は、核酸がＲＮＡであるか、あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）または別の増幅技術を用いて増幅されるＤＮＡである場合に、特に深刻である。ＰＣＲは、微小量の基質ＤＮＡしか必要としないが、このＤＮＡを増幅するために用いられるポリメラーゼ酵素は、微量のインヒビターに対してさえも感受性である。
【０００７】
従って、当該技術において、生物学的サンプルから核酸を単離するための、高速かつ効率的な方法の必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たす。本発明の方法は、全ての核酸を、実質的に任意の生物学的供給源から単離することを可能にする。本発明の方法は、以前の方法が無効または非実用的である条件（生物学的サンプルが多量の汚染物質を含む；核酸の供給源が、生物学的サンプルの総量の小さい画分である；単離が大規模であるかまたは自動化されている；あるいは、電気または研究室設備が利用可能でない条件）下において、特に有用である。
【０００８】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、サンプル（代表的には、生物学的サンプル）から核酸を単離するための、単純、高速、かつ効率的な方法を提供する。この方法に従って、生物学的サンプルを、この生物学的サンプル中で細胞を溶解するのに十分な温度で、核酸抽出試薬と一定時間接触させる。溶解の後、代表的には、サンプルを遠心分離して細胞細片を小さく丸め、そして上清（これは、核酸を含有する）を回収することによって、この核酸を細胞細片から回収する。
【０００９】
本発明の方法において有用な核酸抽出試薬は、代表的に、約０．１％（重量／重量）〜約１８％（重量／重量）のメタケイ酸ナトリウム、および、約０．０５％（重量／重量）〜約８０％（重量／重量）、そして好ましくは約０．５％（重量／重量）〜約４０％（重量／重量）の置換されたエーテルを含有する、水性組成物である。メタケイ酸ナトリウムと置換されたエーテルとの重量比は、代表的に、約１：０．５〜約１：２の範囲内にある。好ましい実施形態において、メタケイ酸ナトリウムと置換されたエーテルとの重量比は、約１：１．３である。代表的な置換されたエーテルとしては、２〜１２個の炭素原子、より好ましくは３または４〜８個の炭素原子を含む、アルコキシアルキルアルコール、アリールオキシアルキルアルコールおよびアルキルオキシアリールアルコールが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい置換されたエーテルは、式ＣＨ３（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＯＨに従う、非分枝の第１級アルコキシアルカノールであり、ここでｍおよびｎは各々、互いに独立して、０〜６の整数である。好ましいアルキル化アルキルアルコールの例としては、２−ブトキシエタノールおよび２−メトキシエタノールが挙げられる。さらなる置換されたエーテルとしては、２−フェノキシエタノール、ジエチレングリコール−モノブチルエーテル、ジエチレングリコール−モノエチルエーテル、ジエチレングリコール−モノペンチルエーテル、ジエチレングリコール−ジエチルエーテル、ジエチレングリコール−ジブチルエーテル、エチレングリコール−モノメチルエーテル、エチレングリコール（ｇｌｃｙｏｌ）−モノエチルエーテル、エチレングリコール−モノブチルエーテル、エチレングリコール−ジメチルエーテルおよびエチレングリコール−ジエチルエーテルが挙げられる。
【００１０】
核酸抽出試薬は、代表的に塩基性（好ましくは、約ｐＨ７〜約ｐＨ１０の範囲のｐＨを有する）であり、そして、以下に挙げられるがこれらに限定されない、さらなる任意の成分を含有し得る：代表的に約０．０１Ｍ〜約０．０４Ｍの範囲の濃度の、有機酸（例えば、クエン酸または酢酸）；代表的に約１０ｍＭ〜約１００ｍＭの濃度の、緩衝剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ）；代表的に約０．１ｍＭ〜約１ｍＭの範囲の濃度の、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）；代表的に１５％（重量／重量）以下の濃度の、樹脂（例えば、架橋ポリスチレンビーズ（例えば、ＣＨＥＬＥＸＴＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、トリス（２−アミノエチル）アミンおよびイミノ二酢酸を有する架橋アガロースビーズ、Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ｃ−４６７、Ｄｕｏｌｉｔｅ  ＧＴ７３）；代表的に約０．０１％〜約０．４％（重量／体積）の範囲の濃度の、保存剤（例えば、ＮａＮ３）；代表的に約０．１％〜約１．０％（重量／体積）の範囲の濃度の、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはＴＷＥＥＮ）；ならびに、代表的に約０．０３％（重量／重量）〜約１％（重量／重量）の範囲の濃度の、安定剤（例えば、ポリエチレングリコール）。抽出された核酸の意図される使用は、抽出試薬中で用いられる各成分の濃度に影響し得る。例えば、抽出された核酸がＰＣＲ反応において用いられる場合、抽出試薬は、ＰＣＲ反応における成分の濃度が、Ｔａｑポリメラーゼを阻害しないか、さもなければ、増幅反応が働くのを妨げないように、処方されるべきである。ＰＣＲ反応の成功に影響する因子については、Ｉｎｎｉｓ（編）、１９９５、ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、特に第１章を参照のこと。
【００１１】
本発明の方法を用いて核酸が単離され得る、生物学的供給源の型は、実質的に無制限である。例えば、核酸は、細菌（例えば、真正細菌または古細菌）、ウイルス、レトロウイルス、または真核生物（例えば、酵母または他の菌類）のような、微生物から単離され得る。この微生物は、病原性微生物であり得る。核酸はまた、例えば、植物細胞または動物細胞（例えば、ヒト細胞）から単離され得る。核酸が単離される細胞またはウイルスは、実質的に任意の型のサンプルの一部であり得る。例えば、この細胞またはウイルスは、食物サンプル、臨床的サンプル、法医学的サンプル、農学的サンプルまたは環境的サンプルの一部であり得る。これらのサンプルは、例えば、体液（例えば、血液、精液、唾液）、被験体から採取される組織または他のサンプル（例えば、生検材料）、細胞またはウイルスを含有することが知られているか、または含有の疑いがある、土、水、または他の任意の固体材料もしくは液体材料を、含み得る。
【００１２】
別の局面において、本発明は、本発明の方法における使用のために特異的に処方される、核酸抽出試薬を提供する。本発明の核酸抽出試薬は、代表的に、０．８％（重量／重量）より大きく５％（重量／重量）未満であるメタケイ酸ナトリウム、および、０．４％（重量／重量）より大きく５％（重量／重量）未満である置換されたエーテルを含有する、水性組成物である。
【００１３】
好ましい実施形態において、この組成物は、約０．８５％（重量／重量）〜約４％（重量／重量）のメタケイ酸ナトリウムを含有する。より好ましい実施形態において、この組成物は、約０．９０％（重量／重量）〜約３％（重量／重量）のメタケイ酸ナトリウムを含有する。もっとも好ましい実施形態において、この組成物は、約１％（重量／重量）〜約２％（重量／重量）のメタケイ酸ナトリウムを含有する。
【００１４】
別の好ましい実施形態において、この組成物は、約１．１％（重量／重量）〜約４％（重量／重量）の置換されたエーテルを含有する。より好ましい実施形態において、この組成物は、約１．２％（重量／重量）〜約３％（重量／重量）の置換されたエーテルを含有する。もっとも好ましい実施形態において、この組成物は、約１．２５％（重量／重量）〜約２．５％（重量／重量）の置換されたエーテルを含有する。
【００１５】
別の好ましい実施形態において、メタケイ酸ナトリウム濃度と置換されたエーテルの濃度との比は、約０．１６：１〜約５：１である。より好ましい実施形態において、メタケイ酸ナトリウム濃度と置換されたエーテルの濃度との比は、約０．５：１〜約４：１である。さらにより好ましい実施形態において、メタケイ酸ナトリウム濃度と置換されたエーテルの濃度との比は、約０．７：１〜約３：１である。さらにより好ましい実施形態において、メタケイ酸ナトリウム濃度と置換されたエーテルの濃度との比は、約０．８：１〜約２：１である。さらにより好ましい実施形態において、メタケイ酸ナトリウム濃度と置換されたエーテルの濃度との比は、約０．９：１〜約１：１．７５である。さらにより好ましい実施形態において、メタケイ酸ナトリウム濃度と置換されたエーテルの濃度との比は、約１：１〜約１：１．５である。さらにより好ましい実施形態において、メタケイ酸ナトリウム濃度と置換されたエーテルの濃度との比は、約１：１．２〜約１：１．４である。もっとも好ましい実施形態において、メタケイ酸ナトリウム濃度と置換されたエーテルの濃度との比は、約１：１．３である。
【００１６】
別の好ましい実施形態において、その組成のｐＨ範囲は、約７以上である。さらに好ましい実施形態において、その組成のｐＨ範囲は、約７〜約１０．５である。最も好ましい実施形態において、その組成のｐＨ範囲は、約８〜約９．５である。
【００１７】
典型的な置換エーテルおよび好ましい置換エーテルは、前に記載されたものである。その核酸抽出試薬はまた、上記のさらなる任意の成分を含有し得る。
【００１８】
別の局面において、本発明は、本発明の方法を実行するのに有用な核酸抽出試薬を含むキットを提供する。そのキットは、必要に応じてさらなる試薬、緩衝液および、配列決定もしくはＰＣＲのような、核酸が抽出されるサンプルを成長させる装置、および／または単離された核酸のその後分析を行うための装置を含有する。例えば、そのキットはサンプルを成長させるか、または本発明の方法を実行するための容器、配列決定プライマーまたはＰＣＲプライマー、ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）または他の酵素、ヌクレオチドトリホスフェ−トまたはヌクレオチドトリホスフェートの混合物、微生物、または微生物を培養するための培地を含有し得る。
【００１９】
本発明の核酸抽出試薬および方法は、現在利用可能な単離技術よりも、有意な利点を提供する。極めて重要なことは、本発明の試薬および／または方法で単離された核酸は、実質的に純粋であり、さらなる操作または精製なしに、種々のアッセイおよび／または分析に直接使用され得るということである。例えば、本発明の試薬および／または方法で単離された核酸は、さらなる精製なしに増幅（例えば、ＰＣＲによって）され得るか、または配列決定され得る。単一の工程で、高純度で、特に、ＰＣＲ増幅のような後の酵素操作に十分な程高純度で、生物学的サンプルから核酸を効率的に単離する能力は、当該分野において前例がない。
【００２０】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明の方法、組成物、およびキットは、細胞およびウイルスから核酸を抽出するのに有用である。それらは、非常に使い道が多く、多数のそして広範な種々の用途での使用に適応し得る。その用途のいくつかは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（編），１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹおよびＡｕｓｕｂｅｌら（編），２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹに記載される。以下にさらに詳細に記載するように、本発明の組成物、方法およびキットは、さらに原始的な（例えば、電気のない）条件下において、実質的に任意の供給源から誘導されたサンプル（例えば、細胞培地、臨床サンプル、農業サンプル、環境サンプル、法医学サンプル、または食物サンプル）において、任意の型の細胞（例えば、原核細胞または真核細胞）または任意の型のウイルス（例えば、ＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルス）から、実質的に任意の型の核酸（例えば、任意の型のＤＮＡまたはＲＮＡ）を単離するために使用され得る。抽出された核酸は、さらなる精製または洗浄なしで、核酸抽出物がおかれ得る当該分野で公知の実質的に任意の目的（例えば、増幅反応、配列決定反応、標識反応、アニーリング反応、制限消化、連結、逆転写反応、ハイブリダイゼーション、サザンブロットまたはノーザンブロット）に使用され得る。本発明の組成物、方法、およびキットは、増殖技術（例えば、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＭＡＳＢＡ、ＳＤＡおよびｂＤＮＡ）および、任意の高スループットプロセスまたは自動プロセスに使用するための、核酸抽出物の精製に特に良く適している。本発明はまた、予め抽出された核酸の精製または洗浄に適応され得る。さらに、本発明の組成物、方法、およびキットは、当該分野に公知の、他の核酸抽出試薬、方法およびキットと比較して、安価、シンプル、そして作製または使用が迅速である。他の核酸抽出の方法と異なり、本発明の方法は、熱源、遠心分離機、または真空デシケーターなしで実行され得る。従って、本発明の方法は、電気の利用できない場所における使用に理想的である。その核酸抽出試薬はまた、環境的に安全である。
【００２１】
本発明の方法に従って、目的の核酸を含むかまたは含む疑いのあるサンプルが、ある温度で、およびサンプル内で細胞が溶解するのに十分な時間で、核酸抽出試薬と接触され、それによって核酸は、抽出試薬中に遊離される。次いで、遊離された核酸は、典型的には、細胞細片および他の混入物から、サンプルを遠心分離して細胞片および混入物をペレット状にし、そしてそのペレットから上清を分離することによって単離され得る。次いで、単離された核酸を、さらなる精製無しに、例えば、ＰＣＲ増幅反応のようなさらなる操作およびアレイに使用し得る。
【００２２】
本発明の方法に有用な核酸抽出試薬は、メタケイ酸ナトリウムおよび置換エーテルを含有する溶液である。その試薬は、典型的には、約７〜約１０のｐＨ範囲を有するｐＨにて中性から塩基性であり、そして一般的には約０．１％〜約１８％（ｗ／ｖ）のメタケイ酸ナトリウムおよび約０．０５％〜約８０％（ｖ／ｖ）の置換エーテルを含有する。
【００２３】
置換エーテルの同一性は、成功のために重要な意味を持たない。使用され得る典型的な置換エーテルとしては以下の例が挙げられ得るが、それらに限定されない：総数２〜１２個の炭素原子（さらに好ましくは、３または４〜８個の炭素原子）を含む、アルコキシアルキルアルコール、アルコキシアルキルアルコールおよびアルキルオキシアリールアルコール。そのアルキル基は、直鎖、分枝または環であり得、そして飽和または不飽和であり得る。そのアリール基は、典型的にはフェニルまたはナフチルである。好ましい置換エーテルは、式ＣＨ３（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｎＣＨ２ＯＨに従う直鎖の第１級アルコキシアルカノールであり、ここで、ｍおよびｎは、互いに独立して、０〜６の間の整数である。好ましいアルキル化アルキルアルコールの例としては、２−ブトキシエタノールおよび２−メトキシエタノールが挙げられる。さらなる置換エーテルとしては、２−フェノキシエタノール、ジエチレングリコール−モノブチルエーテル、ジエチレングリコール−モノエチルエーテル、ジエチレングリコール−モノフェニルエーテル、ジエチレングリコール−ジエチルエーテル、ジエチレングリコール−ジブチルエーテル、エチレングリコール−モノメチルエーテル、エチレングリコール−モノエチルエーテル、エチレングリコール−モノブチルエーテル、エチレングリコール−ジメチルエーテルおよびエチレングリコール−ジエチルエーテルが挙げられる。
【００２４】
当業者によって理解されるように、その核酸抽出試薬は、２以上の置換エーテルの混合物を含有し得る。例えば、その試薬は、上式に従う第１級アルコキシアルカノールおよびアリールオキシアルキルアルコールの混合物を含有し得る。置換エーテルの混合物が使用される場合、本明細書中に記載される様々な量および様々な比率が、置換エーテルの総量を指す。
【００２５】
核酸抽出試薬はまた、さらなる任意の成分を含有し得、その成分としては、例として以下が挙げられるが、それらに限定しない：緩衝剤、キレート剤、防腐剤など。試薬のｐＨを、使用され得るｐＨ７〜ｐＨ１０の範囲に維持するために最適な任意の緩衝剤としては、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、リン酸緩衝液などが挙げられる。試薬のｐＨは、酸または塩基（例えば、ＨＣｌまたはＮａＯＨ）で調整され得る。あるいは、そのｐＨは、弱酸または弱塩基（例えば、クエン酸または酢酸のような弱有機酸）で調整され得る。成功のために重大な意味は持たないが、緩衝剤の濃度は、典型的には１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲であり、より好ましくは、１０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲である。
【００２６】
下記でさらに詳細に議論するように、調製の間、核抽出試薬を酸性化することが、しばしば好まれる。従って、核酸抽出試薬は、酸をさらに含有し得る。好ましい酸は、クエン酸または酢酸のような弱有機酸である。使用される際、有機酸の最終濃度は、典型的には、０．００１Ｍ〜０．５Ｍの範囲であり、さらに典型的には、０．０１Ｍ〜０．２５Ｍ、最も好ましくは、０．０５Ｍ〜０．２Ｍの範囲である。
【００２７】
必要に応じて使用され得るキレート剤としては、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ（典型的には約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲、より好ましくは約０．５ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲、最も好ましくは約１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲）が挙げられるが、それに限定されない。使用され得るキレート樹脂としてはまた、以下が挙げられるが、それらに限定されない：架橋ポリスチレンビーズ（例えば、ＣＨＥＬＥＸＴＭ）、トリス（２−アミノエチル）アミン（ｔｒｉｓ（２−ａｍｉｎｔｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｅ）を伴う架橋アガロースビーズ、イミノジ酢酸、Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ｃ−４６７、Ｄｕｏｌｉｔｅ  ＧＴ７３。これらのキレート剤は、典型的には約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）の範囲の濃度であり、より好ましくは、約０．０２５％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）、最も好ましくは、０．０５％（ｗ／ｖ）〜約０．２％（ｗ／ｖ）である。
【００２８】
防腐剤（例えば、アジドナトリウム）がまた、使用され得る。使用される際、防腐剤は、非常に低い濃度（約０．１％〜０．４％の範囲）で典型的に使用される。
【００２９】
安定剤（例えば、ポリエチレングリコール）がまた、使用され得る。使用される際、安定剤は約０．０４％（ｗ／ｗ）〜約１％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度で典型的に使用され得る。
【００３０】
核酸抽出試薬に使用され得る、他の任意の成分は、当業者に明らかである。例えば、試薬はまた、抽出された核酸のさらなる操作に有用な成分を含有し得る。例えば、その試薬は、１以上のＴａｑポリメラーゼ緩衝液、Ｔａｑポリメラーゼ、ヌクレオチドトリホスフェート、およびプライマーを、抽出された核酸のＰＣＲ増幅を促進する濃度で含有し得る。
【００３１】
本発明の方法を使用して、（必要な場合ｐＨを調整後）核酸抽出試薬として好首尾に使用され得る、メタケイ酸ナトリウムおよび置換エーテルを含む様々な組成物は、以下に記載される：例えば、米国特許第５，９６５，５１２号、同第５，９０６，２１５号、同第５，８８８，３０８号、同第５，８４９，６８１号、同第５，７８６，３１９号、同第５，７７０，５４８号、同第５，６３７，１５２号、同第５，５３４，１８１号、同第５，４４４，０９４号、同第５，３４０，６８２号、同第５，２２７，２７６号、同第５，０９６，６１０号、同第５，２０２，０４９号、同第５，１５８，７１０号、同第４，９２１，６２９号、同第４，８４４，７４５号、同第４，４２１，６８０号、同第３，８７９，２１６号、日本特許出願番号ＪＰ５８００９７９３、欧州特許出願番号０  ３７９  ０９３  Ａ１、欧州特許出願番号０  ４０５  ９８６  Ａ２およびＰＣＴ特許出願番号９７／０９４１２（その開示は、本明細書中で参考として援用する）。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、核酸抽出試薬は、約１％〜約２％（ｗ／ｗ）のメタケイ酸ナトリウムおよび約１．２５％〜２．５％（ｗ／ｗ）の置換エーテル（２−ブトキシエタノール、２−メトキシエタノール、２−フェノキシエタノール、ジエチレンモノエチルエーテル、ジエチレングリコールブチルエーテルおよびジエチレングリコールジブチルエーテルなど）を含有し、そして、ｐＨ８．３〜ｐＨ８．９の範囲のｐＨを有する。好ましくは、メタケイ酸ナトリウム対アルコキシアルキルアルコールの重量対重量の比が、１：１．１〜１：１．５の範囲であり、より好ましくは、１：１．３である。好ましい組成はまた、クエン酸または酢酸を約０．０５Ｍ〜約０．２Ｍの範囲で含有する。好ましい組成はまた、上に列挙した任意の成分のいずれかを前に示した量で含有し得る。
【００３３】
この核酸抽出試薬は、上に列挙された特許および参考文献に教示される技術のような、通常の技術に従って調製され得る。１つの便利な実施形態において、この核酸抽出試薬は、水中でメタケイ酸ナトリウムを最初に溶解し、そしてこの溶液を置換エーテルで希釈することによって調製される。次いで、その水性メタケイ酸置換エーテルナトリウム溶液は、弱有機酸の水溶液でさらに希釈される。最後に、得られた溶液は、緩衝液で希釈され、所望のｐＨに達する。
【００３４】
調製の間かまたは後の貯蔵の間のいずれかにおいて、時々、綿状のものが核酸抽出試薬に懸濁されるようになるのが観察される。一旦形成されると、その綿状のものは、穏やかな撹拌および／または熱を加えることによって再び溶解され得る。しかしながら、その綿状のものは、再び溶解される必要はない。この綿状のものの存在は、本発明の方法に使用される際、核酸を抽出するための試薬の能力に不利に影響を与えない。従って、もし、綿状のものが発生する場合、この試薬は、使用者に好ましいような方法で使用され得るかまたは使用者の選択に従って清澄化される。本発明に従う、異なる種々の核酸抽出試薬の調製の詳細は、実施例において提供される。
【００３５】
核酸抽出試薬がサンプルと接触される温度は、成功に重大ではない。例えば、その接触は、室温で、室温以上の温度で、および室温以下の温度で実施され得る。しかし、混合物の温度が細胞溶解の度合に影響することが考えられるので（以下で詳細に論じる）、温度の選択は、サンプルが試薬と接触されねばならない期間に影響する。一般的に、細胞溶解の度合は、温度の増加に伴い増加する。従って、より高い温度で接触されるサンプルは、一般的に、同じ結果を得るのにより短い時間で接触され得る。しかし、当業者は、核酸が高い温度では完全には安定ではないことを理解する。従って、使用される温度は、抽出される核酸が変性あるいは分解するほど高くないべきである。上で示されるように、その方法は、室温以下の温度であっても機能するが、代表的には、室温（およそ２５℃）から約１２０℃の範囲の温度、より代表的には、約５５℃から約１００℃の範囲の温度が良好な結果を生む。混合物は、接触工程中に、当該分野に公知である任意の方法または任意の装置（例えば、加温された水浴、加熱ブロックまたはサーモサイクラー）を使用して加熱され得る。操作者はまた、混合物を冷やすことにより（例えば、混合物を氷中または冷凍ユニットにおいてインキュベートすることにより）、溶解度合を低下させ得る。
【００３６】
温度に加えて、サンプルが核酸抽出試薬と接触される期間に影響する他の要因として、例えば、抽出されることが所望される核酸の量、開始時のサンプル中の細胞またはウイルスの数または濃度、溶解される細胞またはウイルスの型、およびその核酸が置かれるその後の使用、が挙げられる。当業者はまた、接触工程の期間が溶解のための必要最小限を超えて延長され得ること、およびその限定要因が溶解物中の核酸の分解の度合であることを理解する。例えば、溶解物は、室温で、核酸の分解なしに少なくとも数日間放置され得る。混合物を４℃に冷やすことにより、接触工程は９ヶ月以上に延長され得る。混合物は、更に長い期間の保存のために凍結され得る。
【００３７】
大部分のサンプルについて、約１０分の接触時間が２５℃〜１００℃の温度の間で満足ゆく結果を生じることが見出された。
【００３８】
一旦、細胞が接触工程にて溶解されると、放出された核酸は、標準的な方法を使用して細胞細片および他の粒状物質から回収され得る。都合の良いことに、この溶解物は、放出された核酸を含む水相と、固相に分離され得る。その分離は、溶解物を実質的に静置するかまたは遠心分離によってかのいずれかにより、重力によって達成される。
【００３９】
あるいは、細胞および他の細片は、濾過により除去され得る。核酸は、しばしば、ガラスなどのような特定の物質に非特異的に付着するので、核酸に非特異的には有意に結合しないフィルター材料が選択されるべきである。
【００４０】
本発明の方法の有意な利点は、単離された核酸が、さらなる精製を行わずに、さらなるアッセイおよび実験に直接使用され得ることである。例えば、実施例２に実証されるように、回収された上清は、単離された核酸の直接の分析のために、直接的にアガロースゲルにて泳動され得る。実施例２〜１３に実証されるように、本発明の方法に従って単離された、食物および血液を含む異なるサンプルに由来するＤＮＡは、ＰＣＲ増幅実験において直接的に使用された。それらの実施例に従い、上清画分は、ＰＣＲ反応に対する鋳型ＤＮＡの供給源として直接的に使用された。上清画分はまた、他の応用（例えば、配列決定、標識反応、またはｃＤＮＡ調製）のための鋳型ＤＮＡまたは鋳型ＲＮＡの供給源として使用され得た。
【００４１】
広義においては、本発明の方法は、サンプル中の全ての供給源から全ての核酸を抽出する。操作者が特定の核酸を他のものと分離することを望む場合、１つ以上のさらなる工程が加えられ得る。例えば、単離された核酸は、大きさまたはトポロジーによって核酸を分離するために、アガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲルにて電気泳動され得る。ＲＮＡまたはＤＮＡは、単離された核酸を、それぞれ、ＲＮＡｓｅまたはＤＮＡｓｅと接触させることにより、除去され得る。あるいは、核酸抽出試薬が、所望される場合に、ＲＮＡｓｅまたはＤＮＡｓｅを含み得るが、但し、接触工程は、酵素活性を変性させないか、さもなければ酵素の活性に有害に影響しない温度で、実施される。ハイブリダイゼーション工程が、核酸をそれらの配列に従って分離するために追加され得る。これら様々なさらなる工程の全ては当業者に慣用的であり、そして明確である。
【００４２】
本発明の方法は、細胞、ウイルスまたは他の供給源から、核酸の長さまたは配列に関わらず、実質的に任意の核酸を単離するために使用され得る。操作者は抽出される核酸の配列を知る必要はない。核酸は、非通常のヌクレオチド、化学的に改変されたヌクレオチド、人工ヌクレオチドまたはヌクレオチド代替物を含み得る。核酸はまた、非核酸成分を含み得る。例えば、核酸は、（例えば、ビオチンで）共有結合的に改変され得るか、またはさもなければ、（例えば、放射性同位体または蛍光マーカーで）標識され得る。
【００４３】
核酸は、例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡであり得る。ＤＮＡ分子は、例えば、ゲノムＤＮＡであり得る。ゲノムＤＮＡは、任意の供給源から本発明の方法を使用して単離され得る。ゲノムＤＮＡは、染色体全体または染色体の任意の部分であり得る。ゲノムＤＮＡは、変異体または野生型であり得る。ゲノムＤＮＡは、当該分野に公知の任意の技術によりゲノムＤＮＡ中に導入された、別の供給源由来のＤＮＡ（例えば、他の生物由来の遺伝子）を含み得る。ゲノムＤＮＡは、コード配列または非コード配列を含み得る。コード配列は、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、またはｒＲＮＡをコードし得る。コード配列は、野生型または変異体であり得、全長または短縮型であり得る。非コード配列は、例えば、セントロメア、テロメア、介在領域、イントロン、トランスポゾンまたはマイクロサテライト配列であり得る。
【００４４】
ＤＮＡ分子はまた、プラスミドＤＮＡ分子であり得る。プラスミドＤＮＡ分子は、任意の供給源または生物由来であり得る。語句「プラスミドＤＮＡ」とは、細胞の正常な染色体相補体の部分ではない、細胞内の全てのＤＮＡ分子を称する。従って、語句「プラスミド」は、人工染色体、染色体外ＤＮＡおよびオルガネラＤＮＡを含む。プラスミドは、宿主細胞の染色体中に組み込まれ得るか、また環状または直鎖状の染色体外要素として維持され得る。プラスミドは、天然に存在するプラスミドであり得るか、または遺伝子操作されたプラスミドであり得る。遺伝子操作されたプラスミドは、天然の供給源に由来し得、例えば、生物（例えば、ヒト、酵母、微生物またはウイルス）の染色体ＤＮＡに由来し得る。プラスミドは、宿主細胞中で高コピー数または低コピー数で維持され得る。プラスミドは、宿主細胞中で自身の自律増殖に必要とされる因子の全てを含み得るか、または宿主にコードされる１以上の因子に依存し得る。プラスミドは、遺伝子治療に有用なプラスミドであり得る。プラスミドは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｒＲＮＡをコードする１つ以上の遺伝子を含み得る。
【００４５】
核酸はまた、ｃＤＮＡであり得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡ鋳型の逆転写によってか、またはｃＤＮＡの複製により作製された、ＤＮＡ分子である。
【００４６】
核酸はまた、ＲＮＡであり得る。ＲＮＡは、天然供給源または人工供給源由来であり得る。本発明の方法、試薬およびキットを使用して抽出され得るＲＮＡ分子の例としては、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡが挙げられる。
【００４７】
核酸の供給源は、任意の細胞またはウイルス、あるいは核酸を含む任意の他の組成物、収容物（ｈｏｕｓｉｎｇ）または構造物であり得る。核酸は、原核細胞および真核細胞の両者を含む、任意の細胞種より抽出され得る。真正細菌および古細菌、ならびにグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌を含む、任意の型の原核生物細胞が使用され得る。原核細胞は、病原性細菌であり得る。例えば、真核生物の微生物または多細胞生物体由来の細胞を含む、任意の型の真核生物細胞が使用され得る。真核生物細胞は、例えば、病原性真核生物の微生物、血液細胞、または組織細胞であり得る。
【００４８】
あるいは、核酸は、任意の種類のウイルスより抽出され得る。ウイルスは、ＲＮＡゲノムまたはＤＮＡゲノムを有し得る。ウイルスは、原核生物細胞または真核生物細胞に感染し得る。ウイルスは、毒性ウイルス、弱毒化ウイルスまたは非感染性ウイルスであり得る。ウイルスは、天然に存在するウイルス、人工的に改変されたウイルスまたは人工的に作製されたウイルスであり得る。ウイルスは、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（「ＨＩＶ」）またはそれらの由来のウイルスであり得る。ウイルスは、例えば、そのウイルスの宿主細胞を実質的に含まないウイルス培養物の一部であり得るか、あるいは感染した細胞サンプルまたは組織サンプルから直接的に単離され得る。
【００４９】
核酸の供給源は、大きいサンプルの一部であり得る。例えば、サンプルは、食物サンプル、臨床サンプル、法医学サンプル、農業サンプルまたは環境サンプルであり得る。本明細書で使用される「食物サンプル」とは、食物を含むサンプルであり、「臨床サンプル」とは、被験体における疾患または障害を診断、処置、モニターまたは治療するためにか、あるいは被験体の遺伝子型を決定するために使用されるサンプルであり、「法医学サンプル」とは、犯罪または事件を調査するために使用されるサンプルであり、「農業サンプル」とは、農業目的のために繁殖または飼育される植物または動物より採取されるサンプルであり、そして「環境サンプル」とは、そのサンプルの供給源の環境質を調査するために採取されたサンプルである。代表的に、サンプルは、核酸の供給源の純粋な培養物ではなく、他の物質もまた含む。本発明の方法は、それら他の物質から核酸を分離することに効果的である。
【００５０】
サンプルは、核酸の供給源に加えて、実質的に任意の液体または固体を含み得る。固体は、水溶性または水不溶性であり得る。例えば、本発明の方法は、食物サンプル中の食物病原体の存在を検出するために使用され得る。このことは、本発明の方法を使用して食物サンプルからゲノムＤＮＡを抽出し、そして病原体に特異的なプライマーを使用してＤＮＡを増幅することによりなされ得る。
【００５１】
あるいは、サンプルは、動物被験体から由来する任意の物質（例えば、血液、脳脊髄液、毛髪、柔皮、唾液、痰、精液、尿、便、粘液、皮膚、良性腫瘍または悪性腫瘍、良性成長物または悪性成長物、生検組織、あるいは疾患および状態の診断に使用される他の任意の型の組織サンプル、を含み得る。被験体は、任意の種類の動物（例えば、ヒト）を含み得る。あるいは、サンプルは、植物被験体に由来する任意の物質（例えば、葉、茎、柄、花粉、根、枝、花、種子、球根（ｂｕｌｂ）、胞子または他の植物材料）を含み得る。
【００５２】
サンプルより抽出された核酸は、被験体由来の核酸であり得る。核酸は、例えば、被験体が疾患または医療的な状態を有するか否かを決定するため、または被験体の遺伝子表現型を決定するため、または特定の遺伝子がサンプル中の被験体の組織において発現されているか否かを決定するために、使用され得る。あるいは、抽出された核酸は、サンプル中の病原体または他の生物体の核酸であり得る。病原体または生物体は、例えば、細菌、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）、寄生虫（ｗｏｒｍ）、昆虫または真菌であり得る。次いで、核酸は、サンプル中の病原体または他の生物体の存在を検出するために、その病原体または他の生物体に特異的なプライマーを用いて増幅され得る。従って、本発明の方法は、広範な種々の医療用途、臨床用途、法医学用途および農業用途において有用である。
【００５３】
あるいは、サンプルは、例えば、土壌、ほこり、埋立物、汚物または廃棄物、植物性または動物性の物質、水（例えば、真水、塩水または廃水を含む）、あるいは、構造物（例えば、ビル）または装置（例えば、エアーコンディショナー）より採取したサンプルを含み得る。抽出された核酸は、サンプル中の微生物の存在を診断し得る。微生物は、別の種（例えば、ヒト）に対して病原性または有害であり得る。サンプル中の微生物の存在は、サンプルの供給源に対する環境的な損傷（例えば、栄養分の不足または不均衡、もしくは毒物の存在）を診断、分析、モニターもしくは改善するために使用され得る。
【００５４】
本発明の方法は、細胞またはウイルスを含む生物学的サンプルまたは他のサンプルから核酸を単離する場合において示されているが、当業者は、本方法および試薬が、実質的に任意の供給源より核酸を単離および／または精製を行うために使用され得ることを認識する。例えば、本発明および方法は、インビトロの反応（例えば、インビトロの転写反応または逆転写反応）から核酸を単離するために使用され得る。代表的に、抽出試薬対インビトロ合成産物の比率は、約１：９である。
【００５５】
本発明はまた、例えば、目的の核酸についてのサンプルを分析するために有用なキットを提供する。本発明のキットは、核酸抽出試薬および所望される分析またはアレイに有用な１つ以上の他のさらなる成分を備える。例えば、このキットはさらに、目的の核酸を増幅するために有用な１つ以上の試薬を含み得、その試薬としては、１つ以上の増幅プライマー、１つ以上のジオキシヌクレトチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよび／またはｄＵＴＰもしくはｄＴＴＰの混合物）、１つ以上の重合酵素（例えば、Ｔａｇ  ＤＮＡポリマー）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
あるいは、このキットは、目的の核酸を配列決定するために有用な１つ以上のさらなる試薬（例えば、１つ以上の（標識または非標識）配列決定プライマー、１つ以上のデオキシヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＵＴＰまたはｄＴＴＰの混合物）、１つ以上の標識または非標識ターミネーター（例えば、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＵＴＰまたはｄｄＴＴＰの混合物）あるいは１つ以上の重合酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ））を含み得る。
【００５７】
なお別の実施形態において、このキットは、単離された核酸を標識化するために有用な１つ以上の試薬（例えば、１つ以上の標識または非標識デオキシヌクレオチド三リン酸（たとえば、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＵＴＰもしくはｄＴＴＰの混合物）、１つ以上の重合酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）または１つ以上の標識または非標識プライマーを含み得る。
【００５８】
なお別の実施形態において、このキットは、ＤＮＡマイクロアレイ、すなわち「遺伝子チップ」を作製または使用するために有用な１つ以上の試薬を含み得る。
【００５９】
本明細書の本文中に引用される全ての参考文献は、その全体が、参考として本明細書中に援用される。
【００６０】
（実施例１）
（核酸を抽出するための組成物の調製）
本実施例は、広範な種々の試薬を用いて、本発明の方法を実施し得ることを実証する。
【００６１】
本発明に従い核酸抽出試薬を調製するための一般的な手順は、以下のようであった。メタケイ酸ナトリウムを、第１の容量の水に溶解し、ついで置換されたエーテル（他に特定されない限り、２−ブトキシエタノール）と混合した。弱酸のクエン酸溶液および／またはＴｒｉｓ溶液を必要に応じて添加して、所望されるｐＨを達成し、そして得られた混合物を、第２の容量の水で、必要に応じてさらに希釈した。次いで、ＣＨＥＬＥＸ−１００ＴＭ、アジ化ナトリウム、およびポリエチレングリコールを含む他の成分を、必要に応じて添加した。各々の処方における各々の成分の量を、以下の表に示す。
【００６２】
【表１】
2004534515.tif 000003
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表に列挙した各々の試薬（「ｇｅｌ  ｏｕｔ」と示された試薬を除く。この試薬は、調製の間または後にゼラチン状の残渣を生じる。）を、ＰＣＲインヒビターを本質的に含まない細菌ＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｏ１５７：Ｈ７を添加した後の卵サンプルから抽出する能力について試験した（本質的には、実施例２に記載される）。試験した全ての試薬は、「増幅なし（ｎｏ  ａｍｐ）」と標識した試薬を除き、細菌性ＤＮＡ増幅アッセイにおいて陽性の結果を得た。
【００６３】
（実施例２）
（食品サンプルからの細菌ＤＮＡの抽出および増幅）
この実施例は、食品サンプルからの細菌ＤＮＡの抽出における、本願発明の方法および組成物の用途を示す。
【００６４】
【表２】
2004534515.tif 000013
2004534515.tif 000014
各々の食品サンプルを、食品薬品庁のＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ，１９９８，ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤに本質的に記載されているように試験した。別の実験において、５ｍＬの牛乳、乳児用のフォーミュラ（ｆｏｒｍｕｌａ）、りんごジュース、オレンジジュースまたは非乳製品クリーマ（ｃｒｅａｍｅｒ）を、増菌バッグ（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｂａｇ）中の４５ｍＬの改変ＥＣブロスへ加えた。別の実験において、増菌バッグ中の９０ｍＬの改変ＥＣブロスへ、各々の他の食品１０ｇを加えた。各々の食品の増菌物を、バッグをＳＴＯＭＡＣＨＥＲ−４００ＴＭ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｓｅｗａｒｄ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）中に置き、１分間混合することによってホモジナイズし、次いで、２０時間３７℃でインキュベーションした。次いで、各々のホモジネートの三個の０．９ｍｌアリコートを、２ｍｌ微小遠心チューブ中で、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７株：Ｈ７の適度に希釈したオーバーナイト培養液を用いて、約１．１×１０４ｃｆｕ／ｍｌの濃度へ培養後添加（ｐｏｓｔ−ｓｐｉｋｅ）した。このチューブを２分間１６，０００ｇで遠心分離した。上清画分を、ペレットを崩さずに各々のチューブから除去し、そして捨てた。試薬５３（上記実施例１に記載された）の２００μｌを各々のペレットに加え、次いで、沸騰水浴中で、１０分間インキュベーションした。次いで、このチューブを５分間、１６，０００ｇで遠心分離した。各々のチューブから７０μｌの上清画分を、きれいなチューブへピペッティングした。ＴＡＱＭＡＮＴＭ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７  Ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造業者の使用説明書に従って使用し、細菌ＤＮＡを、ＰＣＲプロトコールを用いて食品サンプル中で検出し得るかどうかを決定した。サーモサイクリングを実行し、得られる増幅物をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造業者の使用説明書に従って使用し、アッセイした。簡単に言えば、細菌ＤＮＡ配列の増幅物を、第一の蛍光プローブを使用して測定した。各々の増幅反応は、コントロールＤＮＡ配列を含む内部のポジティブコントロール、プライマー、および第二の蛍光プローブもまた含む。プローブは異なる波長で蛍光を発し、そのため、各々のプローブの蛍光を、他の蛍光とは独立して測定し得る。各々の反応の失敗または成功を、各々のプローブに対する蛍光量の変化を追跡することによって決定した。サンプル中の細菌ＤＮＡを増幅し、そして検出したことを示すポジティブな結果を、その反応において、両方のプローブの蛍光がバックグラウンドに対して有意に増加した（配列検出器の製造業者提供のソフトウェアによって決定されるように）反応として定義した。ネガティブな結果は、その反応において、細菌配列プローブの蛍光が有意に増加しないが、内部コントロール配列プローブの蛍光が増加する反応である。これは、抽出された食品サンプルが細菌ＤＮＡを��いていることを示した（この結果は、ポジティブコントロールテンプレートＤＮＡを含むが、細菌テンプレートＤＮＡを含まないネガティブコントロール反応によって模倣された）。「増幅しない」結果は、その反応において、どちらのプローブも有意に蛍光を増加しなかった反応であった。従って、抽出された食品サンプルは、ＰＣＲインヒビターまたはプローブの蛍光の測定を阻害する物質のどちらかを含んだ（この結果は、Ｔａｑポリメラーゼを欠いたネガティブコントロール反応によって模倣された）。
【００６５】
上記プロトコールに続いて、ポジティブな結果を、イタリアンスパイスミックス（ｓｅａｓｏｎｉｎｇ  ｍｉｘ）、ココアミックスおよびチョコレートアイスクリームを除いた全ての試験サンプルについて得た。イタリアンスパイスミックスサンプルの三つ全ておよびチョコレートアイスクリームサンプルの三つのうち二つからネガティブな結果を得た。残りのチョコレートアイスクリームサンプルおよびココアミックスサンプルの三つ全てから「増幅しない」結果を得た。これら三つのサンプルは、サンプル中で蛍光測定を阻害し得る異なる色を有したことが注目された。従って、上記方法へ適切な濾過工程を加えることによって、ポジティブな結果をこれらの食品から同様に得ることが可能であるが、これは試験していなかった。
【００６６】
（実施例３）
（種々の抽出試薬を用いた細菌ＤＮＡの抽出および増幅）
この実施例は、本発明の方法において、種々の異なる抽出試薬が、種々の食品サンプルに対して作用することを示す。
【００６７】
別々のサンプルを、りんごジュース、卵、牛ひき肉（ｇｒｏｕｎｄ  ｂｅｅｆ）または牛乳のいずれかを用いて調製した。各々のサンプルを調製するために、２５ｇの適当な食品を、フィルターバッグ中で、２２５ｍｌの増菌培地（例えば、改変ＥＣブロス）と混合した。次いで、各々のバッグを１６〜２４時間３７℃でインキュベーションした。０．９ｍｌの増菌培地を各々のバッグから除去し、０．１ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７のオーバーナイト培養液の希釈液と混合し、その結果、下記増幅反応における細菌の最終濃度は、３５０ｃｆｕ／１反応であった。この１ｍｌの培養後添加された増菌培地を微小遠心機中で、最大速度で３分間、遠心分離した。上清画分を除去し、そして捨てた。各々のペレットを、２００μｌのＬＬ−３２、ＬＬ−３３、ＬＬ−３４もしくはＬＬ−３５（上記実施例１中に記載された）中で、または製造業者の使用説明書に従って使用したＰＲＥＰＭＡＮＴＭ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）中で、再懸濁し、沸騰水浴中で１０分間インキュベーションした。各々のチューブを２分間室温で冷却させ、次いで、微小遠心チューブ中で最大速度で３分間遠心分離し、破片をペレットにした。各々の上清画分５μｌをＴＡＱＭＡＮＴＭ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７  ＰＣＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）ＰＣＲ  ｍｉｘ  ４５μｌと混合し、そしてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で、本質的に実施例２に記載したようにアッセイした。図１に記載したように、４つ全ての試薬によって、試験された４つ全ての食品サンプルについて、ポジティブでかつ実質的に同一の結果が得られた。上のパネルにおいて、各々の試験された試薬によって抽出された各々の食品サンプルについての閾値サイクルを与える。この閾値サイクルを、配列検出器が標的細菌配列の増幅を検出するＰＣＲ増幅サイクルとして定義する。従って、閾値サイクルが低ければ低いほど、検出はより高感度になる。食品サンプルおよび試験された抽出試薬の各々の組合せについて、閾値サイクルは、約２８〜３２であった。下のパネルは、４０回の増幅の完了時に検出器によって測定された蛍光の量を示す。この値は、約１．７から１．９の間で変動した。
【００６８】
（実施例４）
（種々の細菌供給源からのＤＮＡの抽出および増幅）
この実施例は、本発明の組成物および方法が、食品サンプル中の広範な種々の病原性細菌からＤＮＡを抽出および検出するために使用され得ることを示す。
【００６９】
卵および牛乳を使用したオーバーナイトの食品増菌物を、実施例３に記載されているように調製した。別の実験において、各々の増菌物の０．９ｍｌアリコートをＥ．ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓまたはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのいずれかのオーバーナイト培養液の段階希釈液０．１ｍｌを用いて、培養後添加した。各々の培養後添加サンプルを微小遠心機中で、最大速度で３分間遠心分離し、そして上清画分を捨てた。各々の細胞ペレットを２００μｌの試薬ＬＬ−３３（上記実施例１に記載された）中に再懸濁し、沸騰水浴中で１０分間インキュベーションし、前のように遠心分離した。細菌ＤＮＡをまた、同種のオーバーナイト細胞培養液の段階希釈液から、抽出し、そして増幅した。
【００７０】
Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、およびＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＮＡ抽出物５μｌを、それぞれＴＡＱＭＡＮＴＭ  ＳＴＸ１  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ＴＡＱＭＡＮＴＭ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｇｏｌｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）およびＴＡＱＭＡＮＴＭ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、ならびにＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、全て製造業者の使用説明書に従って使用することによって、増幅し、そして検出した。
【００７１】
図２、３および４は、培養後添加食品サンプルおよびオーバーナイト細胞培養液の段階希釈液から、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、およびＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのＤＮＡをそれぞれ検出するための閾値サイクルを示す。細菌の濃度を、増幅反応毎のコロニー形成単位（「ｃｆｕ」）の数値として表現する。
【００７２】
（実施例５）
（細菌のＤＮＡおよびＲＮＡの抽出および可視化）
この実施例は、本発明の方法および組成物が細菌供給源から多量のＤＮＡおよびＲＮＡを単離するために使用され得、そしてこれらの抽出物中の核酸が、一週間より長い間、周囲温度で安定であることを示す。
【００７３】
１ｍｌのトリプシンソイブロスへ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ細胞を接種し（ｉｎｎｏｃｕｌａｔｅ）、攪拌しながら３７℃で一晩中インキュベーションした。２日後の標準のプレートの計数は９．５×１０８ｃｆｕ／ｍｌであった。４００μｌの培養液を１６，０００ｇで３分間遠心分離した。上清画分を除去し、そして捨てた。細胞ペレットを２００μｌのＬＬ−１２（上記実施例１に記載された）中へ、繰り返しピペッティングすることによって再懸濁した。周囲温度での１０分間のインキュベーションの後、細胞破片を１６，０００ｇで３分間の遠心分離によって除去した。上清画分の１μｌ、５μｌおよび１０μｌのアリコートを、１％ＦＭＣ  ＳＥＡＫＥＭＴＭアガロースゲルでサイズマーカーと平行して泳動した。このゲルを臭化エチジウムで染色した。図５Ａ。レーン１：λＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物（非加熱）；レーン２：１ｋＢ  ＤＮＡラダー；レーン３：１μｌのＬ．ｉｎｎｏｃｕａ抽出物；レーン４：５μｌのＬ．ｉｎｎｏｃｕａ抽出物；レーン５：１０μｌのＬ．ｉｎｎｏｃｕａ抽出物。細胞溶解物由来の上清のアリコートを受けた各々のレーンで、有意な量のＬ．ｉｎｎｏｃｕａ染色体ＤＮＡおよびｒＲＮＡが認められた。
【００７４】
抽出されたＤＮＡおよびＲＮＡの安定性を決定するために、上清画分の残りの部分を１０日間周囲温度に放置した。１μｌ、５μｌおよび１０μｌのアリコートを、再度ゲルで泳動し、そして上記のように染色した。図５Ｂ（上記と同じレーン割り当て）。いくらかの分解見られたが、いくつかのバンドのスメアーな見かけによって証明されるように、ＤＮＡおよびＲＮＡは大部分はインタクトのまま残っていた。
【００７５】
（実施例６）
（大豆を含有する食物サンプルにおける遺伝学的に改変された生物の検出）
本実施例は、本発明の方法および組成物を、食物サンプルにおいて遺伝学的に改変された生物（「ＧＭＯ」）の存在を同定するために使用し得ることを実証する。
【００７６】
以下に列挙される、大豆を含有する食物サンプルの全てを、スーパーマーケットにおいて購入した。ＧＭＯを含むとラベルされたものはなかった。１００ｍｇの各食物サンプルを、微小遠心管中で、２００μｌの試薬ＬＬ−３３（上記の実施例１に記載されている）に懸濁し、そして沸騰している湯浴中で１０分間インキュベートした。１ＭのＴＥ（ｐＨ７．０）１ｍｌを、各懸濁液に加え、次いで、３分間、１６０００ｇで遠心分離した。ＤＮＡをまた、０．１％のＧＭＯ大豆、０．５％のＧＭＯ大豆、および２．０％のＧＭＯ大豆を含有する、市販の標準セットから抽出した。５μｌの各上清を、取り出し、２０μｌのＰＣＲミックス（ｍｉｘ）に加えた。ＰＣＲミックスは、ＧＭＯ大豆においては見出されるが、改変されていない大豆においては見出されないＤＮＡ配列に相補的なプライマーを含有する。抽出されたＤＮＡの増幅および検出を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）（これは、各サンプルについて閾値サイクル（「Ｃｔ」）を測定した）を用い、本質的には実施例２に記載されるように成し遂げた。閾値サイクルは、増幅の間の時間であり、配列検出器が最初に診断性蛍光シグナルのバックグラウンドを超える増加を検出する時点において、実行された増幅サイクルの数によって測定する。各サンプル中に含まれるＧＭＯのパーセントは、そのＣｔをＧＭＯ標準のＣｔと比較することによって評価した。
【００７７】
以下の表は、本実施例において使用した大豆含有食品、およびそれらの評価されたＧＭＯ含有量を列挙する。
【００７８】
【表３】
2004534515.tif 000015
（実施例７）
（チーズからの細菌ＤＮＡの抽出およびＰＣＲ）
本実施例は、さらに、本発明の方法および組成物を、様々な食物サンプルからのＤＮＡを抽出および増幅するために使用し得ることを実証する。
【００７９】
別の実験において、富化された培養物を、Ａｍｅｒｉｃａｎチーズ、Ｂｏｕｒｓｉｎチーズ、Ｃｈｅｄｄａｒチーズ、Ｃｒｅｍｅ  ｄｅ  Ｂｒｉｅ、Ｓｗｉｓｓチーズ、卵、すりつぶした牛肉、牛乳またはサラダミックスの１０ｇを、濃縮バッグ中で９０ｍｌの改変されたＥＣブロスと、混合することによって調製し、ＳＴＯＭＡＣＨＥＲ−４００ＴＭ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｂｌｅｎｄｅｒ（Ｓｅｗａｒｄ、Ｌｏｎｄｏｎ、Ｅｎｇｌａｎｄ）中で、上記の実施例２に記載されるように、１分間ホモジナイズした。次いで、ホモジネートを、３７℃で２３時間インキュベートした。次いで、各サンプルのアリコート０．９ｍｌを、スクリュートップ微小遠心管中で、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７の適切に希釈された一晩培養物を用いて、１．３×１０５ｃｆｕ／ｍｌの最終濃度へポストスパイク（ｐｏｓｔ−ｓｐｉｋｅ）し、そして最大速度で３分間微小遠心管において遠心分離した。上清画分を、取り除き、そして捨てた。各ペレットを、２００μｌの試薬６０、試薬６３、または試薬６６（上記の実施例１に記載されている）中で再び懸濁し、沸騰している湯浴中で１０分間インキュベートした。各管は、周囲温度で２分間冷却させ、次いで、微小管中において最大速度で３分間遠心分離し、残骸をペレットにした。５μｌの各上清画分を、４５μｌのＴＡＱＭＡＮＴＭ  Ｅ．ｃｏｌｉ  ＳＴＸ  ＰＣＲ  ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）ＰＣＲミックスに加え、そして本質的には実施例２に記載されるように、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）で増幅およびアッセイした。
【００８０】
多くの食物サンプルは、３つの試験された試薬全てに対し、陽性な結果を与えた。Ｃｈｅｄｄａｒチーズのみが例外であり、これは、試薬６０および試薬６６に対し陽性な結果を与えたが、試薬６３に対しては陽性な結果を与えなかった。
【００８１】
（実施例８）
（ヒト血液からのＤＮＡ抽出および増幅）
本実施例は、本発明の方法および組成物を、ヒト血液から核酸を単離するために使用し得、抽出した核酸が、周囲温度で少なくとも数日間は安定であることを実証する。
【００８２】
別の実験において、ヒト血液で染色した１片のＦＴＡ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）の４ｍｍのパンチ（ｐｕｎｃｈ）を、２００μｌの試薬ＬＬ−２９または試薬ＬＬ−３０（上記の実施例１に記載されている）のいずれかを含有する、微小遠心管に置いた。各管を、１０分間、１００℃、６５℃、５５℃または周囲温度においてインキュベートし、次いで、微小遠心中にて短く遠心分離した。１μｌの各反応は、即座に、製造業者の取扱説明書に従い、そして上記の実施例２に記載されているように、ＴＡＱＭＡＮＴＭβ−Ａｃｔｉｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いる増幅反応のためのテンプレートＤＮＡの供給源として使用された。
【００８３】
陽性な結果を、以下の章に示されるように、試験されたサンプル全てに関して得られた。各サンプルについての閾値サイクルが、一般的に、インキュベーション温度の増加に対して減少したこともまた、注目され、これは、抽出効率が試験された範囲にわたってインキュベーション温度に比例することを示す。
【００８４】
抽出した核酸が、それらを分解させる不純物を長期間含有するか否かを決定するために、各抽出物を、３日間、周囲温度に保持させ、次いで、上記に記載されるような増幅反応におけるテンプレートＤＮＡの供給源として使用した。同様な結果が得られ、このことは、最初に抽出したので、テンプレートＤＮＡの有意な分解が生じなかったことを示した。
【００８５】
【表４】
2004534515.tif 000016
（実施例９）
（ヒト血液から抽出されたＤＮＡの対立遺伝子的識別）
本実施例は、本発明の方法および組成物を、少量のヒト組織から核酸を単離するために使用し得ることを実証する。
【００８６】
各試験された血液サンプルについて、２５μｌの試薬ＬＬ−３３（上記の実施例１に記載される）が、１．５ｍｌの微小遠心管中の１．５μｌの血餅のない全血に加えられた。各管を、キャップし、そして２４ゲージの注射針を用いて１つの小さな穴をキャップに作製した。この管は、沸騰している湯浴中で１０分間インキュベートされ、次いで、約１．５分〜２分間冷却させた。次いで、冷まされたサンプルは、卓上の微小遠心分離機にて最大速度で遠心分離した。生じた上清の１μｌは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）ユーザーマニュアルに見られる指針を使用して最適化された、標準ＴＡＱＭＡＮＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）ＰＣＲ対立遺伝子識別アッセイにおいて使用された。熱サイクル（Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）は、ＧＥＮＥＡＭＰＴＭＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００を使用して実行された。そのＰＣＲの後、９６ウェル反応プレートは、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００ＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）へ移された。
【００８７】
図６の上部パネルに示されるように、対立遺伝子群は、正規化されたビュー（ｖｉｅｗ）において密接にクラスタリングする性質を示す。これはまた、染色ビューにおいても見られる（図６の下部パネル）。また、対立遺伝子１群において僅かな拡がりも見られ、正常であると考えられた。概して、このアッセイは、非常に信頼できる結果を与えた。
【００８８】
（実施例１０）
（ヒト毛髪からのＤＮＡの抽出および増幅）
本実施例は、本発明の方法および組成物を、ヒト毛髪から核酸を単離するために使用し得ることを実証する。
【００８９】
０．２Ｍ  ＮａＯＨを、微小遠心（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）管中のヒト毛髪に加え、そして沸騰している湯浴で１０分間インキュベートした。最初の２つのサンプルに関し、１０μｌのＮａＯＨ調製物（ｐｒｅｐ）を、４０μｌの試薬ＬＬ−３３（上記の実施例１に記載されている）に加え、次いで、沸騰している湯浴でさらに１０分間インキュベートした。次いで、１μｌを、ＰＣＲ反応におけるテンプレートＤＮＡの供給源として使用した。２番目の２つのサンプルに関し、１０μｌのＮａＯＨ調製物を、ＦＴＡ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）上にスポットした。４ｍｍのパンチを作製し、そして１００μｌのＬＬ−３３を含有する微小遠心管に加えた。次いで、これらの管を、沸騰している湯浴で１０分間インキュベートした。次いで、１μｌを、ＰＣＲ反応におけるテンプレートＤＮＡの供給源として使用した。次いで、４つの反応全てからのＰＣＲ反応産物を、本質的には上記されるようにアガロースゲル上で泳動した。
【００９０】
最初の２反応の両方とも、高く増幅された産物を生成し、このことは、テンプレートＤＮＡの豊富な存在およびＰＣＲ阻害物質の非存在を示した。２番目の２サンプルは、より弱く、かつより変動しやすい増幅を示した。
【００９１】
（実施例１１）
（ネコ血液からのＤＮＡの抽出および増幅）
本実施例は、本発明の方法および組成物を、動物組織から核酸を単離するために使用し得ることを実証する。
【００９２】
飼いならされたネコから採血された血液を、ＦＴＡ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）上にスポットした。血液染色された紙の４ｍｍのパンチを、１ｍｌフォーマットの管内に１００μｌの試薬ＬＬ−３３（上記の実施例１に記載されるように）と共に置き、そして沸騰している湯浴に１０分間沈めた。１μｌを、反応容積５０μｌでのＰＣＲに使用した。各ＰＣＲ反応物の一部を、本質的には実施例５に記載されるようにアガロースゲル上で泳動した。図７の列１、２、および３、レーン２−１３、図９の列４、５、および６、レーン２−１９に示されるように、事実上、９０の血液サンプル全てが、増幅された標的ＤＮＡ配列に対応するバンドを生成した（各列のレーン１は、分子量マーカーである）。各サンプル中の増幅された核酸の量が、その後に続くＤＮＡ配列決定反応においてテンプレートＤＮＡとして働くのに十分であるかを、これらの結果から評価した。
【００９３】
（実施例１２）
（ブタの尾からのＤＮＡの抽出および増幅）
本実施例は、本発明の方法および組成物を、農業的サンプルから核酸を単離するために使用し得ることを実証する。
【００９４】
Ｐｏｓｔ  ｐａｒｔｕｍ子豚から取り出された尾からの細胞を、ＦＴＡ紙（Ｗｈａｔｍａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）の上に塗りつけた。核酸を、本質的には上記の実施例１１に記載されるように、４ｍｍパンチから抽出した。ブタにおいて同腹サイズ（ｌｉｔｔｅｒ  ｓｉｚｅ）に関連する遺伝子を特に増幅するプライマーを選択した。各増幅反応物を、アガロースゲル上で泳動し、そして本質的には上記の実施例５に記載されているように染色した。試験した９０サンプルのうち約６０サンプルが、検出可能な増幅産物を与えた。残りの３０サンプルは、全くバンドを与えないか、あるいは所望のアンプリコンバンドよりも僅かに小さい「プライマーダイマー」バンドを与えるかのいずれかであった。ＴＡＱＭＡＮＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）ＰＣＲシステムを、本質的に実施例２に記載されるように使用された場合、成功率は、９０サンプルのうち９０サンプルに増加した。
【００９５】
（実施例１３）
（生理食塩水のうがい薬からのＤＮＡの抽出および増幅）
本実施例は、本発明の方法および組成物を、少量のヒト組織から核酸を単離するために使用し得ることを実証する。
【００９６】
別々の実験において、３人のヒト被検体は、生理食塩水うがい薬で口をリンスした。リンス後に取り出された、各生理食塩水うがい薬１ｍｌを、１分間遠心分離した。各ペレットを、２００μｌのＬＬ−３３（上記の実施例１に記載されている）に再懸濁され、そして沸騰している湯浴中で１０分間インキュベートした。抽出されたＤＮＡサンプルの各々について、テンプレートＤＮＡの供給源として、１μｌ、３μｌ、５μｌ，７μｌおよび１０μｌの抽出されたサンプルを含む１連の、５０μｌＰＣＲ反応を、セットした。プライマーを、５５０ｂｐおよび８５０ｂｐの対立遺伝子サイズを有する、Ａｌｕ  ＰＶ９２遺伝子座の増幅を可能にするように選択した。各ＰＣＲ反応物を、アガロースゲル上で泳動し、そして本質的には上記の実施例５に記載されているように染色した。推定のサイズのバンドが、あらゆるＰＣＲ反応物に関しても観察され、このことは、微少量のヒト組織からでさえ、ＰＣＲで増幅可能なＤＮＡを本方法および本方法の組成物を使用して単離し得ることを示す。
【００９７】
（実施例１４）
（培養された細菌からのＤＮＡの抽出および増幅）
本実施例は、本発明の方法および組成物を、広範な原核生物から核酸を単離するために使用し得ることを実証する。
【００９８】
以下の２１種の細菌各々が、適切な増殖培地を含む寒天プレート上にコロニーとして増殖した。
【００９９】
【表５】
2004534515.tif 000017
2004534515.tif 000018
別々の実験において、各細菌の単一コロニーからの細胞のループフル（ｌｏｏｐｆｕｌ）の１／４〜１／２を、微小遠心管にて２００μｌのＬＬ−３３（上記の実施例１に記載されている）に懸濁した。懸濁液を、ＶＯＲＴＥＸＴＭｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍｉｘｅｒを使用して、１０秒間または細胞集団全体が懸濁されるまで、混合した。各懸濁液を、沸騰している湯浴中で１０分間インキュベートし、次いで、１６０００ｇで２分間、遠心分離した。
【０１００】
ＰＣＲ最適化を、ＭＩＣＲＯＳＥＱＴＭ５００  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のＰＣＲモジュールを使用して、全ての系統に対して行った。各抽出物について、ＰＣＲ反応を、抽出物の上清画分の２μｌ、１μｌ、０．１μｌおよび０．０２μｌを使用して、実行した（０．１μｌ容積および０．０２μｌ容積は、抽出物の各上清画分の段階希釈を使用して得た）。細菌のあらゆる系統に関して、試験した上清画分の４つの量全てについて、陽性な結果（本質的には上記されているように調製した、アガロースゲルを使用して決定した）を、得た。最良の結果を、上清画分の１μｌを使用して得た。
【０１０１】
次いで、ＰＣＲ最適化を、上記のように（２μｌ容積および１μｌ容積のみの抽出上清画分を使用したことを除いて）、ＭＩＣＲＯＳＥＱＴＭ  Ｆｕｌｌ  Ｇｅｎｅ  １６Ｓ  ｒＤＮＡ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）のＰＣＲモジュールを使用して、全ての系統に対して行った。あらゆる増幅（系統４５５７（これは、僅かなバンドを、ゲル上で確認できたが、抽出上清画分のいずれの容積を用いても首尾よく増幅しなかった）を除いて）が、成功した。残りの系統については、１μｌの抽出上清画分が、２μｌの抽出上清画分よりも良好な結果を与えた。
【０１０２】
（実施例１５）
（抽出効率に対するインキュベーション温度の効果）
本実施例は、広範なインキュベーション温度を、本発明を実施するために使用し得ることを実証する。
【０１０３】
別々の実験において、卵およびすりつぶした牛肉濃縮物を、上記の実施例３に記載されるように調製した。各濃縮物のアリコート０．９ｍｌを、Ｅ．ｃｏｌｉの適切に希釈された一晩培養物０．１ｍｌに加え、以下に記載される増幅反応物中に３３５ｃｆｕ／反応の濃度の細菌を与えた。ポストスパイクされた濃縮培養物の各々１ｍｌを、細胞をペレットにするために遠心分離し、そして上清画分を捨てた。細胞ペレットを、２００μｌの試薬ＬＬ−３３（上記の実施例１に記載されている）に再懸濁した。再懸濁された細胞ペレット各々を、２１℃、３７℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、または１００℃で、インキュベートした。遠心分離後、溶解物を、本質的には実施例３に記載されているように、ＴＡＱＭＡＮＴＭ  Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）およびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００ＴＭ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、分析した。
【０１０４】
図８に示されるように、あらゆる増幅が成功した（すなわち、あらゆる増幅が、４０未満の閾値サイクルを有した）。しかし、試験した、より低い温度（２１℃および３７℃）が、より高いインキュベーション温度を使用して達成されるよりも低い抽出効率を示したことに、注目した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、閾値サイクル（上の図）および蛍光強度（下の図）によって測定された、本発明の方法および組成物を用いて調製されたテンプレートＤＮＡを使用した、ＰＣＲ増幅反応の結果を示す。
【図２】
図２は、閾値サイクルによって測定された、本発明の方法および組成物を用いて調製されたＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡを使用した、ＰＣＲ増幅反応の結果を示す。
【図３】
図３は、閾値サイクルによって測定された、本発明の方法および組成物を用いて調製されたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓゲノムＤＮＡを使用した、ＰＣＲ増幅反応の結果を示す。
【図４】
図４は、閾値サイクルによって測定された、本発明の方法および組成物を用いて調製されたＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓｉゲノムＤＮＡを使用した、ＰＣＲ増幅反応の結果を示す。
【図５】
図５は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａから、本発明の方法に従って抽出されたＤＮＡの、臭化エチジウム染色されたアガロースゲルにおける電気泳動分離を示す。
【図６】
図６は、本発明の方法および組成物を用いてヒト血液から抽出されたＤＮＡの、対立遺伝子識別の規格化の結果（上の図）および色素表示の結果（下の図）を示す。
【図７】
図７は、本発明の方法および組成物、ならびにＰＣＲによる増幅を使用して、ネコ血液から抽出されたＤＮＡの、臭化エチジウム染色されたアガロースゲルにおける電気泳動分離を示す。
【図８】
図８は、ＰＣＲ反応の閾値サイクルによって測定される、本発明の方法および組成物を使用する、抽出効率に対するインキュベーション温度の影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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