(57)【要約】本発明は、節足動物集団を制御する方法の開発における幼若ホルモンエステラーゼの使用に関する。本発明の節足動物制御剤を同定する方法は、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）幼若ホルモンエステラーゼをコードするcDNAのクローニングおよび特性決定に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
節足動物制御剤を同定する方法であって、
a)幼若ホルモンエステラーゼ活性をもち配列番号１と少なくとも90％同一であるポリペプチドを候補薬剤に曝すこと、及び
b)ポリペプチドの幼若ホルモンエステラーゼ活性をモジュレートする候補薬剤の能力を評価することを含んでなる前記方法。
【請求項２】
薬剤がポリペプチドの幼若ホルモンエステラーゼ活性を抑制する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
薬剤がポリペプチドの幼若ホルモンエステラーゼ活性を増強する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチドは長さが少なくとも300個のアミノ酸である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
節足動物制御剤を同定する方法であって、
a)配列番号１と少なくとも90％同一であるポリペプチドをポリペプチドと結合する結合パートナー及び候補薬剤に曝すこと、ならびに
b)ポリペプチドと結合する結合パートナーと競合する候補薬剤の能力を評価することを含んでなる前記方法。
【請求項６】
結合パートナーが検出可能なように標識されている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
結合パートナーが幼若ホルモンである、請求項５または請求項６に記載の方法。
【請求項８】
節足動物制御剤を同定する方法であって、
(a)幼若ホルモンエステラーゼをもち配列番号１と少なくとも90％同一であるポリペプチドの３次元構造を規定する原子座標を決定すること；
(b)ステップ(a)で得た原子座標による合理的な薬物設計を実施することにより候補化合物を選択し、ここで前記選択はコンピューターモデルと関連して実施すること；及び
(c)前記ポリペプチドの幼若ホルモンエステラーゼ活性をモジュレートする候補化合物の能力を決定することを含んでなる前記方法。
【請求項９】
幼若ホルモンエステラーゼをもち配列番号１と少なくとも90％同一であるポリペプチドの結晶。
【請求項１０】
節足動物制御剤設計の方法であって、請求項９に記載の結晶の構造座標を利用して、ある化合物をポリペプチドの幼若ホルモンエステラーゼ活性をモジュレートするその能力についてコンピューターにより評価することを含んでなる前記方法。
【請求項１１】
節足動物制御剤を同定する方法であって、
a)幼若ホルモンエステラーゼ活性をもち配列番号１と少なくとも90％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、候補薬剤に前記ポリヌクレオチドが発現される条件下で曝すこと、及び
b)ポリヌクレオチドが産生するポリペプチドのレベルをモジュレートする候補薬剤の能力を評価することを含んでなる前記方法。
【請求項１２】
薬剤がポリペプチドの産生を抑制する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
節足動物制御剤を同定する方法であって、
a)配列番号４と少なくとも90％同一であるポリヌクレオチドを候補薬剤に曝すこと、及び
b)ポリヌクレオチドとハイブリダイズする及び／またはポリヌクレオチドを切断する候補薬剤の能力を評価することを含んでなる前記方法。
【請求項１４】
幼若ホルモンエステラーゼ活性を有する実質的に精製されたポリペプチドであって、
(i)配列番号１の配列を含んでなるポリペプチド；または
(ii)(i)と少なくとも90％同一である配列を有するポリペプチド；からなる群から選択され、
ここで長さが600個以下の残基である、前記ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載の実質的に精製されたポリペプチドであって、(i)と少なくとも95％同一である配列を有する前記ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１４に記載の実質的に精製されたポリペプチドであって、(i)と少なくとも99％同一である配列を有する前記ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の実質的に精製されたポリペプチドであって、長さが少なくとも300個のアミノ酸である前記ポリペプチド。
【請求項１８】
単離されたポリヌクレオチドであって、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする前記ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、
(i)配列番号３に示されるヌクレオチドの配列；
(ii)配列番号４に示されるヌクレオチドの配列；または
(iii)(i)もしくは(ii)と高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列
から選択される配列を有する前記ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載の単離されたポリヌクレオチドであって、1660個未満のヌクレオチドを有する前記ポリヌクレオチド。
【請求項２１】
請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドと高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項２２】
触媒ドメインを含んでなる、請求項２１に記載のアンチセンスポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、２本鎖RNA（dsRNA）分子。
【請求項２４】
請求項２３に記載のdsRNA分子であって、dsRNA分子が単一のオープンリーディングフレームによりコードされかつ得られるdsRNA分子の１つの末端にステムループ構造を有する前記dsRNA分子。
【請求項２５】
少なくとも１つの他のポリペプチド配列と融合した請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチドを含んでなる、融合タンパク質
【請求項２６】
請求項２５に記載の融合タンパク質であって、少なくとも１つの他のポリペプチドは請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチドの安定性を増強するポリペプチド、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチドに対する免疫応答を増強する免疫賦活剤として作用するポリペプチド、及び融合タンパク質の精製を助けるポリペプチドからなる群から選択される、前記融合タンパク質。
【請求項２７】
請求項２５または請求項２６に記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項１８〜２０または２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項２９】
ポリヌクレオチドがプロモーターと機能しうる形で連結されている、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
請求項２１または２２に記載のアンチセンスポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項３１】
アンチセンスポリヌクレオチドがプロモーターと機能しうる形で連結されている請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
発現すると請求項２３または２４に記載のRNA分子を形成するオープンリーディングフレームを含んでなるベクター。
【請求項３３】
dsRNA分子がプロモーターと機能しうる形で連結されている、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
ベクターがプラスミドまたはウイルスである、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３５】
ウイルスベクターがバキュロウイルスである請求項３４のベクター。
【請求項３６】
ベクターがカプソイドである、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３７】
請求項２８〜３６のいずれか１項に記載のベクターを用いて形質転換したまたはトランスフェクトした宿主細胞。
【請求項３８】
細菌細胞である、請求項３７に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
節足動物細胞である、請求項３７に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
昆虫細胞である、請求項３７に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
請求項１８〜２０または２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを用いて形質転換されているトランスジェニック植物であって、前記ポリヌクレオチドを発現する前記植物。
【請求項４２】
請求項２１または請求項２２に記載のアンチセンスポリヌクレオチドを用いて形質転換されてるトランスジェニック植物であって、前記アンチセンスポリヌクレオチドを発現する前記植物。
【請求項４３】
発現すると請求項２３または請求項２４に記載のdsRNA分子を形成するオープンリーディングフレームを用いて形質転換されているトランスジェニック植物であって、前記dsRNA分子を産生する前記植物。
【請求項４４】
請求項１８〜２０または２７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを用いて形質転換されてるトランスジェニック非ヒト動物であって、前記ポリヌクレオチドを発現する前記動物。
【請求項４５】
請求項２１または請求項２２に記載のアンチセンスポリヌクレオチドを用いて形質転換されてるトランスジェニック非ヒト動物であって、前記アンチセンスポリヌクレオチドを発現する前記動物。
【請求項４６】
発現すると請求項２３または請求項２４に記載のdsRNA分子を形成するオープンリーディングフレームを用いて形質転換されているトランスジェニック非ヒト動物であって、前記dsRNA分子を産生する前記動物。
【請求項４７】
節足動物制御組成物であって、請求項１〜８または１０〜１３のいずれか１項に記載の同定された薬剤及び農業上許容される担体を含んでなる前記組成物。
【請求項４８】
節足動物制御組成物であって、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチド及び農業上許容される担体を含んでなる前記組成物。
【請求項４９】
節足動物制御組成物であって、請求項２８〜３６のいずれか１項に記載のベクター及び農業上許容される担体を含んでなる前記組成物。
【請求項５０】
節足動物集団を制御する方法であって、節足動物集団のメンバーを請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の節足動物制御組成物に曝すことを含んでなる前記方法。
【請求項５１】
節足動物が昆虫である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチドを調製する方法であって、請求項２９に記載のベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現が可能となる条件下で培養し、そして発現したポリペプチドを回収することを含んでなる前記方法。
【請求項５３】
節足動物制御剤を同定するキットであって、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のポリペプチド、及び幼若ホルモンエステラーゼ活性を決定する手段を含んでなる前記キット。
【請求項５４】
節足動物制御剤を同定するキットであって、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、及びポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの幼若ホルモンエステラーゼ活性を決定する手段を含んでなる前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、一般的に、節足動物集団を制御する方法の開発における幼若ホルモンエステラーゼの利用に関する。特に、本発明は、幼若ホルモンエステラーゼの産生及び／または活性をモジュレートする節足動物制御剤を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
幼若ホルモン（JH）は、節足動物ホルモンの複数の重要なクラスの１つであり、その相互作用によって発生及び生殖を調節する（Riddiford、1993の総説を参照）。最もよく知られる特徴的なJHの役割は、エクジソンとの相互作用を介する幼生から蛹への移行の調節である。JHはまた、様々な他のプロセスにおいても役割を果たし、卵産生、雌雄両方の性腺刺激ホルモン発生、カースト決定及び休眠が挙げられる。JH系は、昆虫において最もよく理解されているが、この系の重要な態様は全ての節足動物に共通しているようである（Cussonら、1991）。
【０００３】
JHの最も一般的な型は、JHIII（(2E,6E)-10,11-エポキシ-3,7,11-トリメチル-2,6-ドデカジエン酸メチル）であり、今まで研究された全昆虫目に見出されている（Schooleyら、1984）。鱗翅目（lepidopteran）及び双翅目（dipteran）は他の昆虫と異なり、JHIIIに加えて他の型のJHを有する。これらのJHはJHIIIに類似し、わずかに異なるのは酸部分の置換基である。全てがメタノールのエステルであり、10(R),11-エポキシド基及び2,3-二重結合を有する。鱗翅目はJH0、JHI、JHII及び4-メチルJHI型のJHを有するのに対して、JHIIIビスエポキシド（JHB3）（JHIIIの6,7二重結合が6S,7Sエポキシド基により置換えられている）は高等双翅目にだけ見出されている（Schooleyら、1984；Richardら、1989）。キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）においては、JHIIIは少数であり、JHB3が幼若ホルモンの主要な型である。
【０００４】
JH力価の調節は合成と分解との間のバランスにより行われるが、隔離（sequestration）及び分泌（secretion）などの他の機構も関与しうる。JHの２つの主要分解経路は、JHエステラーゼ（JHE）及びJHエポキシド加水分解酵素（JHEH）によるエステル及びエポキシド基の加水分解である。最終齢幼生鱗翅目の血リンパ中のJH分解が最も徹底して研究されていて、その分解はJHEを経由して起こる。この期間の重要な特徴として、血リンパ中のJHEにはプレ遊走（pre-wandering）ピーク及びプレ蛹化（pre-pupation）ピークが一般的に存在し、これは血リンパのJH力価と逆の相関にある。
【０００５】
双翅目においては、幼生JH加水分解酵素は血リンパ及びその他の組織内に見出され、JHEとJHEHの全活性への相対的寄与は種間で変わる。最終齢後期にJH分解活性は最小値となるが、囲蛹殻（puparium）形成直後に可溶の循環JHE活性は高レベルとなり、蛹化（pupation）前に、恐らく全生物からJHを除去し清澄化する。このJHEは活性は低下するものの、蛹期（pupal stage）を通して保持される。成体において低レベルのJHEとJHEHが見出され、サブ細胞分布は様々であるが、恐らく、特定組織のJHシグナルをモジュレートするかまたはその作用部位に到達した後にJHシグナルを消すのであろう。
【０００６】
メトプレン（methoprene）、ヒドロプレン（hydroprene）及びピリプロキシフェン（pyriproxifen）などの、JH代謝を破壊するジュブノイド（juvenoid）殺虫剤が開発されている。しかし、JHシグナル伝達系を破壊するのに利用しうるさらなる薬剤に対するニーズがある。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明者らはキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）由来の幼若ホルモンエステラーゼを同定した。このエステラーゼの知識は、節足動物の発生及び／または生殖を破壊する節足動物制御剤を同定するスクリーニング方法を設計するのに利用することができる、そしてその故に、節足動物集団を制御する手段を提供するものである。
【０００８】
一態様においては、本発明は節足動物制御剤を同定する方法であって、
a)幼若ホルモンエステラーゼをもちかつ配列番号１と少なくとも90％同一であるポリペプチドを、候補薬剤に曝すこと、及び
b)ポリペプチドの幼若ホルモンエステラーゼ活性をモジュレートする候補薬剤の能力を評価することを含んでなる前記方法を提供する。
【０００９】
一実施形態においては、薬剤はポリペプチドの幼若ホルモンエステラーゼ活性を抑制する。他の実施形態においては、薬剤はポリペプチドの幼若ホルモンエステラーゼ活性を増強する。
【００１０】
本発明の一例では、ポリペプチドを用いて人工エステラーゼ基質、酢酸α-ナフチルを加水分解してα-ナフトールを得て、これをファストブルーBN（Fast Blue BN）などのある特定のジアゾ染料と反応させた後に235nmもしくは可視波長の吸収変化により検出してもよい（Campbellら、1998）。候補薬剤をかかるアッセイに用いて、それが適当な節足動物制御剤であるかどうかを決定することができる。
【００１１】
特に好ましい実施形態においては、節足動物制御剤はポリペプチドと直接結合する。
【００１２】
好ましくは、ポリペプチドは長さが少なくとも300個のアミノ酸である。
【００１３】
好ましくは、幼若ホルモンエステラーゼ活性は、JH0、JHI、JHII、JHIII及びJHB3からなる群から選択される幼若ホルモンを加水分解する能力である。さらに好ましくは、幼若ホルモンエステラーゼ活性は、JHIII及びJHB3からなる群から選択される幼若ホルモンを加水分解する能力である。
【００１４】
他の態様においては、本発明は節足動物制御剤を同定する方法であって、
a)配列番号１と少なくとも90％同一であるポリペプチドを、ポリペプチドと結合する結合パートナー及び候補薬剤に曝すこと、及び
b)ポリペプチドとの結合に対して結合パートナーと競合する候補薬剤の能力を評価すること
を含んでなる前記方法を提供する。
【００１５】
好ましくは、結合パートナーに検出可能な標識を付ける。
【００１６】
好ましくは、結合パートナーは幼若ホルモンである。
【００１７】
好ましくは、ポリペプチドは幼若ホルモンエステラーゼ活性を有する。
【００１８】
In silico技術を用いて節足動物制御剤を同定してもよい。
【００１９】
従って、さらなる態様においては、本発明は節足動物制御剤を同定する方法であって、
(a)幼若ホルモンエステラーゼ活性をもちかつ配列番号１と少なくとも90％同一であるポリペプチドの三次元構造を規定する原子座標を決定すること；
(b)ステップ(a)で得た原子座標を用いて合理的な薬物設計を実施することにより候補化合物を選択し、ここで前記選択はコンピューターモデルを用いて実施すること；及び
(c)ポリペプチドの幼若ホルモンエステラーゼ活性をモジュレートする候補化合物の能力を決定することを含んでなる前記方法を提供する。
【００２０】
他の態様においては、本発明は、幼若ホルモンエステラーゼ活性をもちかつ配列番号１と少なくとも90％同一であるポリペプチドの結晶を提供する。
【００２１】
さらに他の態様においては、本発明は、節足動物制御剤を設計する方法であって、ポリペプチドの幼若ホルモンエステラーゼ活性をモジュレートするその能力について、本発明の結晶の構造座標を利用してコンピューターにより化合物を評価することを含んでなる前記方法を提供する。
【００２２】
他の態様においては、本発明は、節足動物制御剤を同定する方法であって、
a)幼若ホルモンエステラーゼ活性をもちかつ配列番号１と少なくとも90％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドが発現しうる条件下で候補薬剤に曝すこと、及び
b)ポリヌクレオチドが産生したポリペプチドのレベルをモジュレートする候補薬剤の能力を評価することを含んでなる前記方法を提供する。
【００２３】
一実施形態においては、薬剤はポリペプチドの産生を抑制する。
【００２４】
他の態様においては、本発明は、節足動物制御剤を同定する方法であって、
a)配列番号４と少なくとも90％同一であるポリヌクレオチドを、候補薬剤に曝すこと、及び
b)ポリヌクレオチドとハイブリダイズする及び／またはポリヌクレオチドを切断する候補薬剤の能力を評価することを含んでなる前記方法を提供する。
【００２５】
本発明の節足動物制御剤を同定する方法は、好ましくは、リード化合物として開発される候補化合物を選択するステップをさらに含んでなる。その上さらに、本発明の節足動物制御剤を同定する方法は、好ましくは、節足動物制御剤を農業上許容される担体を含んでなる節足動物制御組成物に製剤することをさらに含んでなる。
【００２６】
他の態様においては、本発明は、幼若ホルモンエステラーゼ活性を有する実質的に精製されたポリペプチドであって、
(i)配列番号１の配列を含んでなるポリペプチド；または
(ii)(i)と少なくとも90％同一である配列を有するポリペプチド：からなる群から選択され、
ここで長さが600個以下の残基である、前記ポリペプチドを提供する。
【００２７】
好ましくは、ポリペプチドは(i)と少なくとも95％同一である配列を有する。さらに好ましくは、ポリペプチドは(i)と少なくとも99％同一である配列を有する。
【００２８】
さらに、ポリペプチドは長さが少なくとも300個のアミノ酸であることが好ましい。
【００２９】
他の態様においては、本発明は、幼若ホルモンエステラーゼ活性を有する実質的に精製されたポリペプチドであり、
(i)配列番号１の配列を含んでなるポリペプチド；または
(ii)(i)と少なくとも31％同一であるポリペプチド：
からなる群から選択されるポリペプチドであり、
ここで長さが600個以下の残基である、前記ポリペプチドを提供する。
【００３０】
好ましくは、ポリペプチドは、(i)と少なくとも40％同一であり、さらに好ましくは少なくとも50％同一であり、さらに好ましくは少なくとも60％同一であり、さらに好ましくは少なくとも70％同一であり、さらに好ましくは少なくとも80％同一であり、そしてなおさらに好ましくは(i)と少なくとも90％同一である。
【００３１】
好ましくは、ポリペプチドは長さが少なくとも300個のアミノ酸である。
【００３２】
他の態様においては、本発明は、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３３】
一実施形態においては、ポリヌクレオチドは、
(i)配列番号３に示したヌクレオチド配列；
(ii)配列番号４に示したヌクレオチド配列；または
(iii)高ストリンジェンシーの条件下で(i)または(ii)とハイブリダイズする配列
から選択される配列を有する。
【００３４】
好ましくは、ポリヌクレオチドは1660個未満のヌクレオチドである配列を有する。しかし、ポリヌクレオチドは長さが1000個未満またはさらに500個未満のヌクレオチドであってもよい。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは長さが少なくとも18個のヌクレオチドである。
【００３５】
さらなる態様においては、本発明は、高ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。
【００３６】
好ましくは、アンチセンスポリヌクレオチドは触媒ドメインを含んでなる。従って、アンチセンスポリヌクレオチドは触媒酵素でありうる。好ましくは、触媒酵素は、リボザイム及びデオキシリボザイムからなる群から選択される。
【００３７】
他の態様においては、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含んでなる２本鎖RNA（dsRNA）分子を提供する。
【００３８】
好ましくは、dsRNAは単一のオープンリーディングフレームによりコードされかつ得られるdsRNA分子は分子の一端にステムループ（stem loop）構造を有する。
【００３９】
さらに他の態様においては、本発明は、少なくとも１つの他のポリペプチド配列と融合した本発明によるポリペプチドを含んでなる融合タンパク質を提供する。
【００４０】
好ましくは、前記少なくとも１つの他のポリペプチドは、本発明のポリペプチドの安定性を増強するポリペプチド、本発明のポリペプチドに対する免疫応答を増強する免疫賦活薬として作用するポリペプチド、融合タンパク質の精製を助けるポリペプチドからなる群から選択される。
【００４１】
他の態様においては、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００４２】
さらなる態様においては、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含んでなるベクターを提供する。
【００４３】
好ましくは、ポリヌクレオチドはプロモーターと機能しうる形で連結されている。
【００４４】
さらなる態様においては、本発明は、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを含んでなるベクターを提供する。
【００４５】
好ましくは、アンチセンスポリヌクレオチドはプロモーターと機能しうる形で連結されている。
【００４６】
さらなる態様においては、本発明は、発現すると本発明によるdsRNA分子を形成するオープンリーディングフレームを含んでなるベクターを提供する。
【００４７】
好ましくは、dsRNA分子はプロモーターと機能しうる形で連結されている。
【００４８】
さらに好ましい実施形態においては、本発明のベクターはプラスミドまたはウイルスである。さらに好ましくは、ウイルスベクターはバキュロウイルスである。
【００４９】
特に好ましい実施形態においては、ベクターはカプソイド（capsoid）である。
【００５０】
他の実施形態においては、本発明は、本発明によるベクターを用いて形質転換したかまたはトランスフェクトした宿主細胞を提供する。.
一実施形態においては、宿主細胞は細菌細胞である。他の実施形態においては、宿主細胞は節足動物細胞、さらに好ましくは昆虫細胞である。
【００５１】
他の態様においては、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを用いて形質転換されているトランスジェニック植物であって、前記ポリヌクレオチドを発現することを特徴とする前記植物を提供する。
【００５２】
他の態様においては、本発明は、本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドを用いて形質転換されている植物であって、前記アンチセンスポリヌクレオチドを発現することを特徴とする前記植物を提供する。
【００５３】
他の態様においては、本発明は、発現すると本発明によるdsRNA分子を形成するオープンリーディングフレームを用いて形質転換されているトランスジェニック植物であって、dsRNA分子を産生することを特徴とする前記植物を提供する。
【００５４】
多数の節足動物は生存動物、例えば蚊及びヒツジキンバエ（Lucilia cuprina）の幼生を食するので、本発明は、本発明の分子を用いて形質転換された非ヒト動物を提供する。
【００５５】
従って、他の態様においては、本発明はトランスジェニック非ヒト動物であって、本発明によるポリヌクレオチドを用いて形質転換されていて、ポリヌクレオチドを発現することを特徴とする前記動物を提供する。
【００５６】
他の態様においては、本発明はトランスジェニック非ヒト動物であって、本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドを用いて形質転換されていて、アンチセンスポリヌクレオチドを発現することを特徴とする前記動物を提供する。
【００５７】
他の態様においては、本発明はトランスジェニック非ヒト動物であって、発現すると本発明によるdsRNA分子を形成するオープンリーディングフレームを用いて形質転換されていて、dsRNA分子を産生することを特徴とする前記動物を提供する。
【００５８】
他の態様においては、本発明は節足動物制御組成物であって、本発明により同定された薬剤及び農業上許容される担体を含んでなる前記組成物を提供する。
【００５９】
他の態様においては、本発明は節足動物制御組成物であって、本発明によるポリペプチド及び農業上許容される担体を含んでなる前記組成物を提供する。
【００６０】
他の態様においては、本発明は節足動物制御組成物であって、本発明によるベクター及び農業上許容される担体を含んでなる前記組成物を提供する。
【００６１】
他の態様においては、本発明は節足動物集団を制御する方法であって、節足動物集団のメンバーを本発明による節足動物制御組成物に曝すことを含んでなる前記方法を提供する。
【００６２】
好ましくは、節足動物は昆虫である。
【００６３】
他の態様においては、本発明は、本発明によるポリペプチドを調製する方法であって、本発明のポリヌクレオチドをコードするベクターを用いて形質転換するかもしくはトランスフェクトした宿主細胞を、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を与える条件下で培養すること及び発現したポリペプチドを回収することを含んでなる前記方法を提供する。
【００６４】
本プロセスは、コードされたポリペプチドの商業上利用しうる量を生産するために使用することができる。
【００６５】
他の態様においては、本発明は、節足動物制御剤を同定するキットであって、本発明によるポリペプチド及び幼若ホルモンエステラーゼ活性を決定する手段を含んでなる前記キットを提供する。
【００６６】
他の態様においては、本発明は、節足動物制御剤を同定するキットであって、本発明によるポリヌクレオチド及びポリヌクレオチドによりコードされたポリペプチドの幼若ホルモンエステラーゼ活性を決定する手段を含んでなる前記キットを提供する。
【００６７】
本発明の多数の他の態様においては、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、dsRNA分子、ベクター、宿主細胞及び節足動物制御剤を多数の方法に使用して、節足動物集団を制御することができる。
【００６８】
本明細書を通して使用される用語「含んでなる（原型）（comprise）」、「含んでなる（単数）（comprises）」及び「含んでなる（進行形）（comprising）」は、明記した成分もしくは特性または成分もしくは特性の群の包含を、さらなる成分もしくは特性または成分もしくは特性の群を包含してまたは包含せずに参照することを意図する。
【００６９】
本発明を以下に、次の限定されるものでない例を使いかつ添付図を参照して説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７０】
発明の詳細な説明
一般技術
特に断わらない限り、本発明に使用した組換えDNA技術は、当技術分野で周知の標準技術である。かかる技術を記載しかつ説明する文献としては、J. Perbal, 「分子クローニングの実用的手引き（A Practical Guide to Molecular Cloning）」, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrookら, 「分子クローニング：研究室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)、T.A. Brown(編者), 「基本的分子生物学：実用的手法（Essential Molecular Biology: A Practical Approach）」, Volumes 1及び2, IRL Press (1991)、D.M. Glover及びB.D. Hames (編者), 「DNAクローニング：実用的手法（DNA Cloning: A Practical Approach）」, Volumes 1-4, IRL Press (1995及び1996)、ならびにF. M. Ausubelら(編者), 「分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988、現在までの全改定版を含む)が挙げられ、これらは本明細書に参照により組み入れられる。
【００７１】
節足動物制御剤及びそのスクリーニング方法
本発明の方法を利用して同定される節足動物制御剤を使い、幼若ホルモンエステラーゼ活性を破壊して節足動物を死に到らしめるかまたは少なくとも繁殖速度もしくは摂食速度を低下させることができる。例えば、発生中に、JHEが抑制されるとJH力価の増加と致命的な脱皮のブロッキングを生じる一方、JHEが不適当に発現されるとJH力価の低下と早期脱皮を生じる。従って、JHエステラーゼ活性もしくはレベルを増強もしくは抑制する作用剤は、節足動物集団を制御するために利用することができる。
【００７２】
本明細書に使用される「リード化合物（lead compound）」は、最終的には、例えば、節足動物害虫集団を制御する作用剤として、組成物に製剤して販売することを目標として、試験にかけられる節足動物制御剤である。リード化合物を、節足動物、さらに好ましくは昆虫に曝すと、その節足動物内のJHエステラーゼ活性を破壊して繁殖速度の低下、死、摂食速度の低下などをもたらす。
【００７３】
既知のスクリーニング技術を用いて、本発明のJHエステラーゼの活性または産生をモジュレートする節足動物制御剤を同定することができる。例えば、JHエステラーゼを用いて人工基質を加水分解し、検出可能なシグナルを得ることができる。先に記載したように、一例は酢酸α-ナフチルの加水分解であり、それにより得られるα-ナフトールはファストブルーBN（Fast Blue BN）などのある特定のジアゾ染料との反応後に、235nmもしくは可視波長での吸光度の変化により検出することができる（Campbellら、1998）。候補作用剤をかかるアッセイに組み入れて、それらが適当な節足動物制御剤であるか否かを決定することができる。多数の可能性があるインヒビターをスクリーニングする多数の反応を、様々な溶液を移送しかつそれぞれのウエルの吸光度を測定するロボットを用いて、マイクロタイタートレイにおいて自動的に実施することができる。
【００７４】
アゴニスト／アンタゴニストをスクリーニングする他の方法は、ポリペプチドと結合パートナー（そのポリペプチドと結合することができる）とを混合し、それらのお互いとの結合を、可能性があるアゴニスト／アンタゴニストの存在または不在のもとで測定することを含む。ポリペプチドまたは結合パートナーは、放射性同位体、蛍光団及び発色団からなる群から選択されるものなどの既知の標識を利用して検出可能なように標識してもよい。最も好ましくは、結合パートナーは標識した幼若ホルモンである。この結合アッセイはELISAプレートアッセイの形態であってもよい。当業者に知られている他の結合フォーマットも存在しており、それらは共沈降、遠心分離及び表面プラズモン共鳴が挙げられる。
【００７５】
１つの可能性があるアンタゴニストは、ポリペプチドの幼若ホルモン結合部位と結合して幼若ホルモンへの接近ができないようにする小分子である。小分子の例は、限定されるものでないが、小ペプチド、ペプチド様分子、植物二次代謝物または合成有機化学物質が挙げられる。
【００７６】
本明細書に記載したように、適当なアンチセンスポリヌクレオチド及びdsRNA分子を、JHエステラーゼをコードする本発明のポリヌクレオチドの配列に基づいて設計することができる。かかるアンチセンスポリヌクレオチド及びdsRNA分子は、アンチセンスポリヌクレオチドまたはdsRNA分子により形質転換されている節足動物細胞からのJHエステラーゼの産生を抑制する節足動物制御剤として利用することができる。
【００７７】
またかかるアンチセンスポリヌクレオチド及びdsRNA分子を、本発明の方法を用いて、節足動物制御剤としての利用についてスクリーニングすることもできる。例えば、JHエステラーゼをコードする本発明のポリヌクレオチドを細胞系もしくは無細胞発現系で発現させてJHエステラーゼを産生させることができる。JHエステラーゼをコードする本発明のポリヌクレオチドの配列に基づいて設計した候補アンチセンスポリヌクレオチド及びdsRNA分子を前記系に組み込み、それによるJHエステラーゼmRNAレベルまたはJHエステラーゼポリペプチドレベルもしくは活性に対する影響を当技術分野で知られる技術を用いて容易に測定することができる。
【００７８】
幼若ホルモンエステラーゼ活性の適当なインヒビターは、タンパク質の活性部位に直接相互作用し、それによって通常はエステラーゼの活性部位と結合するかさもなくば相互作用するかあるいはそれを修飾することにより、エステラーゼの活性を抑制する化合物である。幼若ホルモンエステラーゼインヒビターはまた、そのタンパク質の他の領域と相互作用してエステラーゼ活性を抑制してもよく、例えば、アロステリック相互作用によって抑制してもよい。
【００７９】
本発明の方法により同定した節足動物制御剤を適用するための有効量及び投与計画は、当業者が周知する技術を用いて容易に決定することができる。
【００８０】
本発明の方法により同定される一部の節足動物制御剤はまた、JH系の他の分子と相互作用することもできる。例えば、一部の節足動物制御剤は、少なくとも部分的に、JH結合タンパク質、JH受容体及び／またはJHEHなどのJH分解酵素に作用することができる。
【００８１】
節足動物制御剤スクリーニング用のファージライブラリー
ファージライブラリーを構築して、それを宿主大腸菌（E.coli）に感染させるとほぼ1〜15個のアミノ酸の無作為ペプチド配列を産生することができる。具体的には、ファージライブラリーを、許容大腸菌（E.coli）と低融点LB寒天中において低希釈率で混合し、次いでこれをLB寒天プレートの上に注いでもよい。プレートを37℃にてある一定時間インキュベートした後、大腸菌（E.coli）のローン（lawn）に、活性ファージの増殖と大腸菌（E.coli）の溶菌を示す小さい透明なプラークが形成される。乾いたフィルターを寒天プレート上に置くことにより、これらのファージの代表をナイロンフィルターに吸収させることができる。このフィルターに方向性をマーキングし、フィルターを取り外し、そして洗浄溶液中に漬け、残りの吸収部位を全てブロックする。次いでフィルターを、例えば、放射標識した本発明のポリペプチド（例えば、配列番号１を含んでなるアミノ酸配列を有するポリペプチド）を含有する、溶液に漬けてもよい。ある規定したインキュベーション期間の後、フィルターを十分洗浄し、オートラジオグラフィ用に現像してもよい。これにより、放射性ポリペプチドと結合するファージを含有するプラークの検出が可能になる。これらのファージをさらにクローニングし、次いで前のようにJHエステラーゼと結合するそれらの能力を再試験することができる。ファージが精製されれば、ファージに含有される結合配列を標準DNA配列決定技術により決定することができる。DNA配列が判明すると、これらの配列に相当する合成ペプチドを作製することができる。
【００８２】
有効なペプチドを、in vivoモデルで使用するため及び最終的にはJHエステラーゼ活性を破壊する節足動物制御剤として利用するために、大量に合成することができる。合成ペプチド生産は比較的労力がかからず、製造や品質管理が容易であり、従って大量の所望の産物をむしろ安価に生産できることは強調されるべきである。
【００８３】
タンパク質構造に基づく節足動物制御剤の設計
本発明のポリペプチドの結晶は様々な技術により成長させることができ、回分結晶化、蒸気拡散（液滴静置（sitting drop）または液滴吊り下げ（hanging drop）のいずれかによる）及び微少透析が挙げられる。複数の事例においては、Ｘ線品質の結晶を得るには結晶のシーディングが必要でありうる。その場合、標準的な結晶のミクロシーディング及び／またはマクロシーディングを利用してもよい。結晶が成長すれば、標準技術を用いてＸ線回折データを取ることができる。
【００８４】
本発明のポリペプチドの３次元構造が一度決定されると、可能性があるアンタゴニストまたはアゴニストを、GRAM、DOCK、またはAUTODOCK（Dunbrackら、1997）などのドッキングプログラムを利用するコンピューターモデリングを用いて検証することができる。この方法は、可能性があるリガンドとJHエステラーゼとのコンピューターフィッティングを行って、その可能性があるリガンドの形状及び化学構造がいかに巧くJHエステラーゼ活性を補完するかまたは妨害するかを確認することを含む。コンピュータープログラムはまた、本発明のポリペプチドに対するリガンドの引力、反発力、及び立体障害を評価するのに利用することもできる。一般的に、これらの物性はより強い結合定数と一致するので、フィットが強いほど（例えば、立体障害が小さいほど、及び／または引力が大きいほど）、可能性がある節足動物制御剤は強力であろう。さらに、可能性がある節足動物制御剤の設計における特異性が高いほど、恐らく節足動物制御剤は他のタンパク質を妨害しないであろう。これは他のタンパク質との望ましくない相互作用による副作用の可能性を最小限に抑えるであろう。
【００８５】
最初に、先に記載した組換えバクテリオファージにより作製した無作為ペプチドライブラリーまたは化学ライブラリーをスクリーニングすることにより、可能性がある化合物を得ることができる。次いで、この方法で選択した化合物を、１以上の期待できる可能性がある化合物が同定されるまで、コンピューターモデリングプログラムにより体系的に改変することができる。
【００８６】
作製されうる本質的に無作為な化学的改変は無数でありかつその化学的改変のいずれかが有用な節足動物制御剤となりうるのに対して、かかるコンピューターモデリングは合理的な化学的改変の有限数の選択を可能にする。それぞれの化学的改変はさらなる化学的ステップを要するが、それらのステップは、有限数の化合物を合成する上では無理なく実行できるが、可能性がある改変物を全て合成する必要があるとなれば、直ちに気が遠くなるような作業となる。従って、３次元構造及びコンピューターモデリングを利用することにより、多数のこれらの化合物をコンピューターモニタースクリーン上で高速スクリーニングして、膨大な数の化合物の手間がかかる合成をすることなく、少数のそれらしい候補を決定することができる。
【００８７】
有望な節足動物制御剤を、いずれであってもよい標準結合アッセイにかけてそのJHエステラーゼ活性に対する効果を試験することができる。
【００８８】
本明細書に記載した節足動物制御剤スクリーニングアッセイの全てに対して、節足動物制御剤の構造のさらなる洗練が一般的に必要であり、これは特定の節足動物制御剤スクリーニングアッセイにより与えられるいずれか及び／または全てのステップの逐次的反復によって行うことができる。
【００８９】
ポリペプチド
「実質的に精製された」により、本発明者らは、それがその天然状態で関連している脂質、核酸、他のポリペプチド、及び他の夾雑分子から分離されたポリペプチドを意味する。
【００９０】
ポリペプチドの％同一性は、GAP（Needleman及びWunsch, 1970）分析（GCG program）により、ギャップ作成ペナルティ（gap creation penalty）＝5、及びギャップ拡張ペナルティ（gap extension penalty）＝0.3を用いて決定する。問合せ配列（query sequence）は長さが少なくとも15個のアミノ酸であり、GAP分析は少なくとも15個のアミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインする。さらに好ましくは、問合せ配列は長さが少なくとも50個のアミノ酸であり、GAP分析は少なくとも50個のアミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインする。なお、さらに好ましくは、問合せ配列は長さが少なくとも100個のアミノ酸であり、GAP分析は少なくとも100個のアミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインする。さらに好ましくは、問合せ配列は長さが少なくとも250個のアミノ酸であり、GAP分析は少なくとも250個のアミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインする。なお、さらに好ましくは、問合せ配列は長さが少なくとも500個のアミノ酸であり、GAP分析は少なくとも500個のアミノ酸の領域にわたって２つの配列をアラインする。
【００９１】
本明細書に使用される、本発明のポリペプチドの「生物学的に活性な断片」は、JHエステラーゼ活性を有するポリペプチドの一部分である。
【００９２】
本発明のポリペプチドは、天然のもの（例えば、配列番号１もしくは２）もしくは突然変異体及び／またはそれらの断片のいずれかであってもよい。
【００９３】
アミノ酸配列突然変異体は、適当なヌクレオチド変化をDNA中に導入するかまたは所望のポリペプチドのin vitro合成により調製することができる。かかる突然変異体は、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入または置換が挙げられる。最終タンパク質産物が所望の特性を有する限り、欠失、挿入または置換の組合せを生成させて最終構築物に到達することができる。
【００９４】
アミノ酸配列突然変異体を設計する上で、突然変異部位の位置と突然変異の性質は改変する特性に依存する。突然変異部位は、個々にまたは順次、例えば、(1)最初に保存アミノ酸を選択して置換して、次いで得られた結果に基づいてさらなる基を選択して置換すること、(2)標的残基を欠失させること、または、(3)所定の部位に隣接して他の残基を挿入することにより、改変することができる。
【００９５】
アミノ酸配列欠失は、一般的に、約1〜30個の残基、さらに好ましくは約1〜10個の残基、そして典型的には約1〜5個の連続残基の範囲である。
【００９６】
置換突然変異体は、そのポリペプチド分子中の少なくとも1個のアミノ酸残基が除去されてその場所に異なる残基が挿入されている。置換突然変異誘発のための最も重要な部位としては、活性及び／または結合部位として同定された部位が挙げられる。他の重要な部位は、様々な種から得られる特定の残基が同一である部位である。これらの位置は生物学的活性にとって重要でありうる。これらの部位、特に少なくとも3つの他の同一に保存された部位の配列内に該当する部位は、比較的保存された方法で置換されることが好ましい。かかる保存的置換を、表題「置換例」とした表１に示した。
【００９７】
Hammockと共同発明者らは、JHEの二重リシン突然変異体（K29R、K522R）及び触媒セリン突然変異体（S201G）が、JHEを発現する組換えバキュロウイルスの、ヘリオチス・ビレセンス（Heliothis virescens）及びトリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）の両方を死滅させる能力を増強することを示している（米国特許第5,643,776号）。2個のリシン除去がユビキチン及びリソソーム経路によるJHEタンパク質の特異的分解を阻止するのにおそらく重要であり、触媒セリンの除去は、不活性酵素を産生し、それがJHと結合してそれを隔離することにより致死率を恐らく高めるであろう。Hammockと共同発明者らは、その上さらに、JHE酵素を原形質膜にターゲティングするシグナル配列を除去することにより、JHEを発現する組換えバキュロウイルスの殺虫活性を改良している（米国特許第5,674,485号）。非グリコシル化JHEはその結果、バキュロウイルス感染細胞の細胞質内に蓄積する。類似の突然変異を、配列番号１として示したポリペプチドについて実施することができる。
【表１】
2004533809.tif 000002
【００９８】
さらに、もし所望であれば、非天然アミノ酸または化学アミノ酸類似体を本発明のポリペプチド中に置換もしくは付加として導入することができる。かかるアミノ酸は、限定されるものでないが、通常のアミノ酸のD-異性体、2,4-ジアミノ酪酸、α-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、2-アミノ酪酸、6-アミノヘキサン酸、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β-アラニン、フルオロ-アミノ酸、β-メチルアミノ酸などのデザイナー・アミノ酸、Cα-メチルアミノ酸、Nα-メチルアミノ酸、及び一般的なアミノ酸類似体が挙げられる。
【００９９】
本発明の範囲内に含まれるのはまた、合成の際または合成後に、例えばビオチン化、ベンジル化、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク分解切断、抗体分子もしくは他の細胞リガンドとの連結などにより、様々に修飾された本発明のポリペプチドである。これらの修飾は、本発明のポリペプチドの安定性及び／または生物活性を増加するのに役立ちうる。
【０１００】
本発明のポリペプチドは様々な方法で生産することができ、天然タンパク質の生産と回収、組換えタンパク質の生産と回収、及びタンパク質の化学合成が挙げられる。一実施形態においては、単離された本発明のポリペプチドは、ポリペプチドを発現しうる細胞をそのポリペプチドを産生するのに有効な条件下で培養しさらにそのポリペプチドを回収することにより生産する。培養する好ましい細胞は本発明の組換え細胞である。効果的な培養条件は、限定されるものでないが、タンパク質産生を可能にする有効な培地、バイオリアクター、温度、pH及び酸素条件が挙げられる。有効な培地は、本発明のポリペプチドを産生するために細胞を培養するいずれであってもよい培地を意味する。かかる培地は典型的には、同化可能な炭素、窒素及びリン酸供給源、ならびに適当な塩類、ミネラル、金属及びビタミンなどの他の栄養素を有する水性培地が挙げられる。本発明の細胞は、通常の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、及びペトリ皿中で培養することができる。培養は、組換え細胞に適当な温度、pH及び酸素含量で実施することができる。かかる培養条件は当業者の技術の範囲内である。
【０１０１】
ポリヌクレオチド
「単離されたポリヌクレオチド」により、本発明者らは、それがその天然状態で随伴するかまたは連結しているポリヌクレオチド配列から分離されたポリヌクレオチドを意味する。さらに、本明細書において用語「ポリヌクレオチド」は用語「核酸分子」と互換的に使用される。
【０１０２】
ポリヌクレオチドの％同一性は、GAP（Needleman及びWunsch、1970）分析（GCG program）により、ギャップ生成ペナルティ＝5、及びギャップ拡張ペナルティ＝0.3を用いて決定する。問合せ配列は長さが少なくとも45個のヌクレオチドであり、GAP分析は少なくとも45個のヌクレオチドの領域にわたって２つの配列をアラインする。好ましくは、問合せ配列は長さが少なくとも150個のヌクレオチドであり、GAP分析は少なくとも150個のヌクレオチドの領域にわたって２つの配列をアラインする。さらに好ましくは、問合せ配列は長さが少なくとも300個のヌクレオチドであり、GAP分析は少なくとも300個のヌクレオチドの領域にわたって２つの配列をアラインする。
【０１０３】
本発明のポリヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー条件下で配列番号３または配列番号４に示した配列とハイブリダイズすることができる。特に、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下で配列番号３または配列番号４に示した配列とハイブリダイズすることができる。本明細書で使用される高ストリンジェンシー条件は、次の通りである；(1)洗浄には低イオン強度および高温、例えば0.015M NaCl/0.0015M クエン酸ナトリウム/0.1％ NaDodSO4、50℃を用いる；(2)ハイブリダイゼーションには、ホルムアミドなどの変性剤、例えば、50％(vol/vol)ホルムアミドとともに0.1％ウシ血清アルブミン、0.1％フィコール、0.1％ポリビニルピロリドン、50mMリン酸ナトリウムバッファーpH6.5とともに750mM NaCl、75mMクエン酸ナトリウム、を42℃にて用いる；または(3)50％ホルムアミド、5 x SSC（0.75M NaCl、0.075Mクエン酸ナトリウム）、50mMリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1％ピロリン酸ナトリウム、5 x デンハルト液（Denhardt's solution）、超音波処理したサケ精子DNA（50 g/ml）、0.1％ SDS及び10％硫酸デキストランを42℃にて用い、次いで0.2 x SSC及び0.1％ SDS中で処理する。
【０１０４】
配列番号３もしくは配列番号４またはそれらの部分とハイブリダイズしうるポリヌクレオチドは、ヌクレオチド残基の欠失、挿入、または置換である１以上の突然変異を有していてもよい。突然変異体は、天然（すなわち天然供給源から単離された）または合成（例えば、その核酸に位置指定突然変異誘発を施すことによって得られた）のいずれであってもよい。従って、本発明のポリヌクレオチドは天然または組換え体のいずれであってもよいことは明らかである。
【０１０５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、RNA、DNA、またはそのいずれかの誘導体であってもよい。かかるオリゴヌクレオチドの最小サイズは、オリゴヌクレオチドと本発明の核酸分子上の相補配列との間で安定なハイブリッドを形成するのに必要とされるサイズである。本発明は、例えば、核酸分子を同定するためのプローブ、核酸分子を産生するためのプライマー、または幼若ホルモンエステラーゼタンパク質産生もしくは活性を抑制するための節足動物制御剤として利用することができるオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンス、３本鎖形成、リボザイム及び／またはRNA薬に基づく試薬）を含む。プローブとして利用される本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的には、放射性同位体、酵素、ビオチン、蛍光分子または化学発光分子などの標識が結合されている。
【０１０６】
触媒核酸
用語「触媒核酸」は、個別の基質を特異的に認識してこの基質の化学的改変を触媒するDNA分子もしくはDNAを含有する分子（当技術分野では「デオキシリボザイム」とも呼ぶ）またはRNAもしくはRNAを含有する分子（当技術分野では「リボザイム」とも呼ぶ）を意味する。触媒核酸の核酸塩基はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ及びＵ、ならびにその誘導体でありうる。これらの塩基の誘導体は当技術分野では周知である。
【０１０７】
典型的には、触媒核酸は標的核酸を特異的に認識するためのアンチセンス配列、及び核酸切断酵素活性（本明細書では「触媒ドメイン」とも呼ぶ）を含有する。本発明において特に有用なリボザイムの型はハンマーヘッドリボザイム（Haseloff及びGerlach、1988；Perrimanら、1992）及びヘアピンリボザイム（Shippyら、1999）である。
【０１０８】
本発明のリボザイム及びそのリボザイムをコードするDNAは、当技術分野で周知の方法を用いて化学合成することができる。リボザイムはまた、RNAポリメラーゼプロモーター、例えば、T7 RNAポリメラーゼもしくはSP6 RNA ポリメラーゼのプロモーターと機能しうる形で連結されたDNA分子（転写されると、RNA分子を生じる）から調製することができる。従って、本発明により提供されるのは、本発明のリボザイムをコードする核酸分子、すなわちDNAまたはcDNAでもある。ベクターがDNA分子と機能しうる形で連結されたRNAポリメラーゼプロモーターも含有する場合、リボザイムを、RNAポリメラーゼとヌクレオチドとのin vitroインキュベーションにより生成することができる。別の実施形態においては、DNAを発現カセットまたは転写カセット中に挿入することができる。合成後、RNA分子を、リボザイムを安定化する能力を有するDNA分子とのライゲーションにより改変してリボヌクレアーゼ（RNase）に対して耐性を与えることができる。あるいは、リボザイムを、リポソーム送達系で利用するためにホスホチオ類似体に改変することができる。この改変はリボザイムにエンドヌクレアーゼ活性に対する耐性も与える。
【０１０９】
dsRNA
dsRNAは、特定のタンパク質の産生を特異的に抑制するために特に有用である。理論によって限定されることは望まないが、Dougherty及びParks（1995）は、dsRNAを用いてタンパク質産生を抑制することができる機構のモデルを提供している。このモデルは最近、Waterhouseら（1998）により改変されかつ拡張されている。この技術は目的の遺伝子のmRNA、この場合は本発明の第１、第２または第３の態様によるポリペプチドをコードするmRNA、と本質的に同一である配列を含有するdsRNA分子の存在に依存するものである。好都合なのは、組換えベクターまたは宿主細胞において、dsRNAが、センス配列とアンチセンス配列が無関係な配列とフランキングしている単一のオープンリーディングフレームとして生成させることができることであり、これによりセンス配列とアンチセンス配列がハイブリダイズして、ループ構造を形成する無関係な配列を有したdsRNA分子を形成することができる。本発明に適当なdsRNA分子の設計及び産生は、特にDougherty及びParks（1995）、Waterhouseら（1998）、WO 99/32619、WO 99/53050、WO 99/49029、及びWO 01/34815を考慮すれば、十分、当業者の実施可能な範囲内である。
【０１１０】
組換えベクター
本発明の一実施形態は、核酸分子を宿主細胞中に送達することができる任意のベクター中に挿入された、少なくとも1個の単離された本発明の核酸分子を含む組換えベクターが挙げられる。かかるベクターは、異種核酸配列、すなわち自然に本発明の核酸分子と隣接して見出されることはなく、かつ好ましくは本発明の核酸分子が誘導された種以外の種から誘導された核酸配列、を含有する。ベクターはRNAまたはDNAのいずれであってもよく、原核生物または真核生物のいずれのものであってもよく、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。
【０１１１】
組換えベクターの１つのタイプとしては、発現ベクターと機能しうる形で連結された本発明の核酸分子を含む。「機能しうる形で連結された」との表現は、宿主細胞中に形質転換された場合に核酸分子が発現されうる様式での核酸分子の発現ベクター中への挿入を意味する。本明細書で使用される発現ベクターは、宿主細胞を形質転換しかつ所与の核酸分子を発現することができるDNAまたはRNAベクターである。好ましくは、発現ベクターはまた、宿主細胞内で複製することもできる。発現ベクターは原核生物または真核生物のいずれのものであってもよく、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。本発明の発現ベクターは、細菌、真菌、内部寄生虫、節足動物、その他の動物、及び植物の細胞を含む本発明の組換え細胞内で機能する（すなわち、遺伝子発現を指令する）、全てのベクターを包含する。本発明の好ましい発現ベクターは、細菌、酵母、節足動物及び哺乳類の細胞内でそしてさらに好ましくは本明細書に開示した細胞型において、遺伝子発現を指令することができる。
【０１１２】
特に、本発明の発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製起点などの調節配列、及び組換え細胞と適合しかつ本発明の核酸分子の発現を制御するその他の調節配列を含有する。特に、本発明の組換え分子は転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長及び終結を制御する配列である。特に、重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター及びリプレッサー配列などの転写開始を制御する配列である。好適な転写制御配列は本発明の少なくとも１つの組換え細胞内で機能しうる全ての転写制御配列を包含する。当業者には様々なかかる転写制御配列は周知である。好ましい転写制御配列は、細菌、酵母、節足動物及び哺乳類の細胞で機能する転写制御配列、例えば、限定されるものでないが、tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、rrnB、バクテリオファージλ、バクテリオファージT7、T71ac、バクテリオファージT3、バクテリオファージSP6、バクテリオファージSP01、メタロチオネイン、α-接合因子、ピチア（Pichia）アルコールオキシダーゼ、αウイルスサブゲノムプロモーター（シンドビスウイルス（Sindbis virus）サブゲノムプロモーターなど）、抗生物質耐性遺伝子、バキュロウイルス、ヘリオチス・ゼア（Heliothis zea）昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ラクーンポックスウイルス（raccoon poxvirus）、他のポックスウイルス、アデノウイルス、サイトメガロウイルス（中初期プロモーター（intermediate early promotor）など）、サルウイルス40、レトロウイルス、アクチン、レトロウイルス長末端反復配列、ラウス肉腫ウイルス、熱ショック、リン酸及び硝酸塩転写制御配列ならびに原核生物細胞もしくは真核生物細胞の遺伝子発現を制御することができる他の配列、を包含する。さらなる好適な転写制御配列は、組織特異的プロモーター及びエンハンサーならびにリンホカイン誘導プロモーター（例えば、インターフェロンもしくはインターロイキンにより誘導しうるプロモーター）が挙げられる。本発明の転写制御配列はまた、節足動物に天然に随伴する天然の転写制御配列も包含する。
【０１１３】
本発明の組換え分子はまた、(a)発現された本発明のポリペプチドがそのポリペプチドを産生する細胞から分泌されるようにする分泌シグナル（すなわち、シグナルセグメント核酸配列）を含有してもよいし、及び／または(b)本発明の核酸分子を融合タンパク質として発現させる融合配列を含有してもよい。適当なシグナルセグメントの例は、本発明のタンパク質の分泌を指令することができるいずれかのシグナルセグメントが挙げられる。好ましいシグナルセグメントは、限定されるものでないが、組織プラスミノゲンアクチベーター（t-PA）、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、組織適合性及びウイルスエンベロープ糖タンパク質シグナルセグメント、ならびに天然シグナル配列が挙げられる。融合セグメント核酸によりコードされた好適な融合セグメントを本明細書に開示した。さらに、本発明の核酸分子を、ユビキチン融合セグメントなどの、コードされたタンパク質をプロテオソームに連結させる融合セグメントと接合することができる。組換え分子はまた、本発明の核酸分子の核酸配列周辺及び／または核酸配列内の介在配列及び／または非翻訳配列を含んでもよい。
【０１１４】
既知の節足動物に特異的なウイルス系を用いて、本発明の分子を送達することができる。これらは、バキュロウイルスなどの大きなDNAウイルスから小さいRNAウイルスまで様々でありうる。野生型ウイルスは一般的に節足動物により摂取される。ウイルス表面のタンパク質は節足動物の消化管の細胞に結合してウイルス内容物の細胞中への侵入を引き起こす。次いで、ウイルスの核酸は２つの仕事を果たす。第１に、ウイルスの核酸は、元来のウイルスと同一でありさらに多くのウイルスを構築するのに必要であるウイルスタンパク質をコードしており、さらに第２には、新しいウイルス中への組込みのためにその核酸のさらなるコピーを産生する。ウイルスを目的のタンパク質を産生するベクターとして改変する場合に、何らかの追加の核酸をウイルス核酸中に挿入し、その際ウイルスの元来の核酸の一部と置換えてもよいしまたは置き換えなくてもよい。毒素をコードする核酸を挿入する部位は、ウイルス感染した細胞内でその核酸が（もし必要であれば）転写されかつ所要のタンパク質に翻訳されうることを保証するように選択する。タンパク質を豊富に発現するには、核酸中の適当なプロモーター部位などの他の改変を必要とすることがありうる。一般的に、改変したウイルスが標的節足動物の多数の細胞に感染し、これらの全ての細胞内でタンパク質が豊富に発現することが意図される。一般的にはまた、該タンパク質の発現が節足動物に対するウイルス感染の有害な効果を加速させるかまたは増強することも意図される。JHE発現の場合、ウイルスに感染した節足動物はウイルス感染と内分泌破壊との両方を受けて死に至るに違いない。かかるウイルスを、作物植物（または節足動物の攻撃から保護することを所望する他の物質）上にスプレーするかまたは撒布し、節足動物が作物を食し始めると節足動物により摂取されるように製剤化することができる。
【０１１５】
ウイルスから誘導されるベクター系も知られている。一例は、カプソイド系（Hanzlikら、1999；WO 97/46666）である。カプソイド系は小RNAウイルスに基づくが、節足動物の細胞内で複製しない点がウイルスと異なる。小RNAウイルスは、１もしくは数個のRNA分子と、それが結合する、そのRNAがコードするカプシドタンパク質とからなる。カプシドタンパク質の分子は、RNAを封入して保護する規則正しい幾何学構造に組み立てられる。前記タンパク質はまた、節足動物の消化管の細胞と結合する機能を与え、ウイルスRNAを消化管細胞へ侵入させる。細胞内で、RNAのさらなるコピーが作られ、これらが発現されてさらに多くのウイルスタンパク質を作る。RNAとタンパク質は新しいウイルス粒子をアセンブルして、他の細胞と節足動物に感染することができる。カプソイド系は、タンパク質を節足動物腸細胞へ送達する野生型ウイルスの一部の機能を利用するものだが、ウイルス感染を持続するために要する全機能を有するものではない。カプソイド系はまた、他の場所で生産されて作物にスプレーされる必要があるというより、むしろトランスジェニック植物により生産されるようにするという特徴を有する。植物は、植物がカプシドタンパク質を生産するようにする遺伝子によって形質転換される。トランスジェニック植物はまた、ウイルス様粒子を産生するカプシドタンパク質に関連する必要な配列を含有するRNA分子も生産する。節足動物は、植物を食する際に、ウイルス様粒子を摂取する。カプシドタンパク質は節足動物の消化管細胞と結合し、RNAが細胞に侵入する。そのRNAをメッセンジャーRNAと似せるように遺伝子操作して、細胞がそのメッセージをタンパク質に翻訳するようにしてもよい。
【０１１６】
カプソイド系の一変形は、目的のタンパク質とカプシドタンパク質を単一遺伝子からの融合産物として発現するトランスジェニック植物である。送達されるのは、対応するRNAではなくタンパク質である。JHEなどの非保護タンパク質を節足動物に単純に給餌することは、タンパク質が通常の消化管処理により恐らく消化されることから、恐らく有効ではない。カプシドタンパク質ドメインはウイルス様構造に組み立てられ、毒素タンパク質ドメインをウイルス様構造のルーメン内での消化から保護される。毒素タンパク質は、カプシドドメインが消化管細胞と結合した後にのみ曝される。ウイルス様構造と標的細胞膜との融合により、毒素ドメインは腸内消化から保護されたまま残った細胞の側に提示される。カプソイドの摂取により、腸を内張りする多数の細胞が活性JHEを含有するようになり、この活性JHEは上記のようにJH減弱に作用することが期待される。
【０１１７】
宿主細胞
他の本発明の実施形態は、１以上の本発明の組換え分子を用いて形質転換された宿主細胞を含む組換え細胞が挙げられる。細胞への核酸分子の形質転換は、核酸分子を細胞中に挿入しうるいずれの方法により達成してもよい。形質転換技術は、限定されるものでないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、及びプロトプラスト融合が挙げられる。組換え細胞は単細胞のままでもよいしまたは組織、器官もしくは多細胞生物に成長させてもよい。形質転換された本発明の核酸分子は染色体外に残ってもよいし、または形質転換された（すなわち、組換え）細胞の染色体内の１以上の部位に、それらの発現される能力が保持される様式で組み込まれてもよい。
【０１１８】
形質転換するのに好適な宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドを用いて形質転換することができるいずれの細胞であってもよい。宿主細胞は、形質転換されてない細胞または少なくとも１つの核酸分子（例えば、１以上の本発明のタンパク質をコードする核酸分子）を用いて既に形質転換された細胞のいずれであってもよい。本発明の宿主細胞は、内因的に（すなわち、天然に）本発明のタンパク質を生産することができるものでもよいし、または少なくとも１つの本発明の核酸分子を用いて形質転換された後にかかるタンパク質を生産することができるものでもよい。本発明の宿主細胞は、少なくとも１つの本発明のタンパク質を生産することができるいずれの細胞であってもよく、細菌、真菌（酵母を含む）、寄生虫、他の節足動物、他の動物及び植物の細胞が含まれる。好ましい宿主細胞は、細菌、ミコバクテリア、酵母、節足動物及び哺乳類の細胞が挙げられる。さらに好ましい宿主細胞は、サルモネラ属（Salmonella）、エシェリキア属（Escherichia）、バチルス属（Bacillus）、リステリア属（Listeria）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、スポドプテラ属（Spodoptera）、ミコバクテリア属（Mycobacteria）、トリコプルシア属（Trichoplusia）、BHK（ベビーハムスター腎）細胞、MDCK細胞（イヌヘルペスウイルス培養用の正常イヌ腎細胞系）、CRFK細胞s（ネコヘルペスウイルス培養用の正常ネコ腎細胞系）、CV-1細胞（例えば、ラクーンポックスウイルスを培養するために用いるアフリカモンキー腎細胞系）、COS（例えば、COS-7）細胞、及びVero細胞が挙げられる。特に好ましい宿主細胞は、E. coli K-12誘導体を含む大腸菌（E.coli）；チフス菌（Salmonella typhi）；弱毒株を含むネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）；スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）菌；トリコプルシア・ニ（Trichoplusia ni）菌；BHK細胞；MDCK細胞s；CRFK細胞；CV-1細胞；COS細胞；Vero細胞；及び非腫瘍形成マウス筋芽細胞G8細胞（例えば、ATCC CRL 1246）である。さらなる適当な哺乳類細胞宿主は、他の腎細胞系、他の繊維芽細胞系（例えば、ヒト、マウスまたはニワトリ胚繊維芽細胞系）、骨髄腫細胞系、チャイニーズハムスター卵巣細胞、マウスNIH/3T3細胞、LMTK細胞及び／またはHeLa細胞が挙げられる。
【０１１９】
組換えDNA技術を使用して、形質転換されたポリペプチド分子の発現を遺伝子操作により改善することができ、例えば、宿主細胞内のポリペプチド分子のコピー数、これらのポリペプチド分子が転写される効率、得られる転写物が翻訳される効率、及び翻訳後修飾の効率を改善することができる。本発明のポリペプチド分子の発現を増加するのに有用な組換え技術は、限定されるものでないが、ポリペプチド分子を高コピー数プラスミドに機能しうる形で連結すること、ポリペプチド分子の１以上の宿主細胞染色体への組み込み、ベクター安定配列のプラスミドへの付加、転写制御シグナル（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換または改変、翻訳制御シグナル（例えば、リボソーム結合部位、シャイン・ダルガーノ配列）の置換または改変、宿主細胞のコドン使用に対応するように本発明のポリペプチド分子を改変すること、及び転写物を不安定化する配列の欠失が挙げられる。発現される本発明の組換えタンパク質の活性は、かかるタンパク質をコードするポリペプチド分子を断片化、改変、または誘導体化することにより改良することができる。
【０１２０】
トランスジェニック植物
用語「植物」は、植物全体、植物器官（例えば、葉、茎、根その他）、種子、植物細胞などを意味する。本発明の実施において利用を意図する植物は単子葉植物と双子葉植物の両方を含む。双子葉植物の例としては、ワタ、トウモロコシ、トマト、タバコ、ジャガイモ、マメ、ダイズなどが挙げられる。
【０１２１】
本発明の文脈で定義したトランスジェニック植物としては、所望の植物もしくは植物器官において本発明の少なくとも１つのタンパク質の生産を生じるかまたは増強するように、組換えDNA技術を用いて遺伝的に改変されている植物（ならびに前記植物の部分及び細胞）及びそれらの子孫が挙げられる。
【０１２２】
本発明のポリペプチドは、トランスジェニック植物において発生の全段階にわたって構成的に発現しうる。植物もしくは植物器官の利用に依存して、タンパク質を段階特異的な方法で発現してもよい。さらにその利用に依存して、タンパク質を組織特異的に発現してもよい。
【０１２３】
植物種の選択は、意図する植物またはその部分の利用及び形質転換に対する植物種の受け容れ能力により決定する。
【０１２４】
植物中で目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現が起こることが知られるかまたは見出されている調節配列は、本発明に利用することができる。利用する調節配列の選択は、目的の標的作物及び／または標的器官に依存する。かかる調節配列は、植物もしくは植物ウイルスから取得するかまたは化学合成することができる。当業者はかかる調節配列を周知している。
【０１２５】
ターミネーター配列及びポリアデニル化シグナルなどの他の調節配列は、植物においてかかる機能を果たすいずれの配列も含み、その選択は、当業者には明白であろう。かかる配列の一例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のノパリンシンターゼ（nos）遺伝子の3'フランキング領域である。
【０１２６】
目的のタンパク質をコードするDNA配列を含有する発現構築物を標的植物中に導入するには、複数の技術を利用することができる。かかる技術としては、限定されるものでないが、カルシウム／ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション及びマイクロインジェクションまたは（コーティングされた）粒子ボンバードメントを用いるプロトプラストの形質転換が挙げられる。これらのいわゆる直接DNA形質転換法に加えて、ウイルス及び細菌ベクター（例えば、アグロバクテリウム属由来）などのベクターに関わる形質転換系が広く利用できる。選択及び／またはスクリーニングの後、形質転換されているプロトプラスト、細胞または植物部分を、当技術分野で公知の方法を利用して植物全体に再生することができる。形質転換及び／または再生技術の選択は、本発明にとって決定的ではない。
【０１２７】
トランスジェニック非ヒト動物
トランスジェニック動物を生産する技術は当技術分野で周知である。この主題についての有用な一般的教科書は、Houdebineの「トランスジェニック動物  作製と用途（Transgenic animals - Generation and Use）」（Harwood Academic、1997）である。
【０１２８】
異種DNAを、例えば受精した哺乳類卵中に導入してもよい。例えば、全能性または多能性幹細胞を、マイクロインジェクション、リン酸カルシウムを介する沈降、リポソーム融合、レトロウイルス感染または他の手段により形質転換することができ、次いで形質転換した細胞を胚中に導入し、そして次いでその胚をトランスジェニック動物に発生させる。非常に好ましい方法では、発生胚を所望のDNAを含有するレトロウイルスを用いて感染し、感染胚からトランスジェニック動物を生産する。しかし、最も好ましい方法では、適当なDNAを、好ましくは単細胞段階の、胚の前核または細胞質中に同時注入し、そして胚を成熟トランスジェニック動物に発生させる。
【０１２９】
トランスジェニック動物を生産するために利用する他の方法は、標準の方法により前核段階卵に核酸をマイクロインジェクションすることを含む。注入された卵は、次いで培養した後、偽妊娠受給者の卵管中に移す。
【０１３０】
トランスジェニック動物はまた、核導入技術により生産してもよい。この方法を利用すると、ドナー動物由来の繊維芽細胞を、レギュレーターの制御下で目的の結合ドメインまたは結合パートナーのコード配列を組み込んでいるプラスミドを用いて、安定してトランスフェクトする。次いで、安定なトランスフェクタントを除核卵細胞と融合し、培養し、そして雌性受給者中に移す。
【０１３１】
組成物及び農業上許容される担体
本明細書に使用される「節足動物制御組成物」は、本発明の節足動物制御剤を含んでなる製剤であり、該組成物を節足動物に曝すとJHエステラーゼ活性が破壊される。
【０１３２】
農業上好適な及び／または環境上許容される節足動物制御用の組成物は当技術分野で知られている。植物及び／または動物の節足動物害虫の制御に用いる農業組成物は、農業上の利用、特に圃場における分散に適していなければならない。同様に、節足動物害虫の制御用組成物は、好ましくは環境上許容されるものである。農業組成物は、適当な固形または、さらに好ましくは、液状担体に加えて、粘着及び接着剤、乳化及び湿潤剤を含んでもよいが、節足動物摂食またはいずれかの節足動物制御剤機能を阻止する成分を含んではならない。節足動物制御剤を紫外線不活化から保護する成分または昆虫病原体の効力及び／または毒性を増加するアジュバントの役割を果たす成分を加えることも所望されうる。節足動物害虫制御用の農業組成物はまた、節足動物摂食を刺激する作用剤を含んでもよい。
【０１３３】
一実施形態においては、本発明の組成物は、外寄生を予防する目的でかかる組成物を投与することにより植物または動物を節足動物外寄生から保護するために使用することができる。かかる投与は経口（動物の場合）であっても、または環境への適用（例えば、噴霧）によってもよい。他の実施形態においては、ヒツジキンバエ（L. cuprina）などの節足動物が、本発明の組成物を投与しておいた宿主動物の血中に存在する組成物またはその産物を摂取してもよい。
【０１３４】
本発明の組成物はまた、賦形剤を含む。本明細書では、賦形剤はまた、「農業上許容される担体」とも呼ばれる。賦形剤は、処理される動物、植物または環境が耐え得るいずれの物質であってもよい。かかる賦形剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、ハンク溶液（Hank's solution）、及び他の生理学的な平衡塩類水溶液が挙げられる。また固定油、ゴマ油、オレイン酸エチル、またはトリグリセリドなどの非水性ビヒクルを使用してもよい。他の有用な製剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの増粘剤を含有する懸濁液が挙げられる。賦形剤はまた、等張性及び化学安定性を増強する物質などの少量の添加剤を含有してもよい。バッファーの例としては、リン酸バッファー、重炭酸バッファー及びトリス（Tris）バッファーが挙げられるのに対して、保存剤の例としては、チメロサールまたはo-クレゾール、ホルマリン及びベンジルアルコールが挙げられる。標準製剤は、注射可能な液体または注射用懸濁液もしくは溶液として好適な液中に取り込みうる固体のいずれかであってもよい。従って、非液状製剤においては、賦形剤は、デキストロース、ヒト血清アルブミン、イヌ血清アルブミン、ネコ血清アルブミン、保存剤などを含んでもよく、これに無菌の水または生理食塩水を加えた後に投与してもよい。
【０１３５】
本発明の一実施形態においては、組成物は担体を含んでもよい。担体としては、処理された動物、植物または環境における組成物の半減期を増加する化合物が挙げられる。好適な担体としては、限定されるものでないが、ポリマーの制御放出ビヒクル、生物分解性移植片、リポソーム、細菌、ウイルス、他の細胞、油、エステル及びグリコールが挙げられる。
【０１３６】
本発明の一実施形態は、本発明の組成物を動物、植物または環境中に徐々に放出することができる制御放出製剤である。本明細書に使用される、制御放出製剤は、制御放出ビヒクル中に本発明の組成物を含んでなる。好適な制御放出ビヒクルとしては、限定されるものでないが、生体適合性ポリマー、他のポリマーマトリックス、カプセル、ミクロカプセル、微粒子、ボーラス調製物、浸透圧ポンプ、拡散デバイス、リポソーム、リポスフェア、及び経皮送達系が挙げられる。他の本発明の制御放出製剤としては、投与すると固体またはゲルをin situ形成する液体が挙げられる。好ましい制御放出製剤は生物分解性（すなわち、生物可蝕性（bioerodible））である。
【０１３７】
好ましい本発明の制御放出製剤は、本発明の組成物を、例えば環境、または動物の血液中に一定速度で十分放出して、節足動物外寄生に対して保護するのに有効な組成物の用量レベルを達成することができる。組成物は好ましくは、約1〜約12ヶ月の期間にわたって放出される。好ましい本発明の制御放出製剤は、好ましくは少なくとも約1ヶ月、さらに好ましくは少なくとも約3ヶ月、なおさらに好ましくは少なくとも約6ヶ月、それよりなおさらに好ましくは少なくとも9ヶ月、そしてそれよりなおさらに好ましくは少なくとも約12ヶ月の間、処置の効果を与えることができる。
【０１３８】
節足動物害虫を制御する有効な組成物を生産するために要求されるであろう節足動物制御剤の濃度は、生物のタイプ及び組成物の製剤に依存しうる。組成物内の節足動物制御剤の有効濃度は、当業者は理解しうるように、実験的に容易に決定することができる。例えば、ウイルスの有効濃度は、当技術分野で公知の技術を用いて容易に決定することができる。
【０１３９】
本発明の組成物を動物に有効な方法で投与するための許容されるプロトコルは、個々の用量サイズ、用量数、用量投与の頻度、及び投与様式を含む。当業者はかかるプロトコルの決定を実施することができる。好適な単一用量は、1回以上好適な期間にわたり投与すると、動物を節足動物の外寄生から保護できる用量である。例えば、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは節足動物制御剤を含んでなる好ましい組成物の単一用量は、動物体重1キログラム当たり、前記組成物の約1マイクログラム〜約10ミリグラムである。最初の投与後約2週間〜数年間、ブースターを投与してもよい。好ましい投与スケジュールは、動物の体重1キログラム当たり組成物の約10μg〜約1mgを、約2週間〜約12ヶ月の期間にわたり、約1〜約2回投与するスケジュールである。投与様式としては、限定されるものでないが、皮下、皮内、静脈内、鼻腔内、口内、経皮、眼内、及び筋肉内経路が挙げられうる。
【０１４０】
キット
本発明はまた、節足動物のエステラーゼ活性を抑制できる化合物を同定する試験キットも含む。かかる試験キットは、エステラーゼ活性を有する本発明に係るポリペプチド、及び推定抑制化合物の存在下での（すなわち、その効果を受けることによる）エステラーゼ活性の抑制の程度を決定する手段を含む。かかる化合物はまた、宿主動物、植物または環境において実質的に無毒であるものを同定するために、スクリーニングすることもできる。
【実施例】
【０１４１】
実施例：
実施例１  キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）JHEの精製
方法
キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）株12I11.2を、蛹殻形成後12±6時間に採集して-70℃で保存した。
【０１４２】
キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）の100gを、氷上で10mM KOH/酢酸バッファー、pH4.5の500ml及びフェニルチオウレアの数ミリグラムとともに、ソルボール（Sorvall）ブレンダー内でホモジナイズした。ホモジネートを、13,000gで、4℃、20分間の遠心分離により清澄化し、次いでグラスウールを通して濾過した。この溶液のpHを、10％グリセロールを含有する100mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7.0の等容積を加えて上昇させた。
【０１４３】
固体硫酸アンモニウムを適当に加えて30〜60％硫酸アンモニウムカットを作り、得られるペレットを、10％グリセロールを含有する100mMリン酸ナトリウムバッファー、pH7.0に再懸濁して最終容積52mlとした。
【０１４４】
氷／水スラリー内で激しく攪拌しながら、アセトン（0℃）を再懸濁した硫酸アンモニウムペレットに徐々に加え、最終濃度40％(v/v)にした。次いで溶液を、9000gにて15分間、0℃で遠心分離した。上清を一夜、4℃にて10％グリセロールを含有する10mMイミダゾール／HClバッファー、pH7.0の3 lに対して透析した。透析チューブ中のこの物質をアクアシド（aquacide）III（Calbiochem 17852）を用いて50ml未満に濃縮し、過剰の水を除去した。
【０１４５】
アセトン上清の等電点電気泳動(IEF)を、ロトフォー（Rotofor）装置（Biorad）を用いて実施した。両性電解質（Pharmalyte pH5-6、Pharmacia）と10％グリセロールの3mlをアセトン上清に加えて、全容積を50ml、ロトフォー泳動チャンバー（focusing chamber）の容積とした。不凍液を-8℃で装置を通して循環し、泳動チャンバーの温度をほぼ2℃とした。サンプルを12ｗで4時間泳動し、その間、電圧を300から880ｖへ上昇した。20個の2.5ml画分を採集して、それらのタンパク質含量、pH及びJHE活性を測定した。JHE活性を含有する画分（pH5.35〜6.12）を、泳動チャンバーを満たすのに十分な10％グリセロールとともにロトフォーに戻した。これらをさらに4時間再泳動し、その間、電圧を1600から1900ｖへ上昇した。次いで画分を採集して上記のようにアッセイした。JHEを含有する画分（pH 5.29〜5.56）をプールし、セントリプレップ30（Centriprep30）限外濾過デバイス（Amicon）を用いて0.22μm膜を通して濾過し、0.5mlに濃縮した。
【０１４６】
前のステップからの濃縮物質を0.1Mイミダゾール/HCl（pH7.0まで）、10％グリセロール、1mMジチオトレイトールを用いて5mlに希釈した。それを、予め同じバッファーを用いて平衡化したファーマシア（Pharmacia）「Mono Q HR5/5」クロマトグラフィカラムに供給した。カラムをバッファー6mlを用いて洗浄し、イミダゾールバッファー中の0〜500mM NaClの20ml直線勾配により0.5ml/分の流速で溶出した。勾配溶出物を1mlの画分で採集した。
【０１４７】
JHEを含有する「Mono Qカラム」（265〜335mM NaCl）からの画分を、セントリコン30（Centricon 30）限外濾過デバイス（Amicon）を用いて約100μlに濃縮し、予め上記イミダゾールバッファーの2カラム容積を用いて平衡化したファーマシア（Pharmacia）「Superose 6」30mlゲル濾過カラムに供給した。カラムをイミダゾールバッファーを用いて0.5ml/分の流速で溶出して1mlの画分を採集した。JHE活性を含有する2画分（ほぼ16.5ml溶出容積）を20℃で一夜保存し、次いでSDS-PAGE及び銀染色により純度を評価した。次いでPAGEゲルをPromegaゲル乾燥フィルムのシート間に入れて室温で保存乾燥した。
【０１４８】
JHE活性用の放射測定分配アッセイ（radiometric partition assay）（Hammock及びRoe、1985）を用いて、JHEの精製をモニターした。分配アッセイは、酵素を鎖標識した3H-JHIIIとインキュベートし、それが加水分解されて3H-JHIII酸を生じることから成る。反応を有機溶媒を加えて停止すると、有機溶媒はJHIIIを抽出するがJHIII酸産物は水相に残る。液体シンチレーション計数を用いて水相の3H量を測定することにより、反応物を定量する。Hammock及びRoe（1985）の方法との唯一の相違は反応容積が半分の100μlであり、0.5mg/ml BSA（Sigma）が含まれかつバッファーは100mMリン酸ナトリウム、pH8.0であったことであった。溶液のタンパク質含量は、Bradford（1976）の方法により、Bioradタンパク質アッセイキットを用い、BSAを標準として測定した。
【０１４９】
結果
最終のゲル濾過クロマトグラフィ分離からの2画分をSDS-PAGEにより分離し、銀染色（BioRad、銀染色キット）してタンパク質を見えるようにした。１つの画分（画分６）は実質的に純粋なJHEを含有したので酵素のｋcatを評価するのに用いた（下記参照）のに対して、他の画分（画分７）は他の反応速度論的実験に用いた（実施例２を参照）。画分のアリコートを含有するSDS-PAGEゲルをPromegaゲル乾燥フィルムのシート間に入れて乾燥し、JHEを含有するバンドを切除してペプチドマスフィンガープリントをとるまで（実施例３を参照）、室温で保存した。
【０１５０】
実施例２  JHEの反応速度論的分析
方法
本発明者らが報じるJHIIIに対するJHE（ｋcat）の1モル当たり反応速度は、最終分離ステップ直後に、均質であると思われた画分（画分６）を用いて計算した。計算は、SDS-PAGE上の移動度から評価した酵素の分子量（66kDa）、画分６のJHE活性、及び画分６のタンパク質含量を用いた。画分７のアリコートは他の反応速度論的パラメーターを計算するのに用いた。この画分は、JHE活性を有しなかった未同定のタンパク質を含有した。幸いにも定数ｋＭ及びｋｉは活性酵素の絶対量に依存しないので、未同定のタンパク質の存在を無視し得た。
【０１５１】
抑制のタイプと抑制定数（ｋi）を、JHの３つの型に対して決定した。アッセイは、3H-JHIII濃度を変化させ、可能性があるインヒビターを複数のアッセイに含ませ、そしてアッセイチューブを2％ポリエチレングリコール（「Carbowax」Compound 4000、Union Carbide）を用いて前処理してJH（及びその類似体）のガラスへの吸着を最小化した点を除くと上記の通りであった。JHI（5、10、及び15μM）、JHB3（3、5、及び8μM)またはメチルファルネソアート（MF）（6、12及び18μM)の全ての組合せに対して、3H-JHIII加水分解のインヒビターとしてのアッセイを実施した（0.0555、0.0715、0.1、0.1665、0.5μM；3871cpm/pmol）。JHIIIは1μl エタノールに入れてアッセイ溶液に加えたが、抑制するJHは、MF及びJHIの場合は1μl ジメチルスルホキシド、またはJHB3の場合はエタノールに入れて加えた。反応はまた、それぞれのJHIII濃度にて溶媒を加えるだけでも実施した。反応は、JHE（画分７を5mg/ml BSA中に1/20希釈した）の3μlを加えて開始した。これらの実験に対するインキュベーション時間は20分間で、その間、最大で基質の20％が消費され、反応速度は直線であった。それぞれの抑制実験はまた、JHEによるJHIIIの加水分解に対するｋＭの評価も与えた。それぞれのインヒビターに対して、実験を３回繰返して、３つのデータセットを与えた。抑制のタイプをグラフにより決定した後に、それぞれのデータセットの適当な速度式（この場合は競合抑制）との総括的フィットを、Cleland（1979）の適当なコンピュータープログラムを用いて実施した。次いで、それぞれのデータセットから抑制定数の重み付け平均及び標準誤差を計算した。
【０１５２】
結果
JHIIIは、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）由来のJHEにより徐々に加水分解される（ｋcat＝0.60sec-1）が、反応に対するミカエリス定数が非常に低い（ＫM＝89±12nM）ので、得られる特異性定数（specificity constant）（ｋCAT/ＫM＝6.8 x 106Ｍ-1sec-1）は非常に高く、理論的拡散律速最高値のほぼ108〜109Ｍ-1sec-1に近づく。
【０１５３】
JHの３つの自然型（JHI、メチルファルネソアート及びJHB3）はそれぞれJHIII加水分解の競合抑制を示し、それらが基質、JHIIIと同じ部位と結合しかつ抑制定数（ｋi）はJHEのこれらの化合物に対する結合アフィニティの尺度と解釈しうることを示した。JHIII（89±12nM)とJHB3（1.2±0.4μM）は、メチルファルネソアート（3.33±0.36μM）またはJHI（3.34±0.47μM）より強く結合し、前の２化合物が高等双翅目に見出されるJHの主要形態であることと一致する。しかし、本発明者らは、ｋiを決定するために用いたJHB3が４つの可能な立体異性体のラセミ体であったことに注目する。本発明者らは、以下に、自然の立体異性体（6S,7S,10R）の結合アフィニティは３つの非自然異性体より大きいことを示す。従って、6S,7S,10R JHB3に対するｋiは1.2μMより低い。
【０１５４】
JHIII加水分解の抑制を、単一の固定濃度において、ある範囲の自然形態のJH及びJH類似体によっても分析した。この実験は、絶対値よりむしろ相対的結合アフィニティを示した。ほとんど全てのJHIIIまたはJHB3の構造からのずれは、JHEとの結合アフィニティの有意な低下を示した（図１）。分子の全体サイズが重要であり、JHIとJHIIにおいて見られるメチルからエチル側鎖への変化などのサイズの小さい増加、またはメチルエステル部分のサイズの増加ですら、結合を低下させる。共役2E,3二重結合及び10R,11エポキシドは両方ともJHEとの結合を促進し、昆虫JHにおいて一般的に存在するこれらの特徴と一致する。さらに、JHEはJHB3の自然の6S,7S,10R立体異性体との優先的結合を示す。JHB3の高いアフィニティ結合は、このJHの形態が高等双翅目においてのみ見出されているので、恐らく高等双翅目由来のJHEにとってユニークであると思われる。
【０１５５】
実施例３  キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）JHEのペプチド・マスフィンガープリント
方法
JHEバンドを、Promegaゲル乾燥フィルムシートの間に保存しておいた銀染色SDS-PAGEゲルからカットした。２つのJHEバンドを別々に次の通り処理して２つのペプチド・マスフィンガープリントを得た。バンドを10μlの水を用いて再水和し、フィルムを除去した。タンパク質のインゲル(in-gel)消化を、いずれかのシステイン残基の還元とカルバミドメチル化により実施した。ゲル片を、2.8mMジチオトレイトールを含む重炭酸アンモニウム溶液(160μl、100mM)とともに30分間、60℃にてインキュベートした。ヨードアセトアミド（10μl、最終濃度5.9mM）を加えて、反応物をさらに30分間、室温にて暗所で保持した。ゲル片を２回、50％アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸を用いて洗浄し、真空下で乾燥し、トリプシン（Promega配列決定品質）150ngを含む重炭酸アンモニウム（100mM）10μlを用いて再水和し、一夜、37℃にてインキュベートし、次いで音波処理水浴内で50％アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸を用いて２回抽出した。それぞれのゲル片に対して、抽出物をプールし、真空遠心分離機内で乾燥し、マトリックス溶液（α-シアノ,4-ヒドロキシ,桂皮酸10 mg/mlを含む50％アセトニトリル/0.1％トリフルオロ酢酸）2μl中に再溶解し、ボイジャー・エリート（Voyager Elite）MALDI-TOF質量分析計（Perseptive Biosystems）のサンプルプレート上で乾燥した。ウシ血清アルブミン（927.4940及び2045.0285）のトリプシン消化物中のペプチドをJHE消化物の近接外側較正に使用した。トリプシン自己分解ペプチド（842.5）及びヒトケラチン由来の複数のペプチドの質量を排除した後、ProFoundソフトウエア（Version 4.8.5, Rockefeller University）を利用して、JHE消化物からの質量表を使ってNCBInrデータベース（29/3/2000、ショウジョウバエ（Drosophila）のみ）を検索した。最良の対合配列からの最大及び最小質量を用いて質量スペクトルの内部較正を行い、検索を繰り返して30ppmの質量許容度とした。
【０１５６】
結果
トリプシン消化ペプチドを、精製キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）JHEのSDS-PAGEゲルからの２つのJHEバンドから回収した。２つのゲルからのペプチド質量スペクトルは実質的に同一であり、その１つを図２に示す。ただ１つのキイロショウジョウバエ（D. melanogaster）（CG8425）由来の予想遺伝子産物だけが、掲げた質量表と密接に対合した（Z＝2.36、p＜0.05）。その遺伝子はカルボキシルエステラーゼ様配列を有することが同定されていたが、その幼若ホルモンエステラーゼとしての機能は同定されていなかった。
【０１５７】
実施例４  キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）JHE cDNAの単離と配列決定
方法
JHE遺伝子のmRNA配列を、cDNA末端の3'及び5'高速増幅（RACE）を用いて決定した。プライマーは、3'と5'-RACEが重複産物、従ってJHE遺伝子の完全cDNA配列を生じうるように選んだ。ポリアデニル化RNAは、ピークJHE活性となるよう上記のように加齢したキイロショウジョウバエ（D. melanogaster）前蛹、株12I11.2の全体ホモジネートから単離した（Campbellら、1992）。前蛹ほぼ50mgから、クイックプレップ（QuickPrep）ミクロmRNA精製キット（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて、精製mRNAの3.4μgを得た。このmRNA（1μg）を、5'RACEシステム（Gibco BRL）用のテンプレートとして使用した。２つのアンチセンスプライマー（5'-GTT-CTG-ATC-CTT-TAG-GCC-3'）（配列番号５）及び（5'-GGC-CAA-AGT-TAC-CAG-ACA-TCA-3'）（配列番号６）を、ネステッド(nested)PCR用に、予想キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）cDNA配列CG8425から設計し、GeneWorksにより合成した。5'RACE産物をpGem-T Easy ベクター系（Promega）を用いてクローニングし、pUC/M13フォワード及びリバース・ユニバーサルベクタープライマー（Bresatec）を用いて配列決定した。
【０１５８】
3'RACE用に、第１鎖cDNAを、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）前蛹mRNA 1μgから、Promega技術資料No.502に従って、AMV逆転写酵素（Promega）及びポリＴアダプタープライマー（5'-GCG-GCC-GCT-TGA-ATT-CCC-ACT-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-T-3'）（配列番号７）0.48μgを用い、新鮮なDTT（最終濃度20mM）を加えて合成した。cDNAの第２鎖合成及びPCR増幅は、アダプタープライマー（5'-GCG-GCC-GCT-TGA-ATT-CCC-AC-3'）（配列番号８）及びCG8425由来のプライマー（5'-GTT-GTC-TAC-GGC-GAT-GAG-3'）（配列番号９）の50pmol、1mM MgCl2、0.2mM dNTPミックス、1X Taq DNAポリメラーゼ反応バッファー及び10u Taq DNAポリメラーゼ（Gibco BRL）ならびに第１鎖cDNA/mRNA混合物の1:20希釈液1μlを含む全容積50μlを使用した。次の増幅条件を用いた：最初の変性については94℃にて3分間、続いて94℃にて45秒間、50℃にて1分間、及び72℃にて2分間の40サイクル。最後の伸張条件は、72℃にて7分間とした。第２のPCRのヘミネステッド(hemi-nested)ラウンドは、第１反応混合物（QAIクイックPCR精製キット、Qiagenを用いて精製した）1μl、アダプタープライマー及び他のCG8425由来のプライマー（5'-CGC-ACT-ACC-TGT-AAT-GGT-CTA-3'）（配列番号１０）のそれぞれ50pmolを用いて実施した。条件と他の試薬は、アニーリングを57℃にて実施したことを除くと、上記の通りであった。ゲル精製産物（QAIクイック PCR精製キット、Qiagen）をpSTBlue-1ベクター（完全ブラントクローニングキット、Novagen）中にクローニングし、そして配列決定した。全てのインキュベーション及びPCRサイクリングはGeneAmp PCRシステム9700または2400（PerkinElmer）のいずれかで実施した。配列決定はABI Prism BigDyeターミネーター法（Perkin-Elmer）により実施した。
【０１５９】
結果
キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）JHEをコードするオープンリーディングフレーム、及びその翻訳物を図３に示す。単離したキイロショウジョウバエ（D. melanogaster）JHE cDNAは、ショウジョウバエ（Drosophila）ゲノムプロジェクトの予想産物CG8425（Adamsら、2000）と複数の共通の配列を共有する。cDNAは、第５番目の予想イントロンが除去されていなかった（その代わりに予想スプライス部位の直後にインフレーム停止コドンと続いてポリアデニル化シグナルとポリAテイルが存在する）ことを除くと、予想CG8425産物であることを確証する。
【０１６０】
本発明のJHEに見出されたカルボキシルエステラーゼの保存された特徴としては、Ser213、His471及びGlu346からなる触媒トライアド（catalytic triad）が挙げられる。また、全ての触媒活性セリンエステラーゼの活性部位に見出されて本質的な機能を有すると提案されるさらなるSer（JHEの239）も保存されている。推定オキシアニオンホール（oxyanion hole）残基（Glyl32、Glyl33及びAla214）が保存され、またジスルフィド結合を形成する一対のCys残基（90と108）、及び塩架橋を形成する残基（Arg67とGlu106、Argl63とAspl85）も保存されている。予想シグナルペプチド（Ala20後に切断）があり、JHEが前蛹の血リンパ中に分泌されることと一致する。
【０１６１】
キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）JHEは、鱗翅目ヘリオチス・ヴィレセンス（Heliothis virescens）及びコリストニュウラ・フミフェラナ（Choristoneura fumiferana）（Fengら、1999）由来のJHEの全長配列全体と29％同一性を示す。これは、一般的にカルボキシルエステラーゼ間で見出される同一性の程度よりほんの僅かに大きい。
【０１６２】
複数の鱗翅目（lepidopterans）及び２種の鞘翅目（coleopterans）からのJHEの全cDNAもしくは部分的cDNAまたはアミノ酸配列は入手可能である（Hanzlikら、1989；Thomasら、2000）が、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）またはいずれかの他の双翅目からは入手されていない。本発明のJHEは、少なくとも２つの状況において、Ｈ・ヴィレセンス（H. virescens）JHEに優先して利用しうる。第１に、本発明のJHEは、異なるJH形態間の異なる結合優先スペクトルの結果として、非鱗翅目の昆虫、特に高等双翅目においてJHを分解するのにより有効でありうる。キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）JHEは、JHIIIについて鱗翅目JHEと類似の反応速度論を示すが、これはまた、高等双翅目にとって明らかにユニークなJHの形態であるJHB3に対しても良い結合アフィニティを示す。キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）酵素は進化してJHB3を効率的に加水分解すると仮定するのは納得できる。第２に、もし本発明のJHEの構造が鱗翅目酵素から十分異なっていてJHEを除去する特定の機構による認識を避けられるのであれば、本発明のJHEは鱗翅目においてさらに有効でありうる。
【０１６３】
実施例５  JHEのin vitro発現
方法
キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）からRNAを実施例４に記載の通り単離した。JHE cDNAは、それぞれBamHIおよびXbaI制限酵素部位（下線部）ならびに後者についてはさらに停止コドン（下線部）を含有するオリゴヌクレオチド、JheRTPCR.F2（5' CGCGGATCCGCGATGCTACAACTGCTGCTTCT 3'）（配列番号１１）及びJheRTPCR.R2（5' GCTCTAGAGCTTATTACTTTTCGTTGAGTATAT 3'）（配列番号１２）を用いてRNAから増幅した。JHE cDNAの増幅は、PLATINUM Taqキット（Life Technologies）によるSUPERSCRIPT ワンステップRT-PCRを利用した。50μl反応物は次を含有した（最終濃度）；1 x 反応ミックス、200ngキイロショウジョウバエ（D. melanogaster）前蛹RNA、0.2μM JheRTPCR.F2、0.2μM JheRTPCR.R2、1μl RT/PLATINUM Taqミックス。次の増幅サイクルを使用した；50℃にて30分間、94℃にて2分間、続いて94℃にて15秒間、48℃にて30秒間、72℃にて2分間の35サイクル、仕上げとして72℃にて10分間の最終増幅ステップ。
【０１６４】
BamHIとXbaIで消化したRT-PCR産物をアガロースゲル電気泳動及びQIAクイックPCR精製キット（QIAGEN）により精製し、次いで予めBamHIとXbaIを用いて消化したpFastBaclプラスミドのマルチクローニングサイト中にライゲートした。ライゲーションミックスをTG-1熱ショック細胞中に形質転換し、取扱説明書、BAC-To-BAC バキュロウイルス発現系（Gibco BRL LIFE TECHNOLOGIES）に従って、バクミド（bacmid）DNAを調製し単離した。
【０１６５】
次の改変を加えた取扱説明書、BAC-TO-BACバキュロウイルス発現系（Gibco BRL LIFE TECHNOLOGIES）に従って上記のように調製した組換えDNAを用いて、Sf9細胞をトランスフェクトした。 グレース（Grace）の細胞培地をSf-900 II無血清培地に置き換えた。溶液Ａは9μl ミニプレップバクミド（mini-prep bacmid）DNA及び41μl 1xHepes緩衝化生理食塩水を含有し、溶液Ｂは15μl DOTAPトランスフェクション試薬及び35μl 1xHBSを含有した。最初の細胞洗浄後、細胞を、胎児ウシ血清または抗生物質を含まない1.5ml グレース細胞培地を用いて上塗りし、完全トランスフェクション混合物を加えてJHE/pFastBaclウイルス上清（初回継代）を作製し、これをトランスフェクション開始後72時間に収穫した。
【０１６６】
JHE/pFastBaclウイルス上清力価を、グレース細胞培地で増殖したSf9細胞単層培養物において増幅した。25cm2フラスコに高集密（ほぼ2x106細胞）で接種し、JHE/pFastBaclウイルス上清（初回継代）の2mlをグレース細胞培地の全3mlに加えて、27℃にて72時間インキュベートした。培養物を収穫し、100gにて5分間遠心分離し、JHE/pFastBaclウイルス上清（第２回継代）を取り出した。この上清（1ml）を用いて75cm2フラスコを、グレース細胞培地の20ml中で高集密、ほぼ5x106細胞で感染させた。75cm2感染培養を27℃にてインキュベートし、72時間後に収穫し、100gにて5分間遠心分離してJHE/pFastBaclウイルス上清（第３継代）から細胞を除去し、そしてこの力価を測定して最終発現培養物を感染するのに使用した。
【０１６７】
JHE遺伝子の発現は、1.5x106細胞/mlの濃度のSf9細胞を含有するHyQ SFX昆虫無血清培地（HyClone）の懸濁培養物10ml中で実施し、JHE/pFastBaclウイルス上清（第３継代）を5pfu/mlの感染多重度にて使用した。対照としてSf9細胞の他のフラスコを、ウイルスがJHE cDNAを用いて改変されていないことを除くと、同一の方法で調製した。懸濁培養物を27℃にて振とうしながら72時間インキュベートし、次いで100gにて5分間遠心分離した。上清を-80℃にて保存した。両方のフラスコからのペレット化した細胞を、800μlの0.1Mリン酸バッファー、pH8.0、中に1x108細胞/mlの最終細胞密度にて再懸濁し、-80℃で保存した。
【０１６８】
再懸濁した細胞ペレット（10μl）及び上清（10μl）のJHE活性を、実施例１に記載したアッセイを用いて測定し、元来の10ml培養物の活性を反映するように調節した。
【０１６９】
結果
対照培養物（0.34nmol/分/10ml培養物）と比較して、JHE cDNA（15nmol/分/10ml培養物）を発現する培養物においては44倍を上回るJHE活性が見出され、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）JHE cDNAはJHE活性のあるタンパク質をコードすることを立証した。対照培養物において検出されたJHE活性のほとんどは、上清画分（0.07nmol/分/10ml培養物）よりむしろ細胞（0.27nmol/分/10ml培養物）中に存在した。対照的にJHE cDNAを発現する培養物中のJHE活性のほとんどは、細胞（0.19nmol/分/10ml培養物）よりむしろ上清（14.7nmol/分/10ml培養物）中に見出された。これは、キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）JHEがSf9細胞から分泌されることを示し、実施例４に記載した予想される分泌のシグナルペプチドと一致する。
【０１７０】
本明細書に含まれる先行技術の文書、議事録、物質、装置、物品などのいずれの考察も本発明の背景を提供する目的だけのためのものである。これらの事項のいずれもまたは全ては、本出願の各請求項の優先権主張日前に存在したものとして、先行技術基礎の部分を形成したとかまたは本発明に関連する分野の共通の一般知識であったことを示唆するものでもまたは表現するものでもない。
【０１７１】
上記の全ての刊行物は本明細書にそれらの全体が組み入れられる。
【０１７２】
当業者は、特定の実施形態に示した本発明に対して、広く記載された本発明の精神または範囲から逸脱することなく、多数の変法及び／または改変をなしうることを理解するであろう。従って、本発明の実施形態は、全ての点において、説明のためであって制限するものでないと考えなければならない。
【０１７３】
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【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】幼若ホルモン類似体によるJHIII加水分解の抑制を示す。JH類似体（10μM）を、3H-JHIII（56nM）及びJHEと共にインキュベートした。対照インキュベーションはJH類似体を添加しなかった（0％抑制)。抑制が大きいほど、その化合物がJHEとの結合がより強固であることを示す。(A)カルボキシル鎖のサイズが異なるJH類似体、(B)アルコール部分が異なるJH類似体、(C)10,11エポキシドが存在し（JHIIIのように）、二重結合の存在（+）または不在（-）が異なるJH類似体、(D)10,11エポキシドが不在であり（メチルファルネソアート（methyl farnesoate）のように）、二重結合の存在（+）または不在（-）が異なるJH類似体、(E)6,7及び10,11エポキシド部分が存在または不在であることが異なるJH類似体（ラセミ）、(F)JHB3の４つの可能な立体異性体、(G)カルボキシル鎖にヒドロキシル基を運ぶ３つのJH類似体、ならびに比較のために含めたJHIII及びメチルファルネソアート、(H)２つの殺虫剤、ヒドロプレン（hydroprene）及びメトプレン（methoprene）、ならびに比較のために含めたJHB3及びJHB3-ジエン。
【図２】乾燥した銀染色SDS-PAGEゲルから回収した精製されたキイロショウジョウバエ（D. melanogaster）JHEのトリプシン消化物フィンガープリントを示す。CG8425遺伝子産物から予測される質量に対応するJHEに対するピークを「J」とマークした。トリプシン自己分解によるピークを「T」とマークした。
【図３】JHE cDNA配列ならびにその翻訳を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１７５】
配列表のキー：
配列番号１  Ｎ末端シグナル配列を欠くキイロショウジョウバエ（D. melanogaster）幼若ホルモンエステラーゼ
配列番号２  キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）幼若ホルモンエステラーゼ
配列番号３  キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）幼若ホルモンエステラーゼをコードするcDNA
配列番号４  配列番号１に与えられたキイロショウジョウバエ（D. melanogaster）幼若ホルモンエステラーゼをコードするオープンリーディングフレーム
配列番号５及び６  キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）cDNA配列に対するPCRプライマー
配列番号７  ポリＴアダプタープライマー
配列番号８  3'RACE用のアダプタープライマー
配列番号９及び１０  キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）cDNA配列に対するPCRプライマー
配列番号１１及び１２  キイロショウジョウバエ（D. melanogaster）幼若ホルモンエステラーゼをコードするcDNAを増幅するために用いるPCRプライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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