(57)【要約】Ｒ１〜Ｒ３が明細書中の記載と同意義である式（Ｉ）：【化１】2004521901.tif 000011で示される治療的に活性なピラゾール誘導体、その製造方法、治療における、特に形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）の過剰発現により特徴付けられる障害の治療または予防におけるその使用、およびかかる治療において用いるための医薬組成物に関する。
2004521901.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2004521901.tif 000009
［式中、
Ｒ１はＨ、Ｃ１−４アルキルまたはＣＨ２ＣＯＮＲ４Ｒ５から選択され、Ｒ４はＨまたはＣ１−４アルキルから選択され、Ｒ５はＣ１−４アルキルから選択され；
Ｒ２は（ＣＨ２）ｎ−フェニル、−（ＣＨ２）ｎ−ヘテロサイクリル、−（ＣＨ２）ｎ−ヘテロアリールから選択され、各々は、さらに、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＨ、−ＯＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシ、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＮＲ４Ｒ６、−ＣＯＮＲ４Ｒ６、−ＮＨＣＯＲ４、−ＳＯ２Ｒ４、−ＳＯ２ＮＨＲ４、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ４Ｒ６から選択される、１つまたはそれ以上の同じであっても異なっていてもよい置換基により置換されていてもよく；
Ｒ３はＨ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシから選択され；
Ｒ４はＨまたはＣ１−４アルキルから選択され；
Ｒ５はＣ１−４アルキルから選択され；
Ｒ６はヘテロサイクリルまたはヘテロアリールから選択され；
または、Ｒ４Ｒ６は結合している窒素で一緒になって、３、４、５、６または７員の飽和または不飽和環を形成し、該環は、Ｎ、ＳまたはＯから選択されるヘテロ原子を含有していてもよく、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＨ、ＯＣＦ３、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシから選択される１つまたはそれ以上の置換基により置換されていてもよく；
ｎは０、１、２、３、４または５から選択され；
ＸおよびＸ’は同じであっても異なっていてもよく、ＣＨまたはＮから選択される：ただし、ＸおよびＸ’は両方ともはＮではない］
で示される化合物またはその塩もしくは溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ１がＨまたはＣ１−４アルキルである請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項３】
Ｒ１がＨである請求項１または請求項２に記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項４】
ｎが０または１である請求項１〜３いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項５】
Ｒ３がピリジン環のＣ（３）またはＣ（６）位に位置する請求項１〜４いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項６】
Ｒ３がＨまたはＣ１−４アルキルである請求項１〜５いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項７】
Ｒ４およびＲ６が結合している窒素で一緒になって、ピロリン、ピロリジン、イミダゾール、Ｎ−置換イミダゾール、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、Ｎ−置換ピペラジンを意味する上記請求項いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項８】
Ｒ４およびＲ６が結合している窒素で一緒になって、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン、Ｎ−置換ピペラジン、イミダゾールまたはＮ−置換イミダゾールを意味する上記請求項いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項９】
（４−クロロフェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
フェニル−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
（４−フルオロ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
フラン−２−イルメチル−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
（３−メタンスルホニル−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
３−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル−アミノ］−ベンゾニトリル；
２−メトキシ−４−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル−アミノ］−ベンゾニトリル；
［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−［３−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−アミン；および
［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−［３−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−アミン；
（３−クロロ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−ｍ−トリル−アミン；
［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−［４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−アミン；
（３，４−ジメトキシ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
（４−クロロ−３−メチル−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
２−クロロ−５−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−ベンゾニトリル；
４−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−フェノール；
（４−メトキシ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−ｐ−トリル−アミン；
［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−（３−トリフルオロメトキシ−フェニル）−アミン；
（３，４−ジメチル−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−アミン；
（３−イソプロポキシ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
（４−メタンスルホニル−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
２−メトキシ−４−｛４−［３−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−ピリジン−２−イルアミノ｝−ベンゾニトリル；
モルホリン−４−イル−｛４−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−フェニル｝メタノン；
（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−｛４−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−フェニル｝−メタノン；
［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；および
［３−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イルメトキシ）−フェニル］−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
またはその塩もしくは溶媒和物から選択される請求項１記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項１０】
請求項１〜９いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物を、医薬上許容される希釈剤または担体と一緒に含んでなる医薬組成物。
【請求項１１】
医薬として用いるための請求項１〜９いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物。
【請求項１２】
ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害の治療および／または予防のための医薬の製造における、請求項１〜９いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物の使用。
【請求項１３】
ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害のヒトまたは動物対象の治療方法であって、該ヒトまたは動物対象に有効量の請求項１〜９いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物をを投与することを含む方法。
【請求項１４】
請求項１〜９いずれか１項記載の式（Ｉ）で示される化合物の製造方法であって：
（ａ）式（Ｄ）：
【化２】
2004521901.tif 000010
［式中、Ｒ３は上記と同意義である］
で示される化合物を、アミンＲ２ＮＨ２で、Ｐｄ２（ｄｂａ）３およびバイナップの存在下で処理すること；および
（ｂ）続いて、得られた生成物から保護基を除去すること；
を含む方法。
【請求項１５】
請求項１〜９いずれか１項記載の化合物の製造方法であって、Ｒ１がＨである式（Ｉ）で示される化合物を適当な塩基の存在下でＮ−アルキル化することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は新規ピラゾール誘導体、その製造法、治療、特に、形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）の過剰発現により特徴付けられる障害の治療および予防におけるその使用に関する。
【０００２】
ＴＧＦ−βは、アクチビン／インヒビン、骨形成蛋白（ＢＭＰ）およびＴＧＦ−βを含むＴＧＦ−βスーパーファミリーに属している多機能サイトカインである。ＴＧＦ−βの３つのイソフォーム（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３）が哺乳類において同定されており、これらの各々は、異なる染色体の別個の遺伝子によりコードされる（D.A. Lawrence, Eur. Cytokine. Netw., 1996, 7(3), 363）。ＴＧＦ−βは、細胞周期を調節し、増殖応答を制御し、または細胞接着、移動および細胞間伝達を媒介する細胞外マトリックス蛋白に関係している、遺伝子の発現を最終的に誘発する細胞内シグナリング経路を開始させる。ＴＧＦ−βは、細胞増殖および分化、細胞外マトリックス形成、造血および免疫調節のモジュレーションを含む多面的効果を有する（RobertsおよびSpoon, Handbook of Experimental Pharmacology, 1990, 95, 419-458）。
【０００３】
種々の細胞表面蛋白および受容体は、活性ＴＧＦ−βリガンドがその受容体に結合することにより開始されるシグナルを変換することが知られている。ＴＧＦ−βシグナリング経路が開始されることにより、ＴＧＦ−βリガンドはＩＩ型膜受容体の細胞外ドメインに結合する（Massague, Ann. Rev. Biochem., 1998, 67, 753.）。ついで、結合ＩＩ型受容体は、Ｉ型（Ａｌｋ５）受容体を、多重結合膜複合体に補充し、ついで、活性ＩＩ型受容体キナーゼは、Ｉ型受容体キナーゼをリン酸化し、活性化する。Ｉ型受容体キナーゼの機能は、受容体結合共転写因子、Ｓｍａｄ−２またはＳｍａｄ−３をリン酸化することであり、その結果これは細胞質中に放出され、Ｓｍａｄ−４に結合する。ＰＡＩ−１遺伝子は、上記した細胞経路の結果として、ＴＧＦ−βにより活性化される。
【０００４】
ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害の治療および／または予防に対する一のアプローチは、ＴＧＦ−βシグナル伝達を阻害することである。例えば、優勢ネガティブＴＧＦ−βＩＩ型受容体の過剰発現によるＴＧＦ−βＩＩ型受容体の阻害は、ラットモデルにおいて、肝臓線維症および機能不全を防止すること（Proc. Natl. Acad. Sci, 1999, 96(5), 2345)）および確定した肝臓線維症の進行を防止すること（Hepatology, 2000, 32, 247）が知られている。
【０００５】
ＴＧＦ−βの病的過剰発現は、重症の病原性症状の進行を最終的に誘発する多くの望ましくない効果に関連していることが知られている（G.C. Blobeら、N. Engl. J. Med., 2000, 1350）。特に、ＴＧＦ−βの病的過剰発現は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の過剰な蓄積、細胞増殖および免疫抑制を引き起こし得る。ＥＣＭの過剰蓄積は、線維症、例えば腫瘍線維症、放射線誘発線維症、肝臓、腎臓、肺、腸、心臓、膵臓、腹膜または他の臓器の線維症を誘発することが知られている。線維症は、肝硬変、特発性肺線維症、球体硬化症および肥厚性瘢痕を誘発し得る。
多くの他の病状は、ＴＧＦ−βにより制御される遺伝子の発現の変化に付随することが知られており、これらは癌の進行、骨機能異常および炎症性障害を含む。
【０００６】
ＴＧＦ−β細胞内経路を阻害することができる化合物の開発は、上記した症状の予防および／または治療に効果がある望ましい手段と思われる。ＴＧＦ−β細胞内経路および／またはＴＧＦ−βの発現を阻害することができる化合物は、線維症の症状の進行を誘発する徴候の障害の治療において用いることができる。例えば、本発明の化合物は、種々の肝臓関連症状、例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、アルコール誘発肝炎、ヘモクロマトーシスおよび原発性胆汁性肝硬変症に関連する線維症の治療において有用であり得る。
【０００７】
本発明の化合物はピラゾール誘導体である。他のピラゾール化合物は、以前に、別の医薬用途において用いることが記載されている。ＰＣＴ特許出願、ＷＯ９６／０３３８５，ＷＯ９８／５２９３７、ＷＯ９８／５２９４０、ＷＯ９８／５２９４１およびＷＯ００／３１０６３（Searle & Co）には、一連の置換ピラゾール化合物およびｐ３８キナーゼ介在障害の治療におけるその使用が開示されている。特に、記載されている化合物は、炎症、炎症性腸疾患、多発性硬化症および喘息において有用である。欧州特許出願０８４６６８７（Lilly & Co）には、脂肪酸のｓＰＬＡ２介在放出の阻害に有用な新規な置換ピラゾールが記載されている。かかる化合物は、敗血性ショックのような症状の治療に有用である。ＥＰ０８４６６８６（Pfizer Ltd）には、インターロイキン−１（ＩＬ−１）および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の両方の阻害剤として作用する一連の縮合ピラゾール誘導体が開示されている。かかる化合物は、ＩＬ−１およびＴＮＦ介在疾患、例えば、慢性炎症性疾患、特定の自己免疫疾患および敗血症誘発臓器傷害の治療に有用である。上記した特許出願は本発明のピラゾール化合物を記載しているものではない。
【０００８】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ００／１２９４７（Scios Inc.）には、キナーゼｐ３８−αおよび／またはＴＧＦ−βの活性の増大に付随する種々の障害を治療するための一連のキナゾリン誘導体の使用が記載されている。これに記載されている化合物は、両方の蛋白の活性を阻害することが示されており、したがって、ｐ３８−αおよびＴＧＦ−βの両方に対する活性の増大が必要とされる症状の治療に特に有用である。
【０００９】
この度、以下に記載するある種の置換ピラゾール化合物が、ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害の治療または予防に有用であることを見出した。特に、本発明の化合物は、Ｉ型ＴＧＦ−β（Ａｌｋ５）受容体レベルで作用するＴＧＦ−β阻害剤である。
【００１０】
本発明の一の態様により、式（Ｉ）：
【化１】
2004521901.tif 000003
［式中、
Ｒ１はＨ、Ｃ１−４アルキルまたはＣＨ２ＣＯＮＲ４Ｒ５から選択され；
Ｒ２は（ＣＨ２）ｎ−フェニル、−（ＣＨ２）ｎ−ヘテロサイクリル、−（ＣＨ２）ｎ−ヘテロアリールから選択され、これらの各々は、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＨ、−ＯＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシ、−ＮＯ２、−ＮＨ２、−ＮＲ４Ｒ６、−ＣＯＮＲ４Ｒ６、−ＮＨＣＯＲ４、−ＳＯ２Ｒ４、−ＳＯ２ＮＨＲ４、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ４Ｒ６から選択される、１つまたはそれ以上の、同じであっても異なっていてもよい置換基により置換されていてもよく；
Ｒ３はＨ、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシから選択され；
Ｒ４はＨまたはＣ１−４アルキルから選択され；
Ｒ５はＣ１−４アルキルであり；
Ｒ６はヘテロサイクリルまたはヘテロアリールから選択され；
または、Ｒ４Ｒ６はそれらが結合している窒素で一緒になって、３、４、５、６または７員の飽和または不飽和環を形成し、Ｎ、ＳまたはＯから選択される１つまたはそれ以上の付加的なヘテロ原子を含有していてもよく、該環は、さらに、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＨ、ＯＣＦ３、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシから選択される１つまたはそれ以上の置換基により置換されていてもよく；
ｎは０、１、２、３、４または５であり；
ＸおよびＸ’は同じでも異なっていてもよく、各々、ＣＨまたはＮから選択される：ただし、ＸおよびＸ’は両方共はＮではない］
で示される化合物およびその塩ならびに溶媒和物（以下、「本発明の化合物」という）を提供する。
【００１１】
基または基の一部として、本明細書で用いられる「アルキル」なる用語は、特定の数の炭素原子を含有する、直鎖または分枝鎖の飽和脂肪族炭化水素ラジカルを意味する。かかるアルキル基は、特に、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉｓｏ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルおよびヘキシルを含む。
【００１２】
基または基の一部として、「アルコキシ」なる用語は、アルキルエーテルラジカルを意味し、ここに、「アルキル」なる用語は上記と同意義である。かかるアルコキシ基は、特に、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｉｓｏ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシおよびｔｅｒｔ−ブトキシを含む。
【００１３】
基または基の一部として、「ヘテロサイクリル」なる用語は、窒素、酸素および硫黄から独立して選択される１つまたはそれ以上のヘテロ原子を含有する、安定な飽和または部分的に不飽和（すなわち、モノ−芳香族）の３〜６員のものサイクリック環を意味し、該基はハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＨ、ＯＣＦ３、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシから選択される、１つまたはそれ以上の同じであっても異なっていてもよい置換基により置換されていてもよい。
【００１４】
基または基の一部として、「ヘテロアリール」なる用語は、窒素、酸素および硫黄から独立して選択される１つまたはそれ以上のヘテロ原子を含有する、安定な６〜１４員のヘテロサイクリック芳香族単環を意味し、該基はハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＨ、ＯＣＦ３、Ｃ１−４アルキルおよびＣ１−４アルコキシから選択される、１つまたはそれ以上の同じであっても異なっていてもよい置換基により置換されていてもよい。
【００１５】
また、本発明は、式（Ｉ）で示される化合物の医薬上許容される塩を範囲に含む。式（Ｉ）で示される化合物の適当な医薬上許容される塩は、酸塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩およびテトラアルキルアンモニウム塩等、または適当な酸、例えば酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸およびコハク酸のような有機カルボン酸；メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、メタンスルホン酸およびｐ−トルエンスルホン酸のような有機スルホン酸、および塩酸、硫酸、リン酸およびスルファミン酸等のような無機酸とのモノもしくはジ塩基塩を含む。
また、本発明は、式（Ｉ）で示される化合物の溶媒和物、例えば水和物にも関する。
【００１６】
Ｒ１がＨである式（Ｉ）で示される化合物は、互変異性体で存在し得る。別個の互変異性体およびそれらの混合物は本発明の範囲内に含まれる。
好ましくは、Ｒ１はＨまたはＣ１−４アルキルであり、より好ましくは、Ｒ１はＨである。
好ましくは、ｎは０または１である。
【００１７】
好ましくは、Ｒ２は（ＣＨ２）ｎ−フェニルまたは（ＣＨ２）ｎ−ヘテロサイクリルである。より好ましくは、Ｒ２は、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＨ、−ＯＣＦ３、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、−ＣＯＮＲ４Ｒ６、−ＳＯ２Ｒ４または−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ４Ｒ６から選択される１つまたはそれ以上の置換基により置換されている、（ＣＨ２）ｎ−フェニルまたは（ＣＨ２）ｎ−ヘテロサイクリルである。最も好ましくは、ｎは０であり、Ｒ２はハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、−ＯＨ、−ＯＣＦ３、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルコキシ、−ＣＯＮＲ４Ｒ６、−ＳＯ２Ｒ４または−Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＲ４Ｒ６から選択される１つまたはそれ以上の置換基により置換されているフェニルであり、ｎは１であり；またはｎが１であり、Ｒ２はフラニルである。
【００１８】
好ましくは、Ｒ３は、ピリジン環のＣ（３）またはＣ（６）位に位置し、Ｈ、ハロ（例えば、フルオロ、クロロ、ブロモ）、−ＣＮ、−ＣＦ３、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−４アルコキシから選択される。より好ましくは、Ｒ３はＨであり、別に、Ｃ１−４アルキルである。最も好ましくは、Ｒ３はＨである。
【００１９】
好ましくは、Ｒ４およびＲ６は、それらが結合している窒素で一緒になって、ピロリン、ピロリジン、イミダゾール、Ｎ−置換イミダゾール、イミダゾリン、イミダゾリジン、ピラゾール、ピラゾリン、ピラゾリジン、ピペリジン、モルホリン、チオモルホリン、ピペラジン、Ｎ−置換ピペラジンを意味する。
【００２０】
最も好ましくは、Ｒ４およびＲ６は、それらが結合している窒素で一緒になって、ピロリジン、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン、Ｎ−置換ピペラジン（好ましくは、Ｎ−メチル−ピペラジン）、イミダゾール、またはＮ−置換イミダゾール（好ましくは、Ｎ−メチル−イミダゾール）を意味する。
【００２１】
本発明は、上記したような好ましい基の組合せを有する化合物を含むことは理解できるだろう。
ＴＧＦ−βの過剰発現に特徴付けられる障害の治療または予防において有用な薬剤として特に対象となる式（Ｉ）で示される化合物は：
（４−クロロフェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
フェニル−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
（４−フルオロ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
フラン−２−イルメチル−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
（３−メタンスルホニル−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
３−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル−アミノ］−ベンゾニトリル；
２−メトキシ−４−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル−アミノ］−ベンゾニトリル；
［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−［３−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−アミン；
［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−［３−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−アミン；
（３−クロロ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
【００２２】
［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−ｍ−トリル−アミン；
［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−［４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−アミン；
（３，４−ジメトキシ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
（４−クロロ−３−メチル−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
２−クロロ−５−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−ベンゾニトリル；
４−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−フェノール；
（４−メトキシ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−ｐ−トリル−アミン；
［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−（３−トリフルオロメトキシ−フェニル）−アミン；
（３，４−ジメチル−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
【００２３】
［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−アミン；
（３−イソプロポキシ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
（４−メタンスルホニル−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
２−メトキシ−４−｛４−［３−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−ピリジン−２−イルアミノ｝−ベンゾニトリル；
モルホリン−４−イル−｛４−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−フェニル｝メタノン；
（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−｛４−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−フェニル｝−メタノン；
［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；および
［３−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イルメトキシ）−フェニル］−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン；
およびその塩ならびに溶媒和物である。
【００２４】
式（Ｉ）で示される化合物およびその塩ならびに溶媒和物は、後に記載する方法により調製することができ、これは本発明のさらなる一の態様を構成する。
式（Ｉ）で示される化合物は、有利には、下記スキーム１、２および３の一般方法に従って調製できる。
【００２５】
2004521901.tif 000004
【００２６】
【化２】
2004521901.tif 000005
【００２７】
【化３】
2004521901.tif 000006
【００２８】
【化４】
2004521901.tif 000007
【００２９】
【化５】
2004521901.tif 000008
【００３０】
略語表
ＡｃＯＨ  酢酸
バイナップ（Ｂｉｎａｐ）  ２、２’−ビス（ジフェニルホスフィノ）−１、１’−ビナフチル
ＤＭＦ・ＤＭＡ  ジメチルホルムアミドジメチルアセタール
ＤＭＦ  ジメチルホルムアミド
ＤＨＰ  ジヒドロピラン
ＤＣＥ  ジクロロエタン
ＤＩＥＡ  ジイソプロピルエチルアミン
ＥＤＣＬ  １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
ＨＯＢＴ  １−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物
ＮａＨＭＤＳ  ナトリウムビス（トリメチルシリル）アミド
ＭｅＣＮ  アセトニトリル
ＰＰＴＳ  ピリジニウムｐ−トルエンスルホナート
Ｐｄ２（ｄｂａ）３  トリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
ＴＨＰ  テトラヒドロピラン
【００３１】
Ｒ１がＨである式（Ｉ）で示される化合物を調製するための本発明による一般方法は：
（ｉ）カリウムビス（トリメチルシリル）アミドまたはナトリウムビス（トリメチルシリル）アミドのような適当な塩基を、式（Ａ）で示される置換ピリジンに、好ましくは、０〜−８０℃の範囲で、より好ましくは−３０〜−６０℃の範囲で、最も好ましくは−５０℃で、ＴＨＦのような適当な溶媒の存在下で加えること；
（ｉｉ）ピリジルエステル、Ｒ３（Ｃ５Ｈ３Ｎ）ＣＯ２Ｅｔ（ここに、Ｒ３は上記と同意義である）を、反応混合物に、好ましくは０〜−８０℃の範囲で、より好ましくは−３０〜−６０℃の範囲で、最も好ましくは−５０℃で、ＴＨＦのような適当な溶媒の存在下で加えること；
（ｉｉｉ）ジメチルホルムアミドジメチルアセタールを、得られたケトン（Ｂ）に、好ましくは０〜７５℃の範囲で、より好ましくは２０〜６０℃の範囲で、最も好ましくは室温で、ＤＭＦのような適当な溶媒の存在下で加えること；および
（ｉｖ）ヒドラジンモノ水和物、ＮＨ２ＮＨ２・Ｈ２Ｏを、好ましくは０〜７５℃で，より好ましくは２０〜６０℃で、最も好ましくは室温で、ＤＭＦのような適当な溶媒の存在下で加えること；
を含む。
【００３２】
スキーム３の工程（ｖｉｉｉ）に記載のＮ−アルキル化剤、Ｒ１Ｙ（ここに、Ｙは適当な脱離基、例えば、ＣｌまたはＢｒである）でのＮ−アルキル化により、式（Ｉ）で示される化合物の構造異性体が形成されることは理解できるだろう。かかる異性体は、上記したＲ１がＨである式（Ｉ）で示される化合物の互変異性体のＮ−アルキル化により得られる。個々の異性体およびそれらの混合物は、本発明の範囲内に含まれる。
【００３３】
式（Ａ）で示される置換ピリジン化合物は当該分野では公知である方法（例えば、 Osuchら、J. Org. Chem., 1957, 22, 939）と類似の方法により調製することができる。かかる調製方法の例は、後に特定の実施例で提供する。
２−ブロモ−４−メチルピリジンは、２−アミノ−４−メチルピリミジン（市販されている）から、文献: Mukkala, Veli-Matti;Sund, Christian; Kwiatkowski, Marek; Pasanen, Paavo; Hoegberg, Mariaら; Helv.Chim.Acta; 75; 5; 1992; 1621-1632に記載のように調製することができる。
【００３４】
上記したスキーム１〜３の工程（ｉｉ）に記載したようなモノ置換ピリジルエステル、Ｒ３（Ｃ５Ｈ３Ｎ）ＣＯ２Ｅｔ（ここに、Ｒ３は上記と同意義である）は当該分野で公知の方法と類似の方法で調製することができる。例えば、Ｒ３がＣ（６）−ＯＭｅである場合、Fingerら、J. Org. Chem., 1962, 27, 3965；Ｒ３がＣ（３）−ＯＭｅである場合、Dejardinら、Bull. Chim. Soc. Fr., 1979, 289；Ｒ３がＣ（５）−Ｂｒである場合、ChambersおよびMarfat, Synth. Commun., 1997, 27(3), 515；およびＲ３がＣ（４）−ＣＮである場合、HeinischおよびLotsch, Heterocycles, 1987, 26(3), 731。
【００３５】
スキーム３の工程（ｖｉｉ）に記載したようなN-アルキル化反応は、当該分野で公知の方法（例えば、R. Fusco, Pyrazoles, Chapter 4, p.71, The Chemistry of Heterocyclic Compounds, A. Weissberger (ed), Vol. 22, Intersciences, New York, 1967およびElguero, Pyrazoles and their Benzo derivatives, p.222, Comprehensive Heterocycles Chemistry, A.R. Katrisky, C.W. ReesおよびK.T. Potts (eds), Vol. 5, Pergamon Press, Oxford, 1984）と類似の方法に従って行うことができる。
【００３６】
本発明の化合物がＴＧＦ−β１型（Ａｌｋ５）受容体を阻害することによりＳｍａｄ−２またはＳｍａｄ−３蛋白のリン酸化を阻害することが見出された。
したがって、本発明の化合物は、本明細書に記載のアッセイにおいて試験され、ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害の治療および予防において可能性ある治療的有用性があることが見出された。
かくして、ヒトまたは獣医学において、特に、ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害の治療または予防において、医薬として用いるための式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩または溶媒和物を提供する。
【００３７】
本明細書において言及する治療は、予防ならびに確定した症状の治療を範囲に含むことは理解できるだろう。さらに、本明細書で言及するＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害の治療または予防は、線維症、特に肝臓および腎臓の線維症、癌の進行、骨機能異常および炎症性障害および瘢痕化のようなＴＧＦ−β関連疾患の治療または予防を含む。
本発明に従って治療され得る他の病的症状は、上記した序文で論じられている。本発明の化合物は、特に、線維症およびそれに関連する症状の治療に適している。
【００３８】
本発明の化合物は、肝臓疾患に対する例えば抗ウイルス剤のような他の治療剤、または腎臓疾患に対するＡＣＥ阻害剤またはアンギオテンシン受容体アンタゴニストと組み合わせて投与することができる。
【００３９】
本発明の他の態様により、ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害、特に線維症の治療および／または予防のための医薬の製造における式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物の使用を提供する。
【００４０】
さらなる態様において、ＴＧＦ−βの過剰発現により特徴付けられる障害、特に線維症を患っているヒトまたは動物の治療方法であって、該ヒトまたは動物対象に、有効量の式（Ｉ）で示される化合物またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を投与することを特徴とする方法を提供する。
【００４１】
本発明の化合物はいずれかの慣用的な方法で投与するために処方されてもよく、したがって、本発明は、式（Ｉ）で示される化合物、またはその医薬上許容される塩もしくは溶媒和物を、１つまたはそれ以上の医薬上許容される希釈剤または担体と混合して含む、治療において用いるための医薬組成物も範囲に含む。
本発明は成分を混合して含む該医薬組成物の製造方法を提供する。
例えば、本発明の化合物は、経口、舌下、非経口、局所および直腸投与で処方することができる。
【００４２】
経口投与用の錠剤およびカプセルは、慣用的な賦形剤、例えば結合剤、例えば、シロップ、アカシア、ゼラチン、ソルビトール、トラガカント、でんぷんの粘漿剤またはポリビニルピロリドン；充填剤、例えば、ラクトース、微結晶セルロース、糖、とうもろこしでんぷん、リン酸カルシウムまたはソルビトール；滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコールまたはシリカ；崩壊剤、例えば、ポテトスターチ、クロスカルメロースナトリウムまたはスターチグリコール酸ナトリウム；または湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムを含んでいてもよい。経口液体製剤は、例えば、水性または油性懸濁液、溶液、乳液、シロップまたはエリキシルの形態であってもよく、または、使用前に水または他の適当なビヒクルで復元する乾燥生成物として調製することができる。かかる液体製剤は、慣用的な添加剤、例えば懸濁化剤、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲルまたは硬化食用油；乳濁化剤、例えば、レシチン、ソルビタンモノオレアートまたはアカシア；非水性ビヒクル（食用油を含んでいてもよい）、例えば、アーモンド油、ヤシ油、油性エステル、プロピレングリコールまたはエチルアルコール；または保存剤、例えば、メチルまたはプロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸を含んでいてもよい。また、製剤は、必要に応じて、緩衝塩、フレーバー、着色剤および／または甘味剤（例えば、マンニトール）を含んでいてもよい。
【００４３】
舌下投与に関しては、組成物は、慣用的な方法で、錠剤またはロゼンジの形態にすることができる。
また、化合物は、例えば、ココアバターまたは他のグリセライドのような慣用的な坐剤基剤を含有する坐剤として処方することもできる。
【００４４】
また、本発明の化合物は、ボーラス注射または持続性注射による非経口投与用に処方することができ、例えば、アンプル、バイアル、少量の注射または予備充填シリンジのような単位剤形、または、付加的な保存剤と一緒に複数回投与容器に調製することができる。組成物は、水性または非水性ビヒクル中の溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態であってもよく、処方剤、例えば、酸化防止剤、緩衝剤、抗菌剤および／または毒性調節剤を含んでいてもよい。別法として、活性成分は、使用前に、適当なビヒクル、例えば滅菌発熱物質不含水で復元するための粉末の形態であってもよい。乾燥固体製剤は、滅菌粉末を、無菌状態で、別個の滅菌容器に充填することにより、または、滅菌溶液を、無菌状態で各々の容器に充填し、凍結乾燥することにより調製することができる。
【００４５】
本発明で用いる局所投与は、吸入による投与を含む。局所投与用の製剤の種々の型の例としては、軟膏、クリーム、ローション、粉末、ペッサリー、スプレー、エアロゾル、吸入で用いるためのカプセルもしくはカートリッジまたは滴剤（例えば、目または鼻の滴剤）が挙げられる。
【００４６】
例えば、軟膏およびクリームは、適当な増粘剤および／またはゲル化剤および／または溶媒を添加した水性または油性基剤と一緒に処方できる。かくして、かかる基剤は、例えば、水および／または液体パラフィンまたはラッカセイ油もしくはヒマシ油のような植物油のような油またはポリエチレングリコールのような溶媒を含む。用いることができる増粘剤は、ソフトパラフィン、ステアリン酸アルミニウム、セトステアリルアルコール、ポリエチレングリコール、微結晶ワックスおよびベースワックスを含む。
【００４７】
ローションは、水性または油性基剤と一緒に処方することができ、一般的には、１つまたはそれ以上の乳濁化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤または増粘剤も含むだろう。
外用粉末は、いずれの適当な粉末基剤、例えば、タルク、ラクトースまたはスターチの補助を用いて形成することができる。滴剤は、１つまたはそれ以上の分散剤、溶解剤または懸濁化剤も含む、水性または非水性基剤と一緒に処方することができる。
【００４８】
スプレー組成物は、例えば、適当な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体を用いることで、加圧パックから供給される水溶液もしくは懸濁液またはエアロゾルとして処方することができる。
吸入で用いるためのゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、本発明の化合物および適当な粉末基剤、例えばラクトースまたはでんぷんの粉末混合物を含んで処方することができる。
【００４９】
本発明の化合物は、有利には、例えば、体重１ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇ、適当には、体重１ｋｇ当たり０．０５〜２５ｍｇの量で、１日１回またはそれ以上の回数で、経口投与することができる。もちろん的確な投与量は、患者の年齢および症状、選択される特定の投与経路に依存し、完全に投与する主治医の判断による。
【００５０】
以下の実施例は本発明を説明するものであって限定するものではない。
【００５１】
中間体
中間体Ｂ１：
１−ピリジン−２−イル−２−［２−ブロモ−ピリジン−４−イル］−エタノン
乾燥ＴＨＦ（２７０ｍｌ）中の２−ブロモ−４−メチル−ピリジン（２７ｇ）の溶液に、ピコリン酸エチル（２８．５ｇ）を加え、得られた混合物をアルゴン雰囲気下で−７８℃に冷却した。ＴＨＦ（３４５ｍｌ）中の１Ｍのビス−（トリメチルシリル）アミドナトリウムの溶液を−７８℃で滴下し、完了した後、反応混合物を室温に加温し、一晩撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させ、固体残渣をジエチルエーテルでトリチュレートし、濾過し、ジエチルエーテルで洗浄した。ついで、固体を飽和ＮＨ４Ｃｌ溶液で希釈し、水相を酢酸エチルで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。得られた有機粉末をペンタンで洗浄し、標題化合物を黄色固体（３３．９７ｇ）として得た。
融点：１１１．２℃
1H NMR (CDCl3): δ 8.56 (d,1H); 8.12 (d, 1H); 7.9 (d , 1H); 7.7 (td,1H);7.39-7.34 (m,1H); 7.33 (s,1H); 7.06 (d,1H); 4.37 (s, 2H)
【００５２】
中間体Ｂ２：
２−［２−ブロモ−ピリジン−４−イル］−１−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−エタノン
２−ブロモ−４−メチル−ピリジン（５ｇ、２９ｍｍｏｌ）および６−メチルピコリン酸メチル（１．１当量、４．８２ｇ、３２ｍｍｏｌ）を中間体Ｂ１に記載のように反応させて、標題化合物を黄色固体（５．８４ｇ、７０％）として得た。
ＭＳ  ｍ／ｚ：２９２（ＭＨ＋）
【００５３】
中間体Ｃ１：
２−ブロモ−４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン
簡素黄ＤＭＦ（１３．５ｍｌ）中の１−ピリジン−２−イル−２−［２−ブロモ−ピリジン−４−イル］−エタノン（６９．６８ｇ、０．２５１ｍｏｌ）の溶液を、窒素雰囲気下で、氷酢酸（２．４当量、３５ｍｌ、０．６１ｍｏｌ）で２分間処理した。ＤＭＦ・ＤＭＡ（１．５当量、５０ｍｌ、０．３７６ｍｏｌ）を滴下し、混合物を、窒素雰囲気下室温で、７８分間撹拌した。ヒドラジンモノ水和物（７．５当量、９１ｍｌ、１．８７６ｍｏｌ）を滴下し、得られた混合物を５０℃で２時間加熱し、ついで、冷却し、室温で一晩撹拌した。反応混合物を水（４ｌ）中に注ぎ、酢酸エチル（１ｌ）で抽出した。有機抽出物をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過した。減圧下で還元して、褐色油を得、これをアセトニトリルから結晶化し、クリーム状の固体として標題化合物（４５．８ｇ、６０．５％）を得た。
1H NMR (CDCl3): δ 8.62 (d,1H); 8.28 (d, 1H); 7.68 (s , 1H); 7.62 (td,1H); 7.51 (s, 1H); 7.39 (d, 1H); 7.26-7.22 (m,2H)
【００５４】
中間体Ｃ２：
２−ブロモ−４−（３−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン
２−［２−ブロモ−ピリジン−４−イル］−１−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−エタノン（５．８４ｇ、２０ｍｍｏｌ）を中間体Ｃ１に記載のように反応させて、黄色固体として標題化合物（３．０７ｇ、４９％）を得た。
ＭＳ  ｍ／ｚ：３１５（ＭＨ＋）
中間体Ｄ１：
２−ブロモ−４−（３−ピリジン−２−イル−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン
アセトン（２００ｍｌ）中の２−ブロモ−４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン（１０．６ｇ）の溶液に、炭酸カリウム（３当量、１４．６ｇ）および塩化トリチル（１．５当量、１４．８ｇ）を加えた。反応物を加熱還流し、２４時間撹拌した。濾過した後、濾液を濃縮し、ついで、ＣＨ２Ｃｌ２およびＨ２Ｏの間で分配した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。この得られた粗物質をＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９８：２）で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、標題化合物を白色固体（１６．３ｇ、８５．３％）として得、これは副成分として、２−トリチル異性体を含んでいた。
融点２０２℃
ＭＳ  ｍ／ｚ  ５４４（ＭＨ＋）
【００５５】
中間体Ｄ２：
２−ブロモ−４−［３−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］ピリジン
２−ブロモ−４−（３−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン（３．０７ｇ、９．８ｍｍｏｌ）および塩化トリチル（１．５当量、４．１ｇ、１４．７ｍｍｏｌ）を、中間体Ｄ１に記載のように反応させて、２つの異性体の混合物の主異性体として、標題化合物を黄色固体（４．９ｇ、９０％）として得た。
ＭＳ  ｍ／ｚ：５５８（ＭＨ＋）
【００５６】
中間体Ｅ：
４−［４−（３−ピリジン−２−イル−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−安息香酸メチルエステル
トルエン（２００ｍｌ）中の中間体Ｄ（５．５ｇ）の懸濁液に、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（１９０ｍｇ、２ｍｏｌ％）、バイナップ（ｂｉｎａｐ）（２５７ｍｇ、４ｍｏｌ％）、４−アミノ−安息香酸メチルエステル（２．０３ｇ、１．３当量）およびナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（１．４ｇ、１．４当量）を加えた。反応混合物を８０℃で一晩撹拌した。混合物を氷水に注ぎ、ＡｃＯＥｔで抽出した。有機層を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させて乾燥し、クロマトグラフィー［ＣＨ２Ｃｌ２／ＥｔＯＨ  ９８：２］に付して、副成分として２−トリチル異性体を含んで、標題化合物（３．７２ｇ）を橙色油として得た。
質量分析、Ｃ４０Ｈ３１Ｎ５Ｏ２として計算して：（Ｍ＋１）＋：６１４．２５５６。実測値（Ｈ．Ｒ．Ｍ．Ｓ）：６１４．２５３６
【００５７】
中間体Ｆ：
４−［４−（３−ピリジン−２−イル−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−安息香酸
ＭｅＯＨ（２５０ｍＬ）中の４−［４−（３−ピリジン−２−イル−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−安息香酸メチルエステル（３．７２ｇ）の溶液に、１ＮのＮａＯＨ溶液（１２．２ｍｌ、２当量）を加えた。混合物を一晩還流温度で撹拌し、ついで、溶媒を蒸発させた。残渣を１ＮのＮＨ４Ｃｌ溶液で処理し、ＡｃＯＥｔで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させて乾燥した。得られた粉末を、熱ＭｅＯＨで洗浄し、副成分として２−トリチル異性体を含む標題化合物（２．８８ｇ）を橙色粉末として得た。
質量分析、Ｃ３９Ｈ２９Ｎ５Ｏ２として計算して、（Ｍ＋１）＋：６００．２４００。実測値（Ｈ．Ｒ．Ｍ．Ｓ）：６００．２３７９
【００５８】
中間体Ｇ：
４−［４−（３−ピリジン−２−イル−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−フェノール
トルエン（１００ｍｌ）中の２−ブロモ−４−（３−ピリジン−２−イル−１−トリチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）ピリジン（４．８ｇ）の懸濁液に、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（１６５ｍｇ、２ｍｏｌ％）、バイナップ（２２２ｍｇ、４ｍｏｌ％）、４−ベンジルオキシ−フェニルアミン塩酸塩（３ｇ、１．４当量）およびナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２．４ｇ、２．８当量）を加えた。反応混合物を８０℃で一晩撹拌した。混合物を氷水に注ぎ、トルエンで抽出した。有機層を飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させて乾燥した。得られた固体を、ＥｔＯＨから再結晶して、副成分として２−トリチル異性体を含む、標題化合物（５．７ｇ、９７％）を得た。
２つの異性体の混合物（５．７ｇ）をＥｔＯＨ／ＴＨＦ（２５０ｍｌ）中に溶解し、Ｐｄ／Ｃ  １０％（５００ｍｇ）を加えた。反応物を、大気圧の水素雰囲気下、４０℃で一晩撹拌した。混合物をセライトを通して濾過した。濾液を減圧下で蒸発させて、ｉＰｒ２Ｏ（４．８ｇ、９７％）中で沈殿させて、標題化合物および２−トリチル異性体を、褐色固体として得た。
融点：１９８℃
【００５９】
実施例
実施例１：
（４−クロロ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン
トルエン（６０ｍｌ）中の中間体Ｄ１（３．１５ｇ）の懸濁液に、Ｐｄ２（ｄｂａ）３（１０６ｍｇ、０．０２ｍｏｌ％）、バイナップ（１４４ｍｇ、０．０４ｍｏｌ％）、４−クロロアニリン（８９０ｍｇ、１．２当量）およびナトリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（７８０ｍｇ、１．４当量）を加えた。反応混合物を、一晩９０℃で撹拌した。混合物をジチオカルバミン酸ジエチル、ナトリウム塩三水和物（１Ｍ）で洗浄し、トルエンで抽出した。有機層を水で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させて、乾燥し、クロマトグラフィー［ＣＨ２Ｃｌ２ついでＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ９９：１］に付して、２．８ｇ（白色固体）の副成分として１−トリチル異性体＋２−トリチル異性体を得た。
２つの異性体の混合物をＨＣｌ（１Ｎ）／ＭｅＯＨ（２／３、１００ｍｌ）で処理し、１８時間加熱還流した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣を水に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。水層をＮａＯＨ（１Ｎ、５０ｍｌ）で塩基性化し、酢酸エチルで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させて乾燥した。得られた固体をｉＰｒＯＨから再結晶して、標題化合物（７４５ｍｇ）を灰白色固体として得た。
融点：２１６℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３４８（ＭＨ＋）
【００６０】
実施例２：
フェニル−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン
実施例１と同様の方法でアニリン（１２３ｍｇ）を用いて、ｉＰｒＯＨから再結晶した後、標題化合物を白色結晶（２１０ｍｇ）として得た。
融点：２３０℃
ＧＣ−ＭＳ．３１２
【００６１】
実施例３：
（４−フルオロ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン
実施例１と同様の方法で４−フルオロアニリン（４４４ｍｇ）を用いて、ｉＰｒＯＨから再結晶した後、標題化合物を白色結晶（３８０ｍｇ）として得た。
融点：２００℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３３２（ＭＨ＋）
【００６２】
実施例４：
フラン−２−イルメチル−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン
実施例１と同様の方法でフルフリルアミン（３８８ｍｇ）を用いて、ＥｔＯＨから再結晶した後、標題化合物を白色結晶（７０ｍｇ）として得た。
融点：２００℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３１８（ＭＨ＋）
【００６３】
実施例５：
（３−メタンスルホニル−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン
実施例１と同様の方法で３−メチルスルホニルアニリン、塩酸塩（５００ｍｇ）を用いて、ｉＰｒＯＨ／ｉＰｒ２Ｏから再結晶した後、標題化合物を白色固体（２００ｍｇ、２７．６％）として得た。
融点：１４６℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３９２（ＭＨ＋）
【００６４】
実施例６：
３−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル−アミノ］−ベンゾニトリル
実施例１と同様の方法で３−アミノ−ベンゾニトリル（４８０ｍｇ）を用いて、ｉＰｒＯＨから再結晶した後に、標題化合物を白色結晶（５１５ｍｇ、４２％）として得た。
融点：２２８℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３３９（ＭＨ＋）
【００６５】
実施例７：
２−メトキシ−４−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル−アミノ］−ベンゾニトリル
実施例１と同様の方法で、４−アミノ−２−メトキシ−ベンゾニトリル（５１８ｍｇ）を用いて、ＭｅＯＨから再結晶して、標題化合物を黄色結晶（２６０ｍｇ）として得た。
融点：２８０℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３６９（ＭＨ＋）
【００６６】
実施例８：
［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−［３−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−アミン
実施例１と同様の方法で３−（２−ピペリジノエトキシ）アニリン（１ｇ）を用いて、ｉＰｒＯＨから再結晶して、標題化合物を白色粉末（２３３ｍｇ、１６％）として得た。
融点：１１５℃
ＭＳ  ｍ／ｚ４４１（ＭＨ＋）
【００６７】
実施例９
［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−［３−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−アミン
実施例１と同様の方法で３−（２−ピロリジノエトキシ）アニリン（１８．７ｇ）を用いて、標題化合物を灰白色粉末（１４．６５ｇ、４９％）として得た。
融点：１４１℃
ＭＳ  ｍ／ｚ４２７（ＭＨ＋）
【００６８】
実施例１０：
（３−クロロ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン
実施例１と同様の方法で３−クロロアニリン（８００ｍｇ）を用いて、標題化合物を淡桃色固体（４３０ｍｇ、４９％）として得た。
融点：２０５℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３４８（ＭＨ＋）
【００６９】
実施例１１：
［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−ｍ−トリル−アミン
実施例１と同様の方法でｍ−トリルアミン（４１７ｍｇ）を用いて、ｉＰｒＯＨから再結晶した後、標題化合物を白色粉末（５５０ｍｇ、５６％）として得た。
融点：１９４℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３２８（ＭＨ＋）
【００７０】
実施例１２：
［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−［４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−アミン
実施例１と同様の方法で４−（２−ピロリジン−１−イル−エトキシ）−フェニルアミン（５００ｍｇ）を用いて、ＭｅＯＨから再結晶した後、標題化合物を白色結晶（３１０ｍｇ、４８％）として得た。
融点：２２４℃
ＭＳ  ｍ／ｚ４２７（ＭＨ＋）
【００７１】
実施例１３：
（３、４−ジメトキシ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン
実施例１と同様の方法で３、４−ジメトキシ−フェニルアミン（６４２ｍｇ）を用いて、ｉＰｒＯＨから再結晶した後、標題化合物を白色結晶（４８０ｍｇ、４０．３％）として得た。
融点：２１０℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３７４（ＭＨ＋）
【００７２】
実施例１４：
（４−クロロ−３−メチル−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン
実施例１と同様の方法で４−クロロ−３−メチル−フェニルアミン（５００ｍｇ）を用いて、ｉＰｒＯＨから再結晶した後、標題化合物を白色結晶（４７０ｍｇ、５２％）として得た。
融点：２１２℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３６３（ＭＨ＋）
【００７３】
実施例１５：
２−クロロ−５−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−ベンゾニトリル
実施例１と同様の方法で５−アミノ−２−クロロ−ベンゾニトリル（５３２ｍｇ）を用いて、ＭｅＯＨから再結晶した後、標題化合物を白色結晶（７００ｍｇ、７５．２％）として得た。
融点：２５０℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３７４（ＭＨ＋）
【００７４】
実施例１６：
４−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−フェノール
中間体Ｇ（４００ｍｇ）をＨＣｌ（１Ｎ）／ＭｅＯＨ（２／３、２５ｍｌ）で処理し、一晩加熱還流した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣を水に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。水層をＮａＨＣＯ３でｐＨ＞１０まで塩基性化して、沈殿を濾過し、水で洗浄した。得られた固体をＭｅＯＨから再結晶して、標題化合物（１６０ｍｇ、６９％）を白色結晶として得た。
融点：２６８℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３２８（Ｍ−１）
【００７５】
実施例１７：
（４−メトキシ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン
実施例１と同様の方法で４−メトキシフェニルアミン（８６．２ｍｇ）を用いて、ＥｔＯＨから再結晶した後、標題化合物（４０ｍｇ、２０％）を無色の結晶として得た。
融点：２１９℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３４４（ＭＨ＋）
【００７６】
実施例１８：
［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−ｐ−トリル−アミン
実施例１と同様の方法でｐ−トリルアミン（１４８ｍｇ）を用いて、クロマトグラフィー［ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ９５：５］に付した後、標題化合物（９０ｍｇ、３０％）を無色の結晶として得た。
融点：２２１℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３２８（ＭＨ＋）
【００７７】
実施例１９：
［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−（３−トリフルオロメトキシ−フェニル）−アミン
実施例１と同様の方法で３−トリフルオロメトキシ−フェニルアミン（４２４ｍｇ）を用いて、ＣＨ２Ｃｌ２から再結晶して、標題化合物（１８０ｍｇ、２４．６％）を白色固体として得た。
融点：１０２．８℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３９８（ＭＨ＋）
【００７８】
実施例２０：
（３、４−ジメチル−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン
実施例１と同様の方法で３、４−ジメチル−フェニルアミン（５９８．１１ｍｇ）を用いて、ＭｅＯＨから再結晶した後、標題化合物（３１０ｍｇ、２５．８％）を白色固体として得た。
融点：２２０℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３４２（ＭＨ＋）
【００７９】
実施例２１：
［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−アミン
実施例１と同様の方法で４−（トリフルオロメチル）アニリン（９０μｌ、１．２当量）を用いて、標題化合物（６０ｍｇ、２７％）を黄色粉末として得た。
融点：２０７℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３８２（ＭＨ＋）
【００８０】
実施例２２：
（３−イソプロポキシ−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン
実施例１と同様の方法で３−イソプロポキシ−フェニルアミン（２９０ｍｇ、１．３当量）を用いて、クロマトグラフィー［ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ９０：１０］に付した後、標題化合物を黄色粉末（３０ｍｇ、１２％）として得た。
融点：２１８℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３７２（ＭＨ＋）
【００８１】
実施例２３：
（４−メタンスルホニル−フェニル）−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン
実施例１と同様の方法で４−メタンスルホニル−フェニルアミン（４１６ｍｇ、１．２当量）を用いて、ｉＰｒＯＨから再結晶した後、標題化合物を黄色粉末（２０７ｍｇ、２６％）として得た。
融点：１３４℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３９２（ＭＨ＋）
【００８２】
実施例２４：
２−メトキシ−４−｛４−［３−（６−メチル−ピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−ピリジン−２−イルアミノ｝−ベンゾニトリル
実施例１と同様の方法で中間体Ｄ２（３．１９ｇ）および４−アミノ−２−メトキシ−ベンゾニトリル（１．２ｇ）を用いて、標題化合物（１．３ｇ、５９．４％）を灰白色固体として得た。
融点：１２５℃
ＭＳ  ｍ／ｚ３８３（ＭＨ＋）
【００８３】
実施例２５：モルホリン−４−イル−｛４−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−フェニル｝メタノン
ＤＭＦ中の中間体Ｆ（１ｇ）の溶液を、ＨＯＢＴ（２９３ｍｇ、１．３当量）、ＥＤＣＩ（４０１ｍｇ、１．３当量）、ＤＩＥＡ（３６５μＬ、１．３当量）およびモルホリン（１８５μＬ、１．３当量）で処理した。得られた混合物を４８時間室温で撹拌した。溶媒を蒸発させて、残渣を水で洗浄し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発させて標題化合物（１．１ｇ）を副成分として２−トリチル異性体を含む無色油として得た（ＭＳ  ｍ／ｚ  ６６９（ＭＨ＋）。２つの異性体の混合物（１．１ｇ）をＨＣｌ（１Ｎ）／ＭｅＯＨ（２／３、１００ｍｌ）で処理し、一晩加熱還流した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣を１ＮのＮａＯＨ溶液中に注ぎ、酢酸エチルで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させて乾燥した。得られた生成物をクロマトグラフィー［ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ９５：５］に付して、ｉＰｒ２Ｏから再結晶して、標題化合物（１１６ｍｇ、１６％）を灰白色粉末として得た。
融点：２４０℃
質量分析、Ｃ２４Ｈ２２Ｎ６Ｏ２として計算値：（Ｍ＋１）＋：４２７．１８８２。実測値（Ｈ．Ｒ．Ｍ．Ｓ）：４２７．１８９２
【００８４】
実施例２６：（４−メチル−ピペラジン−１−イル）−｛４−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イルアミノ］−フェニル｝−メタノン
実施例２５と同様の方法で、中間体Ｆ（４２０ｍｇ）およびＮ−メチル−ピペラジン（１００ｍｇ、１．４当量）を用いて、ＡｃＯＥｔから再結晶した後、標題化合物を白色結晶（９４ｍｇ、３０．６％）として得た。
融点：２００℃
ＭＳ  ｍ／ｚ４４０（ＭＨ＋）
【００８５】
実施例２７：
［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）−フェニル］−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン
アセトン（３０ｍＬ）中の中間体Ｇ（４００ｍｇ）の溶液に、Ｃｓ２ＣＯ３（１．１７ｇ、５．１４当量）および１−（２−クロロエチル）−ピペリジン塩酸塩（１４７ｍｇ、１．１４当量）を加えた。混合物を還流温度で４８時間撹拌し、濾過した。濾液を蒸発させ、残渣をＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、水で洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させて乾燥した。１−トリチルおよび２−トリチル異性体の混合物をＨＣｌ（１Ｎ）／ＭｅＯＨ（２／３、３０ｍｌ）で処理し、一晩加熱還流した。溶媒を減圧下で除去し、得られた残渣を水に注ぎ、ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。水層をｐＨ１４にＮａＯＨ（１Ｎ）で塩基性化し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、蒸発させて乾燥した。得られた固体をｉＰｒＯＨから再結晶して、標題化合物（１５０ｍｇ、４８．７％）を白色結晶として得た。
融点：１７６℃
ＭＳ  ｍ／ｚ４４１（ＭＨ＋）
【００８６】
実施例２８：
［３−（１−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イルメトキシ）−フェニル］−［４−（３−ピリジン−２−イル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−ピリジン−２−イル］−アミン
実施例２７と同様の方法で２−クロロメチル−１−メチル−１Ｈ−イミダゾール（１９０ｍｇ）を用いて、クロマトグラフィー［ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ９５：５ついでＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ  ９０：１０］に付して、標題化合物（８０ｍｇ、２１．７％）を灰白色固体として得た。
融点：１２０℃
ＭＳ  ｍ／ｚ４２４（ＭＨ＋）
【００８７】
アッセイ
アッセイ１
ＴＧＦ−βシグナリングを阻害するための本発明の化合物の可能性は、例えば、以下のインビトロアッセイを用いて示すことができる。
アッセイは、ルシフェラーゼ（ホタル）受容体遺伝子に結合したＰＡＩ−１プロモーター（強力なＴＧＦ−β応答プロモーター）で安定にトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞において行った。化合物をＴＧＦ−βに曝した細胞におけるルシフェラーゼ活性を阻害する能力で選択した。加えて、ＴＧＦ−β応答プロモーターにより操作されず、毒性対照として用いられる第２のルシフェラーゼ（レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ））遺伝子で細胞をトランスフェクトした。
（９６ウェル）マイクロプレートを、マルチドロップ装置を用いて、２００μｌの血清含有培地中、ウェルあたり３５０００細胞の濃度で、安定なトランスフェクト細胞系で播種する。これらのプレートを細胞インキュベータ中に置く。
１８〜２４時間後（２日目）、細胞インキュベーション処理を開始する。細胞をＴＧＦ−βおよび５０ｎＭ〜１０μＭ（１％のＤＭＳＯの最終濃度）の範囲の濃度で、候補化合物と一緒にインキュベートする。試験に用いたＴＧＦ−β（ｒｈＴＧＦβ−１）の最終濃度は１ｎｇ／ｍＬである。細胞を、ＴＧＦ−βを添加する１５〜３０分前に候補化合物と共にインキュベートする。試験反応の最終値は１５０μｌである。各々のウェルは１つだけの候補化合物を含み、そのＰＡＩ−１プロモーターに対する効果を測定する。
カラム１１および１２は対照として用いる。カラム１１は８ウェルを含み、細胞をＴＧＦ−βの存在下、候補化合物無しでインキュベートする。カラム１１を、（阻害活性を定量するための）試験ウェルで測定した値と比較できる、「参考ＴＧＦ−β誘発ホタルルシフェラーゼ値」を測定するために用いる。ウェルＡ１２〜Ｄ１２において、細胞をＴＧＦ−β不含培地で増殖させる。これらの状況で得られたホタルルシフェラーゼ値は、「基礎ホタルルシフェラーゼ活性」の代表的なものである。ウェルＥ１２〜Ｈ１２において、細胞を、ＴＧＦ−βおよび５００μＭのＣＰＯ（シクロペンテノン、Ｓｉｇｍａ）、細胞毒性化合物の存在下でインキュベートする。減少したホタルおよびレニラルシフェラーゼ活性（カラム１１において得られたものの約５０％）により、毒性を明らかにする。
１２〜１８時間後（３日目)、ルシフェラーゼ定量化処理を開始する。以下の反応をDual Luciferaseアッセイキット（Promega）から得た試薬を用いて行う。細胞を洗浄し、10μｌの受動溶解緩衝液（passive lysis buffer）（Promega）で溶解させる。撹拌（１５〜３０分）に続いて、プレートのルシフェラーゼ活性を、デュアルインジェクター照度計（BMG lumistar）で読み取る。このために、５０μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬および５０μｌの「Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ」緩衝液を、順次、両方のルシフェラーゼの活性を定量するために注入する。測定で得られたデータを、適当なソフトウェアを用いて、処理し、分析する。ウェルＡ１１〜Ｈ１１（カラム１１、ＴＧＦ−β 単独）で得られた平均ルシフェラーゼ活性値を１００％とみなし、ウェルＡ１２〜Ｄ１２（培地のみ中の細胞）で得られた値を基底レベル（０％）とする。試験した各々の化合物に関して、濃度応答曲線を、図解して測定できるＩＣ５０値で構成する。
【００８８】
アッセイ２
キナーゼＡｌｋ５受容体を阻害するための本発明の化合物の可能性は、例えば、以下のインビトロアッセイを用いて示すことができる。
Ａｌｋ５のキナーゼドメインを、バキュロウイルス／Ｓｆ９細胞系において、クローン化し、発現させた。蛋白（アミノ酸１６２〜５０３）を、Ｃ末端で６−Ｈｉｓタグ化した。Ｎｉ２＋カラムを用いて、アフィニティークロマトグラフィーにより精製した後、自己リン酸化を試験した。酵素を５０ｍＭ、ｐＨ７．４のトリス；１００ｍＭのＮａＣｌ；５ｍＭのＭｇＣｌ２；５ｍＭのＭｎＣｌ２；１０ｍＭのＤＴＴを含有する培地中でインキュベートした。酵素を化合物（試験において最終的に０．１％のＤＭＳＯ）で、３７℃で１０分間プレインキュベートした。反応を３μＭのＡＴＰ（０．５μＣｉガンマ−３３Ｐ−ＡＴＰ）を添加することにより開始させた。３７℃で１５分後、反応をＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．９、２．５％のグリセロール、１％のＳＤＳ、５％のβ−メルカプトエタノール）を添加することにより停止させた。試料を５分間９５℃で煮沸し、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動を行った。乾燥ゲルを、一晩、リン酸スクリーンに曝露した。Ａｌｋ５自動リン酸化をＳＴＯＲＭ（Molecular Dynamics）を用いて定量した。
【００８９】
生物学的データ
実施例１〜２８の化合物を、インビトロで、上記した生物学的アッセイを用いて試験した。全ての化合物は、アッセイ１において５μＭまたはそれ以下のＩＣ５０値およびアッセイ２において１μＭまたはそれ以下のＩＣ５０値を有した。
【国際公開パンフレット】
2004521901.tif 000012
2004521901.tif 000013
2004521901.tif 000014
2004521901.tif 000015
2004521901.tif 000016
2004521901.tif 000017
2004521901.tif 000018
2004521901.tif 000019
2004521901.tif 000020
2004521901.tif 000021
2004521901.tif 000022
2004521901.tif 000023
2004521901.tif 000024
2004521901.tif 000025
2004521901.tif 000026
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2004521901.tif 000028
2004521901.tif 000029
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2004521901.tif 000047
2004521901.tif 000048
【国際調査報告】
2004521901.tif 000049
2004521901.tif 000050