(57)【要約】ヒト細胞に由来するまたはヒト細胞を含む、癌細胞を含む被験試料が、腫瘍の発生、腫瘍の進行または転移の能力を有するか否かを決定するためのプロセスであって、被験試料、および同じ個体または同じ種の異なる個体から入手した非腫瘍細胞に由来する第２の試料を、各試料のそれぞれを配列番号：１の核酸プローブとともにインキュベートすること、および各試料のそれぞれと前記プローブとのハイブリダイゼーションの概算量を決定すること、ならびに被験試料が含む特定の核酸または核酸の混合物の量が前記第２の試料よりも多いか否かを判定するために、被験試料のハイブリダイゼーションの概算量を前記第２の試料のハイブリダイゼーションの概算量と比較することによって分析するプロセス。
2004500852.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの特定の核酸もしくは核酸の混合物の有無を検出するため、または試料における２つの異なる配列を識別するためのプロセスであって、試料が該１つまたは複数の配列を含むことが疑われ、
（ａ）該試料を、以下のものからなる群から選択される核酸プローブとともに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でインキュベートするステップ：
（ｉ）配列番号：１の核酸配列、
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列に対して相補的な核酸配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、および
（ｉｖ）（ｉｉ）の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、ならびに
（ｂ）該ハイブリダイゼーションが生じたか否かを決定するステップ
を順に含むプロセス
【請求項２】
ステップ（ａ）のハイブリダイゼーション条件が、６．０×ＳＳＣ中、約４５℃でのハイブリダイゼーションに続いて、約５０℃〜約６５℃の温度で約２．０×ＳＳＣ〜約０．２×ＳＳＣにより洗浄することを含む、請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
核酸プローブが標識されている、請求項１または２記載のプロセス。
【請求項４】
核酸プローブが担体と結合しており、ステップ（ｂ）が何らかの抗体結合物が存在するか否かを決定することを含み、ステップがステップ（ａ）の後およびステップ（ｂ）の前に、
ステップ（ａ）の結果として生じたものを洗浄するステップ、
洗浄ステップの結果として生じたものを、核酸プローブに対する標識抗体とともにインキュベートするステップ、および
インキュベーションのステップの結果として生じたものを洗浄するステップ
をさらに含む、請求項１〜３に記載のプロセス。
【請求項５】
ステップ（ａ）の前に、検出しようとする核酸を増幅するステップをさらに含む、請求項１〜４に記載のプロセス。
【請求項６】
ヒト細胞に由来するまたはヒト細胞を含む、癌細胞を含む被験試料が、腫瘍の発生、腫瘍の進行または転移の能力を有するか否かを決定するためのプロセスであって、被験試料、および同じ個体または同じ種の異なる個体から入手した非腫瘍細胞に由来する第２の試料を、
（ａ）各試料のそれぞれを、以下のものからなる群から選択される核酸プローブとともに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でインキュベートすること：
（ｉ）配列番号：１の核酸配列、
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列に対して相補的な核酸配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、および
（ｉｖ）（ｉｉ）の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、ならびに
（ｂ）各試料のそれぞれと該プローブとのハイブリダイゼーションの概算量（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ ａｍｏｕｎｔ）を決定するステップ、ならびに
（ｃ）被験試料が含む特定の核酸または核酸の混合物の量が該第２の試料よりも多いか否かを判定するために、被験試料のハイブリダイゼーションの概算量を該第２の試料のハイブリダイゼーションの概算量と比較すること
によって分析するプロセス。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発癌、腫瘍の進行および転移は、転写プログラムの不均衡、不適切な翻訳後修飾、および後成的修飾（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の調節不全によって起こる（Ｓｃｈｗｉｒｚｋｅ， Ｍ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９（１９９９）１８０１〜１８１４；Ｐａｒｄｅｅ， Ａ．Ｂ．、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６５（１９９４）２１３〜２２７；Ｐｏｎｔａ， Ｈ．、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １１９８（１９９４）１〜１０）。転写プログラムの変化は、癌遺伝子および癌抑制遺伝子、細胞遺伝学的変化によって生じた融合蛋白質、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによる予定外のメチル化ならびにヒストンアセチルトランスフェラーゼおよびヒストンデアセチラーゼなどのクロマチン修飾酵素による遺伝子の発現の変化に起因する（Ｌｉｎ， Ｒ．Ｊ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ １５（１９９９）１７９〜１８４；Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇ， Ｈ．Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４２３（１９９９）Ｆ１５〜Ｆ３３）。
【０００２】
腫瘍と関連のある候補遺伝子の同定のためには、転移性細胞株と非転移性細胞株との比較、異なる進行ステージに対応する腫瘍標本などの細胞システムの発現プロファイリングを行うことが、この目標を達成するための最初のステップである（Ｓｃｈｉｅｍａｎｎ， Ｓ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７（１９９７）１３〜２０；Ｓｃｈｗｉｒｚｋｅ， Ｍ．ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １８（１９９８）１４０９〜１４２２；Ｓｃｈｉｅｍａｎｎ， Ｓ．ら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｓ １６（１９９８）１２９〜１３９）。それ以降のステップには、種々の腫瘍における同定された変化の頻度の分析、安定したトランスフェクタントにおけるアンチセンスＲＮＡまたはリボザイムを用いた過剰発現およびダウンレギュレーションによる検討中の遺伝子のインビトロ調節、ならびに関連したインビトロ系における結果の評価が含まれる。調査中の腫瘍の本来の向性が維持される、皮下異種移植系および同所移植を含むヌードマウス系の登場により、候補遺伝子のインビボでの機能的役割を評価する道が開かれた（Ｆｉｄｌｅｒ， Ｉ．Ｊ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ ５０（１９８６）２９〜４９）。
【０００３】
重要な染色体座位におけるヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）は、癌の発症リスクの増加と相関している。このような重要な座位にあるＬＯＨは、癌発症の可能性を早期に判定するため、ならびに化学予防薬および化学療法薬の有効性を評価するための有用なマーカとして用いられる可能性がある。染色体６ｑに位置する遺伝子は極めて多型性が高く、天然のヘテロ接合性遺伝子システムとなる。染色体６ｑにＬＯＨが存在すると、以下のような腫瘍が発症する確率が高いことが示されている：悪性黒色腫（Ｈｅａｌｙ， Ｅ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６（１９９８）２２１３〜２２１８；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｇ．Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６（１９９６）１６３５〜１６４１；Ｒａｙ， Ｍ．Ｅ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １２（１９９６）２５２７〜２５３３；Ｍｉｌｌｉｋｉｎ， Ｄ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１（１９９１）５４４９〜５４５３）、膵癌（Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｃ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５（１９９５）２３９４〜２３９９；子宮頸癌（Ｈｕｅｔｔｎｅｒ， Ｐ．Ｃ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｌ ２９（１９９８）３６４〜３７０）；前立腺癌（Ｓｒｉｋａｎｔａｎ， Ｖ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８４（１９９９）３３１〜３３５；ＭａｃＧｒｏｇａｎ， Ｄ．およびＢｏｏｋｓｔｅｉｎ， Ｒ．、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８（１９９７）１１〜１９；Ｖｅｒｍａ， Ｒ．Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １７（１９９９）４４１〜４４７）および乳癌（Ｂｉｌａｎｇｅｓ， Ｂ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８（１９９９）３９７９〜３９８８；Ｃｈａｐｐｅｌｌ， Ｓ．Ａ．ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ 癌 ７５（１９９７）１３２４〜１３２９；Ｄｅｖｉｌｅｅ， Ｐ．，ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６（１９９１）１７０５〜１７１１；Ｎｏｖｉｅｌｌｏ， Ｃ．ら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２（１９９６）１６０１〜１６０６；Ｆｕｊｉｉ， Ｈ．，ら、Ｇｅｎｅｓ， Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ＆ Ｃａｎｃｅｒ １６（１９９６）３５〜３９）。
【０００４】
発明の概要
本発明は、少なくとも１つの特定の核酸もしくは核酸の混合物の有無を検出するため、または試料における２つの異なる配列を識別するためのプロセスであって、試料が前記の１つまたは複数の配列を含むことが疑われ、
（ａ）前記試料を、以下のものからなる群から選択される核酸とともに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でインキュベートするステップ：
（ｉ）配列番号：１の核酸配列；
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列に対して相補的な核酸配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；および
（ｉｖ）（ｉｉ）の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；ならびに
（ｂ）前記ハイブリダイゼーションが生じたか否かを決定するステップ
を順に含むプロセスを提供する。
【０００５】
さらに、本発明は、ヒト細胞に由来するまたはヒト細胞を含む被験試料、好ましくは上皮細胞に由来するまたは上皮細胞を含む被験試料が、前記細胞の腫瘍の発生、進行または転移の能力を有するか否かを決定するためのプロセスであって、被験試料、および同じ個体または同じ種の異なる個体からの非腫瘍細胞に由来する第２の試料を、
（ａ）それぞれの試料を、以下のものからなる群から選択される核酸プローブとともに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でインキュベートすること：
（ｉ）配列番号：１の核酸配列；
（ｉｉ）（ｉ）の核酸配列に対して相補的な核酸配列；
（ｉｉｉ）（ｉ）の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；および
（ｉｖ）（ｉｉ）の配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；ならびに
（ｂ）各々のそれぞれの試料と前記プローブとのハイブリダイゼーションの概算量（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅ ａｍｏｕｎｔ）を決定するステップ、ならびに
（ｃ）被験試料が含む特定の核酸または核酸の混合物の量が前記第２の試料よりも多いか否かを判定するために、被験試料のハイブリダイゼーションの概算量を前記第２の試料のハイブリダイゼーションの概算量と比較すること
によって分析するプロセスを提供する。
【０００６】
発明の詳細な説明
本発明は、特に癌の分野における、診断学のためのＴＨＷ遺伝子の使用を提供する。特に本発明は、哺乳動物、特に悪性腫瘍細胞における前記遺伝子ＴＨＷの発現の同定およびその量の測定を含む。本発明は、腫瘍細胞の転移能および進展能の診断にも関する。
【０００７】
ＴＨＷ核酸は、腫瘍細胞において発現がダウンレギュレートされており、腫瘍の進行および／または転移を抑制することができるが、これは特に悪性黒色腫および乳癌細胞においてそうである。
【０００８】
ＴＨＷと命名した癌抑制遺伝子は染色体６ｑに位置し、その喪失または阻害は腫瘍の能力と相関している。また、癌でない対応物と比べて癌細胞においてダウンレギュレートされている、ＴＨＷと命名した蛋白質も提供する。ＴＨＷは腫瘍抑制、特に転移の抑制に関与している可能性がある。ＴＨＷ遺伝子は配列番号：２のポリペプチドをコードする。
【０００９】
ＴＨＷ蛋白質をコードする核酸は腫瘍細胞においてダウンレギュレートされており、以下のものからなる群から選択することができる：
（ａ）配列番号：１；
（ｂ）（ａ）の相補配列を有する核酸プローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、
（ｃ）遺伝暗号の縮重のために、（ａ）または（ｂ）の配列の配列ではないものの（ａ）または（ｂ）の配列によってコードされるポリペプチドと厳密に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列；および
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の配列のいずれかの断片である核酸配列。
【００１０】
ＴＨＷポリペプチドは、以下のものからなる群から選択される核酸によってコードされる：
（ａ）配列番号：１；
（ｂ）（ａ）の相補配列を有する核酸プローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列のいずれかの断片である核酸。
【００１１】
好ましくは、ＴＨＷポリペプチドは配列番号：２の配列を有する。
【００１２】
単離されたＴＨＷポリペプチド、およびそれ故に、それをコードする核酸は、個体ごとに異なる天然の対立遺伝子変異（ａｌｌｅｌｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ）として存在しうる。アミノ酸のこのような変異は通常、アミノ酸の置換である。しかし、それらは全配列に対するアミノ酸の欠失、挿入または付加であってもよい。本発明によるＴＨＷ蛋白質は、その程度および種類の両方の点で、それが発現される細胞および細胞種に依存し、すなわちそれはグリコシル化型または非グリコシル化型でありうる。癌抑制活性を有するポリペプチドは、ＴＨＷに関する発現ベクターを用いたＴＨＷ陰性腫瘍細胞のトランスフェクション、安定的なトランスフェクタントの樹立、およびヌードマウスへの異種移植によるその殺腫瘍能力の評価によって同定可能である。このような評価は例えば、ボラスキ（Ｂｏｒａｓｃｈｉ， Ｄ．）ら、Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４５（１９７９）１８８〜１９４およびボラスキ（Ｂｏｒａｓｃｈｉ， Ｄ．）ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３１（１９８３）１７０７〜１７１３に従って行うことができる。
【００１３】
「ＴＨＷ活性を有するポリペプチドまたはＴＨＷ」は、わずかなアミノ酸の変化を伴うものの、実質的に同じＴＨＷ活性を有する蛋白質のことも意味する。実質的に同じとは、活性が同じ生物特性であって、ポリペプチドがアミノ酸配列に関して少なくとも９０％の同一性を示すことを意味する。
【００１４】
「核酸分子または核酸」という用語は、ポリヌクレオチド分子のことを意味し、これは例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは誘導体化された活性ＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。しかし、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分子が好ましい。
【００１５】
「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、２つの核酸断片が、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡに記載された標準的なハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイゼーションを生じうることを意味する。より詳細には、本明細書で用いる「ストリンジェントな条件下」とは、６．０×ＳＳＣ中、約４５℃でのハイブリダイゼーションに続いて洗浄を行うことを指す。この洗浄は２．０×ＳＳＣ中、５０℃で行うことができる。ハイブリダイゼーションは、サケ精子ＤＮＡを含まない非粘性液体である、クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）社から販売されているＥｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂ（登録商標）ハイブリダイゼーション溶液を用いて行うことが好ましい。洗浄ステップにおける塩濃度のストリンジェンシーは、例えば、低ストリンジェンシー用の約２．０×ＳＳＣ、５０℃から、高ストリンジェンシー用の約０．２×ＳＳＣ、５０℃までの範囲で選択することができる。さらに、洗浄ステップにおける温度は、低ストリンジェンシー条件の室温、約２２℃から、高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで高めることができる。
【００１６】
本明細書の全体を通じて用いる「核酸またはポリペプチド」という語句は、組換えＤＮＡ技術によって生産された場合には細胞材料または培地を実質的に含まない、化学合成された場合には前駆化学物質または他の化学物質を実質的に含まない、ＴＨＷ活性を有する核酸またはポリペプチドのことを指す。このような核酸は、その核酸の由来である生物体においてその核酸と通常は隣接している配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まないことが好ましい。
【００１７】
ＴＨＷは、組換え体の生産後に、免疫沈降、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、等電点フォーカシング、選択的沈降、電気泳動などを含む、既知の蛋白質精製法を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
【００１８】
本発明によるポリペプチドは、組換え手段または合成によって生産することができる。非グリコシル化型のＴＨＷポリペプチドは、それを原核生物において組換え的に産生させた場合に得られる。本発明によって提供される核酸配列を用いることにより、任意の望ましい細胞（例えば、ヒト細胞以外に、他の哺乳動物の細胞も）のゲノムにおけるＴＨＷ遺伝子またはそのバリアントを検索して、これらを同定することおよびＴＨＷ蛋白質をコードする望ましい遺伝子を単離することが可能になる。このようなプロセスおよび適したハイブリダイゼーション条件は当業者に知られており、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（１９８９）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ、およびハーメス（Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．）、ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｓ．Ｇ．）、核酸ハイブリダイゼーション−実践的アプローチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ）（１９８５）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄに記載されている。この場合、これらの刊行物中の標準的なプロトコールは通常、実験のために用いられる。
【００１９】
ＴＨＷ蛋白質をコードするこのような核酸を用いることにより、本発明による蛋白質を再現性のある様式で大量に得ることが可能となる。原核宿主細胞または真核宿主細胞などの原核生物または真核生物における発現のためには、当業者によく知られた方法に従って、核酸を適した発現ベクターに組み込む。このような発現ベクターは、調節可能／誘導可能なプロモーターを含むことが好ましい。続いて、これらの組換えベクターを適した宿主細胞、例えば、原核宿主細胞としての大腸菌、または真核宿主細胞としてのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、奇形癌腫細胞株ＰＡ−１ ｓｃ ９１１７（Ｂｕｔｔｎｅｒ， Ｒ．ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１（１９９１）３５７３〜３５８３）、昆虫細胞、ＣＨＯもしくはＣＯＳ細胞に導入し、形質転換または形質転換がなされた宿主細胞を異種遺伝子の発現を許容する条件下で培養する。蛋白質の単離は、既知の方法に従って、宿主細胞または宿主細胞の培養上清から行うことができる。このような方法は、例えば、アウスユーベル（Ａｕｓｕｂｅｌ Ｉ．）、フレデリック（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｍ．）、分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．）（１９９２）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されている。細胞培養物中に可溶型として認められない場合には、蛋白質のインビトロ再活性化も必要と思われる。
【００２０】
本発明はさらに、ＴＨＷの発現のために適した組換え発現ベクター、このような発現ベクターによってトランフェクトされた組換え宿主細胞、さらにはＴＨＷ遺伝子によってコードされる蛋白質の組換え生産のためのプロセスを含む。
【００２１】
本発明はさらに、遺伝子ＴＨＷの核酸分子を検出するための方法であって、ＴＨＷ遺伝子である核酸分子の存在を決定するために、試料（例えば、血液などの体液、細胞可溶化物、または試料ＲＮＡの逆転写によって生じたＤＮＡ）を本発明による単離された核酸分子とともにインキュベートすること、および前記単離された核酸分子と標的核酸分子とのストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションを評価することを含み、このため、腫瘍細胞の転移の可能性および／または進行を同定するための方法であるような方法を提供する。
【００２２】
癌細胞を含む被験試料が腫瘍の発生、進行または転移の能力を有するか否かを決定するためには、単離された核酸と標的の１つまたは複数の核酸とのハイブリダイゼーションの概算量を評価する。ハイブリダイゼーションの概算量を定量的に評価する必要はないが、定量的評価も本発明に含まれる。一般的には、例えば、ハイブリダイゼーション検出後の肉眼検査により、ハイブリダイゼーションの概算量を定性的に評価する。例えば、試料中の標的核酸とハイブリダイズする標識核酸を分離するためにゲルを用いる場合には、結果として得られたバンドを肉眼的に検査することができる。被験試料におけるハイブリダイゼーションの概算量を非腫瘍細胞におけるハイブリダイゼーションの概算量の概算量と比較することができる。このような非腫瘍細胞は例えば上皮細胞または末梢血細胞である。
【００２３】
本発明に従って示す通り、ＴＨＷ核酸は健康ドナーの末梢血細胞を含まない試料よりも腫瘍試料の方が存在する量が少ない。腫瘍の進行能または転移能がないまたは低い被験試料では、腫瘍の進行能または転移能が高い癌細胞試料よりも、本発明のＴＨＷ核酸の量が多いと考えられる。
【００２４】
本発明によって提供される核酸に基づき、ＴＨＷ核酸の検出を腫瘍の早期発見の手段として用いる腫瘍検査を提供することが可能である。
【００２５】
プローブおよび核酸のハイブリダイゼーションの方法は当業者に知られており、例えば、国際公開公報第８９／０６６９８号、欧州特許第Ａ ０２００３６２号、米国特許第２９１５０８２号、欧州特許第Ａ ００６３８７９号、欧州特許第Ａ ０１７３２５１号、欧州特許第Ａ ０１７３２５１号に記載されている。
【００２６】
本発明の１つの好ましい態様では、例えば既知のＰＣＲ法により、試料の核酸を検査の前に増幅する（試料核酸がＲＮＡであればさらに逆転写する）。通常、誘導体化された（標識された）核酸プローブを核酸診断薬の枠組みで用いる。このプローブを、担体と結合した試料由来の変性ＤＮＡまたはＲＮＡと接触させる。この過程における温度、イオン強度、ｐＨおよび他の緩衝液の条件は、標識したＤＮＡまたはＲＮＡが相同なＤＮＡまたはＲＮＡと結合しうるように、核酸プローブの長さおよび組成ならびに予想されるハイブリッド体の融解温度に応じて選択する（ハイブリダイゼーション、Ｗａｈｌ， Ｇ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６（１９７９）３６８３〜３６８７も参照）。適した担体は、ニトロセルロース（例えば、ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｕｌｌ、ＢＡ ８５、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ， Ｃ．）、粉末状の強化型もしくは結合型のニトロセルロース、または種々の官能基（例えば、ニトロ基）による誘導体化がなされたナイロン膜（例えば、ＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒおよびＳｃｈｔｕｌｌ、Ｎｙｔｒａｎ；ＮＥＮ、Ｇｅｎｅ Ｓｃｒｅｅｎ；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｈｙｂｏｎｄ Ｍ．；Ｐａｌｌ Ｂｉｏｄｙｎｅ）などの膜または担体材料である。
【００２７】
好ましくは、核酸プローブを試料の核酸とともにインキュベートし、ハイブリダイゼーションを、選択的には、試料の核酸および／または核酸プローブに対する別の結合パートナーを用いて検出する。
【００２８】
ハイブリダイズするＤＮＡまたはＲＮＡは、非特異的な結合を防ぐための十分な洗浄および飽和化の後に、担体を抗体または抗体断片とともにインキュベートすることによって検出しうる。抗体または抗体断片は、ハイブリダイゼーション中に核酸プローブに組み入れられた物質を標的とする。抗体を次に標識する。しかし、ＤＮＡを直接標識することも可能である。抗体とともにインキュベートした後に、特異的に結合した抗体結合物のみを検出するためにこれを再び洗浄する。続いて、抗体または抗体断片上の標識を用いる既知の方法に従って評価を行う。
【００２９】
発現の検出は、例えば以下の通りに行うことができる：
−固定した全細胞、固定した組織塗沫標本とのインサイチューハイブリダイゼーション、
−コロニーハイブリダイゼーション（細胞）およびプラークハイブリダイゼーション（ファージおよびウイルス）、
−サザンハイブリダイゼーション（ＤＮＡ検出）、
−ノーザンハイブリダイゼーション（ＲＮＡ検出）、
−血清分析（例えば、スロットブロット分析による血清中の細胞の細胞種の分析）、
−増幅によるもの（例えば、ＰＣＲ法）。
【００３０】
このため、本発明による核酸は、腫瘍の発生能および進行能の診断における有用な予後判定マーカーである。
【００３１】
本発明はさらに、原核宿主細胞または真核宿主細胞における外因性ＤＮＡの発現および望ましい蛋白質の単離による、発現が腫瘍抑制と相関する蛋白質を生産するための方法であって、蛋白質が本発明による核酸分子によってコードされる、好ましくは配列番号：１に示したＤＮＡによってコードされる核酸分子であるような方法を含む。
【００３２】
本蛋白質は、細胞または培養上清から単離して、クロマトグラフィー手段、好ましくはイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび／または逆相ＨＰＬＣによって精製することができる。
【００３３】
本発明はさらに、好ましくは配列番号：１に示したヌクレオチド配列を有する、本発明による核酸分子によってコードされる、本発明による単離された蛋白質を含む。
【００３４】
本発明は、腫瘍抑制遺伝子であり、腫瘍発生能の指標となるダウンレギュレートされる遺伝子であることを特に特徴とする、遺伝子ＴＨＷのクローニングおよび特徴分析に関する。
【００３５】
本発明により、癌の治療、特に腫瘍抑制に有用な化合物の同定および単離のための方法が提供される。これらの方法には、本発明によるポリペプチドの発現を調節するための方法、本発明による蛋白質を模倣しうる化合物を同定するための方法、ならびに前記ポリペプチドおよびそれをコードする遺伝子を活性化しうる化合物を同定するための方法が含まれる。本方法にはさらに、腫瘍細胞における殺腫瘍能力を好ましくはダウンレギュレートする、ＴＨＷ遺伝子のｍＲＮＡへの転写を活性化するための方法も含まれる。これらの方法はインビトロまたはインビボで行うことができ、本発明の細胞株およびトランスジェニック動物モデルの利用および樹立を行ってもよい。
【００３６】
ＴＨＷ活性はいくつかの方法によって測定しうる。例えば、活性化は、インビトロでの運動性もしくは浸潤性の増加といった細胞生理の変化により、または分化状態の変化により、または増殖の増加につながる細胞代謝の変化によって、明らかとなる。
【００３７】
ＴＨＷ遺伝子は、ＬＯＨが以下のような複数の腫瘍で見いだされている領域である、染色体６ｑに位置する：悪性黒色腫（Ｈｅａｌｙ， Ｅ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １６（１９９８）２２１３〜２２１８；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｇ．Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６（１９９６）１６３５〜１６４１；Ｔｒｅｎｔ， Ｊ．Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７（１９９０）５６８〜７１；Ｒａｙ， Ｍ．Ｅ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １２（１９９６）２５２７〜２５３３；Ｍｉｌｌｉｋｉｎ， Ｄ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１（１９９１）５４４９〜５４５３）、膵癌（Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｃ．Ａ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５５（１９９５）２３９４〜２３９９）、子宮頸癌（Ｈｕｅｔｔｎｅｒ， Ｐ．Ｃ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｐａｔｈｏｌ ２９（１９９８）３６４〜３７０）、前立腺癌（Ｓｒｉｋａｎｔａｎ， Ｖ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ８４（１９９９）３３１〜３３５；ＭａｃＧｒｏｇａｎ， Ｄ．およびＢｏｏｋｓｔｅｉｎ， Ｒ．、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８（１９９７）１１〜１９；Ｖｅｒｍａ， Ｒ．Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １７（１９９９）４４１〜４４７）および乳癌（Ｂｉｌａｎｇｅｓ， Ｂ．、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １８（１９９９）３９７９〜３９８８；Ｃｈａｐｐｅｌｌ， Ｓ．Ａ．ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７５（１９９７）１３２４〜１３２９；Ｄｅｖｉｌｅｅ， Ｐ．ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６（１９９１）１７０５〜１７１１；Ｎｏｖｉｅｌｌｏ， Ｃ．ら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２（１９９６）１６０１〜１６０６；Ｆｕｊｉｉ， Ｈ．ら、Ｇｅｎｅｓ， Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ １６（１９９６）３５〜３９）。ＴＨＷ遺伝子の染色体６ｑ上での位置は、区域Ｄ６Ｓ４７２〜Ｄ６Ｓ４５３の内部にある。
【００３８】
ＴＨＷ遺伝子におけるヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）は、現在の技術水準に従って、好ましくは上記の区域に位置するマイクロサテライトマーカーを用いるＰＣＲにより、検出することができる。ＬＯＨの検出およびマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）の状態の決定のためには、この区域からのプライマー（マーカー）および／または隣接区域Ｄ６Ｓ４３４〜Ｄ６Ｓ３０２およびＤ６Ｓ４５３〜Ｄ６Ｓ３１１からのプライマーを用いることができる。上記の区域内にあるマイクロサテライトマーカーは、ゲノムデータベースＧＤＢ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｄｂ．ｏｒｇ）中に発見しうる。ＭＳＩの検出は、上記の隣接領域からのプライマーを用いて、例えば、デラシャペル（ｄｅ ｌａ Ｃｈａｐｅｌｌｅ， Ａ．）、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ． ７（１９９９）４０７〜４０８およびポトクニック（Ｐｏｔｏｃｎｉｋ Ｕ．）ら、Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ ４３９（３ｒｄ Ｓｕｐｐｌ．）２０００、Ｒ４７〜９に記載された既知の方法に従って行うことができる。ＬＯＨの検出方法は、例えば、フリードリッヒ（Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ， Ｍ．Ｇ．）ら、Ｊ． Ｕｒｏｌ． １６３（２０００）１０３９〜１０４２；スガノ（Ｓｕｇａｎｏ， Ｋ．）ら、Ｇｅｎｅｓ， Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ １５（１９９６）１５７〜１６４；チェン（Ｃｈｅｎ， Ｙ．Ｈ．）ら、Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １７７（１９９５）１２９〜１３４；ハーン（Ｈａｈｎ， Ｍ．）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １８（１９９５）１０４０〜１０４７；ロペス−クラペッツ（Ｌｏｐｅｚ−Ｃｒａｐｅｚ， Ｅ．）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７（１９９４）１０７２〜１０７４、１０７６；ドックホーン−ドボルニチャク（Ｄｏｃｋｈｏｒｎ−Ｄｗｏｒｎｉｃｚａｋ， Ｂ．）ら、Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ． ４２４（１９９４）３３７〜３４２；グルス（Ｇｒｕｉｓ， Ｎ．Ａ．）ら、Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６８（１９９３）２０８〜２１３；メルロー（Ｍｅｒｌｏ， Ｇ．Ｒ．）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １１（１９９１）１６６〜１６８、１７０〜１７１に記載されている。
【００３９】
パラフィン切片または他の組織試料から、分子量の比較的高いＤＮＡを単離することが好ましい。分析は、二ヌクレオチド反復配列を含む多型マイクロサテライトマーカーに隣接するオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによって行う。
【００４０】
以下の実施例、参考文献、配列表および図面は、本発明の理解を助けるために提供するものである。発明の精神を逸脱することなく、以下に述べる手順に修正を加えうることは理解される。
【００４１】
配列番号：１： ＴＨＷのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列。
配列番号：２：ＴＨＷのアミノ酸。
配列番号：３：プライマー３１２ｒｅｖｌ。
配列番号：４：プライマー３１２ｆ６。
配列番号：５〜１０：プライマー
【００４２】
実施例１
腫瘍形成能力および転移能力の決定
細胞株５３０は、以前の記載の通り、外科的に摘出されたヒト黒色腫の転移に由来する（ｖａｎ Ｍｕｉｊｅｎ， Ｇ．Ｎ．Ｐ．ら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ９（１９９１）２５９〜２７２；Ｖｅｒｓｔｅｅｇ， Ｒ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ ７（１９８８）１０２３〜１０２９）。細胞株ＮＭＣＬ−１もヒト皮膚黒色腫の転移に由来する。この２つの細胞株を、１０％ウシ胎仔血清、グルタミン、ペニシリンＧおよびストレプトマイシンを添加したダルベッコ変法イーグル培地を入れた培養フラスコ内で増殖させた。５３０細胞株およびＮＭＣＬ−１細胞株の腫瘍形成能力および転移能力を明らかにするために、サブコンフルエント状態の培養物から、０．２５％トリプシンおよび０．０２％ＥＤＴＡで２分間処理することによって腫瘍細胞を回収した。血清含有培地で洗った後、細胞をＰＢＳ中に懸濁し、５×１０６個の細胞を、ナイメーヘン大学中央動物研究所（Ｃｅｎｔｒａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｎｉｊｍｅｇｅｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）のヌードマウス施設で育てられたＢＡＬＢ／ｃ無胸腺ヌードマウスの外側胸壁に対して皮下（ｓ．ｃ．）接種した。マウスを腫瘍の局所的成長および全般的状態に関して週２回検査した。マウス各５匹からなる２つの群に対して各細胞株を注射した。疾病または呼吸困難の徴候が認められた時点でマウスを屠殺した。健康状態を維持したマウスは接種から３〜４カ月後に屠殺した。肺の少なくとも３つの異なるレベルから作製したパラフィン切片に対して、肺転移の検出に関する顕微鏡検査を行った。接種したマウス１０匹中８匹で細胞株５３０による腫瘍形成が認められた。肺の顕微鏡検査では、これらのマウスのいずれにも転移は認められなかった。細胞株ＮＭＣＬ−１は接種したマウス１０匹のすべてで皮下腫瘍の成長を示した。細胞株５３０とは異なり、ＮＭＣＬ−１細胞株を接種したすべてのマウスで広範囲の肺転移が認められた。
【００４３】
実施例２
ディファレンシャルディスプレイＰＣＲ
ディファレンシャルディスプレイ・ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤ−ＰＣＲ）を、リャン（Ｌｉａｎｇ）およびパーディー（Ｐａｒｄｅｅ）（Ｌｉａｎｇ， Ｐ．およびＰａｒｄｅｅ， Ａ．Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７（１９９２）９６７〜９７１；Ｌｉａｎｇ， Ｐ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２（１９９２）６９６６〜６９６８）によって記載された方法に従い、ＲＮＡ画像キット（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．、Ｂｒｏｏｋｌｉｎｅ、ＭＡ）を製造者の推奨に従って用いて行った。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＥ）を用いることにより、全ＲＮＡを５３０細胞およびＮＭＣＬ−１細胞から単離した。全ＲＮＡ試料に混入した痕跡量のＤＮＡの除去は、メッセージクリーン（ＭｅｓｓａｇｅＣｌｅａｎ）（登録商標）キット（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．、Ｂｒｏｏｋｌｉｎｅ、ＭＡ）を用いて、ＲＮアーゼ非含有ＤＮアーゼＩにより３７℃で３０分間消化することによって行った。５３０細胞およびＮＭＣＬ−１細胞から得たＤＮＡ非含有全ＲＮＡ（０．２μｇ）を、３種の異なる一塩基アンカー型Ｈ−Ｔ１１Ｍプライマー、１×逆転写酵素バッファー［１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ ８．３、１８８ｍＭ ＫＣｌ、７．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭジチオトレイトール（ＤＤＴ）］および２５０μＭ ｄＮＴＰの混合物の存在下で、第一鎖ｃＤＮＡ合成のためのテンプレートとして用いた。この溶液を６５℃で５分間加熱し、１０分間かけて３７℃に冷却した後に、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素２００単位を添加した。３７℃で１時間インキュベートした後に、７５℃で５分間インキュベートすることによって反応を停止させた。０．１倍容量の逆転写反応混合物、各１０μＭの一塩基アンカー型Ｈ−Ｔ１１Ｍプライマー、２μＭの任意の１３量体プライマー、１×ＰＣＲバッファー［１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ ８．４、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１％ゼラチン］、２５μＭ ｄＮＴＰ、１０μＣｉ［α−３５Ｓ］ｄＡＴＰおよび１０単位のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を含む溶液中でＰＣＲ手順を行った。ＰＣＲは９４℃ ３０秒間、４０℃ ２分間、７２℃ ３０秒間を４０サイクルの後、最後に７２℃ ５分間を行った。２μｌのローディングバッファーを３．５μｌの各試料に添加した後に、ＰＣＲ産物を８０℃で２分間加熱し、続いて変性５％ポリアクリルアミドシークエンシングゲルにかけて電気泳動を行った。乾燥したゲルをコダック（Ｋｏｄａｋ）社のバイオマックス（ＢｉｏＭａｘ）（登録商標）ＭＲフィルムに対して室温で４８時間露出させ、差異を伴って発現された遺伝子に関してオートラジオグラムを分析した。２つの細胞株の一方に特有の断片が認められた反応を、後に逆転写およびＰＣＲを繰り返すことによって確認した。２つの独立したＤＤ−ＰＣＲ反応において再現性を伴って認められた特有のバンドを乾燥ゲルから切り出し、ゲル切片を１００μｌのＨ２Ｏ中に１０分間浸漬した後に１５分間煮沸することにより、ｃＤＮＡをゲルから溶出させた。３Ｍ ＮａＯＡｃおよび担体としての５０μｇグリコーゲンの存在下でエタノール沈殿によって��ＤＮＡを回収し、１０μｌのＨ２Ｏ中に再び溶解した。溶出したｃＤＮＡ ４μｌを、ｄＮＴＰ濃度を２０μＭとし、放射性同位元素を含めなかった点を除いて同じ５’プライマーおよび３’プライマーならびに上記の条件を用いる第２のＰＣＲによって再び増幅した。得られたＰＣＲ増幅断片を１．５％アガロースゲルで分析し、続いてＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、ＤＥ）を用いて精製した上で、ノーザン分析用のプローブとして用いた。
【００４４】
実施例３
ＴＨＷ遺伝子のシークエンシングおよび特徴分析
ＤＤ−ＰＣＲ断片のクローニング
ＰＣＲ再増幅により直接生成されたハイブリダイゼーションプローブを用いるノーザン分析をまず行った。ノーザンブロット上の差異を伴って発現されるｍＲＮＡを検出するＰＣＲ増幅断片を、Ｔｏｐｏ ＴＡクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）により、ＰＣＲ ２．１−ＴＯＰＯベクター中にサブクローニングした。サブクローニングした断片をキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）プラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、これを再度、差異を伴う発現を確認するためのノーザン分析用のプローブとして用いた。
【００４５】
サブクローニングしたＤＤＲＴ−ＰＣＲ断片のＤＮＡシークエンシング
差異を伴って発現するｍＲＮＡに対応するサブクローニングされた断片のシークエンシングを、Ｔｏｐｏ ＴＡクローニングベクター（上記参照）中へのサブクローニングの後に、ダイターミネーター（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）サイクルシークエンシングキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて直接行った。ヌクレオチド配列データを、最新のＤＮＡデータベース中のＥＳＴの既知の遺伝子との相同性に関して解析した。
【００４６】
ＲＴ−ＰＣＲ
差異を伴うｍＲＮＡ発現を示すｃＤＮＡの５’伸長領域を同定するためにＲＴ−ＰＣＲを行った。ディファレンシャルディスプレイ分析に由来する、この結果得られた３０１ｂｐのクローンに関してＥＭＢＬデータベースを検索した。１１個の相同な重複ＥＳＴ（登録番号：Ｗ９３３９４、ＡＡ４８０３７３、ＡＡ６１０１５１、ＡＡ４６８３８５、Ｒ ８２５８４、ＡＡ１５９８１５、ＡＡ１５９５６５、ＡＩ８１４６２５、ＡＩ７４０８１１、ＡＩ８３０００９２、ＡＩ６９４１２６）のコンセンサス配列から完全長ｃＤＮＡを得ることができた。得られたコンセンサス配列からプライマーを設計した。Ｃ． ｔｈｅｒｍポリメラーゼ・ワンステップＲＴ−ＰＣＲシステムを製造者（Ｒｏｃｈｅ）の指示に従って用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。このシステムは、カルボキシサームス・ヒドロゲノフォルマンス（Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｆｏｒｍａｎｓ）由来のＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片および熱安定性Ｔａｑポリメラーゼを含む酵素混合物から構成される。
【００４７】
第一鎖合成
細胞株５３０の１９０ｎｇのポリＡ＋ＲＮＡを、プライマー３１２ｒｅｖｌ（５’ＡＡＡＴＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＣＴＧＴＧＧ３’、配列番号：３）を最終濃度０．３μＭで用いて逆転写した。ＧＣ含量が極めて高い（＞７５％）ことに起因するＲＮＡ ５’末端の二次構造を除去するためにＤＭＳＯ（７％）を添加した。その後、インキュベーションを６５℃で３０分間行った。
【００４８】
ＰＣＲ
ＲＴ反応を行ったのと同じチューブ内でＰＣＲを行った。 第一鎖ｃＤＮＡを、プライマー３１２ｒｅｖｌおよびプライマー３１２ｆ６（５’ＡＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＴＣＣＧＣＴＣ３’、配列番号：４）をそれぞれ最終濃度０．３μＭで用いるＰＣＲのためのテンプレートとして用いた。ＰＣＲ条件は以下の通りとした：９４℃−３０秒間、６９℃−３０秒間、７２℃−６０秒間を３５サイクル。この結果得られたＰＣＲ断片をサブクローニングして分析した。
【００４９】
ノーザンブロット分析
オリゴテックス（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ）（登録商標）ｍＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ）を用いて、ポリＡ＋ＲＮＡを全ＲＮＡから単離した。ヒト黒色腫細胞株、ヒト乳癌細胞株および膵癌細胞株（各細胞株の１μｇ）由来のポリＡ＋ＲＮＡの平行レーンを、変性１％アガロースホルムアルデヒドゲルでサイズ分離した。ブライトスター−プラス（ＢｒｉｇｈｔＳｔａｒ−Ｐｌｕｓ）（登録商標）（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）正荷電ナイロン膜に対するブロッティングを、キャピラリーによる下方トランスファーによって行った。ＵＶ架橋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＵＶ Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（登録商標）２４００）後に、ブロットを、ランダム１０量体（１０−ｍｅｒ）プライミングによって調製してＳｔｒｉｐ−ＥＺ（登録商標） ＤＮＡキット（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘａｓ）を用いて比活性２×１０９ｃｐｍ／μｇに標識した［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ標識ＤＤ−ＰＣＲ産物とハイブリダイズさせた。ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（登録商標）ハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を６８℃で用いて、プレハイブリダイゼーション（０．５時間）および放射性プローブとの一晩のハイブリダイゼーションを行った。膜を室温の溶液１（２×ＳＳＣ、０．０５％ＳＤＳ）により、洗浄溶液１を何回か交換しながら連続攪拌下で３０〜４０分間洗った後に、５０℃の溶液２（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ）による洗浄ステップを、新たな溶液に１回交換しながら４０分間行った。次に膜をクロネックス（Ｃｒｏｎｅｘ）（登録商標）医用Ｘ線フィルム（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｉｎｃ．、ＵＳＡ）に対して−８０℃で３〜７２時間露出させた。ｍＲＮＡのローディングおよび膜へのトランスファーが均等に行われたことを、ブロットを３２Ｐ標識β−アクチンｃＤＮＡとハイブリダイズさせることにより評価した。
【００５０】
多組織発現アレイおよびヒト腫瘍パネルブロット
ＴＨＷ遺伝子の組織特異的な発現について検討するために、多組織発現（ＭＴＥ（登録商標））アレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）およびヒト腫瘍パネルブロット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるノーザンブロット分析により、種々のヒト組織および細胞株におけるＴＨＷ ｍＲＮＡの分布を分析した。腫瘍パネルブロットは種々の組織に由来する一連の腫瘍ＲＮＡを含み、正常ＲＮＡが腫瘍ＲＮＡに隣接して配置されている。ＭＴＥブロットは７６種の組織特異的ポリＡ＋ＲＮＡを含む。種々のブロットを３２Ｐ標識したＴＨＷ ｃＤＮＡプローブによって検索した。ｍＲＮＡのローディングが均等に行われたことは、種々のブロットを３２Ｐ標識β−アクチンｃＤＮＡと再びハイブリダイズさせることによって確認した。
【００５１】
配列解析
アミノ酸配列中の蛋白質のソーティングシグナルおよび局在化シグナルの予測には、ＰＳＯＲＴ ＩＩコンピュータプログラム（ヒトゲノムセンター、東京大学医科学研究所、日本）を用いた。膜貫通ヘリックスおよび膜内でのその配向の予測には、バイオテクノロジー学部の生物配列解析センター（Ｔｈｅ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｄｅｎｍａｒｋ）のＴＭＨＭＭ（ｖ． ０．１）コンピュータプログラムを用いた。
【００５２】
ｃＤＮＡは１８９０ｎｔに対応しており、ＯＲＦは１９３ａａと推定された。ポリアデニル化シグナルがｎｔ１８５５〜１８６１に同定された。バイオインフォマティクス解析により、４回膜貫通型受容体構造が示唆された（図２）。ＴＨＷの構造は、２つの細胞外ドメイン（４５ａａおよび１８ａａ）、４つの膜貫通ドメイン（１９ａａ、２４ａａ、２３ａａおよび２３ａａ）および３つの細胞質ドメイン（１２ａａ、６ａａおよび２４ａａ）に対応する。配列比較により、国際公開公報第９８／３９４４８号；国際公開公報第９９／５４４６１号；国際公開公報第９８／５５５０８号；および国際公開公報第９９／６１４７１に記載されたヌクレオチドおよび蛋白質との相同性が認められた。
【００５３】
ヌードマウス系におけるヒト黒色腫細胞の転移能力とＴＨＷ遺伝子のｍＲＮＡ定常レベルとの相関を図３にまとめている。最も高い定常レベルは非転移性細胞株５３０（図３、レーンｉ）で認められ、最も低い定常レベルは、レーンａおよびｂに示すように非常に転移性の高い細胞株ＢＬＭおよびＭＶ３で認められ、中間レベルに相当したのは細胞株ＩＦ６ｍ、ＮＭＣＬ−１、Ｍｅｌ５７、Ｍ１４、ＭＶ−１およびＩＦ６であった（ｖａｎ Ｍｕｉｊｅｎ， Ｇ．Ｎ．Ｐ．．ら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ９（１９９１）２５９〜２７２；Ｖｅｒｓｔｅｅｇ， Ｒ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ ７（１９８８）１０２３〜１０２９；ｖａｎ Ｍｕｉｊｅｎ， Ｇ．Ｎ．ら、Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ４８（１９９１）８５〜９１；ｖａｎ Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ， Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５５（１９９５）６２３７〜６２４３；Ｗｅｔｅｒｍａｎ， Ｍ．Ａ．Ｊ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５２（１９９２）１２９１〜１２９６）が、これらはいずれも転移能が中程度の細胞株である。これらの結果は、ＴＨＷ遺伝子の発現のダウンレギュレーションと、ヌードマウス系におけるヒト黒色腫細胞の転移能との間に相関があることを明らかに立証するものである。
【００５４】
これらの検討をさらに進め、乳癌細胞株およびそれらに相当する非悪性細胞株を図４に示すように選択した。細胞株には、正常ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）、原発性腫瘍に由来する細胞株（ＷＡおよびＡＲ）、乳癌の骨髄微小転移に由来する３つの細胞株（ＫＭ２２、ＨＧ１５および１５９０）および腹水に由来する１つの細胞株（ＫＳ）が含まれる。細胞株ＷＡ（図４、レーンｃ）を除き、他の乳癌細胞株はすべて（図４、レーンａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｆ）、ＴＨＷ遺伝子のｍＲＮＡの定常レベルに顕著な（１０倍）ダウンレギュレーションが認められた。これらの結果は、ＴＨＷ遺伝子の発現のダウンレギュレーションが乳癌の発生にも一定の役割を果たしていることを示している。同所異種移植マウスモデルから樹立された一連の細胞株でも同様の結果が認められている。１つの細胞株（Ｋ２）は原発性腫瘍に由来し、３つの細胞株は異なる部位の転移に由来する（Ｋ３は腸間膜、Ｋ１３は肝門、Ｋ１６は肺からのもの）。図５に示す通り、ＴＨＷ ｍＲＮＡは、原発腫瘍に由来する細胞株（Ｋ２）と比較して、転移に由来する３つの細胞株（Ｋ３、Ｋ１３、Ｋ１６）のすべてでダウンレギュレートされていた。
【００５５】
図６に概要を示したように、いくつかの腫瘍試料（乳癌、子宮癌、子宮頸癌および卵巣癌）におけるＴＨＷ ｍＲＮＡの定常レベルを対応する正常組織と比較した。乳癌、子宮癌および子宮頸癌では対応する正常組織と比較してＴＨＷのｍＲＮＡレベルの劇的な低下が認められた；卵巣癌では正常組織および腫瘍組織のいずれにもシグナルが検出されなかった。これらの実験は、いくつかの固形腫瘍におけるＴＨＷ遺伝子のダウンレギュレーションを示している。
【００５６】
図７に示すように、多組織発現アレイ（ＭＴＥ（登録商標）、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いることにより、正常組織および選択した胎児組織、ならびに選択した腫瘍細胞株におけるＴＨＷ遺伝子の発現を調べた。ＴＨＷは、ＨｅＬａ、大腸腺癌細胞株ＳＷ４８０および肺癌細胞株Ａ５４９などの腫瘍細胞株で発現されていたが、赤白血球細胞株Ｋ５６２における発現は極めてわずかであり、白血病細胞株Ｍｏｌｔ４、白血病ＨＬ−６０ならびにバーキットリンパ腫細胞株ＲａｊｉおよびＤａｕｄｉなどの他の造血腫瘍細胞株では発現されなかった。末梢血白血球では発現が全く検出されず、脳およびその区画、骨格筋、脾臓、リンパ節、骨髄、精巣および卵巣における発現は極めてわずかであった。心臓およびその区画、消化管、腎臓、胸腺、肺、膀胱、胎盤、子宮、肝臓、膵臓、副腎、甲状腺、唾液腺、前立腺および乳腺では中程度の発現が認められた；食道および気管では高発現が認められた。ＴＨＷは胎児の心臓、腎臓、肝臓、胸腺および肺で発現されており、胎児の脳および脾臓における発現はわずかであった。このように、ＴＨＷは末梢血白血球を除いてほぼ遍在的に発現される。その受容体は末梢血白血球を除いて遍在的に発現されている（図７）。
【００５７】
このため、ＴＨＷの腫瘍抑制機能は以下の所見を特徴とする：
ａ）ヌードマウス系では、中間的および非転移性の細胞株に比べて、転移性ヒト黒色腫細胞でＴＨＷ遺伝子がダウンレギュレートされている（図３）。
ｂ）ヒト乳腺上皮細胞に比べて乳癌細胞株でＴＨＷ遺伝子がダウンレギュレートされている（図４）。
ｃ）原発性腫瘍に由来する細胞株に比べて、転移に由来する膵臓細胞株でＴＨＷ遺伝子がダウンレギュレートされている（図５）。
ｄ）正常組織に比べて腫瘍組織でＴＨＷ遺伝子がダウンレギュレートされている（図６）
【００５８】
実施例４
ＬＯＲの検出
マイクロサテライトは、直列反復性の単量体（１〜６ｂｐ）から構成される短い配列（５０〜３００ｂｐ）である。これらのマイクロサテライトはゲノム全体に広く存在し、その多くは多型性が高い。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析を用いて、種々の細胞株および腫瘍生検標本における６ｑ２４での対立遺伝子喪失の発生率を検討した。この目的のために、３種の多型マイクロサテライトマーカーに隣接するオリゴヌクレオチドを用いた。これらはすべて二ヌクレオチド反復配列であった。
【００５９】
６番染色体の長腕に位置する３つの多型ＤＮＡマーカーを用いて、３５例の患者から得た正常ＤＮＡおよび自家腫瘍ＤＮＡ（原発性黒色腫および転移性黒色腫）を分析した。種々のヒト黒色腫、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌および卵巣癌の細胞株も分析した。
【００６０】
ＬＯＨは、腫瘍対立遺伝子の相対的なピーク高の低下が正常対立遺伝子と比べて５０％を上回る場合と定義される。
【００６１】
本発明者らは、ＬＯＨの算出に以下の式を用いた：
【式１】
2004500852.tif 000003
対立遺伝子の喪失は、ＬＯＨの値が０．５未満または２．０超であることによって示される。
【００６２】
ａ）ＤＮＡの抽出
２５件の原発性黒色腫および１０件の黒色腫転移から高分子量のＤＮＡを単離した。ＤＮＡは（顕微）解剖したパラフィン切片から単離した。ＤＮＡを同じ患者の正常組織からも単離した。腫瘍細胞株からのＤＮＡはペレット化した細胞から単離した。ＤＮＡの単離にはＱＩＡａｍｐ（登録商標）（Ｑｉａｇｅｎ、ＤＥ）ＤＮＡミニキットを用いた。
【００６３】
ｂ）ＰＣＲ分析
Ｄ６Ｓ２９２、Ｄ６Ｓ１６８４およびＤ６Ｓ３１１にある多型性の高い二ヌクレオチド反復配列に隣接する蛍光標識プライマー。
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【００６４】
ＰＣＲ条件は以下の通りとした：
セットアップ用マスターミックス１：
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マスターミックス２：
２５μｌ 高忠実度ＰＣＲマスター（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ、ＤＥ）
【００６５】
２つの混合物をピペットで混合する。ＰＣＲは以下のサイクルを用いて行った：９４℃ ２分間に続いて、９４℃−３０秒間、５５℃−３０秒間、７２℃−３０秒間を４０サイクル、最終伸長を７２℃で７分間。３つのプライマー対により、蛍光標識されたＰＣＲ産物を生成し、ジーンスキャン（Ｇｅｎｅｃａｎ）分析ソフトウエア（ＰＢ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０遺伝子解析装置で分析する。
【００６６】
参考文献リスト
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【図面の簡単な説明】
【図１】細胞株５３０およびＮＭＣＬ−１におけるＴＨＷ遺伝子の差異を伴う発現（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）。材料および方法の項に述べた通りに、
ＲＮＡを１％アガロース−ホルムアルデヒドゲルでサイズ分離し、ＴＨＷ ｃＤＮＡに由来するα−３２Ｐ標識プローブとハイブリダイズさせた。レーンａ：細胞株５３０；レーンＢ：細胞株ＮＭＣＬ−１。
【図２】細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを示す（上から下に）、ＴＨＷ遺伝子の遺伝子産物に関して推定される配置。この配置の予想はコンピュータプログラムＴＭＨＭＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ）に基づく。
【図３】さまざまな転移能を有するヒト黒色腫細胞株におけるＴＨＷ遺伝子のｍＲＮＡの発現。ノーザンブロットは材料および方法の項に述べた通りに行った。ブロットをＴＨＷ遺伝子に由来するα−３２Ｐ標識プローブとハイブリダイズさせた。各レーンに異なる黒色腫細胞株を示している。レーン：ａ、ＢＬＭ；ｂ、ＭＶ３；ｃ、ＮＭＣＬ−１；ｄ、ＩＦ６ｍ；ｅ、Ｍｅｌ５７；ｆ、Ｍ１４；ｇ、ＭＶ−１；ｈ、ＩＦ６；ｉ、５３０。
【図４】乳癌細胞株におけるＴＨＷ遺伝子の発現。細胞株は正常乳腺上皮（ＨＭＥＣ）、原発性乳癌（ＡＲおよびＷＡ）、骨髄微小転移（１５９０、ＨＧ１５およびＫＭ２２）および腹水（ＫＳ）に由来する。ノーザンブロット法を材料および方法の項に述べた通りに行い、ブロットをＴＨＷ ｃＤＮＡ由来のα−３２Ｐ標識プローブとハイブリダイズさせた。レーンａ：ＨＭＥＣ；ｂ、ＡＲ；ｃ、ＷＡ；ｄ、１５９０；ｅ、ＨＧ１５；ｆ、ＫＭ２２；ｇ、ＫＳ。
【図５】膵癌細胞株におけるＴＨＷ遺伝子の発現。細胞株Ｋ２は膵臓の原発性腫瘍に由来し、３つの細胞株（Ｋ３、Ｋ１３、Ｋ１６）は異なる部位の転移に由来する（Ｋ３は腸間膜、Ｋ１３は肝門、Ｋ１６は肺からのもの）。ノーザンブロット法を材料および方法の項に述べた通りに行い、ブロットをＴＨＷ ｃＤＮＡ由来のα−３２Ｐ標識プローブとハイブリダイズさせた。レーンａ：Ｋ２；ｂ、Ｋ３；ｃ、Ｋ１３；ｄ、Ｋ１６。
【図６】選択した腫瘍組織および対応する正常組織におけるＴＨＷの発現。ノーザンブロット分析は材料および方法の項に述べた通りに行った。ブロットをＴＨＷ ｃＤＮＡ由来のα−３２Ｐ標識ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。レーンａ：正常卵巣；ｂ：卵巣腫瘍；ｃ：正常子宮頸部；ｄ、子宮頸癌；ｅ：正常子宮；ｆ：子宮腫瘍；ｇ：正常乳房；ｈ：乳房腫瘍。
【図７】選択した組織および細胞株におけるＴＨＷ遺伝子の発現。多組織（ＭＴＥ（登録商標））アレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を、製造者の推奨に従って、ＴＨＷ ｃＤＮＡに対応するα−３２Ｐ標識プローブとハイブリダイズさせた。Ｅ６は細胞株ＡＲ由来の１μｇのポリＡ＋ＲＮＡに対応し、Ｈ６は細胞株ＡＲ由来の０．１μｇのポリＡ＋ＲＮＡに対応する。コード化はブロットの上に示している。Ａ１＝全脳；Ａ２＝左小脳；Ａ３＝黒質；Ａ４＝心臓；Ａ５＝食道；Ａ６＝横行結腸；Ａ７＝腎臓；Ａ８＝肺；Ａ９＝肝臓；Ａ１０＝白血病、ＨＬ−６０；Ａ１１＝胎児脳；Ａ１２＝酵母全ＲＮＡ。
Ｂ１＝大脳皮質；Ｂ２＝右小脳；Ｂ３＝側坐核；Ｂ４＝大動脈；Ｂ５＝胃；Ｂ６＝下行結腸；Ｂ７＝骨格筋；Ｂ８＝胎盤；Ｂ９＝膵臓；Ｂ１０＝ＨｅＬａＳ３；Ｂ１１＝胎児心臓；Ｂ１２＝酵母ｔＲＮＡ。
Ｃ１＝前頭葉；Ｃ２＝脳梁；Ｃ３＝視床；Ｃ４＝左心房；Ｃ５＝十二指腸；Ｃ６＝直腸；Ｃ７＝脾臓；Ｃ８＝膀胱；Ｃ９＝副腎；Ｃ１０＝白血病、Ｋ−５６２；Ｃ１１＝胎児腎臓；Ｃ１２＝大腸菌ｒＲＮＡ。
Ｄ１＝頭頂葉；Ｄ２＝扁桃核；Ｄ３＝脳下垂体；Ｄ４＝右心房；Ｄ５＝空腸；Ｄ７＝胸腺；Ｄ８＝子宮；Ｄ９＝甲状腺；Ｄ１０＝白血病、ＭＯＬＴ−４；Ｄ１１＝胎児肝臓；Ｄ１２＝大腸菌ＤＮＡ。Ｅ１＝後頭葉；Ｅ２＝尾状核；Ｅ３＝脊髄；Ｅ４＝左心室；Ｅ５＝回腸；Ｅ７＝末梢血白血球；Ｅ８＝前立腺；Ｅ９＝唾液腺；Ｅ１０＝バーキットリンパ腫、Ｒａｊｉ；Ｅ１１＝胎児脾臓；Ｅ１２＝ポリｒ（Ａ）。
Ｆ１＝側頭葉；Ｆ２＝海馬；Ｆ４＝右脳室；Ｆ５＝回盲部；Ｆ７＝リンパ節；Ｆ８＝精巣；Ｆ９＝乳腺；Ｆ１０＝バーキットリンパ腫、Ｄａｕｄｉ；Ｆ１１＝胎児胸腺；Ｆ１２＝ヒトＣ０ｔ−１ ＤＮＡ。
Ｇ１＝大脳皮質中心傍回；Ｇ２＝延髄；Ｇ４＝心室中隔；Ｇ５＝虫垂；Ｇ７＝骨髄；Ｇ８＝卵巣；Ｇ１０＝大腸腺癌ＳＷ４８０；Ｇ１１＝胎児肺；Ｇ１２＝ヒトＤＮＡ １００ｎｇ。
Ｈ＝橋；Ｈ２＝被殻；Ｈ４＝心尖部；Ｈ５＝上行結腸；Ｈ７＝気管；Ｈ１０＝肺癌、Ａ５４９；Ｈ１２＝ヒトＤＮＡ ５００ｎｇ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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