(57)【要約】ヒトアミノペプチダーゼＮを調節する試薬およびヒトアミノペプチダーゼＮ遺伝子産物に結合する試薬は、がん、ＣＮＳ障害またはＣＯＰＤを含みこれに限定されない機能不全または疾患の予防、改善または是正において役割を果たすことができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）
ｉ．配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約３７％同一なアミノ酸配列；および
ｉｉ．配列番号２に示すアミノ酸配列
より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むアミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１で示される配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）で特定されるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）から（ｃ）に明記するポリヌクレオチド配列とは異なり、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および、
ｅ）（ａ）から（ｄ）で特定されるポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異を表し、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
より成る群から選ばれるポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされている、実質上精製されたアミノペプチダーゼＮポリペプチド。
【請求項５】
以下の工程：
ａ）請求項３に記載の宿主細胞を、アミノペプチダーゼＮポリペプチドの発現に好適な条件下で培養し；そして、
ｂ）アミノペプチダーゼＮポリペプチドを宿主細胞培養から回収する、
を含む、アミノペプチダーゼＮポリペプチドを調製する方法。
【請求項６】
以下の工程：
ａ）請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを生体試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成し；そして、
ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体を検出する、
を含む、生体試料中の、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するための方法。
【請求項７】
ハイブリダイゼーションの前に、生体試料の核酸材料を増幅させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
以下の工程：
ａ）生体試料と、アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドまたはアミノペプチダーゼＮポリペプチドと特異的に相互作用する試薬とを接触させる工程、
ｂ）相互作用を検出する工程
を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のアミノペプチダーゼＮポリペプチドを検出するための方法。
【請求項９】
請求項６から８までのいずれかに記載の方法を実施するための診断キット。
【請求項１０】
ａ．被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによりコードされる任意のアミノペプチダーゼＮポリペプチドと接触させ；
ｂ．アミノペプチダーゼＮポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含む、アミノペプチダーゼＮの活性を低下させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物を、アミノペプチダーゼＮの活性を低下させる可能性ある治療物質として同定する方法。
【請求項１１】
アミノペプチダーゼＮの活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、
ａ．被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによりコードされるアミノペプチダーゼＮポリペプチドと接触させ；そして、
ｂ．該ポリペプチドのアミノペプチダーゼＮ活性を検出する工程、
を含み、アミノペプチダーゼＮ活性を増大させる被験化合物を、アミノペプチダーゼＮの活性を増大させる可能性ある治療物質として同定し、そして該ポリペプチドのアミノペプチダーゼＮ活性を低下させる被験化合物を、アミノペプチダーゼＮの活性を低下させる可能性ある治療物質として同定する方法。
【請求項１２】
アミノペプチダーゼＮの活性を低下させる物質をスクリーニングする方法であって、
ａ．被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドと接触させ、該ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する工程
を含み、該ポリヌクレオチドに結合する被験化合物を、アミノペプチダーゼＮの活性を低下させる可能性ある治療物質として同定する方法。
【請求項１３】
以下の工程を含む、アミノペプチダーゼＮの活性を減少させる方法。
【請求項１４】
ａ．細胞を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載の任意のアミノペプチダーゼＮポリペプチドに特異的に結合する試薬と接触させ、それによりアミノペプチダーゼＮの活性を減少させる工程。
【請求項１５】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法によって同定される、アミノペプチダーゼＮポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調節する試薬。
【請求項１６】
配列番号２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬、および製薬的に許容し得る担体を含有する医薬組成物。
【請求項１７】
疾患におけるアミノペプチダーゼＮの活性を調節するための医薬の製造のための、配列番号２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬の使用。
【請求項１８】
前記疾患が、癌、ＣＮＳ障害またはＣＯＰＤである、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトアミノペプチダーゼＮの調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
アミノペプチダーゼＮ（膜アラニルアミノペプチダーゼ）は、一般的なペプチド分解において機能するペプチダーゼである。本酵素は、小腸膜に存在し、胃および膵臓のプロテアーゼによるタンパク質加水分解によって生じたペプチドの最終的な分解において機能する（Kruse et al., 1988, FEBS Lett. 239: 305-308）。当分野において、調節により治療効果をもたらすことができる関連する酵素を同定する必要性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の要旨
本発明の目的は、ヒトアミノペプチダーゼＮを調節する試薬および方法を提供することである。本発明のこのおよびその他の目的は、下に記載する１またはそれ以上の態様によって提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の一つの態様は、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約３７％同一なアミノ酸配列；および
配列番号２に示すアミノ酸配列
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むアミノペプチダーゼＮポリペプチドである。
【０００５】
本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を減少させる試薬をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約３７％同一なアミノ酸配列および
配列番号２に示すアミノ酸配列
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むアミノペプチダーゼＮポリペプチドと接触させる。
【０００６】
被験化合物とアミノペプチダーゼＮポリペプチドとの結合を検出する。それにより、アミノペプチダーゼＮポリペプチドに結合する被験化合物を、細胞外マトリックス分解を減少させる可能性のある試薬として同定する。この試薬はアミノペプチダーゼＮの活性を減少させることによって作用し得る。
【０００７】
本発明の別の態様は、細胞外マトリックス分解を減少させる物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％同一なヌクレオチド配列；および
配列番号１に示すヌクレオチド配列
からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触させる。
【０００８】
このポリヌクレオチドに対する試験化合物の結合を検出する。このポリヌクレオチドに結合する試験化合物を、細胞外マトリックス分解を増大させる可能性のある試薬として同定する。この試薬は、アミノペプチダーゼＮｍＲＮＡとの相互作用を介してアミノペプチダーゼＮの量を減少させることによって作用し得る。
【０００９】
本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を調節する試薬をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約３７％同一なアミノ酸配列；および
配列番号２に示すアミノ酸配列
からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むアミノペプチダーゼＮポリペプチドと接触させる。
【００１０】
ポリペプチドのアミノペプチダーゼＮ活性を検出する。ポリペプチドのアミノペプチダーゼＮ活性を、試験化合物不在下でのアミノペプチダーゼＮ活性と比較して増加させる試験化合物は、それにより、細胞外マトリックス分解を増大させる可能性のある試薬として同定する。ポリペプチドのアミノペプチダーゼＮ活性を、その試験化合物の不在下でのアミノペプチダーゼＮ活性と比較して減少させる試験化合物は、それにより、細胞外マトリックス分解を減少させる可能性のある試薬として同定する。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を減少させる試薬をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％同一なヌクレオチド配列；および
配列番号１に示すヌクレオチド配列
からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチドのアミノペプチダーゼＮ産物と接触させる。
【００１２】
このアミノペプチダーゼＮ産物に対する試験化合物の結合を検出する。このアミノペプチダーゼＮ産物と結合する試験化合物を、それにより、細胞外マトリックス分解を減少させる、可能性のある試薬として同定する。
【００１３】
本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を減少させる方法である。細胞を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％同一なヌクレオチド配列；および
配列番号１に示すヌクレオチド配列
からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのポリヌクレオチドによってコードされる産物と特異的に結合する試薬と接触させる。
【００１４】
細胞中のアミノペプチダーゼＮ活性は、それにより減少する。
【００１５】
このように、本発明は、例えば、そのヒトアミノペプチダーゼＮの活性部位でアクチベーターまたはインヒビターとして作用し得る試験化合物を同定するために用いることができるヒトアミノペプチダーゼＮを提供する。ヒトアミノペプチダーゼＮおよびその断片はまた、そのレセプターをブロックおよび効果的にそのレセプターの活性を減少することができる特異的な抗体を惹起するのに有用でもある。
【００１６】
本発明は、以下からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチドに関する：
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約３７％同一なアミノ酸配列；および
配列番号２に示すアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１に示す配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に示すポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｄ）その配列が、遺伝コードの縮重のために（ａ）〜（ｃ）に示したポリヌクレオチド配列とは異なり、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；および
ｅ）（ａ）〜（ｄ）に示すポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異を示し、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【００１７】
さらに、本発明者によって、新規なアミノペプチダーゼＮ、特にヒトアミノペプチダーゼＮは、癌、ＣＮＳ障害またはＣＯＰＤを処置するための治療方法に用いることができることが発見された。ヒトアミノペプチダーゼＮは、配列番号２に示したアミノ酸配列を含む。ヒトアミノペプチダーゼＮのコード配列を配列番号１に示す。この配列は、染色体５ｑ２３．１に存在する。関連のＥＳＴ（BG720834; BG719375; BG208666; BG11371;AI222989 ;BG623101）は、胎盤および精巣において発現する。
【００１８】
ヒトアミノペプチダーゼＮのアミノ酸配列は、９４２アミノ酸にわたり、swiss｜P15144｜AMPN_HUMANアミノペプチダーゼＮ（配列番号３）（図１）と３６％同一である。ｐｆａｍデータベースに対する検索によってペプチダーゼファミリーＭ１が同定された。亜鉛金属プロテアーゼとしての本発明の機能を有するタンパク質は、プロサイト解析による亜鉛_プロテアーゼ領域の同定によって支持される。膜貫通領域およびプロサイトの特徴は、図１において下線で示している。金属の結合部位および活性部位の残基は太字で示す。
【００１９】
本発明のヒトアミノペプチダーゼＮは、これまでに同定されたアミノペプチダーゼＮ酵素をとして、いくつかの目的に有用であると期待される。ヒトアミノペプチダーゼＮは、癌、ＣＮＳ障害またはＣＯＰＤ等の障害を処置する治療法に有用であると考えられる。ヒトアミノペプチダーゼＮはまた、ヒトアミノペプチダーゼ活性化因子および阻害剤をスクリーニングするのに使用することもできる。
【００２０】
ポリペプチド
本発明に係るヒトアミノペプチダーゼＮポリペプチドには、配列番号２に示すアミノ酸配列で示されるアミノ酸配列から選択される、少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、または９３３個の連続アミノ酸または以下に定義されるその生物学的に活性体変異体が含まれる。したがって、本発明のアミノペプチダーゼＮポリペプチドは、アミノペプチダーゼＮの一部、完全長のヒトアミノペプチダーゼＮ、またはアミノペプチダーゼＮの全部または一部を含む融合タンパク質であり得る。
【００２１】
生物学的に活性な変異体
生物学的に活性な、即ちリガンドと結合して生物学的な効果、例えばサイクリックＡＭＰ形成、細胞内カルシウムの移動、またはホスホイノシチド代謝、をもたらす能力を保持するアミノペプチダーゼＮポリペプチド変異体もまた、アミノペプチダーゼＮポリペプチドである。好ましくは、天然または非天然に存在するアミノペプチダーゼＮポリペプチド変異体は、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその断片と少なくとも約３７、４０、４５、５０、好ましくは約５５、６５、７０、７５、９０、９６または９８％一致するアミノ酸配列を有する。推定されるアミノペプチダーゼＮポリペプチド変異体と配列番号２のアミノ酸配列との一致パーセントは、慣用の方法によって決定する。例えば、Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986)、およびHenikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照。簡潔には、２つのアミノ酸配列を、ギャップオープニングペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ１、およびHenikoff and Henikoff (ibid.)の「BLOSUM62」スコアリングマトリクスを用いてアライメントスコアが最適になるよう整列させる。当業者は、２つのアミノ酸配列を整列させるために用いることができる確立されたアルゴリズムが多く存在することを理解している。Pearson and Lipmanの「FASTA」類似性検索アルゴリズムは、本明細書に開示されたアミノ酸配列と推定の変異体のアミノ酸配列が共有する同一性のレベルを調べるための適当なタンパク質アライメント法である。FASTAアルゴリズムは、Pearson and Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444(1988)、およびPearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)に記載されている。簡潔には、FASTAは、最初に、保存的なアミノ酸置換、挿入または欠失を考慮することなく、照会する配列（即ち、配列番号２）および最も高い同一性の密度（ktup変数が１である場合）または同一の対（ktup＝２の場合）のいずれかを有する試験配列が共有する領域を同定することによって配列の類似性を特徴付ける。次いで、最も高い同一性の密度を有する１０の領域を、アミノ酸置換マトリクスを用いてすべての対のアミノ酸の類似性を比較することによって再スコア化し、その領域の末端を、最も高いスコア貢献する残基のみを含むように切り取る。「切り捨て（cutoff）」値（配列の長さとktup値に基づいて所定の式によって計算された）よりも大きいスコアを有する領域がいくつか存在する場合は、切取った最初の領域を調べ、その領域が連結してgapを有する近似アライメントを形成することができるかどうかを決定する。最後に、２つのアミノ酸配列の最も高いスコアの領域を、アミノ酸挿入および欠失を許容する、Needleman-Wunsch- Sellers アルゴリズム (Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol.48:444 (1970); Sellers, SIAＭ J. Appl. Math. 26:787 (1974))を用いて整列させる。FASTA分析に好ましいパラメーターは、以下のとおりである：ktup=1, ギャップオープニングペナルティ=10, ギャップ伸長ペナルティ=1、および置換マトリクス=BLOSUM62。これらのパラメータは、Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990)の別紙２において説明されているように、スコアリングマトリクスファイル（「SMATRIX」）に修飾を施してFASTAプログラムに導入することができる。FASTAは、上記の比率を用いて核酸分子の配列同一性を決定するために用いることもできる。ヌクレオチド配列の比較に関して、ktup値は、１〜６の範囲内、好ましくは３〜６の範囲、最も好ましくは３であってよく、その他のパラメータは既定値である。
【００２２】
同一性の百分率における変化は、例えば、アミノ酸置換、挿入または欠失に起因し得る。アミノ酸置換は１対１のアミノ酸の置き換えとして定義される。置換されたアミノ酸が類似の構造的および／または化学的性質を有する場合、置換は保存的である。保存的置換の例は、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの置換、グルタミン酸塩によるアスパラギン酸塩の置換、またはセリンによるスレオニンの置換である。
【００２３】
アミノ酸挿入または欠失は、アミノ酸配列への、またはその内部での変化である。これらは典型的には約１ないし５アミノ酸の範囲で起こる。アミノペプチダーゼＮポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を廃絶することなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失できるかを決定する際の指針は、当分野で周知のコンピュータープログラム、例えばDNASTARソフトウェアを用いて見出すことができる。
【００２４】
本発明はさらに、例えばグリコシレーション、アセチル化、リン酸化、アミド化、周知の保護／ブッロキング基による誘導体化、タンパク質加水分解的開裂、抗体分子またはその他の細胞リガンド等への結合によって、翻訳の間または翻訳後に異なった形で修飾されるアミノペプチダーゼＮポリペプチドを包含する。数多くの化学的修飾のうちのいずれも、臭化シアン、トリプシン、チモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成等が含まれるがこれに限定されない周知の技術によって行うことができる。
【００２５】
本発明に包含されるさらなる翻訳後修飾には、例えばＮ結合またはＯ結合炭化水素鎖、（Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング）アミノ酸骨格への化学的部分の結合、Ｎ−結合またはＯ−結合炭化水素鎖の化学的修飾、および原核宿主発現の結果としてのメチオニン残基の付加または欠失が含まれる。アミノペプチダーゼＮポリペプチドはまた、酵素、蛍光、イオン等の検出可能な標識で、またはアフィニティー標識によって修飾して、タンパク質を検出し単離することができる。
【００２６】
本発明はさらに、ポリペプチドの溶解性、安定性および循環時間の増大、または免疫原性の減少等（米国特許第４１７９３３７号）のさらなる利点をもたらす、アミノペプチダーゼＮポリペプチドの化学的に修飾された誘導体を提供する。誘導体化のための化学的部分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等から選択することができる。ポリペプチドは、無作為にまたはその分子内の予め決められた位置で修飾することができ、１、２、３またはそれ以上の結合した化学的部分を含むことができる。
【００２７】
アミノ酸変化またはポリペプチド修飾が生物学的に活性なアミノペプチダーゼＮポリペプチドを生じるかどうかは、例えば、Ishii et al. (Int. J. Cancer 92(1) : 4954,2001)に記載されているように、酵素活性を分析することにより容易に決定することができる。
【００２８】
融合タンパク質
融合タンパク質は、アミノペプチダーゼＮポリペプチドアミノ酸配列に対する抗体の作製に、そして様々な検定系での使用に有用である。例えば、融合タンパク質は、アミノペプチダーゼＮポリペプチドの一部と相互作用するタンパク質の同定に使用できる。タンパク質アフィニティークロマトグラフィーまたはタンパク質−タンパク質相互作用のためのライブラリーに基づく検定、例えば酵母ツーハイブリッドまたはファージディスプレイ系をこの目的のために使用できる。このような方法は当分野で周知であり、薬物スクリーニングとしても使用できる。
【００２９】
アミノペプチダーゼＮポリペプチド融合タンパク質は、ペプチド結合により融合した２つのポリペプチドセグメントを含んでいる。第一のポリペプチドセグメントは、配列番号２に示すアミノ酸配列の、少なくとも６、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５、８５０、８７５、９００、９２５、または９３３個の連続アミノ酸、または上記に記載したようなその生物学的に活性な変異体を含む。第一のポリペプチドセグメントはまた、完全長アミノペプチダーゼＮを含むことができる。
【００３０】
第二のポリペプチドセグメントは、完全長タンパク質またはタンパク質断片であってよい。融合タンパク質の組み立てに一般的に使用するタンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を包含する）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。さらに、融合タンパク質の組み立てには、ヒスチジン（His）標識、ＦＬＡＧ標識、インフルエンザへマグルチニン（ＨＡ）標識、Ｍｙｃ標識、ＶＳＶ−Ｇ標識、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）標識を包含するエピトープ標識を使用する。その他の融合組み立て物は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、Lex a ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を包含する。融合タンパク質はさらに、このアミノペプチダーゼＮポリペプチドが開裂して、ヘテロローガス部分から精製することができるように、アミノペプチダーゼＮポリペプチドコード配列とヘテロローガスタンパク質配列の間に位置する開裂部位を含むよう組み立てることができる。
【００３１】
融合タンパク質は当分野で周知のように化学合成できる。好ましくは、融合タンパク質は２つのポリペプチドセグメントを共有結合で連結することにより、または分子生物学分野で標準的な方法により調製する。例えば、当分野で知られているように、第二のポリペプチドセグメントをコードするヌクレオチドを有する適切なリーディングフレームに配列番号１から選ばれるコード配列を含む、ＤＮＡ組み立て物を作製し、このＤＮＡ組み立て物を宿主細胞で発現させることによる組換えＤＮＡ法を用いて、融合タンパク質を調製することができる。融合タンパク質を組み立てるための多くのキットが、Promega Corporation(Madison, WI)、Stratagene(La Jolla, CA)、CLONTECH(Mountain View, CA)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)、MBL international Corporation(MIC; Watertown, MA)、およびQuantum Biotechnologies(Montreal, Canada; 1-888-DNA-KITS)といった企業から入手できる。
【００３２】
種相同体の同定
アミノペプチダーゼＮポリペプチドのポリヌクレオチド（下記）を使用して他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために好適なプローブまたはプライマーを作製し、アミノペプチダーゼＮポリペプチドの相同体をコードするｃＤＮＡを同定し、そして当分野で周知のようにこのｃＤＮＡを発現させて、ヒトアミノペプチダーゼＮポリペプチドの種相同体を得ることができる。
【００３３】
ポリヌクレオチド
アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってよく、アミノペプチダーゼＮポリペプチドのコード配列またはこのコード配列の相補体を含んでいる。アミノペプチダーゼＮのコード配列は配列番号１に示す。
【００３４】
ヒトアミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする縮重ヌクレオチド配列、および、配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０％、好ましくは約７５、９０、９６、９８もしくは９９％一致するホモローガスなヌクレオチド配列またはこれらの相補物もまた、アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドである。二つのポリヌクレオチド配列間の配列一致パーセントは、ALIGNのようなコンピュータープログラムを用いて決定するが、これは、ギャップオープンペナルティー−１２およびギャップエクステンションペナルティー−２によるアフィンギャップ検索を用いるFASTAアルゴリズムを使用するものである。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体および生物学的に活性なアミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドの変異体もやはりアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドである。
配列番号１に示すアミノ酸配列の、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１５、２０または２５個の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチド断片またはその相補物もまたアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドである。これらの断片は、例えば、ハイブリダイゼーションプローブまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いることができる。
【００３５】
ポリヌクレオチド変異体および相同体の同定
上記のアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドの変異体および相同体もまたアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドである。典型的には、ホモローガスなアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチド配列は、当分野で周知のように、ストリンジェントな条件下で候補ポリヌクレオチドを既知のアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドにハイブリダイズすることにより同定できる。例えば、以下の洗浄条件 -- ２Ｘ ＳＳＣ（０.３Ｍ ＮａＣｌ、０.０３Ｍクエン酸ナトリウム、pH７.０）、０.１％ＳＤＳ、室温２回、各々３０分間；次いで２Ｘ ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、５０℃ １回、３０分間；次いで２Ｘ ＳＳＣ、室温 ２回、各々１０分間 -- を使用して、最大でも約２５〜３０％の塩基対ミスマッチを含むホモローガス配列を同定できる。より好ましくは、ホモローガス核酸鎖は１５〜２５％の塩基対ミスマッチを、さらに好ましくは５〜１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００３６】
本明細書に開示するアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドの種相同体は、適当なプローブまたはプライマーを作製し、他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定することもできる。アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドのヒト変異体は、例えばヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。二本鎖ＤＮＡのＴｍは相同性が１％低下する毎に１〜１.５℃低下することがよく知られている（Bonner et al., J.Mol.Biol. 81,123(1973)）。故にヒトアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドの変異体または他の種のアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドは、推定のホモローガスアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドを、配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズさせて被験ハイブリッドを形成させることによって同定できる。被験ハイブリッドの融解温度を、完全に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融解温度と比較し、被験ハイブリッドの中の塩基対ミスマッチのパーセント数を算出する。
【００３７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に従いアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズするヌクレオチド配列もまたアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は当分野で周知且つ理解されており、例えばSambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., 1989, 9.50-9.51頁に開示されている。
【００３８】
典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のためには、温度と塩濃度の組み合わせを、検討中のハイブリッドの理論的Ｔｍよりおよそ１２〜２０℃低くなるよう選択すべきである。配列番号１に示すヌクレオチド配列を有するアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドまたはその相同体と、それらのヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも約５０、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％一致するポリヌクレオチド配列とのハイブリッドのＴｍは、例えば、Bolton and McCarthy, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 48, 1390 (1962)の式：
Ｔｍ＝８１.５℃−１６.６(log10[Ｎａ＋])＋０.４１(％Ｇ＋Ｃ)−０.６３(％ホルムアミド)−６００／ｌ）、
[式中、ｌ＝塩基対で表したハイブリッドの長さ]
を用いて算出できる。
【００３９】
ストリンジェントな洗浄条件としては例えば、４Ｘ ＳＳＣ（６５℃）、または５０％ホルムアミド、４Ｘ ＳＳＣ（４２℃）、または０.５Ｘ ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ（６５℃）が挙げられる。高度にストリンジェントな洗浄条件は、例えば０.２Ｘ ＳＳＣ（６５℃）などである。
【００４０】
ポリヌクレオチドの調製
アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドは、膜構成成分、タンパク質および脂質といった他の細胞成分を含まないよう単離できる。ポリヌクレオチドは細胞から調製でき、標準的核酸精製技術を用いて単離、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を用いて合成、もしくは自動合成機を用いることによって調製できる。ポリヌクレオチドを単離する方法は常套的であり、当分野で知られている。ポリヌクレオチドを取得するためこのような任意の技術を用いて、単離されたアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドを得ることができる。例えば、制限酵素よびプローブを用いてアミノペプチダーゼＮヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド断片を単離できる。単離したポリヌクレオチドは、他の分子を少なくとも７０、８０、または９０％含まない調製物である。
【００４１】
ヒトアミノペプチダーゼＮ ｃＤＮＡ分子は、アミノペプチダーゼＮ ｍＲＮＡを鋳型に用いて標準的分子生物学技術にて調製できる。次いで、ヒトアミノペプチダーゼＮ ｃＤＮＡ分子を、当分野で周知でありSambrook et al.(1989)のようなマニュアルに開示される分子生物学技術を用いて複製することができる。ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを鋳型に使用して本発明に係るポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るため、ＰＣＲのような増幅技術を用いることができる。
【００４２】
別法として、合成化学技術を用いてアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドを合成することもできる。遺伝コードの縮重は、例えば配列番号１に示すアミノ酸配列を有するアミノペプチダーゼＮポリペプチドまたはその生物学的に活性な変異体をコードする、別のヌクレオチド配列の合成を可能にする。
【００４３】
ポリヌクレオチドの伸長
ＰＣＲに基づく様々な方法を用いて本明細書に開示の核酸配列を伸長させ、プロモーターおよび調節エレメントといった上流配列を検出することができる。例えば、制限部位ＰＣＲは、既知の座（Sarkar, PCR Methods Applic. 2,318-322,1993）に隣接する未知の配列を回収するため、ユニバーサルプライマーを使用する。まず、ゲノムＤＮＡを、リンカー配列に対するプライマーおよび既知領域に対し特異的なプライマーの存在下で増幅する。次に、増幅させた配列を、同じリンカープライマーおよび最初のものの内部にある別の特異的プライマーを用いる第二回目のＰＣＲに付す。各回のＰＣＲの産物を適当なＲＮＡポリメラーゼで転写し、逆転写酵素を用いて配列決定する。
【００４４】
インバースＰＣＲを用いて、既知領域（Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16,8186,1988）に基づく異なるプライマーを用いて配列を増幅または伸長することもできる。OLIGO 4.06 Primer Analysisソフトウェア（National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.）のような市販ソフトウェアを用いて、長さ２２〜３０ヌクレオチド長、５０％またはそれ以上のＧＣ含有量を持ち、約６８〜７２℃の温度で標的配列とアニーリングするプライマーを設計できる。この方法は、遺伝子の既知領域に適当な断片を作り出す幾つかの制限酵素を使用する。次いでこの断片を分子内ライゲーションにより環化し、ＰＣＲ鋳型として使用する。
【００４５】
使用できるもう一つの方法は、ヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡ中の既知配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む、捕捉ＰＣＲである（Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1,111-119,1991）。この方法では、複数の制限酵素消化とライゲーションを用いて、作製したある二本鎖の配列を、ＰＣＲを行う前にＤＮＡ分子の未知の断片中に配置することができる。
【００４６】
未知の配列を回収するために使用できるもう一つの方法は、Parker et al., Nucleic Acids Res. 19,3055-3060,1991の方法である。加えて、ＰＣＲ、ネスティッドプライマー、およびPROMOTERFINDERライブラリー（CLONTECH, Palo Alto, Calif.）を用いてゲノムＤＮＡを移動させることができる（CLONTECH, Palo Alto, Calif.）。このプロセスはライブラリーをスクリーニングする必要性を排除し、イントロン／エクソン接合点の発見に有用である。
【００４７】
完全長ｃＤＮＡについてスクリーニングする場合、より大きなｃＤＮＡを含むようサイズ選択したライブラリーを使用するのが望ましい。遺伝子の５'領域を含む配列をより多く含んでいるという点で、無作為プライミングしたライブラリーが好ましい。無作為プライミングしたライブラリーの使用は、オリゴｄ(Ｔ)ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況で特に好ましいであろう。ゲノムライブラリーは、配列を５'非転写調節領域へと伸長させるのに有用であり得る。
【００４８】
商業的に入手可能なキャピラリー電気泳動システムを用いて、ＰＣＲまたは配列決定産物のサイズを分析、またはヌクレオチド配列を確認することができる。例えば、キャピラリー配列決定は、電気泳動分離用の流動性ポリマー、レーザー励起する４種の異なる蛍光色素（各ヌクレオチドにつき１種ずつ）、および電荷結合素子カメラによる放射された波長の検出を利用することができる。出力／光強度は適当なソフトウェア（例えばGENOTYPERおよびSequence NAVIGATOR、Perkin Elmer）を用いて電気信号に変換でき、試料のロードからコンピューター分析および電子的データ表示に至る全プロセスをコンピューター管理することができる。キャピラリー電気泳動は、特定の試料中に限られた量で存在するかも知れないＤＮＡの小片を配列決定するのに特に好ましい。
【００４９】
ポリペプチドの取得
ヒトアミノペプチダーゼＮポリペプチドは、例えばヒト細胞からの精製によって、アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドの発現によって、または直接的化学合成によって取得できる。
【００５０】
タンパク質精製
ヒトアミノペプチダーゼＮポリペプチドは、アミノペプチダーゼＮ発現構築物でトランスフェクトした宿主細胞を包含する、該酵素 を発現する任意のヒト細胞から精製できる。精製されたアミノペプチダーゼＮポリペプチドは、細胞内のアミノペプチダーゼＮポリペプチドに通常付随するその他の化合物、例えば或る種のタンパク質、炭水化物、または脂質から、当分野で周知の方法を用いて分離する。このような方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および調製用ゲル電気泳動を包含するが、これらに限定されない。精製アミノペプチダーゼＮポリペプチドの調製物は少なくとも８０％純粋であり、好ましくは該調製物は９０％、９５％、または９９％純粋である。調製物の純度はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような当分野で既知の任意の手段によって評価することができる。
【００５１】
ポリヌクレオチドの発現
アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドを発現させるため、挿入されたコード配列の転写と翻訳に必要なエレメントを含む発現ベクター中にそのポリヌクレオチドを挿入することができる。アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする配列および適当な転写および翻訳調節エレメントを含む発現ベクターを組み立てるため、当業者に周知の方法が利用できる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えがある。このような技術は、例えばSambrook et al.(1989)およびAusubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York., 1989に記載されている。
【００５２】
様々な発現ベクター／宿主系が、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする配列を含みそして発現させるために利用できる。これらには、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）により感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、もしくは細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）により形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が包含されるがこれらに限定される訳ではない。
【００５３】
調節エレメントまたは調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写と翻訳を実行する、ベクターの非翻訳領域  エンハンサー、プロモーター、５'および３'非翻訳領域 である。このようなエレメントはその強さと特異性において変更しうる。利用するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導的プロモーターを包含する、任意の数の好適な転写および翻訳エレメントを使用できる。例えば、細菌系でクローニングを行う場合、BLUESCRIPTファージミド（Stratagene, LaJolla，Calif.）またはpSPORT１プラスミド（Life Technologies）等のハイブリッドlacZプロモーターのような誘導的プロモーターを使用できる。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞に使用できる。植物細胞のゲノム（例えば熱ショック、RUBISCO、および貯蔵タンパク質遺伝子）、または植物ウイルス（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）由来のプロモーターまたはエンハンサーを該ベクター中にクローニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来の、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を複数コピー含むセルラインを作製する必要がある場合は、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択マーカーと共に使用することができる。
【００５４】
細菌および酵母発現系
細菌系では、数多くの発現ベクターをアミノペプチダーゼＮポリペプチドに関して意図する用途に応じて選択することができる。例えば、抗体の誘導のため大量のアミノペプチダーゼＮポリペプチドが必要である場合は、容易に精製できる融合タンパク質の高いレベルの発現を指令するベクターを用いることができる。このようなベクターは、BLUESCRIPT(Stratagene)のような多機能E.coliクローニングおよび発現ベクターを包含するが、これに限定される訳ではない。BLUESCRIPTベクターにおいては、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする配列を、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔとこれに続く７残基の配列と共にフレーム内で該ベクター中にライゲーションすることができる。ｐＩＮベクター（Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264,5503-5509,1989）またはｐＧＥＸベクター（Promega, Madison, Wis.）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を伴う融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるのに使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、その後遊離グルタチオンの存在下で溶離することにより、溶菌させた細胞から容易に精製できる。このような系で調製したタンパク質は、目的とするクローンポリペプチドをＧＳＴ部分から随意に遊離させることができるように、ヘパリン、トロンビン、または第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むよう設計することができる。
【００５５】
酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいては、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨのような構成的または誘導的プロモーターを含む数多くのベクターを使用することができる。総説としてAusubel et al.(1989)およびGrant et al., Methods Enzymol. 153, 516-544,1987を参照されたい。
【００５６】
植物および昆虫発現系
植物発現ベクターを使用する場合、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする配列の発現は、多数のプロモーターのうちの任意のプロモーターにより駆動できる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウイルスプロモーターを、単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用できる（Takamatsu, EMBO J. 6,307-311,1987）。別法として、RUBISCOの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することもできる（Coruzzi et al., EMBO J. 3,1671-1680,1984；Broglie et al., Science 224, 838-843,1984；Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17, 85-105,1991）。これらの組み立て物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体仲介トランスフェクションにより植物細胞中に導入することができる。このような技術は多くの一般に入手可能な総説に記載されている（例えば、HobbsまたはMurray、MCGRAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, New York, N.Y., pp191-196,1992）。
【００５７】
昆虫系もまたアミノペプチダーゼＮポリペプチドの発現に使用できる。例えば、係る系の１つAutographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼虫で外来遺伝子を発現させるベクターとして使用する。アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする配列を、ポリヘドリン遺伝子のような該ウイルスの非必須領域中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置くことができる。アミノペプチダーゼＮポリペプチドをうまく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子は不活性化し、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが生成する。次いでこの組換えウイルスをS.frugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼虫への感染に使用し、そこでアミノペプチダーゼＮポリペプチドを発現させることができる（Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 91, 3224-3227, 1994）。
【００５８】
哺乳動物発現系
ウイルスに基づく多くの発現系を用いて哺乳動物宿主細胞においてアミノペプチダーゼＮポリペプチドを発現させることができる。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび３部に分かれたリーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲーションできる。該ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を用いて、感染宿主細胞においてアミノペプチダーゼＮポリペプチドを発現できる生存ウイルスを取得できる（Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3655-3659, 1984）。所望により、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて哺乳動物宿主細胞での発現を増大させることができる。
【００５９】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）もまた、プラスミドが内包し発現するＤＮＡ断片よりも大きなＤＮＡ断片の運搬に使用できる。６Ｍないし１０ＭのＨＡＣを組み立て、常套的デリバリー法により細胞に到達させる（例えば、リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または小胞）。
【００６０】
さらに、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする配列の、より効率的な翻訳を達成するために、特異的開始シグナルを使用できる。係るシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび連続配列を包含する。アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクター中に挿入する場合、さらなる転写または翻訳調節シグナルは必要ないであろう。しかしながら、コード配列またはその断片のみを挿入する場合は、外因性の翻訳調節シグナル（ＡＴＧ開始コドンを包含する）を供給すべきである。開始コドンは挿入物全体を確実に翻訳させるために、正しいリーディングフレームになければならない。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは天然および合成いずれの様々な起源であってよい。発現の効率は、使用する特定の細胞系に対し適切なエンハンサーを存在させることにより増強できる（Scharf et al., Results Probl.Cell Differ. 20,125-162,1994）。
【００６１】
宿主細胞
宿主細胞菌株は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現されたアミノペプチダーゼＮポリペプチドを所望の方法で処理できる能力を目的として選択できる。該ポリペプチドのこのような修飾には、アセチル化、カルボキシ化、グリコシル化、燐酸化、脂質化、およびアシル化が包含されるがこれらに限定されない。該ポリペプチドの「プレプロ」型を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、折り畳み、および／または機能を促進するために使用できる。翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的メカニズムを持つ異なる宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）が、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ；10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209）から入手でき、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実とするために選択できる。
【００６２】
組換えタンパク質の、長期高収量産生のために、安定した発現が好ましい。例えば、アミノペプチダーゼＮポリペプチドを安定に発現するセルラインは、ウイルス複製起点および／または内因性発現エレメント、および同じまたは別のベクター上にある選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを使用して形質転換することができる。該ベクターの導入に続いて、細胞を強化培地で１〜２日間生育させた後、培地を選択培地に交換することができる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在が、導入されたアミノペプチダーゼＮ配列をうまく発現する細胞の生育と回収を可能にする。安定に形質転換細胞の耐性クローンは、その細胞型にとって適当な組織培養技術を用いて増殖させることができる。例えば、ANIMAL CELL CULTURE, R.I. Freshney, ed., 1986を参照されたい。
【００６３】
幾つかの選択系を用いて、形質転換されたセルラインを回収できる。
【００６４】
これらには、それぞれtk−またはaprt−細胞で使用できる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al., Cell 11, 223-32, 1977）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al., Cell 22, 817-23, 1980）遺伝子が包含されるがこれらに限定される訳ではない。さらに、代謝拮抗試薬、抗生物質、または除草剤耐性を選択の基準に用いることができる。例えば、dhfrはメソトレキサートに対する耐性を付与し（Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 3567-70, 1980）、nptはアミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与し（Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1014, 1981）、そしてalsおよびpatはそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する（Murray, 1992,上記）。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、trpBは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するようにさせ、hisDは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するようにさせる（Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 8047-51, 1988）。アントシアニンのような可視マーカー、β−グルクロニダーゼとその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼとその基質ルシフェリンは、形質転換体を同定し、特異的ベクター系に帰すことのできる一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するために使用できる（Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55, 121-131, 1995）。
【００６５】
発現の検出
マーカー遺伝子発現の存在はアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドもまた存在することを示唆しているが、その存在と発現を確認する必要があるかもしれない。例えば、もしアミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする配列がマーカー遺伝子配列内部に挿入されているならば、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする配列を含む形質転換細胞は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定できる。これに代わり、マーカー遺伝子を、単一のプロモーターの調節下にアミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする配列とタンデムに並べて位置させることもできる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常、アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドの発現を示す。
【００６６】
これとは別に、アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドを含みアミノペプチダーゼＮポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に知られる様々な方法によって同定できる。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質生検またはイムノアッセイ技術（核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための膜、溶液、またはチップに基づく技術を包含する）が包含されるがこれらに限定されない。例えば、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の存在は、プローブまたは断片またはアミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出できる。核酸増幅に基づく検定は、アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドを含む形質転換体を検出するための、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする配列から選択されるオリゴヌクレオチドの使用を含む。
【００６７】
アミノペプチダーゼＮポリペプチドに対し特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを使用して該ポリペプチドの発現を検出および測定するための様々なプロトコルが当分野で知られている。例として、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）がある。アミノペプチダーゼＮポリペプチド上の２個の非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる、２部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイが使用でき、または、競合的結合検定を使用することができる。これらのそしてその他の検定はHamptom et al., SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St. Paul, Minn., 1990およびMaddox et al., J. Exp. Med. 158, 1211-1216, 1983に記載されている。
【００６８】
多岐にわたる標識およびコンジュゲーション技術が当業者に知られており、様々な核酸およびアミノ酸検定に使用できる。アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを調製する手段は、標識したヌクレオチドを使用する、オリゴ標識化、ニック翻訳、末端標識化、またはＰＣＲ増幅を包含する。これとは別に、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする配列を、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクター中にクローニングすることもできる。このようなベクターは当分野で既知であり、市販品が入手でき、標識化ヌクレオチドおよび適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６を添加することによりインビトロでのＲＮＡプローブの合成に使用することができる。これらの方法は、市販の様々なキットを用いて実施できる（Amersham Pharmacia Biotech、 Promega、およびUS Biochemical）。検出を容易にするために使用できる適当なリポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、および蛍光、化学ルミネセント、または色素生成試薬、ならびに基質、補助因子、インヒビター、磁性粒子などが包含される。
【００６９】
ポリペプチドの発現および精製
アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で形質転換させた宿主細胞は、発現と、細胞培養からのタンパク質の回収に適した条件下で培養できる。形質転換細胞により産生されたポリペプチドは、その配列および／または使用したベクターに応じて分泌されまたは細胞内に貯留され得る。当業者には理解できるであろうが、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を介する可溶性アミノペプチダーゼＮポリペプチドの分泌を指令する、または膜結合アミノペプチダーゼＮポリペプチドの、膜挿入を指令する、シグナル配列を含むよう設計することができる。
【００７０】
上に論じたように、他の組み立て物を用いて、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列と結合させることができる。このような精製促進ドメインは、金属キレート化ペプチド、例えば固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、およびFLAGS伸長／アフィニティー精製系で利用するドメインが包含されるが、これらに限定されない（Immunex Corp., Seattle, Wash.）。精製ドメインとアミノペプチダーゼＮポリペプチドとの間に開裂可能リンカー配列、例えば第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼに特異的なリンカー配列を入れること（Invitrogen, San Diego, CA）もまた、精製を促進するために利用できる。このような発現ベクターの１つは、アミノペプチダーゼＮポリペプチドと、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位に先立つ６個のヒスチジン残基とを含む融合タンパク質の発現をもたらす。このヒスチジン残基はＩＭＡＣ（Porath et al., Prot. Exp. Purif. 3, 263-281, 1992に記載の固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）による精製を促進し、一方エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質からのアミノペプチダーゼＮポリペプチドの精製手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターはKroll et al., DNA Cell Biol. 12, 441-453, 1993に開示されている。
【００７１】
化学合成
アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードする配列は、その全体または一部を、当分野で周知の化学的方法を用いて合成できる（Caruthers et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223,1980；Horn et al., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232, 1980）。これとは別に、アミノペプチダーゼＮポリペプチド自身を、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法、例えば固相技術を用いる直接ペプチド合成を用いて調製できる（Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154, 1963；Roberge et al., Science 269, 202-204, 1995）。タンパク質合成は手動による技術またはオートメーションを用いて実施できる。自動化された合成は、例えばApplied Biosystems 431Aペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いて達成することができる。所望により、アミノペプチダーゼＮポリペプチドの断片を別々に合成し、化学的方法を用いて合成して完全長の分子を調製することもできる。
【００７２】
新たに合成したペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフイー（例えばCreighton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co., New York, N.Y., 1983）により実質的に精製できる。合成アミノペプチダーゼＮポリペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定により確認できる（例えばエドマン分解法；Creighton、上記を参照されたい）。さらに、直接合成中にアミノペプチダーゼＮポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を改変させ、そして／または化学的方法を用いて他のタンパク質由来の配列と合して、変異体ポリペプチドまたは融合タンパク質を調製することができる。
【００７３】
改変ポリペプチドの調製
当業者には理解できるであろうが、天然に存在しないコドンを有するアミノペプチダーゼＮポリペプチドコード化ヌクレオチドを調製することは有利であり得る。例えば、特定の原核または真核宿主が好むコドンを選択して、タンパク質発現の速度を増大させ、または所望の性質、例えば天然に存在する配列から産み出される転写物の半減期より長い半減期を持つＲＮＡ転写物を調製することができる。
【００７４】
本明細書に開示するヌクレオチド配列は、当分野で一般的に知られる方法を用いて、該ポリペプチドまたはｍＲＮＡ産物のクローニング、プロセシングおよび／または発現を修飾する改変を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）様々な理由で、アミノペプチダーゼＮポリペプチドコード配列を改変させるように設計できる。無作為断片化によるＤＮＡシャフリングと遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再構築を用いてヌクレオチド配列を設計できる。例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変え、コドンの優先性を変え、スプライス変異体を調製し、突然変異を導入する等を実施できる。
【００７５】
抗体
当分野で知られているいかなる型の抗体も、アミノペプチダーゼＮポリペプチドのエピトープに特異的に結合するよう作製できる。本明細書で使用する「抗体」とは、無傷の免疫グロブリン分子、およびその断片、例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２、およびＦｖを包含し、これらはアミノペプチダーゼＮポリペプチドのエピトープに結合することが可能である。典型的には、エピトープを形成するためには少なくとも６、８、１０、または１２の連続するアミノ酸が必要である。しかしながら、非連続アミノ酸を含むエピトープはより多くの、例えば少なくとも１５、２５、または５０のアミノ酸を必要とするかも知れない。
【００７６】
アミノペプチダーゼＮポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体は治療に使用でき、そして免疫化学検定、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学検定、免疫沈降、またはその他の当分野で既知の免疫化学的検定に使用できる。所望の特異性を有する抗体の同定のため、様々なイムノアッセイが使用できる。競合的結合または免疫放射検定のための多数のプロトコルが当分野でよく知られている。このようなイムノアッセイは典型的には、免疫原と、その免疫原に特異的に結合する抗体との間の複合体形成の測定を含んでいる。
【００７７】
典型的には、アミノペプチダーゼＮポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学検定に使用する時、他のタンパク質が提供する検出シグナルより少なくとも５、１０、または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、アミノペプチダーゼＮポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学検定で他のタンパク質を検出せず、アミノペプチダーゼＮポリペプチドを溶液から免疫沈降させることができる。
【００７８】
ヒトアミノペプチダーゼＮポリペプチドは、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトを免疫してポリクローナル抗体を産生させるのに使用できる。所望により、アミノペプチダーゼＮポリペプチドは、担体タンパク質、例えばウシ血清アルブミン、チログロブリン、およびキーホールリンペットヘモシアニンとコンジュゲートさせることができる。宿主の種に応じて、免疫学的反応を増大させるために種々のアジュバントを使用できる。このようなアジュバントは、フロイントアジュバント、鉱物性ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、および界面活性試薬（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノール）を包含するがこれらに限定されない。ヒトに使用するアジュバントの中ではＢＣＧ（bacilli Calmette-Guerin）およびCorynebacterium parvumが特に有用である。
【００７９】
アミノペプチダーゼＮポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養中の連続的セルラインにより抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて調製できる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術があるがこれらに限定されない（Kohler et al., Nature 256, 495-497, 1985; Kozbor et al., J. Immunol. Methods 81, 31-42, 1985; Cote et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 2026-2030, 1983; Cole et al., Mol. Cell Biol. 62, 109-120,1984）。
【００８０】
さらに、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして適当な抗原特異性と生物学的活性を持つ分子を得る、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術が利用できる（Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nature 312, 604-608, 1984; Takeda et al., Nature 314, 452-454, 1985）。モノクローナルおよびその他の抗体はまた、これを治療に使用した場合に患者が該抗体に対する免疫反応を起こすのを防ぐため、「ヒト化」することができる。このような抗体は、治療に直接使用できるほど配列が充分ヒト抗体に類似しているかも知れず、または幾つかの重要な残基の変更を必要とするかも知れない。齧歯類の抗体とヒト配列の間の配列相違は、個々の残基の部位特異的突然変異誘発により、または相補性決定領域全体のグラフティング（grating）により、ヒト配列内の残基と相違する残基を置き換えることによって最小化することができる。別法として、ヒト化抗体はGB2188638Bに記載のように組換え法を用いて調製できる。アミノペプチダーゼＮポリペプチドに特異的に結合する抗体は、U.S.5565332に開示のように、部分的または完全にヒト化した抗原結合部位を含むことができる。
【００８１】
これに代わり、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の調製のために記載した技術を適合させ、アミノペプチダーゼＮポリペプチドに特異的に結合する一本鎖抗体を調製することができる。関連する特異性を持つが別個のイディオタイプ組成を有する抗体を、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから鎖シャフリングによって調製することができる（Burton, Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 11120-23, 1991）。
【００８２】
一本鎖抗体はまた、ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲのようなＤＮＡ増幅法を用いて組み立てることができる（Thirion et al., 1996, Eur. J. Cancer Prev. 5, 507-11）。一本鎖抗体は単一または二重特異性であり得、また、二価または四価であり得る。四価二重特異性一本鎖抗体の組み立ては例えばColoma & Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15, 159-63に教示されている。二価二重特異性一本鎖抗体の組み立てはMallender & Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269, 199-206に教示されている。
【００８３】
下記のように、一本鎖抗体をコードするヌクレオチド配列を手動または自動ヌクレオチド合成を用いて組み立て、標準的組換えＤＮＡ法を用いて発現組み立て物中にクローニングし、そして細胞中に導入してコード配列を発現させることができる。別法として、一本鎖抗体を、例えば糸状ファージ技術を用いて直接調製することもできる（Verhaar et al., 1995, Int. J. Cancer 61, 497-501; Nicholla et al., 1993, J. Immunol. Meth. 165, 81-91）。
【００８４】
アミノペプチダーゼＮポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、リンパ球集団においてインビボ産生を誘導することによって、または、文献に開示されている極めて特異的な結合試薬のパネルまたは免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることによって調製することもできる（Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 3833-3837, 1989; Winter et al., Nature 349, 293-299, 1991）。
【００８５】
その他の型の抗体を、本発明方法において組み立て、治療に使用することができる。例えば、WO93/03151に開示のように、キメラ抗体を組み立てることができる。免疫グロブリンから誘導され多価且つ多重特異的である結合タンパク質、例えばWO94/13804に記載の「diabodies」もまた調製することができる。
【００８６】
本発明に係る抗体は当分野で周知の方法により精製できる。例えば、抗体は、アミノペプチダーゼＮポリペプチドが結合しているカラムを通過させることによりアフィニティー精製することができる。次いで、結合した抗体を、高い塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶出することができる。
【００８７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対し相補的なヌクレオチド配列である。いったん細胞中に導入されるとこの相補的ヌクレオチドは、該細胞が産生した天然配列と結合して複合体を形成し、転写または翻訳のいずれかを遮断する。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１１ヌクレオチド長であるが、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５もしくは５０またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。より長い配列もまた使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子をＤＮＡ組み立て物に提供し、上記のように細胞中に導入して、その細胞におけるアミノペプチダーゼＮ遺伝子産物のレベルを低下させることができる。
【００８８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこの両者の組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの５'末端を、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロアミデート、燐酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カルボネート、および燐酸トリエステルといった非ホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する別のヌクレオチドの３'末端と共有結合させることにより、手動で、または自動合成機によって合成できる。Brown, Meth. Mol. Biol. 20, 1-8, 1994; Sonveaux, Meth. Mol. Biol. 26, 1-72, 1994; Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543-583, 1990を参照されたい。
【００８９】
アミノペプチダーゼＮ遺伝子の制御、５'、または調節領域と二本鎖を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することにより、アミノペプチダーゼＮ遺伝子発現の修飾が得られる。転写開始部位、例えば開始部位より−１０〜＋１０位から誘導されるオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重らせん」塩基対合法を用いて阻害を達成することができる。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子またはシャペロンの結合に足るほど開く能力の阻害を惹起するため、有用である。三本鎖ＤＮＡを用いる治療上の進歩が文献に記載されている（例えばGee et al., Huber & Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N.Y., 1994）。転写物がリボソームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた設計できる。
【００９０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドの相補配列との間に複合体をうまく形成させるためには、厳密な相補性は必要ない。例えば、アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドに対し厳密に相補的である２、３、４、もしくは５またはそれ以上の長さの連続するヌクレオチドであって、その各々が、隣接するアミノペプチダーゼＮヌクレオチドとは相補的ではない連続するある長さのヌクレオチドによって隔てられているものを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アミノペプチダーゼＮｍＲＮＡに対する十分な標的化特異性を提供できる。好ましくは、相補的な連続ヌクレオチドの長さはそれぞれ少なくとも４、５、６、７もしくは８またはそれ以上のヌクレオチド長である。非相補的な介在配列は、好ましくは１、２、３、または４ヌクレオチド長である。当業者は、アンチセンス−センスの対の算出融点を容易に使用して、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定のアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチド配列間で寛容されるミスマッチの程度を決定することができるであろう。
【００９１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力に影響を及ぼすことなく修飾できる。これらの修飾は該アンチセンス分子の内部、または一端もしくは両端であり得る。例えば、ヌクレオシド間の燐酸結合は、アミノ基と末端リボースの間にいろいろな数の炭素残基を有するコレステリルまたはジアミン部分を加えることによって修飾できる。修飾された塩基および／または糖、例えばリボースの代わりのアラビノース、または３'ヒドロキシ基または５'燐酸基が置換されている３',５'−置換オリゴヌクレオチドもまた修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに使用できる。これらの修飾オリゴヌクレオチドは当分野で周知の方法により調製できる。例えば、Agrawal et al., Trends Biotechnol. 10, 152-158, 1992; Uhlmann et al., Chem. Rev. 90, 543-584, 1990; Uhlmann et al., Tetrahedron. Lett. 215, 3539-3542,1987を参照されたい。
【００９２】
リボザイム
リボザイムは触媒活性を有するＲＮＡ分子である。例えば、Cech, Science 236, 1532-1539; 1987; Cech, Ann. Rev. Biochem. 59, 543-568; 1990, Cech, Curr.Opin.Struct.Biol. 2, 605-609; 1992, Couture & Stinchcomb, Trends Genet. 12,510-515, 1996を参照されたい。当分野で知られるように、リボザイムは、ＲＮＡ配列を開裂することにより遺伝子機能を阻害するのに使用できる（例えば、Haseloff et al., 米国特許5641673）。リボザイムの作用機構は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後の内ヌクレオチド結合分解性(endonucleolytic)の開裂を含む。例には、特異的ヌクレオチド配列の内ヌクレオチド結合分解性の開裂を特異的且つ効果的に触媒できる、設計されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子がある。
【００９３】
アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドのコード配列を用いて、アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡに特異的に結合するリボザイムを作製できる。他のトランスのＲＮＡ分子を極めて配列特異的に開裂できるリボザイムを設計し組み立てる方法が開発され、当分野で記載されている（Haseloff et al. Nature 334, 585-591, 1988）。例えば、リボザイムの開裂活性は、別個の「ハイブリダイゼーション」領域を該リボザイム中に組み入れることによって、特定のＲＮＡを標的とさせることができる。このハイブリダイゼーション領域は標的ＲＮＡに対し相補的な配列を含んでおり、したがってその標的と特異的にハイブリダイズする（例えばGerlach et al., EP321201を参照されたい）。
【００９４】
アミノペプチダーゼＮ ＲＮＡ標的内部の特異的リボザイム開裂部位は、この標的分子を、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを包含するリボザイム開裂部位についてスキャンすることにより同定できる。同定できたならば、該開裂部位を含む標的ＲＮＡの領域に対応する、１５〜２０のリボヌクレオチドを有する短いＲＮＡ配列を、標的を非機能的にし得る二次構造の特徴について評価することができる。さらに、候補のアミノペプチダーゼＮＲＮＡ標的の適合性を、リボヌクレアーゼ防護検定を用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する利用可能性を試験することによって評価することができる。より長い相補配列を用いて、標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大させることができる。リボザイムのハイブリダイズおよび開裂する領域は、相補領域を介して標的ＲＮＡにハイブリダイズすると、リボザイムの触媒領域が標的を開裂し得るといったように、完全に相関している。
【００９５】
リボザイムはＤＮＡ組み立て物の一部として細胞内に導入することができる。マイクロ注入、リポソーム仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、または燐酸カルシウム沈殿といった機械的方法を用いて、アミノペプチダーゼＮ発現の低下が望まれる細胞中にリボザイム含有ＤＮＡ組み立て物を導入することができる。これとは別に、細胞がＤＮＡ組み立て物を安定的に保持することが望まれる場合は、該組み立て物をプラスミド上で供給し、当分野で知られるように、別個のエレメントとして維持するか、または細胞のゲノム中に組み込むことができる。リボザイムをコードするＤＮＡ組み立て物は、細胞中のリボザイムの転写を調節するために、プロモーターエレメント、エンハンサーまたはＵＡＳエレメント、および転写ターミネーターシグナルといった転写調節エレメントを含み得る。
【００９６】
Haseloff et al., 米国特許5641673に教示のように、リボザイムは、標的遺伝子の発現を誘導する因子に応答してリボザイムの発現が起こるように設計することができる。リボザイムはまた、追加レベルの調節を提供するよう設計でき、その結果、ｍＲＮＡの破壊はリボザイムと標的遺伝子の両者が細胞に誘導された時にのみ起こる。
【００９７】
区別的に発現される遺伝子
遺伝子産物がヒトアミノペプチダーゼＮと相互作用する遺伝子の同定方法をここに記載する。このような遺伝子は、癌、ＣＮＳ障害およびＣＯＰＤを包含する（但しこれらに限定されない）障害において区別的に発現される遺伝子を表し得る。さらに、係る遺伝子は、このような障害の進行または処置に関連する操作に応答して区別的に調節される遺伝子を表し得る。加えて、このような遺伝子は、組織または生物の発生の異なる段階で増大または低下する、一時的に調節される発現を示すことができる。区別的に発現される遺伝子はまた、その発現を、対照対実験条件の下で調節させることができる。さらに、ヒトアミノペプチダーゼＮ遺伝子または遺伝子産物は、これ自体を区別的発現について試験できる。
【００９８】
発現が正常対疾病状態で相違する程度は、標準的なキャラクタリゼーション技術、例えば区別的ディスプレイ技術によって視覚化されるに十分に大きいという点だけは必要である。発現の相違を視覚化することのできる、その他のこのような標準的なキャラクタリゼーション技術は、定量的ＲＴ（逆転写酵素）、ＰＣＲ、およびノーザン分析を包含するが、これらに限定されない。
【００９９】
区別的に発現される遺伝子の同定
区別的に発現される遺伝子を同定するためには、目的とする組織から全ＲＮＡ、または好ましくはｍＲＮＡを単離する。例えば、ＲＮＡ試料は、実験対象の組織から、そして対照となる対象の対応組織から取得する。ｍＲＮＡの単離に対して選択しない任意のＲＮＡ単離技術を、係るＲＮＡ試料の精製に利用できる。例えば、Ausubel et al., ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, Inc. New York, 1987-1993を参照されたい。当業者に周知の技術、例えばChomczynski、米国特許4843155の一段階ＲＮＡ単離プロセスを用いて多数の組織試料を容易に処理することができる。
【０１００】
区別的に発現される遺伝子が産生したＲＮＡを表す、集められたＲＮＡ試料内部の転写物は、当業者に周知の方法により同定する。これらには、例えば、ディファレンシャルスクリーニング（Tedder et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 208-12, 1988）、差引きハイブリダイゼーション（Hedrick et al. , Nature 308, 149-53; Lee et al. , Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2825, 1984）、および好ましくはディファレンシャルディスプレイ（Liang & Pardee, Science 257, 967-71, 1992; 米国特許5262311）が包含される。
【０１０１】
区別的発現の情報はこれ自体、ヒトアミノペプチダーゼＮの関与する障害の治療のための関連法を示唆している。例えば、治療は、区別的に発現される遺伝子および／またはヒトアミノペプチダーゼＮをコードする遺伝子の発現の調節を包含し得る。区別的発現の情報は、区別的に発現される遺伝子もしくは遺伝子産物またはヒトアミノペプチダーゼＮ遺伝子もしくは遺伝子産物の活性または発現が、アップレギュレーションであるかダウンレギュレーションであるかを示すことができる。
【０１０２】
スクリーニング方法
本発明は、アミノペプチダーゼＮポリペプチドまたはアミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドに結合する、またはその活性を調節する、被験化合物をスクリーニングするための検定を提供する。被験化合物は好ましくはアミノペプチダーゼＮポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する。より好ましくは、被験化合物は、被験化合物の不在時と比較して、酵素活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下または増大させる。
【０１０３】
被験化合物
被験化合物は当分野で既知の薬理学的試薬であってよく、または薬理活性を持っていることが前もって分かっていない化合物であってよい。この化合物は天然に存在する、または実験室で設計されたものであってよい。これらは、微生物、動物、または植物から単離されたものであってよく、そして組換え的に調製され、または当分野で既知の化学的方法により合成されたものであってよい。所望により被験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的アドレス可能な並行固相または液相ライブラリー、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法、「一ビーズ一化合物」ライブラリー法、およびアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）当分野で既知の数多くの組み合わせライブラリー法のいずれかを用いて取得できる。生物学的ライブラリーの方法は、ポリペプチドライブラリーに限定されているが、他の４種のアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる。Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145, 1997を参照されたい。
【０１０４】
分子ライブラリーの合成法は当分野でよく知られている（例えば、DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6909, 1993; Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678, 1994; Cho et al., Science 261, 1303, 1993; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059, 1994; Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061; Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233, 1994を参照されたい）。化合物のライブラリーは溶液で（例えば、Houghten, Biotechniques 13, 412-421, 1992）、またはビーズ(Lam, Nature 354, 82-84, 1991)、チップ（Fodor, Nature 364, 555-556, 1993）、細菌または胞子（Ladner、米国特許5223409）、プラスミド（Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 1865-1869, 1992）、またはファージ（Scott & Smith, Science 249, 386-390, 1990; Devlin, Science 249, 404-406, 1990）;Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 97, 6378-6382, 1990; Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310, 1991; およびLadner、米国特許5223409）上に提供できる。
【０１０５】
ハイスループットスクリーニング
被験化合物は、ハイスループットスクリーニングを用いて、アミノペプチダーゼＮポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する能力、またはアミノペプチダーゼＮ活性もしくはアミノペプチダーゼＮ遺伝子発現に影響を及ぼす能力についてスクリーニングすることができる。ハイスループットスクリーニングを使用して、多くの化合物を個々に並行して試験でき、その結果多数の被験化合物を迅速にスクリーニングできる。最も広範に確立されている技術は、９６ウェルマイクロタイタープレートを利用するものである。このマイクロタイタープレートのウェルは、典型的には５０〜５００μlの範囲の検定容量を必要とする。このプレートに加えて、９６ウェルフォーマットに適合させた多くの機器、材料、ピペット、ロボット、プレート洗浄機、およびプレート読み取り機が市販されている。
【０１０６】
別法として、「フリーフォーマット検定」、即ち試料間に物理的障壁を持たない検定が使用できる。例えば、組み合わせペプチドライブラリーのための、単純な均質検定で色素細胞（メラノサイト）を用いる検定が、Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 19, 1614-18(1994)に記載されている。ペトリ皿中のアガロースの下にこの細胞を入れた後、組み合わせ化合物を伴っているビーズをアガロースの表面に載せる。組み合わせ化合物はこのビーズから化合物を部分的に放出する。化合物がゲルマトリックス中へと局所的に拡散するにつれて活性化合物が細胞の色の変化を惹起するため、活性化合物を暗色色素領域として視覚化することができる。
【０１０７】
フリーフォーマット検定のもう一つの例は、生体分子スクリーニング学会第１回年次総会（Philadelphia, Pa. 、1995年11月7-10日）で報告されたChelsky、「Strategies for Screening Combinatorial Libraries: Novel and Traditional Approaches, 」により記載されている。Chelskyは、炭酸脱水酵素のための単純な均質酵素検定をアガロースゲルの内部に入れて、ゲル中の酵素がゲル全体に色の変化を惹起するようにさせた。その後、光リンカーを介して組み合わせ化合物を持つビーズをゲル内部に入れ、該化合物をＵＶ光により部分的に放出させた。酵素 を阻害する化合物は、色の変化の少ない局所的な阻害領域として観察された。
【０１０８】
さらに別の例がSalmon et al., Molecular Diversity 2, 57-63(1996)に記載されている。この例では、組み合わせライブラリーを、寒天中で生育する癌細胞への細胞毒性効果を有する化合物についてスクリーニングした。
【０１０９】
もう一つのハイスループットスクリーニング法がBeutel et al. 、米国特許5976813に記載されている。この方法では、被験試料を多孔性マトリックスに入れる。次に１またはそれ以上の検定成分を、マトリックス、例えばゲル、プラスチックシート、フィルター、またはその他の形の容易に操作できる固体担体の内部、上、または底に入れる。試料がこの多孔性マトリックスに導入されると、これら試料は充分ゆっくりと拡散し、被験試料が混ざらずに検定を遂行することができる。
【０１１０】
結合検定
結合検定については、被験化合物は好ましくは、例えばアミノペプチダーゼＮポリペプチドの活性部位に結合してこれを占有し、その結果正常な生物学的活性が妨げられるような小分子である。このような小分子の例は、小ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに限定される訳ではない。
【０１１１】
結合検定では、被験化合物またはアミノペプチダーゼＮポリペプチドのいずれかは、検出可能な標識、例えば蛍光、放射性同位元素、化学ルミネセント、または酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼ）を含むことができる。そこで、アミノペプチダーゼＮポリペプチドに結合している被験化合物の検出は、例えば放射能の放出を直接計数することにより、またはシンチレーション計数により、または検出可能な産物への適当な基質の変換を測定することにより、達成することができる。
【０１１２】
別法として、アミノペプチダーゼＮポリペプチドへの被験化合物の結合を、反応体のいずれをも標識せずに測定することができる。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、被験化合物とアミノペプチダーゼＮポリペプチドとの結合を検出することができる。マイクロフィジオメーター（例えばサイトセンサー（Cytosensor（商標））とは、細胞がその環境を酸性化する速度を光応答性（addressable）電位差センサー（ＬＡＰＳ）を用いて測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、被験化合物とアミノペプチダーゼＮポリペプチドの間の相互作用の指標として用いることができる（McConnell et al., Science 257, 1906-1912, 1992）。
【０１１３】
被験化合物がアミノペプチダーゼＮポリペプチドに結合する能力の測定はまた、リアルタイムのBimolecular Interaction Analysis（ＢＩＡ）のような技術を用いて達成することができる（Sjolander & Urbaniczky, Anal.Chem. 63,2338-2345,1991、およびSzabo et al., Curr.Opin.Struct.Biol. 5,699-705,1995）。ＢＩＡは、いかなる反応体をも標識せずに、生体特異的相互作用をリアルタイムで研究するための技術である（例えばBIAcore(商標)）。光学的現象表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化を、生体分子間のリアルタイムの反応の指標に使用できる。
【０１１４】
本発明のさらに別の態様では、アミノペプチダーゼＮポリペプチドを二ハイブリッド検定または三ハイブリッド検定（例えば、米国特許5283317; Zervos et al., Cell 72,223-232,1993; Madura et al., J.Biol.Chem. 268,12046-12054,1993; Bartel et al., Biotechniques 14,920-924,1993; Iwabuchi et al., Oncogene 8,1693-1696,1993; およびBrent WO94/10300）における「おとりタンパク質」として使用し、アミノペプチダーゼＮポリペプチドに結合またはこれと相互作用してその活性を調節する他のタンパク質を同定することができる。
【０１１５】
二ハイブリッド系は大部分の転写因子のモジュール的性格に基づくものであり、それは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインから成っている。簡潔に述べると、この検定は二種の異なるＤＮＡ組み立て物を利用する。例えば、一方の組み立て物においては、アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、既知の転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合できる（例えばＧＡＬ−４）。別の組み立て物においては、未同定タンパク質（「餌」または「試料」）をコードするＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合できる。もし「おとり」および「餌」タンパク質がインビボで相互作用してタンパク質依存複合体を形成できたならば、該転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは極めて近位に招来される。この近位性は、転写因子に応答する転写調節部位と機能的に結合しているリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。リポーター遺伝子の発現は、検出することができ、機能的転写因子を含む細胞コロニーは、単離して、アミノペプチダーゼＮポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を得るために使用することができる。
【０１１６】
反応体の一方または両方の非結合型からの結合型の分離を促進するため、そして検定の自動化の便宜を図るため、アミノペプチダーゼＮポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固定化することが望ましいかも知れない。したがって、アミノペプチダーゼＮポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固体支持体に結合させることができる。好適な固体支持体は、ガラスまたはプラスチックスライド、組織培養プレート、マイクロタイターウェル、チューブ、シリコンチップ、またはビーズ（ラテックス、ポリスチレン、またはガラスビーズを包含するがこれらに限定されない）のような粒子を包含するがこれらに限定されない。酵素ポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または試験化合物を、共有および非共有結合、受動吸収、またはそれぞれポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物に付着させた結合部分と固体支持体の対、の使用を包含する当分野で既知の任意の方法を用いてアミノペプチダーゼＮポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物を固体支持体に付着させることができる。被験化合物は、好ましくは、個々の被験化合物の位置を追跡することができるように、固体支持体に整列させて結合させることができる。アミノペプチダーゼＮポリペプチド（またはポリヌクレオチド）への被験化合物の結合は、反応体を入れるのに適した任意の容器で達成することができる。係る容器の例にはマイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管がある。
【０１１７】
一つの態様において、アミノペプチダーゼＮポリペプチドは、アミノペプチダーゼＮポリペプチドを固体支持体に結合させるドメインを含む融合タンパク質である。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St.Louis, Mo.）上またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させ、次いでこれを被験化合物または被験化合物および非吸着アミノペプチダーゼＮポリペプチドに合し；次にこの混合物を複合体形成が行われる条件下でインキュベートする（例えば、塩およびpHに関して生理的条件）。インキュベーションの後、ビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルを洗浄して未結合成分を除去する。反応体の結合は上記のように直接的または間接的に測定できる。別法として、複合体を固体支持体から解離させた後に結合を測定することができる。
【０１１８】
本発明に係るスクリーニング検定には、タンパク質またはポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化するためのその他の技術を使用することもできる。例えば、アミノペプチダーゼＮポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化できる。当分野で周知の技術（例えばビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford,Ill.）を用いて、ビオチニル化したアミノペプチダーゼＮポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆した９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定化できる。別法として、アミノペプチダーゼＮポリペプチド、ポリヌクレオチド、または被験化合物に特異的に結合するが、所望の結合部位、例えばアミノペプチダーゼＮポリペプチドの活性部位に干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができる。未結合の標的またはタンパク質が抗体コンジュゲーションによりウェル中に捕捉できる。
【０１１９】
ＧＳＴ−固定化複合体について上に記載した方法に加え、このような複合体を検出する方法には、アミノペプチダーゼＮポリペプチドまたは被験化合物に特異的に結合する抗体を用いる、複合体の免疫検出、アミノペプチダーゼＮポリペプチドの活性検出へと引き継がれる酵素結合検定、および非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動がある。
【０１２０】
アミノペプチダーゼＮポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する被験化合物のスクリーニングは、無傷の細胞で実施することもできる。アミノペプチダーゼＮポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む任意の細胞が、細胞に基づく検定系で使用できる。アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドは細胞中に天然に存在し、または上記のような技術を用いて導入することができる。アミノペプチダーゼＮポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合は、上記のように測定する。
【０１２１】
機能検定
ヒトアミノペプチダーゼＮポリペプチドの酵素活性を増大または低下させる能力について被験化合物を試験できる。酵素活性は、例えば、Ishii et al.（Int. J. Cancer 92(1): 49-54, 2001）に記載されているように測定することができる。
【０１２２】
酵素分析は、精製したアミノペプチダーゼＮポリペプチド、細胞膜調製物、または無傷の細胞のいずれかを被験化合物と接触させた後に実施できる。アミノペプチダーゼＮポリペプチドの酵素活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる被験化合物を、ヒトアミノペプチダーゼＮ活性を減少させる可能性ある試薬として同定する。ヒトアミノペプチダーゼＮの酵素活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％増大させる被験化合物を、ヒトアミノペプチダーゼＮ活性を増大させる可能性ある試薬として同定する。
【０１２３】
遺伝子発現
別の態様では、アミノペプチダーゼＮ遺伝子発現を増大または減少させる被験合物を同定する。アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドを被験化合物と接触させ、アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドのＲＮＡまたはポリペプチド産物の発現を測定する。被験化合物存在下での適当なｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを、該被験化合物不在下でのｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較する。次いで、被験化合物を、この比較に基づく発現のモジュレーターとして同定することができる。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時のほうが大きい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の刺激因子または増強因子と同定する。また、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時のほうが小さい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のインヒビターと同定する。
【０１２４】
細胞におけるアミノペプチダーゼＮ ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを検出するための当分野で周知の方法により測定することができる。定性または定量的方法のいずれかが使用できる。アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在は、例えばラジオイムノアッセイのような免疫化学的方法、ウエスタンブロッティング、および免疫組織化学を包含する、当分野で周知の様々な技術を用いて測定することができる。別法として、ポリペプチド合成は、アミノペプチダーゼＮポリペプチド内への標識アミノ酸の取り込みを検出することにより、インビボで、細胞培養で、またはインビトロ翻訳系で測定することができる。
【０１２５】
このようなスクリーニングは、無細胞検定系または無傷の細胞のいずれかで実施することができる。アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドを発現するいかなる細胞も細胞に基づく検定系で使用できる。アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチドは細胞内に天然に存在するか、または上記のような技術を用いて導入することができる。一次培養または確立されたセルライン、例えばＣＨＯまたはヒト胚性腎２９３細胞のいずれかを使用できる。
【０１２６】
医薬組成物
本発明はさらに、治療効果を達成するために患者に投与することができる医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えばアミノペプチダーゼＮポリペプチド、アミノペプチダーゼＮポリヌクレオチド、リボザイムまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド、アミノペプチダーゼＮポリペプチドに特異的に結合する抗体、または模擬物、アミノペプチダーゼＮポリペプチド活性の活性化因子またはインヒビターを含み得る。この組成物は単独で、または少なくとも１種類の他の試薬、例えば安定化化合物と組み合わせて投与でき、これは、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、および水を包含する（但しこれらに限定されない）任意の無菌で生物学的適合性のある製薬的担体中で投与することができる。この組成物は単独で、または他の試薬、薬物またはホルモンと組み合わせて患者に投与することができる。
【０１２７】
活性成分に加えてこれらの医薬組成物は、製薬的に使用できる調製物への活性化合物の処理を促進する賦形剤および補助試薬を含む適当な製薬的に許容し得る担体を含有することができる。本発明に係る医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下、または直腸手段を包含する（但しこれらに限定されない）多くの経路により投与することができる。経口投与用医薬組成物は、当分野で既知の製薬的に許容し得る担体を用いて経口投与に適した用量に調合できる。このような担体により、該医薬組成物を、患者が内服するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに調合できる。
【０１２８】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を、固体賦形剤と合し、得られた混合物を所望により粉砕し、そしてこの顆粒混合物を、所望ならば適当な補助試薬を加えた後に処理して錠剤または糖衣剤核を得る。好適な賦形剤は炭水化物またはタンパク質増量剤、例えば乳糖、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを包含する糖；トウモロコシ、小麦、米、馬鈴薯、またはその他の植物由来の澱粉；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを包含するゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質である。所望により崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加できる。
【０１２９】
糖衣剤核は、濃縮糖溶液のような適当な被覆剤と共に使用でき、これはさらに、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。製品の同定のためまたは活性化合物の量、即ち用量をあらわすために染料または色素を錠剤または糖衣被覆剤に添加できる。
【０１３０】
経口的に使用できる医薬調合物は、ゼラチン製の押してはめ込む（push-fit）カプセル剤、ならびに、ゼラチンおよび被覆剤、例えばグリセロールまたはソルビトールでできた軟封入カプセル剤を包含する。押してはめ込むカプセル剤は、活性成分を、乳糖または澱粉のような増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定剤と混合して含有できる。軟カプセル剤では、活性化合物を、安定剤を加えたまたは加えない適当な液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁することができる。
【０１３１】
非経口投与に好適な医薬製剤は、水溶液、好ましくは生理学的適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝化した食塩水中で調合できる。水性注射用懸濁剤は、該懸濁液の粘度を増加させる試薬、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有できる。さらに、活性化合物の懸濁剤は適当な油性注射用懸濁剤として調製できる。好適な親油性溶媒または媒質は、胡麻油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。非脂質ポリカチオンアミノポリマーもまたデリバリーに使用できる。所望により懸濁剤は、化合物の溶解性を増し高濃縮溶液の調製を可能にするような適当な安定剤または試薬を含むことができる。局所または鼻腔投与のためには、透過すべき特定の障壁に対し適当な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は当分野で一般に知られている。
【０１３２】
本発明に係る医薬組成物は当分野で既知の方法で、例えば常套的混合、溶解、顆粒化、糖衣剤製造、すりつぶし、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥プロセスによって製造できる。この医薬組成物は塩として提供でき、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸などを包含する（但しこれらに限定されない）多くの酸を用いて調製できる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒において、対応する遊離塩基型よりもより可溶性の傾向がある。別の場合には、好ましい調製物は、pH範囲４.５ないし５.５において以下のもの：１〜５０ｍＭヒスチジン、０.１％〜２％シュクロース、および２〜７％マンニトール、の全てまたは任意のものを含有できる凍結乾燥粉末であってよく、これを使用前に緩衝液と合する。
【０１３３】
調合と投与のための技術のさらなる詳細は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES（Maack Publishing Co., Easton, Pa）の最新版に見出すことができる。医薬組成物を製造した後、これらを適当な容器に入れ、適応状態の治療のためにラベルを貼る。このようなラベル表示は、投与の量、頻度、および投与方法を包含する。
【０１３４】
治療上の適応および方法
ヒトアミノペプチダーゼＮを調節して、癌、ＣＮＳ障害およびＣＯＰＤを処置することができる。
【０１３５】
癌
癌は、基本的に発癌性細胞形質転換によって発症する疾患である。形質転換細胞をそれらの正常な対応物から区別し、かつ癌の病態生理に基づく形質転換細胞の特徴は幾つかある。それらには、非制御型細胞性増殖、通常の死誘導シグナルに対する不応答（不死化）、増大した細胞運動性および侵襲性、新たな血管新生の誘導を通じた血液供給を補充するための増大した能力（血管新生）、遺伝子の不安定性、並びに調節不全遺伝子発現が挙げられる。薬剤耐性の獲得とともに、これらの異常な生理機能の種々の組み合わせににより、最終的に臓器不全および患者の死となる難治性疾患状態に頻繁に陥る。
【０１３６】
最も一般的な癌治療は、細胞増殖を標的とし、形質転換細胞と正常細胞との間の効率に関するその特異な増殖能に基づいている。このアプローチは、幾つかの重要な正常細胞タイプもまた高増殖であり、かつ癌細胞が高頻度にこれらの物質に対して耐性となるという現実により妨げられている。従って、従来の抗癌治療についての治療指数は珍しく２.０を超えている。
【０１３７】
ゲノミクス主導の分子標的同定は、癌患者に安全で、かつより効率的な処置を提供する治療介入のための新たな癌特異的標的を同定する可能性を開いた。従って、新たに発見される腫瘍関連遺伝子およびその産物を疾患におけるそれらの機能（群）について試験でき、そして革新的な治療を発見し、かつ発展させるためのツールとして用いることができる。以上に概説した生理学的プロセスの多くに重要な働きがある遺伝子は、癌標的として特徴付けることができる。
【０１３８】
ゲノミクスを通じて同定される遺伝子または遺伝子断片は容易に１つまたはそれ以上の非相同（ヘテローガス）発現系において発現させ、機能性組換えタンパク質を産生させることができる。このタンパク質は、その生物学的機能についてインビトロで特徴付けられ、その後その生物化学的活性の化学修飾因子（モジュレーター）を同定するため、ハイスループット分子スクリーニングプログラムにおけるツールとして用いられる。標的タンパク質活性のアゴニストおよび／またはインヒビターをこの様式で同定し、次いで、細胞およびインビボ疾患モデルにて抗癌活性について試験する。生物学的モデルにおける反復試験や、詳細な薬物動態力学的分析および中毒学的分析を用いたリード化合物の最適化により、薬物開発および次のヒトでの試験についての基礎を形成する。
【０１３９】
ＣＮＳ障害
中枢および末梢神経系障害、例えば、脳損傷後の原発性および二次的障害、気分の障害、不安障害、思考および意思の障害、睡眠および覚醒の障害、運動単位の疾患、例えば、神経性および筋障害性の障害、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病およびパーキンソン病および末梢および慢性的な疼痛もまた処置することができる。
【０１４０】
ＣＮＳ障害に関連する疼痛もまた、ヒトアミノペプチダーゼＮの活性を調節することによって処置できる。処置できる疼痛には、中枢神経系障害と関連するもの、例えば多発性硬化症、脊髄損傷、坐骨神経痛、失敗した腰部手術(failed back surgery)症候群、外傷性脳損傷、癲癇、パーキンソン病、脳卒中後、および脳や脊髄における血管破壊（例えば、梗塞、出血、血管新生異常）が挙げられる。非中枢神経因性疼痛には、乳房切除術後疼痛、反射性交感神経性ジストロフィー（ＲＤＳ）、三叉神経痛ラジオキュロパシー(trigeminal neuralgiaradio−culopathy)、術後の疼痛、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ関連疼痛、癌疼痛、代謝神経痛（例えば、糖尿病性神経障害、結合組織疾患に対する第２の血管炎神経障害）、例えば肺癌種、白血病、リンパ腫、前立腺、大腸若しくは胃癌種、三叉神経痛および疱疹後神経痛と関連する腫瘍随伴性多発神経障害が挙げられる。癌および癌処置と関連する疼痛もまた処置でき、頭痛（例えば感覚的刺激を伴う片頭痛、感覚的刺激を伴わない片頭痛、および他の片頭痛障害）、偶発性および慢性緊張性頭痛、緊張型様頭痛、群発性頭痛や慢性発作性片頭痛も処置できる。
【０１４１】
慢性閉塞性肺（または気道）疾患（ＣＯＰＤ）は、慢性気管支炎による肺気腫および末梢気道閉塞の併発が一般的な原因である、気流閉塞として生理的に定義される状態である（Senior＆Shapiro, Pulmonary Diseases and Disorders, 3d ed., New York, McGraw-Hill, 1998, pp. 659-681,1998; Barnes, Chest 117, 10S-14S, 2000）。肺気腫は、肺空気間隙の異常な拡張を引き起こす肺胞壁の破壊によって特徴付けられる。慢性気管支炎は、慢性的な喀痰を伴う咳が１年３ヶ月間、２年間連続して見られる状態として臨床的に定義される。ＣＯＰＤにおいては、気流閉塞は一般に進行性であり、希に好転することがある。ＣＯＰＤの発症において、タバコの喫煙はかなり重要な危険因子であるが、この疾患は非喫煙者にも発症する。
【０１４２】
気道の慢性炎症は、ＣＯＰＤの鍵となる病態的特徴である（Senior＆Shapiro, 1998）。炎症細胞群には、増加した数のマクロファージ、好中球およびＣＤ８＋リンパ球が含まれる。吸引した刺激物、例えばタバコの煙が、気道に常在するマクロファージを活性化し、同様にケモカイン（例えば、インターロイキン−８）および他の走化因子の放出につながる上皮細胞を活性化する。これらの走化因子が作用して、血液から肺組織および気道へ輸送される好中球／単球を増加させる。気道に運ばれた好中球および単球が、ダメージを与える可能性のある種々の媒介物、例えばタンパク質分解酵素や活性酸素種を放出し得る。マトリックス分解、並びに気道壁の肥大化、界面活性機能障害および粘液過分泌を伴う気腫、これら全ては、可能性がある炎症性応答の合併症であり、気流およびガス交換の障害につながる。
【０１４３】
本発明は、上記のスクリーニング検定によって同定される新規試薬の使用にさらに関する。従って、本明細書に記載したように同定される被験化合物を適当な動物モデルに使用することは、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書に記載したように同定される試薬（例えば、調節試薬、アンチセンス核酸分子、特異的抗体、リボザイムまたはアミノペプチダーゼＮポリペプチド結合分子）を、そのような試薬を用いた処置の効果、毒性または副作用を決定するために、動物モデルに用いることができる。あるいは、本明細書に記載したように同定された試薬を、該試薬の作用機序を決定するために、動物モデルに使用することができる。さらに、本発明は、本明細書に記載した処置に対する上記スクリーニング検定によって同定される新規試薬の使用に関する。
【０１４４】
アミノペプチダーゼＮ活性に影響を及ぼす試薬を、インビトロまたはインビボのいずれかにおいてアミノペプチダーゼＮ活性を低下させるために、ヒト細胞に投与することができる。この試薬は、ヒトアミノペプチダーゼＮ遺伝子の発現産物と結合することが好ましい。その発現産物がタンパク質である場合、この試薬は抗体であることが好ましい。生体外でのヒト細胞の処置については、抗体を、人体から取り出しておいた幹細胞の調製物に添加することができる。その後、その細胞を、当分野で周知のように、クローン増殖させるか、またはさせずに同じまたは別の人体に戻すことができる。
【０１４５】
１つの態様においては、リポソームを用いて試薬を送達する。好ましくは、リポソームは、投与した動物にて、少なくとも約３０分間、より好ましくは少なくとも約１時間、さらにより好ましくは少なくとも約２４時間安定であることが好ましい。リポソームは、試薬、特にポリヌクレオチドを、動物（例えばヒト）の特定の部位に標的化することができる脂質組成物を含む。好ましくは、リポソームの脂質組成物は、動物の特定の器官、例えば肺、肝臓、脾臓、心臓、脳、リンパ節および皮膚を標的化できる。
【０１４６】
本発明に有用なリポソームは、標的化した細胞の原形質膜と融合でき、その内容物を細胞に送達できる脂質組成物を含む。好ましくは、リポソームのトランスフェクション効率は約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約０.５μｇであり、より好ましくは約１０6細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約１.０μｇであり、さらにより好ましくは約１０6細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約２.０μｇである。好ましくは、リポソームは、直径が、約１００〜５００ｎｍであり、より好ましくは約１５０〜４５０ｎｍであり、さらにより好ましくは約２００〜４００ｎｍである。
【０１４７】
本発明に用いるに適したリポソームは、例えば当業者に知られる遺伝子送達法に標準的に用いられるリポソームを含む。より好ましいリポソームは、ポリカチオン脂質組成物を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリコールと連結されたコレステロールバックボーン（骨格鎖）を有するリポソームを含む。場合により、リポソームは特定の細胞タイプを標的化できる化合物、例えばリポソームの外側表面に曝される細胞特異的リガンドを包含する。
【０１４８】
リポソームを、試薬、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムと複合体化することは、当分野で標準的な方法 (例えば、米国特許5,705,151を参照のこと) を用いて達成することができる。好ましくは、ポリヌクレオチド約０.１μｇ〜約１０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌ、より好ましくは約０．５μｇ〜５μｇのポリヌクレオチドと組み合わせる、より好ましくはポリヌクレオチド約０.５μｇ〜約５μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと組み合わせる、さらにより好ましくはポリヌクレオチド約１．０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと組み合わせる。
【０１４９】
別の態様においては、抗体を、受容体媒介性標的化送達を用いて、インビボにて特定の組織に送達することができる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技術は、例えば、Findeisら、Trends in Biotechnol. 11, 202-05 (1993); Chiouら、GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J. A. Wolffら、) (1994); Wu ＆ Wu, J. Biol. Chem. 263, 621-24 (1988); Wuら、J. Biol. Chem. 269, 542-46 (1994); Zenkeら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87, 3655-59 (1990); Wuら、J. Biol. Chem. 266, 338-42 (1991) にて教示されている。
【０１５０】
治療的有効量の決定
治療的有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内にある。治療的有効量とは、治療的有効量の不在下で起こるアミノペプチダーゼＮ活性に比較してアミノペプチダーゼＮ活性を増大または低下させる活性成分の量を指す。
【０１５１】
いかなる化合物に関しても、治療的有効量は、はじめに、細胞培養検定にて、または動物モデル（通常、マウス、ウサギ、イヌ、またはブタ）において見積もることができる。動物モデルは適当な濃度範囲および投与経路の決定にも使用できる。次にこのような情報を用いて、ヒトでの有用な用量と投与経路を決定することができる。
【０１５２】
治療的有効性および毒性、例えばＥＤ50（集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ50（集団の５０％で致死的な用量）は、培養細胞または実験動物にて、標準的薬学的方法により決定することができる。治療効果に対する毒性効果の用量比が治療指数であり、ＬＤ50／ＥＤ50の比で表すことができる。
【０１５３】
大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。培養細胞検定および動物実験から得られるデータを、ヒトへの使用のための用量範囲を処方する際に使用する。かかる組成物に含まれる用量は、好ましくは殆どまたは全く毒性を持たないＥＤ50を包含する循環濃度の範囲内である。この用量は、使用する用量型、患者の感受性、および投与経路に応じてこの範囲内で変わる。
【０１５４】
正確な用量は、治療を必要とする対象に関連する因子に照らして医師が決定する。用量および投与は、充分なレベルの活性成分を提供するよう、または所望の効果を保持するよう、調節する。考慮できる因子は、疾病状態の重篤度、対象の全身健康状態、年齢、体重、および対象の性別、食餌、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応の感受性、および療法に対する寛容／応答を包含する。長時間作用性医薬組成物は、その具体的な製剤の半減期およびクリアランス率に応じて３から４日毎、毎週、または２週間に１回投与することができる。
【０１５５】
標準的な用量は、投与経路に応じて０.１〜１００,０００μｇまで変更することができ、総用量約１ｇまでとすることができる。特定の用量および送達方法についての指針は文献に提供されており、一般に当分野の医師が入手できる。当業者は、ヌクレオチド用にはタンパク質またはそれらのインヒビター用のものとは異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞、状態、場所などに特異的である。
【０１５６】
この試薬が一本鎖抗体である場合、この抗体をコードするポリヌクレオチドを構築し、トランスフェリン−ポリカチオン−媒介ＤＮＡ転移、裸のまたはカプセル内核酸を用いるトランスフェクション、リポソーム媒介の細胞融合、ＤＮＡ被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」、およびＤＥＡＥまたは燐酸カルシウム介在のトランスフェクションを包含する（但しこれらに限定される訳ではない）十分に確立した技術を用いて、ex vivoまたはインビボで細胞内に導入することができる。
【０１５７】
抗体の有効なインビボ用量は、約５μg〜約５０μg/kg、約５０μg〜約５mg/kg、約１００μg〜約５００μg/kg（患者の体重）、および約２００〜約２５０μg/kg（患者の体重）の範囲である。一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドの投与のためには、有効なインビボ用量は、約１００ng〜約２００ng、５００ng〜約５０mg、約１μg〜約２mg、約５μg〜約５００μg、および約２０μg〜約１００μgのＤＮＡの範囲である。
【０１５８】
発現産物がｍＲＮＡである場合、試薬は好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを発現するポリヌクレオチドは、上記のように、多岐にわたる方法によって細胞中に導入することができる。
【０１５９】
好ましくは、試薬は、アミノペプチダーゼＮ遺伝子の発現またはアミノペプチダーゼＮポリペプチドの活性を、該試薬の不在時と比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる。アミノペプチダーゼＮ遺伝子の発現レベルまたはアミノペプチダーゼＮポリペプチドの活性を低下させるよう選択した機構の有効性は、当分野で周知の方法、例えばアミノペプチダーゼＮ特異的ｍＲＮＡへのヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、アミノペプチダーゼＮポリペプチドの免疫学的検出、またはアミノペプチダーゼＮ活性の測定を用いて評価することができる。
【０１６０】
上記のいずれの態様においても、本発明に係る任意の医薬組成物は他の適当な治療薬と組み合わせて投与することができる。併用療法に使用するための適当な試薬の選択は、常套的製薬原理に従って当業者が実施することができる。治療薬の組み合わせは、相乗的に作用して、上記の様々な疾患の治療または予防を奏効させる。このアプローチを用いて、より低い各試薬の用量で治療効果を達成することができ、有害な副作用の可能性を低減することができる。
【０１６１】
上記の任意の治療方法を、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトといった哺乳動物を包含する、このような治療を必要とする任意の対象に適用することができる。
【０１６２】
診断方法
ヒトアミノペプチダーゼＮはさらに、この酵素をコードする核酸配列における突然変異の存在に関連する疾病および異常、または疾病および異常に対する感受性を検出する診断検定に使用できる。例えば、疾病に罹患している個体と正常な個体とにおけるアミノペプチダーゼＮをコードするｃＤＮＡまたはゲノム配列の間の相違を決定することができる。もし罹患している個体の幾つかまたは全てに突然変異が観察され、正常な個体には観察されないならば、この突然変異がその疾病の原因であると思われる。
【０１６３】
参照遺伝子と突然変異を有する遺伝子との間の配列の相違は、直接のＤＮＡ配列決定法によって明らかにできる。加えて、クローニングしたＤＮＡセグメントを、特定のＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして使用できる。この方法の感受性はＰＣＲと組み合わせたときに大きく増大する。例えば、二本鎖ＰＣＲ産物または修飾ＰＣＲにより調製された一本鎖鋳型分子と共に、配列決定プライマーを使用することができる。配列決定は、放射標識したヌクレオチドを用いる常套的方法によって、または蛍光標識を使用する自動配列決定法によって実施する。
【０１６４】
ＤＮＡ配列相違に基づく遺伝子試験は、変性試薬を含むまたは含まないゲル中のＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化を検出することにより実施することができる。小さな配列の欠失および挿入は、例えば高分解能ゲル電気泳動によって視覚化できる。異なる配列のＤＮＡ断片は変性させるホルムアミド勾配ゲル上で識別でき、ここでは、異なるＤＮＡ断片の移動度が、それらの特異的融解温度または部分的融解温度に従って、ゲル中の異なる位置で遅延する（例えば、Myersら、Science 230, 1242, 1985を参照されたい）。特定の位置での配列改変もまたヌクレアーゼ保護検定、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂法によって明らかにすることができる（例えば、Cottonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 4397-4401, 1985）。即ち特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的開裂、直接のＤＮＡ配列決定といった方法によって、または制限酵素とゲノムＤＮＡのサザンブロッティングを使用することによって実施することができる。ゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定のような直接法に加えて、突然変異はin situ分析により検出することもできる。
【０１６５】
アミノペプチダーゼＮのレベルの変化もまた種々の組織で検出できる。血液または組織生検のような、宿主から得られた身体試料中の受容体ポリペプチドのレベルを検出するために用いる検定は、当業者に周知であり、ラジオイムノアッセイ、競合的結合検定、ウェスタンブロット分析、およびELISA検定を包含する。
【０１６６】
本明細書に引用する全ての特許および特許出願は、引用により本明細書の一部とする。上記の開示は本発明を一般的に記載するものである。より完全な理解は以下の具体的な実施例を参照することによって得られ、それらの実施例は説明目的で提供するものであり、本発明の範囲を限定する意図は無い。
【実施例】
【０１６７】
実施例１
アミノペプチダーゼＮ活性の検出
配列番号１に記載のポリヌクレオチドを発現ベクターｐＣＥＶ４に挿入し、得られた発現ベクターｐＣＥＶ４−アミノペプチダーゼＮポリペプチドをヒト胚の腎臓２９３細胞にトランスフェクトする。これらの細胞から溶解物を得、１ｍLあたりＲＮアーゼＡ（ＥＣ３．１．２７．５；Sigma）１５Ｕと３７℃にて３０分間、および１ｍLあたりＤＮアーゼＩ（ＥＣ３．１．２１．１；Sigma）１．７Ｕと２０℃にて３０分間インキュベーションし、細胞抽出物を、２０，０００×ｇにて２０分間の遠心により回収する。タンパク質の濃度を、ウシ血清アルブミンを標準としてBradfordの方法により推定する。アミノペプチダーゼＮ活性の測定のために、蛍光法により１１８μＭ のＬys−７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）（Bachem）に対して０．１Ｍリン酸ナトリウム（pH７．０）中３７℃にて、標準の酵素分析を行う。試料の体積は２〜１００μLであり、活性は、タンパク質１ｍgが、１分間あたりに基質を加水分解するマイクロモル数で表する。配列番号２のポリペプチドがアミノペプチダーゼＮ活性を有することが示される。
【０１６８】
実施例２
組換えヒトアミノペプチダーゼＮの発現
ピキア パストリス(Pichia pastoris)発現ベクターｐＰＩＣＺＢ(Invitrogen, San Diego, CA) を用いて、大量の組換えヒトアミノペプチダーゼＮポリペプチドを酵母中に産生させる。アミノペプチダーゼＮコード化ＤＮＡ配列は配列番号１から誘導する。ベクターｐＰＩＣＺＢに挿入する前に、ＤＮＡ配列を、その５'端に開始コドン、および３'端にエンテロキナーゼ開列部位、Ｈｉｓ６レポータータグや終止コドンを含ませるといった周知の方法によって修飾する。さらに、その両末端に制限エンドヌクレアーゼの認識配列を加え、対応する制限酵素を用いてｐＰＩＣＺＢの複数のクローニング部位を消化した後に、修飾されたＤＮＡ配列をｐＰＩＣＺＢ中にライゲートする。この発現ベクターを、ピキア パストリスにおいて、発現が酵母プロモーターにより誘導される誘導性発現用に設計する。得られたｐＰＩＣＺ／ｍｄ−Ｈｉｓ６ベクターを用いて、酵母を形質転換する。
【０１６９】
この酵母を、５リッター振盪フラスコ中で通常の条件下にて培養し、組換えにより産生したタンパク質を、８Ｍ尿素の存在下でアフィニティークロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ−樹脂）により培養物から単離する。結合したポリペプチドを、ｐＨ３.５の緩衝液を用いて溶出し、中和する。Ｈｉｓ６レポータータグからのポリペプチドの分離は、製造元の指示に従い、エンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA）を用いる部位特異的タンパク質分解により行なう。精製されたヒトアミノペプチダーゼＮポリペプチドが得られる。
【０１７０】
実施例３
アミノペプチダーゼＮポリペプチドと結合する被験化合物の同定
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質を含み９６ウェル マイクロタイタープレートのグルタチオン誘導化ウェルに吸着した精製アミノペプチダーゼＮポリペプチドを、生理緩衝溶液ｐＨ７.０の小分子ライブラリー由来の被験化合物と接触させる。ヒトアミノペプチダーゼＮポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。被験化合物は蛍光標識を含む。この試料を５分間〜１時間インキュベートする。コントロール試料は、被験化合物の非存在下にてインキュベートする。
【０１７１】
被験化合物を含む緩衝液を、ウェルから洗い出す。アミノペプチダーゼＮポリペプチドに対する被験化合物の結合を、ウェルの内容物の蛍光測定により検出する。被験化合物をインキュベートしていないウェルの蛍光と比較して少なくとも１５％ウェル中の蛍光を増大させる被験化合物を、アミノペプチダーゼＮポリペプチドと結合する化合物と同定する。
【０１７２】
実施例４
アミノペプチダーゼＮ遺伝子発現を低下させる被験化合物の同定
被験化合物を、アミノペプチダーゼＮ発現構築物でトランスフェクトしたヒト培養細胞に投与し、３７℃で１０〜４５分間インキュベートする。トランスフェクトしなかった同じタイプの細胞培養を、被験化合物なして同じ時間インキュベートし、ネガティブコントロールとする。
【０１７３】
ＲＮＡを、Chirgwinら、Biochem. 18, 5294-99, 1979に記載のように２つの培養物から単離する。ノーザンブロットを全ＲＮＡ２０〜３０μｇを用いて調製し、エクスプレスハイブ(Expresshyb)（CLONTECH）にて６５℃で、32Ｐ−標識化アミノペプチダーゼＮ特異的プローブを用いてハイブリダイズさせる。このプローブは配列番号１の相補物より選ばれる少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを包含する。被験化合物の非存在下にて得られるシグナルと比較してアミノペプチダーゼＮ特異的シグナルを低下させる被験化合物を、アミノペプチダーゼＮ遺伝子発現のインヒビターとして同定する。
【０１７４】
実施例５
アミノペプチダーゼＮ活性を低下させる被験化合物の同定
被験化合物を、アミノペプチダーゼＮ発現構築物でトランスフェクトしたヒト培養細胞に投与し、３７℃で１０〜４５分間インキュベートする。トランスフェクトしなかった同じタイプの細胞培養を、被験化合物なして同じ時間インキュベートし、ネガティブコントロールとする。アミノペプチダーゼＮ活性は、Ishiiら（Int. J. Cancer 92(1): 49-54）の方法を用いて測定する。
【０１７５】
アミノペプチダーゼＮのヒトアミノペプチダーゼＮ活性を試験化合物非存在下でのヒトアミノペプチダーゼＮ活性と比べて減少させる試験化合物を、アミノペプチダーゼＮ活性のインヒビターとして同定する。
【０１７６】
実施例６
アミノペプチダーゼＮタンパク質の組織特異的発現
種々の組織におけるアミノペプチダーゼＮの質的な発現パターンは、逆転写ポリペプチドメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって決定することができる。
【０１７７】
アミノペプチダーゼＮタンパク質がＣＯＰＤの疾患過程に関与することを実証するために、初期発現パネルはＣＯＰＤに関連する呼吸器組織および炎症細胞由来のＲＮＡ試料からなる：肺（成人および胎児）、気管、新たに単離されたＩＩ型肺胞細胞、培養されたヒト気管支上皮細胞、培養された小気道上皮細胞、培養された気管支平滑筋細胞、培養されたＨ４４１細胞（Ｃｌａｒａ様）、新たに単離された好中球および単球、並びに培養された単球（マクロファージ様）。また、Clontechから購入した全ＲＮＡパネルを用いてボディマッププロファイリングも行う。組織は、副腎腺、骨髄、脳、大腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、膵臓、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、気管、甲状腺および子宮である。
【０１７８】
アミノペプチダーゼＮがＣＮＳ障害に関与することを実証するために、以下の組織をスクリーニングする：胎児および成人の脳、筋肉、心臓、肺、腎臓、肝臓、胸腺、精巣、大腸、胎盤、気管、膵臓、腎臓、胃粘膜、大腸、肝臓、小脳、皮膚、大脳皮質（アルツハイマーのおよび正常な）、視床下部、大脳皮質、扁桃体、小脳、海馬、脈絡膜、叢（plexus）、視床および脊椎。
【０１７９】
アミノペプチダーゼＮが癌に関与することを実証するために、発現を以下の組織における発現を測定する：副腎、骨髄、脳、小脳、大腸、胎児脳、胎児肝臓、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、膵臓、胎盤、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、子宮および末梢血リンパ球。以下の癌細胞系における発現も測定する：ＤＵ−１４５（前立腺）、ＮＣＩ−Ｈ１２５（肺）、ＨＴ−２９（大腸）、ＣＯＬＯ−２０５（大腸）、Ａ−５４９（肺）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺）、ＨＴ−１１６（大腸）、ＤＬＤ−１（大腸）、ＭＤＡ−ＭＤ−２３１（乳房）、ＬＳ１７４Ｔ（大腸）、ＺＦ−７５（乳房）、ＭＤＡ−ＭＮ−４３５（乳房）、ＨＴ−１０８０、ＭＣＦ−７（乳房）およびＵ８７。同じ患者からの癌組織および正常な組織のマッチングしたペアも試験する。
【０１８０】
定量的発現プロファイル。定量的発現プロファイルは、Higuchiら、BioTechnology 10, 413-17,1992、およびHiguchiら、BioTechnology 11, 1026-30,1993に初めて記載された、「速度論的解析」と呼ばれる定量的ＰＣＲ解析の方式により実施した。原理は、ＰＣＲの対数相内の任意に与えられたサイクルにおいて、産物の量が最初の鋳型のコピー数に比例するというものである。
【０１８１】
増幅を、標的配列に相補的な、クエンチングを内部に有する（internally quenched）蛍光オリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）の存在下で行なう場合、プローブはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５'−３'エンドヌクレアーゼ活性により開裂され、媒体中に蛍光色素が放出される（Hollandら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7276-80, 1991）。蛍光発光は、特異的な増幅産物の量に直接比例して増大するため、ＰＣＲ産物の対数増幅相を検出し、最初の鋳型濃度を決定するのに用いることができる（Heidら、Genome Res. 6, 986-94, 1996、およびGibsonら、Genome Res. 6, 995-1001, 1996）。
【０１８２】
内部対照の増幅を行って、反応物に添加したサンプルＲＮＡの量を標準化することができる。この種類の実験では、選択した対照は１８ＳリボソームＲＮＡである。異なる放射スペクトルを有するレポーター染料が得られるため、異なる染料で標識したプローブを用いれば、標的と内部標準とを同じ試験管内で独立して定量することができる。
【０１８３】
蛍光のリアルタイムＰＣＲ測定はすべて、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００で行う。
【０１８４】
ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ調製。上記の組織から得た全ＲＮＡを発現の定量化に使用する。「剖検から得た」標識ＲＮＡを、ＴＲＩzol試薬（Life Technologies, MD）を用い、製造元のプロトコルにしたがって、剖検組織から抽出した。
【０１８５】
各ＲＮＡ５０μｇを、以下の反応混合物中、ＤＮａｓｅＩで３７℃にて１時間処理する：0.2 Ｕ／μL RNase不含DNase I (Roche Diagnostics, Germany); 0.4 Ｕ／μL RNase インヒビター(PE Applied Biosystems, CA); 10 mＭ Tris-HCl pH 7.9; 10 mＭ MgCl2; 50 ｍＭ NaCl; および１ｍＭ DTT。
【０１８６】
インキュベーション後、ＲＮＡを１体積のフェノール：クロロホルム−イソアミールアルコール（２４：２４：１）で１回、クロロホルムで１回抽出し、１／１０体積の３Ｍ 酢酸ナトリウム（pＨ５.２）および２体積のエタノールで沈殿させた。
【０１８７】
剖検組織から得た各ＲＮＡ５０μｇを、Ambion（Ambion, TX）から購入したＤＮＡ不含キットを用いてＤＮａｓｅ処理する。再懸濁および分光学的定量の後、各サンプルをTaqMan逆転写試薬（PE Applied Biosystems, CA）を用い、製造元のプロトコルにしたがって逆転写する。反応混合物中のＲＮＡの最終濃度は２００ｍg／μLである。逆転写は２.５μＭのランダムヘキサマープライマーを用いて行う。
【０１８８】
ＴａｑＭａｎ定量分析。特異的プライマーおよびプローブは、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの推奨に基づいて設計する。プローブは、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）で５'末端を、ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン）で３'末端を標識する。定量実験は、それぞれの試料由来の逆転写ＲＮＡ１０ｎｇに対して行う。それぞれの測定は３回行なう。
【０１８９】
全ｃＤＮＡ含有量を、Pre-Developed TaqMan Assay Reagents (PDAR)コントロールキット （PE Applied Biosystems, CA）を用いて、１８ＳリボソームＲＮＡの同時定量（多重ＰＣＲ）により標準化する。
【０１９０】
検定反応混合物は以下のとおりである：１×最終ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスターミックス（２×ストック溶液から）（PE Applied Biosystems, CA）；１×ＰＤＡＲコントロール−１８Ｓ ＲＮＡ（２０×ストック溶液から）；３００ｎＭ フォワードプライマー；９００ｎＭ リバースプライマー；２００ｎＭ プローブ；１０ｎｇ ｃＤＮＡ；および水を加えて２５μｌにする。
【０１９１】
以下の工程のそれぞれを一回行う：５０℃で２分間、そして９５℃で１０分間のプレＰＣＲ。以下の工程は４０回行なう：９５℃で１５秒の変性、６０℃で１分のアニーリング／伸長。
【０１９２】
実験は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００シークエンス検出器（PE Applied Biosystems, CA）を用いて実施する。より良いバックグラウンド控除、並びに出発標的量に対する直線性を達成するために、この実施の最後に、ＰＣＲの間に得られた蛍光データを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００使用者マニュアルに記載のように処理する。
【０１９３】
実施例７
増殖阻害検定：アンチセンスオリゴヌクレオチドは癌細胞系の増殖を抑制する
試験に用いられる細胞系はヒト大腸癌細胞系ＨＣＴ１１６である。細胞は、１０〜１５％胎児ウシ血清を含むＰＲＭＩ−１６４０中、濃度１０,０００細胞／ｍｌ ０.５ｍｌ量にて３７℃、９５％空気／５％ＣＯ2雰囲気下で培養する。
【０１９４】
ホスホロチオネート オリゴリボヌクレオチドは、ホスホロアミデイト(phosphoroamidite)ケミストリーを用いるApplied Biosystems Model３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザーにて合成する。配列番号１の１〜２４位のヌクレオチドと相補的な２４塩基の配列を、被験オリゴヌクレオチドとして用いる。コントロールとして、別の（ランダム）配列：５'−ＴＣＡ ＡＣＴ ＧＡＣ ＴＡＧ ＡＴＧ ＴＡＣ ＡＴＧ ＧＡＣ−３'を用いる。構築および脱保護の後、オリゴヌクレオチドを、エタノール沈殿２回、乾燥、そしてリン酸緩衝食塩水中に所望の濃度に懸濁する。オリゴヌクレオチドの純度は、キャピラリーゲル電気泳動およびイオン交換ＨＰＬＣによって試験する。精製オリゴヌクレオを、７日間にわたり、培養培地に１日に１回１０μＭ濃度を加える。
【０１９５】
７日間の被験オリゴヌクレオチド添加により、ヒトアミノペプチダーゼＮの発現は、ウェスタンブロッティングにより決定されるように有意に低下する。この効果は、コントロールオリゴヌクレオチドでは観察されない。３〜７日後、培養中の細胞の数を、自動細胞カウンターを用いて計数する。被験オリゴヌクレオチドで処理した培養中の細胞の数（１００％と表す）を、コントロールオリゴヌクレオチドで処理した培養中の細胞の数と比較する。被験オリゴヌクレオチドで処理した培養物の細胞数は、コントロールの３０％を超えない、このことはヒトアミノペプチダーゼＮの阻害が、癌細胞において抗増殖効果を有することを示している。
【０１９６】
実施例８
化合物／標的確証のインビボ試験
１．急性機械的検定
１.１．分裂促進血漿ホルモンレベルの低下
この非腫瘍検定では、循環ホルモンの内因的なレベルまたは生物学的刺激に応答して生産されるホルモンのレベルのいずれかを低下させる化合物の能力を測定する。げっ歯類に試験化合物を投与（経口、腹腔内、静脈内、筋肉内または皮下投与）する。試験化合物投与後の所定時間に、血漿を採集する。目的のホルモンレベルについて、血漿を検定する。ホルモンの正常な循環レベルが低すぎる、および／または変化し過ぎて一致した結果が得られない場合は、生物学的刺激で前処理してホルモンレベルを亢進してもよい（即ち、ＬＨＲＨ ３０ｎｇ／マウス用量をマウスに筋肉内注射して、テストステロン合成のブーストを誘導することができる）。血漿採集の時期を調整して、誘導したホルモン応答のピークを一致させることができよう。化合物の効果を、媒体で処置したコントロール群と比較する。分散が一致するか、一致しないかを決定するためにＦ試験、次いでチューデントｔ試験後を行う。媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。
【０１９７】
１.２．中空繊維の作用メカニズム分析
中空繊維は、所望の細胞系（群）を用いて調製し、げっ歯類に腹腔内および／または皮下移植する。化合物は、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内または皮下投与する。繊維を、特定のげっ歯類検定プロトコル（これらは遺伝子発現についての分析（ｄＤＮＡ、ＰＣＲまたはＴａｑｍａｎ）または特定の生物化学的活性（例えば、ｃＡＭＰレベル）についての検定を含み得る）に基づいて回収する。結果は、群間の分散をＦ試験によって比較し（媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験またはランク・サム・テストによって分析する。
【０１９８】
２．亜急性機能インビボ検定
２.１．ホルモン依存的組織量の低下
これは、ホルモン依存性組織（即ち、雄の精嚢および雌の子宮）の質量を低下させる化合物の能力を測定する、別の非腫瘍検定である。げっ歯類に、試験化合物を予め決められたスケジュールに基づき、予め決められた期間（即ち、１週間）投与（経口、腹腔内、静脈内、筋肉内または皮下）する。この実験の最後に、動物の体重を測り、標的器官を切除し、全ての体液を搾り出し、その器官の重量を記録する。また、血漿も回収できる。血漿は、目的のホルモンレベルまたは被験試薬のレベルについて検定することができる。器官重量を直接比較するか、それらを動物の体重について標準化することができる。化合物の効果を、ビークル処置コントロール群と比較する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いでスチューデントｔ試験を行なう。媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である。
【０１９９】
２.２．中空繊維増殖検定
中空繊維は、所望の細胞系（群）を用いて調製し、げっ歯類に腹腔内および／または皮下移植する。化合物は、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内または皮下投与する。繊維を、特定のげっ歯類検定プロトコルに基づいて回収する。細胞増殖は、細胞数のマーカー（即ち、ＭＴＴまたはＬＤＨ）を測定することによって決定する。細胞数と出発接種材料からの細胞数の変化を、群間の分散をＦ試験（媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）によって比較した後、スチューデントｔ試験またはランク・サム・テストによって分析する。
【０２００】
２.３．抗血管新生モデル
２.３.１．角膜血管新生
成長因子または細胞を伴う若しくは伴わないヒドロンペレットを、げっ歯類の角膜に外科的に作ったマイクロポケット中に移植する。化合物（ヒドロンペレット中に成長因子と混合した化合物）を、全身または局所投与することができる。移植の７日後にコロイド性カーボンを心臓内注入した後すぐに、角膜を回収し、そして１０％ホルマリン中に固定する。読み取りは、定性的スコアリングおよび／またはイメージ分析で行なう。定性的スコアをランク・サム・テストにより比較する。イメージ分析データは、血管新生領域（ピクセル内）を測定することによって評価し、群平均をスチューデントｔ試験（２テイル）によって比較する。成長因子または細胞のみの群と比較して、ｐ値０.０５以下が有意である。
【０２０１】
２.３.２．マトリゲル(Matrigel)血管新生
細胞または成長因子を含有するマトリゲルを、皮下注射する。化合物を、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内または皮下投与する。マトリゲルプラグを、予め決定した時点で回収し、読み取りのために準備する。読み取りは、ヘモグロビン濃度および／または組織学試験についてのＥＬＩＳＡを基礎とする検定である（即ち、容器カウント、内皮表面マーカーの特殊染色：ＣＤ３１、因子−８）。読み取りは、群間の分散をＦ試験によって比較した後（媒体コントロール群と比較して有意性はｐ値０.０５以下である）、スチューデントｔ試験によって分析する。
【０２０２】
３．原発性抗腫瘍効果
３.１．初期治療モデル
３.１.１．皮下腫瘍
腫瘍細胞または破砕物（フラグメント）を、０日目に皮下移植する。媒体および／または化合物を、ある時、通常１日目から開始する所定のスケジュールに基づいて経口、腹腔内、静脈内、筋肉内または皮下投与し、次いでその能力について腫瘍重量(burden)を測定する。体重および腫瘍測定を週に２、３回記録する。正味の体重および腫瘍重量の平均を、それぞれのデータ収集日ごとに計算する。抗腫瘍効果は、既定の日に処置腫瘍のサイズ（Ｔ）およびコントロール腫瘍のサイズ（Ｃ）を、群間の分散をＦ試験により比較した後（ｐ０.０５以下を有意とする）、スチューデントｔ試験により比較することで最初に決定することができる。また、この実験は、腫瘍成長遅延をモニターし記録して腫瘍測定を継続する場合には、投与の終了後にも継続できる。腫瘍成長遅延は、予め定めたサイズに達するのに要した処置群とコントロール群の中央時間の差を、該サイズに達するのに要したコントロール群の中央時間で割ったものとして表される。成長遅延は、評価サイズに達した個々の腫瘍についての時間からカプラン−マイヤー曲線を作成することによって比較する。ｐ≦０.０５が有意である。
【０２０３】
３.１.２．腹腔内／頭蓋内腫瘍モデル
腫瘍細胞を、０日目に腹腔内または頭蓋内注射する。化合物を、１日目に開始する所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内または皮下投与する。羅患率および／または死亡率の観察を、１日に２回記録する。体重は１週間に２回測定し記録する。羅患率／死亡率のデータを、生存中央値の期間で表し、長期生存数は分けて示す。生存時間を用いて、カプラン−マイヤー曲線を作成する。この実験のコントロール群と比較した対数範囲試験による有意性はｐ≦０.０５である。
【０２０４】
３.２．疾患モデルの確立
腫瘍細胞または破砕物を、皮下的に移植し、処置を開始するのに所望のサイズにまで成長させる。所定のサイズ範囲に達したら、マウスを処置群に無作為に分ける。化合物を、所定のスケジュールに従い、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内または皮下投与する。腫瘍重量および体重を、１週間に２〜３回測定し記録する。インキュベート後の幾日かに渡って全群の腫瘍重量の平均値を、比較のためにグラフにする。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いでスチューデントｔ試験を処置終了時点の処置群およびコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較してｐ≦０.０５が有意である。腫瘍測定は、投与を止め腫瘍成長遅延をモニターした後に、記録することができる。腫瘍成長遅延は、予め定めたサイズに達するのに要した処置群とコントロール群の中央時間の差を、該サイズに達するのに要したコントロール群の中央時間で割ったものとして表される。成長遅延は、評価サイズに達した個々の腫瘍についての時間からカプラン−マイヤー曲線を作成することによって比較する。媒体コントロール群と比較してｐ≦０.０５が有意である。
【０２０５】
３.３．同所性疾患モデル
３.３.１．哺乳類脂肪体検定
哺乳動物の腺癌起源の腫瘍細胞または破砕物を、外科的に露出させて表出させたげっ歯類の乳腺脂肪体(fat pad)に直接移植する。その脂肪体を元あった場所に戻し、外科部分を閉じる。また、ホルモンを、腫瘍の成長を補助するためにげっ歯類に投与することもできる。化合物を所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内または皮下投与する。腫瘍重量および体重を、１週間に２〜３回測定し記録する。接種後の幾日かに渡って全群の腫瘍重量の平均値を、比較のためにグラフにする。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いでスチューデントｔ試験を処置終了時の処置群およびコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較してｐ≦０.０５が有意である。
【０２０６】
腫瘍測定は、投与を止め腫瘍成長遅延をモニターした後に、記録することができる。腫瘍成長遅延は、予め定めたサイズに達するのに要した処置群とコントロール群の中央時間の差を、該サイズに達するのに要したコントロール群の中央時間で割ったものとして表される。成長遅延は、評価サイズに達した個々の腫瘍についての時間からカプラン−マイヤー曲線を作成することによって比較する。媒体コントロール群と比較してｐ≦０.０５が有意である。さらに、このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を提供する。転移は、標的器官当たりの目視できる病巣（フォーカス）の数を計数すること、または標的器官重量を測定することによって、この実験の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（この実験のコントロール群と比較してｐ≦０.０５を有意とする）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２０７】
３.２.２．前立腺内検定
前立腺癌器官の腫瘍細胞または破砕物を、外科的に露出させたげっ歯類の前立腺の背葉に直接移植する。腹部切除して前立腺を外面化し、移植組織が精嚢に侵入しないことを検証しながら、腫瘍を背葉に特異的に移植できるようにする。上手く接種できた前立腺を腹部に移し、腹部に沿った切開部および皮膚を閉じる。また、ホルモンを、腫瘍の成長を助けるためにげっ歯類に投与することもできる。化合物を、所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内または皮下投与する。体重を１週間に２〜３回測定し記録する。所定の時点で実験を終了し、動物を解剖する。原発性腫瘍のサイズを、カリパスまたは解剖顕微鏡を取り付けた接眼マイクロメーターのいずれかを用いて三次元的に測定する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いでスチューデントｔ試験を処置終了時の処置群およびコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較してｐ≦０.０５を有意とする。このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を与える。転移は、標的器官（即ち、肺）当たりの目視できる病巣の数を計数すること、または標的器官（即ち、局所的リンパ節）重量を測定することによって、この実験の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（この実験のコントロール群と比較してｐ≦０.０５を有意とする）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２０８】
３.３.３．気管支内検定
肺器官の腫瘍細胞を、皮膚を切開し、気管を曝すことによって、気管支内に移植することができる。気管支は、斜端の２５ゲージニードルを用いて穴を開け、腫瘍細胞を、主要な気管支に９０°に曲げた平滑端の２７ゲージニードルを用いて接種する。化合物を、所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内または皮下投与する。体重を１週間に２〜３回測定し記録する。所定の時点で実験を終了し、動物を解剖する。原発性腫瘍のサイズを、カリパスまたは解剖顕微鏡を取り付けた接眼マイクロメーターのいずれかを用いて三次元的に測定する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いでスチューデントｔ試験を処置終了時の処置群およびコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較してｐ≦０.０５を有意とする。このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を与える。転移は、標的器官（即ち、反対側の肺）当たりの目視できる病巣の数を計数すること、または標的器官の重量を測定することによって、この実験の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（この実験のコントロール群と比較してｐ≦０.０５を有意とする）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２０９】
３.３.４．盲腸内検定
消化系器官の腫瘍細胞を、腹部の皮膚を切開し、腸を外面化することで盲腸内移植することができる。腫瘍細胞を、２７または３０ゲージニードルを用いて腸の管腔を貫通することなく、盲腸壁に接種する。化合物を、所定のスケジュールに基づき、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内または皮下投与する。体重を１週間に２〜３回測定し記録する。所定の時点で実験を終了し、動物を解剖する。原発性腫瘍のサイズを、カリパスまたは解剖顕微鏡を取り付けた接眼マイクロメーターのいずれかを用いて三次元的に測定する。Ｆ試験は分散が一致するか、一致しないかを決定するために行ない、次いでスチューデントｔ試験を処置終了時の処置群およびコントロール群の腫瘍サイズを比較するために行なう。コントロール群と比較してｐ≦０.０５を有意とする。このモデルは、このタイプの腫瘍の自発的転移速度を増大させる機会を与える。転移は、標的器官（即ち、肝臓）当たりの目視できる病巣の数を計数すること、または標的器官の重量を測定することによって、この実験の最後に評価することができる。これらの終点の平均値を、Ｆ試験を行なった後（この実験のコントロール群と比較してｐ≦０.０５を有意とする）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２１０】
４．続発性（転移性）抗腫瘍効果
４.１．自発転移
腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍を肺または肝臓への自発的転移実験のため予め定めた範囲にまで成長させる。次いで、この原発性腫瘍を切除する。腫瘍転移の初期段階を阻害することを目的とした治療を評価するために、原発性腫瘍を切除するまでの期間を含むことある所定のスケジュールに従い、化合物を、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内または皮下投与する。罹患率および／または死亡率の観察を毎日記録する。１週間に２回、体重を測定し記録する。可能なエンドポイントとしては、生存時間、標的器官当たりの目視できる病巣の数、または標的器官重量が挙げられる。生存時間をエンドポイントとして用いた場合、他の値は定まらない。生存データは、カプラン−マイヤー曲線を作成するのに用いる。この実験では対数範囲試験によりコントロール群と比較してｐ≦０.０５が有意である。解剖マイクロスコープの下で決定されるような目視できる腫瘍の病巣数の平均と、標的器官重量の平均値は、Ｆ試験を行なった後（エンドポイント両方についてこの実験においてコントロール群と比較してｐ≦０.０５が有意である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２１１】
４.２．強制的転移
実験用（強制的）肺、肝臓および骨転移実験のそれぞれにおいて、腫瘍細胞を、尾静脈、門脈、または心臓の左心室に注射する。化合物を、所定のスケジュールに基づいて、経口、腹腔内、静脈内、筋肉内または皮下投与する。罹患率および／または死亡率の観察を毎日記録する。１週間に２回、体重を測定し記録する。可能なエンドポイントとしては、生存時間、標的器官当たりの目視できる病巣の数、または標的器官重量が挙げられる。生存時間をエンドポイントとして用いた場合、他の値は定まらない。生存データは、カプラン−マイヤー曲線を作成するのに用いる。この実験では対数範囲試験によりコントロール群と比較してｐ≦０.０５が有意である。解剖マイクロスコープの下で決定されるような目視できる腫瘍の病巣数の平均と、標的器官重量の平均値は、Ｆ試験を行なった後（エンドポイント両方についてこの実験においてコントロール群と比較してｐ≦０.０５が有意である）、スチューデントｔ試験によって比較する。
【０２１２】
実施例９
化合物／標的確証のインビボ試験
１．疼痛：
急性疼痛
急性疼痛は、主にラットについてはホットプレートで測定される。ホットプレート試験の２つの変法を用いる：典型的な変法は、動物を熱表面（５２〜５６℃）に置き、動物が侵害防御機構行動、例えば、ステップまたは足舐めを見せるまでの時間を測定する。もう１つの変法では、実験動物を室温の表面に置いてホットプレートの温度を上昇させる。次いで、この表面を、動物が後足を舐め始めるまで連続的ではあるがゆっくり熱する。後足を舐め始めた時に達している温度を、疼痛の閾値の尺度とする。
【０２１３】
化合物をビークル処置コントロール群に対して試験する。物質の適用は、疼痛試験前に、種々の適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）により種々の時点で行なう。
【０２１４】
持続痛
持続痛は、主にラットについてはホルマリン試験またはカプサイシン試験を用いて測定する。１〜５％ホルマリンまたは１０〜１００μｇカプサイシン溶液を、実験動物の片方の後ろ足に注射する。ホルマリンまたはカプサイシンを適用した後、その動物は、たじろぎ、患部の足を舐めたり、噛んだりして侵害防御応答を見せる。９０分までの時間帯の侵害防御応答の数が、疼痛強度の尺度である。
【０２１５】
化合物をビークル処置コントロール群に対して試験する。物質の適用は、疼痛試験前に、種々の適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）により種々の時点で行なう。
【０２１６】
神経因性疼痛
神経因性疼痛は、主にラットにおいては片側坐骨神経損傷の種々の変法により誘導される。手術は麻酔下で行なわれる。坐骨神経損傷の第一の変法は、共通の坐骨神経周辺を紐でゆるく締め付けることによって行なわれる。第二の変法は、共通の座骨神経の直径が約半分になるまできつく縛ることである。次の変法は、モデル群を用いて、Ｌ５とＬ６脊髄神経またはＬ５脊髄神経のみ、のいずれかをきつく縛ったものまたは切除したものを作製する。第四の変法は、坐骨神経の３つの末端分枝の２つ（脛骨神経および共通腓骨神経）を軸索切除し、腓腹神経を無傷で残すことを包含するのに対し、最後の変法は、脛骨分枝のみを軸索切除し、腓腹神経および共通神経を傷付けずに残すことを含む。コントロール動物は偽手術を用いて処置する。
【０２１７】
術後に、神経損傷動物は、慢性機械的異痛症（アロディニア)、冷アロディニアおよび温熱性痛覚過敏症を発症する。機械的アロディニアは、圧力変換法（electronic von Frey Anesthesiometer, IITC Inc.-Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA; Electronic von Frey System, Somedic Sales AB, Hourby, Sweden）により測定する。温熱性痛覚過敏症は、患部の後足の侵害防御応答を疼痛強度の尺度として計数する、放射熱源法（Plantar Test, Ugo Basile, Comerio, Italy）または冷却プレート（５〜１０℃）により測定する。冷却誘導型疼痛の更なる試験は、患部の後肢にアセトンを足裏投与した後の侵害防御応答または侵害防御応答持続を測定することである。一般に慢性痛は、活性のサーカディアンリズムを記録すること（SurjoおよびArndt, Universit t zu Kouln, Cologne, Germany）、および足取りの違いをスコアリングすること（フットプリントパターン; FOOTPRINTSプログラム, Klapdorら、1997. フットプリントパターン分析の低コスト法、J. Neurosci. Methods 75,49-54）により評価する。
【０２１８】
化合物を、偽手術コントロール群およびビークル処置コントロール群に対して試験する。物質の適用は、疼痛試験前に、種々の適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）により種々の時点で行なう。
【０２１９】
炎症疼痛
炎症疼痛は、主にラットにおいては一方の後足にカラゲナン０.７５ｍｇまたは完全フロインドアジュバンドを注射することによって引き起こす。動物は、機械的アロディニアおよび温熱性痛覚過敏症を伴う浮腫を発症する。機械的アロディニアは、圧力変換器法（electronic von Frey Anesthesiometer, IITC Inc.-Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA）により測定する。温熱性痛覚過敏症は、放射熱源法（Plantar Test, Ugo Basile, Comerio, Italy, Paw thermal stimulator, G. Ozaki, University of California, USA）により測定する。浮腫測定については、２つの方法を用いる。第一の方法は、動物を屠殺して、患部の後足を細分し、重量を測ることである。第二の方法は、プレチスモメーター（Ugo Basile, Comerio, Italy）における水の押しのけ容積を測定することによる足の容積の差を含む。
【０２２０】
化合物を、非炎症コントロール群およびビークル処置コントロール群に対して試験する。物質の適用は、疼痛試験前に、種々の適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）により種々の時点で行なう。
【０２２１】
糖尿病性神経症性疼痛
ストレプトゾトシン５０〜８０ｍｇ／ｋｇを単回腹腔内注射して処置したラットは、１〜３週間以内に著しい高血糖および機械的アロディニアを発症する。機械的アロディニアは圧力変換器法（electronic von Frey Anesthesiometer, IITC Inc.-Life Science Instruments, Woodland Hills, SA, USA）により測定する。
【０２２２】
化合物を、糖尿病および非糖尿病媒体コントロール群に対して試験する。物質の適用は、疼痛試験前に、種々の適用経路（静脈内、腹腔内、経口、くも膜下腔内、脳室内、皮下、皮内、経皮的）により種々の時点で行なう。
【０２２３】
２．パーキンソン病
６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨ−ＤＡ）病変
ドーパミン作動性黒質線条体および線条体淡蒼球経路の変性は、パーキンソン病における中心的な病理現象である。６−ＯＨ−ＤＡを内側前脳束（ＭＦＢ）中に単回／逐次片側定位（sequential unilateral stereotaxic）注射してラットにおいてこの疾患を実験的に模倣した。
【０２２４】
実験開始時の体重が２００±２５０ｇの雄ウィスターラット（Harlan Winkelmann, Germany）を用いる。実験期間にないときは、ラットは飼料と水を自由飲食することができ、昼／夜１２時間のサイクルのもと温度と湿度が管理された環境下で飼育する。以下のインビボプロトコールは、政府の権限により認可されている。動物への負担を最小限にし、用いる動物の数を減らし、インビボ技術の代替法を利用するようあらゆる努力をする。
【０２２５】
動物に、モノアミンオキシダーゼによる６−ＯＨＤＡの代謝を阻害するためパージリン（Sigma, St. Louis, MO, USA;５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）と、ノルアドレナリン作動性末端による６−ＯＨＤＡの取り込みを防止するためのメチルイミプラミンＨＣｌ（Sigma;２５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）を、外科手術の日に投与する。３０分後、そのラットをペントバービタルナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔し、定位固定フレームに移す。ＤＡ黒質線条体経路を損傷させるため、６−ＯＨＤＡ ＨＢｒ（Sigma）８μｇを含む０.０１％ アスコルビン酸−食塩水４μｌを、左内側前脳側（十字縫合(ブレグマ)および頭蓋骨表面に対して２.４ｍｍ 前側、１.４９ｍｍ 側方、−２.７ｍｍ 腹側）に１μｌ／分の割合で注射する。ニードル（針）をさらに５分間そのままにして拡散させる。
【０２２６】
ステッピング試験
前肢無動症（アキネジア）は、損傷付与後の３週間、改変ステッピング試験プロトコルを用いて評価する。簡単には、実験者が片手でこの動物の後肢を固定し、表面から一方の後足をわずかに持ち上げて、その動物を維持する。一方の足はテーブルについており、初めはフォアハンド方向、その次はバックハンド方向へゆっくり側方移動させる（５秒で１ｍ）。調整ステップの数を、両足について移動のバックハンド方向およびフォアハンド方向においてカウントする。試験の順序は、右足フォアハンドおよびバックハンド調整ステップ、その次に左足フォアハンドおよびバックハンド方向である。この試験は、最初の試験に先立ち３日間の最初のトレーニングの後、連続して３日間で３回繰り返す。フォアハンド調整ステップは、損傷動物と健康なコントロール動物の間に一致した差がないことが分かる。従って、バックハンド調整ステップに限定して分析を行う。
【０２２７】
バランス試験
ステッピング試験セッションの間に、姿勢検証後のバランス調整も測定する。ラットをステッピング試験に記載のように同じ位置で維持し、側方移動に変えて、実験者がテーブルについた足を前方向へ傾ける。この演習はバランスの喪失の結果となり、前肢移動でバランスを回復するラットの能力を０〜３の範囲スケールであるスコア化する。スコア０は正常な足置きに与えられる。前肢運動は遅れるが、姿勢バランスの回復が検出される場合は、スコア１を与える。スコア２は、筋肉収縮によって現れるように、十分とは言えないが明らかな前肢反応であるがバランス回復は成功していないことを表し、スコア３は行動の反応のないものに与える。この試験は、最初の試験に先立ち３日間の最初のトレーニングの後、３日間連続してそれぞれの側（足）で１日に３回繰り返す。
【０２２８】
階段試験（足到達）
階段試験の改良法を用いて最初または２回目の損傷付与後の３週間の足到達（リーチング）行動を評価する。中央に台、両側に取り外し可能な階段を有するプレキシガラス試験ボックスを用いる。この器具は、それぞれの階段で同じ側の足のみを用い、独立して足の運びを測定できるように設計されている。それぞれの試験において、動物をこの試験ボックスに１５分間置く。ダブルの階段に、７×３飼料ペレット（Precision food pellets, formula : P, purified rodent diet, サイズ４５ｍｇ; Sandown Scientific）を各々の側に入れる。それぞれの試験の後、各々の足について食べたペレット（上手く回収したペレット）の数と取得したペレット（触ったが、落とした）の数、およびその成功率（食べたペレット／取得したペレット）を別々に計数する。３日間の絶食（１日当たり１２ｇ／動物）後の動物を１１日間試験する。全ての分析は最後の５日間のみで行なう。
【０２２９】
ＭＰＴＰ処置
神経毒である１−メチル−４−フェニル−１,２,３,６−テトラヒドロ−ピリジン（ＭＰＴＰ）は、げっ歯類、ヒト以外の霊長類およびヒトにおいて中脳ドーパミン作動性（ＤＡergic）ニューロン変性を引き起すことで、多くのパーキンソン病症状を再現する。ＭＰＴＰは、ドーパミンレベルおよびその代謝物レベル、並びに線条体におけるドーパミン作動性末端数の顕著な減少を引き起こし、同様に黒質、パルス緻密質におけるチロシン ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）−免疫応答細胞体の著しい喪失を引き起こす。
【０２３０】
重篤で、長期に及ぶ損傷を与え、かつ死亡率を減少させるために、ＭＰＴＰを動物に単回注射し、その後重症度について損傷の７〜１０日後に試験する。ＭＰＴＰの連続注射は、１、２および３日目に投与する。１日に１度食塩水中のＭＰＴＰヒドロクロライド（シグマ）４ｍｇ／ｋｇを、動物に投与する。注射は全て腹腔内（i.p.）で行ない、ＭＰＴＰストック溶液は、注射と注射との間凍結しておく。動物を１１日目に断頭する。
【０２３１】
免疫組織化学
行動実験が終了した時点で、全ての動物をチオペンタール（１ｇ／４０ｍｌ、腹腔内投与、Tyrol Parma）３ｍｌで麻酔する。マウスは、０.０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ ７.４）で２分間、次いでＰＢＳ中の４％ パラホルムアルデヒド（Merck）で１５分間、噴門から（transcardially）還流する。脳を取り出し、４％ パラホルムアルデヒド中に、４℃にて２４時間置く。その後、脱水のために、それを４℃の０.１Ｍ ＰＢＳ中の２０％ スクロース（Merck）溶液に移して染み込ませる。脳を−２０℃のメチルブタン中で２分間凍結させ、−７０℃で保存する。スレッジマイクロトーム（mod. 3800-Frigocut, Leica）を用いて、２５μｍの切片を、脳梁（ＡＰ １.７ｍｍ）の膝部から海馬（ＡＰ ２１.８ｍｍ）まで、およびＡＰ２４.１６からＡＰ ２６.７２から得る。４６の切片をカットし、免疫組織化学実験のため、選別機（assorter）にて０.２５Ｍ トリスバッファー（ｐＨ ７.４）中に保存する。
【０２３２】
一連の切片を、遊離−浮動性チロシンデヒドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫組織化学試験について処理する。０.１Ｍ ＰＢＳ中で３回リンスした後、内因性のペルオキシダーゼ活性を、０.３％ Ｈ2Ｏ2±ＰＢＳ中で１０分間クエンチする。ＰＢＳ中でリンスした後、切片を、ブロッキング物質として１０％ 正常ウシ血清（シグマ）中で５分間プレインキュベーションし、一次抗ラットＴＨウサギ抗血清（希釈率１：２０００）のいずれかに移す。
【０２３３】
一晩中室温でインキュベートした後、ＴＨ免疫応答用の切片をＰＢＳ中ですすぎ（２×１０分）、ヤギで産生させたビオチン化抗ウサギ免疫グロブリンＧ（希釈率１：２００）（Vector）中で９０分間インキュベートし、繰り返しすすぎ、そしてVectastain ＡＢＣ（Vector）溶液中に移し１時間置く。０.００５％ Ｈ2Ｏ2を加えた０.１Ｍ ＰＢＳ中の３,３'−ジアミノベンジジン テトラヒドロクロリド（ＤＡＢ；Sigma）は、続く可視化反応における色素原として働く。切片を、ゼラチンコーティングスライドに載せ、一晩置いて乾燥させ、ヘマトキシリンを用いて対比染色(counter-stained)し、アルコール濃度の昇華により脱水し、ブチルアセテート中で透明にする。カバースリップをエンテラン（entellan）の上に置く。
【０２３４】
ローターロッド試験
我々は、ＩＢＭ互換パソコン、ＣＩＯ−２４データ取得カード、コントロールユニット、および４線ロータロッドユニットからなるＣＲ−１ Ｒｏｔａｍｅｘシステム（Columbus Instruments, Columbus, OH）を用いるRozasおよびLabandeira-Garcia(1997)が記載した手順の改良法を使用する。このロータロッドユニットは、回転軸（半径７.３ｃｍ）と、それぞれのマウスのための個別のコンパートメントとから成る。このシステムソフトウェアは、回転スピードを変化させて（０〜８０ｒｐｍ）セッションプロトコルを予めプラグラムすることができる。赤外線ビームは、マウスがロータロッドの真下の基底鉄柵（base grid）に落ちた時を検出するために用いる。このシステムは、落下をマウスについての実験の終了として記録し、ローターロッドの上にいた全時間、並びに落下時間および設定したパラメーターのすべてを記録する。また、このシステムでは、トレーニングを目的として、微弱電流を基底鉄柵に流すことができる。
【０２３５】
３．痴呆
物体認知課題
物体認知課題を、げっ歯類の認知能力に対する実験操作の効果を評価するために設計した。ラットを、同一の物体が２個存在する開放された空間に置く。ラットは、最初の対物認知課題の試行で、両方の物体を見て調べる。２度目の試行では、例えば２４時間の保持間隔の後、最初の試行で用いた２個の物体の内の１個、即ち「知っている」物体、と新しい物体とを、その開放された空間に置く。この物体それぞれを見て調べる時間を記録する。ＯＲ課題における基本的な測定値は、ラットが２度目の試行で２個の物体を探索するのにかけた時間である。保持の良さは、「知っている」物体よりも新たな物体に対する探索時間が長いことに反映される。
【０２３６】
推定される認知エンハンサーを最初の試行の前に投与することは、主に、習得および最終的には固定化プロセスにおける効果の評価を可能にする。最初の試行後の試験化合物の投与は、固定プロセスにおける効果を評価できるのに対して、２度目の試行前の投与では、想起プロセスにおける効果を測定できる。
【０２３７】
受動的回避課題
受動的回避課題により、ラットおよびマウスにおける記憶能力を評価する。抑制的回避装置は、明区画と暗区画との２つの区画を有する箱から成る。この２つの区画は、実験者が操作できるギロチンドアによって分けられている。ギロチンドアを上げたとき、２ｃｍの敷居で２つの区画は分けられている。ドアを開けたときの暗区画の照度は約２ルクスである。明区画の中央の床の明度は約５００ルクスである。
【０２３８】
２４時間間隔の中間セッションで分けられた２つの習慣セッション、１つのショックセッションおよび保持セッションが与えられる。ラットは、習慣セッションと保持セッション中、３００秒間装置内を探索することができる。ラットを、ギロチンドアの反対の壁に頭を向けた状態で、明区画に置く。１５秒の適応時間の後、ギロチンドアを器具内の全領域を自由に動き回れるように開ける。通常、ラットはまぶしい明領域を避け、数秒の内に暗区画に入るであろう。
【０２３９】
ショックセッションにおいては、ラットが４本の足で暗区画に入るやいなや区画間のギロチンドアを下ろし、すぐさま１ｍＡのフットショックを２秒間与える。ラットを装置から取り出し、ホーム籠に戻す。保持セッション中の手順は、習慣セッションの手順と同じである。
【０２４０】
ステップ通過潜伏、すなわち保持セッション中に暗区画に入る最初の潜伏（秒）は、動物の記憶能力の指標である；暗区画に入る潜伏が長ければ長いほど、保持はよりよい。ショックセッションの３０分前に、スコポラミン１ｍｇ*ｋｇ-1と一緒に試験化合物を与える。スコポラミンは、２４時間後の保持セッション中の記憶能力を損なわせる。試験化合物が、スコポラミン処置コントロールと比較して侵入潜伏を増大させた場合、認知を増強する潜在能力を有する。
【０２４１】
モーリス水脱出課題
モーリス水脱出課題により、げっ歯類における空間方向学習を測定する。ラットおよびマウスの認知機能に対する推定される治療物質の効果を調べるのに広く用いられている試験系である。動物のこの能力は、水面下約１ｃｍのところに避難用台を沈めた円形水タンク中で評価する。避難用台は、水タンク中を泳いでいる動物には見えない。机、コンピューター設備、第二の水タンクを含む室内の備品、実験者の存在、および優しく響く柵上のラジオにより、迷路外の合図を十分に与える。
【０２４２】
動物は、日々の獲得セッション５日の間に４回の試行を受ける。試行は、動物をプール中に置き、タンクの壁に頭を向けることによって始める。四分区画、北、西、南および東の４つの開始位置のそれぞれは一連の４回の試行のなかで１度は用いる（それらの順序は無作為である）。避難用台はいつも同じ場所に置く。試行は、動物が避難用台に上った時かまたは９０秒経過した時のいずれか早い方で終了とする。動物はその台の上に３０秒間留まらせる。その後台から下し、次の試行を始める。動物が９０秒以内に台を見つけられなかったときは、実験者がその動物を台の上に置き、３０秒間そこに留まらせる。５日簡の毎日のセッションの４回目の試行後に、探索試行として更なる試行を行なう：これは、台を取り出し、動物が４つの４分円内で過ごす時間を３０秒または６０秒間測定する。この探索試行において、動物は全て、獲得セッションの間に避難用台が置いてあった４分円の反対側の同じ開始位置から始める。
【０２４３】
獲得トレーニング中の４つの異なる基準：避難潜伏、移動距離、台への距離および水泳速度を用いて動物の能力を評価する。探索試行については以下の基準：４分円内における時間（秒）および４つの４分円内での移動距離（ｃｍ）を評価する。この探知試行は、動物が避難用台の位置をどれくらい良く学習したかについての情報をさらに与える。動物が、獲得セッション中に台のあった４分円内で、その他の４分円における時間および距離よりも、より多くの時間を費やし、より多くの距離を泳いだ場合、これは結論として、台の位置をよく学習したことを示す。
【０２４４】
推定される認知増強化合物の効果を評価するために、認知機能を損なわせる特定の脳損傷を持つラット若しくはマウス、または正常な学習を妨げるスコポラミン若しくはＭＫ−８０１などの化合物で処置した動物、または認知欠損を患っている高齢動物を用いる。
【０２４５】
Ｔ迷路自発的択一課題
Ｔ迷路自発的択一課題（ＴｅＭＣＡＴ）により、マウスの空間認知能力を評価する。Ｔ迷路のスタートアームと２つのゴールアームは、実験者が手動で操作できるギロチンドアを備えている。トレーニングの開始時、マウスをスタートアーム置く。ギロチンドアは閉めてある。最初の試行、「強制試行」では、左または右のいずれかのゴールアームはギロチンドアを下げてブロックする。マウスがスタートアームから離れた後、迷路を通り抜け、最終的に、開放されたゴールアームに入り、そしてスタート地点に戻り、そこでギロチンドアを下げることによって５秒間閉じ込められる。次に動物は、１４回の「自由選択」試行の間に左と右のゴールアームを自由に選ぶことができる（全てのギロチンドアは開いている）。マウスが一方のゴールアームに入るとすぐに、もう一方のゴールアームを閉じる。マウスは最終的にスタートアームに戻り、マウスはスタートアームに５秒間閉じ込められた後、望むいずれのゴールアームにも自由に向かうことができる。１回のセッション中１４回の自由選択試行が完了した後、動物を迷路から取り出す。トレーニングの間は、マウスには決して手を触れない。
【０２４６】
１４回後の試行から択一パーセントを計算する。このパーセントと最初の強制試行および連続１４回の自由選択試行を完了するのに要した時間（秒）とを分析する。認知欠損は、通常、トレーニングセッションの開始３０分前にスコポラミンを注射することによって誘導する。スコポラミンは、択一パーセントレベルを偶然レベルかまたはそれより低いレベルにまで下げる。トレーニング試行の前に必ず投与される認知エンハンサーは、少なくとも部分的には、スコポラミンにより誘導される偶発的択一率の減少と拮抗し得る。
【０２４７】
実施例１０
ＣＯＰＤ動物モデルにおける試験化合物効果の同定
モルモットを、タバコの煙に５０分間曝す。曝した後１０分〜２４時間の間に動物を屠殺し、その肺をＲＮＡlatter（商標）中に置く。肺組織をホモジナイズし、キアゲンＲＮeasy（商標） Ｍａｘｉキットを用いて、全ＲＮＡを抽出した。Molecular Probes RiboGreen（商標）ＲＮＡ定量法を用いて、それぞれの試料におけるＲＮＡ量を定量する。
【０２４８】
全ＲＮＡを逆転写し、得られたｃＤＮＡを実時間ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に用いる。そのｃＤＮＡを、センス−およびアンチセンス−プライマーおよびアミノペプチダーゼＮ遺伝子の６−カルボキシ−テトラメチル−ローダミン標識化プローブを含む溶液に加える。サイクロフィリンをハウスキーピング遺伝子として用いる。アミノペプチダーゼＮ遺伝子の発現を、それぞれの試料についての増幅曲線を作り出すＴａｑＭａｎ実時間ＰＣＲシステムを用いて測定する。この曲線からサイクル閾値を計算する：増幅された標的の量が固定された閾値に達する小数点（fractional）のサイクル数。アミノペプチダーゼＮ遺伝子の多数コピーを含む試料は、少ないコピーを含む試料よりも早くこの閾値に達する。閾値を０.２に設定し、サイクル閾値ＣTを増幅曲線から計算する。アミノペプチダーゼＮ遺伝子のＣT値を、ハウスキーピング遺伝子のＣT値を用いて標準化する。
【０２４９】
タバコの煙に１０分〜３時間曝露した動物は、空気に曝したコントロール動物と比較して、アミノペプチダーゼＮ遺伝子の発現が少なくとも３倍増大する。
【０２５０】
以下のように試験化合物を評価する。動物を、タバコ煙への曝露の５分〜１時間前に試験化合物で前処理し、タバコ煙曝露を完了した３時間後までに屠殺する。コントロール動物は、試験化合物の際に選んだ投与経路を介して、試験化合物の媒体で前処理する。ビークル処置したタバコ煙に曝露した動物にみられる発現と比較して、タバコ煙により誘導されるアミノペプチダーゼＮ遺伝子の上方調節を低下させる試験化合物を、アミノペプチダーゼＮ遺伝子発現の阻害物質として同定する。
【０２５１】
参考文献
クローン化ｃＤＮＡから推定されるヒト小腸アミノペプチダーゼＮの完全なアミノ酸配列。FEBS Lett 1988 Oct 10; 238 (2): 307-14
ヒト骨髄性原形質膜糖タンパク質ＣＤ１３（ｇｐ１５０）はアミノペプチダーゼＮと同一である。J Clin Invest 1989 Apr; 83 (4): 1299-307
骨髄性細胞および小腸上皮細胞におけるヒトアミノペプチダーゼＮ遺伝子の分離したプロモーター制御の転写。J Biol Chem 1991 Jun 25; 266 (18): 11999-2007
ヒトアミノペプチダーゼＮはヒトコロナウイルス２２９Ｅのレセプターである。Nature 1992 Jun 4 ; 357 (6377): 420-2
ＳＳＣＰ解析および配列決定によるアミノペプチダーゼＮ遺伝子における点変異の同定。Hum Mutat 1998;Suppl 1 :S158-60
ヒトアミノペプチダーゼＮは腫瘍ホーミングペプチドのレセプターであり、血管新生の阻害標的である。Cancer Res 2000 Feb 1; 60 (3): 722-7
アミノペプチダーゼＮ／ＣＤ１３は、単球においてシグナル伝達経路と直接連携している。Cell Immunol 2000 Apr 10; 201 (1): 22-32
多発性硬化症の患者における末梢血単核球細胞での天然のエンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）およびアミノペプチダーゼＮ（ＡＰＮ）の増大した発現。Immunol Lett 2000 Feb 1 ; 71 (2): 127-9
【図面の簡単な説明】
【０２５２】
【図１】アミノペプチダーゼＮポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）を示す。
【図２】図１のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】swiss|P15144|AMPN_HUMANアミノペプチダーゼＮによって同定されるタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。
【図４】swiss|P15144|AMPN_HUMANアミノペプチダーゼＮ（配列番号３）に対する３４０（配列番号２）のBLASTP-アライメントを示す。
【図５】pfam|hmm|Peptidase_M1に対する３４０（配列番号２）のＨＭＭＰＦＡＭ-アライメントを示す。
【図６】プロサイトサーチの結果を示す。
【図７】ＴＭＨＭＭの結果を示す。
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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