(57)【要約】本発明は生物学的試料中のヒト腫瘍関連ウロキナーゼ−タイププラスミノーゲンアクチベーターレセプター（uPAR）欠失変異体を検出するための特異的抗体の製造およびその診断および治療における使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロキナーゼレセプター（ｕＰＡＲ）の欠失変異体をコードする核酸において、天然の配列の１個または２個のエキソンが少なくとも部分的に欠失していることを特徴とする、但しジーンバンク配列Ｕ ０８８３９を除く、ウロキナーゼレセプターの欠失変異体（ｕＰＡＲ）をコードする核酸。
【請求項２】
エキソン４および／または５の配列を少なくとも部分的に欠失する、請求項１記載の核酸配列。
【請求項３】
エキソン４および／または５の配列を実質的に完全に欠失する、請求項１または２記載の核酸配列。
【請求項４】
ヒトｕＰＡＲの欠失変異体をコードする、請求項１から３までのいずれか１項記載の核酸配列。
【請求項５】
腫瘍関連のｕＰＡＲ−変異体をコードする、請求項１から４までのいずれか１項記載の核酸配列。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか１項記載のｕＰＡＲ−欠失変異体をコードする核酸と選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、ｕＰＡＲ−特異的オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
欠失範囲を越えて延びる、請求項６記載のｕＰＡＲ−特異的オリゴヌクレオチド。
【請求項８】
発現制御配列との機能的な結合において有利に、請求項１から５までのいずれか１項記載の核酸のコピーを少なくとも１つ有することを特徴とする、組換えベクター。
【請求項９】
請求項１から５までのいずれか１項記載の核酸または請求項８記載のベクターで形質転換されていることを特徴とする細胞。
【請求項１０】
次の工程
（ａ）請求項１から５までのいずれか１項記載の核酸または請求項８記載のベクターの製造、
（ｂ）この核酸またはベクターの好適な宿主細胞中への導入、
（ｃ）ポリペプチド発現のために好適な培地中での宿主細胞の培養、
（ｄ）発現生成物の培地および／または宿主細胞からの単離、
を包含する、組換えによるポリペプチドの製法。
【請求項１１】
宿主細胞が哺乳動物の細胞、例えばＣＨＯである、請求項１０記載の製法。
【請求項１２】
請求項１から５までのいずれか１項記載の核酸によりコードされていることを特徴とする、ｕＰＡＲ−欠失変異体。
【請求項１３】
腫瘍選択的に発現される、請求項１２記載のｕＰＡＲ−欠失変異体。
【請求項１４】
天然の配列の１個または２個のエキソンが少なくとも部分的に欠失しているｕＰＡＲ−欠失変異体のフラグメントにおいて、最少長さがアミノ酸６個を有しており、天然ｕＰＡＲ−アミノ酸配列とは異なる、ｕＰＡＲ−欠失領域を特徴とするアミノ酸配列を有することを特徴とする、ｕＰＡＲ−欠失変異体のフラグメント。
【請求項１５】
アミノ酸５０個までの長さを有する、請求項１４記載のフラグメント。
【請求項１６】
ｕＰＡＲ−欠失変異体を特徴とする抗原エピトープを有する、請求項１４または１５記載のフラグメント。
【請求項１７】
抗体を製造するための免疫原としての、１個または２個のエキソンを部分的に欠失しているｕＰＡＲ−欠失変異体またはそのフラグメントの使用。
【請求項１８】
天然のｕＰＡＲに対して実質的に全く交叉反応を示さないことを特徴とする、１個または２個のエキソンを部分的に欠失するｕＰＡＲ−欠失変異体に対する抗体。
【請求項１９】
マーカー基および／または細胞毒基との複合体の形で存在する、請求項１８記載の抗体。
【請求項２０】
細胞毒基が放射性核種およびトキシンから選択されている、請求項１９記載の抗体。
【請求項２１】
有効成分として、
（ａ）天然の配列の１個または２個のエキソンを少なくとも部分的に欠失している、ｕＰＡＲ−欠失変異体をコードする核酸、
（ｂ）（ａ）の核酸を含有するベクター、
（ｃ）（ａ）の核酸または（ｂ）のベクターを含有する細胞、
（ｄ）天然の配列の１個または２個のエキソンを少なくとも部分的に欠失しているｕＰＡＲ−欠失変異体、またはその抗原フラグメント、
（ｅ）天然の配列の１個または２個のエキソンを少なくとも部分的に欠失しているｕＰＡＲ−欠失変異体またはその抗原フラグメントに対する抗体、
を包含することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２２】
更に、薬学的に常用の担持剤、助剤および／または添加物を含有する、請求項２１記載の医薬組成物。
【請求項２３】
診断用薬剤または治療用薬剤としての、請求項２１または２２記載の組成物の使用。
【請求項２４】
腫瘍疾患における経過の診断のための診断用薬剤としての請求項２１記載の組成物の、有利に抗体の、使用。
【請求項２５】
生物学的試料中の腫瘍細胞を検出するための請求項２１記載の組成物の、有利に抗体の、使用。
【請求項２６】
腫瘍疾患の治療のための治療用薬剤としての、請求項２４記載の組成物の、有利に抗体の、使用。
【請求項２７】
乳ガンおよび卵巣ガンにおける、請求項２４から２６までのいずれか１項記載の使用。
【請求項２８】
腫瘍細胞の増殖阻止または死滅のための、請求項２３または２４記載の使用。
【請求項２９】
有効成分がｕＰＡＲ−欠失変異体であるｄｅｌ４、ｄｅｌ５および／またはｄｅｌ４＋５に対する抗体である、請求項２３から２８までのいずれか１項記載の使用。
【請求項３０】
次の工程：
（ａ）テストすべき試料の調製、
（ｂ）試料と請求項１８から２０までのいずれか１項記載の抗体の１つとの接触、および
（ｃ）試料への抗体の結合の検出、
を包含する、生物学的試料中でのｕＰＡＲ−欠失変異体の選択的検出法。
【請求項３１】
検出をＥＬＩＳＡにより実施する、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍試料、有利に乳ガンまたは卵巣ガン組織から単離した腫瘍試料、を使用する、請求項３０または３１記載の方法。
【請求項３３】
請求項６に記載のオリゴヌクレオチドによるｕＰＡＲ−欠失変異体の選択的発現阻止法。
【請求項３４】
オリゴヌクレオチドがｕＰＡＲ−変異体１個または複数個の融合領域を覆う、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
選択的に、ｕＰＡＲ変異体であるｄｅｌ４および／またはｄｅｌ５および／またはｄｅｌ４＋５の発現を少なくとも部分的にブロックするオリゴヌクレオチドを使用する、請求項３３または３４記載の方法。
【請求項３６】
ｕＰＡＲ変異体であるｄｅｌ４、ｄｅｌ５およびｄｅｌ４＋５の全てを発現阻止するために、オリゴヌクレオチドの混合物を使用する、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
ｕＰＡＲ−欠失変異体の活性のインヒビターとしての、請求項１８から２０までのいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項３８】
生物学的試料中のｕＰＡＲ−欠失変異体を検出するための分子検出システムとしての、請求項１８から２０までのいずれか１項記載の抗体の使用。
【請求項３９】
天然の配列の１個または２個のエキソンを少なくとも部分的に欠失しているｕＰＡＲ−欠失変異体、またはこれをコードする核酸の、ｕＰＡＲ−変異体の活性を選択的に調節する、特に阻止する作用物質を同定するための方法への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的試料中のヒト腫瘍関連のウロキナーゼタイプのプラスミノーゲンアクチベータレセプター（ｕＰＡＲ）を検出するための特異的な抗体の製造および使用に関する。
【０００２】
固体悪性腫瘍の浸潤および転移における腫瘍関連のウロキナーゼレセプターの役割に関する新規知識は、特に乳ガンおよび卵巣ガンにおいて、腫瘍生物学に向けられた新たな治療戦略の開発のために決定的な必要条件である。これらの腫瘍の浸潤性増殖も腫瘍転移の発生も多因子の関連する工程であり、この工程でプラスミノーゲン活性化システムのプロテアーゼ、例えばウロキナーゼタイプのプラスミノーゲンアクチベータ（ｕＰＡ）およびそのインヒビター（ＰＡＩ−１）が決定的に重要な役割を有している。その際、ｕＰＡ−レセプター（ｕＰＡＲ；ＣＤ８７）はｕＰＡ−酵素システムを細胞表面に集め、かつ活性化する能力により最も重要な鍵を握っている。腫瘍中のｕＰＡＲはその構造のために種々の分子形で存在するので腫瘍組織中でのその機能的および生物化学的特徴付けをすることは困難である。
【０００３】
ウロキナーゼ−レセプター、ｕＰＡＲは、相対質量４５〜６０ｋＤａを有する、強くかつ不均一なグリコシル化蛋白質であり、ＧＰＩ−リピドアンカーを介して細胞膜に懸かっている。ｕＰＡＲの一次構造においては、それぞれｕＰＡＲ−遺伝子の２個のエキソンをコードする３個の同族のドメイン（homologe Domaene）により区別される。ｕＰＡとの相互作用は、特にｕＰＡＲのドメインＩ（ＤＩ）により仲介される。しかしながら、ドメインＩＩ（ＤＩＩ）および／またはドメインＩＩＩ（ＤＩＩＩ）中にはｕＰＡ／ｕＰＡＲ−相互作用に関するその他の決定基が局在している。その他の結合位（多分、ＤＩＩ／またはＤＩＩＩ中）でｕＰＡＲは細胞外マトリックスの蛋白質であるビトロネクチンに高い親和性で結合し、その際ここでもＤＩとの相互作用が重要であるように思われる。ｕＰＡの結合の後、細胞内シグナルトランスダクションは明らかに異なる過程を経過する。活性化単球の細胞膜中ではｕＰＡＲは、例えば他の膜蛋白質及び“セカンドメッセンジャー”蛋白質と多重複合体を形成し、これはシグナルトランスダクションをもたらし、かつその機能的協同を示唆する。
【０００４】
ｕＰＡＲが翻訳後制御だけでなく、細胞刺激およびリガンド結合の結果として可逆性の活性化の影響下にある、ということは公知である。ｕＰＡＲはその構造のために種々の分子形で存在し、その組織中での生物学的活性は、特に腫瘍の発生の際に異なっていることがある。グリカンリピドアンカーの細胞関連酵素を介しての切断の後、ｕＰＡＲはその可溶性の形（ｓｕＰＡＲ）で腫瘍患者の体液中で検出される。更に、ｕＰＡＲに関して異なるグリコシル化変異体が記載されている。こうして、細胞の（例えばフォルボルエステルによる）刺激は明らかにｕＰＡＲのグリコシル化度の上昇に導く。緩和なキモトリプシン消化はｕＰＡＲ分子をＤＩおよびＤＩＩの間で切断する。生じたフラグメントＤＩおよびＤＩＩ／ＤＩＩＩはインビトロで種々の細胞タイプにおいて化学走性に作用する。インビボでのｕＰＡＲフラグメントＤＩもしくはＤＩＩ／ＤＩＩＩの存在並びにその生物学的機能に関しては文献中にあまり記述がない。従来記載されているのは、ＤＩＩ／ＤＩＩＩｕＰＡＲ−変異体（ＤＩの切断下）が幾つかの腫瘍セルライン並びに卵巣ガンの卵巣細胞液中に存在することがあるということ程度である。従来、ｕＰＡＲ−欠失変異体の腫瘍選択的存在は公知ではない。更に従来ｕＰＡＲ−欠失変異体を選択的に検出することのできる方法も存在しなかった。
【０００５】
意外にも、腫瘍細胞中にｕＰＡＲ−欠失変異体の選択的に上昇した発現を検出することができることが見いだされた。更に、腫瘍関連ｕＰＡＲ−欠失変異体、特に卵巣ガン又は乳ガン中のｕＰＡＲの欠失変異体、を特徴付けすることのできる方法が作製された。この方法の適用により得られた結果は腫瘍診断中に、特に診断の判定のためのパラメータとして使用することができる。この方法はｕＰＡＲ−欠失変異体の選択的測定を可能にする条件下に、生物学的試料中のｕＰＡＲ−変異体を、例えばＥＬＩＳＡ法で、検出するために、ｕＰＡＲ−抗体を使用することを包含する。その際、ｕＰＡＲ−欠失変異体に選択的に結合する抗体を有利に使用する。更に、ｕＰＡＲ−欠失変異体を治療介入のためのおよび作用物質スクリーニングのためのターゲットとして製造する。
【０００６】
本発明の対象は、ヒトｕＰＡＲ−レセプターの欠失変異体をコードする核酸であり、この核酸は有利に完全な配列の１個または２個のエキソンを、エキソン４および５を、少なくとも部分的におよび／または実質的に完全に欠失している。この核酸は有利に腫瘍および腫瘍細胞中に、特にヒトの乳ガンおよび卵巣ガン中に選択的に発現されるポリペプチドをコードする。“選択的発現”とは本願においては好適なテストにおいて腫瘍細胞および正常細胞中で異なる発現強度を定性的および／または定量的に検出可能であることを意味する。
【０００７】
図１（配列番号１および２）、図２（配列番号３および４）および図３（配列番号５および６）は、有利な腫瘍関連ｕＰＡＲ−欠失変異体ｄｅｌ４、ｄｅｌ４＋５およびｄｅｌ５のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を示す。図３による欠失変異体ｄｅｌ５の配列（配列番号５および６）はすでに公に入手可能なデータバンク（ジーンバンクアクセスナンバーＵ０８８３９）中に記載されている。しかしながらそこにはこの欠失変異体の腫瘍選択的な発現に関する示唆は全くない。図４Ａ、Ｂ、５Ａ、Ｂおよび６Ａ、Ｂは欠失変異体の核酸配列およびアミノ酸配列を相応する野生型配列（配列番号７および８）と比較して示している。
【０００８】
図１〜３中の核酸配列およびこれに相補性の配列および遺伝学的コードの縮重の範囲に相当する配列の他に、本発明は前記の配列の１つと、有利には融合移行（Fusionuebergang）でハイブリダイゼーションする核酸配列も包含する。有利には、本発明によるヌクレオチド配列は二本鎖または一本鎖のＤＮＡであるが、これはＲＮＡであってもよい。特に有利に、本発明の核酸は図示したヌクレオチド配列の断片、または図示したヌクレオチド配列の１つに８０％より多い、有利には９０％より多いおよび特に有利には９５％より多い相同性を示すかまたは有利にその配列の少なくとも１８個の長さのヌクレオチド断片を示す配列を包含する。その際、相同の度合いＩは次のように測定する：
【０００９】
【化１】
2004534525.tif 000002
この際、Ｎは検査すべき配列およびベース配列の間の一致する塩基の数であり、Ｌはベース配列の長さである。
【００１０】
本発明による核酸は有利に哺乳動物および特に有利にはヒトから、例えば核酸増幅により、例えばＰＣＲにより得られる。他方、核酸は組換え法および／または化学的合成により得ることもできる。
【００１１】
本発明によるゾンデおよびプライマーは、選択的にｕＰＡＲ−欠失変異体を認識し、天然の配列を認識しない、すなわちｕＰＡＲ−欠失変異体をコードする核酸と選択的にハイブリダイズする。これはハイブリダイゼーションゾンデとしておよび／または増幅プライマーとして公知技術により使用することができる。これは有利に欠失領域を越えて延びる、すなわち配列の開始が欠失の開始の上流にあり、配列の末端が欠失の末端の下流にある。
【００１２】
プライマーおよびゾンデは有利にマーカーまたはマーカー基を有する。種々のｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−種を同定するために好適であるプライマー組合せも有利である。ｕＰＡＲ−欠失領域がｄｅｌ４および／またはｄｅｌ５および／またはｄｅｌ４＋５において越えて延びるプライマーが有利である。
【００１３】
本発明の更なる対象は前記の定義した核酸がコードするポリペプチドもしくは診断および治療ターゲットとしてのその使用である。このポリペプチドは有利にｄｅｌ４に関する図１（配列番号２）、ｄｅｌ４＋５に関する図２（配列番号４）およびｄｅｌ５に関する図３（配列番号６）のアミノ酸を包含する。
【００１４】
図示したポリペプチド配列の他に、本発明はその変異体およびフラグメントに関する。これは図示したアミノ酸配列の短いアミノ酸断片であり、これは最短長さアミノ酸６個、特に有利にアミノ酸８個を有し、かつ完全なｕＰＡＲ一次配列に対して異なっている欠失領域からの一次配列が有利である。
【００１５】
更に、本発明によるペプチドおよびポリペプチドは化学合成により製造されてもよい。
【００１６】
本発明はｕＰＡＲ−レセプター−タンパク質のアレル変異体またはスプライス変異体、並びに生物学的および／または免疫学的活性に関して図示した蛋白質に実質的に相当する組換えＤＮＡ技術により生じた蛋白質も包含する。
【００１７】
本発明のその他の対象は本発明による核酸のコピーを少なくとも１つ有するベクターである。このベクターは任意の原核または真核ベクターであってよく、この上に本発明によるＤＮＡ配列が有利に発現シグナル、例えばプロモータおよびその他の発現制御配列と結合して存在する。本発明によるベクターが真核ベクター、例えば高い細胞に好適なベクター、例えばプラスミドベクターであるのが特に有利である。
【００１８】
本発明のその他の対象は本発明による核酸または本発明によるベクターで形質転換された細胞である。この細胞は原核または真核細胞であってよい。細胞を核酸で形質転換するための方法は一般に公知技術であり、ここで詳細に述べる必要はない。有利な細胞の例は真核細胞であり、特に動物細胞および特に有利に哺乳動物細胞である。
【００１９】
本発明のその他の対象はｕＰＡＲ−ペプチドの欠失変異体に対する抗体である。ポリクローナル抗血清は、本発明によるポリペプチドまたはフラグメントで実験動物を免疫することにより得られる。抗体製造のためには有利に本発明によるペプチドおよび／またはポリペプチドをキャリヤー蛋白質、例えばＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）またはＢＳＡ（Bovine Serum Albumin）に結合する。
【００２０】
生じた複合体は実験動物、例えば家ウサギ、ニワトリ、ハムスター、ヤギ、ヒツジおよびウマ、の免疫のためのイムノゲンとして使用することができる。特に有利には免疫のためにｕＰＡＲ−欠失変異体の融合移行に相当するペプチドを使用する。生じたポリクローナル抗体は実質的に天然のｕＰＡＲに対して交叉反応性を全く示さない。交叉反応性は２０％より小さいか、有利には１０％より小さく、特に５％より小さいのが有利である。
【００２１】
本発明による抗体はマーカー基および／または細胞毒基との複合体の形で存在していてもよい。マーカー基としては酵素、例えばアルカリホスファターゼまたはペルオキシダーゼ、蛍光マーカー、を使用することができるが、放射性マーカーを使用することもできる。細胞毒基としては放射性核種またはトキシンを使用することができる。こうして、この種の抗体は診断学的テスト、特に乳ガン組織および卵巣ガン組織の診断学的テストにも、治療のためにも使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡ−法を用いて試料を腫瘍組織中の欠失変異体の存在に関して実験することができる。
【００２２】
こうして、本発明による選択的抗体は腫瘍組織抽出物の診断評価のためのテストシステムを作製することを可能にし、こうして腫瘍患者の再発率または生存可能性を決定する、すなわち本発明による抗体を使用することにより、腫瘍患者の診断対応のための重要な情報を獲得することができる。
【００２３】
診断学的な検査は、核酸レベル、特に転写レベルでの検出のための特異的な核酸ゾンデを用いても実施することができる。本発明によるゾンデ／プライマーは、例えばＲＴ−ＰＣＲ−適用において、特異的なｍＲＮＡのｕＰＡＲ−結失変異体の増幅のためのキットを製造するために好適である。
【００２４】
更に、本発明は、活性成分として核酸、形質転換細胞、ポリペプチドおよびペプチドの他に選択的なｕＰＡＲ−欠失変異体特異的抗体も包含することを特徴とする医薬組成物に関する。この医薬組成物、有利にｕＰＡＲ−欠失変異体特異的抗体、の腫瘍疾患、例えば乳ガンおよび卵巣ガンにおける治療薬としての使用は特に有利である。
【００２５】
更に、ｕＰＡＲの欠失変異体に向けられた抗体は、例えば腫瘍細胞において選択的に機能遮断に作用することのできる治療薬の製造にも好適である。更に、腫瘍細胞を阻止するかまたは死滅させる細胞毒基との複合体の形で抗体を使用することもできる。
【００２６】
本発明のその他の対象は、アンチセンス核酸、例えばオリゴデスオキシヌクレオチド、これはｕＰＡＲ−欠失変異体の融合領域を覆いかつｕＰＡＲ−変異体の発現ブロックのために使用することができる。
【００２７】
本発明を次の図および例により更に詳細に説明する：
図１  はｕＰＡＲ−欠失変異体ｄｅｌ４に関するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号１および２）を示す。
【００２８】
図２  はｕＰＡＲ−欠失変異体ｄｅｌ４＋５に関するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号３および４）を示す。
【００２９】
図３  はｕＰＡＲ−欠失変異体ｄｅｌ５に関するヌクレオチド−アミノ酸配列（配列番号５および６）を示す。
【００３０】
図４  はｕＰＡＲ−欠失変異体ｄｅｌ４に関して、野生型配列のヌクレオチド配列（４Ａ）およびアミノ酸配列（４Ｂ）（配列番号７および８）との比較を示す。
【００３１】
図５  はｕＰＡＲ−欠失変異体ｄｅｌ４＋５に関して、野生型配列のヌクレオチド配列（４Ａ）およびアミノ酸配列（４Ｂ）（配列番号７および８）との比較を示す。
【００３２】
図６  はｕＰＡＲ−欠失変異体ｄｅｌ５に関して、野生型配列のヌクレオチド配列（４Ａ）およびアミノ酸配列（４Ｂ）（配列番号７および８）との比較を示す。
【００３３】
図７  はｕＰＡＲ−変異体をコードするプラスミドが導入された（transfizierte）ＣＨＯ−細胞の上澄み中でのｓｕＰＡＲ（ｕＰＡＲ−変異体）の検出を示す。ＨＵ２７７／ＨＤ１３、ＨＵ２７７／ＩＩＩＦ１０およびＡＤＩは種々のＥＬＩＳＡ−システムに相応する。
【００３４】
図８  はＥＬＩＳＡによる、グリコホスホイノシトール−固定変異体（verankerte Variante）としてｕＰＡＲｄｅｌ５およびｕＰＡＲｄｅｌ４＋５の発現の結果を示す。記号：対照：ＷＴ＝ＣＨＯ−細胞；ＲＳＶ＝ＣＨＯ＋ベクタートランスフェクション；Ｄ２＋３およびＤ２＋３ＣＰ＝ｕＰＡＲ−変異体（ドメイン１を有さず）；ｄｅｌ５＝ｕＰＡＲｄｅｌ５；ｄｅｌ４＋５＝ｕＰＡＲｄｅｌ４＋５
図９  はフローサイトメトリーによりグリコホスホイノシトール−固定変異体としてのｕＰＡＲｄｅｌ５およびｕＰＡＲｄｅｌ４＋５の発現の結果を示す。記号：グレー＝マウスＩｇＧ（関連していない）；明るいブルー＝ｍＡｂＩＩＩＦ１０；ブルー＝ＨＤ１３.１
図１０  は免疫のために選択したペプチドを示す。同じアミノ酸を黄色で強調した。
【００３５】
図１１  は例３により単離したペプチド特異的抗体のウェスタン・ブロット分析の結果を示す。
【００３６】
図１２  は例３により実施したウェスタン・ブロット分析の総括を示す。
【００３７】
図１３  は例３により実施したＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００３８】
図１４  は例３により実施したウェスタン・ブロット分析およびＥＬＩＳＡの結果を比較して示した。
【実施例】
【００３９】
例１：ｕＰＡＲのｍＲＮＡ−スプライス−変異体の検出
腫瘍細胞中でｕＰＡＲ−ｍＲＮＡ−変異体が存在するかどうかを明らかにするために、乳ガンセルラインから、非悪性セルラインから、並びに乳ガン組織からｍＲＮＡを単離し、ｕＰＡＲ−エキソン１および６のための特異的なプライマーを使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。非悪性のセルライン中には主に完全な長さのｕＰＡＲ−ｃＤＮＡが見いだされ、一方乳ガンセルライン中には付加的にエキソン４（ｄｅｌ４）中に、エキソン５（ｄｅｌ５）中にもしくはエキソン４＋５（ｄｅｌ４＋５）中に欠失を有するｃＤＮＡ−変異体を検出することができた。これらは増幅体の配列決定により確認することができた。ｕＰＡＲ−エキソン変異体は卵巣ガン組織中でも検出することができた。
【００４０】
例２：種々のｕＰＡＲ−欠失変異体のクローニングおよび発現
種々のｕＰＡＲ−欠失変異体（欠失−エキソン−４＝ｄｅｌ４、ｄｅｌ５、ｄｅｌ４＋５）を生産し、クローニングし、配列決定し、かつＣＨＯ−細胞中に導入する（過渡トランスフェクション）。コントロールとしては完全なｕＰＡＲ−ｃＤＮＡ（Ｄ１２３）もしくはＤＩ（Ｄ１）に関するｃＤＮＡでのトランスファクタントを使用する。導入されたＣＨＯ−細胞の培養上澄みを７２時間後に取出し、ｕＰＡＲ−ＥＬＩＳＡにより検査した。全ての発現したｕＰＡＲ−変異体（ｓｕＰＡＲ）はそれぞれの細胞上澄み中に検出することができ、ベクター対照並びに培地はマイナスであった。エキソン４−欠失を有するｕＰＡＲ−変異体並びに完全なｕＰＡＲ分子はＥＬＩＳＡによって同様な方法で検出することができ、一方ｄｅｌ５およびｄｅｌ４＋５発現プラスミドの場合には異なる反応モデルを示す。こうしてｕＰＡＲ−ｄｅｌ５−変異体はＨＵ／ＩＩＩＦ１０−ＥＬＩＳＡとは異なり、ＨＵ／ＨＤ１３中で部分的にのみ認識可能であり、一方ｄｅｌ４＋５−変異体はもっぱらＨＵ／ＩＩＩＦ１０−ＥＬＩＳＡ中で検出することができた。
【００４１】
全ての公知のｕＰＡＲ−ｍＲＮＡスプライス変異体の翻訳された蛋白質はＨＵ／ＩＩＩＦ１０−ＥＬＩＳＡで検出可能である（図７）。
【００４２】
ｕＰＡＲ  ｄｅｌ５およびｕＰＡＲ  ｄｅｌ４＋５は更にＣＨＯ−細胞中でグリコホスホイノシトール（ＧＰＩ）−固定変異体として発現され、かつ発現はＥＬＩＳＡ（ＡＤＩ；ＨＵ／ＩＩＩＦ１０；図８）により、およびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ−分析；図９）により検出可能である。Ｄ２＋３およびＤ２＋３ＣＰは、それぞれ天然の蛋白質のドメインＩを欠失するｕＰＡＲの対照変異体を形成する。ＨＵ／ＩＩＩＦ１０−ＥＬＩＳＡはこの変異体を検出せず、一方ＡＤＩ−ＥＬＩＳＡ（American Diagnostica）はこの変異体を認識する。
【００４３】
例３：抗体の製法
ペプチド（図１０）をナメクジのヘモシアニン（ＫＨＬ、Keyhole Limpet Hemocyanin）に、ｍ−マレインイミド安息香酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いて結合する。ＫＬＨをリン酸塩緩衝液中でＭＢＳと約３０分間室温で軽く攪拌し、過剰のＭＢＳをゲル濾過により除去する。その後、ペプチドをリン酸塩緩衝液中に溶かし、僅かにＥＤＴＡ−溶液を添加する。このペプチド溶液を濃縮したＭＢＳ−タンパク質溶液に添加し、室温で４時間軽く振盪する。これに対する選択的方法として標準的な実験報告書によりペプチドをウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）から結合することもできる。
【００４４】
免疫のためには、一般に家ウサギを使用する。家ウサギの免疫は結合させたペプチドとフロインドのアジュバントの皮下注射により行う。最初の免疫の４週間後に、最初のブースター注射を投与する。その後２週間の間隔で免役し、第２のブースター注射の後に、免疫後毎回１０日後に耳の静脈から血液試料を採取する。血液から得られた血清は抗体−タイター測定に好適である。抗体−タイターは間接的なＥＬＩＳＡ−法により測定する。
【００４５】
家ウサギに加えて、ニワトリおよびモルモットもポリクローナル抗血清を獲得するために標準プロトコールにより使用することができる。ここでもそれぞれの種（家ウサギ、ニワトリおよびモルモット）の６匹を相応して複数回の注射により免役し、１８０日後に血清／卵を獲得するための免疫を終了した。
【００４６】
得られた血清および卵をペプチド特異的な抗体を単離するために使用し、かつこれをウェスタン・ブロット分析およびＥＬＩＳＡ法でテストした。
【００４７】
ｕＰＡＲ−変異体の特徴付けのために、相応するｕＰＡＲ  ｄｅｌ４、ｕＰＡＲ  ｄｅｌ５およびｕＰＡＲ  ｄｅｌ４＋５並びに野生型（ＷＴ）−ｕＰＡＲを非グリコシル化蛋白質としてＥ．コリ中で生産した（発現ベクター  ｐＱＥ３０）。更に、ハムスター細胞からのグリコシル化ＷＴ−ｕＰＡＲ（ＣＨＯ−ｕＰＡＲ）を使用した。
【００４８】
抗体１８個のうちの５個は良好な反応性を示した。これらは家ウサギ１−ｄｅｌ４；家ウサギ２−ｄｅｌ４＋５；ニワトリ１−ｄｅｌ５；ニワトリ１−ｄｅｌ４；ニワトリ１−ｄｅｌ４＋５である。これらの抗血清はＣＨＯ−ｕＰＡＲと全く反応を示さなかった（図１１、１２、１４）。
【００４９】
ＥＬＩＳＡ−実験は、得られた抗体の腫瘍抽出物中のｕＰＡＲ−変異体の分析への使用可能性も証明している（図１３、１４）。
【００５０】
例４：免疫組織化学
免疫組織化学的実験は標準プロトコールにより乳ガン組織切片により実施した。テストは抗血清である、家ウサギ１−ｄｅｌ４＋５；家ウサギ２−ｄｅｌ４＋５；家ウサギ１−ｄｅｌ４およびニワトリ２−ｄｅｌ４＋５で実施した。
【００５１】
ニワトリ２−ｄｅｌ４＋５は超音波処理の後、グリコシル化ＷＴ−ｕＰＡＲとも反応するが、付加的に腫瘍細胞中で着色がｕＰＡＲ−ｄｅｌ４＋５の着色のために得られる。家ウサギ１−ｄｅｌ４＋５；家ウサギ２−ｄｅｌ４＋５は同様の着色モデルを示す。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】ｕＰＡＲ−欠失変異体ｄｅｌ４に関するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号１および２）を示す図。
【００５３】
【図２】ｕＰＡＲ−欠失変異体ｄｅｌ４＋５に関するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列（配列番号３および４）を示す図。
【００５４】
【図３】ｕＰＡＲ−欠失変異体ｄｅｌ５に関するヌクレオチド−アミノ酸配列（配列番号５および６）を示す図。
【００５５】
【図４】ｕＰＡＲ−欠失変異体ｄｅｌ４に関して、野生型配列のヌクレオチド配列（４Ａ）およびアミノ酸配列（４Ｂ）（配列番号７および８）との比較を示す図。
【００５６】
【図５】ｕＰＡＲ−欠失変異体ｄｅｌ４＋５に関して、野生型配列のヌクレオチド配列（４Ａ）およびアミノ酸配列（４Ｂ）（配列番号７および８）との比較を示す図。
【００５７】
【図６】ｕＰＡＲ−欠失変異体ｄｅｌ５に関して、野生型配列のヌクレオチド配列（４Ａ）およびアミノ酸配列（４Ｂ）（配列番号７および８）との比較を示す図。
【００５８】
【図７】ｕＰＡＲ−変異体をコードするプラスミドが導入されたＣＨＯ−細胞の上澄み中でのｓｕＰＡＲ（ｕＰＡＲ−変異体）の検出を示すグラフ図。
【００５９】
【図８】ＥＬＩＳＡによる、グリコホスホイノシトール−固定変異体としてｕＰＡＲｄｅｌ５およびｕＰＡＲｄｅｌ４＋５の発現の結果を示すグラフ図。
【００６０】
【図９】フローサイトメトリーによりグリコホスホイノシトール−固定変異体としてのｕＰＡＲｄｅｌ５およびｕＰＡＲｄｅｌ４＋５の発現の結果を示すグラフ図。
【００６１】
【図１０】免疫のために選択したペプチドを示す表の図。
【００６２】
【図１１】例３により単離したペプチド特異的抗体のウェスタン・ブロット分析の結果を示す図。
【００６３】
【図１２】例３により実施したウェスタン・ブロット分析の総括を示す表の図。
【００６４】
【図１３】例３により実施したＥＬＩＳＡの結果を示す表の図。
【００６５】
【図１４】例３により実施したウェスタン・ブロット分析およびＥＬＩＳＡの結果を比較して示した表の図。
【図７】
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【図８】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年6月18日(2003.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウロキナーゼレセプター（ｕＰＡＲ）の欠失変異体をコードする核酸において、天然の配列のエキソン４および／または５の配列が少なくとも部分的に欠失していることを特徴とする、但しジーンバンク配列Ｕ ０８８３９を除く、ウロキナーゼレセプターの欠失変異体をコードする核酸。
【請求項２】
エキソン４および／または５の配列を実質的に完全に欠失する、請求項１記載の核酸配列。
【請求項３】
ヒトｕＰＡＲの欠失変異体をコードする、請求項１または２記載の核酸。
【請求項４】
腫瘍関連のｕＰＡＲ−欠失変異体をコードする、請求項１から３までのいずれか１項記載の核酸。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか１項記載のｕＰＡＲ−欠失変異体をコードする核酸と選択的にハイブリダイズすることを特徴とする、ｕＰＡＲ−特異的オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
欠失範囲を越えて延びる、請求項５記載のｕＰＡＲ−特異的オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
発現制御配列との機能的な結合において、請求項１から４までのいずれか１項記載の核酸のコピーを少なくとも１つ有することを特徴とする、組換えベクター。
【請求項８】
請求項１から４までのいずれか１項記載の核酸または請求項７記載のベクターで形質転換されていることを特徴とする細胞。
【請求項９】
次の工程
（ａ）請求項１から４までのいずれか１項記載の核酸または請求項７記載のベクターの製造、
（ｂ）この核酸またはベクターの好適な宿主細胞中への導入、
（ｃ）ポリペプチド発現のために好適な培地中での宿主細胞の培養、
（ｄ）発現生成物の培地および／または宿主細胞からの単離、
を包含する、組換えによるポリペプチドの製法。
【請求項１０】
宿主細胞が哺乳動物の細胞、例えばＣＨＯである、請求項９記載の製法。
【請求項１１】
請求項１から４までのいずれか１項記載の核酸によりコードされていることを特徴とする、ｕＰＡＲ−欠失変異体。
【請求項１２】
腫瘍選択的に発現される、請求項１１記載のｕＰＡＲ−欠失変異体。
【請求項１３】
天然の配列のエキソン４および／または５の配列が少なくとも部分的に欠失しているｕＰＡＲ−欠失変異体のフラグメントにおいて、アミノ酸６〜５０個の長さを有しており、天然ｕＰＡＲ−アミノ酸配列とは異なる、ｕＰＡＲ−欠失領域を特徴とするアミノ酸配列を有することを特徴とする、ｕＰＡＲ−欠失変異体のフラグメント。
【請求項１４】
ｕＰＡＲ−欠失変異体を特徴とする抗原エピトープを有する、請求項１３記載のフラグメント。
【請求項１５】
抗体を製造するための免疫原としての、天然の配列のエキソン４および／または５の配列を少なくとも部分的に欠失しているｕＰＡＲ−欠失変異体またはそのフラグメントの使用。
【請求項１６】
天然のｕＰＡＲに対して実質的に全く交叉反応を示さないことを特徴とする、天然の配列のエキソン４および／または５の配列を少なくとも部分的に欠失するｕＰＡＲ−欠失変異体に対する抗体。
【請求項１７】
マーカー基および／または細胞毒基との複合体の形で存在する、請求項１６記載の抗体。
【請求項１８】
細胞毒基が放射性核種およびトキシンから選択されている、請求項１７記載の抗体。
【請求項１９】
有効成分として、
（ａ）天然の配列のエキソン４および／または５の配列を少なくとも部分的に欠失している、ｕＰＡＲ−欠失変異体をコードする核酸、但しジーンバンク配列Ｕ０８８３９を除く、
（ｂ）（ａ）の核酸を含有するベクター、
（ｃ）（ａ）の核酸または（ｂ）のベクターを含有する細胞、
（ｄ）（ａ）の核酸によりコードされているｕＰＡＲ−欠失変異体、またはその抗原フラグメント、
（ｅ）天然の配列のエキソン４および／または５の配列を少なくとも部分的に欠失しているｕＰＡＲ−欠失変異体またはその抗原フラグメントに対する抗体、
を包含することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２０】
医薬的使用のために有効成分として、
（ａ）天然の配列のエキソン４および／または５の配列を少なくとも部分的に欠失している、ｕＰＡＲ−欠失変異体をコードする核酸、
（ｂ）（ａ）の核酸を含有するベクター、
（ｃ）（ａ）の核酸または（ｂ）のベクターを含有する細胞、
（ｄ）天然の配列のエキソン４および／または５の配列を少なくとも部分的に欠失しているｕＰＡＲ−欠失変異体、またはその抗原フラグメント、
（ｅ）天然の配列のエキソン４および／または５の配列を少なくとも部分的に欠失しているｕＰＡＲ−欠失変異体またはその抗原フラグメントに対する抗体、
を包含する医薬組成物。
【請求項２１】
更に、薬学的に常用の担持剤、助剤および／または添加物を含有する、請求項１９または２０記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ｕＰＡＲ−欠失変異体がｄｅｌ４、ｄｅｌ５またはｄｅｌ４＋５である、診断用薬剤または治療用薬剤としての、請求項１９から２１までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２３】
ｕＰＡＲ−欠失変異体がｄｅｌ４、ｄｅｌ５またはｄｅｌ４＋５である、腫瘍疾患における経過の診断のための診断用薬剤としての請求項１９または２０記載の医薬組成物、有利に抗体の医薬組成物。
【請求項２４】
ｕＰＡＲ−欠失変異体がｄｅｌ４、ｄｅｌ５またはｄｅｌ４＋５である、生物学的試料中の腫瘍細胞を検出するための請求項１９または２０記載の医薬組成物、有利に抗体の医薬組成物。
【請求項２５】
腫瘍疾患の治療のための治療用薬剤としての、請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２６】
乳ガンおよび卵巣ガンのための、請求項２３から２５までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２７】
腫瘍細胞の増殖阻止または死滅のための、請求項２２または２３記載の医薬組成物。
【請求項２８】
有効成分がｕＰＡＲ−欠失変異体であるｄｅｌ４、ｄｅｌ５および／またはｄｅｌ４＋５に対する抗体である、請求項２２から２７までのいずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項２９】
選択的検出が次の工程：
（ａ）テストすべき試料の調製、
（ｂ）試料と抗体との接触、および
（ｃ）試料への抗体の結合の検出、
を包含する、生物学的試料中のｕＰＡＲ−欠失変異体を選択的に検出するためのｕＰＡＲ−欠失変異体であるｄｅｌ４、ｄｅｌ５またはｄｅｌ４＋５に対する請求項１６から１８までのいずれか１項記載の抗体。
【請求項３０】
検出をＥＬＩＳＡにより実施する、請求項２９記載の抗体。
【請求項３１】
腫瘍試料、有利に乳ガン組織または卵巣ガン組織から単離した腫瘍試料、を使用する、請求項２９または３０記載の抗体。
【請求項３２】
ｕＰＡＲ−欠失変異体の選択的発現阻止のための請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
オリゴヌクレオチドがｕＰＡＲ−欠失変異体１個または複数個の融合領域を覆う、請求項３２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
選択的に、ｕＰＡＲ−欠失変異体であるｄｅｌ４および／またはｄｅｌ５および／またはｄｅｌ４＋５の発現を少なくとも部分的にブロックする、請求項３２または３３記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
オリゴヌクレオチドがｕＰＡＲ−欠失変異体であるｄｅｌ４、ｄｅｌ５およびｄｅｌ４＋５の全てを発現阻止するためのオリゴヌクレオチドの混合物である、請求項３４記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
ｕＰＡＲ−欠失変異体の活性のインヒビターとしての、請求項１６から１８までのいずれか１項記載の抗体。
【請求項３７】
生物学的試料中のｕＰＡＲ−欠失変異体を検出するための分子検出システムとしての、ｕＰＡＲ変異体であるｄｅｌ４、ｄｅｌ５またはｄｅｌ４＋５に対する請求項１６から１８までのいずれか１項記載の抗体。
【請求項３８】
天然の配列のエキソン４および／または５の配列を少なくとも部分的に欠失しているｕＰＡＲ−欠失変異体、またはこれをコードする核酸の、ｕＰＡＲ−欠失変異体の活性を選択的に調節する、特に阻止する作用物質を同定するための方法への使用。
【国際調査報告】
2004534525.tif 000114
2004534525.tif 000115
2004534525.tif 000116
2004534525.tif 000117
2004534525.tif 000118
2004534525.tif 000119
2004534525.tif 000120
2004534525.tif 000121
2004534525.tif 000122
2004534525.tif 000123