(57)【要約】本発明は、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のアルファ６サブユニットをコードする遺伝子内に変異を有する非ヒト哺乳動物に関し、当該変異は、哺乳動物において機能的形態での当該ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットの発現を妨げる。本発明はまた、該動物から得られるシナプトソーム調製物及び上記したアルファ６サブユニットの変異によって得られる細胞培養物に関する。
2004508817.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のアルファ６サブユニットをコードする遺伝子内に変異を有する非ヒト哺乳動物であって、当該変異は、機能的形態での当該ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットの哺乳動物における発現を妨げる上記非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
前記ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子が、そのエキソンの全部または一部の欠失によって変異されることを特徴とする、請求項１に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
前記ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子が、エキソン１及び／又はエキソン２の少なくとも一部の欠失によって変異され、当該欠失は、前記哺乳動物において発現されるｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットにおいて、当該ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットとその作用物質および／または拮抗物質との結合を妨げるために十分であることを特徴とする、請求項２に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
前記ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子が、エキソン１及びエキソン２の欠失によって変異されることを特徴とする、請求項３に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
前記ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子の変異がホモ接合であり、そして前記アルファ６サブユニットの発現の不在を導き、当該哺乳動物は、（α６−／−）表現型を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
前記ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子の変異がホモ接合であり、当該哺乳動物が（α６Δ１−２／Δ１−２）表現型を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
前記ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子の変異が誘導性であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項８】
マウスであることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項９】
前記ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子が、ナシォナール　ド　クルチュール　ド　ミクロオーガニスム（Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ）に２０００年８月２９日の受託番号Ｉ−２５５０をもつ、相同組換えにより変異されていることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１０】
前記アルファ６サブユニットのための遺伝子が、ヘテロ接合で変異されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項記載の非ヒト哺乳動物の細胞から得られる細胞培養物であって、ニューロン細胞であることを特徴とする前記細胞培養物。
【請求項１２】
前記細胞が中脳のニューロンであることを特徴とする、請求項１１に記載の細胞培養物。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物の細胞から得られる調製物であって、線条シナプトソームであることを特徴とする前記調製物。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物又は請求項１１又は１２に記載の細胞培養物又は請求項１３に記載の調製物の、ニコチン性受容体に対する与えられた物質の効果の試験のための使用。
【請求項１５】
ニコチン性受容体への習慣性薬物の効果を試験するための、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
ドーパミン放出に対するニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）の作用物質の効果を決定するための、請求項１４又は１５に記載の使用。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物又は請求項１１又は１２に記載の細胞培養物又は請求項１３に記載の調製物の、ｎＡＣｈＲ作用物質又は拮抗物質のスクリーニングにおける使用。
【請求項１８】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物又は請求項１１又は１２に記載の細胞培養物又は請求項１３に記載の調製物の、カテコールアミン作用性又はドーパミン作用性ニューロンのニコチン性アセチルコリン受容体の作用物質又は拮抗物質のスクリーニングにおける使用。
【請求項１９】
ｎＡＣｈＲと相互作用する物質から選択される、 ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットと相互作用することができる物質をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
選ばれた物質を、当該物質とニコチン性アセチルコリン受容体との間の相互作用を可能にする条件下で、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物又は請求項１１又は１２に記載の細胞培養物又は請求項１３に記載の調製物と接触させ；そして
当該物質と当該ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットとの間のリガンド／受容体タイプの相互作用を検出する、
を含む前記方法。
【請求項２０】
ｎＡＣｈＲと相互作用する物質から選択される、 ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットと相互作用することができる物質をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
選ばれた物質を、当該物質とニコチン性アセチルコリン受容体との間の相互作用を可能にする条件下で、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物又は請求項１１又は１２に記載の細胞培養物又は請求項１３に記載の調製物と接触させ；そして
放出されたドーパミンの量を検出し、当該検出が、非ヒト哺乳動物が使用されるとき、線条体内で行われる、
を含む前記方法。
【請求項２１】
前記試験物質が、ニコチン性ｎＡＣｈＲ作用物質又はｎＡＣｈＲ拮抗物質であることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記試験物質が、ドーパミン作用性ニューロンに関して選択的であるニコチン性薬物によって形成される群から選択される、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
ドーパミン作用性ニューロンに限定されるニコチン性アセチルコリン受容体に関して選択的である、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットに親和性を有する物質を同定する方法であって、以下のステップ：
選ばれた物質を、当該物質とニコチン性アセチルコリン受容体との間の相互作用を可能にする条件下で、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物又は請求項１１又は１２に記載の細胞培養物又は請求項１３に記載の調製物と接触させ；そして
選択的リガンド／受容体タイプの相互作用を検出する、
を含む前記方法。
【請求項２４】
ドーパミン作用性ニューロンに限定されるニコチン性アセチルコリン受容体に関して選択的である、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットに親和性を有する物質を同定する方法であって、以下のステップ：
選ばれた物質を、当該物質とニコチン性アセチルコリン受容体との間の相互作用を可能にする条件下で、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物又は請求項１１又は１２に記載の細胞培養物又は請求項１３に記載の調製物と接触させ；
放出されたドーパミンの量を検出し、当該検出が、非ヒト哺乳動物が使用されるとき、線条体内で行われる、
を含む前記方法。
【請求項２５】
アルファ６サブユニットを含むｎＡＣｈＲ受容体に対する選択的親和性を有する物質を同定するための、請求項２４に記載の方法であって、以下のステップ：
ａ）　 ｎＡＣｈＲ受容体への結合活性を有する試験物質を、当該物質とニコチン性アセチルコリン受容体との間の相互作用を可能にする条件下で、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の非ヒト哺乳動物又は請求項１１又は１２に記載の細胞培養物又は請求項１３に記載の調製物と接触させ；
ｂ）　 放出されたドーパミンの量を検出し、当該検出が、非ヒト哺乳動物が使用されるとき、線条体内で行われ；
ｃ）　 ステップｂ）で線条内で放出されたドーパミンの量の増加を、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットを発現する非ヒト哺乳動物の線条体又は細胞培養物で放出されたドーパミンの量と比較する、
を含む前記方法。
【請求項２６】
Ｔｈｅ ＣＮＣＭに寄託された以下のプラスミド：
ａ６ＨＮ：　２０００年６月２２日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｎｏ．Ｉ−２５００；
ａ６ＥＨ：　２０００年６月２２日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｎｏ．Ｉ−２５０１；
ａ６ＥＥ：　２０００年６月２２日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｎｏ．Ｉ−２５０２；
ａ６ＰＰ：　２０００年６月２２日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｎｏ．Ｉ−２５０３；
ａ６ＫＯ：　２０００年８月２９日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｎｏ．Ｉ−２５５０；
又は２０００年６月２２日に受託番号Ｉ−２５０４でｔｈｅ ＣＮＣＭに寄託されたａ６ＢＡＣと命名された細菌人工染色体（ＢＡＣ）から選択される、マウスのニコチン性アセチルコリン受容体アルファ６サブユニットをコードする遺伝子の全部又は一部を含むプラスミド。
【請求項２７】
ａ６ＨＮ（ＣＮＣＭ，Ｉ−２５００）、ａ６ＥＨ（ＣＮＣＭ，Ｉ−２５０１）、ａ６ＥＥ（ＣＮＣＭ，Ｉ−２５０２）、ａ６ＰＰ（ＣＮＣＭ，Ｉ−２５０３）、ａ６ＫＯ（ＣＮＣＭ，Ｉ−２５５０）又は細菌人工染色体ａ６ＢＡＣ （ＣＮＣＭ，Ｉ−２５０４）から選択されるプラスミド内に含まれるｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子の配列であることを特徴とするヌクレオチド配列。
【請求項２８】
配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で示される連鎖又はｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットのための遺伝子の配列決定された断片に対応する当該連鎖の任意の一部分から選択されるヌクレオチド配列。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の核酸配列を含むことを特徴とする組換え細胞。
【請求項３０】
ドーパミン作用性ニューロン群からのニューロン細胞であることを特徴とする、請求項２９に記載の組換え細胞。
【請求項３１】
マウスの脳の中脳領域に由来することを特徴とする、請求項３０に記載の組換え細胞。
【請求項３２】
ｎＡＣｈＲ受容体と相互作用する物質から選択される、 ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットと相互作用することができる物質をスクリーニングする方法であって、以下のステップ：
選ばれた物質を、当該物質とニコチン性アセチルコリン受容体との間の相互作用を可能にする条件下で、請求項１１又は１２に記載の細胞培養物と接触させ；
当該細胞培養物にストレスを与え；
当該ストレスに対する、当該培養物に対する当該物質の神経保護効果を観察する、
を含む前記方法。
【請求項３３】
請求項２０〜２５又は３２のいずれか１項に記載のスクリーニング方法から得られる物質。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、ニコチン性アセチルコリン受容体（以下、「ｎＡＣｈＲ」と略する）のアルファ６サブユニットの発現のための非ヒト哺乳動物変異体、及び当該受容体と相互作用することができる分子を同定又はスクリーニングするための当該哺乳動物の使用に関する。
【０００２】
中枢神経系におけるニコチン性アセチルコリン受容体の役割については、目下ほとんど知られていない。そのような受容体（マルビオ（Ｍａｒｕｂｉｏ）， Ｌ． Ｍ．ら、ニューロンニコチン性受容体サブユニットを欠くマウスにおける低下した侵害受容抵抗性（Ｒｅｄｕｃｅｄ ａｎｔｉｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ ｉｎ ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔｓ）、Ｎａｔｕｒｅ、１９９９．３９８：ｐ．８０５−８１０）は、侵害受容、記憶、運動制御、ニコチン依存症およびある種の神経変性疾患、例えばパーキンソン病又はアルツハイマー病に関連する（ニューハウス（Ｎｅｗｈｏｕｓｅ），Ｐ．ら、アルツハイマー病及びパーキンソン病におけるニコチン系の関連。治療のための関係（Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｉｎ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅｓ． Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．）、Ｄｒｕｇｓ Ａｇｉｎｇ、１９９７．１１（３）：ｐ２０６−２２８）が、その関連のメカニズムは明らかにされていない。
【０００３】
ニコチン依存症に関しては、近年の研究は、げっ歯類動物におけるニコチン依存性に関して、ｎＡＣｈＲのベータ２サブユニットの重要性を示した（ピチョット （Ｐｉｃｃｉｏｔｔｏ），Ｍ．ら、ベータ２サブユニットを含むアセチルコリン受容体は、ニコチンの強化特性に関連する（Ａｃｅｔｙｌｃｈｏｌｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｂｅｔａ２−ｓｕｂｕｎｉｔ ａｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｒｅｉｎｆｏｒｃｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎｅ．）、Ｎａｔｕｒｅ，１９９８．３９１：ｐ１７３−１７７）。その従来の研究においては、ベータ２サブユニットを欠くマウスは、コカインをニコチンに代えたときに、自己管理挙動を維持することができなかった。その研究はまた、ニコチンに応答した変異体マウスの中脳ドーパミン作用性ニューロンの電気生理学的応答の不在を強調した。さらに、変異体マウスについて行った微小透析（ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ）実験は、ドーパミンの放出が、ニコチンの全身投与後に、核アクムベン（ａｃｃｕｍｂｅｎ）（線条体の腹側部分に対応する）において影響を及ぼされたことを示した。そのような観察は、ニコチンと、その依存効果が核アクムベンにおけるドーパミンの基礎濃度の増加と関連しているところの他の習慣性薬物、例えばヘロイン又はコカインとの間に存在し得る平行関係を強調することに貢献した。
【０００４】
しかしながら、ベータ２サブユニットの広範な細胞性発現プロファイルは、ニコチン依存症の開始に寄与する脳の領域の正確に定めることを可能にせず、そのプロセスにおいてベータ２サブユニットと関連するアルファサブユニットの性質は明らかにされなかった。
げっ歯類動物の脳において既に同定されているｎＡＣｈＲの８個のアルファサブユニットのうち、特定の、特にアルファ４サブユニットが、その特性を調べるために使用されてきた。
本願において、本発明者らは、特定のサブユニット、すなわち、ニューロンのニコチン性アセチルコリン受容体のアルファ６サブユニットに集中することを選択し、このサブユニットは、おそらくベータ２サブユニットと関連し、そしてカテコールアミン作用性のニューロンに限定される発現プロファイルを有する（レ　ノベーレ（Ｌｅ Ｎｏｖｅｒｅ）， Ｎ．ら、ニューロンのニコチン受容体アルファ６サブユニットｍＲＮＡは、ラットの脳のカテコールアミン作用性核に選択的に濃縮される（Ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ６ ｓｕｂｕｎｉｔ ｍＲＮＡ ｉｓ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ ｉｎ ｃａｔｈｅｃｈｏｌａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｕｃｌｅｉ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ）、ヨーロピアン　ジャーナル　オブ　ニューロサイエンス（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）， １９９６， ８（１１）：ｐ２４２８−３９）。本願において非常に有利なやり方で、本発明者らは、黒質、腹側の外皮領域および青斑に主として局在化されるその発現プロファイルのために、このサブユニットを選択した。
【０００５】
研究（レ　ノベーレ（Ｌｅ Ｎｏｖｅｒｅ）， Ｎ．ら、イン　ビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）アンチセンスオリゴヌクレオチド注入によって証明された、ニコチンが誘発する運動におけるアルファ６ニコチン性受容体サブユニットの関連（Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｌｐｈａ６ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔ ｉｎ ｎｉｃｏｔｉｎｅ−ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｌｏｃｏｍｏｔｉｏｎ， ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｂｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）， ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ， １９９９． １０：ｐ．２４９７−２５０１）は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、通常の環境におけるニコチンの過度の運動（ｈｙｐｅｒｌｏｃｏｍｏｔｉｖｅ）効果におけるアルファ６サブユニットの重要性を証明することができ、この効果は、中脳のドーパミン作用系によって仲介されることを示した。それらの要素は、ある著者が、ニコチンの作用物質によってドーパミンの放出を調節することにおいてアルファ６サブユニットが役割を演じることができると仮説を立てるように導いた（リューベン（Ｒｅｕｂｅｎ）， Ｍ．Ｂ．Ｓ．ら、体樹状突起（ｓｏｍａｔｏｄｅｎｄｒｉｔｉｃ）および末端のドーパミン放出を調節するニコチン性受容体は、薬理学的に異なる（Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｓｏｍａｔｏｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ａｎｄ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｄｏｐａｍｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｄｉｆｆｅｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ）， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， ２０００， ３９３（１−３）： ３９−４９）。しかしながら、それらの著者らは、ドーパミン放出と関連する試験作用物質の能力及び効力について得られる結果は、アルファ６サブユニットを含む組換えニコチン性コリン受容体を用いて得られたものと似ていないことを観察した。
【０００６】
本発明は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）での観察または、存在するインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）条件に近づくことができるインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）系での観察が、リガンド／受容体タイプの反応においてニコチン性アセチルコリン受容体、及び特に当該受容体のアルファ６サブユニットを含むものと相互作用することができる分子の同定又はスクリーニングを可能にする手段を提供する。
かくして、本発明は、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子についての変異体である、非ヒト哺乳動物、特にげっ歯類動物、より特にマウスに関し、当該哺乳動物は、機能的なアルファ６サブユニットが涸渇している。説明の残部では、ｎＡＣｈＲ受容体のアルファ６サブユニットをコードする遺伝子内にそれらが有している変異を形容するために、これらの動物を、「ノックアウト」という。これらの動物は、ｎＡＣｈＲ受容体における当該アルファ６サブユニットと相互作用する物質、特に薬理学的特性を有する物質を同定するための動物モデルを構成することができる。アルファ６サブユニットを含むこれらの受容体は、タイプ２α６、２β２、β３であることができる（レ　ノベーレ（Ｌｅ Ｎｏｖｅｒｅ）， Ｎ．ら、ヨーロピアン　ジャーナル　オブ　ニューロサイエンス（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）， １９９６， ８（１１）：ｐ２４２８−３９）。
【０００７】
特に、これらの動物又は産物、特にそれから誘導することができる細胞培養物によって、本発明は、ある種のニューロン集団、及び特にカテコールアミン作用性ニューロンに存在するｎＡＣｈＲ受容体に対して、着目の物質の選択性を決定することを可能にするモデルを提供する。
与えられた物質を、正常にｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットを発現する動物について試験することができ、そして同じ試験を、機能的な形態で発現されたこのサブユニットについての変異体である本発明に係る動物について行って、観察されるそれぞれの効果、特に試験物質と、ｎＡＣｈＲ受容体のアルファ６サブユニットによって仲介されるニコチン伝達及びドーパミン作用性伝達との相互作用を比較することを可能にすることができる。
【０００８】
本発明の手段は、アルファ６サブユニットのニコチン結合部位との相互作用を介して、ｎＡＣｈＲ受容体のためのリガンドとしてふるまうことができる物質、及び特に、ニコチン性タイプの作用物質又は拮抗物質の活動ができる物質のスクリーニング、特に薬理学的スクリーニングに特に適当である。特に有利なことには、同定された物質は、アルファ６サブユニットを介してｎＡＣｈＲに結合し、そしてドーパミン作用性ニューロンに限定された特異性を有する。この特異性は、それらのドーパミン作用性ニューロンに限定されたｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットの発現の故に、検出することができる。
【０００９】
例として、パーキンソン病が、黒質のドーパミン作用性ニューロンの選択的変性によって特徴づけられることが観察された。
同定された物質がｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットのためのリガンドとしてふるまう能力は、本発明内では、少なくとも、アルファ６サブユニットを含むｎＡＣｈＲ受容体に結合するアセチルコリン又はニコチンの能力に関して、アセチルコリン又は作用物質、例えばニコチンの活性に匹敵する活性を有する物質を規定する。そのような特性を有する物質の例は、ニコチン（ｎｉｃｏｔｉｎｅ）、シチシン（ｃｙｔｉｓｉｎｅ）、エピバチジン（ｅｐｉｂａｔｉｄｉｎ）及び化学的修飾によって得られるそれらの誘導体である。
【００１０】
当該ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットに結合する拮抗作用物質の例は、ＤｈβＥ、ヘキサメトチウム（ｈｅｘａｍｅｔｈｏｔｉｕｍ）、アルファ−ブンガロトキシン（ｂｕｎｇａｒｏｔｏｘｉｎ）及びｎ−ブンガロトキシンである。特にスパング（Ｓｐａｎｇ）， Ｊ．らによる刊行物（Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．， ２０００ ７（７）： ｐ５４５−５５５）及びシャープルズ（Ｓｈａｒｐｌｅｓ）， Ｃ．らによる刊行物（Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， ２０００， ２０（８）： ｐ２７８３−９１に例が挙げられる。
【００１１】
パーキンソン病におけるニコチンの神経保護効果についての入手可能な結果（ニューハウス（ＮｅｗＨｏｕｓｅ）， Ｐ． ら、Ｄｒｕｇｓ Ａｇｉｎｇ， １９９７， １１（３）： ｐ２０６−２２８）は、ニコチン性の剤を用いた異なる治療のための新たな可能性へ扉を開く。治療特性を有し、かつ、アルファ６サブユニットを含む受容体に選択性を有し得る、薬物の設計において使用することができる、ニコチン性物質の設計は、望ましくない副作用、例えばニコチンへの暴露に関連した心臓血管のリスクを避けることに関して特に、利点を有し得るであろう。
【００１２】
かくして、本発明は、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のアルファ６サブユニットをコードする遺伝子内に変異を有する非ヒト哺乳動物を提供し、当該変異は、機能的形態での当該ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットの哺乳動物における発現を妨げる。
本発明において使用される「機能的形態」という表現は、このサブユニットとその中にそれが存在するところの受容体の作用物質又は拮抗物質との間の認識及び相互作用を可能にし、そしてさらに特に、アセチルコリンへの結合を可能にするｎＡＣｈＲのアルファ６サブユニット（α６）の形態を意味する。アルファ６サブユニットの機能的形態は、当該サブユニットが作用物質又は拮抗物質の分子のための機能的結合部位を含むものである。
【００１３】
結合部位の機能的性質は、存在しているか又はアルファ６サブユニットを含むｎＡＣｈＲ受容体とのその相互作用を可能にする条件下で投与されたアセチルコリンが、アルファ６サブユニットが不在か又は機能的でないときに放出され得るドーパミンの量と比べて、ドーパミン放出の量を調節するという事実によって立証されうる。言い換えれば、アルファ６サブユニットの不在又は機能的でない形態でのその存在は、ニコチンに対するｎＡＣｈＲ受容体の応答の大きさ及び薬理学を変える。実施例は、これに関して使用することができる試験について記載する。
【００１４】
明細書の残部ではまた、機能的形態でアルファ６サブユニットを発現する遺伝子の能力を翻訳するために、遺伝子の「機能的形態」に言及する。本発明の非ヒト哺乳動物は、ｎＡＣｈＲのアルファ６サブユニットをコードする遺伝の遺伝子不活化を受けたものである。
【００１５】
本発明の第１の実施においては、非ヒト哺乳動物は、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子が、そのエキソンの全部又は一部の欠失によって変異されることを特徴する。
ニコチン又は、この受容体の他の作用物質及び拮抗物質によって認識されるｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットのための結合部位は、当該アルファ６サブユニットをコードする遺伝子のエキソン２，３及び４によってコードされる。
さらに、それらの破壊によるエキソン１及びエキソン２の欠失は、遺伝子転写仮説においてさえ、ｍＲＮＡの正しい翻訳を妨げる（ＡＴＧ及びスプライシング部位が壊されるので）。事実、エキソン１及びエキソン２の不在は、遺伝子転写を妨げる。
【００１６】
かくして、本発明は特に、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子が、哺乳動物において発現されるｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットにおいて、当該ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットとその作用物質及び／又は拮抗物質との結合を妨げるために十分である、エキソン１の少なくとも一部及び／又はエキソン２の少なくとも一部の欠失によって変異されていることを特徴とする非ヒト哺乳動物に関する。
好ましくは、本発明の非ヒト哺乳動物は、エキソン１及び２の本質的に完全な欠失によって変異されている。
【００１７】
特に、本発明は、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子の変異が、ホモ接合の性質であることを特徴とする非ヒト哺乳動物、特にげっ歯類動物、特にマウスに関する。
変異は、例えば、哺乳動物が表現型（α６−／−）を有し、もはやｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットを発現しないようなものであり、遺伝子の２つの対立遺伝子が同様の方法で変異されているものである。
【００１８】
さらなる実施においては、本発明は、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子の変異がホモ接合であり、該哺乳動物が（α６Δ１−２／Δ１−２）表現型を有することを特徴とする非ヒト哺乳動物に関する。
表現型（α６Δ１−２／Δ１−２）は、アルファ６サブユニットをコードする遺伝子の発現に対応し、当該遺伝子は、エキソン１及びエキソン２で切り取られており、それによって当該サブユニットは有効に発現され、特に、天然アルファ６サブユニットの経膜部分を含み；発現された受容体は、エキソン１及びエキソン２の正しい転写及び翻訳に普通は依存する結合作用物質に対して機能的でない。
【００１９】
当該非ヒト哺乳動物は、図１の標的構成物のタイプを有する構成物を用いて、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする野生型遺伝子コードの相同的組換えについて当業者に知られた技術によって得ることができる。変異のホモ接合の性質は、１つの変異された遺伝子の対立遺伝子を有する２匹の動物を交雑させることから得ることができ、よってホモ接合の子孫が選択される。あるいは、変異のホモ接合の性質は、選択のために使用されるネオマイシンの濃度を上げ、そして相同二重組換えを受けたクローンのみを保持することによって、ＥＳ細胞から直接得ることができる。
【００２０】
本発明の非ヒト哺乳動物は、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットの機能的でない発現又はこのアルファ６サブユニットの発現の不在が構成的であるように得ることができ、当該動物は、機能性遺伝子について変異されているか又はその転写産物を発現することができない。
あるいは、本発明は、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子の変異が、誘発性又は条件タイプであることを特徴とする非ヒト哺乳動物に関する。
【００２１】
変異の誘発性又は条件付きの性質は、有用であり得る。なぜなら、特に機能的形態でのｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子の発現の誘導によって変異をされる動物が、例えば、補償、例えば作用物質又は拮抗物質に対して、そして一般に天然ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットと正常に相互作用することができる任意の物質に対して、その行動を修正する補償によって行動適応を受ける位置にないからである。
着目の変異が誘導性である本発明に係る哺乳動物は、遺伝子の欠失又は変異を確立することを意図された組換えが、例えばあるニューロン細胞集団において、ある種の剤、特にテトラサイクリン又はＲＵ４８６（ケレンドンク（Ｋｅｌｌｅｎｄｏｎｋ）Ｃ．ら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９９９， ２８５（１）： ｐ１７５−８２）の制御下で行われることを可能にする特異的な組換え技術によって得ることができる。
【００２２】
誘導性の遺伝子不活化は、酵素、Ｃｒｅ−リコンビナーゼ（Ｃｒｅ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）の発現を制御する誘導プロモーター（例えばＴＲＥ／ｒｔｔａ系（ゴッセン（Ｇｏｓｓｅｎ）Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９５， ２６８： ｐ１７６６−９））を使用することにある。その系では、ある組織において特異的なプロモーターの制御下にある合成活性化因子ｒｔｔａ及び誘導プロモーターＴＲＥの制御下にあるＣｒｅ−リコンビナーゼの両方を発現する、トランスジェニック動物が作製される。テトラサイクリンの存在下で、ｒｔｔａ活性化因子はＴＲＥプロモーターに結合し、そしてｒｔｔａがその中で発現されるところの細胞内でのみＣｒｅ−リコンビナーゼの発現を誘導する。平行して、相同組換えは、アルファ６サブユニットをコードする遺伝子が２つのＬｏｘＰ部位に隣接される動物を作製する。これらの部位は、２つのＬｏｘＰ部位の間に位置する全体ＤＮＡ断片の切除を引き起こすＣｒｅ−リコンビナーゼのための標的である。これらの動物を交雑させることによって、単にテトラサイクリンを飲料水に添加するだけで、アルファ６遺伝子の切除を誘導することができる子孫が得られる。
【００２３】
あるいは着目のＬｏｘＰ部位を遺伝子に挿入して、その欠失が遺伝子を不活化させるか又は機能的でないアルファ６サブユニットの発現をもたらすのに十分な遺伝子の断片を組み立てることができる。
他の等価な系を使用することができる。
本発明の非ヒト哺乳動物、特にげっ歯類動物、及び特にマウスは、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子の所望の変異を生成するのに必要な遺伝子構成を有する動物の交雑によって、そして当該変異をホモ接合にするような方法で、得ることができる。本発明はまた、当該動物からの血統の動物に関する。
【００２４】
本発明はまた、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子が、ヘテロ接合的に変異されたノックアウト非ヒト哺乳動物に関する。このヘテロ接合変異の故に、当該動物は、アルファ６サブユニットのためのリガンドに対する感受性が低く、かくして、物質を用いて観察されたアルファ６サブユニットに対する作用物質または拮抗物質の減少効果を変異に帰することができることを確かめることが重要である。
【００２５】
本発明の動物の製造を可能にするさまざまな構成物を製造した。これらの構成物は以下の実施例において詳細に記載されており、特に、本発明は、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードするその遺伝子が、２０００年８月２９日に受託番号Ｉ−２５５０でｔｈｅ ＣＮＣＭに寄託された大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株内に含まれるａ６ＫＯと命名された配列を用いた相同組換えによって変異されていることを特徴とする非ヒト哺乳動物、特にマウスに関する。
本発明はまた、上記した非ヒト哺乳動物から得られる細胞集団、特に細胞培養物に関する。
本発明の範囲内で、これらの細胞集団は、ｎＡＣｈＲ受容体のアルファ６サブユニットを正常に発現するニューロン集団、特に細胞集団、例えばカテコールアミン作用性ニューロンである。有利な細胞集団の例は、中脳のニューロン細胞である。
【００２６】
本発明はまた、線条体シナプトソームの調製物に関する。
本発明はまた、上記した非ヒト哺乳動物、シナプトソーム調製物又は細胞培養物を、ニコチン受容体に対する与えられた物質の影響の研究のために使用することに関する。
本明細書で本発明の１つの特に有利な使用は、アセチルコリンのニコチン性受容体に対する習慣性薬物の効果の試験のためであり、当該薬物は、それ自体がおそらくすでに一般に知られ、かつ、同定されているか又はその特性が同定されることなく知られているか又はその構造及び機能に関して新規である。
【００２７】
特に、本発明の動物又はシナプトソーム調製物又は誘導された細胞培養物の使用は、例えばドーパミン放出量を測定することによって、ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）、特にこれらの受容体のアルファ６サブユニットについての作用物質の効果を決定することを可能にする。
特に有利には、本発明の動物、シナプトソーム調製物又は細胞培養物は、ｎＡＣｈＲ作用物質又は拮抗物質についてのスクリーニングプロトコル、特に薬理学的プロトコルにおいて使用できる。
ｎＡＣｈＲ受容体に対する試験物質の特異性は、物質について、マウス又は他の野生型哺乳動物での高い活性（すなわち、ニコチンを用いて得られるのと同程度以上の活性）及び本発明のマウス又は他の哺乳動物での活性の不在の観察により特徴づけることができる。
より詳細には、本発明のノックアウト動物又は細胞培養物又はシナプトソーム調製物は、ニコチン性アセチルコリン受容体についての作用物質又は拮抗物質から、カテコールアミン作用性ニューロンへの限定された効果、特にドーパミン作用性ニューロンへ限定された効果を有することができるものの同定を可能にする。
【００２８】
試験物質は知られた物質、例えば受容体に関して、特にｎＡＣｈＲ受容体に関してその作用物質又は拮抗物質の特性が公知の物質である。それらはまた、本発明がそれらのある性質、特にｎＡＣｈＲ受容体に関してある薬理学的特徴を同定するために使用することができる新規物質であることができる。
本発明は、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットと相互作用することができる物質をスクリーニングするための方法に関し、この方法は、以下のステップを含む：
選ばれた物質を、当該物質とニコチン性アセチルコリン受容体との間の相互作用を可能にする条件下で、本発明の非ヒト哺乳動物と接触させ；
リガンド／受容体タイプの相互作用を検出すること。
【００２９】
かくして、本発明は、ｎＡＣｈＲ受容体と相互作用する物質から選択される、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットと相互作用することができる物質をスクリーニングするための方法を提供し、この方法は以下のステップを含む：
選ばれた物質を、当該物質とニコチン性アセチルコリン受容体との間の相互作用を可能にする条件下で、本発明の非ヒト哺乳動物と接触させ；
線条体内で放出されたドーパミンの量を検出すること。
【００３０】
本発明はまた、ｎＡＣｈＲ受容体と相互作用する物質から選択される、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットと相互作用することができる物質をスクリーニングするための方法に関し、この方法は以下のステップを含む：
選ばれた物質を、当該物質とニコチン性アセチルコリン受容体との間の相互作用を可能にする条件下で、本発明の細胞培養物と接触させ；
放出されたドーパミンの量を検出すること。
【００３１】
本発明はまた、ｎＡＣｈＲ受容体と相互作用する物質から選択される、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットと相互作用することができる物質をスクリーニングするための方法に関し、この方法は以下のステップを含む：
選ばれた物質を、当該物質とニコチン性アセチルコリン受容体との間の相互作用を可能にする条件下で、本発明のシナプトソーム調製物と接触させること；
放出されたドーパミンの量を検出すること。
【００３２】
スクリーニングした物質とｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットとの相互作用を検出するための他の方法の例は、二重ハイブリッド系、例えば国際特許出願公開ＷＯ−９９／４２６１２に記載されたものを使用する方法である。
検出されたドーパミン濃度の変化は、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットを正常に発現する動物において放出されるか又はそのような動物から行われるシナプトソーム調製物で放出されるか又はこのサブユニットを発現する細胞培養物で放出されるドーパミンの基本濃度を、着目の動物、調製物又は培養物が、アルファ６サブユニットとの相互作用を可能にする条件下で、試験物質と接触されたときに放出されるドーパミンの濃度と比較することによって、評価することができる。
【００３３】
本発明のさらなる態様においては、スクリーニング方法は、ｎＡＣｈＲへ結合するその能力が以前に研究されていない物質を使用する。
さらなる実施においては、ニコチン性アセチルコリン受容体についての作用物質または拮抗物質から、神経保護効果を有するものを研究又は同定するために、本発明の細胞培養物が使用される。
【００３４】
かくして、本発明は、ｎＡＣｈＲと相互作用する物質から選択される、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットと相互作用することができる物質をスクリーニングするための方法を提供し、この方法は以下のステップを含む：
選ばれた物質を、当該物質とニコチン性アセチルコリン受容体との間の相互作用を可能にする条件下で、本発明の細胞培養物と接触させ；
当該細胞培養物にストレスを与え；そして
当該ストレスに関して当該培養物への当該物質の神経保護効果を観察すること。
【００３５】
細胞培養物に応力を加えることは、例えばアカイケ（Ａｋａｉｋｅ）Ａら（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １９９４， ６４４（２）： ｐ１８１−７）による刊行物に記載されている。当該ストレスの影響は、細胞死となり得る。この場合、神経保護効果の観察は、アルファ６サブユニットを発現する培養物でこのストレスによって引き起こされる細胞死と、本発明の細胞培養物で当該ストレスにより引き起こされる細胞死とを比較することからなることができ、当該細胞培養物は、スクリーニングされた物質と予め接触されている。
【００３６】
定義した本発明の方法は、本発明に従い上記した使用について実行することができるが、アルファ６サブユニットに親和性を有する物質を同定することを可能にし、この物質は、アルファ６サブユニットを介して当該サブユニットを含む受容体に結合することによって選択的であるやり方で、ニコチン性伝達及びドーパミン作用性伝達と相互作用する。この方法は、習慣性薬物とｎＡＣｈＲのアルファ６サブユニットとの相互作用を研究するときに、特に同定されたニューロン集団に対するその選択性を研究するときに、特に有利である。
【００３７】
本発明の動物の線条体内で放出されたドーパミンの量の可能な変化は、公知技術、特に以下の例に記載されている技術を使用して検出することができる。
例として、本発明の方法を実行した後、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットを正常に発現する動物において検出される基本ドーパミン濃度と比較した、放出されたドーパミン濃度の変化、特に増加が検出される。
【００３８】
アルファ６サブユニットにおける変異が条件付き又は誘導性であるときには、放出されるドーパミンの所望の基本濃度を、変異を誘導する前に検出し、その後、変異が誘導された同じ動物でのドーパミン濃度と比較することができる。
その場合には、放出されたドーパミンの濃度は、ミクロ透析によって測定される（マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）Ｄら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ， １９９７， ６８（４）： ｐ１５１１−９）。
【００３９】
本発明の方法の好ましい実施においては、試験物質は、ドーパミン作用性ニューロンに限定されるニコチン性アセチルコリン受容体への選択的な親和性が検出されるべきものである物質である。
【００４０】
本発明の方法の好ましい実施においては、試験物質は、アルファ６サブユニットに対する選択性が調べられる、アルファ６サブユニットを含むｎＡＣｈＲ受容体への親和性を有する物質であり、この方法は以下のステップを含む：
ａ）　選ばれた物質を、当該物質とニコチン性アセチルコリン受容体との間の相互作用を可能にする条件下で、先に定義した非ヒト哺乳動物と接触させ；
ｂ）　線条体内で放出されたドーパミンを検出し；そして
ｃ）　工程ｂ）で線条体内で放出されたドーパミンの量を、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットを発現する非ヒト哺乳動物の線条で検出される放出ドーパミンの量と比較すること。
【００４１】
さらなる実施においては、この方法は以下のステップを含む：
ａ）　選ばれた物質を、該物質とニコチン性アセチルコリン受容体との間の相互作用を可能にする条件下で、本発明において定義されるシナプトソーム調製物と接触させ；
ｂ）　放出されたドーパミンの量を検出し；そして
ｃ）　工程ｂ）で検出された放出ドーパミンの量を、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットを発現する非ヒト哺乳動物からのシナプトソーム調製物で放出されるドーパミンの量と比較すること。
【００４２】
さらなる実施においては、この方法は以下のステップを含む：
ａ）　選ばれた物質を、当該物質とニコチン性アセチルコリン受容体との間の相互作用を可能にする条件下で、本発明において定義される細胞培養物と接触させ；
ｂ）　放出されたドーパミンの量を検出し；そして
ｃ）　工程ｂ）で検出された放出ドーパミンの量を、ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットを発現する細胞培養物で放出されるドーパミンの量と比較すること。
【００４３】
該方法の工程ｂ）及びｃ）は、リガンド／受容体相互作用の検出を可能にする任意の工程で置き換えることができる。
本発明のスクリーニング方法の特定の実施においては、非ヒト哺乳動物、シナプトソーム調製物又は細胞培養物は、選ばれた物質とｎＡＣｈＲ受容体のアルファ６サブユニットとの相互作用のための対照であり、これらの方法は、試験物質のアルファ６サブユニットへの効果が、当該アルファ６サブユニットの発現について野生型である動物又はそのような動物のシナプトソーム調製物又は当該サブユニットを正常に発現する細胞培養物で決定される工程を含む。
【００４４】
本発明はまた、本発明のスクリーニング方法の最後に同定される物質、それらを組成物、特に治療目的のための組成物の製造に使用することに関する。
本発明はまた、ベクター、特にｎＡＣｈＲ受容体のアルファ６サブユニットをコードする遺伝子の全部または一部を含むプラスミド、特に、アルファ６サブユニットについて変異された遺伝子を有するベクターに関し、当該ベクターはあるいは、本発明の動物を生成することを意図された構成物を調製するための手段を構成する。
【００４５】
このために、特に有利なプラスミドは、ｔｈｅ ＣＮＣＭ（コレクシオン　ナシォナール　ド　クルチュール　ド　ミクロオーガニスム，　パリ、フランス（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ， Ｐａｒｉｓ， Ｆｒａｎｃｅ））に寄託された以下のプラスミドから選択されるもの：
ａ６ＨＮ：　２０００年６月２２日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｎｏ．Ｉ−２５００；
ａ６ＥＨ：　２０００年６月２２日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｎｏ．Ｉ−２５０１；
ａ６ＥＥ：　２０００年６月２２日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｎｏ．Ｉ−２５０２；
ａ６ＰＰ：　２０００年６月２２日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｎｏ．Ｉ−２５０３；
ａ６ＫＯ：　２０００年８月２９日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｎｏ．Ｉ−２５５０；
または、２０００年６月２２日に受託番号Ｉ−２５０４でＣＮＣＭに寄託されたａ６ＢＡＣと称する細菌人工染色体（ＢＡＣ）である。
【００４６】
本発明はまた、先に同定されたプラスミドの１つまたは先にまた同定された細菌人工染色体に含まれるヌクレオチドの配列に関する。
本発明のヌクレオチドの好ましい配列は、それが、図２、３、４、５又は６に示された連鎖の全部又は一部、特にこれらの図に示された配列決定された連鎖を含むことを特徴とする。
【００４７】
本発明はまた、該配列の断片、特にｎＡＣｈＲ受容体アルファ６サブユニットをコードする遺伝子において同定されたエキソンに関する。
さらには、本発明は、先に同定されたヌクレオチド配列又はそれを含むベクターを含む組換え細胞に関する。特に有利な組換え細胞は、ニューロン細胞、特に、本発明の動物の脳の中脳領域から誘導されたドーパミン作用性ニューロン又は細胞である。
【００４８】
本発明のさらなる特徴及び特性は、以下の実施例から明らかになろう。
図１０：　ａ６サブユニットのエキソン６に位置するオリゴヌクレオチドプローブを用いたイン　サイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション。黒質及び腹側外皮領域（ＳＮ／ＶＴＡ）並びに青斑（ＬＣ）における発現に注目。ノックアウト動物においては、シグナルが完全に消える。
図１１：　ニコチン性受容体のサブユニットα３、α４、α５、α７、β２およびβ４に対するイン　サイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションから得られるオートラジオグラフの定量化。Ｃｘ＝皮質；Ｔｈ＝視床；ＭＨｂ＝内側手綱；ＩＰＮ＝脚間核；Ｈｐ＝海馬。
図１２：　蛍光コレラ毒素を用いた網膜膝状投影の標識化。Ｗｔ（ａ，ｂ）およびａ６−／−（ｃ，ｄ）動物の左（ａ，ｃ）および右（ｂ，ｄ）の膝状核を示す冠状断面。両目に、２つの異なる蛍光運搬体（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ）（左眼には赤、右目には緑）と結合されたコレラ毒素を注入された。正常な分離（尺度：３５０μｍ）の特徴である、標識の重ね合わせの不在に注目。
図１３：　αＣｔｘＭＩＩの、Ｗｔおよび変異体の動物からの脳断面への結合のオートラジオグラフ。３つの主要解剖系における結合部位の存在に注目：視覚系（側背膝状核（ｄｌＧＮ）、腹側外側膝状核（ＶＬＧＮ）、上丘（ＳＣ）、オリーブ状被蓋前核（ＯＰＮ）、視索（ｏｐｔ））、辺縁間（ｍｅｓｏｌｉｍｂｉｃ）ドーパミン作用系（黒質（ＳＮ）、腹側外皮領域（ＶＴＡ）、核アクムベン（ａｃｃｕｍｂｅｎ）（Ｎａｃｃ）、線条（Ｓｔｒ））ならびに脚間手綱系（脚間核（ＩＰＮ）および内側手綱（ＭＨｂ））。
図１４：　線条膜調製物でのαＣｔｘＭＩＩによるエピバチジンの結合の置換。
図１５：　１００ｎＭのαＣｔｘＭＩＩの不在下（ａ）または存在下（ｂ）での、線条シナプトソームへの３μＭのニコチンの施与により誘発されたドーパミンの放出。α６−／−（ｃ）またはα４−／−（ｄ）動物におけるニコチンに応答したドーパミン放出についての投与量−応答曲線。最大応答を１に標準化した。α４−／−動物における大きさの順の親和性の喪失に注目。
〔実施例〕
【００４９】
材料及び方法
「ノックアウト」マウス（ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットをコードする遺伝子が変異されたマウス、ｎＡＣｈＲ受容体のアルファ６サブユニットの機能的形態での発現は変更される）の製造。
ノックアウトマウスを製造するために使用されたプロトコルの大部分は、条件付き遺伝子標的化のためのラボラトリープロトコル・・・（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ．．．）、トレス（Ｔｏｒｒｅｓ）Ｒ．及びクーン（Ｋｕｈｎ）Ｒ．　オックスフォード　ユニバーシティ　プレス（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）（１９９７）に記載されている。
１．１　組換えベクターの構成
ＰＣＲ（イスラエル（Ｉｓｒａｅｌ），Ｄ． ＤＮＡライブラリーの高ストリンジェンシースクリーニングのためのＰＣＲに基づく方法（Ａ ＰＣＲ ｂａｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９３， ２１（１１）： ｐ２６２７−３１ ）に基づく手法を使用して、１２９ＳＶ／Ｄ３系統からの胚幹細胞（ＥＳ細胞）から調製したマウス遺伝子ＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。他の市販の入手可能なマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ， Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を使用することができた。しかしながら、相同組換えに使用されるＥＳ細胞が誘導される同じ系統を使用することが好ましい。ラットアルファ６サブユニットのｃＤＮＡ配列から、オリゴヌクレオチドが選択された。
【００５０】
前進プライマー：
５’ＡＣＴＧＣＴＧＴＧＡＡＧＡＧＡＴＴＴＡＣＡＣＡ３’
後退プライマー：
５’ＡＡＧＡＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＣＣＡＣＴＴＧ３’
このスクリーニングは、約１７ｋｂの、ニコチン性アセチルコリン受容体のアルファ６サブユニット（α６ｎＡＣｈＲ）を含むファージが同定されることを可能にした。
【００５１】
制限地図作成および部分配列決定によって、最初の５つのエキソンの位置を決定することができた。第６のエキソンは、クローン化した配列の外にあった（図１参照）。次に、置換タイプの組換えベクターを構成して、アルファ６サブユニットのための座へ４ｋｂの欠失を導入し、エキソン１及びエキソン２を除去した。組換えベクターを製造するために、４．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片及び５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ＫＳ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドへサブクローン化して、それぞれプラスミドａ６ＨＮ及びａ６ＥＥ（ＫＳ）を生成した。新たな制限部位を供給するために、次にａ６ＥＥ プラスミドのＳｐｅＩ−ＸｈｏＩ断片を、ポリリンカーがＳａｃＩ−Ｓｆｉｌ−ＡｐａＩ−ＳｐｅＩ−ＸｈｏＩ−ＸｂａＩ−ＮｏｔＩで置き換えられてプラスミドａ６ＥＥ（ＮＳ）を構成する、変性されたｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターへサブクローン化した。この間に、Ｎｅｏｒ発現カセットが、ａ６ＨＮのＸｈｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位へと導入された。得られたプラスミドのＸｈｏＩ−ＮｏｔＩ断片は次に、ａ６ＥＥ（ＮＳ）のＳａｌｌ−ＮｏｔＩ部位へサブクローン化された。最後に、ジフテリア毒素発現カセットが、このプラスミドのＳａＩＩ（アルファ６サブユニットのエキソン５の）−ＮｏｔＩ部位へ導入され、右腕の相同の長さを２．５ｋｂに減らした。
【００５２】
１．２．　 トランスフェクション
１２９ｓｖ／Ｐａｓマウス系統から誘導された、１０７の多分化能胚幹細胞（ＥＳ細胞）（クレス（Ｋｒｅｓｓ）ら、１２９／Ｓｖ株への１回の戻し交配により回避された、マウス胚幹（ＥＳ）細胞派生のための非許容：ＥＳ細胞系の確立は、Ｏｍｄ条件付致命的変異を有する（Ｎｏｎ−ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅｎｅｓｓ ｆｏｒ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ （ＥＳ） ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔｅｄ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｃｋｃｒｏｓｓ ｔｏ １２９／Ｓｖ ｓｔｒａｉｎ： ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＥＳ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｂｅａｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｏｍｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｌｅｔｈａｌ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、Ｍａｍｍ　Ｇｅｎｏｍｅ，１９９８， ９（１２）： ｐ９９８−１００１）を、Ｂｉｏ−Ｒａｄエレクトロポレーション装置（２５０Ｖ、５００μＦ）を用いて、ＳｃａＩで線状にされた組換えベクターのＤＮＡ２０μｇにて、エレクトロポレーションした。Ｇ４１８抗生物質（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）（４００μｇ／ｍｌ）を含む培地中での８日間の選択後、２００の抗生物質耐性コロニーを除去し、９６−ウェルのプレートに塗布するために、トリプシン中に分離した。２日間の培養後、各クローンをトリプシン中に分離し、４８−ウェルのプレートの２ウェルに塗布した。ウェルの１つの内容物は凍結するために使用し、一方、他のウェルの内容物は、２４ウェルプレートに塗布して、ゲノムＤＮＡを調製した。
【００５３】
１．３．　ゲノムサザン法による組換えＥＳ細胞クローンのスクリーニング
ａ）　ＤＮＡの調製
９６−ウェルプレートの合流ウェルを、ＰＢＳで洗浄し、５００μｌの細胞質溶解緩衝液（１００ｍＭのｔｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ８：５ｍＭのＥＤＴＡ；０．２％のＳＤＳ；２００ｍＭのＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ）を用いて３７℃にて１２時間インキュベートした。次に、ゲノムＤＮＡをエタノールから沈殿させることによって回収し、１５０μｌの水に再懸濁させた。
【００５４】
ｂ）　消化及び転移
５０μｌのこのゲノムＤＮＡ調製物を、３７℃にて６時間の５０単位のＰｓｔＩでの消化のために使用した。次に消化産物を、０．８％アガロースゲルに仕込み、４０Ｖにて２０時間、ＴＡＥ電気泳動を行った。消化したＤＮＡを、２０ｘＳＳＣ緩衝液中でのサザントランスファー（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ）によって、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎ−Ｎ＋、アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））上に移した。ＵＶ光に５分間暴露することによって、ＤＮＡを膜に固定した。
【００５５】
ｃ）　プローブの標識化
アルファ６遺伝子の８００ｂｐのＳａＩＩ−ＳｐｅＩ断片２５μｇを、アメルシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）からのランダム　プライミング　キット（ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｉｎｇ ｋｉｔ）（ＲＰＮ１６０７）を用いて標識した。この標識は、スクリーニング構成物の外側の相同の右腕に関して３’末端に局在化された。
【００５６】
ｄ）　ハイブリダイゼーション及び洗浄
転移させた膜を、６５℃にて４０ｍｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．５ＭのＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．６）、７％のＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍｌの鮭血清ＤＮＡ）中で３０分間予備ハイブリダイゼーションした。１０６ｃｐｍ／ｍｌの変性プローブ（１００℃で３分間）を含む、１０ｍｌの同じ緩衝液中で、６５℃にて１５〜２０時間、ハイブリダイゼーションを行った。次に膜を、０．１ ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳで２回洗浄し、提示（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ）前に、ホスホルイメージャーカセット（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ ｃａｓｓｅｔｔｅ）（モレキュラー　ダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ））で２４時間暴露した。
このプローブ（ＳａＩＩ−ＳｐｅＩ断片）及びこの制限酵素（ＰｓｔＩ）は、組換えクローンにおいて２つのバンドが検出されることを可能にした：野生型対立遺伝子に対応する８ｋｂのバンド及び変異された対立遺伝子に対応する４ｋｂのバンド。
得られた３つの組換えＥＳ細胞クローンを増殖させ、凝集において使用されるまで、液体窒素中に少量に分けて凍結保持した。
【００５７】
１．４．　キメラの調製
キラン（Ｋｈｉｌｌａｎ）Ｊ．及びＹ．バオ（Ｂａｏ）（胚幹細胞および予備移植胚の１工程共存培養による高度のキメラ現象を有する動物の調製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｍａｌｓ ｗｉｔｈ ａ ｈｉｇｈ ｄｅｇｒｅｅ ｏｆ ｃｈｉｍｅｒｉｓｍ ｂｙ ｏｎｅ−ｓｔｅｐ ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｅｍｂｒｙｏｓ）． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９７， ２２（３）， ｐ５４４−９）により記載されている、凝集プロトコルの変形を用いて、キメラを得た。標準の細胞培養インキュベーター中で１晩の培養により、野生型予備移植胚で凝集される、少量の組換えＥＳ細胞を生成した。次に胚盤胞の形態で発生した凝集物を、偽妊娠の状態の代理母中に再移植して、キメラ動物を生成した。
ａ）　ＥＳ細胞の調製
凝集の２日前に、５Ｘ１０６のＥＳ細胞を含む凍結チューブを使用して、培養培地を含む５０ｍｍの皿に接種した。次の日、細胞を分離し、６−ウェルプレートに異なる濃度で置いた（より詳細には、３回の次の凝集日に使用するために、１／３、１／６、１／１２及び１／２４の希釈物を、最初の５０ｍｍのプレートに置いた）。
凝集の日、ＥＳ細胞を穏やかな分離を行って（トリプシン中で４分間）、ＥＳ細胞の小さい凝集物（４−２０）を生成した。血清含有培地を添加することによって、トリプシンを阻害した。１０ｍｌのピペットを用いて穏やかに分離した後、ゼラチン化した組織培養プレート上に細胞を広げ、インキュベーター中に２０分間置いた。この工程は、栄養繊維芽細胞および、より迅速に沈降したＥＳ細胞の大きい凝集物の選択的除去を可能にした。ＥＳ細胞を含む上清を採取し、氷上に保持し、一方で、胚を調製した。
【００５８】
ｂ）　 胚の調製
凝集の５日前に、３週令のメスのマウス（ＣＤ１又はＣ５７ＢＩ６）を、５単位のＰＭＳを注射し、４６時間後に５単位のＨＣＧ（インターベット（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ））を注射することによって過剰排卵させた後、対応する系統（すなわちＣＤ１又はＣ５７ＢＩ６）からの２月令のオスのマウスと交尾させた。凝集の日（２．５日ｐｃ）に、９匹の過剰排卵させたマウスを殺して、桑実胚の段階の胚を回収し、Ｍ２培地（シグマ（Ｓｉｇｍａ））中に保存した。
タイロード溶液（シグマ（Ｓｉｇｍａ））中でインキュベーションすることによって透明帯を除去した：この工程は顕微鏡下で環境温度で行った。透明帯が消失したら、胚を数滴のＭ２培地に移して、タイロード溶液への暴露を制限した。
【００５９】
ｃ）　凝集プレートの調製
６滴（５μｌ）の凝集培地（５０％Ｍ１６＋５０％標準ＥＳ細胞培地）を、未処理の３５ｍｍの培養プレートに入れた。次にこれらの滴を鉱油で覆って、蒸発を防いだ。解剖ピンセットの端を用いて、６〜８個の小さいくぼみ（凝集ウェル）を各滴に作った。
各ウェルは、ＥＳ細胞（Ｃ５７ＢＩ６胚については４〜８個の細胞、およびＣＤ１胚については８〜１２個の細胞）及び桑実胚の小さい凝集（凝集塊）を受け入れた。凝集させるために、細胞及び胚の接触を最大にするように注意をはらった。次にプレートをインキュベーター中に１晩置いた。
【００６０】
ｄ）　凝集物の再移植
凝集の次の日、９０％の凝集物は胚盤胞に発達した。次にこれらの胚盤胞を、偽妊娠状態のメスのＢ６Ｄ２マウス（２．５ ｐｃ）の子宮に再移植した。
【００６１】
１．５．　ホモ接合ノックアウトマウスの調製
各株（Ｃ５７ＢＩ６またはＣＤ１）について、得られる新生児の肌の色による選択のために、胚系統の伝達物を得、Ｂ６Ｄ２／Ｆ１またはＣＤ１マウスと（それぞれ）交雑させた。次に、アグーチ着色した新生児をゲノムサザン法（ｇｅｎｏｍｉｃ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）で分析した。次の実験のために交雑することによって、変異がＣ５７ＢＩ／６Ｊマウスに転移された。
【００６２】
２）　灌流された（ｓｕｐｅｒｆｕｓｅｄ）線条シナプトソームからのドーパミンの放出
２．１．　 シナプトソームの調製
２匹のマウスからの線条を氷上へ迅速に切り離し（全湿潤重量＝６０ｍｇ）、１０体積の、氷上で冷却した０．３２Ｍのショ糖／５ｍＭのＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．５中に入れた。次に線条を、ガラス／テフロンのホモジナイザー（９００ｒｐｍで１５ヒット）中でホモジナイズした。ホモジネートを、４℃で１０００ｇにて５分間遠心分離して、核及び細胞破壊物を除去した。次に上清を４℃で１２０００ｇにて２０分間遠心分離した。粗シナプトソーム調製物（Ｐ２）からなる最終残渣を、灌流緩衝液中に再懸濁させた（６ｍｇの最初の組織重量／ｍｌ）。灌流緩衝液（ＳＢ）は以下からなっていた：（ｍＭ）：ＮａＣｌ　１２８、ＫＣｌ　２．４、ＣａＣｌ２　３．２、ＫＨ２ＰＯ４　１．２、ＭｇＳＯ４　０．６、ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）２５、Ｄ−グルコース　１０、Ｌ−アスコルビン酸　１及びパルジリン　０．１。
【００６３】
２．２．　トリチウム化したドーパミンを用いたシナプトソームの仕込み
シナプトソーム調製物を、［３Ｈ］ドーパミン（１００ｎＭ）と共に、３７℃で２０分間インキュベートした後、１２０００ｇにて５分間遠心分離した。残渣をＳＢ緩衝液中に再懸濁させ、軽い減圧下で、１３ｍｍ直径のＡ／Ｅガラス繊維フィルター（ゲルマン　サイエンシーズ（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））上に置いた（２匹のマウスからの線条シナプトソームは一般に、１２フィルターのために十分である）。
【００６４】
２．３．　 灌流
使用した灌流装置は、市販されていて入手可能であった（ブランデル（Ｂｒａｎｄｅｌ））。それは、６〜２０個の同一のチャンネルからなっていた。各チャンネルは、シナプトソームを有するフィルターを含む保持チャンバー（体積＝１００μｌ）により構成された。このチャンバーは、タイゴン（Ｔｙｇｏｎ）チューブ（内径＝１．１４ｍｍ）によって多チャンネル蠕動ポンプ（マスターフレックス（Ｍａｓｔｅｒｆｌｅｘ））および流出物収集装置に接続されていた。灌流緩衝液（ＳＢ）は、５００μｌ／分の速度で、チャンバーを通して連続的にポンプで送られた。
【００６５】
１５分間のフラッシュ時間後、流出物を、５ｍｌのシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌａｎｔ）を含むシンチレーションフラスコに毎分集めた。５分間収集した後、研究されている薬物を１分間投薬し、流出物を新たに１０分間かけて集めた。最後に、各試料において放出されたトリチウム化ドーパミンの量を、シンチレーションカウンター（ワラック　１２１４　ラックベータ（Ｗａｌｌａｃ １２１４ Ｒａｃｋｂｅｔａ））を用いて測定した。
【００６６】
２．４．データ分析
ドーパミン放出の基本濃度は、指数減衰曲線（ｙ＝ａ．ｅｘｐ（−ｂｔ））を用いて、薬物の投薬前に集めた最初の５つの試料からのデータを調整することによって見積もられた。次に、放出ピークは、薬物の投薬後の次の１０試料について、比「１００ｘ（測定したドーパミン−基本線）／基本線」の最大として定義された。この計算方法は、各フィルターに存在する放射能の全量の差異に関係する問題を回避した。
【００６７】
３）　α６サブユニット（α６−／−）についてノックアウトマウスの分子的及び解剖学的な特性決定
３．１．　動物の検証
ニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ）のアルファ６サブユニットをコードするｍＲＮＡの発現の研究は、ラットおよび鶏で得られた結果（レ　ノベーレ（Ｌｅ Ｎｏｖｅｒｅ）， ら、１９９６， Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ８， ｐ２４２８−３９；ヴァイラティ（Ｖａｉｌａｔｉ）ら、１９９９， Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ５６， １１−１９）を確認した。野生型動物（Ｗｔ）においては、α６は網膜の神経節細胞及びカテコールアミン作用性ニューロン（黒質（ＳＮ）、腹側外皮領域（ＶＴＡ）および青斑）の両方で発現される。しかしながら、α６−／−動物においては、本発明者らは、α６サブユニットのｍＲＮＡの全消失を示し、作られた欠失の機能性を確認した（図１０）。
本発明者らはまた、変異動物におけるα６の消失を埋め合わせるために、他のｎＡＣｈＲサブユニットの過剰発現と関連する発生的補償の不在を検証した。サブユニットα３、α４、α５、α７、β２、β４に対して指向するオリゴヌクレオチドプローブを用いたイン　サイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションは、そのようなメカニズムが、少なくとも転写レベルでは、α６−／−動物に存在しないことを示した（図１１）。
一般的には、α６−／−動物は生存可能であり、同腹子にメンデルの割合で存在し、正常に成熟し、重大な物理学的または神経学的な欠陥を示さない。
【００６８】
３．２　α６−／−の神経系における解剖学的異常の不在
本発明は、α６が正常に発現されるニューロン構造の解剖学的発達を研究した。
ａ）　視覚系
視覚系において、本発明者らは、側背膝状核における網膜の神経節細胞投射路について研究した。というのは、これらの投射路の解剖学的な機構は、網膜におけるニコチン性伝達の活動により発達中に調節されることが知られているからである。β２−／−動物で観察された（ロッシ（Ｒｏｓｓｉ）ら、２００１ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８， ６４５３−６４５８）のとは対照的に、α６−／−変異体は、このレベルでは視覚系における変化を示さなかった（図１２）。
【００６９】
ｂ）　ドーパミン作用系
ドーパミン作用系において、本発明者らは、（中脳における）細胞本体に関して、および線条における投射路の両方で、解剖学的な異常の不在を検証した。本発明者らは、その大多数がニコチン投与によって影響されることが知られている、多数のドーパミン作用性マーカーの発現プロファイルについて研究した。これらのマーカーには、ドーパミン作用性チロシンヒドロキシラーゼ酵素（ＴＨ）及びドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）、ドーパミン受容体Ｄ１及びＤ２並びにニューロペプチド（コレシストキニン（ＣＣＫ）、プレプロエンケファリン（ＰＰＥ）及びプレプロタキキニン（ＰＰＴ））が含まれる。もう一度、α６−／−動物の脳においてこれらのマーカーの発現プロファイルに差異は検出されなかった。
【００７０】
４）　 α６サブユニットを含むニコチン性受容体の薬理学
４．１．　慣用のニコチン性リガンド結合のプロファイル：
α６−／−動物の脳における種々のニコチン性リガンドの結合部位の分布が研究された。［１２５Ｉ］α−ブンガロトキシン結合が変異体において変性されず、一方、エピバチジン、シチシン及びニコチン結合は、網膜投射路領域（上丘（ＳＣ）および側背膝状核（ｄＬＧＮ））におけるこれらのリガンドに対する高い親和性を有する部位の数の減少を示した。それに対して、全ての他の構造、特にＳＮ／ＶＴＡ及び線条体内で、Ｗｔ動物と比較して他の差異を検出することはできなかった。いくらか驚くべきことであったが、この結果は、全部の数の部位において小さな変化をマスクすることができたこれらの領域において豊富なタイプα４β２ニコチン性受容体によって説明することができる。
【００７１】
４．２．　ヨウ素処理したα−コノトキシン（ｃｏｎｏｔｏｘｉｎ）ＭＩＩ結合（［１２５Ｉ］αＣｔｘＭＩＩ）
この薬理学的研究の最も驚くべき結果は、αＣｔｘＭＩＩ結合の研究から得られる。実際、この毒素が分離され、α３β２界面を含むｎＡＣｈＲに特異的であると特徴づけられた（カーティエル（Ｃａｒｔｉｅｒ）ら、１９９６ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１， ７５２２−８）。しかしながら、本発明者らは、α６−／−動物において、この毒素に対するすべての高親和性結合部位の完全な消失を示した（図１３）。さらには、低親和性部位と称される他の可能な部位は、このオートラジオグラフ技術によって検出することができなかったので、線条体の膜調製物での未標識のαＣｔｘＭＩＩによる［３Ｈ］エピバチジン結合の交換が研究された。ここで再び、本発明者らは、α６−／−動物において、αＣｔｘＭＩＩへの高親和性及び低親和性の部位（エピバチジン部位の全数の２０％）の全消失を示すことができた。さらなる結果がこの研究から生じる：２０％のエピバチジン結合部位がαＣｔｘＭＩＩに感受性であり、この感受性は変異体では消失した。本発明者らは、α６−／−動物においてエピバチジン部位の全数の減少を示すことができなかった。αＣｔｘＭＩＩに感受性の部位は、変異体では等量の耐性部位によって置き換えられたと思われる（図１４）。この補償のメカニズムは、幾つかの仮説が立てられたにもかかわらず、わからないままである。本発明者らの結果を考慮して、補償のメカニズムは、転写的な性質であるとはあまり思われない。それに対して、クリニク（Ｋｌｉｎｉｋ）ら（２００１ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２１， １４５２−６３）は、ドーパミン作用性ニューロンにおけるα４α６（β２）３タイプの部位の存在を示唆した。α６サブユニットの不在下では、これらの部位は消失しないが、αＣｔｘＭＩＩに反応しない（α４）２（β２）３タイプの部位によって置き換えられる。
【００７２】
５）　 α６サブユニットは、ドーパミン作用性伝達のニコチン性調節に介在する。
５．１．　ドーパミン放出へのニコチンの影響
これらの補償メカニズムにもかかわらず、本発明者らは、線条体シナプトソーム調製物においてニコチンにより誘発されるドーパミン放出について研究した。野生型動物においては、ニコチン投与（３μＭ）は、基本濃度より約１００％のドーパミン放出（ＤＡ）の増加を引き起こした。α６−／−動物及びα４−／−動物においては、この放出ピークは、５０％に減少した。さらには、α４−／−　Ｘ　α６−／−二重変異体および、α２−／−動物においては、ニコチンの影響は完全に不在であった（図６ａ）。
【００７３】
５．２．　ニコチンにより誘発されるドーパミン放出へのαＣｔｘＭＩＩの影響
本発明者らはまた、α４−／−動物、α６−／−動物およびＷｔ動物において、αＣｔｘＭＩＩとニコチンにより誘発されるＤＡ放出との相互作用について研究した。
Ｗｔ動物においては、αＣｔｘＭＩＩ（１００ｎＭ）はニコチンにより誘発されるＤＡ放出ピークを基本濃度より５０％上に減らした。それに対して、α６−／−動物においては、ニコチンにより誘発されるＤＡ放出はαＣｔｘＭＩＩに全く反応せず、一方、それはα４−／−動物においては、完全に廃された（図１５ａ，ｂ）。
これらの結果は、線条体のドーパミン作用性末端において２タイプの受容体の存在を示唆し、それぞれが、ニコチンの影響の５０％に寄与する。それらは、αＣｔｘＭＩＩに反応しないα４β２タイプの受容体及びこの毒素によってブロックされるα６β２タイプの受容体である。しかしながら、α４及びα６ノックアウトマウスにおける投与−応答曲線の近い考察は、α４−／−変異体動物における応答の親和性の変化を示した（大きさが１オーダー低下）（図１５ｃ，ｄ）。α６−／−動物で得られた結果を考慮すると、これは、ニコチンにより誘発されるドーパミンの放出に関連するニコチン性受容体の組成の変更によってのみ説明することができる。これは、本発明者に、線条におけるドーパミン作用性末端に存在するニコチン性受容体の組成についての理論を変更させた。本発明者らは、２つのタイプの受容体、（α４）２（β２）３およびα６α４（β２）３を提案し、それぞれが、ニコチン応答の５０％に寄与し、それぞれがニコチンに対して同じ親和性を有する。α６−／−動物においては、サブタイプ（α４）２（β２）３のみが、αＣｔｘＭＩＩに対して５０％だけ不感性の減らされた応答を引き起こして存在する。それに対して、α４−／−動物では、本発明者らは、αＣｔｘＭＩＩに感受性であり、ニコチンに対して低い親和性を有する（これは、α４−／−動物において観察されるニコチン応答の親和性の変化を説明する）新規なサブタイプ（α６）２（β２）３の形成を示唆する。α６−／−動物において記載された補償メカニズムはまた、α４−／−変異体において存在する。それに対して、α６−／−動物へのニコチンの投与でのドーパミン作用性応答の５０％減少は、これらの動物で観察された補償が機能的でないことを示す。
【００７４】
５．３．　ニコチンに応答するｃＦｏｓ発現の研究
本発明者らは、α６−／−動物においてニコチンに応答する「初期」遺伝子の発現について研究した。これらの遺伝子は、それらが発現される細胞の「遺伝学的」活性化を翻訳する非常に多様な刺激に応答して細胞において発現される転写因子である。薬物常用癖の場合には、これらの遺伝子の１つ、ｃＦｏｓの発現の増加が、線条の細胞において、モルヒネ、コカイン又はニコチンの投与に応答して観察された。線条体へのドーパミン作用性拮抗物質の注入によってブロックされるこの効果は、慢性的な薬物摂取中に観察される長時間変化に対して応答性であると想定される（ネスラー（Ｎｅｓｔｌｅｒ）、２００１ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２， １１９−２８）。α６−／−動物においては、予備的結果は、ニコチンに応答したｃＦｏｓ発現の活性化の不在を示すと思われる。しかしながらこれらの結果は、多数の動物で確認され、他の初期遺伝子に拡大されなければならない。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】
ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットについての遺伝子のスクリーニング。
ａ）　 エキソン１〜６を含む、 アルファ６サブユニットについての遺伝子のゲノム構造および、転移ベクターの構造。制限部位：Ｅ， ＥｃｏＲＩ； Ｈ， ＨｉｎｄＩＩＩ； Ｓ， ＳｌａＩ； Ｐ， ＰｓｔＩ； Ｎ， ＮｏｔＩ。括弧で示されたＮｏｔＩ部位は、ベクターを構成するのに使用されたファージ中にあり；野生型対立遺伝子に不在である。相同の腕を構成するのに使用された５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩおよび４．６ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｏｔＩ断片は、野生型対立遺伝子（ＷＴ）の上に示されている。交換の変異を生成するために、組換えベクターが使用され；それは、正の選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒ）および負の選択マーカーとしてジフテリア毒素遺伝子（ＤＴＡ）を含む。相同の組換え後、エキソン１及びエキソン２を含む４ｋｂの欠失が形成された。ＰｓｔＩ で消化され、ＳａＩＩ−ＳｐｅＩプローブで検出されたＤＮＡ断片が、点線で示されている。
【図１ｂ】
ｂ）　ホモ接合ノックアウト（−／−）、ヘテロ接合（＋／−）および野生型（＋／＋）アルファ６タイプの動物を同定するサザンブロット分析。
【図２】
図２：　Ａ：ａ６ＢＡＣ（２０００年６月２２日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｉ−２５０４）と称される細菌人工染色体の制限地図。ｂａｃは、約１３０ｋｂのマウス系統１２９ｓｖＤＮＡライブラリーから誘導される挿入断片を含む。この挿入断片（α６）は、エキソンＩからエキソンＶＩからのニコチン性アセチルコリン受容体（ｎＡＣｈＲ） アルファ６サブユニットの座に対応する。
Ｂ：転写の方向に向けられた、１３ｋｂの挿入断片の配列。
【図３Ａ】
図３：　Ａ：プラスミドａ６ＨＮ（２０００年６月２２日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｉ−２５００）の制限地図。
プラスミドａ６ＨＮは、ＫＳ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター及び、マウスのニコチン性アセチルコリン受容体のアルファ６サブユニットについての遺伝子（ＳＶ／Ｄ３株からのＥＳ細胞から誘導されるＤＮＡ）から誘導される、ＨｉｎｄＩＩＩ 、ＮｏｔＩ部位へとクローン化された４．６ｋｂの挿入断片によって構成される。この断片は、アルファ６サブユニットのエキソン３〜５を含む（転写の方向：ＨｉｎｄＩＩＩからＮｏｔＩへ）。
【図３Ｂ（１）】
Ｂ：４．６ｋｂの挿入断片の配列。エキソン３、４及び５は大文字である。「ｎ」は、配列決定されていない塩基を示す。
【図３Ｂ（２）】
Ｂ：４．６ｋｂの挿入断片の配列。エキソン３、４及び５は大文字である。「ｎ」は、配列決定されていない塩基を示す。
【図４Ａ】
図４：　Ａ：ａ６ＥＨプラスミド（２０００年６月２２日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｉ−２５０１）の制限地図。
ａ６ＥＨプラスミドは、ベクター、ＳＫ及び、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位へとクローン化された４ｋｂの挿入断片によって構成される。この挿入断片は、マウスのニコチン性アセチルコリン受容体のアルファ６サブユニットについての遺伝子（１２９ＳＶ／Ｄ３株からのＥＳ細胞から誘導されるＤＮＡ）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片である。それは、アルファ６サブユニットの最初の２つのエキソンを含む（転写の方向：ＥｃｏＲＩからＨｉｎｄＩＩＩへ）。
【図４Ｂ（１）】
Ｂ：４ ｋｂの挿入断片の配列。エキソン１及び２は大文字である。「ｎ」は、配列決定されていない塩基を示す。
【図４Ｂ（２）】
Ｂ：４ ｋｂの挿入断片の配列。エキソン１及び２は大文字である。「ｎ」は、配列決定されていない塩基を示す。
【図５Ａ】
図５：　Ａ：プラスミドａ６ＥＥ（２０００年６月２２日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｉ−２５０２）の制限地図。
プラスミドａ６ＥＥは、ＳＫ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター及び、ＥｃｏＲＩ部位へとクローン化された５ｋｂの挿入断片によって構成される。この挿入断片は、マウスのニコチン性アセチルコリン受容体のアルファ６サブユニット（１２９ＳＶ／Ｄ３株からのＥＳ細胞から誘導されるＤＮＡ）のＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片である。それは、アルファ６のＡＴＧのすぐ上流の５ｋｂの非コード化配列を含む。これらの５ｋｂのプロモーターは、ＳＫのＳａｃＩ−ＫｐｎＩ方向に向けられている。
【図５Ｂ（１）】
Ｂ：ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットについてのプロモーターの５ｋｂの断片の配列。制限部位は大文字である。この配列（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ）は、転写の方向５’から３’へ向いている。「ｎ」は、配列決定されていない塩基を示す。
【図５Ｂ（２）】
Ｂ：ｎＡＣｈＲアルファ６サブユニットについてのプロモーターの５ｋｂの断片の配列。制限部位は大文字である。この配列（ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ）は、転写の方向５’から３’へ向いている。「ｎ」は、配列決定されていない塩基を示す。
【図６Ａ】
図６：　Ａ：プラスミドａ６ＰＰ（２０００年６月２２日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｉ−２５０３）の制限地図。
プラスミドａ６ＰＰは、マウスのニコチン性アセチルコリン受容体のアルファ６サブユニット（１２９ＳＶ／Ｄ３株からのＥＳ細胞から誘導されるＤＮＡ）の４．５ｋｂのＰｓｔＩ−ＰｓｔＩ断片を、ＳＫ−ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＰｓｔＩ部位に挿入することによって構成される。この４．５ｋｂの配列は、α６プロモーター領域に属する。この断片の３’末端は、α６遺伝子のＡＴＧから５’方向に３．９ｋｂである。
【図６Ｂ（１）】
Ｂ：転写の方向に向けられた、４．５ｋｂの挿入断片の配列。「ｎ」は、配列決定されていない塩基を示す。
【図６Ｂ（２）】
Ｂ：転写の方向に向けられた、４．５ｋｂの挿入断片の配列。「ｎ」は、配列決定されていない塩基を示す。
【図７】
図７：　Ａ：ＤＨ５α株からの大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細菌に含まれるプラスミドａ６ＫＯ（２０００年８月２９日に寄託された、ＣＮＣＭ Ｉ−２５５０）の制限地図。このプラスミドは、マウスニコチン性受容体のアルファ６サブユニットの座への相同組換えのために使用される。このプラスミドは、ＳＫ−Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター及び１２ｋｂの挿入断片によって構成される。この挿入断片は、ネオマイシン耐性カセット（３．３ｋｂ）（Ｎｅｏｒ）に隣接するマウスアルファ６遺伝子配列に属する２つの相同の腕（４ｋｂおよび５ｋｂ）を含む。ジフテリア毒素発現カセット（ＤＴＡ）がまた含まれる（１．４ｋｂ）。
【図８】
図８：　異なる制限断片ａ６ＰＰ、ａ６ＥＥ、ａ６ＥＨ、ａ６ＨＮの局在化。
【図９（１）】
図９：　ｎＡＣｈＲ受容体アルファ６サブユニットのアルファ６座の配列。エキソンは大文字である。
【図９（２）】
図９：　ｎＡＣｈＲ受容体アルファ６サブユニットのアルファ６座の配列。エキソンは大文字である。
【図９（３）】
図９：　ｎＡＣｈＲ受容体アルファ６サブユニットのアルファ６座の配列。エキソンは大文字である。
【図９（４）】
図９：　ｎＡＣｈＲ受容体アルファ６サブユニットのアルファ６座の配列。エキソンは大文字である。
【図９（５）】
図９：　ｎＡＣｈＲ受容体アルファ６サブユニットのアルファ６座の配列。エキソンは大文字である。
【図９（６）】
図９：　ｎＡＣｈＲ受容体アルファ６サブユニットのアルファ６座の配列。エキソンは大文字である。
【国際公開パンフレット】
2004508817.tif 000003
2004508817.tif 000004
2004508817.tif 000005
2004508817.tif 000006
2004508817.tif 000007
2004508817.tif 000008
2004508817.tif 000009
2004508817.tif 000010
2004508817.tif 000011
2004508817.tif 000012
2004508817.tif 000013
2004508817.tif 000014
2004508817.tif 000015
2004508817.tif 000016
2004508817.tif 000017
2004508817.tif 000018
2004508817.tif 000019
2004508817.tif 000020
2004508817.tif 000021
2004508817.tif 000022
2004508817.tif 000023
2004508817.tif 000024
2004508817.tif 000025
2004508817.tif 000026
2004508817.tif 000027
2004508817.tif 000028
2004508817.tif 000029
2004508817.tif 000030
2004508817.tif 000031
2004508817.tif 000032
2004508817.tif 000033
2004508817.tif 000034
2004508817.tif 000035
2004508817.tif 000036
2004508817.tif 000037
2004508817.tif 000038
2004508817.tif 000039
2004508817.tif 000040
2004508817.tif 000041
2004508817.tif 000042
2004508817.tif 000043
2004508817.tif 000044
2004508817.tif 000045
2004508817.tif 000046
2004508817.tif 000047
2004508817.tif 000048
2004508817.tif 000049
2004508817.tif 000050
2004508817.tif 000051
2004508817.tif 000052
2004508817.tif 000053
2004508817.tif 000054
2004508817.tif 000055
2004508817.tif 000056
2004508817.tif 000057
2004508817.tif 000058
2004508817.tif 000059
2004508817.tif 000060
2004508817.tif 000061
2004508817.tif 000062
2004508817.tif 000063
2004508817.tif 000064
2004508817.tif 000065
2004508817.tif 000066
2004508817.tif 000067
2004508817.tif 000068
2004508817.tif 000069
2004508817.tif 000070
2004508817.tif 000071
2004508817.tif 000072
2004508817.tif 000073
2004508817.tif 000074
2004508817.tif 000075
2004508817.tif 000076
2004508817.tif 000077
2004508817.tif 000078
2004508817.tif 000079
2004508817.tif 000080
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508817.tif 000081
2004508817.tif 000082
【国際調査報告】
2004508817.tif 000083
2004508817.tif 000084
2004508817.tif 000085
2004508817.tif 000086
2004508817.tif 000087
2004508817.tif 000088
2004508817.tif 000089
2004508817.tif 000090
2004508817.tif 000091
2004508817.tif 000092