(57)【要約】本発明は、大腸癌における免疫反応を示す抗原としてのある種の大腸癌関連ポリペプチドを同定することに基づく、大腸癌を含む癌の診断方法を提供する。同定された抗原は、大腸癌診断のマーカーとして、また大腸癌の治療経過をたどるマーカーとして利用可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における大腸癌の診断方法であって、
対象から生物学的試料を得ること、
前記試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、
前記大腸癌関連ポリペプチドと前記試料中の剤との間の特異的な結合を決定し、特異的な結合の存在を前記対象における大腸癌の診断に用いること、を含む、前記方法。
【請求項２】
試料が血液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的試料が、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと接触させられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
剤が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
生物学的試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドと接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
対象における大腸癌の診断方法であって、
対象から生物学的試料を得ること、
前記試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片と接触させること、および
前記抗体またはその抗原結合断片と前記試料中の大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定し、特異的な結合の存在を前記対象における大腸癌の診断に用いること、を含む、前記方法。
【請求項７】
試料が、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
組織が結腸直腸組織である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
生物学的試料が、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片と接触させられる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
生物学的試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片と接触させることをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
抗体がモノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
抗体が、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
抗体が単鎖抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
抗原結合断片がＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｄ、またはＦｖ断片である、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
対象における大腸癌の発症、進行、または退縮を決定する方法であって、
対象から第一の生物学的試料を得ること、
第一の試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた、少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、
第一の試料中の剤と前記の少なくとも２種の大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定すること、
対象から第二の生物学的試料を得ること、
第二の試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた、少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、
第二の試料中の剤と前記の少なくとも２種の大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定すること、および、
第一の試料中の結合の決定結果と第二の試料中の特異的な結合の決定結果を比較し、大腸癌の発症、進行、または退縮を決定すること、を含む前記方法。
【請求項１６】
試料が血液試料である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
結合を、剤と、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドとの間において決定する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
剤が抗体またはその抗原結合断片である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
剤と、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドとの間の結合を決定することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
対象における大腸癌の発症、進行、または退縮を決定する方法であって、
対象から第一の生物学的試料を得ること、
第一の試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片と接触させること、
第一の試料中の大腸癌関連ポリペプチドと、前記の抗体またはその抗原結合断片との間の特異的な結合を決定すること、
対象から第二の生物学的試料を得ること、
第二の試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片と接触させること、
第二の試料中の大腸癌関連ポリペプチドと、前記の抗体またはその抗原結合断片との間の特異的な結合を決定すること、および、
第一の試料中の特異的な結合の決定結果と第二の試料中の特異的な結合の決定結果を比較し、大腸癌の発症、進行、または退縮を決定すること、を含む、前記方法。
【請求項２１】
試料が、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
組織が結腸直腸組織である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
結合を、大腸癌関連ポリペプチドと、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片との間において決定する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
大腸癌関連ポリペプチドと、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片との間の結合を決定することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
抗体がモノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
抗体が、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
抗体が単鎖抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
抗原結合断片がＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｄ、またはＦｖ断片である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
大腸癌に罹患しているか、罹患の疑いのある対象における治療コースの選択方法であって、
前記対象から生物学的試料を得ること、
前記試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、
癌の異なるタイプにおいては異なって発現する前記試料中の剤と、前記大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定すること、および
前記対象の癌に対する適切な治療コースを選択すること、を含む、前記方法。
【請求項３０】
治療が、大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体を投与することである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
抗体が１種または２種以上の細胞毒性剤により標識されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
試料が血液試料である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
剤が抗体またはその抗原結合断片である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
試料が、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと接触させられる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドと接触させることをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
大腸癌に罹患しているか、罹患の疑いのある対象における治療コースの選択方法であって、
対象から生物学的試料を得ること、
前記試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片と接触させること、
癌の異なるタイプにおいては異なって発現する前記試料中の大腸癌関連ポリペプチドと、前記抗体またはその抗原結合断片との間の特異的な結合を決定すること、および
前記対象の癌に対する適切な治療コースを選択すること、を含む、前記方法。
【請求項３７】
治療が、大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体を投与することである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
抗体が１種または２種以上の細胞毒性剤により標識されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
試料が、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
組織が結腸直腸組織である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片と接触させる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片と接触させることをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
抗体がモノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
抗体が、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
抗体が単鎖抗体である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４６】
抗原結合断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｄ、またはＦｖ断片である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
対象における大腸癌の診断用キットであって、
配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチド、１種または２種以上の対照抗原、および前記ポリペプチドを大腸癌の診断に使用するための指示、を含む、前記キット。
【請求項４８】
大腸癌関連ポリペプチドが基材に結合されている、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
キットが、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドを含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項５０】
キットが、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドをさらに含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項５１】
対象における大腸癌の診断用キットであって、
配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、１種または２種以上の対照剤、および前記剤を大腸癌の診断に使用するための指示、を含む、前記キット。
【請求項５２】
１種または２種以上の剤が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
１種または２種以上の剤が基材に結合している、請求項５１に記載のキット。
【請求項５４】
キットが、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項５５】
キットが、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片をさらに含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項５６】
少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドを含むタンパク質マイクロアレイであって、前記大腸癌関連ポリペプチドが配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされ、固体の基材に固定されている、前記マイクロアレイ。
【請求項５７】
マイクロアレイが、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドを含む、請求項５６に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項５８】
マイクロアレイが、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドをさらに含む、請求項５６に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項５９】
少なくとも１つの対照ポリペプチド分子をさらに含む、請求項５６に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項６０】
抗体またはその抗原結合断片を含むタンパク質マイクロアレイであって、該抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合し、固体の基材に固定されている、前記タンパク質マイクロアレイ。
【請求項６１】
マイクロアレイが、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項６０に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項６２】
マイクロアレイが、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片をさらに含む、請求項６０に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項６３】
少なくとも１つの対照ポリペプチド分子をさらに含む、請求項６０に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項６４】
抗体がモノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項６０に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項６５】
抗体が、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である、請求項６０に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項６６】
抗体が単鎖抗体である、請求項６０に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項６７】
抗原結合断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｄ、またはＦｖ断片である、請求項６０に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項６８】
配列番号１〜１５からなる群から選択され、固体の基材に固定された少なくとも２種の核酸を含む、核酸マイクロアレイ。
【請求項６９】
マイクロアレイが、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種の核酸分子を含む、請求項６８に記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項７０】
配列番号１〜１５からなる群から選択されたもの以外の核酸分子をさらに含む、請求項６８に記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項７１】
少なくとも１つの対照核酸分子をさらに含む、請求項６８に記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項７２】
対象における大腸癌の診断方法であって、
対象から生物学的試料を得ること、および
前記試料中の、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む、少なくとも２種の大腸癌関連核酸分子の発現、またはその発現産物を決定し、その発現を前記対象における大腸癌の診断に用いること、を含む、前記方法。
【請求項７３】
発現を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種の核酸分子について決定する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むもの以外の大腸癌関連核酸分子の発現を決定することをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
試料が、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
組織が結腸直腸組織である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
大腸癌関連核酸分子の発現を、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅からなる群から選択された方法により決定する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
ハイブリダイゼーションが、核酸マイクロアレイを用いて実施される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
対象における大腸癌の発症、進行、または退縮を決定する方法であって、
対象から第一の生物学的試料を得ること、
第一の試料中の、配列番号１〜１５からなる群から選択された少なくとも２種の大腸癌関連核酸分子の発現レベル、またはその発現産物を決定すること、
前記対象から第二の生物学的試料を得ること、
第二の試料中の、配列番号１〜１５からなる群から選択された少なくとも２種の大腸癌関連核酸分子の発現レベル、またはその発現産物を決定すること、および
第一の試料中の発現レベルと第二の試料中の発現レベルを比較し、大腸癌の発症、進行、または退縮を決定すること、を含む前記方法。
【請求項８０】
発現を、配列番号１〜１５からなる群から選択された少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５種の核酸分子について決定する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むもの以外の大腸癌関連核酸分子の発現を決定することをさらに含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
試料が、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
組織が結腸直腸組織である、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
大腸癌関連核酸分子の発現を、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅からなる群から選択された方法により決定する、請求項７９に記載の方法。
【請求項８５】
ハイブリダイゼーションが、核酸マイクロアレイを用いて実施される、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
対象における癌の診断方法であって、
対象から生物学的試料を得ること、
前記試料を、配列番号１、２、４、および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、
前記大腸癌関連ポリペプチドと前記試料中の剤との間の特異的な結合を決定し、特異的な結合の存在を前記対象における癌の診断に用いること、を含む、前記方法。
【請求項８７】
試料が血液である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
剤が抗体またはその抗原結合断片である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
癌が大腸癌である、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
対象における癌の診断方法であって、
対象から生物学的試料を得ること、
前記試料を、配列番号１、２、４、および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片と接触させること、
前記抗体またはその抗原結合断片と、前記試料中の大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定し、特異的な結合の存在を前記対象における癌の診断に用いること、を含む、前記方法。
【請求項９１】
試料が、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
組織が結腸直腸組織である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
抗体がモノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
抗体が、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
抗体が、単鎖抗体である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９６】
抗原結合断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｄ、またはＦｖ断片である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９７】
癌が大腸癌である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９８】
対象における癌の発症、進行、または退縮を決定する方法であって、
対象から第一の生物学的試料を得ること、
第一の試料を、配列番号１、２、４、および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、
第一の試料中の剤と前記大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定すること、
対象から第二の生物学的試料を得ること、
第二の試料を、配列番号１、２、４、および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、
第二の試料中の剤と前記大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定すること、および、
第一の試料中の結合の決定結果と第二の試料中の特異的な結合の決定結果を比較し、癌の発症、進行、または退縮を決定すること、を含む前記方法。
【請求項９９】
試料が血液試料である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
剤が抗体またはその抗原結合断片である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０１】
癌が大腸癌である、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
対象における癌の発症、進行、または退縮を決定する方法であって、
対象から第一の生物学的試料を得ること、
第一の試料を、配列番号１、２、４、および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片と接触させること、
第一の試料中の大腸癌関連ポリペプチドと、前記抗体またはその抗原結合断片との間の特異的な結合を決定すること、
対象から第二の生物学的試料を得ること、
第二の試料を、配列番号１、２、４、および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片と接触させること、
第二の試料中の大腸癌関連ポリペプチドと、前記抗体またはその抗原結合断片との間の特異的な結合を決定すること、および、
第一の試料中の特異的な結合の決定結果と第二の試料中の特異的な結合の決定結果を比較し、癌の発症、進行、または退縮を決定すること、を含む前記方法。
【請求項１０３】
試料が、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
組織が結腸直腸組織である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
抗体がモノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０６】
抗体が、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０７】
抗体が、単鎖抗体である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０８】
抗原結合断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｄ、またはＦｖ断片である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０９】
癌が大腸癌である、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１１０】
大腸癌に罹患しているか、罹患の疑いのある対象における治療コースの選択方法であって、
対象から生物学的試料を得ること、
前記試料を、配列番号１、２、４、および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、
癌の異なるタイプにおいては異なって発現する前記試料中の剤と、前記大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定すること、および
前記対象の癌に対する適切な治療コースを選択すること、を含む、前記方法。
【請求項１１１】
治療が、大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体を投与することである、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
抗体が１種または２種以上の細胞毒性剤により標識されている、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
試料が血液試料である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１４】
剤が抗体またはその抗原結合断片である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１５】
癌が大腸癌である、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１６】
大腸癌に罹患しているか、罹患の疑いのある対象における治療コースの選択方法であって、
対象から生物学的試料を得ること、
前記試料を、配列番号１、２、４、および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片と接触させること、
癌の異なるタイプにおいては異なって発現する前記試料中の大腸癌関連ポリペプチドと、前記抗体またはその抗原結合断片との間の特異的な結合を決定すること、および
前記対象の癌に対する適切な治療コースを選択すること、を含む、前記方法。
【請求項１１７】
治療が、大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体を投与することである、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
抗体が１種または２種以上の細胞毒性剤により標識されている、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
試料が、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択される、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２０】
組織が結腸直腸組織である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
抗体が、モノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２２】
抗体が、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２３】
抗体が単鎖抗体である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２４】
抗原結合断片がＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｄ、またはＦｖ断片である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２５】
癌が大腸癌である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２６】
対象における癌の診断用キットであって、
配列番号１、２、４、および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチド、１種または２種以上の対照抗原、および前記ポリペプチドと対照抗原を癌の診断に使用するための指示、を含む、前記キット。
【請求項１２７】
大腸癌関連ポリペプチドが基材に結合されている、請求項１２６に記載のキット。
【請求項１２８】
癌が大腸癌である、請求項１２６に記載のキット。
【請求項１２９】
対象における癌の診断用キットであって、
配列番号１、２、４、および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片、１種または２種以上の対照抗原、ならびに、前記抗体、抗原結合断片および剤を癌の診断に使用するための指示、を含む、前記キット。
【請求項１３０】
１種または２種以上の剤が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項１２９に記載のキット。
【請求項１３１】
１種または２種以上の剤が基材に結合されている、請求項１２９に記載のキット。
【請求項１３２】
癌が大腸癌である、請求項１２９に記載のキット。
【請求項１３３】
大腸癌関連ポリペプチドを含むタンパク質マイクロアレイであって、該大腸癌関連ポリペプチドが、配列番号１、２、４、および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされ、固体の基材に固定されている、前記タンパク質マイクロアレイ。
【請求項１３４】
少なくとも１つの対照ポリペプチド分子をさらに含む、請求項１３３に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項１３５】
抗体またはその抗原結合断片を含むタンパク質マイクロアレイであって、該抗体またはその抗原結合断片が、配列番号１、２、４、および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合し、固体の基材に固定されている、前記タンパク質マイクロアレイ。
【請求項１３６】
少なくとも一つの対照ポリペプチド分子をさらに含む、請求項１３５に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項１３７】
抗体が、モノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項１３５に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項１３８】
抗体が、キメラ、ヒト、またはヒト化抗体である、請求項１３５に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項１３９】
抗体が、単鎖抗体である、、請求項１３５に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項１４０】
抗原結合断片が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｄ、またはＦｖ断片である、、請求項１３５に記載のタンパク質マイクロアレイ。
【請求項１４１】
配列番号１、２、４、および５からなる群から選択され、固体の基材に固定された核酸を含む、核酸マイクロアレイ。
【請求項１４２】
少なくとも１つの対照核酸分子をさらに含む、請求項１４１に記載の核酸マイクロアレイ。
【請求項１４３】
対象における癌の診断方法であって、
対象から生物学的試料を得ること、および
前記試料中における、配列番号１、２、４、および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む大腸癌関連核酸分子の発現、またはその発現産物を決定し、その発現を前記対象における癌の診断に用いること、
を含む、前記方法。
【請求項１４４】
試料が、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択される、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
組織が結腸直腸組織である、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
大腸癌関連核酸分子の発現を、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅からなる群から選択された方法により決定する、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４７】
ハイブリダイゼーションが、核酸マイクロアレイを用いて実施される、請求項１４６に記載の方法。
【請求項１４８】
癌が大腸癌である、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４９】
対象における癌の発症、進行、または退縮を決定する方法であって、
対象から第一の生物学的試料を得ること、
第一の試料における、配列番号１、２、４、および５からなる群から選択された大腸癌関連核酸分子の発現レベル、またはその発現産物を決定すること、
前記対象から第二の生物学的試料を得ること、
第二の試料における、配列番号１、２、４、および５からなる群から選択された大腸癌関連核酸分子の発現レベル、またはその発現産物を決定すること、および、
第一の試料中の発現レベルと第二の試料中の発現レベルを比較し、癌の発症、進行、または退縮を決定すること、
を含む前記方法。
【請求項１５０】
試料が、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
組織が結腸直腸組織である、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
大腸癌関連核酸分子の発現を、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅からなる群から選択された方法により決定する、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５３】
ハイブリダイゼーションが、核酸マイクロアレイを用いて実施される、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
癌が大腸癌である、請求項１４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な大腸癌関連核酸分子およびそれらがコードするポリペプチドの、大腸癌を含む癌のマーカーとしての使用に関する。本発明はまた、大腸癌関連核酸分子およびそれらがコードするポリペプチドのパネルの、大腸癌マーカーとしての使用に関する。さらに、本発明は、かかる核酸分子およびそれらがコードするポリペプチドの、大腸癌の診断と、治療に対する大腸癌の反応を監視するための使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸癌は、大腸および結腸直腸の癌としても知られており、米国では癌による死亡の原因として肺癌につぐものである。結腸直腸癌は、通常は５０歳以上の個人によくみられる悪性状態であり、結腸直腸癌の全体的な罹患率は、過去４０年間大きな変化を示していない。(Harrison’s Principles of Internal Medicine, 14/e, McGraw-Hill Companies, New York, 1998)。診断が下された後の大腸癌の治療は、大腸組織やリンパ節における癌の侵襲の度合い、および肝臓など他の器官への転移の状況に依存する。初期癌と診断された患者の生存率は、５年後で約９０％である。癌が大腸の粘膜層より深く広がるまで検出されなかった場合、５年後生存率は低下し、もし検出された時点で癌がリンパ節を超えて広がっていた場合、５年後生存率は大きく低下する。したがって、良好な予後と転帰の確率を高めるには、大腸癌を可能な限り早期の段階で発見することが必要である。
【０００３】
従来大腸癌の診断は、非侵襲的または軽度に侵襲的な診断検査、より侵襲的な目視検査、およびバイオプシーによる組織学的検査によって行われる。これらの検査によれば大腸癌の検出は可能であるが、各検査はそれぞれ、診断ツールとしての有効性を限定する欠点を有している。現在大腸癌の診断に利用可能な多くの方法の主要な難点の一つは、不快感あるいは恥ずかしいと感じる検査の特徴のために、患者が検査を受けたり実施するのをためらうことである。
【０００４】
より侵襲的でない診断方法は、便潜血検査および直腸内触診を含む。指診により大腸／直腸の遠端における腫瘍を検出することが可能であるが、より内部の腫瘍には効果的でない。潜血反応検査の有効性は、大腸癌からの出血が間欠的であることにより損なわれ、偽陰性の判定の割合を高めている。例えば、結腸直腸癌と診断された患者の約５０％が便潜血検査で陰性の判定を受けている。さらに、便潜血検査における偽陽性の判定も、大腸癌の正確な診断に問題となる。なぜならば、多くの大腸癌ではない状態（例えば、歯肉炎、潰瘍、アスピリン使用）が陽性の判定を引き起こし得るため、不必要な侵襲的な再検査が行われるからである。これらの大腸癌の非侵襲的検査についての制限が、患者が迅速に診断を受け適切な大腸癌の治療を受けることを遅延させている。
大腸の異常の目視検査は、内視鏡またはレントゲン写真検査、例えば硬性直腸Ｓ状結腸鏡検査、軟性Ｓ状結腸鏡検査、結腸鏡検査、およびバリウム造影注腸検査により実施される。これらの方法は費用が高く、苦痛であり、患者に合併症の危険をもたらす。
【０００５】
大腸癌の他の診断方法としては、対象の血液試料から癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を検出することであり、高いレベルのＣＥＡが検出された場合、進行した大腸癌の存在を示す可能性がある。しかしＣＥＡのレベルは、癌がない場合にも異常に高いことがある。したがって、この検査は大腸癌に選択的ではなく、正確で信頼のおける診断ツールとしてのこの検査の価値は限定される。さらに、高いＣＥＡレベルは大腸癌の末期段階でなければ検出できず、この段階では治癒率は低く、治療の選択肢は限定され、患者の予後は悪い。
大腸癌の診断および治療の評価のためのより有効な技術が必要である。大腸癌に利用できる診断方法は部分的には成功しているが、大腸癌の検出方法はまだ十分とは言えない。適切な治療により患者の良好な予後の可能性を大きく高めることのできる早期の段階において大腸癌の検出が可能な診断方法が必要とされる。
【０００６】
発明の概要
本発明は、ある種の大腸癌関連ポリペプチドおよびそれをコードする核酸分子を、大腸癌における免疫反応を発現させる抗原として同定することに基づく大腸癌の診断方法を提供する。同定された抗原は、大腸癌の診断マーカーとして、大腸癌の治療の経過をたどるマーカーとして、また大腸癌治療の評価マーカーとして使用可能である。
本発明の一つの観点により、対象における大腸癌の診断方法を提供する。該方法は、対象から生物学的試料を得ること、該試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、および、前記大腸癌関連ポリペプチドと前記試料中の剤との間の特異的な結合を決定し、その特異的な結合の存在を前記対象における大腸癌の診断に用いることを含む。
【０００７】
本発明の他の観点により、対象における大腸癌の発症、進行、または退縮を決定する方法を提供する。該方法は、対象から第一の生物学的試料を得ること、第一の試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、第一の試料中の剤と前記少なくとも２種の大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定すること、対象から第二の生物学的試料を得ること、第二の試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、第二の試料中の剤と前記少なくとも２種の大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定すること、および、第一の試料中の結合の決定結果と第二の試料中の特異的な結合の決定結果を比較し、大腸癌の発症、進行、または退縮を決定することを含む。
【０００８】
本発明のさらに他の観点により、大腸癌に罹患しているか、罹患の疑いのある対象における治療コースの選択方法を提供する。該方法は、対象から生物学的試料を得ること、該試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、癌の異なるタイプにおいては異なって発現する前記試料中の剤と、前記大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定すること、および、前記対象の癌に対する適切な治療コースを選択することを含む。ある態様においては、治療は、大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体を投与することである。ある態様においては、抗体は、１種または２種以上の細胞毒性剤で標識されている。
【０００９】
前述の方法のある態様においては、生物学的試料は血液試料である。ある態様においては、剤は抗体またはその抗原結合断片である。前述の方法のある態様においては、生物学的試料は、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと接触させる。前述の方法のある態様においては、生物学的試料は、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドと接触させる。
【００１０】
本発明の他の観点により、対象における大腸癌の診断方法を提供する。該方法は、対象から生物学的試料を得ること、該試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた、少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と接触させること、および、前記抗体またはその抗原結合断片と前記試料中の大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定し、特異的な結合の存在を前記対象における大腸癌の診断に用いることを含む。
【００１１】
本発明の他の観点により、対象における大腸癌の発症、進行、または退縮を決定する方法を提供する。該方法は、対象から第一の生物学的試料を得ること、第一の試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた、少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と接触させること、第一の試料中の大腸癌関連ポリペプチドと前記抗体またはその抗原結合断片との間の特異的な結合を決定すること、対象から第二の生物学的試料を得ること、第二の試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた、少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と接触させること、前記第二の試料中の大腸癌関連ポリペプチドと前記抗体またはその抗原結合断片との間の特異的な結合を決定すること、および、第一の試料中の特異的な結合の決定結果と第二の試料中の特異的な結合の決定結果を比較し、大腸癌の発症、進行、または退縮を決定することを含む。
【００１２】
本発明のさらに他の観点により、大腸癌に罹患しているか、罹患の疑いのある対象に対する治療コースの選択方法を提供する。該方法は、対象から生物学的試料を得ること、該試料を、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた、少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と接触させること、癌の異なるタイプにおいては異なって発現する前記試料中の大腸癌関連ポリペプチドと、前記抗体またはその抗原結合断片との間の特異的な結合を決定すること、および、前記対象の癌に対する適切な治療コースを選択することを含む。ある態様においては、治療は、大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体を投与することである。ある態様においては、抗体は１種または２種以上の細胞毒性剤で標識されている。
【００１３】
前述の方法のある態様においては、試料は、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択する。前述の方法の好ましい態様においては、組織は結腸直腸組織である。前述の方法のある態様においては、抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体であり、前述の方法のある態様においては、抗体はキメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。ある態様においては、抗体は単鎖抗体であり、前述の方法のある態様においては、抗原結合断片はＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｄ、またはＦｖ断片である。前述の方法のある態様においては、生物学的試料は、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と接触させる。前述の方法のある態様においては、生物学的試料は、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と接触させる。
【００１４】
本発明のさらに他の観点により、対象における大腸癌の診断用キットを提供する。該キットは、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた、少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチド、１種または２種以上の対照抗原、および、前記ポリペプチドを大腸癌の診断に使用するための指示を含む。ある態様においては、大腸癌関連ポリペプチドは基材に結合されている。ある態様においては、１種または２種以上の剤は抗体またはその抗原結合断片である。ある態様においては、キットは、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドを含む。ある態様においては、キットはさらに、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドを含む。
【００１５】
本発明のさらに他の観点により、対象における大腸癌の診断用キットを提供する。該キットは、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片、１種または２種以上の対照剤、および、前記剤を大腸癌の診断に使用するための指示を含む。ある態様においては、１種または２種以上の剤は、抗体またはその抗原結合断片である。ある態様においては、１種または２種以上の剤は基材に結合されている。ある態様においては、キットは、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。ある態様においては、キットはさらに、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を含む。
【００１６】
本発明の他の観点により、タンパク質マイクロアレイであって、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされ、固体の基材に固定されている少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドを含む、前記タンパク質マイクロアレイを提供する。ある態様においては、マイクロアレイは、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドを含む。ある態様においては、マイクロアレイはさらに、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドから本質的になる。ある態様においては、マイクロアレイはさらに、少なくとも１つの対照ポリペプチド分子から本質的になる。
【００１７】
本発明のさらに他の観点により、抗体またはその抗原結合断片を含むタンパク質マイクロアレイであって、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた少なくとも２種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する該抗体またはその抗原結合断片が、固体の基材に固定されている、前記タンパク質マイクロアレイを提供する。ある態様においては、タンパク質マイクロアレイは、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５種の異なる大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片から本質的になる。ある態様においては、マイクロアレイはさらに、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外の大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片から本質的になる。ある態様においては、タンパク質マイクロアレイはさらに、少なくとも１つの対照ポリペプチド分子から本質的になる。ある態様においては、抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体である。ある態様においては、抗体はキメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。ある態様においては、抗体は単鎖抗体であり、ある態様においては、抗原結合断片はＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｄ、またはＦｖ断片である。
【００１８】
本発明の他の観点により、核酸マイクロアレイを提供する。該核酸マイクロアレイは、配列番号１〜１５からなる群から選択され、固体の基材に固定された少なくとも２種の核酸を含む。ある態様においては、核酸マイクロアレイは、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５種の異なる核酸分子から本質的になる。ある態様においては、マイクロアレイはさらに、配列番号１〜１５からなる群から選択されたもの以外の核酸分子から本質的になる。さらに他の態様においては、マイクロアレイはさらに、少なくとも１種の対照核酸分子から本質的になる。
【００１９】
本発明の他の観点により、対象における大腸癌の診断方法を提供する。該方法は、対象から生物学的試料を得ること、および、該試料中において、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む少なくとも２種の異なる大腸癌関連核酸分子の発現またはその発現産物を決定し、その発現を、前記対象における大腸癌の診断に用いることを含む。ある態様においては、発現は、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５種の異なる核酸分子について決定する。ある態様においては、方法は、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むもの以外の大腸癌関連核酸分子の発現を決定することを含む。ある態様においては、試料は、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択する。好ましい態様においては、組織は結腸直腸組織である。ある態様においては、大腸癌関連核酸分子の発現は、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅からなる群から選択する方法により決定する。好ましい態様においては、ハイブリダイゼーションは核酸マイクロアレイを用いて行う。
【００２０】
本発明の他の観点により、対象における大腸癌の発症、進行、または退縮を決定する方法を提供する。該方法は、対象から第一の生物学的試料を得ること、第一の試料における、配列番号１〜１５からなる群から選択された少なくとも２種の異なる大腸癌関連核酸分子の発現レベルまたはその発現産物を決定すること、前記対象から第二の生物学的試料を得ること、第二の試料における、配列番号１〜１５からなる群から選択された少なくとも２種の異なる大腸癌関連核酸分子の発現レベルまたはその発現産物を決定すること、および、第一の試料中の発現レベルと第二の試料中の発現レベルを比較し、大腸癌の発症、進行、または退縮を決定することを含む。ある態様においては、発現は、配列番号１〜１５からなる群から選択された少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５種の核酸分子について決定する。ある態様においては、方法はさらに、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含むもの以外の大腸癌関連核酸分子の発現を決定することを含む。ある態様においては、試料は、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択する。好ましい態様においては、組織は結腸直腸組織である。ある態様においては、大腸癌関連核酸分子の発現は、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅からなる群から選択する方法により決定する。好ましい態様においては、ハイブリダイゼーションは核酸マイクロアレイを用いて行う。
【００２１】
本発明の他の観点により、対象における癌の診断方法を提供する。該方法は、対象から生物学的試料を得ること、該試料を、配列番号１、２、４および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、および、前記大腸癌関連ポリペプチドと前記試料中の剤の間の特異的な結合を決定し、特異的な結合の存在を前記対象における癌の診断に用いることを含む。
【００２２】
本発明の他の観点により、対象における癌の発症、進行、または退縮を決定する方法を提供する。該方法は、対象から第一の生物学的試料を得ること、第一の試料を、配列番号１、２、４および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、第一の試料中の剤と前記大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定すること、対象から第二の生物学的試料を得ること、第二の試料を、配列番号１、２、４および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、第二の試料中の剤と前記大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定すること、および、第一の試料中の結合の決定結果と第二の試料中の特異的な結合の決定結果を比較し、癌の発症、進行、または退縮を決定することを含む。
【００２３】
本発明のさらに他の観点により、癌に罹患しているか、罹患の疑いのある対象における治療コースの選択方法を提供する。該方法は、対象から生物学的試料を得ること、該試料を、配列番号１、２、４および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと接触させること、癌の異なるタイプにおいては異なって発現する前記試料中の剤と、前記大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定すること、および、前記対象の癌に対する適切な治療のコースを選択することを含む。ある態様においては、治療は、大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体を投与することである。ある態様においては、抗体は１種または２種以上の細胞毒性剤で標識されている。
前述の方法のある態様においては、試料は血液である。前述の方法のある態様においては、剤は抗体またはその抗原結合断片である。前述の方法の好ましい態様においては、癌は大腸癌である。
【００２４】
本発明の他の観点により、対象における癌の診断方法を提供する。該方法は、対象から生物学的試料を得ること、該試料を、配列番号１、２、４および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と接触させること、および、前記抗体またはその抗原結合断片と前記試料中の大腸癌関連ポリペプチドとの間の特異的な結合を決定し、特異的な結合の存在を前記対象における癌の診断に用いることを含む。
【００２５】
本発明の他の観点により、対象における癌の発症、進行、または退縮を決定する方法を提供する。該方法は、対象から第一の生物学的試料を得ること、第一の試料を、配列番号１、２、４および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と接触させること、第一の試料中の大腸癌関連ポリペプチドと前記抗体またはその抗原結合断片との間の特異的な結合を決定すること、対象から第二の生物学的試料を得ること、第二の試料を、配列番号１、２、４および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と接触させること、第二の試料中の大腸癌関連ポリペプチドと前記抗体またはその抗原結合断片との間の特異的な結合を決定すること、および、第一の試料中の特異的な結合の決定結果と第二の試料中の特異的な結合の決定結果を比較し、癌の発症、進行、または退縮を決定することを含む。
【００２６】
本発明のさらに他の観点により、癌に罹患しているか、罹患の疑いのある対象に対する治療コースの選択方法を提供する。該方法は、対象から生物学的試料を得ること、該試料を、配列番号１、２、４および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片と接触させること、癌の異なるタイプにおいては異なって発現する前記試料中の大腸癌関連ポリペプチドと、前記抗体またはその抗原結合断片との間の特異的な結合を決定すること、および、前記対象の癌に対する適切な治療コースを選択することを含む。ある態様においては、治療は、大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体を投与することである。ある態様においては、抗体は１種または２種以上の細胞毒性剤で標識されている。
【００２７】
前述の方法のある態様においては、試料は、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択する。前述の方法のある態様においては、組織は結腸直腸組織である。前述の方法の好ましい態様においては、抗体はモノクローナルもしくはポリクローナル抗体、キメラ、ヒト、もしくはヒト化抗体である。前述の方法の好ましい態様においては、抗体は単鎖抗体であり、抗原結合断片はＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｄ、またはＦｖ断片である。前述の方法の好ましい態様においては、癌は大腸癌である。
【００２８】
本発明のさらに他の観点により、対象における癌の診断用キットを提供する。該キットは、配列番号１、２、４および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチド、１種または２種以上の対照剤、ならびに、前記ポリペプチドおよび対照剤を癌の診断に使用するための指示を含む。ある態様においては、大腸癌関連ポリペプチドは基材に結合されている。ある態様においては、１種または２種以上の剤は抗体またはその抗原結合断片である。好ましい態様においては、癌は大腸癌である。
【００２９】
本発明の他の観点により、対象における癌の診断用キットを提供する。該キットは、配列番号１、２、４および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、１種または２種以上の対照剤、ならびに、前記抗体、抗原結合断片ポリペプチド、および対照剤を癌の診断に使用するための指示を含む。ある態様においては、１種または２種以上の剤は抗体またはその抗原結合断片である。ある態様においては、１種または２種以上の剤は基材に結合されている。好ましい態様においては、癌は大腸癌である。
【００３０】
本発明の他の観点により、タンパク質マイクロアレイを提供する。該タンパク質マイクロアレイは、配列番号１、２、４および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされ、固体の基材に固定された、大腸癌関連ポリペプチドを含む。ある態様においては、タンパク質マイクロアレイはさらに、少なくとも１つの対照ポリペプチド分子を含む。
【００３１】
本発明のさらに他の観点により、タンパク質マイクロアレイを提供する。該タンパク質マイクロアレイは、配列番号１、２、４および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドと特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、固体の基材に固定されているものを含む。ある態様においては、タンパク質マイクロアレイはさらに、少なくとも１つの対照ポリペプチド分子を含む。ある態様においては、抗体はモノクローナルもしくはポリクローナル抗体である。ある態様においては、抗体はキメラ、ヒト、もしくはヒト化抗体であり、ある態様においては、抗体は単鎖抗体である。ある態様においては、抗原結合断片はＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｄ、またはＦｖ断片である。
本発明の他の観点により、核酸マイクロアレイを提供する。該核酸マイクロアレイは、配列番号１、２、４および５からなる群から選択された核酸であって、固体の基材に固定されているものを含む。ある態様においては、核酸マイクロアレイはさらに、少なくとも１つの対照核酸分子を含む。
【００３２】
本発明のさらに他の観点により、対象における癌の診断方法を提供する。該方法は、対象から生物学的試料を得ること、および、該試料における、配列番号１、２、４および５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む大腸癌関連核酸分子の発現またはその発現産物を決定し、その発現を前記対象における癌の診断に用いることを含む。ある態様においては、試料は、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択する。好ましい態様においては、組織は結腸直腸組織である。ある態様においては、大腸癌関連核酸分子の発現は、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅からなる群から選択する方法により決定する。好ましい態様においては、ハイブリダイゼーションは核酸マイクロアレイを用いて行う。好ましい態様においては、癌は大腸癌である。
【００３３】
本発明の他の観点により、対象における癌の発症、進行、または退縮を決定する方法を提供する。該方法は、対象から第一の生物学的試料を得ること、第一の試料における、配列番号１、２、４および５からなる群から選択された大腸癌関連核酸分子の発現レベルまたはその発現産物を決定すること、前記対象から第二の生物学的試料を得ること、第二の試料における、配列番号１、２、４および５からなる群から選択された大腸癌関連核酸分子の発現レベルまたはその発現産物を決定すること、および、第一の試料中の発現レベルと第二の試料中の発現レベルを比較し、癌の発症、進行、または退縮を決定することを含む。ある態様においては、試料は、組織、便、細胞、血液、および粘液からなる群から選択する。好ましい態様においては、組織は結腸直腸組織である。ある態様においては、大腸癌関連核酸分子の発現は、核酸ハイブリダイゼーションおよび核酸増幅からなる群から選択する方法により決定する。ある態様においては、ハイブリダイゼーションは核酸マイクロアレイを用いて行う。好ましい態様においては、癌は大腸癌である。
【００３４】
前述の方法および組成物の好ましい態様においては、配列番号１〜１５によりコードされた大腸癌関連核酸分子は、それぞれ、配列番号１６〜３０として記述されるアミノ酸配列、またはエピトープアミノ酸配列を含むそれらの断片を含む、ポリペプチドである。
前述の方法および組成物のある態様においては、配列番号１〜１５の断片である核酸分子を含む。好ましい断片は、エピトープを含む配列番号１６〜３０の断片をコードするものである。ある好ましい断片は、配列番号１〜１５の２０以上の連続ヌクレトチドを含み、さらに好ましくは、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、またはそれより多いの連続ヌクレオチドを含む。
前述の核酸分子およびポリペプチドの、薬剤の調製における使用も、本発明に含まれる。好ましい態様においては、薬剤は癌、特に大腸癌の治療に有用である。
【００３５】
発明の詳細な説明
本明細書に記載の発明は、癌、特に、大腸および結腸直腸癌としても知られている大腸癌の患者において特異的免疫反応を示すポリペプチドの同定に関する。大腸癌関連ポリペプチドは癌患者のＳＥＲＥＸスクリーニングにより同定された。ＳＥＲＥＸ法（組み換え発現クローニングによる抗原の血清解析）については、Sahinら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:11810-11813, 1995）が記載している。新しく同定された大腸癌関連ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸分子は、大腸癌を含む癌のマーカーとして用いることができ、ヒトにおける大腸癌の診断および治療の評価に用いることができる。さらに、少なくとも２種の大腸癌関連ポリペプチドのセットおよびそれらをコードする核酸分子は、ヒトにおける大腸癌の診断および治療の評価に用いることができる。
【００３６】
大腸癌において特異的免疫反応を示すポリペプチドが今回同定され、この同定により、新しく同定された大腸癌関連ポリペプチドまたはそれをコードする核酸分子を、癌診断検査およびキットに使用することが可能となる。さらに、少なくとも２つの、これら新しく同定されたもしくは以前から同定されていた大腸癌関連ポリペプチドのセットまたはそれをコードする核酸分子を、大腸癌診断検査およびキットに用いることが可能である。かかる検査およびキットは、ヒト対象における大腸癌の検出、および、対象における大腸癌の進行、退縮、または発症の病期分類に有用である。本明細書記載の方法およびキットはまた、大腸癌の治療の評価にも用いることができる。
【００３７】
本明細書で用いる用語「大腸癌関連ポリペプチド」は、大腸癌を有する動物において特異的な免疫反応を示すポリペプチドを意味し、したがって、免疫系に認識される（例えば、抗体および／またはＴリンパ球により）大腸癌関連抗原および大腸癌関連抗原の断片を含む。本発明はまた、大腸癌関連ポリペプチドをコードする核酸分子の使用にも関する。全ての態様において、ヒト大腸癌関連ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸分子が好ましい。本明細書で用いる用語「それをコードする核酸分子」とは、前記ポリペプチドをコードする核酸分子を意味する。
【００３８】
本明細書では、対象は好ましくは、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、またはげっ歯類である。全ての態様において、ヒト対象が好ましい。ある態様においては、対象は癌に罹患している疑いがあり、好ましい態様においては、対象は大腸癌に罹患している疑いがある。ある態様においては、対象は癌と診断されており、好ましい態様においては、対象は大腸癌と診断されている。
本明細書で用いる用語、癌の「異なるタイプ」には、異なる組織学的タイプ、細胞のタイプ、癌の異なる病期（例えば、原発腫瘍または転移性増殖）を含んでよい。
【００３９】
大腸癌に罹患している疑いのある対象の同定方法には、便潜血検査、指診、ＣＥＡ検査、内視鏡またはレントゲン写真検査、バイオプシー、対象の家族の病歴、対象の病歴、または画像技術、例えば磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）を含むことができる。大腸癌に罹患している疑いのある対象を同定するこれらの方法は、医療分野の当業者にはよく知られている。本明細書で用いる生物学的試料は、組織、体液（例えば、血液）、身体からの滲出物、粘液、および便試料を含むが、これらに限定はされない。組織は対象から得るか、または培養してもよい（例えば、細胞株から）。
本明細書で用いる結腸直腸組織試料は、関連医療分野の当業者に周知の方法を用いて（例えば、結腸直腸組織バイオプシーにより）得た組織である。本明細書で用いる語句「癌の疑いのある」は、医療分野の当業者が、癌細胞を含むと考える大腸癌組織試料を意味する。バイオプシーにより試料を得る方法は、腫瘤の全体的な配分（gross apportioning of a mass）、マイクロダイセクション、レーザーに基づくマイクロダイセクション、または当業者に既知の細胞分離手法を含む。
【００４０】
病変組織のバイオプシー材料における細胞タイプの変動が大きいため、また、用いる診断方法の感度の変動が大きいため、検査に必要な試料サイズの範囲は、細胞数にして１、１０、５０、１００、２００、３００、５００、１０００、５０００、１０，０００から５０，０００個、またはそれより多い。適切な試料サイズは、細胞の組成およびバイオプシーの条件に基づいて決定することができ、この決定の標準の準備ステップおよび続いて行われる本発明に用いる核酸の分離は、当業者によく知られている。この例としては、限定を意図するものではないが、あるケースにおいてはバイオプシーによる試料は増幅なしでＲＮＡの発現評価に十分であり、他のケースにおいては、狭いバイオプシー部位の中で適切な細胞が不足するため、ＲＮＡの変換および／もしくは増幅法または核酸分子の検出分解能を強化するための他の方法の使用が必要となる場合もある。限定されたバイオプシー材料の使用を可能にするこれらの方法は当業者によく知られており、直接ＲＮＡ増幅法、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写法、ｃＤＮＡの増幅、または放射標識核酸の生成を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
ある態様においては、表３に示す１から１５まで番号付けされた核酸配列の群からの大腸癌関連核酸分子（配列番号１〜１５）、および、配列番号１〜１５によりコードされた大腸癌関連ポリペプチドは、表３のポリペプチド配列番号１６〜３０の群である。ある態様においては、大腸癌関連ポリペプチドは、配列番号１〜１５からなる群から選択されたヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされたもの以外のポリペプチドを含んでよい。
【００４２】
本発明は、ある態様において、対象において、少なくとも２種の大腸癌関連ポリペプチドに対する免疫反応の存在を決定することにより、大腸癌を診断または監視することを含む。ある態様においては、対象における大腸癌などの癌は、本明細書に記載の新規な大腸癌関連ポリペプチドの一つに対する免疫反応の存在を決定することにより診断または監視可能である。好ましい態様においては、この決定は、対象の身体から得た液体、好ましくは血液を検査し、本明細書に記載の少なくとも２種の大腸癌関連ポリペプチドに対する抗体もしくは該大腸癌関連ポリペプチドをコードする核酸分子の存在を調べること、または、新規な大腸癌関連ポリペプチドの一つに対する抗体もしくはそれをコードする核酸分子の存在を調べることにより行う。この決定はまた、対象の組織を検査し、本明細書に記載の少なくとも２種の大腸癌関連ポリペプチドおよび／もしくは該大腸癌関連ポリペプチドをコードする核酸分子の存在を調べることにより、または、対象の組織を検査して新規な大腸癌関連ポリペプチドの一つもしくはそれをコードする核酸分子の存在を調べることにより、実施する。
【００４３】
本明細書に記載の、対象における一つの新規な大腸癌関連ポリペプチド、または少なくとも２種の大腸癌関連ポリペプチドに対する免疫反応を逐次的決定により時間の経過と共に測定することは、病気および／または治療コースの効果の監視を可能にする。例えば、試料を対象から得て、一つの新規な大腸癌関連ポリペプチドに対する免疫反応を検査すること、または、少なくとも２種の大腸癌関連ポリペプチドに対する免疫反応を検査し、第二の次の時点において前記対象から他の試料を得て、同様に検査することができる。第一と第二（次）の検査結果を比較し、大腸癌の発症、進行、または退縮の指標とすることができ、あるいは、もしこの２つの試料を得る期間の間で大腸癌の治療が行われていれば、その治療の効果を、２つの検査結果の比較により評価できる。
【００４４】
本発明はまた、ある態様において、本明細書に記載の少なくとも２種の大腸癌関連ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸分子の存在を決定すること、または新規な大腸癌関連ポリペプチドの一つおよびそれをコードする核酸分子の存在を決定することにより、大腸癌を診断または監視することを含む。ある態様によれば、この決定は、対象からの組織であって、好ましくは癌性と考えられる試料を、本明細書に記載の少なくとも２種の大腸癌関連ポリペプチドまたはそれらをコードする核酸分子の存在について検査すること、または新規な大腸癌関連ポリペプチドの一つおよびそれをコードする核酸分子の存在について検査することにより実施する。
【００４５】
他の重要な態様によれば、本明細書に記載の少なくとも２種の大腸癌関連ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸分子の存在、または新規な大腸癌関連ポリペプチドの一つおよびそれをコードする核酸分子の存在は、粘液または便／排泄物試料について測定する。かかる試料は、大腸癌関連ポリペプチドまたはそれらをコードする核酸を、例えば剥離細胞（shed cell）中に含み得る。対象の試料における、本明細書に記載の少なくとも２種の大腸癌関連ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸分子の存在、または新規な大腸癌関連ポリペプチドの一つおよびそれをコードする核酸分子の存在を、時間的間隔をもって逐次的に決定することにより経時的に測定すれば、病気および／または治療コースの効果を監視することが可能となる。
【００４６】
全ての態様において、大腸癌の治療は、これらに限定するものではないが、外科的治療、化学療法、放射線治療、および全身補助治療（adjuvant systemic therapy）を含む。好ましい態様においては、治療は、大腸癌関連抗原に特異的に結合する抗体の投与を含んでよい。随意的に、抗体は１種または２種以上の検出可能なマーカー、抗腫瘍剤、または免疫調節剤（immunomodulator）に結合していてもよい。抗腫瘍剤は、細胞毒性剤および腫瘍新生脈管（tumor neovasculature）に作用する剤を含んでよい。検出可能なマーカーは、例えば、放射性または蛍光マーカーを含む。細胞毒性剤は、細胞毒性放射性核種、化学的毒素およびタンパク毒素を含む。
【００４７】
細胞毒性放射性核種または放射線療法アイソトープは、アルファ線放射アイソトープ、例えば２２５Ａｃ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉであってよい。代替的に、細胞毒性放射性核種は、ベータ線放射アイソトープ、例えば１８６Ｒｈ、１８８Ｒｈ、９０Ｙ、１３１Ｉ、または６７Ｃｕであってよい。さらに、細胞毒性放射性核種は、オージェおよび低エネルギー電子、例えばアイソトープ１２５Ｉ、１２３Ｉ、または７７Ｂｒを放射してもよい。
好適な化学的毒素または化学療法剤は、エンジインファミリー分子の成員、例えば、カリケアミシンおよびエスペラミシンを含む。化学的毒素はまた、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シスプラチン、エトポシド、ブレオマイシンおよび５−フルオロウラシルからなる群から得ることができる。他の化学療法剤は、当業者によく知られている。
【００４８】
腫瘍新生脈管に作用する剤は、チューブリン結合剤、例えばコンブレスタチンＡ４（Griggsら、Lancet Oncol. 2:82, 2001）およびアンギオスタチンおよびエンドスタチン（Rosen、Oncologist 5:20, 2000によるレヴュー、本明細書に参照により組み込まれる）を含む。免疫調節剤もまた大腸癌関連抗体に複合してよい。
本発明はしたがって、ある観点により、大腸癌関連ポリペプチド、これらポリペプチドをコードする遺伝子、上記物質の機能的修飾および変種、上記物質の有用な断片、ならびにこれらに関連する診断剤、およびこれらの診断的使用を含む。ある態様においては、大腸癌関連ポリペプチド遺伝子は配列番号１〜１５に対応する。コードされたポリペプチド（例えば、タンパク質）、ペプチド、およびこれらの抗血清も診断に好ましく、配列番号１６〜３０に対応する。ある態様においては、コードされたポリペプチド（例えば、タンパク質）、ペプチド、およびこれらの抗血清は、配列番号１６〜３０に対応する以外のものである。
【００４９】
ＳＥＲＥＸにより大腸癌関連ポリペプチドとして同定されたアミノ酸配列の幾つか、およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、新しく大腸癌関連として同定されたものであり、幾つかはＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースに登録されている。新しく同定された配列（配列番号１、２、４および５）の癌の診断検査における使用は新規であり、少なくとも２種以上の配列のセットの、大腸癌の診断検査およびキットにおける使用も新規である。
本発明の大腸癌関連ポリペプチド核酸の相同体および対立遺伝子は、従来技術により同定可能である。したがって、本発明のある観点は、大腸癌関連抗原をコードするこれら核酸配列およびその抗原断片である。本明細書中で用いる大腸癌関連ポリペプチドの相同体は、同定された大腸癌関連ポリペプチドと構造的に高度に類似した、ヒトまたは他の動物のポリペプチドである。
【００５０】
ヒトおよび他の生物の大腸癌関連ポリペプチド相同体の同定について、当業者は精通している。一般に、核酸ハイブリダイゼーションは、既知の配列に対応する他の種（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ）の相同体配列を同定するのに好適な方法である。標準の核酸ハイブリダイゼーションの方法は、選択された百分率での同一性を有する関連核酸配列を同定するのに用いることができる。例えば、選択された組織（例えば、大腸）のｍＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡのライブラリーを作成し、本明細書中に同定された大腸癌関連ポリペプチドをコードする核酸を、関連するヌクレオチド配列について該ライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。スクリーニングは、配列の同一性によって関連が強い配列を同定するために、高ストリンジェンシーの条件を用いて実施するのが好ましい。このように同定された核酸は、ポリペプチドに翻訳でき、ポリペプチドはその活性を試験することができる。
【００５１】
本明細書中で用いる用語「高ストリンジェンシー」は、当該技術分野でよく知られたパラメータを意味する。核酸ハイブリダイゼーションパラメータは、このような方法を編集する参考文献、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Aussubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに見出せる。より具体的には、本明細書で用いる高ストリンジェンシーの条件は、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５  Ｘ  ＳＳＣ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）において６５℃でハイブリダイゼーションすることを指す。ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７であり、ＳＤＳはデドシル硫酸ナトリウムであり、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡが転移された膜は、例えば２Ｘ  ＳＳＣで室温にて、次に０．１〜０．５Ｘ  ＳＳＣ／０．１Ｘ  ＳＤＳで６８℃までの温度にて洗浄する。
【００５２】
他の条件および剤等を用いることもでき、同程度のストリンジェンシーを提供する。当業者はかかる条件に精通しており、したがってここには記述しない。しかし、当業者が、本発明の大腸癌関連ポリペプチド核酸の相同体および対立遺伝子を明確に同定するように条件を操作できる（例えば、より低ストリンジェンシーの条件を用いる）ことは理解されるだろう。当業者はまた、かかる分子の発現について、細胞またはライブラリーをスクリーニングする方法論に精通しており、したがって、それらは常法により単離され、関連の核酸分子の単離および配列決定に供される。
【００５３】
一般に、相同体および対立遺伝子は、典型的にはそれぞれ、大腸癌関連抗原、その抗原断片、その抗原前駆体の核酸およびポリペプチドの配列と少なくとも７５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９０％のアミノ酸同一性を共有し、ある場合には、少なくとも９０％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９５％のアミノ酸同一性を共有し、また他の場合には少なくとも９５％のヌクレオチド同一性および／または少なくとも９９％のアミノ酸同一性を共有する。相同性は、インターネットを介して得られる、ＮＣＢＩ（Bethesda, Maryland）により開発された種々の公的に利用可能なソフトウェアツールを用いて算出できる。ツールの例としては、米国国立保健研究所の国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトから利用可能なＢＬＡＳＴシステムを含む。Pairwise and ClustalWアラインメント（BLOSUM30マトリクス設定）ならびにKyte-Doolittleハイドロパシック分析は、Mac Vector配列分析ソフトウェア（Oxford Molecular Group）を用いて得られる。前記核酸のワトソン−クリック型の相補体も本発明に包含される。
【００５４】
大腸癌関連ポリペプチド遺伝子に関するスクリーニングにおいて、サザンブロットは、検出可能に標識されたプローブ（例えば、放射性または化学発光性プローブ）と共に前述の条件を用いて実施できる。ＤＮＡが最終的に移された膜を洗浄後、その膜を、放射性または化学発光性シグナルを検出するためにＸ線フィルムまたは蛍光イメージャ（phosphorimager）に接触するように設置する。大腸癌関連ポリペプチド核酸の発現に対するスクリーニングにおいて、前述の条件を用いるノーザンブロットハイブリダイゼーションは、大腸癌患者から採取した、または、結腸直腸組織の異常な細胞増殖または腫瘍により特徴付けられる症状を有する疑いのある対象から採取した試料に対して実施することができる。示された配列とハイブリダイズするプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応などの増幅プロトコルも、大腸癌関連ポリペプチド遺伝子またはその発現の検出に用いることができる。
【００５５】
関連する配列の同定もまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、および関連核酸配列をクローニングするのに好適な他の増幅技術を用いて達成することができる。好ましくは、ＰＣＲプライマーは、保存されていると考えられる核酸配列の部分（例えば、触媒ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン等）を増幅するように選択する。ここでもまた、核酸は組織特異的ライブラリー（例えば、大腸）から増幅するのが好ましい。本明細書に記載の抗血清を利用した発現クローニングを用いて、ＳＥＲＥＸ法で適切な発現ライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒトまたは他の種の関連する抗原タンパク質をコードする核酸を同定することもできる（Sahin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11810-11813, 1995参照）。
【００５６】
本発明はまた、天然材料中に存在するコドンの代替コドンを含む縮重核酸も含む。例えば、セリン残基は、コドンＴＣＡ、ＡＧＴ、ＴＣＣ、ＴＣＧ、ＴＣＴおよびＡＧＣによりコードされる。６つのコドンの各々は、セリン残基をコードする目的に関して等価である。したがって、ｉｎｖｉｔｒｏまたはｉｎｖｉｖｏで延長される大腸癌関連ポリペプチドにセリン残基を組み入れるようタンパク質合成装置に指示を与えるため、セリンをコードするヌクレオチドトリプレットのいずれかを用いることができることは、当業者には明らかである。同様に、他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列トリプレットとしては、これに限定するものではないが以下を含む：ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、およびＣＣＴ（プロリンコドン）；ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡ、およびＡＧＧ（アルギニンコドン）；ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、およびＡＣＴ（トレオニンコドン）；ＡＡＣおよびＡＡＴ（アスパラギンコドン）；およびＡＴＡ、ＡＴＣ、およびＡＴＴ（イソロイシンコドン）。他のアミノ酸残基も、多数のヌクレオチド配列により同様にコードされる。したがって、本発明は、遺伝暗号の縮重のため、生物学的に単離された核酸とはコドン配列の異なる縮重核酸を含む。
【００５７】
本発明はまた、１または２個以上のヌクレオチドの付加、置換、欠失を含む改変核酸分子を提供する。好ましい態様においては、これらの改変核酸分子および／またはそれらがコードするポリペプチドは、非改変核酸分子および／またはそれらがコードするポリペプチドの少なくとも一つの活性または機能、例えば抗原性、受容体結合性等を保持する。ある態様においては、改変核酸分子は、改変ポリペプチドをコードし、好ましくは本明細書中に別記されているような保存的アミノ酸置換を有するポリペプチドをコードする。改変核酸分子は非改変核酸分子と構造的に関連があり、好ましい態様においては、改変および非改変核酸分子が当業者に既知のストリンジェントな条件下でハイブリダイズするのに十分なほど、改変核酸分子は非改変核酸分子と構造的に関連がある。
【００５８】
例えば、単一のアミノ酸の変化を有するポリペプチドをコードする改変核酸分子を調製することができる。これらの核酸分子は各々、本明細書中に記載の遺伝暗号の縮重に対応するヌクレオチド変化を除いた、１、２または３個以上のヌクレオチド置換を有し得る。同様に、２個のアミノ酸の変化を有するポリペプチドをコードする改変核酸分子を調製することができるが、これらは例えば、２〜６個のヌクレオチドの変化を有する。例えばアミノ酸２および３、２および４、２および５、２および６等をコードするコドンのヌクレオチド置換を含めたこれらと同様の多数の改変核酸分子が、当業者により容易に想像される。上記の例では、２つのアミノ酸の各組合せは、改変核酸分子のセットに、ならびにアミノ酸置換をコードするすべてのヌクレオチド置換に含まれる。当業者に容易に想像されるように、さらなる置換（即ち、３または４以上）、付加または欠失（例えば、停止コドンまたはスプライス部位（単数または複数）の導入による）を有するポリペプチドをコードするさらなる核酸分子も調製することができ、本発明に包含される。上記の核酸またはポリペプチドはいずれも、本明細書中に開示される核酸および／またはポリペプチドに対する構造的関連または活性の保持に関して、通常の実験により試験することができる。
【００５９】
本発明はまた、大腸癌関連タンパク質の抗原断片をコードする核酸分子を提供する。
断片は、このような核酸を同定するためにサザンおよびノーザンブロット検定におけるプローブとして用いることができ、またＰＣＲを用いる検定などの増幅検定に用いることができる。当業者には既知のように、大型プローブ、例えば２００、２５０、３００またはそれより多いヌクレオチドが、例えばサザンおよびノーザンブロットなどのある種の用途には好ましいが、一方、より小型の断片は、ＰＣＲなどの用途のために好ましい。断片は、抗体の生成もしくはポリペプチド断片の結合の決定用に、または免疫検定構成成分の生成用に、融合タンパク質を産生するためにも用いることができる。同様に、断片は、例えば抗体の調製に、および免疫検定法に有用な大腸癌関連ポリペプチドの非融合断片を産生するために用いることができる。好ましい断片は抗原断片であり、それらは、大腸癌関連ポリペプチドに特異的に結合する剤により認識される。本明細書中で用いられる大腸癌関連抗体とは、大腸癌関連ポリペプチドに特異的に結合する抗体である。
【００６０】
本発明はまた、大腸癌関連ポリペプチド遺伝子をノックアウトもしくはノックインした細胞または動物の作製を可能とし、大腸癌関連ポリペプチドの発現を調節することによって、大腸癌のある側面および大腸癌に対する免疫系の反応の研究に材料を提供する。例えば、ノックインマウスを作製し、モデルと、大腸癌に罹患し大腸癌関連ポリペプチドの発現が上方調節されたマウスとの間の臨床的類似点（clinical parallels）を検討することができ、これは、ポリペプチドに対する免疫反応を作動させるのに有用でありえる。かかる細胞もしくは動物モデルはまた、大腸癌の治療戦略の評価に有用である。
本発明に基づき大腸癌の動物モデルの代替タイプが開発可能である。動物において大腸癌関連ポリペプチドに対する免疫反応をシミュレーションすることにより、治療を試験し、大腸癌の病因論を評価するためのモデルを提供することができる。
【００６１】
本発明は、上記の大腸癌関連核酸によりコードされる単離ポリペプチド（全タンパク質および部分タンパク質を含む）も提供する。このようなポリペプチドは、例えば単独で、または抗体を生成するための融合タンパク質として、免疫検定または診断検定の構成成分として有用である。大腸癌関連ポリペプチドは、組織または細胞ホモジネートを包含する生物学的試料から単離することができ、また、発現系に適した発現ベクターを構築し、発現系に発現ベクターを導入し、かつ組換え的に発現したタンパク質を単離することにより、種々の原核生物および真核生物発現系中で組換え的に発現させることができる。抗原性ペプチドを包含する大腸癌関連抗原断片などの短いポリペプチドも、十分に確立されたペプチド合成方法を用いて化学的に合成することができる。
【００６２】
ポリペプチドの断片は、好ましくはポリペプチドの明確な機能を保持する断片である。ポリペプチドの断片中に保持することができる機能は、抗体（例えば、抗原性断片）との相互作用、他のポリペプチドまたはその断片との相互作用、核酸またはタンパク質の選択的結合、および酵素活性を含む。重要な活性の一つは、対象において免疫反応を誘発する能力である。当業者に認識されるように、断片のサイズは、抗体により認識されるエピトープが線形エピトープであるか、立体構造エピトープであるか、といったような要因に依存する。したがって、大腸癌関連ポリペプチド抗原性断片のいくつかはより長いセグメントからなり、他はより短いセグメント（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１または１２個以上のアミノ酸長で、大腸癌関連ポリペプチドの全長までの各整数を含む）からなる。
【００６３】
当業者は、保存的アミノ酸置換を大腸癌関連ポリペプチドにおいて行い、機能的に同等な変異体、または前記ポリペプチドの相同体、すなわち、大腸癌関連抗原ポリペプチドの機能を保持した変異体を提供できることを認識する。本明細書中で用いる用語「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされるタンパク質の相対的電荷またはサイズの特徴を変更しないアミノ酸置換を意味する。変異体は、当業者に既知のポリペプチド配列を変更する方法により調製することができ、例えば、かかる方法をまとめた参考文献、例えばMolecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989またはCurrent Protocols in Molecular Biology,  F. M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに見出すことができる。大腸癌関連ポリペプチドと機能的に同等な変異体または相同体の例としては、本明細書中に開示したタンパク質のアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換を含む。アミノ酸の保存的置換としては、以下の群内のアミノ酸間でなされる置換が挙げられる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００６４】
例えば、あるペプチドが大腸癌関連ポリペプチドであると決定する際に、該ペプチドのアミノ酸配列に保存的アミノ酸置換を行うことができ、ポリペプチドにその特異的抗原結合特性を保持させることができる。
【００６５】
大腸癌関連ポリペプチドの機能的に同等な変異体を産生するための大腸癌関連ポリペプチドのアミノ酸配列中の保存的アミノ酸置換は、典型的には、大腸癌関連ポリペプチドをコードする核酸の変更によりなされる。このような置換は、当業者に既知の種々の方法により実施することができる。例えば、アミノ酸置換は、ＰＣＲによる突然変異、Kunkel（Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985）の方法による部位特異的突然変異誘発により、あるいは大腸癌関連ポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成により実施することができる。アミノ酸置換が、自系または同種異系血清あるいは細胞溶解性Ｔリンパ球により認識される抗原性エピトープのような大腸癌関連ポリペプチドの小さなユニーク断片に対してなされる場合、置換は、ペプチドを直接合成することにより実施することができる。大腸癌関連ポリペプチドの機能的等価断片の活性は、改変された大腸癌関連ポリペプチドをコードする遺伝子を細菌または哺乳類の発現ベクターにクローニングし、該ベクターを適切な宿主細胞に導入し、改変されたポリペプチドを発現させ、そして本明細書中に開示したような大腸癌関連ポリペプチドの機能に関して試験することにより、試験することができる。化学的に合成されたペプチドは、機能に関して、例えば関連抗原を認識する抗血清との結合に関して直接試験することができる。
【００６６】
本発明は、本明細書中に記載されているように多数の用途を有し、そのいくつかは本明細書中の他の箇所に記載されている。第一に、本発明は、大腸癌関連タンパク質分子の単離を可能にする。当業者に周知の種々の方法が、単離された大腸癌関連ポリペプチド分子を得るために利用できる。ポリペプチドは、クロマトグラフィー的手段または免疫学的認識により、ポリペプチドを天然に産生する細胞から精製することができる。あるいは、発現ベクターを細胞中に導入して、ポリペプチドの産生を行うことができる。別の方法では、ｍＲＮＡ転写物を微量注射するか、または他の方法で細胞中に導入し、コードされたポリペプチドを産生することができる。無細胞抽出物、例えば網状赤血球溶解物系におけるｍＲＮＡの翻訳も、ポリペプチドの産生に用いることできる。当業者は、大腸癌関連ポリペプチドを単離するための既知の方法にも容易に従い得る。これらには、免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよび免疫アフィニティークロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
大腸癌関連ポリペプチドの単離および同定はまた、大腸癌関連ポリペプチドの発現により特徴づけられる疾患、好ましくは大腸癌関連ポリペプチドに対する免疫反応により特徴付けられる疾患を、当業者が診断することを可能にする。
これら大腸癌関連ポリペプチド免疫反応に関する方法は、１種または２種以上の大腸癌関連ポリペプチドに対する免疫反応（抗体または細胞の）を決定することを含む。このような免疫反応は、当業者に知られた種々の任意の免疫検定法により検定することができる。例えば、抗原性の大腸癌関連ポリペプチドは、ＥＬＩＳＡ検定において患者から採取した血液試料から抗体を捕捉するためのターゲットとして用いることができる。
【００６８】
大腸癌関連ポリペプチドの発現に関連する方法は、１種または２種以上の、大腸癌関連核酸、および／またはそれらがコードする大腸癌関連ポリペプチド、および／またはそれらから派生するペプチドの発現を決定し、大腸癌を有さない対象における発現と比較することを含む。かかる決定は任意の標準の核酸決定検定法によって実施可能であり、ポリメラーゼ連鎖反応または標識ハイブリダイゼーションプローブによる検定を含む。かかるハイブリダイゼーション法は、マイクロアレイ技術を含むが、これには限定されない。
本発明はまた、本明細書中に開示された大腸癌関連抗原と特異的に結合するタンパク質の単離を可能とし、これには大腸癌関連ポリペプチドの抗体および細胞性の結合相手を含む。さらなる用途が本明細書中に記載される。
【００６９】
本発明は、大腸癌関連ポリペプチドと結合するポリペプチドなどの剤も含む。このような結合剤は、例えば、大腸癌関連ポリペプチドおよび大腸癌関連ポリペプチドとそれらの結合相手との複合体の存在の有無を検出するためのスクリーニング検定に、また、大腸癌関連ポリペプチドおよび大腸癌関連ポリペプチドとそれらの結合相手との複合体を単離するための精製プロトコルに用いることできる。かかる剤は、例えば大腸癌関連ポリペプチドと結合することにより、該ポリペプチドの天然の活性を抑制するために用いることもできる。
本発明はしたがって、ペプチド結合剤、例えば、大腸癌関連ポリペプチドと選択的に結合する機能を有する抗体またはその断片等、を包含する。抗体は、従来の方法論により調製されたポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む。
【００７０】
重要なことは、当分野で周知のように、抗体分子の小部分のみ、即ちパラトープが、抗体のそのエピトープとの結合に関与する（概して、Clark, W.R.（1986）The Experimental Foundations of Modern Immunology Wiley & Sons, Inc., New YorkおよびRoitt, I.（1991）Essential Immunology 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford参照）。例えばｐＦｃ’およびＦｃ領域は補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合には関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断された、またはｐＦｃ’領域を伴わずに産生された、Ｆ（ａｂ’）２断片と呼ばれる抗体は、無傷抗体の両方の抗原結合部位を保持している。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断された、またはＦｃ領域を伴わずに産生された、Ｆａｂ断片と呼ばれる抗体は、無傷抗体分子の抗原結合部位の一つを保持している。さらに続けると、Ｆａｂ断片は、共有結合された抗体軽鎖、およびＦｄと示される抗体重鎖の一部分からなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主要決定因子であり（単一Ｆｄ断片は、抗体特異性の変化を伴わずに最大１０個までの異なる軽鎖と結び付くことができる）、Ｆｄ断片は単離した状態でエピトープ結合能力を保持する。
【００７１】
当分野で周知であるように、抗体の抗原結合部分内には、相補性決定領域（ＣＤＲ）が存在し、これが抗原のエピトープ、およびパラトープの三次構造を保持する枠組み構造領域（ＦＲ）と直接相互作用する（概して、Clark, 1986; Roitt, 1991参照）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄ断片および軽鎖の両方において、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）により別々に分けられる４つの枠組み構造領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲｓ、特にＣＤＲ３領域、より詳細には重鎖ＣＤＲ３は、抗体特異性に大いに寄与する。
【００７２】
哺乳類抗体の非ＣＤＲ領域が、元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、同種抗体または異種抗体の同様領域と置換することができることは、当分野で目下十分に確立されている。これは、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域と共有結合されて機能性抗体を形成する「ヒト化」抗体の開発および使用において最も明白に示される。例えば、米国特許第4,816,567号、第5,225,539号、第5,585,089号、第5,693,762号および第5,859,205号参照のこと。
完全ヒトモノクローナル抗体はまた、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分について遺伝子導入したマウスを免疫することにより、調製できる。これらのマウスを免疫した後（例えば、XenoMouse（Abgenix）、HuMAbマウス（Medarex/GenPharm））、標準ハイブリドーマ技術にしたがってモノクローナル抗体を調製できる。これらモノクローナル抗体はヒト免疫グロブリンアミノ酸配列を有し、したがってヒトに投与された場合、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を誘発しない。
【００７３】
したがって、当業者に明らかなように、本発明はまた以下を提供する：Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄ断片；Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられたキメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同性ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられたキメラＦ（ａｂ’）２断片抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が、相同性ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられたキメラＦａｂ断片抗体；ならびにＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が、相同性ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられたキメラＦｄ断片抗体。本発明は、いわゆる単鎖抗体も含む。
【００７４】
したがって、本発明は、大腸癌関連ポリペプチド、ならびに大腸癌関連ポリペプチドおよびそれらの結合相手との複合体と特異的に結合する多数のサイズおよび種類のポリペプチドを含む。これらのポリペプチドは、抗体技術以外の供給源からも得られる。例えば、このようなポリペプチド結合剤は、溶液中において、固定化形態、またはファージディスプレイライブラリーとして容易に調製することが可能な、縮重ペプチドライブラリーにより提供することができる。１種または２種以上のアミノ酸を含有するペプチドのコンビナトリアルライブラリーも合成することができる。ペプトイドおよび非ペプチド合成部分のライブラリーをさらに合成することができる。
【００７５】
ファージディスプレイは、本発明の有用な結合ペプチドを同定するのに特に有効であり得る。簡潔に言えば、従来の手法を用いて、４個から約８０個のアミノ酸残基のインサートを表示するファージライブラリー（例えば、ｍ１３、ｆｄまたはラムダファージを用いる）を調製する。インサートは、例えば完全に縮重したまたはバイアス化されたアレイを表し得る。次に、大腸癌関連ポリペプチドと結合するファージ保有インサートを選択することができる。この過程は、大腸癌関連ポリペプチドと結合するファージを再選択する幾つかのサイクルにより反復することができる。サイクルの反復は、特定配列を保有するファージの富化をもたらす。ＤＮＡ配列分析を実行して、発現されたポリペプチドの配列を同定することができる。大腸癌関連ポリペプチドと結合する配列の最小線状部分を決定することができる。最小線状部分の一部または全部を含有するインサート＋それらの上流または下流の１または２個以上の付加的縮重残基を含有するバイアス化ライブラリーを用いて、当該手法を反復し得る。大腸癌関連ポリペプチドと結合するポリペプチドを同定するために、酵母２ハイブリッドスクリーニング法も用いることできる。
【００７６】
したがって、本発明の大腸癌関連ポリペプチドまたはその断片を用いて、ファージディスプレイライブラリーを含めたペプチドライブラリーをスクリーニングして、本発明の大腸癌関連ポリペプチドのペプチド結合相手を同定し、選定することができる。このような分子は、上記のように、スクリーニング検定に、精製プロトコルに、大腸癌関連ポリペプチドの機能の直接的干渉に、ならびに当業者には明らかであろうその他の目的に用いることができる。
例えば単離された大腸癌関連ポリペプチドは、基材（例えば、ポリスチレンビーズなどのクロマトグラフィー媒体またはフィルター）に結合され、次に結合相手を含有する可能性のある溶液を基材に加えることができる。大腸癌関連ポリペプチドと相互作用し得る結合相手が前記溶液中に存在する場合には、それは基材に結合した大腸癌関連ポリペプチドと結合する。次に結合相手を単離することができる。
【００７７】
本明細書中に詳述されているように、上記の抗体およびその他の結合分子は、例えばタンパク質を発現する組織を同定し、またはタンパク質を精製するために用いることができる。抗体はさらに標準カップリング手法により、大腸癌関連ポリペプチドを発現する細胞および組織の画像化のための特異的診断用標識剤と、あるいは治療的に有用な剤と結合することができる。診断剤としては以下を含むが、これには限定されない：硫酸バリウム、ヨーセタム酸、ヨーパン酸、イポデートカルシウム、ジアトリゾアートナトリウム、ジアトリゾアートメグルミン、メトリザミド、チロパノエートナトリウム、および放射線診断剤、例えばフッ素−１８および炭素−１１などの陽電子放出体、ヨウ素−１２３、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１３１およびインジウム−１１１などのガンマ放出体、ならびにフッ素およびガドリニウムなどの核磁気共鳴のための核種。
【００７８】
本発明はまた、対象における大腸癌の発症、進行、または退縮を監視する方法を含み、該方法は例えば、対象から継続的に試料を得ること、該試料を、症状のマーカーである抗原性応答の有無について検定することによる。対象は、大腸癌に罹患している疑いのあるものであってもよく、または、大腸癌に罹患していないと考えられるものでもよい。後者の場合は、試料は後の試料と比較するための正常ベースラインレベルとして用いることができる。
病状の発症とは、対象において病状に関連する変化が生じることである。かかる変化は、生理学的症状により証拠付けられるものであってもよいし、臨床的には無症候性であってもよい。例えば、大腸癌の発症の後には、臨床的症状は明確ではないが大腸癌に関連する生理学的変化が生じている時期がある。発症の後に病状の進行があり、それは病状の生理学的要素の進行であるが、臨床的症状の増加によって特徴付けられることもそうでないこともある。一方、病状の退縮は、病状の生理学的特徴の減少であり、おそらく平行して症状の軽快が生じ、またそれは治療の結果によることもあり、あるいは自然に生じた病状の逆行によることもある。
【００７９】
大腸癌のマーカーは、大腸癌関連ポリペプチドと抗体との特異的な結合であってよい。大腸癌の病状の発症は、以前はそのようなマーカーが存在しなかった対象の試料中にかかる１種または２種以上のマーカーが出現することにより示されてよい。例えば、対象の第一の試料からは１種または２種以上の大腸癌マーカーの存在が決定されず、該対象の第二の試料またはその後の試料からは１種または２種以上の大腸癌マーカーの存在が決定された場合は、癌の発症を指し示し得る。
【００８０】
大腸癌の状態の進行または退縮はそれぞれ、一般に対象の試料中の１種または２種以上のマーカーの経時的な増加または減少により示される。例えば、対象の第一の試料から１種または２種以上の大腸癌マーカーの存在が決定され、該対象の第二の試料またはその後の試料からは１種または２種以上の他の大腸癌マーカーの存在またはより多量の最初に検出された１種または２種以上の大腸癌マーカーの存在が決定された場合は、癌の進行を指し示し得る。癌の退縮は、対象の試料中に存在が決定された１種または２種以上の大腸癌マーカーが、該対象の第二の試料では検出されないか、またはより低い量での存在が決定されることにより示され得る。
【００８１】
大腸癌の状態の進行または退縮はまた、対象において決定された大腸癌関連ポリペプチドの特徴に基づき示すこともできる。例えば、ある種の大腸癌関連ポリペプチドは、大腸癌の特定の病期において異常に発現されることがある（例えば、初期大腸癌関連ポリペプチド、中期大腸癌関連ポリペプチド、および後期大腸癌関連ポリペプチド）。他の例では、限定を意図するものではないが、大腸癌関連ポリペプチドは原発腫瘍と転移の間では異なって発現することがあり、それにより、対象の試料中の選択された大腸癌関連ポリペプチドの同定に基づいて病気の病期および／または診断レベルを決定することが可能となる。
【００８２】
大腸癌の病期決定の他の方法は、対象において異常に発現していることもそうでないこともある大腸癌関連ポリペプチドに対する、対象の免疫反応の違いに基づいてもよい。前記ポリペプチドに対する免疫反応の違いは、対象において大腸癌の病期を示すのに使用することができ、例えば、ある大腸癌関連ポリペプチドは、他の大腸癌関連ポリペプチドとは異なる大腸癌の病期において免疫反応を誘発する可能性がある。
異なるタイプの大腸癌、例えば、家族性大腸腺腫症（ＦＡＰ）またはリンチ症候群としても知られている遺伝性非腺腫性大腸癌（ＨＮＰＣＣ）は、異なる大腸癌関連ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸分子を発現し、あるいは異なる空間的時間的発現パターンを有する可能性がある。かかる変化は、癌特異的診断および、患者の特定の病状に合わせたその後の治療を可能とするであろう。これらの大腸癌特異的診断はまた、異なる大腸癌関連ポリペプチドに対する免疫反応の変化に基づくことができる。
【００８３】
本発明は、大腸癌関連ポリペプチドおよび／または大腸癌関連ポリペプチドに特異的に結合する抗体の存在を検定するためのキットを含む。かかるキットの一例は、基材、例えばディップスティックに結合した上記のポリペプチドを含み、このディップスティックは、対象の血液または体液試料中に浸されるものである。次に基材の表面が当業者に周知の手順を用いて処理され、ポリペプチドと対象の試料中の剤（例えば、抗体）との間に特異的な結合が生じているかどうかを評価する。例えば、この手順には、二次抗体との接触、または特異的な結合を示す他の方法を含んでもよいが、これらには限定されない。
【００８４】
キットの他の例は、大腸癌関連ポリペプチドに特異的に結合する、抗体またはその抗原結合断片を含んでよい。抗体またはその抗原結合断片は、大腸癌患者からの組織試料に適用し、次に試料を処理して、抗体とポリペプチドまたは試料中の他の成分との間に特異的な結合が生じているかどうかを評価する。さらに、抗体またはその抗原結合断片は、大腸癌に罹患している疑いがある、大腸癌と診断された、または大腸癌ではないと考えられる対象の便試料に適用することができる。当業者が理解するように、かかる結合検定は、溶液中の抗体および／または大腸癌関連ポリペプチドと接触させた試料または物体に対して実施することもでき、例えば、９６穴プレート中、または物体表面に直接適用してもよい。
【００８５】
前述のキットは、該キットの種々の成分を診断目的にどのように使用するかについての指示または他の印刷物を含むことができる。
本発明はさらに、大腸癌関連ペプチドまたはかかるポリペプチドをコードする核酸を含む核酸またはタンパク質マイクロアレイを含む。本発明のこの観点により、大腸癌関連ポリペプチドの発現を評価するため、および／またはかかるポリペプチドと結合する生物学的成分を同定するために、標準のマイクロアレイ技術が用いられる。生物学的試料の成分は、抗体、リンパ球（特にＴリンパ球）等を含む。タンパク質マイクロアレイ技術はタンパク質チップ技術および固相タンパク質アレイ技術など他の名称でも知られており、当業者によく知られている。この技術は、固定された基材上の同定されているペプチドまたはタンパク質のアレイを得ること、標的分子または生物学的成分を前記ペプチドに結合すること、およびかかる結合を評価することに基づくが、これに限定されるものではない。例えば、G. MacBeathおよびS. L Shreiberの"Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination," Science 289 (5485): 1760-1763, 2000を参照のこと。核酸アレイ、特に大腸癌関連ペプチドに結合する核酸アレイもまた、大腸癌関連ポリペプチドの発現により特徴付けられる病状を有する対象の同定などの、診断的応用に用いることができる。
【００８６】
マイクロアレイ基材は、ガラス、シリカ、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、アルミナおよび酸化ニッケルなどの金属酸化物、種々の粘土、ニトロセルロース、またはナイロンなどを含むが、これには限定されない。マイクロアレイ基材は化合物で被覆して、基材上のプローブ（ペプチドまたは核酸）の合成を強化してもよい。基材上のカップリング剤または基は、最初のペプチドまたはアミノ酸を基材に共有結合するために用いることができる。種々のカップリング剤または基が当業者に知られている。したがって、ペプチドまたは核酸プローブは、基材上の予め決められたグリッド上に直接合成可能である。代替的に、ペプチドまたは核酸プローブを基材上にスポットすることも可能であり、このような場合、該基材は、プローブの基材への結合を強化するための化合物で被覆してもよい。これらの態様においては、予め合成されたプローブは、予め決められた体積およびグリッドパターンで正確に適用し、より好ましくは、コンピューター制御ロボットを用いて、接触印刷によるか、またはインクジェットもしくは圧電送達などの非接触法を用いてプローブを基材に適用する。プローブは、基材に共有結合で結合することもできる。
【００８７】
標的はペプチドまたはタンパク質であり、天然または合成のものであってよい。組織は対象から得てもよいし、培養してもよい（例えば、細胞株から）。
本発明のある態様においては、１種または２種以上の対照ペプチドまたはタンパク質分子を基材に付着させてもよい。好ましくは、対照ペプチドまたはタンパク質分子は、ペプチドまたはタンパク質の品質および結合特性、試薬の品質および有効性、ハイブリダイゼーションの成功、および解析の閾値および成功などの因子の決定を可能にする。
【００８８】
核酸マイクロアレイ技術はＤＮＡチップ技術、遺伝子チップ技術、および固相核酸アレイ技術など他の名称でも知られており、当業者によく知られている。この技術は、固定された基材上に同定されている核酸プローブのアレイを得ること、標的分子をリポーター分子で標識すること（例えば、放射性、化学発光性、またはフルオレセイン、Ｃｙｅ３−ｄＵＴＰまたはＣｙｅ５−ｄＵＴＰなどの蛍光タグ）、標的核酸をプローブにハイブリダイズすること、および標的−プローブのハイブリダイゼーションを評価することに基づくが、これに限定されるものではない。標的配列に完全に一致する核酸配列を有するプローブは、一般に、一致がより不完全な核酸配列によるよりも、リポーター分子のより強いシグナルの検出をもたらす。核酸マイクロアレイ技術において用いられる多くの成分および技術は、文献The Chipping Forecast, Nature Genetics, Vol. 21, Jan 1999に記載されており、その内容全体は、本明細書中に参照により組み込まれる。
【００８９】
本発明の記載により、核酸マイクロアレイ基材は、ガラス、シリカ、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、アルミナおよび酸化ニッケルなどの金属酸化物、種々の粘土、ニトロセルロース、またはナイロンなどを含むが、これには限定されない。全ての態様において、ガラス基材が好ましい。本発明の記載により、プローブは、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびオリゴヌクレオチドを含む核酸の群から選択されるがこれには限定されず、天然でも合成でもよい。オリゴヌクレオチドプローブは好ましくは、２０〜２５マーのオリゴヌクレオチドであり、ＤＮＡ／ｃＤＮＡプローブは好ましくは、５００〜５０００塩基長であるが、他の長さを用いてもよい。適切なプローブの長さは、当業者により当分野に既知の手順に従って決定することができる。ある態様においては、好ましいプローブは、２種より多い本明細書記載の大腸癌関連ポリペプチド核酸分子のセットか、または、本明細書に記載の新規な大腸癌関連ポリペプチド核酸分子の一つである。プローブは混入物質を取り除くために、ゲルろ過または沈殿（precipitation）などの当業者に既知の標準方法を用いて精製してもよい。
【００９０】
ある態様においては、マイクロアレイ基材は、プローブの基材への合成を強化するために化合物で被覆してもよい。かかる化合物は、オリゴエチレングリコールを含むが、これには限定されない。他の態様においては、基材上のカップリング剤または基を、最初のヌクレトチドまたはオリゴヌクレオチドを基材に共有結合するために用いることができる。これらの剤または基は、例えばアミノ、ヒドロキシ、ブロモ、およびカルボキシ基を含んでよい。これらの反応基は、アルキレンまたはフェニレン二価ラジカルなどのヒドロカルビル（hydrocarbyl）ラジカルを介して基材に結合し、一つの結合価位置（one valence position）は鎖結合で、残りは反応基に結合しているのが好ましい。これらのヒドロカルビル基は、最大約１０個までの炭素原子を含んでよく、最大約６個までの炭素原子が好ましい。アルキレンラジカルは、通常は、主鎖に２〜４個の炭素原子を含んでいるのが好ましい。これらおよびプロセスのさらなる詳細は、例えば、米国特許4,458,066号に開示されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
ある態様においては、プローブは、光誘導化学合成（light-directed chemical sysnthesis）、光化学脱保護（photochemical deprotection）、または基材上へのヌクレオチド前駆体の送達および引き続いてのプローブ生成などの方法を用いて、基材上に予め決められたグリッドパターンで直接合成される。
他の態様においては、基材は、プローブの基材への結合を強化するために化合物により被覆してもよい。かかる化合物は、ポリリジン、アミノシラン、アミノ反応性シラン（Chipping Forecast, 1999）またはクロムを含むが、これには限定されない。この態様においては、予め合成されたプローブは、予め決められた体積およびグリッドパターンで正確に、コンピューター制御ロボットを用いて、接触印刷によるか、またはインクジェットもしくは圧電送達などの非接触法を用いて基材に適用する。プローブは、限定はしないが、ＵＶ照射を含む方法を用いて共有結合で基材に結合してもよい。他の態様においては、プローブは基材に熱を用いて結合される。
【００９２】
マイクロアレイの標的は、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡを含む群から選択された核酸であるがこれには限定されず、天然でも合成でもよい。全ての態様において、ヒト組織からの核酸標的分子が好ましい。組織は、対象から得てもよく、または培養によってもよい（例えば、細胞株から）。
本発明の態様においては、１種または２種以上の対照核酸分子を基材に結合する。対照核酸分子は、核酸の品質および結合特性、試薬の品質および有効性、ハイブリダイゼーションの成功、および分析の閾値および成功などの因子を決定できるのが好ましい。対照核酸は、ハウスキーピング遺伝子またはその断片などの遺伝子の発現産物を含んでよいが、これには限定しない。
本発明のある態様においては、１種または２種以上の対照核酸分子を基材に結合する。対照核酸分子は、結合特性、試薬の品質および有効性、ハイブリダイゼーションの成功、および分析の閾値および成功などの因子を決定できるのが好ましい。
【００９３】
例
例１
方法
大腸癌患者の血清試料を、スポット検定と称されるプラーク検定の変法を用いてスクリーニングした。この方法においては、８０ｘ１２０ｍｍのニトロセルロース膜を、ＮＺＹ／０．７％アガロース／２．５ｍＭのＩＰＴＧからなるフィルムで事前に被覆し、８６ｘ１２８ｍｍのオムニトレイ（Nalge Nunc International Corp., Naperville, IL）のＮＺＹ／０．７％アガロースからなるリザーバ層（reservoir layer）上に置いた。個別に血清学的に定義された大腸癌抗原をコードする約１．０ｘ１０５ｐｆｕのモノクローナルファージ２０μｌを、指数関数的に増殖している２０μｌの大腸菌ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲＦと混合し、予め被覆されたニトロセルロース膜上にスポットした（０．７μｌのアリコット）。これらの膜を３７℃で１５時間インキュベートした。血清学的に異なって定義された合計７５の大腸癌抗原をデュプリケートで、各ニトロセルロース膜にスポットした。次に、Scanlan et al., Int. J. Cancer 76: 652-658 (1998)およびScanlan et al., Int. J. Cancer 83: 456-64 (1999)の記載に従って、膜からアガロースフィルムを取り除き、活性を検査するためフィルターを個々の血清試料により処理した（１：２００希釈）。
【００９４】
結果
得られた結果（表１参照）は、３７／７５（４９％）の血清は少なくとも一つの抗原と反応し、１７／７５（２３％）の血清は２種以上の抗原と反応し、６／７５（８％）の血清は３種以上の抗原と反応し、２／７５（３％）の血清は４種以上の抗原と反応した。表２に個々の抗原の反応性を示す。
【００９５】
表１  大腸癌血清学
大腸癌患者から得た７５の血清試料の、１５の抗原に対する反応度；いずれも正常血清とは反応しない（０／７５、本文記載のようにスポットブロットにより検定）。
【表１】
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【００９６】
【表２】
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【００９７】
【表３】
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【００９８】
表２  個々の抗原の反応性（適用可能な場合は自己由来のものを含む）
【表４】
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【００９９】
表３  配列同定番号
【表５】
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【０１００】
本発明の他の観点は、当業者には明確であり、本明細書に繰り返す必要はない。本明細書中に引用した参考文献の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
用いた用語および表現は、記述のための用語として用いたものであり、限定を意図したものではない。かかる用語および表現は、表示または記載の特性の同等物あるいはその一部を排除することを意図しておらず、本発明の範囲において種々の改変が可能であることが理解される。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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