(57)【要約】本発明は、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドを含んで成る医薬製剤に関する。本発明はまた、医薬使用のための薬剤の製造、及び対象における出血症状の発現の予防又は処理方法のためへの第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物を含んで成る医薬組成物。
【請求項２】
前記第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドである請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子アミノ酸配列変異体である請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの活性と前記生来のヒト第ＶＩＩａ因子（野生型第ＶＩＩａ因子）の活性との間の割合が、本発明の記載に記載されるような“インビトロ加水分解アッセイ”において試験される場合、少なくとも約１．２５である請求項２又は３記載の組成物。
【請求項５】
前記第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子ポリペプチドである請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記第ＶＩＩ因子が、ヒト第ＶＩＩ因子である請求項５記載の組成物。
【請求項７】
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、組換えヒト第ＶＩＩ因子である請求項６記載の組成物。
【請求項８】
前記第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、その活性化された形で存在する請求項１〜７のいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、組換えヒト第ＶＩＩａ因子である請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
前記第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドが、第ＩＸ因子関連ポリペプチドである請求項１〜９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
前記第ＩＸ因子関連ポリペプチドが、第ＩＸ因子アミノ酸配列変異体である請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
前記第ＩＸ因子関連ポリペプチドの活性と前記生来のヒト第ＩＸ因子（野生型第ＩＸ因子）の活性との間の割合が、本発明の記載に記載されるような“色原体アッセイ”において試験される場合、少なくとも約１．２５である請求項１０又は１１記載の組成物。
【請求項１３】
前記第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドが、第ＩＸ因子ポリペプチドである請求項１〜９のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１４】
前記第ＩＸ因子が、ヒト第ＩＸ因子である請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記第ＩＸ因子ポリペプチドが、組換えヒト第ＩＸ因子である請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
前記第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、及び前記第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子：第ＩＸ因子に関して、約１００：１〜約１：１００の質量比で存在する請求項１〜１５のいずれか１項記載の組成物。
【請求項１７】
出血性症状についての処理を含む部分のキットであって、
ａ）第１単位用量形での有効量の第ＶＩＩ因子又はＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び医薬的に許容できるキャリヤー；
ｂ）第２単位用量形での有効量の第ＩＸ因子又はＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物、及び医薬的に許容できるキャリヤー；及び
ｃ）前記第１及び第２用量形を含むための容器手段を含んで成るキット。
【請求項１８】
前記第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドである請求項１７記載のキット。
【請求項１９】
前記第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子アミノ酸配列変異体である請求項１８記載のキット。
【請求項２０】
前記第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの活性と前記生来のヒト第ＶＩＩａ因子（野生型第ＶＩＩａ因子）の活性との間の割合が、本発明の記載に記載されるような“インビトロ加水分解アッセイ”において試験される場合、少なくとも約１．２５である請求項１８又は１９記載のキット。
【請求項２１】
前記第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子ポリペプチドである請求項１７記載のキット。
【請求項２２】
前記第ＶＩＩ因子が、ヒト第ＶＩＩ因子である請求項２１記載のキット。
【請求項２３】
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、組換えヒト第ＶＩＩ因子である請求項２２記載のキット。
【請求項２４】
前記第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドが、その活性化された形で存在する請求項１７〜２３のいずれか１項記載のキット。
【請求項２５】
前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、組換えヒト第ＶＩＩａ因子である請求項２４記載のキット。
【請求項２６】
前記第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドが、第ＩＸ因子関連ポリペプチドである請求項１７〜２５のいずれか１項記載のキット。
【請求項２７】
前記第ＩＸ因子関連ポリペプチドが、第ＩＸ因子アミノ酸配列変異体である請求項２６記載のキット。
【請求項２８】
前記第ＩＸ因子関連ポリペプチドの活性と前記生来のヒト第ＩＸ因子（野生型第ＩＸ因子）の活性との間の割合が、本発明の記載に記載されるような“色原体アッセイ”において試験される場合、少なくとも約１．２５である請求項２６又は２７記載のキット。
【請求項２９】
前記第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドが、第ＩＸ因子ポリペプチドである請求項１７〜２５のいずれか１項記載のキット。
【請求項３０】
前記第ＩＸ因子が、ヒト第ＩＸ因子である請求項２９記載のキット。
【請求項３１】
前記第ＩＸ因子ポリペプチドが、組換えヒト第ＩＸ因子である請求項３０記載のキット。
【請求項３２】
前記第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、及び前記第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子：第ＩＸ因子に関して、約１００：１〜約１：１００の質量比で存在する請求項１７〜３１のいずれか１項記載のキット。
【請求項３３】
対象における出血性症状の処理のための薬剤の製造のためへの、第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物と組合しての第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物の使用。
【請求項３４】
対象における出血性症状の処理のための薬剤の製造のためへの、請求項１〜１６のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項３５】
凝固時間を減じるための薬剤の製造のためへの、第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物と組合しての第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物の使用。
【請求項３６】
凝固時間を減じるための薬剤の製造のためへの請求項１〜１６のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項３７】
凝塊溶解時間を延長するための薬剤の製造のためへの、第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物と組合しての第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物の使用。
【請求項３８】
凝塊溶解時間を延長するための薬剤の製造のためへの請求項１〜１６のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項３９】
凝塊強度を高めるための薬剤の製造のためへの、第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物と組合しての第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物の使用。
【請求項４０】
凝塊強度を高めるための薬剤の製造のためへの請求項１〜１６のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項４１】
フィブリン凝塊形成を増強するための薬剤の製造のためへの、第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物と組合しての第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物の使用。
【請求項４２】
フィブリン凝塊形成を増強するための薬剤の製造のためへの請求項１〜１６のいずれか１項記載の組成物の使用。
【請求項４３】
前記対象が、第ＩＸ因子応答性症候群を有する請求項３３〜４２のいずれか１項記載の使用。
【請求項４４】
前記対象が、処理の前、低められたレベルの第ＩＸ因子を有する請求項３３〜４３いずれか１項記載の使用。
【請求項４５】
前記対象が、血友病Ａを有する請求項４３又は４４記載の使用。
【請求項４６】
前記薬剤が、単一用量形で存在する請求項３３〜４５のいずれか１項記載の使用。
【請求項４７】
前記薬剤が、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物を含んで成る第１用量形、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ関連ポリペプチドの調製物を含んで成る第２用量形の形で調製される請求項３３〜４５のいずれか１項記載の使用。
【請求項４８】
対象における出血性症状を処理するための方法であって、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、出血を処理するために効果的であることを特徴とする方法。
【請求項４９】
対象における凝固時間を減じるための方法であって、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、凝固時間を減じるために効果的であることを特徴とする方法。
【請求項５０】
対象における止血を増強するための方法であって、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、止血を増強するために効果的であることを特徴とする方法。
【請求項５１】
対象における出血を阻止し、そして止血を維持するために必要とされる凝固因子タンパク質の投与回数を低めるための方法であって、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、出血を阻止し、そして止血を維持するために効果的であることを特徴とする方法。
【請求項５２】
対象における出血を阻止し、そして止血を維持するために必要とされる、投与される凝固因子タンパク質の量を低めるための方法であって、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、出血を阻止し、そして止血を維持するために効果的であることを特徴とする方法。
【請求項５３】
対象における凝塊溶解時間を延長するための方法であって、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、凝塊溶解時間を延長するために効果的であることを特徴とする方法。
【請求項５４】
対象における凝塊強度を高めるための方法であって、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、凝塊強度を高めるために効果的であることを特徴とする方法。
【請求項５５】
対象におけるフィブリン凝塊形成を増強するための方法であって、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、フィブリン凝塊形成を増強するために効果的であることを特徴とする方法。
【請求項５６】
前記対象が、第ＩＸ因子応答性症候群を有する請求項４８〜５５のいずれか１項記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が、処理の前、低められたレベルの第ＩＸ因子を有する請求項４８〜５６のいずれか１項記載の方法。
【請求項５８】
前記対象が、血友病Ａを有する請求項４８〜５７のいずれか１項記載の方法。
【請求項５９】
前記第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドが、単一用量形で投与される請求項４８〜５８のいずれか１項記載の方法。
【請求項６０】
前記第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの調製物を含んで成る第１用量形及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物を含んで成る第２用量形の形で投与される請求項４８〜５８いずれか１項記載の方法。
【請求項６１】
前記第１用量形及び第２用量形が、１５分以下の間隔を伴なって投与される請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
出血性症状についての処理を含む部分のキットであって、
ｄ）１単位用量形での有効量の第ＶＩＩ因子又はＶＩＩ因子関連ポリペプチド及び有効量の第ＩＸ因子又はＩＸ因子関連ポリペプチド、並びに医薬的に許容できるキャリヤー；及び
ｅ）前記１単位用量形を含むための容器手段を含んで成るキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物を含んで成る医薬組成物に関する。本発明はまた、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物を含んで成る、出血性症状の処理のための部分的キットにも関する。本発明はまた、薬剤の調製のためへの第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物の使用にも関する。さらに、本発明は、出血を処理し、凝固時間を減じ、出血を増強し、止血を達成するために必要とされる凝固因子タンパク質の投与回数を低め、凝塊溶解時間を延長し、凝塊強度を高め、そしてフィブリン凝塊形成を増強するための方法に関する。
【０００２】
発明の背景：
血液凝固因子第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）は、血漿凝固因子である。活性化された第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩａ）は、血管壁への損傷の結果として暴露される組織因子（ＴＦ）と複合体を形成することによって正常な止血工程を開始し、続いて、これは第ＩＸ因子及びＸ因子（ＦＩＸ及びＦＸ）を、それらの活性化された形、すなわち第ＩＸａ及びＸａ因子（ＦＩＸａ及びＦＸａ）に活性化する。第Ｘａ因子は、組織因子担持細胞上で制限された量のプロトロンビンをトロンビンに転換する。
【０００３】
トロンビンは、血小板及び第Ｖ及びＶＩＩＩ因子を第Ｖａ及びＶＩＩＩ ａ因子（ＦＶａ及びＦ ＶＩＩＩａ）に活性化し、さらなる工程において、両補因子は十分なトロンビン破裂を導く。この工程は、第ＩＸａ因子（第ＶＩＩＩａ因子との複合体において）による第Ｘａ因子の生成を包含し、そして活性化された血小板の表面上で生じる。トロンビンは最終的に、フィブリノーゲンをフィブリンに転換し、フィブリン凝塊の形成をもたらす。
【０００４】
第ＶＩＩ因子は、ＦＸａによりその二本鎖の活性化された形のＦＶＩＩａに分離される、一本鎖チモーゲンとして主に血漿において存在する。組換え活性化された第ＶＩＩ因子（ｒＦＶＩＩａ）は、プロ−止血剤として開発されて来た。ｒＦＶＩＩａの投与は、抗体形成のために凝固因子生成物により処理され得ない出血を有する血友病患者において急速且つ非常に効果的なプロ−止血応答を提供する。第ＶＩＩ因子欠失を有する出血性対象、又は正常な凝固システムを有するが、しかし過度の出血を経験している対象は、ＦＶＩＩａにより都合良く処理され得る。それらの研究においては、ｒＦＶＩＩａの好ましくない副作用（特に、血栓塞栓症の発生において）は、遭遇されていない。
【０００５】
血液凝固因子ＩＸ（第ＩＸ因子）は、第Ｘ因子（ＦＸ）の活性化に関与する血漿凝固因子である。血流における第ＩＸ因子の存在又は活性の低下が、血友病Ｂを誘導する。第ＩＸ因子活性の低下のレベルは、疾病の重症度に直接的に比例する。血友病Ｂの現在の処理は、血漿由来の又は組換え第ＩＸ因子によるミッシングタンパク質の置換（いわゆる、ＦＩＸ置換、又は置換処理又は治療）から成る。
【０００６】
凝固因子欠失（例えば、ＦＩＸ欠失）は、異なった型の遺伝子欠失に影響を及ぼす。遺伝子損傷、例えば欠失又はフレームシフトが重度である場合、ｍＲＮＡは生成されず、そして（重度の）欠失が生じる。例えば、決定的には位置されていない点突然変異からの低い重度の遺伝子損傷は、低められた生物学的活性を有するタンパク質の分泌をもたらす。その遺伝パターンは劣性であり、そしてＸ−連結され、このことは、１つのＸ染色体を有する男性のみが影響される。凝固欠失の重症度は、軽いか又は重度であり得る。
【０００７】
重症度は、血漿における正常に機能する第ＩＸ因子の濃度に依存する。置換療法の目的は、患者の凝固因子活性のレベル（この後、“因子レベル”と呼ばれる）を、止血をもたらすのであろうレベルまで上昇すること、及び治療が実質的に完全に成るまで、それを維持することである。効果的処理の開始が遅延される場合、創傷の治癒は低められ、そして通常よりもより一層の処理が必要とされるであろう。処理の量は、止血のために必要とされる凝固因子の血漿濃度、血液の回復性及び移入される材料の半減期に依存する。
【０００８】
第ＩＸ因子のレベルはまた、遺伝子欠損のためにヘテロ接合性である何人かの対象（例えば、疾病のキャリヤーである女性）において、多かれ少なかれ、低められ得る。そのような対象は、軽い影響の血友病患者の出血傾向に匹敵する、高められた出血傾向を有することができ、そして従って、処理され得る。
【０００９】
第ＩＸ因子置換療法を受ける何人かの患者（血友病Ｂを有する）は、投与された第ＩＸ因子に対する抗体を進行せしめる。しかしながら、正常な第ＩＸ因子レベルを担持する個人（先天的第ＩＸ因子欠失を有さない）は、未知の理由のために、晩年において、第ＩＸ因子に対する自己−抗体を進行せしめる（後天性血友病Ｂ）。両者の場合、抗体は、低い、中位の又は高い力価で存在することができる。低いか又は中位のインヒビター力価を有する患者の場合、彼らは時々、第ＩＸ因子により処理され得る。
【００１０】
血友病はすべての重症度で存在する。検出できる第ＩＸ因子を有さないか又は１％以下の第ＩＸ因子を有する患者は通常、外傷に基づいて及び時々、明らかに自発的に筋肉及び関節に重度の影響を及ぼし、そして出血する。少量の第ＩＸ因子が相当の保護を付与し、その結果、正常レベルの１〜５％の第ＩＸ因子を有する患者は通常、単なる後−外傷性出血、及び筋肉及び関節中への軽度の出血、等を有し、そしてしばしば、適度に影響されると言われる。５％以上の第ＩＸ因子を有する患者は通常、有意な外傷又は手術の後でのみ出血し、そして軽く影響されると言われる。
【００１１】
この分類は個人の場合においては、必ずしも妥当ではないことが十分に理解されるべきである。非常に低い第ＩＸ因子レベルの何人かの患者はまれに出血するが、ところが５％以上の第ＩＸ因子を有する患者は、外傷性出血性関節症により最初に損傷される“標的関節”中に反復して出血し、そして“重度に”影響されるように思える。しかしながら、一般的に、出血症状はより高い因子レベルでほとんど明白ではなく、その結果、異常出血は通常、正常レベルの３５〜４０％以上の第ＩＸ因子レベルでは存在しない。血友症Ｂにおける因子レベルと症状との間の一般的な相互関係は、下記の表１に示される。
【００１２】
【表１】
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【００１３】
血友病Ｂの現在の処理は、血漿由来の又は組換えの第ＩＸ因子によるミッシングタンパク質の置換から成る。第ＩＸ因子生成物は、要求に基づいて急性出血を処理するためにＩ．Ｖ．注入（又は注射）として使用される。出血型は、次の通りに分類される：
【００１４】
１．出血性関節症（関節における出血）；
２．生命−及び手足脅威の出血（腹膜後方出血、ＣＮＳ出血、咽頭後方出血、仕切り症候群を伴なっての筋肉出血及び大量ＧＩ出血）；
３．手術に関する出血予防（成形外科、選択的方法、緊急手術）。
【００１５】
第ＩＸ因子レベルが、治癒が完結するまで、正常レベルの３０〜４０％以上で維持される場合、正常な止血が通常維持されることを、経験が示している。しかしながら、他の考慮もまた重要である。影響される部分の運動、例えば出血性関節症、腹部手術後の咳又は歩行が出血を促進する。物理療法又は操作はかなり高いレベルを必要とするが、ところが軽い損傷の固定化が比較的低い因子レベルを伴なって、出血の制御を可能にすることができる。種々の状況において目的とされ得るおおよその標的レベルが、下記に示される：
【００１６】
標準の出血性関節症の処理（カテゴリー１）：
この通常の意図は、正常レベルの少なくとも２０−３０％の初期第ＩＸ因子血漿濃度、続いて２〜３日間、正常レベルの少なくとも１０−２０％の血漿濃度を達成することである。
生命−及び手足脅威の出血（カテゴリー２）：
この通常の意図は、少なくとも４０％の初期第ＩＸ因子血漿濃度、続いて１週間、少なくとも１０−２０％の血漿濃度を達成することである。
手術に関連する出血予防（カテゴリー３）：
この通常の目的は、手術の日、少なくとも５５−８０％の第ＩＸ因子血漿濃度、続いて２〜７日間、少なくとも２０−３０％の血漿濃度を達成し、そして１〜２週間、少なくとも１０−２０％の血漿濃度の維持することである。
【００１７】
処理についての上記ガイドラインに従って、次のことが、出血型に関しての第ＩＸ因子注入の回数であるといわれる。１８〜２４時間の第ＩＸ因子の平均血漿半減期により、出血性症状の発現当たりの第ＩＸ因子の次の平均注入回数が通常、臨床学的実習に使用される：出血性関節症（関節の出血）：自宅処理、マイナーな出血性関節症：１〜３回の注入：病院処理、より大きな出血性関節症：６〜１４回の注入；生命−及び手足脅威の出血：１０−２０回の注入；手術に関しての出血の予防：３０−４０回の注入。
【００１８】
血友病の臨床学的処理においては、第ＶＩＩａ因子が現在、ＦＩＸ又はＦＩＸ（置換療法を妨げる）に対するインヒビターを有する患者における出血を停止するために使用される。しかしながら、臨床医は通常、インヒビターを伴なわないで血友病についての第１系統処理としてＦＶＩＩａを使用しない（ここで、ＦＩＩＩ又はＦＩＸがそれぞれ使用され得る）。なぜならば、第ＩＸ因子の半減期に比較して、第ＩＸａ因子の短い半減期（１８−２４時間に比較して２．５時間）が、一定レベルの止血能力を維持するためにより頻繁な第ＶＩＩａ因子注入を必要とするからである。
【００１９】
ヨーロッパ特許第２２５，１６０号（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、ＦＶＩＩａの組成物、及び凝固因子欠失又は凝固因子インヒビターにいより引き起こされない出血性障害の処理方法に関する。
ヨーロッパ特許第８２，１８２号（Ｂａｘｔｅｒ Ｔｒａｖｅｎａｌ Ｌａｂ．）は、血液凝固因子の欠失を妨げることへの使用のための第ＶＩＩａ因子の組成物、又は対象における血液凝固因子に対するインヒビターの効果に関する。
Ｌｕｓｈｅｒなど．， Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ， １９９８， ｐｐ． ７９０−７９８は、インヒビターを伴なって及びインヒビターを伴なわないで、血友病Ａ及びＢの個人における関節、筋肉及び粘膜出血の処理への組換え第ＩＸａ因子の投与に関する。
【００２０】
Ｋｊａｌｋａなど．， Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ， １９９９ （Ｓｕｐｐｌ）， ０９５１は、特定の外因性ＦＶＩＩａの投与、及び血友病Ａ又はＢ状態に類似するモデルシステムにおける活性化された血小板表面上でのトンビンの形成に対する効果に関する。
アメリカ特許第５，８９１，８４３号（Ｉｍｍｕｎｏ）は、ＦＥＩＢ活性を有する第２成分、例えば活性化されたプロトロンビン複合体又はＦＥＩＢＡ調製物と組合してのＦＶＩＩａの組成物に関する。
【００２１】
今日、血友病の処理に使用される多くの第ＩＸ因子生成物は、組換え的に生成された第ＶＩＩ因子を含む。しかしながら、前記生成物はまた、ヒト又はブタ血漿から単離されている。それらの精製された生成物はしばしば、血漿からのより少ない量の他の凝固因子又は他の成分を含む。通常、そのような追加の血漿成分は、所望されず（ウィルス感染又は他の汚染の危険性のために）、そして組換えタンパク質（例えば、第ＶＩＩａ因）によるそのような成分の一部の置換は、組成物及び処理の改良点、及び患者への有益点として考慮されるであろう。
【００２２】
今日、出血性症状の発現を経験する、低められたレベルの第ＩＸ因子を有する対象（例えば、血友病Ｂ患者）は一般的に、出血が停止される前、第ＩＸ因子の数回の注射又は注入により処理される。さらに、相当の回数の注入が、出血を引き起こす外傷が完全に治癒するまで、止血を維持するために必要とされる。
【００２３】
過度の出血を有する外傷犠牲者は一般的に、多量の注入流体、例えば静脈内（ｉ．ｖ．）注射用コロイド注入生成物、アルブミン、赤血球細胞濃縮物、等のための流体により処理される。多量の輸血を必要とする過度の出血は、複数の器官障害、例えば外傷性肺及び腎臓機能の進行を導くことができる。
出血の早い阻止は、そのような対象のためになる。従って、出血を停止し、そして止血を維持するために必要とされる注入の回数の低下、又は出血阻止及び止血の維持のための凝固タンパク質使用の量の低下が存在する。
【００２４】
出血性症状の発現を経験する対象、例えば出血性症状の発現が低められたレベルの凝固第ＩＸ因子のためである患者の改良された処理についての必要性がまだ、当業界において存在する。凝固を増強し、安定した止血栓の形成を増強するか又は確保し、処理された対象のための便利さを増強し、又は対象、特に損傷されたトロンビン生成を有する対象における十分な止血を達成するための改良され、信頼でき且つ広く適用できる方法についての必要性が当業界においてまだ存在する。十分な止血を達成するために必要とされるＦＶＩＩａ又はＦＩＸの量が低められる方法についての必要性がまた存在する。十分な止血を達成するために必要とされる凝固因子タンパク質の合計量が低められる方法、及び出血阻止までの時間が短縮される方法がまた存在する。
【００２５】
発明の要約：
本発明の１つの目的は、出血性症状の発現及び凝固障害の処理又は予防において効果的に使用され得る組成物を提供することである。
本発明の第２の目的は、出血性症状の発現の処理又は予防において、又はプロ凝固剤として効果的に使用され得る、１つの用量形での組成物を提供することである。本発明のもう１つの目的は、相乗効果を示す組成物、又はキットを提供することである。
【００２６】
本発明のさらなる目的は、実質的な副作用、例えば高レベルの凝固システムの組織的活性化を示されない組成物、処理方法又はキットを提供することである。
本発明の他の目的は、発明の記載を読むことによって明らかに成るであろう。
第１の観点においては、本発明は、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物を含んで成る医薬組成物に関する。
【００２７】
第２の観点においては、本発明は、ａ）第１単位用量形での有効量の第ＶＩＩ因子又はＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び医薬的に許容できるキャリヤー；ｂ）第２単位用量形での有効量の第ＩＸ因子又はＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物、及び医薬的に許容できるキャリヤー；及びｃ）前記第１及び第２用量形を含むための容器手段を含んで成る、出血性症状についての処理を含む部分キットに関する。
【００２８】
もう１つの観点においては、本発明は、対象における出血性症状の処理のための薬剤の製造のためへの、第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物と組合しての第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物の使用に関する。
もう１つの観点においては、本発明は、凝固時間を減じるための薬剤の製造のためへの、第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物と組合しての第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物の使用に関する。
もう１つの観点においては、本発明は、凝塊溶解時間を延長するための薬剤の製造のためへの、第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物と組合しての第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物の使用に関する。
【００２９】
もう１つの観点においては、本発明は、凝塊強度を高めるための薬剤の製造のためへの、第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物と組合しての第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物の使用に関する。
１つの観点においては、本発明は、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、出血を処理するために効果的であることを特徴とする、対象における出血性症状を処理するための方法に関する。
【００３０】
もう１つの観点においては、本発明は、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、凝固時間を減じるために効果的であることを特徴とする、対象における凝固時間を減じるための方法に関する。
【００３１】
もう１つの観点においては、本発明は、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、止血を増強するために効果的であることを特徴とする、対象における止血を増強するための方法に関する。
【００３２】
もう１つの観点においては、本発明は、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、出血を阻止し、そして止血を維持するために効果的であることを特徴とする、対象における出血を阻止し、そして止血を維持するために必要とされる凝固因子タンパク質の投与回数を低めるための方法に関する。
【００３３】
もう１つの観点においては、本発明は、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、出血を阻止し、そして止血を維持するために効果的であることを特徴とする、対象における出血を阻止し、そして止血を維持するために必要とされる、投与される凝固因子タンパク質の量を低めるための方法に関する。
【００３４】
もう１つの観点においては、本発明は、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、凝塊溶解時間を延長するために効果的であることを特徴とする、対象における凝塊溶解時間を延長するための方法に関する。
【００３５】
もう１つの観点においては、本発明は、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、凝塊強度を高めるために効果的であることを特徴とする、対象における凝塊強度を高めるための方法に関する。
【００３６】
もう１つの観点においては、本発明は、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、フィブリン凝塊形成を増強するために効果的であることを特徴とする、対象におけるフィブリン凝塊形成を増強するための方法に関する。
【００３７】
もう１つの観点においては、本発明は、ａ）１単位用量形での有効量の第ＶＩＩ因子又はＶＩＩ因子関連ポリペプチド及び有効量の第ＩＸ因子又はＩＸ因子関連ポリペプチド、並びに医薬的に許容できるキャリヤー；及びｂ）前記１単位用量形を含むための容器手段を含んで成る、出血性症状についての処理を含む部分のキットに関する。
【００３８】
本発明の１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドである。もう１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、第ＶＩＩ因子ポリペプチドである。本発明の１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、第ＶＩＩ因子アミノ酸配列変異体である。１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの活性と前記生来のヒト第ＶＩＩａ因子（野生型第ＶＩＩａ因子）の活性との間の割合は、本発明の記載に記載されるような“インビトロ加水分解アッセイ”において試験される場合、少なくとも約１．２５である。
【００３９】
本発明の１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、第ＶＩＩ因子ポリペプチドである。１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子はヒト第ＶＩＩ因子である。１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子は、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネズミ又はサケ第ＶＩＩ因子である。もう１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子は、組換え第ＶＩＩ因子である。もう１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、血漿由来の第ＶＩＩ因子である。もう１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、血漿由来のヒト第ＶＩＩ因子である。本発明の１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、その活性化された形で存在する。本発明の１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、組換えヒト第ＶＩＩａ因子である。
【００４０】
１つの態様においては、前記第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、第ＩＸ因子関連ポリペプチドである。１つの態様においては、前記第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、第ＩＸ因子アミノ酸配列変異体である。１つの態様においては、前記第ＩＸ因子関連ポリペプチドの活性と前記生来のヒト第ＩＸ因子（野生型第ＩＸ因子）の活性との間の割合は、本発明の記載に記載されるような“色原体アッセイ”において試験される場合、少なくとも約１．２５である。１つの態様においては、前記第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、第ＩＸ因子ポリペプチドである。１つの態様においては、前記第ＩＸ因子は、ヒト第ＩＸ因子である。
【００４１】
１つの態様においては、前記第ＩＸ因子は、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネズミ又はサケ第ＩＸ因子である。もう１つの態様においては、前記第ＩＸ因子は、組換え第ＩＸ因子である。もう１つの態様においては、前記第ＩＸ因子ポリペプチドは、血漿由来の第ＩＸ因子である。もう１つの態様においては、前記第ＩＸ因子ポリペプチドは、血漿由来のヒト第ＩＸ因子である。もう１つの態様においては、前記第ＩＸ因子ポリペプチドは、組換えヒト第ＩＸ因子である。本発明の１つの態様においては、前記第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、その活性化された形で存在する。
【００４２】
１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、及び前記第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドが、第ＶＩＩ因子：第ＩＸ因子に関して、約１００：１〜約１：１００の質量比で存在する。
【００４３】
１つの態様においては、第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩ因子（すなわち、アメリカ特許第４，７８４，９５０号に開示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド）に比較して、置換され、欠失され、又は挿入された２０個以下のアミノ酸を有するアミノ酸配列変異体である。もう１つの態様においては、野生型第ＶＩＩ因子に比較して、第ＶＩＩａ因子変異体は、置換され、欠失され、又は挿入された１５個以下のアミノ酸を有し；もう１つの態様においては、第ＶＩＩ因子変異体は、置換され、欠失され、又は挿入された１０個以下のアミノ酸を有し；もう１つの態様においては、第ＶＩＩ因子変異体は、置換され、欠失され、又は挿入された８個以下のアミノ酸を有し；もう１つの態様においては、第ＶＩＩ因子変異体は、置換され、欠失され、又は挿入された６個以下のアミノ酸を有し；もう１つの態様においては、第ＶＩＩ因子変異体は、置換され、欠失され、又は挿入された５個以下のアミノ酸を有し；もう１つの態様においては、第ＶＩＩ因子変異体は、置換され、欠失され、又は挿入された３個以下のアミノ酸を有する。
【００４４】
１つの態様においては第ＶＩＩ因子変異体は、Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩａ， Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ−ＦＶＩＩａ， Ｌ３０５Ｉ−ＦＶＩＩａ， Ｌ３０５Ｔ−ＦＶＩＩａ， Ｆ３７４Ｐ−ＦＶＩＩａ， Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａ， Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａ， Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩａ， Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａ， Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩａ， Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＶＶＩＩａ， Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩａ， Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩａ， Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩａ， Ｋ１５７Ａ−ＦＶＩＩ， Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ， Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ−ＦＶＩＩ及びＳ３３６Ｇ−ＦＶＩＩから選択される。
【００４５】
さらなる観点においては、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、生来のヒト凝固第ＶＩＩａ因子に比較して、高められた組織因子−無関係活性を有する。もう１つの態様においては、高められた活性は、基質特異性における変化を付随しない。本発明のもう１つの観点においては、組織因子への第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの結合は損なわれるべきではなく、そして第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、組織因子に結合される場合、野生型第ＩＩａ因子の活性を少なくとも有すべきである。
【００４６】
１つの好ましい態様においては、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド及び第ＩＸ因又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、組換えヒト第ＩＩａ因子及び第ＩＸ因子である。
【００４７】
１つの態様においては、凝固時間が、哺乳類血液において減じられる。もう１つの態様においては、止血が、哺乳類血液において増強される。もう１つの態様においては、凝塊溶解時間は、哺乳類血液において延長される。もう１つの態様においては、凝塊強度は、哺乳類血液においては高められる。もう１つの態様においては、フィブリン凝塊形成は、哺乳類細胞において増強される。１つの態様においては、哺乳類血液はヒト血液である。
【００４８】
もう１つの態様においては、哺乳類血液は正常血液であり；もう１つの態様においては、哺乳類血液は、正常レベルの凝固因子タンパク質を有する血液であり；もう１つの態様においては、哺乳類血液は、正常レベルの第ＩＸ因子を有する血液であり；もう１つの態様においては、血液は、正常ヒト血液であり；１つの態様においては、血液は、損なわれたトロンビン生成を有する対象からの血液である。１つの態様においては、血液は、１又は複数の凝固因子の欠失を有する対象からの血液であり；もう１つの態様においては、血液は、１又は複数の凝固因子に対するインヒビターを有する対象からの血液である。１つの態様においては、血液は、低められた濃度のフィブリノーゲンを有する対象からである。１つの態様においては、血液は、第ＩＸ因子欠失のヒト血液である。
【００４９】
本発明の１つの態様においては、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、使用される唯一の止血剤である。もう１つの態様においては、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、使用される唯一の止血剤である。もう１つの態様においては、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、使用される唯一の凝固因子である。もう１つの態様においては、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、使用される唯一の活性剤である。
【００５０】
“唯一の”剤又は因子とは、本明細書において使用される場合、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドが、一緒に考慮される場合、医薬組成物又はキットに含まれる、唯一の止血剤、活性止剤又は凝固因子であるか、又は特定の処理、例えば特定の出血性症状の発現の間、患者に投与される、唯一の止血剤、活性止血剤又は凝固因子である状況を言及する。それらの情況は、他の止血剤又は凝固因子が、１又は複数の凝固パラメーターに対して有意に影響を及ぼすために、十分な品質又は活性で存在しないそれらの状況を包含することが理解されるであろう。
【００５１】
もう１つの態様においては、医薬組成物は、静脈内投与のために配合される。１つの態様においては、組成物はさらに、医薬的に許容できる賦形剤を含む。
本発明の１つの態様においては、組成物は、両凝固因子を含む単一容量形で存在する。本発明の１つの態様においては、組成物は、第１単位用量形としての第ＶＩＩ因子又はＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第２単位用量形としての第ＩＸ因子又はＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物、及び前記第１及び第２用量形を含むための容器手段を含んで成る部分キットの形で存在する。１つの態様においては、組成物又はキットは、適用できる場合、それぞれ組成物又は別の成分投与のための説明書をさらに包含する。
【００５２】
本発明の１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、単一用量形で投与される。本発明の１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの調製物を含んで成る第１単位用量形及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物を含んで成る第２単位用量形の形で投与される。
【００５３】
本発明の１つの態様においては、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、同時に投与される。もう１つの態様においては、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは連続的に投与される。１つの態様においては、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、１５分以下、好ましくは１０分以下、より好ましくは５分以下の間隔で投与され、そしてより好ましくは２分である。１つの態様においては、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、２時間まで、好ましくは１〜２時間、より好ましくは１時間まで、より好ましくは３０分〜１時間、より好ましくは３０分まで、より好ましくは１５〜３０分の間核で投与される。
【００５４】
１つの態様においては、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの有効量は、約０．０５ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日（７０ｋｇの対象）の量である。１つの態様においては、第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの有効量は、約０．０５ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日（７０ｋｇの対象）の量である。
１つの態様においては、前記第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、及び前記第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、第ＶＩＩ因子：第ＩＸ因子に関して、約１００：１〜約１：１００の質量比で存在する。
【００５５】
本発明の１つの態様においては、医薬組成物は、単一用量形で存在し、そして第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物、及び医薬的に許容できる賦形剤又はキャリヤー、安定剤、界面活性剤、中性塩、酸化防止剤、保存剤及びプロテアーゼインヒビターから選択された１又は複数の成分から実質的に成る。
さらなる態様においては、対象はヒトであり；もう１つの態様においては、対象は損なわれたトロンビン生成を有し；１つの態様においては、対象は低められた血漿濃度のフィブリノーゲンを有し（例えば、複数回輸血された対象）；１つの態様においては、対象は、低められた血漿濃度の第ＩＸ因子を有する。
【００５６】
１つの関連においては、医薬組成物は、家庭用処理のためである。
もう１つの観点においては、本発明は、第ＩＸ因子応答性症候群を有する対象における出血の処理のための薬剤の製造のためへの、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物の使用に関する。
もう１つの観点においては、本発明は、低められたレベルの第ＩＸ因子を有する対象における出血の処理のための薬剤の製造のためへの、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物の使用に関する。
【００５７】
もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固タンパク質としての第ＩＸ因子により処理される場合に比較して、第ＩＸ因子応答性症候群を有する対象における止血を増強するための方法に関し、前記方法は第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、止血を増強するために効果的であることを特徴とする。
【００５８】
もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固タンパク質としての第ＩＸ因子により処理される場合に比較して、低められたレベルの第ＩＸ因子を有する対象における止血を増強するための方法に関し、前記方法は第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、止血を増強するために効果的であることを特徴とする。
【００５９】
もう１つの観点においては、本発明は、対象におけるトロンビンの形成を増強するための方法に関し、前記方法は第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、止血を増強するために効果的であることを特徴とする。
【００６０】
もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固タンパク質としての第ＩＸ因子により処理される場合に比較して、第ＩＸ因子応答性症候群を有する対象におけるトロンビンの形成を増強するための方法に関し、前記方法は第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、トロンビンの形成を増強するために効果的であることを特徴とする。
【００６１】
もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固タンパク質としての第ＩＸ因子により処理される場合に比較して、低められたレベルの第ＩＸ因子を有する対象におけるトロンビンの形成を増強するための方法に関し、前記方法は第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、トロンビンの形成を増強するために効果的であることを特徴とする。
【００６２】
もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固因子タンパク質としての第ＩＸ因子により処理される場合に必要とされる投与の回数に比較して、第ＩＸ因子応答性症候群を有する対象における出血を達成するために必要とされる凝固因子タンパク質の投与回数を低めるための方法に関し、前記方法は第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、凝固因子タンパク質の投与回数を低めるために効果的であることを特徴とする。
【００６３】
もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固因子タンパク質としての第ＩＸ因子により処理される場合に必要とされる投与の回数に比較して、低められたレベルの第ＩＸ因子を有する対象における出血を達成するために必要とされる凝固因子タンパク質の投与回数を低めるための方法に関し、前記方法は第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、凝固因子タンパク質の投与回数を低めるために効果的であることを特徴とする。
【００６４】
もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固因子タンパク質としての第ＩＸ因子により処理される場合に必要とされる投与の量に比較して、第ＩＸ因子応答性症候群を有する対象における出血を達成するために必要とされる凝固因子タンパク質の投与される量を低めるための方法に関し、前記方法は第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、投与される凝固因子タンパク質の量を低めるために効果的であることを特徴とする。
【００６５】
もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固因子タンパク質としての第ＩＸ因子により処理される場合に必要とされる投与の回数に比較して、低められたレベルの第ＩＸ因子を有する対象における出血を達成するために必要とされる凝固因子タンパク質の投与の量を低めるための方法に関し、前記方法は第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、凝固因子タンパク質の投与の量を低めるために効果的であることを特徴とする。
【００６６】
もう１つの観点においては、本発明は、第ＩＸ因子応答性症候群を有する対象における出血を処理するための方法に関し、前記方法は第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、出血を処理するために効果的であることを特徴とする。
【００６７】
もう１つの観点においては、本発明は、低められたレベルの第ＩＸ因子を有する対象における出血を処理するための方法に関し、前記方法は第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、出血を処理するために効果的であることを特徴とする。  １つの観点においては、対象は、低められたレベルの第ＩＸ因子を有する。１つの態様においては、対象は、第ＩＸ因子応答性症候群を有する。１つの態様においては、前記第ＩＸ因子応答性症候群は、血友病Ｂである。
【００６８】
１つの態様においては、低められた第ＩＸ因子レベルは、正常レベルの９０％又はそれ以下であり、他の態様においては、第ＩＸ因子レベルは、８０％又はそれ以下、もう１つの態様においては、５０％又はそれ以下、もう１つの態様においては、２０％又はそれ以下、もう１つの態様においては、１０％又はそれ以下、もう１つの態様においては、５％又はそれ以下であり、好ましい態様においては、第ＩＸ因子レベルは、正常レベルの３０％以下である。
【００６９】
もう１つの観点においては、本発明は、第ＶＩＩ因子応答性症候群を有する対象における出血を処理するための方法に関し、前記方法は第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの第１量の調製物及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの第２量の調製物を、その必要な対象に投与することを含んで成り、ここで前記第１及び第２量が共に、出血を処理するために効果的であることを特徴とする。
１つの態様においては、第ＶＩＩ因子は、ヒト組換え第ＩＸａ因子（ｒＦＶＩＩａ）である。もう１つの態様においては、ｒＦＶＩＩａは、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ， Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｎｍａｒｋ） である。
【００７０】
１つの態様においては、第ＩＸ因子は、ヒト組換え第ＩＸ因子（ｒＦＩＩＩ）である。もう１つの態様においては、第ＩＸ因子生成物は、ＢｅｎｅＦｉｘ（ＡＨＰ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）， ＭＯｎｏｎｌｉｅ（Ａｖｅｎｔｉｓ）， Ｐｒｏｐｌｅｘ（Ｂａｘｔｅｒ）， Ｂｅｂｕｌｉｎ ＶＨ （Ｂａｘｔｅｒ）， ＦＡＣＴＥＵＲ ＩＸ−ＬＦＢ （Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （ＬＦＢ））， Ｉｍｍｕｎｉｎｅ（Ｂａｘｔｅｒ／Ｉｍｍｕｎｏ）， Ｏｃｔａｎｙｎｅ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）， Ｏｃｔａｎｉｎｅ Ｆ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）， Ｍｏｎｏ ＦＩＸ−ＶＦ（ＣＳＬ）， Ｎｏｖａｃｔ Ｍ（Ｋａｋｅｔｓｕｋｅｎ）である。
【００７１】
１つの態様においては、医薬組成物は、静脈内投与のために配合される。１つの態様においては、組成物はさらに、フィブリン溶解システム、例えばアプロチニン、ε−アミノカプロン酸又はトラネキサム酸のインヒビターを含んで成る。
【００７２】
発明の特定の記載：
手術又は主要外傷に強く関連して出血し、従って輸血を必要とする対象は、いずれかの出血も経験しない対象よりも合併症を進行せしめる。しかしながら、また中位の出血は、それらがヒト血液又は血液生成物（血小板、白血球、凝固欠陥の処理のための血漿由来の濃縮物、等）の投与を必要とする場合、合併症を導くことができる。なぜならば、これは、ヒトウィルス（例えば、ＨＩＶ、パルボウィルス、又は現在まで未知の他のウィルス）及び非ウィルス性病原体をトランスファーする危険性に関連しているからである。多量の輸血を必要とする多量の出血は、損なわれた肺及び腎機能を包含する多発性器官不全の進行を導くことができる。
【００７３】
対象がそれらの重度の合併症を進行すると、多くのサイトカイン及び炎症反応を包含するカスケード現象が開始し、いずれの処理も、非状に困難にし、そして不運なことには、しばしば不成功にする。従って、主要組織損傷の手術及び処理における主要目的は、出血を回避するか又は最少にすることである。そのような所望しない出血を回避するか又は最少にするためには、フィブリン溶解性酵素により容易に溶解されない安定性で且つ固体の止血性栓の形成を確保することが重要である。さらに、そのような栓又は凝塊のすばやく且つ効果的な形成を確保することが重要である。
【００７４】
血小板減少症（血小板の低められた計数又は活性）を有する対象はまた、損なわれたトロンビン生成、及び早まった溶解の傾向がある止血栓をもたらすフィブリン栓の欠陥性安定化を有する。さらに、主な外傷又は器官損傷にゆだねられ、そして結果として、時々の輸血を受けたことがある対象は、しばしば低められた血小板計数及び低められたレベルのフィブリノーゲン、第ＩＸ因子及び他の凝固タンパク質を有する。それらの対象は、損なわれた（又は低められた）トロンビン生成を経験する。従って、それらの対象は、タンパク質分解酵素により容易に且つ早まって溶解されるフィブリン栓の形成を導く、欠陥性の又は効果的でない止血を有し、さらに、そのような酵素は、集中的な外傷及び器官損傷により特徴づけられる情況に集中的に放される。
【００７５】
血液の主要な損失を経験する患者は臨床学的に不安定になる。そのような患者は、心臓活性の致命的な停止、損なわれた腎機能又は肺における流体溢出（いわゆる“湿潤性肺”又はＡＲＤＳ）を導くことができる心房性細動の危険性下にある。
【００７６】
組織における出血はまた、血腫の形成を導く。血腫（特に、頭蓋内及び脊髄）のサイズは、神経学的機能の損失、リハビリテーションの困難性の程度、及び／又はリハビリテーションに続く神経学的機能の永久的障害の重症度及び程度に対して密接に相互関係する。血腫の最も重度な結果は、それらが、患者の死されも導くことができる脳に位置する場合に見られる。いわゆる仕切り症候群は、内部から末端までの重度の出血により引き起こされる臨床学的状態である。手及び足においては、筋肉及び骨は、筋膜と呼ばれるほとんど非弾性のコラーゲンシートにより外部的に閉じ込められる。
【００７７】
筋膜により制限される空間における出血は、その区画における高められた圧力、及び続く、神経、血管及び筋肉組織への圧力を導き、従って、すぐに処理されなければ、集中的な組織壊死を引き起こす。形成される場合、壊死組織は、治癒現象の間、拡大し、結合組織に転換し、元の筋肉組織に比較して、収縮される。そのような収縮体は、調整的手術の必要性を再び導く、影響された関節の損なわれた運動性を対象に経験しがちにする。重度の血腫はさらに、腫瘍のようなそのような嚢腫が、影響された筋肉又は骨組織を侵食することにおいて、良性腫瘍にたとえられ得る偽嚢腫の形成を導くことができる。再び、手術がそのような偽嚢腫を除去するために必要とされる。
【００７８】
血腫の形成はさらに、対象における感染の頻度を高める。その結果、血液生成物、例えば赤血球細胞の注入が存在する。赤血球細胞の注入は、患者における抗体の形成の危険性を導く。血液型抗原に対する抗体が形成される場合、患者の輸血は、適切な型の血液を見出すことがますます困難になるので、困難である。
従って、出血の処理における主要目的は、最少時間で止血を得、従って、血液損失を最少に維持することである。
【００７９】
従って、本発明は、出血状態の発現の処理の必要な対象におけるそのような処理のための有益な組成物、使用及び方法を提供する。前記組成物、使用及び方法は、有益な効果、例えば止血が得られる前、より少ない血液の損失、手術の間に必要とされるより少ない血液、止血が得られるまで許容できるレベルで維持される血圧、血圧のより早い安定化、処理された患者のためのより短い回復時間、処理された患者のためのより短いリハビリテーション時間、脳における血腫を包含する血腫の低められた形成又はより小さな血腫、偽嚢腫の低い形成、筋肉収縮の低い形成、出血の早い阻止、出血を停止し、そして止血を維持するために必要とされる注入の回数の低下、出血を阻止し、そして止血を維持するために凝固タンパク質使用の量の低下に関連している。
【００８０】
第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物と組合しての第ＶＩＩ因子及び第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、例えばＶＩＩａの調製物の投与は、第ＶＩＩａ因子又は第ＩＸ因子のいずれかが単独で投与される場合の凝固時間に比較して、短縮された凝固時間を提供する。
第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物と組合しての第ＶＩＩ因子及び第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、例えばＶＩＩａの調製物の投与はまた、第ＶＩＩａ因子又は第ＩＸ因子のいずれかが単独で投与される場合のタンパク質使用に比較して、そのような処理の必要な対象における出血を阻止し、そして止血を維持するための凝固因子使用の低められた合計量を提供する。
【００８１】
第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物と組合しての第ＶＩＩ因子及び第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、例えばＶＩＩａの調製物の投与はまた、第ＶＩＩａ因子又は第ＩＸ因子のいずれかが単独で投与される場合のタンパク質使用に比較して、出血の阻止を得るための減じられた時間、及び止血を維持するための注射の低められた回数を提供する。第ＶＩＩａ因子又は第ＩＸ因子のいずれかが単独で投与される場合のタンパク質使用に比較してはまた、第ＶＩＩａ因子又は第ＩＸ因子のいずれかが単独で投与される場合のタンパク質使用に比較して、十分止血を確保するために注入の低められた回数を提供する。
【００８２】
血友病Ａを有する患者においては、本発明は、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物の同時又は連続的投与の有益な効果を提供する。凝集第ＩＸ因子置換、及び第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物は、それらの患者グループにおける出血の阻止を誘発するが、しかし異なった作用の生化学的機構を有する。同時投与は、止血効果を高める。
【００８３】
本発明は、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物の組合せを含んで成る医薬組成物を提要する。組成物は、単一組成物の形で存在することができ、又はそれは、多成分キット（部分キット）の形で存在することができる。本発明の組成物は、哺乳類、例えば霊長類、例えばヒトにおける治療及び予防用プロ凝集剤として有用である。本発明はさらに、対象、例えば、ヒトにおける出血状態の発現を処理するための（予防処理又は阻止を包含する）方法を提供する。
第１、第２又は第３、等の単位容量が本明細書を通して言及される場合、これは投与の好ましい順序を示すのではなく、単なる便利目的のために示されている。
【００８４】
第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物の組合せは、短い凝固時間、及び止血栓の急速な形成を確保する好都合な生成物である。本発明者は、第ＶＩＩａ因子及び第ＩＸ因子の組合せが、単独の第ＶＩＩａ因子又は第ＩＸ因子よりもより効果的に、正常ヒト血漿の凝固時間を短くすることができることを示すであろう。従って、凝固時間を短くすることによって、対象における出血のより効果的処理が得られる。さらに、患者は、より低い合計量の第ＶＩＩ因子及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ関連ポリペプチドにより処理され得る。
【００８５】
第ＶＩＩ因子ポリペプチド：
本発明の実施においては、出血を予防し、又は処理することにおいて効果的であるいずれかの第ＶＩＩ因子ポリペプチドが使用され得る。これは、血液又は血漿由来の、又は組換え手段により生成される第ＶＩＩ因子ポリペプチドを包含する。
【００８６】
本発明は、第ＶＩＩ因子ポリペプチド、例えばアメリカ特許第４，７８４，９５０号（野生型第ＶＩＩ因子）に開示されるアミノ酸配列を有するそれらを包含する。いくつかの態様においては、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、例えばアメリカ特許第４，７８４，９５０号（野生型第ＶＩＩ因子）に開示されるように、ヒト第ＶＩＩａ因子である。１つの態様においては、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ヒト第ＶＩＩａ因子の特定の生物学的活性の少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約５０％及び最も好ましくは少なくとも約７０％を示すポリペプチドを包含する。
【００８７】
１つの態様においては、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ヒト第ＶＩＩａ因子の特定の生物学的活性の少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約１００％、好ましくは少なくとも１２０％、より好ましくは少なくとも約１４０％、及び最も好ましくは少なくとも約１６０％を示すポリペプチドを包含する。１つの態様においては、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、アメリカ特許第４，７８４，９５０号に開示されるような野生型第ＶＩＩ因子の配列と、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、及び最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示すポリペプチドを包含する。
【００８８】
本明細書において使用される場合、“第ＶＩＩ因子ポリペプチド”とは、第ＶＩＩ因子及び第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドを包含する。用語“第ＶＩＩ因子”とは、野生型ヒト第ＶＩＩ因子（アメリカ特許第４，７８４，９５０号に開示されるような）、及び他の種由来の野生型第ＶＩＩ因子、例えばウシ、ブタ、イヌ、ネズミ及びサケ第ＶＩＩ因子のアミノ酸配列１−４０６を有するポリペプチドを包含することを意図し、ここで前記第ＶＩ因子は、血液又は血漿由来であり、又は組換え手段により生成される。それはさらに、１つの個人から他の個人に存在し、そして存在することができる第ＶＩＩ因子の天然の対立遺伝子変異を包含する。
【００８９】
また、グリコシル化又は他の後―翻訳修飾の程度及び位置は、選択された宿主細胞及び宿主細胞環境の性質に依存して変化することができる。用語“第ＶＩＩ因子”とはまた、切断されていない（チモーゲン）形での第ＶＩＩ因子ポリペプチド、及び第ＶＩＩａ因子と呼ばれるそれらのそれぞれの生活性形を生成するよう、タンパク質加水分解的に処理されているそれらのペプチドを包含することを意図される。典型的には、第ＶＩＩ因子は、第ＶＩＩａを生成するために、前記１５２と１５３との間で切断される。
【００９０】
“第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド”とは、ヒト第ＶＩＩ因子に関して化学的に修飾されているか、そして／又はヒト第ＶＩＩ因子（すなわち、第ＶＩＩ因子変異体）に関して１又は複数のアミノ酸配列変更を含み、そして／又はヒト第ＶＩＩ因子（すなわち、第ＶＩＩフラグメント）に関して、切断されたアミノ酸配列を含む第ＶＩＩポリペプチドを包含する。そのような第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、ヒト第ＶＩＩ因子に関する異なった性質、例えば安定性、リン脂質結合、変更された比活性及び同様のものを示すことができる。用語“第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド”とは、切断されていない（チモーゲン）形でのそのようなポリペプチド、及び“第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチド”又は“活性化された第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド”と呼ばれるそれらのそれぞれの生活性形を生成するよう、タンパク質加水分解的に処理されているそれらのペプチドを包含することを意図される。
【００９１】
本明細書において使用される場合、“第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド”とは、野生型ヒト第ＶＩＩ因子に関して実質的に同じか又は改良された生物学的活性を示すポリペプチド、及び第ＶＩＩａ因子生物学的活性が野生型ヒト第ＶＩＩａ因子に関して実質的に修飾されているか又は低められているポリペプチドを包含する。それらのポリペプチドは、化学的に修飾されている第ＶＩＩ又は第ＶＩＩａ因子、及びポリペプチドの生活性を修飾するか又は破壊する特定のアミノ酸配列変更が導入されている第ＶＩＩ因子変異体を包含する。
【００９２】
それはさらに、わずかに修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えばＮ−末端アミノ酸欠失又は付加を包含する修飾されたＮ−末端を有するポリペプチド、及び／又はヒト第ＶＩＩａ因子に関して化学的に修飾されているポリペプチドを包含する。
【００９３】
第ＶＩＩ因子の変異体を包含する第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同じか又はそれよりも良好な生活性を示すか、又は他方では、野生型第ＶＩＩ因子に関して実質的に修飾されているか又は低められた生活性を示しても、１又は複数のアミノ酸の挿入、欠失又は置換により野生型第ＶＩＩ因子の配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含するが、但しこれだけには限定されない。
【００９４】
変異体を包含する第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、上記のように、１又は複数の凝固アッセイ、タンパク質加水分解アッセイ又はＴＦ結合アッセイにおいて試験される場合、同じ細胞型において生成された野生型第ＶＩＩａ因子の比活性の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、又は少なくとも約１３０％を示すポリペプチドを包含する。
【００９５】
野生型第ＶＩＩａ因子に関して実質的に同じか又は改良された生物学的活性を有する、変異体を包含する第ＶＩＩ関連ポリペプチドは、上記のように、１又は複数の凝固アッセイ、タンパク質加水分解アッセイ又はＴＦ結合アッセイにおいて試験される場合、同じ細胞型において生成された野生型第ＶＩＩａ因子の比活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約１００％、より好ましくは少なくとも約１１０％、より好ましくは少なくとも約１２０％、及び最も好ましくは少なくとも約１３０％を示すポリペプチドを包含する。
【００９６】
野生型第ＶＩＩａ因子に関して実質的に低められた生物学的活性を有する、変異体を包含する第ＶＩＩ関連ポリペプチドは、上記のように、１又は複数の凝固アッセイ、タンパク質加水分解アッセイ又はＴＦ結合アッセイにおいて試験される場合、同じ細胞型において生成された野生型第ＶＩＩａ因子の比活性の約２５％以下、好ましくは約１０％以下、より好ましくは約５％以下、及び最も好ましくは約１％以下を示すポリペプチドを包含する。野生型第ＶＩＩａ因子に関して実質的に修飾された生物学的活性を有する第ＶＩＩ因子変異体は、ＴＦ−無関係第Ｘ因子タンパク質分解活性を示す第ＶＩＩ因子変異体、及びＴＦを結合するが、しかし第Ｘ因子を分解しないそれらを包含する。
【００９７】
いくつかの態様においては、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、特に変異体であり、ここで前記第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの活性と前記生来のヒト第ＶＩＩａ因子（野生型第ＶＩＩａ因子）の活性との間の割合が、本発明の記載に記載されるような“インビトロ加水分解アッセイ”（下記アッセイを参照のこと）において試験される場合、少なくとも約１．２５であり；他の態様においては、前記割合は少なくとも約２．０であり；さらなる態様においては、前記割合は少なくとも約４．０である。
【００９８】
本発明のいくつかの態様においては、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、特に変異体であり、ここで、前記第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの活性と前記生来のヒト第ＶＩＩａ因子（野生型第ＶＩＩａ因子）の活性との間の割合が、本発明の記載に記載されるような“インビトロ加水分解アッセイ”（下記アッセイを参照のこと）において試験される場合、少なくとも約１．２５であり；他の態様においては、前記割合は少なくとも約２．０であり；さらなる態様においては、前記割合は少なくとも約４．０であり；さらなる態様においては、前記割合は少なくとも約８．０である。
【００９９】
いくつかの態様においては、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、例えば“アメリカ特許第４，７８４，９５０号（野生型第ＶＩＩ因子）に開示されるように、ヒト第ＶＩＩ因子である。いくつかの態様においては、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ヒト第ＶＩＩａである。１つの態様においては、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ヒト第ＶＩＩａ因子の生物学的比較性の少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも約５０％及び最も好ましくは少なくとも約７０％を示す第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドである。いくつかの態様においては、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸の挿入、欠失又は置換により野生型第ＶＩＩ因子の配列とは異なるアミノ酸配列を有する。
【０１００】
野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同じか又は改良された生物学的活性を有する第ＶＩＩ因子の非制限的例は、Ｓ５２Ａ−ＦＶＩＩ、Ｓ６０Ａ−ＦＶＩＩ（Ｉｉｎｏなど．， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｐｈｙｓ． ３５０： １８２−１９２， １９９８）； Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ， Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ−ＦＶＩＩ， Ｌ３０５Ｉ−ＦＶＩＩ， Ｌ３０５Ｔ−ＦＶＩＩ， Ｆ３７４Ｐ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ， Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ， Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ， Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＶＶＩＩ， Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ−ＦＶＩＩ， Ｋ１５７Ａ−ＦＶＩＩ， Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ， Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ−ＦＶＩＩ， Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ−ＦＶＩＩ及びＳ３３６Ｇ−ＦＶＩＩ；
【０１０１】
アメリカ特許第５，５８０，５６０号に開示されるような高められたタンパク質分解安定性を示すＦＶＩＩａ変異体；残基２９０と２９１との間、又は残基３１５と３１６との間でタンパク質分解的に切断されている第ＶＩＩａ因子（Ｍｏｌｌｅｒｕｐなど．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ４８： ５０１−５０５， １９９５）； 及び第ＶＩＩａ因子の酸化された形（Ｋｏｒｎｆｅｌｔなど．， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３６３： ４３−５４， １９９９）を包含する。
【０１０２】
野生型第ＶＩＩ因子に関して実質的に低められた又は修飾された生物学的活性を有する第ＶＩＩ因子変異体の非制限的例は、Ｒ１５２Ｅ−ＦＶＩＩａ（Ｗｉｌｄｇｏｏｓｅなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２９： ３４１３−３４２０， １９９０）， Ｓ３４４Ａ−ＦＶＩＩａ （Ｋａｚａｍａなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： ６６−７２， １９９５）， ＦＦＲ−ＦＶＩＩａ （Ｈｏｌｓｔなど．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｖａｓｃ． Ｅｎｄｏｖａｓｃ． Ｓｕｒｇ． １５： ５１５−５２０， １９９８）， 及びＧｌａドメインを欠いている第ＶＩＩａ因子（Ｎｉｃｏｌａｉｓｅｎなど．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ． ３１７： ２４５−２４９， １９９３）を包含する。化学的に修飾された第ＶＩＩ因子ポリペプチド及び配列変異体の非制限的例は、例えばアメリカ特許第５，９９７，８６４号に記載される。
【０１０３】
血液凝固における第ＶＩＩａ因子の生物学的活性は、（ｉ）組織因子（ＴＦ）に結合し、そして（ｉｉ）活性化された第ＩＸ又はＸ因子（それぞれ、第ＩＸａ又はＸａ因子）を生成するために第ＩＸは第Ｘ因子のタンパク質分解的切断を触媒するその能力に由来する。
【０１０４】
本発明のためには、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物学的活性（“第ＶＩＩ因子生物学的活性”）は、アメリカ特許第５，９９７，８６４号に記載のようにして、第ＶＩＩ因子欠失の血漿及びトロンボプラスチンを用いて、血液凝固を促進する調製物の能力を測定することによって定量化され得る。このアッセイにおいては、生物学的活性は、対照サンプルに関して凝固時間の減少として表され、そして１単位／ｍｌの第ＶＩＩ因子活性を含むプールされたヒト血清標準との比較により“第ＶＩＩ因子単位”に転換される。
【０１０５】
第ＶＩＩａ因子生物学的活性は、
（ｉ）脂質膜に埋封されたＴＦ及び第Ｘ因子を含んで成るシステムにおける活性化された第Ｘ因子（第Ｘａ因子）を生成する第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドの能力を測定し（Ｐｅｒｓｓｏｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： １９９１９−１９９２４， １９９７）；
（ｉｉ）水性システムにおける第Ｘ因子加水分解を測定し（“インビトロタンパク質加水分解アッセイ”；下記参照のこと）；
【０１０６】
（ｉｉｉ）表面プラスチン共鳴に基づいての装置を用いて第ＶＩＩａ因子又は第ＩＩａ因子関連ポリペプチドのＴＦへの物理的結合を測定（Ｐｅｒｓｓｏｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ． ４１３−３５９−３６３， １９９７）；
（ｉｖ）第ＶＩＩａ因子及び／又は第ＶＩＩａ因子関連ポリペプチドにより合成基質の加水分解を測定し（“インビトロ加水分解アッセイ”；下記参照のこと）；そして
（Ｖ）ＴＦ−無冠液インビトロシステムにおけるトロンビンの生成を測定することによって定量化され得る。
【０１０７】
用語“第ＶＩＩ因子生物学的活性”又は“第ＶＩＩ因子活性”とは、トロンビンを生成する能力を包含することを意図し；その用語はまた、組織因子の不在下で、活性化された血小板の表面上でのトロンビンを生成する能力を包含する。
本発明に従って使用され得る第ＶＩＩａ因子調製物は、ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｂ， Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｎｍａｒｋ） であるが、但しこれだけには限定されない。
【０１０８】
第ＩＸ因子ポリペプチド：
本発明は、第ＩＸ因子ポリペプチド、例えばＪａｙｅなど．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１： ２３２５−２３３５， １９８３に開示されるアミノ酸配列を有するそれら（野生型ヒト第ＩＸ因子）を包含する。
本発明の実施においては、出血を予防し、又は処理することにおいて効果的であるいずれかの第ＩＸ因子ポリペプチドが使用され得る。これは、血液又は血漿由来の、又は組換え手段により生成される第ＩＸ因子ポリペプチドを包含する。
【０１０９】
本明細書において使用される場合、“第ＩＸ因子ポリペプチド”とは、第ＩＸ因子及び第ＩＸ因子関連ポリペプチドを包含する。用語“第ＩＸ因子”とは、Ｊａｙｅなど．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １１： ２３２５−２３３５， １９８３に記載されるようなアミノ酸配列を有するポリペプチド（上記参照のこと）（野生型ヒト第ＩＸ因子）、及び他の種由来の野生型第ＩＸ因子、例えばウシ、ブタ、イヌ、ネズミ及びサケ第ＩＸ因子を包含することを意図する。
【０１１０】
それはさらに、１つの個人から他の個人に存在し、そして存在することができる第ＩＸ因子の天然の対立遺伝子変異を包含する。また、グリコシル化又は他の後―翻訳修飾の程度及び位置は、選択された宿主細胞及び宿主細胞環境の性質に依存して変化することができる。用語“第ＩＸ因子”とはまた、切断されていない（チモーゲン）形での第ＩＸ因子ポリペプチド、及び第ＩＸａ因子と呼ばれるそれらのそれぞれの生活性形を生成するよう、タンパク質加水分解的に処理されているそれらのペプチドを包含することを意図される。
【０１１１】
“第ＩＸ因子関連ポリペプチド”とは、ヒト第ＩＸ因子に関して化学的に修飾されているか、そして／又はヒト第ＩＸ因子（すなわち、第ＩＸ因子変異体）に関して１又は複数のアミノ酸配列変更を含み、そして／又はヒト第ＩＸ因子（すなわち、第ＩＸフラグメント）に関して、切断されたアミノ酸配列を含む第ＩＸポリペプチドを包含する。そのような第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、ヒト第ＩＸ因子に関する異なった性質、例えば安定性、リン脂質結合、変更された比活性及び同様のものを示すことができる。用語“第ＩＸ因子関連ポリペプチド”とは、切断されていない（チモーゲン）形でのそのようなポリペプチド、及び“第ＩＸ ａ因子関連ポリペプチド”又は“活性化された第ＩＸ因子関連ポリペプチド”と呼ばれるそれらのそれぞれの生活性形を生成するよう、タンパク質加水分解的に処理されているそれらのペプチドを包含することを意図される。
【０１１２】
本明細書において使用される場合、“第ＩＸ因子関連ポリペプチド”とは、野生型ヒト第ＩＸ因子に関して実質的に同じか又は改良された生物学的活性を示すポリペプチド、及び第ＩＸ因子生物学的活性が野生型ヒト第ＩＸ因子に関して実質的に修飾されているか又は低められているポリペプチドを包含する。それらのポリペプチドは、化学的に修飾されている第ＩＸ又は第ＩＸ因子、及びポリペプチドの生活性を修飾するか又は破壊する特定のアミノ酸配列変更が導入されている第ＩＸ因子変異体を包含する。
【０１１３】
それはさらに、わずかに修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えばＮ−末端アミノ酸欠失又は付加を包含する修飾されたＮ−末端を有するポリペプチド、及び／又はヒト第ＩＸ因子に関して化学的に修飾されているポリペプチドを包含する。
第ＩＸ因子の変異体を包含する第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、野生型第ＩＸ因子と実質的に同じか又はそれよりも良好な生活性を示すか、又は他方では、野生型第ＩＸ因子に関して実質的に修飾されているか又は低められた生活性を示しても、１又は複数のアミノ酸の挿入、欠失又は置換により野生型第ＩＸ因子の配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含するが、但しこれだけには限定されない。
【０１１４】
変異体を包含する第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、本明細書に記載のように、第ＩＸ因子活性アッセイにおいて試験される場合、同じ細胞型において生成された野生型第ＩＸ因子の比活性の少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、又は少なくとも約１３０％を示すポリペプチドを包含する。
【０１１５】
野生型第ＩＸ因子に関して実質的に同じか又は改良された生物学的活性を有する、変異体を包含する第ＩＸ関連ポリペプチドは、本明細書に記載のように、第ＩＸ因子活性アッセイにおいて試験される場合、同じ細胞型において生成された野生型ヒト第ＩＸ因子の比活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約１００％、より好ましくは少なくとも約１１０％、より好ましくは少なくとも約１２０％、及び最も好ましくは少なくとも約１３０％を示すポリペプチドを包含する。
【０１１６】
野生型第ＩＸ因子に関して実質的に低められた生物学的活性を有する、変異体を包含する第ＩＸ関連ポリペプチドは、本明細書に記載のように、第ＩＸ因子活性アッセイにおいて試験される場合、同じ細胞型において生成された野生型第ＩＸ因子の比活性の約２５％以下、好ましくは約１０％以下、より好ましくは約５％以下、及び最も好ましくは約１％以下を示すポリペプチドを包含する。
第ＩＸ因子ポリペプチドの非制限的例は、Ｃｈａｎｄｒａなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １９７３， ３２８： ４５６； Ａｎｄｅｒｓｓｏｎなど．， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ． １９７５， ７： ４５１； Ｓｕｏｍｅｌａなど．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９７６， ７１： １４５に記載されるような血漿由来のヒト第ＩＸ因子を包含する。
【０１１７】
いくつかの態様においては、第ＩＸ因子は、第ＩＸ因子関連ポリペプチドであり、ここで前記第ＩＸ因子関連ポリペプチドの活性と前記生来のヒト第ＩＸ因子（野生型第ＩＸ因子）の活性との間の割合が、本発明の記載に記載されるような“色原体アッセイ”において試験される場合、少なくとも約１．２５であり；他の態様においては、前記割合は少なくとも約２．０であり；さらなる態様においては、前記割合は少なくとも約４．０である。
【０１１８】
市販の第ＩＸ因子生成物（いわゆる、置換生成物）は、正常なプールされた血漿、又は遺伝的に構築された哺乳類細胞形に由来する。置換生成物はしばしば、比活性（タンパク質１ｍｇ当たりの凝固因子活性の国際単位；ＩＵ／ｍｇ）として定義される最終純度に従って分類される。中間生成物は、比較的低い比活性（＜５０ＩＵ／ｍｇ）を有する。なぜならば、それらはまた、外来の血漿タンパク質、例えばフィブリノーゲン、フィブロネクチン及び他の非凝固タンパク質を含むからである。高い純度（＞５０ＩＵ／ｍｇ）及び非常に高い純度（＞１６０ＩＵ／ｍｇ）は、安定剤として添加されるアルブミン以外の血漿タンパク質をほとんど含まないか又は実質的に含まない。
【０１１９】
本発明に従って使用され得る市販の第ＩＸ因子生成物（濃縮物及び調製物）の非制限的例は、例えばＡＨＰ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからのＢｅｎｅＦｉｘ（ｒＦＩＸ）， ＡｖｅｎｔｉｓからのＭｏｎｏｎｉｎｅ（ＦＩＸ）， ＢａｘｔｅｒからのＰｒｏｐｌｅｘ （ＦＩＸ）， ＢａｘｔｅｒからのＢｅｂｕｌｉｎ（ＦＩＸ複合体）， Ｌａｖｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｆｒａｃｔｉｏｎｎｅｍｅｎｔ ｅｔ ｄｅｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （ＬＦＢ） からのＦＡＣＴＥＵＲ ＩＸ−ＬＦＢ （ヒト血漿に基づくＦＩＸ）， Ｉｍｍｕｎｕｎｅ（Ｂａｘｔｅｒ ／Ｉｍｍｕｎｏ），Ｏｃｔａｎｙｎｅ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）， Ｏｃｔａｎｉｎｅ Ｆ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）， Ｍｏｎｏ ＦＩＸ−ＶＦ（ＣＳＬ）， Ｎｏｖａｃｔ Ｍ（Ｋａｋｅｔｓｕｋｅｎ）である。
【０１２０】
高い及び非常に高い活性生成物の非制限的例は、Ｉｍｍｕｎｕｎｅ（Ｂａｘｔｅｒ ／Ｉｍｍｕｎｏ）、Ｏｃｔａｎｙｎｅ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、Ｏｃｔａｎｉｎｅ Ｆ（Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ）、Ｍｏｎｏ ＦＩＸ−ＶＦ（ＣＳＬ）（すべて高い）；ＢｅｎｅＦｉｘ（ＡＨＰ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、Ｍｏｎｏｎｉｎｅ（Ａｖｅｎｔｉｓ）、Ｎｏｖａｃｔ Ｍ（Ｋａｋｅｔｓｕｋｅｎ） （すべて非常に高い）である。
【０１２１】
定義：
本発明においては、アミノ酸の３文字又は１文字表示が、表２に示されるようにそれらの従来の意味に使用されて来た。特にことわらない限り、本明細書に言及されるアミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。例えばＫ３３７における最初の文字は、示される位置の野生型第ＶＩＩ因子で天然において存在するアミノ酸を表し、そして例えばＫ３３７Ａ−ＦＶＩＩａはＦＶＩＩ−変異体を示し、ここで示される位置に天然において存在する１文字コードＫにより表されるアミノ酸が、１文字コードＡにより表されるアミノ酸により置換されることが理解されるべきである。
【０１２２】
【表２】
2004517949.tif 000003
【０１２３】
用語“第ＶＩＩ因子”又は“ＦＶＩＩ”は交換可能的に使用され得る。用語“第ＶＩＩａ因子”又は“ＦＶＩＩａ”は交換可能的に使用され得る。用語“第ＩＸ因子”又は“ＦＩＸ”は交換可能的に使用され得る。
【０１２４】
本明細書においては、“損なわれたトロンビン生成を有する対象”とは、活性化された血小板表面上でトロンビン破裂を生成し得ない対象を意味し、そして凝固因子、血小板及びフィブリノーゲンの正常な量及び機能を包含する、十分に機能する正常な止血システムを有する対象におけるトロンビン−生成よりも低いトロンビンの生成を有する対象を包含し、そして第ＩＸ因子を欠いている対象；低められた数の血小板又は欠陥機能を有する血小板を有する対象（例えば、血小板減少症又はグランツマン血小板無力症、又は過度の出血を有する対象）；低められたレベルのプロトロンビン、ＦＸ又はＦＶＩＩを有する対象；低められたレベルのいくつかの凝固因子を有する対象（例えば、外傷又は集中的手術の結果としての過度の出血のために）；及び低められた血漿濃度のフィブリノーゲンを有する対象（例えば、複数回の輸血を受けた対象）を包含する。
【０１２５】
用語“止血システムの増強”とは、トロンビンを生成する能力の増強を意味する。用語“止血を増強する”とは、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物を含む試験サンプルについての測定されたトロンビン生成が、同じロトンビン生成アッセイにおいて試験される場合、それぞれ、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド又は第ＩＸ因子ま又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドのみを含む対照サンプルの個々のトロンビン生成に対して延長される情況を包含することを意図する。トロンビン生成は、本明細書の記載のトロンビン生成アッセイに記載のようにしてアッセイされ得る（“アッセイ部分”を参照のこと）。
【０１２６】
凝塊溶解時間、フィブリン凝塊形成及び凝固時間は、患者の止血システムの状態をアッセイするために使用される臨床学的パラメーターである。血液サンプルは、適切な間隔で患者から採血され、そして１又は複数のパラメーターが、次の文献により記載のようにして、血栓弾性記録法によりアッセイされる：Ｍｅｈなど．， Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ＆ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ２００１， １２： ６２７−６３７； Ｖｉｇなど．， Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ６（３）ｐｐ． ２０５−２１３ （２００１）； Ｖｉｇ など．， Ｂｌｏｏｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ＆ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ， Ｖｏｌ． １２ （７） ｐｐ． ５５５−５６１ （２００１） Ｏｃｔ． ； Ｇｌｉｄｄｅｎなど．， Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ／ ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ， Ｖｏｌ． ６ （４） ｐｐ． ２２６−２３３ （２０００） Ｏｃｔ．； Ｍｃｋｅｎｚｉｅなど．， Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ９２ （４） ｐｐ． ２４０−２４７ （１９９９） Ａｐｒ．， ； 又はＤａｖｉｓなど．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｎｅｐｈｒｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ６ （４） ｐｐ． １２５０−１２５５ （１９９５）．
【０１２７】
用語“凝塊溶解時間の延長”とは、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物を含む試験サンプルについての測定された凝塊溶解時間が、同じ凝塊溶解アッセイにおいて試験される場合、それぞれ、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド又は第ＩＸ因子ま又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドのみを含む対照サンプルの個々の凝塊溶解時間に対して延長される情況を包含することを意図する。凝塊溶解時間は、上記に記載のようにしてアッセイされ得る。
【０１２８】
用語“凝塊強度を高める”とは、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物を含む試験サンプルについての測定された凝塊強度、例えば機械的強度が、同じ凝塊強度アッセイにおいて試験される場合、それぞれ、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド又は第ＩＸ因子ま又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドのみを含む対照サンプルの個々の凝塊溶解時間に対して延長される情況を包含することを意図する。凝塊強度は、例えばＣａｒｒなど．， １９９１， （Ｃａｒｒ ＭＥ， Ｚｅｋｅｒｔ Ｓｔ Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｏｒｃｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｄｕｒｉｎｇ ｐｌａｓｍａ ｃｌｏｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ． ＡＭ Ｊ ＭＥＤ ＳＣＩ １９９１， ３０２： １３−８） に記載のようにして、又は上記のようにして血栓弾性記録法によりアッセイされ得る。
【０１２９】
用語“フィブリン凝塊形成の増強”とは、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物を含む試験サンプルについての測定されたフィブリン凝塊形成の割合又は程度が、同じ凝固アッセイにおいて試験される場合、それぞれ、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド又は第ＩＸ因子ま又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドのみを含む対照サンプルの個々のフィブリン凝塊形成の割合又は程度に対して高められる情況を包含することを意図する。フィブリン凝塊形成は、上記のようにしてアッセイされ得る。
【０１３０】
用語“凝固時間の短縮”とは、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物を含む試験サンプルについての測定された凝塊形成についての時間が、同じ凝固アッセイにおいて試験される場合、それぞれ、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド又は第ＩＸ因子ま又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドのみを含む対照サンプルの個々の凝固時間に対して延長される情況を包含することを意図する。凝固時間は、当業者に知られている標準のＰＴ ｏｇ ａＰＴＴアッセイによりアッセイされ得る。
【０１３１】
本明細書において使用される場合、用語“出血障害”とは、出血症状の発現において出現される細胞又は分子起源の先天的、後天的又は誘発されたいずれかの欠陥を表す。出血障害の例は、凝固因子欠損（例えば、凝固因子ＶＩＩＩ， ＩＸ， ＸＩ又はＶＩＩの欠損）、凝固因子インヒビター、欠陥性血小板機能（例えば、グランツマン血小板無力症及びベルナール・スリエ症候群）、血小板減少症、ｖｏｎ Ｖｉｌｌｅｂｒａｎｄ病及び凝固タンパク質の希釈により引き起こされる凝固障害、高められたフィブリン溶解、及び出血及び／又は輸血による低められた数の血小板（例えば、手術又は外傷にゆだねられている複数回の輸血を受けた対象において）を包含するが、但し、それらだけには制限されない。
【０１３２】
出血は循環系のいずれかの成分からの血液の溢出を意味する。用語“出血性症状の発現”とは、手術、外傷又は組織損傷の他の形に関しての所望しない、制御されない及びしばしば過度の出血、及び出血性障害を有する対象における所望しない出血の包含を意味する。出血性症状の発現は、基本的に正常な凝固システムを有するが、しかし（一時的な）凝固障害を経験している対象、及び先天性又は後天性の凝固又は出血障害を有する対象において存在する。欠陥性血小板機能を有する対象においては、血友病におけるように止血システムが欠失しているか又は異常な必須凝固“化合物”（例えば、血小板又はｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ 因子タンパク質）を有するので、出血はたぶん、血友病により引き起こされる出血にたとえられ得る。
【０１３３】
手術又は莫大な外傷と共に、集中的な組織損傷を経験する対象においては、正常な止血機構は、即座の止血の要求により圧倒され、そしてそれらは、基本的に正常な止血機構（プレ−外傷又はプレ−手術）にかかわらず、過度の出血を進行することができる。しばしば、複数回の輸血を受けるそのような対象は、出血及び／又は輸血の結果として（すなわち、凝固タンパク質の希釈、高められたフィブリン溶解、及び出血及び／又は輸血による低められた数の血小板）凝固障害を進行せしめる。出血はまた、器官、例えば脳、耳の内部領域及び眼においても生じ；それらは手術による止血のための制限された可能性を有する領域であり、そして従って、満足の行く止血を達成するために問題でもある。
【０１３４】
類似する問題は、種々の器官（肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管）からの生検の採取工程において、及び腹腔手術及び基部恥骨後前立腺切除において発生する。出血が拡散性である（出血性胃炎及び多量の子宮出血）場合、すべてのそれらの情況に共通する手術技法（縫合、クリップ、等）により止血を行うことは困難である。出血はまた、欠陥性止血が与えられる治療により誘発されている。抗凝固療法上の対象において存在し；それらの止血はしばしば、急性及び多量である。抗凝固療法はしばしば、血栓塞栓性疾病を予防するために与えられる。そのような療法は、ヘパリン、プロテオグリカンの他の形、ワルファリン又はビタミンＫ−アンタゴニストの他の形、及びアスピリン及び他の血小板凝集インヒビター、例えば抗体又はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ活性の他のインヒビターを包含することができる。
【０１３５】
出血症状の発現はまた、急性出血性関節炎（関節の出血）、慢性血友病性関節症、血腫（例えば、血管、腹膜後、舌下及び咽頭後）、他の組織にいおける出血、血尿（腎臓路からの出血）、大脳出血、手術（例えば、肝切除）、抜歯及び胃腸出血（例えば、ＵＧＩ出血）を有する対象における手術又は外傷に関連しての制御されず、そして多量の出血を包含することを意味するが、但し、それらだけには限定されない。
【０１３６】
出血症状の発現は、次のものにも関係している：第ＩＸ因子に対するインヒビター；血友病Ａ；インヒビターによる血友病Ａ；血友病Ｂ；第ＶＩＩ因子の欠損；第ＸＩ因子の欠損；血小板減少症；ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の欠損（ｖｏｎ ｗｏｌｌｅｂｒａｎｄ病）；重度の組織損傷；重度の外傷；手術；腹腔鏡手術；出血性胃炎；生検の採取；抗凝固治療；上部胃腸管出血（ＵＧＩ）；又は幹細胞移植。出血症状の発現は、多量の子宮出血であり；機械的止血のための制限された可能性を有する器官において生じ；脳において生じ；耳の内部領域において生じ；又は眼において生じる。用語“止血症状の発現”及び“止血”は、適切な場合、交換可能的に使用され得る。
【０１３７】
本明細書においては、用語“処理”とは、出血を阻止するが又は最少にするために、例えば手術における予測される出血の予防、及び外傷におけるすでに存在する出血の調節の両者の包含を意味する。上記“予測される出血”とは、特定の組織又は器官において発生することが予測される出血であり得るか、又はそれは特定されていない出血であり得る。従って、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物の予防的投与は、用語“処理”に包含される。
【０１３８】
用語“対象”とは、本明細書において使用される場合、動物、特に哺乳類、例えばヒトを意味し、そして適切な場合、用語“患者”と交換可能的に使用され得る。
【０１３９】
本明細書において定義されるような第ＶＩＩ因子及び第ＶＩＩ因子ポリペプチド又は第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、同時に又は連続的に投与され得る。前記因子は、両凝固因子を含む単一用量形で、又は第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの調製物を含んで成る第１単位用量形及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物を含んで成る第２単位用量形を含んで成る部分キットの形で投与され得る。前記第２単位用量形は、高い、中位の又は低い活性の第ＩＸ因子生成物の形で存在することができる。高い活性の生成物が好ましい。組換え高−活性生成物が最も好ましい。第１、第２又は第３、等の単位用量が本明細書を通して言及される場合、これは投与の好ましい順序を示すものではなく、単なる便利目的のために示される。
【０１４０】
第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物の“同時”投与とは、一用量形での凝固因子タンパク質の投与、又は第１の凝固因子タンパク質の投与、続いて、１５分以下、好ましくは１０分以下、より好ましくは５分以下、より好ましくは２分以下の時間間隔で第２の凝固因子タンパク質の投与を意味する。いずれの因子でも最初に投与され得る。
【０１４１】
“連続的”投与とは、第１の凝固因子タンパク質の投与、続いて、２時間までの、好ましくは１〜２時間、より好ましくは１時間までの、より好ましくは３０分〜１時間、より好ましくは３０分までの、より好ましくは１５〜３０分の時間間隔で第２の凝固因子タンパク質の投与を意味する。２種の単位用量形、又は凝固因子タンパク質のいずれでも、最初に投与され得る。好ましくは、両生成物が同じ静脈内注射される。
【０１４２】
“第ＩＸ因子のレベル”又は“第ＩＸ因子レベル”とは、健康な対象におけるレベルに比較して、患者の凝固第ＩＸ因子活性のレベルを意味する。そのレベルは、正常レベルの％として示される。前記用語は、適切な場合、交換可能的に使用され得る。
“低められたレベルの第ＩＸ因子”又は“低められた第ＩＸ因子レベル”とは、凝固第ＩＸ因子欠損又は凝固第ＩＸ因子に対するインヒビターを有さない対象集団における平均第ＩＸ因子レベルに比較して、血流における第ＩＸ因子の％又は活性の低下を意味する。ヒト血漿からのその精製に基づいて、正常な成人における第ＩＸ因子の濃度は、１ｍｌの血漿当たり約３００〜４００ｎｇである。
【０１４３】
正常な健康な個人においては、第ＩＸ因子活性及び抗原レベルは、正常なプールされた血漿の５０〜１６０％で変化する。臨床学的に、循環性第ＩＸ因子のレベルは、凝固又は免疫学的アッセイにより測定され得る。第ＩＸ因子プロ凝固活性は、第ＩＸ因子欠失血漿の凝固時間を補正する患者の血漿の能力により決定される（例えば、ＡＰＴＴアッセイによる、下記を参照のこと；また、本発明の記載の“アッセイ部分”と参照のこと）。
【０１４４】
１単位の第ＩＸ因子は、正常な（プールされた）ヒト血漿（１００％の第ＩＸ因子レベルに対応する）１ｍｌに存在する第ＩＸ因子の量として定義される。
１単位の第ＶＩＩ因子は、約０．５μｇのタンパク質に対応する、１ｍｌの正常血漿に存在する第ＶＩＩ因子の量として定義される。活性化の後、５０単位は、約１μｇのタンパク質に対応する。
“欠失”とは、正常な健康な個人に比較して、血漿における第ＩＸ因子の％又は活性の低下を意味する。この用語は、適切な場合、“低められた第ＩＸ因子レベル”と交換可能的に使用され得る。
【０１４５】
“ＡＰＴＴ”又は“ａＰＴＴ”とは、活性化された部分的トロンボプラスチン時間を意味する（例えば、Ｐｒｏｃｔｏｒ， ＲＲ， Ｒａｐａｐｏｒｔ Ｓ１： Ｔｈｅ ｐａｒｔｉａｌ ｔｈｒａｍｂｏｐｌａｓｔｉｎ ｔｉｍｅ ｗｉｔｈ ｋａｏｌｉｎ； ａ ｓｉｍｐｌｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｆｉｒｓｔ ｓｔａｇｅ ｐｌａｓｍａ ｃｌｏｔｔｉｎｇ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ， Ａｍ Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ， ３６： ２１２， １９６１により記載される）。
“第ＩＸ因子応答性症候群”とは、対象に投与される外因性第ＩＸ因子が、症候群により引き起こされる、予測されるか又は存在するいずれかの症状、状態又は疾病を妨げ、治癒し、又は緩解することができる症候群を意味する。低められたレベルの第ＩＸ因子により引き起こされる症候群、例えば出血性障害、例えば血友病Ａ（但し、これだけには限定されない）、又は第ＩＸ因子に対するインヒビターにより引き起こされる症候群が包含される。
【０１４６】
“第ＶＩＩ因子応答性症候群”とは、対象に投与される外因性第ＶＩＩ因子、好ましくは第ＶＩＩａ因子が、症候群により引き起こされる、予測されるか又は存在するいずれかの症状、状態又は疾病を妨げ、治癒し、又は緩解することができる症候群を意味する。低められたレベルの凝固第ＶＩＩＩ， ＩＸ， ＸＩ又はＶＩＩ因子により引き起こされる症候群、例えば欠陥性血小板機能（例えば、グランツマン血小板無力症及びベルナール・スリエ症候群）、血小板減少症、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ病、及び凝固障害、例えば凝固タンパク質の希釈、高められたフィブリン溶解及び出血及び／又は輸血（例えば、手術又は外傷にゆだねられた、複数回の輸血を受けた対象における）のために低められた数の血小板により引き起こされるその障害が包含される。
【０１４７】
“半減期”とは、特定の値からその値の半分に低下する、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、又は第ＩＸ因子又は第ＶＩＩ因子ポリペプチドの血漿濃度について必要とされる時間を言及する。
“一次止血”とは、ＦＸａ及びＴＦ；第ＶＩＩａ因子によるトロンビンの初期生成、血小板の続く活性化、及びフィブリン及び最終的に、架橋されたフィブリンにより安定化されたことがない、活性化され、付着された血小板の初期のゆるい栓の形成を意味する。止血工程の第２段階の間（維持された止血）、形成されるフィブリンにより安定化されない場合、前記栓はフィブリン溶解システムにより容易に溶解される。
【０１４８】
“二次止血”又は“維持された止血”とは、活性化された血小板の表面上で起こり、そして第ＶＩＩａ因子及び第ＩＸａ因子により触媒されるトロンビンの二次の、十分な、及び主な破裂又は生成、フィブリンの続く形成、及び初期血小板栓の安定化を意味する。フィブリンによる栓の安定化が、十分な止血を導く。
“十分な止血”とは、出血を効果的に止め、そしてフィブリン溶解システムにより容易に溶解されない損傷の部位での安定し且つ個体のフィブリン凝塊の形成を意味する。これに関しては、用語、止血は、上記のように、十分な止血を表すために使用されるであろう。
【０１４９】
本明細書において使用される場合、凝固因子、例えば第ＩＸ因子の“調製物”とは、第ＩＸ因子が優性因子である調製物である。１つの態様においては、凝固因子は、合計量のタンパク質の２０％（ｗ／ｗ）以上、より好ましくは３０％、より好ましくは４０％、より好ましくは５０％、より好ましくは６０％、より好ましくは７０％、より好ましくは８０％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％の量で調製物に存在する。
好ましい態様においては、凝固因子は、合計量の凝固因子タンパク質の５０％（ｗ／ｗ）以上、より好ましくは８０％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％の量で存在する。
【０１５０】
そのような調製物におけるタンパク質の合計量は、一般的に知られている方法、例えば光学密度を測定することによって測定され得る。第ＩＸ因子凝固タンパク質の量は、一般的に知られている方法、例えば標準のＥＬＩＳＡ免疫アッセイにより測定され得る。一般的な用語においては、そのようなアッセイは、第ＩＸ因子タンパク質−含有の調製物の溶液と、ＥＬＩＳＡプレート上に固定された抗−ＦＩＸ抗体とを接触し、続いて、前記固定された抗体−第ＩＸ因子複合体と、マーカーを担持する第２の抗−ＦＩＸ抗体とを接触することによって行われ、ここで個々の量は、第３段階において測定される。
【０１５１】
個々の凝固因子の量は、適切な抗体を用いて、類似する手段で測定され得る。調製物に存在する凝固因子タンパク質の合計量は、個々の凝固因子タンパク質の量を加えることによって決定される。１つの態様においては、調製物は、単離された凝固因子を含んで成る。もう１つの態様においては、調製物は、凝固第ＩＩ因子及び凝固第ＩＩａ因子を含まない。
【０１５２】
本明細書において使用される場合、用語“単離された”とは、凝固因子、例えばそれらが合成される細胞、又はそれらが天然において見出される媒体（例えば、血漿又は血液）から分離された第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドを言及する。それらの起源の細胞からのポリペプチドの分離は、当業界において知られているいずれかの方法、例えば付着細胞培養物から所望する生成物を含む細胞培養培地の除去；非−付着細胞を除去するための遠心分離又は濾過；及び同様の手段（但し、それらだけには限定されない）により達成され得る。
【０１５３】
それらが天然において存在する媒体からのポリペプチドの分離は、当業界において知られているいずれかの方法、例えば、それぞれ抗−第ＶＩＩ因子又は抗−第ＩＸ因子抗体カラム上での親和性クロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動（ＩＥＦ））、示差的溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出及び同様の手段により達成され得る。
【０１５４】
略語：
ＴＦ：組織因子
ＦＶＩＩ：その一本鎖の不活性形での第ＶＩＩ因子
ＦＶＩＩａ：その活性化された形での第ＶＩＩ因子
ｒＦＶＩＩａ：その活性化された形での組換え第ＶＩＩ因子
第ＩＸ因子：そのチモーゲン活性の不活性形での第ＩＸ因子
第ＩＸａ因子：その活性化された形での第ＩＸ因子
ｒ第ＩＸ因子：組換え第ＩＸ因子
ｒ第ＩＸａ因子：組換え第ＩＸａ因子
【０１５５】
化合物の調製：
本発明への使用のために適切なヒト精製された第ＶＩＩａ因子は好ましくは、例えばＨａｇｅｎなど．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ２４１２−２４１６， １９８６， 又はヨーロッパ特許第２００，４２１号（ＺｙｍｏＧｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．）に記載のようにして、ＤＮＡ組換え技法により製造される。
【０１５６】
第ＶＩＩ因子はまた、Ｂｒｏｚｅａｎｄ Ｍａｊｅｒｕｓ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５ （４）： １２４２−１２４７， １９８０及びＨｅｄｎｅｒ ａｎｄ Ｋｉｓｉｅｌ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１： １８３６−１８４１， １９８３により記載される方法により生成され得る。それらの方法は、検出できる量の他の血液凝固因子を伴なわないで第ＶＩＩ因子を生成する。さらに精製された第ＶＩＩ因子調製物が最終精製段階として追加のゲル濾過を包含することによって得られ、次に、第ＶＩＩ因子が既知手段、例えばいくつかの異なった血漿タンパク質、例えば第ＸＩＩａ、 ＩＸ又はＸａ因子により、活性化された第ＶＩＩａ因子に転換される。他方では、Ｂｊｏｅｒｎなど．， （Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ， ２６９ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９８６， ｐｐ． ５６４−５６５） により記載されるように、第ＶＩＩ因子は、それをイオン交換クロマトグラフィーカラム、例えばＭｏｎｏ Ｑ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ） 又は同様の手段に通すことによって活性化され得る。
【０１５７】
第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩ因子の修飾により、又は組換え技法により生成され得る。野生型第ＶＩＩ因子に比較される場合、変更されたアミノ酸配列を有する第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩ因子をコードする核酸配列を、既知の手段、例えば特定部位の突然変異誘発を用いて、アミノ酸コドンを変更することにより、又は天然の第ＶＩＩ因子をコードする核酸におけるいくつかのアミノ酸コドンの除去により、野生型第ＶＩＩ因子をコードする核酸配列を修飾することによって生成される。
【０１５８】
置換が第ＶＩＩａ因子又は第ＩＸ因子−分子の機能に対して決定的な領域外で行われ、そして活性ポリペプチドをもたらすことは、当業者に明らかであろう。第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、又は第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドに必須であり、そして従って、好ましくは、置換を受けないアミノ酸残基は、当業者に知られている方法、例えば特定部位の突然変異誘発又はアラニン−走査突然変異誘発に従って同定され得る（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４： １０８１−１０８５を参照のこと）。
【０１５９】
後者の技法においては、突然変異が、分子におけるあらゆる正に荷電された残基で導入され、そして得られる変異体分子が、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、それぞれ架橋する凝固活性について試験される。基質−酵素相互作用の部位はまた、核磁気共鳴分析、結晶学又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、立体構造の分析により決定され得る（例えば、ｄｅ Ｖｏｓなど．， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： ３０６−３１２； Ｓｍｉｔｈなど．， １９９２， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４４： ８９９−９０４；  Ｗｌｏｄａｖｅｒなど．， １９９２， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３０９： ５９−６４を参照のこと）。
【０１６０】
１つのヌクレオチドともう１つのヌクレオチドとを交換するためへの核酸配列中への突然変異の導入が、当業界において知られているいずれかの方法を用いて、特定部位の突然変異誘発により達成され得る。興味ある挿入体、及び所望する突然変異を含む２種の合成プライマーと共に、スパーコイル二本鎖ＤＮＡベクターを使用する方法が特に有用である。ベクターの反対鎖に対してそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーは、ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ温度環化の間、延長する。
【０１６１】
プライマーの導入に基づいて、付着ニックを含む突然変異誘発されたプラスミドが生成される。温度環化に続いて、親ＤＮＡ鋳型を消化し、そして突然変異含有の合成されたＤＮＡについて選択するために、メチル化され、及び半メチル化されたＤＮＡに対して特異的である生成物がＤｐｎＩにより処理される。変異体を創造し、同定し、そして単離するために当業界において知られている他の方法、例えば遺伝子シャフリング又はファージ表示技法がまた使用され得る。
【０１６２】
それらの起源細胞化らのポリペプチドの分離は、当業界において知られているいずれかの方法、例えば付着細胞培養物からの所望する生成物を含む細胞培養培地の除去；非付着細胞を除去するための遠心分離又は濾過；及び同様の手段により達成され得る。
【０１６３】
任意には、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子ポリペプチドはさらに精製され得る。精製は、当業界において知られているいずれかの方法、例えば抗−第ＶＩＩ因子抗体カラム上での親和性クロマトグラフィー（例えば、Ｗａｋａｂａｙａｓｈｉなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１： １１０９７， １９８６； 及びＴｈｉｍなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７： ７７８５， １９８８を参照のこと）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動（ＩＥＦ））、示差的溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出及び同様の手段を用いて達成され得る。
【０１６４】
一般的には、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８２； 及びＰｒｏｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｊ． Ｃ． Ｊａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｌａｒｓ Ｒｙｄｅｎ， ｅｄｉｔｏｒ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９を参照のこと。精製に続いて、調製物は、好ましくは約１０重量％以下、より好ましくは約５重量％以下及び最も好ましくは約１％以下の宿主細胞由来の非ＶＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドを含む。
【０１６５】
第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、第ＩＩａ因子、又はトリプトシン様特異性を有する他のプロテアーゼ、例えば第Ｉｘａ因子及びトロンビンを用いて、タンパク質分解性切断により活性化され得る。例えば、Ｏｓｔｅｒｕｄなど．，Ｂｉｏｃｈｅｍ． １１： ２８５４（１９７２）；Ｔｈｏｍａｓ、アメリカ特許第４，４５６，５１１号；及びＨｅｄｎｅｒなど．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７１： １８３６ （１９８３） を参照のこと。第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、それをイオン交換クロマトグラフィーカラム、例えばＭｏｎｏ Ｑ（商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 又は同様の手段に通すことによって活性化され得る。次にその得られる活性化された第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、下記のようにして配合され、そして投与され得る。
【０１６６】
本発明内に使用するための第ＩＸ因子は、既知方法、例えば、Ｃｈａｎｄｒａなど．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １９７３， ３２８： ４５６； Ａｎｄｅｒｓｓｏｎなど．， Ｔｈｒｏｍｂ． Ｒｅｓ． １９７５， ７： ４５１； Ｓｕｏｍｅｌａなど．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９７６， ７１： １４５により開示されるそれらの方法に従って、血漿から単離され得る。しかしながら、疾病伝達の危険性を担持する血液−又は組織−由来の生成物の使用を回避するために組換え第ＩＸ因子を使用することが好ましい。本発明への使用のために適切なヒト精製された第ＩＸ因子は好ましくは、例えばＥＰ １０７２７８ （Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）， アメリカ特許第５１７１５６９号（Ｎａｔ． ｒｅｓ． Ｄｅｖ． Ｃｏｒｐ．）， ＥＰ４５０９３０ （Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ）により記載のようにして、ＤＮＡ組換え技法により製造される。
【０１６７】
第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、野生型第ＩＸ因子の修飾により、又は組換え技法により生成され得る。野生型第ＩＸ因子に比較される場合、変更されたアミノ酸配列を有する第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、野生型第ＩＸ因子をコードする核酸配列を、既知の手段、例えば特定部位の突然変異誘発を用いて、アミノ酸コドンを変更することにより、又は天然の第ＩＸ因子をコードする核酸におけるいくつかのアミノ酸コドンの除去により、野生型第ＩＸ因子をコードする核酸配列を修飾することによって生成される。
【０１６８】
それらの起源細胞化らのポリペプチドの分離は、当業界において知られているいずれかの方法、例えば付着細胞培養物からの所望する生成物を含む細胞培養培地の除去；非付着細胞を除去するための遠心分離又は濾過；及び同様の手段により達成され得る。任意には、第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子ポリペプチドはさらに精製され得る。
【０１６９】
精製は、当業界において知られているいずれかの方法、例えば抗−第ＶＩＩ因子抗体カラム上での親和性クロマトグラフィー；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー（例えば、アメリカ特許第６０３４２２２号に記載される）；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動（ＩＥＦ））、示差的溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、又は抽出及び同様の手段を用いて、上記により詳細に記載されるように、達成され得る。精製に続いて、調製物は、好ましくは約１０重量％以下、より好ましくは約５重量％以下及び最も好ましくは約１％以下の宿主細胞由来の非ＶＩＩ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドを含む。次に、その得られる活性化された第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、下記のようにして配合され、そして投与され得る。
【０１７０】
当業者により理解されるように、免疫応答の誘発の危険性を低めるために、対象と同系の第ＩＸ因子ポリペプチド及び第ＶＩＩ因子ポリペプチドを使用することが好ましい。非ヒト第ＩＸ因子の調製物及び特徴化は、例えばＦｕｊｉｋａｗａなど．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９７３， １２： ４９３８（ウシＦＩＸ）により開示されている。本発明はまた、獣医学的方法内へのそのような第ＩＸ因子ポリペプチド及び第ＶＩＩ因子ポリペプチドの使用を包含する。
【０１７１】
医薬組成物及び使用方法：
本発明の調製物は、いずれかの第ＩＸ因子応答性症候群、例えば出血性障害、例えば凝固因子欠失（例えば、血友病Ｂ）又は第ＩＸ因子に対する（低い又は中位に力価の）インヒビターにより引き起こされるそれらの障害を処理するために使用され得る。
【０１７２】
本発明の調製物は、いずれかの第ＶＩＩ因子応答性症候群、例えば出血性障害、例えば低められたレベルの凝固第ＶＩＩＩ、ＩＸ、ＸＩ又はＶＩＩ因子、凝固因子インヒビター、欠失性血小板機能により引き起こされる症候群（例えば、グランツマン血小板無力症及びベルナール・スリエ症候群）、血小板減少症、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ病、及び凝固障害、例えば凝固タンパク質の希釈、高められたフィブリン溶解、及び出血及び／又は輸血のために低められた数の血小板により引き起こされる凝固障害（例えば、手術又は外傷にゆだねられた、複数回、輸血された対象における）を処理するために使用され得る。
【０１７３】
本発明の第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物を含んで成る医薬組成物は、主に、予防及び／又は治療処理のための非経口投与のために意図される。好ましくは、医薬組成物は、非経口、すなわち静脈内、皮下又は筋肉内投与され；静脈内投与が最も好ましい。それらはまた、連続した又は拍動性注入により投与され得る。
【０１７４】
本発明の医薬組成物又は製剤は、医薬的に許容できるキャリヤー、好ましくは水性キャリヤー又は希釈剤と組合しての、又は希釈剤としての、又は好ましくはそれに溶解された、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物、又は第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物と組合しての第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物を含んで成る。種々の水生キャリヤー、例えば水、緩衝された水、０．４％塩溶液、０．３％グリシン及び同様のものが使用され得る。
【０１７５】
本発明の調製物はまた、非水性キャリヤーを用いて、例えば損傷の部位への供給又はその部位を標的化するために、ゲルの形で、又はリポソーム調製物として配合され得る。リポドーム調製物は一般的に、例えばアメリカ特許第４，８３７，０２８号、第４，５０１，７２８号及び第４，９７５，２８２号に記載される。組成物は、従来の良く知られている滅菌技法により滅菌され得る。得られる水溶液は、使用のために包装されるか、又は無菌条件下で濾過され、そして凍結乾燥され、凍結乾燥された調製物は、投与の前、無菌水溶液と組合される。
【０１７６】
組成物は、医薬的に許容できる助剤物質又はアジュバンド、例えばｐＨ調節及び緩衝剤、及び／又は張度調節剤，例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、等を含むことができる。
製剤はさらに、１又は複数の希釈剤、乳化剤、保存剤、緩衝剤、賦形剤、等を含むことができ、そして溶液、粉末、エマルジョン、調節された放出、等のような形で供給され得る。当業者は、適切な態様で、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇｅｎｎａｒｄ， ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＣＯ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， １９００に開示される許容される実施に従って、本発明の組成物を配合することができる。従って、静脈内注入のための典型的な医薬組成物は、２５０ｍｌの無菌リンアガー液及び１０ｍｇの前記調製物を含むよう調製され得る。
【０１７７】
本発明の調製物を含む組成物は、予防及び／又は治療処理のために投与され得る。治療用途においては、組成物は、上記のような疾病をすでに有する対象に、疾病又はその合併症の臨床学的発現を治癒し、緩解し、又は部分的に阻止するのに十分な量で投与される。個々の目的のための有効量は、疾病又は損傷の重傷度、及び対象の体重及び一般的状態に依存するであろう。適切な用量の決定が、通常の実験を用いて、値のマトリックスを構成し、そしてそのマトリックスにおける異なった点を試験することによって達成され得る。
【０１７８】
本発明の調製物の局部供給、例えば局部投与は、スプレー、灌流、二重バルーンカテーテル、血管移植片又はステント中に挿入されるステント、バルーンカテーテルを被覆するために使用されるヒドロゲル、又は他の良く確立された方法により行われ得る。いずれにせよ、医薬組成物は、病状を効果的に処理するために十分な量の調製物を提供すべきである。
【０１７９】
それらの配合物における第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチド、又は第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドと組合しての第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの濃度は、広く変化し、すなわち約０．５重量％以下、通常約１重量％又は少なくとも約１重量％〜１５又は２０重量％で変化し、そして主に流体体積、粘度、等により、選択された投与の特定の態様に従って選択されるであろう。
【０１８０】
注射又は注入、特に注入による投与が好ましい。従って、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、静脈内投与のために適切な形で、例えば溶解された凍結乾燥粉末、又は第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの両者を含む、単一用量形での液体製剤であるか、又は溶解された凍結乾燥粉末、又は第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドを含む、単一用量形での液体製剤及び溶解された凍結乾燥粉末、又は第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドを含む、他の用量形での液体製剤である調製物の形で調製される。
【０１８１】
第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの量及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの量が共に、出血症状の発現を処理するための合計の効果的な量を含んで成ることが理解されるべきである。
本発明の材料は一般的に、重症の疾病又は損傷状態、すなわち生命脅威の又は実質的に生命脅威の情況において使用され得ることが考慮されるべきである。そのような場合、ヒトにおける外来性物質の最少化及び第ＶＩＩａ因子及び第ＩＸ因子の免疫原生の一般的な欠失の観点から、実質的に過剰のそれらの組成物を投与することは可能であり、そして処理する医者により所望されると思われる。
【０１８２】
予防的適用においては、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物を含む組成物は、対象自身の凝固能力を増強するために疾病状態又は損傷に対して敏感な又は他方では、その危険性下にある対象に投与される。そのような量は、“予防的有効用量”であると定義される。第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの量及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの量は共に、出血症状の発現を予防するための効果的な量を含んで成ることは理解されるべきである。
【０１８３】
組成物の単一又は複数回の投与は、処理を行う医者により選択される用量レベル及びパターンで行われ得る。組成物は、１日又は１週当たり１又は複数回、投与され得る。そのような医薬組成物の有効量は、出血症状の発現に対して臨床学的に有意な効果を提供する量である。そのような量は、対象の処理される特定の状態、年齢、体重及び一般的な健康、並びに当業者に明らかな他の要因に一部、依存するであろう。
【０１８４】
本発明の組成物は一般的に、予測される出血の前又は出血の開始で、単一用量で投与される。しかしながら、それは、与えられる用量及び対象の状態に依存して、２−４〜６−１２時間の間隔で反復して（複数回の用量で）与えられ得る。
意図的な介入性に関する処理に関しては、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは典型的には、介入を行う前、約２４時間以内に投与され、そしてその後、７日又はそれ以上の間、投与されるであろう。凝固剤としての投与は、本明細書に記載のような種々の経路により行われ得る。
【０１８５】
組成物は、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物の両者を、適切な濃度で含む単一調製物の形（単一用量形）で存在することができる。組成物はまた、第ＶＩＩ因子又は第ＩＩ関連ポリペプチドの調製物を含んで成る第１単位用量形及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物を含んで成る第２単位用量形から成る部分キットの形で存在することができる。この場合、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドは、１つのものの後に、他のものを、好ましくは、お互い約１５分以内に、例えば１０分以内に、又は好ましくは５分以内に、又はより好ましくは２分以内に投与されるべきである。２種の単位用量形のいずれでも最初に投与され得る。
【０１８６】
キットは、少なくとも２種の別々の医薬組成物を包含する。キットは、別々の組成物を含むための容器手段、例えば分割されたボトル又は分割された箔ポケットを包含する。典型的には、キットは別々の成分の投与のための使用法を包含する。そのキット形は、別々の成分が好ましくは、異なった用量形で投与され、異なった投与間隔で投与され、又は組み合わせの個々の成分の力価が処方する医者により所望される場合、特に好都合である。
【０１８７】
本発明に従って投与される第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの量及び第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドの量は、約１：１００〜約１００：１（ｗ／ｗ）の割合で変化することができる。従って、第ＶＩＩ因子：第ＩＸ因子の割合は、例えば約１：１００， １：９０， １：８０， １：７０， １：６０， １：５０， １：４０， １：３０， １：２０， １：１０， １：５， １：２， １：１， ２：１， ５：１， １０：１， ２０：１， ３０：１， ４０：１， ５０：１， ６０：１， ７０：１， ８０：１， ９０：１又は１００：１；又は約１：９０〜約１：１、約１：８０〜約１：２、約１：７０〜約１：５， 約１：６０〜約１：１０、約１：５０〜約１：２５、約１：４０〜１：３０、約９０：１〜約１：１、約８０〜約２：１、約７０：１〜約５：１、約６０：１〜約１０：１、約５０：１〜約２５：１、又は約４０：１〜約３０：１であり得る。
【０１８８】
第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ関連ポリペプチドの用量は、対象の体重、病状及び病状の重症度に依存して、７０Ｋｇの対象に関して、１日当たり約０．０５ｍｇ〜約５００ｍｇ、例えば約１ｍｇ〜約２００ｍｇ、又は約５ｍｇ〜約１７５ｍｇの範囲である。
第ＩＸ因子又は第ＩＸ関連ポリペプチドの用量は、対象の体重、病状及び病状の重症度に依存して、７０Ｋｇの対象に関して、１日当たり約０．０１ｍｇ〜約５００ｍｇ、例えば約１ｍｇ〜約２００ｍｇ、又は約５ｍｇ〜約１７５ｍｇの範囲である。
第ＩＸ因子又は第ＩＸ関連ポリペプチドの用量は、対象の体重、病状及び病状の重症度に依存して、７０Ｋｇの対象に関して、１日当たり約０．０５ｍｇ〜約５００ｍｇ、例えば約１ｍｇ〜約２００ｍｇ、又は約１ｍｇ〜約１７５ｍｇの範囲である。
【０１８９】
低められたレベルの第ＩＸ因子により対象を処理する場合、下記用量が好ましい：
正常な第ＩＸ因子活性の１０％までの血漿活性レベルに第ＩＸ又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドを投与する場合：
好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：１５−３００μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．；
より好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：３０−２５０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．；
最も好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：６０−１８０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．。
【０１９０】
正常な第ＩＸ因子活性の３０％までの血漿活性レベルに第ＩＸ又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドを投与する場合：
好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：１５−３００μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．；
より好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：３０−２５０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．；
最も好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：６０−１８０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．。
【０１９１】
正常な第ＩＸ因子活性の５０％までの血漿活性レベルに第ＩＸ又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドを投与する場合：
好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：１０ −３００μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．；
より好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：２０−２００μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．；
最も好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：４０−１４０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．。
【０１９２】
正常な第ＩＸ因子活性の８０％までの血漿活性レベルに第ＩＸ又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドを投与する場合：
好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：５−３００μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．；
より好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：１０−１８０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．；
最も好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：６０−１２０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．。
【０１９３】
正常な第ＩＸ因子活性の１００％までの血漿活性レベルに第ＩＸ又は第ＩＸ因子関連ポリペプチドを投与する場合：
好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：５−３００μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．；
より好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：１０−１８０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．；
より好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：３０−１２０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．；
最も好ましい第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドレベル：６０−１２０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．。
【０１９４】
しかしながら、８０％の正常な第ＩＸ因子活性の最大の第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチド用量は、より高い置換レベルが血栓合併症の高められた発生に関連しているので、めったに限度を越えられないであろう。
投与量は、１単位／ｋｇ ｂ．ｗ．のＦＩＸ置換が約０．０１Ｕ／ｍｌ（１％）、血漿活性を高めることを仮定することによって計算され得る。患者の第ＩＸ因子レベルは、適切な間隔で血液サンプルを採取し、そして第ＩＸ因子活性について分析することによってモニターされる（上記を参照のこと）。
【０１９５】
アッセイ：
第ＶＩＩａ活性についての試験；
第ＶＩＩａ活性について試験し、そしてそれにより、適切な第ＶＩＩａ因子変異体を選択するための適切なアッセイは、単純な予備インビトロ試験として行われ得る。
【０１９６】
インビトロ加水分解アッセイ：
生来（野生型）の第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩａ因子変異体（両社は、この後、“第ＶＩＩａ因子として言及される）が、比活性についてアッセイされ得る。それらはまた、同時に、それらの比活性を直接的に比較するためにアッセイされ得る。アッセイは、マイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ， Ｄｅｎｍａｒｋ）において行われる。
【０１９７】
色原体基質Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２２８８、Ｃｈｒａｍｏｇｅｎｉｘ， Ｓｗｅｄｅｎ； １ｍＭの最終濃度）が、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ， ｐＨ７．４， ０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２及び１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンの溶液中、第ＶＩＩａ因子（最終濃度１００ｎＭ）に添加される。４０５ｎｍでの吸光度が、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ ３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＵＳＡ）により連続して測定される。酵素を含まないブランクウェルにおける吸光度の控除の後、２０分間のインキュベーションの間に進行する吸光度が、変異体と野生型第ＶＩＩａ因子との間の活性の割合いを計算するために使用される：
割合＝（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩ因子変異体）／（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩａ因子野生型）。
【０１９８】
これに基づけば、生来の第ＶＩＩａ因子に相当するか又はそれよりも高い活性を有する第ＶＩＩａ変異体、例えば変異体の活性と生来の第ＶＩＩ因子（野生型第ＶＩＩ因子）の活性との間の割合が約１．０以上である。
第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩａ因子変異体の活性はまた、適切には、１００−１０００ｎＭの濃度で、生理学的基質、例えば第Ｘ因子を用いて測定され得、ここで生成される第Ｘａ因子は、適切な色原体基質（例えば、Ｓ−２７６５）の添加の後、測定される。さらに、活性アッセイは、生理学的温度で行われ得る。
【０１９９】
インビトロタンパク質加水分解アッセイ：
生来（野生型）の第ＶＩＩａ因子及び第ＶＩＩａ因子変異体（両者とも、この後、“第ＶＩＩａ因子”として言及される）が同時に、それらの比活性を直接的に比較するためにアッセイされる。アッセイは、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ， ｐＨ７．４， ０．１ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２及び１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンの溶液１００μｌ中、第ＶＩＩａ因子（１０ｎＭ）及び第Ｘ因子（０．８μＭ）を含むマイクロタイタープレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ， Ｎｕｎｃ， Ｄｅｎｍａｒｋ）において行われる。
【０２００】
次に、第Ｘ因子分解が、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ， ｐＨ７．４，０．１ＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＥＤＴＡ及び１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンの溶液５０μｌの添加により停止される。生成される第Ｘａ因子の量は、色原体基質Ｚ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリド（Ｓ−２７６５， Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ， Ｓｗｅｄｅｎ）（最終濃度０．５ｍＭ）の添加により測定される。４０５ｎｍでの吸光度が、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘＴＭ ３４０プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ， ＵＳＡ）により連続して測定される。酵素を含まないブランクウェルにおける吸光度の控除の後、１０分間のインキュベーションの間に進行する吸光度が、変異体と野生型第ＶＩＩａ因子との間の活性の割合いを計算するために使用される：
割合＝（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩ因子変異体）／（Ａ４０５ｎｍ第ＶＩＩａ因子野生型）。
【０２０１】
これに基づけば、生来の第ＶＩＩａ因子に相当するか又はそれよりも高い活性を有する第ＶＩＩａ変異体、例えば変異体の活性と生来の第ＶＩＩ因子（野生型第ＶＩＩ因子）の活性との間の割合が約１．０以上である。
【０２０２】
トロンビン生成アッセイ：
トロンビンを生成する第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド（例えば、変異体）、又は第ＩＸ因子又は第ＩＸ因子関連ポリペプチド（例えば、変異体）の能力は、すべての適切な凝固因子及び生理学的濃度でのインヒビター、及び活性化された血小板を含んで成るアッセイにおいて測定され得る（引用により本明細書に組込まれる、Ｍｏｎｒｏｅなど．， （１９９７） Ｂｒｉｔ． Ｊ． Ｈａｅｍａｔｏｌ． ９９： ５４２−５４７の５４３ページに記載される）。
【０２０３】
第ＩＸ活性についての試験：
第ＩＸ因子活性について試験し、そしてそれにより、本発明への使用のための適切な第ＩＸ因子変異体を選択するための手段を提供するための適切なアッセイが、例えばＷａｇｅｎｖｏｏｒｄなど．，Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ １９９０： ２０（５）： ２７６−８８に記載のようにして、単純なインビトロ試験として行われ得る（“色原体アッセイ”）。
【０２０４】
第ＩＸ因子生物学的活性はまた、Ｎｉｌｓｓｏｎなど．， （Ｎｉｌｓｓｏｎ ＪＭ， Ｂｌｏｍｂａｅｃｋ Ｍ， Ｔｈｉｌｅｎ Ａ， Ｖｏｎ Ｆｒａｎｃｋｅｎ Ｉ．， Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ａ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｓｔｕｄｙ， Ａｃｔａ Ｍｅｄ Ｓｃａｎ １９５９； １６３： ３５７） に記載のようにして、第ＩＸ因子欠失血漿の凝固時間を補正する調製物の能力を測定することによって定量化され得る。このアッセイにおいては、生物学的活性は、単位／ｍｌ血漿として表される（１単位は、正常なプールされた血漿に存在するＦＩＸの量に対応する）。
【０２０５】
本発明の観点：
１つの観点においては、本発明は、ＦＶＩＩポリペプチド及びＦＩＸポリペプチドを、単独の活性凝固因子として含んで成る医薬組成物に関する。１つの態様においては、ＦＶＩＩポリペプチドは、ヒト組換えＦＶＩＩａである。１つの態様においては、ＦＩＸポリペプチドは、ヒト組換えＦＩＸである。１つの態様においては、ＦＶＩＩポリペプチド及びＦＩＸポリペプチドは混合される。１つの態様においては、ＦＶＩＩポリペプチド及びＦＩＸポリペプチドは別々の容器に存在する。１つの態様においては、組成物は家庭用処理のためである。
【０２０６】
もう１つの観点においては、本発明は、
ａ）第１単位用量形での有効量の第ＶＩＩ因子又はＶＩＩ因子関連ポリペプチドの調製物、及び医薬的に許容できるキャリヤー；
ｂ）第２単位用量形での有効量の第ＩＸ因子又はＩＸ因子関連ポリペプチドの調製物、及び医薬的に許容できるキャリヤー；及び
ｃ）前記第１及び第２用量形を含むための容器手段を含んで成るキットを含んで成る、出血症状の発現の処理のためのキットに関する。
【０２０７】
１つの態様においては、ＦＶＩＩポリペプチドは、ヒト組換えＦＶＩＩａである。１つの態様においては、ＦＩＸポリペプチドは、ヒト組換えＦＩＸである。１つの態様においては、キットは、家庭の処理のためである。もう１つの観点においては、本発明は、低められたレベルのＦＩＸを有する態様における出血の処理のための薬剤の調製のためへのＦＶＩＩポリペプチド及びＦＩＸポリペプチドの使用に関する。
【０２０８】
１つの態様においては、薬剤は、血友病Ａ患者における出血症状の発現の処理のためである。１つの態様においては、薬剤は、ＦＶＩＩポリペプチド及びＦＩＸポリペプチドの混合物を含んで成る。１つの態様においては、薬剤は、ＦＶＩＩポリペプチドを含んで成る第１用量形及びＦＩＸポリペプチドを含んで成る第２用量形で調製される。１つの態様においては、ＦＶＩＩポリペプチドは、ヒト組換えＦＶＩＩａである。１つの態様においては、ＦＩＸポリペプチドは、ヒト組換えＦＩＸである。
【０２０９】
もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固タンパク質としてのＦＩＸにより処理される場合に比較して、ＦＩＸ応答症候群を有する対象における止血を増強するための方法に関し、ここで前記方法は、有効量のＦＶＩＩポリペプチド及び有効量のＦＩＸポリペプチドを、その必要な対象に投与することを含んで成る。  もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固タンパク質としてのＦＩＸにより処理される場合に比較して、低められたレベルのＦＩＸを有する対象における止血を増強するための方法に関し、ここで前記方法は、有効量のＦＶＩＩポリペプチド及び有効量のＦＩＸポリペプチドを、その必要な対象に投与することを含んで成る。
【０２１０】
もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固タンパク質としてのＦＩＸにより処理される場合に比較して、ＦＩＸ応答症候群を有する対象におけるトロンビンに形成を増強するための方法に関し、ここで前記方法は、有効量のＦＶＩＩポリペプチド及び有効量のＦＩＸポリペプチドを、その必要な対象に投与することを含んで成る。
【０２１１】
もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固タンパク質としてのＦＩＸにより処理される場合に比較して、低められたレベルのＦＩＸを有する対象におけるトロンビンに形成を増強するための方法に関し、ここで前記方法は、有効量のＦＶＩＩポリペプチド及び有効量のＦＩＸポリペプチドを、その必要な対象に投与することを含んで成る。
【０２１２】
もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固タンパク質としてのＦＩＸにより処理される場合に比較して、ＦＩＸ応答症候群を有する対象における止血を達成するために必要とされる凝固因子タンパク質の投与の回数を低めるための方法に関し、ここで前記方法は、有効量のＦＶＩＩポリペプチド及び有効量のＦＩＸポリペプチドを、その必要な対象に投与することを含んで成る。
【０２１３】
もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固タンパク質としてのＦＩＸにより処理される場合に比較して、低められたレベルのＦＩＸを有する対象における止血を達成するために必要とされる凝固因子タンパク質の投与の回数を低めるための方法に関し、ここで前記方法は、有効量のＦＶＩＩポリペプチド及び有効量のＦＩＸポリペプチドを、その必要な対象に投与することを含んで成る。
【０２１４】
もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固タンパク質としてのＦＩＸにより処理される場合に比較して、ＦＩＸ応答症候群を有する対象における止血を達成するために必要とされる凝固因子タンパク質の投与の量を低めるための方法に関し、ここで前記方法は、有効量のＦＶＩＩポリペプチド及び有効量のＦＩＸポリペプチドを、その必要な対象に投与することを含んで成る。
【０２１５】
もう１つの観点においては、本発明は、対象が唯一の凝固タンパク質としてのＦＩＸにより処理される場合に比較して、低められたレベルのＦＩＸを有する対象における止血を達成するために必要とされる凝固因子タンパク質の投与の量を低めるための方法に関し、ここで前記方法は、有効量のＦＶＩＩポリペプチド及び有効量のＦＩＸポリペプチドを、その必要な対象に投与することを含んで成る。
【０２１６】
もう１つの観点においては、本発明は、ＦＩＸ応答性症候群を有する対象における出血を処理するため方法に関し、ここで前記方法は、有効量のＦＶＩＩポリペプチド及びＦＩＸポリペプチドを、その必要な対象の投与することを含んで成る。
もう１つの観点においては、本発明は、低められたレベルのＦＩＸを有する対象における出血を処理するため方法に関し、ここで前記方法は、有効量のＦＶＩＩポリペプチド及びＦＩＸポリペプチドを、その必要な対象の投与することを含んで成る。
【０２１７】
本発明の１つの態様においては、ＦＶＩＩポリペプチドは、ヒト組換えＦＶＩＩａである。１つの態様においては、ＦＩＸポリペプチドは、ヒト組換えＦＩＸである。１つの態様においては、対象は、血友病Ｂを有する。
本発明は次の例により、さらに例示されるが、但し本発明の範囲を制限するものではない。前述の記載及び次の例に開示される特徴は、その種々の形で本発明を実現するために、別々に及びそれらのいずれかの組合せで使用され得る。
【０２１８】
実施例
例１．頭蓋内出血を有する血友病患者のインビボ処理
頭蓋内出血を有する非インヒビター血友病Ｂ患者を、市販のＦＩＸ生成物により処理する場合、患者は一般的に、止血を達成するためにＦＩＸの注射又は注入を８〜１６ 回必要であろう。ＦＩＸ注入は、正常なレベルの少なくとも８０％の初期ＦＩＸ血漿濃度、続いて１週間、５０％の血漿濃度を達成することを意図する。
【０２１９】
そのような患者を、９０−１８０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ， Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｎｍａｒｋ） 及び同時に投与されるＦＩＸ生成物の１回の用量、又は９０−１８０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ． のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ， Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｎｍａｒｋ） 及び５分以内の間隔でのＦＩＸ生成物の１回の投与により処理する。両生成物は同じ静脈を通して注射される。患者は、出血の阻止を得るために減じられた時間、及び止血を維持するために低められた注射回数を経験する。このレジメは、出血の阻止及び止血のための低められた合計量の凝固因子タンパク質使用法を導く。
【０２２０】
例２．拡散性胃腸上部出血と共に慢性肝疾患を有する患者のインビボ処理
患者は、未知の病因の出血性胃炎のために拡散性胃出血を有する。患者は、慢性Ｃ型肝炎に続いて低められた肝機能のために、低められた量のビタミンＫ依存性凝固因子、特に第ＶＩＩ及びＩＸ因子を有する。患者は、赤血球細胞、ｉ．ｖ．注射のための流体、及び凝固第ＩＸ因子を含む新鮮な凍結血漿により輸血されている。
【０２２１】
そのような患者を、９０−１８０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ， Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｎｍａｒｋ） 及び同時に投与されるＦＩＸ生成物の１回の用量、又は９０−１８０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ． のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ， Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｎｍａｒｋ） 及び５分以内の間隔でのＦＩＸ生成物の１回の投与により処理する。両生成物は同じ静脈を通して注射される。患者は、出血の阻止を得るために減じられた時間、及び止血を維持するために低められた注射回数を経験する。このレジメは、出血の阻止及び止血のための低められた合計量の凝固因子タンパク質使用法を導く。
【０２２２】
例３．仕切り症候群の症状と共に腕に筋肉出血を有する非インヒビター血友病Ｂ患者
患者は、仕切り症候群の症状と共に右腕に主な外傷性筋肉出血を有する非インヒビター血友病Ｂ患者である。
そのような患者を、市販のＦＩＸ生成物により処理する場合、患者は一般的に、止血を達成するためにＦＩＸの注射又は注入を８〜１６回必要であろう。ＦＩＸ注入は、正常なレベルの少なくとも８０％の初期ＦＩＸ血漿濃度、続いて１週間、５０％の血漿濃度を達成することを意図する。
【０２２３】
そのような患者を、９０−１８０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ， Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｎｍａｒｋ） 及び同時に投与されるＦＩＸ生成物の１回の用量、又は９０−１８０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ． のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ， Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｎｍａｒｋ） 及び５分以内の間隔でのＦＩＸ生成物の１回の投与により処理する。両生成物は同じ静脈を通して注射される。
ＮｏｖｏＳｅｖｅｎ及びＦＩＸの前記組合せは、単独で投与されるＮｏｖｏＳｅｖｅｎ又はＦＩＸ生成物のいずれかの効果に比較して、出血を阻止するための時間、末梢神経及び血管損傷の程度、及び手術介入のサイズ及び複雑さに対して改良された効果を提供する。
【０２２４】
例４．非インヒビター血友病Ｂ患者の凝固状態のアッセイ
患者は、出血、例えば頭蓋内出血を有する、非インビビター血友病Ｂ患者である。
そのような患者を、市販のＦＩＸ生成物により処理する場合、患者は一般的に、止血を達成するためにＦＩＸの注射又は注入を１０〜２０回必要であろう。ＦＩＸ注入は、正常なレベルの少なくとも８０％の初期ＦＩＸ血漿濃度、続いて１週間、５０％の血漿濃度を達成することを意図する。
【０２２５】
そのような患者を、９０−１８０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ．のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標）（ＮｏｖｏＮｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ， Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｎｍａｒｋ） 及び同時に投与されるＦＩＸ生成物の１回の用量、又は９０−１８０μｇ／ｋｇ ｂ．ｗ． のＮｏｖｏＳｅｖｅｎ（商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ， Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｎｍａｒｋ） 及び５分以内の間隔でのＦＩＸ生成物の１回の投与により処理する。両生成物は同じ静脈を通して注射される。２種の凝固タンパク質の後者の投与後１０分で、血液サンプルを採血し、そして完全な血液凝固分析を、凝固状態に関して臨床学的に適切な標準化されたアッセイである血栓弾性記録方法を用いて行う（例えば、Ｍｅｈなど．， Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ２ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ２００１； １２： ６２７−６３７を参照のこと）。
【０２２６】
そのようなアッセイからの標準のパラメーター読み取りを用いて、増強されたフィブリン凝塊形成、高められた凝塊強度及び延長された凝塊溶解時間を示す。連続的に血液サンプルにおけるような測定は、第ＶＩＩ因子及び第ＩＸ因子生成物の注入の後の関数としてそれらのパラメーターの変動を示す。
【０２２７】
例５．第ＶＩＩａ因子及び第ＩＸ因子の組合せによる凝固時間の短縮
方法：
凝塊アッセイ：種々の濃度の血漿精製されたヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）の不在又は存在下で、組換えヒト凝固第ＶＩＩａ因子（ｒＦＶＩＩａ）の凝固比活性を、上記のようにして、１段階アッセイにおいて測定した（Ｐｅｒｓｓｏｎなど．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７６： ２９１９５−９， ２００１）。
【０２２８】
手短に言及すれば、５０ｍＭのＰｉｐｅｓ， １００ｍＭのＮａＣｌ， ２ｍＭのＥＤＴＡ， １％ＢＳＡ（ｐＨ７．２）中、５５μｌのｒＦＶＩＩａ（０．２−３μｇ／ｍｌ， Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ｓｔｏｃｋ）のアリコートを、５０ｍＭのＣａＣｌ２及びホスファチジルコリン／ホスファチジルセリンビークル（合計リン脂質濃度１００μＭ；８０％ホスファチジルコリン／２０％ホスファチジルセリン）を含む、等体積の緩衝液と共に混合し、そして凝固を、添加される種々の濃度のＦＩＸ（１０， ５０及び８０％の血漿濃度、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、５５μｌのＦＩＸ−欠失血漿（Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｓ Ｈｅｌｅｎａ Ｌａｂｓ ＃５７９３）を添加することによって開始せしめた。凝固を、標準のＡＰＴＴプログラムを用いて、ＡＣＬ３００ Ｒｅｓｅａｒｃｈ 凝固計測計（Ｉｎｓｔｒｕｍｏｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｍｉｌａｎ， Ｉｔａｌｙ）により５ ００秒間、追跡した。
【０２２９】
結果：
凝塊アッセイ：ｒＦＶＩＩａ及びＦＩＸを、別々に及び組合して、ＦＩＸ−欠失血漿に添加し、そして凝固時間を決定した。ｒＦＶＩＩａ／ＦＩＸの添加の前、両血漿の凝固時間は、５ ００秒のモニター時間よりも長かった。ＦＩＸ−ＦＩＸの不在及び存在下でのｒＦＶＩＩａの凝固短縮効果が、図１に示される。
【０２３０】
結論：
それらの結果は、ｒＦＶＩＩａ及びＦＩＸの組合せが、タンパク質が別々に添加される場合に見られる時間よりも、ＦＩＸ−欠失血漿の凝固時間を短くできることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１： ＦＩＸの不在及び存在下でのｒＦＶＩＩａの凝固短縮時間が図１に示される。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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