(57)【要約】本発明は、破骨細胞活性化のプロセスにおける不可欠の媒体としてのブルトンチロシンキナーゼの同定、ブルトンチロシンキナーゼのモデュレーター、およびそのようなモデュレーターの同定のためのアッセイに関する。今やそのようなモデュレーターが骨粗鬆症および関連疾患状態の治療および予防に有用であることがわかった。
2004533209.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブルトンチロシンキナーゼの活性を変調する化合物を同定するアッセイであって、
（１）ブルトンチロシンキナーゼを発現する細胞を用意し、
（２）ブルトンチロシンキナーゼを発現する該細胞を被験化合物と接触させ、ついで
（３）該被験化合物がブルトンチロシンキナーゼの活性を変調するか否かを決定する
ことを含むアッセイ。
【請求項２】
細胞ベースのアッセイである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
細胞不含アッセイである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
該細胞不含アッセイがリガンド結合アッセイである、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
該被験化合物がブルトンチロシンキナーゼの活性を変調する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項６】
該被験化合物がブルトンチロシンキナーゼのアンタゴニストである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項７】
該被験化合物がブルトンチロシンキナーゼのアゴニストである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項８】
該被験化合物がブルトンチロシンキナーゼに結合する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項９】
骨粗鬆症の治療に有用な化合物を同定するためのものである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１０】
骨粗鬆症の治療を要する患者に治療学的有効量の請求項１に記載のアッセイにより同定した化合物を投与することを含む、骨粗鬆症の治療方法。
【請求項１１】
骨粗鬆症の治療方法であって、
（１）骨粗鬆症を患う患者を同定し、ついで
（２）該患者に治療学的有効量のブルトンチロシンキナーゼのモデュレーターを投与する
ことを含む方法。
【請求項１２】
該患者が、該患者においてブルトンチロシンキナーゼの発現レベルを測定することによって骨粗鬆症を患っていると同定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
該モデュレーターがブルトンチロシンキナーゼのアンタゴニストである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
骨粗鬆症の予防方法であって、
（１）骨粗鬆症のリスクにある患者を同定し、ついで
（２）該患者に治療学的有効量のブルトンチロシンキナーゼのモデュレーターを投与する
ことを含む方法。
【請求項１５】
該患者が、該患者においてブルトンチロシンキナーゼの発現レベルを測定することによって骨粗鬆症のリスクにあると同定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
該モデュレーターがブルトンチロシンキナーゼのアンタゴニストである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
破骨前駆細胞をブルトンチロシンキナーゼのモデュレーターと接触させることを含む、破骨細胞への破骨前駆細胞の分化を低下させる方法。
【請求項１８】
該モデュレーターがブルトンチロシンキナーゼのアンタゴニストである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ブルトンチロシンキナーゼの活性を変調することのできる化合物。
【請求項２０】
該化合物が、
（１）ブルトンチロシンキナーゼを発現する細胞を用意し、
（２）ブルトンチロシンキナーゼを発現する該細胞を該化合物と接触させ、ついで
（３）該化合物がブルトンチロシンキナーゼの活性を変調するか否かを決定することによって同定される、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２１】
ブルトンチロシンキナーゼのアンタゴニストである、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２２】
ブルトンチロシンキナーゼのアゴニストである、請求項１９に記載の化合物。
【請求項２３】
ブルトンチロシンキナーゼに結合する、請求項１９に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、キナーゼモデュレーターおよびその同定方法および疾患の治療および予防におけるその使用に関する。とりわけ、本発明は、ブルトンチロシンキナーゼ（Ｂｒｕｔｏｎ’ｓ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ Ｋｉｎａｓｅ）およびブルトンチロシンキナーゼ媒体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）のモデュレーターおよびその同定方法および骨粗鬆症および関連疾患状態の治療および予防におけるその使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
破骨細胞は単球／マクロファージ系列に由来する最終的に分化した細胞であり、骨格モデリングおよびリモデリングの正常なプロセスの一部として骨を再吸収する。前駆細胞とは対照的に、完全に分化した破骨細胞のみが骨を再吸収することができる。破骨細胞による骨の再吸収の増大は幾つかの骨格疾患、最も顕著には閉経後の骨粗鬆症と関連している。
【０００３】
活性化された破骨細胞は骨表面上を移動して骨再吸収の新たな部位を開始するので、細胞骨格の再構築はポドソーム（ｐｏｄｏｓｏｍｅ）と呼ばれる独特の細胞接着構造に導き、このポドソームは媒体工程を介して骨基質に付着する。ポドソームはアクチン結合タンパク質のビンクリン、タリン、およびα−アクチニンによって囲まれたＦ−アクチンコアからなり、単球やマクロファージなどの極めて運動性の細胞に見出される（Ｍａｒｃｈｉｓｉｏ Ｐ．Ｃ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９９（５）： １６９６−１７０５ （１９８４））。ポドソームの集合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）は破骨細胞と骨基質との間のシーリング領域（ｓｅａｌｉｎｇ ｚｏｎｅ）の形成に必須であり、その後の破骨細胞による骨再吸収はシーリング領域の形成に依存している。
【０００４】
破骨前駆細胞は、破骨細胞の分化に導くリガンド（ＲＡＮＫＬ）を認識するレセプター、ＮＦ−κＢ（ＲＡＮＫ）のレセプターアクチベーターを有することが知られている（Ｓｕｄａ， Ｔ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ． Ｒｅｖ．， ２０： ３４５−３５７ （１９９９））。ＲＡＮＫＬレセプターは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーの一員であり、以前にＮＦ−κＢのアクチベーターであることが示されており、破骨細胞生成（ｏｓｔｅｏｃａｌｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）の特異的なインデューサーである（Ｓｉｍｏｎｅｔ Ｗ．Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ ８９（２）： ３０９−３１９ （１９９７）；Ｋｏｎｇ Ｙ．Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３９７ （６７１７）： ３１５−３２３ （１９９９））。
【０００５】
（発明の開示）
（発明が解決しようとする技術的課題）
ＰＩ３キナーゼ、ｒｈｏＡおよびｐｐ６０ｃ−ｓｒｃが細胞骨格の再構築および破骨細胞によって媒体された骨再吸収に必須であることが示されているが、ＲＡＮＫＬレセプターを介して開始されるシグナル伝達事象については殆どわかっていない（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｉ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １７２（２）： ２３０−２３９ （１９９７）；Ｃｈｅｌｌａｉａｈ Ｍ．Ａ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５（１６）： １１９９３−２０００２ （２０００）；Ｓｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇ Ｐ．Ｌ．ら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １１（２１）： ２８３５−４４ （１９９７））。ＰＩ３キナーゼへテロマルチマー複合体の幾つかの成員が、破骨細胞活性化および骨再吸収の原因であることが報告されている。以前の研究では、ＲＡＮＫＬが破骨細胞生成の枢要なレギュレーターであること、およびＰＩ３キナーゼ複合体がＲＡＮＫＬレセプターと結合することが示されている。ＰＩ３キナーゼが破骨細胞における波打った縁の形成（ｒｕｆｆｌｅｄ ｂｏｒｄｅｒ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）に関与していること、およびＰＩ３キナーゼのインヒビターであるウォーマニン（ｗｏｒｍａｎｎｉｎ）がその後のオステオペニアに導く破骨細胞の付着および拡散に影響を及ぼすことは報告されているが、このプロセスにＢＴＫが関与することはこれまでに示されていない。
【０００６】
さらに、他のキナーゼが破骨細胞の活性化において役割を果たしていることが報告されている（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｍ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７５， （４０） ３１１５５−６１ （２０００））。しかしながら、これらキナーゼ、ＲＡＮＫＬ、および活性化サイクルの際の細胞骨格再構成の間の関連は殆ど同定されていない。
従って、ＲＡＮＫＬ経路に関与する化合物、並びにそのモデュレーターを同定することの必要性が依然として存在しており、このような化合物およびモデュレーターは、骨粗鬆症、関連する疾患状態その他の疾患の同定、予防および治療に有用である。本発明は、これらおよび他の必要性に向けられたものである。
【０００７】
（その解決方法）
今やブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）経路におけるＢＴＫおよび媒体物（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ）が、破骨細胞の活性化に導く細胞骨格再構築経路の重要な媒体物であることがわかった。本発明はさらに、ＢＴＫを欠失したマウスがオステオペニアを示すこと、およびこのオステオペニアがＢＴＫ遺伝子の複数のコピーをトランスジェニックマウスに加えたときに元に戻すことができることを示す。従って、ＢＴＫ活性およびＢＴＫ媒体活性のモデュレーターは、破骨細胞の活性化および骨の再吸収に影響を及ぼすうえで有用である。そのようなモデュレーターは本発明のアッセイを用いて同定でき、それゆえ骨粗鬆症および関連疾患を治療するための治療化合物として有用であることが予期される。本発明の方法を用いて同定したモデュレーターのＢＴＫ標的確認試験は、通常の骨粗鬆症マウスモデルを用いて行うことができる。さらに、そのような化合物は骨粗鬆症および関連疾患状態の治療用組成物に使用するのに適しており、常法で投与することができる。本発明はさらに、アンチセンス療法の使用を包含する。
【０００８】
一つの側面において、本発明は、ＢＴＫの活性を変調する化合物を同定するためのアッセイに関する。このアッセイは、工程：（１）ＢＴＫを発現する細胞を用意し、（２）ＢＴＫを発現する該細胞を被験化合物と接触させ、ついで（３）該被験化合物がＢＴＫの活性を変調するか否かを決定すること、を含む。このアッセイは、細胞ベースのアッセイであってよいし、またはリガンド結合アッセイのような細胞不含アッセイであってもよい。ＢＴＫの活性を変調する被験化合物はアンタゴニストまたはアゴニストであってよく、ＢＴＫに結合してよい。さらに、このアッセイは、骨粗鬆症の治療に有用な化合物を同定するのに用いることができる。
【０００９】
別の側面において、本発明は、骨粗鬆症の治療方法に関し、該方法は、骨粗鬆症の治療を要する患者に上記アッセイにより同定した化合物の治療学的有効量を投与する工程を含む。
別の側面において、本発明は、骨粗鬆症の治療方法に関し、該方法は、工程：（１）骨粗鬆症を患う患者を同定し、ついで（２）該患者にＢＴＫのモデュレーターの治療学的有効量を投与すること、を含む。患者は、該患者においてＢＴＫの発現レベルを測定することによって骨粗鬆症を患っていると同定される。
【００１０】
別の側面において、本発明は、骨粗鬆症の予防方法に関する。この方法は、工程：（１）骨粗鬆症のリスクにある患者を同定し、ついで（２）該患者にＢＴＫのモデュレーターの治療学的有効量を投与すること、を含む。患者は、該患者においてＢＴＫの発現レベルを測定することによって骨粗鬆症のリスクにあると同定される。
【００１１】
別の側面において、本発明は、破骨前駆細胞の破骨細胞への分化を低下させる方法に関する。この方法は、破骨前駆細胞をＢＴＫモデュレーターと接触させる工程を含む。
別の側面において、本発明は、ＢＴＫの活性を変調できる化合物に関する。この化合物は、工程：（１）ＢＴＫを発現する細胞を用意し、（２）ＢＴＫを発現する該細胞を化合物と接触させ、ついで（３）該化合物がＢＴＫの活性を変調できるか否かを決定すること、によって同定することができる。そのような化合物はＢＴＫに結合してよい。
【００１２】
破骨細胞は、骨格リモデリングの正常なプロセスの一部として骨を再吸収する、単球／マクロファージ系列に由来する最終的に分化した細胞である。破骨細胞による骨の再吸収の増大は、多くの骨格疾患、最も顕著には成人女性における閉経後の骨粗鬆症および成人男性における骨格の脆さ（ｆｒａｉｌｔｙ）に導く。ポドソームの生成により、活性化された破骨細胞は骨の表面を移動して骨の再吸収の新たな部位を開始する。これら事象は、ＮＦ−κＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）のレセプターアクチベーターと破骨細胞の膜上に存在するＲＡＮＫＬレセプターとの相互作用によって優先的に開始される。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ＲＡＮＫＬによって活性化されると機能的な破骨細胞に分化することができる。本発明は、これら細胞およびヒトおよびマウスの骨組織に由来する破骨細胞がＢＴＫを発現することがわかったという知見に向けられている。
【００１３】
以下に示すように、本発明において、末梢定量コンピューター連動断層撮影により骨ミネラル密度について評価したＢＴＫ−１−（Ｐｅｔｒｏ Ｊ．Ｂ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９１（１０）： １７４５−１７５４）マウスの近位脛骨切片は、野生型のマウスに比べて大理石骨病の徴候を示す。一方、変異が残基２８におけるアルギニンのシステインへの変換という結果となっているＢＴＫｘｉｄマウス（Ｐｉｎｓｃｈｅｗｅｒ Ｄ．Ｄ．ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９（９）： ２９８１−２９８７）は、野生型のマウスに比べて骨粗鬆症的であることが本発明でわかった。この変異の結果、ＢＴＫタンパク質はサイトゾルから内部の細胞膜（ここで該ＢＴＫタンパク質はその後、ＰＩ３キナーゼのリン脂質産物、ＰＩＰ３に結合する）に移動することができない。
【００１４】
プレクストリン相同ドメインによりリン脂質部分に結合した後、ＢＴＫは膜結合ｓｒｃタンパク質によってリン酸化され、これによりＢＴＫは活性化される。ついで、活性化されたＢＴＫは他の細胞下区画に移動し、その後、その酵素活性かまたは他の制御もしくは構造タンパク質との結合のいずれかにより他の細胞経路を制御する。ＢＴＫｘｉｄマウスでみられる骨粗鬆症効果は、ＢＴＫ／ｘｉｄバックグラウンドに野生型ＢＴＫトランスジーンのコピーを加えることによって元に戻る。従って、本発明のこれらの結果は、ＢＴＫが骨の再吸収および臨床骨粗鬆症における不可欠の酵素であることを示している。
【００１５】
ＲＡＷ２６４．７細胞バックグラウンドで発現される安定なＢＴＫ構築物の分析は、ＢＴＫの自己リン酸化がｘｉｄ変異かまたはＢＴＫ優性陰性変異（キナーゼドメイン中の残基４３０におけるリシンのアルギニンへの置換）のいずれかによって抑制されることを決定した。しかしながら、優性陰性変異体並びに他の構築物とは異なり、ｘｉｄ変異体の安定細胞プールから単離したＢＴＫのキナーゼ活性は、有意に高かった（約１０倍）。ＢＴＫ安定ＲＡＷ２６４．７細胞プールの免疫蛍光観察は、アクチン／ファロイジン染色で染色した変異体間で以下の差異を示した：優性陰性変異体は、ポドソームの単一のリングを含んでおり、幾つかのストレスファイバーおよび細胞質染色を有していた；ｘｉｄ変異体は、ポドソームの二重のリング、大きなシーリング領域を有する不規則な形状の細胞、および細胞質染色を含んでいた；および「機能の獲得（ｇａｉｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」変異（Ｌｉ Ｔ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２（５）： ４５１−４６０）（プレクストリン相同ドメイン中の残基４１におけるグルタミン酸に対して置換したリシン）は、有意の量のストレスファイバーを含む多くの大きな細胞を生成した（オステオポンチンで活性化した後にＲＡＷ２６４．７細胞で観察される細胞骨格の変化を思い起こさせる）。ＢＴＫ抗体による染色は、変異の如何にかかわらず膜または膜の近傍での局在を示した。本発明のこれらの研究は、ＢＴＫおよびそれに引き続く下流エフェクターがポドソームの集合、従って破骨細胞の活性化およびオステオペニアの発生に不可欠であることを確立するものである。
【００１６】
報告されたヒトＢＴＫのＤＮＡ配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を以下の表１および２にそれぞれ示す。報告されたマウスＢＴＫのＤＮＡ配列（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を以下の表３および４にそれぞれ示す。ヒトおよびマウスのＢＴＫ配列は、ともにジーンバンクデータベースから得た。
【００１７】
当業者であれば、本発明に用いるのに適したＢＴＫはマウスまたはヒトのものであるのが望ましいが、いかなる適当な生物からのＢＴＫをも包含することを認識するであろう。これら生物のタンパク質およびゲノム配列は、ジーンバンクまたはザ・ナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により容易にアクセスできる。
【００１８】
表１
ヒトＢＴＫのヌクレオチド配列：ジーンバンク受け入れ番号Ｘ５８９５７
【表１】
2004533209.tif 000003
【００１９】
表２
ヒトＢＴＫのアミノ酸配列：ジーンバンク受け入れ番号ＣＡＡ４１７２８
【表２】
2004533209.tif 000004
【００２０】
表３
マウスＢＴＫのヌクレオチド配列：ジーンバンク受け入れ番号Ｌ２９７８８
【表３】
2004533209.tif 000005
【００２１】
表４
マウスＢＴＫのアミノ酸配列：ジーンバンク受け入れ番号ＡＡＡ６６９４３
【表４】
2004533209.tif 000006
【００２２】
さらに、ＢＴＫの誘導体およびホモログを本発明に用いることができる。たとえば、本発明のＢＴＫをコードする核酸配列は、機能的に等価なＢＴＫの保存変異体を提供する置換、付加または欠失により変えることができる。たとえば、配列内の１またはそれ以上のアミノ酸残基を似た性質を有する他のアミノ酸、たとえば、正に荷電したアミノ酸（アルギニン、リシン、およびヒスチジン）；負に荷電したアミノ酸（アスパラギン酸およびグルタミン酸）；極性の中性アミノ酸；および非極性アミノ酸で置換することができる。
【００２３】
他の保存的アミノ酸置換は、下記表５から採用することができる。
表５
保存的アミノ酸置換
【表５】
2004533209.tif 000007
【００２４】
本発明の範囲内の他のアナログは、タンパク質の安定性を増大させる修飾を有するものである；そのようなアナログは、たとえば、タンパク質配列中に１またはそれ以上の非ペプチド結合（ペプチド結合を置換する）を含んでいてよい。また、天然のＬ−アミノ酸以外の残基、たとえば、Ｄ−アミノ酸または天然に存在しないかまたは合成したアミノ酸、たとえばβまたはγアミノ酸を含むアナログも本発明の範囲内に含まれる。
【００２５】
本発明において使用するＢＴＫは、たとえば、リン酸化、硫酸化、アシル化、または他のタンパク質修飾により修飾できる。本発明において使用するＢＴＫはまた、直接かまたは間接的に検出可能なシグナルを提供しうる標識（放射性同位体および蛍光化合物を含むが、これらに限られるものではない）で修飾することもできる。
【００２６】
ＢＴＫモデュレーターを同定するための本発明の方法に通常のスクリーニングアッセイを用いることができることは当業者には明らかであろう。一例としてのみ挙げれば、本発明において使用するのに適した１つのＢＴＫアッセイは、「材料および方法」の項目に記載したＢＴＫキナーゼアッセイである。簡単に説明すると、このアッセイはＢＴＫ抑制化合物の可能性のあるものをスクリーニングするのに用いることができる。そのような化合物がＢＴＫ活性を抑制する有効性は、ＳＬＰ７６リン酸化の減少に基づいて決定することができる。ついで、そのような化合物はまた、骨の再吸収に影響を及ぼす能力についてインビトロで試験することができる。
【００２７】
さらに、ＢＴＫ活性に影響を及ぼすことがわかったモデュレーターは、そのようなモデュレーターのインビボでの能力を調べるため、たとえば卵巣切除術を施したマウス（閉経後の骨粗鬆症と類似の状況という結果となる）などのマウス骨粗鬆症モデルに導入することができる。一例としてのみ挙げれば、骨質を調べるために本発明において有用な他のマウスモデル系としては、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ Ｍ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， １２５： ２７６−２８３ （１９８６）およびＫｕｒｏ−ｏ Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ， ３９０： ４５−５１ （１９９７）に記載されたものが挙げられる。
【００２８】
本発明において、大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングする方法は、該遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローニングし、得られたベクターのライブラリーで適当な細胞を形質転換し、ついで所望の活性を検出する条件下（たとえば本発明ではＢＴＫへリガンドを結合させる）該遺伝子を発現させることを含む。生成した多数の配列をスクリーニングするための高処理量分析には、たとえばランダム突然変異誘発法により、当該技術分野で知られた方法が適用できる。高処理量アッセイに続いて、さらに生物学的活性を同定するため（このことは、たとえば当業者がアゴニストをアンタゴニストから識別することを可能にするであろう）、二次スクリーニングを行うことができる。使用する二次スクリーニングのタイプは、試験する必要のある所望の活性に依存するであろう。
【００２９】
医薬スクリーニングアッセイも本発明で提供される。本発明の精製し組換えしたＢＴＫまたはその断片を製造することにより、当業者はこれらを用いて正常な細胞機能または細胞シグナル伝達における役割のアゴニストかまたはアンタゴニストのいずれかである医薬をスクリーニングすることができる。一つの側面において、このアッセイは、ある化合物が本発明のＢＴＫと天然のリガンドとの結合を変調する能力を評価する。「変調」なる語は、ＢＴＫ活性の増大、減少、活性化または不活化を包含する。本発明のＢＴＫに対するリガンド（ＢＴＫに結合してその活性を変調することができる；ペプチド、タンパク質、小さな分子、および抗体を含む）を同定するのに有用なアッセイは本発明に包含される。様々なアッセイ形態を本発明に用いることができ、当業者に知られている。ＢＴＫインヒビターの一つの例はＬＦＭ−Ａ１３（Ｍａｈａｊａｎ Ｓ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４（１４）： ９５８７−９９ （１９９９））である。
【００３０】
化合物および天然抽出物のライブラリーを試験する多くの医薬スクリーニングプログラムにおいて、所定の時間内に調べることのできる化合物の数を最大にするために高処理量アッセイが望ましい。細胞不含系で行うアッセイ、たとえば精製したまたは半精製したタンパク質を用いて得られるアッセイは、被験化合物によって媒体される分子標的において速やかな発色および変化の比較的容易な検出を可能とする点で一次スクリーニングとしてしばしば好ましい。
【００３１】
上記で記載したように、アッセイを用いて同定した化合物はＢＴＫのアンタゴニストまたはアゴニストであり、ＢＴＫに結合することができ、それによってＢＴＫ活性を変調する。「変調」なる語は、ＢＴＫ活性の増大、減少、活性化または不活化を包含する。ＢＴＫに結合してその活性を変調することができる本発明のＢＴＫに対するリガンド（ペプチド、タンパク質、小さな分子、および抗体を含む）は本発明に包含される。これら化合物は、ＢＴＫの活性の変調およびＢＴＫ関連疾患の治療に有用である。
【００３２】
「ＢＴＫ関連疾患」とは、ＢＴＫタンパク質が代謝経路において制御的な役割を果たしているようなあらゆる障害または疾患状態をいう。そのような障害または疾患としては、骨粗鬆症が挙げられるがこれに限られるものではない。本明細書において用いる「治療」なる語は、患者における特定の障害の徴候の軽減、特定の障害に付随する確認しうる測定値（ａｓｃｅｒｔａｉｎａｂｌｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）の改善、または特定の免疫応答、炎症応答または細胞応答の予防をいう。
【００３３】
ＢＴＫモデュレーターとして作用する化合物は、治療目的のため、未加工の化学物質として投与してもよいし、または医薬調合物中の活性成分であってもよい。本発明のそのような調合物は、以下に記載する他の治療剤を含んでいてよく、また医薬調合物の技術分野でよく知られているもののような方法に従って、たとえば、通常の固体または液体ビヒクルまたは希釈剤、並びに所望の投与形態に適したタイプの医薬添加剤（たとえば、賦形剤、結合剤、保存剤、安定化剤、芳香剤など）を用いて調合することができる。
【００３４】
本発明の化合物は、適当な手段、たとえば、経口により（たとえば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤または粉末薬の形態で）；舌下により；口内により；非経口により、たとえば、皮下、静脈内、筋肉内、または胸骨内の注射または注入法（たとえば、滅菌注射水溶液または非水溶液または懸濁液）により；鼻内により（たとえば、吸入スプレーにより）；局所により（たとえば、クリーム剤または軟膏剤の形態にて）；または直腸内により（たとえば、坐剤の形態にて）；非毒性の薬理学的に許容しうるビヒクルまたは希釈剤中の投与単位調合物として投与することができる。
【００３５】
そのような化合物は、たとえば、即時放出（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｒｅｌｅａｓｅ）または遅延放出（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ）に適した形態にて投与できる。即時放出または遅延放出は、本発明の化合物を含む適当な医薬組成物の使用によって、または、特に遅延放出の場合には皮下インプラントまたは浸透ポンプなどのデバイスの使用によって達成できる。本発明の化合物はまた、リポソームを用いて投与することもできる。
【００３６】
経口投与用組成物の例としては、たとえば、かさを増大させるための微結晶セルロース、懸濁化剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、粘度増大剤としてのメチルセルロース、および当業者に知られたものなどの甘味剤または芳香剤を含む懸濁剤；および、たとえば、微結晶セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよび／またはラクトースおよび／または当業者に知られた他の賦形剤、結合剤、拡張剤、崩壊剤、希釈剤および滑沢剤を含む即時放出錠剤が挙げられる。
【００３７】
本発明の化合物はまた、舌下投与および／または口内投与により口腔で送達することもできる。湿製錠剤、圧錠または凍結乾燥錠剤が使用できる例示の形態である。組成物の例としては、本発明の化合物をマンニトール、ラクトース、ショ糖および／またはシクロデキストリンなどの速溶解希釈剤で調合した組成物が挙げられる。
【００３８】
そのような調合物にはまた、セルロース（アビセル）やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの高分子量賦形剤が含まれていてもよい。そのような調合物はまた、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＳＣＭＣ）、無水マレイン酸共重合体（たとえば、Ｇａｎｔｒｅｚ）などの粘膜付着を助ける賦形剤、およびポリアクリル酸共重合体（たとえば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ ９３４）などの放出制御剤を含んでいてもよい。滑沢剤、滑り剤（ｇｌｉｄａｎｔｓ）、芳香剤、着色剤および安定化剤も製造および使用を容易にするために添加してよい。
【００３９】
鼻内エアゾルまたは吸入投与用組成物の例としては、たとえば、ベンジルアルコールその他の適当な保存剤、バイオアベイラビリティーを促進する吸収促進剤、および／または当業者に知られたものなどの他の可溶化剤または分散剤を含む食塩水中の液剤が挙げられる。
【００４０】
非経口投与用組成物の例としては、たとえば、適当な非毒性の非経口的に許容しうる希釈剤または溶媒、たとえば、マンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル液、等張塩化ナトリウム液、または他の適当な分散または湿潤および懸濁化剤（合成モノグリセリドまたはジグリセリドおよび脂肪酸（オレイン酸を含む）を含む）を含む注射液または懸濁液が挙げられる。
【００４１】
直腸投与用組成物の例としては、たとえば、通常の温度では固体であるが直腸腔内では液化および／または溶解して薬剤を放出する適当な非刺激性の賦形剤、たとえば、カカオバター、合成グリセリドエステルまたはポリエチレングリコールを含む坐剤が挙げられる。
局所投与用組成物の例としては、プラスチベース（Ｐｌａｓｔｉｂａｓｅ）（ポリエチレンでゲル化した鉱油）などの局所担体が挙げられる。
【００４２】
本発明の化合物の有効量は当業者が決定でき、成人ヒトの投与量の例は１日当たり約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重）の活性化合物であり、これを単回で投与してもよいし、または１日当たり１〜４回のように個々の分割投与の形態であってもよい。ある特定の患者に対する投与量の特定の投与量レベルおよび頻度は変わってよく、使用した特定の化合物の活性、該化合物の代謝的安定性および作用持続時間、患者の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）、年齢、体重、一般的な健康状態、性差および食事、投与の方法および時間、排出率、薬剤の併合、および特定の状態の重篤度を含む様々な因子に依存するであろうことが理解されるであろう。治療に好ましい対象としては、ＢＴＫ関連疾患に罹患しうる動物、最も好ましくはヒトなどの哺乳動物種、およびイヌ、ネコなどの飼いならした動物が挙げられる。
【００４３】
本発明の化合物は、単独、または互いの組み合わせおよび／またはＢＴＫ関連疾患に有用な他の適当な治療剤との組み合わせで用いることができる。
他の側面において、本発明は、「アンチセンス」療法における単離核酸の使用に関する。本明細書において「アンチセンス」療法とは、たとえば転写および／または翻訳を抑制することによってコードタンパク質の発現を抑制すべく、本発明のＢＴＫをコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡと細胞条件下で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはその誘導体の投与またはインシトゥでの生成をいう。一般に、「アンチセンス」療法は当該技術分野で一般に用いられる範囲の方法をいい、オリゴヌクレオチド配列への特異的結合によるあらゆる療法を包含する。
【００４４】
アンチセンス療法に有用な遺伝子構築物は、生物学的に有効な担体中、たとえば核酸配列を細胞にインビボで有効に送達できる調合物または組成物にて投与することができる。方法は、ウイルスベクター（組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、および単純ヘルペスウイルス１型を含む）または組換え細菌または真核プラスミド中に目的遺伝子を挿入することを含む。ウイルスベクターは細胞を直接トランスフェクションし、ウイルスベクターによる細胞の感染の利点は、標的細胞の大部分が該核酸を受け入れることができることである。幾つかのウイルス送達系が当該技術分野で知られており、本発明の実施者によって利用することができる。
【００４５】
ウイルス移送法に加え、非ウイルス法も用いることができる。遺伝子移送の大抵の非ウイルス法は、巨大分子の取り込みおよび細胞内輸送のために哺乳動物細胞によって用いられる正常なメカニズムに基づいている。このタイプの遺伝子送達系の例としては、リポソーム送達系、ポリリシンコンジュゲート、および人工ウイルスエンベロープ（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｖｉｒａｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅｓ）が挙げられる。核酸配列はまた、遺伝子構築物の直接注入によって、またはエレクトロポレーションによっても細胞に導入することができる。
【００４６】
臨床的な場面では、遺伝子送達系は多くの方法（それぞれ当該技術分野で知られている）のいずれによっても患者に導入することができる。たとえば、遺伝子送達系の医薬製剤は、たとえば、静注によって全身的に導入することができ、しかも遺伝子送達ビヒクルによって、または該レセプター遺伝子の発現を制御する転写制御配列による細胞型または組織型の発現によって、またはその両者の組み合わせによって提供される特異性から、該タンパク質の標的細胞での特異的な伝達が優先的に生じる。
【００４７】
遺伝子療法構築物の医薬製剤は、許容しうる希釈剤中の遺伝子送達系から本質的になっていてよいし、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた遅延放出マトリックスを含んでいてよい。あるいは、完全な遺伝子送達系を組換え細胞からそのまま製造できる場合は（たとえば、レトロウイルスベクター）、医薬製剤は遺伝子送達系を生成する１またはそれ以上の細胞を含んでいてよい。
【００４８】
ＲＡＷ２６４細胞（マウスマクロファージ細胞株）からのＲＡＮＫＬ誘導シグナル伝達媒体のプロテオミックス分析を下記実施例に記載するようにして行った。この分析からＲＡＮＫＬがＢＴＫの特異的なチロシンリン酸化を誘導することがわかり、ＲＡＮＫＬによって誘導された破骨細胞活性化のプロセスにおけるＢＴＫの重要性が確立された。このように、ＢＴＫは骨粗鬆症の治療および予防における重要な標的である。
【００４９】
以下に本発明に用いた材料および方法のセクションを記載する。これを下記実施例に用いた。
材料および方法
ＢＴＫ−１−マウス：
文献に記載（Ｋｈａｎ Ｗ．Ｎ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３（３）： ２８３−２９９）。ＢＴＫ−１−マウスは１２９／Ｓｖ × Ｃ５７ＢＬ／６の混合した遺伝子バックグラウンドを有する。野生型の対照としては、１２９／Ｓｖ × Ｃ５７ＢＬ／６マウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウスを用いた。
【００５０】
ＢＴＫｘｉｄマウスおよびＢＴＫｌｏマウス：
ＢＴＫトランスジェニック構築物は文献に記載されている（Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅ Ａ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９４（２４）： １３１５２−１３１５７；Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅ Ａ．Ｂ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９７（１２）： ６６８７−６６９２）。本発明におけるＢＴＫｘｉｄマウスおよびＢＴＫｌｏマウスは、ＢＴＫトランスジェニック構築物から得られたトランスジェニックＢａｌｂ／Ｃマウスであり、ｘｉｄ表現型か、またはＢＴＫｘｉｄバックグラウンド上のＩｇ重鎖プロモーターおよびエンハンサーによって駆動されるマウスＢＴＫ ｃＤＮＡトランスジーンの１または２のコピーを含む。このトランスジーンは、脾臓Ｂ細胞で内生のＢＴＫタンパク質レベルの約２５％を発現する。
【００５１】
骨のスキャニング：
近位脛骨の全密度および小柱密度を、ＸＣＴ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＳＡ ｐＱＣＴ（Ｓｔｒａｔｅｃ Ｍｅｄｉｚｉｎｔｅｃｈｎｉｋ、プフォルツハイム、ドイツ）を用いてイクスビボのマウス骨試料で評価した。骨を試料保持チューブに入れ、脛骨が走査場に入るように装置の構台内で位置を定めた。二次元スカウト（ｓｃｏｕｔ）スキャニングを１０ｍｍの長さで行った。モニターにスカウト画面が表示された後、ｐＱＣＴスキャニングを骨端へ１．４ｍｍ遠位で開始した。スキャニングは１ｍｍの厚さであり、９０μｍの３Ｄ画素（三次元ピクセル）サイズを有し、１８０の映像（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎｓ）からなっていた。スキャニングが完了した後、断面像をモニターに表示した。目的とする領域は脛骨の周辺に際立っていた。反復アルゴリズムを用い、軟組織（密度２２３ｍｇ／ｃｍ３未満）を自動切除した。残った骨の密度を全密度（ｍｇ／ｃｍ３）として報告した。骨の外側５５％を同心円様に剥ぎ取って小柱密度（ｍｇ／ｃｍ３）を決定した。
【００５２】
組換えＢＴＫ構築物の生成：
刊行された配列データに基づくプライマー（センス：
【化１】
2004533209.tif 000008
（配列番号５）、アンチセンス：
【化２】
2004533209.tif 000009
（配列番号６）（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ））を用い、Ａｄｖａｎｔａｑポリメラーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＭａｒａｔｈｏｎ Ｒｅａｄｙマウス脾臓ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から完全長マウスＢＴＫを増幅した。Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００サーモサイクラーでの繰り返し条件は以下のとおりであった：最初の変性を９４℃で２’（分）、９４℃で３０’を５サイクル、５０℃で３０’、６８℃で２’、９４℃で３０’を５サイクル、５５℃で３０’、６８℃で２’、９４℃で３０’を３０サイクル、６５℃で３０’、６８℃で２’、ついで６８℃で７’伸長。
【００５３】
得られた２ｋｂフラグメントを１％アガロースゲルからＱｕａｎｔｕｍ Ｐｒｅｐ Ｆｒｅｅｚｅ ａｎｄ Ｓｑｕｅｅｚｅゲル精製（ＢｉｏＲａｄ）により単離し、ＰＣＲ２．１ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にエレクトロポレーションし、ついで１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを含むＬＢプレート上に広げた。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢの各５ｍｌの培養液に白色コロニーを接種し、３７℃で振盪しながら一夜増殖させた。ＤＮＡを得（Ｑｉａｇｅｎロボット）、陽性のクローンを制限酵素分析により選択し、これを配列分析により確認した。ＢａｍＨＩ消化したｍＢＴＫをＢａｍＨＩ消化／ＣＩＡＰ処理したｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ１０発現ベクター（Ｓｉｇｍａ）にクローニングした。ＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ消化した挿入物をＮｏｔＩ／ＫｐｎＩ消化したｐＣＤＮＡ３．１−（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。
【００５４】
組換えＢＴＫ変異体の生成：
Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてヌクレオチドの変異を生成させ、ｍＢＴＫ中のアミノ酸変化Ａｒｇ−２８−Ｃｙｓ（ＸＩＤ）、Ｇｌｕ−４１−Ｌｙｓ（機能の獲得）、およびＬｙｓ−４３０−Ａｒｇ（優性陰性）とした。以下の領域に相補的なオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＡＧＥ精製した（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ）：Ｒ２８Ｃ：センス−
【化３】
2004533209.tif 000010
（配列番号７）、相補的アンチセンス−
【化４】
2004533209.tif 000011
（配列番号８）（ｍＢＴＫヌクレオチド５７〜９４）、Ｅ４１Ｋ：センス−
【化５】
2004533209.tif 000012
（配列番号９）、相補的アンチセンス−
【化６】
2004533209.tif 000013
（配列番号１０）（ｍＢＴＫヌクレオチド１０２〜１３４）、Ｋ４３０Ｒ：センス−
【化７】
2004533209.tif 000014
（配列番号１１）、相補的アンチセンス−
【化８】
2004533209.tif 000015
（配列番号１２）（ｍＢＴＫヌクレオチド１２６２〜１３００）。
【００５５】
各変異に対応するオリゴヌクレオチドセットをＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅキットコンポーネントを用いてｐｃＤＮＡ３．１−中の完全長ｍＢＴＫにアニールさせ、以下のようにしてＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ９６００サーモサイクラーで繰り返した：最初の変性を９５℃で３０’、９５℃で３０’を１５サイクル、５５℃で１’、６８℃で１６’、ついで６８℃で１’伸長。全反応液をＤｐｎＩで３７℃にて６０’消化することにより、メチル化した親ＤＮＡ鎖を除去した。１μＬをＸＬ−１ Ｂｌｕｅコンピテント細胞に移し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート上にプレーティングした。１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢの個々の５ｍｌにコロニーを接種し、振盪しながら３７℃で一夜増幅させた。ＤＮＡを得（Ｑｉａｇｅｎロボット）、変異を配列分析により確認した。全ての変異体のＮ末端ＦＬＡＧ構築物は、ＢａｍＨＩ消化したフラグメントをＢａｍＨＩ消化しＣＩＡＰ処理したｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ１０発現ベクター中に挿入することにより調製した。
【００５６】
ｍＢＴＫプール安定細胞株の生成：
トランスフェクションの１８時間前に０Ｅ６ＲＡＷ２６４．７前駆細胞を１００ｍｍディッシュ上に植えた。トランスフェクションにはリポフェクタミンプラス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いた。ｐｃＤＮＡ３．１−およびｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ１０中の全ての非標識およびＦＬＡＧ標識した野生型および変異体ｍＢＴＫの４μｇのＱｉａｇｅｎ ｍａｘｉ ｐｒｅｐ由来ＤＮＡを、２０μＬのリポフェクタミンプラスおよび５００μＬのオプチメム（Ｏｐｔｉｍｅｍ）と別々に混合し、室温で１５’インキュベートし、ついで５００μＬのオプチメムと３０μＬのリポフェクタミンとの混合物と室温で１５’混合した。この混合物を、増殖培地を５μＬのオプチメム培地で置換したプレート上に１滴ずつふりかけた。プレートを３７℃／５％ＣＯ２で３時間インキュベートし、この時点でオプチメムを除去して増殖培地と置換した。トランスフェクションの２４時間後、培地を９００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含む培地で置換した。
【００５７】
細胞培養：
ＲＡＷ２６４細胞はＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓから得、以下のようにして調製した：細胞を、５％ウシ胎仔血清および１％非必須アミノ酸を添加した最小必須培地で増殖させた。アッセイ目的のため、ＲＡＷ２６４細胞を血清不含培地で５時間飢渇させ、ついで２％ウシ胎仔血清およびＲＡＮＫリガンドを含む培地で培養した。インヒビターを用いる場合は、ＲＡＮＫＬ刺激する１時間前に細胞をインヒビターに前もって暴露した。
【００５８】
ＦＬＡＧ−ＢＴＫ変異体のウエスタンブロット分析：
ＦＬＡＧベクター単独、ＦＬＡＧ−ＢＴＫ野生型、ＦＬＡＧ−ＢＴＫ Ｒ２８Ｃ、ＦＬＡＧ−ＢＴＫ Ｅ４１ＫかまたはＦＬＡＧ−ＢＴＫ Ｋ４３０Ｒのいずれかを発現するコンフルエントなＲＡＷ２６４．７細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＬＡＧ−ＩＰ溶解緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ［ｐＨ＝７．４］、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭオルトバナジウム酸、１×Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒプロテアーゼインヒビター、１×Ｓｉｇｍａホスファターゼインヒビター）中、氷上で溶解させた。溶解液を掻き取り、ぴったりした（ｔｉｇｈｔ）乳棒で５０行程、ダウンスホモジナイズし、１．５ｍｌ容ミクロ遠心管に移し、１４，０００ｒｐｍで１５’マイクロ遠心し、ついで上澄み液を回収して−８０℃で貯蔵した。
【００５９】
α−ＦＬＡＧ免疫沈降を、２０μｌのα−ＦＬＡＧプロテインＡアガロース（Ｓｉｇｍａ）を含有する１ｍｌの全ＦＬＡＧ−ＩＰ溶解緩衝液中の等価量の溶解液で行った。免疫沈降を４℃で２時間揺らして行い、ペレット化し、ついで４×ＴＢＳで洗浄した。試料をＤＴＴ含有レムリ緩衝液中で３’沸騰させ、ＭＯＰＳ泳動緩衝液を用いて２００Ｖで５０’、１０％アクリルアミドビス−トリスゲル（Ｎｏｖｅｘ）で泳動し、ＰＶＤＦに３０Ｖで１時間ブロッティングした。ブロットを、１％ＢＳＡを含むＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ）中、室温で１時間ブロッキングした。
【００６０】
ついで、ブロットをＴＢＳＴ−ＢＳＡ中のα−ＦＬＡＧ−ＨＲＰ（１：５００、ＵＢＩ）かまたはα−ホスホチロシン−４Ｇ１０（１：２０００、ＵＢＩ）のいずれかで室温にて１時間プローブした。ついで、ブロットをＴＢＳＴで各５分間、４回洗浄し、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ＋プラス化学ルミネセンスキット（α−ＦＬＡＧ）と反応させるかまたは二次抗体（α−ホスホチロシンブロットをα−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ、１：３０，０００で１時間プローブし、ＴＢＳＴで４回洗浄）でプローブし、ついでＥＣＬ＋プラスと反応させた。バンドをＦｌｕｏｒ−Ｓ ＭＡＸ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて可視化し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅイメージ分析ソフトウエア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて定量した。
【００６１】
ＩＰキナーゼアッセイ：
ＦＬＡＧ−ＢＴＫ野生型および変異体タンパク質を上記「ＦＬＡＧ−ＢＴＫ変異体のウエスタンブロット分析」の記載に従って免疫沈降させた。免疫沈降物をＴＢＳで３回、ＢＴＫキナーゼ緩衝液（１３８ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭトリス［ｐＨ＝８．０］、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＭｎＣｌ２）で１回洗浄した。ついで、免疫沈降物を、基質としての精製組換えＳＬＰ−７６（５０ナノグラム）および４０μＭのＡＴＰを含むＢＴＫキナーゼ緩衝液中に再懸濁させた。対照反応液には、組換えＢＴＫ単独、ＳＬＰ−７６単独またはＳＬＰ−７６とともにモック免疫沈降物（溶解液なし）が含まれていた。キナーゼ反応を３７℃で５’行い、簡単にマイクロ遠心分離し、上澄み液を氷上に置き、レムリ緩衝液を加え、ついで反応液を３’沸騰させた。ついで、上記「ＦＬＡＧ−ＢＴＫ変異体のウエスタンブロット分析」の記載に正確に従って試料を１０％アクリルアミドゲル上で泳動させ、ブロッティングし、α−ホスホチロシンでプローブし、可視化し、ついで定量した。
【００６２】
ＢＴＫキナーゼアッセイおよびＥＬＩＳＡプロトコール：
材料：
基質をコーティングするための炭酸ナトリウム緩衝液０．０５Ｎ、ｐＨ８（Ｓｉｇｍａ Ｃ−３０４１）
Ｉｍｍｕｌｏｎ ２ エライサプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ ０１１０１０３４５５）
ＰＢＳ １×ｐＨ７．５
洗浄緩衝液（ＰＢＳ １×中に最終０．０５％のＴｗｅｅｎ ２０）
ブロッキング緩衝液［Ｓａｎｏｆｉ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓブロッキング緩衝液１×（＃０２２０−９６）］
発色原混合物＝５０％Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ ｌａｂｓ ＃５０−７６−０１ ＴＭＢ
５０％Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ ｌａｂｓ ＃５０−６５−００ ペルオキシダーゼ
【００６３】
プロトコール：
１．基質（１００μｌの炭酸ナトリウム緩衝液中のＧＳＴ−ＬＡＴ完全長タンパク質５０ｎｇ／ウエル）をプレート上にコーティング。４℃で一夜インキュベート。
２．プレートをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄。
３．プレートをブロッキング緩衝液（１００μｌ／ウエル）でブロッキング。室温で９０分間インキュベート。
４．プレートをＰＢＳで洗浄、プレートを軽く打って乾燥。
５．１００μｌ／ウエルのキナーゼ緩衝液（２５ｍＭ Ｈｅａｐｓ、ｐＨ７．５、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．１％ＢＳＡ、１０μＭ ＡＴＰ）中の９ｎｇ／ウエルの組換えＧＳＴ−ＢＴＫ−ＫＤ（キナーゼドメイン）を添加。
【００６４】
６．３７℃で６０分間インキュベート。
７．プレートをＰＢＳ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄。
８．ブロッキング緩衝液中に１／１０００最終希釈した抗ホスホチロシンｍＡｂ（ＰＹ９９−ＨＲＰ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃７０２０）１００μｌを添加（室温で４５分間）。
９．上記と同様に洗浄。
１０．１００μｌ／ウエルの発色原混合物を添加（室温で約３〜５分間インキュベート）、ｗ／１００μｌの０．１Ｎ硫酸で反応停止、４５０／５７０ｎｍで読み取り。
【００６５】
全溶解液のα−ホスホチロシンウエスタンブロット：
菌体を溶解し、各試料からの２０μｇの全溶解液を上記「ＦＬＡＧ−ＢＴＫ変異体のウエスタンブロット分析」の記載に従って電気泳動し、ブロッティングし、α−ホスホチロシンでプローブし、ついで可視化した。
【００６６】
免疫蛍光顕微鏡観察：
ＦＬＡＧ標識ｍＢＴＫ野生型および安定細胞株のプールを、コラーゲンＩコーティングオーバースリープ（ｏｖｅｒｓｌｅｅｐｓ）をそれぞれ含む１００ｍｍディッシュ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）当たり１０Ｅ６細胞の濃度にて別々に植えた。６時間後、培地を２００ｎｇ／ｍＬのＲＡＮＫリガンドを含む培地で置換した。刺激後５日目に培地を除去し、５ｍＬの氷冷４％パラホルムアルデヒド／０．１％トリトンＸで置換し、プレートを４℃で３０’インキュベートした。プレートを３×５ｍＬの氷冷１×ＤＰＢＳ／０．１％トリトン−Ｘで洗浄し、ついで４％脱脂粉乳を含む５ｍＬの１×ＤＰＢＳ／０．１％トリトン−Ｘでブロッキングした。ブロッキング緩衝液を２ｍＬのローダミン−ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で置換し、４％脱脂粉乳を含むＤＰＢＳ／０．１％トリトン−Ｘ中に１：４０に希釈し、４℃で１０’インキュベートした。プレートを３×５ｍＬの氷冷１×ＤＰＢＳ／０．１％トリトン−Ｘで洗浄した。プロロング（ｐｒｏｌｏｎｇ）Ａｎｔｉｐｏｄｅマウンティング媒体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用い、オーバースリープをそれぞれ除去してガラススライド上へ細胞スライドから載せ、一夜乾燥させた。ローダミン−ファロイジン結合アクチンを、Ｚｅｕｓ Ａｘｉｏｓｃｏｐ ２ 顕微鏡中、５３０ｎｍＤＦ５３励起／５８０ＤＦ３０放射フィルターを用いて可視化した。映像をＯｐｔｒｏｎｉｃｓ ＤＥＩ−７５０ Ａｃｑｕｉｒｅソフトウエアで捕捉した。
【００６７】
細胞下分画：
ＲＡＷ２６４．７細胞を１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウムを含む氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、氷上のトリトンＸ−１００溶解緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％トリトンＸ−１００、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ、１０μｇ／ｍロイペプチン、１ＴＩＵ／ｍｌアプロチニン、および１ｍＭ ＰＭＳＦ）中で５分間溶解させた。このアリコートはサイトゾル画分を表していた。細胞骨格タンパク質のため、残りの細胞をＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１ＴＩＵ／ｍｌアプロチニン、および１ｍＭ ＰＭＳＦ）中、氷上で５分間溶解した。細胞骨格タンパク質を１６，０００×重力で４℃にて１５分間遠心分離することにより分離した。
【００６８】
電気泳動：
等電点電気泳動を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＩＰＧストリップ中、ｐＨ３〜１０の非線形勾配で約１５０，０００Ｖｈｒ行った。１０％グリセリン、５０ｍＭ ＤＴＴ、２．３％ＳＤＳ、および６２．５ｍＭトリス、ｐＨ６．５中で１５分間平衡化した後、ＩＰＧストリップを１０％アクリルアミドスラブゲル（厚さ１．００ｍｍ）の上部に重層し、ついでＳＤＳスラブゲル電気泳動を２０ワット／ゲルにて５時間行った。スラブゲルをＰＶＤＦメンブレンに一夜移し、ついで該メンブレンを１０％酢酸−４０％メタノールの溶液中に３０分間固定し、ついで製造業社のプロトコールの記載に従って蛍光染料Ｓｙｐｒｏ Ｒｕｂｙ Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン）で一夜染色した。最大の蛍光導入は４時間以内に生じた。
【００６９】
ウエスタンブロットのため、ＰＤＶＦメンブレンを１％Ｔｗｅｅｎ−トリス緩衝食塩水（ＴＴＢＳ）（ｖ／ｖ）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ｗ／ｖ）で＞２時間ブロッキングし、ＴＴＢＳで濯ぎ、１％ＢＳＡ−ＴＴＢＳ中に１：２，５００に希釈した一次抗体とともに２時間インキュベートし、ＴＴＢＳで濯ぎ、ついでＴＴＢＳ中に１：５，０００に希釈した二次抗体とともに１時間インキュベートした。ブロットをＴＴＢＳで濯ぎ、ついでＥＣＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ピスカタウエイ、ニュージャージー）で処理した。ＢｉｏＲａｄ Ｆｌｕｏｒ−Ｓ Ｍａｘ造影系を用いて像を生成させた。ついで、ＰＤＱｕｅｓｔ ６．１ソフトウエア（ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ハーキュールズ、カリフォルニア）を用いて像を解釈した。Ｓｙｐｒｏ蛍光染色ゲル像と対比した化学ルミネセンス染色ウエスタンブロットから生成したデジタル像より得られた情報に基づき、試料をゲル内消化（ｉｎ−ｇｅｌ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）のために選択した。
【００７０】
分析的生化学および質量分析：
ゲル内消化：
Ｓｙｐｒｏ染色メンブレンからの選択タンパク質スポットを切り出し、１５分間、２回水洗した。ついで、試料をＳａｖａｎｔ ＳｐｅｅｄＶａｃ中、真空乾燥させた。ついで、試料を還元し、アルキル化し、ゲル片を５０％アセトニトリル：１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｖ／ｖ）で洗浄し、再び真空乾燥させた。ついで、ゲル片を１２．５ｎｇのトリプシンを含む重炭酸アンモニウムで再水和し、３７℃で一夜インキュベートした。消化後、ゲル片を５０％アセトニトリル：１００ｍＭ重炭酸アンモニウム（ｖ／ｖ）で抽出し、上澄み液を真空乾燥させた。乾燥した物質を質量分析のためにギ酸に再懸濁させた。
【００７１】
液体クロマトグラフィー−質量分析：
ゲル片からペプチドを抽出した後、試料を蒸発乾固した（Ｍｏｄｅｌ ＡＥＳ２０１０、Ｓａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ホルブルック、ニューヨーク）。ペプチドを５％ギ酸に溶解し、攪拌し、超音波処理し、ついで少し遠心分離して不溶性物質を沈殿させた。ついで、試料をアルゴン圧貯蔵器（ａｒｇｏｎ ｐｒｅｓｓｕｒｅ ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を用い、ＰＯＲＯＳ Ｒ２／Ｈ（ＰＥ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フラミンガム、マサチューセッツ）の攪拌スラリーを充填した毛管に負荷した。毛管は試料の負荷プロセス前に＞１０カラム容量の移動相Ａ（Ａ＝０．２％イソプロパノール、０．１％酢酸、０．００１％トリフルオロ酢酸）で前平衡化してあった。クロマトグラフィー分離を、０％Ｂ〜１００％Ｂ（Ｂ＝Ａ＋８０％アセトニトリル）の増大有機濃度の勾配にて４５分間、スプリット（ｓｐｌｉｔ）前に１分間当たり２５０μｌの流量の２相（ｂｉｎａｒｙ）ＨＰＬＣポンプ（Ｍｏｄｅｌ １１００、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、パロアルト、カリフォルニア）を用いて生成した２２バールの初期適用圧にて行った。適用したエレクトロスプレー電圧は２．２ｋＶであった。シースガス（ｓｈｅａｔｈ ｇａｓｅｓ）も処理流（ｍａｋｅ ｕｐ ｆｌｏｗｓ）も適用しなかったが、質量分析計の加熱毛管を１５０℃で操作した。試料をＭｏｄｅｌ ＴＳＱ７０００（Ｆｉｎｎｉｇａｎ、サンホセ、カリフォルニア）中にスプレーした。
【００７２】
質量分析計の第三の四重極を１．０秒に４７５〜１８００の質量／電荷比の範囲までスキャニングした。もしもこの質量範囲に存在するイオンが８０，０００カウントを超えたなら、このスペクトル中に存在する３つの最も強いイオンを衝突誘起法に供した。衝突セルを〜３ｍトルで操作し、一方、適用衝突電圧は各前駆イオンについて各イオンの質量／電荷比に２６の約数を掛けることにより調節した。ＭＳ／ＭＳ走査についてスキャニングした範囲もまた質量／電荷に依存しており、前駆イオンのみかけの質量／電荷の２倍の比までスキャニングした。質量スペクトルデータを内臓（ｂｕｉｌｔ ｉｎ−ｈｏｕｓｅ）スーパーコンピューター上のＳＥＱＵＥＳＴ（ｖｅｒ．２７ＰＶＭ、Ｆｉｎｎｉｇａｎ）により分析した。
【００７３】
下記実施例に示すように、ＢＴＫは骨再吸収において、従って臨床骨粗鬆症において不可欠の酵素であることが今や本発明においてわかった。
実施例１
骨の形態に及ぼすＢＴＫ遺伝子欠失の影響
ＢＴＫ−ｌ−（ノックアウト）マウスおよびその対応野生型の近位脛骨を、骨の形態に及ぼすＢＴＫ遺伝子の変化の影響を決定するために評価した。図１に示した断層撮影による骨ミネラル密度分析の結果は、ＢＴＫ−ｌ−マウスからの脛骨切片が野生型マウスと比較して骨粗鬆症の徴候を示したことを示している。これら結果は、ＢＴＫが骨再吸収プロセスにおいて不可欠の酵素であることを示している。
【００７４】
実施例２
骨の形態に及ぼすＢＴＫ遺伝子の変異の影響
ＢＴＫｘｉｄマウスおよびその対応野生型からの脛骨切片を、骨の形態に及ぼすｘｉｄ変異の影響を決定するために評価した。これらマウスについての断層撮影による骨ミネラル密度分析の結果は図２に示してあり、ＢＴＫｘｉｄマウスからの脛骨切片が野生型マウスと比較して骨粗鬆症の徴候を示したことを示している。
【００７５】
このデータは、骨の再吸収プロセスにおける不可欠の媒体物としてのＢＴＫを確認するのみならず、単一の点変異（おそらくＢＴＫがＰＩＰ３に結合することができないために該タンパク質を不活性にするものと思われる）がノックアウトマウスで以前に観察された骨の表現型を大理石骨病から骨粗鬆症に実際に逆転させ得ることをも示している。この可能性を試験するため、ｘｉｄバックグラウンド上にＢＴＫトランスジーンのコピーを添加し戻したトランスジェニックマウスを用いてオステオペニア表現型の逆転が可能か否かを決定した。ＢＴＫトランスジーンＢＴＫｌｏは、これまで野生型ＢＴＫ酵素の約２５％の酵素活性を有することが報告されている（Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅ Ａ．Ｂ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８（５）： ８３３−４４ （１９９８））。
【００７６】
１×ＴＧは酵素の野生型レベルの約２５％を有する１コピーのトランスジーンを示し、２×は２コピーのトランスジーンを表す。野生型（ｗｔ）に１コピーまたは２コピーのトランスジーンをプラスすると、ＢＴＫの正常なレベル１００％に加えて、存在するトランスジーンの各コピーについてさらに２５％高いＢＴＫレベルを有するであろう。それゆえ、０、２５、５０、１００、１２５および１５０％または野生型レベルを有する動物を得ることが可能である。図３において、骨ミネラル密度分析の結果は、ＢＴＫをトランスジーンとして１または２コピーにて添加し戻したＢＴＫｘｉｄメスマウスからの脛骨が正常なトランスジーンの２コピーの添加によって骨ミネラル密度が上昇し、観察したオステオペニアｘｉｄ欠陥を完全に補償しうることを示している。
これら結果は、ＢＴＫが骨再吸収プロセスにおいて不可欠の酵素であることを示しており、さらに単一の点変異がノックアウトマウスにおいて以前に観察された骨表現型を逆転し得ることを示している。
【００７７】
実施例３
ＢＴＫの分子構築物
ＢＴＫの過剰発現のための４つの分子構築物をデザインし、図４にまとめて示す。マウスＢＴＫ野生型および３つの点変異を、ｐＣＤＮＡ３．１および分子標識用ｐ３ＸＦＬＡＧ（３つのＦＬＡＧエピトープ）中にクローニングした。最初の構築物では、野生型マウスＢＴＫをＣＭＶプロモーターの制御下に置き、ＦＬＡＧアミノ酸配列をＢＴＫタンパク質コード配列のアミノ末端に結合した。同じ一般的デザインを用いる他の構築物は、この構築物から生成した：（１）ｘｉｄ変異（残基２８にアルギニンをシステインに変化させる点変異を含む）；（２）「機能の獲得」変異（ある造血細胞株で報告され、残基４１がグルタミン酸からリシンに変換されている）；および（３）優性陰性変異（残基４３０におけるリシンがアルギニンに変換され、該タンパク質のキナーゼ活性を消し去る（ｏｂｌｉｖｉａｔｅ）ことを意図している）。
【００７８】
構築物を最初にＨＥＫ２９３およびＣＯＳ７細胞株にトランスフェクションした。図５に示すように、ＦＬＡＧ標識ＢＴＫ構築物は両細胞株で首尾よく発現した。ＦＬＡＧ ＢＴＫは、ＦＬＡＧおよびＢＴＫ ＣＯＯＨ末端２０アミノ酸抗体（ＦＬＡＧおよび非標識の両者を検出する）を用いてトランスフェクションしたＣＯＳ−７およびＨＥＫ２９３の溶解液で検出された。ついで、これら構築物をＲＡＷ２６４．７細胞中にトランスフェクションし、ＦＬＡＧ標識ＢＴＫの発現について細胞溶解液を調べた。図６に示すように、ＲＡＷ２６４．７細胞へのトランスフェクションおよび発現は成功であった。ＦＬＡＧ ＢＴＫはトランスフェクションした安定なＲＡＷ２６４．７細胞溶解液で検出された。
このデータは、ＢＴＫおよびその様々な構築物が種々の哺乳動物細胞株にクローニングおよび安定に発現できることを確立するものである。とりわけ、ＢＴＫ構築物は、破骨前駆細胞株で安定に発現される。
【００７９】
実施例４
ＢＴＫアッセイ
ＢＴＫの４つの分子構築物を含むＲＡＷ２６４．７を溶解し、抗ＦＬＡＧ抗体を用いてＢＴＫを免疫沈降した。免疫沈降したＦＬＡＧ標識ＢＴＫを、２つずつ、ＦＬＡＧ抗体かまたは抗ホスホチロシン抗体のいずれかを用いてウエスタンブロッティングし、化学ルミネセンスにより分析した。野生型のＦＬＡＧ標識ＢＴＫの平均蛍光値を１００％に標準化した。図７ａに示すように、ＦＬＡＧ ＢＴＫはトランスフェクションした安定なＲＡＷ２６４．７細胞溶解液においてＦＬＡＧ抗体を用いて検出された。図７ｂに示すように、ホスホチロシン標識ＢＴＫは、同じトランスフェクションした安定なＲＡＷ２６４．７細胞溶解液で検出された。図７ｃは、ＦＬＡＧ標識したＢＴＫおよび変異体について、抗ホスホチロシン蛍光と対比した抗ＦＬＡＧ蛍光の蛍光光度デンシトメトリー分析を示す。
【００８０】
図７ｃに示すように、ｘｉｄ ＢＴＫのリン酸化は野生型ＢＴＫと比較して有意に低減しており、一方、「機能の獲得」構築物はＢＴＫチロシンリン酸化のわずかな増大を示していると思われる。優性陰性構築物は低減したチロシンリン酸化を示した。ついで、トランスフェクションした安定なＲＡＷ２６４．７細胞溶解液を抗ホスホチロシンを用いてブロッティングしたところ、全細胞チロシンリン酸化と等価なレベルが示された（その結果を図８に示す）。
【００８１】
ついで、ＢＴＫ構築物を抗ＦＬＡＧ抗体を用いて全細胞溶解液から免疫沈降させ、公知のＢＴＫ基質であるＳＬＰ７６をインビトロアッセイでリン酸化するのに用いた（その結果を図９に示す）。リン酸化強度のモニターは、基質中へのホスホチロシンの導入により行った。図９に示すように、組換えＦＬＡＧ標識ＢＴＫはこのアッセイにおいてそれ自体で自己リン酸化できるのに対し、ＳＬＰ７６は自己リン酸化を担うことができない。モックおよびベクター単独の免疫沈降では、ＳＬＰ７６標的のリン酸化は生じない。しかしながら、免疫沈降した野生型ＢＴＫを添加すると、ＢＴＫ自体およびＳＬＰ７６標的の両者においてリン酸化される結果となった。ｘｉｄ構築物細胞溶解液から免疫沈降したＢＴＫを添加すると、ＳＬＰ７６標的の過リン酸化並びにＢＴＫ自体のリン酸化の増大という結果となった。「機能の獲得」および優性陰性の変異体細胞構築物からの抽出物を用いたリン酸化は、野生型ＢＴＫに比べて低減していると思われた。
【００８２】
これら結果は、ＢＴＫｘｉｄ変異体が該酵素の過度に活性な形態を表しており、マウスでのオステオペニアの確立においてｘｉｄ変異が果たす役割の説明を提供するものである。これら結果はさらに、ＳＬＰ７６など（これに限られるものではない）の下流エフェクタータンパク質もまた、該変異体ＢＴＫの増大した活性並びに識別区画化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ）によってこのオステオペニア作用に貢献していることを示唆している。
【００８３】
実施例５
細胞生物学
ＢＴＫの上記分子構築物を含むＲＡＷ２６４．７細胞をファロイジンで染色し、蛍光顕微鏡により分析した。アクチン／ファロイジンで染色した異なる変異体間で微妙な差異が認められた。図１０ａに示すように、野生型ＢＴＫを発現する細胞は、ポドソームの単一のリング、幾つかのストレスファイバーおよび細胞質染色を示した。図１０ｂに示すように、Ｒ２８Ｃ（ｘｉｄ）はポドソームの二重のリングを示した。これら不規則な形状の細胞はまた、より大きなかつ複数のシーリング領域を有していた。図１０ｃに示すように、Ｅ４１Ｋ（「機能の獲得」）は、多くのストレスファイバーを含む多数の大きな細胞を示した。ＢＴＫ抗体は、変異の如何にかかわらず膜または膜の近傍での局在を示した。この細胞生物学データは、ＢＴＫ活性をポドソームの集合並びにシーリング領域（活性化した破骨細胞によるその後の骨の再吸収に必要な構造である）の形成と関連付けるものである。
【００８４】
インビトロで過度の活性化の証拠を示しインビボでオステオペニアの増大を示したＢＴＫのｘｉｄ形態は、ポドソームの集合の増大に導き、このことが今度は破骨細胞の活性の増大およびその後のオステオペニアに導く。これら結果はまた、下流エフェクタータンパク質が同様にこのプロセスに関与してオステオペニアに導くこと、とりわけ活性化した破骨細胞において細胞骨格の再構成に最終的に導く下流のエフェクターおよび代謝媒体物を確認するものである。翻訳後修飾のパターンの異なるＢＴＫは異なる細胞下区画にターゲティングされると思われることから、異所性のＢＴＫタンパク質もまた破骨細胞における転写活性に影響を及ぼすことも明らかである。このことはさらに、細胞転写活性の強力なモデュレーターであるＮＦ−κＢをＢＴＫが活性化する能力によって支持される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＢＴＫノックアウトマウスと野生型マウスでの骨ミネラル密度の結果を示す。
【図２】
ＢＴＫｘｉｄマウスと野生型マウスでの骨ミネラル密度の結果を示す。
【図３】
雌のＢＴＫｘｉｄマウス（ＢＴＫｘｉｄバックグラウンドに１および２コピーの野生型ＢＴＫを付加）と野生型マウスでの骨ミネラル密度を示す。
【図４】
ＢＴＫの研究用に生成した分子構築物の概要を示す。
【図５】
トランスフェクションしたＣＯＳ−７およびＨＥＫ２９３溶解液におけるＦＬＡＧ ＢＴＫの検出を示す一次元ウエスタンブロットを示す。
【図６】
トランスフェクションした安定なＲＡＷ２６４．７細胞溶解液におけるＦＬＡＧ ＢＴＫの検出を示す一次元ウエスタンブロットを示す。
【図７ａ】
野生型ＢＴＫおよび変異ＢＴＫのリン酸化を示す一次元ウエスタンブロットを示す。
【図７ｂ】
野生型ＢＴＫおよび変異ＢＴＫのリン酸化を示す一次元ウエスタンブロットを示す。
【図７ｃ】
ＦＬＡＧ標識したＢＴＫおよび変異体での抗ｆｌａｇ蛍光と抗ホスホチロシン蛍光との蛍光光度デンシトメトリー分析を示す。
【図８】
野生型ＢＴＫおよび変異体ＢＴＫの全細胞チロシンリン酸化を示す一次元ウエスタンブロットを示す。
【図９】
ＳＬＰ７６をキナーゼ基質として用いた免疫沈降およびキナーゼアッセイを示す。
【図１０ａ】
ＢＴＫ変異体をトランスフェクションした安定なＲＡＷ２６４．７細胞株のアクチンファロイジン染色を示す。
【図１０ｂ】
ＢＴＫ変異体をトランスフェクションした安定なＲＡＷ２６４．７細胞株のアクチンファロイジン染色を示す。
【図１０ｃ】
ＢＴＫ変異体をトランスフェクションした安定なＲＡＷ２６４．７細胞株のアクチンファロイジン染色を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004533209.tif 000089
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533209.tif 000090
2004533209.tif 000091
【国際調査報告】
2004533209.tif 000092
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