(57)【要約】本発明は、血液凝固第ＸＩＩＩａ因子の活性化の測定方法に関する。本発明の課題は、ハイスループットを有するテストシステムの使用にも適している、容易に実施可能のＦＸＩＩＩａの活性化の測定方法を記載することである。驚くべきことに、活性化ＦＸＩＩＩがフィブリン血液凝塊の光透過性に影響を及ぼすことが見出された。フィブリノーゲンはフィブリノーゲン分解酵素によって凝固される。存在するＦＸＩＩＩａの濃度依存性のサンプルの光透過性の変化が記録され、ＦＸＩＩＩａの活性化の基準として利用される。本発明による方法は、特にＦＸＩＩＩａ阻害物質のスクリーニングに適用される。
2004508832.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル溶液が因子第ＸＩＩＩａを含有し、またはサンプル溶液中にＦＸＩＩＩａが生成する前記サンプル溶液中の血液凝固第ＸＩＩＩａ因子の活性化の測定方法であって、
前記サンプル溶液にフィブリノーゲン分解酵素により凝固されるフィブリノーゲンが添加され、その際に発生する吸光変化が測定され、評価されることを特徴とする方法。
【請求項２】
フィブリノーゲン分解酵素としてバトロキソビンが使用されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
フィブリノーゲン分解酵素としてトロンビンが使用されることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項４】
フィブリノーゲン源として抗凝血性血漿が使用されることを特徴とする、請求項１および２記載の方法。
【請求項５】
吸光測定のための第一液に血液凝塊の光透過性を低減する物質、特にポリマーが添加されることを特徴とする、請求項１ないし３記載の方法。
【請求項６】
ポリマーとしてポリエチレングリコール６０００が使用されることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＦＸＩＩＩａの阻害物質のスクリーニングのための、請求項１ないし６記載の方法の使用。
【請求項８】
ＦＸＩＩＩａの阻害物質とトロンビンとを同時にスクリーニングするための、請求項３記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、血液凝固第ＸＩＩＩａ因子の活性化の測定、特にハイスループットを有するテストシステムの使用のための方法に関する。
【０００２】
血液凝固第ＸＩＩＩａ因子（ＦＸＩＩＩａ）は、グルタミン転移酵素として血漿凝固系内で唯一の非蛋白質分解作用酵素である。血漿中で循環する不活性のプロ酵素第ＸＩＩＩ因子（ＦＸＩＩＩ）が血液凝固経過中にトロンビンによって活性化され、フィブリンモノマーの分子間網状結合を相互にかつ他の血漿蛋白質（たとえばα２アンチプラスミン）と共にε−（−γ−グルタミル）−リジン結合の形成によって触媒する。それによって繊溶分解に対するフィブリン血液凝塊の機械的強度および抵抗力が増強される。
【０００３】
凝固現象のほかに、ＦＸＩＩＩａが創傷治癒においてある役割を果たしている。ＦＸＩＩＩは種々の細胞中（血小板、マクロファージ）および組織中（胎盤）でも検出された。細胞ＦＸＩＩＩａの機能（群）に関しては、これまでまだよく知られていない（Ｌ．　Ｍｕｓｚｂｅｋら：　Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｒｅｓ．　９４，　１９９９，　２７１−３０５）。
【０００４】
しかし、その他のＦＸＩＩＩａの生理学的役割を解明するための有効な特異的インヒビターがない。このような阻害物質について血栓症罹患予防のための治療適用が検討され、プラスミノーゲン賦活体との組合せが血栓症閉塞の溶解現象を促進する（Ｅ．Ｍ．　Ｌｅｉｄｙら：　Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｒｅｓ．　５９，　１９９０，　１５−２６，　Ｒ．Ｊ．　Ｓｈｅｂｕｓｋｉら：　Ｂｌｏｏｄ　７５，　２０００，　１４５５−１４５９）。
【０００５】
これまでＦＸＩＩＩａ阻害物質はあまり多く記載されたことがない。その多くは、フィブリン中のグルタミン残基と結合し、それによりフィブリンの交差網状結合を阻止する置換アルキルアミン型の基質である。もちろん充分な作用を達成するために、この擬基質の高い濃度が必要である（Ｓ．−Ｙ．　Ｋｉｍら：　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　２３３，　１９９７，　３９−４４）。
【０００６】
ＦＸＩＩＩａの直接的阻害物質として、中でも酵素の活性中心でスルフヒドリル基を不可逆的に阻止するイミダゾール誘導体、トリアゾール−およびテトラゾリウム化合物が記載されている（米国特許第５，０７７，２８５号；米国特許第５，１７７，０９２号；米国特許第５，０４７，４１６号）。
【０００７】
メルク・シャープ・アンド・ドーム社が開発したＦＸＩＩＩａ阻害物質Ｌ７２２１５１、チアゾロ−チアジアゾリウム誘導体は、動物モデル中でプラスミノーゲン賦活体による血栓溶解の改善を達成することができる（Ｅ．Ｍ．　Ｌｅｉｄｙら：　Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｒｅｓ．　５９，　１９９０，　１５−２６）。
【０００８】
合成阻害物質のほかに、ＦＸＩＩＩａの天然の阻害物質も公知である。高作用のトリデジンがエーゲル・ヘメンテリア・ギリアニ（Ｅｇｅｌ　Ｈａｅｍｅｎｔｅｒｉａ　ｇｈｉｌｉａｎｉｉ）から単離され、その他の阻害物質は種々の微生物から単離された（米国特許第６，０２５，３３０号；米国特許第５，７１０，１７４号；Ｋ．　Ｉｋｕｒａら：　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　６４，　２０００，　１１６−１２４）。
【０００９】
ＦＸＩＩＩａの活性化同定のための公知の方法は、次の２つの原理に基づいている：
（１）「血餅溶解度試験」（Ｃｌｏｔ−Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ−Ｔｅｓｔ）は尿素中の網状結合および非網状結合のフィブリン血液凝塊の様々な溶解性を利用するが、ＦＸＩＩＩａ活性化の半定量的同定のみを可能にする（Ｐ．　Ｓｉｇｇ：　Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｄｉａｔｈ．　Ｈａｅｍｏｒｒｈ．　１５，　１９６６，　２３８−２５１；　Ａ．Ａ．　Ｔｙｍｉａｋら：　Ｊ．　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　４６，　１９９３，　２０４−２０６）。
（２）は標識またはビオチニル化アミン基質（ダンシルカダベリン、ビオチンペンチルアミン）を常法により不動化したペプチド（たとえばカゼインまたはフィブリン）に結合するためにＦＸＩＩＩａの触媒性質が利用される。結合した基質の同定は、直接的に（蛍光もしくは化学発光の変化）または抗体−もしくはストレプタビジン結合酵素を介して行われる（米国特許第５，０１５，５８８号、米国特許第４，６０１，９７７号）。これらの方法は全て複数のインキュベーション・ステップを必要とし、そのため時間−および作業コストがかかり、前記方法がハイスループットによる自動化テストシステムの適用を可能にしないため、新規の効果的かつ特異的なＦＸＩＩＩａの阻害物質に対する探索に適していない。またグリシンエチルエステルがグルタミン含有ペプチド基質と結合され、その際に遊離したアンモニアが酵素反応で測定される方法は、ハイスループットによるスクリーニングに適していない（Ｋ．　Ｆｉｃｋｅｎｓｃｈｅｒら：　Ｔｈｒｏｍｂ．　Ｈａｅｍｏｓｔ．　６５，　１９９１，　５３５−５４０）。
【００１０】
本発明は、特にハイスループットを有するテストシステムの使用下にＦＸＩＩＩａ阻害物質のスクリーニングに適用できる容易に実施可能のＦＸＩＩＩａの活性化の測定方法を記載する課題を基礎においている。
【００１１】
驚くべきことに、ＦＸＩＩＩａが使用濃度との依存性（たとえばトロンビンまたはバトロキソビンのようなフィブリノーゲン分解酵素の作用によって発生）においてフィブリン血液凝塊の光透過性が変化することが見出された。
【００１２】
この結果に基づき、以下詳しく説明するＦＸＩＩＩａの活性化の測定方法が開発された。
【００１３】
フィブリノーゲンはフィブリノーゲン分解酵素によって凝血される。好ましくはヘビ毒酵素バトロキソビンが使用される。これはトロンビンと異なりフィブリノーゲン分子からフィブリノペプチドＡのみを分離するボトロプス・アトロクス（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ　ａｔｒｏｘ）毒からのトロンビン状酵素である。トロンビンの使用が同様に可能である。ヒトまたはその他の哺乳動物から精製されたフィブリノーゲンの使用が特に有利であることが証明されている。しかしフィブリノーゲン源としてヒトまたは他の哺乳動物の抗凝血性血漿（たとえばクエン酸またはヒルジンによる）も利用してよい。好ましくは、本発明による方法は緩衝液中で実施される。ｐＨ値７．４を有するトリスＨＣｌ緩衝液が有利である。試験方法の感度を高めるために測定第一液に、血液凝塊の光透過性が低減されるような発生するフィブリン繊維の構造を変化させることができる物質（常法によりポリマー）が添加される。好ましくはポリエチレングリコール６０００が濃度０．２％で使用される。
【００１４】
フィブリノーゲン凝固によって発生する吸光増加（混濁）が連続的に一定の時間にわたり光度計で検出される。終点測定が同様に可能である。この測定は、有利には３７℃および波長４０５ｎｍで実施される。活性化ＦＸＩＩＩの測定第一液が添加されると、反応中に吸光増加がより少なくなる。すなわち発生した血液凝塊の光透過性がより大きくなる。ＦＸＩＩＩａを含まない第一液とＦＸＩＩＩａを含む第一液の吸光時間曲線下の吸光変化もしくは面積の間の差分がＦＸＩＩＩａの活性化の基準として利用される。記載したテスト第一液により、阻害物質が血液凝塊の光透過性を阻害作用の強度に応じて低下させるため、ＦＸＩＩＩａの阻害物質を検出することができる。テスト物質を含むおよび含まない因子第ＸＩＩＩａの活性が比較される。この活性の差分が、求めているテスト物質の阻害作用の基準として利用される。フィブリノーゲン分解酵素としてのトロンビンの使用と共に、平行してトロンビン阻害物質も探索することができる。探索している物質がトロンビンに対する阻害作用を有していれば、フィブリノーゲン凝固が阻止され、サンプルの吸光が変化しない。
【００１５】
本発明による方法は血漿および細胞のＦＸＩＩＩａの活性化の測定のために使用することができる。プロ酵素ＦＸＩＩＩは測定前に別の第一液中で活性化される。この活性化はＣａイオンの存在下にトロンビンによって行われる。バトロキソビンのような他のフィブリノーゲン分解酵素の使用時に測定に及ぼすトロンビンの妨害的影響を回避するために、ＦＸＩＩＩの完全な活性化後に活性化第一液に天然または合成のトロンビン阻害物質が充分な濃度で添加される。好ましくは組換えヒルジンが使用される。フィブリノーゲン分解酵素としてのトロンビンを使用する場合は、このステップが省かれる。
【００１６】
本発明は、以下、図面に表した４実施例を利用してより詳しく説明する。
【００１７】
実施例１：
活性化ＦＸＩＩＩの存在下のバトロキソビンによるクエン酸凝血性血漿の凝固ＦＸＩＩＩの活性化：
トリス緩衝液８６５μｌ（０．０５Ｍ；０．１５４ＭＮａＣｌ；ｐＨ７．４）、ＣａＣｌ２２５μｌ（０．２Ｍ）、トロンビン１００μｌ（ウシ血漿由来、１００Ｅ／ｍｌ）および細胞組換えＦＸＩＩＩ　１０μｌ（アヴェンティス−ベーリング、マールブルク、ドイツ；８．６ｍｇ／ｍｌもしくは１１５５Ｅ／ｍｌ）を混合し、１０分間３７℃でインキュベートする。それに続き、組換えヒルジン２５μｌ（ＨＢＷ０２３、ヘキスト、フランクフルト、ドイツ；１０００Ｅ／ｍｌ）を添加する。
【００１８】
測定第一液：
マイクロタイタープレート上でクエン酸血漿１００μｌ、トリス緩衝液６０μｌ（ｐＨ７．４）および上記活性化第一液４０μｌを混合し、３７℃に温度調節する。この反応をバトロキソビン５０μｌ（ペンタプファルム社、バーゼル、スイス；２．５Ｅ／ｍｌ）の添加により開始する。吸光増加を１５分にわたり３７℃および波長４０５ｎｍでマイクロタイタープレート光度計（ｉＥＭＳ、ラブシステムズ、ヘルシンキ、フィンランド）で追跡する。因子第ＸＩＩＩａを含まない測定第一液を対照として利用する。
【００１９】
この測定曲線は図１に示している。
【００２０】
結果：
短い遅滞期後、凝固の開始により吸光が増加し、測定曲線の後部で平坦値に近接する。活性化ＦＸＩＩＩの存在下における吸光増加は、ＦＸＩＩＩａを含まないサンプル中よりも明らかに減少する。非活性化ＦＸＩＩＩは血液凝塊の光透過性に全く影響を及ぼさない。
【００２１】
実施例２：
バトロキソビンによるフィブリノーゲンの凝固に及ぼす種々のポリマーの影響　フィブリノーゲン１００μｌ（シグマ、ダイゼンホーフェン、ドイツ；０．６％）；ポリマー２５μｌ（２５ｍｇ／ｍｌ）；トリス緩衝液７５μｌをマイクロタイタープレート上で混合し、３７℃に温度調節する。バトロキソビン５０μｌ（２．５Ｅ／ｍｌ）の添加後、吸光増加を２０分にわたり実施例１に記載した条件下に測定する。
【００２２】
フィブリノーゲン血液凝塊の光透過性に及ぼすヒドロキシエチルデンプン、デキストランスルフェートおよびポリエチレングリコールの影響は図２に示す。
【００２３】
結果：
添加したポリマーは、明らかに強化された吸光の増加において、血液凝塊の光透過性の低減を生ぜしめる。ヒドロキシエチルデンプン、デキストランおよびポリエチレングリコール１５００の影響は比較的小さい。それに対してポリエチレングリコール６０００および２００００は、ポリマーを添加しないサンプルに比べ吸光を約１５倍高める。
【００２４】
実施例３：
種々のＦＸＩＩＩａ濃度の存在下のバトロキソビンによるフィブリノーゲンの凝固
ＦＸＩＩＩの活性化は実施例１にしたがって行う。
【００２５】
マイクロタイタープレート上でフィブリノーゲン１００μｌ（０．６％）、ＰＥＧ６０００　２５μｌ（２％）、活性化第一液１００μｌ（種々のＦＸＩＩＩａ濃度）を混合し、３７℃に温度調節後にバトロキソビン２５μｌ（５Ｅ／ｍｌ）と反応させる。吸光は実施例２と同様に測定する。サンプルの吸光増加は、ＦＸＩＩＩａを含まないサンプル（対照＝１００％）中の吸光増加を基準として％で表示する。
【００２６】
図３はＦＸＩＩＩａの較正曲線である。表示したものは平均値（ｎ＝６）±標準偏差である。
【００２７】
結果：
ＦＸＩＩＩａは濃度依存性に血液凝塊の光透過性を高める。較正曲線は線形的に１および１２μｇ／ｍｌの間のＦＸＩＩＩａ濃度で推移する。
【００２８】
実施例４：
ヨード酢酸によるＦＸＩＩＩａの阻害
ＦＸＩＩＩの活性化は実施例１にしたがって行う。
【００２９】
フィブリノーゲン１００μｌ（０．６％）、ＰＥＧ６０００　２５μｌ（２％）、緩衝液（０．２から０．８ｍＭ）中のヨード酢酸８０μｌおよび活性化第一液２０μｌを混合し、３７℃に温度調節する。バトロキソビン２５μｌ（５Ｅ／ｍｌ）の添加後、吸光を上記と同様に測定する。
【００３０】
この測定曲線は図４Ａに示している。図４Ｂは阻害物質濃度に依存するＦＸＩＩＩａ活性化である。
【００３１】
結果：
ヨード酢酸は、血液凝塊の光透過性の低減で検出可能に、濃度依存性にＦＸＩＩＩａの活性化を阻害する。この阻害作用の基準として、ＦＸＩＩＩ活性化を５０％低減する阻害物質濃度（ＩＣ５０）を算出する。このヨード酢酸のためのＩＣ５０値は１４７μＭになる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
活性化ＦＸＩＩＩの存在下のバトロキソビンによるクエン酸抗凝血性血漿の凝固である。
【図２】
バトロキソビンによるフィブリノーゲンの凝固に及ぼす種々のポリマーの影響である。
【図３】
種々のＦＸＩＩＩａ濃度の存在下にバトロキソビンによるフィブリノーゲンの凝固である。
【図４】
ヨード酢酸によるＦＸＩＩＩａの阻害である。
【図４Ａ】
測定曲線である。
【図４Ｂ】
阻害物質濃度に依存するＦＸＩＩＩａ活性化である。
【図１】
2004508832.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2004508832.tif 000007
【国際公開パンフレット】
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2004508832.tif 000019
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508832.tif 000020
2004508832.tif 000021
2004508832.tif 000022
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508832.tif 000035
2004508832.tif 000036
【国際調査報告】
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