(57)【要約】本発明は、ドナー細胞集団からＧ１細胞を選択し、分離することによる核移植の方法を提供する。本法は、ドナー核の細胞周期段階が確定し、農業、医薬、機能性食品および生物医学用途のトランスジェニックまたは非トランスジェニック・クローン胚細胞、再構成胚および完全な動物をつくることができる点で従来技術より有利である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナー細胞の増殖または非増殖集団からＧ１細胞を選択し、分離し、かつこのような分離Ｇ１細胞から得た核を除核したレシピエント細胞中に移植することを含む核移植の方法。
【請求項２】
ドナー細胞集団が、細胞周期の１個または複数の既知または未知の段階にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ドナー細胞集団が、非増殖中のものであって、細胞周期のＧ１段階中の任意の時点で同調されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｇ１細胞が早期Ｇ１期に分離されるたものである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
ドナー細胞集団が、非増殖中のものであって、老化細胞よりなる、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ドナー細胞集団が、ｉｎ　ｖｉｖｏで動物から、またはｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞培養から分離される胚、胎児、幼若、成体のいずれかの細胞に由来する、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ドナー細胞集団が、細胞周期に入り、かつ増殖するように刺激されることのできる任意の二倍体核型正常細胞よりなる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ドナー細胞集団が、未分化細胞状態にあるか、または分化の任意の段階または休止期または老化期にある、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ドナー細胞が、成体または胎児の繊維芽細胞または濾胞である、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ドナー細胞が修飾細胞よりなる、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ドナー細胞がトランスジェニック細胞よりなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
レシピエント細胞が除核した卵母細胞を含む、先行するいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１３】
除核した卵母細胞が、ドナー核と一致する種由来のものから得られる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
レシピエント細胞が、除核した幹細胞または除核した融合幹細胞の凝集塊よりなる、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
幹細胞が、増殖中の胚から分離した胚幹細胞であるか、または培養中に樹立細胞系を形成する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
除核レシピエント細胞中に、細胞周期のＧ１段階にある分離されたドナー核を移植することを含む、クローン動物胚の作製方法。
【請求項１７】
この技術分野で所望の遺伝特性を有するクローン胚を作製する周知の方法を用いてドナー核を遺伝子的に改変する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
鳥類、両生類、魚類および哺乳類よりなる群から選択される動物種のクローン胚を作製する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記クローン動物胚が、ヒトを含む霊長類、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、シカ、ヤギおよびブタよりなる群から選択される哺乳動物のものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１６に記載の方法によって調製される再構成動物胚。
【請求項２１】
トランスジェニック胚を含む、請求項１７に記載の再構成動物胚。
【請求項２２】
胚数を更に増加させるために再クローン化されるか、または核再プログラム化および／または発生を促進するために、一連の核移植を受ける、請求項２０または２１に記載の再構成動物胚。
【請求項２３】
ヒトを含む霊長類、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、シカ、ヤギおよびブタよりなる群から選択される哺乳類の１種よりなる、請求項２０から２２のいずれか１項に記載の再構成動物胚。
【請求項２４】
（１）請求項１６または１７のいずれか１項の方法により、ヒト以外のクローン動物胚を作製する段階、（２）既知の方法により、その胚からヒト以外の動物を予定時期に発生させる段階、および（３）従来の方法か、追加のクローニングのいずれかによって形成されるヒト以外の動物から任意選択的に繁殖させる段階を含む、ヒト以外の動物をクローニングする方法。
【請求項２５】
ヒト以外の前記クローン動物が、ヒト以外の霊長類、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジおよびシカよりなる群から選択されるヒト以外の哺乳動物である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ヒト以外の前記クローン動物が、所望の遺伝特性を有するヒト以外のトランスジェニック動物である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
ヒト以外の前記トランスジェニック動物が、トランスジェニック・ウシまたはヒツジである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２４の方法によって調製されるヒト以外のクローン動物。
【請求項２９】
ヒト以外の霊長類、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジおよびシカよりなる群から選択される哺乳動物である、請求項２８に記載のヒト以外のクローン動物。
【請求項３０】
所望の遺伝特性を有するヒト以外のトランスジェニック動物である、請求項２８または２９に記載のヒト以外のクローン動物。
【請求項３１】
トランスジェニック・ウシまたはヒツジである、請求項３０に記載のヒト以外のクローン動物。
【請求項３２】
所望の遺伝特性が、ミルク、血液または尿中の医薬用蛋白の生産；ミルクまたは肉中の機能的生成物の生産；ミルク、肉および繊維性生産の品質を改善するための有益な農産物特性の生産；害虫および病気に対する抵抗性改善；ミルク中での工業用蛋白の生産；異種移植；およびヒト疾患モデルとしてトランスジェニック動物の創出のための、１個または複数の遺伝子の挿入、欠失または修飾から選択されたものである、請求項３０または３１に記載のトランスジェニック・クローン動物。
【請求項３３】
請求項２８から３２のいずれか１項に記載のヒト以外のクローン動物の子および子孫。
【請求項３４】
ａ）ドナー細胞の増殖集団、Ｇ１細胞の同調集団、または老化細胞の集団からＧ１細胞を選択し、分離し、かつこの分離された細胞から得られる核を除核したレシピエント細胞中に移植して形質転換する段階、ｂ）胚盤胞期に成長させる段階、ｃ）胚細胞を回収する段階、およびｄ）この技術分野で既知の方法によってｉｎ　ｖｉｔｒｏで無限分裂細胞系を確立する段階を含む胚細胞系を作製する方法。
【請求項３５】
前記胚細胞が胚幹細胞である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ドナー細胞がヒト細胞である、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
ドナーおよびレシピエント細胞が共にヒト細胞である、請求項３４から３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
ドナー細胞が核型正常な細胞型から選択される成体または胎児細胞であって、かつレシピエント細胞が遺伝子発現を再プログラム化することのできる任意の細胞型から選択される、請求項３４から３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
請求項３４から３６のいずれか１項の方法によって作製される胚細胞系。
【請求項４０】
治療用途に有用な請求項３５に従属する、請求項３６の方法によって作製されるヒト胚幹細胞系。
【請求項４１】
ａ）ドナー細胞の増殖集団、またはＧ１細胞の同調集団、または老化細胞の集団からＧ１細胞を選択し、分離し、かつこの分離された細胞から得られる核を除核したレシピエント細胞中に移植する段階、ｂ）胚盤胞期に増殖させる段階、およびｃ）胚幹細胞を回収する段階を含む胚幹細胞を作製する方法。
【請求項４２】
前記ドナー細胞がヒト細胞である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ドナーおよびレシピエント細胞が共にヒト細胞である、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
ドナー細胞が任意の核型正常な細胞型から選択される成体または胎児細胞であって、かつレシピエント細胞が遺伝子発現を再プログラム化することのできる任意の細胞型から選択される、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
請求項４１から４３のいずれか１項の方法によって作製される胚幹細胞。
【請求項４６】
ヒト胚幹細胞を含む、請求項４５に記載の胚幹細胞。
【請求項４７】
神経細胞、筋肉細胞、心臓細胞、肝細胞、肺細胞、腎細胞または対象とする他の任意の細胞型よりなる群から選択される細胞または組織の分化型が、この技術分野で周知の方法を用いて培養されたものである、請求項３９、４０および４５のいずれか１項に記載の胚細胞の使用。
【請求項４８】
前記胚細胞が、請求項４０または４６に記載のヒト胚幹細胞である、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
胚幹細胞が、被験体由来のドナー細胞から請求項３５および４１から４３のいずれか１項に従って作製され、前記被験体または治療を必要とする他の被験体に移植するため、分化した細胞または組織を生成するために培養される治療用クローニング方法。
【請求項５０】
前記胚性幹細胞が、移植に使用される生成分化細胞において所望の遺伝特性を付与するために、１個または複数の導入遺伝子を含むものである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
分化した細胞または組織の移植によって治療し得る疾患、障害または傷害を治療する方法であって、請求項４９または５０の方法により生成する分化した細胞または組織の治療上有効な量を、それを必要とする患者に適用することからなる上記方法。
【請求項５２】
前記の疾患、障害または傷害が、様々な神経障害（例えば、パーキンソン病）、糖尿病、心臓疾患、筋ジストロフィー、様々な遺伝性疾患、特定の癌（例えば、白血病）、脊髄傷害、火傷および他の病苦から選択されたものである、請求項４９または５０に記載の方法。
【請求項５３】
請求項４７の方法によって作製されるｉｎ　ｖｉｔｒｏで分化されたヒト胚幹細胞を使用する薬物発見または薬物毒性試験の方法。
【請求項５４】
細胞、組織および器官を、請求項２８から３２のいずれか一項に記載のヒト以外のクローン動物から分離し、それを必要とするヒト患者に移植するために使用する異種移植の方法。
【請求項５５】
細胞、組織および器官が導入遺伝子を含んでおり、請求項３０または３１に記載のヒト以外のクローン動物から分離される遺伝子治療の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、とりわけ、遺伝子工学処理またはトランスジェニック哺乳類胚、胎児および子を含む哺乳類胚、胎児および子の生産のためのクローン技術に専ら使用することに限らないが、核移植の新規な方法に関する。
【０００２】
（背景）
ドナー核の細胞周期およびレシピエントである細胞質体の胚再構成時の段階は、核移植後の発生を成功させる重要な要因である。第１杯細胞周期後の染色質の二倍体セットを保証し、かつ核の再プログラミングと、その後の発生の機会を最大化するために、２個の「細胞」の特定の組合せが必要とされる。間期のドナー細胞が除核中期停止卵母細胞（細胞質体またはレシピエント細胞と称する）と融合するとき、即時的核膜破壊（ＮＥＢＤ）が起こり、ドナー染色質が未成熟染色体凝縮（ＰＣＣ）を生ずる（Ｂａｒｎｅｓ等、１９９３）。これらの作用は、卵成熟促進因子（ＭＰＦ。減数分裂または有糸分裂促進因子とも呼ばれる。Ｃａｍｐｂｅｌｌ等、１９９６ａによる総説を参照されたい。）と称する細胞質活性によって誘起される。卵母細胞が成熟する間のＭＰＦ活性は、中期段階で最大となり、受精、人工的活性化のいずかを受けたとき、急速に低下する。したがって、２種の細胞質体が再構成のために使用され得る。それらは、それぞれ非活性化または活性化中期ＩＩ（ＭＩＩ）細胞質体を用いたＭＰＦが高いか、または低いものである。
【０００３】
染色体の一体性およびそれによる発生潜在力を維持するために、哺乳類の核移植において細胞周期の調整が重要であることの理解を促進した初期の研究は、ウサギ、ヒツジ、ウシ等の種における移植前段階の胚から得られる未分化割球（即ち未分化胚細胞）を用いて行われた。これらの研究から、ドナー核の細胞周期段階および細胞質体中のＭＰＦに曝される期間が、観察されるＰＣＣの程度に顕著な効果を及ぼすことが明らかとなった。ＭＰＦに曝されたＳ期核の染色質は普通粉末状の外観を示し、これは染色体研究から異常発生率の高いことが示されている（Ｃｏｌｌａｓ等、１９９２ｂ）。それとは対照的に、Ｇ１またはＧ２期の核を用いた場合、染色質が凝縮することによって、それぞれ１本鎖または２本鎖の染色分体を有する細長い染色体を形成する（Ｃｏｌｌａｓ等、１９９２ｂ）。中期停止から再構成胚を解放し、かつ発生を活性化するための適当な刺激の後で、核膜がドナー染色質の周りに再形成され、次いでその染色質が、前の細胞周期段階と関係なくＤＮＡ合成を行う。したがって、Ｇ１期のドナー核は正常な発生に適合するＤＮＡ合成を開始する一方、Ｇ２期またはＳ期の核は、複製済みのＤＮＡを完全に、または部分的に再複製することによって、第１杯細胞周期の終りまでに、２個の娘細胞中のＤＮＡ含量が不正なものとなり、その結果、異常な早期胚発生が起こると思われる。
【０００４】
それとは対照的に、これらの初期の研究から、細胞質体活性化から十分な間隔をおき、ＭＰＦの消失後に割球核を細胞質体に導入すると、ＮＥＢＤは起こらず（したがって、ＰＣＣも起こらない）、導入時の細胞周期段階に従ってＤＮＡ複製を制御するのはドナー核である。したがって、Ｇ１期またはＳ期の核はそれぞれ複製を開始または継続するが、一方Ｇ２期の核は、次回のＤＮＡ合成に入るように誘起されない。このような予備活性化細胞質体は、「万能レシピエント」と呼ばれており（Ｃａｍｐｂｅｌｌ等、１９９４）、細胞周期の任意の段階にあるドナー細胞の発生を調節することができる。これは、大部分の未分化割球核が任意の一時点でＳ期にあり（８０〜９０％。Ｂａｒｎｅｓ等、１９９３；Ｃａｍｐｂｅｌｌ等、１９９４）、したがってＭＰＦの少ない細胞質体への導入に最も適合する前移植胚をクローニングするために、とりわけ重要であった。
【０００５】
核移植の後、正常な発生は、卵母細胞細胞質内にあって、染色質構造を再構成し、ドナー核の遺伝子発現パターンを適切に再プログラミングすることのできる因子（または外部から導入した追加の因子）に依存すると思われる。成熟細胞質体は、正常に受精した卵割段階胚の発生を普通のゲノム活性化の時まで支配するＲＮＡ転写物および蛋白を含み、胚核は、胚発生を支配するそれ自体のＲＮＡ合成をその時間に開始する。したがって、この時点を既に経過した胚または細胞型から得られるドナー核は、再構成後にＲＮＡ合成を停止して、新たに再プログラミングされた母体−胚間ゲノム遷移が起こるまで不活性のままでいなくてはならない。導入後、ドナー核は接合状態にへの再プログラミングを強制され、その後、正常な胚発生が起こるのに時間的にも空間的にも適当な、正しい水準で適切な遺伝子を活性化する。このような核の再プログラミングを実現する機構は、現在のところ十分に理解されてはいない。
【０００６】
培養して維持することのできる細胞で核移植を行うことに対する最近の関心の高まりから、再プログラミングおよび細胞周期調整は重要な話題となった。これらの培養細胞は、胚割球のクローニングに関するより以前の研究で使用されたものより分化している（即ち、より個別化された細胞機能を有している）。これらの細胞は、胚、胎児、成体のいずれかの動物から分離することができる。より多数の細胞を入手することができるので、これらの分化細胞培養を用いた効果的な核移植技術は、家畜種において所望の遺伝子型の大規模な増殖を可能とし、かつ培養細胞の遺伝子操作後のトランスジェニック動物の生産を容易にすると思われる。
【０００７】
予備活性化細胞質体に融合したヒツジ胚細胞（細胞周期段階は不明）の増殖が活発な非同調培養を用いた初期の研究により、早期継代細胞（Ｃａｍｐｂｅｌｌ等、１９９５）から予定時期に子ヒツジが実際に生まれたが、より後期の継代細胞（Ｃａｍｐｂｅｌｌ等、１９９６ｂ）からは生まれなかった。細胞から５日間血清を除き、その細胞が静止期（即ち、細胞が正常な細胞分裂周期から抜け、いわゆる「Ｇ０」期に入ったと思われる段階）にあると報告されたその後の研究においては、活性化の前、後または同時期に細胞質体と融合した後、同様の総括効率で、生きている子ヒツジが生まれた（Ｃａｍｐｂｅｌｌ等、１９９６ｂ）。これらの著者（Ｃａｍｐｂｅｌｌ等、１９９６ｂ；Ｓｃｈｎｉｅｋｅ等、１９９７；Ｗｉｌｍｕｔ等、１９９７；国際公開特許ＷＯ９７／０７６６９号）は、核再プログラングを促進し、分化細胞からのクローン動物の生産を可能にするために、正常な細胞分裂周期から抜けてしまい、静止期またはＧ０期に同調されている細胞を使用する重要性を示唆している。（Ｓ期の細胞がないことを示す、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の不在に基づいて）細胞を静止期に同調する前記著者等による好ましい方法は、適当な期間、血清飢餓にすることによるものであった。しかし最近、実際にＧ０期にある血清飢餓細胞の割合がどの程度かに関しては疑問が出された。（相対的に少ないＲＮＡと蛋白を有する静止細胞で、二倍体集団中のＧ０細胞とＧ１細胞を識別するために、）細胞ＤＮＡおよび蛋白の含量を同時に測定するためのデュアル・パラメータ・フロー・サイトメトリを用いて、Ｂｏｑｕｅｓｔ等（１９９９）は培養ブタ胎児繊維芽細胞の細胞周期特性を調べた。彼等は、５日間の血清飢餓にも関わらず、実際に彼等の定義によるＧ０期にあった細胞は５０％未満であることを示した。集団中の「小さい」細胞を選択することによって、Ｇ０期にある割合が血清飢餓培養において７２％に増加した（Ｂｏｑｕｅｓｔ等、１９９９）。
【０００８】
静止細胞の使用に代わる方法として、Ｃｉｂｅｌｌｉ等（１９９８；および国際特許公開ＷＯ９９／０１１６３号明細書）は、ＭＩＩ細胞質体に融合し、次にイオノマイシンおよび６−ジメチルアミノプリン（６−ＤＭＡＰ）を用いて活性化したウシ細胞の非血清飢餓無作為増殖培養の使用を報告した。しかし、これらの方法によって最終的にクローン子ウシを作り出した生成胚において、核移植時にドナーの細胞周期段階が何であったのかは、これらの開示からは明らかではない。
【０００９】
同様に、クローン化した子ウシ（Ｖｉｇｎｏｎ等、１９９８，１９９９；Ｚａｋｈａｒｔｃｈｅｎｋｏ等、１９９９）およびマウス（Ｗａｋａｙａｍａ　ａｎｄ　Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，１９９９）が非血清除去無作為増殖細胞培養から作り出された他の報告がある。しかし、クローンの子を産出した核移植時のドナーの細胞周期段階は、やはり明らかではない。
【００１０】
したがって、細胞周期のどの段階が、最終的に生きた子に成長するその低率の再構成胚を生成したのかを、これらの前記研究のいずれも正確には示していない。
【００１１】
上記の考察は、核移植時に培養ドナー細胞が属する細胞周期段階に関する特定が、これまで一般に不十分であり、そのために技術水準が不確実であり、再現するのが容易でない状況となっていることを如実に示している。
【００１２】
したがって、ドナー核の細胞周期段階が正確に知られていることを保証した核移植法があれば、望ましいと思われる。
この願望の実現に近づくこと、または少なくとも公衆に有用な選択手段を提供することが、本発明の目的である。
【００１３】
（発明の概要）
第１の局面によれば、本発明は、ドナー細胞の増殖または非増殖集団からＧ１細胞を選択および分離し、分離されたそのようなＧ１細胞の核を、除核レシピエント細胞に導入することを含む核移植の方法を提供する。ドナー細胞集団は、細胞周期における１つまたは複数の既知または未知の段階であることができる。
そのような方法は、胚再構成の時点でドナー核の細胞周期段階に関して確実性をもたらし、それゆえに従来技術に比べて有利である。
【００１４】
本発明は、細胞周期の特定の段階で、任意に成長している細胞をブロックして、非増殖同調細胞集団を生産するために、細胞周期抑制剤を用いることを意図している。好ましくは、細胞の成長は分裂期でブロックされ、抑制剤から解放された後にＧ１期に進んだ細胞が核移植に用いられる。
【００１５】
すなわち第２の局面において、本発明は、細胞周期のＧ１段階で同調させた非増殖細胞集団から分離した細胞の核を、除核レシピエント細胞に導入することを含む核移植の方法を提供する。
【００１６】
好ましくは、前記Ｇ１細胞は、任意に増殖している集団から、または非増殖同調細胞集団から、初期Ｇ１期において個々に分離される。
別法として、非増殖細胞集団は老化細胞を含むことができる。
【００１７】
分離されたＧ１ドナー細胞は、ｉｎ　ｖｉｖｏで動物から、より好ましくは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで細胞培養から分離される。適した細胞は、胚、胎児、幼若動物から、完全に成熟した成体まで、いずれからも得ることができる。実際、細胞増殖が可能である任意の二倍体核型正常細胞、または老化細胞を本発明に用いることができる。細胞は、刺激されて細胞周期に入り増殖できる限り、未分化細胞状態、または任意の多様な細胞分化段階であることができる。静止期にある細胞は、適切な培養条件（血清または特定の成長因子を添加するなど）で刺激されて細胞周期に入り、分裂期に続く初期Ｇ１状態で核移植に用いることができる。いくつかの細胞型が、他の型に比べてより有効であることが判明する可能性があるが、しかしながら、成体および胎児線維芽細胞、および成体濾胞細胞は両方とも満足できるものであることが見出されている。本発明の実証として、２つの濾胞細胞系統、４つの皮膚線維芽細胞系統、および２つの遺伝子的に改変された胎児線維芽細胞系統を用いたウシ種での結果（実施例１〜７）を後に示す。
【００１８】
好ましくは、レシピエント細胞は、ドナー核と由来が一致する種から得られた除核卵母細胞を含む。除核卵母細胞の胚再構成時のＭＰＦ活性は高くても低くてもよい。いずれの状態も２Ｃ量のＤＮＡを有するＧ１ドナー核に適合するからである。
【００１９】
別法として、レシピエント細胞は、除核幹細胞、または互いに融合した除核幹細胞の塊を含むことができる。好ましくは、これらの幹細胞は胚幹細胞である。核移植においてレシピエント細胞として用いられるそのような胚幹細胞は、成長している胚から、またはすでに培養において確立された幹細胞系統から分離したものであることができる。この場合、本発明の方法によって選択されたＧ１細胞のドナー核を用いる核移植は、「治療的クローニング」の目的で行うことができる。
【００２０】
第３の局面によれば、本発明は、Ｇ１期、好ましくは初期Ｇ１期にある分離したドナー核を除核レシピエント細胞に導入することによって、クローン動物胚を生産する方法を提供する。
【００２１】
本発明のこの方法は、鳥類、両生類、魚類、および哺乳動物を含む、対象となる任意の動物胚種を生産するために用いることができる。好ましくは、対象となる動物胚は哺乳動物であり、これに限定されるものではないが、ヒトを含む霊長類、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ブタを含み、最も好ましくはウシ、ヒツジ、シカ、およびヤギなどの有蹄類を含む。
好ましくは、このクローン動物胚は、当技術分野で知られる方法によって遺伝子的に改変された核を用いることによって所望の遺伝形質を有する。
【００２２】
第４の局面によれば、本発明は、再構成されたトランスジェニック動物胚を含む、本発明の方法によって調製された再構成動物胚を提供する。そのようにして形成された胚は次に、胚の数をさらに増やすために再クローン化する、あるいは核の再プログラミングおよび／または発生ポテンシャルをさらに促進するために連続核移植に供することができる。
【００２３】
第５の局面によれば、本発明は、（１）上述の本発明の方法に従って、クローン動物胚を生産し、（２）既知の方法によって、動物をその胚から所定時期まで発育させ、（３）場合によっては、従来の方法または本発明の方法によるクローニングによって、そのように形成された動物を繁殖することを含む、ヒト以外の動物をクローニングする方法を提供する。
【００２４】
本発明の方法は、鳥類、両生類、魚類、および哺乳動物を含む、対象となるヒト以外の動物種を生産するために用いることができる。好ましくは、前記ヒト以外の動物は、ヒト以外の霊長類、げっ歯類、ウサギ、ネコ、イヌ、ウマ、ブタ、最も好ましくはウシ、ヒツジ、シカ、およびイヌなどの有蹄類を含む群から選択される。
【００２５】
第６の局面によれば、本発明は、上述の本発明の方法によって調製されたヒト以外のクローン動物、ならびにそのようなヒト以外のクローン動物の子孫を提供する。
【００２６】
本発明の方法は、当技術分野で周知の方法により遺伝子的に改変されたドナー核を用いることによって所望の遺伝形質を有するヒト以外の動物、好ましくは哺乳動物を生産するために用いることができる。このような方法で作り出されるトランスジェニック動物も本発明に含まれる。
【００２７】
本発明はさらに、たとえば細胞、組織、および器官移植に用いることのできる、胚細胞系統、胚幹細胞、胎児、または子孫を生産するために用いることができる。
【００２８】
したがってさらなる実施形態において、本発明は、ａ）未知の細胞周期にあるドナー細胞の増殖集団、またはＧ１細胞の同調集団からＧ１細胞を選択および分離し、そのような分離細胞の核を除核レシピエント細胞に導入する段階、ｂ）胚盤胞期に成長させる段階、ｃ）胚細胞を回収する段階、およびｄ）当技術分野で既知の方法によってｉｎ　ｖｉｔｒｏで無限分裂細胞系統を確立する段階を含む、胚細胞系統を生産する方法を提供する。
【００２９】
さらなる実施形態において、ａ）細胞周期の多様な未知の段階にある動物ドナー細胞の成長集団、またはＧ１細胞の同調培養からＧ１細胞を選択および分離し、そのような分離細胞の核を除核動物レシピエント細胞に導入する段階、ｂ）胚盤胞期に成長させる段階、ｃ）胚幹細胞を回収する段階を含む、動物胚幹細胞を生産する方法が提供される。
【００３０】
好ましくは、上述の方法に用いられる動物ドナー細胞はヒト由来である。最も好ましくは、上述の方法に用いられる動物ドナー細胞、およびレシピエント細胞は共にヒト由来である。
【００３１】
最も好ましくは、ドナー細胞は、任意の核型正常細胞型から選択された成体または胎児細胞であり、レシピエント細胞は、除核卵母細胞または胚幹細胞を含む、遺伝子発現を再プログラミングすることが可能な任意の細胞型から選択される。
【００３２】
本発明の方法によって生産された胚幹細胞は多能性であり、培養において分化を誘発されて、当技術分野で知られる方法によって、ニューロン、星状膠細胞、稀突起膠芽細胞などの神経細胞、肝細胞、ミオサイトなどの筋細胞、心筋細胞などの心臓細胞、造血細胞、膵臓細胞、および他の任意の細胞型を含む、ヒト細胞の分化した型の純粋集団を形成することができる。
【００３３】
そのような分化したヒト細胞および組織はその後、損傷した細胞がそれ自体では代替できない、または有効に代替できない特定の疾病または傷害を治療するための移植に用いることができる。ヒトドナー細胞がそのような移植を必要としている患者から得られた場合、その組織は遺伝子的にその患者と一致するので、そのような移植組織は患者によって拒絶されない。
【００３４】
別法として、そのような分化した細胞および組織は、疾病または傷害、たとえば多様な神経疾患（たとえば、パーキンソン病）、糖尿病、心臓病、筋ジストロフィー、多様な遺伝病、特定の癌（たとえば、白血病）、脊髄損傷、熱傷、および他の苦痛を治療するために用いることができる。
これらの方法は、当技術分野において「治療的クローニング」として知られている。
【００３５】
特定の細胞型へのｉｎ　ｖｉｔｒｏでのヒト胚幹細胞の分化はさらに、ヒトの医療における薬剤の発見や毒性研究においても有益である可能性がある。
【００３６】
したがってさらなる局面において、本発明は、本発明の方法によって生産されたｉｎ　ｖｉｔｒｏで分化したヒト胚幹細胞を用いて、薬剤を発見する方法、および薬剤の毒性を試験する方法を提供する。
【００３７】
さらなる局面によれば、本発明は、細胞、組織、および器官を本発明の方法によって生産したヒト以外のクローン動物およびそれらの子孫から分離し、それを治療を必要としているヒトの患者に移植するために用いることのできる異種間移植の方法を提供する。そのような細胞、組織、または器官が移植遺伝子を含む場合、そのような細胞、組織、または器官は、遺伝子治療において、または異種組織に対する患者の免疫応答を抑えるために有用である可能性がある。
【００３８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、従来の核移植によって哺乳動物胚をクローニングする方法の改善を目的としている。本発明の胚クローニング方法は、いろいろの哺乳動物、そしてその他の動物種にも利用することを意図しているが、その方法をウシに関して説明する。ドナー核がＧ１期、好ましくはＧ１期の初期にあることが、本発明の本質的な特徴である。
【００３９】
ばらばらに生育している培養細胞の集団から確実にＧ１細胞を得る１つの手法は、分裂期の細胞を培養表面から個別に取り出し、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有する培地中で分裂を完了させることである。次にそのようなドナー細胞を分裂後短時間のうちに、たとえば一般的には３時間以内でＳ期に入る前に（ＢｒｄＵ標識により検出できる）、レシピエント細胞（すなわち、細胞質体）と融合させる。このようにすると、細胞は確実にＧ１の初期段階にあり、２Ｃ量のＤＮＡを有する。こうして、周期細胞はＧ１／Ｓ境界に進行する前に、核移植のために用いられる。選択された細胞は、この操作の間、少なくとも細胞質体との融合が完了するまで、高血清含有培地中にある。したがって、細胞は細胞分裂周期から出るように誘導されることはなく、どの時点でも静止期にはならない。
【００４０】
本発明は、核移植に用いるためにＧ１細胞の同調集団をつくることを意図してはいるが、本発明の方法の利点として、たとえばＭ期において多くの細胞をあらかじめ同調させ、その後にブロックを解除し、細胞分裂を起こさせて後Ｇ１期初期にある細胞を選択するために、細胞毒性や細胞攪乱性のある細胞同調剤、たとえばノコダゾールまたはコルヒチンなどを用いる必要がない。しかしながら本発明では、核移植に用いるためにより多くのＧ１細胞を選択する、あるいはＧ１期の特定の時点で可逆的に細胞を停止させるために適切な薬剤、すなわち細胞周期抑制剤を適切な薬剤濃度および培養時間で用いることが有利なこともある。そのような薬剤および方法は、当分野の技術者に知られているものであろう。それらの方法では薬剤暴露時間を低減するためにあらかじめ同調処理を行ってもよい：たとえば一時的に血清を排除することによって細胞がＧ０に入るように誘導し、その後、血清を再添加して、細胞をＧ０／Ｇ１境界すなわちＲ点（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｐｏｉｎｔ）に戻し、細胞分裂周期を進行させる。Ｇ１の多様な時点で可逆的に細胞を停止させるために適した薬剤には（Ｇａｄｂｏｉｓ等、１９９２年、およびその参考文献に示されている）、（１）スタウロスポリン（ナノモル領域の非常に低い濃度で用いられる非特異的キナーゼ阻害剤）、（２）細胞周期の進行上より特異的なキナーゼ阻害剤、たとえばｃＡＭＰ依存プロテイン・キナーゼ、およびｃＧＭＰ依存プロテイン・キナーゼの阻害剤など、（３）ロバスタチン、（４）イソロイシン欠乏、（５）Ｓ期に入るのを防ぎ、Ｇ１／Ｓ境界で細胞をブロックするために用いられるアフィジコリンまたはヒドロキシ尿素が含まれる。
【００４１】
Ｇ１ドナー核は２Ｃ量のＤＮＡを有する（すなわち、二倍体である）ので、高いもしくは低いＭＰＦ量を有する細胞質体と再構成することができる。すなわち、Ｇ１核は、活性化が起こる前、後、または同時に細胞質体に導入することができる。しかしながら、クローン胚の発育を向上させるためには、核の再プログラミングを促進するために、（電気的に誘発された細胞融合によって導入された、または直接の核注入で導入された）ドナー核を除核卵母細胞の細胞質に存在する要素に適切な時間曝露することが好ましい。これは「活性化前融合」、すなわちＦＢＡと呼ばれる。これまでの研究によって、本質的に「活性化と同時に行う融合」、すなわちＡＦＳと比較したときのこの手法の利点が実証されている（Ｓｔｉｃｅ等、１９９６年、Ｗｅｌｌｓ等、１９９８年、１９９９年）。さらに、胚盤胞への発生率を向上させるために、細胞質への曝露は少なくとも１時間超、好ましくは３〜６時間の間であることが推奨されている。しかしながらこの方法では、生じる胚が正しい倍数性を維持するために、融合が活性化に先行するときに起こる小核形成をなんらかの適当な手段によって防ぐことが重要である（Ｃｚｏｌｏｗｓｋａ他、１９８４年）。
【００４２】
以下に、Ｇ０（コントロール）およびＧ１の培養ドナー細胞から得られた、ウシ種におけるクローン胚の再構成および生産の方法を概説する。以下に記載する具体例においては、卵胞から採取したウシ濾胞細胞を用いたが、その結果を実施例１〜３に示す（線維芽細胞系統の使用は実施例４〜７に例示する）。実際には、正常な二倍体核型を有する本質的にどのような細胞型（胚、胎児、幼若、および成体細胞で、増殖しているか、あるいは細胞周期に入ることができる、あるいは老化期にある細胞）も、この技法を用いることによって全能性であることが実証される。さらに、当分野の技術者に理解されるとおり、当技術分野で知られている他の任意の方法を、クローン胚を再構成および生産するために用いることができる。
【００４３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの卵母細胞の成熟
食肉処理場の雌のウシから卵巣を採取し、食塩水（３０℃）に入れ、２時間以内に実験室に運んだ。１８ゲージのニードルと陰圧を用いて、３〜１０ｍｍの卵胞を吸引することによって、卵丘−卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を回収した（別法として、ドナーウシから採卵して未熟卵母細胞を集め、その後ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させてもよい）。ＣＯＣは、５０μｇ／ｍｌヘパリン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および０．４％ｗ／ｖＢＳＡ（Ｉｍｍｕｎｏ−Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＩＣＰ）、Ａｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）を補ったヘペス（ＨＥＰＥＳ）緩衝組織培養培地（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）１９９（Ｈ１９９、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａｕｃｋｌａｎｄ、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ）中に集めた。ｉｎ  ｖｉｔｏｒｏで成熟させる前に、コンパクトな非退縮卵丘−放射冠、および同質な卵細胞質を有するＣＯＣのみを選択した。それをＨ１９９培地＋１０％ＦＣＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２回洗浄し、その後、重炭酸イオン緩衝組織培養培地１９９培地＋１０％ＦＣＳで１回洗浄した。１０個のＣＯＣをこの培地１０μｌ中に移し、これを５ｃｍペトリ皿（Ｆａｌｃｏｎ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ、ＮＪ）に入れた４０μｌの成熟培地の液滴中に置き、パラフィン油（Ｓｑｕｉｂｂ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）で覆った。この成熟培地は、１０％ＦＣＳ、１０μｇ／ｍｌのヒツジＦＳＨ（Ｏｖａｇｅｎ、ＩＣＰ）、１μｇ／ｍｌのヒツジＬＨ（ＩＣＰ）、１μｇ／ｍｌのエストラジオール（Ｓｉｇｍａ）、および０．１ｍＭのシスタミン（Ｓｉｇｍａ）を補ったＴｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ１９９を含んだ。液滴の入った培養皿を、１８〜２０時間、空気雰囲気下、給湿５％ＣＯ２中、３９℃で培養した。成熟後、ＨＥＰＥＳ緩衝合成卵管液（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｏｖｉｄｕｃｔ　Ｆｌｕｉｄ）（ＨＳＯＦ、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等、１９９０年）中の０．１％ヒアルロニダーゼ（ウシ精巣、Ｓｉｇｍａ）と一緒にＣＯＣを３分間ボルテックスし、続いてＨＳＯＦ＋１０％ＦＣＳ中で３回洗浄することによって、卵丘−放射冠を完全に除去した。
【００４４】
培養細胞を用いた核移植
ａ）培地　　成熟卵母細胞、細胞質体、および再構成胚は、成熟後から電気パルス後１５〜３０分後に融合を評価するまでの間、Ｈ１９９ベースの培地中で保持、または操作した。活性化の前３〜６時間にドナー細胞とＭＩＩ細胞質体を融合する（ＦＢＡ処理）ことによって再構成した胚を、カルシウムを含まないＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｏｖｉｄｕｃｔ　Ｆｌｕｉｄ培地（ＡｇＲＳＯＦ、これはＧａｒｄｎｅｒ等、１９９４年に記載の培地を改変した配合であり、ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｎｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄから市販されている）＋１０％ＦＣＳで約３〜６時間、活性化の直前まで培養した。以下、用いたすべての培地組成はカルシウムを含む。
【００４５】
ｂ）除核　　約１８〜２０時間成熟させた卵母細胞を、１５〜２０μｍ（外径）のガラスピペットで少量の周囲細胞質とともに第１極体およびＭＩＩプレートを吸引することによって除核した。この卵母細胞は、１０％ＦＣＳ、５μｇ／ｍｌのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２、および７．５μｇ／ｍｌサイトカラシンＢ（Ｓｉｇｍａ）を含有するＨ１９９培地で５〜１５分間あらかじめ染色しておき、操作はＨｏｅｃｈｅｓｔ３３３４２を含まない同じ培地中で行った。除核は、紫外線光で核質を視覚化することによって確認した。除核に続き、生じた細胞質体をＨ１９９＋１０％ＦＣＳでよくよく洗浄し、ドナー細胞の注入までこの培地中で保持した。
【００４６】
ｃ）静止期（Ｇ０）ドナー細胞の調製　　培養した濾胞細胞を、血清を排除することによって静止期に入るように誘導した（Ｃａｍｐｂｅｌｌ等、１９９６年ｂ）。通常の継代培養１日後、この培地を吸引して除き、細胞をＰＢＳをその度に替えながら３回洗浄し、その後、０．５％ＦＣＳのみを含有する新しい培地を添加した。核移植に使用する前に濾胞細胞はさらに９〜２３日間（通常は１０日間）培養した。注入直前に、標準的なトリプシン処理によって、ドナー細胞の単細胞懸濁液を調製した。細胞はペレットにし、Ｈ１９９＋０．５％ＦＣＳ中に再懸濁し、注入までこの培地に保持した。
【００４７】
ｄ）Ｇ１ドナー細胞の調製　　増殖濾胞細胞を、培養皿内のカバーガラス上で、適切な培地（たとえば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％子ウシ胎児血清）で培養した。表面上で細胞が生育しているカバーガラスを無菌的に培養皿から物理的に取り出し、細胞または核を採集および注入できるように、適切な構造のマイクロマニピュレーションチャンバ内に置く。細胞を１０％ＦＣＳを含有するＨＥＰＥＳ緩衝培地の液滴で覆い、次に鉱油で覆う。分裂中の細胞は丸くなり培地表面に緩く接着しているだけなので、カバーガラス上の細胞の密度が高くなりすぎない限り、分裂細胞を識別し操作ピペットでカバーガラスから慎重に物理的に選び出すことができる。これが困難であれば、主としてカバーガラスから細胞を物理的に除去する際に引き起こされる機械的損傷を最小限に抑えるために、ＰＢＳで細胞を簡単に洗浄し、１．５μｇ／ｍｌのサイトカラシンＢを含有する薄い濃度のトリプシン溶液（たとえば、培養した細胞系統の通常の継代培養に用いる濃度の１／１０）を加えてもよい。適当な顕微鏡（たとえば、位相差顕微鏡、またはＤＩＣ光学顕微鏡）を用い、主に、有糸分裂紡錘体上の濃縮染色質を見ることによって、あるいは分裂の終期段階でまだ細胞質橋でつながっている細胞ダブレット内の濃縮染色質を確認することによって、カバーガラス上の分裂細胞が識別できる。こうすると、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２などのＤＮＡ特異的蛍光色素を用いて、細胞をＵＶ光に曝露する必要がない。マニピュレータに装備されたインジェクション・ピペットを利用して、これらの分裂細胞をカバーガラスから別々に取り出し、細胞が分裂を完了させ最終的に分裂して細胞のダブレットを形成できるように、隣接する１０％ＦＣＳを含有するＨＥＰＥＳ緩衝培地の液滴に入れる。ピペットの径は、操作中に細胞または紡錘体を物理的に損傷しないように、細胞系統に応じて適切な大きさでなければならない。このように、分裂細胞は、好ましくは後期または終期の段階において個々に選択し、取り出して、有糸分裂を完了させ２つに分裂させる。次にこの細胞のダブレットを静かに個々の細胞に分離するが、これは適切な酵素溶液に短時間さらすことによって容易に達成することができる。その後、無傷の各細胞を細胞質体に注入し融合させる。別法として、細胞核を分離し、直接除核卵母細胞の細胞質に注入することができる。好ましくは、細胞質体へのドナー核の導入は、培養表面から最初に分裂細胞を取り出して３時間以内に完了させる。これによって、培養細胞が細胞周期のＧＩ初期段階でＳ期になる前に融合されることが確実となる。このことは、たとえば選択された細胞のサンプルのＢｒｄＵ標識が陰性であることなどによって、用いる個々の細胞型または細胞系統について確認するべきである。さらに、この方法によって選択された細胞が、実際に細胞周期中にあり、少し後の時点でＳ期に入ることを確認することが推奨される。
【００４８】
ｅ）マイクロインジェクション    レシピエント細胞質体は、１０％ＦＣＳ、および５％スクロースを含有するＨ１９９中で脱水した。この培地はさらにマイクロマニピュレーションの培地としても用いた。ドナー細胞が入った適切な大きさのピペット（たとえば、外径３０〜３５μｍ）を透明帯を貫いて挿入し、続く融合のために膜を密接して接触させるために細胞を透明帯と細胞質体膜の間に押し込んだ。注入後、再構成胚を次の２つの段階で再水和した。最初に、１０％ＦＣＳおよび２．５％スクロースを含有するＨ１９９中で５分、次に、Ｈ１９９＋１０％ＦＣＳ中で融合まで再水和した。
【００４９】
ｆ）細胞融合    Ｇ０およびＧ１両方の細胞処理に関して、ＦＢＡ（活性化前融合）法を用いて胚を再構成した。再構成した胚を、０．３Ｍマンニトール、０．５ｍＭＨＥＰＥＳ、および脂肪酸を含まない（ＦＡＦ）０．０５％ＢＳＡと０．０５ｍＭカルシウム、および０．１ｍＭマグネシウムを含む緩衝液中、成熟開始後約２４時間（ｈｐｍ）で、電気的に融合させた。融合は、融合緩衝液で覆われた５００μｍ離れた２つのステンレス鋼電極を備えたチャンバ内で、室温で行った。再構成された胚は、細胞質体とドナー細胞との間の接触面が電極と平行になるように、細い、口で操作するパスツールピペットを用いて手操作で１列に並べた。濾胞細胞の場合、ＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ  ２００（ＢＴＸ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）が出す、それぞれ１５μｓ、２．２５〜２．５０ｋＶ／ｃｍの２回のＤＣパルスで、細胞融合が誘発された（それぞれの細胞系統に関して、最適な電気的パラメータを決定する必要がある）。電気刺激の後、再構成された胚は、Ｈ１９９＋１０％ＦＣＳ中で洗浄した。次に１５〜３０分以内に、顕微鏡で融合を確認した。
【００５０】
上述の電気融合パラメータが、２４ｈｐｍで用いられた若い細胞質体に著しい割合で活性化をもたらすことは期待されない。同じような電気刺激後に同齢のコントロール卵母細胞（ｎ＝１１２）の１％未満しか前核を形成しなかったからである（Ｗｅｌｌｓ等、１９９９年）。ＮＥＢＤおよびＰＣＣが起こり、クロマチンの再造形、核の再プログラミングを可能にするためにＧ１およびＧ０の核のドナークロマチンが卵母細胞の細胞質内に存在する要素に曝されることがＦＢＡ処理にとって重要である。
【００５１】
別法として、当分野の技術者に知られているとおり、Ｇ１の細胞の核を分離し、直接、卵母細胞の細胞質に注入することができる。
【００５２】
ｇ）活性化    多様な方法で人為的な活性化をもたらすことができる。１つの特定の方法には、イオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）と６−ジメチルアミノプリン（６−ＤＭＡＰ、Ｓｉｇｍａ）の組み合わせが含まれる（Ｓｕｓｋｏ−Ｐａｒｒｉｓｈ等、１９９４年）。融合後、胚は、好ましくはドナー核が３〜６時間卵母細胞細胞質に曝露された後に、活性化される。この好ましい方法は、「活性化前融合」（ＦＢＡ、Ｗｅｌｌｓ等、１９９８年）と呼ばれる。活性化の３０分前、ＦＢＡ処理の融合胚を、ＨＳＯＦ（カルシウム含有）＋１ｍｇ／ｍｌＦＡＦ  ＢＳＡで洗浄、保持した。活性化は、ＨＳＯＦ＋１ｍｇ／ｍｌＦＡＦ  ＢＳＡ中の５μＭイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ）３０μｌの液滴中で胚を４分間、３７℃でインキュベートすることによって誘発した。活性化は一般に、２７〜３０ｈｐｍ齢の細胞質体で起こる。次に、胚をＨＳＯＦ＋３０ｍｇ／ｍｌＦＡＦ  ＢＳＡ中で５分間徹底的に洗浄し、その後、ＡｇＲ  ＳＯＦ（カルシウムを含む）＋１０％ＦＣＳ中で４時間、２ｍＭの６−ジメチルアミノプリン（６−ＤＭＡＰ、Ｓｉｇｍａ）で培養した。
【００５３】
ＦＢＡ方法論にあるように（Ｓｔｉｃｅ等、１９９６年、Ｗｅｌｌｓ等、１９９８年、１９９９年）、核の卵母細胞細胞質への曝露時間を長くして胚発生率を向上させるには、そのような遅れた活性化の結果起こる小核の形成を防ぐための適切な処理と組み合わせなければならない（Ｃｚｏｌｏｗｓｋａ等、１９８４年）。６−ＤＭＡＰなどのセリン−トレオニンキナーゼ阻害剤は、適した薬剤の１つであると考えられる。したがって６−ＤＭＡＰは、初期活性化刺激後に、単一の無傷核の形成を可能にし、このようにして再構成胚における正しい倍数性を維持する。
【００５４】
核移植胚のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養
胚培養は、パラフィン油で覆ったＡｇＲ  ＳＯＦ（ＡｇＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄから市販）の２０μｌの液滴中で行った。ＡｇＲ  ＳＯＦは、ＳＯＦａａＢＳＡの改質された配合である（８ｍｇ／ｍｌのＦＡＦ  ＢＳＡを含有、Ｇａｒｄｎｅｒ他、１９９４年に記載）。可能なときには、１０個までの胚のグループを培地の液滴内で合わせて培養した。胚は、給湿されたモジュール式培養器チャンバ（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ａｕｒｏｒａ、ＯＨ）で、３９℃、５％ＣＯ２：７％Ｏ２：８８％Ｎ２混合ガス中で培養した。発育の第４〜５日目（第０日＝胚再構成日）に、引用することにより本明細書の一部とする公開特許明細書ＷＯ００／３８５８３に教示されているとおり、ウシ胚のｉｎ　ｖｉｔｒｏでの発生を向上させるために、酸化的リン酸化反応のアンカップラーとして作用する１０μＭの２，４−ジニトロフェノール＋ＡｇＲ　ＳＯＦの新しい２０μｌの液滴に移した。融合後第７日に、移植可能な品質の胚盤胞に発育したかを評価した。
【００５５】
胚導入、受胎診断、および出産
胚の導入、受胎の診断、および出産の管理は、当技術分野で周知の技術を用いて行われた。
【００５６】
連続核移植、および再クローニング
本発明のさらなる実施形態では、Ｇ１のドナー細胞を適切なレシピエント細胞と再構成することによって作られた第１世代クローン胚を再クローン化するのが望ましいこともある。再クローニングは、着床前段階の胚を個々の細胞に分離して、その後、それぞれを適切なレシピエント細胞質体に融合することによって達成することができる。当分野の技術者に理解されるように、こういう胚細胞（または、割球）クローニングは、染色体異常を回避し、発育を最適化するために、ドナー細胞とレシピエント細胞との間で細胞周期を調整する必要がある。好ましくは、第１世代クローン胚が桑実胚段階（ウシでは約３２個の細胞）にあるときにドナー細胞を得るが、胚は発育のそれより前の段階、または後の段階であってもよい。あるいは、まずＧ１培養ドナー細胞からつくられたクローン胎児を発生させ、次に胎児細胞系統を再誘導し、この新しい細胞系統を用いて胚を再クローン化してもよい。この再クローニングの手法は、初期着床前期間中に、最初のドナー核が卵母細胞細胞質に曝露される時間を長くすることによって、核の再プログラミングに利点をもたらすかもしれない。この手法はさらに、第２世代、第３世代などのクローン胚を生産するための、第１世代ファウンダー（始祖）胚から得られるクローン胚の数が増大するという利点を有する。
【００５７】
連続的核移植には、適切なレシピエント細胞細胞質環境への順次核移植が含まれる。本発明の一実施形態として、Ｇ１ドナー細胞、およびＭＰＦの高い非活性化レシピエント細胞質体を用いて、まず１細胞胚を再構成するのが望ましい。これによりＮＥＢＤ、およびＰＣＣが可能となり、このあと活性化刺激があれば無傷の二倍体核が形成されることになる。次にこの核（核の再造形、およびある程度の核の再プログラミングが起こっている）を１細胞クローン胚から核質体として吸引し、ついで受精後の適切な段階にある除核受精卵に導入することができる。その後、胚発育を進行させる。そのような順次連続的核移植工程は、核の再プログラミングを改善できるであろう。さらにこれは、２度目の核移植では、精子による受精を経たために胚発育にむけてより適切に活性化された細胞質環境に核が導入される結果、発育が改善される可能性がある。
【００５８】
トランスジェニック動物の作製
細胞周期のＧ１段階にある遺伝子的に改変されたドナー核を用いて核移植してからトランスジェニック家畜を作製することは、受精卵へのＤＮＡの前核注入（Ｗａｌｌ等、１９９７年）、または精子と外側に結合したＤＮＡを細胞質内に注入する精子媒介形質転換（Ｐｅｒｒｙ等、１９９９年）に比べて、より有効で多角的な手法になることが見込まれる。この培養細胞を用いる核移植手法の利点には、（１）はるかに広範囲の遺伝子操作が可能であること、（２）卵母細胞または受精卵を採取するのとは対照的に、細胞系統を用いて容易に高い遺伝的背景で遺伝子操作が可能なこと、（３）結果として生じるすべてのクローン子孫がトランスジェニックであり、所望の性であること、（４）前核注入手法、または精子媒介形質転換によって個々のファウンダー（始祖）動物を作製するのに比べて、より短い期間で有用な生産物を産出するヒツジやウシの群を速成する機会があることが含まれる。
【００５９】
培養細胞は、所望のＤＮＡ配列を挿入、除去、または改変するために、任意の既知の方法で遺伝子的に変更することができる。改変には、新しいＤＮＡ配列（異種であることができる）のランダム挿入、ゲノムの特定部位でのＤＮＡ挿入、削除、または改変を可能にするＤＮＡの部位特異的挿入と同種組換えが含まれる。細胞を選択し、所望の遺伝子改変を確認するために当技術分野で周知の方法を用いてＤＮＡ分析を行った後に、核型正常トランスジェニック細胞を細胞周期のＧ１期において選択し、クローン／トランスジェニック動物を産出するために核移植に用いることができる。
【００６０】
操作される特定の遺伝子に応じて、生物医学および農業の両方に関して、遺伝子的に改変された家畜に利用できる多様な可能性がある。可能性のある分野には、（１）医薬タンパク質の乳、血液、または尿中での生産、（２）たとえば乳中での、機能性食品、および医療用食品の生産、（３）農産物の特性の操作、たとえば乳、肉、および繊維の量および質の改善、疾患および害虫耐性の改善、（４）工業用タンパク質をたとえば乳中での生産、（５）異種間移植、（６）ヒトの疾患、たとえば嚢胞性線維症やハンチントン病などの疾患モデルとしての家畜の作製が含まれる。
【００６１】
治療的クローニング
核移植および胚性幹細胞技法により大きく影響をうけるのは、ヒトの細胞に基づく治療の分野かもしれない（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、１９９９年）。それ自体では有効に修復も代替もできない組織に特定の疾患または傷害を有する患者（糖尿病、筋ジストロフィー、脊髄損傷、ある種の癌、およびパーキンソン病を含む多様な神経疾患で起こる）が、移植のために自身の治療用組織を作り出し、長期または生涯にわたる治療を行えるかもしれない。まず、この手法ではヒトの核移植を用いるだろう。これは、特定の疾患または傷害を持つヒトの患者から健康な組織の少量のサンプルを採取する段階、培地で細胞の増殖を刺激する段階を含むことができる。細胞周期のＧ１にあるドナー細胞を選択し、それらを適切なレシピエント細胞に融合することによって、核を再プログラミングできるかもしれない。レシピエント細胞が除核ヒト卵母細胞である場合、再構成された胚は、適した活性化刺激後、適切な胚培養培地中で胚盤胞段階にまで生育することができよう。次に適切な培養条件のもとで（Ｔｈｏｍｓｏｎ等、１９９８年）、クローン胚の内部細胞塊からヒト胚性幹細胞を得ることができ、これは培養細胞を供与した患者と遺伝子的に一致する。
【００６２】
「胚性幹細胞」という用語によって、本出願人等は、胚の内部に存在する任意の分化多能性の細胞型から分離される細胞、好ましくは当分野で周知の方法によって胚盤胞段階にある胚の内部細胞塊から分離される細胞を意味する。
【００６３】
本発明の方法によって作られた胚性幹細胞は、未分化で多能性（体内のほぼすべての細胞型に分化できる能力を持つ）で、本質的に無制限なｉｎ　ｖｉｔｒｏでの増殖能力を有する。あるいは、内部細胞塊から分離された細胞系統はある程度分化していて、多様な細胞型に分化する能力がもっと限定されているかもしれないが、依然として治療に有用であろう。マウス胚性幹細胞の経験に基づいて、適切な条件を見出すことができ、これによって特定の疾患を治療するために、神経細胞、造血細胞、心筋細胞など、特定の分化された細胞型の純粋な集団を生産することが可能になる（たとえば、糖尿病のためのインスリン生成脾臓細胞、またはパーキンソン病のためのドーパミン生成神経細胞）。これらの遺伝子的に適合した細胞はその後、移植されたその場所で正常な組織を再生するために、ヒトの患者に再び投与される。その細胞は遺伝子的にその患者と一致するので、拒絶されることがなく、そのため免疫抑制剤がまったく、あるいはほとんど必要ない。さらに、免疫機構による異質細胞の認識において重要な役割を果たす主要組織適合性複合体遺伝子などの遺伝子座の系統的な改変をしてから、同種異系移植のための「ユニバーサル」な胚性幹細胞系統を作製するのも有益であろう。
【００６４】
適用によっては、分化と移植の前に胚性幹細胞の遺伝子改変が必要であろう。これは、治療のために治療薬剤を送達する、あるいはデュシェンヌ型筋ジストロフィー患者の骨格筋のジストロフィン遺伝子に起こるような体細胞の遺伝子欠陥を修正するなどの遺伝子治療のためである。
【００６５】
ヒト胚性幹細胞の特定細胞型への分化はさらに、細胞、組織、または器官を用いる移植治療に加えて、薬剤の発見、およびヒトにおける薬剤の毒性研究に関しても有益であろう。
【００６６】
さらに、細胞、組織、および器官をヒト以外のクローン動物の仔から分離して、そのような治療を必要としているヒトの患者に移植するために用いることができる（異種間移植）。そのような細胞、組織、または器官が導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を含む場合、そのような細胞、組織、または器官は、遺伝子治療において、または異種組織に対する患者の免疫応答を抑えられるので有用であろう。
【００６７】
ヒト応用例のレシピエント細胞
本発明による核移植の方法において、好ましいレシピエントは、上述の方法によって調製された除核卵母細胞である。しかしながら、ヒトに応用する場合、これは困難かもしれない。
【００６８】
別法として胚性幹細胞が、分化した体細胞核を再プログラミングするためのレシピエント細胞の供給源として使えるであろう。したがって、細胞に基づくなんらかの治療を必要としている患者由来の体細胞を、ヒト卵母細胞を必要とすることなく、培養して脱分化させることができる。これは、細胞周期のＧ１にある健康な体細胞を、除核胚性幹細胞、または胚性幹細胞のグループ（再プログラミングのためにより大量の細胞質を提供するため）と融合させることによって達成することができる。レシピエント幹細胞の細胞周期の状態をコントロールする必要があり、好ましくは融合の時点でＭ期、またはＧ１期である。このようにして、体細胞の分化した核は、幹細胞の細胞質に曝露された後脱分化するだろう。結果として生じる再構成された細胞は、多能性あるいは多分化能性を有し、治療に有用な一連の分化した細胞を形成するよう誘導できる。この概念は、胸腺リンパ球と胚生殖細胞を融合してつくられたハイブリッド細胞において以前に実証されている（Ｔａｄａ等、１９９７年）。
【００６９】
本発明をここで以下の実施例によって例示するが、当分野の技術者に理解されるとおり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００７０】
実施例１．核移植後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発生に及ぼすＧ０またはＧ１のいずれかに同調された瀘胞ドナー細胞の効果
この特定実験において、濾胞顆粒膜細胞の１次細胞系が核移植に用いられた。この細胞系は、「Ｊ１」と表示され、ニュージーランド・ジャージー未経産牛から由来した。Ｊ１細胞を、７〜８回の継代培養数の間で本実験に使用した。
【００７１】
ドナー細胞は比較のため、２つの細胞周期段階に同調させた。
（１）Ｇ０細胞は、血清採取後０．５％ＦＣＳを含有する培地中で１０〜１１日間の培養により得られた。
（２）Ｇ１細胞を、有糸分裂終了後１〜３時間以内に細胞質体に融合した。
負のＢｒｄＵ標識により、有糸分裂の３時間以内に融合されたＪ１細胞は、Ｓ期に入っておらず、Ｇ１にあることを確認した。
【００７２】
本実験で、２つの細胞サイクル処理群からのドナー細胞により再構成された胚を、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）ＢＳＡ（ライフテクノロジーズ製品番号３００３６−５７８）を補足したＡｇＲ  ＳＯＦ培地中ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した。
【００７３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発生の結果を表１に示す。細胞サイクルのＧ０期（対照）およびＧ１期におけるドナー細胞は、電気媒介融合法による細胞質体（レシピエント細胞）との融合時、等しく効率的であった。また、下記の表１に示すように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養されて胚盤胞へと発生した融合再構成胚の比率において、Ｇ０とＧ１とのドナー細胞処理群間で相違はなかった。
【００７４】
表１：細胞サイクルのＧ０期またはＧ１期のいずれかにおいてＪ１濾胞細胞により再構成され、ライフテクノロジーズＢＳＡを補足したＡｇＲ  ＳＯＦ培地中で培養されたクローン化胚のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発生（平均±標準誤差）
【表１】
2004500038.tif 000002
【００７５】
実施例２．核移植後、シグマＢＳＡを補足した培地中で培養されたｉｎ　ｖｉｔｒｏ発生に及ぼすＧ０またはＧ１のいずれかに同調された濾胞ドナー細胞（Ｊ１およびＥＦＣ細胞系）の効果
７日培養後クローン化胚の胚盤胞期へのｉｎ　ｖｉｔｒｏ発生に関するＧ０およびＧ１濾胞ドナー細胞間の細胞周期段階の効果はないという知見を支持するさらなる証拠を表２に提供する。
【００７６】
２つの独立した濾胞細胞系により実験を実施した。
（１）「ＥＦＣ」；ニュージーランドフリージアン（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｆｒｉｅｓｉａｎ）乳牛からの濾胞細胞系、および
（２）「Ｊ１」：ニュージーランドジャージー（Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｊｅｒｓｅｙ）未経産乳牛からの濾胞細胞系。
これらの実験において、ＥＦＣ細胞は細胞サイクルのＧ０においてのみ使用され、Ｊ１細胞はＧ１においてのみ使用された。しかし、双方の細胞系が濾胞細胞から由来し、再構成された胚が全て同一培地配合において培養されたことから、本実施例ではそのデータを組み合わせた。これらの実験において、これは、標準ＡｇＲ  ＳＯＦ培地であったが、上記の実施例１のライフテクノロジーズＢＳＡではなくシグマ（Ｓｉｇｍａ）ＢＳＡ（シグマ化学会社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ）；製品番号Ａ−７０３０）を補足した。
【００７７】
Ｊ１細胞は、有糸分裂終了後１〜３時間以内に融合されたドナー細胞で３〜６度の継代間で核移植に使用された。ＥＦＣ細胞を３〜８回の継代培養間で使用し、０．５％血清を含有する培地中９〜１８日間の培養によりＧ０期に同調させた。
【００７８】
表２に示されたｉｎ  ｖｉｔｒｏの発生結果は、濾胞ドナー細胞では、Ｇ０細胞周期段階とＧ１細胞周期段階との間で胚盤胞へと発生する融合胚の比率に相違がないことを示す。
【００７９】
表２．細胞サイクルのＧ０またはＧ１のいずれかにおいて濾胞細胞（Ｊ１またはＥＦＣ）により再構成され、シグマＢＳＡを補足したＡＧＲ  ＳＯＦ培地中で培養されたクローン化胚のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発生（平均±標準誤差）
【表２】
2004500038.tif 000003
【００８０】
実施例３．核移植後のｉｎ　ｖｉｖｏ発生に及ぼすＧ０またはＧ１のいずれかに同調された濾胞ドナー細胞（Ｊ１およびＥＦＣ細胞系）の効果
図１に示すデータは、レシピエント牛への導入後の、細胞サイクルのＧ０またはＧ１のいずれかにおいて濾胞細胞により再構成されたクローン化ウシ胚の妊娠中の生存を示す。図１のデータは、上記の実施例１および２において具体的に説明した実験からまとめたものである。これには、２つの濾胞細胞系、すなわちＪ１とＥＦＣから生じたクローン化胚が含まれる。さらに、それには、シグマＢＳＡまたはライフテクノロジーズＢＳＡのいずれかを補足した外は、同じＡｇＲ　ＳＯＦ培地配合で生じた胚を含む。これら２つの濾胞細胞系のいずれの間にも後導入の生存能力に及ぼす効果がなく、また２つのＢＳＡ源の効果もないことから（胚盤胞への発生に対しては有意な効果があるが）、データをプールした。
【００８１】
図１のデータは、同調化したレシピエント牛の生殖器官に導入された、Ｇ０ドナー細胞により再構成された全部で８５個の胚、および早期Ｇ１ドナー細胞により再構成された全部で９５個の胚を表す。
【００８２】
図１は、通常の超音波検査法、直腸検査および自然分娩により測定された胚導入７日目から出産予定日までの妊娠を通して存在する胚／胎仔の百分率をプロットする。最も注目すべきことに、Ｇ１濾胞細胞を使用すると、月満ちて生存能のある子牛の誕生を生じた。Ｇ０ドナー細胞と比較すると、妊娠３０日から月満ちてから誕生するまでの全期間を通してＧ１細胞で再構成されたクローン化胚の胚生存は低くなる傾向があったが、しかし、このことはここに報告された導入数では統計的な有意性レベルに到達しなかった。
【００８３】
Ｇ１濾胞細胞では、導入された胚の９％（９／９５）は月満ちて子牛の誕生を生じた。しかしながら、これらの子牛のうち４頭は、出産時にまたは出産後まもなく死亡し、Ｇ１細胞からの生存能のあるクローン化牛の有効率は全体として５％（５／９５）となった。それに対して、Ｇ０ドナー濾胞細胞は、出産予定日まで２０％（１７／８５）発生を生じ、分娩中３頭の子牛が死亡して、生存能のある子牛は全体として１６％（１４／８５）の最高の有効率となった。
【００８４】
実施例４．核移植およびライフテクノロジーズＢＳＡを補足した培地中で培養後のｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ発生に及ぼすＧ０またはＧ１に同調された、成牛雌の皮膚線維芽細胞（Ａｇｅ＋およびＡｇｅ−の細胞系）の効果
２つの独立した成牛皮膚線維芽細胞の１次細胞系での実験からのデータが組み合わされている。この２つの細胞系を「加齢＋」および「加齢−」と表示する。それらは共に、性熟期の遅い開始または早い開始のいずれかについてそれぞれ選択されたアンガス（Ａｎｇｕｓ）肉牛由来の雌細胞系である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏ発生に関してこれら２つの類似細胞系の間に相違がないので、データは下記の表３および図２において組み合わせられている。
【００８５】
２つの細胞周期段階をこれらの実験で比較した。
（１）Ｇ１：ドナー細胞を有糸分裂終了後１〜３時間以内に細胞質体に融合した。
（２）Ｇ０：ドナー細胞を０．５％ＦＣＳを補足した培地中３〜１２日間培養した。レシピエント牛に導入されたこれら再構成胚について、細胞から４〜５日間血清を取り出した。
【００８６】
両方の細胞系からの細胞および両方の細胞サイクル処理を、７回の継代培養で核移植に用いた。再構成胚を、ライフテクノロジーズＢＳＡ（ライフテクノロジーズ製品番号３００３６−５７８）を補足した標準ＡｇＲ  ＳＯＦ培地配合において培養した。
【００８７】
表３に示したデータは、Ｇ０細胞が低血清中にあった時間の長さの融合効率に関する効果を示すが、しかし、一旦細胞質体と融合すると、引き続くｉｎ  ｖｉｔｒｏ発生に及ぼす効果がなかったので、Ｇ０胚盤胞データを組み合わせた。発生から胚盤胞期までに対するＧ０とＧ１との間の細胞周期段階の効果はなかった。
【００８８】
表３．細胞サイクルのＧ０またはＧ１で成牛メスの皮膚線維芽細胞（Ａｇｅ＋およびＡｇｅ−）により再構成され、ライフテクノロジーズＢＳＡを補足したＡｇＲ  ＳＯＦ培地中で培養されたクローン化ウシ胚のｉｎ  ｖｉｔｒｏ発生（平均±標準誤差）
【表３】
2004500038.tif 000004
【００８９】
図２のデータは、Ｇ１において選ばれた成牛皮膚の線維芽細胞が月満ちて生存能のある子牛を産生できることを示している。図１のデータと同様に、Ｇ０では出産予定日での生存がより大きな傾向があるが、しかしこれは、ここで実施された導入数からは統計的に有意ではない。Ｇ１ドナー細胞では、導入された胚の４％（１／２５）が出産日に生存能のあるクローン化牛を産生した。それに対し、Ｇ０ドナー細胞は、出産日に１４％（３／２２）の生存能のある発生を生じた。本実験で、生まれた４頭の子牛全てが出生後生き残った。
【００９０】
実施例５．核移植およびＩＣＰ　ＢＳＡを補足した培地中培養後のｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ発生に及ぼすＧ０またはＧ１に同調された、成牛皮膚線維芽細胞（ＬＪ８０１および３ＸＴＣ細胞系）の効果
２つの独立した成牛皮膚線維芽細胞系でＧ０およびＧ１細胞周期段階を比較する追加実験を実施した。この２つの細胞系は、「ＬＪ８０１」および「３ＸＴＣ」と表示した。ＬＪ８０１は、リモージンＸジャージー種のオス子牛由来のオス細胞系であり、３ＸＴＣは、３度において三つ子牛を出産した交雑育種牛由来である。
【００９１】
２つの細胞周期段階を比較した：
（１）両細胞系におけるドナー細胞を、０．５％ＦＣＳを有する培地中４〜５日間培養したＧ０細胞；および
（２）ドナー細胞を、有糸分裂後１〜３時間以内に細胞質体に融合したＧ１細胞。
【００９２】
負のＢｒｄＵ標識により、有糸分裂後３時間以内に融合した成牛皮膚の線維芽細胞がＳ期に入らなかったことが確認された。
ＬＪ８０１および３ＸＴＣの双方を、３〜４回の継代培養で核移植実験に用いた。
【００９３】
ＬＪ８０１細胞と３ＸＴＣ細胞との間で胚盤胞期への発生効率に差がなく、両細胞系から再構成された胚を、今回ＩＣＰ（イムノケミカルプロダクツ社、ニュージーランド国オークランド；製品番号ＡＢＦＦ−００２）からの別のＢＳＡ源を補足した同一の標準ＡｇＲ　ＳＯＦ培地中で培養したことから、表４のデータを組み合わせてある。胚導入後、妊娠を通しての胚生存に関するデータを、細胞系３ＸＴＣとＬＪ８０１とのそれぞれについて図３および４に示す。
【００９４】
表４のデータは、胚盤胞期への発生に対してＧ０またはＧ１のいずれかに同調されたドナー成牛皮膚線維芽細胞の細胞サイクルの効果が無かったことを示す。　表４．細胞サイクルのＧ０またはＧ１のいずれかでの成牛の皮膚線維芽細胞（ＬＪ８０１および３ＸＴＣ細胞）により再構成され、ＩＣＰ　ＢＳＡを補足したＡｇＲ　ＳＯＦ培地中培養されたクローン化胚のｉｎ　ｖｉｔｒｏ発生（平均±標準誤差）
【表４】
2004500038.tif 000005
【００９５】
図３のデータは、３ＸＴＣ細胞により再構成された胚では、少なくとも１５０日目までの生存に差がなかったことを示す。細胞サイクルのＧ１におけるドナー細胞の１５０日目の胚生存は２５％（３／１２）であったのに対し、Ｇ０ドナー細胞では２７％（３／１１）であった。
【００９６】
図４のデータは、ＬＪ８０１線維芽細胞により再構成された胚では、Ｇ０ドナー細胞による妊娠２１０日目により大きな胚生存傾向があることを示すが、これは統計的に有意ではない。細胞サイクルのＧ１におけるドナー細胞では、２１０目における胚生存は、２３％（３／１３）であったのに対し、Ｇ０ドナー細胞では３９％（７／１８）であった。
【００９７】
実施例６．核移植後のｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ発生に及ぼすＧ０またはＧ１のいずれかに同調された、遺伝的に変えた牛胎仔線維芽細胞の効果　本実験は、遺伝的に変えた牛胎仔メスの肺線維芽細胞で実施して、核移植後の発生に対する細胞周期段階の効果を調べた。遺伝子変更は、ウシβ遺伝子およびκ−カゼイン遺伝子の追加コピーの無作為挿入で行った。このトランスジェニック細胞系は、「カゼイン・プラス５１１０」と表示した。
【００９８】
２つの細胞周期段階を比較した：。
（１）ドナー細胞を、０．５％ＦＣＳを有する培地中３〜６日間培養したＧ０細胞；および
（２）ドナー細胞を、有糸分裂後１〜３時間以内に細胞質体に融合したＧ１細胞。
再構成胚をＩＣＰ　ＢＳＰ（イムノケミカルプロダクツ社、ニュージーランド国オークランド；製品番号ＡＢＦＦ−００２）を補足した標準ＡｇＲ　ＳＯＦ培地組成中で培養した。
【００９９】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ胚発生に関するデータを表５に示す。カゼイン・プラス５１１０細胞による胚盤胞期への発生は、核移植に使用したドナー細胞がＧ０における場合に比較してＧ１における場合は有意に少なかった。この結果は、前記実施例に示した他の細胞系と対照的である。
【０１００】
表５．細胞サイクルのＧ０またはＧ１期のいずれかでのトランスジェニックメスの肺皮膚線維芽細胞（カゼイン・プラス５１１０細胞）により再構成され、ＩＣＰ　ＢＳＡを補足したＡｇＲ　ＳＯＦ培地中培養されたクローン化牛胚のｉｎ　ｖｉｔｒｏ発生（平均±標準誤差）
【表５】
2004500038.tif 000006
【０１０１】
図５に示した胚生存データは、カゼイン・プラス５１１０トランスジェニック細胞では、少なくとも９０日目までの発生に及ぼす細胞周期段階の効果が無いことを示す。細胞サイクルのＧ１におけるドナー細胞では、９０日目の胚生存は３８％（９／２４）であったのに対し、Ｇ０ドナー細胞では２７％（６／２２）であった。
【０１０２】
実施例７．核移植後のｉｎ　ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏ発生に及ぼす非増殖性老化ドナー細胞（後期Ｇ１期における）の効果
核移植実験を実施して、非増殖性老化牛ドナー細胞による発生に及ぼす効果を調べた。本実験に用いた細胞は、メス胎仔肺線維芽細胞であり、遺伝的に変更したものである（「５６１細胞」と表示される）。最初に、細胞は活発に増殖するが、しかし培養過程の間に、これは漸次遅くなり、後期継代時に細胞は、当業者により老化として知られている非増殖期に入り、それにより細胞分化が止まる。老化細胞は、細胞サイクルのＧ１、具体的には後期Ｇ１／Ｓ期境界時に止まっていることが知られている（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ等、１９８８年）。細胞が老化に入る場合、それらは後期Ｇ１で遮断され、生理的有糸分裂促進因子に応答してＳ期に入ることがない。したがって、老化は静止期とは異なっている。静止期の細胞は至適条件（例えば、血清不足の細胞培養の場合、血清の追加）に戻すと、細胞サイクル再入へと誘導され増殖する。
【０１０３】
トランスジェニック老化細胞により再構成された胚を、ＩＣＰ　ＢＳＡを補足したＡｇＲ　ＳＯＦ培地中培養した。
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ胚発生に関するデータを表６に示す。老化ドナー細胞による胚盤胞期への発生は、前記実施例に示したＧ０または早期Ｇ１ドナー細胞に関して予想された発生よりも低かった。
【０１０４】
表５．非増殖の老化トランスジェニック線維芽細胞（５６１細胞）により再構成され、ＩＣＰ　ＢＳＡを補足したＡｇＲ　ＳＯＦ培地中培養されたクローン化牛胚のｉｎ　ｖｉｔｒｏ発生
【表６】
2004500038.tif 000007
【０１０５】
図６に示した胚生存データは、後期Ｇ１期に止まっている非増殖性老化細胞によるクローン化が、９０日目までに発生する胚がわずか４％（１／２６）である、という低効率であることを示唆する。
【０１０６】
（結論）
１．細胞周期のある特定の段階、好ましくは早期Ｇ１における個々の細胞を選ぶことが可能である。このことは、核移植に使用される個々の細胞における実際の細胞周期段階が正確に知られていない、いわゆる増殖細胞を用いる先行技術と比較して有利である。同じことが、血清飢餓にした細胞個体群にとっても言える。
【０１０７】
２．細胞サイクルの早期Ｇ１期における有糸分裂後の細胞は、生存牛の出産により立証されているように、核移植後全能性である。
３．このように、Ｇ０は、分化培養細胞を用いて核移植後の発生に適合する唯一の細胞周期段階ではなく、Ｇ１、好ましくは早期Ｇ１でも核は、機能的に再プログラム化できる。
【０１０８】
４．有糸分裂後の早期Ｇ１細胞は、核移植後の胚盤胞期への発生をＧ０における細胞と同様のレベルに促進する。
５．Ｇ０または早期Ｇ１ドナー核のいずれかにより再構成されたクローン化胚の出産予定日までの導入後生存において有意差はない。
【０１０９】
（産業上の利用可能性）
本発明は、特に治療的クローン化分野におけるヒトへの適用のみならず、製薬上有用な蛋白質、肉、牛乳、繊維などの農業的に有用な産物を生産できるトランスジェニック動物などの動物のクローン化群を確立するのに有用である。
【０１１０】
本明細書の記載が、上記実施例にのみ本発明の範囲を限定することを意図しているのではなく、添付の請求の範囲から離脱することなく、当業者により容易に生じる多くの変更が可能であることが解されよう。
【０１１１】
（引用文献）
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全ての引用文献は参照により、その全体をここに組み入れている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ドナー細胞周期がＧ０またはＧ１のいずれかにある、濾胞細胞を用いて再構成したクローン・ウシ胚の妊娠期間中の生存率を示す図である。
【図２】
ドナー細胞周期がＧ０またはＧ１のいずれかにある、成体の雌の皮膚線維芽細胞を用いて再構成したクローン・ウシ胚の妊娠期間中の生存率を示す図である。
【図３】
ドナー細胞周期がＧ０またはＧ１のいずれかにある、成体の雌の皮膚線維芽細胞（３ＸＴＣ細胞）を用いて再構成したクローン・ウシ胚の妊娠期間中の生存率を示す図である。
【図４】
ドナー細胞周期がＧ０またはＧ１のいずれかにある、成体の雄の皮膚線維芽細胞（ＬＪ８０１細胞）を用いて再構成したクローン・ウシ胚の妊娠期間中の胚生存を示す図である。
【図５】
ドナー細胞周期がＧ０またはＧ１期にある、遺伝子的に改変された雌の胎児の肺線維芽細胞（カゼイン・プラス５１１０細胞）を用いて再構成したクローン遺伝子導入ウシ胚の妊娠期間中の胚生存を示す図である。
【図６】
非増殖老化雌胎児線維芽細胞（５６１細胞系統）を用いて再構成したクローン・トランスジェニック・ウシ胚の妊娠期間中の胚生存を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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