(57)【要約】本発明は、有核細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供し、この有核細胞は、ポリグルタミン路を含むアタキシン−２ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む。詳細には、トランスジェニック非ヒト哺乳動物はマウスであり得る。本発明はまた、アタキシン−２ポリペプチドをコードするＳＣＡ２を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を使用して、神経変性疾患を処置する際に使用するための治療剤を同定する方法を提供し、この方法は、アタキシン−２ポリペプチドをコードするＳＣＡ２を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物に化合物を投与し、そしてトランスジェニック非ヒト哺乳動物の神経変性表現型に関連した、改善された神経学的応答について、このトランスジェニック非ヒト哺乳動物をスクリーニングすることにより、それによって神経変性疾患を処置する際に使用するための治療剤を同定する。
2004506444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有核細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物であって、該有核細胞が、アタキシン−２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む導入遺伝子を含み、該配列が、プロモーターに作動可能に連結され、ここで、該アタキシン−２ポリペプチドがポリグルタミン路を含み、そして該トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、野生型マウスと比較して減少した数のプルキンエ細胞を発生すること、および野生型マウスと比較して損なわれた運動機能を発生することからなる群より選択される神経変性表現型を示す、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項２】
前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３】
前記アタキシン−２ポリペプチドが、前記ポリグルタミン路に約３２以上のグルタミンを含む、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項４】
前記アタキシン−２ポリペプチドが約５８のグルタミンを含む、請求項３に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５】
前記導入遺伝子がプルキンエ細胞特異的発現エレメントに作動可能に連結されている、請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項６】
前記導入遺伝子によってコードされるポリペプチドが、プルキンエ細胞内で発現される、請求項５に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項７】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してホモ接合性である、請求項２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項８】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してヘテロ接合性である、請求項２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項９】
請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離された、非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１０】
前記細胞がマウス細胞である、請求項９に記載の非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１１】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してホモ接合性である、請求項１０に記載の非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１２】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してヘテロ接合性である、請求項１０に記載の非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項１３】
ヒトアタキシン−２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、該アタキシン−２ポリペプチドが、プルキンエ細胞特異的発現エレメントに作動可能に連結された約５８グルタミンを含むポルグルタミン路を有する、ＤＮＡ構築物。
【請求項１４】
前記アタキシン−２ポリペプチドが前記ポリグルタミン路に約３２以上のグルタミンを含む、請求項１３に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１５】
前記アタキシン−２ポリペプチドが前記ポリグルタミン路に約５８のグルタミンを含む、請求項１４に記載のＤＮＡ構築物。
【請求項１６】
ヒトアタキシン−２ポリペプチドおよび緑色蛍光タンパク質の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物であって、該アタキシン−２ポリペプチドは、プルキンエ細胞特異的発現エレメントに作動可能に連結された約５８グルタミンを含むグルタミン路を有する、ＤＮＡ構築物。
【請求項１７】
請求項１３に記載のＤＮＡ構築物を含む、ベクター。
【請求項１８】
請求項１３に記載のＤＮＡ構築物を含む、胚性幹細胞。
【請求項１９】
請求項１３に記載のＤＮＡ構築物を含む、単離されたマウス細胞。
【請求項２０】
前記細胞がマウスである、請求項１９に記載の非ヒト哺乳動物細胞。
【請求項２１】
前記細胞が胚性幹細胞である、請求項２０に記載のマウス細胞。
【請求項２２】
神経変性疾患を処置する際に使用するための治療剤を同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１に記載のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に化合物を投与する工程；および、
（ｂ）該トランスジェニック非ヒト哺乳動物の神経変性表現型に関連した、改善された神経学的応答について、該トランスジェニック非ヒト哺乳動物をスクリーニングし、それによって、該神経変性疾患を処置する際に使用するための治療剤を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
前記非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物が神経変性表現型を示す、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記アタキシン−２ポリペプチドが、前記ポリグルタミン路に約３２以上のグルタミンを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記アタキシン−２ポリペプチドが、前記ポリグルタミン路に約５８のグルタミンを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記導入遺伝子がプルキンエ細胞特異的発現エレメントに作動可能に連結されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記導入遺伝子がプルキンエ細胞内で発現される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してホモ接合性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してヘテロ接合性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２２に記載の方法であって、前記神経変性疾患が、１型脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ１）、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ４、ＳＣＡ５、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症、マチャド−ジョセフ病、および歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症からなる群より選択される、方法。
【請求項３２】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、および筋萎縮性側索硬化症からなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
神経変性疾患を処置する際に使用するための潜在的治療剤を同定する方法であって、以下：
（ａ）プロモーターに作動可能に連結されたアタキシン−２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ構築物を含む細胞を、化合物と接触させる工程であって、該アタキシン−２ポリペプチドがポリグルタミン路を有し、そして該細胞中で発現され、該細胞が、該ＤＮＡ構築物を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離され、該哺乳動物が、野生型動物と比較して減少した数のプルキンエ細胞を発生すること、および野生型マウスと比較して損なわれた運動機能を発生することからなる群より選択される神経変性表現型を有する、工程；および、
（ｂ）改善された神経変性表現型について該細胞をスクリーニングし、それによって、該神経変性疾患を処置する際に使用するための潜在的な治療剤を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項３４】
前記アタキシン−２ポリペプチドが前記ポリグルタミン路に約３２のグルタミンを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記アタキシン−２ポリペプチドが前記ポリグルタミン路に約５８のグルタミンを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が、前記ＤＮＡ構築物を含む有核細胞を有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記トランスジェニック非ヒト哺乳動物がマウスである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＤＮＡ構築物が、前記アタキシン−２ポリペプチドとの緑色蛍光タンパク質融合物をコードする核酸を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
約５８のグルタミンのポリグルタミン路を含むアタキシン−２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む細胞を含むトランスジェニックマウスであって、該配列が、プルキンエ細胞特異的プロモーターに作動可能に連結され、ここで、該マウスが、野生型マウスと比較して減少した数のプルキンエ細胞を発生する、トランスジェニックマウス。
【請求項４０】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してホモ接合性である、請求項３９に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４１】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してヘテロ接合性である、請求項３９に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４２】
請求項３９に記載のトランスジェニックマウスから単離された細胞であって、ここで、前記細胞が、約５８のグルタミンのポリグルタミン路を含む前記アタキシン−２ポリペプチドを発現する、単離された細胞。
【請求項４３】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してホモ接合性である、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４４】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してヘテロ接合性である、請求項４２に記載の細胞。
【請求項４５】
神経変性疾患を処置する際に使用するための治療剤を同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項３９に記載のトランスジェニックマウスに化合物を投与する工程；および、
（ｂ）該トランスジェニックマウスの神経変性表現型に関連した、改善された神経学的応答について、該トランスジェニックマウスをスクリーニングし、それによって、該神経変性疾患を処置する際に使用するための治療剤を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してホモ接合性である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してヘテロ接合性である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
神経変性疾患を処置する際に使用するための潜在的治療剤を同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項４２に記載の細胞を化合物と接触させる工程であって、該細胞が、約４３のグルタミンのポリグルタミン路を有するアタキシン−２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を含む、工程；および
（ｂ）アタキシン−２ポリペプチド発現に関連した表現型を変更する活性を有する化合物を同定するために該細胞をスクリーニングし、それによって、該神経変性疾患を処置する際に使用するための潜在的治療剤を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
約５８のグルタミンのポリグルタミン路を含むアタキシン−２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む細胞を含むトランスジェニックマウスであって、該配列が、プルキンエ細胞特異的プロモーターに作動可能に連結され、ここで、該マウスが、野生型マウスと比較して損なわれた運動機能を示す、トランスジェニックマウス。
【請求項５０】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してホモ接合性である、請求項４９に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５１】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してヘテロ接合性である、請求項４９に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５２】
請求項４９に記載のトランスジェニックマウスから単離された細胞であって、ここで、該細胞が、約５８のグルタミンのポリグルタミン路を含むアタキシン−２ポリペプチドを発現する、細胞。
【請求項５３】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してホモ接合性である、請求項５２に記載の細胞。
【請求項５４】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してヘテロ接合性である、請求項５２に記載の細胞。
【請求項５５】
神経変性疾患を処置する際に使用するための治療剤を同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項４９に記載のトランスジェニックマウスに化合物を投与する工程；および、
（ｂ）該トランスジェニックマウスの神経変性表現型に関連した、改善された神経学的応答について、該トランスジェニックマウスをスクリーニングし、それによって、該神経変性疾患を処置する際に使用するための治療剤を同定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５６】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してホモ接合性である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記マウスが前記導入遺伝子に対してヘテロ接合性である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
神経変性疾患を処置する際に使用するための潜在的治療剤を同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項５２に記載の細胞を化合物と接触させる工程であって、該細胞が、約５８のグルタミンのポリグルタミン路を有するアタキシン−２ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を含む、工程；および
（ｂ）アタキシン−２ポリペプチド発現に関連した表現型を変更する活性を有する化合物を同定するために該細胞をスクリーニングし、それによって、該神経変性疾患を処置する際に使用するための潜在的治療剤を同定する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所によって与えられる助成金番号ＮＳ３３１２３の元で、政府の支援を得て行なわれた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、一般に、神経生物学に関し、そしてより詳細には、神経変性疾患のマウスモデルに関する。
【０００３】
遺伝性運動失調は、小脳および小脳経路の機能不全または病理に寄与するバランスの種々の異常によって特徴付けられる複雑な群の神経変性障害である。これらの障害の多数において、機能不全または構造的異常は、小脳を越えて広がり、そして脳幹神経節機能、眼球運動障害、および神経病理を含み得る。優性脊髄小脳運動失調（ＳＣＡ）は、家族性の場合、約１００，０００分の１の有病率で、不均一な群の障害を示す。
【０００４】
種々の遺伝子および表現型が、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、マチャド−ジョセフ病（ＳＣＡ３）、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症、および歯状核赤核小脳萎縮を含む、神経変性障害のファミリーと関連があると同定されている。これらの疾患は、それぞれの疾患遺伝子によってコードされるタンパク質におけるポリグルタミン（ポリＱ）路の拡大に関連する。
【０００５】
正常なヒト脳および病気のヒト脳の研究は、ポリＱ関連疾患病因への重要な洞察を提供し得るが、このような観察は、疾患プロセスの末期に限定される。マウスモデルは、この問題を回避し得るが、ヒトポリＱ疾患の多数のマウスモデルは、神経変性を生じるために、短縮された構築物または非常に長いポリＱ路の使用に依存する（Ｉｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１３：１９６−２０２（１９９６）；Ｍａｇｉａｒｉｎｉら、Ｃｅｌｌ，８７：４９３−５０６（１９９６）Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１５：１９７−２００（１９９７）；Ｄａｖｉｅｓら、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ　Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，３５４：９８１−９８９（１９９９）。さらに、いくつかのポリＱマウスモデルは、顕著なニューロン喪失（ヒトポリＱ疾患の明確な特徴）を示さない。
【０００６】
従って、ポリＱ神経変性疾患の非ヒト動物モデルおよび神経変性疾患を処置するために有用な治療剤を同定する方法に対する必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、そして同様に関連した利点を提供する。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、ポリグルタミン路を含むアタキシン−２ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む有核細胞を含むトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する。詳細には、トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、マウスであり得る。本発明はまた、アタキシン−２ポリペプチドを発現する非ヒト哺乳動物に化合物を投与することによって神経変性疾患を処置する際、およびトランスジェニック非ヒト動物の神経変性表現型に関連する改善された神経学的応答についてトランスジェニック非ヒト動物をスクリーニングする際の使用のための治療剤を同定するために、アタキシン−２ポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を使用する方法を提供し、それにより、神経変性疾患を処置する際に使用するための治療剤を同定する。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ポリグルタミン路を含むアタキシン−２ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む有核細胞を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、詳細には、トランスジェニックマウスを提供する。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、神経変性疾患についてのモデルとして有用である。ＳＣＡ２遺伝子またはコードされたアタキシン−２ポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト動物、またはそれに由来する細胞は、種々の神経変性疾患（例えば、１型脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ１）、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ４、ＳＣＡ５、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症、マチャド−ジョセフ病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮、アルツハイマー病、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ；ルー・ゲーリグ病））を処置するために有用な治療剤を同定するための方法において有利に使用され得る。
【０００９】
ＳＣＡ２は、ポリグルタミン（ポリＱ）路の拡大によって引き起こされる神経変性疾患の増殖するファミリーに属する。この群は、現在、ＳＣＡ１（Ｏｒｒら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，４：２２１−２２６（１９９３））；マチャド−ジョセフ病（ＳＣＡ３またはＭＪＤ）（Ｋａｗａｇｕｃｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，８：２２１−２２８（１９９４））；ＳＣＡ６（Ｚｈｕｃｈｅｎｋｏら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．１５：６２−６９（１９９７））；ＳＣＡ７（Ｄａｖｉｄら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１７：６５−７０（１９９７））；ハンチントン病（ＨＤ）（Ｔｈｅ　Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｒｏｕｐ，Ｃｅｌｌ，７２：９７１−９８３（１９９３））；球脊髄性筋萎縮症（ＳＢＭＡ）（Ｌａ　Ｓｐａｄａら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：７７−７９（１９９１））；および歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮（ＤＲＰＬＡ）（Ｋｏｉｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，６：９−１３（１９９４））を含む。これらの表現型差異に関わらず、証拠によって、これらの疾患は、共通の病原性機構を共有することが示唆されている。ある程度、ポリＱ疾患は、変異および誤って折り畳まれたタンパク質によって引き起こされるヒト神経変性疾患の表現型としてみなされ得る。ユビキチン結合、全長タンパク質または短縮型タンパク質の細胞内局在化、およびカスパーゼ切断の全ては、ポリＱの病原性に関与するが、どの特徴がポリＱ疾患に共通であり、そしてどの特徴が、病原性に必要かつ十分であるかは、明らかではない。
【００１０】
細胞内凝集は、ＳＣＡ３およびハンチントン病（ＨＤ）を有する患者の脳におけるニューロンのサブセットにおいて見出されるので、細胞内封入体（ＮＩ）の形成は、ポリＱ媒介性のニューロンの死滅を引き起こす共通の特徴であることが示唆されている。細胞内封入体はまた、これらが長いＣＡＧ反復を含むｃＤＮＡでトランスフェクトされる場合、ヒトポリＱ疾患のマウスモデルおよび培養細胞において見出された（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１９：１４８−１５４（１９９８）；Ｐａｕｌｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｎ，１９：３３３−３４４（１９９７）；Ｔｒｏｔｔｉｅｒら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．，５：３３５−３４７（１９９８）；Ｈｏｌｍｂｅｒｇら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，７：９１３−９１８（１９９８）；Ｉｇａｒａｓｈｉら，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１８：１１１−１１７（１９９８）；Ｄａｖｉｅｓら，Ｃｅｌｌ，９０：５３７−５４８（１９９７）；Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１８：１５０−１５４（１９９８）；Ｓａｕｄｏｕら、Ｃｅｌｌ，９５：５５−６６（１９９８）；Ｓｃｈｅｒｚｉｎｇｅｒら、Ｃｅｌｌ，９０：５４９−５５８（１９９７）；Ｓｔｅｎｏｉｅｎら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８；７３１−７４１（１９９９））。しかし、いくつかの研究によって、病原性についてのこれらの重要性が疑問視されている。１３０より大きいグルタミン反復を有する短縮されたアミノ末端ハンチンチンフラグメントを発現するトランスジェニックマウス系統は、豊富な数のＮＩを有したが、神経変性におけるＮＩの役割についての証拠はほとんどない（Ｄａｖｉｅｓら、Ｃｅｌｌ，９０：５３７−５４８（１９９７））。対照的に、４８または８９のいずれかのグルタミン反復を有する全長ハンチンチンを発現するマウスは、これらのニューロンにおいてほとんどＮＩを有さない線条体ニューロンの死滅を示した（Ｒｅｄｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，２０：１９８−２０２（１９９８））。
【００１１】
ハンチンチンを用いるインビトロ研究によって、変異タンパク質の核局在化が、神経変性に必要であることが示されたが（Ｓａｕｄｏｕら、Ｃｅｌｌ，９５：５５−６６（１９９８））、ＮＩの形成は、変異ハンチンチンによって誘導されるニューロン死滅と関連していなかった（Ｐａｕｌｓｏｎ　Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，６４：３３９−３４５（１９９９）；Ｇｕｔｅｋｕｎｓｔら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９：２５２２−２５３４（１９９９）；Ｋｕｅｍｍｅｒｌｅら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４６：８４２−８４９（１９９９））。さらに、細胞内凝集は、ＨＤ脳において見出されるが、ＨＤにおけるほとんどのポリＱ凝集は、核周囲である（Ｇｕｔｅｋｕｎｓｔら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９：２５２２−２５３４（１９９９）；Ｋｕｅｍｍｅｒｌｅら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４６：８４２−８４９（１９９９））。他方、ＳＣＡ１病原性については、アタキシン−１の細胞内局在化は、病原性のために必要であるが、凝集の形成は、必要ではない（Ｋｌｅｍｅｎｔら、Ｃｅｌｌ，９５：４１−５３（１９９８））。
【００１２】
いくつかのＮＩは、ユビキシン、プロテアソームタンパク質または熱ショックタンパク質との共存を示し（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、前出、１９９８；Ｐａｕｌｓｏｎら、前出、１９９７；Ｔｒｏｔｔｉｅｒら、前出、１９９８；Ｈｏｌｍｂｅｒｇら、前出、１９９８；Ｉｇａｒａｓｈｉら、前出、１９９８；Ｄａｖｉｅｓら、前出、１９９７；Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅら、前出、１９９８；Ｓａｕｄｏｕら、前出、１９９８；Ｓｃｈｅｒｚｉｎｇｅｒら、前出、１９９７；Ｓｔｅｎｏｉｅｎら、前出、１９９９）、ユビキチン−プロテアソーム経路による分解を示唆する。ユビキチン結合の重要性は、最近、アタキシン−１について実証されている。ユビキチン結合における重要な酵素の１つ（Ｕｂｅ３リガーゼ）の欠如は、封入体の減少を生じるが、マウストランスジェニック系統におけるプルキンエ細胞病理の重篤性を増加させる（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、Ｎｅｕｒｏｎ，２４：８７９−８９２（１９９９））。ユビキチン−プロテアソーム経路による標的化が、全ての変異ポリＱタンパク質の共通の特徴であるか否かは、知られておらず、そしてアタキシン−６は、ヒトＳＣＡ６脳においてユビキチン結合されないようであった（Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８：１１８５−１１９３（１９９９））。
【００１３】
ＳＣＡ２遺伝子（アタキシン−２と命名される）のタンパク質産物は、１４０ｋＤの計算分子量で、１，３１２アミノ酸残基から構成される。ヒトＳＣＡ２　ｃＤＮＡ配列（ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列について、それぞれ、配列番号１および２）は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７０３２３で利用可能である（Ｐｕｌｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１４：２６９−２７６（１９９６））。図１は、アタキシン−２ポリペプチドの概略的なマップを示し、アタキシン−２ポリペプチドはまた、ＳＣＡ２ポリペプチドとも称され得る。アタキシン−２は、グルタミン範囲（ｒｅａｃｈ）領域（ｇｌｎ）およびアミノ酸２５６とアミノ酸４０５との間の酸性ドメインを有する。酸性ドメインの中に、２つのＲＮＡ結合モチーフ（それぞれ、アミノ酸２３０〜２３３およびアミノ酸２８３〜２８６におけるＳｍ１およびＳｍ２）、アミノ酸３９６〜３９９における推定カスパーゼ−３認識部位、および小胞体（ＥＲ）脱出シグナルの下流のアミノ酸４１４〜４１６におけるクラスリン媒介性分類シグナルが存在する。カスパーゼ−３切断アタキシン−２産物についての推定分子量は、４１．２ｋＤである。２つのペプチド（ＳＣＡ２ＡおよびＳＣＡ２Ｂ）（これらは、抗体を産生するために使用された）の位置もまた、図１に示す。
【００１４】
野生型アタキシン−２の最も一般的な形態は、プロリンリッチドメインおよびセリンリッチドメインの領域によって隣接された２２グルタミン反復を含む。対照的に、マウスアタキシン−２は、ヒトポリＱ路の部位において１つのみのグルタミンを有し（Ｎｅｃｈｉｐｏｒｕｋら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．７：１３０１−１３０９（１９９８））、このことは、アタキシン−２の正常な機能が、ＣＡＧ反復に隣接する領域に存在することを示唆する。ポリＱ路が３４以上に拡大すると、個体は、ＳＣＡ２表現型を発症する。ＣＡＧトリヌクレオチド拡大を除いて、ＳＣＡ２のタンパク質産物は、他のポリＱタンパク質と類似性を全く有さない（Ｏｒｒら、前出、１９９３；Ｋａｗａｇｕｃｈｉら、前出、１９９４；Ｚｈｕｃｈｅｎｋｏら、前出、１９９７；Ｄａｖｉｄら、前出、１９９７；Ｔｈｅ　Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｒｏｕｐ、前出、１９９３；Ｌａ　Ｓｐａｄａら、前出、１９９１；Ｋｏｉｄｅら、前出、１９９４；Ｉｍｂｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１４：２８５−２９１（１９９６）；Ｐｕｌｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１４：２６９−２７６（１９９６）；Ｓａｎｐｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１４：２７７−２８４（１９９６））。
【００１５】
免疫組織学的研究によって、アタキシン−２は、正常な脳において、細胞質に局在化し、そしてプルキンエ細胞ならびに特定の群の脳幹および皮質のニューロンにおいて発現されることが、見出された（Ｈｕｙｎｈら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４５：２３２−２４１（１９９９））。ユビキチン化核内封入体は、ＳＣＡ２患者の脳橋ニューロンの１〜２％のみで見出されたが、プルキンエ細胞において見出されなかった。プルキンエ細胞は、ＳＣＡ２病理における主要な標的である（Ｋｏｙａｎｏら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．２７３：１１７−１２０（１９９９））。
【００１６】
本明細書中で議論されるように、ＳＣＡ２病原は、タンパク質の核内局在化を必要とせず、そして変異アタキシン−２は、大きい凝集体または封入体を形成しない。変異アタキシン−２を発現するマウス系統は、変異アタキシン−１を発現するマウス系統と類似した機能的および形態学的欠損を示すが（Ｂｕｒｒｉｇｈｔら、Ｃｅｌｌ，８２：９３７−９４８（１９９５）；Ｃｌａｒｋら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７：７３８５−７３９５（１９９７）；Ｖａｎｄａｅｌｅら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．，５：１１３６−１１４８（１９９１））、核局在化またはユビキチン結合体化タンパク質複合体における検出可能な増加を有さない（実施例ＩＩＩおよびＩＶを参照のこと）。
【００１７】
本発明は、ポリグルタミン路を含むアタキシン−２ポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む有核細胞を含む変異非ヒト哺乳動物を提供する。本明細書中で開示されるように、「変異（体）」は、遺伝的変化、例えば、核酸の野生型形態のような親核酸と比較して遺伝的改変を含む核酸を意味する核酸またはコードされたポリペプチドの変異形態をいう。同様に、「変異（体）」は、動物に関して使用される場合、遺伝的に改変された動物をいう。遺伝的改変は、遺伝子の挿入であり得、それにより、「トランスジェニック」動物を産生する。本明細書中で使用される場合、「導入遺伝子」は、トランスジェニック動物に関して使用される場合、正常な遺伝子としてのその機能、複製、および伝達を保証する様式で、動物の生殖系列に挿入された遺伝子をいう。遺伝的改変は、遺伝子の欠失または破壊であり得、それにより、「ノックアウト」動物を産生する。「ノックアウト」変異動物は、細胞中の内因性ＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の少なくとも一部の発現の部分的または完全な抑制をいう。同様に、破壊された遺伝子は、遺伝子の発現の完全または部分的な抑制を生じる。
【００１８】
本発明の変異動物は、例えば、マウスなどの任意の非ヒト哺乳動物であり得る。変異動物は、例えば、他の非ヒト哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、モルモット、ヒツジ、ウシ、非ヒト霊長類または任意の非ヒト哺乳動物）でもあり得る。本明細書で開示されるアタキシン−２変異マウスに加えて、ＳＣＡ２導入遺伝子を発現する変異動物は、本発明の方法に使用され得ることが理解される。本発明の変異哺乳動物の１つの実施形態において、ヒトＳＣＡ２遺伝子は、マウスに導入されて、種々の長さのポリグルタミン路を有するアタキシン−２を発現するトランスジェニックマウスを生じた（実施例ＩＩを参照のこと）。
【００１９】
本発明のＳＣＡ２トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、ポリグルタミン路を含むアタキシン−２ポリペプチドをコードするＳＣＡ２導入遺伝子を含む。ポリグルタミン路を有するアタキシン−２ポリペプチドは、任意の哺乳動物由来のＳＣＡ２遺伝子またはそのスプライス改変体によってコードされ得る。例えば、ＳＣＡ２核酸またはコードされたアタキシン−２ポリペプチドは、ヒト配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７０３２３；配列番号１および２）であり得、ポリグルタミン路に任意の可変数のグルタミンを有する。別の例示的哺乳動物ＳＣＡ２核酸およびコードされるアタキシン−２ポリペプチドは、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７０６７０；ヌクレオチドおよびアミノ酸についてそれぞれ配列番号１１および１２）に由来し、ポリグルタミン路に任意の可変数のグルタミンを有する。哺乳動物種に由来する任意のＳＣＡ２核酸またはコードされるアタキシン−２ポリペプチドは、例えば、神経変性表現型を生じる、天然に存在するポリグルタミン路または人為的にアタキシン−２ポリペプチド中の適切な位置に挿入されたポリグルタミン路を伴って本発明に用いられ得る。他の例示的哺乳動物種としては、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、モルモット、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類など、すなわち任意の非ヒト哺乳動物が挙げられる。
【００２０】
例えば、ポリグルタミン路は、マウスＳＣＡ２　ｃＤＮＡ中の１つのグルタミンの位置に挿入されて、神経変性表現型を生じるポリグルタミン路を有するアタキシン−２ポリペプチドを生じ得る。同様に任意の哺乳動物ＳＣＡ２　ｃＤＮＡは、改変されて、神経変性表現型を生じる少なくとも最少数のポリグルタミンを有するアタキシン−２ポリペプチドをコードし得る。
【００２１】
アタキシン−２ポリペプチドは、例えば、配列番号２に示されるヒトアミノ酸配列、配列番号１２に示されるマウスアミノ酸配列、または任意の哺乳動物種に由来するアタキシン−２ポリペプチドであり得、ポリグルタミン路を提供し、以下に言及される１個と約２５０個との間のグルタミンをポリグルタミン路に有するアタキシン−２ポリペプチドを生じるグルタミンが加わるか欠失する。本明細書で使用されるように、用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸のペプチドまたはポリペプチドを示すことが意図される。用語「ポリペプチドアナログ」は、本明細書に詳細に記載される配列と実質的に同じであるアミノ酸配列を有する任意のポリペプチドを含み、ここで、本明細書に記載されるように、１つ以上の残基は保存的に、機能的に同様の残基で置換され、そしてこの残基は、アタキシン−２ポリペプチドの機能を模倣する能力を示す。アタキシン−２ポリペプチドの「改変」はまた、アタキシン−２ポリペプチドアミノ酸配列の保存的置換を含む。コードされるアミノアンの保存的置換としては、例えば、以下の群に属するアミノ酸が挙げられる：（１）非極性アミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ）；（２）極性中性アミノ酸（Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎ）；（３）極性酸性アミノ酸（ＡｓｐおよびＧｌｕ）；（４）極性塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓ）；および（５）芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＨｉｓ）。他のわずかな改変は、ポリペプチドが、アタキシン−２ポリペプチドの構造的特性および／または機能的特性のいくらかまたは全てを維持する限り、アタキシン−２ポリペプチドに含まれる。例示的な構造的特性としては、配列同一性または実質的な類似性、抗体反応性、および保存された構造ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合ドメインまたは酸性ドメイン）の存在が挙げられる。
【００２２】
アタキシン−２ポリペプチドのように、本発明はまた、アタキシンー２ポリペプチドの機能的誘導体を提供する。用語「機能的」とは、本明細書において本発明のアタキシン−２ポリペプチドまたはそのポリペプチドフラグメントの修飾因子として使用される場合、アタキシン−２ポリペプチドと同様の機能的特性を呈するポリペプチドを示す。アタキシン−２ポリペプチドの代表的な機能的特性としては、ＲＮＡ結合、分子輸送、またはポリグルタミン路の大きさに基づく潜在的な神経変性表現型の提示することが挙げられ、すなわちより少数のポリグルタミンを有するアタキシン−２ポリペプチドが、正常の表現型を有し、より多数のポリグルタミン（例えば、３２以上のポリグルタミン）を有するアタキシン−２ポリペプチドが、神経変性表現型を有する。当業者は、ポリペプチドまたはコードする核酸配列が、参照配列と実質的に同じか否かを、コードされたポリペプチドの機能的特性を、参照アタキシン−２ポリペプチドと比較することによって容易に決定し得る。
【００２３】
本発明のトランスジェニック動物の産生に有用な例示的アタキシン−２ポリペプチドは、種々の長さのポリグルタミン（ポリＱ）路を含む。例えば、本発明は、２２個または５８個のポリグルタミンを有するヒトアタキシン−２ポリペプチドを発現するトランスジェニックマウスを提供する（実施例ＩＩを参照のこと）。本発明はまた、非ヒト哺乳動物、および１個〜２５０個を超えるポリグルタミン（詳細には、約２２個〜約５８個のポリグルタミン）を有するアタキシン−２ポリペプチドをコードするＳＣＡ２　ｃＤＮＡを発現する対応するＤＮＡ構築物を提供する。ポリグルタミン路は、連続的であり得るか、非グルタミンアミノ酸の短いセグメントを含み得る。ポリグルタミン路の長さは、動物または細胞が神経変性表現型を呈するか否かを決定する。
【００２４】
遺伝的背景および確率的変化に依存して、約３２個以上のポリグルタミンを有するアタキシン−２ポリペプチドは一般に、神経変性表現型を生じる。従って、本発明は、ポリグルタミン路中に約３２個以上、約３５個以上、約４０個以上、約４５個以上、約５０個以上、約５５個以上、約６０個以上、約６５個以上、約７０個以上、約７５個以上、約８０個以上、約９５個以上、約１００個以上、約１２０個以上、約１５０個以上、約１７５個以上、約２００個以上またはさらに約２５０個以上のグルタミンを有し、神経変性表現型を呈するアタキシン−２ポリペプチドをコードするＳＣＡ２導入遺伝子を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物および細胞を提供する。例えば、ＳＣＡ２導入遺伝子を発現する動物または細胞は特に、神経変性疾患のモデルとして有用であり、本発明の方法において用いられて、本明細書に開示されるような神経変性疾患を処置するのに使用される治療因子を同定し得る。
【００２５】
一般に、およそ３０反復までのポリグルタミン路は、正常であり、これは、神経変性表現型を示さない。本発明は、約１個と約３０個の間のポリグルタミン（例えば、約５個〜約３０個、約１０個〜約２５個および詳細には約２２個のポリグルタミン）を有するアタキシン−２ポリペプチドをコードするＳＣＡ２を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供する（実施例ＩＩＩを参照のこと）。従って、アタキシン−２ポリペプチドが神経変性表現型を生じない限り、アタキシン−２ポリペプチドは、約１個、約５個、約１０個、約１５個、約２０個、約２２個、約２５個、約２８個または約３０個以上のポリグルタミンを含み得る。対応する導入遺伝子を発現する動物または細胞は、神経変性表現型を呈する動物または細胞に対するコントロールとして特に有用である。
【００２６】
詳細な実施形態において、本発明は、同型接合のＳＣＡ２変異非ヒト哺乳動物を提供し、これには、ＳＣＡ２導入遺伝子の２つの対立遺伝子が存在する。別の実施形態において、本発明はさらに、異型接合のＳＣＡ２変異非ヒト哺乳動物を提供し、これには、ＳＣＡ２導入遺伝子の１つの対立遺伝子のみが存在する。
【００２７】
本発明のＳＣＡ２変異非ヒト哺乳動物は、アタキシン−２ポリペプチドペプチドをコードするＳＣＡ２　ｃＤＮＡを発現するトランスジェニック動物を、種々の技術を用いて作製することにより産生され得る。このような技術の例は、アタキシン−２ポリペプチドをコードする核酸の正常バージョンまたは変異バージョンのマイクロインジェクション、レトロウイルス感染もしくは当業者に公知の他の手段により、受精胚中へ刺入して、トランスジェニック動物を産生する工程を含み（Ｈｏｇａｎら、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８６）、ならびに米国特許第５，６１６，４９１号および５，７５０，８２６）、以下により詳細に記載される。
【００２８】
ヒトポリＱ疾患のマウスモデルは、病因に重要な形態学的工程および生化学的工程を解明するのに非常に有益である。いくつかの未解明の疑問としては、ポリＱタンパク質の非細胞局在、凝集の必要性および病理における欠損体の重要性が挙げられる。本明細書に開示されるＳＣＡ２トランスジェニックマウス系統は、アタキシン−１系統と重要な特徴を共有し、その特徴として、導入遺伝子の発現を誘導するプロモーター、全長ｃＤＮＡの使用ならびに病理学的および機能的変化の時間経過および状態が挙げられる。これらの類似性に関わらず、それぞれのタンパク質の局在は、非常に異なる。従って、本発明のＳＣＡ２変異マウスは、ポリＱ疾患の発生の機構およびポリＱを処置する方法を解明するのに有用である。
【００２９】
ポリＱ疾患に関するいくつかの変異タンパク質は、核内封入体を形成し（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、前出、１９９８；Ｐａｕｌｓｏｎら、前出、１９９７；Ｔｒｏｔｔｉｅｒら、前出、１９９８；Ｈｏｌｍｂｅｒｇら、前出、１９９８；Ｉｇａｒａｓｈｉら、前出、１９９８；Ｄａｖｉｅｓら、前出、１９９７；Ｍａｒｔｉｎｄａｌｅら、前出、１９９８；Ｓａｕｄｏｕら、前出、１９９８；Ｓｃｈｅｒｚｉｎｇｅｒら、前出、１９９７；Ｓｔｅｎｏｉｅｎら、前出、１９９９；Ｐａｕｌｓｏｎ、前出、１９９９）、変異ポリＱタンパク質の核内凝集は、ポリＱ疾患の共通した病理機構であるという仮設が導かれた。これは、核局在化シグナル（例えば、アタキシン−１）を含む両方のタンパク質およびこれらのシグナルを欠くタンパク質（例えば、アタキシン−３であり、これは、細胞質タンパク質かつ核タンパク質である）に対し当てはめられるようである（Ｔｒｏｔｔｉｅｒら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．、５：３３５〜３４７（１９９８）；Ｐａｕｌｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９：３３３〜３４４（１９９７））。アタキシン−２は、後者の群に属しているようであり、このタンパク質は、既知の核局在化シグナルのいずれも含まず、正常およびＳＣＡ２ヒト脳において排他的細胞質局在を有する（Ｈｕｙｎｈら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、４５：２３２〜２４１（１９９９））。
【００３０】
ＨＤのＹＡＣトランスジェニックモデルからの証拠は、Ｎ末端欠損のハンチンチンのみが核内に移行することを示唆した（Ｈｏｄｇｓｏｎら、Ｎｅｕｒｏｎ、２３：１８１〜１９２（１９９９））。この事実に関わらず、行動性欠損と核のＮ末端ハンチンチン凝集の存在との相関がほとんどなかった。このことは、大部分の核の凝集体は、ハンチントン病神経変性の原因ではないようにであるが、疾患の進行にはおそらく重要であることを示唆した（Ｈｏｄｇｓｏｎら、前出、１９９９）。
【００３１】
本明細書に記載されるように、核内局在は、全てのクラスのポリＱ（特にＳＣＡ２）の病因に対してか、疾患の進行に対して必須でない。細胞質局在および微小な凝集またはアタキシン−２の集積がプルキンエ細胞の病因になるという知見により、ＳＣＡ２を、タンパク質凝集が細胞質で生じるより大きな群の神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびＳＣＡ６）に見出す（Ｍｅｚｅｙら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、３：４９３〜４９９（１９９８）；Ｌｉｐｐａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１５３：１３６５〜１３７０（１９９８）；Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、８：１１８５〜１１９３（１９９９））。それゆえ、ＳＣＡ２（５８）トランスジェニックマウスは、他の神経変性疾患に対する動物モデルとして有用であり、これは、神経変性疾患における、類似および相異を特徴づける研究を含み、この研究とは、以下に記載されるように細胞質凝集対核凝集の機構および処置の方法に関する。
【００３２】
本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、神経変性表現型を呈し、そして神経変性疾患の動物モデルとして有用である。本明細書で使用される、「神経変性疾患表現型」とは、神経変性疾患に関する機能的変化または形態学的変化をいう。神経変性疾患表現型に関する機能的変化は、神経変性に関する種々の行動変化のいずれかに関する。このような行動変化は、例えば、マウスモデルにおける、抱擁（ｃｌａｓｐｉｎｇ）、歩幅長、運動協調性およびバランスに関する（実施例ＩＩＩを参照のこと）。他の代表的な行動変化は、記憶を含み、これは、Ｍｏｒｒｉｓ水迷路または記憶を試験する他の方法を用いて、試験され得る。
【００３３】
神経変性表現型に関する形態学的変化は、種々の構造的変化、解剖学的変化または組織変化のいすれかを含む。このような形態学的変化は、特定の細胞型におけるタンパク質発現の変化を含み得、特定の細胞の数もしくは大きさまたは特定の細胞構造における変化を含み得る。例えば、本明細書で開示されるように、ＳＣＡ２発現に関する神経変性表現型は、カルバインディン（ｃａｌｂｉｎｄｉｎ）−２８Ｋ発現の変化を含み、これは、特に小脳プルキンエ細胞の細胞質および樹状突起に発現される（実施例ＩＶを参照）。他の形態学的変化は、樹状突起アーバー（ａｒｂｏｕｒ）の欠損、プルキンエ細胞数の減少、および封入体の形成を含む。他の例示的形態学的変化は、神経伝達物質もしくは酵素の濃度における変化、またはカルシウム恒常性調節タンパク質、タンパク質フォールディング、もしくはユビキチン化のような神経変性疾患に関するタンパク質の発現における変化（特にニューロン細胞において発現されるタンパク質の変化）を含む。
【００３４】
アタキシン−２（ａｔａｘｉｎ−２）ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを、当業者に周知の任意の標準的な方法によって、トランスジェニック動物のゲノム中に組み込み得る。当該分野で公知の種々の任意の技術を使用して、動物に導入遺伝子を導入し、トランスジェニック動物の創始系統（ｆｏｕｎｄｅｒ　ｌｉｎｅ）を作製し得る（例えば、Ｈｏｇａｎら，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８６）；Ｈｏｇａｎら，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９４），米国特許第５，６０２，２９９号；同第５，１７５，３８４号；同第６，０６６，７７８号；および同第６，０３７，５２１号を参照のこと）。このような技術としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない；前核微量注入（米国特許第４，８７３，１９１号）；生殖細胞系列へのレトロウイルス媒介性遺伝子移入（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｕｔｔｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：６１４８−６１５２（１９８５））；胚性幹細胞における遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｃｅｌｌ　５６：３１３−３２１（１９８９））；胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ，Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：１８０３−１８１４（１９８３））；および精子媒介性遺伝子移入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら，Ｃｅｌｌ　５７：７１７−７２３（１９８９））。
【００３５】
例えば、種々の発達段階にある胚性細胞が、トランスジェニック動物の作製のために導入遺伝子を導入するために使用され得る。胚性細胞の発達段階に依存して、異なる方法が使用される。接合体は、微量注入のために良好な標的であり、そして接合体に微量注入する方法は周知である（米国特許第４，８７３，１９１号を参照のこと）。マウスでは、雄性前核は、直径約２０マイクロメートルのサイズに達する。このサイズは、１〜２ピコリットル（ｐｌ）のＤＮＡ溶液の再現可能な注入を可能にする。遺伝子移入のための標的として接合体を使用することは、多くの場合において、注入されるＤＮＡが最初の分割の前に宿主ゲノム中に組み込まれるという点で、大きな利点を有する（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：４４３８−４４４２（１９８５））。結果として、トランスジェニック非ヒト動物のすべての細胞が、組み込まれた導入遺伝子を保有する。このことはまた、一般的に、創始動物の子孫へのこの導入遺伝子の効率的な伝達に反映される。なぜなら、５０％の生殖細胞が、この導入遺伝子を保有するからである。ＳＣＡ２核酸フラグメントの微量注入物を、前核中に微量注入して、ＳＣＡ２トランスジェニックマウスを作製した（実施例ＩＩを参照のこと）。
【００３６】
本発明のトランスジェニック動物はまた、胚性幹（ＥＳ）細胞中に標的化ベクターを導入することによって作製され得る。ＥＳ細胞は、適切な条件下において、インビトロで移植前の胚を培養することによって得られる（Ｅｖａｎｓら，Ｎａｔｕｒｅ　２９２：１５４−１５６（１９８１）；Ｂｒａｄｌｅｙら，Ｎａｔｕｒｅ　３０９：２５５−２５８（１９８４）；Ｇｏｓｓｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：９０６５−９０６９（１９８６）；およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎら，Ｎａｔｕｒｅ　３２２：４４５−４４８（１９８６））。導入遺伝子は、当該分野で公知の種々の方法（エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈、プロトプラストまたはスフェロプラストの融合、リポフェクションおよびＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクションを含む）を使用するＤＮＡトランスフェクションによって、ＥＳ細胞中に効率的に導入され得る。導入遺伝子はまた、レトロウイルス媒介性形質導入によってかまたは微量注入によって、ＥＳ細胞中に導入され得る。このようにしてトランスフェクトされたＥＳ細胞は、その後、それが胚盤胞段階の胚の胞胚腔内に導入された後に胚に入り込み（ｃｏｌｏｎｉｚｅ）得、そして生じるキメラ動物の生殖細胞系列に寄与し得る（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１４６８−１４７４（１９８８）において概説される）。導入遺伝子が、選択されるための手段を提供する場合には、トランスフェクトされたＥＳ細胞を胞胚腔内に導入する前に、トランスフェクトされたＥＳ細胞を種々の選択プロトコールに供して、導入遺伝子を組み込んだＥＳ細胞を富化し得る。あるいは、ＰＣＲを使用して、導入遺伝子を組み込んだＥＳ細胞をスクリーニングし得る。この技術は、胞胚腔内への移入前に、トランスフェクトされたＥＳ細胞を適切な選択条件下で増殖させる必要を排除する。
【００３７】
さらに、レトロウイルス感染もまた、非ヒト動物中に導入遺伝子を導入するために使用され得る。発達中の非ヒト胚を、胚盤胞段階までインビトロで培養し得る。この時間の間に、割球をレトロウイルス感染の標的にし得る（Ｊａｎｅｎｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７３：１２６０−１２６４（１９７６））。割球の効率的な感染は、透明帯を取り除くための酵素的処理によって達成される（Ｈｏｇａｎら，前出，１９８６）。導入遺伝子を導入するために使用されるウイルスベクター系は、代表的に、導入遺伝子を保有する複製欠損性レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：６９２７−６９３１（１９８５）；Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｕｔｔｅｎら．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：６１４８−６１５２（１９８５））。トランスフェクションは、ウイルスを産生する細胞の単層上において割球を培養することによって、簡単かつ効率的に達成される（Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｐｕｔｔｅｎ，前出，１９８５；Ｓｔｅｗａｒｔら，ＥＭＢＯ　Ｊ．６：３８３−３８８（１９８７））。あるいは、より後期の段階で、感染が実施され得る。ウイルスまたはウイルスを産生する細胞が、胞胚腔内に注入され得る（Ｊａｈｎｅｒ　Ｄ．ら，Ｎａｔｕｒｅ　２９８：６２３−６２８（１９８２））。この大半の創始動物は、導入遺伝子についてモザイクである。なぜなら、組み込みが、トランスジェニック動物を形成する細胞の一部分においてのみ生じるからである。さらに、この創始動物は、ゲノム中の異なる位置でレトロウイルスによる種々の導入遺伝子挿入を含み得、これは一般的に、その子孫において分離する。さらに、妊娠中期（ｍｉｄｇｅｓｔａｔｉｏｎ）の胚の子宮内レトロウイルス感染によって、生殖細胞系列中に導入遺伝子を導入することもまた可能である（Ｊａｈｎｅｒら，前出，１９８２）。当該分野で公知のトランスジェニック動物を作製するためにレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用するさらなる手段としては、受精卵または初期胚の卵黄周囲腔にレトロウイルス粒子またはレトロウイルスを産生するマイトマイシンＣ処理細胞を微量注入することが挙げられる（ＷＯ　９０／０８８３２（１９９０）；ＨａｓｋｅｌｌおよびＢｏｗｅｎ　Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．４０：３８６（１９９５））。
【００３８】
アタキシン−２ポリペプチドをコードするＳＣＡ２　ｃＤＮＡを含むＤＮＡフラグメントを、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）における単一細胞の胚の前核に微量注入し得る（実施例ＩＩを参照のこと）。注入された胚を、偽妊娠の雌（ｐｓｅｕｄｏｐｒｅｇｎａｎｔ　ｆｅｍａｌｅ）の卵管／子宮に移植し、そして最終的にトランスジェニック動物を得る。
【００３９】
一旦、創始動物が作製されると、この創始動物を交配、同系交配、異系交配または交雑して、特定の動物の個体群を生じさせ得る。このような育種ストラテジーの例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：分離系統（ｓｅｐａｒａｔｅ　ｌｉｎｅ）を確立するための、１より多い組み込み部位を有する創始動物の異系交配；各導入遺伝子の相加的な発現効果によってより高いレベルで導入遺伝子を発現する倍加トランスジェニック（ｃｏｍｐｏｕｎｄ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ）を作製するための、分離系統の同系交配；発現を増強するため、およびＤＮＡ分析によって動物をスクリーニングする必要を排除するための両方のために、所定の組み込み部位についてホモ接合性のマウスを作製するためのヘテロ接合性トランスジェニックマウスの交雑；倍加ヘテロ接合性系統または倍加ホモ接合性系統を作製するための、ホモ接合性分離系統の交雑；導入遺伝子の発現に対する対立遺伝子改変効果および発現の神経病理学的効果を試験するために、異なる近交系の遺伝的背景に対して動物を交雑すること。
【００４０】
本発明は、すべての細胞において導入遺伝子を保有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物、ならびにすべてではないがいくつかの細胞において導入遺伝子を保有する動物（すなわち、モザイク動物）を提供する。この導入遺伝子は、単一の導入遺伝子としてかまたはコンカテマー（例えば、頭−頭型タンデムまたは頭−尾型タンデム）状態で、組み込まれ得る。
【００４１】
このトランスジェニック動物は、神経変性表現型を有する動物（これは、神経変性疾患に関する動物モデルである）を選択するためにスクリーニングされそして評価される。最初のスクリーニングは、例えば、サザンブロット分析またはＰＣＲ技術を使用して行われ得、その導入遺伝子の組み込みが生じたことを確認するために動物組織が分析される。そのトランスジェニック動物の組織におけるその導入遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルもまた、その動物から得た組織サンプルのノーザンブロット分析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、および逆転写酵素−ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）を含むがこれらに限定されない、技術を使用して評価され得る。脳のサンプルまたは他の適切な組織のサンプルが、アタキシン−２ポリペプチドに特異的な抗体を使用してかまたはタグ（例えば、ＧＦＰ）を使用して、免疫細胞学的に評価され得る（実施例ＩＶを参照のこと）。このトランスジェニック非ヒト哺乳動物は、本発明の方法において有用な神経変性表現型を有する動物を同定するために、さらに特徴付けられ得る。具体的には、ポリグルタミン領域（ｔｒａｃｔ）中に可変数のグルタミンを有するアタキシン−２ポリペプチドを発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物が、本明細書中に開示される方法を使用して神経変性表現型についてスクリーニングされ得る。
【００４２】
本発明はまた、破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する変異体動物（すなわち、ノックアウト動物）を提供する。破壊されたＳＣＡ２遺伝子を有する変異体動物を生成するための方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓｈａｓｔｒｙ、Ｅｘｐｅｒｅｎｔｉａ　５１：１０２８〜１０３９（１９９５）；Ｓｈａｓｔｒｙ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８１：１６３〜１７９（１９９８）；および米国特許第５，６１６，４９１号（１９９７年４月１日発行）、同第５，７５０，８２６号（１９９８年５月１２日発行）、および同第５，９８１，８３０号（１９９９年１１月９日発行）に記載される。例えば、変異体動物は、遺伝子中に適切な挿入を有するＤＮＡ構築物を胚性幹細胞中に導入して、その胚性幹細胞中の導入された遺伝子の相同組換えがその遺伝子の破壊を生じるようにすることによって、生成され得る。ノックアウト動物は、所望される場合は、本明細書中に開示されるように、異種ＳＣＡ２導入遺伝子を発現するようにさらに改変され得る。
【００４３】
本発明は、本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離された細胞を、さらに提供する。例えば、本発明は、本発明のＳＣＡ２トランスジェニックマウスに由来する、単離されたマウス細胞を提供する。本発明のトランスジェニック非ヒト哺乳動物に由来する細胞は、例えば、以下により詳細に記載されるように、神経変性疾患を処置するための治療剤を同定する方法において、使用され得る。
【００４４】
本発明は、ポリグルタミン領域を有するアタキシン−２ポリペプチド（好ましくは、哺乳動物アタキシン−２、そして特にヒトアタキシン−２）をコードする、核酸を含むＤＮＡ構築物をさらに提供する。用語「核酸」は、ポリヌクレオチドとも呼ばれ、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、プローブ、オリゴヌクレオチド、およびプライマーを包含し、そしてこれは、一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよい。ＤＮＡは、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）またはゲノムＤＮＡのいずれかであり得、そして、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方を示し得る。核酸の例は、アタキシン−２ポリペプチドをコードする、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、または単離されたゲノムＤＮＡである。トランスジェニック動物において発現される場合、そのＤＮＡ構築物は、導入遺伝子を含む。
【００４５】
そのＤＮＡ構築物は、そのポリグルタミン領域をコードする、ポリＣＡＧまたはポリＣＡＡを含む。このＤＮＡ構築物は、配列番号１として参照されるヒトＳＣＡ２　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７０３２３）を含み得、このヌクレオチド配列は、ポリグルタミン領域中に１個と約２５０個と間の個数のグルタミンを有する上記に参照されるアタキシン−２ポリペプチドを生成するようにポリグルタミン領域を与えるような、グルタミンの付加または欠失を有する。このｃＤＮＡ構築物はまた、配列番号１１として参照されるマウスＳＣＡ２　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７０６７０）または他の哺乳動物種由来のＳＣＡ２　ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を含み得、そのいずれもが、ポリグルタミン領域において１個と２５０個との間の個数のグルタミンを含むように同様に改変され得る。従って、そのポリグルタミン領域は、天然に存在する数のグルタミンを含み得るし、またはポリグルタミン領域において１〜約２５０個以上のグルタミンを含むように改変され得る。アタキシン−２ポリペプチドをコードする核酸は、参照ＳＣＡ２核酸配列と同じであり得るし、あるいはコードされるアタキシン−２ポリペプチドがアタキシン−２ポリペプチドの構造的特徴および／または機能的特徴を示す限りは、実質的に同じであり得る。例示的な構造的特徴としては、配列同一性または実質的類似性、抗体反応性、および保存的構造ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合ドメインまたは酸性ドメイン）の存在が、挙げられる。アタキシン−２ポリペプチドの例示的な機能的特徴としては、ＲＮＡ結合、分子の輸送、および／またはそのポリグルタミン領域のサイズに基づく可能な神経変性表現型を示すことが挙げられ、すなわち、比較的少ない数のポリグルタミンを有するアタキシン−２は、正常な表現型を有し、そして比較的大きな数のポリグルタミン（例えば、３２個以上のポリグルタミン）を有するアタキシン−２は、神経変性表現型を有する。コードされるポリペプチドの機能的特徴を参照アタキシン−２ポリペプチドと比較することによって、核酸配列が参照配列と実質的に同じであるか否かを、当業者は容易に決定し得る。
【００４６】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に同じヌクレオチド配列」とは、参照ポリヌクレオチドに対して十分な同一性を有し、その結果中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下またはより高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、その参照ヌクレオチドにハイブリダイズする、ＤＮＡをいう。参照ヌクレオチド配列と「実質的に同じヌクレオチド配列」を有するＤＮＡは、その参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％同一性か、少なくとも７０％同一性か、少なくとも８０％同一性か、少なくとも９０％同一性か、または少なくとも９５％同一性を有し得る。
【００４７】
ＳＣＡ２核酸はまた、ＳＣＡ２　ｃＤＮＡの改変を含み得る。本明細書中で使用される場合、核酸の「改変」はまた、参照配列に対する、１つまたはいくつかのヌクレオチドの付加、欠失、または置換を含み得る。核酸の改変は、遺伝暗号の縮重に起因して、コードされるアミノ酸配列を変化させない置換を含み得る。このような改変は、意図的に作製される変化、または核酸複製の間の変異として生じる変化に、対応し得る。
【００４８】
このＳＣＡ２配列の例示的改変としては、哺乳動物種（例えば、マウス、霊長類（サルおよびヒヒを含む）、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ、または他の動物種を含む）を含む他の種のホモログに対応する配列が、挙げられる。非ヒト種の対応するＳＣＡ２配列は、当該分野で公知の方法によって、例えば、ＰＣＲによってか、またはゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリーもしくは発現ライブラリーのスクリーニングによって、決定され得る。
【００４９】
句「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」とは、標的核酸が相補性核酸に結合することを可能にする条件をいう。このハイブリダイズした核酸は、一般的には、少なくとも約６０％同一性か、少なくとも約７５％同一性か、さらに少なくとも約８５％同一性か、少なくとも約９０％同一性か、または少なくとも約９５％同一性を有する。中程度にストリンジェントな条件は、４２℃における５０％ホルムアミド、５×デンハート溶液、５×　ＳＳＰＥ、０．２％　ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、およびその後の４２℃における０．２×　ＳＳＰＥ、０．２％　ＳＤＳ中での洗浄と等価な条件である。
【００５０】
高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションとは、０．０１８Ｍ　ＮａＣｌ中６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件をいい、例えば、ハイブリッドが０．０１８Ｍ　ＮａＣｌ中６５℃で安定ではない場合には、本明細書中で考慮される場合、高ストリンジェンシーな条件下で安定ではない。高ストリンジェンシーな条件は、例えば、５０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％　ＳＤＳ中４２℃でのハイブリダイゼーション、引き続いて０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％　ＳＤＳ中６５℃での洗浄によって提供され得る。
【００５１】
低ストリンジェンシーなハイブリダイゼーションとは、１０％ホルムアミド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％　ＳＤＳ中２２℃でのハイブリダイゼーション、引き続いて１×ＳＳＰＥ、０．２％　ＳＤＳ中３７℃での洗浄と等価な条件をいう。Ｄｅｎｈａｒｔ溶液は、１％フィコール、１％ポリビニルピロリドン、および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。２０×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））は、３Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウム、および０．０２５Ｍ（ＥＤＴＡ）を含む。他の適切な中程度のストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの緩衝液および条件は、当業者に周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（補遺４７），Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９９）に記載されている。
【００５２】
本発明は、アタキシン（ａｔａｘｉｎ）−２ポリペプチドをコードする核酸を含む、ＤＮＡ構築物を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「ＤＮＡ構築物」とは、ＤＮＡ分子における遺伝エレメントの特定の配置をいう。ヒトＳＣＡ２、またはポリグルタミン路において可変数のグルタミンをコードするその変異形態に加えて、本発明はまた、他の種由来のＳＣＡ２、および非ヒト種からＳＣＡ２を発現するＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物を提供する。例えば、本発明は、プルキンエ細胞特異的発現エレメントに作動可能に結合したアタキシン−２ポリペプチドをコードする核酸を含むＤＮＡ構築物を提供する。本発明は、さらに、ＳＣＡ２−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）構築物を提供する（実施例Ｉを参照のこと）。
【００５３】
本発明のＤＮＡ構築物は、本発明のＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物を生じるために、適切な細胞に伝播またはトランスフェクションするために、ベクターに組み込まれ得る。当業者は、所望の特性に基づいて、ベクターを選択し得る（例えば、特定の細胞（例えば、哺乳動物細胞または細菌細胞）におけるベクターの産生のため）。所望であれば、ＤＮＡ構築物は、適切な発現エレメント（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）に作動可能に結合して、適切な細胞または組織においてＤＮＡ構築物中の遺伝エレメントの発現を可能にするよう操作され得る（例えば、プルキンエ細胞特異的プロモーター）（実施例ＩＩを参照のこと）。
【００５４】
本発明はまた、ポリグルタミン路を有するアタキシン−２ポリペプチドをコードするＳＣＡ２を含むベクターを提供する。適切な発現ベクターは、当該分野において周知であり、そして調節配列または核酸の発現を調節し得るエレメント（例えば、プロモーター領域もしくはエンハンサー領域）に作動可能に結合した核酸を発現し得るベクターが挙げられる。適切な発現ベクターとしては、真核生物細胞および／または原核生物細胞において複製可能なベクター、ならびにエピソームを維持するベクターあるいは宿主細胞ゲノムに組み込まれるベクターが挙げられる。
【００５５】
調節エレメント（プロモーターまたはエンハンサーを含む）は、調節の性質に依存して構成的または調節的であり得、そして種々の組織において、または１つもしくは少数の特異的組織において、発現され得る。調節配列または調節エレメントは、本発明の核酸に作動可能に結合しており、その結果、その核酸と調節配列との間の物理的関係および機能的関係は、その核酸の転写を可能にする。真核生物細胞における発現のために有用なベクターとしては、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、マウス乳腺癌ウイルス（ＭＭＴＶ）ステロイド誘導プロモーター、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）プロモーターなどを含む調節エレメントが挙げられ得る。
【００５６】
ベクターは、作動可能に結合した核酸の組織特異的発現または誘導的発現を提供する、調節エレメントを含み得る。当業者は、アタキシン−２ポリペプチドまたは核酸の、所望の組織における発現を可能にする、適切な組織特異的プロモーターまたはエンハンサーを容易に決定し得る。例えば、ＳＣＡ２は、本明細書中に開示されるように、プルキンエ細胞特異的調節エレメントに作動可能に結合され得る（実施例ＩＩを参照のこと）。プルキンエ細胞特異的調節エレメントを有するようなベクターは、主としてプルキンエ細胞におけるＳＣＡ２の発現を可能にする。
【００５７】
種々の誘導プロモーターまたはエンハンサーのいずれかはまた、アタキシン−２ポリペプチドまたは核酸の調節可能な発現のためのベクターに含まれ得る。このような誘導系としては、例えば、以下が挙げられる：テトラサイクリン誘導系（ＧｏｓｓｅｎおよびＢｉｚａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１（１９９２）；Ｇｏｓｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９（１９９５）；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）；重金属によって誘導されるメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ）プロモーター；エクジソンまたはムリステロン（ｍｕｒｉｓｔｅｒｏｎｅ）のような関連するステロイドに反応性の昆虫ステロイドホルモン（Ｎｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：３３４６−３３５１（１９９６）；Ｙａｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３６６：４７６−４７９（１９９３）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；糖質コルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｏｃｏｉｄ）およびエストロゲンのようなステロイドによって誘導されるマウス乳腺（ｍａｍｍｏｒｙ）癌ウイルス（ＭＭＴＶ）（Ｌｅｅら、Ｎａｔｕｒｅ，２９４：２２８−２３２（１９８１））；ならびに温度変化によって誘導可能な熱ショックプロモーター。
【００５８】
所望であれば、ベクターは、選択マーカーを含み得る。本明細書中で使用される場合、「選択マーカー」とは、選択マーカーが導入された細胞に選択可能な表現型を提供する、遺伝エレメントをいう。選択マーカーは、一般に、遺伝子産物が細胞の増殖を阻害するかまたは細胞を殺傷する薬剤に対する耐性を与える、遺伝子である。種々の選択マーカーが、本発明のＤＮＡ構築物において使用され得、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（補遺４７）、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９９））および米国特許第５，９８１，８３０号に記載されるような、例えば、Ｎｅｏ遺伝子、Ｈｙｇ遺伝子、ｈｉｓＤ遺伝子、Ｇｐｔ遺伝子およびＢｌｅ遺伝子が挙げられる。選択マーカーの存在を選択するために有用な薬物としては、例えば、Ｎｅｏに対してはＧ４１８、Ｈｙｇに対してはハイグロマイシン、ｈｉｓＤに対してはヒスチジノール、Ｇｐｔに対してはキサンチン、そしてＢｌｅに対してはブレオマイシンが挙げられる（Ａｕｓｕｂｅｌら、前出（１９９９）；米国特許第５，９８１，８３０号を参照のこと）。本発明のＤＮＡ構築物は、陽性選択マーカー、陰性選択マーカー、または両方を組み込み得る（例えば、米国特許第５，９８１，８３０号を参照のこと）。
【００５９】
ＤＮＡ構築物を使用して、相同組換えによって動物における内因性遺伝子の発現を妨害する場合には、このＤＮＡ構築物における相同領域とのその内因性遺伝子の組換えがこの内因性遺伝子の破壊を導く限り、任意のゲノム配列から相同配列が選択され得る。特に、この相同配列は、エキソンを含み得る。ＤＮＡ構築物は、細胞に挿入され、そしてネイティブＤＮＡ配列の転写を防止または妨害するような位置で、この細胞のゲノムＤＮＡに組み込む。動物における内因性遺伝子の発現を破壊するために使用される場合、ＤＮＡ構築物は一般に、相同領域において挿入を含む。
【００６０】
本発明は、さらに、本発明のＤＡＮ構築物を含む細胞を提供する。例えば、この細胞は、胚性幹細胞であり得る。本明細書中で使用される場合、「胚性幹細胞」とは、導入遺伝子の導入が所望されるものと同種生物の胚由来の多能性幹細胞である。特に、本発明は、アタキシン−２ポリペプチドをコードする核酸を含むＤＮＡ構築物を含む、胚性幹細胞を提供する。胚性幹細胞を使用してＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物を作製する方法は、本明細書中に開示されるように、当業者に周知である。変異体マウスを作製するためには、胚性幹細胞は、マウスから得られ得る。あるいは、適切な胚性幹細胞を使用して、本発明のＤＮＡ構築物を導入し得る。
【００６１】
本発明は、さらに、本発明のＤＮＡ構築物を含む単離された細胞を提供する（実施例Ｉを参照のこと）。ＤＮＡ構築物は、周知のトランスフェクション方法のいずれかによって、細胞に導入され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）；Ａｕｓｕｂｅｌら、前出（１９９９））。あるいは、細胞は、本発明の変異体非ヒト哺乳動物から細胞を単離し、そして初代培養物を樹立することによって、得られ得る。従って、本発明は、本発明のＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物（特に、ＳＣＡ２変異体マウス）から単離された細胞を提供する。この細胞は、ホモ接合のＳＣＡ２変異体マウスまたはヘテロ接合のＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物（例えば、マウス）から得られる。
【００６２】
本発明のＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物は、神経変性疾患（特に、ＳＣＡと共通の病原機構（すなわち、封入体の形成）を有する神経変性疾患）に関するモデルとして、特に有用である。例示的な神経変性疾患としては、脊髄小脳性運動失調１型（ＳＣＡ１）、ＳＣＡ２、ＳＣＡ３、ＳＣＡ４、ＳＣＡ５、ＳＣＡ６、ＳＣＡ７、ハンチントン病、球脊髄性筋萎縮症（ｓｐｉｎａｌ　ｂｕｌｂａｒ　ｍｕｓｃｕｌａｒ　ａｔｒｏｐｈｙ）、マチャド−ジョセフ病、および歯状球赤球淡蒼球ルイ体萎縮症が挙げられる。本発明のＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物はまた、パーキンソン病、アルツハイマー病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（これらは、タンパク質のミスフォールディング、タンパク質凝集物の形成、または封入体の形成の、類似の病原機構を共有する）についてのモデルとしても有用である。種々の神経変性疾患のモデルとして、本発明のＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物は、神経変性疾患の処置のための治療剤を同定するために有用である。
【００６３】
本発明のＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物は、神経変性疾患を処置するために使用され得る治療剤をスクリーニングするために、有利に使用され得る。従って、本発明は、神経変性疾患の処置において使用するための治療剤を同定する方法を提供し、この方法は、ＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物に化合物を投与すること、およびこの変異体非ヒト哺乳動物を、トランスジェニック非ヒト哺乳動物の神経変性表現型に関連する改善された神経学的応答についてスクリーニングし、これによってその神経変性疾患の処置において使用するための治療剤を同定することによる。
【００６４】
本明細書中で使用される場合、「改善された神経学的応答」とは、さほど重篤でない神経変性表現型を生じると予測される、神経変性表現型における任意の変化をいう。このような変化としては、神経変性表現型に関連する改善された機能的変化および形態学的変化が挙げられる。改善された機能的変化としては、コントロールと類似した行動（例えば、抱擁、歩幅、運動の協調および調和、記憶など）が挙げられる。改善された形態学的変化としては、コントロールとより類似したポリペプチド発現、または神経変性表現型を示すトランスジェニック動物に関対して数が多いプルキンエ細胞、またはそのトランスジェニック動物に対する封入体の減少が挙げられる。
【００６５】
所望であれば、スクリーニングされた化合物の治療効果を確証するために、適切なコントロール動物が使用される。例えば、コントロール動物は、ＳＣＡ２を発現しないかまたはＳＣＡ２導入遺伝子を発現しない、動物であり得る。あるいは、コントロール動物は、神経変性表現型を生じない形態のアタキシン−２ポリペプチド（例えば、ポリグルタミン路において、神経変性表現型を生じるに十分な最少数より少ないグルタミンを有する形態のアタキシン−２ポリペプチド）を発現し得る。例えば、ＳＣＡ２（２２）は、ＳＣＡ（５８）のコントロールとして機能し得る（実施例ＩＩＩ）を参照のこと。
【００６６】
潜在的な治療剤として有用な化合物は、当業者に周知の方法によって作製され得、例えば、複数の化合物（化学的分子または生物学的分子（例えば、単純または複雑な有機分子、金属含有化合物、糖質、ペプチド、タンパク質、ペプチド模倣物、糖タンパク質、リポタンパク質、核酸、抗体など）を含む）を生成するための周知の方法が、当該分野において周知であり、そして例えば、Ｈｕｓｅ，米国特許第５，２６４，５６３号；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２：４２２−４２８（１９９８）；Ｔｉｅｔｚｅら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２：３６３−３７１（１９９８）；Ｓｏｆｉａ，Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．３：７５−９４（１９９８）；Ｅｉｃｈｌｅｒら、Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１５：４８１−１９６（１９９５）などに記載されている。多数の天然化合物および合成化合物を含むライブラリーもまた、商業的供給源から得られ得る。分子のコンビナトリアルライブラリーは、周知のコンビナトリアルケミストリー方法を使用して調製され得る（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−１２３１（１９９４）；Ｇｏｒｄｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５−１４０１（１９９４）；Ｇｏｒｄｏｎら、Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２９：１４４−１５４（１９９６）；ＷｉｌｓｏｎおよびＣｚａｒｎｉｋ編、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９７））。
【００６７】
本発明の方法によって治療剤として同定された化合物は、例えば、神経変性疾患に関連する兆候または症状を軽減するために、個体に投与され得る。当業者は、神経変性疾患に関連する兆候または症状の軽減を知っているか、または容易に決定し得る。神経変性疾患のこのような症状としては、衰弱、痙性、運動障害、記憶喪失、痴呆などが挙げられる。
【００６８】
治療剤としての使用のために、この化合物を、薬学的組成物を生成するために薬学的に受容可能なキャリアとともに処方し得、これを、個体（ヒトまたは他の動物であり得る）に投与し得る。薬学的に受容可能なキャリアは、例えば、水、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水、正常生理食塩水もしくはリンガー溶液、または他の生理学的緩衝化生理食塩水、または他の溶媒またはビヒクル（例えば、グリコール、グリセロール）、オイル（例えば、オリーブオイル）、あるいは注入可能な有機エステルであり得る。薬学的に受容可能なキャリアはまた、例えば、調節性化合物の吸収を安定化または増加させるように作用する、生理学的に受容可能な化合物も含み得る。当業者には、薬学的に受容可能なキャリア（生理学的に受容可能な化合物を含む）の選択は、例えば、化合物の投与経路に依存することは、公知である。
【００６９】
本発明の方法は、ホモ接合性またはヘテロ接合性のＳＣＡ２変異非ヒト哺乳動物から単離された細胞（例えば、神経細胞、線維芽細胞、筋肉細胞）、または所望の目的のために本発明のＳＣＡ２変異非ヒトから単離した任意の適切な細胞を有利に使用し得る。本発明の方法は、トランスフェクトされた細胞株のようなアタキシン−２ポリペプチドをコードするＳＣＡ２を発現する細胞を使用し得る（実施例Ｉを参照のこと）。
【００７０】
アタキシン−２ポリペプチドをコードするＳＣＡ２を発現する細胞を、インビトロ方法において使用し、神経変性疾患を処置するための強力な治療剤として化合物をスクリーニングし得る。このような方法において、化合物をＳＣＡ２を発現する細胞（トランスフェクトされた細胞またはＳＣＡ２変異非ヒト哺乳動物から誘導された細胞のいずれか）と接触させ、そしてＳＣＡ２の発現に関係する表現型の変更についてスクリーニングする。例えば、封入体を形成するＳＣＡ２変異体（例えば、ＳＣＡ２（５８））を発現する細胞を使用して、封入体の形成を阻害または防止する化合物についてスクリーニングし得る。
【００７１】
アタキシン−２融合ポリペプチド（例えば、アタキシン−２−ＧＦＰ）は、このようなスクリーニング方法のために特に有用であり得る。なぜならば、この凝集は、蛍光強度によってモニタリングされ得るからである。他の例示的な融合ポリペプチドは、他の蛍光タンパク質、またはそれらの改変体、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、ポリＨｉｓなど、または任意の型のエピトープタグを含む。このような融合ポリペプチドは、例えば、融合ポリペプチドに特異的な抗体を使用して検出され得る。この機能的タンパク質が所望の特性（例えば、蛍光活性の抗体結合活性）を保持する限り、この融合ポリペプチドは、ポリペプチド全体またはその機能的な部分であり得る。あるいは、アタキシン−２ポリペプチドに特異的な抗体を使用して、本明細書中に開示されるように、封入体の形成のような神経変性の表現型をモニタリングし得る（実施例ＩＶを参照のこと）。
【００７２】
本発明は、神経変性疾患を処置するのに使用するための強力な治療剤を同定する方法をさらに提供する。この方法は、アタキシン−２ポリペプチドをコードする核酸を含むＤＮＡ構築物を含む細胞と化合物とを接触させる工程、および改善された神経変性の表現型についてこの細胞をスクリーニングし、これにより、神経変性疾患を処置するのに使用するための強力な治療剤を同定する工程を包含する。この細胞を、ＳＣＡ２　ＤＮＡ構築物を含む有核細胞を有する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物から単離し得る。あるいは、この細胞は、アタキシン−２ポリペプチドと共に緑色蛍光タンパク質融合物または他の融合ポリペプチドをコードする核酸を含む、ＤＮＡ構築物を含み得る。
【００７３】
アタキシン−２ポリペプチドを発現する細胞を予備的にスクリーニングに使用して、ＳＣＡ２の発現に関連する表現型を変える活性を有する強力な治療剤として化合物（例えば、封入体の形態を阻害する化合物）を同定し得る。ＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物を使用するインビトロスクリーニングを用いる場合、適切なコントロール細胞（例えば、ＳＣＡ２導入遺伝子を発現しないコントロール細胞、または神経変性の表現型（例えば、ＳＣＡ２（２２））を示さないＳＣＡ２の形態を発現するコントロール細胞）を使用して、スクリーニングの結果と比較し得る。ＳＣＡ２を発現する細胞を使用するインビトロスクリーニングにおいて、最初に同定された化合物の有効性を、所望の場合、本発明のＳＣＡ２変異体非ヒト哺乳動物を使用して、インビボにおいてさらに試験し得る。従って、本発明は、細胞ベースのアッセイ（例えば、ハイスループットスクリーニング）を使用して、多数の化合物をスクリーニングする方法、および神経変性疾患の動物モデルにおいて治療剤として化合物をさらに試験する方法を提供する。
【００７４】
本発明の種々の実施形態の活性に実質的に影響を与えない改変はまた、本明細書中で提供される本発明の定義内で提供されることが理解される。従って、以下の実施例は、本発明を例示するが、限定することを意図しない。
【００７５】
（実施例Ｉ）
（ＳＣＡ２における封入体の局在）
本実施例は、ＳＣＡ２患者における封入体の局在およびＳＣＡ２のインビトロモデルの特徴を記載する。
【００７６】
アタキシン−２は、ＳＣＡ２患者由来の３つの脳に、細胞質局在を有すると以前に報告された（Ｈｕｙｎｈら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，４５：２３２−２４１（１９９９））。しかし、以前の研究において使用されるアタキシン−２抗体によって認識されるエピトープを含まない、より小さなポリＱ含有フラグメントに、アタキシン−２を処理することが可能であった。これを扱うために、１Ｃ２モノクローナル抗体（この抗体は、拡大されたポリＱの反復を認識する）を使用して、アタキシン−２の局在を決定した。
【００７７】
アタキシン−２フラグメントの存在を、ＳＣＡ２患者、神経学的に正常な個体およびアルツハイマー患者由来の、脳タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析によって分析した。簡単には、これらの患者におけるアタキシン−２発現を試験するために、ヒト脳皮質（ｃｏｒｔｉｃａｌ　ｂｒａｉｎ）抽出物のウエスタンブロット分析を、アタキシン−２ペプチド（ＳＣＡ２ＡおよびＳＣＡ２Ｂ）（図１を参照のこと）、１Ｃ２（ポリＱドメインに対する）およびβアクチンに対する抗体を用いて実施した。ＳＣＡ２患者、正常な個体およびアルツハイマー患者由来のタンパク質抽出物（１００μｇ／レーン）を、分析した。両方のアタキシン−２抗体により、３つ全ての抽出物中の全長アタキシン−２（１４５ｋＤ）およびＳＣＡ２抽出物中の全長アタキシン−２（Ｑ４１）（１８０ｋＤ）を検出した。このＳＣＡ２Ａ抗体によりまた、１Ｃ２抗体によって認識された４２ｋＤフラグメントを検出した。ＳＣＡ２Ｂ抗体により、全てのサンプル中のさらなる７０ｋＤタンパク質を検出した。
【００７８】
ウエスタンブロットを、ＳＣＡ２Ａ抗体およびＳＣＡ２Ｂ抗体を用いて染色し、そして同定された抽出物を１Ｃ２モノクローナル抗体を用いて染色することによって観測されたパターンと比較した。このＳＣＡ２Ａ抗体は、ＳＣＡ２患者の正常物（１４５ｋＤ）および拡大されたポリＱ反復（１８０ｋＤ）、ならびに４２ｋＤフラグメントを有する全長アタキシン−２を認識した。この４２ｋＤタンパク質は、正常な脳またはアルツハイマーの脳においてほとんど検出されなかった。予想されるように、１Ｃ２抗体は、１４５ｋＤのタンパク質ではなく１８０ｋＤのフラグメントを認識し；この１Ｃ２抗体はまた、ＳＣＡ２患者の４２ｋＤのフラグメントを認識した。このフラグメントは、アルツハイマーの脳およびコントロールの脳において、１Ｃ２抗体によってほとんど検出されなかった。この１Ｃ２抗体は、有意な存在度のより小さなタンパク質を検出せず、このことは、４２ｋＤタンパク質が、拡大されたポリＱ路（ｔｒａｃｔ）を含む最も小さなフラグメントであることを示した。
【００７９】
４２ｋＤのフラグメントが、好ましくは、拡大されたポリＱ路を有するアタキシン−２によって生成されたことを確認するため、および変異体アタキシン−２がユビキチン結合したかどうかを調査するために、２９３Ｔ細胞をｐＥＧＦＰ−ＳＣＡ２（Ｑ２２）またはｐＥＧＦＰ−ＳＣＡ２（Ｑ５８）でトランスフェクトし、その後、プロテアソームの経路を阻害するために、２４時間、ラクタシスチンで処理した。簡単には、ＳＣＡ２とのＧＦＰ融合体を生成するために、ヌクレオチド１４５〜４，４８１を含む全長ＳＣＡ２　ｃＤＮＡ（Ｐｕｌｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１４：２６９〜２７６（１９９６））を、２２のＣＡＧ反復（ｒｅｐｅａｔ）または５８のＣＡＧ反復を有するｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中で構築した。アタキシン−２発現プラスミドを生成するために、２２のＣＡＧ反復または５８のＣＡＧ反復のいずれかを含む、全長ＳＣＡ２　ｃＤＮＡを、ｐＥＧＦＰＣ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ　ＣＡ）またはｐｃＤＮＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ　ＣＡ）中にシャトルさせた。これらの構築物を、ｐＥＧＦＰ−ＳＣＡ２２、ｐＥＧＦＰ−ＳＣＡ５８、ｐｃＤＮＡ−ＳＣＡ２２またはｐｃＤＮＡ−ＳＣＡ５８と命名した。
【００８０】
ｐＥＧＦＰ−ＳＣＡ２構築物の一過性の発現を、２９３Ｔ細胞において分析した。アタキシン−２のユビキチン結合を調査するために、１００ｍｍのペトリ皿において６０％の集密度で増殖する２９３Ｔ細胞を、２２のＣＡＧ反復または５８のＣＡＧ反復のいずれかを含む、ｐＥＧＦＰ−ＳＣＡ２構築物またはｐｃＤＮＡ−ＳＣＡ２構築物（１０μｇ）のいずれかでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、一晩かけて増殖し、次いで、２４時間かけて、ラクタシスチン（１０μＭ）を含むか、または含まない培養培地を用いて処理した。細胞を、三重の洗浄性緩衝液（０．５％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ　１００、０．５％のデオキシコール酸塩、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、およびＳｉｇｍａの哺乳動物プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ　ＭＯ））とともに、１時間、氷上で時折ボルテックスしながらインキュベートした。タンパク質抽出物を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆの微量遠心管中で、４℃にて３０分間かけて最大速度で遠心分離し、そしてこのペレットを、三重の洗浄性緩衝液中で再懸濁した。タンパク質抽出物とペレット懸濁物との両方を、−７０℃で保存した。ウエスタンブロット分析に関して、１レーン当たり１００μｇの総タンパク質抽出物を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）サンプル緩衝液に混合し、そして４〜１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ勾配ゲル上に充填する前に、２時間、３７℃でインキュベートした。ウエスタンブロットを、ＳＣＡ２、１Ｃ２およびユビキチン抗体で検出した。
【００８１】
ウエスタンブロットを、ＧＦＰ抗体またはユビキチン抗体を使用して、トランスフェクトされた２９３細胞タンパク質抽出物および不溶性ペレットについて実施した。未処理の細胞は、コントロールとして役に立った。このＧＦＰ抗体により、ＰＥＧＰ−ＳＣＡ２（Ｑ５８）でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞において、２００ｋＤにＱ２２およびＱ５８を有し、かつ７０ｋＤにさらなるバンドを有する、全長ＧＦＰ−アタキシン−２を検出した。７０ｋＤのタンパク質も２００ｋＤのタンパク質のいずれも、トランスフェクトされていない２９３Ｔタンパク質抽出物中で検出されなかった。この７０ｋＤタンパク質は、ｐＥＧＦＰ−ＳＣＡ２（Ｑ２２）のトランスフェクトされた細胞中に大量に存在せず、この４２ｋＤフラグメントは、好ましくは、拡大したポリＱ反復を含むアタキシン−２から生成されるようであることを示した。
【００８２】
ラクタシスチンを用いた処理は、プロテアソーム経路を不可逆的に阻害し、ユビキチン結合体化タンパク質複合体の蓄積を生じる。ラクタシスチン処理細胞は、増加したレベルのユビキチン結合体化タンパク質複合体およびＧＦＰ標識アタキシン−２を有した。このユビキチン抗体により、未処理のサンプルと比較して、ラクタシスチンで処理した細胞のタンパク質抽出物中に、６０ｋＤを越える強力なスミアを検出し、ラクタシスチン処理により、２９３Ｔ細胞中のユビキチン結合体化タンパク質複合体において一般的な増加を生じたことを示した。コントロール細胞またはラクタシスチン処理した細胞のいずれかにおいて、ＧＦＰ抗体によって検出されたｐ２００バンドを超える大きな凝集体は、存在しなかった。ＧＦＰ抗体またはＳＣＡ２抗体のいずれかを有するこれらの細胞由来の、界面活性剤不溶性タンパク質および核タンパク質のウエスタンブロットは、任意のさらに大きなタンパク質複合体を検出しなかった。ＧＦＰ−アタキシン−２（Ｑ２２）およびＧＦＰ−アタキシン−２（Ｑ５８）融合タンパク質の両方のレベルは、ラクタシスチンで処理したトランスフェクトされた細胞の不溶性フラクションにおいて増加し、ＧＦＰ−アタキシン−２がアタキシン−２の溶解度を増加させるようであることを示す。
【００８３】
ＧＦＰ融合物が、ユビキチン結合の任意の妨害を起こすかどうかを調査するために、２９３Ｔ細胞を、ｐｃＤＮＡ−ＳＣＡ２（Ｑ２２）またはｐｃＤＮＡ−ＳＣＡ２（５８）でトランスフェクトし、そしてラクタシスチンで処理した。１Ｃ２またはユビキチン抗体を有するこれらのタンパク質抽出物のウエスタンブロットは、ラクタシスチン処理により、アタキシン−２（Ｑ５８）（Ｐ１８０）の総量が増加するが、大きなアタキシン−２凝集体は、見出されないことを示した。この不溶性フラクションにおいて、アタキシン−２（Ｑ５８）は、ラクタシスチン処理したサンプルおよび未処理のサンプルの両方においてかすかに検出され、ＧＦＰ融合体を有さない全長アタキシン−２（Ｑ５８）が界面活性剤溶解性であることを示した。これらの結果は、変異体アタキシン−２により形成される検出不可能な大きなユビキチン結合体化タンパク質複合体は存在するが、ポリＱの拡大は、ラクタシスチン処理により増強されたアタキシン−２の集積を生じることを示した。
【００８４】
短縮型アタキシン−２フラグメントまたはユビキチン結合したアタキシン−２フラグメントからなる核内封入体が、ヒトのＳＣＡ２組織中、インビボで存在するかどうかを調査するために、アタキシン−２（ＳＣＡ２Ａ）、ポリＱ路（１Ｃ２）およびユビキチンに対する抗体を使用して、正常な小脳および５８ＣＡＧ反復を有するＳＣＡ２患者由来の小脳からの切片を染色するために使用した。免疫組織化学的な染色を、正常な個体および５８反復を有するＳＣＡ２患者からの小脳切片で実施し、そしてこの切片を、ヘマトキシリンで核対比染色した。プルキンエ細胞を、アタキシン−２ペプチドＳＣＡ２Ａに対する抗体、ポリＱ路に対する１Ｃ２モノクローナル抗体、およびユビキチンで染色した。
【００８５】
ＳＣＡ２Ａ抗体の染色は、以前に示した（Ｈｕｙｎｈら、前出、１９９９）ように、強力であり、斑点状であり、そして正常なプルキンエ細胞中に等しく分布されるが、この１Ｃ２抗体は、いずれの細胞構造も標識しない。ユビキチン標識は、プルキンエ細胞ならびに正常な脳の切片およびＳＣＡ２の脳の切片の両方の他のニューロンにおいて検出できなかった。同一のユビキチン抗体により、散発性のパーキンソン病を患った２人の患者の中脳にあるレーヴィ体およびラクタシスチンで処理した２９３Ｔ細胞にあるスミアバンド形成パターンを検出し、この抗体によりユビキチン結合体化タンパク質複合体が検出されることを確認した。さらに、プロテアソームサブユニットに対する抗体は、プルキンエ細胞またはＳＣＡ２脳の切片にある他のニューロンの増強された標識を示さなかった。４つの異なるＳＣＡ２患者由来の脳の断片において、ＳＣＡ２Ａ抗体および１Ｃ２抗体の両方により、細胞質全体にわたるプルキンエ細胞を、いくらか顆粒化された細胞質ベシクルを用いて標識した。この１Ｃ２抗体により、正常なプルキンエ細胞は標識されなかったが、ＳＣＡ２Ａプルキンエ細胞中の大きな細胞質構造を強力に標識した。
【００８６】
これらの結果は、ＳＣＡ２封入体が細胞質中に配置されること、およびＳＣＡ２中に核内封入体を欠くことを示す。
【００８７】
（実施例ＩＩ）
（変異ヒトアタキシン−２を発現するトランスジェニックマウス株）
この実施例は、変異ヒトアタキシン−２を発現するトランスジェニックマウス株の生成を記載する。
【００８８】
核内封入は、今まで、ヒト優性運動失調の全ての動物モデルにおいて同定されている（Ｒｅｄｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，２０：１９８−２０２（１９９８）；Ｋｌｅｍｅｎｔら、Ｃｅｌｌ，９５：４１−５３（１９９８）；Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉら、Ｃｅｌｌ，８７：４９３−５０６（１９９６）；Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１５：１９７−２００（１９９７）；Ｄａｖｉｅｓら、Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ　Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，３５４：９８１−９８９（１９９９）；Ｂｕｒｒｉｇｈｔら、Ｃｅｌｌ，８２：９３７−９４８（１９９５）；Ｃｌａｒｋら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７：７３８５−７３９５（１９９７））。従って、プルキンエ細胞特異的Ｐｃｐ２調節エレメントの制御下における全長ＳＣＡ２　ｃＤＮＡの発現の効果を研究した。
【００８９】
トランスジェニック構築物を作製するために、ｐＺ０３−β−Ｇａｌプラスミド由来のβ−ガラクトシダーゼ配列（これはＰｃｐ２／Ｌ７プロモーター、ならびにＰｃｐ２の非翻訳配列およびポリ（Ａ）配列を含む）を、全長ＳＣＡ２配列（Ｖａｎｄａｅｌｅら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．，５：１１３６−１１４８（１９９１）で置き換えた；このプラスミドは、Ｈ．Ｔ．Ｏｒｒにより提供された（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）。正確な組換えプラスミドを、二本鎖配列決定によって、確認した。トランスジェニック組換えプラスミドを、ｐＺ０３ＳＣＡ２２（２２　ＣＡＧ反復）またはｐＺ０３ＳＣＡ５８（５８　ＣＡＧ反復）と命名した。このトランスジェニック構築物を直線化するために、このｐＺ０３ＳＣＡ２２プラスミドおよびｐＺ０３ＳＣＡ５８プラスミドを、ＳａｌＩおよびＡａｔＩＩで消化して、２，１８８ｂｐおよび６，４５１ｂｐの２つのバンドを生成した。この６，４５１ｂｐのＳＣＡ２トランスジェニックフラグメントを、スクロース勾配で単離した。
【００９０】
トランスジェニックマウス株を作製するために、スクロース勾配精製したＳＣＡ２トランスジェニックフラグメントを、Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウス株の前核である、Ｃ５７ＢＬ／６ＪｘＤＢＡ／２Ｊハイブリッドに微量注入した。陽性ファウンダを、野生型の同じハイブリッド株に戻し交配した。トランスジェニックマウスの遺伝子型を決定するために、テールＤＮＡを２つのプライマー対を使用するＰＣＲ（一方の対はＣＡＧ反復領域を占め、他方の対はエキソン１６および１７を示す）に供した（以下を参照のこと）。ｋの方法を使用して、ファインダ株を、以下のように同定した；５８個のＣＡＧ反復を有する４つのヒト変異ファインダ株、Ｑ５８−５、Ｑ５８−１１、Ｑ５８−５ＢおよびＱ５８−１９、および２２個のＣＡＧ反復を有する２つのヒト野生型株、Ｑ２２−４およびＱ２２−５。３つのＱ５８株、Ｑ５８−５Ｂ、Ｑ５８−１１およびＱ５８−１９のみが、子孫を産生し得た。
【００９１】
導入遺伝子のコピー数を決定するために、野生型のＱ２２およびＱ５８マウス由来の等量のゲノムＤＮＡを、ＲｓａＩで消化し、マウスおよびヒトの両方に共通のＳＣＡ２　ｃＤＮＡフラグメント（マウスエキソン１５）にハイブリダイゼーションした後に、定量的サザンブロット分析に供した。
【００９２】
アタキシン−２を発現する３つの株（Ｑ５８）およびアタキシン−２を発現する２つの株（Ｑ２２）を、評価した。ＲｓａＩで消化したＤＮＡの定量的サザンブロット分析により、株Ｑ５８５Ｂについて２つの導入遺伝子コピーが存在し、株Ｑ５８−１１およびＱ５８−１９について３または４つのコピーが存在し、一方、株Ｑ２２−４およびＱ２２−５はそれぞれ１つのコピーを有することが示された。
【００９３】
マウス株をまた、ＣＡＧ反復ＰＣＲ分析により、ＣＡＧ反復の数に関して特徴付けた。簡潔には、離乳齢において、尾部の１ｃｍ片をこの動物から切断し、そしてＤＮＡを、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ　ＤＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎキット（Ｇｅｎｔｒａ　Ｓｙｓｔｅｍｓ；Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ　ＭＮ）を使用して単離した。洗浄の後、沈殿物をＴＥ緩衝液（１００μｌ）に再懸濁した。２つのプライマー対を使用して、テールＤＮＡ（５０ｎｇ）をＰＣＲ分析によって分析して、導入遺伝子を有するマウスを同定した。１つのプライマー対、１０５２Ａ（５’−ＧＣＧＴＧＣＧＡＧＣＣＧＧＴＧＴＡＴ−３’；配列番号３）および１１９０Ｂ（５’−ＣＧＧＧＣＴＴＧＣＧＧＡＣＡＴＴＧ−３’；配列番号４）は、ＣＡＧ反復領域に隣接するヒト特異的プライマー対であった。ＰＣＲのステップアップ条件は、以下のとおりであった：９５℃で５分間の変性；９５℃で１分３０秒間の変性、６５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で１分間の伸長を５サイクル；続いて、９５℃で１分３０秒間の変性、６０℃で３０秒のアニーリングおよび７２℃で１分間の伸長を３０サイクル。このプライマー対は、２２ＣＡＧ　ＳＣＡ２　ｃＤＮＡについて、１４５ｂｐのフラグメントを、５８　ＳＣＡ２　ｃＤＮＡについて、２５８ｂｐのフラグメントを生成する。第２のプライマー対、Ａ４０（５’−ＧＧＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＴＣＣＡＡＣＴＧ−３’；配列番号５）および３’ＳＴＳＢ（５’−ＧＡＴＧＴＧＴＴＣＡＴＧＡＣＴＴＴＣＡＡＧＧ−３’；配列番号６）は、イントロン１６に隣接する。標準的なＰＣＲ条件（９５℃で９０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で４分間の伸長を３５サイクル）において、Ａ４０／３’ＳＴＳＢプライマー対は、ＳＣＡ２導入遺伝子について、４２４ｂｐのアンプリコンを、内在性遺伝子（イントロン１６を含む）について、１，４２４ｂｐのアンプリコンを生成する。
【００９４】
不安定であり、後の世代において拡大し続けるヒト拡大ＳＣＡ２　ＣＡＧ反復（Ｐｕｌｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１４：２６９−２７６（１９９６））とは対照的に、Ｑ５８−１１株の３世代における４５子孫は、導入遺伝子を安定に伝達した。
【００９５】
導入遺伝子が発現されたか否かを決定するために、ＲＮＡおよびタンパク質を、トランスジェニック株の小脳から抽出した。ｍＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、一本鎖ＤＮＡに逆転写した。簡潔には、ＲＴ−ＰＣＲおよびＲＮＡ単離について、マウス小脳を、Ｔｒｉ−ｓｏｌｖｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　ＭＤ）中でホモジナイズし、そして総ＲＮＡを、メーカーのプロトコルに記載されるようにして単離した。総ＲＮＡを、３．７５Ｍ　ＬｉＣｌ／２５ｍＭ　ＥＤＴＡで選択的に沈殿させて、微量のゲノムＤＮＡ混入物を除去した。ＲＴ−ＰＣＲのための第１鎖ｃＤＮＡを、Ｐｒｏｍｅｇａ　ＲＴ−ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ　ＷＩ）を使用して、総ＲＮＡ（２μｇ）から合成した。この反応物のアリコートを、ＣＡＧ路を占めるヒト特異的プライマー対を使用するＰＣＲに供した。
【００９６】
野生型のＱ２２−５マウス株またはＱ５８−１１マウス株由来の小脳を、ＣＡＧ反復に隣接するヒト特異的プライマー対（Ａ１−Ｂ１）を使用するＲＴ−ＰＣＲに供した。Ａ１プライマー（５’−ＧＧＧＣＣＣＣＴＣＡＣＣＡＴＧＴＣＧ−３’；配列番号９）、およびＢ１プライマー（５’−ＣＧＧＧＣＴＴＧＣＧＧＡＣＡＴＴＧＧ−３’；配列番号１０）は、以前に記載された（Ｐｕｌｓｔら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１４：２６９−２７６（１９９６））。このＡ１−Ｂ１プライマー対は、Ｑ２２−５株において、２２個のＣＡＧ反復を含む１２６ｂｐのアンプリコンを、Ｑ５８−１１株において、５８個のＣＡＧ反復を含む１６２ｂｐのアンプリコンを生成した。この１２６ｂｐのフラグメントおよび１６２ｂｐのフラグメントはまた、トランスジェニック構築物、ｐＺ０３−ＳＣＡ２（Ｑ２２）またはｐＺ０３−ＳＣＡ２（Ｑ５８）のいずれかを含むポジティブコントロールのＰＣＲ反応において、観察された。アンプリコンを、ＨａｅＩＩＩで消化したφＸ１７４ＲＦＤＮＡマーカーと比較した。野生型マウスの小脳ではなく、トランスジェニックマウス由来の小脳が、ＣＡＧ２２またはＣＡＧ５８のいずれかを有する導入遺伝子ｍＲＮＡを含んだ。
【００９７】
Ｑ５８−１１マウスの小脳から単離したタンパク質抽出物のウエスタンブロット分析は、そのタンパク質レベルにおける導入遺伝子の発現を証明した。マウスタンパク質抽出物を、ウエスタンブロット分析を使用して、ＳＣＡ２Ａ抗体でプローブした。野生型のヘテロ接合性Ｑ５８−１１動物、またはホモ接合性Ｑ５８−１動物由来の小脳（脳幹を含む）を、三重界面活性緩衝液中でホモジナイズし、１００μｇの総タンパク質を、各レーンに充填した。ＳＣＡ２−Ａ抗体は、全ての抽出物において、全長アタキシン−２および３９ｋＤのタンパク質フラグメントを検出した。１８０ｋＤの弱いバンドが、ヘテロ接合性マウスタンパク質抽出物において、検出された。この１８０ｋＤのバンドは、ホモ接合性マウス脳抽出物において、より強かった。
【００９８】
１８０ｋＤのタンパク質は、Ｑ５８−１１のヘテロ接合性マウスおよびホモ接合性マウス由来の小脳において検出され、ホモ接合性動物においてより多く発現されることが予測される。このバンドは、野生型動物においては検出されなかった。より小さな分子量のいくつかのタンパク質は、野生型株およびトランスジェニック株において観察され、このことは、これらのタンパク質がおそらくマウス内在性タンパク質であることを示す。株Ｑ５８−５Ｂ、Ｑ５８−１１およびＱ５８−１９由来の、１Ｃ２抗体で標識したプルキンエニューロンの組織切片において、これらの株がヒト導入遺伝子を発現することを確認した。
【００９９】
アタキシン−２導入遺伝子の相対発現レベルをさらに決定するために、ＲＴ−ＰＣＲを、野生型株およびトランスジェニック株の小脳から単離した総ＲＮＡについて行った。異なる株由来の導入遺伝子の発現レベルを比較するために、ＰＣＲを、プライマー３０１４Ａ（５’−ＴＴＡＣＡＧＣＣＡＡＧＴＣＴＡＣＴＣＴＧＡＡ−３’；配列番号７）および３２５８Ｂ（５’−ＡＧＴＣＴＧＡＡＣＣＣＣＴＴＧＧＧＡＡ−３’；配列番号８）を使用して行った。このプライマーは、エキソン１５を占め、そして内在性マウス転写物の２６６ｂｐのアンプリコンおよび導入遺伝子転写物由来の２６０ｂｐのアンプリコンを生成する。これらのプライマー対３０１４Ａ／３２５８Ｂは、マウス配列との２つのミスマッチに由来して、わずかに効率的に導入遺伝子を増幅する。マウスアンプリコンおよびヒトアンプリコンの分離を容易にするために、ＰＣＲ産物を、ＭｓｅＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ；Ｂｅｖｅｒｌｙ　ＭＡ）で消化した。フラグメントを、３％　Ｔｒｉｓ−ホウ酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）ＭＥＴＡＰＨＯＲアガロース（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｒｏｃｋｌａｎｄ　ＭＥ）中で分離した。このヒトＰＣＲ産物およびマウスＰＣＲ産物は、ＭｓｅＩで消化された後、分化し得、このＭｓｅＩは、内因性のマウスの２６６ｂｐＰＣＲ産物のみを、７９ｂｐおよび１８７ｂｐの２つのフラグメントに切断する。
【０１００】
導入遺伝子の相対発現を、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、内在性アタキシン−２の発現レベルと比較した。野生型のヘテロ接合体Ｑ２２−４、ヘテロ接合体Ｑ２２−５、ヘテロ接合体およびホモ接合体のＱ５８−５Ｂ、ヘテロ接合体およびホモ接合体のＱ５８−１１、ならびにヘテロ接合体およびホモ接合体のＱ５８−１９を分析した。ＲＮａｓｅ処理により、全てのアンプリコンの消失が生じた。
【０１０１】
株Ｑ２２−４は、株Ｑ５８−５ＢおよびＱ５８−１９におけるヘテロ接合体動物に匹敵するレベルにおいて、株Ｑ２２−５よりわずかに高い導入遺伝子の発現を有した。株Ｑ５８−１１における導入遺伝子の発現は、全ての株の中で最も高かった。これらの実験はまた、ホモ接合体動物における導入遺伝子の発現レベルは、それらのヘテロ接合性対応物における導入遺伝子の発現レベルよりも高いことを示した。
【０１０２】
７０〜８０のポリグルタミンを発現するＳＣＡ２トランスジェニックマウスが、生成されている。このマウス株は、本質的に上記および下記のようにして、スクリーニングされる。
【０１０３】
これらの結果は、ヒトＳＣＡ２およびそれらの変異形態を発現するトランスジェニックマウスの生成および特徴付けを記載する。
【０１０４】
（実施例ＩＩＩ）
（ヒトＳＣＡ２を発現するトランスジェニックマウス株の機能試験）
この実施例は、ＳＣＡ２トランスジェニックマウス株の機能的特徴付けを記載する。
【０１０５】
３つの独立した機能試験（折り畳み（ｃｌａｓｐｉｎｇ）分析、フットプリンティング分析およびロータロッド分析）を行って、プルキンエ細胞機能：に対する導入遺伝子発現の効果を決定した。
【０１０６】
神経変性表現型を有するマウスは、少なくとも１分間、尾部によって捕まえられた場合、その後ろ脚を折り畳む傾向を有する。折り畳み試験において、マウスを尾部によって１分間つかんだ。マウスが両後ろ脚を身体に近づけて折り畳んだ場合、このマウスに１００のスコアをつける。一方の脚のみを折り畳んだ場合、このマウスに５０のスコアをつける。生後１週間以内のマウスを、単一の試験群にグループ分けした。
【０１０７】
折り畳みは、１６〜２０週において、ｑ５８−１９株で観察され、８〜１２ヶ月において、Ｑ５８−１１株で観察された。Ｑ５８−５Ｂ動物において、２６週齢まで、折り畳みは観察されなかった。Ｑ２２−４およびＱ２２−５動物は、１２ヶ月目まで折り畳みを示さなかった。
【０１０８】
フットプリント分析もまた行った。歩幅を測定するために、左脚に赤い水性インクを塗り、右脚に黒いインクを塗り、そしてこのマウスを、４０ｃｍ×８ｃｍ×６ｃｍ（Ｌ×Ｗ×Ｈ）の暗室トンネルの中を走らせた。各動物から得た全歩幅値は、各脚により生じるステップの総数からの歩幅の平均であった。８週および１６週における後ろ脚のフットプリントを測定し、そして年齢および体重の一致した動物間で比較した。
【０１０９】
歩幅は、野生型マウスの歩幅またはアタキシン−２を発現するマウス（Ｑ２２）の歩幅と比較して、変異アタキシン−２を発現するマウスにおいて変化した（図２ａ）。ｗｔＱ５８−５Ｂ、ｗｔＱ５８−１９およびｗｔＱ５８−１１と命名されたマウス株は、それぞれのトランスジェニック株と一致した野生型マウスを示す。進行性の機能喪失は、株Ｑ５８−５Ｂ、Ｑ５８−１１およびＱ５８−１９において、観察された。フットプリント分析は、８週および１６週で試験された３つ全ての株において、歩幅の進行性の減少を示した（図２ａ；ｎ＝１１〜１４匹の動物／データポイント）。Ｑ５８−１９株において、歩幅は、８週目において、１９％減少した（Ｐ＜０．０００１、２−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ）。１６週目において、３つ全てのＱ５８株は、歩幅における類似の減少を示した（Ｐ　０．００１、２−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ）。アタキシン−２を発現する動物（Ｑ２２）は、１２ヶ月目において試験した場合でさえ、野生型動物と同じ歩幅を有した（図２ａ）。
【０１１０】
野生型マウスおよびＱ５８−１１マウスのロータロッド能力を分析した。運動協調性およびバランスを測定するために、マウスを、Ｂａｓｉｌｅ　Ｒｏｔａｒｏｄトレッドミル（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ　Ｃｏ．；Ｗｏｏｄ　Ｄａｌｅ　ＩＬ）を使用して試験した。この試験は、ＳＣＡ１およびハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）導入遺伝子を有するマウスにおける機能障害を評価するために使用されている（Ｒｅｄｄｙら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，２０：１９８−２０２）１９９８）；Ｋｌｅｍｅｎｔら、Ｃｅｌｌ，９５：４１−５３（１９９８）；Ｃｌａｒｋら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１７：７３８５−７３９５（１９９７））。マウスを、最大１０分間、１５分の最低試行間間隔で、４〜４０ｒ．ｐ．ｍ．の回転速度を有する加速ロッドに入れ、落ちることなくこのロッドで過ごした時間を記録した。試験の持続期間は４日間であり、１日に４回の個々の試験を行った。
【０１１１】
株Ｑ５８−１１およびＱ５８−５Ｂのロータロッド試験により、機能不全を確認した。株Ｑ５８−１１由来のマウスのロータロッド分析を、図２ｂに示す。このグラフは、ロータロッド装置における、連続４日の各日における４回の試行の平均能力を示す。差異は、１６週および２６週目において、ホモ接合体Ｑ５８−１１マウスについて顕著であり（野生型と比較した２−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）、２６週においてヘテロ接合体Ｑ５８−１１マウスについて顕著である（Ｐ＜０．０００１）。括弧内の数字は、試験した動物の数を示す。
【０１１２】
野生型Ｑ５８−１１マウス、ヘテロ接合性Ｑ５８−１１マウスおよびホモ接合性Ｑ５８−１１マウスを、６週目、１４〜１６週目、および２６週目に試験した。６週目において、トランスジェニック動物の運動能力は、野生型マウスの運動能力とは異ならなかった。１６週目において、ホモ接合性Ｑ５８−１１マウスは、ロータロッド試験においてすでに実行が不十分であった（Ｐ＜０．００１、２−ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ）が、一方、ヘテロ接合性ＱＢ５８−１１動物は、野生型と同様に十分に実行した（図２ｂ）。Ｑ５８−５Ｂ株由来のマウスが、ＱＢ５８−１１由来のマウスよりも遅い、歩幅（ｓｔｒｉｄｅ−ｌｅｎｇｔｈ）不足を示したが、それらのロータロッド能力は、ＱＢ５８−１１マウスのロータロッド能力と一致した。機能不全は、進行性であった。２６週目において、ヘテロ接合性ＱＢ５８−１１動物およびホモ接合性ＱＢ５８−１１動物は、重篤に障害のある運動能力を示した。アタキシン−２（Ｑ２２）を発現する動物のロータロッド能力は、野生型動物のロータロッド能力と顕著には異ならなかった。
【０１１３】
これらの結果は、５８ポリグルタミン反復を有するヒトＳＣＡ２を発現するトランスジェニックマウスにおいて、機能性神経変性表現型を示す。
【０１１４】
（実施例ＩＶ　ヒトＳＣＡ２を発現するトランスジェニックマウス株の解剖学的変化）
この実施例は、ＳＣＡ２トランスジェニックマウス株の形態学的特徴付けを記載する。
【０１１５】
ＳＣＡ２導入遺伝子は、プルキンエ細胞特異的調節エレメントＰｃｐ２の制御下にある。プルキンエ細胞における形態学的変化を調査するために、２７週目においてヘテロ接合性動物由来の組織切片におけるカルビンジン−２８Ｋ免疫反応性を、野生型マウス由来の組織におけるカルビンジン−２８Ｋ免疫反応性と比較した。カルビンジン−２８Ｋは、小脳プルキンエ細胞の細胞質および樹状突起において特異的に発現されるタンパク質である。
【０１１６】
組織学的試験および免疫組織化学を、野生型およびＳＣＡ２トランスジェニックマウス由来のプルキンエ細胞において行った。Ｑ５８トランスジェニックマウスが、プルキンエ細胞損失を示すか否かを決定するために、カルビンジン−２８Ｋ−陽性プルキンエ細胞およびカルビンジン−２８Ｋ−陰性プルキンエ細胞の両方を、異なる年齢で、野生型マウスおよびＱ５８トランスジェニックマウスから数えた。生存プルキンエ細胞の割合は、同じ年齢の少なくとも２匹の異なるＱ５８動物から得られたプルキンエ細胞の平均数を、７匹の野生型動物から得られたプルキンエ細胞の平均数で割ることによって得た。
【０１１７】
ヒトＳＣＡ２患者との比較のために、部検において得られたヒト脳組織を、死亡の２４時間以内に、１０％ホルマリン中で固定し、そして選択されたサンプルをパラフィンに埋め込んだ。切片（６μｍ）を切断し、そしてＳｕｐｅｒｐｌｕｓ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ　ＰＡ）に載せた。この切片を、キシレン、１００％エタノール、９５％エタノールおよび７０％エタノール中で、５分間隔で２回リンスすることによって、再水和した。パラフィン除去（ｄｅｐａｒａｆｆｉｎｉｚａｔｉｏｎ）の後に、切片をプロテアーゼカクテルで処理し、アビジン／ビオチンでブロックし、そして３％正常ヤギ血清で処理した。
【０１１８】
免疫組織化学について、切片を、１０〜２０μｇ／ｍｌのアフィニティー精製アタキシン−２抗体とともに、一晩４℃でインキュベートした。使用される他の抗体は、以下の通りである：ユビキチン（Ｄａｋｏ；Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ　ＣＡ）、１Ｃ２およびカルビンジンＤ−２８Ｋ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ；Ｔｅｍｅｃｕｌａ　ＣＡ）。一次抗体を、Ｖｅｃｔｏｒ　ｒａｂｂｉｔ　ＡＢＣ　ｅｌｉｔｅ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ　ＣＡ）を使用して検出し、ＤＡＢエンハンサーによって増強し、そしてジアミノベンジジン（ＤＡＢ；Ｂｉｏｍｅｄａ；Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ　ＣＡ）で視覚化した。切片を、水性ヘマトキシリン（Ｚｙｍｅｄ；Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ　ＣＡ）を用いて対比染色した。コントロールは、１００μＭのそれぞれのペプチドおよび匹敵する濃度（１／５００）の免疫前血清を予備吸収された抗体から構成された。直接的比較のために、全てのスライドを、変動性を最小化するために、単一のバッチで処理した。
【０１１９】
小脳のカルビンジン−２８Ｋ標識を、２７週目のヘテロ接合性Ｑ５８−５Ｂ、Ｑ５８−１１、およびＱ５８−１９動物において決定し、そして４週目、７週目および１４週目の野生型Ｑ５８−１１マウスおよびホモ接合性Ｑ５８−１１マウスにおいて決定した。直接的比較のため、小脳のカルビンジン−２８Ｋ標識をまた、７週目のＱ２２−５マウス切片、年齢を一致させた正常個体由来のヒト小脳、およびＱ４１−ＳＣＡ２患者において、行った。
【０１２０】
カルビンジン−２８Ｋ標識における変化は、４週目という早い時期に見られたが、年齢とともにより明白になった。大部分のプルキンエ細胞は、株Ｑ５８−５Ｂおよび株Ｑ５８−１１由来のマウスにおいてカルビンジン−２８Ｋ免疫反応性を失ったが、株Ｑ５８−１９における喪失は、より目立たなかった。カルビンジン−２８Ｋ喪失は、進行性であった。４週目において、カルビンジン−２８Ｋ標識は、Ｑ２２マウスおよび野生型動物において強力であったが、カルビンジン−２８Ｋ免疫反応性は、ホモ接合性Ｑ５８−１１マウスのプルキンエ細胞体においてすでに減少していた。７〜１４週目に、カルビンジン−２８Ｋ免疫反応性のさらなる喪失が、野生型動物およびＱ２２トランスジェニックマウスと比較して観測された。Ｑ５８−１１マウスのプルキンエ細胞におけるカルビンジン−２８Ｋ免疫反応性の喪失は、４１　ＳＣＡ２　ＣＡＧ反復を有するＳＣＡ２患者由来のヒトプルキンエ細胞において観測される喪失と類似した。樹状アーバ（ａｒｂｏｕｒ）の喪失に、密接に続いて、プルキンエ細胞数における喪失があった。生存プルキンエ細胞の割合は、進行性の減少を示した。２４〜２７週目において、プルキンエ細胞数は、株Ｑ５８−５Ｂ、株Ｑ５８−１１および株Ｑ５８−１９において５０〜５３％、減少した。野生型マウスと比較して、アタキシン−２（Ｑ２２）を発現するマウスは、１才齢においてさえ、プルキンエ細胞数の減少を示さなかった。
【０１２１】
プルキンエ細胞におけるアタキシン−２の発現および局在化を決定した。野生型マウス、Ｑ５８−１１マウス、Ｑ５８−１９マウスおよびＱ５８−５Ｂマウス由来のパラフィン埋め込みマウス脳切片を、ＳＣＡ２Ａ、１Ｃ２またはユビキチン抗体で染色し、そしてヘマトキシリンで対比染色した。
【０１２２】
アタキシン−２免疫反応の細胞質蓄積およびプルキンエ細胞における核局在化の欠失は、Ｑ５８マウス小脳において観測された。ＳＣＡ２Ａまたは１Ｃ２抗体のいずれかでの標識は、核内封入を明らかにしなかった。３つ全てのＱ５８トランスジェニック株由来のプルキンエ細胞は、ＳＣＡ２Ａおよび１Ｃ２抗体を用いて強く標識した。ＳＣＡ２Ａ染色は、野生型プルキンエ細胞におけるよりも強く、いくつかの粒状細胞質小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）とともに細胞質中に局在化した。１Ｃ２染色は、細胞質微小凝集体（ｍｉｃｒｏａｇｇｒｅｇａｔｅ）からなった。ユビキチン標識は、野生型動物およびトランスジェニック動物のプルキンエ細胞において検出不可能であった。
【０１２３】
実施例ＩＩに記載されるように、全長アタキシン−２（Ｑ５８）でトランスフェクトされた脳抽出物および培養細胞の両方のウェスタンブロットにおいて、アタキシン−２の短縮の証拠が存在する。短縮された４２ｋＤａのフラグメントは、ポリＱ路（ｔｒａｃｔ）を含むが、４２ｋＤａ形態は、このフラグメントが過剰発現される場合でさえ、核に入らない。ウェスタンブロットにおける１Ｃ２抗体による４２ｋＤａフラグメントの認識に基づいて、４２ｋＤａのフラグメントの存在は、ＳＣＡ２を有する患者のプルキンエ細胞の核において観測されなかった。
【０１２４】
本研究において使用される３つ全ての抗体が、細胞質染色を示し、ＳＣＡ２−Ａ抗体およびＳＣＡ２−Ｂ抗体（優先的に、全長正常アタキシン−２および変異アタキシン−２を認識する）が、より拡散性の細胞質染色を生じたが、１Ｃ２抗体は、微小凝集体を検出した。短縮タンパク質が、核内凝集体の形成および全長タンパク質の補充のための位置（ｎｉｄｕｓ）として役立つことが示唆されている（Ｓｃｈｅｒｚｉｎｇｅｒら、Ｃｅｌｌ，９０：５４９−５５８（１９９７））。ＳＣＡ２脳において観測される染色パターンは、細胞質凝集についての類似の機構と一致する。これらの研究は、細胞質における最初の毒性事象の位置を強調する。しかし、細胞の機能不全の開始および最終的な死を含む、他の因子が含まれ得る。カスパーゼ切断が、ポリＱ誘導アポトーシスの細胞モデルにおいて重要であるようである（Ｓａｎｃｈｅｚら、Ｎｅｕｒｏｎ、２２：６２３−６３３（１９９９）；Ｋｉｍら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：９６４−９７３（１９９９）；Ｗｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：９１５８−９１６７（１９９８））ので、全長ｃＤＮＡ構築物を使用するこれらのマウスモデルは、インビボのカスパーゼ切断の重要性を試験するために有用である。ヒトＳＣＡ２脳において、４２−ｋＤアタキシン−２フラグメントの存在比は、正常な脳と比較して増加しているようであるが、この短縮事象が、ＳＣＡ２病原性について重要であるか否かはまだ知られていない。
【０１２５】
プルキンエ細胞特異的プロモーターを使用する、特定のニューロン集団に対する導入遺伝子発現の標的化は、ＳＣＡ２の発現の機能的結果および解剖学的結果の評価を容易にする。ＰｃＰ２プロモーターは、現在、異なる結果を有するアタキシン１、２および３の発現のために使用されている。機能不全およびニューロン変化は、アタキシン−３が大きく（ｓｅｖｅｒｅｌｙ）短縮された場合にのみ検出された（Ｉｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１３：１９６−２０２（１９９６））が、他のモデルとの直接的比較は、導入遺伝子の異なる発現レベルに起因して限定される。
【０１２６】
アタキシン−１（Ｑ８２）およびアタキシン−２（Ｑ５８）を発現するマウスは、類似の機能的特徴および形態学的特徴を共有する。調節が異なるポリＱ長についてなされる場合、病理的な変化の時間経過における類似性は、著しい。両方のモデルにおいて、機能的機能障害は、変化したカルビンジン−２８Ｋ染色によって視覚化されるように、プルキンエ細胞樹状ツリーにおける変化によって反映される。変化は、投薬量に依存し、そしてホモ接合性マウスは、ヘテロ接合性動物よりも、有意に早く影響する（Ｂｕｒｒｉｇｈｔら、Ｃｅｌｌ，８２：９３７−９４８（１９９５）；Ｃｌａｒｋら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｓｉ．，１７：７３８５−７３９５（１９９７）；Ｖｉｇら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５０：１０６−１１３（１９９８））。両方のアタキシンモデルは、神経変性の証拠を示すが、細胞損失は、機能不全の開始よりもずっと遅く生じる。このパターンは、ヒト遺伝性運動失調におけるプルキンエ細胞萎縮が、樹状突起の喪失から開始し、次いで、細胞体の完全な破壊に進行するという、ヒトの脳における観測に従う（Ｋｏｅｐｐｅｎ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．５０：５０５−５１４（１９９１））。
【０１２７】
ＳＣＡ１トランスジェニック株とＳＣＡ２トランスジェニック株との間のこれらの機能的および形態学的類似性にも関わらず、病理の開始部位は、異なるようである。ＳＣＡ１において、核局在化が病原に必須であるが、核内凝集は、必須ではない。上記結果は、正常なアタキシン−２も変異アタキシン−２も、核局在化を獲得しないことを示す。これは、マウスモデル、培養細胞、およびヒトプルキンエ細胞に当てはまる。短縮ポリＱを含むフラグメントの存在はまた、核において見出されなかった。他の研究者が、ヒトＳＣＡ２脳において偶然の核内凝集を検出したが、これらは、プルキンエ細胞において決して見られなかった（Ｋｏｙａｎｏら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，２７３：１１７−１２０（１９９９））。
【０１２８】
培養マウスおよびヒトニューロンにおける以前の結果は、ユビキチン化およびプロテアソーム機構による引き続く分解が、それらの核または細胞質局在化と独立して、全てのポリＱタンパク質に対しておそらく一般的であることを示唆している（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．，１９：１４８−１５４（１９９８）；Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、Ｎｅｕｒｏｎ，２４：８７９−８９２（１９９９）；Ｃｈａｉら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８：６７３−６８２（１９９９））。アタキシン−２およびおそらくアタキシン−６は、少なくとも、凝集または蓄積した変異タンパク質の検出可能なユビキチン化に関して、この型（ｍｏｌｄ）を破壊するようである。ヒトＳＣＡ６脳において、アタキシン−６は、抗ユビキチン抗体によって標識されなかった（Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８：１１８５−１１９３（１９９９））。ＳＣＡ２ヒト脳およびトランスジェニックマウス株由来の脳において、アタキシン−２のユビキチン化における増加は、細胞質中の大量の免疫反応性アタキシン−２の存在にも関わらず、検出可能ではなかった。培養された細胞において、ラクタシスチン（ｌａｃｔａｃｙｓｔｉｎ）処理トランスフェクト細胞は、高分子量のユビキチン結合アタキシン−２（５８）複合体を産生しなかったが、変異アタキシン−２のレベルが、これらの細胞において増加した。アタキシン−２（Ｑ５８）は、アタキシン−１とは異なり、可溶性のままであった（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、Ｎｅｕｒｏｎ，２４：８７９−８９２（１９９９））。
【０１２９】
ｐ１１５　Ｇｏｌｇｉ／ＥＲ輸送タンパク質に連結したＧＦＰの発現研究は、その中心に、可溶性非ユビキチン化タンパク質を含むアグリソーム（ａｇｇｒｅｓｏｍｅ）複合体の記載を導いたが、プロテアソームタンパク質および他のシャペロンが、アグリソームに補充された（Ｇａｒｃｉａ−Ｍａｔａら、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１４６：１２３９−１２５４（１９９９））。これは、細胞質凝集、および誤って折り畳まれ、ユビキチン化した膜貫通タンパク質（例えば、プレセニリン−１または嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンスレギュレーター）の分解に関与する別の種類のアグリソームと対照的である（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１４３：１８８３−１８９８（１９９８））。ＧＦＰ−ｐ１１５キメラの過剰発現は、間違ったＧｏｌｇｉ位置を引き起こすが、ｐ１１５タンパク質の正常なＥＲ−Ｇｏｌｇｉ輸送を伴う。これらの研究において、伸長されたポリＱ反復を有するアタキシン−２の非Ｇｏｌｇｉ局在化が、細胞培養物において観測された。この観測は、ヒトＳＣＡ２ニューロンにおけるアタキシン−２の観測された蓄積とともに、野生型アタキシン−２およびそのインタラクター（Ａ２ＢＰ１）（Ｓｈｉｂａｔａら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，９：１３０−１３１３（２０００））がともにＧｏｌｇｉタンパク質であるという事実とともに、アタキシン−２が、ユビキチン化されず、他のポリＱタンパク質のように分解しないというモデルを支持する。
【０１３０】
これらの結果は、形態学的神経変性表現型が、５８ポリグルタミン反復を有するヒトＳＣＡ２を発現するトランスジェニックマウスにおいて示されることを示す。これらの結果はまた、核内局在化が、全てのクラスのポリＱ病原または疾患進行に必要であるわけではないことを示す。アタキシン−２の細胞質局在化および微小凝集または蓄積が、プルキンエ細胞病因を引き起こすというこの知見は、ＳＣＡ２を、タンパク質凝集が細胞質において生じる、より大きな群の神経変性疾患（例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびＳＣＡ６）にする（Ｍｅｚｅｙら、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，３：４９３−４９９（１９９８）；Ｌｉｐｐａら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，１５３：１３６５−１３７０（１９９８）；Ｉｓｈｉｋａｗａら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、８：１１８５−１１９３（１９９９））。従って、ＳＣＡ２（５８）トランスジェニックマウスは、他の神経変性疾患に対する動物モデル（細胞質対核凝集機構を含む、神経変性疾患における類似性および差異を特徴付けるための研究を含む）として機能し得る。
【０１３１】
本出願を通じて、種々の刊行物が参照されている。これらの刊行物のそれらの全体における開示は、本明細書によって、本発明が関係する技術の状態をより十分に記載するために、本出願において参考として援用される。
【０１３２】
本発明は、上に提供される実施例を参照して記載しているが、種々の変更が、本発明の精神から逸脱することなくなされ得ることが理解されるべきである。従って、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、アタキシン−２の概略的なマップを示す。アタキシン−２は、１，３１２アミノ酸を有するタンパク質である。酸性ドメイン（アミノ酸２５６〜４０５）、２つのＲＮＡ結合モチーフ、命名されたＳｍ１（アミノ酸２３０〜２３３）およびＳｍ２（アミノ酸２８３〜２８６）、推定カスパーゼ−３認識部位（アミノ酸３９６〜３９９）、ならびにクラスリン媒介分類シグナル（アミノ酸４１４〜４１６）（これは、ＥＲ脱出（ｅｘｉｔ）シグナルの下流に存在する）の位置を示す。２つのペプチド（ＳＣＡ２ＡおよびＳＣＡ２Ｂ）（抗体が産生される）の位置もまた示す。
【図２】図２は、５８ポリグルタミン反復を有するヒトアタキシン−２を発現するトランスジェニックマウス株における機能の喪失を示す。図２ａは、野生型およびアタキシン−２トランスジェニックマウスのフットプリント分析を示す。図２ｂは、野生型マウス、５８ポリグルタミンを発現するホモ接合型トランスジェニックマウスおよびヘテロ接合型トランスジェニックマウス（Ｑ５８−１１系統）のローターロッド分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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