(57)【要約】本発明はＩＢＤの治療に有用な化合物を特定する方法を提供する。該方法は、３ＯＳＴ４の活性または量を調節する能力について該化合物をアッセイすることを含む。該アッセイは、３ＯＳＴ４を発現する細胞株を用いるかまたは精製３ＯＳＴ４タンパク質を用いる３ＯＳＴ４活性の測定、および３ＯＳＴ４を発現する細胞株での３ＯＳＴ４の転写または翻訳の測定から選択される。本発明はまた、医薬組成物の製造方法、ＩＢＤに対する感受性を測定するための診断方法、ＩＢＤまたはその素因の診断方法、および３ＯＳＴ４の活性または量を調節することができる化合物のＩＢＤ治療用医薬の製造における使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３ＯＳＴ４の活性または量を調節する化合物の能力について該化合物をアッセイすることを含む、ＩＢＤの治療に有用な化合物を特定する方法。
【請求項２】
アッセイが、
ｉ）３ＯＳＴ４を発現する細胞株を用いるか、または精製３ＯＳＴ４タンパク質を用いる３ＯＳＴ４活性の測定；および
ii）３ＯＳＴ４発現細胞株における３ＯＳＴ４の転写または翻訳の測定
から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
３ＯＳＴ４の活性が、35Ｓ標識３’ホスホアデノシン５’ホスホサルフェートおよび非標識硫酸へパリンとともに３ＯＳＴ４をインキュベートした後に硫酸へパリンの35Ｓ標識の測定を基にする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
３ＯＳＴ４の転写または翻訳の測定に用いられるアッセイが、
ｉ）３ＯＳＴ４ｍＲＮＡの量の測定；
ii）３ＯＳＴ４タンパク質の量の測定；または
iii）３ＯＳＴ４発現細胞における３ＯＳＴ４活性の測定
のいずれかから選択される請求項２に記載の方法。
【請求項５】
３ＯＳＴ４がヒトのリコンビナント３ＯＳＴ４である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
３ＯＳＴ４プロモーターの活性をレポーター遺伝子系を用いて測定する請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
３ＯＳＴ４プロモーターがヒト３ＯＳＴ４プロモーターである請求項６に記載の方法。
【請求項８】
以下の工程：
ｉ）請求項１〜７のいずれか一項に記載された方法にしたがってＩＢＤの治療に有用な化合物を特定し；そして
ii）化合物または医薬的に許容できるその塩を医薬的に許容できる賦形剤または希釈剤と混合する
ことを含む医薬組成物の製造方法。
【請求項９】
ＢＡＣ５０４Ｎ１９（ＥＭＢＬ ＡＦ２６５３４０）、ＢＡＣ Ａ−２４９Ｂ１０（ＥＭＢＬ ＡＣ００２２８８）またはＢＡＣ ＲＰ１１−４５１Ｎ２０（ＥＭＢＬ ＡＣ０６０
７８５）に一致する染色体フラグメントに存在する多型マーカーの対立遺伝子の有無について患者から得たＤＮＡサンプルを分析することを含む、ＩＢＤに対する感受性を判定する診断方法。
【請求項１０】
３ＯＳＴ４に対して向けられる自己抗体を測定することを含むＩＢＤまたはその素因の診断方法。
【請求項１１】
ＩＢＤ治療用医薬の製造における３ＯＳＴ４の活性または量を調節することができる化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＩＢＤの治療に有用な化合物を特定する方法、医薬組成物の製造方法、ＩＢＤに対する感受性を測定するための診断方法、ＩＢＤまたはその素因の診断方法、および３ＯＳＴ４の活性または量を調節することができる化合物のＩＢＤ治療用医薬の製造における使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は胃腸管の慢性再発性の腸炎症を特徴とする。ＩＢＤは欧米の国々で１０００人に約１人が罹患し、平均発症年齢は成人初期である。今日まで該疾患の病因は不明である。臨床的および病理組織学的特色に基づいて、ＩＢＤは以下の２つの主なサブタイプに分類される：クローン病（ＣＤ）（ＮＣＢＩの利用可能なジョンズホプキンス大学作製データベース、オンラインヒトメンデル遺伝（On Line Mendelian Inheritance in Man）OMIM 266600）および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）（OMIM 191390）。ＩＢＤの原因は不明であるが、該疾患の家族内集団発生および一卵性双生児における一致の増加は強い遺伝的感受性をを示している。兄弟内発症の危険率の推定値（λｓ）は１０〜５０の範囲であり、遺伝的因子がＩＢＤ素因に重要な役割を果たすことを示唆している。疫学的データによれば、ＩＢＤは、環境因子と同様に多くの感受性遺伝子によって惹起される多因子性異常であると考えられる。本発明ではＩＢＤという用語は、クローン病および潰瘍性大腸炎に加えてＩＢＤも含むことを意図している。
【０００３】
以前のゲノムワイドな連鎖解析によってＩＢＤに対する多数の感受性遺伝子座、例えばＩＢＤ１（OMIM 2666000）（Hugot et al. 1996; Brant et al. 1998; Curran et al. 1998; Hampe et al. 1999a）、ＩＢＤ２（OMIM 601458）（Duerr et al. 1998; Parkes et al. 2000）、ＩＢＤ３（OMIM 604519）（Hampe et al. 1999b）、ＩＢＤ７（OMIM 605225）（Cho et al. 1998; Cho et al. 2000）が特定された。ＩＢＤ１遺伝子座は、ヒト染色体１６のペリセントロメア領域に位置し、１６ｐ１２−ｑ１３領域にマッピングされる。
【０００４】
硫酸ヘパランＤ−グルコサミニル３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ−４（３ＯＳＴ４）は硫酸ヘパランＤ−グルコサミニル３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼイソ酵素群に属する。この群の５つのメンバー、３ＯＳＴ１、３ＯＳＴ２、３ＯＳＴ３Ａ、３ＯＳＴ３Ｂおよび３ＯＳＴ４がこれまでに特定された。単一コピー遺伝子が３ＯＳＴ１、３ＯＳＴ２および３ＯＳＴ４をコードし、一方、３ＯＳＴ３Ａおよび３ＯＳＴ３Ｂは、各々少なくとも２つの遺伝子によってコードされるといわれている（Shworak et al. 1997; Shworak et al. 1999; WO99/22005）。
【０００５】
硫酸ヘパランは、Ｎ−アセチルグルコサミンと（１−４）結合したグルクロン酸を含む二糖類ユニットの長い繰返しとして先ず初めに合成されるグルコサミノグリカンである（［ＧｌｃＡ（１−４）ＧｌｃＮＡｃ（１−４）］ｎ）。これらのＧＡＧ鎖は、ヘパリンスルホトランスフェラーゼによって触媒される一連の順序をもつ改変を受ける。
【０００６】
したがって、３ＯＳＴ酵素は、カーボハイドレートスルホトランスフェラーゼ類に属し、そのうちの１つの群がヘパリンスルホトランスフェラーゼである。硫酸ヘパラン（ＨＳ）および他のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のカーボハイドレートスルホトランスフェラーゼによる改変は、成熟プロテオグリカンの生物物理学的特性の大部分を決定し、きわめて特異的な生物学的機能をこれら複雑な分子に付与する。そのような改変は、広範囲の生物学的機能、例えば細胞接着、増殖因子およびケモカイン活性の改変、脈管形成並びに血液凝固に中心的に関わる。さらにまた、ある種の硫酸化は、ウイルスレセプターにより認識される特異的認識エピトープに影響を与え、したがって宿主細胞へのウイルスの侵入を仲介またはこれに寄与することが示された（Bowman and Bertozzi, 1999; Sasisekharan and Venkataraman, 2000(概説); Shukla et al. 1999）。
【０００７】
例えば、ヘパリン（もっぱらマスト細胞によって合成される複合体ＧＡＧ）は明瞭な五糖類エピトープを含み、該エピトープはアンチトロンビンと結合して構造変化をもたらす。該構造変化はトロンビンに対し高い親和性を有する結合部位を出現させて該酵素の抑制をもたらし、したがって血液凝固プロセスを停止させる（Rosenberg and Damus, 1973）。ヘパリン内のアンチトロンビン結合部位の親和性は、五糖類エピトープ内の３−Ｏ−硫酸化Ｎ−スルホグルコサミンに決定的に依存する（Rosenberg et al. 1997）。３−Ｏ−硫酸化は、ヘパリンのアンチトロンビン結合エピトープの生合成における最終工程であり律速工程であることが示され、そして３ＯＳＴ１によって触媒される（Shworak et al. 1996; Shworak et al. 1997）。３ＳＯＴイソ酵素の特異的で他と明瞭に区別される機能は、３ＯＳＴ１のみがＨＳを改変しアンチトロンビンとの結合を可能にし（Liu et al. 1999）、３ＯＳＴ３のみが、ＨＳ依存単純疱疹ウイルス１型の侵入に必要なＮ−アセチルグルコサミンの３−Ｏ−硫酸化を触媒するという事実によって明らかにされる(Shukla et al. 1999)。
【０００８】
硫酸ヘパランプロテオグリカンへの増殖因子の結合もまたＧＡＧ内の特定の硫酸化エピトープに依存する（Faham et al. 1996）。さらにまた、いくつかのウイルスは、細胞との結合および／またはウイルスの侵入のために硫酸ヘパランプロテオグリカン上の特定の部位を利用する。最近になってShukla et al.（1999）は、硫酸ヘパラン鎖の特定のＮ−アセチルグルコサミン残基の３−Ｏ−硫酸化（３ＯＳＴ３によって触媒される）は、単純疱疹ウイルス１型の硫酸ヘパラン依存性侵入に必要であることを報告した。
【０００９】
ヘパランスルホトランスフェラーゼは、３’−ホスホアデノシン５’−ホスホサルフェート（ＰＡＰＳ）を活性化サルフェートドナーとして利用する。３ＯＳＴアイソフォームの基質特異性はLiu et al.(1999)が研究し、これらの特異性が、３ＯＳＴイソ酵素によって付与される明瞭な生物学的作用を説明する。
【００１０】
３ＯＳＴイソ酵素の組織分布は異なっている。本明細書に提示したデータより以前では、３ＯＳＴ４の発現は脳でのみ見出されていたが、３ＯＳＴ１および３ＯＳＴ３イソ酵素はより広範囲に分布していた（Shworak 1999）。さらにまた、３ＯＳＴイソ酵素の発現は胃腸組織では調べられてなかった。
【００１１】
これまでのところ、３ＯＳＴ４によって改変されたＨＳ／ＧＡＧに帰せられる特異的な機能は存在していない。ＩＢＤの病因におけるＨＳまたは他のＧＡＧの特異的な関与については不明である。しかしながら、これら疾患における主要な発症メカニズムの仮説は、宿主と微生物との相互反応、粘膜の免疫反応および上皮機能（例えば本来の免疫反応および上皮のバリヤー機能）の混乱を含む。硫酸化ＧＡＧが多様な生物学的反応（免疫反応、増殖および治癒プロセスの制御並びに細胞−細胞相互作用を含む）において有する基本的な役割は、ＧＡＧ関連機能の破壊がＩＢＤの病因に関与するいくつかの可能性を指し示している。
【００１２】
本発明は、３ＯＳＴ４遺伝子のきわめて近傍の染色体１６上の領域に位置する遺伝的マーカーに関連するＩＢＤの遺伝的素因の発見に基づいている。３ＯＳＴ４の活性または量を調節することができる化合物を使用することが、本発明によるＩＢＤ治療の新規な治療概念として確認された。３ＯＳＴ４遺伝子の配列分析はＩＢＤに対する感受性の新規な診断方法を提供するであろう。
【発明の開示】
【００１３】
本発明の特徴の１つにしたがえば、ＩＢＤ治療のために３ＯＳＴ４の活性または量を調節することができる化合物の使用が提供される。化合物による３ＯＳＴ４の量の調節は、例えば遺伝子発現レベルまたはメッセージの安定性の変更によって達成することができる。化合物による３ＯＳＴ４の活性の調節は、例えば化合物を３ＯＳＴ４タンパク質に結合させることによって達成できる。ある実施態様では、３ＯＳＴ４の調節は、３ＯＳＴ４の活性または量を減少させることができる化合物を含む。別の実施態様では、３ＯＳＴ４の調節は、３ＯＳＴ４の活性または量を増加させることができる化合物を含む。３ＯＳＴ４の活性を調節することができる化合物の例は抗体である。抗体は任意の適当な方法を用いて調製することができる。例えば、精製ポリペプチドを利用して特異的抗体を調製することができる。“抗体”という用語はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および種々のタイプの抗体構築物、例えばＦ(ａｂ’)2、Ｆａｂおよび単鎖Ｆｖを含むことを意図する。抗体は、約１０7Ｍ-1より大きいかまたは等しいＫaでＳＬＣ１０Ａ２の対立遺伝子変異体と結合する場合は特異的に結合すると定義される。結合親和性は、通常の技術（例えば文献（Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660(1949)に記載された技術）を用いて決定することができる。
【００１４】
ポリクローナル抗体は、多様な供給源（例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、ラット）から当分野で周知の方法を用いて容易に作製することができる。一般に、抗原は宿主動物に典型的には腹腔注射により投与される。抗原の免疫原性は、アジュバント（例えばフロイントの完全または不完全アジュバント）を使用することによって高めることができる。ブースター免疫の後で、少量の血清サンプルを採集し、抗原に対する反応性を検査する。前記決定に有用な種々のアッセイの例には、以下の文献に記載されたもの（Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988）の他に、例えば反電流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、放射性イムノアッセイ、放射性免疫沈澱、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイおよびサンドイッチアッセイ（米国特許第4,376,110号および4,486,530号を参照されたい）のような方法が含まれる。
【００１５】
モノクローナル抗体は周知の方法を用いて容易に製造できる。例えば以下の文献に記載された方法を参照されたい：米国特許RE32,011号、4,902,614号、4,543,439号および4,411,993号；Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn and Bechtol (eds.), (1980)。
【００１６】
本発明のモノクローナル抗体はまた別の技術、例えばAlting-Mees et al.が記載した技術（“Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3:1-9(1990)、この文献は参照により本明細書に含まれる）を用いて製造することができる。同様に、結合パートナーはリコンビナントＤＮＡ技術を用いて構築し、特異的な結合抗体をコードする遺伝子の可変領域を取り込むことができる。そのような技術はLarrick et al.が記載している（Biotechnology, 7:394(1989)）。
【００１７】
いったん単離し精製したら、この抗体を用いて、確立されたアッセイプロトコルによりサンプル中の抗原の存在を検出することができる（例えば以下を参照されたい：“A Practical Guide to ELISA" , D.M. Kemeny, Pergamon Press, Oxford, England）。
【００１８】
本発明の別の特徴にしたがえば、３ＯＳＴ４の活性または量を調節することができる化合物のＩＢＤ治療用医薬の製造における使用が提供される。
【００１９】
本発明のさらにまた別の特徴にしたがえば、ＩＢＤの治療に潜在的に有用な化合物を特定する方法が提供される。該方法は、３ＯＳＴ４の活性または量を調節するその能力について化合物をアッセイすることを含む。好ましくは該アッセイは以下：
ｉ）３ＯＳＴ４を発現する細胞株を用いるか、または精製３ＯＳＴ４タンパク質を用いる３ＯＳＴ４活性の測定；および
ii）３ＯＳＴ４発現細胞株における３ＯＳＴ４の転写または翻訳の測定
から選択される。
【００２０】
被検化合物の３ＯＳＴ４の活性に対する効果を決定するために用いられるアッセイは、35Ｓ標識ＰＡＰＳ（３’ホスホアデノシン５’ホスホサルフェート）および非標識硫酸ヘパリンとともに３ＯＳＴ４をインキュベートした後で硫酸へパリンの35Ｓ標識を測定することにより達成することができる。
【００２１】
被検化合物の３ＯＳＴ４の転写または翻訳に対する効果を決定するために用いられるアッセイは以下：
ｉ）例えばノザンブロット分析または定量的リアルタイムＰＣＲを用いる生成３ＯＳＴ４ｍＲＮＡの量の測定；
ii）例えばウェスタンブロット分析または免疫化学的分析（例えばＥＬＩＳＡ）を用いる生成３ＯＳＴ４タンパク質の量の測定；または
iii）３ＯＳＴ４発現細胞での３ＯＳＴ４活性の上記に述べたような測定
を基にすることができる。
【００２２】
アッセイで用いられる細胞は３ＯＳＴ４を天然に発現している細胞でも、またリコンビナント３ＯＳＴ４を発現するトランスフェクト細胞でもよい。好ましくは３ＯＳＴ４はヒトリコンビナント３ＯＳＴ４である。
３ＯＳＴ４は多様な宿主、例えば細菌、植物細胞、昆虫細胞、真菌細胞並びにヒトおよび動物細胞で発現させることができる。真核リコンビナントホスト細胞が特に好ましい。例としては、酵母、哺乳類細胞（ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類起源の細胞株を含む）、および昆虫細胞（ショウジョウバエおよびカイコに由来する細胞株を含む）が含まれる。市販されている使用可能な哺乳類種由来の細胞株には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ATCC CCL1.3）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ATCC CCL1.2）、ＨＥＫ２９３（ATCC CRL1573）、Ｒａｊｉ（ATCC CCL86）、ＣＶ−１（ATCC CCL70）、ＣＯＳ−１（ATCC CRL1650）、ＣＯＳ−７（ATCC CRL1651）、ＣＨＯ−Ｋ１（ATCC CCL61）、３Ｔ３（ATCC CCL92）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ATCC CRL1658）、ＨｅＬａ（ATCC CCL2）、Ｃ１２７Ｉ（ATCC CRL1616）、ＢＳ−Ｃ−１（ATCC CCL26）およびＭＲＣ−５（ATCC CCL171）が含まれる。
【００２３】
以下を含む多数の方法のいずれかを用い、３ＯＳＴ４をコードする核酸を含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、本発明のポリペプチドを発現させることができる：リン酸カルシウムによる形質転換、ＤＥＡＥ−デキストランによる形質転換、陽イオン脂質仲介リポフェクチン、電気穿孔または感染。
【００２４】
トランスフェクトした宿主細胞を増殖させ、例えば制限希釈によってクローニングし、さらにリコンビナント３ＯＳＴ４の発現レベルを決定するために分析する。３ＯＳＴ４を発現する形質転換された宿主細胞の同定は、抗体との免疫学的反応性および／または本明細書に述べるアッセイによる生物学的活性の検出を含むいくつかの手段によって達成できる。
【００２５】
リコンビナントヒト３ＯＳＴ１は、ＣＭＶプロモーターの制御下でＣＯＳ−７細胞で一過性に発現された。該発現タンパク質（天然の完全長型およびプロテイン−Ａ付加型の両方）は完全な活性を有することが見出され、へパリングルコサミンユニットの３−Ｏ−位へのサルフェートの移転をもっぱら触媒した（WO99/22005）。
【００２６】
遺伝子発現の転写の調節は転写因子の結合を支配し、それによって遺伝子の転写を仲介するプロモーター中の特定のＤＮＡエレメントによって仲介される。真核生物の転写因子は以下の２つの主な群に分けることができる。ｉ）転写開始部に近位のプロモーター配列と相互作用し、それによってＲＮＡポリメラーゼＩＩが補充されたとき転写を開始させる基礎転写因子、およびii）特定の遠位プロモーターエレメントに結合し、それによって基礎転写機構と接触したときに転写を仲介する転写因子。真核生物における基礎的な生理学的プロセスは、細胞がその環境とコミュニケーションをもち、シグナリング分子（例えばホルモンおよび増殖因子）を介して細胞外刺激に対して反応することができるということである。そのようなシグナリングのための最終事象は、特定の遠位プロモーターエレメントと転写因子との結合であり、これは、例えば遺伝子発現のアップレギュレーションまたは組織特異的遺伝子の発現をもたらす。それらプロモーターエレメントの調節的な役割のために、プロモーターエレメントは治療薬剤スクリーニングのための仮定的標的である。ヒト３ＯＳＴ４プロモーター配列（本出願に開示）は、３ＯＳＴ４の転写を選択的に調節する治療薬剤のスクリーニングを可能にする。
【００２７】
適当な宿主細胞は、３ＯＳＴ４を発現することが判明している細胞、または３ＯＳＴ４の転写に影響を与えることができる転写因子を発現することが判明している細胞である。好ましくは、特定の転写因子をコードするＤＮＡをトランスフェクトされた宿主細胞を用いて、特定の転写因子と３ＯＳＴ４プロモーターとの相互作用を調べることができる。
【００２８】
被検化合物の３ＯＳＴ４の転写に対する効果を判定するために用いられるアッセイは、レポーター遺伝子系を用いる３ＯＳＴ４プロモーターの活性の測定を基準にすることができる。該レポーター遺伝子系は３ＯＳＴ４プロモーターを構成する核酸分子またはそのフラグメントを含む発現系であり、該発現系はさらにレポーター遺伝子を含む。これらプロモーターおよびレポーター遺伝子は、レポーター遺伝子の発現が３ＯＳＴ４プロモーターによって調節されるように配置されている。生成されるレポータータンパク質の量は、３ＯＳＴ４プロモーターの活性の指標として用いられる。
好ましくは３ＯＳＴ４プロモーターはヒト３ＯＳＴ４プロモーター、好ましくは配列番号：３のヌクレオチド配列１−１０７７９、またはそのフラグメントである。
【００２９】
レポーター遺伝子系の構築に用いることができる適当なレポーター遺伝子は、例えばホタルのルシフェラーゼ遺伝子、細菌のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ（β−ＧＡＬ）遺伝子、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子である。
【００３０】
本発明の別の特徴にしたがえば、以下の工程を含む医薬組成物の製造方法が提供される：
ｉ）本明細書に記載される方法にしたがってＩＢＤの治療に有用な化合物を特定し；さらに
ii）該化合物または医薬的に許容できるその塩を医薬的に許容できる賦形剤または希釈剤と混合する。
【００３１】
本発明のさらに別の特徴では診断方法が提供される。該方法は、患者から得られたＤＮＡサンプルで染色体１６の配列またはその一部分をＩＢＤに対する感受性の判定のために分析することを含み、さらにＢＡＣ ５０４Ｎ１９（ＥＭＢＬ ＡＦ２６５３４０）、ＢＡＣ Ａ−２４９Ｂ１０（ＥＭＢＬ ＡＣ００２２８８）またはＢＡＣ ＲＰ−１１−４５１Ｎ２０（ＥＭＢＬ ＡＣ０６０７８５）に一致する染色体フラグメントに存在する多型マーカーの対立遺伝子の有無を判定することを含む。好ましくは、該方法は、患者から得られたＤＮＡサンプル中の３ＯＳＴ４遺伝子またはその部分の配列をＩＢＤに対する感受性の判定のために分析することを含み、さらに患者の３ＯＳＴ４遺伝子に存在する多型マーカーの対立遺伝子の有無を判定することを含む。
【００３２】
本発明のまた別の特徴では、３ＯＳＴ４タンパク質上の自己免疫エピトープに対する免疫反応を調節する方法が提供される。好ましくは、本方法は免疫学的耐性を誘発する方法を含む。免疫学的耐性は、例えば自己抗原と結合させたV. cholera由来のコレラ毒素（ＣＴ）のＢサブユニットまたは大腸菌（E. coli）由来の易熱性毒素（ＬＴ）を用いた経口免疫によって誘発することができる（Simons et al. 2001）。
【００３３】
自己免疫反応は多数の炎症性疾患、例えば慢性関節リウマチ、膵炎および多発性硬化症の原因であることが判明している。
本発明のまた別の特徴では、３ＯＳＴ４タンパク質に対して向けられる自己抗体の測定を含むＩＢＤの診断方法が提供される。
【００３４】
略語
硫酸ヘパランＤ−グルコサミニル３−Ｏ−スルホトランスフェラーゼ−４：３ＯＳＴ４
罹患兄弟ペア：ＡＳＰ
細菌性人工染色体：ＢＡＣ
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ：ＣＡＴ
クローン病：ＣＤ
センチモルガン：ＣＭ
コレラ毒素：ＣＴ
グリコサミノグリカン：ＧＡＧ
緑色蛍光タンパク質：ＧＦＰ
硫酸ヘパラン：ＨＳ
炎症性腸疾患：ＩＢＤ
易熱性毒素：ＬＴ
オンラインヒトメンデル遺伝：ＯＭＩＭ
３’−ホスホアデノシン５’−ホスホサルフェート：ＰＡＰＳ
ペディグリー不平衡検査（Pedigree disequilibrium test）：ＰＤＴ
配列付加部位：ＳＴＳ
伝達不平衡検査：ＴＤＴ
潰瘍性大腸炎：ＵＣ
【００３５】
以下の非限定的実施例を用いて本発明をこれから説明する。図１に、該実施例において調べた染色体領域マップを示す。
アンプリタック（AMPLITAQ（登録商標））（Perkin-Elmer Cetusから入手できる）が耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの供給源として用いられる。
以下の文献に記載されている方法のいずれかに由来する一般的な分子生物学的方法にしたがうことができる：“Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Second Edition, Sambrook, Fritsch and Maniatis ( Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) または“Current Protocols in Molecular Biology Vol.1-3, F.M. Asubel, R. Brent and R.E. Kingston (eds), John Wiley発行, 1998。
【実施例１】
【００３６】
本発明者らは、ＳＴＳマーカーおよび未だ公表されていない単一ヌクレオチド多型による高密度遺伝子型決定を用い、続いて標準的な手順の連鎖不平衡検査（Terwillinger, 1995）にしたがって、ＩＢＤ１に関する感受性遺伝子を含む領域の範囲を物理的距離で約７Ｍｂと限定した。ＳＴＳマーカー、Ｄ１６Ｓ４０１およびＤ１６Ｓ４０９とそれぞれ隣接する領域全体に及ぶＴＤＴ検査によって（合計３２マーカー（１３のＳＴＳおよび１９のＳＮＰ）を用いた）最初の連鎖データが確認され、さらに２つの部位における連鎖のゆがみが明らかにされた。本発明者らのデータは、ＩＢＤ１に対する感受性遺伝子が、Ｄ１６Ｓ４０１およびＤ１６Ｓ４０９に隣接する領域におそらく位置することを示した。
【００３７】
１.１  家族確認および表現型：
患者は以下の施設でＩＢＤプログラムから募集された：Charite University Hospital (Berlin)およびthe Ist Department of Medicine at the Christian-Albrechts-University of Kiel。ＩＢＤと診断された２人以上の罹患兄弟を有する小児をサンプルとし、２５０を越える罹患兄弟ペアーが本分析に含まれた。書面によるインフォームドコンセントを全ての研究参加者から得た。募集プロトコルは院内の監査委員会で承認された。ＩＢＤの診断およびＣＤおよびＵＣにおける分類は、Lennard-Jones（1989）およびPodolsky（1991）が記載した標準的な診断基準によって判定した。患者は１人または２人以上の研究責任者が直接診察した。また別には詳細な病歴および全ての診断過程の結果を記載した２つの記録書を各患者について入手し、研究責任者が概覧した。静脈血サンプルを罹患兄弟および可能な場合には両親から得た。
【００３８】
１.２  遺伝子型決定：
ピュアージーンシステム（Puregene System）, Gentra Systems）を用いて全血サンプルからゲノムＤＮＡを調製した。個々のＤＮＡサンプルを９６ウェルのマイクロタイタープレートに並べ、個々のマーカーアンプリコンを用いてＰＣＲ増幅を実施した。マイクロサテライトマーカーを Hall and Nanthakumar (1997) に記載されたように蛍光法で遺伝子型決定した。データは、ＡＢＩ３７７自動配列決定装置を用いて収集し、データ分析はＧＥＮＥＳＣＡＮ（バージョン２.１）およびＧＥＮＯＴＹＰＥＲ（バージョン１.１.１）を用いて実施した。対立遺伝子分析および個々の対立遺伝子コーリングは、Hall and Nanthakumar (1997) およびIdury and Cardon (1997)が記載したように実施した。ＳＮＰはＡＢＩ３７００自動配列決定装置、ｃＤＮＡ選別および変異検出方法を用いてゲノム配列決定によって特定した。情報量の多いＳＮＰの遺伝子型決定は、タックマン（TAQMAN（登録商標））技術（PE Biosystems）を用いるリアルタイムＰＣＲによって実施した。ＰＣＲ反応はＡＢＩ９７００で実施し、蛍光の結果はＡＢＩ７７００シークェンス−ディテクターシングルポイント測定を用いて判定した。対立遺伝子分析および個々のアレルコーリングは、Hall and Nanthakumar (1997)の記載にしたがって実施した。遺伝子マップは自動マッピングプログラムＭＵＬＴＩＭＡＰ（バージョン２.０、Matise et al. 1994）を用いて構築した。得られたマーカー間の距離（Kosambiマップアルゴリズムによって決定）はセンチモルガン（ｃＭ）で示される。
【００３９】
１.３  遺伝解析：
遺伝解析は前述の２つの標準的診断カテゴリー、ＣＤおよびＵＣを使用して実施した。第三のカテゴリー、ＡＬＬはＣＤ／ＣＤ、ＵＣ／ＵＣおよびＣＤ／ＵＣ（混合ＡＳＰ）を含み、したがってＩＢＤを分析用単一表現型として表す。各マーカーの対立遺伝子頻度は全ての個体についてコホート遺伝子型決定データから計算した。関連の統計はＡＮＡＬＹＺＥソフトウェアパッケージのＴＤＴＬＩＫＥプログラムによって計算した（Terwilliger 1995）。検査する対立遺伝子は１０人以上に観察された伝達に限定される。プログラムアルゴリズムは多数の対立遺伝子の検査について修正されたｐ値を提供する。
【００４０】
Ｄ１６Ｓ４０１およびＤ１６Ｓ４０９間の領域のマーカー（１ＳＴＳ，３ＳＮＰ）に関する配列情報
2004534530.tif 000002
【００４１】
ＩＢＤの２００罹患兄弟ペア（ＡＳＰ）の１６ｐ上の陽性マーカーに対するＴＤＴの結果ａ）ＴＤＴＬＩＫＥ（Terwilliger, 1995）
【表１】
2004534530.tif 000003
対立遺伝子ＧはＳＴＳ(ＣＡ)nのリピートである。
対立遺伝子ＡおよびＢは、上記で述べたＳＮＰ位置での対立遺伝子の１つを示す。
【００４２】
ｂ）ＰＤＴ（Martin et al. 2000）
【表２】
2004534530.tif 000004
もっとも強い関連がＤ１６Ｓ３０６８マーカーについて認められた。
【００４３】
１.４  生物情報科学：
染色体１６に由来する３つのヒトＢＡＣ、マーカーＤ１６Ｓ３０６８を含むＲＰ１１−４５１Ｎ２０（ＥＭＢＬ ＡＣ０６０７８５）、５０４Ｎ１９（ＥＭＢＬ ＡＦ２６５３４０）、２４９Ｂ１０（ＥＭＢＬ ＡＣ００２２８８）を潜在的疾患関連遺伝子について解析した。３ＯＳＴ４ ｃＤＮＡ（ＥＭＢＬ ＡＦ１０５３７８）配列と一致する配列の部分がＢＡＣ ＲＰ１１−４５１Ｎ２０（ＥＭＢＬ ＡＣ０６０７８５）で見出された。このＢＡＣの配列（１４の順不同のフラグメントを含む）をさらに分析し、３ＯＳＴ４遺伝子のエキソン１およびエキソン２を含むことが見出された。さらにまた、３ＯＳＴ４のプロモーター配列を含む１０ｋｂｐフラグメントがこれらフラグメント１つで特定された。
【００４４】
１.５  発現の分析：
３ＯＳＴ４の発現は、タックマン（TAQMAN（登録商標））技術（PE Biosystems）を用いるリアルタイムＰＣＲによって測定した。ＩＢＤ患者の大腸の生検から調製したｍＲＮＡと同様に種々のヒトの組織から調製したｍＲＮＡパネルを用いてｃＤＮＡサンプルを調製した。３ＯＳＴ４ｃＤＮＡの３’非翻訳部分のフラグメントを特異的に増幅するが、他の高度に相同な３ＯＳＴイソ酵素のｃＤＮＡとは結合しないプライマーをデザインする。
【００４５】
上記に述べた技術を用いて、３ＯＳＴ４ｍＲＮＡをＩＢＤ患者およびコントロールのヒト腸組織から調製した材料で検出した。３ＯＳＴ４ｍＲＮＡはまた、ヒト胃腸組織に由来する市販サンプル（ｃＤＮＡパネル）でも検出された。さらにまた、３ＯＳＴ４ｍＲＮＡの存在はヒト腸細胞株でも検出された。これらの細胞株では、炎症性刺激が３ＯＳＴ４ｍＲＮＡをダウンレギュレートすることが見出された（下記表を参照されたい）。
【００４６】
【表３】
2004534530.tif 000005
【００４７】
１.６  完全な３ＯＳＴ４遺伝子のクローニングおよび配列決定：
３ＯＳＴ４ｃＤＮＡ配列に由来するプライマーを用いてＰＣＲ分析によってＢＡＣをスクリーニングする。陽性ＢＡＣの配列を決定し、３ＯＳＴ４遺伝子配列の存在について分析する。３ＯＳＴ４遺伝子のエキソン／イントロン構造を明らかにし、さらにプロモーター配列、近位部および遠位部を特定する。
【００４８】
１.７  ３ＯＳＴ４遺伝子中のＳＮＰの特定：
３ＯＳＴ４遺伝子のプロモーター領域とともにエキソンに隣接するＤＮＡ配列を基にしてＰＣＲプライマーを構築する。ＰＣＲ増幅の後で、２３人のＩＢＤ罹患個体および２０人の正常コントロールから得られたゲノムＤＮＡサンプル由来のエキソンおよびプロモーター領域の配列を決定する。１０％を越える個体に存在する配列の変種を特定し、上記で述べたタックマン（登録商標）技術を用いてコホートの残りのＳＮＰの遺伝子型決定のために選択する。
【００４９】
１.８  患者のＩＢＤ感受性を診断する方法：
患者からＤＮＡサンプルを得る。１つまたは２つ以上の多型マーカーの対立遺伝子の有無（該マーカーはＩＢＤに対する感受性増加に関連する）を、例えばタックマン（登録商標）技術を用いて判定する。
【００５０】
１.９  ３ＯＳＴ４アッセイ：
３ＯＳＴ４の活性に対する被検化合物の影響を判定するために用いられるアッセイは、35Ｓ標識ＰＡＰＳ（３’ホスホアデノシン５’ホスホサルフェート）および非標識硫酸ヘパリン（ＨＳ）とともに３ＯＳＴ４をインキュベートした後の硫酸へパリンの35Ｓ標識の測定を基にしている。
【００５１】
ＨＳスルホトランスフェラーゼ活性は以下で測定される：２００ｎＭの非標識ＨＳ、６０ｘ１０6ｃｐｍの35Ｓ−ＰＡＰＳ、５０ｍＭのＭＥＳ（Sigma）（ｐＨ７.０）、１０ｍＭのＭｎＣｌ2、５ｍＭのＭｇＣｌ2、７５μｇ／ｍＬの塩化プロタミン（Sigma）、１２０μｇ／ｍＬのウシ血清アルブミンおよび１％トリトンＸ−１００（ｖ／ｖ）、最終容積５０μＬ。反応混合物は３７℃で２時間インキュベートし、１００℃で２分加熱して反応を停止させ、さらに１４０００×ｇで２分回転させて不溶性物質を除去する。続いてサンプルを２００μＬのＤＥＡＥセファロースカラムに適用して35Ｓ−ＨＳを単離する。
【００５２】
ヘパランスルホトランスフェラーゼ活性は、標準的なアッセイ条件下でのＰＡＰＳからＨＳへのサルフェートの移転量と定義される。
【００５３】
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【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】染色体領域マップを示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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