(57)【要約】本発明は、ＶＲ１に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、相応するヌクレオチド−構築物、これを含有する細胞、医薬品及び診断剤、疼痛治療のためのその使用及びＶＲ１と関連する症状の診断方法及び疼痛を引き起こす物質を同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
図１，２，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５又は１６のいずれか１つの図中のサブポイント（ｂ）〜（ｊ）のいずれか１つに記載された１つ又は複数の塩基配列、又は前記の塩基配列から最大で１個の塩基が異なるが、その際に、この塩基の変異はサブポイント（ａ）に示された配列範囲には存在しない１つ又は複数の塩基配列を有するか又は前記の塩基配列に一致する、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
図１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５又は１６のいずれか１つの図中のサブポイント（ｂ）〜（ｊ）のいずれか１つに記載された１つ又は複数の塩基配列を有するか又は前記の塩基配列に一致する、オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
図１，２，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５又は１６のいずれか１つの図中のサブポイント（ｋ）に記載の１つ又は複数の塩基配列、又は前記の塩基配列から最大で２個の塩基が異なるが、その際に、この塩基の変異はサブポイント（ａ）に示された配列範囲には存在しない、有利に１つの塩基配列を有するか又は前記の塩基配列に一致する、オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
図１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５又は１６のいずれか１つの図中のサブポイント（ｋ）に記載された１つ又は複数の塩基配列を有するか又は前記の塩基配列に一致する、オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが１５〜３０ヌクレオチド、有利に１５〜２５ヌクレオチド、特に１７〜１９ヌクレオチド又は正確に１８ヌクレオチドの長さを有することを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
場合により１つの塩基が異なり、オリゴヌクレオチド中に含まれるオリゴヌクレオチドか又は前記のオリゴヌクレオチドに一致するオリゴヌクレオチドが、図１，２，３，４，９，１０，１１，１２，１５又は１６のいずれか１つの図の塩基配列から取り出すことができることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
場合により１つの塩基が異なり、オリゴヌクレオチド中に含まれるオリゴヌクレオチドか又は前記のオリゴヌクレオチドに一致するオリゴヌクレオチドが、図１，２，３，４，１１又は１２、有利に図１，３又は１１、特に図１又は３のいずれか１つの図の塩基配列から取り出すことができることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
少なくとも１つの修飾された又は修飾されていないリボース、少なくとも１つの修飾された又は修飾されていないホスホジエステル結合及び／又は少なくとも１つの修飾された又は修飾されていない塩基を有することを特徴とする、請求項１から７までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
ヌクレオチドの少なくとも１つ、特に複数のヌクレオチドが「ロックド核酸」（“ＬＮＡ”）であるか、又はヌクレオチドの少なくとも１つ、特に全てのヌクレオチドがホスホロチオエートであり、有利に複数のヌクレオチドが「ロックド核酸」（“ＬＮＡ”）であることを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
“ＬＮＡ”がオリゴヌクレオチドの５’−末端及び３’−末端にあり、有利にオリゴヌクレオチドの３’−末端及び５’−末端のそれぞれ最後の２〜５個のヌクレオチド、特にそれぞれ最後の３又は４個のヌクレオチドが“ＬＮＡ”であるか、
及び／又は
オリゴヌクレオチド中の６より多くの、特に８以上の連続するヌクレオチドが“ＬＮＡ”ではなく、有利に図１〜１６のいずれか１つの図に記載されたオリゴヌクレオチドの、それぞれサブポイント（ａ）に記載された配列範囲に示されたヌクレオチドの中で、サブポイント（ｂ）〜（ｋ）はそれぞれ多くても１つのヌクレオチドだけが“ＬＮＡ”であるか、又はそのヌクレオチドのどれもがＬＮＡではないことを特徴とする、請求項９記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
該当するオリゴヌクレオチドが請求項６又は７のいずれか１項記載の、有利に請求項７記載のオリゴヌクレオチドであることを特徴とする、請求項９又は１０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか１項記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを有する、ポリヌクレオチド−構築物。
【請求項１３】
２つの相互に別個の領域に、図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つの図中のサブポイント（ｌ）〜（ｎ）のいずれか１つに記載の、２つのヌクレオチド部分配列の断片Ｉ及び断片ＩＩＩを有するか、又はサブポイント（ｏ）〜（ｑ）のいずれか１つに記載の、２つのヌクレオチド部分配列のヘリックスＩ及びＩＩＩを有する、ポリヌクレオチド−構築物。
【請求項１４】
請求項１から７までのいずれか１項記載の、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド−構築物。
【請求項１５】
リボザイム、ＤＮＡ−酵素、ベクター、特に発現ベクター、又はＰＮＡであることを特徴とする、請求項１２から１４までのいずれか１項記載のポリヌクレオチド−構築物。
【請求項１６】
リボザイム、有利に「ハンマーヘッド」−リボザイム又はＤＮＡ−酵素、特にタイプ１０−２３又は１２−３２のＤＮＡ−酵素であることを特徴とする、請求項１３記載のポリヌクレオチド−構築物。
【請求項１７】
図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２又は１３のいずれか１つの図、
有利に図１，３，７又は１１、特に図１又は３のいずれか１つの図、又は
有利に図４，６，８又は１２、特に図４又は１２のいずれか１つの図中の、
サブポイント（ｌ）〜（ｎ）の１つ、有利に（ｎ）に記載されたヌクレオチド部分配列の断片Ｉ及び断片ＩＩＩを少なくとも含有するＤＮＡ−酵素であることを特徴とする、請求項１６記載のポリヌクレオチド−構築物。
【請求項１８】
図１，３，４，５，６，８，１１又は１２のいずれか１つの図、
有利に図１，３又は１１のいずれか１つ、特に図１１の図、又は
有利に図４，６，８又は１２、特に図４又は１２のいずれか１つの図中の、
サブポイント（ｏ）〜（ｑ）の１つ、有利に（ｏ）に記載されたヌクレオチド部分配列のヘリックスＩ及びヘリックスＩＩＩを少なくとも含有するリボザイムであることを特徴とする、請求項１６記載のポリヌクレオチド−構築物。
【請求項１９】
少なくとも１つの修飾された又は修飾されていないリボース、少なくとも１つの修飾された又は修飾されていないホスホジエステル結合及び／又は少なくとも１つの修飾された又は修飾されていない塩基を有することを特徴とする、請求項１２から１８までのいずれか１項記載のポリヌクレオチド−構築物。
【請求項２０】
担体、特にタンパク質、有利にｔｅｔ−、トランスポーチン又はフェリチンと結合しているか及び／又はリポソーム内に封入されていることを特徴とする、請求項１から１１までのいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１２から１９までのいずれか１項記載のポリヌクレオチド−構築物。
【請求項２１】
請求項１から１１までの又は２０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド及び／又は請求項１２から２０までのいずれか１項記載のポリヌクレオチド−構築物の少なくとも１つを含有する、細胞。
【請求項２２】
請求項１から１１までの又は２０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド、請求項１２から２０までのいずれか１項記載のポリヌクレオチド−構築物及び／又は請求項２１記載の細胞の少なくとも１つ、並びに場合により適当な助剤及び／又は添加剤を含有する、医薬品。
【請求項２３】
請求項６，７又は１１のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド、請求項６又は７記載のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドを有するベクター、及び／又は請求項１８記載のリボザイム又は請求項１７記載のＤＮＡ−酵素の少なくとも１つを含有する、請求項２２記載の医薬品。
【請求項２４】
請求項１から１１までの又は２０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド、請求項１２から２０までのいずれか１項記載のポリヌクレオチド−構築物及び／又は請求項２１記載の細胞の少なくとも１つ、並びに場合により適当な添加剤を含有する、診断薬。
【請求項２５】
疼痛、特に慢性の疼痛、触覚性異痛症、熱により引き起こされる疼痛、及び／又は炎症性疼痛を治療する医薬品を製造するための、請求項１から１１までの又は２０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド、請求項１２から２０までのいずれか１項記載のポリヌクレオチド−構築物及び／又は請求項２１記載の細胞の使用。
【請求項２６】
ハルニン尿失禁、神経性水疱症状、そう痒、腫瘍、炎症、特に喘息のような症状を伴うＶＲ１レセプターに関連する炎症、並びにＶＲ１と関連する全ての疾患症状を治療する医薬品を製造するための、請求項１から１１までの又は２０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド、請求項１２から２０までのいずれか１項記載のポリヌクレオチド−構築物及び／又は請求項２１記載の細胞の使用。
【請求項２７】
遺伝子治療、有利にインビボ又はインビトロの遺伝子治療のための、請求項１から１１までの又は２０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド、請求項１２から２０までのいずれか１項記載のポリヌクレオチド−構築物及び／又は請求項２１記載の細胞の使用。
【請求項２８】
有利に標識した、請求項１から１１までの又は２０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド及び／又は請求項１２から２０までのいずれか１項記載のポリヌクレオチド−構築物の少なくとも１つとＲＮＡとの結合の定量化に関する同定を行うことを特徴とする、疼痛を調節する物質を同定する方法。
【請求項２９】
次の方法工程：
（ａ）請求項１から１１までの又は２０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチド及び／又は請求項１２から２０までのいずれか１項記載のポリヌクレオチド−構築物の少なくとも１つ用いて、細胞（試験細胞）の少なくとも１つを遺伝子工学により操作する工程、
（ａ’）同じ細胞（対照細胞）の少なくとも１つを
・操作を行わないか、
・オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド−構築物なしで並行して操作を実施するか、又は
・請求項１から１１又は２０までのいずれか１項記載のものとは異なる変更されたオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド−構築物で並行して遺伝子工学により操作する工程、
（ｂ）少なくとも１つの試験細胞と、少なくとも１つの対照細胞と及び／又はバニロイド−レセプター−ファミリー、有利にＶＲ−１−レセプターから選択される少なくとも１種のレセプタータンパク質を合成したような細胞からの調製物とを用いて適当な条件下で試験すべき物質を並行してインキュベートする工程、
（ｃ）試験物質と細胞から合成されたタンパク質との結合を測定するか、又は試験物質とタンパク質との結合により変更された機能パラメータの少なくとも１つを測定する工程、
（ｄ）試験細胞における測定値と対照細胞における測定値との差異の程度によって物質を同定する工程
を有する、疼痛を調節する物質を同定する方法。
【請求項３０】
方法工程（ａ）及び（ａ’）の前にすでに細胞を遺伝子工学により操作することを特徴とする、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
遺伝子工学による操作が、試験物質により変更された機能パラメータの少なくとも１つの測定を可能にすることを特徴とする、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
遺伝子工学による操作によって、バニロイド−レセプター−ファミリー、有利にＶＲ−１−レセプターの構成員を、細胞内で内因性に発現しない形で発現させるか又はレポーター遺伝子を導入することを特徴とする、請求項３０から３１までのいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
バニロイド−レセプター−ファミリー、有利にＶＲ−１−レセプターの構成員の既知の標識されたリガンドの変更によって結合の測定を行うことを特徴とする、請求項２９から３２までのいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
並行する方法工程（ａ）及び（ａ’）と、方法工程（ｂ）との間で８時間以上、有利に１２時間以上、特に２４時間以上経過させることを特徴とする、請求項２９から３３までのいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
請求項１から１１までの又は２０のいずれか１項記載のオリゴヌクレオチドの１つ及び／又は請求項１２から２０までのいずれか１項記載のポリヌクレオチド−構築物の少なくとも１つとＲＮＡとの結合の定量化によって診断を行うことを特徴とする、バニロイド−レセプター−ファミリーの遺伝子の変更された発現と関連している疾患症状を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はＶＲ１に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、相応するヌクレオチド−構築物、これを含有する細胞、医薬品及び診断薬、疼痛治療のためのその使用、ＶＲ１と関連する症状の診断方法及び疼痛を引き起こす物質の同定方法に関する。
【０００２】
疼痛の有効な治療は、分子医学にとって大きな挑戦である。急性の及び一過性の疼痛は、周囲環境又は身体の過負荷による重大な障害から身体を守るための身体の重要な信号である。これとは反対に、疼痛の原因よりも長く続きかつ治癒に期待される時間よりも長く続く慢性の疼痛は、既知の生物学的機能はなく、かつ世界中に一億人がこれに該当する。ドイツ連邦共和国内だけでも約７５０万人はが慢性の疼痛に苦しんでいる。不幸なことに、慢性の疼痛の薬理学的治療は未だに不十分であり、従って現在医学的研究に挑戦しているところである。現在研究されている鎮痛剤はあまり十分に有効であるとは言えず、部分的に重大な副作用を示してしまう。
【０００３】
従って、特に慢性の疼痛の治療のために、疼痛を調節する作用、例えば低分子量の作用物質又は他の化合物、例えばアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を生じさせると考えられる新規のターゲットである身体固有の構造が探索された。Ｃａｔｅｒｉｎａら（１９９７）によりクローニングされたバニロイド−レセプター−サブタイプ１（ＶＲ１、カプサイシンレセプターとも言われる）は、新規の疼痛医薬品の開発にとって有望な発端である。これは主に一次的感覚ニューロンにより発現するカチオンチャンネルである（Ｃａｔｅｒｉｎａら１９９７）。ＶＲ１はカプサイシン（トウガラシ莢果の成分、熱（４３℃を越える熱）及び低いｐＨ値（プロトン）により、組織損傷の結果として活性化され、一次的輸入におけるカルシウム流入が生じる。ＶＲ１−ノックアウトマウスは組織損傷もしくは炎症による熱的痛覚過敏を生じない（Ｃａｔｅｒｉｎａら，２０００；Ｄａｖｉｓら，２０００）。
【０００４】
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）、リボザイム及び他の触媒作用核酸は、選択されたターゲット（本発明の場合には前記したバニロイド−レセプター−サブタイプ１（ＶＲ１）（Ｃａｔｅｒｉｎａら（１９９７）））のｍＲＮＡの分解及び変更による特に慢性の疼痛の治療のために使用することができ、この発現を下方調節し、それにより１細胞あたりのレセプターの数を減少することができる。このＯＤＮはｍＲＮＡに付着しており、一方で翻訳を遮断し、他方でＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖内のＲＮＡを切断するＲＮａｓｅ　ＨによるｍＲＮＡの分解を発動する。Ｐｏｒｒｅｃａら（１９９９）は、ラットにおいて髄腔内注入したＯＤＮがＰＮ３／ＳＮＳ−チャンネルに対して慢性の神経障害又は組織障害による痛覚過敏及び異痛症の発症を抑制することを示した。
【０００５】
ＶＲ１の配列が公知であったとしても、ｍＲＮＡの有効な遮断及び切断のためには特に正しいアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド、リボザイム及び他の触媒作用核酸の選択が重要である。このターゲットのｍＲＮＡはたいていは折り畳まれており、付着及び引き続き切断するためにわずかな箇所があるだけである。しかしながらＯＤＮの正しい選択については、先行技術においても何も公知ではなかった。
【０００６】
従って、本発明の課題は、バニロイドレセプターのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド及び触媒作用核酸並びに相応するリボザイムを開発することであった。従って、本発明の対象は、図１，２，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５又は１６のいずれか１つの図中のサブポイント（ｂ）〜（ｊ）のいずれか１つに記載された１つ又は複数の塩基配列、又は前記の塩基配列から最大で１個の塩基が異なるが、その際に、塩基の変異はサブポイント（ａ）に示された配列範囲には存在しない１つ又は複数の配列を有する、オリゴヌクレオチドである。この場合に、オリゴヌクレオチドとは本発明の範囲内で２〜４０個のヌクレオチドを有する分子を意味する。
【０００７】
本発明のもう一つの対象は、図１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５又は１６のいずれか１つの図中のサブポイント（ｂ）〜（ｊ）のいずれか１つに記載された１つ又は複数の塩基配列を有するかもしくはそれに一致するオリゴヌクレオチドである。
【０００８】
本発明のもう一つの対象は、図１，２，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５又は１６のいずれか１つの図中のサブポイント（ｋ）に記載の１つ又は複数の塩基配列、又は前記の塩基配列から最大で２個の塩基が異なるが、その際に、この塩基の変異はサブポイント（ａ）に示された配列範囲には存在しない、有利に１つの塩基配列を有するか又は前記の塩基配列に一致するオリゴヌクレオチドである。
【０００９】
本発明のもう一つの対象は、図１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５又は１６のいずれか１つの図中のサブポイント（ｋ）に記載された１つ又は複数の塩基配列を有するかまたは前記の塩基配列に一致するオリゴヌクレオチドである。
【００１０】
本発明の有利な対象は、オリゴヌクレオチドが１５〜３０ヌクレオチド、有利に１５〜２５ヌクレオチド、特に１７〜１９ヌクレオチド、正確に１８ヌクレオチドの長さを有する、前記の本発明による実施形態の１つのオリゴヌクレオチドに記載された本発明によるオリゴヌクレオチドでもある。
【００１１】
他の有利な対象は、前記の本発明による実施形態の１つのオリゴヌクレオチドに記載された本発明による特に有利なオリゴヌクレオチド（以後、オリゴヌクレオチドＡと記載する）でもあり、その際、場合により１つの塩基が異なり、オリゴヌクレオチド中に含まれるオリゴヌクレオチドか又は前記のオリゴヌクレオチドに一致するオリゴヌクレオチドが、図１，２，３，４，９，１０，１１，１２，１５又は１６のいずれか１つの図の塩基配列から取り出すことができる。従って、特に有効であると認識されたかもしくは相応する配列を場合によりわずかに変更されて有しているオリゴヌクレオチドは、ＶＲ１のｍＲＮＡとの高い結合率で結合すると考えられる（オリゴＶ１５、Ｖ３０、Ｖ２、Ｖ１６及びＶ４もしくは相応するヒト配列参照）。
【００１２】
他の特に有利な対象は、前記の本発明による実施形態の１つのオリゴヌクレオチドに記載された本発明による特に有利なオリゴヌクレオチド（以後、オリゴヌクレオチドＢとする）でもあり、その際、場合により１つの塩基が異なり、オリゴヌクレオチド中に含まれるオリゴヌクレオチドか又は前記のオリゴヌクレオチドに一致するオリゴヌクレオチドが、図１，２，３，４，１１又は１２，有利に図１，３又は１１、特に図１又は３のいずれか１つの図の塩基配列から取り出すことができる。
【００１３】
本発明の有利な対象は、少なくとも１つの修飾された又は修飾されていないリボース、少なくとも１つの修飾された又は修飾されていないホスホジエステル結合及び／又は少なくとも１つの修飾された又は修飾されていない塩基を有する本発明によるオリゴヌクレオチドである。
【００１４】
本発明のさらに特に有利な対象は、ヌクレオチドの少なくとも１つ、特に複数のヌクレオチドが「ロックド核酸」（“ＬＮＡ”）であるか、又はヌクレオチドの少なくとも１つ、特に全てのヌクレオチドがホスホロチオエートであり、有利に複数のヌクレオチドが「ロックド核酸」（“ＬＮＡ”）であることを特徴とする。「ロックド核酸」（“ＬＮＡ”、Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）とは、メチレン架橋を有するリボヌクレオチドであり、このメチレン架橋はリボースの２’−酸素を４’炭素とを結合している（図２７参照）。ＬＮＡに関する概要は、Ｂｒａａｓｃｈ　Ｄ．Ａ．及びＣｏｒｅｙ，Ｄ．Ｒ．（２００１），Ｌｏｃｋｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ（ＬＮＡ）；ｆｉｎｅ−ｔｕｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｎｄ　ＲＮＡ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８，１−７に記載されている。この文献は、本願の発明の詳細な記載及び本願発明の開示の明確な構成要素である。ＬＮＡは例えばＰｒｏｌｉｇｏ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ社，ＵＳＡにより提供されている。同様にホスホロチオエートは当業者に公知であり、例えばＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＡＧ社，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙで入手することができる。
【００１５】
この場合、“ＬＮＡ”がオリゴヌクレオチドの５’−末端及び３’−末端にあり、有利にオリゴヌクレオチドの３’−末端及び５’−末端のそれぞれ最後の２〜５個のヌクレオチド、特にそれぞれ最後の３又は４個のヌクレオチドが“ＬＮＡ”であるか、
及び／又は
オリゴヌクレオチド中の６より多くの、特に８以上の連続するヌクレオチドが“ＬＮＡ”ではなく、有利に図１から１６のいずれか１つの図に記載されたオリゴヌクレオチドの、それぞれサブポイント（ａ）に記載された配列に示されたヌクレオチドの中で、サブポイント（ｂ）〜（ｋ）はそれぞれ多くても１つのヌクレオチドだけが“ＬＮＡ”であるか、又はそのヌクレオチドのどれもが“ＬＮＡ”ではないようなオリゴヌクレオチドが有利である。
【００１６】
ＬＮＡ又はホスホロチオエートで修飾されたオリゴヌクレオチドの場合には、本発明によるオリゴヌクレオチドＡ又は本発明によるオリゴヌクレオチドＢ、有利に本発明によるオリゴヌクレオチドＢ（上記参照）であるのが特に有利である。
【００１７】
一般に、本発明の特別な単独の対象は、ヌクレオチドの複数が「ロックド核酸」（“ＬＮＡ”）であり、このヌクレオチドの中でオリゴヌクレオチドの５’−末端及び３’−末端に“ＬＮＡ”が存在し、有利にオリゴヌクレオチドの３’−末端及び５’−末端で、それぞれ最後の２〜５個のヌクレオチド、特にそれぞれ最後の３又は４個のヌクレオチドが“ＬＮＡ”であり、及び／又は、その際、オリゴヌクレオチド中の６個より多くの連続するヌクレオチド、特に８以上の連続するヌクレオチドは“ＬＮＡ”ではないような核酸、特にオリゴペプチドである。今までＬＮＡに関して記載した実施形態は、この対象にも同様に通用する。
【００１８】
本発明の別の有利な対象は、少なくとも１つの本発明によるオリゴヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド−構築物でもある。本願発明の範囲内で、ポリヌクレオチド−構築物とはきわめて広い意味であると解釈される。これには少なくとも２０個のヌクレオチドの長さ以上のＲＮＡ及びＤＮＡ及びヌクレオチドが含まれる。この場合、（組み換え）ポリヌクレオチド−構築物とは、ＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子のそれぞれの種類に対する包括的な名称であると解釈され、これはＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子のインビトロ結合によって生じる。ポリヌクレオチドとは次の意味であると解釈される。基礎をなすヌクレオチドが、基本的にヌクレイン塩基、ペントース及びリン酸からなる、核酸の基本構成単位である。これは、リン酸−ペントース−エステル化によって相互に結合している複数のヌクレオチドからなる高分子量のポリヌクレオチドに相当する。本発明においては、しかしながら、塩基変更箇所を内包するが、リン酸−ペントースの代わりに変更された別の手段を提供する修飾されたポリヌクレオチドもこれに含める。
【００１９】
別の有利な対象は、２つの相互に別個の領域に、図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つの図中のサブポイント（ｌ）〜（ｎ）のいずれか１つに記載の、２つのヌクレオチド部分配列の断片Ｉ及び断片ＩＩＩを有するか、又はサブポイント（ｏ）〜（ｑ）のいずれか１つに記載の、２つのヌクレオチド部分配列のヘリックスＩ及びＩＩＩを有するか、又は前記のヌクレオチド部分配列の中で最大で１つの塩基が異なるヌクレオチド部分配列を含有するポリヌクレオチド−構築物でもある。２つの領域の分割に関する詳細は、図２４（ヘリックスＩ及びヘリックスＩＩＩ／リボザイム）及びＳａｎｔｏｒｏら（１９９７）の図２、第４２６４頁（断片Ｉ及び断片ＩＩＩ／ＤＮＡ−酵素）に記載されており、この場合に、後者の文献の内容は、本願明細書の開示に明確に内包される。
【００２０】
他の有利な対象は、少なくとも１つの本発明によるオリゴヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド−構築物でもある。これには、特に読み取るべきＤＮＡ又はＤＮＡ又はＲＮＡを含むベクターでも含まれ、この産物は本願発明によるオリゴヌクレオチドであることができる。
【００２１】
他の有利な対象は、リボザイム、ＤＮＡ−酵素、ベクター、特に発現ベクター又はＰＮＡである、本発明によるポリヌクレオチド−構築物でもある。
【００２２】
本発明の範囲内で、一般に次の意味を有する。
−（クローニング）ベクター：クローニングの際に外来遺伝子又はこの遺伝子の部分のキャリアとして利用する核酸−分子についての一般的な名称。
−発現ベクター：適当な宿主細胞中へ導入後にベクター内へクローニングされた外来遺伝子の転写及び翻訳を行うことができる特別に構築されたクローニングベクターについての名称。
−ＰＮＡ：ペプチド核酸についての国際的に使用されている省略形。この場合、ペプチド結合したアミノ酸は１つの鎖を形成し、その際に、これらのアミノ酸は側鎖としてＤＮＡ又はＲＮＡとハイブリダイズ可能な塩基を有している。
−配列：ヌクレオチド又はアミノ酸の連続体。本発明の特別な意味において、従って核酸配列を意味する。
−リボザイム：触媒活性のリボ核酸についての名称（例えばリガーゼ、エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ）、例えば図２４又は２５記載のハンマーヘッド−リボザイム並びにこの図面の記載参照又はＮ．Ｋ．ら（１９９８），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．２６，５２３７−５２４２参照。
−ＤＮＡ−酵素：触媒活性を有するＤＮＡ−分子についての名称（例えばリガーゼ、エンドヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ）、例えば図２６記載のＤＮＡ−酵素１０〜２３並びにこの図面の記載参照又はＳａｎｔａｒｏ　ａｎｄ　Ｊｏｙｃｅ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４，４２６２−４２６６参照。
−触媒作用ＲＮＡ／ＤＮＡ：リボザイムもしくはＤＮＡ−酵素（上記参照）についての包括的名称。
【００２３】
他の有利な対象は、２つの相互に別個の領域に、上記したような２つのヌクレオチド部分配列を有する本発明のポリヌクレオチド−構築物でもあり、これはリボザイム、有利に「ハンマーヘッド」リボザイム、又はＤＮＡ−酵素、有利にタイプ１０−２３又は１２−３２のＤＮＡ−酵素である。この場合に、図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２又は１３のいずれか１つの図、
有利に１，３，７又は１１、特に１又は３のいずれか１つの図、又は
有利に４，６，８又は１２、特に４又は１２のいずれか１つの図中の
サブポイント（ｌ）〜（ｎ）のいずれか１つに、有利に（ｎ）に記載のヌクレオチド部分配列の断片Ｉ及び断片ＩＩＩを少なくとも含有するＤＮＡ−酵素である場合が特に有利でありかつ選択される。同様に、ポリヌクレオチド構築物が、図１，３，４，５，６，８，１１又は１２のいずれか１つの図、
有利に１，３又は１１のいずれか１つの図、特に図１１、又は
有利に４，６，８又は１２、特に４又は１２のいずれか１つの図中の
サブポイント（ｏ）〜（ｑ）のいずれか１つに、有利に（ｏ）に記載のヌクレオチド部分配列のヘリックスＩ及びヘリックスＩＩＩを少なくとも含有するリボザイムである場合が特に有利でありかつ選択される。
【００２４】
具体的に、有利な実施形態は特に図２４及び２５に記載されている。図２４は一般的な図で、Ｖａｉｓｈ，Ｎ．Ｋ．ら（１９９８），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．２６，５２３７−５２４２による、「認識アーム」のヘリックスＩ及びヘリックスＩＩＩを有する「ハンマーヘッド」−リボザイム（Ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ−Ｒｉｂｏｚｙｍ）を示しており、これらのヘリックス中へ図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つの図中のサブポイント（ｏ）〜（ｑ）による本発明によるヘリックスＩ及びＩＩＩがそれぞれ導入されて、本発明による「ハンマーヘッド」−リボザイムになる。この場合に、図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つの図中の断片のヘリックスＩは、図２４によるヘリックスＩ中の任意のヌクレオチドに置き換えられており、図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つのそれぞれの図中のヘリックスＩの３’−末端の第１のヌクレオチドは、図２４のヘリックスＩの３’−末端の第１の任意のヌクレオチド「Ｎ」に置き換え、図２４のヘリックスＩ中の次の任意のヌクレオチド「Ｎ」は、５’−末端方向で図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つのそれぞれの図中のサブポイント（ｏ）〜（ｑ）のそれぞれ１つのヘリックスＩに示されているヌクレオチドに置き換えられる。図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つの図中のヘリックスＩＩＩの５’−末端のヌクレオチド「Ａ」及び「Ｃ」は図２４中のヘリックスＩＩＩのヌクレオチド「Ａ」及び「Ｃ」をそれぞれ置き換え、図２４のヘリックスＩＩＩ中の次の任意のヌクレオチド「Ｎ」は、５’−末端の方向で図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つのそれぞれの図中のサブポイント（ｏ）〜（ｑ）のそれぞれ１つのヘリックＩＩＩに示されているスヌクレオチドに置き換えられる。具体的な例は図２５に示されている。「ハンマーヘッド」−リボザイムＶ１６（７／７）は図２４及び図１１に由来する。酵素がオリゴＶ１６のＧＵＣ−部位に対して結合性でありかつ「認識アーム」内にそれぞれ７個のヌクレオチド（ヘリックスＩ及びヘリックスＩＩＩ）を含有し、この場合に図１１中のサブポイント（ｏ）のヘリックスＩ及びヘリックスＩＩＩである場合に、リボザイムＶ１６（７／７）といわれる。同様のことが図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つのぞれぞれの図中のサブポイント（ｏ〜ｑ）による全てのリボザイムにも通用する。
【００２５】
具体的に、有利な実施形態は特に図２６に記載されている。図２６は一般的な図において、Ｓａｎｔｏｒｏら，１９９７，図２、第４２６４頁に記載のタイプ１０〜２３のＤＮＡ−酵素を示している。上方の矢印で示された鎖は、分割すべきＲＮＡ−鎖であり、この場合に矢印は分割位置を表し、下側にはＤＮＡ−酵素が図示されている。本願明細書に関して、この場合に上側の鎖において「Ｙ」＝「Ｕ」であり、「Ｒ」＝「Ｇ」であり、この場合、「Ｙ」の３’−方向には「Ｃ」がある。従って、上側の鎖上の分割位置はいわゆるＧＵＣ−サイト（上記参照）である。相応して、下側の鎖中の「Ｒ」＝「Ａ」であり、下側の鎖中の「Ｒ」の５’−方向には対応する「Ｇ」が存在する。これに、５−方向に図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つのそれぞれの図中のサブポイント（ｌ〜ｎ）に記載された断片Ｉからの他のヌクレオチドが後続する、つまり、サブポイントＩの場合には５つの他のヌクレオチドが、サブポイントｍの場合には６つの他のヌクレオチドが及びサブポイントｎの場合には７つの他のヌクレオチドが後続する。図２５に記載された断片ＩＩＩ（ＲＮＡと塩基対されていない第２の断片）において、断片ＩＩＩに隣接する対になっていない「Ａ」に直接５’−方向から３’−方向で、図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つのそれぞれの図中のサブポイント（ｌ〜ｎ）に記載された断片ＩＩＩからのヌクレオチドが後続し、つまり、サブポイントｌの場合には７つの他のヌクレオチドが、サブポイントｍの場合には８つの他のヌクレオチドが及びサブポイントｎの場合には９つの他のヌクレオチドが後続する。断片ＩＩＩ及び断片ＩはいわゆるＤＮＡ−酵素の「認識アーム」（後に記載する例３参照）である。
【００２６】
本発明の範囲内で特に有利な、図１によるサブポイント（ｎ）についてのタイプ１０〜２３のＤＮＡ−酵素は、従って次の配列を有し、この場合、下線の部分はＲＮＡと塩基対している。
【００２７】
【外１】
2004507263.tif 000002
【００２８】
このＤＮＡ−酵素はＶ１５（９／９）といわれ、この場合にこの名称は、この酵素がオリゴＶ１５のＧＵＣ−部位と結合性でありかつ、認識アーム内にそれぞれ９つのヌクレオチド（断片Ｉ及びＩＩＩ）を有する、例えば図１中のサブポイント（ｎ）の断片Ｉ及び断片ＩＩＩによるヌクレオチドを有することを表している。同様のことが、図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つのそれぞれの図中のサブポイント（ｌ〜ｎ）に記載の全てのＤＮＡ−酵素にも通用する。
【００２９】
他の有利な対象は本発明によるペプチド−構築物でもあり、この場合にこの構築物は少なくとも１つの修飾された又は修飾されていないリボース、少なくとも１つの修飾された又は修飾されていないホスホジエステル結合及び／又は少なくとも１つの修飾された又は修飾されていない塩基を有する。
【００３０】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド又は本発明によるポリヌクレオチド−構築物であり、この場合に、これらは担体、特にタンパク質、有利にｔｅｔ−、トランスポーチン又はフェリチンと結合しているか及び／又はリポソーム内に封入されている。
【００３１】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド及び／又は本発明によるポリヌクレオチド−構築物の少なくとも１つを含有する細胞でもある。
【００３２】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド、本発明によるポリヌクレオチド−構築物及び／又は本発明による細胞の少なくとも１つ、並びに場合により適当な助剤及び／又は添加剤を含有する医薬品でもある。本発明による医薬品は、液状の医薬形状として注射溶液、滴下薬又は液剤の形に加工することができ、半固体の医薬形状として顆粒剤、錠剤、ペレット剤、パッチ剤、カプセル剤、プラスター剤又はエアゾール剤の形に加工することができ、かつ少なくとも１つの本発明の対象物の他に、医薬形状に応じて場合により担持剤量、充填剤、溶剤、希釈剤、着色剤及び／又は結合剤を含有することができる。助剤並びにその使用すべき量の選択は、医薬品が、口腔内、経口、腸管外、静脈内、腹腔内、皮内、筋肉内、鼻腔内、バッカル、直腸又は局所的、例えば皮膚の感染箇所、粘膜及び目に適用するかどうかに依存している。経口投与のためには、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、滴下剤、液剤及びシロップ剤の形状の調製剤が適しており、腸管外、局所及び吸入適用のためには、溶液剤、懸濁剤、容易に再構成可能な乾燥調製剤並びにスプレーが適している。場合により皮膚浸透を促進する薬剤を添加した溶液の形のデポー剤又はプラスター剤の形の本発明による対象は、適当な経皮的用調製剤である。経口又は経皮適用可能な調剤形状は、本発明による対象物を遅延放出することができる。患者に投与される作用物質量は、患者の体重、投与経路、疾患の指標及び重度に依存して変えられる。通常は、少なくとも１つの本発明による対象物は２〜５００ｍｇ／ｋｇである。この医薬品を特に遺伝子治療のために使用する場合には、適当な助剤又は添加剤として、例えば生理食塩水、安定剤、プロテイナーゼ阻害剤、ＤＮＡアーゼ阻害剤などである。
【００３３】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド、本発明によるポリヌクレオチド−構築物及び／又は本発明による細胞の少なくとも１つ、並びに場合により適当な添加剤を含有する診断薬でもある。
【００３４】
この場合に、次の意味を有する：
−医薬品：医薬品の流通に関するドイツ法（ＡＭＧ）第１条第２章に相当する物質。つまり、ヒト又は動物の身体に適用することにより、
１．疾病、疾患、身体的損傷又は病的な苦痛を治癒、緩和、予防又は診断のため、
２．身体の性質、状態又は機能又は精神状態を診断するため、
３．ヒトの身体から生じた作用物質又は体液を交換するため、
４．病原体、寄生体又は体外物質を撃退、排除又は無害化するため、又は
５．身体の性質、状態又は昨日又は精神状態に影響を及ぼすため
に用いるように決められている物質又は物質からなる調製物。
−診断薬：疾病を診断するために使用することができる化合物又は方法。
【００３５】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド、本発明によるポリヌクレオチド−構築物及び／又は本発明による細胞の少なくとも１つの、疼痛、特に慢性の疼痛、触覚性異痛症（Ａｌｌｏｄｙｎｉｅ）、熱により引き起こされる疼痛、及び／又は炎症性疼痛を治療するための医薬品の製造のための使用でもある。
【００３６】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド、本発明によるポリヌクレオチド−構築物及び／又は本発明による細胞の少なくとも１つの、ハルニン尿失禁（Ｈａｒｎｉｎｋｏｎｔｉｎｅｎｚ）、神経性水疱症状、そう痒、腫瘍、炎症、特に喘息のような症状を伴うＶＲ１レセプターに関連する炎症、並びにＶＲ１と関連する全ての疾患症状を治療する医薬品の製造のための使用でもある。
【００３７】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド、本発明によるポリヌクレオチド−構築物及び／又は本発明による細胞の少なくとも１つの、遺伝子治療、有利にインビボ又はインビトロの遺伝子治療のための使用でもある。遺伝子治療とは、細胞内へ核酸を導入することにより、エフェクター遺伝子、たいていはタンパク質、又はアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを発現させる治療形態であると解釈される。原則としてインビトロ法とインビボ法とに分類される。インビトロ法では、器官から細胞を取り出し、エクスビボでベクターを用いてトランスフェクションし、引き続き同様の器官又は他の器官内へ再び導入する。インビトロ遺伝子治療の場合には、ベクターを例えば腫瘍に対抗させるために全身に（例えば血管を介して）又は直接腫瘍内へ適用する。
【００３８】
他の有利な対象は、有利に標識した、本発明によるオリゴヌクレオチドの少なくとも１つ又は本発明によるポリヌクレオチド−構築物の少なくとも１つとＲＮＡとの結合の定量化に関する同定を行うことを特徴とする、疼痛を調節する物質を同定する方法でもある。
【００３９】
他の有利な対象は、次の方法工程：
（ａ）本発明によるオリゴヌクレオチド及び／又は本発明によるポリヌクレオチド−構築物の少なくとも１つを用いて、細胞（試験細胞）の少なくとも１つを遺伝子工学により操作する工程、
（ａ’）同じ細胞（対照細胞）の少なくとも１つを
・操作を行わないか、
・オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド−構築物なしで並行して操作を実施するか、又は
・本発明によるものとは異なるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド−構築物で並行して遺伝子工学により操作する工程、
（ｂ）少なくとも１つの試験細胞と、少なくとも１つの対照細胞と及び／又はバニロイド−レセプター−ファミリー、有利にＶＲ−１−レセプターから選択される少なくとも１種のレセプタータンパク質を合成したような細胞からの調製物を用いて適当な条件下で試験すべき物質とを並行してインキュベートする工程、
（ｃ）試験物質と細胞から合成されたタンパク質との結合を測定するか、又は試験物質とタンパク質との結合により変更された機能パラメータの少なくとも１つを測定する工程、
（ｄ）試験細胞における測定値と対照細胞における測定値との差異の程度によって物質を同定する工程
を有する、疼痛を調節する物質を同定する方法でもある。
【００４０】
この場合に、疼痛を調節するとの概念は、生理学的疼痛現象に関して潜在的に調節する作用、特に鎮痛作用に関している。物質との概念は、医薬品−作用物質として適当な化合物、特に低分子量の作用物質、また同様に核酸、脂肪、糖、ペプチド又はタンパク質、例えば抗体を包括する。適当な条件下でのインキュベーションとは、この場合に、試験すべき物質は細胞又は相応する調製物と水性媒体中で測定の前に規定の時間反応することができることであると解釈される。この場合、水性媒体は、例えば４℃〜４０℃の間に、有利に室温又は３７℃で温度調節することができる。インキュベーション時間は、物質とレセプターとの間の相互作用に応じて数秒から数時間の間で変えることができる。しかしながら１分から６０分の間の時間が有利である。この水性媒体は適当な塩及び／又は緩衝系を含有することができるため、インキュベーション時に例えば媒体はｐＨ６〜８、有利にｐＨ７．０〜７．５である。媒体に他の適当な物質、例えば補酵素、栄養素などを添加することもできる。方法においてできる限り明らかな測定値を得るために、適当な条件は、当業者によって、物質とレセプターとの試験すべき相互作用に依存して、経験、文献又はわずかな簡単な予備試験によって容易に確認することができる。レセプターを合成した細胞は、そのレセプターをすでに内在的に発現した細胞であるか又は、このレセプターを発現しかつ本発明による方法の開始の前に相応してレセプターを含有している遺伝子工学的に変更した細胞である。この細胞は、場合により樹立化細胞株からなる細胞であることもでき又は天然に組織から由来しかつこの組織から単離された細胞であることができ、この場合に、細胞の結合はたいていは解消されている。これらの細胞からの調製物は、特に細胞からなるホモジネート、細胞質ゾル、膜断片を有する細胞の膜フラクション、単離された細胞オルガネラの懸濁液などである。
【００４１】
この方法が興味深い物質を探し出すことができる基準は、例えば公知のリガンドの排除によるか又は結合した物質の程度により検出することができるレセプターとの結合であるか、又は物質とレセプターとの相互作用による機能パラメータの変化である。この相互作用は、特にレセプター、イオンチャンネル及び／又は酵素の調整、阻害及び／又は活性化であることができ、変更される機能パラメータは例えば遺伝子発現、イオン環境、ｐＨ又は膜電位、もしくは酵素活性又は第２次情報伝達物質の濃度の変化であることができる。この場合に次の意味を有する：
−遺伝子工学による操作：遺伝子材料を導入することによる細胞、組織又は器官の操作。
−内因性発現：発現のための遺伝子工学的操作によりこの該当するタンパク質を誘導させることなしの、適当な培養条件下でセルラインを有するタンパク質の発現。
【００４２】
この方法の他の有利な実施形態は、方法工程（ａ）及び（ａ’）の前にすでに細胞を遺伝子工学による操作することである。
【００４３】
この方法の他の有利な実施形態は、遺伝子工学による操作が、試験物質により変更された機能パラメータの少なくとも１つの測定を可能にすることである。
【００４４】
この方法の他の有利な実施形態は、遺伝子工学による操作によって、バニロイド−レセプター−ファミリー、有利にＶＲ−１−レセプターの構成員を、細胞内で内因性に発現しない形で発現させるか又はレポーター遺伝子を導入することである。
【００４５】
この方法の他の有利な実施形態は、バニロイド−レセプター−ファミリー、有利にＶＲ−１−レセプターの構成員の既知の標識されたリガンドの変更によって結合の測定を行うことである。
【００４６】
この方法の他の有利な実施形態は、並行する方法工程（ａ）及び（ａ’）と、方法工程（ｂ）との間で８時間以上、有利に１２時間以上、特に２４時間以上経過させることである。
【００４７】
他の有利な対象は、本発明によるオリゴヌクレオチド及び／又は本発明によるポリヌクレオチド−構築物の少なくとも１つとＲＮＡとの結合の定量化によって診断を行うことを特徴とする、バニロイド−レセプター−ファミリーの遺伝子の変更された発現と関連している疾患症状を診断する方法でもある。
【００４８】
このオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド−構築物も当業者に公知の方法により製造される。この場合に、ヌクレオチド、特にオリゴヌクレオチドは、例えばメリフィールド−合成の方法によって、不溶性担体（Ｈ．Ｇ．Ｇａｓｓｅｎら，Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｆｒａｇｍｅｎｔｓ（Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ　１９８２））上で又は他の方法（Ｂｅｙｅｒ／Ｗａｌｔｅｒ；Ｌｅｈｒｂｕｃｈ　ｄｅｒ　Ｏｒｇａｎｉｓｃｈｅｎ　Ｃｈｅｍｉｅ，第２０版（Ｓ．Ｈｉｒｚｅｌ　Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ　１９８４）、第８１６頁以降）によって合成される。
【００４９】
本発明の他の対象は、本発明による医薬品、特に本発明によるオリゴヌクレオチド及び／又は本発明によるポリヌクレオチド−構築物を含有する医薬品の投与による、疼痛、特に慢性の疼痛の治療を必要としているヒト以外の哺乳動物又はヒトの治療のための、特に疼痛治療のための方法である。他の対象は、そう痒及び／又はハルニン抑制の治療のための相応する方法である。
【００５０】
次の実施例及び図面は本発明を詳説するが、本発明の対象を制限するものではない。
【００５１】
（図面及び実施例）
図面
図面及び図は同じ意味を表すものと見なされる。同様に、図との関連で、サブタイプ又はサブポイントは同じ意味を表す。図示された配列における「Ｘ」は、ＶＲ１のｍＲＮＡに関する相応する塩基に相補的な任意のヌクレオチドを表す。図面は次のことを表している：
【００５２】
【図１】
ラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する一般的なヌクレオチド配列、本願明細書において頻繁にオリゴＶ１５、オリゴヌクレオチド番号１５又はＶ１５と表される。サブポイント（ａ）〜（ｊ）はこれらのアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド配列から短縮された断片を示し、サブポイント（ｋ）は、「メッセンジャー　ワーク　スクリーニング」が実施された完全なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド配列を表し、サブポイント（ｌ）〜（ｎ）は、完全なアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド配列から出発するヌクレオチド配列のそれぞれ２つの（断片Ｉ及び断片ＩＩＩ）を表し、このヌクレオチド配列はそれぞれはこの配列のオーバーラップしない部分領域を有するかもしくはこの部分領域に相当し、たいていはＧＡＣ−領域に接してもしくはＧＡＣ−領域内で切断されており、所定のポリヌクレオチド構築物の形、特にＤＮＡ−酵素の形、２つの相互に別々の領域で、「認識アーム」の形になっており、サブポイント（ｏ）〜（ｑ）は完全なアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発するヌクレオチド部分配列（この場合いずれもＲＮＡとして）のそれぞれ２つ（ヘリックスＩ及びヘリックスＩＩＩ）を示し、これらはそれぞれこの配列のオーバーラップしない部分領域を有するかまたはこの部分領域に相当し、たいていはＧＡＣ−領域に接して又はＧＡＣ−領域内で切断されており、所定のポリヌクレオチド構築物の形、特にリボザイムの形、２つの相互に別々の領域で、「認識アーム」の形になっている。
【００５３】
【図２】
ｍＲＮＡ上の位置中の図１中のオリゴＶ１５に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列。このサブタイプ（ａ）〜（ｋ）は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図１に記載したものに相当する。
【００５４】
【図３】
ラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列、本願明細書では頻繁にオリゴＶ３０、オリゴヌクレオチド番号３０又はＶ３０と表される。このサブタイプの種類及び内容はすでに図１に記載したものに相当する。
【００５５】
【図４】
ｍＲＮＡ上の位置中の図３中のオリゴＶ３０に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列。このサブタイプ（ａ）〜（ｑ）は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図１に記載したものに相当する。
【００５６】
【図５】
ラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列、本願明細書では頻繁にオリゴＶ３２、オリゴヌクレオチド番号３２又はＶ３２と表される。このサブタイプの種類及び内容はすでに図１に記載したものに相当する。
【００５７】
【図６】
ｍＲＮＡ上の位置中の図５中のオリゴＶ３２に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列。このサブタイプ（ａ）〜（ｑ）は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図１に記載したものに相当する。
【００５８】
【図７】
ラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列、本願明細書では頻繁にオリゴＶ２６、オリゴヌクレオチド番号２６又はＶ２６と表される。このサブタイプの種類及び内容はすでに図１に記載したものに相当する。
【００５９】
【図８】
ｍＲＮＡ上の位置中の図７中のオリゴＶ２６に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの配列。このサブタイプ（ａ）〜（ｑ）は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図１に記載したものに相当する。
【００６０】
【図９】
ラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列、本願明細書では頻繁にオリゴＶ２、オリゴヌクレオチド番号２又はＶ２と表される。このサブタイプの種類及び内容はすでに図１に記載したものに相当する。
【００６１】
【図１０】
ｍＲＮＡ上の位置中の図９中のオリゴＶ２に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの配列。このサブタイプ（ａ）〜（ｋ）は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図１に記載したものに相当する。
【００６２】
【図１１】
ラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列、本願明細書では頻繁にオリゴＶ１６、オリゴヌクレオチド番号１６又はＶ１６と表される。このサブタイプの種類及び内容はすでに図１に記載したものに相当する。
【００６３】
【図１２】
ｍＲＮＡ上の位置中の図１１中のオリゴＶ１６に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列。このサブタイプ（ａ）〜（ｑ）は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図１に記載したものに相当する。
【００６４】
【図１３】
ラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列、本願明細書では頻繁にオリゴＶ２８、オリゴヌクレオチド番号２８又はＶ２８と表される。このサブタイプの種類及び内容はすでに図１に記載したものに相当する。
【００６５】
【図１４】
ｍＲＮＡ上の位置中の図１３中のオリゴＶ２８に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列。このサブタイプ（ａ）〜（ｋ）は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図１に記載したものに相当する。
【００６６】
【図１５】
ラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列、本願明細書では頻繁にオリゴＶ４、オリゴヌクレオチド番号４又はＶ４と表される。このサブタイプの種類及び内容はすでに図１に記載したものに相当する。
【００６７】
【図１６】
ｍＲＮＡ上の位置中の図１５中のオリゴＶ４に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの配列。このサブタイプ（ａ）〜（ｋ）は、種類及び包括的な内容に関してはすでに図１に記載したものに相当する。
【００６８】
【図１７】
図１７）はメッセンジャー　ワーク　スクリーニングの結果を示す。それぞれのトレースにおいて、切断されていない基質の上方のバンドの他に、切断されたｍＲＮＡの２つの生成物バンド並びにいくつかの非特異的なバンドを見ることができる。このＶＲ１　ｍＲＮＡは３３種のオリゴヌクレオチド（オリゴＶ１〜オリゴＶ３３）のそれぞれ１つの存在でＲＮａｓｅ　Ｈによる分解後に見ることができる。各トレースにおいて切断されていない基質の上方のバンドの他に切断されたｍＲＮＡの２つの生成物バンド並びにいくつかの非特異的なバンドを見ることができる。
トレース１：ＶＲ１　ｍＲＮＡ、トレース２〜３４：ＶＲ１　ｍＲＮＡの３３種のＧＵＣ−部位（オリゴＶ１〜オリゴＶ３３）に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドを用いたＲＮａｓｅ　Ｈアッセイ。
【００６９】
【図１８】
メッセンジャー　ワーク　スクリーニングの定量的評価。図１８中では個々のＯＤＮを用いたＲＮａｓｅ　Ｈアッセイによる切断されていないｍＲＮＡのパーセント表示による割合をプロットした。それぞれの値は、少なくとも３つの実験からの平均値を表すため、この標準偏差はいずれの場合も１０％を上回らない。第１５及び第３０のＧＵＣ−部位に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドは最も有効にＶＲ１　ｍＲＮＡに結合するため、これは８８±４もしくは９７±１％までＲＮａｓｅ　Ｈによって分解される（オリゴＶ１５及びオリゴＶ３０）。
【００７０】
【図１９】
オリゴヌクレオチドＶ１５、Ｖ１５Ｋｔｒ．（ミスマッチ）、Ｖ３０及びＶ３０Ｋｔｒ．（ミスマッチ）を用いたＲＮａｓｅ　Ｈアッセイによるゲルの画像。オリゴデオキシヌクレオチドＶ１５、Ｖ１５Ｋｔｒ．、Ｖ３０及びＶ３０Ｋｔｒ．（トレース２〜５）。
【００７１】
【図２０】
「シングル−ターンオーバー」条件下でのリボザイム及びＤＮＡ−酵素によるｍＲＮＡの切断の定量的評価。
【００７２】
【図２１】
「シングル−ターンオーバー」条件下でのリボザイム及びＤＮＡ−酵素によるＶＲ１　ｍＲＮＡの切断の速度。
【００７３】
【図２２】
「マルチプル−ターンのバー」条件下でのリボザイム及びＤＮＡ−酵素によるＶＲ１　ｍＲＮＡの切断の速度。
【００７４】
【図２３】
ＶＲ１−アンチセンス（ＡＳ）−オリゴデオキシヌクレオチドとミスマッチ（ＭＳ）−オリゴデオキシヌクレオチド（Ｖ１５及びＶ１５Ｋｔｒ．）による処理の間の触覚性異痛症の評価。
【００７５】
【図２４】
本発明による「ハンマーヘッド」リボザイムになるための、図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３及び１５のいずれか１つの図中のサブポイント（ｏ）〜（ｑ）に記載されたヘリックスＩ及びヘリックスＩＩＩのそれぞれが組み込まれる「認識アーム」のヘリックスＩ及びヘリックスＩＩＩを有する「ハンマーヘッド」リボザイムの一般的な図（図１の記載を参照）。この場合、図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つの図中に断片のヘリックスＩは、図２４に記載のヘリックスＩ中の任意のヌクレオチドを置き換えるため、図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つの図中のヘリックスＩの３’−末端にある最初のヌクレオチドは、図２４のヘリックスＩの３’−末端にある最初の任意のヌクレオチド「Ｎ」を置き換え、かつ図２４中のヘリックスＩ中の次に続く任意のヌクレオチド「Ｎ」は５’−末端方向へ向かって、図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つの図中のヘリックスＩのサブポイント（ｏ）〜（ｑ）のいずれか１つに示されているヌクレオチドに置き換えられる。図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つの図中のヘリックスＩＩＩの５’−末端にあるヌクレオチド「Ａ」及び「Ｃ」は、それぞれ図２４中のヘリックスＩＩＩ中のヌクレオチド「Ａ」及び「Ｃ」をそれぞれ置き換え、図２４のヘリックスＩＩＩ中の次に続く任意のヌクレオチド「Ｎ」は５’−末端の方向へ向かって図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つの図中のヘリックスＩＩＩのサブポイント（ｏ）〜（ｑ）のいずれか１つに示されているヌクレオチドによりそれぞれ置き換えられる。具体的例は図２５に示されている。
【００７６】
【図２５】
図２４及び図１１による（特に有利な）「ハンマーヘッド」−リボザイムＶ１６（７／７）を示す図。この場合、リボザイムＶ１６（７／７）は、オリゴＶ１６のＧＵＣに対して結合する酵素であり、かつ「認識アーム」中ではそれぞれ７個のヌクレオチド（ヘリックスＩ及びヘリックスＩＩＩ）を有し、この場合、これらは図１１）中のサブポイント（ｏ）のヘリックスＩ及びヘリックスＩＩＩに記載されている。同様のことが図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つの図中のサブポイント（ｏ〜ｑ）に記載の全てのリボザイムに通用する。
【００７７】
【図２６】
Ｓａｎｔｏｒｏら，１９９７，図２，第４２６４頁に記載されたタイプ「１０−２３」のＤＮＡ−酵素を示す図。
【００７８】
上側の、矢印で示された鎖は、分割されるべきＲＮＡ−鎖であり、この場合に、この矢印は切断位置を示し、下側の鎖はＤＮＡ−酵素の図である。本願明細書と関連して、この場合、上側の鎖中の「Ｙ」は「Ｕ」であり、かつ「Ｒ」は「Ｇ」であり、この場合、「Ｙ」の３’側には「Ｃ」がある。この上方の鎖上の切断位置は従っていわゆるＧＵＣ−部位（上記参照）である。相応して、下側の鎖中の「Ｒ」は「Ａ」であり、下側の鎖中の「Ｒ」の５’側には相応して「Ｇ」が存在する。これの５側にさらに、図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つの図中のサブポイント（ｌ〜ｎ）に記載の断片Ｉからなる他のヌクレオチドが後続する、つまりサブポイントｌの場合には５個の他のヌクレオチドが後続し、サブポイントｍの場合には６個の他のヌクレオチドが後続し、サブポイントｎの場合には７個の他のヌクレオチドが後続する。図２５の断片ＩＩＩ（ＲＮＡと塩基対した第２の断片）では、次いで５’方向から３’側で断片ＩＩＩに隣接する対になっていない「Ａ」に接して、図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３又は１５のいずれか１つの図中のサブポイント（ｌ〜ｎ）に記載の断片ＩＩＩからなるヌクレオチドが後続し、つまりサブポイントｌの場合には７個の他のヌクレオチドが後続し、サブポイントｍの場合には８個の他のヌクレオチドが後続し、サブポイントｎの場合には９個の他のヌクレオチドが後続する。断片ＩＩＩ及び断片ＩはＤＮＡ−酵素のいわゆる「認識アーム」である（例３参照）。図１に記載のサブポイント（ｎ）に対するタイプ「１０−２３」のＤＮＡ−酵素は、次の配列を有すし、この場合に下線の部分はＲＮＡと塩基対している。
【００７９】
【外２】
2004507263.tif 000003
【００８０】
この（特に有利な）ＤＮＡ−酵素はＶ１５（９／９）として表され、この場合に、この酵素がオリゴＶ１５のＧＵＣ−部位に対して結合しており、かつこの表示は「認識アーム」中にそれぞれ９個のヌクレオチド（断片Ｉ及びＩＩＩ）を有していることを表し、これは例えば図１）中のサブポイント（ｎ）の断片Ｉ及び断片ＩＩＩに記載されている。同様のことが、図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３及び１５のいずれか１つの図中のサブポイント（ｌ〜ｎ）に記載された全てのＤＮＡ−酵素に通用する。
【００８１】
【図２７】
「ロックド核酸」ＬＮＡを示す図式的な図。
【００８２】
実施例
普遍的に適した切断箇所の同定：
アンチセンス−及びリボザイム−戦略の第１の段階は、オリゴヌクレオチドの結合のための、しかしながら特にリボザイムの結合のためのｍＲＮＡのアクセス可能な部位の同定である。このためには、この切断箇所に関するＶＲ１のｍＲＮＡを調査しなければならない。ＶＲ１−ｍＲＮＡの分析はコードする領域内でリボザイムに対して次の潜在的認識箇所が生じる：
３３Ｘ　ＧＴ（Ｕ）Ｃ−配列
２８Ｘ　ＧＴ（Ｕ）Ｔ−配列
１２Ｘ　ＧＴ（Ｕ）Ａ−配列。
【００８３】
ＶＲ１−ｍＲＮＡのアクセス可能な箇所を探し出すために、第１の段階で、次の配列の３つの独立したヌクレオチド混合物を合成した：
混合物１：ＮＮＮＡＡＣＮＮＮ　　いわゆるＧＵＵ−ライブラリー
混合物２：ＮＮＮＣＡＣＮＮＮ　　いわゆるＧＵＡ−ライブラリー
混合物３：ＮＮＮＧＡＣＮＮＮ　　いわゆるＧＵＣ−ライブラリー
これらは、ＲＮａｓｅ　Ｈ−発現において連続して使用され、かつＧＵＣ−ライブラリーとだけＶＲ１−ｍＲＮＡの言及に値する分解が観察されたことが明らかとなった。従ってリボザイムに対する潜在的な目標配列の中でＶＲ１　ｍＲＮＡ中の３３種のＧＵＣ−部位が最も良好にアクセス可能であり、これらをさらなる分析のために使用した。
【００８４】
実施例２：
有効なアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの同定
メッセンジャー　ワーク　スクリーニング
アンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドに対してアクセス可能なｍＲＮＡの領域の同定のために、これを系統的にＲＮａｓｅ　ＨアッセイにおいてＯＤＮを用いてスクリーニングした（メッセンジャー　ワーク　スクリーニング）。このＯＤＮは１８個のヌクレオチドの長さであり、その中央に、ｍＲＮＡ中のＧＵＣ配列に対する逆−相補的であるＧＡＣ−配列を有する。このトリプレットがターゲットとして選択された、それというのもこれが良好な結果を示しかつハンマーヘッド−リボザイム及びＤＮＡ−酵素の発生のための２の段階において使用できるためである。全部で、Ｖ１〜Ｖ３３として表した３３種のＯＤＮが、ＶＲ１−ｍＲＮＡの全てのＧＵＣ−部位に対して試験された。これらのＯＤＮは、ｍＲＮＡにそれぞれ１つのＯＤＮ及びＲＮａｓｅ　Ｈを添加することにより系統的にその性質に関してスクリーニングした。このＲＮａｓｅ　Ｈは、オリゴヌクレオチドがｍＲＮＡに常に結合できる、形成されたＤＮＡ／ＲＮＡ−二重鎖を切断する（図１７）。
【００８５】
ＶＲ１　ｍＲＮＡのインビトロトランスクリプション
まず最初に、バニロイド−レセプターのｃＤＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）中へクローニングした。引き続きこのｍＲＮＡのインビトロトランスクリプションを、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＲｉｂｏＭＡＸ　Ｌａｒｇｅ　Ｓｃａｌｅ　ＲＮＡ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ−Ｔ７を用いて製造元の指示に従って行った。
ＲＮａｓｅ　Ｈアッセイ
アンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドがｍＲＮＡに結合したかどうかをテストするために、ＲＮａｓｅ　Ｈアッセイを実施した。このために、ＶＲ１−ｍＲＮＡ（１００ｍＭ）を、５倍の過剰量のＯＤＮと一緒に、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．２）４０ｍＭ；ＭｇＣｌ２　４ｍＭ；ＤＴＴ　１ｍＭ及びＮａＣｌ　１５０ｍＭの総容量１０μｌ中で７．５分間３７℃でＲＮａｓｅ　Ｈ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）０．４ｕの存在でインキュベーションした。この反応をＥＤＴＡ（６５ｍＭ最終濃度）の添加により停止した。この試料を１．５％のアガロースゲルを用いて分離し、エチジウムブロミド（１μｇ／ｍｌ）で２０分間染色した。このゲルを、Ｂｉｏｒａｄ社のＧｅｌ　Ｄｏｃ　２０００　Ｇｅｌ　Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍを用いて写真撮影し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ　Ｏｎｅプログラムを用いて評価した。
【００８６】
図１７はこのメッセンジャー　ワーク　スクリーニングの結果を示す。各トレース中には切断されていない基質の上側のバンドの他に、切断されたｍＲＮＡの２つの生成物バンド並びに非特異的バンドが見られる。
【００８７】
ＲＮＡ−分解の定量化は、目的−ｍＲＮＡに対して５倍の過剰量で使用した場合に、最も有効なアンチセンス−オリゴヌクレオチド（オリゴ番号３０（Ｖ３０））がＶＲ１　ｍＲＮＡの９０％以上を切断／分解できることを示した（図１８）。
【００８８】
個々のバンドの強度を評価した。図１８では、個々のＯＤＮに対して切断されていないｍＲＮＡの割合がＲＮａｓｅ　Ｈアッセイに対してプロットされている。この１５番目及び３０番目のＧＵＣ−部位（オリゴＶ１５及びオリゴＶ３０）に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドは最も有効にＶＲ１−ｍＲＮＡに結合し、その結果、これは８８±４もしくは９７±１％までＲＮａｓｅ　Ｈによって分解される。
【００８９】
この試験において有効なアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの配列は、図１，３，５，７，９，１１，１３及び１５に示されており、この場合、特にオリゴＶ１５（図１）及びオリゴＶ３０（図３）が参考として有利であると考えられる。
【００９０】
このアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドに対するミスマッチ−対照として、次の発現のためにオリゴデオキシヌクレオチドが合成されかつ使用され、このオリゴデオキシヌクレオチドは５番目の塩基と６番目の塩基とがそれぞれ交換されている（もしくは、これらが同じ場合には、隣接する２つの塩基と交換されている）。この対照の配列のオリゴデオキシヌクレオチド（ミスマッチ）を次に記載する：
オリゴＶ１５Ｋｔｒ．：ＣＡＴ　ＧＣＴ　ＡＴＧ　ＡＧＣ　ＧＴＴ　ＧＡＧ
オリゴＶ３０Ｋｔｒ．：ＡＴＣ　ＴＧＴ　ＴＴＧ　ＡＧＣ　ＧＴＣ　ＴＡＣ
対照のために、ＲＮａｓｅ　ＨアッセイをオリゴヌクレオチドＶ１５、Ｖ１５Ｋｔｒ．、Ｖ３０及びＶ３０Ｋｔｒ．を用いて実施した（図１９参照）。期待通りにこのＲＮＡはアンチセンス−ＯＤＮによってだけ分解され、ミスマッチ−対照によっては分解されなかった、それというのもｍＲＮＡに結合しなかったためである。
【００９１】
要約：
ＶＲ１　ｍＲＮＡの全てのＧＵＣ−トリプレットに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドを用いたＲＮａｓｅ　Ｈアッセイにおいて、ＧＵＣ−トリプレット（２，４，１５，１６，２６，２８，３０及び３２）、特に１５及び３０番目のものに対するオリゴデオキシヌクレオチドが、最も良好に結合するＯＤＮであると同定することができた。このオリゴデオキシヌクレオチド並びに２つのミスマッチ−対照は、従って動物モデルでの試験のために及び他の使用のために提供する。
【００９２】
相応して、図２，４，６，８，１０，１２，１４，１６に記載のヒト配列も重要であり、この位置に関してはラットにおいて見られたものに一致する。ラット及びヒトのｍＲＮＡは、著しく相同性（おそらくは折り畳みにおいても）であり、従って、ラットのｍＲＮＡに関する有利に達成可能な同定された切断位置はヒトの場合にも重要であることは明らかである。この場合に、ＧＵＣ−トリプレットをも示す配列が特に有利であり、図４，６，８及び１２及びラットに類似する局在化に基づきＶ１５及びＶ３０も図２及び４に記載されたものと同様に有利である。
【００９３】
実施例３：
リボザイム及びＤＮＡ−酵素
さらに、見出された有効な結合箇所に基づく相応するリボザイム及びＤＮＡ−酵素を試験した。
【００９４】
「ハンマーヘッド」−リボザイム及びタイプ「１０−２３」のＤＮＡ−酵素（Ｓａｎｔｏｒｏら，１９９７）は、ＯＤＮに対してアクセス可能であった位置に対してｍＲＮＡを構築した。「認識アーム」の長さはそれぞれのサイドで、７又は９個のヌクレオチドであった。「シングル　ターンオーバー」条件（１０倍の過剰量のリボザイム及びＤＮＡ−酵素）下でのｍＲＮＡ−分割／切断の定量的評価は、３７℃で２０分後に、より短い「認識アーム」（ヘリックスＩ及びヘリックスＩＩＩ）を有するリボザイムが活性化されており、ＤＮＡ−酵素の場合にはより長い「アーム」（断片Ｉ及び断片ＩＩＩ）を有するものが活性化されていることを示した（図２０）。ヘリックスＩ及びＩＩＩを有するリボザイムの図式的な図は図２４であり、その例は図２５である。ＤＮＡ−酵素１０−２３については、Ｓａｎｔｏｒｏら（１９９７；第４２６４頁、図２）（触媒活性モチーフの５’側（断片Ｉ）及び３’側（断片ＩＩＩ））、その図面に関する記載から推知できる（図２６も参照）。
【００９５】
リボザイム及びＤＮＡ−酵素を用いた試験は、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＭ及びＭｇＣｌ２　１０ｍＭ中で３７℃で実施した。「シングル−ターンオーバー」−試験のために、リボザイム及びＤＮＡ−酵素を１０倍の過剰量で使用した。「マルチプル−ターンオーバー」−試験の場合には、基質のｍＲＮＡを１０倍の過剰量で使用した。
【００９６】
「シングル−ターンオーバー」−速度論
速度論分析を「シングル−ターンオーバー」−条件下で２つの最も有効なリボザイム及びＤＮＡ−酵素に対して実施した（図２１）。このデータを表１にまとめた。ＤＮＡ−酵素Ｖ１５（９／９）（図２６の記載を参照）（これはｍＲＮＡを二相性の速度論で切断）は最も速い速度（速度定数）を示し、これにリボザイムＶ１６（７／７）（図２５参照）、ＤＮＡ−酵素Ｖ３０（９／９）が続き、最も緩慢なのはリボザイムＶ１５（７／７）であった。この場合に、例えばＤＮＡ−酵素Ｖ１５（７／７）は、オリゴＶ１５のＧＵＣ−部位に対して結合しかつ「認識アーム」においてそれぞれ７個のヌクレオチド（断片Ｉ及びＩＩＩ）を含有する酵素を表し、これは例えば図１中のサブタイプ（ｌ）の断片Ｉ及びＩＩＩに記載されている。
【００９７】
表１：「シングル−ターンオーバー」−条件下でのＶＲ１　ｍＲＮＡに対するリボザイム及びＤＮＡ−酵素の速度論的データ
【表１】
2004507263.tif 000004
「マルチプル−ターンオーバー」−速度論
「マルチプル−ターンオーバー」−条件下（１０倍の基質過剰量）でのｍＲＮＡの切断を図２２に示した。ここでも、ＤＮＡ−酵素Ｖ１５（９／９）がリボザイムＶ１６（７／７）（図２）よりも高い見掛け（ａｐｐａｒｅｎｔｅ）速度（速度定数）（ファクター３．４）を示した。
【００９８】
表２：「マルチプル−ターンオーバー」−条件下でのＶＲ１　ｍＲＮＡに対するリボザイム及びＤＮＡ−酵素の速度論的データ
【表２】
2004507263.tif 000005
実施例４
インビボ実験
２０匹のオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット中で、左側のＬ５／Ｌ６脊髄神経に、Ｋｉｍ及びＣｈｕｎｇ（１９９２）による脊髄神経−結紮を付けた。同じ時間にＰｏｇａｔｚｋｉら６（２０００）による脊髄カテーテルをインプラントした。手術の４〜６日後に、同側性及び対側性の後ろ脚についての触覚閾値−ベースライン（禁断−閾値／ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ）を電気的なｖｏｎ　Ｆｒｅｙ−麻痺計（ＩＩＴＣ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）測定した。脊髄カテーテルの正確な配置は、リドカイン投与（１０μｌ、２％）によって確認した。ベースラインの試験及び測定後に、ＶＲ−１アンチセンス−オリゴ（ＡＳ、ｎ＝１０）又はミスマッチ−オリゴ（ＭＳ、ｎ＝１０）をそれぞれ４５μｇを０．９％のＮａＣｌ中で初日に１回及び４日後に１日２回投与した。触覚禁断−閾値（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ）は最初の１日のオリゴ投与後の３０分に測定した。この結果を最大予想効果率（％ＭＰＥ；ｍａｘｉｍａｌ　ｍｏｇｌｉｃｈｅｎ　Ｅｆｆｅｋｔｓ（％））として同側性の側で表し、その際、ベースラインは０％とし、対照グループの禁断−閾値は１００％ＭＰＥとした。アンチセンスオリゴヌクレオチドとしてＶ１５（図１、サブタイプｋ）及びミスマッチオリゴヌクレオチドとしてすでに上記したようなＶ１５Ｋｔｒ．を使用した。
【００９９】
モノニューロパシーラットをアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドを用いるがミスマッチ−オリゴデオキシヌクレオチドを用いない治療は、処理の第３日に始まる触覚性異痛症の低減及び治療の４及び５日のプラトーの達成を生じさせた。対側性の後ろ脚の禁断−閾値に関する作用は生じなかった。
【０１００】
実施例５
「ロックド核酸」／分解に対して保護されたオリゴヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド−構築物
特に図１及び部分的に図３のサブグループ（ｋ）による多様な本発明によるオリゴヌクレオチドを製造した。このほとんどはＬＮＡ−構築物であり、これはＰＲＯＬＩＧＯ　ｉｎ　Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏ，ＵＳＡにより入手され、かつこのＬＮＡにおいて多様な位置に置かれていた（表３参照）。さらに、図１のサブグループ（ｋ）による未変更のオリゴヌクレオチドを合成し、かつこの塩基配列から対応するホスホロチオエートはＭＷＧ　Ｂｉｏｔｅｃｋ　ＡＧ社（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ　Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ在）で入手した。
【０１０１】
表３：使用したオリゴヌクレオチドのリスト。
小文字＝ＤＮＡ−モノマー、イタリック及びアンダーライン＝ホスホロチオエート、ボールドの大文字＝ＬＮＡモノマー
【０１０２】
【表３】
2004507263.tif 000006
【０１０３】
このオリゴヌクレオチドを用いて多様な試験を実施した：
ａ）まず最初に、ＶＲ１の、オリゴヌクレオチドにより引き起こされたＲＮＡ−切断のパーセント範囲をＲＮＡｓｅ　Ｈにより試験し、その際、試験条件は主に例２に挙げられた条件と一致する。
【０１０４】
この結果は表３に記載されている。ＬＮＡを有するオリゴヌクレオチドは、少なくとも６又はより良好に８個の連続するヌクレオチドがＬＮＡを有していない場合に、最初に天然のオリゴヌクレオチドと比較可能な切断を示したことが明らかになった。
ｄ）次いで、ＬＮＡ／ＲＮＡ：ＤＮＡ−ハイブリッドの融点を標準法により測定した（表４）。意外にも、ＬＮＡは天然のオリゴヌクレオチド及びホスホロチオエートと比較して高い融点を示した。これは安定性にとってきわめて有利である。
【０１０５】
表４：ＬＮＡ／ＲＮＡ：ＤＮＡ−ハイブリッドの融点Ｔｍ
2004507263.tif 000007
ｃ）次に、ＲＮＡｓｅ　Ｈ−切断の速度論を上記したのと同じ条件下で試験するが、等モル量のＲＮＡ及びアンチセンス−オリゴヌクレオチド（それぞれ１００ｎＭ）を使用した。この結果を表５に示した。意外にも、ＬＮＡを有するオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチド及びホスホロチオエートと比較して活性の明らかな向上が示された。
表５：「フルレングス」ＶＲ１　ｍＲＮＡのＲＮＡｓｅ　Ｈ−切断についての切断速度定数は多様なアンチセンス−オリゴヌクレオチドによって誘導する。
2004507263.tif 000008
ｄ）最後に、ＬＮＡを有するオリゴヌクレオチド並びに天然のオリゴヌクレオチドとホスホロチオエートの半価時間を、放射能により標識して３７℃でヒト血清中で２日までにわたり測定した。この結果を表６に示した。天然のＤＮＡは１．５時間の半価時間を示し、ホスホロチオエートは１０時間の半価時間を示したが、末端に３〜４個のＬＮＡを有しているＬＮＡを有するヌクレオチドは、約１７時間のｔ１／２で明らかにより良好であった。
【０１０６】
表６：天然のホスホルチオエート、エンドブロックＬＮＡ／ＤＮＡ−オリゴヌクレオチドのヒト血清中での半価時間
2004507263.tif 000009
従って、約８個の連続するヌクレオチドがＬＮＡを有しておらずかつ３’−末端及び５’末端に３又は４個のＬＮＡを有しているようなＬＮＡを有するヌクレオチドが最も優れていた。
【０１０７】
文献
【０１０８】
【外３】
2004507263.tif 000010
【０１０９】
【外４】
2004507263.tif 000011
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する一般的なヌクレオチド配列を示す。
【図２】
図２はｍＲＮＡ上の位置中の図１中のオリゴＶ１５に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図３】
図３はラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列を示す。
【図４】
図４はｍＲＮＡ上の位置中の図３中のオリゴＶ３０に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図５】
図５はラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列を示す。
【図６】
図６はｍＲＮＡ上の位置中の図５中のオリゴＶ３２に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図７】
図７はラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列を示す。
【図８】
図８はｍＲＮＡ上の位置中の図７中のオリゴＶ２６に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの配列を示す。
【図９】
図９はラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列を示す。
【図１０】
図１０はｍＲＮＡ上の位置中の図９中のオリゴＶ２に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの配列を示す。
【図１１】
図１１はラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列を示す。
【図１２】
図１２はｍＲＮＡ上の位置中の図１１中のオリゴＶ１６に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図１３】
図１３はラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列を示す。
【図１４】
図１４はｍＲＮＡ上の位置中の図１３中のオリゴＶ２８に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−デオキシオリゴヌクレオチドの配列を示す。
【図１５】
図１５はラットからのＶＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチド配列から出発する包括的なヌクレオチド配列を示す。
【図１６】
図１６はｍＲＮＡ上の位置中の図１５中のオリゴＶ４に相当する、ヒトＶＲ１に対するアンチセンス−オリゴデオキシヌクレオチドの配列を示す。
【図１７】
図１７はメッセンジャー　ワーク　スクリーニングの結果を示す。
【図１８】
図１８はメッセンジャー　ワーク　スクリーニングの定量的評価を示す。
【図１９】
図１９はオリゴヌクレオチドＶ１５、Ｖ１５Ｋｔｒ．（ミスマッチ）、Ｖ３０及びＶ３０Ｋｔｒ．（ミスマッチ）を用いたＲＮａｓｅ　Ｈアッセイによるゲルの画像を示す。
【図２０】
図２０は「シングル−ターンオーバー」条件下でのリボザイム及びＤＮＡ−酵素によるｍＲＮＡの切断の定量的評価を示す。
【図２１】
図２１は「シングル−ターンオーバー」条件下でのリボザイム及びＤＮＡ−酵素によるＶＲ１　ｍＲＮＡの切断の速度を示す。
【図２２】
図２２は「マルチプル−ターンのバー」条件下でのリボザイム及びＤＮＡ−酵素によるＶＲ１　ｍＲＮＡの切断の速度を示す。
【図２３】
図２３はＶＲ１−アンチセンス（ＡＳ）−オリゴデオキシヌクレオチドとミスマッチ（ＭＳ）−オリゴデオキシヌクレオチド（Ｖ１５及びＶ１５Ｋｔｒ．）による処理の間の触覚性異痛症の評価を示す。
【図２４】
図２４は本発明による「ハンマーヘッド」リボザイムになるための、図１，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１３及び１５のいずれか１つの図中のサブポイント（ｏ）〜（ｑ）に記載されたヘリックスＩ及びヘリックスＩＩＩのそれぞれが組み込まれる「認識アーム」のヘリックスＩ及びヘリックスＩＩＩを有する「ハンマーヘッド」リボザイムの一般的な図である。
【図２５】
図２５は図２４及び図１１による（特に有利な）「ハンマーヘッド」−リボザイムＶ１６（７／７）を示す。
【図２６】
図２６はＳａｎｔｏｒｏら，１９９７，図２，第４２６４頁に記載されたタイプ「１０−２３」のＤＮＡ−酵素を示す。
【図２７】
図２７は「ロックド核酸」ＬＮＡを示す。
【図１８】
2004507263.tif 000012
【図２０】
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【国際調査報告】
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