(57)【要約】本発明はウイルス性肝炎及びアルコール性肝臓疾患のようなＴＮＦ誘導性の肝臓障害に対して保護するための，ＮＦ−κＢ活性化のＡ２０結合阻害剤またはその機能的断片もしくは変異体の使用に関する。より特定すると，致命的なものを含む，過剰発現ＡＢＩＮによる疾患の毒性作用を防止することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＮＦにより誘導される肝不全の処置のための医薬品の製造のためのＡＢＩＮ又はそれらの機能的断片もしくは変異体の使用。
【請求項２】
ＡＢＩＮが、配列番号４及び／又は配列番号５に示されたコンセンサスアミノ酸配列を含む、請求項１記載の使用。
【請求項３】
機能的断片が、配列番号３に示されるアミノ酸配列を含み、かつタンパク質Ａ２０と相互作用する断片である、請求項１記載の使用。
【請求項４】
機能的断片が、配列番号２のアミノ酸４２０〜６４７を含み、かつタンパク質Ａ２０と相互作用する断片である、請求項１記載の使用。
【請求項５】
変異体が、Ｎａｆ１アルファタンパク質、Ｎａｆ１ベータタンパク質及びビリオン関連核内外移行タンパク質（virion-associated nuclear shuttling protein）からなる群より選択される、請求項１記載の使用。
【請求項６】
ＴＮＦにより誘導される肝不全の処置のための医薬品の製造のためのＡＢＩＮ又はそれらの機能的断片もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列の使用。
【請求項７】
ＴＮＦにより誘導される肝不全の処置のための医薬品の製造のためのＡＢＩＮ誘導及び／又は活性化化合物の使用。
【請求項８】
化合物がＰＨＡである、請求項７記載の使用。
【請求項９】
ＴＮＦにより誘導される肝不全が、ウイルス性肝炎、劇症肝炎及び／又はアルコール性肝疾患である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
医薬品が遺伝子処置ベクターである、請求項６記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の領域
本発明は、ウイルス性肝炎及びアルコール性肝疾患のようなＴＮＦにより誘導される肝不全から防御するための、Ａ２０結合性ＮＦ−κＢ活性化阻害剤（A20-binding inhibitor of NF-κB activation）（ＡＢＩＮ）の使用に関するものである。より具体的には、それは、ＡＢＩＮを過剰発現させることによる、致死を含む該疾患の毒性作用の防止に関するものである。
【０００２】
発明の背景
急性肝不全は、肝性脳障害及び肝機能の重度の障害を来す、肝細胞の大量の壊死及びアポトーシスに起因する臨床症候群である。それは、ウイルス性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型他）、薬物、中毒、自己免疫性肝炎等のような種々の疾患により引き起こされる。多くの研究が、ＴＮＦが肝疾患において中心的な役割を果たすことを示している。ＴＮＦは、主として活性化されたマクロファージにより産生されるが、その他のいくつかの細胞型によっても少量ではあるが産生される。ＴＮＦは、種々の細胞型に対して多様な効果を及ぼし、様々な生理学的及び病態生理学的な状態に重要なメディエーターとして関係している。さらに、ＴＮＦは、アポトーシス（プログラム細胞死）の重要なメディエーターであることが明らかになっている。ＴＮＦは、最初は、マウスにおいて腫瘍の出血性壊死を誘導する能力によって同定された。ＴＮＦを全身性抗癌療法のために使用する試みは、処置用量に達する前に重度の副作用が出現したことから失敗している。ＴＮＦ処置の副作用の一つは、血清中のトランスアミナーゼレベル及びビリルビンレベルの上昇であり、これらは、ヒト肝細胞に対するＴＮＦの直接的な細胞毒性作用を示している。その後の研究は、ＴＮＦが、ウイルス性肝炎、アルコール性肝疾患及び劇症肝不全に関与している可能性を示した（Mutoら、1988; Birdら、1990; Gonzalez-Amaroら、1994; Diehlら、1994; Larreaら、1996）。血清ＴＮＦレベルは、劇症肝炎を有する患者において明らかに上昇している（Mutoら、1988）。さらに、血清ＴＮＦレベルは、生存患者よりも死亡患者の方が有意に高いことが見出された（Birdら、1990）。
【０００３】
慢性Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルス感染の病原におけるＴＮＦの役割が示唆されている。両ウイルスは、ヒト肝細胞系及びヒト肝癌細胞系においてＴＮＦ発現を誘導する（Gonzalez-Amaroら、1994）。慢性Ｂ型肝炎を有する患者は、上昇した血漿ＴＮＦレベルを有しており、それらの末梢血単核細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで増強されたＴＮＦ産生を示す。さらに、インターフェロン処置を受けている慢性慢性Ｂ型感染患者において、血液単核細胞による自発的なＴＮＦ産生の大きな増加が、成功した抗原血清転換の時点で観察されており（Diehlら、1994）、このことは、増加したＴＮＦレベルがＢ型肝炎ウイルスの排除に関与していることを示唆している。さらに、慢性Ｂ型肝炎感染においては、可溶性のＴＮＦ−Ｒ１及びＴＮＦ−Ｒ２の血清レベルが有意に上昇している。可溶性のＴＮＦ−Ｒ２の血清レベルは、肝臓における炎症及び肝細胞死の程度と密接に相関している。インターフェロン療法中の応答及びトランスアミナーゼの増加は、可溶性ＴＮＦ−Ｒ２血清レベルの増加と関連している。Ｃ型肝炎患者の場合、インターフェロン処置は、応答性患者においてウイルスを排除し、ＴＮＦレベルを正常にまで低下させる（Larreaら、1996）。興味深いことに、ＴＮＦの処置前レベルは、応答性患者と比較して非応答性患者の方が高かった（Larreaら、1996）。この相互作用がアポトーシスを促進又は防止するか否かは明らかでないが、Ｃ型肝炎タンパク質はＴＮＦ受容体と相互作用する（Rayら、1998）。最近、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ５Ａタンパク質とＴＮＦ受容体関連タンパク質ＴＲＡＤＤ及びＴＲＡＦ２との間の相互作用が示された（Majumderら、2002; Parkら、2002）。パーク（Park）及び共同研究者らは、ＮＳ５Ａが、ＴＲＡＤＤとＦＡＤＤとの間の会合を防止することにより、ＴＮＦにより媒介される肝臓アポトーシスを障害することを示した。さらに、両グループは、ＮＳ５ＡがＴＲＡＤＤ及びＴＲＡＦ２により媒介されるＮＦ−κＢ活性化を防止することも示した。
【０００４】
ＴＮＦ血清レベルは、アルコール性肝炎を有する患者において増加しており、そのレベルは患者の生存率と逆相関している。急性アルコール性肝炎の発症により死亡した患者においては、ＴＮＦ濃度が有意に高かった（Birdら、1990）。アルコール性肝炎を有する患者から単離された単球は、健常コントロールと比較して、より多量のＴＮＦを自然に産生した。また、アルコール性肝炎を有する患者に由来する単球は、ＬＰＳに応答して、正常な単球より有意に多くのＴＮＦを産生した。慢性エタノール曝露を有する患者における増加したＴＮＦレベルを説明するため、いくつかの仮説が立てられている。慢性的なエタノール供給は、マクロファージにおけるＴＮＦ産生を誘導する可能性のあるＬＰＳのような細菌産物に対する腸の透過性を増加させる（McClain、1991）。さらに、アルコール性脂肪性肝炎を有する患者においてプロモーター多型を検討する研究は、アルコール性脂肪性肝炎を有する患者が、活性を増加させるＴＮＦプロモーターの突然変異を有していることを示した（Groveら、1997）。従って、アルコール性肝炎を有する患者における増加したＴＮＦ産生には、遺伝学的な要因が関与している可能性がある。
【０００５】
肝臓傷害におけるＴＮＦの役割は、いくつかの動物モデルにおいて研究されている。中和抗ＴＮＦ抗体、又はＴＮＦ、ＴＮＦ−Ｒ１もしくはＴＮＦ−Ｒ２に関するノックアウトマウスを使用することにより、ＴＮＦがｉｎ  ｖｉｖｏで肝細胞のアポトーシス及び／又は壊死を誘発することが明らかになった。肝臓傷害の種々の動物モデルにおいて、ＴＮＦは、急性肝臓傷害の病原における中心的又は相加的な役割を果たす。ここで、本発明者らは、ＴＮＦ／ガラクトサミン（ＧａｌＮ）モデルを使用した。このモデルにおいて、ＴＮＦは、ウリジンヌクレオチドを枯渇させることにより肝細胞における転写を選択的に阻止し（Dekker及びKeppler、1974）、致死、カスパーゼの活性化及びその後の肝細胞アポトーシスを誘導する（Leistら、1995; Van Molleら、1999; Tiegsら、1989）肝臓毒であるＤ−（＋）−ガラクトサミン（ＧａｌＮ）と組み合わせて投与される。ＴＮＦ−Ｒ１ノックアウトマウスは、ＴＮＦ／ＧａｌＮ処理に対して抵抗性であり、このことは、このアポトーシスモデルにおけるＴＮＦ−Ｒ１の不可欠な役割を証明している（Leistら、1995）。ＧａｌＮの感作効果は、ＧａｌＮにより誘導される転写阻止が、直接的に抗アポトーシスタンパク質の合成を阻害することを示唆している。最近、転写因子ＮＦ−κＢが、多数の抗アポトーシスタンパク質の発現を制御することが示された。
【０００６】
ＮＦ−κＢは、全ての細胞型に普遍的に発現している不可欠な転写因子であり、その活性は、サイトカイン及び細菌又はウイルスの産物を含む広範囲の誘発因子により調整される。ＮＦ−κＢ応答性遺伝子の多くが、炎症応答及び免疫応答の制御において重大な役割を果たしている。ＮＦ−κＢ活性の脱制御は、慢性関節リウマチ、喘息及び炎症性腸疾患のようないくつかの慢性炎症性疾患、並びに敗血症性ショックのような急性疾患においてしばしば観察される。さらに、ＮＦ−κＢは、アポトーシスに対して防御するよう機能し、細胞周期進行を支持する。ＮＦ−κＢ活性化が、肝臓傷害に関連した肝細胞応答を調整するかもしれないことを最初に示したのは、ＮＦ−κＢのｐ６５／Ｒｅｌ−Ａサブユニットを欠損しているノックアウトマウスが、胚形成中の大量の肝細胞アポトーシスのために発育不可能であるという所見であった（Begら、1995）。今日では、いくつかの研究室からの最近の報告が、ＮＦ−κＢ活性化がｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで肝細胞の増殖及びアポトーシスを制御することを証明している。部分肝切除術に供されたラットにおいて、ＮＦ−κＢ活性化の阻害は、その後の肝再生を障害し、肝細胞アポトーシスを誘発した（Iimuroら、1998）。これらの所見は、分裂促進刺激後の肝細胞におけるＮＦ−κＢ活性化の重大な役割を示唆しているが、ＮＦ−κＢ活性の阻害が増殖を阻止したメカニズムは不明である。アポトーシスは、細胞周期阻止、又は部分肝切除術の後に生じたＴＮＦに対する感作に起因したのかもしれない。肝細胞増殖におけるＮＦ−κＢ活性化の不可欠な役割は、ＮＦ−κＢ活性の阻害が、対数増殖期マウス肝細胞系のアポトーシスをもたらしたという所見によっても支持される（Bellasら、1997）。しかしながら、コンフルエントラット肝細胞培養物における他の研究は、ＮＦ−κＢ阻害自体は細胞死をもたらさないことを証明した（Xuら、1998）。これらの細胞において、ＮＦ−κＢ阻害は、ＴＮＦの分裂促進刺激に対する肝細胞の応答を、増殖からアポトーシスへと変換した（Xuら、1998）。これらの研究においてＮＦ−κＢ不活化がＴＮＦにより誘導されるアポトーシスを誘発したメカニズムは、カスパーゼカスケードの活性化を含んでおり、細胞死は、カスパーゼ阻害又はＮＯによって防止され得た（Xuら、1998）。
【０００７】
ＴＮＦにより誘導される傷害に対して肝細胞を防御する（１個以上の）ＮＦ−κＢ依存性遺伝子産物は、未だ同定されていない。ｉＮＯＳ及びインターロイキン−６は、ＮＦ−κＢにより制御され、遺伝子産物が肝臓防御効果を有し得るため、可能性のある候補遺伝子である。また、ＮＦ−ｋＢ活性化がＴＮＦ以外の傷害剤による肝毒性を阻害するか否かも決定されていない。肝癌細胞系ＨｅｐＧ２において、非毒性濃度のスーパーオキシド発生物質メナジオンによる処理は、ＮＦ−κＢ依存性メカニズムにより、その後の毒性用量のメナジオン又はＨ2Ｏ2に対して防御した（Chen及びCederbaum、1997）。しかしながら、ラット肝細胞系における研究は、Ｈ2Ｏ2及び銅は、ＮＦ−κＢ活性化を誘導し、毒性濃度でアポトーシスを引き起こすが、ＮＦ−κＢ活性の阻害は、Ｈ2Ｏ2又は銅による死に対して細胞を感作しないことを証明した（Xuら、1998）。従って、ＮＦ−κＢ活性化は、ＴＮＦ死経路に特異的な防衛メカニズムを刺激するのかもしれない。肝臓傷害後の肝細胞におけるＮＦ−κＢ活性化が防御性である可能性は、肝臓内の全細胞型におけるＮＦ−κＢの包括的な活性化後のイベントの複雑さを指摘する。毒性刺激の後、肝マクロファージにおけるＮＦ−κＢの活性化が、サイトカイン及び活性酸素中間体のような傷害性産物の産生をもたらすことは既知である。従って、肝臓におけるＮＦ−κＢ活性化の阻害は、肝臓傷害の可能性のある療法として考察された。今日では、肝臓におけるＮＦ−κＢ活性化の総括的な阻害は、有益な効果及び不利益な効果の両方をもたらし得るため、ＮＦ−κＢシグナル伝達は、問題のある処置標的であると考えられている。
【０００８】
最近、ＴＮＦ及びＩＬ−１に応答して起こるＮＦ−κＢ活性化を制御し媒介するシグナル伝達経路の詳細の理解が、大きく進歩した。これらのサイトカインは、特異的な細胞表面受容体と結合することにより作用し、それら受容体が、次に、多数の特異的なアダプタータンパク質の動員、及びＮＦ−κＢ阻害剤ＩκＢをリン酸化するキナーゼ複合体の活性化を開始させる。ＩκＢは、不活性な二量体の形態で細胞質にＮＦ−κＢを保持している。リン酸化された後、ＩκＢは、ユビキチン化及びその後のプロテアソームによる分解のためにマークされ、ＮＦ−κＢの核移行を可能にする。ＩκＢファミリーのメンバーは、ＮＦ−κＢの直接的な阻害剤としてよく研究されており、その他の多数のタンパク質が、ＮＦ−κＢ依存性遺伝子発現の負の制御を行うことが報告されている。本発明者ら及び他の研究者らは、ジンクフィンガータンパク質Ａ２０が、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＬＰＳ及びＣＤ−４０に応答して起こるＮＦ−κＢ活性化の強力な阻害剤であることを以前に示した（Beyaertら、2000に概説）。さらに、Ａ２０は、多数の細胞系において抗アポトーシス機能も示す。Ａ２０は、ＮＦ−κＢ活性化時にのみ発現され、ＮＦ−κＢ活性化の負のフィードバック制御に関与している。Ａ２０欠損マウスにおいては、ＮＦ−κＢ活性化の終結に欠陥があり、それが、強力な炎症応答及び悪液質をもたらすことが、最近示された（Leeら、2000）。Ａ２０によるＮＦ−κＢ依存性遺伝子発現の阻害を担う基本メカニズムは、未だ不明である。Ａ２０は、ＩκＢキナーゼ複合体と相互作用し、さらに、それぞれＴＮＦ及びＩＬ−１／ＬＰＳによって開始するＩκＢキナーゼ活性化カスケードの一部であるＴＲＡＦ２及びＴＲＡＦ６とも相互作用する。さらに、３個の新規のＡ２０結合性タンパク質（ＡＢＩＮ、ＡＢＩＮ−２及びＡＢＩＮ−３）が、最近単離された。細胞系における過剰発現により、これらのタンパク質は、ＴＮＦ又はＩＬ−１に応答して起こるＮＦ−κＢ依存性遺伝子発現を阻害することが示された（Beyaertら、2000; Heyninckら、1999; Van Huffelら、2001、Van Huffelら、未発表; AJ320534）。
【０００９】
本発明は、マウスにおいてＡＢＩＮの過剰発現がＴＮＦにより誘導される致死的な肝炎を防止するという驚くべき所見に関するものである。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明の第一の面は、ＴＮＦにより誘導される肝不全の処置のための医薬品の調製のための、配列番号２に表されるようなＡＢＩＮ又はそれらの機能的断片もしくは変異体の使用である。「ＡＢＩＮ」という用語は、Beyaertら、2000; Heyninckら、1999; Van Huffelら、2001、Van Huffelら(未発表; AJ320534）及びＷＯ９９／５７１３３に開示されたような、ＡＢＩＮ、ＡＢＩＮ−２及びＡＢＩＮ−３に関する。より具体的には、ＡＢＩＮという用語は、参照によりここに組み込まれるＷＯ９９／５７１３３にも開示されている配列番号４及び／又は配列番号５に示されるような（１個以上の）コンセンサスアミノ酸配列を含む任意のポリペプチドに関する。本発明の第二の面は、ＴＮＦにより誘導される肝不全の処置のための医薬品の製造のための、配列番号１に表されるようなＡＢＩＮをコードするヌクレオチド配列、又はそれらの機能的断片もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列の使用である。ＡＢＩＮの機能的断片とは、依然としてタンパク質Ａ２０と相互作用することができ、かつ／又はＮＦ−κＢ活性化を調整することができるポリペプチドである。好ましくは、該調整は、ＮＦ−κＢ活性化の阻害である。機能的断片とは、非制限的な例として、少なくとも配列番号２のアミノ酸４２０〜６４７、好ましくは少なくともアミノ酸３９０〜６４７、より好ましくは少なくとも５４〜６４７（配列番号３）を含む断片である。好ましくは、該断片は、少なくとも配列番号２のアミノ酸４２０〜６４７、好ましくは少なくともアミノ酸３９０〜６４７、より好ましくは少なくとも５４〜６４７（配列番号３）から主になる。変異体とは、アミノ酸レベルで、ＢＬＡＳＴ（Altschulら、1997）により測定されるような少なくとも６５％の同一性、好ましくは７０％の同一性を有するポリペプチドである。変異体は、生物学的活性、免疫学的反応性、コンフォメーション等のような共通の特徴を有する。非制限的な例として、Ｎａｆ１アルファタンパク質（ＡＪ０１１８９５）、Ｎａｆ１ベータタンパク質（ＡＪ０１１８９６）及びビリオン関連核シャトリングタンパク質（ＡＹ０１２１５５）が、変異体と見なされる。
【００１１】
さらなる面は、ＴＮＦにより誘導される肝不全の処置のための医薬品の調製のためのＡＢＩＮ誘導及び／又は活性化化合物の使用である。非制限的な例として、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）が、ＡＢＩＮ誘導化合物である（Guptaら、2000）。ＡＢＩＮ−３の場合、ＬＰＳが、ＴＨＰ１単球におけるこのタンパク質の発現を誘導する。
【００１２】
該ＴＮＦにより誘導される肝不全とは、非制限的な例として、Ａ型、Ｂ型もしくはＣ型肝炎のようなウイルス性肝炎、劇症肝炎及び／又はアルコール性肝疾患である。核酸が使用される場合、該医薬品は、好ましくは、遺伝子処置において該核酸を細胞へ送達するためのものである。極めて多数の送達法が、当業者に周知である。好ましくは、核酸は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子処置の使用のため投与される。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、裸の核酸、及びリポソームのような送達媒体と複合体化された核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後にエピソーム性のゲノム又は組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡウイルス及びＲＮＡウイルスを含む。核酸の非ウイルス送達の方法は、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸コンジュゲート、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、及び薬剤により増強されたＤＮＡの取り込みを含む。リポフェクションは、例えば米国特許第５，０４９，３８６号、米国特許第４，９４６，７８７号及び米国特許第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、トランスフェクタム（Transfectam）（商標）及びリポフェクチン（Lipofectin）（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適している陽イオン性及び中性の脂質は、フレグナー（Flegner）、ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４のものを含む。送達は、細胞に対するもの（ｅｘ  ｖｉｖｏ投与）であってもよいし、又は標的組織に対するもの（ｉｎ  ｖｉｖｏ投与）であってもよい。イムノリピッド複合体のような指向化されたリポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal、1995; Blaese、1995; Behr、1994; Remyら、1994; Gao及びHuang、1995；米国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号、及び第４，９４６，７８７号参照）。核酸の送達のためのＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、体内の特定の細胞にウイルスを指向化し、ウイルスのペイロードを核に輸送するため、高度に進化した過程を利用する。ウイルスベクターは、患者に直接投与されてもよいし（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を処理するために使用され、修飾された細胞が患者に投与されてもよい（ｅｘ  ｖｉｖｏ）。核酸の送達のための従来のウイルスに基づく系は、遺伝子導入用のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター及び単純ヘルペスウイルスベクターを含み得る。ウイルスベクターは、現在、標的の細胞及び組織への遺伝子導入の最も効率的で最も用途の広い方法である。宿主ゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスによる遺伝子導入法によって可能であり、しばしば、挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらす。さらに、多くの異なる細胞型及び標的組織において、高い形質導入効率が観察されている。
【００１３】
核酸の一過性発現が好ましい場合には、複製欠損アデノウイルスベクターを含むアデノウイルスに基づく系が、典型的に使用される。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型において極めて高い形質導入効率を有し、細胞分裂を必要としない。そのようなベクターにより、高い力価及び発現レベルが得られている。このベクターは、比較的単純な系において多量に作製され得る。組換えアデノ随伴ウイルスベクターを含むアデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターも、例えば核酸及びペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ作製において、そしてｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子処置法のため、標的核酸により細胞を形質導入するために使用されている（例えば、米国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Kotin、1994; Muzyczka参照。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Hermonat&Muzyczka、1984; Samulskiら、1989を含む多数の出版物に記載されている）。
【００１４】
遺伝子処置ベクターは、個々の患者への投与により、典型的には全身投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下もしく頭蓋内への注入）又は局所適用により、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達され得る。又は、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検材料）又は一般ドナーの造血幹細胞のような細胞にベクターがｅｘ  ｖｉｖｏ送達され、その後、一般的にはベクターが組み込まれた細胞の選択の後、患者に細胞が再移植されてもよい。（例えば、トランスフェクトされた細胞の宿主生物への再注入を介した）診断、研究、又は遺伝子処置のためのｅｘ  ｖｉｖｏ細胞トランスフェクションは、当業者に周知である。好ましい実施態様において、細胞は、対象生物より単離され、核酸（遺伝子又はｃＤＮＡ）によりトランスフェクトされ、そして対象生物（例えば、患者）へ再び戻し注入される。ｅｘ  ｖｉｖｏトランスフェクションに適した様々な細胞型が、当業者に周知である（患者から細胞を単離し培養する方法の考察については、例えばFreshneyら、1994、及びその中に引用された参照を参照のこと）。
【００１５】
さらなる実施態様において、本発明は、ＡＢＩＮ又はそれらの機能的断片もしくは変異体を含み、該ポリペプチドを医薬的に許容される担体と混合することをさらに含む医薬品又は医薬組成物の作製又は製造のための方法を提供する。
【００１６】
該医薬組成物の投与は、経口投与、吸入投与、又は非経口投与によるものであり得る。活性化合物は、単独で投与されてもよいし、又は好ましくは医薬組成物として製剤化されてもよい。単位用量は、通常、化合物又はそれらの医薬的に許容される塩を０．０１〜５０mg、例えば０．０１〜１０mg又は０．０５〜２mg含有しているであろう。単位用量は、通常、１日１回以上、例えば１日２回、３回、又は４回、より一般的には１日１〜３回、総１日用量が、通常０．０００１〜１mg/kgの範囲にあるよう投与され；従って、７０kgの成人のための適当な総１日用量は、０．０１〜５０mg、例えば０．０１〜１０mg、又はより一般的には０．０５〜１０mgである。化合物又はそれらの医薬的な許容される塩は、単位用量の経口用、非経口用、又は吸入用の組成物のような単位用量組成物の形態で投与されることが非常に好ましい。そのような組成物は、混合により調製され、経口投与、吸入投与又は非経口投与のために適当に適合化され、従って、錠剤、カプセル、経口液体調製物、粉末、顆粒、ロゼンジ（lozenges）、再生可能粉末、注射可能及び注入可能な溶液もしくは懸濁液又は坐剤又はエアロゾルの形態をとり得る。経口投与用の錠剤及びカプセルは、一般的には、単位用量で提示され、結合剤、増量剤、希釈剤、錠剤化剤、滑沢剤、崩壊剤、着色剤、調味剤及び湿潤剤のような従来の賦形剤を含有している。錠剤は、当技術分野において周知の方法に従ってコーティングされ得る。使用に適している増量剤は、セルロース、マンニトール、乳糖及びその他の類似の薬剤を含む。適当な崩壊剤は、デンプン、ポリビニルピロリドン、及びデンプングリコール酸ナトリウムのようなデンプン誘導体を含む。適当な滑沢剤は、例えば、ステアリン酸マグネシウムを含む。適当な医薬的に許容される湿潤剤は、ラウリル硫酸ナトリウムを含む。これらの固体経口組成物は、混和、充填、錠剤化等の従来の方法により調製され得る。反復的な混和操作は、大量の増量剤を利用して組成物全体に活性剤を分布させるために使用され得る。そのような操作は、当然、当技術分野における従来のものである。経口液体調製物は、例えば水性もしくは油性の懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、又はエリキシルの形態をとってもよいし、又は使用前に水もしくはその他の適当な媒体により再生させられる乾燥製品として提示されてもよい。そのような液体調製物は、懸濁化剤、例えばソルビトール、シロップ、メチルセルロース、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル又は食用硬化油脂、乳化剤、例えばレシチン、モノオレイン酸ソルビタン又はアラビアゴム；（食用油を含み得る）非水性媒体、例えばアーモンド油、分画ヤシ油、グリセリンのエステルのような油状エステル、プロピレングリコール、又はエチルアルコール；保存剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル又はソルビン酸のような従来の添加剤を含有していてもよく、所望により、従来の調味剤又は着色剤を含有していてもよい。経口用製剤は、腸溶コーティングを有する錠剤又は顆粒のような従来の徐放製剤も含む。好ましくは、吸入用組成物は、単独で、又は乳糖のような不活性担体と組み合わせられて、嗅ぎ薬（snuff）もしくは噴霧器用のエアロゾルもしくは溶液として、又は通気用の微粉末として、気道への投与のため提示される。そのような場合、活性化合物の粒子は、好適には、５０ミクロン未満、好ましくは１０ミクロン未満、例えば２〜５ミクロンのような１〜５ミクロンの直径を有する。望ましい吸入用量は、０．０５〜２mg、例えば０．０５〜０．５mg、０．１〜１mg又は０．５〜２mgの範囲にあるであろう。非経口投与の場合には、本発明の化合物及び無菌媒体を含有している液状単位剤形が調製される。活性化合物は、媒体及び濃度に依って懸濁又は溶解させられ得る。非経口溶液は、通常、化合物を媒体に溶解させ、ろ過滅菌した後、適当なバイアル又はアンプルへ充填し、密閉することにより調製される。有利には、局部麻酔薬、保存剤及び緩衝剤のような佐剤も、媒体に溶解させられる。安定性を増強するため、組成物は、バイアルへの充填後に凍結させられ、真空下で水が除去されてもよい。非経口用懸濁液は、化合物が、媒体に溶解ではなく懸濁させられ、エチレンオキシド曝露により滅菌された後、無菌媒体に懸濁させられる点を除き、実質的に同様にして調製される。有利には、活性化合物の均一な分布を容易にするため、界面活性剤又は湿潤剤が組成物に含まれる。適宜、少量の気管支拡張薬、例えばイソプレナリン、イソエタリン、サルブタモール、フェニレフリン及びエフェドリンのような交感神経様作用アミン；テオフィリン及びアミノフィリンのようなキサンチン誘導体、並びにプレドニゾロンのようなコルチコイド、並びにＡＣＴＨのような副腎刺激薬が含まれ得る。普通の実務と同様に、組成物には、一般的に、関係する医学的処置における使用のための指示の書面又は印刷物が添付されるであろう。
【００１７】
標的細胞へのＡＢＩＮ又はＡＢＩＮ断片のタンパク質形質導入に関して、タンパク質形質導入ドメイン（protein transduction domains）（ＰＴＤ）と名付けられた一連の小さなタンパク質ドメインが、効率的に、かつトランスポーター又は特異的受容体と無関係に生物学的膜を通過し、細胞へのペプチド及びタンパク質の送達を促進することが示されている。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）由来のＴＡＴタンパク質も、生物学的に活性なタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏ送達することができる。同様に、アンテナペディア（Antennapedia）ホメオドメインの第３アルファヘリックス、及び単純ヘルペスウイルス由来のＶＰ２２タンパク質は、共有結合的に連結されたペプチド又はタンパク質の細胞への送達を促進する（Fordら、2001に概説）。短い両親媒性ペプチド担体Ｐｅｐ−１に基づくタンパク質送達は、事前の化学的な共有結合的カップリングを必要とせず、完全に生物学的に活性な型の多様なペプチド及びタンパク質を、いくつかの細胞系へ送達するのに有効である（Morrisら、2001）。第一の形質導入細胞から周囲の細胞へ蔓延するＶＰ２２キメラタンパク質の能力は、遺伝子処置アプローチを改良しうる（Zenderら、2002）。
【００１８】
タンパク質は、リポソームを介しても送達され得る。リポソームは、薬物送達及び遺伝子処置のための媒体として使用されており、肝臓の特定の細胞型のターゲティングにおける実質的な潜在能力を有することが示されている。従って、リポソームの使用は、多様な肝疾患の処置におけるターゲティング効率を改良し得る（Wu及びZerm、1999）。
【００１９】
定義
ヌクレオチド配列とは、ここで使用されるように、ヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれか）の任意の長さの重合型をさす。この用語は、分子の一次構造のみをさす。従って、この用語は、二本鎖及び一本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡを含む。それは、既知の型の修飾、例えばメチル化、１個以上の天然に存在するヌクレオチドのアナログへの「ｃａｐｓ」置換も含む。
【００２０】
過剰発現とは、ここで使用されるように、同一条件下で維持された場合に、形質転換細胞が、非形質転換コントロールより多く過剰発現されたタンパク質を産生することを意味する。好ましくは、過剰発現は、構成性プロモーターの下流にコーディング配列を置くことにより得られる。
【００２１】
コーディング配列とは、適切な制御配列の調節下に置かれた場合に、ｍＲＮＡへ転写され、かつ／又はポリペプチドへ翻訳されるヌクレオチド配列である。コーディング配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドン及び３’末端の翻訳終止コドンにより決定される。コーディング配列は、以下に制限はされないが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、組換えヌクレオチド配列又はゲノムＤＮＡを含み、ある種の状況においてはイントロンが存在してもよい。
【００２２】
タンパク質Ａ２０（「Ａ２０」）とは、Dixitら、1990; Opipariら、1990及びTewariら、1995により記載されたＴＮＦにより誘導されるジンクフィンガータンパク質、又はジンクフィンガー含有部分（ヒトＡ２０のアミノ酸３８７〜７９０、及びマウスＡ２０のアミノ酸３６９〜７７５）のようなそれらの活性断片を意味する。
【００２３】
タンパク質及びポリペプチドという用語は、本願において使用されるように、交換可能である。ポリペプチドとは、アミノ酸の重合体をさし、分子の特定の長さをさすものではない。この用語は、グリコシル化、リン酸化及びアセチル化のようなポリペプチドの翻訳後修飾も含む。
【００２４】
ＩκＢスーパーリプレッサー（ＩκＢｓ）とは、サイトゾルタンパク質複合体内にＮＦ−κＢを閉じ込め、その核作用を防止する、Ｓ３２Ａ及びＳ３６Ａという突然変異を有する非分解性突然変異型ＩκＢ−αを意味する。
【００２５】
実施例
実施例１：ＡＢＩＮアデノウイルスの作成
ＥタグにＮ末端融合したマウスＡＢＩＮ  ｃＤＮＡを、それぞれＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩの制限部位を含有している順方向プライマー（５’ｃｇｇｇａｔｃｃｇｃｃａｔｇｇｇｔｇｃｇｃｃｇｇｔｇｃｃ３’）及び逆方向プライマー（５’ｃｃｃｃａａｇｃｔｔａａａｔｇａｃｃｃａｃｔｇｃａｇｃｃ３’）を用いたＰＣＲを介して増幅した。得られた断片を、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで開裂させたｐＬｐＡ．ＣＭＶシャトルベクター（Gomez-Foixら、1992）へクローニングし、ＤＮＡ／リン酸カルシウム共沈により９１１網膜細胞へｐＪＭ１７（McGroryら、1988）と共トランスフェクトした。ＡＢＩＮ導入遺伝子を発現するシャトルベクターのｐＪＭ１７骨格とのｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによって、複製欠損Ｅ１欠失アデノウイルス５型（ＡｄＡＢＩＮ）を得た。導入遺伝子を発現しないコントロールウイルス（ＡｄＲＲ５）を、同様にして作成した。組換えの後、組換えプラークを単離し、抽出されたＤＮＡをＰＣＲを介して確認し、正確な導入遺伝子の発現を、ウエスタンブロッティングにより確認した。高力価ウイルスストックをＨＥＫ２９３細胞において調製し、単一ＣｓＣｌバンド形成を介して精製した。感染単位力価を、種々のウイルス希釈物を用いてコンフルエントＨＥＫ２９３細胞で実施されたプラークアッセイにおいて決定した。溶解細胞のプラークを計数し、ウイルスストック１ml当たりのプラーク形成単位（pfu）として計算した。
【００２６】
実施例２：ＡｄＡＢｌＮ感染によるｉｎ  ｖｉｔｒｏのＡＢＩＮ発現
ＡｄＡＢＩＮを、ＢＷＴＧ３肝癌細胞系（Szpirer及びSzpirer、1975）における導入遺伝子の発現に関して試験した。ＡｄＡＢＩＮ感染を、感染多重度（ｍｏｉ）１００：１で実施した。細胞を、最小容量の無血清培地中でウイルスと共に２時間インキュベートし、その後、血清含有培地を一夜のインキュベーションのために添加した。ＡＢＩＮの発現を調節するため、細胞を感染後２４時間目に溶解させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＨＲＰ結合抗Ｅタグ抗体（Amersham）を用いたイムノブロッティングにより分析した。ＡｄＡＢＩＮ感染は、明らかなＡＢＩＮの発現をもたらした（示されないデータ）。
【００２７】
ＡＢＩＮの感染効率及び細胞内発現パターンを、免疫蛍光により分析した。この場合、感染後２４時間目に細胞を分割し、カバーガラス上に播いた。さらに２４時間後、細胞を洗浄し、−２０℃で１００％メタノールで１０分間固定し、室温で１％トリトンＸ−１００により１０分間透過性化した。０．５％ＢＳＡによる３０分間のブロッキングの後、細胞を、モノクローナル抗Ｅタグ抗体（Amersham）の１／３０００希釈物と共に９０分間インキュベートし、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Molecular probes）抗体の１／６００希釈物と共に９０分間インキュベートした。ＤＡＰＩ核染色の後、カバーガラスをVectashield（Vector Laboratories）でマウントし、Leica DM-IL顕微鏡を用いて分析した。これは、感染効率が９０％より高く、ＡＢＩＮが細胞質に排他的に局在していることを明らかにした（示されないデータ）。
【００２８】
実施例３：ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴＮＦにより誘導されるＮＦ−κＢ依存性遺伝子発現のＡｄＡＢＩＮによる阻害
ＮＦ−κＢ依存性遺伝子発現に対するＡＢＩＮの効果を分析するため、感染後２４時間目に細胞をｐＮＦｃｏｎｌｕｃによりトランスフェクトした。ｐＮＦｃｏｎｌｕｃは、最小プロモーター及び３個のＮＦ−κＢ結合部位の後にルシフェラーゼレポーター遺伝子を保持している（Kimuraら、1986）。トランスフェクションは、製造業者（Roche biochemicals）の指示に従い、ＦｕＧｅｎｅトランスフェクション試薬を使用して実施した。６：１というＦｕＧｅｎｅ：ＤＮＡ比率を使用し、ＦｕＧｅｎｅ：ＤＮＡ混合物を４５分間プレインキュベートした後、新鮮な完全培地に２４時間細胞を添加した。細胞を２４穴プレートに播き、２４時間インキュベートした。次いで、細胞を未処理のままにするか、又は１０００IU/ml  ＴＮＦにより刺激した。６時間後、全ての細胞を、溶解バッファー（２５mMリン酸トリスpH７．８、２mM  ＤＴＴ、２mM  ＣＤＴＡ、１０％グリセロール及び１％トリトンＸ−１００）１００μlで溶解させた。Ｌｕｃ活性及びＧａｌ活性を、以前に記載されたようにして（De Valckら、1996）、分析した。トランスフェクション効率の差を補正するため、Ｌｕｃ値をＧａｌ値に対して規準化した（ｌｕｃ／ｇａｌとしてプロットした）。ＡｄＡＢＩＮ感染は、ＴＮＦに応答して起こるＮＦ−κＢ依存性ルシフェラーゼ発現を防止したが、ＡｄＲＲ５感染には効果がなかった。
【００２９】
ＩκＢレベルがＡＢＩＮ発現により変化しなかったという観察は、ＡＢＩＮがＮＦ−κＢ二量体の核移行には影響を与えないことを示唆する。核ＮＦ−κＢの存在及びＮＦ−κＢ特異的ＤＮＡプローブとの結合に対するＡＢＩＮの効果を分析するため、細胞を未処理のままにするか、又は感染後２４時間目に１０００IU/ml  ｍＴＮＦにより３０分間処理した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、プレートから剥離し、細胞を収集するため１２０００×gで３０秒間遠心分離した。
【００３０】
実施例４：ＡＢＩＮはＴＮＦにより媒介される細胞死を有意に阻害しない
ＡＢＩＮが、ＴＮＦにより媒介される細胞死に対する効果を有するか否かを検討するため、ＡｄＡＢＩＮ、ＡｄＲＲ５又は模擬感染させたＢＷＴＧ３細胞を、ＴＮＦ、又はＴＮＦとシクロヘキシミド（ＣＨＸ）との組み合わせと共にインキュベートした。より具体的には、感染後２４時間目に、１ウェル当たり４×１０4個の密度で細胞を９６穴プレートに播いた。さらに２４時間後、ｍＴＮＦ単独の希釈物、又はＴＮＦの希釈物と一定濃度（１０μg/ml）のＣＨＸとの組み合わせにより、細胞を刺激した。細胞死を顕微鏡により観察し、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）（Tadaら、1986）と共に細胞をインキュベートすることにより定量した。形成された結晶の溶解の後、参照波長として６５５nmを用いて、波長５９５nmのイムノリーダー（Biorad）で吸光度を決定した。ＴＮＦは、単独では、ＢＷＴＧ３細胞に対する細胞毒性作用を有しなかったが、ＴＮＦ＋ＣＨＸ処理は、アポトーシスによる細胞死を引き起こした。ＡｄＡＢＩＮ感染は、低用量のＴＮＦに対する限定された防護のみを提供し、より高用量のＴＮＦにおいては防護は全く存在しなかった（図２）。
【００３１】
実施例５：ＡｄＡＢＩＮ感染マウスの肝臓におけるＡＢＩＮの発現
２．５×１０9 pfu  ＡｄＡＢＩＮをＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注射することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏの導入遺伝子の発現及びその生物学的活性に関して、ＡｄＡＢＩＮを試験した。感染後１〜６日目に、マウスを屠殺し、肝臓を単離した。肝臓の３分の１を小片へと切断し、０．１mMアプロチニン、１mM  ＰＭＳＦ及び１mMグルタチオンが補足された溶解バッファー（１％ＮＰ−４０、２００mM  ＮａＣｌ、１０mMトリス−Ｃｌ  pH７．５、５mM  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール）における破砕（douncing）によりホモジナイズした。氷上での２０分間のインキュベーションの後、ホモジネートを、４℃の卓上型遠心分離機において最大速度で３０分間遠心分離した。タンパク質濃度を、ブラッドフォード（Bradford）分析（Biorad）により決定した。タンパク質５０μgをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＨＲＰ結合抗Ｅタグ抗体（Amersham）を用いてイムノブロットした。シグナルを、ＥＣＬ（Amersham）により明らかにした。ＡＢＩＮ発現は感染後３日目に最大となり、少なくとも６日間高いままであった（示されないデータ）。
【００３２】
実施例６：ｉｎ  ｖｉｖｏのＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導されるＮＦ−κＢ活性化のＡｄＡＢＩＮ及びＡｄ−ＩκＢｓによる阻害
肝臓におけるＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導されるＮＦ−κＢ活性化に対するＡｄＡＢＩＮの効果を分析するため、本発明者らは、ＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導されるＩκＢα分解に対するＡｄＡＢＩＮ感染の効果をウエスタンブロッティングにより試験した。平行して、ゲルシフトアッセイにおいて、肝臓の核細胞抽出物中の活性ＮＦ−κＢの存在に関しても同一試料を分析した。マウスに、２．５×１０9 pfuのＡｄ−ＡＢＩＮ、Ａｄ−ＩκＢＳ（＝ＩκＢスーパーリプレッサー）又はＡｄＲＲ５（＝空のウイルスコントロール）を注射（i.v.）し、３日後、ＰＢＳで希釈された致死用量のＴＮＦ（０．３μg）／ＧａｌＮ（２０mg）の注射によりチャレンジした。ＰＢＳそのものを、コントロールとした。ＴＮＦ／ＧａｌＮ処理後の種々の時点において、マウスを死亡させ、肝ホモジネートを調製した。ＩκＢα発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びポリクローナル抗ＩκＢα抗体（Santa Cruz）を用いたイムノブロッティングにより分析した（図１、上パネル）。ＩκＢαは、０．５時間のＴＮＦ／ＧａｌＮ処理後、ほぼ完全に分解され、１．５時間後に再出現した。この再出現は、ＴＮＦに応答して起こったＩκＢαの新規合成のためである可能性が最も高い。導入遺伝子の発現が内因性遺伝子の発現をマスクしたＡｄＩκＢα感染マウスにおいては、強力なＩκＢαシグナルが認められた。最も重要なこととして、ＡｄＡＢＩＮ感染動物の場合には、ＩκＢα分解が、ＡｄＲＲ５コントロールマウスと比較して強く遅延した。これらの結果は、ＡｄＡＢＩＮ感染マウスの肝臓において、ＡＢＩＮがＮＦ−κＢ活性化を阻害することを証明している。さらに、マウス肝臓の核細胞抽出物のゲルシフトアッセイにおいてＮＦ−κＢ活性化を分析した。マウス肝臓の小片を、膨張バッファー（１０mMヘペスpH７．５、１０mM  ＫＣｌ、１mM  ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、０．５mM  ＥＤＴＡ  pH７．５、０．１mM  ＥＧＴＡ  pH７．５、２mMペファブロック（Pefablock）、０．５mM  ＤＴＴ、０．１５IU/MLアプロチニン）１ml中での破砕（Douncing）によりホモジナイズした。氷上での１５分間のインキュベーションの後、１０％ＮＰ−４０溶液６５μlを添加し、その後、エッペンドルフ遠心分離機において最大スピードで１５分間の遠心分離を行った。ペレットを核抽出バッファー（２０mMヘペスpH７．５、１％ＮＰ−４０、１mM  ＭｇＣｌ２、４００mM  ＮａＣｌ、１０mM  ＫＣＬ、２０％グリセロール、０．５mM  ＥＤＴＡ  pH７．５、０．１mM  ＥＧＴＡ  pH７．５、２mMペファブロック（Pefabloc）、０．５mM  ＤＴＴ、０．１５IU/mlアプロチニン）１００μlに再懸濁させた。エッペンドルフ遠心分離機における最大スピードでの１５分間の遠心分離の後、上清を使用時まで−７０で保管した。核溶解物１０μlを、以下のバッファー：４％フィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）４００、２０mMヘペスpH７．５、６０mM  ＫＣｌ、２mM  ＤＴＴ、１００μg/mlポリｄ（Ｉ−Ｃ）、１mg/mlアセチル化ＢＳＡの中で、32Ｐ標識ＮＦ−κＢ特異的ＤＮＡプローブ（ａｇｃｔａｇａｇｇｇｇａｓｃｔｔｔｃｃｇａｇａｇｇ）と共に室温で３０分間インキュベートした。次いで、抽出物を４％非変性ポリアクリルアミドゲルで泳動させた。放射能を、ｘ線フィルムの露光により可視化した。これは、ＡｄＡＢＩＮが、���ｄ−ＩκＢＳと同様に、ＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導されるＮＦ−κＢの核移行及びＤＮＡ結合を強く防止することを示した（図１、下パネル）。これより、アデノウイルスによるＡｄＡＢＩＮ又はＡｄＩκＢαの感染は、マウス肝臓におけるＮＦ−κＢ  ＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害すると結論付けることができる。
【００３３】
実施例７：ＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導される致死的な肝炎のＡＢＩＮによる阻害
ＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導される致死に対するＡＢＩＮの効果を分析するため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２．５×１０9 pfuのＡｄＡＢＩＮ（ｎ＝８）又はＡｄＲＲ５（ｎ＝９）を静脈（i.v.）注射した。３日後、全てのマウスに、致死用量のＴＮＦ／ＧａｌＮを与えた。１時間毎に体温を測定し、致死を査定した。コントロールマウスは、早くも注射後６時間目に体温の劇的な降下を示したが（図３）、ＡＢＩＮ発現マウスは、実験の間中、正常な体温を示した（注射後１８日目まで分析された）。最も重要なこととして、コントロールマウスは全て３６時間以内に死亡したが、ＡＢＩＮ発現マウスは全て生存し続け、その時点で疾病の徴候を何ら示さなかった（図４）。
【００３４】
肝臓毒性に対するＡＢＩＮの効果を分析するため、前記と同様にしてマウスにＡｄＡＢＩＮ（ｎ＝５）又はＡｄＲＲ５（ｎ＝５）を注射し、その３日後、致死用量のＴＮＦ／ＧａｌＮを注射した。ＡｄＲＲ５マウスが強い体温低下を示した時点で、組織学及び生化学の研究のため動物を屠殺した。ＡｄＲＲ５マウス及びＡｄＡＢＩＮマウスから血液を収集し、さらなる分析のため肝臓を調製した。ＴＮＦ／ＧａｌＮ注射後の血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）濃度を、酵素／比色キット（Sigma）を使用して決定し、肝臓壊死に関するパラメーターとした（Reutterら、1968）。血液は、軽いエーテル麻酔下で眼窩静脈叢より採取し、３７℃で３０分間、そして４℃で１時間、凝固させ、その後、１６，０００×gで遠心分離した。血清は−２０℃で保管した。ＡＬＴレベルは、コントロールマウスと比較した場合、ＡｄＡＢＩＮ感染マウスにおいて有意に低減した（図５）。ＤＮＡ断片化及びカスパーゼ活性化を、アポトーシスに関するパラメーターとして分析した。ＤＮＡ断片化は、マイクロタイタープレートにおいて、ヒストン複合体化ＤＮＡ断片の免疫化学的決定により測定した（Salgameら、1997）。簡単に説明すると、プレートに、ヒストンＨ２Ｂに対するＡｂをコーティングした。ブロッキング後、肝ホモジネートを添加し、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ及びＤＮＡのヌクレオソーム粒子構成素に特異的なビオチン化検出Ａｂを投与した。検出は、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（Sanvertech、Boechout、Belgium）及び基質（Sigma）を用いて実施した。ＴＮＦ／ＧａｌＮ処理マウスに由来する試料で得られたシグナルを１００％として設定した。これらの実験は、ＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導されるＤＮＡ断片化が、ＡｄＡＢＩＮ感染動物において有意に低下することを示している（図６）。カスパーゼ活性化は、肝細胞抽出物とのインキュベーションによるＡｃ−ＤＥＶＤ−ａｍｃの加水分解により明らかにした。簡単に説明すると、肝ホモジネート３０μgを、５０μM  Ａｃ−ＤＥＶＤ．ａｍｃ（Peptide Institute; Osaka、Japan）の存在下で、２００ulの無細胞系バッファー（１０mMヘペスpH７．５、２２０mMマンニトール、６８mMショ糖、２mM  ＮａＣｌ、２mM  ＭｇＣｌ2、２．５mM  ＫＨ2ＰＯ4、１０mM  ＤＴＴ）中で３０度で６０分間インキュベートした。７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）の放出を、励起波長３６０nm及び放射波長４０９nmの蛍光光度計（CytoFluor; PerSeptive Biosystems; Cambridge MA、USA）で６０分間モニタリングした。データは、時間の関数としての蛍光の増加（ΔＦ／分）として表されている。ＴＮＦ／ＧａｌＮ処理マウスの肝ホモジネートとのインキュベーションによるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣの加水分解は、ＡｄＡＢＩＮ感染動物において有意に低下した（図７）。同様に、ＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導されるカスパーゼ活性化のＡｄＡＢＩＮ感染による阻害も、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びカスパーゼ−３特異的ポリクローナル抗体を用いたイムノブロッティングにより明らかにされたような、カスパーゼ−３のタンパク質分解成熟の阻害により証明された（図８）。
【００３５】
組織学により示されるように、ＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導される致死的な肝炎は、実質組織の全組織破壊、類洞の部位における赤血球の流入（出血）並びに肝細胞のアポトーシス及び壊死に関連している。さらに、肝臓へのマクロファージ及び好中球の大量の流入が観察され得る。ＡｄＡＢＩＮで前処理されたマウスの肝臓は、組織完全性のより良好な保存を示し、ほぼ全く出血を示さなかった。ＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導される致死、肝細胞の細胞死及び出血からの完全な防護とは対照的に、白血球の浸潤は、ＡＢＩＮのｉｎ  ｖｉｖｏ発現により部分的にしか減少しなかった。
【００３６】
前述のように、肝臓のＮＦ−κＢ活性化の包括的な阻害は、有益な効果及び不利益な効果の両方をもたらし得る。実際、アデノウイルスによるドミナントＩκＢＡスーパーリプレッサーの投与は、ＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導される致死を防御しない。同一の実験において、アデノウイルスによるＡＢＩＮの投与は、マウスを完全に防御した（図９）。現時点では、ＡＢＩＮ及びＩκＢｓの異なる効果の明確な説明を与えることはできない。しかしながら、ＡＢＩＮが、ＩκＢαとは対照的に、ＩＫＫ複合体の上流のＮＦ−κＢ活性化を阻害することは言及されるべきである。ＮＦ−κＢシグナル伝達の刺激特異的な差がＩＫＫ複合体の上流で示されているため、ＮＦ−κＢ依存性遺伝子発現のＡＢＩＮにより媒介される阻害がＮＦ−κＢ応答性遺伝子の選択に限定されている可能性がないわけではない。ＮＦ−κＢ依存性遺伝子のそのような可能性のある選択的な阻害が、感作タンパク質と防御タンパク質と間のバランスをシフトさせ、それが、この阻害剤の正味の防護効果をもたらすのかもしれない。又は、ＴＮＦにより誘導される肝不全に対する防護におけるＡＢＩＮのＮＦ−κＢ非依存的な効果を除外することはできない。
【００３７】
Ｆａｓは、特異的なリガンド又は抗体の結合により細胞死を誘発するアポトーシスシグナル伝達細胞表面分子である。抗Ｆａｓ抗体によるマウスの処理は、大量のアポトーシスによる劇症肝炎を引き起こす（Ogasawaraら、1993）。ＴＮＦ／ＧａｌＮとは対照的に、抗Ｆａｓは、肝臓におけるＮＦ−κＢ活性化及び炎症応答をもたらすのではなく、むしろ直接的なアポトーシス応答を誘導する。抗Ｆａｓにより媒介される致死に対するＡｄＡＢＩＮ感染マウスの感受性を調査するため、前記と同様にしてマウスにＡｄＲＲ５又はＡｄＡＢＩＮを注射し、３日後、抗Ｆａｓ（Pharmingen）１０μgを（i.v.）注射した。ＡｄＲＲ５前処理マウス及びＡｄＡＢＩＮ前処理マウスの両方が、抗Ｆａｓの投与後３〜５時間以内に死亡した（図１０）。これは、ＡＢＩＮが、Ｆａｓにより媒介されるアポトーシスのシグナル伝達経路に有意に影響しないことを証明している。ＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導される肝不全の防護と、抗Ｆａｓにより誘導される肝不全の防護との差違が、受容体関与の差（ＴＮＦ受容体であるかＦａｓであるか）によるものなのか、又はアポトーシスの役割及び遺伝子依存性効果の差を反映しているのかをさらに調査するため、本発明者らは、アクチノマイシンＤ感作マウスにおけるＴＮＦにより誘導される致死に対するＡｄＡＢＩＮの効果も分析した。アクチノマイシンＤは細胞転写を阻止し、炎症成分の寄付なしに、ＴＮＦの直接的なアポトーシス効果に対して細胞を感作する。従って、前記と同様にしてマウスにＡｄＲＲ５又はＡｄＡＢＩＮを注射し、３日後、ＴＮＦ０．３μg及びアクチノマイシンＤ  ２０μgを（i.v.）注射した。ＡｄＲＲ５前処理マウス及びＡｄＡＢＩＮ前処理マウスの両方が、ＴＮＦ／ＡｃｔＤの投与後２０〜３５時間以内に死亡した（図１１）。総合すると、これらの結果は、ＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導される肝不全に対するＡＢＩＮにより媒介される防護が、転写依存性のイベントを含むことを示唆している。
【００３８】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ｉｎ  ｖｉｖｏのＴＮＦ／ＧａｌＮにより刺激されるＩκＢの分解（上パネル）及びＮＦ−κＢのＤＮＡ結合（下パネル）に対するＡｄＡＢＩＮの効果。マウスに、２．５×１０9 pfuのＡｄ−ＡＢＩＮ、Ａｄ−ＩκＢＳ（＝ＩκＢスーパーリプレッサー）又はＡｄＲＲ５（＝空のウイルスコントロール）を注射（i.v.）し、３日後、ＰＢＳで希釈された致死用量のＴＮＦ（０．３μg）／ＧａｌＮ（２０mg）の注射によりチャレンジした。ＰＢＳだけのものを、コントロールとした。ＴＮＦ／ＧａｌＮ処理後の種々の時点において、マウスを死亡させ、肝ホモジネートを調製した。ＩκＢα発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びポリクローナル抗ＩκＢα抗体を用いたイムノブロッティングにより分析した（上パネル）。ＮＦ−κＢ  ＤＮＡ結合は、核抽出物１０μgを放射標識されたプローブと共にインキュベートし、非変性ゲルで泳動させることにより分析した。ＮＦ−κＢのＤＮＡプローブとの結合は、Ｘ線フィルムへの露光により明らかにした（下パネル）。
【図２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＴＮＦにより媒介される細胞死に対するＡｄＡＢＩＮの効果。ＡｄＡＢＩＮ、ＡｄＲＲ５又は模擬感染させたＢＷＴＧ３細胞を、９６穴プレートに播き、ＣＨＸの非存在下（上）又は存在下（下）でｍＴＮＦの段階希釈物により８時間刺激した。細胞死は、ＭＴＴとのインキュベーションにより分析した。
【図３】マウスにおけるＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導される体温降下に対するＡｄＡＢＩＮの効果。マウスに、２．５．１０9 pfuのＡｄＡＢＩＮ（ｎ＝８）又はＡｄＲＲ５（＝コントロール）（ｎ＝９）を注射（i.v.）し、３日後、ＴＮＦ  ０．３μg＋ＧａｌＮ  ２０mgによりチャレンジした。チャレンジ後１８時間目まで１時間毎に温度（℃）を測定した。
【図４】ＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導される致死に対するＡｄＡＢＩＮの効果。マウスに、２．５．１０9 pfuのＡｄＡＢＩＮ（ｎ＝８）又はＡｄＲＲ５（＝コントロール）（ｎ＝９）を注射（i.v.）し、３日後、ＴＮＦ  ０．３μg＋ＧａｌＮ  ２０mgによりチャレンジした。致死を、７２時間にわたり測定した（さらなる死は起こらなかった）。
【図５】ＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導される血清中へのアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）放出に対するＡｄＡＢＩＮの効果。ＡｄＡＢＩＮ又はＡｄＲＲ５を感染させたマウスを致死用量のＴＮＦ／ＧａｌＮによりチャレンジし、注射後８時間目に採血した。血清を調製し、血清ＡＬＴ値（U/L）を測定した。
【図６】肝臓におけるＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導されるＤＮＡ断片化に対するＡｄＡＢＩＮの効果。ＡｄＡＢＩＮ又はＡｄＲＲ５を感染させたマウスの肝臓を、致死用量のＴＮＦ／ＧａｌＮによるチャレンジの後、８時間目に単離した。ＤＮＡ断片化はＥＬＩＳＡにより測定され、コントロールマウス（ＡｄＲＲ５）に対する％として表されている。
【図７】肝ホモジネートにおけるＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導されるカスパーゼ活性に対するＡｄＡＢＩＮの効果。ＡｄＡＢＩＮ又はＡｄＲＲ５を感染させたマウス（各ｎ＝５）を、ＴＮＦ＋ＧａｌＮにより８時間処理した。肝ホモジネート３０μgを、Ａｃ−ＤＥＶＤ．ＡＭＣに対するタンパク質分解活性に関して試験した。タンパク質分解活性は、時間の関数としてのＡＭＣ蛍光の増加（ΔＦ／分）として表されている。
【図８】肝ホモジネートにおけるＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導されるカスパーゼ−３の切断に対するＡｄＡＢＩＮの効果。ＡｄＡＢＩＮ又はＡｄＲＲ５を感染させたマウスを、未処理のままにするか（ｎ＝４）、又はＴＮＦ＋ＧａｌＮを８時間注射した（ｎ＝５）。肝ホモジネートを調製し、タンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ポリクローナル抗カスパーゼ−３抗体を使用してイムノブロットした。不活性プロカスパーゼ−３、及びタンパク質分解により放出されるカスパーゼ−３のｐ２０サブユニットが、矢印により示されている。
【図９】ＴＮＦ／ＧａｌＮにより誘導される致死に対するＡｄＡＢＩＮ及びＡｄＩκＢｓの比較。マウスに、２．５．１０9 pfuのＡｄＡＢＩＮ（ｎ＝５）、ＡｄＩκＢｓ（ｎ＝５）又はＡｄＲＲ５（＝コントロール）（ｎ＝９）を注射（i.v.）し、その３日後、ＴＮＦ  ０．３μg＋ＧａｌＮ  ２０mgによりチャレンジした。致死を、７日間にわたり測定した。
【図１０】抗Ｆａｓにより誘導される致死に対するＡｄＡＢＩＮの効果。マウスに、２．５．１０9 pfuのＡｄＡＢＩＮ（ｎ＝３）又はＡｄＲＲ５（＝コントロール）（ｎ＝３）を注射（i.v.）し、その３日後、抗Ｆａｓ  １０μgによりチャレンジした。致死を、５時間にわたり測定した。
【図１１】ＴＮＦ／ＡｃｔＤにより誘導される致死に対するＡｄＡＢＩＮの効果。マウスに、２．５．１０9 pfuのＡｄＡＢＩＮ（ｎ＝５）又はＡｄＲＲ５（＝コントロール）（ｎ＝５）を注射（i.v.）し、その３日後、ＴＮＦ  ０．３μg＋ＡｃｔＤ（アクチノマイシンＤ）２０μgによりチャレンジした。致死を、３５時間にわたり測定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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