(57)【要約】本発明はエールリヒア・ケイニスの多型性多重遺伝子ファミリーからの相同性免疫応答性２８ｋＤａ蛋白質遺伝子ｐ２８−１、−２、−３、−５、−６、−７、−９のクローニング、配列決定、及び発現に関している。さらに、エールリヒア・ケイニスの全部で９つの相同性２８ｋＤａ蛋白質遺伝子をコードする多重遺伝子座が開示されている。組み換えエールリヒア・ケイニス２８ｋＤａ蛋白質はエールリヒア・ケイニスに感染したイヌの回復期抗血清と反応し、疾病の予防及び血清診断に特に有効なワクチン及び血清診断の開発に有益である可能性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エールリヒア・ケイニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ）の３０キロドルトン蛋白質をコードする単離されたＤＮＡ配列において、前記蛋白質が抗エールリヒア・ケイニス血清と免疫反応性であることを特徴とするＤＮＡ配列。
【請求項２】
前記蛋白質が配列識別番号Ｎｏ．２、４、６、４０、４２、４４、及び４６で構成される群から選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ配列。
【請求項３】
前記蛋白質がＮ末端信号配列を有していることを特徴とする請求項２記載のＤＮＡ配列。
【請求項４】
前記蛋白質が２８キロドルトン蛋白質に翻訳後修飾されることを特徴とする請求項３記載のＤＮＡ配列。
【請求項５】
前記ＤＮＡが配列識別番号Ｎｏ．１、３、５、３９、４１、４３及び４５で構成される群から選択される配列を含んでいることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ配列。
【請求項６】
前記ＤＮＡがエールリヒア・ケイニスの１つの座に含まれていることを特徴とする請求項１記載のＤＮＡ配列。
【請求項７】
前記座が１０，６７７塩基対の長さを有する多重遺伝子座であることを特徴とする請求項６記載のＤＮＡ配列。
【請求項８】
前記座がエールリヒア・ケイニスの相同性２８キロドルトン蛋白質をコードする遺伝子を含んでいることを特徴とする請求項７記載のＤＮＡ配列。
【請求項９】
エールリヒア・ケイニスの前記相同性２８キロドルトン蛋白質がｐ２８−１、ｐ２８−２、ｐ２８−３、ｐ２８−４、ｐ２８−５、ｐ２８−６、ｐ２８−７、ｐ２８−８、及びｐ２８−９で構成される群から選択されることを特徴とする請求項８記載のＤＮＡ配列。
【請求項１０】
請求項１記載のＤＮＡ配列からなるベクター。
【請求項１１】
前記ベクターが、前記発現ベクターが細胞内に導入された場合に、配列識別番号Ｎｏ．１、３、５、３９、４１、４３及び４５で構成される群から選択される配列によってコードされるペプチドあるいはポリペプチドを発現することができる発現ベクターであることを特徴とする請求項１０記載のベクター。
【請求項１２】
配列識別番号Ｎｏ．２、４、６、４０、４２、４４及び４６で構成される群から選択されるアミノ酸配列からなる組み換え蛋白質。
【請求項１３】
前記アミノ酸配列が配列識別番号Ｎｏ．１、３、５、３９、４１、４３及び４５で構成される群から選択される配列を含む核酸セグメントによってコードされることを特徴とする請求項１２記載の組み換え蛋白質。
【請求項１４】
配列識別番号Ｎｏ．１、３、５、３９、４１、４３及び４５で構成される群から選択される核酸セグメントを含むホスト細胞。
【請求項１５】
請求項１２の組み換え蛋白質を生成する方法において、
プロモータに操作可能に結合した配列識別番号Ｎｏ．２、４、６、４０、４２、４４及び４６で構成される群から選択されるアミノ酸配列をコードする配列からなる発現領域を含むベクターを得るステップと、
前記ベクターを細胞にトランスフェクトさせるステップと、そして
前記発現領域の発現に有効な条件下で前記細胞を培養するステップとで
構成されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
配列識別番号Ｎｏ．２、４、６、４０、４２、４４及び４６で構成される群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと免疫反応性がある抗体。
【請求項１７】
個体におけるエールリヒア・ケイニス感染を抑止する方法において、
エールリヒア・ケイニスに露出された、あるいはそれに露出、感染されたことが疑われる個体を識別するステップと、そして
エールリヒア・ケイニスの２８キロドルトン抗原で構成される組成物を、エールリヒア・ケイニス感染を抑止するのに有効な量投与するステップとで
構成される方法。
【請求項１８】
前記２８キロドルトン抗原が配列識別番号Ｎｏ．２、４、６、４０、４２、４４及び４６で構成される群から選択されるアミノ酸配列からなる組み換え蛋白質であることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記組み換え蛋白質が配列識別番号Ｎｏ．１、３、５、３９、４１、４３及び４５で構成される群から選択される配列を含む遺伝子によってコードされることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
２８キロドルトン抗原からなる前記組成物が薬学的に許容される担体内に分散されていることを特徴とする請求項１７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は一般的には分子生物学の分野に関している。より具体的には、本発明はエールリヒア・ケイニス内の相同性２８キロドルトン蛋白質遺伝子、上記エールリヒア・ケイニスの２８キロドルトン相同性蛋白質をコードする多重遺伝子座の分子クローニング及び特徴づけと、その利用に関する。
【０００２】
（関連技術の説明）
イヌの熱帯性汎血球減少症としても知られているイヌのエールリヒア症は、最初に１９３５年にアフリカで報告され、次いで１９６３年にアメリカで報告された（Ｄｏｎａｔｉｅｎ ａｎｄ Ｌｅｓｔｏｑｕａｒｄ， １９３５； Ｅｗｉｎｇ， １９６３）イヌのダニ媒介性リケッチア病である。この病気はベトナム戦争中の米国軍用犬の間に起きた家畜流行病の勃発後によく知られるようになった（Ｗａｌｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７０）。
【０００３】
イヌのエールリヒア症の病原作用因子は小型のグラム陰性細胞内バクテリアで、単核食細胞に対する向性を示し（Ｎｙｉｎｄｏ ｅｔ ａｌ．， １９７１）、褐色イヌ・ダニであるリピセファルス・サンギネウス（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）から放出される（Ｇｒｏｖｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９７５）エールリヒア・ケイニスである。イヌのエールリヒア症の進行は、急性、潜在性、及び慢性の３つの段階で発生する。急性段階は熱、食欲不振、鬱、リンパ節障害、そして血小板減少などを特徴としている（Ｔｒｏｙ ａｎｄ Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ， １９９０）。イヌは通常急性段階からは回復するが、数ヶ月間、場合によっては数年間も臨床的兆候なしで慢性的に感染された保菌体となる（Ｈａｒｒｕｓ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。一部の症例では、血小板減少、高グロブリン症、食欲不振、衰弱、そして出血、特に鼻出血を伴い、その後に死が来ることを特徴とする慢性段階が進行する（Ｔｒｏｙ ａｎｄ Ｆｏｒｒｅｓｔｅｒ， １９９０）。
【０００４】
ホストにおけるそうした永続的感染の定着においては、表面抗原性の調節が重要な機序となっている可能性がある。病因についてはまだ十分には理解されていないが、関連性のある属、エールリヒア（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ）、アナプラスマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）、及びコウドリア（Ｃｏｗｄｒｉａ）のメンバーで示されている多重遺伝子ファミリーが主要表面抗原の変性に関与して、それによって免疫監視機構を働かなくしている可能性がある。エールリヒア・ケイニスに対する関連性が非常に高い生物であるアナプラスマ・マルギナーレ（Ａｎａｐｌａｓｍａ ｍａｒｇｉｎａｌｅ）は主要表面蛋白質３（ｍｓｐ−３）遺伝子の変性をもたらし、その系統内で抗原性多形を発生させる（Ａｌｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
【０００５】
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に基づく分子分類学的分析は、エールリヒア・ケイニスと、ヒト単球性エーリチオシス（ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｙｔｉｃ ｅｈｒｌｉｃｈｉｏｓｉｓ ： ＨＭＥ）の病原作用因子であるエールリヒア・チャフェエンシス（Ｅ． ｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓ）とが非常に深い関連性を有していることを明らかにした（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｄａｗｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。エールリヒア・ケイニスとエールリヒア・チャフェエンシスとの間の６４、４７、４０、３０、２９及び２３キロドルトン抗原のかなりの相互関連性が報告されている（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７； Ｒｉｋｉｈｉｓａ ｅｔ ａｌ．， １９９４；　Ｒｉｋｉｈｉｓａ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。免疫ブロット法によるヒト及びイヌの回復期血清を用いた免疫応答性抗原分析によって、３０キロドルトン蛋白質を含むエールリヒア・ケイニスの多数の免疫優性蛋白質が同定された（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。さらに、エールリヒア・ケイニスの３０キロドルトン蛋白質が上記エールリヒア・チャフェエンシスの３０キロドルトン蛋白質とは抗原的に明確に異なった免疫反応の初期に認められる主要免疫優性抗原であることも示されている（Ｒｉｋｉｈｉｓａ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｒｉｋｉｈｉｓａ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。分子量が２０−３０キロドルトンの範囲のエールリヒア・ケイニスのその他の免疫優性蛋白質も同定されている（Ｂｒｏｕｑｕｉ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｎｙｉｎｄｏ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。
【０００６】
多重遺伝子ファミリーでコードされる相同性２８−３２キロドルトン免疫優性蛋白質がエールリヒア・チャフェエンシス、及びコウドリア・ルミナンチウム（Ｃｏｗｄｏｒｉａ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）を含む関連性のある生物で報告されている（Ｓｕｌｓｏｎａ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８ａ； Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。最近、２３−２８キロドルトンの蛋白質をコードする２１メンバー多重遺伝子ファミリーの特徴づけがエールリヒア・チャフェエンシスで示されている（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。このエールリヒア・チャフェエンシス２８キロドルトン外膜蛋白質は表面露出されており、３つの主要な超可変領域を含んでいる（Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８ａ）。この組み換えエールリヒア・チャフェエンシスＰ２８はマウスで相同性惹起感染に対する保護を提供するようであり、上記組み換え蛋白質に対してつくりだされた抗血清はエールリヒア・ケイニスの３０キロドルトン蛋白質と相互反応した（Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８ａ）。エールリヒア・チャフェエンシス単離体におけるこのＰ２８遺伝子の多様性について報告されており（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９ａ）、そしてモノクローナル抗体を用いた研究で、発現されたＰ２８蛋白質における多様性がさらに実証された（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， １９９３）。逆に、エールリヒア・ケイニスの地理的に異なった単離体においてＰ２８遺伝子の完全な保存が報告されており、エールリヒア・ケイニスが北米で保存されている可能性があることを示唆している（ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９， ２０００）。
【０００７】
先行技術はエールリヒア・ケイニスの新しい相同性２８キロドルトン免疫反応性蛋白質遺伝子及びこの相同性２８キロドルトン蛋白質遺伝子を含んでいる１つの多重遺伝子座のクローニング及び特徴づけが行なわれていない点で不十分である。さらに、先行技術はエールリヒア・ケイニスのこうした免疫反応性遺伝子の組み換え蛋白質がない点でも不十分である。本発明はこの技術分野における長年のニーズと願望を満たすものである。
【０００８】
（発明の要約）
本発明によるいくつかの実施の形態で、エールリヒア・ケイニス（ｐ２８−１、−２、−３、−５、−６、−７、−９で表わされる）の相同性成熟２８キロドルトン免疫反応性蛋白質遺伝子の分子クローニング、配列決定、特徴づけと発現、及びエールリヒア・ケイニス（ｐ２８−１からｐ２８−９）の９個の２８キロドルトン蛋白質遺伝子を含む１つの座（１０，６７７塩基対）の同定について以下に述べる。ｐ２８遺伝子のうち８個は１本のＤＮＡ鎖上に位置が確認され、１個のｐ２８遺伝子は相補鎖上に発見された。９個のｐ２８遺伝子メンバー間の核酸相同性は３７〜７５％、アミノ酸相同性は２８〜７２％の範囲内にあった。
【０００９】
本発明による１つの実施の形態で、エールリヒア・ケイニスの３０キロドルトン免疫反応性蛋白質をコードするＤＮＡ配列が提供される。この蛋白質が配列識別番号Ｎｏ．２、４、６、４０、４２、４４及び４６で構成される群から選択されるアミノ酸配列を有し、この遺伝子は配列識別番号Ｎｏ．１、３、５、３９、４１、４３及び４５で構成される群から選択される核酸配列を有して、多形多重遺伝子ファミリーのメンバーであることが望ましい。一般にこの蛋白質は２８キロドルトンの成熟蛋白質の生成をもたらす翻訳後プロセスの後に切断されるＮ末端信号配列を有する。さらに、２８キロドルトン蛋白質をコードするこの遺伝子は、大きさが１０，６７７塩基対で、エールリヒア・ケイニスの９個の相同性２８キロドルトン蛋白質をコードする１つの多重遺伝子座が含まれていることが望ましい。
【００１０】
本発明による別の実施の形態では、エールリヒア・ケイニスの２８キロドルトン免疫反応性蛋白質をコードする遺伝子で構成され、発現ベクターが細胞内に導入されるとき、その遺伝子を発現させることができる発現ベクターが提供される。
【００１１】
本発明によるさらに別の実施の形態では、配列識別番号Ｎｏ．２、４、６、４０、４２、４４及び４６で構成される群から選択されるアミノ酸配列で構成される組み換え蛋白質が提供される。好ましくは、このアミノ酸配列は配列識別番号Ｎｏ．１、３、５、３９、４１、４３及び４５で構成される群から選択される核酸配列によってコードされる。好ましくは、この組み換え蛋白質は表面露出され、親水性及び抗原性である４個の可変領域で構成される。この組み換え蛋白質は抗原として有用であろう。
【００１２】
本発明によるさらに別の実施の形態では、プロモータに操作可能に結合した配列識別番号Ｎｏ．２、４、６、４０、４２、４４及び４６で構成される群から選択されるアミノ酸配列をコードする配列で構成される発現領域を含むベクターを得るステップと；そのベクターを細胞内にトランスフェクトさせるステップと；そしてその発現領域の発現に有効な条件下でその細胞を培養するステップで構成される組み換え蛋白質の生成方法が提供される。
【００１３】
本発明はまた、エールリヒア・ケイニスに露出される前の、あるいはそれに露出または感染されたことが疑われる個体を識別するステップと、そしてエールリヒア・ケイニスの２８キロドルトン抗原で構成される組成物をエールリヒア・ケイニス感染を抑止するのに有効な量投与するステップで構成される個体におけるエールリヒア・ケイニス感染を抑止する方法として、いくつかの実施の形態で説明することも可能である。この抑止は例えばその個体の体液性または細胞性免疫反応などいずれの手段によっても、あるいは２８キロドルトン抗原の通常の機能を抑止したり、あるいはその個体の体内で何らかの作用因子と相互作用する抗原との競合などの他の手段によって生じる。
【００１４】
本発明によるさらに他の見解、特徴及び利点は、以下に開示の目的で示される本発明の現段階で好ましい実施の形態の説明から明らかになるであろう。
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明はエールリヒア・ケイニスの３０キロドルトン（ｋＤａ）蛋白質をコードする相同性遺伝子のクローニング、配列決定及び発現について開示するものである。７つのエールリヒア・ケイニス単離体及びエールリヒア・チャフェエンシスｏｍｐ−１多重遺伝子ファミリー間の相同性遺伝子の比較分子分析も行われた。いくつかの新しい２８ｋＤａ蛋白質遺伝子が以下のとおり識別された。
【００１６】
ｐ２８−７（ＥＣａ２８−１）は、分子量が３０．５ｋＤａと推定される２７８個のアミノ酸（配列識別番号Ｎｏ．２）の蛋白質をコードする８３４塩基対のオープン・リーディング・フレームを有している。１つのＮ末端信号配列が確認され、このことは上記蛋白質が翻訳後に２７．７ｋＤａの成熟した蛋白質に修飾されることを示唆している。
【００１７】
ｐ２８−６（ＥＣａ２８ＳＡ３）は２８０アミノ酸蛋白質（配列識別番号Ｎｏ．６）をコードする８４０塩基対オープン・リーディング・フレームを有している。
【００１８】
エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質遺伝子を増幅させるためにＰＣＲを用いて、ｐ２８−５（ＥＣａ２８ＳＡ２）のこれまで配列決定されていない領域を完成させた。ｐ２８−５の配列分析を行ったところ、２８３アミノ酸蛋白質をコードするオープン・リーディング・フレーム（配列識別番号Ｎｏ．４）が明らかになった。
【００１９】
２８ｋＤａ蛋白質遺伝子の遺伝子内非コード領域に固有のプライマーを用いたＰＣＲ増幅は、従来別個であった２つの座に関連する領域の配列決定をもたらし、それによって５つの２８ｋＤａ蛋白質遺伝子（ｐ２８−４、−５、−６、−７及び−８）を含む１つの座（５．５９２ｋｂ）が確認された。これら５つの２８ｋＤａ蛋白質は成熟した蛋白質をもたらす信号ペプチドを持っていると推定され、５１−７２％の範囲のアミノ酸相同性を有していた。遺伝子内領域の分析はそれぞれの遺伝子についてプロモータ領域と想定される箇所を明らかにし、このことはこれらの遺伝子が独立に、あるいは差別的に発現される可能性を示唆している。遺伝子内非コード領域（２８ＮＣ１−４）はサイズが２９９−３５５塩基対の範囲にわたっており、４８−７１％の範囲で相同であった。
【００２０】
さらに、タンデム構成で配置されたｐ２８遺伝子の上記５つの遺伝子座の上流及び下流のこれまで分からなかったＤＮＡの領域についての配列決定を行い、ｐ２８−１、−２、−３、及び−９を確認した。その結果として、１０，６７７塩基対の範囲に広がる９遺伝子エールリヒア・ケイニスｐ２８座が本発明で確認された。
【００２１】
本発明は特にエールリヒア・ケイニスｐ２８−１、−２、−３、−６、−７及びｐ２８−９の相同性２８ｋＤａ蛋白質遺伝子と、これまで部分的にしか配列決定されていなかったｐ２８−５の完全な配列を対象としている。エールリヒア・ケイニスの９つの相同性２８ｋＤａ外膜蛋白質をコードする多重遺伝子座も開示される。ｐ２８遺伝子のうちの８つは１つのＤＮＡストランド上に配置されており、そして１つのｐ２８遺伝子が相補性ストランド上に見出された。これら９つのｐ２８遺伝子メンバー間の核酸相同性は３７−７５％で、アミノ酸相同性は２８−７２％の範囲であった。
【００２２】
本発明によれば、この技術分野の当業者に周知の従来の分子生物学、微生物学、及び組み換えＤＮＡ技術を用いることができる。こうした技術については文献で十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （１９８２）； ”ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ”， Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ （Ｄ．Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ． １９８５）； ”Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ” （Ｍ． Ｊ． Ｇａｉｔ ｅｄ． １９８４）； ”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ” ［Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． （１９８５）］； ”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ” ［Ｂ． Ｄ． Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ． Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ． （１９８４）］； ”Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ” ［Ｒ．Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， ｅｄ． （１９８６）］； ”Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ” ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６）］； Ｂ． Ｐｅｒｂａｌ， ”Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ” （１９８４）など参照。
【００２３】
本発明にはエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質をコードする実質的に純粋なＤＮＡが含まれる。本発明によるそのＤＮＡでコードされたその蛋白質は配列識別番号Ｎｏ．２、４、６、４０、４２、４４または４６に記載されるアミノ酸と少なくとも８０％（好ましくは８５％、より好ましくは９０％、そして最も好ましくは９５％）の配列同一性を有している。さらに好ましくは、そのＤＮＡは配列識別番号Ｎｏ．１、３、５、３９、４１、４３及び４５のヌクレオチドのコード配列、あるいはそのような配列の変質した異形を含んでいる。
【００２４】
ある蛋白質のアミノ酸配列がその蛋白質をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列によって決定されることは本技術分野でよく知られている。遺伝子コード（即ち多くのアミノ酸に対して、１つのアミノ酸につき１つを超えるヌクレオチド・トリプレット（コドン）コード）の変質によって、異なるヌクレオチド配列は特定のアミノ酸またはポリペプチドをコードすることができる。従って、本発明によるポリヌクレオチド配列は本発明によるポリペププチド、あるいはその断片または異形をコードするそれら変質した配列も含んでいる。
【００２５】
本発明はまた、配列識別番号Ｎｏ．１、３、５、３９、４１、４３または４５に記載されるヌクレオチドからの領域の少なくとも１５（好ましくは２０、より好ましくは３０、さらに好ましくは５０、そして最も好ましくは全て）の連続するヌクレオチド配列を含む実質的に純粋なＤＮＡも含んでいる。
【００２６】
『実質的に純粋なＤＮＡ』とは、その環境の一部または全ての分子の分離（部分的または全体の精製）の効力によって、あるいは特許請求の対象となるＤＮＡの側面（ｆｌａｎｋ）の配列の変化による効力によって、そのＤＮＡが自然に発生する環境の一部を構成するものではないことを意味する。従ってこの用語は、例えばベクターや、自律的に複製するプラスミドまたはウイルス、あるいは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたり；あるいは他の配列とは独立した１つの個別の分子（例えば、ｃＤＮＡ、あるいはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）または制限エンドヌクレアーゼ消化によって生成されるゲノムまたはｃＤＮＡ断片）として存在する組み換えＤＮＡを含む。この語はまた、例えば融合蛋白質などの付加されたポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を構成する組み換えＤＮＡも含んでいる。本発明はまた、エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質をコードする配列識別番号Ｎｏ．１、３、５、３９、４１、４３及び４５に記載されるヌクレオチドの一部を含む組み換えＤＮＡを含んでいる。
【００２７】
そのＤＮＡは配列識別番号Ｎｏ．１、３、５、３９、４１、４３また４５に記載されるヌクレオチドのコード配列と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも７５％（例えば少なくとも８０％）、そしてもっとも好ましくは少なくとも９０％の配列同一性を持たなければならない。２つの配列間の同一性とは一致する、あるいは同じである位置の数の直接的な関数である。２つの配列の両方においてサブユニットの位置が同じモノマーのサブユニットによって占められる場合、例えば、特定の位置が２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおいてアデニンで占められるならば、それらはその位置において同一である。例えば、全長１０ヌクレオチドの配列が別の１０ヌクレオチドの配列の各々に対応する７個の位置で同一であるならば、この２つの配列は７０％の配列同一性を有する。比較制御配列の長さは一般に少なくとも５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも７５ヌクレオチド、最も好ましくは１００ヌクレオチドである。配列同一性は通例配列分析ソフトを用いて計算される（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ， １７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ５３７０５）。
【００２８】
本発明はまた、エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質をコードする遺伝子をコードするためのＤＮＡ配列で構成されるベクターも含んでおり、そのベクターは操作可能に結合した状態で：ａ）複製開始点；ｂ）プロモータ；そして、ｃ）上記蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含んでおり、ホスト内で複写が可能である。本発明によるそのベクターは配列識別番号Ｎｏ．１、３、５、３９、４１、４３または４５に示されるＤＮＡ配列の一部を含むことが望ましい。
【００２９】
『ベクター』とは、例えばプラスミドまたはウイルスの核酸など複製可能な核酸構造体として定義することができる。ベクターはエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質をコードする核酸を増幅及び／又は発現させるために用いることができる。発現ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列が細胞内でポリペプチドを発現させることができる適切な制御配列に操作可能に結合した複製可能な構造体である。そのような制御配列の必要性は選択される細胞及び選択される形質転換法に応じて異なってくる。一般に、制御配列は転写プロモータ及び／またはエンハンサ、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位、そして、転写及び翻訳の終了を制御する配列を含む。適切な転写及び翻訳制御信号を含む発現ベクターをつくるために本技術分野の当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ Ｅｄ．）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．で説明されている技術を参照。遺伝子とその転写制御配列は、もしその転写制御配列がその遺伝子の転写を効率的に制御するならば、『操作可能に結合』していると定義される。本発明によるベクターにはプラスミド・ベクター及びウイルス・ベクターが、それだけに限られるものではないが、含まれている。本発明による好ましいウイルス・ベクターはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ付随ウイルス、ＳＶ４０ウイルス、またはヘルペス・ウイルスに由来するベクターである。
【００３０】
一般に、挿入されたＤＮＡ断片の効率的な転写を容易にするプロモータ配列を含む発現ベクターはホストとの関連で用いられる。本明細書で使われているように、『ホスト』とは、原核生物だけでなくイースト菌、植物及び動物細胞など真核生物も含んだ意味である。本発明によるエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質をコードする組み換えＤＮＡ分子または遺伝子は本技術分野の当業者に周知の任意の技術を使ってホストを形質転換するために用いることができる。原核生物の形質転換を目的として本発明によるエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質をコードする１つの遺伝子のコード配列を含むベクターの利用は特に好ましい。
【００３１】
原核生物のホストには大腸菌、Ｓ・ティンフィムリウム（Ｓ． ｔｙｍｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、霊菌、及び枯草菌が含まれる。真核生物のホストにはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のようなイースト、哺乳類細胞、及び昆虫細胞が含まれる。形質転換されたホストは細胞の最適な成長を達成するため本技術分野で周知の手段に従って発酵、培養することができる。
【００３２】
本明細書で使われている場合、『遺伝子操作された』または『組み換えられた』細胞とは、エールリヒア・ケイニス抗原をコードする遺伝子のような組み換え遺伝子が導入されている細胞を意味している。従って、遺伝子操作された細胞は、組み換えが導入された遺伝子を含まない自然発生の細胞と区別することができる。つまり、遺伝子操作された細胞とは人の手を介して導入された１つまたは複数の遺伝子を有する細胞である。組み換えが導入された遺伝子はｃＤＮＡ遺伝子またはゲノム遺伝子のコピーのいずれかの形態であるか、または特定の導入遺伝子に自然に付随されないプロモータに隣接した位置にある遺伝子を含んでいる。さらに、組み換え遺伝子はホストのゲノムと一体化されるか、あるいはベクター、またはホストの細胞にトランスフェクトされたバクテリアのゲノムに含まれることがある。
【００３３】
本発明はまた、例えば配列識別番号Ｎｏ．２、４、６、４０、４２、４４または４６に記載されるアミノ酸配列で構成されるエールリヒア・ケイニスの実質的に純粋な２８−３０ｋＤａ免疫反応性蛋白質にも関するものである。
【００３４】
『実質的に純粋な蛋白質』とは、自然においてそれに付随する少なくともいくつかの成分から分離されている蛋白質である。通例その蛋白質は、少なくともその６０重量％がｉｎ　ｖｉｖｏで自然に付随している蛋白質及び他の自然発生する有機分子から遊離しているとき、実質的に純粋である。好ましくはその純度は少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、そして最も好ましくは少なくとも９９重量％である。エールリヒア・ケイニスの実質的に純粋な２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質は、例えば自然界起源からの抽出；エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質をコードする遺伝子組み換えされた核酸の発現：あるいは、その蛋白質の化学的合成；によって得られる。純度は、例えばエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質に特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィー、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法、あるいはＨＰＬＣ分析のようなカラム・クロマトグラフィーなど任意の適切な方法によって測定することができる。ある蛋白質は自然な状態で付随する汚染要因物の少なくともいくつかから分離されているとき、自然に付随する成分から実質的に遊離している。従って、自然発生した細胞とは異なる細胞システムで化学的に合成または生成された蛋白質は、定義により、自然に結合しているその成分から実質的に遊離している。従って、実質的に純粋な蛋白質には大腸菌、その他の原核生物、あるいは自然発生していないその他任意の生物内で合成された真核生物の蛋白質が含まれる。
【００３５】
実質的全長蛋白質に加え、本発明はまた、エールリヒア・ケイニス（配列識別番号Ｎｏ．２、４、６、４０、４２、４４または４６）の２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質の断片（例えば、抗原断片）も含んでいる。本明細書で用いられる場合、『断片』とは、ポリペプチドに利用されるように、通常は全長が少なくとも１０残基、より一般的には少なくとも２０残基、そして好ましくは少なくとも３０残基（例えば５０残基）であるが、完全な配列の全体よりは小さい。エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質の断片は、例えばエールリヒア・ケイニスの自然発生または遺伝子組み換え２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質の酵素消化、エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質の限定された断片をコードする発現ベクターを用いた遺伝子組み換えＤＮＡ技術、あるいは化学的合成などによる本技術分野の当業者に周知の方法でつくることができる。エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質の特徴（例えば、エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質に特異的な抗体に結合する等）を示す候補断片の能力は本明細書で述べられる方法によって評価することができる。
【００３６】
エールリヒア・ケイニスの精製された２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質またはエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質の抗原断片は本技術分野の当業者に周知の標準的な手順を使って新しい抗体の生成または既存の抗体の分析（例えば、診断分析におけるポジティブ・制御）に利用することができる。
【００３７】
本技術分野で良く知られているように、任意のポリペプチドはそれぞれその免疫原性が異なる。従って、免疫原（例えば、本発明による１つのポリペプチド）を担体と結合することがしばしば必要となり。代表的で好ましい担体はキーホール・リンペット・ヘモシアニン（ＫＬＨ）及びヒト血清アルブミンである。ポリペプチドを担体蛋白質に結合する手段は本技術分野で良く知られており、担体蛋白質としては、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・エステル、カルボ・ジイミド及びビス−二アゾ化ベンジジンなどがある。また、そのペプチドが本技術分野で周知の遺伝子組み換え技術によって蛋白質に結合されることもある。
【００３８】
これも本技術分野で良く知られているように、特定の免疫原への免疫原性はアジュバントとして知られる免疫反応の非特異的促進剤の利用によって高められる。代表的で好ましいアジュバントには完全なＢＣＧ，Ｄｅｔｏｘ（ＲＩＢＩ，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．）ＩＳＣＯＭＳ及び水酸化アルミニウム・アジュバント（Ｓｕｐｅｒｐｈｏｓ， Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）などがある。
【００３９】
本発明にはエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質、または例えばウサギの免疫原としてのエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質の断片を用いることによって生成されるポリクローナル抗血清が含まれている。本技術分野の当業者に周知のモノクローナル及びポリクローナル抗体生成の標準的手順が利用される。この手順を使って生成されたモノクローナル抗体は、組み換えエールリヒア・ケイニスのｃＤＮＡクローンを同定し、それらを既知のｃＤＮＡクローンと識別することができるようにスクリーニングすることができる。
【００４０】
本発明にはモノクローナル抗体全体だけでなく、例えばＦａｂあるいは（Ｆａｂ）２断片などの免疫活性化抗体断片、組み換え単鎖Ｆｖ分子、あるいは、例えばマウス由来の１つの抗体の結合特異性と、例えばヒト由来の別の抗体の残り部分を含む抗体のようなキメラ分子が含まれる。
【００４１】
本発明の１つの実施の形態では、抗体またはその断片は、毒素あるいは、例えば放射性ラベル、非放射性同位体ラベル、蛍光性ラベル、化学発光性ラベル、常磁性ラベル、酵素ラベルあるいは比色ラベルなどの検出ラベルと結合することができる。本技術分野の当業者であれば、本発明に従って利用されるこれらのラベルまたはその他の適切なラベルについてはよく知っているであろう。抗体またはその断片とこれらのラベルの結合は本技術分野の当業者に通例周知の標準的な技術を使って達成することができる。
【００４２】
また、本発明による新しい蛋白質を使った医薬品組成物の調製も考えられる。その場合、その医薬品組成物は本発明による新しい活性組成物及び薬学的に許容される担体で構成される。本技術分野の通常の技術を持つ当業者であれば、過度の実験を行わずとも、本発明による活性成分の適切な服用量と投与法を容易に決定できるであろう。
【００４３】
『薬学的に許容される』とは、個体に投与されたときアレルギー性あるいは類似する不都合な反応を引き起こさない分子体化合物及び組成物を意味する。活性成分として蛋白質を含む水性組成物の調製は本技術分野でよく理解されている。通常、そのような組成物は液体溶液または懸濁液のいずれかである注射剤として調合されるが、注射前の液体に溶解または懸濁するのに適した固形物も調製される。その調製剤は乳化することもできる。
【００４４】
ある１つの蛋白質は中性または塩の形で組成物に調製することもできる。薬学的に許容される塩類には酸付加塩（蛋白質の遊離アミノ基で形成される）が含まれ、例えば塩酸またはリン酸のような無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸のような有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩類はまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、あるいは水酸化第２鉄のような無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロケインのような有機塩基にも由来する。
【００４５】
製剤化された段階で、溶液は投薬法と矛盾のない方法で治療上効果的な量が投与される。その処方は注射溶液など種々の投薬法で容易に投与される。
【００４６】
水溶液中の非経口投与のため、例えばその溶液は必要であれば適切に緩衝化され、その希釈液は先ず十分な生理食塩水またはグルコースで等浸透圧にされる。これら特定の水溶液は特に静脈内、筋肉内、皮下、そして腹膜内投与に適している。この点について、本発明による開示に照らし合わせれば、利用可能な無菌水溶性媒体は本技術分野の当業者に周知である。例えば１回分の投薬量を１ｍＬのＮａＣｌ等張液に溶解させ、１０００ｍＬの皮下注入液を加えるか、または注入の対象部位に注入することができる（例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ” １５ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、１０３５−１０３８ページ及び１５７０−１５８０ページ参照）。治療を受ける個体の条件に応じて必然的に投薬量に多少の変更が生じる。投薬担当者はいずれにしても個々の個体にとって適切な投薬量を決定することになる。
【００４７】
本発明による１つの実施の形態では、エールリヒア・ケイニスの３０ｋＤａ免疫反応性蛋白質をコードするＤＮＡ配列が提供される。好ましくは、その蛋白質は配列識別番号Ｎｏ．２、４、６、４０、４２、４４及び４６で構成される群から選択されるアミノ酸配列を有し、その遺伝子は配列識別番号Ｎｏ．１、３、５、３９、４１、４３及び４５で構成される群から選択される核酸配列を有し、多形多重遺伝子ファミリーのメンバーである。より好ましくは、その蛋白質は２８ｋＤａの成熟蛋白質の生成をもたらす翻訳後のプロセスの後に切断されるＮ末端信号配列を有する。さらに好ましくは、２８ｋＤａ蛋白質をコードするそのＤＮＡは単一の多重遺伝子座に含まれ、その多重遺伝子座は大きさが１０，６７７塩基対で、エールリヒア・ケイニスの９つの相同性２８ｋＤａ蛋白質をコードする。
【００４８】
本発明による別の実施の形態では、エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ免疫反応性蛋白質をコードする遺伝子で構成され、その発現ベクターが細胞内に導入されるとき、その遺伝子を発現させることができる発現ベクターが提供される。
【００４９】
本発明によるさらに別の実施の形態では、配列識別番号Ｎｏ．２、４、６、４０、４２、４４及び４６で構成される群から選択されるアミノ酸配列で構成される組み換え蛋白質が提供される。好ましくは、そのアミノ酸配列は配列識別番号Ｎｏ．１、３、５、３９、４１、４３及び４５で構成される群から選択される核酸配列によってコードされる。より好ましくは、その組み換え蛋白質は表面露出され、親水性及び抗原性である４つの可変領域で構成される。さらに好ましくは、その組み換え蛋白質は抗原である。
【００５０】
本発明によるさらに別の実施の形態では、プロモータに操作可能に結合した配列識別番号Ｎｏ．２、４、６、４０、４２、４４及び４６で構成される群から選択されるアミノ酸配列をコードする配列で構成される発現領域で構成されるベクターを得るステップと；そのベクターを細胞内にトランスフェクトさせるステップと；そして、その発現領域の発現に有効な条件下でその細胞を培養するステップ；で構成される組み換え蛋白質の生成法が提供される。
【００５１】
本発明はまた、エールリヒア・ケイニスに露出されていることが疑われる、あるいはそれに感染された個体を識別するステップと、そして、エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ抗原で構成される組成物をエールリヒア・ケイニス感染を抑止するのに有効な量投与するステップで構成される、個体におけるエールリヒア・ケイニス感染を抑止する方法として、いくつかの実施の形態においても説明される。この抑止は例えばその個体の体液性または細胞性免疫反応の刺激などいずれの手段によっても、あるいは２８ｋＤａ抗原の通常の機能を抑止したり、あるいはその個体の体内で何らかの作用因子との相互作用のための抗原と競合さえするような他の手段によって生じる。
【００５２】
【実施例】
以下の実施例は本発明によるいくつかの実施の形態を説明する目的で提供されるものであり、本発明をいかなる形でも限定しようとするものではない。
【００５３】
実施例１
ＥＣａ２８−１（ｐ２８−７）遺伝子の未知の５´及び３´領域の配列決定
エールリヒアエ及び精製エールリヒア・ケイニス（フロリダ系統及び単離体、Ｄｅｍｏｎ， ＤＪ， Ｊａｋｅ 及びＦｕｚｚｙ）はＥｄｗａｒｄ Ｂｒｅｉｔｓｃｈｗｅｒｄｔ博士（Ｃｏｌｌｅｄｇｅ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ， Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｒａｌｅｉｇｈ， ＮＣ）から提供を受けた。エールリヒア・ケイニス（ルイジアナ系統）はＲｉｃｈａｒｄ Ｅ．Ｃｏｒｓｔｖｅｔ博士（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｌｏｕｉｓｉａｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｂａｔｏｎ Ｒｏｕｇｅ， ＬＡ）から提供を受け、エールリヒア・ケイニス（オクラホマ系統）はＪａｃｑｕｅｌｉｎｅ Ｄａｗｓｏｎ博士（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ， Ａｔｌａｎｔａ， ＧＡ）から提供された。エールリヒアの増殖は１０％仔ウシ血清及び２ｍＭＬ−グルタミンで補強されたＤＭＥＭを用いて３７℃の温度でＤＨ８２細胞内で行われた。ＤＨ８２細胞内での成長を通常の細胞学的染色方法を用いてエールリヒア・ケイニス・モルラエの存在下でモニターした。それらの細胞の１００％がエールリヒアで感染された時に細胞を取り出して、１７，０００ ｘ ｇで２０分間遠心分離装置でペレット化した。細胞ペレットを氷上で、４０Ｗで３０秒間、Ｂｒａｕｎ Ｓｏｎｉｃ２０００音波処理装置を用いて２度破砕した。エールリヒアエをこれまでに述べられている手順で精製した（Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．， １９７５）。細胞溶解物をレノグラフィンの４２％−３６％−３０％不連続勾配上に負荷して、８０，０００ ｘ　ｇで１時間遠心分離にかけた。エールリヒアエを含んだ重い帯と軽い帯が回収され、サクロース−ホスフェート−グルタメート緩衝液（ＳＰＧ，２１８ｍＭサクロース、３．８ｍＭ　ＫＨ２ＰＯ４、７．２ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ４、４．９ｍＭグルタメート、ｐＨ７．０）で洗浄して、遠心分離法でペレット化した。
【００５４】
核酸調製：
エールリヒア・ケイニス・ゲノム性ＤＮＡを、これまでに述べられている手順（ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６）に従って、レノグラフィン精製エールリヒアエを６００μｌの１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）内に１％ナトリウム・ドデシル・スルフェート（ＳＤＳ、ｗ／ｖ）及び１００ｎｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫと共に再懸濁させて調製した。この混合物を５６℃で１時間培養して、核酸をフェノール／クロロホルム／イソアミル・アルコール（２４：２４：１）の混合物を用いて２度抽出した。ＤＮＡを無水エタノールで沈殿させてペレット化して、７０％エタノールで１度洗浄し、乾燥させた後、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）内に再懸濁させた。プラスミドＤＮＡを高純度プラスミド単離キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を用いて精製し、ＰＣＲ生成物をＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ， ＣＡ）を用いて精製した。
【００５５】
ＥＣａ２８−１（ｐ２８−７）遺伝子のクローニング：
ｐ２８−７の全長配列をＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｗａｌｋｅｒ Ｋｉｔ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて、業者が提供した手順に従って決定した。ゲノム性エールリヒア・ケイニス（Ｊａｋｅ単離体）ＤＮＡを平滑末端ＤＮＡをつくりだす５つの制限酵素（ＤｒａＩ，ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩ、ＳｃａＩ、　ＳｔｕＩ）を用いて完全に消化させた。上記キット内に提供されているアダプタ（ＡＰ１）をエールリヒア・ケイニスＤＮＡの各末端に結合させた。ゲノム・ライブラリをテンプレートとして用い、上記ｐ２８−７配列の分かっている部分に対して相補的なプライマと上記アダプタＡＰＩに特異性を示すプライマを用いるＰＣＲでｐ２８−７遺伝子の未知のＤＮＡ配列を見つけた。ゲノム・ウォーキングのために用いられたｐ２８−７に特異性を示すプライマはプライマ７９３（配列識別番号Ｎｏ．１６）及び１３３０（配列識別番号Ｎｏ．１７）を用いてｐ２８−７のＰＣＲ増幅から誘導した周知のＤＮＡ配列からつくられた。プライマ３９４（５´−ＧＣＡＴＴＴＣＣＡＣＡＧＧＡＴＣＡＴＡＧＧＴＡＡ−３´；ヌクレオチド６８７−７１０、配列識別番号Ｎｏ．２１）および３９４Ｃ（５´−ＴＴＡＣＣＴＡＴＧＡＴＣＣＴＧＴ　ＧＧＡＡＡＴＧＣ−３；ヌクレオチド７１０−６８７、配列識別番号Ｎｏ．２２）を提供されたプライマＡＰ１と組み合わせて用いて、ＰＣＲでｐ２８−７遺伝子の未知の５´及び３´領域を増幅させた。プライマ３９４Ｃ及びＡＰＩで増幅させたｐ２８−７遺伝子の５´領域に対応するＰＣＲ生成物（２０００塩基対）をプライマ７９３Ｃ（５´−ＧＡＧＴＡ　ＡＣＣＡＡＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣ−３´、配列識別番号Ｎｏ．２３）を用いて一方向に配列決定した。プライマ３９４及びＡＰ１（５８０塩基対）で増幅させたｐ２８−７遺伝子の３´領域に対応するＰＣＲ生成物を同じプライマを用いて双方向に配列決定した。オープン・リーディング・フレームに近接した５´及び３´領域の非コード領域の配列決定を行い、そしてｐ２８−７遺伝子全体を増幅させるために、これらの領域に相補的なプライマＥＣ２８ＯＭ−Ｆ（５´−ＴＣＴＡＣＴＴＴＧＣＡＣＴＴＣＣ　ＡＣＴＡＴＴＧＴ−３´、配列識別番号Ｎｏ．２４）とＥＣ２８ＯＭ−Ｒ（５´−ＡＴＴＣＴＴＴＴＧＣＣＡＣＴＡＴＴＴ　ＴＴＣＴＴＴ−３´、配列識別番号Ｎｏ．２５）を作成した。
【００５６】
ＤＮＡ配列決定：
ＤＮＡをＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて配列決定した。７つのエールリヒア・ケイニス単離体（４つはノース・カロライナ、そしてオクラホマ、フロリダ、及びルイジアナから１つずつ）のｐ２８−７遺伝子全体をプライマＥＣ２８ＯＭ−Ｆ（配列識別番号Ｎｏ．２４）及びＥＣ２８ＯＭ−Ｒ（配列識別番号Ｎｏ．２５）を用い、９５℃で５分間、９５℃で３０秒間を３０サイクル、６２℃で１分間、そして７２℃で２分間、そしてさらに７２℃で伸長１０分間の熱サイクル特性を有するＰＣＲで増幅させた。得られたＰＣＲ生成物を同じプライマを用いて双方向配列決定した。
【００５７】
実施例２
エールリヒア・ケイニス、ＥＣａ２８−１（ｐ２８−７）遺伝子のＰＣＲ増幅、クローニング、配列決定及び発現
発現ベクター：
エールリヒア・ケイニスｐ２８−７遺伝子全体をＥＣ２８ＯＭ−Ｆ及びＥＣ２８ＯＭ−Ｒプライマを用いてＰＣＲ増幅させ、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ　ＴＡクローニング・ベクター内にクローンし、制限酵素切断サイトの望ましいセットを得た（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）。この挿入物をＢｓｔＸ１でｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯから切断して、ｐｃＤＮＡ３．１真核性発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）に結合させて、以後の研究のためにｐｃＤＮＡ３．１／ＥＣ２８と命名した。このｐｃＤＮＡ３．１／ＥＣ２８プラスミドを増幅させ、そしてその遺伝子をＫｐｎＩ−ＸｂａＩ二重消化で切断して、ｐＴｈｉｏＨｉｓ原核性発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）に一方向に結合させた。このクローン（ｐＴｈｉｏＨｉｓ／ＥＣ２８と命名された）は大腸菌ＢＬ２１内で組み換えチオレドキシン融合蛋白質をつくりだした。この組み換え融合蛋白質を遠心分離で不溶相内で粗に精製した。比較対照チオレドキシン融合蛋白質をニッケル−ＮＴＡスピン・カラム（Ｑｉａｇｅｎ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ， ＣＡ）を用いて自然の状態下で可溶性細胞溶解物から精製した。
【００５８】
ウェスターン・ブロット分析：
組み換えエールリヒア・ケイニスｐ２８−７融合蛋白質を４−１５％トリス塩酸勾配ゲル（ＢｉｏＲａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）上でＳＤＳ−ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけて、半乾燥転移細胞（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）を用いて純粋なニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｋｅｅｎｅ， ＮＨ）に転移させた。その膜をエールリヒア・ケイニス感染イヌから採取し、１：５０００に希釈した回復期抗血清で１時間培養して、洗浄し、その後、抗イヌＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）アルカリ性ホスファターゼ結合親和性精製二次抗体を１：１０００の割合で用いて１時間培養した（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ， ＭＤ）。結合した抗体を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル・ホスフェート／ニトロブルー・テトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）基質（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ， ＭＤ）で視覚化させた。
【００５９】
サザーン・ブロット分析：
エールリヒア・ケイニス・ゲノム内にｐ２８−７遺伝子に対して相同的な多重遺伝子が存在しているかどうかを判定するために、標準的な手順（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９）を用いてゲノム性サザーン・ブロット分析を行った。エールリヒア・ケイニス・ゲノム性ＤＮＡをｐ２８−７遺伝子内での切断を行なわない制限酵素ＢａｎＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅＩＩ、　ＫｐｎＩ及びＳｐｅＩのそれぞれと、ヌクレオチド３４、４３、及び６５６でｐ２８−７を消化するＡｓｅＩを用いて完全に消化させた。ＥＣ２８ＯＭ−Ｆ及びＥＣ２８ＯＭ−Ｒプライマとデゴキシゲニン（ＤＩＧ）−ラベル・デオキシヌクレオチド・トリホスフェート（ｄＮＴＰｓ）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を用いたＰＣＲ増幅によってプローブをつくりだし、ＡｓｅＩで消化させた。消化されたプローブ（５６６塩基対）をアガロース・ゲル電気泳動で分離して、ゲル精製し、その後ハイブリダイゼーションのために用いた。この完全に消化されたゲノム性エールリヒア・ケイニスＤＮＡを電気泳動させて、ナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）に転移させ、そして製造業者（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）の手順に従ってＤＩＧ　Ｅａｓｙ　Ｈｙｂ緩衝液内でｐ２８−７遺伝子ＤＩＧラベル・プローブで１６時間、４０℃の温度下でハイブリダイズさせた。結合したプローブを抗ＤＩＧアルカリ・ホスファターゼ接合抗体及び蛍光基質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）で検出して、ＢｉｏＭａｘ科学画像形成フィルム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ， ＮＹ）に露出させた。
【００６０】
配列分析及び比較：
エールリヒア・チャフェエンシスｐ２８とＣ．ルミナンチウム・マップ−１ＤＮＡ配列をＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）から入手した。ヌクレオチド及び推定アミノ酸配列、そして蛋白質と系統発生的分析をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ． Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて行った。翻訳後処理の分析はＭｃＧｅｏｃｈ及びｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅの方法を用いて行い、ＰＳＯＲＴプログラム（ＭｃＧｅｏｃｈ， １９８５； ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ， １９８６）を用いて信号配列を認識した。
【００６１】
上記遺伝子全体を増幅するためにつくられたプライマを用いて、エールリヒア・ケイニスの７つの異なったストレインからのｐ２８−７の配列分析を行った。分析の結果、この遺伝子の配列がノース・カロライナ（４つ）、ルイジアナ、フロリダ、及びオクラホマからの単離体の中で保存されていることが明らかになった。
【００６２】
結果
Ｊｏｔｕｎ−Ｈｅｉｎアルゴリズムを用いたエールリヒア・チャフェエンシスｐ２８とコウドリア・ルミナンチウム・マップ−１からの核酸配列の整合を行ったところ、高度の相同性（＞９０％）を有する複数の領域を含むコンセンサス配列が明らかになった。これらの相同性領域（コウドリア・ルミナンチウム・マップ−１のヌクレオチド３１３−３３２と８２３−８４３；エールリヒア・チャフェエンシスｐ２８の３０７−３２６及び８１４−８３４）をＰＣＲ増幅のためのプライマ・アニール化サイトの標的とした。エールリヒア・ケイニスｐ２８−７遺伝子のＰＣＲ増幅をプライマ７９３（５−ＧＣＡＧＧＡＧＣＴＧＴＴＧＧＴＴＡＣＴＣ−３´）（配列識別番号Ｎｏ．１６）及び１３３０（５´−ＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＴＣＴＡＴＧＣＣ−３´）（配列識別番号Ｎｏ．１７）で行い、５１８塩基対ＰＣＲ生成物を得た。エールリヒア・ケイニスＤＮＡはプライマ７９３と１３３０を用い、９５℃で２分間、９５℃で３０秒間を３０サイクル、６２℃で１分間、７２℃で２分間、そしてさらに７２℃で伸長１０分間、そして４℃で保存という熱サイクルで増幅させた。エールリヒア・ケイニスＰＣＲ生成物の核酸配列をプライマ７９３及び１３３０を用いて生成物を直接配列決定することで得た。
【００６３】
上記配列の分析によって１７０アミノ酸で構成される蛋白質をコードするオープン・リーディング・フレームが明らかになり、さらにエールリヒア・ケイニスのＰＣＲ増幅によって得られた５１８塩基対配列とエールリヒア・チャフェエンシスｐ２８のＤＮＡ配列との位置的整合を調べたところ、７０％以上の類似性が明らかになり、それらの遺伝子が相同性であることが示された。
【００６４】
プライマ３９４と７９３ＣによるアダプタＰＣＲを行って、その遺伝子全体の配列の５´及び３´セグメントの判定を行った。プライマ３９４は４つのＰＣＲ生成物（３−Ｋｂ、２−Ｋｂ、１−Ｋｂ、及び０．８−Ｋｂ）をつくりだし、そのうちの０．８−Ｋｂ生成物をプライマ３９４及びＡＰＩを用いて双方向に配列決定した。この配列は５１８塩基対生成物の３´末端と重複しており、そのオープン・リーディング・フレームが１２塩基対停止コドンまで延びていた。上記ｐ２８−７遺伝子の３´末端の非コード配列のさらに別の６２５塩基対についての配列決定も行った。
【００６５】
プライマ３９４Ｃを用い、供給されたプライマＡＰ１でｐ２８−７の５´末端を増幅させた。これらのプライマによる増幅は３つのＰＣＲ生成物（３．３、３−Ｋｂ、及び２−Ｋｂ）をもたらした。２−Ｋｂフラグメントはプライマ７９３Ｃを用いて一方向に配列決定した。この配列はｐ２８−７遺伝子の推定開始コドンをもたらし、２７８アミノ酸の蛋白質をコードする８３４塩基対オープン・リーディング・フレームを完成させた。上記ｐ２８−７遺伝子の５´非コード領域内のさらに別の１４４塩基対読み取り可能な配列が得られた。そのｐ２８−７遺伝子に隣接した相補性非コード領域からプライマＥＣ２８ＯＭ−Ｆ及びＥＣ２８ＯＭ−Ｒがつくられた。
【００６６】
これらのプライマで増幅されたＰＣＲ生成物を同じプライマを用いて直接配列決定した。エールリヒア・ケイニスｐ２８−７遺伝子（配列識別番号Ｎｏ．１）からの完全なＤＮＡ配列を図１に示す。これらのプライマで増幅させたｐ２８−７ＰＣＲフラグメントは上記オープン・リーディング・フレーム全体と５´非コードプライマ領域からのさらに別の１７個のアミノ酸を含んでいた。この遺伝子をｐＴｈｉｏＨｉｓ発現ベクターに方向性サブクローニングし、この構成物で大腸菌（ＢＬ２１）を形質転換させた。発現されたｐ２８−７チオレドキシン蛋白質は不溶性であった。発現された蛋白質は上記チオレドキシンと結合した１１４個のさらに別のアミノ酸、エンテロキナーゼ認識サイトに対する５つのアミノ酸、及び多重クローニング・サイト及び５´非コード・プライマ領域からのＮ末端での３２アミノ酸を有していた。エールリヒア・ケイニス感染イヌから得た回復期抗血清は発現された組み換え融合蛋白質を認識したが、チオレドキシン比較対照とは反応しなかった（図２）。
【００６７】
実施例３
エールリヒア・ケイニスｐ２８−７遺伝子の配列相同性
エールリヒア・ケイニスｐ２８−７（８３４塩基対）の核酸配列と信号配列（ｐ２８−７、ｏｍｐ−１Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ）を含む遺伝子のエールリヒア・チャフェエンシスｏｍｐ−１ファミリーの位置的整合性について、Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いて調べ、これらの遺伝子間での相同性を調べた（位置的整合については示さず）。核酸相同性はエールリヒア・ケイニスｐ２８−７、エールリヒア・チャフェエンシスｐ２８、そしてｏｍｐ−１Ｆの間で同様に保存されていた。エールリヒア・チャフェエンシスｏｍｐ−１ファミリー、ｏｍｐ−１Ｄ（６８．２％）、ｏｍｐ−１Ｅ（６６．７％）、ｏｍｐ−１Ｃ（６４．１％）、コウドリア・ルミナンチウム・マップ−１（６１．８％）、エールリヒア・ケイニス２８−ｋＤａ蛋白質１遺伝子（６０％）、そして２８−ｋＤａ蛋白質２（部分的）（５９．５％）のその他の推定外膜蛋白質遺伝子もｐ２８−７に対して相同性であった。エールリヒア・チャフェエンシスｏｍｐ−１Ｂはエールリヒア・ケイニスｐ２８−７との核酸相同性が最も低かった（４５．１％）。
【００６８】
エールリヒア・ケイニスｐ２８−７（配列識別番号Ｎｏ．２）とエールリヒア・チャフェエンシスｐ２８の予想されたアミノ酸配列の位置的照合を行ったところ、４つの可変領域（ＶＲ）でのアミノ酸置換が明らかになった。上記アミノ酸配列における置換あるいは欠失と、エールリヒア・ケイニスｐ２８−７及びエールリヒア・チャフェエンシスＯＭＰ−１ファミリーの可変領域の場所についての確認を行った（図３）。信号ペプチドを含むアミノ酸の比較を行ったところ、エールリヒア・ケイニスｐ２８−７はエールリヒア・チャフェエンシスＯＭＰ−１ファミリーのＯＭＰ−１Ｆ（６８％）との相同性が最も高く、以下、エールリヒア・チャフェエンシスｐ２８（６５．５％）、ＯＭＰ−１Ｅ（６５．１％）、ＯＭＰ−１Ｄ（６２．９％）、ＯＭＰ−１Ｃ（６２．９％）、コウドリア・ルミナンチウムＭＡＰ−１（５９．４％）、エールリヒア・ケイニス２８−ｋＤａ蛋白質１（５５．６％）、そして２８−ｋＤａ蛋白質２（部分的）（５３．６％）、そしてＯＭＰ−１Ｂ（４３．２％）となっていた。アミノ酸配列に基づく系統発生関係は、エールリヒア・ケイニスｐ２８−７、ＣルミナンチウムＭＡＰ−１、エールリヒア・チャフェエンシスＯＭＰ−１蛋白質、そしてエールリヒア・ケイニス２８−ｋＤａ蛋白質１及び２（部分的）が相互に関係性を有していることを示している。
【００６９】
実施例４
エールリヒア・ケイニスｐ２８−７の予想される表面特性及び免疫反応性
水治療法及び親水性特性を用いてエールリヒア・ケイニスｐ２８−７の分析を行ったところ、ｐ２８−７上に表面露出領域が予想された（図６）。３−９のアミノ酸で構成される８つの主要な表面露出領域をエールリヒア・ケイニスｐ２８−７上で確認し、それらはエールリヒア・チャフェエンシスｐ２８の表面露出領域の特性と同様であった（図６）。エールリヒア・ケイニスｐ２８−７の５つのより大きな表面露出領域の場所が上記蛋白質のＮ末端領域に特定された。エールリヒア・ケイニスｐ２８−７の４つの可変領域のすべてに表面露出親水性領域が見出された。Ｒｏｔｈｂａｒｄ−Ｔａｙｌｏｒアルゴリズム（Ｒｏｔｈｂａｒｄ ａｎｄ Ｔａｙｌｏｒ， １９８８）を用いて１０個のＴ細胞モチーフの存在がｐ２８−７内に予想され、エールリヒア・ケイニスｐ２８−７の高い抗原性がＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性アルゴリズムによって予想された（図６）（Ｊａｍｅｓｏｎ ａｎｄ Ｗｏｌｆ， １９８８）。エールリヒア・ケイニスｐ２８−７とエールリヒア・チャフェエンシスｐ２８との間で抗原性とＴ細胞モチーフでの類似性が観察された。
【００７０】
実施例５
エールリヒア・ケイニスｐ２８−７遺伝子の相同性ゲノム性コピーの検出
ｐ２８−７内に制限エンドヌクレアーゼ・サイトを有していない制限酵素ＢａｎＩＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨａｅＩＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｅＩと、ヌクレオチド３４、４３、及び６５６に内部制限エンドヌクレアーゼ・サイトを有しているＡｓｅＩでそれぞれ完全に消化したエールリヒア・ケイニスＤＮＡのゲノム性サザーン・ブロット分析を行ったところ、少なくとも３つの相同性ｐ２８−７遺伝子コピーが存在していることが明らかになった（図５）。エールリヒア・ケイニスｐ２８−７は内部ＡｓｅＩ内部制限サイトを有しているが、ハイブリダイゼーション実験で用いられたＤＩＧラベル・プローブはその遺伝子のＡｓｅＩ消化で発生させた１つのＤＮＡフラグメント内部のその遺伝子の１つの領域に向かった。ＡｓｅＩでの消化はｐ２８−７ＤＮＡとハイブリダイズした３つの帯（約５６６塩基対、８５０塩基対、そして３−Ｋｂ）をつくりだし、そのゲノム内でのｐ２８−７に相同性の多重遺伝子の存在を示唆した。ＥｃｏＲＶとＳｐｅＩでの消化によって、ｐ２８−７遺伝子プローブとハイブリダイズした２つの帯がつくりだされた。
【００７１】
実施例６
エールリヒア・ケイニスＥＣａ２８ＳＡ２（ｐ２８−５）、ＥＣａ２８ＳＡ３（ｐ２８−６）遺伝子のＰＣＲ増幅と多重遺伝子座の同定
ＥＣａ２８ＳＡ２（ｐ２８−５）下流に存在している可能性のある未知の遺伝子を特異的に増幅させるために、ｐ２８−５（５´−ＡＴＡＴＡＣＴＴＣＣＴＡＣＣＴＡＡＴＧＴＣＴＣＡ−３´、配列識別番号Ｎｏ．１８）に対して特異性を示すプライマ４６ｆと、及びｐ２８−７遺伝子の３´末端上の１つの保存領域に向かうプライマ１３３０（配列識別番号Ｎｏ．１７）を用いて増幅を行なった。増幅された生成物をゲル精製して、ＴＡクローニング・ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ， ＣＡ）にクローンした。このクローンを上記ベクターからのＭ１３逆相、４６ｆ、ＥＣａ２８ＳＡ２（５´−ＡＧＴＧＣＡＧＡＧＴＣＴＴＣＧＧＴＴＴＣ−３´、配列識別番号Ｎｏ．１９）、ＥＣａ５．３（５´−ＧＴＴＡＣＴＴＧＣＧＧＡＧＧＡＣＡＴ−３´、配列識別番号Ｎｏ．２０）を用いて双方向に配列決定した。ＤＮＡは９５℃で２分間、９５℃で３０秒間を３０サイクル、４８℃で１分間、７２℃で１分間、さらに７２℃で伸長１０分間、そして４℃で保存という熱サイクル特性で増幅させた。
【００７２】
２−ｋｂ　ＰＣＲ生成物を２つのオープン・リーディング・フレームを含んだこれらのプライマで増幅させた。第１のオープン・リーディング・フレームはｐ２８−５遺伝子の知られている領域とこの遺伝子のこれまで配列決定されていない部分を含んでいた。ｐ２８−５から下流に、さらに別の、同じではないが、相同性の２８−ｋＤａ蛋白質遺伝子が見出され、ＥＣａ２８ＳＡ３と命名された（Ｐ２８−６）。
【００７３】
ｐ２８−６内のＥＣａ２８ＳＡ３−２（５´−ＣＴＡＧＧＡＴＴＡＧＧＴＴＡＴＡＧＴＡＴＡＡＧＴＴ−３´、配列識別番号Ｎｏ．２６）と命名された特殊なプライマーとｐ２８−７内の１つの領域にアニールするプライマ７９３Ｃ（配列識別番号Ｎｏ．２３）を用いて、遺伝子ｐ２８−６とｐ２８−７間の遺伝子間領域を増幅させた。ＤＮＡを９５℃で２分間、９５℃で３０秒間を３０サイクル、５０℃で１分間、７２℃で１分間、さらに７２℃で伸長１０分間、そして４℃で保存という熱サイクルで増幅させた。
【００７４】
ｐ２８−６の３´末端、ｐ２８−６とｐ２８−７（２８ＮＣ３）間の遺伝子間領域、及び以前に分離した座に接合したｐ２８−７の５´末端を含む８００塩基対ＰＣＲ生成物を増幅した（図８）。ｐ２８−５の８４９塩基対オープン・リーディング・フレームは２８３アミノ酸蛋白質をコードし、そしてｐ２８−６は２８０アミノ酸蛋白質をコードする８４０ｂｐオープン・リーディング・フレームを有している。ｐ２８−６とｐ２８−７間の遺伝子間非コード領域は長さが３４５塩基対であった（図７及び８）。
【００７５】
実施例７
エールリヒア・ケイニスｐ２８−４、ｐ２８−５、ｐ２８−６、ｐ２８−７、及びｐ２８−８蛋白質の核酸及びアミノ酸相同性
エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質遺伝子５つ全ての核酸及びアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌ法を用いて位置合わせしたところ、これら遺伝子間の相同性を調べた。エールリヒア・ケイニス２８ｋＤａ蛋白質遺伝子メンバー間の核酸相同性は５８〜７５％、類似アミノ酸相同性は６７〜７２％の範囲であることが観察された（図９）。
【００７６】
転写プロモータ領域：
２８ｋＤａ蛋白質遺伝子間での遺伝子内領域をコンセンサス大腸菌プロモータ領域とエールリヒア・チャフェエンシスからのプロモータを比較することによってプロモータ配列分析を行った（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， １９９７； ＭｃＣｌｕｒｅ， １９８５）。ＲＢＳ、−１０及び−３５領域を含む推定プロモータ配列をそれぞれｐ２８−５、ｐ２８−６、ｐ２８−７、及びｐ２８−８（ＥＣａ２８−２）遺伝子に対応する４つの遺伝子間配列に同定した（図１０）。ｐ２８−４（ＥＣａ２８ＳＡ１）の上流非コード領域は未知であり、分析されていなかった。
【００７７】
Ｎ末端信号配列：
アミノ酸配列分析によって、エールリヒア・ケイニスｐ２８−７全体の推定分子量は３０．５ｋＤａで、エールリヒア・ケイニスｐ２８−６全体の推定分子量は３０．７ｋＤａであることが明らかになった。これら蛋白質のいずれも、予想されたエールリヒア・チャフェエンシスＰ２８（ＭＮＹＫＫＩＬＩＴＳＡＬＩＳＬＩＳＳＬＰＧＶＳＦＳ、配列識別番号Ｎｏ．２８）に類似した２３アミノ酸（ＭＮＣＫＫＩＬＩＴＴＡＬＭＳＬＭＹＹＡＰＳＩＳ、配列識別番号Ｎｏ．２７）のＮ末端信号ペプチド、及びＯＭＰ−１蛋白質ファミリーを有している（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９ａ； Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８ｂ）。
【００７８】
信号ペプチダーゼの好ましい切断サイト（ＳＩＳ；Ｓｅｒ−Ｘ−Ｓｅｒ）（Ｏｌｉｖｅｒ， １９８５）はｐ２８−７のアミノ酸２１、２２及び２３に見られる。エールリヒア・チャフェエンシスＰ２８（ＳＦＳ）の予想された切断サイトに等しいアミノ酸位置２５（ＭＮＣＫＫＩＬＩＴＴＡＬＩＳＬＭＹＳＩＰＳＩＳＳＦＳ、配列識別番号Ｎｏ．２９）での別の推定切断サイトも存在しており、予想分子量が２７．７ｋＤａの成熟ｐ２８−７と見られた。ｐ２８−５の以前報告された部分的な配列の信号切断サイトはアミノ酸３０にあると予想される。しかしながら、信号配列分析ではｐ２８−４は非切断信号配列を有すると予想された。
【００７９】
要約
類似の分子量を持つ蛋白質を同定し、エールリヒア・ケイニス、エールリヒア・チャフェエンシス、及びＣ．ルミナンチウムを含む多重リッケチア作用因子からクローニングした（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｊｏｎｇｅｊａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。６つの相同性ｐ２８遺伝子を有するエールリヒア・チャフェエンシスの１つの座と、各々がいくつかの相同性２８ｋＤａ蛋白質遺伝子を含んでいるエールリヒア・ケイニスの２つの座についてはこれまでに説明がなされている。
【００８０】
本発明ではエールリヒア・チャフェエンシスｏｍｐ−１多重遺伝子ファミリー及びＣ．ルミナンチウムｍａｐ−１遺伝子に相同なエールリヒア・ケイニスの成熟した２８ｋＤａ蛋白質をコードする遺伝子のクローニング、発現、及び特徴づけを説明した。２つの新しい２８ｋＤａ蛋白質遺伝子、即ちｐ２８−７とｐ２８−６を同定した。以前部分的に配列決定されていた（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８）別のエールリヒア・ケイニス２８ｋＤａ蛋白質遺伝子であるｐ２８−５を本発明において完全に配列決定した。５つのエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質遺伝子（ｐ２８−４、ｐ２８−５、ｐ２８−６、ｐ２８−７、及びｐ２８−８）を含むエールリヒア・ケイニスの１つの座の同定と特徴づけも開示した。
【００８１】
エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質はエールリヒア・チャフェエンシスＯＭＰ−１ファミリー及びＣ．ルミナンチウムのＭＡＰ−１蛋白質と相同である。最も相同性の高いエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質（ｐ２８−６、ｐ２８−７、及びｐ２８−８）が座の中で整列配置される。これら蛋白質の相同性は６７．５％〜７２．３％の範囲にあった。これら２８ｋＤａ蛋白質の分岐度は２７．３％〜３８．６％の範囲にあった。エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質ｐ２８−４とｐ２８−５は相同性が５０．９％〜５９．４％と最も低く、分岐度は５３．３％〜６９．９％であった。遺伝子間の差違は主に４つの超可変領域に見られ、これらの領域が表面露出され、免疫システムによって淘汰圧を受けやすいことを示唆している。７つのエールリヒア・ケイニス単離体の中でｐ２８−７の保存が報告されており（ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、エールリヒア・ケイニスが北米でクローニングされた可能性を示唆している。逆に、エールリヒア・チャフェエンシス単離体間ではＰ２８のかなりの多様性が報告されている（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９ａ）。
【００８２】
エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質は翻訳後に３０ｋＤａ蛋白質から成熟した２８ｋＤａ蛋白質に処理されたとみられる。近年、信号配列がエールリヒア・チャフェエンシスＰ２８上に同定され（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９ａ）、Ｎ末端アミノ酸配列決定はその蛋白質が翻訳後に処理され、成熟蛋白質を生成する信号配列の切断をもたらすことが検証された（Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ＯＭＰ−１Ｆ及びＯＭＰ−１Ｅのリーダー配列もリーダー信号ペプチドとして提案されている（Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。エールリヒア・チャフェエンシスＯＭＰ−１Ｆ、ＯＭＰ−１Ｅ及びＰ２８上に同定された信号配列はエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質のリーダー配列と相同である。ｐ２８遺伝子のプロモータ配列は実験上は決定されていないが、推定プロモータ領域は大腸菌及び他のエールリヒアエのＲＢＳ，−１０及び−３５プロモータ領域のコンセンサス配列との比較によって同定された（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， １９９７； ＭｃＣｌｕｒｅ， １９８５）。そのようなプロモータ配列は各遺伝子が転写及び翻訳されることを潜在的に可能にし、これらの遺伝子がホスト内で特異的に発現することを示唆している。イヌにおける持続的な感染はｐ２８遺伝子の特異的発現に関連し、ｉｎ　ｖｉｖｏでの抗原的変化をもたらし、その結果生物体に免疫反応を回避させている可能性がある。
【００８３】
エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質遺伝子はエールリヒア・チャフェエンシスｏｍｐ−１遺伝子ファミリー及びＣ．ルミナンチウムｍａｐ−１遺伝子との核酸及びアミノ酸配列相同性を示すことが確認された。今までの研究によって、エールリヒア・チャフェエンシスに対する回復期抗血清と反応するエールリヒア・ケイニスの３０ｋＤａ蛋白質遺伝子が同定されたが、抗原的に異なると考えられた（Ｒｉｋｉｈｉｓａ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。エールリヒア・ケイニス２８ｋＤａ蛋白質の４つの可変領域におけるアミノ酸置換の比較に基づく研究結果はこの可能性を支持している。同時にこれらの知見結果は、エールリヒア・ケイニスとエールリヒア・チャフェエンシスＰ２８間の抗原性差異の原因であるアミノ酸がこれらの可変領域に位置し、免疫システムに容易にアクセスできることも示唆している。
【００８４】
免疫反応性ペプチドがＣ．ルミナンチウム、エールリヒア・チャフェエンシス及びエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質の可変領域に位置していることが報告された（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。エールリヒア・ケイニス及びエールリヒア・チャフェエンシスＰ２８の分析によって全ての可変領域に表面露出されたアミノ酸が予測されることが明らかになった。イヌの研究によってエールリヒア・ケイニスとエールリヒア・チャフェエンシス間の干渉効果の欠失が示された（Ｄａｗｓｏｎ ａｎｄ Ｅｗｉｎｇ， １９９２）。この観察結果はＰ２８の可変領域だけでなく、これらエールリヒア種の他の免疫学的に重要な抗原における抗原性差異も関係があるだろう。別の研究で、エールリヒア・チャフェエンシス感染患者からの回復期ヒト抗血清がエールリヒア・チャフェエンシスの２９／２８ｋＤａ蛋白質を認識し、エールリヒア・ケイニスの相同性蛋白質にも反応することが分かった（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。エールリヒア・ケイニス２８ｋＤａ蛋白質及びエールリヒア・チャフェエンシスＰ２８上の相同性及び交差反応性エピトープは免疫システムによって認識されると見られる。
【００８５】
エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質は重要な免疫防御抗原と考えられる。いくつかの報告によれば、エールリヒア・ケイニスの３０ｋＤａ抗原は強力な免疫活性を示す（Ｒｉｋｉｈｉｓａ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｒｉｋｉｈｉｓａ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。ヒト及びイヌの回復期抗血清の抗体はエールリヒア・チャフェエンシス及びエールリヒア・ケイニスからの大きさの範囲の蛋白質と一貫して反応し、その抗体が重要な免疫防御抗原であることを示唆している（Ｒｉｋｉｈｉｓａ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。加えて、３０、２４及び２１ｋＤａ蛋白質に対する抗体はエールリヒア・ケイニスに対する免疫反応で早期に現れ（Ｒｉｋｉｈｉｓａ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｒｉｋｉｈｉｓａ ｅｔ ａｌ．， １９９２）、これらの蛋白質が疾病急性期における免疫反応で特に重要であることを示唆している。近年、分子量が２８ｋＤａの外膜蛋白質をコードする相同性遺伝子のファミリーがエールリヒア・チャフェエンシスで同定され、組み換えエールリヒア・チャフェエンシスＰ２８で免疫を与えられたマウスは相同性刺激（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対する免疫を発達させたとみられる（Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。エールリヒア・チャフェエンシスのＰ２８は外膜に存在することが示されており、免疫電子顕微鏡によって生物体の表面上にＰ２８の位置を決定し、その結果Ｐ２８が付着因子としてはたらくことが示唆された（Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。この研究で同定されたエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質はその同じ位置を有し、恐らく類似の機能を果たしている可能性が高い。
【００８６】
エールリヒア・ケイニスの異なる系統からのｐ２８−７の比較によって、その遺伝子が明らかに完全に保存されていることがわかった。エールリヒア・チャフェエンシスに関連した研究によって、多様性の免疫学的及び分子的証拠が示されている。エールリヒア・チャフェエンシスに感染した患者は２９／２８ｋＤａ蛋白質に可変性の免疫活性を有しており、抗原多様性の存在を示唆している（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。最近分子的証拠によってエールリヒア・チャフェエンシスからのｐ２８遺伝子の抗原多様性が支持されるようになってきた（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９ａ）。５つのエールリヒア・チャフェエンシス単離体の比較によって、２つの単離体（Ｓａｐｕｌｐａ及びＳｔ． Ｖｉｎｃｅｎｔ）は１００％同一であるが、他の３つ（Ａｒｋａｎｓａｓ、Ｊａｘ、９１ＨＥ１７）はアミノ酸レベルで１３．４％もの分岐度があることがわかった。エールリヒア・ケイニスｐ２８−７の保存により、米国でのエールリヒア・ケイニス系統は遺伝子的に同一であり、従ってエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質は米国でのイヌのエールリヒア症に対する魅力的なワクチン候補であることが示唆される。さらに米国以外のエールリヒア・ケイニス単離体の分析によってエールリヒア・ケイニスの起源と進化に関する情報が提供される。２８ｋＤａ蛋白質の保存はイヌのエールリヒア症の信頼できる血清診断法の重要な潜在的候補になる。
【００８７】
多重相同性遺伝子の役割は現時点で未知とはいえ、イヌにおける持続的なエールリヒア・ケイニス感染は相同性２８ｋＤａ蛋白質遺伝子の可変性発現による抗原性変化に恐らく関係しており、その結果エールリヒア・ケイニスに免疫学的調査を回避させている可能性がある。Ａ．マルギナーレ（Ａ．ｍａｒｇｉｎａｌｅ）のｍｓｐ−３遺伝子の変異体はＭＳＰ−３蛋白質の変異体の部分的な原因となっており、持続的な感染に至る（Ａｌｌｅｍｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。急性及び慢性感染したイヌのエールリヒア・ケイニスによる２８ｋＤａ蛋白質遺伝子発現を調べる研究によって、持続的感染における２８ｋＤａ蛋白質遺伝子ファミリーの役割に対する洞察が提供されるであろう。
【００８８】
実施例８
ｐ２８−１、ｐ２８−２、ｐ２８−３、及びｐ２８−９遺伝子の同定
上に述べたタンデム配列ｐ２８遺伝子の５つの遺伝子座の上流と下流のＤＮＡの未確認領域をｐ２８−１（ＥＣａ２８−７５Ｃ）とｐ２８−５（ＥＣａ２８−５−８１８ｆ）がｐ２８遺伝子座を双方向に延びるようにする遺伝子固有プライマをつくることで配列決定した。多重遺伝子ウォークを行なってそれら未確認配列を以下のように確認した。上記５遺伝子座の下流側１．９−ｋｂをプライマｐ２８−５−８１８ｆ（５´−ＴＴＡＡＡＣＡＴＡＴＧＣＣＡＣＴＴＣＧＧＡＣＴＡ−３´、配列識別番号Ｎｏ．３４）で、増幅、配列決定し、９００塩基対アンプリコンをつくると同時に、さらに１１９１（５´−ＴＡＴＧＡＴＣＧＴＧＴＡＡＡＡＴＴＧＣＴＧＴＧＡＧＴＡＴ−３´、配列識別番号Ｎｏ．３５）を用いて１−ｋｂアンプリコンをつくった。上記５つの遺伝子座上流の３．６７−ｋｂｐＤＮＡをプライマＥＣａ２８−７５Ｃ（５´−ＴＡＣＴＧＧＣＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＣＴＡ−３´、配列識別番号Ｎｏ．３６）で増幅、配列決定して、１．６−ｋｂｐアンプリコンをつくり、ＥＣａ５´−１６００（５´−ＣＡＣＣＡＡＴＡＡＡＴＧＣＡＧＡＧＡＣＴＴＣ−３´、配列識別番号Ｎｏ．３７）を用いて１．６−ｋｂｐアンプリコンをつくり、さらに３１２５（５´−ＡＡＴＣＣＡＴＣＡＴＴＴＣＴＣＡＴＴＡＣＡＧＴＧＴＧ−３´、配列識別番号Ｎｏ．３８）を用いて、８００塩基対アンプリコンをつくった。上記４つの新しいｐ２８遺伝子で構成される９つのタンデム配置遺伝子の座と上に述べた５つのｐ２８遺伝子をそれぞれｐ２８−１からｐ２８−９と命名した（図１１）。
【００８９】
エールリヒア・ケイニスｐ２８遺伝子の核酸及びアミノ酸配列をＣｌｕｓｔａｌ法で位置比較して、これらの遺伝子間の相同性を調べた。これらの蛋白質の相同性は６７．５％から７５％の範囲で、これらｐ２８蛋白質間の分岐度は２６．９％から３８％の範囲であった。エールリヒア・ケイニスｐ２８蛋白質ｐ２８−１、ｐ２８−２及びｐ２８−９はその他のｐ２８遺伝子との相同性が最も低く、３７％から４９％の範囲で、分岐度は５３−７７％の範囲であった。９つのｐ２８遺伝子の核酸相同性は２８−７２％の範囲である。エールリヒア・ケイニスｐ２８アミノ酸配列に基づく系統発生的関係を図１２に示す。
【００９０】
ヌクレオチド配列及び登録番号：
完全な９遺伝子エールリヒア・ケイニス（Ｊａｋｅ系統）ｐ２８遺伝子座の核酸及びアミノ酸配列に関するＧｅｎＢａｎｋ登録番号はＡＦ０８２７４４である。この登録番号は最初ｐ２８−７に与えられたが、ｐ２８−７を含む上記９遺伝子ｐ２８座の配列に更新された。本研究で述べられているその他のエールリヒア・ケイニス単離体におけるｐ２８−７の核酸及びアミノ酸配列のＧｅｎＢａｎｋ登録番号は：ルイジアナ、ＡＦ０８２７４５；オクラホマ、ＡＦ０８２７４６；デモン（Ｄｅｍｏｎ）、ＡＦ０８２７４７；ＤＪ、ＡＦ０８２７４８；ファジー（Ｆｕｚｚｙ）、ＡＦ０８２７４９；フロリダ、ＡＦ０８２７５０である。
【００９１】
エールリヒア・ケイニスに感染したイヌの回復期血清の免疫ブロットによって２８ｋＤａ範囲の複数の帯が観察され（Ｒｉｋｉｈｉｓａ ｅｔ ａｌ．， １９９４）、そして多重ｐ２８蛋白質の発現がこの観察結果を説明するものとして理解された。サザーン・ブロット調査は、この座の５つの部材に加えて、このゲノム内に他のｐ２８遺伝子が存在していることを示唆している（ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８ｂ）。
【００９２】
この調査で、相同性ではあるが、まったく同じではないｐ２８遺伝子をコードする９つのタンデム配置のエールリヒア・ケイニスｐ２８遺伝子を含む１つの遺伝子座が確認された。この９遺伝子座は４つの新しいｐ２８遺伝子（図１３−１６）と上に述べた５つのタンデム配置のｐ２８遺伝子を含んでいた。このｐ２８遺伝子のうちの８つは１つのＤＮＡストランド上に配置されており、１つのｐ２８遺伝子は相補性ストランド上に見出された。この９つのｐ２８遺伝子メンバー間の核酸相同性は３７−７５％の範囲であり、アミノ酸相同性は２８−７２％の範囲であった。
【００９３】
エールリヒア・ケイニスのｐ２８は、それら自体と同様、エールリヒア・チャフェエンシスなどの他の種の２８ｋＤａ蛋白質と強い関連性を有していることが見出された（ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。それら蛋白質間の差は主にいくつかの超可変性領域に見出され、このことはこれらの領域が表面露出されており、免疫系によって選択的圧力を受けていることを示唆している（ＭｃＢｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００）。
【００９４】
７つの地理的に異なった単離体間でエールリヒア・ケイニスｐ２８遺伝子（ｐ２８−７）が保存されていることが報告され（ＭｃＢｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、このことはエールリヒア・ケイニスが北米で高度に保存されていることを示唆している。同様に、エールリヒア・ケイニスの１２０ｋＤａ糖蛋白質も米国内での単離体間で保存されている（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。対照的に、エールリヒア・チャフェエンシスの１２０ｋＤａ及び２８ｋＤａ蛋白質遺伝子は両方とも単離体間に違いが認められる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９ａ； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。エールリヒア・チャフェエンシスの２８ｋＤａ蛋白質遺伝子の違いは恐らくは選択的免疫圧力による超可変性領域でのポイント突然変異によってもたらされるらしい（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．， １９９９ａ）。これらのデータはエールリヒア・ケイニスが北米に比較的最近導入されたこと、そしてそれらが単離体間で観察される保存の理由となっていることを示唆している。エールリヒア・ケイニス単離体のｐ２８遺伝子の保存は疾病の予防及び血清診断に特に有効なワクチン及び抗原診断用抗原開発の機会を提供してくれるであろう。ｐ２８の混合物は最も信頼性の高い血清診断テストを提供してくれるであろうが、１つのｐ２８だけでの血清診断でも免疫診断には有効であることが最近報告されている（Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８ｂ； ＭｃＢｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９）。
【００９５】
以下の文献が本明細書で引用されている。
Ａｌｌｅｍａｎ Ａ． Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６５： １５６−１６３．
Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｂ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２９： ２８３８−２８４２．
Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｂ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９２） Ｉｎｔ Ｊ Ｓｙｓｔ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ ４２： ２９９−３０２．
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Ｄａｗｓｏｎ Ｊ． Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， （１９９１） Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １６３： ５６４−５６７．
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Ｒｏｔｈｂａｒｄ Ｊ． Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， （１９８８） Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ７： ９３−１００．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， （１９８９） Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
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Ｓｕｌｓｏｎａ ｅｔ ａｌ．， （１９９９） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２５７：３００−３０５．
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Ｙｕ， ｅｔ ａｌ．， （１９９３） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３１： ３２８４−３２８８．
Ｙｕ， ｅｔ ａｌ．， （１９９７） Ｇｅｎｅ １８４： １４９−１５４．
Ｙｕ， ｅｔ ａｌ．， （１９９９ａ） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３７： １１３７−１１４３．
Ｙｕ， ｅｔ ａｌ．， （２０００） Ｇｅｎｅ ２４８： ５９−６８．
【００９６】
この明細書で取上げられているすべての特許及び刊行物は本発明が関係している技術分野の当業者のレベルを示している。これらの特許及び刊行物は、引用によって個々の刊行物が個別的に本明細書に組み入れられるのと同様に全体としても本明細書に組み込まれる。
【００９７】
本発明がここに述べられている、及びそれらに本質的に付随した目的及び利点を獲得するのによく適していることは当業者は容易に理解できるであろう。ここに述べられている実施例は、ここに述べられている方法、手順、処理、分子及び特定の化合物と共に現段階で好ましい実施の形態を示すものであり、例示的なものであって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。特許請求の範囲で定義されている本発明の製品の範囲に含まれるそ変更やその他の利用法は当業者には容易に想起されるであろう。
【図面の簡単な説明】
上に述べられた本発明の特徴、利点及び目的が達成され、より詳細に理解できるようにするために、上に述べられた本発明について添付図面に示すいくつかの実施の形態を参照してより詳しく説明する。これらの図面は本明細書の一部を構成する。しかしながら、添付図面は本発明の好ましい実施の形態を示すものであって、その範囲の限定とみなされるものではない。
【図１】
隣接した５’及び３’のノンコーディング配列を含むｐ２８−７遺伝子の核酸配列（配列識別番号Ｎｏ．１）及び推定されたアミノ酸配列（配列識別番号Ｎｏ．２）を示す図。開始コドンＡＴＧ及び終止コドンＴＡＡは太字で示され、２３アミノ酸リーダー信号配列には下線が付されている。
【図２】
発現した５０ｋＤａ組み換えｐ２８−７−チオレドキシン融合蛋白質（線１、矢印）及び１６ｋＤａのチオレドキシン対照群（線２、矢印）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び回復期エールリヒア・ケイニス・イヌ抗血清（線３）によって認識される組み換えｐ２８−７チオレドキシン融合蛋白質の対応する免疫ブロットを示す図。チオレドキシン対照群はエールリヒア・ケイニス抗血清（図示せず）では検出されない。
【図３】
ｐ２８−７蛋白質（ＥＣａ２８−１、配列識別番号Ｎｏ．２）、ｐ２８−５蛋白質（ＥＣａ２８ＳＡ２、部分配列、配列識別番号Ｎｏ．７）、ｐ２８−４蛋白質（ＥＣａ２８ＳＡ１、配列識別番号Ｎｏ．８）、エールリヒア・チャフェエンシスＰ２８（配列識別番号Ｎｏ．９）、エールリヒア・チャフェエンシスＯＭＰ−１ファミリー（配列識別番号Ｎｏ．１０−１４）、及びＣ．ルミナンチウム（Ｃ． ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）ＭＡＰ−１蛋白質（配列識別番号Ｎｏ．１５）のアミノ酸配列の位置的整合を示す図。前記ｐ２８−７アミノ酸配列はコンセンサス配列として提示される。図示されていないアミノ酸はｐ２８−７と同一であり、点で表されている。分岐アミノ酸は対応する１文字の略語で示されている。アミノ酸配列の位置的整合極大のために導入されたギャップはダッシュ記号で示されている。可変領域には下線が引かれ、印がつけられている（ＶＲ１、ＶＲ２、ＶＲ３、及びＶＲ４）。矢印は信号ペプチドの予想された信号ペプチダーゼ切断サイトを示す。
【図４】
非平衡系統樹を用いて推定されたアミノ酸配列から、エールリヒア・ケイニスｐ２８−７（ＥＣａ２８−１）、ｐ２８−５（ＥＣａ２８ＳＡ２、部分配列）、ｐ２８−４（ＥＣａ２８ＳＡ１）、エールリヒア・チャフェエンシスｏｍｐ−１多重遺伝子ファミリーのメンバー、及びＣ．ルミナンチウムｍａｐ−１蛋白質の系統発生的関連を示す図。枝の各対の長さはその対のアミノ酸配列間の距離を表す。目盛りは配列間の距離を示す。
【図５】
６個の異なる制限酵素で完全に消化され、ｐ２８−７ＤＩＧラベル・プローブ（線２−７）とＤＩＧラベル分子量マーカー（線１及び８）でハイブリダイズされたエールリヒア・ケイニス・ゲノムＤＮＡのサザン・ブロット分析を示す図。
【図６】
エールリヒア・ケイニスｐ２８−７（ＥＣａ２８−１、Ｊａｋｅ株）及びエールリヒア・チャフェエンシスｐ２８（Ａｒｋａｎｓａｓ株）の予想された蛋白質の特徴の比較を示す図。表面確率（ｓｕｒｆａｃｅ　ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）によってヘキサペプチドのウィンドウ（ｗｉｎｄｏｗ）を使って表面残基が予想される。表面残基は水アクセス可能表面積が２．０ｎｍ２より大きいどんな残基でもよい（Ａ ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｓｉｄｕｅ ｉｓ ａｎｙ ｒｅｓｉｄｕｅ ｗｉｔｈ ａ ＞２．０ ｎｍ２ ｏｆ ｗａｔｅｒ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｅ ａｒｅａ）。１より高い価を有するヘキサペプチドは表面領域（ｓｕｒｆａｃｅ ｒｅｇｉｏｎ）とみなされた。抗原指標によって潜在的な抗原決定基が予想される。ゼロより大きい価を有する領域は潜在的な抗原決定基である。Ｔ細胞モチーフは５個のアミノ酸のモチーフ、即ち残基１−グリシンあるいは極性、残基２−疎水性、残基３−疎水性、残基４−疎水性またはプロリン、残基５−極性または５−グリシンを使うことによって潜在的なＴ細胞抗原決定基の位置を決定する。目盛りはアミノ酸の位置を示す。
【図７】
遺伝子間ノンコーディング配列（ＮＣ２，ヌクレオチド８５０−１１９４：配列識別番号Ｎｏ．３１）を含むエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質遺伝子ｐ２８−５（ヌクレオチド１−８４９：配列識別番号Ｎｏ．３；アミノ酸配列：配列識別番号Ｎｏ．４）及びｐ２８−６（ヌクレオチド１１９５−２０３１：配列識別番号Ｎｏ．５；アミノ酸配列：配列識別番号Ｎｏ．６）の核酸配列及び推定されたアミノ酸配列を示す図。ＡＴＧ開始コドン及び終止コドンは太字で示されている。
【図８】
ゲノム方向性及び遺伝子間ノンコーディング領域（２８ＮＣ１−４）を示すエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質遺伝子座（５．５９２Ｋｂ、５個の遺伝子を含む）の概要を示す図。座１及び座２（斜線部）に示されたこの２８ｋＤａ蛋白質遺伝子について説明がなされてきた（ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ｐ２８−５の完全な配列及びｐ２８−６と称される新しい２８ｋＤａの蛋白質遺伝子が配列決定された。以前は結合していなかった座１及び座２の結合によってｐ２８−５、ｐ２８−６、及びｐ２８−７間の遺伝子間ノンコーディング領域（２８ＮＣ２−３）が完成した。
【図９】
非均衡系統樹を用いたアミノ酸配列に基づくエールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質遺伝子ｐ２８−４（ＥＣａ２８ＳＡ１）、ｐ２８−５（ＥＣａ２８ＳＡ２）、ｐ２８−６（ＥＣａ２８ＳＡ３）、ｐ２８−７（ＥＣａ２８−１）、及びｐ２８−８（ＥＣａ２８−２）の系統発生的関連を示す図。枝の各対の長さはアミノ酸対間の距離を表す。目盛りは配列間の距離を示す。
【図１０】
エールリヒア・ケイニスの２８ｋＤａ蛋白質遺伝子の遺伝子間ノンコーディング核酸配列（配列識別番号Ｎｏ．３０−３３）の位置的整合を示す図。図示されていないが点（．）で示された核酸はノンコーディング領域１（２８ＮＣ１）と同一である。分岐アミノ酸は対応する１文字の略語で示されている。アミノ酸配列の位置的整合極大のために導入されたギャップはダッシュ（−）で示されている。推定された転写プロモータ領域（−１０及び−３５）及びリボソーム結合部位（ＲＢＳ）はボックス内に示されている。
【図１１】
ゲノム方向性及び遺伝子間ノンコーディング領域を示す９個の遺伝子エールリヒア・ケイニスｐ２８座（１０，６７７塩基対）の概略を示す図。このｐ２８遺伝子（ｐ２８−１、２、３、９）（非斜線部）は実施例８で同定された。斜線をつけたｐ２８遺伝子は以前に同定され、以下のように称される：ｐ２８−４、ｐ３０ａ（Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８ｂ）及びＯＲＦ１（Ｒｅｄｄｙ ｅｔ ａｌ．， １９９８）；　ｐ２８−５及びｐ２８−６（ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００）；ｐ２８−７、ｐ２８（ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．， １９９９）ｐ３０（Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８ｂ）；及びｐ２８−８、ｐ３０−１（Ｏｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８ｂ）。
【図１２】
アミノ酸配列に基づいたエールリヒア・ケイニスｐ２８−１からｐ２８−９の系統発生的関連を示す図。枝の各対の長さはアミノ酸対間の距離を表す。目盛りは配列間の分岐のパーセンテージを示す。
【図１３】
エールリヒア・ケイニスｐ２８−１遺伝子の核酸配列（配列識別番号Ｎｏ．３９）及び推定されたアミノ酸配列（配列識別番号Ｎｏ．４０）を示す図。
【図１４】
エールリヒア・ケイニスｐ２８−２遺伝子の核酸配列（配列識別番号Ｎｏ．４１）及び推定されたアミノ酸配列（配列識別番号Ｎｏ．４２）を示す図。
【図１５】
エールリヒア・ケイニスｐ２８−３遺伝子の核酸配列（配列識別番号Ｎｏ．４３）及び推定されたアミノ酸配列（配列識別番号Ｎｏ．４４）を示す図。
【図１６】
エールリヒア・ケイニスｐ２８−９遺伝子の核酸配列（配列識別番号Ｎｏ．４５）及び推定されたアミノ酸配列（配列識別番号Ｎｏ．４６）を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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