(57)【要約】本発明は、ｈＳＡを産生する宿主細胞の内因性血清アルブミンから、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）を精製する方法に関する。本方法は：ｈＳＡおよび宿主細胞の血清アルブミンを含む試料を提供し；宿主細胞の血清アルブミンに対するよりも高い親和性でｈＳＡに対して結合するアフィニティーカラムに試料を装填し；結合したｈＳＡをアフィニティーカラムから溶出し；溶出したｈＳＡを結晶化する；各工程を含む。また、本発明は、本発明の方法によって作成したｈＳＡを含む組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）および宿主細胞の血清アルブミンを含む試料から、ｈＳＡを精製する方法において：
ｈＳＡおよび宿主細胞の血清アルブミンを含む試料を得る；
宿主細胞の血清アルブミンに対するよりも高い親和性でｈＳＡに対して結合するアフィニティーカラムに前記試料を装填する；
結合したｈＳＡをアフィニティーカラムから溶出する；
溶出したｈＳＡを結晶化する；
各工程を含む方法。
【請求項２】
前記試料が、トランスジェニック非ヒト動物から得られることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記動物が、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウスおよびウサギより成る群から選択されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記試料が、哺乳類の乳、血液または組織から得られることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記試料が、細胞を培養するのに用いられた培養液であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、乳腺上皮細胞中にｈＳＡを産生するトランスジェニック哺乳類の乳から得られることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項７】
乳試料を脱脂する工程をさらに含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
乳試料を処理してカゼインを除去する工程をさらに含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
酸沈殿、遠心分離、またはタンジェンシャルフローフィルトレーションによって、カゼインを除去することを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が、清澄化乳試料であることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記清澄化乳試料が塩バッファー中に含まれていることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記塩バッファーが、２５０ｍＭのＮａＣｌおよび低濃度の非イオン性界面活性剤を含み、ｐＨ８．５であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記アフィニティーカラムが、合成リガンド樹脂を含むことを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記合成リガンド樹脂が、アフィニティーリガンドとして、Reactive Blue 2染料または改良型のReactive Blue 2染料を用いることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記アフィニティーカラムが、ｈＳＡに対して結合する親和性と比較して、宿主細胞の血清アルブミンに対して実質的に結合しないことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１６】
試料をアフィニティーカラムに装填した後、該アフィニティーカラムを洗浄する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１７】
洗浄バッファーが、２５０ｍＭのＮａＣｌおよび低濃度の非イオン性界面活性剤を含み、ｐＨが８．５であることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記アフィニティーカラムに結合した非血清アルブミンタンパク質の溶出を実質的に誘導しない溶出バッファーを用いて、前記アフィニティーカラムからｈＳＡを溶出することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記溶出バッファーが、リン酸バッファー、およびｈＳＡに対する結合に関してカラムのアフィニティーリガンドと競合する脂肪酸分子を含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記溶出バッファーが、２０−５０ｍＭのリン酸塩を含み、約ｐＨ６．０であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記脂肪酸分子がカプリル酸塩であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
アフィニティー精製したｈＳＡ試料を、前記アフィニティーカラムまたは第２のアフィニティーカラムに装填し、ｈＳＡ結合アフィニティーカラムを洗浄し、さらに、アフィニティーカラムに結合したｈＳＡを溶出して、２回アフィニティー精製したｈＳＡ試料を作成する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２３】
試料に結晶化剤を添加することによって、溶出したｈＳＡを結晶化することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２４】
前記結晶化剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、硫安、リン酸塩、およびそれらの組合せより成る群から選択されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記結晶化剤がリン酸塩であり、最終濃度２．７−２．８Ｍになるように添加されることを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
前記結晶化剤が、ｈＳＡに結合する脂肪酸分子をさらに含むことを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
前記脂肪酸分子がカプリル酸塩であることを特徴とする請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
結晶化したｈＳＡを、結晶化溶液から分離することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項２９】
請求項１記載の方法によって作成したｈＳＡを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００１年６月１３日出願の米国特許出願第６０／２９７，８８４号（その内容は参照によって本明細書に組み込まれる）に基づく優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血清アルブミンは、血中に最も豊富に存在するタンパク質の１つである。血清アルブミンは、例えば脂肪酸のような疎水性分子のキャリアとして、および有機分子に結合してその分子が排泄されるまで隔離するスカベンジャーとして、血液内で機能する。血液中に大量に存在するため、血清アルブミンは、血液、特に血清の特性の主要な決定子である。
【０００３】
第二次世界大戦の間、ｈＳＡは、外傷または外科手術によって失われた血液量を補うのに有用なヒト血液代替物（人工血液）を作るのに生理学的に適切な溶液であると考えられていた。例えば、非特許文献１を参照。実際、そのような人工血液は、簡単に失われた血液細胞に置き換わることができ、血液型の適合の問題がないため、ほとんどの場合に理想的な血液代替物である。さらには、ｈＳＡの溶液は、実際の血液よりも半減期がかなり長い。血液中のｈＳＡは高濃度であるため、少量の人工血液を作るのでさえ、大量の高純度のｈＳＡを必要とする。
【０００４】
トランスジェニック動物でのｈＳＡの組換えによる産生は、大量のタンパク質を迅速に得ることができ、それによってかなりの量の人工血液を作成することを可能にするため、魅力的である。残念ながら、組換えによって作成したｈＳＡは、容易に使うことはできない：最初に、宿主動物の血清アルブミン、ならびに例えば脂質、小さな分子、タンパク質、およびウイルス病原体のような、宿主試料中に存在する他の分子から精製する必要がある。結果的に、現在のところ、トランスジェニック動物から得られる試料から開始して、人工血液グレードのｈＳＡを作成する方法は、時間も費用もかかる。このことは、少なくとも部分的に、トランスジェニック宿主として用いやすい動物中に存在する非常に類似する血清アルブミンから、ｈＳＡを分離することの困難性によるものである。したがって、トランスジェニック動物におけるｈＳＡの組換え産生は、大量の純粋なｈＳＡおよび人工血液を提供する可能性を残しているが、経済的要因がその実行可能性を制限してきた。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、部分的に、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）と、トランスジェニック乳用動物由来の宿主細胞（例えばトランスジェニック宿主細胞）の血清アルブミンとを区別できる分離方法の発見に基づくものである。ｈＳＡのトランスジェニック動物による産生は、ｈＳＡとその動物の内因性血清アルブミンの両方が存在する産物をもたらす。しかしながら、しばしば、不純物、特に非ヒト動物に由来する血清アルブミンを含まない純粋なｈＳＡを得ることが必要である。例えばトランスジェニック乳用動物のようなトランスジェニック動物から得られた試料からのｈＳＡの精製は、ｈＳＡとその動物の血清アルブミンとの間の高度な相同性のため、複雑となる。例えば、ｈＳＡはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に非常に類似する。驚くべきことに、ｈＳＡおよび内因性血清アルブミンを含む試料を清澄化し、ｈＳＡに選択的に結合する樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行い、さらにアフィニティーカラムからの溶出の後、ｈＳＡを結晶化する、各工程を含むプロトコルを用いて、宿主細胞の血清アルブミンから、トランスジェニック動物により産生したｈＳＡを適切かつ効率的に精製することができる。
【０００６】
従って、１つの態様において、本発明は、ｈＳＡおよび宿主細胞の血清アルブミンを含む試料から、ヒト血清アルブミン（ｈＳＡ）を精製する方法に関するものであり、本方法は：
ｈＳＡおよび宿主細胞の血清アルブミンを含む試料を得る；
例えば宿主細胞の血清アルブミンに対するよりも高い親和性でｈＳＡに対して結合する等、ｈＳＡと結合するアフィニティーカラムに試料を装填する；
結合したｈＳＡをアフィニティーカラムから溶出する；
溶出したｈＳＡを結晶化する；
各工程を含む。
【０００７】
ある実施形態において、試料は、トランスジェニック非ヒト動物から得る。動物は、例えば、有蹄動物（例えば、ウシ、ヤギ、またはヒツジ）、ブタ、マウス、またはウサギのような、哺乳類であってよい。試料は、例えば、哺乳類の乳、血液、または組織（例えば組織ホモジネート）から得ることができる。他の実施形態において、試料は、例えば鶏、七面鳥、アヒル、キジ、またはダチョウのような鳥類から得る。例えば、鳥類の卵、血液、または組織（例えば、組織ホモジネート）から試料を得る。
【０００８】
他の実施形態において、試料は、例えば哺乳類細胞、鳥類細胞、魚類細胞、または昆虫細胞のような、培養細胞に用いられた培養液である。ある実施形態では、培養細胞はトランスジェニック細胞である。例えば、培養細胞は、適切な調節要素の制御下にｈＳＡをコードする核酸配列を含むトランスジーンを包含していてよい。
【０００９】
ある実施形態において、本発明の方法で用いられる試料は、例えば遠心分離のような標準的な脱脂(decreaming)工程によって、乳脂肪を除去した乳である。
【００１０】
関連する実施形態において、本発明の方法で用いられる試料は、処理してカゼインを除去した乳（例えば脱脂乳(decreamed milk)）である。例えば、カゼインを含む重い沈殿物を形成するように乳のｐＨを下げることによって、乳中のカゼイン濃度を低下させることができる。好ましい実施形態では、例えば稀酢酸のような稀酸等の酸を乳に添加することによって、乳のｐＨを下げる。好ましい実施形態では、乳のｐＨを約ｐＨ４．２−４．８に下げる。ある実施形態では、例えばタンジェンシャルフローマイクロフィルトレーションのようなろ過によって、乳からカゼインの重い沈殿物を除去する。他の実施形態では、遠心分離によって、乳からカゼインの重い沈殿物を除去する。さらに別の実施形態では、カゼインの酸沈殿を行うことなく、タンジェンシャルフローフィルトレーションを用いて試料からカゼインを除去する。
【００１１】
ある実施形態において、本発明の方法で用いられる試料は、カゼインが除去された脱脂乳であってもよい。この試料は、本明細書において、「清澄化乳試料(clarified milk sample)」とも称される。
【００１２】
清澄化ｈＳＡ試料をアフィニティークロマトグラフィーにかけ、またはアフィニティークロマトグラフィーに試料をかける前に1以上の付加的な精製工程にかけてもよい。ある実施形態では、清澄化ｈＳＡ試料は、アフィニティーカラムに装填するのに適した塩バッファー中に含まれている。例えば、塩バッファーは、２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．５）および低濃度の非イオン性界面活性剤を含んでいてよい。
【００１３】
ある実施形態では、本発明の方法は、ｈＳＡ試料（例えば清澄化ｈＳＡ試料）中に存在するｈＳＡタンパク質に結合するアフィニティーカラムの使用を含み、ここでアフィニティーカラムは合成樹脂を含む。ｈＳＡに結合するのに適切な合成樹脂は、アフィニティーリガンドとしてReactive Blue 2染料の改良バージョンを用いるPrometic Biosciences Blue SAカラムにある。好ましい実施形態では、例えば合成樹脂アフィニティーカラムのようなアフィニティーカラムは、ｈＳＡ試料中に存在する多くの、すなわちほとんどの非ｈＳＡタンパク質（例えばホエータンパク質）に実質的に結合しない。特に好ましい実施形態では、例えば合成樹脂アフィニティーカラムのようなアフィニティーカラムは、ｈＳＡに対するその親和性と比較して、例えば哺乳類アルブミンタンパク質（例えばＢＳＡ）のような非ヒト血清アルブミンタンパク質に対して、より低い親和性を有する（例えば、実質的に結合しない）。
【００１４】
関連する実施形態において、本発明の方法は、ｈＳＡ試料（例えば清澄化ｈＳＡ試料）中に存在するｈＳＡタンパク質に結合するアフィニティーカラムの使用を含み、ここでアフィニティーカラムのリガンドとｈＳＡとの間の相互作用は、脂肪酸分子によって阻害することができる。好ましい実施形態では、脂肪酸分子はカプリル酸塩である。
【００１５】
ある好ましい実施形態では、本発明の方法は、ｈＳＡ試料（例えば清澄化ｈＳＡ試料）をカラムに装填した後、アフィニティーカラムを洗浄する工程を含む。好ましい実施形態では、洗浄バッファーは装填バッファーと同じである。適切な洗浄バッファーは、例えば２５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ８．５）および低濃度の非イオン性界面活性剤を含んでいてよい。
【００１６】
ある実施形態では、本発明の方法は、溶出バッファーを用いて、アフィニティーカラムに結合したｈＳＡを溶出して、アフィニティー精製ｈＳＡ試料を作成する工程を含む。ここで溶出バッファーは、アフィニティーカラムに結合した非血清アルブミンタンパク質の溶出を実質的に誘導しない。Prometic Biosciences Blue SA Columnに関して、適切な溶出バッファーは、リン酸バッファー、およびｈＳＡへの結合に対してカラムのアフィニティーリガンドと競合する脂肪酸分子を含む。ある実施形態では、溶出バッファーは、２０−５０ｍＭのリン酸塩（ｐＨ６．０）を含む。ある実施形態では、溶出バッファーは、例えば約２０ｍＭの濃度で脂肪酸のカプリル酸を含む。
【００１７】
ある実施形態では、本発明の方法は、アフィニティーカラムに、アフィニティー精製ｈＳＡを再装填し、ｈＳＡ結合アフィニティーカラムを洗浄し、さらに、アフィニティーカラムに結合したｈＳＡを溶出して、２回アフィニティー精製したｈＳＡ試料を作成する工程を含む。他の実施形態では、さらに１回以上、アフィニティー精製ｈＳＡ試料をアフィニティーカラムに再装填してもよい（例えば３回アフィニティー精製したｈＳＡ試料）。
【００１８】
次に、アフィニティー精製ｈＳＡ試料を結晶化し、または結晶化の前に１以上の付加的な精製工程にかけてもよい。
【００１９】
ある実施形態において、本発明の方法は、結晶化剤を試料に添加することによって、アフィニティー精製ｈＳＡ試料（例えば、１回または２回アフィニティー精製したｈＳＡ試料）を結晶化する工程を含む。結晶化を誘導するように、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、硫酸アンモニウム（硫安）および／またはリン酸塩等の、多くの結晶化剤をｈＳＡ溶液に加えてよい。好ましい実施形態では、結晶化剤はリン酸溶液である。好ましい実施形態において、結晶化剤はリン酸塩であり、最終濃度２．７−２．８Ｍになるように試料に添加される。ある実施形態では、結晶化剤は、例えばカプリル酸塩のような、ｈＳＡに結合する脂肪酸分子をさらに含む。好ましい実施形態では、例えばろ過によって、結晶化溶液（すなわち母液）から結晶化ｈＳＡタンパク質を分離し、バッファーで洗浄し、さらに適切な溶液（例えば水）に再溶解する。他の実施形態では、例えば溶媒乾燥または風乾を用いる等して、結晶化ｈＳＡタンパク質を乾燥してもよい。次に、乾燥ｈＳＡタンパク質結晶を、例えば長期間、例えば室温で保存し、さらに必要に応じて輸送してもよい。ある実施形態において、乾燥結晶化ｈＳＡを適切な溶媒（例えば水）に再溶解させてもよい。
【００２０】
別の態様において、本発明は、別の種の血清アルブミンからｈＳＡを分離する方法に関する。本方法は：
別の種の血清アルブミンをさらに含むｈＳＡ試料を得る；
例えば別の種の血清アルブミンに対して結合するよりも高い親和性でｈＳＡに対して結合する等、ｈＳＡと結合するアフィニティーカラムにｈＳＡ試料を装填する；
結合したｈＳＡをアフィニティーカラムから溶出する；
溶出したｈＳＡを結晶化する；
各工程を含む。
【００２１】
ある実施形態において、試料は、非ヒト動物から得る。動物は、例えば、有蹄動物（例えば、ウシ、ヤギ、またはヒツジ）、ブタ、またはウサギのような、哺乳類であってよい。試料は、例えば、哺乳類の乳、血液、または組織（例えば組織ホモジネート）から得ることができる。他の実施形態において、試料は、例えば鶏、七面鳥、アヒル、キジ、またはダチョウのような鳥類から得る。例えば、鳥類の卵、血液、または組織（例えば、組織ホモジネート）から試料を得る。好ましい実施形態において、動物はトランスジェニック動物である。好ましい実施形態において、動物は哺乳類であり、かつ試料は、例えばトランスジェニック哺乳類から得た乳のような乳である。
【００２２】
他の実施形態において、試料は、例えば哺乳類細胞、鳥類細胞、魚類細胞、または昆虫細胞のような、培養細胞に用いられた培養液である。ある実施形態では、培養細胞はトランスジェニック細胞である。例えば、培養細胞は、適切な調節要素の制御下にｈＳＡをコードする核酸配列を含むトランスジーンを包含していてよい。
【００２３】
ある実施形態において、本発明の方法で用いられる試料は、例えば遠心分離のような標準的な脱脂(decreaming)工程によって、乳脂肪を除去した乳である。
【００２４】
関連する実施形態において、本発明の方法で用いられる試料は、処理してカゼインを除去した乳（例えば脱脂乳(decreamed milk)）である。例えば、カゼインを含む重い沈殿物を形成するように乳のｐＨを下げることによって、乳中のカゼイン濃度を低下させることができる。好ましい実施形態では、例えば稀酢酸のような稀酸等の酸を乳に添加することによって、乳のｐＨを下げる。好ましい実施形態では、乳のｐＨを約ｐＨ４．２−４．８に下げる。ある実施形態では、例えばタンジェンシャルフローマイクロフィルトレーションのようなろ過によって、乳からカゼインの重い沈殿物を除去する。他の実施形態では、遠心分離によって、乳からカゼインの重い沈殿物を除去する。さらに別の実施形態では、カゼインの酸沈殿を行うことなく、トランスジェニックフローフィルトレーションを用いて試料からカゼインを除去する。
【００２５】
ある実施形態では、本発明の方法で用いられる試料は、カゼインが除去された脱脂乳であってもよい。この試料は、本明細書において、「清澄化乳試料(clarified milk sample)」とも称される。
【００２６】
好ましい実施形態では、上述したように、ｈＳＡ試料をアフィニティーカラムに装填し、  アフィニティーカラムから溶出し、および／または結晶化する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、ｈＳＡおよび非ヒト哺乳類の血清アルブミンを含む組成物であって、非ヒト哺乳類の血清アルブミンが、約５、４、３、２、または１ｐｐｍ未満の濃度で存在する組成物を含む。好ましい実施形態では、ｈＳＡに対する非ヒト哺乳類の血清アルブミンの割合は、１：１，０００、１：１０，０００、または１：１００，０００未満である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
図１は、血清アルブミンに結合することが分かっているReactive Blue 2染料を含む染料リガンドクロマトグラフィー樹脂を示す。Ｒ基は、例えば、−ＮＨ−Ｃ６Ｈ４−(メタ)−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ−Ｃ６Ｈ４−(オルト)ＳＯ３Ｈ、またはそれらの混合物のような、多数の異なる化合物で置換されていてよい。固体支持体はアガロースである。
【００２９】
脱脂乳
例えば遠心分離のような標準的脱脂工程によって、トランスジェニック哺乳類から得た乳試料から乳脂肪を除去する。本明細書において、「脱脂乳」は、スキムミルクを称する。脱脂試料を得るための他の公知の方法として、乳の上澄みをすくう方法および／または沈殿法が挙げられる（例えば、H. E. Swaisgood, Developments in Dairy Chemistry, I: Chemistry of Milk Protein, Applied Science Publishers, NY, 1982を参照）。
【００３０】
試料からのカゼインの除去
本発明の方法は、例えば脱脂乳試料のような乳試料中に存在するカゼインの濃度を減らす工程を含んでいてよい。好ましくは、その工程は、該工程前の試料中のカゼイン濃度と比較して、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上まで、試料中に存在するカゼイン濃度を減らすことができる。
【００３１】
試料中のカゼイン濃度は、当業界で公知の様々な方法を用いて減らすことができる。例えば、試料中のカゼイン濃度は、酸沈殿によって減らすことができる。好ましくは、酸は稀酸である。試料からカゼインを沈殿させるのに用いることができる酸の例として、酢酸、硫酸、およびリン酸が挙げられる。好ましくは、酸は酢酸である。試料に酸を添加することによって、試料のｐＨを約４．０−５．５、約４．１−５．２、約４．２−５．０、または約４．２−４．８まで下げる。次に、酸性化試料を遠心分離またはタンジェンシャルフローフィルトレーションにかけて、沈殿したカゼインを除去する。カゼインの酸沈殿は、例えば米国特許第４，６４４，０５６号にさらに詳細に記載されている。
【００３２】
様々な標準的卓上遠心機を用いて、約２５００から５００Ｇで遠心分離を行うことができる。さらには、例えば、Alfa LavalまたはWestphalia連続流れ方式ディスクスタック遠心機(continuous flow disk-stack centrifuge)を用いて遠心分離を行うことができる。後者の遠心機は、特に、プロセススケールの遠心分離に適応させることができる。
【００３３】
沈殿したカゼインの少なくとも一部を保持するが（「残留物 (retentate)」）、ｈＳＡ含有試料を膜に通過させる（「透過液」または「ろ液」）のに十分な孔径の膜を有するクロスフローフィルターに試料を通すことによって、酸性化試料をタンジェンシャルフローフィルトレーションにかけることができる。タンジェンシャルフローフィルトレーションにおいて、ろ過すべき試料は、膜フィルターに平行に流れ、ろ液はその膜を通過する。好ましくは、膜は約０．０８から１．２μｍの平均孔径を有する中空糸カートリッジである。約０．１から１．２μｍの平均孔径を有する膜は市販されている。例えば、Ceramen 0.2μｍセラミックモノリスを好ましい実施形態において用いることができる。他の実施形態では、中空糸カートリッジは、A/G Technologies 750Kカットオフ中空糸である。タンジェンシャルフローフィルトレーション法は、例えば米国特許第４，６４４，０５６号に記載されている。
【００３４】
他の実施形態において、試料を酸性化しないで、試料中のカゼイン濃度を下げることができる。例えば、米国特許第６，２６８，４８７号に示されているように、タンジェンシャルフローマイクロフィルトレーション法によって試料を通過させる。
【００３５】
タンジェンシャルフローフィルトレーションの前に試料を酸性化するか否かにかかわらず、カゼインの少なくとも一部が膜によって保持される必要があり、かつｈＳＡのかなりの部分がろ液中に存在するであろう。好ましくは、試料中の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上のｈＳＡが、タンジェンシャルフローフィルトレーションの後に、ろ液中に存在するであろう。次に、そのろ液を別の工程にかけてｈＳＡを精製する。
【００３６】
アフィニティークロマトグラフィー
様々なやり方でアフィニティークロマトグラフィーを実施することができ、合成化学樹脂（例えば染料リガンド樹脂）またはタンパク質結合樹脂（例えば抗体結合樹脂）の使用を含んでいてよい。例えば、G. Hermanson et al, Immobilized Affinity Ligand Techniques, New York: Academic Press 1992を参照。例えばｈＳＡのような関心タンパク質の精製にどのタイプの樹脂を用いるかを決める際に考慮すべき重要なパラメーターとして、カラムを作成する費用、カラムの拡張性、およびカラムの時間的質（すなわち、繰り返して使用した後、カラムから得られる精製結果の質）が挙げられる。タンパク質結合樹脂（例えば抗体結合樹脂またはペプチド結合ドメイン結合樹脂）は、標的分子に対して高度に特異的であってよく、しばしば、約１０−７から１０−１０Ｍの結合定数を有するが、その樹脂の費用、拡張性、および寿命によって制限される。さらには、一旦関心タンパク質がタンパク質結合樹脂に結合すると、その工程において樹脂を傷つけることなく関心タンパク質を回収することはしばしば困難である。合成化学樹脂は、安価で、より拡大しやすく、かつタンパク質結合樹脂よりも寿命が長い傾向を有するが、一方で特異性が低い傾向があり、約１０−５から１０−９Ｍの結合定数を有する。
【００３７】
本発明の方法での使用に関して、アフィニティーカラムは、合成化学樹脂またはタンパク質結合樹脂のいずれかを含んでいてよい。合成化学樹脂のリガンドは、ｈＳＡに対して、１０−５Ｍ以下、より好ましくは１０−６Ｍ以下、さらに好ましくは１０−７Ｍ以下の親和性を有する。本発明の方法での使用に適したカラムは、Cibacron Blue 3GAカラムであり、そのカラムは多くの供給メーカーから購入でき、図１に示す構造（ここでＲ基は、−ＮＨ−Ｃ６Ｈ４−(メタ)−ＳＯ３Ｈと−ＮＨ−Ｃ６Ｈ４−(オルト)ＳＯ３Ｈとの混合物である）。本発明の方法で使用するための別の適切なカラムは、Prometic Biosciences Blue SAカラムであり、そのカラムは、図１に示す樹脂構造を有する染料リガンドカラムの系列である。１つの態様において、染料リガンドカラムは、Cibacron Blue 3GAカラムの改良型であり、例えば、Ｒ基が混合物ではなく、全て−ＮＨ−Ｃ６Ｈ４−(メタ)−ＳＯ３Ｈまたは−ＮＨ−Ｃ６Ｈ４−(オルト)ＳＯ３Ｈであるようなカラムである。好ましくは、合成化学樹脂は、他の血清アルブミン（例えば、ＢＳＡのような、非ヒト哺乳類血清アルブミン）に対する親和性よりも、少なくとも２、５、１０、２０、５０、または１００倍高い、ｈＳＡに対する親和性を有する。
【００３８】
ｈＳＡを含む試料をカラムに装填するのに適切な装填バッファーは、特定のカラムに依存する。さらには、当業者は、ｈＳＡ試料を任意の特定カラムに装填するのに適した多くの様々なバッファーを認識するであろう。Prometic Biosciences Blue SAカラムに好ましい装填バッファーは、例えば５０−２５０ｍＭの塩（例えばＮａＣｌまたはＫＣｌ）（ｐＨ８−９）、および低濃度の非イオン性界面活性剤（例えば０．０１％−０．１％のPolysorbate 20（すなわちTween 20））を含む。好ましくは、清澄化ｈＳＡ試料のバッファーを適切なカラム装填バッファーに置換するため、カラムに装填する前に、清澄化ｈＳＡ試料を透析する。また、試料中のｈＳＡタンパク質の濃度を高めるように、清澄化ｈＳＡ試料をろ過してもよい。
【００３９】
カラムに適切な洗浄バッファーは、適切な装填バッファーと実質的に同じ（例えば全く同じ）である。洗浄バッファー中の界面活性剤（例えばPolysorbate 20）は、ｈＳＡとカラムとの間の相互作用を破壊することなく、非ヒト血清アルブミン（例えばＢＳＡ）をカラム（例えば、Prometic Biosciences Blue SAカラム）から除くのを助ける。
【００４０】
同様に、カラムに結合したｈＳＡをカラムから溶出するための溶出バッファーは、カラムの正確な性質に依存するであろう。当業者であれば分かるように、特定のカラムから、それに結合したｈＳＡを溶出するのに適した多くの様々なバッファーがある。Prometic Biosciences Blue SAカラムの場合、適切な溶出バッファーは、例えば３０−５０ｍＭのリン酸塩（例えばリン酸カリウムとリン酸ナトリウムとの混合物）（ｐＨ５−７、または好ましくはｐＨ５．５−６．５）、および１０−３０ｍＭのカプリル酸塩を含む。カプリル酸塩の代わりに、他の脂肪酸分子を用いてもよく、例えば、ステアリン酸塩、ラウリル酸塩、ミリスチン酸塩、およびオレイン酸塩のような、短鎖、中鎖、または長鎖の脂肪酸が挙げられる。好ましくは、用いられる特定の溶出バッファーは、２、５、１０、２０、５０、１００倍、またはそれ以上、カラムに結合した他の非血清アルブミン（例えば、血液タンパク質、乳タンパク質、または組織培養タンパク質）よりも、ｈＳＡをより溶出しやすい。
【００４１】
上述したように、タンパク質結合アフィニティーカラムも本発明の方法で用いてよい。他の非ヒト血清アルブミン（例えば、ＢＳＡのような、非ヒト血清アルブミン）を含む試料からｈＳＡを精製するのに有用である例示的なタンパク質結合アフィニティーカラムは、架橋アガロース樹脂に固定化した組換えアルブミン結合ドメイン（ＡＢＤ）タンパク質を含む。組換えアルブミン結合ドメインタンパク質は、Johansson et al, J. Mol. Biol. 1997, 266: 859-865に記載されている。好ましくは、ＡＢＤカラムは、他の血清アルブミン（例えば、ＢＳＡのような非ヒト哺乳類血清アルブミン）に対する親和性よりも、少なくとも１０、２０、５０、１００、５００、または１０００倍高い、ｈＳＡに対する親和性を有する。
【００４２】
ＡＢＤ結合カラムで用いるのに適した平衡バッファーおよび洗浄バッファーは、例えば、１０−５０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ４．５−６．５、好ましくは約５．０−６．０）、および５０−２５０ｍＭの塩、好ましくは約１００−１５０ｍＭの塩を含む。用いることができる塩として、例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌが挙げられる。装填前に、清澄化ｈＳＡ試料を、ｐＨ４．５−６．５、好ましくはｐＨ５．０−６．０に調整する。このｐＨ調整は、酸（例えば稀硫酸または稀リン酸）、またはｈＳＡ試料のｐＨによっては塩基（例えば低濃度のＮａＯＨ）を添加することによって、あるいは平衡バッファーまたは洗浄バッファーにバッファー交換（例えば透析）することによって、行うことができる。また、カラムに装填する前に、清澄化ｈＳＡ試料をろ過して、ｈＳＡタンパク質の濃度を高めてもよい。例えば、ｐＨ２．３−２．８、好ましくは約ｐＨ２．５のような、低ｐＨのバッファーを用いて、ＡＢＤ結合カラムからｈＳＡを溶出させることができる。用いることができるバッファーは、例えば、２５−１００ｍＭのグリシンまたは０．２−１．０Ｍの酢酸を含む。好ましくは、用いられる溶出バッファーは、２、５、１０、２０、５０、１００倍、またはそれ以上、カラムに結合した他の非血清アルブミン（例えば、血液タンパク質、乳タンパク質、または組織培養タンパク質）よりも、ｈＳＡをより溶出しやすい。
【００４３】
好ましくは、アフィニティーカラムに装填した試料中に存在するｈＳＡの少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、またはそれ以上が、溶出液中に回収される。同様に、アフィニティーカラムに装填したｈＳＡ試料中に存在する非ｈＳＡタンパク質不純物の濃度は、溶出液中において、１／５、１／１０、１／１００、１／１０００、またはそれ以下に低下することが好ましい。そのような不純物として、非ｈＳＡ血液タンパク質（例えば凝固タンパク質、アポリポタンパク質、成長因子）、乳タンパク質（例えば、ＢＳＡのような非ヒト哺乳類血清アルブミン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトグロブリン、および例えばＩｇＧのような抗体）、卵タンパク質（例えばリゾチーム）、または、ならし細胞培養液中に通常含まれるタンパク質（例えばＢＳＡまたは成長因子）が挙げられる。
【００４４】
アフィニティークロマトグラフィー工程を、本発明の方法の一部として、必要に応じて繰り返して行ってもよい。そのような場合、単に、１回目のカラム操作からの溶出液を透析して、適切なカラム装填バッファーに溶出バッファーを交換する必要がある。透析の前に、必要に応じて溶出液をろ過して、試料中に存在する脂肪酸の量を減らし、さらにｈＳＡを濃縮してもよい。アフィニティークロマトグラフィー工程を繰り返し行う場合には、１またはそれ以上のアフィニティーカラムを本発明の方法において用いてもよい。例えば、タンパク質結合カラム（例えばＡＢＤカラム）と組合せて、合成化学樹脂カラム（例えば、Cibacron Blue C3AカラムまたはPrometic Biosciences Blue SAカラム）を用いてもよい。カラムを用いる順番は重要ではないが、タンパク質結合カラムの寿命を延ばすように、合成化学樹脂カラムを最初に用いるのが好ましい。
【００４５】
ある実施形態では、本発明の方法は、例えば擬似移動床システム(simulated moving bed system)において、アフィニティークロマトグラフィーを連続的に実施することを含む。
【００４６】
結晶化
本明細書において、「結晶化ｈＳＡ」は、その非晶体(amorphous solid state)と区別できるｈＳＡの固体を称する。結晶は、格子構造および特性形状のような特徴、ならびに屈折率のような光学的特性を示す。光学顕微鏡、電子顕微鏡、Ｘ線粉末回折、固体核磁気共鳴（ＮＭＲ）、または偏光顕微鏡のような、任意の手段によって、結晶としてのｈＳＡの特定を行うことができる。顕微鏡を用いて、結晶の長さ、直径、幅、サイズおよび形状、ならびに結晶が単一粒子として存在するのか多結晶であるのかを特定することができる。
【００４７】
ｈＳＡを含む溶液（例えば、ｈＳＡのアフィニティー精製試料）に、塩、ＰＥＧおよび／または有機溶媒を添加することによって、ｈＳＡの結晶を形成することができる。ｈＳＡを結晶化するのに用いることができる無機塩として、硫安、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウム（例えばリン酸水素２ナトリウムおよび／またはリン酸２水素ナトリウム）、リン酸カリウム（例えば、リン酸２水素カリウムおよび／またはメタリン酸カリウム）、あるいはそれらの混合物が挙げられる。好ましくは、ｈＳＡの結晶化に用いられる無機塩は、リン酸ナトリウムおよび／またはリン酸カリウムである。結晶化を助けるために、無機塩と共に、脂肪酸分子（例えばカプリル酸塩、あるいは別の中鎖または長鎖脂肪酸分子）をｈＳＡ試料に添加してよい。例えば、４Ｍのリン酸塩（ｐＨ６．２）（４ＭのＮａＨ２ＰＯ４と４ＭのＫ２ＨＰＯ４の７０：３０ｖ／ｖ混合物）、ならびに１−３ｍＭのカプリル酸塩を含む溶液を、５−１５℃の温度で、ｈＳＡ試料に少しずつ添加してもよい。
【００４８】
好ましくは、結晶化される試料中に存在するｈＳＡの少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはそれ以上が、例えば再溶解した試料中に回収される。さらには、結晶化されるｈＳＡ試料中に存在する非ｈＳＡタンパク質不純物の濃度は、再溶解試料中において、１／１、１／２、１／３、１／４、１／５、１／１０、１／２０、またはそれ以下に低下することが好ましい。そのような不純物として、非ｈＳＡ血液タンパク質（例えば凝固タンパク質、アポリポタンパク質、成長因子）、乳タンパク質（例えば、ＢＳＡのような非ヒト哺乳類血清アルブミン、β−ラクトグロブリン、α−ラクトグロブリン、および例えばＩｇＧのような抗体）、卵タンパク質（例えばリゾチーム）、または、ならし細胞培養液中に通常含まれるタンパク質（例えばＢＳＡまたは成長因子）が挙げられる。
【００４９】
例えば、漏斗（例えばブフナー漏斗または同等の装置）を用いて、母液からｈＳＡの結晶を分離し、さらに２．８Ｍのリン酸バッファー（ｐＨ６．２）で洗浄する。単離ｈＳＡ結晶を乾燥および保存してもよい。あるいは、例えば水または非経口投与に適合する低濃度の塩溶液（例えばＮａＣｌ）のような適切な溶媒中に再溶解させてもよい。
【００５０】
保存
精製の様々な時点で、精製ｈＳＡをろ過し（例えば滅菌ろ過）、無菌容器で保存してもよい。例えば、清澄化（すなわち、脂質の除去、および乳の脱脂およびカゼインの除去のような他の工程）、アフィニティーカラム精製、結晶化、または活性炭でのｈＳＡの処理の後、長期間（例えば数日まらは数ヶ月）保存してよく、また輸送してもよい。
【００５１】
非経口製剤
上記のように調製したｈＳＡ試料を薬剤組成物中に含めることができる。そのような組成物は、通常、ｈＳＡおよび薬剤的に許容される担体を含む。本明細書において用いられている「薬剤的に許容される担体」の用語は、薬剤投与に適した、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等を含む。補助的な活性化合物を組成物に含めてもよい。
【００５２】
意図した投与経路に適合するように、薬剤組成物を製剤化する。ｈＳＡの好ましい投与経路は、非経口投与である。非経口投与に用いられる溶液または懸濁液は、以下の成分を含んでいてよい：例えば注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒のような、滅菌稀釈剤；例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤；例えばアスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤；例えばエチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤；例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩のような緩衝剤；ならびに例えば塩化ナトリウムまたはデキストロースのような弾力性を調整するための薬剤。ｐＨは、例えば塩酸または水酸化ナトリウムのような、酸または塩基を用いて調整することができる。非経口用調製物は、ガラスまたはプラスチック製の、アンプル、使い捨てシリンジ、または多数回投与バイアルに入れることができる。
【００５３】
投与を簡単にし、かつ用量を均一にするため、用量単位形態で非経口組成物を製剤化すると便利である。本明細書で用いられている用量単位形態は、処置される対象に対する単位用量に相当する、物質的に別個の単位を称する；各単位は、要求される薬剤担体と関連して所望の治療効果をもたらすように計算されたｈＳＡの所定量を含む。
【実施例】
【００５４】
実施例１：トランスジェニックウシの乳からのｈＳＡの精製
酢酸（１０−１５％）を用いて、産物の流れ（product stream）をｐＨ４．２−４．８に酸性化することによって、組換えｈＳＡ産物を含む脱脂（スキム）トランスジェニック乳を沈殿させる。Ceramen 0.2μｍセラミックモノリスまたはA/G Technologies 750 K MWカットオフ中空糸を含むカートリッジを備えた標準的ＴＦＦシステムを用いて、タンジェンシャルフローマイクロフィルトレーションによって、沈殿したカゼインを除去した。
【００５５】
Prometic Biosciences Blue SAカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによって、産物を精製した。装填／洗浄バッファー条件は、ｐＨ８−９で、５０−２５０ｍＭのイオン強度のＮａＣｌ、および低濃度のPolysorbate 20(Tween 20)を含む。１０−３０ｍＭのカプリル酸を含む２０−５０ｍＭのリン酸バッファー（ｐＨ５．５−６．５）を用いて、産物を溶出した。
【００５６】
４Ｍのリン酸塩（ｐＨ６．２）（４ＭのＮａＨ２ＰＯ４と４ＭのＫ２ＨＰＯ４の７０：３０ｖ／ｖ混合物）、ならびに１−３ｍＭのカプリル酸塩を、５−１５℃の温度で、最終リン酸濃度が２．７−２．８Ｍに成るように調節しながら添加することによって、バッチタンク中において産物を結晶化した。ブヒナー漏斗を用いたろ過によって母液から結晶を分離し、２．８Ｍのリン酸バッファーで洗浄し、上述したように調製し、さらに水に再溶解させた。結果を以下の表１に示す。
【表１】
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【００５７】
実施例２：２つの異なるアフィニティーカラムを用いたｈＳＡの精製
組換えｈＳＡ産物を含む脱脂（スキム）トランスジェニック乳から開始して、実施例１で説明したように、カゼインを酸沈殿させて、試料を清澄化した。続いて、染料−リガンドアフィニティークロマトグラフィーを上記のように実施した。
【００５８】
最後に、染料−リガンドアフィニティー精製溶出液において、ＡＢＤタンパク質−リガンドクロマトグラフィーを実施した。ＡＢＤカラムで用いた平衡バッファーおよび洗浄バッファーは、１０−５０ｍＭの酢酸塩（ｐＨ５．０−６．０）、および１００−１５０ｍＭのＮａＣｌを含んでいた。ＡＢＤカラムに装填する前に、稀酸の添加によって、ｈＳＡ試料のｐＨをｐＨ５．０−６．０に調整した。２５−１００ｍＭのグリシンバッファー（ｐＨ２．５）を用いてｈＳＡを溶出した。精製の結果を表２に示す。
【表２】
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【００５９】
本明細書において挙げられた全ての刊行物および特許の内容が参照によって本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、血清アルブミンに結合することが分かっているReactive Blue 2染料を含む染料リガンドクロマトグラフィー樹脂を示す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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