(57)【要約】本発明は、プロテアーゼ部分と変異体部分とを含む融合タンパク質であって、変異体部分が親アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有し、改変アミノ酸配列はＳＳＩに相当する位置６３でアミノ酸置換を有する融合タンパク質に関する。また、親アミノ酸配列はＳＳＩ、ＳＳＩ様インヒビター、ＳＳＩの変異体及びＳＳＩ様インヒビターの変異体からなる群より選択される。このような融合タンパク質は、クリーニング組成物及びパーソナルケア組成物中で有用である。本発明はまた、本融合タンパク質と、当該融合タンパク質をコードするＤＮＡを含むクリーニング組成物及びパーソナルケア組成物にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下により特徴付けられる融合タンパク質：
（ａ）プロテアーゼ部分；及び、
（ｂ）変異体部分であって、変異体部分が親アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有し、改変アミノ酸配列がＳＳＩに対応する位置６３でのアミノ酸置換を特徴とし、親アミノ酸配列がＳＳＩ、ＳＳＩ様インヒビター、ＳＳＩの変異体及びＳＳＩ様インヒビターの変異体からなる群から選択される当該変異体部分。
【請求項２】
連結部分により更に特徴付けられ、前記プロテアーゼ部分と前記変異体部分が当該連結部分を介して共有結合している請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ＳＳＩに対応する位置６３での前記アミノ酸置換は、イソロイシンによるものである、請求項１又は請求項２記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記親アミノ酸配列は、ＳＳＩ及びＳＳＩの変異体からなる群から選択される、前記請求項のいずれか１記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記変異体部分は、変異体部分が：
（ａ）融合タンパク質を包含する組成物中のプロテアーゼ部分を阻害し、そして
（ｂ）稀釈時にプロテアーゼ部分から解離する
ようなＫｉを示す、前記請求項のいずれか１記載の融合タンパク質。
【請求項６】
以下からなる群より選択された前掲の請求項のいずれか１項記載の変異体：
（ａ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｂ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｄ；
（ｃ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｄ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｄ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｅ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７０Ｑ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｆ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７０Ｑ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｆ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｇ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７０Ｑ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｗ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｈ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７０Ｑ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ａ；
（ｉ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｆ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｊ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｗ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｋ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ａ；
（ｌ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７０Ｑ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｆ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｍ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７０Ｑ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｗ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｎ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｆ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ａ；
（ｏ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｗ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ａ；
（ｐ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｑ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｄ；
（ｒ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｄ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｓ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｔ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７０Ｑ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｕ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ａ；
（ｖ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｙ７５Ａ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｗ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ｖ；
（ｘ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７０Ｑ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｙ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ａ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｚ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｆ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ａａ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７０Ｑ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ａ；
（ｂｂ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７０Ｑ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｃｃ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ａ；
（ｄｄ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｅｅ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７３Ｄ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｆｆ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７０Ｑ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｆ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｇｇ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７０Ｑ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｗ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｈｈ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７０Ｑ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ａ；
（ｉｉ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｆ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｊｊ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｗ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｋｋ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ａ；
（ｌｌ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７０Ｑ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｆ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｍｍ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７０Ｑ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｗ ＋ Ｄ８３Ｃ；
（ｎｎ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｆ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ａ；
（ｏｏ） Ａ６２＊ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｖ７４Ｗ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ａ；
（ｐｐ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ａ６２Ｋ ＋ Ｓ９８Ｑ；
（ｑｑ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ａ６２Ｋ ＋ Ｓ９８Ｄ；
（ｒｒ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ａ６２Ｋ ＋ Ｓ９８Ｅ；
（ｓｓ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ａ６２Ｒ ＋ Ｓ９８Ｑ；
（ｔｔ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ａ６２Ｒ ＋ Ｓ９８Ｄ；
（ｕｕ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ａ６２Ｒ ＋ Ｓ９８Ｅ；
（ｖｖ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｓ９８Ａ；
（ｗｗ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ｄ；
（ｘｘ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ｅ；
（ｙｙ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｓ９８Ｄ；
（ｚｚ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｓ９８Ｅ；
（ａａａ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｓ９８Ａ；
（ｂｂｂ） Ａ６２Ｋ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ｄ；
（ｃｃｃ） Ａ６２Ｒ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ｄ；
（ｄｄｄ） Ａ６２Ｋ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ｅ；
（ｅｅｅ） Ａ６２Ｒ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ｅ；
（ｆｆｆ） Ａ６２Ｋ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｓ９８Ａ；
（ｇｇｇ） Ａ６２Ｒ ＋ Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｓ９８Ａ；
（ｈｈｈ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ｄ；
（ｉｉｉ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｇ４７Ｄ ＋ Ｍ７３Ｐ ＋ Ｄ８３Ｃ ＋ Ｓ９８Ｅ； 及び、
（ｊｊｊ） Ｌ６３Ｉ ＋ Ｍ７３Ｐ。
【請求項７】
前掲の請求項のいずれか１項の融合タンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項８】
前記請求項のいずれか１記載の融合タンパク質と、クリーニング組成物担体及びパーソナルケア担体からなる群から選択される担体とを包含する組成物。
【請求項９】
プロテアーゼインヒビターを更に含む請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項７のＤＮＡを含む発現系。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願の引用］
本出願は、米国仮特許出願第６０／０９１，９０４号（１９９８年７月７日提出）の利益を主張する。
【０００２】
［技術分野］
本発明は、（１）プロテアーゼと（２）ストレプトマイセス属サブチリシンインヒビター（ＳＳＩ）の変異体及びＳＳＩとの相同性を有するそのインヒビター（ＳＳＩ様インヒビター）との融合タンパク質に関する。このような融合タンパク質は、クリーニング組成物及びパーソナルケア組成物中で有用である。本発明はまた、本発明の融合タンパク質を含むクリーニング組成物及びパーソナルケア組成物、ならびに融合タンパク質をコードする遺伝子にも関する。
【０００３】
［発明の背景］
酵素は、最大種類の天然タンパク質を構成する。酵素の一種類として、他のタンパク質の加水分解を触媒するプロテアーゼが挙げられる。タンパク質を加水分解するこの能力は、天然及びタンパク質工学処理プロテアーゼをクリーニング組成物、特に洗濯用途に関連した組成物中に混入することにより、開発されてきた。さらに、あまり研究されてはいないが、他のものはパーソナルケア組成物中にこのようなプロテアーゼを混入している。しかしながら、組成物の貯蔵中、又はプロテアーゼの発現中でさえ、プロテアーゼは、しばしばそれ自体で分解してしまうか、又は組成物中に存在する他の酵素を分解してしまう場合がある。この分解のために、クリーニング及びパーソナルケア組成物は、意図された増強性能を達成する能力を制限される。
【０００４】
したがって、プロテアーゼ自己分解及び他のものの分解を制限するために、組成物中にプロテアーゼ活性のインヒビターを混入することは有益である。クリーニング中の組成物の稀釈時に、又はクリーニング環境中で、プロテアーゼがもはや阻害されず、しかしむしろタンパク様汚れを加水分解するために利用可能であるようにするために、プロテアーゼの可逆的インヒビターを提供することは有利である。さらに、このようなインヒビターは、それらの阻害機能を適切に実行するのに十分に安定でなければならない。
【０００５】
当業者は、クリーニング組成物中の酵素を安定化するために、タンパク様プロテアーゼインヒビターを用いて、実験してきた。自然は、プロテアーゼをｉｎ ｖｉｖｏで調節するために、タンパク様プロテアーゼインヒビターを提供する。しかしながら、これらの天然タンパク様プロテアーゼインヒビターは不安定な傾向があるため、プロテアーゼならびにクリーニング及びパーソナルケア担体の存在下でのそれらの商業的使用は多少制限される場合がある。
【０００６】
タンパク様プロテアーゼインヒビターは、典型的には、プロテアーゼの活性部位に結合し、その活性を阻害する長いペプチドである。これらのインヒビターは、典型的には、一次アミノ酸配列相同性を基礎にして、いくつかの族（Ｉ〜ＩＸ族）に分類されている（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ 等、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ」， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ４９， ｐｐ． ５９３−６２６（１９８０）参照）。これらのインヒビターに含まれるのは、一般にＶＩ族インヒビター（例えばエグリン（ｅｇｌｉｎ）及びオオムギキモトリプシンインヒビターを含む）、ならびにＩＩＩ族インヒビター（例えばストレプトマイセス属サブチリシンインヒビター（ＳＳＩ）及びプラスミノストレプチン）と呼ばれるものである。
【０００７】
このようなインヒビターは、ある種のプロテアーゼに、他のものにより良好に結合する傾向がある。したがって、特定のプロテアーゼを念頭に置いてインヒビターを考えると便利である。この理由のために、当業界はしばしば、「プロテアーゼ／ペプチドインヒビター組」を考察する。既知のプロテアーゼ／ペプチドインヒビター組の一例は、サブチリシンＢＰＮ’／ＳＳＩである（例えば、Ｍｉｔｓｕｉ 等、「Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ａｔ ２．６ Å Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １３１， ｐｐ． ６９７−７２４（１９７９）及びＨｉｒｏｎｏ 等、「Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｔ １．６ Å Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＢＰＮ’ ｗｉｔｈ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １７８， ｐｐ． ３８９−４１３（１９８４）参照）。
【０００８】
ＳＳＩは、インヒビターが全プロテアーゼ活性を阻害するのに十分な量で存在する限りは、サブチリシンＢＰＮ’の存在下で安定である。しかしながら、プロテアーゼに対して高親和性を有するインヒビターは、洗濯環境中での稀釈時に解離しない、ということが示唆されている（ＷＯ９２／０３５２９、 Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ等、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓに譲渡。１９９２年３月５日公開、参照）。
【０００９】
しかしながら、インヒビターの結合定数（Ｋｉ）が、酵素／インヒビター組を含有するクリーニング組成物中で何らかのプロテアーゼ活性を提供する場合には、組成物中のインヒビターならびに酵素は加水分解され得る。したがって、プロテアーゼ、ならびにクリーニング及びパーソナルケア組成物の存在下で、適切に安定であるＳＳＩ又はその他のインヒビターの変異体を見出すことが有利である。さらに、これらのインヒビターは、好ましくは、阻害される特定のプロテアーゼに対して、好ましいＫｉを有する。このようなＫｉは、最終組成物中及びその貯蔵中のプロテアーゼの阻害を可能にする必要がある。しかしながら、クリーニング又はパーソナルケア組成物の稀釈時、あるいはクリーニング工程中、プロテアーゼ及びインヒビターは解離し、非阻害プロテアーゼの活性を可能にする必要がある。
【００１０】
しかしながら、このようなプロテアーゼインヒビターの安定性は疑問であった。ＷＯ９８／１３３８７（Ｃｏｒｒｅａ等、Ｔｈｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏ．に譲渡。１９９８年４月２日公開）（米国特許出願第６０／０２６，９４４号に対応する）は、安定性増大を提供するものとして開示される変異体を開示する。
【００１１】
更に、プロテアーゼは、クリーニング及びパーソナルケア組成物において有用なものを含み、その作製は、それ自身の独特な問題を抱えている。例えば、プロテアーゼ生成は、発酵又は精製工程の間での自己分解によって制限され得る。残念なことに、発酵ブロス又は精製混合物へのプロテアーゼインヒビターの付加は、過剰なインヒビターの購入及び付加を必要とする。この段階でのインヒビターの付加はまた、プロテアーゼの加水分解がインヒビターの実行可能な付加の前に生じるかもしれないので、時期はずれかもしれない。更にインヒビターの付加はプロテアーゼの収量を実際に減らすかもしれない。
【００１２】
発酵段階での付加の例として、Ｎａｇａｓｅ ＆ Ｃｏ．へ譲渡、１９７１年１２月３０日公開のドイツ国特許明細書２，１３１，４５１号は、アルカリプロテアーゼの生成プロセスを開示している。このプロセスは、インヒビターとして水溶性ボレートの付加を必要とすると言われている。これらのボレートは濾過活性を増強し、したがってプロテアーゼ収量を増強すると言われている。しかしながら、所定のレベルにおいてボレートは酵素の生成を実際に遅らせることができると理解されている。
【００１３】
１９９３年７月８日公開のＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ へ譲渡されたＪｏｅｒｇｅｎｓｅｎら、ＷＯ ９３／１３１２５は、生成段階の間での不活性化に対してタンパク質を「連続的に及び可逆的に保護」し、タンパク質を脱保護し、タンパク質生成物を回収することによる流体生成媒体中における「不活性化感受性タンパク質」の生成プロセスを開示している。このようなプロセスは、タンパク質を可逆的に不活性化することによってタンパク質の収量増加を得ることに有用であると開示されている。しかしながら、このようなプロセスは、高価で、非効率的であり、更なる付加的な処理を要求し、制御の難しいプロセスになるかもしれない外因性物質の付加を要求するかもしれない。
【００１４】
Ｔｈｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏ．へ譲渡された１９９８年４月２日公開のＳａｕｎｄｅｒｓらのＷＯ ９８／１３４８３号は、融合タンパク質を提供することによってｉｎ ｖｉｖｏでプロテアーゼを阻害する必要性を申し入れている。１９９７年５月１日に公開のＡｒｒｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．へ譲渡されたＨａｒｔｍａｎらのＷＯ ９７／１５６７０号は、融合タンパク質の使用に言及している。このような融合タンパク質は、インヒビター／プロテアーゼ組を有意なコスト削減と収量の増加でもたらすことによって有用であるかもしれない。プロテアーゼと同時にインヒビターの化学量論的な量を与えることによって、プロテアーゼ生成期における早い時期の自己分解が減らされ、又は排除されるかもしれない。しかしながら、プロテアーゼインヒビター自身は、この目的を達成するために十分に安定であるべきである。
【００１５】
ＳＳＩインヒビター、ＳＳＩ様インヒビター及びそれらの変異体が、ＳＳＩに対応する位置６３と６４との間で容易に加水分解されるということが意外にも発見された。したがって、本発明者等は、インヒビターが、アミノ酸残基の置換により、とりわけ位置６３で改変されるＳＳＩインヒビター及びＳＳＩ様インヒビターの変異体であるインヒビター／プロテアーゼ融合タンパク質を提供する。このような置換は、プロテアーゼインヒビターに増大した安定性を付与する。本発明者はここで、このようなインヒビターを融合タンパク質に組み込み、それによりｉｎ ｖｉｖｏでのプロテアーゼ分解の前述の問題を解決した。したがって、本発明は、親インヒビターよりも、大きなタンパク質分解安定性と、プロテアーゼに対する低い親和性を有し、プロテアーゼの自己分解の減少を促進するインヒビターを含む融合タンパク質を提供する。
【００１６】
［発明の概要］
本発明は、以下を含む融合タンパク質を提供する：
（ａ）プロテアーゼ部分；
（ｂ）変異体部分であって、当該変異体部分が親アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有し、改変アミノ酸配列がＳＳＩに対応する位置６３にアミノ酸置換を包含し、そして親アミノ酸配列がＳＳＩ、ＳＳＩ様インヒビター、ＳＳＩの変異体及びＳＳＩ様インヒビターの変異体からなる群から選択される当該変異体部分；並びに、場合によって、
（ｃ）連結部分であって、当該連結部分が存在する場合には、プロテアーゼ部分及び変異体部分は連結部分を介して共有結合している当該連結部分。
プロテアーゼ部分には、好ましくは、ＳＳＩが阻害剤であるものが含まれる。このようなプロテアーゼとしては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、デンプン液化バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｓａｃｃｈａｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物により生成されるものが挙げられる。本発明はまた、このような融合タンパク質をコードする遺伝子、ならびにこのような融合タンパク質を包含するクリーニング及びパーソナルケア組成物にも関する。
【００１７】
［本発明の詳細な説明］
本発明の必須成分は、ここで以下に記述される。本発明の実施形態において有用な種々の任意及び好適成分の非限定記述もまた含まれる。
【００１８】
本発明は、ここで記述される必須又は任意成分及び／又は限定物のいずれもを含み、これらから成り、これらから本質的になることができる。
全てのパーセンテージ及び率は他に示されない限り重量換算である。全てのパーセンテージは他に示されない限り全組成物に基づいて換算される。
ここでは、プロテアーゼ及び任意成分を含むがこれらに限定されない物質について商品名が参照される。本発明者らは、ここで所定の商品名に物質を制限することを意図していない。商品名によって参照されるものと等価な物質（例えば、異なる名前又はカタログ（参照）番号で、異なる供給元から得られたもの）は、ここでの組成物において置換されてもよく、用いられてもよい。
【００１９】
全ての成分及び組成物レベルは、成分又は組成物の活性レベルを基準としており、また不純物、たとえば残余溶媒又は副生物は除かれるが、これらは市販供給源には存在し得る。
ここで参照される全ての文献には、全ての特許、特許出願及び印刷刊行物が含まれるが、これらはその全文を援用して本文の一部とする。
ここで用いられる場合、アミノ酸を記述するために略称が用いられる。表１は、ここで用いられる略称のリストである。
【００２０】
【表１】
2004500008.tif 000002
【００２１】
定義
本明細書で用いる場合、「融合タンパク質」という用語は、業界で認識されている意味を有し、即ち、２つのタンパク質が、通常１つの制御エレメントの制御下で１つのアミノ酸鎖として発現されている。例えば、融合タンパク質はここ数年にわたり多くの用途に用いられてきている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ （１９８９）を参照のこと）。近年、融合技術を用いて対象となるタンパク質を生成するために発現ベクターが市販されている。ＳＳＩ変異体及びプロテアーゼを含む融合タンパク質の議論はまた、Ｓａｎｄｅｒｓら、米国特許出願第６０／０２６，９４７号にも見出されるかもしれない。これは、Ｔｈｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏ．，へ譲渡された１９９８年４月２日公開のＳａｎｄｅｒｓらのＷＯ９８／１３４８３号に対応している。
【００２２】
本明細書中で用いる場合、「突然変異」という用語は、遺伝子配列及びそれらの遺伝子配列により生成されるアミノ酸配列における変化を指す。突然変異は、野生型又は親配列に対するアミノ酸残基の欠失、置換又は付加であり得る。
【００２３】
「親」という用語は、本明細書中で用いる場合、ＳＳＩに対応する位置６３でのアミノ酸置換を有さないプロテアーゼ、プロテアーゼインヒビター、タンパク質又はペプチド、野生型又は変異体を指す（即ち、位置６３でのアミノ酸置換は天然に生じる）。これらの親の一例は、ストレプトマイセス属サブチリシンインヒビター（ＳＳＩ）として既知のインヒビターである（配列番号１で表される）。ＳＳＩはさらに、Ｉｋｅｎａｋａ等（「Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｌｂｏｇｒｉｓｅｏｕｌｕｓ Ｓ−３２５３」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ７６， ｐｐ． １１９１−１２０９（１９７４））により記載されている。本明細書中で用いる場合、ＳＳＩのアミノ酸番号は、Ｉｋｅｎａｋａ等のものである。本発明者等は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＮＡと同様に、アデニン及びチミンが多くなるよう設計された合成ＳＳＩ遺伝子も用いる。この合成遺伝子は、発現プラスミド構築法により、ペプチドのアミノ末端の４つの余分のアミノ酸残基をコードする。この改変アミノ酸配列は、これら４つの付加的アミノ酸を含めて、配列番号２で表される。
【００２４】
本明細書中で用いる場合、「野生型」という用語は、非突然変異化生物体により生成されるタンパク質又はペプチド、本明細書中では特に、プロテアーゼ又はプロテアーゼインヒビターを指す。
【００２５】
本明細書中で用いる場合、「変異体」という用語は、それぞれ親プロテアーゼインヒビター又はプロテアーゼのものとは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド、本明細書中では特に、プロテアーゼインヒビター又はプロテアーゼを意味する。
【００２６】
本発明の融合タンパク質
本発明者らは、（ａ）プロテアーゼ部分（また簡単に、プロテアーゼとここで呼ぶ）；（ｂ）変異体部分（また簡単に変異体とここで呼ぶ）；並びに、場合によって、（ｃ）連結部分であって、連結部分が存在する場合にはプロテアーゼ部分及び変異体部分は連結部分を介して共有結合している当該連結部分、を含む融合タンパク質を見出した。変異体は親アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有し、ここで改変アミノ酸配列はＳＳＩに対応する位置６３でのアミノ酸置換を含み、親アミノ酸配列はＳＳＩ、ＳＳＩ様インヒビター、ＳＳＩの変異体及びＳＳＩ様インヒビターの変異体からなる群から選択される。本融合タンパク質は、変異体の安定性のため、とりわけ有益である。
【００２７】
理論に制限されるつもりはないが、本融合タンパク質は、他よりも高率で発現している１のタンパク質の潜在的な落とし穴を最少にし、又は回避する。本融合タンパク質は、特に選択されたモル量のプロテアーゼ及びインヒビター（変異体）を同時的に合成可能にする。例えば、融合タンパク質は、プロテアーゼに対して等量のインヒビター（変異体）又は２倍のモル量のインヒビター（変異体）をもたらすように構築され得る。従って、可能な最も早い時期、即ちｉｎ ｖｉｖｏでの翻訳直後でプロテアーゼの自己分解を予防することが可能である。融合タンパク質は、融合タンパク質が少なくとも１つのプロテアーゼ部分と１つの変異体部分とを含む限り、同一又は異なる１つ以上のプロテアーゼ部分を含み得、同一及び異なる１つ以上の変異体部分を含み得る。最も好ましくは、融合タンパク質は、１つプロテアーゼ部分、１つの変異体部分を、場合によってであるが好ましくは連結部分と共に、有する。
【００２８】
他のプロテアーゼ及び／又はインヒビターは、融合タンパク質に加えて、融合タンパク質遺伝子と同一のプラスミドであっても、細胞中に同時に存在する異なるプラスミドであっても、プラスミドにあるが融合タンパク質遺伝子は染色体であっても、細胞の染色体の一部としてであっても、同一の細胞により作製される。更に、プロテアーゼを異なるプロテアーゼに特異的なインヒビターと共に生成してもよく、又はプロテアーゼを融合タンパク質中のプロテアーゼに特異的なインヒビターと共に生成してもよい。また更に、融合タンパク質は、１以上の付加的インヒビターと同時発現されてもよく、このインヒビターは融合タンパク質を構成する変異体部分と同一であってもよい。
【００２９】
プロテアーゼ部分
言及したように、本発明はプロテアーゼ部分（プロテアーゼ）を含む融合タンパク質に関する。したがって、融合タンパク質の必須成分は、本変異体部分（変異体）を阻害するプロテアーゼである。プロテアーゼは、動物、植物、又は好ましくは微生物起源のものであり得る。好適なプロテアーゼには、ＳＳＩが阻害剤であるものが含まれる。このようなプロテアーゼとしては、例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ、デンプン液化バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｓａｃｃｈａｒｉｃｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）微生物により産生されるものが挙げられる。このようなプロテアーゼの中で、好ましいものとしては、例えば、サブチリシンＢＰＮ、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンカールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン３０９、プロテイナーゼＫ及びサーミターゼ、例えばＡ／Ｓアルカラーゼ（商品名）（Ｎｏｖｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ， Ｄｅｎｍａｒｋ）、エスペラーゼ（商品名）（ＮｏｖｏＩｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、サビナーゼ（商品名）（Ｎｏｖｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、マキサターゼ（商品名）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ， Ｄｅｌｆｔ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、マキサカル（商品名）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）、マキサペム１５（商品名）（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）及び前記の変異体が挙げられる。本明細書中で用いるのに特に好ましいプロテアーゼとしては、デンプン液化バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）から得られるもの及びその変異体が挙げられる。最も好ましい野生型プロテアーゼは、サブチリシンＢＰＮ’である。
【００３０】
サブチリシンＢＰＮ’の変異体（以後、集合的に「Ａ群プロテアーゼ」と呼ぶ）は、本明細書中のプロテアーゼとして有用であり、米国特許第５，０３０，３７８号（Ｖｅｎｅｇａｓ、１９９１年７月９日）に開示され、以下の突然変異を有するサブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列（その配列は配列番号３で表される）を特徴とする：
（ａ）位置１６６のＧｌｙが、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｌａ又はＧｌｕで置換され；位置１６９のＧｌｙがＳｅｒで置換される；位置２２２のＭｅｔがＧｌｎ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ又はＴｈｒで置換され；あるいは、
（ｂ）位置１６０のＧｌｙがＡｌａで置換され、そして位置２２２のＭｅｔがＡｌａで置換される。
【００３１】
サブチリシンＢＰＮ’の別の変異体（以後、集合的に「Ｂ群プロテアーゼ」と呼ぶ）は、本明細書中のプロテアーゼとして有用であり、欧州特許第ＥＰ−Ｂ−２５１，４４６号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．に譲渡。１９８８年１月７日公開、１９９４年１２月２８日特許付与）に開示され、以下の位置の１つ又はそれ以上で突然変異を有する野生型ＢＰＮ’アミノ酸配列：Ｔｙｒ２１、Ｔｈｒ２２、Ｓｅｒ２４、Ａｓｐ３６、Ａｌａ４５、Ａｌａ４８、Ｓｅｒ４９、Ｍｅｔ５０、Ｈｉｓ６７、Ｓｅｒ８７、Ｌｙｓ９４、Ｖａｌ９５、Ｇｌｙ９７、Ｓｅｒ１０１、Ｇｌｙ１０２、Ｇｌｙ１０３、Ｉｌｅ１０７、Ｇｌｙ１１０、Ｍｅｔ１２４、Ｇｌｙ１２７、Ｇｌｙ１２８、Ｐｒｏ１２９、Ｌｅｕ１３５、Ｌｙｓ１７０、Ｔｙｒ１７１、Ｐｒｏ１７２、Ａｓｐ１９７、Ｍｅｔ１９９、Ｓｅｒ２０４、Ｌｙｓ２１３、Ｔｙｒ２１４、Ｇｌｙ２１５及びＳｅｒ２２１；あるいは上記列挙の位置の２又はそれ以上とＡｓｐ３２、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ１０４、Ａｌａ１５２、Ａｓｎ１５５、Ｇｌｕ１５６、Ｇｌｙ１６６、Ｇｌｙ１６９、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１７及びＭｅｔ２２２との組合せを特徴とする。
【００３２】
本明細書中のプロテアーゼとして有用な別の好ましいサブチリシンＢＰＮ’変異体は、以後、集合的に「Ｃ群プロテアーゼ」と呼び、ＷＯ９５／１０６１５（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．に譲渡。１９９５年４月２０日公開）に記載され、位置Ａｓｎ７６に対する突然変異を、以下からなる群から選択される１つ又はそれ以上の他の位置の突然変異との組合せを有する野生型サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列を特徴とする：Ａｓｐ９９、Ｓｅｒ１０１、Ｇｌｎ１０３、Ｔｙｒ１０４、Ｓｅｒ１０５、Ｉｌｅ１０７、Ａｓｎ１０９、Ａｓｎ１２３、Ｌｅｕ１２６、Ｇｌｙ１２７、Ｇｌｙ１２８、Ｌｅｕ１３５、Ｇｌｕ１５６、Ｇｌｙ１６６、Ｇｌｕ１９５、Ａｓｐ１９７、Ｓｅｒ２０４、Ｇｌｎ２０６、Ｐｒｏ２１０、Ａｌａ２１６、Ｔｙｒ２１７、Ａｓｎ２１８、Ｍｅｔ２２２、Ｓｅｒ２６０、Ｌｙｓ２６５及びＡｌａ２７４。
【００３３】
本明細書中のプロテアーゼとして有用なその他の好ましいサブチリシンＢＰＮ’変異体（以後、集合的に「Ｄ群プロテアーゼ」と呼ぶ）は、米国特許第４，７６０，０２５号（Ｅｓｔｅｌｌ等、１９８８年７月２６日）に記載され、Ａｓｐ３２、Ｓｅｒ３３、Ｈｉｓ６４、Ｔｙｒ１０４、Ａｓｎ１５５、Ｇｌｕ１５６、Ｇｌｙ１６６、Ｇｌｙ１６９、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１７及びＭｅｔ２２２からなる群から選択される１つ又はそれ以上のアミノ酸位置に対する突然変異を有する野生型サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列を特徴とする。
【００３４】
本明細書中で用いられる場合に、さらに好ましいプロテアーゼは、アルカラーゼ（商品名）、サブチリシンＢＰＮ’、Ａ群プロテアーゼ、Ｂ群プロテアーゼ、Ｃ群プロテアーゼ及びＤ群プロテアーゼからなる群から選択される。最も好ましいプロテアーゼは、Ｄ群プロテアーゼから選択される。
【００３５】
変異体部分
プロテアーゼ部分に加えて、本融合タンパク質は変異体部分（変異体）を更に含む。本発明の変異体は、親アミノ酸配列の改変アミノ酸配列を有するプロテアーゼインヒビターであり、この場合、改変アミノ酸配列がストレプトマイセス属サブチリシンインヒビター（本明細書中ではＳＳＩと呼ぶ）に対応する位置６３でのアミノ酸置換を包含し、親アミノ酸配列がＳＳＩ、ＳＳＩ様インヒビター、ＳＳＩの変異体及びＳＳＩ様インヒビターの変異体から選択される。このような変異体は、ｉｎ ｖｉｖｏでプロテアーゼに融合することができる。好ましくは、変異体は、対応するプロテアーゼ部分による加水分解に抵抗性である。
【００３６】
ＳＳＩに対応する位置６３での置換は、親アミノ酸配列と比較して高められた安定性を付与する如何なるアミノ酸残基によるものでもあり得る。最も好ましくは、ＳＳＩに対応する位置６３での置換は、イソロイシンによるものである。このような変異体は、「Ｌ６３Ｉ」として表され得る。この変異体を説明する場合、最初に親アミノ酸配列中に生じる元のアミノ酸が、２番目に位置番号が、３番目に置換アミノ酸が示される。したがって、Ｌ６３Ｉは、元のインヒビターＳＳＩ中の６３番目のアミノ酸位置（位置６３）として出現したロイシン（Ｌ）がイソロイシン（Ｉ）と代替することを意味する。位置番号はＩｋｅｎａｋａ等（上記）に対応しており（配列番号１）、合成ＳＳＩ（配列番号２）のアミノ末端に存在する４つの付加的アミノ酸残基は無視する。本明細書中に列挙した他の置換に関するこのような表現は、一定の様式で示されている。
【００３７】
変異体は、本明細書中では、位置６３で置換されるＳＳＩに限定されない。むしろ、位置６３での置換は、親アミノ酸配列（もちろん、そのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む）においてもなされ得、この場合、親は、それ自体、ＳＳＩ、ＳＳＩ様インヒビター又はＳＳＩ様インヒビターの変異体である。より好ましい親アミノ酸配列としては、ＳＳＩ及びＳＳＩの変異体が挙げられる。最も好ましい親アミノ酸配列は、ＳＳＩの変異体である。ＳＳＩの変異体は、例えば、Ｋｏｊｉｍａ 等、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＢＰＮ’ ｂｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｓｉｔｅ Ｐ１ Ｍｕｔａｎｔｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． １０９， ｐｐ．３７７−３８２（１９９１）； Ｔａｍｕｒａ 等、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ， Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ８６ Ｒｅｐｌａｃｅｄ ｂｙ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ」， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ３０， ｐｐ．５２７５−５２８６（１９９１）； ＪＯ３０９９−０９９−Ａ（Ｔｓｕｍｕｒａ ＆ Ｃｏ．に譲渡。１９８９年９月１２日公開）；米国特許第５，６７４，８３３号（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ等、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓに譲渡。１９９７年１０月７日発行）；及びＷＯ９３／１７０８６（Ｎｉｅｌｓｅｎ等、 Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓに譲渡。１９９３年９月２日公開）に開示されている。ＳＳＩのその他の変異体は、米国特許出願第６０／０２６，９４４号（Ｃｏｒｒｅａ等。ＷＯ９８／１３３８７に対応。Ｔｈｅ Ｐｒｏｃｔｅｒ ＆ Ｇａｍｂｌｅ Ｃｏ．に譲渡。１９９８年４月２日公開）に開示されていて、このような変異体は、本明細書中では、「Ａ群インヒビター」として集合的に記載される。ＳＳＩの好ましい変異体（本明細書中で親アミノ酸配列として用いるために）は、Ａ群インヒビターである。本明細書中で親アミノ酸配列として有用であるさらに好ましい変異体を、以下の表２〜６に列挙する。ここでも、位置番号全ては、Ｉｋｅｎａｋａ等が説明したのと同様に、ＳＳＩに対応する。
【００３８】
【表２】
2004500008.tif 000003
【００３９】
【表３】
2004500008.tif 000004
【００４０】
【表４】
2004500008.tif 000005
【００４１】
【表５】
2004500008.tif 000006
【００４２】
【表６】
2004500008.tif 000007
【００４３】
したがって、本発明の変異体の例は、変異体１、変異体２等として記載され得るが、これらに限定されない。この場合、例えば、変異体１はＬ６３＊＋Ｄ８３Ｃとして表され、「＊」はＳＳＩにおける６３に対応する位置に本来生じるもの以外の任意のアミノ酸を表し、そして、変異体１−ＩはＬ６３Ｉ＋Ｄ８３Ｃとして表され得る。したがって、本発明の好ましい変異体を、以下の表７に列挙する。表７に列挙した変異体の中のより好ましいものは、位置６３で置換するイソロイシンを有するものである。
【００４４】
【表７】
2004500008.tif 000008
【００４５】
【表８】
2004500008.tif 000009
【００４６】
その他の好ましい親アミノ酸配列には、本明細書中では、ＳＳＩに対応する位置６２に置換を包含するものが含まれる。位置６２での置換は、親において天然に生じているもの以外のアミノ酸残基のいずれでもあり得る（ＳＳＩの場合、天然アミノ酸残基はアラニンである）。好ましくは、位置６２での置換アミノ酸は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ及びＴｒｐ、さらに好ましくはＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ及びＡｓｎ、さらに好ましくはＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ及びＡｓｐ、さらに好ましくはＬｙｓ及びＡｒｇから選択され、最も好ましくは、Ｌｙｓである。好ましい親アミノ酸配列は、本明細書中では、表２〜６に列挙した置換に加えて、位置６２での置換を有する。このような親の例は、親Ｘ−Ａ６２＊として設計され、この場合、「Ｘ」は、表２〜６に例示した親に対応する。したがって、親６−Ａ６２＊は、Ａ６２＊＋Ｍ７３Ｐ＋Ｄ８３Ｃ＋Ｓ９８Ａに対応する。同様に、親６−Ａ６２Ｋは、Ａ６２Ｋ＋Ｍ７３Ｐ＋Ｄ８３Ｃ＋Ｓ９８Ａに対応する。同様に、本発明の例示的な変異体は、変異体６−Ｉ−Ａ６２＊であり、これはＡ６２＊＋Ｌ６３Ｉ＋Ｍ７３Ｐ＋Ｄ８３Ｃ＋Ｓ９８Ａに対応する。したがって、変異体６−Ｉ−Ａ６２Ｋは、Ａ６２Ｋ＋Ｌ６３Ｉ＋Ｍ７３Ｐ＋Ｄ８３Ｃ＋Ｓ９８Ａに対応する。この方式で、表８は、本発明のその他の好ましい変異体を列挙する。
【００４７】
【表９】
2004500008.tif 000010
【００４８】
【表１０】
2004500008.tif 000011
【００４９】
【表１１】
2004500008.tif 000012
【００５０】
【表１２】
2004500008.tif 000013
【００５１】
本発明に有用なその他の好ましい親アミノ酸配列（ＳＳＩの変異体である）には、ＳＳＩに対応する位置９８で単一置換を有するもの、ならびに位置６２で１つと位置９８で１つの２つの置換を有するものが含まれる。表９は、この種類の好ましい親アミノ酸配列を列挙する。
【００５２】
【表１３】
2004500008.tif 000014
【００５３】
本発明の変異体の対応例を、以下の表１０に列挙する。
【００５４】
【表１４】
2004500008.tif 000015
【００５５】
ＳＳＩは、二量体形態で存在し得る。したがって、理論に縛られずに考えると、二量体ＳＳＩの安定化は過剰プロテアーゼに対するプロテアーゼ耐性の増大をもたらす。好ましくは、この安定化二量体ＳＳＩ変異体は、一緒に共有結合した２つのＳＳＩ変異体モノマーからなる。これは、エステル、アミド、ジスルフィド又はその他の結合により、一般にアミノ酸及びそれらの側鎖に生じる場合がある。したがって、「共有二量体化」及び「共有安定化」とは、二量体を形成するこのような共有結合モノマーを指す。好ましくは、この二量体化は、ジスルフィド結合を介して起こる。本発明の変異体は、分子内力であろうと又は分子間力によろうと、二量体形態で存在するものを含むよう意図される。
【００５６】
ここで有用な他の親アミノ酸配列には、ＳＳＩ様インヒビター（しばしばＳＳＩ様（ＳＩＬ）タンパク質と呼ばれる）及びＳＳＩ様インヒビターの変異体が含まれる。ＳＳＩ様インヒビターに関連する背景情報はＬａｓｋｏｗｓｋｉ ら、“Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅａｓｅｓ”， Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ４９， ｐｐ． ５９３ − ６２６ （１９８０）に見出されるであろう。好適なＳＳＩ様インヒビターは約５０％を越える、好ましくは６５％を越える、より好ましくは７０％を越えるＳＳＩとのアミノ酸配列同一性を有し、好ましくはインヒビターはＩＩＩ族インヒビターとして分類され得る。Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら、前掲を参照のこと。このようなＳＳＩ様インヒビターの例には、ＳＩＬ１０（この配列は配列番号４として挙げられている）、ＳＩＬ１３（配列番号５）及びＳＩＬ１４（配列番号６）（これらの各々はＴｅｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｈｒｅｅ Ｎｏｖｅｌ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−Ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：　Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． １１６， ｐｐ． １１５６ − １１６３ （１９９４）に更に記述されている）、並びにＳＩＬ２（この配列は配列番号９として挙げられている）、ＳＩＬ３（配列番号１０）及びＳＩＬ４（配列番号１１）（これらの各々はＴａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， “Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ−ｔｒｙｐｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ”， Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ２２０， ｐｐ． ９１１ − ９１８ （１９９４）に更に記述されている）が含まれる。このようなＳＳＩ様インヒビターの他の２つの例には、ＳＴＩ１（この配列は配列番号７として挙げられている）及びＳＴＩ２（配列番号８）が含まれ、これはＳｔｒｉｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， “Ｔｗｏ Ｎｏｖｅｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ２６７， Ｎｏ． ５， ｐｐ． ３２３６ − ３２４１ （１９９２）に更に記述されている。他のＳＳＩ様インヒビターはプラスミノストレプチン（この配列は配列番号１２として挙げられている）として既知であり、Ｓｕｇｉｎｏら、“Ｐｌａｓｍｉｎｏｓｔｒｅｐｔｉｎ， ａ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ”， Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ２５３， Ｎｏ．５，ｐｐ．１５４６−１５５５ （１９７８）に更に記述されている。更に他のＳＳＩ様インヒビターはＳＬＰＩ（この配列は配列番号１３として挙げられている）であり、Ｕｅｄａら．，“Ａ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ ６６ Ｅｘｈｉｂｉｔｓ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ Ｔｏｗａｒｄ Ｂｏｔｈ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ ＢＰＮ’ ａｎｄ Ｔｒｙｐｓｉｎ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．１１２，ｐｐ．２０４−２１１ （１９９３）に更に記述されている。更に他のＳＳＩ様インヒビターはＳＡＣ Ｉ（この配列は配列番号１４として挙げられている）であり、Ｔａｎａｂｅら、“Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｓｉｔｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ （ＳＡＣ）， ａ Ｎｏｖｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ ｓｕｂｓｐ． ｃｉｎｎａｍｏｎｅｕｍ”， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．１１５，ｐｐ．７５２−７６１ （１９９４）に更に記述されている。更に他のＳＳＩ様インヒビターはＳＩＬ１（この配列は配列番号１５として挙げられている）であり、Ｋｏｊｉｍａら、“Ｐｒｉｍａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｃａｏｉ”， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， Ｖｏｌ．１２０７，ｐｐ．１２０−１２５ （１９９４）に更に記述されている。他のＳＳＩ様インヒビターはＴａｇｕｃｈら、“Ｈｉｇｈ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ＳＳＩ−Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ａｍｏｎｇ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ”， Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．５７，ｐｐ．５２２−５２４ （１９９３）、Ｔａｇｕｃｈｉら、“Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−Ｌｉｋｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｒｅ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ Ｗｉｄｅｌｙ ｉｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｔｅｓ”， Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， ｐｐ．４３３８−４３４１ （Ｄｅｃ． １９９３）、及びＳｕｚｕｋｉら、“Ｐａｒｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ”， Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ．４５，ｐｐ．６２９−６３４ （１９８１）において議論されている。当業者が理解しているように、更に他のＳＳＩ様インヒビターが当業界で記述されている。
【００５７】
ＳＳＩ様インヒビターの変異体は、本明細書中では親アミノ酸配列としても利用され得る。このような変異体には、本明細書中で上述したように、選定ＳＳＩ様インヒビターのアミノ酸配列中に１つ又はそれ以上の突然変異を有するものが含まれる。特に、本明細書中に示した変異体で例示した置換はすべて、ＳＳＩ様インヒビターの対応する位置でなされて、親アミノ酸配列を提供し得る。親アミノ酸配列として利用され得るＳＳＩ様インヒビターの変異体の他の例は、ＷＯ９３／１７０８６（Ｎｉｅｌｓｅｎ等、Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓに譲渡。１９９３年９月２日公開）に開示されているが、これらに限定されない。
【００５８】
当業者が理解するように、その元々の番号付けを用いて、ＳＳＩ様インヒビター、その変異体、又はＳＳＩの変異体の位置６３（例えば）は、ＳＳＩの位置６３に対応しなくても良い。したがって、当業界では容易に理解されるように、配列番号は、ＳＳＩの位置６３（例えば）に対応する位置を突き止めるために調整を要してもよい。配列アラインメントは、本明細書中に引用した参考文献、ならびに当業界のその他の参考文献中に容易に見出される。
【００５９】
好ましくは、本発明の変異体は、変異体が、クリーニング又はパーソナルケア組成物中のほとんどすべてのプロテアーゼ（好ましくは、約６０％より多く、さらに好ましくは約９９％）を阻害可能にするが、しかし稀釈時及び／又はクリーニング工程中にプロテアーゼから解離することを可能にするＫｉを示す。変異体は、好ましくは約１０−１２Ｍ〜約１０−４Ｍ、さらに好ましくは約１０−１０Ｍ〜約１０−６Ｍ、最も好ましくは約１０−８Ｍ〜約１０−７ＭのＫｉを示す。もちろん、洗濯機の寸法又は製品の濃度が変われば、Ｋｉはそれにしたがって調整される。有用なＫｉ範囲の予測は、使用時の組成物の稀釈、用いられるクリーニング方法の温度に関連した結合定数の温度依存性、プロテアーゼのインヒビターの化学量論値等のようなパラメーターを考慮することにより、不相応な実験をせずに、熟練当業者により容易に確定される。
【００６０】
連結部分
プロテアーゼ部分及び変異体部分に加えて、融合タンパク質は場合によって連結部分を含む。好ましくは、融合タンパク質は、連結部分を含む。連結部分は、プロテアーゼ部分を変異体部分から分離する加水分解可能な連結アミノ酸鎖であり、ここでプロテアーゼ部分及び変異体部分は連結部分を介して共有的に結合される。
【００６１】
当業者は、いくつかの異なるゴールを達成するように連結部分を構築することができる。例えば、連結部分のアミノ酸残基は、加水分解の良好な基質となるようにデザインされることができる。更に、アミノ酸の配列は、プロテアーゼ部分及び変異体部分の翻訳後分離を促進するように、又はプロテアーゼ部分の結合若しくは活性部位に関して変異体部分の位置を最適化するように、デザインされることができる。
【００６２】
任意の連結部分は約２０アミノ酸残基又はそれよりも少ない長さであることが好ましい。好ましくは連結部分は、プロテアーゼ部分によって容易に開裂される。
融合タンパク質が連結部分を含まない場合、プロテアーゼ部分及び変異体部分は直接、共有結合される。
【００６３】
融合タンパク質の他の特徴
融合タンパク質は、最終的にはｉｎ ｖｉｖｏでＤＮＡによりコードされるため、ＤＮＡは、融合タンパク質の配列を決定するため用いられることができる。融合タンパク質をコードするＤＮＡは、任意の数のプラスミド及び／又は発現系中で用いられることが可能であり、それらの例としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系及びｉｎ ｖｉｖｏ系、例えば、植物（好ましくはバイオテクノロジーに用いられるもの、例えば、タバコ、脂肪種子植物、例えば、ナタネ、ダイズ等、穀類、例えば、トウモロコシ、オオムギ、カラスムギ、その他の野菜、例えば、トマト、ジャガイモ等）並びに微生物、例えば真菌、例えば、酵母菌、ならびに細菌、例えば、バチルス属、大腸菌等が挙げられる。好ましくは、発現系は、微生物、さらに好ましくは自然の細菌、最も好ましくは大腸菌又はバチルス属、さらに好ましくはバチルス属細菌である。
【００６４】
融合タンパク質をコードするＤＮＡは、プラスミド又はファージ中に組み入れられ、細胞中で活性であるか、又は本発明の融合タンパク質のクローニング又は発現に用いられる生物のゲノム中に直接組み入れられてもよい。
【００６５】
本発明の説明を見れば、本発明の融合タンパク質をコードするために用いられるＤＮＡは、本発明の他の変異体と同一プラスミド、ファージ又は染色体中に置かれ得ると、当業者は認識することが理解されるべきである。さらに、このようなプラスミド、ファージ又は染色体は、本発明の融合タンパク質のプロテアーゼにより阻害され得るか又は阻害されないこともある、融合タンパク質の一部としてインヒビター及び／又はプロテアーゼを含む融合タンパク質を含めたプロテアーゼもコードし得る。
【００６６】
前記のＤＮＡはＤＮＡのＲＮＡ転写物も意図し、開示する、ということも当業者には十分理解される。当業者は、もちろん、実験しなくても、ＤＮＡ配列の検査によりＲＮＡ配列を知ることができる。
【００６７】
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードする遺伝子及び／又はＤＮＡにも関する。
本発明の好適実施形態では、融合タンパク質は、１以上の他のプロテアーゼインヒビター、好ましくは１つの他のプロテアーゼインヒビターと共に同一の発現系によって同時発現される。好ましくは、追加のプロテアーゼインヒビターは、ＳＳＩ、ＳＳＩ様インヒビター、ＳＳＩの変異体及びＳＳＩ様インヒビターからなる群より選択されたプロテアーゼインヒビターの変異体である。更に好ましくは、追加のプロテアーゼインヒビターは、独立して、好適な限定物を含んで、本明細書において議論されている「変異体部分」と同一の定義の変異体である。最も好ましくは、追加のプロテアーゼインヒビターは、融合タンパク質の変異体部分と同一の変異体である。
【００６８】
従って、本発明者らはここで、融合タンパク質及び、場合によって１以上の付加的なプロテアーゼインヒビターをコードするＤＮＡを含む発現系を提供する。発現系は、好ましくは生きた生物、最も好ましくは細菌性である。
【００６９】
当業者が本発明の融合タンパク質に対する抗体を調製することを望み得ることも意図される。これらの抗体は、既知の方法を用いて調製し得る。
例えば、本発明の融合タンパク質は、適切な哺乳類被験体、例えば、マウス、ウサギ等に注入されることができる。適切なプロトコールは、血清中での抗体の産生を増強するスケジュールにしたがって、アジュバントの存在下での免疫原を反復注入することを含む。免疫血清の力価は、抗原として本発明の融合タンパク質を用いて、当業界での目下の標準であるイムノアッセイ法を用いて、容易に測定し得る。
【００７０】
得られた抗血清は直接用いられるか、あるいは免疫感作動物の末梢血リンパ球又は脾臓を採取し、抗体産生細胞を不死化した後、標準イムノアッセイ技法を用いて適切な抗体産生体を同定することにより、モノクローナル抗体が得られる。
【００７１】
その場合、ポリクローナル又はモノクローナル調製物は、標準検定法を用いて、本発明の発現をモニタリングするのに有用である。したがって、発現レベル等を確定するために用いるため、これらの抗体を用いて、キットが調製され得ることも意図される。
【００７２】
このような抗体はまた、標準結合法を用いて、シンチグラフ用標識、例えば、テクネチウム９９又はＩ−１３１あるいは蛍光標識といった標識と結合されることができる。標識化抗体はまた、競合アッセイ、例えばＫｉを確定するために用いられる動態論的アッセイにも用いられることができる。
【００７３】
本融合タンパク質はまた、例えば、セルロース結合ドメイン、リパーゼ、アミラーゼ及びセルラーゼのような所望の機能を提供する「部分」を更に含んでもよい。
【００７４】
当業界で認識されているように、ＤＮＡ及びアミノ酸配列決定法には、時折、エラーが生じる。その結果、本明細書中の開示から本発明者等の仕事を再現する当業者は、ルーチン技能を用いてあらゆる配列決定エラーを発見し、適切な場合には変更を加え得る。
【００７５】
製造及び使用方法
以下の実施例は、いかなる点でも本発明を限定するものではなく、むしろ本発明の製造及び使用方法の指針を当業者に提供するものである。実施例の指針、本明細書中のその他の開示及び当業者に容易に利用可能な情報が示されれば、当業者は本発明を製造し、使用し得る。要するに、技術の網羅的詳述及び当業界で既知の技法等は、十分に当業者の範囲内であるために、除去される。
変異体部分（変異体）は親アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を突然変異し、それにより改変アミノ酸配列を有する変異体を得ることにより製造され得る。このような方法は当業界では周知であり、そのような方法の１つを以下に説明する。
【００７６】
親アミノ酸配列に相当する遺伝子を含むファージミドを、大腸菌ｄｕｔ−ｕｎｇ−株ＣＪ２３６に形質転換するために使用し、一本鎖ウラシル含有ＤＮＡ鋳型を、Ｙｕｃｋｅｎｂｅｒｇらによる “Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｕｒａｃｉｌ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＤＮＡ ａｎｄ Ｐｈａｇｅｍｉｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ”， Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｍ．Ｊ．ｅｄ．，ｐ２７−４８（１９９１）により改変されたＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｋｕｎｋｅｌらの “Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ”， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１５４、３６７−３８２頁（１９８７））を用いて生成する。Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，及び Ｍ．Ｓｍｉｔｈらの “Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ − Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｍ１３ − Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａｎ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｉｎｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａｎｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ”， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．１０、ｐ６４８７−６５００（１９８２）に記載された方法により改変された位置指定変異プライマーが、（本質的には上記のＹｕｃｋｅｎｂｅｒｇらにより提供されるような）全ての変異体を生成するために使用される。
【００７７】
オリゴヌクレオチドは、３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を用いて作製される。変異反応生成物を、大腸菌ＭＭ２９４株（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション Ｅ．ｃｏｌｉ ３３６２５）に形質転換させる。全ての突然変異は、ＤＮＡ配列決定により確認され、単離したＤＮＡを、バチルス サブチリス発現株ＰＧ６３２に形質転換させる（Ｓａｕｎｄｅｒらの “Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｇｎａｌ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ｓｉｔｅ ｆｏｒ Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｏｆ ａ ３４−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ Ｈｏｒｍｏｎｅ”， Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１０２、２７７−２８２頁（１９９１）、及びＹａｎｇらの “Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｕｔｒａｌ Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｌｏｎｅｄ Ｇｅｎｅ ｔｏ Ｃｒｅａｔｅ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ” Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１６０、ｐ１５−２１（１９８４））。
【００７８】
変異体コード遺伝子は、プロテアーゼ遺伝子と融合可能である。各遺伝子中の適当な位置に制限位置を処理することは、標準的な方法である。制限消化を実施することができ、制限断片を、例えばＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結することができる。連結（ライゲーション）混合物を用いて、プラスミドの性質に依存して、大腸菌又は Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓを軽質転換することができる。例えば、大腸菌及びＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ双方中で複製され、前者にはアンピシリン耐性、後者にはカナマイシン耐性を与えるプラスミド上で運ばれるサブチリシン遺伝子を使用することができる。オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発を用いて、サブチリシンのカルボキシ末端アミノ酸残基をコードするＤＮＡの直後（３’側）にＥｃｏＲＩ部位を配置することができる。またストップコドンをコードするＤＮＡの直後（３’側）にＢａｍＨＩ部位を配置することができる。インヒビター遺伝子を、Ｎ末端アミノ酸残基をコードするＤＮＡ配列の５’側に隣接してＥｃｏＲＩ部位があるように、構築することができる。更に、ＢａｍＨＩ部位を、ストップコドンをコードするＤＮＡの後（３’側）に配置することができる。インヒビター及びサブチリシン遺伝子を、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで処理し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼですぐに処理することができる。連結混合物を、大腸菌ＭＭ２９４細胞をアンピシリン耐性となるように形質転換するために使用することができる。融合タンパク質コードプラスミドが大腸菌から回収されると、このプラスミドを、カナマイシン耐性となるようにＢ． ｓｕｂｔｉｌｉｓを形質転換するために使用できる。
【００７９】
２０ｇ／ｌのトリプトン、２０ｇ／ｌの酵母抽出物及び５ｇ／ｌの塩化ナトリウムを含有し、１．２５％のマルトリンＭ１００（Ｇｒａｉｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｍｕｓｃａｔｉｎｅ， ＩＡ）、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、８０μＭのＭｎＣｌ２及び５０μＭのカナマイシンを補充した培地中で、対象プラスミドを含有する枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を培養する。培養物を３７℃で２４時間インキュベートする。
【００８０】
融合タンパク質は、培養培地に分泌されて、これから単離されることができる。イオン交換及びゲル濾過クロマトグラフィーを含む多くのクロマトグラフィーのいずれも使用できる。
【００８１】
本発明の融合タンパク質の特徴づけ
本発明の融合タンパク質を含有する発酵上清をプロテアーゼ活性及びプロテアーゼ阻害活性についてテストする。
ＳＳＩは、とりわけサブチリシンＢＰＮ’及びサブチリシンＢＰＮ’のＹ２１７Ｌ変異体を阻害する。制御下で、ＳＳＩをプロテアーゼと混合し、室温で１５分間インキュベートする。次に、ＤｅｌＭａｒ等（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｖｏｌ． ９９， ｐｐ．３１６−３２０（１９７９））の方法を用いて、プロテアーゼ活性を測定する。０．１Ｍトリス、ｐＨ８．６、１０ｍＭのＣａＣｌ２の溶液を加え、９９０μＬの容量にする。１０μＬのＮ−スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリド（２０ｍｇ／ｍＬ）を付加して反応を開始させる。プロテアーゼの阻害を示す４１０ｎｍでの吸光度の増大により、反応率を測定する。
【００８２】
本発明の融合タンパク質の培養上清を、同様の方法でサブチリシンＢＰＮ’のＹ２１７Ｌ誘導体を阻害するその能力について試験する。培養上清をまた、そのプロテアーゼの生成能についても試験する。
【００８３】
有意な阻害活性及びプロテアーゼ活性の欠如は、本発明において所望されたように、変異体部分及びプロテアーゼ部分それぞれが他方の活性を打ち消す（又は実質的に打ち消す）ように作られている融合タンパク質と一致する。この解釈は、融合タンパク質が作られていることを示すウェスタンブロットの結果によって補強され得る。
【００８４】
クリーニング又はパーソナルケア組成物中に、本発明の融合タンパク質を組み入れるのが望ましいために、生成物環境での安定性も検査する。融合タンパク質のプロテアーゼ及びインヒビター活性が安定な場合には、プロテアーゼ活性のレベルは一定である。しかしながら、変異体部分が融合タンパク質のプロテアーゼ部分により加水分解された場合には、プロテアーゼ活性は上昇する。以下の処方により作られた液体洗剤組成物中と、融合タンパク質培養上清を混合する。
【００８５】
【表１５】
2004500008.tif 000016
【００８６】
この組成物は、全試料容積の３分の１を構成する。１５μＬの試料を９７５μＬの０．１ＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．６、０．０１ＭのＣａＣｌ２と混合する。この稀釈液を室温で３０分間インキュベートする。インキュベーション後、基質を付加し、プロテアーゼの量を測定する。数週間に亘るプロテアーゼ活性の増大により、変異体の分解を検出する。このような分解は、例えば融合タンパク質中のＳＳＩの場合と直接比較し得る。
【００８７】
融合タンパク質のＫｉを、以下のようにして確定する。融合タンパク質及び６００μｇ／ｍＬのスクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアニリドを９９０μＬの５０ｍＭトリス、ｐＨ８溶液に混合する。加水分解速度を、２０分間追跡する。最後の１０〜１５分間に、一定速度が観察される。この速度を、プロテアーゼのみを用いて観察された速度と比較して、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ（「Ｔｈｅ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ」， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． ２７， ｐｐ．５２９−５８０（１９４４））の方程式によりＫｉを算出するために用いる。
【００８８】
本発明のクリーニング組成物
本発明の別の実施態様では、有効量の１つ又はそれ以上の本発明の融合タンパク質は、ペプチド汚れ除去を必要とする種々の表面をクリーニングするのに有用なクリーニング組成物中に含有される。このようなクリーニング組成物としては、織物リーニング組成物、硬質表面クレンジング組成物、ライトデューティークリーニング組成物、例えば、食器クレンジング組成物、及び自動食器洗浄機用洗剤組成物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
クリーニング組成物は、本明細書中では、有効量の１つ又はそれ以上の本発明の融合タンパク質と、クリーニング組成物担体とを含む。最も好ましくは、ｋのような融合タンパク質は、１つのプロテアーゼ部分、１つの変異体部分及び、場合によってではあるが好ましくは、連結部分を有する。本発明の好適実施形態では、ここでのクリーニング組成物は、融合タンパク質に加えて、１つ以上の付加的なプロテアーゼインヒビターを更に含む。好ましくは、付加的なプロテアーゼインヒビターは、ＳＳＩ、ＳＳＩ様インヒビター、ＳＳＩの変異体及びＳＳＩ様インヒビターの変異体からなるプロテアーゼインヒビターの変異体である。より好ましくは、付加的なプロテアーゼインヒビターは、独立して、好適な制限物を含めて、ここで議論された「変異体部分」と同一の定義の変異体である。最も好ましくは、付加的なプロテアーゼインヒビターは、融合タンパク質の変異体部分と同一の変異体である。
本クリーニング組成物では、変異体とプロテアーゼとの好ましいモル比（変異体対プロテアーゼ比）（ここで融合タンパク質の変異体部分と付加的なプロテアーゼインヒビターのいずれもは、纏めて変異体のモル量を示す）は、約３：１から約１：１、より好ましくは約３：１から約１．５：１、最も好ましくは約２：１である。
【００９０】
本明細書中で用いる場合、「有効量の融合タンパク質」等といった表現は、特定のクリーニング組成物中に必要なタンパク質分解活性を達成するのに必要な融合タンパク質の量を指す。このような有効量は、当業者には容易に確定され、そして、多数の因子、例えば、用いられる特定の融合タンパク質、クリーニング用途、クリーニング組成物の特定の組成、ならびに望ましいのは液体か乾燥（例えば、顆粒、棒状）組成物か等に基づいている。好ましくは、クリーニング組成物は、約０．０００１％〜約１０％、さらに好ましくは約０．００１％〜約１％、最も好ましくは約０．０１％〜約０．１％の１つ又はそれ以上の本発明の融合タンパク質を包含する。融合タンパク質が用いられ得る種々のクリーニング組成物のいくつかの例を以下でさらに詳細に考察する。
【００９１】
本発明の融合タンパク質に加えて、本クリーニング組成物は更に、融合タンパク質及び／又はプロテアーゼに適合する１つ以上のクリーニング組成物物質を含むクリーニング組成物担体を含む。用語「クリーニング組成物物質」とは、ここで用いられる場合、所望されるクリーニング組成物の特定のタイプ及び製品の形態（例えば、液体、顆粒、棒状、スプレー、スティック、ペースト、ジェル）に選択された如何なる物質をも意味し、これらの物質はまた本組成物に使用される融合タンパク質に適合するものでもある。クリーニング組成物物質の特定の選択は、クリーニングされる物質、使用中のクリーニング条件のための組成物の所望形態を考慮することにより容易に成される。用語「適合」とは、ここで用いられる場合、クリーニング組成物物質が、融合タンパク質の阻害活性及び／又はタンパク質分解活性を、融合タンパク質が通常使用状態の間に所望されるように有効とならない程度まで低下しないことを意味する。特別のクリーニング組成物物質は、以下に詳細に例示される。
【００９２】
本発明の融合タンパク質は、高度に起泡し良好なクレンジング活性が所望される種々の洗剤組成物に使用され得る。従って、融合タンパク質は、十分に配合された硬質表面クリーナー、皿洗い組成物、織物洗濯組成物などを提供するために種々の慣用の配合剤と共に使用できる。このような組成物は、液体、顆粒、棒状などの形態であることができる。このような組成物は、約３０重量％から約６０重量％ほどの界面活性剤を含有する「濃縮」洗剤として配合できる。
【００９３】
ここでのクリーニング組成物は任意に、また好ましくは、種々の界面活性剤（例えば、アニオン、ノニオン又は双性イオン性界面活性剤）を含有し得る。このような界面活性剤は、普通、組成物の約５％から約３５％のレベルで存在する。
【００９４】
ここで有用な界面活性剤の非限定例には、慣用のＣ１１−Ｃ１８アルキルベンゼンスルホネート並びに一級及びランダムアルキルスルフェート、式ＣＨ３（ＣＨ２）ｘ（ＣＨＯＳＯ３）−Ｍ＋）ＣＨ３及びＣＨ３（ＣＨ２）ｙ（ＣＨＯＳＯ３）−Ｍ＋） ＣＨ２ＣＨ３のＣ１０−Ｃ１８二級（２，３）アルキルスルフェートであって、式中、ｘ及び（ｙ＋１）は少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９の整数であり、Ｍは水溶性カチオン、特にナトリウムであるもの、Ｃ１０−Ｃ１８アルキルアルコキシスルフェート（特にＥＯ１−５エトキシスルフェート）、Ｃ１０−Ｃ１８アルキルアルコキシカルボキシレート（特にＥＯ１−５エトキシカルボキシレート）、Ｃ１０−Ｃ１８アルキルポリグリコシド、並びにその対応スルフェート化ポリグリコシド、Ｃ１２−Ｃ１８α−スルホン化脂肪酸エステル、Ｃ１２−Ｃ１８アルキル及びアルキルフェノールアルコキシレート（特にエトキシレート及び混合エトキシ／プロポキシ）、Ｃ１２−Ｃ１８ベタイン及びスルホベタイン（「スルタイン」）、Ｃ１０−Ｃ１８アミンオキシドなどが含まれる。アルキルアルコキシスルフェート（ＡＥＳ）及びアルキルアルコキシカルボキシレート（ＡＥＣ）がここでは好ましい。このような界面活性剤のアミンオキシド及び／又はベタイン又はスルタイン界面活性剤との組合わせての使用も好ましく、これは配合者の希望による。他の慣用の有用な界面活性剤は、標準的なテキストに列記されている。特に有用な界面活性剤には、Ｃ１０−Ｃ１８のＮ−メチルグルカミドが含まれ、これは１９９３年３月１６日発行のＣｏｎｎｏｒらの米国特許第５，１９４，６３９号に開示されている。
【００９５】
本クリーニング組成物に有用な広範な種々の他の配合剤は、例えば他の活性配合剤、担体、ヒドロトロープ、プロセシング助剤、染料又は顔料並びに、液体配合物のための溶媒を含む。起泡の更なる増進が所望される場合、起泡増進剤、例えばＣ１０−Ｃ１６アルコールアミド（ａｌｋｏｌａｍｉｄｅｓ）が、普通約１％から約１０％のレベルで本組成物に組み込まれることができる。Ｃ１０−Ｃ１４モノエタノール及びジエタノールアミドは、普通のクラスのこのような起泡増進剤を説明する。このような起泡増進剤の高度起泡補助界面活性剤、例えばアミンオキシド、ベタイン及び上記したスルタインとの使用もまた有効である。所望される場合、可溶性マグネシウム塩、例えばＭｇＣｌ２、ＭｇＳＯ４などは、更なる起泡をもたらすために、普通、約０．１％から約２％のレベルで付加されることができる。
【００９６】
ここでの液体洗剤組成物は、担体として水及び他の溶媒を含んでもよい。メタノール、エタノール、プロパノール及びｉｓｏ−プロパノールにより例示される低分子量の一級又は二級アルコールが適している。一価アルコールは可溶性界面活性剤に好適であるが、ポリオール、例えば約２から約６の炭素原子及び約２から約６のヒドロキシ基を有するもの（例えば、１，３−プロパンジオール、エチレングリコール、グリセリン及び１，２−プロパンジオール）もまた使用されることができる。本組成物は約５％から約９０％、普通約１０％から約５０％のこのような担体を含み得る。
【００９７】
ここでの洗剤組成物は好ましくは水性クリーニング操作での使用中に洗浄水が約６．８と約１１との間のｐＨを有するように配合されることが好ましいであろう。最終製品は普通この範囲で配合される。ｐＨを推奨使用レベルに調整する技術には、例えば緩衝剤、アルカリ、及び酸の使用が含まれる。このような技術は当業者に公知である。
本発明の硬質表面クリーニング組成物及び織物クリーニング組成物を配合するときに、配合者は種々のビルダーを約５重量％から約５０重量％のレベルで用いたいと思うであろう。普通のビルダーには、１−１０ミクロンのゼオライト、ポリカルボキシレート、例えばシトレート及びオキシジスクシネート、層状シリケート、ホスフェートなどが含まれる。他の慣用ビルダーは標準配合書に列記されている。
【００９８】
同様に、配合者は種々の付加的な酵素、例えばセルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及びプロテアーゼを、このような組成物に普通約０．００１重量％から約１重量％のレベルで使おうとするかもしれない。種々の洗浄性及び織物ケア酵素は洗濯洗剤分野で公知である。
【００９９】
種々の漂白化合物、例えば過炭酸塩、過ホウ酸塩等は、普通、約１重量％から約１５重量％のレベルでこのような組成物に用いられることができる。所望すれば、このような組成物はまた、テトラアセチルエチレンジアミン、ノナノイルオキシベンゼンスルホネート等の漂白活性剤も含有することができ、これらもまた当業界で既知である。使用レベルは普通約１重量％から約１０重量％に及ぶ。
【０１００】
汚れ遊離剤（ｓｏｉｌ ｒｅｌｅａｓｅ ａｇｅｎｔｓ）、特にアニオン性オリゴエステル型、キレート剤、特にアミノホスフェート及びエチレンジアミンジスクシネート、クレイ汚れ除去剤、特にエトキシル化テトラエチレンペンタミン、分散剤、特にポリアクリレート及びポリアスパラテート、増白剤、特にアニオン増白剤、泡抑制剤、特にシリコーン及び二級アルコール、織物柔軟剤、特にスメクタイトクレイ等は、このような組成物に約１重量％から約３５重量％に及ぶレベルで全て使用されることができる。標準配合書及び公開特許は、このような慣用の物質の多数の詳細な記述を含む。
【０１０１】
酵素安定剤も本クリーニング組成物に使用しても良い。このような酵素安定剤には、プロピレングリコール（好ましくは約１％から約１０％）、ナトリウムホルメート（好ましくは約０．１％から約１％）及びカルシウムホルメート（好ましくは約０．１％から約１％）が含まれる。
他の有用なクリーニング組成物物質には、クレイ汚れ除去剤、分散剤、増白剤、泡抑制剤及び織物柔軟剤が含まれる。
【０１０２】
本融合タンパク質は硬質表面クリーニング組成物に有用である。ここで用いられる場合「硬質表面クリーニング組成物」とは、硬質表面、例えば、床、壁、浴室タイル等をクリーニングするための液体及び顆粒の洗剤組成物を指す。本発明の硬質表面クリーニング組成物は、普通、界面活性剤と、水溶性金属イオン封鎖剤ビルダーとを含む。しかしながら、所定の特別製品、例えばスプレー窓クリーナーでは、ガラス表面に薄膜状及び／又はむらのある残査を生成し得るので、界面活性剤は時として使用されない。
【０１０３】
存在する場合、界面活性剤成分は、ここでの組成物の約０．１％程度で含まれてもよいが、普通、組成物は約０．２５％から約１０％、より好ましくは約１％から約５％の界面活性剤を含むであろう。
普通、本組成物は約０．５％から約５０％の洗浄性ビルダー、好ましくは約１％から約１０％で含まれ得る。
【０１０４】
好ましくはｐＨは約７から約１２の範囲にあるべきである。慣用のｐＨ調整剤、例えば水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム又は塩酸が、調整の必要があれば使用されることができる。
【０１０５】
溶媒は、本組成物に含まれてもよい。有用な溶媒には、グリコールエーテル、例えばジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノヘキシルエーテル、プロピレングリコールモノブチルエーテル、ジプロピレングリコールモノブチルエーテル、並びにジオール、例えば２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオール及び２−エチル−１，３−ヘキサンジオールが含まれるが、これらに限定されない。使用する場合、このような溶媒は普通、約０．５％から約１５％、より好ましくは約３％から約１１％のレベルで存在する。
【０１０６】
付加的に、高度揮発性溶媒、例えばｉｓｏ−プロパノール又はエタノールは、表面に対して本組成物の「十分な強さでの」塗布後に表面が濯がれない場合、表面から組成物の速い蒸発を促進するために、本発明において使用されることができる。使用される場合、揮発性溶媒は普通、約２％から約１２％のレベルで本組成物中に存在する。
【０１０７】
本変異体はまた、以下に記述されているクリーニング組成物における含有物として有用である：１９９８年３月２６日発行のＲｕｂｉｎｇｈらの米国仮特許出願第６０／０７９，４７７号；１９９８年３月２６日発行のＲｕｂｉｎｇｈらの米国仮特許出願第６０／０７９，３９７号；１９９８年３月２６日発行のＷｅｉｓｇｅｒｂｅｒらの米国特許出願第０９／０４８，１７４号；１９９８年６月２日出願の Ｗｅｉｓｇｅｒｂｅｒの米国特許第出願第０９／０４８，１７４号に優先権を主張した米国特許第出願第０９／０８８９１２号。
【０１０８】
本発明の硬質表面クリーニング組成物を、以下の実施例により説明する。
実施例１−６
【０１０９】
【表１６】
2004500008.tif 000017
【０１１０】
実施例１−６において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、上記融合タンパク質と置換すると、実質的に同様の結果となる。
【０１１１】
実施例７−１０
【０１１２】
【表１７】
2004500008.tif 000018
【０１１３】
実施例７−１０において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、上記融合タンパク質と置換すると、実質的に同様の結果となる。
【０１１４】
実施例１１−１３
【０１１５】
【表１８】
2004500008.tif 000019
【０１１６】
実施例１１−１３において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、上記融合タンパク質と置換すると、実質的に同様の結果となる。
【０１１７】
パーソナルケア組成物
本融合タンパク質は、パーソナルケア組成物での使用にとくに適切であり、前記パーソナルケア組成物は、例えば、リーブオン及びリンスオフヘアコンディショナー、シャンプー、リーブオン及びリンスオフにきび組成物、フェイシャルミルク及びコンディショナー、シャワ−ジェル、石鹸、泡立ち及び非泡立ちフェイシャルクレンザー、化粧品、ハンド、フェイシャル及びボディーローション、モイスチャライザー、リーブオンフェイシャルモイスチャライザー、化粧品及びクレンジングワイプ、口腔ケア組成物、及びコンタクトケア組成物である。本発明のパーソナルケア組成物は、本発明の融合タンパク質の１つ以上とパーソナルケア担体とを含む。融合タンパク質は、好適な制限物を含めて、クリーニング組成物についてここで記述されている。最も好ましくは、このような融合タンパク質は、１つのプロテアーゼ部分、１つの変異体部分、及び場合によってであるが好ましくは、連結部分を有する。本発明の好適実施形態では、ここでのパーソナルケア組成物は更に、融合タンパク質に加えて、１以上の追加のプロテアーゼインヒビターを含む。好ましくは、付加的なプロテアーゼインヒビターは、ＳＳＩ、ＳＳＩ様インヒビター、ＳＳＩの変異体及びＳＳＩ様インヒビターからなる群より選択されたプロテアーゼインヒビターの変異体である。より好ましくは、付加的なプロテアーゼインヒビターは、好適な制限物を含め、独立して、ここで議論された「変異体部分」と同様の定義の変異体である。最も好ましくは、付加的なプロテアーゼインヒビターは、融合タンパク質の変異体部分と同様の変異体である。
本パーソナルケア組成物では、変異体とプロテアーゼとの好適なモル比（変異体対プロテアーゼ比）（ここで融合タンパク質の変異体部分及び付加的なプロテアーゼインヒビターは、纏めて、変異体のモル量を表す）は、約３：１から約１：１、より好ましくは約３：１から約１．５：１、最も好ましくは約２：１である。
【０１１８】
説明するために、本発明の融合タンパク質は、下記参考文献に記載された組成物中の含有物に対して適当である：１９９７年６月２４日発行のＬｉｎａｒｅｓらの米国特許第５，６４１，４７９号（スキンクレンザー）； １９９７年２月４日発行のＷｉｖｅｌｌらの米国特許第５，５９９，５４９号（スキンクレンザー）； １９９６年１２月１７日発行のＨａらの米国特許第５，５８５，１０４号（スキンクレンザー）； １９９６年７月３０日発行のＫｅｆａｕｖｅｒらの米国特許第５，５４０，８５２号（スキンクレンザー）； １９９６年４月２３日発行のＤｕｎｂａｒらの米国特許第５，５１０，０５０号（スキンクレンザー）； １９９７年３月１８日発行のＧｕａｎｇ Ｌｉｎらの米国特許第５，６１２，３２４号（坑にきび調製物）； １９９６年１２月２４日発行のＷａｒｒｅｎらの米国特許第５，５８７，１７６号（坑にきび調製物）； １９９６年８月２７日発行のＶｅｎｋａｔｅｓｗａｒａｎの米国特許第５，５４９，８８８号（坑にきび調製物）； １９９５年１１月２８日発行のＣｏｒｌｅｓｓらの米国特許第５，４７０，８８４号（坑にきび調製物）； １９９７年７月２２日発行のＧｏｒｄｏｎらの米国特許第５，６５０，３８４号（シャワージェル）； １９９７年３月４日発行のＭｏｏｒｅらの米国特許第５，６０７，６７８号（シャワージェル）； １９９７年４月２９日発行のＣｏｆｆｉｎｄａｆｆｅｒらの米国特許第５，６２４，６６６号（ヘアーコンディショナー及び／又はシャンプー）； １９９７年４月８日発行のＢｏｌｉｃｈらの米国特許第５，６１８，５２４号（ヘアーコンディショナー及び／又はシャンプー）； １９９７年３月１８日発行のＩｎｍａｎの米国特許第５，６１２，３０１号（ヘアーコンディショナー及び／又はシャンプー）； １９９６年１１月１２日発行のＷｅｌｌｓの米国特許第５，５７３，７０９号（ヘアーコンディショナー及び／又はシャンプー）； １９９６年１月９日発行のＰｉｎｇｓの米国特許第５，４８２，７０３号（ヘアーコンディショナー及び／又はシャンプー）； １９９４年４月１２日再発行のＧｒｏｔｅらの米国再発行特許第３４，５８４号（ヘアーコンディショナー及び／又はシャンプー）； １９９７年６月２４日発行のＤａｔｅらの米国特許第５，６４１，４９３号（化粧品）； １９９７年２月２５日発行のＢｌａｎｋらの米国特許第５，６０５，８９４号（化粧品）； １９９６年１２月１７日発行のＹｏｓｈｉｏｋａらの米国特許第５，５８５，０９０号（化粧品）； １９９０年７月３日発行のＣｈｅｎｅｙらの米国特許第４，９３９，１７９号（ハンド、フェイス及び／又はボディーローション）； １９９７年３月４日発行のＭｃＡｔｅｅらの米国特許第５，６０７，９８０号（ハンド、フェイス及び／又はボディーローション）； １９７７年８月３０日発行のＲｉｃｈｔｅｒらの米国特許第４，０４５，３６４号（化粧品及びクレンジングワイプ）； １９９４年１０月１２日の公開のＴｏｕｃｈｅｔらの欧州特許明細書 ＥＰ ０ ６１９ ０７４号（化粧品及びクレンジングワイプ）； １９９０年１２月４日発行のＢｒｏｗｎ−Ｓｋｒｏｂｏｔらの米国特許第４，９７５，２１７号（化粧品及びクレンジングワイプ）； １９９２年３月１７日発行のＳｅｉｂｅｌの米国特許第５，０９６，７００号（口腔洗浄組成物）； １９９１年７月２日発行のＳａｍｐａｔｈｋｕｍａｒの米国特許第５，０２８，４１４号（口腔洗浄組成物）； １９９１年７月２日発行のＢｅｎｅｄｉｃｔらの米国特許第５，０２８，４１５号（口腔洗浄組成物）； １９９１年７月２日発行のＢｅｎｅｄｉｃｔらの米国特許第５，０２８，４１５号（口腔洗浄組成物）； １９８９年９月５日発行のＤａｖｉｅｓらの米国特許第４，８６３，６２７号（コンタクトレンズ洗浄液）； １９８８年５月２４日再発行のＨｕｔｈらの米国再発行特許第３２，６７２号（コンタクトレンズ洗浄液）；及び１９８６年９月２日発行のＳｃｈａｆｅｒの米国特許第４，６０９，４９３号（コンタクトレンズ洗浄液）。
【０１１９】
本融合タンパク質はまた、以下に記述されているパーソナルケア組成物における含有物として有用である：１９９８年３月２６日発行のＲｕｂｉｎｇｈらの米国仮特許出願第６０／０７９，４７７号；１９９８年３月２６日発行のＲｕｂｉｎｇｈらの米国仮特許出願第６０／０７９，３９７号；１９９８年３月２６日発行のＷｅｉｓｇｅｒｂｅｒらの米国特許出願第０９／０４８，１７４号；１９９８年６月２日出願の Ｗｅｉｓｇｅｒｂｅｒの米国特許第出願第０９／０４８，１７４号に優先権を主張した米国特許第出願第０９／０８８９１２号。
【０１２０】
本発明の口腔クリーニング組成物をさらに説明するために、本発明の１つ以上の融合タンパク質が、歯又は義歯からタンパク質性の汚れを除去するために有用な組成物中に含有される。ここで使用されるような「口腔クリーニング組成物」は、歯磨き剤、練り歯磨き、ジェル歯磨き、歯磨き粉、マウスウォッシュ、マウススプレー、マウスゲル、チューインガム、薬用ドロップ、香粉（サッシェ）、タブレット、バイオゲル、歯科掃除用ペースト、歯科治療液等をさす。
【０１２１】
典型的には、口腔クリーニング組成物の口腔クリーニング成分のパーソナルケア担体成分は、一般的に、組成物に対して約５０重量％〜約９９．９９重量％、好ましくは約６５重量％〜約９９．９９重量％、より好ましくは約６５重量％〜約９９重量％を構成し得る。
【０１２２】
本発明の口腔クリーニング組成物に含有されてもよいパーソナルケア担体成分及び任意成分は、当業者によく知られているものである。口腔クリーニング組成物に有用な広範な種類の組成物タイプ、担体成分及び任意成分は、上記引用文献に開示されている。
【０１２３】
本発明のその他の実施形態において、口腔外の義歯を洗浄するための義歯クリーニング組成物は、本発明の１つ以上の融合タンパク質を含む。そのような義歯クリーニング組成物は、１以上の本発明の融合タンパク質と、パーソナルケア担体とを含む。発泡性の錠剤等のような種々の義歯クレンジング組成物の形式等は、当業界でよく知られており（Ｙｏｕｎｇの米国特許第５，０５５，３０５号参照）、義歯からタンパク質性の汚れを除去するために１つ以上の融合タンパク質を組み込むことが概ね適切である。
【０１２４】
本発明のその他の実施形態において、コンタクトレンズクリーニング組成物は、本発明の１つ以上の変異体を含む。そのようなコンタクトレンズクリーニング組成物は、有効量の１つ以上の融合タンパク質と、パーソナルケア担体とを含む。錠剤、液体等のような種々のコンタクトレンズクリーニング組成物の形式等は、当業界でよく知られており、コンタクトレンズからタンパク質性の汚れを除去するために本発明の融合タンパク質の１つ以上を組み込むことが概ね適切である。
【０１２５】
実施例１４−１７
【０１２６】
【表１９】
2004500008.tif 000020
【０１２７】
実施例１４−１７において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、上記融合タンパク質と置換すると、実質的に同様の結果となる。
【０１２８】
実施例１８−２１
【０１２９】
【表２０】
2004500008.tif 000021
【０１３０】
実施例１８−２１において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、上記融合タンパク質と置換すると、実質的に同様の結果となる。
【０１３１】
実施例２２−２５
【０１３２】
【表２１】
2004500008.tif 000022
【０１３３】
実施例２２−２５において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、上記融合タンパク質と置換すると、実質的に同様の結果となる。
【０１３４】
実施例２６−２７
【０１３５】
【表２２】
2004500008.tif 000023
【０１３６】
実施例２６−２７において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、上記融合タンパク質と置換すると、実質的に同様の結果となる。
【０１３７】
実施例２８
【０１３８】
【表２３】
2004500008.tif 000024
【０１３９】
上記組成物を、セルロース及び／又はポリエステルで構成された織込み吸収シートに、吸収シートの約２５０重量％で染み込ませる。
実施例２８において、表７、８及び１０に列記された変異体及び、とりわけここで言及された好適変異体を、上記融合タンパク質と置換すると、実質的に同様の結果となる。
【国際公開パンフレット】
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2004500008.tif 000079
2004500008.tif 000080
2004500008.tif 000081
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500008.tif 000082
2004500008.tif 000083
【国際調査報告】
2004500008.tif 000084
2004500008.tif 000085
2004500008.tif 000086