(57)【要約】１またはそれ以上の検体の高感度検出用組成物および方法が開示される。一般的には、該方法は、レポーターシグナルといわれる特別な標識化合物を使用するものであり、レポーターシグナルは検体に会合、含有、あるいは連結されてもよい。いくつかの具体例において、レポーターシグナルを変化させて、変化して異なったレポーターシグナルの形態が互いに識別されるようにすることができる。いくつかの具体例において、レポーターシグナルのセットが互いに識別されうる。いくつかの具体例において、セット中の２またはそれ以上のレポーターシグナルが、共通の特性を有するレポーターシグナルが共通の特性を有しない他の分子から識別されそして／あるいは分離されるような１またはそれ以上の共通の特性を有する場合に、レポーターシグナルのセットを用いることができる。他の具体例において、セット中の２またはそれ以上のレポーターシグナル／検体抱合体が、共通の特性を有するレポーター／検体抱合体が共通の特性を有しない他の分子から識別されそして／あるいは分離されるような共通の特性を有する場合に、レポーターシグナル／検体抱合体を用いることができる。レポーターシグナルと検体との間に有意な物理的関連性が生じない場合であっても、レポーターシグナルを検体と抱合させることができ（レポーターシグナルと検体との混合物のような）、あるいは検体が存在しない場合には単独であってもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のレポーターシグナル（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｓｉｇｎａｌ）を含むレポーターシグナルのセットであって、
レポーターシグナルは共通する特性、すなわち、レポーターシグナルを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することを可能にする特性を有し、
レポーターシグナルを改変することができ、そしてそれぞれのレポーターシグナルの改変体はレポーターシグナルの他の改変体のそれぞれと識別できるものであるセット。
【請求項２】
共通する特性が質量電荷比（ｍａｓｓ−ｔｏ−ｃｈａｒｇｅ ｒａｔｉｏ）であり、レポーターシグナルはそれらの質量が変えられることによって改変され、レポーターシグナルの改変体をレポーターシグナルの改変体の質量電荷比の違いによって識別できる請求項１に記載のセット。
【請求項３】
レポーターシグナルの質量が断片化によって変えられる請求項２に記載のセット。
【請求項４】
レポーターシグナルの改変によってそれらの電荷も変化する請求項２に記載のセット。
【請求項５】
共通する特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルはそれらの電荷の変化によって改変され、標識化タンパク質の改変体をレポーターシグナルの改変体の質量電荷比の違いによって識別できる請求項１に記載のセット。
【請求項６】
請求項１に記載のセットであって、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なるレポーターシグナルを含むセット。
【請求項７】
セットが１０以上の異なるレポーターシグナルを含む請求項６に記載のセット。
【請求項８】
レポーターシグナルがペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ポリマー、オリゴペプチド又はペプチド核酸である請求項１に記載のセット。
【請求項９】
レポーターシグナルが特異的結合分子と会合するか又は結合し、それぞれのレポーターシグナルが異なる特異的結合分子と会合するか又は結合する請求項１に記載のセット。
【請求項１０】
レポーターシグナルがデコーディングタグ（ｃｏｄｉｎｇ ｔａｇ）と会合するか又は結合し、それぞれのレポーターシグナルが異なるデコーディングタグ（ｄｅｃｏｄｉｎｇ ｔａｇ）と会合するか又は結合する請求項１に記載のセット。
【請求項１１】
レポーターシグナルがペプチドを含み、ペプチドは同一の質量電荷比を有する請求項１に記載のセット。
【請求項１２】
ペプチドが同一のアミノ酸組成を有する請求項１１に記載のセット。
【請求項１３】
ペプチドが同一のアミノ酸配列を有する請求項１２に記載のセット。
【請求項１４】
それぞれのペプチドの重い同位体の分布が異なっている請求項１３に記載のセット。
【請求項１５】
それぞれのレポーターシグナルペプチドの置換基の分布が異なっている請求項１３に記載のセット。
【請求項１６】
それぞれのペプチドが異なるアミノ酸配列を有する請求項１２に記載のセット。
【請求項１７】
それぞれのペプチドが不安定な又は開裂しやすい結合を異なる位置に有する請求項１２に記載のセット。
【請求項１８】
レポーターシグナルがタンパク質又はペプチドに結合している請求項１に記載のセット。
【請求項１９】
共通する特性が、標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することを可能にする特性である請求項１に記載のセット。
【請求項２０】
共通する特性がアフィニティータグではない請求項１に記載のセット。
【請求項２１】
一つ以上のアフィニティータグがレポーターシグナルと会合する請求項２０に記載のセット。
【請求項２２】
（ａ）　それぞれのレポーターシグナルが共通する特性を有するところのレポーターシグナルのセットを、共通する特性を欠く分子から分離する工程、
（ｂ）　レポーターシグナルを改変する工程、
（ｃ）　レポーターシグナルの改変体を他のそれぞれの改変体から検出し、識別する工程
を含む方法。
【請求項２３】
共通する特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルはそれらの質量が変えられることによって改変を受けており、レポーターシグナルの改変体をレポーターシグナルの改変体の質量電荷比の違いによって識別する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
レポーターシグナルの質量が断片化によって変えられる請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
レポーターシグナルが、光で開裂可能なアミノ酸の位置で切断することによって改変を受ける請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
レポーターシグナルが衝突セル内で断片化する請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
レポーターシグナルがアスパラギン−プロリン結合の位置で断片化する請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
レポーターシグナルの改変によりそれらの電荷も変化する請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
共通する特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルの電荷の変化によりそれらが改変され、レポーターシグナルの改変体の質量電荷比の差異によって標識化タンパク質の改変体を識別することができる請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
レポーターシグナルのセットが、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なるレポーターシグナルを含む請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
レポーターシグナルのセットが、１０以上の異なるレポーターシグナルを含む請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
レポーターシグナルがペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ポリマー、オリゴペプチド又はペプチド核酸である請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
レポーターシグナルが特異的結合分子と会合するか又は結合し、それぞれのレポーターシグナルが異なる特異的結合分子と会合するか又は結合する請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
レポーターシグナルがデコーディングタグと会合するか又は結合し、それぞれのレポーターシグナルが異なるデコーディングタグと会合するか又は結合する請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
レポーターシグナルがペプチドを含み、該ペプチドは同一の質量電荷比を有する請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
ペプチドが同一のアミノ酸組成を有する請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
ペプチドが同一のアミノ酸配列を有する請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
それぞれのペプチドの重い同位体の分布が異なっている請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
それぞれのレポーターシグナルペプチドの置換基の分布が異なっている請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
それぞれのペプチドが異なるアミノ酸配列を有する請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
それぞれのペプチドが不安定な又は開裂しやすい結合を異なる位置に有する請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
レポーターシグナルがタンパク質又はペプチドに結合している請求項２２に記載の方法。
【請求項４３】
共通する特性が、標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することを可能にする特性である請求項２２に記載の方法。
【請求項４４】
共通する特性がアフィニティータグではない請求項２２に記載の方法。
【請求項４５】
一つ以上のアフィニティータグがレポーターシグナルと会合する請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
工程（ａ）の前に、
レポーターシグナルを一つ以上の検体と会合させる工程であって、
それぞれのレポーターシグナルが種々の特異的結合分子と会合又は結合し、それぞれの特異的結合分子が異なる検体のうちの一つと特異的な相互作用が可能であり、特異的結合分子の検体との相互作用を介して、レポーターシグナルが検体と会合する工程をさらに含む請求項２２に記載の方法。
【請求項４７】
工程（ａ）の前に、
一つ以上のレポーターシグナルを、一つ以上のサンプルのそれぞれからの一つ以上のタンパク質、一つ以上のペプチド、又は一つ以上のタンパク質及びペプチドと会合させる工程をさらに含む請求項２２に記載の方法。
【請求項４８】
レポーターシグナルが単一のサンプルと会合する請求項２２に記載の方法。
【請求項４９】
サンプルが分離手段によって生じ、分離手段が、液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、二次元クロマトグラフィー、二次元ゲル電気泳動、等電点電気泳動、薄層クロマトグラフィー、遠心分離、ろ過、イオンクロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、膜分離又はこれらの組み合わせを含む請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
それぞれの時点でのレポーターシグナルの異なるセットを用いて、工程（ａ）〜工程（ｃ）を一回以上繰り返す請求項２２に記載の方法。
【請求項５１】
工程（ａ）の前に、レポーターシグナルの異なるセットを異なるサンプルと会合させる請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
レポーターシグナルの異なるセットがそれぞれ同一のレポーターシグナルを含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
サンプルが分離手段によって生じ、分離手段が、液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、二次元クロマトグラフィー、二次元ゲル電気泳動、等電点電気泳動、薄層クロマトグラフィー、遠心分離、ろ過、イオンクロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、膜分離又はこれらの組み合わせを含む請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
異なるサンプルが同一のタンパク質サンプルからのものである請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
異なるサンプルを異なる時点で得る請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
異なるサンプルが同一のタイプの生物体からのものである請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
異なるサンプルが同一のタイプの組織からのものである請求項５１に記載の方法。
【請求項５８】
異なるサンプルが同一の生物体からのものである請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
異なるサンプルを異なる時点で得る請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
異なるサンプルが、異なる生物体からのものである請求項５１に記載の方法。
【請求項６１】
異なるサンプルが、異なるタイプの組織からのものである請求項５１に記載の方法。
【請求項６２】
異なるサンプルが、生物体の異なる種からのものである請求項５１に記載の方法。
【請求項６３】
異なるサンプルが、生物体の異なる系統からのものである請求項５１に記載の方法。
【請求項６４】
サンプルが異なる細胞区画（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）からのものである請求項５１に記載の方法。
【請求項６５】
ある一つのサンプルには存在するが他のサンプルには存在しないタンパク質又はペプチドに対応するタンパク質又はペプチドを同定する工程又は調製する工程をさらに含む請求項５１に記載の方法。
【請求項６６】
異なるサンプル中に存在するタンパク質又はペプチドの相対量を測定するする工程をさらに含む請求項５１に記載の方法。
【請求項６７】
レポーターシグナルのセットのそれぞれが単一のレポーターシグナルを含む請求項５０に記載の方法。
【請求項６８】
セットの中に存在するレポーターシグナルのすべてを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離するわけではなく、レポーターシグナルのすべてが改変を受けるわけではなく、そしてレポーターシグナルの改変体のすべてが同時に検出されるわけではない請求項２２に記載の方法。
【請求項６９】
共通する特性を欠く分子から、セット中のすべてのレポーターシグナルを識別又は分離し、すべてのレポーターシグナルが改変を受け、レポーターシグナルのすべての改変体を異なる時点で検出する請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
それぞれのレポーターシグナルについて個別に工程（ａ）〜工程（ｃ）を実施する請求項２２に記載の方法。
【請求項７１】
検出される標識化タンパク質の改変体が共同でタンパク質の目録を構成する請求項２２に記載の方法。
【請求項７２】
工程（ｂ）及び工程（ｃ）を同時に実施する請求項２２に記載の方法。
【請求項７３】
標的タンパク質断片の改変体を質量分析装置を用いて検出する請求項２２に記載の方法。
【請求項７４】
該工程をタンデム質量分析装置で実施する請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
タンデム質量分析装置が最初の段階及び最後の段階を含み、タンデム質量分析装置の最初の段階を利用して工程（ａ）を実施して質量電荷の狭い範囲のイオンを選択し、ガスによる衝突によって工程（ｂ）を実施し、そしてタンデム質量分析装置の最後の段階を利用して工程（ｃ）を実施する請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
タンデム質量分析装置の最初の段階が四重極質量フィルターである請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
タンデム質量分析装置の最後の段階が飛行時間アナライザーである請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
タンデム質量分析装置の最後の段階が飛行時間アナライザーである請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
それぞれの標的タンパク質断片の質量電荷比を網羅するために、質量電荷比の範囲を変える請求項７４に記載の方法。
【請求項８０】
（ａ）　レポーター分子のセットであって、それぞれのレポーター分子はレポーターシグナル及びデコーディングタグを含み、
レポーターシグナルは共通する特性、すなわち、レポーターシグナルを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することを可能とする特性を有し、
レポーターシグナルを改変することができ、そしてそれぞれのレポーターシグナルの改変体はレポーターシグナルの他の改変体のそれぞれと識別でき、
異なるレポーター分子のそれぞれは異なるデコーディングタグ及び異なるレポーターシグナルを含むものであるセット、
（ｂ）　コーディング分子のセットであって、それぞれのコーディング分子は特異的結合分子及びコーディングタグを含み、それぞれの特異的結合分子は異なる検体と特異的に相互作用することができ、それぞれのコーディングタグは異なるデコーディングタグと特異的に相互作用することができるものであるセットを含むキット。
【請求項８１】
（ａ）　それぞれのレポーターシグナルが共通する特性を有するところのレポーターシグナルの一つ以上を、複数のサンプルのそれぞれに存在する、共通する特性を欠く分子から分離する工程、
（ｂ）　レポーターシグナルを改変する工程、
（ｃ）　レポーターシグナルの改変体を他のそれぞれの改変体から検出し、識別する工程
を含む方法。
【請求項８２】
標識化タンパク質のセットであって、それぞれの標識化タンパク質はタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドに結合したレポーターシグナルとを含み、
レポーターシグナルは共通する特性であって、同一のタンパク質又はペプチドを含む標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することを可能とする特性を有し、
レポーターシグナルを改変することができ、レポーターシグナルのそれぞれの改変体はレポーターシグナルの他の改変体のそれぞれと識別でき、
レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が改変を受け、標識化タンパク質のそれぞれの改変体は標識化タンパク質の他の改変体のそれぞれと識別できるものである標識化タンパク質のセット。
【請求項８３】
レポーター分子のセットを含むキットであって、それぞれのレポーター分子はレポーターシグナル及びカップリングタグを含み、
レポーターシグナルは共通する特性、すなわち、レポーターシグナルを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することを可能とする特性を有し、
レポーターシグナルを改変することができ、レポーターシグナルのそれぞれの改変体はレポーターシグナルの他の改変体のそれぞれと識別でき、
異なるレポーター分子のそれぞれは異なるカップリングタグ及び異なるレポーターシグナルを含むものであるキット。
【請求項８４】
標識化タンパク質のセットであって、それぞれの標識化タンパク質はタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドに結合したレポーターシグナルとを含み、
標識化タンパク質は共通する特性、すなわち、同一のタンパク質又はペプチドを含む標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することを可能とする特性を有し、
レポーターシグナルを改変することができ、レポーターシグナルのそれぞれの改変体はレポーターシグナルの他の改変体のそれぞれと識別でき、
レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が改変を受け、標識化タンパク質のそれぞれの改変体は標識化タンパク質の他の改変体のそれぞれと識別できるものであるセット。
【請求項８５】
標識化タンパク質のセットであって、それぞれの標識化タンパク質はタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドに結合したレポーターシグナルとを含み、
レポーターシグナルを改変することができ、レポーターシグナルのそれぞれの改変体はレポーターシグナルの他の改変体のそれぞれと識別でき、
レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が改変を受け、標識化タンパク質のそれぞれの改変体は標識化タンパク質の他の改変体のそれぞれと識別できるものであるセット。
【請求項８６】
標識化タンパク質のセットであって、それぞれの標識化タンパク質はタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドに結合したレポーターシグナルとを含み、
レポーターシグナルは共通する特性を有し、共通する特性は、同一のタンパク質又はペプチドを含む標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することを可能とするものであるセット。
【請求項８７】
標識化タンパク質であって、標識化タンパク質はタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドに結合したレポーターシグナルとを含み、
標識化タンパク質は共通する特性を有し、その共通する特性によって、標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することを可能とし、
レポーターシグナルを改変することができ、
レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が改変を受け、標識化タンパク質の改変体を標識化タンパク質の非改変体から識別できるものである標識化タンパク質。
【請求項８８】
（ａ）　標識化タンパク質のセットを分離する工程であって、それぞれの標識化タンパク質はタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドに結合したレポーターシグナルとを含み、
それぞれのレポーターシグナルは共通する特性であって、同一のタンパク質又はペプチドを含む標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することを可能にする特性を有する工程、
（ｂ）　レポーターシグナルを改変し、それによって標識化タンパク質を改変する工程、
（ｃ）　標識化タンパク質の改変体を他のそれぞれの改変体から検出し、識別する工程
を含む方法。
【請求項８９】
工程（ａ）の前に、レポーターシグナルを、一つ以上のタンパク質、一つ以上のペプチド、又は一つ以上のタンパク質及びペプチドに結合する工程をさらに含む請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
それぞれの時点でのレポーターシグナルの異なるセットを用いて、工程を一回以上繰り返す請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
工程（ａ）の前に、レポーターシグナルの異なるセットを異なるサンプル中のタンパク質又はペプチドに結合する請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
レポーターシグナルの異なるセットがそれぞれ同一のレポーターシグナルを含む請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
レポーターシグナルのセットのそれぞれが単一のレポーターシグナルを含む請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、
レポーターシグナルがペプチドを含み、レポーターシグナルペプチドが同一の質量電荷比を有する標識化タンパク質のセット。
【請求項９５】
（ａ）　一つ以上の標識化タンパク質を分離する工程であって、それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、それぞれのレポーターシグナルが共通する特性を有し、共通する特性により、一つ以上のサンプルのそれぞれの中において、同一のタンパク質又はペプチドを含む標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となる工程、
（ｂ）　レポーターシグナルを改変して、それにより標識化タンパク質を改変する工程、
（ｃ）　標識化タンパク質の改変体を他のそれぞれのものから検出し識別する工程
を含む方法。
【請求項９６】
サンプルのうちの一つの標識化タンパク質の存在、量、存在および量又は欠如のパターンが、サンプル中のタンパク質の目録を構成する請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
二番目のサンプルの標識化タンパク質の存在、量、存在および量又は欠如のパターンが二番目のサンプル中のタンパク質の目録を構成し、最初のサンプル中のタンパク質の目録が最初の目録であり、そして二番目のサンプル中のタンパク質の目録が二番目の目録であり、
そして最初の目録と二番目の目録とを比較する工程をさらに含む請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
（ａ）　標識化タンパク質のセットを分離する工程であって、それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、
それぞれの標識化タンパク質が共通する特性を有し、共通する特性により、同一のタンパク質又はペプチドを含む標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となる工程、
（ｂ）　レポーターシグナルを改変して、それにより標識化タンパク質を改変する工程、
（ｃ）　標識化タンパク質の改変体を他のそれぞれのものから検出し識別する工程を含む方法。
【請求項９９】
（ａ）　標識化タンパク質を改変する工程であって、それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が改変を受ける工程、
（ｂ）　標識化タンパク質の改変体を他のそれぞれのものから検出し識別する工程
を含む方法。
【請求項１００】
（ａ）標識化タンパク質を改変する工程であって、標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が改変を受ける工程、
（ｂ）　標識化タンパク質の改変体を標識化タンパク質の非改変体から検出し識別する工程
を含む、タンパク質又はペプチドを検出する方法。
【請求項１０１】
標識化タンパク質の非改変体を検出する工程をさらに含む請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
標識化タンパク質を検出する工程であって、標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が改変を受ける工程、
標識化タンパク質の改変体を検出する工程であって、レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が改変を受ける工程、並びに
標識化タンパク質及び標識化タンパク質の改変体の特徴に基づいてタンパク質を同定する工程を含むタンパク質を検出する方法。
【請求項１０３】
標識化タンパク質の質量電荷比及び標識化タンパク質の改変体の質量電荷比又はレポーターシグナルの改変体の質量電荷比を検出することによって、標識化タンパク質及び標識化タンパク質の改変体を検出する請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
（ａ）　他の分子から一つ以上の標識化タンパク質を分離する工程であって、標識化タンパク質が一つ以上のサンプルに由来し、それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含む工程、
（ｂ）　レポーターシグナルを改変して、それにより標識化タンパク質を改変する工程、
（ｃ）　標識化タンパク質の改変体を他のそれぞれのものから検出し識別する工程
を含む方法。
【請求項１０５】
工程（ａ）の前に、
一つ以上のレポーターシグナルを、一つ以上のサンプルのそれぞれからの一つ以上のタンパク質、一つ以上のペプチド、又は一つ以上のタンパク質及びペプチドと会合させる工程をさらに含む請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
一つ以上の標識化タンパク質が単一のサンプルに由来する請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
単一の標識化タンパク質を他の分子から識別又は分離する請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
複数の標識化タンパク質を他の分子から識別又は分離する請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
検出された標識化タンパク質の改変体がサンプル中のタンパク質の目録を構成する請求項１０６に記載の方法。
【請求項１１０】
一つ以上の標識化タンパク質が複数のサンプルのそれぞれに由来する請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１１】
それぞれのサンプルに由来する単一の標識化タンパク質を他の分子から識別又は分離する請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
それぞれのサンプルに由来する複数の標識化タンパク質を他の分子から識別又は分離する請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１３】
検出された、それぞれのサンプルに由来する標識化タンパク質の改変体が、サンプル中のタンパク質の目録を構成する請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１４】
（ａ）　他の分子から一つ以上の標識化タンパク質を分離する工程であって、標識化タンパク質がサンプルに由来し、それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含む工程、
（ｂ）　レポーターシグナルを改変して、それにより標識化タンパク質を改変する工程、
（ｃ）　標識化タンパク質の改変体を他のそれぞれのものから検出し識別する工程
によって検出される、サンプル中のタンパク質及びペプチドを含むタンパク質及びペプチドの目録。
【請求項１１５】
（ａ）　他の分子から一つ以上の標識化タンパク質を分離する工程であって、標識化タンパク質が一つ以上のサンプルに由来し、それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含む工程、
（ｂ）　レポーターシグナルを改変して、それにより標識化タンパク質を改変する工程、
（ｃ）　標識化タンパク質の改変体を他のそれぞれのものから検出し識別する工程
によって検出される、一つ以上のサンプル中のタンパク質及びペプチドを含むタンパク質及びペプチドの目録。
【請求項１１６】
（ａ）　タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を生産する工程であって、
タンパク質断片が標的タンパク質断片のセットを含み、標的タンパク質断片を改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体を標的タンパク質断片の他の改変体から識別できる工程、
（ｂ）　標的タンパク質断片をレポーターシグナルキャリブレーターのセットと混合する工程であって、
それぞれの標的タンパク質断片が、少なくとも一つのレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、
レポーターシグナルキャリブレーターを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができる工程、
（ｃ）　標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターの共通する特性に基づいて、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、他の分子から分離する工程、
（ｄ）　標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを改変する工程、
（ｅ）　標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を検出する工程であって、
標的タンパク質断片の改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、タンパク質サンプル中の、標的タンパク質断片の改変体が由来するところの標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を示し、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量がタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する工程
を含む、タンパク質シグニチャーを得るための方法。
【請求項１１７】
予め定められた量のレポーターシグナルキャリブレーターを標的タンパク質断片と混合し、検出されるレポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれの量が、対応する標的タンパク質断片の改変体の量を評価するための標準を提供する請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
少なくとも二つのレポーターシグナルキャリブレーターの量が異なる請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの相対量が、タンパク質サンプル中にあると予想される、対応するそれぞれの標的タンパク質断片の相対量に基づく請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２０】
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの量が同一である請求項１１７に記載の方法。
【請求項１２１】
タンパク質サンプルのプロテアーゼ消化によりタンパク質断片を生産する請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２２】
セリンプロテアーゼによるタンパク質サンプルの消化によってタンパク質断片を生産する請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
セリンプロテアーゼがトリプシンである請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
因子Ｘａ又はエンテロキナーゼによるタンパク質サンプルの消化によってタンパク質断片を生産する請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２５】
光で開裂可能なアミノ酸の位置での切断によってタンパク質断片を生産する請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２６】
標的タンパク質断片のセットが、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なる標的タンパク質断片を含む請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２７】
タンパク質シグニチャーを一つ以上の他のタンパク質シグニチャーと比較する工程をさらに含む請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２８】
少なくとも一つの標的タンパク質断片が、少なくとも一つの修飾されたアミノ酸を含む請求項１１６に記載の方法。
【請求項１２９】
修飾されたアミノ酸が、リン酸化アミノ酸、アシル化アミノ酸又はグリコシル化アミノ酸である請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
少なくとも一つの標的タンパク質断片が、修飾されたアミノ酸を含む標的タンパク質断片と、修飾されたアミノ酸以外の点で同一である請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
コントロールタンパク質サンプルに関して工程（ａ）〜工程（ｅ）を実施する工程、
タンパク質サンプルとコントロールタンパク質サンプルとから生じるタンパク質シグニチャー間の差異を確認する工程
をさらに含む請求項１１６に記載の方法。
【請求項１３２】
複数のタンパク質サンプルに関して工程（ａ）〜工程（ｅ）を実施する工程をさらに含む請求項１１６に記載の方法。
【請求項１３３】
タンパク質サンプルから生じるタンパク質シグニチャー間の差異を確認する工程をさらに含む請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
コントロールタンパク質サンプルに関して工程（ａ）〜工程（ｅ）を実施する工程、
タンパク質サンプルとコントロールタンパク質サンプルとから生じるタンパク質シグニチャー間の差異を確認する工程
をさらに含む請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３５】
差異が、タンパク質サンプル及びコントロールタンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、量、存在および量又は欠如についての差異である請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
コントロールタンパク質サンプル及びテスタータンパク質サンプルに関して工程（ａ）〜工程（ｅ）が実施され、
テスタータンパク質サンプル中の一つ以上のタンパク質分子を破壊、分裂又は除去できるように、テスタータンパク質サンプル又はテスタータンパク質サンプルの起源を工程（ａ）の前に処理し、
破壊され、分裂し又は除去されたタンパク質分子に対応する標的タンパク質断片が、テスタータンパク質サンプルからではなくコントロールタンパク質サンプルから生じることになる請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３７】
テスタータンパク質サンプル中の一つ以上のタンパク質分子を破壊、分裂又は除去できるように、テスタータンパク質サンプルを処理する請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
テスタータンパク質サンプルから一つ以上のタンパク質分子を分離することによって、テスターサンプル中の一つ以上のタンパク質分子を除去する請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
アフィニティー分離によって一つ以上のタンパク質分子を分離する請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
テスタータンパク質サンプル中の一つ以上のタンパク質分子を破壊、分裂又は除去できるように、テスタータンパク質サンプルの起源を処理する請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４１】
一つ以上の遺伝子の発現を減少させるか又は除去する化合物、組成物又は状態に、テスターサンプルが由来するところの細胞をさらすことによって、起源への処理を成し遂げる請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
コントロールタンパク質サンプル及びテスタータンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の差異を確認する工程をさらに含む請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４３】
タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片間の差異を確認する工程をさらに含む請求項１３２に記載の方法。
【請求項１４４】
複数のタンパク質サンプルが分離手段によって生じ、分離手段は、液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、二次元クロマトグラフィー、二次元ゲル電気泳動、等電点電気泳動、薄層クロマトグラフィー、遠心分離、ろ過、イオンクロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、膜分離又はこれらの組み合わせを含む請求項１３２に記載の方法。
【請求項１４５】
タンパク質サンプルが、同一の分離手段によって生産される異なる画分又は異なるサンプルである請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
二番目のタンパク質サンプルに関して工程（ａ）〜工程（ｅ）を実施する工程をさらに含む請求項１１６に記載の方法。
【請求項１４７】
二番目のタンパク質サンプルからの二番目のタンパク質シグニチャーを得る工程、及び最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとを比較する工程であって、最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとの差異が、最初のタンパク質サンプルと二番目のタンパク質サンプルとの起源又は起源の条件の差異を示す工程をさらに含む請求項１１６に記載の方法。
【請求項１４８】
二番目のタンパク質サンプルからの二番目のタンパク質シグニチャーを得る工程、及び最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとを比較する工程であって、最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとの差異が、最初のタンパク質サンプルと二番目のタンパク質サンプルとのタンパク質修飾の差異を示す工程をさらに含む請求項１１６に記載の方法。
【請求項１４９】
最初のタンパク質サンプルが由来するところの細胞が、二番目のタンパク質サンプルが由来するところの細胞に比較して修飾が不完全なものであることを除いて、二番目のタンパク質サンプルが最初のタンパク質サンプルと同一のタイプの細胞からのサンプルである請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
二番目のタンパク質サンプルが最初のタンパク質サンプルと異なるタイプの細胞からのサンプルであり、最初のタンパク質サンプルが由来するところの細胞が、二番目のタンパク質サンプルが由来するところの細胞に比較して修飾が不完全なものである請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５１】
タンパク質サンプルが一つ以上の細胞に由来する請求項１１６に記載の方法。
【請求項１５２】
タンパク質シグニチャーが細胞の生理的状態を示す請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
タンパク質シグニチャーが細胞の処理の効果を示す請求項１５１に記載の方法。
【請求項１５４】
細胞が生物体に由来し、細胞が生物体を処理することによって処理される請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
生物体に化合物を与えることによって生物体を処理する請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
生物体がヒトである請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５７】
タンパク質サンプルが分離手段によって生じ、分離手段は、液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、二次元クロマトグラフィー、二次元ゲル電気泳動、等電点電気泳動、薄層クロマトグラフィー、遠心分離、ろ過、イオンクロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、膜分離又はこれらの組み合わせを含む請求項１１６に記載の方法。
【請求項１５８】
レポーターシグナルキャリブレーターのセットが単一のレポーターシグナルキャリブレーターから成る請求項１１６に記載の方法。
【請求項１５９】
タンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーが、タンパク質サンプル中の、レポーターシグナルキャリブレーターに対応する標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を意味する請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を検出する工程であって、
標的タンパク質断片の改変体を標的タンパク質断片の他の改変体から識別でき、それぞれの標的タンパク質断片が、少なくとも一つのレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができ、
標的タンパク質断片の改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、タンパク質サンプル中の、標的タンパク質断片の改変体が由来するところの標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を示し、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量がタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する工程を含むタンパク質シグニチャーを得る方法。
【請求項１６１】
標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターの共通する特性に基づいて、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、他の分子から識別又は分離する請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６２】
分離の後で標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを改変する請求項１６１に記載の方法。
【請求項１６３】
タンパク質サンプルの処理によって標的タンパク質断片を生産する請求項１６０に記載の方法。
【請求項１６４】
（ａ）　タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を生産する工程であって、
タンパク質断片が標的タンパク質断片のセットを含み、標的タンパク質断片を改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体を標的タンパク質断片の他の改変体から識別できる工程、
（ｂ）　タンパク質サンプル中の他のタンパク質断片から標的タンパク質断片を分離する工程、
（ｃ）　標的タンパク質断片を改変する工程、
（ｄ）　標的タンパク質断片の改変体を検出する工程であって、
標的タンパク質断片の改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、タンパク質サンプル中の、標的タンパク質断片の改変体が由来するところの標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を示し、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量がタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する工程
を含む、タンパク質シグニチャーを得る方法。
【請求項１６５】
工程（ｂ）の前に又は工程（ｂ）と同時に、標的タンパク質断片をレポーターシグナルキャリブレーターのセットと混合する工程であって、
それぞれの標的タンパク質断片が、少なくとも一つのレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルキャリブレーターを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができる工程をさらに含む請求項１６４に記載の方法。
【請求項１６６】
（ａ）　タンパク質サンプル中の他のタンパク質断片から複数の標的タンパク質断片を分離する工程、
（ｂ）　標的タンパク質断片を改変する工程、
（ｃ）　標的タンパク質断片の改変体を検出する工程であって、
標的タンパク質断片の改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、タンパク質サンプル中の、標的タンパク質断片の改変体が由来するところの標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を示し、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量がタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する工程
を含む、タンパク質シグニチャーを得る方法。
【請求項１６７】
（ａ）　タンパク質サンプルを予め定められた量のレポーターシグナルキャリブレーターと混合する工程であって、
タンパク質サンプルが既知量のタンパク質を有し、タンパク質サンプルが標的タンパク質断片を含み、
標的タンパク質断片を改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体を、標的タンパク質断片の改変体から識別することができる工程、
（ｂ）　標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを改変する工程、
（ｃ）　標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を検出する工程
を含む、タンパク質サンプルを分析する方法。
【請求項１６８】
標的タンパク質断片の量の割合と検出されるレポーターシグナルキャリブレーターの量の割合とを測定する工程、
標的タンパク質断片の量及びレポーターシグナルキャリブレーターの量の測定された割合と予想される割合とを比較する工程であって、
予想される割合が、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の予想される量とレポーターシグナルキャリブレーターの予め定められた量とに基づくものであり、標的タンパク質断片の予想される量が、タンパク質サンプル中の既知量のタンパク質が標的タンパク質断片から成る場合にタンパク質サンプルが有している標的タンパク質断片の量であり、
測定された割合と予想される割合との差異が、標的タンパク質断片についてのタンパク質サンプルの純度の指標であり、測定された割合が予想される割合に近ければ近いほど、タンパク質サンプルがより純粋である工程
をさらに含む請求項１６７に記載の方法。
【請求項１６９】
（ａ）　タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を生産する工程であって、タンパク質サンプルが既知量のタンパク質を有し、タンパク質サンプルが標的タンパク質を含み、タンパク質断片が標的タンパク質に由来する標的タンパク質断片を含む工程、
（ｂ）　タンパク質サンプルを、予め定められた量のレポーターシグナルキャリブレーターと混合する工程であって、
標的タンパク質断片を改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体を、標的タンパク質断片の改変体から識別することができる工程、
（ｂ）　標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを改変する工程、
（ｃ）　標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を検出する工程
を含む、タンパク質サンプルを分析する方法。
【請求項１７０】
標的タンパク質断片の量の割合と検出されるレポーターシグナルキャリブレーターの量の割合とを測定する工程、
標的タンパク質断片の量及びレポーターシグナルキャリブレーターの量の測定された割合と予想される割合とを比較する工程であって、
予想される割合が、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の予想される量とレポーターシグナルキャリブレーターの予め定められた量とに基づくものであり、標的タンパク質断片の予想される量が、タンパク質サンプル中の既知量のタンパク質が標的タンパク質から成る場合にタンパク質サンプルが有している標的タンパク質断片の量であり、
測定された割合と予想される割合との差異が、標的タンパク質についてのタンパク質サンプルの純度の指標であり、測定された割合が予想される割合に近ければ近いほど、タンパク質サンプルがより純粋である工程をさらに含む請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターが、標的タンパク質断片のセットの中の標的タンパク質断片と共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、
標的タンパク質断片を改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体を、標的タンパク質断片の他の改変体から識別することができ、
レポーターシグナルキャリブレーターを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができる、レポーターシグナルキャリブレーターのセット。
【請求項１７２】
予め定められた量のレポーターシグナルキャリブレーターを含む請求項１７１に記載のセット。
【請求項１７３】
少なくとも二つのレポーターシグナルキャリブレーターの量が異なる請求項１７２に記載のセット。
【請求項１７４】
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの相対量が、タンパク質サンプル中にあると予想される、対応するそれぞれの標的タンパク質断片の相対量に基づく請求項１７２に記載のセット。
【請求項１７５】
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの量が同一である請求項１７２に記載のセット。
【請求項１７６】
（ａ）　レポーターシグナルキャリブレーターのセットであって、
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターが、標的タンパク質断片のセットの中の標的タンパク質断片と共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、
標的タンパク質断片を改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体を、標的タンパク質断片の他の改変体から識別することができ、
レポーターシグナルキャリブレーターを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができるセット、
（ｂ）　タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を生産するための一つ以上の試薬
を含む、タンパク質シグニチャーを得るためのキット。
【請求項１７７】
レポーターシグナルキャリブレーターのセット及び標的タンパク質断片のセットを含む混合物であって、
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターが、標的タンパク質断片のセットの中の標的タンパク質断片と共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、
標的タンパク質断片を改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体を、標的タンパク質断片の他の改変体から識別することができ、
レポーターシグナルキャリブレーターを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができるセットを含む混合物。
【請求項１７８】
それぞれの標的タンパク質断片が、レポーターシグナルキャリブレーターのセットの中のレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、
標的タンパク質断片を改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体を、標的タンパク質断片の他の改変体から識別することができ、
レポーターシグナルキャリブレーターを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができる、標的タンパク質断片のセット。
【請求項１７９】
（ａ）　タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を生産する工程であって、
タンパク質断片が標的タンパク質断片のセットを含み、標的タンパク質断片のそれぞれを改変することが可能であり、標的タンパク質断片のそれぞれの改変体を標的タンパク質断片の他のすべての改変体から識別できる工程、
（ｂ）　標的タンパク質断片をレポーターシグナルキャリブレーターのセットと混合する工程であって、
それぞれの標的タンパク質断片が、少なくとも一つのレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、
レポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを改変することが可能であり、それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができる工程、
（ｃ）　標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターの共通する特性に基づいて、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、他の分子から分離する工程、
（ｄ）　標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを改変する工程、
（ｅ）　標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を検出する工程であって、
標的タンパク質断片の改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、タンパク質サンプル中の、標的タンパク質断片の改変体が由来するところの標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を示し、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量がタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する工程
を含む、タンパク質シグニチャーを得る方法。
【請求項１８０】
標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を検出する工程であって、
標的タンパク質断片の改変体のそれぞれを標的タンパク質断片の改変体の他のすべてから識別することができ、それぞれの標的タンパク質断片が、少なくとも一つのレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができ、
標的タンパク質断片の改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、タンパク質サンプル中の、標的タンパク質断片の改変体が由来するところの標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を示し、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量がタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する工程を含む、タンパク質シグニチャーを得る方法。
【請求項１８１】
（ａ）　タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を生産する工程であって、
タンパク質断片が標的タンパク質断片のセットを含み、標的タンパク質断片のそれぞれを改変することが可能であり、標的タンパク質断片のそれぞれの改変体を標的タンパク質断片の他のすべての改変体から識別できる工程、
（ｂ）　タンパク質サンプル中の他のタンパク質断片から標的タンパク質断片を分離する工程、
（ｃ）　標的タンパク質断片を改変する工程、
（ｄ）　標的タンパク質断片の改変体を検出する工程であって、
標的タンパク質断片の改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、タンパク質サンプル中の、標的タンパク質断片の改変体が由来するところの標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を示し、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量がタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する工程を含む、タンパク質シグニチャーを得る方法。
【請求項１８２】
工程（ｂ）の前に又は工程（ｂ）と同時に、標的タンパク質断片をレポーターシグナルキャリブレーターのセットと混合する工程であって、
それぞれの標的タンパク質断片が、少なくとも一つのレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができる工程をさらに含む、請求項１８１に記載の方法。
【請求項１８３】
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターが、標的タンパク質断片のセットの中の標的タンパク質断片と共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、
標的タンパク質断片のそれぞれを改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体のそれぞれを、標的タンパク質断片の他のすべての改変体から識別することができ、
レポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができる、レポーターシグナルキャリブレーターのセット。
【請求項１８４】
（ａ）　レポーターシグナルキャリブレーターのセットであって、
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターが、標的タンパク質断片のセットの中の標的タンパク質断片と共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、
標的タンパク質断片のそれぞれを改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体のそれぞれを、標的タンパク質断片の他のすべての改変体から識別することができ、
レポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができるセット、
（ｂ）　タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を生産するための一つ以上の試薬
を含む、タンパク質シグニチャーを得るためのキット。
【請求項１８５】
レポーターシグナルキャリブレーターのセット及び標的タンパク質断片のセットを含む混合物であって、
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターが、標的タンパク質断片のセットの中の標的タンパク質断片と共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、
標的タンパク質断片のそれぞれを改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体のそれぞれを、標的タンパク質断片の他のすべての改変体から識別することができ、
レポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができるセットを含む混合物。
【請求項１８６】
それぞれの標的タンパク質断片が、レポーターシグナルキャリブレーターのセットの中のレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、
標的タンパク質断片のそれぞれを改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体のそれぞれを、標的タンパク質断片の他のすべての改変体から識別することができ、
レポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができる標的タンパク質断片のセット。
【請求項１８７】
それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができる、核酸分子のセット。
【請求項１８８】
それぞれの核酸分子がさらに発現配列を含むものであって、アミノ酸セグメントが発現できるように、発現配列が機能できる状態でヌクレオチドセグメントに結合している請求項１８７に記載のセット。
【請求項１８９】
発現配列が翻訳発現配列を含む請求項１８８に記載のセット。
【請求項１９０】
発現配列がさらに転写発現配列を含む請求項１８９に記載のセット。
【請求項１９１】
アミノ酸セグメントがインビトロで発現される請求項１８８に記載のセット。
【請求項１９２】
アミノ酸セグメントがインビボで発現される請求項１８８に記載のセット。
【請求項１９３】
アミノ酸セグメントが細胞培養中に発現される請求項１９２に記載のセット。
【請求項１９４】
それぞれの核酸分子の発現配列が異なっている請求項１８８に記載のセット。
【請求項１９５】
異なる発現配列が異なって調節される請求項１９４に記載のセット。
【請求項１９６】
発現配列が同じように調節される請求項１９４に記載のセット。
【請求項１９７】
複数の発現配列が、同一の発現カスケードの一部として発現される遺伝子の発現配列か、又は遺伝子に由来する発現配列である請求項１９６に記載のセット。
【請求項１９８】
それぞれの核酸分子の発現配列が同一である請求項１８８に記載のセット。
【請求項１９９】
発現配列が同じように調節される請求項１９８に記載のセット。
【請求項２００】
少なくとも二つの核酸分子の発現配列が異なっている請求項１８８に記載のセット。
【請求項２０１】
少なくとも二つの核酸分子の発現配列が同一である請求項１８８に記載のセット。
【請求項２０２】
それぞれの核酸分子がさらに複製配列を含むものであって、複製配列により核酸分子の複製が可能となる請求項１８７に記載のセット。
【請求項２０３】
核酸分子がインビトロで複製される請求項２０２に記載のセット。
【請求項２０４】
核酸分子がインビボで複製される請求項２０２に記載のセット。
【請求項２０５】
核酸分子が細胞培養中に複製される請求項２０４に記載のセット。
【請求項２０６】
それぞれの核酸分子がさらに組み込み配列を含むものであって、組み込み配列は核酸分子の他の核酸への組み込みを可能なものにする請求項１８７に記載のセット。
【請求項２０７】
核酸分子が染色体に組み込まれている請求項２０６に記載のセット。
【請求項２０８】
核酸分子が染色体の予め決定された位置に組み込まれている請求項２０７に記載のセット。
【請求項２０９】
一つ以上の核酸サンプル中で核酸を複製することにより核酸分子を生産する請求項１８７に記載のセット。
【請求項２１０】
プライマーのペアを用いて核酸を複製し、核酸分子の生産に用いられるプライマーのペアにおける最初のプライマーのそれぞれがレポーターシグナルペプチドをコード化しているヌクレオチド配列を含む請求項２０９に記載のセット。
【請求項２１１】
それぞれの最初のプライマーがさらに発現配列を含む請求項２１０に記載のセット。
【請求項２１２】
最初のプライマーのそれぞれのヌクレオチド配列がエピトープタグをもコード化している請求項２１１に記載のセット。
【請求項２１３】
それぞれのアミノ酸セグメントがさらにエピトープタグを含む請求項１８７に記載のセット。
【請求項２１４】
それぞれのアミノ酸セグメントのエピトープタグが異なっている請求項２１３に記載のセット。
【請求項２１５】
それぞれのアミノ酸セグメントのエピトープタグが同一である請求項２１３に記載のセット。
【請求項２１６】
少なくとも二つのアミノ酸セグメントのエピトープタグが異なっている請求項２１３に記載のセット。
【請求項２１７】
少なくとも二つのアミノ酸セグメントのエピトープタグが同一である請求項２１３に記載のセット。
【請求項２１８】
それぞれのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが異なっている請求項１８７に記載のセット。
【請求項２１９】
それぞれのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが同一である請求項１８７に記載のセット。
【請求項２２０】
少なくとも二つのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが異なっている請求項１８７に記載のセット。
【請求項２２１】
少なくとも二つのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが同一である請求項１８７に記載のセット。
【請求項２２２】
核酸分子が細胞中に存在する請求項１８７に記載のセット。
【請求項２２３】
それぞれの核酸分子が異なる細胞内に存在する請求項２２２に記載のセット。
【請求項２２４】
それぞれの核酸分子が同一の細胞内に存在する請求項２２２に記載のセット。
【請求項２２５】
それぞれの核酸分子がさらに発現配列を含むものであって、アミノ酸セグメントが発現できるように、発現配列が機能できる状態でヌクレオチドセグメントに結合している請求項２２４に記載のセット。
【請求項２２６】
それぞれの核酸分子の発現配列が異なる請求項２２５に記載のセット。
【請求項２２７】
発現配列が同じように調節される請求項２２６に記載のセット。
【請求項２２８】
複数の発現配列が、同一の発現カスケードの一部として発現される遺伝子の発現配列か、又は遺伝子に由来する発現配列である請求項２２７に記載のセット。
【請求項２２９】
核酸分子が細胞の染色体内に組み込まれている請求項２２２に記載のセット。
【請求項２３０】
核酸分子が染色体の予め決定された位置に組み込まれている請求項２２９に記載のセット。
【請求項２３１】
染色体が人工染色体である請求項２２９に記載のセット。
【請求項２３２】
核酸分子がプラスミドか又はプラスミド内に組み込まれている請求項２２２に記載のセット。
【請求項２３３】
細胞が細胞系に属する請求項２２２に記載のセット。
【請求項２３４】
それぞれの核酸分子が異なる細胞系内に存在する請求項２３３に記載のセット。
【請求項２３５】
それぞれの核酸分子が同一の細胞系内に存在する請求項２３３に記載のセット。
【請求項２３６】
核酸分子が生物体内に存在する請求項１８７に記載のセット。
【請求項２３７】
それぞれの核酸分子が異なる生物体内に存在する請求項２３６に記載のセット。
【請求項２３８】
それぞれの核酸分子が同一の生物体内に存在する請求項２３６に記載のセット。
【請求項２３９】
それぞれの核酸分子がさらに発現配列を含むものであって、アミノ酸セグメントが発現できるように、発現配列が機能できる状態でヌクレオチドセグメントに結合している請求項２３８に記載のセット。
【請求項２４０】
それぞれの核酸分子の発現配列が異なる請求項２３９に記載のセット。
【請求項２４１】
発現配列が同じように調節される請求項２４０に記載のセット。
【請求項２４２】
複数の発現配列が、同一の発現カスケードの一部として発現される遺伝子の発現配列か、又は遺伝子に由来する発現配列である請求項２４１に記載のセット。
【請求項２４３】
核酸分子が生物体の染色体内に組み込まれている請求項２３６に記載のセット。
【請求項２４４】
核酸分子が染色体の予め決定された位置に組み込まれている請求項２４３に記載のセット。
【請求項２４５】
染色体が人工染色体である請求項２４３に記載のセット。
【請求項２４６】
核酸分子がプラスミドか又はプラスミド内に組み込まれている請求項２３６に記載のセット。
【請求項２４７】
それぞれの核酸分子が異なる生物体内に存在する請求項２３６に記載のセット。
【請求項２４８】
それぞれの核酸分子が同一の生物体内に存在する請求項２３６に記載のセット。
【請求項２４９】
核酸分子が生物体の細胞内に存在する請求項１８７に記載のセット。
【請求項２５０】
核酸分子が生物体の実質的にすべての細胞内に存在する請求項２４９に記載のセット。
【請求項２５１】
核酸分子が生物体のいくつかの細胞内に存在する請求項２４９に記載のセット。
【請求項２５２】
アミノ酸セグメントが生物体の実質的にすべての細胞内で発現される請求項２４９に記載のセット。
【請求項２５３】
アミノ酸セグメントが生物体のいくつかの細胞内で発現される請求項２４９に記載のセット。
【請求項２５４】
それぞれのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている請求項１８７に記載のセット。
【請求項２５５】
それぞれのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが同一である請求項１８７に記載のセット。
【請求項２５６】
少なくとも二つのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている請求項１８７に記載のセット。
【請求項２５７】
少なくとも二つのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが同一である請求項１８７に記載のセット。
【請求項２５８】
対象となっているタンパク質又はペプチドが関連性を有するものである請求項２５４に記載のセット。
【請求項２５９】
対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一のカスケードで生成するタンパク質である請求項２５８に記載のセット。
【請求項２６０】
対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一の条件の下で発現されるタンパク質である請求項２５８に記載のセット。
【請求項２６１】
対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一の疾患に関連しているタンパク質である請求項２５８に記載のセット。
【請求項２６２】
対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一の細胞のタイプに関連しているタンパク質である請求項２５８に記載のセット。
【請求項２６３】
対象となっているタンパク質又はペプチドが同一の組織のタイプに関連しているタンパク質である請求項２５８に記載のセット。
【請求項２６４】
対象となっているタンパク質又はペプチドが同一の酵素経路中のタンパク質である請求項２５８に記載のセット。
【請求項２６５】
ヌクレオチドセグメントが、アミノ酸セグメントのそれぞれがレポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むところの複数のアミノ酸セグメントをコード化している請求項１８７に記載のセット。
【請求項２６６】
ヌクレオチドセグメントのうちの一つの中の少なくとも二つのアミノ酸セグメントの対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている請求項２６５に記載のセット。
【請求項２６７】
ヌクレオチドセグメントのうちの一つの中のアミノ酸セグメントの対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている請求項２６５に記載のセット。
【請求項２６８】
ヌクレオチドセグメントのうちのそれぞれの中の少なくとも二つのアミノ酸セグメントの対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている請求項２６５に記載のセット。
【請求項２６９】
ヌクレオチドセグメントのうちのそれぞれの中のアミノ酸セグメントの対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている請求項２６５に記載のセット。
【請求項２７０】
セットが単一の核酸分子から成る請求項２６５に記載のセット。
【請求項２７１】
セットが単一の核酸分子から成り、核酸分子が、ヌクレオチドセグメントのそれぞれがアミノ酸セグメントをコード化しているところの複数のヌクレオチドセグメントを含む請求項１８７に記載のセット。
【請求項２７２】
アミノ酸セグメントが、レポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとの間の結合部の近傍の開裂部位を含む請求項１８７に記載のセット。
【請求項２７３】
開裂部位がトリプシン開裂部位である請求項２７２に記載のセット。
【請求項２７４】
開裂部位が、レポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとの間の結合部に存在する請求項２７２に記載のセット。
【請求項２７５】
それぞれのアミノ酸セグメントがさらに自己開裂セグメントを含んでいる請求項１８７に記載のセット。
【請求項２７６】
自己開裂セグメントが、レポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとの間に存在する請求項２７５に記載のセット。
【請求項２７７】
自己開裂セグメントがインテインセグメント（ｉｎｔｅｉｎ ｓｅｇｍｅｎｔ）である請求項２７５に記載のセット。
【請求項２７８】
それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸セグメントが変化し、それぞれのアミノ酸セグメントの改変体をアミノ酸セグメントの他の改変体から識別することができる核酸分子のセット。
【請求項２７９】
それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
アミノ酸セグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸セグメントを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができる核酸分子のセット。
【請求項２８０】
それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
アミノ酸セグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸セグメントを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸セグメントが変化し、それぞれのアミノ酸セグメントの改変体をアミノ酸セグメントの他の改変体から識別することができる核酸分子のセット。
【請求項２８１】
それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
アミノ酸セグメントがそれぞれアミノ酸サブセグメントを含み、それぞれのアミノ酸サブセグメントが対象となっているタンパク質又はペプチドの一部と、レポーターシグナルペプチドのすべて又は一部とを含み、
アミノ酸サブセグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸サブセグメントを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができる核酸分子のセット。
【請求項２８２】
それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
アミノ酸セグメントがそれぞれアミノ酸サブセグメントを含み、それぞれのアミノ酸サブセグメントが対象となっているタンパク質又はペプチドの一部と、レポーターシグナルペプチドのすべて又は一部とを含み、
アミノ酸サブセグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸サブセグメントを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸サブセグメントが変化し、それぞれのアミノ酸サブセグメントの改変体をアミノ酸サブセグメントの他の改変体から識別することができる核酸分子のセット。
【請求項２８３】
それぞれのアミノ酸セグメントがレポーターシグナルペプチドと対象となっているタンパク質又はペプチドとを含み、
レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができるアミノ酸セグメントのセット。
【請求項２８４】
アミノ酸セグメントがタンパク質又はペプチドである請求項２８３に記載のセット。
【請求項２８５】
セットが単一のアミノ酸セグメントから成り、アミノ酸セグメントが複数のレポーターシグナルペプチドを含む請求項２８３に記載のセット。
【請求項２８６】
それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができる核酸分子のセットを含む細胞。
【請求項２８７】
それぞれの細胞が核酸分子を含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができる細胞のセット。
【請求項２８８】
それぞれの細胞がさらに追加的な核酸分子を含む請求項２８７に記載のセット。
【請求項２８９】
単一の細胞から成るセットであって、細胞が複数の核酸分子を含む請求項２８７に記載のセット。
【請求項２９０】
単一の細胞から成るセットであって、細胞が核酸分子のセットを含み、核酸分子のセットが単一の核酸分子から成り、そして核酸分子が複数の核酸セグメントをコード化している請求項２８７に記載のセット。
【請求項２９１】
それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができる核酸分子のセットを含む生物体。
【請求項２９２】
それぞれの生物体が核酸分子を含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができる生物体のセット。
【請求項２９３】
それぞれの生物体がさらに追加的な核酸分子を含む請求項２９２に記載のセット。
【請求項２９４】
単一の生物体から成るセットであって、生物体が複数の核酸分子を含む請求項２９２に記載のセット。
【請求項２９５】
単一の生物体から成るセットであって、生物体が核酸分子のセットを含み、核酸分子のセットが単一の核酸分子から成り、そして核酸分子が複数の核酸セグメントをコード化している請求項２９２に記載のセット。
【請求項２９６】
一つ以上の発現サンプルに由来する標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、
一つ以上の発現サンプルは集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが改変レポーターシグナルペプチドのうちの一つであり、
標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現を示す工程を含む、発現を検出する方法。
【請求項２９７】
検出される標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの量を測定する工程であって、
標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの量が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの一つ以上の発現サンプルの存在量を示す工程をさらに含む請求項２９６に記載の方法。
【請求項２９８】
存在するアミノ酸セグメントの量が、検出される標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの量に比例する請求項２９７に記載の方法。
【請求項２９９】
複数の改変レポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、
それぞれの改変レポーターシグナルペプチドの検出が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現を示す工程をさらに含む請求項２９６に記載の方法。
【請求項３００】
検出される改変レポーターシグナルペプチドの量を測定する工程であって、
それぞれの改変レポーターシグナルペプチドの量が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの一つ以上の発現サンプルの存在量を示す工程をさらに含む請求項２９９に記載の方法。
【請求項３０１】
存在するアミノ酸セグメントの量が、検出される改変レポーターシグナルペプチドの量に比例する請求項３００に記載の方法。
【請求項３０２】
レポーターシグナルペプチドの改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、レポーターシグナルペプチドの改変体が由来するところのレポーターシグナルペプチドの発現サンプルの存在、欠如、量又は存在および量を示し、発現サンプル中のレポーターシグナルペプチドの存在、欠如、量又は存在および量が発現サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する請求項２９９に記載の方法。
【請求項３０３】
レポーターシグナルペプチドの改変体を質量分析装置を用いて検出する請求項３０２に記載の方法。
【請求項３０４】
レポーターシグナルペプチドの改変体をタンデム質量分析装置で検出する請求項３０３に記載の方法。
【請求項３０５】
質量分析装置が、単一イオンフィルタリング、衝突セル及び飛行時間分析装置についての四重極セットを含む請求項３０４に記載の方法。
【請求項３０６】
レポーターシグナルペプチドが断片化によって改変を受ける請求項３０２に記載の方法。
【請求項３０７】
レポーターシグナルペプチドは、光で開裂可能なアミノ酸の位置で切断することによって改変を受ける請求項３０６に記載の方法。
【請求項３０８】
レポーターシグナルペプチドが衝突セル内で断片化する請求項３０６に記載の方法。
【請求項３０９】
レポーターシグナルペプチドがアスパラギン−プロリン結合、メチオニン又はリン酸化アミノ酸の位置で断片化する請求項３０６に記載の方法。
【請求項３１０】
共通する特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルペプチドの質量、電荷又は質量と電荷の変化によりそれらが改変され、レポーターシグナルペプチドの改変体の質量電荷比の差異によってレポーターシグナルペプチドの改変体を識別することができる請求項３０２に記載の方法。
【請求項３１１】
２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なるレポーターシグナルペプチドが存在する請求項３０２に記載の方法。
【請求項３１２】
１０以上の異なるレポーターシグナルペプチドが存在する請求項３１１に記載の方法。
【請求項３１３】
それぞれのレポーターシグナルペプチドが不安定な又は開裂しやすい結合を異なる位置に有する請求項３１２に記載の方法。
【請求項３１４】
タンパク質シグニチャーを一つ以上の他のタンパク質シグニチャーと比較する工程をさらに含む請求項３０２に記載の方法。
【請求項３１５】
検出された改変レポーターシグナルペプチドが複数の発現サンプルに由来する請求項３０２に記載の方法。
【請求項３１６】
検出された改変レポーターシグナルペプチドのいくつかがコントロール発現サンプルに由来し、
発現サンプルとコントロール発現サンプルとから生じるタンパク質シグニチャー間の差異を確認する請求項３１５に記載の方法。
【請求項３１７】
差異が、発現サンプル及びコントロール発現サンプル中のレポーターシグナルペプチドの存在、量、存在および量又は欠如についての差異である請求項３１６に記載の方法。
【請求項３１８】
複数の発現サンプルがコントロール発現サンプル及びテスター発現サンプルを含み、
テスター発現サンプル中の一つ以上のアミノ酸セグメントを破壊、分裂又は除去できるように、テスター発現サンプル又はテスター発現サンプルの起源を処理し、
破壊され、分裂し又は除去されたアミノ酸セグメントに対応するレポーターシグナルペプチドが、テスター発現サンプルからではなくコントロール発現サンプルから生じることになる請求項３１５に記載の方法。
【請求項３１９】
テスター発現サンプル中の一つ以上のアミノ酸セグメントを破壊、分裂又は除去できるようにテスター発現サンプルを処理する請求項３１８に記載の方法。
【請求項３２０】
テスター発現サンプルから一つ以上のアミノ酸セグメントを分離することによって、テスターサンプル中の一つ以上のアミノ酸セグメントを除去する請求項３１９に記載の方法。
【請求項３２１】
アフィニティー分離によって一つ以上のアミノ酸セグメントを分離する請求項３２０に記載の方法。
【請求項３２２】
テスター発現サンプル中の一つ以上のアミノ酸セグメントを破壊、分裂又は除去できるように、テスター発現サンプルの起源を処理する請求項３１８に記載の方法。
【請求項３２３】
一つ以上のヌクレオチドセグメントの発現を減少させるか又は除去する化合物、組成物又は状態に、テスターサンプルが由来するところの細胞をさらすことによって、起源への処理を成し遂げる請求項３２２に記載の方法。
【請求項３２４】
コントロール発現サンプル及びテスター発現サンプル中のレポーターシグナルペプチドの差異を確認する工程をさらに含む請求項３１８に記載の方法。
【請求項３２５】
発現サンプル中のレポーターシグナルペプチド間の差異を確認する工程をさらに含む請求項３１５に記載の方法。
【請求項３２６】
少なくとも二つの発現サンプル又は少なくとも二つの発現サンプルの起源を異なる条件に付す請求項３１５に記載の方法。
【請求項３２７】
発現サンプルの起源が細胞である請求項３２６に記載の方法。
【請求項３２８】
少なくとも二つの発現サンプルのタンパク質シグニチャーの差異が、異なる条件の影響を示す請求項３２６に記載の方法。
【請求項３２９】
異なる条件が異なる化合物にさらすことである請求項３２６に記載の方法。
【請求項３３０】
異なる条件が、化合物にさらすこと及び化合物にさらさないことである請求項３２６に記載の方法。
【請求項３３１】
二番目の発現サンプルからの二番目のタンパク質シグニチャーを得る工程、及び最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとを比較する工程であって、最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとの差異が、最初の発現サンプルと二番目の発現サンプルとの起源又は起源の条件の差異を示す工程をさらに含む請求項３０２に記載の方法。
【請求項３３２】
二番目の発現サンプルからの二番目のタンパク質シグニチャーを得る工程、及び最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとを比較する工程であって、最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとの差異が、最初の発現サンプルと二番目の発現サンプルとのタンパク質修飾の差異を示す工程をさらに含む請求項３０２に記載の方法。
【請求項３３３】
最初の発現サンプルが由来するところの細胞が、二番目の発現サンプルが由来するところの細胞に比較して修飾が不完全なものであることを除いて、二番目の発現サンプルが最初の発現サンプルと同一のタイプの細胞からのサンプルである請求項３３２に記載の方法。
【請求項３３４】
二番目の発現サンプルが最初の発現サンプルと異なるタイプの細胞からのサンプルであり、最初の発現サンプルが由来するところの細胞が、二番目の発現サンプルが由来するところの細胞に比較して修飾が不完全なものである請求項３３２に記載の方法。
【請求項３３５】
発現サンプルが一つ以上の細胞に由来する請求項３０２に記載の方法。
【請求項３３６】
タンパク質シグニチャーが細胞の生理的状態を示す請求項３３５に記載の方法。
【請求項３３７】
タンパク質シグニチャーが細胞の処理の効果を示す請求項３３５に記載の方法。
【請求項３３８】
細胞が一つの生物体に由来し、そして細胞が生物体を処理することによって処理される請求項３３７に記載の方法。
【請求項３３９】
生物体に化合物を与えることによって生物体を処理する請求項３３８に記載の方法。
【請求項３４０】
生物体がヒトである請求項３３８に記載の方法。
【請求項３４１】
改変を受けたレポーターシグナルペプチドを最初の及び二番目の発現サンプル中にて検出する請求項２９９に記載の方法。
【請求項３４２】
二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルと同一のタイプの生物体からのサンプルである請求項３４１に記載の方法。
【請求項３４３】
二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルと同一のタイプの組織からのサンプルである請求項３４１に記載の方法。
【請求項３４４】
二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルと同一の生物体からのサンプルである請求項３４１に記載の方法。
【請求項３４５】
二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルとは異なる時点で得られるものである請求項３４４に記載の方法。
【請求項３４６】
二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルとは異なる生物体からのサンプルである請求項３４１に記載の方法。
【請求項３４７】
二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルとは異なるタイプの組織からのサンプルである請求項３４１に記載の方法。
【請求項３４８】
二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルとは異なる生物体の種からのサンプルである請求項３４１に記載の方法。
【請求項３４９】
二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルとは異なる生物体の株からのサンプルである請求項３４１に記載の方法。
【請求項３５０】
二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルとは異なる細胞区画からのサンプルである請求項３４１に記載の方法。
【請求項３５１】
レポーターシグナルペプチドを改変する工程をさらに含む請求項２９６に記載の方法。
【請求項３５２】
断片化によってレポーターシグナルペプチドが改変を受ける請求項３５１に記載の方法。
【請求項３５３】
光で開裂可能なアミノ酸の位置で切断することによってレポーターシグナルペプチドが改変を受ける請求項３５２に記載の方法。
【請求項３５４】
レポーターシグナルペプチドが衝突セル内で断片化する請求項３５２に記載の方法。
【請求項３５５】
レポーターシグナルペプチドが、アスパラギン−プロリン結合の位置、メチオニンの位置又はリン酸化アミノ酸の位置で断片化する請求項３５２に記載の方法。
【請求項３５６】
レポーターシグナルペプチドを発現サンプルから分離する工程をさらに含む請求項２９６に記載の方法。
【請求項３５７】
共通する特性に基づいて、発現サンプルからレポーターシグナルペプチドを識別又は分離する請求項３５６に記載の方法。
【請求項３５８】
対象となっているタンパク質又はペプチドからレポーターシグナルペプチドを切断する工程をさらに含む請求項２９６に記載の方法。
【請求項３５９】
共通する特性に基づいて、対象となっているタンパク質又はペプチドからレポーターシグナルペプチドを識別又は分離する請求項３５８に記載の方法。
【請求項３６０】
アミノ酸セグメントをレポーターシグナルペプチド部分とタンパク質部分とに切断する工程をさらに含む請求項２９６に記載の方法。
【請求項３６１】
２以上の発現サンプルを互いに混合する工程をさらに含む請求項２９６に記載の方法。
【請求項３６２】
２以上のアミノ酸セグメントを互いに混合する工程であって、混合されたアミノ酸セグメントが２以上の発現サンプルに由来したものである工程をさらに含む請求項２９６に記載の方法。
【請求項３６３】
標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現により、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところの発現サンプルを同定する請求項２９６に記載の方法。
【請求項３６４】
発現サンプルが一つ以上の細胞に由来し、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現により、同定される発現サンプルが由来するところの細胞を同定する請求項３６３に記載の方法。
【請求項３６５】
発現サンプルが一つ以上の生物体に由来し、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現により、同定される発現サンプルが由来するところの生物体を同定する請求項３６３に記載の方法。
【請求項３６６】
発現サンプルが一つ以上の組織に由来し、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現により、同定される発現サンプルが由来するところの組織を同定する請求項３６３に記載の方法。
【請求項３６７】
発現サンプルが一つ以上の細胞系に由来し、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現により、同定される発現サンプルが由来するところの細胞系を同定する請求項３６３に記載の方法。
【請求項３６８】
それぞれの核酸分子がさらに発現配列を含むものであって、アミノ酸セグメントが発現できるように、発現配列が機能できる状態でヌクレオチドセグメントに結合している請求項２９６に記載の方法。
【請求項３６９】
発現配列が翻訳発現配列を含む請求項３６８に記載の方法。
【請求項３７０】
発現配列がさらに転写発現配列を含む請求項３６９に記載の方法。
【請求項３７１】
アミノ酸セグメントがインビトロで発現される請求項３６８に記載の方法。
【請求項３７２】
アミノ酸セグメントがインビボで発現される請求項３６８に記載の方法。
【請求項３７３】
アミノ酸セグメントが細胞培養中に発現される請求項３７２に記載の方法。
【請求項３７４】
それぞれの核酸分子の発現配列が異なっている請求項３６８に記載の方法。
【請求項３７５】
異なる発現配列がそれぞれ異なって調節される請求項３７４に記載の方法。
【請求項３７６】
発現配列が同じように調節される請求項３７４に記載の方法。
【請求項３７７】
複数の発現配列が、同一の発現カスケードの一部として発現される遺伝子の発現配列か、又は遺伝子に由来する発現配列である請求項３７６に記載の方法。
【請求項３７８】
それぞれの核酸分子の発現配列が同一である請求項３６８に記載の方法。
【請求項３７９】
発現配列が同じように調節される請求項３７８に記載の方法。
【請求項３８０】
少なくとも二つの核酸分子の発現配列が異なっている請求項３６８に記載の方法。
【請求項３８１】
少なくとも二つの核酸分子の発現配列が同一である請求項３６８に記載の方法。
【請求項３８２】
アミノ酸セグメントの発現が誘導される請求項３６８に記載の方法。
【請求項３８３】
それぞれの核酸分子がさらに複製配列を含むものであって、複製配列は核酸分子の複製を媒介する請求項２９６に記載の方法。
【請求項３８４】
核酸分子がインビトロで複製される請求項３８３に記載の方法。
【請求項３８５】
核酸分子がインビボで複製される請求項３８３に記載の方法。
【請求項３８６】
核酸分子が細胞培養中に複製される請求項３８５に記載の方法。
【請求項３８７】
それぞれの核酸分子がさらに組み込み配列を含むものであって、組み込み配列は核酸分子の他の核酸への組み込みを媒介する請求項２９６に記載の方法。
【請求項３８８】
核酸分子が染色体に組み込まれている請求項３８７に記載の方法。
【請求項３８９】
核酸分子が染色体の予め決定された位置に組み込まれている請求項３８８に記載の方法。
【請求項３９０】
一つ以上の核酸サンプル中で核酸を複製することにより核酸分子を生産する請求項２９６に記載の方法。
【請求項３９１】
プライマーのペアを用いて核酸を複製し、核酸分子の生産に用いられるプライマーのペアにおける最初のプライマーのそれぞれがレポーターシグナルペプチドをコード化しているヌクレオチド配列を含む請求項３９０に記載の方法。
【請求項３９２】
それぞれの最初のプライマーがさらに発現配列を含む請求項３９１に記載の方法。
【請求項３９３】
最初のプライマーのそれぞれのヌクレオチド配列がエピトープタグをもコード化している請求項３９２に記載の方法。
【請求項３９４】
それぞれのアミノ酸セグメントがさらにエピトープタグを含む請求項２９６に記載の方法。
【請求項３９５】
それぞれのアミノ酸セグメントのエピトープタグが異なっている請求項３９４に記載の方法。
【請求項３９６】
それぞれのアミノ酸セグメントのエピトープタグが同一である請求項３９４に記載の方法。
【請求項３９７】
少なくとも二つのアミノ酸セグメントのエピトープタグが異なっている請求項３９４に記載の方法。
【請求項３９８】
少なくとも二つのアミノ酸セグメントのエピトープタグが同一である請求項３９４に記載の方法。
【請求項３９９】
エピトープタグを介して、アミノ酸セグメントを一つ以上の発現サンプルから識別又は分離する請求項３９４に記載の方法。
【請求項４００】
それぞれのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが異なっている請求項２９６に記載の方法。
【請求項４０１】
それぞれのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが同一である請求項２９６に記載の方法。
【請求項４０２】
少なくとも二つのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが異なっている請求項２９６に記載の方法。
【請求項４０３】
少なくとも二つのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが同一である請求項２９６に記載の方法。
【請求項４０４】
核酸分子が細胞中に存在する請求項２９６に記載の方法。
【請求項４０５】
それぞれの核酸分子が異なる細胞内に存在する請求項４０４に記載の方法。
【請求項４０６】
それぞれの核酸分子が同一の細胞内に存在する請求項４０４に記載の方法。
【請求項４０７】
それぞれの核酸分子がさらに発現配列を含むものであって、アミノ酸セグメントが発現できるように、発現配列が機能できる状態でヌクレオチドセグメントに結合している請求項４０６に記載の方法。
【請求項４０８】
それぞれの核酸分子の発現配列が異なる請求項４０７に記載の方法。
【請求項４０９】
発現配列が同じように調節される請求項４０８に記載の方法。
【請求項４１０】
複数の発現配列が、同一の発現カスケードの一部として発現される遺伝子の発現配列か、又は遺伝子に由来する発現配列である請求項４０９に記載の方法。
【請求項４１１】
核酸分子が細胞の染色体内に組み込まれている請求項４０４に記載の方法。
【請求項４１２】
核酸分子が染色体の予め決定された位置に組み込まれている請求項４１１に記載の方法。
【請求項４１３】
染色体が人工染色体である請求項４１１に記載の方法。
【請求項４１４】
核酸分子がプラスミドか又はプラスミド内に組み込まれている請求項４０４に記載の方法。
【請求項４１５】
細胞が細胞系に属する請求項４０４に記載の方法。
【請求項４１６】
それぞれの核酸分子が異なる細胞系内に存在する請求項４１５に記載の方法。
【請求項４１７】
それぞれの核酸分子が同一の細胞系内に存在する請求項４１５に記載の方法。
【請求項４１８】
発現サンプルが細胞から生産される請求項４０４に記載の方法。
【請求項４１９】
それぞれの発現サンプルが一つの細胞サンプルから生産され、そしてそれぞれの発現サンプルが一つの異なる細胞サンプルから生産される請求項４１８に記載の方法。
【請求項４２０】
それぞれの細胞サンプルが異なる条件に付される請求項４１９に記載の方法。
【請求項４２１】
それぞれの細胞サンプルを異なる試験化合物と接触させる請求項４２０に記載の方法。
【請求項４２２】
それぞれの細胞サンプルが異なる条件下にて培養される請求項４２０に記載の方法。
【請求項４２３】
それぞれの細胞サンプルが異なる生物体に由来する請求項４２０に記載の方法。
【請求項４２４】
それぞれの細胞サンプルが異なる組織に由来する請求項４２０に記載の方法。
【請求項４２５】
それぞれの細胞サンプルが、同一の起源の異なる時点のものから得られる請求項４２０に記載の方法。
【請求項４２６】
発現サンプルが、細胞を溶解することによって生産される請求項４１８に記載の方法。
【請求項４２７】
核酸分子が生物体内に存在する請求項２９６に記載の方法。
【請求項４２８】
それぞれの核酸分子が異なる生物体内に存在する請求項４２７に記載の方法。
【請求項４２９】
それぞれの核酸分子が同一の生物体内に存在する請求項４２７に記載の方法。
【請求項４３０】
それぞれの核酸分子がさらに発現配列を含むものであって、アミノ酸セグメントが発現できるように、発現配列が機能できる状態でヌクレオチドセグメントに結合している請求項４２９に記載の方法。
【請求項４３１】
それぞれの核酸分子の発現配列が異なる請求項４３０に記載の方法。
【請求項４３２】
発現配列が同じように調節される請求項４３１に記載の方法。
【請求項４３３】
複数の発現配列が、同一の発現カスケードの一部として発現される遺伝子の発現配列か、又は遺伝子に由来する発現配列である請求項４３２に記載の方法。
【請求項４３４】
核酸分子が生物体の染色体内に組み込まれている請求項４２７に記載の方法。
【請求項４３５】
核酸分子が染色体の予め決定された位置に組み込まれている請求項４３４に記載の方法。
【請求項４３６】
染色体が人工染色体である請求項４３４に記載の方法。
【請求項４３７】
核酸分子がプラスミドか又はプラスミド内に組み込まれている請求項４２７に記載の方法。
【請求項４３８】
それぞれの核酸分子が異なる生物体内に存在する請求項４２７に記載の方法。
【請求項４３９】
それぞれの核酸分子が同一の生物体内に存在する請求項４２７に記載の方法。
【請求項４４０】
核酸分子が一つの生物体の細胞内に存在する請求項２９６に記載の方法。
【請求項４４１】
核酸分子が生物体の実質的にすべての細胞内に存在する請求項４４０に記載の方法。
【請求項４４２】
核酸分子が生物体のいくつかの細胞内に存在する請求項４４０に記載の方法。
【請求項４４３】
アミノ酸セグメントが生物体の実質的にすべての細胞内で発現される請求項４４０に記載の方法。
【請求項４４４】
アミノ酸セグメントが生物体のいくつかの細胞内で発現される請求項４４０に記載の方法。
【請求項４４５】
それぞれのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている請求項２９６に記載の方法。
【請求項４４６】
それぞれのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが同一である請求項２９６に記載の方法。
【請求項４４７】
少なくとも二つのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている請求項２９６に記載の方法。
【請求項４４８】
少なくとも二つのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが同一である請求項２９６に記載の方法。
【請求項４４９】
対象となっているタンパク質又はペプチドが関連性を有するものである請求項４４５に記載の方法。
【請求項４５０】
対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一のカスケードで生成するタンパク質である請求項４４９に記載の方法。
【請求項４５１】
対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一の条件の下で発現されるタンパク質である請求項４４９に記載の方法。
【請求項４５２】
対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一の疾患に関連しているタンパク質である請求項４４９に記載の方法。
【請求項４５３】
対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一の細胞のタイプに関連しているタンパク質である請求項４４９に記載の方法。
【請求項４５４】
対象となっているタンパク質又はペプチドが同一の組織のタイプに関連しているタンパク質である請求項４４９に記載の方法。
【請求項４５５】
対象となっているタンパク質又はペプチドが同一の酵素経路中のタンパク質である請求項４４９に記載の方法。
【請求項４５６】
ヌクレオチドセグメントが、アミノ酸セグメントのそれぞれがレポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むところの複数のアミノ酸セグメントをコード化している請求項２９６に記載の方法。
【請求項４５７】
ヌクレオチドセグメントのうちの一つの中の少なくとも二つのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている請求項４５６に記載の方法。
【請求項４５８】
ヌクレオチドセグメントのうちの一つの中のアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている請求項４５６に記載の方法。
【請求項４５９】
ヌクレオチドセグメントのうちのそれぞれの中の少なくとも二つのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている請求項４５６に記載の方法。
【請求項４６０】
ヌクレオチドセグメントのうちのそれぞれの中のアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている請求項４５６に記載の方法。
【請求項４６１】
セットが単一の核酸分子から成る請求項４５６に記載の方法。
【請求項４６２】
セットが単一の核酸分子から成り、核酸分子が、ヌクレオチドセグメントのそれぞれがアミノ酸セグメントをコード化しているところの複数のヌクレオチドセグメントを含む請求項２９６に記載の方法。
【請求項４６３】
アミノ酸セグメントが、レポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとの間の結合部の近傍の開裂部位を含む請求項２９６に記載の方法。
【請求項４６４】
開裂部位が開裂されている請求項４６３に記載の方法。
【請求項４６５】
レポーターシグナルペプチドを、対象となっているペプチド又はタンパク質から識別又は分離する請求項４６４に記載の方法。
【請求項４６６】
開裂部位がトリプシン開裂部位である請求項４６３に記載の方法。
【請求項４６７】
開裂部位が、レポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとの間の結合部に存在する請求項４６３に記載の方法。
【請求項４６８】
それぞれのアミノ酸セグメントがさらに自己開裂セグメントを含んでいる請求項２９６に記載の方法。
【請求項４６９】
自己開裂セグメントが、レポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとの間に存在する請求項４６８に記載の方法。
【請求項４７０】
自己開裂セグメントがアミノ酸セグメントを開裂する請求項４６９に記載の方法。
【請求項４７１】
レポーターシグナルペプチドを、対象となっているペプチド又はタンパク質から識別又は分離する請求項４７０に記載の方法。
【請求項４７２】
自己開裂セグメントがインテインセグメントである請求項４６８に記載の方法。
【請求項４７３】
異なる改変を受けた複数のレポーターシグナルペプチドが検出され、改変を受けたレポーターシグナルペプチドのそれぞれの検出が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現を示す請求項２９６に記載の方法。
【請求項４７４】
異なる発現サンプルが異なる核酸分子を含み、改変レポーターシグナルペプチドのそれぞれの検出が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む発現サンプルの発現を示す請求項４７３に記載の方法。
【請求項４７５】
複数の異なる発現サンプルが存在し、異なる発現サンプルのそれぞれが異なる核酸分子を含み、改変レポーターシグナルペプチドの検出が、検出される改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む発現サンプルの発現を示す請求項２９６に記載の方法。
【請求項４７６】
一つ以上の発現サンプルに由来する標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、
一つ以上の発現サンプルが集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが改変レポーターシグナルペプチドのうちの一つであり、
標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントの発現を示す工程を含む、発現を検出する方法。
【請求項４７７】
検出される標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの量を測定する工程であって、
標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの量が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むヌクレオチドセグメントの一つ以上の発現サンプルの存在量を示す工程をさらに含む請求項４７６に記載の方法。
【請求項４７８】
ヌクレオチドセグメントの存在している量が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが検出された量に比例する請求項４７７に記載の方法。
【請求項４７９】
改変を受けた複数のレポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、改変を受けたそれぞれのレポーターシグナルペプチドの検出が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むヌクレオチドセグメントの発現を示す工程をさらに含む請求項４７６に記載の方法。
【請求項４８０】
検出される改変レポーターシグナルペプチドの量を測定する工程であって、
改変レポーターシグナルペプチドのそれぞれの量が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むヌクレオチドセグメントの一つ以上の発現サンプルの存在量を示す工程をさらに含む請求項４７９に記載の方法。
【請求項４８１】
ヌクレオチドセグメントの存在している量が、改変を受けたレポーターシグナルペプチドが検出された量に比例する請求項４８０に記載の方法。
【請求項４８２】
一つ以上の発現サンプルに由来する標的である改変を受けたアミノ酸セグメントを検出する工程であって、
一つ以上の発現サンプルが集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
アミノ酸セグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸セグメントを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸セグメントが変化し、それぞれのアミノ酸セグメントの改変体をアミノ酸セグメントの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントが改変アミノ酸セグメントのうちの一つであり、
標的である改変を受けたアミノ酸セグメントの検出が、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントが由来するところのアミノ酸セグメントの発現を示す工程を含む、発現を検出する方法。
【請求項４８３】
一つ以上の発現サンプルに由来する改変アミノ酸サブセグメントを検出する工程であって、
一つ以上の発現サンプルが集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
アミノ酸セグメントがそれぞれアミノ酸サブセグメントを含み、それぞれのアミノ酸サブセグメントが対象となっているタンパク質又はペプチドの一部と、レポーターシグナルペプチドのすべて又は一部とを含み、
アミノ酸サブセグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸サブセグメントを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸サブセグメントが変化し、それぞれのアミノ酸サブセグメントの改変体をアミノ酸サブセグメントの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントが改変アミノ酸サブセグメントのうちの一つであり、
標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントの検出が、標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントが由来するところのアミノ酸セグメントの発現を示す工程を含む、発現を検出する方法。
【請求項４８４】
一つ以上の細胞に由来する、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、
一つ以上の細胞が集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが改変レポーターシグナルペプチドのうちの一つであり、
標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところの細胞の存在を示す工程を含む、細胞を検出する方法。
【請求項４８５】
それぞれの細胞が少なくとも一つの核酸分子を含むように設計され、そしてそれぞれの細胞内の核酸分子のヌクレオチドセグメントによってコード化されたアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが異なるものである請求項４８４に記載の方法。
【請求項４８６】
対象となっている形質を有する細胞のそれぞれが同一のレポーターシグナルペプチドを含む請求項４８５に記載の方法。
【請求項４８７】
対象となっている形質が異種遺伝子である請求項４８６に記載の方法。
【請求項４８８】
異種遺伝子が核酸分子を含む請求項４８７に記載の方法。
【請求項４８９】
異種遺伝子がアミノ酸セグメントをコード化している請求項４８６に記載の方法。
【請求項４９０】
異なる改変を受けた複数のレポーターシグナルペプチドが検出され、改変を受けたレポーターシグナルペプチドのそれぞれの検出が、改変を受けたそのレポーターシグナルペプチドが由来するところの細胞の存在を示す請求項４８４に記載の方法。
【請求項４９１】
異なる細胞が異なる核酸分子を含み、改変を受けたレポーターシグナルペプチドのそれぞれの検出が、アミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む細胞の存在を示すものであって、アミノ酸セグメントが改変を受けたそのレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むものである請求項４９０に記載の方法。
【請求項４９２】
複数の異なる細胞が存在し、それぞれの異なる細胞は異なる核酸分子を含み、改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、アミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む細胞の存在を示すものであって、アミノ酸セグメントが、検出された改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むものである請求項４８４に記載の方法。
【請求項４９３】
一つ以上の細胞サンプルに由来する、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出する工程を含む、細胞サンプルを検出する方法であって、
一つ以上の細胞サンプルは集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子は、レポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
レポーターシグナルペプチドは共通する特性、すなわち、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することを可能にする特性を有し、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが改変レポーターシグナルペプチドのうちの一つであり、
標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところの細胞サンプルの存在を示す方法。
【請求項４９４】
複数の異なる改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出し、それぞれの改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところの細胞サンプルの存在を示す請求項４９３に記載の方法。
【請求項４９５】
異なる細胞サンプルが異なる核酸分子を含み、それぞれの改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む細胞サンプルの存在を示す請求項４９３に記載の方法。
【請求項４９６】
複数の異なる細胞サンプルが存在し、それぞれの異なる細胞サンプルが異なる核酸分子を含み、改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、検出された改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む細胞サンプルの存在を示す請求項４９３に記載の方法。
【請求項４９７】
一つ以上の細胞に由来する、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、
一つ以上の細胞が集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが改変レポーターシグナルペプチドのうちの一つであり、
標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところの細胞の存在を示す工程を含む、細胞を検出する方法。
【請求項４９８】
一つ以上の細胞に由来する、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントを検出する工程であって、
一つ以上の細胞が集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
アミノ酸セグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸セグメントを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸セグメントが変化し、それぞれのアミノ酸セグメントの改変体をアミノ酸セグメントの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントが改変アミノ酸セグメントのうちの一つであり、
標的である改変を受けたアミノ酸セグメントの検出が、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントが由来するところの細胞の存在を示す工程を含む、細胞を検出する方法。
【請求項４９９】
一つ以上の細胞に由来する改変アミノ酸サブセグメントを検出する工程であって、
一つ以上の細胞が集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
アミノ酸セグメントがそれぞれアミノ酸サブセグメントを含み、それぞれのアミノ酸サブセグメントが対象となっているタンパク質又はペプチドの一部と、レポーターシグナルペプチドのすべて又は一部とを含み、
アミノ酸サブセグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸サブセグメントを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸サブセグメントが変化し、それぞれのアミノ酸サブセグメントの改変体をアミノ酸サブセグメントの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントが改変アミノ酸サブセグメントのうちの一つであり、
標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントの検出が、標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントが由来するところの細胞の存在を示す工程を含む、細胞を検出する方法。
【請求項５００】
一つ以上の生物体に由来する、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、
一つ以上の生物体が集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが改変レポーターシグナルペプチドのうちの一つであり、
標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところの生物体の存在を示す工程を含む、生物体を検出する方法。
【請求項５０１】
それぞれの生物体が少なくとも一つの核酸分子を含むように設計され、そしてそれぞれの生物体内の核酸分子のヌクレオチドセグメントによってコード化されたアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが異なるものである請求項５００に記載の方法。
【請求項５０２】
対象となっている形質を有する生物体のそれぞれが同一のレポーターシグナルペプチドを含む請求項５０１に記載の方法。
【請求項５０３】
対象となっている形質が導入遺伝子である請求項５０２に記載の方法。
【請求項５０４】
導入遺伝子遺伝子が核酸分子を含む請求項５０３に記載の方法。
【請求項５０５】
導入遺伝子遺伝子がアミノ酸セグメントをコード化している請求項５０２に記載の方法。
【請求項５０６】
複数の異なる改変レポーターシグナルペプチドが検出され、それぞれの改変レポーターシグナルペプチドの検出が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところの生物体の存在を示す請求項５００に記載の方法。
【請求項５０７】
異なる生物体が異なる核酸分子を含み、それぞれの改変レポーターシグナルペプチドの検出が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む生物体の存在を示す請求項５０６に記載の方法。
【請求項５０８】
複数の異なる生物体が存在し、それぞれ異なる生物体が異なる核酸分子を含み、改変レポーターシグナルペプチドの検出が、検出された改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む生物体の存在を示す請求項５００に記載の方法。
【請求項５０９】
一つ以上の生物体に由来する、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、
一つ以上の生物体が集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが、改変を受けたレポーターシグナルペプチドのうちの一つであり、
標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところの生物体の存在を示す工程を含む、生物体を検出する方法。
【請求項５１０】
一つ以上の生物体に由来する、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントを検出する工程であって、
一つ以上の生物体が集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
アミノ酸セグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸セグメントを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することが可能となり、
レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸セグメントが変化し、それぞれのアミノ酸セグメントの改変体をアミノ酸セグメントの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントが、改変を受けたアミノ酸セグメントのうちの一つであり、
標的である改変を受けたアミノ酸セグメントの検出が、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントが由来するところの生物体の存在を示す工程を含む、生物体を検出する方法。
【請求項５１１】
一つ以上の生物体に由来する改変アミノ酸サブセグメントを検出する工程であって、
一つ以上の生物体が集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチドと対象となっているタンパク質又はペプチドとを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、
それぞれのアミノ酸セグメントがアミノ酸サブセグメントを含み、それぞれのアミノ酸サブセグメントが対象となっているタンパク質又はペプチドの一部分と、レポーターシグナルペプチドのすべて又は一部分とを含み、
アミノ酸サブセグメントが共通する特性を有し、共通する特性がアミノ酸サブセグメントを、共通する特性を欠く分子から識別又は分離することを可能とする特性であり、
レポーターシグナルペプチドは改変を受けることができ、レポーターシグナルペプチドの改変がアミノ酸サブセグメントを変化させ、それぞれのアミノ酸サブセグメントの改変体を他のアミノ酸サブセグメントの改変体から識別することができ、標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントは改変を受けたアミノ酸サブセグメントのうちの一つであり、
標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントの検出が、標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントが由来するところの生物体の存在を示す工程を含む、生物体を検出する方法。
【請求項５１２】
（ａ）　複数のレポーターシグナルのうちの一つと、複数のサンプルのそれぞれの中にある一つ以上の検体とを会合させる工程であって、
それぞれのレポーターシグナルが共通する特性、すなわち、それぞれのレポーターシグナルが共通する特性を欠く分子から分離するのを可能にする特性を有するものである工程、
（ｂ）　それぞれのサンプル中に含まれる検体を分離する工程、
（ｃ）　レポーターシグナルを改変する工程、並びに
（ｄ）　レポーターシグナルの改変体を検出する工程
を含む方法。
【請求項５１３】
工程（ａ）の直後かつ工程（ｂ）の前に、二以上のサンプルを混合する工程をさらに含む請求項５１２に記載の方法。
【請求項５１４】
それぞれのサンプル中の検体を一つのレポーターシグナルのみと会合させる方法であって、それぞれのサンプル中の検体と会合するレポーターシグナルが異なるものである請求項５１２に記載の方法。
【請求項５１５】
キャプチャーアレイ（ｃａｐｔｕｒｅ ａｒｒａｙ）との接触により検体が分離される請求項５１２に記載の方法。
【請求項５１６】
（ａ）　複数のコーディングタグのうちの一つと、少なくとも一つのサンプルの中に存在する一つ以上の検体とを会合させる工程、
（ｂ）　それぞれのサンプル中に含まれる検体を分離する工程、
（ｃ）　コーディングタグを一つ以上のレポーター分子と会合させる工程であって、それぞれのレポーター分子がレポーターシグナル及びデコーディングタグを含み、
それぞれのレポーターシグナルが共通する特性、すなわち、それぞれのレポーターシグナルが共通する特性を欠く分子から分離するのを可能にする特性を有し、
そしてそれぞれのデコーディングタグが一つ以上のコーディングタグについて特異的である工程、
（ｄ）　レポーターシグナルを改変する工程、並びに
（ｅ）　レポーターシグナルの改変体を検出する工程
を含む方法。
【請求項５１７】
コーディングタグがオリゴヌクレオチドであり、デコーディングタグがペプチド核酸であり、そしてレポーターシグナルがレポーターシグナルペプチドである請求項５１６に記載の方法。
【請求項５１８】
（ａ）　複数のコーディングタグのうちの一つと、少なくとも一つのサンプルの中に存在する一つ以上の検体とを会合させる工程、
（ｂ）　それぞれのサンプル中に含まれる検体を分離する工程、
（ｃ）　コーディングタグを一つ以上のレポーターシグナルと会合させる工程であって、
それぞれのレポーターシグナルが共通する特性、すなわち、それぞれのレポーターシグナルが共通する特性を欠く分子から分離するのを可能にする特性を有し、
そしてそれぞれのレポーターシグナルが一つ以上のコーディングタグについて特異的である工程、
（ｄ）　レポーターシグナルを改変する工程、並びに
（ｅ）　レポーターシグナルの改変体を検出する工程
を含む方法。
【請求項５１９】
コーディングタグがオリゴヌクレオチドであり、そしてレポーターシグナルがペプチド核酸である請求項５１８に記載の方法。
【請求項５２０】
（ａ）　複数のレポーターシグナルのうちの一つと、複数のサンプルのそれぞれの中に存在する一つ以上の検体とを会合させて、レポーターシグナル／検体複合体を形成させる工程であって、
それぞれのレポーターシグナル／検体複合体が共通する特性、すなわち、それぞれのレポーターシグナル／検体複合体が共通する特性を欠く分子から分離するのを可能にする特性を有するものである工程、
（ｂ）　それぞれのサンプル中に含まれる検体を分離する工程であって、分離はレポーターシグナル／検体複合体に共通する特性に基づくものではない工程、
（ｃ）　レポーターシグナルを改変し、それによってレポーターシグナル／検体複合体を改変する工程、並びに
（ｄ）　レポーターシグナル／検体複合体の改変体を検出する工程
を含む方法。
【請求項５２１】
（ａ）　複数のコーディングタグと、少なくとも一つのサンプル中に存在する一つ以上の検体とを会合させる工程、
（ｂ）　それぞれのサンプル中に含まれる検体を分離する工程、
（ｃ）　コーディングタグを一つ以上のレポーター分子と会合させる工程であって、それぞれのレポーター分子がレポーターシグナルとデコーディングタグを含み、
それぞれのレポーター分子が共通する特性、すなわち、それぞれのレポーター分子が共通する特性を欠く分子から分離するのを可能にする特性を有し、
そしてそれぞれのデコーディングタグが一つ以上のコーディングタグについて特異的である工程、
（ｄ）　レポーターシグナルを改変し、それによってレポーター分子を改変する工程、並びに
（ｅ）　レポーター分子の改変体を検出する工程
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
一般的には、本発明は検体及び生体分子を検出する分野に属するものであり、より具体的には、検体及び生体分子を多重的に検出し分析する分野に属するものである。
【０００２】
発明の背景
分子の検出は、生物学及び医学における重要な作業の一つである。このような検出には、特別な標識分子、シグナルの増幅又はその両方を用いることがしばしば求められる。というのは、対象となっている多数の分子は少量しか存在せず、そしてそれらの分子そのものが検出可能なシグナルを発することがないからである。多数の標識、標識化システム及びシグナル増幅技術が開発されてきた。例えば、核酸分子及び核酸配列は、ポリメラーゼ連結部反応法（ＰＣＲ）、リガーゼ連結部反応法（ＬＣＲ）、持続的配列複製法（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）、ストランド置換増幅法（ＳＤＡ）及びＱβレプリカーゼを用いる増幅法を用いて増幅及び／又は検出されてきた（ビルケンマイヤー及びムッシャワー（Ｂｉｒｋｅｎｍｅｙｅｒ ａｎｄ Ｍｕｓｈａｈｗａｒ）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， ３５： １１７−１２６ （１９９１）； ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ９： １９９−２０２ （１９９３））。タンパク質は、例えばサンドイッチ測定法（マイリニ及びメイセフ（Ｍａｉｌｉｎｉ ａｎｄ Ｍａｙｓｅｆ）、「酵素免疫測定のためのサンドイッチ法。Ｉ．ラット及びヒトのアルファ−フェトプロテインへの応用」、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８： ２２３−２３４ （１９７５））及び酵素結合免疫吸着検定法（エングバル及びパールマン（Ｅｎｇｖａｌｌ ａｎｄ Ｐｅｒｌｍａｎｎ）、「酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）。免疫グロブリンの定量」、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ８： ８７１−８７４ （１９７１））、並びに二次元（２−Ｄ）ゲル電気泳動法（パットン（Ｐａｔｔｏｎ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２８： ９４４−９５７ （２０００））などの抗体に基づく検出システムを用いて検出されてきた。これらの技術は有効であるものの、その多くには明らかな欠点や限界があった。例えば、放射性標識は危険であり扱いが難しく、識別可能な標識が限られていることから蛍光標識を多重的検出に用いる能力には限界があり、そして増幅方法によって偽のシグナルが増幅される可能性もある。微量の特定の分子を検出でき、かつ高度な多重度に適用可能な検出標識及び検出技術の改良が必要とされている。
【０００３】
タンパク質の発現と存在の分析、例えばプロテオームプロファイリング、すなわちプロテオミクスには、タンパク質を多重的かつ鋭敏に検出する必要がある。プロテオームプロファイリングに関する最近の方法においては、このような検出に必要なツールが不足していることが示されている（ヘインズ及びイェーツ（Ｈａｙｎｅｓ ａｎｄ Ｙａｔｅｓ）、プロテオームプロファイリングにおける陥りやすい過ちと進歩、Ｙｅａｓｔ １７ （２）： ８１−８７ （２０００））。クロマトグラフィー及びキャピラリー電気泳動の技術はプロテオミクスの研究に影響を受けやすく、そしてその技術には顕著な開発の成果（例えば、クルル（Ｋｒｕｌｌ）ら、キャピラリー電気クロマトグラフィーの、タンパク質、核酸、ペプチドマッピング、抗体などの生体高分子への一定の応用。Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ， ８８７： １３７−６３ （２０００）、ヘイグ（Ｈａｇｅ）、アフィニティークロマトグラフィー：臨床への応用についての展望。Ｃｌｉｎ Ｃｈｅｍ， ４５ （５）： ５９３−６１５ （１９９９）、ヘイグら、クロマトグラフィーによる免疫測定法。Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ７３ （０７）： １９８ Ａ−２０５ Ａ， （２００１）、クルルら、クロマトグラフィーに応用できる標識化反応と微量タンパク質の電気泳動。Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ｂ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ Ａｐｐｌ， ６９９： １７３−２０８ （１９９７）などを参照すること）が見られているのに対して、業界の主力製品は依然として、等電点分離と分子サイズとの二次元から成る二次元電気泳動のままである。ヘインズ及びイェーツはこの技術の明らかな欠点を指摘しているものの、このような欠点に照らしてこの方法の有用性を議論している。ヘインズ及びイェーツはさらに、同位体コードアフィニティータグ（ＩＣＡＴ）、ＬＣ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ及び安定同位体を標識化する技術についても議論している（シェフチェンコ（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ）ら、ナノエレクトロスプレー、同位体の標識化及び四重極飛行時間型質量分析装置を組み合わせることによる、迅速「ｄｅ ｎｏｖｏ」アミノ酸配列決定。Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ １１ （９）： １０１５−１０２４ （１９９７）、オダ（Ｏｄａ）ら、タンパク質発現と部位特異的リン酸化の精密定量。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６ （１２）： ６５９１−６５９６ （１９９９））。
【０００４】
アエバソルド（Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ）ら（ＷＯ ００／１１２０８）はＰＲＧ−Ｌ−Ａ組成物の標識について記載しており、ここで、ＰＲＧとはタンパク質反応性基であり、Ｌとは（同位体的に区別できる成分を含んでいてもよい）リンカーであり、そしてＡとは親和性部分である。アエバソルドらは、標識をタンパク質に結合するためにタンパク質反応性基を使用し、親和性部分を捕獲するために親和性捕獲分子を使用し、そして残りのタンパク質は捨てられ、次いでこの親和性部分が遊離し、標識化タンパク質が質量分析法によって検出されるという方法を記載している。アエバソルドらの方法は、標識若しくはタンパク質の断片化又はその他の修飾を含んではいない。
【０００５】
コントロールサンプルとテスターサンプルの中において、重いタグ又は軽いタグのそれぞれが親和性部分を含むこれらのタグでシステイン残基を標識化するＩＣＡＴの技術は、顕著な利益とタンパク質のプロファイリングについての潜在的な手がかりとを受け入れてきた（ギギ（Ｇｙｇｉ）ら、同位体コードアフィニティータグを用いての、タンパク質の複雑な混合物の定量分析。Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７ （１０）： ９９４−９９９ （１９９９）、グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）ら、ＭＡＬＤＩ四重極飛行時間型質量分析装置を用いての、プロテオームの定量分析。Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７３： ９７８−９８６ （２００１））。ギギら及びグリフィンらは二つのタンパク質サンプルの相対的なプロファイリングを示しており、ここでは、八つの通常の水素原子か又は八つの重い水素原子（ジュウテリウム）のいずれか一方を含むリンカーを利用して、この二つのサンプルを識別している。リンカー分子中の８原子質量単位の違いに対応して分離するピークの比率から、標識化タンパク質の相対濃度を測定している。現時点での完成度では、二つの標識が限界である。この技術は、標識若しくはタンパク質の断片化又はその他の修飾を含んではいない。
【０００６】
質量分析法はリン酸化タンパク質の検出に用いられている（デグノール及びクイン（ＤｅＧｎｏｒｅ ａｎｄ Ｑｉｎ）、イオントラップ型質量分析装置によるホスホペプチドの断片化。Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ９： １１７５−１１８８ （１９９８）、クイン及びチャイト（Ｑｉｎ ａｎｄ Ｃｈａｉｔ）、ＭＡＬＤＩイオントラップ型質量分析法による翻訳後修飾タンパク質の同定とキャラクタリゼーション。Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ， ６９： ４００２−９ （１９９７）、アンナン（Ａｎｎａｎ）ら、多次元エレクトロスプレーＭＳに基づくホスホペプチドマッピングへのアプローチ。Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７３： ３９３−４０４ （２００１））。この方法は、リン酸基の存在を示すシグニチャー質量を利用する。例えば、陰イオンモードにおいてはｍ／ｚ＝６３及び／又はｍ／ｚ＝７９はＰ０２−イオン及びＰ０３−イオンに対応し、あるいは、親イオンからの９８ダルトンのニュートラルロスは、リン酸化ペプチドからのＨ３Ｐ０４の脱離を示し、このことはリン酸化セリン、リン酸化チロシン、リン酸化スレオニンの存在を示す。いったんリン酸化アミノ酸が同定されると、標準的なＭＳ／ＭＳ技術によって修飾を含むペプチドの配列が決定される。プロテオミクスのための、高い信頼性を有し高度に多重化された読み出しシステムが必要とされている。
【０００７】
「プロテオーム」を構成するタンパク質の複雑な配列によって、あらゆる生きている生物体の、その生物体の寿命の範囲の任意の時点における状態を規定することができる。存在する（修飾を伴う変異体を含めた）すべてのタンパク質の目録、並びにそれらの細胞内での位置及び濃度の目録を作成することによって、プロテオームの完全な状態を規定できるかもしれないものの、このような作業は現在のあらゆる単一分析方法の能力を超えている。しかしながら、タンパク質の小さなサブセットを同定し、その相対濃度を測定することによって、細胞又は組織の状態を規定する試みがなされてきた。例えば、コンラーズ（Ｃｏｎｒａｄｓ）ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ７２： ３３４９−３３５４ （２０００）、はプロテオーム全体のタンパク質の同定のために「精密質量タグ」（ＡＭＴ）を使用することを記載している。コンラードらは、単純な生物体について、十分に高い精密さと分解能とを有する質量分析装置を用いて、タンパク質由来のある特定の複数のトリプシン消化断片を検出できることを示している。いったん同定されれば、タンパク質のトリプシン消化と超精密高分解能質量分析とによって、サンプル中でＡＭＴを直接検出することができる。
【０００８】
精密質量タグのコンセプトは、タンパク質の発見並びに通常の生物学上の実験におけるペプチドパターンの作成にとって実用的であるものの、複数のタンパク質の診断上の評価という、本当の実用性の核心であるものについての感度の問題を解決するものではない。ＡＭＴから成る実用的な評価において、信頼性のある情報を読み出すためには、少なくとも２０００〜１０，０００の細胞を含むサンプルが必要となる。多くの重要な細胞性タンパク質は、一つの細胞あたりわずか５００〜５０００分子のレベルしか存在しないために、上記の通りとなるのである。臨床上の関連性を有するタンパク質が一つの細胞あたり５００コピー存在し、かつガン患者からの貴重な臨床サンプルにわずか１０００細胞しか含まれていない場合、タンパク質の総数は５００，０００となり、この数は通常の質量分析法の検出限界以下である。このように、ＡＭＴの同定後におけるプロテオームの研究についての、コンラードらによって提案された測定法のタイプは、例えばガンの診断などの重要な臨床上の問題を扱うには適当ではない。
【０００９】
発明の概要
一つ又は多数の検体の鋭敏な検出についての組成物及び方法が開示されている。この方法は一般的に、レポーターシグナル（ｒｅｐｏｒｔｅｒ ｓｉｇｎａｌ）と称する特別の標識成分の使用を含み、このレポーターシグナルは検体と会合すること、検体に組み込まれること又は別の形式で検体と連結されることが可能である。さらにレポーターシグナルを、検体とレポーターシグナルとの間に有意な会合を伴うことなく、検体と単に組み合わせて使用することも可能である。レポーターシグナルが検体と会合していたり、検体に組み込まれていたり、又は別の形式で検体と連結している状態の組成物を、レポーターシグナル／検体複合体と称する。このような複合体には、例えば、核酸配列とハイブリダイズしたレポーターシグナルプローブなどの検体と会合しているレポーターシグナル、連結基を介してタンパク質と連結しているレポーターシグナルなどの検体と共有結合しているレポーターシグナル、及び対象となっているタンパク質及びペプチドとレポーターシグナルとの融合体などの検体に組み込まれているレポーターシグナルなどが含まれる。
【００１０】
いくつかの態様において、種々のレポーターシグナルの改変体を他のそれぞれの改変体から識別できるようにレポーターシグナルを改変することができる。一般的に複合体のレポーターシグナル部分の改変を介してレポーターシグナル／検体複合体を改変することができ、それによって種々のレポーターシグナルの改変体、レポーターシグナル／検体複合体の改変体又はその両者を、他のそれぞれの改変体から識別できることとなる。レポーターシグナル又はレポーターシグナル／検体複合体が断片化によって改変された場合、いずれか一つの、いくらかの又はすべての断片を他のそれぞれの断片から、その態様に依存して識別することができる。例えば、レポーターシグナルが二つの部分に断片化した場合、レポーターシグナルのいずれか一方又は両者の識別が可能となる。レポーターシグナル／検体複合体が（レポーターシグナル部分に開裂点を伴う）二つの部分に断片化した場合、レポーターシグナル断片、レポーターシグナル／検体断片又はその両者のいずれか一つの識別が可能となる。いくつかの態様において、断片化レポーターシグナルの一方の部分だけが検出されることとなり、そういうわけで、レポートされたシグナルのこの部分だけを識別する必要がある。
【００１１】
いくつかの態様において、セットの中に存在する２以上のレポーターシグナルが一つ以上の共通する特性、すなわち、共通する特性を有するレポーターシグナルを、共通する特性を欠く他の分子から識別すること及び／又は分離することを可能にする特性を有する場合に、レポーターシグナルのセットを使用することができる。他の態様において、セットの中に存在する２以上のレポーターシグナル／検体複合体が一つ以上の共通する特性、すなわち、共通する特性を有するレポーターシグナル／検体複合体を、共通する特性を欠く他の分子から識別すること及び／又は分離することを可能にする特性を有する場合に、レポーターシグナル／検体複合体のセットを使用することができる。さらに他の態様において、（複合化の前又は後で）検体の断片化が可能であり、それによりレポーターシグナル／検体断片複合体（これは断片複合体と称することがある）が得られる。これらのケースにおいては、セットの中に存在する２以上の断片複合体が一つ以上の共通する特性、すなわち、共通する特性を有する断片複合体を、共通する特性を欠く他の分子から識別すること及び／又は分離することを可能にする特性を有する場合に、断片複合体のセットを使用することができる。断片化した検体であっても、それ自体が独立した検体と考えることができることを理解すべきである。この考え方に立てば、断片化した検体に言及することは、ある特定の態様を記述する際に好都合かつ明瞭であり、ベースとなる検体と断片化検体の両方に言及することを可能とする。
【００１２】
上記のように、複合体となっている間及び識別の間に、検体と複合化したレポーターシグナルを改変することができる。改変を行う前に、複合化した検体から複合化レポーターシグナルを全体的に又は部分的に解離又は分離することもできる。レポーターシグナルが検体から（全体的に又は部分的に）解離する場合には、検体とレポーターシグナルとの間の会合という事実が、レポーターシグナルが検出された時に得られる情報の一部分となるように、この方法を実施することができる。言い換えれば、検出のために検体からレポーターシグナルが解離してもよいという事実は、検出されたレポーターシグナルが検体と会合しているという情報を不明確にはしないということである。
【００１３】
さらに、レポーターシグナルは検体と（例えば、レポーターシグナルと検体との混合物の状態で）共存することも、又は単独で存在することも可能であり、前者の場合はレポーターシグナルと検体との間の顕著な物理学的会合は生じず、後者の場合は検体は存在しない。このようなケースにおいて、レポーターシグナルは検体と会合しないか又はもはや会合することはなく、セットの中に存在する２以上のレポーターシグナルが、一つ以上の共通する特性、すなわち、共通する特性を有するレポーターシグナルを、共通する特性を欠く他の分子から識別すること及び／又は分離することを可能とする特性を有する場合において、レポーターシグナルのセットを用いることができる。
【００１４】
レポーターシグナルの検出によって、それに対応する検体の存在が示される。レポーターシグナルは二つの重要な特色を持つことができることが好ましい。最初は、セットの中に存在するレポーターシグナルのすべてが類似の特性を有する場合（例えば、質量分析用のレポーターシグナルが類似の質量電荷比（ｍａｓｓ−ｔｏ−ｃｈａｒｇｅ ｒａｔｉｏ）を持っているかもしれない場合）においても、そのレポーターシグナルをセットの中で使用できることである。この類似の特性は、レポーターシグナルを、一つ以上の特性を欠く他の分子から識別すること及び／又は分離することを可能にしている。二番目は、セット中の種々のレポーターシグナルを識別するために、セット中のすべてのレポーターシグナルが断片化し得ること、分解され得ること、反応し得ること、誘導体化され得ること又は他の方法によって修飾され得ることである。類似の電荷を持つが質量が異なる断片を生じるように、質量分析用のレポーターシグナルが断片化することが好ましい。
【００１５】
レポーターシグナルの断片の質量が他の断片と異なるように分布させることは、多くのやり方によって達成され得る。例えば、ジュウテリウムなどの重い同位体の分布を変えることで、同一の名称の構造（例えば、同一のアミノ酸配列を有するペプチド）のレポーターシグナルを得ることができ、メチル化、リン酸化、硫酸化及びメチオニンに代えてのセレノメチオニンの使用などの修飾の分布を変えることで、同一の名称の構造のレポーターシグナルを得ることができ、レポーターシグナルのサブユニット又は構成エレメントの順序を変えることで、同一の名称の組成の（例えば、同一のアミノ酸から成る）レポーターシグナルを得ることができ、そして不安定な又は開裂しやすい結合をレポーターシグナルの種々の位置に設けることによって、同一の名称の組成のレポーターシグナルを得ることができる。これらの方法のそれぞれを互いに組み合わせること及び／又は一つ以上の他の方法と組み合わせることで、種々の質量の分布を有するレポーターシグナルの断片が得られる。
【００１６】
質量電荷比に基づく分子間の高感度な識別を可能にする質量分析法を用いてレポーターシグナルの検出を行うことが好ましい。開示されているレポーターシグナルとしては、種々の標識化技術及び／又は検出技術における一般的な標識を用いることができる。レポーターシグナル断片が広範囲の質量を持つように、かつ検出時にそれぞれの質量を個々に識別できるように設定することができることから、多数の検体を多重標識化及び／又は多重検出するために、同重体レポーターシグナルのセットを用いることができる。
【００１７】
開示されているこの方法は、非常に多くの分野、例えば、抗体マイクロアレイ又はタンパク質マイクロアレイ、ＤＮＡマイクロアレイ、発現プロファイリング、比較ゲノム学、免疫学、診断用測定及び品質管理などの分野において検出システムとして使用できるという有利な特性を有する。
【００１８】
Ａ．レポーター分子の標識化
レポーター分子の標識化（ＲＭＬ）と称する開示された方法の一つの態様においては、最初にレポーターシグナルは検体と会合し、次いで解離して検出される。レポーターシグナルは、特異的結合分子と検体との相互作用を介して検体と会合することが好ましい。レポーターシグナルは、特異的結合分子と検体との相互作用によってレポーターシグナルが検体と会合できるように、特異的結合分子と直接的又は間接的に会合する。この方法は、検体とレポーターシグナルとの間の会合の事実がレポーターシグナルが検出された時に得られる情報の一部であるように実行することができる。換言すれば、検出のために検体からレポーターシグナルが解離してもよいという事実は、検出されたレポーターシグナルが検体と解離したという情報をあいまいにはしないということである。
【００１９】
Ｂ．レポーターシグナルの標識化
レポーターシグナルの標識化（ＲＳＬ）と称する開示された方法の別の態様においては、一つ又は複数の検体を鋭敏に検出するためにレポーターシグナルが用いられる。この方法において、レポーターシグナルで標識化した検体をレポーターシグナルを用いて分析し、標識化検体を識別する（ここで、検体はレポーターシグナルで標識されている）。レポーターシグナルが検出されることにより、対応する１つ（又は複数）の検体の存在が示される。次いで、検出された１つ（又は複数）の検体を公知の技術で分析する。この標識は、１つ（又は複数）の検体を特異的に同定することができる独特の検体／標識組成物を提供する。特製のレポーターシグナルを標識として用いることによって、このことが成就される。１つ（又は複数）の標識化検体を、分析の前に断片化してもよい。さらに、分析される検体サンプルを分画又は分離に付してもよく、それによりサンプルの複雑さを緩和する。断片化と分画とを、同一の測定において一緒に行うこともできる。このような断片化と分画とによって、検体の分析を単純化することや、拡張することができる。
【００２０】
レポーターシグナルを検体と結合させてもよく、又は直接会合させてもよい。例えば、レポーターシグナルを反応性基を介して検体と結合させることや、あるいは（特異的結合分子及びレポーターシグナルから成る）レポーター分子を検体と会合させることができる。レポーターシグナルの検体への結合は、どのようなやり方であっても実施することができる。例えば、タンパク質上のシステインとレポーターシグナル上のシステインとの間の硫黄−硫黄結合を介して、レポーターシグナルをタンパク質と共有結合させることができる。化合物に検体を結合させるための数多くの他の化学反応及び技術が知られており、それらを用いてレポーターシグナルを検体に結合させてもよい。例えば、チオール、エポキシド、チオールのためのニトリル、ＮＨＳエステル、アミンのためのイソチオシアネート及びカルボン酸のためのアルコールを用いて結合させることができる。検体にレポーターシグナルを直接的に又は間接的に、例えばリンカーを介して結合してもよい。
【００２１】
あるいは、レポーターシグナルを検体と間接的に会合させてもよい。この方式では、特異的結合分子とコーディングタグ（ｃｏｄｉｎｇ ｔａｇ）とを含む「コーディング（ｃｏｄｉｎｇ）」分子を（特異的結合分子を介して）検体と会合させることができる。あるいは、コーディングタグを検体と結合させたり、又は直接的に会合させてもよい。次いで、デコーディングタグ（ｄｅｃｏｄｉｎｇ ｔａｇ）と会合したレポーターシグナル（このような組み合わせはレポーター分子の別の形態である）を、コーディングタグとデコーディングタグとの間の相互作用を介してそのコーディング分子と会合させる。この相互作用の一例はハイブリダイゼーションであり、ここではコーディングタグとデコーディングタグとが相補的核酸配列である。結果は、レポーターシグナルと検体との間接的な会合である。同一のタイプのコーディングタグ及びデコーディングタグを使うことによって、セット中にあるコーディング分子及びレポーター分子のすべてについての、レポーターシグナルとコーディング分子とのすべての相互作用を化学的かつ物理的に同等にすることができるという利点をこの方式は有する。
【００２２】
レポーターシグナルを断片化、分解、反応、誘導体化又は他のやり方で、好ましくは特徴的な方法で修飾することができる。このことにより、標識化検体と、レポーターシグナルの断片化、分解、反応、誘導体化又は他の修飾化後の一つ以上の標識化検体の産物との相関性を有する検出による、レポーターシグナルが結合した検体の同定が可能となる（標識化検体は検体／レポーターシグナルの組み合わせである）。特徴的で検出可能な方法によるレポーターシグナルの改変によって、標識化検体が変化することとなる。それと一緒に、特徴的な標識化検体と標識化検体の特徴的な産物とを検出することにより、検体を一義的に同定することができる。このやり方において、開示された方法と材料とを用いることで、一つ以上の検体を単独で又は（例えば、多重測定により）一緒に検出することができる。さらに、一つ以上のサンプルに存在する一つ以上の検体も多重的な方法により検出することができる。レポーターシグナルの質量分析のために、レポーターシグナルが断片化して類似の電荷を持つが質量が異なる断片を得ることが好ましい。
【００２３】
好ましい態様において、セット中のすべてのレポーターシグナルが同様の特性（例えば、類似の質量電荷比）を持っているようなセットの中で、レポーターシグナルを用いる。この同様の特性によって、一つ以上のその特性を欠く他の分子からレポーターシグナルを識別すること及び／又は分離することが可能となる。あるいは、又はさらに、得られた標識化検体が同様の特性、すなわち、一つ以上のその特性を欠く他の分子から標識化検体を識別すること及び／又は分離することを可能とする特性を持つようなセットの中で、レポーターシグナルを用いることができる。
【００２４】
開示されたレポーターシグナルを用いて、様々な方法で検体を検出することができる。例えば、検体と、結合したレポーターシグナルとを一緒に検出することができ、一つ以上の検体の断片と、一つ以上の結合したレポーターシグナルの断片とを一緒に検出することができ、レポーターシグナルの断片又はその組み合わせを検出することができる。好ましい検出には、レポーターシグナルの断片化の前及び後の両方で検体／レポーターシグナルを検出することが挙げられる。
【００２５】
開示された方法の好ましい態様には、レポーターシグナルの断片化の前及び後の両方での、そのレポーターシグナルの相関性を有する検出が挙げられる。このことによって、標識化検体の変化を介して標識化検体が検出されて同定されることが可能となる。すなわち、検出されたレポーターシグナルの性質（断片化していないことに対して断片化していること）が、標識されたものとしての検体を同定する。検体及びレポーターシグナルが質量電荷比によって検出された場合には、断片化したサンプルと断片化していないサンプルとの間の質量電荷比の変化によって比較の基礎が与えられる。このような質量電荷比の検出は、質量分析法によって成し遂げられることが好ましい。
【００２６】
一つの例としては、質量分析用の標識として設計されたレポーターシグナルでサンプル中の検体を標識化することができる、というものがある。この標識化検体を質量分析法に適用することは可能である。検体／レポーターシグナルに対応するピークが検出されることになる。質量分析装置の衝突セル中でのレポーターシグナルの断片化の結果、結合したレポーターシグナル部分の消失に対応するピークの移動、消失した断片に対応するピークの出現又はそれら両事象の組み合わせが生じる。観察された移動は、どのレポーターシグナルが検体上にあるかということに明確に依存することになる。というのは、異なるように設計されたレポーターシグナルは、種々の質量電荷比を持つ断片を生じることになるからである。親の質量／電荷（衝突ガスなし）と、レポーターシグナルからの断片の消失に対応する質量／電荷（衝突ガスあり）とが組み合わせて検出されるという事象は、標識化検体を示す。標準的な質量分析技術、例えば組成分析などにより、検体の同定を測定することができる。
【００２７】
開示された方法の一つの効果的な態様は、レポーターシグナルで標識された検体を使用して複数のサンプル（例えば、時系列測定又は他の比較分析など）を測定することことである。摂動後の生体システムの時間的応答の知識は、そのシステムの理解を追求するための非常に効果的なプロセスの一つである。時間的応答を追跡するために、摂動後の所定の時点にこのシステムのサンプル（例えば、細胞培養物からの細胞、最初に同期化して屠殺されたマウスなど）を得る。検体の空間プロファイルの知識（例えば、組織切片内の相対的な位置など）は、この生体システムの理解を追求するための非常に効果的なプロセスの一つである。
【００２８】
開示された方法において、一連のサンプルのそれぞれをレポーターシグナルのセット由来の種々のレポーターシグナルで標識化することができる。この目的のための好ましいレポーターシグナルは、質量に差が付くように分布しているものとなろう。とりわけ、レポーターシグナルのセットを構成する個々のものは、化学的には同一の挙動をするのにもかかわらず、それらの識別をできることが保証されていることから、安定同位体を使用することが好ましい。
【００２９】
質量電荷比に基づく分子間の高感度な識別を可能にする質量分析法を用いて標識化検体の検出を行うことが好ましい。開示されているレポーターシグナルとしては、種々の標識化技術及び／又は検出技術における一般的な標識を用いることができる。レポーターシグナル断片が広範囲の質量を持つように、かつ検出時にそれぞれの質量を個々に識別できるように設定することができることから、多数の検体を多重標識化及び／又は多重検出するために、同重体レポーターシグナルのセットを用いることができる。同一の検体又は同一のタイプの検体を同重体レポーターシグナルのセットで（例えば、種々のサンプル中にある同一の検体を標識化することによって）標識化する場合、同重体レポーターシグナルのセットを用いたことから生ずる標識化検体のセットも同重体となるだろう。レポーターシグナルの断片化によって、標識化検体のセットが、個々に検出可能な標識化タンパク質であって特徴のある種々の質量を持つタンパク質に分割されることとなるだろう。
【００３０】
開示された方法を多くの方式で使用することができる。例えば、開示された方法は、（一つの特定のサンプル中若しくは複数のサンプル中にある）一つの特定の検体の検出又は（単一のサンプル若しくは複数のサンプル中にある）複数の検体の検出に使用することができる。それぞれのケースにおいて、他の標識されていない検体から、又は１つ（又は複数）の検出される標識化検体の有する特性を欠く分子から、検出される１つ（又は複数）の検体を分離することができる。例えば、サンプル中の検体をレポーターシグナルで一般的に標識化することができ、いくつかの検体をその検体の有するいくつかの特性を基礎として分離することができる。例えば、分離された検体はある特定の質量電荷比を持つことができるであろう（質量電荷比に基づく分離によって選択された質量電荷比を持つ標識化検体及び標識されていない検体の両方が選択されることになる）。別の例としては、例えば、アフィニティータグなどのレポーターシグナルの特徴に基づいて、標識されていない分子から標識化検体のすべてを識別及び／又は分離することができる。種々のアフィニティータグを用いる場合、いくつかの標識化検体を他のものから識別及び／又は分離することができる。レポーターシグナルの標識化によって、検体のプロファイリングと目録作成とが可能になる。
【００３１】
開示された方法の一つの方式では、複数のサンプル中の複数の検体が標識され、そこでは、ある特定のサンプル中の検体のすべてが、同一のレポーターシグナルで標識される。すなわち、一つのサンプル中の検体の一般的な標識としてレポーターシグナルが使用される。しかしながら、それぞれのサンプルごとに、一つの異なるレポーターシグナルを用いる。このことにより、サンプル全体として、他のサンプルのそれぞれと比較することが可能となる。さらに、サンプル中の種々の検体を分離又は識別することにより、単一の測定で多数のサンプル中の検体を容易に分析することができる。例えば、複数のサンプル中のタンパク質を上記のようにレポーターシグナルで標識化することができ、そしてサンプルを一緒に混合した。種々の標識化タンパク質のうちのいくつか又はすべてを、例えば、タンパク質と抗体とをアレイ上で会合させることなどによって分離すれば、それぞれのアレイエレメントに存在するレポーターシグナルを同定することによって、それぞれのサンプル中のある特定のタンパク質の存在と量とを測定することができる。ある特定のアレイエレメントに対応するタンパク質が特定のサンプル中に存在したならば、次いで、そのアレイエレメントと会合したタンパク質のいくつかが、その特定のサンプルの標識化に使用したレポーターシグナルで標識されることとなる。そのレポーターシグナルの検出はこのことを示すであろう。これと同一の関係は他のサンプルのすべてについて当てはまる。さらに、検出されたレポーターシグナルの量から、ある特定のサンプル中のある特定のタンパク質の量を示すことができ、複数のサンプル中のタンパク質を同時に定量することによって、様々なサンプル中のタンパク質のレベルのとりわけ正確な比較検討を行うことができる。
【００３２】
レポーターシグナルタンパク質の標識化（ＲＳＰＬ）と称するレポーターシグナルの標識化の一つの態様においては、一つ又は複数のタンパク質を鋭敏に検出するためにレポーターシグナルが用いられる。この方法において、レポーターシグナルで標識されたタンパク質をレポーターシグナルを用いて分析し、標識化タンパク質を識別する。レポーターシグナルが検出されることにより、対応する１つ（又は複数）のタンパク質の存在が示される。次いで、検出された１つ（又は複数）のタンパク質を公知の技術で分析する。この標識は、１つ（又は複数）のタンパク質を特異的に同定することができる独特のタンパク質／標識組成物を提供する。特製のレポーターシグナルを標識として用いることによって、このことが成就される。分析の前に、１つ（又は複数）の標識化タンパク質を、例えばプロテアーゼ消化などによって断片化しておいてもよい。さらに、分析されるタンパク質サンプルを分画又は分離に付してもよく、それによりサンプルの複雑さを緩和する。断片化と分画とを、同一の測定において一緒に行うこともできる。このような断片化と分画とによって、タンパク質の分析を単純化することや、拡張することができる。
【００３３】
Ｃ．レポーターシグナルの較正
レポーターシグナルの較正（ＲＳＣ）と称するこの方法の別の態様においては、レポーターシグナルキャリブレーターと称するレポーターシグナルの一つの形態のものを検体又は検体断片と混合し、レポーターシグナルキャリブレーターと検体又は検体断片とを改変して、そしてレポーターシグナルキャリブレーターの改変体と検体の改変体又は検体断片の改変体を検出する。レポーターシグナルキャリブレーターは存在している検体の量を評価するための標準として有用である。すなわち、存在している検体の量を評価するために既知量のレポーターシグナルキャリブレーターを添加し、改変された検体又は改変された検体断片の検出量と改変されたレポーターシグナルキャリブレーターの検出量とを比較し、そしてこれらの量を添加した既知量のレポーターシグナルキャリブレーターで較正する（そしてこのようにして、改変されたレポーターシグナルキャリブレーターの量を予測する）。
【００３４】
いくつかの態様において、それぞれの検体又はそれぞれの検体断片は、少なくとも一つのレポーターシグナルキャリブレーターが有する一つ以上の共通する特性を共有することができ、それにより、この共通する特性を有するレポーターシグナルキャリブレーター及び検体又は検体断片を、この共通する特性を欠く他の分子から識別及び／又は分離することができる。
【００３５】
いくつかの態様において、レポーターシグナルキャリブレーター並びに検体及び検体断片を改変することができ、それにより、検体の改変体又は検体断片の改変体を、検体又は検体断片が共有する共通する特性を有するレポーターシグナルキャリブレーターの改変体から識別することができる。いくつかの態様において、種々のレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を他のそれぞれのものから識別することができる。いくつかの態様において、種々の検体又は種々の検体断片の改変体を他のそれぞれのものから識別することができる。
【００３６】
レポーターシグナルの較正のいくつかの態様において、検体又は検体断片は改変されずに、改変されたレポーターシグナルキャリブレーター及び検体又は検体断片が検出される。このケースにおいては、検体又は検体断片が共有する共通する特性を有するレポーターシグナルキャリブレーターの改変体から検体又は検体断片を識別することができる。
【００３７】
いくつかの態様において、検体又は検体断片がレポーターシグナル又はレポーターシグナルの断片であってもよい。このケースにおいて、レポーターシグナルキャリブレーターはレポーターシグナルの検出量についてのキャリブレーターとしての役割を果たす。
【００３８】
（検体としての）タンパク質及びペプチドとの関連においてレポーターシグナルの較正を行うことが好ましい。レポーターシグナルの較正のこの形態をレポーターシグナルタンパク質の較正と称する。レポーターシグナルタンパク質の較正は、例えば、タンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを作成するために有用である。本明細書で用いる場合、タンパク質シグニチャーとは、タンパク質のセット又はタンパク質代替物のセットの存在、欠如、量又は存在および量のことである。
【００３９】
レポーターシグナルタンパク質の較正のいくつかの態様において、検出される結合であって、タンパク質中の不安定な、開裂しやすい又は開裂可能な結合の存在を活用することができる。その結合の位置で断片化することによって、このような結合を含むペプチド、タンパク質又はタンパク質断片（便宜上、残りの明細書中で集合的にタンパク質断片と称する）を改変することができる。このようにして、タンパク質断片と（例えば、質量電荷比などの）共通する特性を持つレポーターシグナルキャリブレーターを用いることができ、そしてレポーターシグナルキャリブレーターの改変体及びタンパク質断片の改変された（すなわち断片化した）形態を検出し識別することができる。この点に関連して、タンパク質断片はそれらと適合するレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有しているのにもかかわらず、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体及びタンパク質断片の改変体を識別することができる（というのは、例えば、改変体は異なる質量電荷比などの種々の特性を持っているからである）。
【００４０】
Ｄ．レポーターシグナル融合体
レポーターシグナル融合体（ＲＳＦ）と称する開示された方法及び組成物の別の態様においては、レポーターシグナルペプチドが、単一のアミノ酸セグメント中に存在する、対象となっているタンパク質又はペプチドと結合している。このようなタンパク質とレポーターシグナルペプチドとの融合体は、この融合を構成するアミノ酸セグメントをコード化している核酸分子から発現され得る。本明細書において、この融合タンパク質をレポーターシグナル融合体と称する。レポーターシグナルペプチドは、そのレポーターシグナルペプチドと融合するタンパク質及びペプチドや、遺伝子、ベクター、発現構築物及びこれらをコード化している核酸の発現を鋭敏に監視し検出することを可能にする。とりわけ、このレポーターシグナル融合体は、対象となっている特定のタンパク質及びペプチドの発現、及び／又は対象となっているタンパク質及びペプチドをコード化している遺伝子、ベクター及び発現構築物を鋭敏かつ多重的に検出することを可能にする。
【００４１】
さらに、開示されたレポーターシグナル融合体は、レポーターシグナル融合体で標識された（すなわち、それと会合した又はその中に含まれている）、特定の１つ（又は複数）のタンパク質、１つ（又は複数）の遺伝子、１つ（又は複数）のベクター及び／又は１つ（又は複数）の発現配列を有する細胞、細胞系及び生物体を創製するためにも有用である。例えば、種々のレポーターシグナルペプチドを伴うレポーターシグナル融合体をそれぞれコード化している核酸構築物のセットを使用することができ、それにより細胞、細胞系及び／又は生物体のセットを独自に標識化する。あらゆる標識化供給源からのサンプルを加工することによって、他の改変体から識別され得る潜在的な供給源のそれぞれについての独自のレポーターシグナルペプチドの改変体（又はアミノ酸セグメント若しくはアミノ酸サブセグメント）を得ることができる。特定の改変体の検出により、それが生じた供給源を特定する。
【００４２】
さらに、開示されたレポーターシグナル融合体を、特定の経路、制御カスケード並びに他の遺伝子、タンパク質、ベクター及び／又は発現配列のひとそろいを「標識化」するのにも使用することができる。このような標識化は、同一の細胞、細胞系若しくは生物体の中にあり得るか又は細胞、細胞系若しくは生物体のセットを横断する形であり得る。例えば、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントは、対象となっている内因性発現配列、対象となっている内因性遺伝子、対象となっている外因性発現配列、対象となっている外因性遺伝子又はそれらの組み合わせと会合することができる。次いで、外因性構築物を対象となっている細胞又は対象となっている生物体の中へ導入する。例えば、（レポーターシグナル融合体をコード化している）核酸分子を挿入のために対象となっている発現配列又は遺伝子の部位へ導入することにより、又は（内因性発現配列若しくは遺伝子及びレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントの両方を含む）ベクター若しくは他の核酸構築物をインビトロで創製し、その構築物を対象となっている細胞又は対象となっている生物体の中へ導入することにより、内因性発現配列又は遺伝子との会合を成し遂げることができる。数多くの使用や使用方法があり得、それらのいくつかを下記に説明として記載する。とりわけ、緑色蛍光性タンパク質及び緑色蛍光性タンパク質融合体が用いられるところのいかなる文脈においてもかついかなる目的のためにも、開示されたレポーターシグナル融合体を使用することができる。しかしながら、開示されたレポーターシグナル融合体を多重化する能力のために、開示されたレポーターシグナルタンパク質の方が、少なくとも緑色蛍光性タンパク質よりも多くの用途があり、かつ有用である。
【００４３】
一つ又は複数のタンパク質（すなわち、レポーターシグナルペプチドが融合しているタンパク質）の高感度検出のために、レポーターシグナルペプチドを使用することができる。この方法において、レポーターシグナルペプチドを用いてレポーターシグナルペプチドと融合したタンパク質を分析し、それによりレポーターシグナル融合体を識別する。レポーターシグナルペプチドの検出は、１つ（又は複数）の対応するタンパク質の存在を示す。次いで、検出された１つ（又は複数）のタンパク質を公知の技術を用いて分析する。レポーターシグナル融合体により、１つ（又は複数）のタンパク質を特異的に同定することかできる独特のタンパク質／標識組成物が提供される。標識として特別なレポーターシグナルペプチドを用いることを通して、このことが成し遂げられる。
【００４４】
レポーターシグナル融合体は、その融合体をコード化している核酸分子の発現によって生産され得る。一般的には、例えば、一つのレポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとをその中に含むアミノ酸セグメントをコード化している核酸セグメントを設計することによって、開示されている融合体を設計することができる。ある特定の核酸分子は一つ以上の核酸セグメントを含むことができる。ある特定の核酸セグメントは一つ以上のアミノ酸セグメントをコード化することができる。ある特定のアミノ酸セグメントは、一つ以上のレポーターシグナルペプチドと、一つ以上の対象となっているタンパク質又はペプチドとを含むことができる。開示されているアミノ酸セグメントは、単一の、隣接するポリペプチド鎖から成るものである。すなわち、たとえ複数のアミノ酸セグメントが同一の隣接するポリペプチド鎖の一部分であり得るとしても、ある特定のアミノ酸セグメントのすべての構成成分（すなわち、対象となっている、１つ（又は複数）のレポーターシグナルペプチド、１つ（又は複数）のタンパク質及び１つ（又は複数）のペプチド）は、同一の隣接するポリペプチド鎖の一部分である。
【００４５】
レポーターシグナルペプチドを断片化、分解、反応、誘導体化又は他のやり方で、好ましくは特徴的な方法で修飾することができる。このことにより、レポーターシグナルペプチドの断片化、分解、反応、誘導体化又は他の修飾化後の一つ以上のレポーターシグナル誘導体の産物の検出による、レポーターシグナルペプチドが融合するタンパク質の同定が可能となる。一つ以上のサンプルに存在する一つ以上のタンパク質の発現も多重的な方法により検出することができる。レポーターシグナルの質量分析のために、レポーターシグナルペプチドが断片化して類似の電荷を持つが質量が異なる断片を得ることが好ましい。
【００４６】
レポーターシグナルペプチドを断片化して、類似の電荷を持つが質量が異なる断片を得ることが好ましい。これにより、セット中のそれぞれのレポーターシグナル融合体（及び／又はそれぞれのレポーターシグナルペプチド）を、レポーターシグナルペプチド断片又はレポーターシグナル融合体断片（すなわち、その改変体）の質量電荷比の違いによって識別することが可能となる。種々のレポーターシグナルペプチドの断片（又はレポーターシグナル融合体の断片）が種々の質量電荷比を持つようにこれら断片を設計することが可能なので、このことは可能である。開示された方法において、このことにより、レポーターシグナルペプチドの断片化後にそれぞれのレポーターシグナル融合体をレポーターシグナル融合体の質量電荷比によって識別することが可能となる。
【００４７】
レポーターシグナル融合体中のレポーターシグナルペプチドの改変によって、多様な改変された組成物を形成することができる。これらの改変体のいかなるもの又はすべてを検出することができる。例えば、レポーターシグナルペプチドの改変体を検出することができ、（レポーターシグナルペプチドを含む）アミノ酸セグメントの改変体を検出することができ、アミノ酸セグメントのサブセグメントの改変体を検出することができ、又はこれらの組み合わせを検出することができる。断片化によってレポーターシグナルペプチドを改変した場合、一般的に生じるものは、レポーターシグナルペプチドの断片と、対象となっているタンパク質又はペプチドとレポーターシグナルペプチドの一部（すなわち、レポーターシグナルペプチド断片中にはない方の一部）とを含むアミノ酸セグメントの改変体であろう。さらに、対象となっているタンパク質又はペプチドをも断片化することができる。生じるものはアミノ酸セグメントのサブセグメントであろう。アミノ酸サブセグメントは、レポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドの一部とを含むことになる。アミノ酸サブセグメント中のレポーターシグナルペプチドを改変した場合（アミノ酸セグメントの断片化の前、断片化中又は断片化後に起こすことができる）、アミノ酸サブセグメントの改変体（及びレポーターシグナルペプチドの改変体）が生じる。アミノ酸サブセグメントのこの改変体を検出することができる。
【００４８】
一般的にレポーターシグナルと同様、セット内のレポーターシグナルペプチドが一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性、を持つことができるというセット内でレポーターシグナルペプチドを用いることができる。レポーターシグナル融合体のケースにおいては、セット内のアミノ酸セグメント及びアミノ酸サブセグメントが一つ以上の共通する特性、すなわちアミノ酸セグメント及びアミノ酸サブセグメントをそれぞれ共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性、を持つことができるセット内で、アミノ酸セグメント及びアミノ酸サブセグメントを使用することができる。一般的に、共通する特性を有するレポーターシグナル融合体の１つ（又は複数）の構成成分は、検出される１つ（又は複数）の構成成分に及び／又は使用する方法の方式に依存してもよい。
【００４９】
一組の核酸分子によってコード化されているレポーターシグナル融合体中のレポーターシグナルペプチドが、一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸分子を使用することができる。同様に、一組の核酸セグメントによってコード化されているレポーターシグナル融合体中のレポーターシグナルペプチドが一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメント（一般的には核酸分子の一部）を使用することができる。対象となっている核酸分子、核酸セグメント、アミノ酸セグメント、レポーターシグナルペプチド及びタンパク質のセットを構成する個々のもの間の他の関係が検討されている。
【００５０】
開示されたレポーターシグナル融合体を用いて、様々な方法で細胞、細胞系、生物体及び遺伝子の発現並びにタンパク質を検出することができる。例えば、タンパク質と、結合したレポーターシグナルペプチドとを一緒に検出することができ、一つ以上のタンパク質のペプチドと、一つ以上の結合したレポーターシグナルペプチドとを一緒に検出することができ、レポーターシグナルペプチドの断片又はその組み合わせを検出することができる。好ましい検出には、レポーターシグナルペプチドの断片化の前及び後の両方でレポーターシグナル融合体を検出することが挙げられる。
【００５１】
開示された方法の一つの効果的な態様は、レポーターシグナル融合体を使用して複数のサンプル（例えば、時系列測定又は他の比較分析など）を測定することことである。摂動後の生体システムの時間的応答の知識は、そのシステムの理解を追求するための非常に効果的なプロセスの一つである。時間的応答を追跡するために、摂動後の所定の時点にこのシステムのサンプル（例えば、細胞培養物からの細胞、最初に同期化して屠殺されたマウスなど）を得る。タンパク質の空間プロファイルの知識（例えば、組織切片内の相対的な位置など）は、この生体システムの理解を追求するための非常に効果的なプロセスの一つである。
【００５２】
質量電荷比に基づく分子間の高感度な識別を可能にする質量分析法を用いてレポーターシグナル融合体の検出を行うことが好ましい。レポーターシグナルペプチド断片が広範囲の質量を持つように、かつ検出時にそれぞれの質量を個々に識別できるように設定することができることから、多数の遺伝子発現物、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系及び生物体を多重標識化及び／又は多重検出するために、同重体レポーターシグナルペプチドのセット又は同重体レポーターシグナル融合体のセットを用いることができる。同一の遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系若しくは生物体（又は同一のタイプの遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系若しくは生物体）を同重体レポーターシグナル融合体のセットか又は同重体レポーターシグナルペプチドを含むレポーターシグナル融合体のセットで（例えば、種々のサンプル中にある同一の遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系又は生物体を「標識化」することによって）標識化する場合、生ずるレポーターシグナル融合体のセット又はレポーターシグナルペプチドのセットも同重体となるだろう。レポーターシグナルペプチドの断片化によって、レポーターシグナルペプチドのセットが、個々に検出可能な、特徴のある種々の質量を持つレポーターシグナル融合体断片及びレポーターシグナルペプチド断片に分割されることとなるだろう。
【００５３】
開示された方法の好ましい態様には、他の分子からの、質量電荷比に基づく同重体レポーターシグナル融合体又は同重体レポーターシグナルペプチドのフィルタリング、レポーターシグナルペプチドの断片化とそれによる種々の質量を有する断片の産生、及び質量電荷比に基づく種々の断片の検出が含まれる。本明細書の他の箇所に記載されているように、タンデム質量分析装置を用いてこの方法を実施することが最も好ましい。
【００５４】
本発明の目的は、検体の存在、量又は存在および量を多重測定するための方法を提供することにある。
【００５５】
本発明の目的は、その存在、量又は存在および量を測定することが可能な標識化タンパク質を提供することにある。
【００５６】
本発明の別の目的は、タンパク質の存在、量又は存在および量の多重測定が可能となるように、タンパク質を標識化する方法を提供することにある。
【００５７】
本発明の別の目的は、タンパク質の存在、量又は存在および量の多重測定方法を提供することにある。
【００５８】
本発明の目的は、質量タグシグニチャーを検出する方法を提供することにある。
【００５９】
本発明の目的は、タンパク質シグニチャーを検出する方法を提供することにある。
【００６０】
本発明の別の目的は、タンパク質シグニチャーの評価を含む、ペプチドの同定と純度とを評価することを提供することにある。
【００６１】
本発明の別の目的は、タンパク質シグニチャーを検出する工程を含む、複数のペプチドの中からホスホペプチド又は他の翻訳後修飾タンパク質を検出する方法を提供することにある。
【００６２】
本発明の別の目的は、質量タグシグニチャーを創製するためのキットを提供することにある。
【００６３】
本発明の別の目的は、タンパク質シグニチャーを創製するためのキットを提供することにある。
【００６４】
発明の詳細な説明
一つ又は多数の検体の鋭敏な検出についての組成物及び方法が開示されている。この方法は一般的に、レポーターシグナルと称する特別の標識成分の使用を含み、このレポーターシグナルは検体と会合すること、検体に組み込まれること又は別の形式で検体と連結することが可能である。さらにレポーターシグナルを、検体とレポーターシグナルとの間に有意な会合を伴うことなく、検体と単に組み合わせて使用することも可能である。レポーターシグナルが検体と会合していたり、検体に組み込まれていたり、又は別の形式で検体と連結している状態の組成物を、レポーターシグナル／検体複合体と称する。このような複合体には、例えば、核酸配列とハイブリダイズしたレポーターシグナルプローブなどの検体と会合しているレポーターシグナル、連結基を介してタンパク質と連結しているレポーターシグナルなどの検体と共有結合しているレポーターシグナル、及び対象となっているタンパク質及びペプチドとレポーターシグナルとの融合体などの検体に組み込まれているレポーターシグナルなどが含まれる。
【００６５】
いくつかの態様において、種々のレポーターシグナルの改変体を他のそれぞれの改変体から識別できるようにレポーターシグナルを改変することができる。一般的に複合体のレポーターシグナル部分の改変を介してレポーターシグナル／検体複合体を改変することができ、それによって種々のレポーターシグナルの改変体、レポーターシグナル／検体複合体の改変体又はその両者を、他のそれぞれの改変体から識別できることとなる。レポーターシグナル又はレポーターシグナル／検体複合体が断片化によって改変された場合、いずれか一つの、いくらかの又はすべての断片を他のそれぞれの断片から、その態様に依存して識別することができる。例えば、レポーターシグナルが二つの部分に断片化した場合、レポーターシグナルのいずれか一方又は両者の識別が可能となる。レポーターシグナル／検体複合体が（レポーターシグナル部分に開裂点を伴う）二つの部分に断片化した場合、レポーターシグナル断片、レポーターシグナル／検体断片又はその両者のいずれか一つの識別が可能となる。いくつかの態様において、断片化レポーターシグナルの一方の部分だけが検出されることとなり、そういうわけで、レポートされたシグナルのこの部分だけを識別する必要がある。
【００６６】
いくつかの態様において、セットの中に存在する２以上のレポーターシグナルが一つ以上の共通する特性、すなわち、共通する特性を有するレポーターシグナルを、共通する特性を欠く他の分子から識別すること及び／又は分離することを可能にする特性を有する場合に、レポーターシグナルのセットを使用することができる。他の態様において、セットの中に存在する２以上のレポーターシグナル／検体複合体が一つ以上の共通する特性、すなわち、共通する特性を有するレポーターシグナル／検体複合体を、共通する特性を欠く他の分子から識別すること及び／又は分離することを可能にする特性を有する場合に、レポーターシグナル／検体複合体のセットを使用することができる。さらに他の態様において、（複合化の前又は後で）検体の断片化が可能であり、それによりレポーターシグナル／検体断片複合体（これは断片複合体と称することがある）が得られる。これらのケースにおいては、セットの中に存在する２以上の断片複合体が一つ以上の共通する特性、すなわち、共通する特性を有する断片複合体を、共通する特性を欠く他の分子から識別すること及び／又は分離することを可能にする特性を有する場合に、断片複合体のセットを使用することができる。断片化した検体であっても、それ自体が独立した検体と考えることができることを理解すべきである。この考え方に立てば、断片化検体に言及することは、ある特定の態様を記述する際に好都合かつ明瞭であり、ベースとなる検体と断片化検体の両方に言及することを可能とする。
【００６７】
上記のように、複合体となっている間及び識別の間に、検体と複合化したレポーターシグナルを改変することができる。改変を行う前に、複合化した検体から複合化レポーターシグナルを全体的に又は部分的に解離又は分離することもできる。レポーターシグナルが検体から（全体的に又は部分的に）解離する場合には、検体とレポーターシグナルとの間の会合という事実が、レポーターシグナルが検出された時に得られる情報の一部分となるように、この方法を実施することができる。言い換えれば、検出のために検体からレポーターシグナルが解離してもよいという事実は、検出されたレポーターシグナルが検体と会合しているという情報を不明確にはしないということである。
【００６８】
さらに、レポーターシグナルは検体と（例えば、レポーターシグナルと検体との混合物の状態で）共存することも、又は単独で存在することも可能であり、前者の場合はレポーターシグナルと検体との間の顕著な物理学的会合は生じず、後者の場合は検体は存在しない。このようなケースにおいて、レポーターシグナルは検体と会合しないか又はもはや会合することはなく、セットの中に存在する２以上のレポーターシグナルが、一つ以上の共通する特性、すなわち、共通する特性を有するレポーターシグナルを、共通する特性を欠く他の分子から識別すること及び／又は分離することを可能とする特性を有する場合において、レポーターシグナルのセットを用いることができる。
【００６９】
レポーターシグナルの検出は、対応する検体の存在を示す。レポーターシグナルは鍵となる特徴を持つことができる。第一は、セットの中のすべてのレポーターシグナルが類似の特性を持っているというセット中で、レポーターシグナルを使用することができるというものである。この類似の特性によって、レポーターシグナルを、一つ以上のこの特性を欠く他の分子と識別及び／又は分離することができる。セット中のレポーターシグナルが同一の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有していることが好ましい。すなわち、セット中のレポーターシグナルは同重体である。これにより、レポーターシグナルを質量電荷比に基づいて他の分子と正確に分離することができる。フィルタリングの結果、システムについての信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比が大きく向上し、より高感度でより正確な検出が可能となる。
【００７０】
第二は、セット中のすべてのレポーターシグナルを断片化、分解、反応、誘導体化又は他の修飾法に付することができ、それによりセット中の種々のレポーターシグナルを識別するというものである。例えば、レポーターシグナルを断片化することができ、それにより同一の電荷を持つが質量が異なる断片を得る。これにより、セット中のそれぞれのレポーターシグナルを、レポーターシグナル断片の質量電荷比の違いによって識別することが可能となる。セット中の断片化していないレポーターシグナルは同重体であるにもかかわらず、異なるレポーターシグナルの断片はそうではないため、このことは可能である。質量電荷比に基づいて検出される及び／又は質量分析装置を用いて検出されるレポーターシグナルを、マススペクトロメーターレポーターシグナルと称することができる。
【００７１】
レポーターシグナルの断片の質量が他の断片と異なるように分布させることは、多くのやり方によって達成され得る。例えば、ジュウテリウムなどの重い同位体の分布を変えることで、同一の名称の構造（例えば、同一のアミノ酸配列を有するペプチド）のレポーターシグナルを得ることができる。セット中のすべてのレポーターシグナルが同数のある特定の重い同位体を持っていても、異なるレポーターシグナルに関しては、これらの分布は異なるものとなるだろう。同様に、例えば、メチル化、リン酸化、硫酸化及びメチオニンに代えてのセレノメチオニンの使用などの異なる区分の修飾を伴った、同一の一般構造（例えば、同一のアミノ酸配列を持つペプチドなど）のレポーターシグナルを作成することができる。セット中のすべてのレポーターシグナルが同数のある特定の修飾を受けていても、異なるレポーターシグナルに関しては、これらの分布は異なるものとなるだろう。レポーターシグナルのサブユニットの順序が異なっているか又はレポーターシグナルの成分が異なっている同一名称の組成物（例えば、同一のアミノ酸から構成されているものなど）のレポーターシグナルを作成できる。セット中のすべてのレポーターシグナルが同一のサブユニットの数又は同一の成分であっても、異なるレポーターシグナルに関しては、これらの分布は異なるものとなるだろう。不安定な又は開裂しやすい結合をレポーターシグナルの異なる位置に有する同一名称の組成物（例えば、同一のアミノ酸から構成されているものなど）のレポーターシグナルを作成することができる。セット中のすべてのレポーターシグナルが同一の数かつ同一の順序のサブユニット又は成分を有するだろう。不安定な又は開裂しやすい結合が、ある特定のサブユニット又は成分の間に存在する場合、不安定な又は開裂しやすい結合を作るサブユニット又は成分を除いて、レポーターシグナル中のサブユニット又は成分の順序は同一であってもよい。これらの方式のそれぞれを一つ以上の他の方式と組み合わせてもよく、それにより質量分布が異なる複数のレポーターシグナル断片が製造される。例えば、不安定な又は開裂しやすい結合が異なる位置に存在するレポーターシグナル中で、異なる分布を持つ重い同位体を使用することができる。
【００７２】
質量電荷比に基づく分子間の高感度な識別を可能にする質量分析法を用いてレポーターシグナルの検出を行うことが好ましい。開示されているレポーターシグナルとしては、種々の標識化技術及び／又は検出技術における一般的な標識を用いることができる。レポーターシグナル断片が広範囲の質量を持つように、かつ検出時にそれぞれの質量を個々に識別できるように設定することができることから、多数の検体を多重標識化及び／又は多重検出するために、同重体レポーターシグナルのセットを用いることができる。
【００７３】
現在の技術には、標識を多重化する能力に限界がある。対照的に、開示された方法によって、多数のサンプルを同時に読み取ることや、逐次読み取りシステムと比較して本質的な精度を高めることが可能となる。
【００７４】
開示された方法の好ましい態様には、他の分子からの、質量電荷比に基づく同重体レポーターシグナルのフィルタリング、レポーターシグナルの断片化とそれによる種々の質量を有する断片の産生、及び質量電荷比に基づく種々の断片の検出が含まれる。タンデム質量分析装置を用いてこの方法を実施することが最も好ましく、ここでは、同重体レポーターシグナルが四重極フィルタリングを通過し、レポーターシグナルが衝突セル中で断片化し、そして飛行時間（ＴＯＦ）段階にて断片を識別し検出する。このような装置において、サンプルが源で（例えば、ＭＡＬＤＩイオン源で）イオン化され、荷電イオンを生ずる。主に一価の親イオンが生ずるとなるイオン化条件が好ましい。最初の四重極、Ｑ０はラジオ周波数（ＲＦ）モードのみで操作され、そしてすべての荷電粒子のためのイオンガイドとして機能する。次の四重極、Ｑ１はＲＦ＋ＤＣモードで操作され、（レポーターシグナルの質量電荷比を含む）狭い範囲の質量電荷比のみが通過する。この四重極により、対象となっている質量電荷比が選択される。四重極Ｑ２は衝突セルに囲まれ、ＲＦモードのみで操作されてイオンガイドとして機能する。Ｑ２を囲んでいる衝突セルはガスで適切な圧力に満たされ、進入してきたイオンを衝突誘起解離によって破壊する。衝突ガスは化学的に不活性なものが好ましいが、反応性のガスを使用することも可能である。開裂しやすい結合、不安定な結合又はこれらの組み合わせを含み、これらの結合がＱ２衝突セルの中で優先的に破壊されるようなレポーターシグナルを活用する分子システムが好ましい。
【００７５】
Ａ．レポーター分子の標識化
レポーター分子の標識化（ＲＭＬ）と称する開示された方法の一つの態様においては、レポーターシグナルが検体と会合して検出され及び／又は定量される。例えば、レポーターシグナルを、対象となっている検体と相互作用する特異的結合分子と会合させてもよい。このような組み合わせをレポーター分子と称する。レポーター分子における特異的結合分子は検体と相互作用し、それによりレポーターシグナルと検体とが会合する。あるいは、レポーターシグナルを検体と間接的に会合させてもよい。この方式では、特異的結合分子とコーディングタグとを含む「コーディング」分子を（特異的結合分子を介して）検体と会合させる。あるいは、コーディングタグを検体と結合させたり、又は直接的に会合させてもよい。次いで、デコーディングタグと会合したレポーターシグナル（このような組み合わせはレポーター分子の別の形態である）を、コーディングタグとデコーディングタグとの間の相互作用を介してそのコーディング分子と会合させる。この相互作用の一例はハイブリダイゼーションであり、ここではコーディングタグとデコーディングタグとが相補的核酸配列である。結果は、レポーターシグナルと検体との間接的な会合である。同一のタイプのコーディングタグ及びデコーディングタグを使うことによって、セット中にあるコーディング分子及びレポーター分子のすべてについての、レポーターシグナルとコーディング分子とのすべての相互作用を化学的かつ物理的に同等にすることができるという利点をこの方式は有する。
【００７６】
Ｂ．レポーターシグナルの標識化
レポーターシグナルの標識化（ＲＳＬ）と称する開示された方法の別の態様においては、一つ又は複数の検体を鋭敏に検出するためにレポーターシグナルが用いられる。この方法において、レポーターシグナルで標識された検体をレポーターシグナルを用いて分析し、標識化検体を識別する（ここで、検体はレポーターシグナルで標識されている）。レポーターシグナルが検出されることにより、対応する１つ（又は複数）の検体の存在が示される。次いで、検出された１つ（又は複数）の検体を公知の技術で分析する。この標識は、１つ（又は複数）の検体を特異的に同定することができる独特の検体／標識組成物を提供する。レポーターシグナルを標識として用いることによって、このことが成就される。１つ（又は複数）の標識化検体を、分析の前に断片化してもよい。さらに、分析される検体サンプルを分画又は分離に付してもよく、それによりサンプルの複雑さを緩和する。断片化と分画とを、同一の測定において一緒に行うこともできる。このような断片化と分画とによって、検体の分析を単純化することや、拡張することができる。
【００７７】
レポーターシグナルを検体と結合させてもよく、又は直接会合させてもよい。例えば、レポーターシグナルを反応性基を介して検体と結合させることや、又は（特異的結合分子及びレポーターシグナルから成る）レポーター分子を検体と会合させることができる。レポーターシグナルの検体への結合は、どのようなやり方であっても実施することができる。例えば、タンパク質上のシステインとレポーターシグナル上のシステインとの間の硫黄−硫黄結合を介して、レポーターシグナルをタンパク質と共有結合させることができる。化合物に検体を結合させるための数多くの他の化学反応及び技術が知られており、それらを用いてレポーターシグナルを検体に結合させてもよい。例えば、チオール、エポキシド、チオールのためのニトリル、ＮＨＳエステル、アミンのためのイソチオシアネート及びカルボン酸のためのアルコールを用いて結合させることができる。検体にレポーターシグナルを直接的に又は間接的に、例えばリンカーを介して結合してもよい。
【００７８】
さらに、レポーターシグナル又はレポーターシグナルを含む構築物もライゲーションによって検体に取り付けたり又は結合させることができる。核酸のライゲーションの方法はよく知られており（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、１９８９、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨークを参照すること）、効率的なタンパク質のライゲーションも知られている（例えば、ドーソン（Ｄａｗｓｏｎ）ら、「ネイティブ化学ライゲーションによるタンパク質の合成」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６， ７７６−９ （１９９４）、ハッケング（Ｈａｃｋｅｎｇ）ら、「マルチドメインタンパク質の化学合成と自発的フォールディング：抗凝血性微小タンパク質Ｓ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７： １４０７４−８ （２０００）、ドーソンら、「化学ライゲーションによる天然タンパク質の合成」Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６９： ９２３−９６０ （２０００）、米国特許第６，１８４，３４４号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ ９８／２８４３４号を参照すること）。
【００７９】
あるいは、レポーターシグナルを検体と間接的に会合させてもよい。この方式では、特異的結合分子とコーディングタグとを含む「コーディング」分子を（特異的結合分子を介して）検体と会合させることができる。あるいは、コーディングタグを検体と結合させたり、又は直接的に会合させてもよい。次いで、デコーディングタグと会合したレポーターシグナル（このような組み合わせはレポーター分子の別の形態である）を、コーディングタグとデコーディングタグとの間の相互作用を介してそのコーディング分子と会合させる。この相互作用の一例はハイブリダイゼーションであり、ここではコーディングタグとデコーディングタグとが相補的核酸配列である。結果は、レポーターシグナルと検体との間接的な会合である。同一のタイプのコーディングタグ及びデコーディングタグを使うことによって、セット中にあるコーディング分子及びレポーター分子のすべてについての、レポーターシグナルとコーディング分子とのすべての相互作用を化学的かつ物理的に同等にすることができるという利点をこの方式は有する。
【００８０】
レポーターシグナルを断片化、分解、反応、誘導体化又は他のやり方で、好ましくは特徴的な方法で修飾することができる。このことにより、標識化検体と、レポーターシグナルの断片化、分解、反応、誘導体化又は他の修飾化後の一つ以上の標識化検体の産物との相関性を有する検出による、レポーターシグナルが結合している検体の同定が可能となる（標識化検体は検体／レポーターシグナルの組み合わせである）。特徴的で検出可能な方法によるレポーターシグナルの改変によって、標識化検体が変化することとなる。それと一緒に、特徴的な標識化検体と標識化検体の特徴的な産物とを検出することにより、検体を一義的に同定することができる。このやり方において、開示された方法と材料とを用いることで、一つ以上の検体を単独で又は（例えば、多重測定により）一緒に検出することができる。さらに、一つ以上のサンプルに存在する一つ以上の検体も多重的な方法により検出することができる。レポーターシグナルの質量分析のために、レポーターシグナルが断片化して類似の電荷を持つが質量が異なる断片を得ることが好ましい。
【００８１】
レポーターシグナルを断片化して、類似の電荷を持つが質量が異なる断片を得ることが好ましい。これにより、セット中のそれぞれの標識化検体（及び／又はそれぞれのレポーターシグナル）を、レポーターシグナル断片の質量電荷比の違いによって識別することが可能となる。セット中の断片化していないレポーターシグナルは同重体であるのにもかかわらず、異なるレポーターシグナルの断片はそうではないため、このことは可能である。開示された方法において、このことにより、レポーターシグナルの断片化後にそれぞれの検体／レポーターシグナルの組み合わせを、検体／レポーターシグナルの質量電荷比によって識別することが可能となる。
【００８２】
好ましい態様においては、セット中のすべてのレポーターシグナルが同様の特性（例えば、類似の質量電荷比）を持っているようなセットの中で、レポーターシグナルを用いる。この同様の特性によって、一つ以上のその特性を欠く他の分子からレポーターシグナルを識別すること及び／又は分離することが可能となる。セット中のレポーターシグナルが同一の質量電荷比（ｍ／ｚ）を持つことが好ましい。すなわち、セット中のレポーターシグナルは同重体である。これにより、質量電荷比に基づいて、レポーターシグナル（又はレポーターシグナルが結合しているあらゆる検体）を他の分子から正確に分離することが可能となる。フィルタリングの結果、システムについての信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比が大きく向上し、より高感度でより正確な検出が可能となる。あるいは、又はさらに、得られた標識化検体が同様の特性、すなわち、一つ以上のその特性を欠く他の分子から標識化検体を識別すること及び／又は分離することを可能とする特性を持つようなセットの中で、レポーターシグナルを用いることができる。
【００８３】
開示されたレポーターシグナルを用いて、様々な方法で検体を検出することができる。例えば、検体と、結合したレポーターシグナルとを一緒に検出することができ、一つ以上の検体の断片と一つ以上の結合したレポーターシグナルの断片とを一緒に検出することができ、レポーターシグナルの断片又はその組み合わせを検出することができる。好ましい検出には、レポーターシグナルの断片化の前及び後の両方で検体／レポーターシグナルを検出することが挙げられる。
【００８４】
開示された方法の好ましい態様には、レポーターシグナルの断片化の前及び後の両方での、そのレポーターシグナルの相関性を有する検出が挙げられる。このことによって、標識化検体の変化を介して標識化検体が検出されて同定されることが可能となる。すなわち、検出されたレポーターシグナルの性質（断片化していないことに対して断片化していること）が、標識されたものとしての検体を同定する。検体及びレポーターシグナルが質量電荷比によって検出された場合には、断片化したサンプルと断片化していないサンプルとの間の質量電荷比の変化によって比較の基礎が与えられる。このような質量電荷比の検出は、質量分析法によって成し遂げられることが好ましい。
【００８５】
一つの例としては、質量分析用の標識として設計されたレポーターシグナルでサンプル中の検体を標識化することができる、というものがある。この標識化検体を質量分析法に適用することは可能である。検体／レポーターシグナルに対応するピークが検出されることになる。質量分析装置中（好ましくは衝突セル中）でのレポーターシグナルの断片化の結果、結合したレポーターシグナル部分の消失に対応するピークの移動、消失した断片に対応するピークの出現又はそれら両事象の組み合わせが生じる。観察された移動は、どのレポーターシグナルが検体上にあるかということに明確に依存することになる。というのは、異なるように設計されたレポーターシグナルは、種々の質量電荷比を持つ断片を産することになるからである。親の質量／電荷（衝突ガスなし）と、レポーターシグナルからの断片の消失に対応する質量／電荷（衝突ガスあり）とが組み合わせて検出されるという事象は、標識化検体を示す。標準的な質量分析技術、例えば組成分析などにより、検体の同定を行なうことができる。
【００８６】
開示された方法の一つの効果的な態様は、レポーターシグナルで標識された検体を使用して複数のサンプル（例えば、時系列測定又は他の比較分析など）を測定することことである。摂動後の生体システムの時間的応答の知識は、そのシステムの理解を追求するための非常に効果的なプロセスの一つである。時間的応答を追跡するために、摂動後の所定の時点にこのシステムのサンプル（例えば、細胞培養物からの細胞、最初に同期化して屠殺されたマウスなど）を得る。検体の空間プロファイルの知識（例えば、組織切片内の相対的な位置など）は、この生体システムの理解を追求するための非常に効果的なプロセスの一つである。
【００８７】
開示された方法において、一連のサンプルのそれぞれをレポーターシグナルのセット由来の種々のレポーターシグナルで標識化することができる。この目的のための好ましいレポーターシグナルは、質量に差が付くように分布しているものとなろう。とりわけ、レポーターシグナルのセットを構成する個々のものは、化学的には同一の挙動をするのにもかかわらず、それらの識別をできることが保証されていることから、安定同位体を使用することが好ましい。
【００８８】
質量電荷比に基づく分子間の高感度な識別を可能にする質量分析法を用いて標識化検体の検出を行うことが好ましい。開示されているレポーターシグナルとしては、種々の標識化技術及び／又は検出技術における一般的な標識を用いることができる。レポーターシグナル断片が広範囲の質量を持つように、かつ検出時にそれぞれの質量を個々に識別できるように設定することができることから、多数の検体を多重標識化及び／又は多重検出するために、同重体レポーターシグナルのセットを用いることができる。同一の検体又は同一のタイプの検体を同重体レポーターシグナルのセットで（例えば、種々のサンプル中にある同一の検体を標識化することによって）標識化する場合、同重体レポーターシグナルのセットを用いたことから生ずる標識化検体のセットも同重体となるだろう。レポーターシグナルの断片化によって、標識化検体のセットが、個々に検出可能な標識化タンパク質であって特徴のある種々の質量を持つタンパク質に分割されることとなるだろう。
【００８９】
開示された方法の好ましい態様には、他の分子からの、質量電荷比に基づく同重体レポーターシグナル（及び結合した検体）のフィルタリング、レポーターシグナルの断片化とそれによる種々の質量を有する断片の生成、及び質量電荷比に基づく種々の断片の検出が含まれる。本明細書の他の箇所に記載されているように、タンデム質量分析装置を用いてこの方法の本態様を実施することが最も好ましい。
【００９０】
開示された方法を多くの方式で使用することができる。例えば、開示された方法は、（一つの特定のサンプル中若しくは複数のサンプル中にある）一つの特定の検体の検出又は（単一のサンプル若しくは複数のサンプル中にある）複数の検体の検出に使用することができる。それぞれのケースにおいて、他の標識されていない検体から、又は１つ（又は複数）の検出される標識化検体の有する特性を欠く分子から、検出される１つ（又は複数）の検体を分離することができる。例えば、サンプル中の検体をレポーターシグナルで一般的に標識化することができ、いくつかの検体をその検体の有するいくつかの特性を基礎として分離することができる。例えば、分離された検体はある特定の質量電荷比を持つことができるであろう（質量電荷比に基づく分離によって選択された質量電荷比を持つ標識化検体及び標識されていない検体の両方が選択されることになる）。別の例としては、例えば、アフィニティータグなどのレポーターシグナルの特徴に基づいて、標識されていない分子から標識化検体のすべてを識別及び／又は分離することができる。種々のアフィニティータグを用いる場合、いくつかの標識化検体を他のものから識別及び／又は分離することができる。レポーターシグナルの標識化によって、検体のプロファイリングと目録作成とが可能になる。
【００９１】
開示された方法の一つの方式では、複数のサンプル中の複数の検体が標識され、そこでは、ある特定のサンプル中の検体のすべてが、同一のレポーターシグナルで標識される。すなわち、一つのサンプル中の検体の一般的な標識としてレポーターシグナルが使用される。しかしながら、それぞれのサンプルごとに、一つの異なるレポーターシグナルを用いる。このことにより、サンプル全体として、他のサンプルのそれぞれと比較することが可能となる。さらに、サンプル中の種々の検体を分離又は識別することにより、単一の測定で多数のサンプル中の検体を容易に分析することができる。例えば、複数のサンプル中のタンパク質を上記のようにレポーターシグナルで標識化することができ、そしてサンプルを一緒に混合する。種々の標識化タンパク質のうちのいくつか又はすべてを、例えば、タンパク質と抗体とをアレイ上で会合させることなどによって分離すれば、それぞれのアレイエレメントに存在するレポーターシグナルを同定することによって、それぞれのサンプル中のある特定のタンパク質の存在と量とを測定することができる。ある特定のアレイエレメントに対応するタンパク質が特定のサンプル中に存在したならば、次いで、そのアレイエレメントと会合したタンパク質のいくつかが、その特定のサンプルの標識化に使用したレポーターシグナルで標識されることとなる。そのレポーターシグナルの検出はこのことを示すであろう。これと同一の関係は他のサンプルのすべてについて当てはまる。さらに、検出されたレポーターシグナルの量から、ある特定のサンプル中のある特定のタンパク質の量を示すことができ、複数のサンプル中のタンパク質を同時に定量することによって、様々なサンプル中のタンパク質のレベルのとりわけ正確な比較検討を行うことができる。
【００９２】
１．レポーターシグナルタンパク質の標識化
レポーターシグナルタンパク質の標識化（ＲＳＰＬ）と称するレポーターシグナルの標識化の一つの態様においては、一つ又は複数のタンパク質を鋭敏に検出するためにレポーターシグナルが用いられる。この方法において、レポーターシグナルで標識されたタンパク質をレポーターシグナルを用いて分析し、標識化タンパク質を識別する。レポーターシグナルが検出されることにより、対応する１つ（又は複数）のタンパク質の存在が示される。次いで、検出された１つ（又は複数）のタンパク質を公知の技術で分析する。この標識は、１つ（又は複数）のタンパク質を特異的に同定することができる独特のタンパク質／標識組成物を提供する。特製のレポーターシグナルを標識として用いることによって、このことが成就される。
【００９３】
上記に及び本明細書の他の箇所に、たとえ「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」又は「複数のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」の検出と言及されていたとしても、開示された方法及び組成物はタンパク質、ペプチド及びタンパク質又はペプチドの断片を包含する。したがって、本明細書におけるタンパク質への言及は、文脈上明らかに他のものを示していない限り、タンパク質、ペプチド及びタンパク質又はペプチドの断片に言及することを意味する。本明細書で用いられているように、「標識化タンパク質」とは、文脈上明らかに他のものを示していない限り、レポーターシグナルが結合したタンパク質、ペプチド又はタンパク質若しくはペプチドの断片を示す。例えば、分析の前にプロテアーゼ消化を行うことによって、１つ（又は複数）の標識化タンパク質を断片化することができる。さらに、分析されるタンパク質を分画又は分離に付してもよく、それによりサンプルの複雑さを緩和する。断片化と分画とを、同一の測定において一緒に行うこともできる。このような断片化と分画とによって、タンパク質の分析を単純化することや、拡張することができる。
【００９４】
レポーターシグナルのタンパク質への結合は、どのようなやり方であっても実施することができる。例えば、タンパク質上のシステインとレポーターシグナル上のシステインとの間の硫黄−硫黄結合を介して、レポーターシグナルをタンパク質と共有結合させることができる。化合物にタンパク質を結合させるための数多くの他の化学反応及び技術が知られており、それらを用いてレポーターシグナルをタンパク質に結合させてもよい。例えば、チオール、エポキシド、チオールのためのニトリル、ＮＨＳエステル、アミンのためのイソチオシアネート及びカルボン酸のためのアルコールを用いて結合させることができる。タンパク質にレポーターシグナルを直接的に又は間接的に、例えばリンカーを介して結合してもよい。さらに、（例えば、レポーターシグナルペプチドのタンパク質へのタンパク質ライゲーションなどの）ライゲーションによってレポーターシグナルをタンパク質に結合してもよい。
【００９５】
レポーターシグナルが特異的にホスホペプチドに結合している標識化タンパク質を形成することは可能である。ホスホセリン残基又はホスホチロシン残基を特異的に誘導体化する化学反応についての記載がある（チョウ（Ｚｈｏｕ）ら、タンパク質リン酸化反応における課題への系統的アプローチ。Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １９： ３７５−３７８ （２００１）、オダら、ホスホプロテオームを精査する道具としてのリン酸化タンパク質の分析の質の向上化。Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． １９： ３７９−３８２ （２００１））。これらの二つの手順のいずれかに従って処理されたトリプシン消化ペプチドによって、タンパク質リン酸化部位における反応性メルカプト基が露出するであろう。これらの部位はレポーターシグナルと反応してもよく、それにより標識化タンパク質が創製される。非リン酸化ペプチドが誘導されることはない。
【００９６】
レポーターシグナルを断片化、分解、反応、誘導体化又は他のやり方で、好ましくは特徴的な方法で修飾することができる。このことにより、標識化タンパク質と、レポーターシグナルの断片化、分解、反応、誘導体化又は他の修飾化後の一つ以上の標識化タンパク質の産物との相関性を有する検出による、レポーターシグナルが結合しているタンパク質の同定が可能となる（標識化タンパク質はタンパク質／レポーターシグナルの組み合わせである）。特徴的で検出可能な方法によるレポーターシグナルの改変によって、標識化タンパク質が変化することとなる。それと一緒に、特徴的な標識化タンパク質と標識化タンパク質の特徴的な産物とを検出することにより、タンパク質を一義的に同定することができる。このやり方において、開示された方法と材料とを用いることで、一つ以上のタンパク質を単独で又は（例えば、多重測定により）一緒に検出することができる。さらに、一つ以上のサンプルに存在する一つ以上のタンパク質も多重的な方法により検出することができる。レポーターシグナルの質量分析のために、レポーターシグナルが断片化して類似の電荷を持つが質量が異なる断片を得ることが好ましい。
【００９７】
レポーターシグナルを断片化して、類似の電荷を持つが質量が異なる断片を得ることが好ましい。これにより、セット中のそれぞれの標識化タンパク質（及び／又はそれぞれのレポーターシグナル）を、レポーターシグナル断片の質量電荷比の違いによって識別することが可能となる。セット中の断片化していないレポーターシグナルは同重体であるのにもかかわらず、異なるレポーターシグナルの断片はそうではないため、このことは可能である。開示された方法において、このことにより、レポーターシグナルの断片化後にそれぞれのタンパク質／レポーターシグナルの組み合わせを、タンパク質／レポーターシグナルの質量電荷比によって識別することが可能となる。
【００９８】
好ましい態様においては、セット中のすべてのレポーターシグナルが同様の特性（例えば、類似の質量電荷比）を持っているようなセットの中で、レポーターシグナルを用いる。この同様の特性によって、一つ以上のその特性を欠く他の分子からレポーターシグナルを識別すること及び／又は分離することが可能となる。セット中のレポーターシグナルが同一の質量電荷比（ｍ／ｚ）を持つことが好ましい。すなわち、セット中のレポーターシグナルは同重体である。これにより、質量電荷比に基づいて、レポーターシグナル（又はレポーターシグナルが結合しているあらゆるタンパク質）を他の分子から正確に分離することが可能となる。フィルタリングの結果、システムについての信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比が大きく向上し、より高感度でより正確な検出が可能となる。あるいは、又はさらに、得られた標識化タンパク質が同様の特性、すなわち、一つ以上のその特性を欠く他の分子から標識化タンパク質を識別すること及び／又は分離することを可能とする特性を持つようなセットの中で、レポーターシグナルを用いることができる。
【００９９】
開示されたレポーターシグナルを用いて、様々な方法でタンパク質を検出することができる。例えば、タンパク質と、結合したレポーターシグナルとを一緒に検出することができ、一つ以上のタンパク質のペプチドと一つ以上の結合したレポーターシグナルの断片とを一緒に検出することができ、レポーターシグナルの断片又はその組み合わせを検出することができる。好ましい検出には、レポーターシグナルの断片化の前及び後の両方でタンパク質／レポーターシグナル又はペプチド／レポーターシグナルを検出することが挙げられる。
【０１００】
開示された方法の好ましい態様には、レポーターシグナルの断片化の前及び後の両方での、そのレポーターシグナルの相関性を有する検出が挙げられる。このことによって、標識化タンパク質の変化を介して標識化タンパク質が検出されて同定されることが可能となる。すなわち、検出されたレポーターシグナルの性質（断片化していないことに対して断片化していること）が、標識されたものとしてのタンパク質を同定する。タンパク質及びレポーターシグナルが質量電荷比によって検出された場合には、断片化したサンプルと断片化していないサンプルとの間の質量電荷比の変化によって比較の基礎が与えられる。このような質量電荷比の検出は、質量分析法によって成し遂げられることが好ましい。
【０１０１】
一つの例としては、質量分析用の標識として設計されたレポーターシグナルでサンプル中のタンパク質を標識化することができる、というものがある。この標識化タンパク質をトリプシンで消化し、次いで得られた成分を質量分析に適用することが可能である。レポーターシグナルを含むトリプシン断片に対応するピークが検出されることになる。質量分析装置中（好ましくは衝突セル中）でのレポーターシグナルの断片化の結果、結合したレポーターシグナル部分の消失に対応するピークの移動、消失した断片に対応するピークの出現又はそれら両事象の組み合わせが生じる。観察された移動は、どのレポーターシグナルがタンパク質上にあるかということに明確に依存することになる。というのは、異なるように設計されたレポーターシグナルは、種々の質量電荷比を持つ断片を生じることになるからである。親の質量／電荷（衝突ガスなし）と、レポーターシグナルからの断片の消失に対応する質量／電荷（衝突ガスあり）とが組み合わせて検出されるという事象は、標識化タンパク質を示す。組み合わせ事象は上記のリン酸化部位の検出と類似の方法で起こるのかもしれない。例えば組成分析などの標準的な質量分析技術とペプチドの配列決定とにより、タンパク質のトリプシン断片の同定を測定することができる。
【０１０２】
タンパク質サンプルから開示された方法によって作ることが可能な標識化タンパク質断片のすべてが独特のものとなるわけではない。いくつかのタンパク質は、異なるタンパク質においても同一のものとなり得る共通するモチーフを有していることから、サンプルから作られるいくつかのタンパク質断片又はペプチドは、たとえそれらが異なるタンパク質に由来したとしても、同一のものとなるだろう。例えば、関連性のあるタンパク質のいくつかのファミリーは、このような共通するモチーフ又は共通するアミノ酸配列を有している。したがって、開示された方法のいくつかの態様においては、特徴的な標識化タンパク質の検出は、関連性のあるタンパク質の共通する部分の検出の結果であることもあり得る。タンパク質のファミリーの検出を希望する場合は、そのような結果は都合が良いと言える。あるいは、ファミリーにおけるタンパク質の独特の断片（すなわち、同一でない部分）の検出に焦点を当てることによって、このような関連性のあるタンパク質を集団的に検出することを避けることが可能である。便宜上、本明細書で用いられているように、独特のタンパク質、標識化タンパク質又は他の成分の検出への言及は、文脈上明らかに他のものを示していない限り、複数の関連性のあるタンパク質の共通部分の検出を包含することを意味する。
【０１０３】
開示された方法の一つの効果的な態様は、レポーターシグナルで標識されたタンパク質を使用して複数のサンプル（例えば、時系列測定又は他の比較分析など）を測定することことである。摂動後の生体システムの時間的応答の知識は、そのシステムの理解を追求するための非常に効果的なプロセスの一つである。時間的応答を追跡するために、摂動後の所定の時点にこのシステムのサンプル（例えば、細胞培養物からの細胞、最初に同期化して屠殺されたマウスなど）を得る。タンパク質の空間プロファイルの知識（例えば、組織切片内の相対的な位置など）は、この生体システムの理解を追求するための非常に効果的なプロセスの一つである。
【０１０４】
開示された方法において、一連のサンプルのそれぞれをレポーターシグナルのセット由来の種々のレポーターシグナルで標識化することができる。この目的のための好ましいレポーターシグナルは、質量に差が付くように分布しているものとなろう。とりわけ、レポーターシグナルのセットを構成する個々のものは、化学的には同一の挙動をするのにもかかわらず、それらの識別をできることが保証されていることから、安定同位体を使用することが好ましい。標識の典型的なセットを表１に示す。ここでは、五箇所の時点でのそれぞれが五つの示された標識のうちの一つで標識されており、サンプルの混合物が同時に読み取られている。断片化していない標識は配列番号：１であり、断片化した標識は配列番号：１の７〜１２位のアミノ酸である。
【０１０５】
【表１】
2004506900.tif 000002
【０１０６】
質量電荷比に基づく分子間の高感度な識別を可能にする質量分析法を用いて標識化タンパク質の検出を行うことが好ましい。開示されているレポーターシグナルとしては、種々の標識化技術及び／又は検出技術における一般的な標識を用いることができる。レポーターシグナル断片が広範囲の質量を持つように、かつ検出時にそれぞれの質量を個々に識別できるように設定することができることから、多数のタンパク質を多重標識化及び／又は多重検出するために、同重体レポーターシグナルのセットを用いることができる。同一のタンパク質又は同一のタイプのタンパク質を同重体レポーターシグナルのセットで（例えば、種々のサンプル中にある同一のタンパク質を標識化することによって）標識化する場合、同重体レポーターシグナルのセットを用いたことから生ずる標識化タンパク質のセットも同重体となるだろう。レポーターシグナルの断片化によって、標識化タンパク質のセットが、個々に検出可能な標識化タンパク質であって特徴のある種々の質量を持つタンパク質に分割されることとなるだろう。
【０１０７】
開示された方法の好ましい態様には、他の分子からの、質量電荷比に基づく同重体レポーターシグナル（及び結合したタンパク質）のフィルタリング、レポーターシグナルの断片化とそれによる種々の質量を有する断片の産生、及び質量電荷比に基づく種々の断片の検出が含まれる。本明細書の他の箇所に記載されているように、タンデム質量分析装置を用いてこの方法を実施することが最も好ましい。
【０１０８】
この方法により、タンパク質、ペプチド及びタンパク質断片の検出が可能となり、検出により、検出されたタンパク質又はペプチドについてのいくつかの配列情報又は他の構造情報が提供される。例えば、質量又は質量電荷比、アミノ酸組成又はアミノ酸配列を測定することができる。特定のレポーターシグナルを使用して検出されたサンプル中のタンパク質、ペプチド及び／又はタンパク質断片のセットにより、タンパク質の情報及びペプチドの情報の特徴的なセットが提示される。この方法により、再現性のあるやり方にて、複雑なタンパク質のサンプルの目録を迅速にかつ容易に作成することが可能となる。さらに、開示された方法により、サンプル中のタンパク質、ペプチド又はペプチド断片のそれぞれについて、二つの「シグナル」をも提示されるはずである。すなわち、もともとの標識化タンパク質及びその標識化タンパク質の改変体である。このことにより、検出されたタンパク質及びペプチドのセットの比較及び検証が可能となる。
【０１０９】
レポーターシグナルタンパク質の標識化により、タンパク質のプロファイリング、新規タンパク質の発見及びタンパク質の目録作成が可能となる。この方法には、タンパク質分析、プロテオーム分析、プロテオミクス、タンパク質発現のプロファイリング、新規タンパク質の発見、機能的ゲノミクス及びタンパク質検出のための検出システム及び分析システムとして利用することが可能であるという有利な特性がある。
【０１１０】
Ｃ．レポーターシグナルの較正
レポーターシグナルの較正（ＲＳＣ）と称するこの方法の別の態様においては、レポーターシグナルキャリブレーターと称するレポーターシグナルの一つの形態のものを検体又は検体断片と混合し、レポーターシグナルキャリブレーターと検体又は検体断片とを改変して、そしてレポーターシグナルキャリブレーターの改変体と検体の改変体又は検体断片の改変体を検出する。レポーターシグナルキャリブレーターは存在している検体の量を評価するための標準として有用である。すなわち、存在している検体の量を評価するために既知量のレポーターシグナルキャリブレーターを添加し、改変された検体又は改変された検体断片の検出量と改変されたレポーターシグナルキャリブレーターの検出量とを比較し、そしてこれらの量を添加した既知量のレポーターシグナルキャリブレーターで較正する（そしてこのようにして、改変されたレポーターシグナルキャリブレーターの量を予測する）。
【０１１１】
開示されたレポーターシグナルの較正方法によって、組織、微生物又は他のあらゆる生物サンプル中の種々のタンパク質の相対存在量に関する、非常に敏感で独自のタンパク質シグニチャーが生成される。開示された方法によれば、小さいが非常に情報量の多いタンパク質のサブセットを同定し、その相対濃度を測定することによって、細胞又は組織の状態を明確にすることが可能となる。このような測定はタンパク質シグニチャーとして知られている。タンパク質シグニチャーは、例えば、ガンの診断、段階決定及び段階化、薬剤のスクリーニング並びに毒性試験などに有用である。
【０１１２】
いくつかの態様において、それぞれの検体又はそれぞれの検体断片は、少なくとも一つのレポーターシグナルキャリブレーターが有する一つ以上の共通する特性を共有することができる。それにより、この共通する特性を有するレポーターシグナルキャリブレーター及び検体又は検体断片を、この共通する特性を欠く他の分子から識別及び／又は分離することができる。
【０１１３】
いくつかの態様において、レポーターシグナルキャリブレーター並びに検体及び検体断片を改変することができ、それにより、検体の改変体又は検体断片の改変体を、検体又は検体断片が共有する共通する特性を有するレポーターシグナルキャリブレーターの改変体から識別することができる。いくつかの態様において、種々のレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を他のそれぞれのものから識別することができる。いくつかの態様において、種々の検体又は種々の検体断片の改変体を他のそれぞれのものから識別することができる。
【０１１４】
レポーターシグナルの較正のいくつかの態様において、検体又は検体断片は改変されずに、改変されたレポーターシグナルキャリブレーター及び検体又は検体断片が検出される。このケースにおいては、検体又は検体断片が共有する共通する特性を有するレポーターシグナルキャリブレーターの改変体から検体又は検体断片を識別することができる。
【０１１５】
いくつかの態様において、検体又は検体断片がレポーターシグナル又はレポーターシグナルの断片であってもよい。このケースにおいて、レポーターシグナルキャリブレーターはレポーターシグナルの検出量についてのキャリブレーターとしての役割を果たす。
【０１１６】
（検体としての）タンパク質及びペプチドとの関連においてレポーターシグナルの較正を行うことが好ましい。レポーターシグナルの較正のこの形態をレポーターシグナルタンパク質の較正と称する。レポーターシグナルタンパク質の較正は、例えば、タンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを作成するために有用である。本明細書で用いる場合、タンパク質シグニチャーとは、タンパク質のセット又はタンパク質代替物のセットの存在、欠如、量又は存在および量のことである。
【０１１７】
レポーターシグナルタンパク質の較正のいくつかの態様において、検出される結合であって、タンパク質中の不安定な、開裂しやすい又は開裂可能な結合の存在を活用することができる。その結合の位置で断片化することによって、このような結合を含むペプチド、タンパク質又はタンパク質断片（便宜上、残りの明細書中で集合的にタンパク質断片と称する）を改変することができる。このようにして、タンパク質断片と（例えば、質量電荷比などの）共通する特性を持つレポーターシグナルキャリブレーターを用いることができ、そしてレポーターシグナルキャリブレーターの改変体及びタンパク質断片の改変された（すなわち断片化した）形態を検出し識別することができる。この点に関連して、タンパク質断片はそれらと適合するレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有しているのにもかかわらず、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体及びタンパク質断片の改変体を識別することができる（というのは、例えば、改変体は異なる質量電荷比などの種々の特性を持っているからである）。
【０１１８】
レポーターシグナルタンパク質の較正の一つの例として、対象となっているタンパク質サンプルをセリンプロテアーゼで、好ましくはトリプシンで消化することができる。この消化によって、タンパク質断片の複雑な混合物が新たに生成する。これらのタンパク質断片の中に、ジペプチドＡｓｐ−Ｐｒｏを含むサブセットが（概算で４００のタンパク質断片ごとに一つ）見出されることになる。このジペプチド配列は、質量分析を行っている際に鋭敏に独自の断片と化し、したがって断片化モードにおいて高い収率でイオンが生じる。ヒトのプロテオームは、少なくとも２，０００，０００の異なるトリプシン消化ペプチドから成るものであるために、Ａｓｐ−Ｐｒｏ配列を含むタンパク質断片の数はほぼ５，０００程度である。これらのうちのいくつかは、ホスホペプチドとして、又は他の修飾を受けた形態として存在しているかもしれないため、この数値はさらに高くなるだろう。断片化し得る、情報価値の高いタンパク質シグニチャーを新たに得るのに適したタンパク質断片の（おそらく５０〜１００かその程度の）サブセットの選択には、この数値は十分なほどに高い。Ａｓｐ−Ｐｒｏジペプチド配列を含むペプチド、細胞内でのリン酸化による修飾を受けたアミノ酸を含むペプチド、又は内部にメチオニンを含むペプチドが、レポーターシグナルの較正の際に用いるために特に好ましいものである。もう一つの方法として、末端がアルギニンであるトリプシン消化ペプチドを、アセチルアセトン（ペンタン−２，４−ジオン）を用いる反応によって修飾してもよく、それによりフラグメントイオンの回数を高める（ディクラー（Ｄｉｋｌｅｒ）ら、Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ３２： １３３７−４９ （１９９７））。タンパク質シグニチャーの情報の内容を最大化するために、バイオインフォマティクスを用いてタンパク質断片のサブセットの選択を実施する。
【０１１９】
レポーターシグナルタンパク質の較正のこの態様について、タンパク質消化物を、特別に設計したレポーターシグナルキャリブレーターのセットと混合することが可能であり、次いで、タンデム質量分析法を用いて分析する。タンデムインスペース装置（例えば、マイクロマス社のＱ−Ｔｏｆ（商標）など）のケースにおいては、（配列データから得ることができるそれぞれの独特の断片の分子量によって規定される）単一イオンのフィルタリングのために最初の四重極の設定を行い、次いでイオン断片化のための衝突段階、そして最後にもともとの単一イオンから生じるペプチド断片（この断片はＡｓｐ−Ｐｒｏなどの弱い結合、リン酸化アミノ酸を含む結合又はメチオニンスルホキシドなどの酸化アミノ酸に隣接した結合での開裂によって生じる。スミスら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ． ２６： １０３−１１ （１９９７））のＴＯＦ質量分析となる。二番目の段階では、ＴＯＦ測定の信号対雑音は通常の質量分析実験でのものよりもはるかに大きい。一般的に、タンパク質シグニチャーを作成するために使用する予定の、サンプル中のそれぞれのタンパク質断片（このようなタンパク質断片をシグニチャータンパク質断片と称する）のためにレポーターシグナルキャリブレーターを使用することが可能であり、そしてそれぞれは質量のパターンが容易に検出できる断片となるように、かつ断片化していないシグニチャータンパク質断片の質量と識別可能となるように設計される。次いで、タンパク質シグニチャー（すなわち、シグニチャータンパク質断片）を含むように予め選択しておいたそれぞれのタンパク質断片の質量に対応した値を超える範囲（例えば５０の）で、順々に四重極フィルタリングの設定を変える。フィルタリングを行う質量の設定のそれぞれの時点で、断片化後のＴＯＦにより検出できるシグナルには二つのタイプがあり、一方はトリプシン消化ペプチド（すなわち、もともとのタンパク質断片）に由来するセットであり、そして他方はレポーターシグナルキャリブレーターに対応するセットである。レポーターシグナルキャリブレーターにより、それぞれのシグニチャータンパク質断片についての相対存在量を計算することが可能になる。ある特定のサンプルについて測定されるこれらの相対存在量比は、タンパク質シグニチャーの構成エレメントである。ＭＳ／ＭＳモードでのタンデム質量分析装置の検出限界は非常に低く、おそらくペプチド５００分子程度であろう。この検出レベルはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法のそれよりも概算で１，０００倍程度良好であり、単一の細胞からタンパク質シグニチャーを作成できるはずである。
【０１２０】
以上のように、レポーターシグナルの較正のこの態様については、ヒトのゲノムの全体及び他の多数の生物体のゲノムの配列を利用することによって、公知のすべてのタンパク質に照らして独特であるタンパク質断片の同定を容易にすることが可能である。すなわち、生成してくる、タンパク質シグニチャーが内在するペプチドを同定するために、そしてレポーターシグナルキャリブレーターの選択を導くために、配列情報を使用することが可能である。
【０１２１】
Ｄ．レポーターシグナル融合体
レポーターシグナル融合体（ＲＳＦ）と称する開示された方法及び組成物の別の態様においては、レポーターシグナルペプチドが、単一のアミノ酸セグメント中に存在する、対象となっているタンパク質又はペプチドと結合している。このような、対象となっているタンパク質とレポーターシグナルペプチドとの融合体は、融合タンパク質又は融合ペプチドとして、この融合を構成するアミノ酸セグメントをコード化している核酸分子から発現され得る。本明細書において、この融合タンパク質又は融合ペプチドをレポーターシグナル融合体と称する。レポーターシグナルの一つの形態であるレポーターシグナルペプチドは、このレポーターシグナルペプチドと融合するタンパク質及びペプチドを鋭敏に監視し検出することを可能にする。とりわけ、このレポーターシグナル融合体は、対象となっている特定のタンパク質及びペプチドの発現、及び／又は対象となっているタンパク質及びペプチドをコード化している遺伝子、ベクター及び発現構築物を鋭敏かつ多重的に検出することを可能にする。開示されているレポーターシグナル融合体はさらに、開示されている方法及び組成物の別の形態についてのレポーターシグナルの供給源としての使用を含むいかなる目的にも使用することができる。
【０１２２】
さらに、開示されたレポーターシグナル融合体は、レポーターシグナル融合体で標識された（すなわち、それと会合した又はその中に含まれている）、特定の１つ（又は複数）のタンパク質、１つ（又は複数）の遺伝子、１つ（又は複数）のベクター及び／又は１つ（又は複数）の発現配列を有する細胞、細胞系及び生物体を創製するためにも有用である。例えば、種々のレポーターシグナルペプチドを伴うレポーターシグナル融合体をそれぞれコード化している核酸構築物のセットを使用することができ、それにより細胞、細胞系及び／又は生物体のセットを独自に標識化する。あらゆる標識化供給源からのサンプルを加工することによって、他の改変体から識別され得る潜在的な供給源のそれぞれについての独自のレポーターシグナルペプチドの改変体（又はアミノ酸セグメント若しくはアミノ酸サブセグメント）を得ることができる。特定の改変体の検出により、それが生じた供給源を特定する。レポーターシグナル融合体をコード化している核酸構築物を遺伝子組み換え植物系統（例えば、ラウンドアップ耐性トウモロコシ系統など）に導入することができ、次いで、この植物系統を、レポーターシグナル融合体を検出することによって同定することができる。種々の遺伝子、タンパク質、ベクター、構築物、細胞、細胞系若しくは生物体の中で用いられるか又はそれらと会合するレポーターシグナル融合体中で使用するための好ましいレポーターシグナルペプチドは、質量が異なるように分布したものであろう。とりわけ、同一のアミノ酸組成であって別のアミノ酸配列のものを使用することが好ましい。
【０１２３】
さらに、開示されたレポーターシグナル融合体を、特定の経路、制御カスケード並びに他の遺伝子、タンパク質、ベクター及び／又は発現配列のひとそろいを「標識化」するのにも使用することができる。このような標識化は、同一の細胞、細胞系若しくは生物体の中にあり得るか又は細胞、細胞系若しくは生物体のセットを横断する形であり得る。例えば、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントは、対象となっている内因性発現配列、対象となっている内因性遺伝子、対象となっている外因性発現配列、対象となっている外因性遺伝子又はそれらの組み合わせと会合することができる。次いで、外因性構築物を対象となっている細胞又は対象となっている生物体の中へ導入する。例えば、（レポーターシグナル融合体をコード化している）核酸分子を挿入のために対象となっている発現配列又は遺伝子の部位へ導入することにより、又は（内因性発現配列若しくは遺伝子及びレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントの両方を含む）ベクター若しくは他の核酸構築物をインビトロで創製し、その構築物を対象となっている細胞又は対象となっている生物体の中へ導入することにより、内因性発現配列又は遺伝子との会合を成し遂げることができる。数多くの使用や使用方法があり得、それらのいくつかを下記に説明として記載する。例えば、緑色蛍光性タンパク質及び緑色蛍光性タンパク質融合体が用いられるところのいかなる文脈においてもかついかなる目的のためにも、開示されたレポーターシグナル融合体を使用することができる。しかしながら、開示されたレポーターシグナル融合体をより高度に多重化する能力のために、開示されたレポーターシグナルタンパク質の方が、少なくとも緑色蛍光性タンパク質よりも多くの用途があり、かつ有用である。
【０１２４】
レポーターシグナルペプチドをコード化している核酸配列を遺伝子の特定のエクソン内に設計することが可能である。融合されるタンパク質をコード化している遺伝子がイントロンを含む場合、レポーターシグナルペプチドをコード化している配列が、一緒にスプライシングを受ける種々のエクソン間で分割され得るのにもかかわらず、これは標準的な状況となろう。レポーターシグナルペプチドをコード化している核酸配列を特定のエクソン内に設置することは、ＲＮＡの選択的スプライシングを監視し分析するために有用である。最終タンパク質内にレポーターシグナルペプチドが出現することは、レポーターシグナルペプチドをコード化しているエクソンがスプライシングを受けてｍＲＮＡとなったことを示す。
【０１２５】
一つ又は複数のタンパク質（すなわち、レポーターシグナルペプチドが融合しているタンパク質）の高感度検出のために、レポーターシグナルペプチドを使用することができる。この方法において、レポーターシグナルペプチドを用いてレポーターシグナルペプチドと融合したタンパク質を分析し、それによりレポーターシグナル融合体を識別する。レポーターシグナルペプチドの検出は、１つ（又は複数）の対応するタンパク質の存在を示す。次いで、検出された１つ（又は複数）のタンパク質を公知の技術を用いて分析する。レポーターシグナル融合体により、１つ（又は複数）のタンパク質を特異的に同定することかできる独特のタンパク質／標識組成物が提供される。標識として特別なレポーターシグナルペプチドを用いることを通して、このことが成し遂げられる。
【０１２６】
上記に及び本明細書の他の箇所に、たとえ「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」又は「複数のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」の検出と言及されていたり、これらとの融合体に言及されていたとしても、開示された方法及び組成物はタンパク質、ペプチド及びタンパク質又はペプチドの断片を包含する。したがって、本明細書におけるタンパク質への言及は、文脈上明らかに他のものを示していない限り、タンパク質、ペプチド及びタンパク質又はペプチドの断片に言及することを意味する。本明細書で用いられているように、「レポーターシグナル融合体」とは、文脈上明らかに他のものを示していない限り、レポーターシグナルペプチドと融合している（すなわち、同一のポリペプチド鎖における１つ（又は複数）のペプチド結合によって結合している）タンパク質、ペプチド又はタンパク質若しくはペプチドの断片を示す。例えば、分析の前にプロテアーゼ消化などを行うことにより、１つ（又は複数）のレポーターシグナル融合体を断片化することができる。さらに、分析される発現サンプルを分画又は分離に付してもよく、それによりサンプルの複雑さを緩和する。断片化と分画とを、同一の測定において一緒に行うこともできる。このような断片化と分画とによって、発現の分析を単純化することや、拡張することができる。１つ（又は複数）のレポーターシグナルペプチドをタンパク質と任意の配置で、例えば、タンパク質のＮ−末端の位置で、タンパク質のＣ−末端の位置で、ドメイン結合部内若しくはドメイン結合部で、又はタンパク質の他の適切な任意の位置で融合することができる。この方法のいくつかの態様において、タンパク質が機能を保持していることが望ましい。このようなケースにおいて、末端での融合体又はドメイン内での融合体が好ましい。タンパク質融合体に係る当業者は、一般的に、対象となっているタンパク質が機能を保持することを期待できるような融合体をどのようにして設計するのかを知っている。他の態様において、レポーターシグナルペプチド及びタンパク質がいずれかの所望の構造上の構成をとることができる場合には、タンパク質が機能を保持することは必要ではない。
【０１２７】
レポーターシグナル融合体は、その融合体をコード化している核酸分子の発現によって生産され得る。例えば、一つのレポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとをその中に含むアミノ酸セグメントをコード化している核酸セグメントを設計することによって、開示されている融合体を一般的に設計することができる。ある特定の核酸分子は一つ以上の核酸セグメントを含むことができる。ある特定の核酸セグメントは一つ以上のアミノ酸セグメントをコード化することができる。ある特定のアミノ酸セグメントは、一つ以上のレポーターシグナルペプチドと、一つ以上の対象となっているタンパク質又はペプチドとを含むことができる。開示されているアミノ酸セグメントは、単一の、隣接するポリペプチド鎖から成るものである。すなわち、たとえ複数のアミノ酸セグメントが同一の隣接するポリペプチド鎖の一部分であり得るとしても、ある特定のアミノ酸セグメントのすべての構成成分（すなわち、対象となっている、１つ（又は複数）のレポーターシグナルペプチド、１つ（又は複数）のタンパク質及び１つ（又は複数）のペプチド）は、同一の隣接するポリペプチド鎖の一部分である。
【０１２８】
レポーターシグナルペプチドを断片化、分解、反応、誘導体化又は他のやり方で、好ましくは特徴的な方法で修飾することができる。このことにより、レポーターシグナルペプチドの断片化、分解、反応、誘導体化又は他の修飾化後の一つ以上のレポーターシグナル融合体の産物の検出による、レポーターシグナルペプチドと融合するタンパク質の同定が可能となる。さらに、レポーターシグナル融合体と、レポーターシグナルペプチドの断片化、分解、反応、誘導体化又は他の修飾化後の一つ以上のレポーターシグナル融合体の産物との相関性を有する検出によっても、このタンパク質を同定することができる。特徴的で検出可能な方法によるレポーターシグナルペプチドの改変によって、レポーターシグナル融合体が変化することとなる。それと一緒に、特徴的なレポーターシグナル融合体とレポーターシグナル融合体の特徴的な産物（すなわち、その改変体）とを検出することにより、そのタンパク質を一義的に同定することができる（必要に応じて、その改変体だけが検出されることもあるが）。このやり方において、開示された方法と材料とを用いることで、一つ以上のタンパク質の発現を単独で又は（例えば、多重測定により）一緒に検出することができる。さらに、一つ以上のサンプルに存在する一つ以上のタンパク質の発現も多重的な方法により検出することができる。レポーターシグナルの質量分析のために、レポーターシグナルペプチドが断片化して類似の電荷を持つが質量が異なる断片を得ることが好ましい。
【０１２９】
レポーターシグナルペプチドを断片化して、類似の電荷を持つが質量が異なる断片を得ることが好ましい。これにより、セット中のそれぞれのレポーターシグナル融合体（及び／又はそれぞれのレポーターシグナルペプチド）を、レポーターシグナルペプチド断片（すなわち、その改変体）の質量電荷比の違いによって識別することが可能となる。種々のレポーターシグナルペプチドの断片（又はレポーターシグナル融合体の断片）が種々の質量電荷比を持つようにこれら断片を設計することが可能なので、このことは可能である。開示された方法において、このことにより、レポーターシグナルペプチドの断片化後にそれぞれのレポーターシグナル融合体をレポーターシグナル融合体の質量電荷比によって識別することが可能となる。
【０１３０】
レポーターシグナル融合体中のレポーターシグナルペプチドの改変によって、多様な改変された組成物を形成することができる。これらの改変体のいかなるもの又はすべてを検出することができる。例えば、レポーターシグナルペプチドの改変体を検出することができ、（レポーターシグナルペプチドを含む）アミノ酸セグメントの改変体を検出することができ、アミノ酸セグメントのサブセグメントの改変体を検出することができ、又はこれらの組み合わせを検出することができる。断片化によってレポーターシグナルペプチドを改変した場合、一般的に生じるものは、レポーターシグナルペプチドの断片と、対象となっているタンパク質又はペプチドとレポーターシグナルペプチドの一部（すなわち、レポーターシグナルペプチド断片中にはない方の一部）とを含むアミノ酸セグメントの改変体であろう。
【０１３１】
さらに、対象となっているタンパク質又はペプチドを断片化することもできる。得られるものはアミノ酸セグメントのサブセグメントとなろう。アミノ酸サブセグメントレポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドの一部を含むことになる。アミノ酸サブセグメント中のレポーターシグナルペプチドを改変した場合（アミノ酸セグメントの断片化前、断片化中又は断片化後に生じ得る）、得られるものはアミノ酸サブセグメントの改変体（及びレポーターシグナルペプチドの改変体）である。アミノ酸サブセグメントの改変体を検出することができる。断片化によってレポーターシグナルペプチドが改変された場合、得られるものは一般的に、レポーターシグナルペプチドの断片及びアミノ酸サブセグメントの改変体（すなわち、その断片）であろう。このケースにおいて、アミノ酸サブセグメントの改変体は対象となっているタンパク質又はペプチドの一部と、レポーターシグナルペプチドの一部（すなわち、この部分はレポーターシグナルペプチド断片中にはない）とを含むものになろう。
【０１３２】
一般的にレポーターシグナルと同様、セット内のレポーターシグナルペプチドが一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性、を持つことができるというセット内でレポーターシグナルペプチドを用いることができる。レポーターシグナル融合体のケースにおいては、セット内のアミノ酸セグメント及びアミノ酸サブセグメントが一つ以上の共通する特性、すなわちアミノ酸セグメント及びアミノ酸サブセグメントをそれぞれ共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性、を持つことができるセット内で、アミノ酸セグメント及びアミノ酸サブセグメントを使用することができる。一般的に、共通する特性を有するレポーターシグナル融合体の１つ（又は複数）の構成成分は、検出される１つ（又は複数）の構成成分に及び／又は使用する方法の方式に依存してもよい。
【０１３３】
一組の核酸分子によってコード化されているレポーターシグナル融合体中のレポーターシグナルペプチドが、一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸分子を使用することができる。同様に、一組の核酸分子によってコード化されているアミノ酸セグメント中のレポーターシグナルペプチドが、一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、アミノ酸セグメントをコード化している核酸分子を使用することができる。一組の核酸分子によってコード化されているアミノ酸セグメントが、一つ以上の共通する特性、すなわちアミノ酸セグメントをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、アミノ酸セグメントをコード化している核酸分子を使用することができる。
【０１３４】
一組の核酸セグメントによってコード化されているレポーターシグナル融合体中のレポーターシグナルペプチドが、一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメント（一般的には核酸分子の一部）を使用することができる。同様に、一組の核酸分子によってコード化されているアミノ酸セグメント中のレポーターシグナルペプチドが一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、アミノ酸セグメントをコード化している核酸セグメントを使用することができる。一組の核酸分子によってコード化されているアミノ酸セグメントが一つ以上の共通する特性、すなわちアミノ酸セグメントをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、アミノ酸セグメントをコード化している核酸セグメントを使用することができる。対象となっている核酸分子、核酸セグメント、アミノ酸セグメント、レポーターシグナルペプチド及びタンパク質のセットを構成する個々のもの間の他の関係が検討される。
【０１３５】
レポーターシグナル融合体は、対象となっているタンパク質及びレポーターシグナルペプチドに加えて他の成分を含むことができる。例えば、レポーターシグナル融合体はエピトープタグ又はｆｌａｇペプチドを含んでいてもよい（例えば、ブリザード（Ｂｒｉｚｚａｒｄ）ら、（１９９４）新規モノクローナル抗体及びペプチド溶出を用いての、ＦＬＡＧエピトープタグを付けた細菌のアルカリ性ホスファターゼのイムノアフィニティー精製。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １６： ７３０−７３５などを参照すること）。エピトープタグ及びｆｌａｇペプチドはタグとしての機能を果たすことができ、このタグにより、レポーターシグナル融合体を操作することができる。エピトープタグ及びｆｌａｇペプチドを使用することは一般的に知られており、開示されているレポーターシグナル融合体においての使用に適合させることもできる。
【０１３６】
好ましい態様において、セットを構築しているか又はセット中にあるレポーターシグナルペプチド、レポーターシグナル融合体及び／又はレポーターシグナル融合体のサブセグメントが類似の特性（例えば、類似の質量電荷比など）を有しているというセットの中で、レポーターシグナルペプチド、レポーターシグナル融合体（又はアミノ酸セグメント）、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメント及び／又はレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントを含む核酸分子を用いる。この類似の特性によって、レポーターシグナル、レポーターシグナル融合体又はレポーターシグナル融合体のサブセグメントを一つ以上のその特性を欠く他の分子から識別及び／又は分離することができる。セットを構築しているか又はセット中にあるレポーターシグナル、レポーターシグナル融合体又はレポーターシグナル融合体のサブセグメントが同一の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有していることが好ましい。すなわち、セット中のレポーターシグナル、レポーターシグナル融合体又はレポーターシグナル融合体のサブセグメントは同重体である。これにより、レポーターシグナル、レポーターシグナル融合体又はレポーターシグナル融合体のサブセグメントを質量電荷比に基づいて他の分子と正確に分離することができる。フィルタリングの結果、システムについての信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比が大きく向上し、より高感度でより正確な検出が可能となる。
【０１３７】
開示されたレポーターシグナル融合体を用いて、様々な方法で細胞、細胞系、生物体及び遺伝子の発現並びにタンパク質を検出することができる。例えば、タンパク質と、結合したレポーターシグナルペプチドとを一緒に検出することができ、一つ以上のタンパク質のペプチドと一つ以上の結合したレポーターシグナルペプチドとを一緒に検出することができ、レポーターシグナルペプチドの断片又はその組み合わせを検出することができる。好ましい検出には、レポーターシグナルペプチドの断片化の前及び後の両方でレポーターシグナル融合体を検出することが挙げられる。
【０１３８】
開示された方法の好ましい態様には、レポーターシグナルペプチドの断片化の前及び後の両方での、そのレポーターシグナルペプチドの相関性を有する検出が挙げられる。このことによって、レポーターシグナル融合体及び／又はレポーターシグナルペプチドの変化を介して、レポーターシグナルペプチドで「標識化」された遺伝子、タンパク質、ベクター及び発現構築物が検出されて同定されることが可能となる。すなわち、検出されたレポーターシグナル融合体又はレポーターシグナルペプチドの性質（断片化していないことに対して断片化していること）が、遺伝子、タンパク質、ベクター又はそれが由来するところの核酸構築物を同定する。レポーターシグナル融合体及びレポーターシグナルペプチドが質量電荷比によって検出された場合には、断片化したサンプルと断片化していないサンプルとの間の質量電荷比の変化によって比較の基礎が与えられる。このような質量電荷比の検出は、質量分析法によって成し遂げられることが好ましい。
【０１３９】
一つの例としては、対象となっているタンパク質とレポーターシグナルペプチドとの、質量分析用の標識として設計された融合体を挙げることができる。このレポーターシグナル融合体をトリプシンで消化し、次いで得られた成分を質量分析に適用することが可能である。レポーターシグナルペプチドを含むトリプシン断片に対応するピークが検出されることになる。質量分析装置中（好ましくは衝突セル中）でのレポーターシグナルペプチドの断片化の結果、結合したレポーターシグナルペプチド部分の消失に対応するピークの移動、消失した断片に対応するピークの出現又はそれら両事象の組み合わせが生じる。観察された移動は、どのレポーターシグナルペプチドがタンパク質に融合しているかということに明確に依存することになる。というのは、異なるように設計されたレポーターシグナルペプチドは、種々の質量電荷比を持つ断片を生じることになるからである。親の質量／電荷（衝突ガスなし）と、レポーターシグナルペプチドからの断片の消失に対応する質量／電荷（衝突ガスあり）とが組み合わせて検出されるという事象は、レポーターシグナル融合体を示す（すなわち、レポーターシグナル融合体の発現及びそれをコード化している遺伝子、ベクター又は構築物の発現を示す）。
【０１４０】
開示された方法の一つの効果的な態様は、レポーターシグナル融合体を使用して複数のサンプル（例えば、時系列測定又は他の比較分析など）を測定することことである。摂動後の生体システムの時間的応答の知識は、そのシステムの理解を追求するための非常に効果的なプロセスの一つである。時間的応答を追跡するために、摂動後の所定の時点にこのシステムのサンプル（例えば、細胞培養物からの細胞、最初に同期化して屠殺されたマウスなど）を得る。タンパク質の空間プロファイルの知識（例えば、組織切片内の相対的な位置など）は、この生体システムの理解を追求するための非常に効果的なプロセスの一つである。
【０１４１】
質量電荷比に基づく分子間の高感度な識別を可能にする質量分析法を用いてレポーターシグナル融合体の検出を行うことが好ましい。レポーターシグナルペプチド断片が広範囲の質量を持つように、かつ検出時にそれぞれの質量を個々に識別できるように設定することができることから、多数の遺伝子発現物、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系及び生物体を多重標識化及び／又は多重検出するために、同重体レポーターシグナルペプチドのセット又は同重体レポーターシグナル融合体のセットを用いることができる。同一の遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系若しくは生物体（又は同一のタイプの遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系若しくは生物体）を同重体レポーターシグナル融合体のセットか又は同重体レポーターシグナルペプチドを含むレポーターシグナル融合体のセットで（例えば、種々のサンプル中にある同一の遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系又は生物体を「標識化」することによって）標識化する場合、生ずるレポーターシグナル融合体のセット又はレポーターシグナルペプチドのセットも同重体となるだろう。レポーターシグナルペプチドの断片化によって、レポーターシグナルペプチドのセットが、個々に検出可能な、特徴のある種々の質量を持つレポーターシグナル融合体断片及びレポーターシグナルペプチド断片に分割されることとなるだろう。
【０１４２】
開示された方法の好ましい態様には、他の分子からの、質量電荷比に基づく同重体レポーターシグナル融合体又は同重体レポーターシグナルペプチドのフィルタリング、レポーターシグナルペプチドの断片化とそれによる種々の質量を有する断片の産生、及び質量電荷比に基づく種々の断片の検出が含まれる。本明細書の他の箇所に記載されているように、タンデム質量分析装置を用いてこの方法を実施することが最も好ましい。
【０１４３】
核酸配列及びレポーターシグナル融合体をコード化しているセグメントを適切なあらゆる方法で発現させることができる。例えば、開示された核酸配列及び開示された核酸セグメントをインビトロで、細胞内で及び／又は生物体中の細胞内で発現させることができる。核酸配列及びタンパク質の発現のための数多くの技術及びシステムが知られており、開示されたレポーターシグナル融合体を用いてそれらを実施することができる。例えば、数多くの発現配列、ベクター系、形質転換技術及びトランスフェクション技術並びにトランスジェニック生物製造方法が知られており、そして開示されたレポーターシグナルペプチドの方法及び組成物を用いてそれらを実施することができる。
【０１４４】
例えば、プロモーター及び転写及び翻訳される核酸配列を含むＤＮＡ構築物のインビトロ転写／翻訳のためのキットが知られている（例えば、テキサス州オースチンのアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社のＰＲＯＴＥＩＮｓｃｒｉｐｔ−ＰＲＯ（商標）、ウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）（１９９９）「無細胞そしてハッピー：インビトロ翻訳及び転写／翻訳システム」、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ １３ ［１３］： １５、１９９９年１月２１日）。生物体のゲノムＤＮＡの中で、プラスミドの中で若しくは生物体内へトランスフェクションされ得る他のベクターの中で又はインビトロ系の中で、このような構築物を使用することができる。例えば、プロモーター配列及び核酸配列を含む構築物の転写及び翻訳後に、レポーター／マーカーとして緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼがインビボ系で産生するというものが知られている（例えば、スワインとナース（Ｓａｗｉｎ ａｎｄ Ｎｕｒｓｅ）、「ランダムポリペプチドと緑色蛍光性タンパク質との融合体を用いる分裂酵母核マーカーの同定。」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３ （２６）： １５１４６−５１ （１９９６）、チャタジー（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ）ら、「哺乳類の細胞中における核タンパク質輸送のインビボ分析。」Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２３６ （１）： ３４６−５０ （１９９７）、パターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）ら、「生きている酵母細胞中でのＴＡＴＡ−結合性タンパク質の定量的イメージング。」Ｙｅａｓｔ １４ （９）： ８１３−２５ （１９９８）、ダンダユサパニ（Ｄｈａｎｄａｙｕｔｈａｐａｎｉ）ら、「遺伝子発現用マーカーとしての緑色蛍光性タンパク質及びマイコバクテリウムのマクロファージとの相互作用についての細胞生物学。」Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １７ （５）： ９０１−１２ （１９９５）、クレマー（Ｋｒｅｍｅｒ）ら、「マイコバクテリウムにおける新規発現マーカーとしての緑色蛍光性タンパク質。」Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １７ （５）： ９１３−２２ （１９９５）、レイレンダー（Ｒｅｉｌａｎｄｅｒ）ら、「バキュロウイルス発現系を用いてのオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光性タンパク質の昆虫細胞中での機能的発現。」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２１９ （１）： １４−２０ （１９９６）、マンケルツ（Ｍａｎｋｅｒｔｚ）ら、「ヒトのオクルディンプロモーターからの発現は、腫瘍壊死因子アルファ及びインターフェロンガンマに影響を受ける」Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ， １１３： ２０８５−９０ （２０００）、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら、「単一の哺乳類の細胞におけるＨＩＶプロモーター及びｈＣＭＶプロモーターの転写調節のリアルタイム分析」Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ， １０８： ４４１−５５ （１９９５））。緑色蛍光タンパク質又は変異体が安定的に組み込まれることや、生物体に干渉しないことは示されており−開示されたレポーターシグナルペプチドよりも一般的にＧＦＰの方が大きい（オワンクラゲ由来のＧＦＰは２３８アミノ酸のサイズである。ＮＣＢＩ ＧＩ： ６０６３８４）ことから、一般的に、レポーターシグナルペプチドがより小さい方が、添加される発現系の崩壊が少なくなる傾向にある。
【０１４５】
内因性プロモーターがプロモーター−レポーター構築物で置換されるように、例えば、緑色蛍光性タンパク質（パターソンら、「生きている酵母細胞中でのＴＡＴＡ−結合性タンパク質の定量的イメージング。」Ｙｅａｓｔ １４ （９）： ８１３−２５ （１９９８））又はルシフェラーゼがある位置に来るようにプロモーター領域を修飾する技術は知られている。ＧＦＰ又はルシフェラーゼを監視することによって転写因子の濃度を追跡する。これらの技術は開示されたレポーターシグナル融合体及びレポーターシグナル融合体構築物を用いて使用される。対象となっている遺伝子への核酸配列の標的ノックイン（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）のための技術が知られており、通常、内因性プロモーターの制御下となる。このような技術は開示された方法及び組成物を用いて実行可能となり、そしてその技術は、遺伝子の転写及び翻訳のレポーター／マーカーを、核酸を挿入した位置に導入するために用いられている。開示されたレポーターシグナル融合体を内因性発現配列の支配下に置くために同一の技術を用いることができる。あるいは、非標的性ノックイン（このための技術も公知である。ホブス（Ｈｏｂｂｓ）ら、「組み換え型タンパク質を超高レベルで発現する哺乳類の安定細胞系の創製のためのヒトのポリペプチド鎖伸長因子１アルファプロモーターによって作動するバイシストロン性ベクターの開発」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ， ２５２： ３６８−７２ （１９９８）、ケルシュナー（Ｋｅｒｓｈｎａｒ）ら、「マルチタンパク質複合体のエピトープタグ化サブユニットを条件付で発現するクローン細胞系由来のヒト転写因子ＩＩＨ及びＲＮＡポリメラーゼＩＩのイムノアフィニティー精製及び機能のキャラクタライゼイション」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７３： ３４４４４−５３ （１９９８）、ウ及びチャン（Ｗｕ ａｎｄ Ｃｈｉａｎｇ）、「テトラサイクリン制御法及びエピトープタグ化法による潜在的毒性タンパク質を発現する安定細胞系の樹立」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２１： ７１８−２２，７２４−５ （１９９６））を、挿入された核酸と会合した転写因子−レポーターシグナルペプチド融合体のレベル又は活性を追跡するために用いることができ、コードは転写／翻訳活性を直接示すことができる。
【０１４６】
タンパク質の他のタンパク質との及び他の分子との相互作用の検出と分析の際にも、開示されているレポーターシグナル融合体を用いることができる。例えば、タンパク質−タンパク質相互作用のためのインタラクショントラップには、周知の酵母２−ハイブリッド（フィールズ及びソング（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ）、「タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための新規な遺伝系」Ｎａｔｕｒｅ ３４０： ２４５−６ （１９８９）、ウエツ（Ｕｅｔｚ）ら、「サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるタンパク質−タンパク質相互作用の包括的分析」Ｎａｔｕｒｅ ４０３： ６２３−７ （２０００））及び関連する系（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン・ウィリーアンドソンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）社、２００１、ファンクリーキンジ及びベイヤート（Ｖａｎ Ｃｒｉｅｋｉｎｇｅ ａｎｄ Ｂｅｙａｅｒｔ）、「酵母２−ハイブリッド：到達水準」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ｏｎｌｉｎｅ， ２ （１）， １９９９）が挙げられる。これらの系へのペプチドレポーターシグナルをコード化している核酸配列の組み込みを誘導することは可能であり、例えば、普通に使われているＬａｃＺ選択領域の終端が挙げられる（ＬａｃＺ選択については、例えば、サムブルックら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、１９８９、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨークに記載されている）。このように組み込まれた配列のセット（例えば、それぞれのプラスミドがレポーターシグナルコーディング配列と機能性ＬａｃＺとを有するプラスミドのセット）によって、（使用したレポーターシグナルと同程度に多い種々の相互作用）より多数の相互作用を同時に明白に検出することができる。
【０１４７】
レポーターシグナル融合体の別の態様において、レポーターシグナルをコード化している核酸配列は、Ｔ細胞レセプター及びＢ細胞レセプターの定常部（Ｃ領域）をコード化している配列に付加されてもよい。Ｃ領域が転写後のスプライシングを受けてＪ領域と結合する時に、レポーターシグナルがＴ細胞レセプター又はＢ細胞レセプターにおいて現れることになる。
【０１４８】
レポーターシグナル提示と称するレポーターシグナル融合体の別の態様においては、主要組織適合性（ＭＨＣ）分子及び非−主要組織適合性分子による特定の抗原性ペプチドの提示を検出し分析することができる。タンパク質抗原が抗原提示細胞によってプロセッシングを受け、そしてＴ細胞に認識させるために、通常８〜１２アミノ酸から成る小ペプチドがクラスＩＭＨＣ分子及びクラスＩＩＭＨＣ分子によって提示される、ということはよく知られている。特定のＴ細胞／ペプチド−ＭＨＣ複合体の研究は、種々の標識化に必要な物（放射性又は蛍光性のいずれか一方）並びに特定のレセプター及び／又はペプチド−ＭＨＣ複合体を認識する抗体試薬への共通する信頼を前提とした技術的な挑戦である。
【０１４９】
抗原プロセッシング及び抗原提示についての我々の知識をさらに拡大することができるという要求がある。特定のタンパク質抗原に設計されたレポーターシグナルは、このプロセスの新しい識見を提供し、そして新しい実験用のアプローチを与えるだろう。例えば、ウイルス性又は細菌性の二つのタンパク質、タンパク質Ａ及びタンパク質Ｂについて考えると、これらはわずかに２、３のアミノ酸のみが異なっている。これらのタンパク質が同一の効率でプロセッシングを受けて同一の効率で免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に提示されているかどうかを知ることは有用であろう。レポーターシグナルをタンパク質Ａ中に置くように処理加工し、そして処理加工されたタンパク質Ｂを抗原提示細胞に対させることによって、提示されるレポーターシグナルが異なるかどうかの試験を行うことができ、そしてそれにより、タンパク質が効率的にプロセッシングを受けて提示されているかどうかを測定する。（タンパク質Ａ中に存在する）レポーターシグナルＡが存在するものの、（タンパク質Ｂ中に存在する）レポーターシグナルＢが存在しないことは、タンパク質Ａがプロセッシングを受け、タンパク質Ｂがプロセッシングを受けなかったことを示す。タンパク質Ｂが抗原プロセッシングを受けなかったことは、その免疫系による免疫監視機構からウイルス又は細菌がなぜ逃げたのかについての一つの解釈となるかもしれない。抗原性ペプチドは、アミノ末端及びカルボキシ末端の両方の近傍にあるアンカー残基が保存され、中央部ではそれ以上の不均一性が許容されていることに特徴がある。したがって、この不均一性を有する中央部は、レポーターシグナルペプチドを付加する目的からは好ましい部位である。
【０１５０】
Ｅ．レポーターシグナルの再配列
レポーターシグナルの再配列と称する開示された方法及び組成物の別の態様においては、特定の遺伝子の再配列事象の発生の検出、それらのタンパク質産物の検出及びそれらのレセプターを有している特定の細胞集団の検出が可能である。さらに、レポーターシグナルの再配列によって、ある特定のレセプターの進行又は発達や、レポーターシグナルの有無について監視されている細胞又は細胞集団の進行又は発達を追跡することも可能となる。再配列されたレポーターシグナルについての設計の検討項目は、本明細書の他の箇所で記載されているレポーターシグナル融合体に要求されるそれと同様である。
【０１５１】
開示されている方法のたいていの態様には、さまざまな手段によって検体と会合している無処理レポーターシグナルが含まれる。レポーターシグナルの再配列では、生産過程、例えば生物学的な生産過程を利用し、レポーターシグナルの断片の特定の再配列によって、又はレポーターシグナルの一部のみをコード化している核酸セグメントの特定の再配列によってレポーターシグナルを形成させる。レポーターシグナルの再配列の一つの形態では、例えば、哺乳類の免疫系に存在する可変部−多様性部−結合部（Ｖ−Ｄ−Ｊ）遺伝子の再配列機構などの内因性の生体システムを利用する。このシステムにおいて、生殖系列の隣接していないＤＮＡ（Ｖ遺伝子断片、Ｄ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片）の複数の短い配列が、転写のための鋳型としての機能を果たす前に（組み換えられて）まとめられる。遺伝子の再配列は例えばＴリンパ球及びＢリンパ球などの白血球の中で起こり、そしてそれはＴ細胞抗原レセプター及びＢ細胞抗原レセプターの多様性を生じさせる主要な機構である。理論の上では、莫大な数の種々のレセプターを生み出すことができる。このレベルの複雑さが、まれな再配列事象、すなわちレセプターの存在の検出を困難にしている。ＰＣＲに基づく測定によるアプローチ及びフローサイトメトリーによるアプローチが、レセプターの多様性を研究するために現在用いられている。しかしながら、ＰＣＲによるアプローチは骨の折れる作業であり、そして発現したタンパク質の状態について何らの情報をも与えることがない。フローサイトメトリーによるアプローチは、用いる蛍光プローブの発光スペクトルが重複することから、その能力の多重化には限界がある。
【０１５２】
５０〜１００種のＴ細胞レセプター又はＢ細胞レセプターについて試験を実施しようとすると、それらのレセプターに対する抗体を同程度の数だけ使用する必要性が出てくる。これは実際のところ実施不可能である。それゆえに、レセプターの非常に複雑なプールの中での、高感度で特異性の高い特定のレセプターの検出を可能とする実用的な方法が求められている。このアプローチを高度に多重化する能力によって、現在のところ達成できない実験によるアプローチが可能となる。開示されているレポーターシグナル技術は、検出用のシグナルの大規模な多重化を可能にする。
【０１５３】
レポーターシグナルの再配列の一つの例として、レポーターシグナルをコード化している核酸配列がそのマウスの生殖系列内に設計されているトランスジェニックマウスを新たに得ることができる。このことを行うための方法は当業者に広く知られており、そしてこの方法には、レポーターシグナルを、例えば酵母からの又は細菌からの人工染色体（ＹＡＣ又はＢＡＣ）の中に再配列し、次いでこれらの構築物を用いてトランスジェニックマウスを新たに得るという操作を行うための標準的な分子生物学の方法を用いることが含まれる。
【０１５４】
レポーターシグナルを再配列するために免疫グロブリンの再配列を利用する一つの例として、レポーターシグナルの一部をコード化しているＤ領域と、レポーターシグナルの残りの部分をコード化しているＪ領域とを挙げる。これらの「部分的」レポーターシグナルをコード化しているＤ領域及びＪ領域が結合する再配列事象のすぐ後に、「完全」レポーターシグナルをコード化している一つの配列が生じることとなる。転写及び翻訳の後に、コード化されていたレポーターシグナルがタンパク質産物の中に現れる。次いで、本明細書の他の箇所に記載されているようにして、レポーターシグナルを検出することができる。Ｄ領域及びＪ領域の設計された結合である再配列事象が起こらない場合、レポーターシグナルは検出されないことになる。多様なレポーターシグナルの部分品をコード化している配列の、異なるＤ領域及びＪ領域への含有と再配列とによって、多様の異なるレポーターシグナル、すなわち異なっておりかつ診断用のレポーターシグナルが生じることが可能であり、ここで、このレポーターシグナルは起こり得る再配列のそれぞれが異なっているものである。さらに、このシステムを拡張することもでき、例えば、レポーターシグナルを（例えば、Ｖ−Ｄ−Ｊ、Ｖ−Ｄ−Ｄ−Ｊなどの）三つ以上の遺伝子領域に分割することが挙げられ、その結果、複合的な再配列事象によってレポーターシグナルが生ずることになる。この方式では、レポーターシグナルの部分品の再配列の組み合わせによって、多数の異なるレポーターシグナルが生じてしまう可能性があり、ここで、レポーターシグナルのそれぞれが、特定のレポーターシグナルの部分品が再配列されてレポーターシグナルを形成しているという特徴を持つものである。
【０１５５】
再配列されたレポーターシグナルを持つトランスジェニックマウスによって、他のやり方では取り組むことが困難か、又は不可能な疑問に取り組むことができる。例えば、（数千のうちの、若しくはひょっとすると数百万のうちの）どのＴ細胞レセプター及びＢ細胞レセプターが特定の刺激に対して特異的に応答しているか、又は発達の特定の段階でどのようなタイプの細胞が存在しているかについて、分析することができるだろう。
【０１５６】
Ｆ．質量分析装置
開示された方法は、レポーターシグナル、レポーターシグナルの改変体並びに種々の検体及び検体断片を分析するために質量分析装置を利用することが可能である。質量分析装置は一般的に使用されており、そしてそのような装置及びその操作方法は当業者に知られている。質量分析装置と一体化した分画システムは市販されており、代表的なシステムは、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）及びキャピラリー電気泳動（ＣＥ）を含んでいる。
【０１５７】
質量分析装置の主要な構成エレメントには、（ａ）一つ以上の供給源、（ｂ）一つ以上のアナライザー及び／又はセル並びに（ｃ）一つ以上のディテクターが含まれる。供給源のタイプには、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）のタイプが含まれる。アナライザー及びセルのタイプには、四重極質量フィルター、六重極衝突セル、イオンサイクロトロントラップ及び飛行時間（ＴＯＦ）のタイプが含まれる。ディテクターのタイプには、マルチチャンネルプレート（ＭＣＰ）及びイオンマルチプライヤーのタイプが含まれる。開示された方法での使用に好ましい質量分析装置は、クルチンスキー（Ｋｒｕｔｃｈｉｎｓｋｙ）ら、新規ＭＡＬＤＩ−イオントラップ質量分析装置を用いるタンパク質の迅速自動化同定法、質量分析及びそれに関連する話題に関する第４９回ＡＳＭＳ会議の要旨集、（２００１年５月２７〜３１日）、ロックフェラー大学、ニューヨーク市、ニューヨーク州、に記載されている。
【０１５８】
二つ以上のアナライザー／セルを備える質量分析装置は、タンデム質量分析装置として知られている。タンデム質量分析装置には二つのタイプがあり、これらのタイプのハイブリッド型及び連結型と同じく：「タンデムインスペース」分析装置及び「タンデムインタイム」分析装置がある。イオンが二つ以上のアナライザー／セルを横切るタンデム質量分析装置はタンデムインスペース質量分析装置として知られている。タンデムインスペース分析装置は空間的に整えられたエレメントを利用し、それぞれのエレメントを通過したイオンに順番に作用する。イオンが主に一つのアナライザー／セル中に残るタンデム質量分析装置はタンデムインタイム質量分析装置として知られている。タンデムインタイム分析装置は、ある空間内に含まれている時のイオンについて、時間的に整えられた操作を利用する。これらのタイプのハイブリッドシステム及び連結システムが知られている。質量アナライザーにて対象となっている特定の質量電荷比を選択する能力は、通常、（質量電荷の質量中心を選択された対象イオンの半値幅で割った値として記録される）分解能によって特徴付けられる。それゆえに、分解能は、アナライザーからディテクターを通過するイオン質量電荷分布の狭さの指標である。このような分解能について言及することは、狭い質量電荷比の範囲のみを通過させるための質量分析装置の能力について本明細書で触れることにより、一般に留意される。
【０１５９】
開示された方法において使用する質量分析装置の好ましい方式はタンデム質量分析装置であり、例えば、タンデムインスペースタンデム質量分析装置などである。タンデムインスペースの部類の装置の使用例としては、同重体レポーターシグナルが最初に四重極フィルタリングを通過することができ、レポーターシグナルが（好ましくは衝突セル中で）断片化し、そして飛行時間（ＴＯＦ）段階にて断片を識別し検出する。このような装置において、サンプルがイオン源で（例えば、ＭＡＬＤＩイオン源で）イオン化され、荷電イオンを生ずる。最初に一価の親イオンが生ずるとなるイオン化条件が好ましい。最初の四重極、Ｑ０はラジオ周波数（ＲＦ）モードのみで操作され、そしてすべての荷電粒子のためのイオンガイドとして機能する。次の四重極、Ｑ１はＲＦ＋ＤＣモードで操作され、（レポーターシグナルの質量電荷比を含む）狭い範囲の質量電荷比のみが通過する。この四重極により、対象となっている質量電荷比が選択される。四重極Ｑ２は衝突セルに囲まれ、ＲＦモードのみで操作されてイオンガイドとして機能する。Ｑ２を囲んでいる衝突セルをガスで適切な圧力に満たすことができ、レポーターシグナルの断片化を望む場合は衝突誘起解離によって進入してきたイオンを破壊する。衝突ガスは化学的に不活性なものが好ましいが、反応性のガスを使用することも可能である。開裂しやすい結合、不安定な結合又はこれらの組み合わせを含み、これらの結合がＱ２衝突セルの中で優先的に破壊されるようなレポーターシグナルを活用する分子システムが好ましい。
【０１６０】
開示された方法によって、ＭＳＮが可能なタンデム装置を使用することが可能である。考えられる一例としては、最初の段階のフィルター（ＭＳ）を用いて分子のセットを選択し、これらの分子が光開裂してレポーターシグナルのセットを生じさせ、これらのレポーターシグナルを第二段階を用いて選択し（ＭＳ／ＭＳ）、これらのレポーターシグナルを衝突による断片化によって変化させ、飛行時間によって検出する（ＭＳ３）方法がある。多数の他の組み合わせがあり得、そして、開示された方法をそのような方法による使用に適用することが可能である。例えば、より多くの段階にまで拡張することや、又はレポーターシグナル断片を分析することは当業者の能力の範囲内のことである。
【０１６１】
材料
Ａ．レポーターシグナル
レポーターシグナルとは、検出のために、優先的に断片化、分解、反応、誘導体化又は他のやり方で修飾若しくは改変され得る分子である。質量分析法によって、修飾されたレポーターシグナルの検出を成し遂げることが好ましい。開示されているレポーターシグナルを、セットを構成する個々のものが同一の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有しているというセットの状態で使用することが好ましい。このことにより、質量電荷比に基づいて、他の分子からのレポーターシグナルの高感度なフィルタリング又は分離が促進される。レポーターシグナルは、レポーターシグナルの修飾及び種々の修飾されたレポーターシグナルの同定を可能とするあらゆる構造を持つことが可能である。レポーターシグナルは、少なくとも一つの優先的な結合の断裂が分子中で誘導され得るように構成されていることが好ましい。断片化の際に、セットを構成する個々のもののそれぞれが関連する独特の娘断片を生じさせることとなるような、名目上同一の分子量と任意に選ばれた内部の断片化点とを有するレポーターシグナルのセットを構築してもよい。便宜上、検出のために、断片化、分解、反応、誘導体化又は他のやり方で修飾を受けるレポーターシグナルを断片化レポーターシグナルと称する。
【０１６２】
例えば、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸、オリゴマー、炭水化物、ポリマー並びに他の天然ポリマー及び合成ポリマー並びにこれらの任意の組み合わせなどのサブユニットの鎖で構成されているレポーターシグナルが好ましい。最も好ましい鎖はペプチドであり、本明細書においてレポーターシグナルペプチドと称する。サブユニットの鎖及びサブユニットは、ポリマー及びマー（ｍｅｒｓ）との関係と類似の関係を有する。マーが一緒に結合してポリマーを形成する。同様に、サブユニットが一緒に結合してサブユニットの鎖を形成する。類似の又は関連性を有するサブユニットの鎖で構成されているレポーターシグナルが好ましい。これらは同一の鎖、すなわちホモポリマーと称されている。例えば、核酸はホスホヌクレオシドで構成されており、そしてペプチドはアミノ酸で構成されている。
【０１６３】
さらに、レポーターシグナルは異種の鎖、すなわちヘテロポリマーで構成されていてもよい。異種の鎖は、鎖を形成しているサブユニットが異なるタイプであるか、又はポリマーを形成しているマーが異なるタイプである鎖、すなわちポリマーである。例えば、異種の鎖であるグアノシン−アラニン、これは一つのヌクレオシドサブユニットと一つのアミノ酸サブユニットとから構成されている。サブユニットのタイプのあらゆる組み合わせを、開示されている組成物、セット及び方法の範囲内で使用することが可能であるということが理解できる。必要とされる特性を有するあらゆる分子をレポーターシグナルとして用いることが可能である。好ましいレポーターシグナルはタンデム質量分析法で断片化することが可能である。
【０１６４】
セット中のレポーターシグナルのすべてが類似の物理的特性を有しているセット中で、レポーターシグナルを用いることが好ましい。類似の（又は共通する）特性によって、レポーターシグナルを、一つ以上のその特性を欠く他の分子と識別及び／又は分離することができる。セット中にあるレポーターシグナルが同一の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有していることが好ましい。すなわち、セット中のレポーターシグナルは同重体である。これにより、レポーターシグナル（及び／又はレポーターシグナルが結合しているタンパク質）を質量電荷比に基づいて他の分子と正確に分離することができる。フィルタリングの結果、システムについての信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比が大きく向上し、より高感度でより正確な検出が可能となる。レポーターシグナルのセットはあらゆる数のレポーターシグナルを持つことができる。例えば、レポーターシグナルのセットは１、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上又は５００以上の種々のレポーターシグナルを含むことができる。たとえレポーターシグナルの特定の数及びレポーターシグナルの数の範囲の特定の終点を列挙したとしても、レポーターシグナルのそれぞれの特定の数及びレポーターシグナルの数の範囲のそれぞれの特定の終点が具体的に検討され、たとえ目録が明示されていなくても、レポーターシグナルのそれぞれの特定の数及びレポーターシグナルの数の範囲のそれぞれの特定の終点が本明細書に具体的に記載されている。
【０１６５】
レポーターシグナルのセットは、鎖又はポリマーで構成されているレポーターシグナルで構成されていてもよい。レポーターシグナルのセットは、一種類のレポーターシグナルで構成されるセット又は同一の鎖若しくはホモポリマーで構成されるレポーターシグナルを意味する同種のセットであってもよい。さらに、レポーターシグナルのセットは、種々のレポーターシグナルで構成されるセット又は異なる種類の鎖若しくはポリマーで構成されるレポーターシグナルを意味する異種のセットであってもよい。異種のセットの特別なタイプの一つは、同一の鎖又はホモポリマーで異なるように構成されているセットであり、例えば、一つのペプチド鎖と一つの核酸鎖とから成るものが挙げられる。異種のセット特別なタイプの別のものは、鎖そのものが異種の鎖又はヘテロポリマーであるセットである。異種のセットのさらに別のタイプは、異種の鎖／ヘテロポリマー及び同一の鎖／ホモポリマーの両者から構成されるセットである。
【０１６６】
共通する特性を欠く他の分子からレポーターシグナルを分離するために用いる、共通する物理的特性としては、様々な異なる特性を使用することができる。例えば、共通する特性として有用な他の物理的特性としては、質量、電荷、等電点、疎水性、クロマトグラフィー特性及び密度が挙げられる。セット中のレポーターシグナルによって共有され（そして他の分子からレポーターシグナルを識別及び／又は分離するために用いられ）る物理的特性は、（例えば、ビオチンなどのアフィニティータグなどの）単に存在している特徴又は部分よりも、（例えば、全体の質量、全体の電荷、等電点、全体の疎水性などの）レポーターシグナル全体の特性のほうがより好ましい。本明細書では、このような特性を「全体の」特性と称している（そしてそれゆえに、セット中のレポーターシグナルは「共通する全体の特性」を共有しているとみなされることになる）。レポーターシグナルはアフィニティータグなどの特徴又は部分を有していてもよいこと、及びこのような特徴又は部分は（例えば、質量として貢献することにより）共通する全体の特性を構成する一員となり得ることを理解すべきである。しかしながら、このように限定的であり孤立している特徴又は部分が、共通する全体の特性の唯一の基礎としての役割を有するわけではない。
【０１６７】
好ましい共通する全体の特性は、サブユニット異性体の特性である。少なくとも二つの（例えば、ポリマーとポリマーを作る単位との間の関係のように、サブユニットで次々に構成されているサブユニット鎖から構成されるものが典型的な）レポーターシグナルのセットがサブユニット異性体から構成されており、次いでこのセットがサブユニット・アイソメリック（ｓｕｂｕｎｉｔ ｉｓｏｍｅｒｉｃ）又はアイソメリック・フォー・サブユニット（ｉｓｏｍｅｒｉｃ ｆｏｒ ｓｕｂｕｎｉｔｓ）と呼ばれ得る時に、この特性が現れる。サブユニットは本明細書の他の箇所で議論されているものの、レポーターシグナルは、あらゆるタイプの鎖、例えば、それぞれアミノ酸及びホスホヌクレオシド及び（一般的な）マーなどのサブユニットで次々に構成されているペプチド又は核酸又は（一般的な）ポリマーから構成され得る。それぞれのタイプのサブユニットの範囲内で、複数の主要な構成物のすべてが同一のタイプのサブユニットであるが、異なっているものがある。例えば、サブユニットのタイプが「アミノ酸」の範囲内で、多数の構成する個々のもの、例えば、アラニン、チロシン及びセリン又は他の任意のアミノ酸の組み合わせなどがある。
【０１６８】
レポーターシグナルのセットがサブユニット・アイソメリックか又はサブユニット異性体で構成されるものである場合、これは、セットの個々のもののそれぞれが、セット中の他の個々のサブユニットのサブユニット異性体であることを意味する。異性体又はアイソメリックは、サブユニット鎖を形成するサブユニットの組み立て（すなわち、配置又は整列）は同一であるが、鎖を形成するサブユニットの全体的な接続の仕方が異なっていることを意味する。それゆえに、例えば、最初のレポーターシグナルがアラニン−セリン−リジン−グルタミンという鎖であり得、二番目のレポーターシグナルがアラニン−リジン−セリン−グルタミンという鎖であり得、そして三番目のレポーターシグナルがアラニン−セリン−リジン−プロリンという鎖であり得る。レポーターシグナルのセットが最初のレポーターシグナルと二番目のレポーターシグナルを含むもので作られていれば、このセットはサブユニット・アイソメリックとなる。なぜなら最初のレポーターシグナルと二番目のレポーターシグナルは同一の構成を有し、すなわち、それぞれが一つのアラニン、一つのセリン、一つのリジン及び一つのグルタミンを有するが、それぞれの鎖は接続の仕方が異なるからである。しかし、レポーターシグナルのセットが最初の、二番目の及び三番目のレポーターシグナルを含むもので作られていれば、このセットはアイソメリックとならない。なぜなら最初の鎖と二番目の鎖がプロリンを含まず、三番目の鎖がグルタミンを含まないことからそれぞれの鎖の構成は同一ではないからである。
【０１６９】
別の説明は次のとおりである。最初のレポーターシグナルがアラニン−グアノシン−リジン−アデノシンという鎖であり得、二番目のレポーターシグナルがアラニン−アデノシン−リジン−グアノシンという鎖であり得、そして三番目のレポーターシグナルがアラニン−セリン−リジン−プロリンという鎖であり得る。レポーターシグナルのセットが最初のレポーターシグナルと二番目のレポーターシグナルを含むもので作られていれば、このセットはサブユニット・アイソメリックとなる。なぜなら最初のレポーターシグナルと二番目のレポーターシグナルとは同一の構成を有し、すなわち、それぞれが一つのアラニン、一つのグアノシン、一つのリジン及び一つのアデノシンを有するが、それぞれの鎖は接続の仕方が異なるからである。しかし、レポーターシグナルのセットが最初の、二番目の及び三番目のレポーターシグナルを含むもので作られていれば、このセットはアイソメリックとならない。なぜなら最初の鎖と二番目の鎖がプロリン又はセリンを含まず、三番目の鎖がグアノシン又はアデノシンを含まないことからそれぞれの鎖の構成は同一ではないからである。この説明は、このセットが異種の鎖から構成され得るか又は異種の鎖を含み得るということ及び、このセットがそれでもなおサブユニット異性体とみなされることを示す。
【０１７０】
レポーターシグナルの共通する特性はアフィニティータグでないことが好ましい。それにもかかわらず、そのようなケースでさえ、別な方法で共通する特性を有するレポーターシグナルはアフィニティータグを含んでいてもよい−そして実際のところ、そのすべてが同一のアフィニティータグを共有していてもよい−その共通する特性を欠く他の分子からその共通する特性を共有するレポーターシグナルを分離するのに使用可能である（そして開示された方法のいくつかの態様においては使用する）別の共通する特性が存在する限り。このことに留意すれば、クロマトグラフィー又は他の分離技術を使用して、共通する特性に基づいてレポーターシグナルを分離すると、親和性はレポーターシグナルの全体の物理的特性に基づくものとなり、例えば、アフィニティータグなどの特徴又は部分の存在に基づくのではないことが好ましい。本明細書で用いられるように、共通する特性とは、（例えば、レポーターシグナルなどの）成分のセットによって共有されている特性である。すなわち、この成分は 「共通する」特性を有している。セット中のレポーターシグナルは非常に多数の共通する特性を有していてもよいことを理解すべきである。しかしながら、本明細書で用いられるように、レポーターシグナルの共通する特性と言われるものは、開示された方法において用いられる、その共通する特性を共有するレポーターシグナルをその共通する特性を欠く分子から識別すること及び／又は分離することという特性だけである。
【０１７１】
セット中のレポーターシグナルを断片化、分解、反応、誘導体化又は他のやり方で修飾又は改変することができ、それにより、セット中の種々のレポーターシグナルを識別する。レポーターシグナルを断片化して、類似の電荷を持つが質量が異なる断片を得ることが好ましい。レポーターシグナルを断片化して、電荷及び質量が異なる断片を得ることも可能である。このような変化により、セット中のそれぞれのレポーターシグナルをレポーターシグナル断片の質量電荷比の違いにより識別する。セット中の断片化していないレポーターシグナルは同重体であるのにもかかわらず、種々のレポーターシグナルの断片はそうではないため、このことは可能である。このようにして、修飾されたレポーターシグナルが識別可能であるのに対して、開示されたレポーターシグナルの重要な特色とはレポーターシグナルが特性の類似性を有するということである。
【０１７２】
レポーターシグナルの断片の質量が他の断片と異なるように分布させることは、多くのやり方によって達成され得る。例えば、ジュウテリウム（２Ｈ）、トリチウム（３Ｈ）、１７Ｏ、１８Ｏ、１３Ｃ又は１４Ｃなど、好ましくは安定同位体などの重い同位体の分布を変えることで、同一の名称の構造（例えば、同一のアミノ酸配列を有するペプチド）のレポーターシグナルを得ることができる。セット中のすべてのレポーターシグナルが同数のある特定の重い同位体を持っていても、異なるレポーターシグナルにとっては、これらの分布は異なるものとなるだろう。このようなレポーターシグナルのセットの例としては、Ａ＊Ｇ＊ＳＬＤＰＡＧＳＬＲ、Ａ＊ＧＳＬＤＰＡＧ＊ＳＬＲ及びＡＧＳＬＤＰＡ＊Ｇ＊ＳＬＲ（配列番号：２）であり、ここで、アスタリスクは、少なくとも一つの重い同位体で置換されたアミノ酸であることを示す。一価の親イオンについては、開裂しやすいＤＰ結合の位置での断片化の後、一つの支配的な荷電娘イオンと、三種類の識別可能な一次娘イオン、ＰＡＧＳＬＲ＋、ＰＡＧ＊ＳＬＲ＋、ＰＡ＊Ｇ＊ＳＬＲ＋（配列番号：２の６〜１１位のアミノ酸）が現れる。
【０１７３】
同様に、例えば、メチル化、リン酸化、硫酸化及びメチオニンに代えてのセレノメチオニンの使用などの異なる区分の修飾又は基の置換を伴った、同一の一般構造（例えば、同一のアミノ酸配列を持つペプチドなど）のレポーターシグナルを作成することができる。セット中のすべてのレポーターシグナルが同数のある特定の修飾を受けていても、異なるレポーターシグナルにとっては、これらの分布は異なるものとなるだろう。このようなレポーターシグナルのセットの例としては、ＡＧＳ＊Ｍ＊ＬＤＰＡＧＳＭＬＲ、ＡＧＳ＊ＭＬＤＰＡＧＳＭ＊ＬＲ及びＡＧＳ＊ＭＬＤＰＡＧＳ＊Ｍ＊ＬＲ（配列番号：３）であり、ここで、Ｓ＊はセリンではなくホスホセリンを示し、Ｍ＊はメチオニンではなくセレノメチオニンを示す。一価の親イオンについては、開裂しやすいＤＰ結合の位置での断片化の後、一つの支配的な荷電娘イオンと、三種類の識別可能な一次娘イオン、ＰＡＧＳＭＬＲ＋、ＰＡＧＳＭ＊ＬＲ＋、ＰＡＧＳ＊Ｍ＊ＬＲ＋（配列番号：３の７〜１３位のアミノ酸）が現れる。
【０１７４】
レポーターシグナルのサブユニットの順序が異なっているか又はレポーターシグナルの成分が異なっている同一名称の組成物（例えば、同一のアミノ酸から構成されているものなど）のレポーターシグナルを作成できる。セット中のすべてのレポーターシグナルが同一のサブユニットの数又は同一の成分であっても、異なるレポーターシグナルにとっては、これらの分布は異なるものとなるだろう。このようなレポーターシグナルのセットの例としては、ＡＧＳＬＡＤＰＧＳＬＲ（配列番号：４）、ＡＬＳＬＡＤＰＧＳＧＲ（配列番号：５）、ＡＬＳＬＧＤＰＡＳＧＲ（配列番号：６）がある。一価の親イオンについては、開裂しやすいＤＰ結合の位置での断片化の後、一つの支配的な荷電娘イオンと、三種類の識別可能な一次娘イオン、ＰＧＳＬＲ＋（配列番号：４の７〜１１位のアミノ酸）、ＰＧＳＧＲ＋（配列番号：５の７〜１１位のアミノ酸）、ＰＡＳＧＲ＋（配列番号：６の７〜１１位のアミノ酸）が現れる。
【０１７５】
不安定な又は開裂しやすい結合をレポーターシグナルの異なる位置に有する同一名称の組成物（例えば、同一のアミノ酸から構成されているものなど）のレポーターシグナルを作成することができる。セット中のすべてのレポーターシグナルが同一の数かつ同一の順序のサブユニット又は成分を有するだろう。不安定な又は開裂しやすい結合が、ある特定のサブユニット又は成分の間に存在する場合、不安定な又は開裂しやすい結合を作るサブユニット又は成分を除いて、レポーターシグナル中のサブユニット又は成分の順序は同一であってもよい。レポーターシグナル融合体中で使用されるレポーターシグナルペプチドは、質量分布が異なるこの形態で使用することが好ましい。このようなレポーターシグナルのセットの例としては、ＡＧＳＬＡＤＰＧＳＬＲ（配列番号：４）、ＡＧＳＤＰＬＡＧＳＬＲ（配列番号：７）、ＡＤＰＧＳＬＡＧＳＬＲ（配列番号：８）がある。一価の親イオンについては、開裂しやすいＤＰ結合の位置での断片化の後、一つの支配的な荷電娘イオンと、三種類の識別可能な一次娘イオン、ＰＧＳＬＲ＋（配列番号：４の７〜１１位のアミノ酸）、ＰＬＡＧＳＬＲ＋（配列番号：７の５〜１１位のアミノ酸）、ＰＧＳＬＡＧＳＬＲ＋（配列番号：８の３〜１１位のアミノ酸）が現れる。
【０１７６】
これらの方式のそれぞれを一つ以上の他の方式と組み合わせてもよく、それにより質量分布が異なる複数のレポーターシグナル断片が製造される。例えば、不安定な又は開裂しやすい結合が異なる位置に存在するレポーターシグナル中で、異なる分布を持つ重い同位体を使用することができる。他の方法によって、質量の異なる分布を完成することができる。例えば、レポーターシグナルの種々の位置に種々の修飾を導入することができる。有用な修飾のいくつかの例には、アセチル化、メチル化、リン酸化、メチオニンに代わるセレノメチオニン、硫酸化が挙げられる。類似の方式を利用して、レポーターシグナル中の電荷を異なったふうに分布させることができる。質量及び電荷の異なる分布をレポーターシグナルのセット中で一緒に利用することができる。
【０１７７】
さらにレポーターシグナルは、開裂しやすい結合及び不安定な結合を組み合わせて持つこともできる。これにより、識別可能なシグナルのより多数の組み合わせの検出を促進することができる。例えば、不安定な結合を利用して同重体断片を遊離させてもよく、開裂しやすい結合を利用してタンパク質をデコードしてもよい。
【０１７８】
レポーターシグナルの質量を変えるために、セレンによる置換を利用することができる。セレンはメチオニンの硫黄と置換することができ、それにより修飾されたアミノ酸であるセレノメチオニンが生ずる。セレンは硫黄よりも概算で４７質量単位大きい。セレノメチオニン及びメチオニンが特定の比率で組み込まれたペプチド又はタンパク質を同定するために、質量分析法を用いてもよい。セレノメチオニン及びメチオニンを所望の比率で組み込んだ化学合成によって、既知のセレン／硫黄比を伴う小さなタンパク質及びペプチドを生産することが好ましい。セレノメチオニン及びメチオニンを所望の比率で挿入した大腸菌発現系又は他の任意の発現系から、大きいタンパク質又はペプチドを生産してもよい（ヘンドリクソン（Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ）ら、多波長異常回折（ＭＡＤ）による分析のためのセレノメチオニン含有タンパク質の生産：三次元構造の直接測定のための媒体。Ｅｍｂｏ Ｊ， ９ （５）： １６６５−７２ （１９９０）、クーイ及びコーエン（Ｃｏｗｉｅ ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ）、硫黄の代わりにセレンを含有する、活性を持つ改変タンパク質の大腸菌による生合成。Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， ２６： ２５２−２６１ （１９５７）及びオイカワ（Ｏｉｋａｗａ）ら、メタロチオネインのセレン類似体であるメタロセレノネイン：合成及び銅イオンとの複合体のキャラクタリゼーション。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， ８８ （８）： ３０５７−９ （１９９１））。
【０１７９】
レポーターシグナルのいくつかの態様は、一つ以上のアフィニティータグを含むことができる。このようなアフィニティータグによって、標識化タンパク質、レポーターシグナル又はレポーターシグナル断片の、アフィニティータグに基づく検出、分離、仕分け又は他の操作が可能となる。このようなアフィニティータグは、レポーターシグナルのセットの持つ、他の分子からのレポーターシグナルの分離を可能とする共通する特性とは別個のものであり、かかる特性に（基づくのではなく）さらに追加される。むしろ、このようなアフィニティータグは、開示された方法に先立って、又はその一部としてサンプルへの許容された操作の異なる目的を果たすものであり、共通する特性に基づいてレポーターシグナルを分離することを意味するのではない。レポーターシグナルはアフィニティータグを有していなくてもよく、一つ有していてもよく、二つ以上有していてもよい。レポーターシグナルが複数のアフィニティータグを有している場合、ある特定のレポーターシグナル上にあるタグについては、すべてが同一であってもよく、又は異なるアフィニティータグが組み合わさったものであってもよい。さらに、上記及び本明細書の他の箇所に記載の方式に従って、アフィニティータグを用いて、レポータータグ上の質量及び／又は電荷を異なったふうに分布させることもできる。ＰＣＴ公開公報ＷＯ ００／１１２０８号に記載されたアフィニティー標識を用いるやり方と類似のやり方で、レポーターシグナルと一緒にアフィニティータグを用いることができる。
【０１８０】
ペプチド−ＤＮＡ複合体（オレジュニク（Ｏｌｅｊｎｉｋ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２７ （２３）： ４６２６−３１ （１９９９））、ＰＮＡ−ＤＮＡ構築物の合成及び例えば、ＷＯ ００／０４０３６号に記載の、光で開裂可能な普遍的ヌクレオチドなどの特別のヌクレオチドを、開示された方法にてレポーターシグナルとして用いることができる。さらに、有用な光で開裂可能な連結部も、マリオット及びオットル（Ｍａｒｒｉｏｔｔ ａｎｄ Ｏｔｔｌ）、ヘテロ二機能性の光で開裂可能な架橋結合剤の合成と応用、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２９１： １５５−７５ （１９９８）に記載されている。
【０１８１】
レポーターシグナルの正確で制御された（次の検出のための）断片化、及びレポーターシグナルが結合した検体（又は他の中間的な分子）からの正確で制御されたレポーターシグナルの遊離が可能となるため、レポーターシグナル中にある（及びレポーターシグナルと一緒に用いるための）光で開裂可能な結合及び連結部は有用である。光で開裂可能な種々の結合及び連結部が公知であり、レポーターシグナル中で及びレポーターシグナルと一緒に使用することへの適合が可能である。最近では、光で開裂可能なアミノ酸は市販されるようになっている。例えば、Ｆｍｏｃで保護されわずかに修飾された光で開裂可能なフェニルアラニン（Ｆｍｏｃ−Ｄ、Ｌ−ベータＰｈｅ（２−ＮＯ２））が入手可能である（カタログ番号００１１−Ｆ、イノーバケム（Ｉｎｎｏｖａｃｈｅｍ）社、ツーソン、アリゾナ州）。フェニルアラニン環へのニトロ基の導入により、紫外線（概算で３５０ｎｍの波長）照射下でアミノ酸の断片化が生じる。窒素レーザーは概算で３３７ｎｍの光を放射し、断片化のために使用することが可能である。使用されるこの波長は、残りのペプチドに顕著な損傷を与えることはない。
【０１８２】
Ｆｍｏｃ合成はペプチド合成についての通常の技術であり、この技術を用いてペプチドに光で開裂可能なアミノ酸のＦｍｏｃ−誘導体を組み込むことができる。たとえ任意のレポーターシグナル中で及びレポーターシグナルと一緒に用いる際に光で開裂可能なアミノ酸が有用であっても、これらがペプチドレポーターシグナル中にあることが特に有用である。
【０１８３】
レポーターシグナル中で及びレポーターシグナルと一緒に光で開裂可能な結合及び連結部を使用することを、次の実施例と共に説明として示すことができる。空の（例えば、コンパクトディスク（ＣＤ）などの）プラスチック担体上で、ＭＡＬＤＩ源イオントラップを用いてその表面から材料を直接測定してもよい。例えば、急速凍結組織サンプルの薄い切片をＣＤ表面に添加してもよい。レポーター分子（例えば、光で開裂可能な連結部を介してレポーターシグナルが結合している抗体）を組織表面に添加することができる。組織内にある特異的な成分の認識により、抗体／レポーターシグナル複合体のいくつかが会合することが可能となる（余分の複合体は次の洗浄工程で除去される）。次いで、紫外光の照射により抗体からレポーターシグナルが放出され、ＭＡＬＤＩイオントラップ装置を用いてレポーターシグナルを直接検出する。例えば、ＣＦ＊ＸＸＸＸＸＤＰＸＸＸＸＸＲ（配列番号：２４）の配列のペプチド（これはレポーターシグナルを含むものである）はジスルフィド結合連結方法を用いて抗体に結合させることができる。ＭＡＬＤＩレーザーの紫外線源への暴露により、修飾されたフェニルアラニン、Ｆ＊の位置でペプチドが開裂し、ＸＸＸＸＸＤＰＸＸＸＸＸＲレポーターシグナル（配列番号：２４の３〜１５位のアミノ酸）が遊離することとなる。その後、ＤＰ結合の位置でレポーターシグナルが断片化し、本明細書の他の箇所に記載されている通りに、荷電断片を検出することができる。
【０１８４】
レポーターシグナルと一緒に光で開裂可能な連結部を使用する別の例には、レポーター分子としてＤＮＡ−ペプチドキメラを用いることが含まれる。このようなレポーター分子は、特定の核酸配列を検出するためのプローブとして有用である。ＤＮＡ−ペプチドキメラ（又はＰＮＡ−ペプチドキメラ）において、ペプチド部分はレポーターシグナルであってもよく、又はレポーターシグナルを含んでいてもよい。例えば、レポーター分子中のＤＮＡ−ペプチド連結部の近傍に光で開裂可能なフェニルアラニンを配置することにより、紫外光によるレポーター分子からのレポーターシグナルの遊離が可能になる。本明細書の他の箇所に記載されているように、遊離したレポーターシグナルを直接検出することができ、又は断片化して検出することができる。上記の抗体−ペプチドレポーター分子のケースと同じく、ＤＮＡ−ペプチドキメラをＣＤなどの担体表面の上に存在する核酸分子と会合させて、ＭＡＬＤＩレーザーの紫外線源を用いてレポーターシグナルを遊離させることができる。
【０１８５】
さらに、光で開裂可能な連結部をレポーターシグナル中に組み込むことも可能であり、開示された方法によってレポーターシグナルを断片化するために使用される。例えば、光で開裂可能なアミノ酸（例えば、光で開裂可能なフェニルアラニンなど）をペプチドレポーターシグナル中の任意の所望の位置に組み込むことができる。例えば、ＸＸＸＸＸＸＦ＊ＸＸＸＸＸＲなどの光で開裂可能なフェニルアラニン（Ｆ＊）を含有するレポーターシグナルは光で開裂可能な。次いで、このレポーターシグナルを適切な波長の光を用いて断片化することができ、そして荷電断片を検出する。検出のためにレポーターシグナルを（例えば表面から）イオン化する場合、顕著な光開裂を引き起こさないＭＡＬＤＩレーザー（例えば、２．９４μｍのＥｒ：ＹＡＧ）をイオン化のために使用することができ、二番目のレーザー（例えば、３３７ｎｍの窒素）をレポーターシグナルの断片化のために使用することができる。このケースでは、ＸＸＸＸＸＸＦＸＸＸＸＸＲ＋が光開裂してＸＸＸＸＸＲ＋が生じることとなろう。二番目のレーザーはレポーターシグナルのイオンパケットと任意の位置で交差してもよい。この目的のために、質量分析装置の真空系をまっすぐに変更する。
【０１８６】
レポーターシグナルが結合する検体（又は他の成分）が衝突セル中で、開裂しやすい結合の位置で開裂する場合、レポーターシグナル中の光で開裂可能な連結部を使用することは、特に有用である。例えば、レポーターシグナル融合体において、タンパク質断片部分及びレポーターシグナル部分の両方に開裂しやすい結合を含むタンパク質断片／レポーターシグナルポリペプチドが生成し得る。一例としては、ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＰＸＸＸ（ＸＸＸＸＸＸＸＤＰＸＸＸＸＸＸＸＲ）ＸＸＸＸ（配列番号：２５）があり、ここで、丸かっこの中の配列はレポーターシグナル部分及びＤＰジペプチドが開裂しやすい結合を含んでいることを示す。衝突セル中でこのポリペプチドを断片化することは、ＤＰ結合のいずれか一方の位置又は両方の位置で断片化することとなり、それゆえに断片スペクトルが複雑になる。光で開裂可能な連結部（例えば、光で開裂可能なアミノ酸など）をレポーターシグナル部分において使用することにより、分析中にレポーターシグナルの特異的な光開裂が可能となるだろう。例えば、類似しているポリペプチドＸＸＸＸＸＸＸＸＸＤＰＸＸＸ（ＸＸＸＸＸＸＸＦ＊ＸＸＸＸＸＸＸＲ）ＸＸＸＸ（配列番号：２６）により、レポーターシグナルのＦ＊の位置での特異的な光開裂が可能となる。
【０１８７】
種々の効果を獲得するために、同一のレポーターシグナル又はレポーターシグナル複合体（例えば、レポーター分子若しくはレポーターシグナル融合体）の中で又はそれらと一緒に、光で開裂可能な複数の結合及び／又は複数の連結部を用いることができる。例えば、種々の波長の光で開裂する連結部であって光で開裂可能な種々の連結部を、レポーターシグナル又はレポーターシグナル複合体の種々の部分の中で使用することができ、それによりこの方法の異なる段階で開裂する。種々の断片化波長により、例えば、遊離方法と断片化方法とを組み合わせた逐次処理が可能となる。
【０１８８】
一つの例として、光で開裂可能な二つのアミノ酸Ｚ（開裂波長は赤外領域内）及びＦ＊（光で開裂可能なフェニルアラニン、開裂波長は紫外領域内）を含むペプチドを、アミノ末端が検体又は他の分子と結合することが可能な、ＸＺＸＸＸＸＸＸＦ＊ＸＸＸＸＸＸＲの形態から公知の化学反応を利用して構築することができる。その結果はレポーターシグナル／検体複合体（又は代替物としてのレポーター分子）である。適切な波長の光（この例では赤外線）をこの複合体に照射することによって、この複合体からレポーターシグナルを遊離させることができ、それゆえに、Ｚの位置で結合が開裂する。いったん親イオンが選択されてイオントラップ内に蓄えられると、適切な波長の光（この例では紫外線）に暴露されることによってレポーターシグナルが断片化し、検出及び定量可能な娘イオン（ＸＸＸＸＸＸＲ＋）を生産することができる。
【０１８９】
レポーターシグナルキャリブレーターは、レポーターシグナルの較正にて使用されることで特徴付けられるレポーターシグナルの特別の形態である。上記及び本明細書の他の箇所で記載されているように、レポーターシグナルキャリブレーターはレポーターシグナルの任意の形態あってもよいが、評価される検体と物理的に会合しない別個の分子として使用される。それゆえに、レポーターシグナルキャリブレーターは検体と結合するための反応性基を持つ必要がなく（好ましくは持たない）、かつ特異的結合分子と又は他の分子すなわち本明細書に記載されているレポーターシグナルと会合する成分と会合する必要がない（好ましくは会合しない）。
【０１９０】
一つ以上の共通する特性を一つ以上の検体と共有するレポーターシグナルキャリブレーターが好ましい。一つ以上の共通する特性を共有するレポーターシグナルキャリブレーター及び検体は、レポーターシグナルキャリブレーター／検体セットと称される。一つの検体と一つのレポーターシグナルキャリブレーターだけが共通する特性を共有している場合、これらをレポーターシグナルキャリブレーター／検体ペアと称することもできる。レポーターシグナルキャリブレーター／検体セット中のレポーターシグナルキャリブレーター及び検体は、適合していると言われる。共通する特性によって、一つ以上の特性を欠く他の分子からレポーターシグナルキャリブレーター及びそれに適合している検体を識別及び／又は分離することができる。同一の質量電荷比（ｍ／ｚ）をセット中に有するレポーターシグナルキャリブレーター及び検体が好ましい。すなわち、セット中にある、適合するレポーターシグナルキャリブレーター及び検体は同重体である。このことにより、質量電荷比に基づいて、他の分子からレポーターシグナルキャリブレーター及び検体を正確に分離することが可能となる。レポーターシグナルキャリブレーターを断片化、分解、反応、誘導体化又は他のやり方で修飾若しくは改変することが可能であり、それによって改変されたレポーターシグナルキャリブレーターを、それらの適合する検体から識別する。検体を断片化することもできる。レポーターシグナルキャリブレーターを断片化して、類似の電荷を持つが質量が異なる断片を得ることが好ましい。レポーターシグナルキャリブレーターを断片化して異なる電荷と質量を持つ断片を得ることもできる。このような変更により、レポーターシグナルキャリブレーターの断片の異なる質量電荷比に基づいて、適合している検体（そしてもしあるとすれば、同一のセットを構成する個々の他の検体及び／又はレポーターシグナルキャリブレーター）からレポーターシグナルキャリブレーターを識別することが可能となる。たとえセットの状態の断片化していない１つ（又は複数）のレポーターシグナルキャリブレーター及び１つ（又は複数）の検体が同重体であっても、１つ（又は複数）のレポーターシグナルキャリブレーターの断片はそうではないことから、このことは可能である。それゆえに、開示されたレポーターシグナルキャリブレーターの鍵となる特徴は、修飾されたレポーターシグナルキャリブレーターをそれらの適合する検体と識別できるのに対し、レポーターシグナルキャリブレーターがそれらの適合する検体との特性の類似性を有することである。
【０１９１】
レポーターシグナルキャリブレーターと一緒に用いるための検体としてはタンパク質、ペプチド及び／又はタンパク質断片（便宜上、まとめてタンパク質と称する）が好ましい。一つ以上の共通する特性を共有するレポーターシグナルキャリブレーター及びタンパク質を、レポーターシグナルキャリブレーター／タンパク質セットと称する。一つのタンパク質及び一つのレポーターシグナルキャリブレーターだけが、その共通する特性を共有している場合、これらをレポーターシグナルキャリブレーター／タンパク質ペアと称することもできる。レポーターシグナルキャリブレーター／検体セット中のレポーターシグナルキャリブレーター及びタンパク質は、適合していると言われる。
【０１９２】
本明細書の他の箇所に記載されているように、サンプル中の検体の存在と量とを評価するための標準としてレポーターシグナルキャリブレーターを使用することができる。この目的のために、それぞれの評価される検体について設計されたレポーターシグナルキャリブレーターをサンプルと混合して分析することができる。次いで、検体及び適合しているレポーターシグナルキャリブレーターを一緒に処理して検体及びレポーターシグナルキャリブレーターの両方（好ましくはそれらの改変体）を検出する。レポーターシグナルキャリブレーター又は改変されたレポーターシグナルキャリブレーターの検出量により、その標準に対して検体の又は改変された検体の検出量が比較可能であるところの標準が与えられる（添加されたレポーターシグナルキャリブレーターの量を知ることができるため）。これにより、サンプル中に存在する検体の量を正確に評価することが可能となる。
【０１９３】
Ｂ．検体
開示された方法では、一般的に検出、測定及び／又は分析の対象として検体を利用する。検体は、検出する予定の、測定する予定の又は他のやり方で分析する予定のあらゆる分子又は分子の一部であってよい。検体は物理的に別個の分子である必要はないが、大きな分子の一部であれば構わない。 検体には生物学的分子、有機的分子、薬品、組成物及び他のあらゆる分子又は開示された方法を適用することができる構造体が含まれる。開示された方法の異なる態様の方が、この方法の別の態様よりもいくつかのタイプの検体にさらに適していることを理解すべきである。検体を標的分子とも称する。
【０１９４】
好ましい検体は生物学的分子である。生物学的分子には、タンパク質、ペプチド、酵素、アミノ酸修飾体、タンパク質ドメイン、タンパク質モチーフ、核酸分子、核酸配列、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、代謝産物、炭水化物及び核酸モチーフが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いるように、「生物学的分子」及び「生体分子」とは、あらゆる分子若しくは分子の一部又は複数の分子から成る集合体すなわち組成物のことであって、これらは生物学的起源を有し、生物学的起源を有する分子若しくは分子の一部又は複数の分子から成る集合体すなわち組成物と関係がある。生体分子は、生物学的起源を有する分子と関係がある完全な人工分子でも構わない。
【０１９５】
上記に及び本明細書の他の箇所に、たとえ「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」又は「複数のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」の検出と言及されていたとしても、開示された方法及び組成物はタンパク質、ペプチド及びタンパク質又はペプチドの断片を包含する。したがって、本明細書におけるタンパク質への言及は、文脈上明らかに他のものを示していない限り、タンパク質、ペプチド及びタンパク質又はペプチドの断片に言及することを意味する。
【０１９６】
Ｃ．検体サンプル
任意の起源からのあらゆるサンプルを開示された方法で使用することができる。一般的に、検体サンプルは検体を含んでいるか、又は含んでいるかもしれないサンプルのはずである。適切な検体サンプルの例には、細胞サンプル、組織サンプル、細胞抽出物、別のサンプルから精製された成分又は画分、環境上のサンプル、培養サンプル、組織サンプル、体液及び生検サンプルが含まれる。非常に多くの他のサンプルの供給源が知られているか又は開発可能であり、そしていかなるサンプルも開示された方法で使用することができる。開示された方法で使用するのに好ましい検体サンプルは、細胞サンプル及び組織サンプルである。検体サンプルは複雑であってもよく、単純であってもよく、又はその間のいずれかのものであってもよい。例えば、検体サンプルには生物学的分子（例えば、組織サンプル）の複雑な混合物が含まれていてもよく、検体サンプルは高度に精製されたタンパク質調製物又は単一の種類の分子でもかまわない。
【０１９７】
Ｄ．タンパク質サンプル
任意の起源からのあらゆるサンプルを開示された方法で使用することができる。一般的に、タンパク質サンプルはタンパク質分子を含んでいるか、又は含んでいるかもしれないサンプルのはずである。適切なタンパク質サンプルの例には、細胞サンプル、組織サンプル、細胞抽出物、別のサンプルから精製された成分又は画分、環境上のサンプル、バイオフィルムサンプル、培養サンプル、組織サンプル、体液及び生検サンプルが含まれる。非常に多くの他のサンプルの供給源が知られているか又は開発可能であり、そしていかなるサンプルも開示された方法で使用することができる。開示された方法で使用するのに好ましいタンパク質サンプルは、細胞サンプル及び組織サンプルである。タンパク質サンプルは複雑であってもよく、単純であってもよく、又はその間のいずれかのものであってもよい。例えば、タンパク質サンプルにはタンパク質（例えば、組織サンプル）の複雑な混合物が含まれていてもよく、タンパク質サンプルは高度に精製されたタンパク質調製物又は単一の種類のタンパク質でもかまわない。
【０１９８】
Ｅ．レポーター分子
レポーター分子はレポーターシグナルが特異的結合分子又はデコーディングタグと結合した分子である。レポーターシグナルと特異的結合分子又はデコーディングタグとが互いに共有結合しているか又は互いに拘束しあっているものが好ましい。本明細書で用いられるように、電子対が直接的に又は間接的に共有されてつながる場合に、分子が結合する。間接的な結合の一つの態様は、リンカー分子を介するものである。いくつかの確立されたカップリング反応のうちの任意の反応によって、レポーターシグナルは特異的結合分子又はデコーディングタグと結合することができる。例えば、ヘンドリクソンら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２３ （３）： ５２２−５２９ （１９９５）は、オリゴヌクレオチドを抗体に結合させるための適切な方法を記載している。
【０１９９】
レポーター分子の一つの態様は、デコーディングタグとしてペプチド核酸を、そしてレポーターシグナルとしてレポーターシグナルペプチドを有するものである。ペプチド核酸は例えば、オリゴヌクレオチドコーディングタグと会合することができ、それゆえに、レポーターシグナルペプチドとコーディングタグとが会合する。本明細書の他の箇所に記載されているように、コーディングタグを標識化検体及び他の分子に用いることができる。
【０２００】
本明細書で用いられるように、分子の一つの（又は分子の一つからの）ループが、他の分子の（又は他の分子からの）ループを貫通している場合、分子は別の分子に拘束されていると言われる。二つの分子が拘束されている場合は、これらは共有的に結合していない。拘束していることは、一本のひもでできた閉じたループがジョッキの取っ手の穴を貫通していることの類推によって心に描くことができる。一般的に、一方の又は両方の分子がループの周りを自由に回転できるように拘束を設計する。
【０２０１】
Ｆ．特異的結合分子
特異的結合分子は、特定の分子又はその一部と特異的に相互作用する分子である。特異的結合分子と特異的に相互作用する分子又はその一部は、例えば、検体などの検体と称される。好ましい検体は検体である。検体という用語は個々の分子及びそのような分子の一部の両方を意味し、例えば、タンパク質のエピトープであり、それは特異的結合分子と特異的に相互作用する、ということが理解される。特異的な結合親和性を有する抗体、レセプター／リガンドペアを構成する個々のもののいずれか一方、合成ポリアミド（ダーバン及びブルリ（Ｄｅｒｖａｎ ａｎｄ Ｂｕｒｌｉ）、ポリアミドによる配列特異的ＤＮＡ認識。Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ， ３ （６）： ６８８−９３ （１９９９）、ウェマー及びダーバン（Ｗｅｍｍｅｒ ａｎｄ Ｄｅｒｖａｎ）、マイナーグルーブＤＮＡのターゲティング。Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ， ７ （３）： ３５５−６１ （１９９７））、核酸プローブ及び他の分子は特異的結合分子の例であり、レポーター結合分子の親和性部分として有用である。
【０２０２】
特定の検体と特異的に相互作用する特異的結合分子は、その検体について特異的であると言われている。例えば、特異的結合分子が特定の抗原と会合する抗体の場合、その特異的結合分子はその抗原について特異的であると言われる。抗原は検体である。特異的結合分子を含むレポーター分子を特定の検体について特異的であると称することもできる。特異的結合分子としては、抗体、リガンド、結合タンパク質、レセプタータンパク質、ハプテン、アプタマー、炭水化物、合成ポリアミド、ペプチド核酸又はオリゴヌクレオチドが好ましい。好ましい結合タンパク質はＤＮＡ結合タンパク質である。好ましいＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガーモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、ヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフである。これらのモチーフを同一の特異的結合分子内で組み合わせてもよい。
【０２０３】
レポーター結合剤の親和性部分として有用な抗体を市販品として入手することができ、又は十分に確立された方法で生産することができる。例えば、ジョンストン及びソープ（Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ ａｎｄ Ｔｈｏｒｐｅ）、免疫化学の実際（ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）社、オックスフォード、イギリス、１９８７）の３０−８５ページに、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を生産するための有用で一般的な方法が記載されている。この本の全体には、測定系における抗体の使用のための多くの一般的な技術及び原理が記載されている。
【０２０４】
ジンクフィンガー、ジンクフィンガーモチーフ及びそれらの相互作用の特性は、ナルデリ（Ｎａｒｄｅｌｌｉ）らによるジンクフィンガー−ＤＮＡの認識：部位特異的突然変異誘発による基本的な特異性の分析、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２０ （１６）： ４１３７−４４ （１９９２）、ジェーミソン（Ｊａｍｉｅｓｏｎ）らによる改変されたＤＮＡ−結合特異性を伴うジンクフィンガーのインビトロ選択、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３３ （１９）： ５６８９−９５ （１９９４）、チャンドラセガーラン及びスミス（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ）によるキメラ制限酵素：次は何か？Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ３８０ （７−８）： ８４１−８ （１９９９）及びスミスらによるキメラ制限酵素の基質特異性に関する詳細な研究、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２７ （２）： ６７４−８１ （１９９９）に記載されている。
【０２０５】
特異的結合分子の一つの態様は、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体である。このような特異的結合分子は、特定の核酸配列を検出するために設計され、使用される。それゆえに、オリゴヌクレオチド特異的結合分子のための検体は核酸配列である。検体は大きな核酸分子の中のヌクレオチド配列であってもよい。オリゴヌクレオチド特異的結合分子の長さは、レポーター結合プローブと検体との間の特異的かつ安定したハイブリダイゼーションに対応する長さであれば、どのような長さでもよい。この目的のために、１０〜４０ヌクレオチドの長さのものが好ましく、オリゴヌクレオチド特異的結合分子を伴う１６〜２５ヌクレオチドの長さのものが最も好ましい。オリゴヌクレオチド特異的結合分子としてはペプチド核酸が好ましい。ペプチド核酸はＤＮＡと安定したハイブリッドを形成する。これにより、次に続く増幅操作及び検出操作の間を通してペプチド核酸特異的結合分子が標的配列に強固に結合し続けることが可能となる。
【０２０６】
ガスパロ（Ｇａｓｐａｒｒｏ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２ （１４）： ２８４５−２８５２ （１９９４）に記載の三重らせん体化学結合技術を利用することにより、オリゴヌクレオチド特異的結合分子を用いてこのような有用な効果を得ることもできる。簡単に言えば、標的配列とハイブリッド形成した場合に三重らせん体を形成するようにオリゴヌクレオチド特異的結合分子を設計する。このことは一般的に知られている通りにして達成するが、主にホモプリン標的配列又は主にホモピリミジン標的配列のいずれか一方を選択することにより達成することが好ましい。特異的結合分子を構成する、適合したオリゴヌクレオチド配列は、選択された標的配列に対して相補的となり、そしてそれゆえに、それぞれ主にホモピリミジン又は主にホモプリンとなる。（ガスパロらによって記載された三重らせん体プローブに対応する）特異的結合分子は化学的に連結しているソラレン誘導体を含む。特異的結合分子の標的配列へのハイブリッド形成の際に、三重らせん体が形成される。三重らせん体を低波長紫外線放射に暴露することにより、ソラレン誘導体がプローブの標的配列への架橋結合を媒介する．
【０２０７】
Ｇ．レポーターシグナル融合体
レポーターシグナル融合体は、単一のアミノ酸セグメント（すなわち、融合体タンパク質）中で対象となっているタンパク質又はペプチドと結合しているレポーターシグナルペプチドである。レポーターシグナルペプチドを伴う、対象となっているタンパク質及びペプチドのこのような融合体を、融合体を構築しているアミノ酸セグメントをコード化している核酸分子から融合体タンパク質又はペプチドとして発現させることができる。レポーターシグナル融合体核酸分子又はレポーターシグナル核酸セグメントを、それぞれ核酸分子又は核酸配列と称し、これらはレポーターシグナル融合体をコード化している。上記に及び本明細書の他の箇所に、たとえ「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」又は「複数のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」の検出と言及されていたり、これらとの融合体と言及されていたとしても、開示されたレポーターシグナル融合体はタンパク質、ペプチド及びタンパク質又はペプチドの断片との融合体を包含する。したがって、本明細書におけるタンパク質への言及は、文脈上明らかに他のものを示していない限り、タンパク質、ペプチド及びタンパク質又はペプチドの断片に言及することを意味する。
【０２０８】
本明細書で用いられているように、「レポーターシグナル融合体」とは、文脈上明らかに他のものを示していない限り、レポーターシグナルペプチドと融合している（すなわち、同一のポリペプチド鎖における１つ（又は複数）のペプチド結合によって結合している）タンパク質、ペプチド又はタンパク質若しくはペプチドの断片を示す。レポーターシグナル融合体に含まれるレポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質は、直接融合される必要はない。すなわち、他のアミノ酸、アミノ酸配列及び／又はペプチド成分が介在してもよい。例えば、レポーターシグナル融合体中の対象となっているタンパク質とレポーターシグナルペプチドとの間に、エピトープタグを、もし存在するのであれば、位置させることができる。１つ（又は複数）のレポーターシグナルペプチドをタンパク質と任意の配置で、例えば、タンパク質のＮ−末端の位置で、タンパク質のＣ−末端の位置で、ドメイン結合部内若しくはドメイン結合部で、又はタンパク質の他の適切な任意の位置で融合することができる。この方法のいくつかの態様において、タンパク質が機能を保持していることが望ましい。このようなケースにおいて、末端での融合体又はドメイン内での融合体が好ましい。タンパク質融合体に係る当業者は、一般的に、対象となっているタンパク質が機能を保持できるような融合体をどのようにして設計するのかを知っている。他の態様において、レポーターシグナルペプチド及びタンパク質がいずれかの所望の構造上の構成をとることができる場合には、タンパク質が機能を保持することは必要ではない。
【０２０９】
ある特定のレポーターシグナル融合体には、一つ以上のレポーターシグナルペプチド及び一つ以上の対象となっているタンパク質又はペプチドが含まれていても構わない。さらに、レポーターシグナル融合体には、一つ以上のアミノ酸、アミノ酸配列及び／又はペプチド成分が含まれていても構わない。開示されたレポーターシグナル融合体は、単一の、近接するポリペプチド鎖を含む。それゆえに、たとえ複数のアミノ酸セグメントが同一の近接するポリペプチド鎖の一部となり得ても、ある特定のアミノ酸セグメントのすべての成分（すなわち、１つ（又は複数）のレポーターシグナルペプチド並びに対象となっている１つ（又は複数）のタンパク質及び１つ（又は複数）のペプチド）は同一の近接するポリペプチド鎖の一部である。
【０２１０】
レポーターシグナル融合体は、その融合体をコード化している核酸分子の発現によって生産され得る。例えば、一つのレポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとをその中に含むアミノ酸セグメントをコード化している核酸セグメントを設計することによって、開示されている融合体を一般的に設計することができる。ある特定の核酸分子は一つ以上の核酸セグメントを含むことができる。ある特定の核酸セグメントは一つ以上のアミノ酸セグメントをコード化することができる。ある特定のアミノ酸セグメントは、一つ以上のレポーターシグナルペプチドと、一つ以上の対象となっているタンパク質又はペプチドとを含むことができる。開示されているアミノ酸セグメントは、単一の、隣接するポリペプチド鎖から成るものである。すなわち、たとえ複数のアミノ酸セグメントが同一の隣接するポリペプチド鎖の一部分であり得るとしても、ある特定のアミノ酸セグメントのすべての構成成分（すなわち、対象となっている、１つ（又は複数）のレポーターシグナルペプチド、１つ（又は複数）のタンパク質及び１つ（又は複数）のペプチド）は、同一の隣接するポリペプチド鎖の一部分である。
【０２１１】
レポーターシグナル融合体は、対象となっているタンパク質及びレポーターシグナルペプチドに加えて他の成分を含むことができる。例えば、レポーターシグナル融合体はエピトープタグ又はｆｌａｇペプチドを含んでいてもよい（例えば、グロース（Ｇｒｏｔｈ）ら、（２０００）、ファージのインテグラーゼはヒト細胞における能率的な部位特異的組み込みを導く。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９７： ５９９５−６０００などを参照すること）。エピトープタグ及びｆｌａｇペプチドはタグとしての機能を果たすことができ、このタグにより、レポーターシグナル融合体を分離したり、識別したり、会合させたり及び／又は結合させることができる。エピトープタグ及びｆｌａｇペプチドを使用することは一般的に知られており、開示されているレポーターシグナル融合体においての使用に適合させることもできる。
【０２１２】
レポーターシグナルペプチドを断片化、分解、反応、誘導体化又は他のやり方で、好ましくは特徴的な方法で修飾することができる。このことにより、レポーターシグナルペプチドの断片化、分解、反応、誘導体化又は他の修飾化後の一つ以上のレポーターシグナル融合体の産物の検出による、レポーターシグナルペプチドと融合するタンパク質の同定が可能となる。さらに、レポーターシグナル融合体と、レポーターシグナルペプチドの断片化、分解、反応、誘導体化又は他の修飾化後の一つ以上のレポーターシグナル融合体の産物との相関性を有する検出によっても、このタンパク質を同定することができる。特徴的で検出可能な方法によるレポーターシグナルペプチドの改変によって、レポーターシグナル融合体が変化することとなる。それと一緒に、特徴的なレポーターシグナル融合体とレポーターシグナル融合体の特徴的な産物（すなわち、その改変体）とを検出することにより、そのタンパク質を一義的に同定することができる（必要に応じて、その改変体だけが検出されることもあるが）。このやり方において、一つ以上のタンパク質の発現を単独で又は（例えば、多重測定により）一緒に検出することができる。さらに、一つ以上のサンプルに存在する一つ以上のタンパク質の発現も多重的な方法により検出することができる。レポーターシグナルの質量分析のために、レポーターシグナルペプチドが断片化して類似の電荷を持つが質量が異なる断片を得ることが好ましい。
【０２１３】
類似の電荷を持つが質量が異なる断片を得るように、レポーターシグナルペプチドの断片化が設計されていることが好ましい。これにより、セット中のそれぞれのレポーターシグナル融合体（及び／又はそれぞれのレポーターシグナルペプチド）を、レポーターシグナルペプチド断片（すなわち、その改変体）の質量電荷比の違いによって識別することが可能となる。種々のレポーターシグナルペプチドの断片（又はレポーターシグナル融合体の断片）が異なる質量電荷比を持つようにこれら断片を設計することが可能なので、このことは可能である。開示された方法において、このことにより、レポーターシグナルペプチドの断片化後にそれぞれのレポーターシグナル融合体をレポーターシグナル融合体の質量電荷比によって識別することが可能となる。
【０２１４】
レポーターシグナル融合体中のレポーターシグナルペプチドの改変によって、多様な改変された組成物を形成することができる。これらの改変体のいずれか又はすべてを検出することができる。例えば、レポーターシグナルペプチドの改変体を検出することができ、（レポーターシグナルペプチドを含む）アミノ酸セグメントの改変体を検出することができ、アミノ酸セグメントのサブセグメントの改変体を検出することができ、又はこれらの組み合わせを検出することができる。断片化によってレポーターシグナルペプチドを改変した場合、一般的に生じるものは、レポーターシグナルペプチドの断片と、対象となっているタンパク質又はペプチドとレポーターシグナルペプチドの一部（すなわち、レポーターシグナルペプチド断片中にはない方の一部）とを含むアミノ酸セグメントの改変体であろう。
【０２１５】
さらに、対象となっているタンパク質又はペプチドを断片化することもできる。得られるものはアミノ酸セグメントのサブセグメントとなろう。アミノ酸サブセグメントレポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドの一部を含むことになる。アミノ酸サブセグメント中のレポーターシグナルペプチドを改変した場合（アミノ酸セグメントの断片化前、断片化中又は断片化後に生じ得る）、得られるものはアミノ酸サブセグメントの改変体（及びレポーターシグナルペプチドの改変体）である。アミノ酸サブセグメントの改変体を検出することができる。断片化によってレポーターシグナルペプチドが改変された場合、得られるものは一般的に、レポーターシグナルペプチドの断片及びアミノ酸サブセグメントの改変体（すなわち、その断片）であろう。このケースにおいて、アミノ酸サブセグメントの改変体（本明細書ではレポーターシグナル融合体断片とも称する）は対象となっているタンパク質又はペプチドの一部と、レポーターシグナルペプチドの一部（すなわち、この部分はレポーターシグナルペプチド断片中にはない）とを含むものになろう。
【０２１６】
一般的にレポーターシグナルと同様、セット内のレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドが一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドがその共通する特性を欠く分子から分離されるか又は識別されることを可能とする特性、を持つことができるというセット内で（アミノ酸セグメントとも称する）レポーターシグナル融合体、（レポーターシグナル融合体のサブセグメントとも称する）レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドを用いることができる。レポーターシグナル融合体のケースにおいては、セット内のアミノ酸セグメント及びアミノ酸サブセグメントが一つ以上の共通する特性、すなわちアミノ酸セグメント及びアミノ酸サブセグメントがそれぞれ共通する特性を欠く分子から分離されるか又は識別されることを可能とする特性、を持つことができるセット内で、アミノ酸セグメント及びアミノ酸サブセグメントを使用することができる。一般的に、共通する特性を有するレポーターシグナル融合体の１つ（又は複数）の構成成分は、検出される１つ（又は複数）の構成成分に及び／又は使用する方法の方式に依存してもよい。
【０２１７】
共通する特性を欠く他の分子からレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片及び／又はレポーターシグナルペプチドを分離するために用いる、共通する物理的特性としては、様々な異なる特性を使用することができる。例えば、共通する特性として有用な物理的特性としては、質量電荷比、質量、電荷、等電点、疎水性、クロマトグラフィー特性及び密度が挙げられる。セット中のレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドによって共有され（そして他の分子からレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドを識別及び／又は分離するために用いられ）る物理的特性は、（例えば、ビオチンなどのアフィニティータグなどの）単に存在している特徴又は部分よりも、（例えば、全体の質量、全体の電荷、等電点、全体の疎水性などの）レポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチド全体の特性のほうがより好ましい。本明細書では、このような特性を「全体の」特性と称している（そしてそれゆえに、セット中のレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドは「共通する全体の特性」を共有しているとみなされることになる）。レポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドはアフィニティータグなどの特徴又は部分を有していてもよいこと、及びこのような特徴又は部分は（例えば、質量として貢献することにより）共通する全体の特性を構成する一員となり得ることを理解すべきである。しかしながら、このように限定的であり孤立している特徴又は部分が、共通する全体の特性の唯一の基礎としての役割を有するわけではない。
【０２１８】
レポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドの共通する特性はアフィニティータグでないことが好ましい。それにもかかわらず、そのようなケースでさえ、別な方法で共通する特性を有するレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドはアフィニティータグを含んでいてもよい−そして実際のところ、そのすべてが同一のアフィニティータグを共有していてもよい−その共通する特性を欠く他の分子からその共通する特性を共有するレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドを分離するのに使用可能である（そして開示された方法のいくつかの態様においては使用する）別の共通する特性が存在する限り。このことに留意すれば、クロマトグラフィー又は他の分離技術を使用して、共通する特性に基づいてレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドを分離すると、親和性はレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドの全体の物理的特性に基づくものとなり、例えば、アフィニティータグなどの特徴又は部分の存在に基づくのではないことが好ましい。本明細書で用いられるように、共通する特性とは、（例えば、レポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドなどの）成分のセットによって共有されている特性である。すなわち、この成分は 「共通する」特性を有している。セット中のレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドは非常に多数の共通する特性を有していてもよいことを理解すべきである。しかしながら、本明細書で用いられるように、レポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドの共通する特性と言われるものは、開示された方法において用いられる、その共通する特性を共有するレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片又はレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から識別すること及び／又は分離することという特性だけである。
【０２１９】
セットを構築しているか又はセット中にあるレポーターシグナルペプチド、レポーターシグナル融合体及び／又はレポーターシグナル融合体のサブセグメントが類似の特性（例えば、類似の質量電荷比など）を有しているというセットの中で、レポーターシグナルペプチド、レポーターシグナル融合体（又はアミノ酸セグメント）、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメント及び／又はレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントを含む核酸分子を用いる態様が好ましい。この類似の特性によって、レポーターシグナル、レポーターシグナル融合体又はレポーターシグナル融合体のサブセグメントを一つ以上のその特性を欠く他の分子から識別及び／又は分離することができる。セットを構築しているか又はセット中にあるレポーターシグナル、レポーターシグナル融合体又はレポーターシグナル融合体のサブセグメントが同一の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有していることが好ましい。すなわち、セット中のレポーターシグナル、レポーターシグナル融合体又はレポーターシグナル融合体のサブセグメントが同重体である。これにより、レポーターシグナル、レポーターシグナル融合体又はレポーターシグナル融合体のサブセグメントを質量電荷比に基づいて他の分子と正確に分離することができる。フィルタリングの結果、システムについての信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比が大きく向上し、より高感度でより正確な検出が可能となる。
【０２２０】
（アミノ酸セグメントとも称される）レポーターシグナル融合体のセット、（レポーターシグナル融合体のサブセグメント又はアミノ酸サブセグメントとも称される）レポーターシグナル融合体断片のセット、レポーターシグナルペプチドのセット、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントのセット又はレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントを含む核酸分子のセットは、あらゆる数のレポーターシグナル融合体融合体、レポーターシグナル融合体断片、レポーターシグナルペプチド、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメント又はレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントを含む核酸分子を持つことができる。例えば、レポーターシグナル融合体のセット、レポーターシグナル融合体断片のセット、レポーターシグナルペプチドのセット、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントのセット又はレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントを含む核酸分子のセットは、１、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上又は５００以上の種々のレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片、レポーターシグナルペプチド、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメント又はレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントを含む核酸分子を含むことができる。たとえレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片、レポーターシグナルペプチド、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメント及びレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントを含む核酸分子の特定の数を、並びにレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片、レポーターシグナルペプチド、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメント及びレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントを含む核酸分子の数の範囲の特定の終点を列挙したとしても、レポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片、レポーターシグナルペプチド、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメント及びレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントを含む核酸分子のそれぞれの特定の数が、並びにレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片、レポーターシグナルペプチド、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメント及びレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントを含む核酸分子の数の範囲のそれぞれの特定の終点が具体的に検討され、たとえ目録が明示されていなくても、レポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片、レポーターシグナルペプチド、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメント及びレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントを含む核酸分子のそれぞれの特定の数が、並びにレポーターシグナル融合体、レポーターシグナル融合体断片、レポーターシグナルペプチド、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメント及びレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントを含む核酸分子の数の範囲のそれぞれの特定の終点が本明細書に具体的に記載されている。
【０２２１】
質量電荷比に基づく分子間の高感度な識別を可能にする質量分析法を用いてレポーターシグナル融合体の検出を行うことが好ましい。レポーターシグナルペプチド断片が広範囲の質量を持つように、かつ検出時にそれぞれの質量を個々に識別できるように設定することができることから、多数の遺伝子発現物、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系及び生物体を多重標識化及び／又は多重検出するために、同重体レポーターシグナルペプチドのセット又は同重体レポーターシグナル融合体のセットを用いることができる。同一の遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系若しくは生物体（又は同一のタイプの遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系若しくは生物体）を同重体レポーターシグナル融合体のセットか又は同重体レポーターシグナルペプチドを含むレポーターシグナル融合体のセットで（例えば、種々のサンプル中にある同一の遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系又は生物体を「標識化」することによって）標識化する場合、生ずるレポーターシグナル融合体のセット又はレポーターシグナルペプチドのセットも同重体となるだろう。レポーターシグナルペプチドの断片化によって、レポーターシグナルペプチドのセットが、個々に検出可能な、特徴のある種々の質量を持つレポーターシグナル融合体断片及びレポーターシグナルペプチド断片に分割されることとなるだろう。
【０２２２】
レポーターシグナル融合体を適切なあらゆる方法で発現させることができる。例えば、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸配列及び核酸セグメントをインビトロで、細胞内で及び／又は生物体中の細胞内で発現させることができる。核酸配列及びタンパク質の発現のための数多くの技術及びシステムが知られており、開示されたレポーターシグナル融合体を用いてそれらを実施することができる。例えば、数多くの発現配列、ベクター系、形質転換技術及びトランスフェクション技術並びにトランスジェニック生物産生方法が知られており、そして開示されたレポーターシグナルペプチドの方法及び組成物を用いてそれらを実施することができる。核酸構築物を細胞の染色体及び生物体に組み込む系は公知であり、（例えば、グロースら、（２０００）、ファージのインテグラーゼはヒト細胞における能率的な部位特異的組み込みを導く。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７： ５９９５−６０００、ホン（Ｈｏｎｇ）ら、（２００１）、哺乳類細胞中の大型遺伝子の組み換えに基づくクローニングと統制された発現のための、二つの細菌の人工染色体シャトルベクターの開発。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９１： １４２−１４８などを参照すること）開示された核酸分子及びレポーターシグナル融合体をコード化しているセグメントと共に、又はレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントを形成させるためにその系を用いることができる。
【０２２３】
本明細書で用いられるように、発現サンプルは、一つの核酸分子から発現した一つ以上のレポーターシグナル融合体を含むサンプルか又は含むかもしれないサンプルである。分析される発現サンプルを分画又は分離に付してもよく、それによりサンプルの複雑さを緩和する。断片化と分画とを、同一の測定において一緒に行うこともできる。このような断片化と分画とによって、発現の分析を単純化することや、拡張することができる。
【０２２４】
一組の核酸分子によってコード化されているレポーターシグナル融合体中のレポーターシグナルペプチドが、一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸分子を使用することができる。同様に、一組の核酸分子によってコード化されているアミノ酸セグメント中のレポーターシグナルペプチドが、一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、アミノ酸セグメントをコード化している核酸分子を使用することができる。一組の核酸分子によってコード化されているアミノ酸セグメントが、一つ以上の共通する特性、すなわちアミノ酸セグメントをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、アミノ酸セグメントをコード化している核酸分子を使用することができる。
【０２２５】
一組の核酸セグメントによってコード化されているレポーターシグナル融合体中のレポーターシグナルペプチドが、一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメント（一般的には核酸分子の一部）を使用することができる。同様に、一組の核酸分子によってコード化されているアミノ酸セグメント中のレポーターシグナルペプチドが一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、アミノ酸セグメントをコード化している核酸セグメントを使用することができる。一組の核酸分子によってコード化されているアミノ酸セグメントが一つ以上の共通する特性、すなわちアミノ酸セグメントをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、アミノ酸セグメントをコード化している核酸セグメントを使用することができる。対象となっている核酸分子、核酸セグメント、アミノ酸セグメント、レポーターシグナルペプチド及びタンパク質のセットを構成する個々のもの間の他の関係が検討されている。
【０２２６】
レポーターシグナル融合体により、対象となっている特定のタンパク質及びペプチドの発現の及び／又は対象となっているタンパク質及びペプチドをコード化している遺伝子、ベクター及び発現構築物の鋭敏かつ多重的な検出が可能となる。さらに、開示された方法及び組成物の他の態様のためのレポーターシグナルの起源としての目的を含むあらゆる目的のために、開示されたレポーターシグナル融合体を使用することもできる。
【０２２７】
Ｈ．レポーターシグナル／検体複合体
検体と会合しているか、検体に組み込まているか又は他のやり方で検体と連結しているレポーターシグナルの組成物をレポーターシグナル／検体複合体と称する。このような複合体には、核酸配列とハイブリッド形成したレポーターシグナルプローブなどの、検体と会合したレポーターシグナル、結合基を介してタンパク質に連結したレポーターシグナルなどの、検体と共有結合したレポーターシグナル、及び対象となっているタンパク質とペプチドレポーターシグナルとの融合体などの、検体に組み込まれたレポーターシグナルが含まれる。
【０２２８】
一般的に複合体のレポーターシグナル部分の改変を介してレポーターシグナル／検体複合体を改変することができ、それによって種々のレポーターシグナルの改変体、レポーターシグナル／検体複合体の改変体又はその両者を、他のそれぞれの改変体から識別できることとなる。レポーターシグナル又はレポーターシグナル／検体複合体が断片化によって改変された場合、いずれか一つの、いくらかの又はすべての断片を他のそれぞれの断片から、その態様に依存して識別することができる。例えば、レポーターシグナル／検体複合体が（レポーターシグナル部分に開裂点を伴う）二つの部分に断片化した場合、レポーターシグナル断片、レポーターシグナル／検体断片又はその両者のいずれか一つの識別が可能となる。
【０２２９】
セットの中に存在する２以上のレポーターシグナル／検体複合体が一つ以上の共通する特性、すなわち、共通する特性を有するレポーターシグナル／検体複合体を、共通する特性を欠く他の分子から識別すること及び／又は分離することを可能にする特性を有する場合に、レポーターシグナル／検体複合体のセットを使用することができる。さらに他の態様において、（複合化の前又は後で）検体の断片化が可能であり、それによりレポーターシグナル／検体断片複合体（これは断片複合体と称することがある）が得られる。これらのケースにおいては、セットの中に存在する２以上の断片複合体が一つ以上の共通する特性、すなわち、共通する特性を有する断片複合体を、共通する特性を欠く他の分子から識別すること及び／又は分離することを可能にする特性を有する場合に、断片複合体のセットを使用することができる。断片化した検体であっても、それ自体が独立した検体と考えることができることを理解すべきである。この考え方に立てば、断片化検体に言及することは、ある特定の態様を記述する際に好都合かつ明瞭であり、ベースとなる検体と断片化検体の両方に言及することを可能とする。
【０２３０】
レポーターシグナル／検体複合体のセット又はレポーターシグナル／検体断片複合体（断片複合体）のセットは、あらゆる数のレポーターシグナル／検体複合体又はレポーターシグナル／検体断片複合体を持つことができる。例えば、レポーターシグナル／検体複合体のセット又はレポーターシグナル／検体断片複合体のセットは、１、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上、１００以上、２００以上、３００以上、４００以上又は５００以上の種々のレポーターシグナル／検体複合体又はレポーターシグナル／検体断片複合体を含むことができる。たとえレポーターシグナル／検体複合体及びレポーターシグナル／検体断片複合体の特定の数を、並びにレポーターシグナル／検体複合体及びレポーターシグナル／検体断片複合体の数の範囲の特定の終点を列挙したとしても、レポーターシグナル／検体複合体及びレポーターシグナル／検体断片複合体のそれぞれの特定の数が、並びにレポーターシグナル／検体複合体及びレポーターシグナル／検体断片複合体の数の範囲のそれぞれの特定の終点が具体的に検討され、たとえ目録が明示されていなくても、レポーターシグナル／検体複合体及びレポーターシグナル／検体断片複合体のそれぞれの特定の数が、並びにレポーターシグナル／検体複合体及びレポーターシグナル／検体断片複合体の数の範囲のそれぞれの特定の終点が本明細書に具体的に記載されている。
【０２３１】
上記のように、複合体となっている間及び識別の間に、検体と複合化したレポーターシグナルを改変することができる。改変を行う前に、複合化した検体から複合化レポーターシグナルを全体的に又は部分的に解離又は分離することもできる。レポーターシグナルが検体から（全体的に又は部分的に）解離する場合には、検体とレポーターシグナルとの間の会合という事実が、レポーターシグナルが検出された時に得られる情報の一部分となるように、この方法を実施することができる。言い換えれば、検出のために検体からレポーターシグナルが解離してもよいという事実は、検出されたレポーターシグナルが検体と会合しているという情報を不明確にはしないということである。
【０２３２】
本明細書で用いられるように、レポーターシグナル複合体とは、レポーターシグナル／検体複合体及びレポーター分子などの開示された方法の他の成分の両方を意味する。
【０２３３】
一般的にレポーターシグナルと同様、セット内のレポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体が一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体をその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性、を持つことができるというセットとして、レポーターシグナル／検体複合体及びレポーターシグナル／検体断片複合体を用いることができる。レポーターシグナルと同様、一般的に、共通する特性を欠く他の分子からレポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体を分離するために用いる、共通する物理的特性としては、様々な異なる特性を使用することができる。例えば、共通する特性として有用な物理的特性としては、質量電荷比、質量、電荷、等電点、疎水性、クロマトグラフィー特性及び密度が挙げられる。セット中のレポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体によって共有され（そして他の分子からレポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体を識別及び／又は分離するために用いられ）る物理的特性は、（例えば、ビオチンなどのアフィニティータグなどの）単に存在している特徴又は部分よりも、（例えば、全体の質量、全体の電荷、等電点、全体の疎水性などの）レポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体全体の特性のほうがより好ましい。本明細書では、このような特性を「全体の」特性と称している（そしてそれゆえに、セット中のレポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体は「共通する全体の特性」を共有しているとみなされることになる）。レポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体はアフィニティータグなどの特徴又は部分を有していてもよいこと、及びこのような特徴又は部分は（例えば、質量として貢献することにより）共通する全体の特性を構成する一員となり得ることを理解すべきである。しかしながら、このように限定的であり孤立している特徴又は部分が、共通する全体の特性の唯一の基礎としての役割を有するわけではない。
【０２３４】
レポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体の共通する特性はアフィニティータグでないことが好ましい。それにもかかわらず、そのようなケースでさえ、別な方法で共通する特性を有するレポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体はアフィニティータグを含んでいてもよい−そして実際のところ、そのすべてが同一のアフィニティータグを共有していてもよい−その共通する特性を欠く他の分子からその共通する特性を共有するレポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体を分離するのに使用可能である（そして開示された方法のいくつかの態様においては使用する）別の共通する特性が存在する限り。このことに留意すれば、クロマトグラフィー又は他の分離技術を使用して、共通する特性に基づいてレポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体を分離すると、親和性はレポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体の全体の物理的特性に基づくものとなり、例えば、アフィニティータグなどの特徴又は部分の存在に基づくのではないことが好ましい。本明細書で用いられるように、共通する特性とは、（例えば、レポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体などの）成分のセットによって共有されている特性である。すなわち、この成分は 「共通する」特性を有している。セット中のレポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体は非常に多数の共通する特性を有していてもよいことを理解すべきである。しかしながら、本明細書で用いられるように、レポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体の共通する特性と言われるものは、開示された方法において用いられる、その共通する特性を共有するレポーターシグナル／検体複合体又は断片複合体をその共通する特性を欠く分子から識別すること及び／又は分離することという特性だけである。
【０２３５】
Ｉ．キャプチャーアレイ
キャプチャーアレイ（ｃａｐｔｕｒｅ ａｒｒａｙ）（本明細書ではアレイとも称する）には、固体担体上に、好ましくは固体担体上の特定された位置又は予め定められた位置に固定化された複数のキャプチャータグが含まれる。この文脈において、複数のキャプチャータグとは、それぞれが異なる構造を有する複数のキャプチャータグを意味する。アレイ上のそれぞれの予め定められた位置（本明細書ではアレイエレメントと称する）に一つのタイプのキャプチャータグ（すなわち、この位置にあるすべてのキャプチャータグは同じ構造を有する）があることが好ましい。それぞれの位置には、キャプチャータグの複数のコピーがあることになる。アレイにおいて、種々の構造のキャプチャータグを空間的に分離することにより、キャプチャータグと会合することになる検体を別個に検出し同定することがが可能となる。デコーディングタグがキャプチャーアレイのある特定の位置に検出されることは、アレイエレメントに対応する検体が標的サンプル中に存在することを示す。
【０２３６】
キャプチャーアレイにて使用するための固体担体には、キャプチャータグと直接的に又は間接的に結合し得るあらゆる固形物が含まれる。これには、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリル酸塩、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ガラス、ポリケイ酸塩、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマル酸塩、コラーゲン、グリコサミノグリカン及びポリアミノ酸のような材料が含まれる。固体担体は、薄膜又は膜、ビーズ、瓶、ディッシュ、ディスク、コンパクトディスク、繊維、光ファイバー、織った繊維、成型ポリマー、粒子及び微粒子を含むあらゆる有用な形態をとることができる。好ましい固体担体の形態はコンパクトディスクである。
【０２３７】
たとえ好ましいものであっても、ある特定のキャプチャーアレイが単一の単位又は構造である必要はない。キャプチャータグのセットを任意の数の固体の支持体のすべてに分配しても構わない。例えば、一つの極端な例として、それぞれのキャプチャータグを別個の反応管又は反応容器に固定化しても構わない。上記のもののような多種多様の支持体組成物から成る、非浸透性の支持体上又は浸透性の支持体上にアレイを構築しても構わない。アレイのスポットの大きさや密集したスポットの濃度は、１つ（又は複数）の処理及び１つ（又は複数）の用いた材料に依存して極めて広い範囲にわたって変化する。
【０２３８】
抗体及び他のタンパク質を担体に固定化する方法は十分に確立されている。結合によって固定化を達成することができ、標準的な固定化化学反応を用いて、例えば、表面をアミノ化したり、カルボキシル化したり、又はヒドロキシル化する。結合剤の例としては、臭化シアン、スクシンイミド、アルデヒド、トシルクロリド、アビジン−ビオチン、光架橋化剤、エポキシド及びマレイミドがある。好ましい結合剤はグルタルアルデヒドである。これらの及びその他の結合剤、並びに結合の際のそれらの使用方法は、タンパク質の固定化：基本と応用、リチャード・エフ・テイラー（Ｒｉｃｈａｒｄ Ｆ． Ｔａｙｌｏｒ）編（エム・デッカー（Ｍ． Ｄｅｋｋｅｒ）社、ニューヨーク、１９９１）、ジョンストン及びソープ、免疫化学の実際（ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ社、オックスフォード、イギリス、１９８７）、２０９−２１６頁及び２４１−２４２頁、及び固定化アフィニティーリガンド、クレイグ・ティー・ヘルマンソン（Ｃｒａｉｇ Ｔ． Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）ら編（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）社、ニューヨーク、１９９２）に記載されている。抗体上の遊離アミノ基を担体中にある反応性側鎖と化学的に架橋結合させることにより、抗体を担体に結合することができる。例えば、グルタルアルデヒド又はカルボジイミドを架橋剤として用いることにより、抗体を、遊離アミノ基又は遊離カルボキシル基を含む担体に化学的に架橋結合させてもよい。この方法において、グルタルアルデヒド又はカルボジイミドの存在下で、遊離の抗体を含む水溶液を固体担体と共にインキュベートする。グルタルアルデヒドで架橋結合を行うためには、例えば０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム、ｐＨ７．４の緩衝液中で、２容量％のグルタルアルデヒドと一緒に反応物をインキュベートすればよい。他の標準的な固定化化学反応を、当業者は知っている。
【０２３９】
オリゴヌクレオチドを固体担体に固定化する方法は十分に確立している。確立している結合方法を用いて、オリゴヌクレオチドキャプチャータグを担体に結合させることができる。例えば、適切な結合方法が、ピース（Ｐｅａｓｅ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１ （１１）： ５０２２−５０２６ （１９９４）、フラプコ（Ｋｈｒａｐｋｏ）ら、 Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ （Ｍｏｓｋ） （ＵＳＳＲ） ２５： ７１８−７３０ （１９９１）、フォドー（Ｆｏｄｏｒ）らの米国特許第５，８７１，９２８号、ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）の米国特許第５，６５４，４１３号、ピースらの米国特許第５，４２９，８０７号及び米国特許第５，５９９，６９５号に記載されている。３’−アミンオリゴヌクレオチドのカゼイン被覆スライドガラス上への固定化方法がスティムソン（Ｓｔｉｍｐｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２： ６３７９−６３８３ （１９９５）に記載されている。オリゴヌクレオチドの固体担体への好ましい結合方法は、グオ（Ｇｕｏ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２２： ５４５６−５４６５ （１９９４）に記載されている。
【０２４０】
長年にわたって平面アレイ技術が利用されてきた（シャロン，ディー、エス・ジェイ・スミス及びピー・オー・ブラウン（Ｓｈａｌｏｎ， Ｄ．， Ｓ． Ｊ． Ｓｍｉｔｈ， ａｎｄ Ｐ． Ｏ． Ｂｒｏｗｎ）、二色蛍光プローブハイブリダイゼーションを用いての、複雑なＤＮＡサンプルの分析のためのＤＮＡマイクロアレイシステム、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ， １９９６．６ （７）： ｐ． ６３９−４５、シン−ガッソン，エス（Ｓｉｎｇｈ−Ｇａｓｓｏｎ， Ｓ．）ら、デジタルマイクロミラーアレイを用いての、マスク不要の光指向性オリゴヌクレオチドマイクロアレイの組み立て、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １９９９．１７ （１０）： ｐ． ９７４−８、サザン，イー・エム、ユー・マスコス及びジェイ・ケイ・エルダー（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｅ． Ｍ．， Ｕ． Ｍａｓｋｏｓ， ａｎｄ Ｊ． Ｋ． Ｅｌｄｅｒ）、オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリッド形成による核酸配列の分析と比較：実験モデルを用いての評価、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， １９９２．１３ （４）： ｐ． １００８−１７、ニチェック，ディー（Ｎｉｚｅｔｉｃ， Ｄ．）ら、ヒト染色体Ｘ及び２１の巨大挿入ライブラリーの構築、アレイ形成及び高密度スクリーニング：参照ライブラリーとしてのそれらの潜在的な使用、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９９１．８８ （８）： ｐ． ３２３３−７、ファンオス，シー・ジェイ、アール・ジェイ・グッド及びエム・ケイ・チャウダリー（Ｖａｎ Ｏｓｓ， Ｃ． Ｊ．， Ｒ． Ｊ． Ｇｏｏｄ， ａｎｄ Ｍ． Ｋ． Ｃｈａｕｄｈｕｒｙ）、ニトロセルロース及び他の膜上での、ＤＮＡ（サザン）ブロッティング及びタンパク質（ウエスタン）ブロッティングのメカニズム、Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ， １９８７．３９１ （１）： ｐ． ５３−６５、ラムゼー，ジー（Ｒａｍｓａｙ， Ｇ．）、ＤＮＡチップ：最新技術、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １９９８．１６ （１）： ｐ． ４０−４、シェナ，エム （Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ．）ら、ヒトゲノムのパラレル分析：マイクロアレイに基づく１０００遺伝子の発現の監視、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９９６．９３ （２０）： ｐ． １０６１４−９、ライプシュッツ，アール・ジェイ（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ， Ｒ． Ｊ．）ら、高密度合成オリゴヌクレオチドアレイ、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ， １９９９．２１ （１ 補遺１）： ｐ． ２０−４、ピース，エイ・シーら、迅速ＤＮＡ配列解析のための光創製オリゴヌクレオチドアレイ、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９９４．９１ （１１）： ｐ． ５０２２−６、メイヤー、イー（Ｍａｉｅｒ， Ｅ．）ら、オリゴヌクレオチドハイブリッド形成による配列のフィンガープリント分析を自動化するためのロボット利用技術の応用、Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， １９９４．３５ （２−３）： ｐ． １９１−２０３、バジリスコフ、エイ・ブイ （Ｖａｓｉｌｉｓｋｏｖ， Ａ． Ｖ．）ら、共重合反応によりチップ上にゲルで固定化された化合物のマイクロアレイの組み立て、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １９９９．２７ （３）： ｐ． ５９２−４，５９６−８，６００の各所及びエルショフ，ジー（Ｙｅｒｓｈｏｖ， Ｇ．）ら、オリゴヌクレオチドマイクロチップ上でのＤＮＡ分析と診断���、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ， １９９６．９３ （１０）： ｐ． ４９１３−８）。
【０２４１】
アレイにおけるオリゴヌクレオチドキャプチャータグも同様のハイブリッドの安定性を持つように設計することができる。これにより、このようなキャプチャータグへの断片のハイブリダイゼーションの効率がより向上し、かつハイブリダイゼーションの不一致の発生が低下する。公知の計算式と熱力学の原理を用いて、オリゴヌクレオチドキャプチャータグのハイブリッドの安定性を計算することができる（例えば、サンタルシア（Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５： ３５５５−３５６２ （１９９６）；フレイヤー（Ｆｒｅｉｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ９３７３−９３７７ （１９８６）；ブレスラウアー（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ３７４６−３７５０ （１９８６）を参照すること）。例えば、キャプチャータグの化学的な修飾（グエン（Ｎｇｕｙｅｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５ （１５）： ３０５９−３０６５ （１９９７）；ホーシセル（Ｈｏｈｓｉｓｅｌ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２４ （３）： ４３０−４３２ （１９９６））により、オリゴヌクレオチドキャプチャータグのハイブリッドの安定性をより同様なものとすることができる（ハイブリッドの安定性の平滑化と称され得る工程）。特別な条件下（グエンら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２７ （６）： １４９２−１４９８ （１９９９）；ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２ （６）： １５８５−１５８８ （１９８５））でハイブリダイゼーションを行うことによっても、ハイブリッドの安定性を平滑化することができる。
【０２４２】
オリゴヌクレオチドキャプチャータグのハイブリッドの安定性の平滑化のための別の手段としては、キャプチャータグの長さを変えるというものがある。これにより、それぞれのキャプチャータグのハイブリッドの安定性を調整することができるため、すべてのキャプチャータグが（可能な範囲で）類似のハイブリッドの安定性を持つようになるだろう。キャプチャータグから単一のヌクレオチドを付加したり又は削除することによって、キャプチャータグのハイブリッドの安定性が一定の幅で変化するので、キャプチャーアレイ中のキャプチャータグのハイブリッドの安定性は均等ではないことが理解される。この理由のために、本明細書で用いられるハイブリッドの安定性の類似性とは、キャプチャータグのハイブリッドの安定性の類似性がいくらかでも向上すること（又は、別の表現をすれば、キャプチャータグのハイブリッドの安定性の相違がいくらかでも減少すること）を意味する。
【０２４３】
オリゴヌクレオチドキャプチャータグのサンプル断片へのハイブリダイゼーション及びライゲーションの効率性も、種々のハイブリダイゼーション条件に付すことができるキャプチャーアレイのセクション又はセグメントにおいて、類似のハイブリッドの安定性を持つキャプチャータグを集めることによって改善することができる。このようにして、特定のクラスのキャプチャータグについてのハイブリダイゼーション条件を最適化することができる。
【０２４４】
Ｊ．キャプチャータグ
キャプチャータグは、キャプチャータグを有する化合物又は複合体を捕らえる又は分離するのに用いることのできる任意の化合物である。好ましいキャプチャータグは、特定の分子又はその一部と特異的に相互作用する化合物である。キャプチャータグと特異的に相互作用する、好ましい分子又はその一部は検体である。検体という用語は個々の分子及びそのような分子の一部の両方を意味し、例えば、タンパク質のエピトープであり、それはキャプチャータグと特異的に相互作用する、ということが理解される。特異的な結合親和性を有する抗体、レセプター／リガンドペアを構成する個々のもののいずれか一方、合成ポリアミド（ダーバン及びブルリ、ポリアミドによる配列特異的ＤＮＡ認識。Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ， ３ （６）： ６８８−９３ （１９９９）、ウェマー及びダーバン、マイナーグルーブＤＮＡのターゲティング。Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ， ７ （３）： ３５５−６１ （１９９７））、核酸プローブ及び他の分子はキャプチャータグの例である。
【０２４５】
特定の検体と特異的に相互作用するキャプチャータグは、その検体について特異的であると言われている。例えば、キャプチャータグが特定の抗原と会合する抗体の場合、そのキャプチャータグはその抗原について特異的であると言われる．抗原は検体である。キャプチャータグとしては、抗体、リガンド、結合タンパク質、レセプタータンパク質、ハプテン、アプタマー、炭水化物、合成ポリアミド、ペプチド核酸又はオリゴヌクレオチドが好ましい。好ましい結合タンパク質はＤＮＡ結合タンパク質である。好ましいＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガーモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、ヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフである。これらのモチーフを同一のキャプチャータグ内で組み合わせてもよい。
【０２４６】
レポーター結合剤の親和性部分として有用な抗体を市販品として入手することができ、又は十分に確立された方法で生産することができる。例えば、ジョンストン及びソープ、免疫化学の実際（ブラックウェル・サイエンティフィック・パブリケーションズ社、オックスフォード、イギリス、１９８７）の３０−８５ページに、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を生産するための有用で一般的な方法が記載されている。この本の全体には、測定系における抗体の使用のための多くの一般的な技術及び原理が記載されている。
【０２４７】
ジンクフィンガー、ジンクフィンガーモチーフ及びそれらの相互作用の特性は、ナルデリらによるジンクフィンガー−ＤＮＡの認識：部位特異的突然変異誘発による基本的な特異性の分析、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２０ （１６）： ４１３７−４４ （１９９２）、ジェーミソンらによる改変されたＤＮＡ−結合特異性を伴うジンクフィンガーのインビトロ選択、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３３ （１９）： ５６８９−９５ （１９９４）、チャンドラセガーラン及びスミスによるキメラ制限酵素：次は何か？Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ３８０ （７−８）： ８４１−８ （１９９９）及びスミスらによるキメラ制限酵素の基質特異性に関する詳細な研究、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２７ （２）： ６７４−８１ （１９９９）に記載されている。
【０２４８】
キャプチャータグの一つの態様は、オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド誘導体である。このようなキャプチャータグは、特定の核酸配列を検出するために設計され、使用される。それゆえに、オリゴヌクレオチドキャプチャータグのための検体は核酸配列である。検体は大きな核酸分子の中のヌクレオチド配列であってもよい。オリゴヌクレオチドキャプチャータグの長さは、キャプチャータグと検体との間の特異的かつ安定したハイブリダイゼーションに対応する長さであれば、どのような長さでもよい。この目的のために、１０〜４０ヌクレオチドの長さのものが好ましく、オリゴヌクレオチドキャプチャータグを伴う１６〜２５ヌクレオチドの長さのものが最も好ましい。オリゴヌクレオチドキャプチャータグとしてはペプチド核酸が好ましい。ペプチド核酸はＤＮＡと安定したハイブリッドを形成する。これにより、次に続く増幅操作及び検出操作の間を通してペプチド核酸キャプチャータグが標的配列に強固に結合し続けることが可能となる。
【０２４９】
ガスパロら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２ （１４）： ２８４５−２８５２ （１９９４）に記載の三重らせん体化学結合技術を利用することにより、オリゴヌクレオチドキャプチャータグを用いてこのような有用な効果を得ることもできる。簡単に言えば、標的配列とハイブリッド形成した場合に三重らせん体を形成するようにオリゴヌクレオチドキャプチャータグを設計する。このことは一般的に知られている通りにして達成するが、主にホモプリン標的配列又は主にホモピリミジン標的配列のいずれか一方を選択することにより達成することが好ましい。キャプチャータグを構成する、適合したオリゴヌクレオチド配列は、選択された標的配列に対して相補的となり、そしてそれゆえに、それぞれ主にホモピリミジン又は主にホモプリンとなる。（ガスパロらによって記載された三重らせん体プローブに対応する）キャプチャータグは化学的に連結しているソラレン誘導体を含む。キャプチャータグの標的配列へのハイブリッド形成の際に、三重らせん体が形成される。三重らせん体を低波長紫外線放射に暴露することにより、ソラレン誘導体がプローブの標的配列への架橋結合を媒介する．
【０２５０】
Ｋ．サンプルアレイ
サンプルアレイには、固体担体上に、好ましくは固体担体上の特定された位置又は予め定められた位置に固定化された複数のサンプル（例えば、発現サンプル、組織サンプル、タンパク質サンプル）が含まれる。サンプルアレイ上のそれぞれの予め定められた位置（本明細書ではサンプルアレイエレメントと称する）に一つのタイプのサンプルがあることが好ましい。サンプルアレイにおいて、種々のサンプルを空間的に分離することにより、サンプルと会合することになるレポーターシグナル（又はレポーター分子若しくはコーディングタグ）を別個に検出し同定することが可能となる。レポーターシグナルがサンプルアレイのある特定の位置に検出されることは、そのレポーターシグナルに対応する検体が、そのサンプルアレイエレメントに対応するサンプル中に存在することを示す。
【０２５１】
サンプルアレイにて使用するための固体担体には、サンプルに直接的に又は間接的に結合できるあらゆる固形物が含まれる。これには、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリル酸塩、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ガラス、ポリケイ酸塩、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマル酸塩、コラーゲン、グリコサミノグリカン及びポリアミノ酸のような材料が含まれる。固体担体は、薄膜又は膜、ビーズ、瓶、ディッシュ、ディスク、コンパクトディスク、繊維、光ファイバー、織った繊維、成型ポリマー、粒子及び微粒子を含むあらゆる有用な形態をとることができる。好ましい固体担体の形態はコンパクトディスクである。
【０２５２】
たとえ好ましいものであっても、ある特定のサンプルアレイが単一の単位又は構造である必要はない。サンプルのセットを任意の数の固体の支持体のすべてに分配しても構わない。例えば、一つの極端な例として、それぞれのサンプルを別個の反応管又は反応容器に固定化しても構わない。上記のもののような多種多様の支持体組成物から成る、非浸透性の支持体上又は浸透性の支持体上にサンプルアレイを構築しても構わない。アレイのスポットの大きさや密集したスポットの濃度は、１つ（又は複数）の処理及び１つ（又は複数）の用いた材料に依存して極めて広い範囲にわたって変化する。サンプル及びサンプル成分を担体に結合させる方法又は固定する方法は十分に確立している。
【０２５３】
サンプルアレイの好ましい態様は組織アレイであり、ここでは小さい組織サンプルが担体上にある。このような組織マイクロアレイが存在し、そして例えば、一群として乳ガンの群の研究などに用いられる。例えば、複数のサンプルにおける複数の検体を精査するために開示された方法を用いることができる。例えば、種々のレポーターシグナルでサンプルアレイを標識することができ、次いで、支持体の全体を質量分析装置の源領域に導入し、ＭＡＬＤＩによって見本をとる。
【０２５４】
Ｌ．デコーディングタグ
デコーディングタグは、コーディングタグと直接的に又は間接的に会合することができる、あらゆる分子又はその一部である。デコーディングタグが（レポーター分子を構成する）レポーターシグナルと会合することで、レポーターシグナルが検体と間接的に会合することが可能になる。デコーディングタグとしては、オリゴヌクレオチド、炭水化物、合成ポリアミド、ペプチド核酸、抗体、リガンド、タンパク質、ハプテン、ジンクフィンガー、アプタマー又は質量標識が好ましい。
【０２５５】
好ましいデコーディングタグは、オリゴヌクレオチドコーディングタグと特異的にハイブリッド形成することができる分子である。最も好ましいものは、ペプチド核酸デコーディングタグである。オリゴヌクレオチド又はペプチド核酸デコーディングタグはどのような任意配列でもよい。唯一の必要条件は、コーディングタグとハイブリッド形成することである。デコーディングタグの長さは、コーディングタグとデコーディングタグとの間の特異的かつ安定したハイブリダイゼーションに対応する長さであれば、どのような長さでもよい。この目的のために、１０〜３５ヌクレオチドの長さのものが好ましく、デコーディングタグを伴う１５〜２０ヌクレオチドの長さのものが最も好ましい。
【０２５６】
デコーディングタグを含むレポーター分子としては、飛行時間（ＴＯＦ）質量分析法又は他の検出技術によって分離及び同定を行うために、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）によって遊離できるものが好ましい。デコーディングタグは、コーディングタグとハイブリッド形成が可能な任意のオリゴマー分子で構わない。例えば、デコーディングタグはＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸（ＰＮＡ）分子であることができる。好ましいデコーディングタグはＰＮＡ分子である。
【０２５７】
Ｍ．コーディングタグ
コーディングタグはデコーディングタグが会合できる分子又はその一部である。コーディングタグは、デコーディングタグ会合のための標的として機能できるあらゆるタイプの分子又はその一部であり得る。好ましいコーディングタグは、オリゴマー、オリゴヌクレオチド又は核酸配列である。コーディングタグは、ストレプトアビジン又はビオチンのような結合ペアを構成する個々のものでもあり得、ここで、その同起源のデコーディングタグはその結合ペアを構成する他のものである。いくつかのタイプのレポーターシグナルと直接会合するようにコーディングタグを設計することもできる。例えば、（ペプチド核酸から成るレポーターシグナルである）ペプチド核酸レポーターシグナルと直接相互作用するように、オリゴヌクレオチドコーディングタグを設計することができる。
【０２５８】
オリゴマーコーディングタグのオリゴマー塩基配列には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾されたＲＮＡ又はＤＮＡ、ペプチド核酸のような修飾されたバックボーンヌクレオチド様オリゴマー、メチルホスホネートＤＮＡ及び２’−Ｏ−メチルＲＮＡ又はＤＮＡを含むことができる。オリゴマー又はオリゴヌクレオチドコーディングタグはどのような任意配列でもよい。唯一の必要条件はデコーディングタグと（好ましくはハイブリダイゼーションによって）会合することである。開示された方法において、複数のコーディングタグが単一の検体と会合できるようになる。これらの複数のコーディングタグの状況は、シグナル増幅のために用いる技術に依存する。それゆえに、分枝ＤＮＡが用いられる場合、この分枝ＤＮＡ分子はその分枝部分に複数のコーディングタグを含む。オリゴヌクレオチドデンドリマーを用いる場合、コーディングタグはデンドリマーの腕の部分に存在する。ローリングサークル型複製を用いる場合、複数のコーディングタグは、増幅の標的である（コーディングタグ配列の少なくとも一つの相補鎖を含む）環状配列の相補鎖のタンデム反復から生じる。このケースにおいて、コーディングタグは直列型配列ＤＮＡ中でタンデムに反復している。
【０２５９】
オリゴヌクレオチドコーディングタグの長さは、コーディングタグとデコーディングタグとの間の特異的かつ安定したハイブリダイゼーションに対応する長さであれば、どのような長さでもよい。この目的のために、１０〜３５ヌクレオチドの長さのものが好ましく、コーディングタグを伴う１５〜２０ヌクレオチドの長さのものが最も好ましい。
【０２６０】
開示された方法にて使用する分枝ＤＮＡは一般に知られている（ウルデア（Ｕｒｄｅａ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２： ９２６−９２８ （１９９４）、及びホーン（Ｈｏｒｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３： ４８３５−４８４１ （１９９７））。本明細書で用いられるように、分枝ＤＮＡ分子の尾部は、分枝ＤＮＡ分子の、検体と相互作用するように設計された部分を指す。尾部は特異的結合分子である。一般的に、それぞれの分枝ＤＮＡ分子はただ一つの尾部を持っているはずである。分枝ＤＮＡの枝状部（本明細書では分枝ＤＮＡの腕の部分とも称する）にコーディングタグ配列が含まれている。オリゴヌクレオチドデンドリマー（すなわち樹状ＤＮＡ）も一般に知られている（シェピノフ（Ｓｈｃｈｅｐｉｎｏｖ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ４４４７−４４５４ （１９９７）、及びオーレンタス（Ｏｒｅｎｔａｓ）ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ７７： １５３−１６３ （１９９９））。本明細書で用いられるように、オリゴヌクレオチドデンドリマーの尾部は、デンドリマーの、検体と相互作用するように設計された部分を指す。一般的に、それぞれのデンドリマーはただ一つの尾部を持っているはずである。本明細書では、デンドリマーの樹状鎖をオリゴヌクレオチドデンドリマーの腕の部分とも称し、ここにはコーディングタグ配列が含まれている。
【０２６１】
コーディングタグを検体又は他の標識化分子に（直接的に又はリンカー若しくはスペーサーを介して）結合させることができる。コーディングタグを検体及び他の標識化分子と会合させることもできる。この目的のためには、コーディング分子が好ましい。コーディング分子は、検体及びデコーディングタグと相互作用できる分子である。コーディング分子には、特異的結合分子及びコーディングタグが含まれる。 特異的結合分子は上記の通りである。
【０２６２】
Ｎ．レポーターキャリアとコーディングキャリア
レポーターキャリアは、一つ以上の特異的結合分子、キャリア及び複数のレポーターシグナルの会合体である。開示された方法において、多数のレポーターシグナルを検体と会合させるためにレポーターキャリアを用いる。コーディングキャリアは、一つ以上の特異的結合分子、キャリア及び複数のコーディングタグの会合体である。開示された方法において、多数のコーディングタグを検体と会合させるためにコーディングキャリアを用いる。キャリアは、多数のレポーターシグナルの特異的結合分子との会合を促進する任意の分子又は構造であり得る。具体例としては、リポソーム、微粒子、ナノ粒子、ビリオン、ファージミド及び分枝ポリマー構造体が挙げられる。キャリアの一般的な部類は、ドラッグデリバリーのために設計された構造体及び材料である。多数のこのようなキャリアが知られている。リポソームが好ましいキャリアの態様である。
【０２６３】
リポソームは、主にリン脂質二重層から成る人工な構造体である。コレステロール及び脂肪酸を二重層構築物に含めても構わない。開示された方法のいくつかの態様において、リポソームは、任意のレポーターシグナル又はコーディングタグのためのキャリアとして機能する。リポソームレポーターキャリアと、任意のシグナル又はタグの添加と、極めて多数のシグナル及びタグを分離することができる方法を組み合わせることによって、高度に多重化された測定を実施することが可能である。
【０２６４】
リポソーム、好ましくは単層のベシクルを、確立された、極めて多数の（数千の）レポーターシグナル又はコーディングタグ分子が内部区画に封入される結果をもたらす手段を用いて作成し、ここで、これらの分子の化学的性質は予め選択された検出法による検出に十分に適合したものである。それぞれの特定のタイプのリポソームキャリアについて、一つの特定のタイプのレポーターシグナル又はコーディングタグを用いることが好ましい。
【０２６５】
それぞれの特定のタイプのリポソームレポーター又はコーディングキャリアは、特異的結合分子と会合する。この会合は直接的なものでもよく、間接的なものでも構わない。直接的な会合の一つの例は、リン脂質二重層の表面上に共有結合した抗体を含むリポソームである。あるいは、間接的な会合体組成物は、その表面に任意な配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドが共有結合しているリポソームである。これらのオリゴヌクレオチドは、塩基の相補性によって特異的なレポーター分子を認識するように設計されている。レポーター分子は抗体−ＤＮＡ共有結合性複合体を含んでもよく、それにより、この複合体のＤＮＡ部分が、リポソームレポーターキャリア上の相補的配列と特異的にハイブリッド形成することができる。このやり方において、リポソームレポーターキャリアは一般的な試薬となり、これは望のあらゆる結合分子と間接的に会合するだろう。
【０２６６】
リポソームレポーターキャリアの使用については、以下の実施例で説明することができる。
【０２６７】
１．押出し法を用いてリポソーム（平均直径が１５０〜３００ナノメートルの単層のベシクルが好ましい）を調製する（ホープ（Ｈｏｐｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， ８１２： ５５−６５ （１９８５）；マクドナルド（ＭａｃＤｏｎａｌｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １０６１： ２９７−３０３ （１９９１））。なお、リポソームの調製のための他の方法を用いても構わない。
【０２６８】
２．４００マイクロモーラーの濃度のオリゴペプチド溶液をリポソームの調製の際に用い、リポソームの内部にこの特異的なオリゴペプチドを封入する。これは、対象となっている特定の検体を同定するのに役立つだろう。内径が２００ナノメートルのリポソームは、平均して９６０分子のオリゴペプチドを含むこととなる。三つの別個のリポソーム調製物を押出し、それぞれに種々のオリゴペプチドを封入する。同一の質量電荷比を持っているが、開裂すると種々の質量電荷比の断片となるようなオリゴペプチドを選択することで、質量分析にて容易に分離されることとなる。
【０２６９】
３．三つのリポソーム調製物の外側の表面に特異的抗体を次のようにして結合する：ａ）第一のリポソーム調製物をｐ５３腫瘍サプレッサーに特異的な抗体と反応させる；ｂ）二番目のリポソーム調製物をＢｃｌ−２腫瘍性タンパク質に特異的な抗体と反応させる；ｃ）三番目のリポソーム調製物をＨｅｒ２／ｎｅｕ膜レセプターに特異的な抗体と反応させる。反応性アミノ基を提供する分子に抗体を共有結合させるための標準的な手段を用いてカップリング反応を実施する（ヘンドリクソンら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２３： ５２２−５２９ （１９９５）；ヘルマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ． ５２８−５６９ （１９９６）；シェッフォルド（Ｓｃｈｅｆｆｏｌｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １： １０７−１１０ （２０００））。リポソームのケースにおいて、反応性アミノ基はリポソームのホスファチジルエタノールアミン部分に存在する。
【０２７０】
４．リポソームを、固定化組織中に存在する対応するタンパク質抗原と会合させるために、標準的なホルマリン固定化組織切片を有するスライドガラスに、３０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ７．６、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のウシ血清アルブミンを含む緩衝液で懸濁させた三つのすべてのリポソーム調製物の混合物を接触させる。１時間のインキュベートの後、このスライドガラスを同一の緩衝液（３０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ７．６、１００ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％のウシ血清アルブミン）で５分間で２回洗浄する。このスライドガラスを空気流通下で乾燥させる。
【０２７１】
５．１０ｍｇ／ｍｌのアルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、０．１％の５０：５０のトリフルオロ酢酸：アセトニトリル混合液の水溶液から成るマトリックス溶液の薄層でこのスライドガラスを被覆する。このスライドガラスを空気流通下で乾燥させる。
【０２７２】
６．ＭＡＬＤＩプレートの表面上にスライドガラスを置き、例えば、ロボダ（Ｌｏｂｏｄａ）ら、ＭＡＬＤＩ−ＱｑＴＯＦ質量分析装置の設計と性能、第４７回ＡＳＭＳ会議、ダラス、テキサス州（１９９９）、ロボダら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． １４ （１２）： １０４７−１０５７ （２０００）、シェフチェンコら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７２： ２１３２−２１４２ （２０００）、及びクルチンスキーら、Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．， １１ （６）： ４９３−５０４ （２０００）に記載されているようにして質量分析装置に導入する。
【０２７３】
７．スライドガラス表面上の規定された位置から質量スペクトルを得る。レポーターシグナルポリペプチドの三つのピークのそれぞれの相対量を用いて、リポソーム−ディテクター複合体によって検出された抗原の相対的な割合を測定する。
【０２７４】
リポソームキャリア法は組織切片上の検体の検出に限定されない。ソーティングにより得られる細胞を開示された方法を用いて分析しても構わない（シェッフォルド，エイ、アッセンマッチャー，エム、レイナースシャラム，エル、ラウスター、アール及びラドブルッチ、エイ（Ｓｃｈｅｆｆｏｌｄ， Ａ．， Ａｓｓｅｎｍａｃｈｅｒ， Ｍ．， Ｒｅｉｎｅｒｓ−Ｓｃｈｒａｍｍ， Ｌ．， Ｌａｕｓｔｅｒ， Ｒ．， ａｎｄ Ｒａｄｂｒｕｃｈ， Ａ．）、２０００， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １： １０７−１１０）。
【０２７５】
Ｏ．標識化タンパク質
標識化タンパク質は、一つ以上のレポーターシグナルが結合したタンパク質又はペプチドである。レポーターシグナルとタンパク質又はペプチドとが互いに共有結合しているか又は互いにつながりあっているものが好ましい。本明細書で用いられるように、電子対が直接的に又は間接的に共有されてつながる場合に、分子が結合する。間接的な結合の一つの態様は、リンカー分子を介するものである。あらゆる適切なカップリング反応によって、レポーターシグナルをタンパク質又はペプチドと結合させることが可能である。例えば、タンパク質上のシステインとレポーターシグナル上のシステインとの間の硫黄−硫黄結合を介して、レポーターシグナルをタンパク質と共有結合させることが可能である。化合物にタンパク質を結合させるための数多くの他の化学反応及び技術が知られており、それらを用いてレポーターシグナルをタンパク質に結合させてもよい。例えば、チオール、エポキシド、チオールのためのニトリル、ＮＨＳエステル、イソチオシアネート、アミンのためのイソチオシアネート及びカルボン酸のためのアルコールを用いて結合させることができる。タンパク質及びペプチドをインビボで標識化することもできる。
【０２７６】
本明細書で用いられるように、「標識化タンパク質」とは、一つ以上のレポーターシグナルが結合したタンパク質及びペプチドの両方のことである。標識化タンパク質という用語は、無処理（例えば、断片化していない）レポーターシグナルが結合したタンパク質及びペプチド、並びに修飾された（例えば、断片化）レポーターシグナルが結合したタンパク質及びペプチドの両方に用いられる。標識化タンパク質の後者の態様を断片化標識化タンパク質と称する。たとえ標識化タンパク質のタンパク質部分が（例えば、プロテアーゼ消化により）断片化していても、断片化標識化タンパク質という用語はレポーターシグナルが断片化している標識化タンパク質を意味する。同重体標識化タンパク質は、タンパク質のセットが同一の質量電荷比を持つように同重体レポーターシグナルで標識された同一のタイプのタンパク質又はペプチドである。
【０２７７】
Ｐ．標識化検体
標識化検体は、一つ以上のレポーターシグナルが結合した検体である。レポーターシグナルと検体とが互いに共有結合しているか又は互いに拘束しあっているものが好ましい。本明細書で用いられるように、電子対が直接的に又は間接的に共有されてつながる場合に、分子が結合する。間接的な結合の一つの態様は、リンカー分子を介するものである。あらゆる適切なカップリング反応によって、レポーターシグナルを検体と結合させることが可能である。化合物を結合させるための数多くの他の化学反応及び技術が知られており、それらを用いてレポーターシグナルを検体に結合させてもよい。例えば、チオール、エポキシド、チオールのためのニトリル、ＮＨＳエステル、イソチオシアネート、アミンのためのイソチオシアネート及びカルボン酸のためのアルコールを用いて結合させることができる。
【０２７８】
本明細書で用いられるように、「標識化検体」とは、一つ以上のレポーターシグナルが結合した検体のことである。標識化検体という用語は、無処理（例えば、断片化していない）レポーターシグナルが結合した検体、並びに修飾された（例えば、断片化）レポーターシグナルが結合した検体の両方に用いられる。標識化タンパク質の後者の態様を断片化標識化検体と称する。たとえ標識化検体の検体部分が断片化していても、断片化標識化検体という用語はレポーターシグナルが断片化している標識化検体を意味する。同重体標識化検体は、検体のセットが同一の質量電荷比を持つように同重体レポーターシグナルで標識された同一のタイプの検体である。
【０２７９】
Ｑ．アフィニティータグ
アフィニティータグは、アフィニティータグを有する化合物又は複合体を、それを持っていない化合物又は複合体から分離することができる任意の化合物である。好ましいアフィニティータグは化合物であり、リガンド−結合分子若しくは抗体のような別の化合物と会合するか又は相互作用するリガンド又はハプテンなどである。例えば、ハプテンと抗体又はリガンドとリガンド−結合分子の間のように、アフィニティータグと捕獲成分との間の相互作用が特異的相互作用であるものが好ましい。アフィニティータグとしては、抗体、リガンド、結合タンパク質、レセプタータンパク質、ハプテン、アプタマー、炭水化物、合成ポリアミド又はオリゴヌクレオチドが好ましい。好ましい結合タンパク質はＤＮＡ結合タンパク質である。好ましいＤＮＡ結合タンパク質は、ジンクフィンガーモチーフ、ロイシンジッパーモチーフ、ヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフである。これらのモチーフを同一の特異的結合分子内で組み合わせてもよい。
【０２８０】
核酸プローブの文脈中で記載したアフィニティータグは、シブネン（Ｓｙｖｎｅｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４： ５０３７ （１９８６）に記載されている。好ましいアフィニティータグとしてはビオチンが挙げられ、これを核酸内に組み込むことができる。開示された方法において、レポーターシグナル内に組み込まれたアフィニティータグにより、担体にレポーターシグナルが捕獲されるか、担体にそれが結合するか、又は担体とそれが結合することが可能となる。このような捕獲により、他の分子からのレポーターシグナルの分離、レポーターシグナルの洗浄及び取扱いの簡素化が可能となり、この方法の全体を又は部分的に自動化することができる。
【０２８１】
ジンクフィンガーをアフィニティータグとして使用することもできる。ジンクフィンガー、ジンクフィンガーモチーフ及びそれらの相互作用の特性は、ナルディーニらによるジンクフィンガー−ＤＮＡの認識：部位特異的突然変異誘発による基本的な特異性の分析、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２０ （１６）： ４１３７−４４ （１９９２）、ジェーミソンらによる改変されたＤＮＡ−結合特異性を伴うジンクフィンガーのインビトロ選択、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３３ （１９）： ５６８９−９５ （１９９４）、チャンドラセガーラン・エス及びジェイ・スミスによるキメラ制限酵素：次は何か？Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ３８０ （７−８）： ８４１−８ （１９９９）及びスミスらによるキメラ制限酵素の基質特異性に関する詳細な研究、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２７ （２）： ６７４−８１ （１９９９）に記載されている。
【０２８２】
必要に応じて、いくつかのやり方によって担体上でのレポーターシグナルの捕獲を成し遂げても構わない。一つの態様においては、担体にアフィニティードック（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｄｏｃｋ）を取り付けるか又は結合する。アフィニティードックは、レポーターシグナル上のアフィニティータグと会合又は相互作用することによってレポーターシグナルの結合を媒介する化合物又はその一部である。担体上に固定化されたアフィニティードックにより、担体上でのレポーターシグナルの捕獲が可能となる。このような捕獲により、次に続く工程を妨害するおそれがある分子を洗い流すという便利な手段が提供される。捕獲されたレポーターシグナルも担体から遊離させることができる。アフィニティータグを解離することによって、又はレポーターシグナルと担体との間の光で開裂可能な連結を切断することによって、このことを成し遂げることができる。
【０２８３】
開示された方法で使用するための担体には、レポーターシグナルに取り付け可能か又は結合可能なあらゆる固形物が含まれる。担体の例としては、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、シリコン、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリル酸塩、ポリエチレン、ポリエチレンオキサイド、ポリケイ酸塩、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマル酸塩、コラーゲン、グリコサミノグリカン及びポリアミノ酸のような材料が含まれるが、これらに限定されない。担体は、薄膜又は膜、ビーズ、瓶、ディッシュ、繊維、光ファイバー、織った繊維、成型ポリマー、粒子、コンパクトディスク及び微粒子を含むあらゆる有用な形態をとることができる。
【０２８４】
Ｒ．ベクター及び発現配列
プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド及び人工染色体に限定されない遺伝物質を用いて直接移送することにより、又は細胞中の遺伝物質若しくはカチオン性リポソームなどのキャリアを介して、遺伝子導入を達成することができる。このような方法は技術的に十分に知られており、本明細書に記載された方法での使用にも容易に適用することができる。トランスファーベクターは、遺伝子の細胞内（例えばプラスミド）への移送に用いるための、又は遺伝子移送計画の全体の一部としての、例えば組み換え型レトロウイルス又は組み換え型アデノウイルスの一部としての任意のヌクレオチド構築物であり得る（ラム（Ｒａｍ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３： ８３−８８， （１９９３））。ウイルスベクター、化学的トランスフェクタント又はエレクトロポレーション及びＤＮＡの直接拡散などの物理力学的方法を含むトランスフェクションのための適切な手段は、例えば、ウォルフ，ジェイ・エイ（Ｗｏｌｆｆ， Ｊ． Ａ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４７， １４６５−１４６８ （１９９０）；及びウォルフ，ジェイ・エイ、Ｎａｔｕｒｅ， ３５２， ８１５−８１８ （１９９１）に記載されている。
【０２８５】
本明細書で用いられるように、プラスミド又はウイルスベクターは、劣化を伴わずに遺伝子を細胞内に輸送する因子であり、遺伝子が届けられる細胞中でその遺伝子の発現をもたらすプロモーターを含むものである。好ましい態様において、ベクターはウイルス又はレトロウイルスのいずれかに由来する。好ましいウイルスベクターはアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ＡＩＤＳウイルス、ニューロナルトロフィックウイルス（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｔｒｏｐｈｉｃ ｖｉｒｕｓ）、シンドビスウイルス及び他のＲＮＡウイルスであり、ＨＩＶバックボーンを伴うこれらのウイルスも含まれる。さらに、これらのウイルスの持つ特性であって、ウイルスをベクターとしての使用に適したものとする特性を共有する任意のウイルスファミリーが好ましい。好ましいレトロウイルスには、マウスマローニ白血病ウイルス、ＭＭＬＶ、及びＭＭＬＶのベクターとして好ましい特性を発現するレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも大きな遺伝子の積荷が可能で、すなわち導入遺伝子又はマーカー遺伝子を運ぶことができ、そしてその理由により、広くベクターとして使われている。しかしながら、非増殖性の細胞ではこれらは使い物にならない。アデノウイルスベクターは比較的安定しており、連携作業が容易であり、高力価であり、そしてエアロゾル構築体の中へも届けられることができ、さらには非分裂性細胞に形質移入を行うこともできる。ポックスウイルスベクターは大きく、遺伝子を挿入するための数箇所の部位を持ち、熱に安定で室温で貯蔵することができる。好ましい態様は、ウイルス抗原によって引き出される宿主生物体の免疫応答を抑制するように操作されたウイルスベクターである。このタイプの好ましいベクターは、インターロイキン８又は１０についてのコーディング領域を運ぶだろう。
【０２８６】
ウイルスベクターは、遺伝子を細胞内に導入するためのたいていの化学的方法又は物理的方法よりも高い処理能力（遺伝子を導入する能力）を持っている。通常、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製及びキャプシド形成に必要な逆方向末端反復並びにウイルスゲノムの転写及び複製を制御するためのプロモーターを含んでいる。ベクターとして操作した場合、ウイルスは通常、一つ以上の除去された初期遺伝子を持ち、そして除去されたウイルスＤＮＡの代わりに、遺伝子又は遺伝子／プロモーターカセットがウイルスゲノム内に挿入されている。このタイプの構築物は約８ｋｂまでの外来遺伝物質を運ぶことができる。除去された初期遺伝子の必要な機能は通常、初期遺伝子の遺伝子産物がｔｒａｎｓに発現するように操作された細胞系によって供給される。
【０２８７】
１．レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、レトロウイルス科のあらゆるタイプ、サブファミリー、遺伝子又は向性を含めたウイルスファミリーに属する動物ウイルスである。一般的に、レトロウイルスベクターは、ベルマ、アイ・エム（Ｖｅｒｍａ， Ｉ． Ｍ．）、遺伝子導入のためのレトロウイルスベクター。Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５、米国微生物学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、２２９〜２３２頁、ワシントン（１９８５）に記載されている。遺伝子治療のためにレトロウイルスベクターを使用する方法の具体例は、米国特許第４，８６８，１１６号及び第４，９８０，２８６号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ ９０／０２８０６号及びＷＯ ８９／０７１３６号並びにムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）、（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０： ９２６−９３２ （１９９３））に記載されている。
【０２８８】
レトロウイルスは基本的に、積荷である核酸が中に詰め込まれたパッケージである。積荷である核酸はそれと一緒にパッケージングシグナルを運び、このことは、複製された娘分子がパッケージ層内に効率的にパッケージされることを約束する。パッケージングシグナルに加えて、複製及び複製されたウイルスのパッケージングのためにｃｉｓに必要な多数の分子がある。通常、レトロウイルスのゲノムは、タンパク質層の形成に関与するｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子を含んでいる。標的細胞に移される外来ＤＮＡによって通常置換されるのは、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子である。レトロウイルスベクターは通常、パッケージ層への組み込みのためのパッケージングシグナル、ｇａｇ転写単位の開始を合図する配列、逆転写のｔＲＮＡプライマーに結合するプライマー結合部位を含む逆転写に必要なエレメント、ＤＮＡ合成に際してＲＮＡ鎖の転換を導く末端反復配列、二番目のＤＮＡ鎖の合成のための合成プライミング部位として機能するプリンに富む５’〜３’ＬＴＲ配列、及び挿入するための、ＤＮＡの状態のレトロウイルスの宿主ゲノムへの挿入を可能とする配列であってＬＴＲ末端近傍にある特定の配列を含む。ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子を除去することによって、約８ｋｂの外来配列がウイルスゲノム内に挿入されることが可能になり、逆転写が生じ、そして複製のすぐ後に新規レトロウイルス粒子内にパッケージされる。核酸のこの量は、それぞれの転写物のサイズに応じて１個ないし多数の遺伝子を送達するに十分な量である。ポジティブ選択マーカーか又はネガティブ選択マーカーのいずれかが他の遺伝子と一緒にインサートに含まれていることが好ましい。
【０２８９】
たいていのレトロウイルスベクターにおける複製機構及びパッケージングタンパク質は除去されているので（ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ）、通常、これらをパッケージング細胞系内に設置することによりベクターを創製する。パッケージング細胞系は、複製機構及びパッケージング機構を含むがパッケージングシグナルを少しも持たないレトロウイルスを用いて、トランスフェクション又は形質転換された細胞系である。最適なＤＮＡを運ぶベクターをこれらの細胞系にトランスフェクションすると、ヘルパー細胞によってインシスで提供された機構によって、対象となっている遺伝子を含むベクターが複製されて新しいレトロウイルス粒子内にパッケージされる。これらは必要なシグナルを欠いているために、この機構のためのゲノムはパッケージされない。
【０２９０】
２．アデノウイルスベクター
複製欠損アデノウイルスの構築が記載されている（バークナー（Ｂｅｒｋｎｅｒ）ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１： １２１３−１２２０ （１９８７）；マシーエ（Ｍａｓｓｉｅ）ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６： ２８７２−２８８３ （１９８６）；ハジアーマド（Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ）ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５７： ２６７−２７４ （１９８６）；デビッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６１： １２２６−１２３９ （１９８７）；チャン（Ｚｈａｎｇ）「リポソーム−媒介トランスフェクション及びＰＣＲ分析による組み換え型アデノウイルスの精製と同定」ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５： ８６８−８７２ （１９９３））。これらのウイルスをベクターとして使用することの利点は、他のタイプの細胞に広がることが可能な範囲に制限があるということである。というのは、これらは最初の感染細胞の中で複製することができるが、新たな感染性ウイルス粒子を作る能力がないからである。気道上皮、肝細胞、血管内皮細胞、中枢神経系実質及び多数の他の組織部位に組み換え型アデノウイルスを直接インビボ送達した後は、高い効率で遺伝子導入が達成されていることが示されている（モーシー（Ｍｏｒｓｙ）、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９２： １５８０−１５８６ （１９９３）；キルシェンバウム（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ）、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９２： ３８１−３８７ （１９９３）；ロースラー（Ｒｏｅｓｓｌｅｒ）、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９２： １０８５−１０９２ （１９９３）；モーリアー（Ｍｏｕｌｌｉｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４： １５４−１５９ （１９９３）；ラサール（Ｌａ Ｓａｌｌｅ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９： ９８８−９９０ （１９９３）；ゴメスフォイク（Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ）、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： ２５１２９−２５１３４ （１９９２）；リッチ（Ｒｉｃｈ）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４ ： ４６１−４７６ （１９９３）；ザブナー（Ｚａｂｎｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６： ７５−８３ （１９９４）；グズマン（Ｇｕｚｍａｎ）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７３： １２０１−１２０７ （１９９３）；ブート（Ｂｏｕｔ）、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５： ３−１０ （１９９４）；ザブナー、Ｃｅｌｌ ７５： ２０７−２１６ （１９９３）；カイルラウド（Ｃａｉｌｌａｕｄ）、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ５： １２８７−１２９１ （１９９３）；及びラゴット（Ｒａｇｏｔ）、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４： ５０１−５０７ （１９９３））。組み換え型アデノウイルスにより、特定の細胞表面レセプターに結合することによる遺伝子の形質導入が達成され、その後に野生型すなわち複製欠損型アデノウイルスと同一の方式で、レセプター介在性エンドサイトーシスによりウイルスが内在化する（チャドネット及びダイレス（Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ ａｎｄ Ｄａｌｅｓ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０： ４６２−４７７ （１９７０）；ブラウン及びバーリンガム（Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １２： ３８６−３９６ （１９７３）；スベンソン及びパーソン（Ｓ��ｅｎｓｓｏｎ ａｎｄ Ｐｅｒｓｓｏｎ）、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５５： ４４２−４４９ （１９８５）；セス（Ｓｅｔｈ）ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５１： ６５０−６５５ （１９８４）；セスら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４： １５２８−１５３３ （１９８４）；バーガ（Ｖａｒｇａ）ら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５： ６０６１−６０７０ （１９９１）；ウィッカム（Ｗｉｃｋｈａｍ）ら、Ｃｅｌｌ ７３： ３０９−３１９ （１９９３））。
【０２９１】
好ましいウイルスベクターは、Ｅ１遺伝子が除去されたアデノウイルスに基づくものであり、これらのウイロン（ｖｉｒｏｎｓ）はヒトの２９３細胞系などの細胞系中で生み出される。別の好ましい態様は、アデノウイルスゲノムからＥ１遺伝子とＥ３遺伝子の両方が除去されたものである。
【０２９２】
別のタイプのウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に基づくものである。多数の細胞のタイプに感染することができ、そしてヒトに対して病原性を示さないことから、この欠陥パルボウイルスはベクターとして好ましい。ＡＡＶタイプのベクターは約４〜５ｋｂを運ぶことができ、野生型ＡＡＶは１９番染色体内に安定的に挿入されることが知られている。このような部位特異的組み込み特性を持つベクターは好ましい。このタイプのベクターの特に好ましい態様は、アビゲン（Ａｖｉｇｅｎ）社、サンフランシスコ、カリフォルニア州で生産されているＰ４．１ Ｃベクターであり、これは単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、及び／又は緑色蛍光性タンパク質、ＧＦＰをコード化している遺伝子などのマーカー遺伝子を含むことができる。
【０２９３】
ウイルス及びレトロウイルス中に挿入された遺伝子はたいてい、所望の遺伝子産物の発現を制御するのを支援するためのプロモーター及び／又はエンハンサーを含んでいる。プロモーターは、一般的に転写開始点に関する比較的固定された位置にある場合に機能するＤＮＡ配列又は複数のＤＮＡ配列である。プロモーターはＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子の基本的な相互作用に必要なコアとなるエレメントを含み、そして上流のエレメントと応答エレメントとを含んでも構わない。
【０２９４】
３．ウイルスプロモーター及びエンハンサー
哺乳類の宿主細胞中のベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の供給源、例えば、ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスなどのウイルスのゲノムであり、最も好ましくはサイトメガロウイルスから、又は異種の哺乳類のプロモーター、例えばベータアクチンプロモーターからから得ても構わない。都合が良いことに、ＳＶ４０ウイルスの初期プロモーター及び後期プロモーターは、さらにＳＶ４０ウイルス複製起点（フィアース（Ｆｉｅｒｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ， ２７３： １１３ （１９７８））も含むＳＶ４０制限酵素断片として得られる。都合が良いことに、ヒトのサイトメガロウイルスの最初期プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限酵素断片（グリーンウェイ，ピー・ジェイ（Ｇｒｅｅｎｗａｙ， Ｐ． Ｊ．）ら、Ｇｅｎｅ １８： ３５５−３６０ （１９８２））として得られる。もちろん、宿主細胞又は近縁種由来のプロモーターも本明細書で使用される。
【０２９５】
エンハンサーは一般的に転写開始点から定められていない間隔を空けた位置で機能するＤＮＡ配列を指し、転写単位に対して５’（ライミンス，エル（Ｌａｉｍｉｎｓ， Ｌ．）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７８： ９９３ （１９８１））又は３’（ラスキー，エム・エル（Ｌｕｓｋｙ， Ｍ． Ｌ．）ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ３： １１０８ （１９８３））の位置を取り得る。その上、エンハンサーはコーディング配列それ自体の範囲内だけでなく（オズボーン，ティー・エフ（Ｏｓｂｏｒｎｅ， Ｔ． Ｆ．）ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ． ４： １２９３ （１９８４））、イントロンの範囲内に位置することも可能である（バナージ，ジェイ・エル（Ｂａｎｅｒｊｉ， Ｊ． Ｌ．）ら、Ｃｅｌｌ ３３： ７２９ （１９８３））。これらはたいてい１０〜３００ｂｐの間の長さであり、ｃｉｓに作用する。エンハンサーはプロモーター近傍から転写を促進する機能を持つ。さらにエンハンサーは、多くの場合、転写の調節を媒介する応答エレメントをも含んでいる。さらにプロモーターも、転写の調節を媒介する応答エレメントを含むことができる。多くの場合、エンハンサーは遺伝子の発現の調節を決定する。現在のところ、哺乳類の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）に由来する数多くのエンハンサー配列が知られているのに対して、通常用いられるのは真核生物の細胞のウイルス由来のエンハンサーである。好ましい例は、複製起点（１００〜２７０ｂｐ）の後期側上のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーである。
【０２９６】
プロモーター及び／又はエンハンサーは、これらの機能を始動させる光又は特定の化学的現象のいずれかにより、特異的に活性化されても構わない。テトラサイクリン及びデキサメタゾンなどの試薬によってシステムを調節することができる。ガンマ線照射などを照射したり又はアルキル化化学療法剤にさらすことによって、ウイルスベクター遺伝子発現を促進するやり方もある。
【０２９７】
プロモーター領域及び／又はエンハンサー領域が、転写される転写単位領域の発現を最大化するための構成的プロモーター及び／又は構成的エンハンサーとして機能することが好ましい。プロモーター領域及び／又はエンハンサー領域がすべての真核生物の細胞のタイプにおいて有効であることがさらに好ましい。このタイプの好ましいプロモーターはＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（全長プロモーター）及びレトロウイルスベクターＬＴＦである。
【０２９８】
すべての特異的調節エレメントをクローン化できること、及び例えばメラノーマ細胞などの特定のタイプの細胞中で選択的に発現される発現ベクターを構築するために用いられることが示されている。グリア細胞を起源とする細胞中で選択的に遺伝子を発現させるために、グリア繊維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターが用いられてきた。
【０２９９】
真核生物の宿主細胞（酵母、菌類、昆虫、植物、動物、ヒトすなわち有核細胞）中で用いる発現ベクターは転写の終結に必要な、ｍＲＮＡ発現に影響するかもしれない配列も含んでいても構わない。これらの領域は、組織因子タンパク質をコード化しているｍＲＮＡの非翻訳部分の中のポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域もまた、転写終結部位を含む。転写単位もポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の一つの利点は、転写される単位がプロセシングを受けてｍＲＮＡのように運ばれることとなる可能性が高まることである。発現構築物中のポリアデニル化シグナルの同定と使用は十分に確立されている。導入遺伝子構築の際に相同的なポリアデニル化シグナルを用いることが好ましい。転写単位の好ましい態様において、ポリアデニル化領域はＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルに由来し、そして約４００塩基から成る。他の標準的な配列のみを含むか又は上記配列との組み合わせを含む、その転写される単位が構築物からの発現又は構築物の安定性を向上させることも好ましい。
【０３００】
４．マーカー
ウイルスベクターは、マーカー産物をコード化している核酸配列を含むことができる。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に届けられていたかどうか、そしていったん送達されたものが発現しているかどうかを調べるのに用いられる。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼと緑色蛍光性タンパク質とをコード化している大腸菌のｌａｃＺ遺伝子である。いくつかの態様において、マーカーは選択マーカーであっても構わない。哺乳類細胞に適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイドロマイシン及びピューロマイシンがある。このような選択マーカーが哺乳類の宿主細胞内に首尾よく移送されると、選択圧下に置いた場合でも形質転換された哺乳類の宿主細胞は生き残ることができる。選択制度には、広く用いられている二つの別個のカテゴリーがある。第一のカテゴリーは、細胞の代謝と補足培地から独立して生育する能力を欠くミュータント細胞系の使用とに基づくものである。二つの例としては：ＣＨＯ ＤＨＦＲ−細胞及びマウスＬＴＫ−細胞である。これらの細胞は、チミジン又はヒポキサンチンのような栄養素の添加なしに生育する能力を欠いている。これらの細胞は完全なヌクレオチド合成経路に必要な特定の遺伝子を欠いているため、不足しているヌクレオチドを補足培地に供給しなければ、これらは生き残ることができない。培地に補足することの代替物としては、無処理ＤＨＦＲ遺伝子又はＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠く細胞に導入することであり、それゆえに、それらの生育に必須のものが変わる。ＤＨＦＲ遺伝子又はＴＫ遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非補足培地中で生き残ることはできない。
【０３０１】
第二のカテゴリーは、あらゆるタイプの細胞中で用いられる選択スキームを指す優性選択であり、このスキームではミュータント細胞系の使用を要求しない。これらのスキームでは通常、宿主細胞の生育を停止させる薬剤を用いる。新規遺伝子を有するこれらの細胞は、薬剤耐性を伝えるタンパク質を発現し、選択を切り抜けて生き残るだろう。このような優性選択の例では、ネオマイシン（サザン・ピー及びバーグ，ピー（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐ． ａｎｄ Ｂｅｒｇ， Ｐ．）、Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． １： ３２７ （１９８２））、マイコフェノール酸（ムリガン，アール・シー及びバーグ，ピー（Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｒ． Ｃ． ａｎｄ Ｂｅｒｇ， Ｐ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０９： １４２２ （１９８０））又はハイグロマイシン（スジェン，ビー（Ｓｕｇｄｅｎ， Ｂ）ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５： ４１０−４１３ （１９８５））といった薬剤が用いられる。この三例では、適切な薬剤Ｇ４１８すなわちネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（マイコフェノール酸）又はハイグロマイシンのそれぞれに対する耐性を伝えるために、真核生物の制御下にある細菌遺伝子を採用する。他には、ネオマイシンアナログのＧ４１８及びピューロマイシンが含まれる。
【０３０２】
開示された材料の形態及び態様
Ａ．レポーター分子の標識化
複数のレポーターシグナルを含み、レポーターシグナルが共通する特性を有し、共通する特性によって、レポーターシグナルを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルを改変することができ、レポーターシグナルのそれぞれの改変体をレポーターシグナルの他のすべての改変体から識別することができるレポーターシグナルのセットが開示される。
【０３０３】
レポーターシグナルがペプチドを含み、ペプチドが同一の質量電荷比を有するレポーターシグナルのセットが開示される。
【０３０４】
さらに、共通する特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルの質量の変化によりそれらが改変され、レポーターシグナルの改変体の質量電荷比の差異によってレポーターシグナルの改変体を識別することができるセット、及び断片化によってレポーターシグナルの質量が改変されるセットも開示される。
【０３０５】
さらに、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なるレポーターシグナルを含むセットが開示され、そして１０以上の異なるレポーターシグナルを含むセットが開示される。
【０３０６】
レポーターシグナルがペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ポリマー、オリゴペプチド又はペプチド核酸であるセットが開示される。
【０３０７】
さらに、レポーターシグナルが特異的結合分子と会合するか又は結合し、それぞれのレポーターシグナルが異なる特異的結合分子と会合するか又は結合するセットも開示される。
【０３０８】
さらに、レポーターシグナルがデコーディングタグと会合するか又は結合し、それぞれのレポーターシグナルが異なるデコーディングタグと会合するか又は結合するセットも開示される。
【０３０９】
さらに、ペプチドが同一のアミノ酸組成を有するセットも開示される。
【０３１０】
さらに、ペプチドが同一のアミノ酸配列を有するセットも開示される。
【０３１１】
さらに、それぞれのペプチドの重い同位体の分布が異なっているセットも開示される。
【０３１２】
さらに、それぞれのペプチドが種々のアミノ酸配列を有するセットも開示される。
【０３１３】
さらに、それぞれのペプチドが不安定な又は開裂しやすい結合を種々の位置に有するセットも開示される。
【０３１４】
（ａ）それぞれのレポーター分子がレポーターシグナル及びデコーディングタグを含み、レポーターシグナルが共通する特性を有し、共通する特性によって、レポーターシグナルを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルの改変体をレポーターシグナルの他のすべての改変体から識別することができ、それぞれの異なるレポーター分子が異なるデコーディングタグと異なるレポーターシグナルとを含むレポーター分子のセット、（ｂ）それぞれのコーディング分子が特異的結合分子とコーディングタグとを含み、それぞれの特異的結合分子が異なる検体と特異的に相互作用することができ、それぞれのコーディングタグが異なるデコーディングタグと特異的に相互作用することができるコーディング分子のセットを含むキットが開示される。
【０３１５】
Ｂ．レポーターシグナルタンパク質の標識化
それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、レポーターシグナルが共通する特性を有し、共通する特性によって、同一のタンパク質又はペプチドを含む標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は区別することが可能となり、レポーターシグナルを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルの改変体をレポーターシグナルの他のすべての改変体から識別することができ、レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が変化し、それぞれの標識化タンパク質の改変体を標識化タンパク質の他のすべての改変体から識別することができる標識化タンパク質のセットが開示される。
【０３１６】
それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、標識化タンパク質が共通する特性を有し、共通する特性によって、同一のタンパク質又はペプチドを含む標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルの改変体をレポーターシグナルの他のすべての改変体から識別することができ、レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が変化し、それぞれの標識化タンパク質の改変体を標識化タンパク質の他のすべての改変体から識別することができる標識化タンパク質のセットが開示される。
【０３１７】
それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドとタンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、レポーターシグナルを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルの改変体を、レポーターシグナルの他のすべての改変体から識別することができ、レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が変化し、標識化タンパク質のそれぞれの改変体を標識化タンパク質の他のすべての改変体から識別することができる標識化タンパク質のセットが開示される。
【０３１８】
それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、レポーターシグナルが共通する特性を有し、共通する特性によって、同一のタンパク質又はペプチドを含む標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となる標識化タンパク質のセットが開示される。
【０３１９】
さらに、共通する特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルの質量の変化によりそれらが改変され、レポーターシグナルの改変体の質量電荷比の差異によって標識化タンパク質の改変体を識別することができるセット、及び断片化によってレポーターシグナルの質量が改変されるセットも開示される。
【０３２０】
さらにレポーターシグナルの改変によりそれらの電荷も変化するセットが開示される。
【０３２１】
さらに、共通する特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルの電荷の変化によりそれらが改変され、レポーターシグナルの改変体の質量電荷比の差異によって標識化タンパク質の改変体を識別することができるセットも開示される。
【０３２２】
さらに、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なるレポーターシグナルを含むセットが開示される。
【０３２３】
１０以上の異なるレポーターシグナルを含むセットが開示され、そしてレポーターシグナルがペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ポリマー、オリゴペプチド又はペプチド核酸であるセットが開示される。
【０３２４】
さらに、レポーターシグナルがタンパク質又はペプチドと結合しているセットが開示される。
【０３２５】
共通する特性によって、共通する特性を欠く分子から標識化タンパク質を識別及び／又は分離することができるセットが開示される。
【０３２６】
さらに、共通する特性がレポーターシグナルと会合する一つ以上のアフィニティータグであるセット、及び一つ以上のアフィニティータグがレポーターシグナルと会合するセットも開示される。
【０３２７】
それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドとタンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、そのレポーターシグナルがペプチドを含み、そのレポーターシグナルペプチドが同一の質量電荷比を有する標識化タンパク質のセットが開示される。
【０３２８】
さらに、レポーターシグナルペプチドが同一のアミノ酸組成を有するセット、及びレポーターシグナルペプチドが同一のアミノ酸配列を有するセットも開示される。
【０３２９】
それぞれのレポーターシグナルペプチドの重い同位体の分布が異なっているセット、及びそれぞれのレポーターシグナルペプチドの置換基の分布が異なっているセットが開示される。
【０３３０】
それぞれのレポーターシグナルペプチドが異なるアミノ酸配列を有するセット、及びそれぞれのレポーターシグナルペプチドが不安定な又は開裂しやすい結合を異なる位置に有するセットが開示される。
【０３３１】
一つ以上のアフィニティータグがレポーターシグナルと会合するセットが開示される。
【０３３２】
それぞれのレポーター分子がレポーターシグナル及びカップリングタグを含み、レポーターシグナルが共通する特性を有し、共通する特性によってレポーターシグナルを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することができ、レポーターシグナルを改変することができ、レポーターシグナルの改変体のそれぞれをレポーターシグナルの他のすべての改変体から識別することができ、それぞれの異なるレポーター分子が異なるカップリングタグ及び異なるレポーターシグナルを含む、レポーター分子のセットを含むキットが開示される。
【０３３３】
標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、標識化タンパク質が共通する特性を有し、共通する特性により、標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することができ、レポーターシグナルを改変することができ、レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が変化し、標識化タンパク質の改変体を標識化タンパク質の非改変体から識別することができる標識化タンパク質が開示される。
【０３３４】
Ｃ．レポーターシグナルキャリブレーター
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターが、標的タンパク質断片のセットの中の標的タンパク質断片と共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、標的タンパク質断片を改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体を、標的タンパク質断片の他の改変体から識別することができ、レポーターシグナルキャリブレーターを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができるレポーターシグナルキャリブレーターのセットが開示される。
【０３３５】
さらに、予め定められた量のレポーターシグナルキャリブレーターをそれぞれ含むセット、及び少なくとも二つのレポーターシグナルキャリブレーターの量が異なるセットも開示される。
【０３３６】
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの相対量が、タンパク質サンプル中にあると予想される、対応するそれぞれの標的タンパク質断片の相対量に基づくセットが開示される。
【０３３７】
さらに、それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの量が同一であるセットも開示される。
【０３３８】
標的タンパク質断片及び標的レポーターシグナルキャリブレーターを、断片化によって改変することができるセット、及び光で開裂可能なアミノ酸の位置での切断により標的タンパク質断片及び標的レポーターシグナルキャリブレーターを改変することができるセットが開示される。
【０３３９】
標的タンパク質断片及び標的レポーターシグナルキャリブレーターが衝突セル内で断片化可能なセット、及び標的タンパク質断片がアスパラギン−プロリン結合の位置で断片化可能なセットが開示される。
【０３４０】
さらに、タンパク質サンプルのプロテアーゼ消化により標的タンパク質断片を生産するセット、及びタンパク質サンプルのセリンプロテアーゼによる消化によって標的タンパク質断片を生産するセットも開示される。
【０３４１】
さらに、セリンプロテアーゼがトリプシンであるセット、及び光で開裂可能なアミノ酸の位置での開裂によって標的タンパク質断片を生産するセットも開示される。
【０３４２】
共通する特性が質量電荷比であり、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターの質量、電荷又は質量と電荷の変化によりそれらを改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体の質量電荷比の差異によって標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を識別することができるセットが開示される。
【０３４３】
さらに、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なるレポーターシグナルキャリブレーターを含むレポーターシグナルキャリブレーターのセットも開示される。
【０３４４】
１０以上の異なるレポーターシグナルキャリブレーターを含むレポーターシグナルキャリブレーターのセットが開示され、そして２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なる標的タンパク質断片を含む標的タンパク質断片のセットも開示される。
【０３４５】
レポーターシグナルキャリブレーターがペプチドを含み、そのペプチドが、対応する標的タンパク質断片と同一の質量電荷比を持つセットが開示される。
【０３４６】
さらに、ペプチドが、対応する標的タンパク質断片と同一のアミノ酸組成を有するセットも開示される。
【０３４７】
さらに、ペプチドが、対応する標的タンパク質断片と同一のアミノ酸配列を有するセットも開示される。
【０３４８】
加えて、それぞれのペプチドが、対応する標的タンパク質断片と異なるアミノ酸配列を有するセットが開示される。
【０３４９】
さらに、それぞれのペプチドが不安定な又は開裂しやすい結合を異なる位置に有するセットが開示される。
【０３５０】
レポーターシグナルキャリブレーターが、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ポリマー、オリゴペプチド又はペプチド核酸であるセット、及び少なくとも一つの標的タンパク質断片が、少なくとも一つの修飾されたアミノ酸を含むセットが開示される。
【０３５１】
さらに、修飾されたアミノ酸が、リン酸化アミノ酸、アシル化アミノ酸又はグリコシル化アミノ酸であるセットも開示される。
【０３５２】
さらに、少なくとも一つの標的タンパク質断片が、修飾されたアミノ酸を含む標的タンパク質断片と、その修飾されたアミノ酸以外の点で同一であるセットも開示される。
【０３５３】
（ａ）それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターが、標的タンパク質断片のセットの中の標的タンパク質断片と共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、標的タンパク質断片を改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体を、標的タンパク質断片の他の改変体から識別することができ、レポーターシグナルキャリブレーターを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができるレポーターシグナルキャリブレーターのセット、（ｂ）タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を生産するための一つ以上の試薬を含むキットであって、タンパク質シグニチャーを得るためのキットが開示される。
【０３５４】
さらに、予め定められた量のレポーターシグナルキャリブレーターをそれぞれ含むレポーターシグナルキャリブレーターのセットのキットも開示される。
【０３５５】
さらに、少なくとも二つのレポーターシグナルキャリブレーターの量が異なるキット、及びそれぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの相対量が、タンパク質サンプル中にあると予想される、対応するそれぞれの標的タンパク質断片の相対量に基づくキットも開示される。
【０３５６】
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの量が同一であるキット、及び標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、断片化によって改変できるキットが開示される。
【０３５７】
さらに、光で開裂可能なアミノ酸の位置で切断することにより、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを改変することができるキット、及び標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、衝突セル内で断片化することができるキットが開示される。
【０３５８】
標的タンパク質断片がアスパラギン−プロリン結合の位置で断片化可能なキット、及び標的タンパク質断片がタンパク質サンプルのプロテアーゼ消化によって生成するキットが開示される。
【０３５９】
セリンプロテアーゼによるタンパク質サンプルの消化によって標的タンパク質断片を生産するキット、及びそのセリンプロテアーゼがトリプシンであるキットが開示される。
【０３６０】
光で開裂可能なアミノ酸の位置での切断によって標的タンパク質断片が生産されるキットが開示される。
【０３６１】
さらに、共通する特性が質量電荷比であり、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターの質量、電荷又は質量と電荷の変化によりそれらを改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体の質量電荷比の差異によって標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を識別することができるキットも開示される。
【０３６２】
２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なるレポーターシグナルキャリブレーターを含むレポーターシグナルキャリブレーターのセットのキットが開示される。
【０３６３】
さらに、１０以上の異なるレポーターシグナルキャリブレーターを含むレポーターシグナルキャリブレーターのセットのキットも開示される。
【０３６４】
２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なる標的タンパク質断片を含む標的タンパク質断片のセットのキットが開示される。
【０３６５】
さらに、レポーターシグナルキャリブレーターがペプチドを含み、そのペプチドが、対応する標的タンパク質断片と同一の質量電荷比を持つキットも開示される。
【０３６６】
ペプチドが、対応する標的タンパク質断片と同一のアミノ酸組成を有するキット、及びペプチドが、対応する標的タンパク質断片と同一のアミノ酸配列を有するキット、及びそれぞれのペプチドが、対応する標的タンパク質断片と異なるアミノ酸配列を有するキットが開示される。
【０３６７】
それぞれのペプチドが不安定な又は開裂しやすい結合を異なる位置に有するキットが開示される。
【０３６８】
さらに、レポーターシグナルキャリブレーターが、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ポリマー、オリゴペプチド又はペプチド核酸であるキットも開示される。
【０３６９】
少なくとも一つの標的タンパク質断片が、少なくとも一つの修飾されたアミノ酸を含むキットが開示され、そして修飾されたアミノ酸が、リン酸化アミノ酸、アシル化アミノ酸又はグリコシル化アミノ酸であるキットが開示される。
【０３７０】
さらに、少なくとも一つの標的タンパク質断片が、修飾されたアミノ酸を含む標的タンパク質断片と、その修飾されたアミノ酸以外の点で同一であるキットも開示される。
【０３７１】
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターが、標的タンパク質断片のセットの中の標的タンパク質断片と共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、標的タンパク質断片を改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体を、標的タンパク質断片の他の改変体から識別することができ、レポーターシグナルキャリブレーターを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができる、レポーターシグナルキャリブレーターのセット及び標的タンパク質断片のセットを含む混合物が開示される。
【０３７２】
さらに、予め定められた量のレポーターシグナルキャリブレーターをそれぞれ含むレポーターシグナルキャリブレーターのセットの混合物も開示される。
【０３７３】
さらに、少なくとも二つのレポーターシグナルキャリブレーターの量が異なる混合物、及びそれぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの相対量が、タンパク質サンプル中にあると予想される、対応するそれぞれの標的タンパク質断片の相対量に基づく混合物も開示される。
【０３７４】
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの量が同一である混合物、及び標的タンパク質断片とレポーターシグナルキャリブレーターを断片化によって改変できる混合物が開示される。
【０３７５】
光で開裂可能なアミノ酸の位置での切断により標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを改変することができる混合物が開示される。
【０３７６】
さらに、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが衝突セル内で断片化可能である混合物も開示される。
【０３７７】
標的タンパク質断片がアスパラギン−プロリン結合の位置で断片化可能な混合物、及びタンパク質サンプルのプロテアーゼ消化により標的タンパク質断片を生産する混合物、及びセリンプロテアーゼによるタンパク質サンプルの消化によって標的タンパク質断片を生産する混合物、及びセリンプロテアーゼがトリプシンである混合物が開示される。
【０３７８】
標的タンパク質断片が光で開裂可能なアミノ酸の位置での切断により生産される混合物、及び共通する特性が質量電荷比であり、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターの質量、電荷又は質量と電荷の変化によりそれらを改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体の質量電荷比の差異によって標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を識別することができる混合物が開示される。
【０３７９】
２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なるレポーターシグナルキャリブレーターを含むレポーターシグナルキャリブレーターのセットの混合物も開示される。
【０３８０】
さらに、１０以上の異なるレポーターシグナルキャリブレーターを含むレポーターシグナルキャリブレーターのセットの混合物も開示され、そして２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なる標的タンパク質断片を含む標的タンパク質断片のセットの混合物も開示される。
【０３８１】
レポーターシグナルキャリブレーターがペプチドを含み、そのペプチドが、対応する標的タンパク質断片と同一の質量電荷比を持つ混合物、及びペプチドが、対応する標的タンパク質断片と同一のアミノ酸組成を有する混合物が開示される。
【０３８２】
ペプチドが、対応する標的タンパク質断片と同一のアミノ酸配列を有する混合物、及びそれぞれのペプチドが、対応する標的タンパク質断片と異なるアミノ酸配列を有する混合物が開示される。
【０３８３】
それぞれのペプチドが不安定な又は開裂しやすい結合を異なる位置に有する混合物が開示される。
【０３８４】
レポーターシグナルキャリブレーターが、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ポリマー、オリゴペプチド又はペプチド核酸である混合物が開示される。
【０３８５】
さらに、少なくとも一つの標的タンパク質断片が、少なくとも一つの修飾されたアミノ酸を含む混合物、及び修飾されたアミノ酸が、リン酸化アミノ酸、アシル化アミノ酸又はグリコシル化アミノ酸である混合物、及び少なくとも一つの標的タンパク質断片が、修飾されたアミノ酸を含む標的タンパク質断片と、その修飾されたアミノ酸以外の点で同一である混合物も開示される。
【０３８６】
それぞれの標的タンパク質断片が、レポーターシグナルキャリブレーターのセットの中のレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、標的タンパク質断片を改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体を、標的タンパク質断片の他の改変体から識別することができ、レポーターシグナルキャリブレーターを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができる標的タンパク質断片のセットが開示される。
【０３８７】
さらに、予め定められた量のレポーターシグナルキャリブレーターをそれぞれ含むレポーターシグナルキャリブレーターのセットのセットも開示される。
【０３８８】
少なくとも二つのレポーターシグナルキャリブレーターの量が異なるセット、及びそれぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの相対量が、タンパク質サンプル中にあると予想される、対応するそれぞれの標的タンパク質断片の相対量に基づくセットが開示される。
【０３８９】
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの量が同一であるセット、及び標的タンパク質断片とレポーターシグナルキャリブレーターを断片化により改変できるセットが開示される。
【０３９０】
光で開裂可能なアミノ酸の位置での切断により標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを改変することができるセット、及び標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを衝突セル内で断片化できるセットが開示される。
【０３９１】
標的タンパク質断片がアスパラギン−プロリン結合の位置で断片化可能なセットが開示される。
【０３９２】
さらに、タンパク質サンプルのプロテアーゼ消化により標的タンパク質断片を生産するセットも開示される。
【０３９３】
さらに、タンパク質サンプルのセリンプロテアーゼ消化により標的タンパク質断片を生産するセット、及びセリンプロテアーゼがトリプシンであるセット、及び光で開裂可能なアミノ酸の位置での切断により標的タンパク質断片が生産されるセットも開示される。
【０３９４】
共通する特性が質量電荷比であり、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターの質量、電荷又は質量と電荷の変化によりそれらを改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体の質量電荷比の差異によって標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を識別することができるセットが開示される。
【０３９５】
さらに、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なるレポーターシグナルキャリブレーターを含むレポーターシグナルキャリブレーターのセットも開示される。
【０３９６】
さらに、１０以上の異なるレポーターシグナルキャリブレーターを含むレポーターシグナルキャリブレーターのセットも開示される。
【０３９７】
さらに、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なる標的タンパク質断片含む標的タンパク質断片のセットも開示される。
【０３９８】
レポーターシグナルキャリブレーターがペプチドを含み、そのペプチドが、対応する標的タンパク質断片と同一の質量電荷比を持つセットが開示される。
【０３９９】
さらに、ペプチドが、対応する標的タンパク質断片と同一のアミノ酸組成を有するセットも開示される。
【０４００】
ペプチドが、対応する標的タンパク質断片と同一のアミノ酸配列を有するセット、及びそれぞれのペプチドが、対応する標的タンパク質断片と異なるアミノ酸配列を有するセットが開示される。
【０４０１】
さらに、それぞれのペプチドが不安定な又は開裂しやすい結合を異なる位置に有するセットも開示される。
【０４０２】
レポーターシグナルキャリブレーターが、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ポリマー、オリゴペプチド又はペプチド核酸であるセットが開示される。
【０４０３】
さらに、少なくとも一つの標的タンパク質断片が、少なくとも一つの修飾されたアミノ酸を含むセットも開示される。
【０４０４】
さらに、修飾されたアミノ酸が、リン酸化アミノ酸、アシル化アミノ酸又はグリコシル化アミノ酸であるセットも開示される。
【０４０５】
少なくとも一つの標的タンパク質断片が、修飾されたアミノ酸を含む標的タンパク質断片と、その修飾されたアミノ酸以外の点で同一であるセットが開示される。
【０４０６】
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターが、標的タンパク質断片のセットの中の標的タンパク質断片と共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、標的タンパク質断片のそれぞれを改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体のそれぞれを、標的タンパク質断片の他のすべての改変体から識別することができ、レポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができるレポーターシグナルキャリブレーターのセットが開示される。
【０４０７】
（ａ）それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターが、標的タンパク質断片のセットの中の標的タンパク質断片と共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、標的タンパク質断片のそれぞれを改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体のそれぞれを、標的タンパク質断片の他のすべての改変体から識別することができ、レポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができるレポーターシグナルキャリブレーターのセット、（ｂ）タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を生産するための一つ以上の試薬を含むキットであって、タンパク質シグニチャーを得るためのキットが開示される。
【０４０８】
それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターが、標的タンパク質断片のセットの中の標的タンパク質断片と共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、標的タンパク質断片のそれぞれを改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体のそれぞれを、標的タンパク質断片の他のすべての改変体から識別することができ、レポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができるレポーターシグナルキャリブレーターのセット及び標的タンパク質断片のセットを含む混合物が開示される。
【０４０９】
さらに、それぞれの標的タンパク質断片が、レポーターシグナルキャリブレーターのセットの中のレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、標的タンパク質断片のそれぞれを改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体のそれぞれを、標的タンパク質断片の他のすべての改変体から識別することができ、レポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができる標的タンパク質断片のセットも開示される。
【０４１０】
Ｄ．レポーターシグナル融合体
それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができる核酸分子のセットが開示される。
【０４１１】
さらに、それぞれの核酸分子がさらに発現配列を含むものであって、アミノ酸セグメントが発現できるように、その発現配列が機能できる状態でヌクレオチドセグメントに結合しているセットも開示される。
【０４１２】
さらに、発現配列が翻訳発現配列を含むセット、及び発現配列がさらに転写発現配列を含むセットも開示される。
【０４１３】
アミノ酸セグメントがインビトロで発現されるセット、及びアミノ酸セグメントがインビボで発現されるセット、及びアミノ酸セグメントが細胞培養中に発現される セットが開示される。
【０４１４】
さらに、それぞれの核酸分子の発現配列が異なっているセット、及び異なる発現配列が異なって調節されるセット、及び発現配列が同じように調節されるセット、及び複数の発現配列が、同一の発現カスケードの一部として発現される遺伝子の発現配列か、又は遺伝子に由来する発現配列であるセット、及びそれぞれの核酸分子の発現配列が同一であるセット、及び発現配列が同じように調節されるセット、及び少なくとも二つの核酸分子の発現配列が異なっているセット、及び少なくとも二つの核酸分子の発現配列が同一であるセットも開示される。
【０４１５】
それぞれの核酸分子がさらに複製配列を含むものであって、その複製配列により核酸分子の複製が可能となるセットが開示される。
【０４１６】
核酸分子がインビトロで複製されるセット、及び核酸分子がインビボで複製されるセット、並びに核酸分子が細胞培養中に複製されるセットが開示される。
【０４１７】
それぞれの核酸分子がさらに組み込み配列を含むセットが開示されており、ここで、組み込み配列によって、核酸分子の他の核酸への組み込みが可能となる。
【０４１８】
さらに、核酸分子が染色体に組み込まれているセット及び核酸分子が染色体の予め決定された位置に組み込まれているセットも開示される。
【０４１９】
さらに、一つ以上の核酸サンプル中で核酸を複製することにより核酸分子を生産するセットも開示される。
【０４２０】
さらに、プライマーのペアを用いて核酸を複製し、核酸分子の生産に用いられるプライマーのペアにおける最初のプライマーのそれぞれがレポーターシグナルペプチドをコード化しているヌクレオチド配列を含むセット、及びそれぞれの最初のプライマーがさらに発現配列を含むセット、及び最初のプライマーのそれぞれのヌクレオチド配列がエピトープタグをもコード化しているセットも開示される。
【０４２１】
それぞれのアミノ酸セグメントがさらにエピトープタグを含むセット、及びそれぞれのアミノ酸セグメントのエピトープタグが異なっているセット、及びそれぞれのアミノ酸セグメントのエピトープタグが同一であるセット、及び少なくとも二つのアミノ酸セグメントのエピトープタグが異なっているセット、並びに少なくとも二つのアミノ酸セグメントのエピトープタグが同一であるセットが開示される。
【０４２２】
それぞれのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが異なっているセット、及びそれぞれのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが同一であるセット、及び少なくとも二つのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが異なっているセット、並びに少なくとも二つのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが同一であるセットが開示される。
【０４２３】
核酸分子が細胞中に存在するセット、及びそれぞれの核酸分子が異なる細胞内に存在するセット、及びそれぞれの核酸分子が同一の細胞内に存在するセット、及びそれぞれの核酸分子がさらに発現配列を含むものであって、アミノ酸セグメントが発現できるように、発現配列が機能できる状態でヌクレオチドセグメントに結合しているセット、及びそれぞれの核酸分子の発現配列が異なるセット、及び発現配列が同じように調節されるセット、並びに複数の発現配列が、同一の発現カスケードの一部として発現される遺伝子の発現配列か、又は遺伝子に由来する発現配列であるセットが開示される。
【０４２４】
核酸分子が細胞の染色体内に組み込まれているセットが開示される。
【０４２５】
さらに、核酸分子が染色体の予め決定された位置に組み込まれているセットも開示される。
【０４２６】
染色体が人工染色体であるセットが開示される。
【０４２７】
核酸分子がプラスミドか又はプラスミド内に組み込まれているセットが開示される。
【０４２８】
さらに、細胞が細胞系に属するセットも開示される。
【０４２９】
さらに、それぞれの核酸分子が異なる細胞系内に存在するセット及びそれぞれの核酸分子が同一の細胞系内に存在するセットも開示される。
【０４３０】
核酸分子が生物体内に存在するセット、及びそれぞれの核酸分子が異なる生物体内に存在するセット、及びそれぞれの核酸分子が同一の生物体内に存在するセット、及びそれぞれの核酸分子がさらに発現配列を含むものであって、アミノ酸セグメントが発現できるように、発現配列が機能できる状態でヌクレオチドセグメントに結合しているセット、及びそれぞれの核酸分子の発現配列が異なるセット、及び発現配列が同じように調節されるセット、並びに複数の発現配列が、同一の発現カスケードの一部として発現される遺伝子の発現配列か、又は遺伝子に由来する発現配列であるセットが開示される。
【０４３１】
さらに、核酸分子が生物体の染色体内に組み込まれているセットも開示される。
【０４３２】
核酸分子が染色体の予め決定された位置に組み込まれているセットが開示される。
【０４３３】
さらに、染色体が人工染色体であるセットも開示される。
【０４３４】
核酸分子がプラスミドか又はプラスミド内に組み込まれているセットが開示される。
【０４３５】
さらに、それぞれの核酸分子が異なる生物体内に存在するセット、及びそれぞれの核酸分子が同一の生物体内に存在するセット、及び核酸分子が一つの生物体の細胞内に存在するセット、及び核酸分子が生物体の実質的にすべての細胞内に存在するセット、並びに核酸分子が生物体のいくつかの細胞内に存在するセットも開示される。
【０４３６】
アミノ酸セグメントが生物体の実質的にすべての細胞内で発現されるセット、及びアミノ酸セグメントが生物体のいくつかの細胞内で発現されるセットが開示される。
【０４３７】
それぞれのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっているセット、及びそれぞれのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが同一であるセット、及び少なくとも二つのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっているセット、及び少なくとも二つのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが同一であるセット、及び対象となっているタンパク質又はペプチドが関連性を有するものであるセット、及び対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一のカスケードで生成するタンパク質であるセット、及び対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一の条件の下で発現されるタンパク質であるセット、及び対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一の疾患に関連しているタンパク質であるセット、及び対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一の細胞のタイプに関連しているタンパク質であるセット、及び対象となっているタンパク質又はペプチドが同一の組織のタイプに関連しているタンパク質であるセット、並びに対象となっているタンパク質又はペプチドが同一の酵素経路中のタンパク質であるセットが開示される。
【０４３８】
レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むそれぞれの複数のアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントのセット、及びヌクレオチドセグメントのうちの一つにおけるアミノ酸セグメントの少なくとも二つの対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっているセット、及びヌクレオチドセグメントのうちの一つのアミノ酸セグメントの対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっているセット、及びヌクレオチドセグメントのそれぞれにおけるアミノ酸セグメントの少なくとも二つの対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっているセット、及びヌクレオチドセグメントのそれぞれにおけるアミノ酸セグメントの対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっているセットが開示される。
【０４３９】
単一の核酸分子からなるセット、及び単一の核酸分子からなるセットであって、核酸分子が複数のヌクレオチドセグメントを含み、それぞれがアミノ酸セグメントをコード化しているセット、及びレポーターシグナルペプチドと対象となっているタンパク質又はペプチドとの間の結合部近傍の開裂部位を含むアミノ酸セグメントのセット、及び開裂部位がトリプシン開裂部位であるセット、及び開裂部位がレポーターシグナルペプチドと対象となっているタンパク質又はペプチドとの間の結合部に位置するセットが開示される。
【０４４０】
それぞれのアミノ酸セグメントがさらに自己開裂セグメントを含んでいるセットが開示される。
【０４４１】
自己開裂セグメントが、レポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとの間に存在するセットが開示される。
【０４４２】
自己開裂セグメントがインテインセグメント（ｉｎｔｅｉｎ ｓｅｇｍｅｎｔ）であるセットが開示される。
【０４４３】
それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性によりレポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することができ、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸セグメントが変化し、それぞれのアミノ酸セグメントの改変体をアミノ酸セグメントの他の改変体から識別することができる核酸分子のセットが開示される。
【０４４４】
それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチドと対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、アミノ酸セグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸セグメントを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができる核酸分子のセットが開示される。
【０４４５】
それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、アミノ酸セグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸セグメントを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸セグメントが変化し、それぞれのアミノ酸セグメントの改変体をアミノ酸セグメントの他の改変体から識別することができる核酸分子のセットが開示される。
【０４４６】
それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、アミノ酸セグメントがそれぞれアミノ酸サブセグメントを含み、それぞれのアミノ酸サブセグメントが対象となっているタンパク質又はペプチドの一部と、レポーターシグナルペプチドのすべて又は一部とを含み、アミノ酸サブセグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸サブセグメントを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができる核酸分子のセットが開示される。
【０４４７】
それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチドと対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、アミノ酸セグメントがそれぞれアミノ酸サブセグメントを含み、それぞれのアミノ酸サブセグメントが対象となっているタンパク質又はペプチドの一部と、レポーターシグナルペプチドのすべて又は一部とを含み、アミノ酸サブセグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸サブセグメントを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸サブセグメントが変化し、それぞれのアミノ酸サブセグメントの改変体をアミノ酸サブセグメントの他の改変体から識別することができる核酸分子のセットが開示される。
【０４４８】
それぞれのアミノ酸セグメントがレポーターシグナルペプチドと対象となっているタンパク質又はペプチドとを含み、レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性によって、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することが可能であるアミノ酸セグメントのセットが開示される。
【０４４９】
さらに、アミノ酸セグメントがタンパク質又はペプチドであるセット、及びセットが単一のアミノ酸セグメントから成り、そのアミノ酸セグメントが複数のレポーターシグナルペプチドを含むセットも開示される。
【０４５０】
さらに、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができる核酸分子のセットを含む細胞も開示される。
【０４５１】
それぞれの細胞が核酸分子を含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができる細胞のセットが開示される。
【０４５２】
さらに、それぞれの細胞がさらに追加的な核酸分子を含むセット、及び単一の細胞から成るセットであって、その細胞が複数の核酸分子を含むセット、及び単一の細胞から成るセットであって、その細胞が核酸分子のセットを含み、核酸分子のセットが単一の核酸分子から成り、その核酸分子が複数の核酸セグメントをコード化しているセットも開示される。
【０４５３】
それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができる核酸分子のセットを含む生物体が開示される。
【０４５４】
それぞれの生物体が核酸分子を含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができる生物体のセットが開示される。
【０４５５】
さらに、それぞれの生物体がさらに追加的な核酸分子を含むセット、及び単一の生物体から成るセットであって、その生物体が複数の核酸分子を含むセット、及び単一の生物体から成るセットであって、その生物体が核酸分子のセットを含み、その核酸分子のセットが単一の核酸分子から成り、そしてその核酸分子が複数の核酸セグメントをコード化しているセットも開示される。
【０４５６】
方法
開示された方法は一つ又は複数の検体の高感度検出に有用である。一般的に、本方法はレポーターシグナルと称する特別の標識成分の使用を含み、このレポーターシグナルは検体と会合すること、検体に組み込まれること若しくは別の形式で検体と連結することが可能であり、又はこのレポーターシグナルは、検体とレポーターシグナルとの間に有意な会合を伴うことなく、検体と単に組み合わせて使用することが可能である。本方法のいくつかの態様において、レポーターシグナル（又はレポーターシグナルの誘導体）を検出すると、このようにして会合した検体の存在が示される。別の態様において、検体（又は検体の誘導体）はレポーターシグナル（又はレポーターシグナルの誘導体）と共に検出される。
【０４５７】
いくつかの方法の態様において、種々のレポーターシグナルの改変体を他のそれぞれの改変体から識別できるようにレポーターシグナルを改変することができる。一般的に複合体のレポーターシグナル部分の改変を介してレポーターシグナル／検体複合体を改変することができ、それによって種々のレポーターシグナルの改変体、レポーターシグナル／検体複合体の改変体又はその両者を、他のそれぞれの改変体から識別できることとなる。レポーターシグナル又はレポーターシグナル／検体複合体が断片化によって改変された場合、いずれか一つの、いくらかの又はすべての断片を他のそれぞれの断片から、その態様に依存して識別することができる。例えば、レポーターシグナルが二つの部分に断片化した場合、レポーターシグナルのいずれか一方又は両者の識別が可能となる。レポーターシグナル／検体複合体が（レポーターシグナル部分に開裂点を伴う）二つの部分に断片化した場合、レポーターシグナル断片、レポーターシグナル／検体断片又はその両者のいずれか一つの識別が可能となる。いくつかの態様において、断片化レポーターシグナルの一方の部分だけが検出されることとなり、そういうわけで、レポートされたシグナルのこの部分だけを識別する必要がある。
【０４５８】
いくつかの方法の態様において、セットの中に存在する２以上のレポーターシグナルが一つ以上の共通する特性、すなわち、共通する特性を有するレポーターシグナルを、共通する特性を欠く他の分子から識別すること及び／又は分離することを可能にする特性を有する場合に、レポーターシグナルのセットを使用することができる。他の態様において、セットの中に存在する２以上のレポーターシグナル／検体複合体が一つ以上の共通する特性、すなわち、共通する特性を有するレポーターシグナル／検体複合体を、共通する特性を欠く他の分子から識別すること及び／又は分離することを可能にする特性を有する場合に、レポーターシグナル／検体複合体のセットを使用することができる。さらに他の態様において、（複合化の前又は後で）検体の断片化が可能であり、それによりレポーターシグナル／検体断片複合体（これは断片複合体と称することがある）が得られる。これらのケースにおいては、セットの中に存在する２以上の断片複合体が一つ以上の共通する特性、すなわち、共通する特性を有する断片複合体を、共通する特性を欠く他の分子から識別すること及び／又は分離することを可能にする特性を有する場合に、断片複合体のセットを使用することができる。
【０４５９】
上記のように、複合体となっている間及び識別の間に、検体と複合化したレポーターシグナルを改変することができる。改変を行う前に、複合化した検体から複合化レポーターシグナルを全体的に又は部分的に解離又は分離することもできる。レポーターシグナルが検体から（全体的に又は部分的に）解離する場合には、検体とレポーターシグナルとの間の会合という事実が、レポーターシグナルが検出された時に得られる情報の一部分となるように、この方法を実施することができる。言い換えれば、検出のために検体からレポーターシグナルが解離してもよいという事実は、検出されたレポーターシグナルが検体と会合しているという情報を不明確にはしないということである。
【０４６０】
さらに、レポーターシグナルは検体と（例えば、レポーターシグナルと検体との混合物の状態で）共存することも、又は単独で存在することも可能であり、前者の場合はレポーターシグナルと検体との間の顕著な物理学的会合は生じず、後者の場合は検体は存在しない。このようなケースにおいて、レポーターシグナルは検体と会合しないか又はもはや会合することはなく、セットの中に存在する２以上のレポーターシグナルが、一つ以上の共通する特性、すなわち、共通する特性を有するレポーターシグナルを、共通する特性を欠く他の分子から識別すること及び／又は分離することを可能とする特性を有する場合において、レポーターシグナルのセットを用いることができる。
【０４６１】
好ましい態様において、開示された方法には二つの基本的な工程が含まれる。存在するかもしれない他の分子からレポーターシグナルを分離するためのフィルタリング、選択、すなわち分離工程と、種々のレポーターシグナルを識別する検出工程。好ましくは、いくつかの共通する特性に基づいて、レポーターシグナルを他の分子と識別及び／又は分離する。ここで、この共通する特性はレポーターシグナルには共有されているものの、そこにあるたいていの（又は好ましくはすべての）他の分子には含まれていない。次いで、種々のレポーターシグナルを識別できるように、分離後のレポーターシグナルの処理及び／又は検出を行う。開示された方法の有用な態様は、レポーターシグナルを対象となっている検体と会合させることを含む。レポーターシグナルの検出の結果、それに対応する検体が検出される。このように、開示された方法は検体の標識化及び検出のための一般的な技術である。
【０４６２】
開示された方法の好ましい態様には、他の分子からの、質量電荷比に基づく同重体レポーターシグナルのフィルタリング、レポーターシグナルの断片化とそれによる種々の質量を有する断片の産生、及び質量電荷比に基づく種々の断片の検出が含まれる。タンデム質量分析装置を用いてこの方法を実施することが最も好ましい。タンデム質量分析装置には二つのタイプがあり、これらのタイプのハイブリッド型及び連結型と同じく：「タンデムインスペース（ｔａｎｄｅｍ ｉｎ ｓｐａｃｅ）」分析装置及び「タンデムインタイム（ｔａｎｄｅｍ ｉｎ ｔｉｍｅ）」分析装置がある。タンデムインスペース分析装置は空間的に整えられたエレメントを利用し、それぞれのエレメントを通過したイオンに順番に作用する。タンデムインタイム分析装置は、ある空間内に含まれている時のイオンについて、時間的に整えられた操作を利用する。タンデムインスペースの部類の装置において、同重体レポーターシグナルが最初に四重極フィルタリングを通過し、レポーターシグナルが（好ましくは衝突セル中で）断片化し、そして飛行時間（ＴＯＦ）段階にて断片を識別し検出する。このような装置において、サンプルがイオン源で（例えば、ＭＡＬＤＩで）イオン化され、荷電イオンを生ずる。最初に一価の親イオンが生ずるとなるイオン化条件が好ましい。最初の四重極、Ｑ０はラジオ周波数（ＲＦ）モードのみで操作され、そしてすべての荷電粒子のためのイオンガイドとして機能する。次の四重極、Ｑ１はＲＦ＋ＤＣモードで操作され、（レポーターシグナルの質量電荷比を含む）狭い範囲の質量電荷比のみが通過する。この四重極により、対象となっている質量電荷比が選択される。四重極Ｑ２は衝突セルに囲まれ、ＲＦモードのみで操作されてイオンガイドとして機能する。Ｑ２を囲んでいる衝突セルをガスで適切な圧力に満たすことができ、衝突誘起解離によって進入してきたイオンを破壊する。衝突ガスは化学的に不活性なものが好ましいが、反応性のガスを使用することも可能である。開裂しやすい結合、不安定な結合又はこれらの組み合わせを含み、これらの結合がＱ２衝突セルの中で優先的に破壊されるようなレポーターシグナルを活用する分子システムが好ましい。
【０４６３】
同一のサンプルを（衝突ガス有りで及び無しで操作することにより）断片化して及び断片化すること無く分析することができ、その結果、検出された質量電荷比のシフトを比較する。断片化していない結果及び断片化した結果の両方から、含まれるレポーターシグナル（及び検体）を確認する特徴的なピークが得られるはずであり、ここで、この特徴的なピークは、断片化によるピーク及び断片化無しのピークの両方の組み合わせを伴っている。このような特徴的なピークは、同重体レポーターシグナルの適切なセットを用いることによって得られ、そしてそれにより、検体の検出を大きな規模で多重化することが可能となる。
【０４６４】
開示された方法は、ＭＡＬＤＩ−ＱｑＴＯＦ質量分析装置での使用に特に適している。本方法により、極めて高感度で、高度に多重化された検体の検出が可能となる。好ましいタンデム質量分析装置は、ロボダ（Ｌｏｂｏｄａ）ら、ＭＡＬＤＩ−ＱｑＴＯＦ質量分析装置の設計と性能、第４７回ＡＳＭＳ会議、ダラス、テキサス州（１９９９）；ロボダら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． １４ （１２）： １０４７−１０５７ （２０００）；シェフチェンコら、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７２： ２１３２−２１４２ （２０００）及びクルチンスキーら、Ｊ． Ａｍ． Ｓｏｃ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．， １１ （６）： ４９３−５０４ （２０００）に記載されている。このような装置において、サンプルを（例えばＭＡＬＤＩ）源にてイオン化し、荷電イオンを生成させる。主に一価の親イオンが生ずることとなるイオン化条件が好ましい。最初と三番目の四重極、ＱＯ及びＱ２はＲＦモードのみで操作され、そしてすべての荷電粒子のためのイオンガイドとして機能し、二番目の四重極Ｑ１はＲＦ＋ＤＣモードで操作され、特定の質量電荷比（すなわち、実用上は狭い範囲の質量電荷比）のみが通過する。この四重極により、対象となっている質量電荷比（ｍ／ｚ）が選択される。Ｑ２を囲んでいる衝突セルはガスで適切な圧力に満たすことができ、進入してきたイオン衝突誘起解離によってを破壊する（通常、衝突ガスは化学的に不活性なものであるが、反応性のガスも検討される）。開裂しやすい結合、不安定な結合又はこれらの組み合わせを含み、これらの結合がＱ２衝突セルの中で優先的に破壊されるようなレポーターシグナルを活用する分子システムが好ましい。
【０４６５】
開示された方法にとってはＭＡＬＤＩ源が好ましい。というのは、不均一な環境、例えば、アレイ、ビーズ、微細加工されたデバイス、組織サンプルなど、からのサンプルの多重分析を容易化するからである。このような装置の一例は、クインら、マトリックス支援レーザー脱離イオン化によるペプチド分析のための実用的なイオントラップ型質量分析装置、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ６８： １７８４−１７９１ （１９９６）に記載されている。均一なものの測定のためには、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）源が非常に役に立つ。ＬＣシステムと接続しているエレクトロスプレーイオン化源装置は市販されている（例えば、ピーイー−サイエックス（ＰＥ−ＳＣＩＥＸ）社のＱＳＴＡＲ、マイクロマス（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）社のＱ−ＴＯＦなど）。ＥＳＩ源は多価の荷電イオンを生成する傾向があり、二価の荷電イオンが開示された方法で最も共通するイオンとなることから、ＥＳＩ源の操作には注意すべきである。このような二価の荷電イオンは技術的に十分に知られており、開示された方法を制限するものではない。ＴＯＦアナライザー及び四重極アナライザーは、扇状アナライザーよりも好ましいディテクターである。フーリエ変換イオンサイクロトロ共鳴（ＦＴ−ＩＣＲ）質量分析装置のようなタンデムインタイムイオントラップシステムも、開示された方法で用いても構わない。
【０４６６】
多数の因子が開示された方法の感度に寄与する。フィルター四重極、Ｑ１は狭い質量電荷比を選択し、他の質量電荷を持つイオンを排除し、不適切なイオンからのバックグラウンドを顕著に減少させる。例えば、３０００ダルトンの幅の質量電荷分布とし、この分布に２ダルトンの質量電荷の透過窓を適用することで、信号対雑音が少なくとも３０００／２＝１５００の係数まで向上させることができる。いったん四重極Ｑ１によって親イオンが選択されれば、親イオンの断片化、好ましくは一価に荷電した娘イオンへの断片化は、親が多数の娘イオンに断片化するというシステムよりも有利である。例えば、２０の娘イオンに断片化する一つの親は、親イオンの強度が平均で２０分の１というシグナルを与えることになる。一つの親が一つの娘になるシステムについては、このシグナルの希釈化は生じないだろう。
【０４６７】
開示された方法で利用するためのこの好ましいシステムは高い負荷サイクルであり、それ自体で良好な統計値を速やかに得ることができる。（多重標識化タンパク質を伴う複雑なタンパク質サンプルの一回の走査分析については、このような走査は有用であるにもかかわらず）同重体の親の単一のセットを用いるケースに関して、フィルター四重極での走査をすることなく多重化検出が達成される。エレクトロスプレー源は連続して機能することが可能であり、ＭＡＬＤＩ源は数ｋＨｚにて機能することが可能であり、四重極は連続して機能し、飛行時間アナライザーは対象の質量電荷の全領域を数ｋＨｚの繰返し率で捕獲することができる。このようにして、システム全体で１秒あたり数千の測定値を得ることが可能である。多重化測定についての処理能力の利点に関しては、飛行時間アナライザーは、最後の段階については四重極アナライザーよりも優れている。というのは、四重極アナライザーでは、イオンの始めから終わりまでの範囲を走査する（又はイオンを階段状に並べる）必要があるのに対して、飛行時間アナライザーはすべてのフラグメントイオンを同時に捕獲して検知するからである。
【０４６８】
１つ（又は複数）の追加されたレーザーによるタンパク質の横断を可能とする、飛行経路に沿ったレーザーの引き込み口の追加を含む装置の改良は、光化学作用及び光物理的作用を介してのさらなる断片化（例えば、選択的な結合の切断、選択的イオン化など）への道を切り開く。フィルター段階の後に、レーザーを用いてタンパク質を断片化することは、極めて高い処理能力のＴＯＦ−ＴＯＦ装置（５０ｋＨｚ〜１００ｋＨｚシステム）の使用を可能ならしめるであろう。
【０４６９】
開示された方法は、多段階検出システムの最初の段階に採用する前のサンプルを単純化するための、大量のサンプルの切断、処理又は断片化を含む技術と両立できる。開示された方法はさらに、未加工の抽出物や分画サンプルなどのあらゆる所望のサンプルに適合する。
【０４７０】
Ａ．レポーター分子の標識化
レポーター分子の標識化と称する開示された方法の一つの態様においては、レポーターシグナルが検体と会合して検出され及び／又は定量される。例えば、レポーターシグナルを、対象となっている検体と相互作用する特異的結合分子と会合させてもよい。このような組み合わせをレポーター分子と称する。レポーター分子における特異的結合分子は検体と相互作用し、それによりレポーターシグナルと検体とが会合する。あるいは、レポーターシグナルを検体と間接的に会合させてもよい。この方式では、特異的結合分子とコーディングタグとを含む「コーディング」分子を（特異的結合分子を介して）検体と会合させる。あるいは、コーディングタグを検体と結合させたり、又は直接的に会合させてもよい。次いで、デコーディングタグと会合したレポーターシグナル（このような組み合わせはレポーター分子の別の形態である）を、コーディングタグとデコーディングタグとの間の相互作用を介してそのコーディング分子と会合させる。この相互作用の一例はハイブリダイゼーションであり、ここではコーディングタグとデコーディングタグとが相補的核酸配列である。結果は、レポーターシグナルと検体との間接的な会合である。同一のタイプのコーディングタグ及びデコーディングタグを使うことによって、セット中にあるコーディング分子及びレポーター分子のすべてについての、レポーターシグナルとコーディング分子とのすべての相互作用を化学的かつ物理的に同等にすることができるという利点をこの方式は有する。
【０４７１】
開示された方法は、対象となっている検体の検出の感度と正確さとを向上させる。開示された方法の好ましい態様は、多段階検出システムを利用して、類似性の高い特性を有する分子の検出分解能を向上させる。本方法は少なくとも二つの段階を含む。最初の段階は、レポーターシグナルに固有の特性に基づいて、レポーターシグナル（すなわち、そこにある分子のサブセット）の通過又は選択を可能とするフィルトレーション又は選択であり、他のすべての分子は排除される。次に続く１つ（又は複数）の段階で、最初の段階でフィルターを通過したレポーターシグナルのさらなる分離及び／又は検出を行う。この方法の鍵となる一面は、レポーターシグナルの多重セットがフィルターで選択され、続いて切断され、分解され、反応し又は他のやり方で修飾されて、さらなる段階にてレポーターシグナルの正体及び／又は量を理解する、というものである。特異的結合分子と検出された娘断片との間には対応関係がある。
【０４７２】
Ｂ．レポーターシグナルの標識化
レポーターシグナルの標識化と称する開示された方法の別の態様は、レポーターシグナル、標識化検体若しくはその両者を検出することにより、又は種々のレポーターシグナル、種々の標識化検体若しくはその両者を識別することにより、検体を検出することを含む。レポーターシグナルの検出の結果、対応する標識化検体（ここで、検体はレポーターシグナルで標識されている）が検出されることとなる。標識化検体の検出の結果、対応する検体が検出されることとなる。このように、レポーターシグナルの標識化は標識化、検出及び検体の定量のための一般的な技術である。
【０４７３】
一つの態様において、開示された方法には二つの基本的な工程が含まれる。存在するかもしれない他の分子から、標識化検体を分離するためのフィルタリング、選択、すなわち分離工程と、レポーターシグナル、標識化検体若しくはその両方を検出する；又は種々のレポーターシグナル、種々の標識化検体若しくはその両方を識別する検出工程。好ましくは、いくつかの共通する特性に基づいて、標識化検体を他の分子と識別及び／又は分離する。ここで、この共通する特性は結合したレポーターシグナルには共有されているものの、そこにあるたいていの（又は好ましくはすべての）他の分子には含まれていない。標識化検体の全体に共通する特性、例えば標識化検体の質量電荷比、に基づいて、標識化検体を他の分子と識別及び／又は分離することもできる。次いで、種々のレポーターシグナル、種々の標識化検体又はその両方が識別可能となるやり方で、分離後の標識化検体の処理及び／又は検出を行う。
【０４７４】
レポーターシグナルを検体と結合させてもよく、又は直接会合させてもよい。例えば、レポーターシグナルを反応性基を介して検体と結合させることや、又は（特異的結合分子及びレポーターシグナルから成る）レポーター分子を検体と会合させることができる。あるいは、レポーターシグナルを検体と間接的に会合させてもよい。この方式では、特異的結合分子とコーディングタグとを含む「コーディング」分子を（特異的結合分子を介して）検体と会合させることができる。あるいは、コーディングタグを検体と結合させたり、又は直接的に会合させてもよい。次いで、デコーディングタグと会合したレポーターシグナル（このような組み合わせはレポーター分子の別の形態である）を、コーディングタグとデコーディングタグとの間の相互作用を介してそのコーディング分子と会合させる。この相互作用の一例はハイブリダイゼーションであり、ここではコーディングタグとデコーディングタグとが相補的核酸配列である。結果は、レポーターシグナルと検体との間接的な会合である。同一のタイプのコーディングタグ及びデコーディングタグを使うことによって、セット中にあるコーディング分子及びレポーター分子のすべてについての、レポーターシグナルとコーディング分子とのすべての相互作用を化学的かつ物理的に同等にすることができるという利点をこの方式は有する。
【０４７５】
さらに、レポーターシグナル又はレポーターシグナルを含む構築物もライゲーションによって検体に取り付けたり又は結合させることができる。核酸のライゲーションの方法はよく知られており（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、１９８９、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨークを参照すること）、効率的なタンパク質のライゲーションも知られている（例えば、ドーソン（Ｄａｗｓｏｎ）ら、「ネイティブ化学ライゲーションによるタンパク質の合成」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６， ７７６−９ （１９９４）、ハッケング（Ｈａｃｋｅｎｇ）ら、「マルチドメインタンパク質の化学合成と自発的フォールディング：抗凝血性微小タンパク質Ｓ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７： １４０７４−８ （２０００）、ドーソンら、「化学ライゲーションによる天然タンパク質の合成」Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６９： ９２３−９６０ （２０００）、米国特許第６，１８４，３４４号、ＰＣＴ公開公報ＷＯ ９８／２８４３４号を参照すること）。
【０４７６】
開示された方法を多くの方式で使用することができる。例えば、開示された方法は、（一つの特定のサンプル中若しくは複数のサンプル中にある）一つの特定の検体の検出又は（単一のサンプル若しくは複数のサンプル中にある）複数の検体の検出に使用することができる。それぞれのケースにおいて、他の標識されていない検体から、又は１つ（又は複数）の検出される標識化検体の有する特性を欠く分子から、検出される１つ（又は複数）の検体を分離することができる。例えば、サンプル中の検体をレポーターシグナルで一般的に標識化することができ、いくつかの検体をその検体の有するいくつかの特性を基礎として分離することができる。例えば、分離された検体はある特定の質量電荷比を持つことができるであろう（質量電荷比に基づく分離によって選択された質量電荷比を持つ標識化検体及び標識されていない検体の両方が選択されることになる）。別の例としては、例えば、アフィニティータグなどのレポーターシグナルの特徴に基づいて、標識されていない分子から標識化検体のすべてを識別及び／又は分離することができる。種々のアフィニティータグを用いる場合、いくつかの標識化検体を他のものから識別及び／又は分離することができる。
【０４７７】
開示された方法の一つの方式では、複数のサンプル中の複数の検体が標識され、そこでは、ある特定のサンプル中の検体のすべてが、同一のレポーターシグナルで標識される。すなわち、一つのサンプル中の検体の一般的な標識としてレポーターシグナルが使用される。しかしながら、それぞれのサンプルごとに、一つの異なるレポーターシグナルを用いる。このことにより、サンプル全体として、他のサンプルのそれぞれと比較することが可能となる。さらに、サンプル中の種々の検体を分離又は識別することにより、単一の測定で多数のサンプル中の検体を容易に分析することができる。例えば、複数のサンプル中のタンパク質を上記のようにレポーターシグナルで標識化することができ、そしてサンプルを一緒に混合した。種々の標識化タンパク質のうちのいくつか又はすべてを、例えば、タンパク質と抗体とをアレイ上で会合させることなどによって分離すれば、それぞれのアレイエレメントに存在するレポーターシグナルを同定することによって、それぞれのサンプル中のある特定のタンパク質の存在と量とを測定することができる。ある特定のアレイエレメントに対応するタンパク質が特定のサンプル中に存在したならば、次いで、そのアレイエレメントと会合したタンパク質のいくつかが、その特定のサンプルの標識化に使用したレポーターシグナルで標識されることとなる。そのレポーターシグナルの検出はこのことを示すであろう。これと同一の関係は他のサンプルのすべてについて当てはまる。さらに、検出されたレポーターシグナルの量から、ある特定のサンプル中のある特定のタンパク質の量を示すことができ、複数のサンプル中のタンパク質を同時に定量することによって、様々なサンプル中のタンパク質のレベルのとりわけ正確な比較検討を行うことができる。
【０４７８】
必要に応じて、選択段階に先立って、標識化検体又は標識化予定の検体を含む検体のサブセットをサンプル中の他の成分から分離するという分画段階があってもよい。このような段階は、たとえ必要がなくとも、そこにある無関係な分子の数を減少させることで選択段階を改善することができる。
【０４７９】
開示された方法の好ましい態様には、質量電荷比に基づく他の分子からの同重体標識化検体のフィルタリング、種々の質量電荷比を持つ断片を生じさせるレポーターシグナルの断片化、及び質量電荷比に基づく種々の断片の検出が含まれる。この種々の断片は、レポーターシグナルの断片と（検体とレポーターシグナルの残りの部分とで構成される）断片化標識化検体とを含むこととなる。これらのいずれか一方、又は両方が検出されるかもしれず、これらは最初の標識化検体の指標となる。本方法をタンデム質量分析装置を用いて実施することが最も好ましい。このような装置では、まず最初に同重体レポーターシグナルをフィルタリングし、次いでレポーターシグナルを（好ましくは衝突により）断片化し、断片を識別して検出する。
【０４８０】
開示された方法の好ましい態様には、同一の測定における二以上のサンプル中の標識化検体の検出が含まれる。これにより、サンプル中の検体間の違いを単純かつ矛盾なく検出することが可能となる。それぞれのサンプル中で種々のレポーターシグナルを用いて検体を標識することによって、差異に基づく検出を成し遂げる。種々のサンプルについて用いられる種々のレポーターシグナルが同重体セットを構成するようになることが好ましい。このようにして、それぞれのサンプル中にある同一の標識化検体は、種々のサンプル中の標識化検体と同一の質量電荷比を持つことになる。しかしながら、レポーターシグナルの断片化の際に、種々のサンプル中にある断片化標識化検体のそれぞれが異なる質量電荷比を持つことになり、そしてそれゆえに、それぞれが別々に検出されることがあり得る。すべてを同一の計測で検出することが可能である。このことは、時間とデータの質の両方に関する計り知れない利点である。例えば、サンプルを一回の作業で測定するために、種々の作業で測定された種々のサンプルについての結果の補正又は標準化を行う必要がない。このことによって、異なるサンプル中にある同一の検体についての相対量の正確な比較を行うことができる。というのは、同一の作業で種々のサンプルを測定するからである。サンプル間に不一致を引き起こすような違いは見られないだろう。
【０４８１】
開示された方法のこの複数サンプル方式については、サンプルの時系列分析に使用することが好ましい。このような系列は、サンプル又は反応の期間の終わりまでの変化を検出するために有用である。例えば、試験化合物添加後から、期間の終わりまでの細胞培養における検体レベルの変化を測定することができる。この方式において、異なる時点のサンプルは異なるレポーターシグナルで標識され、同重体セットを構成することが好ましい。このようにして、それぞれの時点についての同一の標識化検体は、異なる時点からの標識化検体と同一の質量電荷比を持つことになる。しかしながら、レポーターシグナルの断片化の際に、異なる時点からの断片化標識化検体のそれぞれが異なる質量電荷比を持つことになり、そしてそれゆえに、それぞれが別々に検出されることがあり得る。
【０４８２】
開示された方法を、未知の検体に関する情報の収集及びその目録化に使用することもできる。この検体発見方式により、検体の存在又はパターンをそれらの分析と容易に関連付けることができる。例えば、標識化検体のサンプルを一つ以上の他のサンプル中にある検体と比較することができる。一つ又はいくつかのサンプル中で現れたが他のサンプル中ではそうではないという検体を、通常の技術を用いて分析することができる。開示された標識化、検出及び定量方法によって、目的の検体を他のものと区別できるようになる。質量分析方法を用いて本方法のこの方式を実施することが好ましい。
【０４８３】
開示された方法は、対象となっている検体の検出の感度と正確さとを向上させる。開示された方法の好ましい態様は、多段階検出システムを利用して、類似性の高い特性を有する分子の検出分解能を向上させる。本方法は少なくとも二つの段階を含むことができる。最初の段階は、レポーターシグナル（及び結合した検体）に固有の特性に基づいて、標識化検体（すなわち、そこにある分子のサブセット）の通過又は選択を可能とするフィルトレーション又は選択であり、他のすべての分子は排除される。次に続く１つ（又は複数）の段階で、最初の段階でフィルターを通過した標識化検体のさらなる分離及び／又は検出を行う。この方法の鍵となる一面は、標識化検体の多重セットがフィルターで選択され、続いて結合したレポーターシグナルが切断され、分解され、反応し又は他のやり方で修飾されて、さらなる段階にて、断片化レポーターシグナル及び／又は断片化標識化検体の正体及び／又は量を理解する、というものである。レポーターシグナルと検出された１つ（又は複数）の娘断片との間には対応関係がある。
【０４８４】
いくつかの態様において、開示された方法によって、検体の複雑なサンプルを迅速かつ容易に再現性の高い様式で目録化することができる。このような目録を、同様に作成された別の検体サンプルの他の目録と比較することができ、それによりサンプル間の差異を都合よく検出することが可能となる。目録、これは検体サンプルに関する意味のある情報を組み込んでいる、は、関連する検体サンプルの検出と検体サンプルの比較との両方に用いることができるサンプルの指紋として役に立つことができる。例えば、その試験生物体の検体の目録を作成し、そして得られた目録を既知の生物体から作成された基準目録と比較することによって、特定の生物体の存在又は正体を検出することができる。種々の細胞サンプルから検体の目録を作成し、その目録を比較することにより、検体パターンの変化及び差異も検出することができる。例えば、質量分析によって得ることができる優れた分解能により、作成された検体の目録を開示された方法とを比較することが容易になる。
【０４８５】
開示された方法で処理されるそれぞれの標識化検体は、結果として標識化検体の特徴（例えば質量電荷比）に基づいたシグナルを生じさせることになる。複雑な検体サンプルは独特のシグナルのパターンを形成することができる。検体サンプルの独特の目録形成と、種々の検体サンプルから産するシグナルのパターンの鋭敏かつ説得力のある比較検討とを可能にするのはこのパターンである。
【０４８６】
種々の標識化検体の存在、量、存在および量又は欠如は、その検体のシグナチャー又は指紋を、そしてそれゆえにサンプル中にある特定の検体又は検体断片の存在又は欠如に基づく検体サンプルの署名又は指紋を提供するシグナルのパターンを形成する。この理由から、このシグナルのパターン（すなわち、標識化検体の存在のパターン、量のパターン、存在および量のパターン又は、欠如のパターン）の目録作成は、開示された方法のすなわち特定の対象の一つの態様である。
【０４８７】
例えば、標識化検体のパターン、標識化検体の存在のパターン、標識化検体の目録又はサンプル中の検体の目録から目録が構成され得、あるいはそれらを目録ということができる。目録中の情報は質量電荷情報又は組成情報の形式となっていることが好ましい。目録にはさらに、開示された方法により生じた情報（例えば検出された検体の正体）に由来するその他の情報を含んでいてもよく、それらから構成されていても構わない。そして目録は、あらゆる他の源から得られた情報又はその源により生じた情報を加えてもよい。開示された方法を用いて形成された目録の情報上の本質は、既知のバイオインフォマティクスのシステム及び方法を用いた組み合わせ及び／又は分析の役に立つ。
【０４８８】
検体サンプルのこのような目録を、任意の他のサンプルに由来する類似の目録と比較することができ、それによりサンプル中の類似点と相違点とを検出する（これはサンプル中の検体の類似点と相違点とを示す）。例えば、最初の検体サンプルの目録を、最初の検体サンプルと同一のタイプの生物体からのサンプルの目録と、最初の検体サンプルと同一のタイプの組織からのサンプルの目録と、最初の検体サンプルと同一の生物体からのサンプルの目録と、最初の検体サンプルと同一の起源から得られたサンプルであるが時間が異なるサンプルの目録と、最初の検体サンプルとは異なる生物体からのサンプルの目録と、最初の検体サンプルとは異なるタイプの組織からのサンプルの目録と、最初の検体サンプルとは異なる系統の生物体からのサンプルの目録と、最初の検体サンプルとは異なる種の生物体からのサンプルの目録と、又は最初の検体サンプルとは異なるタイプの生物体からのサンプルの目録と比較することができる。
【０４８９】
同一のタイプの組織とは、例えば（同一若しくは異なる生物体からのものでも又は同一若しくは異なるタイプの生物体からのものでもかまわない）肝組織、筋肉組織又は皮膚のような同一のタイプの組織である。同一の生物体とは、同一の個体、動物又は細胞を指す。例えば、一人の患者から選ばれる二つのサンプルは同一の生物体からのものである。同一の起源とは似ているがより広範囲であり、例えば、同一の生物体、同一の生物体からの同一の組織、同一の検体又は同一の検体サンプルからのサンプルを指す。同一の起源からの比較予定のサンプルを異なる時点で集めることができる（それゆえに、期間の最後までに起こり得る変化を検出することが可能となる）。処理又は条件変化の影響を測定する場合に、これはとりわけ有用である。同一の起源からの異なる処理を受けたサンプルを集めて、開示された方法を用いて比較することもできる。異なる生物体とは、例えば異なる患者、異なる個体の動物などの異なる個体の生物体を指す。異なる生物体には、同一のタイプの異なる生物体又は異なるタイプの生物体が含まれる。異なるタイプの生物体とは、例えば、イヌとネコ、ヒトとマウス又は大腸菌とサルモネラ菌などの異なるタイプの生物体を指す。異なるタイプの組織とは、例えば、肝臓と腎臓又は皮膚と脳などの異なるタイプの組織を指す。異なる系統の生物体又は異なる種の生物体とは、これらの用語が技術的に理解されるような意味の種又は系統の異なる生物体を指す。
【０４９０】
関係のあるサンプルから得られる検体の目録を比較すると、標識化検体とそれらの改変体との関連性を有するペアのサブセットの存在を確認することができる。もともとの標識化検体（及びその特徴を調べるために）並びに標識化検体の改変体を検出するために、開示された方法を用いることができる。検出された検体のこの部分は、標識された（たとえ必ずしも独自性がなくとも）特異的なレポーターシグナルが用いられる検体の特徴となる。
【０４９１】
１．レポーターシグナルタンパク質の標識化
レポーターシグナルタンパク質の標識化と称するレポーターシグナルの標識化の一つの態様は、レポーターシグナル、標識化タンパク質若しくはその両者を検出することにより、又は種々のレポーターシグナル、種々の標識化タンパク質若しくはその両者を識別することにより、タンパク質を検出することを含む。レポーターシグナルの検出の結果、対応する標識化タンパク質が検出されることとなる。標識化タンパク質の検出の結果、対応するタンパク質が検出されることとなる。このように、開示された方法は標識化、検出及びタンパク質の定量のための一般的な技術である。
【０４９２】
一つの態様において、開示された方法には二つの基本的な工程が含まれる。存在するかもしれない他の分子から、標識化タンパク質を分離するためのフィルタリング、選択、すなわち分離工程と、レポーターシグナル、標識化タンパク質若しくはその両方を検出する；又は種々のレポーターシグナル、種々の標識化タンパク質若しくはその両方を識別する検出工程。好ましくは、いくつかの共通する特性に基づいて、標識化タンパク質を他の分子と識別及び／又は分離する。ここで、この共通する特性は結合したレポーターシグナルには共有されているものの、そこにあるたいていの（又は好ましくはすべての）他の分子には含まれていない。標識化タンパク質の全体に共通する特性、例えば標識化タンパク質の質量電荷比、に基づいて、標識化タンパク質を他の分子と識別及び／又は分離することもできる。次いで、種々のレポーターシグナル、種々の標識化タンパク質又はその両方が識別可能となるやり方で、分離後の標識化タンパク質の処理及び／又は検出を行う。
【０４９３】
開示された方法を多くの方式で使用することができる。例えば、開示された方法は、（一つの特定のサンプル中若しくは複数のサンプル中にある）一つの特定のタンパク質の検出又は（単一のサンプル若しくは複数のサンプル中にある）複数のタンパク質の検出に使用することができる。それぞれのケースにおいて、他の標識されていないタンパク質から、又は１つ（又は複数）の検出される標識化タンパク質の有する特性を欠く分子から、検出される１つ（又は複数）のタンパク質を分離することができる。例えば、サンプル中のタンパク質をレポーターシグナルで通常に標識化することができ、いくつかのタンパク質をそのタンパク質の有するいくつかの特性を基礎として分離することができる。例えば、分離されたタンパク質はある特定の質量電荷比を持つことができるであろう（質量電荷比に基づく分離によって選択された質量電荷比を持つ標識化タンパク質及び標識されていないタンパク質の両方が選択されることになる）。別の例としては、例えば、アフィニティータグなどのレポーターシグナルの特徴に基づいて、標識されていない分子から標識化タンパク質のすべてを識別及び／又は分離することができる。種々のアフィニティータグを用いる場合、いくつかの標識化タンパク質を他のものから識別及び／又は分離することができる。
【０４９４】
必要に応じて、選択段階に先立って、標識化タンパク質又は標識化予定のタンパク質を含むタンパク質のサブセットをサンプル中の他の成分から分離するという分画段階があってもよい。例えば、選択段階の前に、細胞サンプル中の他のタンパク質からＳＨ２ドメインを持つタンパク質を分離することができる。このような段階は、たとえ必要がなくとも、そこにある無関係な分子の数を減少させることで選択段階を改善することができる。
【０４９５】
開示された方法の好ましい態様には、質量電荷比に基づく他の分子からの同重体標識化タンパク質のフィルタリング、種々の質量電荷比を持つ断片を生じさせるレポーターシグナルの断片化、及び質量電荷比に基づく種々の断片の検出が含まれる。この種々の断片は、レポーターシグナルの断片と（タンパク質とレポーターシグナルの残りの部分とで構成される）断片化標識化タンパク質とを含むこととなる。これらのいずれか一方、又は両方が検出されるかもしれず、これらは最初の標識化タンパク質の指標となる。本方法をタンデム質量分析装置を用いて実施することが最も好ましい。このような装置では、まず最初に同重体レポーターシグナルをフィルタリングし、次いでレポーターシグナルを（好ましくは衝突により）断片化し、断片を識別して検出する。
【０４９６】
同一のサンプルを（衝突ガス有りで及び無しで操作することにより）断片化して及び断片化すること無く分析することができ、その結果、検出された質量電荷比のシフトを比較する。断片化していない結果及び断片化した結果の両方から、含まれるタンパク質（及びレポーターシグナル）の同一性を確認する特徴的なピークが得られるはずであり、ここで、この特徴的なピークは、断片化によるピーク及び断片化無しのピークの両方の組み合わせを伴っている。このような特徴的なピークは、同重体レポーターシグナルの適切なセットを用いることによって得られ、そしてそれにより、タンパク質の検出を大きな規模で多重化することが可能となる。
【０４９７】
開示された方法の好ましい態様には、同一の測定における二以上のサンプル中の標識化タンパク質の検出が含まれる。これにより、サンプル中のタンパク質間の違いを単純かつ矛盾なく検出することが可能となる。それぞれのサンプル中で異なるレポーターシグナルを用いてタンパク質を標識することによって、差異に基づく検出を成し遂げる。異なるサンプルについて用いられる異なるレポーターシグナルが同重体セットを構成するようになることが好ましい。このようにして、それぞれのサンプル中にある同一の標識化タンパク質は、異なるサンプル中の標識化タンパク質と同一の質量電荷比を持つことになる。しかしながら、レポーターシグナルの断片化の際に、異なるサンプル中にある断片化標識化タンパク質のそれぞれが異なる質量電荷比を持つことになり、そしてそれゆえに、それぞれが別々に検出されることがあり得る。すべてを同一の計測で検出することが可能である。このことは、時間とデータの質の両方に関する計り知れない利点である。例えば、サンプルを一回の作業で測定するために、異なる作業で測定された異なるサンプルについての結果の補正又は標準化を行う必要がない。このことによって、異なるサンプル中にある同一のタンパク質又はペプチドについての相対量の正確な比較を行うことができる。というのは、同一の作業で異なるサンプルを測定するからである。サンプル間に不一致を引き起こすような違いは見られないだろう。
【０４９８】
開示された方法のこの複数サンプル方式については、サンプルの時系列分析に使用することが好ましい。このような系列は、サンプル又は反応の期間の終わりまでの変化を検出するために有用である。例えば、試験化合物添加後から、期間の終わりまでの細胞培養における発現タンパク質の変化を測定することができる。この方式において、異なる時点のサンプルは異なるレポーターシグナルで標識され、好ましくは同重体セットを構成する。このようにして、それぞれの時点についての同一の標識化タンパク質は、異なる時点からの標識化タンパク質と同一の質量電荷比を持つことになる。しかしながら、レポーターシグナルの断片化の際に、異なる時点からの断片化標識化タンパク質のそれぞれが異なる質量電荷比を持つことになり、そしてそれゆえに、それぞれが別々に検出されることがあり得る。
【０４９９】
開示された方法を、未知のタンパク質に関する情報の収集及びその目録化に使用することもできる。このタンパク質発見方式により、タンパク質の存在又はパターンをそれらの分析と容易に関連付けることができる。例えば、標識化タンパク質のサンプルを一つ以上の他のサンプル中にあるタンパク質と比較することができる。一つ又はいくつかのサンプル中で現れたが他のサンプル中ではそうではないというタンパク質の組成及び／又は配列を、通常の技術を用いて分析することができる。開示された標識化、検出及び定量方法によって、目的のタンパク質を他のものと区別できるようになる。開示された方法のこの方式は、機能的ゲノミクス又はプロテオミクスを援助するものとして特に有用である。というのは、サンプル間で異なっていることが発見されたタンパク質のキャラクタリゼーションができるからである。質量分析方法を用いて本方法のこの方式を実施することが好ましい。
【０５００】
開示された方法は、対象となっているタンパク質の検出の感度と正確さとを向上させる。開示された方法の好ましい態様は、多段階検出システムを利用して、類似性の高い特性を有する分子の検出分解能を向上させる。本方法は少なくとも二つの段階を含む。最初の段階は、レポーターシグナル（及び結合したタンパク質）に固有の特性に基づいて、標識化タンパク質（すなわち、そこにある分子のサブセット）の通過又は選択を可能とするフィルトレーション又は選択であり、他のすべての分子は排除される。次に続く１つ（又は複数）の段階で、最初の段階でフィルターを通過した標識化タンパク質のさらなる分離及び／又は検出を行う。この方法の鍵となる一面は、標識化タンパク質の多重セットがフィルターで選択され、続いて結合したレポーターシグナルが切断され、分解され、反応し又は他のやり方で修飾されて、さらなる段階にて、断片化レポーターシグナル及び／又は断片化標識化タンパク質の正体及び／又は量を理解する、というものである。レポーターシグナルと検出された１つ（又は複数）の娘断片との間には対応関係がある。
【０５０１】
いくつかの態様において、開示された方法によって、タンパク質及び／又はペプチドの複雑なサンプルを迅速かつ容易に再現性の高い様式で目録化することができる。このような目録を、同様に作成された別のタンパク質サンプルの他の目録と比較することができ、それによりサンプル間の差異を都合よく検出することが可能となる。目録、これはタンパク質サンプルに関する意味のある情報を組み込んでいる、は、関連するタンパク質サンプルの検出とタンパク質サンプルの比較との両方に用いることができるサンプルの指紋として役に立つことができる。例えば、その試験生物体のタンパク質及び／又はペプチドの目録を作成し、そして得られた目録を既知の生物体から作成された基準目録と比較することによって、特定の生物体の存在又は正体を検出することができる。異なる細胞サンプルからタンパク質の目録を作成し、その目録を比較することにより、タンパク質発現のパターンの変化及び差異も検出することができる。例えば、質量分析によって得ることができる優れた分解能により、作成されたタンパク質の目録を開示された方法とを比較することが容易になる。
【０５０２】
開示された方法で処理されるそれぞれの標識化タンパク質は、結果として標識化タンパク質の特徴（例えば質量電荷比）に基づいたシグナルを生じさせることになる。複雑なタンパク質サンプルは独特のシグナルのパターンを形成することができる。タンパク質サンプルの独特の目録形成と、異なるタンパク質サンプルから生じるシグナルのパターンの鋭敏かつ説得力のある比較検討とを可能にするのはこのパターンである。
【０５０３】
種々の標識化タンパク質の存在、量、存在および量又は欠如は、そのタンパク質の署名又は指紋を、そしてそれゆえにサンプル中にある特定のタンパク質、ペプチド又はタンパク質断片の存在又は欠如に基づくタンパク質サンプルの署名又は指紋を提供するシグナルのパターンを形成する。この理由から、このシグナルのパターン（すなわち、標識化タンパク質の存在のパターン、量のパターン、存在および量のパターン又は、欠如のパターン）の目録作成は、開示された方法のすなわち特定の対象の一つの態様である。
【０５０４】
例えば、標識化タンパク質のパターン、標識化タンパク質の存在のパターン、標識化タンパク質の目録、サンプル中のタンパク質の目録又はサンプル中のアミノ酸配列の目録から目録が構成され得、あるいは目録とはこれらのものをいうことができる。目録中の情報は質量電荷情報、組成（すなわち、アミノ酸組成）情報の形式、又はより好ましくはアミノ酸配列の形式となっていることが好ましい。目録にはさらに、開示された方法により生じた情報（例えば検出されたタンパク質の正体）に由来するその他の情報を含んでいてもよく、それらから構成されていても構わない。そして目録は、あらゆる他の源から得られた情報又はその源により生じた情報を加えてもよい。開示された方法を用いて形成された目録の情報上の本質は、既知のバイオインフォマティクスのシステム及び方法を用いた組み合わせ及び／又は分析の役に立つ。
【０５０５】
タンパク質サンプルのこのような目録を、任意の他のサンプルに由来する類似の目録と比較することができ、それによりサンプル中の類似点と相違点とを検出する（これはサンプル中のタンパク質の類似点と相違点とを示す）。例えば、最初のタンパク質サンプルの目録を、最初のタンパク質サンプルと同一のタイプの生物体からのサンプルの目録と、最初のタンパク質サンプルと同一のタイプの組織からのサンプルの目録と、最初のタンパク質サンプルと同一の生物体からのサンプルの目録と、最初のタンパク質サンプルと同一の起源から得られたサンプルであるが時間が異なるサンプルの目録と、最初のタンパク質サンプルとは異なる生物体からのサンプルの目録と、最初のタンパク質サンプルとは異なるタイプの組織からのサンプルの目録と、最初のタンパク質サンプルとは異なる系統の生物体からのサンプルの目録と、最初のタンパク質サンプルとは異なる種の生物体からのサンプルの目録と、又は最初のタンパク質サンプルとは異なるタイプの生物体からのサンプルの目録と比較することができる。
【０５０６】
関係のあるサンプルから得られるタンパク質の目録を比較すると、標識化タンパク質とそれらの改変体との関連性を有するペアのサブセットの存在を確認することができる。もともとの標識化タンパク質（及びその特徴を調べるために）並びに標識化タンパク質の改変体を検出するために、開示された方法を用いることができる。検出されたタンパク質のこのペアは、標識された（たとえ必ずしも独自性がなくとも）特異的なレポーターシグナルが用いられるタンパク質の特徴となる。
【０５０７】
Ｃ．レポーターシグナルの較正
レポーターシグナルの較正（ＲＳＣ）と称するこの方法の別の態様においては、レポーターシグナルキャリブレーターと称するレポーターシグナルの一つの形態のものを検体又は検体断片と混合し、レポーターシグナルキャリブレーターと検体又は検体断片とを改変して、そしてレポーターシグナルキャリブレーターの改変体と検体の改変体又は検体断片の改変体を検出する。レポーターシグナルキャリブレーターは存在している検体の量を評価するための標準として有用である。すなわち、存在している検体の量を評価するために既知量のレポーターシグナルキャリブレーターを添加し、改変された検体又は改変された検体断片の検出量と改変されたレポーターシグナルキャリブレーターの検出量とを比較し、そしてこれらの量を添加した既知量のレポーターシグナルキャリブレーターで較正する（そしてこのようにして、改変されたレポーターシグナルキャリブレーターの量を予測する）。
【０５０８】
開示されたレポーターシグナルの較正方法によって、組織、微生物又は他のあらゆる生物サンプル中の種々の検体の相対存在量に関する、非常に敏感で独自の検体シグニチャーが生成される。開示された方法によれば、例えば、小さいが非常に情報量の多い検体のサブセットを同定し、その相対濃度を測定することによって、細胞又は組織の状態を明確にすることが可能となる。このような測定は検体シグニチャーとして知られている。検体シグニチャーは、例えば、ガンの診断、段階の決定及び段階化、薬剤のスクリーニング並びに毒性試験などに有用である。
【０５０９】
いくつかの態様において、それぞれの検体又はそれぞれの検体断片は、少なくとも一つのレポーターシグナルキャリブレーターが有する一つ以上の共通する特性を共有することができる。それにより、この共通する特性を有するレポーターシグナルキャリブレーター及び検体又は検体断片を、この共通する特性を欠く他の分子から識別及び／又は分離することができる。
【０５１０】
いくつかの態様において、レポーターシグナルキャリブレーター並びに検体及び検体断片を改変することができ、それにより、検体の改変体又は検体断片の改変体を、検体又は検体断片が共有する共通する特性を有するレポーターシグナルキャリブレーターの改変体から識別することができる。いくつかの態様において、種々のレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を他のそれぞれのものから識別することができる。いくつかの態様において、種々の検体又は種々の検体断片の改変体を他のそれぞれのものから識別することができる。
【０５１１】
レポーターシグナルの較正のいくつかの態様において、検体又は検体断片は改変されずに、改変されたレポーターシグナルキャリブレーター及び検体又は検体断片が検出される。このケースにおいては、検体又は検体断片が共有する共通する特性を有するレポーターシグナルキャリブレーターの改変体から検体又は検体断片を識別することができる。
【０５１２】
いくつかの態様において、検体又は検体断片がレポーターシグナル又はレポーターシグナルの断片であってもよい。このケースにおいて、レポーターシグナルキャリブレーターはレポーターシグナルの検出量についてのキャリブレーターとしての役割を果たすことができる。
【０５１３】
（検体としての）タンパク質及びペプチドとの関連においてレポーターシグナルの較正を行うことが好ましい。レポーターシグナルの較正のこの形態をレポーターシグナルタンパク質の較正と称する。レポーターシグナルタンパク質の較正は、例えば、タンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを作成するために有用である。本明細書で用いる場合、タンパク質シグニチャーとは、タンパク質のセット又はタンパク質代替物のセットの存在、欠如、量又は存在および量のことである。
【０５１４】
レポーターシグナルタンパク質の較正のいくつかの態様において、検出される結合であって、タンパク質中の不安定な、開裂しやすい又は開裂可能な結合の存在を活用することができる。その結合の位置で断片化することによって、このような結合を含むペプチド、タンパク質又はタンパク質断片（便宜上、残りの明細書中で集合的にタンパク質断片と称する）を改変することができる。このようにして、タンパク質断片と（例えば、質量電荷比などの）共通する特性を持つレポーターシグナルキャリブレーターを用いることができ、そしてレポーターシグナルキャリブレーターの改変体及びタンパク質断片の改変された（すなわち断片化した）形態を検出し識別することができる。この点に関連して、タンパク質断片はそれらと適合するレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有しているのにもかかわらず、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体及びタンパク質断片の改変体を識別することができる（というのは、例えば、改変体は異なる質量電荷比などの種々の特性を持っているからである）。
【０５１５】
開示されたレポーターシグナルタンパク質の較正方法によって、組織、微生物又は他のあらゆる生物サンプル中の種々のタンパク質の相対存在量に関する、非常に敏感で独自のタンパク質シグニチャーが生成される。開示された方法によれば、例えば、小さいが非常に情報量の多いタンパク質のサブセットを同定し、その相対濃度を測定することによって、細胞又は組織の状態を明確にすることが可能となる。このような測定はタンパク質シグニチャーとして知られている。タンパク質シグニチャーは、例えば、ガンの診断、段階の決定及び段階化、薬剤のスクリーニング並びに毒性試験などに有用である。
【０５１６】
レポーターシグナルタンパク質の較正の一つの例として、対象となっているタンパク質サンプルをセリンプロテアーゼで、好ましくはトリプシンで消化することができる。この消化によって、タンパク質断片の複雑な混合物が新たに生成する。これらのタンパク質断片の中に、ジペプチドのＡｓｐ−Ｐｒｏを含むサブセットが（概算で４００のタンパク質断片ごとに一つ）見出されることになる。このジペプチド配列は、質量分析を行っている際に鋭敏に独自の断片と化し、したがって断片化モードにおいて高い収率でイオンが生じる。ヒトのプロテオームは、少なくとも２，０００，０００の種々のトリプシン消化ペプチドから成るものであるために、Ａｓｐ−Ｐｒｏ配列を含むタンパク質断片の数はほぼ５，０００程度である。これらのうちのいくつかは、ホスホペプチドとして、又は他の修飾を受けた形態として存在しているかもしれないため、この数値はさらに高くなるだろう。断片化し得る、情報価値の高いタンパク質シグニチャーを新たに得るのに適したタンパク質断片の（おそらく５０〜１００かその程度の）サブセットの選択には、この数値は十分なほどに高い。Ａｓｐ−Ｐｒｏジペプチド配列を含むペプチド、細胞内でのリン酸化による修飾を受けたアミノ酸を含むペプチド、又は内部にメチオニンを含むペプチドが、レポーターシグナルの較正の際に用いるために特に好ましいものである。もう一つの方法として、末端がアルギニンであるトリプシン消化ペプチドを、アセチルアセトン（ペンタン−２，４−ジオン）を用いる反応によって修飾してもよく、それによりフラグメントイオンの回数を高める（ディクラー（Ｄｉｋｌｅｒ）ら、Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ３２： １３３７−４９ （１９９７））。タンパク質シグニチャーの情報の内容を最大化するために、バイオインフォマティクスを用いてタンパク質断片のサブセットの選択を実施する。
【０５１７】
レポーターシグナルの較正のこの態様について、タンパク質消化物を、特別に設計したレポーターシグナルキャリブレーターのセットと混合することが可能であり、次いで、タンデム質量分析法を用いて分析することができる。タンデムインスペース装置（例えば、マイクロマス社のＱ−Ｔｏｆ（商標）など）のケースにおいては、（配列データから得ることができるそれぞれの独特の断片の分子量によって規定される）単一イオンのフィルタリングのために最初の四重極の設定を行い、次いでイオン断片化のための衝突段階、そして最後にもともとの単一イオンから生じるペプチド断片（この断片はＡｓｐ−Ｐｒｏなどの弱い結合、リン酸化アミノ酸を含む結合又はメチオニンスルホキシドなどの酸化アミノ酸に隣接した結合での開裂によって生じる。スミスら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ． ２６： １０３−１１ （１９９７））のＴＯＦ質量分析となる。二番目の段階では、ＴＯＦ測定の信号対雑音は通常の質量分析実験でのものよりもはるかに大きい。一般的に、タンパク質シグニチャーを作成するために使用する予定の、サンプル中のそれぞれのタンパク質断片（このようなタンパク質断片をシグニチャータンパク質断片と称する）のためにレポーターシグナルキャリブレーターを使用することが可能であり、そしてそれぞれは質量のパターンが容易に検出できる断片となるように、かつ断片化していないシグニチャータンパク質断片の質量と識別可能となるように設計される。次いで、タンパク質シグニチャー（すなわち、シグニチャータンパク質断片）を含むように予め選択しておいたそれぞれのタンパク質断片の質量に対応した値を超える範囲（例えば５０の）で、順々に四重極フィルタリングの設定を変える。フィルタリングを行う質量の設定のそれぞれの時点で、断片化後のＴＯＦにより検出できるシグナルには二つのタイプがあり、一方はトリプシン消化ペプチド（すなわち、もともとのタンパク質断片）に由来するセットであり、そして他方はレポーターシグナルキャリブレーターに対応するセットである。レポーターシグナルキャリブレーターにより、それぞれのシグニチャータンパク質断片についての相対存在量を計算することが可能になる。ある特定のサンプルについて測定されるこれらの相対存在量比は、タンパク質シグニチャーの構成エレメントである。ＭＳ／ＭＳモードでのタンデム質量分析装置の検出限界は非常に低く、おそらくペプチド５００分子程度であろう。この検出レベルはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法のそれよりも概算で１，０００倍程度良好であり、単一の細胞からタンパク質シグニチャーを作成できるはずである。
【０５１８】
以上のように、レポーターシグナルの較正のこの態様については、ヒトのゲノムの全体及び他の多数の生物体のゲノムの配列を利用することによって、公知のすべてのタンパク質に照らして独特であるタンパク質断片の同定を容易にすることが可能である。すなわち、生成してくる、タンパク質シグニチャーが内在するペプチドを同定するために、そしてレポーターシグナルキャリブレーターの選択を導くために、配列情報を使用することが可能である。
【０５１９】
Ｄ．レポーターシグナル融合体
レポーターシグナル融合体（ＲＳＦ）と称される開示された方法の別の態様において、レポーターシグナルペプチドは、単一のアミノ酸セグメント内で対象となっているタンパク質又はペプチドと結合しており、レポーターシグナルペプチド、レポーターシグナル融合体、レポーターシグナルペプチドの改変体及び／又はレポーターシグナル融合体の改変体を検出することができる。
【０５２０】
開示された方法により、レポーターシグナルペプチドが融合するタンパク質及びペプチドの鋭敏な監視方法及び検出方法が提供される。とりわけ、この方法により、対象となっている特定のタンパク質及びペプチドの発現を及び／又は対象となっているタンパク質及びペプチドをコード化している遺伝子、ベクター及び発現構築物を鋭敏かつ多重的に検出する方法が提供される。
【０５２１】
開示された方法では、レポーターシグナル融合体で標識された（すなわち、それと会合した又はその中に含まれている）特定の１つ（又は複数）のタンパク質、１つ（又は複数）の遺伝子、１つ（又は複数）のベクター及び／又は１つ（又は複数）の発現配列を有する細胞、細胞系及び生物体を用いることができる。例えば、種々のレポーターシグナルペプチドを伴うレポーターシグナル融合体をそれぞれコード化している核酸構築物のセットを使用することができ、それにより細胞、細胞系及び／又は生物体のセットを独自に標識化する。開示されたこの方法において、あらゆる標識化供給源からのサンプルを加工することによって、他の改変体から識別され得る潜在的な供給源のそれぞれについての独自のレポーターシグナルペプチドの改変体（又はアミノ酸セグメント若しくはアミノ酸サブセグメント）を得ることができる。特定の改変体の検出により、それが生じた供給源を特定する。より具体的な例としては、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸構築物がその中に導入された遺伝子組み換え植物系統（例えば、ラウンドアップ耐性トウモロコシ系統など）を、レポーターシグナル融合体を検出することによって同定することができる。
【０５２２】
また、特定の経路、制御カスケード並びに他の遺伝子、タンパク質、ベクター及び／又は発現配列のひとそろいの状態及び／又は発現を評価するために、開示された方法を使用することもできる。レポーターシグナル融合体を使用して、同一の細胞、細胞系若しくは生物体の中で、又は細胞、細胞系若しくは生物体のセットを横切る形でこのような経路、カスケードなどを「標識化」することにより、経路、カスケード及びその他のシステムを一回の測定で評価することができ、及び／又は細胞、細胞系又は生物体を横断する形で比較することができる。例えば、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントは、対象となっている内因性発現配列、対象となっている内因性遺伝子、対象となっている外因性発現配列、対象となっている外因性遺伝子又はそれらの組み合わせと会合することができ、レポーターシグナルペプチド及び／又はレポーターシグナル融合体の検出によって遺伝子及び／又は発現配列の発現を評価することができる。数多くの使用方法があり得、それらのいくつかを下記に説明として記載する。とりわけ、開示された方法において、緑色蛍光性タンパク質及び緑色蛍光性タンパク質融合体が用いられるあらゆる目的に類似した目的のために、開示されたレポーターシグナル融合体を使用することができる。しかしながら、開示されたレポーターシグナル融合体をより高度に多重化する能力のために、開示された方法では、少なくとも緑色蛍光性タンパク質よりもさらに多くのやり方で及びより有用性の高い目的のためにレポーターシグナル融合体を役立てることができる。
【０５２３】
レポーターシグナルペプチドをコード化している核酸配列を遺伝子の特定のエクソン内に設計することが可能である。融合されるタンパク質をコード化している遺伝子がイントロンを含む場合、レポーターシグナルペプチドをコード化している配列が、一緒にスプライシングを受ける種々のエクソン間で分割され得るのにもかかわらず、これは標準的な状況となろう。レポーターシグナルペプチドをコード化している核酸配列を特定のエクソン内に設置することは、ＲＮＡの選択的スプライシングを監視し分析するために有用である。最終タンパク質内にレポーターシグナルペプチドが出現することは、レポーターシグナルペプチドをコード化しているエクソンがスプライシングを受けてｍＲＮＡとなったことを示す。
【０５２４】
開示された方法により、一つ又は複数のタンパク質（すなわち、レポーターシグナルペプチドが融合しているタンパク質）の高感度検出を提供することができる。この方法において、レポーターシグナルペプチドを用いてレポーターシグナルペプチドと融合したタンパク質を分析し、それによりレポーターシグナル融合体を識別する。レポーターシグナルペプチドの検出は、１つ（又は複数）の対応するタンパク質の存在を示す。次いで、検出された１つ（又は複数）のタンパク質を公知の技術を用いて分析する。レポーターシグナル融合体により、１つ（又は複数）のタンパク質を特異的に同定することかできる独特のタンパク質／標識組成物が提供される。標識として特別なレポーターシグナルペプチドを用いることを通して、このことが成し遂げられる。
【０５２５】
この方法において、例えば、分析の前にプロテアーゼ消化を行うことによってレポーターシグナル融合体を断片化することができる。さらに、分析される発現サンプルを分画又は分離に付してもよく、それによりサンプルの複雑さを緩和する。断片化と分画とを、同一の測定において一緒に行うこともできる。このような断片化と分画とによって、発現の分析を単純化することや、拡張することができる。
【０５２６】
この方法において、レポーターシグナルペプチドを断片化、分解、反応、誘導体化又は他のやり方で、好ましくは特徴的な方法で修飾することができる。このことにより、レポーターシグナルペプチドの断片化、分解、反応、誘導体化又は他の修飾化後の一つ以上のレポーターシグナル融合体の産物の検出による、レポーターシグナルペプチドと融合するタンパク質の同定が可能となる。さらに、レポーターシグナル融合体と、レポーターシグナルペプチドの断片化、分解、反応、誘導体化又は他の修飾化後の一つ以上のレポーターシグナル融合体の産物との相関性を有する検出によっても、このタンパク質を同定することができる。特徴的で検出可能な方法によるレポーターシグナルペプチドの改変によって、レポーターシグナル融合体が変化することとなる。それと一緒に、特徴的なレポーターシグナル融合体とレポーターシグナル融合体の特徴的な産物（すなわち、その改変体）とを検出することにより、そのタンパク質を一義的に同定することができる（必要に応じて、その改変体だけが検出されることもあるが）。このやり方において、開示された方法を用いることで、一つ以上のタンパク質の発現を単独で又は（例えば、多重測定により）一緒に検出することができる。さらに、一つ以上のサンプルに存在する一つ以上のタンパク質の発現も多重的な方法により検出することができる。レポーターシグナルの質量分析のために、レポーターシグナルペプチドが断片化して類似の電荷を持つが質量が異なる断片を得ることが好ましい。
【０５２７】
レポーターシグナルペプチドを断片化して、類似の電荷を持つが質量が異なる断片を得ることが好ましい。これにより、セット中のそれぞれのレポーターシグナル融合体（及び／又はそれぞれのレポーターシグナルペプチド）を、レポーターシグナルペプチド断片（すなわち、その改変体）の質量電荷比の違いによって識別することが可能となる。異なるレポーターシグナルペプチドの断片（又はレポーターシグナル融合体の断片）が異なる質量電荷比を持つようにこれら断片を設計することが可能なので、このことは可能である。開示された方法において、このことにより、レポーターシグナルペプチドの断片化後にそれぞれのレポーターシグナル融合体をレポーターシグナル融合体の質量電荷比によって識別することが可能となる。
【０５２８】
レポーターシグナル融合体中のレポーターシグナルペプチドの改変によって、多様な改変された組成物を形成することができる。これらの改変体のいかなるもの又はすべてを検出することができる。例えば、レポーターシグナルペプチドの改変体を検出することができ、（レポーターシグナルペプチドを含む）アミノ酸セグメントの改変体を検出することができ、アミノ酸セグメントのサブセグメントの改変体を検出することができ、又はこれらの組み合わせを検出することができる。断片化によってレポーターシグナルペプチドを改変した場合、一般的に生じるものは、レポーターシグナルペプチドの断片と、対象となっているタンパク質又はペプチドとレポーターシグナルペプチドの一部（すなわち、レポーターシグナルペプチド断片中にはない方の一部）とを含むアミノ酸セグメントの改変体であろう。
【０５２９】
さらに、対象となっているタンパク質又はペプチドを断片化することもできる。得られるものはアミノ酸セグメントのサブセグメントとなろう。アミノ酸サブセグメントレポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドの一部を含むことになる。アミノ酸サブセグメント中のレポーターシグナルペプチドを改変した場合（アミノ酸セグメントの断片化前、断片化中又は断片化後に生じ得る）、得られるものはアミノ酸サブセグメントの改変体（及びレポーターシグナルペプチドの改変体）である。アミノ酸サブセグメントの改変体を検出することができる。断片化によってレポーターシグナルペプチドが改変された場合、得られるものは一般的に、レポーターシグナルペプチドの断片及びアミノ酸サブセグメントの改変体（すなわち、その断片）であろう。このケースにおいて、アミノ酸サブセグメントの改変体は対象となっているタンパク質又はペプチドの一部と、レポーターシグナルペプチドの一部（すなわち、この部分はレポーターシグナルペプチド断片中にはない）とを含むものになろう。
【０５３０】
開示されたレポーターシグナル融合体を用いて、様々な方法で細胞、細胞系、生物体及び遺伝子の発現並びにタンパク質を検出することができる。例えば、タンパク質と、結合したレポーターシグナルペプチドとを一緒に検出することができ、一つ以上のタンパク質のペプチドと一つ以上の結合したレポーターシグナルペプチドとを一緒に検出することができ、レポーターシグナルペプチドの断片又はその組み合わせを検出することができる。好ましい検出には、レポーターシグナルペプチドの断片化の前及び後の両方でレポーターシグナル融合体を検出することが挙げられる。
【０５３１】
開示された方法の好ましい態様には、レポーターシグナルペプチドの断片化の前及び後の両方での、そのレポーターシグナルペプチドの相関性のある検出が挙げられる。このことによって、レポーターシグナル融合体及び／又はレポーターシグナルペプチドの変化を介して、レポーターシグナルペプチドで「標識化」された遺伝子、タンパク質、ベクター及び発現構築物が検出されて同定されることが可能となる。すなわち、検出されたレポーターシグナル融合体又はレポーターシグナルペプチドの性質（断片化していないことに対して断片化していること）が、遺伝子、タンパク質、ベクター又はそれが由来するところの核酸構築物を同定する。レポーターシグナル融合体及びレポーターシグナルペプチドが質量電荷比によって検出された場合には、断片化したサンプルと断片化していないサンプルとの間の質量電荷比の変化によって比較の基礎が与えられる。このような質量電荷比の検出は、質量分析法によって成し遂げられることが好ましい。
【０５３２】
一つの例としては、対象となっているタンパク質とレポーターシグナルペプチドとの、質量分析用の標識として設計された融合体を挙げることができる。このレポーターシグナル融合体をトリプシンで消化し、次いで得られた成分を質量分析に適用することが可能である。レポーターシグナルペプチドを含むトリプシン断片に対応するピークが検出されることになる。質量分析装置の衝突セル中でのレポーターシグナルペプチドの断片化の結果、結合したレポーターシグナルペプチド部分の消失に対応するピークの移動、消失した断片に対応するピークの出現又はそれら両事象の組み合わせが生じる。観察された移動は、どのレポーターシグナルペプチドがタンパク質に融合しているかということに明確に依存することになる。というのは、異なるように設計されたレポーターシグナルペプチドは、異なる質量電荷比を持つ断片を産することになるからである。親の質量／電荷（衝突ガスなし）と、レポーターシグナルペプチドからの断片の消失に対応する質量／電荷（衝突ガスあり）とが組み合わせて検出されるという事象は、レポーターシグナル融合体を示す（すなわち、レポーターシグナル融合体の発現及びそれをコード化している遺伝子、ベクター又は構築物の発現を示す）。
【０５３３】
開示された方法の一つの効果的な態様は、レポーターシグナル融合体を使用して複数のサンプル（例えば、時系列測定又は他の比較分析など）を測定することことである。摂動後の生体システムの時間的応答の知識は、そのシステムの理解を追求するための非常に効果的なプロセスの一つである。時間的応答を追跡するために、摂動後の所定の時点にこのシステムのサンプル（例えば、細胞培養物からの細胞、最初に同期化して屠殺されたマウスなど）を得る。タンパク質の空間プロファイルの知識（例えば、組織切片内の相対的な位置など）は、生体システムの理解を追求するための非常に効果的なプロセスの一つである。
【０５３４】
質量電荷比に基づく分子間の高感度な識別を可能にする質量分析法を用いてレポーターシグナル融合体の検出を行うことが好ましい。レポーターシグナルペプチド断片が広範囲の質量を持つように、かつ検出時にそれぞれの質量を個々に識別できるように設定することができることから、多数の遺伝子発現物、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系及び生物体を多重標識化及び／又は多重検出するために、同重体レポーターシグナルペプチドのセット又は同重体レポーターシグナル融合体のセットを用いることができる。同一の遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系若しくは生物体（又は同一のタイプの遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系若しくは生物体）を同重体レポーターシグナル融合体のセットか又は同重体レポーターシグナルペプチドを含むレポーターシグナル融合体のセットで（例えば、種々のサンプル中にある同一の遺伝子、タンパク質、ベクター、発現構築物、細胞、細胞系又は生物体を「標識化」することによって）標識化する場合、生ずるレポーターシグナル融合体のセット又はレポーターシグナルペプチドのセットも同重体となるだろう。レポーターシグナルペプチドの断片化によって、レポーターシグナルペプチドのセットが、個々に検出可能な、特徴のある種々の質量を持つレポーターシグナル融合体断片及びレポーターシグナルペプチド断片に分けられることとなるだろう。
【０５３５】
開示された方法の好ましい態様には、他の分子からの、質量電荷比に基づく同重体レポーターシグナル融合体又は同重体レポーターシグナルペプチドのフィルタリング、レポーターシグナルペプチドの断片化とそれによる種々の質量を有する断片の産生、及び質量電荷比に基づく種々の断片の検出が含まれる。本明細書の他の箇所に記載されているように、タンデム質量分析装置を用いてこの方法を実施することが最も好ましい。
【０５３６】
核酸配列及びレポーターシグナル融合体をコード化しているセグメントを適切なあらゆる方法で発現させることができる。例えば、開示された核酸配列及び開示された核酸セグメントをインビトロで、細胞内で及び／又は生物体中の細胞内で発現させることができる。核酸配列及びタンパク質の発現のための数多くの技術及びシステムが知られており、開示されたレポーターシグナル融合体を用いてそれらを実施することができる。例えば、数多くの発現配列、ベクター系、形質転換技術及びトランスフェクション技術並びにトランスジェニック生物産生方法が知られており、そして開示されたレポーターシグナルペプチドの方法及び組成物を用いてそれらを実施することができる。
【０５３７】
例えば、プロモーター及び転写及び翻訳される核酸配列を含むＤＮＡ構築物のインビトロ転写／翻訳のためのキットが知られている（例えば、テキサス州オースチンのアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）社のＰＲＯＴＥＩＮｓｃｒｉｐｔ−ＰＲＯ（商標）、ウィルキンソン（Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ）（１９９９）「無細胞そしてハッピー：インビトロ翻訳及び転写／翻訳システム」、Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ １３ ［１３］： １５、１９９９年１月２１日）。生物体のゲノムＤＮＡの中で、プラスミドの中で若しくは生物体内へトランスフェクションされ得る他のベクターの中で又はインビトロ系の中で、このような構築物を使用することができる。例えば、プロモーター配列及び核酸配列を含む構築物の転写及び翻訳後に、レポーター／マーカーとして緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼがインビボ系で産生するというものが知られている（例えば、スワインとナース（Ｓａｗｉｎ ａｎｄ Ｎｕｒｓｅ）、「ランダムポリペプチドと緑色蛍光性タンパク質との融合体を用いる分裂酵母核マーカーの同定。」Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３ （２６）： １５１４６−５１ （１９９６）、チャタジー（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ）ら、「哺乳類の細胞中における核タンパク質輸送のインビボ分析。」Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２３６ （１）： ３４６−５０ （１９９７）、パターソン（Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ）ら、「生きている酵母細胞中でのＴＡＴＡ−結合性タンパク質の定量的イメージング。」Ｙｅａｓｔ １４ （９）： ８１３−２５ （１９９８）、ダンダユサパニ（Ｄｈａｎｄａｙｕｔｈａｐａｎｉ）ら、「遺伝子発現用マーカーとしての緑色蛍光性タンパク質及びマイコバクテリウムのマクロファージとの相互作用についての細胞生物学。」Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １７ （５）： ９０１−１２ （１９９５）、クレマー（Ｋｒｅｍｅｒ）ら、「マイコバクテリウムにおける新規発現マーカーとしての緑色蛍光性タンパク質。」Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ １７ （５）： ９１３−２２ （１９９５）、レイレンダー（Ｒｅｉｌａｎｄｅｒ）ら、「バキュロウイルス発現系を用いてのオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光性タンパク質の昆虫細胞中での機能的発現。」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２１９ （１）： １４−２０ （１９９６）、マンケルツ（Ｍａｎｋｅｒｔｚ）ら、「ヒトのオクルディンプロモーターからの発現は、腫瘍壊死因子アルファ及びインターフェロンガンマに影響を受ける」Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ， １１３： ２０８５−９０ （２０００）、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）ら、「単一の哺乳類の細胞におけるＨＩＶプロモーター及びｈＣＭＶプロモーターの転写調節のリアルタイム分析」Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ， １０８： ４４１−５５ （１９９５））。緑色蛍光タンパク質又は変異体が安定的に組み込まれることや、生物体に干渉しないことは示されており−開示されたレポーターシグナルペプチドよりも一般的にＧＦＰの方が大きい（オワンクラゲ由来のＧＦＰは２３８アミノ酸のサイズである。ＮＣＢＩ ＧＩ： ６０６３８４）ことから、レポーターシグナルペプチドは、それらが添加される発現系を崩壊させる可能性が低い。
【０５３８】
内因性プロモーターがプロモーター−レポーター構築物で置換されるように、例えば、緑色蛍光性タンパク質（パターソンら、「生きている酵母細胞中でのＴＡＴＡ−結合性タンパク質の定量的イメージング。」Ｙｅａｓｔ １４ （９）： ８１３−２５ （１９９８））又はルシフェラーゼがある位置に来るようにプロモーター領域を修飾する技術は知られている。ＧＦＰ又はルシフェラーゼを監視することによって転写因子の濃度を追跡する。これらの技術は開示されたレポーターシグナル融合体及びレポーターシグナル融合体構築物を用いて使用される。対象となっている遺伝子への核酸配列の標的性ノックインのための技術が知られており、通常、内因性プロモーターの制御下となる。このような技術は開示された方法及び組成物を用いて実行可能となり、そしてその技術は、遺伝子の転写及び翻訳のレポーター／マーカーを、次いで核酸を挿入した位置に導入するために用いられている。開示されたレポーターシグナル融合体を内因性発現配列の支配下に置くために同一の技術を用いることができる。あるいは、非標的性ノックイン（このための技術も公知である。）を、転写因子のレベル又は活性を追跡するために用いることができる。
【０５３９】
一般的にレポーターシグナルと同様、セット内のレポーターシグナルペプチドが一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性、を持つことができるというセット内でレポーターシグナルペプチドを用いることができる。レポーターシグナル融合体のケースにおいては、セット内のアミノ酸セグメント及びアミノ酸サブセグメントが一つ以上の共通する特性、すなわちアミノ酸セグメント及びアミノ酸サブセグメントをそれぞれ共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性、を持つことができるセット内で、アミノ酸セグメント及びアミノ酸サブセグメントを使用することができる。一般的に、共通する特性を有するレポーターシグナル融合体の１つ（又は複数）の構成成分は、検出される１つ（又は複数）の構成成分に及び／又は使用する方法の方式に依存してもよい。
【０５４０】
一組の核酸分子によってコード化されているレポーターシグナル融合体中のレポーターシグナルペプチドが、一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸分子を使用することができる。同様に、一組の核酸分子によってコード化されているアミノ酸セグメント中のレポーターシグナルペプチドが、一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、アミノ酸セグメントをコード化している核酸分子を使用することができる。一組の核酸分子によってコード化されているアミノ酸セグメントが、一つ以上の共通する特性、すなわちアミノ酸セグメントをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、アミノ酸セグメントをコード化している核酸分子を使用することができる。
【０５４１】
一組の核酸セグメントによってコード化されているレポーターシグナル融合体中のレポーターシグナルペプチドが、一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメント（一般的には核酸分子の一部）を使用することができる。同様に、一組の核酸分子によってコード化されているアミノ酸セグメント中のレポーターシグナルペプチドが一つ以上の共通する特性、すなわちレポーターシグナルペプチドをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、アミノ酸セグメントをコード化している核酸セグメントを使用することができる。一組の核酸分子によってコード化されているアミノ酸セグメントが一つ以上の共通する特性、すなわちアミノ酸セグメントをその共通する特性を欠く分子から分離するか又は識別することを可能とする特性を持つことができるものであるセットとして、アミノ酸セグメントをコード化している核酸セグメントを使用することができる。対象となっている核酸分子、核酸セグメント、アミノ酸セグメント、レポーターシグナルペプチド及びタンパク質のセットを構成する個々のもの間の他の関係が検討されている。
【０５４２】
レポーターシグナル融合体は、対象となっているタンパク質及びレポーターシグナルペプチドに加えて他の成分を含むことができる。例えば、レポーターシグナル融合体はエピトープタグ又はｆｌａｇペプチドを含んでいてもよい。エピトープタグ及びｆｌａｇペプチドはタグとしての機能を果たすことができ、このタグにより、レポーターシグナル融合体を分離したり、識別したり、会合させたり及び／又は結合させることができる。エピトープタグ及びｆｌａｇペプチドを使用することは一般的に知られており、開示されているレポーターシグナル融合体においての使用に適合させることもできる。
【０５４３】
セットを構築しているか又はセット中にあるレポーターシグナルペプチド、レポーターシグナル融合体及び／又はレポーターシグナル融合体のサブセグメントが類似の特性（例えば、類似の質量電荷比など）を有しているというセットの中で、レポーターシグナルペプチド、レポーターシグナル融合体（又はアミノ酸セグメント）、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメント及び／又はレポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントを含む核酸分子を用いる態様が好ましい。この類似の特性によって、レポーターシグナル、レポーターシグナル融合体又はレポーターシグナル融合体のサブセグメントを一つ以上のその特性を欠く他の分子から識別及び／又は分離することができる。セットを構築しているか又はセット中にあるレポーターシグナル、レポーターシグナル融合体又はレポーターシグナル融合体のサブセグメントが同一の質量電荷比（ｍ／ｚ）を有していることが好ましい。すなわち、セット中のレポーターシグナル、レポーターシグナル融合体又はレポーターシグナル融合体のサブセグメントが同重体である。これにより、レポーターシグナル、レポーターシグナル融合体又はレポーターシグナル融合体のサブセグメントを質量電荷比に基づいて他の分子と正確に分離することができる。フィルタリングの結果、システムについての信号対雑音（Ｓ／Ｎ）比が大きく向上し、より高感度でより正確な検出が可能となる。
【０５４４】
種々の遺伝子、タンパク質、ベクター、構築物、細胞、細胞系若しくは生物体の中で用いられるか又はそれらと会合するレポーターシグナル融合体中で使用するための好ましいレポーターシグナルペプチドは、質量が異なるように分布したものであろう。とりわけ、同一のアミノ酸組成であって別のアミノ酸配列のものを使用することが好ましい。
【０５４５】
上記に及び本明細書の他の箇所に、たとえ「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」又は「複数のタンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」の検出と言及されていたり、これらとの融合体に言及されていたとしても、開示された方法はタンパク質、ペプチド及びタンパク質又はペプチドの断片を包含することができる。したがって、本明細書におけるタンパク質への言及は、文脈上明らかに他のものを示していない限り、タンパク質、ペプチド及びタンパク質又はペプチドの断片に言及することを意味する。本明細書で用いられているように、「レポーターシグナル融合体」とは、文脈上明らかに他のものを示していない限り、レポーターシグナルペプチドと融合している（すなわち、同一のポリペプチド鎖における１つ（又は複数）のペプチド結合によって結合している）タンパク質、ペプチド又はタンパク質若しくはペプチドの断片を示す。１つ（又は複数）のレポーターシグナルペプチドをタンパク質と任意の配置で、例えば、タンパク質のＮ−末端の位置で、タンパク質のＣ−末端の位置で、ドメイン結合部内若しくはドメイン結合部で、又はタンパク質の他の適切な任意の位置で融合することができる。この方法のいくつかの態様において、タンパク質が機能を保持していることが望ましい。このようなケースにおいて、末端での融合体又はドメイン内での融合体が好ましい。タンパク質融合体に係る当業者は、一般的に、対象となっているタンパク質が機能を保持できるような融合体をどのようにして設計するのかを知っている。他の態様において、レポーターシグナルペプチド及びタンパク質がいずれかの所望の構造上の構成をとることができる場合には、タンパク質が機能を保持することは必要ではない。
【０５４６】
レポーターシグナル融合体は、その融合体をコード化している核酸分子の発現によって生産され得る。例えば、一つのレポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとをその中に含むアミノ酸セグメントをコード化している核酸セグメントを設計することによって、開示されている融合体を一般的に設計することができる。ある特定の核酸分子は一つ以上の核酸セグメントを含むことができる。ある特定の核酸セグメントは一つ以上のアミノ酸セグメントをコード化することができる。ある特定のアミノ酸セグメントは、一つ以上のレポーターシグナルペプチドと、一つ以上の対象となっているタンパク質又はペプチドとを含むことができる。開示されているアミノ酸セグメントは、単一の、隣接するポリペプチド鎖から成るものである。すなわち、たとえ複数のアミノ酸セグメントが同一の隣接するポリペプチド鎖の一部分であり得るとしても、ある特定のアミノ酸セグメントのすべての構成成分（すなわち、対象となっている、１つ（又は複数）のレポーターシグナルペプチド、１つ（又は複数）のタンパク質及び１つ（又は複数）のペプチド）は、同一の隣接するポリペプチド鎖の一部分である。
【０５４７】
ＲＮＡの選択的スプライシングを監視し分析するためにレポーターシグナル融合体を用いることができる。ゲノム中の情報をタンパク質発現に翻訳する際の主な問題は、ｍＲＮＡの選択的プロセシングと、選択的なエクソンの利用を介してのタンパク質のイソ型（ｉｓｏｔｙｐｅ）の生成とを理解することである（ブラック（Ｂｌａｃｋ）、「選択的スプライシングによるタンパク質の多様性：バイオインフォマティクスとポストゲノム生物学のための挑戦」Ｃｅｌｌ １０３： ３６７−７０ （２０００））。選択的プレ−ｍＲＮＡスプライシングを用いてタンパク質のイソ型の多様性を生じさせる多数の実例、例えば赤血球分化を制御する際の例（例えば、ホウ及びコンボイ（Ｈｏｕ ａｎｄ Ｃｏｎｂｏｙ）、「赤血球分化の間の選択的プレ−ｍＲＮＡスプライシングの調節」、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ ８： ７４−９ （２００１）を参照すること）が存在する。選択的スプライシング後のタンパク質の複雑なイソ型を検出することは、多くの場合、困難な作業である。というのも、２０００アミノ酸を超えるタンパク質において、エクソンは６アミノ酸と同じほどに小さいかもしれないからである（例えば、シアンシ（Ｃｉａｎｃｉ）ら、「脳及び筋肉はａＩＩスペクトリンの独特の選択的転写物を発現する」、Ｂｉｏｃｈｅｍ ３８： １５７２１−１５７３０ （１９９９）を参照すること）。
【０５４８】
レポーターシグナルをコード化している核酸配列を対象のエクソン配列内に挿入すること（それにより、レポーターシグナル融合体をコード化している核酸セグメントを形成すること）によって、エクソンの利用とプロセシングの情報を得ることができる。適切な小型の遺伝子構築物、又は細胞内へ導入された非内因性プレ−ｍＲＮＡを、例えば、ゲノムＤＮＡ内に挿入することができる。レポーターシグナルのセットを用いることによって、翻訳されるタンパク質のエクソンのすべての多重読み出しを一度で行うことが可能となる。短い外因性オープンリーディングフレームＤＮＡ配列をエクソン内に組み込んでいる小型の遺伝子構築物又は構築物の使用と、機能性イントロンのスプライスエレメントに関連する外来ＤＮＡの組み込みは、レポーターシグナルの組み込みに用いることができる開発済みの技術である（例えば、ギー（Ｇｅｅ）ら、「タンパク質４．１Ｒエクソン１６の選択的スプライシング：側面にあるイントロンの規則正しい切り出しは適切なスプライス部位の選択を保証する」、Ｂｌｏｏｄ ９５： ６９２−９ （２０００）；キクモリ（Ｋｉｋｕｍｏｒｉ）ら、「プレ−ｍＲＮＡスプライセオソーム介在性トランススプライシングの乱雑さ：遺伝子治療の問題とは？」、Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １２： １４２９−４１ （２００１）；マリク（Ｍａｌｉｋ）ら、「組み換え型ＭＦＧレトロウイルスベクターに与える第二イントロンの影響」、Ａｒｃｈ Ｖｉｒｏｌ １４６： ６０１−９ （２００１）；バーツとラシュケ（Ｖｉｒｔｓ ａｎｄ Ｒａｓｃｈｋｅ）、「ＣＤ４５のｃＣＤＮＡ構築物からの高レベル発現に関するイントロン配列の役割」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７６： １９９１３−２０ （２００１）を参照すること）。レポーターシグナルの検出、レポーターシグナルの量及びどのレポーターシグナルがどのエクソンと相関とするのかについての知識によって、エクソンの使用法と選択的スプライシングに関する情報が提供される。
【０５４９】
タンパク質の他のタンパク質との及び他の分子との相互作用の検出と分析の際にも、開示されているレポーターシグナル融合体を用いることができる。例えば、タンパク質−タンパク質相互作用のためのインタラクショントラップには、周知の酵母２−ハイブリッド（フィールズ及びソング（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ）、「タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための新規な遺伝系」Ｎａｔｕｒｅ ３４０： ２４５−６ （１９８９）、ウエツら、「サッカロマイセス・セレビシエにおけるタンパク質−タンパク質相互作用の包括的分析」Ｎａｔｕｒｅ ４０３： ６２３−７ （２０００））及び関連する系（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン・ウィリーアンドソンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）社、２００１、ファンクリーキンジ及びベイヤート（Ｖａｎ Ｃｒｉｅｋｉｎｇｅ ａｎｄ Ｂｅｙａｅｒｔ）、「酵母２−ハイブリッド：到達水準」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ Ｏｎｌｉｎｅ， ２ （１）， １９９９）が挙げられる。これらの系へのペプチドレポーターシグナルをコード化している核酸配列の組み込みを誘導することは可能であり、例えば、普通に使われているＬａｃＺ選択領域の終端が挙げられる（ＬａｃＺ選択については、例えば、サムブルックら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、１９８９、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨークに記載されている）。このように組み込まれた配列のセット（例えば、それぞれのプラスミドがレポーターシグナルコーディング配列と機能性ＬａｃＺとを有するプラスミドのセット）によって、（使用したレポーターシグナルと同程度に多い種々の相互作用）より多数の相互作用を同時に明白に検出することができる。
【０５５０】
レポーターシグナル融合体の別の態様において、レポーターシグナルをコード化している核酸配列は、Ｔ細胞レセプター及びＢ細胞レセプターの定常部（Ｃ領域）をコード化している配列に付加されてもよい。Ｃ領域が転写後のスプライシングを受けてＪ領域と結合する時に、レポーターシグナルがＴ細胞レセプター又はＢ細胞レセプター中に現れることになる。
【０５５１】
レポーターシグナル提示と称するレポーターシグナル融合体の別の態様においては、主要組織適合性（ＭＨＣ）分子及び非−主要組織適合性分子による特定の抗原性ペプチドの提示を検出し分析することができる。タンパク質抗原が抗原提示細胞によってプロセッシングを受け、そしてＴ細胞に認識させるために、通常８〜１２アミノ酸から成る小ペプチドがクラスＩＭＨＣ分子及びクラスＩＩＭＨＣ分子によって提示される、ということはよく知られている。特定のＴ細胞／ペプチド−ＭＨＣ複合体の研究は、種々の標識化に必要な物（放射性又は蛍光性のいずれか一方）並びに特定のレセプター及び／又はペプチド−ＭＨＣ複合体を認識する抗体試薬への共通する信頼を前提とした技術的な挑戦である。
【０５５２】
抗原プロセッシング及び抗原提示についての我々の知識をさらに拡大することができるという要求がある。特定のタンパク質抗原に設計されたレポーターシグナルは、このプロセスの新しい識見を提供し、そして新しい実験用のアプローチを与えるだろう。例えば、ウイルス性又は細菌性の二つのタンパク質、タンパク質Ａ及びタンパク質Ｂについて考えると、これらはわずかに２、３のアミノ酸のみが異なっている。これらのタンパク質が同一の効率でプロセッシングを受けて同一の効率で免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に提示されているかどうかを知ることは有用であろう。レポーターシグナルをタンパク質Ａ中に置くように処理加工し、処理加工されたタンパク質Ｂを抗原提示細胞に対向させることによって、提示されるレポーターシグナルが異なるかどうかの試験を行うことができ、そしてそれにより、タンパク質が効率的にプロセッシングを受けて提示されているかどうかを測定する。（タンパク質Ａ中に存在する）レポーターシグナルＡが存在するが、（タンパク質Ｂ中に存在する）レポーターシグナルＢが存在しないことは、タンパク質Ａがプロセッシングを受け、タンパク質Ｂがプロセッシングを受けなかったことを示す。タンパク質Ｂが抗原プロセッシングを受けなかったことは、その免疫系による免疫監視機構からウイルス又は細菌がなぜ回避したのかについての一つの解釈となるかもしれない。抗原性ペプチドは、アミノ末端及びカルボキシ末端の両方の近傍にあるアンカー残基が保存され、中央部ではそれ以上の不均一性が許容されていることに特徴がある。したがって、この不均一性を有する中央部は、レポーターシグナルペプチドを付加する目的からは好ましい部位である。
【０５５３】
Ｅ．レポーターシグナルの再配列
レポーターシグナルの再配列と称する開示された方法及び組成物の別の態様においては、特定の遺伝子の再配列事象の発生の検出、それらのタンパク質産物の検出及びそれらのレセプターを有している特定の細胞集団の検出が可能である。さらに、レポーターシグナルの再配列によって、ある特定のレセプターの進行又は発達や、レポーターシグナルの有無について監視されている細胞又は細胞集団の進行又は発達を追跡することも可能となる。再配列されたレポーターシグナルについての設計の検討項目は、本明細書の他の箇所で記載されているレポーターシグナル融合体に要求されるそれと同様である。
【０５５４】
開示されている方法のたいていの態様には、さまざまな手段によって検体と会合している無処理レポーターシグナルが含まれる。レポーターシグナルの再配列では、生産過程、例えば生物学的な生産過程を利用し、レポーターシグナルの断片の特定の再配列によって、又はレポーターシグナルの一部のみをコード化している核酸セグメントの特定の再配列によってレポーターシグナルを形成させる。レポーターシグナルの再配列の一つの形態では、例えば、哺乳類の免疫系に存在する可変部−多様性部−結合部（Ｖ−Ｄ−Ｊ）遺伝子の再配列機構などの内因性の生体システムを利用する。このシステムにおいて、生殖系列の隣接していないＤＮＡ（Ｖ遺伝子断片、Ｄ遺伝子断片及びＪ遺伝子断片）の複数の短い配列が、転写のための鋳型としての機能を果たす前に（組み換えられて）まとめられる。遺伝子の再配列は例えばＴリンパ球及びＢリンパ球などの白血球の中で起こり、そしてそれはＴ細胞抗原レセプター及びＢ細胞抗原レセプターの多様性を生じさせる主要な機構である。理論の上では、莫大な数の異なるレセプターを生み出すことができる。このレベルの複雑さが、まれな再配列事象、すなわちレセプターの存在の検出を困難にしている。ＰＣＲに基づく測定によるアプローチ及びフローサイトメトリーによるアプローチが、レセプターの多様性を研究するために現在用いられている。しかしながら、ＰＣＲによるアプローチは骨の折れる作業であり、そして発現したタンパク質の状態について何らの情報をも与えることがない。フローサイトメトリーによるアプローチは、用いる蛍光プローブの発光スペクトルが重複することから、その能力の多重化には限界がある。
【０５５５】
５０〜１００のＴ細胞レセプター又はＢ細胞レセプターについて試験を実施しようとすると、それらのレセプターに対する抗体を同程度の数だけ使用する必要性が出てくる。これは実際のところ実施不可能である。それゆえに、レセプターの非常に複雑なプールの中での、高感度で特異性の高い特定のレセプターの検出を可能とする実用的な方法が求められている。このアプローチを高度に多重化する能力によって、現在のところ達成できない実験によるアプローチが可能となる。開示されているレポーターシグナル技術は、検出用のシグナルの大規模な多重化を可能にする。
【０５５６】
レポーターシグナルの再配列の一つの例として、レポーターシグナルをコード化している核酸配列がそのマウスの生殖系列内に設計されているトランスジェニックマウスを新たに得ることができる。このことを行うための方法は当業者に広く知られており、そしてこの方法には、レポーターシグナルを、例えば酵母からの又は細菌からの人工染色体（ＹＡＣ又はＢＡＣ）の中に再配列し、次いでこれらの構築物を用いてトランスジェニックマウスを新たに得るという操作を行うための標準的な分子生物学の方法を用いることが含まれる。
【０５５７】
レポーターシグナルを再配列するために免疫グロブリンの再配列を利用する一つの例として、レポーターシグナルの一部をコード化しているＤ領域と、レポーターシグナルの残りの部分をコード化しているＪ領域とを挙げる。これらの「部分的」レポーターシグナルをコード化しているＤ領域及びＪ領域が結合する再配列事象のすぐ後に、「完全」レポーターシグナルをコード化している一つの配列が生じることとなる。転写及び翻訳の後に、コード化されていたレポーターシグナルがタンパク質産物の中に現れる。次いで、本明細書の他の箇所に記載されているようにして、レポーターシグナルを検出することができる。Ｄ領域及びＪ領域の設計された結合である再配列事象が起こらない場合、レポーターシグナルは検出されないことになる。多様なレポーターシグナルの部分品をコード化している配列の、異なるＤ領域及びＪ領域への含有と再配列とによって、多様の異なるレポーターシグナル、すなわち異なっておりかつ診断用のレポーターシグナルが生じることが可能であり、ここで、このレポーターシグナルは起こり得る再配列のそれぞれが異なっているものである。さらに、このシステムを拡張することもでき、例えば、レポーターシグナルを（例えば、Ｖ−Ｄ−Ｊ、Ｖ−Ｄ−Ｄ−Ｊなどの）三つ以上の遺伝子領域に分割することが挙げられ、その結果、複合的な再配列事象によってレポーターシグナルが生ずることになる。この方式では、レポーターシグナルの部分品の再配列の組み合わせによって、多数の異なるレポーターシグナルが生じてしまう可能性があり、ここで、レポーターシグナルのそれぞれが、特定のレポーターシグナルの部分品が再配列されてレポーターシグナルを形成しているという特徴を持つものである。
【０５５８】
再配列されたレポーターシグナルを持つトランスジェニックマウスによって、他のやり方では取り組むことが困難か、又は不可能な疑問に取り組むことができる。例えば、（数千のうちの、若しくは数百万のうちの）どのＴ細胞レセプター及びＢ細胞レセプターが特定の刺激に対して特異的に応答しているか、又は発達の特定の段階でどのようなタイプの細胞が存在しているかについて、分析することができるだろう。
【０５５９】
Ｆ．脂質レポーターシグナル
開示された方法及び組成物を脂質の組成、分布及びプロセシングの監視に用いることもできる。脂質は有機溶媒に高い溶解性を示す疎水性生体分子である。脂質は種々の生物学的役割を有し、この役割によって脂質は監視の価値が高い標的となる。栄養源としては、脂質は（炭水化物と共に）重要な細胞のエネルギー源を及び細胞シグナリングや他のプロセスに必要な代謝中間体を構成する。エネルギー変換のために処理される脂質は通常、種々の酵素経路を経て数多くの中間体を生成する。最新の生化学の教科書（例えばストライヤー（Ｓｔｒｙｅｒ）、１９９５を参照すること）でこれらのサイクルの要旨を知ることができる。代謝されるときのアシル鎖中間体のプロセシングを監視することは、中鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症などの生化学上の疾患の臨床における検出のためだけでなく、脂質及び細胞生物学の研究においても重要なツールである（例えばチョッケ（Ｚｓｃｈｏｃｋｅ）ら、「軽度ＭＣＡＤ欠損症の分子的及び機能的キャラクタリゼーション」、Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １０８： ４０４−８ （２００１）を参照すること）。例えば、処理されるアシル鎖中間体のより迅速な多重検出が可能となることにより、レポーターシグナルを脂質内に組み込むこと、又はレポーターシグナルを脂質と会合させることは脂質の検出方法を改善することができる（例えばアンドレセン（Ａｎｄｒｅｓｅｎ）ら、「ＭＳ／ＭＳに基づく新生児の将来のスクリーニングによって同定された中鎖アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ（ＭＣＡＤ）の変異は、臨床症状を伴う患者で見られる変異とは異なる：軽度ＭＣＡＤ欠損症をもたらす新たに流行している変異の同定とキャラクタリゼーション」Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ６８： １４０８−１８ （２００１）など）。
【０５６０】
別の役割に関して、脂質はすべての生体膜の最も基本的かつ定義付ける成分として機能する。膜の脂質の主な三つのタイプには、リン脂質、糖脂質及びコレステロールがある。これらのうちで最も量が多いのはリン脂質であり、グリセロール又はスフィンゴシンのいずれかに由来する。グリセロールに基づくものは通常、二本のエステル化長鎖脂肪酸（炭素数１４〜２４）とリン酸化アルコール又は糖を含んでいる。スフィンゴシンに基づくリン脂質は単一の脂肪酸を含んでいる。これらの脂質が集まって生体膜の構造と流動性とに貢献している。さらに、これらの脂質のプロセシングの環状的な変化、とりわけホスファチジルイノシトール４，５リン酸などの酸性糖リン脂質も多種多様の細胞内プロセスを調節している（例えばキャントレル（Ｃａｎｔｒｅｌｌ）、「ホスホイノシチド３−キナーゼシグナリング経路」、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ １１４： １４３９−４５ （２００１）；ペイラストラ（Ｐａｙｒａｓｔｒｅ）ら、「ホスホイノシチド：細胞シグナリングの時間と空間における中心的存在」、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌ １３： ３７７−８７ （２００１）を参照すること）。このようにして、レポーターシグナルをそのような分子のアシル鎖に組み込むことにより、又はレポーターシグナルをそのような分子のアシル鎖と会合させることにより、次に続く、酵素活性測定のために用いるこれらのようなインビトロ測定又はインビボ測定のいずれかへのこのようなレポーター分子の組み込みが、これらの脂質の別個の細胞区画（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）内への分離（例えばゴルジ体対原形質膜（例えばゴジ（Ｇｏｄｉ）ら、「ＡＲＦはＰｔｄＩｎｓ−４−ＯＨキナーゼ−ベータの補充を媒介し、ゴルジ複合体上のＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２合成を刺激する」、Ｎａｔ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １： ２８０−７ （１９９９）を参照すること））と、上記の代謝経路及びシグナリング経路を介するそれらのプロセシングを速やかに追跡することを可能とさせる。
【０５６１】
外因性脂質標識を生体システム内に容易に組み込むことができること、そして開示されたレポーターシグナルもこのようなシステムに組み込むことができることが知られている。例えば、スピン標識化アシル脂肪酸及びリン脂質はリン脂質ベシクル及び細胞の膜内に組み込まれる（例えば、コーンバーグとマコーネル（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ）、「ベシクル膜中のリン脂質の内側−外側移行」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １０： １１１１−２０ （１９７１）；コーンバーグとマコーネル、「ベシクル膜中のリン脂質の側方拡散」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ６８： ２５６４−８ （１９７１）；アローラ（Ａｒｏｒａ）ら、「スピン標識化ＥＰＲによる、脂質−タンパク質とトリプシン処理Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰアーゼとの選択的相互作用の研究」、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １３７１： １６３−７ （１９９８）；アロンゾー（Ａｌｏｎｓｏ）ら、「スピン標識電子常磁性共鳴により調査された角質層における脂質鎖の動力学」、Ｃｈｅｍ Ｐｈｙｓ Ｌｉｐｉｄｓ １０４： １０１−１１ （２０００）を参照すること）。
【０５６２】
トリグリセリド又はスフィンゴ脂質若しくは糖脂質のアシル鎖及びコレステロールを、レポーターシグナルを含めて合成しても構わない。このようなレポーターシグナルの一例は、光で開裂可能な結合を伴うカルボン酸を有する脂肪族の鎖から成る脂質となろう。光で開裂可能な結合の例は、グラッサーとガイゼ（Ｇｌａｔｔｈａｒ ａｎｄ Ｇｅｉｓｅ）、Ｏｒｇ． Ｌｅｔｔ， ２： ２３１５−２３１７ （２０００）；ギレレ（Ｇｕｉｌｌｉｅｒ）ら、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． １００： ２０９１−２１５７ （２０００）；ビーレンガ（Ｗｉｅｒｅｎｇａ）、米国特許第４，０８６，２５４号及び本明細書の別の箇所に記載されている。脂肪族の鎖の中の異なる位置に開裂しやすい結合を設けることによって、レポーターシグナルのセットを調製しても構わない（それゆえに、結合が開裂すると異なる質量の断片が生じることとなる）。光で開裂可能な結合を伴う脂肪族の鎖はレポーターシグナルを構成する。このような合成レポーター分子を、例えば脱水反応により合成トリグリセリド内に組み込むことができる。いったん形成すると、これらの合成トリグリセリドのセットを対象の生体システム、例えば上記のものの中に導入することができる。例えば、その脂質をクロロホルムに抽出したり、リパーゼ又は加水分解反応を用いてトリグリセリド（ｔｒｉｇｙｃｅｒｉｄｅ）からレポーターシグナルを遊離させることによって、検出と定量のために、対象の生体システムからレポーターシグナルを回収することができる。
【０５６３】
開示された方法の形態及び態様
Ａ．レポーター分子の標識化
（ａ）それぞれのレポーターシグナルが共通する特性を有するところのレポーターシグナルのセットを、共通する特性を欠く分子から分離する工程、（ｂ）レポーターシグナルを改変する工程、（ｃ）レポーターシグナルの改変体を他のそれぞれのものから検出し識別する工程を含む方法が開示される。
【０５６４】
さらに、共通する特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルの質量の変化によりそれらが改変され、レポーターシグナルの改変体の質量電荷比の差異によってレポーターシグナルの改変体を識別する方法も開示される。
【０５６５】
さらに、レポーターシグナルの質量が断片化によって変化する方法も開示される。
【０５６６】
さらに、レポーターシグナルのセットが、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なるレポーターシグナルを含む方法も開示される。
【０５６７】
さらに、レポーターシグナルのセットが、１０以上の異なるレポーターシグナルを含む方法も開示される。
【０５６８】
さらに、レポーターシグナルが、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ポリマー、オリゴペプチド又はペプチド核酸である方法も開示される。
【０５６９】
さらに、レポーターシグナルが特異的結合分子と会合するか又は結合し、それぞれのレポーターシグナルが種々の特異的結合分子と会合するか又は結合する方法も開示される。
【０５７０】
さらに、レポーターシグナルがデコーディングタグと会合するか又は結合し、それぞれのレポーターシグナルが種々のデコーディングタグと会合するか又は結合する方法も開示される。
【０５７１】
さらに、工程（ａ）の前に、レポーターシグナルを一つ以上の検体と会合させる工程であって、それぞれのレポーターシグナルが種々の特異的結合分子と会合又は結合し、それぞれの特異的結合分子が異なる検体のうちの一つと特異的な相互作用が可能であり、特異的結合分子の検体との相互作用を介して、そのレポーターシグナルが検体と会合する工程をさらに含む方法も開示される。
【０５７２】
さらに、それぞれの時点でのレポーターシグナルの異なるセットを用いて、工程（ａ）〜工程（ｃ）を一回以上繰り返す方法も開示される。
【０５７３】
さらに、工程（ａ）の前に、レポーターシグナルの異なるセットを異なるサンプルと会合させる方法も開示される。
【０５７４】
さらに、レポーターシグナルの異なるセットはそれぞれ同一のレポーターシグナルを含む方法も開示される。
【０５７５】
さらに、レポーターシグナルのセットのそれぞれが単一のレポーターシグナルを含む方法も開示される。
【０５７６】
さらに、セットの中に存在するレポーターシグナルのすべてを、共通する特性を欠く分子から識別するか及び／又は分離するわけではなく、レポーターシグナルのすべてが改変されるわけではなく、そしてレポーターシグナルの改変体のすべてが同時に検出されるわけではない方法も開示される。
【０５７７】
さらに、共通する特性を欠く分子から、セット中のすべてのレポーターシグナルを識別及び／又は分離し、すべてのレポーターシグナルが改変を受け、レポーターシグナルのすべての改変体を異なる時点で検出する方法も開示される。
【０５７８】
さらに、それぞれのレポーターシグナルについて個別に工程（ａ）〜工程（ｃ）を実施する方法も開示される。
【０５７９】
さらに、レポーターシグナルがペプチドを含み、ペプチドが同一の質量電荷比を有する方法、及びペプチドが同一のアミノ酸組成を有する方法、及びペプチドが同一のアミノ酸配列を有する方法、及びそれぞれのペプチドの重い同位体の分布が異なっている方法、及びそれぞれのペプチドが異なるアミノ酸配列を有する方法、及びそれぞれのペプチドが不安定な又は開裂しやすい結合を異なる位置に有する方法も開示される。
【０５８０】
（ａ）それぞれのレポーターシグナルが共通する特性を有するところの一つ以上のレポーターシグナルを、複数のサンプルのそれぞれにおいて、共通する特性を欠く分子から分離する工程、（ｂ）レポーターシグナルを改変する工程、（ｃ）レポーターシグナルの改変体を他のそれぞれのものから検出し識別する工程を含む方法が開示される。
【０５８１】
さらに、共通する特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルの質量の変化によりそれらが改変され、レポーターシグナルの改変体の質量電荷比の差異によってレポーターシグナルの改変体を識別する方法も開示される。
【０５８２】
さらに、レポーターシグナルの質量が断片化によって変化する方法も開示される。
【０５８３】
さらに、レポーターシグナルが特異的結合分子と会合するか又は結合し、それぞれのレポーターシグナルが種々の特異的結合分子と会合するか又は結合する方法も開示される。
【０５８４】
さらに、レポーターシグナルがデコーディングタグと会合するか又は結合し、それぞれのレポーターシグナルが種々のデコーディングタグと会合するか又は結合する方法も開示される。
【０５８５】
さらに、工程（ａ）の前に、レポーターシグナルを一つ以上の検体と会合させる工程であって、それぞれのレポーターシグナルが種々の特異的結合分子と会合又は結合し、それぞれの特異的結合分子が異なる検体のうちの一つと特異的な相互作用が可能であり、特異的結合分子の検体との相互作用を介して、そのレポーターシグナルが検体と会合する工程をさらに含む方法も開示される。
【０５８６】
さらに、それぞれの時点での一つ以上のレポーターシグナルの異なるセットを用いて、工程（ａ）〜工程（ｃ）を一回以上繰り返す方法、及び工程（ａ）の前に、レポーターシグナルの異なるセットを異なるサンプルと会合させる方法、及びレポーターシグナルの異なるセットはそれぞれ同一のレポーターシグナルを含む方法、及びレポーターシグナルのセットがそれぞれ単一のレポーターシグナルを含む方法も開示される。
【０５８７】
さらに、レポーターシグナルのすべてを、共通する特性を欠く分子から識別するか及び／又は分離するわけではなく、レポーターシグナルのすべてが改変されるわけではなく、そしてレポーターシグナルの改変体のすべてが同時に検出されるわけではない方法も開示される。
【０５８８】
さらに、共通する特性を欠く分子から、すべてのレポーターシグナルを識別及び／又は分離し、すべてのレポーターシグナルが改変を受け、レポーターシグナルのすべての改変体を異なる時点で検出する方法も開示される。
【０５８９】
さらに、それぞれのサンプルについて個別に工程（ａ）〜工程（ｃ）を実施する方法も開示される。
【０５９０】
Ｂ．レポーターシグナルタンパク質の標識化
さらに、（ａ）標識化タンパク質のセットを分離する工程であって、それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、それぞれのレポーターシグナルが共通する特性を有し、共通する特性により、同一のタンパク質又はペプチドを含む標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となる工程、（ｂ）レポーターシグナルを改変して、それにより標識化タンパク質を改変する工程、（ｃ）標識化タンパク質の改変体を他のそれぞれのものから検出し識別する工程を含む方法も開示される。
【０５９１】
さらに、共通する特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルの質量の変化によりそれらが改変され、標識化タンパク質の改変体の質量電荷比の差異によって標識化タンパク質の改変体を識別する方法も開示される。
【０５９２】
さらに、レポーターシグナルの質量が断片化によって変化する方法も開示される。
【０５９３】
さらに、レポーターシグナルの改変によりそれらの電荷も変化する方法も開示される。
【０５９４】
さらに、共通する特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルの電荷の変化によりそれらが改変され、レポーターシグナルの改変体の質量電荷比の差異によって標識化タンパク質の改変体を識別することができる方法も開示される。
【０５９５】
さらに、標識化タンパク質のセットが、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なるレポーターシグナルを含む方法も開示される。
【０５９６】
さらに、標識化タンパク質のセットが、１０以上の異なるレポーターシグナルを含む方法も開示される。
【０５９７】
さらに、レポーターシグナルが、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ポリマー、オリゴペプチド又はペプチド核酸である方法も開示される。
【０５９８】
さらに、レポーターシグナルがタンパク質又はペプチドと結合する方法も開示される。
【０５９９】
さらに、それぞれの標識化タンパク質について個別に工程（ａ）〜工程（ｃ）を実施する方法も開示される。
【０６００】
さらに、工程（ａ）の前に、レポーターシグナルを、一つ以上のタンパク質、一つ以上のペプチド、又は一つ以上のタンパク質及びペプチドに結合する工程をさらに含む方法も開示される。
【０６０１】
さらに、それぞれの時点でのレポーターシグナルの異なるセットを用いて、工程を一回以上繰り返す方法も開示される。
【０６０２】
さらに、工程（ａ）の前に、レポーターシグナルの異なるセットを異なるサンプル中のタンパク質又はペプチドに結合する方法も開示される。
【０６０３】
さらに、レポーターシグナルの異なるセットがそれぞれ同一のレポーターシグナルを含む方法も開示される。
【０６０４】
また、レポーターシグナルのセットのそれぞれが単一のレポーターシグナルを含む方法も開示される。
【０６０５】
さらに、セットの中に存在する標識化タンパク質のすべてを、共通する特性を欠く分子から識別するか及び／又は分離するわけではなく、レポーターシグナルのすべてが改変されるわけではなく、そして標識化タンパク質の改変体のすべてが同時に検出されるわけではない方法も開示される。
【０６０６】
さらに、共通する特性を欠く分子から、セット中のすべての標識化タンパク質を識別及び／又は分離し、すべてのレポーターシグナルが改変を受け、標識化タンパク質のすべての改変体を異なる時点で検出する方法も開示される。
【０６０７】
さらに、それぞれのレポーターシグナルについて個別に工程（ａ）〜工程（ｃ）を実施する方法も開示される。
【０６０８】
さらに、共通する特性がレポーターシグナルと会合する一つ以上のアフィニティータグである方法も開示される。
【０６０９】
さらに、一つ以上のアフィニティータグがレポーターシグナルと会合する方法も開示される。
【０６１０】
さらに、検出される標識化タンパク質の改変体の収集によってタンパク質の目録が構成される方法も開示される。
【０６１１】
さらに、（ａ）一つ以上の標識化タンパク質を分離する工程であって、それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、それぞれのレポーターシグナルが共通する特性を有し、共通する特性により、一つ以上のサンプルのそれぞれの中において、同一のタンパク質又はペプチドを含む標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となる工程、（ｂ）レポーターシグナルを改変して、それにより標識化タンパク質を改変する工程、（ｃ）標識化タンパク質の改変体を他のそれぞれのものから検出し識別する工程を含む方法も開示される。
【０６１２】
さらに、共通する特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルの質量の変化によりそれらが改変され、標識化タンパク質の改変体の質量電荷比の差異によって標識化タンパク質の改変体を識別することができる方法も開示される。
【０６１３】
さらに、レポーターシグナルの質量が断片化によって変化する方法も開示される。
【０６１４】
さらに、レポーターシグナルの改変によりそれらの電荷も変化する方法も開示される。
【０６１５】
さらに、共通する特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルの電荷の変化によりそれらが改変され、レポーターシグナルの改変体の質量電荷比の差異によって標識化タンパク質の改変体を識別することができる方法も開示される。
【０６１６】
さらに、レポーターシグナルがタンパク質又はペプチドと結合する方法も開示される。
【０６１７】
さらに、工程（ａ）の前に、レポーターシグナルを、一つ以上のタンパク質、一つ以上のペプチド、又は一つ以上のタンパク質及びペプチドに結合させる工程をさらに含む方法も開示される。
【０６１８】
さらに、それぞれの時点での一つ以上のレポーターシグナルの異なるセットを用いて、工程を一回以上繰り返す方法も開示される。
【０６１９】
さらに、工程（ａ）の前に、レポーターシグナルの異なるセットを異なるサンプル中のタンパク質又はペプチドに結合する方法も開示される。
【０６２０】
さらに、レポーターシグナルの異なるセットがそれぞれ同一のレポーターシグナルを含む方法も開示される。
【０６２１】
また、レポーターシグナルのセットのそれぞれが単一のレポーターシグナルを含む方法も開示される。
【０６２２】
さらに、標識化タンパク質のすべてを、共通する特性を欠く分子から識別するか及び／又は分離するわけではなく、レポーターシグナルのすべてが改変されるわけではなく、そして標識化タンパク質の改変体のすべてが同時に検出されるわけではない方法も開示される。
【０６２３】
さらに、共通する特性を欠く分子から、すべての標識化タンパク質を識別及び／又は分離し、すべてのレポーターシグナルが改変を受け、標識化タンパク質のすべての改変体を異なる時点で検出する方法も開示される。
【０６２４】
さらに、それぞれのサンプルについて個別に工程（ａ）〜工程（ｃ）を実施する方法、及び異なるサンプルが同一のタンパク質サンプルからのものである方法、及びその異なるサンプルを異なる時点で得る方法、及び異なるサンプルが同一のタイプの生物体からのものである方法、及び異なるサンプルが同一のタイプの組織からのものである方法、及び異なるサンプルが同一のタイプの生物体からのものである方法、及び異なるサンプルが同一の生物体からのものである方法、及びその異なるサンプルを異なる時点で得る方法も開示される。
【０６２５】
さらに、異なるサンプルが異なる生物体からのものである方法も開示される。
【０６２６】
さらに、異なるサンプルが異なるタイプの組織からのものである方法も開示される。
【０６２７】
さらに、異なるサンプルが、生物体の異なる種からのものである方法も開示される。
【０６２８】
さらに、異なるサンプルが、生物体の異なる系統からのものである方法も開示される。
【０６２９】
さらに、異なるサンプルが異なる細胞区画からのものである方法も開示される。
【０６３０】
さらに、ある一つのサンプルには存在するが他のサンプルには存在しないタンパク質又はペプチドに対応するタンパク質又はペプチドを同定する工程又は調製する工程をさらに含む方法も開示される。
【０６３１】
さらに、異なるサンプル中に存在するタンパク質又はペプチドの相対量を測定するする工程をさらに含む方法も開示される。
【０６３２】
さらに、共通する特性が、レポーターシグナルと会合する一つ以上のアフィニティータグである方法も開示される。
【０６３３】
さらに、一つ以上のアフィニティータグがレポーターシグナルと会合する方法も開示される。
【０６３４】
さらに、サンプルのうちの一つの標識化タンパク質の存在、量、存在および量又は欠如のパターンが、サンプル中のタンパク質の目録を構成する方法も開示される。
【０６３５】
さらに、二番目のサンプルの標識化タンパク質の存在、量、存在および量又は欠如のパターンが二番目のサンプル中のタンパク質の目録を構成し、最初のサンプル中のタンパク質の目録が最初の目録であり、そして二番目のサンプル中のタンパク質の目録が二番目の目録であり、そして最初の目録と二番目の目録とを比較する工程をさらに含む方法も開示される。
【０６３６】
さらに、それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドとタンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、レポーターシグナルがペプチドを含み、レポーターシグナルペプチドが同一の質量電荷比を有する方法も開示される。
【０６３７】
さらに、レポーターシグナルペプチドが同一のアミノ酸組成を有する方法も開示される。
【０６３８】
さらに、レポーターシグナルペプチドが同一のアミノ酸配列を有する方法も開示される。
【０６３９】
さらに、レポーターシグナルペプチドの重い同位体の分布が異なっている方法も開示される。
【０６４０】
さらに、それぞれのレポーターシグナルペプチドの置換基の分布が異なっている方法も開示される。
【０６４１】
さらに、それぞれのレポーターシグナルペプチドが異なるアミノ酸配列を有する方法も開示される。
【０６４２】
さらに、それぞれのレポーターシグナルペプチドが不安定な又は開裂しやすい結合を異なる位置に有する方法も開示される。
【０６４３】
さらに、一つ以上のアフィニティータグがレポーターシグナルと会合する方法も開示される。
【０６４４】
（ａ）標識化タンパク質のセットを分離する工程であって、それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、それぞれの標識化タンパク質が共通する特性を有し、共通する特性により、同一のタンパク質又はペプチドを含む標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となる工程、（ｂ）レポーターシグナルを改変して、それにより標識化タンパク質を改変する工程、（ｃ）標識化タンパク質の改変体を他のそれぞれのものから検出し識別する工程を含む方法が開示される。
【０６４５】
（ａ）標識化タンパク質を改変する工程であって、それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が改変を受ける工程、（ｂ）標識化タンパク質の改変体を他のそれぞれのものから検出し識別する工程を含む方法が開示される。
【０６４６】
（ａ）標識化タンパク質を改変する工程であって、標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が改変を受ける工程、（ｂ）標識化タンパク質の改変体を標識化タンパク質の非改変体から検出し識別する工程を含む、タンパク質又はペプチドを検出する方法が開示される。
【０６４７】
さらに、標識化タンパク質の非改変体を検出する工程をさらに含む方法も開示される。
【０６４８】
標識化タンパク質を検出する工程であって、標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含み、レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が改変を受ける工程、標識化タンパク質の改変体を検出する工程であって、レポーターシグナルの改変によって標識化タンパク質が改変を受ける工程、並びに標識化タンパク質及び標識化タンパク質の改変体の特徴に基づいてタンパク質を同定する工程を含むタンパク質を検出する方法が開示される。
【０６４９】
さらに、標識化タンパク質の質量電荷比及び標識化タンパク質の改変体の質量電荷比又はレポーターシグナルの改変体の質量電荷比を検出することによって、標識化タンパク質及び標識化タンパク質の改変体を検出する方法も開示される。
【０６５０】
（ａ）他の分子から一つ以上の標識化タンパク質を分離する工程であって、標識化タンパク質が一つ以上のサンプルに由来し、それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含む工程、（ｂ）レポーターシグナルを改変して、それにより標識化タンパク質を改変する工程、（ｃ）標識化タンパク質の改変体を他のそれぞれのものから検出し識別する工程を含む方法が開示される。
【０６５１】
さらに、工程（ａ）の前に、一つ以上のレポーターシグナルを、一つ以上のサンプルのそれぞれからの一つ以上のタンパク質、一つ以上のペプチド、又は一つ以上のタンパク質及びペプチドと会合させる工程をさらに含む方法も開示される。
【０６５２】
さらに、それぞれの時点での一つ以上のレポーターシグナルの異なるセットを用いて、工程を一回以上繰り返す方法も開示される。
【０６５３】
さらに、工程（ａ）の前に、レポーターシグナルの異なるセットを異なるサンプル内のタンパク質又はペプチドに結合する方法も開示される。
【０６５４】
さらに、レポーターシグナルの異なるセットはそれぞれ同一のレポーターシグナルを含む方法も開示される。
【０６５５】
さらに、それぞれのレポーターシグナル又はそれぞれの標識化タンパク質が共通する特性を有し、共通する特性によって、同一のタンパク質又はペプチドを含む標識化タンパク質を、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となる方法も開示される。
【０６５６】
さらに、一つ以上の標識化タンパク質が単一のサンプルに由来する方法も開示される。
【０６５７】
さらに、単一の標識化タンパク質を他の分子から識別及び／又は分離する方法も開示される。
【０６５８】
さらに、複数の標識化タンパク質を他の分子から識別及び／又は分離する方法も開示される。
【０６５９】
さらに、検出された標識化タンパク質の改変体がサンプル中のタンパク質の目録を構成する方法も開示される。
【０６６０】
さらに、一つ以上の標識化タンパク質が複数のサンプルのそれぞれに由来する方法も開示される。
【０６６１】
さらに、それぞれのサンプルに由来する単一の標識化タンパク質を他の分子から識別及び／又は分離する方法も開示される。
【０６６２】
さらに、それぞれのサンプルに由来する複数の標識化タンパク質を他の分子から識別及び／又は分離する方法も開示される。
【０６６３】
さらに、検出された、それぞれのサンプルに由来する標識化タンパク質の改変体が、そのサンプル中のタンパク質の目録を構成する方法も開示される。
【０６６４】
（ａ）他の分子から一つ以上の標識化タンパク質を分離する工程であって、標識化タンパク質がサンプルに由来し、それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含む工程、（ｂ）レポーターシグナルを改変して、それにより標識化タンパク質を改変する工程、（ｃ）標識化タンパク質の改変体を他のそれぞれのものから検出し識別する工程によって検出される、サンプル中のタンパク質及びペプチドを含むタンパク質及びペプチドの目録が開示される。
【０６６５】
さらに、（ａ）他の分子から一つ以上の標識化タンパク質を分離する工程であって、標識化タンパク質が一つ以上のサンプルに由来し、それぞれの標識化タンパク質がタンパク質又はペプチドと、タンパク質又はペプチドが結合したレポーターシグナルとを含む工程、（ｂ）レポーターシグナルを改変して、それにより標識化タンパク質を改変する工程、（ｃ）標識化タンパク質の改変体を他のそれぞれのものから検出し識別する工程によって検出される、一つ以上のサンプル中のタンパク質及びペプチドを含むタンパク質及びペプチドの目録も開示される。
【０６６６】
Ｃ．レポーターシグナルの較正
（ａ）タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を生産する工程であって、タンパク質断片が標的タンパク質断片のセットを含み、標的タンパク質断片のそれぞれを改変することが可能であり、標的タンパク質断片のそれぞれの改変体を標的タンパク質断片の他のすべての改変体から識別できる工程、（ｂ）標的タンパク質断片をレポーターシグナルキャリブレーターのセットと混合する工程であって、それぞれの標的タンパク質断片が、少なくとも一つのレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、レポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを改変することが可能であり、それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができる工程、（ｃ）標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターの共通する特性に基づいて、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、他の分子から分離する工程、（ｄ）標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを改変する工程、（ｅ）標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を検出する工程であって、標的タンパク質断片の改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、タンパク質サンプル中の、標的タンパク質断片の改変体が由来するところの標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を示し、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量がタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する工程を含む、タンパク質シグニチャーを得る方法が開示される。
【０６６７】
さらに、工程（ｄ）及び工程（ｅ）を同時に実施する方法も開示される。
【０６６８】
さらに、標的タンパク質断片の改変体を質量分析装置を用いて検出する方法も開示される。
【０６６９】
さらに、工程（ｃ）、工程（ｄ）及び工程（ｅ）をタンデム質量分析装置で実施する方法も開示される。
【０６７０】
さらに、タンデム質量分析装置が最初の段階及び最後の段階を含み、タンデム質量分析装置の最初の段階を利用して工程（ｃ）を実施して質量電荷の狭い範囲のイオンを選択し、ガスによる衝突によって工程（ｄ）を実施し、そしてタンデム質量分析装置の最後の段階を利用して工程（ｅ）を実施する方法も開示される。
【０６７１】
さらに、タンデム質量分析装置の最初の段階が四重極質量フィルターであり、タンデム質量分析装置の最後の段階が飛行時間アナライザーである方法、及びタンデム質量分析装置の最後の段階が飛行時間アナライザーである方法も開示される。
【０６７２】
さらに、それぞれの標的タンパク質断片の質量電荷比を網羅するために、質量電荷の範囲を変える方法も開示される。
【０６７３】
さらに、予め定められた量のレポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを標的タンパク質断片と混合し、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれの検出される量が、標的タンパク質断片に対応する改変体の量の評価についての標準を与える方法も開示される。
【０６７４】
さらに、少なくとも二つのレポーターシグナルキャリブレーターの量が異なる方法も開示される。
【０６７５】
さらに、それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの相対量が、タンパク質サンプル中にあると予想される、対応するそれぞれの標的タンパク質断片の相対量に基づく方法も開示される。
【０６７６】
さらに、それぞれのレポーターシグナルキャリブレーターの量が同一である方法も開示される。
【０６７７】
さらに、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが断片化によって改変を受ける方法も開示される。
【０６７８】
さらに、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、光で開裂可能なアミノ酸の位置での開裂によって改変する方法も開示される。
【０６７９】
さらに、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが衝突セル内で断片化する方法も開示される。
【０６８０】
さらに、標的タンパク質断片がアスパラギン−プロリン結合の位置で断片化可能な方法も開示される。
【０６８１】
さらに、タンパク質サンプルのプロテアーゼ消化によりタンパク質断片を生産する方法も開示される。
【０６８２】
さらに、セリンプロテアーゼによるタンパク質サンプルの消化によってタンパク質断片を生産する方法も開示される。
【０６８３】
さらに、セリンプロテアーゼがトリプシンである方法も開示される。
【０６８４】
さらに、因子Ｘａ又はエンテロキナーゼによるタンパク質サンプルの消化によってタンパク質断片を生産する方法も開示される。
【０６８５】
さらに、タンパク質断片が、光で開裂可能なアミノ酸の位置での切断によって生産される方法も開示される。
【０６８６】
さらに、共通する特性が質量電荷比であり、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターの質量、電荷又は質量と電荷の変化によりそれらを改変し、標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体の質量電荷比の差異によって標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を識別することができる方法も開示される。
【０６８７】
さらに、標的タンパク質断片のセットが、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なる標的タンパク質断片を含む方法も開示される。
【０６８８】
さらに、標的タンパク質断片のセットが、１０以上の異なる標的タンパク質断片を含む方法も開示される。
【０６８９】
さらに、レポーターシグナルキャリブレーターのセットが、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なるレポーターシグナルキャリブレーターを含む方法も開示される。
【０６９０】
さらに、レポーターシグナルキャリブレーターがペプチドを含み、そのペプチドが、対応する標的タンパク質断片と同一の質量電荷比を持つ方法も開示される。
【０６９１】
さらに、ペプチドが、対応する標的タンパク質断片と同一のアミノ酸組成を有する方法、及びペプチドが、対応する標的タンパク質断片と同一のアミノ酸配列を有する方法、及びそれぞれのペプチドが、対応する標的タンパク質断片と異なるアミノ酸配列を有する方法、及びそれぞれのペプチドが不安定な又は開裂しやすい結合を異なる位置に有する方法も開示される。
【０６９２】
さらに、レポーターシグナルキャリブレーターが、ペプチド、オリゴヌクレオチド、炭水化物、ポリマー、オリゴペプチド又はペプチド核酸である方法も開示される。
【０６９３】
さらに、タンパク質シグニチャーを一つ以上の他のタンパク質シグニチャーと比較する工程をさらに含む方法も開示される。
【０６９４】
さらに、少なくとも一つの標的タンパク質断片が、少なくとも一つの修飾されたアミノ酸を含む方法も開示される。
【０６９５】
さらに、修飾されたアミノ酸が、リン酸化アミノ酸、アシル化アミノ酸又はグリコシル化アミノ酸である方法も開示される。
【０６９６】
さらに、少なくとも一つの標的タンパク質断片が、修飾されたアミノ酸を含む標的タンパク質断片と、その修飾されたアミノ酸以外の点で同一である方法も開示される。
【０６９７】
さらに、複数のタンパク質サンプルに関して工程（ａ）〜工程（ｅ）を実施する工程をさらに含む方法も開示される。
【０６９８】
さらに、タンパク質サンプルから生じるタンパク質シグニチャー間の差異を確認する工程をさらに含む方法も開示される。
【０６９９】
さらに、コントロールタンパク質サンプルに関して工程（ａ）〜工程（ｅ）を実施する工程、並びにタンパク質サンプルとコントロールタンパク質サンプルとから生じるタンパク質シグニチャー間の差異を確認する工程をさらに含む方法も開示される。
【０７００】
さらに、差異が、タンパク質サンプル及びコントロールタンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、量、存在および量又は欠如についての差異である方法も開示される。
【０７０１】
さらに、コントロールタンパク質サンプル及びテスタータンパク質サンプルに関して工程（ａ）〜工程（ｅ）が実施され、テスタータンパク質サンプル中の一つ以上のタンパク質分子を破壊、分裂又は除去できるように、テスタータンパク質サンプル又はテスタータンパク質サンプルの起源を工程（ａ）の前に処理し、破壊され、分裂し又は除去されたタンパク質分子に対応する標的タンパク質断片が、テスタータンパク質サンプルからではなくコントロールタンパク質サンプルから生じることになる方法も開示される。
【０７０２】
さらに、テスタータンパク質サンプル中の一つ以上のタンパク質分子を破壊、分裂又は除去できるように、テスタータンパク質サンプルを処理する方法も開示される。
【０７０３】
さらに、テスタータンパク質サンプルから一つ以上のタンパク質分子を分離することによって、テスターサンプル中の一つ以上のタンパク質分子を除去する方法も開示される。
【０７０４】
さらに、アフィニティー分離によって一つ以上のタンパク質分子を分離する方法も開示される。
【０７０５】
さらに、テスタータンパク質サンプル中の一つ以上のタンパク質分子を破壊、分裂又は除去できるように、テスタータンパク質サンプルの起源を処理する方法も開示される。
【０７０６】
さらに、一つ以上の遺伝子の発現を減少させるか又は除去する化合物、組成物又は状態に、テスターサンプルが由来するところの細胞をさらすことによって、起源への処理を成し遂げる方法も開示される。
【０７０７】
さらに、コントロールタンパク質サンプル及びテスタータンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の差異を確認する工程をさらに含む方法も開示される。
【０７０８】
さらに、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片間の差異を確認する工程をさらに含む方法も開示される。
【０７０９】
さらに、複数のタンパク質サンプルが分離手段によって生じ、分離手段は、液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、二次元クロマトグラフィー、二次元ゲル電気泳動、等電点電気泳動、薄層クロマトグラフィー、遠心分離、ろ過、イオンクロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、膜分離又はこれらの組み合わせを含む方法も開示される。
【０７１０】
さらに、タンパク質サンプルが、同一の分離手段によって生産される異なる画分又は異なるサンプルである方法も開示される。
【０７１１】
さらに、二番目のタンパク質サンプルに関して工程（ａ）〜工程（ｅ）を実施する工程をさらに含む方法も開示される。
【０７１２】
さらに、二番目のタンパク質サンプルが、最初のタンパク質サンプルと同一のタイプの生物体からのサンプルである方法も開示される。
【０７１３】
さらに、二番目のタンパク質サンプルが、最初のタンパク質サンプルと同一のタイプの組織からのサンプルである方法も開示される。
【０７１４】
さらに、二番目のタンパク質サンプルが、最初のタンパク質サンプルと同一の生物体からのサンプルである方法も開示される。
【０７１５】
さらに、二番目のタンパク質サンプルが、最初のタンパク質サンプルの異なる時点で得られるものである方法も開示される。
【０７１６】
さらに、二番目のタンパク質サンプルが、最初のタンパク質サンプルとは異なる生物体からのサンプルである方法も開示される。
【０７１７】
さらに、二番目のタンパク質サンプルが、最初のタンパク質サンプルとは異なるタイプの組織からのサンプルである方法も開示される。
【０７１８】
さらに、二番目のタンパク質サンプルが、最初のタンパク質サンプルとは異なる生物体の種からのサンプルである方法も開示される。
【０７１９】
さらに、二番目のタンパク質サンプルが、最初のタンパク質サンプルとは異なる生物体の系統からのサンプルである方法も開示される。
【０７２０】
さらに、二番目のタンパク質サンプルが、最初のタンパク質サンプルとは異なる細胞区画からのサンプルである方法も開示される。
【０７２１】
さらに、二番目のタンパク質サンプルからの二番目のタンパク質シグニチャーを得る工程、及び最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとを比較する工程であって、最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとの差異が、最初のタンパク質サンプルと二番目のタンパク質サンプルとの起源又は起源の条件の差異を示す工程をさらに含む方法も開示される。
【０７２２】
さらに、二番目のタンパク質サンプルからの二番目のタンパク質シグニチャーを得る工程、及び最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとを比較する工程であって、最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとの差異が、最初のタンパク質サンプルと二番目のタンパク質サンプルとのタンパク質修飾の差異を示す工程をさらに含む方法も開示される。
【０７２３】
さらに、最初のタンパク質サンプルが由来するところの細胞が、二番目のタンパク質サンプルが由来するところの細胞に比較して修飾が不完全なものであることを除いて、二番目のタンパク質サンプルが最初のタンパク質サンプルと同一のタイプの細胞からのサンプルである方法も開示される。
【０７２４】
さらに、二番目のタンパク質サンプルが最初のタンパク質サンプルと異なるタイプの細胞からのサンプルであり、最初のタンパク質サンプルが由来するところの細胞が、二番目のタンパク質サンプルが由来するところの細胞に比較して修飾が不完全なものである方法も開示される。
【０７２５】
さらに、タンパク質サンプルが一つ以上の細胞に由来する方法も開示される。
【０７２６】
さらに、タンパク質シグニチャーが細胞の生理的状態を示す方法も開示される。
【０７２７】
さらに、タンパク質シグニチャーが細胞の処理の効果を示す方法も開示される。
【０７２８】
さらに、細胞が一つの生物体に由来し、そしてその細胞がその生物体を処理することによって処理される方法も開示される。
【０７２９】
さらに、生物体に化合物を与えることによってその生物体を処理する方法も開示される。
【０７３０】
さらに、生物体がヒトである方法も開示される。
【０７３１】
さらに、タンパク質サンプルが分離手段によって生じ、分離手段は、液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、二次元クロマトグラフィー、二次元ゲル電気泳動、等電点電気泳動、薄層クロマトグラフィー、遠心分離、ろ過、イオンクロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、膜分離又はこれらの組み合わせを含む方法も開示される。
【０７３２】
さらに、レポーターシグナルキャリブレーターのセットが単一のレポーターシグナルキャリブレーターから成る方法も開示される。
【０７３３】
さらに、タンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーが、レポーターシグナルキャリブレーターに対応するタンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を表す方法も開示される。
【０７３４】
標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を検出する工程であって、標的タンパク質断片の改変体を標的タンパク質断片の他の改変体から識別することができ、それぞれの標的タンパク質断片が、少なくとも一つのレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができ、標的タンパク質断片の改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、タンパク質サンプル中の、標的タンパク質断片の改変体が由来するところの標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を示し、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量がタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する工程を含むタンパク質シグニチャーを得る方法が開示される。
【０７３５】
さらに、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターの共通する特性に基づいて、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、他の分子から識別及び／又は分離する方法も開示される。
【０７３６】
さらに、分離の後で標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを改変する方法も開示される。
【０７３７】
さらに、タンパク質サンプルの処理によって標的タンパク質断片を生産する方法も開示される。
【０７３８】
（ａ）タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を生産する工程であって、タンパク質断片が標的タンパク質断片のセットを含み、標的タンパク質断片を改変することが可能であり、標的タンパク質断片の改変体を標的タンパク質断片の他の改変体から識別できる工程、（ｂ）タンパク質サンプル中の他のタンパク質断片から標的タンパク質断片を分離する工程、（ｃ）標的タンパク質断片を改変する工程、（ｄ）標的タンパク質断片の改変体を検出する工程であって、標的タンパク質断片の改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、タンパク質サンプル中の、標的タンパク質断片の改変体が由来するところの標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を示し、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量がタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する工程を含む、タンパク質シグニチャーを得る方法が開示される。
【０７３９】
さらに、工程（ｂ）の前に又は工程（ｂ）と同時に、標的タンパク質断片をレポーターシグナルキャリブレーターのセットと混合する工程であって、それぞれの標的タンパク質断片が、少なくとも一つのレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルキャリブレーターを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができる工程をさらに含む方法も開示される。
【０７４０】
（ａ）タンパク質サンプル中の他のタンパク質断片から複数の標的タンパク質断片を分離する工程、（ｂ）標的タンパク質断片を改変する工程、（ｃ）標的タンパク質断片の改変体を検出する工程であって、標的タンパク質断片の改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、タンパク質サンプル中の、標的タンパク質断片の改変体が由来するところの標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を示し、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量がタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する工程を含む、タンパク質シグニチャーを得る方法が開示される。
【０７４１】
（ａ）タンパク質サンプルを予め定められた量のレポーターシグナルキャリブレーターと混合する工程であって、タンパク質サンプルが既知量のタンパク質を有し、タンパク質サンプルが標的タンパク質断片を含み、標的タンパク質断片を改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体を、標的タンパク質断片の改変体から識別することができる工程、（ｂ）標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを改変する工程、（ｃ）標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を検出する工程を含む、タンパク質サンプルを分析する方法が開示される。
【０７４２】
さらに、標的タンパク質断片の量の割合と検出されるレポーターシグナルキャリブレーターの量の割合とを測定する工程、標的タンパク質断片の量及びレポーターシグナルキャリブレーターの量の測定された割合と予想される割合とを比較する工程であって、予想される割合が、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の予想される量とレポーターシグナルキャリブレーターの予め定められた量とに基づくものであり、標的タンパク質断片の予想される量が、タンパク質サンプル中の既知量のタンパク質が標的タンパク質断片から成る場合にタンパク質サンプルが有している標的タンパク質断片の量であり、測定された割合と予想される割合との差異が、標的タンパク質断片についてのタンパク質サンプルの純度の指標であり、測定された割合が予想される割合に近ければ近いほど、タンパク質サンプルがより純粋である工程をさらに含む方法も開示される。
【０７４３】
（ａ）タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を生産する工程であって、タンパク質サンプルが既知量のタンパク質を有し、タンパク質サンプルが標的タンパク質を含み、タンパク質断片が標的タンパク質に由来する標的タンパク質断片を含む工程、（ｂ）タンパク質サンプルを、予め定められた量のレポーターシグナルキャリブレーターと混合する工程であって、標的タンパク質断片を改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体を、標的タンパク質断片の改変体から識別することができる工程、（ｂ）標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを改変する工程、（ｃ）標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を検出する工程を含む、タンパク質サンプルを分析する方法が開示される。
【０７４４】
さらに、標的タンパク質断片の量の割合と検出されるレポーターシグナルキャリブレーターの量の割合とを測定する工程、標的タンパク質断片の量及びレポーターシグナルキャリブレーターの量の測定された割合と予想される割合とを比較する工程であって、予想される割合が、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の予想される量とレポーターシグナルキャリブレーターの予め定められた量とに基づくものであり、標的タンパク質断片の予想される量が、タンパク質サンプル中の既知量のタンパク質が標的タンパク質から成る場合にタンパク質サンプルが有している標的タンパク質断片の量であり、測定された割合と予想される割合との差異が、標的タンパク質についてのタンパク質サンプルの純度の指標であり、測定された割合が予想される割合に近ければ近いほど、タンパク質サンプルがより純粋である工程をさらに含む方法も開示される。
【０７４５】
（ａ）タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を生産する工程であって、タンパク質断片が標的タンパク質断片のセットを含み、標的タンパク質断片のそれぞれを改変することが可能であり、標的タンパク質断片のそれぞれの改変体を標的タンパク質断片の他のすべての改変体から識別できる工程、（ｂ）標的タンパク質断片をレポーターシグナルキャリブレーターのセットと混合する工程であって、それぞれの標的タンパク質断片が、少なくとも一つのレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、レポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができる工程、（ｃ）標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターの共通する特性に基づいて、標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを、他の分子から分離する工程、（ｄ）標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターを改変する工程、（ｅ）標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を検出する工程であって、標的タンパク質断片の改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、タンパク質サンプル中の、標的タンパク質断片の改変体が由来するところの標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を示し、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量がタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する工程を含むタンパク質シグニチャーを得る方法が開示される。
【０７４６】
標的タンパク質断片の改変体及びレポーターシグナルキャリブレーターの改変体を検出する工程であって、標的タンパク質断片のそれぞれの改変体を標的タンパク質断片の他のすべての改変体から識別でき、それぞれの標的タンパク質断片が、少なくとも一つのレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、共通する特性を共有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターが互いに対応しあい、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができ、標的タンパク質断片の改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、タンパク質サンプル中の、標的タンパク質断片の改変体が由来するところの標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を示し、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量がタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する工程を含むタンパク質シグニチャーを得る方法が開示される。
【０７４７】
（ａ）タンパク質サンプルを処理してタンパク質断片を生産する工程であって、タンパク質断片が標的タンパク質断片のセットを含み、標的タンパク質断片のそれぞれを改変することが可能であり、標的タンパク質断片のそれぞれの改変体を標的タンパク質断片の他のすべての改変体から識別できる工程、（ｂ）タンパク質サンプル中の他のタンパク質断片から標的タンパク質断片を分離する工程、（ｃ）標的タンパク質断片を改変する工程、（ｄ）標的タンパク質断片の改変体を検出する工程であって、標的タンパク質断片の改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、タンパク質サンプル中の、標的タンパク質断片の改変体が由来するところの標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量を示し、タンパク質サンプル中の標的タンパク質断片の存在、欠如、量又は存在および量がタンパク質サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する工程を含む、タンパク質シグニチャーを得る方法が開示される。
【０７４８】
さらに、工程（ｂ）の前に又は工程（ｂ）と同時に、標的タンパク質断片をレポーターシグナルキャリブレーターのセットと混合する工程であって、それぞれの標的タンパク質断片が、少なくとも一つのレポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有し、共通する特性により、共通する特性を有する標的タンパク質断片及びレポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルキャリブレーターのそれぞれを改変することが可能であり、レポーターシグナルキャリブレーターの改変体のそれぞれを、レポーターシグナルキャリブレーターと共通する特性を共有する標的タンパク質断片の改変体から識別することができる工程をさらに含む方法も開示される。
【０７４９】
Ｄ．レポーターシグナル融合体
一つ以上の発現サンプルに由来する、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、一つ以上の発現サンプルは集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが改変レポーターシグナルペプチドのうちの一つであり、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現を示す工程を含む、発現を検出する方法が開示される。
【０７５０】
さらに、検出される、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの量を測定する工程であって、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの量が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの一つ以上の発現サンプルの存在量を示す工程をさらに含む方法も開示される。
【０７５１】
さらに、存在するアミノ酸セグメントの量が、検出される、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの量に比例する方法も開示される。
【０７５２】
さらに、複数の改変レポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、それぞれの改変レポーターシグナルペプチドの検出が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現を示す工程をさらに含む方法も開示される。
【０７５３】
さらに、検出される改変レポーターシグナルペプチドの量を測定する工程であって、それぞれの改変レポーターシグナルペプチドの量が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの一つ以上の発現サンプルの存在量を示す工程をさらに含む方法も開示される。
【０７５４】
さらに、存在するアミノ酸セグメントの量が、検出される改変レポーターシグナルペプチドの量に比例する方法も開示される。
【０７５５】
さらに、レポーターシグナルペプチドの改変体の存在、欠如、量又は存在および量が、レポーターシグナルペプチドの改変体が由来するところのレポーターシグナルペプチドの発現サンプルの存在、欠如、量又は存在および量を示し、発現サンプル中のレポーターシグナルペプチドの存在、欠如、量又は存在および量が発現サンプルのタンパク質シグニチャーを構成する方法も開示される。
【０７５６】
さらに、レポーターシグナルペプチドの改変体を質量分析装置を用いて検出する法も開示される。
【０７５７】
さらに、レポーターシグナルペプチドの改変体をタンデム質量分析装置で検出する方法も開示される。
【０７５８】
さらに、質量分析装置が、単一イオンフィルタリング、衝突セル及び飛行時間分析装置についての四重極セットを含む方法も開示される。
【０７５９】
さらに、レポーターシグナルペプチドが断片化によって改変を受ける方法も開示される。
【０７６０】
さらに、レポーターシグナルペプチドが光で開裂可能なアミノ酸の位置で切断されることによって改変を受ける方法も開示される。
【０７６１】
さらに、レポーターシグナルペプチドが衝突セル内で断片化する方法も開示される。
【０７６２】
さらに、レポーターシグナルペプチドが、アスパラギン−プロリン結合の位置、メチオニンの位置又はリン酸化アミノ酸の位置で断片化する方法も開示される。
【０７６３】
さらに、共通する特性が質量電荷比であり、レポーターシグナルペプチドの質量、電荷又は質量と電荷の変化によりそれらが改変され、レポーターシグナルペプチドの改変体の質量電荷比の差異によってレポーターシグナルペプチドの改変体を識別することができる方法も開示される。
【０７６４】
さらに、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上、４０以上、５０以上、６０以上、７０以上、８０以上、９０以上又は１００以上の異なるレポーターシグナルペプチドが存在する方法も開示される。
【０７６５】
さらに、１０以上の異なるレポーターシグナルペプチドが存在する方法も開示される。
【０７６６】
さらに、それぞれのペプチドが不安定な又は開裂しやすい結合を異なる位置に有する方法も開示される。
【０７６７】
さらに、タンパク質シグニチャーを一つ以上の他のタンパク質シグニチャーと比較する工程をさらに含む方法も開示される。
【０７６８】
さらに、検出された改変レポーターシグナルペプチドが複数の発現サンプルに由来する方法も開示される。
【０７６９】
さらに、検出された改変レポーターシグナルペプチドのいくつかはコントロール発現サンプルに由来し、発現サンプルとコントロール発現サンプルとから生じるタンパク質シグニチャー間の差異を確認する方法も開示される。
【０７７０】
さらに、差異が、発現サンプル及びコントロール発現サンプル中のレポーターシグナルペプチドの存在、量、存在および量又は欠如についての差異である方法も開示される。
【０７７１】
さらに、複数の発現サンプルがコントロール発現サンプル及びテスター発現サンプルを含み、テスター発現サンプル中の一つ以上のアミノ酸セグメントを破壊、分裂又は除去できるように、テスター発現サンプル又はテスター発現サンプルの起源を処理し、破壊され、分裂し又は除去されたアミノ酸セグメントに対応するレポーターシグナルペプチドが、テスター発現サンプルからではなくコントロール発現サンプルから生じることになる方法も開示される。
【０７７２】
さらに、テスター発現サンプル中の一つ以上のアミノ酸セグメントを破壊、分裂又は除去できるように、テスター発現サンプルを処理する方法も開示される。
【０７７３】
さらに、テスター発現サンプルから一つ以上のアミノ酸セグメントを分離することによって、テスターサンプル中の一つ以上のアミノ酸セグメントを除去する方法も開示される。
【０７７４】
さらに、アフィニティー分離によって一つ以上のアミノ酸セグメントを分離する方法も開示される。
【０７７５】
さらに、テスター発現サンプル中の一つ以上のアミノ酸セグメントを破壊、分裂又は除去できるように、テスター発現サンプルの起源を処理する方法も開示される。
【０７７６】
さらに、一つ以上のヌクレオチドセグメントの発現を減少させるか又は除去する化合物、組成物又は状態に、テスターサンプルが由来するところの細胞をさらすことによって、起源への処理を成し遂げる方法も開示される。
【０７７７】
さらに、コントロール発現サンプル及びテスター発現サンプル中のレポーターシグナルペプチドの差異を確認する工程をさらに含む方法も開示される。
【０７７８】
さらに、発現サンプル中のレポーターシグナルペプチド間の差異を確認する工程をさらに含む方法も開示される。
【０７７９】
さらに、少なくとも二つの発現サンプル又は少なくとも二つの発現サンプルの起源を異なる条件に付す方法も開示される。
【０７８０】
さらに、発現サンプルの起源が細胞である方法も開示される。
【０７８１】
さらに、少なくとも二つの発現サンプルのタンパク質シグニチャーの差異が、異なる条件の影響を示す方法も開示される。
【０７８２】
さらに、異なる条件が異なる化合物にさらすことである方法も開示される。
【０７８３】
さらに、異なる条件が、化合物にさらすこと及び化合物にさらさないことである方法も開示される。
【０７８４】
さらに、二番目の発現サンプルからの二番目のタンパク質シグニチャーを得る工程、及び最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとを比較する工程であって、最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとの差異が、最初の発現サンプルと二番目の発現サンプルとの起源又は起源の条件の差異を示す工程をさらに含む方法も開示される。
【０７８５】
さらに、二番目の発現サンプルからの二番目のタンパク質シグニチャーを得る工程、及び最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとを比較する工程であって、最初のタンパク質シグニチャーと二番目のタンパク質シグニチャーとの差異が、最初の発現サンプルと二番目の発現サンプルとのタンパク質修飾の差異を示す工程をさらに含む方法も開示される。
【０７８６】
さらに、最初の発現サンプルが由来するところの細胞が、二番目の発現サンプルが由来するところの細胞に比較して修飾が不完全なものであることを除いて、二番目の発現サンプルが最初の発現サンプルと同一のタイプの細胞からのサンプルである方法も開示される。
【０７８７】
さらに、二番目の発現サンプルが最初の発現サンプルと異なるタイプの細胞からのサンプルであり、最初の発現サンプルが由来するところの細胞が、二番目の発現サンプルが由来するところの細胞に比較して修飾が不完全なものである方法も開示される。
【０７８８】
さらに、発現サンプルが一つ以上の細胞に由来する方法も開示される。
【０７８９】
さらに、タンパク質シグニチャーが細胞の生理的状態を示す方法も開示される。
【０７９０】
さらに、タンパク質シグニチャーが細胞の処理の効果を示す方法も開示される。
【０７９１】
さらに、細胞が一つの生物体に由来し、そしてその細胞がその生物体を処理することによって処理される方法も開示される。
【０７９２】
さらに、生物体に化合物を与えることによってその生物体を処理する方法も開示される。
【０７９３】
さらに、生物体がヒトである方法も開示される。
【０７９４】
さらに、改変を受けたレポーターシグナルペプチドを最初の及び二番目の発現サンプル中にて検出する方法も開示される。
【０７９５】
さらに、二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルと同一のタイプの生物体からのサンプルである方法も開示される。
【０７９６】
さらに、二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルと同一のタイプの組織からのサンプルである方法も開示される。
【０７９７】
さらに、二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルと同一の生物体からのサンプルである方法も開示される。
【０７９８】
さらに、二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルとは異なる時点で得られるものである方法も開示される。
【０７９９】
さらに、二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルとは異なる生物体からのサンプルである方法も開示される。
【０８００】
さらに、二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルとは異なるタイプの組織からのサンプルである方法も開示される。
【０８０１】
さらに、二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルとは異なる生物体の種からのサンプルである方法も開示される。
【０８０２】
さらに、二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルとは異なる生物体の系統からのサンプルである方法も開示される。
【０８０３】
さらに、二番目の発現サンプルが、最初の発現サンプルとは異なる細胞区画からのサンプルである方法も開示される。
【０８０４】
さらに、レポーターシグナルペプチドを改変する工程をさらに含む方法も開示される。
【０８０５】
さらに、断片化によってレポーターシグナルペプチドが改変を受ける方法も開示される。
【０８０６】
さらに、光で開裂可能なアミノ酸の位置で開裂することによってレポーターシグナルペプチドが改変を受ける方法も開示される。
【０８０７】
さらに、レポーターシグナルペプチドは衝突セル内で断片化する方法も開示される。
【０８０８】
さらに、レポーターシグナルペプチドが、アスパラギン−プロリン結合の位置、メチオニンの位置又はリン酸化アミノ酸の位置で断片化する方法も開示される。
【０８０９】
さらに、レポーターシグナルペプチドを発現サンプルから分離する工程をさらに含む方法も開示される。
【０８１０】
さらに、共通する特性に基づいて、発現サンプルからレポーターシグナルペプチドを識別する及び／又は分離する方法も開示される。
【０８１１】
さらに、対象となっているタンパク質又はペプチドからレポーターシグナルペプチドを切断する工程をさらに含む方法も開示される。
【０８１２】
さらに、共通する特性に基づいて、対象となっているタンパク質又はペプチドからレポーターシグナルペプチドを識別する及び／又は分離する方法も開示される。
【０８１３】
さらに、アミノ酸セグメントをレポーターシグナルペプチド部分とタンパク質部分とに切断する工程をさらに含む方法も開示される。
【０８１４】
さらに、２以上の発現サンプルを一緒に混合する工程をさらに含む方法も開示される。
【０８１５】
さらに、２以上のアミノ酸セグメントを一緒に混合し、混合されたアミノ酸セグメントが２以上の異なる発現サンプルに由来する工程をさらに含む方法も開示される。
【０８１６】
さらに、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現により、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところの発現サンプルを同定する方法も開示される。
【０８１７】
さらに、発現サンプルが一つ以上の細胞に由来し、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現により、同定される発現サンプルが由来するところの細胞を同定する方法も開示される。
【０８１８】
さらに、発現サンプルが一つ以上の生物体に由来し、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現により、同定される発現サンプルが由来するところの生物体を同定する方法も開示される。
【０８１９】
さらに、発現サンプルが一つ以上の組織に由来し、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現により、同定される発現サンプルが由来するところの組織を同定する方法も開示される。
【０８２０】
さらに、発現サンプルが一つ以上の細胞系に由来し、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現により、同定される発現サンプルが由来するところの細胞系を同定する方法も開示される。
【０８２１】
さらに、それぞれの核酸分子がさらに発現配列を含むものであって、アミノ酸セグメントが発現できるように、その発現配列が機能できる状態でヌクレオチドセグメントに結合している方法も開示される。
【０８２２】
さらに、発現配列が翻訳発現配列を含む方法も開示される。
【０８２３】
さらに、発現配列がさらに転写発現配列を含む方法も開示される。
【０８２４】
さらに、アミノ酸セグメントがインビトロで発現される方法も開示される。
【０８２５】
さらに、アミノ酸セグメントがインビボで発現される方法も開示される。
【０８２６】
さらに、アミノ酸セグメントが細胞培養中に発現される方法も開示される。
【０８２７】
さらに、それぞれの核酸分子の発現配列が異なっている方法も開示される。
【０８２８】
さらに、異なる発現配列が異なって調節される方法も開示される。
【０８２９】
さらに、発現配列が同じように調節される方法も開示される。
【０８３０】
さらに、複数の発現配列が、同一の発現カスケードの一部として発現される遺伝子の発現配列か、又は遺伝子に由来する発現配列である方法も開示される。
【０８３１】
さらに、それぞれの核酸分子の発現配列が同一である方法も開示される。
【０８３２】
さらに、発現配列が同じように調節される方法も開示される。
【０８３３】
さらに、少なくとも二つの核酸分子の発現配列が異なっている方法も開示される。
【０８３４】
さらに、少なくとも二つの核酸分子の発現配列が同一である方法も開示される。
【０８３５】
さらに、アミノ酸セグメントの発現が誘導される方法も開示される。
【０８３６】
さらに、それぞれの核酸分子がさらに複製配列を含むものであって、その複製配列は核酸分子の複製を媒介する方法も開示される。
【０８３７】
さらに、核酸分子がインビトロで複製される方法も開示される。
【０８３８】
さらに、核酸分子がインビボで複製される方法も開示される。
【０８３９】
さらに、核酸分子が細胞培養中に複製される方法も開示される。
【０８４０】
さらに、それぞれの核酸分子がさらに組み込み配列を含むものであって、組み込み配列は核酸分子の他の核酸への組み込みを媒介する方法も開示される。
【０８４１】
さらに、核酸分子が染色体に組み込まれている方法も開示される。
【０８４２】
さらに、核酸分子が染色体の予め決定された位置に組み込まれている方法も開示される。
【０８４３】
さらに、一つ以上の核酸サンプル中で核酸を複製することにより核酸分子を生産する方法も開示される。
【０８４４】
さらに、プライマーのペアを用いて核酸を複製し、核酸分子の生産に用いられるプライマーのペアにおける最初のプライマーのそれぞれがレポーターシグナルペプチドをコード化しているヌクレオチド配列を含む方法も開示される。
【０８４５】
さらに、それぞれの最初のプライマーがさらに発現配列を含む方法も開示される。
【０８４６】
さらに、最初のプライマーのそれぞれのヌクレオチド配列がエピトープタグをもコード化している方法も開示される。
【０８４７】
さらに、それぞれのアミノ酸セグメントがさらにエピトープタグを含む方法も開示される。
【０８４８】
さらに、それぞれのアミノ酸セグメントのエピトープタグが異なっている方法も開示される。
【０８４９】
さらに、それぞれのアミノ酸セグメントのエピトープタグが同一である方法も開示される。
【０８５０】
さらに、少なくとも二つのアミノ酸セグメントのエピトープタグが異なっている方法も開示される。
【０８５１】
さらに、少なくとも二つのアミノ酸セグメントのエピトープタグが同一である方法も開示される。
【０８５２】
さらに、エピトープタグを介して、アミノ酸セグメントを一つ以上の発現サンプルから識別するか及び／又は分離する方法も開示される。
【０８５３】
さらに、それぞれのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが異なっている方法も開示される。
【０８５４】
さらに、それぞれのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが同一である方法も開示される。
【０８５５】
さらに、少なくとも二つのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが異なっている方法も開示される。
【０８５６】
さらに、少なくとも二つのアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが同一である方法も開示される。
【０８５７】
さらに、核酸分子が細胞中に存在する方法も開示される。
【０８５８】
さらに、それぞれの核酸分子が異なる細胞内に存在する方法も開示される。
【０８５９】
さらに、それぞれの核酸分子が同一の細胞内に存在する方法も開示される。
【０８６０】
さらに、それぞれの核酸分子がさらに発現配列を含むものであって、アミノ酸セグメントが発現できるように、発現配列が機能できる状態でヌクレオチドセグメントに結合している方法も開示される。
【０８６１】
さらに、それぞれの核酸分子の発現配列が異なる方法も開示される。
【０８６２】
さらに、発現配列が同じように調節される方法も開示される。
【０８６３】
さらに、複数の発現配列が、同一の発現カスケードの一部として発現される遺伝子の発現配列か、又は遺伝子に由来する発現配列である方法も開示される。
【０８６４】
さらに、核酸分子が細胞の染色体内に組み込まれている方法も開示される。
【０８６５】
さらに、核酸分子が染色体の予め決定された位置に組み込まれている方法も開示される。
【０８６６】
さらに、染色体が人工染色体である方法も開示される。
【０８６７】
さらに、核酸分子がプラスミドか又はプラスミド内に組み込まれている方法も開示される。
【０８６８】
さらに、細胞が細胞系に属する方法も開示される。
【０８６９】
さらに、それぞれの核酸分子が異なる細胞系内に存在する方法も開示される。
【０８７０】
４０８Ｈ．それぞれの核酸分子が同一の細胞系内に存在する請求項４０８Ｆの方法。
【０８７１】
さらに、発現サンプルが細胞から生産される方法も開示される。
【０８７２】
さらに、それぞれの発現サンプルが細胞サンプルの細胞から生産され、それぞれの発現サンプルが異なる細胞サンプルから生産される方法も開示される。
【０８７３】
さらに、それぞれの細胞サンプルが異なる条件に付される方法も開示される。
【０８７４】
さらに、それぞれの細胞サンプルを異なる試験化合物と接触させる方法も開示される。
【０８７５】
さらに、それぞれの細胞サンプルが異なる条件下で培養される方法も開示される。
【０８７６】
さらに、それぞれの細胞サンプルが異なる生物体に由来する方法も開示される。
【０８７７】
さらに、それぞれの細胞サンプルが異なる組織に由来する方法も開示される。
【０８７８】
さらに、それぞれの細胞サンプルが、異なる時点での同一の起源から選ばれる方法も開示される。
【０８７９】
さらに、発現サンプルが細胞の溶解によって生産される方法も開示される。
【０８８０】
さらに、核酸分子が生物体内に存在する方法も開示される。
【０８８１】
さらに、それぞれの核酸分子が異なる生物体内に存在する方法も開示される。
【０８８２】
さらに、それぞれの核酸分子が同一の生物体内に存在する方法も開示される。
【０８８３】
さらに、それぞれの核酸分子がさらに発現配列を含むものであって、アミノ酸セグメントが発現できるように、発現配列が機能できる状態でヌクレオチドセグメントに結合している方法も開示される。
【０８８４】
さらに、それぞれの核酸分子の発現配列が異なる方法も開示される。
【０８８５】
さらに、発現配列が同じように調節される方法も開示される。
【０８８６】
さらに、複数の発現配列が、同一の発現カスケードの一部として発現される遺伝子の発現配列か、又は遺伝子に由来する発現配列である方法も開示される。
【０８８７】
さらに、核酸分子が生物体の染色体内に組み込まれている方法も開示される。
【０８８８】
さらに、核酸分子が染色体の予め決定された位置に組み込まれている方法も開示される。
【０８８９】
さらに、染色体が人工染色体である方法も開示される。
【０８９０】
さらに、核酸分子がプラスミドか又はプラスミド内に組み込まれている方法も開示される。
【０８９１】
さらに、それぞれの核酸分子が異なる生物体内に存在する方法も開示される。
【０８９２】
さらに、それぞれの核酸分子が同一の生物体内に存在する方法も開示される。
【０８９３】
さらに、核酸分子が一つの生物体の細胞内に存在する方法も開示される。
【０８９４】
さらに、核酸分子が生物体の実質的にすべての細胞内に存在する方法も開示される。
【０８９５】
さらに、核酸分子が生物体のいくつかの細胞内に存在する方法も開示される。
【０８９６】
さらに、アミノ酸セグメントが生物体の実質的にすべての細胞内で発現される方法も開示される。
【０８９７】
さらに、アミノ酸セグメントが生物体のいくつかの細胞内で発現される方法も開示される。
【０８９８】
さらに、それぞれのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている方法も開示される。
【０８９９】
さらに、それぞれのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが同一である方法も開示される。
【０９００】
さらに、少なくとも二つのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている方法も開示される。
【０９０１】
さらに、少なくとも二つのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが同一である方法も開示される。
【０９０２】
さらに、対象となっているタンパク質又はペプチドが関連性を有するものである方法も開示される。
【０９０３】
さらに、対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一のカスケードで生成するタンパク質である方法も開示される。
【０９０４】
さらに、対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一の条件の下で発現されるタンパク質である方法も開示される。
【０９０５】
さらに、対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一の疾患に関連しているタンパク質である方法も開示される。
【０９０６】
さらに、対象となっているタンパク質又はペプチドが、同一の細胞のタイプに関連しているタンパク質である方法も開示される。
【０９０７】
さらに、対象となっているタンパク質又はペプチドが同一の組織のタイプに関連しているタンパク質である方法も開示される。
【０９０８】
さらに、対象となっているタンパク質又はペプチドが同一の酵素経路中のタンパク質である方法も開示される。
【０９０９】
さらに、そのヌクレオチドセグメントが、アミノ酸セグメントのそれぞれがレポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むところの複数のアミノ酸セグメントをコード化している方法も開示される。
【０９１０】
さらに、ヌクレオチドセグメントのうちの一つの中の少なくとも二つのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている方法も開示される。
【０９１１】
さらに、ヌクレオチドセグメントのうちの一つの中のアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている方法も開示される。
【０９１２】
さらに、ヌクレオチドセグメントのうちのそれぞれの中の少なくとも二つのアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている方法も開示される。
【０９１３】
さらに、ヌクレオチドセグメントのうちのそれぞれの中のアミノ酸セグメントの、対象となっているタンパク質又はペプチドが異なっている方法も開示される。
【０９１４】
さらに、そのセットが単一の核酸分子から成る方法も開示される。
【０９１５】
さらに、そのセットが単一の核酸分子から成り、その核酸分子が、ヌクレオチドセグメントのそれぞれがアミノ酸セグメントをコード化しているところの複数のヌクレオチドセグメントを含む方法も開示される。
【０９１６】
さらに、アミノ酸セグメントが、レポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとの間の結合部の近傍の開裂部位を含む方法も開示される。
【０９１７】
さらに、開裂部位が開裂している方法も開示される。
【０９１８】
さらに、レポーターシグナルペプチドを、対象となっているペプチド又はタンパク質から識別するか及び／又は分離する方法も開示される。
【０９１９】
さらに、開裂部位がトリプシン開裂部位である方法も開示される。
【０９２０】
さらに、開裂部位が、レポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとの間の結合部に存在する方法も開示される。
【０９２１】
さらに、それぞれのアミノ酸セグメントがさらに自己開裂セグメントを含んでいる方法も開示される。
【０９２２】
さらに、自己開裂セグメントが、レポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとの間に存在する方法も開示される。
【０９２３】
さらに、自己開裂セグメントがアミノ酸セグメントを開裂させる方法も開示される。
【０９２４】
さらに、レポーターシグナルペプチドを、対象となっているペプチド又はタンパク質から識別する及び／又は分離する方法も開示される。
【０９２５】
さらに、自己開裂セグメントがインテインセグメントである方法も開示される。
【０９２６】
さらに、異なる改変を受けた複数のレポーターシグナルペプチドが検出され、改変を受けたレポーターシグナルペプチドのそれぞれの検出が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントの発現を示す方法も開示される。
【０９２７】
さらに、異なる発現サンプルが異なる核酸分子を含み、改変レポーターシグナルペプチドのそれぞれの検出が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む発現サンプルの発現を示す方法も開示される。
【０９２８】
さらに、複数の異なる発現サンプルが存在し、異なる発現サンプルのそれぞれが異なる核酸分子を含み、改変レポーターシグナルペプチドの検出が、検出される改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む発現サンプルの発現を示す方法も開示される。
【０９２９】
一つ以上の発現サンプルに由来する、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、一つ以上の発現サンプルは集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが改変レポーターシグナルペプチドのうちの一つであり、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントの発現を示す工程を含む、発現を検出する方法が開示される。
【０９３０】
さらに、検出される標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの量を測定する工程であって、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの量が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むヌクレオチドセグメントの一つ以上の発現サンプルの存在量を示す工程をさらに含む方法も開示される。
【０９３１】
さらに、存在するヌクレオチドセグメントの量が、検出される、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの量に比例する方法も開示される。
【０９３２】
さらに、改変を受けた複数のレポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、改変を受けたそれぞれのレポーターシグナルペプチドの検出が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むヌクレオチドセグメントの発現を示す工程をさらに含む方法も開示される。
【０９３３】
さらに、検出される改変レポーターシグナルペプチドの量を測定する工程であって、改変レポーターシグナルペプチドのそれぞれの量が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むヌクレオチドセグメントの一つ以上の発現サンプルの存在量を示す工程をさらに含む方法も開示される。
【０９３４】
さらに、存在するヌクレオチドセグメントの量が、検出される改変レポーターシグナルペプチドの量に比例する方法も開示される。
【０９３５】
一つ以上の発現サンプルに由来する、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントを検出する工程であって、一つ以上の発現サンプルは集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、アミノ酸セグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸セグメントを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸セグメントが変化し、それぞれのアミノ酸セグメントの改変体をアミノ酸セグメントの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントが改変アミノ酸セグメントのうちの一つであり、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントの検出が、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントが由来するところのアミノ酸セグメントの発現を示す工程を含む、発現を検出する方法が開示される。
【０９３６】
一つ以上の発現サンプルに由来する改変アミノ酸サブセグメントを検出する工程であって、一つ以上の発現サンプルは集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、アミノ酸セグメントがそれぞれアミノ酸サブセグメントを含み、それぞれのアミノ酸サブセグメントが対象となっているタンパク質又はペプチドの一部と、レポーターシグナルペプチドのすべて又は一部とを含み、アミノ酸サブセグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸サブセグメントを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸サブセグメントが変化し、それぞれのアミノ酸サブセグメントの改変体をアミノ酸サブセグメントの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントが改変アミノ酸サブセグメントのうちの一つであり、標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントの検出が、標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントが由来するところのアミノ酸セグメントの発現を示す工程を含む、発現を検出する方法が開示される。
【０９３７】
一つ以上の細胞に由来する、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、一つ以上の細胞は集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが改変レポーターシグナルペプチドのうちの一つであり、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところの細胞の存在を示す工程を含む、細胞を検出する方法が開示される。
【０９３８】
さらに、それぞれの細胞が少なくとも一つの核酸分子を含むように設計され、そしてそれぞれの細胞内の核酸分子のヌクレオチドセグメントによってコード化されたアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが異なるものである方法も開示される。
【０９３９】
さらに、対象となっている形質を有する細胞のそれぞれが同一のレポーターシグナルペプチドを含む方法も開示される。
【０９４０】
さらに、対象となっている形質が異種遺伝子である方法も開示される。
【０９４１】
さらに、異種遺伝子が核酸分子を含む方法も開示される。
【０９４２】
さらに、異種遺伝子がアミノ酸セグメントをコード化している方法も開示される。
【０９４３】
さらに、異なる改変を受けた複数のレポーターシグナルペプチドが検出され、改変を受けたレポーターシグナルペプチドのそれぞれの検出が、改変を受けたそのレポーターシグナルペプチドが由来するところの細胞の存在を示す方法も開示される。
【０９４４】
さらに、異なる細胞が異なる核酸分子を含み、改変を受けたレポーターシグナルペプチドのそれぞれの検出が、アミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む細胞の存在を示すものであって、アミノ酸セグメントは改変を受けたそのレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含む方法も開示される。
【０９４５】
さらに、複数の異なる細胞が存在し、それぞれの異なる細胞は異なる核酸分子を含み、改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出は、アミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む細胞の存在を示すものであって、アミノ酸セグメントは、検出された改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含む方法も開示される。
【０９４６】
一つ以上の細胞サンプルに由来する、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出する工程を含む、細胞サンプルを検出する方法であって、一つ以上の細胞サンプルは集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子は、レポーターシグナルペプチドと、対象となっているタンパク質又はペプチドとを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、レポーターシグナルペプチドは共通する特性、すなわち、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することを可能にする特性を有し、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが改変レポーターシグナルペプチドのうちの一つであり、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところの細胞サンプルの存在を示す方法が開示される。
【０９４７】
さらに、複数の異なる改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出し、それぞれの改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところの細胞サンプルの存在を示す方法も開示される。
【０９４８】
さらに、異なる細胞サンプルが異なる核酸分子を含み、それぞれの改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む細胞サンプルの存在を示す方法も開示される。
【０９４９】
さらに、複数の異なる細胞サンプルが存在し、それぞれの異なる細胞サンプルが異なる核酸分子を含み、改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、検出された改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む細胞サンプルの存在を示す方法も開示される。
【０９５０】
一つ以上の細胞に由来する、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、一つ以上の細胞は集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが改変レポーターシグナルペプチドのうちの一つであり、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところの細胞の存在を示す工程を含む、細胞を検出する方法が開示される。
【０９５１】
一つ以上の細胞に由来する、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントを検出する工程であって、一つ以上の細胞は集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、アミノ酸セグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸セグメントを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸セグメントが変化し、それぞれのアミノ酸セグメントの改変体をアミノ酸セグメントの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントが改変アミノ酸セグメントのうちの一つであり、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントの検出が、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントが由来するところの細胞の存在を示す工程を含む、細胞を検出する方法が開示される。
【０９５２】
一つ以上の細胞に由来する改変アミノ酸サブセグメントを検出する工程であって、一つ以上の細胞は集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、アミノ酸セグメントがそれぞれアミノ酸サブセグメントを含み、それぞれのアミノ酸サブセグメントが対象となっているタンパク質又はペプチドの一部と、レポーターシグナルペプチドのすべて又は一部とを含み、アミノ酸サブセグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸サブセグメントを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸サブセグメントが変化し、それぞれのアミノ酸サブセグメントの改変体をアミノ酸サブセグメントの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントが改変アミノ酸サブセグメントのうちの一つであり、標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントの検出が、標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントが由来するところの細胞の存在を示す工程を含む、細胞を検出する方法が開示される。
【０９５３】
一つ以上の生物体に由来する、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、一つ以上の生物体は集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが改変レポーターシグナルペプチドのうちの一つであり、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところの生物体の存在を示す工程を含む、生物体を検出する方法が開示される。
【０９５４】
さらに、それぞれの生物体が少なくとも一つの核酸分子を含むように設計され、そしてそれぞれの生物体内の核酸分子のヌクレオチドセグメントによってコード化されたアミノ酸セグメントのレポーターシグナルペプチドが異なる方法も開示される。
【０９５５】
さらに、対象となっている形質を有する生物体のそれぞれが同一のレポーターシグナルペプチドを含む方法も開示される。
【０９５６】
さらに、対象となっている形質が導入遺伝子である方法、導入遺伝子遺伝子が核酸分子を含む方法、導入遺伝子遺伝子がアミノ酸セグメントをコード化している方法も開示される。
【０９５７】
さらに、複数の異なる改変レポーターシグナルペプチドが検出され、それぞれの改変レポーターシグナルペプチドの検出が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところの生物体の存在を示す方法も開示される。
【０９５８】
さらに、異なる生物体が異なる核酸分子を含み、それぞれの改変レポーターシグナルペプチドの検出が、改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む生物体の存在を示す方法も開示される。
【０９５９】
さらに、複数の異なる生物体が存在し、それぞれ異なる生物体が異なる核酸分子を含み、改変レポーターシグナルペプチドの検出が、検出された改変レポーターシグナルペプチドが由来するところのレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含む核酸分子を含む生物体の存在を示す方法も開示される。
【０９６０】
一つ以上の生物体に由来する、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドを検出する工程であって、一つ以上の生物体は集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、レポーターシグナルペプチドが共通する特性を有し、共通する特性により、レポーターシグナルペプチドを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、それぞれのレポーターシグナルペプチドの改変体をレポーターシグナルペプチドの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが、改変を受けたレポーターシグナルペプチドのうちの一つであり、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドの検出が、標的である改変を受けたレポーターシグナルペプチドが由来するところの生物体の存在を示す工程を含む、生物体を検出する方法が開示される。
【０９６１】
一つ以上の生物体に由来する、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントを検出する工程であって、一つ以上の生物体は集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子が、レポーターシグナルペプチド及び対象となっているタンパク質又はペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、アミノ酸セグメントが共通する特性を有し、共通する特性により、アミノ酸セグメントを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することが可能となり、レポーターシグナルペプチドを改変することができ、レポーターシグナルペプチドの改変によりアミノ酸セグメントが変化し、それぞれのアミノ酸セグメントの改変体をアミノ酸セグメントの他の改変体から識別することができ、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントが、改変を受けたアミノ酸セグメントのうちの一つであり、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントの検出が、標的である改変を受けたアミノ酸セグメントが由来するところの生物体の存在を示す工程を含む、生物体を検出する方法が開示される。
【０９６２】
一つ以上の生物体に由来する改変アミノ酸サブセグメントを検出する工程であって、一つ以上の生物体は集団全体として核酸分子のセットを含み、それぞれの核酸分子は、レポーターシグナルペプチドと対象となっているタンパク質又はペプチドとを含むアミノ酸セグメントをコード化しているヌクレオチドセグメントを含み、それぞれのアミノ酸セグメントはアミノ酸サブセグメントを含み、それぞれのアミノ酸サブセグメントは対象となっているタンパク質又はペプチドの一部分と、レポーターシグナルペプチドのすべて又は一部分とを含み、アミノ酸サブセグメントは共通する特性を有し、共通する特性はアミノ酸サブセグメントを、共通する特性を欠く分子から識別及び／又は分離することを可能とする特性であり、レポーターシグナルペプチドは改変を受けることができ、レポーターシグナルペプチドの改変はアミノ酸サブセグメントを変化させ、それぞれのアミノ酸サブセグメントの改変体を他のアミノ酸サブセグメントの改変体から識別することができ、標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントは改変を受けた アミノ酸サブセグメントのうちの一つであり、標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントの検出が、標的である改変を受けたアミノ酸サブセグメントが由来するところの生物体の存在を示す工程を含む、生物体を検出する方法が開示される。
【０９６３】
説明
開示された方法の例を含む以下の説明を経ることによって開示された方法をさらに理解することができる。この説明は、この方法の範囲を何ら制限するものではない。
【０９６４】
Ａ．説明１：重い同位体
この説明は、特定のペプチド結合の位置で断片化し、かつ異なるレポーターシグナル中で質量が異なるように分布させるために重い同位体を用いるペプチドレポーターシグナルであって、同一の質量を有するペプチドレポーターシグナルを活用するものである。例えば、イオントラップにて、アルギニンを含むペプチドがアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基のＣ−末端の位置で優先的に断片化すること、及びプロリンを含むペプチドがプロリン残基のＮ−末端の位置で断片化することが示されている（クイン及びチャイト、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．（オランダ）、１９０−１９１： ３１３−２０ （１９９９））。アスパラギン酸とプロリンとの間の開裂しやすい結合の位置での衝突誘起性断片化を生じさせる開示されたレポーターシグナル中でＤＰ（アスパラギン酸（Ｄ）及びプロリン（Ｐ））アミノ酸配列を用いることができる。
【０９６５】
模範的なペプチド、ＡＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ（配列番号：２）の一価の荷電イオンは、質量分析装置の衝突セル中で「Ｄ」及び「Ｐ」の間で断片化する。同位体の天然存在度を利用すると、この一価の荷電親イオンは平均整数（ｍ／ｚ）＝１０４３ａｍｕであり、可能性のある生成娘イオンＡＧＳＬＤ＋（配列番号：２の１〜５位のアミノ酸）及びＰＡＧＳＬＲ＋（配列番号：２の６〜１１位のアミノ酸）はそれぞれ４６１ａｍｕ及び６００ａｍｕの平均整数（ｍ／ｚ）を持つ。実際問題として、断片化は通常、一つの支配的な娘イオン、このケースでは例えばＰＡＧＳＬＲ＋（配列番号：２の６〜１１位のアミノ酸）を産する。この説明のためには、一価の荷電親の集団から一つの荷電娘だけと考える。一般性又は応用性を無視すれば、これらの娘イオンチャネルを分岐比（ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｒａｔｉｏ）で割った値は、ＰＡＧＳＬＲ＋（配列番号：２の６〜１１位のアミノ酸）娘断片を分岐比で割った値の１００％とはならないかもしれないことに留意すること。
【０９６６】
このようなペプチドを構築するために、標準的な合成方法を利用することができる。レポーター分子のこの説明において、同位体標識化アミノ酸（例えばＡ対Ａ＊、ここで、ＡはＣＨ３側鎖を持ち、Ａ＊はＣＤ３側鎖を持つ）を考える。合成ペプチドとしては四つの可能性があり、それらの整数（ｍ／ｚ）を括弧内に示す：ＡＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ（１０４３）、Ａ＊ＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ（１０４６）、ＡＧＳＬＤＰＡ＊ＧＳＬＲ（１０４６）、Ａ＊ＧＳＬＤＰＡ＊ＧＳＬＲ（１０４９）（配列番号：２）。この例のためには、二つの単一標識化ペプチドＡ＊ＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ、ＡＧＳＬＤＰＡ＊ＧＳＬＲ（配列番号：２）を考える。これらは共通の整数質量電荷１０４６を持っている。
【０９６７】
開示された方法の好ましい方式を簡単に実証するものとして、二つの合成ペプチドを含む溶液を考える。たくさんの生物学的実験に続いてこの溶液を集めることができ、そして一般的に、プロセシングのせいで多数の余分な成分も含まれる。
【０９６８】
Ａ＊ＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ及びＡＧＳＬＤＰＡ＊ＧＳＬＲ（配列番号：２）を含む溶液を、質量分析法による分析を実施するための適切なマトリックス溶液と混合する。シナピン酸、４−ヒドロキシ−α−シアノケイ皮酸又は２，５−ジヒドロキシ安息香酸を含めた適切なマトリックスが技術的に知られている。
【０９６９】
得られる溶液をＭＡＬＤＩターゲットの上にスポットし、結晶化させる。
【０９７０】
このターゲットを質量分析装置の源の中へ挿入する。ＭＡＬＤＩターゲット上のサンプルスポットにレーザーを衝突させることを利用して、最初の四重極、Ｑ０内に多数のイオンを導入する。Ｑ０内に導入される種の間には、一価に荷電した支配的な種（Ａ＊ＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ＋、ＡＧＳＬＤＰＡ＊ＧＳＬＲ＋；配列番号：２）、種々の断片化イオン、中性マトリックス、マトリックスイオン及び多量体があることが技術的に知られている。中性粒子は二番目の四重極、Ｑ１に導かれることなくＱ０から消え去ることになる。
【０９７１】
Ｑ０内に導入されたイオンはＱ１を備えるより高い真空領域に導かれる。
【０９７２】
質量電荷比１０４６のイオンが通過して三番目の四重極、Ｑ２（ここで同一の質量電荷を持つ、すなわち質量分析の専門用語では「同重体」であるＡ＊ＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ及びＡＧＳＬＤＰＡ＊ＧＳＬＲ（配列番号：２）を思い出すこと）の中へ移動するように、四重極Ｑ１を設定する。１０４６とは異なる質量電荷比のイオンはＱ１−Ｑ２軸上のＱ１から出て行くことのない軌道に従うことになり、効果的に廃棄される。これにより、このシステムの信号対雑音が大きく向上し、この質量フィルタリングを持たないシステムよりも１００〜１０００倍程度改善する。
【０９７３】
Ｑ２を囲んでいる衝突セルは化学的に不活性なガスで適切な圧力、通常、数ミリトールの窒素で満たされ、ペプチドイオンの開裂しやすい結合であるＤＰの優先的な開裂を引き起こす。上記のように、一価の荷電親イオンの断片化を期待でき、支配的な一つの娘イオンが生じる。このケースでは、それぞれの同重体の親（配列番号：２）から対応する独特の娘（配列番号：２の１〜５位及び６〜１１位のアミノ酸）が生じることとなる：
【０９７４】
Ａ＊ＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ＋　→　Ａ＊ＧＳＬＤ＋ＰＡＧＳＬＲ＋ （ｍ／ｚ６００）
ＡＧＳＬＤＰＡ＊ＧＳＬＲ＋　→　ＡＧＳＬＤ＋ＰＡ＊ＧＳＬＲ＋ （ｍ／ｚ６０３）
【０９７５】
本明細書で論じられているように、質量分析装置の分解能は、ほぼ５０００〜１００００程度であり、そしてそれゆえに、これらの（ｍ／ｚ）では３ａｍｕの差を容易に達成する。
【０９７６】
Ｑ２から出たイオンは装置の飛行時間（ＴＯＦ）区域に入る。一時的な電場勾配が加えられ、正荷電イオンがリフレクトロンに向かって加速されて最終的にディテクターに至る。イオンのすべてが同一の電場勾配を経て加速され（技術的に知られているように、この主張において、リフレクトロンは小さな摂動を補正することとなる）、そしてそれゆえに、イオンのすべては、それらに与えられる同一の運動エネルギーを持つことになる。運動エネルギーはすべてのイオンについて同一であり、かつイオンの質量は異なるので、イオンがディテクターに到達するのに要する時間は異なることになる：より重いイオンは軽いイオンよりも到着が遅れるだろう。
【０９７７】
得られた質量スペクトルは、もともとのサンプル中の二つの検体（例えばペプチド）の相対量を反映する。
【０９７８】
このスキームをより多くの検体（例えばペプチド）に拡張することができる。Ｘ／Ｘ＊の違いを利用しての、上記ペプチドに基づく同重体ディテクターのパネルについての最も基本的な拡張は表２に示すとおりである。アスタリスクは重い同位体標識化アミノ酸を示す。このセットでは、それぞれの残基についての、標識化体に対する非標識化体の質量変化｛（ｍ／ｚ）ｘ＊−（ｍ／ｚ）ｘ｝が同一であると仮定している。それぞれの残基についての｛（ｍ／ｚ）ｘ＊−（ｍ／ｚ）ｘ｝が同一ではないという一般的なケースでは、質量分析装置によって分解され得るある特定のペプチドについて、より多くの組み合わせがある。親分子は配列番号：２であり、主な娘は配列番号：２の６〜１１位のアミノ酸である。
【０９７９】
【表２】
2004506900.tif 000003
【０９８０】
特定の同位体標識化アミノ酸の合成により、パネルサイズの急速な増大が促進されるだろう。例えば、側鎖がＣＨ３、ＣＨ２Ｄ、ＣＨＤ２、ＣＤ３の固有のアラニンの合成を行って、小さなペプチドについての相当に大きなパネルサイズを得ることができよう。
【０９８１】
開示された方法のこの方式は、すべての検出されたイオンは（数個の中性子の位置のみが異なるという）極めてよく似た化学的環境に由来するという望ましい特性を有しており、そしてそれゆえにＭＡＬＤＩ源及び衝突セルにおいて処理される場合、これらイオンは（すべての実用的な目的について）同一の振る舞いを行うことになる。特に注目すべきなのは、同重体レポーターシグナル分子の一つが定量用の標準として、測定のために用いられる同重体検出用分子に添加されるというケースである。測定で用いられる検出用分子のセットの全体を定量することは、簡便であり、定量的である。この分子が同位体濃縮を除いて本質的に同一であるというケースについては、セット中のすべての同重体はプロセシングの始めから終わりまで同一の振る舞いを行うことになる。
【０９８２】
Ｂ．説明２：不安定な結合、一つの娘イオン
この説明は、不安定な結合の位置で断片化する、同一の質量を持つペプチドレポーターシグナルを活用するものである。ここで、この不安定な結合は、種々のレポーターシグナルの中の異なる位置に設けられている。この説明において、親イオンは単一の娘を生成する。アミノ酸の間の規定された位置に不安定な結合を伴うペプチドの合成例は、ＷＯ ９７／１１９５８に開示されている。アミノ酸の間に不安定な結合を伴う、開示された方法及び組成物にて使用するためのペプチドを生産するために、類似の化学反応を利用しても構わない。例えば、ＧＳＷＦＳＧＭＣＡＲ（配列番号：１２）の形態のペプチド分子の一つのペアを考える：
【０９８３】
ペプチドＡ：ＧＳＷＦＳＧ＃ＭＣＡＲ
ペプチドＢ：ＧＳＷＦ＃ＳＧＭＣＡＲ
【０９８４】
ここで、記号＃は不安定な結合の位置を示す。本方法のためにこのペプチド配列が保存されている必要はなく、唯一の必要条件はペプチドの分子量が同一であることに留意すること。
【０９８５】
単純化のために、不安定な結合を伴う前述の二つの合成ペプチド、Ａ及びＢを含む溶液を考える。たくさんの生物学的実験に続いてこの溶液を集めることができ、そして一般的に、プロセシングのせいで多数の余分な成分も含まれる。
【０９８６】
Ａ及びＢを含む溶液を、質量分析法による分析を実施するための適切なマトリックス溶液と混合する。シナピン酸４−ヒドロキシ−α−シアノケイ皮酸又は２，５−ジヒドロキシ安息香酸を含めた適切なマトリックスが技術的に知られている。
【０９８７】
得られる溶液をＭＡＬＤＩターゲットの上にスポットし、結晶化させる。
【０９８８】
このターゲットを質量分析装置の源の中へ挿入する。
【０９８９】
ＭＡＬＤＩターゲット上のサンプルスポットにレーザーを衝突させることを利用して、最初の四重極、Ｑ０内に多数のイオンを導入する。Ｑ０内に導入される種の間には、一価に荷電した支配的な種（Ａ＋、Ｂ＋）、種々の断片化イオン、中性マトリックス、マトリックスイオン及び多量体があることが技術的に知られている。中性粒子はＱ１に導かれることなくＱ０から消え去ることになる。
【０９９０】
Ｑ０内に導入されたイオンはＱ１を備えるより高い真空領域に導かれる。
【０９９１】
（ｍ／ｚ）Ａ及び（ｍ／ｚ）Ｂの質量電荷比のイオンが通過するように四重極Ｑ１を設定する（（ｍ／ｚ）Ａ＝（ｍ／ｚ）Ｂ、すなわち質量分析の専門用語では「同重体」を思い出すこと）。（ｍ／ｚ）Ａ及び（ｍ／ｚ）Ｂとは異なる質量電荷比を持つイオンはＱ１−Ｑ２軸上のＱ１から出て行くことのない軌道に従うことになり、効果的に廃棄される。これにより、このシステムの信号対雑音が大きく向上し、この質量フィルタリングを持たないシステムよりも１００〜１０００倍程度改善する。
【０９９２】
Ｑ２を囲んでいる衝突セルは化学的に不活性なガスで適切な圧力、通常、数ミリトールの窒素で満たされ、ペプチドイオンＡ＋及びＢ＋の不安定な結合の優先的な開裂を引き起こす。不安定な結合の位置の断片化だけを考えれば、そしてＱ２での操作をＲＦモードだけで行えば、Ｑ２から現れてＴＯＦ区域に至ることができる四つのイオンが存在し得る。上記のように、熱力学及び反応速度論に依存して、それぞれの親からの娘のうちの一つは他の娘よりも荷電しやすい傾向にあることはよく知られている。大部分のケースについて、一つの支配的な娘イオンが存在することになる。主な断片化は（配列番号：１２では、配列番号：１２の１〜６位のアミノ酸及び７〜１０位のアミノ酸に、並びに配列番号：１２の１〜４位のアミノ酸及び５〜１０位のアミノ酸に）となる：
【０９９３】
ＧＳＷＦＳＧ＃ＭＣＡＲ＋　→　ＧＳＷＦＳＧ＋ＭＣＡＲ＋
ＧＳＷＦ＃ＳＧＭＣＡＲ＋　→　ＧＳＷＦ＋ＳＧＭＣＡＲ＋
【０９９４】
Ｑ２から出たイオンは装置の飛行時間、ＴＯＦ、区域に入る。一時的な電場勾配が加えられ、正荷電イオンがリフレクトロンに向かって加速されて最終的にディテクターに至る。イオンのすべてが同一の電場勾配を経て加速され（技術的に知られているように、この主張において、リフレクトロンは小さな摂動を補正することとなる）、そしてそれゆえに、イオンのすべては、それらに与えられる同一の運動エネルギーを持つことになる。運動エネルギーはすべてのイオンについて同一であり、かつイオンの質量は異なるので、イオンがディテクターに到達するのに要する時間は異なることになる：より重いイオンは軽いイオンよりも到着が遅れるだろう。
【０９９５】
得られた質量スペクトルから、もともとのサンプルにおける二つのレポーターシグナルの相対量が示される。
【０９９６】
定量の結果を容易に求めるために、そのペプチド（例えばＧＳＷ＃ＦＳＧＭＣＡＲ、即ち配列番号：１２）と同一の質量を持つ標準を添加しても構わない。計画中の同重体検出用分子の定量の結果を推定するために、較正、すなわち簡単な処理を行うべきである。
【０９９７】
Ｃ．説明３：不安定な結合、二つの娘イオン
この説明は、不安定な結合の位置で断片化する、同一の質量を持つペプチドレポーターシグナルを活用するものである。ここで、この不安定な結合は、異なるレポーターシグナルの中の異なる位置に設けられている。この説明において、親イオン二つの娘に分岐する。説明２に記載されたペプチド（配列番号：１２）を考える：
【０９９８】
ペプチドＡ：ＧＳＷＦＳＧ＃ＭＣＡＲ
ペプチドＢ：ＧＳＷＦ＃ＳＧＭＣＡＲ
【０９９９】
ここで、記号＃は不安定な結合の位置を示す。本方法のためにこのペプチド配列が保存されている必要はなく、唯一の必要条件はレポーター分子ペプチドの分子量が名目上同一であることに留意すること。
【１０００】
単純化のために、不安定な結合を伴う前述の二つの合成ペプチド、Ａ及びＢを含む溶液を考える。たくさんの生物学的実験に続いてこの溶液を集めることができ、そして一般的に、プロセシングのせいで多数の余分な成分も含まれる。
【１００１】
Ａ及びＢを含む溶液を、質量分析法による分析を実施するための適切なマトリックス溶液と混合する。シナピン酸４−ヒドロキシ−α−シアノケイ皮酸又は２，５−ジヒドロキシ安息香酸を含めた適切なマトリックスが技術的に知られている。
【１００２】
得られる溶液をＭＡＬＤＩターゲットの上にスポットし、結晶化させる。
【１００３】
このターゲットを質量分析装置の源の中へ挿入する。
【１００４】
ＭＡＬＤＩターゲット上のサンプルスポットにレーザーを衝突させることを利用して、最初の四重極、Ｑ０内に多数のイオンを導入する。Ｑ０内に導入される種の間には、一価に荷電した支配的な種（Ａ＋、Ｂ＋）、種々の断片化イオン、中性マトリックス、マトリックスイオン及び多量体があることが技術的に知られている。中性粒子はＱ１に導かれることなくＱ０から消え去ることになる。
【１００５】
Ｑ０内に導入されたイオンはＱ１を備えるより高い真空領域に導かれる。
【１００６】
（ｍ／ｚ）Ａ及び（ｍ／ｚ）Ｂの質量電荷比のイオンが通過するように四重極Ｑ１を設定する（（ｍ／ｚ）Ａ＝（ｍ／ｚ）Ｂ、すなわち質量分析の専門用語では「同重体」を思い出すこと）。（ｍ／ｚ）Ａ及び（ｍ／ｚ）Ｂとは異なる質量電荷比を持つイオンはＱ１−Ｑ２軸上のＱ１から出て行くことのない軌道に従うことになり、効果的に廃棄される。これにより、このシステムの信号対雑音が大きく向上し、この質量フィルタリングを持たないシステムよりも１００〜１０００倍程度改善する。
【１００７】
Ｑ２を囲んでいる衝突セルは化学的に不活性なガスで適切な圧力、通常、数ミリトールの窒素で満たされ、ペプチドイオンＡ＋及びＢ＋の不安定な結合の優先的な開裂を引き起こす。不安定な結合の位置の断片化だけを考えれば、そしてＱ２での操作をＲＦモードだけで行えば、Ｑ２から現れてＴＯＦ区域に至ることができる四つのイオンが存在し得る。上記のように、大部分のケースについて、一つの支配的な娘イオンが存在することになる。一価の荷電親イオン集団の娘への断片化は次のようになるかもしれない（経験的にこれらの分岐比を決定する）（配列番号：１２では、配列番号：１２の１〜６位のアミノ酸及び７〜１０位のアミノ酸に、並びに配列番号：１２の１〜４位のアミノ酸及び５〜１０位のアミノ酸に）：
【１００８】
ＧＳＷＦＳＧ＃ＭＣＡＲ＋　→　ＧＳＷＦＳＧ＋ＭＣＡＲ＋ （Ａ１：５０％）
→　ＧＳＷＦＳＧ＋＋ＭＣＡＲ（Ａ２：５０％）
ＧＳＷＦ＃ＳＧＭＣＡＲ＋　→　ＧＳＷＦ＋ＳＧＭＣＡＲ＋ （Ｂ１：５０％）
→　ＧＳＷＦ＋＋ＳＧＭＣＡＲ（Ｂ２：５０％）
【１００９】
本明細書に記載のとおり、図２に概略を示す質量スペクトルが分岐比から得られることになる。スペクトルによって、もともとのサンプルにおいてＢはＡの二倍存在することが示される。衝突セル中の圧力が極めて低いケースにおいて、親イオンは断片化することなくＱ２を通過することになり（図２Ａ）、衝突セル中にガスがある場合は、ペプチドは不安定な結合の位置で断片化するだろう（図２Ｂ）。Ａ＋娘とＢ＋娘との（強度は同一であり、質量の総和は親イオンの質量電荷に等しいという）相関関係に留意すること。
【１０１０】
Ｑ２から出たイオンは装置の飛行時間、ＴＯＦ、区域に入る。一時的な電場勾配が加えられ、正荷電イオンがリフレクトロンに向かって加速されて最終的にディテクターに至る。イオンのすべてが同一の電場勾配を経て加速され（技術的に知られているように、この主張において、リフレクトロンは小さな摂動を補正することとなる）、そしてそれゆえに、イオンのすべては、それらに与えられる同一の運動エネルギーを持つことになる。運動エネルギーはすべてのイオンについて同一であり、かつイオンの質量は異なるので、イオンがディテクターに到達するのに要する時間は異なることになる：より重いイオンは軽いイオンよりも到着が遅れるだろう。
【１０１１】
得られた質量スペクトルは、もともとのサンプル中の二つの検体（例えばペプチド）の相対量を示す。既知の分岐比及び既知の親イオン（ｍ／ｚ）のために、娘イオンシグナルの互いの相互関係が明らかになり、そしてそれゆえに、検体測定の信頼性が向上する。
【１０１２】
定量の結果を容易に求めるために、その検体（例えばＧＳＷ＃ＦＳＧＭＣＡＲ、即ち配列番号：１２）と同一の質量を持つ標準を添加しても構わない。計画中の同重体の相対的効率の定量の結果を推定するために、較正を行うべきである。
【１０１３】
Ｄ．説明４：切れやすい結合
この説明は、特定のペプチド結合の位置で断片化する、同一の質量を有するペプチドレポーターシグナルを活用するものであり、ここで、その結合は異なるレポーターシグナル中の異なる位置に設けられている。上記のように、ＤＰを含むアミノ酸配列は衝突セル中でアスパラギン酸及びプロリンの間で断片化する。開示された方法で有用となりそうなペプチドのセットとしては、次のようなものがあろう：
【１０１４】
ペプチドＣ：ＹＦＭＴＳＧＣＤＰＧＧＲ（配列番号：１３）
ペプチドＤ：ＹＦＭＴＳＧＤＰＣＧＧＲ（配列番号：１４）
ペプチドＥ：ＹＦＭＴＳＤＰＧＣＧＧＲ（配列番号：１５）
ペプチドＦ：ＹＦＭＴＤＰＳＧＣＧＧＲ（配列番号：１６）
ペプチドＧ：ＹＦＭＤＰＴＳＧＣＧＧＲ（配列番号：１７）
【１０１５】
単純化のために、これらの合成ペプチドを含む溶液を考える。たくさんの生物学的実験に続いてこの溶液を集めることができ、そして一般的に、プロセシングのせいで多数の余分な成分も含まれる。
【１０１６】
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇを含む溶液を、質量分析法による分析を実施するための適切なマトリックス溶液と混合する。シナピン酸４−ヒドロキシ−α−シアノケイ皮酸又は２，５−ジヒドロキシ安息香酸を含めた適切なマトリックスが技術的に知られている。
【１０１７】
得られる溶液をＭＡＬＤＩターゲットの上にスポットし、結晶化させる。
【１０１８】
このターゲットを質量分析装置の源の中へ挿入する。
【１０１９】
ＭＡＬＤＩターゲット上のサンプルスポットにレーザーを衝突させることを利用して、最初の四重極、Ｑ０内に多数のイオンを導入する。Ｑ０内に導入される種の間には、Ｃ＋、Ｄ＋、Ｅ＋、Ｆ＋、Ｇ＋、種々の断片化イオン、中性マトリックス、マトリックスイオン及び多量体があることが技術的に知られている。中性粒子は二番目の四重極、Ｑ１に導かれることなくＱ０から消え去ることになる。Ｑ０内に導入されたイオンはＱ１を備えるより高い真空領域に導かれる。
【１０２０】
（ｍ／ｚ）Ｃ、（ｍ／ｚ）Ｄ、（ｍ／ｚ）Ｅ、（ｍ／ｚ）Ｆ、（ｍ／ｚ）Ｇの質量電荷比のイオンが通過するように四重極Ｑ１を設定する（これらは同一の分子量を持つ「同重体」である）。（ｍ／ｚ）Ｃ、（ｍ／ｚ）Ｄ、（ｍ／ｚ）Ｅ、（ｍ／ｚ）Ｆ、（ｍ／ｚ）Ｇとは異なる質量電荷比を持つイオンはＱ１−Ｑ２軸上のＱ１から出て行くことのない軌道に従うことになり、効果的に廃棄される。これにより、このシステムの信号対雑音が大きく向上し、この質量フィルタリングを持たないシステムよりも１００〜１０００倍程度改善する。
【１０２１】
Ｑ２を囲んでいる衝突セルは化学的に不活性なガスで適切な圧力、通常、数ミリトールの窒素で満たされ、Ｄ−Ｐ結合の開裂を引き起こす。ＤＰ結合の位置の断片化だけを、Ｃ末端断片近傍に保持される荷電の総量を、そしてＱ２での操作をＲＦモードだけで行うことを考えれば、Ｑ２から現れてＴＯＦ区域に至ることができる五つのイオンが存在することとなる。
【１０２２】
Ｃ１＋：ＰＧＧＲ＋　（配列番号：１３の９〜１２位のアミノ酸）
Ｄ１＋：ＰＣＧＧＲ＋　（配列番号：１４の８〜１２位のアミノ酸）
Ｅ１＋：ＰＧＣＧＧＲ＋　（配列番号：１５の７〜１２位のアミノ酸）
Ｆｌ＋：ＰＳＧＣＧＧＲ＋　（配列番号：１６の６〜１２位のアミノ酸）
Ｇ１＋：ＰＴＳＧＣＧＧＲ＋　（配列番号：１７の５〜１２位のアミノ酸）
【１０２３】
Ｑ２から出たイオンは装置の飛行時間、ＴＯＦ、区域に入る。一時的な電場勾配が加えられ、正荷電イオンがリフレクトロンに向かって加速されて最終的にディテクターに至る。イオンのすべてが同一の電場勾配を経て加速され（技術的に知られているように、この主張において、リフレクトロンは小さな摂動を補正することとなる）、そしてそれゆえに、イオンのすべては、それらに与えられる同一の運動エネルギーを持つことになる。運動エネルギーはすべてのイオンについて同一であり、かつイオンの質量は異なるので、イオンがディテクターに到達するのに要する時間は異なることになる：より重いイオンは軽いイオンよりも到着が遅れるだろう。
【１０２４】
得られた質量スペクトルから、もともとのサンプルにおける検体（例えばペプチド）の相対量が示される。
【１０２５】
定量の結果を容易に求めるために、その検体と同一の質量を持つ標準を添加しても構わない。計画中の分子の相対的効率の定量の結果を推定するために、較正、すなわち簡単な処理を行うべきである。
【１０２６】
Ｅ．説明５：直接読み出しのための前処理
この説明には、装置の最初の四重極に先立って、特異的結合分子からのレポーターシグナルの遊離が含まれる。この特異的結合分子は、ＤＮＡ、ＰＮＡ、抗体又は高い特異性と親和性とを備える他の任意の一部であっても構わない。このレポーターシグナルは、例えば、制限酵素、光で開裂可能なヌクレオチド（ＷＯ ００／０４０３６）、光で開裂可能な連結部（オレジュニクら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２７ （２３）： ４６２６−３１ （１９９９））及びビオチン−アビジン様相互関係（ニーマイヤー（Ｎｉｅｍｅｙｅｒ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２２ （２５）： ５５３０−９ （１９９４）、サノ（Ｓａｎｏ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５８ （５０７９）： １２０−２ （１９９２））を活用することを通して選択的に壊され得る相互作用を介して特異的結合分子に結合している。
【１０２７】
構築物の模範的なセットは、Ｎｊ−Ｘｋの一般形態を持っているかもしれない。ここで、このヌクレオチドはＮで示されるＰＮＡであり、アミノ酸はＸで示され、ダッシュ記号は、光で開裂可能な連結部で介されている、ＰＮＡからペプチドへの移行個所を示し、そして「ｊ」、「ｋ」は独立した整数を示す。このような模範的なセットの一員は（配列番号：１８；ペプチド部分）：
【１０２８】
Ｈ：ＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＣＴＡＡＴＣ−Ａ＊Ｇ＊Ｓ＊Ｌ＊Ａ＊Ｇ＊Ｓ＊Ｌ＊ＤＰＡＧＳＬＡＧＳＬＲ
Ｉ：ＣＧＡＧＡＧＣＴＡＧＣＴＡＴＡＴＧＣ−ＡＧ＊Ｓ＊Ｌ＊Ａ＊Ｇ＊Ｓ＊Ｌ＊ＤＰＡ＊ＧＳＬＡＧＳＬＲ
ここで、アスタリスクは説明１で記載した通りの重いアミノ酸を示す。ＰＮＡは、「Ｈ」がＧＡＴＴＡＧＣＣＡＣＧＴＣＧＣＣＧＴ（配列番号：１９）を認識し、「Ｉ」がＧＣＡＴＡＴＡＧＣＴＡＧＣＴＣＴＣＧ（配列番号：２０）を認識するように、特定の分子の認識を導く。上記の説明と類似したやり方で処理すると、ＭＡＬＤＩレーザーパルスによって光で開裂可能な連結部は壊され、ペプチド同重体シグナル分子はＱ１質量フィルターによって選択され、ＰＡＧＳＬＡＧＳＬＲ＋及びＰＡ＊ＧＳＬＡＧＳＬＲ＋（配列番号：１８の１０〜１９位のアミノ酸）がそれぞれ「Ｈ」及び「Ｉ」のレポーター分子として検出されることになる。
【１０２９】
内部の制限部位をそのＤＮＡ鎖の中に設けるＤＮＡ−ペプチド構築物の計画によって、ＤＮＡ特異的結合分子とペプチドレポーターシグナルが可能となる。エンドヌクレアーゼＨｈａ Ｉ、ＨｉｎＰｌ Ｉ及びＭｎｌ Ｉは、顕著な一本鎖活性を持つこと（ＮＥＢカタログ）が知られている。Ｈｈａ Ｉ（ＧＣＧ＾Ｃ）を利用すれば、原型的なレポーター分子が（配列番号：２１、ＤＮＡ部分；配列番号：１８、ペプチド部分）の形態を有することができる。
【１０３０】
ＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＣＴＧＣＧＣ−Ａ＊Ｇ＊Ｓ＊Ｌ＊Ａ＊Ｇ＊Ｓ＊Ｌ＊ＤＰＡＧＳＬＡＧＳＬＲ
ここで、ＧＡＣＧＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＣＴ（配列番号：２１の１〜１８位のヌクレオチド）は特異的結合分子を表し、ＧＣＧＣはＨｈａ Ｉに対する認識部位であり、そしてダッシュ記号はＤＮＡからペプチドへの移行個所を示す。開示された方法のこの方式については、分子のセットのすべてがペプチドへの移行個所近傍の下線が付された配列を共有している。Ｈｈａ Ｉで前処理することにより、ＧＣＧＣを含むすべての分子が開裂して、ペプチドが結合する３’シトシンヌクレオチドを放出することになる。
【１０３１】
類似のやり方において、ペプチド配列については自由度があるので、ペプチドの特異的な切断についての極めて多数の技術文献を利用してペプチド部分の範囲内にあるレポーター分子を特異的に切断する。このような特異的な切断システムの例には、（アルギニンとグリシンとの間を切断する）トロンビン、（アルギニン又はリジンのＣ−末端を切断する）トリプシン、（アスパラギン酸又はグルタミン酸のＣ−末端を切断する）エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ及びオリゴペプチダーゼ又はエンドプロテアーゼとして知られる一般的なクラスのものが含まれる。
【１０３２】
Ｆ．説明６：間接読み出し
開示された方法の好ましい態様において、デコーディングタグを備えるレポーター分子を用いてコーディング分子を特異的に認識する。一例として、説明５中で「Ｈ」として示されている認識配列（配列番号：２２及び配列番号：２３）を持つコーディング分子を考える。
【１０３３】
ＡＣＧＧＣＧＡＣＧＴＧＧＣＴＡＡＴＣ−スペーサー−ＣＧＴＣＡＴＣＧＴＡＧ
ここで、特異的結合分子はＧＡＴＴＡＧＣＣＡＣＧＴＣＧＣＣＧＴ（配列番号：１９）を認識してこのものと会合することとなり、−スペーサー−はＰＥＧなどの使いやすいスペーサー部分であり、そしてＣＧＴＣＡＴＣＧＴＡＧ（配列番号：２３）はコーディングタグを表す。レポーター分子は形態ＮＪ−ＸＫの１つであり、ここで、このヌクレオチドはＮで示されるＰＮＡであり、アミノ酸はＸで示され、ダッシュ記号はＰＮＡからペプチドへの移行個所（必要に応じて切断可能な連結部を介してもよい）を示し、そして「ｊ」、「ｋ」は独立した整数を示す。一例は（配列番号：１８；ペプチド部分）：
【１０３４】
ＣＴＡＣＧＡＴＧＡＣＧ−Ａ＊Ｇ＊Ｓ＊Ｌ＊Ａ＊Ｇ＊Ｓ＊Ｌ＊ＤＰＡＧＳＬＡＧＳＬＲ
【１０３５】
デコーディングタグであるＰＮＡは、コーディング分子
【表３】
2004506900.tif 000004
のコーディングタグＣＧＴＣＡＴＣＧＴＡＧ（配列番号：２３）を認識し、このものと会合することになる。
【１０３６】
上記のプロセシングを通して、フィルター四重極、Ｑ１によってレポーター分子イオンを選択し、そして娘断片を読み出しても構わない。ＰＮＡとペプチドとの間の連結が選択的に壊されていてもよいという任意のケースでは、フィルター四重極、Ｑ１はペプチドイオンの質量電荷の方に向けられることになる。
【１０３７】
多重測定のための分子のセットは、レポーター分子がセット中で共通した質量（又は、ＰＮＡ及びペプチドの間で選択的な結合の切断があるケースでは、ペプチドセットの中で共通した質量）を持つことだけを必要とする。レポーター分子が共通した質量を持つことは、単に、ＰＮＡの組成が維持されている（すなわち、すべての事例中のＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ残基が同数である）ＰＮＡが交互に並んだ配列と、説明１で記載した通りのペプチド同重体検出用分子とを組み合わせて利用することによって簡単に実現する。
【１０３８】
開示された方法のこの方式の明確な利点は、特異的結合分子とレポーター分子のレポーターシグナルとを別々に最適化する能力である。コーディング分子のコーディングタグに関する軽微な制限は、セットの中ではＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの含有量を一定にし続けておかなければならないということである。
【１０３９】
Ｇ．説明７：単一のサンプル中のタンパク質におけるＳＨ２ドメイン及びＳＨ３ドメインの検出
この説明には、特定のタンパク質における個々のＳＨ２ドメイン及びＳＨ３ドメインの検出が含まれる。タンパク質のＳＨ２ドメイン及びＳＨ３ドメインはプロテオミクスの分野における注目に値する対象であり、腫瘍学の分野における独特の関連性を有する。それぞれがＳＨ２ドメイン及びＳＨ３ドメインの両方を持つ、二つの既知のタンパク質を含むサンプルを考える。例えばヒトのｃ−ｓｒｃ及びｖ−ｓｒｃ。これらのドメインを認識する捕獲部分（例えば抗体）を用いて、サンプルからこれらのドメインを含むタンパク質を選択することができる。このようなタンパク質配列のペアの一つを下に示す。
【１０４０】
ｃ−ｓｒｃ（ＮＣＢＩリファレンス　ＧＩ：１１４３３１１９；配列番号：９）
【１０４１】
【表４】
2004506900.tif 000005
【１０４２】
ｖ−ｓｒｃ（ＮＣＢＩリファレンス　ＧＩ：１１４２１７９４；配列番号：１０）
【１０４３】
【表５】
2004506900.tif 000006
【１０４４】
ＳＨ３ドメイン及びＳＨ２ドメインにはそれぞれ、二重下線及び一重下線が付されている。システイン残基は太字で示されている。硫黄−硫黄共有架橋により、これらを標識化することができる。ｃ−ｓｒｃタンパク質及びｖ−ｓｒｃタンパク質のトリプシン消化により、表３に示される断片が生じる。
【１０４５】
組成物ＣＧＡＧＳＤＰＬＡＧＳＬＲ（ｍ／ｚ＝１２０３；配列番号：１１）のレポーターシグナルを考え、そしてｃ−ｓｒｃタンパク質及びｖ−ｓｒｃタンパク質のシステインの硫黄基とレポーターシグナルのシステインの硫黄基との間に共有結合を形成させることを介しての、レポーターシグナルによるこれらのタンパク質のシステイン残基の標識化を考える。表３に、非標識化断片、標識化断片及び改変断片の質量を示す。
【１０４６】
この説明において、レポーターシグナルは、好ましい断片化部位を持つように設計されたペプチドである。アルギニンを含むペプチドがアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基のＣ−末端の位置で優先的に断片化し、プロリンを含むペプチドがプロリン残基のＮ−末端の位置で断片化する（クイン及びチャイト、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．（オランダ）、１９０−１９１： ３１３−２０ （１９９９））。それゆえに、アスパラギン酸とプロリンとの間の開裂しやすい結合の位置での衝突誘起性断片化を生じさせる開示されたレポーターシグナル中でＤＰ（アスパラギン酸（Ｄ）及びプロリン（Ｐ））アミノ酸配列を用いることができる。
【１０４７】
【表６】
2004506900.tif 000007
【１０４８】
表３．ＣＧＡＧＳＤＰＬＡＧＳＬＲ（配列番号：１１）で標識化したｓｒｃタンパク質のトリプシン消化で生じた断片。この断片は、上から下にかけて、配列番号：９の１〜１７位のアミノ酸、配列番号：９の１８〜３２位のアミノ酸、配列番号：９の１０８〜１２５位のアミノ酸、配列番号：９の１３８〜１６６位のアミノ酸、配列番号：９の２２３〜２２５位のアミノ酸、配列番号：９の２８４〜２９３位のアミノ酸、配列番号：９の２９４〜３１３位のアミノ酸、配列番号：９の３４６〜３５７位のアミノ酸、配列番号：１０の１８５〜１９８位のアミノ酸、配列番号：１０の２３６〜２４３位のアミノ酸、配列番号：１０の２４４〜２６０位のアミノ酸、配列番号：１０の２７６〜２９４位のアミノ酸、配列番号：１０の３９２〜４０４位のアミノ酸、配列番号：１０の４８４〜５０３位のアミノ酸である。さらに、ＰＬＡＧＳＬＲ断片（配列番号：１１の７−１３位のアミノ酸）の喪失後の標識化断片の残りの質量も示されている。
【１０４９】
タンパク質のトリプシン消化物が質量分析装置内に導入される。表３の標識化物の質量の縦列中の質量に対応するイオンを選び、衝突セル内で断片化し、続いてＴＯＦによって分析する。主な断片化がアスパラギン酸（Ｄ）とプロリン（Ｐ）との間の開裂しやすい結合であるように、衝突エネルギーと衝突ガス濃度を合わせる。
【１０５０】
断片化の際の開裂しやすい結合の位置における、親イオン質量電荷の、複数のＰＬＡＧＳＬＲ（配列番号：１１の７〜１３位のアミノ酸）単位のシフトにより、レポーターシグナルの存在が明確に確認され、又はいくつかの（分子解離反応速度論、動力学及び熱力学によって測定できるような）ケースにおいては、ＰＬＡＧＳＬＲ＋（配列番号：１１の７〜１３位のアミノ酸）が直接観察される。例えば、表３の５行目に示される標識化タンパク質Ｃ（ＣＧＡＧＳＤＰＬＡＧＳＬＲ）ＩＫ（配列番号：９の２２３〜２２５位のアミノ酸及び配列番号：１１）は最初の四重極にて１５６３ａｍｕで選択され、断片化して８５１ａｍｕとなる（そしておそらくＰＬＡＧＳＬＲ＋、すなわち配列番号：１１の７〜１３位のアミノ酸に対応する７１２ａｍｕとなる）。対照的に、（この説明では触れていない）同一の公称質量の非標識化断片は最初の四重極で選択されるものの、７１２ａｍｕのシフトも７１２ａｍｕのピークも示されない。これにより、非標識化断片に対する例外的な識別能力がもたらされる。この質量スペクトルの説明を図１に示す。
【１０５１】
未知の断片のために、又は既知の断片を確認するために、標識を含ませることを決意し、さらなるプロセシングを伴わない標準的なＭＳ／ＭＳペプチド配列決定技術を用いて配列を求めることができる。
【１０５２】
この説明は、（既知のタンパク質の特定の断片の検出を介する）本方法を用いて、そのタンパク質のペアを検出する一つの単純なケースを実証する。本方法は、複雑な混合物の状態にある、既知及び／又は未知の多数のタンパク質に拡大することができる。親シグナルと１つ（又は複数）の断片化イオンとの組み合わせ事象により、「バックグラウンド」に対する極めて高い識別能力が付与される。
【１０５３】
さらなる分画を望む場合、自動化工業システム、例えばＨＰＬＣ又はキャピラリー電気泳動など、を質量分析装置の前に加えてもよく、それにより識別能力がさらに向上する。分画システムを直列に配列（例えばＬＣ／ＬＣ）して用いてもよい。タンパク質発見及び機能的ゲノミクスの分野において、対象となる相互作用、例えばＳＨ２ドメイン及びＳＨ３ドメインに対するアフィニティーパートナーなどのファミリーを捕獲するための機能的に関連する系を用いて生物学的分画を実施しても構わない。
【１０５４】
Ｈ．説明８：複数のサンプルのタンパク質の中のＳＨ２ドメイン及びＳＨ３ドメインのタンパク質のプロファイリング
説明７に記載されたタンパク質ｃ−ｓｒｃと表３に記載されたそのトリプシン断片を考える。
【１０５５】
安定的なジャーカットＴ細胞に刺激を与えることによって生産されるｃ−ｓｒｃの一時的なタンパク質発現（例えばバーディカ（Ｂｒｄｉｃｋａ）ら、スフィンゴ糖脂質に富むマイクロドメイン（ＰＡＧ）と会合するホスホタンパク質、遍在的に発現される新規膜貫通アダプタータンパク質はタンパク質チロシンキナーゼｃｓｋと会合し、そしてこのものはＴ細胞活性化の調節に関係する。Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，． １９１： １５９１−６０４ （２０００）を参照すること）は、刺激及び細胞の溶解の後の定められた時間内にサンプル細胞を集める前に行うことができる。この時点では、（ｃ−ｓｒｃを含む）ＳＨ２ドメイン及びＳＨ３ドメインタンパク質をこの手段によって捕獲しても構わない。次いで、それぞれの溶解物を表１の異なるレポーターシグナルで標識し、タンパク質をトリプシンで消化する。
【１０５６】
表３の５行目に示されるｃ−ｓｒｃのトリプシン断片ＣＩＫの特定の例を考える。０時間、１時間、２時間、３時間及び４時間の一定の時間について、溶解物をそれぞれＣＧ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊ＤＰＧＧＧＧＲ、ＣＧ＊Ｇ＊Ｇ＊ＧＤＰＧＧＧＧ＊Ｒ、ＣＧ＊Ｇ＊ＧＧＤＰＧＧＧ＊Ｇ＊Ｒ、ＣＧ＊ＧＧＧＤＰＧＧ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｒ及びＧＧＧＧＤＰＧ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｒ（配列番号：１）で標識し、衝突断片化の際にそれぞれＰＧＧＧＧＲ＋、ＰＧＧＧＧ＊Ｒ＋、ＰＧＧＧ＊Ｇ＊Ｒ＋、ＰＧＧ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｒ＋及びＰＧ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｒ＋（配列番号：１の７〜１２位のアミノ酸）が生じることになる。標識化タンパク質混合物を質量分析装置内に導入し、標識化タンパク質の同重体セット（Ｃ（ＣＧ＊Ｇ＊Ｇ＊Ｇ＊ＤＰＧＧＧＧＲ）ＩＫ、すなわち配列番号：１に対応する質量電荷）が通過するように最初のフィルターを設定し、レポーターシグナルを断片化し、そしてそれぞれの時点（それぞれ０時間、１時間、２時間、３時間及び４時間）に特徴的な質量電荷比を有する断片を検出するためにレポーターシグナルをｍ／ｚ＝４９９、５００、５０１、５０２、５０３で測定することにより、五つの時点での測定値を一回の測定で得る。
【１０５７】
フィルターによって対象となっている他の標識化タンパク質が選択され、類似のやり方でこのものが定量される。
【１０５８】
Ｉ．説明９：レポーターシグナルキャリブレーターを用いてのタンパク質断片の検出
この説明には、レポーターシグナルキャリブレーターを用いてタンパク質断片を検出することが含まれる。
【１０５９】
１．１０００個の細胞を含む懸濁液を遠心分離装置にかけて細胞ペレットを得る。
【１０６０】
２．界面活性剤を用いてこの細胞を溶解する。
【１０６１】
３．溶解物をトリプシンで消化する。
【１０６２】
４．必要に応じて、このタンパク質消化物を過酸化水素で酸化してもよく、又はアセチルアセトンで誘導体化してもよい。
【１０６３】
５．壊れやすい独特のトリプシン消化ペプチドからのシグナルと、それぞれの独特のトリプシン消化ペプチドに対応するように設計されたレポーターシグナルキャリブレーター標準からのシグナルとを測定するために、この試料をタンデム質量分析装置中に置き、イオン化し、質量電荷フィルターで選択し、断片化し、質量を分析し、そして検出する。
６．トリプシン消化ペプチドシグニチャー及びその対応するレポーターシグナルキャリブレーターペプチドシグニチャーのそれぞれに適合した質量電荷比であって、５０個の異なるペプチドの質量電荷比についての異なる、特定のフィルタリング設定によって、質量分析を繰り返す。
７．ペプチドシグニチャーから構成される５０×２個の独立した測定値の目録としてデータを集める。
【１０６４】
Ｊ．説明１０：エピトープタグを持つプラスミドベクターから発現されるレポーターシグナル融合体
この説明により、すべてのベクター中で同一であるエピトープタグを含み、かつベクターのセットのすべてのベクター中で異なっているレポーターシグナルペプチドを含むアミノ酸セグメントをコード化している単純な発現ベクターのセットの一例及びその一つの使用例が提供される。このレポーターシグナルペプチドをトリプシンによってアミノ酸セグメントから切断することができる。すべてのレポーターシグナルペプチドは同一の質量電荷比を持つものの、断片化した場合、生産される断片は種々の質量電荷比を持つ。
【１０６５】
１．次のエレメントを含む種々のＤＮＡプラスミドベクターのセットを構築する：
（ａ）共通する複製起点及び共通する抗菌性選択マーカー、
（ｂ）誘導可能なプロモーター（この説明に関して、プロモーターはすべてのプラスミドについて同一であるか、又はそれぞれのプラスミドについて異なっている）並びに
（ｃ）アミノ酸セグメント（レポーターシグナル融合体）をコード化している核酸セグメント、ここで、当アミノ酸セグメントは次のものを含む：
（１）プロモーターの制御下で発現される（すなわち実施できるようにプロモーターに連結した）、対象のタンパク質（この説明のために、タンパク質はそれぞれのプラスミドと異なるか、又はすべてのプラスミドと同一である）、
（２）ｆｌａｇペプチドなどの共通するエピトープタグ及び
（３）トリプシン消化の際にアミノ酸セグメントから遊離可能なレポーターシグナルペプチド（この説明に関して、それぞれのプラスミドは種々のレポーターシグナルペプチドをコード化し、それぞれのレポーターシグナルペプチドはレポーターシグナルペプチドの同一の同重体セットに属するものである）。
【１０６６】
２．それぞれのプラスミドベクターを個々の形質転換受容性細胞に導入する。
【１０６７】
３．形質転換細胞を抗生物質選択下で培養する。
【１０６８】
４．適切な活性化物質によって、誘導可能なプロモーターを誘導する。
【１０６９】
５．発現されたアミノ酸セグメント（すなわちレポーターシグナル融合体）を次のように測定する：
（ａ）種々の発現ベクターを担持している細胞を単一の容器内で混合し、
（ｂ）細胞混合物を溶解してすべてのタンパク質を遊離させ、
（ｃ）エピトープタグに特異的な抗体を用いてこの溶解物から１つ（又は複数）のレポーターシグナル融合体を精製（分離）し、
（ｄ）エピトープタグで精製されたレポーターシグナル融合体をトリプシンで消化し、
（ｅ）トリプシン消化ペプチドをマトリックスと混合してＭＡＬＤＩ−タンデム質量分析法で分析し、種々のレポーターシグナルのそれぞれの量を測定する。
【１０７０】
Ｋ．説明１１：シス切断可能な連結を伴うプラスミドベクターから発現されるレポーターシグナル融合体
この説明により、インテインの活性化可能な自己切断性タンパク質分解活性又は任意の適切なシス作用性プロテアーゼに基づくペプチド遊離メカニズムを伴う、レポーターシグナル融合体をコード化している発現ベクターのセットの一例及びその一つの使用例が提供される。このタンパク質分解活性は、それぞれのレポーターシグナル融合体中に存在するレポーターシグナルペプチドの遊離を制御するのに役立つ。
【１０７１】
１．次の配列エレメントを担持している種々のＤＮＡプラスミドベクターのセットを構築する：
（ａ）複製起点及び抗菌性選択マーカー、
（ｂ）誘導可能なプロモーター、ここで、当プロモーターはすべてのプラスミドが同一であってもよく、又はそれぞれのプラスミドが異なっていてもよい、
（ｃ）プロモーターの指示の下で発現されるアミノ酸セグメント（レポーターシグナル融合体）をコード化している核酸セグメント、ここで、当アミノ酸セグメントは次のものを含む：
（１）対象のタンパク質、ここで、当タンパク質はそれぞれのプラスミドが異なっていてもよく、又はすべてのプラスミドが同一でもよい、
（２）シス切断反応によってレポーターシグナルペプチドの遊離触媒作用を及ぼすことが可能となるように位置するインテインタンパク質ドメイン、
（２）レポーターシグナルペプチドの特定の同重体セットに属するレポーターシグナルペプチドであって、それぞれのプラスミドがレポーターシグナルペプチドの同重体セットの種々の一員をコード化しているもの。
【１０７２】
２．このプラスミドベクターを形質転換受容性細胞に導入する。
【１０７３】
３．形質転換細胞を抗生物質選択下で培養する。
【１０７４】
４．適切な活性化物質によって、誘導可能なプロモーターを誘導する。
【１０７５】
５．発現されたレポーターシグナル融合体を次のようにして測定する：
（ａ）細胞を溶解して内部タンパク質を遊離させ、
（ｂ）ＤＴＴを添加してインテイン自己切断活性を活性化させ（チョン（Ｃｈｏｎｇ）ら、（１９９８）、タンパク質スプライシングエレメントのＣ−末端切断活性を利用する、単一のクロマトグラフィー段階による組み換え型タンパク質の精製、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２６： ５１０９− ５１１５）、
（ｃ）遊離ペプチドをマトリックスと混合してＭＡＬＤＩ−タンデム質量分析法によって分析し、種々のレポーターシグナルのそれぞれの量を測定する。
【１０７６】
Ｌ．説明１２：エピトープタグを伴うＢＡＣベクターから発現されるレポーターシグナル融合体
この説明により、組み込みを促進する能力のあるリコンビナーゼ部位を特定の遺伝子座に伴う哺乳類のＢＡＣ発現ベクターのセットの一例及びその一つの使用例が提供される。
【１０７７】
１．ｐＥＹＭＴ（ホンら、（２００１）、哺乳類細胞中の大型遺伝子の組み換えに基づくクローニングと統制された発現のための、二つの細菌の人工染色体シャトルベクターの開発。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９１： １４２−１４８）に由来する種々のＢＡＣベクターのセットを構築する。これらのベクターは細菌、酵母及び哺乳類の細胞の間を行き来する能力を有する。このベクターは次の特徴を有する：
（ａ）共通するプロモーター、
（ｂ）プロモーターの指示の下で発現されるアミノ酸セグメント（レポーターシグナル融合体）をコード化している核酸セグメント、ここで、当アミノ酸アミノ酸セグメントは次のものを含む：
（１）対象タンパク質の一セット、ここで、それぞれのＢＡＣについての当タンパク質コーディング配列が異なっているか、あるいはすべてのＢＡＣについての当タンパク質コーディング配列は同一であるものの、ＢＡＣは次いで、それぞれのＢＡＣ中の種々のプロモーターを用いて異なるものになる、
（２）ｆｌａｇペプチドなどのエピトープタグ、
（３）レポーターシグナルペプチドの特定の同重体セットに属するレポーターシグナルペプチドであって、それにより、エピトープタグ及び独自のレポーターシグナルペプチドでレポーターシグナル融合体にタグが付され、それにより、トリプシン消化によりレポーターシグナルペプチドが遊離しても構わないもの。
【１０７８】
２．それぞれのＢＡＣベクターをマウス胚性幹細胞内に個別に導入し、ゲノムＤＮＡ中への組み込みを完成させる。形質転換ＥＳ細胞を胚に導入し、生殖系列中にＥＳ細胞を含むキメラ動物を生み出す。これらのマウスの子孫をスクリーニングにかけ、組み込まれているレポーターシグナル融合体構築物を担持するトランスジェニックマウスを同定する。
【１０７９】
３．それぞれのトランスジェニック動物から組織を得て、いくつかの動物からの等量の組織を混合する。
【１０８０】
４．組織の混合物を溶解し、タンパク質を遊離させる。
【１０８１】
５．エピトープタグに特異的な抗体（例えば抗ｆｌａｇ抗体）を用いてレポーターシグナル融合体を精製する。
【１０８２】
６．ｆｌａｇ精製タンパク質をトリプシンで消化する。
【１０８３】
７．このトリプシン消化ペプチドをマトリックスと混合してＭＡＬＤＩ−タンデム質量分析法によって分析し、それぞれの種々のレポーターシグナルの量を測定する。
【１０８４】
Ｍ．説明１３：エピトープタグ及びリコンビナーゼ部位を伴う植物ベクターから発現されるレポーターシグナル融合体
この説明により、組み込みを促進する能力のある二つの正方向のｌｏｘサイト部位を特定の受容遺伝子座に伴う植物発現ベクターのセットの一例及びその一つの使用例が提供される（ベルガンスト（Ｖｅｒｇｕｎｓｔ）ら、（１９９８）、Ｃｒｅリコンビナーゼの媒介によるシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）へのアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔ−ＤＮＡの部位特異的組み込み．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２６： ２７２９−２７３４を若干変更した）。
【１０８５】
１．次の配列エレメントを担持する種々のアグロバクテリウムＴ−ＤＮＡベクターのセットを構築する：
（ａ）ｌｏｘ部位で両側がはさまれたＴ−ＤＮＡ組み換えカセットを伴わないプロモーター（ベルガンストら、（１９９８）、Ｃｒｅリコンビナーゼの媒介によるシロイヌナズナへのアグロバクテリウムＴ−ＤＮＡの部位特異的組み込み．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２６： ２７２９−２７３４）であって、Ｃｒｅリコンビナーゼにより促進される組み込みにより、プロモーターの指示の下で発現されるアミノ酸セグメント（レポーターシグナル融合体）をコード化している核酸セグメントを含むカセットを伴う受容植物のゲノム中に組み込まれるように設計されたプロモーター、ここで、当アミノ酸セグメントは次のものを含む：
（１）対象のタンパク質についてのコーディング配列、ここで、それぞれのＴ−ＤＮＡについての当タンパク質が異なっていてもよく、又はすべてのＴ−ＤＮＡについての当タンパク質が同一でもよい、
（２）ｆｌａｇペプチドなどのエピトープタグ、
（３）レポーターシグナルペプチドの特定の同重体セットに属するレポーターシグナルペプチド。
【１０８６】
２．化学的に誘導可能なプロモーター（クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）ら、（１９９９）、植物形質転換のための高効率マーカーとしての誘導可能なイソペンテニルトランスフェラーゼ。 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７： ９１６−９１９）の制御の下、組み込みベクターの組み換え型タンパク質カセットをＣｒｅ促進性組み換えにより受け取るように設計された、キメラ性プロモーター−ｌｏｘ−Ｃｒｅ遺伝子を担持している植物のような受容植物にＴ−ＤＮＡプラスミドベクターを誘導する。ベルガンストと協力者、（１９９８）のもともとの設計のように、部位特異的組み込みは同時にＣｒｅ−発現の消失を導き、挿入事象は不可逆的なものになる。
【１０８７】
３．組み込まれた遺伝子の前方に存在する化学的に誘導可能なプロモーターの指示の下で発現され、組み込まれたレポーターシグナル融合体が生成する。発現は次のようにして測定される：
（ａ）それぞれの植物から組織を得て、いくつかの植物からの等量の組織を混合し、
（ｂ）組織の混合物を溶解してタンパク質を遊離させ、
（ｃ）エピトープタグに特異的な（すなわち抗ｆｌａｇ）抗体を用いてレポーターシグナル融合体を精製し、
（ｄ）ｆｌａｇ精製タンパク質をトリプシンで消化し、
（ｅ）このトリプシン消化ペプチドをマトリックスと混合してＭＡＬＤＩ−タンデム質量分析法によって分析し、それぞれの種々のレポーターシグナルの量を測定する。
【１０８８】
Ｎ．説明１４：レポーターシグナル融合体をコード化しているベクターを含むキット
この説明により、レポーターシグナル融合体をコード化している二以上のベクターのセットを含むキットの一例が提供される。このキットは二以上の発現ベクターを含み、ここでそれぞれのベクターは種々のレポーターシグナル融合体を発現し、レポーターシグナル融合体中のすべてのレポーターシグナルペプチドは単一の同重体セットに属するものである。さらにキットは例えば、
（ａ）形質転換のための試薬、
（ｂ）レポーターシグナル融合体からレポーターシグナルペプチドの遊離を誘導するための試薬、及び
（ｃ）レポーターシグナルペプチドの分析を最適化するためのマトリックスのような質量スペクトル分析を実施するための試薬、
などのベクターの使用に必要な試薬を含んでも構わない。
【１０８９】
Ｏ．説明１５：ＰＣＲ産物にコード化されているレポーターシグナル融合体
この説明により、ウサギ網状赤血球無細胞系中で発現するように設計されたレポーターシグナル融合体のセットの一例及びその一つの使用例が提供され、ここで、当レポーターシグナル融合体をコード化しているＤＮＡはＰＣＲにより生成したものである。
【１０９０】
１．対象のタンパク質配列を増幅するようにＰＣＲプライマーを設計し、それによりＰＣＲプライマーの一つがＴ７・ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとＡＵＧ開始コドンに対して正確な位置にあるコザック翻訳開始配列とを含む。さらにＰＣＲプライマーもレポーターシグナルペプチドについてのコーディング配列を含み、これは対象タンパク質（それゆえにレポーターシグナル融合体を形成する）のアミノ末端又はカルボキシ末端に位置しても構わない。例えばトリプシン消化によってタンパク質から切断できるようにそれぞれのレポーターシグナルペプチドを設計する。
【１０９１】
２．この人工遺伝子をＰＣＲで増幅し、十分な量のＤＮＡを生成させる。
【１０９２】
３．ＰＣＲにより生成したＤＮＡを、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで転写する。
【１０９３】
４．転写されたＤＮＡを含む溶液をウサギ網状赤血球インビトロ翻訳系に添加して、レポーターシグナル融合体産物を生成させる。
【１０９４】
５．インビトロで合成したレポーターシグナル融合体を精製して又は精製せずに使用する。
【１０９５】
６．対象タンパク質の他の変異体のためにこの工程を繰り返す。典型的な応用例においては、インビトロでの転写／翻訳により、１２８個もの種々のタンパク質変異体が生成され得る。
【１０９６】
Ｐ．説明１６：ＰＣＲ産物にコード化されているレポーターシグナル融合体
この説明により、大腸菌の連動−転写／翻訳系で発現するように設計された核酸分子でコード化されたレポーターシグナル融合体のセットの一例及びその一つの使用例が提供される。
【１０９７】
１．対象のタンパク質配列を増幅するようにＰＣＲプライマーを設計し、それによりＰＣＲプライマーの一つがＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとＡＵＧ開始コドンに対して正確な位置にあるシャイン・ダルガーノ翻訳開始配列とを含む。さらにＰＣＲプライマーもレポーターシグナルペプチドについてのコーディング配列を含み、これは対象タンパク質（それゆえにレポーターシグナル融合体を形成する）のアミノ末端又はカルボキシ末端に位置しても構わない。例えばトリプシン消化によってタンパク質から切断できるようにそれぞれのレポーターシグナルペプチドを設計する。
【１０９８】
２．この人工遺伝子をＰＣＲで増幅し、インビトロ連動−転写／翻訳系で使用するのに十分な量のＤＮＡを生成させる。
【１０９９】
３．ＰＣＲにより生成したＤＮＡをインビトロ連動−転写／翻訳系中でインキュベートしてレポーターシグナル融合体産物を生成する。
【１１００】
４．インビトロで合成したレポーターシグナル融合体を精製して又は精製せずに使用する。
【１１０１】
５．対象タンパク質の他の変異体のためにこの工程を繰り返す。典型的な応用例においては、インビトロでの転写／翻訳により、１２８個もの種々のタンパク質変異体が生成され得る。
【１１０２】
Ｑ．説明１７：酵母細胞中で発現されるレポーターシグナル融合体
この説明により、それぞれの株が単一のレポーターシグナル融合体を担持している３２種の酵母株のセットの一例及びその一つの使用例が提供される。
【１１０３】
非必須遺伝子を標的とする相同組み換えを用いて酵母株（サッカロマイセス・セレビシエ）を構築し、それにより、治療に使えそうなタンパク質と（３２個の同重体レポーターシグナルペプチドのセットに属する）レポーターシグナルペプチドとの融合体をガラクトース応答性プロモーターの制御下に置く。同一の酵母プロモーターを用いて別の３１種の類似の酵母株を構築し、それにより、レポーターシグナル融合体についてのコーディングＤＮＡ配列中の他の唯一の違いは、３１種の種々のレポーターシグナルペプチドのうちの一つを生成するように設計されたコドンを使用することであり、そして３２個の種々のプロモーターのセット及び３２個の別個のレポーターシグナルペプチドの同重体セットが完成する。この酵母株をあらゆる測定に用いることができ、そこではレポーターシグナルペプチド（及び／又はレポーターシグナル融合体）はレポーターシグナルペプチドに融合したタンパク質の発現のためのレポーターとして機能する。このケースではこれは候補治療タンパク質である。
【１１０４】
Ｒ．説明１８：マウス細胞中で発現されるレポーターシグナル融合体
この説明により、 それぞれの細胞系が単一のレポーターシグナル融合体を担持している３２種のマウス細胞系のセットの一例及びその一つの使用例が提供される。
【１１０５】
ＳＶ４０ベクター系を用いてマウス細胞系を構築し、それにより治療に使えそうなタンパク質と（３２個の同重体レポーターシグナルペプチドのセットに属する）レポーターシグナルペプチドとの融合体をサイトカインプロモーターの制御の下に置く。３１個の種々のサイトカインプロモーターを用いて別の３１種の類似の細胞系を構築し、それによりレポーターシグナル融合体についてのコーディングＤＮＡ配列中の他の唯一の違いは、３１個の種々のレポーターシグナルペプチドのうちの一つを生成するように設計されたコドンを使用することであり、そして３２個の種々のプロモーターのセット及び３２個の別個のレポーターシグナルペプチドの同重体セットが完成する。この細胞系をあらゆる測定に用いることができ、そこではレポーターシグナルペプチド（及び／又はレポーターシグナル融合体）はレポーターシグナルペプチドに融合したタンパク質の発現のためのレポーターとして機能する。このケースではこれは治療に使えそうなタンパク質である。
【１１０６】
Ｓ．説明１９：対象のプロモーターを用いて発現されるレポーターシグナル融合体　この説明により、サイトカイン−ＳＴＡＴ５ａ−応答性プロモーターの一部として単一の融合体を担持している細胞を使用する一例が提供される。この系によって、レポーターシグナルペプチド対ＧＦＰ内部標準との比較を提供することができる。
【１１０７】
１．独自の質量のセット（すなわち同重体セット）に属する９６個の種々のレポーターシグナルペプチドのセットを用いて実験を行う。ここで、それぞれの細胞系は単一のレポーターシグナル融合体をコード化している核酸構築物を担持している。融合体構築物はＣＩＳ１タンパク質についてのサイトカイン応答性プロモーターを含み、このものはＳＴＡＴ５応答（マスモト（Ｍａｓｕｍｏｔｏ）ら、（１９９９）、ＳＴＡＴ５の抑制は、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質１トランスジェニックマウス中の肝臓、乳腺及びＴ細胞で機能する。Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９： ６３９６−６４０７）、ＧＦＰをコード化している配列及びＧＦＰに融合しているレポーターシグナルペプチドをコード化している配列を経て活性化する。
【１１０８】
２．組み合わせ薬剤ライブラリーからの３８４００個の種々の、サイトカインを模倣した薬剤候補物のセットにて、３８４００個の細胞培養液を６時間処理した後、ＧＦＰ蛍光値を得るために、３８４０個の細胞培養液のサブセットをサンプルとして抜き取る。
【１１０９】
３．この細胞を９６個の群の中にプールする。
【１１１０】
４．この細胞混合物を溶解し、ＧＦＰ融合体タンパク質を遊離させる。
【１１１１】
５．溶解物をトリプシンで消化する。
【１１１２】
６．このトリプシン消化ペプチドをマトリックスと混合してＭＡＬＤＩ−タンデム質量分析法によって分析し、それぞれの種々のレポーターシグナルの量をここで測定する。
【１１１３】
プロテオミクス分析においては、多くの場合、高価な質量分析装置の読み出し速度が律速の要因である。本方法の鍵となる特徴は、レポーターシグナルペプチドの質量分析に基づくイムノプロファイリングの前に、９６個の処理された細胞サンプルのセットをプールする能力である。合計で３８４００個の細胞培養液を、それぞれ異なる薬剤で処理する。９６個の種々のレポーターシグナルペプチドのうちの一つを担持している、プールされた種々の細胞を使用することにより、３８４００個の培養液を４００個のプールされたサンプルとして分析することが可能となる。
【１１１４】
工程２において得られるサンプルのサブセット（３８４００個の中の３８４０個）についてのＧＦＰ蛍光値を、同一のサンプルからのレポーターシグナルペプチドの質量分析により得られるデータと比較する。蛍光値と質量分析により得られる値との間に良好な相関関係は、機能の制御とレポーターシグナル融合体のタグが付いた細胞系の有用性を構成するエレメントである。
【１１１５】
Ｔ．説明２０：一つの細胞中で発現される複数のレポーターシグナル融合体
この説明により、３２個の種々のレポーターシグナル融合体のプロファイリングを表現する方法及び複数のレポーターシグナル融合体を担持する細胞を利用する方法の一例が提供される。
【１１１６】
独自の質量のセット（すなわち同重体）に属する３２個の種々のレポーターシグナルペプチドのセットを用いて実験を行う。ここで、それぞれの細胞系は、異なるプロモーターの制御の下で独立して発現する３２個の種々のレポーターシグナル融合体を担持している。これらの３２個の種々のタンパク質の発現を監視することは、薬物の毒性を測定することに役立つ。
【１１１７】
細胞培養液を一つずつ分析する：
（ａ）細胞を溶解してタンパク質を遊離させ、
（ｂ）この溶解物をトリプシンで消化する。
（ｃ）このトリプシン消化ペプチドをマトリックスと混合してＭＡＬＤＩ−タンデム質量分析法によって分析し、種々のレポーターシグナルのそれぞれの量を測定する。
【１１１８】
Ｕ．説明２１：哺乳類の細胞系にて発現される複数のレポーターシグナル融合体
この説明により、マイクロカプセルに封入された、異種タンパク質送達のための生産装置として用いるように設計された哺乳類の細胞系であって、当細胞系は１２個のレポーターシグナル融合体を担持しているものである細胞系の一例及びその一つの使用例が提供される。
【１１１９】
ＢＡＣ相同組み換えベクター系（ホンら、（２００１）、哺乳類細胞中の大型遺伝子の組み換えに基づくクローニングと統制された発現のための、二つの細菌の人工染色体シャトルベクターの開発。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９１： １４２−１４８）を用いて、哺乳類の細胞系を構築する。それにより、二つの治療に使えそうなタンパク質と（１２個の同重体レポーターシグナルペプチドのセットに属する）二つの同重体レポーターシグナルペプチドの融合体を、テトラサイクリンプロモーターの制御の下に置く。種々の分泌タンパク質をコード化している残りの１０個の遺伝子中の１０個の融合体を、同一の細胞系中で、それら自身の天然のプロモーターの制御の下で構築し、それにより融合体ペプチドについてのコーディングＤＮＡ配列中の他の唯一の違いは、１０個の種々のレポーターシグナルペプチドのうちの一つを生成するように設計されたコドンを使用することとなる。これにより、１２個の種々の遺伝子のセット及び１２個の別個のレポーターシグナルペプチドのセットが完成する。
【１１２０】
この細胞系はマイクロカプセルに封入されており、そして動物宿主又はヒトの患者における異種タンパク質送達のために用いられる。ここで、治療用のタンパク質の分泌はテトラサイクリンによって誘導される。
【１１２１】
免疫測定法を実施する。ここで、対象の１２個のレポーターシグナル融合体を捕獲するために特定の抗体を使用し、それにより、レポーターシグナルペプチド（及び／又はレポーターシグナル融合体）が、一つのレポーターシグナルペプチドが融合した、二つの治療に使えそうなタンパク質を含むそれぞれのタンパク質の発現のレポーターとして機能する。それゆえに、テトラサイクリン誘導に対するマイクロカプセルに封入された細胞の応答と、それと同時にそのマイクロカプセルに封入された細胞による他の分泌タンパク質の産生とを測定することができるかもしれない。
【１１２２】
レポーターシグナル融合体を用いてのマイクロカプセルに封入された細胞によるタンパク質発現の正確な監視は、投薬量の最適化を促進するものとして機能し、その結果、治療の安全性がより制御しやすくなる。本方法で監視される余分の分泌タンパク質の中で、サイトカイン又はマイトジェンの可能性がある他のタンパク質を含めても構わない。
【１１２３】
Ｖ．説明２２：複数の細胞系にて発現される複数のレポーターシグナル融合体
この説明により、それぞれの細胞系が１０個の種々のレポーターシグナル融合体を担持している６つの種々のヒトの細胞系のセットの一例及びその一つの使用例が提供され、それにより、すべてのレポーターシグナルペプチが同一の同重体セットに属することになる。
【１１２４】
６つの細胞系は成人の幹細胞に由来し、ここで、それぞれの細胞系は、独特のＳＮＰの組み合わせにより定義される種々の主なヒトのハプロタイプを代表するものである。そしてそれにより、それぞれの六つのハプロタイプは、重要なファーマコジェノミックスのための、β（２）−アドレナリンレセプター（ドリスダール（Ｄｒｙｓｄａｌｅ）ら、（２０００）、プロモーターとベータ２−アドレナリンレセプターのハプロタイプのコーディング領域との複合体はレセプター発現を変更し、インビボ感応性を予測する。Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． ９７： １０４８３−１０４８８）についてのヒト集団の薬剤応答サブセットを代表する。
【１１２５】
ＢＡＣ相同組み換えベクター系（ホンら、（２００１）、哺乳類細胞中の大型遺伝子の組み換えに基づくクローニングと統制された発現のための、二つの細菌の人工染色体シャトルベクターの開発。Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９１： １４２−１４８）を用いて、合計で六つの哺乳類の細胞系を構築し、それにより、種々のシグナル伝達タンパク質をコード化している１０個の種々の遺伝子における１０個の融合体のセットを、それら自身の天然のプロモーターの制御の下で同一の細胞系内に構築する。それにより、融合体ペプチドについてのコーディングＤＮＡ配列中の他の唯一の違いは、１０個の種々のレポーターシグナルペプチドのうちの一つのみを生成するように設計されたコドンを使用することとなる。これにより、１０個の種々の遺伝子のセット及びそれぞれの細胞系に対応する１０個の別個のレポーターシグナルペプチドのセットが完成する。それにより、それぞれの細胞系はヒトのβ（２）−アドレナリンレセプターの主なハプロタイプを代表し、それゆえに、六つのすべての細胞系のセットの組み合わせの中に６０個の種々のレポーターシグナル融合体が存在することになる。
【１１２６】
この細胞系をあらゆる測定に用いることができ、そこでは６０個のレポーターシグナルペプチドのセットが、それぞれのレポーターシグナルペプチドに融合した特定のタンパク質の発現のためのレポーターとして、それぞれの細胞系において機能する。
【１１２７】
Ｗ．説明２３：複数のヒト細胞系中で発現される複数のレポーターシグナル融合体　この説明により、それぞれの細胞系がヒトのハプロタイプを代表し、そしてそれぞれの細胞系がレポーターシグナル融合体を担持している６つの細胞系のセットの一例及びその一つの使用例が提供される。
【１１２８】
１．独自の質量のセット（すなわち同重体）に属する６０個の種々のレポーターシグナルペプチドのセットを用いて実験を行う。ここで、それぞれの細胞系は１０個のレポーターシグナル融合体を担持している。この実験の目的は、細胞の薬剤への応答を測定することである。
【１１２９】
２．この細胞を六つのハプロタイプの群の中にプールする。
【１１３０】
３．この細胞混合物を溶解し、タンパク質を遊離させる。
【１１３１】
４．溶解物をトリプシンで消化する。
【１１３２】
５．このトリプシン消化ペプチドをマトリックスと混合してＭＡＬＤＩ−タンデム質量分析法によって分析し、それぞれの種々のレポーターシグナルの量をここで測定する。
【１１３３】
プロテオミクス分析においては、多くの場合、高価な質量分析装置の読み出し速度が律速の要因である。本方法の鍵となる特徴は、レポーターシグナルペプチドの質量分析に基づくイムノプロファイリングの前に、六つの処理された細胞サンプルのセットをプールする能力である。合計で２４００個の細胞培養液を、それぞれ異なる薬剤で処理する。プールされた六つの種々の細胞系を使用することにより、２４００個の培養液を４００個のプールされたサンプルとして分析することが可能となる。すべての４００個のサンプルを質量分析装置のプレート上に置き、タンデム質量分析法で分析する。それぞれのレーザー照射についての情報は、６０個の種々のレポーターシグナル融合体の発現レベルから成る。
【１１３４】
Ｘ．説明２４：レポーターシグナル融合体標識化ヒト細胞系のキット
この説明により、それぞれの細胞系が主なヒトのハプロタイプを代表し、そしてそれぞれの細胞系が複数のレポーターシグナル融合体を担持している６つの細胞系を含むキットの一例及びその一つの使用例が提供される。このキットは、細胞系及び、レポーターシグナルペプチドのセットの、独自の質量のセットに属する６０個の種々のレポーターシグナルペプチドのセットを用いて実施する実験において用いられるように計画された制御を含み、ここで、それぞれの細胞系は１０個のレポーターシグナル融合体を担持するものである。この実験の目的は、細胞の種々の薬剤に対する応答に関するものである。
【１１３５】
Ｙ．説明２５：レポーターシグナル融合体標識化ハエ
この説明により、レポーターシグナル融合体を担持するトランスジェニックショウジョウバエの一例及びその一つの使用例が提供される。
【１１３６】
相同組み換え（ロン及びゴリック（Ｒｏｎｇ ａｎｄ Ｇｏｌｉｃ）、（２００１）、ショウジョウバエにおける標的遺伝子のノックアウト、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５７： １３０７−１３１２）を用いてキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）種の組み換え型ハエを構築し、それにより合計で１６個の遺伝子が、独自の質量のセット（すなわち同重体である）に属するレポーターシグナル融合体をコード化している配列の付加により修飾される。異なるシグナル伝達経路、例えばｒａｓ、ｍｙｃなどの種々のレベルにおけるそれらの既知の機能に基づいて、この１６個の組み換え型タンパク質を選択する。この融合体を、それぞれのタンパク質のカルボキシ末端か又はアミノ末端のいずれかに位置させ、そして必要に応じて、ｆｌａｇエピトープなどのエピトープタグをこの融合体の前に置いてもよい。
【１１３７】
組み換え型タンパク質ライブラリーの一員を担持するＰ因子を用いての形質転換によって生成した新規遺伝子型における実験のために、このハエを用いる。形質転換を実行する目的は、組み換え型ライブラリーに存在する異なるタンパク質配列によって生成した表現型を観察することに関する。
【１１３８】
形質転換の後、個々のハエをタンパク質を抽出するために処理し、そのタンパク質をトリプシンで消化し、そしてレポーターシグナル融合体に由来するレポーターシグナルペプチドを、衝突誘導断片化タンデム質量分析法と一緒にナノレベルの構造のシリコンフィルム（ヘイズ（Ｈａｙｅｓ）ら、（２００１）、ナノレベルの構造物が付着したシリコンフィルムを用いる脱離イオン化質量分析法、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７３： １２９２−１２９５）を用いて、脱離イオン化によって分析する。このレポーターシグナルペプチドのプロフィールにより、ハエにおけるレポーターシグナル融合体の相対発現量が得られる。
【１１３９】
Ｚ．説明２６：レポーターシグナル融合体標識化マウス
この説明により、シグナル伝達経路分析のために、レポーターシグナル融合体を担持するトランスジェニックマウスの一例及びその一つの使用例が提供される。
【１１４０】
胚性幹（ＥＳ）細胞（テンプルトン（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ）ら、（１９９７）、マウス胚性幹細胞における効果的な標的遺伝子組み換え、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４： ７００−７０９）における相同組み換えを用いて、ハツカネズミ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）種の組み換え型マウスを構築し、それにより合計で１２遺伝子が、独自の質量のセット（すなわち同重体である）に属するレポーターシグナル融合体の付加により修飾される。対象の組み換え型タンパク質のそれぞれのアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかの位置にレポーターシグナルペプチドを付加するようにその遺伝子融合体を設計する。異なるシグナル伝達経路、例えばｒａｓ、ｍｙｃ、ｗｎｔなどの種々のレベルにおけるそれらの既知の鍵となる機能に基づいて、この１２個の組み換え型タンパク質を選択する。必要に応じて、いくつかの融合体はｆｌａｇエピトープなどのエピトープタグ又はＧＦＰ融合体を含んでいてもよい。いくつかの融合体は未知の機能のマウスタンパク質を含んでいるかもしれない。
【１１４１】
特定の仮説を検証するためには、組み換え型レポーターシグナル融合体の多くは正常マウスプロモーターの下に位置し、それに対して一つ又は二、三の組み換え型レポーターシグナル融合体は異種プロモーターの制御の下にあってもよい。例えば、実験用の組み換え型レポーターシグナル融合体は、インターロイキン−２プロモーターの（不適当な）制御の下で、レポーターシグナルペプチドと融合したインターロイキン−６コーディング配列から成っていても構わない。
【１１４２】
腫瘍を化学的突然変異誘発原（２−アゾキシメタン）で誘導するという一連の実験において、レポーターシグナル融合体が連結した実験用の異種プロモーターを有するマウスと同様に、正常プロモーターを有するマウスを用いる。腫瘍が現れた後、種々の抗腫瘍剤候補でマウスを処理する。
【１１４３】
薬剤処理の後の種々の時点において、個々のマウスから腫瘍を切り出して、タンパク質を抽出するために腫瘍組織を処理する。そのタンパク質をトリプシンで消化し、そしてレポーターシグナル融合体に由来するレポーターシグナルペプチドを、衝突誘導断片化タンデム質量分析法と一緒にナノレベルの構造のシリコンフィルム（ヘイズら、（２００１）、ナノレベルの構造物が付着したシリコンフィルムを用いる脱離イオン化質量分析法、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７３： １２９２−１２９５）を用いて、脱離イオン化によって分析する。このレポーターシグナルペプチドのプロフィールにより、１２個のレポーターシグナル融合体の相対発現量が得られ、そしてこのプロフィールは、正常マウスにおける又は実験用の異種プロモーター構築物を有するマウスにおける抗腫瘍剤に対する複数の経路の応答の有益な指標として機能する。さらに、このプロフィールによって、未知の機能のタンパク質の発現に関する情報も提供されるかもしれない。
【１１４４】
ＡＡ．説明２７：レポーターシグナル融合体標識化マウス
この説明により、炎症反応とシクロオキシゲナーゼ２（Ｃｏｘ−２）プロモーターミュータントについて研究するために、レポーターシグナル融合体を担持するトランスジェニックマウスの一例及びその一つの使用例が提供される。
【１１４５】
胚性幹（ＥＳ）細胞（テンプルトンら、（１９９７）、マウス胚性幹細胞における効果的な標的遺伝子組み換え、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４： ７００−７０９）における相同組み換えを用いて、ハツカネズミ種の組み換え型マウスを構築し、それにより合計で１０個の遺伝子が、独自の質量のセットに属するレポーターシグナル融合体の付加により修飾される。対象の組み換え型タンパク質のそれぞれのアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかの位置にレポーターシグナルペプチドを付加するようにその遺伝子融合体を設計する。組織の炎症反応（例えばＣｏｘ−２など）の種々のレベルにおけるそれらの既知の機能に基づいて、この１０個の組み換え型タンパク質を選択する。必要に応じて、いくつかの融合体はｆｌａｇエピトープなどのエピトープタグ又はＧＦＰ融合体を含んでいてもよい。いくつかの融合体は未知の機能のマウスタンパク質を含んでいるかもしれない。しかし、これらは炎症時の役割を有しているのではと推測される。
【１１４６】
特定の仮説を検証するためには、組み換え型レポーターシグナル融合体の多くは正常マウスプロモーターの下に位置し、それに対して一つ又は二、三の組み換え型レポーターシグナル融合体はミュータントプロモーターの制御の下にあってもよい。例えば、実験用の組み換え型レポーターシグナル融合体は、転写応答が低減されたＣｏｘ−２ミュータントプロモーターの制御の下で、レポーターシグナルペプチドと融合したＣｏｘ−２コーディング配列から成っていても構わない。
【１１４７】
結腸の炎症及び大腸炎をデキストラン硫酸により誘導するという一連の実験において、レポーターシグナル融合体が連結した実験用のミュータントプロモーターを有するマウスと同様に、正常プロモーターを有するマウスを用い、次いで、抗炎症剤でマウスを処理する。
【１１４８】
薬剤処理の後の種々の時点において、個々のマウスから結腸を切り出して、タンパク質を抽出するために組織を処理する。そのタンパク質をトリプシンで消化し、そしてレポーターシグナル融合体に由来するレポーターシグナルペプチドを、衝突誘導断片化タンデム質量分析法と一緒にナノレベルの構造のシリコンフィルム（ヘイズら、（２００１）、ナノレベルの構造物が付着したシリコンフィルムを用いる脱離イオン化質量分析法、Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７３： １２９２−１２９５）を用いて、脱離イオン化によって分析する。このレポーターシグナルペプチドのプロフィールにより、１０個のレポーターシグナル融合体の相対発現量が生じ、そしてこのプロフィールは、正常マウスの大腸炎を伴う結腸における又は実験用のミュータントＣｏｘ−２プロモーター構築物を有するマウスにおける抗炎症剤に対する複数の経路の応答の有益な指標として機能する。さらに、このプロフィールによって、未知の機能のタンパク質の発現に関する情報も提供されるかもしれない。
【１１４９】
ＢＢ．説明２８：種々のレポーターシグナルで標識した複数のサンプル
この説明は、レポーターシグナルを用いる複数のサンプルの標識化の一例であり、ここでは、それぞれのサンプルが種々のレポーターシグナルで標識されている。
【１１５０】
この説明には、３８４個の異なるタンパク質抗原のプロフィールを作り出すために、３８４個の抗体のミニカラムを使用することが含まれる。標準的な水溶性カルボジイミドの化学反応（マーチ（Ｍａｒｃｈ）ら、（１９７４）、アフィニティークロマトグラフィーのための、臭化シアンによるアガロースの簡便な活性化方法、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６０： １４９−１５２）を用いて、アガロースビーズに抗体を共有結合させる。一つの抗体を有する小容積（７５μＬ）のアフィニティーカラムは、それぞれのタンパク質の約２×１０１１分子と等しい。レポーターシグナルを２５６倍に多重化すると、最大タンパク質結合能は概算で１０８分子となる。それゆえに、測定のダイナミックレンジは１００００〜１００００００００分子のタンパク質となる。
【１１５１】
１．４セットのそれぞれが同一の質量を持つように、６４個のレポーターシグナルを４セット（合計で２５６）用意する。
【１１５２】
２．ＳＡＴＡ及びＳＳＣＰ（ピアスケミカルズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社）などの標準的なヘテロ二機能試薬を用いて、２５６個の細胞調製品のそれぞれを独自のレポーターシグナルを共有結合で標識する。この目的のために好ましい化学は、スルホ−ＬＳ−ＳＰＤＰ（ピアス社のカタログ番号２１６５０；ウト（Ｕｔｏ）ら、酵素−抗体複合体についてのマレイミド法を用いてのＥＬＩＳＡによる尿中タム−ホースフォールタンパク質の定量、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １３８： ８７−９４ （１９９１））を用いることである。
【１１５３】
３．特異的抗体を含むマイクロチップ上にアフィニティーカラムを取り付ける。
【１１５４】
４．３８４個の抗体について繰り返す。すなわち、すべての標識化細胞調製品を３８４のカラムのそれぞれと会合させる。
【１１５５】
５．光で開裂可能なレポーターシグナル遊離化学反応（イノーバケム社、ツーソン、アリゾナ州、例えば、ハースフリッチー及びカンタクジーン（Ｈａｒｔｈ−ｆｒｉｔｓｃｈｙ ａｎｄ Ｃａｎｔａｃｕｚｅｎｅ）、Ｐｅｐｔ． Ｒｅｓ． ５０： ４１５ （１９９７）を参照すること）を利用してカラムから溶出する。
【１１５６】
６．このレポーターシグナルをマトリックスと混合してＭＡＬＤＩ−タンデム質量分析法によって分析し、四つのセットのそれぞれの質量についてを一種類として、四種類の逐次的な質量電荷設定（４×６４）を用い、種々のレポーターシグナルのそれぞれの量をここで測定する。
【１１５７】
データポイントの数は２５６×３８４＝９８３０４個となる。一日あたり１０回稼動することにより、９８００００個のデータポイントが得られる。この方法は、３８４×１０抗体＝３８４０抗体まで簡単に拡張することができる。３８４０個の抗体に関して言えば、一日あたり１０回稼動することにより、一日あたり９８３０４００個のデータポイントが得られることになる。
【１１５８】
ＣＣ．説明２９：種々のレポーターシグナルで標識された複数のサンプル
この説明は、レポーターシグナルを用いる複数サンプルの標識化の一例であり、ここで、それぞれのサンプルを種々のレポーターシグナルで標識する。ＤＮＡコーディングタグ中間体を介して、このサンプルを標識する。
【１１５９】
この説明には、３８４個の異なるタンパク質抗原のプロフィールを作り出すために、３８４個の抗体のミニカラムを使用することが含まれる。標準的な水溶性カルボジイミドの化学反応（マーチら、（１９７４）、アフィニティークロマトグラフィーのための、臭化シアンによるアガロースの簡便な活性化方法、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６０： １４９−１５２）を用いて、アガロースビーズに抗体を共有結合させる。一つの抗体を有する小容積（７５μＬ）のアフィニティーカラムは、それぞれのタンパク質の約２×１０１１分子と等しい。レポーターシグナルを２５６倍に多重化すると、最大タンパク質結合能は概算で１０８分子となる。それゆえに、測定のダイナミックレンジは１００００〜１００００００００分子のタンパク質となる。
【１１６０】
それぞれのタンパク質調製物に独自のＤＮＡオリゴヌクレオチド（コーディングタグ）のタグを付ける。ここで、６４個の異なるコーディングタグのセットは、お互いにハイブリッド形成できないという特性を有するものである。このタンパク質調製物を２−イミノチオラン（アラゴン及びキング（Ａｌａｇｏｎ ａｎｄ Ｋｉｎｇ）、（１９８０）、２−イミノチオランでの多糖類の活性化とその利用、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． １９： ４３４１−４３４５）と反応させて、もし存在しない場合は、反応性メルカプト基を導入する。その末端の一方に反応性アミノ基を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド（コーディングタグ）を、例えば、スルホ−ＳＭＣＣ（ピアス社）などのヘテロ二機能性架橋結合剤と反応させる。チオール含有タンパク質を活性化オリゴヌクレオチドと一緒にインキュベートし、タンパク質−ＤＮＡ共有性付加物（それゆえに、コーディングタグ標識化タンパク質）を形成させる。多くのタンパク質分子にとって、この共有性付加物の形成がその同起源の抗体と会合するタンパク質の能力を妨害することはないだろう。それぞれが独自のコーディングタグ配列と共有結合した合計で６４個のタンパク質調製物を、多重化測定に用いる前に一緒にプールする。
【１１６１】
この例はさらにペプチド核酸デコーディングタグ及びレポーターシグナルペプチドから成るレポーター分子を使用することも含む。このデコーディングタグは、別のものとハイブリッド形成できないように、さらにタンパク質の標識化に用いるための上記の６４個のコーディングタグのそれぞれと相補的と成るように設計された６４個の異なるＰＮＡ配列を含む。レポーター分子のＰＮＡ部分の長さは９〜１５塩基が好ましく、１０〜１１塩基がより好ましい。本例のこのレポーター分子はさらに、６４個の異なるアミノ酸配列（レポーターシグナルペプチド）を含む。ここで、アミノ酸配列は同一の質量を持つという共通する特性を有するものの、衝突誘導断片化の後で互いに分離できるようなやり方で切断され得るというものである。
【１１６２】
１．上記のように、スルホ−ＳＭＣＣ化学を利用し、独自の、自己ハイブリッド非形成性ＤＮＡオリゴヌクレオチド（コーディングタグ）で、６４個の細胞調製品を標識する。
【１１６３】
２．特異的抗体を含むマイクロチップ上にアフィニティーカラムを取り付ける。
【１１６４】
３．３８４個の抗体について繰り返す。すなわち、すべての標識化細胞調製品を３８４個のカラムのそれぞれと会合させる。
【１１６５】
４．６４個のレポーター分子のすべてをカラムに通し、ＰＮＡとタンパク質上のＤＮＡコーディングタグとのハイブリダイゼーションを成立させる。
【１１６６】
５．酸性マトリックスを用いてカラムからタンパク質を溶出する。
【１１６７】
６．ＭＡＬＤＩ−タンデム質量分析法によってレポーターシグナルの分離と定量を行う。種々のレポーターシグナルのそれぞれの量をここで測定する。
【１１６８】
ペプチド核酸レポーターシグナル（すなわちペプチド核酸から成るレポーターシグナル）を用いてこの例を実施することができ、それによりコーディングタグと直接会合させる。このレポーターシグナルは、別のものとハイブリッド形成できないように、さらにタンパク質の標識化に用いるための上記の６４個のコーディングタグのそれぞれと相補的と成るように設計された、同一の質量を持つ６４個の異なるＰＮＡ配列を含む。このレポーターシグナルは（検出のために）コーディングタグから簡単に解離することができる。というのも、これらはコーディングタグと非共有的に会合しているだけだからである。
【１１６９】
ＤＤ．説明３０：種々のレポーターシグナルで標識された複数のサンプル
この説明は、レポーターシグナルを用いての複数サンプルの標識化の一例であり、ここで、それぞれのサンプルを種々のレポーターシグナルで標識する。ＤＮＡコーディングタグ中間体を介して、このサンプルを標識し、そして抗体アレイを用いてこのサンプルを分析する。
【１１７０】
この説明には、固体表面に構築された３２００個のエレメントの抗体マイクロアレイを使用することが含まれ、ここで、その表面は質量分析法による分析と互換性を有するものである。
【１１７１】
それぞれのタンパク質調製物に独自のＤＮＡオリゴヌクレオチド（コーディングタグ）のタグを付ける。ここで、１６個の異なるオリゴヌクレオチドのセットは、お互いにハイブリッド形成できないという特性を有するものである。このタンパク質調製物を２−イミノチオラン（アラゴン及びキング、（１９８０）、２−イミノチオランでの多糖類の活性化とその利用、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． １９： ４３４１−４３４５）と反応させて、もし存在しない場合は、反応性メルカプト基を導入する。その末端の一方に反応性アミノ基を有するＤＮＡオリゴヌクレオチド（コーディングタグ）を、例えば、スルホ−ＳＭＣＣ（ピアス社）などのヘテロ二機能性架橋結合剤と反応させる。チオール含有タンパク質を活性化オリゴヌクレオチドと一緒にインキュベートし、タンパク質−ＤＮＡ共有性付加物、それゆえに、コーディングタグ標識化タンパク質、を形成させる。多くのタンパク質分子にとって、この共有性付加物の形成がその同起源の抗体と会合するタンパク質の能力を妨害することはないだろう。それぞれが独自のＤＮＡコーディングタグ配列と共有結合した合計で１６個のタンパク質調製物を、多重化測定に用いる前に一緒にプールする。
【１１７２】
説明２９と同じく、この例はさらにＰＮＡ−ペプチドレポーターシグナルレポーター分子の使用を含む。このＰＮＡ部分はデコーディングタグであり、別のものとハイブリッド形成できないように、さらにタンパク質の標識化に用いるための上記の１６個のＤＮＡタグのそれぞれと相補的な配列と成るように設計された、１６個の異なるＰＮＡ配列を含む。レポーター分子のこのレポーターシグナル部分は１６個の異なるアミノ酸配列を含む。ここで、アミノ酸配列は同一の質量を持つという共通する特性を有するものの、衝突誘導断片化の後で互いに分離できるようなやり方で切断され得るというものである。
【１１７３】
１６のタンパク質サンプルのそれぞれにタグを付与するために用いる、１６個のコーディングタグの更なる特性は、それぞれのコーディングタグがレポーター分子の中の八つの分子と会合する能力があることである。サンプル中のそれぞれのタグが付いたタンパク質は、平均して１〜３のＤＮＡコーディングタグを含むことになる。それゆえに、それぞれのタンパク質は多数（８〜２４個）のレポーター分子と会合できるだろう。この設計の結果、質量分析装置におけるレポーターシグナルのシグナル強度が強くなる。
【１１７４】
１．上記のように、スルホ−ＳＭＣＣ化学を利用し、独自の、自己ハイブリッド非形成性ＤＮＡオリゴヌクレオチド（コーディングタグ）で、１６個の細胞調製品を標識する。
【１１７５】
２．３２００個の固定化抗体を含むマイクロアレイであって、質量分析装置上での読み取りに適したプレートの表面上に構築されているマイクロアレイ上にサンプルを置く。３７℃で２時間インキュベートを行う。表面を洗浄して非会合サンプルを除去する。
【１１７６】
３．抗体マイクロアレイを１６個のＰＮＡ−ペプチドレポーターシグナルレポーター分子の混合物と接触させる。洗浄して余分のレポーター分子を除去する。
【１１７７】
４．表面をマトリックスで被覆し、このマイクロアレイをＭＡＬＤＩタンデム質量分析装置内に装着する。
【１１７８】
５．ＭＡＬＤＩ−タンデム質量分析法によってレポーターシグナルの分離と定量を行う。種々のレポーターシグナルのそれぞれの量をここで測定する。
【１１７９】
ペプチド核酸レポーターシグナル（すなわちペプチド核酸から成るレポーターシグナル）を用いてこの例を実施することができ、それによりコーディングタグと直接会合させる。このレポーターシグナルは、別のものとハイブリッド形成できないように、さらにタンパク質の標識化に用いるための上記の１６個のコーディングタグのそれぞれと相補的と成るように設計された、同一の質量を持つ１６個の異なるＰＮＡ配列を含む。このレポーターシグナルは（検出のために）コーディングタグから簡単に解離することができる。というのも、これらはコーディングタグと非共有的に会合しているだけだからである。
【１１８０】
実施例
いくつかの開示されたレポーターシグナルの重要な特性は、レポーターシグナルのすべてが共通する特性を有し（この共通する特性に基づいて「がらくた」からレポーターシグナルを分離することが可能となる）、そしてその後にレポーターシグナルが改変されてレポーターシグナルのセットの個々の一員の検出が可能となるというセットにおいてそれらを使用することにある。タンデム質量分析装置を利用してレポーターシグナルの操作と分析とを実証するために、特定の配列及び特定の組成物によって多数のペプチドを合成した。この例のために、質量は共通しているが配列が異なるレポーターシグナルのセットを使用した。このレポーターシグナルを断片化して配列の部分を除去し、レポーターシグナル断片を検出した。開裂しやすい−ＤＰ−結合を持つレポーターシグナルの使用を実証した。
【１１８１】
複雑な混合物から複数タンパク質を定量することは、プロテオミクスの領域では十分に実施されてこなかった。イオントラップにて、Ｃ−末端アルギニンを含む一価の荷電ペプチドがアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基のＣ−末端の位置で優先的に断片化し、プロリンを含むペプチドがプロリン残基のＮ−末端の位置で断片化する（クイン及びチャイト、マトリックス支援レーザー脱離イオン化イオントラップ質量分析装置での一価の荷電ペプチドイオンの衝突誘起解離、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．（オランダ）、１９０−１９１： ３１３−２０ （１９９９））。アスパラギン酸とプロリンとの間にある開裂しやすい結合の位置での衝突による断片化を試験するために、ＤＰアミノ酸配列を利用するペプチドレポーターシグナルのセットの例を設計する際に、これらの方式を使用した。
【１１８２】
マイクロマス社のＱ−ＴＯＦ装置（マイクロマス社、ベバリー、マサチューセッツ州）をこの実施例にて使用した。レイニンシンフォニー（Ｒａｉｎｉｎ Ｓｙｍｐｈｏｎｙ）上でのＦｍｏｃアミノ酸合成によって、この実施例についてのペプチドを合成した。反応スケールは２５μｍｏｌであった。粗合成産物をこの実施例で使用した。開示された方法は汚れたサンプルや複雑な混合物を許容すべきである。
【１１８３】
Ａ．最初のペプチド
アミノ酸配列が改変されている及び／又は特定のアミノ酸の同位体が組み込まれている八つのペプチドを合成した。これらはレポーターシグナルであった。レポーターシグナルにおける重い同位体の分布を異なるものとすることにより（重い同位体方式）質量の分布が異なることを実証するために、修飾されたアミノ酸を用い、そしてレポーターシグナル中の個々のアミノ酸の分布を種々のものとすることにより（可変配列方式）質量の分布が異なることを実証するために、種々のレポーターシグナル配列を用いた。重い安定同位体を含む、修飾によって保護されるアミノ酸をケンブリッジアイソトープ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｉｓｏｔｏｐｅｓ）社から入手した。本明細書で用いられるこの二つのアミノ酸は３−１３Ｃ−アラニンと２−１３Ｃ−グリシンであり、これらはそれらの天然のアミノ酸よりもそれぞれ１ダルトン重い。Ｆｍｏｃで保護されたリン酸化セリンを用いて、さらに重い同位体方式を実証し、加えて側鎖が修飾されたアミノ酸を使用することを実証した。表４に示す通り、Ｎ末端とＣ末端上の遊離のＮＨ２と遊離のＣＯＯＨをそれぞれ用いてこれらのペプチドを合成した。
【１１８４】
【表７】
2004506900.tif 000008
【１１８５】
ペプチド及び主な荷電断片は、配列番号：２及び配列番号：２の６〜１１位のアミノ酸のＬＡＴ３８３８、ＬＡＴ３８３９、ＬＡＴ３８４０、ＬＡＴ３８４１及びＬＡＴ３８４２；配列番号：４及び配列番号：４の７〜１１位のアミノ酸のＬＡＴ３８４３；配列番号：７及び配列番号：７の５〜１１位のアミノ酸のＬＡＴ３８４４；配列番号：８及び配列番号：８の３〜１１位のアミノ酸のＬＡＴ３８４５並びに配列番号：２７及び配列番号：２７の１０〜１１位のアミノ酸のＬＡＴ３８４６である。表４において、アスタリスクは、グリシン及びアラニンのケースにおける非放射性の重い同位体アミノ酸を、セリンのケースにおけるホスホセリンを示す。ＬＡＴ３８３９については、断片はコントロールとは識別可能であり、親イオンは識別可能である。ＬＡＴ３８４５及びＬＡＴ３８４６はペプチド効果の末端を示す。
【１１８６】
Ｂ．二番目のペプチド
最初のペプチドによる結果に基づいて（レポーターシグナルとして機能する）六つのペプチドを合成して追加し、配列の逆転、（硫黄架橋による共有結合を促進する）末端システインの付加及び（紫外線による定量を可能とするための）チロシンの付加といった更なる効果を実証した。これらのレポーターシグナルを表５に示す。ＫＥＲ４０８６−ＫＥＲ４０９０のセットはトリプトファンを含み、その結果紫外線の吸収を利用する定量が可能となる。ペプチド及び主な荷電断片は、配列番号：２８及び配列番号：２８の８〜１４位のアミノ酸のＫＥＲ４０８６；配列番号：２９及び配列番号：２９の９〜１４位のアミノ酸のＫＥＲ４０７６；配列番号：３０及び配列番号：３０の１０〜１４位のアミノ酸のＫＥＲ４０８８；配列番号：３１及び配列番号：３１の１１〜１４位のアミノ酸のＫＥＲ４０８９；配列番号：３２及び配列番号：３２の１２〜１４位のアミノ酸のＫＥＲ４０９０並びに配列番号：３３及び配列番号：３３の１〜６位のアミノ酸のＫＥＲ４１２０である。
【１１８７】
【表８】
2004506900.tif 000009
【１１８８】
Ｃ．分析装置
開示された方法についての好ましい方式は質量分析法を利用することである。質量分析装置は主に三つのカテゴリーのエレメント、すなわち源、フィルター／イオンガイド／アナライザー及びディテクターから成る。生物学的な応用のために一般に用いられている源には、マトリックス支援レーザー脱離イオン化、ＭＡＬＤＩとエレクトロスプレーイオン化、ＥＳＩが含まれる。最新の分析装置上のディテクターは、一般的にいくつかの他のディテクターを具備することが可能なマイクロチャンネルプレート、ＭＣＰである。源とディテクターとの間には、任意の数のフィルター、イオンガイド、衝突セル、レーザー励起部、質量アナライザーなどがある。
【１１８９】
本実施例で用いられる装置の部類はタンデム質量分析装置と称されるものである。これらの実験で用いられるこの特定の装置の概略を図１に示す。ＥＳＩ源よりもＭＡＬＤＩ源を有する分析装置が好ましい（ＭＡＬＤＩは一価の荷電イオンを生じさせる傾向があり、ＥＳＩは多価の荷電イオンを生じさせる傾向がある）。本明細書で用いられる分析装置のＥＳＩ源は、開示された方法のより説得力のある証明を与えることに役立つ。
【１１９０】
Ｄ．結果
１．ＤＰ配列、一つの成分
開裂しやすい結合が開裂することをこの装置で実証するために、単一のペプチド（ＬＡＴ３８３８）を用いて最初の分析を実施した。開裂しやすい結合の開裂を実証するために、概算で１ｍｇ／ｍＬの単一ペプチド（５０％アセトニトリル／５０％水／０．２％ギ酸中に溶解したＬＡＴ３８３８）の溶液を質量分析装置にセットした。
【１１９１】
配列はＡＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ（配列番号：２）であり、ただ一つの娘ＰＡＧＳＬＲ＋（配列番号：２の６〜１１位のアミノ酸）に断片化することが予想された。ＡＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ（配列番号：２）の複雑なＥＳＩ−ＴＯＦスペクトルを図３に示す。ＥＳＩ源からのすべてのペプチド（完全なペプチドとあらゆる断片）が最初の分解四重極、衝突セルを通過し、そしてＴＯＦ内に至った場合、このスペクトルが生じた。娘のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトルを図４に示す。このスペクトルを得るために、分解四重極を質量フィルターとして動作させて親ペプチドを選択し、それにより親ペプチドが衝突セル内に入れるようにし、それに対して他のペプチドが衝突セルに入ることはできなかった。いったん衝突セル内に入れば、予想どおり、開裂しやすいＤＰ結合の位置で断片化が生じた。
【１１９２】
２．ＤＰ配列、多重化されたもの
ペプチドのセットのＬＡＴ３８３８及びＬＡＴ３８４３−３８４６は、レポーターシグナルの同重体セットを含む。すなわち、このセットの中のすべてのレポーターシグナルは同一の質量電荷比を有する。このセットをほぼ等しい濃度で一緒に混合した。７ｍｇのそれぞれのペプチドを、０．７ｍＬの５０％アセトニトリル／５０％水／０．２％ギ酸中に溶解した。ストックサンプルを希釈したものを用意し、それぞれのペプチドの終濃度が０．１μｇ／ｍＬの溶液を質量分析装置内にセットし、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析に付した。図３に示す親スペクトルは、すべての五つのレポーターシグナルがほぼ等量であることを示している図５に示す娘イオンスペクトルと比較できる程度であった。
【１１９３】
３．重い同位体
ｉ．リン酸化セリンからのリン酸の喪失
リン酸の喪失がこのシステムにおいて共通していることが、スペクトルから明確に示される。このことにより、サンプリングを多くすると、レポーターシグナルあたり二点のデータが生じることが提供された。リン酸化セリンからのリン酸の喪失を示す典型的な例を図６に示す。
【１１９４】
ｉｉ．安定同位体アミノ酸
安定同位体が組み込まれたレポーターシグナルは、アミノ酸の天然型とは１ダルトンだけ異なる。結果として、自然に発生する重い同位体のピークと設計されたレポーターシグナルからのピークは同一の質量電荷である。開示された方法に関しては、質量電荷比はある範囲をとることが好ましい。得られたトレースを簡単な方法で分析した（表６を参照すること）。表６及び図７から、「複雑なピーク」は三つの種に対応し、そして五つの測定値があるは明らかであり、−それぞれの断片についてのこの連立方程式を解くことができる。加えて、ｍ／ｚ＝５８２近傍のピーク及びｍ／ｚ＝６８０近傍のピークはほとんどリン酸化されていない断片及び断片にそれぞれ対応する。この情報は不必要であり（リン酸の消失は無作為の偶発的事象であるとみなす）、そして定量法の信頼性を高めるために用いてもよい。
【１１９５】
【表９】
2004506900.tif 000010
【１１９６】
表６において、観察されたｍ／ｚは図７に対応する。命名法（業界標準ではない）：ペプチド識別番号Ｍは自然発生的な重い同位体を含んでいない断片であり、ペプチド識別番号Ｍ＋１は、断片中の一単位だけ重い同位体の発生における自然発生的な一質量によるピークであり、ペプチド識別番号Ｍ＋２は、自然発生的な二倍の質量単位だけ重い同位体に加えて、自然発生的な二つの一質量だけ重い同位体の例によるピークである。ここではＭ＋２までのみの効果を考慮するが、この方法は拡張性がある。
【１１９７】
４．二番目のペプチド
ペプチド（レポーターシグナル）の二番目のセットを表５に示し、そして特定の側面はこれらの次の区分中に対応している。このデータは、開示された方法において、ペプチドの二番目のセット中のトリプトファン、システイン及び追加のグリシンが十分に機能していることを示す。
【１１９８】
ｉ．配列の効果
レポーターシグナルと特異的結合分子との硫黄架橋による共有結合を利用することができる。この化学作用を促進するために、末端残基としてシステインを持つことが有利である。さらに、ペプチド合成はＮ末端からＣ末端に進むため、システインがペプチドの最後である場合、（オリゴヌクレオチド合成の際、固定されたオリゴヌクレオチドを精製するために最後のアミンリンカーが機能することと比較すると）ペプチドが特異的結合分子に共有結合で結合したときの精製エレメントとして機能することができる。
【１１９９】
Ｃ−末端システインの効果を実証するために、ペプチドＫＥＲ４０８７（ＣＧＷＡＧＳＬＤＰＡＧＳＬＲ；配列番号：２９）の正確な逆配列であるペプチドＫＥＲ４１２０（ＲＬＳＧＡＤＰＬＳＧＡＷＧＣ；配列番号：３３）を合成した。ＫＥＲ４１２０の断片化パターンはＫＥＲ４０８７の断片化パターンと類似していた。このことは、Ｎ−末端にアルギニンを有するペプチドを合成した結果、類似の断片化パターンを伴うペプチドが生じるという結論と一致する。
【１２００】
５．複雑な混合物
開示された方法の能力を複雑な混合物の測定例で明確に実証する。適度に複雑な混合物を生じさせるために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（６６ｋＤａ）及びクレアチンホスホキナーゼ（８４ｋＤａ）を、トリプシンを用いて消化した。五つのペプチド（ＫＥＲ４０８６〜ＫＥＲ４０９０）を消化混合物に（それぞれのペプチドの終濃度を０．１μｇ／ｍＬに）添加した。この複雑な混合物について得られた質量スペクトルを図８に示す。以上のように、この混合物はかなり複雑であり、広範囲の質量電荷比のピークを示す。共通する質量電荷比の選択の後のこのスペクトルを図９に示す。以上のように、フィルタリング（選択）段階により、複雑さが劇的に（本質的には完全に）減少する。選択された質量電荷断片の断片化の直後のスペクトルを図１０に示す。以上のように、それぞれの予想される五つのレポーターシグナル断片（特徴的な質量電荷比を有する、について、すべてが（それぞれのレポーターシグナルの出発成分に等しい量に基づいて予想される）ほぼ同一のレベルの明確なピーク現れる。図８〜図１０により、複雑な混合物から特定の標識の相対濃度の識別と測定までの経過についての説得力のある説明が与えられる。
【１２０１】
本明細書で用いられるように、そして添付された請求の範囲において、文脈上明らかに他のものを示していない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、複数のものへの言及を含むことについて留意する必要がある。それゆえに、例えば、「宿主細胞（ａ　ｈｏｓｔ　ｃｅｌｌ）」への言及は複数のそのような宿主細胞を含み、「抗体（ｔｈｅ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）」への言及は、一つ以上の抗体及び当業者が知っているそれらの均等物への言及であり、その他も同様である。
【１２０２】
組成物そのものと同じく、開示された組成物の調製のために用いられる成分、並びに本明細書で開示される方法の範囲内に用いられる成分が開示される。これら及び他の材料が本明細書で開示され、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示され、その一方でこれらの化合物の種々の個別的及び集合的順列のそれぞれの特定のものの言及が明白に開示されていないかもしれない場合でも、それぞれが特に考慮されて本明細書で開示されていると理解される。例えば、開示された方法のいくつかの方式及び態様と関連して、特定のタイプのレポーターシグナルが開示され議論されている場合であって、それと反対のものが特に示されていない場合は、レポーターシグナルのそれぞれの組み合わせ及び順列、並びに開示された方法の種々の起こり得る形態及び態様が特に考慮されている。それゆえに、分子Ａ、分子Ｂ及び分子Ｃのクラスが開示され、並びに分子Ｄ、分子Ｅ及び分子Ｆのクラス及び分子Ａ−Ｄの組み合わせの一例も開示されている場合、次いで、たとえそれぞれが個別に列挙されていなくても、それぞれは個別的にかつ集団的に考慮され、意味のある組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ及びＣ−Ｆは開示されたものとみなす。同様に、これらのあらゆるサブセット又は組み合わせも開示される。それゆえに、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ及びＣ−Ｅのサブグループは開示されたものとみなす。この考え方を、開示された組成物を作る方法及び使用する方法の工程を含む本出願のすべての側面に適用するが、これらに限定されるものでない。それゆえに、実施することのできる種々の追加的工程がある場合、開示された方法のあらゆる特定の態様又は態様の組み合わせと共に、これら追加的工程のそれぞれを実施することができると理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは質量電荷比（ｍ／ｚ）対シグナル強度のグラフである。図１Ａは、レポーターシグナルは断片化していないという結果を示す。単一のピークは親イオンを意味する。図１Ｂは、レポーターシグナルが断片化しているという結果を示す。二つの断片化イオンと共に、親イオンが検出されている。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは質量電荷比（ｍ／ｚ）対検出カウントのグラフである。図２Ａは、レポーターシグナルＡ及びＢには断片化が生じていないという結果を示す。図２Ｂは、すべてのレポーターシグナルが断片化しているという結果を示す（ＡはＡ１及びＡ２に断片化し、ＢはＢ１及びＢ２に断片化する）。
【図３】図３は、レポーターシグナルペプチドの一例（このケースではＬＡＴ３８３８）のＥＳＩ−ＴＯＦ質量スペクトルの一例である。スペクトルの複雑さの多くは、源でのレポーターシグナルペプチドの断片化による。
【図４】図４は、断片化の直後に選択されたレポーターシグナルペプチド（このケースではＬＡＴ３８３８）のスペクトルの一例である。フィルターの設定がｍ／ｚ＝１０４４で親のレポーターシグナルが選択され、約２０ｅＶの衝突エネルギーでアルゴンガスを衝突させることによって断片化されることにより改変された。ｍ／ｚ＝６００での娘レポーターシグナルペプチド断片は、予想されたＰＡＧＳＬＲ＋断片（配列番号：２の６〜１１位のアミノ酸）に対応する。
【図５】図５は、（ＬＡＴ３８３８及びＬＡＴ３８４３からＬＡＴ３８５６までの）五つのレポーターシグナルペプチドの断片化産物のスペクトルの一例である。レポーターシグナルペプチド断片に対応するピークはそれぞれ標識化されている。
【図６】図６は、レポーターシグナルペプチド断片からのリン酸基の喪失の影響を示すスペクトルの一例である。
【図７】図７は、レポーターシグナルペプチドにおいて安定同位体を使用したことに基づくレポーターシグナルペプチド断片の差異を示すスペクトルの一例である。
【図８】図８は、五つのレポーターシグナルペプチド（ｍ／ｚ＝１３８９．６）を含む分子の複雑な混合物のスペクトルの一例である。
【図９】図９Ａ及び図９Ｂは、質量電荷比（ｍ／ｚは約１３９０）に基づいて選択した直後のレポーターシグナルペプチドのセットのスペクトルの一例であり、１３９０近辺のｍ／ｚ以外のいずれの場所においても、バックグラウンドがほとんど存在しないことが示されている。これは、図８の複雑なスペクトルが得られた（選択前の）サンプルと同一のサンプルである。図９Ｂはピークの拡大図である。フィルターの限定された分解能によって三つのピークが通過できたため、このサンプルの選択は完全ではなかった。
【図１０】図１０は、図９の選択されたレポーターシグナルペプチドの（もともとは図８の複雑なサンプル中の）断片化産物のスペクトルの一例である。それぞれの五つのレポーターシグナルペプチドのレポーターシグナルペプチド断片の予想されたｍ／ｚの位置に、ほぼ同じ大きさの五つの目立ったピークが見られる。断片化しなかったレポーターシグナルペプチドは、最も右側のピーク（１３９０近傍のｍ／ｚ）にとどまっている。
【図１】
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【図２】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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