(57)【要約】本発明は概して、挫瘡、特に全体または一部が、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓまたは関連の生物体によって生じる挫瘡の形態の治療および診断に関する。本発明はより詳細には、挫瘡の予防、処置および／または診断のための、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓのポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および他の組成物に関する。１つの局面において、本発明は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓのタンパク質、またはそのフラグメントもしくは改変体の少なくとも一部を含むポリペプチドを提供する。特定の部分および他の改変体は免疫原性であり、この結果、この改変体が抗原特異的抗血清と反応する能力は実質的には低下しない。
2004520803.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下：
（ａ）配列番号１〜２９９に提供される配列；
（ｂ）配列番号１〜２９９に提供される配列の相補体；
（ｃ）配列番号１〜２９９に提供される配列の少なくともＸ個の連続残基からなるＰ．ａｃｎｅｓタンパク質をコードする配列であって、ここで、Ｘは、２０、３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００および５００からなる群から選択される、配列；
（ｄ）ハイストリンジェントな条件下で、配列番号１〜２９９に提供される、配列にハイブリダイズする配列；
（ｅ）デフォルトパラメーターに対して設定されたコンピュータアルゴリズムＢＬＡＳＴセットを使用して決定された、配列番号１〜２９９の配列に対して少なくともＹ％同一性を有する、配列であって、Ｙが、７５、８０、８５、９０、９５および９９からなる群から選択される、配列；および
（ｆ）配列番号１〜２９９に提供される配列の縮重改変体、
からなる群から選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下：
（ａ）請求項１のポリヌクレオチドによってコードされる配列；および
（ｂ）デフォルトパラメーターに対して設定されたコンピュータアルゴリズムＢＬＡＳＴセットを使用して決定された場合、請求項１に記載されるポリヌクレオチドによってコードされる配列と少なくともＹ％同一性を有する配列であって、Ｙが、７５、８０、８５、９０、９５および９９からなる群から選択される、配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）Ｐ．ａｃｎｅｓトランスフェラーゼ−関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：９２７、１０５１、２０８４、２５２５、２７６７、２８９１、３２５５、３４４３、４２８７、５４９５、５７５１、６１３３、６１８６、１０６７４、１２１１３、１２３１６、１２３３４、１２３４７、１２６１０、１２８６８、１４２３４、１４３０７、１４７６９、１６００１、１６４０３、１７８６９、１８６９０、２０１０８、２０７８３、２１２５８、２２９４８、２４３２６、２４７８７、２５８０３、２６３３３、２７０１２、２７０１９、２７１３８、２７１４１、２７３０７、２８９２５、２９０８５および２９２０４からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｂ）Ｐ．ａｃｎｅｓエンテロトキシン関連ポリペプチドであって、該ペプチドは、配列番号２３４１９からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｃ）Ｐ．ａｃｎｅｓリポタンパク質関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：６７４０、１２２７１、１５１３８、１６０７３、１９３９９、１９４４７、２１７１１、２４６２２、２６１６１および２８１２３からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｄ）Ｐ．ａｃｎｅｓ膜関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：１４６９、１９０９、２４８２、２６７６、２９０５、３０８１、３１５１、３７７３、４１１４、４７２５、５８６４、６５１５、７３８０、７４２５、７５７６、７７１０、８０４２、８３２４、８３７０、９１００、９７８２、１０６５８、１３１２２、１３８９７、１５８９０、１６３３７、１６７１３、１７０９３、１７６３１、１９０２１、１９０８５、１９１０８、１９１５４、１９４０７、２０１３２、２０２０７、２０３８２、２０３９５、２０５１２、２１０７４、２２７７１、２３８０９、２４３５５、２４７７０、２４８００、２４８２６、２６５０４、２６７９８、２７０７９、２７４７０、２７４７５および２９１３２からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｅ）Ｐ．ａｃｎｅｓパーミアーゼ関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：９３８３、９４３０、１１５６４、１２０５２、１２１１０、１２２６１、１４４８４、１４８２０、１５４７６、２１１５４、２１１８０、２１９８３、２２０１９、２２４５６、２４３００、２６７８４および２７７６９からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｆ）Ｐ．ａｃｎｅｓプロテアーゼ／プロテイナーゼ関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：１０００３、１０１０７、１０１９７、１７４０３、１８４３６、２１３６８、１５８５、２９０９、３０７１、８７６８、１０７８９、１１０３２、１１０３３および１２７８５からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｇ）Ｐ．ａｃｎｅｓタンパク質Ａ関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：２３８２０からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｈ）Ｐ．ａｃｎｅｓ分泌ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：３６０９、４１１８、６１２４、８００３、１０２７３、１１８１６、１４３５１、１４５１４、１６１４２、１７６２９、２１１５５、２２９９６、２３４１８および２４１８５からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｉ）Ｐ．ａｃｎｅｓジスムターゼ関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：３６０８からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；；
（ｊ）Ｐ．ａｃｎｅｓ付着因子関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：１７２３７からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｋ）Ｐ．ａｃｎｅｓ輸送体関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：３９７９、４１５７、４６８６、５３２９、６５８９、６７０９、６８９６、７０２８、７５６４、８１２５、８１２６、８１７０、８５４１、９００４、９３８３、９４３０、１１５６４、１１５６５、１１６２４、１１６８２、１２３４６、１２４２９、１２５６３、１２７１８、１４１０３、１４４８４、１４７４２、１５８８４、１６２７９、１６３２７、１７３０６、１７３０７、１８１３４、１８１７７、１８２４５、１９１５７、１９１９１、１９３５９、１９５６６、１９５８１、２０３１１、２０４７９、２０９２３、２０９２６、２１１５３、２１１７２、２２８１９、２３８８０、２３８９１、２５７２０、２６０２１、２６０２５、２６２８１、２６４９０、２６７００、２６７８４、２６９７７、２７５２３、２８１１６、２８２５０および２８３８５からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｌ）Ｐ．ａｃｎｅｓヘモリシン関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：７０１７からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｍ）Ｐ．ａｃｎｅｓペニシリン結合関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：１０６５７、１６５９５および２５２６７からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｎ）Ｐ．ａｃｎｅｓシアリダーゼ関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：６７１０、１６３８０、２６５０３および２７２１２からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｏ）Ｐ．ａｃｎｅｓヘモジデリン貪食細胞関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：６８８７からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；；
（ｐ）Ｐ．ａｃｎｅｓリパーゼ関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：１３４０２からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｑ）Ｐ．ａｃｎｅｓ腸内バクトリンレセプター関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：５３３４および１１０７５からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；
（ｒ）Ｐ．ａｃｎｅｓコヘモリシン関連ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、以下の配列番号：１５１２７、２５５４０、６７０６、２３０７６、８７５１および２７５３３からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む、ポリペプチド；ならびに
（ｓ）上記（ａ）〜（ｒ）に記載されるＰ．ｃａｎｅ配列と少なくともＹ％の同一性を有する配列であって、ここで、Ｙは、７５、８０、８５、９０、９５および９９からなる群から選択される、配列、
からなる群から選択される、ペプチド。
【請求項４】
以下の配列番号２５１３１、２５１３３、２５１３５、２５１６３、２５１６４、２５１６５、２５１６６、２５１６７、２５１６８、２５１６９、２５１９２、２５１９３、２５２１５、２５２１６、２５２１７、２５２１８、７７２９、２５９５７、６８８４、７６５３、７６６８、２０９６６、２０９８４、２１００２、９０５、９０６、１００８、５５４１、２５９５７、５５２７、５５４１、２５０８６、２５０８８、２５０８９、２５０９０、２５１０３、２５１３０、２５１３１、２５１３３、２５１３５、２５１６３、２５１６４、２５１６５、２５１６６、２５１６７、２５１６８、２５１６９、２５１９２、２５１９３、２５２１５、２５２１６、２５２１７、２５２１８、２５９２２、２５９３８、２５９５７、５５２７、５５４１、２５０８８、２５０８９、２５０９０、２５１０３、２５１３１、２５１３３、２５１３５、２５１６３、２５１６４、２５１６５、２５１６６、２５１６７、２５２１５、２５２１６、２５２１７、２５０８９、２５１０３、２５１３５、２５１６４、２５１６５、２５１６６、２５２１６、６６９５、５５２７、５５４１からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む単離されたポリペプチド、または上記のＰ．ａｃｎｅｓ配列と少なくともＹ％の同一性を有するポリペプチドであって、ここで、Ｙは、７５、８０、８５、９０、９５および９９からなる群から選択される、ポリペプチド。
【請求項５】
以下の配列番号１５１２７、２５５４０、６７０６、２３０７６、８７５１、２７５３３からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む単離されたポリペプチド、または上記のＰ．ａｃｎｅｓ配列と少なくともＹ％の同一性を有するポリペプチドであって、ここで、Ｙは、７５、８０、８５、９０、９５および９９からなる群から選択される、ポリペプチド。
【請求項６】
以下の配列番号２００３６、１９８７２、６３７３、８７６９、５９９１、１９２９９、５０１１、１２３１７、１１０６２、４９５８、６９２３、１１９８９、２４３６９、２１４９１、７８８７、１０４４７、３０７０、７８７８、２５１０３、６８６８、９１２１（２個の一致）、２４４７４、１２０２９、２０９５５、１６５５５、１５２３７、２０９７３、２０４７５、１５２５９、６４２７、４９６７、２０１００、１０１４１、１５６５７、３６０８、１６６０８、２１７１０、２５３８０、４８５３、２５９５７、９０７１、３６５９、１３５１２、３６９７、７３８４、２４７２２、１０６７４、１２８２、１２０９、６５０１、３６９１、１２３４７、２１７６２、１５１９７、１１６５、２３０９１、６４２８、５４２９、２４７５８、３５９０、３７２３、９１０６、１２２１７、７２７０、２９１３、１１８７、１５８５、１６５３７、２４６７９、２６３９７、２６６９１、７３９７、６６９５、６８９２、１９９２６、４７５４、２６６９２、１５６７０、３６５２、２０５１０、３４４９、２００７０、１９２４５、２０１０８、１９４２７、１０５６４、１０６７８、２１１７２、２１７８０、３３３４、６３３８、５３７９、１１５８０、１５６９３、９９９４、２４９７３、２０６８４、７８６５、１６５７３、１１８６４、１２３２４、２０４３９、１２３０、１４２７８、３４１２、１２３１７、５９９１、６９２３、１０７４１、５３７３、１９２９９、３８３、１２８４、１２２２８、２６４０２、４６７３、７８８７、９００４、３８４、２５１０３、６３７３、１２０２９、２００３６、１６５５５、１７５２１、２０４７６、１５２３７、２４５８１、３６５９、１４０３１、９０７１、４９５８、１５２５９、１２９０４、５４４０、２３５６０、３６９７、３６０８、２５９５７、７３８４、２４７２２、１５８６３、８１３５、２０５８５、３６９１、１２２１７、１６４３９、１６４５、５５１４、２１７１０、２４８９５、４８５３、２３４２０、５４３７、１２７８、１６９９２、１２１２６、２０９３４、２０４７５、１７９７０、２０９５５、３０７０、６５６４、９０６９、１２６６６、７８６４、１８６９２、２４５３、１２０９、２０９７３、７４１９、１５１９７、２３５９１、２０１００、２３０６５、６３３７、１０９８９、１５８５、１７８４１、６８６８からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントからなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む単離されたポリペプチド、または上記のＰ．ａｃｎｅｓ配列と少なくともＹ％の同一性を有するポリペプチドであって、ここで、Ｙは、７５、８０、８５、９０、９５および９９からなる群から選択される、ポリペプチド。
【請求項７】
発現制御配列に作動可能に連結された配列番号１のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項８】
配列番号７に記載の発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項９】
請求項２〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体、またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
患者のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該患者由来の生物学的サンプルを得る、工程；
（ｂ）請求項２〜６のいずれか１項のポリペプチドに結合する結合剤と該生物学的サンプルを接触させる、工程；
（ｃ）該サンプルにおいて、該結合剤に結合するポリペプチドの量を検出する、工程；および
（ｄ）予め決定されたカットオフ値とポリペプチドの量を比較し、それにより、該患者のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１１】
請求項２〜６のいずれか１項に記載の少なくとも１種のポリペプチドを含む、融合タンパク質。
【請求項１２】
ハイストリンジェンシー条件下で、配列番号１〜２９９に記載の配列に対してハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質に対して特異的である免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項２〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；および
（ｃ）Ｔ細胞および／またはＢ細胞の刺激および／または発現を可能にするのに十分な条件および時間で、請求項２〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する、抗原提示細胞、
からなる群から選択される少なくとも１成分とＴ細胞および／またはＢ細胞を接触させる工程、を包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載される方法に従って調製されたＴ細胞を含む、単離されたＴ細胞集団。
【請求項１５】
第１成分および第２成分を含む組成物であって、該第１成分は、生理学的に受容可能なキャリアおよび免疫賦活薬からなる群から選択され、そして該第２成分は、以下：
（ａ）請求項２〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド；
（ｂ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項９に記載の抗体；
（ｄ）請求項１１に記載の融合タンパク質；
（ｅ）請求項１４に記載のＴ細胞集団；および
（ｆ）請求項２〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、からなる群から選択される、
組成物。
【請求項１６】
患者の免疫応答を刺激するための方法であって、該方法は、請求項１５に記載の組成物を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１７】
患者の挫瘡を処置するための方法であって、該方法は、請求項１５の組成物を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
患者のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの存在または非存在を決定するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）該患者由来の生物学的サンプルを得る、工程；
（ｂ）請求項１２に従って、オリゴヌクレオチドと該生物学的サンプルとを接触させる、工程；
（ｃ）該サンプルにおいて、該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を検出する、工程；および
（ｄ）該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を予め決定されたカットオフ値と比較し、それにより、該患者のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの存在または非存在を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１２に記載の少なくとも１種のオリゴヌクレオチドを含む、診断キット。
【請求項２０】
請求項９に従う少なくとも１種の抗体および検出剤を含む診断キットであって、ここで、該検出剤は、レポーター基を含む、診断キット。
【請求項２１】
患者のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの発生を阻害するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）以下：
（ｉ）請求項２〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド；
（ｉｉ）請求項１に記載のポリヌクレオチド；および
（ｉｉｉ）請求項２〜６のいずれか１項に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、
からなる群から選択される少なくとも１種の成分と共に、患者から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞をＴ細胞が増殖するようにインキュベートする工程；
（ｂ）有効量の該増殖されたＴ細胞を該患者に投与して、これにより、患者のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの発生を阻害する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は概して、挫瘡、特に全体または一部が、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓまたは関連の生物体によって生じる挫瘡の形態の治療および診断に関する。本発明はより詳細には、挫瘡の予防、処置および／または診断のための、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓのポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体および他の組成物に関する。
【０００２】
（本発明の背景）
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のメンバーは、成体および小児の結膜培養物由来の嫌気性フローラの優勢なメンバーである嫌気性の非芽胞形成グラム陽性桿菌の群を含む。プロピオンバクテリウム（プロピオン酸菌属）は、ＳＡＰＨＯ症候群（滑膜炎症、挫瘡、膿疱症、過緊張、および骨髄炎）、ブドウ膜炎、および眼内炎を含む多数のヒトの状態に関係している。この生物体はまた、骨、関節、および中枢神経系の感染において病原性を示した。
【０００３】
いくつかの系等の証拠によって、皮膚障害である尋常性挫瘡に関連する炎症性病変におけるＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの特に重要な役割が支持される。尋常性挫瘡は、炎症性および非炎症性の顔料病変を生じる、毛包（毛嚢）脂腺の小胞の疾患である。ほとんどの患者では、非炎症性コメド（面ぽう）および炎症性丘疹、膿疱および小節（ｎｏｄｕｌｅ）が混在する。炎症性挫瘡の重篤度とＰ．ａｃｎｅｓ．に対する循環する抗体のレベルとの間には相関関係が観察されている。
【０００４】
その機構によって、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓが、周囲の真皮において濾胞上皮の破壊および引き続く炎症性応答を導くと現在考えられている、いくつかの機構が存在する。Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓが古典的経路および別の補完的経路の両方を刺激する能力に加えて、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓはまた、低分子量の血清依存性の好中球走化性因子（脂腺管腔内のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓに対して上皮壁を通じて好中球を誘引し得る）を生成することが報告されている。Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓに特異的な抗体の存在下における、好中球によるＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの摂食によって、濾胞壁の破壊に寄与し得る加水分解酵素の放出が生じる。脂腺上皮の好中球浸潤に伴う、リンパ球蓄積および浸潤が、炎症性挫瘡の病理における早期の事象として記載されている。
【０００５】
尋常性挫瘡、およびＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍに関連する他の状態の治療に対するかなりの研究にもかかわらず、その有効な処置に対する代替的なアプローチの必要性は残存している。従って、挫瘡の予防処置および／または治療処置のための改善方法の必要性が存在する。本発明はこれらの必要性を満たし、さらに他の関連する利点を提供する。
【０００６】
（発明の要旨）
要するに、本発明は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓおよび他の関連の生物体によって、哺乳動物において、少なくとも部分的には生じるかまたはこれに起因する、皮膚および他の障害（例えば尋常性挫瘡）の診断および治療のための組成物および方法を提供する。１つの局面において、本発明は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓのタンパク質、またはそのフラグメントもしくは改変体の少なくとも一部を含むポリペプチドを提供する。特定の部分および他の改変体は免疫原性であり、この結果、この改変体が抗原特異的抗血清と反応する能力は実質的には低下しない。特定の実施形態において、このポリペプチドは、以下：（ａ）配列番号１〜２９９に記載の配列；（ｂ）配列番号１〜２９９に記載の配列の改変体および生物学的な機能等価物；ならびに（ｃ）（ａ）または（ｂ）の配列の相補体、からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列によってコードされる配列を含む。特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、配列番号３００〜２９，２１２、ならびにそれらの改変体および誘導体からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓのタンパク質の少なくとも一部を含む。
【０００７】
さらに、本発明は、上記のようなポリペプチド、またはそれらの一部（例えば、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓのタンパク質の少なくとも１５、２５、３５、４５、５５など連続するアミノ酸残基をコードする部分）をコードするポリヌクレオチド、ならびにこのようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびこのような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【０００８】
Ｐ．ａｃｎｅｓポリペプチドは、種々の実験アプローチおよび生命情報工学アプローチによって、本明細書中において同定されている。例えば、１つの局面において、本発明は、配列番号９２７、１０５１、２０８４、２５２５、２７６７、２８９１、３２５５、３４４３、４２８７、５４９５、５７５１、６１３３、６１８６、１０６７４、１２１１３、１２３１６、１２３３４、１２３４７、１２６１０、１２８６８、１４２３４、１４３０７、１４７６９、１６００１、１６４０３、１７８６９、１８６９０、２０１０８、２０７８３、２１２５８、２２９４８、２４３２６、２４７８７、２５８０３、２６３３３、２７０１２、２７０１９、２７１３８、２７１４１、２７３０７、２８９２５、２９０８５および２９２０４からなる群より選択されるアミノ酸の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓトランスフェラーゼ関連ポリペプチドを提供する。
【０００９】
本発明はさらに、配列番号２３４１９からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓエンテロトキシンポリペプチドを提供する。
【００１０】
本発明はさらに、配列番号６７４０、１２２７１、１５１３８、１６０７３、１９３９９、１９４４７、２１７１１、２４６２２、２６１６１および２８１２３からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓリポタンパク質関連ポリペプチドを提供する。
【００１１】
本発明はさらに、配列番号１４６９、１９０９、２４８２、２６７６、２９０５、３０８１、３１５１、３７７３、４１１４、４７２５、５８６４、６５１５、７３８０、７４２５、７５７６、７７１０、８０４２、８３２４、８３７０、９１００、９７８２、１０６５８、１３１２２、１３８９７、１５８９０、１６３３７、１６７１３、１７０９３、１７６３１、１９０２１、１９０８５、１９１０８、１９１５４、１９４０７、２０１３２、２０２０７、２０３８２、２０３９５、２０５１２、２１０７４、２２７７１、２３８０９、２４３５５、２４７７０、２４８００、２４８２６、２６５０４、２６７９８、２７０７９、２７４７０、２７４７５および２９１３２からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓ膜関連ポリペプチドを提供する。
【００１２】
本発明はさらに、配列番号９３８３、９４３０、１１５６４、１２０５２、１２１１０、１２２６１、１４４８４、１４８２０、１５４７６、２１１５４、２１１８０、２１９８３、２２０１９、２２４５６、２４３００、２６７８４および２７７６９からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓ透過酵素を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、配列番号１０００３、１０１０７、１０１９７、１７４０３、１８４３６、２１３６８，１５８５、２９０９、３０７１、８７６８、１０７８９、１１０３２、１１０３３および１２７８５からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓプロテアーゼ／プロテアーゼ関連ポリペプチドを提供する。
【００１４】
本発明はさらに、配列番号２３８２０からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓプロテインＡ関連ポリペプチドを提供する。
【００１５】
本発明はさらに、配列番号３６０９、４１１８、６１２４、８００３、１０２７３、１１８１６、１４３５１、１４５１４、１６１４２、１７６２９、２１１５５、２２９９６、２３４１８および２４１８５からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓ分泌ポリペプチドを提供する。
【００１６】
本発明はさらに、配列番号３６０８からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓジスムターゼ関連ポリペプチドを提供する。
【００１７】
本発明はさらに、配列番号１７２３７からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓ付着因子関連ポリペプチドを提供する。
【００１８】
本発明はさらに、配列番号３９７９、４１５７、４６８６、５３２９、６５８９、６７０９、６８９６、７０２８、７５６４、８１２５、８１２６、８１７０、８５４１、９００４、９３８３、９４３０、１１５６４、１１５６５、１１６２４、１１６８２、１２３４６、１２４２９、１２５６３、１２７１８、１４１０３、１４４８４、１４７４２、１５８８４、１６２７９、１６３２７、１７３０６、１７３０７、１８１３４、１８１７７、１８２４５、１９１５７、１９１９１、１９３５９、１９５６６、１９５８１、２０３１１、２０４７９、２０９２３、２０９２６、２１１５３、２１１７２、２２８１９、２３８８０、２３８９１、２５７２０、２６０２１、２６０２５、２６２８１、２６４９０、２６７００、２６７８４、２６９７７、２７５２３、２８１１６、２８２５０および２８３８５からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓトランスポーター関連ポリペプチドを提供する。
【００１９】
本発明はさらに、配列番号７０１７からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓヘモリシン関連ポリペプチドを提供する。
【００２０】
本発明はさらに、配列番号１０６５７、１６５９５および２５２６７からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓペニシリン結合関連ポリペプチドを提供する。
【００２１】
本発明はさらに、配列番号６７１０、１６３８０、２６５０３および２７２１２からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓシアリダーゼ関連ポリペプチドを提供する。
【００２２】
本発明はさらに、配列番号６８８７からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓシデロホア関連ポリペプチドを提供する。
【００２３】
本発明はさらに、配列番号１３４０２からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓリパーゼ関連ポリペプチドを提供する。
【００２４】
本発明はさらに、配列番号５３３４および１１０７５からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含むＰ．ａｃｎｅｓ腸内バクトリンレセプター関連ポリペプチドを提供する。
【００２５】
本発明はさらに、配列番号１５１２７、２５５４０、６７０６、２３０７６、８７５１および２７５３３からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む単離されたコヘモリシン関連ペプチドを提供する。
【００２６】
本発明はさらに、単離されたポリペプチド（例えば、実施例６および７に記載されるような本明細書中で同定されたポリペプチド）を提供し、このポリペプチドは、配列番号２００３６、１９８７２、６３７３、８７６９、５９９１、１９２９９、５０１１、１２３１７、１１０６２、４９５８、６９２３、１１９８９、２４３６９、２１４９１、７８８７、１０４４７、３０７０、７８７８、２５１０３、６８６８、９１２１、２４４７４、１２０２９、２０９５５、１６５５５、１５２３７、２０９７３、２０４７５、１５２５９、６４２７、４９６７、２０１００、１０１４１、１５６５７、３６０８、１６６０８、２１７１０、２５３８０、４８５３、２５９５７、９０７１、３６５９、１３５１２、３６９７、７３８４、２４７２２、１０６７４、１２８２、１２０９、６５０１、３６９１、１２３４７、２１７６２、１５１９７、１１６５、２３０９１、６４２８、５４２９、２４７５８、３５９０、３７２３、９１０６、１２２１７、７２７０、２９１３、１１８７、１５８５、１６５３７、２４６７９、２６３９７、２６６９１、７３９７、６６９５、６８９２、１９９２６、４７５４、２６６９２、１５６７０、３６５２、２０５１０、３４４９、２００７０、１９２４５、２０１０８、１９４２７、１０５６４、１０６７８、２１１７２、２１７８０、３３３４、６３３８、５３７９、１１５８０、１５６９３、９９９４、２４９７３、２０６８４、７８６５、１６５７３、１１８６４、１２３２４、２０４３９、１２３０、１４２７８、３４１２、１２３１７、５９９１、６９２３、１０７４１、５３７３、１９２９９、３８３、１２８４、１２２２８、２６４０２、４６７３、７８８７、９００４、３８４、２５１０３、６３７３、１２０２９、２００３６、１６５５５、１７５２１、２０４７６、１５２３７、２４５８１、３６５９、１４０３１、９０７１、４９５８、１５２５９、１２９０４、５４４０、２３５６０、３６９７、３６０８、２５９５７、７３８４、２４７２２、１５８６３、８１３５、２０５８５、３６９１、１２２１７、１６４３９、１６４５、５５１４、２１７１０、２４８９５、４８５３、２３４２０、５４３７、１２７８、１６９９２、１２１２６、２０９３４、２０４７５、１７９７０、２０９５５、３０７０、６５６４、９０６９、１２６６６、７８６４、１８６９２、２４５３、１２０９、２０９７３、７４１９、１５１９７、２３５９１、２０１００、２３０６５、６３３７、１０９８９、１５８５、１７８４１および６８６８からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む。
【００２７】
本発明はさらに、例えば、本明細書中に記載されるように、配列番号２５１３１、２５１３３、２５１３５、２５１６３、２５１６４、２５１６５、２５１６６、２５１６７、２５１６８、２５１６９、２５１９２、２５１９３、２５２１５、２５２１６、２５２１７、２５２１８、７７２９、２５９５７、６８８４、７６５３、７６６８、２０９６６、２０９８４、２１００２、９０５、９０６、１００８、５５４１、２５９５７、５５２７、５５４１、２５０８６、２５０８８、２５０８９、２５０９０、２５１０３、２５１３０、２５１３１、２５１３３、２５１３５、２５１６３、２５１６４、２５１６５、２５１６６、２５１６７、２５１６８、２５１６９、２５１９２、２５１９３、２５２１５、２５２１６、２５２１７、２５２１８、２５９２２、２５９３８、２５９５７、５５２７、５５４１、２５０８８、２５０８９、２５０９０、２５１０３、２５１３１、２５１３３、２５１３５、２５１６３、２５１６４、２５１６５、２５１６６、２５１６７、２５２１５、２５２１６、２５２１７、２５０８９、２５１０３、２５１３５、２５１６４、２５１６５、２５１６６、２５２１６、６６９５、５５２７および５５４１からなる群より選択されるポリペプチド配列のように、血清学的発現クローニングによって同定されたＤＮＡ分子によってコードされるポリペプチドの少なくとも１つの免疫原性フラグメントを含む単離されたポリペプチドを提供する。
【００２８】
本発明はさらに、配列番号１〜２９９に示されるようなＤＮＡ配列のいずれか１つによってコードされるポリペプチド組成物を提供する。例えば、本発明は、配列番号３１８、３１９、３３７、３４０、３４８、３５１、３６４、３６５、３６６、３６９、３７３、３７４、３８２、３８３、３８４、３９８、４１８、４２７、４２８、４２９、４３１、４４３、４４４、４７０、４８６および２８６５０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００２９】
本発明はさらに、配列番号４９３、５０４、５０６、５１３、５１８、５２４、５４７、５５９、５７２、５７８、５８９、５９３、６００、６１７、６２０、６２４、６３２、６４２、６４４、６６５、６６６、６９２、７０１、７０９、７１０、７１６、７２７、７３６、７３７、７７１、７８６、７８７、７８９、７９０、７９１、７９２、８０５、８０７、８０８および８１２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００３０】
本発明はさらに、配列番号８１４、８５３、８７３、８７８、８８５、８９８、８９９、９０５、９０６、９１７、９２１、９２７、９２８、９３０、９７０、９７５、９９３、９９５、９９７、１００７、１００８、１０１２、１０２６および２８６５４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００３１】
本発明はさらに、配列番号１０４９、１０５１、１０５４、１０５６、１０８１、１１２３および２８６５７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００３２】
本発明はさらに、配列番号１１２７、１１３３、１１３７、１１３８、１１５３、１１５９、１１６１、１１６２、１１６３、１１６５、１１６７、１１６８、１１７１、１１７２、１１８１、１１８７、１１９６、１２０３、１２０９、１２１２、１２１５、１２２５、１２２９、１２３０、１２３１、１２３５、１２５１、１２５２、１２６９、１２７０、１２７４、１２７５、１２７７、１２７８、１２８２、１２８４、１２８５、１２８９、１２９０、１２９２、１２９３、１２９４、１２９５、１２９７、１３００、１３１８、１３２３、１３２４、１３３２、１３３４、１３３５、１３３８、１３３９、１３４０、１３４１、１３４３、１３５８、１３５９、１３７５、１３７６、１３７７、１３７８、１３７９、１３８３、１３８５、１３８９、１３９０、１３９１、１３９３、１３９４、１３９６、１４１１、１４１２、１４２１、１４２２、１４２５および２８６６０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００３３】
本発明はさらに、配列番号１４３４、１４３７、１４４２、１４４４、１４４５、１４４６、１４４７、１４４９、１４５２、１４６０、１４６３、１４６９、１４８３、１４８８、１４８９、１４９０、１４９１、１５０８、１５２２、１５２３、１５２４、１５３５、１５５０、１５６７、１５７５、１５８５、１５８６、１５８８、１５９５、１５９６、１５９９、１６０３、１６０７、１６０８、１６１１、１６１６、１６２４、１６２６、１６２７、１６３２、１６３５、１６３６、１６３７、１６４５、１６４６、１６５２および２８６６１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００３４】
本発明はさらに、配列番号１６７０、１６７４、１７０８、１７１４、１７１６、１７３１、１７３４、１７４４、１７５４、１７５６、１７６７、１７７６、１７７９、１７８０、１７９５、１８００、１８２７、１８３２、１８４１および１８４５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００３５】
本発明はさらに、配列番号１８７１、１８８４、１８９５、１９０６、１９０７、１９０９、１９３８、１９４１、１９５２、１９５５、１９５７、１９６８、１９７１、１９７３、１９７９、１９８０、１９９８、２００４、２００５、２０２０、２０２５、２０２８、２０３５、２０３６、２０４０、２０４４、２０８４、２０８８、２１１４、２１２７、２１３７、２１５０、２１５３、２１５８、２１６４、２１８０、２１９０、２１９２、２１９８、２２０３、２２１５、２２１８、２２２８、２２３０、２２３１、２２４０、２２４３、２２４６、２２５８、２２５９、２２６０、２２６５および２２７８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００３６】
本発明はさらに、配列番号２２８８、２２９２、２２９９、２３００、２３０３、２３０５、２３０６、２３１０、２３１１、２３１５、２３１６、２３２４、２３２６、２３２９、２３４４、２３４６、２３５７、２３７８、２３７９、２３８８、２３９８、２４０２、２４０３、２４０５、２４１０、２４１２、２４１４、２４１７、２４２０、２４２５、２４２７、２４４７、２４５３、２４５７、２４５８、２４６０、２４６１、２４６２、２４６９、２４７４、２４８２、２４８３、２４８７、２４９２、２４９４、２４９７、２５０６、２５０７および２８６６６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００３７】
本発明はさらに、配列番号２５１２、２５１８、２５２２、２５２５、２５３５、２５４４、２５４８、２５４９、２５５３、２５７６、２５７７、２５７８、２５８６、２６０４、２６１７、２６１８、２６３２、２６４８、２６５７、２６６６、２６７２、２６７６、２６８２、２６８５、２７０３、２７１３、２７２４、２７４２、２７４３、２７４５、２７４８、２７５２、２７５５、２７６０、２７６７、２７６９、２７８４、２７９０、２７９８、２７９９、２８００、２８０１、２８０２、２８１３、２８２４、２８２５、２８２６、２８２７、２８２８、２８３０、２８４５、２８５０、２８８０、２８９１、２８９４、２９０５、２９０７、２９０９、２９１３、２９２５、２９２６、２９２７、２９３７、２９４０、２９４２、２９５２、２９５６、２９７８、２９８４、２９８６、２９８７、２９８８、２９８９、２９９７、３００４、３０１３、３０１８、３０３８、３０３９、３０５１、３０６０、３０６１、３０７０、３０７１、３０７３、３０７５、３０７６、３０７９、３０８１、３０９１、３０９８、３１１２、３１１４、３１１８、３１１９、３１２１、３１２８、３１３８、３１５１、３１５５、３１６０、３１７６、３１７８、３１７９、３１８１、３１８８、３１９５、３１９７、３２０４および２８６６８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００３８】
本発明はさらに、配列番号３２１７、３２２２、３２３５、３２５５、３２６１、３２６７、３２７２、３２８７、３２８９、３２９６、３２９７、３３０１、３３０２、３３１３、３３１４、３３１５、３３１７、３３１９、３３２０、３３２７、３３３１、３３３４、３３４２、３３４９、３３６９、３３７０、３３７１、３３７３、３３７５、３３８１、３３８２、３３９０、３４０２、３４０３、３４１８、３４２２、３４２５、３４２９、３４３７、３４４１、３４４２、３４４３、３４４９、３４５１、３４５４、３４５５、３４５７、３４５８、３４７１、３４８３、３４８９、３４９９、３５２２、３５２３、３５２５、３５２８および３５３６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００３９】
本発明はさらに、配列番号３５３９、３５４４、３５４９、３５５１、３５５２、３５５５、３５５８、３５５９、３５６０、３５７２、３５８４、３５８５、３５８６、３５８７、３５８９、３５９１、３５９３、３５９４、３６０８、３６０９、３６２５、３６２６、３６２７、３６３２、３６３５、３６５２、３６５８、３６５９、３６６１、３６６６、３６８２、３６８３、３６８７、３６９０、３６９１、３６９７、３７０１、３７０８、３７２１、３７２２、３７２３、３７３１、３７３６および２８６７４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００４０】
本発明はさらに、配列番号３７５５、３７５９、３７６３、３７６４、３７６７、３７７３、３７７６、３７８３、３７９９、３８０７、３８０８、３８０９、３８１５、３８１６、３８１７、３８２１、３８２８、３８３１、３８３５、３８３７、３８３８、３８４９、３８６６、３８７５、３８８９、３９０４、３９０９、３９１６、３９１７、３９１８、３９２３、３９２５、３９４５、３９４７、３９５５、３９５６、３９６９、３９７９、３９８８、４００４、４０２３、４０２４、４０６０、４０７３、４０８０、４０９６、４１０１、４１０２、４１０３、４１１１、４１１４、４１１８、４１２２、４１３４、４１３５、４１４３、４１４９および４１５２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００４１】
本発明はさらに、配列番号４１５７、４１６９、４１７１、４１７４、４１７９、４１８８、４１８９、４１９８、４２０７、４２１１、４２１３、４２２０、４２２４、４２２７、４２４０、４２４７、４２４９、４２５８、４２６１、４２６２、４２６５、４２７４、４２７５、４２７８、４２８７、４３０６、４３０７、４３０８、４３０９、４３１０、４３１１、４３２８、４３３３、４３３６、４３３９、４３４５、４３４６、４３５０および４３５１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００４２】
本発明はさらに、配列番号４３６２、４３６５、４３７０、４３７３、４３７８、４３８０、４３８６、４３８９、４３９３、４３９４、４４０７、４４０８、４４１７、４４１８、４４２８、４４３５、４４３７、４４３８、４４３９、４４４２、４４５０、４４５４、４４５８、４４６０、４４６２、４４６６、４４７４、４４９５、４４９６、４５１０、４５１１、４５２２、４５２９、４５３１、４５３３、４５３６、４５３９、４５４５、４５５２、４５５３、４５７０、４５７７、４５８１、４５８７、４５９１、４５９４、４５９９、４６０５、４６１２、４６１６、４６１７、４６１８、４６２０、４６２２、４６３０、４６３４、４６４０、４６４３、４６４６、４６５１、４６５９、４６６６、４６７３、４６７８および２８６８０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００４３】
本発明はさらに、配列番号４６８６、４６８７、４６９４、４７２３、４７２５、４７４２、４７４５、４７４９、４７５４、４７５７、４７６３、４７６６、４７６７、４７７１、４７７２、４７８９、４７９２、４８２５、４８３２、４８３４、４８４７、４８５３、４８５７、４８６６、４８７１、４８７３、４８７５、４８７７、４８７９、４８８７、４８８８、４８９０、４８９７、４９０７、４９３８、４９４５、４９４７、４９４８、４９５０、４９５１、４９５２、４９５８、４９６６、４９６７、４９６８、４９７５、４９７７、４９７８、４９８６、４９８８、４９９６、５００１、５００６、５００８、５００９、５０１１、５０１７、５０２１、５０２２、５０２５、５０３５、５０３７、５０３８、５０４０、５０５３、５０５４、５０５６、５０５７、５０６２、５０６８、５０７９、５１１１、５１２０、５１２４、５１２５、５１３４、５１４１、５１４２、５１４３、５１４４、５１４９、５１５６、５１５７、５１６０、５１６３、５１６７、５１７９、５１８０、５１８１、５１８４、５１８５、５１８６、５１８７、５１８９、５２０１、５２１８、５２４７、５２５９、５２６９、５２７０、５２７１、５２８１、５２８２、５２８３、５２８６、５２９２、５２９３、５３０２、５３０３、５３０４、５３０６、５３１１、５３１８、５３１９、５３２０、５３２１、５３２３、５３２６、５３２８、５３２９、５３３２、５３３４、５３３８、５３４１および５３４７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００４４】
本発明はさらに、配列番号５３５４、５３５６、５３５８、５３７３、５３７９、５３８９、５３９６、５３９７、５３９９、５４１７、５４２９、５４３７、５４３８、５４４０、５４４１、５４４６、５４５２、５４６３、５４７８、５４９３、５４９５、５５０３、５５１１、５５１２、５５１４、５５１９、５５２０、５５２３、５５２７、５５４１、５５４４、５５５９、５５６８、５５７７、５５８５、５５８６、５５９３、５６０６、５６０７、５６１３、５６１４、５６３９、５６４８、５６５５、５６６２、５６６４、５６７１、５６７３、５６７５、５６７８、５７１６、５７３７、５７３８、５７４７、５７５１、５７５６、５７５８、５７５９および２８６８５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００４５】
本発明はさらに、配列番号５７７０、５７７３、５７７４、５７７６、５７８３、５７８９、５８１０、５８１１、５８２３、５８３４、５８４４、５８４７、５８５２、５８５５、５８５８、５８６０、５８６１、５８６３、５８６４、５８６５、５８６７、５８６８、５８７２、５８８４、５８８６、５８９５、５９００および２８６８７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００４６】
本発明はさらに、配列番号５９２２、５９２８、５９３２、５９７５、５９９１、５９９３、６００１、６０３２、６０３４、６０４２、６０５５、６０６１、６０８４、６０８９、６１０４、６１０８、６１０９、６１２２、６１２４、６１２９、６１３２、６１３３、６１３７、６１４０、６１５２、６１５３、６１５４、６１６４、６１７４、６１８５、６１８６、６１９８、６２０２および６２１３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００４７】
本発明はさらに、配列番号６２２５、６２４５、６２４８、６２５２、６２５９、６２６８、６２７０、６２７８、６２７９、６２８０、６２８８、６３０１、６３０２、６３０４、６３１８、６３２１、６３２２、６３２７、６３３１、６３３７、６３３８、６３４２、６３４６、６３６０、６３６１、６３６２、６３６７、６３７３、６４０４、６４１７、６４２７、６４２８、６４２９、６４３２、６４４８、６４５５、６４８２、６４８３、６４８４、６４９６、６５００、６５０１、６５０５、６５０７、６５０８、６５１１、６５１５、６５７３、６５７６、６５８０、６５８９、６５９７、６５９８、６５９９、６６０７、６６１０、６６１８、６６３９、６６４３、６６５８、６６６６、６６８４、６６９５、６６９８、６７０２、６７０６、６７０９および６７１０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００４８】
本発明はさらに、配列番号６７１１、６７１２、６７２２、６７３１、６７３２、６７４０、６７４１、６７５６、６７７３、６７８２、６７８４、６７９４、６７９５、６７９６、６８４９、６８５２、６８６８、６８７０、６８７５、６８７７、６８７９、６８８１、６８８４、６８８７、６８８９、６８９０、６８９２、６８９３、６８９４、６８９６、６９０８、６９１６、６９２３および２８６９２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００４９】
本発明はさらに、配列番号６９２７、６９２９、６９３０、６９３１、６９５５、６９５６、６９５７、６９５８、６９６１、６９６２、６９７０、６９８５、６９９６、６９９８、７０１０、７０１６、７０１７、７０１８、７０２６、７０２８、７０３５および７０３７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００５０】
本発明はさらに、配列番号７０４０、７０５４、７０６０、７０６６、７０７１、７０７５、７０８４、７０８５、７０９１、７０９２、７０９３、７１００、７１０２、７１０８、７１１２および７１１７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００５１】
本発明はさらに、配列番号７１２５、７１３０、７１３１、７１３２、７１５２、７１６３、７１６４、７１６８、７１７４、７１７６、７１７７、７１９７、７２０９、７２１０、７２１１、７２１２、７２２４、７２２５、７２５８、７２５９、７２６０、７２６１、７２７０、７２７２、７２７４、７２７７、７２８７、７２９２、７２９４、７２９７、７３０９、７３１０、７３１６、７３１８、７３３８、７３４５、７３５２、７３５６および２８６９７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００５２】
本発明はさらに、配列番号７３８０、７３８１、７３８３、７３８４、７３８６、７３８８、７３９０、７３９４、７３９７、７４０６、７４１２、７４１９、７４２１、７４２２、７４２５、７４２６、７４３８、７４４８、７４５２、７４６６、７４６８、７４６９、７４７４、７４７８、７４８２、７４８８、７４８９、７４９０、７４９１、７５０２、７５０４および２８６９８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００５３】
本発明はさらに、配列番号７５１１、７５６４、７５７６、７５７８、７６０１および２８７０１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００５４】
本発明はさらに、配列番号７６０５、７６０６、７６０７、７６２２、７６２３、７６３２、７６３５、７６３６、７６４１、７６４８、７６５３、７６６１、７６６２、７６６３、７６６８、７６７３、７６７４、７６８３および７６８９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００５５】
本発明はさらに、配列番号７６９９および７７１０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００５６】
本発明はさらに、配列番号７７２１、７７２５、７７２９、７７３１、７７３９、７７４１、７７４２、７７５２、７７６４、７７６５、７７６７、７７７２、７７８１、７７８７、７７８８、７７８９、７７９３、７７９４、７８０１、７８０３、７８０６、７８０７、７８２２、７８２８、７８２９、７８３１、７８３２、７８３９、７８４１、７８５９、７８６５、７８７８、７８７９、７８８２、７８８３、７８８７、７８８９、７８９１、７８９４、７８９５、７８９７および７８９８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００５７】
本発明はさらに、配列番号７９００、７９１４、７９１５、７９２０、７９２２、７９２５、７９２９、７９３２、７９４２、７９６７、７９６８、７９７０、７９８１、７９９０、７９９１、７９９６、８００３、８０１４、８０１５、８０２３、８０２４、８０３６、８０３７、８０３９、８０４０、８０４１、８０４２、８０４７、８０５５、８０６６、８０６７、８０７５、８１０４、８１０８、８１１８、８１２０、８１２１、８１２２、８１２５、８１２６、８１２７、８１５３、８１６３および８１７０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号３０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００５８】
本発明はさらに、配列番号８１８８、８２０８、８２１４、８２１５、８２１８、８２２９、８２３９、８２４２、８２４４、８２４６、８２４９、８２５３、８２６３、８２７９、８２８０、８２８２、８２８９、８２９０、８２９２、８２９８および８３０２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号３１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００５９】
本発明はさらに、配列番号８３１２、８３１８、８３２１、８３２２、８３２３、８３２４、８３２６、８３２９、８３３３、８３３６、８３４０、８３４３、８３４４、８３７０、８３７１、８４０１、８４０２、８４０６、８４１１、８４１７、８４２４、８４２５、８４２９、８４３４および８４３５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号３２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００６０】
本発明はさらに、配列番号８４４８、８４６０、８４６１、８４８８、８５０７、８５０９、８５２７、８５４１、８５４６、８５５６、８５６７、８５７５、８５８９、８６０５、８６２７、８６２８、８６４７および８６５８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号３３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００６１】
本発明はさらに、配列番号８６８５、８６８６、８７０５、８７３１、８７３６、８７４５、８７４７、８７４８、８７４９、８７５１、８７５７、８７６４、８７６８、８７８０、８７８２、８７８３、８７８７、８７９３、８７９４、８７９５、８７９６、８８０５、８８０６、８８１３、８８１８、８８２０、８８２８、８８６１、８８７６、８８７７、８８７８、８８７９、８８８０、８８８３、８８９０、８９０８、８９１２、８９３３、８９３８、８９４９、８９６８、８９６９、８９７６、８９９３、８９９４、８９９５、８９９６および９００４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号３４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００６２】
本発明はさらに、配列番号９０１７、９０１８、９０１９、９０２０、９０２１、９０２２、９０２３、９０２４、９０２５、９０２６、９０２７、９０２８、９０２９、９０３０、９０３１、９０３２、９０３３、９０３４、９０３５、９０３６、９０３７、９０３８、９０４０および９０４１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号３５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００６３】
本発明はさらに、配列番号９０４４、９０４８、９０５２、９０６１、９０６５、９０６９、９０７１、９０７６、９０７７、９０９２、９０９５、９０９７、９１００、９１０１、９１０５、９１０６、９１１３、９１１４、９１１６、９１２１、９１２２、９１２３、９１２４、９１２９、９１５２、９１５５、９１６９、９１７２、９１７３、９１７４、９１８２、９１８６、９１８７、９１８８、９１８９、９１９０、９１９２、９１９３、９１９４、９１９５、９１９６、９１９７、９１９８、９２００、９２０１、９２０３、９２０５、９２０７、９２３２、９２４６、９２４７、９２４８、９２５１、９２５４、９２５５、９２６７、９２７２、９２８８、９２９６、９２９８、９２９９、９３０１、９３１１および９３１２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号３６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００６４】
本発明はさらに、配列番号９３３７、９３３８、９３４０、９３４２、９３５３、９３５６、９３６４、９３６５、９３６７、９３８３、９３８５、９３９２、９４０９、９４１１、９４１４、９４１５、９４２０、９４３０、９４３４、９４３８、９４５１、９４５２、９４６４、９４７１、９４７２、９４７６、９４８３、９４８４、９４８５、９５０６、９５３６、９５３７、９５４８、９５４９、９５５６、９５５７、９５６０、９５８７、９５８９、９５９０、９６１１、９６１２、９６２１、９６３９、９６５２、９６５４、９６５７、９６６４、９６６７、９６７４および９６７９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号３７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００６５】
本発明はさらに、配列番号９６８５、９６８９、９６９１、９６９８、９７１５、９７１６、９７１７、９７１８、９７２２、９７２５、９７５５、９７７０、９７７２、９７７３、９７７６、９７８０、９７８１、９７８２、９７８７、９７９５、９７９８、９８０３、９８１４、９８２４、９８４２、９８５１、９８５５、９８５６、９８５８、９８６１、９８６２、９８６６、９８６７、９８８３、９８９７、９９０２、９９０６、９９４１、９９４９、９９５５、９９５６、９９５７、９９６０、９９９４、９９９７、９９９８、１０００２、１０００３、１００２１、１００３８、１０１０５、１０１０７、１０１１０、１０１２３、１０１２９、１０１３１、１０１４１、１０１６１、１０１９２、１０１９７、１０１９９、１０２０２、１０２１８、１０２１９、１０２２０、１０２２１および２８７１４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号３８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００６６】
本発明はさらに、配列番号１０２２６、１０２２９、１０２５０、１０２５４、１０２５８、１０２６１、１０２７３、１０３０６、１０３０９、１０３１５、１０３３６、１０３３９、１０３４１、１０３５０および２８７１５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号３９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００６７】
本発明はさらに、配列番号１０３５６、１０３５８、１０３７７、１０３８９、１０３９６、１０４３７、１０４３９、１０４４７、１０４５９、１０４６７、１０４７３、１０４８７、１０４８９、１０５３４、１０５３５、１０５４０、１０５４１、１０５４７、１０５４８、１０５５２、１０５５８、１０５６４、１０５８１、１０６００、１０６０１、１０６１６、１０６２９、１０６３７、１０６４５、１０６５７、１０６５８、１０６７４、１０６７８、１０６８１、１０６８３、１０６８４、１０６８６、１０６８７、１０６９２、１０６９８、１０７００、１０７０８、１０７２３、１０７４１、１０７４４、１０７４７、１０７８５、１０７８９、１０７９９、１０８０２、１０８０３、１０８０７、１０８０８、１０８０９、１０８１２、１０８２５、１０８３０、１０８３７、１０８４５、１０８５３、１０８６５、１０８７０、１０８８６、１０８９５、１０９１０、１０９２２、１０９２３、１０９２４、１０９２７、１０９２８、１０９２９、１０９３０、１０９３１、１０９３３、１０９３４、１０９３５、１０９４５、１０９６５、１０９７１、１０９８８、１０９８９、１１００７、１１０１０、１１０３２、１１０３３、１１０４８、１１０４９、１１０５２、１１０５３、１１０６６、１１０６７、１１０７１、１１０７５および２８７１７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号４０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００６８】
本発明はさらに、配列番号１１０９１、１１０９２、１１０９３、１１０９４、１１０９８、１１０９９、１１１０７、１１１０８、１１１１０、１１１１３、１１１２２、１１１３８、１１１４５、１１１４６、１１１４８、１１１５４、１１１６８、１１１７２、１１１７４、１１１９５、１１１９９、１１２０２、１１２１２、１１２１８、１１２２２、１１２２３、１１２２４、１１２２５、１１２３６、１１２４９、１１２５０、１１２５８、１１２６１、１１２７３、１１２７５、１１２７７、１１２８４、１１２８５、１１２８６、１１３０３、１１３１４、１１３１９および１１３４２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号４１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００６９】
本発明はさらに、配列番号１１３９１および２８７２３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号４２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００７０】
本発明はさらに、配列番号１１３９９、１１４０１、１１４１７、１１４２７、１１４３０、１１４３９、１１４４１、１１４５３、１１４５７、１１４６０、１１４６２、１１４６３、１１４６４、１１４６９、１１４７０、１１４７５、１１４７６、１１４９０、１１４９１、１１５０３、１１５２６、１１５３０、１１５３７、１１５５０、１１５６０、１１５６４、１１５６５、１１５７１、１１５７２、１１５７７、１１５８０、１１５８２、１１５８３、１１５８５、１１５９９、１１６１３、１１６２４、１１６４１、１１６４６、１１６４８、１１６５５、１１６５８、１１６６１、１１６６７、１１６８２および２８７２４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号４３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００７１】
本発明はさらに、配列番号１１７０７、１１７１６、１１７１９、１１７２４、１１７４７、１１７４９、１１７５６、１１７７１、１１７７６、１１７８２、１１７８３、１１７８８、１１７９６、１１８００、１１８０６、１１８０９、１１８１１、１１８１４、１１８１６、１１８２５、１１８３４、１１８３８、１１８４９、１１８５５、１１８５６、１１８５８、１１８６３、１１８６４、１１８７８、１１８８３、１１８９０、１１８９９、１１９００、１１９０７、１１９１４、１１９２０、１１９３０、１１９３１、１１９３５、１１９３７、１１９３８、１１９５９、１１９６０、１１９６１、１１９６２、１１９７３、１１９７４、１１９７６、１１９７９、１１９８４、１１９８９、１１９９１、１１９９７、１１９９８、１２００２、１２００４、１２００６、１２０１３、１２０２９、１２０３５、１２０３６、１２０３７、１２０３８、１２０３９、１２０４０、１２０４３、１２０４７、１２０５１、１２０５２、１２０５７、１２０６０、１２０６８、１２０７２、１２０８３、１２０８４、１２０９３、１２０９４、１２１０２、１２１０３、１２１０４、１２１０７、１２１１０、１２１１１、１２１１３、１２１２３、１２１２６、１２１３７、１２１４９、１２１６９、１２１７５、１２１９２、１２１９７、１２２１０、１２２１７、１２２２１、１２２２８、１２２３３、１２２５１、１２２５２、１２２６１、１２２６２、１２２７１、１２２９４および１２３０７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号４４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００７２】
本発明はさらに、配列番号１２３１０、１２３１４、１２３１６、１２３１７、１２３１９、１２３２０、１２３２２、１２３２４、１２３３０、１２３３１、１２３３４、１２３４１、１２３４２、１２３４３、１２３４６、１２３４７、１２３５７、１２３７４、１２３７７、１２３７８、１２３７９、１２３８５、１２３９５、１２４０５、１２４１０、１２４１１、１２４１３、１２４１４、２８７２６および２８７２７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号４５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００７３】
本発明はさらに、配列番号１２４１８、１２４２０、１２４２９、１２４４０、１２４４１、１２４４２、１２４４７、１２４４８、１２４５３、１２４５６、１２４６０、１２４８１、１２４８７、１２５０１、１２５０３、１２５２４、１２５２８、１２５３３、１２５３４、１２５３５、１２５４６、１２５５８、１２５６３、１２５７４、１２５７６、１２５８６、１２５８７、１２５８８、１２５８９、１２５９０、１２６００、１２６０９、１２６１０、１２６１１、１２６２６、１２６４５、１２６４７、１２６４９、１２６５０、１２６５４、１２６５９、１２６６７、１２６６８、１２６６９、１２６７０、１２６７４、１２６７５、１２６８６、１２７１８、１２７３９、１２７４０、１２７４１、１２７４９、１２７５０、１２７５１、１２７５２、１２７５５、１２７５６、１２７６６、１２７７３、１２７８５、１２８０９、１２８１６、１２８１９、１２８２０、１２８２７、１２８２８、１２８３０、１２８３１、１２８３３および１２８５０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号４６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００７４】
本発明はさらに、配列番号１２８６１、１２８６２、１２８６６、１２８６８、１２８７１、１２８７５、１２８７９、１２８８７、１２８９０、１２８９７、１２９０２、１２９０４、１２９０７、１２９１３、１２９１４、１２９１６、１２９１７、１２９２０、１２９２１、１２９２６、１２９４１、１２９４５、１２９４８、１２９６２、１２９７６、１２９７８、１２９７９、１２９８１、１２９８３、１２９９２、１３００２、１３００６、１３０１１、１３０１６、１３０２３、１３０２６、１３０２９、１３０３１、１３０３２、１３０３４、１３０３６、１３０３８、１３０３９、１３０４０、１３０５４、１３０５６、１３０６２、１３０６３、１３０６６、１３０６９、１３０８５、１３０８６および１３０８８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号４７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００７５】
本発明はさらに、配列番号１３０９３、１３０９７、１３１１５、１３１１９、１３１２２、１３１２４、１３１３０、１３１３１、１３１３４、１３１３９、１３１５２、１３１５６、１３１６１、１３１６５、１３１７１、１３１７３、１３１８４、１３１８５、１３１８７、１３２００、１３２０１、１３２０６、１３２１４、１３２３２、１３２４３、１３２４８、１３２７３、１３２７７、１３２８４、１３２９７、１３３０１、１３３１２、１３３１８、１３３２１、１３３２４、１３３２６、１３３２８、１３３３２、１３３４０、１３３４２、１３３４８、１３３４９、１３３５２、１３３５６、１３３５８、１３３８３、１３３８５、１３３８６、１３３９４、１３３９６、１３４０２、１３４１３、１３４１７、１３４２４、１３４２８、１３４３０、１３４３７、１３４３８、１３４４０、１３４５１、１３４５５、１３４７５、１３４７６、１３４８９および２８７３２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号４８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００７６】
本発明はさらに、配列番号１３４９４、１３４９６、１３５００、１３５０２、１３５０５、１３５０６、１３５０７、１３５１２、１３５１７、１３５２４、１３５２６、１３５２７、１３５２８、１３５２９、１３５３８、１３５４７、１３５５０、１３５５２、１３５５７、１３５８０、１３５９３、１３５９４、１３６０９、１３６１７、１３６１８、１３６４１、１３６４６および１３６４７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号４９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００７７】
本発明はさらに、配列番号１３６６１、１３６６７、１３６７３、１３６８４、１３６９０、１３６９１、１３７００、１３７１８、１３７３２および１３７９７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号５０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００７８】
本発明はさらに、配列番号１３８３０、１３８４１、１３８６１、１３８６３、１３８６５、１３８６６、１３８７７、１３８７８、１３８７９、１３８８０および１３８９３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号５１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００７９】
本発明はさらに、配列番号１３８９７、１３９０５、１３９１５、１３９５２、１３９６１、１３９６７、１４００１、１４０３１、１４０４１、１４０４２、１４０６２、１４０６４、１４０６８、１４０９４、１４１０１および１４１０３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号５２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００８０】
本発明はさらに、配列番号１４１２０、１４１２４、１４１２６、１４１４３、１４１５１、１４１５２、１４１６８、１４１６９、１４１７３、１４１８１、１４１８８、１４１８９、１４１９５、１４２０９、１４２１４、１４２１５、１４２１６、１４２２２、１４２２９、１４２３３、１４２３４、１４２３６、１４２４２、１４２４７、１４２４９、１４２６１、１４２６８、１４２７７、１４２７９、１４２８７、１４３０１、１４３０６、１４３０７、１４３０８、１４３１２、１４３１３、１４３２１、１４３２２、１４３２３、１４３２４、１４３３１、１４３３６、１４３３８、１４３３９、１４３４６、１４３４９、１４３５１、１４３５３、１４３６５、１４３６８、１４３６９、１４３７０、１４３７４、１４３７６、１４３７８、１４３７９および１４３８０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号５３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００８１】
本発明はさらに、配列番号１４３９８、１４４０８、１４４１１、１４４２９、１４４５６、１４４５８、１４４６４、１４４７１、１４４８０、１４４８２、１４４８４、１４４８５、１４５０３、１４５０９、１４５１４、１４５１８、１４５２０、１４５２１、１４５４５および２８７４１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号５４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００８２】
本発明はさらに、配列番号１４５５２、１４５５７、１４５５８、１４５７５、１４５７７、１４５７９、１４５８０、１４５８９、１４５９２、１４５９３、１４５９５、１４６０２、１４６０３、１４６０６、１４６０８、１４６１８、１４６２５、１４６３７、１４６３８、１４６４１、１４６４４、１４６４７、１４６５２、１４６５３、１４６５６、１４６５９、１４６６１、１４６７１、１４６７２、１４６７５、１４６７６、１４６９９、１４７０２、１４７０７、１４７０８、１４７０９、１４７１２、１４７２０、１４７２１および２８７４４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号５５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００８３】
本発明はさらに、配列番号１４７４２、１４７４５、１４７５１、１４７５２、１４７６４、１４７６９、１４７８９、１４７９６および１４７９８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号５６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００８４】
本発明はさらに、配列番号１４８１９、１４８２０、１４８３３、１４８３４、１４８３６、１４８３７、１４８３８、１４８４９、１４８７０、１４８７２、１４８７６、１４８７７、１４８８５、１４８９８、１４９１２、１４９１３、１４９２３、１４９２４、１４９３３、１４９３５、１４９７２、１４９７３、１４９９１、１４９９２、１４９９３、１４９９４、１４９９８、１５００２、１５０３６、１５０４３、１５０４７、１５０４９、１５０５０、１５０６５、１５０８０、１５０８５、１５０９０、１５０９４、１５０９５、１５０９６、１５１０１、１５１０６、１５１１３、１５１２７、１５１３８、１５１４７、１５１４９、１５１７０、１５１７２、１５１９２、１５１９３、１５１９７、１５１９８、１５２１５、１５２１７、１５２１８および２８７４８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号５７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００８５】
本発明はさらに、配列番号１５２３７、１５２５０、１５２５５、１５２５９、１５２６５、１５２７２、１５２７８、１５２８６、１５２８８、１５２９８、１５３０２、１５３０３、１５３０５、１５３１１、１５３１２、１５３１８、１５３１９、１５３２２、１５３２３、１５３２４、１５３２５、１５３３５、１５３３６、１５３３８、１５３３９、１５３５０および１５３７１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号５８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００８６】
本発明はさらに、配列番号１５３８５、１５３８６、１５４１０、１５４１１、１５４１３、１５４２１、１５４２２、１５４２３、１５４２４、１５４２５、１５４３７、１５４４１、１５４５５、１５４５８、１５４７０、１５４７２、１５４７６、１５４７９、１５４８６、１５４８７、１５４８８、１５４９０、１５４９６、１５４９７、１５５００、１５５０２、１５５０７、１５５０８、１５５１８、１５５１９、１５５２５、１５５３１、１５５４１、１５５４４、１５５４９、１５５６０、１５５６１、１５５６３、１５５６７、１５５７０、１５５７３、１５５９８、１５６１４、１５６２０、１５６２２、１５６２４、１５６２７、１５６２９、１５６３３、１５６３５、１５６４３、１５６４６、１５６４７、１５６５２、１５６５３、１５６５７、１５６７０、１５６８５、１５６８７、１５６８９および１５６９３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号５９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００８７】
本発明はさらに、配列番号１５６９５、１５６９７、１５７０６、１５７２４、１５７２８および１５７４２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号６０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００８８】
本発明はさらに、配列番号１５７５７、１５７６９、１５７９５、１５７９６、１５８０８、１５８１６、１５８１９、１５８２１、１５８３７、１５８４４、１５８４５、１５８４９、１５８５１、１５８５３、１５８７５、１５８７６、１５８８４、１５８８８、１５８９０、１５８９６、１５９１５、１５９１６、１５９１７、１５９１８、１５９３１、１５９３５、１５９３８、１５９４８、１５９４９、１５９６０、１５９６４、１５９６５、１５９６６、１５９７０、１５９８２、１５９８７、１５９８９、１５９９０、１５９９１、１５９９２、１５９９３、１５９９４、１５９９７、１６００１、１６００２、１６００３、１６０１５、１６０１８、１６０２６、１６０２９、１６０４５、１６０５０、１６０５２、１６０５３、１６０６８、１６０６９、１６０７３、１６０７８、１６０７９、１６０８０、１６０８８、１６１０９、１６１１１および１６１１９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号６１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００８９】
本発明はさらに、配列番号１６１３１、１６１３４、１６１３８、１６１４１、１６１４２、１６１４５、１６１４６、１６１５５、１６１６８、１６１７６、１６１８７、１６１８９、１６１９０、１６１９２、１６１９５、１６２１０、１６２１９、１６２２５、１６２３２、１６２３４、１６２３８、１６２４１、１６２４２、１６２４８、１６２５６および１６２５８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号６２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００９０】
本発明はさらに、配列番号１６２６５、１６２７２、１６２７４、１６２７９、１６２８５、１６２９７、１６２９９、１６３１２、１６３１５、１６３１６、１６３２７、１６３２８、１６３３７、１６３５２、１６３５３、１６３５４、１６３５５、１６３５６、１６３５７、１６３７１、１６３７２、１６３７８、１６３７９、１６３８０、１６３９２、１６３９９、１６４００、１６４０３、１６４２４、１６４２６、１６４３９、１６４４２、１６４４７、１６４４８、１６４５３、１６４７１、１６４８３、１６４９２および１６４９８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号６３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００９１】
本発明はさらに、配列番号１６５０１、１６５０２、１６５０４、１６５３６、１６５３７、１６５４６、１６５４７、１６５５５、１６５６６、１６５７３、１６５９０、１６５９２、１６５９３、１６５９４、１６５９５、１６６０１、１６６０２、１６６０８、１６６１６、１６６１９、１６６２９、１６６４９、１６６５９、１６６８８、１６６９１、１６６９３、１６６９４、１６６９５、１６７１２、１６７１３、１６７３６、１６７４４、１６７４５、１６７４９、１６７８７および１６７８８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号６４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００９２】
本発明はさらに、配列番号１６８０５、１６８０８、１６８１１、１６８１２、１６８１６、１６８１７、１６８４２、１６８４３、１６８４５、１６８５０および１６８６５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号６５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００９３】
本発明はさらに、配列番号１６８８１、１６８８８、１６８９１、１６９０１、１６９０２、１６９１０、１６９２０、１６９２４、１６９３２、１６９３５、１６９６２、１６９６７、１６９７１、１６９８２、１６９８９、１６９９０、１６９９２、１６９９３および２８７６７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号６６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００９４】
本発明はさらに、配列番号１７００１、１７００６、１７０１１、１７０２０、１７０２２、１７０２９、１７０３７、１７０３９、１７０４４、１７０４９、１７０５０、１７０５５、１７０５７、１７０５８、１７０６４、１７０７３、１７０８０、１７０９３、１７０９７、１７０９８、１７０９９、１７１０２、１７１１３および１７１１６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号６７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００９５】
本発明はさらに、配列番号１７１２０、１７１２１、１７１３４、１７１３５、１７１４５、１７１４８、１７１６３、１７１６９、１７１７０、１７１７１、１７１８９、１７１９０、１７１９１、１７１９２、１７１９３、１７１９４、１７２００、１７２１０、１７２１２、１７２２６、１７２２９、１７２３７、１７２５７、１７２５９、１７２８４、１７２８７、１７２９４、１７２９５、１７２９８、１７３０６、１７３０７、１７３１１、１７３１７、１７３１９、１７３２８、１７３２９、１７３３０、１７３３１、１７３３２、１７３４８、１７３５１、１７３７２、１７３７７、１７３８０、１７３８８、１７３９５、１７３９６、１７４０３、１７４０７、１７４３０、１７４３６、１７４４０、１７４５４、１７４５５、１７４６３、１７４６９、１７４８０、１７４８２、１７４９７、１７５１４および１７５２１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号６８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００９６】
本発明はさらに、配列番号１７５２６、１７５２７、１７５３７、１７５６０、１７５６１および２８７７１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号６９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００９７】
本発明はさらに、配列番号１７５８４、１７５９７、１７６１３、１７６２９および１７６３１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号７０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００９８】
本発明はさらに、配列番号１７６６５、１７６８１、１７６８５、１７６９１、１７７０３および１７７０６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号７１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【００９９】
本発明はさらに、配列番号１７７１１、１７７１３、１７７３４、１７７３８、１７７３９、１７７４４、１７７４５、１７７４８、１７７４９、１７７５４、１７７５７、１７７５９、１７７７６、１７７７８、１７７８２、１７７９８、１７８０６、１７８１４、１７８１５、１７８１９、１７８２０、１７８２１、１７８２２、１７８２３、１７８４１、１７８５０、１７８５８、２８７７３および２８７７４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号７２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１００】
本発明はさらに、配列番号１７８６０、１７８６９、１７８７０、１７８７４、１７８８３、１７８８４、１７８８７、１７８８８、１７９１９、１７９３１、１７９３５、１７９４０、１７９４６、１７９５９、１７９６０、１７９６２、１７９７０、１７９７５、１７９８７、１７９９３、１８００９、１８０２４、１８０３３、１８０３６、１８０５３、１８０５５、１８０６８および２８７７５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号７３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１０１】
本発明はさらに、配列番号１８０８０、１８０８３、１８０８６、１８０８９、１８１２３、１８１２４、１８１３４、１８１４２、１８１４９、１８１６０、１８１６１、１８１６４、１８１６６、１８１７７、１８１８９、１８１９９、１８２００、１８２０２、１８２２０、１８２２１、１８２２２、１８２３５、１８２４５、１８２４８および１８２４９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号７４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１０２】
本発明はさらに、配列番号１８２７０、１８２７６、１８２８４、１８２８７、１８２９６、１８２９７、１８２９８、１８２９９、１８３００、１８３０７、１８３１１、１８３１２、１８３１４、１８３１９、１８３２０、１８３２２、１８３２３、１８３２４、１８３２６、１８３２８、１８３２９、１８３３０、１８３３１、１８３３７、１８３５９、１８３６０、１８３６７、１８３８０、１８３８８、１８３９７、１８４１２、１８４１３、１８４１６、１８４２０、１８４２１および２８７８１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号７５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１０３】
本発明はさらに、配列番号１８４２２、１８４２３、１８４３０、１８４３２、１８４３３、１８４３４、１８４３６、１８４３７、１８４３８、１８４３９、１８４４０、１８４４６、１８４５４、１８４６０、１８４７１、１８４７２、１８４７３、１８４７４、１８４８０、１８４８３および１８４８４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号７６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１０４】
本発明はさらに、配列番号１８４９１、１８４９２、１８４９３、１８４９５、１８４９７、１８５００、１８５１３、１８５１４、１８５１７、１８５２１、１８５２５、１８５２６および１８５３２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号７７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１０５】
本発明はさらに、配列番号１８５４４、１８５５３、１８５５７、１８５６０、１８５６２、１８５６３、１８５７８、１８５８２、１８５８７、１８５９１、１８５９４、１８５９５、１８５９９、１８６１０、１８６１６、１８６２４、１８６３７、１８６４６、１８６４９、１８６５４、１８６５６、１８６６３、１８６７１、１８６７２、１８６８０、１８６８１、１８６８８、１８６８９、１８６９０、１８６９２、１８６９５、１８６９８、１８６９９、２８７８５および２８７８６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号７８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１０６】
本発明はさらに、配列番号１８７１６、１８７３５、１８７３７、１８７４９および１８７５７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号７９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１０７】
本発明はさらに、配列番号１８７７８、１８７９０、１８７９９、１８８０３、１８８１６、１８８２９、１８８３３、１８８３４、１８８３７、１８８４７、１８８６８、１８８７１、１８８７９、１８８８８、１８８９３、１８８９５、１８８９７、１８９０９、１８９２１、１８９２７、１８９２８、１８９３１および１８９３８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号８０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１０８】
本発明はさらに、配列番号１８９７９、１８９８６、１９０２１、１９０２３、１９０２６、１９０２８、１９０３０、１９０３４および１９０３６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号８１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１０９】
本発明はさらに、配列番号１９０５３、１９０６０、１９０６３、１９０６７、１９０７２、１９０８０、１９０８５、１９０９０、１９０９１、１９１０５および１９１０８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号８２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１１０】
本発明はさらに、配列番号１９１１９、１９１３３、１９１３４、１９１３５、１９１３６、１９１３７、１９１３８、１９１３９、１９１４１、１９１４２、１９１４３、１９１４４、１９１４９、１９１５４、１９１５７、１９１５８、１９１５９、１９１７７、１９１７８、１９１７９、１９１８０、１９１８３、１９１８４、１９１９１、１９１９９、１９２００、１９２０４、１９２０５、１９２０８、１９２１２、１９２１３、１９２１８、１９２４４、１９２４５、１９２４６、１９２４８、１９２４９、１９２５８、１９２６１、１９２７３、１９２７７、１９２８７、１９２８８、１９２９８および１９２９９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号８３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１１１】
本発明はさらに、配列番号１９３００、１９３３０、１９３３１、１９３４４、１９３４５、１９３５０、１９３５３、１９３５９、１９３６７、１９３６８、１９３７０、１９３９１、１９３９９、１９４００、１９４０１、１９４０７、１９４２２、１９４２４、１９４２７、１９４４７、１９４４８、１９４４９および２８７９４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号８４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１１２】
本発明はさらに、配列番号１９４５６、１９４６０、１９４８７、１９４９９、１９５００、１９５０１、１９５１９、１９５２１、１９５２６、１９５３３、１９５３５、１９５４２、１９５５３、１９５６６、１９５６７、１９５７３、１９５７７、１９５８１、１９５８６、１９５８９、１９５９５および２８７９６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号８５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１１３】
本発明はさらに、配列番号１９６００、１９６０５、１９６０７、１９６０８、１９６０９、１９６１０、１９６１１、１９６１２、１９６３１、１９６３４、１９６４１、１９６４２、１９６４４、１９６４６、１９６４８、１９６４９、１９６５１、１９６６０、１９６６３、１９６６８、１９６７０、１９６７６、１９６８２、１９６８３、１９６８４、１９６８７および１９７０５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号８６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１１４】
本発明はさらに、配列番号１９７３４、１９７４３および１９７５７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号８７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１１５】
本発明はさらに、配列番号１９７７１、１９７７２、１９７７３、１９７７５、１９７８０、１９７８２、１９７８８、１９８０５、１９８０９、１９８１０、１９８１３、１９８２０、１９８４３、１９８４４、１９８５４、１９８５５、１９８５６、１９８６３、１９８６４、１９８６５、１９８７２、１９８８３、２８８００および２８８０１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号８８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１１６】
本発明はさらに、配列番号１９８８６、１９８９１、１９８９６、１９８９８、１９９０３、１９９２６、１９９３０、１９９３３、１９９４０、１９９４１、１９９４５、１９９６１、１９９６５、１９９６７、１９９６８、１９９７０、１９９７２、１９９７７、１９９７９および１９９８１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号８９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１１７】
本発明はさらに、配列番号２０００５、２００１３および２８８０６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号９０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１１８】
本発明はさらに、配列番号２００２９、２００３６、２００４１、２００４６、２００４８、２００５２、２００５７、２００６８、２００６９、２００７０、２００９２、２０１００、２０１０６、２０１０８、２０１１３、２０１１６、２０１１９、２０１２９、２０１３２、２０１３３、２０１４７、２０１６３、２０１６４、２０１６５、２０１６６、２０１７４、２０１７７、２０１８６、２０１９３、２０１９４、２０１９７、２０１９８、２０１９９、２０２０１、２０２０２、２０２０４、２０２０７、２０２０８、２０２１３、２０２１４、２０２２１、２０２２９、２８８０７および２８８０９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号９１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１１９】
本発明はさらに、配列番号２０２６２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号９２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１２０】
本発明はさらに、配列番号２８８１２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号９３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１２１】
本発明はさらに、配列番号２０２８４、２０２８６、２０２８７、２０２８８、２０２８９、２０２９０、２０２９２、２０２９３、２０２９４、２０２９６、２０２９７、２０２９８、２０２９９、２０３００および２８８１４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号９４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１２２】
本発明はさらに、配列番号２０３１１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号９５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１２３】
本発明はさらに、配列番号２０３２９、２０３３２、２０３３３、２０３３４、２０３５７、２０３６０、２０３６９、２０３７０、２０３７２、２０３８２、２０３８５、２０３８６、２０３９１、２０３９２、２０３９３、２０３９５、２０３９９、２０４００、２０４０１、２０４１１、２０４１２、２０４１４、２０４１５、２０４２２、２０４２５、２０４４２、２０４５８、２０４６３、２０４７４、２０４７５、２０４７６、２０４７９、２０４８０、２０４８５、２０４９４、２０５１０、２０５１２、２０５１７、２０５２５、２０５２８、２０５３０および２０５４２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号９６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１２４】
本発明はさらに、配列番号２０５６２、２０５６４、２０５６５、２０５７３、２０５７７、２０５８５、２０５９０、２０６０８、２０６０９、２０６１１、２０６１６、２０６１７、２０６１８、２０６２０、２０６３０、２０６３５、２０６３８、２０６５８、２０６６９、２０６７１、２０６８３、２０６８４、２８８２０および２８８２２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号９７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１２５】
本発明はさらに、配列番号２０７０３、２０７０４、２０７０５、２０７１４、２０７１５、２０７３３および２０７３４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号９８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１２６】
本発明はさらに、配列番号２０７４２、２０７５６、２０７５９、２０７６４、２０７６６、２０７７４、２０７７６、２０７８３、２０７９９、２０８００、２８８２６および２８８２７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号９９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１２７】
本発明はさらに、配列番号２０８０６、２０８３２、２０８３６、２０８５４、２０８５５、２０８５６、２０８７７、２０８８２、２０８９７、２０９１３、２０９２３、２０９２５、２０９２６、２０９３５、２０９４３、２０９４９および２０９５１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１００によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１２８】
本発明はさらに、配列番号２０９５２、２０９５５、２０９６３、２０９６６、２０９７３、２０９７５、２０９８４、２０９８７、２１００２、２１０１８、２１０４９および２１０５４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１０１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１２９】
本発明はさらに、配列番号２１０６５、２１０７０、２１０７４、２１０７９、２１０８５、２１０８９、２１０９２、２１０９３、２１１１２、２１１２６、２１１２９、２１１３２、２１１３５、２１１３７、２１１４６、２１１５３、２１１５４、２１１５５、２１１７２、２１１８０、２１１８５、２１１９０、２１１９８、２１２０２、２１２１７、２１２２１、２１２２２、２１２２９および２８８３０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１０２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１３０】
本発明はさらに、配列番号２１２４１、２１２５０、２１２５６、２１２５８、２１２５９、２１２６４、２１２６５、２１２６６、２１２６７、２１２７１、２１２８７、２１３００、２１３１５、２１３３３、２１３４８、２１３４９、２１３５０、２１３５５、２１３５９、２１３６３、２１３６８、２１３７２、２１３８７、２１３９９、２１４０２、２１４０５、２１４２８、２１４３５、２１４４６、２１４４７、２１４４９、２１４５３、２１４６６、２１４７７、２１４８３、２１４８５、２１４８６、２１４８９、２１４９０、２１４９３および２１４９５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１０３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１３１】
本発明はさらに、配列番号２１５０４、２１５１１、２１５１９、２１５２２、２１５２６、２１５２８、２１５２９、２１５３１、２１５３２、２１５３３、２１５３９、２１５４３、２１５４４、２１５６７、２１５６８、２１５７０、２１５７３、２１５７４、２１５７５、２１５７９、２１５８４、２１５８７、２１５９７、２１５９８、２１６０８、２１６１５、２１６１９、２１６２０、２１６３４、２１６４１、２１６４３、２１６４９、２１６５０、２１６５５、２１６５８、２１６５９、２１６６３、２１６７０、２１６７１、２１６７４、２１６７５、２１６８０、２１６９１、２１６９３、２１６９５、２１７０３、２１７０５、２１７０７、２１７０８、２１７１０、２１７１１、２１７４０、２１７４３、２１７４９、２１７６２、２１７６５、２１７７４、２１７７８、２１７８０、２１７８８、２８８３４および２８８３５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１０４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１３２】
本発明はさらに、配列番号２１７８９、２１７９１、２１８０３、２１８０６、２１８０８、２１８２７および２１８３１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１０５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１３３】
本発明はさらに、配列番号２１８４５、２１８５０および２１８５６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１０６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１３４】
本発明はさらに、配列番号２１８６１、２１８７２、２１８７５、２１８９４、２１８９７、２１９０８、２１９１０、２１９１３、２１９２３、２１９２６、２１９７８、２１９７９、２１９８３、２１９９７、２２００３、２２０１４、２２０１９、２２０２０、２２０２７、２２０４２、２２０５４、２２０６２、２２０６３、２２０６４、２２０６５、２２０７１、２２０７２、２８８４４および２８８４５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１０７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１３５】
本発明はさらに、配列番号２２０８４、２２０８５、２２０８６、２２０９０、２２０９３、２２０９８、２２１０７、２２１０８、２２１１９、２２１２４、２２１２５、２２１２７、２２１３９、２２１４６、２２１４８、２２１５２、２２１５３、２２１５７、２２１６３、２２１６４、２２１６５、２２１６７、２２１６８、２２１７７、２２１８５、２２１８８、２２１８９、２２１９６、２２２１１、２２２１８、２２２１９、２２２２７、２２２３３、２２２３９、２２２４７、２２２５６、２２２６５、２２２６９、２２２７０、２２２８９、２２２９０、２２２９２、２２２９８、２２３００、２２３０９、２２３１１、２２３１２、２２３１８、２２３２３、２２３２４および２２３２８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１０８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１３６】
本発明はさらに、配列番号２２３２９、２２３３７、２２３４２、２２３４３、２２３４７、２２３５０、２２３５５、２２３６３および２８８５２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１０９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１３７】
本発明はさらに、配列番号２２３６９、２２３７９、２２３８１、２２３９３、２２３９４、２２３９５、２２３９６、２２４０６、２２４２７、２２４４４、２２４５４、２２４５６および２２４６２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１１０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１３８】
本発明はさらに、配列番号２２４８１、２２５１５、２２５１９、２２５２３、２２５３４、２２５４３、２２５４７、２２５５１、２２５６３、２２５８１、２２５８６、２２５９０、２２５９５、２２５９６、２２５９７、２２６１５、２２６１６、２２６１９、２２６２２、２２６２９、２２６３０および２８８５７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１１１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１３９】
本発明はさらに、配列番号２２６５９、２２６６０、２２６６９、２２６７０、２２６７５、２２６７６、２２６７７、２２６７８および２２６８４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１１２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１４０】
本発明はさらに、配列番号２２６９３、２２７０６、２２７１２、２２７１９、２２７２６、２２７３８、２２７４７、２２７４８、２２７５２、２２７７１、２２７７５、２２７８４、２２７９０、２２８０４および２８８６１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１１３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１４１】
本発明はさらに、配列番号２２８０９、２２８１９、２２８２１、２２８３７、２２８３８、２２８４２、２２８４６および２２８７２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１１４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１４２】
本発明はさらに、配列番号２２８７９、２２８８２、２２８８６、２２９０６、２２９０７、２２９１０、２２９２０、２２９２２、２２９３７、２２９３８、２２９３９、２２９４８、２２９５８、２２９７６、２２９７７、２２９８４、２２９８７、２２９８８、２２９８９、２２９９０、２２９９１、２２９９６、２３００１、２３０１３、２３０１７、２３０２１、２３０３４、２３０３８、２３０３９、２３０４４、２３０４６、２３０６３、２３０６５、２３０７４、２３０７５、２３０７６、２３０７９、２３０８２、２３０８４、２３０９０、２３０９１、２３０９２および２３０９３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１１５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１４３】
本発明はさらに、配列番号２３０９６、２３０９８、２３１０１、２３１０６、２３１１２、２３１１４、２３１１５、２３１１６、２３１１８、２３１２５、２３１２７、２３１３０、２３１３６、２３１３８、２３１４０、２３１４４、２３１５１、２３１６４、２３１６８、２３１７０および２８８７１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１１６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１４４】
本発明はさらに、配列番号２３１８６、２３１８７、２３１８９、２３１９０、２３１９４、２３１９５、２３２０２、２３２０３、２３２０９、２３２１３および２８８７３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１１７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１４５】
本発明はさらに、配列番号２３２１５、２３２１９、２３２２２、２３２２５、２３２３３、２３２３８、２３２４６、２３２５３、２３２５６、２３２６０、２３２６４、２３２６９、２３２７５、２３２７９、２３２９１、２３３０４、２３３２２、２３３２６、２３３２８、２３３３５、２３３３６、２３３４４、２３３６７、２３３６８、２３３６９、２３３７０、２３３７９、２３３８２、２３３８３、２３３８４、２３３８８および２８８７４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１１８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１４６】
本発明はさらに、配列番号２３４１８、２３４１９、２３４２０、２３４３７、２３４４１、２３４４２、２３４４３、２３４４４、２３４４８、２３４４９および２３４５２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１１９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１４７】
本発明はさらに、配列番号２３４８１、２３４８４、２３４８５、２３４８９、２３５１３、２３５１８、２３５３２、２３５３３、２３５３５、２３５３８、２３５４３、２３５４９、２３５５８、２３５６１、２３５６７、２３５７１、２３５７７、２３５８２、２３５８６、２３５８７および２３５９１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１２０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１４８】
本発明はさらに、配列番号２３６１０、２３６１３、２３６１４、２３６１６、２３６１８、２３６２４、２３６３５、２３６４７、２３６５１、２３６５７、２３６５８、２３６６４、２３６８２、２３６８３、２３６８５、２３６８７、２３７０６、２３７０７、２３７０８、２３７０９、２３７１１、２３７１９、２３７２２および２８８８２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１２１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１４９】
本発明はさらに、配列番号２３７２９、２３７４１、２３７４５、２３７５０、２３７６３、２３７６８、２３７７０、２３７９０、２３７９１、２３７９２、２３７９６、２３７９９、２３８０５、２３８０６、２３８０９および２３８１７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１２２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１５０】
本発明はさらに、配列番号２３８４７、２３８５７、２３８６４、２３８７１、２３８８０、２３８８６、２３８９１および２３９０７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１２３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１５１】
本発明はさらに、配列番号２３９１１、２３９１３、２３９２５、２３９２６、２３９２７、２３９２８、２３９３１、２３９３２、２３９３４、２３９３７、２３９３８、２３９４１、２３９４３、２３９４４、２３９４５、２３９５０、２３９５１、２３９５４、２３９５６、２３９５７、２３９５９、２３９７２、２３９９９、２４０１１、２４０１８、２４０２２、２４０２４、２４０２７、２４０３２、２４０３４および２８８８７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１２４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１５２】
本発明はさらに、配列番号２４０４７、２４０５１、２４０５５、２４０９７、２４０９９、２４１０７、２４１１３、２４１１４、２４１１８、２４１２８、２４１４６、２４１５４、２４１８０、２４１８１、２４１８５および２４２１１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１２５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１５３】
本発明はさらに、配列番号２４２２７、２４２３１、２４２４４、２４２４６、２４２４８、２４２６２、２４２７１、２４２７３、２４２７５、２４２７９、２４２８４および２８８９２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１２６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１５４】
本発明はさらに、配列番号２４２９３、２４２９４、２４３００、２４３０３、２４３１７、２４３１９、２４３２６、２４３２７、２４３３１、２４３４１、２４３４２、２４３５１、２４３５２、２４３５５、２４３６１、２４３９８、２４３９９、２４４０６、２４４２０、２４４３１、２４４３３、２４４３４、２４４３５、２４４４２、２４４５０、２４４５６、２４４５９、２４４６３、２４４６５、２４４７３、２４４７４、２４４８２、２４４８７、２４４９９、２４５１４および２４５１５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１２７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１５５】
本発明はさらに、配列番号２４５２８、２４５３４、２４５４３、２４５４５、２４５６６、２４５８７、２４５８８、２４５８９、２４５９０、２４５９７、２４６０２、２４６０５、２４６０６、２４６０９、２４６１２、２４６１９、２４６２０、２４６２１、２４６２２、２４６２３、２４６２６、２４６２９、２４６３０、２４６３９、２４６４０、２４６４１、２４６５２、２４６６３、２４６６５、２４６６７、２４６７３、２４６７６、２４６７９、２４６８４、２４６８５、２４６８７、２４６９６、２４６９８、２４７０４、２４７０５、２４７０９、２４７１５、２４７１６、２４７２１、２４７２２、２４７２８、２４７３０、２４７３９、２４７４２、２４７４３、２４７４５、２４７４９、２８８９７および２８９００からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１２８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１５６】
本発明はさらに、配列番号２４７５５、２４７５８、２４７６１、２４７７０、２４７７８、２４７７９、２４７８０、２４７８７、２４７８８、２４７９１、２４８００、２４８０１、２４８２１、２４８２４、２４８２５、２４８２６、２４８２９、２４８４０、２４８５０、２４８５１、２４８６１、２４８７９、２４８９５、２４９０３、２４９０７、２４９１３、２４９３６、２４９３７、２４９５０、２４９５２、２４９５５および２４９５７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１２９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１５７】
本発明はさらに、配列番号２４９６１、２４９６７、２４９６８、２４９６９、２４９７３、２４９８１、２４９８４、２４９８６、２４９８７、２４９９２、２４９９３、２４９９５、２５００４、２８９０３および２８９０４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１３０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１５８】
本発明はさらに、配列番号２５０２４、２５０２９、２５０３８、２５０４５、２５０６７および２５０７６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１３１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１５９】
本発明はさらに、配列番号２５０８２、２５０８５、２５０８６、２５０８８、２５０８９、２５０９０、２５０９４、２５０９６、２５１０２、２５１０３、２５１１２、２５１２９、２５１３０、２５１３１、２５１３３、２５１３５、２５１３９、２５１５０、２５１６０、２５１６３、２５１６４、２５１６５、２５１６６、２５１６７、２５１６８、２５１６９、２５１７４、２５１７８、２５１８７、２５１９２、２５１９３、２５１９４、２５１９５、２５１９７、２５２０８、２５２１５、２５２１６、２５２１７および２５２１８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１３２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１６０】
本発明はさらに、配列番号２５２２９、２５２３７、２５２３９、２５２４６、２５２６７、２５２７１、２５２７４、２５２７５、２５２８３および２８９０８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１３３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１６１】
本発明はさらに、配列番号２５２８８、２５３０４、２５３０９、２５３１３、２５３１５、２５３２０、２５３３９、２５３４０、２５３４６、２５３５４、２５３５５、２５３５６、２８９１１および２８９１２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１３４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１６２】
本発明はさらに、配列番号２５３６５、２５３６７、２５３７８、２５３７９、２５３８０、２５３８５、２５３８７、２５４０４、２５４１０および２５４１７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１３５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１６３】
本発明はさらに、配列番号２５４４２、２５４４５、２５４５６、２５４５８、２５４７４、２５４７５、２５４７９、２５４８０、２５４９０および２５５１６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１３６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１６４】
本発明はさらに、配列番号２５５３５、２５５３９、２５５４０、２５５４６、２５５５０、２５５５３、２５５６２、２５５７８、２５５８４および２５５９０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１３７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１６５】
本発明はさらに、配列番号２５６０２、２５６０３、２５６１１、２５６１３、２５６２０、２５６２１、２５６２２、２５６２９および２８９２０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１３８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１６６】
本発明はさらに、配列番号２５６４４および２５６７１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１３９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１６７】
本発明はさらに、配列番号２５６８４、２５６８５、２５６８７、２５６９２、２５７００、２５７０６、２５７１５、２５７２０、２５７３７、２５７３８、２５７４２、２５７４５、２５７４６、２５７６０、２５７６４、２５７６６、２５７７７および２５７８０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１４０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１６８】
本発明はさらに、配列番号２５７８４、２５７８８、２５７９１、２５８０３、２５８０４、２５８０７、２５８１２、２５８１５、２５８２８、２５８３０および２５８３２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１４１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１６９】
本発明はさらに、配列番号２５８５３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１４２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１７０】
本発明はさらに、配列番号２５８６２、２５８７３、２５８７４、２５８７７、２５８８４、２５８９６および２８９２５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１４３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１７１】
本発明はさらに、配列番号２５９０６、２５９１１、２５９１３および２８９２７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１４４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１７２】
本発明はさらに、配列番号２５９１６、２５９１７、２５９１８、２５９２２、２５９２９、２５９３８、２５９５２、２５９５７、２５９６０および２５９６３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１４５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１７３】
本発明はさらに、配列番号２５９８７、２５９９０、２５９９４、２５９９７、２５９９８、２６００５、２６００６、２６０１１、２６０１２、２６０１６、２８９３２および２８９３３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１４７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１７４】
本発明はさらに、配列番号２６０２１、２６０２５、２６０３６および２６０３７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１４８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１７５】
本発明はさらに、配列番号２６０４４、２６０６１、２６０６７、２６０７１、２６０９０、２６０９９および２８９４０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１４９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１７６】
本発明はさらに、配列番号２６１２２、２６１４０、２６１４１、２６１４３、２６１４９、２６１５６、２６１５７、２６１６１、２６１６３、２６１７１、２６１７５および２８９４１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１５０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１７７】
本発明はさらに、配列番号２６１８１、２６１９５、２６１９６、２６２００、２６２０７、２６２１４、２６２１６、２６２２１、２６２３２、２８９４３および２８９４５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１５１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１７８】
本発明はさらに、配列番号２６２４７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１５２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１７９】
本発明はさらに、配列番号２６２８１、２６２８４および２８９５０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１５３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１８０】
本発明はさらに、配列番号２６２８７および２８９５３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１５４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１８１】
本発明はさらに、配列番号２６３２１、２６３３３、２６３３７および２８９５５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１５５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１８２】
本発明はさらに、配列番号２６３７０、２６３８０、２６３８８、２６３９０、２６３９２、２６３９７および２８９５６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１５６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１８３】
本発明はさらに、配列番号２６４３６、２６４３７および２６４４２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１５７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１８４】
本発明はさらに、配列番号２６４９０、２６５０３および２６５０４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１５８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１８５】
本発明はさらに、配列番号２８９６２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１５９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１８６】
本発明はさらに、配列番号２６５３２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１６０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１８７】
本発明はさらに、配列番号２６５４９、２６５５５および２８９６５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１６１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１８８】
本発明はさらに、配列番号２６５６７および２６５８６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１６２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１８９】
本発明はさらに、配列番号２６５９８、２６６０５および２８９６９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１６３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１９０】
本発明はさらに、配列番号２６６１８、２６６１９、２６６２１、２６６２５、２６６２９および２８９７０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１６４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１９１】
本発明はさらに、配列番号２６６５８および２６６５９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１６５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１９２】
本発明はさらに、配列番号２６６９１、２６６９２および２８９７６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１６６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１９３】
本発明はさらに、配列番号２６６９３、２６７００および２６７０３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１６７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１９４】
本発明はさらに、配列番号２６７２６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１６８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１９５】
本発明はさらに、配列番号２６７３８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１６９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１９６】
本発明はさらに、配列番号２８９８６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１７１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１９７】
本発明はさらに、配列番号２６７７０および２６７７３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１７２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１９８】
本発明はさらに、配列番号２６７７６および２６７８４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１７３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０１９９】
本発明はさらに、配列番号２６７９３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１７４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２００】
本発明はさらに、配列番号２６７９８および２８９９１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１７５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２０１】
本発明はさらに、配列番号２６８１６、２６８１７、２６８１９および２８９９２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１７６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２０２】
本発明はさらに、配列番号２６８５２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１７８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２０３】
本発明はさらに、配列番号２６８８０、２８９９７および２８９９８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１７９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２０４】
本発明はさらに、配列番号２６８９４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１８０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２０５】
本発明はさらに、配列番号２６９００および２６９０９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１８１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２０６】
本発明はさらに、配列番号２６９１５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１８２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２０７】
本発明はさらに、配列番号２６９３７および２９００４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１８３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２０８】
本発明はさらに、配列番号２６９４５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１８４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２０９】
本発明はさらに、配列番号２６９４９および２６９６２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１８５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２１０】
本発明はさらに、配列番号２６９６６、２６９７１および２６９７５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１８６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２１１】
本発明はさらに、配列番号２６９７７、２６９８０、２６９８４、２６９８５および２６９８６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１８７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２１２】
本発明はさらに、配列番号２６９９５、２６９９６、２６９９８および２９０１２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１８８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２１３】
本発明はさらに、配列番号２７００１、２７００５、２７００９、２７０１２および２７０１９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１８９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２１４】
本発明はさらに、配列番号２７０２３、２７０２９、２７０３０、２７０３１、２７０３６、２７０３７、２７０５０、２７０５１および２９０１４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１９０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２１５】
本発明はさらに、配列番号２７０７０および２７０７２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１９２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２１６】
本発明はさらに、配列番号２７０７９および２７０８４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１９３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２１７】
本発明はさらに、配列番号２７０９０および２９０２４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１９４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２１８】
本発明はさらに、配列番号２７１１６、２７１１８、２７１２２、２７１２４、２７１２６、２７１２７、２７１３１、２７１３４、２７１３５、２７１３７、２７１３８、２７１４１および２９０２７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１９６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２１９】
本発明はさらに、配列番号２７１５２、２７１５３、２７１５４および２９０３０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１９７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２２０】
本発明はさらに、配列番号２７１５５、２７１６３および２７１６５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１９８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２２１】
本発明はさらに、配列番号２７１６７、２７１６８、２７１７１、２７１７２、２７１７５および２９０３５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号１９９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２２２】
本発明はさらに、配列番号２７１９０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２００によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２２３】
本発明はさらに、配列番号２７１９９、２７２０５および２９０４０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２０１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２２４】
本発明はさらに、配列番号２７２１２および２７２１８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２０２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２２５】
本発明はさらに、配列番号２９０４１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２０４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２２６】
本発明はさらに、配列番号２７２７０および２７２７１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２０５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２２７】
本発明はさらに、配列番号２７２８３および２９０４３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２０６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２２８】
本発明はさらに、配列番号２７３０７および２９０４４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２０７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２２９】
本発明はさらに、配列番号２７３１５および２７３１９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２０８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２３０】
本発明はさらに、配列番号２７３２８および２９０４７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２０９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２３１】
本発明はさらに、配列番号２９０４８および２９０４９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２１０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２３２】
本発明はさらに、配列番号２７３６６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２１２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２３３】
本発明はさらに、配列番号２７３７５および２９０５３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２１３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２３４】
本発明はさらに、配列番号２７３９８および２９０５６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２１４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２３５】
本発明はさらに、配列番号２７３９９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２１５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２３６】
本発明はさらに、配列番号２７４１９、２７４３１、２７４３４、２７４３８、２９０６０ および２９０６２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２１７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２３７】
本発明はさらに、配列番号２７４４６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２１８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２３８】
本発明はさらに、配列番号２７４４９および２７４６１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２１９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２３９】
本発明はさらに、配列番号２７４７０、２７４７５および２９０６９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２２０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２４０】
本発明はさらに、配列番号２７４８５、２７４８６および２９０７１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２２１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２４１】
本発明はさらに、配列番号２７４９７および２９０７６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２２２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２４２】
本発明はさらに、配列番号２７５０３、２７５０８、２７５２３および２７５２５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２２３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２４３】
本発明はさらに、配列番号２７５２７、２７５３３および２７５４１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２２４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２４４】
本発明はさらに、配列番号２７５５０、２７５５８、２７５６１、２９０８２および２９０８３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２２５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２４５】
本発明はさらに、配列番号２７５７８、２７５８０、２７５８２、２７５８４、２７５８５、２７５８６および２７５９０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２２６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２４６】
本発明はさらに、配列番号２７５９８、２７６０１、２７６０２、２７６０５および２９０８５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２２７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２４７】
本発明はさらに、配列番号２７６０７、２７６１０および２９０８７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２２８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２４８】
本発明はさらに、配列番号２７６４０および２９０８９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２２９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２４９】
本発明はさらに、配列番号２７６５６および２７６５７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２３０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２５０】
本発明はさらに、配列番号２７６６５および２９０９２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２３１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２５１】
本発明はさらに、配列番号２７６８７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２３２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２５２】
本発明はさらに、配列番号２７６９２、２７６９８、２７７０１、２７７０４および２７７０９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２３３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２５３】
本発明はさらに、配列番号２７７１２および２７７２０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２３４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２５４】
本発明はさらに、配列番号２７７３８、２７７４６および２９０９８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２３５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２５５】
本発明はさらに、配列番号２７７５９および２９０９９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２３６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２５６】
本発明はさらに、配列番号２７７６７、２７７６９、２７７７０および２９１０１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２３７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２５７】
本発明はさらに、配列番号２９１０２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２３８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２５８】
本発明はさらに、配列番号２７８００、２７８０７および２９１０５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２３９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２５９】
本発明はさらに、配列番号２７８１９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２４０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２６０】
本発明はさらに、配列番号２７８３６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２４１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２６１】
本発明はさらに、配列番号２７８４８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２４２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２６２】
本発明はさらに、配列番号２７８５７、２７８７０、２７８７９、２９１１２、２９１１４および２９１１５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２４３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２６３】
本発明はさらに、配列番号２７８８５および２７８８７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２４４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２６４】
本発明はさらに、配列番号２７９０６、２７９０８および２９１１８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２４５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２６５】
本発明はさらに、配列番号２７９１１、２７９２１および２７９２６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２４６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２６６】
本発明はさらに、配列番号２７９２７、２７９２８および２７９３５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２４７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２６７】
本発明はさらに、配列番号２７９３８および２７９４０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２４８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２６８】
本発明はさらに、配列番号２７９４３、２７９４４、２７９５２、２７９５３および２９１２４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２４９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２６９】
本発明はさらに、配列番号２７９５７、２７９５８、２７９６４および２７９６６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号に２５０よってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２７０】
本発明はさらに、配列番号２７９８０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２５１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２７１】
本発明はさらに、配列番号２７９８６および２７９９１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２５２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２７２】
本発明はさらに、配列番号２９１２９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２５３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２７３】
本発明はさらに、配列番号２８０２１および２９１３２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２５４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２７４】
本発明はさらに、配列番号２８０３２、２８０３３および２８０４２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２５５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２７５】
本発明はさらに、配列番号２８０５１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２５６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２７６】
本発明はさらに、配列番号２８０６７および２８０７９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２５７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２７７】
本発明はさらに、配列番号２８０８７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２５８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２７８】
本発明はさらに、配列番号２８１００および２９１３９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２５９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２７９】
本発明はさらに、配列番号２８１１６、２８１１９および２８１２１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２６０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２８０】
本発明はさらに、配列番号２８１２３および２９１４４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２６１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２８１】
本発明はさらに、配列番号２８１３２からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２６２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２８２】
本発明はさらに、配列番号２８１４３、２８１４６および２９１４９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２６３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２８３】
本発明はさらに、配列番号２８１６１および２９１５０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２６４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２８４】
本発明はさらに、配列番号２８１６６、２８１６９および２８１７５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２６５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２８５】
本発明はさらに、配列番号２８１７７および２８１７９からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２６６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２８６】
本発明はさらに、配列番号２８１８７、２８１９９および２８２０３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２６７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２８７】
本発明はさらに、配列番号２８２０７および２８２２１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２６８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２８８】
本発明はさらに、配列番号２８２３０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２６９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２８９】
本発明はさらに、配列番号２８２４８、２８２５０および２９１６６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２７０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２９０】
本発明はさらに、配列番号２８２５３、２８２６３および２８２６５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２７１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２９１】
本発明はさらに、配列番号２８２６９および２８２７４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２７２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２９２】
本発明はさらに、配列番号２８２８２、２８２９０および２８２９１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２７３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２９３】
本発明はさらに、配列番号２８２９５、２８３００、２８３０２、２８３０５、２８３１２および２８３１６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２７４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２９４】
本発明はさらに、配列番号２８３２８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２７５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２９５】
本発明はさらに、配列番号２８３３４、２８３３９、２８３４２、２８３４６、２９１７４および２９１７５からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２７６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２９６】
本発明はさらに、配列番号２８３５７、２８３５８および２８３６１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２７７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２９７】
本発明はさらに、配列番号２８３８５および２８３８７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２７９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２９８】
本発明はさらに、配列番号２８３９４、２８３９６、２９１８２および２９１８４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２８０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０２９９】
本発明はさらに、配列番号２８４１０からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２８１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３００】
本発明はさらに、配列番号２８４２４、２８４３２および２８４３４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２８２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３０１】
本発明はさらに、配列番号２８４３９、２８４４０および２８４４６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２８３によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３０２】
本発明はさらに、配列番号２８４５２、２８４５４および２８４６１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２８４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３０３】
本発明はさらに、配列番号２８４７４、２８４７６、２８４７７および２９１９１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２８５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３０４】
本発明はさらに、配列番号２８４９０、２９１９２および２９１９３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２８６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３０５】
本発明はさらに、配列番号２８４９７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２８７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３０６】
本発明はさらに、配列番号２８５０３、２８５０９、２８５１２および２８５１３からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２８８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３０７】
本発明はさらに、配列番号２８５２３および２８５２６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２８９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３０８】
本発明はさらに、配列番号２９１９８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２９０によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３０９】
本発明はさらに、配列番号２８５４４、２８５４７および２８５５８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２９１によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３１０】
本発明はさらに、配列番号２８５６０、２８５６４および２９２０１からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２９２によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３１１】
本発明はさらに、配列番号２８５８４および２８５８６からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２９４によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３１２】
本発明はさらに、配列番号２８５８８、２８５８９、２８５９３、２８５９４、２８５９７および２８５９８からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２９５によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３１３】
本発明はさらに、配列番号２８６０４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２９６によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３１４】
本発明はさらに、配列番号２８６１２および２９２０４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２９７によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３１５】
本発明はさらに、配列番号２９２０７からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２９８によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３１６】
本発明はさらに、配列番号２８６４４からなる群より選択されるポリペプチドのように、配列番号２９９によってコードされるポリペプチドを提供する。
【０３１７】
他の局面において、本発明は、上記のようなポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および生理学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【０３１８】
本発明の関連の局面において、予防用または治療用用途のためのワクチンが提供される。このようなワクチンは、上記のようなポリペプチドまたはポリヌクレオチド、および免疫刺激剤を含む。
【０３１９】
本発明はさらに以下：（ａ）Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメント；および（ｂ）生理学的に受容可能なキャリア、を含む薬学的組成物を提供する。
【０３２０】
さらなる局面において、本発明は、以下：（ａ）上記のようなポリペプチドを発言する抗原提示細胞、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤、を含む薬学的組成物を提供する。抗原提示細胞は、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞、およびＢ細胞を含む。
【０３２１】
関連の局面において、以下：（ａ）上記のようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、および（ｂ）免疫刺激剤、を含むワクチンが提供される。
【０３２２】
本発明はさらに、他の局面において、上記のような少なくとも１つのポリペプチドを含む融合タンパク質、およびこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【０３２３】
関連の局面において、生理学的に受容可能なキャリアと組み合わせて、融合タンパク質、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む薬学的組成物が提供される。
【０３２４】
他の局面において、免疫刺激剤と組み合わせて、融合タンパク質、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンがさらに提供される。
【０３２５】
さらなる局面において、本発明は、患者における挫瘡の処置のための方法を提供する。この方法は、上記の薬学的組成物またはワクチンを患者に投与する工程を包含する。患者が、挫瘡に罹患されている場合、この方法は疾患の処置を提供し得るか、または挫瘡の危険性が考慮される患者は予防的に処置され得る。
【０３２６】
他の局面において、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質について特異的なＴ細胞を刺激および／または増殖するための方法がさらに提供される。この方法は、Ｔ細胞の刺激および／または増殖を可能にするのに十分な条件および時間のもとで、Ｔ細胞を、以下：（ｉ）上記のポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および／または（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞、の１つ以上と接触させる工程を包含する。上記のように調製されたＴ細胞を含む単離されたＴ細胞集団がまた提供される。
【０３２７】
さらなる局面において、本発明は、患者における挫瘡の発生または進行を阻害する方法を提供する。この方法は、上記のようなＴ細胞集団の有効量を患者に投与する工程を包含する。
【０３２８】
本発明はさらに、患者における挫瘡の処置のための方法を提供する、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から単離されたＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を、以下の１以上とともにインキュベートする工程：（ｉ）Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質の少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞；および（ｂ）有効量の増殖したＴ細胞を患者に投与し、そしてそれによって患者における挫瘡の発生または進行を阻害する工程。増殖した細胞は、患者への投与の前にクローニングされ得るが、それは必要ではない。
【０３２９】
さらなる局面において、本発明は、患者におけるＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの存在または非存在を決定する方法を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、上に列挙されたポリペプチドに結合する結合因子と接触させる工程；（ｂ）この結合因子に結合するポリペプチドの、サンプル中における量を検出する工程；および（ｃ）ポリペプチドの量を、予め決定されたカットオフ値と比較し、それから患者におけるこの生物体の存在または非存在を決定する工程。好ましい実施形態において、結合因子は、抗体、より好ましくはモノクローナル抗体である。
【０３３０】
本発明はまた、他の局面において、患者における挫瘡の進行をモニタリングする方法を提供する。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）第１の時点で、患者より得た生物学的サンプルを、上に列挙されたポリペプチドに結合する結合因子と接触させる工程；（ｂ）結合因子に結合するポリペプチドの、サンプル中における量を検出する工程；（ｃ）その後、続く時点で、患者より得た生物学的サンプルを使用して、工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）で検出されたポリペプチドの量を、工程（ｂ）で検出された量と比較する工程。
【０３３１】
本発明は、他の局面において、患者におけるＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの存在または非存在を決定する方法をさらに提供し、その方法は、以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド、好ましくはｍＲＮＡの、サンプル中におけるレベルを検出する工程；および（ｃ）オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドのレベルを、予め決められたカットオフ値と比較し、それから患者におけるこの生物体の存在または非存在を決定する工程。特定の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、例えば、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマー（上に列挙されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはこのようなポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズする）を用いるポリメラーゼ連鎖反応を通じて検出される。他の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、上記に列挙されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのようなポリヌクレオチドの相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用してハイブリダイゼーション技術を使用して検出される。
【０３３２】
関連する局面において、患者における挫瘡の進行をモニタリングする方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドと接触させる工程；（ｂ）このオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの、サンプル中における量を検出する工程；（ｃ）その後、続く時点で、患者より得られた生物学的サンプルを使用して、工程（ａ）および（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）で検出されたポリヌクレオチドの量を、工程（ｂ）で検出された量と比較する工程。
【０３３３】
さらなる局面において、本発明は、上記のようにポリペプチドに結合するモノクローナル抗体のような抗体、ならびにそのような抗体を備える診断キットを提供する。上記のような１以上のオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを備える診断キットもまた、提供される。
【０３３４】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば明確になる。本明細書中に開示されるすべての参考文献は、各々が個別に援用されるように、そのすべてが本明細書中で参考として援用される。
【０３３５】
（発明の詳細な説明）
上記のように、本発明は一般に、組成物およびこの組成物を使用するための方法（例えば、挫瘡、特に生物体であるＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓによって全体または一部が生じる、挫瘡の形態の治療および診断）に関する。本明細書中に記載される特定の例示的な組成物としては、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗原のような結合因子、抗原提示細胞（ＡＰＣ）および／または免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられる。特定の好ましいＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチドは、挫瘡に罹患した患者の抗血清と（ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットのようなイムノアッセイで）検出可能に反応するポリペプチドである。
【０３３６】
本発明の実施には、特に逆に示さない限り、当業者の範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、および組み換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。その多くが例示の目的で以下に記載されている。このような技術は、本明細書において完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第二版，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，第Ｉ巻およびＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ、編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、編、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【０３３７】
本明細書に引用した全ての刊行物、特許および特許出願は、前出であっても後出であっても、その全体が参考として本明細書に援用される。
【０３３８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「１つの（ａ、ａｎ）」および「この、その（ｔｈｅ）」は、文脈が明白に他を示さない限り、複数の言及を含む。
【０３３９】
従って、上記に従って、そして以下でさらに記載されるように、本発明は、配列番号１〜２９９に記載される配列を有する例示的なポリヌクレオチド組成物、配列番号３００〜２９，２１２に記載のアミノ酸配列を有する例示的ポリペプチド、このようなポリペプチドに結合し得る抗体組成物、ならびにこれらの組成物および他の組成物を使用する多数のさらなる実施形態（例えば、ヒトの挫瘡の検出、診断および／または治療）を提供する。
【０３４０】
（ポリヌクレオチド組成物）
本明細書中で使用される場合、用語「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」は、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まない単離されたＤＮＡ分子をいう。従って、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、ＤＮＡセグメントが得られる種の全ゲノムＤＮＡから実質的に単離されたか、またはこのゲノムＤＮＡから精製された、１つ以上のコード配列を含むＤＮＡセグメントをいう。ＤＮＡセグメントおよびこのようなセグメントのより小さなフラグメント、そしてまた、組換えベクター（例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなどを含む）が、用語「ＤＮＡセグメント」および「ポリヌクレオチド」内に含まれる。
【０３４１】
当業者に理解されるように、本発明のＤＮＡセグメントは、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するか、または発現し得るように適応されたゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドにコードされる配列、ならびにより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、自然に単離され得るか、または人の手によって合成的に改変され得る。
【０３４２】
本明細書中で使用される場合、「単離された」は、ポリヌクレオチドが、実質的に他のコード配列から離れており、そしてＤＮＡセグメントが無関係のコードＤＮＡ（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子あるいはポリペプチドコード領域）の大部分を含まないことを意味する。当然のことながら、これは、最初に単離され、そして人の手によってセグメントに後に加えられた遺伝子またはコード領域を除外しないＤＮＡセグメントをいう。
【０３４３】
当業者に認識されるように、ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であり得、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、ＨｎＲＮＡ分子（これはイントロンを含み、そしてＤＮＡ分子に１対１の様式で対応する）、およびｍＲＮＡ分子（これは、イントロンを含まない）を含む。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るがその必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結され得るがその必要はない。
【０３４４】
ポリヌクレオチドは、ネイティブの配列（すなわち、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質またはその一部をコードする内因性配列）を含み得るか、あるいはこのような配列の改変体、または生物学的もしくは抗原性の機能的均等物を含み得る。ポリヌクレオチド改変体は、以下にさらに記載されるように、好ましくはネイティブのＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質と比較して、コードされたポリペプチドの免疫原性が減少しないように、１つ以上の置換、付加、欠失、および／または挿入を含み得る。コードされたポリペプチドの免疫原性に対する効果は、一般に、本明細書中に記載されるように評価され得る。用語「改変体」はまた、異種間の起源の相同な遺伝子を含む。
【０３４５】
ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を比較する場合、２つの配列におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載されるように最大一致について整列される場合に同じときに、２つの配列が「同一」であるといわれる。２つの配列の間の比較は、代表的には、配列類似性の局所領域を同定および比較するために、比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）にわたって配列を比較することによって行われる。本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」とは、２つの配列が最適に整列された後に、配列が連続した位置の同じ数の参照配列と比較され得る、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続した位置のセグメントをいう。
【０３４６】
比較のための配列の最適な整列は、生命情報科学ソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスイート（ｓｕｉｔｅ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメーターを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  第５巻，補遺３，３４５−３５８頁におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ  ｐｐ．６２６−６４５  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６−７３０。
【０３４７】
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所同定アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同定整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
【０３４８】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムであり、これはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメーターを使用して使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアーは、生物工学情報についてのナショナルセンター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公に利用可能である。１つの例示的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基の対についての報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ  ｓｃｏｒｅ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出され得る。アミノ酸配列について、スコアリング行列を用いて、累積スコアを算出し得る。各指示におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長さ（Ｗ）１１、および期待値（Ｅ）１０をデフォルトとして使用し、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５を参照のこと）は、５０の（Ｂ）、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を整列する。
【０３４９】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０位置の比較ウインドウにわたる２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の部分は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を乗算して配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【０３５０】
従って、本発明は、本明細書中に開示される配列に実質的に同一性を有するポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列（例えば、本明細書中に記載される方法（例えば、以下に記載するような標準パラメーターを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用する本発明のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と比較して、少なくとも５０％以上の配列同一性、好ましくは少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上の配列同一性を含む配列）を含む。当業者は、これらの値が、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置などを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために、適切に調整され得ることを認識する。
【０３５１】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書中に記載の配列の１つ以上に同一であるかまたは相補的な配列の種々の長さの連続したストレッチを含む単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドを提供する。例えば、本発明に開示される配列の１つ以上の、少なくとも約１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００以上、ならびにその間の中間の長さの連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチド（好ましくは、Ｐ．ａｃｎｅｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）が、本発明によって提供される。この文脈において、「中間の長さ」が、示される値の間の任意の長さ（例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００〜５００；５００〜１，０００などの間の全ての整数を含む）を意味することが容易に理解される。
【０３５２】
本発明のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、そのコード配列自体の長さに関わらず、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と組合わされ得、その結果、その全体の長さは、相当変化し得る。従って、ほとんど任意の長さの核酸フラグメントが使用され得ることが意図され、その全長は、好ましくは意図した組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０の塩基対長など（全ての中間の長さを含む）の全長を有する例示的なＤＮＡセグメントが、本発明の多くの実行において有用であることが意図される。
【０３５３】
本発明の別の実施形態において、中程度〜高度にストリンジェントな条件下で、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列またはそのフラグメント、あるいはその相補配列にハイブリダイズし得るポリヌクレオチド組成物が提供される。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の分野において周知である。例示の目的で、本発明のポリヌクレオチドの、他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するために適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予洗；５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーション；続いて０．１％  ＳＤＳを含む２×、０．５×、および０．２×ＳＳＣで各２０分、６５℃で２回の洗浄を含む。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが、容易に操作され得ること（例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度および／またはハイブリダイゼーションが行われる温度を変化させることによる）を理解する。例えば、別の実施形態において、適切な高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション温度が上昇したこと（例えば、６０〜６５℃、または６５〜７０℃）を除いた、上記のものを含む。
【０３５４】
特定の好ましい実施形態において、上記ポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド改変体、フラグメントおよびハイブリダイズする配列）は、本明細書中に具体的に記載されるポリペプチド配列と免疫学的に交差反応するポリペプチドをコードする。他の好ましい実施形態において、このようなポリヌクレオチドは、本明細書中に具体的に記載されるポリペプチド配列の免疫原性活性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の免疫原性活性のレベルを有するポリペプチドをコードする。
【０３５５】
さらに、遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのうちいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドンの用法における差異に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に意図される。さらに、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換）の結果として変化する内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有し得るが、その必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて、同定され得る。
【０３５６】
（プローブおよびプライマー）
本発明の他の実施形態において、本明細書中で提供されるポリヌクレオチド配列は、核酸のハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして、有利に使用され得る。そのようなものとして、本明細書中で開示される１５ヌクレオチド長の連続した配列と同じ配列か、またはこの連続した配列に相補的な配列を有する、少なくとも約１５ヌクレオチド長の連続した配列の配列領域を含む核酸セグメントが、特定の有用性を見出すことが意図される。より長い連続した同一または相補的な配列（例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００（全ての中間長さを含む）および全長配列までもの配列）はまた、特定の実施形態において使用される。
【０３５７】
このような核酸プローブの、目的の配列に特異的にハイブリダイズする能力は、所定のサンプルにおける相補配列の存在を検出におけるこれらの核酸プローブの使用を可能にする。しかし、他の用途（例えば、変異体種プライマーの調製のための配列情報の使用、または他の遺伝的構築物の調製における使用のためのプライマーの使用）もまた想定される。
【０３５８】
１０〜１４、１５〜２０、３０、５０、または１００〜２００ヌクレオチド程度（同様に中間長さを含む）の連続したヌクレオチドストレッチからなる配列領域を有し、配列番号１〜２９９に同一または相補的なポリヌクレオチド分子は、例えばサザンブロッティングまたはノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして特に意図される。これは、遺伝子産物またはそのフラグメントの、多様な細胞型およびまた種々の細菌細胞の両方における分析を可能にする。フラグメントの全サイズ、ならびに相補的ストレッチのサイズは、究極的には、特定の核酸セグメントの意図される用途または適用に依存する。より小さなフラグメントは、一般にハイブリダイゼーション実施形態における用途を見出し、ここで連続した相補領域の長さが変化され得る（例えば、約１５ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間）が、検出を望む相補配列の長さに従って、より長い連続した相補ストレッチが使用され得る。
【０３５９】
約１５〜２５ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定および選択的の両方の二重鎖分子の形成を可能にする。しかし、１５塩基長より長いストレッチにわたる連続した相補配列を有する分子は、ハイブリッドの安定性および選択性を増加するために一般に好ましく、それによって、得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度が改善する。１５〜２５の連続したヌクレオチド、または望まれる場合にはより長い遺伝子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計するのが一般には好ましい。
【０３６０】
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に開示される配列のいずれかの、任意の部分から選択され得る。配列番号１〜２９９に記載の配列、あるいはプローブまたはプライマーとしての利用を望む約１５〜２５ヌクレオチド長から全長配列まで、および全長配列を含む配列の任意の連続した部分までを再検討することが、必要とされる全てである。プローブおよびプライマー配列の選択は、種々の要因によって支配され得る。例えば、例のみとして、全配列の終端に向かってプライマーを使用することが望まれ得る。
【０３６１】
小さなポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、通常自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して行われるように、例えば化学的手段によってフラグメントを直接合成することによって、容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸複製技術（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号（本明細書中に参考として援用される）のＰＣＲＴＭ技術）の適用によって、組換え産物のために選択配列を組換えベクターに導入することによって、および一般に分子生物学の分野の当業者に公知の他の組換えＤＮＡ技術によって、得られ得る。
【０３６２】
本発明のヌクレオチド配列は、目的の完全遺伝子または遺伝子フラグメントの相補的ストレッチと、二重鎖分子を選択的に形成するその能力のために使用され得る。想定される適用に依存して、代表的には、標的配列に対するプローブの選択性の種々の程度に達するために、ハイブリダイゼーションの種々の条件を使用することが望ましい。高い選択性を必要とする適用について、代表的には、ハイブリッドを形成するための比較的ストリンジェントな条件を使用することが望ましい（例えば、比較的低い塩、および／または高温の条件（例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩の塩濃度によって提供されるような）を選択する）。このような選択条件は、存在する場合、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチにわずかに許容性であり、そして関連する配列の単離のために特に適切である。
【０３６３】
当然のことながら、いくつかの適用（例えば、潜在的なテンプレートにハイブリダイズする変異体プライマー鎖を使用する、変異体の調製が望ましい場合）について、低ストリンジェント（減少したストリンジェンシー）のハイブリダイゼーション条件は、ヘテロ二重鎖の形成を可能にするために代表的に必要とされる。これらの状況において、約２０℃〜約５５℃の温度範囲で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩の条件のような塩条件を使用することが望ましくあり得る。これによって、交差ハイブリダイズ種は、コントロールハイブリダイゼーションに関して、陽性ハイブリダイズシグナルとして容易に同定され得る。任意の場合において、増加した量のホルムアミド（これは、増加した温度と同じ様式で、ハイブリッド二重鎖を不安定化するように作用する）の添加によって、条件がよりストリンジェントになり得ることが一般に理解される。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、従って一般に、所望の結果に依存して選択される方法である。
【０３６４】
（ポリヌクレオチドの同定および特徴づけ）
ポリヌクレオチドは、種々の十分に確立された技術のいずれかを使用して、同定、調製および／または操作され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、以下により詳細に記載されるように、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｕｎｅｓ  ｃＤＮＡのマイクロアレイをスクリーニングすることによって、同定され得る。このようなスクリーニングは、例えば、製造者の指示に従ってＳｙｎｔｅｎｉマイクロアレイ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して（そして本質的にＳｃｈｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１０６１４−１０６１９，１９９６およびＨｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：２１５０−２１５５，１９９７に記載されるように）、行われ得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるタンパク質を発現する細胞（例えば、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｕｎｅｓ由来ＤＮＡを含む細胞）から調製されるｃＤＮＡから増幅され得る。このようなポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅され得る。このアプローチのために、配列特異的プライマーが、本明細書中で提供される配列に基づいて設計され得、そして購入または合成され得る。
【０３６５】
本発明のポリヌクレオチドの増幅した部分を使用して、適切なライブラリー（例えば、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｕｎｅｓ  ｃＤＮＡライブラリー）から周知の技術を使用して全長遺伝子を単離し得る。このような技術において、増幅に適した１以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用して、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー）をスクリーニングする。好ましくは、ライブラリーはより大きな分子を含むようにサイズが選択される。無作為に刺激されたライブラリー（ｒａｎｄｏｍ  ｐｒｉｍｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）もまた、遺伝子の５’領域および上流領域の同定ために好ましくあり得る。ゲノムライブラリーは、イントロンを入手することおよび５’配列を伸長させることについて好ましくあり得る。
【０３６６】
ハイブリダイゼーション技術に関して、部分配列は、周知の技術を使用して標識（例えば、ニックトランスレーションまたは３２Ｐでの末端標識）され得る。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーは、一般に、標識プローブと、変性した細菌コロニー（またはファージプラークを含む菌叢）を含むフィルターとをハイブリダイズすることによってスクリーニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズするコロニーまたはプラークを選択し、そして拡大する。そしてそのＤＮＡをさらなる分析のために単離する。ｃＤＮＡクローンを、さらなる配列の量を決定するために、例えば、部分配列由来のプライマーおよびそのベクター由来のプライマーを使用するＰＣＲによって分析し得る。制限地図および部分配列を作成して、１以上の重複クローンを同定し得る。次いで、標準的な技術（これは、一連の欠失クローンを作製することを包含し得る）を使用して完全配列を決定し得る。次いで、得られた重複配列を１つの連続配列にアセンブルし得る。周知の技術を使用して、適切なフラグメントを連結することにより全長ｃＤＮＡ分子を生成し得る。
【０３６７】
あるいは、部分ｃＤＮＡ配列から全長コード配列を得るための多くの増幅技術が存在する。このような技術において、増幅は、一般的に、ＰＣＲを介して行われる。種々の市販キットのいずれかを使用して増幅工程を行い得る。例えば、当該分野で周知のソフトウエアーを使用してプライマーを設計し得る。多くの適用に対してプライマーは、好ましくは、長さが２２〜３０ヌクレオチドであり、少なくとも５０％のＧＣ含有量を有し、そして標的配列に約６８℃〜７２℃の温度でアニールする。増幅した領域は、上記に記載されるように配列決定され得、そして重複配列が連続する配列へと構築され得る。
【０３６８】
このような増幅技術の１つは、インバースＰＣＲである（Ｔｒｉｇｌｉａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８１８６，１９８８を参照のこと）。この技術は、制限酵素を使用して、その遺伝子の既知の領域内のフラグメントを生成する。次いで、このフラグメントを分子内連結により環状化し、そして既知の領域に由来する多岐したプライマーを用いたＰＣＲのための鋳型として使用する。代替のアプローチにおいて、部分配列に隣接した配列を、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーを使用する増幅により取り出し得る。この増幅した配列を、代表的に、同じリンカープライマーおよび既知の領域に特異的な第２のプライマーを使用する２回目の増幅に供する。既知の配列から反対方向に伸長を開始する２つのプライマーを使用するこの手順についての改変は、ＷＯ  ９６／３８５９１に記載される。そのような別の技術は、「迅速なｃＤＮＡ末端の増幅」またはＲＡＣＥとして公知である。この技術は、公知配列の５’および３’である配列を同定するために、内側プライマーおよび外側プライマー（これは、ポリＡ領域またはベクター配列にハイブリダイズする）の使用を含む。さらなる技術としては、キャプチャーＰＣＲ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９，１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０，１９９１）が挙げられる。増幅を利用する他の方法もまた使用して、全長ｃＤＮＡ配列を入手し得る。
【０３６９】
特定の場合において、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋより入手可能のもの）に提供される配列の分析により、全長ｃＤＮＡ配列を入手することが可能である。重複ＥＳＴの検索は、一般に、周知のプログラム（例えば、ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ検索）を使用して行われ得、そしてこのようなＥＳＴを使用して連続した全長配列を生成し得る。全長ＤＮＡ配列はまた、ゲノムフラグメントの分析により入手され得る。
【０３７０】
（宿主細胞におけるポリヌクレオチド発現）
本発明の他の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、適切な宿主細胞におけるポリペプチドの発現に方向付けるように組換えＤＮＡ分子において使用され得る。遺伝コードの先天的な縮重に起因して、実質的に同じか、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が産生され得、そしてこれらの配列を使用して所定のポリペプチドをクローン化し、そして発現させ得る。
【０３７１】
当業者によって理解されるように、いくつかの場合において、天然に存在しないコドンを所有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を作製することが有利であり得る。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンは、タンパク質発現の速度を増加させるためか、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生成される転写物の半減期よりも長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するように選択され得る。
【０３７２】
さらに、本発明のポリヌクレオチド配列は、種々の理由（遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を変更する改変が挙げられるが、それらに限定されない）のためにポリペプチドコード配列を変更するために、当該分野において一般的に公知の方法を使用して操作され得る。例えば、無作為切断によるＤＮＡシャッフリングならびに遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再アセンブリを使用して、ヌクレオチド配列を操作し得る。さらに、部位指向性変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して、新たな制限部位を挿入し得るか、グリコシル化パターンを改変し得るか、コドン優先（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を変化させ得るか、スプライス改変体を作製し得るか、または変異を導入したりなどし得る。
【０３７３】
本発明の別の実施形態において、天然の核酸配列、改変された核酸配列、または組換え核酸配列は、融合タンパク質をコードするために異種配列に連結され得る。例えば、ポリペプチド活性のインヒビターについてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体により認識され得るキメラタンパク質をコードすることが有用であり得る。融合タンパク質はまた、ポリペプチドコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作され得、その結果そのポリペプチドは、切断され得、そして異種部分から精製されて取り出され得る。
【０３７４】
所望のポリペプチドをコードする配列が、当該分野において周知の化学的方法を使用して、全体または部分的に合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５〜２２３、Ｈｏｒｎ，Ｔら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５〜２３２を参照のこと）。あるいは、タンパク質自体は、ポリペプチドまたはその一部のアミノ酸配列を合成するための化学的方法を使用して産生され得る。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術を使用して実施され得（Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｙら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：２０２〜２０４）、そして自動化合成は、例えば、ＡＢＩ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して達成され得る。
【０３７５】
新たに合成されたペプチドは、例えば、分離高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）または当該分野において利用可能な他の同等技術により実質的に精製され得る。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解手順）により確認され得る。さらに、ポリペプチドまたはその任意の部分のアミノ酸配列は、直接合成の間改変されて、そして／または化学的方法を使用して、他のタンパク質もしくはその任意の部分に由来する配列と組み合わせられて、改変体ポリペプチドを産生し得る。
【０３７６】
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または機能的等価物は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）内に挿入され得る。当業者に周知である方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列および適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。そのような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載される。
【０３７７】
種々の発現ベクター／宿主系が、ポリヌクレオチド配列を含み、そして発現させるように利用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌）；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系。
【０３７８】
発現ベクター内に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するように宿主細胞タンパク質と相互作用する、それらのベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）である。そのようなエレメントは、その強度および特異性を変更し得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が使用され得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘導性プロモーター（例えば、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターが使用され得る。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが、一般的に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成することが必要とされる場合、ＳＶ４０またはＥＢＶベースのベクターが、適切な選択マーカーと共に都合良く使用され得る。
【０３７９】
細菌系において、多数の発現ベクターが、発現されるポリペプチドに対して意図される使用に依存して選択され得る。例えば、抗体の誘導のために大量に必要とされる場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を方向づけるベクターが使用され得る。そのようなベクターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ここでは目的のポリペプチドをコードする配列が、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに引続く７残基についての配列とインフレームでベクター内に連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ，Ｇ．およびＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）はまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次に遊離のグルタチオンの存在下において溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製され得る。そのような系において作製されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され得、その結果、クローン化された目的のポリペプチドが、随意にＧＳＴ部分から放出され得る。
【０３８０】
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ）を含む多数のベクターが使用され得る。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌら、（前出）およびＧｒａｎｔら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照のこと。
【０３８１】
植物発現ベクターを使用する場合において、ポリペプチドをコードする配列の発現は、任意の多数のプロモーターにより駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーター）が、単独でか、またはＴＭＶに由来するωリーダー配列と組み合わせて使用され得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３０７−３１１）。あるいは、植物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたはヒートショックプロモーター）を使用し得る（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇら、（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ，Ｒら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２４：８３８−８４３；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．ら、（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５）。これらの構築物は、直接的ＤＮＡ形質転換または病原体媒介性トランスフェクションによって植物細胞内に導入され得る。そのような技術は、多数の一般的に入手可能な概説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ，Ｓ．またはＭｕｒｒｙ，Ｌ．Ｅ．ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｙｅａｒｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；１９１−１９６頁を参照のこと）。
【０３８２】
昆虫系はまた、目的のポリペプチドを発現させるために使用され得る。例えば、そのような１つの系において、オートグラファカリフォルニア核発汗病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅにおいて外来遺伝子を発現させるベクターとして使用される。ポリペプチドをコードする配列は、ウイルスの非必須領域内（例えば、ポリへドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）にクローン化され得て、ポリへドリンプロモーターの制御下に置かれ得る。ポリペプチドコード配列の首尾良い挿入は、ポリへドリン遺伝子を不活性化し、そして外殻タンパク質を欠損している組換えウイルスを産生する。次いで、この組換えウイルスを使用して、例えば、目的のポリペプチドが発現され得る、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｌａｒｖａｅに感染させ得る（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）。
【０３８３】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系が一般的に利用可能である。例えば、アデノウイルスが、発現ベクターとして使用される場合において、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび３部からなるリーダー配列から構成されるアデノウイルス転写／翻訳複合体に連結され得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現し得る、生存可能ウイルスを入手し得る（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）を使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させ得る。
【０３８４】
特定の開始シグナルはまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。そのようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合において、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要とされなくとも良い。しかし、コード配列のみ、またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために正確なリーディングフレーム内にあるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）に由来し得る。発現の効率は、使用される特定の細胞系に適切なエンハンサー（例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら、（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）に記載されるエンハンサー）の封入によって増大され得る。
【０３８５】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の様式において発現されたタンパク質をプロセシングするその能力について選択され得る。ポリペプチドのそのような改変としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、リピデーション（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングはまた、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能を促進させるために使用され得る。異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）（これらは、そのような翻訳後活性についての特定の細胞機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）および特徴的機構（ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）を有する）は、正確な改変および外来タンパク質のプロセシングを確実にするように選択され得る。
【０３８６】
組換えタンパク質の長期間で高収率の産生のために、安定な発現が一般的に好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株が、ウイルス複製起点および／または内因性発現エレメントならびに同じかもしくは別個のベクター上の選択マーカー遺伝子を含み得る、発現ベクターを使用して形質転換され得る。そのベクターの導入後、細胞は、それらが選択培地に切換えられる前に、富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培地において１〜２日間の増殖が可能とされ得る。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、そしてその存在は、導入された配列を首尾良く発現する細胞の増殖および回収を可能とする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適切な組織培養技術を使用して、増殖され得る。
【０３８７】
多数の選択系を使用して、形質転換細胞株を回収し得る。これらの選択系としては、それぞれ、ｔｋ．ｓｕｐ．−細胞またはａｐｒｔ．ｓｕｐ−細胞において使用され得る、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍら、（１９７７）Ｃｅｌｌ  １１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉら、（１９９０）Ｃｅｌｌ  ２２：８１７−２３）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗剤耐性、抗生物質耐性または除草剤耐性は、選択のための基礎として使用され得る；例えば、ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０））；ｎｐｔ（これは、アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆら、（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４）；ならびにａｌｓまたはｐａｔ（これらは、それぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える（Ｍｕｒｒｙ、前出））。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢ（これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）またはｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）。最近、アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質のＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質のルシフェリンのようなマーカーを用いる、可視マーカーの使用の人気が高くなっており、形質転換体を同定するためのみならず、特定のベクター系に起因し得る一過性のタンパク質発現または安定なタンパク質発現の量を定量するためにもまた広範に使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら、（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
【０３８８】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、目的の遺伝子もまた存在するということを示唆しているが、その存在および発現は、確認されることを必要とし得る。例えば、ポリヌクレオチドをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入される場合、配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、１つのプロモーターの制御下にポリペプチドコード配列と直列に配置され得る。誘導または選択に応じてマーカー遺伝子の発現は、通常、その直列遺伝子の発現も同様に示す。
【０３８９】
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含み、かつ発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の手順によって同定され得る。これらの手順としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：核酸またはタンパク質の検出および／または定量化のための膜ベースの技術、溶液ベースの技術、またはチップベースの技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション技術およびタンパク質バイオアッセイ技術またはイムノアッセイ技術。
【０３９０】
ポリヌクレオチドコード化産物に特異的なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、ポリヌクレオチドコード化産物の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当該分野において公知である。例としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。所定のポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を利用する２つの部位の、モノクローナルベースのイムノアッセイが、いくつかの適用のために好まれ得るが、競合的結合アッセイもまた、利用され得る。これらのアッセイおよび他のアッセイが他の場所に記載される（Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｒら、（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ  Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら、（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６）。
【０３９１】
広範に種々の標識技術および結合技術は、当業者に公知であり、そして種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを作製するための手段としては、オリゴ標識（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション、末端標識または標識されたヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ｍＲＮＡプローブの産生のために、配列またはその任意の部分が、ベクター内にクローン化され得る。そのようなベクターは、当該分野において公知であり、市販されており、そして適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）および標識されたヌクレオチドを添加することにより、ＲＮＡプローブをインビトロで合成するために使用され得る。これらの手順は、種々の市販キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＰｒｏｍｅｇａおよびＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）を使用して実施され得る。使用され得る適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素形成剤ならびに基質、コファクター、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
【０３９２】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、発現および細胞培養からタンパク質を回収するのに適した条件下において培養され得る。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して、細胞内に分泌または含まれ得る。当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を介して、コードされたポリペプチドの分泌を方向付けるシグナル配列を含むように設計され得る。他の組換え構築物を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させ得る。そのような精製促進ドメインとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：固定された金属上での精製を可能にする金属キレート化ペプチド（例えば、ヒスチジン−トリプトファンモジュール）、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）において利用されるドメイン。精製ドメインとコードされるポリペプチドとの間に切断可能なリンカー配列（例えば、第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに対して特異的な配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））の封入体を使用して、精製を促進させ得る。そのような発現ベクターの１つは、目的のポリペプチドを含む融合タンパク質およびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前に６つのヒスチジン残基をコードする核酸の発現を提供する。ヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ，Ｊら、（１９９２、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１）に記載されるように、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上での精製を促進する一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊら、（１９９３；ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｏｉｌ，１２：４４１−４５３）において提供される。
【０３９３】
組換え産生方法に加えて、本発明のポリペプチドおよびそのフラグメントは、固相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｊ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）を使用する、直接的ペプチド合成によって産生され得る。タンパク質合成は、手動技術を使用してか、または自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、達成され得る。あるいは、種々のフラグメントは、別々に化学的に合成されて、そして全長分子を産生するために化学的方法を使用して組み合わせられ得る。
【０３９４】
（部位特異的変異誘発）
部位特異的変異誘発は、個々のペプチド、または生物学的に機能的等価なポリペプチドの調製の際に有用な技術であり、この変異誘発は、それらをコードする、基礎を成すポリヌクレオチドの特異的変異誘発を介する。当業者に周知の技術は、例えば、１つ以上の前述の考察を取り入れながら、１つ以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡ内に導入することによって配列改変体を調製し、そして試験する迅速な能力をさらに提供する。部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を介して変異体の産生を可能にし、横断される欠失結合部の両側に安定な二重鎖を形成するために、十分なサイズのプライマー配列および配列複雑性を提供する。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善するか、変更するか、減少させるか、修飾するか、さもなくば変化させるため、そして／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成物、安定性または一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
【０３９５】
本発明の特定の実施形態において、本発明者らは、コードされたポリペプチドの１つ以上の特性（例えば、ポリペプチドワクチンの抗原性）を変更するような開示されたポリヌクレオチド配列の変異誘発を意図する。部位特異的変異誘発の技術は、当該分野において周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の改変体を作製するために広範に使用される。例えば、部位特異的変異誘発は、しばしば、ＤＮＡ分子の特定部分を変更するために使用される。そのような実施形態において、代表的に約１４ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの長さから成るプライマーが使用され、配列の両側の結合部にある、約５残基〜約１０残基が変更される。
【０３９６】
当業者によって理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、しばしば、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用してきた。部位特異的変異誘発において有用である代表的なベクターとしては、例えば、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファージは、容易に商業的に入手可能であり、そしてそれらの使用は、一般的に当業者に周知である。二本鎖プラスミドもまた、目的の遺伝子をプラスミドからファージに伝達する工程を取り除く部位特異的変異誘発において慣用的に使用される。
【０３９７】
一般的に、本発明に従う部位特異的変異誘発は、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列中に含む、一本鎖ベクターを最初に入手する工程またはその配列を含む二本鎖ベクターの２本の鎖を融解して分ける工程によって実行される。所望の変異した配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的に、合成的に調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖ベクターとともにアニーリングされ、そして変異を保有する鎖の合成を完了するために、ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ  Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）に供せられる。このようにヘテロ二重鎖が形成され、ここで一方の鎖が変異を有さないもともとの配列をコードし、そして２つめの鎖は所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターは、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために使用され、そして、変異した配列の配置（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
【０３９８】
部位特異的変異誘発を使用する、選択されたペプチドコードＤＮＡセグメントの配列改変体の調製は、潜在的に有用な種を産生する手段を提供し、そしてこれは、限定を意味するものではない。なぜなら、ペプチドの配列改変体およびそれらをコードするＤＮＡ配列が入手され得る他の方法が存在するからである。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターは、変異誘発剤（例えば、ヒドロキシルアミン）で処理されて、配列改変体を入手し得る。これらの方法およびプロトコルに関する具体的な詳細は、Ｍａｌｏｙら、１９９４；Ｓｅｇａｌ、１９７６；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１；Ｋｕｂｙ、１９９４；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２（各々がその目的のために本明細書中に参考として援用される）の教示において見出され得る。
【０３９９】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」とは、鋳型依存的プロセスおよびベクター媒介増殖をいい、これは、その初期の濃度と比較して、特定の核酸分子の濃度の増加を生じるか、または検出可能なシグナルの濃度の増加（例えば、増幅）を生じる。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を含むプロセスをいうことが意図される。用語鋳型依存的プロセスとは、ＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成をいい、ここで新規に合成された核酸の鎖の配列は、相補的塩基対の周知の規則によって指示される（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７を参照のこと）。代表的には、ベクター媒介方法論は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの核酸フラグメントの導入、ベクターのクローン性増幅、および増幅した核酸フラグメントの回収を包含する。これらの方法論の例は、具体的にその全体が参考として本明細書中に援用される、米国特許第４，２３７，２２４号によって提供される。
【０４００】
（ポリヌクレオチド増幅技術）
多数の鋳型依存性プロセスが、サンプル中に存在する目的の標的配列（すなわち、本明細書中で開示されるポリヌクレオチド配列）を増幅するために利用可能である。最もよく知られた増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲＴＭ）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号に詳細に記載され、これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ＰＣＲＴＭにおいては、標的配列の向かい合った相補鎖上の領域に対して相補的な２つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合液に添加する。標的配列がサンプル中に存在する場合、プライマーはその標的に結合し、そしてポリメラーゼが、ヌクレオチドを付加することによって標的配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合液の温度を上昇および下降させることによって、伸長したプライマーは、標的から解離して反応生成物を形成し、過剰のプライマーは標的および反応生成物に結合し、そしてこのプロセスが反復される。好ましくは、逆転写およびＰＣＲＴＭ増幅手順が、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために実行され得る。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野で周知である。
【０４０１】
増幅のための別の方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲともいわれる）であり、欧州特許出願公開番号３２０，３０８（その全体が特に本明細書中に参考として援用される）において開示されている。ＬＣＲにおいては、２つの相補的プローブ対が調製され、そして標的配列の存在下では、各対がその標的の向かい合った相補鎖に結合し、その結果、それらは隣接する。リガーゼの存在下では、これらの２つのプローブ対は、連結して１つの単位を形成する。温度サイクリングによって、ＰＣＲＴＭにおけるのと同様に、結合した連結単位は標的から解離し、次いで過剰のプローブ対の連結のために「標的配列」として働く。米国特許第４，８８３，７５０号（その全体が参考として本明細書中に援用される）は、標的配列に対するプローブ対の結合のためのＬＣＲに類似する増幅の代替方法を記載する。
【０４０２】
Ｑβレプリカーゼ（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載され、その全体が参考として本明細書中に援用される）もまた、本発明におけるなお別の増幅方法として使用され得る。この方法において、標的の配列に相補的な領域を有するＲＮＡの複製配列が、ＲＮＡポリメラーゼの存在下でサンプルに添加される。このポリメラーゼは、次いで検出され得る複製配列をコピーする。
【０４０３】
等温増幅方法（ここで、制限エンドヌクレアーゼおよびリガーゼを使用して、制限部位の一方の鎖におけるヌクレオチド５’−［α−チオ］三リン酸を含む標的分子の増幅を達成する（Ｗａｌｋｅｒら、１９９２））もまた、本発明における核酸の増幅において有用であり得る。
【０４０４】
鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）は、複数のラウンドの鎖置換および合成（すなわち、ニックトランスレーション）を含む核酸の等温増幅を実行する別の方法である。同様の方法（修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＣＲ）と呼ばれる）は、本発明において有用であり得る別の増幅方法であり、そして増幅のために標的化される領域全体にわたっていくつかのプローブをアニーリングする工程、続いて４塩基のうちの２塩基のみが存在する修復反応を包含する。他の２塩基は、容易な検出のためにビオチン化誘導体として添加され得る。同様のアプローチは、ＳＤＡにおいて使用される。
【０４０５】
配列はまた、周期的プローブ反応（ｃｙｃｌｉｃ  ｐｒｏｂｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＣＰＲ）を使用して検出され得る。ＣＰＲにおいて、非標的ＤＮＡの３’配列および５’配列ならびに標的タンパク質特異的ＲＮＡの内部または「中間」配列を有するプローブは、サンプル中に存在するＤＮＡにハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーションに際して、反応物はＲＮａｓｅＨで処理され、そしてプローブの生成物は、消化後に遊離されるシグナルを生成することによって特有の産物として同定される。もともとの鋳型は、別のサイクリングプローブにアニーリングされ、そして反応が反復される。従って、ＣＰＲは、標的遺伝子特異的な発現した核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションによって生成されるシグナルを増幅する工程を包含する。
【０４０６】
英国特許出願番号２  ２０２  ３２８号およびＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５（これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるなお他の増幅方法は、本発明に従って使用され得る。前者の出願において、「修飾された」プライマーが、ＰＣＲ様の鋳型および酵素依存性合成において使用される。そのプライマーは、捕捉部分（例えば、ビオチン）および／または検出体部分（例えば、酵素）で標識することによって修飾され得る。後者の出願において、過剰の標識したプローブがサンプルに添加される。標的配列の存在下において、プローブが結合し、そして触媒的に切断される。切断後、標的配列は、過剰のプローブによって結合されるためにインタクトで遊離される。標識されたプローブの切断は、標的配列の存在をシグナルによって示す。
【０４０７】
他の核酸増幅手順には、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）（Ｋｗｏｈら、１９８９；ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ  ８８／１０３１５（その全体が本明細書中に参考として援用される））が挙げられ、これには、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲが含まれる。ＮＡＳＢＡにおいて、核酸は、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、サンプルの熱変性、溶解緩衝液を用いる処理、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの単離のためのミニスピンカラムまたはＲＮＡの塩化グアニジウム抽出によって増幅のために調製され得る。これらの増幅技術は、標的配列に特異的な配列を有するプライマーをアニーリングさせる工程を包含する。重合後、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドはＲＮａｓｅＨで消化され、一方、二本鎖ＤＮＡ分子は再度熱変性される。いずれの場合においても、一本鎖ＤＮＡは重合の前の第２の標的特異的プライマーの添加によって完全に二本鎖にされる。次いで、二本鎖ＤＮＡ分子は、ポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）によって相乗的に転写される。等温サイクル反応において、ＲＮＡはＤＮＡに逆転写され、そして再度ポリメラーゼ（例えば、Ｔ７またはＳＰ６）を用いて転写される。得られる生成物は、短縮型または完全型のいずれにせよ、標的特異的配列を示す。
【０４０８】
欧州特許出願公開番号３２９，８２２（その全体が本明細書中に参考として援用される）は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（これらは、本発明に従って使用され得る）をサイクル的に合成する工程を包含する核酸増殖プロセスを開示する。ｓｓＲＮＡは、第１のプライマーオリゴヌクレオチド（これは、逆転写酵素（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長される）のための最初の鋳型である。次いで、ＲＮＡは、得られるＤＮＡ：ＲＮＡ二重鎖からリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかとの二重鎖中のＲＮＡに特異的なＲＮａｓｅ）の作用によって除去される。得られたｓｓＤＮＡは、第２のプライマーのための第２の鋳型（これはまた、その鋳型に対するその相同性に対して５’側であるＲＮＡポリメラーゼプロモーター（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによって例示される）の配列を含む）である。次いで、このプライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな「クレノウ」フラグメントによって例示される）によって伸長させられ、プライマー間にもともとのＲＮＡの配列と同一の配列を有し、そして一方の端にプロモーター配列をさらに有する、二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）分子として得られる。このプロモーター配列は、ＤＮＡの多くのＲＮＡコピーを作製するために適切なＲＮＡポリメラーゼによって使用され得る。次いで、これらのコピーはサイクルに再び入り得、非常に迅速な増幅をもたらす。酵素の適切な選択を用いて、この増殖は、各サイクルで酵素の添加なしに等温で行われ得る。このプロセスのサイクル性の性質のために、開始の配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの形態であるように選択され得る。
【０４０９】
ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ  ８９／０６７００（その全体が本明細書中で参考として援用される）は、プロモーター／プライマー配列の多くのＲＮＡコピーの転写の前の、プロモーター／プライマー配列の標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのハイブリダイゼーションに基づく核酸配列増幅スキームを開示する。このスキームは、サイクル性ではない；すなわち、新しい鋳型は、得られたＲＮＡ転写物から産生されない。他の増幅方法には、「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）および「片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ（Ｏｈａｒａ、１９８９）」が挙げられ、これらは当業者に周知である。
【０４１０】
生じる「ジ−オリゴヌクレオチド」の配列を有し、それによってジ−オリゴヌクレオチドを増殖する核酸の存在下で２つ（または２より多い）のオリゴヌクレオチドの連結に基づく方法（ＷｕおよびＤｅａｎ、１９９６、その全体が参考として本明細書中に援用される）もまた、本発明のＤＮＡ配列の増幅において使用され得る。
【０４１１】
（生物学的機能的等価物）
修飾および変化が、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造においてなされ得、そしてなお、所望の特性を有するポリペプチドをコードする「機能的」分子を入手し得る。上述のように、特定のポリヌクレオチド配列に１以上の変異を導入することがしばしば所望される。いくつかの状況において、得られるコードされたポリペプチド配列はこの変異によって変更されるか、または他の場合において、このポリペプチドの配列は、コードするポリヌクレオチドにおける１以上の変異によっては変化しない。
【０４１２】
等価物または改善された第２世代の分子さえを作製するために、ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることが所望される場合、このアミノ酸の変化は、表１に従ってＤＮＡ配列をコードするコドンの１以上を変化させることによって達成され得る。
【０４１３】
例えば、特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上の結合部位のような構造との相互作用的な結合能の、感知できる程度の損失なしで、タンパク質構造中の他のアミノ酸を置換し得る。タンパク質の相互作用的な能力および性質がタンパク質の生物学的機能的活性を規定するので、特定のアミノ酸配列置換は、タンパク質配列、および当然ながら、その根底にあるＤＮＡコード配列においてなされ得、そしてそれにも関わらず、同様の特性を有するタンパク質が入手される。従って、種々の変化が、ペプチドの生物学的有用性または活性の感知できる程度の損失なしで、開示された組成物のペプチド配列またはそのペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列においてなされ得ることが本発明者らによって意図される。
【０４１４】
【表１】
2004520803.tif 000003
【０４１５】
このような変化を作製するために、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般的に当該分野において理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、本明細書中に参考として援用される）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性的性質は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これは次には、そのタンパク質の他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定することが受け入れられている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０４１６】
特定のアミノ酸が同様の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、そしてなお同様の生物学的活性を有するタンパク質を生じる（すなわち、生物学的に機能的に等価なタンパク質をなお入手する）ことが、当該分野において公知である。このような変化を作製する際に、その疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその疎水性親水性指標が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。同様なアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が本明細書中に参考として具体的に援用される）は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるようなタンパク質の最大局所的平均親水性が、タンパク質の生物学的特性と相関することを言及する。
【０４１７】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、同様の親水性の値を有する別のアミノ酸を置換し得、そしてなお、生物学的に等価なタンパク質（特に、免疫学的に等価なタンパク質）を得ることが理解される。このような変化において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその親水性値が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。
【０４１８】
上記に概説したように、従って、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、サイズ、など）に基づく。前述の種々の特徴を考慮する典型的な置換は当業者に周知であり、そして以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；およびバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【０４１９】
さらに、任意のポリヌクレオチドが、インビボでの安定性を増加させるためにさらに修飾され得る。可能な修飾には以下が挙げられるがこれらに限定されない：５’末端および／または３’末端での隣接配列の付加；骨格において、ホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒａｓｅ）結合よりはむしろホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；ならびに／あるいは従来とは異なる塩基（例えば、イノシン、キューオシン、およびワイブトシン、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル、メチル、チオ、および他の修飾形態）の含有。
【０４２０】
（インビボポリヌクレオチド送達技術）
さらなる実施形態において、本発明の１以上のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築物は、インビボで細胞に導入される。これは、種々のまたは周知のアプローチのいずれかを用いて達成され得、これらのいくつかは、例示の目的で以下に概説される。
【０４２１】
（１．アデノウイルス）
１以上の核酸配列のインビボ送達のための好ましい方法の１つは、アデノウイルス発現ベクターの使用を包含する。「アデノウイルス発現ベクター」は、（ａ）この構築物のパッケージングを支持するため、および（ｂ）センス方向またはアンチセンス方向でその中にクローニングされたポリヌクレオチドを発現するため、に十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。当然のことながら、アンチセンス構築物の文脈において、発現は、遺伝子産物が合成されることを必要としない。
【０４２２】
発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作された形態を含む。アデノウイルスの遺伝的構成の知見（３６ｋｂ、線状、二本鎖ＤＮＡウイルス）は、７ｋｂまでの外来性配列でアデノウイルスＤＮＡの大きな断片を置換することを可能にする（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体への組込みを生じない。なぜなら、アデノウイルスＤＮＡは、潜在的な遺伝毒性を有さないエピソーム性様式で複製し得るからである。また、アデノウイルスは構造的に安定であり、そして大規模な増幅後にゲノム再構成は検出されなかった。アデノウイルスは、細胞の細胞周期段階に関わりなく、実質的にすべての上皮細胞に感染し得る。今日まで、アデノウイルス感染は、穏やかな疾患（例えば、ヒトの急性呼吸器疾患）にのみに関連しているらしい。
【０４２３】
アデノウイルスは、その中程度のサイズのゲノム、操作の容易さ、高い力価、広範な標的−細胞範囲、および高い感染力のため、遺伝子移入ベクターとしての使用のために特に適している。ウイルスゲノムの両端は１００〜２００塩基対の逆方向反復（ＩＴＲ）を含み、これらは、ウイルスＤＮＡ複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである。ゲノムの初期（Ｅ）領域および後期（Ｌ）領域は、異なる転写単位を含み、これは、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分裂する。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の調節の原因であるタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現は、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成を生じる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞シャットオフに関与する（Ｒｅｎａｎ、１９９０）。後期遺伝子の産物（ウイルスキャプシドタンパク質の大多数を含む）は、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）によって与えられる単一の一次転写物の有意なプロセシング後にのみ発現される。ＭＬＰ（１６．８  ｍ．ｕ．に位置する）は、感染の後期の間に特に効率的であり、そしてこのプロモーターに由来するすべてのｍＲＮＡは、５’−３成分リーダー（ＴＰＬ）配列（この配列は、これらのｍＲＮＡを翻訳のために好ましいｍＲＮＡにする）を有する。
【０４２４】
現在の系では、組換えアデノウイルスが、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えから生成する。２つのプロウイルスベクター間の可能な組換えに起因して、野生型アデノウイルスは、このプロセスから生成され得る。従って、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離すること、およびそのゲノム構造を調べることが重要である。
【０４２５】
複製欠損である現在のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、特有のヘルパー細胞株（２９３と称される）に依存し、そのヘルパー細胞株は、Ａｄ５ＤＮＡフラグメントによりヒト胚性腎臓細胞から形質転換され、そしてＥ１タンパク質を構成的に発現する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムから不必要であるので（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８）、２９３細胞の補助によって、現在のアデノウイルスベクターは、Ｅ１、Ｄ３またはその両方の領域のいずれかに、外来ＤＮＡを保有する（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１）。本質的には、アデノウイルスは、ＤＮＡの約２ｋＢ多い容量を提供すると、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージし得る（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７）。Ｅ１およびＥ３領域で交換可能である約５．５ｋＢのＤＮＡと組み合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大容量は、７．５ｋＢより低いか、またはベクターの全長の約１５％である。アデノウイルスのウイルス性のゲノムの８０％より多くは、ベクター骨格内にあり、そしてベクター保有（ｂｏｒｎｅ）細胞毒性の供給源である。また、Ｅ１欠失ウイルスの複製欠損は、不完全である。例えば、ウイルス遺伝子発現のリーク（ｌｅａｋａｇｅ）は、高い多重感染（ＭＯＩ）で、現在利用可能なベクターで観察された（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３）。
【０４２６】
ヘルパー細胞株は、ヒト細胞（例えば、ヒト胚性腎臓細胞、筋細胞、造血細胞または他のヒト胚性間葉細胞または上皮細胞）に由来し得る。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスを許容性である他の哺乳動物種の細胞に由来し得る。このような細胞としては、例えば、Ｖｅｒｏ細胞または他のサル胚性間葉細胞または上皮細胞が挙げられる。上記のように、現在、好ましいヘルパー細胞株は、２９３である。
【０４２７】
最近、Ｒａｃｈｅｒら（１９９５）は、２９３細胞の培養およびアデノウイルスの増殖についての改良方法を開示した。１つのフォーマットにおいて、天然の細胞の凝集物は、１００〜２００ｍｌの培地を含む１リットルのシリコン処理した攪拌フラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｇｅ、ＵＫ）内に、個々の細胞を播種することによって増殖する。４０ｒｐｍでの攪拌後、細胞生存度を、トリパンブルーで評価する。別のフォーマットにおいて、Ｆｉｂｒａ−Ｃｅｌマイクロキャリア（Ｂｉｂｂｙ  Ｓｔｅｒｌｉｎ、Ｓｔｏｎｅ，ＵＫ）（５ｇ／ｌ）を、以下のように使用する。５ｍｌの培地に再懸濁された細胞接種材料を、２５０ｍｌのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中のキャリア（５０ｍｌ）に添加し、そして時々攪拌しながら、１〜４時間、静止させておく。次いで培地を、５０ｍｌの新鮮な培地で置換し、そして振盪を開始する。ウイルス産生のために、細胞を、約８０％のコンフルーエンスまで増殖させ、その後、培地を置換し（最終容量の２５％まで）、そしてアデノウイルスを０．０５のＭＯＩで添加する。培養物を、一晩静止させ、その後容量を１００％まで増やし、そしてさらに７２時間の振盪を開始する。
【０４２８】
アデノウイルスベクターは、複製欠損または少なくとも条件付で複製欠損であるという必要性以外に、アデノウイルスベクターの特性は、本発明の実施の成功に重要でないと考えられる。アデノウイルスは、４２の異なる既知の血清型またはサブグループＡ〜Ｆのいずれかのアデノウイルスであり得る。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発明において使用するための条件付複製欠損アデノウイルスベクターを得るために好ましい開始物質である。なぜならアデノウイルス５型は、大量の生化学的情報および遺伝学的情報が公知であるヒトアデノウイルスであり、そしてそれは、ベクターとしてアデノウイルスを使用するほとんどの構築物に歴史的に使用されてきたからである。
【０４２９】
上記のように、本発明による代表的なベクターは、複製欠損であり、そしてアデノウイルスＥ１領域を有さない。従って、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、Ｅ１コード配列が除去された位置に導入することが最も簡便である。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入の位置は、本発明に重要ではない。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドはまた、Ｋａｒｌｓｓｏｎら（１９８６）に記載されるように、Ｅ３置換ベクターに、欠失したＥ３領域の代わりに挿入され得るか、またはヘルパー細胞株もしくはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補足するＥ４領域に挿入され得る。
【０４３０】
アデノウイルスは、容易に増殖し、かつ容易に操作され、そしてインビトロおよびインビボでの広い宿主範囲を示す。この群のウイルスは、高い力価（例えば、１０９〜１０１１プラーク形成ユニット／ｍｌ）で得られ得、そしてそれらは非常に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達された外来遺伝子は、エピソーム性であり、従って、宿主細胞に対して低い遺伝毒性を有する。副作用は、野生型アデノウイルスでのワクチン接種の研究において報告されていない（Ｃｏｕｃｈら、１９６３；Ｔｏｐら、１９７１）。このことは、インビボ遺伝子トランスファーベクターとしてのそれらの安全かつ治療的な可能性を示す。
【０４３１】
アデノウイルスベクターを、真核生物遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチンの開発（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ，１９９２）に使用した。最近、動物研究は、組換えアデノウイルスは、遺伝子療法に使用され得ることを示唆した（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。異なる組織に組換えアデノウイルスを投与する際の研究としては、気管点滴注入法（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈内注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３）および脳における定位接種法（Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅら、１９９３）が挙げられる。
【０４３２】
（２．レトロウイルス）
レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染された細胞においてそれらのＲＮＡを２本鎖ＤＮＡに転換する能力によって特徴付けられる一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次いで、生じるＤＮＡを、プロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込み、そしてウイルスタンパク質を合成させる。この組込みは、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持を生じる。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする３つの遺伝子（ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を含む。ｇａｇ遺伝子の上流に見出された配列は、ビリオンへのゲノムのパッケージングのためのシグナルを含む。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含み、そしてまた宿主細胞ゲノムへの組込みに必要とされる（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。
【０４３３】
レトロウイルスベクターを構築するために、１つ以上の目的のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列をコードする核酸が、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入され、複製欠損であるウイルスを作製する。ビリオンを作製するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、およびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ成分およびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株が構築される（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲ配列およびパッケージング配列と一緒にｃＤＮＡを含む組換えプラスミドがこの細胞株に（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）導入される場合、パッケージング配列は、ウイルス粒子にパッケージングされる組換えプラスミドのＲＮＡの転写を可能にし、次いで培養培地に分泌される（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次いで、この組換えレトロウイルスを含む培地は、収集され、必要に応じて、濃縮され、そして遺伝子移入のために使用される。レトロウイルスベクターは、広範な細胞型に感染し得る。しかし、組み込みおよび安定な発現は、宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。
【０４３４】
レトロウイルスベクターの特異的な標的化を可能にするように設計された新規なアプローチが、最近、ラクトース残基のウイルスエンベロープへの化学的な付加によるレトロウイルスの化学的な変更に基づいて、開発された。この変更は、シアログリコタンパク質レセプターを介する肝細胞の特異的な感染を可能にし得る。
【０４３５】
組換えレトロウイルスの標的化のための異なるアプローチが、設計され、この方法においては、レトロウイルスエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特定の細胞レセプターに対するビオチン化抗体が使用された。この抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介して結合された（Ｒｏｕｘら、１９８９）。主な組織適合性複合体の、クラスＩ型抗原およびクラスＩＩ型抗原に対する抗体を使用して、著者らは、インビトロでエコトロピックウイルスを伴なった細胞表面抗原を保持する種々のヒト細胞の感染を実証した（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
【０４３６】
本発明の全ての局面において、レトロウイルスベクターを使用するための特定の制限が存在する。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノムのランダムな部位に組み込まれる。これは、宿主遺伝子の妨害を介するかまたは隣接遺伝子の機能を妨害し得るウイルス調節配列の挿入を介して、挿入変異誘発を導き得る（Ｖａｒｍｕｓら、１９８１）。不完全なレトロウイルスベクターの使用に関する別のことは、パッケージング細胞中の野生型複製コンピテントウイルスの潜在的な出現である。これは、組換えウイルス由来のインタクトな配列が、宿主細胞ゲノムに組み込まれたｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ配列から上流に挿入する組換え事象から生じ得る。しかし、組換えの可能性が大きく減少しているはずである新しいパッケージング細胞株が、現在では利用可能である（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら，１９８８；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒら，１９９０）。
【０４３７】
（３．アデノ随伴ウイルス）
ＡＡＶ（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ，１９８４）は、パルボウイルス（ｐａｒｏｖｉｒｕｓ）であり、アデノウイルスのストックの汚染物質として発見された。ＡＡＶは、いかなる疾患にも関連していない偏在する（抗体は、アメリカ人の集団の８５％に存在する）ウイルスである。ＡＡＶはまた、ＡＡＶの複製がヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）の存在に依存するので、デペンドウイルスとして分類される。５つの血清型が単離されている。そのうち、ＡＡＶ−２は、最も特徴付けされている。ＡＡＶは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３にキャプシド形成され、直径２０ｎｍ〜２４ｎｍの正二十面体のビリオンを形成する、一本鎖の線状ＤＮＡを有する（ＭｕｚｙｃｚｋａおよびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，１９８８）。
【０４３８】
このＡＡＶ  ＤＮＡは、約４．７キロ塩基長である。このＤＮＡは、２つのオープンリーディングフレームを含み、そして２つのＩＴＲに隣接される（図２）。ＡＡＶゲノム中には、２つの主な遺伝子（ｒｅｐおよびｃａｐ）が存在する。ｒｅｐ遺伝子は、ウイルスの複製を担うタンパク質をコードし、これに対し、ｃａｐは、キャプシドタンパク質ＶＰ１−３をコードする。各々のＩＴＲは、Ｔ形状のヘアピン構造を形成する。これらの末端繰り返しは、染色体組み込みのために必須のＡＡＶのｃｉｓ成分のみである。従って、このＡＡＶは、送達のための遺伝子のカセットで全てのウイルスコード配列が除去および置換されたベクターとして使用され得る。それらの地図位置に従って、３つのウイルスプロモーターが同定され、そしてｐ５、ｐ１９、およびｐ４０と称されている。ｐ５およびｐ１９からの転写はｒｅｐタンパク質の産生を生じ、そしてｐ４０からの転写はキャプシドタンパク質を産生する（ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ，１９８４）。
【０４３９】
発現ベクターとしてｒＡＡＶを使用する可能性を研究するために研究者を刺激するいくつかの因子が存在する。１つは、宿主染色体に組み込むために遺伝子を送達する必要が、驚くべきことに少ないことである。１４５ｂｐのＩＴＲ（ＡＡＶゲノムのわずか６％である）を有することが必要である。これは、４．５ｋｂのＤＮＡ挿入物を作製する余地をベクター残す。これは、ＡＡＶが大きな遺伝子を送達するのを妨げ得る、能力を保有するが、本発明のアンチセンス構築物を送達するのに十分に適している。
【０４４０】
ＡＡＶはまた、その安全性に起因して、送達ビヒクルの優れた選択である。相対的に複雑な救援機構が存在する：野生型のアデノウイルス遺伝子だけでなく、ＡＡＶ遺伝子もｒＡＡＶを動員する必要がある。同様に、ＡＡＶは、病原性ではなく、そしていかなる疾患にも関連しない。ウイルスコード配列の除去は、ウイルス遺伝子発現に対する免疫反応を最小化し、従って、ｒＡＡＶは、炎症応答を招かない。
【０４４１】
（４．発現構築物としての他のウイルスベクター）
他のウイルスベクターを、宿主細胞へのオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の送達のための本発明における発現構築物として用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）、レンチウイルス、ポリオウイルス、およびヘルペスウイルスのようなウイルス由来のベクターを用いてもよい。これらは、種々の哺乳動物細胞に、いくつかの魅力のある特性を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
【０４４２】
Ｂ型ヘルペス欠損ウイルスの最近の認識によると、新しい見識は、異なるウイルス配列の構造−機能の関連性を与えた。インビトロでの研究は、このウイルスが、そのゲノムの８０％までの欠失にもかかわらず、ヘルパー依存パッケージングおよび逆転写についての能力を保持し得ることを示した（Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。このことは、ゲノムの大部分が外来の遺伝物質と交換され得ることを示唆した。肝臓向性（ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｓｍ）および持続（組込み）は、肝臓指向性遺伝子移入についての特に魅力的な特性であった。Ｃｈａｎｇら、（１９９１）は、ポリメラーゼコード配列、表面コード配列、および前表面（ｐｒｅ−ｓｕｒｆａｃｅ）コード配列に代えて、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子をアヒルＢ型肝炎ウイルスゲノムに導入した。これを、野生型ウイルスと共に、トリ肝炎細胞株へと、同時トランスフェクトした。高力価の組換えウイルスを含む培養培地を用いて、初代仔ガモ肝細胞を感染させた。安定なＣＡＴ遺伝子発現を、トランスフェクション後の少なくとも２４日間検出した（Ｃｈａｎｇら、１９９１）。
【０４４３】
（５．非ウイルスベクター）
本発明のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の発現をもたらすために、発現構築物は、細胞に送達されなければならない。この送達は、細胞株を形質転換するための実験手順の際のように、インビトロで達成され得るか、または特定の疾患状態の処置の際のように、インビボもしくはエキソビボで達成され得る。上記のように、送達のための１つの好ましい機構は、ウイルス感染を介する機構であり、ここで、発現構築物は、感染性ウイルス粒子の中にカプセル化される。
【０４４４】
一旦、発現構築物が、細胞の中に送達されると、所望のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列をコードする核酸は、異なる部位に配置され、そして異なる部位で発現し得る。特定の実施形態では、この構築物をコードする核酸は、細胞のゲノムの中に安定に組込まれ得る。この組込みは、相同組換えを介する特定の位置および特定の配向であってもよい（遺伝子置換）し、またはこれは無作為な非特異的な位置に組込まれてもよい（遺伝子増強）。なおさらなる実施形態では、核酸は、ＤＮＡの別個のエピソームセグメントとして、細胞の中で安定に維持され得る。このような核酸セグメント、または「エピソーム」は、宿主細胞周期から独立して、または宿主細胞周期に同調して維持および複製させるのに十分な配列をコードする。どのように発現構築物を細胞に送達させ、そして細胞の中のどこで核酸を維持するかは、用いられる発現構築物の型に依存する。
【０４４５】
本発明の特定の実施形態では、１つ以上のオリゴヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列を含む発現構築物は、単に、裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドから構成されてもよい。この構築物の移入は、細胞膜を物理的または化学的に透過化処理する、上記の方法のいずれかにより行われ得る。このことは、特に、インビトロでの移入に適用可能であるが、これはインビボでの使用でも同様に適用され得る。Ｄｕｂｅｎｓｋｙら、（１９８４）は、ポリオーマウイルスＤＮＡを、成体および新生仔マウスの肝臓および腎臓に、リン酸カルシウム沈殿物の形態で首尾良く注入した。これは、能動的ウイルス複製および急性感染を実証した。ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＲｅｓｈｅｆ（１９８６）はまた、沈降リン酸カルシウムプラスミドの直接的腹腔内注入が、トランスフェクトした遺伝子の発現を生じることを実証した。目的の遺伝子をコードするＤＮＡもまた、インビボで同じ様式で移入され得、そして遺伝子産物を発現することが想定される。
【０４４６】
細胞の中に裸のＤＮＡ発現構築物を移入するための本発明の別の実施形態は、粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）を包含し得る。この方法は、ＤＮＡをコーティングした微粒子を、この粒子が細胞膜を貫き、そして細胞を殺すことなく細胞に侵入することが可能な高速まで加速させる能力に依存する（Ｋｌｅｉｎら、１９８７）。小さな粒子を加速させるためのいくつかの装置が、開発されている。このような装置の１つは、高電圧放電に依存して電流を発生させ、これは、次いで原動力を提供する（Ｙａｎｇら、１９９０）。用いられる微粒子は、タングステンビーズまたは金ビーズのような生物学的に不活性な物質からなっている。
【０４４７】
ラットおよびマウスの肝臓組織、皮膚組織、および筋肉組織を含む選択された器官は、インビボでボンバードされた（Ｙａｎｇら、１９９０；Ｚｅｌｅｎｉｎら、１９９１）。このことは、銃と標的器官との間の任意の介在組織を除去する（すなわち、エキソビボ処置）ための、組織または細胞の外科的露出を必要とし得る。また、特定の遺伝子をコードするＤＮＡは、この方法を介して送達され、そしてなお本発明により取りこまれ得る。
【０４４８】
（アンチセンスオリゴヌクレオチド）
遺伝子情報の流れの最終的結果は、タンパク質の合成である。ＤＮＡは、ポリメラーゼによってメッセンジャーＲＮＡへと転写され、そしてリボソーム上で翻訳されて、フォールディングされた機能性タンパク質が生じる。従って、反応の極度に複雑なセットの単純化したこの記載からであっても、この経路に沿って、タンパク質合成が阻害され得るいくつかの段階が存在することが明らかである。本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするネイティブのＤＮＡセグメントは、すべての哺乳動物ＤＮＡ鎖のように、水素結合により結合された２つの鎖（センス鎖およびアンチセンス鎖）を有する。ポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡは、センスＤＮＡ鎖と同じヌクレオチド配列を有するが、ただし、そのＤＮＡのチミジンがウリジンに置き換わっている。従って、合成アンチセンスヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡに結合し、そしてそのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現を阻害する。
【０４４９】
従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドをｍＲＮＡに結合のために標的化させることは、タンパク質合成を妨げるための１つの機構であり、結果的に、強力かつ標的化された治療アプローチを示す。例えば、ポリガラクツウロナーゼの合成およびムスカリン２型アセチルコリンレセプターは、そのそれぞれのｍＲＮＡ配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号（各々その全体が、本明細書中に特に参考として援用される））。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡＡレセプターおよびヒトＥＧＦを用いて示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら、１９８８；ＶａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒおよびＡｈｍｅｄ、１９８９；Ｐｅｒｉｓら、１９９８；米国特許第５，８０１，１５４号；同第５，７８９，５７３号；同第５，７１８，７０９号および同第５，６１０，２８８号（各々その全体が、本明細書中に特に参考として援用される））。種々の異常な細胞増殖（例えば、癌）を阻害しそして処置するために使用され得る、アンチセンス構築物もまた、記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；同第５，５９１，３１７号および同第５，７８３，６８３号（各々その全体が、本明細書中に特に参考として援用される））。
【０４５０】
従って、例示的実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る任意の配列もしくはその相補体のすべてまたは一部を含む、オリゴヌクレオチド配列を提供する。１つの実施形態において、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはその誘導体を含む。第３の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート改変骨格を含む、改変ＤＮＡである。第４の実施形態において、そのオリゴヌクレオチド配列は、ペプチド核酸またはその誘導体を含む。各場合において、好ましい組成物は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドのうちの１つ以上の部分に相補的な、より好ましくは実質的に相補的な、そしてさらにより好ましくは完全に相補的な、配列領域を含む。
【０４５１】
所定の遺伝子配列に特異的なアンチセンス組成物の選択は、選択された標的配列（すなわち、これらの例示的例においては、ラット配列およびヒト配列）の分析ならびに二次構造、Ｔｍ、結合エネルギー、相対的安定性の決定に基づき、そしてアンチセンス組成物は、二量体、ヘアピン、または宿主細胞において標的ｍＲＮＡへの特異的結合を減少または妨げる他の二次構造をそれらが形成できない相対的能力に基づいて選択された。
【０４５２】
ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域と実質的に相補的な配列である。これらの二次構造分析および標的部位選択の考慮は、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアーのバージョン４（Ｒｙｃｈｌｉｋ、１９９７）およびＢＬＡＳＴＮ  ２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）を使用して実施された。
【０４５３】
短いペプチドベクター（ＭＰＧ（２７残基）と称する）の使用に基づくアンチセンス送達法の最近の開発もまた意図される。このＭＰＧペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１の融合配列由来の疎水性ドメインと、ＳＶ４０  Ｔ抗原の核局在化配列由来の親水性ドメインとを含む（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９７）。このＭＰＧペプチドのいくつかの分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドをコートし、そして比較的高効率（９０％）で１時間未満で培養哺乳動物細胞へと送達され得ることが示された。さらに、ＭＰＧとの相互作用は、ヌクレアーゼに対するそのオリゴヌクレオチドの安定性および形質膜を横切る能力の両方を強力に増加させる（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９７）。
【０４５４】
（リボザイム）
タンパク質が伝統的に、核酸の触媒のために使用されているが、別の種類の高分子が、この試みにおいて有用であるとして出現した。リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ、１９８７；Ｇｅｒｌａｃｈら、１９８７；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｓｏｎｓ、１９８７）。例えば、多数のリボザイムが、高い程度の特異性でホスホエステル転移反応を促進し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質中の数個のホスホエステルのうちの１つだけを切断する（Ｃｅｃｈら、１９８１；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、１９９０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、１９９２）。この特異性は、この基質が、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）との特異的塩基対形成相互作用を介して結合するという要件に帰せられている。
【０４５５】
リボザイム触媒は、主に、核酸に関与する配列特異的切断／連結反応の一部として観察されている（Ｊｏｙｃｅ、１９８９；Ｃｅｃｈら、１９８１）。例えば、米国特許第５，３５４，８５５号（特に本明細書中に参考として援用される）は、特定のリボザイムが、配列特異性が既知のリボヌクレアーゼの配列特異性よりも高くかつＤＮＡ制限酵素の配列特異性に近い、エンドヌクレアーゼとして作用し得ることを報告している。従って、遺伝子発現の配列特異的リボザイム媒介性阻害は、治療適用に特に適切であり得る（Ｓｃａｎｌｏｎら、１９９１；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０）。最近、リボザイムが適用されたいくつかの細胞株においてそのリボザイムが遺伝子変化を惹起したこと；その変化した遺伝子がオンコジーンであるＨ−ｒａｓ，ｃ−ｆｏｓおよびＨＩＶの遺伝子を含んだことが、報告された。この研究のほどんどは、特定のリボザイムにより切断される特定の変異体コドンに基づく、標的ｍＲＮＡの改変に関した。
【０４５６】
天然に存在する酵素的ＲＮＡの６つの基本的変種が、現在公知である。各々が、生理学的条件下で、トランスで、ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒し得（従って、他のＲＮＡ分子を切断し得）る。一般に、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡへの結合によって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持される、酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。従って、その酵素的核酸はまず、標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対形成を介してその標的ＲＮＡに結合し、そして一旦正確な部位に結合すると、その標的ＲＮＡを酵素的に切断するように作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされるタンパク質を直接合成する能力を破壊する。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的に結合しそして切断した後、その酵素的核酸は、別の標的を探索するためにそのＲＮＡから離れ、そして繰り返し、新しい標的に結合しそして切断し得る。
【０４５７】
リボザイムの酵素特性は、多くの技術（例えば、アンチセンス技術（ここで、核酸分子は、翻訳を遮断するために核酸標的に簡単に結合する））に対して有利である。なぜなら、治療的処置に影響を与えるのに必要であるリボザイムの濃度は、アンチセンスオリゴヌクレオチの濃度よりも低いからである。この利点は、酵素的に作用するリボザイムの能力に影響を与える。従って、単一のリボザイム分子は、標的ＲＮＡの多くの分子を切断し得る。さらに、このリボザイムは、高度に選択的なインヒビターであり、この阻害の特異性は、標的ＲＮＡに結合する塩基対形成の機構に依存するだけでなく、標的ＲＮＡの切断の機構にも依存する。切断部位付近の１個のミスマッチまたは塩基置換により、リボザイムの触媒活性が完全に排除され得る。アンチセンス分子内の同様のミスマッチでは、それらの作用は妨げない（Ｗｏｏｌｆら、１９９２）。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の特異性よりも高い。
【０４５８】
この酵素的核酸分子は、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）モチーフ、ヘアピンモチーフ、δ型肝炎ウイルスモチーフ、Ｉ群イントロンモチーフまたはＲＮａｓｅＰ  ＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ誘導配列に関連する）あるいはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡモチーフにおいて形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら（１９９２）に記載される。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開番号ＥＰ  ０３６０２５７）、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ（１９８９）、Ｈａｍｐｅｌら（１９９０）および米国特許第５，６３１，３５９号（本明細書中で特に参考として援用される）に記載される。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ（１９９２）に記載される；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら（１９８３）に記載される；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ＶＳ  ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９９０；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，１９９１；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ，１９９３）に記載される；そしてＩ群イントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載される（本明細書中で特に参考として援用される）。本発明の酵素的核酸分子において重要であることは、１以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に相補的である特定の基質結合部位を有すること、およびこの分子にＲＮＡ切断活性を付与する基質結合部位内にヌクレオチド配列を有することまたはこの基質結合部位を取り囲むヌクレオチド配列を有することだけである。従って、リボザイム構築物は、本明細書中に記載される特定のモチーフに限定する必要はない。
【０４５９】
特定の実施形態において、所望の標的のＲＮＡ（例えば、本明細書中において開示される配列の１つ）に対して高度の特異性を示す、酵素的切断試薬を産生することが重要であり得る。好ましくは、この酵素的核酸分子は、標的ｍＲＮＡの高度に保存された配列領域に対して標的化される。このような酵素的核酸分子は、必要とされる場合、特定の細胞に外因的に送達され得る。あるいは、このリボザイムは、特定の細胞に送達されるＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターから発現され得る。
【０４６０】
小さな酵素的核酸モチーフ（例えば、ハンマーヘッド構造またはヘアピン構造のモチーフ）はまた、外因的送達のために使用され得る。これらの分子の単純な構造は、酵素的核酸がｍＲＮＡ構造の標的化領域に浸潤する能力を増大させる。あるいは、触媒ＲＮＡ分子は、真核生物のプロモーターより細胞内で発現され得る。当業者は、任意のリボザイムが、適切なＤＮＡベクター由来の真核生物細胞において発現されることを理解する。このようなリボザイムの活性は、第二リボザイムによる第一転写物からのその解放によって増強され得る（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／２３５６９、および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５（これらの両方は、参考として援用される）；Ｏｈｋａｗａら、１９９２；Ｔａｉｒａら、１９９１；ならびにＶｅｎｔｕｒａら、１９９３）。
【０４６１】
リボザイムは、直接的に添加されるか、またはリポソーム内にパッケージングされたカチオン性脂質と共に複合体化され（脂質複合体）、さもなければ、標的細胞に送達され得る。ＲＮＡまたはＲＮＡ複合体は、生体高分子中に取り込んだ状態または取り込んでない状態で、注射、エアロゾル吸入、注入ポンプまたはステントを介して、関連する組織（エキソビボ、またはインビボ）に局所的に投与され得る。
【０４６２】
リボザイムは、国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／２３５６９および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に記載されるように設計され得、そして記載されるようにインビトロおよびインビボにおいて試験するために合成され得る。このようなリボザイムはまた、送達するために最適化され得る。特定の例が提供されるが、当業者は、他の種において等価なＲＮＡ標的が、必要な場合に利用され得ることを理解する。
【０４６３】
ハンマーヘッドリボザイムまたはヘアピンリボザイムを、コンピュータフォールディング（Ｊａｅｇｅｒら、１９８９）によって個々に分析し、リボザイム配列が、適切な２次構造に折り畳まれたかどうかを評価し得る。結合アーム（ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｒｍ）と触媒中心との間で好ましくない分子内相互作用を有するこれらのリボザイムは、考慮から外される。種々の結合アームの長さが、活性を最適化するために選択され得る。一般に、各アームにおいて少なくとも５個以上の塩基が標的ＲＮＡに結合するか、さもなくばこの標的ＲＮＡと相互作用し得る。
【０４６４】
ハンマーヘッドモチーフまたはヘアピンモチーフのリボザイムは、ｍＲＮＡメッセージの種々の部位に対してアニールするように設計され得、そして化学的に合成され得る。使用される合成の方法は、Ｕｓｍａｎら（１９８７）およびＳｃａｒｉｎｇら、（１９９０）に記載されるような通常のＲＮＡ合成のための手順に従い、そして一般的な核酸保護基および連結基（例えば、５’末端におけるジメトキシトリチルおよび３’末端におけるホスホルアミダイト）が使用される。平均的、段階的な連結収率は、代表的に、９８％より高い。ヘアピンリボザイムは、２個の部分で合成され得、そして活性リボザイムを再構築するためにアニールされ得る（ＣｈｏｗｒｉｒａおよびＢｕｒｋｅ、１９９２）。リボザイムは、大規模に改変され得、ヌクレアーゼ耐性基を用いて改変すること（例えば、２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−ｏ−メチル、２’−Ｈ（概説について、例えばＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、１９９２を参照のこと））によって安定性が増大され得る。リボザイムは、一般的な方法を使用するゲル電気泳動または高圧液体クロマトグラフィーによって精製され得、そして水中に再懸濁され得る。
【０４６５】
リボザイムの活性は、リボザイムの結合アームの長さを変更することにより、または血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぐ改変（例えば、国際特許出願番号ＷＯ  ９２／０７０６５；Ｐｅｒｒａｕｌｔら、１９９０；Ｐｉｅｋｅｎら、１９９１；ＵｓｍａｎおよびＣｅｄｅｒｇｒｅｎ、１９９２；国際特許公開番号ＷＯ  ９３／１５１８７；国際特許出願公開番号ＷＯ  ９１／０３１６２；欧州特許出願公開番号９２１１０２９８．４；米国特許第５，３３４，７１１号、および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／１３６８８（これには、酵素的ＲＮＡ分子の糖部分に対して成され得る、種々の化学的修飾が記載される）を参照のこと）、細胞中でのリボザイムの有効性を増強する改変、ならびにＲＮＡの合成時間を短縮および化学的必要性を低下させるための幹（ｓｔｅｍ）ＩＩ塩基を除去して、リボザイムを化学的に合成することによって最適化され得る。
【０４６６】
Ｓｕｌｌｉｖａｎら（国際特許出願公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５）は、酵素的ＲＮＡ分子の送達のための一般的な方法を記載する。リボザイムは、当業者に公知の種々の方法によって細胞に投与され得、これらには、リポソームへのカプセル化、イオン泳動法、あるいは、例えば、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性ミクロスフィアのような他のビヒクルへの取り込みによる方法が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの指針のために、リボザイムは、エキソビボで細胞または組織に、上記のビヒクルを使用してか、または使用せずに直接送達され得る。あるいは、ＲＮＡ／ビヒクルの組合せは、直接的な吸入、直接的な注射、またはカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により、局所的に送達され得る。他の送達経路としては、血管内注射、筋内注射、皮下注射または関節注射、エアロゾル吸入、経口送達（錠形態または丸剤形態）、局所送達、全身送達、眼送達、腹腔内送達および／またはくも膜下腔内送達が挙げられるが、これらに限定されない。リボザイム送達および投与のより詳細な記載は、国際特許公開番号ＷＯ  ９４／０２５９５および国際特許出願公開番号ＷＯ  ９３／２３５６９（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に提供される。
【０４６７】
高濃度のリボザイムを細胞内に蓄積する別の手段は、リボザイムコード配列をＤＮＡ発現ベクターに組み込むことである。リボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ  Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ  ＩＩＩ）のためのプロモーターにより駆動される。ｐｏｌ  ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターからの転写物は、全ての細胞内で高レベルで発現される；所定の細胞型における所定のｐｏｌ  ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた使用され得るが、但し、原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素は、適切な細胞において発現される（Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ、１９９０；ＧａｏおよびＨｕａｎｇ、１９９３；Ｌｉｅｂｅｒら、１９９３；Ｚｈｏｕら、１９９０）。このようなプロモーターから発現するリボザイムは、哺乳動物細胞において機能し得る（例えば、Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｒら、１９９２；Ｏｊｗａｎｇら、１９９２；Ｃｈｅｎら、１９９２；Ｙｕら、１９９３；Ｌ’Ｈｕｉｌｌｉｅｒら、１９９２；Ｌｉｓｚｉｅｗｉｃｚら、１９９３）。このような転写ユニットは、哺乳動物細胞内への導入のための種々のベクター（プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクター）、またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルス、セムリキフォレストウイルス、シンドビスウイルスベクター）が挙げられるがこれらに限定されない）に組み込まれ得る。
【０４６８】
本発明のリボザイムを診断道具として使用して、疾患細胞内の遺伝的変動および変異を試験し得る。これらをまた使用して、標的ＲＮＡ分子のレベルを評価し得る。リボザイム活性と標的ＲＮＡの構造との間の緊密な関係は、標的ＲＮＡの塩基対形成および３次元構造を変える分子の任意の領域における変異の検出を可能にする。本発明に記載される複数のリボザイムを使用することにより、インビトロならびに細胞および組織でのＲＮＡの構造および機構に対して重要であるヌクレオチドの変化をマップし得る。リボザイムを用いる標的ＲＮＡの切断を使用して、遺伝子発現を阻害し得、そして疾患の進行における特定の遺伝子産物の役割（必須性）を規定し得る。この様式で、他の遺伝子標的が、その疾患の重要な媒介物として、規定され得る。これらの研究は、組合せ治療の可能性（例えば、異なる遺伝子を標的とする複数のリボザイム、公知の低分子インヒビターに結合したリボザイム、あるいはリボザイムおよび／または他の化学的分子もしくは生物学的分子と組み合わせた間欠性処置）を提供することにより、疾患の進行のより良好な処置をもたらす。本発明のリボザイムのインビトロでの他の使用は、当該分野で周知であり、そしてＩＬ−５に関連する状態に関するｍＲＮＡの存在の検出を包含する。このようなＲＮＡは、標準的な方法を使用してリボザイムと共に処置した後に、切断産物の存在を決定することによって検出される。
【０４６９】
（ペプチド核酸）
特定の実施形態において、本発明者は、本発明の方法の実施において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）の使用を意図する。ＰＮＡは、ＤＮＡ模倣物であり、核酸塩基は、偽ペプチド骨格に結合される（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ、１９９７）。ＰＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡを伝統的に使用した多くの方法において利用され得る。時々、ＰＮＡ配列は、対応するＲＮＡまたはＤＮＡ配列よりも技術的により良く実施され、そしてＲＮＡにもＤＮＡにも固有でない有用性を有していた。産生方法、使用の特徴付け、および使用方法を含むＰＮＡの優れた総説は、Ｃｏｒｅｙ（１９９７）によって提供され、そして本明細書中で参考として援用される。このように、特定の実施形態において、ＡＣＥ  ｍＲＮＡ配列の１以上の部分に相補的であるＰＮＡ配列を調製し得、そしてこのようなＰＮＡ組成物は、ＡＣＥ−特異的ｍＲＮＡの翻訳を調節、変更、減少、または低下させるために使用され得、これにより、このようなＰＮＡ組成物が投与される宿主細胞におけるＡＣＥ活性のレベルを変更する。
【０４７０】
ＰＮＡは、ＤＮＡの正常なホスホジエステル骨格を置換する２−アミノエチル−グリシン連結を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１；Ｈａｎｖｅｙら、１９９２；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ，１９９６；Ｎｅｉｌｓｅｎ、１９９６）。この化学は、３つの重要な結果を有する。第１に、ＤＮＡまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとは対照的に、ＰＮＡは、中性の分子であり；第２に、ＰＮＡは、アキラル（立体選択的な合成を開発する必要がない）であり；そして第３に、ＰＮＡ合成は、固相ペプチド合成についての標準的なＢｏｃプロトコル（Ｄｕｅｈｏｌｍら、１９９４）またはＦｍｏｃプロトコル（Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５）を、使用する。一方、改良型Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を含む他の方法が使用される（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、１９９５）。
【０４７１】
ＰＮＡモノマーまたは既製のオリゴマーは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されている。ＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルのいずれかによるＰＮＡの合成は、手動プロトコルまたは自動プロトコルを使用して簡単に実施される（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５）。この手動プロトコルは、それ自体で、化学的に修飾されたＰＮＡの産生または密接に関係するＰＮＡのファミリーの同時合成に役立つ。
【０４７２】
ペプチドの合成に関して、特定のＰＮＡ合成の成功は、選択した配列の特性に依存する。例えば、理論上、ＰＮＡは、ヌクレオチド塩基の任意の組合せを取り込み得るが、隣接するプリンの存在は、産物における、１以上の残基の欠失を導き得る。この困難性の見込みにおいて、隣接するプリンを有するＰＮＡを産生する際に、非効率的に加えられているようである残基の連結を繰り返すべきであることが提案される。この後、ペプチド合成の間に観測されるのと類似する産物の収率および純度を提供する逆相高圧液体クロマトグラフィーによってＰＮＡを精製するべきである（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５）。
【０４７３】
所与の適用のためのＰＮＡの修飾が、固相合成の間にアミノ酸をカップリングすることによって、または露出されたＮ末端アミンにカルボン酸基を含む化合物を付加することによって達成され得る。あるいは、ＰＮＡは、導入されたリジンまたはシステインにカップリングすることによって合成した後に修飾され得る。ＰＮＡが修飾され得る簡便さにより、より良い溶解度または特定の機能的必要性の最適化を容易にする。一旦合成されると、ＰＮＡおよびそれらの誘導体の同定は、質量分析器によって確認され得る。いくつかの研究が、ＰＮＡの修飾物を作製および利用した（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９５；Ｈａａｉｍａら、１９９６；Ｓｔｅｔｓｅｎｋｏら、１９９６；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９９５；Ｕｌｍａｎｎら、１９９６；Ｋｏｃｈら、１９９５；Ｏｒｕｍら、１９９５；Ｆｏｏｔｅｒら、１９９６；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、１９９５；Ｋｒｅｍｓｋｙら、１９９６；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、１９９５；Ｂｏｆｆａら、１９９５；Ｌａｎｄｓｄｏｒｐら、１９９６；Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ−Ｐａｓｓｅｒｉｎｉら、１９９６；Ａｒｍｉｔａｇｅら、１９９７；Ｓｅｅｇｅｒら、１９９７；Ｒｕｓｋｏｗｓｋｉら、１９９７）。米国特許第５，７００，９２２号は、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラ分子および診断におけるその分子の使用、生物におけるタンパク質の調節、ならびに治療に対して影響を受け易い状態の処置について議論する。
【０４７４】
負に荷電した連結を含有するＤＮＡおよびＲＮＡと比較して、ＰＮＡ骨格は、中性である。この劇的な変更にも係らず、ＰＮＡは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ対形成によって相補的なＤＮＡおよびＲＮＡを認識し（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９１）による初期のモデル化を確認する。ＰＮＡは、３’〜５’の極性を欠き、そして平行様式または逆平行様式のいずれかで結合し得るが、逆平行様式が好ましい（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）。
【０４７５】
ＤＮＡオリゴヌクレオチドとＤＮＡおよびＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、相補鎖の負に荷電したリン酸骨格の間の静電気的な反発によって不安定化される。対照的に、ＰＮＡ−ＤＮＡまたはＰＮＡ−ＲＮＡの二重鎖において電荷の反発がないことにより、融解温度（Ｔｍ）が上昇し、そして一価のカチオンまたは二価のカチオンの濃度へのＴｍの依存度が減少する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）。ハイブリダイゼーションの増加した速度および親和性は重要である。なぜならば、これらは、緩和した二重鎖ＤＮＡ内の相補配列の鎖侵入を実施するようなＰＮＡの驚くべき能力の原因となるからである。さらに、逆方向反復での効果的なハイブリダイゼーションは、ＰＮＡが、二重鎖ＤＮＡ内で効果的に二次構造を認識し得ることを示唆する。増強した認識はまた、表面上に固定化されたＰＮＡで生じ、Ｗａｎｇらは、支持体に結合したＰＮＡが、ハイブリダイゼーション事象を検出するために使用され得ることを示した（Ｗａｎｇら、１９９６）。
【０４７６】
相補的な配列に対するＰＮＡの強固な結合がまた、類似の（同じではない）配列との結合を増加し、ＰＮＡ認識の配列特異性を減少させることが予期される。しかし、ＤＮＡハイブリダイゼーションに関して、選択的認識は、オリゴマー長およびインキュベーション温度を平均化することにより達成され得る。さらに、ＰＮＡの選択的ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションよりも低い塩基ミスマッチを許容するＰＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって促進される。例えば、１６ｂｐのＰＮＡ−ＤＮＡ二重鎖内での１個のミスマッチは、１５℃までＴｍを低下させ得る（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３）。高いレベルの識別は、点変異の分析に対して、数種のＰＮＡに基づく戦略の開発を可能にする（Ｗａｎｇら、１９９６；Ｃａｒｌｓｓｏｎら、１９９６；Ｔｈｉｅｄｅら、１９９６；ＷｅｂｂおよびＨｕｒｓｋａｉｎｅｎ、１９９６；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、１９９６）。
【０４７７】
高い親和性結合は、ＰＮＡに対する分子認識および新規適用の開発のための明確な利点を提供する。例えば、１１〜１３個のヌクレオチドＰＮＡは、テロメラーゼ（本質的なＲＮＡ鋳型を使用するテロメア末端を伸長するリボヌクレオ−タンパク質）の活性を阻害するが、アナログＤＮＡオリゴマーは、阻害しない（Ｎｏｒｔｏｎら、１９９６）。
【０４７８】
中性ＰＮＡは、アナログＤＮＡオリゴマーよりもより疎水性であり、そしてこのことは、特に、ＰＮＡが高いプリン含有量を有する場合、または二次構造を形成するような能力を有する場合に、このＰＮＡを中性のｐＨで溶解するのをより困難にし得る。これらの溶解度は、１以上の正電荷をＰＮＡ末端に付与することによって増加され得る（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）。
【０４７９】
Ａｌｌｆｒｅｙおよび共同実験者による発見は、鎖の侵入が染色体ＤＮＡ内の配列において自然に起こることを示唆している（Ｂｏｆｆａら、１９９５；Ｂｏｆｆａら、１９９６）。これらの研究は、ヌクレオチドＣＡＧの三塩基反復に対してＰＮＡを標的化し、そして転写的に活性なＤＮＡを精製（Ｂｏｆｆａら、１９９５）し、そして転写を阻害（Ｂｏｆｆａら、１９９６）するためにこの認識を使用した。この結果は、ＰＮＡが細胞内に送達され得た場合、このＰＮＡが遺伝子発現の一般的な配列特異的調節因子となる能力を有することを示唆する。ＰＮＡのアンチセンスおよび抗遺伝子試薬としての使用に関する研究および総説には、Ｎｉｅｌｓｅｎら（１９９３ｂ）、Ｈａｎｖｅｙら（１９９２）、およびＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９７）が挙げられる。Ｋｏｐｐｅｌｈｕｓら（１９９７）は、ＨＩＶ−１の逆転写を阻害するためにＰＮＡを使用して、ＰＮＡが抗ウイルス治療に使用され得ることを示した。
【０４８０】
ＰＮＡのアンチセンス結合特性を特徴づけする方法は、Ｒｏｓｅ（１９９３）およびＪｅｎｓｅｎら（１９９７）において議論される。Ｒｏｓｅは、キャピラリーゲル電気泳動を使用して、相対的な結合速度論および化学量論を測定することで、ＰＮＡのそれらの相補的オリゴヌクレオチドとの結合を決定する。同じタイプの測定が、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ技術を使用してＪｅｎｓｅｎらによって成された。
【０４８１】
ＰＮＡの他の適用には、ＤＮＡ鎖の侵入（Ｎｉｅｌｓｅｎら、１９９１）、アンチセンス阻害（Ｈａｎｖｅｙら、１９９２）、変異分析（Ｏｒｕｍら、１９９３）、転写の増強（Ｍｏｌｌｅｇａａｒｄら、１９９４）、核酸の精製（Ｏｒｕｍら、１９９５）、転写活性遺伝子の単離（Ｂｏｆｆａら、１９９５）、転写因子結合のブロッキング（Ｖｉｃｋｅｒｓら、１９９５）、ゲノムの切断（Ｖｅｓｅｌｋｏｖら、１９９６）、バイオセンサー（Ｗａｎｇら、１９９６）、インサイチュハイブリダイゼーション（Ｔｈｉｓｔｅｄら、１９９６）、およびサザンブロットの代替（Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ、１９９６）における使用が挙げられる。
【０４８２】
（ポリペプチド組成物）
本明細書中において使用される場合、用語「ポリペプチド」は、その従来の意味（すなわち、アミノ酸の配列として）で使用される。ポリペプチドは、生成物の特定の長さに限定されず；すなわち、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質が、ポリペプチドの定義内に含まれ、そしてこのような用語は、他に特に示されない限り、本明細書中において交換可能に使用され得る。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当該分野で公知の他の修飾（天然に存在するものおよび天然に存在しないものの両方））を言及しなくても、排除しなくてもよい。ポリペプチドは、タンパク質全体であっても、またはその部分配列であってもよい。本発明の状況における目的の特定のポリペプチドは、エピトープ（すなわち、ポリペプチドの免疫原性特性を実質的に担い、かつ、免疫応答を誘起し得る抗原性決定基）を含むアミノ酸の部分配列である。
【０４８３】
一般に、本発明のポリペプチドは、哺乳動物種由来の単離されたポリペプチド（もしくはエピトープ、改変体、またはその活性フラグメント）である。１つの好ましい実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１〜２９９）、またはこのようなポリヌクレオチド配列に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列内でコードされる。例示されるように、本発明のポリペプチド組成物は、配列番号３００〜２９，２１２からなる群の間から選択される。
【０４８４】
本発明において、ポリペプチド組成物はまた、本発明のポリペプチド（特に、配列番号１〜２９９の１つ以上によってコードされるポリペプチド、もしくは配列番号３００〜２９，２１２のいずれか１つに示される配列を有するポリペプチド、あるいはその活性なフラグメント、またはその改変体もしくは生物学的機能の等価物）に対して作製された抗体と免疫学的に反応性である１つ以上のポリペプチドを含むことが理解される。
【０４８５】
同様に、本発明のポリペプチド組成物は、配列番号１〜２９９に含まれる１つ以上の連続する核酸配列もしくは中程度から高いストリンジェンシーの条件下でこれらの配列の１つ以上にハイブリダイズする１つ以上の核酸配列によってコードされる１つ以上のポリペプチド、または配列番号３００〜２９，２１２のいずれか１つに示される配列を有するポリペプチド、あるいはそれらの活性なフラグメント、またはそれらの種改変体と免疫学的に反応性である抗体を誘発し得る１以上のポリペプチドを含むことが理解される。
【０４８６】
本明細書中で使用される場合、ポリペプチドの活性フラグメントは、ポリペプチドの全体または一部を含み、これは、従来の技術（例えば、突然変異誘発）により、または付加、失欠、もしくは置換によって改変されるが、活性フラグメントは、本明細書中に記載されるようなネイティブなポリペプチドと実質的に同一の構造的機能性、抗原性などを示す。
【０４８７】
特定の例示的な実施形態において、本発明のポリペプチドは、本明細書中に記載されるように、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質またはその改変体の少なくとも免疫原性部分を含む。Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質であるタンパク質はまた、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）内で検出可能に、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓに感染した患者由来の抗血清と反応する。本明細書中に記載されるようなポリペプチドは、任意の長さであり得る。ネイティブなタンパク質および／または異種配列由来のさらなる配列が存在し得、そしてこのような配列は、さらに免疫原性特性または抗原性特性を有し得るが、必要であるわけではない。
【０４８８】
本明細書中で使用される場合、「免疫原性部分」は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の表面抗原レセプターによって認識される（すなわち、特異的に結合される）タンパク質の一部である。一般に、このような免疫原性部分は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質またはそれらの改変体の、少なくとも５アミノ酸残基、より好ましくは、少なくとも１０アミノ酸残基、そしてさらにより好ましくは、少なくとも２０アミノ酸残基、を含む。特定の好ましい免疫原性部分は、Ｎ末端リーダー配列および／または膜貫通ドメインが欠失されているペプチドを含む。他の好ましい免疫原性部分は、成熟タンパク質と比較して、少ないＮ末端および／またはＣ末端失欠（例えば、１〜３０個のアミノ酸、好ましくは、５〜１５個のアミノ酸）を含み得る。
【０４８９】
免疫原性部分は、一般的にＰａｕｌ，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版、２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびそこに引用される参考文献に要約されるような周知技術を使用して、同定され得る。このような技術は、抗原特異的な抗体、抗血清および／あるいはＴ細胞株またはＴ細胞クローンと反応する能力についてポリペプチドをスクリーニングする工程を包含する。本明細書中で使用される場合、抗血清および抗体は、それらが抗原に特異的に結合する（すなわち、これらが、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおいてそのタンパク質と反応し、無関係なタンパク質とは検出可能に反応しない）場合、「抗原特異的」である。このような抗血清および抗体は、本明細書中に記載されるように、そして周知技術を使用して調製され得る。ネイティブのＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質の免疫原性部分は、（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）その全長ポリペプチドの反応性よりも実質的に小さくないレベルで、このような抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である。このような免疫原性部分は、このようなアッセイにおいて、その全長ポリペプチドの反応性と類似またはそれより大きいレベルで反応し得る。このようなスクリーニングは、一般的に、当業者に周知の方法（例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載のような技術）を使用して行われ得る。例えば、ポリペプチドを固体支持体に固定し、そして患者の血清を接触させて、その血清中の抗体をその固定されたポリペプチドに結合させ得る。次いで、結合されなかった血清を除去し、結合された抗体を、例えば、１２５Ｉ標識化プロテインＡを使用して検出し得る。
【０４９０】
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの免疫原性部分は、全長ポリペプチドの反応性よりも実質的に小さくないレベルで抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）。好ましくは、免疫原性部分の免疫原性活性のレベルは、全長ポリペプチドについての免疫原性の、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは約９０％よりも大きい免疫原性のレベルである。いくつかの例において、対応する全長ポリペプチドの免疫原性活性のレベルよりも大きい免疫原性活性のレベルを有する好ましい免疫原性部分（例えば、約１００％より上または１５０％以上の免疫原性活性を有する）が、同定される。
【０４９１】
上記のように、組成物は、ネイティブのＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質の改変体を含み得る。本明細書中で使用される場合、ポリペプチド「改変体」は、一般的にそのネイティブなポリペプチドに対して５未満、好ましくは１０未満、より好ましくは２５未満以上の置換、欠失、付加および／または挿入を有する（その結果、そのポリペプチド改変体の免疫原性は、実質的には減少されない）点で、ネイティブのＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質と異なるポリペプチドである。言い換えると、抗原特異的な抗血清と反応する改変体の能力は、そのネイティブタンパク質と比較して、増強されても、または変化されなくてもよく、あるいは、そのネイティブタンパク質と比較して、５０％未満、そしてより好ましくは、２０％未満で減少されてもよい。このような改変体は、一般に、本明細書中に記載のように、上記ポリペプチド配列の１つを改変し、この改変ポリペプチドと抗原特異的な抗体または抗血清との反応性を評価することによって同定され得る。好ましい改変体は、１つ以上の部分（例えば、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン）が取り除かれた改変体を含む。他の好ましい改変体は、小さな部分（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）が、成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から取り除かれた改変体を含む。
【０４９２】
１つの好ましい実施形態において、本発明によって提供されるポリペプチドフラグメントおよびポリペプチド改変体は、詳細に本明細書中に示される全長Ｐ．ａｃｎｅｓポリペプチドと反応する抗体および／またはＴ細胞と免疫学的に反応性である。
【０４９３】
別の好ましい実施形態において、本発明によって提供されるポリペプチドフラグメントおよびポリペプチド改変体は、詳細に本明細書中に示される全長Ｐ．ａｃｎｅｓポリペプチド配列によって示される免疫原性活性のレベルの、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％またはそれより大きい免疫原性活性のレベルを示す。
【０４９４】
本発明によって含まれるポリペプチド改変体は、本明細書中に開示されたポリペプチドに対して、少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、もしくは約９９％またはそれより高い同一性（上記のように決定された）を示すポリペプチド改変体を含む。
【０４９５】
好ましくは、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、あるアミノ酸が、類似の特性を有する別のアミノ酸と置換されている置換であり、その結果、ペプチド化学の当業者は、そのポリペプチドの二次構造および疎水性親水性（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ）性質が、実質的に変化されないことを予測する。アミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性性質の類似性に基づいて作製され得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニン；および類似の親水性値を有する非荷電の極性頭部を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他のグループとしては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。改変体はまた、またはあるいは、非保存的変化を含み得る。好ましい実施形態において、改変体ポリペプチドは、５または５より少ないアミノ酸の置換、欠失または付加によって、ネイティブの配列とは異なる。改変体はまた（またはあるいは）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性親水性性質に最小限の影響しか有さないアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
【０４９６】
上記のように、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（または、リーダー）配列を含み得、これは、翻訳と同時に、または翻訳後に、そのタンパク質の転移を指向する。このポリペプチドはまた、このポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするために、またはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカー配列または他の配列（例えば、ポリＨｉｓ）に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合体化され得る。
【０４９７】
ポリペプチドは、任意の種々の周知技術を使用して調製され得る。上記のようなＤＮＡ配列によってコードされる組換えポリペプチドは、当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを使用して、ＤＮＡ配列から容易に調製され得る。発現は、組換えポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた、任意の適切な宿主細胞において達成され得る。適切な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞、および高等真核生物細胞（例えば、哺乳動物細胞および植物細胞）が挙げられる。好ましくは、使用される宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母または哺乳動物細胞株（例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ）である。組換えタンパク質または組換えポリペプチドを培養培地中に分泌する適切な宿主／ベクター系からの上清は、市販のフィルターを使用して、最初に濃縮され得る。濃縮後、この濃縮物を、適切な精製マトリックス（例えば、アフィニティーマトリックスまたはイオン交換樹脂）に適用し得る。最終的に、１以上の逆相ＨＰＬＣ工程を使用して、組換えポリペプチドをさらに精製し得る。
【０４９８】
約１００アミノ酸未満、そして一般に、約５０アミノ酸未満のアミノ酸を有する部分および他の改変体もまた、当業者に周知の技術を使用して、合成手段によって生成され得る。例えば、このようなポリペプチドは、任意の市販の固相技術（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成法（ここでは、アミノ酸が連続的に付加されて、アミノ酸鎖を成長させる））を使用して、合成され得る。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６，１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための装置は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のような供給者から市販され、そして製造業者の説明書に従って操作され得る。
【０４９９】
ある特定の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドおよび関連しない配列（例えば、公知のタンパク質）を含む融合タンパク質であり得る。例えば、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを提供する際に（免疫学的融合パートナー）補助し得るか、またはネイティブの組換えタンパク質より高い収量でタンパク質を発現する際に（発現エンハンサー）補助し得る。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解性を増加するように、またはタンパク質が所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするように選択され得る。なおさらなる融合パートナーには、親和性タグ（これは、タンパク質の精製を容易にする）が挙げられる。
【０５００】
融合タンパク質は、一般に、標準的な技術（化学的結合体化を含む）を使用して調製され得る。好ましくは、融合タンパク質は、発現系において、組換えタンパク質として発現され、非融合タンパク質と比較して、増加したレベルの産生を可能にする。手短に言うと、このポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列を、別々にアセンブルし得、そして適切な発現ベクターに連結し得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてかまたは用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に、これらの配列のリーディングフレームが同じ相にあるように連結される。このことが、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質への翻訳を可能にする。
【０５０１】
ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと折り畳まれるのを保証するために十分な距離で第一および第二のポリペプチド構成要素を隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質中に組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）フレキシブルな伸長したコンホメーションをとる能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造をとることができないこと；および（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電した残基の無いこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基およびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような中性に近い他のアミノ酸もまた、リンカー配列に用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列を含む。リンカー配列は、一般的に１から約５０アミノ酸長であり得る。リンカー配列は、第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分離するため、および立体的な干渉を防ぐために用いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、必要とされない。
【０５０２】
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳および転写終結シグナルを終了するために必要とされる終止コドンは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
【０５０３】
融合タンパク質もまた提供される。このようなタンパク質は、関連しない免疫原性ポリペプチドと共に、本明細書中に記載されるようなポリペプチドを含む。好ましくは、免疫原性タンパク質は、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起し得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１（１９９７）を参照のこと）。
【０５０４】
好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性の細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂの表面タンパク質である、プロテインＤ（ＷＯ  ９１／１８９２６）に由来する。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、このタンパク質のほぼ３分の１（例えば、最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅ）され得る。特定の好ましい実施形態において、リポタンパク質Ｄ融合パートナーの最初の１０９残基は、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するように、そしてＥ．ｃｏｌｉ中の発現レベルを増加する（従って、発現エンハンサーとして機能する）ように、Ｎ末端に含まれる。脂質テールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を保証する。他の融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質、ＮＳ１（血球凝集素）を含む。代表的に、Ｎ末端の８１アミノ酸が用いられるが、Ｔヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントが用いられてもよい。
【０５０５】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその部分（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ  ４３：２６５〜２９２，１９８６）として公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）への親和性についての原因である。この性質は、融合タンパク質の発現のために有用なＥ．ｃｏｌｉ  Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの発達のために開発された。アミノ酸末端でＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製が、記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７９５〜７９８，１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分は、融合タンパク質に組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域中に見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組み込む。
【０５０６】
一般に、本明細書に記載されるようなポリペプチド（融合タンパク質を含む）およびポリヌクレオチドが単離される。「単離された」ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、その元来の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するタンパク質は、それが天然の系中で共存する物質のいくつかまたは全てから分離されている場合、単離されている。好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。ポリヌクレオチドは、例えば、それが天然の環境の一部でないベクターにクローニングされる場合、単離されていると考えられる。
【０５０７】
（結合因子）
本発明は、さらにＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質に特異的に結合する因子（例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント）を提供する。本明細書において用いる場合、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質と検出可能レベルで反応し（例えば、ＥＬＩＳＡにおいて）、そして類似の条件下で無関係のタンパク質とは検出可能に反応しない場合、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質に「特異的に結合する」といわれる。本明細書において用いる場合、「結合」は、「複合体」が形成されるような２つの別々の分子間の非共有結合をいう。結合する能力は、例えば、複合体の形成についての結合定数を決定することにより評価され得る。結合定数は、複合体の濃度を成分濃度の積で割って得られる値である。一般に、２つの化合物は、複合体形成の結合定数が約１０３Ｌ／ｍｏｌを超える場合、本発明の文脈中で「結合している」といわれる。結合定数は、当該分野で周知の方法を用いて決定され得る。
【０５０８】
結合因子は、本明細書において提供される代表的アッセイを用いて、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓを有する患者と有さない患者の間でさらに区別され得る。言い換えれば、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質に結合する抗体または他の結合因子は、疾患を有する患者の少なくとも約２０％においてはＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質の存在を示すシグナルを生成し、そしてこの疾患を有さない固体の少なくとも約９０％においては疾患が存在しないことを示すネガティブなシグナルを生成する。結合因子がこの要件を満たすか否かを決定するために、ａｃｎｅを有する患者およびａｃｎｅを有さない（標準的臨床試験を用いて決定した場合）患者由来の生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰および／または尿）は、この結合因子に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載のようにアッセイされ得る。疾患を有するサンプルおよび疾患を有さないサンプルの、統計的に有意な数のサンプルをアッセイすべきであることが明白である。それぞれの結合因子は、上記の基準を満たすべきであるが；当業者は、結合因子が感度を改善する組み合わせで用いられ得ることを認識する。
【０５０９】
上記の要件を満たす任意の因子が結合因子であり得る。例えば、結合因子はリボソーム（ペプチド成分を伴うかまたは伴わない）、ＲＮＡ分子またはポリペプチドであり得る。好ましい実施形態において、結合因子は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術により調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般に、組換え抗体の産生を可能にするために、細胞培養技術（本明細書中に記載のモノクローナル抗体の産生を含む）によってか、または適切な細菌細胞宿主もしくは哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、抗体は産生され得る。１つの技術では、ポリペプチドを含む免疫原は、任意の広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはヤギ）にまず注射される。この工程で、本発明のポリペプチドは、改変なしの免疫原としてはたらき得る。あるいは、特に、相対的に短いポリペプチドについて、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合する場合、優れた免疫応答が惹起され得る。この免疫原は、好ましくは所定のスケジュール（１回以上のブースター免疫を組み込む）に従って、動物宿主に注射され、そしてこの動物は、定期的に採血される。次いで、このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、例えば、適切な固体支持体に結合しているポリペプチドを用いるアフィニティークロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製され得る。
【０５１０】
目的の抗原性ポリペプチドについて特異的なモノクローナル抗体は、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９、１９７６の技術、ならびにその改良型を使用して調製され得る。手短に言うと、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生し得る不死化細胞株の調製を包含する。このような細胞株は、例えば、上記のように、免疫された動物から得られた脾細胞から産生され得る。次いで、脾細胞は、例えば、ミエローマ細胞融合パートナー（好ましくは、免疫された動物と同系のもの）との融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾細胞およびミエローマ細胞は、非イオン性界面活性剤と数分間組み合わせられ得、次いで、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが、ミエローマ細胞の増殖を支持しない選択培地上に低密度でプレートされる。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間（通常約１〜２週間）後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーが選択され、そしてそれらの培養上清が、ポリペプチドに対する結合活性について試験される。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【０５１１】
モノクローナル抗体を、増殖しているハイブリドーマコロニーの上清から単離し得る。さらに、種々の技術（例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹膜腔へのハイブリドーマ細胞株の注入）が、収量を増大させるために利用され得る。次いで、モノクローナル抗体を、腹水または血液から収集し得る。夾雑物を、通常の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出）によって抗体から除去し得る。本発明のポリペプチドを、例えば、アフィニティークロマトグラフィー工程における精製工程において使用し得る。
【０５１２】
特定の実施形態において、抗体の抗原結合フラグメントの使用が好ましくあり得る。このようなフラグメントは、標準的な技術を使用して調製され得るＦａｂフラグメントを含む。手短に言うと、免疫グロブリンを、プロテインＡビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィー（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）によってウサギ血清から精製し得、そしてパパインによって消化して、ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントを生成し得る。ＦａｂフラグメントおよびＦｃフラグメントは、プロテインＡビーズカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによって分離され得る。
【０５１３】
本発明のモノクローナル抗体は、１つ以上の治療剤に結合され得る。この点において適切な薬剤は、放射性核種、分化誘導剤、薬物、毒素、およびそれらの誘導体を含む。好ましい放射性核種には、９０Ｙ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１１Ａｔ、および２１２Ｂｉが含まれる。好ましい薬物には、メトトレキセート、ならびにピリミジンアナログおよびプリンアナログが含まれる。好ましい分化誘導剤には、ホルボールエステルおよび酪酸が含まれる。好ましい毒素には、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が含まれる。
【０５１４】
治療剤は、直接的にかまたは間接的にか（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで適切なモノクローナル抗体にカップリング（例えば、共有結合によって）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が互いに反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方のカルボニル含有基（例えば、無水物もしくは酸ハロゲン化物）または良好な遊離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基などと反応し得る。
【０５１５】
あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体とをカップリングさせることが所望され得る。リンカー基は、結合の可能性を妨げることを回避するために、抗体を薬剤から隔てるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるために働き得、従ってカップリング効率を増大させる。化学的反応性の増大はまた、薬剤または薬剤上の官能基の使用を容易にし得、これは他の方法では可能ではない。
【０５１６】
種々の二官能性または多官能性試薬、ホモ官能性とヘテロ官能性との両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログ中に記載されるもの）が、リンカー基として使用され得ることが当業者には明らかである。カップリングは、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を介してもたらされ得る。このような方法論を記載する多数の参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
【０５１７】
本発明の免疫結合体の抗体部分がないときに治療剤がより強力である場合、細胞中へのインターナリゼーションの間に、またはその際に切断可能なリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されてきた。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒへの米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらへの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈｎらへの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらへの米国特許第４，５６９，７８９号）による切断を含む。
【０５１８】
１つより多い薬剤を抗体にカップリングさせることが望ましくあり得る。１つの実施形態において、薬剤の複数の分子が１つの抗体分子にカップリングされる。別の実施形態において、１つより多い型の薬剤が１つの抗体にカップリングされ得る。特定の実施形態に関わらず、１つより多い薬剤を有する免疫結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１つより多い薬剤が、抗体分子に直接的にカップリングされ得るか、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。
【０５１９】
キャリアは、種々の方法（直接的にかまたはリンカー基を介するかのいずれかの共有結合を含む）で薬剤を保有し得る。適切なキャリアには、アルブミンのようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらへの米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランのような多糖類（例えば、Ｓｈｉｈらへの米国特許第４，６９９，７８４号）を含む。キャリアはまた、例えばリポソーム小胞内に、非共有結合によってかまたはカプセル化によって、薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３、０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物を含む。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むキレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらへの米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
【０５２０】
抗体および免疫結合体についての投与の種々の経路が使用され得る。抗体／免疫結合体の正確な用量は、使用される抗体、抗原密度、および抗体のクリアランスの速度に依存して変化することは明白である。
【０５２１】
（Ｔ細胞）
免疫治療組成物はまた、あるいは、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質に特異的なＴ細胞を含み得る。このような細胞は、一般的に標準的手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システム（例えば、ＩｓｏｌｅｘＴＭシステム（Ｎｅｘｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ；米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと）から入手可能）を使用して、患者の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分中に存在し得る。あるいは、Ｔ細胞は、関連または無関連のヒト、非ヒト動物、細胞株または培養物から誘導され得る。
【０５２２】
Ｔ細胞は、Ｐｒｏｐｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチド、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはそのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて刺激され得る。このような刺激は、このポリペプチドに特異的であるＴ細胞の生成を可能にする条件下および十分な時間、行われる。好ましくは、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、送達ビヒクル（例えば、ミクロスフェア）中に存在して、特異的Ｔ細胞の生成を容易にする。
【０５２３】
Ｔ細胞は、このＴ細胞が、特異的に増殖するか、サイトカインを分泌するか、またはＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチドで被覆されるか、もしくはこのポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を殺傷する場合に、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、種々の標準的技術のいずれかを使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、ネガティブコントロールと比較して、溶解および／または増殖における２倍を超える増加の刺激指標は、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０，１９９４に記載されるように、実行され得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の速度の増加を測定することによって検出され得る（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、そしてＤＮＡに取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）。３〜７日間のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との接触は、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の増加を生じるべきである。２〜３時間の上記のような接触は、標準的なサイトカインアッセイを使用して測定されるように、Ｔ細胞の活性化を生じるべきであり、ここで、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）放出のレベルの２倍の増加が、Ｔ細胞の活性化を示す（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ  １９９８）を参照のこと）。Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋であり得る。Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して展開され得る。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、患者、関連するドナーまたは無関連のドナーに由来し、そして刺激および展開後にその患者に投与される。
【０５２４】
治療目的で、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで大量に展開され得る。このようなＴ細胞のインビトロでの増殖は、種々の方法で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インターロイキン−２）の添加を伴うか、または伴わずに、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチド、またはこのようなポリペプチドの免疫原性部分に対応する短いペプチド、および／またはＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチドを合成する刺激細胞に対して再曝露され得る。あるいは、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質の存在下で増殖する１つ以上のＴ細胞は、クローニングによって数の上で拡大され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、限界希釈が挙げられる。
【０５２５】
（薬学的組成物）
さらなる実施形態において、本発明は、細胞または動物に、単独で、または１つ以上の他の様式の療法との組み合わせのいずれかで投与するための、１つ以上の薬学的に受容可能な溶液中に本明細書中に開示されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、Ｔ細胞および／または抗体組成物の処方物に関する。
【０５２６】
所望ならば、本明細書に開示されるようなポリペプチドを発現する核酸セグメント、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＰＮＡ組成物は、同様に、他の薬剤（例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な薬剤）と組み合わせて投与され得ることがまた理解される。事実、さらなる薬剤が、標的細胞または宿主組織との接触の際に有意な有害な効果を引き起こさなければ、また含まれ得る他の成分に実質的に制限はない。従って、これらの組成物は、特定の場合に必要とされる種々の他の薬剤とともに送達され得る。このような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは本明細書中に記載されるように化学的に合成され得る。同様に、このような組成物は、置換されたかまたは誘導体化されたＲＮＡ組成物あるいは置換されたかまたは誘導体化されたＤＮＡ組成物をさらに含み得る。
【０５２７】
薬学的に受容可能な賦形剤およびキャリア溶液の処方は当業者に周知であり、これは、種々の処置レジメン（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内および筋肉内投与および処方が挙げられる）で、本明細書中に記載される特定の組成物の使用についての適切な用量および処置レジメンの開発である。
【０５２８】
（１．経口送達）
特定の適用において、本明細書に開示される薬学的組成物は、経口投与を介して動物に送達され得る。このように、これらの組成物は、不活性な希釈剤とともに処方され得るか、もしくは吸収可能な食用キャリアとともに処方され得るか、または、それらは、硬質シェルまたは軟質シェルのゼラチンカプセルに封入され得るか、またはそれらは、錠剤に圧縮され得るか、またはそれらは、治療食の食物と、直接混合され得る。
【０５２９】
活性な化合物は、賦形剤となお混合され得、そして経口摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、カシェ剤などの形態で使用され得る（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、１９９７；Ｈｗａｎｇら、１９９８；米国特許第５，６４１，５１５号；米国特許第５，５８０，５７９号および米国特許第５，７９２，４５１号（各々は、本明細書中で、その全体が参考として具体的に援用される））。錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどはまた、以下を含み得る：バインダー（例えば、カラヤゴム、アラビアゴム、コーンスターチ、またはゼラチン）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸など）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；および甘味料（例えば、添加され得るスクロース、ラクトースまたはサッカリン）または香料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリー香料）。投薬単位形態が、カプセルである場合、それは、上記のタイプの材料に加えて、液体キャリアを含み得る。種々の他の材料は、コーティングとして存在し得るか、または投薬単位の物理的形態を改変するために存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセルは、シェラックか、糖か、または両方でコーティングされ得る。エリキシルのシロップは、活性化合物、甘味料としてのスクロース、防腐剤としてのメチルパラベンおよびプロピパラベン、色素および香料（例えば、チェリーまたはオレンジ味）を含み得る。もちろん、任意の投与単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に純粋であるべきであり、そして使用される量で実質的に無毒性であるべきである。さらに、活性化合物は、徐放性調製物または処方物に組み込まれ得る。
【０５３０】
代表的に、これらの処方物は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多い活性化合物を含み得るが、活性成分の割合は、もちろん、変化し得、そして好都合に、全処方物の重量または体積の約１または２％と、約６０％または７０％以上のとの間であり得る。自然に、薬学的に有用な処方物の各々の中の活性化合物の量は、適切な投薬量が、化合物の任意の所定の単位用量において得られるような様式で、調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与の経路、製品の有効期限のような要因、および他の薬理学的考慮が、このような薬学的処方物を調製する分野の当業者によって意図され、そしてそのように、種々の投薬量および処置レジメンが、所望され得る。
【０５３１】
あるいは、経口投与について、本発明の処方物は、うがい薬、歯みがき剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下経口投与処方物の形態で、１つ以上の賦形剤と混合され得る。例えば、うがい薬は、活性成分を、必要とされる量で、適切な溶媒（例えば、ホウ酸ナトリウム溶液（Ｄｏｂｅｌｌ溶液））に組み込むように調製される。あるいは、活性成分は、経口溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含む溶液）に組み込まれ得るか、または歯みがき剤に分散され得るか、または治療的有効量で、水、バインダー、研磨剤、香料、発泡剤、および湿潤剤を含み得る組成物に添加され得る。あるいは、これらの組成物は、舌下に置かれ得るか、そうでなければ口の中で溶解され得る錠剤形態または溶液形態に成形され得る。
【０５３２】
（２．注入送達）
特定の状況において、本明細書に記載される薬学的組成物を、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号（各々は、その全体が、本明細書中で参考として具体的に援用される）に記載されるように、非経口的に、静脈内に、筋肉内に、または腹腔内にでさえ、送達することが所望される。遊離塩基としての活性化合物または薬理学的受容可能な塩の溶液は、水中で界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合されて、調製され得る。分散系はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、そしてオイル中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防止するために、防腐剤を含む。
【０５３３】
注入用途のために適切な薬学的形態は、滅菌水溶液または分散系および滅菌注射用溶液または分散系の即時調製のための滅菌散剤を含む（米国特許第５，４６６，４６８号（これは、本明細書中でその全体が参考として具体的に援用される））。全ての場合において、その形態は、滅菌でなけらばならず、そして容易な注射能力（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に、流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／もしくは植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散系の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤に使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって促進され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含むことが、望ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、組成物中での吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって、もたらされ得る。
【０５３４】
水溶液中での非経口投与のために、例えば、必要ならばその溶液は、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤が、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本発明の知見を考慮して、当業者に公知である。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張のＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または注入予定部位で注入され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくらかの変化が、処置される被検体の状態に依存して、必ず生じる。投与に責任のある人物は、いずれにしても、個々の被験体のための適切な用量を決定する。さらに、ヒト投与に対して、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、および一般的な安全性標準および純度標準を満たさなくてはならない。
【０５３５】
滅菌注入溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性化合物を、上記に列挙される種々の他の成分と混合し、必要ならば、濾過滅菌して調製される。一般に、分散系は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒および上に列挙される成分からの必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注入溶液の調製のための滅菌散剤の場合において、調製の好ましい方法は、真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これらは、活性成分の散剤および上記のその滅菌濾過された溶液からの任意のさらなる所望の成分を得る。
【０５３６】
本明細書中に開示される組成物は、中性形態または塩形態として処方され得る。薬学的に受容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）を含み、そしてこれらの塩は、無機酸（例えば、塩酸、リン酸など）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成された塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄（ＩＩＩ））、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。処方の際に、溶液は、投薬処方と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投与される。この処方物は、種々の投薬形態（例えば、注入溶液、薬物放出カプセルなど）で容易に投与される。
【０５３７】
本明細書中で使用される場合、「キャリア」は、任意および全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収を遅延させる薬剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である限りを除いては、治療組成物におけるその使用が、企図される。補助的活性成分もまた、これらの組成物に組み込まれ得る。
【０５３８】
句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応または類似の厄介な反応を生成しない分子実体および組成物をいう。活性成分としてタンパク質を含む水性組成物の調製は、当該分野で十分に理解されている。代表的に、このような組成物は、注入可能物として、液体溶液または懸濁液のいずれかとして調製され；注入前に、液体中の溶液、液体中の懸濁液に適切な固体形態もまた、調製され得る。この調製物はまた、乳化され得る。
【０５３９】
（３．経鼻送達）
特定の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。遺伝子、核酸およびペプチド組成物を、経鼻エアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号（各々は、本明細書中で、その全体が、参考として特に援用される）に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、１９９８）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号（本明細書中で、その全体が参考として特に援用される））を使用する薬物の送達はまた、薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が、参考として本明細書中で特に援用される）に記載される。
【０５４０】
（４．リポソーム媒介送達、ナノカプセル媒介送達、および微粒子媒介送達）
特定の実施形態において、本発明者らは、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、マイクロスフィア、脂質粒子、ベシクルなどを、本発明の組成物の適切な宿主細胞への導入のために、使用することを、意図する。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、ベシクル、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化されて、送達のために処方され得る。
【０５４１】
このような処方物は、本明細書中に開示される核酸または構築物の薬学的に受容可能な処方物の導入のために好ましくあり得る。リポソームの形成および使用は、一般に、当業者に公知である（例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９７７；Ｃｏｕｖｒｅｕｒ、１９８８；Ｌａｓｉｃ、１９９８；これらは、細胞内細菌感染および細胞内細菌疾患に対する標的化抗生物質治療におけるリポソームおよびナノカプセルの使用を記載する）。近年、改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが、開発された（ＧａｂｉｚｏｎおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，１９８８；ＡｌｌｅｎおよびＣｈｏｕｎ，１９８７；米国特許５，７４１，５１６（その全体が、参考として本明細書中で特に援用される））。さらに、潜在的な薬物キャリアとしての、リポソームおよびリポソーム様調製物の種々の方法は、総説されている（Ｔａｋａｋｕｒａ，１９９８；Ｃｈａｎｄｒａｎら，１９９７；Ｍａｒｇａｌｉｔ，１９９５；米国特許５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許５，５６５，２１３号；米国特許５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号（各々、その全体が、参考として本明細書中で特に援用される））。
【０５４２】
リポソームは、Ｔ細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞を含む他の手順によるトランスフェクションに通常耐性である多くの細胞型とともに、首尾よく使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、１９９０；Ｍｕｌｌｅｒら、１９９０）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達システムに代表であるＤＮＡ長制限がない。リポソームは、遺伝子、薬物（ＨｅａｔｈおよびＭａｒｔｉｎ，１９８６；Ｈｅａｔｈら、Ｂａｌａｚｓｏｖｉｔｓら、１９８９；ＦｒｅｓｔａおよびＰｕｇｌｉｓｉ，１９９６）、放射線治療剤（Ｐｉｋｕｌら、１９８７）、酵素（Ｉｍａｉｚｕｍｉら、１９９０ａ；Ｉｍａｉｚｕｍｉら、１９９０ｂ）、ウイルス（ＦａｌｌｅｒおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８４）、転写因子およびアロステリックエフェクター（ＮｉｃｏｌａｕおよびＧｅｒｓｏｎｄｅ、１９７９）を、種々の培養された細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。さらに、リポソーム媒介薬物送達の有効性を試験するいくつかの成功した臨床試験が、完了している（Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎら、１９８５ａ；１９８５ｂ；Ｃｏｕｎｅ、１９８８；Ｓｃｕｌｉｅｒら、１９８８）、さらに、いくつかの研究は、リポソームの使用は、全身送達後の、自己免疫応答、毒性または生殖腺局在化に関連しないことが示唆されている（ＭｏｒｉおよびＦｕｋａｔｓｕ、１９９２）。
【０５４３】
リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、そして多層の同心性二重層ベシクル（多層ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。ＭＬＶは、一般的に、２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は、小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）の形成を生じる。この単層ベシクルは、そのコアに水溶液を含む２００〜５００Åの直径を有する。
【０５４４】
リポソームは、細胞膜と類似点を有し、そしてペプチド組成物のためのキャリアとして、本発明と組み合わせての使用が企図される。それらは、水溶性物質および脂溶性物質の両方がトラップされるので（すなわち、それぞれ水性空間において、そして二重層自体内で）、広範に適切である。薬物保有リポソームは、リポソーム処方物を選択的に改変することによって、活性薬剤の部位特異的送達のためにさらに使用され得ることが可能である。
【０５４５】
Ｃｏｕｖｒｅｕｒら（１９７７；１９８８）の教示に加えて、以下の情報が、リポソーム処方物を作製する際に利用され得る。リン脂質は、水中に分散される場合、水に対する脂質のモル比に依存して、リポソーム以外の種々の構造を形成し得る。低い比において、リポソームは、好ましい構造である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、および二価のカチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性物質および極性物質に対する低い透過性を示し得る。しかし、高温において、リポソームは、それらの透過性を顕著に変える相転移を受ける。この相転移は、密にパッキングした秩序構造（ゲル状態として既知）から、ゆるくパッキングした秩序性の低い構造（流体状態として既知）への変化を含む。これは、特徴的な相転移温度で起こり、そしてイオン、糖および薬物に対する透過性の増加を生じる。
【０５４６】
温度に加え、タンパク質への曝露は、リポソームの浸透を改変し得る。特定の可溶性タンパク質（シトクロムｃ）は、二重膜に結合し、二重膜を変質し、そして２重膜を浸透し、これらによって浸透性の変化を生じる。コレステロールは、リン脂質をより密に充填することによって、明らかにこのタンパク質の浸透を阻害する。抗生物質および阻害剤送達に対する最も有用なリポソーム形成体は、コレステロールを含む。
【０５４７】
溶質をトラップする能力は、異なるタイプのリポソーム間で変化する。例えば、ＭＬＶは、溶質のトラッピングにおいて、中程度に効率的であるが、しかし、ＳＵＶは、極端に非効率である。ＳＵＶは、サイズ分布における均一性および再現性についての利点を提供するが、サイズとトラップ効率との間の妥協が、大きい単層ベシクル（ＬＵＶ）によって提供される。これらは、エーテルエバポレーションによって調製され、そしてＭＬＶより溶質のトラップが、３〜４倍効率的である。
【０５４８】
リポソームの特徴に加えて、トラップ化合物における重要な決定因子は、化合物自体の物理化学的特性である。極性化合物は、水性空間にトラップされ、そして非極性化合物は、ベシクルの脂質二重層に結合する。極性化合物は、浸透を通してか、または二重層が壊れた場合に放出されるが、非極性化合物は、温度によって崩壊するか、またはリポタンパク質に暴露されるまで、二重層に残ったままである。両方のタイプは、相転移温度において、最大の流出速度を示す。
【０５４９】
リポソームは、以下の４つの異なる機構を介して細胞と相互作用する：細網内皮系の食作用細胞（例えば、マクロファージおよび好中球）によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水性力または静電力によってか、あるいは細胞表面成分との特異的な相互作用によってかのいずれかによる、細胞表面への吸着；リポソーム内容物の細胞質への同時放出を伴う、リポソームの脂質二重膜の形質膜への挿入による形質細胞膜との融合；およびリポソーム内容物の任意の会合がなく、リポソーム脂質の細胞膜または細胞内膜への移動、またはその逆による。どの機構が作用しているのか、そして１より多い機構が同時に作用し得るのかを、決定することはしばしば困難である。
【０５５０】
静脈内注入されたリポソームの運命および動向は、それらの物理的特質（例えば、サイズ、流動性、および表面電荷）に依存する。それらは、それらの組成に依存して数時間〜数日の間、組織内で持続し得、そして血液の中で半減期は、数分〜数時間の範囲である。より大きいリポソーム（例えば、ＭＬＶおよびＬＵＶ）は、細網内皮系の食作用細胞によって、急速に取り込まれるが、循環器系の生理学は、ほとんどの部位においてこのような大きな種の放出を制限する。それらは、大きな開口部または孔が、毛細管の内皮（例えば、肝臓および脾臓の洞様毛細血管）に存在する場所においてのみ出て行く。従って、これらの器官は、取り込みの主な部位である。一方で、ＳＵＶは、より広い組織分布を示すが、なおも肝臓および脾臓において、高度に失われる。一般に、このインビボ挙動は、リポソームの、それらの大きなサイズのアクセス可能な、これらの器官および組織のみへの潜在的な標的化を制限する。これらは、血液、肝臓、脾臓、骨髄およびリンパ器官を含む。
【０５５１】
標的化は、一般的には、本発明に関しては限定ではない。しかし、特定の標的化が所望される場合は、これを達成する方法が利用可能である。抗体は、リポソーム表面に結合するため、そしてその抗体およびその薬物内容物を特定の細胞型表面上に位置する特定の抗原性レセプターへと指向するために使用され得る。糖質決定基（細胞間の認識、相互作用および接着にて役割を果たす、糖タンパク質または糖脂質細胞表面成分）もまた、それらは特定の細胞型にリポソームを指向させることに能力を有するので、認識部位として使用され得る。たいてい、リポソーム調製物の静脈内注射が使用されることが意図されるが、他の投与経路も考えられる。
【０５５２】
あるいは、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供し得る。ナノカプセルは、安定かつ再現可能な様式で、一般的に化合物を捕捉し得る（Ｈｅｎｒｙ−Ｍｉｃｈｅｌｌａｎｄら、１９８７；Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、１９９８；Ｄｏｕｇｌａｓら、１９８７）。過剰な細胞内ポリマー負荷に起因する副作用を回避するために、このような超微細粒子（約０．１μｍの大きさ）が、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、本発明における使用のために意図される。このような粒子は、記載されるように（Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、１９８０；１９８８；ｚｕｒ  Ｍｕｈｌｅｎら、１９９８；Ｚａｍｂａｕｘら、１９９８；Ｐｉｎｔｏ−Ａｌｐｈａｎｄｒｙら、１９９５および米国特許第５，１４５，６８４号（本明細書中にその全体が参考として特に援用される））、容易に作製され得る。
【０５５３】
（ワクチン）
本発明の特定の好ましい実施形態において、薬学的組成物が、ワクチンとしての使用について提供される。このワクチンは一般的に、免疫刺激剤と組み合わせて、１つ以上の薬学的組成物（例えば、上記のようなもの）を含む。免疫刺激剤は、外因性抗原に対する免疫応答（抗体媒介性および／または細胞媒介性）を促進または増強する任意の物質であり得る。免疫刺激剤の例としては、アジュバント、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ガラクトシド）およびリポソーム（その化合物が中に組み込まれる；例えば、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、米国特許第４，２３５，８７７号を参照のこと）が挙げられる。ワクチン調製物は、例えば、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ）」Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ、１９９５）に一般的に記載されている。本発明の範囲内にある薬学的組成物およびワクチンはまた、生物学的に活性であっても不活性であってもよい、他の化合物を含み得る。例えば、他の抗原の１つ以上の免疫原性部分が、その組成物またはワクチン中に、融合ポリペプチドへと組み込まれてかまたは別個の化合物としてかのいずれかで、存在し得る。
【０５５４】
例示的ワクチンは、上記のようなポリペプチドのうちの１つ以上をコードするＤＮＡを、そのポリペプチドがインサイチュで生成されるように含み得る。上記のように、そのＤＮＡは、当業者に公知の種々の送達系（核酸発現系、細菌発現系およびウイルス発現系を含む）のいずれかに存在し得る。多数の遺伝子送達技術が当該分野で周知であり、例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５：１４３〜１９８、１９９８およびその中に引用される参考文献により記載される技術である。適切な核酸発現系は、患者における発現に必要なＤＮＡ配列（例えば、適切なプロモーターおよび終止コドン（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ））を含む。細菌送達系は、その細胞表面上にそのポリペプチドの免疫原性部分を発現するかまたはそのようなエピトープを分泌する、細菌（例えば、カルメット−ゲラン杆菌）の投与を包含する。好ましい実施形態において、そのＤＮＡは、ウイルス発現系（例えば、ワクシニアウイルスまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を使用して導入され得、このウイルス発現系は、非病原性（欠損）複製コンピテントウイルスの使用を含み得る。適切な系は、例えば、以下に開示される：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３１７〜３２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６〜１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：１７〜２１、１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ  ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ  ２，２００，６５１：ＥＰ  ０，３４５，２４２号；ＷＯ  ９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６〜６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１〜４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：２１５〜２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１４９８〜１１５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８：２８３８〜２８４８、１９９３；ならびにＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２〜１２０７、１９９３。このような発現系にＤＮＡを組み込む技術は、当業者に周知である。このＤＮＡはまた、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１７４５〜１７４９、１９９３に記載されそしてＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：１６９１〜１６９２、１９９３により概説されるように、「裸」でもあり得る。裸のＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ（これは、細胞に効率的に輸送される）上にそのＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。ワクチンがポリヌクレオチドおよびポリペプチド成分の両方を含み得ることは、明らかである。このようなワクチンは、増強した免疫応答を提供し得る。
【０５５５】
ワクチンが、本明細書中で提供されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的に受容可能な塩を含み得ることは、明らかである。このような塩は、薬学的に受容可能な非毒性塩基（有機塩基（例えば、一級アミンの塩、二級アミンの塩および三級アミンの塩、ならびに塩基性アミノ酸の塩）ならびに無機塩基（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩）を含む）から調製され得る。
【０５５６】
当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明のワクチンにて使用され得るが、キャリアの型は、投与様式に依存して変化する。本発明の組成物は、任意の適切な投与様式（例えば、局所投与、経口投与、経鼻投与、静脈内投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、または筋肉内投与を含む）のために処方され得る。非経口投与（例えば、皮下注射）のために、そのキャリアは、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ろう、または緩衝剤を含む。経口投与のために、上記のキャリア、または固体キャリア（例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、および／または炭酸マグネシウム）のいずれかが使用され得る。生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸）もまた、本発明の薬学的組成物のためのキャリアとして使用され得る。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号および同第５，９４２，２５２号に開示される。米国特許第５，９２８，６４７号に記載される微粒子−タンパク質複合体を含むキャリアもまた使用され得、このようなキャリアは、宿主においてクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る。
【０５５７】
このような組成物はまた、緩衝剤（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）；糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）；マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）；抗酸化剤；静菌剤；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；処方物をレシピエントの血液に対して等張性、低張性または弱く高張性にする溶質；懸濁剤；濃化剤および／または保存剤を含み得る。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。化合物はまた、周知の技術を使用してリポソーム内にカプセル化され得る。
【０５５８】
種々の任意の免疫刺激剤が、本発明のワクチンにおいて使用され得る。例えば、１つ以上のアジュバントが含まれ得る。多くのアジュバントは、抗原を迅速な異化作用から保護するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）および免疫応答の刺激物（例えば、リピドＡ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来のタンパク質またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のタンパク質）を含む。適切なアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ６５（Ｍｅｒｃｋ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．、Ｒａｈｗａｙ、ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）；アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム）；カルシウム塩、鉄塩または亜鉛塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁物；アシル化糖；カチオン誘導体化多糖またはアニオン誘導体化多糖；ポリフォスファーゼン；生分解性ミクロスフェア；モノホスホリルリピドＡおよびｑｕｉｌ  Ａとして市販されている。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、あるいはインターロイキン−２、インターロイキン−７、またはインターロイキン−１２）もまた、アジュバントとして使用され得る。
【０５５９】
本明細書中に提供されるワクチンにおいて、そのアジュバント組成物は、好ましくは、優勢にＴｈ１型の免疫応答を誘導するように設計される。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与される抗原に対する細胞媒介性応答の誘導を支持する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用の後、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を支持する。応答が優勢にＴｈ１型である好ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５〜１７３、１９８９を参照のこと。
【０５６０】
優勢なＴｈ１型応答を惹起する際の使用に好ましいアジュバントとしては、例えば、モノホスホリルリピドＡ；好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ（３Ｄ−ＭＰＬ）とアルミニウム塩との組み合わせが挙げられる。ＭＰＬアジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ；米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（そのＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）もまた、優勢なＴｈ１応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、ＷＯ  ９６／０２５５５、ＷＯ  ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載されている。免疫刺激性ＤＮＡ配列もまた、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：３５２、１９９６により記載されている。別の好ましいアジュバントは、サポニン（好ましくはＱＳ２１（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）であり、これは、単独でも他のアジュバントと組み合わせても使用され得る。例えば、増強された系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（例えば、ＷＯ  ９４／００１５３に記載されるような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬとの組み合わせ）またはＷＯ  ９６／３３７３９に記載されるような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチされている反応生成が低い（ｌｅｓｓ  ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）組成物を含む。他の好ましい処方物は、水中油滴型エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油滴型エマルジョン中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む、特に強力なアジュバント処方物が、ＷＯ  ９５／１７２１０に記載されている。サポニンアナログアジュバントは、例えば、米国特許第５，９７７，０８１号に記載される。
【０５６１】
他の好ましいアジュバントとしては、Ｍｏｎｔｈａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７２０（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、ＳＢＡＳシリーズのアジュバント（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、ベルギーから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ、Ｈａｍｉｌｔｏｎ、ＭＴ）、ならびに他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）（例えば、係属中の米国特許出願第０８／８５３，８２６号および同第０９／０７４，７２０号（その開示は、全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるもの）が挙げられる。
【０５６２】
本明細書中に提供されるワクチンは、抗原、免疫応答エンハンサーおよび適切なキャリアもしくは賦形剤の組み合わせを生じる、周知の方法を使用して調製され得る。本明細書中に記載される組成物は、徐放性処方物（すなわち、投与後に化合物のゆっくりした放出をもたらす、カプセル、スポンジまたはゲル（例えば、多糖から構成される）のような処方物）の一部として投与され得る。このような処方物は、一般的に、周知の技術（例えば、Ｃｏｏｍｂｅｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １４：１４２９〜１４３８、１９９６を参照のこと）を使用して調製され得、そしてたとえば、経口投与、直腸投与もしくは皮下移植または所望の標的部位への移植により投与され得る。徐放性処方物は、キャリアマトリックス中に分散されており、そして／または速度制御膜により囲まれた貯蔵物中に含まれる、ポリペプチド、ポリヌクレオチドもしくは抗体を含み得る。
【０５６３】
このような処方物内での使用のためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた、生分解性であり得；好ましくはその処方物は、比較的一定なレベルの活性成分放出を提供する。このようなキャリアとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の遅延性放出キャリアとしては、超分子バイオベクター（ｓｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ）が挙げられ、これは、非液体親水性コア（例えば、架橋した多糖またはオリゴ糖）と、必要に応じて両親媒性化合物（例えば、リン脂質）を含む外層とを含む（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ  ９６／０６６３８を参照のこと）。徐放性処方物中に含まれる活性化合物の量は、移植部位、放出の速度および予想持続期間、ならびに処置もしくは予防される状態の性質に依存する。
【０５６４】
種々の任意の送達ビヒクルが、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅを標的とする抗原特異的免疫応答の生成を促進するために、薬学的組成物およびワクチンにて使用され得る。送達ビヒクルとしては、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、ならびに有効なＡＰＣであるように操作され得る他の細胞）が挙げられる。このような細胞は、抗原を提示するための能力を増加するように、Ｔ細胞応答の活性化および／もしくは維持を改善するように、それ自体が抗Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ効果を有するように、そして／または受容物と免疫学的に適合性（すなわち、一致したＨＬＡハロタイプ）であるように、遺伝子改変され得るが、必ずしもその必要はない。ＡＰＣは、一般的には、種々の生物学的流体ならびに器官のいずれかから単離され得、そして自系細胞でも、同種異系細胞でも、同系細胞でも、または異種細胞でもよい。
【０５６５】
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはその前駆細胞を使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５１、１９９８）、そして予防的または治療的な抗腫瘍免疫性を誘発するための生理学的アジュバンドとして有効であることが示されてきた（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７−５２９、１９９９を参照のこと）。一般に、樹状細胞は、それらの代表的な形状（インサイチュでは星状、インビトロでは目に見える顕著な細胞質プロセス（樹枝状結晶）を有する）、高い効率で抗原を取り込み、処理し、そして提示するそれらの能力、および未処置の（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞応答を活性化するそれらの能力に基づいて同定され得る。もちろん樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹状細胞上に通常見出されない特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように操作され得、このような改変樹状細胞は本発明によって意図される。樹状細胞の代替として、分泌小胞抗原装荷樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ）（エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる）がワクチン内で使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：５９４−６００，１９９８を参照のこと）。
【０５６６】
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または他の適切な組織もしくは流体から得られ得る。例えば、樹状細胞は、末梢血から収集された単球の培養物に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのようなサイトカインの組み合わせを添加することによってエキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞は、培養培地にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／または樹状細胞の分化、成熟、および増殖を誘導する他の化合物を添加することによって、樹状細胞に分化され得る。
【０５６７】
樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として都合良く分類され、このことは、２つの充分に特徴付けられた表現型の間を区別する単純な方法を与える。しかしこの名称は、あらゆる可能な分化の中間段階を排除するように解釈されるべきではない。未熟な樹状細胞は、抗原の取り込みおよび処理の高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられ、この能力は、Ｆｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高度な発現と相関する。成熟表現型は、代表的に、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）のようなＴ細胞活性化の原因である細胞表面分子の高度な発現ではなく、これらのマーカーのより低い発現によって特徴付けられる。
【０５６８】
ＡＰＣは、一般に、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質（またはその部分もしくは他の改変体）をコードするポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトされ得、その結果、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチドまたはその免疫原性部分が細胞表面上に発現される。このようなトランスフェクションはエキソビボで生じ得、次いでこのようなトランスフェクトされた細胞を含む組成物またはワクチンは、本明細書中に記載されるように、治療目的のために使用され得る。あるいは、細胞を提示する樹状または他の抗原を標的とする遺伝子送達ビヒクルが、患者に投与され得、インビボで起こるトランスフェクションを生じる。樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションは、例えば、ＷＯ９７／２７４４４７に記載される方法、またはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７５：４５６−４６０、１９９７によって記載される遺伝子銃アプローチのような当該分野で公知の任意の方法を使用して一般に実施され得る。樹状細胞の抗原装荷は、樹状細胞または前駆細胞を、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチド、ＤＮＡ（裸のもしくはプラスミドベクター中の）またはＲＮＡ；あるいは抗原発現性組換え細菌またはウイルス（例えば、牛痘、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスのベクター）とインキュベートすることによって達成され得る。装荷の前に、ポリペプチドは、Ｔ細胞補助（例えば、キャリア分子）を提供する免疫学的パートナーに共有結合され得る。あるいは、樹状細胞は、単独でかまたはポリペプチドの存在下で、結合していない免疫学的パートナーと同調（ｐｕｌｓｅ）され得る。
【０５６９】
ワクチンおよび薬学的組成物は、単回用量または複数回用量の容器（例えば、密閉アンプルまたはバイアル）中に提供され得る。このような容器は、好ましくは、使用するまでこの処方物の滅菌性を保つために、密閉される。一般的に、処方物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンとして保存され得る。あるいは、ワクチンまたは薬学的組成物は、使用直前に滅菌液体キャリアの添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存され得る。
（アクネ治療）
本発明のさらなる局面において、本明細書において記載される組成物は、アクネの免疫治療に用いられ得る。このような方法において、薬学的組成物およびワクチンが、代表的に患者に投与される。本明細書において用いられる場合、「患者」とは、任意の温血動物、好ましくはヒトをいう。患者は、アクネに感染していてもいなくてもよい。従って、上記の薬学的組成物およびワクチンは、アクネの発生を予防するために、またはアクネに罹患した患者を処置するために用いられ得る。アクネは、当該分野で一般に受け入れられている基準を用いて診断される。投与は、任意の適切な方法によって行われるが、最も代表的には、経口投与または局所投与である。
【０５７０】
特定の実施形態において、免疫療法は、能動的免疫療法であり得、この療法において処置は、免疫応答改変剤（例えば、本明細書中で開示されたポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与でＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓに対して反応する内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存する。
【０５７１】
他の実施形態において、免疫療法は、受動的免疫療法であり得、この療法において処置は、確立されたＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ免疫反応性を有する因子（例えば、効果細胞または抗体）の送達（抗腫瘍効果を直接的または間接的に媒介し得、そしてインタクトな宿主免疫系に依存する必要はない）を含む。効果細胞の例としては、上記のようなＴ細胞、本明細書中に提供されるポリペプチドを発現するＴリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤性リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞および抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書中に列挙されるポリペプチドに特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、養子免疫療法のために他のベクターまたは効果細胞中にクローニングされ、発現され、そして移入され得る。本明細書に提供されるポリペプチドはまた、受動免疫療法のための抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載される）を生成するために用いられ得る。
【０５７２】
エフェクター細胞は、通常、本明細書中に記載されるように、インビトロでの増殖により養子免疫治療のために十分な量で得られ得る。単一の抗原特異的効果細胞を、インビボでの抗原認識の保持しながら数十億まで増殖させるための培養条件は当該分野で周知である。このようなインビトロの培養条件は代表的に、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および分裂しない支持細胞の存在下で、抗原での間欠刺激を用いる。上で述べたように、本明細書中で提供される免疫反応性ポリペプチドは、抗原特異的Ｔ細胞培養を急速に増殖するために用いられ、免疫治療に十分な数の細胞を生成し得る。詳細には、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞、またはＢ細胞）は、当該分野で周知の標準的技術を用いて、免疫反応性ポリペプチドでパルスされ得るか、または１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞は、組換えウイルスまたは他の発現系における発現を増大するのに適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。治療において使用するための培養された効果細胞は、増殖されかつ広範に流通され得、そしてインビボで長期間生存され得なければならない。培養された効果細胞が、インビボで増殖し、そしてＩＬ−２を補充された抗原での反復刺激によって、長期間、多数生存しするように誘導され得ることが研究で示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １５７：１７７、１９９７を参照のこと）。
【０５７３】
あるいは、本明細書において列挙されるポリペプチドを発現するベクターは、患者から得られた抗原提示細胞に導入され得、そして同じ患者に戻す移植のためにエキソビボでクローン的に増殖され得る。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で公知の任意の手段（好ましくは、静脈投与、腔内投与、または腹腔内投与による滅菌形態）を用いて患者に再導入され得る。
【０５７４】
本明細書中に開示される治療的組成物の投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個々人で異なり、そして標準的技術を用いて容易に確立され得る。概して、薬学的組成物およびワクチンは、注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、または皮下）により、経鼻的に（例えば、吸引により）、経口的に、舌下または好ましくは局所的に投与され得る。例えば、５２週間にわたって１〜１０用量の間が投与され得る。好ましくは、１ヶ月の間隔で６用量が投与され、そしてブースター（追加）ワクチン接種がその後定期的に与えられ得る。代替のプロトコールが個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記のように投与された場合、抗腫瘍免疫応答を促進し得、そして基底（すなわち、未処置）レベルより少なくとも１０〜５０％上である、化合物の量である。このような応答は、患者内の抗Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ抗体を測定することによってか、または患者のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ細胞を殺傷し得る細胞溶解性効果細胞のワクチン依存性のインビトロでの生成によってモニターされ得る。一般に、１つ以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについて、用量中に存在する各ポリペプチドの量は、宿主の体重（ｋｇ）あたり、約２５μｇ〜５ｍｇにわたる。適切な用量サイズは、患者の大きさで変化するが、代表的には約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
【０５７５】
一般に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的および／または予防的利点を提供するのに十分な量の活性薬剤を提供する。このような応答は、処置されていない患者に比較して、処置された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全なまたは部分的な、あるいはより長い疾患なしでの生存）を確立することによってモニターされ得る。Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質に対する既存の免疫応答における増加は、一般的に、改善された臨床的結果と関連する。このような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖アッセイ、細胞障害性アッセイまたはサイトカインアッセイを使用して評価され得、これは、処置の前または後に患者から得られるサンプルを使用して行われ得る。
【０５７６】
（Ｐｒｏｐｉｏｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの検出および診断）
一般的に、Ｐｒｏｐｉｏｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓは、患者から得られた生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰および／または尿）における１つ以上のＰｒｏｐｉｏｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質および／またはこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいて患者において検出され得る。言い換えると、このようなタンパク質は、Ｐｒｏｐｉｏｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの存在または非存在を示すためのマーカーとして使用され得る。さらに、このようなタンパク質は、Ｐｒｏｐｉｏｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓに関連する他の生物の検出に有用であり得る。本明細書に提供される結合剤が、一般的に、生物学的サンプル中の薬剤に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、Ｐｒｏｐｉｏｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用され得、これもまた、Ｐｒｏｐｉｏｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの存在または非存在を示す。一般に、乳房腫瘍の配列は、正常な組織におけるよりも、腫瘍組織において少なくとも３倍高いレベルで存在する。
【０５７７】
サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するために結合剤を使用するための、当業者に公知の種々のアッセイ型式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般的に、患者におけるＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの存在または非存在は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを結合剤と接触させる工程；（ｂ）結合剤に結合するポリペプチドのレベルをサンプルにおいて検出する工程；および（ｃ）ポリペプチドのレベルと所定のカットオフ値とを比較する工程によって決定され得る。
【０５７８】
好ましい実施形態において、このアッセイは、結合するためおよびサンプルの残りからポリペプチドを除くために固体支持体上に固定化された結合剤の使用を含む。次いで、結合されたポリペプチドは、レポーター基を含み、結合剤／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出され得る。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体に特異的に結合する結合剤あるいは結合剤に特異的に結合する他の薬剤（例えば、抗免疫グロブリン、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａまたはレクチン）を含み得る。あるいは、競合アッセイが、使用され得、ここで、ポリペプチドは、レポーター基で標識され、そしてサンプルと結合剤のインキュベーション後にその固定化結合剤に結合し得る。サンプルの成分が、標識ポリペプチドの結合剤への結合を阻害する程度は、サンプルの固定化結合剤との反応性を示す。このようなアッセイにおける使用に適切なポリペプチドは、上記のような、全長Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質および結合剤が結合するその部分を含む。
【０５７９】
固体支持体は、腫瘍タンパク質が付着され得る当業者に公知の任意の物質であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートにおける試験ウェルあるいはニトロセルロースまたは他の適切な膜であり得る。あるいは、その支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス）、ファイバーグラス、ラテックス、またはプラスチック物質（例えば、ポリスチレン、またはポリ塩化ビニル）であり得る。その支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に記載のような）であり得る。結合剤は、当業者に公知の種々の技術を使用して固体支持体上に固定化され得、これは特許および科学文献に十分に記載されている。本発明の状況において、用語「固定化」とは、非共有結合的な会合（例えば、吸着）および共有結合的な付着（これは、薬剤と支持体上の官能基との間で直接結合され得るかまたは架橋剤を用いる結合であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートのウェル、または膜への吸着による固定化は好ましい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中で固体支持体を用いて適切な時間で結合剤に接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度によって変化するが、代表的には、約１時間から約１日の間である。一般的には、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、そして好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合剤とプラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウェルを接触させることは、適切な量の結合剤を固定化するのに十分である。
【０５８０】
固体支持体への結合剤の共有結合的付着は、一般に、支持体および結合剤上の官能基（例えば、水酸基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬と支持体を最初に反応させることによって達成され得る。例えば、この結合剤は、ベンゾキノンを用いるかまたは結合パートナー上のアミンおよび活性水素を用いる支持体上のアルデヒド基の縮合によってコートする適切なポリマーを有する支持体に、共有結合的に付着され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２−Ａ１３を参照のこと）。
【０５８１】
特定の実施形態において、このアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイである。本アッセイは、最初に、固体支持体（通常、マイクロタイタープレートのウェル）上で固定化されている抗体をサンプルと接触させて、サンプル内のポリペプチドを固定化抗体に結合させることによって実施され得る。次いで、非結合サンプルは固定化ポリペプチド−抗体複合体から除去され、そして検出試薬（好ましくは、そのポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体（レポーター基を含む））が添加される。次いで、固体支持体に結合したままである検出試薬の量が、特定のレポーター基に関して適切な方法を用いて決定される。
【０５８２】
より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定化されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、典型的にはブロックされる。任意の適切なブロック剤（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０ＴＭ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））は、当業者に公知である。固定化抗体は次いで、サンプルとインキュベートされ、そしてポリペプチドをこの抗体に結合させる。インキュベーションの前に、このサンプルは適切な希釈液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈され得る。概して、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓを有する個体から得られたサンプル内のポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間である。好ましくは、この接触時間は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡が少なくとも約９５％で達成される結合レベルを達成するのに十分な時間である。当業者は、ある時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、平衡に達するまでに必要な時間が容易に決定され得ることを認識する。室温では、一般に、約３０分間のインキュベーション時間で十分である。
【０５８３】
次いで、非結合サンプルが、適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０ＴＭを含むＰＢＳ）を用いて固体支持体を洗浄することによって除去される。レポーター基を含む第２の抗体が次いで、固体支持体に添加され得る。好ましいレポーター基は、上記の基を含む。
【０５８４】
次いで、検出試薬が、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な量の時間、固定化抗体−ポリペプチド複合体とインキュベートされる。適切な量の時間は、一般に、ある時間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、非結合の検出試薬は除去され、そして結合した検出試薬は、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、一般的には、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が適切である。分光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（一般に、放射性もしくは蛍光基または酵素）に結合されたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加（一般には、特定の時間の間）、続いて反応産物の分光分析または他の分析により検出され得る。
【０５８５】
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルが、一般に、所定のカットオフ値と対応するシグナルと比較される。１つの実施形態において、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの検出のためのカットオフ値は、固定化抗体を、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓを有さない患者由来のサンプルとインキュベートした際に得られた平均シグナル値である。１つの実施形態において、所定のカットオフ値を３標準偏差上回るシグナルを生じるサンプルが、この試験に対して陽性とみなされる。代わりの好ましい実施形態において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，１９８５，１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーターカーブ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ  Ｃａｒｖｅ）を使用して決定される。簡単に言うと、本実施形態において、このカットオフ値は、診断試験結果について各可能なカットオフ値に対応する真の陽性割合（すなわち、感度）および偽陽性割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。プロット上の上方左手角に最も近いカットオフ値（すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、そして本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが陽性と見なされ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性割合を最小にするためにプロットに沿って左へシフトされ得るか、または偽陰性割合を最小にするために右へシフトされ得る。概して、本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓに対して陽性と見なされる。
【０５８６】
関連の実施形態において、このアッセイは、フロースルー試験形式またはストリップ試験形式で実行される（ここで、抗体は、ニトロセルロースのような膜上で固定化される）。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜を通過するにつれて固定化抗体に結合する。次いで、第２の標識化された抗体が、この第２の抗体を含む溶液がその膜を介して流れるにつれて、抗体−ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２の抗体の検出は、上記のように実行され得る。ストリップ試験形式では、抗体が結合される膜の一端をサンプルを含む溶液中に浸す。このサンプルは、膜に沿って、第２の抗体を含む領域を通って、そして固定化抗体の領域まで移動する。固定化抗体の領域での第２の抗体の濃度が、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの存在を示す。代表的には、その部位での第２の抗体の濃度は、視覚的に読みとられ得るパターン（例えば、線）を生成する。このようなパターンを示さないことは陰性の結果を示す。概して、この膜上に固定化される抗体の量は、生物学的サンプルが、上記の形式において、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じるのに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるように選択される。このようなアッセイにおける使用のために好ましい結合因子は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化される抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少ない量の生物学的サンプルを用いて実行され得る。
【０５８７】
もちろん、本発明のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質または結合剤との使用に適する多数の他のアッセイ手順が存在する。上記の記載は、例示のみを意図する。例えば、上記のプロトコールが、生物学的サンプル中のこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出するためのＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチドを使用するために、容易に改変され得ることは、当業者に明らかである。このようなＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質特異的抗体の検出は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの存在と相関し得る。
【０５８８】
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓはまた、あるいはＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓは、生物学的サンプル中のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法において、患者から単離されたＣＤ４＋  Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む生物学的サンプルが、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、そしてそのＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるが、これに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用的技術（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離）によって、患者から単離され得る。Ｔ細胞は、ポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともに、３７℃で２〜９日間（代表的には４日間）、インビトロでインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立つように、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓポリペプチドの非存在下でインキュベーションすることが、所望され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞について、活性化は、好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８＋細胞について、活性化は、細胞溶解活性を評価することによって、好ましくは検出される。
【０５８９】
上記のように、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓはまた、あるいはＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓは、生物学的サンプル中のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルに基づいて検出され得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、生物学的サンプル由来のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ  ｃＤＮＡの一部を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて使用され得、このオリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つは、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、この増幅されたｃＤＮＡは、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動）を使用して、分離および検出される。同様に、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブが、生物学的サンプル中のこのＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出するために、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。
【０５９０】
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチドの長さ、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さのＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して、少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有する、オリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記のように、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に使用され得るオリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、このオリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に記載されるＤＮＡ分子のうちの、少なくとも１０個連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５個連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３、１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、１９８９を参照のこと）。
【０５９１】
別の実施形態において、本明細書中に記載される組成物は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの存在をモニターすることによってニキビ疾患の進行についてのマーカーとして使用され得る。この実施形態において、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓの検出のための上記のようなアッセイが、経時的に実施され得、そして反応性のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変化が評価され得る。例えば、このアッセイは、６ヶ月〜１年の期間に２４〜７２時間ごとに実施され得、その後も必要ならば実施され得る。
【０５９２】
特定のインビボ診断アッセイは、病変に対して直接実施され得る。１つのこのようなアッセイは、病変細胞を結合剤と接触させる工程を包含する。次いで、結合された結合剤が、直接的またはレポーター基を介して間接的に検出され得る。このような結合剤はまた、組織学的適用において使用され得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブが、このような適用において使用され得る。
【０５９３】
上記のように、感度を改善するために、複数のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質マーカーが、所定のサンプルにおいてアッセイされ得る。本明細書中に提供される異なるタンパク質に特異的な結合剤が、単一のアッセイ中で混合され得ることは、明らかである。さらに、複数のプライマーまたはプローブが、同時に使用され得る。Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質マーカーの選択は、最適な感度を生じる組み合わせを決定するための慣用的実験に基づき得る。さらに、またはあるいは、本明細書中に提供されるＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質についてのアッセイが、他の公知のまたは関連のニキビ原因タンパク質についてのアッセイと組み合わせられ得る。
【０５９４】
本発明は、上記の診断方法のうちのいずれかにおける使用のためのキットをさらに提供する。このようなキットは、代表的には、診断アッセイを実施するために必要な２つ以上の成分を含む。成分は、化合物、試薬、容器および／または装置であり得る。例えば、キット中の１つの容器が、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質に特異的に結合する、モノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントは、上記のように、支持体材料に結合して提供され得る。１つ以上のさらなる容器が、このアッセイにおいて使用される要素（例えば、試薬または緩衝液）を含み得る。このようなキットはまた、またはあるいは、抗体結合の直接検出または間接検出に適切な、レポーター基を含む上記のような検出試薬を含み得る。
【０５９５】
あるいは、生物学的サンプル中のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを検出するための、キットが設計され得る。このようなキットは、一般的に、上記のような、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーを含む。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る。このようなキット中に存在し得るさらなる成分としては、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にするための、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬もしくは診断容器が挙げられる。
【０５９６】
以下の実施例は、例示として提供され、限定としては提供されない。
【０５９７】
（実施例）
（実施例１：Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓゲノムＤＮＡ配列の同定）
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ（ＡＴＣＣ番号６９１９；型株）を、ＡＴＣＣから得た。凍結乾燥した細菌を、１ｍｌのチオグリコレート培地に再懸濁し、そして約１５ｍｌの液体チオグリコレートを含むいくつかの培養管の各々に約２００μｌを移し、そして３７℃で７〜１０日間インキュベートした。各１５ｍｌの濃培養物を、続いて嫌気性増殖を可能にする、ほとんど空間容積（空間）のないチオグリコレート培地の５００ｍｌの培養容積に播種するために使用した。この培養物を、３７℃で約３週間増殖させるかまたは濁った増殖が明らかになるまで増殖させた。Ｐ．ａｃｎｅｓのペレットを、遠心分離によって回収し、そしてこのペレットを、複数の再懸濁および遠心分離によって、１×ＰＢＳで３回洗浄した。最終遠心分離は、１０，０００ｒｐｍであり、そして残りの液体を除去した。
【０５９８】
洗浄したペレットを、１）ショットガンＤＮＡクローニングおよびゲノム配列決定のための高分子量ＤＮＡ、または２）生化学的評価および免疫学的評価のための全細胞溶解物の調製のために使用した。高分子量ＤＮＡを、以下のように調製した：Ｐ．ａｃｎｅｓペレットを、水浴中で８０℃にて２０分間加熱インキュベートし、次いで、ＴＥ（１０ｍＭ  ｔｒｉｓ；１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中のリゾチーム（５ｍｌのＴＥ中、０．１０ｇのリゾチーム）の２０ｍｇ／ｍｌ溶液で、３７℃で１時間酵素的に溶解した。続いて、溶解緩衝液０．５ｍｌにつき、１０μｌのＰｒｏｔ  Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ）および７０μｌの１０％  ＳＤＳを添加し（工程３、上記）、そして懸濁液を室温で約１０分間振動させた。次いで、６５℃で１５分間インキュベートし、そしてなお６５℃で保ちつつ、溶解緩衝液５００μｌ当たり１００μｌの５Ｍ  ＮａＣｌ溶液を添加した。最後に、８０μｌの１０％  ＣＴＡＢ溶液（１０ｇ  ＣＴＡＢ；１４ｍｌ  ５Ｍ  ＮａＣｌ、８６ｍｌ水）を５００μｌの溶解緩衝液ごとに添加し、そしてインキュベーションを６５℃で１０分間続けた。
【０５９９】
ゲノムＤＮＡを、等量のフェノールおよび数滴のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）の添加、続く混合によって溶解したペレットから抽出した。均一な「白色」溶液を遠心分離し、そして水相をもう２回、再抽出した。次いで、ゲノムＤＮＡを沈殿させるために０．６倍量のイソプロパノールを添加した。
【０６００】
ゲノムライブラリーの調製のために、高分子量ＤＮＡを、超音波処理によって無作為に剪断し、そして平均サイズ約１，２００ｂｐのフラグメントを精製し、そして標準的な充填（ｆｉｌｌｉｎｇ）プロセスによって平滑末端を作製した。挿入ＤＮＡをＰＵＣベクターに連結し、そして独立したクローンのライブラリーを作製するためにＥ．ｃｏｌｉ宿主細胞に形質転換した。個々のクローンから単離されたＤＮＡを、Ｐ．ａｃｎｅｓゲノムライブラリーから配列決定した。約８．６全長ゲノム等価物を示す重複するクローンを、２９９個の線状コンティグを形成するために整列させた。この様式によって同定された配列を、配列番号１〜２９９に示し、そして表２（本出願の別の添付書類に存在する）においてコンティグ名および長さによってさらに同定した。これらの２９９個のコンティグは、Ｐ．ａｃｎｅｓゲノムの９０％より多くをカバーする２，６５６，８６０ヌクレオチドの総組立長を示す。
【０６０１】
配列番号１〜２９９に示されるコンティグポリヌクレオチド配列を使用して、６フレームの翻訳を、５０アミノ酸残基長以上のＰ．ａｃｎｅｓポリペプチド配列をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を予測するために実行した。この分析から生じるＯＲＦポリペプチド配列を、配列番号３００〜２９，２１２に示す。これらのＯＲＦを、その起源であるＤＮＡコンティグＯＲＦをコードするコンティグ上の特定のヌクレオチド位置およびＯＲＦが翻訳されるフレーム（１、２、３、−１、−２、−３）と比較して表３（本出願の別の添付書類に存在する）でさらに参照する。
【０６０２】
（実施例２：Ｐ．ａｃｎｅｓの免疫原生成分の同定）
Ｐ．ａｃｎｅｓの全細胞溶解物を、超音波処理によって調製し、そして総タンパク質含量を、標準的な分析によって決定した。各々１０μｇを標準的なＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分解し、そして分解された種を血清と共に免疫学的探索において使用するためにニトロセルロースに移した。顔面ニキビの重篤な症状を有する５つのドナー（１〜５）由来の血清を、イムノブロット（１０μｇのＰ．ａｃｎｅｓ溶解物を含む）で使用して、Ｐ．ａｃｎｅｓの抗原性成分を同定した。
【０６０３】
図１に例示されるように、顔面ニキビの重篤な症状を有する個体由来の血清を、以下のサイズを有するいくつかの優性な種と反応させた：１８〜２８ｋＤａ；３５〜４０ｋＤａ；約５０ｋＤａ；約７０ｋＤａ；約１００ｋＤａ、ならびに１８ｋＤａより小さいいくつかの低分子量種。
【０６０４】
（実施例３：Ｐ．ａｃｎｅｓゲノムＤＮＡの生物情報学的分析）
（ＢＬＡＳＴ分析）
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、実施例１に記載のように、６つ全ての可能なリーディングフレームで全てのコンティグを翻訳することによって、Ｐ．ａｃｎｅｓゲノムＤＮＡ配列から作製した。５０残基以上の任意のＯＲＦを、さらなる分析のために保持した。配列番号３００〜２９，２１２に開示され、そして表３で参照されるように、これらは、合計２８，９１３個の５０残基以上のＯＲＦである。２８，９１３個の推定Ｐ．ａｃｎｅｓ  ＯＲＦアミノ酸配列をＧｅｎｂａｎｋの非重複のｎｒタンパク質データベース（２０００年９月２５日に公開のＧｅｎｂａｎｋ  ｎｒタンパク質）のＢＬＡＳＴＰ配列相同性検索において、問い合わせとして使用した。このデータベースは、全ての非重複Ｇｅｎｂａｎｋタンパク質配列（ＣＤＳ翻訳＋ＰＤＢ＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ＋ＰＩＲ）からなる。このデータベースの詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで見出され得る。ＢＬＡＳＴＰ検索のためのパラメーターを、顕著な「ヒット」を、１０ｅ−８未満の「Ｅ値」（期待値）を有する任意の適合として定義する点を除いて、標準的なデフォルトにセットした。このＥ値は、偶然に生じる、２つの配列間で観察される相同性の特定のストレッチのオッズを表す。従って、Ｅ値が低いほど、観察される相同性が本物である統計学的可能性、そして推定ＯＲＦポリペプチドが真の翻訳産物を示する統計学的可能性は高くなる。
【０６０５】
２８，９１３個の推定Ｐ．ａｃｎｅｓ  ＯＲＦアミノ酸配列をまた、Ｇｅｎｂａｎｋ非重複（ｎｒ）核酸データベース（Ｇｅｎｂａｎｋ  ｎｒ、２０００年１１月６日に公開）のＴＢＬＡＳＴＮ配列相同性検索において、問い合わせとして使用した。このデータベースは、非重複核酸配列（Ｇｅｎｂａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ）の全てを含む。このデータベースの詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで見出され得る。ＴＢＬＡＳＴＮは、６つ全てのリーディングフレームで翻訳されるＤＮＡデータベースを検索するために、タンパク質の問い合わせを使用する。このＢＬＡＳＴＮ検索のためのパラメーターを、顕著な「ヒット」を、１０ｅ−８未満の「Ｅ値」（期待値）を有する任意の適合として定義する点を除いて、標準的なデフォルトにセットした。
【０６０６】
（ＧｅｎｅＭａｒｋ分析）
ＧｅｎｅＭａｒｋソフトウェア（Ｇｅｏｒｇｉａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；  Ａｔｌａｎｔａ，  ＧＡ）は、Ｍａｒｋｏｖモデルに基づきＤＮＡ配列からタンパク質コード領域を同定するために用いられるバイオインフォマティクスソフトウェアプログラムであり、そしてｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｍａｒｋ．ｂｉｏｌｏｇｙ．ｇａｔｅｃｈ．ｅｄｕ／ＧｅｎｅＭａｒｋ／（このサイトは、このモデルに対する情報および参照事項を含む）において議論される。
【０６０７】
完全に配列決定され、注釈をつけられ、そしてＰ．ａｃｎｅｓと類似であると考えられる生物に由来する７つの原核生物ゲノムから得られたＧｅｎｅｍａｒｋマトリックスを用いて、Ｐ．ａｃｎｅｓにおけるタンパク質コード配列を同定した。５０残基以上の大きさの全ての予想されたＰ．ａｃｎｅｓのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、上記で議論したように、この比較分析のために使用した。
【０６０８】
次いで、ＢＬＡＳＴ配列比較プログラムを用いて、Ｇｅｎｅｂａｎｋタンパク質データベース（ｂｌａｓｔｐ）のアミノ酸配列およびＧｅｎｅｂａｎｋＤＮＡ配列（ｔｂｌａｓｔｎ）のＤＮＡ配列から翻訳されるアミノ酸配列に対してこれらのＯＲＦを比較した。
【０６０９】
以下を有する７つの異なる原核生物（以下を参照のこと）由来の７つのＧｅｎｅＭａｒｋマトリックス（またはトレーニングセット（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ））を選択した：
・完全なゲノム配列および利用可能な注釈
・Ｐ．ａｃｎｅｓのタンパク質コード配列と類似するタンパク質コード配列の最も高い数。
【０６１０】
これらの７つのＧｅｎｅＭａｒｋマトリックスを用いて、Ｐ．ａｃｎｅｓゲノムにおいてＯＲＦを同定した。用いた７つの生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓであった。各マトリックスは、Ｐ．ａｃｎｅｓゲノム配列からタンパク質コード配列のセットを予想する。いくつかのタンパク質コード配列を、７つの生物全てから予想し、そしていくつかは、７つの生物のサブセットから予想した。特定のＯＲＦが７つのマトリックスにより予想される回数を表４に「Ｇｅｎｅｍａｒｋスコア」として列挙する（本出願に添付される別書類に配置される）。従って、Ｇｅｎｅｍａｒｋスコアが高いほど、ＯＲＦが真正のＰ．ａｃｎｅｓタンパク質配列を示している可能性が高い。なぜならば、それは複数のマトリックスから予想され、このタンパク質が進化論的に保存されていることを示すからである。
【０６１１】
表４は、以下の基準を満たすＢＬＡＳＴおよびＧｅｎｅＭａｒｋ分析データＯＲＦを要約する：
ｉ．５０残基以上、および
ｉｉ．１０ｅ−８またはそれ未満のＥ値を有するＢＬＡＳＴＰヒットを生成した、および／または
ｉｉｉ．１０ｅ−８またはそれ未満のＥ値を有するＴＢＬＡＳＴＮヒットを生成した、および／または
ｉｖ．少なくとも６つのＧｅｎｅＭａｒｋマトリックスから予想された。
【０６１２】
基準（ｉ）および他の基準（ｉｉ）〜（ｉｖ）の少なくとも１つを満たさないＯＲＦは、表４に記載された最終的なＯＲＦのリストに含めなかった。
【０６１３】
表４は、以下の情報を含む：
・ＯＲＦ配列番号：表３に規定されるような各ＯＲＦに対して割り当てられた配列番号。
・ＤＮＡ配列番号：ＯＲＦが由来した（翻訳された）、表２に規定されるような対応するＤＮＡ配列番号。
・コンティグ名：本来のゲノム配列分析において割り当てられた配列名。
・フレーム：ＯＲＦを得るために用いられたＤＮＡコンティグ上のリーディングフレーム。正方向フレーム１、２、または３。逆方向フレーム−１、−２、または−３。
・ＤＮＡコンティグ上のヌクレオチド位置（開始）：ＤＮＡコンティグ配列上に位置する場合のＯＲＦの開始位置。
・ＤＮＡコンティグ上のヌクレオチド位置（終止）：ＤＮＡコンティグ配列上に位置する場合のＯＲＦの終止位置。
・ＯＲＦ長：アミノ酸残基数でのＯＲＦの長さ。
・最高ＢＬＡＳＴＰヒット、ＧｅｎＢａｎｋ説明文：有意なＢＬＡＳＴＰヒット（すなわち、定義によると、１０ｅ−８未満のＥ値を有するヒット）が獲得された場合、最高ヒットの説明文がここに与えられる。有意なヒットが獲得されなかった場合、セルは空である。
・ＢＬＡＳＴＰ  Ｅ値：最高ＢＬＡＳＴＰヒットのＥ値。有意なヒットが獲得されなかった場合、セルは空である。
・最高ＴＢＬＡＳＴＮヒット、ＧｅｎＢａｎｋ説明文：有意なＴＢＬＡＳＴＮヒット（すなわち、定義によると、１０ｅ−８未満のＥ値を有するヒット）が獲得された場合、最高ヒットの説明文がここに与えられる。有意なヒットが獲得されなかった場合、セルは空である。
・ＴＢＬＡＳＴＮ  Ｅ値：最高ＴＢＬＡＳＴＮヒットのＥ値。有意なヒットが獲得されなかった場合、セルは空である。
・ＧｅｎｅＭａｒｋスコア：特定のＯＲＦが、７つの原核生物マトリックスにより予想された回数（空欄のセルは、そのＯＲＦが、いずれのＧｅｎｅＭａｒｋマトリックスによっても予想されなかったことを示す）。
【０６１４】
これらのＢＬＡＳＴおよびＧｅｎｅｍａｒｋバイオインフォマティックス分析から、上記の基準を満たす４５００よりも多いＰ．ａｃｎｅｓタンパク質を同定した。このＰ．ａｃｎｅｓタンパク質の数を、上記のように、１０ｅ−８未満のＥ値の閾値を用いて同定したが、この閾値を１０ｅ−１５に変更すると約３４００のＯＲＦが生じ、この閾値を１０ｅ−２０に変更すると約２９００のＯＲＦが生じ、そしてこの閾値を１０ｅ−２５に変更すると約２６００のＯＲＦが生じる。その大きさを考慮し、そして他の関連の微生物について利用可能な情報に基づき、Ｐ．ａｃｎｅｓゲノムによりコードされる、ほぼ２５００〜３５００のタンパク質が存在すると考えられる。この点について、本発明の特定の好ましいＰ．ａｃｎｅｓポリペプチドとしては、１０ｅ−１５〜１０ｅ−２５またはそれより小さい範囲のＢＬＡＳＴＰおよび／またはＴＢＬＡＳＴＮ  Ｅ値を有すると表４で同定されるポリペプチドが挙げられる。これらの組み合わせた分析の結果から、当業者は、表４のデータが、本明細書中で同定されたタンパク質がＰ．ａｃｎｅｓゲノムの真正の翻訳産物を表すことを実質的に支持すると考える。
【０６１５】
（実施例４：Ｐ．ａｃｎｅｓ抗原の血清学的発現クローニング）
発現ライブラリーを以下のようにして構築した：Ｐ．ａｃｎｅｓ株６９１９由来の総ゲノムＤＮＡを３０％の出力（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ）にて５秒間超音波破砕することにより無作為に剪断し、次いで、室温にて３０分間ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ：Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、続いて７２℃にて３０分間Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で満たした。次にＥｃｏＲＩアダプター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を４℃にて４８時間、平滑末端フラグメントに連結し、リガーゼの熱不活性化の後、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて３７℃にて３０分間アダプターをリン酸化した。最終的にＤＮＡフラグメントを、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−４００  ＨＲ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）カラムを用いてサイズ選択し、その後、４℃にて４８時間、ＥｃｏＲＩ消化したＬａｍｂｄａ  ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）ベクターに連結し、そしてＧｉｇａｐａｃｋ  ＩＩＩ  Ｇｏｌｄ  ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてパッケージした。
【０６１６】
この発現ライブラリーを、１）重度のａｃｎｅｓの病歴を有するプールされた個体由来の血清、および２）Ｐ．ａｃｎｅｓ溶解物に対して惹起されたウサギポリクローナルＡｂを用いてスクリーニングした。これにより、いくつかの遺伝子をクローニングした。これらの配列決定により、５’および３’配列を獲得し、そしていくつかの場合、「全長」インサートの配列を、Ｐ．ａｃｎｅｓについて生成され、そして実施例１に記載されるゲノム配列を用いるバイオインフォマティックアプローチによりクローニングした。
【０６１７】
これらのＰ．ａｃｎｅｓ（ＰＡ）クローンを、ヒト（ｈ）血清またはウサギ（ｒ）血清のいずれを用いてクローニングされたかに依存してｈＰＡまたはｒＰＡと命名した。８つの完全なクローンを、ヒト血清スクリーンにより獲得し（クローンｈＰＡ−２、４、１４、２０、２１、２３、２５、および２９）、そしてウサギスクリーニングにより９つを獲得した（ｒＰＡ−２、３、７、１５、１７、１９、２８、３４ｂ、および４０）。これらのクローンおよび配列番号１〜２９９のＰ．ａｃｎｅｓ  ＤＮＡコンティグにおけるそれらの位置を、以下の表５に示す。ＤＮＡコンティグの各領域内でコードされるポリペプチド配列の配列番号もまた示す。従って、特定のこれらのポリペプチドは、重度の挫瘡の病歴を有するプールされた個体由来の血清および／またはＰ．ａｃｎｅｓ溶解物に対して惹起されたウサギポリクローナルＡｂと反応性であり、従って免疫原性Ｐ．ａｃｎｅｓタンパク質を表す。
【０６１８】
【表５】
2004520803.tif 000004
【０６１９】
（実施例５：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの共通溶血素（ｃｏｈｅｍｏｌｙｓｉｎ）に対する相同性を有するＰ．ａｃｎｅｓタンパク質）
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ株（ＡＴＣＣ＃６９１９  （ＮＣＴＣ７３７）および２つの臨床的な単離体（ＰＡ−１およびＰＡ−２））由来の総細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、銀染色し、そしてそれらのタンパク質プロフィールを比較した。これらの結果は、両方の臨床的な単離体において、ＡＴＣＣ株では欠失している２つの豊富なタンパク質種の存在を明らかにした。これらのタンパク質ＺＩおよびＺＩＩは、それぞれ、約２８ｋＤａおよび２４ｋＤａの分子量で移動した（図２）。複写ゲルをＰＶＤＦメンブレンに移し、そして分離した種を、クマシーブリリアントブルーを用いた染色の後に可視化した。ＰＶＤＦブロットから直接獲得したＺＩおよびＺＩＩのＮ末端の配列決定は、それぞれ、アミノ酸配列ＡＰＶＡＰＩＶＡＶＳＡＴＱＰＮおよびＳＬＬＤＴＱＫＳＡＫＫＡＦＡＰＡＮを明らかにした。
【０６２０】
公開されているデータベースの検索は、これらの２つのペプチド配列のいずれとも有意な相同性を明らかにしなかった。しかし、配列決定されたＰ．ａｃｎｅｓゲノム（実施例１を参照のこと）の翻訳されたＯＲＦに対して実施された同様の検索は、ＺＩおよびＺＩＩの両方に対する同一性を有する配列の存在を明らかにした。両方のペプチドを、配列番号１５１２７により示される配列決定されたＰ．ａｃｎｅｓゲノムの同一のＯＲＦ内で見出した。このＯＲＦの配列は、３１３アミノ酸長であった。しかし、第１のメチオニン残基がＯＲＦのアミノ酸番号２９に位置するので、おそらく、全長タンパク質（ＦＬ  ｐｒｅ−ｐｒｏ）はこの位置で開始し、そしてそれにより、わずか２８９アミノ酸長である（３０．４ｋＤａの予想される分子量を有する）。全長タンパク質（ＦＬ  ｐｒｅ−ｐｒｏ）の最初の約２５〜３０アミノ酸は、疎水性残基が豊富であり、シグナルペプチドの存在を示唆する。従って、ＺＩ／ＩＩはおそらく、膜に結合／分泌される。
【０６２１】
ＺＩのＮ末端配列は、ＺＩＩの上流に位置し、これは、両方の形態が、同一の遺伝子産物に由来する（おそらく、異なるプロセシングから生じる）ことを示す。さらに、ＺＩおよびＺＩＩのトリプシン消化の後の質量スペクトル配列決定は、Ｎ末端配列決定により同定された配列と類似の配列情報およびさらなる中間フラグメントを明らかにした。これらのＺＩおよびＺＩＩのＯＲＦの大きさは、それぞれ、２７．７ｋＤａ（２５７残基）および２４ｋＤａ（２２２残基）である。
【０６２２】
質量スペクトル分析を以下のようにして実施した。２つのバンド（ＺＩおよびＺＩＩ）を切り出し、そしてゲル中（ｉｎ−ｇｅｌ）でトリプシンを用いて消化した。この消化されたタンパク質を５％酢酸中の５０％アセトニトリルにより抽出し、そして速度真空（ｓｐｅｅｄ  ｖａｃｕｕｍ）において濃縮した。消化したペプチドをマイクロキャピラリーＬＣにより分離し、そしてオンラインタンデム質量分析法（ＬＣＱ，Ｆｉｎｎｉｇａｎ）により分析した。同定されたペプチド配列は以下のようなものである：
ＺＩペプチド：
１）Ａ．ＡＰＶＡＰＩＶＡＶＳＡＴＱＰＮＫ．Ｔ
２）Ｋ．ＴＬＳＶＡＥＡＱＫ．Ｅ
３）Ｋ．ＥＬＱＶＶＮＡＲ．Ｉ
４）Ｒ．ＩＡＳＬＬＤＴＱＫ．Ｓ
５）Ｒ．ＶＥＬＬＶＴＭＶＤＴＶＮＧＡＡＨＴＬＱＤＫ．Ａ
６）Ｐ．ＤＬＫＰＮＤＶＡＴＦＹＴＫ．Ｔ
７）Ｋ．Ｍ＊ＰＤＬＫＰＮＤＶＡＴＦＹＴＫ．Ｔ
８）．ＭＰＤＬＫＰＮＤＶＡＴＦ−ＹＴＫ．Ｔ
９）Ｋ．ＡＴＧＶＬＭ＊ＥＰＬＶＲ．Ｖ
１０）Ｋ．ＡＴＧＶＬＭＥＰＬＶＲ．Ｖ
１１）Ｒ．ＶＳＥＶＤＱＡＩＴＤＶＫ．Ａ
ＺＩＩペプチド：
１）Ａ．ＳＬＬＤＴＱＫ．Ｓ
２）Ｒ．ＶＥＬＬＶＴＭＶＤＴＶＮＧＡＡＨＴＬＱＤＫ．Ａ
３）Ｋ．Ｍ＊ＰＤＬＫＰＮＤＶＡＴＦＹＴＫ．Ｔ
４）Ｋ．ＭＰＤＬＫＰＮＤＶＡＴＦＹＴＫ．Ｔ
５）Ｒ．ＶＳＥＶＤＱＡＩＴＤＶＫ．Ａ。
【０６２３】
続いて、ＺＩ／ＩＩの全長タンパク質配列を用いて、配列決定されたＰ．ａｃｎｅｓゲノムのＯＲＦを検索した。この検索は、ＺＩ／ＩＩ（配列番号１５１２７）がタンパク質のファミリーに属し、そしてＰ．ａｃｎｅｓの翻訳されたゲノムにおいて同定された５つの他の関連のタンパク質（配列番号２５５４０；６７０６；２３０７６；８７５１；２７５３３）と有意な相同性を共有することを明らかにした。ＺＩおよびＺＩＩの全ＯＲＦが、ＡＴＣＣ＃６９１９培養単離体の配列決定されたゲノムにおいて同定されているので、ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルの銀染色により対応する産物（ＡＴＣＣ＃６９１９）を検出できないことは、この遺伝子の欠失に起因し得ないが、転写／翻訳機構の抑制に起因する。
【０６２４】
最後に、ＧｅｎＢａｎｋデータベースを用いたＺＩ／ＺＩＩの全長タンパク質配列の検索は、Ａ群およびＢ群のｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ、ａｇａｌａｃｔｉａｅ、ｐｙｏｇｅｎｅｓ）において同定されたＣＡＭＰファクタータンパク質との有意な相同性を明らかにした。ＣＡＭＰファクタータンパク質は、ＣＡＭＰ反応に関わる２つの成分の１つ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ｓｐｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎａｓｅ  Ｃ（β毒素）によるヒツジ血液赤血球の相乗的溶解物）を含む。また、ＣＡＭＰタンパク質は、免疫グロブリンＧおよびＭのＦｃ部分と結合することを示された。従って、これらの同定されたＰ．ａｃｎｅｓタンパク質は、宿主の免疫応答を修復し得る毒性因子を表し得る。
【０６２５】
（実施例６：Ｐ．ａｃｎｅｓのタンパク質同定）
Ｐ．ａｃｎｅｓ（ＡＴＣＣ＃６９１９株）細胞ペレットをＦｒｅｎｃｈ  Ｐｒｅｓｓにより溶解させた。この溶解物を、予備分画（ｐｒｅ−ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）のためにイオン交換クロマトグラフィーカラム（ｐＨ＝８、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０〜３００ｍＭ塩化ナトリウムの０〜３０分勾配）に供し、そして各画分（１０ｍｌ中の１０μｌ）を１Ｄゲルで泳動した。各バンドを画分番号（ＦＰ）で標識し、そして分子量を概算した（例えば、ＦＰ２４−２８ＫＤＡ）。各画分を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｍ（３０００カットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、各画分のタンパク質濃度に依存して５×、１０×、そして１００×にさらに濃縮した。目的のバンドを切り出し、そしてゲル中（ｉｎ−ｇｅｌ）で消化した。消化したペプチド混合物を、ＥＳＩおよびタンデム質量分析法（ＬＣＱ，Ｆｉｎｎｉｇａｎ）とオンラインで接続されたマイクロキャピラリーＬＣに供した。
【０６２６】
得られたタンデム質量分析法を用いて、Ｐ．ａｃｎｅｓの翻訳されたＯＲＦに対して検索した。このタンデム質量分析法のデータを、各実験のために配列検索の後に手動で再検討した。Ｐ．ａｃｎｅｓデータベース検索結果により、タンパク質の配列を得、次いで各同定されたＰ．ａｃｎｅｓタンパク質を、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎに対して検索し、類似性一致（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｍａｔｃｈ）（Ｅ値、代表的には、良好な一致についてＥ＜０．００１）を見出し、予想されるタンパク質機能を決定した。概して、タンパク質のポジティブな同定を、同一のタンパク質から同定された３つのペプチドにより規定した。時々、一致した単一のペプチド（有意な一致スコアを有する）もまた、タンパク質についてのポジティブな同定として用いた。
【０６２７】
合計１０８のタンパク質をこの手順を用いて同定し、そして以下の配列番号に対応させた：配列番号２００３６；１９８７２；６３７３；８７６９；５９９１；１９２９９；５０１１（２つの一致）；１２３１７；１１０６２；４９５８；６９２３；１１９８９；２４３６９；２１４９１；７８８７；１０４４７；３０７０；７８７８；２５１０３；６８６８；９１２１（２つの一致）；２４４７４；１２０２９；２０９５５；１６５５５；１５２３７；２０９７３；２０４７５；１５２５９；６４２７；４９６７；２０１００；１０１４１；１５６５７；３６０８；１６６０８；２１７１０；２５３８０；４８５３；２５９５７；９０７１；３６５９；１３５１２；３６９７；７３８４；２４７２２；１０６７４；１２８２；１２０９；６５０１；３６９１；１２３４７；２１７６２；１５１９７；１１６５；２３０９１；６４２８；５４２９；２４７５８；３５９０；３７２３；９１０６；１２２１７；７２７０；２９１３；１１８７；１５８５；１６５３７；２４６７９；２６３９７；２６６９１（２つの一致）；７３９７；６６９５；６８９２；１９９２６；４７５４；２６６９２；１５６７０；３６５２；２０５１０；３４４９；２００７０；１９２４５；２０１０８；１９４２７；１０５６４；１０６７８；２１１７２；２１７８０；３３３４；６３３８；５３７９；１１５８０；１５６９３；９９９４；２４９７３；２０６８４；７８６５；１６５７３；１１８６４；１２３２４；２０４３９；１２３０；１４２７８；３４１２。
【０６２８】
（実施例７：Ｐ．ａｃｎｅｓタンパク質の同定）
実施例６に記載される方法を用いて、さらなるタンパク質を同定し、そして以下の配列番号に開示されるタンパク質に対応させた：配列番号１２３１７；５９９１；６９２３；１０７４１；５３７３；１９２９９；３８３；１２８４；１２２２８；２６４０２；４６７３；７８８７；９００４；３８４；２５１０３；６３７３；１２０２９；２００３６；１６５５５；１７５２１；２０４７６；１５２３７；２４５８１；３６５９；１４０３１；９０７１；４９５８；１５２５９；１２９０４；５４４０；２３５６０；３６９７；３６０８；２５９５７；７３８４；２４７２２；１５８６３；８１３５；２０５８５；３６９１；１２２１７；１６４３９；１６４５；５５１４；２１７１０；２４８９５；４８５３；２３４２０；５４３７；１２７８；１６９９２；１２１２６；２０９３４；２０４７５；１７９７０；２０９５５；３０７０；６５６４；９０６９；１２６６６；７８６４；１８６９２；２４５３；１２０９；２０９７３；７４１９；１５１９７（２つの一致）；２３５９１；２０１００；２３０６５；６３３７；１０９８９；１５８５；１７８４１；６８６８。
【０６２９】
（実施例８：Ｐ．ａｃｎｅｓ免疫治療標的の同定）
特定のクラスのタンパク質は、それらの役割（例えば、これらのタンパク質を発現する因子に対する宿主の防御における役割）に基づき、魅力的な免疫治療標的を表すことが公知である。例えば、ワクチン標的としてのエンテロトキシンは、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０１：１５４−１６０（２０００）において議論される。ワクチンとしてのリポタンパク質は、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：１１２３−１１２８（１９９５）；Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４：１９５−２０２（１９９６）；Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８７−２５０（１９９９）；およびＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０２：１１５３−１１６４（２０００）において議論される。ワクチンとしての膜タンパク質は、Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：１９５２−１９６１（２０００）；Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：１４５−１５３（１９９６）；Ｖａｃｃｉｎｅ  １８：１４５６−１４６６（２０００）；Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：８２１−８２９（１９９５）；Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２３：２１６−２２２（１９９８）；Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ．６９：３５１０−３５７５（２００１）；およびＪ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８３：１０７９−１０８６（２００１）において議論される。パーミアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおけるペニシリン耐性において役割を果たす（Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：１２８５−１２９６（１９９８））。エンテロバクチンレセプターは、鉄の取り込みに関与し（Ｊ．Ｄａｉｒｙ  Ｓｃｉ．８１：２１５１−０２１５８（１９９８））、動物の免疫のために用いられてきた（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９９  Ｍａｙ；１８１（９）：２８９５−９０１）。ワクチンとしてのプロテアーゼ／プロテイナーゼは、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ．６６：８９９−９０６（１９９８）およびＩｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍ．６８：４０５５−４０６３（２０００）において議論される。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの推定プロテイナーゼ変異プロテインＡは、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：４１８０−４１８８（２０００）において、免疫応答を誘導する可能性を有することが開示されている。分泌タンパク質、または分泌に関与するタンパク質に基づく潜在的なワクチンは、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：３１００−３１０９（２００１）；Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：４１８０−４１８８（２０００）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３８５３−１３８５８（２０００）；およびＩｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．３７：１１５７−１１６６（１９９９）において議論される。抗原スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）に基づくワクチンは、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ  ６５：１２８６−１２９２（１９９７）；Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：３２８６−３２８９（２０００）；およびＩｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：９８６−９８８（１９９９）において議論される。付着因子ファミリーのタンパク質のワクチンとしての使用、およびそれらの構造は、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９（Ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ８７−９５（２０００）；Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８２：１１４６−１１５２（２０００）；Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．５：３９５−４０３（１９９９）；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：１５５３−１５６１（１９９８）；およびＭｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９：１２８５−１２９６（１９９８）において議論される。トランスポータータンパク質およびそれらの免疫原性の性質は、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３６：６８−８４（２０００）；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １５：１５５３−１５６１（１９９８）；ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：１３７−１５０（１９９７）；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：１１１３−１１１９（１９９９）；およびＭｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３７：１０９４−１１０５（２０００）において議論される。ヘモリシン（Ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ）は、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４：１２０５−１２１１（１９９８）に記載され、そしてペニシリン結合タンパク質を用いたワクチン接種は、Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４４：７６７−７７４（１９９９）に記載される。毒性因子および／または免疫原としてのシアリダーゼは、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔ．３：１−１０（１９９７）；Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７：８９−１１５（１９９３）；およびＭｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．６：４６１−４６７（１９９８）において議論される。細菌による鉄獲得のためのヘモジデリン貪食細胞結合は、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：２８９５−２９０１およびＭｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：１１１７−１１２３（１９９９）に記載される。ＰｓａＡ抗原構造における亜鉛の役割は、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：１５５３−１５６１（１９９８）において議論される。鉄獲得および輸送における細菌タンパク質の役割は、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：６８−８４（２０００）；Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３２：１１１７−１１２３（１９９９）；およびＪ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：２６２６−２６３３（１９８９）に記載される。マンガナーゼおよび抗原構造におけるその役割は、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２５：２４５−２５４；Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：１５５３−１５６１（１９９８）；およびＩｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９：１３７−１５０（１９９７）に記載される。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの病原性におけるリパーゼの役割は、Ｃａｎ．Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：４５５−４６３（１９９０）に記載される。
【０６３０】
ワクチン標的としてのこれらのクラスのタンパク質の重要性を考慮して、表４のｂｌａｓｔｐおよびｔｂｌａｓｔｎのカラムを、以下のキーワードを問い合わせとして用いて検索した：トランスフェラーゼ、エンテロトキシン、リポタンパク質、膜、パーミアーゼ、エンテロバクチン、プロテアーゼ／プロテイナーゼ、プロテインＡ、分泌された／分泌／分泌性、ジスムターゼ、接着因子、トランスポーター、ヘモリシン、ペニシリン結合タンパク質、シアリダーゼ、ヘモジデリン貪食細胞、亜鉛、鉄、マンガナーゼ、およびリパーゼ。これらの検索は、以下の表６においてそれらの配列番号により参照され、表４のｂｌａｓｔｐおよびｔｂｌａｓｔｎ検索結果の記述子におけるこれらのキーワードを含む微生物タンパク質に対する有意な相同性を有する、Ｐ．ａｃｎｅｓタンパク質の同定を導いた。従って、以下の表６は、配列番号により参照され、おそらくタンパク質のこれらの重要なクラスの各々に属し、それによって免疫治療／ワクチン開発のために価値のある標的を表すＰ．ａｃｎｅｓタンパク質のリストを含む。
【０６３１】
【表６】
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【０６３２】
（実施例９：ポリペプチドの合成）
ポリペプチドは、ＨＰＴＵ（Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）活性化を伴うＦＭＯＣ化学を使用するＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ４３０Ａペプチドシンセサイザー上で合成され得る。Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ配列は、結合体化、固定された表面への結合、またはペプチドの標識化の方法を提供するために、そのペプチドのアミノ末端に付着され得る。固体支持体からのペプチドの切断は、以下の切断混合物を使用して実施され得る：トリフルオロ酢酸：エタンジチオール：チオアニソール：水：フェノール（４０：１：２：２：３）。２時間の切断の後、そのペプチドを、冷却メチル−ｔ−ブチル−エーテル中において沈殿させ得る。次いで、このペプチドペレットを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水中に溶解し得、そしてＣ１８逆相ＨＰＬＣによる精製の前に凍結乾燥し得る。水（０．１％ＴＦＡを含む）中の０％〜６０％のアセトニトリル（０．１％ＴＦＡを含む）の勾配を使用して、ペプチドを溶出させ得る。純粋な画分の凍結乾燥後、このペプチドを、エレクトロスプレーもしくは他の型の質量分析法を使用し、そしてアミノ酸分析によって特徴付け得る。
【０６３３】
前述のことから、本発明の特定の実施形態が、例示の目的のために本明細書中に記載されてきたが、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による以外には限定されない。
【０６３４】
（表２：Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ａｃｎｅｓのコンティグ配列）
【表２】
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【０６３５】
（表３：Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ａｃｎｅｓのオープンリーディングフレーム）
【表３】
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2004520803.tif 000595
【０６３６】
（表４：Ｐ．ａｃｎｅｓのＯＲＦのＢＬＡＳＴ分析およびＧｅｎｅＭａｒｋ分析）
【表４】
2004520803.tif 000596
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、重篤な症例の顔面挫瘡を有する個体由来の血清が、約１８〜２８ｋＤａ；３５〜４０ｋＤａ；約５０ｋＤａ；約７０ｋＤａ；約１００ｋＤａのサイズを有するいくつかの優勢種；ならびに１８ｋＤａ未満のいくつかの低分子量種と反応することを実証するイムノブロットである。
【図２】
図２は、ＺＩおよびＺＩＩと呼ばれる、臨床分離株において見出された２つのタンパク質の分子量を示すゲルである。
【図３】
図３は、Ｐ．ａｃｎｅｓの配列ＩＤ＃１５１２７の推定ＯＲＦのアミノ酸配列を示す。＋２９位（開始）の下線を付した残基（Ｍ）は、全長タンパク質の可能性のある開始メチオニンを示す。残りの下線を付した配列は、ＺＩ＆ＩＩのＮ末端（イタリック体になっていない）配列決定および質量分析（マス−スペック）（ＭＳ）（イタリックになっている）配列決定によって同定された残基を示す。推定の全長タンパク質は、３０．４ｋＤａ（３１３アミノ酸残基）であるが、ＺＩ＆ＩＩの全長タンパク質は、その観察された移動度によれば、それぞれ約２７．７（２５７アミノ酸残基）および２４ｋＤａ（２２２アミノ酸残基）である。
【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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