(57)【要約】本発明は、ヒトの酵素(NZMS)群および、NZMSを同定しコードするポリヌクレオチド群を提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、抗体、アゴニストおよびアンタゴニストをも提供する。本発明はまた、NZMSの異常発現に関連する疾患を、診断、治療または予防する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の(a)乃至(d)からなる群から選択した、単離されたポリペプチド。
（ａ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｂ）SEQ ID NO：1-11からなる群から選択したアミノ酸配列に対して少なくとも90％が同一であるような天然アミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｃ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片
（ｄ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片
【請求項２】
SEQ ID NO:1-11からなる群から選択されたアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
請求項1に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項2に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:12-22からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有する、請求項４に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項３に記載のポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞。
【請求項８】
請求項６に記載の組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体。
【請求項９】
請求項１のポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドの発現に好適な条件下で、請求項１に記載されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーター配列を含む組換えポリヌクレオチドで形質転換される細胞を培養する過程と、
（ｂ）そのように発現した前記ポリペプチドを回収する過程とからなる方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体。
【請求項１２】
以下の(a)乃至(e)からなる群から選択した単離されたポリヌクレオチド。
（ａ）SEQ ID NO:12-22からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｂ）SEQ ID NO:12-22からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90％が同一であるような天然ポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド
（ｃ）(a)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｄ）(b)のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド
（ｅ）(a)〜(d)のRNA等価物
【請求項１３】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも６０の連続したヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）前記サンプル中の前記標的ポリヌクレオチドに相補的な配列を持つ少なくとも２０の連続したヌクレオチドを持つプローブと前記サンプルとをハイブリダイズする過程であって、前記プローブと前記標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、該プローブが前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズすることを特徴とする過程と、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、該複合体が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程とを含む方法。
【請求項１５】
前記プローブが少なくとも60の連続したヌクレオチドを含むことを特徴とする請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
請求項12に記載のポリヌクレオチドの配列を有する標的ポリヌクレオチドをサンプル中から検出する方法であって、
（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて前記標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、
（ｂ）前記の増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の有無を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドと、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
機能的NZMSの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項17に記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２０】
請求項１に記載のポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法によって同定したアゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２２】
機能的NZMSの発現の低下に関連する疾患や病態の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項21に記載の組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２３】
請求項１に記載のポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性を確認するために化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを含むサンプルを化合物に曝す過程と、
（ｂ）前記サンプルにおいてアンタゴニスト活性を検出する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２４】
請求項23に記載の方法によって同定したアンタゴニスト化合物と、薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項２５】
機能性NZMSの過剰発現に関連する疾患又は病状の治療方法であって、そのような治療を必要とする患者に対して請求項24に記載の成分を投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの試験化合物との結合を検出し、それによって請求項１に記載のポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程を含む方法。
【請求項２７】
請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１のポリペプチドの活性が許容される条件下で、請求項１に記載のポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、
（ｂ）請求項１に記載のポリペプチドの活性を試験化合物の存在下で算定する過程と、
（ｃ）試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性を、試験化合物の不存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性と比較する過程を含み、試験化合物の存在下での請求項１に記載のポリペプチドの活性の変化が、請求項１に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を標示することを特徴とする方法。
【請求項２８】
請求項5に記載の配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を改変するのに効果的な化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチドの発現に好適な条件下で、該標的ポリヌクレオチドを含むサンプルを化合物に曝露する過程と、
（ｂ）前記標的ポリヌクレオチドの発現改変を検出する過程と、
（ｃ）可変量の前記化合物の存在下と前記化合物の不存在下で、前記標的ポリヌクレオチドの発現を比較する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項２９】
試験化合物の毒性を算定する方法であって、
（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを前記試験化合物で処理する過程と、
（ｂ）処理した前記生物学的サンプルの核酸と、請求項12に記載のポリヌクレオチドの少なくとも２０の連続するヌクレオチドを持つプローブをハイブリダイズさせる過程であって、このハイブリダイゼーションゼーションが、前記プローブと前記生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドとの間で特異的なハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で行われ、前記標的ポリヌクレオチドが、請求項12に記載のポリヌクレオチドまたはその断片のポリヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドである、前記過程と、
（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の収量を定量する過程と、
（ｄ）前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量を、処理されていない生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量と比較する過程とを含み、前記処理された生物学的サンプル中のハイブリタイゼーション複合体の量の差が、前記試験化合物の毒性を標示するような方法。
【請求項３０】
生物学的サンプル中のNZMSの発現に関連する症状または疾患に対する診断試験法であって、
（ａ）前記生物学的サンプルと請求項11に記載の抗体との混合を、前記抗体が前記ポリペプチドに結合し、抗体とポリペプチドとの複合体を形成するのに適した条件下で行う過程と、
（ｂ）前記複合体を検出する過程とを含み、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプル中の前記ポリペプチドの存在と相関することを特徴とする方法。
【請求項３１】
請求項11に記載の抗体であって、
（ａ）キメラ抗体
（ｂ）単鎖抗体
（ｃ）Fab断片
（ｄ）F（ab'）2 断片
（ｅ）ヒト化抗体のいずれかである抗体。
【請求項３２】
請求項11に記載の抗体と、許容できる賦形剤とを含む組成物。
【請求項３３】
被検者のNZMSの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項32に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３４】
前記抗体が標識されることを特徴とする請求項32に記載の組成物。
【請求項３５】
被検者のNZMSの発現に関連する病状又は疾患の診断方法であって、請求項34に記載の化合物の有効量を前記被検者に投与する過程を含むことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項11に記載の抗体の特異性を有するポリクローナル抗体を調製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体を単離する過程と、
（ｃ）前記単離された抗体を前記ポリペプチドでスクリーニングし、それによって、SEQ ID NO：1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するポリクローナル抗体を同定する過程とを含むような方法。
【請求項３７】
請求項36に記載の方法で産出したポリクローナル抗体。
【請求項３８】
請求項37に記載のポリクローナル抗体及び適切なキャリアを含む組成物。
【請求項３９】
請求項11に記載の抗体の特異性を有するモノクローナル抗体を作製する方法であって、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列またはその免疫原性断片を含むポリペプチドを用いて動物を免疫化する過程と、
（ｂ）前記動物から抗体産出細胞を単離する過程と、
（ｃ）前記抗体産出細胞と不死化した細胞とを融合して、モノクローナル抗体を産出するハイブリドーマ細胞を形成する過程と、
（ｄ）前記ハイブリドーマ細胞を培養する過程と、
（ｅ）SEQ ID NO：1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異結合するようなモノクローナル抗体を前記培養物から単離する過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４０】
請求項39に記載の方法で産出したモノクローナル抗体。
【請求項４１】
請求項40に記載のモノクローナル抗体及び適切なキャリアを含む組成物。
【請求項４２】
Fab発現ライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項11に記載の抗体。
【請求項４３】
組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニングにより前記抗体を産出することを特徴とする請求項11に記載の抗体。
【請求項４４】
サンプル中のSEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出する方法であって、
（ａ）請求項11に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
（ｂ）特異結合を検出する過程とを含み、該特異結合が、SEQ ID NO：1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドがサンプル中に存在することを標示することを特徴とする方法。
【請求項４５】
SEQ ID NO:1-11 からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドをサンプルから精製する方法であって、
（ａ）請求項11に記載の抗体と前記ポリペプチドとの特異結合を許容する条件下で、前記抗体と１サンプルとをインキュベートする過程と、
（ｂ）前記サンプルから前記抗体を分離し、SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を含む精製したポリペプチドを得る過程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項４６】
マイクロアレイの少なくとも1つのエレメントが請求項13に記載のポリヌクレオチドであるマイクロアレイ。
【請求項４７】
ポリヌクレオチドを含むサンプルの発現プロフィールを作製する方法であって、
（ａ）サンプル中のポリヌクレオチドを標識化する過程
（ｂ）ハイブリダイゼーション複合体が形成されるのに適した条件下で請求項46に記載のマイクロアレイのエレメントとサンプル中の標識化ポリヌクレオチドを接触させる過程
（ｃ）サンプル中のポリヌクレオチドの発現を定量する過程を含む方法
【請求項４８】
固体基板上の別個の物理的位置に固定した異なるヌクレオチド分子群を含むアレイであり、該ヌクレオチド分子の少なくとも１つが標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続するヌクレオチドと特異的にハイブリダイゼーション可能な最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含み、前記標的ポリヌクレオチドが請求項12に記載のポリヌクレオチドであるアレイ。
【請求項４９】
請求項48に記載のアレイであり、前記最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも30の連続するヌクレオチドに完全に相補的であるアレイ。
【請求項５０】
請求項48に記載のアレイであり、前記最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列は前記標的ポリヌクレオチドの少なくとも60の連続するヌクレオチドに完全に相補的であるアレイ。
【請求項５１】
請求項48に記載のアレイであり、前記最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が前記標的ポリヌクレオチドに完全に相補的であるアレイ。
【請求項５２】
請求項48に記載のアレイであり、マイクロアレイであるアレイ。
【請求項５３】
請求項48に記載のアレイであり、前記最初のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列を含むヌクレオチド分子にハイブリダイズされた前記標的ポリヌクレオチドをも含むアレイ。
【請求項５４】
請求項48に記載のアレイであり、リンカーが少なくとも1つの前記ヌクレオチド分子を前記固体基板に接合するアレイ。
【請求項５５】
請求項48に記載のアレイであり、基板上のそれぞれ固有の物理的位置には複数のヌクレオチド分子を含み、またいかなる単一の固有の物理位置の該複数のヌクレオチド分子も同じ配列を有し、基板上の各固有物理的位置には基板上の別の固有の物理的位置でのヌクレオチド分子の配列と異なる配列を持つヌクレオチド分子が含まれるアレイ。
【請求項５６】
SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
SEQ ID NO:3のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
SEQ ID NO:4のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
SEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６１】
SEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６２】
SEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６３】
SEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
SEQ ID NO:9のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
SEQ ID NO:10のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
SEQ ID NO:11のアミノ酸配列を含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
SEQ ID NO:12のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６８】
SEQ ID NO:13のポリヌクレオチド配列を有する請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６９】
SEQ ID NO:14のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７０】
SEQ ID NO:15のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７１】
SEQ ID NO:16のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７２】
SEQ ID NO:17のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７３】
SEQ ID NO:18のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７４】
SEQ ID NO:19のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７５】
SEQ ID NO:20のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７６】
SEQ ID NO:21のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７７】
SEQ ID NO:22のポリヌクレオチド配列を含む請求項12に記載のポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、酵素の核酸配列及びアミノ酸配列に関する。本発明はまた、これらの配列を利用した、免疫系の疾患、免疫不全、発達障害、眼疾患、代謝異常、平滑筋障害、神経疾患、肺の疾患、寄生虫感染症、および、癌を含む細胞増殖異常の診断・治療・予防に関する。本発明はさらに、酵素の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外因性化合物の影響についての評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
酸化還元酵素
真核細胞は総称して好気的代謝と呼ばれる一連の複雑な酸化還元反応により、エネルギーの抽出を行い、高分子を合成する。好気的代謝の１つの結果は、スーパーオキシド(O2・-)とヒドロキシル・イオン(OH・)の形態のフリーラジカルの産生である。スーパーオキシドは、電子伝達鎖における正しい経路から電子の「漏出」がO2へ起こる結果として、ミトコンドリアと小胞体によって細胞内で産生される。ヒドロキシルイオンは、電離放射線により、また、鉄含有部位または銅含有部位でのO2・-と過酸化水素(H2O2)の反応により産生される。フリーラジカル、特にヒドロキシルイオンは極端に反応性があり、タンパク質、糖質、DNA、脂質等ほとんどすべての分子と相互作用し得る。これらの相互作用により、リン脂質ヒドロペルオキシド等の非ラジカル・ヒドロペルオキシドの形成が可能となる。ヒドロキシルイオンとDNAの相互作用は、年齢依存性の癌発生に有意な寄与を与え得る。細胞はまた、チトクロームP45Oを介する酸化や、平滑筋緊張の調節、およびマクロファージと顆粒球による微生物の殺傷等、フリーラジカルとその誘導体とを有益な方法でも使用する(Bast, A. 他 (1991) Am. J. Med. 91(3C):2S-13S)。
【０００３】
細胞における酸化還元反応に関係する酵素（オキシドレダクターゼ）に欠陥が起こると、細胞内での酸化電位の不均衡を引き起こし、しばしば臨床症状の発現をもたらす。例えば、スーパーオキシド化合物を解毒する酵素であるスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の過剰は、ダウン症候群として知られる臨床症状に関連しうる。抗酸化物質のレベルが低くなりまたは、O2・-及びH2O2のレベルが高くなると、酸化ストレスを生む。慢性炎症の部位で食細胞により誘発される酸化ストレスは、関節のリウマチ様関節炎と腸の炎症性腸疾患を引き起こす。喘息も肺における炎症反応の症状であり、酸素フリーラジカル形成に関連する(Sies, H. (1991) Am. J. Med. 91 (3C):31S-38S)。
【０００４】
酸化と還元に関与するタンパク質は、細胞内の合成、触媒反応、回収(salvage)、解毒における、特定の機能をも有する。これらの酵素の欠陥によって、細胞内に有毒前駆物質分子の蓄積を、または細胞存続に重要な化合物の合成の失敗を引き起こす可能性がある(下記の実例参照)。天然基質上での活性に加えて、オキシドレダクターゼはまた、薬物代謝と薬物動態に密接に関連する。薬物代謝における遺伝的な差異が、個体間で、薬剤効果および毒性のレベルの著しい違いを引き起こす。治療指数が狭い薬物または、コデイン等、生理活性を必要とする薬物の場合、このような遺伝子多型は極めて重要たり得る。更に、有望な新規の薬物が、患者群の一部のみに副作用を引き起こし得るという毒性のため臨床試験で排除されることがよくある。薬物代謝酵素が重要な部分を占める薬理ゲノミックス研究が進歩すれば、薬物の効果および毒性の疑問に耐え得るツールが発展し、そのような情報が拡大されるであろう（Evans, W. E.およびR. V. Relling (1999) Science 286 :487-491を参照）。
【０００５】
先天性または後天性遺伝病と薬物代謝に関連する選択された酸化還元酵素（グルタチオン・ペルオキシダーゼ、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、グルタレドキシン、ペルオキシソームβ酸化酵素、タンパク質二硫化物イソメラーゼ、チオレドキシン、アルド／ケト還元酵素、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アシル-CoAデヒドロゲナーゼ、6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、リボヌクレオチド二リン酸還元酵素、ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ、15-オキソプロスタグランジン 13-還元酵素、15-hydroxyprostaglandinデヒドロゲナーゼ、グルコース-メタノール-コリン酸化還元酵素と他の分泌性レドックス・タンパク質）の特性を下記に記載する。
【０００６】
グルタチオン・ペルオキシダーゼ
グルタチオン・ペルオキシダーゼのファミリーは、3つの四量体グルタチオン・ペルオキシダーゼ(GPx1-3)と単量体リン脂質ヒドロペルオキシド・グルタチオン・ペルオキシダーゼ(PHGPx/GPx4)を含む。四量体酵素とGPx4の間の全体的な相同性は30％未満であるが、活性部位に関連する著しい類似性がクラスタで検出された。また共通の触媒トライアッドが、構造的及び運動データにより定義された(Epp, O. 他 (1983) Eur. J. Biochem. 133:51-69)。ファミリーメンバーは異なる組織分布を示す。GPx1は細胞内に普遍的に発現するが、GPx2は肝臓と結腸に存在し、またGPx3は原形質に存在する。GPx4はすべての組織に低レベルで見出されるが、精巣に高レベルで発現する。これらの組織局在性パターンは、グルタチオン・ペルオキシダーゼ活性のレベルと標的を調節するために重要になり得る(Ursini, F他 (1995) Meth. Enzymol. 252:38-53)。
【０００７】
GPx4は構造と活性の両者において独特である。GPx4は哺乳動物で見出される、唯一の単量体グルタチオン・ペルオキシダーゼである。またリン脂質ヒドロペルオキシドとの強い親和性と反応性を示し、膜結合する、唯一の哺乳動物グルタチオン・ペルオキシダーゼでもある。GPx4による脂質過酸化の阻害には、グルタチオンと生理学的レベルのビタミンＥとが必要となり、GPx4とビタミンＥとの酸化防止活性のためのタンデムメカニズムを示唆する。GPx4はまた、細胞内局在性を決定する選択的転写および翻訳開始部位を有する(Esworthy, R.S. 他 (1994) Gene 144:317-318、Maiorino, M.他. (1990) Meth. Enzymol. 186:448-450)。
【０００８】
グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)
グルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）は、生体異物の生体内変化と解毒、薬物代謝、および、過酸化損傷に対する組織保護における、重要な生化学的機能を実施する、二重基質特異性を有する酵素の普遍的なファミリーである。これらの酵素によって触媒される基本的な反応は、還元型グルタチオン(GSH)での求電子体の抱合であり、その結果、化学物質の活性化または不活性化／解毒のどちらかが起こる。還元型のGSHが広範囲の化学物質に結合する絶対的な必要性があるため、様々な生物と細胞の種類でGST構造の多様性を必要とする。
【０００９】
GSTはホモ二量体またはヘテロ二量体タンパク質であって、細胞サイトゾルに局在する。主なイソ酵素は、共通の構造および触媒特性を共有し、イソ酵素は、α、μ、π、およびθの４つの主要クラスに分類される。２つの最も大きなクラスであるαおよびμは、それぞれの等電点（αはpIが約7.5〜9.0、μはpIが約6.6）によって同定される。それぞれのGSTは、GSHに対する共通の結合部位および可変性疎水性結合部位を有する。それぞれのイソ酵素における疎水性結合部位は、特定の求電子性基質に対して特異的である。GST内の特定のアミノ酸残基が、これらの結合部位および触媒活性に重要であるとして同定されている。残基Q67、T68、D101、E104、およびR131は、GSHの結合に重要である（Lee, H-C他 (1995) J. Biol. Chem. 270:99-109）。残基R13、R20、およびR69はGSTの触媒活性に重要である（Stenberg G他(1991) Biochem. J. 274:549-555）。
【００１０】
GSTは通常、潜在的な変異誘発性および発癌性の化学物質の不活性化と解毒において必須機能を実施するが、GSTの機能障害または不適切な発現は有害である。ラットとヒトのGSTの内には、信頼できる発癌の新生物発生前マーカーもある。変異誘発性を調べるための良く知られたエイムス試験に用いられるサルモネラ菌（Salmonella typhimurium）などの細菌株におけるヒトGSTの発現は、変異誘発におけるこれらの酵素の役割を決定するのに役立つ。マウスにおいて肝腫瘍を引き起こすジハロメタン（dihalomethanes）は、GSTによって活性化されると考えられている。この考えは、ジハロメタンが、ヒトGSTを発現する形質転換した細菌細胞において、非形質転換細胞でよりも突然変異誘発性が高いということから支持される(Thier, R.他 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8567-8580)。二臭化エチレンおよび二塩化エチレンの変異誘発性はヒトαGSTであるA1−1を発現する細菌細胞において上昇し、アフラトキシンB1の変異誘発はGSTの発現が増強されることで実質的に減少する（Simula, T. P.他(1993) Carcinogenesis 14:1371-1376）。従って、GST活性の制御が、変異誘発および発癌の制御において有用であろう。
【００１１】
GSTは、多剤耐性（MDR）として知られる現象である、多くの癌の、薬物治療に対する獲得耐性に関係すると思われる。MDRは、シクロホスファミドなどの細胞毒で治療を受けた癌患者に起こり、その薬物に対する耐性を有するようになった後、更にその他の様々な細胞毒に対しても耐性を有するようになる。GSTレベルの上昇は、これらの薬物耐性癌の幾つかに関係する。また、薬剤に応答してGSTレベルが上昇した後、GSTによって触媒されたGSH抱合反応によりその薬剤が不活化されると考えられる。次に、上昇したGSTレベルにより癌細胞がGSTが親和性を有する他の細胞毒から保護される。腫瘍におけるA1−1のレベルの上昇は、シクロホスファミド治療によって生じた薬剤耐性に関係付けられてきた（Dirven H. A.他 (1994) Cancer Res. 54:6215-6220）。従って、癌組織におけるGST活性の調節は、癌患者のMDR治療に有用であろう。
【００１２】
グルタレドキシン
細胞増殖中のDNA合成に必要な対応するデオキシリボヌクレオチドへのリボヌクレオチドの還元は、リボヌクレオチドニリン酸還元酵素によって触媒される。グルタレドキシンは、リボヌクレオチドニリン酸還元酵素のためのグルタチオン(GSH)依存水素供与体であり、活性部位コンセンサス配列-C-P-Y-C-を含む。この配列は、大腸菌、ワクシニアウイルス、酵母菌、植物、哺乳動物細胞等の異なる生物からのグルタレドキシンで保存されている。グルタレドキシンは、GSH、NADPH、GSH-レダクターゼとの共役系(coupled system)で固有のGSH-ジスルフィド・オキシドレダクターゼ（チオールトランスフェラーゼ）活性を有し、タンパク質の他に低分子量ジスルフィドの還元を触媒する。グルタレドキシンは、チオレドキシンに類似の効果的なタンパク質ジスルフィドレダクターゼそして特異なGSH-混合ジスルフィドレダクターゼの両者として作用することにより、一般的なタンパク質活性のチオールレドックス調節に働くと提案されてきた(Padilla, C.A. 他 (1996) FEBS Lett. 378:69-73)。
【００１３】
DNA合成と細胞分裂における重要な役割に加えて、グルタレドキシンと他のチオプロテインは酸素ラジカルと過酸化水素に対する有効な抗酸化防御を提供する(Schallreuter, K.U.及びJ.M. Wood (1991) Melanoma Res. 1:159-167)。グルタレドキシンは、in vivoでタンパク質の脱チオール化（dethiolation）に関与する主な薬剤であり、正常なヒト好中球内でデヒドロアスコルビン酸を還元する(Jung, C.H及びJ.A. Thomas (1996) Arch. Biochem. Biophys. 335:61-72、Park, J.B及びM. Levine (1996) Biochem. J. 315:931-938)。
【００１４】
分泌されるレドックス・タンパク質
レドックス・ポリペプチドはまた、細胞外環境に放出され、細胞内相同体と比較して類似または特有の機能を持ち得る。成人Ｔ細胞白血病由来因子、3B6-インターロイキン-1、T-ハイブリドーマ由来(MP-6) B細胞刺激因子、および早期妊娠因子など、複数のサイトカインまたは分泌されるサイトカイン様因子がチオレドキシンと同一であると報告されてきた(Holmgren, A. (1985) Annu. Rev. Biochem. 54:237-271、Abate, C他.(1990) Science 249:1157-1161、Tagaya, Y.他(1989) EMBO J. 8:757-764、Wakasugi, H. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:804-808、Rosen, A.他 (1995) Int. Immunol. 7:625-633)。従って、刺激したリンパ球により分泌したチオレドキシン(Yodoi, J.及びT. Tursz(1991) Adv.Cancer Res. 57:381-411、Tagaya, N. 他(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8282-8286)は、細胞成長の調節因子と免疫系のメディエーターとしての役割を含む細胞外活性を有する(Miranda-Vizuete, A. 他 (1996) J. Biol. Chem. 271:19099-19103、Yamauchi, A. 他 (1992) Mol. Immunol. 29:263-270)。
【００１５】
セレン含有タンパク質チオレドキシンレダクターゼは、正常また新生物性細胞の両者により分泌される。また成長因子としてそしてアポトーシスに関係するポリペプチドとして関与するとされる(Soderberg, A. 他 (2000) Cancer Res. 60:2281-2289)。ハムスター卵巣細胞(HT-1080)により分泌される細胞外プラスミンレダクターゼが、プラスミンからのアンギオスタチン（angiostatin）の生成に関与することが示されている。この場合、プラスミンジスルフィド結合の還元は、血管形成阻害薬、angiostatinを産生するプラスミンのタンパク質分解切断を誘発する(Stathakis, P. 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:20641-20645)。原形質における低レベルの還元したスルフヒドリル基は、リウマチ様関節炎に関連付けられてきた。活性酸素種類（例えば活性化好中球により産生する過酸化水素）を除去する点でのこれらのスルフヒドリル基の不全は、周囲の組織に酸化的な傷害と結果として炎症を引き起こす(Hall, N.D. 他 (1994) Rheumatol. Int. 4:35-38)。
【００１６】
タンパク質二硫化物イソメラーゼ、チオレドキシンおよびグルタレドキシン
細胞は、ジスルフィド結合の形成を調整することによりタンパク質２次及び３次構造の形成を助ける多数の特殊な分子を含む。還元されて折り畳まれていないタンパク質が、酸化されたチオールと還元されたチオールを所定の比で含むバッファー中でインキュベートされると生来のコンフォーメーションを引き起こすが、折り畳みの速度は遅く、生来のコンフォーメーションの達成度はタンパク質中のシステインのサイズと数に比例して減少する。真核生物の小胞体や原核生物のペリプラズム間隙などの特定の細胞区画は、周囲のサイトゾルよりも更に酸化した状態を維持する。正しいジスルフィド形成がこれらの区画で発生し得るが、正常な細胞プロセスには不十分な速度であり、分泌タンパク質を合成するのに適切ではない。タンパク質二硫化物イソメラーゼ、チオレドキシン、およびグルタレドキシンは、ジスルフィド結合の形成を触媒することが可能であり、必要なチオール：ジスルフィド交換を可能とするために細胞の酸化還元環境を調節する(Loferer, H. (1995) J. Biol. Chem. 270:26178-26183)。
【００１７】
これらの各タンパク質は多少異なる機能を有するが、すべてが保存した活性部位配列を含むジスルフィド含有レドックス・タンパク質の群に属し、真核生物や原核生物に広範囲に分布する。タンパク質二硫化物イソメラーゼは真核生物の小胞体や原核生物のペリプラズム間隙に見出される。これらは、折り畳みペプチド鎖中のチオールを自らのジスルフィドと交換することにより機能する。対照的に、還元したチオレドキシンとグルタレドキシンは通常は細胞質に見出され、基質タンパク質中で直接ジスルフィドを還元することにより機能する。
【００１８】
これらの触媒分子はジスルフィド形成を促進するだけでなく、多様な生理的プロセスを調節そして関与する。例えばチオレドキシン系は、リボヌクレオチド還元酵素のための水素供与体としてまた酸化還元制御による酵素の調節因子として役割を果たす。チオレドキシン系はまた、NF-κB、AP-1、ステロイド受容体等の転写因子の活性を調節する。
【００１９】
アルド／ケト還元酵素
アルド／ケト還元酵素は単量体NADPH依存性オキシドレダクターゼであって、幅広い基質特異性を有する(Bohren, K.M. 他 (1989) J. Biol. Chem. 264:9547-9551)。これらの酵素は、カルボニル含有糖および芳香族化合物など、カルボニル含有化合物の、対応するアルコールへの還元を触媒する。従って、様々なカルボニル含有薬物および生体異物はこのクラスの酵素によって代謝されると思われる。
【００２０】
ファミリーメンバーであるアルドースレダクターゼによって触媒される既知の或る反応は、グルコースがソルビトールへ還元され、更にソルビトールデヒドロゲナーゼによってフルクトースに代謝される。通常の条件下で、グルコースのソルビトールへの還元は主な経路ではない。しかしながら、高血糖状態では、ソルビトールの蓄積は糖尿病合併症の発症に関係すると思われる（OMIM *103880 Aldo-keto reductase family 1, member B1）。この酵素ファミリーのメンバーはまた、或る種の肝癌で高発現される（Cao, D.他 (1998) J. Biol. Chem. 273：11429-11435）。
【００２１】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ
アルデヒドデヒドロゲナーゼは、脂肪族アルデヒドと芳香族アルデヒドの酸化を触媒する。これらの酵素は多くの生命体に存在する。代表的酵素には下記が含まれる：(i)コハク酸セミアルデヒドをコハク酸に還元する大腸菌のNADP+依存性酵素であるコハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、(ii)乾燥状態に反応して蓄積する第四級アンモニウム化合物であるベタインの生合成に関係する植物と細菌に存在する酵素であるベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼ、(iii)プロリンをグルタミン酸に転換する酵母菌に存在する酵素である、Δ-1-ピロリン-5-カルボン酸デヒドロゲナーゼ、(iv)バクテリアから哺乳動物まで多様な種に存在する酵素であり、バリン異化作用に関係するメチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、(v)10-ホルミルテトラヒドロ葉酸からテトラヒドロ葉酸と蟻酸へのNADP+非依存性加水分解、さらに10-ホルミルテトラヒドロ葉酸からテトラヒドロ葉酸と二酸化炭素へのNADP+依存性脱カルボキシル還元反応に関与する哺乳動物のサイトゾル酵素であるホルミルテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼがある。ラットの肝臓10-ホルミルテトラヒドロ葉酸デヒドロゲナーゼ(残基1-203)のアミノ末端ドメインは、グリシンアミド・リボヌクレオチド・トランスホルミラーゼ(EC 2.1.2.1)の群に24-30%の同一性を有する。これらの酵素の活性部位は、ファミリーのすべての酵素に保存されるグルタミン酸とシステイン残基を含む(Weretilnyk, E.A及びA.D. Hanson (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2745-2749、Cook, R.J. 他(1991) J. Biol. Chem. 266:4965-4973、Steele, M.I.他 (1992) J. Biol. Chem. 267:13585-13592、Krupenko, S.A.他 (1995) 270:519-522)。
【００２２】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子ファミリーのメンバ−の欠陥は、ヒトの疾患と直接関連する。例えば、アルデヒドデヒドロゲナーゼ10（脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼ）の欠陥は、常染色体性劣性神経皮膚疾患であるシェーグレン-ラルソン症候群(SLS)を引き起こす。この病気は、通常誕生時に明らかになる重度の精神遅滞、痙性二肢麻痺または痙性四肢麻痺、および先天性魚鱗癬（角化の悪化）によって特徴付けられる。患者には、網膜上の白斑、発作、低身長症、言語障害も現われ得る(De Laurenzi, V. 他 (1996) Nat. Genet. 12:52-57)。アルデヒドデヒドロゲナーゼ４（グルタミンガンマ-セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；ピロリン-5-カルボン酸デヒドロゲナーゼ）の欠陥は、高プロリン血症タイプII（原形質内プロリン(10〜15倍の過剰)の蓄積によって特徴付けられる常染色体性劣性疾患）を引き起こす。この疾患の臨床表現型は、発作と精神遅滞を含んで無症候性から神経発現まで変わる(Hu, C.A. 他 (1996) J. Biol. Chem. 271:9795-9800)。
【００２３】
更に、ミトコンドリア酵素であるアルデヒドデヒドロゲナーゼ2はエタノール利用の第２ステップを触媒する。
ステップ1：エタノール+NAD+ →アセトアルデヒド+NADH  (アルコールデヒドロゲナーゼ)
ステップ2：アセトアルデヒド+ NAD+ →酢酸+ NADH  (アルデヒドデヒドロゲナーゼ)。
【００２４】
アルデヒドデヒドロゲナーゼの欠陥は、急性アルコール中毒を引き起こす。この遺伝子欠損は、東南アジア人と南米インディオの間で非常に多く発生しており、白人の間ではそれほどではない。不活性な変異体対立遺伝子は、一回のアミノ酸交換をコードする(Hsu, L.C. 他 (1988) Genomics 2:57-65)。
【００２５】
アルコールデヒドロゲナーゼ
アルコールデヒドロゲナーゼ（ADH）は、単純アルコールを対応するアルデヒドへ酸化する。ADHはサイトゾル酵素であって、補助因子NAD+を好み、また亜鉛イオンに結合する。ADHのレベルは肝臓において最も高く、腎臓、肺、および胃粘膜においては低い。
【００２６】
既知のADHアイソフォームは、40 kDaのサブユニットからなる二量体タンパク質である。これらのサブユニットをコードする５つの既知の遺伝子座（a、b、g、p、c）が存在し、その内の幾つかは特徴的な対立遺伝子変異体（b1、b2、b3、g1、g2）を有する。サブユニットはホモ二量体およびヘテロ二量体を形成することができ、サブユニットの構成によって活性な酵素の特異的特性が決定される。従って、ホロ酵素がクラスI （サブユニット構成、aa、ab、ag、bg、gg）、クラスII（pp）、およびクラスIII（cc）として分類されている。クラスI ADHイソ酵素はエタノールその他の小さい脂肪族アルコールを酸化し、ピラゾールによって阻害される。クラスIIイソ酵素は長鎖の脂肪族アルコールおよび芳香族アルコールを好み、メタノールを酸化できない。また、ピラゾールによって阻害されない。クラスIIIイソ酵素は、更に長い長鎖脂肪族アルコール（５炭素以上）および芳香族アルコールを好み、ピラゾールによって阻害されない。
【００２７】
ペルオキシソームβ酸化酵素
細胞代謝における酸化還元反応の重要性の別の例は、補酵素A（ＣｏＡ）活性化脂肪酸から2個の炭素のユニットを次々に除くミトコンドリアとペルオキシソームのベータ酸化酵素による飽和及び不飽和脂肪酸の分解である。主要なベータ酸化経路は飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の両方を分解するが、補助経路は不飽和脂肪酸の分解に必要な付加的ステップを行う。
【００２８】
ミトコンドリアとペルオキシソームのベータ酸化経路は同様の酵素を使用するが、異なる基質特異性と機能をもつ。ミトコンドリアは短鎖、中鎖、長鎖の脂肪酸を酸化して、細胞のためのエネルギーを産生する。ミトコンドリアのベータ酸化は心筋と骨格筋の主要なエネルギー源となっている。飢餓、持久運動、及び糖尿病の場合のようにグルコースレベルが低くなった時は、肝臓でのベータ酸化がケトン体を末梢の循環へ提供する（Eaton, S. 他(1996) Biochem. J. 320:345-357）。ペルオキシソームは中鎖、長鎖、超長鎖の脂肪酸、ジカルボン脂肪酸、分岐脂肪酸、プロスタグランジン、生体異物、胆汁酸中間物を酸化する。ペルオキシソームのベータ酸化の主な役割は、毒性の脂肪親和性カルボン酸を短くしてそれらの分泌を促進させ、ミトコンドリアのベータ酸化の前に超長鎖脂肪酸を短くすることにある（Mannaerts, G.P.及びP.P. Van Veldhoven (1993) Biochimie 75:147-158）。
【００２９】
補助ベータ酸化酵素である2,4-ジエノイルＣｏＡ還元酵素は、下記の反応を触媒する：
トランス-2, シス/トランス-4--ジエノイル-ＣｏＡ+NADPH + H+ →トランス-3--エノイル-ＣｏＡ+ NADP+。
【００３０】
この反応は、主要なベータ酸化経路に入る前に不飽和脂肪酸から偶数の二重結合を取り除く(Koivuranta, K.T. 他(1994) Biochem. J. 304:787-792)。この酵素は不飽和脂肪酸から奇数の二重結合をも取り除くことができる(Smeland, T.E. 他 (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6673-6677)。
【００３１】
ラット2,4-ジエノイル-ＣｏＡ還元酵素は、ミトコンドリアとペルオキシソームの両者に存在する(Dommes, V. 他. (1981) J. Biol. Chem. 256:8259-8262)。ラットのミトコンドリア酵素の免疫学的に異なる２つの型は、その分子量が60 kDaと120 kDaである(Hakkola, E.H.及びJ.K. Hiltunen (1993) Eur. J. Biochem. 215:199-204)。120 kDaのラットのミトコンドリア酵素は、成熟酵素を形成するために切断される、29アミノ酸N-末端リーダーペプチドを持つ335アミノ酸前駆体として合成される(Hirose, A.他 (1990) Biochim. Biophys. Acta 1049:346-349)。ラットの酵素に83％類似であるヒトのミトコンドリア酵素は、19アミノ酸N-末端リーダーペプチドの付いた335アミノ酸残基前駆体として合成される(前出のKoivuranta)。これらのクローニングされたヒトとラットのミトコンドリア酵素はホモ四量体として機能する(前出のKoivuranta)。出芽酵母菌ペルオキシソーム2,4-ジエノイル-ＣｏＡ還元酵素は長さが295アミノ酸であり、C-末端ペルオキシソーム標的シグナルを含む。またホモ二量体として機能する(Coe, J.G.S.他 (1994) Mol. Gen. Genet. 244:661-672、Gurvitz, A. 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:22140-22147)。すべての2,4-ジエノイル-ＣｏＡ還元酵素は、かなりよく保存された、配列のNADPH結合部位モチーフを有する(前出のKoivuranta)。
【００３２】
主要経路ベータ酸化酵素であるエノイルＣｏＡヒドラターゼは、下記の反応を触媒する：2-トランス-エノイル-CoA + H2O ⇔3-ヒドロキシアシル-CoA。この反応は、2-トランス-エノイル-CoAのC-2とC-3間の二重結合を水酸化するが、それは飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸から生成する(Engel, C.K. 他 (1996) EMBO J. 15:5135-5145)。このステップは、２，４-ジエノイル還元酵素によって触媒されるステップから下流にある。異なるエノイル-ＣｏＡヒドラターゼ群が、短鎖、中鎖、および長鎖の脂肪酸に作用する(前出のEaton)。ミトコンドリアとペルオキシソームとのエノイル-ＣｏＡヒドラターゼは、単一機能酵素及び多機能酵素複合体の一部の両方として存在する。ヒトの肝臓ミトコンドリア短鎖エノイル-ＣｏＡヒドラターゼは、29アミノ酸N-末端リーダーペプチドを持つ290アミノ酸前駆体として合成される(Kanazawa, M 他 (1993) Enzyme Protein 47:9-13、Janssen, U. 他 (1997) Genomics 40:470-475)。ラットの短鎖エノイル-ＣｏＡヒドラターゼは、このタンパク質の成熟領域においてヒトの配列と87％同一であり、ホモ六量体として機能する(前出のKanazawa、前出のEngel)。ミトコンドリアの或る三機能タンパク質は、長鎖エノイル-ＣｏＡヒドラターゼ、３ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素、および長鎖3-オキソチオラーゼ活性を有する(前出のEaton)。ヒトのペルオキシソームでは、エノイル-ＣｏＡヒドラターゼ活性が、327アミノ酸残基単機能酵素及び、二機能酵素としても知られる多機能酵素の一部の両者に見出される。それはエノイル-ＣｏＡヒドラターゼ、エノイル-ＣｏＡイソメラーゼ、および3-ヒドロキシアシル-CoAヒドロゲナーゼ活性を有する(FitzPatrick, D.R.他 (1995) Genomics 27:457-466、Hoefler, G他 (1994) Genomics 19:60-67)。短鎖エノイル-ＣｏＡヒドラターゼ活性を伴う或る339アミノ酸残基ヒトタンパク質もAU-特異的RNA結合タンパク質として作用する(Nakagawa, J.他 (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2051-2055)。全てのエノイル-ＣｏＡヒドラターゼは、高度に保存された17アミノ酸残基を持ち、2つの活性部位グルタミン酸残基付近の相同性を共有する(Wu, W.-J. 他 (1997) Biochemistry 36:2211-2220)。
【００３３】
ミトコンドリアとペルオキシソームのベータ酸化酵素における先天的欠陥は、生後まもなく発現して数年以内に死亡につながることもある重度の疾患と関連する。ミトコンドリアのベータ酸化酵素が関連する不全症としては例えば、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼおよびカルニチン欠損症、超長鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症、中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症、短鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症、電子伝達フラビンタンパク質および電子伝達フラビンタンパク質：ユビキノンオキシドレダクターゼ欠損症、三機能タンパク質欠乏症、および短鎖３ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症が含まれる(前出のEaton)。ミトコンドリア三機能タンパク質（エノイル-ＣｏＡヒドラターゼを含む）欠損患者は、長鎖エノイル-ＣｏＡヒドラターゼ活性が下がっている。そして非ケトン性低血糖症、乳幼児突然死症候群、心筋症、肝機能障害、筋衰弱を患い、若死にする可能性もある(前出のEaton)。ミトコンドリア2,4-ジエノイル-ＣｏＡ還元酵素を欠損する或る患者は、生後間もない内に低張性であり、摂食が困難であり、呼吸性アシドーシスから４ヶ月で死亡した(Roe, C.R. 他. (1990) J. Clin. Invest. 85:1703-1707)。
【００３４】
ミトコンドリアのベータ酸化の欠陥は、ライ症候群（肝機能障害、および子供の場合ウイルス感染の後に時折おこる脳障害により特徴付けられる疾患）と関連する。ライ症候群患者は、遊離脂肪酸の血清濃度が上昇し得る(Cotran, R.S. 他 (1994) Robbins Pathologic Basis of Disease、W.B. Saunders Co., Philadelphia PA, 866ページ)。ミトコンドリア短鎖３ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症と中鎖３ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症を患う患者も、ライ症候群のような病気を示した(前出のEaton及びEgidio, R.J..他 (1989) Am. Fam. Physician 39:221-226)。
【００３５】
ペルオキシソームのベータ酸化と関連する遺伝性病態には、ツェルヴェーガー症候群、新生児副腎脳白質ジストロフィー、小児レフサム症候群、アシルCoAオキシダーゼ欠損症、ペルオキシソームチオラーゼ欠損症、二機能タンパク質欠損症(bifunctional protein deficiency)がある(Suzuki, Y. 他(1994) Am. J. Hum. Genet. 54:36-43、前出のHoefler)。エノイルＣｏＡヒドラターゼを含むペルオキシソーム二頭酵素欠損症を患う患者は、低緊張(hypotonia)、発作、精神運動不全、欠陥性神経細胞移動(defective neuronal migration)を患い、超長鎖脂肪酸を蓄積し、通常は生後数年で死亡する(Watkins, P.A. 他 (1989) J. Clin. Invest. 83:771-777)。
【００３６】
ペルオキシソームのベータ酸化は、癌性組織で十分に機能しなくなる。新生物ヒト乳房上皮細胞は正常な細胞と同数のペルオキシソームを有するが、脂肪アシルCoAオキシダーゼ活性は対照組織より低い(el Bouhtoury, F. 他 (1992) J. Pathol. 166:27-35)。ヒト結腸癌は正常な結腸組織よりも少ないペルオキシソームを有し、正常な組織よりも脂肪アシルCoAオキシダーゼと二機能（二頭）酵素（エノイルＣｏＡヒドラターゼを含む）活性が低い(Cable, S. 他 (1992) Virchows Arch. B Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 62:221-226)。
【００３７】
アシル-ＣｏＡデヒドロゲナーゼ
アシル-ＣｏＡデヒドロゲナーゼファミリーは、少なくとも７つのメンバ−からなる。そのうち4つは脂肪酸のベータ酸化と関連する（上記参照）。超長鎖脂肪酸、ジカルボン脂肪酸、幾つかのプロスタノイド、プリスタン酸、胆汁酸中間体類、および生体異物化合物は、哺乳動物のペルオキシソームのベータ酸化により分解する(Van Veldhoven, P.P. 他 (1999) Adv. Exp. Med. Biol. 466:261-272)。例えば、70-kDaミトコンドリア膜関連タンパク質のホモ二量体である超長鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ(VLCAD) (Souri, M.他 (1998) FEBS Lett. 426:187-190)は、ミトコンドリアのアシル-ＣｏＡ脂肪酸の初期フラビン依存性酸化を触媒する。その過程で電子は電子伝達フラビンタンパク質に移される。VLCAD欠損症を患う患者は、早発性心筋症を示し、その結果、高発生率で低ケトン性低血糖症と乳児死亡が起こる。これらの症状は、VLCAD発現の欠陥の結果、あるいはVLCADの突然変異した形態の発現の結果である可能性がある。少なくとも１つの症例で、VLCADの遺伝子のヌクレオチド変化はmRNAの不正確なスプライシングと欠損タンパク質の合成へとつながった(Watanabe, H. 他 (2000) Hum. Mutat. 15:430-438)。アミノ酸置換を起こすエキソン10と12の突然変異またはナンセンス突然変異も報告されている(He, G. 他 (1999) Biochem. Biophys. Res. Commun. 264:483-487)。或る致死的な遺伝疾患も、中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼでの単一アミノ酸置換と関連する(Yang, B.Z. (2000) Mol. Genet. Metab. 69:259-262)。
【００３８】
アシルCoAデヒドロゲナーゼファミリ-の残りの3つの酵素は、アミノ酸の異化に関与する(即ちイソバレリル-ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、短／分岐鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ、グルタリルCoA デヒドロゲナーゼ)。例えば、イソバレリル-ＣｏＡデヒドロゲナーゼ(IVD)は、ロイシン異化経路におけるイソバレリル-ＣｏＡからメチルクロトニル-CoA への変換を触媒する。IVDは175kDaのホモ四量体であり、サブユニット毎に1つのFAD補欠分子族を含む。サブユニットは、成熟ポリペプチドを形成するためにタンパク質分解して処理される2 kDaのN末端リーダー配列が付いて合成される。IVDをコードする遺伝子はヒト染色体15にマップされ、そして１２のエキソンと11のイントロンからなる15キロベースにまたがる。突然変異の5つの異なるクラスが、IVDの欠損により引き起こされる疾患であるイソ吉草酸血症の患者の細胞株で同定されてきた(Volchenboum, S.L.及びJ. Vockley (2000) J. Biol. Chem. 275:7958-7963、Reinard, T.他 (2000) J. Biol. Chem. 275:33738-33743)。
【００３９】
6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ
6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ(6-PGDH)は、NADPHの産生を伴うリブロース5-リン酸への6-ホスホグルコン酸のNADP+依存性酸化脱炭酸反応を触媒する。6-PGDHが存在しなかったり、阻害があると、真核細胞で6-ホスホグルコン酸が有毒レベルまで蓄積する。6-PGDHは、ペントースリン酸経路(PPP)の３番目の酵素であり、遍在性である。あるヘテロ型発酵種では、NAD+は補助因子として使用され、続いてNADHの生成が起こる。
【００４０】
反応は、3-ケト中間物質を介して進み、これが脱カルボキシル化されてリブロース5-リン酸のエノールを与える。次いでエノールの互変異性化後にケト生成物に変換する(Berdis A.J.及びP.F. Cook (1993) Biochemistry 32:2041-2046)。6-PGDH活性は、NADPHの阻害作用そして6-ホスホグルコン酸の活性化作用により調節される(Rippa, M.他 (1998) Biochim. Biophys. Acta 1429:83-92)。6-PGDH活性の欠乏は、慢性溶血性貧血に関連すると考えられている。
【００４１】
6-PGDHの特異的形態（例えばトリパノソーマに見出される酵素）の標的化は、寄生虫感染を制御するための手段として示唆されている(Tetaud, E. 他 (1999) Biochem. J. 338:5560)。例えばＴ・ブルセイ酵素は、哺乳動物酵素に比べて、基質類似体6-ホスホ-2-デオキシグルコン酸と補酵素類似体アデノシン2',5'-２リン酸による阻害に対して際立って感受性が高い(Hanau, S. 他 (1996) Eur. J. Biochem. 240:592-599)。
【００４２】
リボヌクレオチドニリン酸還元酵素
リボヌクレオチドニリン酸還元酵素は、リボヌクレオチド二リン酸(即ち、ADP、GDP、CDP、UDP)の、DNAの合成に使用される対応するデオキシリボヌクレオチド二リン酸(即ちdADP、dGDP、dCDP、dUDP)への還元を触媒する。それによってリボヌクレオチドニリン酸還元酵素は、デオキシヌクレオチド前駆体の新規合成において重要な役割を果たす。デオキシヌクレオチドはまた、サルベージ経路経由でヌクレオシドキナーゼによりデオキシヌクレオシドから生成する。
【００４３】
哺乳動物リボヌクレオチドニリン酸還元酵素は、エフェクター結合成分(E)と非ヘム鉄成分（Ｆ）の2つの成分から成る。成分Ｆは触媒に必要な鉄ラジカルを含み、成分Ｅはヌクレオシド三リン酸エフェクターと結合する。ホロ酵素と同じく、ＥとＦ成分の分子量の決定は、タンパク質の精製で用いられる方法とその特定の研究所によって異なる。成分Ｅは約90〜100 kDaであり、成分Ｆは約100〜120 kDa、ホロ酵素は200〜250 kDaである。
【００４４】
リボヌクレオチド二リン酸還元酵素活性は、ＥＤＴＡと同様、チオセミカルバゾン等の鉄キレート剤により悪影響を受ける。デオキシリボヌクレオチド二リン酸も、リボヌクレオチド二リン酸還元酵素の負のアロステリック・エフェクターのようである。ヌクレオチド三リン酸（リボ-とデオキシリボ-の両者）はこの酵素の活性を刺激するようである。広く使用される有機リン農薬の代謝産物である3-メチル-4-ニトロフェノールは、哺乳動物細胞のリボヌクレオチド二リン酸還元酵素の強力なインヒビターである。DNAウイルス（例えばヘルペスウイルス）で感染した細胞と癌細胞のリボヌクレオチド二リン酸還元酵素活性は、アロステリック制御因子による調節に対して感受性が低く、高レベルのリボヌクレオチド二リン酸還元酵素活性と高速度の細胞増殖（例えば肝臓癌：hepatoma）との間には相関が存在することを示す証拠がある。この観察によると、ウイルスがコードしたリボヌクレオチド二リン酸還元酵素と癌細胞に存在するリボヌクレオチド二リン酸還元酵素は、ウイルスのゲノムの生成用または癌細胞を特徴付ける増加したＤＮＡ合成用のために増加した供給デオキシリボヌクレオチドのプールを維持することが可能であることを示す。したがって、リボヌクレオチド二リン酸還元酵素は、治療処置の標的である(Nutter, L.M.及びY.-C. Cheng (1984) Pharmac. Ther. 26:191-207、Wright, J.A. (1983) Pharmac. Ther. 22:81-102)。
【００４５】
ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ
ジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ(DD)は、NAD(P)+-依存性で、単量体形の34〜37 kDaの酵素であり、トランス-ジヒドロジオールと、ベンゾ[α]イレン、ベンゾ[α]アントラセン、７−メチル-ベンゾ[α]アントラセン、7,12-ジメチル-ベンゾ[α]アントラセン、クリセン、５−メチルークリセン等の多環式芳香族炭化水素(PAH)のアンチジオールエポキシド代謝産物の解毒に関与する。哺乳動物細胞では、ベンゾ[α]yrene等の環境的PAH毒素はミクロソームチトクロームP450によりまずエポキシ化されて7R,8R-アレーン-オキシドを産生し、続いて(-)-7R,8R-ジヒドロジオール((-)-トランス-7,8-ジヒドロキシ-7,8-ジヒドロベンゾ[α]ピレンまたは(-)-トランス-B[α]P-ジオール)を産生する。後者の化合物は更に種によって異なる酵素または同じ酵素によりベンゾ[α]ピレンの抗ジオールエポキシド（即ち(±)アンチ-7β,8α-ジヒドロキシ-9α,10α-エポキシ-7,8,9,10-テトラヒドロベンゾ[α]ピレン）に転換する。この結果として生じるベンゾ[α]yreneのアンチ-ジオールエポキシドまたは別のPAH化合物からの対応する誘導体は、突然変異誘発性が高い。
【００４６】
ＤＤは、効果的にアンチ-ジオールエポキシドの前駆体（即ちトランス-ジヒドロジオール）を一過性カテコールに酸化し、一過性カテコールはキノンに自己酸化し、過酸化水素とセミキノンラジカルをも生成する。この反応は発癌性の高いアンチ-ジオールの形成を妨げる。アンチ-ジオールはそれ自体はＤＤの基質ではないが、アンチ-ジオール化合物を含むサンプルへのＤＤの添加はエイムス試験で観察される誘導された突然変異誘発率の有意な減少へとつながる。この場合、ＤＤは抗ジオールが酸化されなくても、抗ジオールに結合し隔離することができる。酸化または隔離のいずれによるにせよ、ＤＤは生体異物多環化合物の代謝産物の解毒において重要な役割を果たす(Penning, T.M. (1993) Chemico-Biological Interactions 89:1-34)。
【００４７】
15-オキソプロスタグランジン 13-還元酵素
15-オキソプロスタグランジン 13-還元酵素(PGR)と15-ヒドロキシプロスタグランジン・デヒドロゲナーゼ(15-PGDH)は、循環するプロスタグランジンの分解に関与する肺に存在する酵素である。肺システムの通過による酸化異化は、循環するプロスタグランジンの濃度を減少する一般的な手段である。15-PGDHは、対応する15-オキソ化合物を生成するために多様なプロスタグランジンの１５―ヒドロキシ基を酸化する。１５―オキソ誘導体は通常、15-ヒドロキシル分子に比べて減少した生物学的活性を有する。PGRは更に、15-オキソ化合物の13，14二重結合を還元し、これは通常、その生物学的活性を更に減らす。PGRは約36 kDaの分子量を有する単量体である。この酵素には、補助因子としてNADHかNADPHが必要であるが、ＮＡＤＨの方がより好まれる。プロスタグランジンPGE1、PGE2、PGE2αの15-オキソ誘導体はすべてPGRの基質である。しかし、非誘導体化プロスタグランジン（即ちPGE1、PGE2、PGE2α）は基質ではない(Ensor, C.M. 他 (1998) Biochem. J. 330:103-108)。
【００４８】
15-PGDHとPGRはまた、リポキシンA4(LXA4)の代謝を触媒する。リポキシン(LX)は、オータコイド（限局性の炎症の部位で生成される脂質）であり、多形核白血球(PMN)機能を下方調節して、限局性外傷の回復を促進する。リポキシン生成は、既にアスピリンによりアセチル化されたシクロオキシゲナーゼII (COX II)を現す細胞、また、5-リポキシゲナーゼ(5-LO)を有し相互作用してリポキシンを生成する細胞では、アスピリンの投与により刺激される。15-PGDHは15-オキソ-LXA4を産出し、PGRは、この15-オキソ化合物を更に13,14-ジヒドロ-15-オキソ-LXA4に転換する、(Clish, C.B. 他 (2000) J. Biol. Chem. 275:25372-25380)。この発見は、プロスタグランジン・デヒドロゲナーゼの幅広い基質特異性を示す。また薬物代謝におけるこれらの酵素の関連を暗示する。そして炎症を調節するための治療のための標的としての関連を暗示する。
【００４９】
GMC オキシドレダクターゼ
酵素のGMC(グルコースメタノールコリン)オキシドレダクターゼファミリーは、ショウジョウバエのグルコースデヒドロゲナーゼ、大腸菌のコリンデヒドロゲナーゼ、黒色麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）のグルコースオキシダーゼ、Hansenula polymorpha のメタノールオキシダーゼの配列アラインメントに基づいて定義される。異なる源泉と異なる基質特異性にもかかわらず、これらの４つのフラビンタンパク質は相同であり、幾つかの独特の配列と構造的特徴の存在により特徴付けられる。各分子は、アミノ末端に近い正準なADP結合、β-α-βモノヌクレオチド結合モチーフを含む。この折り畳みは、3ストランド逆並行ベータシートとアルファヘリックスに挟まれた４ストランド並列ベータシートから成る。ヌクレオチド群は、この鎖折り畳みに関連して類似の位置で結合する(Cavener, D.R. (1992) J. Mol. Biol. 223:811-814、Wierenga, R.K. 他 (1986) J. Mol. Biol. 187:101-107)。GMCオキシドレダクターゼファミリーのメンバーも、ポリペプチドの中心領域近くのコンセンサス配列を共有する。GMCオキシドレダクターゼファミリーの他のメンバーには、Brevibacterium sterolicumとストレプトマイセスのコレステロール・オキシダーゼ、Pseudomonas oleovoransのアルコールデヒドロゲナーゼが含まれる(前出のCavener, D.R.、Henikoff, S.及びJ.G. Henikoff (1994) Genomics 19:97-107、van Beilen, J.B. 他. (1992) Mol. Microbiol. 6:3121-3136)。
【００５０】
ＩＭＰデヒドロゲナーゼ/ＧＭＰレダクターゼ
ＩＭＰデヒドロゲナーゼとＧＭＰレダクターゼは、配列類似性を持つ多くの領域を共有する2つの酸化還元酵素である。ＩＭＰデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.205)は、新規なGTP生合成の一部としてIMP(イノシン1リン酸)からXMP(キサンチン１リン酸)へのNAD依存性の還元を触媒する(Collart, F.R.及びE. Huberman (1988) J. Biol. Chem. 263:15769-15772)。ＧＭＰレダクターゼは、GMPからIMPへのNADPH依存性還元的脱アミノ反応を触媒し、アデニンとグアニンのヌクレオチドの細胞内バランスの維持を助ける(Andrews, S.C.及びJ.R. Guest (1988) Biochem. J. 255:35-43)。
【００５１】
ピリジンヌクレオチドジスルフィド酸化還元酵素
ピリジンヌクレオチドジスルフィド酸化還元酵素は、ＦＡＤから基質への還元当量の転移に関与するＦＡＤフラビン蛋白質である。これらのフラビン蛋白質は、このタンパク質ファミリーの特長であるコンセンサス配列内に含まれる対のレドックス活性システインを含む(Kurlyan, J.他(1991) Nature 352:172-174)。酸化還元酵素のこのファミリーのメンバーには、グルタチオンレダクターゼ(EC 1.6.4.2)、高等な真核生物のチオレドキシンレダクターゼ(EC 1.6.4.5)、trypanothione レダクターゼ(EC 1.6.4.8)、リポアミド・デヒドロゲナーゼ(EC 1.8.1.4)、αケト酸デヒドロゲナーゼ化合物のＥ３成分、水銀還元酵素(EC 1.16.1.1)が含まれる。
【００５２】
乳酸フェリチトクローム C 酸化還元酵素
乳酸の利用には２つの酵素が必要とされる。即ちＤ及びＬ乳酸フェリチトクローム C 酸化還元酵素(D及びL-LCR; EXPASY E.C. 1123とE.C. 1124)であり、Ｄ−及びＬ−乳酸をピルビン酸に立体特異的に酸化する(Lodi, T. 他. (1994) Mol. Gen. Genet. 244: 622-629)。酵母菌では、３つの酵素が核内でコードされ、またミトコンドリアに局在する(Alberti A. 他. (2000) Yeast 16:657-665)。D-LCRは、酸化還元反応の電子受容体としてシトクロムCを伴う呼吸鎖に連関する。D-及びL-LCRの両遺伝子は、基質乳酸によって誘発され、グルコースにより抑制される炭素源により制御される(Lodi, T. 他 (1994) Mol. Gen. Genet. 244: 622-629)。
【００５３】
ヒドロラーゼ
ヒドロラーゼは水分子の導入によって基質内のさまざまな共有結合の切断を触媒する酵素クラスである。この反応においては、水分子の酸素原子が基質内の標的結合に求核攻撃を加える。水分子が標的結合のところで分かれて結合を破り、二つの分子が生成される。ヒドロラーゼは細胞成分の合成と分解などの機能および、細胞シグナル伝達、細胞増殖、炎症、アポトーシス、分泌および排泄を含む細胞機能の調節に必須な反応にかかわっている。ヒドロラーゼはこれらの機能にかかわる病気プロセスの重要な過程に関連している。加水分解酵素、すなわちヒドロラーゼは基質特異性によって、ホスファターゼ、ペプチダーゼ、リゾホスホリパーゼ、ホスホジエステラーゼ、グリコシダーゼ、グリオキサラーゼ、リボヌクレアーゼ、チオエーテルヒドロラーゼおよび、ペプチド結合以外の炭素窒素（C-N）結合に作用するヒドロラーゼなどのサブクラスに分類されうる。
【００５４】
ホスファターゼは加水分解によりタンパク質からリン酸基を除去する。これは、多くの細胞内シグナル伝達経路を調節し、ひいては細胞成長と分化、細胞間接触、細胞周期および発癌を制御するエネルギー供給過程である。
【００５５】
ペプチダーゼはプロテアーゼとも呼ばれ、ペプチドやタンパク質の鎖のバックボーンを形成するペプチド結合を切断する。タンパク分解は細胞増殖、分化、再構築や恒常性ならびに炎症および免疫反応において重要である。典型的なタンパク質の半減期は数時間から数日の範囲であるため、ペプチダーゼはつねにタンパク質前駆体を切断して活性型に変え、標的タンパク質からシグナル配列を除去し、古いタンパク質や欠陥のあるタンパク質を分解している。ペプチダーゼはバクテリア、寄生生物およびウィルスの侵入と宿主内での複製の際に機能する。ペプチダーゼの例としてはトリプシンおよびキモトリプシン、補体カスケードと血液凝固カスケードの成分、リソソームのカテプシン、カルパイン、ペプシン、レニンおよびキモシンなどが挙げられる(Beynon, R.J. および J.S. Bond (1994) Proteolytic Enzymes: A Practical Approach, Oxford University Press, New York, NY, 1-5ページ)。
【００５６】
リゾホスホリパーゼ（LPL）はエステル結合の加水分解でアシル基を除去するという、脂質分解の重要な過程を触媒することによって細胞内脂質を調節する。約１５〜３０ｋＤの小さいLPLアイソフォームはヒドロラーゼとして機能し、大きなアイソフォームはヒドロラーゼとアシル基転移酵素の両方の機能をする。LPLの特定の基質であるリソホスファチジルコリンは細胞膜の溶解を起こす。LPLの活性は、炎症反応を含む数多くの経路で重要なシグナル伝達分子によって調節される。
【００５７】
ホスホジエステラーゼはホスホジエステル化合物内の２つのエステル結合のうちの１つの加水分解を触媒する。従って、ホスホジエステラーゼは様々な細胞プロセスにとって重要である。ホスホジエステラーゼにはDNAおよびRNAのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼが含まれるが、これらは細胞の成長と複製およびタンパク質合成に必須である。エンドヌクレアーゼV（デオキシイノシン３’エンドヌクレアーゼ）はタイプIIの部位特異性デオキシリボヌクレアーゼの一例であり、これは、ヒポキサンチン、ウラシルまたはミスマッチ塩基を含むDNAを切断する推定DNA修復酵素である。大腸菌エンドヌクレアーゼVは、デオキシキサンチンへの第２のホスホジエステル結合３'においてデオキシキサンチンを含むDNAを切断し、切断部位で３’ヒドロキシル基および５’ホスホリル基を生成することが示されている(He, B.他. (2000) Mutat. Res. 459:109-114)。大腸菌エンドヌクレアーゼVは脱アミノ化されたグアニンすなわちキサンチンをDNAから除去する際に役割を果たし、ひいてはニトロソ基の脱アミノ化による突然変異誘発効果から細胞を保護すると示唆されている(Schouten KA および Weiss B (1999) Mutat. Res. 435:245-254)。真核生物においては、tRNAスプライシング過程において、アンチコドンループ１塩基３’からアンチコドンを妨害する小さなtRNAイントロンを除去する(the removal of small tRNA introns that interrupt the anticodon loop 1 base 3’ to the anticodon)必要がある。この過程にはエンドヌクレアーゼ、リガーゼおよびホスホトランスフェラーゼの段階的な作用が必要とされる(Hong, L. 他 (1998) Science 280:279-284)。リボヌクレアーゼP（Rnase P）は、tRNAスプライシング過程中に成熟したtRNA ５’末端を生成するために必要な遍在性のRNA処理エンドヌクレアーゼである。これはプレtRNA上の特異的な部位でP-3’O 結合の切断を触媒することによって５’リン酸および３’ヒドロキシル末端基を生成することで達成される。RNase Pによる触媒反応はMg2+ または Mn2+などの2価のカチオンに絶対的に依存している(Kurz, J.C. 他 (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:553-558)。RNase P の基質認識機構は真核生物、始原菌（Archaea）およびバクテリアの間でよく保存されていることが実証されている(Fabbri, S. 他 (1998) Science 280:284-286)。S. cerevisiaeにおいてPOP1（前駆体RNAの処理）と名づけられている遺伝子が、RNase PおよびRNase MRP（もう一つのRNA処理タンパク質）の両方のタンパク質成分をコードしている。酵母菌POP1における突然変異が致死的であることが示されてきた(Lygerou, Z. 他. (1994) Genes Dev. 8:1423-1433)。もう１つのホスホジエステラーゼである酸性スフィンゴミエリナーゼは、膜リン脂質スフィンゴミエリンを加水分解してセラミドおよびホスホリルコリンを生成する。ホスホリルコリンはホスファチジルコリンの合成に使用されるが、ホスファチジルコリンは数多くの細胞内シグナル伝達経路に関与している。セラミドは、神経組織に高濃度に存在する膜脂質であるガングリオシドの生成に必須な前駆体である。酸性スフィンゴミエリナーゼが欠損すると、リソソームにおいてスフィンゴミエリン分子が蓄積され、それによってニーマン−ピック病が引き起こされる。
【００５８】
グリコシダーゼはグリコシドのヘミアセチル結合を切断する。グリコシドは１つ以上の糖を含む化合物である。たとえば、哺乳動物のラクターゼ・フロリジンヒドロラーゼは乳糖を分割する腸酵素である。哺乳動物のベータガラクトシダーゼはガングリオシド、糖タンパク質およびグリコサミノグリカンから末端ガラクトースを除去し、この酵素の欠損はモルキオ病タイプBとして知られるガングリオシド蓄積症と関連している。脊椎動物のリソソームのアルファグルコシダーゼ（グリコーゲン、マルトースおよびイソマルトースを加水分解）および脊椎動物の腸スクラーゼ・イソマルターゼ（スクロース、マルトースおよびイソマルトースを加水分解）はこのファミリの広範囲に分布するメンバーであり、活性部位に高度に保存された配列を持っている。
【００５９】
グリオキシラーゼ系は糖新生、すなわち体内に保存された化合物からグルコースを産生することに関与している。この系はグリオキシラーゼI（トリオースリン酸エネルギー代謝の副産物であるメチルグリオキサルからS-Dラクトイルグルタチオンを形成する反応を触媒）およびグリオキシラーゼII（S-DラクトイルグルタチオンをD乳酸と還元グルタチオンに加水分解）からなっている。グリオキシラーゼは高血糖症、非インシュリン依存糖尿病、バクテリア毒素の解毒、および細胞増殖と微小管アセンブリの制御に関与している。
【００６０】
リボヌクレアーゼは、RNAとオリゴリボヌクレオチドを加水分解する酵素である。リボヌクレアーゼＴ2は、ＲＮＡから３’ホスホモノヌクレオチドと３’ホスホオリゴヌクレオチドそして２’，３’サイクリックリン酸中間体への２段階内ヌクレオチド鎖切断を触媒する。膵臓リボヌクレアーゼ(RNase) (EC 3.1.27.5)は、多数の哺乳動物分類群およびある種の爬虫類の膵臓に大量に見られるピリミジン特異的なエンドヌクレアーゼである。膵臓ＲＮａｓｅファミリに属する他の多数のタンパク質としては、腎臓非分泌型リボヌクレアーゼ(好酸球に由来する神経毒、EDN)、肝臓タイプリボヌクレアーゼ、アンギオゲニン、好酸球カチオン性タンパク質(ECP) (PROSITE:PDOC00118)がある。EDNは、実験動物の運動失調、麻痺、および中枢神経系細胞変性を誘発する能力を主に知られる、好酸球の大きな特異的顆粒の、明確なカチオン性蛋白質である(Rosenberg, H.F. 他 (1989) PNAS 86:4460-4464)。エーテル結合に作用するヒドロラーゼの小さなサブクラスとして、チオエーテルヒドロラーゼなどが挙げられる。SアデノシルLホモシステインヒドロラーゼはAdoHcyaseまたは SAHH (PROSITE PDOC00603; EC 3.3.1.1)としても知られているが、S-アデノシル-L-ホモシステイン(AdoHcy)からアデノシンとホモシステインへの可逆的な加水分解に関与する活性として初めにラットの肝臓抽出物中で記述されたチオエーテルヒドロラーゼである(Sganga, M.W. 他 (1992) PNAS 89:6328-6332)。SAHHはサイトゾル酵素であって、大腸菌およびある種の近縁バクテリアを除いて、試験されたすべての細胞で見つかっている(Walker, R.D. 他(1975) Can. J. Biochem. 53:312-319、Shimizu, S. 他 (1988) FEMS Microbiol. Lett. 51:177-180、Shimizu, S. 他 (1984) Eur. J. Biochem. 141:385-392)。SAHH活性は補助因子としてNAD+ に依存している。SAHHの欠損は高メチオニン血症(Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) #180960 Hypermethioninemia)に関連しているが、これは新生児胆汁鬱滞、成長障害、知的および運動能力の遅滞、異常な毛髪および歯を含む顔面異形症、および心筋症によって特徴付けられる病理学的状態である(Labrune, P. 他 (1990) J. Pediat. 117:220-226)。
【００６１】
ヒドロラーゼのもう１つのサブクラスにはペプチド結合以外の炭素窒素（C-N）結合に作用する酵素が含まれる。このサブクラスにはアミド、アミジンおよびその他のC-N結合を加水分解する酵素が属している。このサブクラスはさらにリニアアミド、サイクリックアミド、リニアアミジン、サイクリックアミジン、ニトリルおよびその他の化合物を含む基質特異性によって分けられている。
【００６２】
この酵素サブクラスに属するヒドロラーゼでサイクリックアミジンに作用するのがアデノシンデアミナーゼ（ADA）である。ADAはアデノシンをイノシンに分解する反応を触媒する。ADAは胎盤、筋肉、肺、胃、消化性憩室、脾臓、赤血球、胸腺、精漿、甲状腺、T細胞、骨髄幹細胞および肝臓を含む多くの哺乳動物組織に存在する。ADAのサブクラスであるADARはRNAに作用し、RNAエディターゼ（editase）として分類されている。ショウジョウバエからのADARであるdADARは発生中の神経系で発現することが示されているため、中枢神経系のパラ電位依存性Na+チャネル転写物に作用するエディターゼの候補になっている(Palladino, M.J. 他 (2000) RNA 6:1004-1018)。ADAの欠損は重症複合型免疫不全（SCID）を伴う重大なリンパ球減少症を引き起こす。ADA欠損を示す患者の細胞はADA触媒活性およびADAタンパク質の量が正常より少ないか、ときには検出不能な場合もある。ADA欠損はADA遺伝子の遺伝的な突然変異に起因し、SCIDを引き起こすことが示されている(Hershfield, M.S. (1998) Semin. Hematol. 4:291-298)。マウスにおけるADA欠損の代謝への影響は肺胞形成（alveogenesis）の欠陥、肺の炎症および気道閉塞と関連していることが示されている(Blackburn, M.R. 他 (2000) J. Exp. Med. 192:159-170)。
【００６３】
膵臓リボヌクレアーゼ(RNase) は、ある種の哺乳動物分類群および一部の爬虫類の膵臓に大量に見られるピリミジン特異的なエンドヌクレアーゼである(Beintema, J.J. 他 (1988) Prog. Biophys. Mol. Biol. 51:165-192)。哺乳動物の膵臓Rnaseスーパーファミリーのタンパク質は、２段階リン酸転移加水分解反応を通じてRNAを分解する非サイトゾルのエンドヌクレアーゼである(Beintema, J.J. 他 (1986) Mol. Biol. Evol. 3:262-275)。特に、これらの酵素は３'ホスホモノヌクレオチドと３’ホスホオリゴヌクレオチドの内ヌクレオチド結合を切断してC-PまたはU-Pと２’，３’サイクリックリン酸中間体にする過程に関与している。リボヌクレアーゼは一本鎖のDNAと複合体を作ってDNAヘリックスを巻き戻すことができる。この複合体は酵素のリジンおよびアルギニン残基とヌクレオチドのリン酸基の間の拡張多部位カチオン・アニオン相互作用によって生じる。このファミリに属する酵素の一部は純粋な消化機能を演じているようであるが、その他のものは強力で異例な生物学的活性を示す(D'Alessio, G. (1993) Trends Cell Biol. 3:106-109)。膵臓ＲＮａｓｅファミリに属するタンパク質としては、ウシの精嚢および脳リボヌクレアーゼ、腎臓非分泌型リボヌクレアーゼ(Beintema, J.J. 他 (1986) FEBS Lett. 194:338-343)、肝臓タイプリボヌクレアーゼ(Rosenberg, H.F. 他(1989) PNAS U.S.A. 86:4460-4464)、正常および悪性組織の血管新生を誘発するアンギオゲニン、リボヌクレアーゼ活性を持つ細胞毒素および寄生虫毒素(helminthotoxin)である好酸球カチオン性タンパク質(Hofsteenge, J. 他. (1989) Biochemistry 28:9806-9813)、およびカエル肝臓リボヌクレアーゼとカエルのシアル酸結合レクチンが含まれる。膵臓ＲＮａｓｅの配列には４つの保存されたジスルフィド結合と触媒活性に関与する３つのアミノ酸残基が含まれている。
【００６４】
1つのアミノ酸を含むアスパラギンオリゴ糖だけに作用する酵素のこのサブ・サブクラスに所属するヒドロラーゼが、N4-(β-N-アセチルグルコサミニル)-L-アスパラギナーゼ（別名：アスパルチルグルコシラミニダーゼ）(AGA; EC 3.5.1.26)である。AGAは、糖タンパク質のN結合性オリゴサッカライドの異化作用における主要酵素である。AGA酵素は糖タンパク質のリソソーム分解の最終段階の1つとして残留N-アセチルグルコサミンからアスパラギンを切断する。AGAは、蠕虫類(worms)、ラット、マウス、ブタ、ヒト、フラボバクテリアに見出されるリソソーム起源の酵素である(ExPASy Enzyme View of ENZYME: 3.5.1.2; SWISS-PROT P20933)。AGA欠損は、アスパルチルグルコミン尿症(AGU)として知られるリソソーム病引き起こす(Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) #208400 Aspartylglucosaminuria、Jenner, F.A. 他. (1967) Biochem. J. 103:48P-49P、Pollitt, R.J. 他. (1968) Lancet II:253-255)。AGU患者は、重度の精神遅滞、頭蓋非対称性（cranial asymmetry）、脊柱側弯症、周期性多動（periodic hyperactivity）、空胞化したリンパ球を示す。乳児のAGUは、下痢と頻繁な感染によって特徴付けられる（Palo, J. 他 (1970) J. Ment. Defic. Res. 14:168-173）。AGUがＡＧＵ遺伝子の遺伝的な突然変異から生じることが示されてきた。変異はおそらくＡＧＵ分子の折り畳みと安定性に影響を与える(Ikonen, E. 他 (1991) PNAS 88:11222-11226、Ikonen, E. 他 (1991) EMBO J. 10:51-58、Ikonen, E. 他. (1991) Genomics 11:206-211)。マウスのAGA欠損の代謝への影響が、老年のマウスにおける、障害性の膀胱機能、および重度の失調性歩行を含む、神経運動器協調における欠損と関連することが発見されてきた(Tenhunen, K. 他 (1995) Genomics 30:244-250、Gonzalez-Gomez, I. 他. (1998) Am. J. Path. 153:1293-1300)。
【００６５】
トランスフェラーゼ
トランスフェラーゼは分子グループの転移を触媒する酵素である。この反応は酸化、還元または共有結合の切断に関与する場合があり、基質またはある種の基質の特定部位にしばしば特異的である。トランスフェラーゼは、細胞構成成分の合成や分解、細胞のシグナル伝達などの細胞機能の調節、細胞増殖、炎症、アポトーシス、分泌および排泄のような機能にとって必須の反応に関与する。トランスフェラーゼはこれらに関連する疾患の過程における重要な段階に関与している。トランスフェラーゼは転移される基のタイプにしたがってしばしば分類される。例えば、メチルトランスフェラーゼは一つの炭素メチル基を転移し、アミノトランスフェラーゼは窒素を含むアミノ基を転移し、また同様に名付けられた酵素はアルデヒド基またはケトン基、アシル基、グリコシル基、アルキル基あるいはアリール基、イソプレニル基、糖（saccharyl）基、リン含有（phosphorous-containing）基、硫黄含有基、またはセレニウム含有基、および補酵素Aのような小さい酵素基を転移する。
【００６６】
アシルトランスフェラーゼには脂肪酸β酸化経路に関与するペルオキシソームのカルニチンオクタノイルトランスフェラーゼ、および脂肪酸代謝および輸送に関与するミトコンドリアのカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼがある。コリンO-アセチルトランスフェラーゼは神経伝達物質アセチルコリンの生合成を触媒する。N−アシルトランスフェラーゼ酵素は、アミノ酸抱合体の、活性化したカルボキシル基への転移を触媒する。内因性化合物および生体異物は、サイトゾル、ミクロソームおよびミトコンドリアにおいて、アシル−CoAシンセターゼによって活性化される。次に、アシル−CoA中間体は、サイトゾルまたはミトコンドリアにおけるN−アシルトランスフェラーゼによってアミノ酸（通常はグリシン、グルタミン、またはタウリンであるが、オルニチン、アルギニン、ヒスチジン、セリン、アスパラギン酸、およびいくつかのジペプチドを含む）と抱合し、アミド結合を有する代謝産物を形成する。胆汁酸−CoA：アミノ酸N−アシルトランスフェラーゼ（BAT）は、このクラスの良く特徴づけられた酵素の１つである。BATは、胃腸管において界面活性剤として作用する、胆汁酸抱合体の生成を担う(Falany, C. N.他 (1994) J. Biol. Chem. 269:19375-19379; Johnson, M. R.他 (1991) J. Biol. Chem. 266:10227-10233)。BATはまた、部分肝切除の後の肝臓癌患者の予後の予測インジケータとして有用である(Furutani, M.他(1996) Hepatology 24:1441-1445)。
【００６７】
N−アセチルトランスフェラーゼは、補助因子アセチル−補酵素A（アセチル−CoA）を用いてアセチル基を芳香族アミンおよびヒドラジン含有化合物に転移するサイトゾル酵素である。ヒトの場合、２つの高度に類似したN-アセチルトランスフェラーゼ酵素であるNAT1およびNAT2が存在し、マウスには第３型酵素であるNAT3が存在する。N−アセチルトランスフェラーゼのヒト型は、独立した調節（NAT1は広範に発現されるが、NAT2は肝臓および腸のみに発現される）および、重複した基質選択性を有する。両方の酵素はある程度まで多くの基質を受容するようであるが、NAT1は数種の基質（パラアミノ安息香酸、パラアミノサリチル酸、スルファメトキサゾール、およびスルファニルアミド）を好み、一方NAT2は他の基質（イソニアジド、ヒドララジン、プロカインアミド、ダプソン、アミノグルテチミド、およびスルファメタジン）を好む。最近単離されたヒト遺伝子、tubedown-1は酵母NAT-1 N-アセチルトランスフェラーゼに相同であり、アセチルトランスフェラーゼ活性に関連するタンパク質をコードする。tubedown-1 の発現パターンは、これが血管および造血系の発達の調節に関与することを示唆する(Gendron, R.L. 他 (2000) Dev. Dyn. 218:300-315)。
【００６８】
リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ (LPAAT) はリゾホスファチジン酸(LPA)のアシル化を触媒しホスファチジン酸に変える。リゾホスファチジン酸は最も単純なグリセロリン脂質であり、グリセロール分子、リン酸基およびモノ飽和脂肪アシル鎖からなる。LPAAT はLPAに二番目の脂肪アシル鎖を付加し、ホスファチジン酸(PA)を生じるPAはリン脂質の生成に必要なジアシルグルセロールや、重要な生物学的燃料分子であるトリアシルグリセロールの前駆体分子である。生合成反応において極めて重大な前駆体分子であることに加えて、LPAは最近、細胞内脂質メッセンジャー分子のリストに追加された。LPA はGタンパク質共役受容体と相互作用し、アデニル酸シクラーゼの阻害、ホスホリパーゼCの刺激、MAPキナーゼの活性化、および小GTP結合タンパク質RasおよびRhoの活性化を含む種々の独立型作動体経路に共役する(Moolenaar, W.H. (1995) J. Biol. Chem 28-:12949-12952)。LPAの生理学的作用は十分に調べられていないが、その生理学的作用には腫瘍細胞の増殖や浸潤が含まれている。LPAAT(リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ)の生成物である、PA(ホスファチジン酸)はインターロイキン-1b、腫瘍壊死因子α、血小板活性化因子および脂質Aのような炎症誘発性媒介物によって活性化される共通のシグナル伝達経路の重要なメッセンジャーである（Bursten, S.L. 他 (1992) Am. J. Physiol. 262:C328-C338、Bursten S.L. 他 (1991) J. Biol. Chem. 255:20732-20743、Kester, M. (1993) J. Cell Physiol. 156:317-325）。したがって、LPAAT 活性は種々の炎症誘発性物質に対する炎症応答を媒介している可能性がある。
【００６９】
アミノトランスフェラーゼ類は、ピリドキサール5'−リン酸（PLP）依存性酵素の１ファミリーを構成する。PLP依存性酵素は、アミノ酸の成分置換を触媒する。アミノトランスフェラーゼはタンパク質の合成や分解において重要な役割を果たし、他の過程にも寄与する。例えば、GABA アミノトランスフェラーゼ(GABA-T)は主要な阻害性アミノ酸神経伝達物質であるGABAの分解を触媒する。GABA-T の活性化はアルコール中毒症、癲癇およびアルツハイマー疾患のような神経精神疾患に関連する(Sherif, F.M.およびAhmed, S.S. (1995) Clin. Biochem. 28:145-154)。このファミリーの他のメンバーには、ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、チロシンアミノトランスフェラーゼ、芳香族アミノトランスフェラーゼ、アラニン：グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ（AGT）およびキヌレニンアミノトランスフェラーゼが含まれる(Vacca, R. A.他(1997) J. Biol. Chem. 272:21932-21937)。キヌレニンアミノトランスフェラーゼは、L−トリプトファン代謝産物L−キヌレニンの不可逆的なアミノ転移を触媒してキヌレン酸を形成する。この酵素はまた、L−2−アミノアジピン酸から2−オキソグルタル酸およびその逆への可逆的なアミノ基転移反応を触媒して2−オキソアジピン酸およびL−グルタミン酸を生成し得る。キヌレン酸は、グルタミン酸作動性神経伝達の推定上のモジュレーターであるため、キヌレニンアミノトランスフェラーゼの欠損が多面発現性効果に関係すると思われる(Buchli, R.他 (1995) J. Biol. Chem. 270:29330-29335)。
【００７０】
グリコシルトランスフェラーゼには哺乳類UDP-グルクロノシルトランスフェラーゼがあり、これは、薬物、発癌物質および他の外来性物質の解毒および排泄において重要な役割を果たす反応においてグルクロン酸の親油性基質への転移を触媒する膜結合性ミクロソーム酵素のファミリーである。他の哺乳類グリコシルトランスフェラーゼである、哺乳類UDP-ガラクトース-セラミド-ガラクトシルトランスフェラーゼは神経系のミエリン膜におけるガラクトセレブロシドの合成においてガラクトースのセラミドへの転移を触媒する。ガラクトシルトランスフェラーゼ類は、溶液に遊離している糖脂質または糖タンパク質の一部であるN末端アセチルグルコサミン（GlcNAc）オリゴ糖鎖にガラクトース（Gal）を転移する、グリコシルトランスフェラーゼ（糖転移酵素）のサブセットである（Kolbinger, F.他 (1998) J. Biol. Chem. 273:433-440、Amado, M.他 (1999) Biochim. Biophys. Acta 1473:35-53）。β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼはGal (β1-3)GlcNAc リンケージを有するI型糖鎖を形成する。既知のヒトおよびマウスβ1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼは、短いサイトゾルドメイン、１つの膜貫通ドメイン、および８つの保存された領域を有する触媒ドメインを有すると考えられる（Kolbinger, F.、前出および Hennet, T.他 (1998) J. Biol. Chem. 273 : 58-65）。マウス UDP-ガラクトース:β-N-アセチルグルコサミン β1,3-ガラクトシルトランスフェラーゼ-I 領域 8 内に見られる配列の変異体はまた、細菌のガラクトシルトランスフェラーゼの中にも存在し、この配列が-ガラクトシルトランスフェラーゼ配列モチーフを定義することを示している(Hennet, T. 前出)。
【００７１】
メチルトランスフェラーゼは薬理学的に重要な多様な過程に関与している。ニコチンアミドN-メチルトランスフェラーゼはニコチンアミドおよび他のピリジンのN−メチル化を触媒するが、これは薬物や他の外来化合物の細胞内処理における重要な段階である。フェニルエタノールアミンN-メチルトランスフェラーゼはノルアドレナリンからアドレナリンへの変換を触媒する。6-O-メチルグアニン-DNA メチルトランスフェラーゼは発癌の重要な段階であるDNA メチル化を逆転する。二つのメチル基の転移を触媒してS-アデノシル-L-メチオニンからウロポルフィリノーゲン IIIにするウロポルフィリン-IIIC-メチルトランスフェラーゼはコバラミンの生合成における最初の特異的酵素である。コバラミンは悪性貧血においてその取り込みが欠乏する食餌性酵素である。タンパク質-アルギニンメチルトランスフェラーゼはタンパク質におけるアルギニン残基の翻訳後メチル化を触媒し、グアニジノ基におけるアルギニンのモノメチル化やジメチル化を生じる。基質にはヒストン、ミエリン塩基タンパク質およびmRNA プロセッシング、スプライシングおよび輸送に関与する不均一核内リボ蛋白質（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins)がある。タンパク質-アルギニンメチルトランスフェラーゼは、分裂促進因子によって上方制御されるタンパク質、慢性リンパ性白血病に関与するタンパク質およびインターフェロンと相互作用するが、これはサイトカイン受容体シグナル伝達におけるメチル化の重要な役割を示唆している (Lin, W.-J. 他 (1996) J. Biol. Chem. 271:15034-15044、Abramovich, C. 他(1997) EMBO J. 16:260-266、及び Scott, H.S. 他 (1998) Genomics 48:330-340)。
【００７２】
ホスホトランスフェラーゼは高エネルギーリン酸基の転移を触媒し、エネルギー要求反応および放出性反応において重要である。代謝酵素のクレアチンキナーゼはクレアチン/クレアチンリン酸とATP/ADPとの間の可逆的リン酸転移を触媒する。グリコシアミンキナーゼはATP からグアニド酢酸へのリン酸の転移を触媒し、アルギニンキナーゼはATPからアルギニンへのリン酸転移を触媒する。システイン含有活性部位はこのファミリ (PROSITE: PDOC00103)で保存されている。
【００７３】
プレニルトランスフェラーゼは、イソプレニル基の転移を触媒する、αおよびβサブユニットからなるヘテロ二量体である。このグループの特に重要なメンバーはRas ファルネシルトランスフェラーゼ(FTase) 酵素であり、これはサイトゾルのファルネシルピロリン酸からRas発癌遺伝子タンパク質のカルボキシル末端のシステイン残基にファルネシル部分を転移する。この修飾はRasがシグナル伝達における役割を果たすことができるようにRas を細胞膜に固着するために必要である。FTase インヒビターはRas機能の遮断に有効であることが示されており、in vitro およびin vivo における抗腫瘍活性が実証されている（Buolamwini, J.K. (1999) Curr. Opin. Chem. Biol. 3:500-509）。FTase はゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ即ちRab GG トランスフェラーゼと構造的類似性を共有している。この酵素はRab タンパク質をプレニル化し、これによって、Rab タンパク質は小胞輸送の調節に関与することができる(Seabra, M.C. (1996) J. Biol. Chem. 271:14398-14404)。酵素パラ-ヒドロキシ安息香酸（ＰＨＢ）ポリプレニル2リン酸トランスフェラーゼは、電子伝達系の重要な成分であるユビキノンの合成におけるポリプレニル2リン酸とＰＨＢの凝縮を触媒する。
【００７４】
糖転移酵素(saccharyl transferases)は多様な代謝過程に関与するグリコシル化酵素である。例えば、オリゴ糖転移酵素（oligosacchryl transferase）-48は高度にグリコシル化された最終生成物の受容体である。これらの最終生成物の蓄積は糖尿病の血管性合併症、大血管の疾患、腎不全およびアルツハイマー病において見られる (Thornalley, P.J. (1998) Cell Mol. Biol. (Noisy-Le-Grand) 44:1013-1023)。
【００７５】
補酵素A (CoA) トランスフェラーゼは2つのカルボン酸間の CoA の転移を触媒する。例えば、スクシニルCoA:3オキソ酸CoA トランスフェラーゼはスクシニル-CoA からアセト酢酸のような受容体に CoA を転移する。アセト酢酸はケトン体の代謝に必須である。ケトン体は糖尿病のような代謝性疾患によって影響される組織に蓄積する(PROSITE: PDOC00980)。
【００７６】
NAD:アルギニンモノ-ADP-リボシルトランスフェラーゼは、NADから標的タンパク質上のアルギニンのグアニド基へのADP-リボースの転移を触媒する。これらの酵素の基質は筋管内、および活性化したリンパ球内で同定されており、またαインテグリンサブユニットを含む。これらのタンパク質は、NAD結合およびADPリボース転移に関与する特徴的ドメイン群を有し、そのドメインとしては酵素活性に必要とされるカルボキシ末端の近くの酸性度の高い領域を含む(Moss, J. 他 (1999) Mol. Cell. Biochem. 193:109-113)。
【００７７】
ホスホリボシルトランスフェラーゼは、ホスホリボシルピロリン酸とアミンからのβ-n-5'-モノホスフェートの合成を触媒する。これらの酵素はプリンヌクレオチドおよびピリミジンヌクレオチドの生合成、並びにプリンおよびピリミジンの回収経路に関与している。例えば、酵素のヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ (HGPRT) はプリン回収酵素であり、ヒポキサンチンおよびグアニンの各々のモノヌクレオチドへの変換を触媒する。HGPRT は偏在性であり、「ハウスキーピング」遺伝子として知られており、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応の内部コントロールとしてしばしば用いられる。HGPRT ファミリのすべてのメンバーの中で保存され、プリン塩基のホスホリボシル化に重要なセリン-チロシンジペプチドがある(Jardim, A. and Ullman, B. (1997) J. Biol. Chem. 272:8967-8973)。HGPRTの部分的欠損は尿酸の過剰生産につながり、重症な痛風を生じることがある。HGPRTが無い場合は、高尿酸血症、精神遅滞、舞踏病アテトーシスおよび強迫性自傷症を特徴とするレッシュ‐ナイハン症候群を生じる(Sculley, D.G. 他 (1992) Hum. Genet. 90:195-207)。多くの寄生生物はプリンを新たに合成することができず、プリンヌクレオチド合成の回収経路の酵素に頼らなければならないため、これらの酵素は寄生体感染の治療の標的となる可能性がある(Craig, S. P.およびEakin, A. R. (2000) J. Biol. Chem. 275:20231-20234)。
【００７８】
トランスグルタミナーゼ(Tgアーゼ)トランスフェラーゼは、タンパク質結合グルタミンからタンパク質結合リジン残基または他の一級アミンのε-アミノ基へのγ-カルボキシ基の転移を触媒することによってイソペプチド結合を形成できるCa2+ 依存性酵素である。TGアーゼは角化膜(CE)の架橋を担う酵素であり、CEは角質細胞の表面にある可溶性の高いタンパク質構造であるが、架橋により、化学的かつ機械的に耐性のあるタンパク質高分子になる。７種の既知のヒトTgアーゼが同定されている。個々のトランスグルタミナーゼ遺伝子生成物は第XIIIa因子のような特定のタンパク質または組織構造の架橋をするように特殊化されている。例えば第XIIIa因子は止血におけるフィブリン凝固を安定化し、前立腺トランスグルタミナーゼは精液凝固において作用し、組織トランスグルタミナーゼは受容体シグナル伝達においてGTP-結合に関与する。Tgアーゼ 1、2、3およびXの四つのTgアーゼは表皮のような最終的に分化している上皮において発現される。Tgアーゼは、先天性魚鱗癬と呼ばれるある種の皮膚疾患を患う患者の病理に見られるように、角化膜の適切な架橋のために重要である。先天性魚鱗癬はケラチン生成細胞トランスグルタミナーゼ (TGK)遺伝子の突然変異に関連する(Nemes, Z. 他 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96:8402-8407、Aeschlimann, D. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:3452-3460)。
【００７９】
リアーゼ
リアーゼは、２分子を形成するために、加水分解や酸化せずにC-C、C-O、C-N、C-S、C-(ハロゲン化合物)、P-Oあるいは他の結合の切断を触媒する酵素のクラスであり、その２分子の少なくとも1つは二重結合を含んでいる(Stryer, L. (1995) Biochemistry, W.H. Freeman and Co., New York NY, 620ページ)。酵素の国際的な分類(Webb, E.C. (1992) Enzyme Nomenclature 1992: Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology on the Nomenclature and Classification of Enzymes, Academic Press, San Diego CA)の下で、リアーゼは酵素番号の最初の桁が数字４で名付けられる（即ちEC 4.x.x.x）固有のクラスを形成する。
【００８０】
リアーゼのさらに細かい分類は、切断した分子基の性質だけでなく切断した結合のタイプを反映している。C-Cリアーゼのグループには、カルボキシル・リアーゼ（デカルボキシラーゼ）、アルデヒド・リアーゼ（アルドラーゼ）、オキソ酸リアーゼとその他のリアーゼが含まれる。C-Oリアーゼのグループには、多糖に作用するリアーゼであるヒドロリアーゼや他のリアーゼが含まれる。C-Nリアーゼのグループには、アンモニアリアーゼ、アミジンリアーゼ、アミンリアーゼ（デアミナーゼ）その他のリアーゼが含まれる。リアーゼは細胞生化学の重要な成分であり、脂肪酸代謝、トリカルボン酸回路や他の多様な酵素プロセス等の代謝エネルギー生産において役割を果たしている。
【００８１】
1つの重要なリアーゼのファミリーは、炭酸デヒドラターゼとも呼ばれる炭酸脱水酵素(CA)であり、H2O + CO2  → HCO3 -  + H+反応における二酸化炭素の水和を触媒する。このタンパク質の表面下約15Åにあり、深い裂け目に位置し、3つのHis残基のイミダゾール基に配位される亜鉛イオンにより、ＣＡはこの反応を106を超える割合で加速する。亜鉛イオンに結合する水は、急速にHCO3 に変換される。
【００８２】
炭酸脱水酵素の8つの、酵素的そして進化的に関連する形態が、現在ヒトに存在することが知られている：3つのサイトゾルイソ酵素(CAI、CAII、CAIII)、2つの膜結合型(CAIV、CAVII)、ミトコンドリア型(CAV)、分泌唾液型(CAVI)、まだ特徴付けられていないイソ酵素である(Prosite PDOC00146Eukaryotic-type carbonic anhydrases signature)。イソ酵素CAI、CAIIとウシCAIIIは類似の二次構造とポリペプチド鎖折り畳みを有するが、CAIは6-トリプトファン、CAIIは7-トリプトファン、CAIIIは8-トリプトファンを有する(Boren, K. 他. (1996) Protein Sci. 5:2479-2484)。CAIIは哺乳動物の脳の主要なCAイソ酵素である。
【００８３】
CAは、pH調節、CO2及びHCO3輸送、イオン輸送、水分と電解質バランスを含む多様な生理的プロセスに関与する。例えばCAIIは、骨を再吸収する区画を酸性化するH+を分泌する破骨細胞に、また、胃壁細胞や尿細管細胞によるH+ 分泌に寄与する。更にCAIIは膵管細胞、毛様体上皮組織、脈絡叢、唾液腺腺房細胞、遠位結腸上皮組織によるHCO3 分泌を促進する。それにより膵液、房水、脳脊髄液、唾液の生成に関与すると共に、電解質と水分のバランスに寄与する。CAIIは腎臓の近位尿細管、赤血球、肺におけるCO2交換をも促進する。CAIVは幾つかの組織において役割を果たす。：腎臓においてHCO3の再吸収を促進する；脳、骨格筋、心筋等の組織におけるCO2流動を促進する；血液中から肺の肺胞へのCO2交換を促進する。CAVIはCAIIと共に唾液のpH調節におそらく関与する。また食道と胃での保護効果を有し得るミトコンドリアのCAVは、糖新生と尿生成の経路へのCAのインヒビター効果に基づいてこれらにおいて重要な役割を果たすように思われる(Sly, W.S及び Hu, P.Y. (1995) Ann. Rev. Biochem. 64:375-401)。
【００８４】
多数の疾患状態が、CA活性の変化によって特徴付けられる。CAIIの欠損を引き起こすCAIIにおける突然変異は、尿細管性アシドーシスを伴う骨石化症の原因である(Online Medelian Inheritance in Man 259730 Osteopetrosis with Renal Tubular Acidosis)。脳脊髄液(CSF)におけるCAIIの濃度は、脳損傷の患者の疾患作用を特徴付けるように思われる。高いCA濃度が脳梗塞を患う患者に観察された。一過性脳虚血発作、多発性硬化症あるいは癲癇を患う患者のCAIIの濃度は、通常正常な範囲であるが、中枢神経系感染、痴呆あるいは三叉神経痛の患者にはCSFにおいて高いレベルのCAIIが観察されてきた(Parkkila, A.K. 他 (1997) Eur. J. Clin. Invest. 27:392-397)。非腫瘍性対照は、大腸陰窩の上半分に並んだ円柱細胞の細胞質にCAIとCAIIを示すが、大腸腺腫と腺癌はＣＡに対して染色しないことが観察されてきた。腫瘍は、正常な陰窩の基底に並ぶ、それほど成熟していない細胞に類似の染色パターンを示す(Gramlich T.L.他 (1990) Arch. Pathol. Lab. Med. 114:415-419)。
【００８５】
多数の疾患における治療は、CA活性を変更することを伴う。アセタゾールアミド等のＣＡインヒビターが緑内障(Stewart, W.C. (1999) Curr. Opin. Opthamol. 10:99-108)、本態性振戦とパーキンソン病(Uitti, R.J. (1998) Geriatrics 53:46-48, 53-57)、間欠性運動失調(Singhvi, J.P. 他. (2000) Neurology India 48:78-80)、高度と関連する疾患(Klocke, D.L. 他 (1998) Mayo Clin. Proc. 73:988-992) の治療において使用される。
【００８６】
CA活性は、酵素が生理学的変化に対して比較的ゆっくり反応するので、長期の疾患状態の指標として特に有用である。甲状腺亢進症のグレーブス病ではCAI濃度と亜鉛濃度の下降(Yoshida, K. (1996) Tohoku J. Exp. Med. 178:345-356)、糖尿病ではグリコシル化CAI(Kondo, T. 他 (1987) Clin. Chim. Acta 166:227-236)が観察される。正の相関性がCAI、CAII反応性と子宮内膜症の間で観察される(Brinton, D.A他 (1996) Ann. Clin. Lab. Sci. 26:409-420、D'Cruz, O.J. 他 (1996) Fertil. Steril. 66:547-556)。
【００８７】
リアーゼのファミリーの別の重要なメンバーは、ポリアミン生合成における初期律速酵素であるオルニチンデカルボキシラーゼ(ODC)である。ODCは、L-オルニチン→ プトレッシン+CO2反応におけるオルニチンからプトレッシンへの転換を触媒する。ポリアミンは、プトレッシン、および続く代謝経路の生成物であるスペルミジンとスペルミンを含み、ＤＮＡ合成、細胞分化、増殖に不可決な遍在性細胞構成成分である。したがってポリアミンは腫瘍増殖において重要な役割を果たす(Medina, M.A. 他 (1999) Biochem. Pharmacol. 57:1341-1344)。
【００８８】
ODCは、ホモ二量体として活性であるピリドキサル-5−リン酸(PLP)依存性酵素である。保存した残基には、PLP結合部位での残基と基質結合領域の一部と思われるグリシン残基の区間が含まれる(Prosite PDOC00685 Orn/DAP/Arg decarboxylase family 2 signatures)。哺乳動物のODCは、PEST領域（細胞内分解のためのシグナルとして作用するプロリン、グルタミン酸、セリン、トレオニン残基がリッチな配列断片）をも含む(前出のMedina)。
【００８９】
多くの化学発癌物質と腫瘍プロモータがODCレベルと活性を上昇させる。複数の既知の発癌遺伝子が、ODC遺伝子の転写を促進することによりＯＤＣレベルを上昇させる。また超高レベルで発現する時、ＯＤＣ自体が発癌遺伝子として作用する可能性がある。高レベルのＯＤＣが多数の前癌症状で見出される。またＯＤＣレベルの上昇が腫瘍促進化合物のためのスクリーニングの一部として使用される(Pegg, A.E. 他 (1995) J. Cell. Biochem. Suppl. 22:132-138)。
【００９０】
動物モデルとヒトの臨床試験において腫瘍を治療するためにODCのインヒビターが使用されている。膀胱、脳、食道、胃腸管、肺、口腔、乳腺、胃、皮膚、気管の腫瘍の発達を抑制することを示してきた(前出Pegg、McCann, P.P及びPegg, A.E. (1992) Pharmac. Ther. 54:195-215)。ODCは化学防御のための標的としても有望である(前出Pegg)。ODCインヒビターは、アフリカトリパノゾーマ、マラリア、ニューモシスティスカリニ属による感染を治療するためにも使用されている。また狼瘡とリウマチ様関節炎等の自己免疫性疾患の治療のために潜在的に有用である(前出McCann)。
【００９１】
ピリドキサル依存性デカルボキシラーゼの別のファミリーは、グループIIデカルボキシラーゼである。このファミリーには、グルタミン酸から神経伝達物質GABAへの脱炭酸反応を触媒するグルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)、ヒスチジンからヒスタミンへの脱炭酸反応を触媒するヒスチジンデカルボキシラーゼ(HDC)、トリプトファンからトリプタミンへの脱炭酸反応を触媒し、また5-ヒドロキシ-トリプトファンとジヒドロキシフェニルアラニン(L-dopa)にも作用する芳香族L-アミノ酸脱炭酸酵素(DDC)（L-ドーパ脱炭酸酵素またはトリプトファン・デカルボキシラーゼとしても知られる）、システインからのタウリンの合成における律速酵素であるシステインスルフィン酸脱炭酸酵素(CSD)が含まれる(PROSITE PDOC00329 DDC/GAD/HDC/TyrDC ピリドキサルリン酸付着部位)。タウリンは脳内の豊富なスルホン基アミノ酸（sulfonic amino acid）であり、脳細胞内で浸透圧調節器として作用すると思われる(Bitoun, M.及びTappaz, M. (2000) J. Neurochem. 75:919-924)。
【００９２】
TNFα処理
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）は、炎症誘発性のサイトカインである。それは、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、反応性酸素中間体、ホスホリパーゼ、プロテアーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、転写因子等の多様な媒介により、免疫調節と炎症反応を仲介する。TNFα関連サイトカインは、異なる細胞表面受容体(TNFR)との相互作用を通して、分化、増殖、細胞死、及び核因子-κB (NF-κB)の活性化等の細胞応答を引き起こす(Smith, C.A. 他. (1994) Cell 76:959-962)。NF-κBは、損傷と感染への反応等の生理的プロセスに関係する遺伝子群を誘発する転写因子である(NF-κB活性化経路におけるTNF-αを概観するために、Bowie 及びO'Neill (2000) Biochem Pharmacol 59:13-23を参照)。
【００９３】
TNAαは、虚血後再灌流、急性および慢性炎症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、慢性低血圧症等の事象により内皮が物理的に破壊または機能的に乱された場合上方制御される。炎症刺激は後の組織修復のための段階を整える。上昇したＴＮＦαは、プロテインチロシンキナーゼ(PTKase)、プロテインチロシンホスファターゼ等の多数の重要な酵素の活性を最初に増加して、次いで阻害する(Holden, R.J. 他. (1999) Med. Hypotheses 52:319-23)。
【００９４】
アテローム性動脈硬化症の発生には、循環リポタンパク質によって誘発された炎症応答が関係する。低密度リポタンパク質(LDL)等のリポタンパク質は、血管内膜の細胞外空間に蓄積して、LDLからOxーLDLへの酸化等の修飾を受けるが、修飾は、循環抗酸化剤防御の効果が少ないサブ内皮空間で最も激しい。。単核食細胞は内膜に入り、マクロファージに分化して、Ox-LDL等の修飾した脂質を取り込む。Ox-LDL取り込み中、マクロファージはインターロイキン-1と成長因子(例えばM-CSF、VEGF、PDGF-BB)や、TNF-α等のサイトカインを生成する。それらはさらに平滑筋細胞増殖と、血管上皮による細胞外マトリクスの生成等の、アテローム発生における事象を誘発する。これらのマクロファージは、スーパーオキシドジスムターゼ(SOD)とIL-8とICAM-1とを含む、炎症と組織分化に関係する、内皮内と平滑筋組織内の遺伝子を活性化させ得る。
【００９５】
非アテローム性血管上皮は血管拡張を仲介するだけでなく、血小板粘着と活性化を妨げ、トロンビン形成を阻止し、繊維素沈着を緩和する。さらに炎症性白血球の付着と遊出を軽減する。内皮が物理的に破壊される、あるいは虚血後再灌流、急性および慢性炎症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、慢性動脈高血圧等の事象により乱される時に、この上皮は反対の方法で作用する。乱された、あるいは炎症誘発性状態は、血管収縮、血小板と白血球との活性化および粘着(例えば、フォンウィルブランド因子、血小板活性化因子、P−セレクチン、ICAM-1、IL-8、MCP-1、TNF-αの外面化、発現および上方制御に関する)、トロンビン形成の促進、血管壁のフィブリンの凝固と沈着（組織因子、PAI-1、ホスファチジルセリンの発現）、そして血小板-白血球共凝集体における血小板CD40リガンドの内皮、単球、およびB細胞CD40への付着による付加的な炎症相互作用で特徴付けられる。トロンビン形成と炎症刺激は、後の組織修復のための段階を整えるが、機能を障害した血管内皮の凝血促進（procoagulatory）、プロトロンビン性（prothrombotic）作用の限定は、臨床介入の目標となり得る(概説はBecker 他. (2000) Z Kardiol 89:160-167を参照のこと)。
【００９６】
新規の酵素およびそれらをコードするポリヌクレオチドの発見により、新規の組成物を提供することで当分野の要望に応えることができる。これらの新規の組成物は、免疫系の疾患、免疫不全、発達障害、代謝障害、平滑筋障害、神経の疾患、肺の疾患、寄生体感染、および癌を含む細胞増殖異常の診断・予防・治療において有用であり、また酵素の核酸配列及びアミノ酸配列の発現における外因性化合物の影響についての評価にも有用である。
【発明の開示】
【発明の効果】
【００９７】
本発明は、総称して「NZMS」、個別にはそれぞれ「NZMS-1」、「NZMS-2」、「NZMS-3」、「NZMS-4」、「NZMS-5」、「NZMS-6」、「NZMS-7」、「NZMS-8」、「NZMS-9」、「NZMS-10」、及び「NZMS-11」と呼ぶ酵素である精製されたポリペプチドを提供する。或る態様において本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％が同一である天然のアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択した単離されたポリペプチドを提供する。一態様では、SEQ ID NO:1-11のアミノ酸配列からなる単離されたポリペプチドを提供する。
【００９８】
また、本発明は（ａ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を持つ或る天然アミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチドを提供する。一態様では、該ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るポリペプチドをコードする。別の態様では、ポリヌクレオチドはSEQ ID NO:12-22からなる群から選択される。
【００９９】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片からなる群から選択したポリペプチドをコードするようなポリヌクレオチドと機能的に連結したプロモーター配列を有する組換えポリヌクレオチドを提供する。一態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞を提供する。別の態様では、本発明は組換えポリヌクレオチドを含む遺伝形質転換体を提供する。
【０１００】
また、本発明は、（ａ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90%が同一である天然のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片から構成される群から選択したポリペプチドを製造する方法を提供する。製造方法は、（ａ）組換えポリヌクレオチドを用いて形質転換した細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養する過程と、（ｂ）そのように発現したポリペプチドを回収する過程とを有し、組換えポリヌクレオチドはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結したプロモーター配列を有する。
【０１０１】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドに特異結合する、単離された抗体を提供する。
【０１０２】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:12-22からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:12-22からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物からなる群から選択された単離されたポリヌクレオチドを提供する。一態様では、ポリヌクレオチドは少なくとも60の連続したヌクレオチドを有する。
【０１０３】
本発明は更に、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは（ａ）SEQ ID NO:12-22からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO:12-22からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性を有する天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、または（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物を含む群から選択されたポリヌクレオチドの配列を有する。検出方法は、（ａ）サンプル中の上記標的ポリヌクレオチドに相補的な或る配列からなる少なくとも２０の連続したヌクレオチド群からなる或るプローブを用いて該サンプルをハイブリダイズする過程と、（ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体の有無を検出し、複合体が存在すればオプションでその量を検出する過程からなる。該プローブと該標的ポリヌクレオチドあるいはその断片との間でハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プローブは、該標的ポリヌクレオチドに対し特異的にハイブリダイズする。一態様では、プローブは少なくとも60の連続したヌクレオチド群からなる。
【０１０４】
本発明はまた、サンプル中の標的ポリヌクレオチドを検出する一方法を提供する。ここで、標的ポリヌクレオチドは、（ａ）SEQ ID NO：12-22からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｂ）SEQ ID NO：12-22からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列との少なくとも９０％の同一性を有する天然ポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ｃ）（ａ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（ｄ）（ｂ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、および（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のRNA等価物、からなる群から選択した、或るポリヌクレオチドの配列を有する。検出方法は、（ａ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅を用いて標的ポリヌクレオチドまたはその断片を増幅する過程と、（ｂ）増幅した標的ポリヌクレオチドまたはその断片の存在・不存在を検出し、該標的ポリヌクレオチドまたはその断片が存在する場合にはオプションでその量を検出する過程を含む。
【０１０５】
本発明は更に、有効量のポリペプチドと薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。有効量のポリペプチドは、（ａ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％の同一性を有する天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列の免疫原性断片からなる群から選択される。一実施例では、SEQ ID NO:1-11からなる一群から選択されたアミノ酸配列を含む組成物を提供する。更に、本発明は、患者にこの組成物を投与することを含む、機能的NZMSの発現の低下に関連した疾患やその症状の治療方法を提供する。
【０１０６】
本発明はまた、（ａ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも90％の同一性を有する天然アミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列を持つポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアゴニストとしての有効性を確認するために、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを有するサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアゴニスト活性を検出する過程からなる。別法では、本発明は、この方法で同定したアゴニスト化合物と許容される医薬用賦形剤とを有する、或る組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、機能的NZMSの発現の低下に関連した疾患や症状の治療を要する患者への該組成物の投与を含む治療方法を提供する。
【０１０７】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列との少なくとも90％の同一性を有する天然アミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択したポリペプチドのアンタゴニストとしての有効性につき、或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドを含むサンプルを或る化合物に曝す過程と、（ｂ）サンプル中のアンタゴニスト活性を検出する過程からなる。別法で本発明は、この方法によって同定したアンタゴニスト化合物と薬剤として許容できる賦形剤とを含む組成物を提供する。更なる別法では、本発明は、機能的NZMSの過剰発現に関連した疾患や症状の治療を要する患者への該組成物の投与を含む治療方法を提供する。
【０１０８】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列と少なくとも90％が同一である天然のアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、または（ｄ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片を含む群から選択されたポリペプチドに特異結合する化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）ポリペプチドを適切な条件下で少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、（ｂ）試験化合物とのポリペプチドの結合を検出し、それによってポリペプチドに特異結合する化合物を同定する過程とを含む。
【０１０９】
本発明は更に、（ａ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｂ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択したアミノ酸配列との少なくとも９０％の同一性を有する或る天然アミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｃ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの生物学的活性断片、および（ｄ）SEQ ID NO:1-11からなる群から選択した或るアミノ酸配列を有するポリペプチドの免疫原性断片、からなる群から選択した或るポリペプチドの活性を調節する或る化合物をスクリーニングする方法を提供する。スクリーニング方法は、（ａ）該ポリペプチドの活性にとり許容し得る条件下で、該ポリペプチドを少なくとも１つの試験化合物と混合する過程と、（ｂ）該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の存在下で算定する過程と、（ｃ）この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性をこの試験化合物の不存在下での該ポリペプチドの活性と比較する過程からなり、この試験化合物の存在下での該ポリペプチドの活性の変化は、該ポリペプチドの活性を調節する化合物を標示する。
【０１１０】
更に本発明は、SEQ ID NO:12-22からなる群から選択した或るポリヌクレオチド配列を含む標的ポリヌクレオチドの発現を改変する効果につき、或る化合物をスクリーニングする一方法を提供する。この方法は、（ａ）この標的ポリヌクレオチドを有するサンプルを或る化合物に曝露する過程と、（ｂ）この標的ポリヌクレオチドの発現の改変を検出する過程と、（ｃ）可変量のこの化合物の存在下でのこの標的ポリヌクレオチドの発現と、この化合物の不在下での発現とを比較する過程とからなる。
【０１１１】
本発明は更に、（ａ）核酸を含む生物学的サンプルを試験化合物で処理する過程と、（ｂ）（i）SEQ ID NO:12-22を有する群から選択したポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:12-22を有する群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90％が同一である天然のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、（iii）（i）に相補的な配列を有するポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物を含む群から選択したポリヌクレオチドの少なくとも20の連続したヌクレオチドから構成されるプローブを用いて、処理した生物学的サンプルの核酸をハイブリダイズする過程とを含む試験化合物の毒性の算定方法を提供する。ハイブリダイゼーションは、上記プローブと生物学的サンプル中の標的ポリヌクレオチドの間に特定のハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で発生し、上記標的ポリヌクレオチドは、（i）SEQ ID NO:12-22からなる群から選択したポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（ii）SEQ ID NO:12-22からなる群から選択したポリヌクレオチド配列と少なくとも90％が同一である天然のポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、（iii）（i）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（iv）（ii）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、（v）（i）〜（iv）のRNA等価物を含む群から選択する。或いは、標的ポリヌクレオチドは、上記（i）〜（v）からなる群から選択したポリヌクレオチド配列の断片を有する。毒性の算定方法には更に、（ｃ）ハイブリダイゼーション複合体の量を定量する過程と、（ｄ）処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量を、非処理の生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量と比較する過程を含み、処理した生物学的サンプルのハイブリダイゼーション複合体の量の差は、試験化合物の毒性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１２】
（本発明の記載について）
本発明のタンパク質、ヌクレオチド配列及び方法について説明するが、その前に、説明した特定の装置、材料及び方法に本発明が限定されるものではなく、改変し得ることを理解されたい。また、ここで使用する専門用語は特定の実施例を説明する目的で用いたものに過ぎず、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではないことも併せて理解されたい。
【０１１３】
請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」は複数の宿主細胞を含み、「或る抗体」には複数の抗体が含まれ、当業者には周知の等価物なども含まれる。
【０１１４】
本明細書中で用いる全ての技術用語及び科学用語は、特に定義されている場合を除き、当業者に一般に理解されている意味と同じ意味を有する。本明細書で説明するものと類似あるいは同等の任意の装置、材料及び方法を用いて本発明の実施または試験を行うことができるが、ここでは好適な装置、材料、方法について説明する。本発明で言及する全ての刊行物は、刊行物中で報告されていて且つ本発明に関係して用い得る、細胞株、プロトコル、試薬及びベクターについて説明及び開示する目的で引用しているものである。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【０１１５】
（定義）
用語「NZMS」は、天然、合成、半合成或いは組換え体など任意の供給源からの、全ての種（特にウシ、ヒツジ、ブタ、ネズミ、ウマ及びヒトを含む哺乳動物）から得られる実質的に精製されたNZMSのアミノ酸配列を指す。
【０１１６】
用語「アゴニスト」は、NZMSの生物学的活性を強化または模倣する分子を指す。アゴニストの例としては、NZMSと直接相互作用することによって、或いはNZMSが関与する生物学的経路の構成要素に作用することによってNZMSの活性を調節する、タンパク質、核酸、糖質、小分子その他の任意の化合物や組成物を含みうる。
【０１１７】
用語「対立遺伝子変異体（または変異配列）」は、NZMSをコードする遺伝子の別の形を指す。対立遺伝子変異体は、核酸配列における少なくとも１つの突然変異から生じ得る。また、変容したRNAまたはポリペプチドを生じ得る。そのポリペプチドの構造または機能は、変容することもしないこともある。或る遺伝子は、その天然型の対立遺伝子変異配列を全く持たない場合もあり、１個以上持つこともある。対立遺伝子変異配列を生じさせる通常の突然変異性変化は一般に、ヌクレオチドの自然な欠失、付加または置換に帰するものである。これら各種の変化は、単独であるいは他の変化と共に、或る配列内で１回以上、生じ得る。
【０１１８】
NZMSをコードする「変容した／改変された」核酸配列としては、様々なヌクレオチドの欠失、挿入、或いは置換を持つ結果、NZMSと同じポリペプチド或いはNZMSの機能特性の少なくとも１つを備えるポリペプチドを生じる配列を含む。この定義には、NZMSをコードするポリヌクレオチド配列にとり正常な染色体の遺伝子座ではない位置での、対立遺伝子変異配列群への不適当あるいは予期しないハイブリダイゼーションを含み、また、NZMSをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチドプローブを用いて容易に検出可能な或いは検出困難な多形性を含む。コードされるタンパク質も「変容する／改変される」ことがあり、また、サイレント変化を生じた結果、機能的に等価なNZMSとなるような、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を持ち得る。意図的なアミノ酸置換は、生物学的或いは免疫学的にNZMSの活性が保持される範囲で、残基の、極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性についての、類似性に基づいて成され得る。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンがある。親水性値が近似した非荷電極性側鎖を持つアミノ酸には、アスパラギンとグルタミン、セリンとトレオニンがある。親水性値が近似した非荷電側鎖を持つアミノ酸には、ロイシンとイソロイシンとバリン、グリシンとアラニン、フェニルアラニンとチロシンがある。
【０１１９】
用語「アミノ酸」及び「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列、或いはそれらの任意の断片を指し、天然の分子及び合成分子を含む。「アミノ酸配列」が天然のタンパク質分子の配列を指す場合、「アミノ酸配列」及び類似の用語は、アミノ酸配列を記載したタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定するものではない。
【０１２０】
「増幅」は、核酸配列の付加的複製物を作製することに関連する。増幅は通常、当業者によく知られたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて行う。
【０１２１】
「アンタゴニスト」の語は、NZMSの生物学的活性を阻害或いは弱める分子を指す。アンタゴニストとしては、NZMSと直接に相互作用するか或いはNZMSが関与する生物学的経路の諸成分に作用してNZMSの活性を調節する、抗体などのタンパク質、核酸、糖質、小分子、任意の他の化合物や組成物を含み得る。
【０１２２】
「抗体」の語は、抗原決定基と結合することができる、無傷の免疫グロブリン分子やその断片、例えばFaｂ、F(ab')2 及びFv断片を指す。NZMSポリペプチドを結合する抗体は、免疫抗原として、無傷ポリペプチド群を用いて、または、当該の小ペプチド群を有する断片群を用いて作製可能である。動物（マウス、ラットあるいはウサギ等）を免疫化するために用いるポリペプチドまたはオリゴペプチドの由来は、RNAの翻訳の場合や、または化学合成があり得る。また、それらは所望により、キャリアタンパク質に抱合することも可能である。通常用いられるキャリアであってペプチドと化学結合するものは、ウシ血清アルブミン、サイログロブリン及びスカシガイのヘモシアニン（KLH）等がある。結合したこのペプチドは、前記動物を免疫化するために用いる。
【０１２３】
用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する、分子の領域（即ちエピトープ）を指す。タンパク質またはタンパク質断片を用いて宿主動物を免疫化する場合、タンパク質の多数の領域が、抗原決定基（タンパク質の特定の領域または３次元構造）に特異結合する抗体の産生を誘導し得る。或る抗原決定基は、或る抗体への結合について、無損傷抗原（即ち免疫応答を誘導するために用いられる免疫原）と競合し得る。
【０１２４】
用語「アプタマー」は、特定の分子標的に結合する核酸またはオリゴヌクレオチド分子を指す。アプタマーはin vitroの進化過程（例えば米国特許番号第5,270,163号に記載されたSELEX（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment））から由来するもので、そのような過程は大きな組み合わせライブラリから標的特異的なアプタマー配列を選択する。アプタマー組成は、２本鎖または１本鎖であってもよく、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチド誘導体、または他のヌクレオチド様分子を含み得る。アプタマーのヌクレオチド成分は、修飾された糖基（例えばリボヌクレオチドの2'-OH基が2'-Fまたは2'-NH2で置換し得る）を有することが可能で、そのような糖基はヌクレアーゼへの抵抗性または血液中でのより長い寿命など、所望の特性を向上し得る。循環系からアプタマーが除去される速度を遅くするために、アプタマーを他の分子（例えば高分子量のキャリア）に抱合させることができる。アプタマー類は、例えば或る架橋剤の光活性化によって、それらの同種リガンド群と特異的に架橋させ得る（Brody, E.N.及びL. Gold (2000) J. Biotechnol. 74:5-13等を参照）。
【０１２５】
「イントラマー（intramer）」の用語はin vivoで発現されるアプタマーを意味する。例えば、ワクシニアウイルスに基づく或るRNA発現系を用いて、白血球の細胞質内で特定のRNAアプタマー類が高レベルに発現されている（Blind, M.他 (1999) Proc. Natl Acad. Sci. USA 96:3606-3610）。
【０１２６】
「スピーゲルマー（spiegelmer）」の語はＬ-ＤＮＡ、Ｌ-ＲＮＡその他の左旋性ヌクレオチド誘導体またはヌクレオチド様分子を含むアプタマーを指す。左旋性のヌクレオチドを含むアプタマーは右旋性ヌクレオチド群を持つ基質に通常は作用する、天然酵素による分解に対して耐性がある。
【０１２７】
用語「アンチセンス」は、特定の核酸配列の「センス」（コーディング）鎖と塩基対を形成し得る任意の組成物を指す。アンチセンス組成物としては、DNAや、RNAや、ペプチド核酸（PNA）や、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸またはベンジルホスホン酸等の修飾されたバックボーン結合を有するオリゴヌクレオチドや、2'-メトキシエチル糖または2'-メトキシエトキシ糖等の修飾された糖基を有するオリゴヌクレオチドや、或いは5-メチルシトシン、2-デオキシウラシルまたは7-デアザ-2'-デオキシグアノシン等の修飾された塩基を有するオリゴヌクレオチドを含みうる。アンチセンス分子は、化学合成または転写を含む任意の方法で製造することができる。相補的アンチセンス分子は、ひとたび細胞に導入されたら、細胞が産生した天然核酸配列との塩基対を形成し、転写または翻訳を妨害する二重鎖を形成する。「負」または「マイナス」という表現は、ある参考ＤＮＡ分子のアンチセンス鎖を意味し、「正」または「プラス」という表現は、ある参考ＤＮＡ分子のセンス鎖を意味しうる。
【０１２８】
用語「生物学的に活性」は、天然分子の構造的、調節的、或いは生化学的な機能を有するタンパク質を指す。同様に、用語「免疫学的に活性」または「免疫原性」は、天然或いは組換え体のNZMS、合成のNZMSまたはそれらの任意のオリゴペプチドが、適当な動物或いは細胞の特定の免疫応答を誘発して特定の抗体と結合する能力を指す。
【０１２９】
「相補」は、塩基対合によってアニールする２つの一本鎖核酸配列間の関係を指す。例えば、配列「5'-AGT-3'」は、その相補配列「3'-TCA-5'」との対を形成する。
【０１３０】
「〜のポリヌクレオチド配列を含む(有する)組成物」または「〜のアミノ酸配列を含む(有する)組成物」は広い意味で、所定のポリヌクレオチド配列若しくはアミノ酸配列を含む任意の組成物を指す。この組成物には、乾燥製剤または水溶液が含まれ得る。NZMS若しくはNZMSの断片をコードするポリヌクレオチド配列を含む組成物は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。このプローブは、凍結乾燥状態で保存可能であり、糖質などの安定化剤と結合させることも可能である。ハイブリダイゼーションにおいては、塩（例えばNaCl）、界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム；SDS）及びその他の構成成分（例えばデンハート液、粉乳、サケ精子DNA等）を含む水溶液中にプローブを分散させることができる。
【０１３１】
「コンセンサス配列」は、不要な塩基を分離するためにDNA配列の解析を繰り返し行い、XL-PCRキット（Applied Biosystems, Foster City CA）を用いて５'及び／または３'の方向に伸長され、再度シークエンシングされた核酸配列、またはGELVIEW 断片構築システム（GCG, Madison, WI）またはPhrap (University of Washington, Seattle WA)等の断片構築用のコンピュータプログラムを用いて１つ或いはそれ以上のオーバーラップするcDNAやEST、またはゲノムDNA断片から構築された核酸配列を指す。伸長及び構築の両方を行ってコンセンサス配列を産生した配列もある。
【０１３２】
「保存的なアミノ酸置換」は、元のタンパク質の特性を殆ど変えないと予測される置換を指す。即ち、置換によってそのタンパク質の構造や機能が大きくは変わらず、そのタンパク質の構造、特にその機能が保存される。下表は、タンパク質中で元のアミノ酸と置換され得るアミノ酸であり、保存的アミノ酸置換と認められるアミノ酸を示している。
2004520832.tif 000002
【０１３３】
保存アミノ酸置換では通常、（ａ）置換領域におけるポリペプチドのバックボーン構造、例えばβシートやα螺旋構造、（ｂ）置換部位における分子の電荷または疎水性、及び／または（ｃ）側鎖の大部分を保持する。
【０１３４】
「欠失」は、１個以上のアミノ酸残基が欠如するアミノ酸配列の変化、或いは１個以上のヌクレオチドが欠如する核酸配列の変化を指す。
【０１３５】
用語「誘導体」は、化学修飾されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。例えば、アルキル基、アシル基、ヒドロキシル基またはアミノ基による水素の置換は、ポリヌクレオチド配列の化学修飾に含まれ得る。ポリヌクレオチド誘導体は、天然分子の生物学的または免疫学的機能を少なくとも１つは保持しているポリペプチドをコードする。ポリペプチド誘導体は、グリコシル化、ポリエチレングリコール化（pegylation）、或いは任意の同様なプロセスであって、誘導起源のポリペプチドの少なくとも１つの生物学的若しくは免疫学的機能を保持するプロセスによって、修飾されたポリペプチドである。
【０１３６】
「検出可能な標識」は、測定可能な信号を発生し得る、ポリヌクレオチドやポリペプチドに共有結合或いは非共有結合するレポーター分子または酵素を指す。
【０１３７】
「差次的発現」は、少なくとも2つの異なったサンプルを比較することによって決められる、増加（上方調節）、あるいは減少（下方調節）、または欠損した、遺伝子またはタンパク質の発現を指す。このような比較は例えば、処理済サンプルと不処理サンプル、または病態のサンプルと正常サンプルの間で行われ得る。
【０１３８】
「エキソンシャッフリング」は、異なるコード領域（エキソン）の組換えを意味する。1つのエキソンはコードされるタンパク質の1つの構造的または機能的ドメインを代表し得るため、安定した基礎構造群の新規な再構築(reassortment)を介して新しいタンパク質が組立てられることが可能であり、これにより新しいタンパク質機能の進化を促進できる。
【０１３９】
「断片」は、NZMSまたはNZMSをコードするポリヌクレオチドの固有部分であって、親配列と同一配列であるが親配列よりも長さが短い配列を指す。断片は、定義された配列の全長から１ヌクレオチド／アミノ酸残基を差し引いた長さよりも短い長さを有し得る。例えば、或る断片は、５〜１０００の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有し得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、或いはその他の目的のために用いられる断片は、少なくとも5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250若しくは５００の連続したヌクレオチド或いはアミノ酸残基の長さであり得る。断片は、分子の特定領域から選択的に選択し得る。例えば、ポリペプチド断片は、定義された或る配列内に見られるようなポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（または最初の２５％または５０％）から選択された或る長さの連続したアミノ酸を有し得る。これらの長さは明らかに例として挙げているものであり、本発明の実施例では、配列表、表及び図面を含む明細書に裏付けされた任意の長さであってよい。
【０１４０】
SEQ ID NO:12-22の断片は、例えば、この断片を得たゲノム内の他の配列とは異なる、SEQ ID NO:12-22を特異的に同定する固有のポリヌクレオチド配列の領域を含む。SEQ NO ID:12-22の断片は、例えば、ハイブリダイゼーション及び増幅技術において、或いは関連するポリヌクレオチド配列からSEQ NO ID:12-22を区別する類似の方法において有用である。SEQ ID NO:12-22の断片の正確な長さ及び、断片が対応するSEQ ID NO:12-22の領域は、断片に対する意図した目的に基づき当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１４１】
SEQ ID NO：1-11のある断片はSEQ ID NO：12-22のある断片によってコードされている。SEQ ID NO：１-11の断片はSEQ ID NO：１-11を特異的に同定する固有のアミノ酸配列の領域を含む。例えば、SEQ ID NO：１-11の断片は、SEQ ID NO：１-11を特異認識する抗体を産出するための免疫原性ペプチドとして有用である。SEQ ID NO：１-11のある断片の正確な長さとその断片に対応するSEQ ID NO:1-11での領域は、その断片の目的に基づいて当業者が慣例的に決定することが可能である。
【０１４２】
「完全長」ポリヌクレオチド配列とは、少なくとも１つの翻訳開始コドン（例えばメチオニン）と、それに続くオープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンを有する配列である。「完全長」ポリヌクレオチド配列は、「完全長」ポリペプチド配列をコードする。
【０１４３】
「相同性」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列の、配列類似性、互換性、または配列同一性を意味する。
【０１４４】
ポリヌクレオチド配列に適用される「一致率」または「〜％同一」の語は、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた、２つ以上のポリヌクレオチド配列間で一致する残基の割合を意味する。このようなアルゴリズムは、２配列間のアラインメントを最適化するために、比較する配列において、標準化された再現性のある方法でギャップを挿入しうるので、２つの配列をより有意に比較できる。
【０１４５】
ポリヌクレオチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる。このプログラムは、LASERGENE ソフトウェアパッケージ（一組の分子生物学的分析プログラム）（DNASTAR, Madison WI）の一部である。このCLUSTAL Vは、Higgins, D.G.およびP.M. Sharp（1989）CABIOS 5:151-153、Higgins, D.G. 他 (1992) CABIOS 8:189-191に記載されている。 ポリヌクレオチド配列を２つ１組(ペアワイズ)でアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=2、gap penalty=5、window=4、「diagonals saved」=4と設定される。「weighted（重み付けされた）」残基重み付け表が、デフォルトとして選択される。一致率は、アラインメントされたポリヌクレオチド配列間の「percent similarity（類似性パーセント）」としてCLUSTAL Vによって報告される。
【０１４６】
或いは、一般的に用いられ且つ自由に入手できる配列比較アルゴリズム一式が、米国国立バイオテクノロジー情報センター（NCBI）Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）から提供されており（Altschul, S.F. 他 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410）、これはメリーランド州ベセスダにあるNCBI及びインターネット（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を含む幾つかの情報源から入手可能である。このBLASTソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「blastn」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「BLAST 2 Sequences」と呼ばれるツールも入手可能であり、２つのヌクレオチド配列を直接のペアワイズで比較するために用いられる。「BLAST 2 Sequences」は、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.htmlにアクセスして、対話形式で利用ができる。「BLAST 2 Sequences」ツールは、blastn及びblastp（以下に記載）の両方に用いることができる。BLASTプログラムは、一般的には、ギャップ（gap）などのパラメータをデフォルト設定にセットして用いる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較するために、デフォルトパラメータに設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12（2000年4月21日）を用いてblastnを実行してもよい。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１４７】
Matrix: BLOSUM62
Reward for match: 1
Penalty for mismatch: -2
Open Gap: 5 and Extension Gap: 2 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 11
Filter: on
一致率は、ある定義された配列の全長（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きな配列から得られた断片（例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、７０、１００または２００の連続したヌクレオチドの断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に裏付けられた任意の配列長さの断片を用いて、一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１４８】
高度の同一性を示さない核酸配列が、それにもかかわらず遺伝子コードの縮重が原因で、類似のアミノ酸配列をコードする場合がある。この縮重を利用して核酸配列内で変化を生じさせて、全ての核酸配列が実質上同一のタンパク質をコードするような多数の核酸配列を生成し得ることを理解されたい。
【０１４９】
ポリペプチド配列に用いられる用語「一致率」または「〜％同一」とは、標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされる２つ以上のポリペプチド配列間の一致する残基の百分率のことである。ポリペプチド配列アラインメントの方法は公知である。保存的アミノ酸置換を考慮するアラインメント方法もある。既に詳述したこのような保存的置換は通常、置換部位の電荷及び疎水性を保存するので、ポリペプチドの構造を（従って機能も）保存する。
【０１５０】
ポリペプチド配列間の一致率は、MEGALIGN version 3.12e配列アラインメントプログラムに組込まれているようなCLUSTAL Vアルゴリズムのデフォルトのパラメータを用いて決定できる（参照先と共に上述）。CLUSTAL Vを用いて、ポリペプチド配列をペアワイズアラインメントする際のデフォルトパラメータは、Ktuple=1、gap penalty=3、window=5、「diagonals saved」=5と設定される。デフォルトの残基重み付け表としてPAM250マトリクスが選択される。ポリヌクレオチドアラインメントと同様に、CLUSTAL Vは、アラインメントされたポリペプチド配列対間の「percent similarity」として一致率を報告する。
【０１５１】
或いは、NCBI BLASTソフトウェア一式を用いてもよい。例えば、２つのポリペプチド配列をペアワイズで比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータで設定された「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.12 (2000年４月２１日)でblastpを使用すしうる。デフォルトパラメータの設定例を以下に示す。
【０１５２】
Matrix: BLOSUM62
Open Gap: 11 and Extension Gap: 1 penalties
Gap x drop-off: 50
Expect: 10
Word Size: 3
Filter: on
一致率は、ある定義されたポリペプチド配列（例えば特定のSEQ IDナンバーで定義された配列）の全長について測定し得る。或いは、より短い長さ、例えば、定義された、より大きなポリペプチド配列から得られた断片（例えば少なくとも１５、２０、３０、４０、５０、７０、または１５０の連続した残基の断片）の長さについて一致率を測定してもよい。ここに挙げた長さは単なる例示的なものに過ぎず、表、図及び配列リストを含めた本明細書に記載された配列に支持された任意の断片長を用いて、或る長さであってその長さに対して一致率を測定し得る長さを説明し得ることを理解されたい。
【０１５３】
「ヒト人工染色体（HAC）」は、約６kb 〜１０MbのサイズのDNA配列を含み得る、染色体の複製、分離及び維持に必要な全てのエレメントを含む直鎖状の微小染色体である。
【０１５４】
用語「ヒト化抗体」は、もとの結合能力を保持しつつ、よりヒトの抗体に似せるために、非抗原結合領域のアミノ酸配列が改変された抗体分子を指す。
【０１５５】
「ハイブリダイゼーション」とは、所定のハイブリダイゼーション条件下で、ある一本鎖ポリヌクレオチドがある相補的な一本鎖と塩基対を形成するアニーリングのプロセスである。特異的ハイブリダイゼーションは、２つの核酸配列が高い相補性を共有することを示すものである。特異的ハイブリダイゼーション複合体は許容的アニーリング条件下で形成され、「洗浄」ステップ後もハイブリダイズされたままである。洗浄ステップは、ハイブリダイゼーションプロセスのストリンジェンシーを決定する際に特に重要であり、よりストリンジェントな条件では、非特異結合（即ち完全には一致しない核酸鎖間の対の結合）が減少する。核酸配列のアニーリングのための許容的条件は、当業者が慣例的に決定できる。アニーリング条件は、どのハイブリダイゼーション実験でも一定でありうるが、洗浄条件は所望のストリンジェンシーを得るように、従ってハイブリダイゼーション特異性も得るように実験によって変更されうる。許容的アニーリング条件は、例えば、温度が68℃で、約6×SSC、約1％（w/v）のSDS、並びに約100μｇ／ｍｌのせん断して変性したサケ精子DNAの存在下である。
【０１５６】
一般に、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、洗浄ステップを実行する温度を基準にしてある程度表すことができる。このような洗浄温度は通常、所定のイオン強度及びpHにおける特異配列の融点（Tm）より約５〜20℃低くなるように選択する。このTmは、所定のイオン強度及びpHの条件下で、完全に一致するプローブに標的配列の50％がハイブリダイズする温度である。Tmを計算する式及び核酸のハイブリダイゼーション条件はよく知られており、Sambrook 他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻, Cold Spring Harbor Press, Plainview NYに記載されており、特に2巻の9章を参照されたい。
【０１５７】
本発明のポリヌクレオチド間の高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションでは、約0.2×SSC及び約0.1％のSDSの存在の下、68℃で1時間の洗浄過程を含む。別法では、65℃、60℃、55℃、または42℃の温度で行う。SSC濃度は、約0.1％のSDS存在下で、約0.1〜2×SSCの範囲で変更し得る。通常は、ブロッキング剤を用いて非特異ハイブリダイゼーションを阻止する。このようなブロッキング剤には、例えば、約100〜200μg/mlのせん断した変性サケ精子DNAがある。例えばRNAとDNAのハイブリダイゼーションのような特定条件下では、有機溶剤、例えば約35〜50%v/vの濃度のホルムアミドを用いることもできる。洗浄条件の有用なバリエーションは、当業者には自明であろう。ハイブリダイゼーションは、特に高ストリンジェント条件下では、ヌクレオチド間の進化的な類似性を示唆し得る。このような類似性は、ヌクレオチド群及びヌクレオチドにコードされるポリペプチド群について、類似の役割を強く示唆している。
【０１５８】
用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的な塩基間の水素結合によって形成された、２つの核酸配列の複合体を指す。ハイブリダイゼーション複合体は、溶解状態で形成し得る（C0tまたはR0t解析等）。或いは、一方の核酸配列が溶解状態で存在し、もう一方の核酸配列が固体支持体（例えば紙、膜、フィルタ、チップ、ピンまたはガラススライド、或いは他の適切な基板であって細胞若しくはその核酸が固定される基板）に固定されているような２つの核酸配列間に形成され得る。
【０１５９】
用語「挿入」或いは「付加」は、１個以上のアミノ酸残基或いはヌクレオチドがそれぞれ追加される、アミノ酸配列或いは核酸配列の変化を指す。
【０１６０】
「免疫応答」は、炎症、外傷、免疫異常症、伝染性疾患または遺伝性疾患に関連する症状を指し得る。これらの症状は、細胞及び全身の防御系に作用し得る種々の因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、その他のシグナル伝達分子の発現によって特徴づけることができる。
【０１６１】
「免疫原性断片」とは、哺乳動物等の生命体に導入されると免疫応答を誘発し得るようなNZMSのポリペプチドまたはオリゴペプチド断片である。「免疫抗原性断片」の語には、本明細書中で開示したような或いは当分野で既知であるような任意の抗体産出方法において有用な、NZMSの任意のポリペプチドまたはオリゴペプチド断片も含まれる。
【０１６２】
用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物の構成を指す。
【０１６３】
用語「エレメント」または「アレイエレメント」は、マイクロアレイ上に固有の定義された位置を有する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはその他の化合物を指す。
【０１６４】
「活性を調節(する)」の語は、NZMSの活性を変化させることを指す。例えば、調節によって、NZMSのタンパク質活性、或いは結合特性、またはその他の生物学的特性、機能的特性或いは免疫学的特性の変化が起きうる。
【０１６５】
「核酸」及び「核酸配列」の語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはこれらの断片を指す。「核酸」及び「核酸配列」の語は、ゲノム起源または合成起源のDNAまたはRNAであって一本鎖または二本鎖であるか或いはセンス鎖またはアンチセンス鎖を表し得るようなDNAまたはRNAや、ペプチド核酸（PNA）や、任意のDNA様またはRNA様物質を指すこともある。
【０１６６】
「機能的に連結した」は、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的な関係にある状態を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合には、そのプロモーターはそのコード配列に機能的に連結している。機能的に連結したDNA配列は非常に近接するか、或いは連続的に隣接し得る。また、２つのタンパク質コード領域を結合するために必要な場合は、同一のリーディングフレーム内に在り得る。
【０１６７】
「ペプチド核酸（PNA）」は、末端がリジンで終わるアミノ酸残基のペプチドバックボーンに結合した、少なくとも約5ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを有する、アンチセンス分子または抗遺伝子剤を指す。末端のリジンは、この組成物に溶解性を与える。PNAは、相補的一本鎖DNAまたはRNAに優先的に結合して転写の伸長を停止するものであり、ポリエチレングリコール化することにより、細胞におけるPNAの寿命を延長し得る。
【０１６８】
NZMSの「翻訳後修飾」は、脂質化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ラセミ化、タンパク質分解切断、及びその他の当分野で既知の修飾を含み得る。これらのプロセスは、合成的または生化学的に発生し得る。生化学的修飾は、NZMSの酵素環境に依存し、細胞タイプによって変化することとなる。
【０１６９】
「プローブ」とは、同一配列或いは対立遺伝子核酸配列、関連する核酸配列の検出に用いる、NZMSやそれらの相補配列、またはそれらの断片をコードする核酸配列のことである。プローブは、単離されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドであって、検出可能な標識またはレポーター分子に結合したものである。典型的な標識には、放射性アイソトープ、リガンド、化学発光試薬、及び酵素がある。「プライマー」とは、相補的な塩基対を形成して標的のポリヌクレオチドにアニーリング可能な、通常はDNAオリゴヌクレオチドである短い核酸である。プライマーは次に、DNAポリメラーゼ酵素によって標的DNA鎖に沿って伸長され得る。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）による核酸配列の増幅（及び同定）に用い得る。
【０１７０】
本発明に用いるようなプローブ及びプライマーは通常、既知の配列の、少なくとも15の連続したヌクレオチドを含んでいる。特異性を高めるために長めのプローブ及びプライマー、例えば開示した核酸配列の少なくとも20、25、30、40、50、60、70、80、90、100または少なくとも150の連続したヌクレオチドからなるようなプローブ及びプライマーを用いてもよい。これよりもかなり長いプローブ及びプライマーもある。表、図面及び配列リストを含む本明細書に裏付けされた任意の長さのヌクレオチドを用いることができるものと理解されたい。
【０１７１】
プローブ及びプライマーの調製及び使用方法については、Sambrook, J.他 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1-3巻、Cold Spring Harbor Press, Plainview NY、Ausubel, F.M.他, (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pubi. Assoc. & Wiley-Intersciences, New York NY、Innis他 (1990) PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications Academic Press, San Diego CA等を参照されたい。PCRプライマー対は、その目的のためのコンピュータプログラム、例えばPrimer（Version 0.5, 1991, Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge MA）を用いるなどして既知の配列から得ることができる。
【０１７２】
プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの選択は、そのような目的のために本技術分野で既知のソフトウェアを用いて行う。例えばOLIGO 4.06ソフトウェアは、各100ヌクレオチドまでのPCRプライマー対の選択に有用であり、32キロベースまでのインプットポリヌクレオチド配列からオリゴヌクレオチド及び最大5.000ヌクレオチドまでの大きめのポリヌクレオチドを分析するのにも有用である。類似のプライマー選択プログラムには、拡張能力のための追加機能が組込まれている。例えば、PrimOUプライマー選択プログラム（テキサス州ダラスにあるテキサス大学南西部医療センターのゲノムセンターから一般向けに入手可能）は、メガベース配列から特定のプライマーを選択することが可能であり、従ってゲノム全体の範囲でプライマーを設計するのに有用である。Primer3プライマー選択プログラム（Whitehead Institute/MIT Center for Genome Research（マサチューセッツ州ケンブリッジ）より入手可能）によって、ユーザーは、プライマー結合部位として避けたい配列を指定できる「ミスプライミングライブラリ（mispriming libｒary）」を入力できる。Primer3は特に、マイクロアレイのためのオリゴヌクレオチドの選択に有用である（後二者のプライマー選択プログラムのソースコードはそれぞれの情報源から得て、ユーザー固有のニーズを満たすように変更してもよい）。PrimerGenプログラム（英国ヒトゲノムマッピングプロジェクト-リソースセンター(英国ケンブリッジ)から一般向けに入手可能）は、多数の配列アラインメントに基づいてプライマーを設計し、それによって、アラインメントされた核酸配列の最大保存領域または最小保存領域の何れかとハイブリダイズするようなプライマーの選択を可能にする。従って、このプログラムは、固有なもの、及び保存されたもの双方のオリゴヌクレオチドとポリヌクレオチド断片との同定に有用である。上記選択方法のいずれかによって同定したオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの断片は、ハイブリダイゼーション技術において、例えばPCRまたはシークエンシングプライマーとして、マイクロアレイエレメントとして、或いは核酸のサンプルにおいて完全または部分的相補的ポリヌクレオチドを同定する特異プローブとして有用である。オリゴヌクレオチドの選択方法は、上記の方法に限定されるものではない。
【０１７３】
「組換え核酸」は天然の配列ではなく、配列の、２つ以上の離れたセグメントを人工的に組み合わせた配列である。この人為的組合せはしばしば化学合成によって達成するが、より一般的には核酸の単離セグメント群の人為的操作によって、例えばSambrookの文献（前出）に記載されているような遺伝子工学的手法によって達成する。組換え核酸の語は、単に核酸の一部が付加、置換または欠失により改変された核酸も含む。しばしば組換え核酸には、プロモーター配列に機能的に連結した核酸配列が含まれる。このような組換え核酸は、例えば細胞を形質転換するために使用されるベクターの一部とすることが可能である。
【０１７４】
或いはこのような組換え核酸は、ウイルスベクターの一部と成すことができ、ベクターは例えばワクシニアウイルスに基づくものであり得る。そのようなベクターは哺乳動物に接種され、その組換え核酸が発現されて、その哺乳動物内で防御免疫応答を誘導するように使用することができる。
【０１７５】
「調節エレメント」は、通常は遺伝子の非翻訳領域に由来する核酸配列であり、エンハンサー、プロモーター、イントロン及び５'及び３'の非翻訳領域（UTR）を含む。調節エレメントは、転写、翻訳またはRNA安定性を調節する宿主タンパク質またはウイルスタンパク質と相互作用する。
【０１７６】
「レポーター分子」は、核酸、アミノ酸または抗体の標識化に用いられる化学的または生化学的な部分である。レポーター分子としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、基質、補助因子、阻害因子、磁気粒子及びその他の当分野で既知の成分を含む。
【０１７７】
DNA配列に対する「RNA等価物」は、基準となるDNA配列と同じ直鎖の核酸配列から構成されるが、全ての窒素性塩基のチミンがウラシルで置換され、糖鎖のバックボーンがデオキシリボースではなくリボースからなる。
【０１７８】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている。NZMS、NZMSをコードする核酸、またはその断片を含むと推定されるサンプルは、体液と、細胞や細胞から単離した染色体や細胞内小器官（オルガネラ）や膜からの抽出物と、細胞と、溶液中に存在するまたは基板に固定されたゲノムDNA、RNA、cDNAと、組織と、組織プリント等を含み得る。
【０１７９】
用語「特異結合」及び「特異的に結合する」は、タンパク質若しくはペプチドと、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、若しくは任意の天然若しくは合成の結合組成物との間の相互作用を指す。この相互作用は、タンパク質の特定の構造（例えば抗原決定基即ちエピトープ）であって結合分子が認識する構造が存在するか否かに依存する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、結合していない標識した「Ａ」及び抗体を含む反応液に、エピトープＡを含むポリペプチド或いは結合していない無標識の「Ａ」が存在すると、抗体と結合する標識Ａの量が減少する。
【０１８０】
用語「実質的に精製された」は、自然の環境から取り除かれてから、単離或いは分離された核酸配列或いはアミノ酸配列であって、自然に会合している他の成分が少なくとも約60％除去されたものであり、好ましくは約75％以上の除去、最も好ましくは90％以上除去されたものを指す。
【０１８１】
「置換」とは、一つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチドをそれぞれ別のアミノ酸残基またはヌクレオチドに置き換えることである。
【０１８２】
「基板」は、任意の好適な固体或いは半固体の支持物を指し、膜及びフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、チューブ、プレート、ポリマー、微小粒子、毛細管が含まれる。基板は、ウェル、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有することができ、基板にはポリヌクレオチドやポリペプチドが結合する。
【０１８３】
「転写物イメージ」あるいは「発現プロフィール」は、所定条件下での所定時間における特定の細胞の種類または組織による遺伝子発現の集合的パターンを指す。
【０１８４】
「形質転換(transformation)」とは、外因性DNAが受容細胞に導入されるプロセスのことである。形質転換は、本技術分野で知られている種々の方法に従って自然条件または人工条件下で生じ得るものであり、外来性の核酸配列を原核宿主細胞または真核宿主細胞に挿入する任意の既知の方法を基にし得る。形質転換の方法は、形質転換する宿主細胞の種類によって選択する。限定するものではないが形質転換方法には、バクテリオファージあるいはウイルス感染、電気穿孔法（エレクトロポレーション）、熱ショック、リポフェクション及び微粒子銃を用いる方法がある。用語「形質転換された細胞」には、導入されたDNAが、自律的に複製するプラスミドとして或いは宿主染色体の一部として複製可能である安定的に形質転換された細胞が含まれる。さらに、限られた時間に一過的に導入DNA若しくは導入RNAを発現する細胞も含まれる。
【０１８５】
ここで用いる「遺伝形質転換体(transgenic organism)」とは任意の有機体(生物体)であり、限定するものではないが動植物を含み、有機体の１個以上の細胞が、ヒトの関与によって、例えば本技術分野でよく知られているトランスジェニック(transgenic)技術によって導入された異種核酸を有する。核酸の細胞への導入は、直接または間接的に、細胞の前駆物質に導入することによって、計画的な遺伝子操作によって、例えば微量注射法によって或いは組換えウイルスでの感染によって行う。遺伝子操作の語は、古典的な交雑育種或いはin vitro受精を指すものではなく、組換えDNA分子の導入を指すものである。本発明に基づいて予期される遺伝形質転換体には、バクテリア、シアノバクテリア、真菌及び動植物がある。本発明の単離されたDNAは、本技術分野で知られている方法、例えば感染、形質移入、形質転換またはトランス接合によって宿主に導入することができる。本発明のDNAをこのような生物体に移入する技術はよく知られており、前出のSambrook 他(1989)等の参考文献に記載されている。
【０１８６】
特定の核酸配列の「変異体／変異配列」は、核酸配列１本全部の長さに対して特定の核酸配列と少なくとも40％の配列同一性を有する核酸配列であると定義する。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastnを実行する。このような核酸対は、所定の長さに対して、例えば少なくとも50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。或る変異体は、例えば「対立遺伝子」変異体（前述）、「スプライス」変異体、「種」変異体または「多型性」変異体として説明し得る。スプライス変異体は参照分子との有意な同一性を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによって通常、より多くまたはより少数のポリヌクレオチドを有することになる。対応するポリペプチドは、追加機能ドメインを有するか或いは参照分子に存在するドメインが欠落していることがある。種変異体は、種によって異なるポリヌクレオチド配列である。結果的に生じるポリペプチドは通常、相互に有意なアミノ酸同一性を有する。多型性変異体は、所与の種の個体間での特定遺伝子のポリヌクレオチド配列中での変異である。多型変異配列はまた、ポリヌクレオチド配列の１つのヌクレオチド塩基が異なる「１塩基多型性」（SNP）も含み得る。SNPの存在は、例えば特定の個体群、病状または病状性向を示し得る。
【０１８７】
特定のポリペプチド配列の「変異体」は、ポリペプチド配列の１本の長さ全体で該特定ポリペプチド配列に対して少なくとも40％の配列同一性を有するポリペプチド配列として定義される。定義づけには、デフォルトパラメータに設定した「BLAST 2 Sequences」ツールVersion 2.0.9（1999年5月7日）を用いてblastpを実行する。このようなポリペプチド対は、一方のポリペプチドの或る所定の長さに対して、例えば少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を示し得る。
【０１８８】
（発明）
本発明は、新規のヒト酵素（NZMS）及びNZMSをコードするポリヌクレオチドの発見に基づき、またこれらの組成物を利用した、免疫系の疾患、免疫不全、発達障害、代謝障害、平滑筋障害、神経の疾患、肺の疾患、寄生虫感染、および癌を含む細胞増殖異常の診断、治療、あるいは予防法の発見に基づく。
【０１８９】
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名の概略である。各ポリヌクレオチド及びその対応するポリペプチドは、１つのIncyteプロジェクト識別番号（IncyteプロジェクトID）と相関する。各ポリペプチド配列は、ポリペプチド配列識別番号（ポリペプチドSEQ ID NO）とIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）によって表示した。各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO）とIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（IncyteポリヌクレオチドID）によって表示した。
【０１９０】
表２は、GenBankタンパク質（genpept）データベースに対するBLAST分析によって同定されたような、本発明のポリペプチドとの相同性を有する配列を示している。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドに対するポリペプチド配列識別番号（ポリペプチド SEQ ID NO:）と、それに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、最も近いGenBank相同体のGenBank識別番号（Genbank ID NO）を示す。列４は、各ポリペプチドとそのGenBank相同体との間の一致について確率スコアを示す。列５は、GenBank相同体の注釈を示し、更に該当箇所には適当な引用文も示す。これら全てを引用することを以って本明細書の一部とする。
【０１９１】
表３は、本発明のポリペプチドの様々な構造的特徴を示す。列１および列２はそれぞれ、本発明の各ポリペプチドのポリペプチド配列識別番号（SEQ ID NO:）およびそれに対応するIncyteポリペプチド配列番号（IncyteポリペプチドID）を示す。列３は、各ポリペプチドのアミノ酸残基数を示す。列４は、GCG配列分析ソフトウェアパッケージのMOTIFSプログラム（Genetics Computer Group, Madison WI）によって決定された、リン酸化およびグリコシル化の可能性のある部位を示し、またシグネチャ配列、ドメインおよびモチーフを含むアミノ酸残基を示す。列5は、タンパク質の構造／機能の分析のための分析方法を示し、該当箇所にはさらに分析方法に利用した検索可能なデータベースを示す。
【０１９２】
表２及び３は共に、本発明の各々のポリペプチドの特性を要約しており、それら特性が請求の範囲に記載されたポリペプチドが酵素であることを確立している。
【０１９３】
例えば、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)での決定で、SEQ ID NO：3は、残基P68から残基S297までシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）のパラヒドロキシ安息香酸ポリプレニル2リン酸トランスフェラーゼ（GenBank ID g12082328）と64％同一である（図２参照）。BLAST確率スコアは1.6e-78であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:3は、また、１つのUbiA プレニルトランスフェラーゼファミリードメインを持つが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して判定された （表3参照）。
【０１９４】
また他の例として、SEQ ID NO:4は、残基Q44から残基C377まで、ヒトのβ-1.3−N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼbGnT-3 （GenBank ID g12619296）と55％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは7.14e-94であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:4はまた、１つのグリコシルトランスフェラーゼドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。
【０１９５】
また他の例として、SEQ ID NO:5は好気性酵母菌[Kluyveromyces lactis] D-乳酸デヒドロゲナーゼ(チトクローム) (GenBank ID g602029)とP66残基からV483残基まで41％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは8.9e-87であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:5はまた、FAD結合ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。
【０１９６】
また他の例として、SEQ ID NO:7はP27残基からE508残基まで、アナウサギ(Oryctolagus cuniculus)のラクターゼ・フロリジンヒドロラーゼ（GenBank ID g415865）と50％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは3.1e-131であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:7はまた、１つのグリコシルヒドロラーゼファミリー1ドメインを有するが、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された（表3参照）。BLIMPS、PROFILESCAN、MOTIFS、及び付加的BLAST解析よりのデータは、SEQ ID NO:7 がグリコシルヒドロラーゼである、さらに確証的な証拠を提供する。
【０１９７】
また他の例として、SEQ ID NO:8はヒトの炭酸脱水酵素14(GenBank ID g6009640)とM1残基からG287残基まで99％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは4.5e-156であり、これは観察されたポリペプチド配列アラインメントが偶然に得られる確率を示している。SEQ ID NO:8はまた、１つの真核生物タイプ炭酸脱水酵素ドメインを有するが、 これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して決定された （表3参照）。BLIMPS、PROFILESCAN、及び付加的BLAST 解析よりのデータは、SEQ ID NO:8が炭酸脱水酵素である、さらに実証的な証拠を提供する。
【０１９８】
また他の例として、SEQ ID NO:9はウシのUDP_Gal NAC：ポリペプチド N-アセチルガラクトサミントランスフェラーゼ(GenBank ID g289412)とM1残基からL554残基まで85％同一であることがBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)によって示された（表2参照）。BLAST確率スコアは4.9e-269であるが、これは観測されたポリペプチド配列が偶然に得られる確率を示す。SEQ ID NO:9はまた、１つのグリコシル転移酵素ドメインを有し、これは、隠れマルコフモデル（HMM）を基にした、保存されたタンパク質ファミリードメイン群のPFAMデータベースにおいて、統計的に有意な一致を検索して判定された（表3参照）。BLIMPS解析および付加的BLAST解析からのデータは、SEQ ID NO:9がグリコシルトランスフェラーゼであることを更に確証する証拠を提供する。
【０１９９】
SEQ ID NO:1-2、SEQ ID NO:6およびSEQ ID NO:10-11は同じような方法で解析し、注釈を付けた。 SEQ ID NO:１−１1の解析のためのアルゴリズム及びパラメータが表７で記述されている。
【０２００】
表４に示すように、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列は、cDNA配列またはゲノムDNA由来のコード（エキソン）配列を用いて、或いはこれら２種類の配列を任意に組み合わせて構築(assemble)した。列１は、本発明の各ポリヌクレオチドについて、ポリヌクレオチド配列識別番号（ポリヌクレオチドSEQ ID NO:）および対応するIncyteポリヌクレオチドコンセンサス配列番号（Incyte ID）を示し、また各ポリヌクレオチド配列の長さを塩基対で示している。列２は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列を構築するのに用いたcDNA配列および／またはゲノム配列の、また、例えばSEQ ID NO:12-22を同定するため、或いはSEQ ID NO:12-22と、関連するポリヌクレオチド配列群とを区別するためのハイブリダイゼーション技術または増幅技術に有用なポリヌクレオチド配列の断片の、開始ヌクレオチド（５'）位置および終了ヌクレオチド（３'）位置を示す。
【０２０１】
表４の列２で記述されたポリヌクレオチド断片は特に、例えば組織特異的cDNAライブラリあるいはプールしたcDNAライブラリに由来するIncyte cDNAを指す場合もある。或いは列2のポリヌクレオチド断片は、完全長ポリヌクレオチド配列の構築に寄与したGenBank cDNAまたはESTを指す場合もある。さらに、列2のポリヌクレオチド断片は、ENSEMBL（The Sanger Centre（英国ケンブリッジ））データベースから由来した配列を同定し得る（即ち「ENST」命名を含む配列）。或いは、列2で記述されたポリヌクレオチド断片は、NCBI RefSeq Nucleotide Sequence Records データベースから由来する場合もあり（即ち「NM」または「NT」の命名を含む配列）、またNCBI RefSeq Protein Sequence Recordsから由来する場合もある（即ち「NP」の命名を含む配列）。または列2のポリヌクレオチド断片は、「エキソンスティッチング（exon-stitching）」アルゴリズムにより結び合わせたcDNA及びGenscan予想エキソンの両方からなる構築物を意味する場合がある。例えば、FL_XXXXXX_N1_N2_YYYYY_N3_N4 と同定されるポリヌクレオチド配列は、アルゴリズムが適用された配列のクラスターの識別番号がXXXXXXであり、アルゴリズムにより生成される予測の番号がYYYYY であり、（もし存在すれば）N1,2,3..が解析中に手動で編集された可能性のある特定のエキソンであるような「縫合された(stitched)」配列である(実施例５参照)。または、列2のポリヌクレオチド断片は「エキソンストレッチング（exon-stretching）」アルゴリズムにより結び合わせたエキソンの構築物を指す場合もある。例えば、FLXXXXXX_gAAAAA_gBBBBB_1_Nとして同定されるポリヌクレオチド配列は、「ストレッチされた」配列である。XXXXXXはIncyteプロジェクト識別番号、gAAAAAは「エキソンストレッチング」アルゴリズムを適用したヒトゲノム配列のGenBank識別番号、gBBBBBは一番近いGenBankタンパク質相同体のGenBank識別番号またはNCBI RefSeq 識別番号であり、Nは特定のエキソンを指す（実施例５を参照）。あるRefSeq配列が「エキソンストレッチング」アルゴリズムのためのタンパク質相同体として使用された場合では、RefSeq識別子（「NM」、「NP」、または「NT」によって表される）が、GenBank識別子（即ち、gBBBBB）の代わりに使用される場合もある。
【０２０２】
或いは、接頭コードは、手動で編集された構成配列、ゲノムDNA配列から予測された構成配列、または組み合わされた配列解析方法から由来する構成配列を同定する。次の表は、構成配列の接頭コードと、接頭コードに対応する配列分析方法の例を列記する(実施例４と５を参照)。
2004520832.tif 000003
【０２０３】
場合によっては、最終コンセンサスポリヌクレオチド配列を確認するために、表4に示すような配列の適用範囲と重複するIncyte cDNAの適用範囲が得られたが、それに関連するIncyte cDNA識別番号は示さなかった。
【０２０４】
表５は、Incyte cDNA配列を用いて構築された完全長ポリヌクレオチド配列のための代表的なcDNAライブラリを示している。代表的なcDNAライブラリは、上記のポリヌクレオチド配列群を構築及び確認するために用いられたIncyte cDNA配列によって最も頻繁に代表される、Incyte cDNAライブラリである。cDNAライブラリを作製するために用いた組織及びベクターを表５に示し、表６で説明している。
【０２０５】
本発明はまた、NZMSの変異体も含む。好適なNZMS変異体は、NZMSの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有し、かつNZMSアミノ酸配列に対して少なくとも約80％のアミノ酸配列同一性、或いは少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性、更には少なくとも約95％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０２０６】
本発明はまた、NZMSをコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施例において、本発明は、NZMSをコードする、SEQ ID NO:12-22からなる一群から選択された配列を含むポリヌクレオチド配列を提供する。SEQ ID NO:12-22のポリヌクレオチド配列には、配列表に示したように等価RNA配列をも含むが、そこでは窒素塩基チミンの出現はウラシルで置換され、糖のバックボーンはデオキシリボースではなくリボースで構成される。
【０２０７】
本発明はまた、NZMSをコードするポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。詳細には、このような変異体ポリヌクレオチド配列は、NZMSをコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも約70％のポリヌクレオチド配列同一性、或いは少なくとも約85％のポリヌクレオチド配列同一性、更には少なくとも約95％ものポリヌクレオチド配列同一性を有する。本発明の或る実施態様では、SEQ ID NO:12-22からなる群から選択された核酸配列と少なくとも約70％、或いは少なくとも約85％、または少なくとも約95％ものポリヌクレオチド配列同一性を有するようなSEQ ID NO:12-22からなる群から選択された配列を有するポリヌクレオチド配列の変異配列を含む。上記の任意のポリヌクレオチドの変異体は、NZMSの機能的若しくは構造的特徴を少なくとも１つ有するアミノ酸配列をコードし得る。
【０２０８】
更にあるいは別法では、本発明のポリヌクレオチド変異体はNZMSをコ−ドするポリヌクレオチド配列のスプライス変異体である。スプライス変異体はNZMSをコードするポリヌクレオチド配列との有意な配列同一性を持つ部分を有し得るが、mRNAプロセッシング中のエキソンの選択的スプライシングによる配列ブロックの付加または欠失により、通常、ヌクレオチドをより多くまたはより少数有することになる。スプライス変異体はその全長についてNZMSをコードするポリヌクレオチド配列とのポリヌクレオチド配列同一性が約70％未満、あるいは約60％、あるいは約50％未満でありえるが、そのスプライス変異体のある部分は、NZMSをコードするポリヌクレオチド配列の各部分とのポリヌクレオチド配列同一性が少なくとも約70％、あるいは少なくとも約85％、あるいは少なくとも約95％、あるいは100％になる。上記したスプライス変異配列は何れも、NZMSの機能的或いは構造的特徴の少なくとも１つを有するアミノ酸配列をコードしうる。
【０２０９】
当業者であれば、遺伝暗号の縮重の結果、NZMSをコードする多数のポリヌクレオチド配列（いかなる既知の天然遺伝子のポリヌクレオチド配列とも最低限の類似性しか有しないポリヌクレオチド配列もある）を産出し得ることは理解されよう。したがって本発明には、可能コドン選択に基づく組合せの選択によって産出し得るようなありとあらゆる可能性のあるポリヌクレオチド配列のバリエーションを網羅し得る。これらの組合せは、天然NZMSのポリヌクレオチド配列に適用されるような標準トリプレット遺伝暗号を基に作られるものであり、このような変異は全て明確に開示されているものと考えられるべきものである。
【０２１０】
NZMS及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は通常、好適に選択されたストリンジェントな条件下で天然NZMSのヌクレオチド配列とハイブリダイズ可能であるが、NZMSまたはその誘導体であって実質上異なるコドンの使用法があるもの、例えば天然に存在しないコドンの封入があるものをコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であろう。宿主が特定のコドンを利用する頻度に基づいて、特定の真核宿主又は原核宿主に発生するペプチドの発現率を高めるようにコドンを選択することが可能である。コードされるアミノ酸配列を改変せずに、NZMS及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を実質的に改変する別の理由には、天然配列から作製される転写物より好ましい、例えば半減期が長いなどの特性を有するRNA転写物の作製がある。
【０２１１】
本発明には、NZMSおよびNZMS誘導体をコードするDNA配列又はそれらの断片を完全に合成化学によって作製することも含まれる。作製後にこの合成配列を、当分野で良く知られた試薬を用いて、種々の入手可能な発現ベクター及び細胞系の何れの中にも挿入可能である。更に、合成化学を用いて、NZMSをコードする配列、またはその任意の断片の中に突然変異を導入することも可能である。
【０２１２】
更に本発明には、種々のストリンジェンシー条件下で、請求項に記載されたポリヌクレオチド配列に、特に、SEQ ID NO:12-22及びそれらの断片群にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド配列群が含まれる（例えば、Wahl, G.M.およびS.L. Berger（1987）Methods Enzymol.152:399-407、Kimmel, A.R.（1987）Methods Enzymol.152:507-511)。アニーリング及び洗浄条件を含むハイブリダイゼーションの条件は、「定義」に記載されている。
【０２１３】
DNAシークエンシングの方法は当分野では公知であり、本発明のいずれの実施例もDNAシークエンシング方法を用いて実施可能である。DNAシークエンシング方法には酵素を用いることができ、例えばDNAポリメラーゼ１のクレノウ断片、SEQUENASE（US Biochemical, Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Applied Biosystems）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham, Pharmacia Biotech, Piscataway NJ）を用いることができる。或いは、例えばELONGASE増幅システム（Life Technologies, Gaithersburg MD）において見られるように、ポリメラーゼと校正エキソヌクレアーゼを併用することができる。好適には、MICROLAB2200液体転移システム（Hamilton, Reno, NV）、PTC200サーマルサイクラー（MJ Research, Watertown MA）及びABI CATALYST 800サーマルサイクラー（Applied Biosystems）等の装置を用いて配列の準備を自動化する。次に、ABI 373或いは377 DNAシークエンシングシステム（Applied Biosystems）、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamics, Sunnyvale CA）または当分野でよく知られている他の方法を用いてシークエンシングを行う。結果として得られた配列を当分野でよく知られている種々のアルゴリズムを用いて分析する（Ausubel, F.M. (1997) Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY, unit 7.7、Meyers, R.A. (1995) Molecular Biology and Biotechnology, Wiley VCH, New York NY, 856-853ページ等を参照）。
【０２１４】
NZMSをコードする核酸配列を、部分的ヌクレオチド配列を利用し且つ当分野でよく知られている、PCR法をベースにした種々の方法を用いて伸長させ、プロモーター及び調節エレメント等の上流配列を検出することができる。例えば、使用し得る方法の１つである制限部位PCR法は、ユニバーサルプライマーおよびネステッドプライマーを用いてクローニングベクター内のゲノムDNAからの未知の配列を増幅する方法である（例えば、Sarkar, G. (1993) PCR Methods Applic. 2:318-322を参照）。別の方法に逆PCR法があり、これは広範な方向に伸長させたプライマーを用いて環状化した鋳型から未知の配列を増幅する方法である。鋳型は、或る既知のゲノム遺伝子座およびその周辺の配列群からなる制限酵素断片群から得る（例えばTriglia, T. 他 (1988) Nucleic Acids Res. 16:8186を参照）。第３の方法としてキャプチャPCR法があり、これはヒト及び酵母菌人工染色体DNAの既知の配列に隣接するDNA断片をPCR増幅する方法に関与している（例えばLagerstrom, M. 他 (1991) PCR Methods Applic. 1:111-119）。この方法では、PCRを行う前に複数の制限酵素の消化及びライゲーション反応を用いて未知の配列領域内に組換え二本鎖配列を挿入することが可能である。未知の配列群を検索するために用い得る他の複数の方法も当分野で既知である（例えばParker, J.D.他 (1991) Nucleic Acids Res. 19:3055-3060を参照）。更に、PCR、ネステッドプライマー及びPromoterFinderライブラリ（Clontech, Palo Alto CA）を用いてゲノムDNAをウォーキングすることができる。この手順は、ライブラリをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エキソン接合部を見付けるのに有用である。全てのPCRベースの方法に対して、市販されているソフトウェア、例えばOLIGO 4.06プライマー分析ソフトウェア（National Biosciences, Plymouth MN）或いは別の好適なプログラムを用いて、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50％以上、温度約68℃〜72℃で鋳型に対してアニーリングするようにプライマーを設計し得る。
【０２１５】
完全長cDNA群をスクリーニングする際は、より大きなcDNA群を含むようにサイズ選択されたライブラリ群を用いるのが好ましい。更に、ランダムプライマーのライブラリは、遺伝子群の５'領域を有する配列をしばしば含んでおり、オリゴd(T)ライブラリが完全長cDNAを作製できない状況に対して好適である。ゲノムライブラリは、５'非転写調節領域への配列の伸長に有用であろう。
【０２１６】
市販のキャピラリー電気泳動システムを用いて、シークエンシング産物またはPCR産物のサイズを分析し、またはそのヌクレオチド配列を確認することができる。具体的には、キャピラリーシークエンシングは、電気泳動による分離のための流動性ポリマーと、４つの異なるヌクレオチドに特異的であるような、レーザで刺激される蛍光色素と、発光された波長の検出に利用するCCDカメラとを有し得る。出力／光の強度は、適切なソフトウェア（Applied Biosystems社のGENOTYPER、SEQUENCE NAVIGATOR等）を用いて電気信号に変換し得る。サンプルのロードからコンピュータ分析及び電子データ表示までの全プロセスがコンピュータ制御可能である。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプルに少量しか存在しないようなDNA小断片のシークエンシングに特に適している。
【０２１７】
本発明の別の実施例では、NZMSをコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を、適切な宿主細胞内でNZMS、NZMSの断片またはその機能的等価物を発現させるような組換えDNA分子内でクローニングし得る。遺伝暗号固有の縮重により、実質的に同じ或いは機能的に等価のアミノ酸配列をコードする別のDNA配列が作られ得、これらの配列をNZMSの発現に利用可能である。
【０２１８】
種々の目的で、NZMSをコードする配列を改変するために、本発明のヌクレオチド配列を当分野で通常知られている方法を用いて組み換えることができる。ここで目的には、限定するものではないが遺伝子産物のクローニング、プロセッシング、発現の調節がある。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【０２１９】
本発明のヌクレオチドは、MOLECULARBREEDING（Maxygen Inc., Santa Clara CA。 米国特許第5,837,458号、Chang, C.-C.他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:793-797、Christians, F.C.他 (1999) Nat. Biotechnol. 17:259-264、Crameri, A. 他 (1996) Nat. Biotechnol. 14:315-319に記載）等のDNAシャッフリング技術の対象となり、NZMSの生物学的特性、例えば生物活性、酵素活性、或いは他の分子や化合物との結合力等を変更または向上させ得る。DNAシャッフリングは、遺伝子断片のPCRを介する組換えを用いて遺伝子変異体のライブラリを生成するプロセスである。ライブラリはその後、所望の特性を持つ遺伝子変異配列群を同定する、選択またはスクリーニングにかける。次にこれらの好適な変異体をプールし、更に反復してDNAシャッフリング及び選択／スクリーニングを行ってもよい。かくして、「人工的な」育種及び急速な分子進化によって遺伝的多様性が生み出される。例えば、ランダムポイント突然変異を有する単一の遺伝子の断片を組み換えて、スクリーニングし、その後所望の特性が最適化されるまでシャッフリングすることができる。或いは、所与遺伝子の断片を同種または異種のいずれかから得た同一遺伝子ファミリーの相同遺伝子の断片と組み換え、それによって天然に存在する複数の遺伝子の遺伝的多様性を、定方向の、制御可能な方法で最大化させることができる。
【０２２０】
別の実施例によれば、NZMSをコードする配列は、当分野で周知の化学的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（Caruthers. M.H.他（1980） Nucleic Acids Symp. Ser. 7:215-223、Horn, T. 他. (1980) Nucleic Acids Symp. Ser. 7:225-232等を参照）。別法として、化学的方法を用いてNZMS自体またはその断片を合成することが可能である。例えば、種々の液相または固相技術を用いてペプチド合成を行うことができる（例えばCreighton, T. (1984) Proteins, Structures and Molecular Properties, WH Freeman, New York NY, 55-60ページ、Roberge, J.Y. 他. (1995) Science 269:202-204等を参照）。
自動合成はABI 431Aペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて達成し得る。更にNZMSのアミノ酸配列または任意のその一部は、直接的な合成の際の改変、及び／または他のタンパク質または任意のその一部からの配列との組み合わせにより、天然のポリペプチド配列を有するポリペプチドまたは変異体ポリペプチドを作製することが可能である。
【０２２１】
このペプチドは、分取用高速液体クロマトグラフィーを用いて実質的に精製し得る（Chiez, R.M.及びF.Z. Regnier (1990) Methods Enzymol. 182:392-421等を参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析またはシークエンシングによって確認することができる（前出のCreighton, 28-53ページ等を参照）。
【０２２２】
生物学的に活性なNZMSを発現させるために、NZMSをコードするヌクレオチド配列またはその誘導体を好適な発現ベクターに挿入することができる。好適な発現ベクターとは即ち好適な宿主内で挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要なエレメントを含むベクターである。必要なエレメントの例には、ベクターに、またNZMSをコードするポリヌクレオチド配列における調節配列、例えばエンハンサー、構成型および発現誘導型のプロモーター、５'および３'の非翻訳領域などが含まれる。このようなエレメントは、強度及び特異性が様々である。特異な開始シグナルを用いて、NZMSをコードする配列をより効果的に翻訳することもできる。このようなシグナルには、ATG開始コドンと、コザック配列などの近傍の配列が含まれる。NZMSをコードする配列及びその開始コドン、および上流の調節配列が好適な発現ベクターに挿入された場合は、更なる転写調節シグナルや翻訳調節シグナルは必要ないこともある。しかしながら、コーディング配列或いはその断片のみが挿入された場合は、インフレームのATG開始コドンを含む外因性の翻訳調節シグナルが発現ベクターに含まれるようにすべきである。外因性の翻訳要素及び開始コドンは、様々な天然物及び合成物を起源とし得る。用いられる特定の宿主細胞系に好適なエンハンサーを含めることで発現の効率を高めることが可能である（例えばScharf, D. 他 (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162等を参照）。
【０２２３】
当業者によく知られている方法を用いて、NZMSをコードする配列と、好適な転写及び翻訳調節要素とを含む発現ベクターを構築することが可能である。これらの方法には、in vitro組換えDNA技術、合成技術、及びin vivo遺伝子組換え技術が含まれる(例えば、 Sambrook, J. 他. (1989) Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY, 4章及び8章及び１6-17章、Ausubel, F.M. 他. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York NY,9章、13章及び16章等を参照)。
【０２２４】
種々の発現ベクター／宿主系を利用して、NZMSをコードする配列の保持及び発現が可能である。限定するものではないがこのような発現ベクター／宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドDNA発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌などの微生物や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMVまたはタバコモザイクウイルスTMV）または細菌発現ベクター（例えばTiプラスミドまたはpBR322プラスミド）で形質転換させた植物細胞系または動物細胞系がある（前出のSambrook、前出のAusubel、Van Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509、Engelhard、E.K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V. 他(1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945、Takamatsu, N. (1987) EMBOJ. 6:307-311、;『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY, 191-196ページ、Logan, J.及びT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659、Harrington, J.J. 他 (1997) Nat. Genet. 15:345-355等を参照）。レトロウイルス、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来の発現ベクター、または種々の細菌性プラスミド由来の発現ベクターを用いて、ヌクレオチド配列を標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる（Di Nicola, M. 他 (1998) Cancer Gen. Ther. 5(6):350-356、Yu, M. 他(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(13):6340-6344、Buller, R.M. 他(1985) Nature 317(6040):813-815、McGregor, D.P. 他(1994) Mol. Immunol. 31(3):219-226、Verma, I.M.及びN. Somia (1997) Nature 389:239-242等を参照）。本発明は使用される宿主細胞によって限定されるものではない。
【０２２５】
細菌系では、多数のクローニングベクター及び発現ベクターが、NZMSをコードするポリヌクレオチド配列の使用目的に応じて選択可能である。例えば、NZMSをコードするポリヌクレオチド配列の日常的なクローニング、サブクローニング、増殖は、PBLUESCRIPT(Stratagene, La Jolla CA)またはPSPORT１プラスミド(Life Technologies)などの多機能の大腸菌ベクターを用いて達成できる。NZMSをコードする配列の、ベクターのマルチクローニング部位への連結反応によって、lacＺ遺伝子が破壊され、組換え分子を含む形質転換された細菌を同定するための比色スクリーニング法が可能となる。更にこれらのベクターは、クローニングされた配列におけるin vitro転写、ジデオキシのシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖のレスキュー、入れ子状態の欠失の生成にも有用であろう(Van Heeke, G.及びS.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509等を参照)。例えば、抗体の産生のためなどに多量のNZMSが必要な場合は、NZMSの発現をハイレベルで誘導するベクターが使用できる。例えば、強力な誘導SP6バクテリオファージプロモーターまたは誘導T7バクテリオファージプロモーターを有するベクターが使用できる。
【０２２６】
NZMSの生成に酵母の発現系の使用が可能である。α因子、アルコールオキシダーゼ、PGHプロモーター等の構成型或いは誘導型のプロモーターを含む多数のベクターが、出芽酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）またはピキア酵母（Pichia pastoris）に使用可能である。更に、このようなベクターは、発現したタンパク質の分泌か細胞内での保持のどちらかを指示する。また、安定した繁殖のために宿主ゲノムの中に外来配列を組み込むことを可能にする（例えば前出のAusubel, 1995; Bitter, G.A. 他 (1987) Methods Enzymol. 153:516-544、Scorer, C.A. 他. (1994) Bio/Technology 12:181-184等を参照）。
【０２２７】
植物系もNZMSの発現に使用可能である。NZMSをコードする配列の転写は、ウイルスプロモーター、例えば単独或いはＴＭＶ（Takamatsu, N. (1987) EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と組み合わせて用いられるようなCaMV由来の35S及び19Sプロモーターによって促進される。或いは、RUBISCOの小サブユニット等の植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを用いてもよい（例えばCoruzzi, G.他 (1984) EMBO J. 3:1671-1680、Broglie, R. 他 (1984) Science 224:838-843、Winter, J. 他. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105等を参照）。
これらの作製物は、直接DNA形質転換にまたは病原体を媒介とする形質移入によって、植物細胞内に導入可能である（『マグローヒル科学技術年鑑』(The McGraw Hill Yearbook of Science and Technology) (1992) McGraw Hill New York NY,191-196ページ等を参照）。
【０２２８】
哺乳動物細胞においては、多数のウイルスベースの発現系を利用し得る。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合、後期プロモーター及び３連リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にNZMSをコードする配列を結合し得る。ウイルスゲノムの非必須のE1またはE3領域への挿入を用いれば、宿主細胞でNZMSを発現する感染ウイルスを得ることが可能である。(例えば、Logan, J.及びT. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3655-3659等を参照)。更に、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサー等の転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞における発現を増大させ得る。SV40またはEBVをベースにしたベクターを用いてタンパク質を高レベルで発現させることもできる。
【０２２９】
ヒト人工染色体（HAC）を用いて、プラスミドに含まれ且つプラスミドから発現するものより大きなDNAの断片を送達することもできる。治療のために約6kb〜10MbのHACを作製し、従来の送達方法（リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、またはベシクル）で送達されている(Harrington, J.J.他 (1997) Nat. Genet. 15:345-355等を参照)。
【０２３０】
哺乳動物系の組換えタンパク質の長期にわたる産生のためには、株化細胞におけるNZMSの安定した発現が望ましい。例えば、NZMSをコードする配列を細胞株に形質転換するために、発現ベクター類と、同じベクター上の或いは別のベクター上の選択可能マーカー遺伝子とを用い得る。用いる発現ベクターは、ウイルス起源の複製要素、および／または内因性の発現要素を持ち得る。ベクターの導入後、選択培地に移す前に強化培地で約１〜２日間細胞を増殖させることができる。選択可能マーカーの目的は選択培地への抵抗性を与えることであり、選択可能マーカーが存在することにより、導入された配列をうまく発現するような細胞の成長及び回収が可能となる。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖可能である。
【０２３１】
任意の数の選択系を用いて、形質転換細胞株を回収できる。限定するものではないがこのような選択系には、tk−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子と、apr−細胞のために用いられる単純ヘルペスウイルスのアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子がある(Wigler, M. 他. (1977) Cell 11:223-232、Lowy, I. 他. (1980) Cell 22:817-823等を参照)。また、選択の基礎として代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え、neoはアミノグリコシッドネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え、alsはクロルスルフロンに対する耐性を、patはホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を各々与える(Wigler, M. 他. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:3567-3570、Colbere-Garapin, F.他 (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14等を参照)。この他の選択可能な遺伝子、例えば、代謝物のための細胞の必要条件を変えるtrpB及びhisDが、文献に記載されている(Hartman, S.C及びR.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047-8051等を参照)。可視マーカー、例えばアントシアニン、緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、βグルクロニダーゼ及びその基質βグルクロニド、またはルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等を用いてもよい。これらのマーカーを用いて、トランスフォーマントを特定するだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性或いは安定したタンパク質発現を定量することが可能である(Rhodes, C.A. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131等を参照)。
【０２３２】
マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在が示唆されても、その遺伝子の存在及び発現の確認が必要な場合もある。例えば、NZMSをコードする配列がマーカー遺伝子配列の中に挿入された場合、NZMSをコードする配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の欠落により同定可能である。または、１つのプロモーターの制御下でマーカー遺伝子を、NZMSをコードする配列とタンデムに配置することも可能である。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は通常、タンデム遺伝子も発現していることを意味する。
【０２３３】
一般に、NZMSをコードする核酸配列を含み且つNZMSを発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定するものではないが当業者によく知られている方法には、DNA-DNA或いはDNA-RNAハイブリダイゼーション、PCR法、核酸或いはタンパク質配列の検出、定量、或いはその両方を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク質の生物学的検定法または免疫学的検定法がある。
【０２３４】
特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるNZMSの発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で既知である。 このような技法には、酵素結合免疫吸着剤検定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、蛍光活性化細胞選別（FACS）などがある。NZMS上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた、２部位のモノクローナルベースイムノアッセイ（two-site, monoclonal-based immunoassay）が好ましいが、競合結合アッセイも用いることもできる。これらのアッセイ及びこれ以外のアッセイは、当分野で公知である（Hampton. R. 他 (1990) Serological Methods, a Laboratory Manual. APS Press. St Paul. MN, Sect. IV、Coligan, J. E. 他 (1997) Current Protocols in Immunology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience, New York NY、Pound, J.D. (1998) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa NJ等を参照）。
【０２３５】
多岐にわたる標識方法及び抱合方法が、当業者に知られており、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにこれらの方法を用い得る。NZMSをコードするポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブ或いはPCRプローブを生成する方法には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション、エンドラベリング（末端標識化)、または標識されたヌクレオチドを用いるPCR増幅が含まれる。別法として、NZMSをコードする配列、またはその任意の断片をmRNAプローブの生成のためのベクターにクローニングすることも可能である。このようなベクターは、当分野において知られており、市販もされており、T7、T3またはSP6等の好適なRNAポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えて、in vitroでRNAプローブの合成に用いることができる。このような方法は、例えばAmersham Pharmacia Biotech、Promega（Madison WI）、およびU.S. Biochemical等から市販されている種々のキットを用いて実行することができる。検出を容易にするために用い得る好適なレポーター分子或いは標識には、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子の他、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、発色剤等がある。
【０２３６】
NZMSをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。NZMSをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するNZMSの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【０２３７】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなポリペプチドの修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」または「プロ」形を切断する翻訳後のプロセシングを利用して、タンパク質の標的への誘導、折りたたみ及び／または活性を特定することが可能である。翻訳後の活性のための特異的な細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばCHO、HeLa、MDCK、MEK293、WI38等）は、American Type Culture Collection（ATCC, Manassas, VA）から入手可能であり、外来タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【０２３８】
本発明の別の実施例では、NZMSをコードする天然の核酸配列、修飾された核酸配列または組換え核酸配列を、或る異種配列にライゲーションすることにより、上記した任意の宿主系内で、或る融合タンパク質の翻訳を生じ得る。例えば、市販されている抗体を用いて認識可能な異種部分を含むキメラNZMSタンパク質は、NZMS活性阻害剤に対するペプチドライブラリのスクリーニングを促進し得る。また、異種タンパク質部分及び異種ペプチド部分も、市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合タンパク質（MBP）、チオレドキシン（Trx）、カルモジュリン結合ペプチド（CBP）、6-His、FLAG、c-myc、赤血球凝集素（HA）がある。GSTは固定化グルタチオン上で、MBPはマルトース上で、Trxはフェニルアルシンオキシド上で、CBPはカルモジュリン上で、そして6-Hisは金属キレート樹脂上で、同族の融合タンパク質の精製を可能にする。FLAG、c-myc及び赤血球凝集素（HA）は、これらのエピトープ標識を特異的に認識する市販されているモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて、融合タンパク質の免疫親和性精製を可能にする。また、NZMSが精製後に異種部分から切断できるように、NZMSコード配列と異種タンパク質配列の間にタンパク質分解性切断部位を含めるように融合タンパク質を遺伝子操作することもできる。融合タンパク質の発現及び精製方法は、前出のAusubel (1995) 10章に記載されている。市販されている種々のキットを用いて融合タンパク質の発現及び精製を促進することもできる。
【０２３９】
本発明の別の実施例では、TNTウサギ網状赤血球可溶化液またはコムギ胚芽抽出系(Promega)を用いてin vitroで、放射能標識したNZMSの合成が可能である。これらの系は、T7、T3またはSP6プロモーターと機能的に連結したタンパク質コード配列の転写及び翻訳をカップルさせる。翻訳は、例えば35Sメチオニンのような放射能標識したアミノ酸前駆体の存在下で起こる。
【０２４０】
本発明のNZMSまたはその断片を用いて、NZMSに特異結合する化合物をスクリーニングすることができる。少なくとも１つまたは複数の試験化合物を用いて、NZMSへの特異的な結合をスクリーニングすることが可能である。試験化合物の例には、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば受容体）または小分子が挙げられる。
【０２４１】
或る実施態様では、このように同定された化合物は、DMEの天然リガンドに密接に関連し、例えばリガンドやその断片であり、または天然基質や、構造的または機能的な擬態物質（mimetic）、あるいは自然結合パートナーである（Coligan, J.E. 他 (1991) Current Protocols in Immunology 1(2)の5章等を参照）。同様に、この化合物は、NZMSが結合する天然受容体、或いは例えばリガンド結合部位などの少なくとも受容体のある断片に密接に関連し得る。何れの場合も、既知の技術を用いてこの化合物を合理的に設計することができる。一実施例では、このような化合物に対するスクリーニングには、分泌タンパク質或いは細胞膜上のタンパク質の何れか一方としてNZMSを発現する好適な細胞の作製が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、酵母、ショウジョウバエ、あるいは大腸菌からの細胞が含まれる。NZMSを発現する細胞またはNZMSを含有する細胞膜分画を次に試験化合物と接触させて、NZMSまたは化合物の何れかの結合、刺激または活性の阻害を分析する。
【０２４２】
あるアッセイは、単に試験化合物をポリペプチドに実験的に結合させ、結合を、フルオロフォア、放射性同位体、酵素抱合体またはその他の検出可能な標識により検出することができる。例えば、このアッセイは、少なくとも１つの試験化合物を、溶液中の或いは固体支持物に固定されたNZMSと混合するステップと、NZMSとこの化合物との結合を検出するステップを含み得る。別法では、アッセイでは標識された競合物の存在下での試験化合物の結合の検出及び測定を行うことができる。更にこのアッセイでは、無細胞再構成標本、化学ライブラリまたは天然産物の混合物を用いて実施することができ、試験化合物は、溶液中で遊離させるか固体支持体に固定させる。
【０２４３】
本発明のNZMSまたはその断片を用いて、NZMSの活性を調節する化合物をスクリーニングすることが可能である。このような化合物には、アゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、または逆アゴニスト等が含まれうる。一実施例では、NZMSの活性が許容される条件下でアッセイを実施し、そのアッセイでは少なくとも1つの試験化合物をNZMSと混合し、試験化合物の存在下でのNZMSの活性を試験化合物不在下でのNZMSの活性と比較する。試験化合物の存在下でのNZMSの活性の変化は、NZMSの活性を調節する化合物の存在を示唆する。別法では、試験化合物を、NZMSの活性に適した条件下で、NZMSを有するin vitro系すなわち無細胞系と混合してアッセイを実施する。これらアッセイの何れにおいても、NZMSの活性を調節する試験化合物は間接的に調節する場合があり、その際は試験化合物と直接接触する必要がない。少なくとも１つから複数の試験化合物をスクリーニングすることができる。
【０２４４】
別の実施例では、胚性幹細胞（ES細胞）における相同組換えを用いて動物モデル系内で、NZMSまたはその哺乳動物相同体をコードするポリヌクレオチドを「ノックアウト」する。このような技術は当技術分野において周知であり、ヒト疾患動物モデルの作製に有用である（米国特許第5,175,383号及び第5,767,337号等を参照）。例えば129/SvJ細胞株等のマウスES細胞は初期のマウス胚に由来し、培地で増殖させることができる。このES細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neo: Capecchi, M.R. (1989) Science 244:1288-1292）等のマーカー遺伝子で破壊した目的の遺伝子を含むベクターで形質転換する。このベクターは、相同組換えにより宿主ゲノムの対応する領域に組み込まれる。別法では、Cre-loxP系を用いて相同組換えを行い、組織特異的または発生段階特異的に目的遺伝子をノックアウトする（Marth, J.D. (1996) Clin. Invest. 97:1999-2002; Wagner, K.U.他 (1997) Nucleic Acids Res. 25:4323-4330）。形質転換したES細胞を同定し、例えばC57BL/6マウス株等から採取したマウス細胞胚盤胞に微量注入する。胚盤胞を偽妊娠メスに外科的に導入し、得られるキメラ子孫の遺伝形質を特定し、これを交配させてヘテロ接合性系またはホモ接合性系を作製する。このようにして作製した遺伝子組換え動物は、可能性のある治療薬や毒性薬剤で検査することができる。
【０２４５】
NZMSをコードするポリヌクレオチドをin vitroでヒト胚盤胞由来のES細胞において操作することが可能である。ヒトES細胞は、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞の種類を含む少なくとも８つの別々の細胞系統に分化する可能性を有する。これらの細胞系統は、例えば神経細胞、造血系統および心筋細胞に分化する（Thomson, J.A.他 (1998) Science 282:1145-1147）。
【０２４６】
NZMSをコードするポリヌクレオチドを用いて、ヒト疾患をモデルとした「ノックイン」ヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換え動物（マウスまたはラット）を作製することが可能である。ノックイン技術を用いて、NZMSをコードするポリヌクレオチドの或る領域を動物ES細胞に注入し、注入した配列を動物細胞ゲノムに組み込ませる。形質転換細胞を胞胚に注入し、胞胚を上記のように移植する。遺伝子組換え子孫または近交系について研究し、可能性のある医薬品を用いて処理し、ヒトの疾患の治療に関する情報を得る。別法では、例えばNZMSを乳汁内に分泌するなどNZMSを過剰発現する哺乳動物近交系は、便利なタンパク質源となり得る（Janne, J. 他 (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4:55-74）。
【０２４７】
（治療）
NZMSのある領域と酵素の領域との間に、例えば配列およびモチーフの文脈における化学的および構造的類似性が存在する。さらに、NZMSの発現は脳組織、腎臓組織、肺組織、心室組織、食道腫瘍組織、前立腺腫瘍組織に密接に関連している。従って、NZMSは、免疫系の疾患、免疫不全、発達障害、代謝障害、平滑筋障害、神経の疾患、心臓障害、肺疾患、寄生虫感染、および癌を含む細胞増殖異常においてある役割を果たすと考えられる。NZMSの発現若しくは活性の増大に関連する疾患の治療においては、NZMSの発現または活性を低下させることが望ましい。また、NZMSの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、NZMSの発現または活性を増大させることが望ましい。
【０２４８】
従って、一実施例において、NZMSの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、被験者にNZMSまたはその断片や誘導体を投与することが可能である。限定はされないがそのような疾患には、免疫系疾患として、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ(リウマチ様関節炎)、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症(強皮症)、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、免疫不全には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、ブルトン型X染色体性無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全(CVI)、DiGeorge症候群（胸腺低形成）、胸腺形成異常、IgA単独欠損症、重症複合型免疫不全症（SCID）、血小板減少と湿疹を伴う免疫不全症（Wiskott-Aldrich症候群）、Chediak−東症候群、慢性肉芽腫症、遺伝性血管神経症浮腫、Cushing病を伴う免疫不全が含まれ、発達障害には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Smith-Magenis syndrome）、骨髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症や、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症や、Syndenham舞踏病（Syndenham's chorea）および脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれ、眼疾患には、高眼圧症と緑内障が含まれ、代謝障害には、シェーグレン・ラルソン症候群（SLS）、高プロリン血症II型、急性アルコール中毒、副腎脳白質ジストロフィー、Alport症候群、コロイデレミア、デュシェンヌおよびベッカー型筋ジストロフィー、ダウン症候群、嚢胞性線維症、慢性肉芽腫症、ゴーシェ病、ハンチントン病、Marfan症候群、筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、濃化異骨症（ピクノディスオストーシス）、Refsum症候群、網膜芽細胞種、鎌状赤血球貧血、サラセミア、ウェルナー症候群、von Willebrand症候群、ウィルムス腫瘍、ツェルヴェーガー症候群、ペルオキシソームアシルCoAオキシダーゼ欠損症、ペルオキシソームチオラーゼ欠損症、ペルオキシソーム二頭タンパク質欠損症、ミトコンドリアカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼおよびカルニチン欠損��、ミトコンドリア超長鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症、ミトコンドリア中鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症、ミトコンドリア短鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症、ミトコンドリア電子伝達フラビンタンパク質および電子伝達フラビンタンパク質：ユビキノン酸化還元酵素欠損症、ミトコンドリア三機能性タンパク質欠乏症およびミトコンドリア短鎖３ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症が含まれ、平滑筋疾患には、狭心症、アナフィラキシーショック、不整脈、喘息、心血管性ショック、クッシング症候群、高血圧、低血糖症、心筋梗塞、片頭痛、およびクロム親和細胞腫(褐色細胞腫)、およびミオパシー（心筋症を含む）、脳症(encephalopathy)、癲癇、カーンズ・セイヤ症候群、乳酸アシドーシス、ミオクローヌス疾患、および眼筋麻痺、高アンモニア血症、トリメチルアミン尿症（魚臭症候群）、３−ヒドロキシジカルボン酸尿症、ジカルボン酸尿症、キサンチン尿症、先天性副腎リポイド過形成(CLAH)、白皮症３型、高インシュリン-高アンモニア血症症候群（ＨＨＳ）、グルタル酸血症１型（GA-I)、家族性再発性ミオグロビン尿症、インシュリン抵抗性、遺伝性チミン‐ウラシル尿症(家族性ピリミジン血症)、突発性鉄芽球性貧血（ＡＩＳＡ）、新生児型副腎白質ジストロフィー、低酸素症、外傷による組織への損壊悪化、被曝と紫外線照射、肝機能障害、著しい肥満症、メトヘモグロビン血症(HM1、HM2、HM3)、hypertrophic hirsutism with amenorrhea、ハーマンスキー−プゥドラック症候群、ライ症候群、hypoketotic低血糖症、イソ吉草酸血症、慢性溶血性貧血が含まれ、神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎(網膜色素変性症)、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳三叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞及び他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄疾患筋ジストロフィー、および他の神経筋障害、末梢神経系疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の障害、分裂病（統合失調症）性疾患を含む精神障害と、季節性感情障害（SAD）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群(遅発性ジスキネジア)、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症及び家族性前頭側頭型痴呆および、レッシュ-ナイハン症候群が含まれ、心血管疾患の中には、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、拡張蛇行静脈(静脈瘤)、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術、大動脈冠状動脈バイパス手術、うっ血性心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性二尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、及び心臓移植の合併症が含まれ、呼吸器系の疾患には、先天性肺異常、肺拡張不全、肺うっ血及び肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、細気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏症肺炎、肺好酸球増加閉塞性細気管支炎―器質性肺炎（pulmonary eosinophilia bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、肺併発膠原血管病併発性肺疾患、肺胞たんぱく症、肺腫瘍、炎症性及び非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、及び肺移植の合併症、プラスモディムまたはマラリア性、寄生アメーバ症、リーシュマニア属、トリパノソーマ属、トキソプラスマ属、ニューモシスティスカリニ属、ジアルジアのような腸内原生動物類、トリコモナス属、旋毛虫のような組織線虫類、回虫のような腸内線虫類、リンパ性フィラリア線虫類、住血吸虫のような吸虫類および条虫類(サナダムシ)として分類される寄生虫による感染症、細胞増殖異常の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれる。別の実施例では、限定するものではないが上に列記した疾患を含むNZMSの発現または活性の低下に関連した疾患の治療または予防のために、NZMSまたはその断片や誘導体を発現し得るベクターを被験者に投与することも可能である。
【０２４９】
更に別の実施例では、実質的に精製されたNZMSを含む組成物を好適な医薬用キャリアと共に被験者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むNZMSの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２５０】
更に別の実施例では、NZMSの活性を調節するアゴニストを被験者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むNZMSの発現または活性の低下に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２５１】
更に別の実施例では、被験者にNZMSのアンタゴニストを投与して、NZMSの発現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することが可能である。限定するものではないが、このような疾患の例には、上記した免疫系の疾患、免疫不全、発達障害、代謝障害、神経の疾患、肺の疾患、寄生虫による感染、および癌を含む細胞増殖異常が含まれる。
【０２５２】
一実施態様においては、アンタゴニストとして直接的に、或いはNZMSを発現する細胞または組織に薬剤を輸送するターゲティングまたは送達機構として間接的にNZMSと特異結合する抗体を用いることができる。
【０２５３】
別の実施例では、NZMSをコードするポリヌクレオチドの相補体を発現するベクターを被験者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むNZMSの発現または活性の増大に関連した疾患を治療または予防することも可能である。
【０２５４】
別の実施例では、本発明の任意のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列、またはベクターを、別の好適な治療薬と組み合わせて投与することもできる。併用療法で用いる好適な治療薬は、当業者が従来の医薬原理に従ってを選択し得る。治療薬と組み合わせることにより、上記した種々の疾患の治療または予防に相乗効果をもたらし得る。この方法を用いることにより少量の各薬剤で医薬効果をあげることが可能となり、それによって副作用の可能性を低減し得る。
【０２５５】
NZMSのアンタゴニストは、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。詳しくは、精製されたNZMSを用いて抗体を作ったり、治療薬のライブラリをスクリーニングしてNZMSと特異的に結合するものの同定が可能である。NZMSの抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。 このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。一本鎖抗体（例えばラクダまたはラマに由来する）は強力な酵素インヒビターであり得る。またペプチド擬態物質の設計及び免疫吸着剤とバイオセンサーの開発に長所を有し得る(Muyldermans, S. (2001) J. Biotechnol. 74:277-302)。
【０２５６】
抗体の産生のためには、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ヒト及びその他のものを含む種々の宿主が、NZMSまたは任意の断片、または免疫原性の特性を備えるそのオリゴペプチドの注入によって免疫化され得る。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫応答を高めることもできる。限定するものではないがこのようなアジュバントには、フロイントアジュバントと、水酸化アルミニウム等のミネラルゲルアジュバントと、リゾレシチン、プルロニックポリオル、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシガイのヘモシニアン、ジニトロフェノール等の界面活性剤とがある。ヒトに用いられるアジュバントの中では、BCG（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム‐パルバム（Corynebacterium parvum）が特に好ましい。
【０２５７】
NZMSに対する抗体を誘導するために用いられるオリゴペプチド、ペプチド、または断片は、少なくとも約５個のアミノ酸を持つものが好ましく、一般的には、約１０個以上のアミノ酸からなる配列となる。これらのオリゴペプチド、ペプチドまたは断片は、天然のタンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であることも望ましい。NZMSのアミノ酸群の短い区間を、KLHなどの別のタンパク質の配列と融合し、このキメラ分子に対する抗体を産生し得る。
【０２５８】
NZMSに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続した細胞株によって、抗体分子を産生する任意の技術を用いて作製することが可能である。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びEBV-ハイブリドーマ技術がある（Kohler, G. 他 (1975) Nature 256:495-497、Kozbor, D.他 (1985) .J. Immunol. Methods 81:31-42、Cote, R.J. 他 (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030、Cole, S.P.他 (1984) Mol. Cell Biol. 62:109-120等を参照）。
【０２５９】
更に、ヒト抗体遺伝子にマウス抗体遺伝子をスプライシングするなどの「キメラ抗体」作製のために開発した技術が、好適な抗原特異性及び生物学的活性を備える分子を得るために用いられる（例えば、Morrison, S.L.他. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855、Neuberger, M.S.他. (1984) Nature 312:604-608、Takeda, S.他. (1985) Nature 314:452,454を参照）。別法では、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を適用して、NZMS特異性一本鎖抗体を生成しうる。関連する特異性を有するがイディオタイプ組成が異なるような抗体を、ランダムな組合せの免疫グロブリンライブラリからチェーンシャッフリングによって産生することもできる（Burton D.R. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137等を参照）。
【０２６０】
抗体の産生は、リンパ球集団におけるin vivo産生の誘導によって、或いは文献に開示されているように非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンのライブラリまたはパネルのスクリーニングによっても行い得る（Orlandi, R. 他 (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833-3837、Winter, G.他 (1991) Nature 349:293-299等を参照）。
【０２６１】
NZMSのための特異結合部位を有する抗体断片を産生することもできる。例えば、限定するものではないが、このような断片には、抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab')2 断片と、F(ab')2 断片のジスルフィド架橋を還元することによって作製されるFab断片とがある。あるいは、Fab発現ライブラリを作製することによって、所望の特異性を持つモノクローナルFab断片を迅速且つ容易に同定することが可能となる(Huse, W.D他 (1989) Science 246:1275-1281等を参照)。
【０２６２】
種々のイムノアッセイを用いてスクリーニングし、所望の特異性を有する抗体を同定することができる。確立された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合結合アッセイ、または免疫放射定量測定法のための数々のプロトコルが、当分野では周知である。通常このようなイムノアッセイには、NZMSとその特異性抗体との間の複合体形成の計測が含まれる。二つの非干渉性NZMSエピトープに対して反応性を持つモノクローナル抗体を用いる、２部位モノクローナルベースのイムノアッセイが一般に利用されるが、競合的結合アッセイも利用することができる(Pound、前出)。
【０２６３】
ラジオイムノアッセイ技術と共にScatchard分析などの様々な方法を用いて、NZMSに対する抗体の親和性を評価する。親和性を結合定数Kaで表すが、このKaは、平衡状態の下でNZMS抗体複合体のモル濃度を遊離抗体と遊離抗原のモル濃度で除して得られる値である。ポリクローナル抗体類は多数のNZMSエピトープに対して親和性が不均一であり、或るポリクローナル抗体製剤に関して判定したKaは、NZMSに対する抗体群の平均の親和性または結合活性を表す。特定のNZMSエピトープに単一特異的なモノクローナル抗体の製剤のＫａは、親和性の真の測定値を表す。Ka値が10９〜10１２liter／ｍｏｌの高親和性抗体製剤は、NZMS抗体複合体が激しい操作に耐えなければならないイムノアッセイに用いるのが好ましい。Ka値が10６〜10７Ｌ／ｍｏｌの低親和性抗体製剤は、NZMSが抗体から最終的に活性化状態で解離する必要がある免疫精製（immunopurification）及び類似の処理に用いるのが好ましい。 (Catty, D. (1988) Antibodies, Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Washington, DC; Liddell, J. E.およびCryer, A. (1991) A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York NY)。
【０２６４】
ポリクローナル抗体製剤の抗体価及び結合活性を更に評価して、後に使う或る適用例に対するこのような試薬の品質及び適性を決定することができる。例えば、少なくとも1〜2ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体、好ましくは5〜10ｍｇ／ｍｌの特異的な抗体を含むポリクローナル抗体製剤は一般に、NZMS抗体複合体を沈殿させなければならない処理に用いられる。抗体の特異性、抗体価、結合活性、様々な適用例における抗体の品質や使用に対する指針については、一般に入手可能である（前出のCattyの文献、同Coligan他の文献等を参照）。
【０２６５】
本発明の別の実施例では、NZMSをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片や相補配列が、治療目的で使用されうる。ある実施態様では、NZMSをコードする遺伝子のコーディング領域や調節領域に相補的な配列やアンチセンス分子（DNA、RNA、PNAあるいは修飾ヌクレオチド）を設計して遺伝子発現を変更することができる。このような技術は当分野では周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはより大きな断片が、NZMSをコードする配列の制御領域またはコード領域に沿ったさまざまな位置から設計可能である。(Agrawal, S.編集 (1996) Antisense Therapeutics, Humana Press Inc., Totawa NJ等を参照)。
【０２６６】
治療に用いる場合、アンチセンス配列を好適な標的細胞に導入するのに好適な任意の遺伝子送達系を用いることができる。アンチセンス配列は、転写時に標的タンパク質をコードする細胞配列の少なくとも一部に相補的な配列を作製する発現プラスミドの形で、細胞内に送達し得る（例えばSlater, J.E. 他 (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102(3):469-475、 Scanlon, K.J.他 (1995) 9(13):1288-1296を参照）。
アンチセンス配列はまた、例えばレトロウイルスやアデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて細胞内に導入することもできる（Miller, A.D. (1990) Blood 76:271、前出のAusubel、Uckert, W.及びW. Walther (1994) Pharmacol. Ther. 63(3):323-347等を参照）。その他の遺伝子送達機構には、リポソーム系、人工的なウイルスエンベロープおよび当分野で公知のその他のシステムが含まれる（例えばRossi, J.J.（1995）Br. Med. Bull. 51（1）:217-225、Boado、R.J.他 (1998) J. Pharm. Sci. 87(11):1308-1315、Morris, M.C. 他. (1997) Nucleic Acids Res. 25(14):2730-2736を参照）。
【０２６７】
本発明の別の実施例では、NZMSをコードするポリヌクレオチドを、体細胞若しくは生殖細胞遺伝子治療に用いることが可能である。遺伝子治療を行うことにより、（i）遺伝子欠損症（例えばＸ染色体鎖遺伝（Cavazzana-Calvo, M. 他 (2000) Science 288:669-672）により特徴付けられる重症複合型免疫欠損(SCID)-X1の場合）、先天性アデノシンデアミナーゼ（ADA）欠損症に関連する重症複合型免疫欠損（Blaese, R.M. 他(1995) Science 270:475-480、Bordignon, C. 他 (1995) Science 270:470-475）、嚢胞性繊維症（Zabner, J. 他 (1993) Cell 75:207-216: Crystal、R.G. 他 (1995) Hum. Gene  Therapy 6:643-666、Crystal, R.G. 他. (1995) Hum. Gene Therapy 6:667-703）、サラセミア（thalassamia）、家族性高コレステロール血症、第VIII因子若しくは第IX因子欠損に起因する血友病（Crystal, R.G. (1995) Science 270:404-410、Verma, I.M. 及びSomia. N. (1997) Nature 389:239-242）を治療し、（ii）条件的致死性遺伝子産物を発現させ（例えば制御不能な細胞増殖に起因する癌の場合）、（iii）細胞内の寄生体（例えばヒト免疫不全ウイルス(HIV)（Baltimore, D. (1988) Nature 335:395-396、Poescbla, E. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:11395-11399）などヒトレトロウイルス、B型若しくはC型肝炎ウイルス（HBV、HCV）、Candida albicans及びParacoccidioides brasiliensis等の真菌寄生体、並びにPlasmodium falciparum及びTrypanosoma cruzi等の原虫寄生体に対する防御機能を有するタンパク質を発現させることができる。NZMSの発現若しくは調節に必要な遺伝子の欠損が疾患を引き起こす場合、導入した細胞の好適な集団からNZMSを発現させて、遺伝子欠損によって起こる症状の発現を緩和することが可能である。
【０２６８】
本発明の更なる実施例では、NZMSの欠損による疾患や異常症は、NZMSをコードする哺乳動物発現ベクターを作製して、これらのベクターを機械的手段によってNZMS欠損細胞に導入することによって治療する。in vivo或いはex vitroの細胞に用いる機械的導入技術には、（i）個々の細胞内への直接的なDNA微量注射法、（ii）遺伝子銃、（iii）リポソームを介した形質移入、（iv）受容体を介した遺伝子導入、及び（v）DNAトランスポソンの使用（Morgan, R.A.およびW.F. Anderson (1993) Annu. Rev. Biochem. 62:191-217、Ivics, Z. (1997) Cell 91:501-510、Boulay,J-L.およびH. Recipon (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:445-450）がある。
【０２６９】
限定するものではないがNZMSの発現に有効でありうる発現ベクターには、PCDNA 3.1、EPITAG、PRCCMV2、PREP、PVAX、PCR2-TOPOTAベクター（Invitrogen, Carlsbad CA）、PCMV-SCRIPT、PCMV-TAG、PEGSH/PERV（Stratagene, La Jolla CA）及びPTET-OFF、PTET-ON、PTRE2、PTRE2-LUC、PTK-HYG（Clontech, Palo Alto CA）がある。NZMSを発現させるために、（i）構成的に活性なプロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（CMV）、ラウス肉腫ウイルス（RSV）、SV40ウイルス、チミジンキナーゼ（TK）、若しくはβ−アクチン遺伝子等）、(ii)誘導性プロモーター（例えば、市販されているT-REXプラスミド（Invitrogen）に含まれている、テトラサイクリン調節性プロモーター（Gossen, M.及びH. Bujard (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:5547-5551; Gossen, M. 他 (1995) Science 268:1766-1769; Rossi, F.M.V及びH.M. Blau (1998) Curr. Opin. Biotechnol. 9:451-456））、エクジソン誘導性プロモーター（市販されているプラスミドPVGRXR及びPINDに含まれている：Invitrogen）、FK506／ラパマイシン誘導性プロモーター、またはRU486／ミフェプリストーン誘導性プロモーター（Rossi, F.M.V.及びH.M. Blau, 前出）、または（iii）正常な個体に由来するNZMSをコードする内在性遺伝子の天然のプロモーター若しくは組織特異的プロモーターを用いることが可能である。
【０２７０】
市販のリポソーム形質転換キット（例えばInvitrogen社のPerFect Lipid Transfection Kit）を用いれば、当業者はポリヌクレオチドを、培養中の標的細胞に送達することが可能になる。また、実験パラメータ群を最適化するのに必要な努力が最小限になる。別法では、リン酸カルシウム法（Graham. F.L.及びA.J. Eb (1973) Virology 52:456-467）若しくは電気穿孔法（Neumann, B.他 (1982) EMBO J. 1:841-845）を用いて形質転換を行う。初代培養細胞にDNAを導入するためには、標準化された哺乳動物の形質移入プロトコルの修飾が必要である。
【０２７１】
本発明の別の実施例では、NZMSの発現に関連する遺伝子欠損によって起こる疾患や異常症は、（i）レトロウイルス末端反復配列（LTR）プロモーター若しくは独立したプロモーターのコントロール下でNZMSをコードするポリヌクレオチドと、（ii）好適なRNAパッケージングシグナルと、（iii）追加のレトロウイルス・シス作用性RNA配列及び効率的なベクターの増殖に必要なコーディング配列を伴うRev応答性因子（RRE）とからなるレトロウイルスベクターを作製して治療することができる。レトロウイルスベクター（例えばPFB及びPFBNEO）はStratagene社から市販されており、刊行データ（Riviere, I. 他. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:6733-6737）に基づいている。上記データを引用することをもって本明細書の一部とする。ベクターは、好適なベクター産生細胞株（VPCL）において増殖され、VPCLは、標的細胞上の受容体に対する親和性を有するエンベロープ遺伝子またはVSVg等の汎親和性エンベロープタンパク質を発現する（Armentano, D. 他 (1987) J. Virol. 61:1647-1650、Bender, M.A. 他 (1987) J. Virol. 61:1639-1646、Adam, M.A.およびA.D. Miller (1988) J. Virol. 62:3802-3806、Dull, T. 他 (1998) J. Virol. 72:8463-8471、Zufferey, R. 他 (1998) J. Virol. 72:9873-9880）。Riggに付与された米国特許第5,910,434号（「Method for obtaining retrovirus packaging cell lines producing high transducing efficiency retroviral supernatant」）において、レトロウイルスパッケージング細胞系を得るための方法が開示されており、引用することをもって本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターの増殖、細胞集団（例えばCD4+ Ｔ細胞）の形質導入、及び形質導入した細胞の患者への戻しは、遺伝子治療の分野では当業者に公知の方法であり、多数の文献に記載されている（Ranga, U. 他 (1997) J. Virol. 71:7020-7029、Bauer, G.他(1997) Blood 89:2259-2267、Bonyhadi, M.L. (1997) J. Virol. 71:4707-4716、Ranga, U.他 (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1201-1206、Su, L. (1997) Blood 89:2283-2290）。
【０２７２】
別法では、アデノウイルス系遺伝子治療の送達系を用いて、NZMSの発現に関連する１つ若しくは複数の遺伝子異常を有するような細胞にNZMSをコードするポリヌクレオチドを送達する。アデノウイルス系ベクター類の作製およびパッケージングについては、当業者に周知である。複製欠損型アデノウイルスベクター類は、種々の免疫調節タンパク質をコードする遺伝子群を、無損傷の膵島内にインポートする目的で多様に利用し得ることが証明された（Csete, M.E.他 (1995) Transplantation 27:263-268）。潜在的に有用なアデノウイルスベクターは、Armentanoに付与された米国特許第5,707,618号（「Adenovirus vectors for gene therapy」）に記載されており、引用することをもって本明細書の一部とする。アデノウイルスベクターについては、Antinozzi, P.A. 他 (1999) Annu. Rev. Nutr. 19:511-544、Verma, I.M.及びN. Somia (1997) Nature 18:389:239-242も参照されたい。両文献は、引用することをもって本明細書の一部とする。
【０２７３】
別法では、ヘルペス系遺伝子治療の送達系を用いて、NZMSの発現に関連する１つ或いは複数の遺伝子異常を有する標的細胞にNZMSをコードするポリヌクレオチドを送達する。単純疱疹ウイルス（HSV）系のベクターの使用は、HSVが向性を持つ中枢神経細胞にNZMSを導入する際に特に有用たり得る。ヘルペス系ベクター類の作製およびパッケージングは、当業者に公知である。或る複製適格性単純ヘルペスウイルス（HSV）I型系のベクターが、或るレポーター遺伝子の、霊長類の眼への送達に用いられている（Liu, X. 他 (1999) Exp. Eye Res. 169:385-395）。HSV-1ウイルスベクターの作製についても、DeLucaに付与された米国特許第5,804,413号（「Herpes simplex virus strains for gene transfer」）に開示されており、該特許の引用をもって本明細書の一部とする。米国特許第5,804,413号には、ヒト遺伝子治療を含む目的のために好適なプロモーターの制御下において細胞に導入される少なくとも１つの外因性遺伝子を有するゲノムを含む組換えHSV d92の使用についての記載がある。上記特許はまた、ICP4、ICP27及びICP22を欠失した組換えHSV系統の作製及び使用について開示している。HSVベクターについては、Goins, W.F.他 (1999) J. Virol. 73:519-532及びXu, H. 他 (1994) Dev. Biol. 163:152-161も参照されたい。両文献は、引用をもって本明細書の一部とする。クローン化ヘルペスウイルス配列の操作、大ヘルペスウイルスゲノム（large herpesvirus genomes）の様々なセグメントを含む多数のプラスミドを形質移入した後の組換えウイルスの産生、ヘルペスウイルスの成長及び増殖、並びにヘルペスウイルスの細胞への感染は、当業者に公知の技術である。
【０２７４】
別法では、αウイルス（正の一本鎖RNAウイルス）ベクターを用いてNZMS をコードするポリヌクレオチドを標的細胞に送達する。プロトタイプのαウイルスであるセムリキ森林熱ウイルス（SFV）の生物学的研究が広範に行われており、遺伝子導入ベクターはSFVゲノムに基づいている（Garoff, H.及びK.-J. Li (1998) Cun. Opin. Biotech. 9:464-469）。αウイルスRNAの複製中に、ウイルスのカプシドタンパク質群を通常はコードする、サブゲノムRNAが作り出される。このサブゲノムRNAは、完全長のゲノムRNAより高いレベルに複製されるため、酵素活性（例えばプロテアーゼ及びポリメラーゼ）を有するウイルスタンパク質に比べてカプシドタンパク質が過剰産生される。同様に、NZMSに対するコード配列をαウイルスゲノムのカプシドをコードする領域に導入することにより、ベクター導入細胞において多数のNZMSコードRNAが産生され、高レベルのNZMSが合成される。通常、αウイルスの感染は、数日以内の細胞溶解を伴う。一方、シンドビスウイルス（SIN）の或る変異体を有するハムスター正常腎臓細胞（BHK-21）群が持続的な感染を確立する能力は、αウイルス類の溶解複製を、遺伝子治療に応用し得るように好適に改変可能であることを示唆する（Dryga, S.A.他 (1997) Virology 228:74-83）。αウイルスの宿主域は広いので、様々なタイプの細胞にNZMSを導入できることとなる。或る集団におけるサブセットの細胞の特定形質導入は、形質導入前に細胞の選別を必要とし得る。αウイルスの感染性cDNAクローンの処置方法、αウイルスのcDNA及びRNAの形質移入方法及びαウイルスの感染方法は、当業者に公知である。
【０２７５】
転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子発現を阻害することも可能である。転写開始部位(transcription initiation site)とは例えばスタート部位(start site)から数えて約−10と約＋１０の間である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重らせんDNAを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Gee, J.E.他 (1994) in: Huber、B.E.及びB.I. Carr, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, NY, 163-177ページ等を参照）。相補配列またはアンチセンス分子もまた、転写物がリボソームに結合するのを阻止することによってmRNAの翻訳を阻止するべく設計することができる。
【０２７６】
リボザイムは酵素的RNA分子であり、RNAの特異的切断を触媒するためにリボザイムを用いることもできる。リボザイム作用のメカニズムは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の配列特異性ハイブリダイゼーションとその後に起こる内ヌクレオチド鎖切断に関与している。例えば、遺伝子操作で作られたハンマーヘッド型リボザイム分子が、NZMSをコードする配列の内ヌクレオチド鎖切断を特異的且つ効果的に触媒できる可能性がある。
【０２７７】
任意の潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、GUC配列を含めたリボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって先ず同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列が、そのオリゴヌクレオチドを機能不全にするような２次構造の特徴をもっていないかを評価することが可能になる。候補標的の適合性の評価も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのアクセス可能性をテストすることによって行うことができる。
【０２７８】
本発明の相補リボ核酸分子及びリボザイムは、核酸分子合成のために当分野でよく知られている任意の方法を用いて作製し得る。作製方法には、固相フォスフォアミダイト化学合成等の、オリゴヌクレオチドを化学的に合成する方法がある。或いは、NZMSをコードするDNA配列のin vitro及びin vivo転写によってRNA分子を産出し得る。このようなDNA配列は、T7やSP6等の好適なRNAポリメラーゼプロモーターを用いて多様なベクター内に取り込むことが可能である。或いは、相補的RNAを構成的或いは誘導的に合成するようなこれらcDNA作製物を、細胞株、細胞または組織内に導入することができる。
【０２７９】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにRNA分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５'末端、３'末端、あるいはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネートまたは2' O-メチルを使用したりすることが含まれる。この概念は、PNAの産出に固有のものであるが、これら全ての分子に拡大することができる。そのためには、内因性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されない、アデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものや、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（queosine）、ワイブトシン（wybutosine）等を含める。
【０２８０】
本発明の追加実施例は、NZMSをコードするポリヌクレオチドの発現の改変に有効な化合物をスクリーニングする方法を含む。限定するものではないが特異ポリヌクレオチドの発現改変を起こすのに有効な化合物には、オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、三重らせん形成オリゴヌクレオチド、転写因子その他のポリペプチド転写制御因子、及び特異ポリヌクレオチド配列と相互作用し得る非高分子化学的実体がある。有効な化合物は、ポリヌクレオチド発現のインヒビターまたはエンハンサーのいずれかとして作用することによりポリヌクレオチド発現を改変し得る。従って、NZMSの発現または活性の増加に関連する疾患の治療においては、NZMSをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に阻害する化合物が治療上有用であり、NZMSの発現または活性の低下に関連する疾患の治療においては、NZMSをコードするポリヌクレオチドの発現を特異的に促進する化合物が治療上有用であり得る。
【０２８１】
特異ポリヌクレオチドの発現を改変する際の有効性に対して、少なくとも１個から複数個の試験化合物をスクリーニングし得る。試験化合物は、当分野で通常知られている任意の方法により得られる。このような方法には、ポリヌクレオチドの発現を変容させる場合と、既存の、商用のまたは専用の、天然または非天然の化合物ライブラリから選択する場合と、標的ポリヌクレオチドの化学的及び／または構造的特性に基づく化合物を合理的にデザインする場合と、組合せ的にまたは無作為に生成した化合物のライブラリから選択する場合に有効であることが知られているような化合物の化学修飾がある。NZMSをコードするポリヌクレオチドを含むサンプルは、このようにして得られた試験化合物の少なくとも１つに曝露する。サンプルには例えば、無傷細胞、または透過化処理した細胞、あるいはin vitro 無細胞系すなわち再構成生化学系があり得る。NZMSをコードするポリヌクレオチドの発現における変容は、当分野で通常知られている任意の方法でアッセイする。通常、NZMSをコードするポリヌクレオチドの配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、特異ヌクレオチドの発現を検出する。ハイブリダイゼーション量を定量し、それによって１つ若しくは複数の試験化合物に曝露される及び曝露されないポリヌクレオチドの発現の比較に対する基礎を形成し得る。試験化合物に曝露されるポリヌクレオチドの発現における変化の検出は、ポリヌクレオチドの発現を改変する際に試験化合物が有効であることを示している。特異ポリヌクレオチドの発現改変に有効な化合物に対して、例えばSchizosaccharomyces pombe遺伝子発現系（Atkins, D.他 (1999) 米国特許第5,932,435号、Arndt, G.M.他 (2000) Nucleic Acids Res. 28:E15）またはHeLa細胞等のヒト細胞系（Clarke, M.L. 他 (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun. 268:8-13）を用いてスクリーニングを実行する。本発明の特定の実施例は、特異的ポリヌクレオチド配列に対するアンチセンス活性のためのオリゴヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、ペプチド核酸、修飾オリゴヌクレオチド等）の組み合わせライブラリをスクリーニングすることに関与している（Bruice, T.W. 他 (1997) 米国特許第5,686,242号、Bruice, T.W. 他 (2000) 米国特許第6,022,691号）。
【０２８２】
ベクターを細胞または組織に導入する多数の方法が利用可能であり、in vivo、in vitro及びex vivoの使用に対して同程度に適している。ex vivo治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、クローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクションによる、またはリボソーム注入やポリカチオンアミノポリマーによる送達は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（例えばGoldman, C.K.他 (1997) Nat. Biotechnol. 15:462-466）。
【０２８３】
上記の治療方法はいずれも、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【０２８４】
本発明のさらなる実施態様は、薬物として許容できる或る賦形剤と共に製剤される或る活性成分を一般に有する組成物の投与に関連する。賦形剤には例えば、糖、でんぷん、セルロース、ゴム及びタンパク質がある。様々な剤形が広く知られており、詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing, Easton PA）の最新版に記載されている。このような組成物は、NZMS、NZMSの抗体、擬態物質、アゴニスト、アンタゴニスト、またはNZMSのインヒビターなどからなる。
【０２８５】
本発明に用いられる組成物は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。
【０２８６】
肺から投与する組成物は、液状または乾燥粉末状で調製し得る。このような組成物は通常、患者が吸入する直前にエアロゾル化する。小分子（例えば伝統的な低分子量有機薬）の場合には、速効製剤のエアロゾル送達は当分野で公知である。高分子（例えばより大きなペプチド及びタンパク質）の場合には、当該分野において肺の肺胞領域を介しての肺送達が最近向上したことにより、インスリン等の薬剤を実質的に血液循環へ輸送することを可能にした（Patton, J.S. 他, 米国特許第5,997,848号等を参照）。肺送達は、針注射なしに投与する点で優れており、有毒な可能性のある浸透エンハンサーの必要性をなくす。
【０２８７】
本発明での使用に適した組成物には、所定の目的を達成するために必要なだけの量の活性成分を含有する組成物が含まれる。有効投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行う。
【０２８８】
NZMSを有する、またはその断片群を有する高分子群を直接、細胞内に送達すべく、特殊な種々の形状の組成物群が調製され得る。例えば、細胞不透過性高分子を含むリポソーム製剤は、細胞融合及び高分子の細胞内送達を促進し得る。別法では、NZMSまたはその断片をHIV Tat-1タンパク質の短い陽イオンN末端部に結合することもできる。このようにして生成された融合タンパク質類は、或るマウスモデル系の、脳を含む全ての組織の細胞群に形質導入することがわかっている（Schwarze, S.R. 他 (1999) Science 285:1569-1572）。
【０２８９】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ、例えば新生物性細胞の細胞培養アッセイにおいて、或いは、動物モデル、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、サルまたはブタ等において、先ず治療有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、好適な濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【０２９０】
治療有効量は、治療有効量は、症状や容態を回復させる活性処方成分（例えば、NZMSまたはその断片、NZMSの抗体、NZMSのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターなど）の量を意味する。治療有効性及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばED50（集団の50％の治療有効量）またはLD50（集団の50％の致死量）を測定するなどして決定することができる。毒性効果の治療効果に対する投与量比が治療指数であり、LD50/ED50比として表すことができる。高い治療指数を示すような組成物が望ましい。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに用いるための投与量の範囲を策定するのに用いられる。このような組成物が含まれる投与量は、毒性を殆ど或いは全く含まず、ED50を含むような血中濃度の範囲にあることが好ましい。用いられる投与形態、患者の感受性及び投与の経路によって、投与量はこの範囲内で様々に変わる。
【０２９１】
正確な投与量は、治療が必要な被験者に関する要素を考慮して、現場の医者が決定することになる。充分なレベルの活性成分を与え、或いは所望の効果を維持するべく、用法および用量を調節する。被験者に関する要素としては、疾患の重症度、被験者の全身健康状態、被験者の年齢、体重及び性別(ジェンダー)、投与の時間及び頻度、薬剤の併用、反応感受性及び治療に対する応答等を考慮しうる。作用期間が長い組成物は、特定の製剤の半減期及びクリアランス率によって、3〜4日毎に1度、1週間に1度、或いは2週間に1度の間隔で投与し得る。
【０２９２】
通常の投与量は、投与の経路にもよるが約0.1〜100.000μgであり、合計で約1gまでとする。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、現場の医者は通常それを利用することができる。当業者は、ヌクレオチドの処方では、タンパク質またはそれらのインヒビター類とは異なる処方を利用することになる。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等に特異的なものとなる。
【０２９３】
（診断）
別の実施例では、NZMSに特異的に結合する抗体が、NZMSの発現によって特徴付けられる疾患の診断、またはNZMSやNZMSのアゴニストまたはアンタゴニスト、インヒビターで治療を受けている患者をモニターするためのアッセイに用いられる。診断目的に有用な抗体は、上記の治療の箇所で記載した方法と同じ方法で調合される。NZMSの診断アッセイには、ヒトの体液から、あるいは細胞や組織の抽出物から、抗体および標識を用いてNZMSを検出する方法が含まれる。この抗体は修飾されたものもされていないものも可能であり、レポーター分子との共有結合または非共有結合で標識化できる。レポーター分子としては広くさまざまな種類が本分野で知られており、また使用可能であるが、そのうちのいくつかは上記で説明されている。
【０２９４】
NZMSを測定するための様々なプロトコル、例えばELISA、RIA、FACS等が本技術分野において知られており、NZMS発現の変容した、或いは異常なレベルを診断する基盤を提供する。正常あるいは標準的なNZMSの発現の値は、複合体の形成に適した条件の下、正常な哺乳動物、例えばヒトなどの被験者から採取した体液または細胞抽出物とNZMSに対する抗体とを結合させることによって決定する。標準複合体形成量は、種々の方法、例えば測光法で定量できる。被験者、対照および生検組織からの疾患サンプルで発現するNZMSの量を標準値と比較する。標準値と被験者との偏差が疾患を診断するパラメータを確定する。
【０２９５】
本発明の別の実施例によれば、NZMSをコードするポリヌクレオチドを診断のために用いることもできる。用いることができるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、相補的RNA及びDNA分子、そしてPNAが含まれる。これらのポリヌクレオチドを用いて、NZMSの発現が疾患と相関し得る生検組織群における、遺伝子発現を検出し定量し得る。診断アッセイは、NZMSの不在、存在及び過剰発現を測定するために、そして治療インターベンション中にNZMSレベルの調製をモニターするために用いることができる。
【０２９６】
ある実施形態では、NZMSをコードする核酸配列を同定するために、NZMSまたは近縁の分子をコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出可能なPCRプローブとのハイブリダイゼーションを用いることができる。プローブが高度に特異的な領域（例えば５'調節領域）から作られている、或いはやや特異性の低い領域（例えば保存されたモチーフ）から作られているかという、そのプローブの特異性と、ハイブリダイゼーション或いは増幅のストリンジェンシーとによって、そのプローブがNZMSをコードする天然配列のみを同定するかどうか、或いは対立遺伝子変異配列や関連配列を同定するかどうかが決まることとなる。
【０２９７】
プローブはまた、関連する配列の検出にも用いることができ、その配列はNZMSをコードする任意の配列と少なくとも50%の配列同一性を有し得る。本発明のハイブリダイゼーションプローブには、DNAあるいはRNAが可能であり、SEQ ID NO:12-22の配列、或いはNZMS遺伝子のプロモーター、エンハンサー、イントロンを含むゲノム配列に由来し得る。
【０２９８】
NZMSをコードするDNAに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、NZMSまたはNZMS誘導体をコードするポリヌクレオチド配列をmRNAプローブの作製のためのベクターにクローニングする方法がある。mRNAプローブ作製のためのベクターは、当業者に知られており、市販されており、好適なRNAポリメラーゼ及び好適な標識されたヌクレオチドを加えることによって、in vitroでRNAプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得る。 レポーター集団の例としては、32Pまたは35S等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識などが挙げられる。
【０２９９】
NZMSをコードするポリヌクレオチド配列を用いて、NZMSの発現に関連する疾患を診断することが可能である。限定はされないがそのような疾患には、免疫系疾患として、後天性免疫不全症候群(AIDS)、アジソン病、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、強直性脊椎炎、アミロイド症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性多腺性内分泌カンジダ症外胚葉ジストロフィ(APECED)、気管支炎、胆嚢炎、接触皮膚炎、クローン病、アトピー皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、肺気腫、リンパ球傷害因子性偶発性リンパ球減少症、新生児溶血性疾患（胎児赤芽球症）、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、痛風、グレーブス病、橋本甲状腺炎、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、多発性筋炎、乾癬、ライター症候群、慢性関節リウマチ、強皮症、シェ−グレン症候群、全身性アナフィラキシー、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、血小板減少性紫斑病、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、ウェルナー症候群、癌合併症、血液透析、体外循環、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、寄生虫感染症、原虫感染症、蠕虫感染症、外傷が含まれ、免疫不全には、後天性免疫不全症候群(AIDS)、ブルトン型X染色体性無ガンマグロブリン血症、分類不能型免疫不全(CVI)、DiGeorge症候群（胸腺低形成）、胸腺形成異常、IgA単独欠損症、重症複合型免疫不全症（SCID）、血小板減少と湿疹を伴う免疫不全症（Wiskott-Aldrich症候群）、Chediak−東症候群、慢性肉芽腫症、遺伝性血管神経症浮腫、Cushing病を伴う免疫不全が含まれ、発達障害には尿細管性アシドーシス、貧血、クッシング症候群、軟骨形成不全性小人症、デュシェンヌ／ベッカー型筋ジストロフィー、癲癇、性腺形成異常、WAGR症候群（ウィルムス腫瘍、無虹彩症、尿生殖器異常、精神遅滞）、スミス‐マジェニス症候群（Smith- Magenis syndrome）、骨髄形成異常症候群、遺伝性粘膜上皮異形成、遺伝性角皮症や、シャルコーマリーツース病および神経線維腫症などの遺伝性神経病、甲状腺機能低下症、水頭症や、Syndenham舞踏病（Syndenham's chorea）および脳性小児麻痺などの発作障害、二分脊椎、無脳症、頭蓋脊椎披裂、先天性緑内障、白内障、感音難聴が含まれ、眼疾患には、高眼圧症と緑内障が含まれ、代謝障害には、シェーグレン・ラルソン症候群（SLS）、高プロリン血症II型、急性アルコール中毒、副腎脳白質ジストロフィー、Alport症候群、コロイデレミア、デュシェンヌおよびベッカー型筋ジストロフィー、ダウン症候群、嚢胞性線維症、慢性肉芽腫症、ゴーシェ病、ハンチントン病、Marfan症候群、筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、濃化異骨症（ピクノディスオストーシス）、Refsum症候群、網膜芽細胞種、鎌状赤血球貧血症、サラセミア、ウェルナー症候群、von Willebrand症候群、ウィルムス腫瘍、ツェルヴェーガー症候群、ペルオキシソームアシルCoAオキシダーゼ欠損症、ペルオキシソームチオラーゼ欠損症、ペルオキシソーム二機能タンパク質欠損症、ミトコンドリアカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼおよびカルニチン欠損症、ミトコンドリア超長鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症、ミトコンドリア中鎖ア��ルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症、ミトコンドリア短鎖アシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症、ミトコンドリア電子伝達フラビンタンパク質および電子伝達フラビンタンパク質：ユビキノン酸化還元酵素欠損症、ミトコンドリア三機能性タンパク質欠乏症およびミトコンドリア短鎖３ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ欠損症が含まれ、平滑筋疾患には、狭心症、アナフィラキシーショック、不整脈、喘息、心血管性ショック、クッシング症候群、高血圧、低血糖症、心筋梗塞、片頭痛、およびクロム親和細胞腫(褐色細胞腫)、およびミオパシー（心筋症を含む）、脳症(encephalopathy)、癲癇、カーンズ・セイヤ症候群、乳酸アシドーシス、ミオクローヌス疾患、および眼筋麻痺、高アンモニア血症、トリメチルアミン尿症（魚臭症候群）、３−ヒドロキシジカルボン酸尿症、ジカルボン酸尿症、キサンチン尿症、先天性副腎リポイド過形成(CLAH)、白皮症３型、高インシュリン-高アンモニア血症症候群（ＨＨＳ）、グルタル酸血症１型（GA-I)、家族性再発性ミオグロビン尿症、インシュリン抵抗性、遺伝性チミン‐ウラシル尿症(家族性ピリミジン血症)、突発性鉄芽球性貧血（ＡＩＳＡ）、新生児型副腎白質ジストロフィー、低酸素症、外傷による組織への損壊悪化、被曝と紫外線照射、肝機能障害、著しい肥満症、メトヘモグロビン血症(HM1、HM2、HM3)、hypertrophic hirsutism with amenorrhea、ハーマンスキー−プゥドラック症候群、ライ症候群、hypoketotic低血糖症、イソ吉草酸血症、慢性溶血性貧血が含まれ、神経の疾患の中には、癲癇、虚血性脳血管障害、脳卒中、大脳新生物、アルツハイマー病、ピック病、ハンチントン病、痴呆、パーキンソン病及びその他の錐体外路障害、筋萎縮性側索硬化及びその他の運動ニューロン障害、進行性神経性筋萎縮症、色素性網膜炎(網膜色素変性症)、遺伝性運動失調、多発性硬化症及び他の脱髄疾患、細菌性及びウイルス性髄膜炎、脳膿瘍、硬膜下膿瘍、硬膜外膿瘍、化膿性頭蓋内血栓性静脈炎、脊髄炎及び神経根炎、ウイルス性中枢神経系疾患と、クールー及びクロイツフェルト‐ヤコブ病、Gerstmann-Straussler-Scheinker症候群を含むプリオン病と、致死性家族性不眠症、神経系性栄養病及び代謝病、神経線維腫症、結節硬化症、小脳網膜血管芽腫（cerebelloretinal hemangioblastomatosis）、脳三叉神経血管症候群、ダウン症を含む中枢神経系性精神遅滞及び他の発達障害、脳性麻痺、神経骨格異常症、自律神経系障害、脳神経疾患、脊髄疾患筋ジストロフィー、および他の神経筋障害、末梢神経系疾患、皮膚筋炎及び多発性筋炎と、遺伝性、代謝性、内分泌性、及び中毒性ミオパシーと、重症筋無力症、周期性四肢麻痺と、気分性及び不安性の障害、分裂病（統合失調症）性疾患を含む精神病と、季節性感情障害（SAD）と、静座不能、健忘症、緊張病、糖尿病性ニューロパシー、錐体外路性終末欠陥症候群(遅発性ジスキネジア)、ジストニー、パラノイド精神病、帯状疱疹後神経痛、及びトゥーレット病と、進行性核上麻痺、大脳皮質基底核変性症及び家族性前頭側頭型痴呆および、レッシュ-ナイハン症候群が含まれ、心血管疾患の中には、レイノー病、動脈瘤、動脈解離、拡張蛇行静脈、血栓静脈炎及び静脈血栓、血管の腫瘍、血栓崩壊の合併症、バルーン血管形成術、血管置換術、大動脈冠状動脈バイパス手術、うっ血��心不全、虚血性心疾患、狭心症、心筋梗塞、高血圧性心疾患、変性弁膜性心疾患、石灰化大動脈弁狭窄症、先天性二尖大動脈弁、僧帽弁輪部石灰化、僧帽弁逸脱、リウマチ熱、リウマチ性心疾患、感染性心内膜炎、非細菌性血栓性心内膜炎、全身性エリテマトーデスの心内膜炎、カルチノイド心疾患、心筋症、心筋炎、心膜炎、腫瘍性心疾患、先天性心臓疾患、及び心臓移植の合併症が含まれ、呼吸器系の疾患には、先天性肺異常、肺拡張不全、肺うっ血及び肺水腫、肺動脈塞栓症、肺出血、肺梗塞、肺高血圧症、血管硬化症、閉塞性肺疾患、拘束性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、慢性気管支炎、気管支喘息、細気管支拡張症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎及びマイコプラズマ肺炎、肺膿瘍、肺結核、びまん性間質性疾患、塵肺症、サルコイド症、特発性肺線維症、剥離性間質性肺炎、過敏症肺炎、肺好酸球増加閉塞性細気管支炎―器質性肺炎（pulmonary eosinophilia bronchiolitis obliterans-organizing pneumonia）、びまん性肺出血症候群、グッドパスチャー症候群、特発性肺血鉄症、肺併発膠原血管病併発性肺疾患、肺胞たんぱく症、肺腫瘍、炎症性及び非炎症性胸水、気胸症、胸膜腫瘍、薬物性肺疾患、放射線による肺疾患、及び肺移植の合併症、プラスモディムまたはマラリア性、寄生アメーバ症、リーシュマニア属、トリパノソーマ属、トキソプラスマ属、ニューモシスティスカリニ属、ジアルジアのような腸内原生動物類、トリコモナス属、旋毛虫のような組織線虫類、回虫のような腸内線虫類、リンパ性フィラリア線虫類、住血吸虫のような吸虫類および条虫類(サナダムシ)として分類される寄生虫による感染症、細胞増殖異常の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（MCTD）、骨髄線維症、発作性夜間ヘモグロビン尿症、真性多血症、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌など癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、頚部、胆嚢、神経節、消化管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、子宮の癌などが含まれる。NZMSをコードするポリヌクレオチド配列は、変容したNZMS発現を検出するために患者から採取した体液或いは組織を利用する、サザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、PCR法や、ディップスティック（dipstick）、ピン（pin）、およびマルチフォーマットのELISA式アッセイ、及びマイクロアレイに使用することが可能である。このような定性方法または定量方法は、当分野で公知である。
【０３００】
或る形態では、関連する疾患、特に上記した疾患を検出するアッセイにおいて、NZMSをコードするヌクレオチド配列が有用であり得る。NZMSをコードするヌクレオチド配列は、標準的な方法で標識化され、ハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者から採取した体液或いは組織のサンプルに加えることができる。好適なインキュベーション期間が経過したらサンプルを洗浄し、シグナルを定量して標準値と比較する。患者のサンプルのシグナルの量が、対照サンプルと較べて著しく変わっている場合は、サンプル内のNZMSをコードするヌクレオチド配列の変異レベルにより、関連する疾患の存在が明らかになる。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。
【０３０１】
NZMSの発現に関連する疾患の診断の基盤を提供するために、発現の正常すなわち標準的なプロフィールが確立される。これは、ハイブリダイゼーション或いは増幅に好適な条件の下、動物或いはヒトの何れかの正常な被験者から採取された体液或いは細胞抽出物と、NZMSをコードする配列或いはその断片とを混合することにより達成され得る。実質的に精製されたポリヌクレオチドを既知量用いて行った実験から得た値を正常な被験者から得た値と比較することにより、標準ハイブリダイゼーションを定量することができる。このようにして得た標準値は、疾患の徴候を示す患者から得たサンプルから得た値と比較することができる。標準値からの偏差を用いて疾患の存在を確定する。
【０３０２】
疾患の存在が確定されて治療プロトコルが開始されると、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定するため、ハイブリダイゼーションアッセイを定期的に繰り返し得る。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数ヶ月の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【０３０３】
癌に関しては、個体からの生体組織における異常な量の転写物（過少発現または過剰発現）の存在は、疾患の発生素質を示したり、実際に臨床的症状が現れる前に疾患を検出する方法を提供したりし得る。この種のより明確な診断により、医療の専門家が予防方法または積極的な治療法を早くから利用し、それによって癌の発生または更なる進行を防止することが可能となる。
【０３０４】
NZMSをコードする配列から設計されたオリゴヌクレオチドのさらなる診断への利用には、PCRの利用が含まれ得る。これらのオリゴマーは、化学的に合成するか、酵素により生産するか、或いはin vitroで産出し得る。オリゴマーは、好ましくはNZMSをコードするポリヌクレオチドの断片、或いはNZMSをコードするポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチドの断片を含み、最適な条件下で、特定の遺伝子や条件を識別するために利用される。また、オリゴマーは、やや緩いストリンジェンシー条件下で、近縁のDNA或いはRNA配列の検出、定量、或いはその両方のため用いることが可能である。
【０３０５】
或る実施態様において、NZMSをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、一塩基多型性（SNP）を検出し得る。ＳＮＰは、多くの場合にヒトの先天性または後天性遺伝病の原因となるような置換、挿入及び欠失である。限定するものではないがSNPの検出方法には、ＳＳＣP(single-stranded conformation polymorphism)及び蛍光SSCP（fSSCP）法がある。SSCPでは、NZMSをコードするポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）でDNAを増幅する。DNAは例えば、病変組織または正常組織、生検サンプル、体液その他に由来し得る。DNA内のSNPは、一本鎖形状のPCR生成物の２次及び３次構造に差異を生じさせる。差異は非変性ゲル中でのゲル電気泳動法を用いて検出可能である。fSCCPでは、オリゴヌクレオチドプライマーを蛍光性に標識する。それによってDNAシークエンシング機などの高処理機器でアンプリマー（amplimer）の検出が可能になる。更に、インシリコSNP（in silico SNP, isSNP）と呼ばれる配列データベース分析法は、一般的なコンセンサス配列に配列されるような個々のオーバーラップするDNA断片の配列を比較することにより、多型性を同定し得る。これらのコンピュータベースの方法は、DNAの実験室での調製に、また統計モデル及びDNA配列クロマトグラムの自動分析を用いたシークエンシングのエラーに起因する配列の変異をフィルタリングして除去する。別の態様では、例えば高処理MASSARRAYシステム（Sequenom, Inc., San Diego CA）を用いた質量分析によりSNPを検出し、特徴付ける。
【０３０６】
ヒト疾患の遺伝的根拠を研究するためにSNPを用いることができる。例えば、少なくとも16の一般的ＳＮＰが、非インスリン依存型真性糖尿病と関連がある。ＳＮＰは、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血あるいは慢性肉芽腫症等の単一遺伝子病の転帰の差異を研究する面でも有用である。例えば、マンノース結合レクチンの変異体であるMBL2は、嚢胞性線維症の肺での有害な転帰と相関することが示されてきた。ＳＮＰはまた、生命に関わる毒性等の薬剤への患者の反応に影響する遺伝変異体の同定という薬理ゲノミックスにおいても有用性がある。例えば、ALOX5遺伝子のコア・プロモーターにおける或る変異は5-リポキシゲナーゼ経路を標的とする抗喘息剤を用いた治療への臨床反応の減少につながるが、Nアセチルトランスフェラーゼの或る変異は抗結核薬剤イソニアジドに反応する末梢神経障害の高発生率と関連する。異なる集団におけるＳＮＰ分布の分析は、集団の起源と移動の追跡以外にも遺伝的浮動、突然変異、組換え、選択の調査において有用である(Taylor, J.G他 (2001) Trends Mol. Med. 7:507-512、Kwok, P.-Y.及びZ. Gu (1999) Mol. Med. Today 5:538-543、Nowotny, P.他(2001) Curr. Opin. Neurobiol. 11:637-641)。
【０３０７】
NZMSの発現を定量するために用い得る方法には、ヌクレオチドの放射標識またはビオチン標識、対照核酸の共増幅（coamplification）、及び標準曲線から得た結果の補間もある(例えば、Melby, P.C.他 (1993) J. Immunol. Methods 159:235-244、Duplaa, C.他 (1993) Anal. Biochem. 212:229-236を参照)。目的のオリゴマーまたはポリヌクレオチドが種々の希釈液中に存在し、分光光度法または比色反応によって定量が迅速になるような高処理フォーマットのアッセイを行うことによって、複数のサンプルの定量速度を加速することができる。
【０３０８】
更に別の実施例では、本明細書で記載した任意のポリヌクレオチド配列由来のオリゴヌクレオチドまたはより長い断片を、マイクロアレイにおけるエレメントとして用いることができる。多数の遺伝子の関連発現レベルを同時にモニターする転写物イメージング技術にマイクロアレイを用いることが可能である。これについては、以下に記載する。マイクロアレイはまた、遺伝変異体、突然変異及び多型性の同定に用いることができる。この情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、遺伝子発現の機能としての疾病の進行／後退をモニターし、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。特に、患者にとって最もふさわしく、有効な治療法を選択するために、この情報を用いて患者の薬理ゲノムプロフィールを開発することができる。例えば、患者の薬理ゲノムプロフィールに基づき、患者に対して高度に効果的で副作用を殆ど示さない治療薬を選択することができる。
【０３０９】
別の実施例では、NZMS、NZMSの断片、NZMSに特異的な抗体をマイクロアレイ上のエレメントとして用いることができる。マイクロアレイを用いて、上記のようなタンパク質−タンパク質相互作用、薬剤−標的相互作用及び遺伝子発現プロフィールをモニターまたは測定することが可能である。
【０３１０】
或る実施例は、或る組織または細胞タイプの転写物イメージを生成するような本発明のポリヌクレオチドの使用に関連する。転写物イメージは、特定の組織または細胞タイプにより遺伝子発現の包括的パターンを表す。包括的遺伝子発現パターンは、所与の条件下で所与の時間に発現した遺伝子の数および相対存在量を定量することにより分析し得る（Seilhamer 他の米国特許第5,840,484号「Comparative Gene Transcript Analysis」を参照。当該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。従って、特定の組織または細胞タイプの転写物または逆転写物全体に、本発明のポリヌクレオチドまたはそれらの相補体をハイブリダイズすることにより、転写物イメージを生成し得る。或る実施例では、本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体が１マイクロアレイ上に複数エレメントの１サブセットを含むような高処理フォーマットでハイブリダイゼーションを発生させる。結果として得られる転写物イメージは、遺伝子活性のプロフィールを提供し得る。
【０３１１】
転写物イメージは、組織、株化細胞、生検またはその生物学的サンプルから単離した転写物を用いて生成し得る。転写物イメージは従って、組織または生検サンプルの場合にはin vivo、または株化細胞の場合にはin vitroでの遺伝子発現を反映する。
【０３１２】
本発明のポリヌクレオチドの発現のプロフィールを作製する転写物イメージはまた、工業的または天然の環境化合物の毒性試験のみならず、in vitroモデル系及び薬剤の前臨床評価に関連して使用し得る。全ての化合物は、作用及び毒性のメカニズムを暗示する、しばしば分子フィンガープリントまたは毒性シグネチャ(toxicant signatures)と称されるような特徴的な遺伝子発現パターンを惹起する（Nuwaysir, E.F. 他 (1999) Mol. Carcinog. 24:15 3-159、Steiner, S.及びN.L. Anderson (2000) Toxicol. Lett. 112-113:467-471、該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす）。試験化合物が既知の毒性を有する化合物のシグネチャと類似のシグネチャを有する場合には、毒性特性を共有している可能性がある。フィンガープリントまたはシグネチャは、多数の遺伝子及び遺伝子ファミリーからの発現情報を含んでいる場合には、最も有用且つ正確である。理想的には、ゲノム全域にわたる発現の測定が最高品質のシグネチャを提供する。たとえ、発現が任意の試験された化合物によって変化しない遺伝子があったとしても、それらの発現レベルを残りの発現データをノーマライズするために使用できるため、それらの遺伝子は重要である。ノーマライズ手順は、異なる化合物で処理した後の発現データの比較に有用である。毒物シグネチャの要素に遺伝子機能を割り当てることが毒性メカニズムの解釈に役立つが、毒性の予測につながる、シグネチャを統計的に一致させる過程に、遺伝子機能の知識は必要とされない（例えば2000年2月29日に米国国立環境健康科学研究所（National Institute of Environmental Health Sciences）より発行されたPress Release 00-02を参照されたい。これについてはhttp://www.niehs.nih.gov/oc/news/toxchip.htmで入手可能である）。従って、毒性シグネチャを用いる中毒学的スクリーニングの際に、全ての発現した遺伝子配列を含めることは重要且つ望ましいことである。
【０３１３】
或る実施例では、核酸を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理した生物学的サンプル中で発現した核酸は、本発明のポリヌクレオチドに特異的な１つ若しくは複数のプローブでハイブリダイズし、それによって本発明のポリヌクレオチドに対応する転写レベルを定量し得る。処理した生物学的サンプル中の転写物レベルを、未処理生物学的サンプル中のレベルと比較する。両サンプルの転写物レベルの差は、処理されたサンプル中で試験化合物が引き起こす毒性反応を示す。
【０３１４】
別の実施例は、本発明のポリペプチド配列を用いて組織または細胞タイプのプロテオームを分析することに関連する。プロテオームの語は、特定の組織または細胞タイプでのタンパク質発現の包括的パターンを指す。プロテオームの各タンパク質成分は、個々に更に分析の対象とすることができる。プロテオーム発現パターン即ちプロフィールは、所与の条件下で所与の時間に発現したタンパク質の数及び相対存在量を定量することにより分析し得る。従って細胞のプロテオームのプロフィールは、特定の組織または細胞タイプのポリペプチドを分離及び分析することにより作成し得る。或る実施態様では、１次元等電点電気泳動によりサンプルからタンパク質を分離し、次に２次元ドデシル硫酸ナトリウムスラブゲル電気泳動により分子量に応じて分離するような２次元ゲル電気泳動により分離が達成される（前出のSteinerおよびAnderson）。タンパク質は、通常クーマシーブルーまたは銀染色液または蛍光染色液などの物質を用いてゲルを染色することにより、分散した、独特な位置にある点としてゲル中で可視化される。各タンパク質スポットの光学密度は、通常、サンプル中のタンパク質レベルに比例する。異なるサンプル、例えば試験化合物または治療薬で処理または未処理のいずれかの生物学的サンプルから得られる、同等に位置するタンパク質スポットの光学密度を比較し、処理に関連するタンパク質スポット密度の変化を同定する。スポット内のタンパク質は、例えば化学的または酵素的切断とそれに続く質量分析を用いる標準的な方法を用いて部分的にシークエンシングする。スポット内のタンパク質の同一性は、その部分配列を、好適には少なくとも５個の連続するアミノ酸残基を、本発明のポリペプチド配列と比較することにより決定し得る。場合によっては、決定的なタンパク質同定のための更なる配列データが得られる。
【０３１５】
プロテオームのプロフィールは、NZMSに特異的な抗体を用いてNZMS発現レベルを定量することによっても作成可能である。或る実施例では、マイクロアレイ上でエレメントとして抗体を用い、マイクロアレイをサンプルに曝して各アレイ要素へのタンパク質結合レベルを検出することによりタンパク質発現レベルを定量する（Lueking, A. 他(1999) Anal. Biochem. 270:103-111、Mendoze, L.G. 他 (1999) Biotechniques 27:778-788）。検出は当分野で既知の様々な方法で行うことができ、例えば、チオールまたはアミノ反応性蛍光化合物を用いてサンプル中のタンパク質を反応させ、各アレイのエレメントにおける蛍光結合の量を検出し得る。
【０３１６】
プロテオームレベルでの毒性シグネチャも中毒学的スクリーニングに有用であり、転写レベルでの毒性シグネチャと並行に分析するべきである。数種の組織の数種のタンパク質に対しては、転写物とタンパク質との存在量の相関が乏しいので（Anderson, N.L.及びJ. Seilhamer (1997) Electrophoresis 18:533-537）、転写物イメージには有意に影響しないがプロテオームのプロフィールを変化させるような化合物の分析においてプロテオーム毒物シグネチャは有用たり得る。更に、体液中での転写物の分析はmRNAの急速な分解のため困難であるので、プロテオームのプロフィール作成はこのような場合により信頼でき、情報価値がありうる。
【０３１７】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。処理された生物学的サンプル中で発現したタンパク質は、各タンパク質の量を定量し得るように分離する。各タンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中の対応するタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。個々のタンパク質は、個々のタンパク質のアミノ酸残基をシークエンシングし、これら部分配列を本発明のポリペプチドと比較することにより同定する。
【０３１８】
別の実施例では、タンパク質を含有する生物学的サンプルを試験化合物で処理することにより試験化合物の毒性を算定する。生物学的サンプルから得たタンパク質は、本発明のポリペプチドに特異的な抗体を用いてインキュベートする。抗体により認識されたタンパク質の量を定量する。処理された生物学的サンプル中のタンパク質の量を、非処理生物学的サンプル中のタンパク質の量と比較する。両サンプルのタンパク質量の差は、処理サンプル中の試験化合物に対する毒性反応を示す。
【０３１９】
マイクロアレイは、本技術分野で既知の方法を用いて調製し、使用し、そして分析する（Brennan, T.M. 他 (1995) の米国特許第5,474,796号、Schena, M. 他 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619、Baldeschweiler 他 (1995) PCT出願第WO95/251116号、Shalon, D.他 (1995) PCT出願第WO95/35505号、Heller, R.A. 他 (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155、Heller, M.J. 他 (1997) 米国特許第5,605,662号等を参照）。様々なタイプのマイクロアレイが公知であり、詳細については、DNA Microarrays: A Practical Approach, M. Schena, 編集. (1999) Oxford University Press, Londonに記載されている。該文献は、特に引用することを以って本明細書の一部となす。
【０３２０】
本発明の別の実施例ではまた、NZMSをコードする核酸配列を用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。コード配列または非コード配列のいずれかを用いることができ、或る例では、コード配列よりも非コード配列が好ましい。例えば、多重遺伝子ファミリーのメンバー内でのコード配列の保存により、染色体マッピング中に望ましくないクロスハイブリダイゼーションが生じる可能性がある。配列は、或る特定の染色体に、または或る染色体の或る特定領域に、または人為形成の染色体、例えば、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC）、細菌P1作製物、あるいは単一染色体cDNAライブラリ群に対してマッピングされうる(Harrington, J.J. 他 (1997) Nat. Genet. 15:345-355、Price, C.M. (1993) Blood Rev. 7:127-134、Trask, B.J. (1991) Trends Genet. 7:149-154等を参照)。一度マッピングすると、本発明の核酸配列を用いて例えば病状の遺伝を特定の染色体領域の遺伝または制限酵素断片長多型（RFLP）と相関させるような遺伝子連鎖地図を発生させ得る(例えば、 Lander, E.S及びD. Botstein (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:7353-7357を参照)。
【０３２１】
蛍光原位置ハイブリッド形成法（FISH）は、他の物理的及び遺伝地図データと相関し得る(前出、Heinz-Ulrich, 他. (1995) in Meyers, 965-968ページ)。遺伝地図データの例は、種々の科学雑誌あるいはOnline Mendelian Inheritance in Man（OMIM）のウェブサイトに見ることができる。物理的な染色体地図上のNZMSをコードする遺伝子の位置と、特定の疾患との相関性、あるいは特定の疾患に対する素因との相関性は、この疾患と関連するDNAの領域の決定に役立ち得るため、位置を決定するクローニングの作業を促進し得る。
【０３２２】
確定した染色体マーカーを用いた結合分析等の物理的マッピング技術及び染色体標本原位置ハイブリッド形成法を用いて、遺伝地図を拡張することができる。例えばマウスなど別の哺乳動物の染色体上に遺伝子を配置することにより、正確な染色体上の遺伝子座が未知でも、関連するマーカー類をしばしば明らかにし得る。この情報は、位置クローニングその他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を探す研究者にとって価値がある。いったん疾患または症候群に関与する遺伝子（群）が、血管拡張性失調症の11q22-23領域など、特定のゲノム領域への遺伝的連鎖によって、大まかに位置決めがなされると、該領域にマップされる任意の配列は、更なる調査のための関連遺伝子あるいは調節遺伝子を提示している可能性がある（例えばGatti, R.A. 他 (1988) Nature 336:577580を参照）。転座、反転等に起因する、健常者、保有者、感染者の三者間における染色体位置の相違を発見するために本発明のヌクレオチド配列を用いてもよい。
【０３２３】
本発明の別の実施例では、任意の種々の薬剤スクリーニング技術を以って化合物のライブラリをスクリーニングするために、NZMS、NZMSの触媒作用断片、免疫原断片、またはそのオリゴペプチドを用いることができる。薬剤スクリーニングに用いる断片は、溶液中に遊離しているか、固体支持物に固定されるか、細胞表面上に保持されるか、細胞内に位置することができる。NZMSと検査する薬剤との結合による複合体の形成を測定してもよい。
【０３２４】
別の薬物スクリーニング方法は、目的のタンパク質に対して好適な結合親和性を有する化合物を高い処理能力でスクリーニングするために用いられる(Geysen,他 (1984) PCT application WO84/03564等を参照)。この方法においては、多数の異なる小さな試験用化合物を固体基板上で合成する。試験用化合物は、NZMS、或いはその断片と反応してから洗浄される。次ぎに、結合されたNZMSが、当分野で周知の方法で検出される。精製されたNZMSはまた、前記した薬剤をスクリーニングする技術に用いられるプレート上に直接被覆することもできる。別法では、非中和抗体を用いてペプチドを捕捉し、ペプチドを固体支持物に固定することもできる。
【０３２５】
別の実施例では、NZMSと結合可能な中和抗体がNZMSと結合するため試験用化合物と特に競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを用いることができる。この方法では、抗体が、NZMSと１つ以上の抗原決定基を共有するどのペプチドの存在も検出する。
【０３２６】
別の実施例では、将来に開発される分子生物学技術であり、現在知られているヌクレオチド配列群の特性（限定はされないが、トリプレット遺伝暗号及び特異的な塩基対相互作用など)に依存する新技術に用い得る。
【０３２７】
更に詳細説明をしなくとも、当業者であれば以上の説明を以って本発明を最大限に利用できるであろう。従って、これ以下に記載する実施例は単なる例示目的にすぎず、いかようにも本発明を限定するものではない。
【０３２８】
前述した及び以下に記載する全ての特許出願、特許、刊行物は、米国特許出願第60/268,113号、同第60/269,215号、同第60/272,271号、同第60/274,091号、同第60/274,423号、同第60/278,480号、および同第60/278,479号を含め、言及することをもって特に本明細書の一部とする。
【実施例】
【０３２９】
１  cDNAライブラリの作製
Incyte cDNA群の由来は、LIFESEQ GOLDデータベース (Incyte Genomics, Palo Alto CA)に記載されたcDNAライブラリ群である。ホモジナイズしてグアニジニウムイソチオシアネート溶液に溶解した組織もあり、また、ホモジナイズしてフェノールまたは好適な変性剤の混合液に溶解した組織もある。変性剤の混合液は、例えばフェノールとグアニジンイソチオシアネートの単相溶液であるTRIZOL（Life Technologies）等である。結果として得られた溶解物は、塩化セシウムクッション上で遠心分離するかクロロホルムで抽出した。イソプロパノールか、酢酸ナトリウムとエタノールか、いずれか一方、或いは別の方法を用いて、溶解物からRNAを沈殿させた。
【０３３０】
RNAの純度を高めるため、RNAのフェノールによる抽出及び沈殿を必要な回数繰り返した。場合によっては、DNアーゼでRNAを処理した。殆どのライブラリでは、オリゴd(T)連結常磁性粒子（Promega）、OLIGOTEXラテックス粒子（QIAGEN, Chatsworth CA）またはOLIGOTEX mRNA精製キット（QIAGEN）を用いて、ポリ(A+) RNAを単離した。別法では、別のRNA単離キット、例えばPOLY(A)PURE mRNA精製キット（Ambion, Austin TX）を用いて組織溶解物からRNAを直接単離した。
【０３３１】
場合によってはStratagene社へのRNA提供を行い、対応するcDNAライブラリをStratagene社が作製することもあった。そうでない場合は、UNIZAPベクターシステム（Stratagene）またはSUPERSCRIPTプラスミドシステム（Life Technologies）を用いて本技術分野で既知の推奨方法または類似の方法でcDNAを合成し、cDNAライブラリを作製した（前出のAusubel, 1997, unit 5.1-6.6等を参照）。逆転写は、オリゴd(T)またはランダムプライマーを用いて開始した。合成オリゴヌクレオチドアダプターを二本鎖cDNAに連結反応させ、好適な制限酵素または酵素でcDNAを消化した。殆どのライブラリに対して、cDNAのサイズ（300〜1000bp）選択は、SEPHACRYL S1000、SEPHAROSE CL2BまたはSEPHAROSE CL4Bカラムクロマトグラフィー（Amersham Pharmacia Biotech）、或いは分取アガロースゲル電気泳動法を用いて行った。cDNAは好適なプラスミドのポリリンカーの適合する制限酵素部位へ連結された。好適なプラスミドは、例えばPBLUESCRIPTプラスミド（Stratagene）、PSPORT1 プラスミド(Life Technologies)、PCDNA2.1 プラスミド(Invitrogen, Carlsbad CA)、PBK-CMV プラスミド(Stratagene)、PCR2-TOPOTAプラスミド(Invitrogen)、PCMV-ICISプラスミド(Stratagene)、pIGEN (Incyte Genomics, Palo Alto CA)、pRARE (Incyte Genomics)またはplNCY（Incyte Genomics）等およびその誘導体である。組換えプラスミドは、Stratagene社のXL1-Blue、XL1-BIueMRFまたはSOLR、或いはLife Technologies社のDH5α、DH10BまたはELECTROMAX DH10Bなど適格な大腸菌細胞に形質転換した。
【０３３２】
２  cDNAクローンの単離
UNIZAPベクターシステム（Stratagene）を用いたin vivo切除によって、或いは細胞溶解によって、実施例1のようにして得たプラスミドを宿主細胞から回収した。プラスミドの精製には、下記の少なくとも１つを用いた。すなわちMagicまたはWIZARD Minipreps DNA精製システム（Promega）、AGTC Miniprep精製キット（Edge Biosystems, Gaithersburg MD）、QIAGEN社のQIAWELL 8 Plasmid、QIAWELL 8 Plus PlasmidおよびQIAWELL 8 Ultra Plasmid精製システム、R.E.A.L. Prep 96プラスミド精製キットのいずれかである。プラスミドは、沈殿させた後、0.1mlの蒸留水に再懸濁して、凍結乾燥して或いは凍結乾燥しないで4℃で保管した。
【０３３３】
別法では、高処理フォーマットにおいて直接結合PCR法を用いて宿主細胞溶解物からプラスミドDNAを増幅した（Rao, V.B. (1994) Anal. Biochem. 216:1-14）。宿主細胞の溶解及び熱サイクリング過程は、単一反応混合液中で行った。サンプルを処理し、それを３８４ウェルプレート内で保管し、増幅したプラスミドDNAの濃度をPICOGREEN色素（Molecular Probes, Eugene OR）及びFluoroskan II蛍光スキャナ（Labsystems Oy, Helsinki, Finland）を用いて蛍光分析的に定量した。
【０３３４】
３  シークエンシングおよび分析
実施例２に記載したようにプラスミドから回収したＩｎｃｙｔｅ cDNAを、以下に示すようにシークエンシングした。cDNAのシークエンス反応は、標準的方法或いは高処理装置、例えばABI CATALYST 800 サーマルサイクラー（Applied Biosystems）またはPTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research）をHYDRAマイクロディスペンサー（Robbins Scientific）またはMICROLAB 2200（Hamilton）液体転移システムと併用して処理した。cDNAのシークエンス反応は、Amersham Pharmacia Biotech社が提供する試薬、またはABIシークエンシングキット、例えばABI PRISM BIGDYE Terminator cycle sequencing ready reaction kit（Applied Biosystems）の試薬を用いて準備した。cDNAのシークエンス反応の電気泳動的分離及び標識したポリヌクレオチドの検出には、MEGABACE 1000 DNAシークエンシングシステム（Molecular Dynamics）か、標準ABIプロトコル及び塩基呼び出し(base calling)ソフトウェアを用いるABI PRISM 373または377シークエンシングシステム（Applied Biosystems）か、或いはその他の本技術分野で既知の配列解析システムを用いた。cDNA配列内のリーディングフレームは、標準的方法（前出のAusubel, 1997, unit 7.7に概説）を用いて同定した。cDNA配列の幾つかを選択して、実施例８に記載した方法で配列を伸長させた。
【０３３５】
IncyteのｃＤＮＡ配列に由来するポリヌクレオチド配列は、ベクター、リンカー及びポリ(A)配列を除去し、あいまいな塩基をマスクすることによって有効性を確認した。その際、BLAST、動的プログラミング及び隣接ジヌクレオチド頻度分析に基づくアルゴリズム及びプログラムを用いた。次に、IncyteのcDNA配列、またはその翻訳を公共のデータベース（例えばGenBankの霊長類及びげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、真核生物のデータベースと、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM）と、ヒト、ラット、マウス、線虫、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、および鵞口瘡カンジダ（Candida albicans ）からの配列を含むPROTEOMEデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）、及びPFAM等隠れマルコフモデル（HMM）に基づいたタンパク質ファミリーデータベース並びに、SMART(Schultz他(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:5857-5864; Letunic, I. 他 (2002) Nucleic Acids Res. 30:242-244)のようなHMMに基づいたタンパク質ドメインデータベースから選択したデータベースに対して問い合わせた（HMMは、遺伝子ファミリのコンセンサス１次構造を分析する確率的アプローチである。例えば、Eddy, S.R. (1996) Curr. Opin. Struct. Biol. 6:361-365を参照のこと）。問合せは、BLAST、FASTA、BLIMPS及びHMMERに基づくプログラムを用いて行った。Incyte cDNA配列は、完全長のポリヌクレオチド配列を産出するように構築された。或いは、GenBank cDNA、GenBank EST、ステッチされた配列、ストレッチされた配列またはGenscan予測コード配列（実施例４及び５を参照）を用いてIncyte cDNAの集団を完全長まで伸長させた。Phred、Phrap及びConsedに基づくプログラムを用いて構築し、GenMark、BLAST及びFASTAに基づくプログラムを用いてcDNAの集団をオープンリーディングフレームに対してスクリーニングした。対応する完全長ポリペプチド配列を誘導するべく完全長ポリヌクレオチド配列を翻訳した。或いは、本発明のポリペプチドは完全長翻訳ポリペプチドの任意のメチオニン残基で開始し得る。引き続いて、GenBankタンパク質データベース（genpept）、SwissProt、PROTEOMEデータ-ベース、BLOCKS、PRINTS、DOMO、PRODOM及びProsite等のデータベース、PFAM等の隠れマルコフモデル（HMM）に基づいた、タンパク質ファミリーデータベース、及びSMART等のHMMに基づいたタンパク質ドメインデータベースに対する問合せによって完全長ポリペプチド配列を分析した。完全長ポリヌクレオチド配列はまた、MACDNASIS PROソフトウェア（日立ソフトウェアエンジニアリング, South San Francisco CA）及びLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて分析される。ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列アラインメントは、アラインメントした配列と配列の一致率も計算するMEGALIGNマルチシークエンスアラインメントプログラム（DNASTAR）に組み込まれているようなCLUSTALアルゴリズムによって指定されるデフォルトパラメータを用いて生成する。
【０３３６】
Incyte ｃＤＮＡ及び完全長配列の分析及びアセンブリ(構築)に利用したツール、プログラム及びアルゴリズムの概略と、適用可能な説明、参照文献、閾値パラメータを表7に示す。用いたツール、プログラム及びアルゴリズムを表7の列１に、それらの簡単な説明を列２に示す。列３は適切な参照文献であり、全ての文献は引用を以って全文を本明細書の一部となす。適用可能な場合には、列４は２つの配列が一致する強さを評価するために用いたスコア、確率値その他のパラメータを示す（スコアが高いほど、また確率値が低いほど、２配列間の同一性が高くなる）。
【０３３７】
完全長ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の組み立て及び分析に用いる上記のプログラムは、SEQ ID NO:12-22のポリヌクレオチド配列断片の同定にも利用できる。ハイブリダイゼーション及び増幅技術に有用である約20〜約4000ヌクレオチドの断片を表４の列2に示した。
【０３３８】
４  ゲノムDNAからのコード配列の同定および編集
推定上の酵素は、公共のゲノム配列データベース（例えば、gbpriやgbhtg）においてGenscan遺伝子同定プログラムを実行して初めに同定された。Genscanは、様々な生物からゲノムDNA配列を分析する汎用遺伝子同定プログラムである（Burge, C.及びS. Karlin (1997) J. Mol. Biol. 268:78-94、Burge, C及びS. Karlin (1998) Cuff. Opin. Struct. Biol. 8:346-354参照）。プログラムは予測されたエキソンを連結し、メチオニンから停止コドンに及ぶ構築されたcDNA配列を形成する。Genscanの出力は、ポリヌクレオチド及びポリペプチド配列のFASTAデータベースである。Genscanが一度に分析する配列の最大範囲は、30kbに設定した。これらのGenscan予測cDNA配列の内、どの配列が酵素をコードするかを決定するために、コードされたポリペプチドをPFAMモデルにおいて酵素について問合せて分析した。潜在的酵素はまた、酵素として注釈が付けられたIncyte cDNA配列に対する相同性を基に同定された。こうして選択されたGenscan予測配列は、次にBLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriと比較した。必要であれば、genpeptからのトップのBLASTヒットと比較することによりGenscan予測配列を編集し、余分なまたは取り除かれたエキソンなど、Genscanにより予測された配列のエラーを修正した。BLAST分析はまた、任意のIncyte cDNAまたはGenscan予測配列の公共cDNA適用範囲の発見に用いられ、したがって転写の証拠を提供した。。Incyte cDNA適用範囲が利用できる場合には、この情報を用いてGenscan予測配列を修正または確認した。完全長ポリヌクレオチド配列は、実施例３に記載された構築プロセスを用いて、Incyte cDNA配列及び／または公共のcDNA配列でGenscan予測コード配列を構築することにより得た。或いは、完全長ポリヌクレオチド配列は、編集した、または非編集のGenscan予測コード配列に完全に由来する。
【０３３９】
５  ｃDNA配列データとのゲノム配列データの統合(assembly)
スティッチ配列（Stitched Sequence）
部分cDNA配列は、実施例４に記載のGenscan遺伝子同定プログラムにより予測されたエキソンを用いて伸長させた。実施例３に記載されたように構築された部分cDNAは、ゲノムDNAにマッピングし、関連するcDNA及び１つ若しくは複数のゲノム配列から予測されたGenscanエキソンを含むクラスタに分解した。cDNA及びゲノム情報を統合するべくグラフ理論及び動的プログラミングに基づくアルゴリズムを用いて各クラスタを分析し、引き続いて確認、編集または伸長して完全長配列を産出するような潜在的スプライス変異体を生成した。区間全体の長さがクラスタ中の２以上の配列に存在するような配列を同定し、そのように同定された区間は推移性により等しいと考えられた。例えば、１つのcDNA及び２つのゲノム配列に区間が存在する場合、３つの区間は全て等しいと考えられた。このプロセスは、無関係であるが連続したゲノム配列をcDNA配列により結び合わせて架橋し得る。このようにして同定された区間を、親配列に沿って現われるようにステッチアルゴリズムで縫い合わせ、可能な最も長い配列および変異配列を作製する。１種類の親配列に沿って発生した区間と区間との連鎖（cDNA−cDNAまたはゲノム配列−ゲノム配列）は、親の種類を変える連鎖（cDNA−ゲノム配列）に優先した。結果として得られるステッチ配列は、BLAST分析により公共データベースgenpept及びgbpriに翻訳されて比較された。Genscanにより予測された不正確なエキソンは、genpeptからのトップBLASTヒットと比較することにより修正した。必要な場合には、追加cDNA配列を用いるかゲノムDNAの検査により配列を更に伸長させた。
【０３４０】
ストレッチ配列（Stretched Sequence）
部分DNA配列は、BLAST分析に基づくアルゴリズムにより完全長まで伸長された。先ず、BLASTプログラムを用いて、GenBankの霊長類、げっ歯類、哺乳動物、脊椎動物及び真核生物のデータベースなどの公共データベースに対し、実施例３に記載されたように構築された部分cDNAを問い合わせた。次に、最も近いGenBankタンパク質相同体をBLAST分析によりIncyte cDNA配列または実施例４に記載のGenScanエキソン予測配列のいずれかと比較した。結果として得られる高スコアリングセグメント対（HSP）を用いてキメラタンパク質を産出し、翻訳した配列をGenBankタンパク質相同体上にマッピングした。元のGenBankタンパク質相同体と比較して、キメラタンパク質内では挿入または欠失が起こり得る。GenBankタンパク質相同体、キメラタンパク質またはその両方をプローブとして用い、公共のヒトゲノムデータベースから相同ゲノム配列を検索した。このようにして、部分的なDNA配列を相同ゲノム配列の付加によりストレッチすなわち伸長した。結果として得られるストレッチ配列を検査し、完全遺伝子を含んでいるか否かを決定した。
【０３４１】
６  NZMSをコードするポリヌクレオチドの染色体マッピング
SEQ ID NO:12-22を構築するために用いた配列を、BLAST及び他のSmith-Watermanアルゴリズムの実装を用いて、Incyte LIFESEQデータベース及び公共のドメインデータベースの配列と比較した。SEQ ID NO:12-22と一致するこれらのデータベースの配列を、Phrapなどの構築アルゴリズム（表７）を使用して、連続的配列及びオーバーラップした配列のクラスターに組み入れた。スタンフォード・ヒトゲノムセンター（SHGC）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（WIGR）、Genethon等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、クラスタ化された配列が既にマッピングされていたかを決定した。マッピングされた配列がクラスタに含まれている場合は、個々の配列番号を含めてそのクラスタの全配列が地図上の位置に割り当てられた。
【０３４２】
地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または区間として表される。センチモルガン単位での或る区間の地図上の位置は、染色体のpアームの末端に関連して測定する（センチモルガン（cM）は、染色体マーカー間の組換え頻度に基づく計測単位である。平均して、１cMは、ヒト中のDNAの１メガベース（Mb）にほぼ等しい。尤も、この値は、組換えのホットスポット及びコールドスポットに起因して広範囲に変化する）。cM距離は、配列が各クラスタ内に含まれるような放射線ハイブリッドマーカーに対して境界を提供するようなGenethonによってマッピングされた遺伝マーカーに基づく。NCBI「GeneMap'99」（http://www.ncbi.nlm.nih.gpv/genemap/）などの公的に入手可能なヒト遺伝子マップおよびその他の情報源を用いて、既に同定されている疾患遺伝子群が、上記した区間内若しくは近傍に位置するかを決定できる。
【０３４３】
７  ポリヌクレオチド発現の分析
ノーザン分析は、転写された遺伝情報の存在を検出するために用いられる実験技術であり、特定の細胞種または組織からのRNAが結合される膜への標識されたヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに関与している（例えば前出のSambrook, 7章、同Ausubel (1995) 4章および16章を参照）。
【０３４４】
BLASTを適用する類似のコンピュータ技術を用いて、GenBankやLIFESEQ（Incyte Genomics）等のcDNAデータベースにおいて同一または関連分子を検索した。ノーザン分析は、多数の膜系ハイブリダイゼーションよりも非常に速い。更に、特定の一致を厳密な一致、或いは類似的な一致として分類するか否かを決定するため、コンピュータ検索の感度を変更することができる。検索の基準は積スコアであり、次式で定義される。
【０３４５】
【数１】
2004520832.tif 000004
【０３４６】
積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列が一致する長さの両方を考慮している。積スコアは、0〜100のノーマライズされた値であり、次のようにして求める。BLASTスコアにヌクレオチドの配列一致率を乗じ、その積を2つの配列の短い方の長さの5倍で除する。高スコアリングセグメント対（HSP）に一致する各塩基に+5のスコアを割り当て、各不一致塩基対に-4を割り当てることにより、BLASTスコアを計算する。2つの配列は、2以上のHSPを共有し得る（ギャップにより隔離され得る）。2以上のHSPがある場合には、最高BLASTスコアのセグメント対を用いて積スコアを計算する。積スコアは、断片的オーバーラップとBLASTアラインメントの質とのバランスを表す。例えば積スコア100は、比較した2つの配列の短い方の長さ全体にわたって100％一致する場合のみ得られる。積スコア70は、一端が100％一致し、70％オーバーラップしているか、他端が88％一致し、100％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。積スコア50は、一端が100％一致し、50％オーバーラップしているか、他端が79％一致し、100％オーバーラップしているかのいずれかの場合に得られる。
【０３４７】
或いは、NZMSをコードするポリヌクレオチド配列は、由来する組織に対して分析する。例えば或る完全長配列は、Incyte cDNA配列（実施例３を参照）と少なくとも一部はオーバーラップするように構築される。各ｃＤＮＡ配列は、ヒト組織から作製されたｃＤＮＡライブラリに由来する。各ヒト組織は、以下の臓器／組織カテゴリーの１つに分類される。すなわち心血管系、結合組織、消化器系、胎芽構造、内分泌系、外分泌腺、女性生殖器、男性生殖器、生殖細胞、血液および免疫系、肝、筋骨格系、神経系、膵臓、呼吸器系、感覚器、皮膚、顎口腔系、非分類性／混合性または尿路である。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。同様に、各ヒト組織は、以下の疾患／条件カテゴリーすなわち癌、細胞株、発達、炎症、神経性、外傷、心血管、プール、その他の１つに分類される。各カテゴリーのライブラリ数を数えて、全カテゴリーの総ライブラリ数で除する。演算結果の割合は、NZMSをコードするcDNAの組織特異発現または疾患特異発現を反映する。cDNA配列及びcDNAライブラリ／組織情報については、LIFESEQ GOLDデータベース（Incyte Genomics, Palo Alto CA）で見られる。
【０３４８】
８  NZMSをコードするポリヌクレオチドの伸長
完全長のポリヌクレオチド配列はまた、完全長分子の適切な断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて該断片を伸長させて生成した。一方のプライマーは既知の断片の５'伸長を開始するべく合成し、他方のプライマーは既知の断片の３'伸長を開始するべく合成した。開始プライマーの設計は、長さが約22〜30ヌクレオチド、GC含有率が約50％以上となり、約68〜72℃の温度で標的配列にアニーリングするように、OLIGO 4.06ソフトウェア（National Biosciences）或いは別の適切なプログラムを用いて、cDNAから設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を生ずるようなヌクレオチドの区間は全て回避した。
【０３４９】
配列を伸長するために、選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いた。２段階以上の伸長が必要または望ましい場合には、付加的プライマー或いはプライマーのネステッドセットを設計した。
【０３５０】
高忠実度の増幅が、当業者によく知られている方法を利用したＰＣＲ法によって得られた。ＰＣＲは、PTC-200 サーマルサイクラー（MJ Research, Inc.）を用いて96ウェルプレート内で行った。反応混合液は、鋳型DNA及び200nmolの各プライマーを有する。また、Mg２+と(NH4)2SO4と２−メルカプトエタノールを含む反応バッファー、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)、ELONGASE酵素(Life Technologies)、Pfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を含む。プライマー対、PCI AとPCI Bに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1：94℃で3分間、ステップ2：94℃で15秒間、ステップ3：60℃で1分間、ステップ4：68℃で2分間、ステップ5：ステップ2、3および4を20回繰り返す、ステップ6：68℃で5分間、ステップ7：4℃で保存。別法では、プライマー対であるT7とSK+とに対して以下のパラメータで増幅を行った。ステップ1：94℃で3分間、ステップ2：94℃で15秒間、ステップ3：57℃で1分間、ステップ4：68℃で2分間、ステップ5：ステップ2、3および4を20回繰り返す、ステップ6：68℃で5分間、ステップ7：4℃で保存。
【０３５１】
各ウェルのDNA濃度は、１X TE及び0.5μlの希釈していないPCR産物に溶解した100μlのPICOGREEN定量試薬(0.25(v/v) PICOGREEN; Molecular Probes, Eugene OR)を不透明な蛍光光度計プレート(Corning Costar, Acton MA)の各ウェルに分配してDNAが試薬と結合できるようにして測定する。サンプルの蛍光を計測してDNAの濃度を定量すべく、プレートをFluoroskan II （Labsystems Oy, Helsinki, Finland）でスキャンした。反応混合物のアリコート5〜10μlを1％アガロースミニゲル上で電気泳動法によって解析し、どの反応が配列の伸長に成功したかを決定した。
【０３５２】
伸長させたヌクレオチドは、脱塩及び濃縮して３８４穴プレートに移し、CviJIコレラウイルスエンドヌクレアーゼ（Molecular Biology Research, Madison WI）を用いて消化し、pUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）への再連結反応前に音波処理またはせん断した。ショットガン・シークエンシングのために、消化したヌクレオチドを低濃度（0.6〜0.8％）のアガロースゲル上で分離し、断片を切除し、寒天をAgar ACE（Promega）で消化した。伸長させたクローンをＴ4リガーゼ（New England Biolabs, Beverly MA）を用いてpUC 18ベクター（Amersham Pharmacia Biotech）に再連結し、Pfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）で処理して制限部位のオーバーハングを満たし、大腸菌細胞に形質移入した。形質転換した細胞を選択して抗生物質を含む培地に移し、それぞれのコロニーを切りとってLB/2Xカルベニシリン培養液の384ウェルプレートに37℃で一晩培養した。
【０３５３】
細胞を溶解して、Taq DNAポリメラーゼ(Amersham Pharmacia Biotech)及びPfu DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて以下の手順でDNAをPCR増幅した。ステップ1：94℃で3分間、ステップ2：94℃で15秒間、ステップ3：60℃で1分間、ステップ4：72℃で2分間、ステップ5：ステップ2、3および4を29回繰り返す、ステップ6：72℃で5分間、ステップ7：4℃で保存。上記したようにPICOGREEN試薬(Molecular Probes)でDNAを定量化した。DNAの回収率が低いサンプルは、上記と同一の条件を用いて再増幅した。サンプルは20％ジメチルスルホキシド（1：2, v/v）で希釈し、DYENAMIC エネルギートランスファー シークエンシングプライマー、及びDYENAMIC DIRECT kit（Amersham Pharmacia Biotech）またはABI PRISM BIGDYE ターミネーターサイクル シークエンシングレディ反応キット（Terminator cycle sequencing ready reaction kit）（Applied Biosystems）を用いてシークエンシングした。
【０３５４】
同様に、上記手順を用いて完全長ポリヌクレオチド配列を検証し、或いはそのような伸長のために設計されたオリゴヌクレオチド及び適切なゲノムライブラリを用いて5'調節配列を得る。
【０３５５】
９  NZMSをコードするポリヌクレオチドの一塩基多型の同定
一塩基多型性（SNP）として知られる一般的なＤＮＡ配列変異体は、LIFESEQデータベース(Incyte Genomics)を用いてSEQ ID NO:12-22において同定された。実施例３に記述されているように、同じ遺伝子からの配列は共にクラスター化され、構築され、遺伝子内の全ての配列変異体を同定することができた。一連のフィルタから成るアルゴリズムが、ＳＮＰを他の配列変異体から区別するために用いられた。前段フィルタ群が、最小限のPhredクオリティスコア15を要求することにより大多数のベースコールのエラーを除去し、また、配列アラインメントエラーと、ベクター配列、キメラ、スプライス変異体の、不適切なトリミングに起因するエラーを除去した。先進の染色体分析の自動化した手順により、推定上のSNPの近傍のオリジナルのクロマトグラムファイルを分析した。クローンエラ−フィルタ群は、統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、逆転写酵素、ポリメラーゼあるいは体細胞性突然変異によって引き起こされる等の、実験プロセッシング中に導入されたエラ−を同定した。クラスタリングエラ−フィルタ群は、統計的に生み出されたアルゴリズムを用いて、近縁の相同体あるいは偽遺伝子のクラスタリングに起因するエラー、または非ヒト配列によるコンタミネーションによるエラ−を同定した。フィルタの最終セットは、免疫グロブリンまたはT細胞受容体に見出される重複(duplicates)とSNPを除去した。
【０３５６】
異なる4つのヒト集団のＳＮＰ部位における対立遺伝子頻度を分析するために、高処理MASSARRAYシステム(Sequenom, Inc.)を用いる質量分析によって、更なる特徴付けのためにいくつかのＳＮＰが選択された。白人集団は92人（男性46人、女性46人）から成り、そのうち83人はユタ州、4人はフランス、3人はベネズエラ、2人はアーミッシュの出身である。アフリカ系集団は194人（男性97人、女性97人）から成り、全てアフリカ系米国人である。ラテンアメリカ系集団は324人（男性162人、女性162人）から成り、全てメキシコ出身である。アジア系の集団は126人（男性64人、女性62人）からなり、中国人43％、日本人31％、コリアン13％、ベトナム人5％、他のアジア系8％の親の構成が報告されている。対立遺伝子頻度は最初に白人集団で分析された。この集団で対立遺伝子分散を示さないＳNＰの時には他の３つの集団で更に試験されない場合もあった。
【０３５７】
１０  個々のハイブリダイゼーションプローブの標識化および使用
SEQ ID NO:12-22から導き出されたハイブリダイゼーションプローブを用いて、cDNA、mRNA、またはゲノムDNAをスクリーニングする。約20塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記載するが、より大きなヌクレオチド断片に対しても事実上同一の手順が用いられる。オリゴヌクレオチドを、OLIGO4.06ソフトウェア（National Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、50pmolの各オリゴマーと、250μCiの[γ-32P] アデノシン三リン酸（Amersham Pharmacia Biotech)及びＴ4ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN、Boston MA）とを組み合わせて用いることにより標識する。標識したオリゴヌクレオチドは、SEPHADEX G-25超細繊分子サイズ排除デキストラン ビードカラム（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて実質的に精製する。Ase I、Bgl II、Eco RI、Pst I、Xba1またはPvu II（DuPont NEN）のいずれか１つのエンドヌクレアーゼで消化されたヒトゲノムDNAの典型的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において、毎分１０7カウントの標識されたプローブを含むアリコットを用いる。
【０３５８】
各消化物から得たＤＮＡは、0.7％アガロースゲル上で分画してナイロン膜（Nytran Plus, Schleicher & Schuell, Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは、40℃で16時間行う。非特異的シグナルを除去するため、例えば0.1×クエン酸ナトリウム食塩水及び0.5％ドデシル硫酸ナトリウムに一致する条件下で、ブロットを室温で順次洗浄する。オートラジオグラフィーまたはそれに代わるイメージング手段を用いてハイブリダイゼーションパターンを視覚化し、比較する。
【０３５９】
１１  マイクロアレイ
マイクロアレイの表面上でアレイエレメントの結合または合成は、フォトリソグラフィ、圧電印刷（インクジェット印刷、前出のBaldeschweiler等を参照）、機械的マイクロスポッティング技術及びこれらから派生したものを用いて達成することが可能である。上記各技術において基板は、均一な、無孔の表面を持つ固体とすべきである（Schena（1999）前出）。推奨する基板には、シリコン、シリカ、スライドガラス、ガラスチップ及びシリコンウエハがある。或いは、ドットブロット法またはスロットブロット法に類似した手順を利用して、熱的、紫外線的、化学的または機械的結合手順を用いて基板の表面にエレメントを配置及び結合させてもよい。通常のアレイは、利用可能な、当業者に公知の方法と機械とを用いて作製でき、任意の適正数のエレメントを有し得る(例えばSchena, M. 他. (1995) Science 270:467-470、Shalon, D.他. (1996) Genome Res. 6:639-645、Marshall, A.及びJ. Hodgson (1998) Nat. Biotechnol. 16:27-31等を参照)。
【０３６０】
完全長cDNA、発現配列タグ（EST）、またはその断片またはオリゴマーが、マイクロアレイのエレメントと成り得る。ハイブリダイゼーションに好適な断片またはオリゴマーを、LASERGENEソフトウェア（DNASTAR）等の本技術分野で公知のソフトウェアを用いて選択することが可能である。アレイエレメントは、生物学的サンプル中でポリヌクレオチドを用いてハイブリダイズされる。生物学的サンプル中のポリヌクレオチドは、検出を容易にするために蛍光標識またはその他の分子タグに抱合される。ハイブリダイゼーション後、生物学的サンプルからのハイブリダイズされていないヌクレオチドを除去し、蛍光スキャナを用いて各アレイエレメントにおいてハイブリダイゼーションを検出する。或いは、レーザー脱離及び質量スペクトロメトリを用いてもハイブリダイゼーションを検出し得る。マイクロアレイ上のエレメントにハイブリダイズする各ポリヌクレオチドの相補性の度合及び相対存在度は、算定し得る。一実施例におけるマイクロアレイの調製及び使用について、以下に詳述する。
【０３６１】
組織または細胞サンプルの調製
グアニジニウムチオシアネート法を用いて組織サンプルから全RNAを単離し、オリゴ(dT)セルロース法を用いてポリ(A)+RNAを精製する。各ポリ(A)+RNAサンプルを、MMLV逆転写酵素、0.05pg/μlのオリゴ(dT)プライマー（21mer）、１×第一鎖合成バッファー、0.03unit/μlのRNアーゼ阻害因子、500μMのdATP、500μMのdGTP、500μMのdTTP、40μMのdCTP、40μMのdCTP-Cy3（BDS）またはdCTP-Cy5（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて逆転写する。逆転写反応は、GEMBRIGHTキット（Incyte）を用い、200ｎｇのポリ（A）+RNAを含有する体積25ｍｌで行う。特異的対照ポリ(A)+RNAは、非コード酵母ゲノムDNAからin vitro転写により合成する。37℃で2時間インキュベートした後、各反応サンプル（１つはCy3、もう１つはCy5標識）は、2.5mlの0.5M水酸化ナトリウムで処理し、85℃で20分間インキュベートし、反応を停止させてRNAを分解させる。サンプルは、２つの連続するCHROMA SPIN 30ゲル濾過スピンカラム（CLONTECH Laboratories, Inc. (CLONTECH), Palo Alto CA）を用いて精製する。混合後、２つの反応サンプルは、１mlのグリコーゲン（１mg/ml）、６０mlの酢酸ナトリウム及び３００mlの１００％エタノールを用いてエタノール沈殿させる。サンプルは次に、SpeedVAC（Savant Instruments Inc., Holbrook NY）を用いて完全に乾燥させ、14μlの5×SSC／0.2％SDS中で再懸濁する。
【０３６２】
マイクロアレイの調製
本発明の配列を用いて、アレイエレメントを作製する。各アレイエレメントは、クローン化したcDNAインサートを有するベクターを含有する細菌細胞から増幅する。PCR増幅は、cDNAインサートの側面に位置するベクター配列に相補的なプライマーを用いる。30サイクルのPCRで1〜2ngの初期量から5μgより大きい最終量までアレイエレメントを増幅する。増幅されたアレイエレメントは、SEPHACRYL-400（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて精製される。
【０３６３】
精製したアレイエレメントは、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Corning）は、処理の間及び処理後に0.1％のSDS及びアセトン中で超音波処理をかけ、蒸留水で充分に洗浄する。スライドグラスは、4％フッ化水素酸（VWR Scientific Products Corporation (VWR), West Chester PA）中でエッチングし、蒸留水中で充分に洗浄し、95％エタノール中で0.05％アミノプロピルシラン（Sigma）を用いてコーティングする。コーティングしたスライドガラスは、110℃のオーブンで硬化させる。
【０３６４】
米国特許第5,807,522号で説明されている方法を用いて、コーティングしたガラス基板にアレイエレメントを付加する。該特許は、引用を以って本明細書の一部となす。平均濃度が100ng/μlのアレイエレメントDNA１μlを高速ロボット装置により開放型キャピラリープリンティングエレメント（open capillary printing element）に充填する。装置はここで、スライド毎に約5nlのアレイエレメントサンプルを加える。
【０３６５】
マイクロアレイには、STRATALINKER ＵＶ架橋剤（Stratagene）を用いてＵＶ架橋する。マイクロアレイは、室温において0.2％SDSで１度洗浄し、蒸留水で3度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)（Tropix, Inc., Bedford MA）中の0.2％カゼイン中において60℃で30分間マイクロアレイをインキュベートした後、前に行ったように0.2％SDS及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【０３６６】
例えば、SEQ ID NO:21では、37℃で5%CO2の雰囲気で、CASMCが、５％ウシ胎児血清(FBS)、組換えhEGF (0.5 ng.ml-1)、インシュリン(5 ng.ml-1)、hFGF-B (4 ng.ml-1)、ゲンタマイシン(50 μg.ml-1)、アムホテリシン-B (50 ng.ml-1)を含有するSmGM-2培地(供給元はClonetics, San Diego CA)で維持された。細胞は85%のコンフルエンシー(培養飽和密度、confluency)に増殖させた。次いで1、2、4、6、8、10、24、および48時間、TNF-α(10 ng.ml-1)で処理した。これらのTNF-α処理細胞は、85%のコンフルエンシーで収集した未処理のCASMCと比較した(t = 0 時間)。このような方法で、TNF-αの存在が、SEQ ID NO:21の成分(component)2191340の、脈管組織での発現を少なくとも2倍に改変することを実証した。
【０３６７】
ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション反応には、5×SSC、０.２％SDSハイブリダイゼーション緩衝液中のCy3及びCy5標識したcDNA合成生成物を各0.2μg含む9μlのサンプル混合体を有する。サンプル混合体は、65℃まで5分間加熱し、マイクロアレイ表面上へ等分して1.8cm2 のカバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡用スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに140μlの5×SSCを加えることにより、チェンバー内部を湿度100％に保持する。アレイを含むチェンバーは、60℃で約6.5時間インキュベートする。アレイは、第1洗浄緩衝液中（1×SSC、0.1％SDS）において45℃で10分間洗浄し、第2洗浄緩衝液中（0.1×SSC）において各々45℃で10分間、3度洗浄して乾燥させる。
【０３６８】
検出
レポーター標識したハイブリダイゼーション複合体は、Cy3の励起のためには488nm、Cy5の励起のためには632nmでスペクトル線を発生し得るInnova 70混合ガス10 Wレーザ（Coherent, Inc., Santa Clara CA）を備えた顕微鏡で検出する。20×顕微鏡対物レンズ（Nikon, Inc., Melville NY）を用いて、アレイ上に励起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のX-Yステージに置き、対物レンズを通過してラスタースキャンする。本実施例で用いた1.8cm×1.8cmのアレイは、20μmの解像度でスキャンする。
【０３６９】
２回の異なるスキャンで、混合ガスマルチラインレーザは２つのフルオロフォアを連続的に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つのフルオロフォアに対応する２つの光電子増倍管検出器（PMT R1477, Hamamatsu Photonics Systems, Bridgewater NJ）に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いるフルオロフォアの最大発光の波長は、Cy3では565nm、Cy5では650nmである。装置は両方のフルオロフォアからのスペクトルを同時に記録し得るが、レーザ源において好適なフィルタを用いて、フルオロフォア１つにつき１度スキャンし、各アレイを通常２度スキャンする。
【０３７０】
スキャンの感度は通常、既知濃度のサンプル混合体に添加されるcDNA対照種により生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイ上の特定の位置には相補的DNA配列が含まれ、その位置におけるシグナルの強度を、ハイブリダイズする種の重量比1：100,000に相関させる。 異なる源泉（例えば試験される細胞及び対照細胞など）からの２つのサンプルを、各々異なるフルオロフォアで標識し、他と異なって発現した遺伝子を同定するために単一のアレイにハイブリダイズする場合には、その較正を、較正するcDNAのサンプルを２つのフルオロフォアで標識し、ハイブリダイゼーション混合体に各々等量を加えることによって行う。
【０３７１】
光電子増倍管の出力は、IBMコンパチブルPCコンピュータにインストールされた12ビットRTI-835Hアナログ−ディジタル（A/D）変換ボード（Analog Devices, Inc., Norwood MA）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリニア２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なるフルオロフォアを同時に励起及び測定する場合には、各フルオロフォアの発光スペクトルを用いて、データは先ずフルオロフォア間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。
【０３７２】
グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、GEMTOOLS遺伝子発現分析プログラム（Incyte）である。
【０３７３】
１２  相補的ポリヌクレオチド
NZMSをコードする配列群或いはその任意の部分に対する相補配列群を用いることにより、天然NZMSの発現が検出、低減、または阻害される。約15〜30塩基対を含むオリゴヌクレオチドの使用について記すが、これより小さな或いは大きな配列の断片の場合でも本質的に同じ方法を用いることができる。Oligo4.06ソフトウェア（National Biosciences）及びNZMSのコーディング配列を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計する。転写を阻害するためには、最も独特な５' 配列から相補的オリゴヌクレオチドを設計し、これを用いてプロモーターがコーディング配列に結合するのを阻害する。翻訳を阻害するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがNZMSをコードする転写物に結合するのを阻害する。
【０３７４】
１３  NZMSの発現
NZMSの発現および精製は、細菌若しくはウイルスを基にした発現系を用いて行うことができる。細菌内でNZMSを発現させるためには、cDNAを好適なベクターにサブクローニングする。ベクターは、抗生物質耐性遺伝子と、cDNA転写レベルを高める誘導性のプロモーターとを持つものを用いる。このようなプロモーターの例には、lacオペレーター調節エレメントと併用するT5またはT7バクテリオファージプロモーター及び、trp-lac (tac)ハイブリッドプロモーターが含まれるが、これらに限定するものではない。組換えベクターを、BL21（DE3）等の好適な細菌宿主に形質転換する。抗生物質耐性をもつ細菌は、イソプロピルβ−Dチオガラクトピラノシド(IPTG)で誘発されるとNZMSを発現する。真核細胞でのNZMSの発現は、昆虫細胞株または哺乳動物細胞株に一般にバキュロウイルスとして知られているAutographica californica核多角体病ウイルス(AcMNPV)の組換え型を感染させて行う。バキュロウイルスの非必須のポリヘドリン遺伝子を、相同組換え或いは転移プラスミドの媒介を伴う細菌の媒介による遺伝子転移のどちらかによって、NZMSをコードするcDNAと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモーターによって高いレベルのcDNAの転写が行われる。組換えバキュロウイルスは、多くの場合はSpodoptera frugiperda（Sf9）昆虫細胞への感染に用いられるが、ヒト肝細胞の感染にも用いられる。後者の感染の場合は、バキュロウイルスの更なる遺伝的変更が必要になる（Engelhard. E. K.他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3224-3227、Sandig, V.他 (1996) Hum. Gene Ther. 7:1937-1945等を参照）。
【０３７５】
殆どの発現系では、NZMSが、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼ(GST)、またはFLAGや6-Hisなどのペプチドエピトープ標識と合成された融合タンパク質となるため、未精製の細胞溶解物からの組換え融合タンパク質の親和性ベースの精製を素早く１回で行うことができる。GSTは日本住血吸虫からの26kDaの酵素であり、タンパク質の活性及び抗原性を維持した状態で、固定化グルタチオン上で融合タンパク質の精製を可能とする（Amersham Pharmacia Biotech）。精製後、GSTの部分を、特異的に操作した部位においてNZMSからタンパク分解的に切断することが可能である。ＦＬＡＧは８アミノ酸のペプチドであり、市販されているモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Eastman Kodak）を用いた免疫親和性精製を可能にする。６ヒスチジン残基が連続して伸長した6-Hisは、金属キレート樹脂（QIAGEN）上での精製を可能にする。タンパク質の発現及び精製の方法は、前出のAusubel（1995）10章、16章に記載されている。これらの方法で精製したNZMSを直接用いて以下の実施例17、18および19の、適用可能なアッセイを行うことができる。
【０３７６】
１４  機能的アッセイ
NZMSの機能は、哺乳動物細胞培養系において生理学的に高められたレベルでの、NZMSをコードする配列の発現によって評価する。cDNAを、cDNAを高いレベルで発現する強いプロモーターを含む哺乳動物発現ベクターにサブクローニングする。選択されるベクターには、pCMV SPORTプラスミド（Life Technologies）及びpCR 3.1プラスミド（Invitrogen, Carlsbad CA）が含まれ、どちらもサイトメガロウイルスプロモーターを有する。リポソーム製剤或いは電気穿孔法を用いて、5〜10μgの組換えベクターをヒト細胞株、例えば内皮由来または造血由来の細胞株に一過的に形質移入する。更に、標識タンパク質をコードする配列を含む１〜２μgのプラスミドを同時に形質移入する。標識タンパク質の発現により、形質移入細胞と非形質移入細胞を区別する手段が与えられる。また、標識タンパク質の発現によって、cDNAの組換えベクターからの発現を正確に予想できる。標識タンパク質は、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP；Clontech）、CD64、またはCD64-GFP融合タンパク質から選択できる。自動化された、レーザー光学に基づく技術であるフローサイトメトリー（FCM）を用いて、GFPまたはCD64-GFPを発現する形質移入された細胞を同定し、その細胞のアポトーシス状態や他の細胞特性を評価する。FCMは、細胞死に先行するか或いは同時に発生する現象を診断する蛍光分子の取込を検出して計量する。このような現象として挙げられるのは、ヨウ化プロピジウムによるDNA染色によって計測される核DNA含量の変化、前方散乱光と90°側方散乱光によって計測される細胞サイズと粒度の変化、ブロモデオキシウリジンの取込量の低下によって計測されるDNA合成の下方調節、特異抗体との反応性によって計測される細胞表面及び細胞内におけるタンパク質の発現の変化、及びフルオレセイン抱合したアネキシンＶタンパク質の細胞表面への結合によって計測される原形質膜組成の変化とがある。フローサイトメトリー法については、Ormerod, M. G. (1994) Flow Cytometry Oxford, New York, NY.に記述がある。
【０３７７】
遺伝子発現におけるNZMSの影響は、NZMSをコードする配列とCD64またはCD64-GFPのどちらかが形質移入された高度に精製された細胞集団を用いて評価することができる。CD64またはCD64-GFPは、形質転換された細胞表面で発現し、ヒト免疫グロブリンG（IgG）の保存領域と結合する。形質転換細胞と非形質転換細胞は、ヒトIgGまたはCD64に対する抗体（DYNAL, Lake Success. NY）で覆われた磁気ビーズを用いて有効に分離することができる。mRNAは、本技術分野で公知の方法で細胞から精製することができる。NZMSその他の目的の遺伝子をコードするmRNAの発現は、ノーザン分析或いはマイクロアレイ技術で分析することができる。
【０３７８】
１５NZMS  に特異的な抗体の作製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（PAGE；Harrington, M.G. (1990) Methods Enzymol. 182:488-495等を参照）または他の精製技術を用いて実質上精製されたNZMSを用いて、標準プロトコルで動物（ウサギ、マウス等）を免疫化して抗体を産出する。
【０３７９】
別法では、NZMSアミノ酸配列をLASERGENEソフトウェア（DNASTAR）を用いて解析して免疫原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを合成してこれを用いて当業者に周知の方法で抗体を生産する。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープなどの適切なエピトープの選択については、当分野で周知である(例えば、前出のAusubel, 1995,11章を参照)。
【０３８０】
通常は、長さ約１５残基のオリゴペプチドを、Fmocケミストリを用いるABI 431A ペプチドシンセサイザ（Applied Biosystems）を用いて合成し、N-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（MBS）を用いた反応によってKLH（Sigma-Aldrich, St. Louis MO）に結合させて、免疫原性を高める（前出のAusubel, 1995等を参照）。完全フロイントアジュバントにおいてオリゴペプチド-KLH複合体を用いてウサギを免疫化する。得られた抗血清の抗ペプチド活性及び抗NZMS活性を検査するには、ペプチドまたはNZMSを基質に結合し、1％BSAを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素で標識したヤギ抗ウサギIgGと反応させる。
【０３８１】
１６  特異的抗体を用いる天然NZMSの精製
天然または組換えNZMSを、NZMS特異抗体を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィにより実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、抗NZMS抗体を活性化クロマトグラフィー用樹脂、例えばCNBr活性化セファロース（Amersham Pharmacia Biotech）と共有結合させることにより作製する。結合後に、製造者の使用説明書に従って樹脂をブロックし、洗浄する。
【０３８２】
NZMSを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、NZMSを優先的に吸着する条件下（例えば洗浄剤が存在する高イオン強度緩衝液）でカラムを洗浄する。そのカラムを、抗体とNZMSとの結合を切るような条件で（例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸イオンのようなカオトロープで）溶出させ、NZMSを回収する。
【０３８３】
１７  NZMSと相互作用する分子の同定
NZMSまたは生物学的に活性であるNZMS断片を、125Iボルトンハンター試薬で標識する(例えばBolton A.E.およびW.M. Hunter (1973) Biochem. J. 133:529-539を参照)。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したNZMSと共にインキュベートし、洗浄して、標識したNZMS複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々なNZMS濃度で得られたデータを用いて、候補分子と結合したNZMSの数量及び親和性、会合についての値を計算する。
【０３８４】
或いは、NZMSと相互作用する分子は、Fields, S.及びO. Song (1989) Nature 340:245-246 に記載されているような酵母２ハイブリッドシステムを用いて分析するか、またはMATCHMAKERシステム（Clontech）等の２ハイブリッドシステムに基づく市販のキットを用いて分析する。
【０３８５】
NZMSはまた、ハイスループットな方法で酵母２ハイブリッドシステムを使用するPATHCALLINGプロセス（CuraGen Corp., New Haven CT）に用いて、遺伝子の２大ライブラリにコードされるタンパク質間の全ての相互作用を決定することができる（Nandabalan, K. 他 (2000) 米国特許第6,057,101号）。
【０３８６】
１８  NZMS活性の実証
NZMSの活性はさまざまな特定の酵素アッセイによって実証される。その一部を以下に概説する。
【０３８７】
NZMSの活性は、NZMSと共にＲＮＡ基質をインキュベートする結果として生成される可溶化したＲＮＡの量を決定することにより分光光度法で測定することが可能である。NZMSを含有する40mMのリン酸ナトリウム（pH 7.5）の0.8mlに、4mg/mlの酵母tRNA (Sigma)溶液を5μl(20μg)加える。反応液を25℃で15分間インキュベートする。3%過塩素酸を加えた20mM 硝酸ランタンの氷冷した新鮮な溶液0.5mlを加えることにより、反応を停止する。停止した反応物を氷上で少なくとも15分インキュベートする。そして10,000gで5分間遠心分離機にかけることにより不溶性tRNAを除去する。可溶性tＲＮＡは、可溶性tＲＮＡの40 μgに対応する1.0のA260、残りの上澄みのＵＶ吸収(260nm)として測定された(Rosenberg, H.F.他. (1996) Nucleic Acids Research 24:3507-3513)。
【０３８８】
NZMSの活性は、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸) (DTNB)との反応により形成された生成物（ホモシステイン）の速度を測定することにより加水分解の方向で分光器で測定される。1mMのEDTAを含有する50 mMのリン酸カリウムバッファ（pH 7.2）(バッファA)中に、4.7μg のNZMS-1と4ユニットのアデノシンデアミナーゼとを含有する800μlの酵素溶液に、バッファA中に250μM DTNBを含有する200μlのS-アデノシル‐L‐ホモシステイン(500μM)が加えられる。反応混合物は37℃で2分間インキュベートされる。加水分解活性を412nmでダイオード・アレイUV分光光度計を用いて連続してモニタ−する。酵素活性は、1μmolのSアデノシルLホモシステイン/分を加水分解することができる酵素の量として定義される(Yuan, C-S 他. (1996) J. Biol. Chem. 271:28009-28015)。
【０３８９】
あるいは、NZMSの活性は、基質として3-デアザアデノシンを用いて形成された生成物（Sアデノシルホモシステイン）として合成方向で測定することが可能である(前出、Sganga, M.W.他)。略述すると、NZMSを0.1mMの3-デアザアデノシン（deazaadenosine）、5mMのホモシステイン、20mMのHepes (pH 7.2)を含有する容量100μl中でインキュベートする。アッセイ混合液を37℃で15分間インキュベートする。10μlの3M 過塩素酸を加えることにより反応を停止する。氷上で15分間インキュベートした後、混合物をマイクロ遠心分離で4℃で5分間18,000×gで遠心分離機にかける。上澄みを除去して、1 M 炭酸カリウムの添加により中和して、再び遠心分離する。次に上澄みの50μlのアリコットは、流速1 ml/minで0.2 M 無水リン酸アンモニウム(Aldrich)での定組成溶離により、Altex Ultrasphere ODSカラム(5μmの粒子、4.6×250mm)でクロマトグラフィーにかける。ビシンコニン酸（bicinchoninic acid）アッセイによりタンパク質を決定する(Pierce)。
【０３９０】
または、NZMSの活性はTLC方法により、合成方向で測定することが可能である(Hershfield, M.S. 他. (1979) J. Biol. Chem. 254:22-25)。プレインキュベーション段階で、50 Mm [8-14C]アデノシンはNAD+の5モルの等価物と共に15分間22℃でインキュベートする。
【０３９１】
50 mMのリン酸カリウムバッファ（pH 7.4）、1mMのDTT、5mMのホモシステインから成る50 μlの最終容量のNZMSを含有するアッセイサンプルは、反応を開始するためにプレインキュベートした[8-14C]アデノシン/NAD+と混合する。反応は37℃でインキュベートする。またサンプル1μlを30分間、5分間隔でＴＬＣプレートにスポットとして載せる。クロマトグラムはブタノール-1/氷酢酸/水(12:3:5, v/v)で展開して、乾燥させる。紫外線下で基質と生成物を同定するために標準が用いられる。次に[14C]アデノシンと[14C]SAHを含有する完全なスポットは、X線フィルムをＴＬＣプレートに曝露することにより検出される。次に放射標識した基質と生成物はクロマトグラムから切断され、液体シンチレーション分析器により計数される。生成物ｖｓ時間プロットの線形最小二乗法の傾斜とサンプル中のタンパク質のｍｇ数から酵素の特異的活性を決定する(Bethin, K.E. 他. (1995) J. Biol. Chem. 270:20698-20702)。
【０３９２】
NZMSトランスフェラーゼ活性は供与基質と受容基質の間の放射標識されたメチル基の転移を測定するメチルトランスフェラーゼアッセイのような試験によって測定される(Bokar, J.A. 他 (1994) J. Biol. Chem. 269:17697-17704)。反応混合液(最終容量50μl )にはpH 7.9の15mM HEPES、1.5mM MgCl2、10 mM ジチオスレイトール、3% ポリビニルアルコール、1.5 μCi [methyl-3H]AdoMet(0.375 μM AdoMet)(DuPont-NEN)、0.6 μg HEM、および受容基質(1 mM の最終濃度に対して、0.4μg [35S]RNAまたは6-メルカプトプリン(6-MP))が含まれる。反応混合液は30℃で30分間、次に65℃ で5分間インキュベートする。この生成物はクロマトグラフィーか、または電気泳動によって分離し、メチルトランスフェラーゼ活性のレベルをmethyl-3H 回収の定量によって測定する。
【０３９３】
NZMSのリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ活性は、NZMSを含むサンプルを100 mM Tris-HCl（pH 7.4）、1 mMのチオール試薬 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)、50μm LPA, および50μm アシル-CoAとともにインキュベートすることによって測定される。この反応はアシル-CoAを加えることによって開始され、平衡状態に到達させる。アシル-CoA からLPAへのアシル基の転移によって遊離CoAが放出され、これがDTNBと反応する。DTNBと遊離CoA間の反応生成物は413nmの光を吸収する。413nmにおける吸光度の変化は、分光光度計を用いて測定され、また、サンプル中のNZMSのリゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ活性に比例する。
【０３９４】
NZMSのN-アシルトランスフェラーゼ活性は、放射標識されたアミノ酸基質を用いて、放射標識の抱合型生成物への取り込みを測定することによって測定される。非標識アシル-CoA化合物と放射標識アミノ酸を含む反応バッファー中でNZMSをインキュベートし、放射標識アシル抱合体をn-ブタノールまたは他の適切な有機溶媒に抽出することによって未反応のアミノ酸から分離する。例えばJohnson, M. R 他 (1990; J. Biol. Chem. 266:10227-10233)は、胆汁酸-CoA:アミノ酸N-アシルトランスフェラーゼ活性の測定を、この酵素をコリル-CoA および 3H-グリシンまたは 3H-タウリンと共にインキュベートし、また、トリチウム化コール酸抱合体（tritiated cholate conjugate)をn-ブタノールへの抽出によって分離し、シンチレーションによって抽出産物内の放射活性を測定して行った。あるいはN−アシルトランスフェラーゼ活性の測定には、下記の還元されたCoA (CoASH)の分光光度測定法を用いる。
【０３９５】
NZMSのN-アシルトランスフェラーゼ活性は[14C]アセチル-CoAから基質分子への放射標識の転移を用いて測定される(例えば、Deguchi, T. (1975) J. Neurochem. 24:1083-5参照)。あるいは、CoASHとのDTNB反応に基づいた、より新しい分光光度アッセイを用いてもよい。遊離チオール含有CoASHは、N-アセチルトランスフェラーゼが触媒する、基質へのアセチル基の転移時に形成される。CoASHの検出には、DTNB抱合体の吸光度（412nm)を用いる(De Angelis, J. 他 (1997) J. Biol. Chem. 273:3045-3050)。NZMS活性は放射活性の基質への取り込み率、すなわち分光光度測定における吸光度の増加率に比例する。
【０３９６】
NZMSのアミノトランスフェラーゼ活性の測定は、酵素結合補助因子であるピリドキサール5'-リン酸(PLP)のUV/VIS吸収スペクトルにおける変化をモニタリングして、一回のターンオーバーの条件下で精製されたNZMSのサンプル或いはNZMSを含む未精製のサンプルの様々なアミノ酸およびオキソ酸基質に対する活性を測定して行う。この反応は、9μM 精製NZMSまたはNZMS含有サンプルおよび試験する基質（アミノ酸およびオキソ酸基質）を含む50mM4-メチルモルフォリン(pH7.5)において25℃で行う。アミノ酸からオキソ酸への半反応の後に、酵素結合PLPのPMPへの変換により生じる360nmにおける吸光度の低下および330nmにおける吸光度の増加を測定する。NZMSの特異性および相対的な活性を、特定の基質に対する酵素活性によって測定する（Vacca, R. A.他 (1997) J. Biol. Chem. 272:21932-21937）。
【０３９７】
NZMSのガラクトシルトランスフェラーゼ活性は、放射性アッセイにおけるUDP-ガラクトースからGlcNAc末端オリゴサッカライド鎖へのガラクトースの転移を測定することによって測定できる(Kolbinger, F. 他(1998) J. Biol. Chem. 273:58-65)。NZMSサンプルは、14 μl のアッセイ用ストック溶液(180 mM のカコジル酸ナトリウム、pH 6.5、1 mg/ml のウシ血清アルブミン、0.26 mM のUDP-ガラクトース、2 μl のUDP-[3H]ガラクトース)、1 μl の MnCl2 (500 mM)および 2.5 μl の GlcNAcβO-(CH2)8-CO2Me (ジメチルスルホキシド中に37 mg/ml )で37℃にて60分間インキュベートする。この反応は1mlの水を加えて停止させ、C18 Sep-Pak カートリッジ(Waters)に搭載し、カラムを2回5mlの水で洗浄して未反応のUDP-[3H]ガラクトースを除去する。[3H]ガラクトシル化GlcNAcβO-(CH2)8-CO2Me は水で洗浄する間はカラムに結合されたままであり、5mlのエタノールで溶出する。溶出された物質の放射活性は液体シンチレーションカウンターで測定され、これは開始サンプルのNZMSのガラクトシルトランスフェラーゼ活性に比例する。
【０３９８】
NZMSのホスホリボシルトランスフェラーゼ活性はホスホリボシルピロリン酸(PRPP) からプリンまたはピリミジン塩基へのホスホリボシル基の転移として測定される。pH 9.0の50 mM Tris 酢酸、20 mM 2-メルカプトエタノール、 12.5 mM MgCl2および0.1 mM 標識基質([14C]ウラシル等)を含むアッセイ混合液(20ml)は、pH 9.7の0.1 M Tris 酢酸で希釈したNZMS、1 mg/ml のウシ血清アルブミンを含む20mlの溶液と混合する。反応液は前もって37℃で一分間加熱し、10mlの6 mM PRPPで開始され、37℃で5分間インキュベートする。この反応は100℃で一分間加熱することによって停止する。生成物[14C]UMP をDEAE-セルロース紙上で[14C]ウラシルから分離する(Turner, R.J. 他 (1998) J. Biol. Chem. 273:5932-5938)。生成された[14C]UMP の量はNZMSのホスホリボシルトランスフェラーゼ活性に比例する。
【０３９９】
NZMSのADP-リボシルトランスフェラーゼ活性はアデニン-NAD からアグマチンへの放射標識の転移として測定される(Weng, B. 他 (1999) J. Biol. Chem. 274:31797-31803)。精製されたNZMSは、50 mM リン酸カリウム (pH. 7.5)、20 mM アグマチン、および0.1 mM [アデニン-U-14C]NAD (0.05 mCi)を含む総量300ml中で1時間、30℃でインキュベートする。サンプル(100ml)をDowex カラムにかけ、5mlの水で[14C]ADP-リボシルアグマチンを溶出し、液体シンチレーションカウンターにかける。回収された放射活性の量は、NZMSのADP-リボシルトランスフェラーゼ活性に比例する。
【０４００】
NZMSのアルド／ケト還元酵素活性は、NADPHが消費されるにつれての、340nmにおける吸光度の減少に比例する（あるいは、例えば逆反応が観察される場合のようにNADPHが生成されるなら吸光度は増加する）。標準的な反応混合液は、135mMのリン酸ナトリウムバッファ（酵素によりpH6.2〜7.2の範囲）、0.2mM NADPH、0.3M硫酸リチウム、0.5〜2.5μgNZMS、および好適なレベルの基質を含む。この混合液を30℃でインキュベートし、反応を分光光度計で連続的に測定する。NZMS活性は、NZMS1μg当たり消費されるNADPHのモル数として計算される。
【０４０１】
NZMSのアシルCoAデヒドロゲナーゼ活性を、嫌気性の電子伝達フラビンタンパク質(ETF)アッセイを用いて測定する。反応混合液は、32℃に前もって加熱した50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5% グルコースと50 μM アシルCoA基質(即ちイソバレリルCoA)から成る。混合液は、真空へ反復して曝露することにより酸素を枯渇させ、その後アルゴンガスで覆われる。ブドウ糖酸化酵素とカタラーゼの添加によって微量の酸素を除去し、最終濃度1μMのETFを添加する。この反応は、精製したNZMSまたはNZMSを含むサンプルを加え、342nmで反応を刺激することによって開始する。基質からETFへの電子の転移により引き起こされる蛍光の消光（クエンチング）が、496 nmにおいて観察される。アシルCoAデヒドロゲナーゼ活性の1ユニットを、1分間にETFを1μmol減少するために必要なNZMSの量として定義する(Reinard, T. 他 (2000) J. Biol. Chem. 275:33738-33743)。
【０４０２】
NZMSのアルコールデヒドロゲナーゼ活性を、25℃、0.1 Mリン酸カリウム(pH 7.5)、0.1 Mグリシン(pH 10.0)、2.4 mM NAD+で340 nm (ε340 = 6.22 mM-1 cm-1)におけるNAD+からNADHへの変換を追跡して測定する。次に、基質（エタノール等）とNZMSが反応液に添加される。NADHの生成は、340nmにおける吸光度の増加を生じる。そしてこれは、アルコール基質の酸化と、また、NZMSサンプル中のアルコールデヒドロゲナーゼ活性の量と相関する(Svensson, S. (1999) J. Biol. Chem. 274:29712-29719)。
【０４０３】
NZMSのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性は、NZMSの総デヒドロゲナーゼ活性+加水分解酵素活性を決定し、加水分解酵素活性を引くことにより測定する。加水分解酵素活性を、例えば10-HCO-HPteGlu (10-ホルミルテトラヒドロ葉酸、HPteGlu, テトラヒドロ葉酸)または10-FDDF (10-ホルミルー5,8-dideazafolate)等の0.05 M Tris-HCl (pH 7.8)、100 mM 2-メルカプトエタノール、および0.5〜18μMの基質を含む反応混合液で最初に決定する。約1μgのNZMSを最終容量1.0 mlに添加する。反応をモニターして、酵素以外のすべての成分を含むブランク対照のキュベットに比較して測定する。5,8-dideazafolateで1.89x104、HPteGluで2.17x104のモル吸光係数を用いて5,8-dideazafolateに対しては295 nmあるいはHpteGluに対しては300 nmで生成物を測定する。反応混合液へのNADP+の添加により、デヒドロゲナーゼ活性と加水分解酵素活性の両者の測定が可能となる（アッセイはすでに記載されたように実施する）。NADP+の存在下での生成物の生成と補助因子の不存在下での生成物の生成に基づき、NZMSのアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を計算する。別法では、プロパナールを基質として用いてアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性をアッセイする。反応混合液は、60 mM ピロリン酸ナトリウムバッファー(pH 8.5) 5 mM プロパナール、1mM NADP+、総量1mlのNZMSを含む。NADPHの生成による340nmにおける吸光度の増加により、活性を決定する。これはサンプル中のアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性と比例する(Sergey A. Krupenko. S.A. 他. (1995) J. Biol. Chem. 270:519-522)。
【０４０４】
NZMSの6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を、120 mMトリエタノールアミン(pH 7.5)、0.1 mM EDTA、 0.5 mM NADP+、10〜150 μMの 6-ホスホグルコン酸の基質を含む溶液に精製したNZMSまたはNZMSから成る組成物を20〜25℃でインキュベートして測定する。NADPHの生成を蛍光的に測定し(340 nm 励起、450 nm 発光)、生成は6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性を意味する。あるいは、NADPHの生成物を吸光度340 nmに基づいて光度測定する。反応で生成したNADPHのモル量は、サンプル中の6-ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ活性に比例する(Tetaud, E. 他 (1999) Biochem. J. 338:5560)。
【０４０５】
NZMSのリボヌクレオチド二リン酸還元酵素活性は、ジチオスレイトールと共に、精製したNZMSまたはNZMSから成る組成物、Mg++、ADP、GDP、CDP、およびUDPの基質をインキュベートすることにより決定する。対応するデオキシリボヌクレオチドである反応の生成物は、薄層クロマトグラフィにより基質から分離される。反応生成物は、移動速度に基づいて反応物質から区別することが可能である。放射標識した基質の使用は、アッセイの感度を高めるための代替である。反応で生成したデオキシリボヌクレオチドの量は、サンプル中のリボヌクレオチドニリン酸還元酵素の活性量に比例する（酵素は生成物により負にフィードバック阻害されるので、リボヌクレオチドニリン酸還元酵素活性が定常状態に至る以前のみにあてはまることに注意）（Nutter, L.M.及びCheng, Y-C. (1984) Pharmac. Ther. 26:191-207）。
【０４０６】
NZMSのジヒドロジオールデヒドロゲナーゼ活性は、限定するわけではないが(±)-トランス-ナフタリン-1,2-ジヒドロジオール、(±)-トランス-フェナントレン-1,2-ジヒドロジオール、(±)-トランス-クリセン-1,2-ジヒドロジオールを含む基から選択した50 mMグリシン(pH 9.0)、2.3 mM NADP+、8% DMSO、トランス-ジヒドロジオールの基質から成る反応混合液において精製したNZMSまたはNZMSから成る組成物をインキュベートして測定する。酸化反応をNADPHの形成を検出するために340nmにおいて観察する。形成は基質の酸化を示す。反応成分の立体化学を決定するために、またNZMSにより酸化するラセミ酸基質成分の光学異性体を決定するために円偏光二色性により、NZMSの添加前後に、反応混合液を分析することもできる(Penning, T.M. (1993) Chemico-Biological Interactions 89:1-34)。
【０４０７】
多くのグルタチオンSトランスフェラーゼ（GST）の共通基質である1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼン(CDNB)とGSHとの、NZMSが触媒する抱合の測定により、NZMSのGST活性を決定する。NZMSを0.1Mリン酸カリウムバッファ（pH 6.5）中で、1 mM CDNBと2.5mM GSHと共に25℃でインキュベートする。紫外線分光光度計を用いて340 nmにおいて抱合反応を吸光度の変化により測定する。NZMS活性は、340nmでの吸光度の変化に比例する。
【０４０８】
NZMSの15-オキソプロスタグランジン13-還元酵素(PGR)活性を、DEAEクロマトグラフィにより15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ（15-PGDH）活性の汚染を分離した後に測定する。PGRを含む分画の単離後に（あるいは精製したNZMSを使用して）、0.1 M リン酸ナトリウム(pH 7.4)、1 mM 2-メルカプトエタノール、20 μgの基質(例えばプロスタグランジンPGE1、PGE2、PGE2αの15-オキソ誘導体)と1 mM NADH (あるいはより高濃度のNADPH)から成る反応液で活性をアッセイする。NZMSを反応液に添加した後、37℃で10分インキュベートする。この反応は0.25 mlの2 N NaOHを加えて止める。サンプル中に残る15-オキソ化合物の量は、停止した反応の500 nmでの最大吸光度の測定により決定する。そしてこの値を、NZMSを入れなかった停止したコントロール反応液の測定値と比較する。１単位の酵素は、１分間に1μmolの基質の酸化を触媒するために必要な量と定義する。これはサンプル中のPGR活性量に比例する。
【０４０９】
NZMS発現ベクターで形質転換した大腸菌を、唯一の炭素源と窒素源としてコリンを含む培地で増殖させることにより、NZMSのコリンデヒドロゲナーゼ活性を同定する。形質転換したバクテリアの成長能力は、コリンデヒドロゲナーゼ活性を示す(Magne Osteras, M. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:11394-11399)。
【０４１０】
NZMSの炭酸脱水酵素活性のアッセイは、炭酸脱水酵素活性を測定するために流れの停止した蛍光光度法を併用して蛍光pH指示薬8-ヒドロキシピレン-1,3,6-トリスルホン酸塩（ピラニン）を使用する(Shingles, 他. 1997, Anal. Biochem. 252: 190-197)。pH 6.0の溶液をpH 8.0の溶液と混合し、重炭酸の脱水化の初期速度を測定する。pH 6.0の溶液への炭酸脱水酵素の追加により、2 ミリ秒の分解時間で生理学的温度における活性の初期速度の測定が可能となる。Shingles他はこのアッセイを使用して、哺乳動物の炭酸脱水酵素アイソフォーム間の比較により、活性とスルホンアミドへの感度の差異を解析した。蛍光技術の感度により、65 ng/mlほどの低いタンパク質濃度の初期速度の決定が可能となる。
【０４１１】
タンパク質ホスファターゼ（PP）活性は、P-ニトロフェニルリン酸(PNPP)の加水分解によって測定する。NZMSを、0.1％のβメルカプトエタノールの存在下で、ｐH7.5のHEPESバッファー中にPNPPと共に37℃で60分インキュベートする。この反応は６mlの10N NaOHを加えて停止する（Diamond, R.H.他 (1994) Mol. Cell. Biol. 14:3752-62）。或いは、NZMSの酸性ホスファターゼ活性は、ｐH4.5の0.1Mクエン酸ナトリウム、及び50μlの40ｍM塩化ナトリウム中にNZMSを含む抽出液と100μlの10ｍM PNPPを37℃で20分インキュベートして実証する。この反応は0.5 mlの0.4M グリシン／NaOH（ｐH10.4）を加えて止める（Saftig, P. 他 (1997) J. Biol. Chem. 272:18628-18635）。PNPPの加水分解によって起こる410nmでの光吸収の増加を分光光度計で測定する。このアッセイでは、光吸収の増加がNZMSの活性に比例する。
【０４１２】
別法では、NZMS活性は、リン酸化したタンパク質基質から除去されたリン酸の量を測定して決定する。反応は、60mM Tris（pH7.6）、1mM EDTA、1mM EGTA、0.1％2-メルカプトエタノールおよび10μM 基質（セリン／トレオニンまたはチロシン残基で好適に32P標識された基質）を含む最終容量30μlに、2nM或いは4nMのNZMSを加えて行なう。反応は基質で開始し、30℃で10〜15分間インキュベートする。0.6 M HC1、90mM Na4P2O7、および2mM NaH2PO4中の4％(w/v)活性化木炭450μlで停止させ、次に12,000×gで5分間遠心分離する。酸可溶性32Piを液体シンチレーションカウンターで定量する（Sinclair, C. 他 (1999) J. Biol. Chem. 274:23666-23672）。
【０４１３】
NZMS活性は、32P内部標識化T. thermophila pre-tRNAGlnを切断するNZMSの能力として測定することができる。NZMSと基質は反応槽に加えられ、反応はMBBバッファ(50 mM トリス-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl2)で１時間、37℃で実施される。反応は同じローディングバッファー(SLB: 40 mM EDTA, 8 M 尿素, 0.2% キシレンシアノール、0.2% ブロムフェノール青)の同量を添加して停止する。反応生成物は、8 M尿素、6% ポリアクリルアミドゲルで電気泳動法により分離する。そして検出機器と、生成物を定量化可能なソフトウエアを使用して分析する。NZMS活性の1ユニットは、１時間、37℃で生成物を成熟させるのにT. thermophila pre-tRNAGlnの28 fmolの10%を切断するのに必要な酵素の量として定義される(True, H.L. 他. (1996) J. Biol. Chem. 271:16559-16566)。
【０４１４】
あるいは、NZMSによる32P内部標識化基質tRNAの切断は、30 mMのHEPES-KOH (pH 7.6)、6 mMのMgCl2、30 mMのKcl、2 mMのDTT、25μg/mlのウシ血清アルブミン、1 unit/μlのrRNasin、ゲル精製基質RNA 5,000-50,000 cpmを含有する20 μlの反応混合物において測定可能である。3.0μlのNZMSを反応混合物に加え、次に37℃、30分間インキュベートする。反応はguanidinium/フェノール抽出により停止し、グリコーゲンの存在下でエタノール沈殿させ、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(6または8%ポリアクリルアミド、7 M尿素)とオートラジオグラフィーにかける(Rossmanith, W. 他 (1995) J. Biol. Chem. 270:12885-12891)。NZMS活性は、検出された切断生成物の量に比例する。
【０４１５】
１９  NZMS阻害剤の同定
実施例１７のアッセイで説明したように、試験する化合物を、好適なバッファーおよび基質と共に、様々な濃度でマルチウェルプレートのウェルに分注する。NZMS活性はそれぞれのウェルについて測定し、NZMS活性を阻害するそれぞれの化合物の能力および用量反応プロフィール（dose-response profiles）を決定することができる。NZMS活性を増強する分子の同定にも、このアッセイを用いることができる。
【０４１６】
当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【０４１７】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の完全長ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の命名法の概略を示す。
【０４１８】
表２は、GenBank識別番号及び本発明のポリペプチドに最も近いGenBank相同体の注釈を示す。各ポリペプチドとその相同体(群)との一致の確率スコアも併せて示す。
【０４１９】
表３は、予測されるモチーフ及びドメインを含む本発明のポリペプチド配列の構造的特徴を、ポリペプチドの分析に用いるための方法、アルゴリズム及び検索可能なデータベースと共に示す。
【０４２０】
表４は、本発明のポリヌクレオチド配列を構築するために用いたcDNAやゲノムDNA断片を、ポリヌクレオチド配列の選択した断片と共に示す。
【０４２１】
表５は、本発明のポリヌクレオチドの代表的なcDNAライブラリを示す。
【０４２２】
表６は、表５に示したcDNAライブラリの作製に用いた組織及びベクターを説明する付表である。
【０４２３】
表７は、本発明のポリヌクレオチドとポリペプチドの分析に用いたツール、プログラム、アルゴリズムを、適用可能な説明、参照文献及び閾値パラメータと共に示す。
【０４２４】
【表１】
2004520832.tif 000005
【０４２５】
【表２−１】
2004520832.tif 000006
【０４２６】
【表２−２】
2004520832.tif 000007
【０４２７】
【表３−１】
2004520832.tif 000008
【０４２８】
【表３−２】
2004520832.tif 000009
【０４２９】
【表３−３】
2004520832.tif 000010
【０４３０】
【表３−４】
2004520832.tif 000011
【０４３１】
【表３−５】
2004520832.tif 000012
【０４３２】
【表３−６】
2004520832.tif 000013
【０４３３】
【表４−１】
2004520832.tif 000014
【０４３４】
【表４−２】
2004520832.tif 000015
【０４３５】
【表４−３】
2004520832.tif 000016
【０４３６】
【表５】
2004520832.tif 000017
【０４３７】
【表６−１】
2004520832.tif 000018
【０４３８】
【表６−２】
2004520832.tif 000019
【０４３９】
【表６−３】
2004520832.tif 000020
【０４４０】
【表７−１】
2004520832.tif 000021
【０４４１】
【表７−２】
2004520832.tif 000022
【国際公開パンフレット】
2004520832.tif 000023
2004520832.tif 000024
2004520832.tif 000025
2004520832.tif 000026
2004520832.tif 000027
2004520832.tif 000028
2004520832.tif 000029
2004520832.tif 000030
2004520832.tif 000031
2004520832.tif 000032
2004520832.tif 000033
2004520832.tif 000034
2004520832.tif 000035
2004520832.tif 000036
2004520832.tif 000037
2004520832.tif 000038
2004520832.tif 000039
2004520832.tif 000040
2004520832.tif 000041
2004520832.tif 000042
2004520832.tif 000043
2004520832.tif 000044
2004520832.tif 000045
2004520832.tif 000046
2004520832.tif 000047
2004520832.tif 000048
2004520832.tif 000049
2004520832.tif 000050
2004520832.tif 000051
2004520832.tif 000052
2004520832.tif 000053
2004520832.tif 000054
2004520832.tif 000055
2004520832.tif 000056
2004520832.tif 000057
2004520832.tif 000058
2004520832.tif 000059
2004520832.tif 000060
2004520832.tif 000061
2004520832.tif 000062
2004520832.tif 000063
2004520832.tif 000064
2004520832.tif 000065
2004520832.tif 000066
2004520832.tif 000067
2004520832.tif 000068
2004520832.tif 000069
2004520832.tif 000070
2004520832.tif 000071
2004520832.tif 000072
2004520832.tif 000073
2004520832.tif 000074
2004520832.tif 000075
2004520832.tif 000076
2004520832.tif 000077
2004520832.tif 000078
2004520832.tif 000079
2004520832.tif 000080
2004520832.tif 000081
2004520832.tif 000082
2004520832.tif 000083
2004520832.tif 000084
2004520832.tif 000085
2004520832.tif 000086
2004520832.tif 000087
2004520832.tif 000088
2004520832.tif 000089
2004520832.tif 000090
2004520832.tif 000091
2004520832.tif 000092
2004520832.tif 000093
2004520832.tif 000094
2004520832.tif 000095
2004520832.tif 000096
2004520832.tif 000097
2004520832.tif 000098
2004520832.tif 000099
2004520832.tif 000100
2004520832.tif 000101
2004520832.tif 000102
2004520832.tif 000103
2004520832.tif 000104
2004520832.tif 000105
2004520832.tif 000106
2004520832.tif 000107
2004520832.tif 000108
2004520832.tif 000109
2004520832.tif 000110
2004520832.tif 000111
2004520832.tif 000112
2004520832.tif 000113
2004520832.tif 000114
2004520832.tif 000115
2004520832.tif 000116
2004520832.tif 000117
2004520832.tif 000118
2004520832.tif 000119
2004520832.tif 000120
2004520832.tif 000121
2004520832.tif 000122
2004520832.tif 000123
2004520832.tif 000124
2004520832.tif 000125
2004520832.tif 000126
2004520832.tif 000127
2004520832.tif 000128
2004520832.tif 000129
2004520832.tif 000130
2004520832.tif 000131
2004520832.tif 000132
2004520832.tif 000133
2004520832.tif 000134
2004520832.tif 000135
2004520832.tif 000136
2004520832.tif 000137
2004520832.tif 000138
2004520832.tif 000139
2004520832.tif 000140
2004520832.tif 000141
2004520832.tif 000142
2004520832.tif 000143
2004520832.tif 000144
2004520832.tif 000145
2004520832.tif 000146
2004520832.tif 000147
2004520832.tif 000148
2004520832.tif 000149
2004520832.tif 000150
2004520832.tif 000151
2004520832.tif 000152
2004520832.tif 000153
2004520832.tif 000154
2004520832.tif 000155
2004520832.tif 000156
2004520832.tif 000157
2004520832.tif 000158
2004520832.tif 000159
2004520832.tif 000160
2004520832.tif 000161
2004520832.tif 000162
2004520832.tif 000163
2004520832.tif 000164
2004520832.tif 000165
2004520832.tif 000166
2004520832.tif 000167
2004520832.tif 000168
2004520832.tif 000169
2004520832.tif 000170
2004520832.tif 000171
2004520832.tif 000172
2004520832.tif 000173
2004520832.tif 000174
2004520832.tif 000175
2004520832.tif 000176
2004520832.tif 000177
2004520832.tif 000178
2004520832.tif 000179
2004520832.tif 000180
2004520832.tif 000181
2004520832.tif 000182
2004520832.tif 000183
2004520832.tif 000184
2004520832.tif 000185
2004520832.tif 000186
2004520832.tif 000187
2004520832.tif 000188
2004520832.tif 000189
2004520832.tif 000190
2004520832.tif 000191
2004520832.tif 000192
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520832.tif 000193
【国際調査報告】
2004520832.tif 000194
2004520832.tif 000195
2004520832.tif 000196
2004520832.tif 000197
2004520832.tif 000198
2004520832.tif 000199
2004520832.tif 000200