(57)【要約】ヒトＰ２Ｙ１様Ｇタンパク共役受容体を調節する試薬は、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症及びウイルス感染症、特にＨＩＶウイルスによって引き起こされる感染症、疼痛、癌、摂食障害、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧症、高血圧症、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、多発性硬化症、良性前立腺肥大、並びに不安症（ａｎｘｉｅｔｙ）、統合失調症、躁鬱病、譫妄、痴呆、様々な精神遅延、及びハンチントン舞踏病やテゥレット（Ｔｏｕｒｅｔｔ）症候群を含む精神異常及び神経疾患を包含する機能障害又は疾患（これらに制限される訳ではない）を、予防し、回復させ又は改善させるのに重要な働きをし得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および配列番号２に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１、３、４又は５に記載の配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）〜（ｃ）に明記するポリヌクレオチド配列から逸脱しているポリヌクレオチド；並びに
ｅ）（ａ）〜（ｄ）に明記するポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異体を表すポリヌクレオチド、
から成る群より選択されるポリヌクレオチド。
【請求項２】
請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項３】
請求項２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４】
請求項１に記載のポリヌクレオチドによってコードされている、実質上精製されたＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド。
【請求項５】
ａ）請求項３に記載の宿主細胞を、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの発現に好適な条件下で培養する工程；および、
ｂ）該宿主細胞培養からＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを回収する工程、
を含む、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを生産する方法。
【請求項６】
ａ）請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを生物試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させる工程；および、
ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程、
を含む、生物試料中のＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するための方法。
【請求項７】
ハイブリダイゼーション前に、生物試料の核酸材料を増幅させる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
生物試料を、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドと特異的に相互作用する試薬と接触させる工程を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを検出するための方法。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれかに記載の方法を実施するための診断キット。
【請求項１０】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによってコードされている任意のＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドと接触させる工程；
該Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を低下させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドと結合する被験化合物を、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を低下させる可能性のある治療物質として同定する方法。
【請求項１１】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドによってコードされるＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドと接触させる工程；および、
該ポリペプチドのＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性を検出する工程、
を含むＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を調節する物質をスクリーニングする方法であって、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性を増大させる被験化合物をＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を増大させる可能性のある治療物質として同定し、そして該ポリペプチドのＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性を減少させる被験化合物をＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を減少させる可能性のある治療物質として同定する方法。
【請求項１２】
被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドと接触させ、該ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する工程を含む、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を減少させる物質をスクリーニングする方法であって、該ポリヌクレオチドに結合する被験化合物をＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を減少させる可能性のある治療物質として同定する方法。
【請求項１３】
細胞を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドと特異的に結合する試薬と接触させ、それによりＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を減少させる工程を含む、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を減少させる方法。
【請求項１４】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法によって同定される、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を調整する試薬。
【請求項１５】
請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の試薬および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項１６】
疾患においてＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を調整する、請求項１５に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１７】
該疾患が、細菌、真菌、原虫及びウイルス感染症、疼痛、癌、摂食障害、過食症、喘息、ＣＮＳ疾患、急性心不全、低血圧症、高血圧症、尿閉、骨粗鬆症、糖尿病、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、炎症、アレルギー、多発性硬化症、良性前立腺肥大症、精神病、神経疾患又はジスキネジアである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ。
【請求項１９】
配列番号１、３、４又は５を含む、請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
【請求項２０】
配列番号１、３、４又は５から成る、請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
【請求項２１】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２２】
該ポリヌクレオチドが配列番号１、３、４又は５から成る、請求項２１に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
該ポリヌクレオチドが配列番号１、３、４又は５から成る、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含む精製されたポリペプチド。
【請求項２６】
配列番号２に示すアミノ酸配列から成る、請求項２５に記載の精製されたポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２８】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリペプチドが発現される条件下で培養し；そして該ポリペプチドを単離する工程を含む、該ポリペプチドを生産する方法。
【請求項２９】
該発現ベクターが配列番号１、３、４又は５を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
配列番号１、３、４又は５に記載の１１個の連続ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを、生物試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ；そして、該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程を含む、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出する方法。
【請求項３１】
ハイブリダイズさせる工程の前に、該核酸材料を増幅させる工程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
配列番号１、３、４又は５に記載の１１個の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド；および、
請求項３０に記載の方法についての説明書、
を含む、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出するためのキット。
【請求項３３】
生物試料を、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する試薬と接触させて、試薬−ポリペプチド複合体を形成させる工程；および、
該試薬−ポリペプチド複合体を検出する工程、
を含む、該ポリペプチドを検出するための方法。
【請求項３４】
該試薬が抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する抗体；および
請求項３３に記載の方法についての説明書、
を含む、該ポリペプチドを検出するためのキット。
【請求項３６】
被験化合物を、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列、および（２）配列番号２に示すアミノ酸配列、から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる工程；および
該ポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を調整することができる物質をスクリーニングするための方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物をヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を調節する可能性のある物質として規定する方法。
【請求項３７】
接触させる工程が細胞においてである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
インビトロにおける細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
接触させる工程が無細胞系においてである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
該ポリペプチドが検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
被験化合物が検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
被験化合物が該ポリペプチドと結合している標識化リガンドに取って代わる、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
該ポリペプチドが固体支持体と結合している、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
被験化合物が固体支持体と結合している、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
被験化合物を、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列、および、（２）配列番号２に示すアミノ酸配列、から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させる工程；および
該ポリペプチドの活性を検出する工程、
を含むヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を調整する物質をスクリーニングする方法であって、該ポリペプチドの活性を増大させる被験化合物をヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を増大させる可能性のある物質として同定し、該ポリペプチドの活性を減少させる被験化合物をヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を減少させる可能性のある物質として同定する方法。
【請求項４６】
接触させる工程が細胞においてである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
インビトロにおける細胞である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
接触させる工程が無細胞系においてである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
被験化合物を、配列番号１、３、４又は５に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる産物と接触させる工程；および
該産物に対する被験化合物の結合を検出する工程、
を含むヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を調整する物質をスクリーニングする方法であって、該産物に結合する被験化合物をヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を調節する可能性のある物質として同定する方法。
【請求項５０】
該産物がポリペプチドである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
該産物がＲＮＡである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
細胞を、配列番号１、３、４又は５に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる産物と特異的に結合する試薬と接触させ、それによりヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を減少させる工程を含む、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を減少させる方法。
【請求項５３】
該産物がポリペプチドである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
該産物が抗体である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
該産物がＲＮＡである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
該試薬がリボザイムである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
インビトロにおける細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
該細胞がインビボにおいてである、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する試薬；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６１】
該試薬が抗体である、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
配列番号１、３、４又は５に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの産物と特異的に結合する試薬；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６３】
該試薬がリボザイムである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
該試薬が抗体である、請求項６２に記載の医薬組成物。
【請求項６６】
配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする発現ベクター；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
【請求項６７】
該発現ベクターが配列番号１、３、４又は５を含む、請求項６６に記載の医薬組成物。
【請求項６８】
細菌、真菌、原虫及びウイルス感染症、疼痛、癌、摂食障害、過食症、喘息、ＣＮＳ疾患、急性心不全、低血圧症、高血圧症、尿閉、骨粗鬆症、糖尿病、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、炎症、アレルギー、多発性硬化症、良性前立腺肥大症、精神病、神経疾患及びジスキネジアより選択されるＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ機能障害関連疾患を処置する方法であって、それを必要とする患者に、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの機能を調整する試薬の治療的有効量を投与し、それによりＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ機能障害関連疾患の症状を回復させる方法。
【請求項６９】
該試薬が請求項３６に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
該試薬が請求項４５に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
該試薬が請求項４９に記載の方法によって同定される、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、Ｇタンパク共役受容体の分野に関する。より具体的には、本発明は、Ｐ２Ｙ１様Ｇタンパク共役受容体及びその調節の分野に関する。
【０００２】
（背景技術）
Ｇタンパク質共役受容体
多くの医学的に重要な生体プロセスは、Ｇタンパク質を含むシグナル伝達経路により媒介されている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ， Ｎａｔｕｒｅ ３５１， ３５３−３５４， １９９１）。Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のファミリーには、ホルモン、神経伝達物質、成長因子及びウイルスに対する受容体が含まれる。ＧＰＣＲの具体的例としては、ドーパミン、カルシトニン、アドレナリン作動性ホルモン、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｇｅｎｅ）−１、ロドプシン、臭気物質、サイトメガロウイルス、Ｇタンパク質自身、エフェクタータンパク質（例えばホスホリパーゼＣ、アデニル酸シクラーゼ及びホスホジエステラーゼ）、及びアクチュエータータンパク質（例えばプロテインキナーゼＡ及びプロテインキナーゼＣ）などの多彩な物質のための受容体が挙げられる。
【０００３】
ＧＰＣＲは、少なくとも８つの異なる親水性ループを連結する７つの保存性の（保存的）膜貫通ドメインを有する。ＧＰＣＲ（７ＴＭ受容体としても知られる）は、少なくとも８つの異なる親水性ループを連結する７つのアミノ酸約２０〜３０個より成る保存的疎水性区間を含むことで特徴付けられる。たいていのＧＰＣＲは、最初の二つの細胞外ループのそれぞれに、機能性タンパク質構造を安定化させると考えられているジスルフィド結合を形成する単一の保存的システイン残基を有している。この７つの膜貫通領域はＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６及びＴＭ７と称される。ＴＭ３がシグナル伝達に関与している。
【０００４】
システイン残基のリン酸化及び脂質化（パルミチル化またはファルネシル化）は、幾つかのＧＰＣＲのシグナル伝達に影響を及ぼし得る。たいていのＧＰＣＲは、第三の細胞質ループ内部に潜在的なリン酸化部位、及び／またはカルボキシ末端を含んでいる。幾つかのＧＰＣＲ、例えばβ−アドレナリン作動性受容体は、プロテインキナーゼＡ及び／または他の特異的受容体キナーゼによるリン酸化によって受容体の脱感作が媒介される。
【０００５】
幾つかの受容体は、ＧＰＣＲのリガンド結合部位に、数個のＧＰＣＲ膜貫通ドメインより形成される親水性ソケットを含むと考えられている。この親水性ソケットは、ＧＰＣＲの疎水性残基に取り囲まれている。各ＧＰＣＲ膜貫通ヘリックスの親水性側は内側を向き、極性リガンド結合部位を形成すると推定されている。ＴＭ３はリガンド結合部位、例えばＴＭ３のアスパラギン酸残基を有するように、幾つかのＧＰＣＲと関わりがある。ＴＭ５のセリン、ＴＭ６のアスパラギン、及びＴＭ６またはＴＭ７のフェニルアラニンまたはチロシンもまたリガンド結合に関与している。
【０００６】
ＧＰＣＲは細胞内部でヘテロ三量体Ｇタンパク質を介して、種々の細胞内酵素、イオンチャンネル及び輸送体と共役している（Ｊｏｈｎｄｏｎら、Ｅｎｄｏｃ．Ｒｅｖ． １０， ３１７−３３１， １９８９を参照のこと）。種々のＧタンパク質αサブユニットは特定のエフェクター（効果器）を優先的に刺激し、細胞の様々な生体機能を調整する。ＧＰＣＲの細胞質残基のリン酸化は、幾つかのＧＰＣＲの調節に重要なメカニズムである。例えば、シグナル伝達の一つの形態におけるホルモン結合は、酵素、アデニル酸シクラーゼの細胞内部での活性化に影響する。ホルモンによる酵素の活性化はヌクレオチド ＧＴＰの存在に依存する。また、ＧＴＰはホルモン結合にも影響を及ぼす。Ｇタンパク質はホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼに関係させる。Ｇタンパク質はホルモン受容体によって活性化された場合に、結合しているＧＤＰをＧＴＰに交換する。その後、このＧＴＰ運搬型が、活性化されるアデニル酸シクラーゼに結合する。Ｇタンパク質自身により触媒されるＧＴＰからＧＤＰへの加水分解によって、Ｇタンパク質はその基本的な不活性型へと戻る。このようにＧタンパク質は、シグナルを受容体からエフェクターへ中継する仲介物質としての役割と、シグナルの長さを制御する時計としての役割の二つを担っている。
【０００７】
過去１５年間にわたり、ＧＰＣＲを標的とする３５０近くの治療薬が市場に出され、成功している。このことは、これらの受容体が治療薬として確立され、折り紙付きの歴史を有することを示すものである。細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症及びウイルス感染症、特にＨＩＶウイルスによって引き起こされる感染症、疼痛、癌、摂食障害、過食症、喘息、パーキンソン病、急性心不全、低血圧症、高血圧症、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、多発性硬化症、良性前立腺肥大、並びに不安症（ａｎｘｉｅｔｙ）、統合失調症、躁鬱病、譫妄、痴呆、様々な精神遅延及びジスキネジア（例えばハンチントン舞踏病とテゥレット（Ｔｏｕｒｅｔｔ）症候群）を含む精神異常及び神経疾患、を包含する機能障害または疾患（これらに制限されない）を予防、改善または是正する役割を果たすことのできる、さらなる受容体の同定及び特徴づけに対する必要性が存続していることは明らかである。
【０００８】
Ｐ２Ｙ受容体
アデノシン５’−トリホスフェート（ＡＴＰ）は、細胞において数多くの異なる生物学的機能を有する。例えばＡＴＰは、数多くの生化学反応のエネルギー源であり、リボ核酸（ＲＮＡ）合成の前駆体であり、またサイクリックＡＭＰ合成などの前駆体である。また、ＡＴＰはニューロン及び非ニューロン組織における細胞外メッセンジャーとして機能する。細胞外ＡＴＰは、膜会合プリン受容体（ｐｕｒｉｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）を通じて作用して、これらの組織においてその効果を示す （Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ， Ｇ． Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９９０） ６０３： １−１７）。プリン受容体は、Ｐ２Ｘ受容体（プリン作動性チャネル、Ｐ２Ｘ Ｒチャネル、及びＡＴＰゲート型チャネルとしても知られている）又はＧタンパク共役（Ｐ２Ｙ又はＰ２Ｖ）受容体（Ｂａｒｎａｒｄ， Ｅ． Ａ．ら、（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃ． Ｓｃｉ． １５：６７−７０）と一般的に称されるリガンドゲート型イオンチャネル（Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ， Ｇ． Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９９０） ６０３： １−１７）のいずれかであってもよい。
【０００９】
Ｐ２Ｙ１受容体は脳内に大量に存在し（Ｆｉｌｉｐｐｏｖら、Ｂｒ． Ｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １２９， １０６３−６６，２０００）、血管平滑筋（Ｅｒｌｉｎｇｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４８， ８６４−７０， ２９９８）、新生仔ラット心臓腺維芽細胞（Ｚｈｅｎｇら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ３７，７１８−２８，１９９８）及び新生仔及び成体心臓筋細胞（Ｗｅｂｂら、Ｊ Ａｕｔｏｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １６， ３０３−０７，１９９６）を含む他の種々の部位に見られる。
【００１０】
Ｐ２Ｙ受容体を含み、多様な生物効果を有するＧＰＣＲの広範囲に及ぶ分布のため、その活性を調節でき、治療効果を提供できる更なるＧＰＣＲファミリーのメンバーを同定する必要性がこの分野にはある。
【００１１】
（発明の概要）
本発明の目的は、ヒトＰ２Ｙ１様Ｇタンパク共役受容体を調節する試薬及び方法を提供することである。本発明のこの目的及び他の目的は、以下に記載の１つ又はそれ以上の態様によって提供される。
【００１２】
本発明の１つの態様は、配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；及び配列番号２に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドである。
【００１３】
本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を低下させる物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および配列番号２に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド、
と接触させる。
【００１４】
被験化合物とＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドとの間の結合を検出する。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドと結合する被験化合物を、それにより、細胞外マトリックス分解を低下させる可能性のある物質として同定する。その物質は、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲの活性を低下させることによって機能し得る。
【００１５】
本発明の別の態様は、細胞外マトリックス分解を低下させる物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；配列番号１に示すヌクレオチド酸配列；配列番号３に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；配列番号３に示すヌクレオチド酸配列；配列番号４に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；配列番号４に示すヌクレオチド酸配列；配列番号５に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；及び配列番号５に示すヌクレオチド酸配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
と接触させる。
【００１６】
該ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する。該ポリヌクレオチドと結合する被験化合物を、細胞外マトリックス分解を低下させる可能性のある物質として同定する。この物質は、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲｍＲＮＡと相互作用することを通じてＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ量を減少させることによって機能し得る。
【００１７】
本発明の別の態様は、細胞外マトリックス分解を調節する物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および配列番号２に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド、
と接触させる。
【００１８】
該ポリペプチドのＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性を検出する。被験化合物の非存在下のＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性と比較して該ポリペプチドのＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性を増大させる被験化合物を、それにより、細胞外マトリックス分解を増大させる可能性のある物質として同定する。被験化合物の非存在下のＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性と比較して該ポリペプチドのＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性を低下させる被験化合物を、それにより、細胞外マトリックス分解を低下させる可能性のある物質として同定する。
【００１９】
本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を低下させる物質をスクリーニングする方法である。被験化合物を、
配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；配列番号１に示すヌクレオチド酸配列；配列番号３に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；配列番号３に示すヌクレオチド酸配列；配列番号４に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；配列番号４に示すヌクレオチド酸配列；配列番号５に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；及び配列番号５に示すヌクレオチド酸配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドのＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ産物、
と接触させる。
【００２０】
該Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ産物に対する被験化合物の結合を検出する。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ産物と結合する被験化合物を、それにより、細胞外マトリックス分解を低下させる可能性のある物質として同定する。
【００２１】
本発明のさらなる別の態様は、細胞外マトリックス分解を調節する方法である。細胞を、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドによってコードされている産物と特異的に結合する試薬、と接触させる［ここに、上記ポリヌクレオチドは、配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；配列番号１に示すヌクレオチド酸配列；配列番号３に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；配列番号３に示すヌクレオチド酸配列；配列番号４に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；配列番号４に示すヌクレオチド酸配列；配列番号５に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０％一致するヌクレオチド配列；及び配列番号５に示すヌクレオチド酸配列から成る群より選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む］。
【００２２】
それにより、細胞におけるＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性を低下させる。
【００２３】
このように、本発明は、受容体部位でアゴニスト又はアンタゴニストとして作用し得る被験化合物を同定するのに用いることができる、あるいは治療効果を提供するのに調節することができるＰ２Ｙ１様Ｇタンパク共役受容体を提供する
【００２４】
（本発明の詳しい説明）
本発明は、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０％一致するアミノ酸配列；および配列番号２に示すアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
ｂ）配列番号１、３、４又は５に記載の配列を含むポリヌクレオチド；
ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）〜（ｃ）に明記するポリヌクレオチド配列から逸脱しているポリヌクレオチド；並びに
ｅ）（ａ）〜（ｄ）に明記するポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはアレル変異体を表すポリヌクレオチド、
から成る群より選択されるポリヌクレオチドに関する。
【００２５】
さらに、本発明の発見である新規Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ、特にヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲを、本出願人は発見した。ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲは、配列番号２に示すアミノ酸配列を有する。ＢＬＡＳＴＰアライメントプログラムを用いることで、このアミノ酸配列は、スイスプロット アクセッションＮｏ．Ｐ４９６５０により同定され、「Ｐ２Ｙプリン受容体１（ＡＴＰ受容体）（Ｐ２Ｙ１）」と注釈されるマウスタンパク質（配列番号６）と２９９アミノ酸に渡って３６％一致する（図１）。したがって、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲはリガンドと結合して、サイクリックＡＭＰ形成、細胞内カルシウム流動化、又はホスホイノシチド代謝などの生物学的効果又は活性を産することが期待される。ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの膜貫通ドメインを図１においてボールド体で示す。
【００２６】
細菌、真菌、原虫及びウイルス感染症、特にＨＩＶウイルスによって引き起こされる感染症、疼痛、癌、摂食障害、過食症、喘息、心疾患（例えば、急性心不全、低血圧症、高血圧症、狭心症及び心筋梗塞）、尿閉、骨粗鬆症、糖尿病、ＣＯＰＤ、炎症、潰瘍、喘息、アレルギー、多発性硬化症、良性前立腺肥大症、並びに精神病及び神経疾患（不安症、統合失調症、躁鬱病、譫妄、痴呆、種々の精神遅延及びジスキネジア（例えば、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病及びトゥーレット症候群）を含む）などの疾患は、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲを調節することにょって処置できる。また、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲは、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲアゴニスト及びアンタゴニストをスクリーニングするのに用いることができる。
【００２７】
ポリペプチド
本発明に係るＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドには、配列番号２に示すアミノ酸配列、または以下定義による生物学的に活性な変異体より選択される、少なくとも１０、１２、１５、２０、２４、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５又は３５０個の連続アミノ酸が含まれる。したがって、本発明のＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドは、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲの一部、完全長のＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ、又はＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの全部または一部を含む融合タンパク質であり得る。
【００２８】
生物学的に活性な変異体
生物学的活性がある、即ちリガンドと結合し、生物学的効果、例えばサイクリックＡＭＰ形成、細胞内カルシウムの流動化又はホスホイノシチド代謝を産する能力を保持しているＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド変異体のもまた、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドである。天然または非天然Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド変異体は、配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０、５５、６０、６５または７０％、より好ましくは、約７５、９０、９６または９８％一致するアミノ酸配列またはその断片を有することが好ましい。推定されるＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド変異体と配列番号２に記載のアミノ酸配列との間の一致パーセントは、Ｂｌａｓｔ２整列（アライメント）プログラムを用いて決定される。
【００２９】
一致パーセントの変異は、例えばアミノ酸置換、挿入または欠失に起因し得る。アミノ酸置換は１対１のアミノ酸の置き換えとして定義される。置換されたアミノ酸が類似の構造的および／または化学的性質を有する場合、置換は事実上保存的である。保存的置換の例は、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの置換、グルタメートによるアスパルテートの置換、またはセリンによるスレオニンの置換である。
【００３０】
アミノ酸挿入または欠失はアミノ酸配列への、またはその内部での変化である。これらは典型的には約１〜５アミノ酸の範囲で起こる。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を破壊することなく、どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失できるかを決定する際の指針は、当分野で周知のコンピュータープログラム、例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを用いて見出すことができる。あるアミノ酸変化が生物学的に活性なＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに影響するか否かは、例えば以下の具体的実施例に記載のように、リガンドに対する結合を検定することにより、又は機能検定を行なうことにより容易に決定できる。
【００３１】
融合タンパク質
融合タンパク質は、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドアミノ酸配列に対する抗体の作製に、そして様々な検定系での使用に有用である。例えば、融合タンパク質は、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの一部と相互作用するタンパク質の同定に使用できる。タンパク質親和クロマトグラフィーまたはタンパク質−タンパク質相互作用のためのライブラリーに基づく検定、例えば酵母２−ハイブリッドまたはファージディスプレイ系をこの目的のために使用できる。このような方法は当分野で周知であり、薬物スクリーニングとしても使用できる。
【００３２】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド融合タンパク質は、ペプチド結合により互いに融合した二つのポリペプチドセグメントを含んでいる。第一のポリペプチドセグメントは、配列番号２または上記のような生物学的に活性な配列番号２の変異体の少なくとも１０、１２、１５、２０、２４、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５又は３５０個の連続アミノ酸を含む。融合タンパク質に使用する連続アミノ酸は、配列番号２に示すアミノ酸配列から、又は上記のようにそれらの配列の生物学的に活性な変異体から選択され得る。第一のポリペプチドセグメントはまた、完全長Ｐ２Ｙ１様Ｇタンパク共役受容体を含み得る。
【００３３】
第二のポリペプチドセグメントは完全長タンパク質またはタンパク質断片であってよい。融合タンパク質の構築に一般的に使用するタンパク質は、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を包含する）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。さらに、融合タンパク質の構築には、ヒスチジン（Ｈｉｓ）標識、ＦＬＡＧ標識、インフルエンザへマグルチニン（ＨＡ）標識、Ｍｙｃ標識、ＶＳＶ−Ｇ標識、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）標識を包含するエピトープ標識を使用する。その他の融合構築は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、Ｌｅｘ ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を包含する。また、融合タンパク質はさらに、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドコード配列と非相同タンパク質配列の間に位置する開裂部位を含むよう組み立てることができ、その結果、このＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドは、開裂され、非相同部分を無くすように精製できる。
【００３４】
融合タンパク質は当分野で周知のように化学合成できる。好ましくは、融合タンパク質は二つのポリペプチドセグメントを共有結合で連結することにより、または分子生物学分野で標準的な方法により調製する。例えば、当分野で知られているように、第二のポリペプチドセグメントをコードしているヌクレオチドを有する適切なリーディングフレームに配列番号７より選ばれるコード配列を含むＤＮＡ構築物を作製し、このＤＮＡ構築物を宿主細胞で発現させることによる組換えＤＮＡ法を用いて、融合タンパク質を調製できる。融合タンパク質構築用の多くのキットが、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）、ＭＢＬ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＭＩＣ； Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ， ＭＡ）、およびＱｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｃａｎａｄａ； １−８８８−ＤＮＡ−ＫＩＴＳ）といった企業から入手できる。
【００３５】
種相同体の同定
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチド（下記）を使用して他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするために好適なプローブまたはプライマーを作製し、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの相同体をコードしているｃＤＮＡを同定し、そして当分野で周知のようにこのｃＤＮＡを発現させて、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの種相同体を得ることができる。
【００３６】
ポリヌクレオチド
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖であってよく、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドのコード配列又はそのコード配列の相補物を含んでいてもよい。配列番号２をコードするヌクレオチド配列を配列番号５に示す。ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ遺伝子の５’及び３’端を配列番号１及び３にそれぞれ示す。開始コドンＡＴＧを有するプロモーター領域を配列番号４に示す。
【００３７】
ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている縮重ヌクレオチド配列、および、配列番号１、３、４又は５に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、好ましくは約７５、９０、９６または９８％一致するホモローガスなヌクレオチド配列、又はその相補物もまた、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドである。二つのポリヌクレオチド配列間の配列一致パーセントは、ＡＬＩＧＮのようなコンピュータープログラムを用いて決定するが、これは、ギャップオープンペナルティー−１２およびギャップエクステンションペナルティー−２によるアフィンギャップ検索を用いるＦＡＳＴＡアルゴリズムを使用するものである。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体および生物学的に活性なＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの変異体もやはりＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドである。
【００３８】
ポリヌクレオチド変異体および相同体の同定
上記のＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチド変異体および相同体もまたＣ／Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドである。典型的には、相同Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチド配列は、当分野で周知のように、ストリンジェントな条件下で候補ポリヌクレオチドを既知のＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドにハイブリダイズさせることにより同定できる。例えば、以下の洗浄条件 −− ２Ｘ ＳＳＣ（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、室温 ２回、各々３０分間；次いで２× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃ １回、３０分間；次いで２× ＳＳＣ、室温 ２回、各々１０分間 −− を使用して、最大約２５−３０％の塩基対ミスマッチ（不対合）を含む相同配列を同定できる。より好ましくは、相同核酸鎖は１５−２５％の塩基対ミスマッチを、さらに好ましくは５−１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００３９】
本明細書に開示するＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの種相同体はさらに、適当なプローブまたはプライマーを作製し、他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのヒト変異体は、例えばヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。二本鎖ＤＮＡのＴｍは相同性が１％低下する毎に１−１．５℃低下することがよく知られている（Ｂｏｎｎｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ８１，１２３（１９７３））。故にヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの変異体または他の種のＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは、推定の相同Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを、配列番号１又は７に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズさせて被験ハイブリッドを作製することによって同定できる。被験ハイブリッドの融解温度を完全に相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融解温度と比較し、被験ハイブリッド中の塩基対ミスマッチの数またはパーセントを算出する。
【００４０】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に従いＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズするヌクレオチド配列もまたＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドである。ストリンジェントな洗浄条件は当分野で周知且つ理解されており、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ２ｄ ｅｄ．， １９８９， ９．５０−９．５１頁に開示されている。
【００４１】
典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のためには、温度と塩濃度の組み合わせを、検討中のハイブリッドの理論的Ｔｍよりおよそ１２−２０℃低くなるよう選択すべきである。配列番号１、３、４又は５に示すヌクレオチド配列を有するＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドまたはその相同体と、それらのヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも約５０、５５、６０、６５、７０、好ましくは約７５、９０、９６、または９８％一致するポリヌクレオチド配列とのハイブリッドのＴｍは、例えばＢｏｌｔｏｎおよびＭｃＣａｒｔｈｙ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ４８，１３９０（１９６２）の式：
Ｔｍ＝８１．５℃−１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｌ）、
［式中、ｌ＝塩基対で表したハイブリッドの長さ］
を用いて算出できる。
ストリンジェントな洗浄条件としては例えば、４× ＳＳＣ（６５℃）、または５０％ホルムアミド、４× ＳＳＣ（４２℃）、または０．５× ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ（６５℃）が挙げられる。高度ストリンジェントな洗浄条件は、例えば０．２× ＳＳＣ（６５℃）などである。
【００４２】
ポリヌクレオチドの調製
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは、膜構成成分、タンパク質および脂質といった他の細胞成分を含まないよう単離できる。ポリヌクレオチドは細胞から調製でき、標準的核酸精製技術を用いて単離、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を用いて合成、若しくは自動合成機を用いることによって調製できる。ポリヌクレオチドを単離する方法は機械的であり、当分野で知られている。ポリヌクレオチドを取得するためこのような任意の技術を用いて、単離されたＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを得ることができる。例えば、制限酵素およびプローブを用いてＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド断片を単離できる。単離したポリヌクレオチドは他の分子を含まないか、あるいは少なくとも７０、８０、または９０％含まない調製物である。
【００４３】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ ｃＤＮＡ分子は、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ ｍＲＮＡを鋳型に用いて標準的分子生物学技術にて調製できる。その後Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ ｃＤＮＡ分子は、当分野で周知でありＳａｍｂｒｏｏｋら．（１９８９）のようなマニュアルに開示される分子生物学技術を用いて複製できる。ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡのいずれかを鋳型として使用して本発明に係るポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るため、ＰＣＲのような増幅技術を用いることができる。
【００４４】
別法として、合成化学技術を用いてＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを合成することもできる。遺伝コードの縮重により、例えば配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドまたはその生物学的に活性な変異体をコードする別のヌクレオチド配列の合成を可能にする。
【００４５】
ポリヌクレオチド伸長
ＰＣＲに基づく様々な方法を用いて、本明細書中に開示したヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの一部をコードする核酸配列を伸長させ、プロモーターおよび調節要素といった上流配列を検出することができる。例えば制限部位ＰＣＲは、既知の座に隣接する未知配列を検索するため、ユニバーサルプライマーを使用する（Ｓａｒｋａｒ， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． ２，３１８−３２２，１９９３）。まず、ゲノムＤＮＡを、リンカー配列に対するプライマーと既知領域に特異的なプライマーの存在下で増幅する。次に、増幅させた配列を、同じリンカープライマーと最初のものの内部にある別の特異的プライマーを用いて、第二回目のＰＣＲを行なう。各回のＰＣＲ産物を適当なＲＮＡポリメラーゼで転写し、かつ逆転写酵素を行いて配列決定する。
【００４６】
既知領域に基づく異なる（ディバージェント）プライマーを用いて配列を増幅または伸長するために、逆ＰＣＲを使用することもできる（Ｔｒｉｇｌｉａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６，８１８６，１９８８）。ＯＬＩＧＯ ４．０６ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ， Ｍｉｎｎ）のような市販ソフトウェアを用いて、長さ２２−３０ヌクレオチド長、５０％またはそれ以上のＧＣ含有量を持ち、約６８−７２℃の温度で標的配列とアニーリングするプライマーを設計できる。この方法は、幾つかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域に適当な断片を作り出せる。次いでこの断片を分子内ライゲーションにより環化し、ＰＣＲ鋳型として使用する。
【００４７】
使用できるもう一つの方法は、ヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡ中の既知配列に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む、捕捉ＰＣＲである（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍら、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌｉｃ． １，１１１−１１９，１９９１）。この方法では、作製した二本鎖配列を、ＰＣＲの実施前に当該ＤＮＡ分子の未知断片中に入れるため、さらに複数の制限酵素消化とライゲーションを行うことができる。
【００４８】
未知配列を回収するために使用できるもう一つの方法はＰａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９，３０５５−３０６０，１９９１の方法である。さらに、ＰＣＲ、ネスティド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー、およびＰＲＯＭＯＴＥＲＦＩＮＤＥＲライブラリー（ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）を用いてゲノムＤＮＡ歩行を行なうことができる（ＣＬＯＮＴＥＣＨ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）。このプロセスはライブラリーをスクリーニングする必要性を排除し、イントロン／エクソン接合点の発見に有用である。
【００４９】
スクリーニングで完全長ｃＤＮＡを求める場合、より大きなｃＤＮＡを含むようサイズ選択したライブラリーを使用するのが望ましい。遺伝子の５’領域を含む配列をより多く含んでいるという点で、無作為プライミングしたライブラリーが好ましい。無作為プライミングしたライブラリーの使用は、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを生産しない状況で特に好ましいであろう。ゲノムライブラリーは、配列を５’非転写調節領域へと伸長させるのに有用な場合がある。
【００５０】
市販品が入手可能な毛細管電気泳動系を用いて、ＰＣＲまたは配列決定産物のサイズを分析、またはヌクレオチド配列を確認することができる。例えば、毛細管配列決定は、電気泳動分離用の流動性ポリマー、レーザー励起する４種の異なる蛍光色素（各ヌクレオチドにつき１種ずつ）、および電荷結合素子カメラによる放射された波長の検出を利用することができる。出力／光強度は適当なソフトウェア（例えばＧＥＮＯＴＹＰＥＲおよびＳｅｑｕｅｎｃｅ ＮＡＶＩＧＡＴＯＲ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて電気信号に変換でき、試料のロードからコンピューター分析および電子的データ表示に至る全プロセスをコンピューター管理することができる。毛細管電気泳動は、特定の試料中に限られた量で存在するかも知れないＤＮＡの小片を配列決定するのに特に好ましい。
【００５１】
ポリペプチドの取得
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドは、例えばヒト細胞からの精製によって、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの発現によって、または直接的化学合成によって取得できる。
【００５２】
タンパク質精製
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを、その受容体を発現する任意の細胞（Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドでトランスフェクトし、該ポリペプチドを発現する宿主細胞を含む）から精製することができる。精製Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドは、当分野で周知の方法を用いて、細胞内でＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドと通常会合している他の化合物、例えば特定のタンパク質、炭水化物または脂質から分離される。そのような方法には、サイズ排除クロマトフラフィー、硫酸アンモニウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーおよび調製用ゲル電気泳動が挙げられるが、これらに制限されない。
【００５３】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドは、以下の具体的な実施例に記載のように、その会合されるＧタンパク質との複合体として従来通りに単離できる。精製Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの調製は、少なくとも８０％純粋；９０％、９５％または９９％純粋な調製であることが好ましい。調製物の純度は当分野で周知の任意の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価できる。
【００５４】
ポリヌクレオチドの発現
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを発現させるため、挿入されたコード配列の転写と翻訳に必要な要素を含む発現ベクター中にＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを挿入することができる。当業者に周知の方法を利用して、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列および適当な転写および翻訳調節要素を含む発現ベクターを構築できる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えがある。このような技術は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．， １９８９に記載されている。
【００５５】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を含み、そして発現する様々な発現ベクター／宿主系が利用できる。これらには、微生物、例えば組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）により感染を受けた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）、若しくは細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）により形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が包含されるがこれらに限定される訳ではない。
【００５６】
調節要素または調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写と翻訳を実行するベクターの非翻訳領域−エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域−である。かかる要素はその強さと特異性において異なっている。利用するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導的プロモーターを包含する、多数の好適な転写および翻訳要素を使用できる。例えば、細菌系でクローニングを行う場合、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のハイブリッドｌａｃＺプロモーターのような誘導的プロモーターを使用できる。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞に使用できる。植物細胞のゲノムから誘導したプロモーターまたはエンハンサー（例えば熱ショック、ＲＵＢＩＳＣＯ、および貯蔵タンパク質遺伝子）、または植物ウイルスから誘導したプロモーターまたはエンハンサー（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）を該ベクター中にクローニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来の、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を複数コピー含む細胞系を作製する必要がある場合は、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択マーカーと共に使用することができる。
【００５７】
細菌および酵母発現系
細菌系では、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに対して意図する用途に応じて幾つかの発現ベクターを選択できる。例えば、抗体の誘導のため、大量のＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドが必要である場合は、容易に精製できる融合タンパク質の高レベル発現を指令するベクターが使用できる。このようなベクターは、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のような多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクターを包含するが、これに限定される訳ではない。ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクターにおいては、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔとこれに続く７残基の配列と共にフレーム内で該ベクター中にライゲーションすることができ、その結果ハイブリッドタンパク質が生産される。ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６４，５５０３−５５０９，１９８９）またはｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を伴う融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるのに使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、その後遊離グルタチオンの存在下で溶離することにより、溶菌させた細胞から容易に精製できる。このような系で調製したタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含むよう設計でき、その結果、目的とするクローンポリペプチドをＧＳＴ部分から随意に解放することができる。
【００５８】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいては、α因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨのような構成的または誘導的プロモーターを含む幾つかのベクターが使用できる。総説としてＡｕｓｕｂｅｌら、（１９８９）およびＧｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３，５１６−５４４，１９８７を参照されたい。
【００５９】
植物および昆虫発現系
植物発現ベクターを使用する場合、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列の発現は、幾つかのプロモーターのうち任意のものにより駆動できる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウイルスプロモーターを、単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用できる（Ｔａｋａｍａｔｓｕ， ＥＭＢＯ Ｊ． ６，３０７−３１１，１９８７）。別法として、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することもできる（Ｃｏｒｕｚｚｉら、ＥＭＢＯ Ｊ． ３，１６７１−１６８０，１９８４；Ｂｒｏｇｌｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４，８３８−８４３，１９８４；Ｗｉｎｔｅｒら、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． １７，８５−１０５，１９９１）。これらの構築物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞中に導入できる。このような技術は、幾つかの一般に入手可能な総説に記載されている（例えば、ＨｏｂｂｓまたはＭｕｒｒａｙ、ＭＣＧＲＡＷ ＨＩＬＬ ＹＥＡＲＢＯＯＫ ＯＦ ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ， ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ１９１−１９６，１９９２）。
【００６０】
昆虫系もまたＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの発現に使用できる。例えば、かかる系の１つＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫で外来遺伝子を発現させるベクターとして使用する。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を、ポリヘドリン遺伝子のような該ウイルスの非必須領域中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置くことができる。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをうまく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子は不活性化し、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが生成する。次いでこの組換えウイルスをＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａの幼虫への感染に使用し、そこでＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを発現させることができる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ９１，３２２４−３２２７，１９９４）。
【００６１】
哺乳動物発現系
ウイルスに基づく多くの発現系を用いて哺乳動物宿主細胞でＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを発現させることができる。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列は、後期プロモーターおよび３部に分かれたリーダー配列を含むアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲーションできる。該ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を用いて、感染宿主細胞においてＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを発現できる生存ウイルスを取得できる（Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８１，３６５５−３６５９，１９８４）。所望によりラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞での発現を増大させることができる。
【００６２】
ヒト人工染色体（ＨＡＣ）もまた、プラスミドが内包し発現するＤＮＡ断片よりも大きなＤＮＡ断片の運搬に使用できる。６Ｍから１０ＭのＨＡＣを組み立て、常套的送達法により細胞に到達させる（例えば、リポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、または小胞）。
【００６３】
さらに、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列のより効率的な翻訳を達成するために、特異的開始シグナルを使用できる。かかるシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび連続配列を包含する。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクター中に挿入した場合、さらなる転写または翻訳調節シグナルは必要ないであろう。しかしながら、コード配列またはその断片のみを挿入した場合は、外因性の翻訳調節シグナル（ＡＴＧ開始コドンを包含する）を供給すべきである。開始コドンは挿入物全体を確実に翻訳させるために、正しいリーディングフレームになければならない。外因性翻訳要素および開始コドンは天然および合成両者の様々な起源であってよい。発現の効率は、使用する特定の細胞系に対し適切なエンハンサーを存在させることにより増強できる（Ｓｃｈａｒｆら、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ． ２０，１２５−１６２，１９９４）。
【００６４】
宿主細胞
宿主細胞菌株は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現されたＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを所望の方法で処理できる能力を目的として選択できる。該ポリペプチドのこのような修飾には、アセチル化、カルボキシ化、グリコシル化、燐酸化、脂質化、およびアシル化が包含されるがこれらに限定されない。該ポリペプチドの「プレプロ」型を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正しい挿入、折り畳み、および／または機能を促進するために使用できる。翻訳後活性のための特異的な細胞機構および特徴的メカニズムを持つ異なる宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）が、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９）から入手でき、外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実とするために選択できる。
【００６５】
組換えタンパク質の長期高収量生産のために、安定な発現が好ましい。例えば、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを安定に発現する細胞系を、ウイルス複製起点および／または内因性発現要素、および同じまたは別のベクター上にある選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換することができる。該ベクターの導入に続いて、細胞を強化培地で１−２日間生育させた後、培地を選択培地に交換することができる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を付与することであり、その存在が、導入されたＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ配列をうまく発現する細胞の生育と回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型にとって適当な組織培養技術を用いて増殖させることができる。例えば、ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ， Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６を参照されたい。
【００６６】
幾つかの選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収できる。これらには、それぞれｔｋ−またはａｐｒｔ−細胞で使用できる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ １１，２２３−３２，１９７７）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ ２２，８１７−２３，１９８０）遺伝子が包含されるが、これらに限定される訳ではない。さらに、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性を選択の基準に用いることができる。例えば、ｄｈｆｒはメソトレキサートに対する耐性を付与し（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ７７，３５６７−７０，１９８０）ｎｐｔはアミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与し（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０，１０１４，１９８１）、そしてａｌｓおよびｐａｔはそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与する（Ｍｕｒｒａｙ， １９９２，上記）。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するようにさせ、ｈｉｓＤは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するようにさせる（Ｈａｒｔｍａｎ ＆ Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８５，８０４７−５１，１９８８）。アントシアニンのような可視マーカー、β−グルクロニダーゼとその基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼとその基質ルシフェリンは、形質転換体を同定し、特異的ベクター系に帰すことのできる一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するために使用できる（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ５５，１２１−１３１，１９９５）。
【００６７】
ポリペプチド発現の検出
マーカー遺伝子発現の存在はＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドが存在することも示唆しているが、その存在と発現は確認する必要がある。例えば、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列がマーカー遺伝子配列内部に挿入されている場合、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の不在によって同定できる。これとは別に、単一のプロモーターの調節下にＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列と、マーカー遺伝子が直列（タンデム）に位置する場合がある。誘導または選択に応答してこのマーカー遺伝子は発現し、通常、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの発現を示す。
【００６８】
これとは別に、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを含み、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に知られる様々な方法によって同定できる。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質生検またはイムノアッセイ技術（核酸またはタンパク質の検出および／または定量のための膜、溶液、またはチップに基づく技術を包含する）が包含されるがこれらに限定されない。例えば、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の存在は、プローブまたは断片またはＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドの断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションまたは増幅によって検出できる。核酸増幅に基づく検定は、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを含む形質転換体を検出するための、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドをコードしている配列から選択されるオリゴヌクレオチドの使用を含む。
【００６９】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに対し特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを使用して該ポリペプチドの発現を検出および測定するための様々なプロトコルが当分野で知られている。例として、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）がある。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド上の２個の非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる、２部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイが使用でき、または、競合的結合検定を使用することができる。これらのおよびその他の検定はＨａｍｐｔｏｍら、ＳＥＲＯＬＯＧＩＣＡＬ ＭＥＴＨＯＤＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， ＡＰＳ Ｐｒｅｓｓ， Ｓｔ．Ｐａｕｌ， Ｍｉｎｎ．， １９９０およびＭａｄｄｏｘら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １５８，１２１１−１２１６，１９８３に記載されている。
【００７０】
多岐にわたる標識およびコンジュゲーション技術が当業者に知られており、様々な核酸およびアミノ酸検定に使用できる。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを調製する手段は、標識したヌクレオチドを使用する、オリゴ標識化、ニック翻訳、末端標識化、またはＰＣＲ増幅を包含する。これとは別に、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を、ｍＲＮＡプローブの生産のためのベクター中にクローニングすることもできる。このようなベクターは当分野で既知であり、市販品が入手でき、標識化ヌクレオチドおよび適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６を添加することによりインビトロでのＲＮＡプローブの合成に使用することができる。これらの方法は、市販の様々なキットを用いて実施できる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、 Ｐｒｏｍｅｇａ、およびＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）。検出を容易にするために使用できる適当なリポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、および蛍光、化学ルミネセント、または色素生成物質、ならびに基質、補助因子、阻害物質、磁性粒子などが包含される。
【００７１】
ポリペプチドの発現および精製
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列で形質転換させた宿主細胞は、発現と、細胞培養からのタンパク質の回収に適した条件下で培養できる。形質転換細胞により生産されたポリペプチドは、その配列および／または使用したベクターに応じて分泌されまたは細胞内に貯留され得る。当業者には理解できるであろうが、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通った可溶性Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの分泌を指令する、または膜結合Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの膜挿入を指令する、シグナル配列を含むよう設計できる。
【００７２】
上に論じたように、他の構築物を用いて、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードしているヌクレオチド配列と結合させることができる。このような精製促進ドメインは、金属キレート化ペプチド、例えば固定化金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和精製系で利用するドメインが包含されるが、これらに限定されない（Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐ．， Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｗａｓｈ．）。精製ドメインとＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドとの間に開裂可能リンカー配列、例えば第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼに特異的なリンカー配列を入れること（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）もまた、精製を促進するために利用できる。このような発現ベクターの１つは、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドと、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位に先立つ６個のヒスチジン残基とを含む融合タンパク質の発現を提供する。このヒスチジン残基はＩＭＡＣ（Ｐｏｒａｔｈら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ． ３，２６３−２８１，１９９２に記載の固定化金属イオン親和クロマトグラフィー）による精製を促進し、一方エンテロキナーゼ開裂部位は融合タンパク質からのＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの精製手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターはＫｒｏｌｌら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２，４４１−４５３，１９９３に開示されている。
【００７３】
化学合成
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列は、その全体または一部を、当分野で周知の化学的方法を用いて合成できる（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ． ２１５−２２３，１９８０；Ｈｏｒｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ． ２２５−２３２，１９８０）。これとは別に、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド自身を、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法、例えば固相技術を用いる直接ペプチド合成を用いて調製できる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ８５，２１４９−２１５４，１９６３；Ｒｏｂｅｒｇｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９，２０２−２０４，１９９５）。タンパク質合成は手動技術またはオートメーションを用いて実施できる。自動化合成は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３１Ａペプチド合成機（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて達成できる。所望により、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの断片を別々に合成し、化学的方法を用いて合して完全長の分子を調製することもできる。
【００７４】
新たに合成したペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフイー（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， ＰＲＯＴＥＩＮＳ： ＳＴＲＵＣＴＵＲＥＳ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．， １９８３）により実質的に精製できる。合成Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定により確認できる（例えばエドマン分解法；Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、上記を参照されたい）。さらに、直接合成中にＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を改変させ、そして／または化学的方法を用いて他のタンパク質由来の配列と合して、変異体ポリペプチドまたは融合タンパク質を調製することができる。
【００７５】
改変ポリペプチドの調製
当業者には理解できるであろうが、天然に存在しないコドンを有するＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドコード化ヌクレオチドを調製することは有利であり得る。例えば、特定の原核または真核宿主が好むコドンを選択して、タンパク質発現の速度を増大させ、または所望の性質、例えば天然に存在する配列から産み出される転写物の半減期より長い半減期を持つＲＮＡ転写物を調製することができる。
【００７６】
本明細書に開示するヌクレオチド配列は、当分野で一般的に知られる方法を用いて、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドまたはｍＲＮＡ産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を修飾する改変を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）様々な理由で、該ポリペプチドコード配列を改変させるように設計できる。無作為断片化によるＤＮＡシャフリングと遺伝子断片および合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再集合を用いてヌクレオチド配列を設計できる。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化パターンを変え、コドンの優先性を変え、スプライス変異体を調製し、突然変異を導入する等を実施できる。
【００７７】
抗体
当分野で知られているいかなる型の抗体も、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドのエピトープに特異的に結合するよう作製できる。本明細書で使用する「抗体」とは、無傷の免疫グロブリン分子、およびその断片、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖを包含し、これらはＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドのエピトープに結合できる。典型的には、エピトープを形成するためには少なくとも６、８、１０、または１２の連続するアミノ酸が必要である。しかしながら、非連続アミノ酸を含むエピトープはより多くの、例えば少なくとも１５、２５、または５０のアミノ酸を必要とするかも知れない。
【００７８】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体は治療に使用でき、そして免疫化学検定、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学検定、免疫沈降、またはその他の当分野で既知の免疫化学的検定に使用できる。所望の特異性を有する抗体の同定のため、様々なイムノアッセイが使用できる。競合的結合または免疫放射検定のための多数のプロトコルが当分野でよく知られている。このようなイムノアッセイは典型的には、免疫原と、その免疫原に特異結合する抗体との間の複合体形成の測定を含んでいる。
【００７９】
典型的には、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合する抗体は、免疫化学検定に使用する時、他のタンパク質が提供する検出シグナルより少なくとも５、１０、または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに特異結合する抗体は、免疫化学検定で他のタンパク質を検出せず、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを溶液から免疫沈降させることができる。
【００８０】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドは、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトを免疫してポリクローナル抗体を産生させるのに使用できる。所望により、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドは、担体タンパク質、例えば牛血清アルブミン、チログロブリン、およびスカシガイヘモシアニンとコンジュゲートさせることができる。宿主の種に応じて、免疫学的反応を増大させるために種々のアジュバントを使用できる。このようなアジュバントは、フロイントアジュバント、鉱物性ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、および界面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノール）を包含するがこれらに限定されない。ヒトに使用するアジュバントの中ではＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍが特に有用である。
【００８１】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養中の連続的細胞系により抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて調製できる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術があるがこれらに限定されない（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７，１９８５； Ｋｏｚｂｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１，３１−４２，１９８５； Ｃｏｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８０，２０２６−２０３０，１９８３； Ｃｏｌｅら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２，１０９−１２０，１９８４）。
【００８２】
さらに、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして適当な抗原特異性と生物活性を持つ分子を得る、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術が利用できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８１，６８５１−６８５５，１９８４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３１２，６０４−６０８，１９８４； Ｔａｋｅｄａら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４，４５２−４５４，１９８５）。モノクローナルおよびその他の抗体はまた、これを治療に使用した場合に患者が該抗体に対する免疫反応を起こすのを防ぐため、「ヒト化」することができる。このような抗体は、治療に直接使用できるほど配列が充分ヒトに類似しているかも知れず、または幾つかの重要残基の変更を必要とするかも知れない。齧歯類の抗体とヒト配列の間の配列相違は、個々の残基の位置指定突然変異誘発により、または相補性決定領域全体の格子により、ヒト配列内の残基と相違する残基を置き換えることによって最小化することができる。別法として、ヒト化抗体はＧＢ２１８８６３８Ｂに記載のように組換え法を用いて調製できる。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合する抗体は、Ｕ．Ｓ．５５６５３３２に開示のように、部分的または完全にヒト化した抗原結合部位を含むことができる。
【００８３】
これに代わり、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の調製のために記載した技術を適合させ、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに特異結合する一本鎖抗体を調製することができる。関連する特異性を持つが別個のイディオタイプ組成を有する抗体を、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから鎖シャフリングによって調製することができる（Ｂｕｒｔｏｎ， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８８，１１１２０−２３，１９９１）。
【００８４】
一本鎖抗体はまた、ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲのようなＤＮＡ増幅法を用いて組み立てることができる（Ｔｈｉｒｉｏｎら、１９９６， Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｐｒｅｖ． ５，５０７−１１）。一本鎖抗体は単一または二重特異性であり得、また、二価または四価であり得る。四価二重特異性一本鎖抗体の組み立ては例えばＣｏｌｏｍａ ＆ Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， １９９７， Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １５，１５９−６３に教示されている。二価二重特異性一本鎖抗体の組み立てはＭａｌｌｅｎｄｅｒ ＆ Ｖｏｓｓ， １９９４， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９，１９９−２０６に教示されている。
【００８５】
下記のように、一本鎖抗体をコードしているヌクレオチド配列を手動または自動ヌクレオチド合成を用いて組み立て、標準的組換えＤＮＡ法を用いて発現構築物中にクローニングし、そして細胞中に導入してコード配列を発現させることができる。別法として、一本鎖抗体を、例えば糸状ファージ技術を用いて直接調製することもできる（Ｖｅｒｈａａｒら、１９９５， Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ６１，４９７−５０１； Ｎｉｃｈｏｌｌａら、１９９３， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ． １６５，８１−９１）。
【００８６】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに特異結合する抗体はまた、リンパ球集団においてインビボ生産を誘導することによって、または、文献に開示されている極めて特異的な結合試薬のパネルまたは免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることによって調製することもできる（Ｏｒｌａｎｄｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８６，３８３３−３８３７，１９８９； Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４９，２９３−２９９，１９９１）。
【００８７】
その他の型の抗体を、本発明方法において組み立て、治療に使用することができる。例えば、ＷＯ９３／０３１５１に開示のように、キメラ抗体を組み立てることができる。免疫グロブリンから誘導され多価且つ多重特異的である結合タンパク質、例えばＷＯ９４／１３８０４に記載の「ｄｉａｂｏｄｉｅｓ」もまた調製できる。
【００８８】
本発明に係る抗体は当分野で周知の方法により精製できる。例えば、抗体は、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドが結合しているカラムを通過させることにより親和精製できる。次いで、結合した抗体を、高い塩濃度の緩衝液を用いてカラムから溶出することができる。
【００８９】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対し相補的なヌクレオチド配列である。いったん細胞中に導入されるとこの相補的ヌクレオチドは、該細胞が生産した天然配列と結合して複合体を形成し、転写または翻訳のいずれかを遮断する。好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは少なくとも１１ヌクレオチド長であるが、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、若しくは５０またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよい。より長い配列もまた使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子をＤＮＡ構築物に提供し、上記のように細胞中に導入して、その細胞におけるＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ遺伝子産物のレベルを低下させることができる。
【００９０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはこの両者の組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドは、１つのヌクレオチドの５’末端を、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、ホスホロアミデート、燐酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、カルボネート、および燐酸トリエステルといった非ホスホジエステルヌクレオチド間結合を有する別のヌクレオチドの３’末端と共有結合させることにより、手動で、または自動合成機によって合成できる。Ｂｒｏｗｎ， Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０，１−８，１９９４； Ｓｏｎｖｅａｕｘ， Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２６，１−７２，１９９４； Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． ９０，５４３−５８３，１９９０を参照されたい。
【００９１】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲの制御、５’、または調節領域と二本鎖を形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することにより、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ遺伝子発現の修飾が得られる。転写開始部位、例えば開始部位から−１０および＋１０位の間から誘導されるオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重らせん」塩基対合法を用いて阻害を達成できる。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子またはシャペロンの結合に対して十分に開くという能力の阻害を引き起こすため、有用である。三本鎖ＤＮＡを用いる治療上の進歩が文献に記載されている（例えばＧｅｅら、Ｈｕｂｅｒ ＆ Ｃａｒｒ， ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＡＮＤ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣ ＡＰＰＲＯＡＣＨＥＳ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｍｔ．Ｋｉｓｃｏ， Ｎ．Ｙ．， １９９４）。転写物がリボソームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた設計できる。
【００９２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの相補配列との間に好結果の複合体を形成させるためには、正確な相補性は必要ない。例えばＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドに対し正確に相補的である２、３、４、若しくは５またはそれ以上の長さの連続するヌクレオチドを含み、その各々が、隣接するＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲヌクレオチドとは相補的ではない連続するある長さのヌクレオチドによって隔てられているアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ ｍＲＮＡに対して充分な標的化特異性を提供できる。好ましくは、相補的な連続ヌクレオチドの長さはそれぞれ少なくとも４、５、６、７若しくは８またはそれ以上のヌクレオチド長である。非相補的な介在配列は、好ましくは１、２、３、または４ヌクレオチド長である。当業者は、アンチセンス−センスの対の算出融点を容易に使用して、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定のＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチド配列間で寛容されるミスマッチの程度を決定できるであろう。
【００９３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力に影響を及ぼすことなく修飾できる。これらの修飾は該アンチセンス分子の内部、または一端若しくは両端である。例えば、ヌクレオシド間の燐酸結合は、アミノ基と末端リボースの間にいろいろな数の炭素残基を有するコレステリルまたはジアミン部分を加えることによって修飾できる。修飾された塩基および／または糖、例えばリボースの代わりのアラビノース、または３’ヒドロキシ基または５’燐酸基が置換されている３’，５’−置換オリゴヌクレオチドもまた修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに使用できる。これらの修飾オリゴヌクレオチドは当分野で周知の方法により調製できる。例えば、Ａｇｒａｗａｌら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０，１５２−１５８，１９９２； Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ． ９０，５４３−５８４，１９９０； Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ． ２１５，３５３９−３５４２，１９８７を参照されたい。
【００９４】
リボザイム
リボザイムは触媒活性を有するＲＮＡ分子である。例えば、Ｃｅｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６，１５３２−１５３９； １９８７； Ｃｅｃｈ， Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９，５４３−５６８； １９９０， Ｃｅｃｈ， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ２，６０５−６０９； １９９２， Ｃｏｕｔｕｒｅ ＆ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １２，５１０−５１５， １９９６を参照されたい。当分野で知られるように、リボザイムは、ＲＮＡ配列を開裂することにより遺伝子機能を阻害するのに使用できる（例えば、Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許５６４１６７３）。リボザイムの作用機構は、相補的標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後のエンドヌクレオ分解的な（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）開裂を含む。例には、特異的ヌクレオチド配列のエンドヌクレオ分解的な開裂を特異的且つ効果的に触媒できる、設計されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子がある。
【００９５】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのコード配列を用いて、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドから転写されたｍＲＮＡに特異結合するリボザイムを作製できる。他のトランスのＲＮＡ分子を極めて配列特異的に開裂できるリボザイムを設計し組み立てる方法が開発され、当分野で記載されている（Ｈａｓｅｌｏｆｆら、Ｎａｔｕｒｅ ３３４，５８５−５９１，１９８８）。例えば、リボザイムの開裂活性は、別個の「ハイブリダイゼーション」領域を該リボザイム中に組み入れることによって、特定のＲＮＡを標的とさせることができる。このハイブリダイゼーション領域は標的ＲＮＡに対し相補的な配列を含んでおり、したがってその標的と特異的にハイブリダイズする（例えばＧｅｒｌａｃｈら、ＥＰ３２１２０１を参照されたい）。
【００９６】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ ＲＮＡ標的内部の特異的リボザイム開裂部位は、この標的分子を、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを包含するリボザイム開裂部位についてスキャンすることにより同定できる。同定できたならば、該開裂部位を含む標的ＲＮＡの領域に対応する、１５および２０の間のリボヌクレオチドを有する短いＲＮＡ配列を、標的を非機能的にし得る二次構造の特徴について評価できる。さらに、候補のＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ ＲＮＡ標的の適合性を、リボヌクレアーゼ防護検定を用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対する利用可能性を試験することによって評価できる。より長い相補配列を用いて、標的に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大させることができる。リボザイムのハイブリダイズおよび開裂する領域は、相補領域を介して標的ＲＮＡにハイブリダイズする時、リボザイムの触媒領域が標的を開裂し得るといったように、完全に相関している。
【００９７】
リボザイムはＤＮＡ構築物の一部として細胞内に導入できる。マイクロ注入、リポソーム媒介トランスフェクション、電気穿孔、または燐酸カルシウム沈殿といった機械的方法を用いて、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ発現の低下が望まれる細胞中にリボザイム含有ＤＮＡ構築物を導入することができる。これとは別に、細胞がＤＮＡ構築物を安定的に保持することが望まれる場合は、該構築物をプラスミド上で供給し、当分野で知られるように、別個の要素として維持するか、または細胞のゲノム中に組み込むことができる。リボザイムコード化ＤＮＡ構築物は、細胞中のリボザイムの転写を調節するために、プロモーター要素、エンハンサーまたはＵＡＳ要素、および転写ターミネーターシグナルといった転写調節要素を含み得る。
【００９８】
Ｈａｓｅｌｏｆｆら、米国特許５６４１６７３に教示のように、リボザイムは、標的遺伝子の発現を誘導する因子に応答してリボザイムの発現が起こるように設計することができる。リボザイムはまた、追加レベルの調節を提供するよう設計でき、その結果、ｍＲＮＡの破壊はリボザイムと標的遺伝子の両者が細胞に誘導された時にのみ起こる。
【００９９】
区別的に発現される遺伝子
遺伝子産物がヒトＰ２Ｙ１様Ｇタンパク共役受容体と相互作用する遺伝子の同定方法をここに記載する。このような遺伝子は、ＣＮＳ疾患、心疾患、喘息、骨粗鬆症、糖尿病及びＤＯＰＤを包含する（但しこれらに限定されない）疾患において区別して（区別的に）発現される遺伝子を表し得る。さらに、係る遺伝子は、このような疾患の進行または治療に関連する操作に応答して区別的に調節される遺伝子を表し得る。加えて、このような遺伝子は、組織または生物の発生の異なる段階で増大または低下する、一時的に調節される発現を示すことができる。区別的に発現される遺伝子はまた、その発現を、対照対実験条件の下で調節させることができる。さらに、ヒトＰ２Ｙ１様Ｇタンパク共役受容体遺伝子または遺伝子産物は、これ自体区別的発現について試験できる。
【０１００】
発現が正常対疾病状態で相違する程度は、標準的特性決定技術、例えば区別的ディスプレイ技術によって視覚化されるに充分大きいというだけでよい。発現の相違を視覚化することのできる、その他のこのような標準的特性決定技術は、定量的ＲＴ（逆転写酵素）、ＰＣＲ、およびノーザン分析を包含するが、これらに限定されない。
【０１０１】
区別的に発現される遺伝子の同定
区別的に発現される遺伝子を同定するためには、目的とする組織から全ＲＮＡ、または好ましくはｍＲＮＡを単離する。例えば、ＲＮＡ試料は、実験対象の組織から、そして対照となる対象の対応組織から取得する。ｍＲＮＡの単離に対して不利に選択しない任意のＲＮＡ単離技術を、係るＲＮＡ試料の精製に利用できる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄ．， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７−１９９３を参照されたい。当業者に周知の技術、例えばＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、米国特許４８４３１５５の一段階ＲＮＡ単離プロセスを用いて多数の組織試料を容易に処理することができる。
【０１０２】
区別的に発現される遺伝子が産生したＲＮＡを表す、集められたＲＮＡ試料内部の転写物は、当業者に周知の方法により同定する。これらには、例えば、ディファレンシャルスクリーニング（Ｔｅｄｄｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５，２０８−１２，１９８８）、差引きハイブリダイゼーション（Ｈｅｄｒｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ ３０８，１４９−５３； Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８，２８２５，１９８４）、および好ましくはディファレンシャルディスプレイ（Ｌｉａｎｇ ＆ Ｐａｒｄｅｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，９６７−７１，１９９２； 米国特許５２６２３１１）が包含される。
【０１０３】
区別的発現の情報はこれ自体、ヒトＰ２Ｙ１様Ｇタンパク共役受容体の関与する疾病の治療のための関連法を示唆している。例えば、治療は、区別的に発現される遺伝子および／またはヒトＰ２Ｙ１様Ｇタンパク共役受容体をコードしている遺伝子の発現の調節を包含し得る。区別的発現の情報は、区別的に発現される遺伝子若しくは遺伝子産物またはヒトＰ２Ｙ１様Ｇタンパク共役受容体遺伝子若しくは遺伝子産物の活性または発現が、アップレギュレーションであるかダウンレギュレーションであるかを示すことができる。
【０１０４】
スクリーニング方法
本発明は、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドまたはＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドに結合する、またはその活性を調節する被験化合物をスクリーニングするための検定を提供する。好ましくは、被験化合物はＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する。より好ましくは、被験化合物は、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲを介して媒介される生物学的効果を、被験化合物の不在時に比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下または増大させる。
【０１０５】
被験化合物
被験化合物は当分野で既知の薬理学的物質であってよく、または薬理活性を持っていることが前もって分かっていない化合物であってよい。この化合物は天然に存在する、または実験室で設計されたものであってよい。これらは、微生物、動物、または植物から単離されたものであってよく、そして組換え的に調製され、または当分野で既知の化学的方法により合成されたものであってよい。所望により被験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的アドレス特定可能な並行固相または液相ライブラリー、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法、「一ビーズ一化合物」ライブラリー法、および親和クロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）当分野で既知の数多くの組み合わせライブラリー法のいずれかを用いて取得できる。生物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されているが、他の４種のアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物の小分子ライブラリーに適用できる。Ｌａｍ， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２，１４５，１９９７を参照されたい。
【０１０６】
分子ライブラリーの合成法は当分野でよく知られている（例えば、ＤｅＷｉｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９０，６９０９，１９９３； Ｅｒｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１，１１４２２，１９９４； Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３７，２６７８，１９９４； Ｃｈｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１，１３０３，１９９３； Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ３３，２０５９，１９９４； Ｃａｒｅｌｌら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ． ３３，２０６１； Ｇａｌｌｏｐら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ３７，１２３３，１９９４を参照されたい）。化合物のライブラリーは溶液で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３，４１２−４２１，１９９２）、またはビーズ（Ｌａｍ， Ｎａｔｕｒｅ ３５４，８２−８４，１９９１）、チップ（Ｆｏｄｏｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３６４，５５５−５５６，１９９３）、細菌または胞子（Ｌａｄｎｅｒ、米国特許５２２３４０９）プラスミド（Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９，１８６５−１８６９，１９９２）、またはファージ（Ｓｃｏｔｔ ＆ Ｓｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，３８６−３９０， １９９０； Ｄｅｖｌｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９，４０４−４０６，１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９７，６３７８−６３８２，１９９０； Ｆｅｌｉｃｉ， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ２２２，３０１−３１０，１９９１； およびＬａｄｎｅｒ、米国特許５２２３４０９）上に提供できる。
【０１０７】
ハイスループットスクリーニング
被験化合物は、高（ハイ）スループットスクリーニングを用いて、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する能力、またはＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性若しくはＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ遺伝子発現に影響を及ぼす能力についてスクリーニングできる。ハイスループットスクリーニングを使用して、多くの個別的化合物を並行して試験でき、その結果多数の被験化合物を迅速にスクリーニングできる。最も広範に確立されている技術は９６ウェル微量定量プレートを利用するものである。この微量定量プレートのウェルは、典型的には５０から５００μｌの範囲の検定容量を必要とする。このプレートに加えて、９６ウェルフォーマットに適合させた多くの機器、材料、ピペット、ロボット、プレート洗浄機、およびプレート読み取り機が市販されている。
【０１０８】
別法として、「自由フォーマット検定」、または試料間に物理的障壁を持たない検定が使用できる。例えば、組み合わせペプチドライブラリーのための、単純な均質検定で色素細胞（メラノサイト）を用いる検定が、Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． １９，１６１４−１８（１９９４）に記載されている。ペトリ皿中のアガロースの下にこの細胞を入れ、次いで組み合わせ化合物を伴っているビーズをアガロースの表面に載せる。組み合わせ化合物はこのビーズから化合物を部分的に放出する。化合物がゲルマトリックス中へと局所的に拡散するにつれて活性化合物が細胞の色の変化を惹起するため、活性化合物を暗色色素領域として視覚化することができる。
【０１０９】
自由フォーマット検定のもう一つの例は、生体分子スクリーニング学会第１回年次総会（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．、１９９５年１１月７−１０日）で報告されたＣｈｅｌｓｋｙ、「組み合わせライブラリーのスクリーニングのための戦略：新規な、そして伝統的なアプローチ」により記載されている。Ｃｈｅｌｓｋｙは、カルボニックアンヒドラーゼのための単純な均質酵素検定をアガロースゲルの内部に入れ、その結果ゲル中の酵素がゲル全体に色の変化を惹起するようにさせた。その後、光リンカーを介して組み合わせ化合物を持つビーズをゲル内部に入れ、すると該化合物はＵＶ光により部分的に放出された。酵素を阻害する化合物は、色の変化がより少ない局所阻害領域として観察された。
【０１１０】
さらに別の例がＳａｌｍｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ２，５７−６３（１９９６）に記載されている。この例では、組み合わせライブラリーを、寒天中で生育する癌細胞への細胞毒性効果を有する化合物についてスクリーニングした。
【０１１１】
もう一つのハイスループットスクリーニング法がＢｅｕｔｅｌら、米国特許５９７６８１３に記載されている。この方法では、被験試料を多孔性マトリックスに入れる。次に１またはそれ以上の検定成分を、マトリックス、例えばゲル、プラスチックシート、フィルター、またはその他の形の容易に操作できる固体担体の内部、上、または底に入れる。試料がこの多孔性マトリックスに導入されるとこれらは充分ゆっくりと拡散し、その結果、被験試料が混ざらずに検定が遂行できる。
【０１１２】
結合検定
結合検定について、被験化合物は、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの活性部位に結合してこれを占有することで、基質がリガンド結合部位に近づけないようにして正常な生物活性を妨げるような小分子であることが好ましい。このような小分子の例は、小ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに限定される訳ではない。本発明のポリペプチドに結合できる可能性のあるリガンドには、天然の既知ＧＰＣＲリガンド及びそのアナログ又は誘導体が含まれるが、これらに制限される訳ではない。ＧＰＣＲの天然リガンドには、アドレノメデュリン、アミリン、カルシトニン遺伝子関連タンパク質（ＣＧＲＰ）カルシトニン、アナンダミド（ａｎａｎｄａｍｉｄｅ）、セロトニン、ヒスタミン、アドレナリン、ノルアドレナリン、血小板活性化因子、トロンビン、Ｃ５ａ、ブラジキニン及びケモカインが含まれる。
【０１１３】
結合検定では、被験化合物またはＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドのいずれかが検出可能な標識、例えば蛍光、放射性同位元素、化学ルミネセント、または酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼ）を含むことができる。そこで、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに結合している被験化合物の検出は、例えば放射能の放出を直接計数することにより、またはシンチレーション計数により、または検出可能産物への適当な基質の変換を測定することにより、達成できる。
【０１１４】
別法として、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドへの被験化合物の結合を、反応体のいずれをも標識せずに測定することができる。例えば、マイクロフィジオメーターを用いて、被験化合物とＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドとの結合を検出できる。マイクロフィジオメーター（例えばサイトセンサーＴＭ）とは、細胞がその環境を酸性化する速度を光アドレッサブル電位差センサー（ＬＡＰＳ）を用いて測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、被験化合物とＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの相互作用の指標として使用できる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７，１９０６−１９１２，１９９２）。
【０１１５】
被験化合物がＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに結合する能力の測定はまた、実時間Ｂｉｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＢＩＡ）のような技術を用いて達成できる（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ ＆ Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ６３，２３３８−２３４５，１９９１、およびＳｚａｂｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ． ５，６９９−７０５，１９９５）。ＢＩＡは、いかなる反応体をも標識せずに、生体特異的相互作用を実時間で研究するための技術である（例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標））。光学的現象表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化を、生体分子間の実時間反応の指標に使用できる。
【０１１６】
本発明のさらに別の態様では、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを２−ハイブリッド検定または３−ハイブリッド検定（例えば、米国特許５２８３３１７； Ｚｅｒｖｏｓら、Ｃｅｌｌ ７２，２２３−２３２，１９９３； Ｍａｄｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８，１２０４６−１２０５４，１９９３； Ｂａｒｔｅｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４，９２０−９２４，１９９３； Ｉｗａｂｕｃｈｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８，１６９３−１６９６，１９９３； およびＢｒｅｎｔ ＷＯ９４／１０３００）における「おとりタンパク質」として使用し、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに結合またはこれと相互作用してその活性を調節する他のタンパク質を同定することができる。
【０１１７】
２ハイブリッド系は殆どの転写因子のモジュール的性格に基づくものであり、それは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインから成っている。簡潔に述べると、この検定は二種の異なるＤＮＡ構築物を利用する。例えば、一方の構築物においては、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが、既知の転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる（例えばＧＡＬ−４）。別の構築物においては、未同定タンパク質（「餌」または「試料」）をコードしているＤＮＡ配列が、既知の転写因子の活性化ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる。もし「おとり」および「餌」タンパク質がインビボで相互作用してタンパク質依存複合体を形成できたならば、該転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは極めて近位に招来される。この近位性が、転写因子に応答する転写調節部位と機能的に結合しているリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。リポーター遺伝子の発現が検出でき、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードしているＤＮＡ配列取得に使用することができる。
【０１１８】
反応体の一方または両方の非結合型からの結合型の分離を促進するため、そして検定の自動化の便宜を図るため、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固定化することが望ましいかも知れない。したがって、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固体支持体に結合させることができる。好適な固体支持体は、ガラスまたはプラスチックスライド、組織培養プレート、微量定量ウェル、管、シリコンチップ、またはビーズ（ラテックス、ポリスチレン、またはガラスビーズを包含するがこれらに限定されない）のような粒子を包含するがこれらに限定されない。共有および非共有結合、受動吸収、またはそれぞれポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物に付着させた結合部分と固体支持体の対の使用を包含する、当分野で既知の任意の方法を用いてＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物を固体支持体に付着させることができる。被験化合物は好ましくは整列して固体支持体に結合させ、その結果個々の被験化合物の位置を追跡することができる。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）への被験化合物の結合は、反応体を入れるのに適した任意の容器で達成できる。かかる容器の例には微量定量プレート、試験管、および微量遠沈管がある。
【０１１９】
一つの態様において、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドは、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを固体支持体に結合させるドメインを含む融合タンパク質である。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）上またはグルタチオン誘導体化微量定量プレート上に吸着させ、次いでこれを被験化合物または被験化合物および非吸着Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに合し；次にこの混合物を複合体形成が行われる条件下でインキュベートする（例えば、塩およびｐＨに関して生理的条件）。インキュベーションの後、ビーズまたは微量定量プレートのウェルを洗浄して未結合成分を除去する。反応体の結合は上記のように直接的または間接的に測定できる。別法として、複合体を固体支持体から解離させた後に結合を測定することもできる。
【０１２０】
本発明に係るスクリーニング検定には、タンパク質またはポリヌクレオチドを固体支持体上に固定化するためのその他の技術を使用することもできる。例えば、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して固定化できる。当分野で周知の技術（例えばビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．）を用いて、ビオチニル化したＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆した９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化できる。別法として、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド、ポリヌクレオチド、または被験化合物に特異的に結合するが、所望の結合部位、例えばＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの活性部位に干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化できる。未結合の標的またはタンパク質を抗体コンジュゲーションによりウェル中に捕捉できる。
【０１２１】
ＧＳＴ−固定化複合体について上に記載した方法に加え、このような複合体を検出する方法には、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドまたは被験化合物に特異結合する抗体を用いる、複合体の免疫検出、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの活性検出へと引き継がれる酵素結合検定、および非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動がある。
【０１２２】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する被験化合物を求めるスクリーニングは、無傷の細胞で実施することもできる。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む任意の細胞が、細胞に基づく検定系で使用できる。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは細胞中に天然に存在し、または上記のような技術を用いて導入できる。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合は、上記のように測定する。
【０１２３】
機能検定
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの生物学的効果を増大または低下させる能力について被験化合物を試験できる。かかる生物学的効果は、下記の具体的実施例に記載の機能検定を用いて測定できる。機能検定は、精製したＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド、細胞膜調製物、または無傷の細胞を被験化合物と接触させた後に実施できる。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲの機能的活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる被験化合物を、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性を低下させる可能性のある物質として同定する。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％増大させる被験化合物を、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性を増大させる可能性のある物質として同定する。
【０１２４】
そのようなスクリーニング方法の１つは、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを発現するようトランスフェクトしたメラノフォア（メラニン細胞）の使用を含む。そのようなスクリーニング技術は１９９２年２月６日に公開されたＷＯ９２／０１８１０に記載されている。したがって、例えばこのような検定は、この受容体ポリペプチドの活性を阻害する化合物をスクリーニングするため、この受容体を含むメラニン細胞を、その受容体リガンドとスクリーニングされる被験化合物の両方と接触させることで行なうことができる。このリガンドによって発せられるシグナルを阻害することは、被験化合物がこの受容体のアンタゴニスト、即ちこの受容体の活性を阻害することを示している。前記細胞を、スクリーニングされる化合物と接触させるスクリーニングを行なうことで、この受容体を活性化する被験化合物を同定し、各々の被験化合物がシグナルを発するか否か、即ちこの受容体を活性化するか否かを決定することができる。
【０１２５】
その他のスクリーニング技術には、受容体の活性化によって引き起こされる細胞外ｐＨ変化を測定する系におけるヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを発現する細胞（例えば、トランスフェクトＣＨＯ細胞）の使用が含まれる（例えば、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６， １８１−２９６， １９８９を参照のこと）。例えば被験化合物を、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを発現する細胞と接触させ、そして二次メッセンジャー応答、例えばシグナル伝達またはｐＨ変化を測定して、被験化合物が受容体を活性化するか、または阻害するかを決定することができる。
【０１２６】
別のこのようなスクリーニング技術には、その受容体を一過的に発現させるべくヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードするＲＮＡをゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中に導入することが含まれる。その後、このトランスフェクトした卵母細胞をその受容体リガンドおよびスクリーニングされる被験化合物と接触させ、次いでカルシウムシグナルの阻害または活性化を検出し、その場合に、受容体の活性を阻害すると考えられる被験化合物をスクリーニングすることができる。
【０１２７】
別のスクリーニング技術には、本受容体がホスホリパーゼＣまたはＤと関連している細胞において、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを発現させることが含まれる。そのような細胞には、内皮細胞、平滑筋細胞、胚の腎細胞などが含まれる。ホスホリパーゼ活性の変化から受容体の活性化の程度を定量化して、このスクリーニングを上記のように行なうことができる。
【０１２８】
上記のような機能検定の詳細は、下記の具体的実施例において提供される。
【０１２９】
遺伝子発現
別の態様では、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ遺伝子の発現を増大または減少させる被験化合物を同定する。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを被験化合物と接触させ、ＲＮＡまたはＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのポリペプチド産物の発現を測定する。被験化合物存在下での適当なｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルを、該被験化合物不在下でのｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと比較する。すると被験化合物が、この比較に基づく発現のモジュレーターとして同定できる。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により大きい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の刺激物質または増強物質と同定する。そうではなく、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により小さい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の阻害物質と同定する。
【０１３０】
細胞におけるＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のレベルは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを検出するための当分野で周知の方法により決定できる。定性または定量的方法のいずれかが使用できる。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在は、例えばラジオイムノアッセイのような免疫化学的方法、ウエスタンブロッティング、および免疫組織化学を包含する、当分野で周知の様々な技術を用いて決定できる。別法として、ポリペプチド合成は、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド内への標識アミノ酸の取り込みを検出することにより、インビボで、細胞培養で、またはインビトロ翻訳系で決定できる。
【０１３１】
このようなスクリーニングは、無細胞検定系または無傷の細胞のいずれかで実施できる。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを発現するいかなる細胞も細胞に基づく検定系で使用できる。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは細胞内に天然に存在するか、または上記のような技術を用いて導入することができる。一次培養または樹立された細胞系、例えばＣＨＯまたはヒト胚腎２９３細胞のいずれかを使用できる。
【０１３２】
医薬組成物
本発明はさらに、治療効果を達成するために患者に投与できる医薬組成物を提供する。本発明に係る医薬組成物は、例えばＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリヌクレオチド、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合する抗体、または類似体、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド活性のアゴニスト、アンタゴニスト又は阻害物質を含み得る。この組成物は単独で、または少なくとも１種類の他の物質、例えば安定化化合物と組み合わせて投与でき、これは、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、および水を包含する（但しこれらに限定されない）任意の無菌で生物学的適合性のある製薬的担体中で投与できる。この組成物は単独で、または他の物質、薬物またはホルモンと組み合わせて患者に投与できる。
【０１３３】
活性成分に加えてこれらの医薬組成物は、賦形剤および補助物質を含む適当な製薬的に許容し得る担体を含有でき、これらは、製薬的に使用できる調製物への活性化合物の処理を促進する。本発明に係る医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、肺内、肝臓内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局所、舌下、または直腸手段を包含する（但しこれらに限定されない）多くの経路により投与できる。経口投与用医薬組成物は、当分野で既知の製薬的に許容し得る担体を用いて経口投与に適した用量に調合できる。このような担体により、該医薬組成物を、患者が内服するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液体、ゲル、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに調合できる。
【０１３４】
経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を、固体賦形剤と合し、得られた混合物を所望により粉砕し、そしてこの顆粒混合物を、所望ならば適当な補助物質を加えた後に処理して錠剤または糖衣剤核を得る。好適な賦形剤は炭水化物またはタンパク質増量剤、例えば乳糖、シュクロース、マンニトール、またはソルビトールを包含する糖；トウモロコシ、小麦、米、馬鈴薯、またはその他の植物由来の澱粉；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；アラビアゴムおよびトラガカントゴムを包含するゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのようなタンパク質である。所望により崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加できる。
【０１３５】
糖衣剤核は、濃縮糖溶液のような適当な被覆剤と共に使用でき、これはさらに、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ｃａｒｂｏｐｏｌゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。製品の同定のためまたは活性化合物の量、即ち用量をあらわすために染料または色素を錠剤または糖衣被覆剤に添加できる。
【０１３６】
経口的に使用できる医薬調合物は、ゼラチン製の押してはめ込むカプセル剤、ならびに、ゼラチンおよび被覆剤、例えばグリセロールまたはソルビトールでできた軟封入カプセル剤を包含する。押してはめ込むカプセル剤は、活性成分を、乳糖または澱粉のような増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および所望により安定剤と混合して含有できる。軟カプセル剤では、活性化合物を、安定剤を加えたまたは加えない適当な液体、例えば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁できる。
【０１３７】
非経口投与に好適な医薬製剤は、水溶液、好ましくは生理学的適合性の緩衝液、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝化した食塩水中で調合できる。水性注射用懸濁剤は、該懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有できる。さらに、活性化合物の懸濁剤は適当な油性注射用懸濁剤として調製できる。好適な親油性溶媒または媒質は、胡麻油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームを包含する。非脂質ポリカチオンアミノポリマーもまた送達に使用できる。所望により懸濁剤は、化合物の溶解性を増し高濃縮溶液の調製を可能にするような適当な安定剤または物質を含むことができる。局所または鼻腔投与のためには、透過すべき特定の障壁に対し適当な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は当分野で一般に知られている。
【０１３８】
本発明に係る医薬組成物は当分野で既知の方法で、例えば常套的混合、溶解、顆粒化、糖衣剤製造、すりつぶし、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥プロセスによって製造できる。この医薬組成物は塩として提供でき、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、琥珀酸などを包含する（但しこれらに限定されない）多くの酸を用いて調製できる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒において、対応する遊離塩基型よりもより可溶性の傾向がある。別の場合には、好ましい調製物は、ｐＨ範囲４．５から５．５において以下のもの：１−５０ｍＭヒスチジン、０．１％−２％シュクロース、および２−７％マンニトール、の全てまたは任意のものを含有できる凍結乾燥粉末であってよく、これを使用前に緩衝液と合する。
【０１３９】
調合と投与のための技術のさらなる詳細は、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ）の最新版に見出すことができる。医薬組成物を製造した後、これらを適当な容器に入れ、適応状態の治療のためにラベルを貼る。このようなラベル表示は、投与の量、頻度、および投与方法を包含する。
【０１４０】
治療上の適応および方法
ＧＰＣＲは哺乳類の宿主に広範囲に分布し、多くの病理を包含するたくさんの生体機能を担っている。したがって、一方ではＧＰＣＲを刺激し、他方ではＧＰＣＲの機能を阻害する化合物および薬物を発見することが望まれる。例えば、ＧＰＣＲを活性化する化合物を治療目的、例えば喘息、炎症、パーキンソン病を含むＣＮＳ疾患、急性心不全、尿閉および骨粗鬆症を処置するために用いることができる。詳細には、ＧＰＣＲを活性化する化合物は、様々な心血管の病気、肺血流欠乏または高血圧症によって引き起こされる病気を処置するのに有用である。加えて、これらの化合物を用いて、体液および電解液ホメオスタシスの異常な制御に関連する様々な生理的疾患、並びに異常なアンジオテンシン誘導性アルドステロン分泌に関係する疾患を処置することができる。ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの調節は、神経調節が望まれる状態において特に有用であり得る。
【０１４１】
一般に、ＧＰＣＲの活性化を阻害する化合物を様々な治療目的、例えば、低血圧症および／または高血圧症、狭心症、心筋梗塞、炎症、潰瘍、喘息、アレルギー、良性前立腺肥大症、並びに統合失調症、躁病性興奮、うつ病、譫妄、痴呆または様々な精神遅滞を含む精神病および神経病、ジスキネジア（例えば、ハンチントン病若しくはテューレット症候群）、その他のものを処置するために用いることができる。また、ＧＰＣＲを阻害する化合物も内因性食欲不振を拡幅させるのに、及び過食症を制御するのに有用である。
【０１４２】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性の調節を伴う糖尿病の処置は特に興味深い。糖尿病は、血糖の異常上昇、脂質の変質、心血管系、目、腎臓および神経系における異常（合併症）によって特徴付けられる一般的な代謝障害である。糖尿病は、２つの別々の疾患：インスリンを産生し、かつ分泌する細胞の喪失が原因の糖尿病Ｉ型（若年発症）と、インスリン分泌の欠乏およびインスリン作用の欠乏によって引き起こされる糖尿病ＩＩ型（成人発症）とに分けられる。
【０１４３】
糖尿病Ｉ型は、膵島におけるインスリン分泌細胞（β細胞）を攻撃する自己免疫反応によって引き起こされる。この反応の発症を予防するか、またはベータ細胞の破壊が完了する前にこの反応を停止させる物質が、この疾患の可能性のある治療である。β細胞の増殖および再生を誘導する別の物質もまた、可能性のある治療である。
【０１４４】
糖尿病ＩＩ型は、２つの糖尿病性状態の中で最も一般的である（人口の６％）。インスリン分泌不足が、有力な糖尿病状態の病因であり、適切に検出し、かつ応答してインスリンを放出させ血糖レベルを上昇させるβ細胞の不能性の結果である。β細胞によるグルコースに対する応答を増大させる治療が、これらの疾患の有力な新しい治療を提供するであろう。
【０１４５】
糖尿病ＩＩ型被験者におけるインスリン作用の欠損症は、治療処置の別の標的である。筋肉、肝臓および脂肪におけるインスリン受容体の活性を増大させる物質は、血糖の減少および血漿脂質の正常化を生じさせるであろう。受容体活性は、受容体を直接刺激するか、または受容体由来の細胞内シグナルを増大させる物質によって増大させることができる。他の治療は、細胞端（ｃｅｌｌｕｌａｒｅｎｄ）プロセス、即ちグルコース輸送または種々の酵素系を直接活性し、非インスリン様効果を生じさせ、そしてさらに有益な結果を産することができる。過体重被験者は糖尿病ＩＩ型の罹患率が高く、体重を減少させる任意の物質が可能性のある治療である。
【０１４６】
糖尿病Ｉ型およびＩＩ型の両方は、インスリン活性を模倣し、かつ血糖レベルを減少させることによって糖尿病性合併症を処置する物質を用いて処置できる。同様に、新しい血管成長を低下させる物質を、両方の疾患に発症する目の合併症を処置するのに用いることができる。
【０１４７】
また、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲを調節して、癌を処置することができる。癌は、基本的に発癌性細胞形質転換によって発症する疾患である。形質転換細胞をそれらの正常な対応物から区別し、かつ癌の病態生理に基づく、形質転換細胞の特徴は幾つかある。それらには、非制御型細胞性増殖、通常の死誘導シグナルに対する不応答（不死化）、増大した細胞運動性及び侵襲性、新たな血管新生の誘導を通じた血液供給を補充させるための増大した能力（血管新生）、遺伝子の不安定性、並びに調節不全遺伝子発現が挙げられる。薬剤耐性の獲得とともに、これらの異常な生理機能の種々の組み合わせににより、最終的に臓器不全および患者の死となる難治性疾患状態に頻繁に陥る。
【０１４８】
最も一般的な癌治療は、細胞増殖を標的とし、形質転換細胞と正常細胞との間の効率に関するその特異な増殖能に基づいている。このアプローチは、幾つかの重要な正常細胞タイプもまた高増殖であり、かつ癌細胞が高頻度にこれらの物質に対して耐性となるという現実により妨げられている。従って、従来の抗癌治療についての治療指数は珍しく２．０を超えている。
【０１４９】
ゲノミクス誘導性分子の標的同定の到来は、癌患者に安全で、かつより効率的な処置を提供できる治療介入のための新たな癌特異的標的同定の可能性を開いた。従って、新たに発見される腫瘍関連遺伝子及びその産物は疾患におけるその機能（群）について試験でき、そして革新的な治療を発見し、かつ開発するための道具として用いることができる。以上に概説した生理学的プロセスの多くに重要な働きをする遺伝子は、癌標的として特徴付けることができる。
【０１５０】
ゲノミクスを通じて同定される遺伝子又は遺伝子断片は、すぐに１つ又はそれ以上の非相同（ヘテローガス）発現系において発現させ、機能性組換えタンパク質を生産させることができる。このタンパク質は、その生物学的機能についてインビトロで特徴付けられ、次いでその生化学活性の化学修飾因子（モジュレーター）を同定するため、ハイスループット分子スクリーニングプログラムにおける道具として用いられる。標的タンパク質活性の活性化物質及び／又は阻害物質をこの様式で同定し、次いで、細胞およびインビボ疾患モデルにて抗癌活性について試験する。生物学的モデルにおける反復試験や、詳細な薬物動態力学的分析及び中毒学的分析を用いたリード化合物の最適化により、薬物開発及び次のヒトでの試験に関する基礎が形成される。
【０１５１】
ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲを調節して骨粗鬆症を処置できる。骨粗鬆症は、低骨量や骨組織の微細構造劣化によって特徴付けられ、骨脆弱性を高め、骨折の危険性を増大させる結果となる疾患である。これは、最も一般的なヒト代謝性骨障害である。確立された骨粗鬆症には、骨折が存在する。骨代謝回転は、骨内部の２種の主な効果細胞：骨再吸収に関係する破骨細胞と、骨基質を合成し且つミネラル化する骨芽細胞、との作用によって生じる。破骨細胞と骨芽細胞との作用は、非常に協調的である。破骨細胞前駆型は、代謝回転部位に補充される；それらは分化して融合し、後に骨を再吸収する成熟破骨細胞を形成する。骨表面に付着した場合、破骨細胞は特殊化した破骨細胞周辺膜と骨基質との間の強固に規定された連結部にて、酸性の微小環境を作り出し、骨基質の局所的可溶化を引き起こす。これにより、続く脱ミネラル化骨コラーゲンのタンパク質分解を容易にする。基質分解により、基質関連成長因子およびサイトカインが放出されると考えられており、それにより、時間的および空間的に調節された様式で骨芽細胞が補充される。骨芽細胞は、新たな骨基質タンパク質を合成し、かつ分泌し、引き続いてこの新たな基質をミネラル化する。このことは、正常な骨格においては、正味の骨量変化にはならない生理学的プロセスである。骨粗鬆症などの病理学的状態においては、再吸収と形成との間の均衡が変化する結果、骨喪失が生じる。ＷＯ９９／４５９２３を参照のこと。
【０１５２】
破骨細胞自身が、現在利用できる全ての骨粗鬆症物質（フッ化物を除く場合がある）の直接的または間接的な標的である。抗再吸収治療は、処置個体の更なる骨喪失を予防する。骨髄に存在し、さらに脂肪細胞、軟骨細胞、繊維芽細胞および筋細胞となる多能性幹細胞から、骨芽細胞は誘導される。骨芽細胞活性の選択的増進は、骨粗鬆症治療の非常に望ましい目的である、というのはさらなる骨喪失を予防するよりも、骨量を増大させることになるからである。効果的な同化治療は、現在利用可能な処置よりも骨折の危険性をかなり減少させると期待されている。
【０１５３】
新たに発見したポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストは、破骨細胞分化、骨基質に対する破骨細胞吸着、または骨基質を分解する破骨細胞機能を直接変化させることによって、抗再吸収として作用し得る。アゴニストまたはアンタゴニストは、破骨細胞の分化または機能の効果分子（例えばサイトカイン、ペプチドまたはステロイドホルモン、プロテアーゼなど）の合成および／または修飾を妨げることによって、破骨細胞機能を間接的に変化させ得るであろう。
【０１５４】
新たに発見されたポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニストは、骨芽細胞分化および／またはその骨基質形成機能を直接増進することにより、同化として作用し得る。さらに、このアゴニストまたはアンタゴニストは、増殖因子、ペプチド又はステロイドホルモンの合成を増進すること、あるいは阻害分子の合成を低下させることによって、骨芽細胞機能を間接的に変化させ得る。
【０１５５】
骨粗鬆症、パジェット病、骨移植、特に歯移植の分解を処置するに有用であり得る新たに発見されたポリペプチドの作用を模擬するため、増強するため又は阻害するため、そのアゴニスト及びアンタゴニストを用いることができる。
【０１５６】
心疾患もまた、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲを調節することで処置できる。心疾患には心臓及び血管系における疾患：うっ血性心不全、心筋梗塞、心臓の虚血疾患、全種類の心房性不整脈及び心室性不整脈、高血性血管疾患及び末梢血管疾患が含まれる。
【０１５７】
心不全は、心機能の異常が新陳代謝組織の要求に見合った割合で血液をポンプする心臓の機能不全が原因の病理学的状態として規定される。これには、ポンプ不全の全ての形態、例えば高拍出及び低拍出、急性及び慢性、右心系又は左心系、収縮期又は拡張期、根本原因とは無関係なものが含まれる。
【０１５８】
心筋梗塞（ＭＩ）は、動脈硬化症により狭くなった冠動脈の血栓性閉塞に続いて、一般的に冠血流量の急激な低下により発症する。ＭＩ予防法（１次予防及び二次予防）が含まれ、ＭＩの急性期処置及び合併症の予防が含まれる。
【０１５９】
虚血疾患は、冠流量が制限され、灌流が心筋の酸素要求量を補うには不十分となる状態を表す。この疾患群には、安定狭心症、不安定狭心症及び無症候性虚血が含まれる。
【０１６０】
不整脈には、心房性及び心室性頻脈性不整脈（心房頻脈、心房粗動、心房細動、心房−心室興奮回帰性（リエントラント）頻脈、早期興奮症候群、心室頻脈、心室粗動、心室細動）の全形態、並びに除脈性不整脈形態が含まれる。
【０１６１】
高血圧血管疾患には、原発及び全種類の二次的動脈高血圧症（腎臓性、内分泌性、神経因性、その他）が含まれる。遺伝子を、高血圧症の処置や全ての合併症の予防に対する薬物標的として用いることができる。末梢血管疾患は、動脈流量及び／又は静脈流量が減少して、血液の供給量と組織の酸素要求量との間に不均衡が生じるようになる血管疾患として規定される。この疾患には、慢性末梢血管閉塞性疾患（ＰＡＯＤ）、急性動脈血栓症及び閉塞症、炎症性血管疾患、及びレイノー病が含まれる。
【０１６２】
喘息及びアレルギーもまた、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲを調節することによって処置できる。アレルギーは、環境抗原により臨床的な副作用が引き起こされる複合過程である。アレルゲンと称される誘導性抗原は、一般に特異的なＩｇＥ応答を引き起こし、大抵の場合、アレルゲン自体には毒性がほとんどないか、あるいは全くないが、ＩｇＥ応答により次々とＩｇＥ依存性又はＴ細胞依存性の過敏反応が誘導され、病理が発症する。過剰反応は、局所的又は全身性の場合があり、以前にあるアレルゲンに対して敏感となった個体にそのアレルゲンを曝すと、典型的には数分以内に過剰反応を発症する。このアレルギーの過剰反応は、効果細胞（例えば、筋肉細胞、好塩基性球又は好酸球）表面の特定の受容体と結合しているＩｇＥ抗体がアレルゲンを認識して、効果細胞を活性化し、そして急性サイン及び応答の症状を起こす媒介物質を放出することにより発症する。アレルギー疾患には、喘息、アレルギー性鼻炎（枯草熱）、アトピー性皮膚炎及びアナフィキラシーが含まれる。
【０１６３】
喘息は、多くの遺伝子と環境因子との相互作用による結果として考えられており、以下の３つの主要な特性：１）気管支収縮、粘液生産増大、気道の狭小化を引き起こす気道壁の肥厚化により引き起こされる断続的かつ可逆的な気道閉塞、２）気道口径制御の低下により引き起こされる気道反応亢進、及び３）気道炎症、により特徴付けられる。特定の細胞は、喘息の炎症反応に重要であり、それらにはＴ細胞、及び抗原提示細胞、ＩｇＥを産生するＢ細胞、並びにＩｇＥと結合する肥満細胞、好塩基球、好酸球及び他の細胞が含まれる。これらの効果細胞は、気道のアレルギー反応部位に蓄積しており、そして急性病状に及び最終的に該疾患に関連する組織破壊に関与する毒性産物を放出する。平滑筋細胞、肺上皮細胞、粘液生産細胞及び神経細胞などの他の在住（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）細胞もまた喘息を患っている個体においては異常体であり、病状に寄与し得る。臨床的に断続喘鳴及び呼吸不足などを示す喘息の気道閉塞は、一般に緊急処置が必要とされる疾患の多くの圧迫症状を引き起こすと同時に、該疾患と関連した炎症及び組織破壊は、最終的に喘息を長期管理が必要な身体障害とする不可逆変化を引き起こし得る。
【０１６４】
近年の喘息に対する病理理解の大きな進展にも拘わらず、この疾患の羅患率及び重傷度は増大しているようだ（Ｇｅｒｇｅｎ及びＷｅｉｓｓ， Ａｍ． Ｒｅｖ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｄｉｓ． １４６， ８２３−２４，１９９２）。人口の３０〜４０％がアトピー性アレルギーに苦しんでおり、人口のうち子供１５％及び成人５％が喘息に苦しんでいる（Ｇｅｒｇｅｎ及びＷｅｉｓｓ， １９９２）。従って、健康保証財源に莫大な負担がかかっている。しかしながら、喘息の診断及び処置は困難である。肺組織炎症の重症度を測定するのは容易でなく、この疾患の症状はしばしば呼吸器感染症、慢性呼吸器炎症疾患、アレルギー性鼻炎又は他の呼吸性疾患から区別できない。原因となる環境因子を取り出すことが困難であるため、刺激性アレルゲンを決定できないことがしばしばである。現在の薬理学的処置はそれ自体の不利益さによる問題がある。共通して用いられる治療物質、例えばβアゴニストは、一時的に肺機能を改善する症状緩和物として作用し得るが、根本的な炎症には作用しない。根本的な炎症を低減させ得る物質、例えば抗炎症性ステロイドは、免疫抑制から骨喪失の範囲にまで及ぶという大きな欠点があり得る（Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎ’ｓ ＴＨＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＬＯＧＩＣ ＢＡＳＩＳ ＯＦ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ， ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ＮＹ， ＵＳＡ， １９８５）。さらに、コルチコステロイドを吸入するなどの現在の治療の多くは持続性が短く、使用に不便であり、そして症例によってはしばしば一生定期的に用いなければならない、重要な問題は患者が処置に応じるのを止めることで処置の有効性が低減することである。
【０１６５】
この従来の治療に関する問題のため、処置ストラテジーの変法が評価されている。グリコホリンＡ（Ｃｈｕ及びＳｈａｒｏｍ， Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４５， ２２３−３９，１９９２）、シクロスポリン（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｌａｎｃｅｔ ３３９， ３２４−２８，１９９２）及びＩＬ−２のノナペプチド断片（Ｚａｖ’ｙａｌｏｖら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． ３１， ２８５−８８，１９９２）の全てはインターロイキン−２依存性Ｔリンパ球増殖を阻害するが、これらは多くの別の効果を示すことが知られている。例えば、シクロスポリンは臓器移植後の免疫抑制物質として使用される。これらの物質は、喘息の処置におけるステロイドの代替物に相当し得ると同時に、インターロイキン−２依存性Ｔリンパ球増殖及びホメオスタシスと関連する潜在的に重要な免疫機能を阻害する。気管支圧縮（ｂｒｏｎｃｈｏｃｈｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）の媒介物質、例えばクロモン（ｃｒｏｍｏｎｅｓ）又は抗ロイコトリエンの放出又は活性化をブロックする別の処置が穏和な喘息の処置に最近導入されたが、これらは非常に高価な上に、全ての患者に有効という訳でもなく、これらが喘息性炎症と関連する慢性変化に何らかの影響を及ぼすか否かについても明らかではない。喘息の発症に重要な経路において作用でき、該疾患の偶発的攻撃をブロックし、患者を免疫無防備状態にすることなく過剰反応アレルギー免疫応答を優先的に弱らせることのできる処置の同定が、当分野で必要とされている。
【０１６６】
喘息に対するＰ２Ｙ様ＧＰＣＲの潜在的関連性
細胞外ヌクレオチドは、多くの細胞型において筋収縮及び筋弛緩、血管拡張、神経伝達、血小板凝集、イオン輸送調節及び細胞増殖を含む幅広い応答を誘導する。この効果は、リガンドゲート型イオンチャネルであるＰ２Ｘ受容体とＧタンパク共役受容体であるＰ２Ｙ受容体との２つの主なファミリーに分類されるＰ２受容体を通じて発揮される。１２の異なるＰ２Ｙファミリーメンバーはこれまでに、そのリガンドがＬＴＢ４でありＰ２Ｙ７と称され、ヌクレオチドと結合しないことが知られている様々な種の少なくとも１つにクローニングされた。ヌクレオチド結合Ｐ２Ｙ受容体は、リガンド特異性に基づいてさらに３つの群：アデニンヌクレオチドにより活性化されるＰ２Ｙ、ウリジンヌクレオチドにより活性化されるＰ２Ｙ、及びアデニンとウリジンヌクレオチドの双方により活性化されるＰ２Ｙ、にさらに分けることができる。
【０１６７】
本発明のヒトＰ２Ｙ様ＧＰＣＲは、Ｐ２Ｙ１と非常にホモロジーが高い新規Ｐ２Ｙ様７回膜貫通ドメイン分子である。このことは、Ｐ２Ｙホモログについてゲノム配列データベースをサーチして独自に見い出した。正常ヒト上皮から誘導されたｃＤＮＡライブラリー由来のこの遺伝子について、１つのＥＳＴのみがこれまでに報告された。我々独自のこの遺伝子の発現プロファイリングにより、この遺伝子が気管、唾液腺及び腎臓においては高発現であるが、胎児の脳、大腸、胎盤及び肺においてはそれほど発現されていないことが示される。
【０１６８】
ヒトＰ２Ｙ様ＧＰＣＲは、アデニンヌクレオチド（ＡＴＰ及びＡＤＰ）と結合するＰ２Ｙ１と非常にホモロジーがあるが、ＡとＵヌクレオチドの両方と結合するＰ２Ｙ２やＰ２Ｙ４、Ｕヌクレオチドと結合するＰ２Ｙ３、及びＬＴＢ４、ＬＴＣ４やＬＴＤ４と結合するロイコトリエン受容体とも有意なホモロジーがある。従って、ヒトＰ２Ｙ様ＧＰＣＲが結合できるリガンドの適当な範囲は相対的に限定できるが、この受容体の本当のリガンドは実験に基づいて決定されるはずである。
【０１６９】
気道上皮の研究において、ＡＴＰやＵＴＰの両方が、等力的に上皮電解質及び水輸送を調節し、ムチン分泌を引き起こし、そして毛様体β頻度を増大させることを見出した。気管において、ヌクレオチドは、抗菌タンパク質及び抗タンパク質分解タンパク質の分泌に寄与する気管腺漿液細胞を誘導し、分泌性白血球プロテイナーゼ阻害物質を生産し、クロライド輸送を増大させることができる。Ｐ２Ｙ２受容体のノックアウトマウス研究では、気道上皮には主要な細胞外ヌクレオチド受容体があるが、気道には同様に機能する他のヌクレオチド受容体が存在することが示される。
【０１７０】
我々のヒトＰ２Ｙ様ＧＰＣＲの発現プロファイリング研究により、気道上部の組織にて高発現されていることが示される。唾液腺及び気管におけるこの高発現は、気道において主に保護機能を果たす外分泌物を分泌する働きがあることを示し得る。しかしながら、喘息においては、ムチン過剰発現は、喘息患者の気道を塞ぐ粘性粘液栓に寄与する。喘息患者の大気道の粘膜下腺もまた、何らかの形で外部媒介物質により過剰刺激されるためであろう肥厚化についての証拠が頻繁に示される。
【０１７１】
従って、ヒトＰ２Ｙ様ＧＰＣＲ受容体のアゴニスト又はアンタゴニストが、喘息に対して、どのような効果を有し得るかという点については不明である。アゴニストは保護性タンパク質分泌を有利に増大させ、毛様体βの割合を増大させ、そして平滑筋を弛緩させることができるのに対し、アンタゴニストは粘液生産及び腺性肥厚化を遅延させることができる。
【０１７２】
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【０１７３】
ＣＯＰＤ。慢性閉塞性肺（又は気道）疾患（ＣＯＰＤ）は、慢性気管支炎による肺気腫及び末梢気道閉塞の併発が一般的な原因である、気流閉塞として生理的に定義される状態である（Ｓｅｎｉｏｒ＆Ｓｈａｐｉｒｏ， Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ， ３ｄ ｅｄ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ， １９９８， ｐｐ． ６５９−６８１，１９９８； Ｂａｒｎｅｓ， Ｃｈｅｓｔ １１７， １０Ｓ−１４Ｓ， ２０００）。肺気腫は、肺空気間隙の異常な拡張を引き起こす肺胞壁の破壊によって特徴付けられる。慢性気管支炎は、連続２年間それぞれに３ヶ月間の慢性多産咳（ｃｈｒｏｎｉｃ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｃｏｕｇｈ）が見られるというように臨床的に定義される。ＣＯＰＤにおいては、気流閉塞は通常進行性であり、希に好転することがある。ＣＯＰＤの発症において、タバコの喫煙はかなり重要な危険因子であるが、この疾患は非喫煙者にも発症する。
【０１７４】
気道の慢性炎症は、ＣＯＰＤの鍵となる病態的特徴である（Ｓｅｎｉｏｒ＆Ｓｈａｐｉｒｏ， １９９８）。炎症細胞群には、増加した数の貪食細胞、好中球およびＣＤ＋８リンパ球が含まれる。吸引した刺激物、例えばタバコの煙が、気道に常在する貪食細胞を活性化し、同様にケモカイン（例えば、インターロイキン−８）及び他の走化因子を放出することになる上皮細胞を活性化する。これらの走化因子が作用して、血液から肺組織及び気道へ輸送する好中球／単球を増加させる。気道に補充された好中球及び単球が、ダメージを与える可能性のある種々の媒介物、例えばタンパク質分解酵素や活性酸素種を放出し得る。マトリックス分解、並びに気道壁の肥大化、界面活性剤機能障害及び粘液過分泌を伴う肺気腫、これら全てが障害性気流及びガス交換を引き起こす炎症性応答となる可能性がある後遺症である。
【０１７５】
種々のＧＰＣＲはＣＯＰＤの病理と関連付けられている。例えば、ケモカインＩＬ−８はＣＸＣＲ１及びＣＸＣＲ２を通じて作用し、これらの受容体のアンタゴニストはＣＯＰＤの治療として研究されている。代謝調節型受容体のＰ２Ｙファミリーメンバーは、正常な肺機能において非常に重要な役割を果たし得る。特に、Ｐ２Ｙ２受容体は肺の粘膜毛様体排除機構の調節に関与すると考えられており、この受容体のアゴニストが慢性気管支炎を患っている患者の気道の粘液排除を刺激し得る（Ｙｅｒｘａ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｄｒｕｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ ２４，７５９−７６９，１９９９）。従って、ＧＰＣＲはＣＯＰＤについての治療標的であり、既存のＧＰＣＲファミリー又は新規ＧＰＣＲの更なるメンバーを同定することで、より魅力的な標的を産出できる。
【０１７６】
本発明は、上記のスクリーニング検定によって同定される新規物質の使用にさらに関する。従って、本明細書に記載するように同定される被験化合物を適当な動物モデルに使用することは、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書に記載するように同定される物質（例えば、調整物質、アンチセンス核酸分子、特異的な抗体、リボザイム又はＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド結合分子）を、そのような物質を用いた処置の効果、毒性又は副作用を決定するために、動物モデルに用いることがある。あるいは、本明細書に記載するように同定された物質を、該物質の作用機構を決定するために、動物モデルに使用する場合がある。さらに、本発明は、本明細書に記載の処置に対する上記スクリーニング検定によって同定される新規物質の使用に関する。
【０１７７】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性に影響を及ぼす試薬を、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性を低下させるために、インビトロ又はインビボのいずれかにおいてヒト細胞に投与することができる。試薬は、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ遺伝子の発現産物と結合することが好ましい。その発現産物がタンパク質である場合、試薬は抗体であることが好ましい。エックスビボにおけるヒト細胞の処置については、抗体を、人体から取り出しておいた幹細胞の調製物に添加することができる。その後、その細胞を、当分野で周知のように、クローン増殖させるか、又はさせずに同じ又は別の人体に移すことができる。
【０１７８】
１つの態様においては、試薬を、リポソームを用いて送達する。リポソームは、投与した動物中にて、少なくとも約３０分間、より好ましくは少なくとも約１時間、さらにより好ましくは少なくとも約２４時間安定であることが好ましい。リポソームは、試薬、特にポリヌクレオチドを、動物（例えばヒト）の特定の部位に標的化することができる脂質組成物を含む。リポソームの脂質組成物は、動物の特有の器官、例えば肺、肝臓、脾臓、心臓、脳、リンパ節及び皮膚を標的化できることが好ましい。
【０１７９】
本発明に有用なリポソームは、標的化した細胞の原形質膜と融合でき、その内容物を細胞に送達できる脂質組成物を含む。好ましくは、リポソームのトランスフェクション効率は約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約０．５μｇであり、より好ましくは約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約１．０μｇであり、さらにより好ましくは約１０６細胞に送達されるリポソーム１６ｎｍｏｌ当たりＤＮＡ約２．０μｇである。好ましくは、リポソームは直径が、約１００〜５００ｎｍであり、より好ましくは約１５０〜４５０ｎｍであり、さらにより好ましくは約２００〜４００ｎｍである。
【０１８０】
本発明に用いるに適したリポソームは、例えば当業者に知られる遺伝子送達法に標準的に用いられるリポソームを含む。より好ましいリポソームは、ポリカチオン脂質組成物を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリコールと連結されたコレステロールバックボーン（骨格鎖）を有するリポソームを含む。あるいは、リポソームは特定の細胞タイプを標的化できる化合物、例えばリポソームの外側表面に曝される細胞特異的リガンドを包含する。
【０１８１】
リポソームを、試薬、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムと複合化させることは、当分野で標準的な方法 （例えば、米国特許５，７０５，１５１を参照のこと） を用いて達成することができる。好ましくは、ポリヌクレオチド約０．１μｇ〜約１０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと複合化する、より好ましくはポリヌクレオチド約０．５μｇ〜約５μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと複合化する、さらにより好ましくはポリヌクレオチド約１０μｇをリポソーム約８ｎｍｏｌと複合化する。
【０１８２】
別の態様においては、抗体を、受容体媒介性標的化送達を用いて、インビボにて特定の組織に送達することができる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技術は、例えばＦｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １１， ２０２−０５ （１９９３）； Ｃｈｉｏｕら、ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ： ＭＥＴＨＯＤＳ ＡＮＤ ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＯＦ ＤＩＲＥＣＴ ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ （Ｊ． Ａ． Ｗｏｌｆｆら、） （１９９４）； Ｗｕ ＆ Ｗｕ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３， ６２１−２４ （１９８８）； Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９， ５４２−４６ （１９９４）； Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７， ３６５５−５９ （１９９０）； Ｗｕら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， ３３８−４２ （１９９１） にて教示されている。
【０１８３】
治療的有効量の決定
治療的有効量の決定は、充分当業者の能力の範囲内にある。治療的有効量とは、治療的有効量の不在下で起こるＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性に比較してＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性を増大させ又は低下させる活性成分の量を指す。
【０１８４】
いかなる化合物に関しても、治療的有効量は最初に細胞培養検定で、または動物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタで見積もることができる。動物モデルは適当な濃度範囲および投与経路の決定にも使用できる。次にこのような情報を用いて人間での有用な用量と投与経路を決定できる。
【０１８５】
治療的有効性および毒性、例えばＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％で致死的な用量）は、細胞培養または実験動物における標準的薬学的方法により決定できる。治療効果に対する毒性効果の用量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。
【０１８６】
大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養検定および動物研究から得られるデータを、人間への使用のための用量範囲を処方する際に使用する。かかる組成物に含まれる用量は、好ましくは殆どまたは全く毒性を持たないＥＤ５０を包含する循環濃度の範囲内である。この用量は、使用する用量型、患者の感受性、および投与経路に応じてこの範囲内で変わる。
【０１８７】
正確な用量は、治療を必要とする対象に関連する因子に照らして医師が決定する。用量および投与は、充分なレベルの活性成分を提供するよう、または所望の効果を維持するよう、調節する。考慮できる因子は、疾病状態の重篤度、対象の全身健康状態、年齢、体重、および対象の性別、食餌、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応の感受性、および療法に対する寛容／応答を包含する。長時間作用性医薬組成物は、その製剤の半減期およびクリアランス率に応じて３から４日毎、毎週、または２週間に１回投与することができる。
【０１８８】
標準的な用量は投与経路に応じて０．１から１０００００マイクログラムまで変えることができ、約１ｇまでの総用量とすることができる。特定の用量および送達方法についての指針は文献に提供されており、一般に当分野の医師が入手できる。当業者は、ヌクレオチド用にはタンパク質またはそれらの阻害物質用のものとは異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は特定の細胞、状態、場所などに特異的である。
【０１８９】
この試薬が一本鎖抗体である場合、この抗体をコードしているポリヌクレオチドを組み立て、トランスフェリン−ポリカチオン−媒介ＤＮＡ転移、裸のまたはカプセル内核酸を用いるトランスフェクション、リポソームの媒介する細胞融合、ＤＮＡ被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、電気穿孔、「遺伝子銃」、およびＤＥＡＥ−または燐酸カルシウム−媒介トランスフェクションを包含する（但しこれらに限定される訳ではない）充分確立した技術を用いて、ｅｘ ｖｉｖｏまたはインビボで細胞内に導入できる。
【０１９０】
抗体の有効なインビボ用量は、約５μｇから約５０μｇ／ｋｇ、約５０μｇから約５ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇから約５００μｇ／ｋｇ（患者の体重）、および約２００から約２５０μｇ／ｋｇ（患者の体重）の範囲である。一本鎖抗体をコードしているポリヌクレオチドの投与のためには、有効なインビボ用量は、約１００ｎｇから約２００ｎｇ、５００ｎｇから約５０ｍｇ、約１μｇから約２ｍｇ、約５μｇから約５００μｇ、および約２０μｇから約１００μｇのＤＮＡの範囲である。
【０１９１】
発現産物がｍＲＮＡである場合、試薬は好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムである。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを発現するポリヌクレオチドは、上記のように多岐にわたる方法によって細胞中に導入できる。
【０１９２】
好ましくは、試薬は、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ遺伝子の発現またはＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの活性を、該試薬の不在時と比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ遺伝子の発現レベルまたはＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの活性を低下させるよう選択した機構の有効性は、当分野で周知の方法、例えばＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ特異的ｍＲＮＡへのヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの免疫学的検出、またはＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性の測定を用いて評価できる。
【０１９３】
上記のいずれの態様においても、本発明に係る任意の医薬組成物は他の適当な治療薬と組み合わせて投与できる。併用療法に使用するための適当な物質の選択は、常套的製薬原理に従い、当業者により実施することができる。治療薬の組み合わせは、相乗的に働いて、上記の様々な疾患の治療または予防を奏効させる。このアプローチを用いて、より低い各物質の用量で治療効果を達成することができ、したがって有害な副作用の可能性を低減することができる。
【０１９４】
上記の治療方法のいずれも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、および最も好ましくはヒトといった哺乳動物を包含する、このような治療を必要とする任意の対象に適用することができる。
【０１９５】
診断方法
ＧＰＣＲはさらに、ＧＰＣＲをコードしている核酸配列における突然変異の存在に関連した疾病および異常、または疾病および異常に対する感受性を検出する診断検定に使用できる。該疾患は、一例として、細胞形質転換体（例えば、腫瘍及び癌）、及び種々の心疾患（高血圧症及び低血圧症を含む）、並びに異常な血流量、異常なアンジオテンシン誘導型アルドステロン分泌、及び異常な体液や電解質ホメオスタシスから生じる疾患に関連している。本発明に基づき、疾患に罹患している個体と正常な個体とにおけるＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲをコードしているｃＤＮＡまたはゲノム配列の間の差異を決定できる。もし、罹患している個体の幾つかまたは全てに突然変異が観察され、正常な個体で観察されないならば、その突然変異がその疾患の原因物質である可能性がある。
【０１９６】
レファレンス遺伝子および突然変異を有する遺伝子の間の配列相違は、直接ＤＮＡ配列決定法によって明らかにできる。加えて、クローニングしたＤＮＡセグメントを、特定のＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして使用できる。この方法の感受性はＰＣＲと組み合わせる時極めて増強される。例えば、二本鎖ＰＣＲ産物または修飾ＰＣＲにより調製された一本鎖テンプレート分子と共に、配列決定プライマーを使用することができる。配列決定は、放射標識したヌクレオチドを用いる常套的方法によって、または蛍光標識を使用する自動配列決定法によって実施する。
【０１９７】
ＤＮＡ配列相違に基づく遺伝子試験は、変性させる物質を含むまたは含まないゲル中のＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化を検出することにより実施できる。小配列の欠失および挿入は、例えば高分解能ゲル電気泳動によって視覚化できる。異なる配列のＤＮＡ断片は変性させるホルムアミド勾配ゲル上で識別でき、ここでは、異なるＤＮＡ断片の移動度が、それらの特異的融解温度または部分的融解温度に従って、ゲル中の異なる位置で遅延する（例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０，１２４２，１９８５を参照されたい）。特定の位置での配列改変もまたヌクレアーゼ保護検定、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂法によって明らかにすることができる（例えば、Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，４３９７−４４０１，１９８５）。即ち特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定といった方法によって、または制限酵素とゲノムＤＮＡのサザンブロッティングを使用することによって実施できる。ゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定のような直接法に加えて、突然変異はｉｎ ｓｉｔｕ分析により検出することもできる。
【０１９８】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲレベルの変化もまた種々の組織で検出できる。血液または組織生検のように、宿主から誘導した身体試料中のタンパク質ポリペプチドのレベルを検出するために用いる検定は、当業者に周知であり、ラジオイムノアッセイ、競合的結合検定、ウェスタンブロット分析、およびＥＬＩＳＡ検定を包含する。
【０１９９】
本明細書に引用する全ての特許および特許出願は、引用により特に本明細書の一部とする。上記の内容は本発明を一般的に記載するものである。より完全な理解は以下の具体的実施例を参照することによって得られ、それらの実施例は例示のみの目的で提供するものであり、本発明の範囲を限定する意図は無い。
【０２００】
実施例１
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性の検出
配列番号１に記載のポリヌクレオチドを発現ベクターｐＣＥＶ４中に挿入し、得られたｐＣＥＶ４−Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチド発現ベクターをヒト胚腎臓２９３細胞中にトランスフェクトする。これらの細胞をトリスＨＣｌ５ｍｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中の培養フラスコから掻き出し、超音波処理して溶菌させる。細胞可溶化液を４℃にて１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。その上清を４℃にて３０，０００ｒｐｍ×２０分間遠心分離する。そのペレットを５０ｍＭ トリスＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に０．１％ ＢＳＡ、２μｇ／ｍｌ アプロチニン、０．５ｍｇ／ｍｌ ロイペプチンと１０μｇ／ｍｌ ホスホラミドンを補助した結合バッファー中に懸濁する。添加した放射性リガンドの１０％未満と結合するのに必要とされるタンパク質濃度として規定される最適膜懸濁希釈液を、１２５Ｉ−標識化リガンド又は被験化合物、非標識化ペプチド及び結合バッファーを含む９６ウェル ポリプロピレンマイクロタイタープレートに、最終量が２５０μｌとなるまで加える。
【０２０１】
平衡飽和結合検定においては、膜調製物を増大濃度（０．１ｎＭ〜４ｎＭ）１２５Ｉ−標識化リガンド又は被験化合物（比放射能２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下にてインキュベートする。種々の被験化合物の結合親和度は、各被験化合物の１２の異なる濃度の存在下で０．１ｎＭ １２５Ｉ−ペプチドを用いる平衡的競合作用において決定する。
【０２０２】
結合反応混合液を３０℃で１時間インキュベートする。この反応は、細胞回収機を用い、０．５％ ポリエチレンイミンで処理したＧＦ／Ｂフィルターを通じて濾過することにより停止させる。放射活性は、シンチレーション計数により測定し、データをコンピューター処理非線型回帰プログラムにより分析する。
【０２０３】
非特異的結合は、１００ｎＭ 非標識化ペプチドの存在下で膜タンパク質をインキュベートした後に残存する放射活性量として規定される。タンパク質濃度は標準物としてウシ血清アルブミンを含むＢｉｏ−Ｒａｄ Ｒｅａｇｅｎｔを用いるブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法により測定する。これにより、配列番号２のポリペプチドがＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ活性を有することが示される。
【０２０４】
実施例２
組換えヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの発現
ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクターｐＰＩＣＺＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ） を用いて、大量の組換えヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを酵母中に生産させる。ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲコード化ＤＮＡ配列は配列番号５に示されるヌクレオチド配列から誘導する。ベクターｐＰＩＣＺＢ中に挿入する前に、ＤＮＡ配列を、その５’端に開始コドン、及び３’端にエンテロキナーゼ開列部位、Ｈｉｓ６レポータータグや終止コドンを含ませるといった周知の方法によって修飾する。さらに、その両末端に制限エンドヌクレアーゼの認識配列を加え、対応する制限酵素を用いてｐＰＩＣＺＢのマルチクローニングサイトを消化した後に、修飾ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列をｐＰＩＣＺＢ中にライゲートする。この発現ベクターを、ピキア パストリスにて発現が酵母プロモーターにより誘導される誘導性発現用に設計する。得られたｐＰＩＣＺ／ｍｄ−Ｈｉｓ６ベクターを用いて、酵母を形質転換する。
【０２０５】
この酵母を、５リッター攪拌フラスコ中で通常の条件下にて培養し、組換え産物タンパク質を、８Ｍウレアの存在下で親和性クロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ−樹脂）により培養物から単離する。結合したポリペプチドを、ｐＨ３．５の緩衝液を用いて溶出し、中性化する。Ｈｉｓ６レポータータグからのＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドの分離は、製造元の指示に従い、エンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いる部位特異的タンパク質分解により行なう。精製ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを得る。
【０２０６】
実施例３
放射結合検定
ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲを発現するポリヌクレオチドを用いてトランスフェクトしたヒト胚腎臓２９３細胞を、トリスＨＣｌ５ｍｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５中の培養フラスコから掻き出し、超音波処理して溶菌させる。細胞可溶化液を４℃にて１０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。その上清を４℃にて３０，０００ｒｐｍ×２０分間遠心分離する。そのペレットを５０ｍＭ トリスＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５に０．１％ ＢＳＡ、２μｇ／ｍｌ アプロチニン、０．５ｍｇ／ｍｌ ロイペプチンと１０μｇ／ｍｌ ホスホラミドンを補助した結合バッファー中に懸濁する。添加した放射性リガンドの１０％未満と結合するのに必要とされるタンパク質濃度として規定される最適膜懸濁希釈液を、１２５Ｉ−標識化リガンド又は被験化合物、非標識化ペプチド及び結合バッファーを含む９６ウェル ポリプロピレンマイクロタイタープレートに、最終量が２５０μｌとなるまで加える。
【０２０７】
平衡飽和結合検定においては、膜調製物を増大濃度（０．１ｎＭ〜４ｎＭ）１２５Ｉ−標識化リガンド又は被験化合物（比放射能２２００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下にてインキュベートする。種々の被験化合物の結合親和度は、各被験化合物の１２の異なる濃度の存在下で０．１ｎＭ １２５Ｉ−ペプチドを用いる平衡的競合作用において決定する。
【０２０８】
結合反応混合液を３０℃で１時間インキュベートする。この反応は、細胞回収機を用い、０．５％ ポリエチレンイミンで処理したＧＦ／Ｂフィルターを通じて濾過することにより停止させる。放射活性は、シンチレーション計数により測定し、データをコンピューター処理非線型回帰プログラムにより分析する。
【０２０９】
非特異的結合は、１００ｎＭ 非標識化ペプチドの存在下で膜タンパク質をインキュベートした後に残存する放射活性量として規定される。タンパク質濃度は標準物としてウシ血清アルブミンを含むＢｉｏ−Ｒａｄ Ｒｅａｇｅｎｔを用いるブラッドフォード法により測定する。被験化合物と共にインキュベートしていない膜タンパク質の放射活性と比較して膜タンパク質の放射活性を１５％増大させる被験化合物を、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドと結合する化合物と同定する。
【０２１０】
実施例４
ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ媒介型サイクリックＡＭＰ形成における被験化合物の効果
ｃＡＭＰ形成の受容体媒介型阻害は、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲを発現する宿主細胞において検定することができる。細胞を９６ウェル プレートに移し、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ テオフィリン、２μｇ／ｍｌ アプロチニン、０．５ｍｇ／ｍｌ ロイペプチン、及び１０μｇ／ｍｌ ホスホラミドンを補助したダルベッコホスフェート緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、５％ ＣＯ２下にて３７℃で２０分間インキュベートする。被験化合物を加え、３７℃でさらに１０分間インキュベートする。培地を吸引し、１００ｍＭ ＨＣｌを加えてこの反応を停止させる。そのプレートを４℃で１５分間保存する。停止させた溶液中の内容物ｃＡＭＰを放射免疫測定により測定する。
【０２１１】
放射活性は、データ換算ソフトウェアーを備えたガンマ計数を用いて定量化する。被験化合物が存在しないウェル内容物中の放射活性と比較してウェル内容物中の放射活性を低下させる被験化合物を、ｃＡＭＰ形成を阻害する可能性のある物質（インヒビター）として同定する。被験化合物が存在しないウェル内容物中の放射活性と比較してウェル内容物中の放射活性を増大させる被験化合物を、ｃＡＭＰ形成を増進する可能性のある物質（エンハンサー）として同定する。
【０２１２】
実施例５
細胞内カルシウム流動化における被験化合物の効果
細胞内の遊離カルシウム濃度は、蛍光指示薬Ｆｕｒａ−２／ＡＭ染色を用いる顕微分光蛍光分析により測定できる（Ｂｕｓｈら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ５７， ５６２−７４， １９９１）。安定にトランスフェクトされた細胞を、ガラスカバースリップインサートを含む３５ｍｍ培養皿に蒔く。細胞をＨＢＳで洗浄し、被験化合物と共にインキュベートし、２０〜４０分間Ｆｕｒａ−２／ＡＭ溶液１００μｌを充填する。ＨＢＳで洗浄した後にＦｕｒａ−２／ＡＭ溶液を取り除き、細胞を１０〜２０分間ＨＢＳで平衡化する。その後、細胞をＬｅｉｔｚ Ｆｌｕｏｖｅｒｔ ＦＳマクロスコープの対物レンズ４０×の下で可視化する。
【０２１３】
励起波長を３４０ｎＭ〜３８０ｎＭの間で変更して、蛍光発光を５１０ｎＭで決定する。生蛍光データを、標準カルシウム濃度曲線と分析技術ソフトウェアーとを用いてカルシウム濃度に変換する。被験化合非存在下の蛍光と比較して蛍光を１５％増大させる被験化合物を、細胞内カルシウムを流動化させる化合物と同定する。
【０２１４】
実施例６
ホスホイノシチド代謝における被験化合物の効果
ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ ｃＤＮＡを安定して発現する細胞を９６ウェル プレートにプレーティングし、増殖させて密集させる。検定の前日に、増殖培地を１％血清及び０．５μＣｉ ３Ｈ−マイイノシトール（ｍｙｉｎｏｓｉｔｏｌ）を含む培地１００μｌに交換する。このプレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃で５％ＣＯ２）中で一晩中インキュベートする。検定の直前に培地を除去し、１０ｍＭ ＬｉＣｌを含むＰＢＳ２００μｌに置き換え、そして細胞を新しい培地を用いて２０分間平衡化する。この間隔の間に、ＰＢＳ中の２０倍濃縮の一部１０μｌとして加えるアンタゴニストを用いて、細胞をさらに平衡化する。
【０２１５】
イノシトールリン脂質代謝由来の３Ｈ−イノシトールホスフェート蓄積は、被験化合物を含む溶液１０μｌを加えることで始まる。最初のウェルに１０μｌを加え、基礎蓄積を測定する。被験化合物の１１種の濃度を、その次の各プレート列の１１ウェルにて検定する。全ての検定は、２つの連続プレート列に等量を添加するして繰り返すことにより２回行なう。
【０２１６】
このプレートをＣＯ２インキュベーターにて１時間インキュベートする。この反応は、５０％ トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）１５μｌを加え、次いで４℃で４０分間インキュベートして停止させる。１Ｍ トリス４０μｌを用いてＴＣＡを中和した後、ウェル中の内容物をＤｏｗｅｘ ＡＧ１−Ｘ８（２００〜４００メッシュ、義酸塩形態）を含むマルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ）ＨＶフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移す。このフィルタープレートは、各ウェルに対してＤｏｗｅｘ ＡＧ１−Ｘ８懸濁液（５０％ｖ／ｖ、水：樹脂） ２００μｌを加えて調製する。そのフィルタープレートを真空多岐管（ｖａｃｕｕｍ ｍａｎｉｆｏｌｄ）に置き、樹脂床を洗うか、又は溶出する。それぞれのウェルを水２００μｌで２回洗い、５ｍＭ テトラホウ酸ナトリウム／６０ｍＭ ギ酸アンモニウム２００μｌで２回洗う。
【０２１７】
３Ｈ−ＩＰを１．２Ｍ ギ酸アンモニウム／０．１ ギ酸２００μｌを用いて空の９６−ウェルプレート中を溶出する。ウェル中の内容物をシンチレーションカクテル３ｍｌに加え、放射活性を液体シンチレーション計数により決定する。
【０２１８】
実施例７
受容体結合法
標準的結合検定。結合検定は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．５％ ＢＳＡ及び５ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む結合バッファー中にて行なう。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲを含む膜断片と結合している放射性リガンド（例えば、１２５Ｉ−被験化合物）に対する標準検定を、９６ウェル マイクロタイタープレート（例えば、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｉｍｍｕｌｏｎ ＩＩ リムーバウェル（Ｒｅｍｏｖａｗｅ）ｌｌプレート）において以下のように行なう。放射性リガンドを結合バッファー＋ＰＭＳＦ／Ｂａｃｉ中に所望のｃｐｍ／５０μｌとなるように希釈した後、一部５０μｌをこのウェルに加える。非特異的結合試料について、４０μＭ 冷リガンド ５μｌをさらにウェルに加える。結合は、結合バッファー＋ＰＭＳＦ／Ｂａｃｉ中に所望の濃度（膜タンパク質１０〜３０μｇ／ウェル）に希釈した膜をウェル当たり１５０μｌ添加して開始させる。その後、プレートをＬｉｎｂｒｏマイラープレートシーラー（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｓ）で覆い、Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭｉｃｒｏｓｈａｋｅｒＩＩに置く。結合は、室温で１〜２時間進行させ、そのプレートを２，０００×ｇで１５分間遠心分離することによって停止させる。その上清を棄て、膜ペレットを一度冷却結合バッファー２００μｌを加えて洗浄し、手短に攪拌し、再び遠心分離する。個々のウェルを１２×７５ｍｍチューブに置き、ＬＫＢ ガンママスター計数にて計数する（効率７８％）。この方法による特異的結合は、素早く（３〜５秒）ろ過すること、及びポリエチレンイミンコーティンググラスファイバーフィルターで洗浄することにより取り除いた場合に測定したものと一致する。
【０２１９】
さらに、この標準結合検定の変法も用いる。
【０２２０】
１．冷リガンド対、１２５Ｉ−標識化リガンドの濃度範囲を用いる競合放射性リガンド結合検定は、上記のように改良を用いて実施する。検定するリガンドの全希釈物は、検定における最終濃度の４０倍濃度になるように４０×ＰＭＳＦ／Ｂａｃｉにて作製する。その後、ペプチド試料（各々５μｌ）をマクロタイターウェルごとに加える。膜及び放射性リガンドを、プロテアーゼ阻害物質を含まない結合緩衝液にて希釈する。放射性リガンドを加え、冷リガンドと混合し、次いでその結合は膜を添加することで開始する。
【０２２１】
２．受容体と放射性リガンドとの化学架橋結合は、標準検定と同一の結合工程の後に行なう。しかしながら、洗浄過程は、ＢＳＡと放射性リガンドとの非特異的架橋結合の可能性を低減させるため、ＢＳＡを抜いた結合バッファーを用いて行なわれる。架橋結合工程は、以下の記載のように行なわれる。
【０２２２】
３．受容体：リガンド複合体の可溶化研究用及び受容体精製用の膜ペレットを得るため、大量結合検定もさらに行なう。これらは、（ａ）結合を１〜２５０ｍｌ量のポリプロピレンチューブにて行なうこと、（ｂ）膜タンパク質濃度を常に０．５ｍｇ／ｍｌにすること、及び（ｃ）受容体精製において、結合バッファー中のＢＳＡ濃度を０．２５％にまで低下させ、かつ洗浄工程はＢＳＡ不含結合バッファーを用いて行なうことで、精製受容体におけるＢＳＡ混入を低減させることを除けば、標準法と同一である。
【０２２３】
実施例８
受容体に対する放射性リガンドの化学架橋結合
上記のように放射性リガンド結合の後に、膜ペレットをマイクロタイタープレート当たりＢＳＡ不含冷却結合バッファー２００μｌ中に再懸濁する。その後、ウェル当たり４ｍＭ Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯＳ、Ｐｒｉｅｒｃｅ）５μｌを添加混合する。試料を氷上で維持し、距離５〜１０ｃｍでミネラライトＲ−５２Ｇランプ（ＵＶＰ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｇａｂｒｉｅｌ， Ｃａｌｉｆ．）を用いて１０分間ＵＶ照射する。その後、試料をエッペンドルフチューブに移し、膜を遠心分離してペレット化し、上清を棄て、そして膜を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）用のＬａｅｍｍｌｉ ＳＤＳサンプルバッファー中に溶解させる。以下のようにＰＡＧＥを行なう。放射標識化タンパク質を、コダックＸＡＲフィルム及びＤｕＰｏｎｔイメージ増強スクリーンを用いて乾燥ゲルのオートラジオグラフィーにより可視化する。
【０２２４】
実施例９
膜可溶化
膜可溶化は、２５ｍＭ トリス、ｐＨ８、１０％ グリセロール（ｗ／ｖ）及び０．２ｍＭ ＣａＣｌ２を含む緩衝液（可溶化バッファー）において行なう。トリトンＸ−１００、デオキシコレート、デオキシコレート：リゾレシチン、ＣＨＡＰＳ及びｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔを含む高溶解界面活性剤は、可溶化バッファー中、１０％濃度にて用いられ、凍結部分として保存される。リゾレシチンは、凍結融解の際に不用化するため新たに作製し、ジギトニンはそのさらに限定された可溶性のため低濃度で新たに作製する。
【０２２５】
膜を可溶化するため、結合工程後の洗浄ペレットを粒子が見えなくなるまで可溶化バッファー中でピペッティング及びボルテックスして再懸濁し、１００，０００×ｇで３０分間遠心分離する。その上清を取り出し、氷上にて維持し、ペレットを廃棄する。
【０２２６】
実施例１０
可溶化受容体の検定
１２５Ｉ−リガンドを結合させ、界面活性剤を用いて膜を可溶化した後に、無傷のＲ：Ｌ複合体を４つの異なる方法で検定することができる。全ての方法は、氷上又は４〜１０℃の低温室にて行なう。
【０２２７】
１．カラムクロマトグラフィー（Ｋｎｕｈｔｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ ２５４， ６４１−６４７，１９８８）。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−５０カラム（８×２５０ｍｍ）を、膜を可溶化するのに用いる濃度の界面活性剤及び１ｍｇ／ｍｌ ウシ血清アルブミンを含む可溶化バッファーを用いて平衡化する。可溶化膜の試料（０．２〜０．５ｍｌ）をカラムに充填し、流速約０．７ｍｌ／分で溶出する。試料（０．１８ｍｌ）を回収する。放射活性をガンマカウンターにて決定する。カラムの空隙容量はブルーデキストランの溶出量により決定される。空隙容量に溶出する放射活性を、タンパク質に対する結合とみなす。遊離１２５Ｉリガンドと同量の溶出後の放射活性を、非結合とみなす。
【０２２８】
２．ポリエチレングリコール沈殿（Ｃｕａｔｒｅｃａｓａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９， ３１８−３２２，１９７２）。１２×７５ｍｍポリプロピレンチューブ中の可溶化膜試料１００μｌに対して、０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液中の１％（ｗ／ｖ）ウシガンマグロブリン（シグマ）０．５ｍｌを加え、次いで２５％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（シグマ）０．５ｍｌを加えて混合する。この混合物を氷上にて１５分間維持する。その後、０．１Ｍ リン酸ナトリウムｐＨ７．４を試料当たり３ｍｌ加える。この試料を素早く（１〜３秒）Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｂ グラスファイバーフィルターによりろ過し、ホスフェート緩衝液４ｍｌを用いて洗浄する。ＰＥＧ沈殿受容体：１２５Ｉ−リガンド複合体をフィルターのガンマ計数により決定する。
【０２２９】
３．ＧＦＢ／ＰＥＩフィルター結合（Ｂｒｕｎｓら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３２， ７４−８１，１９８３）。Ｗｈａｔｍａｎ ＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターを０．３％ ポリエチレンイミン（ＰＥＩ， Ｓｉｇｍａ）中に３時間浸す。可溶化膜の試料（２５〜１００μｌ）を１２×７５ｍｍ ポリプロピレンチューブに移す。その後、界面活性剤不含可溶化バッファーを試料当たり４ｍｌ加え、その試料を素早く（１〜３秒）ＧＦＢ／ＰＥＩフィルターに通じて、ろ過し、可溶化バッファー４ｍｌで洗浄する。フィルターに吸着している受容体：１２５Ｉ−リガンド複合体のＣＰＭをガンマ計数により決定する。
【０２３０】
４．チャコール／デキストラン（Ｐａｕｌ及びＳａｉｄ， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ７［Ｓｕｐｐｌ． １］， １４７−１４９，１９８６）。デキストラン Ｔ７０（０．５ｇ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を水１Ｌ中に溶解し、次いで活性化チャコール（Ｎｏｒｉｔ Ａ， ａｌｋａｌｉｎｅ； Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５ｇを加える。その懸濁液を１０分間室温にて攪拌した後、使用するまで４℃で維持する。Ｒ：Ｌ複合体を測定するため、チャコール／デキストラン懸濁液４部容量を可溶化膜１部容量に加える。この試料を混合し、氷上で２分間維持した後、ベックマン微量遠心管にて１１，０００×ｇで２分間遠心分離する。遊離放射性リガンドをチャコール／デキストランに吸着させ、ペレットを破棄する。上清中に受容体：１２５Ｉ−リガンド複合体が残留しており、ガンマ計数により決定する。
【０２３１】
実施例１１
受容体精製
ＧＨ４Ｃｌ膜に対するビオチン化受容体の結合は、上記のように行なう。室温で１時間インキュベートする。標準的な精製プロトコルでは、結合インキュベーションには１０ｎＭ Ｂｉｏ−Ｓ２９が含まれる。１２５Ｉ リガンドを、標的として５，０００〜１００，０００ｃｐｍ／膜タンパク質ｍｇレベルで加える。コントロール（対照）インキュベーションは、非ビオチン化受容体を用いて受容体を飽和させるための１０μＭ 冷リガンドが含まれる。
【０２３２】
さらに上記のように、０．２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む可溶化バッファー中の０．１５％デオキシコール酸塩：リゾレクチンを用いて受容体：リガンド複合体の可溶化を行ない、可溶化Ｒ：Ｌ複合体を含む１００，０００×ｇ上清を得る。
【０２３３】
固定化ストレプトアビジン（６％ ビーズアガロースに対するストレプトアビジン架橋結合、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．； 「ＳＡアガロース」）を可溶化バッファー中にて洗浄し、最終量の３０分の１の可溶化膜を加える。この混合物を、終始回転させて定常攪拌しながら、４〜１０℃で４〜５時間インキュベートする。次いで、その混合物をカラムに充填し、非結合物質を洗い出す。ＳＡアガロースに対する放射性リガンドの結合を、１００，０００×ｇ上清中のｃｐｍとＳＡアガロースに対する吸着後のカラム溶出中のｃｐｍとを比較することで決定する。最終的にカラムを、０．１５％ デオキシコール酸塩：リゾレシチンと１／５００（ｖｏｌ／ｖｏｌ）１００×４パセ（ｐａｓｅ）を含む可溶化バッファー１２〜１５カラム容量を用いて洗浄する。
【０２３４】
ストレプトアビジンカラムを、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．１ｍＭ ＧＴＰ−ガンマ−Ｓ（シグマ）、０．１５％（ｗｔ／ｖｏｌ）デオキシコール酸塩：リゾレシチン、１／１０００（ｖｏｌ／ｖｏｌ）１００×４パセを含む可溶化バッファーを用いて溶出する。初め、カラムに溶出バッファー１カラム容量を通じ、流出を２０〜３０分間で止める。その後、さらに溶出バッファー３〜４カラム容量を通じる。全ての溶出物を集める。
【０２３５】
ストレプトアビジンカラム由来の溶出物を、固定化コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡアガロース、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）と共に一晩中インキュベートし、ＷＧＡレクチンと共有結合炭化水素との相互作用を介して、この受容体を吸着させる。ストレプトアビジンカラム溶出物に対するＷＧＡ−アガロースの割合（ｖｏｌ／ｖｏｌ）は一般に１：４００である。また１：１０００〜１：２００の割合も用いることができる。結合工程の後、樹脂を遠心分離してペレット化し、その上清を取り出して保存し、その樹脂を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、５ｍＭ ＭｇＣｌ２及び０．１５％ デオキシコール酸塩：リゾレシチンを含む緩衝液中で３回（各約２分）洗浄する。ＷＧＡ結合受容体を溶出するため、樹脂を洗浄するのに用いたのと同じＨＥＰＥＳ緩衝液中の１０ｍＭ Ｎ−Ｎ’−Ｎ’’−トリアセチルシトトリオースの３樹脂カラム容量を毎回用い、氷上にて１５〜３０分間かけて繰り返し混合（低速ボルテックス混合）することを３回行なって樹脂を抽出する。各溶出工程の後に、樹脂を遠心分離して、ＷＧＡアガロースペレットを含まないよう慎重に上清を取り出す。３回分の集めた溶出物には最終的な精製受容体が含まれる。ＷＧＡに非結合的な物質には、ストレプトアビジンカラムから特異的に溶出されるＧタンパクサブユニット及び非特異的混入物が含まれる。これら全てのフラクションを−９０℃で凍結保存する。
【０２３６】
実施例１２
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドと結合する被験化合物の同定
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質を含み９６ウェル マイクロタイタープレートのグルタチオン誘導化ウェルに吸着した精製Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドを、生理緩衝溶液ｐＨ７．０の小分子ライブラリー由来の被験化合物と接触させる。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドは、配列番号２に示すアミノ酸配列を含む。被験化合物は蛍光標識を含む。この試料を５分間〜１時間インキュベートする。コントロール試料は、被験化合物の非存在下にてインキュベートする。
【０２３７】
被験化合物を含む緩衝液を、ウェルから洗い出す。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドに対する被験化合物の結合を、ウェルの内容物の蛍光測定により検出する。被験化合物をインキュベートしていないウェルの蛍光と比較して少なくとも１５％ウェル中の蛍光を増大させる被験化合物を、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドと結合する化合物と同定する。
【０２３８】
実施例１３
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ遺伝子発現を低下させる被験化合物の同定
被験化合物を、ヒト胃細胞培養に投与し、３７℃で１０〜４５分間インキュベートする。同じタイプの細胞培養を、被験化合物を加えず同じ時間インキュベートし、ネガティブコントロールとする。
【０２３９】
ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８， ５２９４−９９，１９７９に記載のように２つの培養物から単離する。ノーザンブロットを全ＲＮＡ２０〜３０μｇを用いて調製し、エクスプレスハイブ（Ｅｘｐｒｅｓｓｈｙｂ）（ＣＬＯＮＴＥＣＨ）にて６５℃で、３２Ｐ−標識化Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ特異的プローブを用いてハイブリダイズさせる。このプローブは配列番号５より選ばれる少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを包含する。被験化合物の非存在下にて得られるシグナルと比較してＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ特異的シグナルを低下させる被験化合物を、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ遺伝子発現の阻害物質として同定する。
【０２４０】
実施例１４
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ遺伝子産物と特異的に結合する試薬を用いた、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲが過剰発現している疾患の処置
配列番号５の相補物より選択される少なくとも１１個の連続ヌクレオチドを含むアンチセンスＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲオリゴヌクレオチドの合成は、ホスホラミダイト手順を用いるファルマシア ジーン アセンブリー シリーズ シンセサイザー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｇｅｎｅ Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ ｓｅｒｉｅｓ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）にて実施する（Ｕｈｌｍａｎｎら、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖ． ９０， ５３４−８３， １９９０を参照のこと）。アセンブリーおよび脱保護に続き、オリゴヌクレオチドを２度エタノール沈殿させ、乾燥させ、そしてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に所望の濃度に懸濁する。これらのオリゴヌクレオチドの純度は、キャピラリーゲル電気泳動及びイオン交換ＨＰＬＣにより試験する。オリゴヌクレオチド調製のエンドトキシンレベルは、リムルスアメーバ様検定（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ａｓｓａｙ）（Ｂａｎｇ， Ｂｉｏｌ． Ｂｕｌｌ． （Ｗｏｏｄｓ Ｈｏｌｅ， Ｍａｓｓ．） １０５， ３６１−３６２， １９５３） を用いて決定する。
【０２４１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを患者に投与する。患者の疾患の重症度を低減させる。
【０２４２】
実施例１５
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲの組織特異的発現
ＣＯＰＤの病因におけるＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの働きを確立するための最初の段階として、ＣＯＰＤに関連するヒト呼吸組織及び炎症細胞由来のＲＮＡ試料を用いた実時間定量的ＰＣＲを使用して、遺伝子発現プロファイルを行なった。このパネルは、肺（成人及び胎児）、気管、新たに単離された肺胞型ＩＩ細胞、培養されたヒト気管支上皮細胞、培養された小気道上皮細胞、培養された気管支平滑筋細胞、培養されたＨ４４１細胞（Ｃｌａｒａ様）、新たに単離された好中球及び単球、並びに培養された単球（マクロファージ様）の全ＲＮＡ試料から構成された。また、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲの発現は、クローンテック研究所（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＵＫ， Ｌｔｄ）から得た全ＲＮＡパネルを用い、ヒト組織の範囲で評価した。この組織は、副腎腺、骨髄、脳、大腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、膵臓、唾液腺、骨格筋、小腸、脾臓、胃、精巣、胸腺、気管、甲状腺及び子宮であった。
【０２４３】
実時間定量的ＰＣＲ。標的遺伝子の発現プロファイルは、実時間定量的ＰＣＲ（ＰＣＲの動力学的分析の開発は、Ｈｉｇｕｃｈｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ４１３−１７，１９９２、及びＨｉｇｕｃｈｉら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１， １０２６−３０，１９９３に初めて記載された）を用いて実施した。原理は、ＰＣＲの指数関数相内の所定の任意のサイクルにおいては、産物の量が最初の鋳型のコピー数と比例することである。
【０２４４】
ＰＣＲ増幅は、標的配列と相補的であり、かつ蛍光レポーター染色及び消光染色で標識化されたオリゴヌクレオチドプローブ（ＴａｑＭａｎプローブ）の存在下で行なう。ＰＣＲの伸長相の間に、プローブはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの５’−３’エンドヌクレアーゼ活性により開裂され、フルオロフォアを消光染色の効果から放出する（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８８， ７２７６−８０， １９９１）。蛍光発光は、特異的増幅産物量と直接比例して増大するため、ＰＣＲ産物の指数関数的増幅相を検出し、初期鋳型濃度を決定するのに用いることができる（Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６， ９８６−９４， １９９６、及びＧｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ６， ９９５−１００１， １９９６）。
【０２４５】
実時間定量的ＰＣＲは、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００シークエンス検出器を用いて行なった。普遍基準曲線の補間法により初期鋳型濃度（コピー数）を決定するために、それぞれの反応について得られたＣＴ値を用いた。それぞれの試料中の標的遺伝子の発現レベルは、遺伝子発現の最も少ない試料に関して計算した。
【０２４６】
ＲＮＡ抽出及びｃＤＮＡ調製。以上に挙げた呼吸組織及び炎症細胞タイプの各々由来の全ＲＮＡを、キアゲン社のＲＮｅａｓｙシステムを用い、製造元のプロトコルに従って単離した（Ｃｒａｗｌｅｙ， Ｗｅｓｔ Ｓｕｓｓｅｘ， ＵＫ）。精製ＲＮＡ濃度は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ ＲＮＡ定量キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｅｕｒｏｐｅ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて決定した。ｃＤＮＡの調製については、全ＲＮＡ１μｇを、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ ＲＮａｓｅ Ｈ−逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｐａｉｓｌｅｙ， ＵＫ）２００Ｕ、１０ｍＭ ジチオスレイトール、各々のｄＮＴＰ ０．５ｍＭ及び５μＭ ランダムヘキサマー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ， Ｃｈｅｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を用いて製造元のプロトコルに従い、最終量２０μｌ中にて逆転写した。
【０２４７】
ＴａｑＭａｎ定量分析。特異的プライマー及びプローブは、ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの推奨に基づいて設計した。プローブは、ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）を用いて５’端を標識化した。定量的ＰＣＲはそれぞれの試料由来の逆転写されるＲＮＡ５ｎｇを用いて実施した。それぞれの測定は２回行なう。
【０２４８】
検定反応混合は以下のとおりである：１×最終ＴａｑＭａｎユニバーサルＰＣＲマスター混合（２×ストック溶液から）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ）；９００ｎＭ フォワードプライマー；９００ｎＭ リバースプライマー；２００ｎＭ プローブ；５ｎｇ ｃＤＮＡ；及び２５μｌにする水。
【０２４９】
以下の工程のそれぞれを一回行なった：５０℃で２分間、そして９５℃で１０分間のプレ（前）ＰＣＲ。以下の工程は４０回行なう：９５℃で１５秒の変性、６０℃で１分のアニーリング／伸長。
【０２５０】
全ての実験は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００シークエンス検出器（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ＣＡ）を用いて実施した。この実施の最後に、ＰＣＲの間に得られた蛍光データを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００使用者マニュアルに記載のように処理し、さらにバックグラウンド減算を行ない、出発標的定量を用いたシグナル直線性を行なった。
【０２５１】
表１及び表２は、示した細胞及び組織試料を用いて、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲについての発現プロファイリングの結果である。表１については、細胞は以下のように規定する：ＨＢＥＣ、培養されたヒト気管支上皮細胞、Ｈ４４１、Ｃｌａｒａ様細胞系、ＳＡＥ、培養された小気道上皮細胞；ＳＭＣ、培養された気道平滑筋細胞；ＡＩＩ、新たに単離されたヒト肺胞型ＩＩ細胞；Ｎｅｕｔ、新たに単離された循環好中球；Ｍｏｎｏ、新たに単離された単球；及びＣＭ、培養された単球。別の報告ではドナーは一致する。この結果を図８及び９にてグラフにする。
【表１】
2004506426.tif 000002
【表２】
2004506426.tif 000003
【０２５２】
さらに、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ（ＩＩＩ）の特異的遺伝子発現を図１０に示す。この実験におけるポリメラーゼ連鎖反応は、オリゴヌクレオチドプライマーＬＢＲＩ１１９ｃｄｓ−Ｌ２ （ｔｔｃｇｇａｔｃｇａａｔｃｔｃｇｃｃｔｇｃｔ）及びＬＢＲＩ１１９ｃｄｓ−Ｒ２ （ｔｇｃｔｔｇｃｔｃａａｇｇｔｔｃｃｃｇｃｔｔａ）を用いて実施し、発光強度測定は、この反応が各サイクルごとに温度８２℃に達した後に行なった。
【０２５３】
喘息に対するＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの潜在的関連性
細胞外ヌクレオチドは、多くの細胞型における筋収縮及び筋弛緩、血管拡張、神経伝達、血小板凝集、イオン輸送調節及び細胞増殖を含む幅広い応答を誘導する。この効果は、リガンドゲート型イオンチャネルであるＰ２Ｘ受容体とＧタンパク共役受容体であるＰ２Ｙ受容体との２つの主なファミリーに分類されるＰ２受容体を通じて発揮される。１２の異なるＰ２Ｙファミリーメンバーを、そのリガンドがＬＴＢ４でありＰ２Ｙ７と称され、ヌクレオチドと結合しないことが知られている様々な種の少なくとも１つにクローニングし、日付を付した。ヌクレオチド結合Ｐ２Ｙ受容体は、リガンド特異性に基づいてさらに３つの群：アデニンヌクレオチドにより活性化されるＰ２Ｙ、ウリジンヌクレオチドにより活性化されるＰ２Ｙ、及びアデニンとウリジンヌクレオチドの両方により活性化されるＰ２Ｙ、にさらに分けることができる。
【０２５４】
Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲは、Ｐ２Ｙ１と非常にホモロジーが高い新規Ｐ２Ｙ様７回膜貫通ドメイン分子である。このことは、Ｐ２Ｙホモログについてゲノム配列データベースをサーチして独自に見い出した。正常ヒト上皮から誘導されたｃＤＮＡライブラリー由来のこの遺伝子に日付を付すため、１つのＥＳＴについてのみして報告した。我々独自のこの遺伝子の発現プロファイリングにより、この遺伝子が気管、唾液腺及び腎臓においては高発現であるが、胎児の脳、大腸、胎盤及び肺においてはそれほど発現されていないことが示される。
【０２５５】
ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲは、アデニンヌクレオチド（ＡＴＰ及びＡＤＰ）と結合するＰ２Ｙ１と非常にホモロジーがあるが、ＡとＵヌクレオチドの両方と結合するＰ２Ｙ２やＰ２Ｙ４、Ｕヌクレオチドと結合するＰ２Ｙ３、及びＬＴＢ４、ＬＴＣ４やＬＴＤ４と結合するロイコトリエン受容体とも有意なホモロジーがある。従って、ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲが結合できるリガンドの適当な範囲は相対的に限定できるが、この受容体の本当のリガンドは実験に基づいて決定されるはずである。
【０２５６】
気道上皮の研究において、ＡＴＰやＵＴＰの両方が、等力的に上皮電解質及び水輸送を調節し、ムチン分泌を引き起こし、そして毛様体β頻度を増大させることを見出した。気管において、ヌクレオチドは、抗菌タンパク質及び抗タンパク質分解タンパク質の分泌に寄与する気管腺漿液細胞を誘導し、分泌性白血球プロテイナーゼ阻害物質を生産し、クロライド輸送を増大させることができる。Ｐ２Ｙ２受容体のノックアウトマウス研究では、気道上皮には主要な細胞外ヌクレオチド受容体があるが、気道には同様に機能する他のヌクレオチド受容体が存在することが示される。
【０２５７】
我々のヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの発現プロファイリング研究により、気道上部の組織にて高発現されていることが示される。唾液腺及び気管におけるこの高発現は、気道において主に保護機能を果たす外分泌物を分泌する働きがあることを示し得る。しかしながら、喘息においてはムチン過剰発現は、喘息患者の気道を塞ぐ粘性粘液栓に寄与する。喘息患者の大気道の粘膜下腺もまた、何らかの形で外部媒介物質により過剰刺激されるためであろう肥厚化についての証拠が頻繁に示される。
【０２５８】
従って、Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲ受容体のアゴニスト又はアンタゴニストが、喘息に対して、どのような効果を有し得るかという点については不明である。アゴニストは保護性タンパク質分泌を有利に増大させ、毛様体βの割合を増大させ、そして平滑筋を弛緩させることができるのに対し、アンタゴニストは粘液生産及び腺性肥厚化を遅延させることができる。
【０２５９】
Ｎａｎｄａｎａｎ Ｅ， Ｊａｎｇ ＳＹ， Ｍｏｒｏ Ｓ， Ｋｉｍ ＨＯ， Ｓｉｄｄｉｑｕｉ ＭＡ， Ｒｕｓｓ Ｐ， Ｍａｒｑｕｅｚ ＶＥ，Ｂｕｓｓｏｎ Ｒ， Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ。
Ｐ， Ｈａｒｄｅｎ ＴＫ， Ｂｏｙｅｒ ＪＬ， Ｊａｃｏｂｓｏｎ ＫＡ． Ｐ２Ｙ（１）受容体リガンドのようなリボース修飾デオキシアデノシンビスホスフェートアナログの合成、生物学的活性および分子モデリング。ＪＭｅｄ Ｃｈｅｍ． ２０００ Ｍａｒ ９； ４３ （５） ： ８２９−４２。
Ｍａｊｏｒ ＤＴ， Ｈａｌｂｆｉｎｇｅｒ Ｅ， Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｂ． Ｐ２Ｙ（１）受容体２による修飾アデニンヌクレオチドの分子認識。計算（コンピューターナショナル）アプローチ． Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． １９９９ Ｄｅｃ ３０ ； ４２ （２６） ： ５３３８−４７。
Ｈａｌｂｆｉｎｇｅｒ Ｅ， Ｍａｊｏｒ ＤＴ， Ｒｉｔｚｍａｎｎ Ｍ， Ｕｂｌ Ｊ， Ｒｅｉｓｅｒ Ｇ， Ｂｏｙｅｒ ＪＬ， Ｈａｒｄｅｎ ＫＴ， Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｂ． Ｐ２Ｙ（２）受容体１による修飾アデニンヌクレオチドの分子認識。合成的、生化学的及びＮＭＲアプローチ。Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． １９９９ Ｄｅｃ ３０； ４２ （２６）： ５３２５−３７。
Ｍｏｒｏ Ｓ， Ｈｏｆｆｍａｎｎ Ｃ， Ｊａｃｏｂｓｏｎ ＫＡ． リガンド認識におけるＧタンパク共役受容体の細胞外ループの役割：ヒトＰ２Ｙ１受容体の分子モデリング研究。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． １９９９ Ｍａｒ ２３； ３８ （１２）： ３４９８−５０７。
Ｍｏｒｏ Ｓ， Ｇｕｏ Ｄ， Ｃａｍａｉｏｎｉ Ｅ， Ｂｏｙｅｒ ＪＬ， Ｈａｒｄｅｎ ＴＫ， Ｊａｃｏｂｓｏｎ ＫＡ． ヒトＰ２Ｙ１受容体：アゴニスト及びアンタゴニスト認識部位を同定する道具としての分子モデリング及び部位特異的突然変異誘発。Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ． １９９８ Ａｐｒ ２３； ４１ （９）： １４５６−６６。
Ｗｅｂｂ ＴＥ， Ｓｉｍｏｎ Ｊ， Ｂａｒｎａｒｄ ＥＡ． ヒヨコ脳内の［３５Ｓ］２’−デオキシ５’−Ｏ−（１−チオ）ＡＴＰ結合部位及びＰ２Ｙ１メッセンジャーＲＮＡの領域分布。Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ． １９９８ Ｊｕｎ； ８４ （３）： ８２５−３７。
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Ｋｉｎｇ ＢＦ， Ｔｏｗｎｓｅｎｄ−Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ Ａ， Ｂｕｒｎｓｔｏｃｋ Ｇ． ＡＴＰ及びＵＴＰについての代謝調節型受容体：天然型ヌクレオチド受容体と組換えヌクレオチド受容体との間の対応を探索する。Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ． １９９８ Ｄｅｃ ； １９ （１２）： ５０６−１４。
Ｓａｌｅｈ Ａ， Ｆｉｇａｒｅｌｌａ Ｃ， Ｋａｍｍｏｕｎｉ Ｗ， Ｍａｒｃｈａｎｄ−Ｐｉｎａｔｅｌ Ｓ， Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ Ａ， Ｔｕｂｕｌ Ａ， Ｂｒｕｎ Ｐ， Ｍｅｒｔｅｎ ＭＤ． シュードモナス ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ｑｕｏｒｕｍセンスシグナル分子 Ｎ（３−オキシドデカノイル）−Ｌ−ホモセリンラクトンは線維症気管腺細胞におけるＰ２Ｙ受容体の発現を阻害する。Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ． １９９９ Ｏｃｔ； ６７ （１０）： ５０７６−８２。
Ｃｒｅｓｓｍａｎ ＶＬ， Ｌａｚａｒｏｗｓｋｉ Ｅ， Ｈｏｍｏｌｙａ Ｌ， Ｂｏｕｃｈｅｒ ＲＣ， Ｋｏｌｌｅｒ ＢＨ， Ｇｒｕｂｂ ＢＲ． マウス上皮Ｃｌ（−）輸送のヌクレオチド調節におけるＰ２Ｙ（２）受容体遺伝子発現の喪失効果。Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９９ Ｓｅｐ １０； ２７４ （３７）： ２６４６１−８。
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号１）。
【図２】図１に記載のＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号２）。
【図３】Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号３）
【図４】Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号４）
【図５】Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡ配列（配列番号５）
【図６】スイスプロット アクセッション Ｎｏ．Ｐ４９６５０により同定されたタンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）。
【図７】ヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲ（配列番号２）とスイスプロット アクセッションＮｏ．Ｐ４９６５０により同定されたタンパク質（配列番号６）とのＢＬＡＳＴＰアライメント。この配列の膜貫通ドメインをボールド体と下線で強調する。Ｆ２２６Ａ、Ｋ２８０Ａ又はＱ３０７Ａ突然変異を有するＰ２Ｙ１受容体は、アンタゴニストである２’−デオキシ−Ｎ６−メチルアデノシン３’５’−ビスホスフェート（ＭＲＳ２１７９）と結合しない、このことは、これらの残基がアンタゴニスト分子の結合に重要であることを示している。Ｐ２Ｙ１様ＧＰＣＲはこれら３つの部位を喪失している。ヒトにおけるリガンドの結合に重要な３つの部位の内２つは、クエリー配列においてボールド体、下線した（イタリック体ではない）残基により示されるように保存されている。こられの残基それぞれにおける突然変異は、個々に結合の喪失を引き起こす。したがって、ＴＭ３及びＴＭ７のエキソフェイシャル（ｅｘｏｆａｃｉａｌ）側の残基がＡＴＰ結合ポケットの重要な決定因子である。ＡＴＰは、本受容体において、以前に同定されたＴＭ間隙内、及び細胞外ループにより同定されメタ−結合部位と称される本受容体の別の２つの領域内の双方とドッキングされ得る。第一のメタ−結合部位はＴＭ束の外側、ＥＬ２とＥＬ３の間に位置し、そして２番目に高いエネルギー部位はすぐさまＥＬ２の真下に配置される。主要なＴＭ結合部位と低エネルギーメタ−結合部位との両方における結合は、リガンド力価に影響を及ぼす可能性がある。メタ−結合部位Ｉでは、側鎖Ｇｌｕ（ＥＬ２）（ボールド体、イタリック体、下線で表しＴＭドメイン４及び５の間にある）はリボースＯ３’の水素結合距離（２．８Ａ）内にあり、Ａｒｇ（ＥＬ３）（ボールド体、イタリック体、下線で表しＴＭドメイン６及び７の間にある）はトリホスフェート鎖のα−及びβ−ホスフェートと協調している。
【図８】種々のヒト組織及び好中球様細胞系ＨＬ６０におけるヒトＰ２Ｙ１様Ｇタンパク共役受容体の相対発現。
【図９】呼吸細胞及び組織におけるヒトＰ２Ｙ１様Ｇタンパク共役受容体の相対発現。
【図１０】種々のヒト組織におけるヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの相対発現。
【図１１】非喫煙者及び喫煙者のヒト血小板における、冠動脈における、脳及び小腸におけるヒトＰ２Ｙ１様ＧＰＣＲの相対発現。
【図１】
2004506426.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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