(57)【要約】本発明は、固形腫瘍および他の脈管形成に関連する疾患と、関連する増殖している脈管形成内皮細胞で細胞死を特異的に誘発することができる薬学的組成物に関する。さらに詳しくは、本発明は、脈管形成内皮細胞で選択的に活性であり、そして、そのような細胞での発現のための非常に有毒な薬剤（例えば、ジフテリア毒素）をコードするヌクレオチド構築物に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
脈管形成内皮細胞で選択的にその配列を発現するのに有効である、調節要素と非常に有毒なタンパク質とをコードする配列とを含む単離された核酸分子。
【請求項２】
前記タンパク質が、ジフテリア毒素、シュードモナス・エキソトキシン、コレラ毒素、志賀毒素様毒素Ｉ、リシンＡ、トリコアンギン、α−トリコサンチン、アブリンＡ、モデッシン、グラヌリシンとそれに関連した毒素、非常に有毒な突然変異体、および前記のもののフラグメントからなる群より選択されることを特徴とする請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記タンパク質が、ジフテリア毒素またはジフテリア毒素突然変異体およびそのフラグメントであることを特徴とする請求項２に記載の単離された核酸。
【請求項４】
さらに脈管形成内皮細胞で選択的に活性であるプロモーターを含むことを特徴とする請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項５】
前記プロモーターが、Ｅ−セレクチン・プロモーター、ｅｔｓ−１プロモーター、エンドシアリンプロモーター、ｆｌｔ−１プロモーター、ｆｌｋ−１プロモーターおよびＫＤＲプロモーターからなる群より選択されることを特徴とする請求項４に記載の単離された核酸。
【請求項６】
さらに内皮細胞において活性であるエンハンサーを一つまたは複数のコピーで含むことを特徴とする請求項４に記載の単離された核酸。
【請求項７】
さらに脈管形成内皮細胞で選択的に活性であるエンハンサーを一つまたは複数のコピーで含むことを特徴とする請求項６に記載の単離された核酸。
【請求項８】
エンハンサーが、ＨＢ−ＥＧＦエンハンサー、マウスｔｉｅ２遺伝子の第１のイントロンからのエンハンサー、ＶＥＧＦ受容体（ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）遺伝子の第１のイントロンからのエンハンサー、ｅｔｓ−１遺伝子の第１のイントロンからのエンハンサー、および低酸素状態下で選択的に活性である、低酸素性レスポンス・エンハンサー要素からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された核酸。
【請求項９】
前記低酸素性レスポンス・エンハンサー要素がエリスロボイエチンＨＲＥ要素、ピルビン酸キナーゼＨＲＥ要素、エノラーゼＨＲＥ要素、エンドセリン−１ ＨＲＥ要素およびＶＥＧＦ低酸素調節エンハンサーからなる群より選択されることを特徴とする請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
さらにＥＴＳ結合部位に対応するヌクレオチド配列を１つまたは複数のコピーで含むことを特徴とする請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１１】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離された核酸を含むデリバリー・ビヒクル。
【請求項１２】
レトロウイルスの粒子、パルボウイルスの粒子、リポソーム、カチオン性リポソーム、選択的に内皮細胞および脈管形成内皮細胞にそれぞれそのリポゾームをターゲットする薬剤を取りつけられたリポソームまたはカチオン性リポソーム、およびポリヌクレオチド脂質複合体からなる群より選択される成分をさらに含むことを特徴とする請求項１１に記載のデリバリー・ビヒクル。
【請求項１３】
請求項１〜７のいずれか１項または請求項１０に記載の単離された核酸を含む薬学的組成物。
【請求項１４】
レトロウイルス粒子、パルボウイルス粒子、リポソーム、カチオン性リポソーム、選択的に内皮細胞および脈管形成内皮細胞にそれぞれのリポゾームをターゲットする薬剤を取りつけられたリポソームまたはカチオン性リポソーム、およびポリヌクレオチド脂質複合体からなる群より選択される成分をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
組成物が脈管形成に関連する疾患を治療するために使用されることを示す、そう書かれたラベルまたはパッケージ挿入物と組み合わせられている請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
患者の脈管形成に関連する疾患を治療する方法であって、請求項１３に記載の薬学的組成物を治療的に有効な量で該患者に投与することを特徴とする前記方法。
【請求項１７】
薬学的組成物がレトロウイルスの粒子、パルボウイルスの粒子、リポソーム、カチオン性リポソームおよびポリヌクレオチド脂質複合体からなる群より選択される成分をさらに含むことを特徴とする、請求項１６に記載の患者の脈管形成に関連する疾患を治療する方法。
【請求項１８】
脈管形成に関連する疾患が、リウマチ性関節炎、アテローム性動脈硬化症、真性糖尿病、網膜症、乾癬および後水晶体線維増殖症からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
脈管形成に関連する疾患が癌であり、薬学的組成物の投与が結果として、腫瘍退縮の１つまたは複数の基準によって示される、腫瘍退縮をもたらすことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
患者の病理的な血管増殖を治療する方法であって、請求項１３に記載の薬学的組成物を治療的に有効な量で患者に投与することを特徴とする前記方法。
【請求項２１】
前記病理的な血管増殖がリウマチ性関節炎、アテローム性動脈硬化症、真性糖尿病、網膜症、乾癬および後水晶体線維増殖症からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
薬学的組成物が放射線療法、化学療法、抗脈管形成剤または免疫調節剤と組み合わせて投与されることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
化学療法剤、免疫調節剤、脈管形成阻害剤およびそれらの混合物からなる群より選択される少なくとも１つの追加の治療剤をさらに含む請求項１３または１４に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、単離された核酸配列、関連する発現ベクターとデリバリー・ビヒクルに関し、そして 腫瘍と転移または他の血管新成（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ）疾患（例えば、糖尿病性網膜症および類似した眼病、乾癬やリウマチ性関節炎）と関連する、増殖する脈管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）内皮細胞において細胞死を特異的に誘発することできる 核酸とベクターの標的デリバリーに関する。さらに詳しくは、本発明は、脈管形成内皮細胞で選択的に活性であり、非常に有毒な薬剤（例えばジフテリア毒素）をコードし、そのような細胞でこれらの薬剤を発現するヌクレオチド構築物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌の治療は、一般に外科手術、放射線療法、および／または化学療法の組合わせを必要とする。広く使用されてはいるが、これらの治療方法は、完全に効果的であることからほど遠い。外科手術は、疑わしい腫瘍を検出し、除去する外科医の能力によって制限され、それは特に進行した転移性癌にとっては難しい。放射線および化学療法は、軽度から重度の副作用を誘発して、実際に更なる腫瘍増殖のリスクを増やすかもしれない。従来の癌治療法の問題について更なる議論は、ＭｃＤｏｎａｌｄらの米国特許第５，８３７，２８３号（１９９８年）に見出だされる。
【０００３】
分子生物学の出現により、癌の治療に関して数多くの新しい手法が提案されてきた。例えば、多くの腫瘍は正常組織で発現される遺伝子やタンパク質と比較して、特定セットの遺伝子やタンパク質を発現することが知られている。これから、抗体（免疫療法）、または遺伝子発現ビヒクル（遺伝子療法）を用いて癌を治療するという提案に至った。
【０００４】
免疫療法では、腫瘍によってユニークに、または優先的に提示される抗原に対して特異的である抗体をしばしば用いて、治療的、若しくは細胞毒性物質を直接腫瘍細胞に指向させる。理論的には有望であるが、免疫療法は固形腫瘍を治療するのに効果的であると証明されなかった。この失敗に対して疑われた理由の中で、抗体が固形腫瘍中に深く貫通することができないことがある（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９５ Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １（１２）： １６２３−１６３４）。また、治療的抗体は、抗イディオタイプ免疫応答によって破壊され得る。また、治療的抗体は、特定の癌若しくは特定癌の抗原性の亜細胞にしばしば限定される。
【０００５】
また、免疫療法は、患者に健康リスクをもたらす可能性もある。特に、リシン抱合体（コンジュゲート）を用いる免疫療法は、血管若しくは毛細管の漏れ症候群を引き起こすことが示された（Ｄｅ Ｖｉｔａら、Ｃａｎｃｅｒ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， （５版１９９７年） １巻， ｐｐ． ３０４５−３０５５）。血管の漏れ症候群は、減少した血清アルブミン・レベル、増加した間質液レベルによって特徴づけられ、肺水腫を引き起こすかもしれない。また、例えば血管の内皮成長因子（ＶＥＧＦ）の受容体を含む表面抗原は、増殖していない内皮細胞の上では少なくとも比較的低濃度で存在する。このように、脈管形成内皮細胞に対する抗体は、健康な組織を囲む脈管形成しない内皮細胞をも殺すかもしれない。
【０００６】
一般に、遺伝子療法手順は、特定の標的細胞（例えば、腫瘍細胞または腫瘍に関係する脈管形成内皮細胞）に、治療的若しくは細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子発現ベクターをデリバリーすることを含む。例えば、Ｈｕｂｅｒら１９９１ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ， Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８（１８）： ８０３９−４３には、「腫瘍性」ＨｅｐＧ２細胞中で組織特異的に、少なくとも細胞培養物中では、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子の発現を指図できるＤＮＡベクターが記載されている。ｔｋ遺伝子の発現は、これらの細胞をプロドラッグａｒａＭ処理に感受しやすくする。ＡｒａＭは細胞に有害でないが、チミジンキナーゼとともに細胞タンパク質によって細胞毒性化合物であるａｒａＡＴＰに変換される。
【０００７】
そのような遺伝子療法手順のもう一つの例は、細胞培養物中でのＢ−リンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｉｄ）細胞において免疫グロブリン遺伝子からのプロモーターとエンハンサーの制御下、ＤＴ−Ａ鎖コード配列の発現である。そのプラスミドは、Ｂ−リンパ腫細胞中より、プレＢ−細胞系中で、ＤＴ−Ａを発現するのに活性が低く、このように正常Ｂ細胞原体を残すことを許容する。しかしながら、ＤＴ−Ａ発現のレベルは、予想外に低かった（Ｍａｘｗｅｌｌら、１９９１ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５１：４２０９９−４３０４）。
【０００８】
免疫療法と同様に、遺伝子療法は遺伝子発現ベクターを全腫瘍にデリバリーする能力によって制限される。さらに、ベクター取り込みが単に腫瘍細胞だけに限ることができないというだけ、標的癌細胞でのみタンパク質が発現されるように治療的若しくは細胞毒性タンパク質の発現が厳しく調節されなければならない。遺伝子発現のこの厳しい調節は、どんな特定の遺伝子発現ベクターで一般的に用いることを排除するという逆効果を有する。
【０００９】
１．  脈管形成内皮細胞のトランスフェクションに基づく治療法
直接腫瘍をターゲットするという癌治療法の困難さから、脈管形成を抑制する、すなわち増殖する腫瘍を助ける血管形成を抑制することによって腫瘍を治療するという提案に至った（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９５ Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １（１２）： １６２３−１６３４）。脈管形成の阻害は、免疫療法に勝るいくつかの利点を有し、遺伝子療法によって腫瘍細胞を形質転換させようとする。固形腫瘍塊と違って、生育する毛細管の内皮細胞は、様々な治療薬に比較的容易にアクセスできる。さらに、脈管形成は本質的に全ての固形腫瘍に共通する要件であるので、脈管形成を抑制する方法は、広くどんな系統の固形腫瘍にも少なくとも理論的には適用できる可能性がある。
【００１０】
例えば、ＭｃＤｏｎａｌｄらの米国特許第５，８３７，２８３号には、カチオン性リポソームを含む、脂質／ＤＮＡ複合体による脈管形成内皮細胞の選択的なターゲッティングを行い、標的細胞の増殖を抑制するか、または促進させてその細胞に影響を及ぼす物質をデリバリーすることが記載されている。そのような物質の一例として、この特許は、脈管形成内皮細胞を殺すタンパク質をコードするヌクレオチド配列の使用を記載している（第１２欄、５５−５６行）。好適な配列は、脈管形成内皮細胞の周囲の環境内でのみ選択的に活性化されるプロモーターに連結される。ＭｃＤｏｎａｌｄらによって提案された特定の構築物には、単純ヘルパスチミジンキナーゼ遺伝子）のコード配列が含まれる（続くガンシクロビル（ｇａｎｃｙｃｌｏｖｉｒ）の投与を含む患者治療による）。細胞の生存のために必要なタンパク質の発現をブロックする、アンチセンス分子は、より一般的に提案されている。
【００１１】
Ｍｕｅｌｌｅｒらの米国特許第５，８８５，８３３号（１９９９年）では、活性化因子配列、プロモーター・モジュールおよび構造遺伝子を含む、核酸構築物を遺伝子療法目的に使用することが議論されている。特定の構築物がＣＨＲ領域とＥ２Ｆファミリーのタンパク質に結合するヌクレオチド配列をさらに含む、プロモーター・モジュールを含むと記載された。この特許には、それが直接または間接的に内皮細胞の増殖を抑制するか、または増殖している内皮細胞を殺すタンパク質を発現するように内皮細胞をターゲッティングし、そして形質転換させることが記載されている（例えば、第８欄、５−９行）。そのような「抗炎症性」または「増殖阻害剤」タンパク質をコードするＤＮＡの使用が、例えば第９欄４５行〜第１０欄５０行に提案されている。これらには、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ／ｐ１１０またはその類似体ｐ１０７やｐ１３０）、ｐ５３タンパク質、ｐ２１（ＷＡＦ−１）タンパク質、ｐ１６タンパク質、他のｃｄｋ阻害剤、ＧＡＤＤ４５タンパク質およびｂａｋタンパク質が含まれる。米国特許第５，８８５，８３３号、第１０欄１〜１９行を参照。
【００１２】
注目されるのは、Ｍｕｅｌｌｅｒらのタンパク質が、毒素よりもむしろ増殖に否定的に影響を及ぼす細胞周期調節剤であることである。さらに、列挙されたタンパク質は、複雑な調節系の一部分であって、直接アポトーシス（すなわち細胞死）を引き起こさない。例えば、ｐ５３は、転写を調節することができるＤＮＡ結合タンパク質である。ｐ５３のより高いレベルは、細胞周期を通して進行の静止を引き起こすが、細胞死は引き起こさない（Ｐｒｉｖｅｓら、１９９３ Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５：２１４−８）。同様に、Ｐ１６と他のｃｄｋ阻害剤は、基質をリン酸化し、細胞周期を通して、規則正しい進行を促進するサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫｓ）に影響を及ぼす。注目されるのは、これらのタンパク質がヒト細胞で遍在しており、したがって、それら自身有毒でないことである。実際、Ｈａａｓ−Ｋｏｇａｎら、１９９５ ＥＭＢＯ Ｊ １４：４６１−４７２には、網膜芽細胞腫遺伝子産物によってヒト骨肉腫細胞系でアポトーシスが阻害されることが記載されている。
【００１３】
同様に、Ｓｅｄｌａｃｅｋらの米国特許第５，８３０，８８０号（１９９８年）には、抗腫瘍物質をコードするＤＮＡ配列の上流側に細胞周期依存性のプロモーターと内皮特異的な活性化配列を含む遺伝子発現ベクターを用いる、腫瘍の遺伝子療法が記載されている。この特許は、腫瘍細胞を殺す細胞毒性薬剤の使用を提案するが、第６欄４３〜４５行において内皮細胞の増殖の阻害にも言及している。この特許に記載された抗腫瘍性物質には、腫瘍に向けられる細胞毒性または細胞増殖抑制性の物質（例えば、インターフェロン）、脈管形成阻害剤（例えば、アンジオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ））、および抗増殖性タンパク質（例えば、ｐ５３または網膜芽細胞腫タンパク質）が含まれる。そのような抗増殖性物質をコードするＤＮＡの特定の例は、第６欄４８〜６４行に提供されているが、さらに網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ／ｐ１１０またはその類似体ｐ１０７やｐ１３０）、ｐ５３タンパク質、ｐ２１（ＷＡＦ−１）タンパク質、ｐ１６タンパク質、他のｃｄｋ阻害剤、ＧＡＤＤ４５タンパク質およびｂａｋタンパク質もまた含まれる。そのような構築物は、内皮細胞を抑制するかもしれないが、それら自身は有毒（または非常に有毒）ではない。
【００１４】
Ｗｉｌｌｉａｍｓらの米国特許第５，９１６，７６３号（１９９９年）には、ＶＥＧＦ受容体・プロモータ領域、そして特にＦｌｔ−１プロモーターを含む核酸分子および関連するベクターが開示されている。その特許は、従来のドラッグデリバリー技術は生物活性種の組織特異的デリバリーにそぐわないので、内皮細胞での異種遺伝子またはＤＮＡの組織特異的発現が望ましいだろうと注記している。したがって、Ｗｉｌｌｉａｍｓらの明細書には、内皮での特異的な内因性産生を経る、内皮細胞（血管内皮細胞を含む）へ生物活性種を直接的にデリバリーする方法が記載されている。血管内皮に影響を及ぼすか、またはそれに関連する様々な疾患を治療するのに有用であると言われているベクターも記載されている。しかしながら、その特許には、非常に有毒なタンパク質の発現を指示する実際の構築物の開示が欠如している。また、いかにしてそのような構築物が調製されるか、或いは脈管形成細胞または細胞系に対するその実際の効果を示唆する開示または証明も欠如している。
【００１５】
２  内皮または他の細胞をターゲットとした毒素の限定的な治療用途
Ｈａｗｒｏｔらの米国特許第４，９４８，５９０号（１９９０年）に記載されているように、様々なタンパク質毒素がカプセル化でき、例えば、腫瘍に関連する毛細管内皮細胞へ標的化デリバリーされ得ることが、提案されてきた。この特許は、一般に例えば、リシンＡまたはジフテリア毒素を含む、アビジン若しくはストレプトアビジンとコンジュゲートされたリポソームに関する。内皮細胞に向けられる毒素の他の例は、Ｔｈｏｒｐｅらの米国特許第５，９６５，１３２号（１９９９年）を含み、それは固形腫瘍の脈管構造に向けての抗体コンジュゲートの使用を議論している。特に、Ｔｈｏｒｐｅらでは、脈管化した腫瘍内の血管の表面に存在する成長因子と成長因子受容体の複合体に結合するが、その個々の成長因子または成長因子受容体には結合しない、抗体コンジュゲードが記載されている。Ｔｈｏｒｐｅらには、関連する抗体が様々な細胞毒素（例えば、脱グリコシル化されたリシンＡ若しくはジフテリア毒素）または診断薬に連結されている抗体コンジュゲートも記載されている。同様に、ジフテリア毒素は、内皮細胞上でＶＥＧＦに対するＦＬＫ−１受容体をターゲットとする免疫毒性な構築物の成分としての細胞毒性薬剤に使用することが提案されてきた。例えば、Ｕｌｌｒｉｃｈらの米国特許第５，８５１，９９９号（１９９８年）を参照。
【００１６】
Ｗｉｌｌｉａｍｓらの特許は、ＶＥＧＦ調節配列を使用して、内皮細胞を殺すターゲットにすることができることを示唆している。その特許に、病的な細胞に毒素薬剤をデリバリーするために腫瘍細胞または感染細胞に特異的な抗体を使ってなされてきたように、腫瘍細胞または感染細胞を殺すターゲットとすることができることを示している。しかしながら、Ｗｉｌｌｉａｍｓらの特許には、そのような毒剤の使用についての詳細は提供されていないし、開示された調節配列を使用して、細菌、植物または動物起源の毒性ペプチドの発現を内皮細胞へ、好ましくは血管内皮へターゲットとすることができることを本質的に言及するのみである。数多くの細菌起源の毒性タンパク質（例えば、シュードモナス・エキソトキシンＡまたはジフテリア毒素）および動物由来の毒性タンパク質（例えば、腫瘍壊死因子α）のいかなるものもこの目的に適切であると言われている。その特許には、このようような毒性タンパク質もまた、抗ウイルス剤若しくは抗腫瘍剤として作用するかもしれないと指摘されている。
【００１７】
一般に、特定の構築物が開発され、試験されたようにみえる場合、ヌクレオチド構築物を使用し、標的細胞をトランスフェクトしてリシンやジフテリア毒素のような毒素を発現することは、医学文献で支持されていないようにみえる。Ｃｈｉｏｃｃａらの米国特許５，６８８，７７３（１９９７年）では、局所的に、例えば神経系で一旦放出されると、毒素が血管や骨髄を含む様々なターゲットとされない組織で、毒性を引き起こすことがありえ、そして形質転換細胞が選択的に制御し得なかったと説明されている。毒性のこの危険は、そのような毒素が全身的に循環系に放出されることになっているならば悪化するかもしれない。
【００１８】
このように、脈管形成内皮細胞の遺伝子療法に関して上記に説明したＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｍｕｅｌｌｅｒら、およびＳｅｄｌａｃｅｋらの特許には、一般的に細胞増殖を抑制するか、または局部の炎症によって媒介される免疫応答を強化する、多種多様な薬剤の使用が示唆されていることは注目すべきであるかもしれない。しかしながら、これらの特許は、ジフテリア毒素のような毒性タンパク質をコードする構築物の使用を教示していない。本発明のときまで、例えば、ジフテリア毒素が脈管形成内皮細胞で安全、且つ選択的に発現できて、治療的に抗腫瘍活性を示すことは知られていなかった。
【００１９】
Ｍｕｒａｙａｍａらによれば、非内皮細胞系において、ヒトαフェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーターとエンハンサーに連結されたジフテリア毒素Ａ（ＤＴ−Ａ）フラグメントを含むプラスミドを構築することによって、ＤＴ−Ａ鎖「自殺」遺伝子を選択的に腫瘍細胞に投与するための細胞特異的発現系の開発が記載されており、それが選択的にＡＦＰ産生細胞に対して細胞破壊効果を発揮することができるかどうか試験した（Ｊ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ １９９９ Ｍａｒ； ７０（３）： １４５−９）。彼らの結果から、 ＡＦＰ産生細胞を選択的に殺すことが、ＡＦＰのプロモーターとエンハンサー領域に連結されたＤＴ−Ａ遺伝子を導入することによって達成されることが示された。
【００２０】
同様に、Ｔａｎａらによって、ウシの白血病細胞の腫瘍関連抗原に対するモノクローナル抗体でコンジュゲートされた、ジフテリア毒素Ａ鎖を含むカチオン性リポソームの抗腫瘍効果がＪｐｎ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９８ Ｎｏｖ； ８９（１１）： １２０２−１１に報告された。これらの研究者は、ｐＵＣ−１８のマルチクローニング部位に、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）の末端反復配列（ＬＴＲ）制御下、ジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴ−Ａ）の遺伝子を含むプラスミドｐＬＴＲ−ＤＴを保持するカチオン性リポソームにコンジュゲートされた形状でのウシ白血病細胞の上発現される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対するモノクローナル抗体を投与した。ｃ１４３とカップリングされた、ｐＬＴＲ−ＤＴを含んでいるカチオン性リポソームを、腫瘍を有しているヌードマウスに注射すると、腫瘍増殖の有意な阻害が結果として得られた。
３．  脈管形成内皮細胞での転写の調節
増殖している内皮細胞で特異的に、または優先的に活性である、幾つかの転写調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーおよび転写因子結合部位）が、特徴づけられてきた。様々な転写調節配列、特に内皮細胞または脈管形成内皮細胞で活性化されるプロモーターが、上で議論したＭｃＤｏｎａｌｄら、Ｍｕｅｌｌｅｒら、およびＳｅｄｌａｃｅｋらの特許に記載されている。これらの特許（さらに、本明細書で特定される他の全ての文書）の開示は、それらの全体が引用文献として特定的に組み入れられる。
【００２１】
そのような転写調節配列の例としては、エンドグリン（ｅｎｄｏｇｌｉｎ）、ＶＥＧＦ受容体（ｆｌｔ−１とｆｌｋ−１）、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、ｔｉｅ， ｔｉｅ２， ｅｔｓ−１、エンドセリン（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ）、エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）、Ｅセレクチン、ＶＥカドヘリン（ｃａｄｈｅｒｉｎ）の遺伝子に由来する配列が挙げられる。例えば、上記のＳｅｄｌａｃｅｋらの特許を参照。転写調節配列は、個々の要素またはより大きい配列（例えば、プロモーター）をも含む。これらの内皮細胞特異的要素は、転写因子ＥＴＳ−１およびＧＡＴＡ−２の結合部位を含み、これらはコンセンサス結合部位、５’−ＧＧＡ（Ａ／Ｔ）−３および、５’−ＴＴＡＴＣＴ−３をそれぞれ有する。そのような制御配列の使用は、脈管形成内皮に特異的にまたは優先的に所望の遺伝子生成物の発現を強制することができる。
【００２２】
最近、いくつかの非常に特異的なエンハンサーが確認された。これらは、細胞の特定のタイプでのみ見出だされ、シス結合されたＤＮＡ配列の転写活性を調節する、特定のタンパク質（例えば、転写因子）に結合するＤＮＡ配列である。これらのエンハンサー結合タンパク質は、特定の遺伝子の発現を調節する、転写の活性化因子であり、したがって、これらの細胞のみで発現されるか、または、特定の条件下でのみ転写的に活性となる。Ｓｃｈｌａｅｇｅｒら、１９９７ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９４： ３０５８−３０６３に記載されているように、例えば、そのような自律的な内皮細胞特異的エンハンサーは、マウスｔｉｅ２遺伝子の第１のイントロンで見出だされる。ＶＥＧＦレセプター２（ＦＬＫ−１）の第１イントロンからの対応するエンハンサーは、Ｋａｐｐｅｌら、１９９９ Ｂｌｏｏｄ ９３：４２８４−９２に記載されており、そして，
そして、ｅｔｓ−１遺伝子の第１イントロンからのものは、Ｊｏｒｃｙｋら、１９９７ Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４３：２１１−２２５に記載されている。別の血管内皮細胞に特異的エンハンサー（ＨＢ−ＥＧＦエンハンサー）は、Ｌｅｅらの米国特許第５，６５６，４５４号（１９９７年）にアテローム性動脈硬化を治療する目的で記載されている。
【００２３】
他の調節要素は、低酸素状態に反応し、そして低酸素症は、冠状動脈疾患、腫瘍脈管形成および糖尿病性血管新成に関して見られるので、新しい血管形成のための非常に重要な刺激であることが示されてきた。低酸素条件は、腫瘍にデリバリーされた薬によっても誘発されるかもしれない。Ｗｅｂｓｔｅｒらの米国特許５，８３４，３０６号（１９９８年）は、エリスロポイエチンＨＲＥ、ピルビン酸キナーゼＨＲＥ、エノラーゼ３のＨＲＥおよびエンドセリン−１のＨＲＥ要素の群からの特定の低酸素症応答・エンハンサー要素に関する。選ばれた遺伝子の発現は、低酸素状態下、標的組織で増大することが示された。Ｌｉｕら、１９９５ Ｃｉｒｃ． Ｒｅｓ． ７７： ６３８−６４３には、異種のプロモーターの上流側または下流側に配置されると、低酸素症特異的エンハンサーの作用をするＨＩＦ（低酸素症誘発因子１）コンセンサス配列の５’要素が記載されている。エンハンサーの２つまたはそれ以上のコピーは、異種のタンパク質の発現をより高いレベルに増加させるためにタンデム（連結型）に配置されるかもしれない。
４．  脈管形成内皮細胞をターゲットとするヌクレオチド構築物のデリバリー
脈管形成内皮細胞での選択的遺伝子発現は、デリバリー方法によっても容易にされるかもしれない。例えば、特定のカチオン性リポソームまたはポリヌクレオチド／脂質複合体は、脈管形成性（増殖している）内皮細胞によって、優先的に取り込まれる。例えば、上記で議論したＭｃＤｏｎａｌｄらの特許およびそこに記載された様々な構築物を参照。リポソーム以外の核酸デリバリー系または薬剤もまた、当該技術分野で公知であり、本明細書で説明される本発明において役に立つと考えられる。例えば、Ｗｕらの米国特許第５，１６６，３２０号（１９９２年）、第５，６３５，３８３号（１９９７年）、および第５，８７４，２９７号（１９９９年）；Ｈａｒｔｍｕｔの米国特許第５，３５４，８４４号（１９９４年）、および第５，７９２，６４５号（１９９８年）；そして、Ｇｏｐａｌの米国特許第５，６７０，３４７（１９９７年）を参照。
【００２４】
レトロウイルスのベクターもまた、レトロウイルス組み込みのための細胞分裂条件のために興味深く、それは非増殖細胞に比べて増殖している細胞（例えば、脈管形成上皮細胞）による、取り込みを好ましくするだろう。しかしながら、本発明に係るデリバリーの特定の方法は、脈管形成内皮細胞で優先的に転写される構築物が利用されるときは、比較的関心が少ない。
【００２５】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、上記のように固形腫瘍に関連する増殖している脈管形成内皮細胞で、特異的に、且つ効果的に細胞死を誘発することができるる発現ベクターおよび発現ベクター・デリバリーの方法に対する必要性が医療分野において存在する。
【００２６】
【課題を解決するための手段】
本発明の目的は、脈管形成内皮細胞で選択的に活性であり、そしてそのような細胞での発現のために非常に有毒な薬剤をコードする、ヌクレオチド構築物を提供することである、。企図される薬剤としては、例えば、ジフテリア毒素、シュードモナス・エキソトキシン、コレラ毒素、志賀様毒素Ｉ、リシンＡ、トリコアングイン（ｔｒｉｃｈｏａｎｇｕｉｎ）、α−トリコサンチン（ｔｒｉｃｈｏｓａｎｔｈｉｎ）、アブリン（ａｂｒｉｎ）Ａ、モデッシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）、グラヌリシン（Ｇｒａｎｕｌｙｓｉｎ）とそれに関連した毒素のような特定の細菌性および他の毒素、並びに前記のものの非常に有毒な突然変異体とフラグメントが含まれる。特に好適なものは、ジフテリア毒素およびジフテリア毒素突然変異体とフラグメントである。本発明の更なる目的は、このような薬剤を制御して活性化するためのヌクレオチド構築物を提供することであり、全身の細胞死を結果としてもたらさない構築物とデリバリー方法論を提供することである。
【００２７】
好ましい実施の形態において、本発明は内皮細胞特異的プロモーターを含む発現ベクターに関し、それは増殖している内皮細胞で誘導性があり、好ましくはＥセレクチンおよびｅｔｓ−１プロモーター、ジフテリア毒素のＤＴ−Ａ鎖とそのような毒素の突然変異体（例えば、ｔｏｘ１７６）のような細菌性毒素をコードする、ＤＮＡ−配列である。本発明で企図される他のプロモーターには、エンドシアリン・プロモーター、ｆｌｔ−１プロモーター、ｆｌｔ−１プロモーターおよびＫＤＲプロモーターが含まれるが、これらには限定されない。本発明には、内皮細胞および脈管形成内皮細胞で活性であるエンハンサーを一つまたは複数のコピーで、さらに含む発現ベクターもまた含まれる。本発明で企図されるエンハンサーには、ＨＢ−ＥＧＦエンハンサー、マウスｔｉｅ２遺伝子の第１イントロンからのエンハンサー、ＶＥＧＦ受容体（ｆｌｋ−１／ＫＤＲ）をコードしている遺伝子の第１イントロンからのエンハンサー、ｅｔｓ−１遺伝子の第１イントロンからのエンハンサー、低酸素状態の下で選択的に活性である、低酸素状態レスポンス・エンハンサー要素が含まれるが、これらには限定されない。好ましい低酸素状態レスポンス・エンハンサー要素には、エリスロポエチンＨＲＥ要素、ピルビン酸キナーゼＨＲＥ要素、エノラーゼＨＲＥ要素、エンドセリン−１ＨＲＥ要素およびＶＥＧＦの低酸素状態に調節されたエンハンサーが含まれるが、これらには限定されない。
【００２８】
そのようなヌクレオチド構築物を、ヒトを含む動物へ移送するために、当該技術で利用可能ないかなる手段をも利用できることが考えられる。そのような手段には、次ぎのものが含まれる。すなわち、ウイルス性ベクター（特にレトロウイルスベクターやパルボウイルス・ベクター）、並びにリポソーム、好ましくはカチオン性リポソーム、そのリポゾームを選択的に内皮細胞や脈管形成内皮細胞へてターゲットする、抗体や他のタンパク質のような薬剤に取りつけられたリポソームとカチオン性リポソーム、さらにポリヌクレオチド脂質複合体である。
【００２９】
本発明はまた、脈管形成内皮細胞で選択的にその配列を発現するのに有効な調節要素と、非常に有毒なタンパク質をコードする配列とを含む単離された核酸分子およびデリバリー・ビヒクルを含む薬学的組成物に関する。デリバリー・ビヒクルの例としては、レトロウイルス粒子、パルボウイルス粒子、リポソーム、カチオン性リポソーム、内皮細胞および脈管形成内皮細胞にそれぞれリポソームを選択的にターゲットする薬剤を取りつけられたリポソームまたはカチオン性リポソーム、そしてポリヌクレオチド脂質複合体が挙げられるが、これらには限定されない。
本発明はまた、脈管形成に関連する疾患およびリウマチ性関節炎、アテローム性動脈硬化症、真性糖尿病、網膜症、乾癬や後水晶体線維増殖症のような、病理的な血管増殖を伴う疾患を治療するための薬学的組成物使用に関する。
【００３０】
本発明が他の抗腫瘍治療薬または治療法、或いは抗脈管形成治療薬または治療法とともに使われるかもしれないこともまた考慮される。抗腫瘍療法には、公知の化学療法剤（例えば、シスプラチン）および放射線療法が含まれる。抗脈管形成療法には、化合物（例えば、アンジオスタチン）、サリドマイド、抗ＶＥＧＦ抗体の投与が含まれる。
【００３１】
【発明の実施の形態】
特定のデリバリー・ビヒクルに提供されるヌクレオチド構築物を含む薬学的組成物が、固形腫瘍および他の脈管形成に関連ある疾患に関連する、増殖している脈管形成内皮細胞で、細胞死を特異的に誘発することが可能であるという発見に 本発明は基づく。さらに、詳しくは、非常に有毒な薬剤をコードする特定のヌクレオチド構築物が、脈管形成内皮細胞で選択的に活性であるという発見に本発明は、基づく。
【００３２】
１．  定義
別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的、科学的な術語は、本発明が属する技術分野の通常の技術を有する者によって普通に理解されるのと同じ意味をもつものとされる。
【００３３】
「脈管形成」とは、新しい血管の形成を指す。内皮細胞は、傷の修復の間、腫瘍形成中、または特定の他の病的状態下、そうすることを誘導されるとき、インビボで新しい毛細管を形成する。
【００３４】
「脈管形成に関連する疾患」という術語は、脈管形成が異常に持続的であるか、または病的に誘発されている、ヒトにおける特定の病理的プロセスを指す。そのような脈管形成に関連する疾患としては、糖尿病性網膜症、慢性の炎症性疾患、リウマチ性関節炎、皮膚炎、乾癬、胃潰瘍およびヒト固形腫瘍の大部分のタイプが挙げられる。
【００３５】
「脈管形成内皮細胞」とは、一般の内皮細胞についての正常増殖速度より実質的により大きい速度で増殖する、脈管形成を経験している内皮細胞を指す。
【００３６】
「組合わせ」または「共投与」とは、同期であるか、経時的であるか、重なり合うか、交替しているか、または平行である投与スケジュールを指すか、或いは他の治療スケジュールであり、様々な薬剤または療法が単一の治療計画、処方または指示用法の一部として投与されるいかなるもの、或いは投与される様々な薬剤または療法の期間がさもなければ、部分的にまたは完全に一致するいかなるものをも指す。
【００３７】
「デリバリー・ビヒクル」とは、本発明に係る核酸構築物を含むか、またはそれと関連する、ベクター若しくは他の薬学的に許容される成分を指す。そのようなデリバリー・ビヒクルとしては、当該技術で公知のものが挙げられ、レトロウイルス粒子、パルボウイルス粒子、カチオン性リポソームを含むリポソーム、およびポリヌクレオチド脂質複合体を含む。
【００３８】
「内皮細胞」とは、内皮を作っている細胞を指し、そして内皮は循環系の血管の内部表面を裏打ちする細胞の単一層である。これらの細胞は、細胞分裂能力を保持するが、それらは正常な条件下（すなわち、非脈管形成状態）、非常にゆっくり増殖し、だいたい年に一度細胞分裂を経るだけである。
【００３９】
「エンハンサー」とは、シス結合され配列の転写活性を調節するＤＮＡ−配列を指す。エンハンサーは、ＤＮＡ配列のコード領域の上流、または下流に位置するか、その領域内に包埋されてもよい。エンハンサーの一つまたは複数のコピーを使用して、組織特異的な発現の増加を含む、異種タンパク質の発現を増加させる。
【００４０】
「異種の」とは、ヌクレオチド配列（例えば、プロモーター）を指すか、或いはそれが存在するＤＮＡ配列の一部として、自然には起こらない、タンパク質コード配列を指す。
【００４１】
「非常に有毒な」または「非常に有毒な薬剤」とは、標的細胞で発現されて、タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡの合成を抑制するか、或いは脂質界面を不安定にするか、さもなければアポトーシスまたは壊死による細胞死を結果としてもたらすタンパク質またはペプチドを指す。
【００４２】
「ヌクレオチド構築物」とは、インビトロで分子的な操作の対象になったＤＮＡまたは他の核酸分子を指す。
【００４３】
「プロモーター」とは、遺伝子の転写開始点の方向に関して、上流側に位置し一つまたは複数の遺伝子の転写を制御するように機能するＤＮＡ配列を指す。それはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始点、およびある場合には、他のＤＮＡ配列を含むが、それは転写因子結合部位、リプレッサーや活性化因子結合部位、カルシウム、血清若しくはｃＡＭＰ応答要素、さらには直接または間接的にプロモーターからの転写の量を調節するよう作用する当業者に知られているヌクレオチドどの配列をも含むが、これらには限定されない。
【００４４】
「選択的に活性」とは、特定のタイプ、カテゴリーまたはグループの細胞における、特定のヌクレオチド構築物の転写または発現のレベルであり、他のタイプ、カテゴリーまたはグループの細胞におけるその構築物の転写または発現のレベルより実質的に高いものを指し、好ましくは、そのようなタイプ、カテゴリーまたはグループの細胞は、その構築物の転写または発現の実質的ゼロ、または比較的低いベースのレベルを有する。例えば、本発明の構築物は、内皮細胞で非内皮細胞と比較して、選択的に活性であり、そして、好ましくは、静止状態、または非脈管形成内皮細胞と比較して脈管形成内皮細胞で選択的に活性である。
【００４５】
「治療的に有効である」とは、脈管形成または血管新成の量、またはプロセスの速度を減少させるのに有効であり、好ましくは脈管形成の既存の部位でのそのようなプロセスの継続を実質的に防ぐか、脈管形成の追加の、望ましくない部位での脈管形成の開始を実質的に防ぐために有効な薬剤を指す。例えば、腫瘍転移に関連した脈管形成を治療する場合、治療的に活性若しくは有効な薬剤は、脈管形成の阻害を通して有意な抗腫瘍活性または腫瘍退縮を示すだろう。そのような化合物は、例えば原発腫瘍増殖、そして、好ましくは、癌の転移の可能性を減少されるかもしれない。あるいは、そのような化合物は、微小血管サイズまたは数を減らすか、または血管密度比を減らすかのいずれかによって、腫瘍血管分布を減少させるかもしれない。
【００４６】
「腫瘍退縮」とは、本発明に係る組成物を用いる癌患者の治療の結果として、腫瘍の全体的なサイズ、直径、横断切片、腫瘍塊のｉｒ生存度の減少、腫瘍マーカの減少、或いは癌細胞の減少または増殖の鈍化を示す癌診断、予後診断の他の従来の肯定的な指標を指す。好ましくは、そのような化合物の投与は、癌患者で一つまたは複数の腫瘍部位において、少なくとも約３０％から５０％の腫瘍退縮、より好ましくは少なくとも約６０％から７５％の腫瘍退縮、さらに好ましくは約８０％から９０％の腫瘍退縮、最も好ましくは約８０％から９０％の腫瘍退縮の結果となる。理想的に、そのような投与は、癌患者で一つまたは複数の腫瘍部位において、成長可能な腫瘍細胞を殺すかまたは根絶するか、或いは完全に腫瘍細胞を根絶する結果となり、臨床上観察されうる軽減または患者の健康での他の増強に至る。
【００４７】
２．  詳細な説明
Ａ．ジフテリア毒素（ＤＴ）およびＤＴ−Ａ鎖の調節された発現
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅのジフテリア毒素（ＤＴ）は、単一のポリペプチド鎖として、翻訳され、それは翻訳後Ａ（Ｍｒ ２１，１６７）フラグメントとＢ（Ｍｒ ３７，１９５）フラグメント開裂され、そしてこれらジスルフィド結合によって繋がれたまま残る（Ｐａｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ， （１９７７）． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４６， ６９−９４）。ＤＴのＢ−鎖は、細胞表面膜貫通タンパク質に結合することにより（上皮成長因子前駆体に関連があるが、Ｎａｇｌｉｃｈら、（１９９２）． Ｃｅｌｌ ６９， １０５１−１０６１）細胞形質に、それに続いて、受容体に媒介されたエンドサイトーシスによってエンドソームにＡ鎖が侵入するのを容易にする。エンドソームの酸性化に際して、ジスルフィド結合が還元されて、Ａ鎖が細胞形質にデリバリーされる（Ｏ’Ｋｅｅｆｅら、（１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， ６２０２−６２０６）。Ｂ−鎖がこのデリバリーに関与する機構は、Ｘ線結晶学によって決定されたＤＴの構造から提案された（Ｃｈｏｅら、（１９９２）． Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ） ３５７， ２１６−２２２）。ジフテリア毒素Ａ鎖は、真核生物伸長因子２（ｅＥＦ−２）のその唯一知られた基質であるジフタミド（ｄｉｐｔｈａｍｉｄｅ）の翻訳後に修飾されたヒスチジン残基に特異的なＡＤＰリボシルトランスフェラーゼである。ＮＡＤ＋からｅＥＦ−２へのＡＤＰリボース部分の移送は、アポトーシス・プログラムの誘導によるか、または他のメカニズムのいずれかによって（Ｋｅｐｐｌｅｒ−Ｈａｆｋｅｍｅｙｅｒら、（１９９８）． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７， １６９３４−１６９４２）、タンパク質合成を阻害して、細胞死に至らしめる（Ｃｏｌｌｉｅｒ， （１９９０）． ＡＤＰ−Ｒｉｂｏｓｙｌａｔｉｎｇ Ｔｏｘｉｎｓ ａｎｄ Ｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ， Ｊ． Ｍｏｓｓ ａｎｄ Ｍ． Ｖａｕｇｈａｎ， Ｅｄｓ。（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｓｔｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ） ｐｐ． ３−１９）。その酵素活性のために、ＤＴ−Ａは、非常に有毒であり、単一分子が細胞死に引き起こすのに十分であるかもしれない（Ｙａｍａｉｚｕｍｉら、（１９７８）． Ｃｅｌｌ １５， ２４５−２５０）。
【００４８】
毒素遺伝子の調節発現は、インビトロおよびトランスジェニック動物で特定の細胞タイプを殺す効率的な手段として使用することができる（Ｍａｘｗｅｌｌら、（１９８６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４６， ４６６０−４６６４； Ｐａｌｍｉｔｅｒら、（１９８７） Ｃｅｌｌ ５０， ４３５−４４３； Ｂｒｅｉｔｍａｎら、（１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８， １５６３−１５６５）。本発明者らは、以前にジフテリア毒素Ａ鎖（ＤＴ−Ａ）遺伝子を癌のための治療薬としての使用することを提案した（Ｍａｘｗｅｌｌら、（１９８６） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４６， ４６６０−４６６４）。成功する療法は、効率的なデリバリーとＤＴ−Ａ遺伝子の適切なターゲット発現の両方に依存するであろう。ＤＴ−Ａは、細胞につき１つの分子と同じくらい低いレベルで細胞に導入されるとき、致死性であるかもしれないので、（Ｙａｍａｉｚｕｍｉら、（１９７８）． Ｃｅｌｌ １５， ２４５−２５０）、理論的にはＤＴ−Ａ遺伝子の最小の発現だけで標的細胞を除去をするのに十分であるだろう。ＤＴ−ＡはＢ鎖がない場合、細胞に入ることができないので、細胞溶解された細胞からＤＴ−Ａが放出されたとしても隣接した組織には有害でないだろう。
【００４９】
したがってＤＴ−Ａ遺伝子は、その発現に十分に厳しい調節を課すことができるならば、潜在的に非常に特異的な治療薬を提供する。この条件の実施可能性は、インビボでトランスジェニック・マウスにおいて実証されてきた。このように、組織特異的な転写調節要素を用いることによって、他の組織への損傷なしに標的組織、例えば、膵臓外分泌部（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、（１９８７） Ｃｅｌｌ ５０， ４３５−４４３）または接眼レンズ（Ｂｒｅｉｔｍａｎら、（１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８， １５６３−１５６５； Ｋａｕｒら、（１９８９） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １０５， ６１３−６１９））の除去（ａｂｌａｔｉｏｎ）を引き起こす十分な厳格さを持って、ＤＴ−Ａの発現をターゲットすることが可能となってきた。そのようなマウスを生育させることができ、除去された表現型を伝えることができる（Ｂｒｅｉｔｍａｎら、（１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８， １５６３−１５６５； Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒら、（１９８８） Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ２， ４５３−４６１； Ｋａｕｒら、（１９８９） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， １０５， ６１３−６１９．）。このアプローチは、ｔｏｘ１７６として知られているＤＴ−Ａの弱毒化突然変異体を使用することによって、非標的組織で漏れた発現の低レベルを示す調節要素を用いる適切な系統で適用されるだろう（Ｍａｘｗｅｌｌら、（１９８７）． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７， １５７６−１５７９）。
【００５０】
Ｂ．ヌクレオチド構築物の調製
本発明は、さらにコード配列を含む、組換え型ヌクレオチド構築物を提供する。ヌクレオチド構築物を作成する方法は、周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （１９８９）を参照。ヌクレオチド構築物において、コード化ＤＮＡ配列は、作動的に発現調節配列および／またはベクター配列に連結されている。
【００５１】
本発明に係る毒素をコードする配列の１つが作動的に結合されているベクターおよび／または発現調節配列の選択は、当該技術分野で公知であるように、所望の機能的性質（例えば、タンパク質発現、宿主または形質転換される標的細胞）に直接依存する。本発明で企図されるヌクレオチド構築物は、少なくとも作動的にベクターおよび／または発現調節配列に連結されている構造毒素遺伝子を選択的に発現すること可能であり、そして、好ましくは複製を指示し、或いは、真核生物または原核生物宿主のゲノム若しくは標的細胞に必要に応じて挿入することが可能である。
【００５２】
作動的に連結されたタンパク質をコードする配列の発現を調節するために使用される発現調節要素は、当該技術において公知であり、誘導性のプロモーター、構成的プロモーター、エンハンサー、分泌シグナルおよびその他の調節要素を含むがこれらには限定されない。発現が単に脈管形成内皮だけに制限される発現ベクターが最も好ましいが、脈管形成内皮細胞での選択的発現も考えられる。また、好ましいものは、容易に制御される誘導性のプロモーターであり、これは例えば標的また宿主細胞の培地中、若しくは環境中で栄養素に反応するようなものである。
【００５３】
真核細胞と適合性を持つ（好ましくは、脊椎動物細胞と適合性を持つもの）発現ベクターまたはヌクレオチド構築物を使用して、コード配列を含むヌクレオチド構築物を形成することができる。真核細胞発現ベクターは、当該技術において周知であり、いくつかの商業的な供給元から入手可能である。一般的に、そのようなベクターは、所望のＤＮＡセグメント挿入のために、便利な制限酵素部位を含んで提供される。そのようなベクターの典型的なものは、ｐＳＶＬおよびｐＫＳＶ−１０ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＢＰＶ−１／ｐＭＬ２ｄ （Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ｐＴＤＴ１（ＡＴＣＣ、＃３１２５５）、本明細書に記載されるベクターｐＣＤＭ８、類似の真核生物発現ベクターである。
【００５４】
本発明のヌクレオチド構築物を作成するために使用する真核細胞発現ベクターは、さらに真核細胞で効果的である選択可能なマーカー、好ましくは薬剤耐性選択マーカー含んでもよい。好ましい薬剤耐性マーカーは、その発現がネオマイシン耐性の結果となる遺伝子である（すなわち、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ネオ）遺伝子）。（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｎａｌ．Ｇｅｎｅｔ １：３２７−３４１， １９８２．）。あるいは、選択可能なマーカーは、別のプラスミド上に存在することができ、その２つのベクターが宿主細胞の共トランスフェクションによって、導入され、そしてその選択可能なマーカーについて、適切な薬物中で、培養することによって選択される。
【００５５】
１つの実施の形態において、コード化核酸分子を含むベクターは、原核生物レプリコンを含むことになり、これはすなわち原核生物宿主細胞（例えば、形質転換された細菌性の宿主細胞）において、組換え型ＤＮＡ分子の自律増殖や維持をその染色体外で指示する能力を有するＤＮＡ配列である。そのようなレプリコンは、当該技術において周知である。加えて、原核生物レプリコンを含むベクターは、その発現が薬剤耐性のような検出可能なマーカーを付与する遺伝子を含んでもよい。典型的な細菌性の薬剤耐性遺伝子は、アンピシリンまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与するものである。
【００５６】
原核生物レプリコンを含むベクターは、細菌性の宿主細胞（例えば、大腸菌）でコード遺伝子配列の発現（転写と翻訳）を指示することができる原核生物またはバクテリオファージ・プロモーターをさらに含むことができる。プロモーターとは、ＲＮＡポリメラーゼの結合と転写が起こるのを許容するＤＮＡ配列によって形成される発現調節要素である。細菌性の宿主と適合性を持つプロモータ配列は、本発明のＤＮＡセグメント挿入のために、便利な制限酵素部位を含んでいるプラスミドベクター中に、典型的に提供される。そのようなベクター・プラスミドの代表例は、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ） から入手可能なｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２とｐＢＲ３２９、Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊから入手可能なｐＰＬとｐＫＫ２２３である。
【００５７】
Ｃ．転写調節要素
上記で説明したように、例えばプロモーターやエンハンサーのような転写調節要素を含む本発明のヌクレオチド構築物が考えられる。プロモーターやエンハンサーの機能は、当該技術で周知である。プロモーターは、プロモーター自身の位置に関して関連性のない位置でＲＮＡ転写の開始を指示する。真核生物プロモーターに見出される特徴的な配列は、「ＣＡＡＴ」と「ＴＡＴＡ」ボックスである。また、プロモーターは、そのなかでの様々なシス作用配列の有無、および配列に依存して、発現された配列上で組織特異性、発生的に調節されるか若しくは誘導性の発現パターンをも付与できる。エンハンサーは、しばしば所定のプロモーターからの転写レベルを増加させるＤＮＡ配列である。プロモーターと同様に、転写に対するエンハンサーの効果は、様々なシス作用配列の有無、および配列に依存して、組織特異的、発生的に調節されるか若しくは誘導的であることが多い。エンハンサーの１つの顕著な特徴は、転写に対するその効果が所定のプロモーターに関するその位置や方向へ無関係であり得ることである。
【００５８】
毒素遺伝子が脈管形成上皮で選択的に発現される、本発明のヌクレオチド構築物が企図される。その結果、上皮の特異的制御配列が注目され、それらのいくつかが記載されてきた。例えば、ＷＯ Ｐａｔｅｎｔ ９７／１７３５９には、様々な遺伝子産物をコードする遺伝子に、作動的に連結されたｆｌｔ−ｌプロモーターを含む構築物が記載されている。別の特許（ＷＯ ９７／００９５７）には、ポリペプチドをコードする配列のＫＤＲ／ｆｌｋ−ｌプロモーターによって指示された内皮細胞特異的転写またはそれが作動的に連結されたアンチセンス鋳型が開示されている。さらに、もう１つの特許は、ＴＩＥプロモーター記載する（米国特許第５，８７７，０２０号）。米国特許第５，７４７，３４０号には、気管支の上皮および血管内皮細胞で、核酸カセットを発現させるためのベクターであり、プレプロエンドセリン−１遺伝子の５’−フランキング領域のセグメントと発現用核酸カセットとを含むものが記載されている。
【００５９】
本発明に係る構築物に用いられるのに興味がある他のプロモーターとしては、エンドシアリン遺伝子、エンドグリン遺伝子、Ｅセレクチン遺伝子およびｅｔｓ−１遺伝子が挙げられる。エンドシアニンは、ヒト癌での血管内皮細胞の細胞表面グリコプロテインである（Ｒｅｔｔｉｇ Ｗ．ら、１９９２ Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０８３２−１０８３６）。エンドグリン遺伝子のプロモーター領域は、ＲｉｕｓらによってＢｌｏｏｄ １９９８； ９２：４６７７−４６９０に記載された。Ｅセレクチン発現は、正常成人血管で非常に低いが、新しく生産された腫瘍毛細管でかなり上昇している。例えば、Ｗａｌｔｏｎら（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １９８９； １８：１３５７−１３６０）を参照のこと、これには変換された内皮細胞でのＥセレクチンプロモーターからのリポーター遺伝子の発現が、未処置の細胞と比較してＴＮＦ−αによる遺伝子の３０倍の増加を起こすことが示されている。転写因子であるＥＴＳ−１は、それ自身の遺伝子産物によって自律的にポジティブに調節され、その遺伝子構造が記載されている（Ｊｏｒｃｙｋ Ｃ．Ｌ．ら、１９９１）。ＥＴＳ転写因子は、コアＧＧＡ（Ａ／Ｔ） ＤＮＡ配列に結合するＤＮＡ−結合ドメインを持つ。ＥＴｓ結合部位は、内皮細胞で発現され、脈管形成に関与している多くの遺伝子のプロモーター活性のために必須である。
【００６０】
脈管形成の間に発現されて、役に立つ転写調節配列を提供すると考えられる他の遺伝子には、ＶＥカドヘリン（Ｇｏｒｙら、１９９８； ２７３； ６７５０−５）、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（Ｓｃｈｗａｃｈｔｇｅｎら、１９９７； Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １５：３０９１−１０２）、ＰおよびＥセレクチン、エンドグリン（Ｒｉｕｓら、１９９８； Ｂｌｏｏｄ １２：４６７７−４６９０）、ｆｌｔ−１（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、１９９５； Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２７９４８−２７９５３）が含まれる。
【００６１】
Ｄ．構築物とベクターの内皮細胞へのデリバリー
真核細胞への核酸のデリバリー方法と関連するデリバリー・ビヒクルは、当該技術において周知である。Ａｕｓｕｂｅｌら、（編） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９）第９章を参照。本発明の核酸構築物およびベクターは、いかなる利用可能な手段ででも内皮細胞にデリバリーできるであろうが、これにはトランスフェクションを容易にするタンパク質および脂質、ウイルス性のデリバリー・ベクター、「遺伝子銃」、さらに裸の核酸が含まれるが、それらには限定されない。Ｔｅｉｆｅｌら、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ５：２１−３５ （９１９９７）と米国特許第５，８３７，２８３号を参照。例えば、核酸構築物とベクターは、循環系への導入によって、または腫瘍塊への直接的な注入によって、脈管形成内皮細胞へデリバリーできる。米国特許第５，８３７，２８３号を参照。
【００６２】
リポゾーム・デリバリーは、好ましいデリバリーの方法である。「リポソーム」という術語は、広く解釈され、そして微粒子コロイド系、特に薬またはヌクレオチド構築物をカプセル化することが可能な脂質または親油性ベシクルを包含することを意図する。Ｍｅｙｅｒｓ （編） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９５） ２６０， ５１４を参照。リポソーム製剤とその使用は、当該技術で周知である。例えば、Ｓｃｈｅｕｌｅらの米国特許第５，９４８，７６７号には、患者に生物学的に活性な分子の治療的に有効量をデリバリーするのに適したカチオン性、親油性両親媒性物質が記載されている。腫瘍塊への経静脈、若しくは局部または直接投与に適したリポゾーム製剤ならいかなるものも好ましいことになる。ＭｃＤｏｎａｌｄらへの米国特許第５，８３７，２８３号に記載されているように、特に好ましいものは、脈管形成上皮細胞によって優先的に取りこまれるそれらのリポソーム製剤である。さらに、好ましいものは、内皮細胞および脈管形成内皮細胞へ選択的にリポソームをターゲットする取りつけられた薬剤（例えば、抗体や他のタンパク質）を有するリポソームおよびカチオン性リポソームである。核酸複合体を伴う、医者に興味ある他のデリバリー方法は、Ｗｕらへの米国特許第５，１６６，３２０号（１９９２年）、第５，６３５，３８３号（１９９７年）および第５，８７４，２９７号（１９９９年）、Ｈａｒｔｍｕｔへの米国特許第５，３５４，８４４号（１９９４年）および第５，７９２，６４５号（１９９８年）、さらにＧｏｐａｌへの米国特許第５，６７０，３４７号（１９９７年）に記載されている。
【００６３】
レトロウイルス発現ベクターは、本発明の考えられるもう一つのデリバリー・ビヒクルである。レトロウイルスベクターの構築は、当該技術分野において周知である。Ａｕｓｕｂｅｌら、（編） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９９） 第９章を参照。レトロウイルスベクターは、宿主または標的細胞ゲノムへのベクターの一体化のために、細胞分裂を必要とする。この特性により、嚢胞性線維症のような細胞分裂が存在しない疾患にそのようなベクターの用途を疑わしいものとする。Ｗｅｌｓｈらの米国特許第５，９５８，８９３号を参照。しかしながら、本発明のレトロウイルス性ヌクレオチド構築物は、好ましくは脈管形成しているか、または増殖している上皮に指向される。本発明で企図されるレトロウイルスベクターの利点は、そられが健康な組織と関連する静止性であるか、若しくは増殖していない上皮によって、取りこまれないことである。レトロウイルス発現ベクターの使用に関する１つの心配は、そのようなベクターが残滓ヘルパーウイルスの存在、またはそれらの標的細胞へのパッケージング能力転移の存在のために野生株ウイルスに戻るかもしれないかという危険によって制限されている。Ｄａｎｏｓらの米国特許第５，９５５，３３１号には、それらの標的細胞にパッケージング能力を転移できないか、またはその能力を獲得できないヘルパーなしの組換え型レトロウイルスの作成が記載されている。
【００６４】
組換え型パルボウイルス発現ベクターも、また本発明で考えられる。組換え型パルボウイルスベクターは、インターロイキン遺伝子の腫瘍特異的発現のために設計加工されてきた（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６： ２８２１−２８２８）。また、パルボウイルスベクターは、遺伝情報をデリバリーするためにパルボウイルス抗原を生産して、そして空の非感染性パルボウィルス・カプシドを生産するために設計加工されてきた（ＷＯ ９０／０５５３８、１９９０年５月３１日）。組換え型パルボイルスベクターの構築は、Ｔａｔｔｅｒｓａｌｌらの米国特許第５，８５３，７１６号に記載されている。
【００６５】
他のデリバリー方法、ビヒクルまたはベクターは、当業者の熟練度の範囲内であり、前記のことは本発明の範囲内にあると考えられるデリバリー方法、ビヒクルまたはベクターを制限するものと解釈されてはならない。
【００６６】
Ｅ．腫瘍治療のための本発明の化合物の投与
本発明の薬剤は、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内または口腔内の経路、腫瘍塊への直接の注射、或いは本発明のヌクレオチド構築物の脈管形成上皮細胞への進入を提供するいかなる方式でも投与することができる。投与される投与量は、受容個体の年齢、健康状態、体重、あるとすると同時治療の種類、治療の頻度、および所望の効果の性質に依存する。
【００６７】
薬理学的に活性な薬剤に加えて、本発明の組成物は、佐薬や助剤を含む適当な薬学的に許容される担体であって、作用点へのデリバリーのために薬学的に使用できる製剤に活性化合物をプロセッシングするのを容易にするものを含んでもよい。非経口的投与用の適当な製剤は、水溶性の形態（例えば、水溶性の塩）で、活性化合物の水溶液を含む。さらに、適当な油性の注射懸濁液としての活性化合歩の懸濁液を投与してもよい。適当な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、胡麻油）、合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルまたはトリグリセリド）が挙げられる。水性の注射懸濁液は、懸濁液の粘性を増加させる物質を含んでもよく、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および／またはデキストランが挙げられる。選択肢として、その懸濁液は安定化剤を含んでもよい。細胞へのデリバリーのために薬剤をカプセル化するためにリポソームを使用することもできる。
【００６８】
本発明の方法を実施するに際して、本発明の化合物を単独で、または組合わせて使用してもよいし、或いは他の治療剤または診断剤と併用してもよい。特定の好ましい実施の形態では、本発明の化合物は、一般に認められた医療処置に従って、これらの症状に対して典型的に処方される他の化合物と共に、共投与されてもよいが、それらはアンジオスタチンまたはエンドスタチン発現ベクター若しくはタンパク質のような抗脈管形成剤、或いは抗癌治療薬を含む。本明細書で使用する場合、２つの薬剤が同時に投与されるか、またはそれら薬剤が同時に作用するような様式で独立して投与されるとき、２つの薬剤は組合わせて投与されると言う。本発明の化合物は、インビボで、通常哺乳類（例えば、ヒト、ヒツジ、ウマ、家畜、ブタ、イヌ、ネコ、ラットやマウス）に、またはインビトロで利用することができる。
【００６９】
治療的に有効な投与量は、インビトロまたはインビボのいずれかの方法によって決定できる。本発明の特定の化合物の各々について、必要な最適の投与量を決定するための個々の決定がなされてもよい。治療的に有効な投与量の範囲は、投与経路、治療の対象および患者の状態、さらには例えば、腫瘍の性質、段階やサイズによって影響されることになる。皮下注射針による注射について、投与量が体液にデリバリーされると推定される。他の投与経路については、吸収効率を各化合物ごとに薬理学で周知である方法によって個々に決定せねばならない。したがって、治療専門家が最適な治療効果を得るのに要求されるように、投与物の力価を決定し、投与経路を修正することが必要であるかもしれない。有効な投与量レベル（すなわち、所望の結果を達成するのに必要な投与量レベル）の決定は、当業者よって容易に決定される。一般的に、化合物の適用はより低い投与量レベルで始められる、投与量レベルは、所望の効果が達成されるまで増加される。
【００７０】
個々の要求は変わり得るが、各成分の有効量の最適範囲の決定は当該技術の熟練度の範囲内である。本発明の化合物は、約０．０１ｍｇから５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは、約０．０５ｍｇから約５ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．２ｍｇから約１．５ｍｇ／ｋｇの投与量範囲内で、単一の若しくは２から４の１日分割用量および／または連続注入の投薬計画により、有効量で静脈内にまたは非経口的に投与することができる。
【００７１】
本発明のヌクレオチド構築物は、リポソーム・デリバリー系（例えば、小単層ベシクル、大単層ベシクル、複層ベシクル）の形態で投与されてもよい。特に、Ｍｉｘｓｏｎへの米国特許第５，８３７，２８３号、第５，９４８，７６７号、ＥＰ特許第９２１，１９３号およびＸｕら、（１９９７） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８： １７７−１８５には、静脈内または腹腔内の使用のためのヌクレオチド構築物／リポソーム複合体の製剤化に関してのガイダンスが提供されている。リポソームは、様々な脂質（例えば、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリン）から形成することができる。
【００７２】
本発明の化合物と構築物は、化合物分子がカップリングされている抗体、抗体フラグメント、成長因子、ホルモン類またはその他のターゲッティング部分の使用によってデリバリーされることもある。また、本発明の化合物は、ターゲティング可能な薬物担体として適当なポリマーにカップリングされてもよい。そのようなポリマーには、ポリビニルピロリジノン、ピラン・コポリマー、ポリヒドロキシ−プロピル−メタクリルアミド・フェノール、ポリヒドロキシエチル・アスパラアミド・フェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシド・ポリリシンが含まれる。さらに、本発明の化合物は、薬物の制御放出を達成するのに役立つ生体分解性ポリマーの一群にカップリングされてもよい。例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸とポリグリコール酸のコポリマー、ポリエプシロン カプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリヒドロキシピラン、ポリシアノアクリレート、および架橋されているか、または両親媒性ヒドロゲルのブロック共重合体である。ポリマーおよび半透過性のポリマー・マトリックスは、例えば、ステント、管材等の成形製品に形成されてもよい。
【００７３】
Ｆ．様々な脈管形成に関連する疾患への適応性
増殖するまたは脈管形成する上皮細胞に関連するいくつかの腫瘍性および非腫瘍性疾患がある。Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈらへの米国特許第５，９５２，１９９号で議論されているように、これらの疾患には、固形腫瘍と転移性腫瘍、例えば、リウマチ性関節炎、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、後水晶体線維増殖症、血管新成緑内障、加齢黄斑部変性、血管腫、移植された角膜または他の組織の免疫拒否反応および慢性炎症等の疾患が含まれる。
【００７４】
これらの疾患のための従来の療法は、変えられる。例えば、癌は多種多様な化学療法剤によって治療することができる。リウマチ性関節炎は、しばしばアスピリン、アスピリン代替物（例えば、イブプロフェン）、コルチコステロイドまたは免疫抑制療法によって治療される。Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ （１９９２） 第１６版， ｐｐ． １３０５−１２。アテローム性動脈硬化症の治療は、症状条件またはリスク因子（例えば、循環するコレステロールレベルを下げるか、または血管形成術）に向けられている。Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ （１９９２） 第１６版， ｐｐ． ４０９−４１２。真性糖尿病は、糖尿病性アテローム動脈硬化症や糖尿病性網膜症を含むある種の症状を誘発し得るが、それは一次性糖尿病を、または関連する症状（例えば、血圧）を制御することによって治療できる。Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ （１９９２） 第１６版， ｐｐ． ４１２−４１３， １１０６−１１２５， ２３８３−３８５。乾癬は、局部用軟膏およびステロイド治療によって、最も一般に治療される。Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ （１９９２） 第１６版， ｐｐ． ２４３５−２４３７。後水晶体線維増殖症は、寒冷療法的除去も必要かもしれないけれども、予防的な酸素とビタミンＥ治療によって、最適に治療される。Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ （１９９２） 第１６版， ｐｐ． １９７５−１９７６。前述のことから、これらの脈管形成に関連する疾患が、それらの脈管形成関連を共有するにもかかわらず、共通の治療、症状を共有しないことは明らかである。
【００７５】
脈管形成の阻害または予防は、そのような脈管形成に関連する疾患を治療する新しい、より包括的なメカニズムを提供する。Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈらの特許では、治療は、内因性の脈管形成ＶＥＧＦタンパク質に結合し、不活性化するキメラ型のＶＥＧＦ受容体によって媒介され、その結果として、血管の上皮の増殖と脈管形成が減少する。本発明では、脈管形成するか、若しくは増殖している内皮細胞で本発明に係るヌクレオチド構築物を使用すると細胞死の結果となり、疾患の進行の比較的初期に、前述の疾患に関連する脈管形成プロセスを効果的に終了させるかまたは予防する。
【００７６】
Ｇ．組み合わせまたは共投与療法
企図されるように、本発明は、関連する発明的な方法によって、本明細書に開示した化合物を他の治療剤、脈管形成阻害剤および／または他の抗腫瘍剤の投与と共に、組み合わせること或いは共投与することにも関する。そのような他の治療剤、脈管形成阻害剤および薬剤は、例えば眼科医や腫瘍学者に周知である。本発明の構築物や方法と組み合わせて使用されるそのような他の薬剤および付随する方法には、従来の化学療法剤、放射線療法、免疫調節剤、遺伝子療法、さらに様々な他の組成物（例えば、イムノトキシン）、および抗脈管形成製剤（例えば、アンジオテンシンまたはエンドスタチン）の使用が含まれ、これは例えば、Ｐａｒｉｓｈらへの米国特許第５，８７４，０８１号（１９９９年）そしてＴｈｏｒｐｅらへの米国特許第５，８６３，５３８号（１９９９年）に開示されているか、または当該技術で公知である。本発明と脈管形成に関連する疾患（上記のＦセクションにおいて議論されたような）に対する従来の療法に基づく組み合わせまたは共投与療法が特に考えられる。
【００７７】
前述の一般的な議論を考慮して、以下に提示される特定の実施例は、例示的のみのものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。他の一般的および特定の構成体は、当業者にとって明らかであろう。
【００７８】
【実施例】
（実施例１）ＳＶ４０プロモーターに加えてジフテリア毒素構築物を用いるＨＵＶＥＣのトランスフェクション
材料および方法
ジフテリア毒素Ａ鎖（”ＤＴ−Ａ”）またはジフテリア毒素Ａ鎖の弱毒化変異体（”ＤＴ−Ａ−ｔｏｘ１７６）をコードするＤＮＡ配列を、ＳＶ４０アーリープロモーター（ｅａｒｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）の下流にクローン化してプラスミドｐＳＶ２Ａ−ＤＴ−Ａ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｍａｘｗｅｌｌ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． （１９９５） ６：１２７−１４３）およびそのｔｏｘ１７６誘導体を作出した。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）と増殖培地をＣａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社から購入し、製造業者によって提供された指示書に従い、細胞を培養した。
【００７９】
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
有効な一過性トランスフェクションは、エレクトロポレーション法（Ｍａｘｗｅｌｌ ａｎｄ Ｍａｘｗｅｌｌ （１９８８） ＤＮＡ ７：５５７−５６２）を使用して達成した。一過性の共トランスフェクション（ｃｏトランスフェクトｉｏｎ）アッセイでは、Ｍａｘｗｅｌｌら（１９９２）に記載されているダブルレポーター系（ｐＧ４ＲＬＵＣにｐＳＧ２３６が加えられたもの）を使用した。ルシフェラーゼアッセイでは、Ｔｕｒｎｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社からの照度計と共にＰｒｏｍｅｇａ 社からのキットを使用した。
【００８０】
増加量のＤＴ−ＡまたはＤＴ−Ａ−ｔｏｘ１７６発現プラスミドと、ルシフェラーゼレポータープラスミドでＨＵＶＥＣを共トランスフェクトした。図１に示される結果から、ＨＵＶＥＣは、タンパク質合成の迅速な阻害によって媒介される、ＤＴ−Ａ発現の毒性作用を非常に受けやすいということが確認された。図１に示されるように、増加量のＤＴ−Ａプラスミドでトランスフェクトされると、ＨＵＶＥＣの一過性の共トランスフェクションアッセイにおけるルシフェラーゼ活性が累進的に減少した（Ｍａｘｗｅｌｌら、１９８６）。また、細胞は、弱毒化変異体（ｔｏｘ１７６）の発現にも影響されやすかったが、匹敵する阻害が起こるには約３０倍も高い濃度が必要とされた。これは、以前の知見（Ｍａｘｗｅｌｌら、１９８７）と一致している。
【００８１】
（実施例２）Ｅセレクチンプロモーターに加えてジフテリア毒素を用いるＨＵＶＥＣのトランスフェクション
材料
Ｅセレクチンプロモーター（ヌクレオチド ‐５２３から＋３３；Ｗｈｉｔｌｅｙら、１９９４）を、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、ｐＴＨＡ７（Ｍａｘｗｅｌｌら、１９８９）の誘導体内にクローン化してｐＥ−Ｓ−ＤＴ−Ａ を作成した。可能なＰＣＲエラーを除外するために、該プロモーターの配列をＤＮＡシーケンシングにより確認した。プラスミドｐＥ−Ｓ−ＧＦＰ−ＬＵＣは、ｐＥ−Ｓ−ＤＴ−Ａ中のＤＴ−Ａ配列をＧＦＰルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ｄａｙら、１９９８）で置換することによって構築した。ＴＮＦαは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した。
【００８２】
プラスミドｐＥ−Ｓ−ＧＦＰ−Ｌｕｃ（０．５〜５μｇのＤＮＡ）をＨＵＶＥＣ内にトランスフェクトさせ、トランスフェクションの３時間後、６時間後、および１２時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。これと並行するトランスフェクションを１０ μｇ／ｍｌ ＴＮＦαまたは１．０ μｇ／ｍｌリポ多糖（ＬＰＳ）の存在下で行った。この結果は図２に示されており、レポータープラスミドｐＥ−Ｓ−ＧＦＰ−ＬＵＣからのルシフェラーゼ発現によって示唆されるように、クローン化されたＥセレクチンプロモーターがＨＵＶＥＣ内で活性であることが実証された。さらに、この結果から、このプロモーターは、ＴＮＦαに反応して予想通り（約３倍）に刺激されることが確認された。リポ多糖（ＬＰＳ）もレポーター発現を刺激したが、その程度は小さかった。
【００８３】
ルシフェラーゼ発現ベクターＰＳＶ２Ａ Ｌｕｃと増加量のｐ−Ｅ−Ｓ−ＤＴ−ＡでＬＰＳ刺激されたＨＵＶＥＣを共トランスフェクトして、ＨＵＶＥＣに対するＤＴ−Ａ発現の効果をアッセイした。トランスフェクションから９．５時間後、および１９．５時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。
【００８４】
この結果、図３に示されるように、Ｅセレクチンプロモーター（プラスミドｐＥ−Ｓ−ＤＴ−Ａ）からのＤＴ−Ａ発現によってＨＵＶＥＣ内でタンパク質合成が抑制されたこと、並びにＴＮＦαによって活性化された細胞では抑制が高まったことが実証された。ＴＮＦαによるＤＴ−Ａ発現の刺激を含む同様の結果が両方のアッセイ時間から得られた。これらのデータから、インビボで、腫瘍血管系の活性化された内皮にＤＴ−Ａ発現および毒性をターゲティングするのにＥセレクチンプロモーターが有用となることが示唆される。
【００８５】
（実施例３）Ｅｔｓ−１ プロモーター／ジフテリア毒素の構築物を用いるＨＵＶＥＣのトランスフェクション
材料
Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ社（サンディエゴ、カリフォルニア州）からヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の初代培養物を取得し、２０％ＦＣＳ（Ｈｙ−Ｃｌｏｎｅ、ローガン、ユタ州）と、３０ｍｇの血管内皮細胞増殖サプリメント（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ、ベッドフォード、マサチューセッツ州）と、２５ｍｇのへパリンを含むゼラチン塗布された組織培養プレートで補充されたＭ１９９培地中で増殖した。初代培養物を４−６日毎に継代し、初代培養から３−６継代目に実験を行った。
【００８６】
細胞株２９３（ＥＣＡＣＣ Ｒｅｆ Ｎｏ： ８５１２０６２）は、２ｍＭグルタミン、１％非必須アミノ酸、１０％ウマ血清または１０％胎児ウシ血清で補充されたＥＭＥＭ培地中で培養されたヒト上皮細胞株である。細胞株ＢＨＫ２１（クローン１３）（ＥＣＡＣＣ Ｒｅｆ Ｎｏ：８５０１１４３３）は、２ｍＭグルタミン、５％トリプトースリン酸塩ブロス、および５−１０％胎児ウシ血清で補充されたＧＭＥＭ培地中で培養した線維芽細胞株である。
【００８７】
ヒトｅｔｓ−１遺伝子の５’フランキング領域のクローニング
供給元に従い、Ｗｉｚａｒｄ ＧｅｎｏｍｉｃのＤＮＡ精製キットを使用して、ＨＵＶＥＣ細胞からヒトゲノムＤＮＡを単離した。ＰＣＲ増幅により一連のＥＴＳプロモーターを作成し、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にクローン化した。デオキシヌクレオチドシーケンシングにより、全てのレポーター構築物においてプロモーターの挿入を確認した。また、このプロモーターを、ジフテリアＡ鎖をコードする、プロモーターのないプラスミドｐＴＨＡ７（Ｍａｘｗｅｌｌら）内にもクローン化した。
【００８８】
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ
以前に記載された（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）リン酸カルシウム法を使用して、ＨＵＶＥＣおよび対照細胞株（２９３およびＢＨＫ ２１）をトランスフェクトした。細胞のトランスフェクションは、１２μｇのレポータープラスミド（Ｅセレクチン・プロモーター‐ルシフェラーゼ、ｅｔｓ−１‐プロモーター・ルシフェラーゼ、対照：ＳＶ４０‐プロモーター・ルシフェラーゼ）で行った。ｅｔｓ−１‐プロモータープラスミドについては、細胞を２μｇのｅｔｓ−１‐発現プラスミドで共トランスフェクトした。トランスフェクション（ＴＮＦ−αまたは成長因子による誘導の有無にかかわらず）から１９．５時間後、サンプルを収集して、市販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。その結果、対照細胞株に比較してＨＵＶＥＣではＥセレクチンおよびｅｔｓ−１プロモーター構築物が強く発現されることが示される。ルシフェラーゼレポータープラスミドとｅｔｓ−１‐プロモーター／ＤＴ−Ａ発現構築物とでこの細胞株を共トランスフェクトすると、対照細胞株に比較してルシフェラーゼ活性が大きく抑制された。
【００８９】
（実施例４）Ｆｌｔ−１プロモーター／ジフテリア毒素の構築物を用いるリポフェクション
ジフテリアＡ鎖をコードする、プロモーターのないプラスミドｐＴＨＡ７の上流に、特許第ＷＯ ９７／１７３５９号に開示されたＦｌｔ−１プロモーターをクローン化する。実施例３に記載したように、ディデオキシリボヌクレオチド・シーケンシングにより構築物のプロモーター挿入を確認する。その後、米国特許第５，８３７，２８３号に従い、これらの構築物をカチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＡＰ：ＣＨＯＬ ５０：５０）へ調製する。実施例３に記載したようにして、ＨＵＶＥＣ、２９３およびＢＨＫ細胞を調製する。ＴＵＮＥＬアッセイ（Ｇａｖｒｉｅｌｉ （１９９２） Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１９：４９３−５０１）を用いる測定によれば、細胞内へ構築物をリポトランスフェクトした後、８０％のＨＵＶＥＣ細胞がアポトティック（ａｐｏｐｔｏｔｉｃ）である。同様の条件下では、５％未満のＢＨＫ細胞および２９３細胞がアポトティックである。
【００９０】
（実施例５）ＫＤＲ−プロモーター／ジフテリア毒素の構築物の調製およびトランスフェクション
ジフテリアＡ鎖をコードする、プロモーターのないプラスミドｐＴＨＡ７内に、公開されたＰＣＴ特許出願第ＷＯ ９７／００９５７号に開示されたＫＤＲプロモーターをクローン化する。実施例３に記載したようにして、ＨＵＶＥＣ、２９３およびＢＨＫ細胞を培養する。得られたプラスミドを、実施例２に記載したように、ルシフェラーゼレポータープラスミドと共に、ＨＵＶＥＣおよび非内皮対照細胞にトランスフェクトする。対照細胞株と比較してＨＵＶＥＣではルシフェラーゼ活性が大きく抑制される。
【００９１】
（実施例６）ＶＥＧＦエンハンサーおよびルシフェラーゼ遺伝子に連結したＥセレクチンプロモーターを用いるトランスフェクション
Ｌｉｕら（１９９５ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７７：６３８）により開示されている、ＶＥＧＦプロモーターのヌクレオチド（転写開始サイトに対して、‐９８５から‐９５１）からのＶＥＧＦエンハンサーを、ＥセレクチンプロモーターｐＥ−Ｓ−ＧＦＰ−ＬＵＣ（実施例２を参照）の上流にクローン化し、ディデオキシシーケンシングにより確認する。その後、このプラスミドを、低酸素（０％Ｏ２）または通常酸素（２１％Ｏ２）条件下でインキュベートしたＨＵＶＥＣにトランスフェクトする。低酸素下では、少なくとも３〜５倍のルシフェラーゼ活性が誘発される。
【００９２】
（実施例７）レトロウイルス構築物を用いるトランスフェクション
Ｄａｎｏｓらに記載されているように、ｅｔｓ−１ プロモーター／ＤＴ−Ａレトロウイルス粒子を調製する。これらの粒子で培養されたＨＵＶＥＣおよび対照細胞を感染させる。感染の２４時間後、ＨＵＶＥＣの約８０％がアポトティックである。
【００９３】
（実施例８）ヌードマウスにおける腫瘍退縮
Ｅエラスチンプロモーターの制御下にあるＤＴ−Ａ遺伝子を、プラスミド内にクローン化し、リポソームに調製し、腫瘍を持つ試験用ヌードマウスに注射する。これに平行して、腫瘍を持つ対照用ヌードマウスには、ＤＴ−Ａインサートを欠いているプラスミドを含むリポソームを注射する。二つの注射から１４日後、試験用および対照用マウスを殺して解剖検査する。試験用マウスは、統計学的に有意な腫瘍塊の減少を示す。
【００９４】
（実施例９）固形腫瘍を持つガン患者の治療
実施例２に従い、ＤＴ−Ａ遺伝子の上流にＥセレクチンプロモーターを挿入する。この構築物を、ＭｃＤｏｎａｌｄらの特許に記載されたようにしてリポソーム製剤中にパッケージする。この製剤の治療学的有効量を、一つまたは複数の固形腫瘍成長を患う患者の静脈内に投与する。療法は、腫瘍退縮が起こるまで継続して行う。腫瘍退縮は、一つまたは複数の退縮マーカーによって決定され、これには循環する腫瘍抗原および／または物理的再吸収の低下が含まれる。該製剤を用いた連続的または定期的治療を続けることは、全腫瘍退縮を確実にする手段として、または予防法として、選択肢で必要な場合もある。
【００９５】
（実施例１０）後水晶体繊維増殖症を持つ患者の治療
後水晶体線維増殖を患う患者を寒冷療法的除去で治療する。また、実施例４に記載した治療学的ＤＴ−Ａ製剤も患者に投与する。除去された領域の血管再生が減少しまたは防止される。
【００９６】
（実施例１１）ジフテリア毒素を用いる併用療法
実施例９に従い、一つまたは複数の固形腫瘍を患う患者を治療する。ＤＴ−Ａ療法の初期経過に続いて、患者は従来の化学療法および／または放射線療法を受ける。治療の進行度は、実施例９に記載したようにしてモニターする。併用療法を使用すると、放射線または化学療法に患者を晒すことが少なくなる。
【００９７】
（実施例１２）第二薬剤とのジフテリア毒素構築物の共投与
実施例４に記載したリポソーム製剤を、特許第５，９６５，１３２号に記載されたように、免疫毒素と共に調製する。共に調製されたリポソームの治療学的有効量を、一つまたは複数の固形腫瘍を患う患者に投与する。腫瘍退縮を観察する。
【００９８】
（実施例１３）ルシフェラーゼ遺伝子およびＥＴＳ−１結合サイトペンタマーに連結されたＥセレクチンプロモーターを用いるトランスフェクション
Ｅセレクチンプロモーターおよびルシフェラーゼ遺伝子（ｅｔｂｚ−ＥＳ）の前にＥＴＳ−１結合サイトのペンタマーをクローン化した。このプラスミドを、ｅｔｓ−１発現プラスミドと共に３２４Ｋ細胞にトランスフェクトした。エンハンサー（Ｅ−Ｓ）を欠いている同一プラスミドと比較して、７倍のルシフェラーゼ活性が誘発された。
【００９９】
先の議論および例示は、特定の好ましい実施の形態についての詳細な説明を単に提示するだけのものであることを理解すべきである。従って、本発明の意図および範囲から逸脱することなく、種々の変更および等価物が作られ得ることは、当業者にとって明らかである。例えば、本発明の単離された核酸および薬学的組成物によって非常に有毒な他のタンパク質およびペプチドがコード化され得ることが企図される。この特許出願において同定される、全ての雑誌論文、他の文献、特許および特許出願は、その全体が引用文献として組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＤＴ−Ａでトランスフェククされていない細胞と比べて、ルシフェラーゼ活性の減少によって、測定される、ＨＵＶＥＣでのタンパク質合成に対するＤＴ−ＡとＤＴ−Ａ−ｔｏｘ１７６発現の相対的な作用を示す図である。
【図２】
Ｅセレクチン・プロモーター／ルシフェラーゼ発現ベクター（ｐＥ−Ｓ−ＧＦＰ ＬＵＣ）単独で、或いはＴＮＦαまたはリポ多糖（ＬＰＳ）の存在下、トランスフェクトされたＨＵＶＥＣにおけるルシフェラーゼ活性を示す図である。
【図３】
Ｅセレクチン／ルシフェラーゼ発現ベクターで共トランスフェクトされたＨＵＶＥＣ細胞へ増加量のＤＴ−Ａ発現ベクター（ｐＥ−Ｓ−ＤＴ−Ａ）をトランスフェクトする効果を示す図である。細胞は、ＴＮＦαの存在または不存在下で培養し、そして、トランスフェクションの９．５または１９．５時間後、アッセイした。
【図４】
ｅｔｂｚ−ＥＸ−ＧＦＰ ＬｕｃまたはｐＥ−Ｓ−ＧＦＰ−ＬｕｃとｐＥＶＲＦＥＴＳ（ｅｔｓ）発現プラスミドで電気搾孔された３２４Ｋ細胞におけるルシフェラーゼ発現を示す図である。
【図１】
2004500049.tif 000002
【図２】
2004500049.tif 000003
【図３】
2004500049.tif 000004
【図４】
2004500049.tif 000005
【国際公開パンフレット】
2004500049.tif 000006
2004500049.tif 000007
2004500049.tif 000008
2004500049.tif 000009
2004500049.tif 000010
2004500049.tif 000011
2004500049.tif 000012
2004500049.tif 000013
2004500049.tif 000014
2004500049.tif 000015
2004500049.tif 000016
2004500049.tif 000017
2004500049.tif 000018
2004500049.tif 000019
2004500049.tif 000020
2004500049.tif 000021
2004500049.tif 000022
2004500049.tif 000023
2004500049.tif 000024
2004500049.tif 000025
2004500049.tif 000026
2004500049.tif 000027
2004500049.tif 000028
2004500049.tif 000029
2004500049.tif 000030
2004500049.tif 000031
2004500049.tif 000032
2004500049.tif 000033
2004500049.tif 000034
2004500049.tif 000035
2004500049.tif 000036
2004500049.tif 000037
2004500049.tif 000038
2004500049.tif 000039
2004500049.tif 000040
2004500049.tif 000041
2004500049.tif 000042
2004500049.tif 000043
2004500049.tif 000044
2004500049.tif 000045
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500049.tif 000046
2004500049.tif 000047
2004500049.tif 000048
2004500049.tif 000049
2004500049.tif 000050
2004500049.tif 000051
2004500049.tif 000052
2004500049.tif 000053
2004500049.tif 000054
2004500049.tif 000055
2004500049.tif 000056
2004500049.tif 000057
2004500049.tif 000058
2004500049.tif 000059
2004500049.tif 000060
2004500049.tif 000061
2004500049.tif 000062
2004500049.tif 000063
2004500049.tif 000064
2004500049.tif 000065
2004500049.tif 000066
2004500049.tif 000067
2004500049.tif 000068
2004500049.tif 000069
2004500049.tif 000070
2004500049.tif 000071
2004500049.tif 000072
2004500049.tif 000073
2004500049.tif 000074
2004500049.tif 000075
2004500049.tif 000076
2004500049.tif 000077
2004500049.tif 000078
2004500049.tif 000079
2004500049.tif 000080
2004500049.tif 000081
2004500049.tif 000082
2004500049.tif 000083
2004500049.tif 000084
2004500049.tif 000085
【国際調査報告】
2004500049.tif 000086
2004500049.tif 000087
2004500049.tif 000088