(57)【要約】本発明は、プリオンとの結合能を有する１若しくは２以上のデバイスに組織／臓器を接触させ、かかる組織／臓器との接触から上記デバイスを抜き出し、プリオンがデバイスに結合しているかどうかを測定することからなり、デバイスを組織／臓器と１２０分間接触させることを特徴とする組織／臓器若しくはそれらの液におけるプリオンの存在を測定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織／臓器におけるプリオンの存在を検出する方法において、
（ａ）組織／臓器を、プリオンとの結合能を有するデバイスと接触させ、
（ｂ）上記組織／臓器との接触から上記デバイスを抜き出し、及び
（ｃ）プリオンが上記デバイスに結合しているかどうかを測定する
工程からなる方法。
【請求項２】
組織／臓器におけるプリオンの存在を検出する非侵襲的方法において
（ａ）組織／臓器を、プリオンとの結合能を有するデバイスと接触させ、
（ｂ）上記組織／臓器との接触から上記デバイスを抜き出し、及び
（ｃ）プリオンが上記デバイスに結合しているかどうかを測定する
工程からなる方法。
【請求項３】
デバイスが、プリオンを分解から保護する能力を有することを特徴とする請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
組織／臓器が、哺乳動物の組織／臓器であることを特徴とする請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
組織／臓器が、家畜又はヒトの組織／臓器であることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
組織／臓器が、プリオンが蓄積する組織／臓器であることを特徴とする請求項１〜５いずれかに記載の方法。
【請求項７】
組織／臓器が、脳、脾臓、リンパ節、又は扁桃腺から選択されることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
デバイスが金属を含むことを特徴とする先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
金属が、スチール、ステンレススチール、銀、金、又はそれらの組み合わせからなるグループから選択される１若しくは２以上の金属を含むことを特徴とする請求項８記載の方法。
【請求項１０】
デバイスが、１若しくは２以上のワイヤーを含むことを特徴とする請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
１若しくは２以上の実験動物をデバイスと接触させ；
上記実験動物のインキュベーションを行い；
上記実験動物における悪影響や死亡例を観察し；また任意に
プリオンを証明するため、悪影響又は死亡が認められる実験動物の生検を実施する
工程からなるデバイスにプリオンが結合しているかどうかを測定する方法。
【請求項１２】
デバイスを１若しくは２以上の実験動物と、１実験動物あたり1時間以上接触させることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
デバイスを１若しくは２以上の実験動物と、１実験動物あたり５時間以上接触させることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
デバイスを１若しくは２以上の実験動物と、１実験動物あたり５時間を超えて接触させることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
実験動物が哺乳動物であることを特徴とする請求項１１〜１４いずれかに記載の方法。
【請求項１６】
実験動物がマウスであることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
実験動物がトランスジェニックマウスであることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
トランスジェニックマウスが、１若しくは２以上のＰｒＰトランスジーンを有することを特徴とする請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ＰｒＰトランスジーンが、哺乳動物におけるＰｒＰをコードすることを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＰｒＰトランスジーンが、家畜又はヒトのＰｒＰをコードすることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
（ａ）細胞株をデバイスと接触させ；
（ｂ）上記細胞株のインキュベーションを行い；及び
（ｃ）上記細胞株がプリオンを含んでいるかどうかを測定する
工程からなり、デバイスにプリオンが結合しているかどうかを測定する方法。
【請求項２２】
蛋白質測定法、免疫測定法、ウエスタンブロット法、又はセルブロット法を用いて、細胞株がプリオンを含んでいるかどうかを測定することを特徴とする請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
デバイスの表面で直接プリオンを検出することにより、該デバイスにプリオンが結合しているかどうかを測定する方法。
【請求項２４】
蛋白質測定法、免疫測定法、又はウエスタンブロット法を用いて、デバイスの表面にプリオンが結合しているかどうかを測定することを特徴とする請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
デバイスと組織／臓器との接触時間が１２０分以下であることを特徴とする請求項１〜２４いずれかに記載の方法。
【請求項２６】
デバイスと組織／臓器との接触時間が３０分以下であることを特徴とする請求項１〜２４いずれかに記載の方法。
【請求項２７】
デバイスと組織／臓器との接触時間が５分以下であることを特徴とする請求項１〜２４いずれかに記載の方法。
【請求項２８】
金属を含むことを特徴とするプリオンとの結合能を有するデバイス。
【請求項２９】
スチール、ステンレススチール、銀、金、又はそれらの組み合わせからなるグループから選択される１若しくは２以上の金属を含むことを特徴とする請求項２８記載のデバイス。
【請求項３０】
１若しくは２以上のワイヤーからなることを特徴とする請求項２８又は２９に記載のデバイス。
【請求項３１】
デバイスに結合したプリオンが保護されることを特徴とする請求項２８〜３０いずれかに定義されるデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は方法に関する。具体的に本発明はプリオンタンパク質の存在を検出するアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景知識として、プリオンとは核酸をもたない伝達性（伝播性）粒子である。プリオンタンパク質（ＰｒＰ）遺伝子はプリオンタンパク質をコードする。ＰｒＰの正常型はＰｒＰｃと呼ばれるのに対し、異常構造をとる異性体はＰｒＰＳｃと呼ばれており、プリオンの主要な又は唯一の成分であると信じられている。プリオン病の中で最も注目されているのは牛海綿状脳症（ＢＳＥ；Bovine Spongiform Encephalopathy）、羊スクレイピー、及びヒトにおけるクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ；Creutzfeldt-Jacob Disease）である。ＣＪＤの最も一般的な症状は、個体に特発性に現れる孤発性（散発性）ＣＪＤ（ｓＣＪＤ）である。医原性ＣＪＤ（ｉＣＪＤ）は事故感染による疾病である。家族性ＣＪＤ（ｆＣＪＤ）は、ヒトＰｒＰ遺伝子の変異を原因として稀に家族内で発生する形態のＣＪＤである。ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ；Gerstmann-Strassler-Scheinker Disease）もまた稀な遺伝性のヒト・プリオン病である。いずれの家族性疾患も常染色体優性疾患である。ヒトにおける「新変異型」ＣＪＤ（ｖＣＪＤ）は、他のＣＪＤ型におけるものとは異なるＰｒＰ糖化パターンを伴う別種のＣＪＤ株型である。畜牛からＢＳＥが伝播してヒトｖＣＪＤが発生した可能性が示唆されている。
【０００３】
プリオンは、物理的及び化学的不活化に対し極めて耐性であり、そのことが、プリオンを含む材料を、熱滅菌やホルムアルデヒド等の従来法により滅菌する場合の問題となっている（Taylor et al. (1994), Arch. Virol. 139, 313-326; Brown et al. (1982), N. Engl. J. Med. 306, 1279-1282; Ernst & Race (1993), J. Virol. Methods 41, 193-201; Taylor (1993), Br. Med. Bull. 49, 810-821）。医原性であると証明された、若しくは医原性であることが疑われる１００を超えるヒトへの伝播例が既に報告されている。Zobeley et al. (1999) Mol. Med. 5, 240-243 では、スクレイピープリオンに感染したステンレススチール器具を滅菌するモデルシステムが提供されている。ワイヤーを１０％ホルムアルデヒドで１時間処理した後でもなお、該ワイヤーを指標マウスの脳内に移植した結果、感染が引き起こされたとの知見に証明されるように、マウス馴化スクレイピープリオンがステンレススチールワイヤーに強固に結合し得ることが報告されている。
【０００４】
ヒトに対する診断は通常、組織病理学的及び免疫組織化学的測定法に依拠している。さらに進んだプリオン感染診断法には、脳又は扁桃腺の生検などの侵襲的手法が必要となる。これら生検のホモジェネートをマウス等の実験動物の脳に注入する。実験動物がプリオン感染の臨床症状を発症した場合は、その実験動物の脳をさらに調べてプリオンの存在を確認する。この方法が抱える問題は、生検に含まれるプリオンが分解されてしまう点にある。結果的に、感染性は通常２４時間以内に消失する。
【０００５】
本発明は、先行技術が抱える問題を克服しようとするものである。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、組織／臓器又はそれらの液におけるプリオンを検出する方法を提供する。本方法では、組織／臓器と接触させる金属ワイヤー等のデバイスを使用する。驚くべきことに、本デバイスは５分以内にプリオンと結合する能力を有する。その後、本デバイスを組織／臓器との接触から抜出する。本デバイスでは、プリオンが３日以上も分解されずに保存されるが、これは驚きに値する。先行技術の方法では、プリオンは早くも２４時間後には分解してしまう。デバイスにプリオンが結合しているかどうかを確認するため、以下に記載するように数多くの異なる方法を用いることができる。従来知られていたより遥かに短時間でプリオンが本デバイスに結合するので、プリオン感染の診断も、先行技術の方法に比べると著しく速やかにくだすことができる。
【０００７】
第一の特徴として本発明は、組織／臓器におけるプリオンの存在を検出する方法を提供する。この方法は、プリオンとの結合能を有するデバイスに組織／臓器を接触させ、該組織／臓器との接触から該デバイスを抜き出し、該デバイスにプリオンが結合しているかどうかを測定する工程からなる。
【０００８】
第二の特徴として本発明は、組織／臓器におけるプリオンの存在を測定する非侵襲的方法を提供する。この方法は、プリオンとの結合能を有するデバイスに組織／臓器を接触させ、該組織／臓器との接触から該デバイスを抜き出し、該デバイスにプリオンが結合しているかどうかを測定する工程からなる。上記非侵襲的方法により、上記無損傷の組織／臓器が少なくとも実質的に無損傷のままであることが好ましい。
【０００９】
本発明の方法で用いるデバイスでは、プリオンが分解されずに保存される点で有利である。
【００１０】
組織／臓器は哺乳動物のものであることが好ましい。組織／臓器が、家畜又はヒトの組織／臓器であることがより好ましい。
【００１１】
本発明の方法は、プリオンが蓄積する組織／臓器におけるプリオンを検出する点で有利である。組織／臓器は、脳、脾臓、リンパ節、又は扁桃腺から選択されることが好ましい。
【００１２】
本発明のデバイスは、１若しくは２以上の金属を含み、又はポリスチレン等のプラスチック、若しくは硝子を含むものでもよい。本発明では、これらの材料にプリオンタンパク質が結合することを開示しているが、これは驚くべきことである。本発明のデバイスは、１若しくは２以上の金属を含むことが好ましい。金属が、スチール、ステンレススチール、銀、金、若しくはそれらの組合せからなるグループから選択される１若しくは２以上の金属を含むことが好ましい。より好ましいのは、金属がステンレススチールであることである。
【００１３】
本発明のデバイスは、直径が５ｍｍ未満、好ましくは１ｍｍ未満、好ましくは実施例に記載した大きさをもつ１若しくは２以上のワイヤー又は球（sphere）を含むことが好都合である。デバイスが、１若しくは２以上の金属ワイヤーを含むことが好ましい。
【００１４】
本発明の第三の特徴として、１若しくは２以上の実験動物をデバイスに接触させ、該実験動物のインキュベーションを行い、該実験動物における悪影響や死亡例を観察し、またプリオンを証明するため、悪影響又は死亡が認められる実験動物の生検を任意に実施する工程からなる、デバイスにプリオンが結合しているかどうかを測定する方法を提供する。
【００１５】
１若しくは２以上のデバイスを、１時間以上実験動物と接触させることが好ましい。１若しくは２以上のデバイスを、５時間以上実験動物と接触させることがより好ましい。１若しくは２以上のデバイスを、５時間を超えて実験動物と接触させることがより好ましい。最も好ましいのは、１若しくは２以上のデバイスを実験動物と永久に接触させておくことである。デバイスそのものに起因する悪影響は、これまで認められていない。
【００１６】
本発明に有用な実験動物（１若しくは２以上）は、哺乳動物であることが好ましい。実験動物がマウスであることが好ましい。実験動物には、トランスジェニックマウスも含まれる。
【００１７】
かかるトランスジェニックマウスが、１若しくは２以上のＰｒＰトランスジーンを有することが好ましい。
【００１８】
第四の特徴として本発明は、１若しくは２以上の細胞株をデバイスと接触させ、該細胞株のインキュベーションを行い、プリオン／プリオンタンパク質の存在を調べるために上記細胞株のアッセイを行う工程からなる、プリオンがデバイスに結合しているかどうかを測定する方法を提供する。
【００１９】
プリオン／プリオンタンパク質の存在は、蛋白質測定法（プロテインアッセイ）、免疫測定法（イムノアッセイ）、ウエスタンブロット法、又はセルブロット法等、当技術分野で公知の好適方法のいずれによってもアッセイが可能である。プロテイナーゼＫによる処理後にＰｒＰScの存在を検出することが好ましい。
【００２０】
第五の特徴として本発明は、デバイスにプリオンが結合しているかどうかを、該プリオン／プリオンタンパク質を該デバイス表面上で直接検出することにより測定する方法を提供する。上記方法によりプリオン／プリオンタンパク質を検出するにあたり、蛋白質測定法、免疫測定法、又はウエスタンブロット法、好ましくは免疫測定法を用いることが好ましい。
【００２１】
本発明に用いるデバイスは、組織／臓器との接触時間が１２０分以下であることが好ましい。デバイスと組織／臓器との接触時間が３０分以下であることが、より好ましい。最も好ましいのは、デバイスと組織／臓器との接触時間が５分以下であることである。
【００２２】
利点
本発明には数多くの利点がある。それらの利点を以下に明らかにする。
【００２３】
例えば本発明は、商業的に有用な方法を提供する点で有利である。
【００２４】
さらに例をあげると本発明は、組織／臓器におけるプリオンの存在を検出する方法を提供する点で有利である。
【００２５】
さらに例をあげると本発明は、プリオンを分解から保護する点で有利である。
【００２６】
さらに例をあげると本発明は、プリオン感染を治療する薬剤の調製に用いられる１若しくは２以上の作用因子（agent）の同定法を提供する点で有利である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
プリオン、ＰｒＰｃ及びＰｒＰＳｃ
ここに言及される「プリオン」なる用語は、核酸をもたないタンパク性感染性粒子のことである。
【００２８】
ＰｒＰＳｃは、ＰｒＰｃ（プリオンタンパク質の正常型）の構造的異性体であり、プリオンの主要な又は唯一の成分であると確信されている。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態においては、プリオンを含有している可能性のある組織／臓器を試験する。
【００３０】
Victor A. McKusick et alが HYPERLINK "http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Omim" においてプリオンの背景を教示している。以下に記載するプリオンに関する情報は、そこからの抜粋である。
【００３１】
プリオンタンパク質遺伝子の変異は、ゲルストマン・ストロイスラー病（ＧＳＤ；Gerstmann-Straussler disease）、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ；Creutzfeldt-Jakob disease）、及び家族性致死性不眠症と関係があり、プリオンタンパク質の異常アイソフォームは、上記疾病、並びにクールー病及び羊スクレイピーにおける感染性作用因子として作用し得る。
【００３２】
Prusiner（1982、1987）は、プリオンが核酸をもたない新しい分類の感染性作用因子を代表していることを示唆した（プリオンという用語はPrusiner（１９８２）によって提唱されたもので、「タンパク質感染性作用因子（protein infectious agent）」を表している）。プリオン病は接種により伝達し、或いは常染色体優性疾患として遺伝する神経変性症状である。Prusiner（1994）は、伝達性海綿状脳症の病因を再検討し、プリオンタンパク質のプロテアーゼ耐性アイソフォームがかかる疾患の病因として重要であることを記している。Mestel（1996）は、感染性タンパク質の存在についての肯定的及び否定的証拠（並びに肯定的又は否定的見解）を再検討している。
【００３３】
Tagliavini et al.（1991）は、インディアナ州の家族（Indiana kindred）内患者２名から単離したアミロイド・プラークコアから抽出したタンパク質を精製して特徴づけを行った。上記著者らは、ＧＳＤアミロイドの主要成分は１１ｋＤのＰｒＰ分解産物であり、そのＮ末端がヒトＰｒＰｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列の５８番目に位置するグリシン残基に相当していることを見出した。またアミロイド断片は、さらに大きなＰｒＰ断片を含み、外見上無処理のＮ末端及びアミロイドＰ成分を有していた。Tagliavini et al.（1991）はこれらの知見を、疾患プロセスに伴いタンパク質分解によるＰｒＰの開裂が生じ、不溶性フィブリルへとポリマー化するアミロイド生成ペプチドが生成されることを示唆するものであると解釈した。上記家族には、構造遺伝子の変異が認められなかったので、ＰｒＰの一次構造以外の要因が、アミロイド形成過程において重要な役割を担っている可能性がある。
【００３４】
プリオンが、上記疾患の主要原因たる感染性作用因子によって合成が刺激されるシアロ糖タンパク質であるというのが、一つの解釈となっており、Manuelidis et al.（1987）は、ＰｒＰペプチドがＣＪＤにおける感染性作用因子ではないことを示唆する証拠を提示した。Pablos-Mendez et al.（1993）は、「プリオン病のねじれた歴史」を再検討し、プリオンが感染性であるという見解にとって代わる見解、すなわちプリオンは細胞毒性代謝産物であるとの見解を示唆した。本著者らは、代謝産物ＰｒＰのプロセシングの研究、及びこのタンパク質の出現を増強する作用因子の試験を行うことが、自分達の仮説を立証する上で有用であると示唆した。上記著者らのモデルからは、ＰｒＰの異化を阻害し得る物質によりＰｒＰが蓄積されることが予想された。トランスジェニックマウスにおいてＰｒＰ合成量が増加すると、実験用スクレイピーの潜伏期間が短縮される。Pablos-Mendez et al.（1993）の仮説は、ＰｒＰの合成経路よりむしろ分解経路が細胞内で脱線することを示唆した。
【００３５】
Forloni et al.（1993）は、ＰｒＰの１０６〜１２６ペプチドには、インビトロにおいてアミロイド様フィブリルへとポリマー化する高い固有の能力がみられることを見出した。上記著者らはまた、初期ラット海馬培養物を、上記ペプチドに相当するペプチドにマイクロモル濃度下で慢性的に曝すことにより、神経死が生じることを示した。このようなペプチドの細胞毒効果にはアポトーシス機構が関与していることをForloni et al.は示唆した。
【００３６】
伝達性海綿状脳症の感染性、病原性作用因子は、ＰｒＰタンパク質のプロテアーゼ耐性かつ不溶性の形態であり、正常型プロテアーゼ感受性ＰｒＰタンパク質から翻訳後に派生することが示唆されている（Beyreuther and Masters, 1994）。Kocisko et al.（1994）は、精製成分からなる無細胞系において、正常型ＰｒＰタンパク質がプロテアーゼ耐性ＰｒＰタンパク質へと転化することについて報告している。このようにＰｒＰが正常型から病原性へと選択的に転化するには、既存の病原性ＰｒＰが存在していることが必要とされる。上記著者らは、新たなＰｒＰタンパク質の生合成、アミノ基に結合することによるＰｒＰタンパク質のグリコシル化、又はＰｒＰタンパク質における正常型グリコシルホスファチジルイノシトール・アンカーの存在は、上述の転化には不要であることを示した。これは、病原性ＰｒＰタンパク質が、それ自身と正常型ＰｒＰタンパク質との間の特異的タンパク質−タンパク質相互作用の結果、形成され得ることを示す直接的な証拠である。
【００３７】
Rivera et al.（1989）は、１３歳の重症進行性神経疾患男性患者について記載している。その患者の核型は、１５ｐ；２０ｐのテロメア融合に起因する偽中心重複性染色体を示していた。リンパ球においては、異常染色体のセントロメア収縮は常に２０番染色体で起きるのに対し、線維芽細胞においては上記両染色体のセントロメアが交互に収縮していた。上記著者らは、機能性ＤＮＡ配列の構造が修飾される結果、セントロメア特異的タンパク質への正常な結合が妨げられ、セントロメアが不活化することを示唆した。上記著者らはまた、クロイツフェルト・ヤコブ病で認められる海綿状グリオニューロナル（glioneuronal）ジストロフィーを想起させる上記患者の疾患は、プリオンタンパク質の変異が生じた後に発生すると主張した。
【００３８】
Collinge et al.（1990）は、家族性であれ孤発性であれ、「プリオン病」という用語が診断用語として、より適切であると示唆した。ＧＳＤ病に罹患したインディアナ州の家族（Indiana kindred）の症例が、Farlow et al.（1989）及び Ghetti et al.（1989）によって報告された。遺伝子予測にＰｒＰ遺伝子分析を採用することには、遺伝性の遅発性神経変性疾患の発症前検査の浸透度や合併症が不確実であるがゆえに生じる潜在的な問題がある。しかしCollinge et al.（1991）は、遺伝性プリオン病を抱える家族にとって、リスク保持者の発症前診断並びにＣＪＤ又はＧＳＤの排斥を可能にし、遺伝カウンセリングの質を向上させる機能が上記分析にはあると結論付けた。
【００３９】
Gajdusek（1991）は、現在までに判明しているＰＲＮＰ変異をチャート図にまとめた。すなわち単一アミノ酸の変化を起こす５種類の変異と、オクタペプチド反復がそれぞれ５、６、７、８又は９回行われる５ヶ所における挿入である。上記著者はまた、トランスサイレチン遺伝子（ＴＴＲ；１７６３００）において同定されたアミロイドーシスを惹起する18種類のアミノ酸置換をまとめた表も発表し、上述した２分類の疾患における挙動を比較した。
【００４０】
Schellonberg et al.（1991）は、ＰＲＮＰ挿入変異と共に、ＣＪＤ及びＧＳＳＤと関連するＰＲＮＰ遺伝子の１０２、１１７及び２００番目のコドンにおけるミスセンス変異を、アルツハイマー病の７６家族、孤発性アルツハイマー病と推測される１２７症例、ダウン症候群の１６症例、及び２５６正常対照例で調べたが、いずれの症例も上記のどの変異に対しても、ポジティブではなかった。Jendroska et al.（1994）は、特発性パーキンソン病（ＰＤ；１６８６００）、多系統萎縮症、びまん性レビー小体病（１２７７５０）、スチール−リチャードソン−オルゼウスキー（Steele-Richardson-Olszewski）症候群（２６０５４０）大脳皮質基底核変性症、及びピック病（１７２７００）を含む種々の運動障害を呈する90症例において、組織ブロット免疫染色法により病原性プリオンタンパク質の検出を試みた。これらの脳標本のいずれからも病原性プリオンタンパク質は同定されなかったが、クロイツフェルト・ヤコブ病に罹患している４対照例からは容易に検出された。Perry et al.（1995）は、５４家族からのアルツハイマー病患者８２名（家族内症例を３０件含む）と、これら患者とそれぞれ同年齢の対照群３９名のプリオン遺伝子座における変異をＳＳＣＰによりスクリーニングした。その結果、第６８コドン近傍に２４ｂｐの欠失が認められたが、それは遅発性アルツハイマー病家族の成員中、罹患した兄弟姉妹２名と子供１名においてｇｌｙ−ｐｒｏに富む５個のオクタペプチド反復のうちの１個が消失したものだった。しかし、同じ家系で罹患した他の家族成員には、このような欠失が認められなかった。ただし遅発性アルツハイマー病家族の非罹患成員６名のうち年齢が一致する対照３名においても上記の欠失が認められた。これとは別のオクタペプチド反復の欠失が同じアルツハイマー病家族のさらに別の成員３名において観察されたが、その３名のうち２名は罹患していた。これら以外に変異は認められなかった。Perry et al.（1995）は、プリオンタンパク質の変異とアルツハイマー病との間に関係があるとの証拠はないと結論した。
【００４１】
Hsiao et al.（1990）は、分析対象家族のうち３名のＰｒＰ遺伝子のオープンリーディングフレームに変異は認められなかったが、その後Hsiao et al.（1992）は、ｐｈｅ１９８−ｔｏ−ｓｅｒ変異を明らかにした。１７６６４０．００１１を参照のこと。
【００４２】
Palmer and Collinge（1993）は、プリオンタンパク質遺伝子における変異及び多型性について再検討を行った。
【００４３】
Chapman et al.（1996）は、プリオンタンパク質遺伝子の第２００コドンにおける病原性リシン変異（１７６６４０．０００６）に対してヘテロ接合性で、第１２９コドンでのメチオニンに対してホモ接合性である患者の致死性不眠症及び重症視床病理について報告した。上記著者らは、この表現型と、第１７８コドンでの変異（１７６６４０．００１０）に関する表現型との類似性を強調した。
【００４４】
Collinge et al.（1996）は、ヒト・プリオン病を広範な症例から調べ、種々の天然型プリオン株型を示す可能性があるプロテアーゼ耐性ＰｒＰのパターンを同定した。上記著者らは「新変異型」ＣＪＤのプロテアーゼ耐性ＰｒＰを研究して、かかるＰｒＰが、他の形態のＣＪＤから分子基準によって区別され得る別種の株型であるか否かを判定した。Collinge et al.（1996）は、ウエスタンブロット法を行った結果、孤発性ＣＪＤ及び医原性ＣＪＤ（死体の脳から得た成長ホルモンの投与に通常起因する）が、異なる３種類のプロテアーゼ耐性ＰｒＰパターンを伴うことを明らかにした。１型及び２型は、孤発性ＣＪＤと一部の医原性ＣＪＤにおいて認められる。３番目の型は、抹消経路からプリオンに暴露されることによる後天性プリオン病で認められる。Collinge et al.（1996）は、「新変異型」ＣＪＤが、ＰｒＰグリコシル化の特徴的なパターンを含むウエスタンブロット上でみられるプロテアーゼ耐性ＰｒＰの独特で高度に一貫した出現と会合していることを明らかにした。近交系マウスにＣＪＤを伝達すると、接種したＣＪＤに特有のＰｒＰパターンを示した。牛海綿状脳症（ＢＳＥ）プリオンを伝達すると「新変異型」ＣＪＤのグリコフォーム率と極めて近いグリコフォーム率パターンが生じた。上記著者らは、サルにおける実験的ＢＳＥと、家猫における天然型ＢＳＥのＰｒＰが、実験的マウスＢＳＥ及び「新変異型」ＣＪＤのものと区別できないグリコシル化パターンを示すことを見出した。Collinge et al.（1996）の報告に対し、Aguzzi and Weissmann（1996）による再検討が行われたが、その再検討においてCollinge et al.（1996）はＢＳＥと関連性のある「新変異型」ＣＪＤの神経病理性及び臨床上の性質の再検討を行ったのであると結論された。
【００４５】
Prusiner（1996）は、プリオン病に関する分子生物学及び遺伝子学に包括的な再検討を加えた。Collinge（1997）も同様に、この観点から再検討した。Collingeは、ヒト・プリオン病の３種類のカテゴリー、すなわち（１）クールー及び医原性ＣＪＤを含む後天性、（２）定型及び非定型ＣＪＤを含む孤発性、（３）家族性ＣＪＤ、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、致死性家族性不眠症、及び種々の非定型痴呆を含む遺伝性、を認識した。Collinge（1997）は、当時までに報告されていた１２種の病理性変異を表に示した。疾患表現型をコードするタンパク質の能力は、生物学に重要なメンデルの法則に依拠しない伝達性を表していることを記した上でCollinge（1997）は、進化の過程で、多様な種において他のタンパク質にかかる方法が用いられてこなかったとすれば驚きであると述べている。同著者はまた、酵母にみられるプリオン様機構の同定についても言及した（Wickner, 1994; Ter Avanesyan et al., 1994）。
【００４６】
Horwich and Weissman（1997）は、関連性のある伝達性神経変性疾患群におけるプリオンタンパク質の中心的役割について再検討した。そのデータからはプリオンタンパク質が疾患プロセスに必要であることが示され、プリオンタンパク質が、その正常な可溶性αへリックス構造から不溶性βシート構造へと構造転化することが疾患及び感染の発生と密接に関連していることが示された。上記著者らは、かかる転化プロセスの多くは未だ解明されていないと記している。
【００４７】
Mallucci et al.（1999）は、常染色体優性分裂により、初老期痴呆、運動失調及び他の神経精神症状がみられる英国の大家族について報告した。特定の個々人について種々の時期に、脱髄疾患、アルツハイマー病、クロイツフェルト・ヤコブ病、及びゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群の診断を行った。Mallucci et al.（1999）はまた、上記家族と血縁関係にあると思われるアイルランドの家族についても記載しており、その記載においては罹患した個人に対し、多発性硬化症、痴呆、大脳皮質基底核変性症、及び「新変異型」ＣＪＤの診断が考慮された。分子研究を行った結果、ＰＲＮＰ遺伝子のａｌａ１１７−ｔｏ−ｖａｌに変異が認められたことから、上記罹患者の疾患がプリオン病であると同定した。上記著者らは、上述の血縁関係にある両家族にみられる表現型の発現に多様性があることを強調し、「新変異型」ＣＪＤが疑われる症例を含め、非定型初老期痴呆又は神経精神性特性や運動失調を呈する個人に関しては、ＰＲＮＰ分析により遺伝性プリオン病を除外すべきであると提唱した。Hegde et al.1999は、伝達性プリオン病と遺伝性プリオン病には神経変性に至る共通の経路があることを明らかにした。Hegde et al.1999は、異常な折りたたみを有するアイソフォームである蓄積したＰｒＰScがもつ神経変性疾患を引き起こす際の有効性は、宿主がコードするＰｒＰがＣｔｍＰｒＰと呼ばれる膜透過体となって偏在することに依存していることを観察した。さらに、伝達性プリオン病におけるＰｒＰSc蓄積の時間経過に密接に引き続いてＣｔｍＰｒＰ生成量が増加する。従って、ＰｒＰScが蓄積することにより、ＣｔｍＰｒＰの発生又は代謝に関与する現象がイントランスで調節されていることが明らかである。以上のデータからHegde et al.1999は、ＣｔｍＰｒＰに介される神経変性現象が、遺伝性プリオン病と感染性プリオン病の病原における共通のステップであるかもしれないと結論した。
【００４８】
ＰｒＰの非病原性細胞アイソフォームであるＰｒＰCは、神経細胞に強く発現される遍在型（ユビキタスな）糖タンパク質である。Mouillet-Richard et al.（2000）は、抗体仲介架橋を介したＰｒＰC依存性シグナルトランスダクションを調べるためにマウス１Ｃ１１神経細胞分化モデルを用いた。この１Ｃ１１クローンは、上皮形態を有し、神経細胞会合機能をもたない委任神経外胚葉幹細胞である。１Ｃ１１細胞は誘導を受けて神経細胞様形態を発達させ、セロトニン作動性細胞又はノルアドレナリン作動性細胞のいずれかへと分化する。これら２つの分化経路のどちらを選択するかは、どのような誘導体が用いられたかに依存する。ＰｒＰCが特異的抗体と結合することにより、セロトニン作動性細胞又はノルアドレナリン作動性細胞の双方においてチロシンキナーゼＦＹＮ（１３７０２５）のリン酸化レベルが著減した。ＰｒＰCのＦＹＮへの結合は、カベオリン−１（６０１０４７）依存性だった。Mouillet-Richard et al.（2000）は、クラトウリン（clathourin）（１１８９６０を参照のこと）もまた、この結合に関与している可能性のあることを示唆した。ＰｒＰC依存性のＦＹＮ活性化を誘導する１Ｃ１１細胞株の能力は、完全に分化したそのセロトニン作動性又はノルアドレナリン作動性幹細胞に限定されていた。さらに、ＰｒＰCのシグナリング活性は主として神経突起で生じた。Mouillet-Richard et al.（2000）は、ＰｒＰCがシグナルトランスダクションタンパク質である可能性を示唆した。
【００４９】
マッピング
体細胞ハイブリダイゼーション及びインサイチューハイブリダイゼーションを組み合わせることにより（Sparkes et al., 1986）、或いは染色体をソーティングして得たＤＮＡをスポットブロッティングすることにより（Liao et al., 1986）、プリオン関連タンパク質のヒト遺伝子を２０ｐ１２−ｐｔｅｒにマッピングした。Robakis et al.（1986）もまたインサイチューハイブリダイゼーションによりＰＲＮＰ遺伝子座を２０ｐに定めた。
【００５０】
２０ｐの中間部欠失を分析した結果からSchnittger et al.（1992）は、ｐｔｅｒ−−ＰＲＮＰ−−ＳＣＧ１（１１８９２０）−−ＢＭＰ２Ａ（１１２２６−−ＰＡＸ１（１６７４１１)−−ｃｅｎの順番の遺伝子座を明らかにした。Puckett et al.（1991）は、ＰＲＮＰ遺伝子の５−primeであり、高いヘテロ接合性を有するＲＦＬＰを同定した。このＲＦＬＰは、２０番染色体のｐｔｅｒ−ｐ１２領域における有用なマーカーとして使える可能性がある。
【００５１】
Riek et al.（1998）は、マウス・プリオンタンパク質の精製ＮＭＲ構造を用いて、遺伝性のヒト伝達性海綿状脳症の構造基礎を解明した。マウス・プリオンタンパク質細胞型においては、疾病特異的サブドメインの存在を示唆する変異部位の空間クラスターは観察されなかった。ヒトＰＲＮＰ第１２９位置における多型性が、ａｓｐ１７８−ｔｏ−ａｓｎ（Ｄ１７８Ｎ；１７６６４０．０００７）変異から遮断されている疾患表現型に対して高度に特異的な影響を及ぼすことが観察されたが、第１２８残基と第１７８残基との水素結合がかかる影響の構造的基礎となっている。全般的にみて、一部の疾患関連アミノ酸の置換が発生するだけで、ＰＲＮＰ細胞型の安定性が減じられることをＮＭＲ構造は示しており、変異タンパク質にみられる僅かな構造上の差異が、種々多様な方法により分子間のシグナリングに影響することが示唆される。
【００５２】
Windl et al.（1999）は、ドイツ・クロイツフェルト・ヤコブ病サーベイランスユニットと呼ばれる、プリオン病が疑われる患者５７８名のＰＲＮＰ遺伝子のコーディング領域における変異及び多型性の調査を４年半にわたり実施した。上記著者らは、病原性であることが既に報告されていたミスセンス変異が認められた４０症例を見出した。その中ではＤ１７８Ｎ変異が一番多かった。それらの症例全てにおいてＤ１７８Ｎは第１２９コドンのメチオニンと結びついており、それにより定型致死性家族性不眠症遺伝子型がもたらされていた。新規なミスセンス変異が２例と、サイレントな多型性が数例認められた。Windl et al.（1999）は、文献記載中の図１にＰＲＮＰのコーディング領域における既知の病原性変異を図式化した。
【００５３】
歴史
Aguzzi and Brandner（1999）は、「プリオン遺伝子学（the genetics of prions）」を再検討したが、本著者らが伝達性海綿状脳症を引き起こす不可解な作用因子と定義したプリオンは、非遺伝性病原のパラダイムに含まれることから、「プリオン遺伝子学」というのは言葉の矛盾ではないかとの疑問を呈した。Griffith（1967）が初めて提唱したタンパク質オンリー（protein-only）仮説によれば、プリオン感染性は、現在ではＰＲＮＰと呼ばれる細胞タンパク質の異常型であるスクレイピータンパク質と同一である。スクレイピープリオンが細胞プリオンを集めて、それらをさらにスクレイピープリオンに転化させることにより複製が行われる。新たに形成されたスクレイピープリオンが転化サイクルに参加して連鎖反応が生じ、スクレイピープリオンがこれまでにない速さで蓄積されることになる。Prusiner（1982）が病原性タンパク質を精製し、Weissmannら（Oesch et al., 1985; Basler et al., 1986）が、その正常細胞型タンパク質であるＰＲＮＰと同様にスクレイピータンパク質もコードする遺伝子をクローニングしてからは、上記の仮説は広く認められ、受け入れられるようになった。タンパク質オンリー仮説から予測されたように、Ｐｒｎｐ遺伝子を除去することにより、プリオンに暴露させたマウスが実験的スクレイピーに罹患することが阻止されたことを、Weissmannのグループ（Bueler et al., 1993）が報告したことから、上記の説にさらに弾みがついた。Aguzzi and Brandner（1999）は、プリオン病の家族性形状とプリオン遺伝子の変異との関連性に関する発見は、非常に画期的なものであると考えた。
【００５４】
動物モデル
プリオンの構造遺伝子（Ｐｒｎ−ｐ）をマウス２番染色体にマッピングした。マウスの第２遺伝子座であり、Ｐｒｎ−ｐと密接な関連性があるＰｒｎ−ｉは、マウスにおけるスクレイピーの潜伏期間の長さを決定する（Carlson et al., 1986）。スクレイピーの潜伏期間を制御する別の遺伝子であるシンボル化した（symbolized）Ｐｉｄ−１はマウス１７番染色体に位置している。プリオン潜伏期間に影響を及ぼす量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）についても第９、１１章（Stephenson et al 2000）、第２、１１、１２章（Lloyd et al 2001）、及び第２、８、４、１５章（Manolatron et al 2001）に記載がある。Scott et al.（1989）は、シリアンハムスターから得たプリオンタンパク質遺伝子をハーバリングするトランスジェニックマウスに、ハムスター・スクレイピープリオンを接種すると、ハムスターに特有のスクレイピー感染力、潜伏期間、及びプリオンタンパク質アミロイドプラークを示すことを報告した。Hsiao et al.（1994）は、高レベルの変異型Ｐ１０１Ｌプリオンタンパク質を発現する２系統のトランスジェニックマウスは、実験的マウス・スクレイピーと識別できない神経疾患及び中枢神経系病理を発生した。ヒト・プリオンタンパク質の第１０２アミノ酸は、マウス・プリオンタンパク質の第１０１アミノ酸に対応しているので、Ｐ１０１Ｌマウス変異は、ゲルストマン・ストロイスラー病をヒトに発生させるｐｒｏ１０２−ｔｏ−ｌｅｕ変異（１７６６４０．０００２）に相当する。Hsiao et al.（1994）は、Ｐ１０１Ｌトランスジーンを低レベルに発現するマウスと、変異型Ｐ１０１Ｌプリオンタンパク質を高レベルに発現するトランスジェニックマウスの脳抽出物を注入したシリアンハムスターとに、神経変性が連続して伝達されたことを報告した。上記高発現トランスジェニックマウスの脳には低レベルの感染性プリオンしか蓄積しなかったにもかかわらず、接種を受けた動物に連続して疾患が伝達されたことは、これら未接種動物の脳においてもプリオンのデノボ形成が生じたことを示唆しており、プリオンに外来核酸がないことのさらなる証拠となった。
【００５５】
Bueler et al.（1994）、Manson et al.（1994）、及びSakaguchi et al.（1996）は、ＰｒＰノックアウトマウスに関する研究を報告した。Sakaguchi et al.（1996）は、自分たちが作製したＰｒＰノックアウトマウスは、７０週齢までは一見正常だが、その時点から一様に小脳性失調症の兆候を呈し始めたと報告した。組織学的研究により、小脳回の大部分においてプルキニェ細胞（Purkinje cells）が顕著に消失していることが判明した。小脳萎縮及び第四脳室拡張についての記載がある。同様の病理学的変化は、Bueler et al.（1994）及びManson et al.（1994）が作製したＰｒＰノックアウトマウスでは観察されなかった。Sakaguchi et al.（1996）は、この結果の違いは、マウス系統の違い、或いはＰｒＰ遺伝子内におけるノックアウトの程度の違いに起因する可能性があると述べた。特筆すべきは、記載されている３系統全てのノックアウトマウスにおいてプリオン感染感受性が消失していたことである。
【００５６】
Collinge et al.（1994）は、ＰｒＰヌルマウスに関する自らの研究に基づき、正常なシナプス機能にとってプリオンタンパク質が必要であると結論付けた。上記著者らは、細胞性ＰｒＰが翻訳後に修飾された形態であるＰｒＰScの生成に伴うドミナントネガティブ効果により、遺伝性プリオン病が引き起こされ、究極的には機能性ＰｒＰ（ＰｒＰC）が漸進的に消失すると主張した。Tobler et al.（1996）は、ＰｒＰヌルマウスにおいてサーカディアンリズムや睡眠の変化がみられることを報告し、かかる変化が致死性家族性不眠症における睡眠変化との興味深い類似性を示すものであると強調した。
【００５７】
ＰｒＰを欠損するマウスは正常に発達するが、スクレイピー耐性であり、ＰｒＰトランスジーンを導入することにより、スクレイピー病に対する感受性が回復する。かかる活性に必要なＰｒＰ内の領域を同定するため、Shmerling et al.（1998）は、アミノ近位（amino-proximal）に欠失をもつＰｒＰを発現するＰｒＰノックアウトマウスを調製した。驚くべきことに、第３２〜１２１残基又は第３２〜１３４残基は欠失しているが、それより短い欠失のないＰｒＰは、生後１〜３ヶ月という早い段階で重篤な運動失調、及び小脳の顆粒層に限定される神経細胞死を惹起した。この欠陥は、野生型ＰｒＰ遺伝子の複製を1つ導入することにより完全に防ぐことができた。Shmerling et al.（1998）は、上述の切断ＰｒＰが非機能的であり、ＰｒＰ様機能を有する別の分子と、共通リガンドを目指して競合するのではと推測した。
【００５８】
Telling et al.（1996）は、プリオン病における基本的現象は、細胞性プリオンタンパク質が病原性アイソフォームＰｒＰScへと転化する該タンパク質における構造変化であるとする見解を支持する観察結果を報告した。上記著者らは、致死性家族性不眠症（ＦＦＩ）においては、脱グリコシル後のＰｒＰScのプロテアーゼ耐性断片の大きさは１９ｋＤであるのに対し、他の遺伝性及び孤発性プリオン病におけるそれは２１ｋＤだったことを見出した。ＦＦＩ患者の脳から得た抽出物は、ヒト−マウスキメラＰｒＰ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスへの接種約２００日後に疾患を伝達し、１９−ｋＤのＰｒＰSc断片の形成を誘導したが、他方、家族性及び孤発性クロイツフェルト・ヤコブ病患者の脳から得た抽出物を接種した場合は、上述のマウスに２１−ｋＤのＰｒＰSc断片が産生された。Telling et al.（1996）の結果は、ＰｒＰScの構造が初期ＰｒＰSc形成を指示する鋳型として機能することを示しており、ＰｒＰSc構造内において多様性が暗号化されている各種プリオン株を説明する機構が示唆された。
【００５９】
Lindquist（1997）は、「一見無関係の現象が予期せぬ衝突をすることにより生まれた最もエキサイティングな科学の概念のひとつ」を指摘した。上記著者が論じているのは、酵母遺伝学における2つの不可解な問題は、プリオン仮説と同様の仮説により説明できるかもしれないとするWickner（1994）による示唆についてである。Two- yeast変異から、表現型の遺伝はときとして異なる核酸が遺伝するというより、むしろ異なるタンパク質構造が遺伝することに基づいている可能性があることを確信させる例が得られた。従って、酵母はプリオン様プロセスを研究する上で新しい重要なツールとなる可能性がある。さらに上記著者は、プリオンが病原性である必要はないと示唆した。実際、同著者は高分子の自発的構造変化は、クロマチン構造の変化に関連する現象等の後成現象だけでなく、発達途上で調節される一部の正常な現象をも含めた多様で正常な生物学的プロセスの中心に位置していることを示唆した。
【００６０】
Hegde et al.（1998）は、位相体の相対比率を変化させるＰｒＰ変異を発現するトランスジェニックマウスを用いて種々のＰｒＰ位相体の形態を研究した。ある位相体は完全に小胞体腔へと転位し、ＰｒＰ−Ｓｅｃと命名された。他の２つの位相体は、カルボキシル末端側から体腔側(ＰｒＰ−Ｃｔｍ)へ、又はアミノ末端側から体腔側（ＰｒＰ−Ｎｔｍ）へのいずれかの方向性により小胞体膜全体に及んでいる。高レベルのＰｒＰ−Ｃｔｍをもたらす変異をハーバリングするＦ２産生マウスは、５８±１１日に神経変性を発生した。ＰｒＰの過剰発現がその原因ではなかった。神経病理はスクレイピーのものと類似の変化を示したが、ＰｒＰScは存在しなかった。ＰｒＰ−Ｃｔｍの発現レベルは疾患の程度と相関していた。
【００６１】
Supattapone et al.（1999）は、野生型ＰｒＰを欠損する（Ｐｒｎｐ−／−）トランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおいて、大きな欠失を2つ有する１０６アミノ酸の編集後ＰｒＰが発現することから、プリオンの伝播が支持されると報告した。完全長ＰｒＰScを含むRocky Mountain laboratory（ＲＭＬ）プリオンは、約３００日後にＴｇ（ＰｒＰ１０６）Ｐｒｎｐ−／−マウスに疾患を発生させたが、他方、ＰｒＰSc106を含むＲＭＬ１０６プリオンを伝達した場合、反復継代により約６６日後にＴｇ（ＰｒＰ１０６）Ｐｒｎｐ−／−マウスに疾患を発生させた。約１６５日以内にスクレイピーを発病したＴｇ（ＰｒＰ１０６）Ｐｒｎｐ＋／−マウスに野生型のマウスＰｒＰCを共発現させることにより、ＲＭＬプリオンの継代に対する人工的伝達障壁が消失し、野生型のマウスＰｒＰが、ＲＭＬ１０６プリオンの複製をイントランスで加速する作用を有していることが示唆された。精製ＰｒＰSc106は、プロテアーゼ耐性であり、糸状体を形成し、非変性洗浄剤に不溶だった。
【００６２】
Kuwahara et al.(1999)は、Ｐｒｎｐ−／−及びＰｒｎｐ＋／＋マウスから海馬細胞株を樹立した。１４日齢マウス胚から、かかる培養物を樹立した。研究対象とした６細胞株は、その発達段階は異なるものの、全て神経前駆細胞系統に属していた。Kuwahara et al.(1999)は、細胞培養物から血清を除去するとＰｒｎｐ−／−細胞ではアポトーシスが生じたが、Ｐｒｎｐ＋／＋細胞では生じなかったことを見出した。プリオンタンパク質又はＢＣＬ２遺伝子に形質導入を行うことにより、無血清条件下におけるＰｒｎｐ−／−細胞のアポトーシスが抑制された。Ｐｒｎｐ−／−細胞はＰｒｎｐ＋／＋細胞のものより短い神経突起を伸張していたが、ＰｒＰを発現させることにより、Ｐｒｎｐ−／−細胞の神経突起の長さが伸びた。Kuwahara et al.(1999)は、かかる知見から、野生型プリオンタンパク質の機能消失がプリオン病の病理の一部要因になり得ると結論した。Ｙｅａｓｔ−２−ハイブリッドシステムにおいてＢＣＬ２遺伝子がプリオンタンパク質と相互作用することが既に報告されていたことから、上記著者らはＢＣＬ２遺伝子に形質導入を試みた。その結果は、哺乳動物細胞においてもＢＣＬ２とＰｒＰとの間に何らかの相互作用があることを示唆するものだった。
【００６３】
スクレイピー感染マウスにおいてプリオンは、循環Ｂ及びＴリンパ球でなく、脾臓Ｂ及びＴリンパ球と会合することが見出され、また濾胞樹状細胞を含む間質において見出される。成熟濾胞樹状細胞の形成及び維持には、膜結合型リンフォトキシン−α／βを発現させるＢ細胞の存在が必要とされる。可溶性リンフォトキシン−β受容体でマウスを処理すると、脾臓から成熟濾胞樹状細胞が消失する。Montrasio et al.（2000）は、上記処理により脾臓でのプリオン蓄積が消失し、またスクレイピーを腹腔内接種した後に神経侵入が遅延したことを明らかにした。Montrasio et al.（2000）は、脾臓におけるプリオン複製にとって濾胞性樹状細胞が主要な部位であることが、自分たちの研究結果により証明されたと結論した。
【００６４】
Chiesa et al.（1998）は、14回のオクタペプチド反復を含む変異プリオンタンパク質を発現するトランスジェニックマウス系統を作製した。この変異プリオンタンパク質のヒトホモログは、遺伝性プリオン痴呆と会合する。この挿入部はＰＲＮＰ遺伝子において同定されたものとしては当時最大のものであり、進行性痴呆及び運動失調によって、また小脳及び基底核におけるＰｒＰ含有アミロイドプラークの存在によって特徴付けられるプリオン病と会合していた（Owen et al., 1992; Duchen et al., 1993; Krasemann et al., 1995）。上記の変異タンパク質を発現するマウスは、トランスジーンアレイがそれぞれホモ接合性かヘミ接合性であるかにより、６５日齢又は２４０日齢で顕著な運動失調を伴う神経系の疾患を発症した。変異ＰｒＰは誕生直後からプロテアーゼに耐性及び洗浄剤に不溶な形態に転化したが、その形態はＰｒＰのスクレイピーアイソフォームに似たものだった。かかる形態は、マウスの生涯にわたり脳の多くの領域で劇的に蓄積した。ＰｒＰが蓄積するに連れ、小脳では顆粒細胞の大規模なアポトーシスが生じた。
【００６５】
非侵襲的
ここに用いる「非侵襲的」なる用語は、本発明の方法により被験者の表面が、損傷、穿孔、又は切断されないことが好ましいことを意味する。ここにおいて「表面」なる用語は、皮膚（内部、外部いずれも）を指し、また粘膜、呼吸器表面等の表面、或いは消化管、三半規管、口腔、咽喉等の解剖学的表面の壁部や、被験者におけるその他全ての表面を指す。
【００６６】
本発明の方法は、非侵襲的であることが好ましい。
【００６７】
組織／臓器
ここに用いられる「組織／臓器」なる用語は、本発明の方法により、プリオンの存在を試験する対象としての全ての組織／臓器を指す。
【００６８】
組織／臓器は、プリオンが蓄積する組織／臓器のいずれでもよく、又はそれら組織／臓器に由来するものでもよい。
【００６９】
組織／臓器が、脳、脾臓、リンパ節、又は扁桃腺であることが好ましい。組織／臓器が脳若しくは扁桃腺であることが、より好ましい。
【００７０】
組織／臓器は、生検若しくはホモジェネートの形状のものでもよい。
【００７１】
組織／臓器、生検、若しくはホモジェネートには、かかる組織／臓器における液、例えば喀痰、粘液又はそれ以外の液も含まれる。
【００７２】
ここに用いる「無損傷」なる用語は、最低限の場合を除いて、組織又は生検が、本発明のデバイス又は方法によって被験者から取り去られないことを意味する。
【００７３】
プリオンを結合する
ここに用いる「プリオンを結合する」なる用語は、接着、会合、結合、粘着、又はこれら以外のプリオンと金属表面との相互作用を意味する。
【００７４】
金属とプリオンは、共有結合、イオン結合、Van Der Waals結合、一時的又は可逆的会合、或いはこれら以外の形態での結合相互作用等、金属とタンパク質との間に生じることが可能な結合形態のいずれによってでも結合する。
【００７５】
プリオンを保存する
ここに用いる「プリオンを保存する」なる用語は、金属表面に結合したプリオンが保存されるという本発明に開示した驚くべき知見に言及するものである。ここにおいて「保存する」なる用語は、金属表面に結合したプリオンが分解から保護され、その感染性が通常予想されるより長期に維持されることを意味する。例えば、先行技術を用いる場合、脳に注入したプリオンの感染性は約２４時間しか保たれない。本発明の方法によれば、金属表面に結合したプリオンは、少なくとも３日間は脳内に保存されるので有利である。
【００７６】
さらにプリオンを保存するため、約−２０℃でデバイスをインキュベーションすることが有利である。プリオンとプロテアーゼとの接触を阻害したり、プリオンと食細胞との接触を阻害したりするなどのプリオンを分解から保護する作用により、上記保存性は一層強化される。
【００７７】
デバイス
ここに用いる「デバイス」なる用語は、本発明の方法に有用なデバイスであれば、いずれのデバイスにも言及するものである。
【００７８】
デバイスは、プリオンとの結合能を有するものであればどのようなデバイスでもよい。
【００７９】
デバイスが、ポリスチレン等のプラスチック、硝子、又は金属を含むことが好ましい。デバイスが金属を含むことが好ましい。金属が、スチール、ステンレススチール、銀、金、又はそれらの組合せからなるグループから選択される１若しくは２以上の金属を含むことが、より好ましい。最も好ましいのは、ワイヤーがステンレススチールを含むことである。ここにいう「それらの組合せ」なる用語は、合金中の少なくとも１種が、スチール、ステンレススチール、銀、又は金からなるグループから選択される２若しくは３以上の金属合金に言及するものである。
【００８０】
デバイスは、２若しくは３以上の種類の異なる金属、又は２若しくは３以上の種類の異なる金属合金を含むものでもよい。
【００８１】
デバイスが、１若しくは２以上の針、スパーテル、ピン、ワイヤー又は球を含むことが好ましい。デバイスが、１若しくは２以上のワイヤーを含むことがより好ましい。Braun Melsunger AG社（ドイツ）が市販しているステンレススチール製モノフィラメント縫合ワイヤーなどのように、それぞれ直径が約０．１５ｍｍ、長さが約５ｍｍである１若しくは２以上のワイヤーを含むデバイスが最も好ましい。
【００８２】
本発明の方法により組織／臓器をデバイスに接触させる。
【００８３】
デバイスを組織／臓器と接触させる前に滅菌することが好ましい。デバイスをバー１１（約１２１℃）で３０分間滅菌することがより好ましい。デバイスを、１ＭのＮａＯＨにバー１１（約１２１℃）で１時間３０分間浸漬するか、４Ｍのチオシアン酸グアニジウムに１６時間浸漬するかにより、滅菌することが最も好ましい。
【００８４】
デバイスに接触させる
被験者を覆っている皮膚表面を損傷、穿孔若しくは切断して、デバイスを組織／臓器と接触させる。組織／臓器が、脳、脾臓、扁桃腺、又はリンパ節であることが好ましい。
【００８５】
生存被験者には、デバイスとの接触前に全身若しくは局所麻酔を施す。その代わりとして、又はそれに加えて、被験者の意識を一部若しくは完全に消失せしめるように、鎮静剤を投与してもよい。
【００８６】
本発明の方法は、組織／臓器を貫通若しくは突刺して、デバイスを組織／臓器に挿入し、組織／臓器の表面にデバイスを接触させ、組織／臓器に付随する粘液等の液にデバイスを接触させ、又は他の何らかの方法でデバイスを組織／臓器に接触させることからなる。
【００８７】
非侵襲的方法
本発明の方法は、非侵襲的であることが好ましい。組織／臓器が無損傷で残ることが、より好ましい。
【００８８】
かかる非侵襲的方法により試験する組織／臓器は、プリオンが蓄積していればいかなる組織／臓器、生検、ホモジェネートであってもよい。
【００８９】
生存被験者に試験を行う場合の組織／臓器には、扁桃腺を用いる。扁桃腺へは経口で到達できるので、被験者の外側を覆う皮膚表面を損傷、穿孔若しくは切断することがない。
【００９０】
生存被験者を試験する場合は、デバイスとの接触前に、被験者が意識消失しない程度に軽鎮静剤を投与してもよい。その代わりとして、又はそれに加えて、被験者に局所麻酔を施してもよい。かかる麻酔は、１若しくは２以上の扁桃腺周辺部位に局所的に処すことが好ましい。
【００９１】
本発明の方法は、デバイスを組織／臓器に挿入し、組織／臓器の表面にデバイスを接触させ、喀痰、粘液等の液、又は組織／臓器に付随する他の液にデバイスを接触させることからなる。
【００９２】
デバイスと組織／臓器との接触時間は１２０分以下であることが好ましい。デバイスと組織／臓器との接触時間は３０分以下であることがより好ましい。デバイスと組織／臓器との接触時間は５分以下であることが最も好ましい。これらの時間は、本発明の侵襲的及び非侵襲的いずれの方法にも適用される。
【００９３】
デバイスを組織／臓器に接触させる所要時間が短いことは、本発明の利点である。その結果、他の先行技術の方法に比し、より速やかに、より経済的に結果を得ることが可能になる。またこれにより、生存被験者の場合における被験者の不快感や苦痛を軽減することができる。
【００９４】
デバイスの抜出（removing）
接触後、組織／臓器若しくはそれらの液からデバイスを抜出する。プリオンがデバイスに結合しているかどうかを直ちに試験してもよい。本発明では、プリオンがデバイスに結合すると保存される点が有利である。従って、試験するまでデバイスを貯蔵しておいてもよい。
【００９５】
デバイスは、約−２０℃以下で貯蔵することが好ましい。
【００９６】
デバイスの試験
本発明においては、プリオンがデバイス表面に結合しているかどうかを測定するためにデバイスの試験を行う。
【００９７】
本発明の実施態様の１つとして、１若しくは２以上のプリオン感染感受性実験動物との接触を含む方法により、デバイスを試験する。
【００９８】
本発明の別の実施態様においては、１若しくは２以上のプリオン感染感受性細胞株との接触を含む方法により、デバイスを試験する。
【００９９】
別の実施態様においては、プリオン／プリオンタンパク質をデバイス表面で直接検出する。かかる検出は、蛋白質測定法、免疫測定法、又はウエスタンブロット法等の方法を用いることにより可能である。
【０１００】
実験動物
ここに用いる「実験動物（test animal）」なる用語は、デバイスと接触させ、その組織／臓器にプリオンが含まれているかどうかが測定される動物全てを指す。実験動物は、プリオン感染に感受性を示す動物ならいずれの動物でもよい。
【０１０１】
好ましい実験動物は哺乳動物である。実験動物が成熟哺乳動物であることがより好ましい。さらに好ましくは、実験動物がラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、又はマウスであることである。最も好ましい実験動物はマウスである。
【０１０２】
実験動物は、Ｔｇａ２０マウスなどのようにトランスジェニックマウスでもよい。
【０１０３】
トランスジェニックマウスは、例えば好適宿主にＢＳＥを引き起こすプリオン株のように、特定のプリオン株がもたらすプリオン感染に感受性を示すものでもよい。
【０１０４】
デバイスを実験動物に接触させる
本発明においては、組織／臓器と接触させたデバイスを１若しくは２以上の実験動物と接触させる前に洗浄する。１回の洗浄に緩衝液５０ｍｌを用い、１０分間５回洗浄工程を繰り返すことが好ましい。リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液を用いることが好ましい。
【０１０５】
洗浄したデバイスを次に、ハロタン／Ｏ2等の麻酔剤により麻酔した実験動物と接触させる。
【０１０６】
脳への直接挿入などにより、デバイスの少なくとも一部を実験動物の脳内へ導入して接触させる方法が好ましい。実験動物の脳右頭頂葉にデバイスを直接挿入することが、より好ましい。
【０１０７】
デバイスは１若しくは２以上の実験動物の脳と接触させる。デバイスと１若しくは２以上の実験動物の脳との接触時間が、１実験動物につき１時間以下であることが好ましい。デバイスと１若しくは２以上の実験動物の脳との接触時間が、１実験動物につき５時間であることがより好ましい。デバイスと１若しくは２以上の実験動物の脳との接触時間が、１実験動物につき５時間以上であることがより好ましい。最も好ましいのは、デバイスと１若しくは２以上の実験動物の脳を永久に接触させることである。
【０１０８】
デバイスとの接触後、実験動物のインキュベーションを行う。ここにおいて、「インキュベーションを行う」なる用語は、当技術分野で十分公知の封じ込め施設等の好適条件下で実験動物を維持することを意味する。
【０１０９】
実験動物の観察
プリオン感染症状の発生を調べることにより、実験動物におけるプリオン感染の症状を観察する。症状を発症した実験動物の検査を定期的に行い、苦痛の兆候が現れたら殺処分してもよい。マウスにおけるプリオン感染の臨床症状の基準は、Carlson et al. (1986), Cell, 46, 503-511に記載されており、全身振戦、運動失調、尾部硬直、又は頭部の上下運動の兆候のうち少なくとも2つが含まれる。実験動物の生検を任意に行ってもよい。生検は、プリオンが蓄積している臓器や組織など、適切なものであればいずれの臓器や組織に対してでも行うことができる。脳生検を実施することが好ましい。
【０１１０】
プリオンタンパク質の検出には、ウエスタンブロット法（Collinge et al. 1996, Nature 383, 685-690）、免疫測定法（ＷＯ９８３７２１０号に記載）、及び電気特性のプロービング（ＷＯ９８３１８３９号に記載）等、当技術分野においてよく知られている種々の方法が採用できる。
【０１１１】
悪影響
ここに用いる「悪影響」なる用語は、プリオン感染によって生じる神経機能障害の臨床兆候のことである。プリオン感染の臨床兆候は当技術分野では十分公知である。臨床兆候が認められた場合、実験動物の検査を毎日実施する。１若しくは２以上の実験動物の死期が確実に近い場合、かかる実験動物は殺処分とし、組織病理学的研究及びプリオン感染確認のために脳を摘出する。
【０１１２】
トランスジェニック動物
ここに用いる「トランスジェニック動物」なる用語は、組換えＤＮＡ技術により導入された１若しくは２以上の遺伝子をそのゲノムに有する動物を指す。組換えＤＮＡ技術は当技術分野の専門家には公知である。トランスジェニック動物においては、「遺伝子」なる用語は「トランスジーン」という用語と同義である。
【０１１３】
本発明の実験動物はトランスジェニック実験動物であってよい。かかる実験動物が、トランスジェニックラット、トランスジェニックハムスター、トランスジェニックラビット、トランスジェニックモルモット又はトランスジェニックマウスであることが好ましい。より好ましいのは、実験動物がトランスジェニックマウスであることである。
【０１１４】
外因性ＰｒＰ遺伝子
ここに用いる「外因性ＰｒＰ遺伝子」なる用語は一般的に、いずれかの形態のＰｒＰアミノ酸配列又はタンパク質をコードする、いずれかの種のＰｒＰ遺伝子を指す。Gabriel et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 9097-9101 に、一般に知られているいくつかのＰｒＰ配列が記載されている。従って、「外因性ＰｒＰ遺伝子」なる用語は、「人工ＰｒＰ遺伝子」及び「キメラＰｒＰ遺伝子」をも包含するものである。ここにおいて「人工ＰｒＰ遺伝子」及び「キメラＰｒＰ遺伝子」とは、組換えＤＮＡ技術を用い、当技術の専門家には公知の方法により構築された遺伝子のことである。ある動物のゲノムに外因性ＰｒＰ遺伝子が含まれると、その動物に、本来その動物とは遺伝的に異なる種にしか感染しないプリオンによる感染に対して感受性が生じることになる。米国特許第５７９２９０１号、同５９０８９６９号、同６００８４３５号及びＷＯ９７０４８１４号に、人工ＰｒＰ遺伝子を有するトランスジェニック動物に関する記載がある。
【０１１５】
実験動物が、１若しくは２以上の外因性ＰｒＰ遺伝子を導入されたマウスであることが好適である。外因性ＰｒＰ遺伝子が哺乳動物のＰｒＰをコードすることが好ましい。外因性ＰｒＰ遺伝子が家畜若しくはヒトのＰｒＰ遺伝子をコードすることが最も好ましい。
【０１１６】
蛋白質測定法
本発明では、蛋白質測定法により１若しくは２以上のデバイスにおけるプリオンタンパク質の存在を試験する。組織／臓器と接触させたデバイスを緩衝液で洗浄する。この緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水であることが好ましい。次に上記デバイスをプロテイナーゼＫ又はアルカリ共存下にて２０℃で１時間インキュベーションする。このときのアルカリは２MのＮａＯＨであることが好ましい。ＢＳＡ希釈液を標準とするMicro BCA Protein assay（Pierce社製、 Rockford, IL, USA）等の蛋白質測定法により、溶出液中のタンパク質を定量する。
【０１１７】
免疫測定法
本発明では、免疫測定法によりデバイスにおけるプリオンの存在を試験する。簡潔に述べると、組織／臓器と接触させた１若しくは２以上のデバイスを緩衝液で洗浄する。この緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水であることが好ましい。検出されるプリオンタンパク質に特異的なモノクローナル抗体の共存下において、デバイスをインキュベーションする。５％ＢＳＡを用いてブロックする。その後、ウエスタンブロット法、酵素免疫濾過測定法、及び酵素免疫吸着測定法等により、結合抗体を検出する。これらの方法は、ＷＯ９８／３７２１０号に詳細に記載されている。
【０１１８】
細胞株
ここに用いる「細胞株」なる用語は、プリオンに対して感受性を示す１若しくは２以上の細胞型に言及するものである。かかる細胞株としては、ヒツジやマウスにスクレイピーを引き起こすプリオンなど、哺乳動物から単離したプリオンに対して感受性を示すものが好ましい。より好ましいのは細胞株が、ＢＳＥ、ＣＪＤ若しくはｖＣＪＤを引き起こすプリオンなど、家畜やヒトから単離したプリオンに対する感受性を有することである。
【０１１９】
Bosque and Prusiner (2000), J. Virol. 74, 4377-4386は、マウスにスクレイピーを引き起こすＲＭＬプリオンに対し感受性を示すＮ２ａという細胞株に関する記載である。ＲＭＬプリオンに感染したマウスの脳ホモジェネートを、Ｎ２ａ細胞株に接種すると、１５日後にセルブロット法によりプリオンタンパク質が検出された。２０日後にネガティブだった培養物は、その後もネガティブを保っていたので、接種後２０日目以降にアッセイに供した。
【０１２０】
本発明では、１若しくは２以上の細胞株を用いて、１若しくは２以上のデバイスにおけるプリオンタンパク質の存在を試験する。簡潔に述べると、組織／臓器と接触させた１若しくは２以上のデバイスを緩衝液で洗浄する。この緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水であることが好ましい。当技術分野で公知の方法により、上記細胞株を増殖させる。デバイスと細胞株の接触時間が１時間以上であることが好ましい。デバイスと細胞株の接触時間が５時間以上であることが、より好ましい。デバイスと細胞株の接触時間が５時間を超えることが、より好ましい。デバイスと細胞株の接触時間が１日以上であることが、より好ましい。デバイスと細胞株の接触時間が３日以上であることが、より好ましい。デバイスと細胞株の接触時間が３日を超えることが、より好ましい。これらの細胞を培養し、４日後に、１：１０の割合で新鮮培地に播く。細胞株におけるプリオンタンパク質の存在は、当技術分野で公知の種々の方法により検出される。用いる方法としては、蛋白質測定法、免疫測定法、ウエスタンブロット法、又はセルブロット法が好ましい。より好ましい方法は、セルブロット法である。
【０１２１】
セルブロット法
本発明では、１若しくは２以上のデバイスに接触させた１若しくは２以上の細胞株におけるプリオンタンパク質の存在を、Bosque and Prusiner (2000), J. Virol. 74, 4377-4386の方法に従ったセルブロット法により検出する。簡潔に述べると、 ２４−ウエルプレートの各ウエルにプラスチックカバースリップを置き、それらのウエルに細胞を載せる。４日後に培地を取り除き、ＰＢＳ等の緩衝液でウエルを洗浄する。ニトロセルロース膜を溶解緩衝液に浸漬し、細胞がニトロセルロース膜と接触するようにカバースリップに該膜を強く押し付ける。この膜をプロテイナーゼＫ共存下でインキュベーションし、蒸留水で洗浄する。次に、上記ブロットを変性緩衝液で洗浄し、ブロックした（５％無脂肪粉ミルク及び０．１％Tween-20）。次にこのブロットを、検出されるＰｒＰSc型に特異的な抗体の共存下においてインキュベーションし、ウエスタンブロット法におけると同様の手順に従った。Bosque and Prusiner (2000), J. Virol. 74, 4377-4386は、セルブロット法は、ウエスタンブロット法に比べ、約１５０倍の感度を有すると報告した。
【０１２２】
作用因子の同定
別の特徴として本発明は、１若しくは２以上の作用因子の同定法を提供するものである。少なくとも2つのデバイスを同じ組織／臓器と接触させる。次にこれらのデバイスを組織／臓器から抜出する。少なくとも1つのデバイスに結合したプリオンの量を推定する。少なくとも1つのデバイスを作用因子（1若しくは２以上）共存下でインキュベーションする。作用因子とのインキュベーション後、デバイスに結合したプリオンの量を推定する。作用因子とのインキュベーションの前後にデバイスに結合したプリオンの量を測定する。作用因子により、デバイスに結合するプリオンの量が減少することが好ましい。作用因子がプリオン感染性を調節することが、より好ましい。
【０１２３】
プリオンレベルの推定
デバイスに結合したプリオンの量を、蛋白質測定法、免疫測定法、ウエスタンブロット法等の方法により、或いは細胞株を用いたセルブロット法により推定する。
【０１２４】
作用因子
ここに用いる「作用因子」なる用語は、単一の実存物質（entity）又は実存物質の組合せである。
【０１２５】
作用因子は、有機化合物又は他の化学物質である。作用因子は、入手可能な形態の化合物、又は天然、人工を問わず適当な材料から産生される化合物である。作用因子は、アミノ酸分子、ポリペプチド、又はそれらの化学誘導体、又はそれらの組合せである。作用因子は、センス分子又はアンチセンス分子を問わずポリヌクレオチド分子であってもよい。作用因子は抗体でもよい。
【０１２６】
作用因子は、設計してもよく、ペプチド若しくは有機小分子等の他の化合物を含む化合物のライブラリーから入手可能のものであってもよい。
【０１２７】
作用因子としては、天然物質、生物高分子、細菌若しくは真菌若しくは動物（特に哺乳動物）細胞・組織等の生物材料から生成された抽出物、有機若しくは無機分子、合成作用因子、半合成作用因子、構造的若しくは機能的模倣体、ペプチド、模倣ペプチド、誘導化作用因子、全タンパク質から分裂したペプチド、又は合成的に合成されたペプチド（例えばペプチド合成装置を用いて、又は組換え技術、又はそれらを組み合わせて）、組換え作用因子、抗体、天然若しくは人工作用因子、融合タンパク質若しくはその均等物及び変異体、それらの誘導体又は組合せ、が列挙される。
【０１２８】
作用因子は通常、有機化合物である。有機化合物は通常、２若しくは３以上のヒドロカルビル基を有する。ここにおいて「ヒドロカルビル基」とは、少なくともＣ及びＨを含む基のことであり、任意に１若しくは２以上の他の適当な置換基を有していてもよい。置換基の例としては、ハロ−、アルコキシ−、ニトロ−、アルキル基、環式基などがある。置換基が環式基である可能性に加えて、置換基を組み合わせたものも環式基を構成する。ヒドロカルビル基が２個以上のＣを有する場合、それらの炭素は必ずしも互いに結合していなくてもよい。例えば炭素のうち少なくとも２個の炭素が適当な元素又は基を介して結合していてもよい。従って、ヒドロカルビル基にはヘテロ原子が含まれていてもよい。当技術分野の専門家には適当なヘテロ原子は明らかであるが、例えば硫黄、窒素、酸素などがある。一部の適用例においては作用因子が少なくとも１個の環式基を有することが好ましい。環式基は、非融合多環式基等の多環式基でもよい。一部の適用例においては、上記環式基が別のヒドロカルビル基に結合したものが少なくとも１つ作用因子に含まれている。
【０１２９】
作用因子にはハロ基が含まれていてもよい。ここにおいて「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードのことである。
【０１３０】
作用因子には１個若しくは２個以上の非分枝鎖状若しくは分枝鎖状のアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキレン及びアルケニレンの各基が含まれていてもよい。
【０１３１】
作用因子の形状は、酸付加塩又は塩基性塩等の薬理学的に許容される塩、或いは水和物を含むその溶媒和物であってもよい。適当な塩に関してはBerge et al, J. Pharm. Sci., 1977,66, 1-19を参照のこと。
【０１３２】
本発明の作用因子は、他の治療上の特性を示すことが可能である。
【０１３３】
作用因子は、１若しくは２以上の他の薬理学的に活性な作用因子と併用してもよい。
【０１３４】
複数の活性作用因子を併用して投与する場合は、同時に、個別に、又は連続して投与してよい。
【０１３５】
さらなる特徴として本発明は、１若しくは２以上の作用因子の同定法を提供する。かかる方法は、プリオン結合能を有するデバイスを組織／臓器に接触させ、該組織／臓器との接触から該デバイスを抜き出し、該デバイスに結合したプリオンの量を推定し、作用因子を該デバイスとインキュベーションし、該作用因子により該デバイスに結合するプリオンの量が減少したかどうかを測定する工程からなるものである。
【０１３６】
従って別の特徴として本発明は、プリオン感染を調節し得る１若しくは２以上の作用因子に関する。かかる作用因子は、薬剤調製に有利に用いられる。従って本発明の別の特徴は、被験者に治療有効量の上記作用因子を投与し、該被験者におけるプリオン感染性を調節することに関する。
【０１３７】
アミノ酸配列
アミノ酸配列には本発明の作用因子が含まれていてもよい。
【０１３８】
ここにおいて、「アミノ酸配列」なる用語は、「ポリペプチド」及び／又は「タンパク質」という用語と同義である。場合によっては、「アミノ酸配列」なる用語が「ペプチド」なる用語と同じ意味である。場合によっては、「アミノ酸配列」なる用語が「タンパク質」なる用語と同じ意味である。
【０１３９】
アミノ酸配列は、適当な材料から単離するか、合成して作製するか、組換えＤＮＡ技術により調製するかのいずれでもよい。
【０１４０】
ヌクレオチド配列
ヌクレオチド配列は、本発明の組成物の成分として使用されるアミノ酸配列を発現させるために用いられる。
【０１４１】
ここにおいて、「ヌクレオチド配列」なる用語は、「ポリヌクレオチド」なる用語と同義である。
【０１４２】
ヌクレオチド配列は、ゲノム又は合成又は組換えに端を発するＤＮＡ若しくはＲＮＡである。ヌクレオチド配列は、センス鎖若しくはアンチセンス鎖のいずれかの二本鎖若しくは一本鎖、又はそれらの組合せのいずれでもよい。
【０１４３】
ヌクレオチド配列はＤＮＡであってもよい。
【０１４４】
ヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ技術（例えば組換えＤＮＡ）を用いて調製できる。
【０１４５】
ヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡであってもよい。
【０１４６】
ヌクレオチド配列は、自然に発生する配列と同じでもよく、それに由来するものでもよい。
【０１４７】
変異体／ホモログ／誘導体
本発明はまた、変異体、ホモログ及びそれらの誘導体の使用も包含するものである。ここにおいて、「ホモログ」なる用語は、対象とするアミノ酸配列及び対象とするヌクレオチド配列とある程度の相同性を有する実存物質を意味する。ここにおいて、「相同性（homology）」なる用語は、「同一性（identity）」と言い換えることもできる。
【０１４８】
本発明の文脈において相同配列には、対象とする配列と、少なくとも７５、８５若しくは９０％の同一性を示し、好ましくは少なくとも９５若しくは９８％の同一性を示すアミノ酸配列が含まれると解される。通常相同配列は、対象とするアミノ酸配列と同じ活性部位等を有する。相同性は類似性として捉えることもできるが（すなわち、アミノ酸残基が類似の化学特性・機能を有する）、本発明の文脈においては相同性が配列の同一性を表すことが好ましい。
【０１４９】
本発明の文脈において相同配列には、対象とする配列と、少なくとも７５、８５若しくは９０％の同一性を示し、好ましくは少なくとも９５若しくは９８％の同一性を示すヌクレオチド配列が含まれると解される。通常相同体は、活性部位等をコードする配列として、対象とする配列と同じ配列を有している。相同性は類似性として捉えることもできるが（すなわち、アミノ酸残基が類似の化学特質・機能を有する）、本発明の文脈においては相同性が配列の同一性を表すことが好ましい。
【０１５０】
相同性の比較は肉眼により、さらに一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けを借りて行うことができる。これら市販コンピュータープログラムにより、２若しくは３以上の配列間における相同性の割合（％）が計算できる。
【０１５１】
相同性の割合は、隣接する配列を基に計算される。すなわち、一方の配列を他方の配列と並べ、一方の配列中の各アミノ酸を、他方の配列中の対応するアミノ酸と直接、一残基毎に比較するのである。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれる。通常、このようなギャップなしアラインメントは、比較的残基数の少ない場合に行われる。
【０１５２】
上記の方法は、非常に簡便かつ堅実な方法であるが、１つの挿入部又は欠失部以外は同一な2つの配列において、かかる挿入部又は欠失部以降のアミノ酸残基がアラインメントから外れてしまう結果になるということが考慮されず、その結果、全体のアラインメントが終了したときの相同性の割合が大きく低下してしまう可能性がある。結果的に殆どの配列比較法は、全体としての相同性スコアに不当にペナルティを課すことなく、可能性のある挿入部又は欠失部を考慮に入れた最適化アラインメントを作出するように設計されている。これは、局所相同性を最大化することを意図して、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することにより実現される。
【０１５３】
しかしながら、より複雑なこれらの方法は、アラインメントで生じるそれぞれのギャップに「ギャップペナルティ」を課すことになり、同数の同一アミノ酸に対し、配列アラインメント内のギャップ数が少なければ少ないほど（比較する２つの配列間における高い関連性を反映して）、ギャップ数の多い場合より高いスコアが得られる。ギャップの存在に対し相対的に高いコストを課し、ギャップ内に続く残基の各々に、より少ないペナルティを課す「アフィンギャップコスト」が通常使用される。これは最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。当然のことながら高いギャップペナルティは、より少ないギャップで最適化アラインメントをもたらす。殆どのアラインメントプログラムは、ギャッププログラムに修正を加えることを認めている。しかし、そのようなソフトウエアを配列比較に用いる際には、初期値を使用することが好ましい。例えば、GCG Wisconsin Bestfit packageを使う場合のアミノ酸配列に対する初期ギャップペナルティは、ギャップ１個につき−１２で、各ギャップ延長につき−４である。
【０１５４】
従って相同性の最大割合（％）を計算するには、まず、ギャップペナルティを考慮した上で最適化アラインメントを作製する必要がある。かかるアラインメントを実現するのに適したコンピュータープログラムは、GCG Wisconsin Bestfit package（University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12: 387）である。配列比較を行えるソフトウエアの例としては他にも、BLAST package（Ausubel et al., 1999 ibid-Chapter 18を参照）、FASTA（Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403-410）、及びGENEWORKSの比較ツールセットがあるが、これらに限定されない。BLAST及びFASTAはいずれもオフライン及びオンラインでのサーチに利用できる（Ausubel et al., 1999 ibid、7-58〜7-60頁を参照）。しかし適用例の中には、GCG Bestfitプログラムを使用することが好ましい場合もある。BLAST 2 Sequencesという新しいツールもタンパク質とヌクレオチド配列との比較を行うために利用できる（FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8を参照）。
【０１５５】
最終的な相同性割合は同一性に換算して求められものの、通常アラインメントプロセス自体は、オールオアナッシング（all-or-nothing）という考えに依拠して2つの配列を比較するものではない。その代わり、化学的類似性又は進化論的距離に基づき、２つ１組の比較にスコアを与える類似性スコア拡大縮小マトリックス（scaled similarity score matrix）が一般的に使用される。そのようなマトリックスの中でよく用いられるものとして、BLASTプログラムセットの初期マトリックスであるBLOSUM62 matrixが例示される。GCG Wisconsinプログラムには一般的に公開初期値を、カスタムシンボル比較表（custom symbol comparison table）（詳細はユーザーマニュアルを参照）がある場合は、それらのいずれかを使用する。適用例の中には、GCG packageには公開初期値を、また他のソフトウエアには、BLOSUM62などの初期マトリックスを用いることが好ましい場合がある。
【０１５６】
ソフトウエアが一旦最適化アラインメントを作製すると、相同性割合、好ましくは配列同一性割合を計算することが可能になる。通常ソフトウエアは配列比較の一部として上記計算を行い、数字で結果を出す。
【０１５７】
配列にはまた、アミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換があり、沈黙の変化をもたらし、機能的同等物を産生する。残基の極性、電荷、可溶性、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性に基づき、物質の二次結合活性が保持される限りにおいて意図的にアミノ酸の置換を行ってもよい。例えば、負電荷アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正電荷アミノ酸にはリシン及びアルギニンが含まれ、同じような親水性値を有する無電荷極性頭部基をもつアミノ酸にはロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンが含まれる。
【０１５８】
例えば下記の表に基づき、保存的置換を行うことができる。２段目の同じブロック内のアミノ酸同士、及び好ましくは３段目の同じ行にあるアミノ酸同士は、互いに置換させてもよい。
【０１５９】
【表Ａ】
2004530107.tif 000002
本発明はまた、相同的置換（ここでは、置換（substitution）及び交換（replacement）はいずれも、既存のアミノ酸残基を他の残基と入れ替えることを意味する）の発生、すなわち、塩基性と塩基性、酸性と酸性、極性と極性など、既存物ベース（like-for-like）の置換が生じることもその範囲に含むものである。非相同的置換、すなわち、ある分類の残基から別の分類の残基への置換、或いは、オルニチン（以下Ｚと記す）、ジアミノ酪酸オルニチン（以下Ｂと記す）、ノルロイシンオルニチン（以下Ｏと記す）、ピリルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシン等の非天然型アミノ酸を含めることも包含している。
【０１６０】
α*及びα二基置換*アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸*、乳酸*、天然型アミノ酸のハロゲン化誘導体（トリフルオロチロシン*、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン*、ｐ−Ｂｒ−フェニルアラニン*、ｐ−Ｉ−フェニルアラニン*、Ｌ−アリル−グリシン*、β−アラニン*、Ｌ−α−アミノ酪酸*、Ｌ−γ−アミノ酪酸*、Ｌ−α−アミノイソ酪酸*、Ｌ−ε−アミノカプロン酸#、７−ヘプタン酸*、Ｌ−メチオニンスルホン#*、Ｌ−ノルロイシン*、Ｌ−ノルバリン*、ｐ−ニトロ−Ｌ−フェニルアラニン*、Ｌ−ヒドロキシプロリン#、Ｌ−チオプロリン*など）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）のメチル誘導体[４−メチル−Ｐｈｅ*、ペンタメチル−Ｐｈｅ*、Ｌ−Ｐｈｅ（４−アミノ）#、Ｌ−Ｔｙｒ（メチル）*、Ｌ−Ｐｈｅ（４−イソプロピル）*、Ｌ−Ｔｉｃ（１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシル酸）*、Ｌ−ジアミノプロピオン酸#及びＬ−Ｐｈｅ（４−ベンジル）*など]を含む非天然型アミノ酸によって交換を行ってもよい。記号*は、上記の説明に照らして（相同的又は非相同的置換に関連して）つけたものであって誘導体が疎水性であることを示し、記号#は、誘導体が親水性であることを示し、また記号#*は、誘導体が両親媒性であることを示している。
【０１６１】
変異型アミノ酸配列には、配列中の２個のアミノ酸の間ならどこにでも挿入できる適当なスペーサー基を含んでいてもよく、かかるスペーサー基には、グリシン又はβ−アラニン残基等のアミノ酸スペーサーの他にメチル、エチル又はプロピル基等のアルキル基が含まれる。さらなる変異型には１個若しくは２個以上のアミノ酸残基がペプトイド型で存在することが含まれ、当技術分野の専門家には十分理解されるものである。誤解を招かないように、ここにおいて、「ペプトイド型」とは、α−炭素置換基が、残基内においてα−炭素上よりむしろ窒素原子上に存在している変異型アミノ酸残基のことである。ペプトイド型ペプチドの調製法については、例えば、Simon RJ et al., PNAS (1992)89(20), 9367-9371 and Horwell DC, Trends Biotechnol.(1995)13(4), 132-134等の文献に見出せる。
【０１６２】
本発明に用いるヌクレオチド配列は、その中に合成若しくは修飾ヌクレオチドが含まれていてもよい。オリゴヌクレオチドに施す種々多様の修飾の形は当技術分野では公知である。かかる修飾には、メチルホスホン酸バックボーン及びホスホロチオ酸バックボーン、及び／又は、分子の３´及び／又は５´末端へのアクリジン鎖又はポリリシン鎖の付加が含まれる。本発明の目的を達成するために、ここに説明するヌクレオチド配列は、当技術で利用されるいずれの方法によって修飾されても構わない。そのような修飾は、本発明において有用なヌクレオチド配列のインビボでの活性増強や寿命延長を図るために行われる。
【０１６３】
本発明はさらに、ここに開示された方法により同定された配列との相補ヌクレオチド配列若しくはそれらの誘導体、断片若しくはその誘導体の使用にも関する。配列がその断片と相補的であれば、その配列は別の生物等における類似のコード配列を同定するためのプローブとして用いることができる。
【０１６４】
ハイブリダイゼーション
本発明にはまた、ヌクレオチド配列、又は誘導体、断片若しくはその誘導体とのハイブリダイズ能を有するヌクレオチド配列の使用も含まれる（作用因子がアンチセンス配列の場合など）。
【０１６５】
ここにおいて、「ハイブリダイゼーション」とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術による増幅方法と同様に、「塩基ペアリングによって核酸鎖を相補鎖に結びつける方法」をも含むものである。
【０１６６】
「変異型」なる用語には、他のヌクレオチド配列とのハイブリダイズ能を有する配列と相補的な配列も含まれる。
【０１６７】
「変異型」なる用語が、ストリンジェントな条件下（例えば、５０℃、０．２×ＳＳＣ[１×ＳＳＣ=０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ  Ｎａ3クエン酸  ｐＨ７．０]）でヌクレオチド配列とのハイブリダイズ能を有する配列と相補的な配列を包含することが好ましい。
【０１６８】
より好ましいのは、「変異型」なる用語が、高度にストリンジェントな条件下（例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣ[１×ＳＳＣ=０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１５Ｍ  Ｎａ3クエン酸  ｐＨ７．０]）でヌクレオチド配列とのハイブリダイズ能を有する配列と相補的な配列を包含することである。
【０１６９】
分泌
ポリペプチドは、発現宿主から、より簡便にポリペプチドを回収できる培養培地へと分泌される。
【０１７０】
構築物
「共役体」、「カセット」、及び「ハイブリッド」等の用語と同じ意味を有する「構築物」なる用語には、直接的又は間接的にプロモーターに結合する本発明に有用なヌクレオチド配列が含まれる。「融合」なる用語には、直接的又は間接的な結合が含まれる。通常は野生型遺伝子プロモーターと会合するタンパク質をコードするヌクレオチド配列が自然に結びつくとき、また両方の配列が自然環境下にあるときは、これらの用語に含まれない場合もある。
【０１７１】
構築物が導入された例えば細菌、好ましくはBacillus subtilis等のBacillus属の細菌又は植物において遺伝的構築物の選択を可能にするために、構築物にさらにマーカーを含有させるか発現させることもできる。使用できるマーカーは数多く存在し、マンノース−６−リン酸イソメラーゼをコードするマーカー（特に植物に対して）、或いはＧ４１８耐性、ヒグロマイシン耐性、ブレオマイシン耐性、カナマイシン耐性及びゲンタマイシン耐性等の抗生物質耐性をもたらすマーカー等が例示される。
【０１７２】
ベクター
「ベクター」なる用語には、発現ベクター、形質転換ベクター、及びシャトルベクターが含まれる。
【０１７３】
「発現ベクター」なる用語は、インビボ又はインビトロでの発現が可能な構築物を意味する。
【０１７４】
「形質転換ベクター」なる用語は、ある実存物質から別の実存物質へと伝達させることが可能な構築物を意味し、これら実存物質は同じ種でも異なる種でもよい。構築物がある種から別の種へと伝達され得るとき、例えばE.coliプラスミドからBacillus属等の細菌へ伝達され得るとき、かかる形質転換ベクターは「シャトルベクター」と呼ばれることがある。シャトルベクターは、E.coliプラスミドからアグロバクテリア菌へと導入され、それがさらに植物に導入されることさえ可能な構築物である。
【０１７５】
ベクターを、下記に説明するように適切な宿主細胞に導入し、本発明の範疇にあるポリペプチドを発現させる。従って本発明はさらなる特徴として、本発明に用いるポリペプチドの調製法を提供するものであり、かかる調製法は、上述したように発現ベクターを導入又はトランスフェクトした宿主細胞を、ポリペプチドをコードするコード配列のベクターによる発現が可能な条件下において培養し、発現したポリペプチドを回収することからなる方法である。
【０１７６】
ベクターとしては、複製起点を有するプラスミド、ウイルス、又はファージベクター、任意に上記ポリヌクレオチドの発現プロモーター及び任意にかかるプロモーターの調節因子が例示される。
【０１７７】
ベクターには、１若しくは２以上の選択マーカー遺伝子が含まれていてもよい。産業用微生物に対する最適な選択系は、宿主生物内において変異を必要としない選択マーカー集団によって形成されるものである。真菌選択マーカーとしては、アセタミダーゼ（ａｍｄＳ）、ＡＴＰ合成酵素、サブユニット９（oliC）、オロチジン−５´−リン酸−脱炭酸酵素（ｐｖｒＡ）、フレオマイシン耐性及びベノミル耐性（ｂｅｎＡ）の各遺伝子が例示される。非真菌選択マーカーとしては、細菌性Ｇ４１８耐性遺伝子（これは酵母にも使用できるが、糸状菌には使えない）、アンピシリン耐性遺伝子（E. coli）、ネオマイシン耐性遺伝子（Bacillus）、及びβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）をコードするE. coli uidA遺伝子が例示される。
【０１７８】
ベクターは、例えばＲＮＡ産生のため、若しくは宿主細胞のトランスフェクション及び形質転換に用いるため、インビトロで用いることができる。
【０１７９】
従って本発明に用いるポリヌクレオチドは、例えばクローニングベクター又は発現ベクター等の組換えベクター（特に複製ベクター）に取り込むことができる。かかるベクターは適合宿主細胞において核酸を複製するのに用いられる。従って、ポリヌクレオチドを複製ベクターに導入し、該ベクターを適合宿主細胞に導入し、また該宿主細胞を、ベクター複製を生じさせる条件下で増殖させることにより、多量のポリヌクレオチドが作出される。ベクターは宿主細胞から回収する。好適な宿主細胞については発現ベクターとの関連で下記に説明する。
【０１８０】
遺伝子工学的に作出された宿主細胞は、作用因子及び拮抗因子を同定するスクリーニング法において、アミノ酸配列（又はその変異体、ホモログ、断片又はその誘導体）を発現させることに用いられる。このような遺伝子工学的に作出された宿主細胞をペプチドライブラリー又は有機分子のスクリーニングに用いることができる。拮抗因子、及び抗体、ペプチド、又は有機小分子等の作用因子は、薬理組成物の基礎となる。プリオン感染治療における治療薬として、かかる作用因子又は拮抗因子は、単独又は他の治療薬との併用のいずれで投与してもよい。
【０１８１】
発現ベクター
ヌクレオチド配列は組換え複製ベクターに取り込むことができる。かかるベクターは、ヌクレオチド配列の複製・発現に用いられる。発現は、プロモーター／エンハンサー及び他の発現調節シグナルを含む制御配列を使用することによって制御できる。原核プロモーター、及び真核細胞において機能を有するプロモーターが使用される。組織特異的又は刺激特異的プロモーターが用いられる。上記２若しくは３以上の異なるプロモーターの配列エレメントを有するキメラプロモーターもまた用いられる。
【０１８２】
ヌクレオチド配列を発現させることにより、宿主組換え細胞によって産生されるタンパク質は、その配列及び／又は使用するベクターによって、分泌されるか或いは細胞内で保持されるが決まる。特定の原核又は真核細胞膜を介して配列をコードする物質の分泌を指示するシグナル配列を、コード配列を用いて設計することができる。
【０１８３】
融合タンパク質
本発明に用いられるアミノ酸配列を、例えば、抽出及び精製の補助とするための融合タンパク質として作出してもよい。融合タンパク質とするためのパートナーとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘＨｉｓ、ＧＡＬ４（ＤＮＡ結合及び／又は転写活性化ドメイン）及びβ−ガラクトシダーゼなどが挙げられる。融合タンパク質パートナーとタンパク質配列との間に、融合タンパク質配列を除去させるためのタンパク質分解開裂部位を含めても都合よい。融合タンパク質がタンパク質配列の活性を阻害しないことが好ましい。
【０１８４】
融合タンパク質には、目的物質に融合させた抗原又は抗原決定基が含まれていてもよい。融合タンパク質は、免疫系の全身性刺激をもたらすという意味においてアジュバントとして作用する物質を有する非天然に生成された融合タンパク質であってもよい。抗原又は抗原決定基は、かかる物質のアミノ末端又はカルボキシ末端いずれに結合させてもよい。
【０１８５】
融合タンパク質をコードするためにアミノ酸配列を異種配列と結合させてもよい。例えば、上記物質の活性に影響し得る作用因子のペプチドライブラリーをスクリーニングする際に、市販抗体によって認識される異種エピトープを発現させるキメラ物質をコードすることが有用であるとも考えられる。
【０１８６】
立体異性体及び幾何異性体
作用因子は、立体異性体及び／又は幾何異性体として存在することができる。例えば、作用因子は１若しくは２以上の不斉中心及び／又は幾何中心を有し、２若しくは３以上の立体異性型及び／又は幾何異性型として存在し得る。本発明は、かかる作用因子の立体異性体及び幾何異性体の全体を個別に、又はそれらを混合して使用することを意図する。これらの形態が適切な機能的活性をもち続ける限りにおいて（必ずしも同程度の活性を維持しなくてもよいが）、請求項に用いる用語はこれらの形態を包含するものである。
【０１８７】
薬理学的塩
作用因子は薬理学的に許容される塩としての剤型で投与される。
【０１８８】
薬理学的に許容される塩は、当技術分野の専門家には公知であり、例えば、Berge et al, in J. Pharm. Sci., 66, 1-19 (1977) に記載されている塩が該当する。好適な酸付加塩は、非毒性塩を形成する酸から形成することができ、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸、硫酸、重硫酸、リン酸、リン酸水素、酢酸、トリフルオロ酢酸、グルコン酸、乳酸、サリチル酸、クエン酸、タトル酸、アスコルビン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、ギ酸、安息香酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸及びｐ−トルエンスルホン酸が含まれる。
【０１８９】
１若しくは２以上の酸性成分が存在するとき、薬理学的に許容される適切な塩基が付加された塩は、非毒性塩を形成する塩基から形成することができ、アルミニウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩、及びジエタノールアミン塩等の薬理学的に活性なアミン類が含まれる。
【０１９０】
作用因子における薬理学的に許容される塩は、作用因子の溶液と必要な酸又は塩基を適宜混合することにより、容易に調製できる。かかる塩を溶液中で沈殿させ、濾過により回収するか、又は溶媒を留去させることにより回収する。
【０１９１】
作用因子は、多型性として存在することができる。
【０１９２】
作用因子には、１若しくは２以上の不斉炭素原子が含まれていてもよく、従って作用因子は２若しくは３以上の立体異性型として存在する。作用因子がアルケニル又はアルケニレン基を有するとき、シス（Ｅ）及びトランス（Ｚ）異性もまた生じる。本発明は、作用因子の個々の立体異性体、適宜にその個々の互変異性型、またその混合物を含むものである。
【０１９３】
ジアステレオ異性体又はシス−及びトランス−異性体は、例えば作用因子又はその適切な塩若しくは誘導体の立体異性体混合物に、画分の結晶化、クロマトグラフィー又はＨＰＬＣといった従来法を施すことにより分離できる。作用因子の個別の鏡像異性体もまた、対応する光学的に純粋な中間体から調製されるか、或いは、適切な対掌性支持体を用いて、ＨＰＬＣ等により対応ラセミ体を分解することにより調整されるか、或いは、対応ラセミ体を、適当な光学活性を有する酸又は塩基と適宜に反応させて形成されたジアステレオ異性塩の画分を結晶化することにより調製される。
【０１９４】
また本発明は、作用因子又はその薬理学的に許容される塩の適切な同位体バリエーション（isotopic variations）を全て含む。作用因子又はその薬理学的に許容される塩の同位体バリエーションとは、少なくとも１個の原子が、原子番号は同じだが自然界で通常見出されるものとは原子量が異なる原子に置換されているものと定義される。作用因子又はその薬理学的に許容される塩に取り込まれてもよい同位体には、例えば、それぞれ水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素及び塩素の同位体である2Ｈ、3Ｈ、13Ｃ、14Ｃ、15Ｎ、17Ｏ、31Ｐ、32Ｐ、35Ｓ、18Ｆ及び36Ｃｌ等が含まれる。作用因子又はその薬理学的に許容される塩の同位体バリエーションの中には、例えば3Ｈや、14Ｃなどの放射性同位体が取り込まれたもののように、薬剤及び／又は基質の組織分布の研究用として有用なものがある。トリチウム化した同位体（3Ｈ）、及び炭素１４同位体（14Ｃ）は、その調製及び検出が簡便な点で特に好ましい。さらに重水素（2Ｈ）等の同位体で置換すると代謝安定性が向上し、例えばインビボでの半減期の延長又は必要投与量の低減化などの一定の治療上の利点が得られので、好ましい場合がある。本発明の作用因子又は本発明におけるその薬理学的に許容される塩の同位体バリエーションは一般的に、適切な試薬の好適な同位体バリエーションを用いて従来どおりの手順により調製される。
【０１９５】
作用因子がプロドラッグに由来してもよいことは当技術の専門家には理解されるところである。プロドラッグとしては、保護基（１又は複数）を有し、そのままでは薬物学的活性はもたないが、状況次第で投与に供してもよく（経口又は非経口で）、投与されると体内で代謝されて薬物学的に活性な本発明作用因子を形成する実存物質が例として挙げられる。
【０１９６】
例えばH. Bundgaard, Elsevier,1985「プロドラッグの設計（Design of Prodrugs）」（その開示を参考のため本明細書に添付する）に記載があるように、「プロ成分」として知られるある種の成分を、作用因子の適切な機能上に配置してもよい。このようなプロドラッグも本発明の範疇に含まれる。
【０１９７】
本発明はまた、本発明作用因子の両性イオン型の使用も含む。請求項で用いられる用語は、かかる型を１若しくは２以上包含している。
【０１９８】
溶媒和物
本発明には、本発明作用因子を溶媒和物として使用することも含まれる。
【０１９９】
プロドラッグ
上に示したとおり本発明はまた、作用因子のプロドラッグとしての使用も含むものである。
【０２００】
薬理学的に許容される塩
作用因子は、薬理学的に許容される塩として投与される。通常薬理学的に許容される塩は、所望の酸又は塩基を適宜に用いて容易に調製できる。塩は溶液中で沈殿させ、濾過により回収し、又は溶媒を留去させて回収する。
【０２０１】
化学合成法
作用因子は化学合成技術により調製できる。
【０２０２】
本発明化合物の合成過程において、感作性官能基の保護、脱保護を行わければならないことは、当技術の専門家には明白である。従来法によってもこれは可能であり、そのような方法としては例えば、「有機合成における保護基（Protective Groups in Organic Synthesis）」T W Greene and P G M Wuts, John Wiley and Sons Inc. (1991)、及び「保護基（Protective Groups）」P.J. Kocienski, Georg Thieme Verlag (1994)に記載の方法が挙げられる。
【０２０３】
反応過程において、特定条件下、例えば塩基感作性基を含む光学中心を有する基質と共に塩基を反応に用いる場合、存在する立体中心のラセミ化が起こり得る場合がある。これは例えばグアニル酸化の過程で起こり得る。当技術分野で公知のように、反応に用いる配列、条件、試薬、保護／脱保護方法等を選択することにより、このような潜在的な問題を回避することが可能となる。
【０２０４】
本発明の化合物及び塩は、従来法により分離・精製される。
【０２０５】
ジアステレオ異性体は従来法により分離され、かかる従来法としては、式［１］に示される化合物又はその適当な塩若しくは誘導体と立体異性体との混合物の画分結晶化、クロマトグラフィー又はＨＰＬＣがある。式［１］に示される化合物の個別の鏡像異性体もまた、対応する光学的に純粋な中間体から調製されるか、或いは、適当な対掌性支持体を用いて、ＨＰＬＣ等により対応ラセミ体を分解することにより調整されるか、或いは、対応ラセミ体を、適切な光学活性を有する酸又は塩基と反応させて形成されたジアステレオ異性塩の画分結晶化とにより調製される。
【０２０６】
作用因子、又はその変異体、ホモログ、誘導体、断片若しくは模倣体は、作用物質の全体若しくは一部を合成する化学的手法により生成される。例えば、ペプチドの場合は、固相法によりペプチドを合成し、樹脂から剥がし、分取高速液体クロマトグラフィー（例：Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY）により精製する。合成ペプチドの組成物はアミノ酸分析又は配列決定（例：the Edman degradation procedure; Creighton, supra）を行うことにより確認できる。
【０２０７】
ペプチド作用因子は、種々の固相法（Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204）により合成され、また例えば、ABI 43 1 A Peptide Synthesizer（Perkin Elmer社製）を製造者マニュアルに準拠して用いることにより、自動的な合成も可能である。従って、作用因子若しくはその一部を有するアミノ酸配列を、直接合成を行う間に改変させ、及び／又は他のサブユニット若しくはその一部から得た配列と化学的手法により結合させて、変異型作用因子を生成することもできる。
【０２０８】
本発明の別の実施態様においては、ペプチド作用因子（又はその変異体、ホモログ、誘導体、断片若しくは模倣体）のコード配列は、全体的若しくは部分的に、当技術分野で公知の化学的手法により合成される（Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232を参照）。
【０２０９】
模倣体
ここにおいて、「模倣体（mimetic）」なる用語は、基準（reference）作用因子と同質の活性若しくは効果を有するペプチド、ポリペプチド、抗体、又は他の有機化学物質などを含む全ての化学物質に関するが、それらに限定されない。
【０２１０】
化学誘導体
ここに用いられる「誘導体」又は［誘導された］なる用語には、作用因子の化学修飾が含まれる。かかる化学修飾は、水素を、ハロ基、アルキル基、アシル基、又はアミノ基と置換することであると説明される。
【０２１１】
化学修飾
作用因子の化学修飾により、作用因子と標的との間の水素結合相互作用、電荷相互作用、疎水相互作用、Van Der Waals相互作用、又は双極相互作用が、増強又は減弱される。
【０２１２】
１つの特徴として、同定された作用因子は他の化合物の発生モデル（例えば、鋳型として）となり得る。
【０２１３】
組換え法
作用因子又は標的は、組換えＤＮＡ法により調製できる。
【０２１４】
他の活性成分
組成物には作用因子以外にも治療に用いられる別の物質が含まれていてもよい。
【０２１５】
抗体
組成物に使用する作用因子には１若しくは２以上の抗体が含まれていてもよい。
【０２１６】
ここにおいて、「抗体」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、及びＦａｂ発現ライブラリーから作出された断片が含まれるが、それらに限定されない。かかる断片には、標的物質に対する結合活性を保持している全抗体の断片、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ´）及びＦ（ａｂ´）２の各断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、抗体の抗原結合部位を有する融合タンパク質や他の合成タンパク質が含まれる。さらに抗体又はその断片は、例えば米国特許Ａ−２３９４００号に記載のあるヒト化抗体であってもよい。中和抗体、すなわち対象ポリペプチドの生物活性を阻害する抗体は、特に診断及び治療において好ましい。
【０２１７】
抗体は、本発明物質で免疫したり、ファージディスプレイライブラリーを用いたりするなどの標準的な方法で作製される。
【０２１８】
ポリクローナル抗体が望まれる場合、本発明において同定された作用因子及び／又は物質から得られるエピトープ（１又は複数）を有する免疫原性ポリペプチドを用い、選択した哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマなど）を免疫する。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを使用して免疫応答を高めてもよい。かかるアジュバントには、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、並びにリソレシチン、プルロン酸ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、スカシ貝ヘモシアニン及びジニトロフェノール等の界面活性物質が含まれるが、これらに限定されない。ＢＣＧ（Bacilli Calmette-Guerin）及び Corynebacterium parvumは、ヒト・アジュバントとして潜在的有用性をもち、精製した上で採用され、全身性防御を刺激することを目的として対象ポリペプチドを免疫反応不全の個体に投与する。
【０２１９】
免疫した動物の血清を回収し、公知の手法に従って処理する。本発明において同定された作用因子及び／又は物質から得られるエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する血清に、他の抗原に対する抗体が含まれている場合、かかるポリクローナル抗体を免疫親和性クロマトグラフィーにかけて精製する。ポリクローナル抗血清の作製及び処理方法は、当技術分野で公知である。このようなポリクローナル抗体を作製するために、本発明はさらに、動物やヒトにおける免疫原として用いるために、本発明のポリペプチド又はその断片を別のポリペプチドにハプテン結合させることも含む。
【０２２０】
特定のエピトープに対することを意図したモノクローナル抗体の作出も、当技術分野の専門家には容易なことである。ハイブリドーマを用いてモノクローナル抗体を作製する一般的な方法がよく知られている。細胞を融合させることにより、また、腫瘍形成ＤＮＡでＢリンパ球の形質転換を直接行うことや、Epstein-Barrウイルスによるトランスフェクションによっても、抗体産生不死化細胞株を作出することができる。軌道エピトープに対して産生されたモノクローナル抗体のパネルをスクリーニングして、アイソタイプ又はエピトープ親和性といった種々の特性を調べる。
【０２２１】
培養中の連続細胞株を用いた抗体分子の産生方法であればいずれの方法によってモノクローナル抗体を調製してもよい。これらの方法には、Koehler and Milstein (1975 Nature 256: 495-497) によって初めて報告されたハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Kosbor et al (1983) Immunol Today 4: 72; Cote et al (1983) Proc Natl Acad Sci 80: 2026-2030）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Cole et al (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, pp 77-96）が含まれるが、これらに限定されない。さらに、好適な抗原特異性及び生物活性を有する分子を得るために、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に挿入するという、「キメラ抗体」を産生するために開発された方法も用いられる（Morrison et al (1984) Proc Natl Acad Sci 81: 6851-6855; Neuberger et al (1984) Nature 312: 604-608; Takeda et al (1985) Nature 314: 452-454）。或いは、一本鎖抗体の作製に関する記載に基づく方法（米国特許第４９４６７７９号）を、ある物質に特異的な一本鎖抗体の産生に採用してもよい。
【０２２２】
Orlandi et al (1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837)及びWinter G and Milstein C (1991; Nature 349: 293-299）に記載されているように、リンパ球集団においてインビボでの産生を誘導することによっても抗体は産生され、また、組換え免疫グロブリンライブラリー又は高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによっても産生される。
【０２２３】
物質に対する特異的結合部位を有する抗体断片も作製することができる。かかる断片には例えば、抗体分子のペプシンを消化させることにより作出されるＦ（ａｂ´）２断片、及びＦ（ａｂ´）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより作出されるＦａｂ断片が含まれるが、これらに限定されない。或いは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ簡便な同定を可能にするため、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築してもよい（Huse WD et al (1989) Science 256: 1275-1281）。
【０２２４】
一般的なアッセイ方法
１若しくは２以上の好適標的（プリオン感受性タンパク質又は遺伝子のアミノ酸配列及び／又はヌクレオチド配列など）を用いて、本発明の作用因子を同定する。
【０２２５】
そのような試験において使用される標的は、溶液中で遊離の状態、固体支持体に固着させた状態、細胞表面に担持されている状態、又は細胞内に局在する状態のいずれであってもよい。標的活性の消失、又は標的と試験に供する作用因子との間の結合複合体の形成を測定する。
【０２２６】
本発明の方法としてはスクリーニングがあり、それにより数多くの作用因子におけるプリオン感染調節性を試験する。
【０２２７】
薬剤スクリーニングの方法は、１９８４年９月１３日に公開された欧州特許出願８４／０３５６４号に記載の方法に基づいて行う。概略を述べると、種々の小ペプチド試験化合物を、プラスチックピン又は他の物の表面などの固体基質上で多数合成する。これらのペプチド試験化合物を適当な標的又はその断片と反応させ、洗浄する。その後、当技術分野で公知の方法を適切に実施するなどして、結合した実存物質を検出する。精製した標的もまた、プレートに直接コーティングして薬剤スクリーニング法に用いることができる。或いは、非中和抗体を使用し、ペプチドを捕捉して固体支持体上で不死化させることができる。
【０２２８】
本発明による方法は、定量アッセイにだけでなく、試験化合物の小規模及び大規模いずれのスクリーニングにも適していると期待される。
【０２２９】
好ましい特徴の１つとして本発明は、プリオン感染に対する調節能を有する作用因子の同定法に関する。
【０２３０】
レポーター
本発明の方法により同定された作用因子のスクリーニングには種々多様なレポーターを用いることができ、好都合に検出され得る（例えば分光法により）シグナルを有するレポーターが好適である。例を挙げると、Pharmacia Biotech（Piscataway, NJ）、Promega（Madison, WI）及びUS Biochemical Corp（Cleveland, OH）等の数多くの企業が、アッセイ手法に用いる市販キットやプロトコールを供給している。適切なレポーター分子若しくは標識物には、基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などと同様、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、又はクロモジェニック（発色性）材料が含まれる。かかる標識物の使用について教示している特許には、米国特許Ａ−３８１７８３７号、同Ａ−３８５０７５２号、同Ａ−３９３９３５０号、同Ａ−３９９６３４５号、同Ａ−４２７７４３７号、同Ａ−４２７５１４９号、及び同Ａ−４３６６２４１号がある。
【０２３１】
宿主細胞
「宿主細胞」なる用語には、本発明の作用因子に対する標的を有することができる全ての細胞が含まれる。
【０２３２】
従って、本発明のさらなる実施態様では、本発明の標的である、若しくは本発明の標的を発現させるポリヌクレオチドにより形質転換若しくはトランスフェクトさせた宿主細胞を提供する。かかるポリヌクレオチドが、標的となるポリヌクレオチド若しくは標的を発現させるポリヌクレオチドの複製及び発現に用いるベクターに担持されていることが好ましい。細胞は、このようなベクターと適合するものを選択するが、原核細胞（例えば細菌）、真菌細胞、酵母細胞、又は植物細胞が例挙される。
【０２３３】
グラム陰性細菌であるE. coliは、異種遺伝子発現のための宿主として広く使用されている。しかし、E. coli細胞内には大量の異種タンパク質が蓄積する傾向がみられる。しかる後にE. coli細胞内の大量のタンパク質から所望のタンパク質を精製することは時として困難である。
【０２３４】
E. coliとは対照的に、Bacillus属の細菌は培養培地へのタンパク質分泌能を有している点で異種宿主として非常に好適である。他にも宿主として適している細菌としては、Streptomyces属やPseudomonas属のものがある。
【０２３５】
本発明に有用なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの特質及び／又は発現されたタンパク質をさらにプロセシングする必要度によっては、酵母や他の真菌等の真核宿主が好ましい。一般的に、真菌細胞より酵母細胞の方が、操作が容易な点で好ましい。しかしタンパク質の中には、酵母細胞からの分泌が乏しいものや、時には正しくプロセシングされない（例えば、酵母における過グリコシル化）ものがある。そういった場合には、別の真菌宿主生物を選択しなければならない。
【０２３６】
本発明の範囲における発現宿主としての好適例には、Aspergillus種（欧州特許出願公開第０１８４４３８号及び同０２８４６０３号に記載あるもの）及びTrichoderma種等の真菌；Bacillus種（欧州特許出願公開第０１３４０４８号及び同０２５３４５５号に記載あるもの）、Streptomyces種及びPseudomonas種等の細菌；並びにKluyveromyces種（欧州特許出願公開第００９６４３０号、同０３０１６７０号に記載あるもの）及びSaccharomyces種等の酵母がある。例を挙げると一般的な発現宿主は、Aspergillus niger、Aspergillus niger var. tubigenis、Aspergillus niger var. awamori、Aspergillus aculeatis、Aspergillus nidulans、Aspergillus orvzae、Trichoderma reesei、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、Bacillus amyloliquefaciens、Kluyveromyces lactis及びSaccharomyces cerevisiaeから選択される。
【０２３７】
酵母、真菌、及び植物宿主細胞等の適当な宿主細胞を使用することにより、本発明の組換え発現産物に最適化生物活性を発生させるために必要な翻訳後修飾（例：ミリストイル化、グリコシル化、切断化（truncation）、ラピデーション（投石；lapidation）及びチロシン、セリン又はトレオニンのリン酸化）をもたらすことができる。
【０２３８】
生物
「生物」なる用語には、本発明による標的及び／又は該標的から得られる産物を有することができる生物であればいかなる生物も含まれる。生物の例には、真菌、酵母又は植物が含まれる。
【０２３９】
本発明に関し、「トランスジェニック生物」なる用語には、本発明による標的及び／又は得られた産物を有する生物であればいかなる生物も含まれる。
【０２４０】
治療
本発明の方法により同定される作用因子は、治療用の作用因子として用いられる。つまり治療に利用される。
【０２４１】
「治療（therapy）」なる用語は、「治療（treatment）」なる用語同様、治療効果、軽減効果、及び予防効果を含意するものである。
【０２４２】
治療は、ヒト及び家畜等の哺乳動物を対象とする。
【０２４３】
治療は、プリオン感染に伴う症状を治療するためのものである。
【０２４４】
薬理組成物
本発明に有用な薬理組成物には、治療有効量の作用因子（１若しくは２以上）及び薬理学的に許容される担体、希釈剤若しくは賦形剤が含まれる（それらを併用することも含めて）。
【０２４５】
薬理組成物は、ヒト医学及び獣医学におけるヒト及び動物への使用に供され、通常１若しくは２以上の薬理学的に許容される希釈剤、担体若しくは賦形剤を含んでいる。治療に使用する上で許容される担体又は希釈剤は薬理学分野では十分公知であり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985) に、それらに関する記載がみられる。薬理学的担体、賦形剤若しくは希釈剤は、意図する投与経路及び標準的な薬理学的運用例に基づいて選択される。薬理組成物には、担体、賦形剤若しくは希釈剤として（或いはそれらに加えて）、（１若しくは２以上の）適切な結合剤、潤滑剤、懸濁化剤、コーティング剤又は可溶化剤が含まれていてもよい。
【０２４６】
保存料、安定剤、染料、さらには香料が薬理組成物に含まれていてもよい。保存料としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが例示される。酸化防止剤及び懸濁化剤も用いられる。
【０２４７】
送達系が異なると、異なる組成物／処方要件が必要とされる場合もある。例を挙げると本発明に有用な薬理組成物を、吸入用若しくは摂取可能溶液用の鼻腔スプレー若しくはエアゾールとして、ミニポンプを用いて投与又は粘膜経路から投与すべく処方し、或いは、非経口経路により投与するために、例えば静脈内、筋肉内若しくは皮下経路により送達するために組成物を注入可能な剤型に処方する。その他、数多くの経路から投与するような処方を計画することもできる。
【０２４８】
作用因子はシクロデキストリンと併用することもできる。シクロデキストリンは、薬剤分子と包接及び非包接複合体を形成することが知られている。薬剤−シクロデキストリン複合体が形成されると、薬剤分子における可溶性、溶解速度、生体利用率及び／又は安定性が変化する。一般的に薬剤−シクロデキストリン複合体は、殆どの投与形態及び投与経路において有用である。シクロデキストリンは、薬剤との複合体化を指示する代わりに、例えば担体、希釈剤若しくは可溶化剤などの補助添加剤として用いることもできる。α−、β−、及びγ−シクロデキストリンが最も一般的に用いられ、好適例については、ＷＯ−Ａ−９１／１１１７２号、同Ａ−９４／０２５１８号、及び同Ａ−９８／５５１４８号に記載がある。
【０２４９】
作用因子がタンパク質の場合、該タンパク質は、治療中の被験者においてインサイチューで調製される。これに関し、上記タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、上記タンパク質が上記ヌクレオチド配列により発現されるように、非ウイルス方法（例えばリポソームを用いて）及び／又はウイルス方法（例えばレトロウイルスベクターを用いて）により送達される。
【０２５０】
投与
「投与する」なる用語には、ウイルス又は非ウイルス方法による送達が含まれる。ウイルス送達機構には、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びバキュロウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。非ウイルス送達機構には、脂質仲介トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン性界面両親媒性物質（ＣＦＡ）、及びそれらを組み合わせたものが含まれる。
【０２５１】
本発明に有用な成分は単独でも投与できるが、例えば成分が、意図する投与経路や標準的な薬理学的運用例に基づいて選択された好適な薬理賦形剤、希釈剤又は担体と混合される場合のように、一般的には薬理組成物として投与される。
【０２５２】
例えばかかる成分は、香料又は色素を含有していてもよい錠剤、カプセル剤、胚珠（ovule）剤、エリキシル剤、液剤、又は懸濁剤の各剤型において、即効性、遅延性、非定型性、徐放性、間欠性、又は放出制御性の各処方にて投与される。
【０２５３】
薬剤が錠剤の場合、かかる錠剤は、ミクロクリスタリンセルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基酸カルシウムホスフェート及びグリシン等の賦形剤、澱粉（トウモロコシ、ジャガイモ、タピオカの澱粉が好ましい）、ナトリウムデンプングリコラート、クロスカルメロースナトリウム及びある種の錯体珪酸塩等の崩壊剤、並びにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアカシア等の粒状化バインダーを含有していてもよい。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、及びタルク等の潤滑剤を含有していてもよい。
【０２５４】
同じような形状をした各種固形組成物もゼラチンカプセルへの充填物として採用される。この場合の好適な賦形剤には、ラクトース、澱粉、セルロース、乳糖、又は高分子ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁剤及び／又はエリキシル剤とする場合は、種々の甘味料、香味料、色素若しくは染料を、乳化剤及び／又は懸濁剤を、水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリン等の希釈剤を、或いはこれらの組合せを、作用因子と混合させることができる。
【０２５５】
投与（送達）経路には、経口（例えば錠剤、カプセル剤として、又は摂取可能溶液として）、局所、粘膜（例えば吸入用鼻腔スプレー若しくはエアゾールとして）、鼻腔内、非経口（例えば注入により）、胃腸内、脊髄内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、眼窩内、皮内、頭蓋内、気管内、膣内、大脳室内、脳内、皮下、眼内（硝子体内若しくは前房内を含む）、経皮、経直腸、口腔内、経膣、硬膜外、舌下からの１若しくは２以上が含まれるが、これらに限定されない。
【０２５６】
薬理成分の全てが同じ経路から投与されなければならない訳ではない。同様に、組成物が２以上の活性成分を有しているとき、これらの成分は異なる経路から投与されることもある。
【０２５７】
非経口投与される場合の成分の投与例には、静脈内投与、動脈内投与、くも膜下投与、脳室内投与、尿道内投与、胸骨内投与、頭蓋内投与、筋肉内投与、又は皮下投与からの１若しくは２以上が含まれ、及び／又は点滴法により投与される。
【０２５８】
非経口投与の場合、成分は無菌水溶液として用いることが最適であり、かかる無菌水溶液には、該溶液を血液と等張にするために十分量の例えば塩分又はグルコース等の物質が別に含まれていてもよい。水溶液は、必要に応じて適宜に緩衝化しなければならない（ｐＨ３〜９が好ましい）。無菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当該技術の専門家には公知の標準的な薬理技術に基づいて容易に実施される。
【０２５９】
上述したように本発明における有用成分（１若しくは２以上）は、鼻腔内投与又は吸入により投与され、乾燥パウダー吸入器により、或いは加圧容器、ポンプ、スプレー若しくはネブライザーを用いたエアゾールスプレー方式により好都合に伝達される。その際、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４ＡTM）若しくは１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ  ２２７ＥＡTM）等のヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、又は他の好適ガス等の噴射剤が用いられる。加圧式エアゾールの場合は、一定量を送達するためのバルブ弁を設けることにより、投与単位を決定できる。例えば溶媒としてエタノールと噴射剤との混合物を使用して、活性化合物の溶液若しくは懸濁液を、加圧容器、ポンプ、スプレー、又はネブライザーに収容させることができ、さらには、ソルビタントリオレアートなどの潤滑剤を収容することもできる。吸入器又は散布器に用いるカプセル及びカートリッジ（例えばゼラチンから作られる）は、作用因子とラクトースや澱粉等の適当なパウダーベースとの混合パウダーを収容するような製法とする。
【０２６０】
或いは、成分（１若しくは２以上）を座剤、膣座薬の剤型で投与するか、ゲル、ヒドロゲル、ローション、液剤、クリーム、軟膏、又は粉パウダーの剤型として局所に塗布することもできる。成分（１若しくは２以上）は、例えば皮膚パッチを用いて皮膚に、つまり経皮的に投与することもできる。上記成分はまた、肺若しくは直腸を経路として投与することもできる。また、眼を経路として投与することもできる。眼に使用するときは、ｐＨを調整した等張の無菌生理食塩水を用いた微粉状懸濁剤として、又は好ましくはｐＨを調整した等張の無菌生理食塩水を用いた溶液として、任意に塩化ベンジルアルコニウム等の保存料を添加し、化合物を処方する。或いはまたペトロラツム等の軟膏として処方することもできる。
【０２６１】
皮膚に局所塗布する場合、成分（１若しくは２以上）は、例えば鉱物油、液状ペトロラツム、白色ペトロラツム、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン・  ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス及び水の１若しくは２以上を混合したものに懸濁若しくは溶解させた活性化合物を含有する好適な軟膏として処方される。
【０２６２】
或いは、成分（１若しくは２以上）は、例えば鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリエチレングリコール、液状パラフィン、ポリソルビン酸６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール及び水の１若しくは２以上を混合したものに懸濁若しくは溶解させた適切なローション又はクリームとして処方される。
【０２６３】
投与量
通常医師は、実際に個々の対象者にとって最適な投与量を決定する。特定患者に対する投与量及び投与回数は多様であり、用いる特定化合物の活性、該化合物の代謝安定性及び作用持続時間、年齢、体重、健康状態、食生活、投与形態及び投与時期、排出速度、薬剤の併用状況、特定症状の程度、個々人が受ける治療などの種々の要因に左右される。
【０２６４】
処方
成分（１若しくは２以上）は、当技術分野で公知の手法を用いて、１若しくは２以上の適切な担体、希釈剤又は賦形剤と混合することにより、薬理組成物に処方される。
【０２６５】
動物実験モデル
プリオン感染を調節する療法又は治療的作用因子を探索及び／又は設計する際に、インビボモデルを使用する。かかるモデルは、プリオン感染の発生又は治療に関与する多様なパラメーターに対する種々のツール／リード化合物の効果を調べるために用いられる。これらの動物実験モデルは、本発明の方法として、又は本発明の方法において使用される。動物実験モデルは、非ヒト動物実験モデルである。
【０２６６】
一般的な組換えＤＮＡ方法技術
ここに述べる方法は、当技術分野において一般的によく知られているが、特に、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)、及びAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4thEd, John Wiley & Sons, Inc.を参照している。ＰＣＲについては、米国特許Ａ−４６８３１９５号、同Ａ−４８００１９５号、同Ａ−４９６５１８８号に記載されている。
【０２６７】
本発明の別の特徴として、デバイスを実験動物に接触させて組織／臓器内のプリオンの量を測定することが挙げられる。かかる測定は、デバイスに接触させた実験動物が臨床症状を呈するまでに要した時間、及びその実験動物が死亡するまでに要した時間を調べることにより実現する。簡潔に説明すると、実験動物をデバイスと接触させた時間を記録する。次に実験動物を観察して臨床症状の発生を調べる。マウスにおけるプリオン感染の臨床診断の基準に関しては、Carlson et al. (1986), Cell, 46, 503-511に記載がある。臨床症状を発症した時間を記録する。再び実験動物を観察するが、その際、最初は１日１回で、死期が近づくにつれ観察回数を増やす。マウスが死亡すると、その時間を再度記録する。臨床症状の発症と死亡までの間隔を計算する。この時間間隔は、試料中のプリオン量と反比例関係にある。この時間間隔から時間係数を引いたものの対数は、試料中のプリオンの数の対数の一次関数として表される。時間係数は、Pruisner et al. (1982), Annals. of Neurology 11 353-358)に従い、時間間隔と投与量との線形関係を最大化することにより決定される。
【０２６８】
以下の実施例を参照しながら本発明を説明する。
【実施例１】
【０２６９】
試料中のプリオンの検出
組織／臓器は、プリオンの有無を試験する生存ヒト脳である。真直ぐなスチールワイヤーを従来どおりに無菌する。定位固定フレームを被験者の頭部に固定し、軽鎮静剤を投与する。頭蓋に脳が露出しないように５ｍｍの開口部をドリルで開ける。開口部の向き合う両端部位から、２本の真直ぐなステンレススチールワイヤー切片をそれぞれ進入させ、脳内に挿入することにより脳と接触させる。５分後にワイヤーを抜去し、事前滅菌済密封管内において−２０℃下で一晩保存する。
【０２７０】
上記金属ワイヤーにプリオンが結合しているかどうかを測定するため、ヒトにＣＪＤを引き起こすプリオンによる感染に対して感受性を示すマウスを使用する。
【０２７１】
試験対象試料と接触させるマウスはレベル１の動物微生物用封じ込め施設で飼育し、耳穿孔により識別する。試料との接触前に、これらマウスをハロタン／Ｏ2で麻酔する。ワイヤーを室温解凍し、永久挿入を行うことによりマウス５匹の脳右頭頂葉と接触させる。その後かかるマウスをレベル１の動物微生物用封じ込め施設で維持する。
【０２７２】
上記マウスにおける悪影響を３日毎に観察した。プリオン感染の臨床兆候が認められたマウスは毎日調べ、苦痛の兆候がみられたら死亡させる。マウスにおけるスクレイピーの臨床診断基準は、Carlson et al. (1986), Cell 46, 503-511に記載されている。
【０２７３】
死亡したマウスの脳を、プリオン感染の確認作業を行うまで−８０℃で保存する。
【０２７４】
死亡した実験マウスにおけるプリオン感染を、ウエスタンブロット分析により確認した。１０％（ｗ／ｖ）脳ホモジェネートを冷温の溶解緩衝液（ＰＢＳ中に１０ｍMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び１０ｍMのＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）、１００ｍMのＮａＣｌ、０．５％ＮＰ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム）において調製する。３０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行って不溶物を除去する。プロテイナーゼＫ（５０ｍｇ／ｍｌ）により、３７℃で１時間消化させる。Pefabloc（Boehringer社製）を最終濃度が２ｍMとなるように添加して反応を終了させる。同量のローディングバッファー（１２５ｍMのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２０％グリセロール、４％ＳＤＳ、０．０２％ブロモフェノールブルー）中で試料を５分間沸騰させてから、１６％トリス−グリシンゲル上で電気泳動を行う。ゲルをImmobilon-P膜上にブロットし、５％Blotto（０．０５％Tween-20を含むＰＢＳ中に５％無脂肪粉ミルクと）に固定した後、ＣＪＤプリオンを特異的に検出する抗体の共存下で一晩インキュベーションする。０．０５％Tween-20を含むＰＢＳでブロットを洗浄し、アルカリホスファターゼ共役抗マウス抗体共存下にて室温で1時間インキュベーションする。ブロットを再度洗浄し、化学発光基質（Amersham社製）を用いて現像し、Storm 840 phosphoimager（Molecular Dynamics社製）上で視覚化する。
【０２７５】
以上より、本発明の方法を用いてプリオンが試料から検出されることが示される。
【実施例２】
【０２７６】
試料中のプリオンの検出
組織／臓器は、プリオンの存在を試験する死亡ウシの冷凍脳生検である。レベル３の微生物用封じ込め施設内で上記組織を解凍する。各々の直径が０．１５ｍｍで長さが５ｍｍのステンレスワイヤー５本を、１ＭのＮａＯＨにバー１１で１時間３０分浸漬させて滅菌する。ワイヤーが冷却したら組織／臓器にそれぞれ挿入する。
【０２７７】
５分後、各ワイヤーを扁桃腺組織から抜き出し、ワイヤー間で生じる交叉汚染を回避するために別々の事前滅菌済密封管において−２０℃下で一晩保存する。
【０２７８】
実施例１と同様に、実験マウスを用い上記各ワイヤーのプリオン感染性に関するアッセイを行う。
【０２７９】
プリオン感染の確認作業を行うまで、死亡マウスの脳を−８０℃で保存する。
【０２８０】
好適宿主にＢＳＥを引き起こすプリオンに対して特異的なモノクローナル抗体を使用する以外は、実施例１と同様にしてウエスタンブロット法を実施する。
【０２８１】
これにより、本発明の方法により試料中のプリオンが検出されることが示される。
【実施例３】
【０２８２】
スチール表面に結合するプリオンによるスクレイピーの伝播
イントロダクション：プリオンは、従来の滅菌消毒法に対して顕著に耐性である。滅菌消毒を実施したにも関わらず、クロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）患者の大脳内で使用された電極から続けて２名の患者に疾病が伝播し、最終的にはチンパンジーにも伝播した。脳以外の種々の組織で、感染性の代用マーカーであるＰｒＰScが認められたことにより、手術用器具を介して変異型ＣＪＤが伝播する可能性が懸念されてきている。
【０２８３】
材料と方法：ステンレススチールワイヤーをスクレイピーに感染した脳又は脳ホモジェネートに露出し、徹底的に洗浄し、指標マウスの脳に挿入して感染性を測定した。
【０２８４】
結果：スクレイピー感染マウス脳と５分間接触させるだけで、スチールワイヤーが高度な感染性を獲得し、指標マウスの脳に感染性ワイヤーを３０分間挿入すれば、疾患を誘発するに十分だった。ワイヤーに結合した感染性は、ホモジェネートとして注入する場合より、遥かに長期にわたり脳に滞留し、ワイヤーに介される感染の顕著な有効性が説明される。ＮａＯＨを用いた場合、検出可能レベルのＰｒＰは溶出されなかったが、感染性ワイヤー上のＰｒＰの存在はケミルミネセンスによって明らかになった。推奨されるいくつかの殺菌消毒法により、ワイヤーに結合したマウス・プリオンは不活化したが、１０％ホルムアルデヒドへの露出では不活化には不十分だった。
【０２８５】
結論：プリオンは、簡便かつ緊密にステンレススチールの表面に結合し、短時間の露出でスクレイピーをレシピエントマウスに伝播できる。このシステムは汚染された手術用器具と類似しているので、滅菌法の評価が可能になる。
【０２８６】
概要
プリオンは、最も一般的な病原体よりも不活化に対し耐性である（Ernst, D. R.& Race, R.E. (1993) J. Virol. Methods 41, 193-201, Taylor, D. M., Fraser, H., McConnell, I., Brown, D. A., Brown, K. L., Lamza, K. A.& Smith, G. R. (1994) Arch. Virol. 139, 313-326, Taylor, D. M., (2000) Vet. J. 159, 10-17, Brown, P., Gibbs, C. J., Jr., Amyx, H. L., Kingsbury, D. T., Rohwer, R. G., Sulima, M. P.& Gajdusek, D. C. (1982) N. Engl. J. Med. 306, 1279-1282）。孤発性ＣＪＤ（ｓＣＪＤ）患者の脳内で使用した電極は、毎回の使用後にベンゼン、７０％エタノール及びホルムアルデヒドの蒸気にあてたにも関わらず、続けて２名の患者に、最後にはチンパンジーに疾患を伝播した（Bernoulli, C., Siegfried, J., Baumgartner, G., Regli, F., Rabinowicz, T., Gajdusek, D. C.& Gibbs, C. J., Jr. (1977) Lancet 1, 478-479, Gibbs, C. J., Jr., Asher, D. M., Kobrine, A., Amyx, H. L., Sulima, M. P.& Gajdusek, D. C. (1994) J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 57, 757-758）。ＰｒＰScが神経においてだけでなく、リンパ組織でも認められたことにより、手術用器具を介して変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）が伝播する可能性が懸念されてきている（Hill, A. F., Zeidler, M., Ironside, J. & Collinge, J. (1997) Lancet 349, 99-100, Hill, A. F., Desbruslais, M., Joiner, S., Sidle, K. C. L., Gowland, I., Collinge, J., Doey, L. J. & Lantos, P. (1997) Nature 389, 448-450, Hill, A. F., Butterworth, R. J., Joiner, S., Jackson, G., Rossor, M. N., Thomas, D. J., Frosh, A., Tolley, N., Bell, J. E., Spencer, M., King, A., Al-Sarraj, S., Ironside, J. W., Lantos, P. L. & Collinge, J. (1999) Lancet 353, 183-189, Wadsworth, J. D. F., Joiner, S., Hill, A. F., Campbell, T. A., Desbruslais, M. & Collinge, S. (2001) Lancet, In press.）。スチールワイヤーをスクレイピー感染脳ホモジェネート共存下で一晩インキュベーションし、これらワイヤーを指標マウス脳内に永久挿入することにより、スチール表面が有するスクレイピープリオンとの結合能を調べた。この方法で疾患が有効に伝播した（Zobeley, E., Flechsig, E., Cozzio, A., Enari, M. & Weissmann, C. (1999) Mol. Med. 5, 240-243）。
【０２８７】
しかしながら、スチールワイヤーの脳ホモジェネートへの長時間露出は、手術による侵襲の過程で得られる条件を反映していない。本発明者らは、無損傷の脳にワイヤーを５分間だけ挿入するのみで、脳ホモジェネートに一晩露出するときより、遥かに高い感染性を獲得することができ、また１％スクレイピー感染脳ホモジェネート０．０３ｍｌを脳に直接注入することにより得られるのと同程度の感染性を獲得できることを示している。さらに、感染を引き起こす露出時間は３０分で十分だった。本発明の実験により、スチールに結合したプリオンに対する滅菌法の有効性を評価するモデルが提供され、脳及び扁桃腺等の臓器における感染性を評価するための、侵襲を最低限にしたアプローチが示唆される。
【０２８８】
材料及び方法
感染性ワイヤーの調製
「ステンレススチール製モノフィラメント縫合ワイヤー（Stainless steel suture monofilament wire）」 (Art.Nr. 01614037, USP 4/0, B.Braun Melsungen AG, D-34209 Melsungen, Germany; batch 1/7502 or 1/8452) からステンレススチールワイヤー切片（直径０．１５ｍｍ；長さ５ｍｍ）を切り出した。文献記載（Williams, R. L. & Williams, D. F., (1988) Biomaterials 9, 206-212）のとおり、金ワイヤー切片（５×０．１３ｍｍ、Alfa Aesar Johnson Matthey GmbH製、 Germany）を２％Triton X-100で１５分間超音波洗浄し、蒸留水で入念にすすぎ洗いし、１時間３７℃で乾燥した。１×ダルベッコリン酸緩衝液（Ｄ−ＰＢＳ；Gibco BRL社製、Glasgow, UK）中で脳を２１ゲージ及び２５ゲージの針にそれぞれ８回通過させてホモジェナイズし、１０％（ｗ／ｖ）ホモジェネートを得た。これらのホモジェネートを室温下にて５分間、１０００ｒｐｍで遠心分離（Eppendorf centrifuge 5415c, Hamburg, Germany）にかけ、上清を回収した。かかる遠心分離工程の結果、試料中のＰｒＰScのうち８０〜９０％が消失することが、本発明者らにより最近判明したことから（P.Kloehn、未発表データ）、この工程は避けることが好ましい。ワイヤーを、遠心分離処理をした１０％脳ホモジェネートの共存下においてＰＢＳ中、室温下で１６時間インキュベーションし、やはり室温下において５０ｍｌのＰＢＳで１０分間５回洗浄した。これらのワイヤーを風乾し、室温で１日間保存し、２５ゲージの注入針をトロカール(套管針)として用いて、深麻酔下にある指標マウスの脳内に挿入した。
【０２８９】
表面に結合したＰｒＰのケミルミネセンス
ステンレスワイヤー切片（０．１５×５ｍｍ）２０本を脳の一方の半球に５分間挿入した。もう一方の半球は、上述のとおりにホモジェナイズして遠心分離にかけた。２０本のステンレスワイヤー切片を、遠心分離処理をした１０％ホモジェネート０．５ｍｌの共存下において室温で５分間インキュベーションし、５０ｍｌのＤ−ＰＢＳにおいて１０分間５回洗浄し、２４時間の乾燥後直ちにＰｒＰについてのアッセイを行った。５％無脂肪粉ミルク（ｗ／ｖ；Marvel, Premier Brands UK Ltd.製、 Wirral, Merseyside, U.K.）を含有するＤ−ＰＢＳ０．２ｍｌの共存下で、攪拌しながら１時間ワイヤーのインキュベーションを行った。ブロッキング試薬を除去した後、上記ワイヤーを、１％無脂肪粉ミルクを含有するＤ−ＰＢＳにおいて２００ｎｇ／ｍｌの抗ＰｒＰ抗体（6H4；Prionics AG社製、Zurich, Switzerland）共存下で１時間インキュベーションし、０．２ｍｌのＤ−ＰＢＳにおいて５分間３回洗浄し、その後ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ウサギ抗マウスＩｇＧ１抗体（１：５０００希釈物；Zymed社製、South San Francisco, California, USA）共存下で１時間インキュベーションした。Ｄ−ＰＢＳにおいて５分間５回洗浄した後、ワイヤーを、製造者のマニュアルに従ってSuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate（Pierce社製、Rockford, ILL, USA）０．２ｍｌに露出した。ルミノメーター（AutoLumat LB953；EG&G Berthold GmbH製、Bad Wildbad, Germany）を用いてケミルミネセンスを測定した。
【０２９０】
結果
ステンレススチールの表面がスクレイピー感染性と結合する能力は、スクレイピー終末期のマウスの１０％ｗ／ｖ脳ホモジェネート共存下でスチールワイヤー（５×０．１５ｍｍ）を１６時間インキュベーションした結果から文献で既に明らかになっており、これを以下に「標準条件」として言及する（Zobeley, E., Flechsig, E., Cozzio, A., Enari, M. & Weissmann, C. (1999) Mol. Med. 5, 240-243）。感染組織への手術用器具の露出を、より実際的にモデル化するために、スクレイピーを接種してスクレイピー症状の発症が予想される２ヶ月前に殺処分した野生型マウスの脳に、ワイヤー切片を５、３０、又は１２０分間挿入した。これらの「一時的に挿入した」ワイヤーを洗浄し、乾燥させて、Ｔｇａ２０指標マウスの脳内に永久移植してアッセイを行った（Fischer, M., Rulicke, T., Raeber, A., Sailer, A., Moser, M., Oesch, B., Brandner, S., Aguzzi, A. & Weissmann, C. (1996) EMBO J. 15, 1255-1264）。３グループの潜伏期間は、６５±４及び６９±５日であり（表１、実験１）、スクレイピー感染脳への露出が一番短い場合でも、同じ脳ホモジェネートの１％ホモジェネート０．０３ｍｌを脳内接種した場合（潜伏期間は６８±８日）と同程度の感染性が得られたことが示された。脳ホモジェネートに露出した金ワイヤーを脳内に挿入した場合においても感染性が得られた（表１、実験２）。
【０２９１】
【表１】
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実験１を行うに際し、ＲＭＬ大脳内接種の８７日後、すなわち臨床症状発症の約２ヶ月前にＣ５７ＢＬ／６マウス２匹を殺処分した。ワイヤーを、脳内に上述の時間挿入し、或いは遠心分離処理した１０％脳ホモジェネートに１６時間露出させ、方法の項に記載したとおりの処理を行った。実験２では、方法の項に記載したとおりに、ＲＭＬに感染した終末期ＣＤ１マウスの遠心分離処理した脳ホモジェネートにワイヤー切片を露出させた。
【０２９２】
+Ｔｇａ２０マウスにおいて終点滴定（Reed, J.& Muench, H. (1938) Am. J. Hygiene 27, 493-497）によって測定した６．８ｌｏｇＬＤ50ユニット／ｍｌの１０％ホモジェネート。
【０２９３】
第二の重要な疑問は、疾患が発生するためには感染性ワイヤーをどの位の時間、脳組織に接触させる必要があるかということに関するものである。感染性ワイヤーは、スクレイピー症状の発症が予想される１ヶ月前に殺処分した感染野生型マウスの脳に５分間挿入して調製した。洗浄後、麻酔下の指標マウスの脳にワイヤーを一時的に挿入した。表２に示したように、３０分間又は２時間ワイヤーに接触させたマウスは全て、それぞれ９４±１０及び１００±１８日後に症状を発症した。その後続けて脳組織に露出させた、又は露出させなかった感染性ワイヤーを、最終的に指標マウスを用いて分析したところ、全例において約７０日後にスクレイピー病が発症し、脳に露出したことによっても検出可能レベルの感染性が消失しなかったことが示された。
【０２９４】
【表２】
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感染性ワイヤーは、ＲＭＬ脳内接種１２１日後に殺処分されたＣ５７Ｂ１６×１２９Ｓｖマウスの脳内に５分間挿入することにより調製し、ＰＢＳ５０ｍｌで１０分間５回洗浄した。深麻酔下にあるＴｇａ２０指標マウス６匹の脳内に感染性ワイヤーを表２に示した期間挿入した。回収したワイヤーをＰＢＳ１ｍｌで洗浄し、Ｔｇａ２０指標マウスに移植した。対照群として、同じ脳から得て遠心分離処理した１０％ホモジェネート（６．８ｌｏｇＬＤ50ユニット／ｍｌ）の共存下においてインキュベーションしたワイヤーと、ホモジェネート自体を指標マウスに導入した。
$マウス６匹中２匹は、侵襲当日に死亡した。
#マウス６匹中４匹は、侵襲から１日以内に死亡した。
&潜伏期間は、８７及び１１３日だった。
【０２９５】
これまでの実験では、１０％脳ホモジェネートに露出させたワイヤーから、２ＭのＮａＯＨを用いて検出可能レベルのタンパク質を溶出させることはできなかった（１ワイヤーあたり５０ｎｇ未満のタンパク質）（Zobeley, E., Flechsig, E., Cozzio, A., Enari, M. & Weissmann, C. (1999) Mol. Med. 5, 240-243）。脳ホモジェネート又は無損傷の脳に露出させたワイヤーの表面にＰｒＰが結合しているかどうかを測定するため、これらのワイヤーをモノクローナルＰｒＰ抗体６Ｈ４共存下でインキュベーションし（Korth, C., Stierli, B., Streit, P., Moser, M., Schaller, O., Fischer, R., Schulz-Schaeffer, W., Kretzschmar, H., Raeber, A., Braun, U., Ehrensperger, F., Hornemann, S., Glockshuber, R., Riek, R., Billeter, M., Wuthrich, K. & Oesch, B. (1997) Nature 390, 74-77）、次にホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ウサギ抗マウスＩｇＧ１抗体共存下でインキュベーションし、基質存在下でケミルミネセンスを測定することにより、脳又は脳ホモジェネートに露出させたステンレススチールワイヤー表面に結合したＰｒＰのケミルミネセンスを明らかにした。ステンレススチールワイヤー切片を脳内に一時的に挿入（「浸す」）するか、或いは、ＰｒＰノックアウトマウス（Ｐｒｎｐ0/0）、非感染Ｔｇａ２０マウス（Ｔｇａ２０）及びＲＭＬ感染終末期Ｔｇａ２０マウス（ＲＭＬ−Ｔｇａ２０）からそれぞれ得た１０％脳ホモジェネート（ホモジェネート）共存下で上記ワイヤー切片をインキュベーションした。ワイヤーを洗浄し、抗ＰｒＰ抗体６Ｈ４及びホースラディッシュペルオキシダーゼ共役抗マウスＩｇＧ１抗体で処理し、ケミルミネセンスを測定した。
【０２９６】
終末期にある指標マウスの感染脳に一時的に挿入したワイヤーのケミルミネセンスは、試薬バックグラウンドの約５．５倍に上った。バックグラウンド減算後の値は、感染脳ホモジェネートに露出させたワイヤーの値より約４倍、非感染脳に一時的に挿入したワイヤーの値より約１．８倍高かった。この実験から、ＰｒＰがワイヤー表面に結合していることが示された。感染脳から得た試料のケミルミネセンスが高い値を示すのは、ＰｒＰScが蓄積するために終末期感染マウス脳の総ＰｒＰ量が、非感染対照群のものより約５倍多いとの知見（Fischer, M., Rulicke, T., Raeber, A., Sailer, A., Moser, M., Oesch, B., Brandner, S., Aguzzi, A. & Weissmann, C. (1996) EMBO J. 15, 1255-1264, Bueler, H., Raeber, A., Sailer, A., Fischer, M., Aguzzi, A. & Weissmann, C. (1994) Mol. Med. 1, 19-30）と一致している。プロテイナーゼＫによる処理の結果、全例においてイムノフルオレセンスが消失してしまったため、ワイヤー上でＰｒＰCとＰｒＰScを識別することはできなかった。ＰｒＰを脱着させるため、スクレイピー感染脳に一時的に挿入したワイヤー切片４０本を２ＭのＮａＯＨ０．０５ｍｌを用いて１時間抽出し、溶出液をＨＣｌで中和し、試料の半分をウエスタンブロット分析に供した。上記同様にＮａＯＨに溶解して中和した精製グリコシル化マウスＰｒＰ０．３ｎｇが明瞭に検出された条件下においても、ＰｒＰ特異的免疫反応は全く検出されなかった。従って、１本のワイヤーが１５ｐｇ未満のＰｒＰ、つまり３×１０8分子未満、を放出したことになる。１ｌｏｇＬＤ50ユニットの感染性に１０5ＰｒＰSc分子が伴うと仮定した場合（Bolton, D.C., Rudelli, R.D., Currie, J.R. & Bendheim, P. E. (1991) J. Gen. Virol. 72, 2905-2913）、１本のワイヤーの放出量が、３０００ｌｏｇＬＤ50ユニット未満であることになる。だが１本のワイヤーがもたらす潜伏期間は、約２００００ｌｏｇＬＤ50ユニットに相当する１％脳ホモジェネート０．０３ｍｌの注入がもたらす潜伏期間とほぼ同じである。この若干推論的な計算から、ワイヤー表面から放出されたと考えられるＰｒＰレベルが、直ちにワイヤーの感染性の根拠とはならないことが示唆され、感染性は、脱着したプリオンに起因するよりむしろ不可逆的に結合したＰｒＰSc（又はＰｒＰ*）（Weissmann, C. (1991) Nature 349, 569-571）に起因しているのではないかという疑問が提起される。
【０２９７】
ワイヤーに結合したプリオンが濃縮ホモジェネートと同程度の感染性を示すのはどういう理由からであろうか。脳ホモジェネートを脳内接種すると、マウスの体内全体に急速に感染性が広がり（Millson, G.C., Kimberlin, R.H., Manning, E.J. & Collis, S.C. (1979) Vet. Microbiol. 1979, 89-99）、４日以内にプリオンは脳内で検出されなくなる（Bueler, H., Aguzzi, A., Sailer, A., Greiner, R.A., Autenried, P., Aguet, M. & Weissmann, C. (1993) Cell 73, 1339-1347）。恐らくワイヤーに結合したプリオンは、より安定しているため、より長期にわたり作用し得ると考えられる。本発明者らは、直接、或いはＰｒｎｐ+/+又はＰｒｎｐ0/0マウスの脳内に１日又は５日間放置した後に、感染性ワイヤーのアッセイを行った。表３は、指標マウスにおける潜伏期間が約９０日間であることから証明されるように、５日間脳組織に滞留した後も低レベルとはいえワイヤーが感染性を維持していたことを示している。ワイヤーに結合した感染性は、５日以上局所的に高濃度を保っていたことから、ホモジェネートを注入した場合より総露出量が多いとも考えられる。
【０２９８】
【表３】
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感染性ワイヤーは、終末期のＣＤ１マウスの遠心分離処理した１０％脳ホモジェネートから調製した（Zobeley, E., Flechsig, E., Cozzio, A., Enari, M. & Weissmann, C. (1999) Mol. Med. 5, 240-243）。インビトロアッセイ（実験１）においては、２０本のワイヤーを、用時調製した非感染Ｐｒｎｐ0/0マウスの脳ホモジェネート（ＰＢＳ中で１０％ｗ／ｖ）０．２ｍｌと共に、或いはＰＢＳ／０．１％アルブミン０．２ｍｌと共にEppendorf管に入れて、サーモミキサー（１４００ｒｐｍ）を用い、３７℃で２４時間振盪した。cog溶液０．２ｍｌで洗浄した後、ワイヤーの感染性アッセイを行った。各調製物（０．４ｍｌ）からの試料３０μｌの感染性アッセイを、Ｔａｇ２０指標マウスを用いて行った。インビボ実験（実験２）においては、非感染Ｐｒｎｐ+/+（Ｃ５７Ｂ１６）又はＰｒｎｐ0/0マウスの脳内に感染性ワイヤーを移植した。１日後及び５日後にそれぞれマウスを殺処分し、ワイヤーに隣接する周辺脳組織を切断し取り出した。ワイヤーはＰＢＳ１ｍｌで洗浄し、アッセイにかけた。脳試料（それぞれ約８０ｍｇ）をＰＢＳ中でホモジェナイズして１０％ホモジェネートを得、遠心分離処理した試料を指標マウスの各々に大脳内注入した。
【０２９９】
*スクレイピーの診断は組織病理学又はヒストブロット法によって確定した（Flechsig, E., Shmerling, D., Hegyi, I., Raeber, A.J., Fischer, M., Cozzio, A., von Mering, C., Aguzzi, A. & Weissmann, C. (2000) Neuron 27, 399-408）。
？マウス９匹中１匹が注入をしている間又は注入後に死亡した。
【０３００】
本発明者らによるワイヤーモデルは、推奨された方法（Ernst, D. R.&  Race, R.E. (1993) J. Virol. Methods 41, 193-201, Taylor, D. M., (2000) Vet. J. 159, 10-17, Manuelidis, L. (1997) J. Neurovirol. 3, 62-65）又は他の方法により手術用器具を滅菌する際のモデルとなる。さらなる実験において、種々の処理を感染性ワイヤー切片に施してアッセイを行った。水酸化ナトリウム（１Ｍ、１時間）又はチオシアン酸グアニジニウム（４Ｍ、１６時間）によって、ワイヤーはバイオアッセイ能力の限界まで完全に非感染性となったが（表４）、ホルムアルデヒド処理を行い、プリオンコーティングしたワイヤーを挿入された指標マウスは６匹全て９２±８日でスクレイピーを発症した。
【０３０１】
【表４】
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感染性ワイヤーは、遠心分離処理した脳ホモジェネートから調製し、文献記載のとおりにアッセイを行った（Zobeley, E., Flechsig, E., Cozzio, A., Enari, M. & Weissmann, C. (1999) Mol. Med. 5, 240-243）。ホモジェネートの滴定終点検出法（Reed, J.& Muench, H. (1938) Am. J. Hygiene 27, 493-497）から、６．７５ｌｏｇＬＤ50ユニット／ｍｌの１０％ホモジェネート力価を得た。ＮａＯＨ及びホルムアルデヒドの各溶液を使用直前に調製し、４Ｍのチオシアン酸グアニジニウムをＲＮＡ溶解緩衝液とした（#40082、Applied Biosystems社製、Foster City, CA, USA）。ワイヤーを１ｍｌの溶液に露出させ、移植前にＰＢＳ１ｍｌで４回洗浄した。
【０３０２】
上述の汚染除去研究から、手術に用いられる器具の汚染除去研究用モデルが得られる。しかし、ＲＭＬマウス・プリオンや、マウスで継代したＢＳＥ（３０１Ｖ）より熱安定性に劣るマウス馴化スクレイピー単離物（Chandler, R.L. (1961) Lancet 1, 1378-1379）、又はハムスター２６３Ｋ系統（Taylor, D. M., (2000) Vet. J. 159, 10-17, Taylor, D.M., Fernie, K., McConnell, I. & Steele, P.J. (1998) Vet. Microbiol. 64, 33-38）を本実施例において用いたことは重要な点である。本発明による表面に結合した感染性の滅菌実験は、好適な感受性を示す宿主においてＣＪＤ、ｖＣＪＤ、及びＢＳＥプリオンを用いて実施することが当然に望ましい。本実施例では、ワイヤー表面と組織との接触面積は、手術用器具の場合に比し相対的に小さいので、マウスで得られた結果をさらに補強するために小さいスチールビーズ等によって拡大した表面を使用することが望ましく、かかる拡大表面は、より大型の指標動物に好都合に用いることができる。
【０３０３】
ケミルミネセンスによりＰｒＰScの存在を測定するため、或いは好適な指標マウス若しくは培養感受性細胞株を用いて感染性を調べるために、組織生検でなく、脳又は扁桃腺に短時間「浸した」ワイヤーを使用することが有利なことは明らかである。
【実施例４】
【０３０４】
ワイヤー切片の脳又は脾臓への一時的挿入によるプリオン感染性の生体内アッセイ及び指標マウスを用いた分析
スクレイピー感染性と結合するステンレススチールの能力は、終末期のスクレイピー罹患ＣＤ１マウスの１０％脳ホモジェネート共存下でスチールワイヤーを１６時間インキュベーションすることにより既に明らかにされている（Zobeley et al. 1999）。ＲＭＬに感染したＣ５７Ｂ１６マウス（８７ｄｐｉ）の脳内に、スクレイピー症状の予想発症時期の２ヶ月前にステンレススチールワイヤーを一時的に５分間挿入するだけで、ワイヤー表面をプリオン感染性で飽和させるに十分なことを本発明者らはここに示すものである。さらに本発明者らは、ワイヤーを一時的にＣ５７Ｂ１６マウス脾臓に挿入することによりＲＭＬを大脳内接種した４９日後に、該マウス脾臓においてプリオン感染性を認めた（表１）。１匹のマウス（ＤＮＡ＃４１６８２）の脾臓にワイヤーを挿入し、５分及び３０分後に抜き出した。「浸した」ワイヤーを、ＰＢＳを用いて標準条件下で洗浄し、実施例３に説明したように指標マウスの脳に永久移植することにより、直ちにアッセイを行った。表１に示すように、潜伏期間はそれぞれ７９±７及び８２±３日だった。また、ワイヤーを上記と同一マウスの全脳に一時的に挿入し、同一条件下で分析した。脳に５分及び３０分間露出させたワイヤーは、それぞれ８７±５（４／５）及び１０３±１５（３／５）日後に指標マウスに疾患を発症させた。同じ脳の１％ホモジェネートは、８５±６（５／５）日以内に全指標マウスに疾患を伝達し（表１）、滴定終点検出法による力価は約４．５ｌｏｇＬＤ50ユニット／ｍｌだった。
【０３０５】
【表５】
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【国際公開パンフレット】
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2004530107.tif 000116
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004530107.tif 000117
【国際調査報告】
2004530107.tif 000118
2004530107.tif 000119
2004530107.tif 000120
2004530107.tif 000121