(57)【要約】本発明は、固定化ベクターを利用した磁気結合によって、支持体と結合した生物学的又は化学的プローブの組織化されたアレイに関する。この支持体は、永久磁石を含んでもよく、電気的に誘導された磁化を示し得る。固定化ベクターは、１つの特定の型の生物学的プローブと特異的に結合することが可能なように機能化した磁石ビーズによって構成することができる。
2004525345.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
固定化ベクターを利用する磁気結合によって支持体へ結合した生物学的又は化学的プローブの組織化されたアレイ。
【請求項２】
光学的に中性である支持体へ固定化した、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３】
永久磁石を含む支持体へ固定化した請求項１又は２に記載のアレイ。
【請求項４】
電気的に誘導した磁気を示す支持体へ固定化した、請求項１又は２に記載のアレイ。
【請求項５】
構造化した磁気を示す支持体へ固定化した、請求項１から４のいずれか１つに記載のアレイ。
【請求項６】
磁場が支持体の平面に対して垂直又は平行な、請求項１から５のいずれか１つに記載のアレイ。
【請求項７】
固定化ベクターが常磁性体、超常磁性体、又は強磁性体である、請求項１から６のいずれか１つに記載のアレイ。
【請求項８】
固定化ベクターが、酸化鉄の粒子を含むラテックス又は多糖類のビーズである、請求項７に記載のアレイ。
【請求項９】
固定化ベクターが多極性ビーズである、請求項７又は８に記載のアレイ。
【請求項１０】
固定化ベクターが、磁場においてそれ自体を適用させることができる、請求項７又は８に記載のアレイ。
【請求項１１】
固定化ベクターそのものが磁気化している、請求項１０に記載のアレイ。
【請求項１２】
固定化ベクターが、１ｎｍから５００μｍの範囲、好ましくは、０．５μｍから５μｍの範囲にある直径を有する、請求項７から１１のいずれか１つに記載のアレイ。
【請求項１３】
固定化ベクターが、生物学的標的と特異的に結合することが可能なエレメントを有する、請求項１から１２のいずれか１つに記載のアレイ。
【請求項１４】
固定化ベクターによって運ばれる生物学的標的と特異的に結合することが可能なエレメントが、免疫グロブリン、抗原、膜レセプター、膜レセプターリガンド、アビジン、ストレプトアビジン、ポリ-Ｔ又はポリ-Ｕオリゴヌクレオチドを含んでなる群から選択される、請求項１３に記載のアレイ。
【請求項１５】
各プローブが、１０μｍから１ｍｍの範囲、好ましくは、５０μｍから２００μｍの範囲にある直径のスポットに配される、請求項１から１４のいずれか１つに記載のアレイ。
【請求項１６】
各スポットが、１０５から１０１０プローブ、好ましくは、１０８から１０１０プローブを有する、請求項１から１５のいずれか１つに記載のアレイ。
【請求項１７】
１ｃｍ２当たり１から１００，０００スポットの密度、好ましくは、１ｃｍ２当たり１０から１０００スポットの密度を有する、請求項１から１６のいずれか１つに記載のアレイ。
【請求項１８】
Ａ）固定化ベクターへプローブを結合させ；及び
Ｂ）組織化されたアレイの磁気支持体上の固定化ベクターに結合したプローブを配することの段階を含んでなる方法であって、固定化ベクターによる磁気結合によって支持体と結合した生物学的又は化学的プローブの組織化されたアレイを製造する方法。
【請求項１９】
Ａ）支持体上の既知の座標で固定化ベクターを磁気によって結合させ：及びＢ）固定化ベクターへプローブを結合させる段階を含む方法であって、固定化ベクターによる磁気結合によって支持体と結合したへ生物学的又は化学的プローブの組織化されたアレイを製造する方法。
【請求項２０】
固定化ベクターと支持体を結合させる段階が、マスクを利用しておこなわれると特徴付けられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項２１】
Ａ）固定化ベクターへプローブを結合させ；
Ｂ）組織化されたアレイで、非磁気化スライド上へ固定化ベクターで結合させたプローブを配し；及び
Ｃ）磁気支持体上へ段階Ｂ）のアレイを移す段階を含む方法であって、固定化ベクターによる磁気結合によって支持体へ結合した生物学的又は化学的プローブの組織化されたアレイを製造する方法。
【請求項２２】
Ａ）少なくとも１つがビオチン化されている、ヌクレオチドプライマーからのプローブを増幅し、
Ｂ）そのプローブを加熱によって変性させ、その後で急冷し；
Ｃ）常磁性体、超常磁性体、又は強磁性体であり、アビジン又はストレプトアビジンと結合したビーズ上にビオチン化プローブを結合させること；
Ｄ）そのビーズと結合したプローブを磁気によって沈殿させ；
Ｅ）未結合プローブを洗浄によって除き；
Ｆ）選択した濃度でそのプローブを再懸濁させること；及び
Ｇ）支持体上へプローブを配する段階を含んでなる方法であって、一本鎖核酸分子によって構成されるプローブの組織化されたアレイを作製するための、請求項１８又は請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
プローブを固定化ベクターへ結合させる段階が、固定化ベクターに関して飽和しているプローブの濃度でおこなわれる、請求項１８から２２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２４】
請求項１８から２３のいずれか１つに記載の方法を用いて、生物学的又は化学的プローブのアレイを作製するための構造化された永久磁化を表示する支持体。
【請求項２５】
構造化された磁化が、任意の電場から分離された静磁化の結果であり、任意の荷電分子にとって不活性である、請求項２４に記載の支持体。
【請求項２６】
支持体と固定化ベクターの間の磁気相互作用によって支持体へ結合している、固定化ベクターの組織化されたアレイ。
【請求項２７】
固定化ベクターが１０３から１０８の範囲、及び好ましくは１０５から１０７の範囲にある多くの核酸分子と結合する、核酸プローブと固定化ベクターを結合させることによって産生させる対。
【請求項２８】
請求項１から１７のいずれか１つに記載の生物学的又は化学的プローブの組織化されたアレイを作製するために、生物学的又は化学的プローブと固定化ベクターを結合させることによって産生される対の利用。
【請求項２９】
キットが磁気支持体及び固定化ベクターを含んでなる、生物学的又は化学的プローブの組織化されたアレイを作製するためのキット。
【請求項３０】
固定化ベクターが、生物学的プローブとの特異的な結合を可能にするエレメントを有する、請求項２９に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（磁力によって支持体上に固定化されている生物学的又は化学的プローブの固定マイクロアレイ）
【０００２】
本発明は、化学的に機能化されていない支持体上へ磁力によって固定化された生物学的又は化学的リガンド（プローブ）のアレイに関する。
【０００３】
プローブは、生物学的又は化学的分子に関する生物学的又は化学的活性又は親和性を示す天然又は合成基質、例えば、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、RNA、一本鎖又は二本鎖DNA、多糖類、及びリン脂質、及び化学基質の組み合わせであってもよい。非常に低コストである、そのようなアレイは、例えば、診断手段、又は分子又は生物学的試料、又は治療又は診断目的のための分子のコレクションのスクリーニングのための手段として、多くの分野で応用可能である。本発明は、生物学的又は化学的プローブのアレイを組織化するための磁気面に安定的に固定されている前記リガンドにある。この方法は、種々の密度のマイクロアレイ、又はマクロアレイを産するために適応できる。
【０００４】
ここ数年にわたって、しっかりと定まった位置に固定された生物学的プローブの小型アレイを作成するために、多くの方法が提案されてきた。
そのようなマトリックスを作成するための２つの技術がある。最初の技術は、グラフト化が可能となるように、前もって機能化及び活性化された表面で、直接に短いオリゴヌクレオチド又はペプチドを合成することにある。
二番目の技術は、前もって合成及び特徴付けられたリガンドを、機械的又は電気化学的方法によって置くことのできる前記プローブとともに機能化された表面上に固定化することにある。
【０００５】
幾つかの特許及び刊行物には、特に、取り組んでいる光化学によってオリゴヌクレオチド又はペプチドのマトリックスを得るために、取り組んでいる光化学をおこなうことへの写真平板の応用が記載されている。その方法は、光活性化が可能な官能基によって保護された化学的に機能化された表面を用いることにある。次いで、マスクを通して選択的照明は、異なるカップリング部位からの保護を取り除き、オリゴヌクレオチド又はペプチドのインサイツ合成をおこなうことを可能にする。
【０００６】
取り組んでいる光化学のその方法には、幾つかの欠点がある。最初に、保護を取り除くための反応の効率は、１００％ではない。その結果として、インサイツ合成は、例えば、切断されたリガンド、又は間違って対をなすオリゴヌクレオチド終止反応につながることのできるエラーを蓄積する。これは、プローブが高度に重複していて、多くのチェックをおこなうことを必要とし、また、標準シグナルを再構築するために、かなりのコンピューターの力を必要とする。さらには、固相に固定した短いリガンドとの相互作用又はハイブリダイゼーション反応の質は、予想することが難しい。最後に、マスクのセットを利用することは方法を複雑にし、それを高価で比較的に柔軟性のないものにし、それによって主な欠点が構成される。極めて多くの研究室によって得られる新しい結果が連続して取り込まれるために、ゲノム及び機能的データベースが常に発展している。これは、最初に、前記のデータベースを豊富にすることにつながり、二番目に、データベースに存在する幾つかの間違った配列が直されることにつながる。研究及び臨床研究の分野では、よって、研究下で生物学的材料に用いたアレイを、知識を変換する関数として適応できることは有用である。マスクのセットを用いることに依存するアレイの製造に関する上述の方法は、あるプローブの配列の低コストでの迅速な修飾にとって必要な柔軟性も、単一の付加的プローブの容易な付加さえも有しない。
【０００７】
プローブのアレイを製造するのに利用する二番目の型の技術は、支持体上へ固定化する間に個々のプローブを合成して特徴付けることにあるので、新しいデータを取り込むことに先天的により良く適用されているように思われる。
【０００８】
プローブをグラフト化する最初の方法は、Lehrachら（Hybridization fingerprinting in genome mapping and sequencing, Genome Analysis, 1990, コールド・スプリング・ハーバー出版，３９-８１頁）に記載されている。その方法は、9216ハイブリダイゼーションユニットのアレイを構築するための針を用いる。その方法の限界は、堆積物の大きな可変性、及び一度に製造できる少数のアレイにある。
【０００９】
取り組んでいる機械的又は電気化学的なものを用いる他の技術が記載されている。これらの方法では、リガンドが調製され、精製され、次いで活性化した表面に蒸着される。例えば、種々の長さのオリゴヌクレオチド、及び前もって増幅した二本鎖プローブを、DNAマトリックスアレイを作製するために蒸着させることができる。この蒸着表面は、ガラス、又は場合によってはポーラス・シリコン、ポリマー材料、又は任意の他の化学的に機能化された表面で作製されてもよい。
【００１０】
従って、幾つかの資料は、ポリ-ｌ-リジンによって、又はヒドラジド基で置換した所定のアミド基で活性化されたポリアクリルアミドゲルによって機能化されたガラス表面上に核酸プローブを蒸着させるために、マイクロピペッティング又は針転移技術を利用することを記載している。これら方法には、幾つかの大きな欠点がある。最初に、表面を化学的に機能化することは、コントロールすることが困難であるが、そのような機能化が無くては、リガンドの強い共有結合固定化は不可能である。さらには、蒸着させて固定化されるリガンドの密度は、コントロールできるものではない。最後に、幾つかの場合には、プローブの化学的グラフト化は、例えば、認識部位に近接しているアミノ基によって機能化支持体へ固定化されているレセプターの場合には、それらの標的と比較してそれらの反応性を損なう可能性がある。
【００１１】
電気化学的に取り組んでいる技術も記載されていた（特許出願 国際公開Ａ-94/22889）。その場合は、多くの電極を有する支持体で始まり、その電極は、電気化学的に生物学的なリガンドを固定化するために用いられ、電流の影響下でポリマー化する特性を有するピロール環のような電解質によって前もって機能化されたリガンドを利用する。その方法は、反応ゾーンに対するリガンドのコントロールされたアドレッシングの利点を示す。にもかかわらず、このアドレッシングは、導電性表面、機能性試薬、及び大量に製造されるマトリックスに関する品質管理を産業化し提供することが困難な工程を利用することを必須にする。
【００１２】
上記のすべての方法は、生物学的プローブのマイクロアレイを製造することを可能にするが、多様性に関するそれらの安定性に関して、及びそれらが産業規模でおこなうためには大抵は複雑であるために、それらは限定されている。
【００１３】
さらには、上で引用されている文献の殆どは、これらの方法を利用して、オリゴヌクレオチド又は二本鎖DNAに限定されている核酸プローブのアレイを得ることを記載している。にもかかわらず、感度のために、その合成オリゴヌクレオチドよりも長い一本鎖DNAプローブであって、約１０オリゴヌクレオチド長よりも長いものを作製することは困難であるものを用いることは、より利点がある。例えば、１００から５００塩基を有する一本鎖DNAプローブは、優れたハイブリダイゼーション特異性を得ることを可能にする。さらには、機能的ゲノム学の出現は、ポリペプチド、タンパク質、そして細胞プローブのアレイに対する高いレベルの需要につながっている。
【００１４】
従って、安上がりで、多くの修飾によりよく適合し、すべての型のプローブ（核酸、タンパク質、細胞性、化学性、．．．）を用いることができ、そして特別な設備を必要とせずに実験室の需要によって構成することのできる方法に対する大きな需要が存在することを見出すことができる。
【００１５】
本発明の目的は、特に、核酸プローブ（オリゴヌクレオチド、二本鎖DNA又は一本鎖DNA、RNA、．．．）、タンパク質（膜レセプター、モノクローナル抗体、ペプチド、組み換えタンパク質、又はそのドメイン、．．．）、又はウイルスでも、細胞、又はコンビナトリアルライブラリに由来する有機化学的に合成した分子であり得る極めて様々なプローブのマイクロアレイを提供する。そのような生物学的又は化学的プローブのアレイは、磁力の相互作用によってプローブを固定化することに依存する方法を用いて、容易に作製できる。この方法で作ったマトリックスは、マイクロ又はマクロアレイを利用するすべての分野、とりわけ、診断、薬理ゲノム学、毒素ゲノム学、ゲノムの構造及び発現を研究すること、そして一般的には、分子間相互作用に関わるあらゆる型の応用において用いることができる。それらは、従って、特に、診断又は高速スクリーニングのために用いることができる。これらのアレイを製造することは、支持体の任意の事前の化学的機能化を必要とせず、単純で安価な手法でおこなうことができる。固定化がおこなわれる化学基質の質は、もはや限定する要素ではない。
【００１６】
本発明の１つの利点は、そのようなアレイの検出感度を高めることでもある。有意な例としては、一本鎖DNAの固定化の可能性にあり、それによって核酸標的のハイブリダイゼーションの間の二本鎖競争を回避する。比活性のための事前の試験後に容易に組み換えタンパク質の多くの断片又はドメインを固定する能力は、その他の有意な例を構成する。プローブをグラフト化するための化学処理の欠如は、スライド上での連続した光学的処理をおこなうことを可能にし、それらスライドを蛍光及び拡散干渉に対して不活性にする。
【００１７】
本発明の詳細な概説は、以下に定義されている種々の考えに依存する：
本文を通して、用語「生物学的プローブ」とは、
−任意の生物学的分子、例えば、ペプチド、タンパク質、及び糖タンパク質（抗原、抗体、レセプター、リガンド、又はその断片）、核酸（一本鎖又は二本鎖DNA、オリゴヌクレオチド、RNA）、炭水化物、リポタンパク質、脂質；
−任意の型の細胞（細菌、原生動物、酵母、糸状菌、真核生物細胞、．．．）；
−任意の型のウイルス；又は
−細胞又はウイルス等の断片
を示す。
「化学的プローブ」とは、例えば、コンビナトリアルライブラリに由来する任意の型の化学分子を指す。
【００１８】
この出願では、「固定化ベクター」とは、初めの共有的な結合、又は生物学的及び／又は化学的プローブとの強い相互作用によって可能な、そして二番目には、磁力によって支持体に固定化されることが可能なエレメントである。１つの特定の場合には、固定化ベクターとは、当該分野に熟練している者に知られている磁気ビーズの型であり、細胞を分離するため、又は分子を精製するために生物学で広く利用されており、例えば、Miltenyi又はDynabeads（例えば、Dynal M-280ストレプトアビジン）によって販売されている。この固定化ベクターは、必ずしも球形ではない。すべての場合において、「固定化ベクターの直径」とは、粒子が囲まれることが可能な球体の直径を指す。
【００１９】
「組織化されたアレイ」とは、各スポットが、その組み合わせの機能として知られている、スポットの一組として定義することができる。拡大解釈すれば、「アレイ」という用語は、ここで、支持体上に固定したスポットの一組を指すために用いられ、その場合には、それは、「チップ」と同義語になる。
【００２０】
「磁気チップ」とは、本発明のチップ、すなわち、固定化ベクターによる磁力によって支持体上に固定化した生物学的又は化学的リガンド又はプローブのアレイである。
【００２１】
本発明では、アレイの「スポット」は、与えられたプローブを有するハイブリダイゼーション又は反応単位を構成し、与えられた「密度」を示す。
「スポット密度」とは、ここで、スポット当たりのプローブの数として定義される（例えば、プローブが分子ならば、分子の数）。
「アレイ密度」とは、単位領域当たりのスポットの数を指す。
【００２２】
「常磁性」材料は、一度はもはや磁場にはない、磁化の急速な損失を伴う低い磁化率によって特徴付けられる。
「強磁性」材料は、高い磁化率を有し、磁場（永久磁気）存在しない場合の磁気特性を保存することができる。
【００２３】
「超常磁性」と呼ばれる材料は、高い磁化率（即ち、それらは、磁場に置かれると強い磁力となる）によって特徴付けられるが、常磁性材料のように、それらは、磁場がない場合に、彼らの磁化を急激に失う。超常磁性は、結晶の大きさが臨界値よりも小さい場合、強磁性材料で得ることができる。超常磁性ビーズは、磁石による強い引力に曝され、磁場の無い場合に凝集することができないという二重の利点を示す。
【００２４】
支持体は、磁化スライドによって構成することができ、よって、表面をおおう均一の強度の磁場を作り出す。あるいは、支持体は、支持体の表面上で均一ではない磁場の強度によって定義される「構造化された磁化」を示すことができ、明確な位置で最高値を示す。これは、例えば、埋め込まれた極小磁石（三次元構造化）を有するシリカスライドを用い、磁場を通さず、規則的に間隔を離した窓（二次元的に構造化）が貫通するマスクで覆われた単純な磁化スライドへ適用する。
【００２５】
本発明は、磁気支持体上のアレイに組織化された明確な位置に生物学的又は化学的プローブを固定化することにあり、このプローブは、磁力によって引きつけられることができる粒子と共有結合によって、又は強い相互作用によって結合している。前記粒子は、「固定化ベクター」を構成する。このプローブは、固定化ベクターと磁気支持体の間の相互作用によって、支持体上の正確な座標に保持される。
【００２６】
従って、支持体は、磁力を供給又はそれに曝すことができなければならない。それは、単純な磁気化スライドによって構成されることができるが、例えば、強磁性粒子で満たされた穴を有するシリカスライドのような、三次元磁気ゾーンを有する構造化支持体としても作用する。支持体の磁化は、電気的な起源でもあり得る。構造化した電磁気化を示す支持体の例は、通電伝導体ループの一組を有する集積回路である。
【００２７】
支持体に対するカップリングプローブのための固定化ベクターは、磁力に曝され、また、それを提供する可能性があるエレメントである。これら固定化ベクターは常磁性、すなわち、磁場から取り出された場合に磁化を示すのではなくて磁石によって引きつけられる可能性がある。しかしながら、常磁性物質の固定化ベクターによるプローブと支持体の間のカップリングは、あまり強くなく、故に、超常磁性又は強磁性物質を用いて予見することが好ましい。一例として、これらは、生物学で広く用いられていて安価な、５マイクロメーター（μｍ）よりも小さな直径を有する磁石ビーズ、又はナノフェリンスのようなナノ粒子であってもよい。
【００２８】
プローブは、共有結合、又はアフィニティー型の非共有結合、例えば、ストレプトアビジンとビオチンの間に関与している結合、抗原と抗体の間の結合、又はレセプター/リガンド相互作用等のいずれかによって固定化ベクターに固定化することができる。生物学的標的と特異的に結合することができる分子で覆われている多くの型の磁石ビーズは、すでに販売されている。例えば、ビオチンと相互作用することができるストレプトアビジンで覆われているか、又はアビジンの中のビーズ、或いはタンパク質、又は膜レセプターとの相互作用によって細胞と結合することが可能な特定の抗体を有するビーズがある。ポリ-Ｔ又はポリ-Ｕオリゴヌクレオチドで覆われているビーズは、ポリ-Ａ残基（例えば、ポリ-Ａ「テール」又はメッセンジャーRNAを有するｃDNA）を含む核酸プローブのための固定化ベクターとしても利用が可能である。これらの例は、決して限定されておらず、当該分野に熟練している者は、ここに記載のアレイへの意図した応用に適用させる他の固定化ベクターをどのように選択するのかを知っている。
【００２９】
各アレイスポット、又はハイブリダイゼーション単位は、固定化ベクターとの相互作用によって固定化されている同一のプローブがグラフト化されている、数十平方マイクロメーター（μｍ２）から１平方ミリメーター（ｍｍ２）の支持体上の同定された領域を示す。このアレイスポットの直径は、利用される固定化ベクターの型に依存し、意図する用途の機能として選択される。従って、診断のためのDNAチップ、又はハイスループットスクリーニングでは、このアレイスポットは、有利に小型であり、例えば、約５０μｍの直径を有する。対照的に、より大きな直径、例えば、２００μｍは、他の型の用途、例えばプローブが細胞である場合に好まれる。好ましい様式では、与えられたアレイのすべてのスポットは、同じ領域を有する。従って、本発明は、支持体上に規則的に配置される二次元又は三次元アレイのスポットに適用し、その各スポットは、磁力で支持体上に固定化されていて、その固定化ベクターとの共有結合又は強い相互作用によって結合している異なる型の生物学的又は化学的プローブで構成されている。
【００３０】
そのようなアレイの独自性は、プローブ及びマイクロアレイを形成するために支持体上の正確な座標のその固定化ベクターによって構成されている各対を固定化するための方法にある。このプローブは、化学反応ではなく、物理力：磁力によってアレイに固定化されている。
【００３１】
固定化ベクターを介する磁力相互作用によって支持体と結合しているプローブは、多くの利点を示す。最初に、この型のカップリングは、プローブを固定化する目的のための、どんな事前の支持体の化学的処理も必要とせず、特別な条件下での貯蔵をおこなうことを必要としない。この支持体の表面が化学的機能化に曝されるならば、表面処理のランダムな性質、及び貯蔵している間に生じる損傷は、化学基質は再生可能で安定であることを保証できる可能性が無いことを意味する。一例として、基質であるリジン又はポリアクリルアミドの脱水又は再水和について言及することが可能である。本発明に記載のようなアレイによって、磁力支持体を直ぐに用いることが可能であり、それらは、何ら特別なパッケージングを必要としない。
【００３２】
さらに、プローブを固定するために、支持体を化学処理に曝す必要が無いということは、検出を最適化するために、光学的に中性で、磁場に対して透過性のある基質で支持体の表面を覆うことを可能にする。
【００３３】
分子プローブは、マイクロアレイを構築するために、支持体上の正確な位置に高度に安定な様式で固定化されるRNA又は一本又は二本鎖DNA、タンパク質、又はペプチド、及びより一般的には、任意の型の生物学的又は化学的分子によって構成することが可能である。核酸を研究するからみでは、用いられるDNA又はRNAの一本鎖断片の大きさ及び質は、それらが、最適条件下でチップから合成及び精製されるために、限定されるものではない。実施例４に例示したような、本発明のアレイの特定の実施態様では、そのプローブは、大きなサイズの一本鎖DNA分子であり、それ故に、オリゴヌクレオチドプローブ又は二本鎖DNAプローブと比較して検出感度が増大している。
【００３４】
磁力相互作用により支持体へ結合している固定化ベクターによって支持体へプローブを固定化することは、また、分子をスクリーニングするための多くの細胞を作製することを非常に容易にする（場合によっては、遺伝的に修飾）。例えば、遺伝的に修飾してストレス遺伝子を発現するようにした細胞は、大規模にストレス剤又はアンチストレス分子をスクリーニングするために固定化することが可能である。
【００３５】
マイクロアレイを作製する目的で、静止支持体への分子プローブに固定化ベクター対を加えたものの耐久性のある固定化は、固定化ベクターと支持体の間の磁力相互作用の結果である。この手法では、固定化支持体及び固定化ベクターによって構成される対のメンバーは、その双方が磁力（又は磁場）を同時に提供する必要が無いことを認めることは重要である。他方が、力へ応答することができる（又は、磁場によって引きつけられる）一方で、それらのうちの１つにとっては、前記の力（又は、磁場）を供給することで十分である。
【００３６】
従って、本発明は、最初に、固定化ベクターによる磁気結合によって支持体へ結合した生物学的又は化学的プローブの組織化されたアレイを提供する。この支持体は、好ましくは、光学的に中性である。
本発明の特定の実施態様では、この支持体は、業者Ugimag、3830 セイント ピエール  ダレヴァール、フランスによって販売されている永久磁石、例えば、サマリウム/コバルト又はネオジミウム/鉄/ホウ素磁石を含む。
あるいは、支持体は、電気的に誘導される磁化を示す。
【００３７】
本発明の特定の実施態様では、支持体は構造化された磁化を示す。支持体が永久磁石を含むならば、この特性は、支持体の特異的構造の結果であり得る。例えば、支持体は、規則的空間で分けられ、強磁性粒子で満たされている穴を有する磁気に不活性な（例えば、シリカの）材料のスライド面によって構成することができる。この構造化された磁化は、マスクを有する平面永久磁石を利用して得ることもできる。電気磁化支持体によって、構造化された磁化を、例えば、導体ループの一組を同時に有する集積回路によって得ることができる。
【００３８】
磁力支持体は、磁場が支持体の主な表面に対して垂直か又は平行となるように選択することができる。
本発明のアレイは、磁力支持体へ生物学的及び化学的プローブを結合させるための固定化ベクターを含む。定義によると、これら固定化ベクターは、磁力へ応答するか、又は、適切ならば、それを供給することが可能でなければならない。従って、固定化ベクターは、常磁性体、超常磁性体、又は強磁性体である。固定化ベクターの例には、酸化鉄の粒子を含む、ラテックス又は多糖類のビーズがある。
【００３９】
固定化ベクターは多極性であってもよく、又は、その反対で、それらは、磁場で特定の方向に向くことが可能であってもよい。本発明の特定の実施態様では、固定化ベクターは、そのものが磁気化されている。にもかかわらず、磁化固定化ベクターは、適用された磁場の非存在下でさえも、凝集することの欠点によって害を受ける。固定化ベクターは、従って、好ましくは超常磁性体である。
本発明のアレイの作製に利用するのに適切な固定化ベクターは、１ナノメーター（nm）から５００μｍの範囲、及び好ましくは０．５μｍから５μｍの範囲にある直径を有する。
【００４０】
固定化ベクターは、プローブと支持体の間の結合を提供する役割を担う。それらの磁気特性に加えて、従って、共有結合によって、又は、例えば、アフィニティー型の強い相互作用によって、それらは、プローブとの結合が可能である。本発明の好ましい実施態様では、固定化ベクターは、生物学的標的との特異的な結合が可能なエレメントを有する。特定の型の標的に対して特異的な共有結合の例は、シッフ塩基とR-NH２型のある化合物との間の縮合によって確立される結合である。生物学的標的に対して特異的な非共有結合の例としては、レセプターと対応するリガンドの間、又は、抗原とそれを認識する抗体の間で確立しているアフィニティー相互作用がある。この結合は、また、２つの相補的核酸配列の間で確立している水素結合によって構成され得る。下のこの本文では、固定化ベクターは、ある型の生物学的分子のための高い親和性を有するエレメントを有する場合、生物学的標的と特異的に結合することが可能なエレメントを有すると言われている。問題となっているプローブの型によっては、そのようなエレメントは、例えば、免疫グロブリン、抗原又はその断片、膜レセプター、膜レセプターリガンド、アビジン、ストレプトアビジン、ポリ-Ｔ又はポリ-Ｕオリゴヌクレオチド、又は、特定の相互作用を可能にする任意の化学的又は生物学的分子によって構成される群から選択することができる。
【００４１】
本発明は、また、生物学的又は化学的プローブと固定化ベクターの間の結合の産物を提供する。そのプローブの性質に依存し、各固定化ベクターと結合したそのプローブの例の数は、１（例えば、プローブが細胞の場合）から１０８（核酸プローブに関して）の範囲にある。特に、本発明は、核酸プローブと固定化ベクターを結合させることによって産せられる対を提供する。その核酸プローブは、好ましくは、５０オリゴヌクレオチドよりも長い一本鎖DNAプローブであるが、一本鎖オリゴヌクレオチド又は二重鎖DNAでもあってもよい。固定化ベクターと核酸プローブを結合することによって産せられる各対は、１０３から１０８の範囲、好ましくは、１０５から１０７の範囲にある核酸プローブの数を有する。
【００４２】
生物学的又は化学的プローブの組織化されたアレイを作製するために、生物学的又は化学的プローブと固定化ベクターを結合させることによって産せられる対の利用によって、本発明の不可欠な部分が形成される。
本発明のアレイでは、固定化ベクターと結合した各プローブは、１０μｍから１ｍｍの範囲、好ましくは、５０μｍから２００μｍの範囲にある直径のスポットに配置される。スポット直径は、意図する用途の機能として、特に、利用されるプローブの型の機能として、当該分野に熟練した者によって選択される。
【００４３】
本発明のアレイの各スポットは、１０５から１０１０プローブ、好ましくは、１０８から１０１０プローブを有する。スポット当たりのプローブの数は、固定化ベクターと結合したプローブの平均数をスポット当たりの固定化ベクターに乗じた積である。これら２つのパラメーターは、実験によって確かめることができる。固定化ベクターと結合したプローブの平均数は、特に、ベクターの「許容量」、即ち、各ベクター上の結合部位の平均数に依存する。この「許容量」は、機能化された磁気ビーズの供給者によって特定化される。スポット当たり固定化ベクターの数は、単位領域当たりの固定化ベクターの密度が、固定化ベクターが単層を形成するように、当該分野の熟練者によって計算される。従って、本発明のアレイは、均一な密度のスポットを有利に有していて、即ち、各スポットは、理想的には同じ数のプローブを有する。
【００４４】
本発明のアレイの密度は、１cm２当たり１から１００，０００スポットの範囲、好ましくは、１cm２当たり１０から１０００スポットの範囲にある。
【００４５】
本発明は、また、固定化ベクターによる磁気結合によって支持体と結合した生物学的又は化学的プローブの組織化されたアレイを製造する方法を提供する。実施例１に記載の本発明の最初の方法は、次の段階を含む：
Ａ）固定化ベクターへプローブを結合させること；及び
Ｂ）固定化ベクターと結合させたプローブを、組織化されたアレイの磁気支持体上の固定化ベクターに配置すること。
【００４６】
実施例２に例示した、固定化ベクターによる磁気結合によって支持体と結合した生物学的又は化学的プローブの組織化されたアレイの製造のその他の方法には、次の段階が含まれる：
Ａ）支持体上の既知の座標に固定化ベクターを磁気によって結合させること；及び
Ｂ）固定化ベクターへプローブを結合させること。
上記の方法では、支持体への固定化ベクターを結合させる段階は、マスクを用いておこなうことができる。
【００４７】
このマスクは、規則的に間隔を離した窓によって貫通されていて、好ましくは、固定化ベクターが単独で前記窓に固定化されるように、磁場を通さない。あるいは、このマスクは、磁場に対して透過性がある。このような環境下では、マスクで覆われるか否かに関わらず、この固定化ベクターは、最初に、支持体の全表面にわたって固定化される。その結果、支持体と直接に接触しない固定化ベクターが取り除かれるように、このマスクは、慎重に取り除かれる。
【００４８】
固定化ベクターによる磁気結合によって支持体と結合した生物学的又は化学的プローブの組織化されたアレイの製造の代替法は、実施例３に記載されていて、次の段階が含まれる：
Ａ）固定化ベクターへのプローブの結合；
Ｂ）組織化されたアレイの非磁気化スライド上の固定化ベクターと結合したプローブを配置すること；及び
Ｃ）磁気支持体上へ段階Ｂ）のアレイを転移させること。
【００４９】
上記のような本発明のすべての方法、固定化ベクターは、それらがプローブと結合するか否かにも関わらず、当該分野の熟練者によって考案されることが可能な任意の手法を用いて、随意的に磁気支持体上に配置される。例えば、これは、それぞれが、その先端が２００μｍよりも小さな直径の針によって構成されているピペット、マイクロピペット、圧電ピペット、ノズル、針、又は柔らかい鉄の芯を有する小さな電磁石を利用しておこなうことができる。
【００５０】
実施例４に記載の本発明の特定の方法は、２０から５０００ヌクレオチドの範囲、好ましくは、１００から５００ヌクレオチドの範囲にある大きさの一本鎖核酸分子によって構成されるプローブの組織化されたアレイを製造するために役立つ。この方法は、以下の段階を含む：
Ａ）少なくとも１つがビオチン化されているヌクレオチドプライマーからのプローブを増幅すること；
Ｂ）急冷の後の加熱によってプローブを変性させること；
Ｃ）常磁性体、超常磁性体、又は強磁性体であって、アビジン又はストレプトアビジンと結合しているビーズ上のビオチン化プローブを結合させること；
Ｄ）ビーズと結合しているプローブを磁気的に沈殿させること；
Ｅ）洗浄によって、未結合プローブを取り除くこと；
Ｆ）選択した濃度でプローブを再懸濁すること；及び
Ｇ）支持体上にプローブを配置すること。
【００５１】
上記の方法の好ましい実施では、固定化ベクターへプローブを結合する段階は、固定化ベクターのためのプローブの飽和濃度でおこなわれる。これは、特に、各固定化ベクターと結合しているプローブの平均数を知ること、容易に再生可能なようにそれをおこなうことを可能にする。
【００５２】
本発明は、また、上記のような生物学的又は化学的プローブのアレイの製造を目的とする、永久又は電気的に誘導される構造化した磁化を表示することが可能な支持体を提供する。本発明の好ましい支持体は、永久である構造化した磁化を示す。さらにより好ましい様式では、本発明の支持体は、任意の電界から分離され、任意の荷電分子にとって不活性な静磁化を表示する。最も生物学的なポリマー、特にDNAは、それ故に、Mellerら（A.Meller, L.Nivon, ら(2000), 「Rapid nanopore discrimination between single polynucleotide molecules」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97(3): 1079-84；及びA.Meller, L.Nivon, ら(2001), 「Voltage-driven DNA translocations through a nanopore」, Phys. Rev. Lett., 86(15): 3435-8）による論文に記載されているように、荷電していて、それによって非常に低い電圧でも、電界に対して感度がある。コイルによって誘導される磁場は、一般的に、残存する電界に付随して起こる（コイルの形に依存する）。残存する磁場が完全に消滅することを可能にしないコイルの形によって誘導される電磁場の利用は、支持体の表面上の荷電分子の非特異的吸収を引き起こす。さらには、そのような電界は、分子の物理化学的特徴を修飾する可能性がある。例えば、ある条件下では、電界によって誘導されるイオン勾配は、DNAらせんを劣化する可能性がある。
【００５３】
支持体と固定化ベクターの間の磁化相互作用によって支持体と結合している固定化ベクターの組織化されたアレイは、また、本発明の一部分を形成する。
【００５４】
最終的には、本発明は、磁化支持体及び固定化ベクターを含むキットであって、生物学的又は化学的プローブの組織化されたアレイを作製するためのキットを提供する。そのようなキットは、独自の要求に特に適応しているプローブの独自のアレイを作製し、それを低コストで研究又は分析研究室がおこなえるために特に利点がある。例えば、このキットによって、研究室が、おそらくは、上記の最後の方法を利用して「特注」DNAチップを作製することを可能にする。
【００５５】
限定されていないが好ましい様式で、本発明のキットに存在する磁化支持体は、光学的に中性であり、永久磁石を含む。適切ならば、この支持体は、構造化磁化を示す。
本発明のキットのある特定の種類では、固定化ベクターは、すでに、組織化されたアレイの支持体に固定化されている。
本発明のキットに存在する固定化ベクターは、例えば、常磁性体、超常磁性体、又は強磁性体ビーズによって構成される。
本発明のキットの有利な実施態様では、固定化ベクターは機能化されている、即ち、それは、生物学的標的と特異的に結合することが可能なエレメントを有する。
【００５６】
本発明のキットは、幾つかの型の用途のために設計されることが可能であり、それらは、ある型のプローブによる用途のために設計することが可能である。例えば、片方の末端にポリ-Ｔ又はポリ-Ｕがあるオリゴヌクレオチドを有する固定化ベクターを有するキットは、ポリ-ＡテールがグラフトされているメッセンジャーRNA又はcDNAチップを作製する用途のためにさらに特化されている。対照的に、固定化ベクターがストレプトアビジンと又はアビジンと結合しているキットは、ビオチン化が可能な任意の型のプローブによる用途について適している。
【００５７】
本発明のキットは、また、場合によっては固定化ベクターと結合している１つ又は複数のコントロールプローブを有する。例えば、このキットが真核生物細胞の遺伝子発現を解析するためのチップを作製することを意図しているならば、それを、β-アクチンの断片をコードする一本鎖DNAプローブによって構成することができる。キットは、また、遊離状態のコントロールプローブと既に固定化ベクターに固定化してあるコントロールプローブの双方を含み、それ故に、使用者が固定化ベクターへプローブを結合させる段階をモニターすることを可能にする。キットは、また、支持体上の固定化ベクターの配置を校正するために、印を付けたプローブと結合させた固定化ベクターを含む。これらの例は限定されておらず、当該分野の熟練者は、結果をより正確に判断することを可能にするため、又は、特定の型の応用を標的とするために、容易に利用できるための付加的なエレメントを有する任意の型のキットを考案することができる。
【００５８】
以下の実施例及び図面は、本発明がどのように実行され、どのような利点があるのかを、その範囲を限定することなく示している。
【実施例１】
【００５９】
単段階配置による磁気チップを作製する方法
プローブは、例えば、多極磁化ビーズなどの磁化粒子へ固定化させた。ビーズへの固定化は、共有結合によって、又は任意の他の化学結合、例えば、シッフ塩基を確立することによって、又は、例えば、ストレプトアビジン/ビオチン又は抗体/抗原結合等の非共有結合のいずれかによっておこなわれた（図１）。
固定化ベクター及びプローブを含む対は、次いで、磁化支持体の数μｍ２の小さな領域上に、所望される密度で配置された。支持体上の決まった座標で、これは、同一のプローブのスポットを所望される密度で提供する。この操作は、必ず異なるプローブのスポットのマイクロアレイを得るためごとにおこなわれた。多くのスポットが同時に作製できることが観察されるべきである（図２）。
【実施例２】
【００６０】
二段階の配置による磁気チップを作製する方法
実施例１に記載のプロトコールに関する代替案は、固定化ベクターとプローブの間に非共有結合を利用することである。そのような環境下では、磁化表面上に機能化ビーズ及びプローブを配することを分離することが可能である。従って、実施例によって、ストレプトアビジンで機能化したビーズは、各スポットが明確な密度でビーズによって構成される磁化ビーズの正規のアレイを作製するために、最初に磁化支持体上に配される。このアレイは、上のような連続配置（図３Ａ）、又は、他にマスクを用いる単一操作のいずれかによる（図３Ｂ）、２つの異なる方法で作製された。
【００６１】
磁化ビーズのアレイは、磁場を隔離するマスクを用いて作製され、ビーズを受け取るべき帯磁スライドの領域のみを非マスク化し、帯磁スライドの残りの表面をマスク化として残した（図３Ｂを比較せよ）。結果として、磁石の非マスク化部分のみが磁気ビーズを固定化することができる。ビーズを配するためのマスクは、化学処理で構成されたシリカスライドによって、又はレーザーによって機械加工されたプラスチックフィルムによって構成することができる。
構造化された磁化を示す支持体、例えば、それに埋め込まれた小型磁石については、固定化ベクターのアレイは、マスクを利用することを必要とせずに、単一の操作で作製することが可能である。
【００６２】
従って、単一の配置操作によって、組織化された磁気ビーズのアレイを得ることが可能である（図４）。
従って、二番目のステップでは、ストレプトアビジンの飽和濃度でビオチンと結合させた特定のプローブを、磁気ビーズの各スポット上に配した（図５）。同じような方策は、固定化ベクターとプローブの間のすべての非共有結合に対して利用することができる。
配置の後、遊離型のストレプトアビジンを添加して洗浄することによって、非固定化プローブを取り除いた。
これによって、決められた座標の支持体へ所望する濃度で耐久的に固定化した、特定のプローブによって構成されるマイクロアレイのスポットを産した。
【実施例３】
【００６３】
再生によって、磁気チップを作製する方法
最終的な変形型は、固定化ベクターと結合したプローブをガラススライド上に配し、次いで、磁気ビーズによって構成される対、及びさらに帯磁スライドへ固定化したプローブを移すことから成る。
転移は、単に、帯磁ビーズ及びガラススライドから帯磁スライドの等価座標へ同時に跳ぶプローブによって構成される対を伴って、帯磁スライドをガラススライドへ動かすことによって行うことができる。
【実施例４】
【００６４】
一本鎖DNAプローブの磁気チップを調製して利用すること
・スライドの調製
最初の製造段階では、磁力は、３５mmｘ２５mmの容積、及び１mmの厚さを有する帯磁スライドによって提供される。
スライドの２つの型の組成物、最初に、１．３テスラ（Ｔ）の最大磁化を提供することが可能なネオジミウムホウ化鉄で作製されたスライド、及び二番目には、１Ｔの最大磁化を供給することが可能なサマリウムコバルト帯磁スライドが試験された。
各型のスライドについて、磁場に関する２つの方向が試験された：最初は、スライドの主な表面に対して垂直な場、そして二番目には、スライドの主な表面と平行な磁化である。各場については、４つの異なる力が利用された：０．２Ｔ、０．５Ｔ、そして１Ｔ又は１．３Ｔのいずれかである。
【００６５】
・固定化ベクター
最初の実験では、利用される固定化ベクターは、２．８μｍの直径を有し、単位当たり８ｘ１０-３cgsの感受率を持つ酸化鉄（１０％-１４％のFe３O３）を含むポリマーで作られている。酸化物の粒子は、磁場と反応する能力を提供した。ビーズは、ビオチンを固定化することが可能なストレプトアビジン分子で、共有的な様式で覆われていた。ストレプトアビジンレセプターの平均密度は、ビーズ当たり７ｘ１０５から１０６である。
【００６６】
・スポット又はハイブリダイゼーション単位を配すること
ベクター（ビーズ）及びプローブ（一本鎖cDNA分子）を含む対を、０．２mmチップを有するペンを利用して、最初に配した。各ディポジットのために選択したビーズの濃度は、ハイブリダイゼーション単位当たり６ｘ１０９プローブに一致する約６０００ビーズを含有するディポジットであり、すべてのストレプトアビジン部位は飽和していたと仮定した。そのような条件下では、ビーズの単層ディポジットが得られた（各ビーズは、スライド上に直接に静止している）。
【００６７】
・プローブの調製
５' でビオチン化されたプライマーの対に始まり、前方向プライマー又は逆方向プライマーのいずれか、又は両方のプライマーで、研究中の遺伝子の特定領域のポリメラーゼ連鎖反応法（PCR)によって、増幅をおこなった。従って、各PCRのために、二重鎖配列を得た。その配列を、選択した構築物によって、コード鎖の５' 、そして逆標準の５' のそれぞれでビオチン化するか、又は、両ストランドの５' でビオチン化した。双方の場合では、二重鎖を浸積によって変性させ、次いで、ストレプトアビジンで機能化した磁石ビーズへ結合させた。添加した磁石ビーズの数を、ストレプトアビジン部位がDNAのビオチンによって飽和されるような様式で測定した。結果として、すべてのビーズは、ｎの一本鎖DNA分子を固定化し、そのｎとは、ビーズ当たりのストレプトアビジン部位の数を示す。ビーズ及び一本鎖DNA対を磁場で沈殿し、次いで洗浄して、ビオチンへ固定化していないすべてのDNAを除いた（プライマーの１つのみがビオチン化された場合、二重鎖DNAの２つのストランドの１つのみが保持される）。DNAの最終的な所望される濃度を得るために、磁石ビーズ（ベクター）及び一本鎖DNA（プローブ）を含む対を、所望する濃度で懸濁した；そのような環境下では、DNAのモル濃度は、ビーズの濃度に依存するので、それを直接得る。
【００６８】
・アレイの調製
固定化ベクター（磁石ビーズ）及びプローブ（一本鎖DNA）を含む対を、ペン又は圧電ピペットによって、所望される密度で、１００μｍから３００μｍの辺を有する小さな領域上に配した。これは、所望される密度での同一プローブのハイブリダイゼーション単位が、支持体の定まった座標で得られたことを確かなものにする。操作は、異なるプローブのスポットのマイクロアレイを得るために必要な度におこなった。多くのスポットが同時に作製されることが観察されるべきである。
【００６９】
・ハイブリダイズ
この方法で作製したスライドを、次いで、蛍光標識cDNAの混合物で直接にハイブリダイズした。cDNAは、RT-PCR（例えば、蛍光マーカーとしてＣｙ３（商品名）の存在下で）によって、研究中の細胞から抽出したmRNAから得た。また、それぞれＣｙ３（商品名）及びＣｙ５（商品名）で標識したcDNAを供給するRNAの２つの抽出物を利用して、同時ハイブリダイゼーションをおこなうことが可能である。
【００７０】
スライドを洗浄し、非ハイブリダイズcDNA分子を除いた後、各スポットの蛍光の量は、ハイブリダイゼーションの量を示し、従って、各型の分子の比率を示す。
この標識化は、限定されない；同じような実験は、放射性cDNAを用いておこなうことができる。
【実施例５】
【００７１】
GAPDH及びHPRT遺伝子をスクリーニングするための一本鎖DNAプローブの磁石チップ
磁石チップを、プローブによって、特異的増幅（PCR)によって得られるように、以下の配列を利用して作製した。各配列に関して、上記の３つの構造を作製した：
−５' ビオチン化コード鎖の配列
−５' ビオチン化アンチセンスストランドの配列
−５' ビオチン化の両鎖の配列。
下線が引かれた配列は、プローブを増幅するために用いる特異的プライマーに該当する。
【００７２】
GAPDH遺伝子のために選択したプローブ
2004525345.tif 000003
【００７３】
HPRT遺伝子のために選択したプローブ
2004525345.tif 000004
【実施例６】
【００７４】
核酸プローブとスライド上の固定化ベクター間での複合体の形成の検証
ここで用いる固定化ベクターは、ストレプトアビジンで機能化した、１μｍの直径を有する常磁性Fe２O３ポリスチレン粒子であった。プローブは、前出の実施例で示したGAPDH遺伝子の断片と一致する。それは、その２つの鎖のうちの１つのみ（センス鎖）の５' のビオチンによって機能化されたか、又は機能化されなかった。
配列を明らかにしたプライマー：
５' CTGGTGTCTTCACCACCATG ３'
５' TCACCACCTTCTTGATGTCATC ３'
このプローブは、PCRによる増幅の間、全配列にわたってＣｙ３（商品名）又はＣｙ５（商品名）のいずれかによって標識された。
【００７５】
PCRの産物を沈殿させ、再懸濁し、１００℃で変性し、０℃で浸積させ、次いで、４℃で６０分にわたって粒子と浸積させた。その結果として生じたプローブ及びベクター複合体は、磁石活性化によって沈殿させ、それらは、１０X ＳＳＣ緩衝液で３回、そして３Ｘ ＳＳＣ緩衝液で１回洗浄した。その残存物は、３Ｘ ＳＳＣ緩衝液に再懸濁させた。
結果として生じた溶液のアリコートを、針を用いて取り出し、２０mm ｘ３０mm ｘ １mmの容積を有する１Ｔの磁石スライドへ配した。この堆積物は、１０Ｘ ＳＳＣ緩衝液で３回洗浄した。
【００７６】
図６は、次の堆積の結果を示す：
Ａ）ビオチンによって機能化されていないＣｙ３-標識プローブ；
Ｂ）５' でビオチンによって機能化されたＣｙ３-標識プローブ；
Ｃ）機能化されていない、Ｃｙ３-標識プローブ；
Ｄ）５' でビオチンによって機能化されたＣｙ３-標識プローブ；
Ｅ）単一粒子。
この図は、粒子へのプローブの固定化は、実際に特異的であり（プローブがビオチンで機能化されていない場合は、蛍光標識はない）、そして、ビーズ及びプローブ複合体は、実際には、磁石スライド上に保持されている（図Ｂ及びＤ）。
【実施例７】
【００７７】
ビーズ及びプローブ複合体上での核酸標的のハイブリダイゼーションの検証
プローブは、センス鎖上の５' のビオチンによって機能化された又は機能化されていないGAPDH遺伝子に関する配列の断片によって構築された。
標的は、Ｃｙ３（商品名）又はＣｙ５（商品名）によって配列すべてに沿って標識されたＧＡＰＤＨのＰＣＲ産物によって構築された。
固定化ベクターは、１μｍの直径を有し、ストレプトアビジンによって機能化された常磁性Fe２O３ポリスチレン粒子である。
【００７８】
プローブを１００℃で変性させ、０℃で浸積させ、次いで、４℃で６０分にわたって粒子と複合化させた。その結果として生じたプローブ及びベクター複合体を、磁石活性化によって沈殿させ、１０X ＳＳＣ緩衝液で４回洗浄した。その残存物は、２５％ホルムアミド緩衝液に再懸濁させ、次いで、その変性標的をプローブと混合させ、それらを５０℃でハイブリダイズした。
結果として生じた溶液のアリコートを、針を用いて取り出し、２０mm ｘ ３０mm ｘ １mmの容積を有する１Ｔの磁石スライド上へ配した。この堆積物を、１０Ｘ ＳＳＣ緩衝液で３回、そして３Ｘ ＳＳＣ緩衝液で１回洗浄した。
【００７９】
その結果は、図７に示してあり、その種々のスポットは、以下の条件と一致する：
Ａ）５' でビオチンによって機能化した未標識プローブであって、Ｃｙ３で標識された標的；
Ｂ）ビオチンで機能化されていないプローブであって、Ｃｙ３で標識された標的；
Ｃ）５' でビオチンによって機能化した未標識プローブであって、Ｃｙ５で標識された標的；
Ｄ）ビオチンで機能化されていないプローブであって、Ｃｙ５で標識された標的。
従って、粒子と固定化した場合に、標的は、プローブ上へハイブリダイズすることが可能であり、極めて僅かな非特異的吸収があった。
実際に、標的は、ベクターによってスライド上に保持された。
【実施例８】
【００８０】
標的及びタンパク質プローブが固定化ベクターと固定化されていることの検証
ベクターは、非特異的に、それらの表面上のタンパク質を吸収することが可能な、１μｍの直径を有する常磁性Fe２O３ポリスチレン粒子である。
この場合のプローブは、タンパク質ｘに対して特異的な抗体である。
標的は、Ｃｙ３で標識された細胞抽出物に含まれるタンパク質ｘであった。
標的を含有する細胞抽出物の任意のエレメントを認識しない、タンパク質ｘの非特異的抗体は、参考として用いられた。
【００８１】
種々の異なるハイブリダイゼーションをおこない、その結果を図８に示す。
図８Ａ：粒子を血清アルブミン（ＢＳＡ）で、次いで、Ｃｙ３-標識全タンパク質抽出物でプレインキュベートした。
非特異的固定化を認めることができる。
図８Ｂ：粒子を非特異的抗体でプレインキュベートし、次いで、非標識ＢＳＡで飽和し、その後で、Ｃｙ３-標識全抽出物でインキュベートした。
同じ非特異的固定化は、ＢＳＡによるプレハイブリダイゼーションの間の現象として考えることができる。
【００８２】
図８Ｃ：粒子を、ｘに対して特異的な抗体でプレインキュベートし、非標識ＢＳＡで飽和し、次いで、Ｃｙ３標識全抽出物でインキュベートした。
蛍光シグナルの強度は、非特異的ハイブリダイゼーションのそれよりも大きい。実際に、特異的ハイブリダイゼーションは、抗ｘ抗体によっておこった。
【００８３】
この実験で観察された非特異的固定化は、大きい。この非特異的固定化は、ＳＨ基がグラフト化されている「シリカ粒子」又は「ビーズシリカ」等のケイ酸又はシリコン型の常磁性粒子を利用して取り除くことができる。
これらの粒子は、タンパク質を吸収せず、よって、それらは、非特異的吸収を取り除く。抗体は、例えば、還元の後に、重鎖のチオールによって固定化することができる。よって、特異的固定化部位は、S-S架橋によって粒子と共有結合した重鎖と軽鎖によって構成することができる。
【実施例９】
【００８４】
１Ｔでの固定化アレイを有する支持体上の常磁性粒子アレイの可能性
Ｃｙ３標識プローブで機能化したビーズを、１Ｔで静止磁化を示す支持体上へ、1cm２当たり６２５の密度で配した。次いで、結果として生じたアレイを、１０Ｘ ＳＳＣ溶液で３回、３Ｘ ＳＳＣ溶液で１回洗浄した。その結果は図９に示してあり、安定なアレイが得られたことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】磁化粒子へのプローブの固定化。
【図２】磁気チップを作製すること。
【図３】Ａ）連続の堆積によって；  Ｂ）磁場を通さないマスクを利用する単段での配置による機能化されたビーズのアレイの作製。
【図４】磁化ビーズの組織化されたアレイ。
【図５】前もって磁気によって組織化したアレイへプローブを配すること。
【図６】スライド上の核酸プローブと固定化ベクターの間の複合体の形成を示す、５μｍの解像度でスキャンした蛍光画像：  Ａ）ビオチンで機能化されていない、Ｃｙ３-標識プローブ；  Ｂ）５' でビオチンによって機能化されたＣｙ３-標識プローブ；  Ｃ）機能化されていない、Ｃｙ３-標識プローブ；  Ｄ）５' でビオチンによって機能化されたＣｙ３-標識プローブ；  Ｅ）単一粒子。  観察は、５μｍの解像度でGMS 428スキャナーを用いておこなった。
【図７】ビーズ及びプローブ複合体上での核酸標的のハイブリダイゼーションを示す、５μｍの解像度でスキャンした蛍光画像：  Ａ）５' でビオチンによって機能化された非標識プローブ、Ｃｙ３で標識した標的；  Ｂ）ビオチンで機能化されていないプローブ、Ｃｙ３で標識した標的；  Ｃ）５' でビオチンによって機能化された非標識プローブ、Ｃｙ５で標識した標的；  Ｄ）ビオチンで機能化されていないプローブ、Ｃｙ５で標識した標的。  観察は、５μｍの解像度でGMS 428スキャナーを用いておこなった。
【図８】タンパク質プローブの固定化及び固定化ベクター上の標的を示す、５μｍの解像度でスキャンした蛍光画像：  Ａ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でプレインキュベートし、次いで、Ｃｙ３で標識した全タンパク質抽出物；  Ｂ）非特異的抗体、次いで非標識ＢＳＡ、次いでＣｙ３-標識全抽出物でプレインキュベートした粒子；  Ｃ）特異的抗体ｘ、次いで非標識ＢＳＡで、次いでＣｙ３-標識全抽出物でプレインキュベートした粒子；  Ｄ）洗浄後に配したＣｙ３標識タンパク質。  観察は、５μｍの解像度でGMS 428スキャナーを用いておこなった。
【図９】５μｍの解像度でGMS 428スキャナーを用いて観察された、１cm２あたり６２５の密度で、Ｃｙ３-標識プローブで機能化したビーズのアレイ。スキャンした表面は、０．７５cmの側面を有する正方形であった。
【図１】
2004525345.tif 000005
【図２】
2004525345.tif 000006
【図３】
2004525345.tif 000007
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004525345.tif 000011
【図８】
2004525345.tif 000012
【図９】
2004525345.tif 000013
【国際公開パンフレット】
2004525345.tif 000014
2004525345.tif 000015
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【国際調査報告】
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