(57)【要約】本発明は関連のマングローブ植物から生活性分子を抽出、分画および精製する方法、粗抽出液、その画分および精製化合物の薬理活性のスクリーニング方法、および粗抽出液から得られたパルミチン酸メチルのムスカリンアンタゴニストとしての使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
マングローブ植物サルバドラ・ペルシカから得られた化合物パルミチン酸メチルの有効量を含んでなる、新規なムスカリンアンタゴニスト。
【請求項２】
ラットの胃の筋肉におけるＭ１受容体に対する胃酸度を抑える、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
モルモット回腸および膀胱排尿筋のＭ３受容体に対して活性を示す、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
サルバドラ・ペリシア植物から得られた有効量のパルミチン酸メチルを投与する工程を含んでなる、ムスカリン障害の治療方法。
【請求項５】
ムスカリン障害が腎性大腸炎、動揺病、腹部痙攣および気管支喘息などである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
投与されるパルミチン酸メチルの量が０．１〜１０ｍｇ／体重ｋｇである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
マングローブ植物サルバドラ・ペルシカからパルミチン酸メチルを製造する方法であって、
（ａ）サルバドラ・ペルシカから抽出液を得、さらに
（ｂ）その抽出液から生物学的に活性なパルミチン酸メチルを抽出および精製する
ことを含んでなる、方法。
【請求項８】
抽出液が
（ｉ）植物部分を風乾し；
（ii）その植物部分を室温（２８±２℃）で１週間９０％メタノール水溶液に浸漬し；
（iii）そのメタノール抽出液を常法により濾過し；さらに
（iv）そのメタノール抽出液を室温（２８±２℃）で蒸発させて粗抽出物を得る
ことにより製造される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
サルバドラ・ペルシカの植物部分が葉、茎および花から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
抽出液がクロロホルム抽出液、水性抽出液およびヘキサン抽出液から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
パルミチン酸メチルの抽出および精製が
ａ）サルバドラ・ペルシカの抽出液を得；
ｂ）薬理学的方法を用いてその抽出液を試験し；
ｃ）その抽出液を分画し；
ｄ）薬理学的方法を用いてその画分を試験し；
ｅ）従来から知られている方法のいずれか一つを用いて純粋なパルミチン酸メチルを単離し；
ｆ）薬理学的方法を用いてその純粋な化合物を試験し；さらに
ｇ）公知の方法のいずれかによって化合物を同定する
ことにより行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
パルミチン酸メチルが心房と身体のその他の部分の間のムスカリン受容体を識別することができ、かつ、ムスカリン受容体のヘテロ性を示す、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
パルミチン酸メチルが胃酸度および胃腸管障害を抑制する、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
パルミチン酸メチルがラットの胃のＭ１受容体に対する胃酸度を抑制する、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
パルミチン酸メチルがＭ２受容体を遮断せず、これにより使用する用量範囲内でモルモットの心房筋の収縮に阻害作用を持たない、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
パルミチン酸メチルがモルモット回腸および膀胱排尿筋のＭ３受容体に対して活性を示す、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
パルミチン酸メチルが最大応答をそのままに、アセチルコリンの用量応答曲線を右へシフトさせる、請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
パルミチン酸メチルが本質的に可逆的な競合的拮抗作用を示す、請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
パルミチン酸メチルがアトロピンよりも効力の弱いムスカリン活性を示す、請求項８に記載の方法。
【請求項２０】
パルミチン酸メチルまたは新たなマングローブ植物限、すなわちサルバドラ・ペルシカからの抽出液を投与することによる、哺乳類の胃酸度および胃腸管障害を治療する方法。
【請求項２１】
Ｍ１受容体が０．１〜１０ｍｇ／体重ｋｇのパルミチン酸メチルを受容する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
パルミチン酸メチルが１５分ごとに投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
Ｍ２受容体が１０×１０−６〜４００×１０−６モル／ｍｌのパルミチン酸メチルを受容する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
パルミチン酸メチルが１０分ごとに投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
Ｍ３受容体が５０×１０−６〜４００×１０−６モル／ｍｌのパルミチン酸メチルを受容する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
パルミチン酸メチルが６０秒分ごとに投与される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
Ｍ３受容体が回腸および膀胱である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
胃酸度の抑制が用量増加と直接比例関係にある、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
パルミチン酸メチルまたは新しいマングローブ植物源、すなわちサルバドラ・ペルシカから得られた抽出液の、哺乳類のムスカリンアンタゴニストとしての使用。
【請求項３０】
パルミチン酸メチルが心房と身体のその他の部分の間のムスカリン受容体を識別することができ、かつ、ムスカリン受容体のヘテロ性を示す、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
パルミチン酸メチルが胃酸度および胃腸管障害を抑制する、請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
パルミチン酸メチルがラットの胃のＭ１受容体に対する胃酸度を抑制する、請求項２９に記載の使用。
【請求項３３】
パルミチン酸メチルがＭ２受容体を遮断せず、これにより使用する用量範囲内でモルモットの心房筋の収縮に阻害作用を持たない、請求項２９に記載の使用。
【請求項３４】
パルミチン酸メチルがモルモット回腸および膀胱排尿筋のＭ３受容体に対して活性を示す、請求項２９に記載の使用。
【請求項３５】
パルミチン酸メチルが最大応答をそのままに、アセチルコリンの用量応答曲線を右へシフトさせる、請求項２９に記載の使用。
【請求項３６】
パルミチン酸メチルが本質的に可逆的な競合的拮抗作用を示す、請求項２９に記載の使用。
【請求項３７】
パルミチン酸メチルがアトロピンよりも効力の弱いムスカリン活性を示す、請求項２９に記載の使用。
【請求項３８】
Ｍ１受容体が０．１〜１０ｍｇ／体重ｋｇのパルミチン酸メチルを受容する、請求項２９に記載の使用。
【請求項３９】
パルミチン酸メチルが１５分ごとに投与される、請求項２９に記載の使用。
【請求項４０】
Ｍ２受容体が１０×１０−６〜４００×１０−６モル／ｍｌのパルミチン酸メチルを受容する、請求項２９に記載の使用。
【請求項４１】
パルミチン酸メチルが１０分ごとに投与される、請求項２９に記載の使用。
【請求項４２】
Ｍ３受容体が５０×１０−６〜４００×１０−６モル／ｍｌのパルミチン酸メチルを受容する、請求項２９に記載の使用。
【請求項４３】
パルミチン酸メチルが６０秒分ごとに投与される、請求項２９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はインドのゴア地方のマングローブ湿原河口から採集されたサルバドラ・ペルシカ(Salvadora persica)LinneausＬ１７５３と呼ばれる関連マングローブ植物から得られた新規なムスカリンアンタゴニストに関する。詳しくは本発明はサルバドラ・ペルシカ植物から単離されたパルミチン酸メチルのムスカリンアンタゴニストとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
パルミチン酸メチルは脂肪酸メチルエステルである。これは天然の食用油脂から商業生産されている。これらの化合物は食品、医薬、化粧品および工業用の幅広い範囲で間接的に広く用いられている(Pearson, R. Report of the FAME (Fatty acid Methyl Esters) Task Force, January 9,1997)。同じ文献で、パルミチン酸メチルを含有するメチルエステルに関してラットにおいて経口毒性を試験したことが示されている。これにより無毒であることが明らかになった。また、パルミチン酸メチルのエマルションを経口挿管または腹腔内注射によりマウスに投与したところ、網膜内皮系の器官重量または食作用に変化は認められなかったことも記載されている。Environment mutagen 8, (Suppl 7): 1-119,1986 (Pearson, R. Report of the FAME (Fatty acid Methyl Esters) Task Force, 9 January, 1997から引用)では、パルミチン酸メチルはサルモネラおよび哺乳類小胞体アッセイ試験に基づき、いずれの突然変異誘発作用も受けなかったことが報告されている。パルミチン酸メチルはウサギ皮膚の化合物感受性を示したが、ヒト皮膚での結果は極めて弱い作用しか持たないことが分かった。用いた脂肪酸メチルエステルは動物飼料用脂肪の補助源として使用できる。
【０００３】
「ムスカリン作用」は節後副交感神経終末からアセチルコリンの放出の結果もたらされる作用、または節後副交感神経が通っている器官の受容体に外からアセチルコリンを投与することによる作用である。内的に放出されたアセチルコリンならびに外的に投与されたアセチルコリンいずれのムスカリン作用もアトロピンにより遮断される。「ムスカリン作用」とは、これらの作用が有毒なマッシュルームアルカロイドムスカリンによって生じるものに似ていることから来た表現である(Satoskar, R. S. and S. D. Bhandarkar. Pharmacology and pharmacotherapeutics, vol. 1. Popular Prakashan Bombay. 1990)。アセチルコリンはムスカリンおよびニコチンの２種の受容体に作用する(Goodman & Gilman: In : The pharmacological basis of therapeutics. 9th edition 1997. McGraw-Hill, health profession's division, New York; 1905 PP.)。サルバドラ・ペルシカ植物の粗抽出物の活性は平滑筋で見られたことから、ムスカリン受容体だけが研究されてきた(Nazarine, F. Ph. D. Thesis, Goa University, 1998)。
【０００４】
多数の結合および機能研究が、５つのサブタイプのムスカリン受容体、すなわちＭ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４およびＭ５の存在を示している(Birdsall, N. J. M and Hulme F. C.; 1983; Trends Pharmacological Sciences, 4: 459-461,1983)。最も重要なのはムスカリン受容体サブタイプＭ１、Ｍ２およびＭ３である。Ｍ１受容体は胃に見られ、胃の分泌を媒介し、一方、Ｍ２受容体は心筋に見られ、Ｍ３は回腸および膀胱排尿筋に見られ、平滑筋の収縮を起こさせる。
【０００５】
Thompson Wayne J, Ransom Richard W; Mallorga Pierre; Sugrue Michael F'は１９９７年５月９日公開の特許ＷＯ９７１６１９２でピペルジン誘導体の抗ムスカリン活性を開示し、一般に近視として知られているミオピアの治療および／または予防におけるそれらの使用を記載している。
【０００６】
Haertel, Bernd and Klimek, Peterは１９９３年５月１３日公開の特許ＤＥ４１３６８１１で特にパルミチン酸メチル、エチルおよび／またはイソプロピルを数種の溶媒および乳化剤とともに含有する、塗料を除去するためのスキンクレンザーを開示している。Jeanne, R. L. and Henderson, Gは１９９２年４月２８日公開の米国特許第５，１０９，０２２号でパルミチン酸メチルおよびその他数種の化合物を含み、昆虫の飛来の駆散、食害、虫さされの防御に有用な組成物を記載している。Khwaja, Tasneem, A. and Friedman; Elliot P.は２０００年３月２１日公開の米国特許第６，０３９，９５０号で米国南部に見られる小型のヤシであるソウ・パルメット(Saw Palmetto)由来の脂肪エステルを含む数種の医薬級化合物の処方を記載している。Ueoka, Hideaki; tabata; Osamu; Sakamoto; Tohruは２０００年４月１１日公開の米国特許第６，０４９，０１３号でアルコール生産法において脂肪酸（一例としてパルミン酸メチルのもの）がココヤシ、ヤシ、およびこの用途のパームカーネルから抽出することができたことを記載している。
【０００７】
Wood; Ronald W. el-Fawal; hassan, A. n.; Graefe, John F.; Chen; Lung C.; Shojaie; Jalilは１９９８年１０月１３日公開の特許（米国特許第５，８２１，２４９号）でコカイン塩基を加熱（「クラック」）することによる無水エクゴニンメチルエステル（ＭＥＧ）の生産および抗コリン作動薬としてのそれらの使用を記載している。ＭＥＧは単独およびコカインと組み合わせて、アセチルコリンとの接触を模擬した単離気管リングに対する作用を試験した。
【０００８】
パルミチン酸メチルの抗ムスカリン活性に関して利用できる特許はない。本発明は塩基性条件下での幽門結紮によって胃酸度を観測することによるＭ１受容体に対するパルミチン酸メチルの作用を初めて開示するものである。アトロピン同様、パルミチン酸メチル化合物は遊離酸度を低下させた。しかし、行った研究ではそれは標準的なアンタゴニストアトロピンより５０倍効果が小さかった。通道組織および心筋に見られるＭ２ムスカリン受容体はコリン作動性刺激の徐脈作用と負の変力作用の双方を媒介する。本発明はモルモット心房の収縮率および収縮力に対するパルミチン酸メチルおよびアトロピンの比較作用に関する。本発明ではアトロピンの阻害作用を記載する。本発明はパルミチン酸メチル化合物は使用する用量範囲ではそのような作用はなく、これがおそらくそれがＭ２受容体を遮断しないことを示していることを記載する。この作用の理由は分かっていないが、なお本発明はパルミチン酸メチル化合物が心房と身体のその他の部分の間のムスカリン受容体を識別することができることを記載する。まさにパルミチン酸メチルが心房のＭ２受容体に作用しない理由はムスカリン受容体のヘテロ性にあることが確実である。
【０００９】
本明細書において「抗ムスカリン活性」とはムスカリン受容体に対するアンタゴニスト活性をいい、ここでアンタゴニスト活性とはアトロピンおよび該化合物の阻害作用をいう。「ムスカリン受容体のヘテロ性」とは、該化合物が心房と身体のその他の部分の間のムスカリン受容体を識別する能力を意味する。「化合物の選択性」とは、Ｍ１およびＭ３ムスカリン受容体にのみ対するその化合物の阻害作用を意味する。「競合的拮抗作用」とは、化合物が最大応答をそのままに、アセチルコリンの用量応答曲線を右へシフトさせることを意味する。胃酸度試験では、化合物はラット体重当たりで皮下注射した（体重はキログラムで測定しＫｇ．ｓ．ｃ．と表記。「ｓ．ｃ．」は皮下を意味する）。
【００１０】
薬理学的方法によるアンタゴニスト活性スクリーニングに適合された方法は本化合物に関しては初めて記載されるものである。本発明はパルミチン酸メチルが最大応答をそのままに、アセチルコリンの用量応答曲線を右へシフトさせることを記載する。さらにまた、該化合物によって示される競合的拮抗作用は本質的に可逆的であることを記載する。パルミチン酸メチルはアトロピン同様、Ｍ３受容体を遮断するが、２．２倍効力が弱い。
【発明の目的】
【００１１】
本発明の主要な目的はサルバドラ・ペルシカ植物の抽出液から精製したパルミチン酸メチル化合物の抗ムスカリン活性を研究することである。
【００１２】
本発明のもう一つの目的はムスカリン受容体に関するパルミチン酸メチルのヘテロ性を研究することである。
【００１３】
本発明のなおもう一つの目的はin vivoおよびin vitroにおけるパルミチン酸メチルおよびアトロピンの競合作用を研究することである。
【００１４】
本発明のもう一つの目的はアセチルコリンの用量応答曲線に対するパルミチン酸メチルの作用を検出することである。
【００１５】
本発明のもう一つの目的はラットにおけるパルミチン酸メチルの作用を検出することである。
【００１６】
本発明のさらにもう一つの目的はモルモットにおけるパルミチン酸メチルの作用を見出すことである。
【発明の概要】
【００１７】
本発明はサルバドラ・ペルシカ植物から精製されたパルミチン酸メチル化合物の抗ムスカリン活性をスクリーニングするための高効率・高選択的法を提供することにより先行技術に内在する欠点を克服しようとするものであり、本化合物のムスカリンアンタゴニストとしての使用を開示する。
【発明の具体的説明】
【００１８】
よって、本発明はマングローブ植物源、すなわちサルバドラ・ペルシカからパルミチン酸メチルを得る方法であって、
（ａ）サルバドラ・ペルシカから抽出液を得、さらに
（ｂ）その抽出液から生物学的に活性な抽出物を抽出および精製してパルミチン酸メチルを得ることを含んでなる方法を提供する。
【００１９】
また本発明は、マングローブ植物源サルバドラ・ペルシカからパルミチン酸メチルを含んでなる抽出液を製造する方法であって、
（ｉ）植物部分を風乾し；
（ii）その植物部分を室温（２８±２℃）で１週間９０％メタノール水溶液に浸漬し；
（iii）そのメタノール抽出液を常法にて濾過し、さらに
（iv）そのメタノール抽出液を室温（２８±２℃）で蒸発させて粗抽出物を得ることを含んでなる方法を提供する。
【００２０】
より詳しくは本発明はサルバドラ・ペルシカマングローブ植物の抽出液からムスカリンアンタゴニストととして有用な生物学的に活性なパルミチン酸メチルの抽出および精製する方法であって、
ａ）サルバドラ・ペルシカの植物部分から溶媒抽出液を得；
ｂ）薬理学的方法を用いてその抽出液を試験し；
ｃ）その抽出液を分画し；
ｄ）薬理学的方法を用いてその画分を試験し；
ｅ）常法によりその純粋な化合物を単離し；
ｆ）薬理学的方法を用いてその純粋な化合物を試験し；さらに
ｇ）常法により合物を同定することを含んでなる方法を提供する。
【００２１】
本発明の一つの具体例では、サルバドラ・ペルシカの植物部分は葉、茎および花から選択される。
【００２２】
本発明のもう一つの具体例では、抽出液はクロロホルムおよびヘキサンなどの溶媒を用いて得られる。
【００２３】
本発明のなおもう一つの具体例では、パルミチン酸メチル分子は
分子式：Ｃ１６Ｈ３２Ｏ２
分子量：２５６
融点：３０℃
という特徴を持つ。
【００２４】
本明細書において「抽出液」とは、サルバドラ・ペルシカ植物から得られる抽出液を表す。本発明のさらにもう一つの具体例では、パルミチン酸メチルは心房と身体のその他の部分の間のムスカリン受容体を識別することができ、かつ、ムスカリン受容体のヘテロ性を示す。パルミチン酸メチルは本質的に可逆的な競合的拮抗作用を示す。
【００２５】
本発明のもう一つの具体例では、得られるパルミチン酸メチルは胃酸度および胃腸管障害を抑制する。本願者らはパルミチン酸メチルがラットの胃に見られるＭ１受容体に対して活性を示す場合に胃酸度を抑制することを見出した。それはまたブタの回腸および膀胱排尿筋に見られるＭ３受容体に対しても活性を示す。
【００２６】
また、パルミチン酸メチルはＭ２受容体を遮断せず、これにより使用する用量範囲ではモルモットの心房筋の収縮に阻害作用を持たないことが判明した。
【００２７】
本発明のなおもう一つの具体例では、パルミチン酸メチルは最大応答をそのままに、アセチルコリンの用量応答曲線を右へシフトさせる。
【００２８】
本発明のもう一つの具体例では、パルミチン酸メチルはアトロピンよりもムスカリン活性を示す。
【００２９】
行った研究に基づけば、本発明はサルバドラ・ペルシカ植物から得られた新規なムスカリンアンタゴニストを提供する。本出願者らはサルバドラ・ペルシカの抽出液ならびに抽出液から得られたパルミチン酸メチルがムスカリンアンタゴニストとして作用することを見出した。
【００３０】
さらに本発明は、マングローブ植物サルバドラ・ペルシカから得られた抽出液の有効量を所望により従来の添加剤とともに含んでなる、ムスカリンアンタゴニストとして有用な医薬組成物を提供する。この組成物はまた有効成分としてパルミチン酸メチルを含んでもよい。組成物中の有効成分の量は当業者ならば治療する患者、その体重などの要因に応じて容易に決定することができるが、有効量は０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。
【００３１】
さらに本発明者らはこの植物から得られたパルミチン酸メチル化合物が収縮を緩慢にする、または停止させることにより筋肉収縮に影響を及ぼす全般的な能力を有することを見出した。結果として、これは平滑筋の痙攣を軽減することができることから抗ムスカリン剤として作用する。このようにこの化合物は効果的な「ムスカリンアンタゴニスト」として作用する。好ましくはこの治療方法はサルバドラ・ペルシカから得られたパルミチン酸メチル化合物を含有する組成物をそれを必要とする被験体に投与する工程を含んでなる。組成物を投与し得る疾病は腎性大腸炎、気管支喘息、腹部痙攣、動揺病および早産の予防である。本出願者らは抽出物中のパルミチン酸メチル化合物が上記活性の一端を担うものと考えている。
【００３２】
本発明の具体例では、標準的なアゴニスト薬アセチルコリンの用量応答曲線をパルミチン酸メチルの存在および不在下、モルモット心房に対し、Ｍ２およびＭ３受容体に対するその活性に関して作製した。
【００３３】
本発明のもう一つの具体例では、比較のため、回腸および膀胱筋上のＭ３受容体に対する抗ムスカリン活性の試験に３種類の濃度のアトロピンを用いた。その用量は、
槽濃度３５×１０−６モル／ｍｌ；
槽濃度８６×１０−６モル／ｍｌ；および
槽濃度１７３×１０−６モル／ｍｌ
である。
【００３４】
本発明のなおもう一つの具体例では、比較のため、Ｍ２受容体に対して３種類の用量のアトロピンを投与した。その用量は、
槽濃度０．４×１０−６モル／ｍｌ；
槽濃度０．９×１０−６モル／ｍｌ；および
槽濃度１．７×１０−６モル／ｍｌ
である。
【００３５】
本発明のなおもう一つの具体例では、比較のため、胃液強度を調べる目的でＭ１受容体に対して３種類の用量のアトロピンを投与した。その用量は、
０．０１ｍｇ／ラット体重ｋｇ；
０．０５ｍｇ／ラット体重ｋｇ；および
０．１０ｍｇ／ラット体重ｋｇ
である。
【００３６】
もう一つの具体例では、パルミチン酸メチル化合物による胃酸度の抑制は
１ｍｇ／ラット体重ｋｇの用量の場合は５０．７２％；
３ｍｇ／ラット体重ｋｇの用量の場合は５５％；および
５ｍｇ／ラット体重ｋｇの用量の場合は９１．５％
であった。
【００３７】
表の説明
表１：ラットにおける胃酸度に対するパルミチン酸メチルおよびアトロピンの作用
【実施例】
【００３８】
実施例１：使用した化学薬品、試薬、装置およびその入手先
2004525144.tif 000002
装置：
１．フィジオグラフ
企業：Biodevices,
Ambala, India.
２．フォーストランスデューサー
モデルＮｏ．Ｔ−３０５
企業：GRASS, USA 3. Organ Bath
Ambala,
India
【００３９】
サルバドラ・ペルシカであることが確認された関連のマングローブ植物から抽出および精製した脂肪族エステルパルミチン酸メチルの抗ムスカリン活性のスクリーニング方法および結果を開示する。
【００４０】
実施例２：
ゴア沿岸部からのマングローブ植物サルバドラ・ペルシカＬの採集では、マンドリ川上流河口域の河口付近リバンダールに沿って行った。この種はゴア沿岸領域に偏在し、干潮時の河岸から手で採集した。
【００４１】
実施例３：
採集したマングローブの処理としては、まず海水、次に水道水で洗浄した。不要な材料は水道水で洗浄して塩を除去している間にふるい落とされた。関連のマングローブ植物の葉、茎および花を乾燥さた。乾燥後、植物材料を細かく刻み、９０％メタノール水溶液に１週間浸漬して抽出した。腐敗しないように溶媒に適切に浸漬するよう注意する。
【００４２】
実施例４：
粗抽出液の抽出および調製は室温にて常温浸出法、および減圧下水浴（５０℃）にて溶媒蒸発により行った。これはその中に存在する熱に不安定な代謝産物の保護に役立つ。抽出液が濃縮されるまで減圧下で２回再抽出を行い、粗抽出物を得た。
【００４３】
実施例５：粗抽出物の分画
粗抽出物は分液漏斗を用いて石油エーテル、クロロホルム、ｎ−ブタノールおよび水性画分へと分液した。分液漏斗中の抽出液に石油エーテルを加えて分離した。次に、残渣にクロロホルムを加えてよく混合し、下層を分離した。残渣にブタノールを加え、上層をブタノール画分呼び、下層を水性画分と呼ぶ。各画分の抽出は３回行い、エマルションとなった場合にはエマルションを崩壊させるために塩化ナトリウムを加えた。クロロホルムおよびブタノール画分には硫酸ナトリウムを加え、濃縮までに水の痕跡を除去した。これらの画分は全て粗抽出液と同様の方法で濃縮した。これらの画分がもとの粗抽出液と同じ薬理活性を有するかどうか調べた。
【００４４】
粗抽出物の薬理試験
均一な管理条件（温度２５±１℃）下で飼育した体重３００〜３５０ｇ前後の交尾したことのない雌モルモットを用いた。これらの動物を試験の２４時間前から絶食させ、水だけは自由に摂取させた。
【００４５】
単離したモルモット回腸を用いて抗痙攣抗コリン作動性子宮収縮活性および出産誘導活性を調べた。
【００４６】
生理溶液は全て試験の度ごとに新しく調製した。
【００４７】
実施例６：
モルモット回腸の薬理試験のため、頭部に一撃を加えて失神させることでモルモットを犠牲にした。腹部を速やかに切開した。腹部の下端方向は緑がかった袋様の盲腸であった。小腸は局部的な壁の肥厚、すなわちリンパ組織のパイエル板の徴候があった。回盲接合部に最も近い回腸の最下部１０ｃｍを除去した。そこから約１０ｃｍの回腸組織を切り取り、腸管膜を除去し、温かいタイロード溶液を含むペトリ皿に入れた。回腸の管腔をタイロード溶液を満たした皮下注射用シリンジで穏やかにすすいで管腔内の粘液の蓄積を防いだ。回腸を十分弛緩した状態で約３〜４ｃｍの長さの小片に切断した。下端をチューブと直接接触しないようにまずループを作って組織ホルダーに縫合した。この組織を３７℃で曝気したタイロード溶液の入った１０ｍｌ容の器官槽に入れた。回腸の上端の糸はフォーストランスデューサー（ＦＴ０３）のレバーに固定し、これは筋肉のアイソメトリック収縮を測定するものであり、グラスポリグラフ（モデル７）に接続されている。回腸組織はタイロード溶液中で３０分間安定に維持され、器官槽の液体は１０分ごとに更新した。
【００４８】
２〜４種類の用量の痙攣原物質(アセチルコリン、ヒスタミン、５−ヒドロキシチリプタミン、塩化バリウムおよびニコチン）を槽に加え、接触時間３０秒で均一な収縮力を得、これをポリグラフで記録した。抽出液および画分の水溶液は痙攣原物質の添加１分前に加えた。痙攣原物質により誘導される収縮には段階的用量の抽出物（５０×２５０μｇ／ｍｌ）の作用が見られ、収縮の低下率は以下に示す式に従って測定する。
【００４９】
阻害％＝（Ｘ−Ｙ／Ｘ）×１００
ここで、Ｘ＝標準収縮の高さ（ｍｍ）
Ｙ＝抽出液の存在下での標準収縮の高さ（ｍｍ）
【００５０】
実施例７：
単離したモルモット子宮に対する試験では、双角子宮を摘出し、脂肪組織を除去した。一方の角を切り取り、生理溶液、すなわち予め曝気したデジャロン液の入った薄型のディッシュで維持した。組織が薄く、飽和が速い場合には通気は酸素が好ましい。両端を縫合した。子宮片の下端を組織ホルダーに結びつけ、１０ｍｌ容の器官槽に懸垂したが、上端の方がグラスポリグラフ（モデル７）に接続したフォーストランスデューサー（ＦＴ０３）のレバーに対して感度が高い。これを１０分ごとに槽の生理溶液を更新しながら３０分間安定化させた。接触時間６０秒としてオキシトシンおよびＰＧ  Ｆ２αなどの標準的な子宮刺激に対する種々の用量の抽出液（５０×２５０μｇ／ｍｌ）への子宮応答をポリグラフで記録した。出産誘導作用は以下で示される式によって評価した。
阻害％＝（Ｘ−Ｙ／Ｘ）×１００
【００５１】
ここで、Ｘ＝標準収縮の高さ（ｍｍ）
Ｙ＝抽出液の存在下での標準収縮の高さ（ｍｍ）
【００５２】
実施例８：
純粋な化合物の薬理試験
in vitro試験：抗コリン作動活性に関して有効な画分を単離し、単離した５種類の化合物を単離したモルモット回腸のみで試験した。新しく犠牲にしたモルモットからの縦回腸筋を１０ｍｌ容の器官槽に懸垂し、タイロード溶液を満たし、曝気した。３０秒間の接触で均一な大きさを得るために２種または４種の用量の標準薬アセチルコリンをこの槽に加え、その収縮をポリグラフで記録した。単離した５種類の化合物は１９６および３９２×１０−６モル／ｍｌの槽濃度で試験した。アセチルコリン誘導性収縮に対するこれら化合物の作用を観察し、収縮の低下率を測定した。
【００５３】
実施例９：パルミチン酸メチル、アセチルコリンおよびアトロピンの原液および種々の用量の調製
上記植物の粗抽出液のクロロホルム画分から精製したパルミチン酸メチルは粉末状であった。その１ｍｇ／ｍｌ濃度の原液を作製するため、秤量した粉末をまずクロロホルム１滴に溶かした後、蒸留水を加えて容積１ｍｌとした。この原液は４℃で保存した。この原液を蒸留水で希釈することで種々の濃度の用量を調製した。標準ムスカリン作用薬としてアセチルコリンを用い、標準アンタゴニストとしてアトロピンを用いた。これら両標準薬の原液を調製した後、蒸留水で一連の希釈を行って種々の濃度とした。
【００５４】
実施例１０：Ｍ１受容体に対するin vivo胃酸度試験の用量
これらの活性はラットで試験した。用いたパルミチン酸メチルの用量は１ミリグラム／ラット体重キログラム皮下注射（１ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）；３ミリグラム／ラット体重キログラム（３ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）；５ミリグラム／体重キログラム（５ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）であった。
【００５５】
比較の目的で胃酸度試験に用いたアトロピンの用量は０．０１ミリグラム／ラット体重キログラム皮下注射（０．０１ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）；０．０５ミリグラム／ラット体重キログラム皮下注射（０．０５ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）；０．１０ミリグラム／ラット体重キログラム皮下注射（０．１０ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）であった。
【００５６】
実施例１１：心房組織のＭ２受容体に対するin vivo試験の用量
パルミチン酸メチルの４種の用量、すなわち槽濃度２０×１０−６モル／ｍｌ、槽濃度４０×１０−６モル／ｍｌ、槽濃度１９６×１０−６モル／ｍｌ、および槽濃度３９２×１０−６モル／ｍｌを原液を蒸留水で希釈することで調製した。比較の目的で用いたアトロピンの用量は槽濃度０．４×１０−６モル／ｍｌ、槽濃度０．９×１０−６モル／ｍｌ、および槽濃度１．７×１０−６モル／ｍｌであった。
【００５７】
実施例１２：回腸および膀胱のＭ３受容体のin vivo試験の用量
調製おおび適用した３種の用量は、槽濃度９８×１０−６モル／ｍｌ、槽濃度１９６×１０−６モル／ｍｌ、および槽濃度３９２×１０−６モル／ｍｌであった。
【００５８】
比較の目的で用いたアトロピンの３種の用量は、槽濃度３５×１０−６モル／ｍｌ、槽濃度８６×１０−６モル／ｍｌ、および槽濃度１７３×１０−６モル／ｍｌであった。
【００５９】
実施例１３：in vivo試験のためのパルミチン酸メチルの投与
胃酸度試験のin vivo試験はラットの幽門結紮によって行った。体重１９０〜２５０ｇのいずれかの性のアルビノラットを無作為に各６匹の群に分け、１群６匹を対照とした。ラットは総て試験前４８時間絶食させた。まず２４時間後、８時間０．２％塩化ナトリウム中８％スクロースに近づけるようにした。８時間のスクロース処理と幽門結紮前２時間以外は自由に水を摂らせた。
【００６０】
基礎胃酸度はエーテル麻酔下で幽門結紮した後に生理食塩水で胃洗浄することで測定した。幽門結紮１５分前に対照群以外の総てのラットに３種の用量（１、３および５ｍｇ／ｋｇ）の上記化合物および標準アンタゴニストのアトロピン（０．０１、０．０５および０．１ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した。３時間後に動物を犠牲にし、食道接合で胃を結紮して取り出した。大きい方の屈曲に沿って切開して内容物を回収し、指示薬としてTopfer試薬を用いて０．０１規定のＮａＯＨに対して滴定することで遊離酸度を求めた。
【００６１】
実施例１４：パルミチン酸メチルの抗ムスカリン活性を試験するためのin vitro試験：
このin vitro試験はモルモット心房、回腸および膀胱組織で行った。心房を取り出し、酸素管に結紮し、他端はフィジオグラフ(Biodevices Physiograph)に接続した「フォーストランスデューサー」（モデルＴ−３０５）に固定した。心房の自然拍動および平衡化（３０分）後の停止張力を長さ−張力曲線のピークに調節した後、再平衡化（３０分）を行った。増加濃度の化合物（実施例５に記載の用量）を添加する前と添加した後のアセチルコリンに対する累積濃度応答曲線を得た。応答はアンタゴニスト（化合物）の不在下においてアセチルコリンによって誘導された心房最大阻害率％で表した。縦回腸筋は組織槽の曝気したタイロード溶液中に懸垂した。アンタゴニスト活性は増加濃度の化合物およびムスカリンアンタゴニストであるアトロピンの不在または存在下におけるアセチルコリンに対する濃度応答曲線から求めた。化合物の用量は実施例５に示した通りとした。
【００６２】
縦膀胱排尿筋片を曝気したタイロード生理溶液中、停止張力（０．５ｇ）で懸垂した。張力はアイソメトリックフォーストランスデューサー（ＦＴ３０５）で測定し、Biodevices Physiographで記録した。抗ムスカリン活性は増加濃度の上記化合物の不在および存在下でのアセチルコリンに対する濃度応答曲線から求めた。収縮応答は上記化合物の不在下においてアセチルコリンによって誘導された最大収縮のパーセンテージで表した。パルミチン酸メチル、アセチルコリンおよびアトロピンの用量は実施例５に示した通りとした。
【００６３】
実施例１５：胃酸度：
アトロピン同様、パルミチン酸メチル化合物は３種類総ての用量（１、３および５ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．）で用量依存的に基礎胃酸度を抑制した（表１）。それぞれ低用量での抑制率は５０．７２％、３ｍｇ／ｋｇでは５５．００％、高濃度では９１．５０％であった。グラフ（図１および２）に示されているように、この化合物はアトロピンよりも５倍効力が弱かった。
【００６４】
実施例１６：モルモットのＭ２受容体に対するパルミチン酸メチルの作用
上記化合物は検討した濃度、すなわち２０×１０−６モル／ｍｌ槽、４０×１０−６モル／ｍｌ槽、１９６×１０−６モル／ｍｌ槽、および３９２×１０−６モル／ｍｌ槽ではその固有の正の変力作用または変時作用は生じなかった。パルミチン酸メチル化合物はアトロピンより１１８倍効力が弱かった（図３および４）。
【００６５】
実施例１７：
パルミチン酸メチル化合物は９８、１９６および３９２×１０−６モル／槽ｍｌの濃度で、ムスカリンアゴニストアセチルコリンによって生じたに回腸平滑筋の収縮を阻害した。さらにアトロピン同様、この化合物はその傾きおよび最大応答を変化させることなくアセチルコリンに対する用量応答曲線を右へシフトさせ、競合的拮抗作用を示す（図５および６）。
【００６６】
実施例１８：
膀胱排尿筋片についての試験では、パルミチン酸メチル化合物は９８×１０−６モル／槽ｍｌ、１９６×１０−６モル／ｍｌ槽および３９２×１０−６モル／ｍｌ槽の濃度で用量依存的かつ競合的にアセチルコリンの作用を阻害した（図７および８）。この化合物はアトロピンより２．２倍効力が弱かった。
【００６７】
表１：ラットの胃酸度に対するパルミチン酸メチルおよびアトロピンの作用    
2004525144.tif 000003
【００６８】
発明の効果
本発明は関連のマングローブ植物の新規な供給源から精製した新規なムスカリンアンタゴニストに関する。
【００６９】
本発明はin vivoおよびin vitro試験の双方で抗ムスカリン活性に関する生活性分子の薬理学的スクリーニング法を採用するのに利用できる。Ｍ１、Ｍ２およびＭ３受容体に対するパルミチン酸メチルおよびアトロピンの作用を比較すると、パルミチン酸メチルではＭ１およびＭ３に対して阻害作用を示し、一方、アトロピンでは３種類総ての受容体に対して阻害作用を示す。
【００７０】
本発明はまたパルミチン酸メチル化合物が使用する用量範囲ではこのような作用を持たず、おそらくはＭ２受容体を遮断しないことを示すものと考えられる。パルミチン酸メチルのムスカリン受容体を識別するこの能力は、選択的組織治療薬の臨床試験のための医薬組成物を製造する上で広い適用局面を持ち得る。
【００７１】
このように好ましい使用様式では、パルミチン酸メチルがアセチルコリンの最大応答曲線はそのままにアセチルコリンの用量応答曲線を右へシフトさせるという発見を用いる。
【００７２】
本発明はまたこの化合物によって示される拮抗作用が競合的なものであるという発見を意図する。パルミチン酸メチルはアトロピン同様Ｍ３受容体を遮断するが、２．２倍効力が弱い。
【００７３】
化合物の選択性および効力が弱いという両特性によって無関連の組織／器官に対する副作用を克服するというさらなる利点を有する組成物を試験する上で優れた組合せを作り出すことができる。
【００７４】
好ましい使用様式では、パルミチン酸メチル化合物は胃酸度および胃腸管障害の可能性のある抑制剤となり得る。胃酸度の抑制％はこの化合物の用量と直接比例関係にあった。
表１：ラットの胃酸度に対するパルミチン酸メチルおよびアトロピンの作用    
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【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】パルミチン酸メチルによる胃液強度の抑制率％。
【図２】アトロピンによる胃液強度の抑制率％。
【図３】パルミチン酸メチルの不在および存在下でのモルモット心房におけるアセチルコリンの用量応答曲線。
【図４】アトロピンの不在および存在下でのモルモット心房におけるアセチルコリンの用量応答曲線。
【図５】パルミチン酸メチルの不在および存在下でのモルモット回腸におけるアセチルコリンの用量応答曲線。
【図６】アトロピンの不在および存在下でのモルモット回腸におけるアセチルコリンの用量応答曲線。
【図７】パルミチン酸メチルの不在および存在下でのモルモット膀胱におけるアセチルコリンの用量応答曲線。
【図８】アトロピン不在および存在下でのモルモット膀胱におけるアセチルコリンの用量応答曲線。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年3月15日(2003.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サルバドラ・ペルシカ植物から得られた有効量のパルミチン酸メチルを投与するステップを含んでなる、ムスカリン障害の治療方法。
【請求項２】
ムスカリン障害が腎性大腸炎、動揺病、腹部痙攣および気管支喘息などである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
投与されるパルミチン酸メチルの量が０．１〜１０ｍｇ／体重ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
マングローブ植物サルバドラ・ペルシカからパルミチン酸メチルを製造する方法であって、
（ａ）サルバドラ・ペルシカから抽出物を得て、さらに
（ｂ）その抽出物から生物学的に活性なパルミチン酸メチルを抽出および精製する
ことを含んでなる、方法。
【請求項５】
抽出物が
（ｉ）植物部分を風乾し；
（ii）その植物部分を室温（２８±２℃）で１週間９０％メタノール水溶液に浸漬し；
（iii）そのメタノール抽出物を常法により濾過し；さらに
（iv）そのメタノール抽出物を室温（２８±２℃）で蒸発させて粗抽出物を得る
ことにより製造される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
サルバドラ・ペルシカの植物部分が葉、茎および花から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
抽出物がクロロホルム抽出物、水性抽出物およびヘキサン抽出物から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
パルミチン酸メチルの抽出および精製が
ａ）サルバドラ・ペルシカの抽出物を得て；
ｂ）薬理学的方法を用いてその抽出物を試験し；
ｃ）クロロホルム、石油メチル、n−ブタノールおよび水を用いてその抽出物を分画し；
ｄ）薬理学的方法を用いてその画分を試験し；
ｅ）従来公知の方法のいずれか一つを用いて工程ｃ）のクロロホルム画分から純粋なパルミチン酸メチルを単離し；
ｆ）薬理学的方法を用いてその純粋な化合物を試験し；さらに
ｇ）公知の方法のいずれかによって化合物を同定する
ことにより行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
パルミチン酸メチルまたは新たなマングローブ植物源、すなわちサルバドラ・ペルシカからの抽出物を投与することによる、哺乳類の胃酸度および胃腸管障害を治療する方法。
【請求項１０】
Ｍ１受容体が０．１〜１０ｍｇ／体重ｋｇのパルミチン酸メチルを受容する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
パルミチン酸メチルが１５分ごとに投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
Ｍ２受容体が１０×１０−６〜４００×１０−６モル／ｍｌのパルミチン酸メチルを受容する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
パルミチン酸メチルが１０分ごとに投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
Ｍ３受容体が５０×１０−６〜４００×１０−６モル／ｍｌのパルミチン酸メチルを受容する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
パルミチン酸メチルが６０秒分ごとに投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
Ｍ３受容体が回腸および膀胱である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
胃酸度の抑制が用量増加と直接比例関係にある、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
パルミチン酸メチルまたは新しいマングローブ植物源、すなわちサルバドラ・ペルシカから得られた抽出物の、哺乳類のムスカリンアンタゴニストとしての使用。
【請求項１９】
パルミチン酸メチルが心房と身体のその他の部分の間のムスカリン受容体を識別することができ、かつ、ムスカリン受容体のヘテロ性を示す、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
パルミチン酸メチルが胃酸度および胃腸管障害を抑制することができる、請求項１８に記載の使用。
【請求項２１】
パルミチン酸メチルがラットの胃のＭ１受容体に対する胃酸度を抑制することができる、請求項１８に記載の使用。
【請求項２２】
パルミチン酸メチルがＭ２受容体を遮断せず、これにより使用する用量範囲内でモルモットの心房筋の収縮に阻害作用を持たない、請求項１８に記載の使用。
【請求項２３】
パルミチン酸メチルがモルモット回腸および膀胱排尿筋のＭ３受容体に対して活性を示す、請求項１８に記載の使用。
【請求項２４】
パルミチン酸メチルが最大応答をそのままに、アセチルコリンの用量応答曲線を右へシフトさせる、請求項１８に記載の使用。
【請求項２５】
パルミチン酸メチルが本質的に可逆的な競合的拮抗作用を示す、請求項１８に記載の使用。
【請求項２６】
パルミチン酸メチルがアトロピンよりも効力の穏やかなムスカリン活性を示す、請求項１８に記載の使用。
【請求項２７】
Ｍ１受容体が０．１〜１０ｍｇ／体重ｋｇのパルミチン酸メチルを受容する、請求項１８に記載の使用。
【請求項２８】
パルミチン酸メチルが１５分ごとに投与されるものである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２９】
Ｍ２受容体が１０×１０−６〜４００×１０−６モル／ｍｌのパルミチン酸メチルを受容する、請求項１８に記載の使用。
【請求項３０】
パルミチン酸メチルが１０分ごとに投与されるものである、請求項１８に記載の使用。
【請求項３１】
Ｍ３受容体が５０×１０−６〜４００×１０−６モル／ｍｌのパルミチン酸メチルを受容する、請求項１８に記載の使用。
【請求項３２】
パルミチン酸メチルが６０秒分ごとに投与されるものである、請求項１８に記載の使用。
【国際調査報告】
2004525144.tif 000042
2004525144.tif 000043