(57)【要約】Ｓｌｕｇ遺伝子またはその遺伝子の転写もしくは発現生成物の異常発現は癌細胞を保有するの疑いのある生物検体において癌細胞、特に腫瘍性間葉細胞の存在を検出することができる。Ｓｌｕｇ遺伝子またはその遺伝子の転写もしくは発現生成物は癌を治療するために有用である。
2004520045.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓｌｕｇ遺伝子の異常発現を基礎にした試験検体にお
ける癌細胞の存在を検出するための方法であって、
１）癌細胞を保有する疑いのある脊椎動物の生物検体を入手することにより試験検体を得ること。
２）該試験検体の細胞におけるＳｌｕｇ遺伝子の発現を評価すること。
３）試験検体の細胞におけるＳｌｕｇ遺伝子の発現を対照検体の細胞におけるＳｌｕｇ遺伝子の発現と比較すること。
からなり、対照検体の細胞におけるＳｌｕｇ遺伝子の発現と比較した際に、試験検体の細胞におけるＳｌｕｇ遺伝子の異常発現の存在が試験検体における癌細胞の存在を示すことを特徴とする癌細胞の存在を検出する方法。
【請求項２】
癌細胞が間葉性腫瘍細胞であり、そして白血病と肉腫とからなる請求項1に記載の方法。
【請求項３】
間葉性腫瘍細胞が白血病と肉腫とからなる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
癌細胞を有する疑いのある脊椎動物がヒトである請求項１に記載の方法。
【請求項５】
対照検体が（ｉ）癌細胞を有していない脊椎動物の生物検体、および（ｉｉ）癌細胞を保有している脊椎動物の生物検体から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ｓｌｕｇ遺伝子の発現の評価が生成されたＳｌｕｇ遺伝子のコピーの数を測定することにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
生成されたＳｌｕｇ遺伝子のコピーの数の測定が二重染色体外断片を視覚化すること、均質統合染色領域を視覚化すること、あるいは細胞融合技術の手段によって行なう請求項６に記載の方法。
【請求項８】
Ｓｌｕｇ遺伝子の発現の評価がＳｌｕｇ遺伝子（Ｓｌｕｇ  ｍＲＮＡ）に相当するｍＲＮＡのレベルを測定することにより行う請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ｓｌｕｇ  ｍＲＮＡのレベルの測定がノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼでのマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写（ＲＴ−ＬＣＲ）、細胞融合、あるいはマイクロアレイによって行う請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｓｌｕｇ遺伝子の発現生成物（Ｓｌｕｇ蛋白質）の発現に基づいて試験検体における癌細胞の存在を検出する方法であって、
１）癌細胞を有する疑いのある脊椎動物の生物検体を採取することにより試験検体を取得すること。
２）該試験検体の細胞におけるＳｌｕｇ蛋白質の発現を評価すること。
３）試験検体の細胞におけるＳｌｕｇ蛋白質の発現を対照検体の細胞におけるＳｌｕｇ蛋白質の発現と比較すること。
からなり、対照検体の細胞におけるＳｌｕｇ蛋白質の発現と比較した際に、試験検体の細胞におけるＳｌｕｇ蛋白質の異常発現の存在が試験検体における癌細胞の存在を示すことを特徴とする癌細胞の存在を検出する方法。
【請求項１１】
癌細胞が間葉性腫瘍細胞であり、そして白血病と肉腫とからなっている請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
間葉性腫瘍細胞が白血病と肉腫とからなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
癌細胞を有する疑いのある脊椎動物がヒトである請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
対照検体が（ｉ）癌細胞を保有していない脊椎動物の生物検体、および（ｉｉ）癌細胞を保有している脊椎動物の生物検体から選択される請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
Ｓｌｕｇ遺伝子の発現の評価が生成されたＳｌｕｇ遺伝子のコピーの数を測定することにより行う請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
Ｓｌｕｇ蛋白質またはその蛋白質の断片を認識する治療上有効な量の抗体、またはＳｌｕｇ作用をＤＮＡレベル、ＲＮＡレベル、もしくは蛋白質レベル（Ｓｌｕｇ）で阻害する治療上有効な量の化合物と、製薬上許容できる任意の添加剤とからなる癌を治療するための医薬組成物。
【請求項１７】
抗体がヒトＳｌｕｇ蛋白質を認識するかまたはその蛋白質の断片を認識する請求項１６に記載の医療組成物。
【請求項１８】
Ｓｌｕｇ蛋白質またはその蛋白質の断片を認識する抗体が単クローン抗体あるいは多クローン抗体である請求項１６に記載の医療組成物。
【請求項１９】
Ｓｌｕｇ作用をＤＮＡレベル、ＲＮＡレベル、もしくは蛋白質レベル（Ｓｌｕｇ）で阻害する化合物がＳｌｕｇ遺伝子の発現をじゃまするか、またはＳｌｕｇ  ｍＲＮＡを非活性化するか、あるいはＳｌｕｇ蛋白質を非活性化するか、もしくは負の優性遺伝子を有するその蛋白質の作用と競合する化合物または化合物の混合物である請求項１６に記載の医療組成物。
【請求項２０】
Ｓｌｕｇ遺伝子の発現調節に基づく抗腫瘍物質を生体内でスクリーニングする方法であって、
（ｉ）一定の条件下でＳｌｕｇ遺伝子を発現する細胞システムを発生させ、
（ｉｉ）該細胞システムを試験対象化合物と接触させ、
（ｉｉｉ）Ｓｌｕｇ遺伝子の発現を評価し、
Ｓｌｕｇ遺伝子が発現されない場合、試験化合物が抗腫瘍物質の可能性があることを特徴とする抗腫瘍物質の生体内スクリーニング方法。
【請求項２１】
癌を治療するための薬剤を製造するためにＳｌｕｇ蛋白質またはその蛋白質の断片を認識する抗体、あるいはＳｌｕｇ作用をＤＮＡレベル、ＲＮＡレベル、もしくは蛋白質レベル（Ｓｌｕｇ）で阻害する化合物を使用する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＳｌｕｇ遺伝子またはその遺伝子の転写もしくは発現生成物の異常発現に基き生物検体中の癌細胞の存在を検出するためにＳｌｕｇ遺伝子を使用する方法に関するものである。また、本発明は癌の治療のためにＳｌｕｇ遺伝子、あるいはその遺伝子の転写もしくは発現生成物（ＲＮＡあるいは蛋白質）を使用する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
癌治療における近年の進歩は適切な癌治療を計画しかつ正確な予後経過を判断をするために、癌の有無および癌の種類を検出しかつその部位の特定および他の組織への転移の可能性を判断するために癌の段階を検出するための有効な方法を備えることが必要であることを示した。癌の正確な診断はこの疾患を原因とする死者の数を減らし、最適な治療選択肢（化学療法、外科的摘出等）を選ぶことにより患者の生活の質を向上させることができ、治療の最終ポイントを明確にさせることにより患者の不便を軽減することに寄与できる。
【０００３】
予後指針は患者の癌治療および癌発育に関する重要な情報を提供する。事実、ある種の初期癌の治療における全身性アジュバント（補助）療法の適用では、患者が高リスク患者であるか低リスク患者であるかの特定が主要目標の1つとなっている。複数の予後指針が公知であり、従来型のものとしては、腫瘍サイズ、リンパ節の状態、組織検査、ステロイド受容体の状態等があり、第二世代指針としては、増殖率、ＤＮＡ倍数性、癌遺伝子、増殖因子受容体、ある種の糖蛋白質受容体等があり、いずれも治療選択のうえで有用である（マグガイヤー，ダブリュー  エル氏著、再発及び生存についての予後要因、臨床腫瘍学の教育パンフレット米国学会、第２５回年次総会、第８９頁乃至第９２頁、１９８９年及びコンテッソ氏等著、ヨーロッパジャーナル臨床腫瘍学、第２５巻、第４０３頁乃至第４０９頁、１９８９年「ＭｃＧｕｉｒｅ，  Ｗ．Ｌ．、Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋｌｅｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２５ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，８９−９２（１９８９）ａｎｄ  Ｃｏｎｔｅｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｕｒ．  Ｊ.  Ｃｌｉｎ.  Ｏｎｃｏｌ．２５号、４０３−４０９（１９８９）」。公知の予後指針は高リスク患者と低リスク患者との間を識別する目的を完全に満たすことがないけれど、複数の指針を組み合わせることによって患者の予後予測の質を高めることができ、そのため、癌の予後、その進行、および治療後の残存疾患を確認するために従来の予後指針に付加することができる新たな予後指針のための研究が進められている。
【０００４】
他方、核酸の分析に基づいた分子方法は感受性を改善したけれど（バーチル  エス  エイ  及び  セルビー  ピ  ジェイ氏著、病理学ジャーナル、第１９０巻、第６頁乃至第１４頁、２０００年「Ｂｕｒｃｈｉｌｌ  Ｓ．Ａ．  ＆  Ｓｅｌｂｙ  Ｐ．Ｊ．，Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ，１９０，６−１４，（２０００）」）、癌細胞検出に用いられる方法のほとんどが感受性に制限がある。それにも関わらず、これらの方法は浸潤性腫瘍細胞と非浸潤性腫瘍細胞の識別ができない。
【０００５】
Ｓｌｕｇ遺伝子は脊椎動物に存在する遺伝子である。本遺伝子は上皮−間葉転位に影響を与える「Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒｓ」型（Ｓｌｕｇ）の転写因子をコード化する（ニエト氏等著、サイエンス、第２６４巻、第８３５頁乃至第８４９頁、１９９４年「Ｎｉｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４，８３５−８４９（１９９４）」）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、一般に、間葉性腫瘍細胞のような癌細胞を検出する指針を見出すための問題を取り扱うものである。
【０００７】
本発明により提供する解決策はＳｌｕｇ遺伝子の発現が間葉性腫瘍細胞等の癌細胞の存在に関連していることを発明者グループが発見し、係る悪性細胞が対照細胞と較べて、非常に高いレベルのＳｌｕｇ遺伝子、および／またはその遺伝子の転写および発現生成物を発現することを発明者グループが観察できた事実に基づくものである。発明者グループにより行なわれた各種の実験は間葉性腫瘍細胞を有する組織検体の細胞中にＳｌｕｇ遺伝子の生成物が発現されるが、しかし正常組織検体中ではその生成物が発現されないか、あるいはほとんど測定できないレベルで発現されることを示した。特別な実施例において、発見者グループはＳｌｕｇ遺伝子がＢＣＲ−ＡＢＬを有する白血病細胞の播殖能力を調節することを観察し、これはＳｌｕｇ遺伝子が腫瘍浸潤の役割を演することを意味している。
【０００８】
上述した発見から導き出した考えられる応用の1つは腫瘍浸潤を検出するためにおよび／または癌治療の治療目的としてＳｌｕｇ遺伝子またはその遺伝子の転写もしくは発現生成物を使用することにある。
【０００９】
従って、本発明の目的はＳｌｕｇ遺伝子またはその遺伝子の転写生成物もしくは発現生成物（ＲＮＡあるいは蛋白質）の発現の評価に基づいて試験検体中の癌細胞の存在を検出する方法を提供することにある。
【００１０】
本発明の他の目的は、癌の治療における治療目的としてＳｌｕｇ遺伝子またはその遺伝子の転写生成物もしくは発現生成物を使用する方法を提供することにある。
【００１１】
本発明は、一般に、癌細胞を検出および／あるいは癌細胞を治療するためにＳｌｕｇ遺伝子またはその遺伝子の転写生成物もしくは発現生成物（ＲＮＡあるいは蛋白質）を使用する方法に関するものである。Ｓｌｕｇ遺伝子は、上皮−間葉転位に影響を与える「Ｚｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒｓ」型（Ｓｌｕｇ）の転写因子をコード化する。癌細胞、特に間葉性腫瘍細胞は正常細胞と比較して非常に高いレベルのＳｌｕｇ遺伝子および／またはその遺伝子の転写生成物もしくは発現生成物（ＲＮＡあるいは蛋白質）を発現することから、Ｓｌｕｇ遺伝子またはその遺伝子の転写生成物もしくは発現生成物（ＲＮＡあるいは蛋白質）の異常発現に基づき悪性細胞を検出するための方法を確立することができる。
【００１２】
１．癌細胞の検出
第１態様において、本発明は、Ｓｌｕｇ遺伝子またはその遺伝子の転写生成物もしくは発現生成物（ＲＮＡあるいは蛋白質）の異常発現の評価に基づき対照検体中の当該遺伝子あるいは転写生成物もしくは発現生成物（ＲＮＡあるいは蛋白質）の発現との比較から、試験検体中の癌細胞を検出する方法を提供するものである。この方法は、癌細胞を有するおそれがあるあらゆる脊椎動物、特に哺乳動物、例えばヒトに適用することができる。
【００１３】
本発明が提供する方法は、Ｓｌｕｇ遺伝子またはその遺伝子の転写生成物もしくは発現生成物（ＲＮＡあるいは蛋白質）を発現する癌細胞、例えば白血病および肉種のような間葉性腫瘍細胞の検出に適しており、そのため、癌細胞により生じる疾患の診断、ならびにその予後の評価、および治療後の残存疾患の特定という本疾患治療における重要な面に活用できる。
【００１４】
本明細書に用いる意味において、用語「試験検体」は間葉性あるいは癌性の腫瘍細胞を有するおそれのある脊椎動物の生物検体を意味する。
【００１５】
用語「対照検体」は間葉性あるいは癌性の腫瘍細胞を含有する脊椎動物の疾患予後に関する情報を取得するためにここで使用されるものとして、（ｉ）間葉性あるいは癌性の腫瘍細胞を有していない脊椎動物の生物検体と、（ｉｉ）間葉性あるいは癌性の腫瘍細胞を有する脊椎動物の生物検体とを含むものとする。
【００１６】
本明細書に用いられている「異常発現」は一般に非腫瘍組織の正常細胞における遺伝子あるいはその遺伝子の転写もしくは発現生成物（ＲＮＡあるいは蛋白質）の発現と比較して、同一腫瘍組織の細胞における上記遺伝子あるいはその遺伝子の転写もしくは発現生成物（ＲＮＡあるいは蛋白質）の変質発現として理解されるべきものとする。遺伝子の異常発現には、遺伝子の増幅、遺伝子の過剰発現、および通常その遺伝子を発現しない細胞中の当該遺伝子の発現が含まれる。
１．Ａ      Ｓｌｕｇ遺伝子の異常発現に基づく検出
本発明は、Ｓｌｕｇ遺伝子の異常発現に基づく試験検体中の癌細胞の存在を検出する方法を提供し、その方法は：
１）癌細胞の保有する疑いのある脊椎動物の生物検体を入手することにより試験検体を得ること。
２）当該試験検体中に含まれている細胞におけるＳｌｕｇ遺伝子の発現を評価すること。
３）試験検体の細胞におけるＳｌｕｇ遺伝子の発現と対照検体の細胞におけるＳｌｕｇ遺伝子の発現とを比較すること。
から成り、対照検体の細胞におけるＳｌｕｇ遺伝子の発現と比較した時に、試験検体の細胞におけるＳｌｕｇ遺伝子の異常発現の存在が試験検体における癌細胞の存在を現わす。
【００１７】
特別な実施例において、本発明が提供するＳｌｕｇ遺伝子の異常発現に基づく癌細胞を検出する方法は、癌細胞の保有の疑がいのあるヒトに適用される。ヒトＳｌｕｇ遺伝子のｃＤＮＡ配列、ならびにｃＤＮＡから導出されたアミノ酸配列はニエト氏等の著書（上記に引用したニエト氏等の論文、１９９４）に開示されている。
【００１８】
特別な実施例において、検出される癌細胞は例えば白血病や肉腫の間葉性腫瘍細胞である。
【００１９】
試験検体は試験される脊椎動物の生物検体から入手する。当該生物検体は例えば組織の生検あるいは血液抽出の従来型方法により取得することができる。
【００２０】
間葉性あるいは癌性の腫瘍細胞におけるＳｌｕｇ遺伝子の異常発現には、Ｓｌｕｇ遺伝子の増幅、当該遺伝子の過剰発現、および通常当該遺伝子を発現しない細胞における当該遺伝子の発現が含まれる。現在、ＤＮＡの増幅が腫瘍の増殖においてきわめて大きな役割をもち、癌細胞によるおびただしい数の遺伝子の調節を可能にすることが認められている。他方、治療に奏効性のない患者では通常、種々の癌の進行中にＤＮＡ増幅の頻度、ならびに複写数（コピー数）の増加は増幅目的遺伝子の過剰発現が悪性細胞に選択的有利要因をもたらすことを示唆している。
【００２１】
Ｓｌｕｇ遺伝子の発現は例えばＳｌｕｇ遺伝子に相応するｍＲＮＡ（Ｓｌｕｇ  ｍＲＮＡ）のレベルの測定、あるいは生成されたＳｌｕｇ遺伝子のコピー数の測定等の適切な従来の方法により評価させ得る。
【００２２】
本明細書に使用する意味において、「Ｓｌｕｇ  ｍＲＮＡのレベルの測定」は試験検体の細胞においてＳｌｕｇ蛋白質に翻訳できるｍＲＮＡのレベルと対照検体の細胞におけるＳｌｕｇ  ｍＲＮＡのレベルとの直接的あるいは相対的比較により、ｍＲＮＡのレベルの質的あるいは量的な測定もしくは評価が可能なあらゆる方法を含む。同様に、「生成されたＳｌｕｇ遺伝子のコピーの数の測定」は試験検体の細胞において生成されたＳｌｕｇ遺伝子のコピーの数と対照検体の細胞における生成されたＳｌｕｇ遺伝子のコピーの数との直接的あるいは相対的比較により生成されたＳｌｕｇ遺伝子のコピーの数の質的あるいは量的な測定が可能なあらゆる方法を含む。特別な実施例において、試験検体の細胞におけるＳｌｕｇ  ｍＲＮＡのレベルあるいは生成されたＳｌｕｇ遺伝子のコピーの数が測定あるいは評価され、続いて対照検体の細胞におけるＳｌｕｇ  ｍＲＮＡのレベルあるいは生成されたＳｌｕｇ遺伝子のコピーの数との比較が行なわれる。
【００２３】
特別な実施例において、対照検体は癌細胞、例えば間葉性腫瘍細胞を有していない脊椎動物の生物検体にすることができる。この場合、対照検体において、Ｓｌｕｇ  ｍＲＮＡのレベルあるいはＳｌｕｇ遺伝子のコピーの数は知られているので、その得られた情報は比較の目的の基準として繰り返し利用することができる。変形例として、対照検体が癌細胞、例えば間葉性腫瘍細胞を有している脊椎動物の生物検体の場合がある。この場合、Ｓｌｕｇ  ｍＲＮＡのレベルあるいはＳｌｕｇ遺伝子のコピーの数は癌細胞を保有する脊椎動物における癌疾患の予後に関する情報を提供する。
【００２４】
Ｓｌｕｇ遺伝子のコピーの数の測定はＳｌｕｇ遺伝子のヌクレオチド配列を考慮して従来の方法により得られた適切なプローブを用いる細胞融合技術の手段により、例えば染色体外双微体（ｄｍｉｎ）あるいは均一染色領域（ｈｓｒｓ）を可視化するような適切な従来の方法により行うことができる（ゲブハルト氏等著、乳癌研究治療、第８巻、第１２５頁、１９８６年及びデュトリラーウクス氏等著、癌細胞遺伝学、第４９巻、第２０３頁、１９９０年「Ｇｅｂｈａｒｔ，ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  Ｔｒｅａｔ  ８，１２５（１９８６）／Ｄｕｔｒｉｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅｔ．  Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．４９，２０３（１９９０）」）。
【００２５】
同様に、Ｓｌｕｇ  ｍＲＮＡのレベルは例えばノーザンブロット分析法（原田氏等著、細胞、第６３巻、第３０３頁乃至第３１２頁、１９９０年「Ｈａｒａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６３  ３０３−３１２（１９９０）」）、Ｓ１ヌクレアーゼによるマッピング法（藤田氏等著、細胞、第４９巻、第３５７頁乃至第３６７頁、１９９８年「Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４９，３５７−３６７（１９８７）」）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４．６８３．１９５号、同第ＵＳ４．６８３．２０２号、同第ＵＳ４．９６５．１８８号明細書）、ポリメラーゼ連鎖反応と結合させた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）（牧野氏等著、テクニック、第２巻、第２９５頁乃至第３０１頁、１９９０年「Ｍａｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  ２，２９５−３０１（１９９０）」）、ミクロアレイ細胞融合技術（ウースター  アール氏著、遺伝学の傾向、第１６巻、第３２７頁乃至第３２９頁、２０００年「Ｗｏｏｓｔｅｒ  Ｒ．，  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６  ３２７−３２９（２０００）」）のような適切な従来型方法により測定可能である。特別な実施例において、Ｓｌｕｇ  ｍＲＮＡの発現は、ノーザンブロット分析の手段およびポリメラーゼ連鎖反応と結合させた逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）の手段（下記の「対象および方法」の欄参照）により評価された。
【００２６】
本発明によって、対照検体におけるＳｌｕｇ遺伝子の発現との比較において、試験検体におけるＳｌｕｇ遺伝子の異常発現の存在は試験検体における間葉性あるいは癌性の腫瘍細胞の存在を示す。
１．Ｂ      Ｓｌｕｇ遺伝子の発現生成物に基づく検出
本発明はＳｌｕｇ遺伝子の発現生成物（Ｓｌｕｇ蛋白質）の発現に基づく試験検体における癌細胞の存在を検出する法を提供し、該方法は：
ａ）癌細胞の保有する疑いのある脊椎動物の生物検体を入手することにより試験検体を取得すること。
ｂ）当該試験検体の細胞におけるＳｌｕｇ蛋白質の発現を評価すること。
ｃ）試験検体の細胞におけるＳｌｕｇ蛋白質の発現と対照検体の細胞におけるＳｌｕｇ蛋白質の発現とを比較すること。
からなり、対照検体の細胞におけるＳｌｕｇ蛋白質の発現との比較において、試験検体の細胞におけるＳｌｕｇ蛋白質の異常発現の存在が試験検体における癌細胞の存在を表示する。
【００２７】
特別な実施例において検出される癌細胞は例えば白血病あるいは肉腫のような間葉性腫瘍細胞である。
【００２８】
前述した［１．ａ］の変形例と同様に、試験検体は組織生検あるいは血液抽出のような従来の方法にて入手できる例えば、ヒトである試験対象の脊椎動物の生物検体である。
【００２９】
Ｓｌｕｇ蛋白質の発現は抗体利用に基づく技術手段、生体内画像診断に基づく技術手段、流動血球計算の手段、プロテオミックスの手段のような従来の方法で評価可能である。
【００３０】
１実施例として、組織内におけるＳｌｕｇ蛋白質の発現は従来の組織学的な免疫学方法を用いることにより検討することができ、該方法において抗Ｓｌｕｇ抗体によって特別に認識することができ、他の検出方法は適切なマーカー標識を付けた二次抗体を利用することができる。組織内のＳｌｕｇ蛋白質の発現はウエスタンブロットあるいはドット／スロット分析法（ジャルカネン氏等著、細胞生物学ジャーナル、第１０１巻、第９７６頁乃至第９８５頁、１９８５年及びジャルカネン氏等著、細胞生物学ジャーナル、第１０５巻、第３０８７頁乃至３０９６頁、１９８７年「Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  101，９７６−９８５（１９８５）  ａｎｄ  Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０５，３０８７−３０９６（１９８７）」）、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫抗体法）のような免疫学的方法、あるいはＲＩＡ（放射性免疫測定法）で調べることもできる。
【００３１】
更に、Ｓｌｕｇ蛋白質の発現は例えばＸ線や核磁気共鳴（ＮＭＲ）等で検出可能なマーカーのような適切なマーカーと結合した抗Ｓｌｕｇ抗体を利用する画像診断技術手段から生体内で検出が可能である。腫瘍の画像診断の概要については腫瘍画像化（癌の放射化学検出、エス  ダブリュー  バーチェル  および  ビー  エー  ローデス編集、マッソン  パブリッシング  インコーポレーテッド、１９８２「Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ:  Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓ．Ｗ．  Ｂｕｒｃｈｉｅｌ  ＆  ｂ．ａ．  Ｒｈｏｄｅｓ  ｅｄｓ．，Ｍａｓｓｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．（１９８２）」）に記載されている。
【００３２】
本発明が提供する方法に使用できる抗Ｓｌｕｇ抗体は任意に担体に結合させた無損Ｓｌｕｇ蛋白質に対する抗体あるいは当該蛋白質の抗原性断片に対する抗体にすることができる。当該抗体はハイブリドーマ技術（コーレー氏等著、ネイチャー、第２５６巻、第４９５頁１９７５年「Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５（１９７５）」）により入手可能である多クローン性または好ましくは単クローン性にすることができる。変形例において、抗体断片は例えばＦａｂ，  Ｆ（ａｂ'）２ 等を利用できる。
【００３３】
組織内のＳｌｕｇ蛋白質の発現を測定するための他の方法は流動血球計算（ワード  エム  エス氏著、病理学、第３１巻、第３８２頁乃至第３９２頁、１９９９年「Ｗａｒｄ  Ｍ．Ｓ．，  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ３１，３８２−３９２（１９９９）」）、プロテオミクス（パンディ  エム及びマン  エム氏等著、ネイチャー、第４９５巻、第８３７頁乃至第８４６頁、２０００年「Ｐａｎｄｅｙ  ｍ．  ＆  Ｍａｎｎ  ｍ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０５，８３７−８４６（２０００）」及びチャンバース氏等著、病理学ジャーナル、第１９２巻、第２８０頁乃至第２８８頁、２０００年、「Ｃｈａｍｂｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．  １９２，２８０−２８８（２０００）」）がある。
【００３４】
本発明にしたがって、試験検体における細胞内のＳｌｕｇ蛋白質の異常発現は対照検体における細胞内のＳｌｕｇ蛋白質の発現との比較において、試験検体における癌細胞の存在を表示する。
２．      癌の治療
第２態様において、本発明は癌の治療、特に白血病および肉腫の間葉性腫瘍細胞のような癌細胞の存在に関連した病理レベルを治療するためにＳｌｕｇ遺伝子あるいはその遺伝子の転写もしくは発現生成物を使用する方法に関するものである。
【００３５】
本明細書に使用する意味において、「癌の治療におけるＳｌｕｇ遺伝子あるいはその遺伝子の転写もしくは発現生成物の使用」は、Ｓｌｕｇ遺伝子、Ｓｌｕｇ蛋白質に翻訳可能なｍＲＮＡのレベル、あるいはＳｌｕｇ蛋白質それ自体に対する質的あるいは量的介入を可能にするあらゆる方法を意味する。
【００３６】
この意味において、本発明はＳｌｕｇ蛋白質あるいはその蛋白質の断片を認識する抗体の治療上有効な量、もしくはＳｌｕｇ機能をＤＮＡレベル、ＲＮＡレベル、もしくは蛋白質レベル（Ｓｌｕｇ）で阻害する化合物の治療上有効な量からなる医薬組成物を提供する。前記抗体または化合物には任意に医薬上許容できる添加剤を添加することができる。
【００３７】
本発明が提供する医薬組成物に使用できる抗Ｓｌｕｇ抗体は任意に担体に結合させた無損Ｓｌｕｇ蛋白質に対する抗体あるいはその蛋白質の抗原性断片に対する抗体にすることができる。その抗体はハイブリドーマ技術（コーレー氏等著、ネイチャー、第２５６巻、第４９５頁、１９７５年「Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５（１９７５）」）を用いることにより取得可能である。変形例として、抗体断片は従来の方法により可能なＦａｂ，Ｆ（ａｂ'）２ 等も使用できる。
【００３８】
Ｓｌｕｇ機能をＤＮＡレベルおよびＲＮＡレベルの双方で、あるいは蛋白質レベル（Ｓｌｕｇ）で阻害する化合物はＳｌｕｇ遺伝子の発現をじゃまする、あるいはアンチセンス・オリゴヌクレオチドもしくはリボソームにより発生させたＳｌｕｇ  ｍＲＮＡを非活性化させる、あるいは抗体の使用によってＳｌｕｇ蛋白質を非活性化させる、もしくは当該蛋白質の作用を負の優性遺伝子と競合させる化合物もしくは化合物の混合物にさせることができる（チョー  ワイ氏等著、分子生物学ジャーナル、第２７３巻、第５２５頁乃至５３２頁（１９９７）及び  コバレダ  シー  及び  サンチェス  ガルシア  アイ氏著、血液、第９５巻、第７３１頁、第７３７頁，２０００年「Ｃｈｏｏ， Ｙ.ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７３，５２５−５３２（１９９７）  ａｎｄ  Ｃｏｂａｌｅｄａ，  Ｃ．＆  Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇａｒｉａ，Ｉ．  Ｂｌｏｏｄ  ９５，７３１−７３７（２０００）」）。
【００３９】
本発明が提供する医薬組成物に添加可能な添加剤は、さまざまな条件のなかでも当該医薬品構成物の投与経路に依存する。作用物質の異なる投与経路、使用する添加剤、および製造過程の評論は１９９３年、ルサン  ５  エス  エイ  編集、シー  ファウリ  イ  トリロ著、製剤調剤法論文（Ｔｒｅａｔｉｓｅ  ｏｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｃ．  Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ，Ｌｕｚａｎ  ５，Ｓ．Ａ．  ｏｆ  Ｅｄｉｔｏｒｓ，１９９３）に記載されている。
【００４０】
本発明はＳｌｕｇ遺伝子の発現の調節に基づいて抗腫瘍物質の生体内スクリーニング法関するものである。該方法は（ｉ）一定の条件においてＳｌｕｇ遺伝子を発現する細胞システムを生成させ、（ｉｉ）該細胞システムを試験される化合物と接触させ、（ｉｉｉ）Ｓｌｕｇ遺伝子の発現を評価することから成り、Ｓｌｕｇ遺伝子が発現されない場合、該試験化合物は抗腫瘍物質候補となる。
【００４１】
Ｓｌｕｇ遺伝子の機能は、その発現をじゃまするか、あるいはアンチセンス・オリゴヌクレオチドもしくはリボソームにより発生されるｍＲＮＡを非活性化させるか、あるいは抗体を使用することにより蛋白質を非活性化させるか、もしくは負の優性遺伝子に対して該蛋白質の作用を競合させることによりＤＮＡレベルで阻害可能である（Ｃｈｏｏ，Ｙ.ｅｔ  ａｌ．，「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３，５２５−５３２（１９９７）  ａｎｄ  Ｃｏｂａｌｅｄａ，Ｃ．＆Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇａｒｃｉａ，Ｉ．，  Ｂｌｏｏｄ，  ９５，７３１−７３７（２０００）」）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
本発明を以下に発明者グループが実施した効力検定により説明し、Ｓｌｕｇ遺伝子がＢＣＲ−ＡＢＬを有する白血病細胞の播種能力を調節していることを示す。
Ｉ．      対象および方法
細胞培養
使用した細胞系は、Ｂａ／Ｆ３細胞（パラシオス及びステインメス氏著、細胞、第４１巻、第７２７頁、１９８５年「Ｐａｌａｃｉｏｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｉｎｍｅｔｚ，  Ｃｅｌｌ  ４１，７２７（１９８５）」）およびヒト蛋白質ＢＣＲ−ＡＢＬＰ１ ９ ０ （Ｂａ／Ｆ３＋ｐ１９０）ならびにＢＣＲ−ＡＢＬＰ２ １ ０ （Ｂａ／Ｆ３＋ｐ２１０）を発現するＢａ／Ｆ３細胞を有する（サンチェス  ガルシア及びグルツ氏著、プロセス  ナショナル  アカデミック  サイエンス  米国、第９２巻、第５２８７頁乃至第５２９１頁、１９９５年「Ｓａｎｃｈｅｚ−ＧａｒｃｉＡ  ａｎｄ  Ｇｒｕｔｚ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ.ＵＳＡ，９２，５２８７−５２９１（１９９５）」）。これらの細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で維持させた。必要に応じ、１０％培養基を添加し、ＩＬ−３（インターロイキン−３）をもとにＷＥＨＩ−３Ｂで調節した。
代表的差異分析
フバンクおよびシャッツ氏（フバンク及びシャッツ氏著、核酸研究、第２２巻、第５６４０頁乃至第５６４８頁、１９９４年「Ｈｕｂｎａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｔｚ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２，５６４０−５６４８（１９９４）」）が記述した通りにＲＤＡが実施された。要約するとｍＲＮＡはＢａ／Ｆ３，Ｂａ／Ｆ３＋ｐ１９０，Ｂａ／Ｆ３＋ｐ２１０細胞から単離された。各細胞個体群から１０ｍｇのｍＲＮＡ検体がＲＤＡ用に採取された。ｃＤＮＡはｍＲＮＡから合成され、Ｄｐｎ  ＩＩで分解された。２つのオリゴヌクレオチド（Ｒ−２４）[ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１]、（Ｒ−１２）「ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．２]からなるＤｐｎ  ＩＩで分解したｃＤＮＡにアダプターが加えられた。得られた混合物はＲ−２４オリゴヌクレオチド（ＳＥＱ．ＩＤ．：Ｎｏ．１）でＰＣＲにより増幅され、そしてアダプターはＤｐｎ  ＩＩで分解された。その後２対目のアダプター（Ｊ−２４）「ＳＥＱ．ＩＤ．ｎｏ．：３」および（Ｊ−１２）「ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４」を、Ｂａ／Ｆ３＋ｐ１９０およびＢａ／Ｆ３＋ｐ２１０（検定）細胞からの増幅断片と結合させた。次に、該結合物はＢａ／Ｆ３細胞（誘導体）のＲ−２４［ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．：１］を有する増幅ｃＤＮＡ断片と１：１００の比で２０時間にわたって細胞融合された。この細胞融合混合物はＰＣＲ増幅用のテンプレートとして用いた。
【００４３】
第１段階のＰＣＲの生成物のアリコートからＪアダプター［ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．３およびＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．４］を取り出し、３対目のオリゴヌクレオチド（Ｎ−２４）［ＳＥＱ．ＩＤ．ｎｏ．：５］および（Ｎ−１２）［ＳＥＱ．ＩＤ．ｎｏ．６］を結合させ、そして誘導アンプリコンと１：１０００の比で細胞融合させることにより第２段階の単離が行なわれた。ＰＣＲ生成物は２．０％アガロースゲル上で分離され、そして個々のバンドがサブクローン化され、異なる発現に関しノーザンブロット分析により検査された。
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＴ−ＰＣＲ）
ＰＨ−１の陽性患者におけるヒト細胞系および末梢血液検体におけるＳｌｕｇの発現を分析するため、５０ｍｇのランダム六量体、３μｇの全ＲＮＡ，２００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮＡｓｅ  Ｈ−逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を含有する２０μｌの反応においてＲＴが製造元のプロトコルにしたがって行なわれた。ＰＣＲ用の熱サイクルのパラメータおよび特別なプライマーの配列は次の通りであった。Ｓｌｕｇ：９４℃で１分間３０サイクル、５６℃で１分間および７２℃で２分間、正常センスプライマー［ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．７］、およびアンチセンスプライマー［ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．８］；ｃ−ＡＢＬ：９４℃で１分間３０サイクル、５６℃で１分間および７２℃で２分間、通常のセンスプライマー［ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．９］、およびアンチセンスプライマー［ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１０］。ｃ−ＡＢＬのｍＲＮＡの増幅はＲＮＡの各検体の質を評価する対照として作用した。内部プローブの配列は次の通りであった。
【００４４】
Ｓｌｕｇ：ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１１、および
ｃ−ＡＢＬ：ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１２。
ＰＴ−ＰＣＲによる全長のＳｌｕｇ  ｃＤＮＡ全長クローニング
マウスのＳｌｕｇ  ｃＤＮＡがアドバンズプライマー［ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１３］および逆プライマー［ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎｏ．１４］を使用するＲＴ−ＰＣＲによりクローン化された（ＧｅｎＢａｎｋに対するアクセス番号Ｕ７０５５０）。
ＲＮＡの分析
全細胞質ＲＮＡ（１０μｇ）は１０ｍｍＮａ２ ＨＰＯ４ 緩衝液（ｐＨ７．０）中において１．４％アガロースゲル上でグリオキシル化されかつ分画された。電気泳動法後、そのゲルは紫外線で処理されたＨｙｂｏｎｄ−Ｎナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に写しとり、３ ２ ｐで標識を付けたプローブと細胞融合された。フィルターにｃＤＮＡ  βアクチンのｃＤＮＡプローブで再処理し、電荷が制御された。プローブとして用いたアンチセンスＳｌｕｇオリゴヌクレオチドはマウスのＳｌｕｇ  ｃＤＮＡをコード化する配列の最初の３４塩基からなっている。
生体内試験におけるプラスミド構造体
マウスのＳｌｕｇ  ｃＤＮＡは制限酵素を添加し、ｃＤＮＡの５'および３'末端と細胞融合するプライマーを使用し、遺伝子のコード領域全体を含む領域を増幅することによりクローニングを容易にさせるためＰＣＲにより増幅された。マウスのＳｌｕｇ  ｃＤＮＡは、記載された通り（水島及び永田氏著、核酸研究第１８巻、第４３２２頁、１９９年「Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  ａｎｄ  Ｎａｇａｔａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１８，４３２２（１９９０）」）ヒトＧ−ＣＳＦのｃＤＮＡのポリ（Ａ）アデニル酸のシグナルに結合するポリエンガルス（ｐｏｌｙｅｎｇａｒｃｅ）の領域により続くＥＦ１−αプロモーターの配列を含有するｐＥＦ−ＢＯＳベクターにおけるセンスおよびアンチセンス定位（それぞれ優性遺伝されたＢＯＳ−ＳｌｕｇおよびＢＯＳ−アンチＳｌｕｇ）でクローン化された。Ｃｏｍｂｉ−ｐ１９０ベクターはＣｏｍｂｉ−ｔＴＡプラスミドのルシフェラーゼのｃＤＮＡ（シュルツ氏等著、ネイチャー  バイオテクノロジー、第１４巻、第４９９頁乃至第５０３頁、１９９６年「Ｓｃｈｕｌｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４，４９９−５０３（１９９６）」）をＢＣＲ−ＡＢＬＰ１ ９ ０ のｃＤＮＡに置換させることにより取得された。構造体の確実性はＤＮＡ配列法で確認された。
細胞の形質変換
Ｂａ／Ｆ３細胞は電気穿孔法（９６０μＦ、２２０Ｖ）により１μｇのＭＣ１−新発現ベクターと共に２０μｇのＣｏｍｂｉ−ｐ１９０でそれぞれ形質変換された。その細胞（Ｂａ／Ｆ３＋Ｃｏｍｂｉ  ｐ１９０）においては、ＢＣＲ−ＡＢＬの発現はテトラサイクリン（２０ｎｇ／ｍｌ）の存在下および非存在下においてノーザンブロット法により分析された。これらの細胞はテトラサイクリンの存在下で生成された場合、ＩＬ−３の非存在に対して耐性があった。
Ｂａ／Ｆ３およびＢＣＲ／ＡＢＬを発現する細胞におけるマウスＳｌｕｇ遺伝子の発現ならびに細胞生存分析試験
Ｂａ／Ｆ３、Ｂａ／Ｆ３＋ｐ１９０、およびＢａ／Ｆ３＋ｐ２１０細胞は電気穿孔法（９６０μＦ、２２０Ｖ）により１μｇの純ＭＣ１発現ベクターと共に２０μｇのＢＯＳ−ＳｌｕｇおよびＢＯＳ−アンチＳｌｕｇでそれぞれ形質導変換された。これら細胞系において、Ｓｌｕｇ発現はノーザンブロット法により分析された。それらの細胞はＩＬ−３の非存在に対する耐性に関して選択され、そして細胞増殖力はトリパンブルー色素排除法により測定された。
ＤＮＡの分析
低分子量ＤＮＡは下記に示した通り単離された。それらの細胞は１．５ｍｌの培地に集め、１，５００ｒｐｍ（４００ｘｇ）で１分間マイクロ遠心分離にかけ、沈降物が３００μｌのプロティナーゼＫ緩衝液で懸濁された。１晩、５５℃で培養後、ＤＮＡをエタノール中で沈殿させ、５０μｌ／ｍｌのＲＮＡｓｅ  Ａを含有したＴＥ緩衝液２００μｌのなかで懸濁し、2時間、３７℃で培養した。ＤＮＡはフェノールおよびクロロホルムで抽出され、エタノールを加えて沈殿させた。ＤＮＡアルコート（２μｇ）は末端にα３２−ｄＣＴＰで標識を付けられ、２％アガロースゲル上で電気泳動法にかけられた。電気泳動法後、ゲルがＨｙｂｏｎｄ  Ｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に転写され、２時間、−７０℃でオートラジオグラフィにかけられた。
表現型分析
血球計算染色法のため、ファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）から下記のモノクローナル抗マウス抗体、即ちリンパマーカーＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０および骨髄マーカーＧｒ−１を使用した。抗マウスＣＤ３２／ＣＤ１６で従来技術により取得し、Ｆｃ受容体結合を阻害するため精製した異なる細胞系の単一細胞の懸濁液が異なる抗体の適切な希釈液で室温あるいは４℃でそれぞれ培養された。検体はＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで再懸濁した。検体の死亡細胞はヨウ化プロピジウムで染色させることにより排除した。検体およびデータはＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてＦＡＣＳｃａｎにより分析した。
腫瘍分析試験
種々の細胞系の腫瘍を分析試験するため、リン酸塩で緩衝処理した塩水溶液２００μｌに再懸濁した１０６ 細胞を、生後２−４週間の雄無胸腺（裸）マウスの両サイドに皮下注入した。マウス腫瘍形成を2ヶ月間検査した。
組織構造分析
腫瘍検体は１０％ホルマリン中で１晩固定した。次に検体を処理し、そしてパラフィンブロックに入れた。６μｍの切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色し、組織構造を検査し、写真を撮った。全ての切片は解剖用に提供された腫瘍の均質および生存可能な部位から入手したものであった。
ＩＩ      結果
血液生成細胞におけるＳｌｕｇの発現を確実に調節するＢＣＲ−ＡＢＬ
ヒトにおける癌と関連性をもつ一定の染色体異常の分子特性は主要結果が腫瘍特別融合蛋白質であることを示している。提唱される一般的見解は、このような蛋白質の生成がアポプトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を阻害する腫瘍特別的標的細胞の正常な生成を変化させるというものであるが（コバレダ氏等著、ビオアッセイ、第２０巻、第９２２頁、１９９８年「Ｃｏｂａｌｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢｉｏＡｓｓａｙｓ  ２０，９２２（１９９８）」）、しかし腫瘍発生過程において最も生命を脅かす要因は浸潤および転移である。悪性表現型の発現の臨床的重要性は正しく評価されているけれども、浸潤に関連する分子作用メカニズムに対する理解の進歩は癌研究の分野において他の進歩を遅らせている。従って、白血病に関連する染色体異常の生成物により媒介となる悪性転換を理解するうえで不可欠な最初の段階はこれらの蛋白質に向けられるものから下流のリポーター遺伝子の特定である。ＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子は実験モデルとして使用されており、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合蛋白質をコード化するベクターを形質導入したマウス血液生成前駆体Ｂａ／Ｆ３細胞系を使用する細胞システムからメリットが得られた（サンチェス  ガルシアおよびグツ氏著、１９９５年、前述の著書）。Ｂａ／Ｆ３におけるＢＣＲ−ＡＢＬの発現は細胞形質転換を誘発し、サイトカイン非依存増殖をもたらし、アポプトーシスを阻害する（ダレイおよびバルチモアー氏著、プロセス  ナショナル  アカデミック  サイエンス  米国、第８５巻、第９３１２頁、１９８８年「Ｄａｌｅｙ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，９３１２（１９８８）  ａｎｄ  Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇａｒｃｉａ  ａｎｄ  Ｇｒｕｔｚ，１９９５，前述の著書）。ＢＣＲ−ＡＢＬ機能の潜在的標的を特定するため、代表的差異分析（ＲＤＡ）のために基質プロセスが選択された。Ｂａ／Ｆ３細胞と、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ１９０を発現したＢａ／Ｆ３細胞（Ｂａ／Ｆ３＋ｐ１９０）と、ＢＣＲ−ＡＢＬｐ２１０を発現したＢａ／Ｆ３細胞（Ｂａ／Ｆ３＋ｐ２１０）のｍＲＮＡ分子を使用して、ｃＤＮＡが調合され、そしてフバンクおよびシャッツ氏のＲＤＡプロトコル（Ｈｕｂａｎｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｔｚ，１９９４，前述の著書）にしたがって、ＰＣＲにより３サイクルの配列細胞融合とＰＣＲ増幅を受けた。微分的に増幅させたｃＤＮＡ断片の複数の断片がそれぞれサブクローン化され、そしてＢａ／Ｆ３  ＲＮＡのノーザンブロット分析法で種々の遺伝子発現に関し分析試験された。微分的に調節された遺伝子を表わしかつＩ−１を示したｃＤＮＡの断片を特定した。配列の比較は５２７ヌクレオチドＩ−１断片がコード化領域の一部およびＢＬＡＳＴ研究施設（バイオテクノロジー情報用の国内センター「Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ」）にて特定されたマウスＳｌｕｇ  ｃＤＮＡのみ翻訳３'領域に相当することを示した。
【００４５】
Ｓｌｕｇ  ｍＲＮＡの生成を刺激するためのＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子の能力は、ノーザンｍＲＮＡ  Ｂａ／Ｆ３、Ｂａ／Ｆ３＋ｐ１９０、およびＢａ／Ｆ３＋ｐ２１０細胞フィルター（図１Ａ）との細胞融合により分析試験された。ノーザンブロット分析はＢａ／Ｆ３＋ｐ１９０およびＢａ／Ｆ３＋ｐ２１０細胞中のＳｌｕｇの発現を示した。本分析試験はＢＣＲ−ＡＢＬの陽性細胞がＳｌｕｇ  ｍＲＮＡを発現するが、しかし対照細胞が発現しないことを示している。従って、これらのデータはＳｌｕｇ遺伝子の活性化とこのシステムにおけるＢＣＲ−ＡＢＬの発現との間には明確な関連性があることを示している。
Ｓｌｕｇの異常発現に必要なＢＣＲ−ＡＢＬの存在
上記のデータは融合遺伝子ＢＣＲ−ＡＢＬを保有するＳｌｕｇ  Ｉ細胞の異常発現を示している。ＢＣＲ−ＡＢＬがＳｌｕｇ遺伝子の転写に必要であるかどうかを定めるために、ＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の発現が外因的に調節できるＢａ／Ｆ３細胞を生成した。トランスアクチベーターと単一プラスミドにて遺伝子発現ユニットを向けるｔｅｔオペレーターの最少プロモーターとを有するＣｏｍｂｉ−ｔＴａシステムが使用された（Ｓｃｈｕｌｔｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、前述の著書）。ウイルスＶＰ１６のトランスアクチベーター領域に融合したリプレッサーｔｅｔ蛋白質が遺伝子工学技術により取得したｔｅｔオペレーターの最少プロモーターにテトラサイクリンの非存在下において結合させ、そしてＢＣＲ−ＡＢＬ（Ｃｏｍｂｉ−ｐ１９０）の転写を活性化させた。エフェクター分子の存在下において、上記結合を解き、プロモーターを切片化した（図１Ｂ）。この意味において、ＢＣＲ−ＡＢＬＰ１ ９ ０ がテトラサイクリンなしのＢａ／Ｆ３＋Ｃｏｍｂｉｐ１９０で検出されたけれども、ｍＲＮＡはテトラサイクリンの（２０ｎｇ／ｍｌ）で検出されなかった。これらデータはＢＣＲ−ＡＢＬの誘発がテトラサイクリンによって完全に抑制され得ることを意味している。
【００４６】
Ｓｌｕｇ遺伝子の活性化の特異性はＢａ／Ｆ３＋Ｃｏｍｂｉ  １９０細胞においてノーザンフィルターの細胞融合の分析から分析された。２日間の培養後、テトラサイクリンの存在下および非存在下においてＳｌｕｇ発現を調べた。図１Ｂに示したように、Ｓｌｕｇ発現は急速に減少し、ＢＣＲ−ＡＢＬＰｐ１９０のｍＲＮＡの発現の減少と合致している。加えて、これらの細胞において、ＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子のよく知られている２種の下流エフェクターと、Ｍｙｃ（サイヤース氏等著、細胞、第７０巻、第９０１頁乃至第９１０頁、１９９２年「Ｓａｗｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，７０，９０１−９１０（１９９２）」）と、ＢｃＬ−２（サイチエス−ガルシアおよびダルッツ氏著の前述の著書、１９９５年およびサンチェス  ガルシアおよびマーチン  サンカ氏著、分子生物学ジャーナル、第２６７巻、第２５５頁、１９９７年「Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇａｒｃｉａ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ−Ｚａｎｃａ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２６７，２５５（１９９７）」）との発現がＢＣＲ−ＡＢＬの存在に依存性があるかどうか調べた。図１Ｂが示したように、ＢｃＬ−２，Ｍｙｃいずれの発現もテトラサイクリンなしでＢａ／Ｆ３＋Ｃｏｍｂｉｐ１９０に検出されたが、テトラサイクリンの存在下においてｍＲＮＡは検出されなかった（図１Ｂ）。この観察は遺伝子発現に認められた変化がＢＣＲ−ＡＢＬにより刺激されたものであることを裏付けている。
フィラデルフィア染色体について陽性白血病患者の細胞系および末梢血液細胞に存在するＳｌｕｇ発現
ＢＣＲ−ＡＢＬがＢａ／Ｆ３細胞におけるＳｌｕｇの発現を正に調節しているという発見から、発明者グループはＳｌｕｇ発現のレベルも、癌遺伝子BCR-ABL融合蛋白質の天然標的の一次親細胞におけるＢＣＲ−ＡＢＬの発現の結果として正に調節されるかどうかを調べることになった（Ｃｏｂａｌｅｄａ氏等著の前述の著書、２０００年及びＳａｎｃｈｅｚ−Ｇａｒｃｉａ氏著の前述の著書、２０００年）。マウス組織のスペクトルのノーザンブロット分析は、ほとんど例外なしにＳｌｕｇがマウス組織で広範囲に発現することを示した（図２Ａ）。しかし、末梢血液白血球ではＳｌｕｇが発現されていない（図２Ａ）。Ｓｌｕｇが正常なマウスの末梢血液中では発現されないことを認識したうえで、白血病を有する遺伝子導入ＢＣＲ−ＡＢＬマウスの末梢血液においてＢＣＲ−ＡＢＬの発現の作用がＳｌｕｇ  ｍＲＮＡのレベルにおよぼす影響を調べた（キャステラーノス氏等著、血液、第９０巻、第２１６８頁、１９９７年「Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ  ９０，２１６８（１９９７）」）。ノーザンフィルターとのＢＣＲ−ＡＢＬを発現したマウスの親細胞が試験された（図２Ｂ）。βアクチンのプローブとの細胞融合により完全性と電荷の観点からＲＮＡの各バンドが評価された（図２Ｂ、下部）。Ｂａ／Ｆ３細胞で観察した結果によれば、ＢＣＲ−ＡＢＬを保有する初期細胞はＳｌｕｇの発現の増加を生成した。その後、ＰＨ１陽性ヒト白血病患者の初期細胞にもＳｌｕｇの発現が存在していたかどうかを調べた。Ｓｌｕｇ遺伝子の発現生成物が正常なヒト検体の細胞に存在していなかったことが示された（図３、バンド１）。これに反し、フィラデルフィア染色体を保有する患者の細胞ではＳｌｕｇ発現が認められた（図３、バンド６−８）。ｔ（９；２２）陽性の細胞系Ｋ５６２、Ｎａｌｍ−１、およびＴＯＭ−１はＰｈ１陽性ＬＬＡ患者およびＬＭＣ患者から入手した。従って、これらの細胞系はＳｌｕｇの発現の有無に関しヒト非白血病細胞系と比較された。ｍＲＮＡにＳｌｕｇ発現があるかどうか逆転写ＰＣＲで調べたところ、Ｓｌｕｇが全Ｐｈ１陽性細胞系で観察されることが明らかになった（図３、バンド９−１１）。Ｓｌｕｇが形質転換ＢＣＲ−ＡＢＬの発現後の細胞に現われるという発見は、Ｓｌｕｇ遺伝子がＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病患者から単離された細胞系および骨髄細胞に認められるという発見とともに、Ｓｌｕｇ遺伝子の存在はＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病の浸潤の１つの要素になりうることを示唆している。
他の染色体異常を保有する白血病患者の細胞系に存在するＳｌｕｇ
Ｓｌｕｇは中胚葉の形成に関する蛋白質のＳｎａｉｌファミリーの１つであり（Ｎｉｅｔｏ氏等著、１９９４、前述の著書）、その発現はある程度制御されない（図２）。Ｓｌｕｇ遺伝子の発現はその後他の間葉性腫瘍で分析された。図３はｔ（９；２２）のない更に４種の白血病細胞系即ち系統Ｂ初期６９７（図３、バンド５）、骨髄Ｕ９３７（図３、バンド３）、ＫＯＰＴＩ−Ｋ１（図２、バンド４）のＲＮＡの例を示している。図３が示したように、全ての白血病細胞系において、Ｓｌｕｇ遺伝子の発現が認められている。この意味において、最近の発見は、Ｓｌｕｇがｔ（１７；１９）白血病細胞において発現すること（イヌカイ氏等著、分子細胞、第４巻、第３４３頁乃至第３５２頁、１９９９年「Ｉｎｕｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  ４，３４３−３５２（１９９９）」）、およびＰＡＸ−ＦＫＨＲ転座を発現する横紋筋肉種細胞（カーン氏等著、プロセス  ナショナル  アカデミック  サイエンス  米国、第９６巻、第１３２６４頁乃至第１３２６９頁、１９９９年「Ｋｈａｎ等  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６，１３２６４−１３２６９（１９９９）」）において発現することが明らかになっている。そこでこれら結果を組み合わせると、他の遺伝子変性の支持に基づいて形質転換した間葉性腫瘍（白血病および肉腫双方）においてはＳｌｕｇ遺伝子の発現が少なくないことを示しており、Ｓｌｕｇ遺伝子が、ＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病だけではなく、おそらく他の間葉性癌においても、癌生態の１つの構成要素となることを示唆している。
Ｓｌｕｇの抗アポプトーシス活性
癌生態におけるＳｌｕｇの機能をさらに理解するため、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合蛋白質をコード化するベクターを形質導入したＢａ／Ｆ３細胞系も使用した（サンチェス−ガルシアおよびグラッツ氏等著、１９９５年、前述の著書）。Ｂａ／Ｆ３におけるＢＣＲ−ＡＢＬの発現は細胞質分裂の非依存増殖を与え、アポプトーシスを阻害する（デレイおよびバルチモアー氏著、１９８８年、前述の著書及びサンチェス−ガルシアおよびグルッツ氏著、１９９５年、前述の著書）。発明者グループはＳｌｕｇが腫瘍性蛋白質の非存在下においてこれらの機能を行うかどうか疑問をもった。それ故え、Ｂａ／Ｆ３細胞がＳｌｕｇを発現したベクターで形質変換（図４Ａ）され、そして細胞生存能力がＩＬ−３の非存在下で分析された。図４が示すように、ＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子を発現したＢａ／Ｆ３細胞はごくわずかな生存能力の喪失を示しただけであり、Ｓｌｕｇを発現したこれらの細胞は成長培地からのＩＬ−３の除去後にアポプトーシスを受けることがなかった（図４Ｂ、４Ｃ）。この観察は先の研究結果（イヌカイ氏等著、１９９９年、前述の著書）を裏付けることになり、Ｓｌｕｇが試験細胞システム中のアポプトーシスを阻害することを示している。したがって、Ｐｈ陽性ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞による規制解除が、ｔ（９；２２）細胞の長期生存の特性に寄与しているものと考えられている。Ｓｌｕｇ遺伝子は成長因子をもたないマウスＢＡ／Ｆ３細胞の生存促進においてＢＣＲ−ＡＢＬに代わることができ、Ｐｈ陽性白血病の細胞死特性に対する耐抵抗性およびｔ（９；２２）の陽性白血病の発育に向けての主要段階におそらく関与していることを示唆している。
ＢＣＲ−ＡＢＬ白血病細胞の播殖能力に影響を及ぼすＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子の腫瘍化能力を高めるＳｌｕｇ遺伝子の抑制
これまでの研究結果はＢＣＲ−ＡＢＬの発現がＳｌｕｇ遺伝子の経路を誘発するアポプトーシスからその細胞を保護することを示している。この場合において、Ｓｌｕｇ発現レベルの形質変性でＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢａ／Ｆ３細胞の成長および腫瘍化中にある変異が生じると考えられている。ＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢａ／Ｆ３細胞はアンチセンスマウスＳｌｕｇ（ＢＯＳ−アンチＳｌｕｇ）のｃＤＮＡを発現するベクターにより増殖され、クローンを生成した（図５Ａ）。ＲＮＡが抽出され、ＳｌｕｇのｍＲＮＡのレベルが非増殖対照細胞のｍＲＮＡのレベルと比較された（図５Ｂ）。ＢＯＳ−アンチＳｌｕｇで増殖された細胞ではアンチセンスＳｌｕｇが検出され、ＢＯＳ−アンチＳｌｕｇにより増殖させたＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢＡ／Ｆ３細胞ではＢＣＲ−ＡＢＬ量のレベルに影響がなかった（図５Ａ）。他方、アンチセンスＳｌｕｇにより増殖された細胞ではＳｌｕｇ  ｍＲＮＡが検出されず、Ｂａ／Ｆ３−ｐ１９０およびＢａ／Ｆ３−ｐ２１０細胞がその中に検出された（図５Ｂ）。Ｓｌｕｇ発現の抑制の結果はＢａ／Ｆ３細胞中のＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子により与えられた分化プログラムと裸マウスへの注入から得られた異なる細胞系の生体内腫瘍化能力とを調査することにより評価された。
【００４７】
Ｓｌｕｇ発現が、ＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子より誘発される分化プログラムにおける重要構成要素そのものであるかどうかを決定するため、発明者グループはＳｌｕｇの発現が特別的に抑制されているものに増殖されたＢＣＲ−ＡＢＬを発現する造血前駆細胞を識別する能力を調べた。ＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢａ／Ｆ３細胞中の細胞分化のＳｌｕｇ発現の抑制の影響は異なる細胞系で特別な造血マーカーの発現を分析することにより評価された。図５Ｃが示すように、ＢＣＲ−ＡＢＬ−ｐ１９０あるいはＢＣＲ−ＡＢＬ−ｐ２１０癌遺伝子を発現するＢａ／Ｆ３初期細胞はそれぞれ骨髄マーカーＧｒ−１あるいはリンパマーカーＢ２２０の存在により特定される通り、骨髄細胞およびリンパ細胞で特別的に分化される。類推により、Ｓｌｕｇの発現が特異的に抑制したＢＣＲ−ＡＢＬを発現したＢａ／Ｆ３細胞の分化は影響されなかった（図５Ｃ）。これら結果は分化におけるＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子の作用Ｓｌｕｇの発現に依存しないことを示している。
【００４８】
その後、発明者グループは異なる細胞系の生体内腫瘍化能力を調べた。ＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子を発現するＢａ／Ｆ３初期細胞は裸マウスで腫瘍として生成した（サンチェス−ガルシア及びグッツ氏著、１９９５年、前述の著書）。類推により、腫瘍形成はＢＣＲ−ＡＢＬを発現した細胞系の注入からちょうど５日目に観察された。対照細胞とは対照的に、ＢＣＲ−ＡＢＬおよびアンチセンスＳｌｕｇを発現したＢａ／Ｆ３細胞は非常に腫瘍化能力が低かった（図６）。腫瘍は細胞注入から２０日目に切断して肉眼検査を行った。平均的に見て、ＢＣＲ−ＡＢＬを発現したＢａ／Ｆ３細胞を注入されたマウスの腫瘍量はＢＣＲ−ＡＢＬおよびアンチセンスＳｌｕｇを発現した細胞注入マウスの腫瘍量の２倍であった（図６）。生体内浸潤腫瘍の形成中に、腫瘍細胞は臓器境界線の正常状態から逸脱し、他の組織に拡散していた。そのため、Ｓｌｕｇの存在下または非存在下で発生されたＢＣＲ−ＡＢＬ腫瘍の組織学検査が実施された。Ｓｌｕｇの発現が抑制されていたＢＣＲ−ＡＢＬ発現のＢａ／Ｆ３細胞の結果として発生する腫瘍において、細胞は集積していたものの、増殖は許容領域に系統的に限定されていた（図７）。それとは反対に、Ｓｌｕｇの変性発現があったＢＣＲ−ＡＢＬを発現したＢａ／Ｆ３細胞の結果として発生した腫瘍の場合に、先に規定していた許容領域を超えており、従って、腫瘍が拡大していた。図７にあるように、Ｓｌｕｇは明らかにＢＣＲ−ＡＢＬ細胞に転移行動をもたらし、個体細胞として腫瘍細胞の移動が可能である。同様の結果が腫瘍の複数切片およびＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子の２つの型（ｐ１９０とｐ２１０）で認められた。したがって、上記結果は、Ｓｌｕｇ遺伝子が本来の位置から浸潤への腫瘍の転換において重要な役割をもち、個体細胞として腫瘍細胞の移動を可能にしていることを示している。
ＩＩＩ．      考察
ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞の浸潤能力を調節するＳｌｕｇ及び間葉性腫瘍の病原における重要性
白血病誘発において腫瘍細胞は分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）が阻止される原始親細胞であるが（コバレダ氏等著、２０００年、前述の著書及びサンチェス−ガルシア氏著、２０００年、前述の著書）、しかし分化の抑制は標的細胞の生存および増殖が特定微環境に限定されているため、形質転換に十分ではない。そのため、形質転換は、分化を阻害する突然変異体に加えて細胞をその正常環境外で発育させることができる遺伝子変性に依存させねばならない。この仮説を実証するため、造血細胞においてｔ（９；２２）（ｑ３４；ｑ１１）により融合されたＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子の下流標的遺伝子を特定することを試みた。腫瘍形成特性をもたらす下流遺伝子生成物の特定は白血病誘発作用のメカニズムを完全に理解するための必要条件である。現在の研究において、Ｓｌｕｇ遺伝子はキメラＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子により誘発された白血病発生プロセスに関わる下流標的遺伝子として特定された。本発明者グループの試験は、ＳｌｕｇプロモーターがＢＣＲ−ＡＢＬの直接標的であるかどうか、または当該遺伝子がキメラ蛋白質により変調に反応する一定の生化学カスケードにおける１要素として関わっている可能性があるかどうかを明確にするものではない。Ｓｌｕｇの発現が形質転換ＢＣＲ−ＡＢＬの発現後の細胞に認められること、ならびにＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病患者から単離された細胞系および骨髄細胞にＳｌｕｇが認められるという２つの発見は、Ｓｌｕｇの存在がＢＣＲ−ＡＢＬに関し白血病陽性という悪性特性の重要な１要素であることを示している。これはＳｌｕｇが分化阻害に寄与している可能性および本疾患の播種性の原因になっている可能性を示唆するものである。
【００４９】
発明者グループの他の発見はＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子に依存する細胞形質変性の関係においてＳｌｕｇの生物学的機能を特定することにある。ここで示すデータはＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子の発現により活性化されたＳｌｕｇがＢａ／Ｆ３細胞におけるアポプトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）の阻害をもたらすことを明らかにしている。更に、ＢＣＲ−ＡＢＬを発現する細胞の成長および腫瘍化の変異があると、Ｓｌｕｇの発現のレベルが異なってくる。Ｓｌｕｇ発現が前もって排除されたＢＣＲ−ＡＢＬ細胞の結果として発生した生体内腫瘍において、細胞は集積していたが、しかし増殖は許容環境に系統的に制限されていた。それに反して、Ｓｌｕｇ発現が前もって変性されてＢＣＲ−ＡＢＬ細胞の結果として発生した腫瘍においては、許容環境の境界線は広がりを見せ、その結果として、腫瘍は拡大し、正常境界線を逸脱して他の組織に浸潤していた。このように、Ｓｌｕｇは明らかに腫瘍の本来の位置から浸潤への転換においてＢＣＲ−ＡＢＬ細胞に転移行動をもたらし、個体細胞として腫瘍細胞の移動を可能にしている。
【００５０】
発明者グループの発見は、融合蛋白質ＢＣＲ−ＡＢＬを保有する親細胞が構造的にＳｌｕｇを発現し、必要となる外部シグナルに関係なく、細胞を正常環境外に増殖させることができる腫瘍標的細胞の異常生存と、欠損標的細胞を異なる環境に転移する移動とを促進させるモデルと一致している（図８）。しかし、Ｓｌｕｇ発現の増加はＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子による形質転換に関わる唯一の結果ではない。その理由は次の通りである。即ち構成性Ｓｌｕｇの発現が成長受容体を通して誘発された生存シグナルに代わり、細胞を正常微環境外で成長させることができ、本研究の結果は分化に対するＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子の作用がＳｌｕｇの発現に依存していないことを示している。そのため、ＢＣＲ−ＡＢＬ形質転換シグナルを再構成するためにはＳｌｕｇに加えて他の要素が必要である。
【００５１】
発明者グループはＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子がＳｌｕｇ発現をそれ自体で誘発するに十分であること、および細胞浸潤におけるこれら癌遺伝子の生物学的機能にＳｌｕｇが必要であることを示した。Ｓｌｕｇは中胚葉の形成に関与する蛋白質であり（Ｎｉｅｔｏ氏等、１９９４年、前述の著書及びサバグナー氏等著、細胞生物学ジャーナル、第１３７巻、第１４０３頁乃至１４９１頁（１９９７年））、その発現はある完全に制御させることはできず（図２）、それはＢＣＲ−ＡＢＬの形質転換に特異的に関与しているというよりは、癌生態のなかでもっと一般的な役割をもつと思われる。そのため、Ｓｌｕｇの発現は他の白血病で検出されている融合蛋白質および肉腫に関連する蛋白質のための細胞浸潤の作用機能としての役割を果たしている。事実、Ｓｌｕｇ発現は、他の遺伝子変性の支持に基づき形質転換された間葉性腫瘍（白血病および肉腫）においてまれではなく（イヌカイ氏等著、１９９９年、前述の著書およびカーン氏等著、１９９９年、前述の著書）、このことはＳｌｕｇがＢＣＲ−ＡＢＬ陽性白血病だけではなく、おそらく他の間葉性癌でも腫瘍浸潤の１成分であることを示唆している。したがって、Ｓｌｕｇは、白血病および肉腫のいずれにおいても腫瘍浸潤のメカニズムと思われる。本研究の結果において、ＢＣＲ−ＡＢＬの浸潤能力の原因となる作用機能が確立され、Ｓｌｕｇが間葉性腫瘍用の潜在的に広範な腫瘍浸潤メカニズムを有することを示唆する指摘が報告されている。したがって、Ｓｌｕｇそのものはヒト癌治療において、治療（悪性マーカーとして考慮可能）および浸潤能力の治療的調節の魅力的な目標を構成することができる。
同一遺伝子制御を有する転移および腫瘍化
自発成長状態を有する細胞における腫瘍性標的細胞の白血病転換（コバレダ氏著、２０００年、前述の著書およびサンチエス−ガルシア氏著、２０００年、前述の著書）は、一定の特別な遺伝子が増殖／分化の制御を分離しかつ浸潤および細胞拡散中に成長因子の条件を取り替えることができる細胞内シグナルを生成させるために、活性化されねばならないことを意味する。浸潤性腫瘍の発育中に、腫瘍細胞は臓器境界線の正常状態を逸脱し、そして他の組織に浸潤する。正常位置の腫瘍から浸潤性腫瘍に転換中においてのみ、腫瘍細胞は基底上皮膜に浸潤し、そして基礎間質性肉腫に侵入し、肉腫性細胞と相互作用する。転移性腫瘍細胞の行動の定義は組織区画境界線を交差する傾向がありそして複数種の細胞と混合する傾向がある。発明者グループは、ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞が転移性腫瘍細胞ような動きがあることを示している。分化を阻害することはキメラ融合蛋白質（サンチェス−ガルシア氏著、評論年鑑遺伝学、第３１巻、第４２９頁乃至第４５３頁、１９９７年「Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇａｒｃｉａ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３１，４２９−４５３（１９９７）」）この場合において、ＢＣＲ−ＡＢＬの特性の変更の結果であると想定されている。癌遺伝子以外の遺伝子が腫瘍形成と関連性のある転移を生み出す可能性があるのではないかという疑いがもたれている。しかし、その結果はＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子の適切なレセプター細胞への形質転換が腫瘍形成および浸潤の完全な表現型を誘発することを示している。これら発見は融合蛋白質が標的細胞と、腫瘍細胞を浸潤細胞に形質転換させるために必要である浸潤の特別な誘導物質とに変質分化プログラムを与えたことを示している。発見者グループは浸潤のエフェクター遺伝子が新しい腫瘍形成メカニズムの作用を示す同じ融合遺伝子によって腫瘍化をもたらす遺伝子とは無関係に調節可能であることも示している。上記データを合わせた結果、形質転換は単一癌遺伝子の生成／活性化の結果として生成できるという見解が裏打ちされた（サンチェス−ガルシア氏著、１９９７年、前述の著書）。今後の研究調査の興味深い課題としては、Ｓｌｕｇの発現を調節する因子の特定、およびその発現を誘発する他の腫瘍性蛋白質関与の可能性の特定がある。
浸潤および腫瘍発育に関わりをもつＳｌｕｇ
Ｓｌｕｇは無脊椎動物および脊椎動物における中胚葉の形成における進化の視点から保持的役割を有する「Ｚｉｎｃ  フィンガー（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒｓ）」を有する転写因子のＳｎａｉｌファミリーのメンバーである（ニエト氏等著、１９９４年、前述の著書）。ニワトリにおいてはＳｌｕｇは間葉性細胞に転換中に外胚葉性上皮細胞により発現される。Ｓｌｕｇに対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理されたニワトリ胚は、上皮細胞から間葉細胞への転換における区画上の細胞移行異常に関連した不適切な中胚葉形成を示す（ニエト氏等著、１９９４年、前述の著書）。したがって、Ｓｌｕｇは、中胚葉形成および神経冠から細胞の移行における上皮から間葉への転換時の細胞移動を誘発する（フーズ氏著、遺伝子および発育、第８巻、第２２７０頁乃至２２８１頁、１９９４年「Ｆｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８号，２２７０−２２８１（１９９４）」）。しかし、マウスでは、上皮―間葉転換の活性化はＳｎａｉｌ調節下にあり（カノ氏等著、自然細胞生物学、第２巻、第７６頁乃至第８３頁、２０００年「Ｃａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２，７６−８３（２０００）」）、Ｓｎａｉｌは上皮細胞の形状において原中胚葉からの移行を可能とする。その結果、Ｓｌｕｇを有しないマウスにおいて、正常な発育が認められる（ジアン氏等著、発育生物学、第１８巻、第２７７頁乃至第２８５頁、１９９８年「Ｊｉａｎｇｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１８，２７７−２８５（１９９８）」）。更に、遺伝子Ｓｎａｉｌは充実性上皮腫瘍における浸潤性表現型の獲得に関連性をもつＥＭＴを活性化し（バトル氏等著、自然細胞生物学、第２巻、第８４頁乃至第８９頁、２０００年「Ｂａｔｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２，８４−８９（２０００）」およびカノ氏等著、２０００年、前述の著書）、これが転移プロセスの第１段階の結果に寄与することが明らかになっている。したがって、ＥＭＴ誘発はマウスにおいてＳｎａｉｌ遺伝子に特異的関連性をもつ機能と思われる（カノ氏等著、２０００年、前述の著書）。
【００５２】
ここで示したデータはＳｌｕｇがＥＭＴを要しない間葉性腫瘍の増殖中に浸潤能力の重要な調節遺伝子であることを示している。この見解は移行する能力の親間葉細胞の一部分の獲得におけるＳｌｕｇの役割にまで幅を広げることができる。この説を支持するために、本発明者グループの実験は生体内では白血病を有するＢＣＲ−ＡＢＬ遺伝子導入マウスの末梢血液ではＳｌｕｇが発現されず、間葉細胞における未分化、多能性および移動性表現型を特定することを示している。そこで、Ｓｌｕｇの存在は原造血細胞の適切な拡大と生存において正常発育の一定の段階で必要であると考えられている（図８）。同時に、その結果は発育初期段階の調節遺伝子と白血病形成との間の分子的関連性を備え、特に白血病と一般に間葉性腫瘍における浸潤性行動をもたらす分子変性を理解するうえでの手がかりを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１Ａ】ＢＣＲ−ＡＢＬによるＳｌｕｇ遺伝子の正の調節を示している。
【００５４】
Ｂａ／Ｆ３（バンド１）、Ｂａ／Ｆ３＋ｐ１９０（バンド２）、およびＢａ／Ｆ３＋ｐ２１０（バンド３）細胞から単離した全ＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示している。対照実験は空ベクターにより形質変換させたＢａ／Ｆ３細胞にて行った。ナイロン膜にはＳｌｕｇ  ｃＤＮＡの断片を細胞融合し、精製して、そしてβアクチンプローブを再び細胞融合した。
【図１Ｂ】ＢＣＲ−ＡＢＬによるＳｌｕｇ遺伝子の正の調節を示している。
【００５５】
テトラサイクリンの非存在下で発育したＢａ／Ｆ３＋Ｃｏｍｂｉ  ｐ１９０細胞（バンド１）、テトラサイクリン存在下で発現したＢａ／Ｆ３＋ｐ１９０細胞（バンド２）およびＢａ／Ｆ３対照細胞（バンド３）からそれぞれ単離した全ＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示している。ブロットにＳｌｕｇ  ｃＤＮＡ断片、Ｂｃ１−２、およびｍｙｃを細胞融合し、精製して、βアクチンプローブを再び細胞融合させた。
【図２Ａ】正常マウスの組織におけるＳｌｕｇ  ｍＲＮＡの発現を示す。
【００５６】
Ｓｌｕｇ  ｃＤＮＡプローブを細胞融合し、精製して、βアクチンプローブを再び細胞融合させた異なるマウス組織（肺、末梢血液（ＰＢ）、心臓、精巣、脳、小腸、腎臓、筋肉、肝臓、脾臓、胸腺、骨髄（ＢＭ））から単離した全ＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示す。２８Ｓと１８  Ｓ  ＲＮＡの移動度が示されている（末梢血液（ＰＢ）、骨髄（ＢＭ））。
【図２Ｂ】正常マウスの組織におけるＳｌｕｇ  ｍＲＮＡの発現を示す。
【００５７】
ＢＣＲ−ＡＢＬＰ１ ９ ０ およびＢＣＲ−ＡＢＬＰ２ １ ０ 遺伝子導入マウスのＳｌｕｇ  ｍＲＮＡの発現を示すものであり、ｃＤＮＡプローブを細胞融合し、精製して、βアクチンプローブを再び細胞融合した対照マウス（バンド１）、ＢＣＲ−ＡＢＬＰ１ ９ ０ 遺伝子導入マウス（バンド２−４）、およびＢＣＲ−ＡＢＬＰ２ １ ０ 遺伝子導入マウス（バンド５−６）の末梢血から単離した全ＲＮＡのノーザンブロット分析の結果をまとめたものである。２８Ｓと１８  Ｓ  ＲＮＡの移動度が示されている
【図３】内在性Ｓｌｕｇがヒト浸潤細胞系に存在することを示している。各ＲＮＡ分子を逆転写法（ＲＴ）で転写し、ＰＣＲ生成物をナイロン膜に写しとり、遺伝子ごとに末端に特別に標識を付けた内部オリゴヌクレオチドプローブとの細胞融合により分析した。ＲＮＡは非白血病造血細胞系７０７（バンド１）、骨髄性白血病細胞系Ｕ９３７（バンド２）、ＡｌＬ−ＳＩＬ白血病Ｔ細胞系（バンド３）、ＫＯＰＴＩ−Ｋ１（バンド４）、前Ｂ白血病６９７細胞系（バンド５）、ｔ（９；２２）を有する患者の検体（バンド６−８）、ｔ（９；２２）Ｋ５６２陽性ヒト白血病細胞系（バンド９）、ＴＯＭ−１陽性ヒト白血病細胞系（バンド１０）、およびＮａｌｍ−１陽性ヒト白血病細胞系（バンド１１）に対してて評価された。
【図４Ａ】成長因子の非存在下におけるＢａ／Ｆ３細胞の生存についてのＳｌｕｇ遺伝子の影響を示している。
【００５８】
マウスからのＳｌｕｇ  ｃＤＮＡを増殖させたＢａ／Ｆ３細胞（バンド１）、およびＢａ／Ｆ３対照細胞（バンド２）から単離した全ＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を示している。ナイロン膜にはＳｌｕｇ  ｃＤＮＡの断片を細胞融合し、精製して、βアクチンプローブを再び細胞融合させた。
【図４Ｂ】成長因子の非存在下におけるＢａ／Ｆ３細胞の生存についてのＳｌｕｇ遺伝子の影響を示している。
【００５９】
ＩＬ−３の非存在下でＳｌｕｇ蛋白質を発現したＢａ／Ｆ３細胞の生存を示すグラフ図である。ＩＬ−３を有する補充培地で指数関数的に成長した細胞を０日目に５×１０５ 細胞／ｍｌに調整し、その後ＩＬ−３の除去後に培養を行った。ＢＣＲ−ＡＢＬを増殖したＢａ／Ｆ３とＩＬ−３の非存在下でＳｌｕｇを増殖したＢａ／Ｆ３細胞について発育細胞の数が示されている。
【図４Ｃ】成長因子の非存在下におけるＢａ／Ｆ３細胞の生存についてのＳｌｕｇ遺伝子の影響を示している。
【００６０】
細胞死がＩＬ−３の除去後、インターヌクレオソーム分解によりＤＮＡラダーの出現を伴ったことを示している。低分子量ＤＮＡをＩＬ−３の除去から２４時間後にＢａ／Ｆ３＋Ｓｌｕｇ細胞（バンド１）、Ｂａ／Ｆ３＋ｐ２１０細胞（バンド２）、Ｂａ／Ｆ３＋ｐ１９０細胞（バンド３）、および対照Ｂａ／Ｆ３細胞（バンド４）から単離した。そのＤＮＡは末端に標識を付け、２％アガロースゲル電気泳動にかけて分解し、オートラジオグラフ法で発育させた。
【図５Ａ】アンチセンスｃＤＮＡを耐Ｓｌｕｇを有するＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢａ／Ｆ３細胞のＳｌｕｇ  ｍＲＮＡの抑制を示している。
【００６１】
センス配列のないＳｌｕｇ遺伝子（マウスのＳｌｕｇ遺伝子）を発現するベクターを増殖したＢａ／Ｆ３＋ｐ２１０細胞（バンド１）およびＢａ／Ｆ３＋ｐ１９０細胞（バンド２）から全ＲＮＡの単離の結果を示している。細胞ＲＮＡにはマウスＳｌｕｇのｃＤＮＡプローブを細胞融合した。フィルターが変性され、そしてＡＢＬおよびβ−アクチンで再び細胞融合された。
【図５Ｂ】アンチセンスｃＤＮＡを耐Ｓｌｕｇを有するＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢａ／Ｆ３細胞のＳｌｕｇ  ｍＲＮＡの抑制を示している。
【００６２】
増殖ＢＣＲ−ＡＢＬを発現したＢａ／Ｆ３（バンド１−Ｂａ／Ｆ３＋ｐ２１０＋ＡＳｌｕｇ、バンド３−Ｂａ／Ｆ３＋ｐ１９０＋ＡＳｌｕｇ）および非増殖Ｂａ／Ｆ３（バンド２−Ｂａ／Ｆ３＋ｐ２１０、バンド４−Ｂａ／Ｆ３＋ｐ１９０）のノーザンフィルターの細胞融合の結果を示している。プローブとしてマウスのＳｌｕｇ  ｃＤＮＡをコード化する配列の初期４９塩基をもつアンチセンスＳｌｕｇオリゴヌクレオチドが使用された。
【図５Ｃ】アンチセンスｃＤＮＡを耐Ｓｌｕｇを有するＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢａ／Ｆ３細胞のＳｌｕｇ  ｍＲＮＡの抑制を示している。
【００６３】
Ｂａ／Ｆ３細胞においてＢＣＲ−ＡＢＬＰ１ ９ ０ およびＢＣＲ−ＡＢＬＰ２ １ ０ 癌遺伝子によりそれぞれが誘発されたＢ細胞に特異性をもつリンパ分化および骨髄分化がＳｌｕｇの抑制により影響されないことを示している。図５Ｃにおいて、Ｂａ／Ｆ３＋ｐ１９０細胞（パネル左上）、Ｂａ／Ｆ３＋ｐ１９０＋アンチセンスＳｌｕｇ（パネル右上）、Ｂａ／Ｆ３＋ｐ２１０（パネル左下）、およびＢａ／Ｆ３＋ｐ２１０＋アンチセンスＳｌｕｇ（パネル右下）の発現像を示している。細胞はＢ２２０単クローン抗体（特別Ｂ細胞マーカー）およびＧｒ−１（特別骨髄マーカー）で染色し、流動血球計算法により分析された。
【図６】ＢＣＲ−ＡＢＬを発現するＢａ／Ｆ３細胞の腫瘍化におけるＳｌｕｇの条件を示している。ＢＣＲ−ＡＢＬ癌遺伝子を発現した一次Ｂａ／Ｆ３は裸マウス（ＲＥＦ）において腫瘍として成長した。類推により、腫瘍の形成はＢＣＲ−ＡＢＬを発現した細胞系の注入後5日目にすでに観察されたことが明らかになった。これらの対照検体に反し、ＢＣＲ−ＡＢＬおよびアンチセンスＳｌｕｇを発現したＢａ／Ｆ３細胞は腫瘍化が非常に低い。腫瘍は細胞注入後２０日目にスライスして肉眼分析が行われた。平均的に、ＢＣＲ−ＡＢＬを発現したＢａ／Ｆ３細胞を注入したマウスに見出された腫瘍の重量はＢＣＲ−ＡＢＬおよびアンチセンスＳｌｕｇ構造を発現した細胞により誘発された腫瘍の重量の２倍であった。
【図７Ａ】ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞による腫瘍の発育に対するＳｌｕｇの影響を示したものである。
【００６４】
裸マウスにおけるＢａ／Ｆ３＋ｐ１９０細胞により誘発された腫瘍の肉眼検査の結果を示している。
【図７Ｂ】ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞による腫瘍の発育に対するＳｌｕｇの影響を示したものである。
【００６５】
裸マウスに誘発された腫瘍の組織学的検査を示している。Ｂａ／Ｆ３＋ｐ１９０細胞注入後に発育したマウス腫瘍の切片にヘマトキシリン−エオジンで染色させた。Ｓｌｕｇを発現するＢａ／Ｆ３＋ｐ１９０細胞は臓器境界線の正常状態から逸脱し、個体細胞として増殖しており異なる部位に転移を形成していた。腫瘍の複数の切片に同様の結果が認められた。図７Ｂの画像は４０倍である。
【図７Ｃ】ＢＣＲ−ＡＢＬ細胞による腫瘍の発育に対するＳｌｕｇの影響を示したものである。
【００６６】
裸マウスに誘発された腫瘍の組織学的検査を示している。Ｓｌｕｇ発現が特別に抑制されたＢａ／Ｆ３＋ｐ１９０細胞注入後に発育したマウス腫瘍の切片にヘマトキシリン−エオジンで染色させた。Ｓｌｕｇを発現するＢａ／Ｆ３＋ｐ１９０細胞は臓器境界線の正常状態から逸脱し、個体細胞として増殖しており異なる部位に転移を形成していた。腫瘍の複数の切片に同様の結果が認められた。図７Ｃの画像は４０倍である。
【図８Ａ】癌の発育におけるＳｌｕｇの役割をモデル化した図である。
【００６７】
造血システムにおいて、自己再生能力を有する正常な非結合原種細胞が成熟細胞から分化することを示している。この形質転換中に、Ｓｌｕｇの発現は低く調整される。これらの正常な非結合原種細胞は生成された成熟細胞の数を調整しかつ原始細胞の自己再生を制限する培地のシグナルに応答することができる。生理学的状況においてこれらの正常な非結合の原種細胞が移動した場合、Ｓｌｕｇ遺伝子がこれら細胞の生存を促進し、その細胞の機能を行うことができる。これが特定の期間に行われない場合に必要な外部シグナルを拒絶するので、アポプトーシスにいたる。
【図８Ｂ】癌の発育におけるＳｌｕｇの役割をモデル化した図である。
【００６８】
白血病誘発のケースを示したものである。このケースにおいて、染色体異常のある標的細胞は非結合原種細胞である（コラレダ氏等著、血液、第９５巻、第１００７頁乃至第１１１３頁、２０００年およびサンチェス−ガルシア氏等著、現在のゲノム、第１巻、第７１頁乃至第８０頁、２０００年「Ｃｏｌａｌｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｌｏｏｄ，９５，１００７−１１１３（２０００）ａｎｄ  Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｇａｒｃｉａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，１，７１−８０（２０００）」）。この結果として、標的細胞の分化は阻止されるが、この分化の抑制は標的細胞の生存および増殖が特別微環境に制限されるためで、形質転換に十分ではない。そのため、分化を阻止する突然変異に加えて、正常環境外での細胞の成長を可能にする他の遺伝子を変化させねばならない。間葉細胞（白血病や充実性腫瘍）に関連する融合癌遺伝子は分化を阻止し（必要となる外部シグナルに関係なく）、欠損標的細胞の生存および他の環境への移動を促進するＳｌｕｇのような標的遺伝子の活性化能力を有している。これらデータは形質転換が単一癌遺伝子の生成／活性化の結果として生ずるとする考えを裏打ちしている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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