(57)【要約】本発明は、適切な発現プラスミドを導入した大腸菌細胞における、または無細胞系転写−翻訳システムにおけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）逆転写酵素（ＲＴ）の発現、そして大腸菌内で発現させた場合には同大腸菌細胞の溶菌および大腸菌溶菌液からのＨＢＶ−ＲＴの精製、または前記転写−翻訳システムからのＨＢＶ−ＲＴの精製のステップを含む、機能的な無細胞ＨＢＶ−ＲＴの製造法に関する。本発明はさらに本発明の方法により製造した無細胞ＨＢＶ−ＲＴを、潜在的な阻害剤と接触させ、同潜在的阻害剤がＨＢＶ−ＲＴ活性を阻害するかどうかをアッセイするステップを含む、ＨＢＶ−ＲＴ活性の阻害剤をスクリーニングする法に関する。さらに本発明は、本発明のスクリーニング法により同定された阻害剤を医薬組成物中に製剤化するステップを含む、医薬組成物の製造法を提供する。
2004525645.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的な無細胞Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）逆転写酵素（ＲＴ）を製造する方法であって、以下のステップ；
（ａ）ＨＢＶ−ＲＴの発現を、
（ａａ）適切な発現ベクターを導入した大腸菌において；または
（ａｂ）無細胞の転写−翻訳システムにおいて行い
（ｂ）大腸菌細胞内で発現させる場合には前記大腸菌細胞の溶菌し、および
（ｃ）大腸菌溶菌液または前記転写−翻訳システムからのＨＢＶ−ＲＴの精製
を含む該方法。
【請求項２】
ＨＢＶ−ＲＴを融合タンパク質として発現させる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
融合タンパク質がタグを含む請求項２に記載の方法。
【請求項４】
タグを前記ＨＢＶ−ＲＴのＮ末端に融合させる請求項３に記載の方法。
【請求項５】
タグを前記ＨＢＶ−ＲＴのＣ末端に融合させる請求項３に記載の方法。
【請求項６】
タグがＨｉｓタグ、ストレプトアビジン−タグ、ＨＡタグ 、ＧＳＴタグ、ＣＢＰタグ、ＭＢＰタグ、およびＦＬＡＧタグの群から選択される、請求項３から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）が以下のステップ；
（ｃａ）溶菌液または転写−翻訳システムの不溶性分画を分離するための、溶菌液または転写−翻訳システムの約３００００×ｇでの遠心；および
（ｃｂ）ＨＢＶ−ＲＴを含む上清の分離
を含む請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃｃ）クロマトグラフィーによる上清の精製、をさらに含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
クロマトグラフィーがアフィニティークロマトグラフィーであり、前記アフィニティーがタグ特異的である請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＨＢＶ−ＲＴがヒトＨＢＶ−ＲＴである請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＢＶ−ＲＴ活性の阻害剤をスクリーニングする方法であって、以下のステップ
（ａ）請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法により製造された無細胞ＨＢＶ−ＲＴを、潜在的な阻害剤と接触させること；および
（ｂ）前記潜在的阻害剤がＨＢＶ−ＲＴ活性を阻害するかどうかをアッセイすること、
を含む該方法。
【請求項１２】
ステップ（ｂ）のアッセイが読み取りシステムにより行われる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記読み取りシステムが非放射性を基本とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｂ）のアッセイが定性的である請求項１１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）のアッセイが定量的である請求項１１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
潜在的阻害剤が植物の産物または植物由来の産物である請求項１１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
植物がフィランタスである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記フィランタスがキダチコミカンソウ（Phyllantus amarus）である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１１から１８のいずれか１項に記載の方法により同定された阻害剤を改良する方法であって、以下の方法
（ａ）ペプチドミメティクスによる前記阻害剤のモデル化：および
（ｂ）モデル化した阻害剤の化学的合成
を含む該方法。
【請求項２０】
、請求項１１から１８のいずれか１項に記載の方法により同定された、または請求項１９に記載の方法により改良された阻害剤をリード化合物として修飾する方法であって、以下の項目
（ｉ）修飾された作用部位、活性スペクトル、器官特異性、および/または
（ｉｉ）改善された効果、および/または
（ｉｉｉ）低減された毒性（治療指標の改善）、および/または
（ｉｖ）低減された副作用、および/または
（ｖ）修飾された治療作用の発現、効果の持続時間、および/または
（ｖｉ）修飾された薬物動態学的パラメータ（吸収、分散、代謝および排泄）、および/または
（ｖｉｉ）修飾された生理化学的パラメータ（溶解度、吸湿性、色、味、におい、安定性、状態）、および/または
（ｖｉｉｉ）改善された一般的特異性、器官/組織特異性、および/または
（ｉｘ）最適化された投与剤形および投与経路、
を達成するために、
（ｉ）カルボキシル基のエステル化、または
（ｉｉ）ヒドロキシル基の炭素酸によるエステル化、または
（ｉｉｉ）ヒドロキシル基の、例えばリン酸エステル、ピロリン酸エステルまたは硫酸エステルまたはヘミコハク酸エステルへのエステル化、または
（ｉｖ）医薬的に受容可能な塩の形成、または
（ｖ）医薬的に受容可能な複合体の形成、または
（ｖｉ）薬学的に活性なポリマーの合成、または
（ｖｉｉ）親水性部分の導入、または
（ｖｉｉｉ）芳香族上のまたは側鎖上の置換基の導入/変換、置換基のパターンの変更、または
（ｉｘ）等価性または生物学的等価性部分の導入による修飾、または
（ｘ）相同化合物の合成、または
（ｘｉ）分枝側鎖の導入、または
（ｘｉｉ）アルキル置換基の環状類似体への変換、または
（ｘｉｉｉ）ヒドロキシル基のケタール、アセタールへの誘導体化、または
（ｘｉｖ）アミド、フェニルカルバメートへのＮ−アセチル化、または
（ｘｖ）マンニッヒの塩基、イミンの合成、または
（ｘｖｉ）ケトンまたはアルデヒドのシッフ塩基、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チオゾリジンへの転換、
または、これらの組み合わせ、
により修飾する前記方法。
【請求項２１】
請求項１１から１８または２０のいずれか１項に記載のスクリーニング法により同定された、または請求項１９に記載の方法により改良された阻害剤を、医薬的に受容可能な担体または希釈剤と共に製剤化するステップを含む、医薬組成物を製造する方法。
【請求項２２】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法により製造されたＨＢＶ−ＲＴを使用してｃＤＮＡをin vitroで合成する方法。
【請求項２３】
キダチコミカンソウ抽出物/阻害剤の調製品のバッチ間の一貫性および/またはそれらの有効期限を評価する方法であって、請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法により製造されたＨＢＶ−ＲＴを同バッチと接触させて、ＲＴ活性を評価することを含む該方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、適切な発現プラスミドを導入した大腸菌細胞における、または無細胞転写−翻訳システムにおけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）逆転写酵素（ＲＴ）の発現、そして大腸菌内で発現させた場合には同大腸菌細胞の溶菌および大腸菌溶菌液からのＨＢＶ−ＲＴの精製、または前記転写−翻訳システムからのＨＢＶ−ＲＴの精製のステップを含む、機能的な無細胞ＨＢＶ−ＲＴの製造法に関する。本発明はさらに本発明の方法により製造した無細胞ＨＢＶ−ＲＴを、潜在的な阻害剤と接触させ、同潜在的阻害剤がＨＢＶ−ＲＴ活性を阻害するかどうかをアッセイするステップを含む、ＨＢＶ−ＲＴ活性の阻害剤をスクリーニングする方法に関する。さらに本発明は、本発明のスクリーニング法により同定された阻害剤を医薬組成物中に製剤化するステップを含む、医薬組成物の製造法を提供する。
【０００２】
本明細書の本文を通して幾つかの文献を引用する。当明細書に引用した各文献の開示内容（あらゆる製造の明細書、説明等を含む）を参照として当明細書に援用する。
Ｂ型肝炎ウイルスは小さなエンヴェロープで覆われたＤＮＡウイルスのファミリーであるヘパドナウイルス科に分類され、ＲＮＡ中間体の逆転写によりゲノムを複製する（Hu & Seeger, 1996）。このウイルスはヒトの急性および慢性肝硬変および肝細胞癌の原因となる(Tavis & Ganem, 1993)。環状のウイルスゲノムは３２２１塩基対から成る（ｈＨＢＶ）。
【０００３】
pol gen の産物であるヘパドナウイルスの逆転写酵素は、ポリシストロン性のウイルス（プレゲノム）ＲＮＡから直接発現する（Hu & Seeger, 1996）。逆転写酵素は数箇所の異なる部位でリン酸化される９５ｋＤａのタンパク質である(Ayola et al., 1993)。
【０００４】
ウイルスの感染サイクルにおいて、逆転写酵素は異なる複数の役割を果たさなければならない(Nassal, 1999)。この酵素はヌクレオキャプシド内へのウイルスＲＮＡのパッケージングに必須であり（Hirsch et al., 1990）、ＲＮＡを鋳型としてマイナス鎖ＤＮＡを合成するプライマーとなり（タンパク質のプライミング反応）(Bartenschlager & Schaller, 1998; Wang & Seeger, 1992; Zoulim & Seeger, 1994)、マイナス鎖ＤＮＡを合成し（逆転写）、続いてマイナス鎖ＤＮＡを鋳型としてプラス鎖ＤＮＡを合成する。さらにＲＴはＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡに対してＲＮアーゼＨ活性を示す(Radziwill et al., 1999)。
【０００５】
最近の研究はヒトの（ｈＨＢＶ）性肝炎およびアヒルの（ｄＨＢＶ）性肝炎に集中した(Hu & Seeger, 1996a)。ＲＴポリペプチドの特定のドメインへの機能の割付けが突然変異分析および配列比較により行われた。同定された４つの構造的ドメイン(Radziwill et al., 1990; Chang et al., 1990)は、Ｎ末端ドメイン、スペーサー領域、中央の逆転写酵素ドメインおよびＣ末端ＲＮアーゼＨドメインを含む。
【０００６】
中央の逆転写酵素ドメインおよびＣ末端ＲＮアーゼＨドメインは、他の逆転写酵素の相応するドメインと非常に類似している。プライミングを行うチロシン残基を含むＮ末端ドメイン（末端タンパク質、ＴＰ）は、ヘパドナウイルス特有の特徴である（ｈＨＢＶ：Ｔｙｒ６３；Lanford et al., 1997）。この独特なタンパク質プライミング過程では、マイナス鎖ＤＮＡの５’末端が逆転写酵素と共有結合し、ＤＮＡ合成の全過程を通して結合が保持される (Bartenschlager & Schaller, 1988; Hu & Seeger, 1996)。
【０００７】
逆転写酵素を介しての第２の過程は、プレゲノムＲＮＡをポリメラーゼと共にウイルス粒子内にパッケージングすることである。ヌクレオカプシドのアッセンブリーの開始はリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体が引き金となり、さらなる逆転写活性に必須となる(Hirsch et al.,1991)。ＲＮＰ複合体はポリメラーゼ（ＲＴ）、pol genの上流のＲＮＡ配列、およびいわゆるε−ＲＮＡまたはε−配列から成る(Pollack & Ganem, 1994; Wang et al., 1994)。ε−ＲＮＡは、シス型でポリメラーゼにより認識される明確なステムループ構造に折りたたまれている。このことは、ポリメラーゼはおそらく翻訳過程の間には既に、それ自体のｍＲＮＡを認識し結合することを意味する。pol genの下流に、ポリメラーゼのin vivoの機能には必須ではないと思われる付加的なε−構造がある(Lanford et al., 1997)。
【０００８】
ＲＮＰのアッセンブリーおよびパッケージング過程の開始以外に、ε−ＲＮＡはさらに２つの機能を示す。ステムループ構造の一部が、逆転写酵素による４から５塩基対の長さのプライマー合成のための鋳型（ＵＵＡＣ）として提供される(Tavis et al., 1994)。共有結合されたプライマー合成の後、いわゆる鋳型の切り換えが起こる。プライマーはε−ＲＮＡから離れ、プレゲノムＲＮＡ３’末端（ＤＲ１ element）付近の正しい転写開始領域（ＵＵＡＣ）に結合し(Tavis et al., 1994)、その結果逆転写が開始する。逆転写酵素への結合におけるε−ＲＮＡのさらなる特徴は、コンフォメーションの変化を誘導して酵素として活性なタンパク質とすることである。この活性状態の逆転写酵素は、in vitro ではプロテアーゼへの耐性を示す(Tavis and Ganem, 1996; Tavis et al., 1998)。
【０００９】
無細胞システムにおける逆転写酵素の発現の研究は、宿主由来因子がＲＮＰ複合体のアッセンブリーに必須であることを示した(Hu & Seeger, 1996)。ウサギの網状赤血球溶解液中で発現させた逆転写酵素の活性は、小麦種子抽出物中で発現させた酵素の５０倍の高値であった。小麦種子抽出物は機能的に均等なＨｓｐ９０を含まないことが知られている(Dalman et al., 1989)。このことは、Ｈｓｐ９０が逆転写酵素活性に必須の宿主成分であることを示唆する。共免疫沈降実験によりＨｓｐ９０が逆転写酵素に結合することが証明された。Ｈｓｐ９０の機能は、おそらく新たに合成された逆転写酵素をε−ＲＮＡと結合できるコンフォメーションに安定化させることであろう(Hu & Seeger, 1996b; Lanford et al., 1997)。逆転写酵素と相互作用するこのＨｓｐ９０複合体はｐ２３を含み、ステロイドホルモン受容体の成熟より知られるところとなった様式でＡＴＰを加水分解する(Hu et al., 1997; Pratt & Dittmar, 1998)。この複合体のさらなる成分はＨｓｐ７０およびおそらくＨｓｐ４０である。複合体中にＨｓｐ７０およびｐ２３が含まれることは共免疫沈降法、抗体のマスキングおよびＲＴ活性のアッセイにより示された。ＡＴＰ依存性のこの反応は、ゲルダナマイシンにより阻害され得る (Hu et al., 1997)。
【００１０】
ウイルス複製サイクルの間ずっとシャペロン複合体は逆転写酵素と会合し、最終的にヌクレオカプシド内にパッケージングされるという説が提案されている(Hu et al., 1997)。このことは、もう１つの天然の基質であるステロイドホルモン受容体とＨｓｐ９０との一時的な相互作用とは対照的である(Pratt, 1993)。
【００１１】
突然変異誘発の研究により、逆転写酵素における２つのＨｓｐ９０/ｐ２３結合部位、すなわち１つはＴＰ領域、他の１つは中央のポリメラーゼドメインが明らかにされた。他のＨｓｐ９０基質に関しては、逆転写酵素に保存されている結合モチーフは認められていない(Hu et al., 1997; Cho et al., 2000)。
【００１２】
ウイルス粒子における逆転写酵素のＤＮＡポリメラーゼ機能は１９７３年に発見された。ウイルス粒子から単離されたＲＴはウイルス自身のプラス鎖ＤＮＡを合成することができた。ＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖の様な外来の鋳型をＤＮＡ合成に用いることはできなかった(Kaplan et al., 1973; Summers & Mason, 1982; Radziwill et al., 1988)。したがってウイルス粒子から単離されたＲＴは、生化学的に特徴づけるには適していなかった。
【００１３】
in vitroの翻訳システムを用いて、Wang とSeeger (1992)はウサギの網状赤血球溶解液中で初めてｄＨＢＶ  ＲＴを発現させることができた。１９９３年にはTavisとGanemは、酵母細胞内でＲＴ融合タンパク質を発現させた。アフリカツメガエル卵母細胞内でのＨＢＶ−ＲＴの発現は、Seifer & Standring (1993)により達成された。Landford et al. (1995)は、バキュロウイルスシステムを用いて昆虫の細胞からｈＨＢＶ−ＲＴを発現し精製することができた。
【００１４】
上述の発現システムから単離されたＲＴは、予想される機能（逆転写、鋳型としてＲＴ−ｍＲＮＡを用いてのＤＮＡ重合）を示した。加えて単離されたＲＴはまた、外来のＤＮＡおよびＲＮＡの鋳型を利用することが示された(Tavis et al., 1998)。
【００１５】
しかしこれらの研究は、ＲＴ活性に潜在的に必要とされる付加的なタンパク質を含む真核細胞溶解液中で行われた。
近年、新たな真核細胞発現システムが開発および改良された。１９９９年、酵母Ｔｙ１発現システム(Tavis & Ganem, 1993)をＨＢＶ−ＲＴ活性を追跡するためにヒスチジンマーカーを使用して修正した (Qadri & Siddiqui)。Ladner ら(1997)はＨＢＶ−ＲＴ発現が培地のテトラサイクリン濃度によって制御される肝芽腫幹細胞系を開発した。
（参考文献リスト）
【非特許文献１】
Ayola, B., P. Kanda, and R.E. Lanford. 1993. 組み換えバキュロウイルスを導入した昆虫の細胞におけるＢ型肝炎ウイルスポリメラーゼのハイレベルの発現およびリン酸化 (High level expression and phosphorylation of hepatitis B virus polymerase in insect cells with recombinant baculoviruses)。Virology 194: 370-373.
【非特許文献２】
Bartenschlager, R. and H. Schaller. 1988. ヘパドナウイルスのＰ遺伝子のアミノ末端ドメインが逆転写をプライミングすると考えられている末端タンパク質（ゲノムにリンクするタンパク質）をコードする (The amino-terminal domain of the hepadnaviral P-gene encodes the terminal protein (genome-linked protein) believed to prime reverse transcription)。EMBO J 7: 4185-4192.
【非特許文献３】
Chang, L.J., P. Pryciak, D. Ganem, and H.E. Varmus. 1989. Ｂ型肝炎ウイルスの逆転写酵素の生合成は、リボソームのフレームシフトではなくde novo翻訳開始を含む (Biosynthesis of the reverse transcriptase of hepatitis B virus involves de novo translational initiation not ribosomal frameshifting)。Nature 337: 364-368.
【非特許文献４】
Chang, L.J., R.C. Hirsch, D. Ganem, and H.E. Varmus. 1990. アヒルＢ型肝炎ウイルスポリメラーゼの機能における挿入変異および点変異の効果 (Effects of insertional and point mutations on the functions of the duck hepatitis B virus polymerase)。J Virol 64: 5553-5558.
【非特許文献５】
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【非特許文献６】
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【非特許文献７】
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【非特許文献８】
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【非特許文献１４】
Kaplan, P.M., R.L. Greenman, J.L. Gerin, R.H. Purcell, and W.S. Robinson. 1973.ヒトＢ型肝炎ウイルス抗原に関連するＤＮＡポリメラーゼ (DNA polymerase associated with human hepatitis B antigen)。J Virol 12: 995-1005.
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【非特許文献１６】
Lanford, R.E., L. Notvall, and B. Beames. 1995. 昆虫細胞内で発現させたＢ型肝炎ウイルスポリメラーゼのヌクレオチドプライミングおよび逆転写酵素活性 (Nucleotide priming and reverse transcriptase activity of hepatitis B virus polymerase expressed in insect cells)。J Virol 69: 4431-4439.
【非特許文献１７】
Lanford, R.E., L. Notvall, H. Lee, and B. Besmes. 1997. 独立して発現させたＢ型肝炎ウイルス逆転写酵素のＴＰおよびＲＴドメイン間の、ヌクレオチドプライミングと逆転写のトランス相補性 (Transcomplementation of nucleotide priming and reverse transcription between independently expressed TP and RT domains of the hepatitis B virus reverse transcriptase)。J Virol 71: 2996-3004.
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Wang, G.H. and C. Seeger. 1992. Ｂ型肝炎ウイルスの逆転写酵素はウイルスのＤＮＡ合成のタンパク質プライマーとして作用する (The reverse transcriptase of hepatitis B virus acts as a protein primer for viral DNA synthesis)。Cell 71: 663-670.
【非特許文献３２】
Wang, G.H., F. Zoulim, E.H. Leber, J. Kitson, and C. Seeger. 1994. Ｂ型肝炎ウイルスの逆転写酵素の酵素活性におけるＲＮＡの役割 (Role of RNA in enzymatic activity of the reverse transcriptase of hepatitis B viruses)。J Virol 68: 8437-8442.
【非特許文献３３】
Zoulim, F. and C. Seeger. 1994. Ｂ型肝炎ウイルスの逆転写はポリメラーゼのチロシン残基によりプライミングされる (Reverse transcription in hepatitis B viruses is primed by a tyrosine residue of the polymerase)。J Virol 68: 6-13.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
上述の経過を考慮すると本発明の根底にある技術的問題は、真核細胞タンパク質を本質的に混入しない、または混入するタンパク質から容易に精製することのできる、機能的なＨＢＶ−ＲＴを効率的に提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この技術的問題の解決は、請求項に特徴を示した態様を提供することで達成された。
したがって本発明は、機能的な無細胞Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）逆転写酵素（ＲＴ）の製造法に関し、同製造法は以下のステップ
（ａ）ＨＢＶ−ＲＴの発現を、
（ａａ）適切な発現ベクターを導入した大腸菌において；または
（ａｂ）無細胞の転写−翻訳システムにおいて行い、
（ｂ）大腸菌細胞内で発現させる場合には同大腸菌細胞の溶菌し、および、
（ｃ）大腸菌溶菌液または前記転写−翻訳システムからのＨＢＶ−ＲＴの精製
を含む。
【００１８】
本発明に従って“機能的な”という用語は、逆転写酵素活性を有するＨＢＶ−ＲＴポリペプチドを意味する。この活性は、ＲＴＡ（逆転写酵素アッセイ）キット(RetroTech, Unterschlessheim,ドイツ)を利用することを含む、当該技術分野で知られている方法により分析することができる。一般に本ＲＴアッセイは逆転写酵素により行われる過程である、標識ヌクレオチドが合成されるＤＮＡに統合されることを使用する。in vitroシステムにおける逆転写酵素活性の定量のために、ＲＴ活性のパラメータとしての役割を果たす、ＤＮＡに組み入れられる（標識）ｄＵＴＰを測定する。測定は通常、化学発光、生物発光、または放射能に起因するシグナルを基本とする。このような逆転写酵素のアッセイの詳細を本出願の実施例４に示す。
【００１９】
“無細胞”という用語は本発明に従って使用する場合、実質的に生きた細胞を含まないシステムを示す。
“Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）逆転写酵素（ＲＴ）”という用語は本明細書で使用する場合、新生マイナス鎖ＤＮＡへのプレゲノムｍＲＮＡの転写、新生マイナス鎖ＤＮＡからのプラスＤＮＡ鎖の合成、二本鎖ＤＮＡの完成、を行うことのできるポリペプチドに関する。
【００２０】
ＨＢＶ−ＲＴはGenBankアクセス番号Ｘ５１９７０．１にて寄託されている配列に含まれる核酸配列によりコードされることができる(http://www.ncbi.nlm.nih.gov;last update 25.04.2001)。ヒトＨＢＶ−ＲＴの相応のワイルドタイプのタンパク質の配列は、GenBankアクセス番号ＣＡＡ３６２２９である (http://www.ncbi.nlm.nih.gov;last update 25.04.2001)。
【００２１】
“発現ベクター”という用語は本明細書で使用する場合、ＨＢＶ−ＲＴポリヌクレオチドを含むベクターを包含する。本発明において、前記ベクターは大腸菌細胞内でのＨＢＶ−ＲＴの発現に適するものとする。したがってＨＢＶ−ＲＴポリペプチドは、組み換えにより製造することができる。ベクターは例えばファージベクター、プラスミドベクター、ウイルスベクター、またはレトロウイルスベクターとすることができる。レトロウイルスベクターは複製受容能があっても、または複製欠陥であってもよい。後者の場合、一般にウイルスの増殖は欠陥を補足する宿主細胞においてのみ起こることになる。
【００２２】
宿主内での増殖のために、ＨＢＶ−ＲＴポリヌクレオチドは選択可能なマーカーを含むベクターに組み入れることができる。一般にプラスミドベクターは沈殿、例えばリン酸カルシウム沈殿にて、または荷電脂質との複合体にて導入することができる。ベクターがウイルスの場合、適当なパッケージング細胞系を使用してin vitroでパッケージングさせた後、宿主細胞に形質導入させることができる。
【００２３】
ＨＢＶ−ＲＴポリヌクレオチドの挿入にあたっては、適当なプロモーター、例えば少数例をあげればラムダファージＰＬプロモーター、大腸菌 ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーターおよびレトロウイルスＬＴＲのプロモーターと機能可能にリンクさせなければならない。他の適切なプロモーターも当該技術者には公知であろう。発現構成物(constructs)はさらに転写開始部位、終結部位を含み、および転写された領域に翻訳のためのリボソーム結合部位を含むものとする。これらの構成物により発現される転写物のコード部分は、好ましくは翻訳されるポリペプチドのはじめに翻訳開始コドンを、および末端に適切に位置する終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含むものとする。
【００２４】
これまで示したように、発現ベクターは好ましくは少なくとも１つの選択可能なマーカーを含むものとする。このようなマーカーは、大腸菌で培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。上述の大腸菌細胞の適当な培養培地および条件は当該技術分野において公知である。
【００２５】
細菌に使用するための好ましいベクターとして、QIAGEN, Inc.より入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９；Stratagene Cloning System, Inc.より入手可能なpBluescriptベクター、Phagescriptベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ，ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；および Pharmacia Biotech, Inc.より入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５を含む。その他の適切なベクターも当業者には容易に明らかとなるであろう。
【００２６】
“大腸菌”という用語は大腸菌（Escherichia coli）種をいい、外来（ポリ）ペプチドの発現に適するあらゆる有用な菌株を含むことを意味する。適切な菌株はＤＨ１０Ｂ、ＪＭ１０９、Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］、ＢＬ２１ＤＥ３、ＪＭ１０９  ＤＥ３、ＴＯＰ１０を含む。
【００２７】
“転写−翻訳システム”という用語は本発明の内容において、ＲＴＳ５００システム（Roche、スイス）を含む転写と翻訳をカップルさせた無細胞発現システムを示す。簡単に言えばＨＢＶ−ＲＴポリヌクレオチドを発現ベクター内に組み込む。in vitroの反応においてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが鋳型をｍＲＮＡに転写し、次に大腸菌溶菌液に存在するリボソーム機構の翻訳が続いて起こる。このようにＨＢＶ−ＲＴポリペプチドへの転写および翻訳が反応容器内で同時に起こる。
【００２８】
“溶菌（溶解）”という用語は本発明に従って、細胞膜の裂開により細胞を開き、ポリペプチドを放出する、当該技術分野の公知の技術により行われる過程をいう。この過程は、例えば前記細胞の凍結および解凍のサイクルを数回繰り返すことにより、機械的にホモジナイザー、ガラスビーズにより、超音波処理、French Pressにより、またはりリゾチームを利用することにより行うことができる。好ましくは大腸菌の場合、細胞を超音波処理により溶菌した後、French Press処理を続けて行う。
【００２９】
本発明に従って“精製”と言う用語は、一度発現または合成すれば、本発明のポリペプチドを硫安沈殿、カラムクロマトグラフィー、アフェニティークロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む、当該技術分野の標準的な方法により精製することができることを意味する；Scopes, “Protein Purification”, Springer-Verlag, N.Y. (1982)を参照のこと。精製過程の結果としては、少なくとも約９０から９５％の均質性の実質的に純粋なタンパク質が好ましく、９８から９９％またはそれより高い均質性が最も好ましい。上に引用した程度にまで一度精製すれば、このタンパク質を次に治療に（体外を含む）またはアッセイ法の開発および実施に使用することができる。
【００３０】
実施例に述べた幾つかの実験条件下では、本発明に従って製造されるＨＢＶ−ＲＴの一部が精製過程の間に分解してしまうことが観察された。このような分解を避けるまたは減らすため、使用する発現システムは誘導プロモーターを利用することが好ましい。溶菌および精製は発現誘導後２時間で続けて行うことがさらに好ましい。加えて本発明の方法ではプロテアーゼ阻害剤の使用が考えられるが、前記プロテアーゼ阻害剤は遅くとも最後の精製ステップ中には精製されたＨＢＶ−ＲＴから除去できるものとする/除去できなければならない。プロテアーゼ阻害剤は当該技術分野では知られており、Pefabloc SC、 Pefabloc SC Plus、PMSF、登録商標Completeを含む。これらは例えばRoche Diagnostics（スイス）、SIGMA（ドイツ）より購入でき、製造元の説明書に従って使用することができる。顕著な分解を抑えるため、溶菌/精製プロトコルの全ステップは好ましくは４℃で中断せずに行う。
【００３１】
本発明に従って、機能的なＨＢＶ−ＲＴの効率的な製造が、不利な面のある真核細胞または細胞系の利用に頼ることなく達成できることを、驚くべきことに示すことができた。
上述のように当該技術分野の従来の研究は、ＲＴ活性に潜在的に必要な付加的なタンパク質を含む真核細胞溶菌液中で行われた。真核細胞システムとは対照的に、本発明はこのような細胞成分の干渉作用を排除することができる。このシステムにさらに操作を加えることなく、宿主の原核細胞内で酵素として活性な形でＨＢＶ−ＲＴを生成できることは、驚きでありまた予期しないことであった。本発明はさらなる研究、例えばＨＢＶ−ＲＴ活性の阻害剤の直接的な影響の研究を大きく促進するものである。
【００３２】
本発明の好ましい態様において前記ＨＢＶ−ＲＴは融合タンパク質として発現させる。
“融合タンパク質”という用語は、天然の条件下では互いに融合しない、好ましくは互いに異種の少なくとも２つのアミノ酸配列を含む１つの（ポリ）ペプチド（すなわちポリペプチドまたはペプチド）に関する。
【００３３】
例えばＨＢＶ−ＲＴポリペプチドをマーカー配列、例えばＨＢＶ−ＲＴの精製を容易にするペプチドと融合させることができる。
マーカーのアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド、例えば市販の入手可能な多くのマーカーの中でもｐＱＥベクターに提供されるタグ(QIAGEN,Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311 )とすることができる。Gentz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989); 821-824 に記載されているように、例えばヘキサヒスチジンは融合タンパク質の使い勝手のよい精製を提供する。精製に有用なもう１つのペプチドタグである“ＨＡ”タグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに相当する；Wilson, Cell 37 (1984); 767を参照のこと。
【００３４】
前記タグがＨｉｓタグ、ストレプトアビジン−タグ、ＨＡタグ 、ＧＳＴタグ、ＣＢＰタグ、ＭＢＰタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃおよび抗体結合領域の１本鎖フラグメント（ｓｃ Ｆｖｓ）からなる群から選択される（ただしこれに限定されない）ことが、本発明に従っての特に好ましい態様である。
【００３５】
さらに特に好ましい態様において、前記タグは前記ＨＢＶ−ＲＴのＮ末端または前記ＨＢＶ−ＲＴのＣ末端に融合させる。
さらにＨＢＶ−ＲＴポリペプチドは第２のタンパク質と融合させる場合、抗原タグとして使用することができる。ＨＢＶ−ＲＴポリペプチドに対して産生される抗体を、ＨＢＶ−ＲＴと結合していることを利用して第２のタンパク質を間接的に検出するために使用することができる。さらに分泌されるタンパク質は輸送シグナルに基づいて細胞内の位置を標的とするため、一度ＨＢＶ−ＲＴを他の分子と融合させれば、ＨＢＶ−ＲＴポリペプチドを標的分子として使用することができる。ＨＢＶ−ＲＴポリペプチドと融合させることのできるドメインの例としては、異種のシグナル配列だけでなく、異種の他の機能的領域も含む。融合は必ずしも直接でなくてもよく、リンカー配列を通して融合することもできる。
【００３６】
さらに融合タンパク質はまた、ＨＢＶ−ＲＴポリペプチドの特性を改善するために改変することもできる。例えば付加的なアミノ酸、特に荷電アミノ酸領域をＨＢＶ−ＲＴポリペプチドのＮ末端に付加して、宿主細胞からの精製またはその後の操作および保存の間の安定性および永続性を改善することができる。またペプチド部分をＨＢＶ−ＲＴポリペプチドに付加して、精製を容易にすることもできる。このような領域はＨＢＶ−ＲＴポリペプチドの最終的な調製の前にはずすことができる。ポリペプチドの取り扱いを容易にするためにペプチド部分を付加することは、当該技術分野ではよく知られた通常の技術である。
【００３７】
さらにフラグメントおよび特にエピトープを含むＨＢＶ−ＲＴポリペプチドを、免疫グロブリン（ＩｇＧ）の定常ドメインの部分と結合させ、キメラタンパク質を得ることができる。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、in vivo の半減期を延長を示す。ある実施例の報告は、ヒトＣＤ−４ポリペプチドの最初の２つのドメイン、および哺乳類免疫グロブリンのＨ鎖またはＬ鎖の定常領域の様々なドメインから成るキメラタンパク質について記載している；例えばＥＰ−Ａ３  ０  ０９４  ８２７；Traunecker, Nature 331 (1988); 84-86を参照のこと。
【００３８】
多くの場合、融合タンパク質におけるＦｃ部分は治療および診断に有益であり、したがってその結果、例えば薬物動態学的特性を改善することができる；例えばＥＰ−Ａ  ０  ２３２  ２６２を参照のこと。あるいは融合タンパク質の発現、検出および精製後、Ｆｃ部分をはずすことを所望されることも考えられる。例えば、融合タンパク質を免疫の抗原として使用する場合には、Ｆｃ部分が治療および診断の妨げとなり得る。薬剤の開発において、例えばヒトタンパク質、例えばｈＩＬ−５を、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイの目的のために、Ｆｃ部分に融合させている；Bennett, J. Molecular Recognition 8 (1995), 52-58; Johanson, J. Biol. Chem. 270 (1995), 9459-9471 を参照のこと。
【００３９】
さらなる好ましい態様において、本発明の方法のステップ（ｃ）は以下のステップ
（ｃａ）溶菌液または転写−翻訳システムの不溶性分画を分離するための、溶菌液または転写−翻訳システムの約３００００×ｇでの遠心；および
（ｃｂ）ＨＢＶ−ＲＴを含む上清の除去
を含む。
【００４０】
本発明による持続的な遠心力を加えることにより、懸濁液中のＨＢＶ−ＲＴの迅速な濃縮および最初の精製ステップを達成することができる。遠心中に、例えば細胞の残骸からの密度のより高い粒子、または転写−翻訳反応からの不溶性化合物が遠心チューブの外縁に集積するため、ＨＢＶ−ＲＴを含む上清を容易に分離することができる。
【００４１】
さらに特に好ましい態様において、本発明の方法はさらにステップ（ｃｃ）クロマトグラフィーによる上清の精製、を含む。
本発明の加えて特に好ましい態様において、前記クロマトグラフィーはアフィニティークロマトグラフィーであり、前記アフィニティーはタグ特異的である。
【００４２】
本発明のもう１つの好ましい態様において、前記ＨＢＶ−ＲＴはヒトＨＢＶ−ＲＴ（ｈＨＢＶ−ＲＴ）である。
本発明はさらにＨＢＶ−ＲＴ活性の阻害剤をスクリーニングする方法に関し、その方法は以下のステップ
（ａ）本発明の方法により製造された無細胞ＨＢＶ−ＲＴを、潜在的な阻害剤と接触させること；および
（ｂ）前記潜在的阻害剤がＨＢＶ−ＲＴ活性を阻害するかどうかアッセイすること
を含むものとする。
【００４３】
本発明のポリペプチドは、ＨＢＶ−ＲＴまたはそれをコードする遺伝子の阻害剤となり得る化合物をスクリーニングする方法を開発するための基礎を提供する。“阻害剤”またはアンタゴニストという用語は当該明細書で使用する場合、ＨＢＶ−ＲＴタンパク質の生物活性をダウンレギュレートする（例えば、抑制する又は阻害する）物質をいうものとする。阻害剤またはアンタゴニストは、タンパク質ともう１つの分子との相互作用を阻害する、または低下させる化合物とすることができる。阻害剤またはアンタゴニストはまた、ＨＢＶ−ＲＴ遺伝子の発現をダウンレギュレートする化合物、またはワイルドタイプのタンパク質の存在量を低減させる化合物とすることもできる。
【００４４】
本発明はまた、前記阻害剤の候補となり得る化合物のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を可能とする（上記に従っての）スクリーニング法もまた提供することは理解されるだろう。例えば、ＨＢＶ遺伝子にコードされるＨＢＶ−ＲＴポリペプチドとの結合の可能性については未知の阻害剤またはアンタゴニストの候補物質を、以下の様に試験することができる。すなわち前記ポリペプチドと結合することが知られているリガンドの結合可能条件下で、阻害剤またはアンタゴニストの候補物質と前記ポリペプチドとを接触させ、結合したあらゆるリガンドの存在を検出し、それにより前記アンタゴニストまたは阻害剤の候補物質が、前記ポリペプチドへのリガンドの結合を阻害するかどうかを決定する。
【００４５】
前記阻害剤またはアンタゴニストは化学的に合成または微生物学的に生成することができ、および/または例えば植物、動物、微生物からの細胞抽出物中にも含まれ得る。さらに前記化合物は当該技術分野で公知でもよいが、前記ポリペプチドを抑制または阻害できることについてはこれまでに知られていない。ＨＢＶ−ＲＴポリペプチドとの結合のできることについては知られていないアンタゴニストまたは阻害剤の候補物質を、ポリペプチドとの結合について試験することができる。同試験は、前記ポリペプチドと結合することが知られているリガンドの結合可能な条件下で、アンタゴニストまたは阻害剤の候補物質と前記ポリペプチドとを接触させ、結合しているあらゆるリガンドの存在を検出し、それにより前記アンタゴニストまたは阻害剤の候補物質が、上述のようにポリペプチドへのリガンドの結合を阻害するかどうか決定することを含む。
【００４６】
例えばポリペプチドと結合し、同ポリペプチドを阻害または妨害することのできるタンパク質を、酵母ツーハイブリッド法(Fields, Nature 340 (1989), 245-246)を用いて “捉える”ことができる。酵母ツーハイブリッド法を一部修正した方法がRoger Brentおよびその同僚により報告された (Gyuris, Cell 75 (1993), 791-803; Zervos, Cell 72 (1993, 223-232))。手短に言えば、ポリペプチドのドメインを結合する化合物のベイト（bait）として利用する。そして、以前に非常に詳細に報告されたように(Gyuris, supra; WO 95/31544)、陽性のものをロイシンを含まないプレート上で増殖能力によって選択し、その後Ｘ−ｇａｌを含むプレート上で青色に変色できるかどうかをさらに試験する。
【００４７】
阻害剤およびアンタゴニストを同定するために行うことのできるもう１つのアッセイは、次にそれらペプチドの妨害効果または阻害効果についてスクリーニングすることのできるランダムなペプチドを合成するための、コンビナトリアル化学の使用を含む。
【００４８】
このような１つのアッセイが、バクテリオファージの表面で発現させたランダムなペプチドを用いて、最近行われた(Wu(1996), Nature Biotechnology 14, 429-431)。
当該技術分野で公知の、ポリペプチドの阻害剤およびアンタゴニストを迅速に同定するもう１つの方法は、ＢＩＡＣＯＲＥシステム(Pharmacia, スウェーデン)を使用するものである。
【００４９】
タンパク質−タンパク質間相互作用および阻害剤の同定に関するさらなるプロトコルは、例えばPhizicky and Fields(Microbiological reviews, 1995)に記述されている。本発明による阻害剤に関するこのようなスクリーニング法は、鋳型ＲＮＡ，プライマー（例えばオリゴｄＴ）、ｄＮＴＰｓ、放射性標識ｄＵＴＰ、または鋳型ＲＮＡ，プライマー（例えばオリゴｄＴ）、ｄＮＴＰｓ、ビオチン化ｄＵＴＰ、マーカー酵素（例えばストレプトアビジンをカップルさせたペルオキシダーゼ）、マーカー酵素の基質（例えばＡＥＢＴＳ）を使用することができ（ただしこれらに限定されない）、翻訳されたタンパク質に結合してその活性を阻害または拮抗することのできる化合物を同定するために、阻害剤もしくはアンタゴニストの候補物質、または阻害剤もしくはアンタゴニストの多数の推定物質を含むことができる。
【００５０】
本発明の方法の好ましい態様において、ステップ（ｂ）のアッセイは読み取り(readout)システムにより達成される。
“読み取りシステム”という用語は本発明に伴う内容において、例えば酵素に誘導される変化によりモニターすることのできる、あらゆる基質を意味する。このような読み取りシステムは当該技術分野の技術者に公知であり、放射性アッセイまたは非放射性のアッセイを含む。本発明に従っての検出法は、比色変化、生物発光、蛍光発光、燐光または放射性標識による検出可能なシグナルの測定を含む。したがってシンチレーション計数器、分光光度計またはマイクロタイタープレート（ＥＬＩＳＡ）リーダーを適宜利用する。
【００５１】
このような“読み取りシステム”および定量システムは、放射性標識ヌクレオチド、ジゴキシゲニンまたはビオチン標識ヌクレオチドを組み込んでＤＮＡを合成する、ＨＢＶ逆転写酵素活性の能力を利用することができる。例えばRoche（スイス）より購入可能なＲＴアッセイでは、ビオチン標識ＤＮＡをストレプトアビジンでコートしたマイクロタイタープレート表面に結合させる。次にペルオキシダーゼに結合させたジゴキシゲニンの抗体を加え、ジゴキシゲニン標識ヌクレオチドに結合させる。最後のステップで、ペルオキシダーゼの基質を加える。ペルオキシダーゼ酵素は基質の切断を触媒し、着色した反応生成物を生成する。サンプルの吸収をマイクロタイタープレート（ＥＬＩＳＡ）リーダーにて決定し、サンプル中のＲＴ活性レベルに直接相関させる。
【００５２】
特に好ましい態様において、前記読み取りシステムは実施例４に記載したように非放射性を基本としたアッセイである。
さらに好ましい態様において、ステップ（ｂ）のアッセイは定性的または定量的である。
【００５３】
本発明のさらなる好ましい態様において、潜在的阻害剤は植物の産物または植物由来の産物である。
本発明の内容において植物の産物または植物由来の産物は、潜在的にＨＢＶ−ＲＴの阻害活性を有する前記植物の水性、アルコール性または親油性の抽出物を含む。適切な抽出、蒸留、析出、濾過および/またはクロマトグラフィーの方法は、当該技術分野の技術者に公知である。
【００５４】
本発明の特に好ましい態様において前記植物はフィランタス (Phyllantus)である。
本発明に従ってフィランタスはキダチコミカンソウ(Phyllantus amarus)、チャンカビエドラ(Phyllantus niruri)、マムラ(Phyllantus emblica)、コミカンソウ(Phyllantus urinaria)、Phyllantus myrtifolius Moon、Phyllantus maderas pratensisおよびヒメミカンソウ(Phyllantus ussuriensis)から成るフィランタス属のメンバーから選択される。
【００５５】
さらなる特に好ましい態様において、前記フィランタスはキダチコミカンソウである。
本発明に従ってフィランタスの葉、樹皮、花、種子、果実、茎、枝、幹、根および/または木質部、好ましくは草木部、すなわち植物の地上部分のすべてを使用することができる。さらにフィランタスを粉末の形および/またはそのままの形で、すなわち葉全体として、顆粒、粉末、析出物、抽出物、乾燥した抽出物および/または滲出液として、好ましい複数の抽出物または乾燥させた抽出物と共に使用することができる。
【００５６】
加えて本発明は、本発明の方法により同定された阻害剤を改良する方法に関し、その方法は（ａ）ペプチドミメティクスによる前記阻害剤のモデル化、および（ｂ）モデル化した阻害剤の化学的合成、を含む。ペプチドミメティクスによるモデル化の最も適切な出発点は、ＨＢＶ−ＲＴの阻害について異なる長さおよび異なる配列のペプチドライブラリーを試験することである。
【００５７】
本発明はさらに本発明の方法により同定された阻害剤をリード化合物として修飾する方法であって、以下の項目：（ｉ）修飾された作用部位、活性スペクトル、器官特異性；および/または（ｉｉ）改善された効果；および/または（ｉｉｉ）低減された毒性（治療指標の改善）；および/または（ｉｖ）低減された副作用；および/または（ｖ）修飾された治療作用の発現、効果の持続時間；および/または（ｖｉ）修飾された薬物動態学的パラメータ（吸収、分散、代謝および排泄）；および/または（ｖｉｉ）修飾された生理化学的パラメータ（溶解度、吸湿性、色、味、におい、安定性、状態）；および/または（ｖｉｉｉ）改善された一般的特異性、器官/組織特異性；および/または（ｉｘ）最適化された投与剤形および投与経路；を達成するために、（ｉ）カルボキシル基のエステル化、または（ｉｉ）ヒドロキシル基の炭素酸によるエステル化、または（ｉｉｉ）ヒドロキシル基の例えばリン酸エステル、ピロリン酸エステルまたは硫酸エステルまたはヘミコハク酸エステルへのエステル化、または（ｉｖ）医薬的に受容可能な塩の形成、または（ｖ）医薬的に受容可能な複合体の形成、または（ｖｉ）薬学的に活性なポリマーの合成、または（ｖｉｉ）親水性部分の導入、または（ｖｉｉｉ）芳香族上または側鎖上の置換基の導入/変換、置換基のパターンの変更、または（ｉｘ）等価性または生物学的等価性部分の導入による修飾、または（ｘ）相同化合物の合成、または（ｘｉ）分枝側鎖の導入、または（ｘｉｉ）アルキル置換基の環状類似体への変換、または（ｘｉｉｉ）ヒドロキシル基のケタール、アセタールへの誘導体化、または（ｘｉｖ）アミド、フェニルカルバメートへのＮ−アセチル化、または（ｘｖ）マンニッヒの塩基、イミンの合成、または（ｘｖｉ）ケトンまたはアルデヒドのシッフ塩基、オキシム、アセタール、ケタール、エノールエステル、オキサゾリジン、チオゾリジンへの転換、またはこれらの組み合わせ、により修飾する方法に関する。
【００５８】
上述の様々なステップは、当該技術分野において一般に知られている。これらのステップは、定量的構造活性相関（ＱＳＡＲ）分析(Kubinyi, 1993)、コンビナトリアル生化学、古典的化学およびその他の方法（例えばHolzgrabe and Bechtold, 2000を参照のこと）を含む、またはこれらにより行う。
【００５９】
さらに本発明は、スクリーニング法により同定された、または本明細書で上述したような方法により改良された阻害剤を、医薬的に受容可能な担体および/または希釈剤と共に製剤化するステップを含む、医薬組成物の製造法に関する。
【００６０】
“医薬組成物”という用語は本発明に従って使用する場合、少なくとも本明細書で先に同定されたような阻害剤、例えばタンパク質、前記タンパク質の抗原フラグメント、融合タンパク質、核酸分子、および/または上述のような抗体、および所望によりさらなる分子を、単独であるいは、例えば抗原のプロセシングを最適化できる分子、サイトカイン、免疫グロブリンまたはリンフォカイン、所望によりアジュバントと組み合わせ、のいずれかで含む。
【００６１】
本発明により同定された治療に有用な化合物を、その特定の化合物に適するあらゆる方法で、例えば経口、静脈内、非経口、経皮、粘膜から、または同化合物の効果が所望される部位もしくはその付近に（例えば固体または半固体の生物学的に適合し吸収されるマトリックスの形とした化合物を用いて）外科的もしくは移植により、患者に投与することができる。治療の用量は当該技術分野の技術者により適当に決定することができる。
【００６２】
医薬組成物はまた、所望の製剤に依存して、医薬的に受容可能な、通常殺菌した、非毒性の担体または希釈剤を含むが、これらは動物またはヒトに投与する医薬組成物の製剤化に一般に使用される賦形剤と定義される。希釈剤はその組み合わせの生物学的活性に影響を与えないように選択する。このような希釈剤の例として、蒸留水、生理食塩水、リンガー液、デキストロース液、およびハンクス液がある。加えて医薬組成物または製剤はまた、他の担体、アジュバント、または非毒性で、非治療性で、非免疫原性の安定剤等も含むことができる。治療上有効な用量は、症状または状態を改善する阻害剤の量をいう。このような化合物の治療効果および毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な医薬的手法により、例えばＥＤ５０（母集団の５０％において治療上有効な用量）およびＬＤ５０（母集団の５０％に致死的な用量）により決定することができる。治療効果および毒性効果間の用量比が治療係数であるが、ＬＤ５０/ＥＤ５０の比率として表わすことができる。
【００６３】
適切な医薬的担体のさらなる例は当該技術分野で公知であり、リン酸緩衝化生理食塩水、水、エマルジョン、例えば油/水エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、殺菌溶液等を含む。そのような担体を含む組成物は公知の従来の方法で製剤化することができる。これらの医薬組成物は適切な用量で被験者に投与することができる。適切な組成物の投与は上述のように行うことができる。投与計画は担当医師および臨床的因子により決定されることになる。医学分野で公知であるように、いずれの患者への投与も、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与する特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、全身の健康状態、および他の併用薬剤を含む多くの因子に依存する。一般に医薬組成物の正規の投与としての投与計画は、１μｇから１０ｍｇユニット/日の範囲とすべきである。投与計画が継続的な輸液の場合もまた、各々１μｇから１０ｍｇユニット/体重ｋｇ/分の範囲とすべきであろう。進行は周期的な評価によりモニターすることができる。
【００６４】
例えばポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、化合物の薬剤、プロドラッグまたは医薬的に受容可能なそれらの塩である阻害剤を含む組成物を、薬剤投与に従来より使用されているいずれの経路でも、例えば経口、局所、非経口、または吸気により適宜投与することができる。受容可能な塩は酢酸塩、メチルエステル、ＨＣｌ塩、硫酸塩、塩化物等を含む。薬剤は、従来の手法により標準的な医薬的担体と薬剤とを組み合わせて製造する従来の剤形で投与することができる。本発明に従って同定され、得られた薬剤およびプロドラッグはまた、治療上活性な公知の第２の化合物を組み合わせて、従来の投与法で投与することもできる。このような治療上活性な化合物は、例えば上述のものを含む。これらの手法は、所望の製剤に適当な成分の混合、顆粒化、および圧縮または溶解を含む。医薬的に受容可能な担体または希釈剤の形および特徴は、組み合わせる活性成分の量、投与経路およびその他の公知の変数により決定されることは理解されるだろう。（複数の）担体は製剤中の他の成分と共存でき、そのレシピエントに有害ではないという意味において、“受容可能” でなければならない。使用する医薬的担体は、例えば固体または液体のいずれでもよい。固体の担体の例には、ラクトース、石膏(terra alba)、スクロース、タルク、ゼラチン、アガー、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸等がある。液体の担体の例には、リン酸緩衝化生理食塩水、シロップ、オイル例えばピーナッツオイルおよびオリーブオイル、水、エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、殺菌した溶液等がある。同様に担体または希釈剤は、当該技術分野で公知の徐放性物質、例えばモノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルを、単独でまたはワックスと共に含むことができる。
【００６５】
広範な多様な医薬剤形を利用することができる。したがって固体の担体を使用する場合、製剤は錠剤化、粉末のハードゼラチンカプセルへの封入、ペレットの形またはトローチもしくはロゼンジの形とすることができる。固体の担体の量は広範囲に渡って変わるが、好ましくは約２５ｍｇから約１ｇである。液体の担体を使用する場合、製剤はシロップ、エマルジョン、ソフトゼラチンカプセル、殺菌した注射用液、例えばアンプルまたは非水溶性懸濁液の形をとることになる。
【００６６】
さらに本発明は、本発明の方法に従って製造されたＨＢＶ−ＲＴを用いて所望のｃＤＮＡを合成するin vitroの方法に関する。
最後に本発明は、キダチコミカンソウ抽出物/阻害剤の調整品のバッチ間の一貫性、および/または、それらの有効期限を評価する方法に関するが、この方法は、本発明に従って製造されたＨＢＶ−ＲＴを同バッチと接触させ、ＲＴ活性を評価することを含むものとする。前記バッチは凍結および解凍（４℃または室温（２２℃）で例えば１時間、２４時間、１ヶ月または６ヶ月間）のサイクルを繰り返す場合もそうでない場合も、−２０℃で保存することができる。試験は例えば以下の修飾を含む実施例４の記載のように行うことができる、すなわちＨＩＶ−ＲＴの代わりに、本発明の方法に従って製造されたＨＢＶ−ＲＴを逆転写酵素のアッセイに使用する。適用可能であれば内部標準を含めることができる。
【００６７】
実施例にて本発明を説明する：
【実施例】
【００６８】
実勢例１：大腸菌内でｈＨＢＶの逆転写酵素を発現するためのベクターの作成
ｐＱＥ３０ベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）で利用可能なＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素認識部位をクローニングに用いた。ＲＴはｐＵＣをベースとする鋳型からプライマーＯＮ−ｈＨＢＶ−ＲｃａＩ（ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＴ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＣＡＣ  ＴＴＣ  ＣＧＧ）およびＯＮ−ｈＨＢＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＴＴＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＣＡＡ  ＣＧＴ  ＧＣ）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物は制限酵素ＲｃａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＱＥ３０（Ｎ末端  ６×Ｈｉｓタグ）内にクローニングした。
【００６９】
ｐＢＡＤベクター(Invitrogen, Groningen,オランダ)へのＲＴのクローニングには、制限酵素認識部位ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩを使用した。ＲＴはプライマーＯＮ−ｈＨＢＶ−ＲｃａＩ（ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＡＴＧ  ＡＣＣ  ＣＴＡ  ＴＣＴ  ＴＡＴ  ＣＡＡ  ＣＡＣ    ＴＴＣ  ＣＧＧ）およびＯＮ−ＲＴ３−ｎｅｗ（ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＣＧＡ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＣＡＡ  ＣＧ）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物を制限酵素ＲｃａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、ｐＢＡＤ（Ｃ末端  ６×Ｈｉｓタグ）内にクローニングした。
【００７０】
ｐＩＶＥＸ２．４ｂ (Roche, Basel, CH)へのＲＴのクローニングには、制限酵素認識部位ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩを使用した。ＲＴはプライマーＯＮ−ＲＴ１−ｎｅｗ（ＧＡＴ   ＣＣＡ ＴＡＴ ＧＣＣ ＣＣＴ ＡＴＣ ＴＴＡ  ＴＣＡ ＡＣＡ ＣＴＴ  ＣＣＧ Ｇ）およびＯＮ−ＲＴ２−ｎｅｗ（ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＣＧＡ  ＧＴＣ  ＡＴＣ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＡＴＧ  ＣＡＡ  ＣＧ）を用いて増幅した。ＰＣＲ産物は制限酵素認識部位ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩにて切断し、ｐＩＶＥＸ２．４ｂ（Ｎ末端  ６×Ｈｉｓタグ）内に組み込んだ。同じＰＣＲ産物を用いて、ｈＨＢＶ−ＲＴをｐＩＶＥＸ２．２ｂ（ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ）内にも組み込んだ。
【００７１】
酵素はRoche(Basel, CH)より購入した。
結果は以下の作成物のクローニングに成功したことを示す：
−Ｎ末端にストレプトアビジン−タグをもつ、in vitro実験用のｐＩＶＥＸ−Ｔ７システム内にクローニングしたｈＨＢＶ由来のＲＴ
−Ｎ末端にＨｉｓタグをもつｐＩＶＥＸ−Ｔ７システム内にクローニングしたｈＨＢＶ由来のＲＴ
−Ｎ末端にＨｉｓタグをもつｐＱＥ−Ｔ５システムにおけるｈＨＢＶ由来のＲＴ
−Ｃ末端にＨｉｓタグをもつｐＢＡＤシステムにおけるｈＨＢＶ由来のＲＴ
実施例２：大腸菌内で発現させたｈＨＢＶ−ＲＴの検出（ウェスタンブロット）
ｐＩＶＥＸ２．４ｂ：：ＲＴおよびｐＢＡＤ：：ＲＴ発現構築物を大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３およびＴＯＰ１０内で各々増殖させ、発現させた。組み換えｈＨＢＶ−ＲＴの検出には３種類の異なるモノクローナル抗体の混合物を使用した。
【００７２】
大腸菌細胞内でのＲＴの発現はＯ．Ｄ．〜０．７で誘導した。Ｍ１５  ｐＲＥＰ４細胞は１ｍＭ  ＩＰＴＧで、ＴＯＰ１０細胞は０．１％アラビノースで誘導した。
誘導後ｔ＝０時間、１時間、２時間、３時間、４時間および５時間の時点でサンプル採取した。全細胞のサンプルをＳＤＳ−Ｐａｇｅ（１０％ポリアクリルアミド）で分離した。最後にゲルをブロットし、αＲＴ抗体を用いてＲＴを検出した。
【００７３】
ｐＢＡＤ、ｐＩＶＥＸおよびｐＱＥ３０：：ｈｓ８２をネガティブコントロールとして使用した。増殖および発現にはＬＢ培地をそのまま使用した。
実施例３：ｈＨＢＶ−ＲＴのアフェニティークロマトグラフィーによる精製
大腸菌細胞からの精製：
ｐＱＥ３０：：ＲＴ（Ｎ末端  Ｈｉｓタグ）株の精製に、ＮｉＮＴＡマトリックス(Qiagen, Hilden, ドイツ)を以下のバッファーにて使用した：
溶菌バッファー（１００ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ８，３００ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭイミダゾール）；
洗浄バッファー（１００ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ８，３００ｍＭ  ＫＣｌ，２０ｍＭイミダゾール）；
溶出バッファー（１００ｍＭ  ＮａＰＯ４  ｐＨ８，３００ｍＭ  ＫＣｌ，５ｍＭイミダゾール）
封入体の調製および続いての精製には８Ｍ尿素を上記バッファーに加えた。
【００７４】
大腸菌Ｍ１５  ｐＲＥＰでの発現には１ｍＭ  ＩＰＴＧによりＯ．Ｄ．〜０．６で細胞を誘導した。次に誘導後５時間で細胞を集め、溶菌バッファー中で溶菌し（超音波処理、French Press）、溶菌液を遠心した（Beckman ＪＡ２５．５０、１９０００ｒｐｍ、６０分、４℃）。
【００７５】
上清をＮｉＮＴＡカラムにかけた。細胞溶菌液の分画、洗浄分画および溶出分画をＳＤＳ−Ｐａｇｅ（１０％ポリアクリルアミド）で分離し、続いてニトロセルロース膜にブロットした。
【００７６】
超音波処理した細胞の遠心後に得られた細胞ペレットからのタンパク質を、８Ｍ尿素を加えた溶菌バッファーで抽出した。可溶性の分画をＮｉＮＴＡカラムにかけた。細胞ペレットの分画、洗浄分画および溶出分画を、細胞質の分画で記述したように処理した（ＲＴの存在に関する、細胞膜の分画および封入体の試験）。
【００７７】
in vitro 転写−翻訳システムからの精製：
in vitroの転写および翻訳反応は、適当なＲＴＳキットを用いてＲＴＳ５００システム(Roche)にて製造元の説明書に従って行った。すべての反応は３０℃、撹拌速度１２０ｒｐｍ、２４時間で行った。
【００７８】
精製前にin vitroの転写および翻訳反応から得られたすべてのサンプルを１８，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、アグリゲートを除去した。さらに分析するためペレットを保存した。Ｓｔｒｅｐタグを付加したＲＴの場合、サンプルを平衡バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ/ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）で予め平衡状態にしておいた０．６ｍｌのStrep Tactine セルロースカラムにかけ、重力により流出させた。カラムを６ｍｌの平衡バッファーで洗浄し、ＲＴを５ｍｌの溶出バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ/ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５ｍＭデスチオビオチン、ｐＨ８．０）で溶出した。全過程より１ｍｌのサンプルを採取した。カラムは再使用するため１０ｍｌの再生バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ/ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＨＡＢＡ、ｐＨ８．０）で再生した。Ｈｉｓタグを付加したＲＴ  ＲＴＳサンプルをＮｉ−ＮＴＡ平衡バッファー（１００ｍＭ  ＮａＨＰＯ４，３００ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）で１：１０に希釈した後、１ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ−superflow (Qiagen)カラムに、１ｍｌ/分の連続フローでかけた。カラムを５ｍｌの同バッファーおよび５ｍｌの洗浄バッファー（１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ６．８）で洗浄した。５ｍｌの溶出バッファー（１００ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭ  イミダゾール、ｐＨ７．５）でＣＳを溶出させた。全過程より１ｍｌのサンプルを得た。サンプルはさらにＳＤＳ−ＲＡＧＥにより分析した。
【００７９】
まとめると、大腸菌細胞またはin-vitro翻訳システムを用いてＲＴを発現および精製することができる。
実施例４：逆転写酵素活性のアッセイおよびＣＭＩ１１１による阻害
ＲＴ活性を試験するRetroTech ＲＴＡ（逆転写アッセイ）キット（Unterschlerssheim, ドイツ）。大腸菌のＲＴ発現培養からのサンプルを製造元の説明書に従って分析した。
【００８０】
ｐＱＥ３０：：ＲＴを導入した大腸菌Ｍ１５  ｐＲＥＰ４およびｐＢＡＤ：：ＲＴを導入した大腸菌ＴＯＰ１０の溶菌液を試験した。ｐＱＥ３０：：ｈｓｐ８２を導入したＭ１５  ｐＲＥＰ４を、内在する大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ活性のネガティブコントロールとして使用した。
【００８１】
キットに同封のＨＩＶ−ＲＴを、ＲＴ活性のポジティブコントロールおよびスタンダードとして利用した。
相応する活性のアッセイの結果を図４に示した。組み換えＲＴを発現するｐＱＥ３０：：ＲＴを導入した大腸菌Ｍ１５  ｐＲＥＰ４およびｐＢＡＤ：：ＲＴを導入した大腸菌ＴＯＰ１０の溶菌液は、ＲＴＡアッセイで明確な活性を示した。
【００８２】
大腸菌Ｍ１５  ｐＲＥＰ４およびＴＯＰ１０で発現させたｈＨＢＶ−ＲＴの活性は、各々ＩＰＴＧおよびアラビノースによる誘導後、１時間で顕著に増加した。誘導後３時間でのＲＴ活性は、誘導後１時間で測定された活性に比してわずかしか増加しなかった。
【００８３】
溶菌液への阻害剤ＣＭＩ１１１（０．１４ｍｇ/ｍｌ）の添加により、本来の活性の５％未満までＲＴ活性が低減した（図４）。
図５にＲＴアッセイの第２のセットの比較をまとめる。大腸菌溶菌液のＲＴ活性について試験した。ｐＱＥ３０：：ｈｓｐ８２を導入したＭ１５  ｐＲＥＰ４をネガティブコントロールとして使用した。ＲＴを組み換え発現していない溶菌液が微量のＲＴ活性を示した。この基礎活性は大腸菌に内在する、ＲＮＡ鋳型上にＤＮＡ鎖を合成することができるＤＮＡポリメラーゼによるものである。このバックグラウンドの活性は、組み換えＲＴを発現する細胞の溶菌液のＲＴ活性の約３％から１０％である。異なる濃度のＲＴ阻害剤ＣＭＩ１１１を加えると、組み換え発現させたｈＨＢＶ−ＲＴへの阻害が添加量に依存して観察された。
【００８４】
本明細書に提示した結果は、ｈＨＢＶから組み換え発現させたＲＴ、またはin-vitro転写/翻訳システムを用いて発現させたＲＴが、ＲＴ活性のアッセイ（Retro-Tech）において機能を有することを示す。さらに阻害剤ＣＭＩ１１１がＲＴ活性を９５％以上まで阻害することが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、大腸菌で発現させたｈＨＢＶ−ＲＴの検出（ウェスタンブロット）を示す図である。  図は大腸菌におけるｈＨＢ  ＲＴの発現動態を示す。ｐＢＡＤ発現システムを使用した場合、１ｍＭ  ＩＰＴＧによる誘導後１時間でＲＴタンパク質を検出することができた。ＲＴのバンド（約９５ｋＤａ）以外に、ＲＴのタンパク質分解によるフラグメントも視覚化することができた（図１Ａ）。ＲＴおよびそのタンパク質分解によるフラグメントは可溶性分画に認められた。ペレットの分画（封入体）はＲＴを含んでいなかった（データは示さない）。天然型のＲＴの最大量は誘導後約２時間で現れた。タンパク質分解によるＲＴフラグメント（約５０ｋＤａのバンド）の量が誘導後５時間でもなお増加しているのに対して、誘導後３時間で天然型のＲＴの量は減少した。
【００８６】
ｐＩＶＥＸ発現システムを含む大腸菌細胞において（図１Ｂ）、天然型のＲＴが誘導前に既に低レベルで発現している。ｐＢＡＤ発現システムとは反対にｐＩＶＥＸ発現システムは厳密には抑制されない。天然型のＲＴの最大量は誘導後約３から４時間で観察された。
【００８７】
ネガティブコントロールとして（１）ｐＱＥ：：ｈｓｐ８２ベクターを導入したＭ１５ｐＲＥＰ４細胞、（２）ｐＩＶＥＸを含むＢＬ２１ＤＥ３細胞、（３）ｐＱＥ３０：：ｈｓｐ８２ベクターを導入したＭ１５ｐＲＥＰ４細胞を使用した。ＩＰＴＧまたはアラビノーズにより誘導したこれら細胞の溶菌液を、ＳＤＳ−Ｐａｇｅで分離した後、ブロットした。９７ｋＤａの範囲にバンドは検出されなかった（データは示さない）。このことはプラスミドｐＩＶＥＸ：：ＲＴおよびｐＢＡＤ：：ＲＴを含む細胞においてのみ、ｈＨＢＶ−ＲＴが発現したことを示す。
【００８８】
図１（Ａ）の１から８のレーンは以下の分画を含む：［１］から［７］：誘導前ｔ＝１時間、誘導時ｔ＝０、および誘導後ｔ＝１時間、２時間、３時間、４時間および５時間の時点での細胞溶菌液；［８］ＬＭＶタンパク質スタンダード(Biorad)。
【００８９】
図１（Ｂ）の１から９のレーンは以下の分画を含む：［１］から［３］：誘導前ｔ＝４時間、３時間および１時間の時点での細胞溶菌液；［４］ＬＭＶタンパク質スタンダード(Biorad)；［５］から［９］：誘導時および誘導後１時間、２時間、３時間および４時間での細胞溶菌液。ブロットに使用したゲルは１０％ポリアクリルアミドを含むものとした。
【図２】図２は大腸菌溶菌液からのＲＴ精製物のウェスタンブロットを示す図である。αＲＴ抗体を使用して、細胞溶菌液および溶出分画中に逆転写酵素を検出することができた。洗浄分画には少量のＲＴしか含まれていなかった。天然型のＲＴのバンド（約９５ｋＤａ）以外にもタンパク質分解によるフラグメントが検出された。ペレットの分画にはＲＴは検出されなかった（データは示さない）。結果として、ｈＨＢＶ由来のＲＴを大腸菌中で発現させることに成功した。
【００９０】
レーン１から８は以下の分画を含む：
［１］：誘導後５時間の細胞溶菌液；［２］から［５］：洗浄分画；［６］ＬＭＶタンパク質スタンダード(Biorad)；［７］から［９］溶出分画。タンパク質はＳＤＳ−Ｐａｇｅ（１０％ポリアクリルアミド）により分離した。矢印は天然型のＲＴの位置を示す。
【図３】図３はin vitroの転写/翻訳システムを用いてＲＴを発現させるＴ７ベクターシステムによる、ｈＨＢＶ−ＲＴタンパク質サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【００９１】
レーン１：３０℃で２０時間発現させた後の反応；Ｎ末端にＨｉｓタグをもつＴ７発現プラスミド  １５μｇ；レーン２：３０℃で２０時間発現させた後の反応；Ｎ末端にＳｔｒｅｐタグをもつＴ７発現プラスミド  １５μｇ；レーン３：Ｈｉｓタグ精製プロトコルによりレーン１の反応から精製したＲＴ；レーン４：Ｓｔｒｅｐタグ精製プロトコルによりレーン２の反応から精製したＲＴ。
【図４】図４は、ＲＴ活性のアッセイを示す図である。組み換えＲＴを発現するｐＱＥ３０：：ＲＴを導入した大腸菌Ｍ１５  ｐＲＥＰ４およびｐＢＡＤ：：ＲＴを導入した大腸菌ＴＯＰ１０の溶菌液は、ＲＴＡアッセイにおいて著明な活性を示した。
【００９２】
大腸菌Ｍ１５  ｐＲＥＰ４およびＴＯＰ１０で発現させたｈＨＢＶ−ＲＴの活性は、各々ＩＰＴＧおよびアラビノースによる誘導後１時間で顕著に増加した。誘導後３時間ではＲＴ活性は、誘導後１時間で測定した活性に比してわずかしか増加していなかった。
【００９３】
溶菌液への阻害剤ＣＭＩ１１１（０．１４ｍｇ/ｍｌ）の添加により、ＲＴ活性は本来の活性の５％未満にまで低下した。
【図５】図５は、大腸菌溶菌液をＲＴ活性について試験した結果を示す図である。ｐＱＥ３０：：ｈｓｐ８２を導入した大腸菌Ｍ１５  ｐＲＥＰ４をネガティブコントロールとして使用した。ＲＴを組み換え発現していない溶菌液が微量のＲＴ活性を示した。この基礎活性は大腸菌に内在する、ＲＮＡ鋳型上にＤＮＡ鎖を合成することができるＤＮＡポリメラーゼによるものである。このバックグラウンドの活性は、組み換えＲＴを発現する細胞の溶菌液のＲＴ活性の約３％から１０％である。異なる濃度のＲＴ阻害剤ＣＭＩ１１１を加えると、組み換え発現させたｈＨＢＶ−ＲＴへの阻害が添加量に依存して観察された。組み換えＲＴは、ｐＢＡＤ：：ＲＴを導入した大腸菌ＴＯＰ１０およびｐＱＥ３０：：ＲＴを導入した大腸菌Ｍ１５  ｐＲＥＰ４で発現させた。縦軸は、ＲＴＡ（逆転写酵素アッセイ）における抽出物の相対的活性を示す。レーン１から４：大腸菌ＴＯＰ１０におけるｐＢＡＤ：：ＲＴ；［１］誘導前；［２］０．１％アラビノースによる誘導後１時間；［３］０．１％アラビノースによる誘導後２時間；［４Ａ］レーン３に０．３６ｍｇ/ｍｌ  ＣＭＩ１１１を添加；［４Ｂ］レーン３に０．０９ｍｇ/ｍｌ  ＣＭＩ１１１を添加；［４Ｃ］レーン３に０．０２２ｍｇ/ｍｌ  ＣＭＩ１１１を添加；［４Ｄ］レーン３に０．００６ｍｇ/ｍｌ  ＣＭＩ１１１を添加。レーン５：ｐＱＥ３０：：ｈｓｐ８２を導入した大腸菌Ｍ１５ｐＲＥＰ４。レーン６から９：ｐＱＥ３０：：ＲＴを導入した大腸菌Ｍ１５  ｐＲＥＰ４；［６］誘導前；［７］１ｍＭ  ＩＰＴＧによる誘導後１時間；［８］１ｍＭ  ＩＰＴＧによる誘導後２時間；［９Ａ］レーン８に０．３６ｍｇ/ｍｌ  ＣＭＩ１１１を添加。
【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004525645.tif 000045
【国際調査報告】
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