(57)【要約】改良された細胞キャリアグリッド（２０）。グリッド（２０）は、別個の場所の配列に個々の生体細胞を含みおよび保持することができ、孔（２６）の整列された配列（２４）を認識できる本体（２２）を含む。前記孔（２６）の各々が、個々の生体細胞の少なくとも一部を含むことができる。本発明のいくつかの実施形態によれば、前記孔（２６）に含まれる個々の細胞が、実質的に単一の局所面に残存し、それにより、収集されるデータの正確さが増す。本発明のいくつかの実施形態によれば、前記本体（２２）は、少なくとも部分的に生物学的活性材料（５８）で被覆される。本発明のいくつかの実施形態によれば、前記本体（２２）は、前記孔（２６）内に含まれる個々の細胞が、回収装置により回収可能であるように設計され組み立てられる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（ａ）から（ｃ）を含んでなり、予め定められた別個の場所の配列中に個々の生体細胞を含み保持することができる細胞キャリアグリッド：
（ａ）第１の外側面と第２の外側面を定め、前記第１の外側面と前記第２の外側面との間を各々が連通する貫通孔の整列された配列を有する本体、
（ｂ）孔の各々の位置が識別できて孔が予め定められた別個の場所の配列を形成するように前記孔を前記本体上に配置するために適用される組織化計画、
（ｃ）前記孔の各々が、個々の生体細胞の少なくとも一部をその中に含むような寸法にされ、各孔は、
（ｉ）前記個々の生体細胞の少なくとも一部が実質的損害を被ることなく第１の交差区域を通過することができるような寸法の、前記第１の外側面における前記第１の交差区域、
（ｉｉ）個々の生体細胞が第２の交差区域を通過できない寸法の、前記第１の外側面と第２の外側面との間の中間の水準における前記第２の交差区域、
（ｉｉｉ）前記個々の生体細胞の少なくとも一部が孔に含まれることができ前記個々の細胞がそこに保持されるような、前記第１の外側面と第２の交差区域の水準との間の高さ
を有し、
前記本体は、前記孔中に含まれる前記個々の細胞が分析中に実質的に単一の局所面に残存するように設計および組み立てられ、
前記孔中の前記個々の細胞から収集されたデータの正確さは、前記細胞が実質的に単一の局所面に残存することにより増加する。
【請求項２】
前記孔中に含まれる前記個々の細胞が分析中に実質的に単一の局所面に残存するように前記本体が本質的に剛直である、請求項１に記載の細胞キャリアグリッド。
【請求項３】
前記孔中に含まれる前記個々の細胞が分析中に実質的に単一の局所面に残存するように前記本体が少なくとも一つの支持体により支持されている、請求項１に記載の細胞キャリアグリッド。
【請求項４】
さらに下記（ｄ）を有する、請求項１に記載の細胞キャリアグリッド：
（ｄ）下記のように設計および組み立てられたホルダー：
（ｉ）細胞キャリアグリッドの操作を容易にする、
（ｉｉ）グリッドの前記第１の外側面に適用される懸濁液中の細胞が前記孔に向かってその中に移動するように、グリッド中の前記孔を通して吸引を適用する、
（ｉｉｉ）前記孔中に存在する細胞への溶液の適用および除去を許容する。
【請求項５】
下記（ａ）から（ｃ）を含んでなり、予め定められた別個の場所の配列中に個々の生体細胞を含み保持することができる細胞キャリアグリッド：
（ａ）第１の外側面と第２の外側面を定め、前記第１の外側面と前記第２の外側面との間を各々が連通する貫通孔の整列された配列を有する本体、
（ｂ）孔の各々の位置が識別できて孔が予め定められた別個の場所の配列を形成するように前記孔を前記本体上に配置するために適用される組織化計画、
（ｃ）前記孔の各々が、個々の生体細胞の少なくとも一部をその中に含むような寸法にされ、各孔は、
（ｉ）前記個々の生体細胞の少なくとも一部が実質的損害を被ることなく第１の交差区域を通過することができるような寸法の、前記第１の外側面における前記第１の交差区域、
（ｉｉ）第２の交差区域は前記第１の交差区域より寸法が大きくない、前記第１の外側面と第２の外側面との間の中間の水準における前記第２の交差区域、
（ｉｉｉ）前記個々の生体細胞の少なくとも一部が孔に含まれることができ前記個々の細胞がそこに保持されるような、前記第１の外側面と第２の交差区域の水準との間の高さ
を有し、
前記本体は、生物学的活性材料で少なくとも部分的に被覆されている。
【請求項６】
前記生物学的活性材料が、蛋白、炭水化物、核酸および脂質からなるグループより選択される少なくとも一つの材料を含む、請求項５に記載の細胞キャリアグリッド。
【請求項７】
前記蛋白が、抗体、抗原、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、酵素、配位子、受容体、分裂促進剤、ハプテン、多量体ＭＨＣ−抗原複合体およびレクチンからなるグループより選択される、請求項６に記載の細胞キャリアグリッド。
【請求項８】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの誘導体からなるグループより選択される、請求項６に記載の細胞キャリアグリッド。
【請求項９】
前記脂質が、リゾホスファチジルコリン（極性リン脂質）およびＯｘＬＤＬからなるグループより選択される、請求項６に記載の細胞キャリアグリッド。
【請求項１０】
前記孔の内部および前記孔への隣接からなるグループより選択される位置において前記本体を被覆するために前記生物学的活性材料が用いられる、請求項５に記載の細胞キャリアグリッド。
【請求項１１】
前記生物学的活性材料が少なくとも２つの別々の生物学的活性材料を含み、前記孔の一部に適用された前記少なくとも２つの材料の各々が予め定められた別個の場所の配列を有する、請求項５に記載の細胞キャリアグリッド。
【請求項１２】
さらに下記（ｄ）を有する、請求項５に記載の細胞キャリアグリッド：
（ｄ）下記のように設計および組み立てられたホルダー：
（ｉ）細胞キャリアグリッドの操作を容易にする、
（ｉｉ）グリッドの前記第１の外側面に適用される懸濁液中の細胞が前記孔に向かってその中に移動するように、グリッド中の前記孔を通して吸引を適用する、
（ｉｉｉ）前記孔中に存在する細胞への溶液の適用および除去を許容する。
【請求項１３】
下記（ａ）から（ｃ）を含んでなり、予め定められた別個の場所の配列中に個々の生体細胞を含み保持することができる細胞キャリアグリッド：
（ａ）第１の外側面と第２の外側面を定め、前記第１の外側面と前記第２の外側面との間を各々が連通する貫通孔の整列された配列を有する本体、
（ｂ）孔の各々の位置が識別できて孔が予め定められた別個の場所の配列を形成するように前記孔を前記本体上に配置するために適用される組織化計画、
（ｃ）前記孔の各々が、個々の生体細胞の少なくとも一部をその中に含むような寸法にされ、各孔は、
（ｉ）前記個々の生体細胞の少なくとも一部が実質的損害を被ることなく第１の交差区域を通過することができるような寸法の、前記第１の外側面における前記第１の交差区域、
（ｉｉ）前記第１の交差区域より寸法が大きくない、前記第１の外側面と第２の外側面との間の中間の水準における第２の交差区域、
（ｉｉｉ）前記個々の生体細胞の少なくとも一部が孔に含まれることができ前記個々の細胞がそこに保持されるような、前記第１の外側面と第２の交差区域の水準との間の高さ
を有し、
前記本体は、前記孔中に含まれる前記個々の細胞が回収装置により回収可能であるように設計され組み立てられている。
【請求項１４】
孔中に含まれる前記個々の生体細胞の少なくとも２０％が前記第１の外側面により定められる平面を超えて突出し、前記細胞を回収装置により回収可能にする、請求項１３に記載の細胞キャリアグリッド。
【請求項１５】
孔中に含まれる前記個々の生体細胞の少なくとも４０％が前記第１の外側面により定められる平面を超えて突出し、前記細胞を回収装置により回収可能にする、請求項１３に記載の細胞キャリアグリッド。
【請求項１６】
孔中に含まれる前記個々の生体細胞の少なくとも５０％が前記第１の外側面により定められる平面を超えて突出し、前記細胞を回収装置により回収可能にする、請求項１３に記載の細胞キャリアグリッド。
【請求項１７】
さらに下記（ｄ）を有する、請求項１３に記載の細胞キャリアグリッド：
（ｄ）下記のように設計および組み立てられたホルダー：
（ｉ）細胞キャリアグリッドの操作を容易にする、
（ｉｉ）グリッドの前記第１の外側面に適用される懸濁液中の細胞が前記孔に向かってその中に移動するように、グリッド中の前記孔を通して吸引を適用する、
（ｉｉｉ）前記孔中に存在する細胞への溶液の適用および除去を許容する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野及び背景）
本発明は、改良された細胞キャリアグリッドに関し、より詳細には、生物学的活性材料で被覆された細胞キャリアグリッド、および分析のための単一の局所面において細胞を保持するように設計および組み立てられた細胞キャリアグリッドに関する。本発明は、さらに、それについて行われた分析結果に基づいて個々の細胞を回収可能にする細胞キャリアグリッドに関する。
生物学的系の複雑な性質故に、標準的値と比較するために特異的サンプルについて分析を行うのが望ましいことが多い。例えば、同じ酵素についての標準的値と比較される特定患者からの肝臓酵素水準を用いて、糖尿病を診断することができる。
さらに、患者の症状を診断するために、特定の器官または組織から得た細胞を検査することが望ましい場合が多い。ある場合には、サンプルは、生理学的に混合された細胞の集団を含み得、その一部のみが分析される。この問題を克服するために、蛍光活性細胞選別機（ＦＡＣＳ）のような機械が一部設計された。しかしながら、ＦＡＣＳ機は、選別後に個々の細胞を再検査することができない。この制限は、個々の細胞の運動研究および、検査結果に基づく検査後の個々の細胞の回収の両方を排除してしまう。
【０００２】
従って、これらの問題のいくつかに対処するために、多くの従来技術の装置がウェインラウブら（Ｗｅｉｎｒａｕｂ ｅｔ ａｌ．）によって特許取得された（米国特許第４，７２９，９４９号；第５，２７２，０８１号；第５，３１０，６７４号；および第５，５０６，１４１号）。
米国特許第４，７２９，９４９号は、個々の生体細胞について分析を行うための方法および装置を教示している。この特許の教示によれば、細胞の各々が個々に検査および再検査されるように個々の細胞がグリッドの孔に押し込まれる。この特許の教示は、グリッド中での滞在およびその後の検査中に全ての細胞が単一の局所面に保持されることを確保するための手段を提供していない。その結果、この特許の教示の実施は、測定に不正確さを導入する。さらに、この特許により教示されるグリッドは生物学的に不活性である。
米国特許第５，３１０，６７４号は、細胞を寸法により２つの下位集団に分類することを理論的に可能とする２つの異なる寸法の孔の整列された配列を教示している点を除いて同様である。この特許の教示は、吸引を適用したときに何故大きな細胞が小さな穴に保持されないかを説明していない。
米国特許第５，２７２，０８１号は、米国特許第４，７２９，９４９号に教示されたタイプのグリッド中に存在する細胞の選択された下位群の同定および下位培地を教示している。従って、この特許の教示中には同じ固有の欠点が存在する。
米国特許第５，５０６，１４１号は、「孔のキャリア上の位置を確認することができる」という教示以外は米国特許第４，７２９，９４９号と類似している。
【０００３】
デューチュら（Ｄｅｕｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．）の米国特許第４，７７２，５４０号は、機械的な歪みに抵抗性のある硬質グリッドの製造方法を教示している。強度の増加にも拘わらず、デューチュの教示により製造されたグリッドは、単一の局所面には細胞を保持しない。
テイラー（Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．）に発行された米国特許第６，１０３，４７９号は、生物学的活性化合物への細胞の生理学的反応に関する細胞系スクリーニング用の装置を用いて、小さい細胞配列を生物学的活性化合物で被覆することを教示している。この特許の教示は、分析の正確さを増すために、単一の局所面に細胞を保持することを含まない。同様に、検査結果に基づく個々の細胞の分析およびその後の収集は、この特許では教示されていない。
アルトマンら（Ａｌｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．）に発行された米国特許第５，６３５，３６３号は、Ｔ細胞を用いて安定構造を形成するために、多量体ＭＨＣ−抗原複合体を用いることを教示している。この特許の教示は、特定のＴ細胞を標識、同定および分離可能にするために、個々のＴ細胞を結合したりその後に検査することを含まない。
このように、前記制限を含まない細胞キャリアグリッドに対する広く確認された要望があり、それを得ることが非常に有利である。
【０００４】
（発明の開示）
本発明の一つの態様によれば、予め定められた別個の場所の配列中に個々の生体細胞を含み保持することができる細胞キャリアグリッドが提供される。細胞キャリアグリッドは、（ａ）第１の外側面と第２の外側面を定め、第１の外側面と第２の外側面との間を各々が連通する貫通孔の整列された配列を有する本体、（ｂ）孔の各々の位置が識別できて孔が予め定められた別個の場所の配列を形成するように孔を本体上に配置するために適用される組織化計画を含む。孔の各々は、個々の生体細胞の少なくとも一部をその中に含むような寸法にされ、各孔は、（ｉ）個々の生体細胞の少なくとも一部が実質的損害を被ることなく第１の交差区域を通過することができるような寸法の、第１の外側面における第１の交差区域、（ｉｉ）個々の生体細胞が第２の交差区域を通過できない寸法の、第１の外側面と第２の外側面との間の中間の水準における第２の交差区域、（ｉｉｉ）個々の生体細胞の少なくとも一部が孔に含まれることができ個々の細胞がそこに保持されるような、第１の外側面と第２の交差区域の水準との間の高さ、を有する。本体は、孔中に含まれる個々の細胞が分析中に実質的に単一の局所面に残存するように設計および組み立てられ、孔中の個々の細胞から収集されたデータの正確さは、細胞が実質的に単一の局所面に残存することにより増加する。
【０００５】
本発明の別の態様は、下記の（ａ）から（ｃ）を含んでなり、予め定められた別個の場所の配列中に個々の生体細胞を含み保持することができる細胞キャリアグリッドが提供される：（ａ）第１の外側面と第２の外側面を定め、第１の外側面と第２の外側面との間を各々が連通する貫通孔の整列された配列を有する本体；（ｂ）孔の各々の位置が識別できて孔が予め定められた別個の場所の配列を形成するように孔を本体上に配置するために適用される組織化計画；（ｃ）孔の各々が、個々の生体細胞の少なくとも一部をその中に含むような寸法にされ、各孔は、（ｉ）個々の生体細胞の少なくとも一部が実質的損害を被ることなく第１の交差区域を通過することができるような寸法の、第１の外側面における第１の交差区域、（ｉｉ）第２の交差区域は第１の交差区域より寸法が大きくない、第１の外側面と第２の外側面との間の中間の水準における第２の交差区域、（ｉｉｉ）個々の生体細胞の少なくとも一部が孔に含まれることができ個々の細胞がそこに保持されるような、第１の外側面と第２の交差区域の水準との間の高さ、を有する。本体は、生物学的活性材料で少なくとも部分的に被覆されている。
【０００６】
本発明のさらに別の態様は、下記の（ａ）から（ｃ）を含んでなり、予め定められた別個の場所の配列中に個々の生体細胞を含み保持することができる細胞キャリアグリッドが提供される：（ａ）第１の外側面と第２の外側面を定め、第１の外側面と第２の外側面との間を各々が連通する貫通孔の整列された配列を有する本体、（ｂ）孔の各々の位置が識別できて孔が予め定められた別個の場所の配列を形成するように孔を本体上に配置するために適用される組織化計画、（ｃ）孔の各々が、個々の生体細胞の少なくとも一部をその中に含むような寸法にされ、各孔は、（ｉ）個々の生体細胞の少なくとも一部が実質的損害を被ることなく通過することができるような寸法の、第１の外側面における第１の交差区域、（ｉｉ）第１の交差区域より寸法が大きくない、第１の外側面と第２の外側面との間の中間の水準における第２の交差区域、（ｉｉｉ）個々の生体細胞の少なくとも一部が孔に含まれることができ個々の細胞がそこに保持されるような、第１の外側面と第２の交差区域の水準との間の高さ、を有する。本体は、孔中に含まれる個々の細胞が回収装置により回収可能であるように設計され組み立てられている。
【０００７】
以下に記載の本発明の好適な実施形態のさらなる特徴によれば、孔中に含まれる個々の細胞が分析中に実質的に単一の局所面に残存するように本体が本質的に剛直である。
請求項１に記載の細胞キャリアグリッドの好適な実施形態のさらなる特徴によれば、孔中に含まれる個々の細胞が分析中に実質的に単一の局所面に残存するように本体が少なくとも一つの支持体により支持されている。
ここに記載された好適な実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞キャリアグリッドはさらに、下記のように設計および組み立てられたホルダーを有する；（ｉ）細胞キャリアグリッドの操作を容易にする、（ｉｉ）グリッドの第１の外側面に適用される懸濁液中の細胞が孔に向かってその中に移動するように、グリッド中の孔を通して吸引を適用する、（ｉｉｉ）孔中に存在する細胞への溶液の適用および除去を許容する。
ここに記載された好適な実施形態におけるさらなる特徴によれば、生物学的活性材料が、蛋白、炭水化物、核酸および脂質からなるグループより選択される少なくとも一つの材料を含む。
【０００８】
ここに記載された好適な実施形態におけるさらなる特徴によれば、蛋白が、抗体、抗原、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、酵素、配位子、受容体、分裂促進剤、ハプテン、多量体ＭＨＣ−抗原複合体およびレクチンからなるグループより選択される。
ここに記載された好適な実施形態におけるさらなる特徴によれば、核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの誘導体からなるグループより選択される。
ここに記載された好適な実施形態におけるさらなる特徴によれば、脂質が、リゾホスファチジルコリン（極性リン脂質）およびＯｘＬＤＬからなるグループより選択される。
ここに記載された好適な実施形態におけるさらなる特徴によれば、孔の内部および孔への隣接からなるグループより選択される位置において本体を被覆するために生物学的活性材料が用いられる。
ここに記載された好適な実施形態におけるさらなる特徴によれば、生物学的活性材料が少なくとも２つの別々の生物学的活性材料を含み、孔の一部に適用された少なくとも２つの材料の各々が予め定められた別個の場所の配列を含む。
【０００９】
ここに記載された好適な実施形態におけるさらなる特徴によれば、孔中に含まれる個々の生体細胞の少なくとも２０％が第１の外側面により定められる平面を超えて突出し、細胞を回収装置により回収可能にする。
ここに記載された好適な実施形態におけるさらなる特徴によれば、孔中に含まれる個々の生体細胞の少なくとも４０％が第１の外側面により定められる平面を超えて突出し、細胞を回収装置により回収可能にする。
ここに記載された好適な実施形態におけるさらなる特徴によれば、孔中に含まれる個々の生体細胞の少なくとも５０％が第１の外側面により定められる平面を超えて突出し、細胞を回収装置により回収可能にする。
本発明は、生物学的活性材料で被覆された細胞キャリアグリッドおよび、分析用の単一の局所面に細胞を維持するように設計され組み立てられた細胞キャリアグリッドを提供することにより、現在知られている構成の欠点に首尾良く対処するものである。本発明は、さらに、それについて行われた分析結果に基づいて個々の細胞を回収可能にする細胞キャリアグリッドに関するものである。
【００１０】
（好適な実施形態の説明）
本発明を、添付の図面を参照にして、単なる例示としてここに説明する。図について詳しく言及すれば、ここに示される詳細は例示であり、本発明の好適な実施形態を説明する目的のものであり、最も有用であると考えられるものを提供するのものであり、本発明の原理および概念を容易に理解する説明である。この点において、本発明の基本的理解に必要である以上に詳細に発明の構造的詳細を説明しようとはせず、図面と説明により、当業者には、本発明のいくつかの形状が実施においてどのように具体化されるかが明白である。
本発明は、生物学的活性材料で被覆することができ、分析用の単一の局所面において細胞を保持するように設計され組み立てることができ、それについて行われた分析結果に基づいて個々の細胞を回収可能にする改良された細胞キャリアグリッドである。
具体的には、本発明は、検査前または検査中に細胞中の生物学的機能を調節して、細胞キャリアグリッド中に含まれる細胞に行われる検査の正確さを増すと共にそれについて行われた分析結果に基づいて個々の細胞を回収可能にするように用いることができる。
本発明の改良された細胞キャリアグリッドの原理よび操作は、図面およびそれに伴う説明を参照にしてより良く理解され得る。
本発明の少なくとも一つの実施形態を詳細に説明する前に、以下の説明および図面に示す構造および成分の配列の詳細に、本発明が限定されないことを理解されたい。本発明は、他の実施形態が可能であり、あるいは種々の方法で実行または実施することができる。また、ここで用いる表現および専門用語は説明のためであり限定的ではないことを理解されたい。
【００１１】
図１は、予め定められた別個の場所２６の配列２４に、個々の生体細胞を含み保持することができる細胞キャリアグリッド２０を示す。グリッド２０は、例えば、孔２６の１００×１００の二次元配列を含み得る。孔２６の各々は、例えば、直径がだいたい７μであり、約２０μ離れている。細胞キャリアグリッド２０は、第１の外側面と第２の外側面（２８および３０）を定める本体２２を含む。本体２２は、そこを貫通する孔２６の整列された配列２４を有する。孔２６の各々は、第１の外側面２８と第２の外側面３０との間を連通する。グリッド２０は、孔の各々の位置が識別できて孔が予め定められた別個の場所の配列２４を形成するように孔２６を本体上２２に配置するために適用される組織化計画（図３ａ−ｄ）も含む。孔２６の各々は、その中に個々の生体細胞の少なくとも一部を含むような寸法にされている（図２）。この目的で、各孔２６は、個々の生体細胞の少なくとも一部が実質的損害を被ることなく通過することができるような寸法の、第１の外側面２８における第１の交差区域３２を有する。孔２６の各々は、第１の外側面と第２の外側面（２８および３０）との間の中間の水準に第２の交差区域３４も有する。ある場合には、この第２の交差区域３４は、個々の生体細胞のそこを通過できないような寸法である。他の場合には、第２の交差区域３４は第１の交差区域３２に類似している。個々の生体細胞の少なくとも一部が孔中に含まれることができ個々の細胞がその中に保持されるように、第１の外側面２８と第２の交差区域３４の水準との間に高さ３６が定められる。本発明の好適な実施形態によれば、本体２２は、少なくとも部分的に孔２６中に含まれる個々の細胞が分析中に実質的に単一の局所面に残存するように設計および組み立てられている。これは、さらなる物理的強度をグリッド２０に与えることにより達成され、これは、使用中のグリッド２０への損傷を防止するのにも役立つ。その結果、孔２６中の個々の細胞から集められたデータの正確さが、従来技術の教示に比べて増加する。
【００１２】
単一の局所面に細胞を保持することは、例えば、本質的に剛直な材料の本体２２を構成することにより達成することができる。これを達成するために、１，０００：１のグリッドダイアグラムをコンピューターに入力する。このダイアグラムは、グリッド２０の孔２６の配列２４のマップである。次に、ダイアグラムを「逆転」し、コンピュータープログラムまたは写真により縮小される。これにより、グリッドの縮小された寸法のネガが製造される。さらなる寸法低下が、ネガを顕微鏡を通過して反対方向に投影することにより達成され、それにより、対象物の側面に所望の画像が受け止められる。この工程により、孔２６が所望の寸法（典型的には、数μ）である画像が得られる。このグリッドの画像は、対物レンズを通過して、写真乳剤で被覆された薄い金属紙（例えば、厚さ０．５ｍｍの銅紙）上に投影される。乳剤は、光に晒されたときにその構造を変える。典型的には、数百のグリッドが単一シート上に投影される。次に、金属紙が、順次、現像剤、固定剤および洗浄溶液中に浸される。これにより、グリッドの固定画像を有する金属紙が得られる。金属紙上に留まる、使用される現像剤は、非導電性である。次に、金属紙を、ニッケル、金または銀のような金属で電気めっきする。現像剤で覆われる領域は、電気を誘導しないので、このプロセスでは被覆されない。これにより、投影された金属画像が得られる。このプロセスは、以下に詳細に記載するように孔２６が所望の高さ３６を有するまで循環的に繰り返される。
各工程において、孔２６の各々に、より大きな直径の被覆が適用されると、円柱孔のかわりに円錐ウェルが製造される。直径を一定に維持すると、円柱孔が製造される。
【００１３】
従来技術のグリッドは典型的には非常に薄い。それらは、円形のグリッドキャリアに接着されるので、グリッドキャリアに緩衝液を適用すると、グリッドに大きな圧力がかかり、膨れる。この膨れが、グリッド上に載せられた細胞を、種々の局所面に残存させ、測定の不正確が生じる。膨れは、効果的に、プログラムされたマイクロマニピュレーターを用いる細胞の自動的回復を排除する。
本発明によれば、より厚い出発材料を用いて開始することにより膨れが防止される。別の方法として、またはそれに加えて、電気めっきプロセスを循環的に繰り返すことにより、より厚いグリッドを製造することができる。別の方法として、またはそれに加えて、分析中に実質的に単一の局所面において孔２６中に含まれる個々の細胞を保持するために、少なくとも一つの支持体４２（図５）により本体２２を支持することができる。支持体４２は、互いに交差し補強するように、２つ以上の方向に走る。支持体は、例えば、２つの垂直配列に組織化され、各配列の構成員は互いに並行である。また、別の方法として、支持体は、ホイールのスポークのように一点から外側に放射することができる。
【００１４】
本発明の好適な実施形態によれば、本体２２は、生物学的活性材料５８で少なくとも部分的に被覆される。生物学的活性材料５８は、孔２６中に、またはそれに近接して、例えば、第１の外側面２８に存在することができる。生物学的活性材料５８は、例えば、蛋白、炭水化物、核酸または脂質を含む。適当な蛋白には、抗体、抗原、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、酵素、配位子、受容体、分裂促進剤、ハプテン、多量体ＭＨＣ−抗原複合体およびレクチンを含むが、これらに限定されない。適当な核酸には、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない。適当な脂質には、リゾホスファチジルコリン（極性リン脂質）およびＯｘＬＤＬを含むが、これらに限定されない。ＯｘＬＤＬで予めインキュベーションすると、ＦＤＡで染色された細胞の蛍光が変化することが知られているザージル　Ｎ．ら（Ｎ．Ｚｕｒｇｉｌ ｅｔ ａｌ．）著、（１９９９年）、Ｃｌｉｎ．Ｃａｒｄｉｏｌ第２２巻：５２６０〜５３２頁）。従って、細胞キャリアグリッドの被覆は、近年進歩している動脈硬化を検査するこの技術に重要である。同様に、リゾホスファチジルコリンがリンパ球を活性化することが示された（ザージル　Ｎ．の非公開結果）。細胞キャリアグリッドをこの材料で被覆することが、動脈硬化を検査するこの技術にとって重要な進歩である。何故なら、従来技術を用いて達成されるよりも、高い局所的試薬濃度でマイクロ環境中に個々の細胞を導入するからである。さらに、被覆グリッドの供給は、被覆に用いられる材料と共に細胞をインキュベーションする必要性を覗くことにより、アッセイをより簡単に行うことができるようにする。これは、また、グリッド２０の使用者に必要な技術水準を低下させる。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、生物学的活性材料５８は、少なくとも２つの別々の生物学的活性材料を含み、少なくとも２つの材料の各々が、予め定められた別個の場所の配列２４中の孔２６の一部に適用される。図３ｃおよび３ｄは、孔２６中の生物学的活性材料１、２および３の２つの可能な配列を示す。各生物学的活性材料が材料の組み合わせを含み得ることに注目すべきである。例えば、３は１と２との組み合わせを表す。そのような実施形態により、異なる被覆材料間の相乗効果を迅速かつ容易に発見することができる。０は、生物学的活性材料を含まない孔を表す。そのような孔は、典型的には、検査のためのベースラインまたは陰性対照読み取りを提供する。これにより、単一のグリッド２０上で２つ以上の生物学的活性材料を同時に検査することができ、従来技術の方法では不可能であった。
【００１６】
本発明の好適な実施形態によれば、孔２６中に含まれる個々の細胞が回収装置により回収できるように、本体２２が設計かつ組み立てられる。これは、例えば、高さ３６を、孔２６に含まれる細胞の平均半径より小さくすることにより達成される。本発明の好適な実施形態によれば、孔中に含まれる個々の生体細胞の少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、最も好ましくは５０％が、本体２２の第１の外側面２８により定められる面を超えて突出し、細胞を回収装置により回収可能にする。表１は、研究目的の細胞型についての計算されたウェルの深さを示す。
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本発明の好適な実施形態によれば、細胞キャリアグリッド２０は、さらに、細胞キャリアグリッド２０の操作を容易にするように設計され組み立てられたホルダー４４（図４）を含む。ホルダー４４は、さらに、グリッド２０の第１の外側面２８に適用される懸濁液中の細胞が、孔２６の方向に移動して孔に入る傾向があるように、グリッドの孔を通して吸引を適用する。ホルダー４４は、さらに、孔２６中に存在する細胞の溶液の適用および除去を可能にする。ホルダー４４は、第一の入り口５０および第二の入り口５２を含み、各々が、グリッド２０の第２の外側面３０と接触する空間４８と連通する。入り口５０および５２は、空間４８への液体の導入および除去に役立ち、そこを通過する相対的流速率が、グリッド２０の孔２６を通る吸引を形成する。
【００１７】
本発明のさらなる目的、利点および新規特徴は、限定を意図していない以下の実施例を実験したときに当業者に明らかとなる。さらに、以下に線図で示し以下の請求項に記載する本発明の種々の実施形態および態様の各々が、以下の実施例において実験的に支持される。本発明を特定の実施形態について説明したが、添付の請求項の精神および広い範囲に含まれる多くの別法、修正および変更が当業者には明らかであることが明確である。
この明細書に述べられた全ての公報、特許および特許出願が、個々の公報、特許または特許出願が特異的かつ個々に、ここで参考のために組み込まれるように、同じ程度で、その全体が参考のためにこの明細書に組み込まれる。さらに、この出願中のいかなる参考文献の引用または検証も、本発明への従来技術として利用されるとは見なされない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明による細胞キャリアグリッドの斜視図である。
【図２】
孔の別の実施形態を示す本発明の細胞キャリアグリッドの断面図である。
【図３】
ａおよびｂは、本発明による細胞キャリアグリッドにおける孔の配列の２つの可能の配列を示す図、ｃおよびｄは、異なる孔を異なる生物学的活性材料で被覆し、一部の孔は被覆されないままである２つの可能な方法を示す図である。
【図４】
本発明による細胞キャリアグリッドを含む細胞キャリアグリッドホルダーの断面図である。
【図５】
グリッド用の支持体が見える図４におけるような細胞キャリアグリッドホルダーの断面図である。
【符号の説明】
２０　細胞キャリアグリッド、２２　本体、２４　配列、２６　孔（予め定められた別個の場所）、２８　第１の外側面、３０　第２の外側面、３２　第１の交差区域、３４　第２の交差区域、３６　高さ、４２　支持体、４４　ホルダー、４８　（グリッドの第２の外側面と接触する）空間、５０　第一の入り口、５２　第二の入り口、５６　孔、５８　生物学的活性材料
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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