(57)【要約】本発明は細胞外マトリックスとしての電気処理されたフィブリンの形成および使用、ならびに細胞と合わせた改変された組織形成での利用を目的としている。改変された組織はレシピエント内に移植され得る特異的臓器または組織の合成製造を包含し得る。電気処理されたフィブリンはまた、電気処理されたフィブリンの適用または移植部位への分子を運搬する目的で、その他分子と組み合わせてもよい。フィブリンまたはフィブリン／細胞懸濁液は基体上に電着されて、組織および臓器を形成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
電気処理されたフィブリン。
【請求項２】
マトリックス内にある請求項１記載の電気処理されたフィブリン。
【請求項３】
さらに細胞を含む、請求項２記載の電気処理されたフィブリンマトリックス。
【請求項４】
さらに成長因子、分化誘導体、酸化防止剤、ビタミン、ホルモン、核酸、薬物、ペプチド、核酸、皮膚軟化剤、湿潤剤、コンディショナーまたは化粧品を含む、請求項２記載の電気処理されたフィブリンマトリックス。
【請求項５】
請求項２記載の電気処理されたフィブリンマトリックスおよび細胞を含む改変された組織。
【請求項６】
細胞が幹細胞または分化した細胞である、請求項５記載の改変された組織。
【請求項７】
止血、または物質運搬を目的とする、前記請求項のいずれか一項に記載の電気処理されたフィブリンまたはフィブリンマトリックスの創傷ドレッシングとしての改変された組織内での使用。
【請求項８】
物質に対する前記細胞の生物学的反応を評価することを目的とする、請求項３記載の電気処理されたフィブリンマトリックスの使用。
【請求項９】
フィブリンまたはフィブリンを形成できる分子を含む１またはそれ以上の帯電溶液を接地標的基体上に、前記基体上へフィブリンを電着するのに有効な条件で電着させることを含む、請求項１記載の電気処理されたフィブリンの製造方法。
【請求項１０】
フィブリンまたはフィブリンを形成できる分子を含む１またはそれ以上の帯電溶液を接地標的基体上に、前記基体上へフィブリンを電着して電気処理されたフィブリン含有細胞外マトリックスを形成するのに有効な条件で電着させること；を含む、請求項２記載の電気処理されたフィブリンマトリックスの製造方法。
【請求項１１】
電気処理されたフィブリンまたはフィブリンを形成できる分子、および細胞を含む１またはそれ以上の帯電溶液を接地標的基体上に、該基体上への前記電気処理されたフィブリンおよび前記細胞の電着に有効な条件で電着することを含む、請求項５記載の改変された組織の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、電気処理されたフィブリンを製造および使用する新規の方法に関する。発明は様々な機能に関する細胞外マトリックスとしての電気処理されたフィブリンの使用を包含する。さらに発明は、電気処理されたフィブリンと細胞とを一つに組み合わせ改変された組織を形成することを包含する。この改変された組織は特定臓器または「臓器様」組織の合成製造も包含し得る。
【０００２】
［発明の背景］
フィブリンは天然の凝固剤である。それゆえにフィブリンおよびフィブリン誘導体は止血用途に一般的に使用されている。類似の用途および各種強化添加物と組み合わせての使用が知られており、十分立証されている。
【０００３】
別の分野では、損失または損傷した臓器機能を持つ患者の組織または臓器の移植が、いくつかの重大な問題によって妨げられている。第一は、移植組織または移植臓器の供給源が一般には生存中の親族ドナーまたは死体ドナーであることである。これら供給源は共にその数が限られており、レシピエントが病原性ウイルスに曝されるリスクを有している。第二は、移植組織または臓器の供給源が（生存一卵性双子ドナーの場合を除き）レシピエントと遺伝的に異なっているため、臓器拒絶および移植片対宿主疾患が問題になることである。これら問題は共に免疫抑制により治療できるが、それが重大な副作用を引き起こし、患者の感染リスクを大きく増加させることがある。
【０００４】
さらに別の分野では、新たに登場した遺伝子移入に関連した技術は、インビボで実施された場合危険な場合がある。言い換えれば、インビボ遺伝子移入はレシピエントを各種ウイルス合併症の危険に曝す可能性がある。さらに既知の遺伝子治療には限界があり、例えば第ＶＩＩＩ因子（抗血友病因子）の遺伝子のような大型遺伝子を受け取るのに十分な大きさを持つウイルスコートを遺伝子工学的に作製することに関し限界がある。
【０００５】
別の研究分野では、癌患者に関する化学療法の科学は、少なくとも一定レベルに関しては、患者癌細胞との闘いについて各種治療に推定された効果に基づいている。インビボまたはインビトロでの化学療法に対する患者癌細胞の反応を特定する効果的な方法は存在しない。
【０００６】
止血、ドラッグデリバリー、その他物質の運搬、皮膚修復、創傷治療、組織工学およびその他各種用途に使用できる能力を備えたフィブリンの新規製造法が必要とされている。
【０００７】
［発明の概要］
本発明は、電気処理されたフィブリンおよび電気処理されたフィブリンマトリックス、電気処理されたフィブリンおよびフィブリンマトリックスの製造方法、および電気処理されたフィブリンおよびフィブリンマトリックスの広範な用途での使用方法を提供することにより上記限界を克服する。
【０００８】
本発明の電気処理されたフィブリンにはいくつかの利用法がある。用途の一つでは、電気処理されたフィブリンは細胞外マトリックスとして用いられる。電気処理されたフィブリンは他の天然または非天然繊維と、ならびに細胞とも組み合わされ得る。組織および臓器移植の分野では、細胞とフィブリンを含むがこれに限定されない電気処理されたフィブリンの使用は、潜在的感染および拒絶の問題を克服できる。遺伝子移入の分野では細胞操作をインビトロで行うことができるが、この場合には培養され、電気処理されたフィブリンを含む細胞外マトリックス内に挿入される細胞をより簡便に操作し、試験することができるだろう。創傷治療の分野では、電気処理されたフィブリンのシートは、例えば非自己性の電気処理されたフィブリンを傷害部位または慢性潰瘍に用いて血友病患者の出血を抑制するように、出血抑制に利用できる。細胞と共に移植された電気処理されたフィブリン細胞外マトリックスは薬物またはその他試験物質に対する細胞の反応性を試験するのに使用できるだろう。化学療法の分野では、患者の腫瘍細胞と共に移植された電気処理されたフィブリン細胞外マトリックスは、代替化学療法による治療に対するこれら細胞の感受性をインビトロで同定するのに使用できるだろう。上記各代替法はより安全且つより予測的な医療をもたらすことができるだろう。
【０００９】
本発明は電気処理されたフィブリンマトリックスを含む、細胞増殖を促進する細胞外マトリックスを提供する。フィブリンは電気紡糸（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ：電界紡糸）フィブリン繊維または電気エアロゾル（ｅｌｅｃｔｒｏａｅｒｏｓｏｌ）フィブリン滴に形成できる。電気処理されたフィブリンはまた、フィブリンを形成できる分子を用いて作ることもできる。フィブリノーゲンおよびトロンビンはこの種の２分子であり、そして本発明の電気処理技術を用いこれら分子またはその他分子から電気処理されたフィブリンを作ることができるだろう。フィブリノーゲンはまた電気紡糸または電気エアロゾル技術を用い加工してから酵素的方法により電気処理されたフィブリンに変換することもできる。
【００１０】
本発明はまた電気処理されたフィブリンおよび細胞を含む電気改変された組織も提供する。いずれの細胞も使用できる。細胞はフィブリンと共に、あるいは別々に細胞を電気処理することを含む多くの技術を使って電気処理されたフィブリンに適用され得る。細胞は幹細胞、コミットした細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）、または分化した細胞である。細胞分化誘導因子も利用できるが、これらにはペプチド成長因子、薬物またはセンスもしくはアンチセンス方向の完全もしくは部分遺伝子配列が含まれるが、もとよりこれらに限定されるものではない。改変された組織は所定の形状を有し、そして所望形状を形成するのに電気処理されたフィブリンおよび細胞が用いられる。
【００１１】
本発明は電気処理された技術を用いたフィブリン含有細胞外マトリックスの製造方法を包含する。これら技術は、電気紡糸、電気スプレー、電気エアロゾル、電気スパッターまたは基体または標的上に電着を達成するその他任意の技術を含むが、もとよりこれらに限定されるものではない。方法は、接地基体上にフィブリンを付着させて細胞外マトリックスを形成するのに有効な条件の下に、フィブリンを含む帯電溶液を接地標的基体上に流すことを含む。溶液およびアースの極性は交換可能である。帯電溶液はさらにフィブリンを形成する能力を持つ分子を含んでもよい。好ましい実施形態では、帯電溶液は電気処理されたフィブリンを作るのに使用されるフィブリノーゲンおよびトロンビンを含み得る。あるいは帯電溶液は血漿およびトロンビンを含む。基体上に流されたフィブリンまたはフィブリン形成分子は電気紡糸繊維または電気エアロゾル滴を含み得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなキャリアー分子を用いて電気処理を促進してもよい。例えばシステムのある成分に好ましい溶媒が水系の場合（例えば薬物化合物）、フィブリノーゲンまたはフィブリンは高分子量ＰＥＧ存在下に水中に懸濁され得る。ＰＥＧは水から容易に紡ぎ出され、キャリアーとして機能して、特定のパターンまたはランダムなパターンにフィブリノーゲンまたはフィブリン分子を特定部位に電着する。キャリアーはまた純粋な有機溶媒からフィブリノーゲン／フィブリンを加工するのにも用いられ得る。
【００１２】
本発明はまた所定形状を持ったフィブリン含有細胞外マトリックスの製造方法も提供する。方法は、所定形状の作製に適したモールドを前もって選択すること、およびこのモールドに電気処理技術を使ってフィブリンまたはフィブリン形成分子を充填することを含む。または方法は所定の形状を作るのに適したモールドであって、接地標的基体を含むモールドを事前に選択することを含み得る。次にフィブリンまたはフィブリンを形成できる分子を含む１またはそれ以上の帯電溶液を、基体上にフィブリンを付着させ所定の形状を持つ細胞外マトリックスを形成させるのに有効な条件の下に接地標的基体上に流す。基体上に流されたフィブリンは電気紡糸繊維または電気エアロゾル滴を含み得る。
【００１３】
電気処理され改変された組織を製造する本方法では、基体上にフィブリンおよび細胞を電着するのに有効な条件の下、フィブリンまたはフィブリン形成可能な分子の帯電溶液および細胞を接地標的基体上に電着する。基体上に流されたフィブリンおよび細胞は電気紡糸繊維または電気エアロゾル滴を含み得る。いずれの細胞を使用してもよい。この細胞としては以下のものが挙げられるが、もとよりこれらに限定されるものではない：以下を含むがこれに限定されない幹細胞および／またはコミットした細胞：以下を含むがこれに限定されない骨芽細胞、筋原細胞、神経芽細胞、繊維芽細胞、膠芽細胞；生殖細胞、肝細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、結合組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、ホルモン分泌細胞、免疫系細胞および神経細胞。電気処理を使い、細胞を体内の特定部位に運搬することができる。いくつかの応用では、ある臓器に運ばれると多くのタイプの幹細胞はその臓器特異的パターンに分化するよう誘導できることから、電気処理技術を使って特定部位に運ばれる幹細胞のタイプを事前選択する必要がない場合がある。例えば肝臓に運ばれた幹細胞は、肝臓の生物化学的環境内に幹細胞を置くだけで肝臓細胞に誘導される。電気紡糸は、マトリックスが特定臓器部位に合わせ調整できることから、このタイプの応用に有効である。電気紡糸マトリックスはまた、素早く安定または分解するよう「プログラム」され得る。
【００１４】
本発明は電気処理されたフィブリン含有細胞外マトリックスの製造方法を提供する。方法は電気的に接地された基体を含み、さらにフィブリン溶液またはフィブリンを形成できる分子の溶液を含む１または複数のタンクを備える。実施形態の一つでは、タンクは単一の開口部と実質的に接続しており、それによりタンクから溶液が出ることでタンクからの溶液を混合することができる。溶液は帯電しており、溶液の混合体は基体上に流され細胞外マトリックスを形成する。別の実施形態では、複数のタンクが第一および第二タンクを含む。第一タンクはフィブリノーゲンを含む溶液を有し、第二タンクはトロンビンを含む溶液を有する。フィブリノーゲンもまた、キャリアー分子、例えばＰＥＧもしくはコラーゲン有りまたは無しに電気紡糸され、フィブリンに加工された後、電気処理される。これら物質もまた、トロンビンおよびフィブリノーゲンをフィブリンに加工するその他生化学作用物質を含む標的または溶媒槽上に電気紡糸することができる。このタイプの応用では、標的上にフィブリノーゲンを付着した後のいずれかの時点でそれを電気処理し、そしてフィブリンに変換する。
【００１５】
本発明はフィブリノーゲンおよびトロンビンの電気処理の工程の産物を包含する。この処理は、フィブリノーゲンおよびトロンビンを電気紡糸しフィブリンを製造することを含み、それはフィブリノーゲンおよびトロンビン滴を電気スプレーすることを含み、それはフィブリノーゲンおよびトロンビンを電気スパッターすることを含み、またはそれはフィブリノーゲンおよびトロンビンの電気エアロゾル付着を含むだろう。使用する方法を問わず、フィブリンは基体または標的上に電着される。架橋剤を電気処理されたフィブリンと共に使用してもよい。例えば第ＸＩＩＩａ因子による共有結合の導入は、構造強度を増し、その後のマトリックスの溶解を遅らせる。
【００１６】
電気処理されたフィブリンのマトリックスを製造する方法の一つは、基体および２個の溶液タンクを提供すること含み、この場合溶液の一つはフィブリノーゲンを含み、もう一つの溶液はトロンビンまたはその他の物質を含み、各タンクはタンクから溶液を出すことができる開口部を有している。実施形態の一つでは、各開口部は共通流路と連絡しており、２種類の溶液を一つに合わせ、共通流路への開口部から押し出すことができる。次に基体または溶液の一方を帯電し、もう一方を接地する。次にフィブリノーゲンおよびトロンビンを共通開口部から基体上に流し、マトリックスを形成させる。フィブリノーゲンおよびトロンビンを流す段階により電気処理されたフィブリン繊維のマトリックスを形成することができる。この段階により、あるいは電気処理されたフィブリン滴のマトリックスを形成することができる。
【００１７】
別の構成では、フィブリノーゲンおよびトロンビンを含む溶液の入った別個のタンクは共通流路に連絡しないが、それぞれのタンクから溶液の流れを可能にする開口部を個別に有している。２種類の溶液を同時に併せて流すことで標的上に、または標的に達する前の外気の中でフィブリンを形成させることができる。
【００１８】
さらに別の構成では、フィブリノーゲン溶液を含むタンクを使用してトロンビン溶液を含む標的またはトロンビンを含む表層上にフィブリノーゲンを電気スパッター、電気スプレーまたは電気紡糸し、標的上に直接フィブリンを形成させることができる。キャリアー分子を随意使用し、標的または表層にフィブリノーゲンを受動的に運搬してもよい。あるいは、トロンビン溶液を用い、フィブリノーゲンを含む標的上にトロンビンを電気スパッター、電気スプレーまたは電気紡糸してフィブリンを形成させてもよい。凝固反応はカルシウムイオン存在下に合理的な速度で進行することから、カルシウムを含まないフィブリノーゲンとトロンビン、またはカルシウムを含まない血漿とトロンビンをカルシウムを含む標的上に電気加工することができる。あるいはカルシウムを含まないフィブリン形成分子の流れを、任意のフィブリン形成分子のカルシウムを含む流と一緒に電着させることができる。
【００１９】
別のフィブリンマトリックス製造方法は、基体、標的、および一方がフィブリノーゲンを含み、もう一方がトロンビンを含む少なくとも２種類の分離したタンク溶液を提供し、この場合各タンクは下記いずれかの開口部を有する；ａ）タンクを出た溶液が、各開口部と連絡する共通流路を通る別の溶液と接触してから、共通流路の端部に配置された開口部から混合溶液となって電気押し出しされることが可能な開口部、またはｂ）各タンクの開口部と連絡する一つの口から直接電気押し出しできる開口部。次に標的または溶液の一方を帯電し、もう一方を接地する。基体を開口部と標的の間に配置する。次にフィブリノーゲン／トロンビン混合体またはフィブリノーゲンおよびトロンビン別々の溶液をタンクから開口部を通して基体上に流し、マトリックスを形成させる。これらフィブリノーゲンおよびトロンビン溶液を流す段階は、フィブリン繊維のマトリックス、またはフィブリン滴のマトリックスを形成する。さらに基体は前もって選択した形状を画定していてもよい。フィブリンマトリックスは架橋剤存在下に形成しても、または流した後に架橋剤で処理してもよい。
【００２０】
本発明の電気処理されたフィブリンはその他細胞外マトリックスタンパク質、薬物および他の物質のスカフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）用ビークルまたはキャリアーとして利用できる。電気処理されたフィブリンを他のポリマーまたは天然もしくは非天然繊維と組み合わせ、そしてポリマーを電気処理されたフィブリン内に架橋した場合には、フィブリンは天然または人工的手段によって後で溶解され、所定位置に架橋スカフォールドが残される。
【００２１】
本発明の電気処理されたフィブリンはドラッグデリバリーまたはその他物質、例えば酸化防止剤、ビタミン、化粧品、核酸、ベクター、創傷治療製品およびホルモンのような物質の運搬のためのビークルとして使用できる。この電気処理されたフィブリンは「生体分解性」貯蔵システムとして使用でき、薬物のような物質を特定部位に高濃度に貯蔵することができる。薬物放出は電気処理されたフィブリンの構造、またはそれが溶解する速度を変えることで目的に合わせ調整できる。いずれの薬物その他の物質も電気処理されたフィブリンと組み合わせることができる。
【００２２】
電気処理されたフィブリンは特に皮膚および表皮への応用、例えば治療または化粧応用に有用である。例えば電気処理されたフィブリンは血管内皮形成促進を目的とする血管移植体に有用である。例えば傷、擦過傷、または潰瘍といった創傷の治療および修復は、発明の好ましい応用である。このような応用では抗生物質、抗菌剤、抗炎症剤または当業者既知の治癒を促進する物質を使用することができる。その他分類の薬物または物質としては、抗生物質、化学療法剤、抗カビ剤、鎮痛剤、ホルモン、皮膚軟化剤、湿潤剤、酸化防止剤、ビタミン、注射薬、およびコンディショナーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい薬物または物質としては、エストロゲン、アンドロゲン、コルチゾン、シクロスポリン、ペプチド、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＦＧＦｂ、ＦＧＦａおよびＢＧＦ（骨成長因子）を含む成長因子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。局所抗生物質としては、ペニシリン、ゲンタマイシン、テトラサイクリンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗真菌剤も使用され得る。
【００２３】
本発明の電気処理されたフィブリン、電気処理されたフィブリンマトリックスおよび／または電気処理されたフィブリンと細胞は、経口投与、肛門投与、局所適用、エアロゾル適用、吸入、腹腔内投与、体腔内投与、臓器内腔および実質内投与、所望部位への直接噴霧を含む任意の手段により所望部位に適用できるが、もとよりこれら手段に限定されるものではない。噴霧には所望部位への電気スプレーが包含され得る。適用部位は上皮のような外面、または胃潰瘍のような内側、手術域等である。本発明の電気処理されたフィブリンはクリーム、ゲル、溶液、懸濁液、リポソーム、粒子、または治療薬および化粧品物質の調合ならびに送達に関し当業者既知であるその他手段の形状で適用される。超微細粒子の大きさを持つ電気処理されたフィブリンは、治療薬の吸入送達に使用できる。
【００２４】
本発明は電気処理されたフィブリンマトリックス内に含まれた細胞に対する有効分子をインビトロで試験する方法を包含している。任意の細胞をフィブリンマトリックス内に配置し、任意の所望の物質をフィブリンマトリックス内の細胞に投与する。そして任意の所望の生物学的反応を評価する。あるいは、この方法はフィブリンと癌細胞が基体上に付着するのに効果的な条件の下に、フィブリンおよび癌細胞を含む帯電溶液を接地された標的基体上に流すことにより電気改変された組織を製造することを包含し得る。本発明はインビトロでの癌治療法の有効性を試験する方法を包含する。方法は、フィブリンと癌細胞を含む電気改変された組織を製造することを包含する。電気改変された組織の複数のサンプルについて、複数の癌治療法が行われる。方法はさらに癌治療法の相対的有効性を評価することも包含する。この場合も癌細胞は癌治療を必要としている患者より得られるだろう。
【００２５】
従って本発明は上記限界および欠点を、電気処理されたフィブリンを製造し、使用することで克服することを目的としている。
【００２６】
本発明の別の目的は、電気処理されたフィブリンマトリックスを提供することである。電気処理によって、とりわけ生物医学応用を含む様々な分野での使用に合ったフィブリンマトリックスを形成できる。電気処理されたフィブリンは、３次元の、空間充填ネットワークを形成し、形成中に流体力学を利用することで配列を整えることができる。形成後もフィブリンマトリックスは機械的牽引、磁力またはその他手段によりその配列を調整できる。
【００２７】
本発明の別の目的は、電気処理されたフィブリンおよび電気処理されたフィブリンマトリックスの製造方法を提供することである。
【００２８】
本発明の目的の一つは、電気処理工程にフィブリンまたはフィブリンを形成できる任意の溶液を使用することである。
【００２９】
本発明の別の目的は、電気処理工程にトロンビン、および／またはフィブリノーゲンをフィブリンに加工できるその他作用物質と組み合わせたフィブリノーゲンを使用することである。本発明の電気処理方法を通じて、とりわけ生物医療応用を含む複数の領域での使用に合わせてフィブリンマトリックスを形成できる。
【００３０】
本発明の別の目的は、本法を利用し電気処理されたフィブリンまたは電気処理されたフィブリンマトリックスを含む組織を改変することである。これら組織は細胞、薬物またはその他物質を含む。
【００３１】
本発明のさらに別の目的は、薬物のような物質を、電気処理されたフィブリン、電気処理されたフィブリンマトリックスおよび電気処理されたフィブリンマトリックスを含む改変された組織のような物質を用いて送達する新規の方法を提供することである。
【００３２】
本発明のさらに別の目的は、創傷ドレッシング、神経ガイドとして、または別の移植可能組織として利用できる電気処理されたフィブリンマトリックスを含む改変された組織を提供することである。
【００３３】
本発明の利点は、自己フィブリンが使用でき、それにより電気処理されたフィブリンマトリックスまたは電気処理されたフィブリンマトリックスを含む改変された組織の免疫拒絶の機会を最小限にすることである。
【００３４】
本発明のこれらおよびその他目的、特徴および利点は、開示の実施形態に関する以下の詳細な説明および添付の図面を概観することで明らかになるだろう。
【００３５】
好ましい実施形態の詳細な説明
用語「電気処理」および「電着」は広義に用いられ、フィブリン滴を電気紡糸、電気スプレー（電気エアロゾル）、電気スパッターする方法、電気紡糸および電気エアロゾルの組み合わせ、それらの別の組み合わせ、およびフィブリン、フィブリンを形成できる分子、フィブリノーゲン、トロンビンまたはそれらの組み合わせが電界を横切り、標的に向かって流され、噴霧され、スパッターされまたは滴下されるその他方法を包含する。同様に、溶液は１またはそれ以上の接地タンクから帯電基体に向かって、または帯電タンクから接地標的に向かって流される。「電気紡糸」とは、フィブリン繊維が溶液から形成されるか、または帯電溶液を流し溶解するか、または開口部を通し溶解する工程を意味する。「電気エアロゾル」とは、溶液から滴が形成されるか、または帯電ポリマー溶液を流して溶解するか、または開口部を通し溶解する工程を意味する。従って用語「電気処理」は、ここに記載の具体例に限定されるものではない。
【００３６】
本発明の目的に於いては、用語フィブリン細胞外マトリックスとはその上またはその中に細胞が付着し、増殖し、そして成長することのできる任意の３次元構造を指す。フィブリン細胞外マトリックスに関するその他一般的用語としては、筋肉または神経を取り囲むことができるスカフォールド、プラットホームおよび筋膜鞘が挙げられる。
【００３７】
本明細書を通し、用語「溶液」は電気処理法のタンク内にある液体を表すのに用いられる。好ましい実施形態では、溶液中のフィブリンは標的上に電着される。本発明では、フィブリン形成に適した溶液はトロンビン溶液およびフィブリノーゲン溶液を含む。フィブリノーゲンはトロンビンによりフィブリンモノマーに変換され、それが静電的相互作用により集合しフィブリンとなる。このフィブリンは共有結合で架橋されてはいない。電気紡糸、電気スプレーまたはいずれか形の電着によりフィブリンを形成できるいずれの溶液も本発明の範囲内と理解される。例えばフィブリン、フィブリン類似体、その前駆体または活性断片、フィブリノーゲン類似体、その前駆体または活性断片、およびトロンビン類似体、その前駆体または活性化断片、ならびにフィブリン形成可能なその他分子が本発明に利用できる。血漿は、フィブリン形成のためのフィブリノーゲンのよい供給源であり、この応用のために電気処理され得る。実施形態の一つでは、自己に投与するためにフィブリンマトリックスが患者の血液を用いて調製される。複数の酵素がフィブリノーゲンを凝固するが、この能力を持ついずれの酵素も本発明の範囲内と考えられる。これらにはレプチラーゼ、バトロキソビンおよびその他各種蛇毒酵素が挙げられるが、もとよりこれらに限定されない。さらにフィブリノーゲンは大量の硫酸プロタミンを付加することで「フィブリン様」マトリックスを形成する。この工程はパラコアグレーションと呼ばれている。
【００３８】
本明細書では、用語「溶液」はまたフィブリン、フィブリンを形成できる分子、細胞、薬物のような物質、その他分子または電着物を含む懸濁液も指す。「溶液」は有機的または生物学的に適合した形状であり得る。この広義の定義は、多くの電気処理の変形に使用され得る多数の溶媒またはその他液体ならびにＰＥＧ等のキャリアー分子を考慮する上で適当である。非架橋型のフィブリンモノマーは尿素、一塩化酢酸またはヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）のような溶媒から電着または電気スパンされる。
【００３９】
用語「フィブリン」は本明細書を通し、その最も広い定義で使用される。それには断片、類似体、保存的アミノ酸置換および非天然型アミノ酸による置換が含まれるが、これらに限定されるものではない。フィブリンには天然型ならびに合成的に製造されたかもしくは遺伝子工学的に製造されたタイプといった複数のタイプのフィブリンが存在する。将来別のタイプのフィブリンが見いだされ、または合成されるか、あるいは各種フィブリン分子の特定のサブセットが固有の作用を持つ形で単離され、そしてここに記載のものと同様の産物の製造に使用されるかもしれない。これらタイプおよびサブセットは全てここでは用語「フィブリン」の使用の中に包含される。同様に実施例のいくつかにより実証される如く、フィブリンまたはフィブリンマトリックスの特定の最終使用に関して特に望まれる特性を得るために、フィブリノーゲンおよび／またはトロンビンを電気処理中に別のポリマーまたはその他分子と混合することがある。
【００４０】
フィブリン形成電気処理法
本発明ではフィブリンまたはフィブリンを形成できる任意の分子を用い、電気処理されたフィブリンを形成できる。フィブリノーゲンおよびトロンビンはフィブリン製造に関する２種類の好ましい分子である。フィブリノーゲンをトロンビンと共に、または別々に電気処理して電気処理されたフィブリンまたは電気処理されたフィブリンマトリックスを形成することができる。これは、トロンビンがフィブリノーゲンからフィブリンへの加工を促進しない条件の下に実行される。これはいくつかの方法で達成される。例えばフィブリノーゲンおよびトロンビンを、トロンビンを機能させない溶媒から電気処理することができる。あるいはフィブリノーゲンまたはトロンビンをキャリアー物質内に包み込むことができる。本明細書においてフィブリノーゲンは１種類の供給源液より標的上に電気処理（それ自体のみで、またはキャリアーと共に）することができる。トロンビンは別の供給源より電気エアロゾル法で付着させることができる。トロンビンはカプセル化し、微細な粒子の霧として噴霧することができる。またはトロンビンおよびフィブリノーゲンはＰＥＧまたはコラーゲンのようなキャリアーと混合することができる。
【００４１】
予備成形ゲルのようなフィブリンを電気処理することができる。フィブリンゲルは、例えばその後方に圧力ヘッドがあるシリンジを使って加圧され、フィブリンゲルは電界内に押し出される。
【００４２】
キャリアーは、反応物が活性化されるまでそれらを所定位置に保持するのに働く。生成物は全て乾燥状態に保存されることが好ましい。物質を湿潤環境、例えば切傷、潰瘍または湿潤創傷内に置くと、トロンビンが放出され、フィブリノーゲンをフィブリンに加工し凝固塊の形成が起こる。上記の如くキャリアーはフィブリンを形成できる分子と共に使用されると理解される。例えばフィブリノーゲンはＰＥＧ、コラーゲンまたはフィラメントを形成するその他既知キャリアーと混合することができる。これにより毛髪状のフィラメントが作られるが、この毛髪状フィラメントがフィブリンである。このタイプの利用では、フィブリンは周囲のマトリックスキャリアーを架橋してゲルを形成する。この手法は、常態でゲルでない分子をゲル化するために用いられ得る。例えばＩＶ型コラーゲン、または何らかのその他コラーゲンはフィラメントを形成しない場合、フィブリノーゲン、コラーゲンおよびＰＥＧを電気スプレーして電気処理されたフィブリン含有マトリックスを形成することができる。フィブリン形成が始まった後にフィブリン／コラーゲンゲルが作られる。
【００４３】
あるいはフィブリノーゲン／フィブリンはシートを形成する別の分子（例えばＰＥＧ、ＰＬＡ、ＰＧＡ：ＰＬＡ、コラーゲン、フィブロネクチン）と共にスパッターできる。このシートは創傷の上全体に置くことができる。創傷が開いている場合、フィブリノーゲンはフィブリンに変換され、凝固塊を形成する。トロンビンがシート内に存在する場合、凝固塊は水の付加およびトロンビンの放出により得ることができる。このようなシートはとりわけ外科手術および創傷治療に応用できる。フィブリノーゲンおよびトロンビン以外のその他フィブリン形成分子も使用され得ると理解すべきである。
【００４４】
所望の結果を得ることができるよう成された複数の装置の変形および改良に加え、溶液もまた異なる結果を得るために変更できる。例えばフィブリノーゲンまたはトロンビンが溶解された、または懸濁された溶媒または液体は変更できる。
【００４５】
フィブリノーゲンまたはトロンビンは所望の結果を得るために、他の分子、モノマーまたはポリマーと混合することができる。例えばポリマーを加えて溶液の粘度を変更することができる。さらに別の変形では、複数のタンクを使用する場合、これらタンク内の成分を別々または併せてノズルから電気スプレーし、各種タンク内の成分を同時に相互反応させながら溶液を電界内に流し込むことができる。また複数のタンクを使用する場合、異なるタンク内の異なる成分を処理期間中、時間的に段階導入してもよい。例えばフィブリノーゲンは、分子の炭水化物プロフィールを変化させることで直接変化させられる。またその他物質はフィブリノーゲンおよび／またはトロンビンを電気処理する前、最中または後にフィブリンに付着され得る。さらに温度および工程のその他物理特性を変更して、異なる結果を得ることができる。
【００４６】
最後に電気処理法より生ずるフィブリンマトリックスを変更、調整するのに使用できる多くのタイプの工程後処理が存在する。例えばフィブリンマトリックスは、化学物質およびＵＶ光ベース架橋剤を含む架橋剤で処理することができる。またフィブリンマトリックスは各種温度で処理することができる。マトリックスに特定の最終特性を望む者は、さらに別の化学的変更も構想され得る。フィブリンは、例えばフィブリノーゲンとトロンビンとを適当な濃度で一つに混合するような様々な方法で形成される。この様にフィブリンを含む細胞外マトリックスを構築することは、フィブリノーゲンおよびトロンビンといったフィブリンを形成できる分子を一緒にして電気処理法にかける多様な方法を包含している。またこのフィブリンは電気処理法で形成された後に操作することもできる。
【００４７】
最も基本的な意味に於いて、フィブリンを電気処理するための電気処理装置は流動機構と標的基体を含む。流動機構は、工程中に流される１またはそれ以上の溶液を保持するための１または複数のタンクを含む。１または複数のタンクはタンクから溶液を流すことができる少なくとも１個の開口部またはノズルを持つ。所与の電気処理装置は１本または複数本のノズルを持つ場合がある。複数のノズルがある場合は、それらは同一または異なる溶液を含む１または複数のタンクに取り付けられ得る。同様に同一または異なる溶液を含む複数のタンクに単一のノズルが接続されることもある。またノズルの大きさは、ノズルを通しタンクの外に流れ出る溶液量の増加または減少に合わせ変えることもできる。タンクに接続して使用されるポンプを利用し、１または複数のノズルを通りタンクから流れる溶液流を制御することもできる。ポンプは電気処理中に様々な点で流量を増やし、または減らすようにプログラムされる。
【００４８】
標的基体はまた電気処理されたフィブリン製造に使用される分子の電気処理に於ける変動特性として利用することもできる。具体的には、標的は電気処理されたフィブリンの製造に使用される分子に関する実際の基体であるか、または電気処理されたフィブリンそのものが付着する基体である。あるいは、基体は標的とノズルの間に配置することができる。例えばペトリ皿をノズルと標的間に配置することができ、そしてマトリックスを皿の中に形成し、皿の底にスカフォールドを形成することで細胞増殖を３次元で研究することができる。その他変動要素としては、ノズルおよび標的間の非付着性表面がある。開口部から流れ出た溶液を特定の方向に向けるために、標的を前もって選択されたパターンに特異的に帯電（接地）することもできる。電界はプログラムにより制御され、希望の構造配置を持つ電気処理されたフィブリンマトリックスを作る。標的および１または複数本のノズルは互いに可動式に改変されたすることができ、それにより形成されるフィブリンマトリックスの構造配置を追加制御することができる。全工程は、特定の、前もって選択され電気処理されたフィブリンおよび、必要でればその他分子、モノマーまたはポリマーのマトリックスを得るための特定パラメータでプログラムされたマイクロプロセッサーにより制御することができる。
【００４９】
また以下特定例に記載される如く、タンクからの溶液の流れを可能にするノズルまたは開口部は帯電されて示されており、そして標的は接地されて示されている。電気処理分野の当業者は、ノズルおよび溶液を接地し、そして標的を帯電できることを認識するだろう。いずれの場合も、それにより電界が形成され、そしてフィブリン流またはフィブリン形成を補助するトロンビンおよびフィブリノーゲン流に電界が影響する。
【００５０】
本発明によれば、電気紡糸フィブリン繊維の細胞外マトリックスは以下記載の様に作ることができる。フィブリンを形成できるいずれの分子も利用できるが、フィブリノーゲンまたはトロンビンを電気紡糸してフィブリン繊維を作製することが好ましい。様々な有効条件を用いてフィブリン繊維マトリックスを電気紡糸することができる。以下は好ましい方法の説明であるが、他のプロトコールを用い同一の結果を得ることもできる。フィブリン繊維を電気紡糸している図３および図４を参照すると、マイクロピペット１０にはフィブリノーゲンまたはトロンビン溶液が充填され、例えばＲＣＣＳバイオリアクターの中心シリンダー内に置かれた金属製接地スクリーンのような接地標的１１の上に懸垂されている。微細ワイヤー１２が溶液内に配置され、各ピペットチップ１３内にある溶液に高電圧をかけている。溶液および装置配置毎に定められた特定電圧により、各ピペットチップ内にある懸濁溶液は接地標的に向け流される。このフィブリノーゲンおよびトロンビンの流れ１４は連続するフィラメントを形成し、このフィラメントは接地標的に到達すると集まり、乾燥して３次元の極めて薄い、相互に接続したフィブリン繊維のマトリックスを形成する。
【００５１】
この工程では最低の電流が用いられており、従って作業中フィブリノーゲンおよびトロンビン溶液内の温度が上昇することは予想されないことから、この流動工程はフィブリノーゲンおよびトロンビンを変性しない。
【００５２】
電気紡糸工程同様、電気エアロゾル工程を用い高密度の、マット状の（ｍａｔｔｅ−ｌｉｋｅ）フィブリン滴マトリックスを作ることができる。電気エアロゾル工程は電気紡糸工程の変形であり、電気エアロゾル工程では作業中に低濃度のフィブリノーゲンおよびトロンビンを使用する。スプレーノズルの帯電先端部ではポリマースプレー（繊維）を生成するのではなく、フィブリノーゲンおよび／またはトロンビンの小滴が形成される。次にこれら滴は帯電先端部から接地基体に移され、融合ポリマー滴から成る、一般には直径１０ミクロン未満程度のスポンジ状のマトリックスを形成する。
【００５３】
先述の電気紡糸工程同様、電気エアロゾル工程も様々な有効条件を利用し実施できる。例えば図３および図４に示すように、電気紡糸工程で使用した同一装置を電気エアロゾル工程に利用する。電気紡糸との違いとしては、マイクロピペットタンク内の溶液に加えられたフィブリノーゲンおよびトロンビンの濃度、および／または滴流を作り出すのに用いられた電圧が挙げられる。
【００５４】
当業者は、フィブリノーゲンおよびトロンビン溶液の濃度変更は、ピペット先端部での滴の形成および流れを得るための必要な特定電圧の変更も必要とすることを認識している。
【００５５】
各種分子を単独または組み合わせて使用して、電気紡糸および／または電気エアロゾルフィブリンマトリックスを作ることができる。フィブリンを形成するいずれの好ましい分子も利用することができる。好ましい実施形態では、フィブリノーゲンおよびトロンビンを用い、細胞外フィブリンマトリックスが形成される。フィブリン、フィブリノーゲンおよびトロンビンは販売会社より入手するか、または当分野で既知の方法に従い調製することができる。
【００５６】
ポリマーのような各種分子、細胞またはその他物質を電気紡糸または電気エアロゾル溶液内に追加できる。実施形態の一つでは、特定産物（複数可）に関する所望コード情報を含む裸のＤＮＡまたはベクターを、組織工学スカフォールド内に取り込ませることを目的としてフィブリノーゲンまたはトロンビン溶液内に混入できる。接種細胞によるスカフォールドの消費／再構築により、細胞はベクターを自身のＤＮＡ内に取り込み、所望の効果を生じ得る。ＤＮＡは細胞内への取り込みを促進するのに効果的ないずれの形状でもよい。例えばそれは裸の状態（例えば米国特許第５，５８０，８５９号、第５，９１０，４８８号）であっても、または複合もしくはカプセル化（例えば米国特許第５，９０８，７７７号；第５，７８７，５６７号）されたものでよい。ＤＮＡ添加同様にして、抗生物質、化学療法剤、抗真菌剤、鎮痛剤、ホルモン、皮膚軟化剤、湿潤剤、抗カビ剤、酸化防止剤、ビタミン、コンディショナー、拒絶薬、その他薬物、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＧＦｂ、ＰＧＦａおよびＢＧＦ（骨成長因子）を含むペプチド成長因子、モノカイン、免疫抑制剤、血管形成因子または本書他所にて論じるその他の因子を電気紡糸または電気エアロゾルマトリックス内に加え、組織再生を補助し、あるいはその他希望の生物学的結果を得ることができる。
【００５７】
電気紡糸または電気エアロゾル工程は、これら方法で作られた電気処理されたフィブリンの任意の所定の応用に合わせて操作でき、特定条件に合致させることができる。実施形態の一つでは、マイクロピペットは接地基体に関しｘ、ｙおよびｚ面に動くフレーム上に取り付けることができる。マイクロピペットは接地基体、例えば管状マンドレル（ｍａｎｄｒｅｌ）の周辺に取り付けてもよい。このように、マイクロピペットから流れ出たフィブリノーゲンまたはトロンビンを特定の目標に向かわせるか、またはパターン化することができる。マイクロピペットは手で動かすこともできるが、好ましくはマイクロピペットが取り付けられたフレームはマイクロプロセッサーとモーターによって制御され、これにより特定マトリックスを作製する者は流動コラーゲンのパターンを事前に決定することができる。このようなマイクロプロセッサーおよびモーターは当業者にとって既知である。例えばフィブリン繊維または滴は特定の方向に配置でき、それらを層状に重ねることができ、あるいはそれらをプログラムして完全に無作為で、方向性を持たないようにすることもできる。
【００５８】
電気紡糸工程では、フィブリノーゲンおよびトロンビン流（単数または複数）を枝分かれさせてフィブリン繊維を形成することができる。分枝の程度は、電圧、接地構造、マイクロピペット先端部から基体までの距離、マイクロピペット先端部の直径、フィブリノーゲン濃度、およびトロンビン濃度を含む多くの要素により変わるが、もとより要素はこれらに限定されない。フィブリノーゲン、トロンビン、フィブリンおよび各種組み合わせを、物質をエアロゾルにする装置から電界内に噴射することで、システムの電界に送り込むこともできる。この工程は、電圧（例えば約０〜３０，０００ボルトの範囲）、マイクロピペット先端部から基体までの距離（例えば０〜４０ｃｍ）、およびマイクロピペット先端部の直径（約０〜２ｍｍ）を含む多くの要素により変わるが、もとより要素はこれらに限定されない。これら変数のいくつかは電子紡糸微小繊維織物分野の当業者にとって周知である。
【００５９】
接地標的の構造は、所望マトリックスの生産に合わせて変更できる。好ましい実施形態では、回転壁バイオリアクターが用いられる。接地基体は、電気紡糸または電気エアロゾル工程の内部シリンダー内側に適合するシリンダーである。接地構造を変えること、例えば平面または直線若しくは複数の点で接地するようにすることで、フィブリンの流れの方向を変え、特定の応用に合わせ変更することができる。例えば一連の平行線を有する接地標的を用いて、電気紡糸フィブリンを特定の方向に向けることができる。接地標的はシリンダー状マンドレルでもよく、これにより管状マトリックスが形成される。最も好ましくは、接地は、その中にプログラムされた特定の接地構造を指令するマイクロプロセッサーにより制御できる可変式表面である。あるいは、例えば接地はコラーゲンを流す固定式マイクロピペット先端部に対しｘ、ｙおよびｚ面内に動くフレーム上に取り付けられる。図４の接地標的１１は、その長軸に沿って振動できることが示されている。
【００６０】
フィブリンがその上に流され、噴霧され、またはスパッターされる基体は接地標的自体であっても、またはマイクロピペットチップ先端部と接地標的の間に配置されてもよい。基体はインビボでのその後の使用に合わせた特定の形状、例えば神経ガイド、皮膚パッチ、筋膜鞘、または血管移植体といった形状に成形することができる。フィブリンマトリックスは成形して、欠損部または充填部位に合わせることができる。例えば腫瘍が除去された部位、あるいは皮膚の損傷部位（傷、生検部位、穴やその他欠損）であり、失った若しくは粉砕された骨片を再構築または交換する。電気処理は高い柔軟性を持っており、実質的に必要とされる如何なる形状にも構築体を作り上げることができる。フィブリンは柔軟性に富んでおり、実質如何なる形にも形成できる。
【００６１】
電気処理、特に電気紡糸および電気エアロゾル法のその他変形としては以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：
１．異なる溶液（例えばフィブリノーゲンおよびトロンビン）を用い２種類またはそれ以上の異なるファイバー若しくは滴を同時に産生するもの（マトリックス繊維または滴列）。この場合、単一成分溶液は別々のタンクの中に維持できる。
２．同一タンク（複数可）内にある混合溶液（例えばフィブリン、フィブリンと細胞、フィブリノーゲンと細胞、トロンビンと細胞、フィブリノーゲンと成長因子、フィブリノーゲンまたはトロンビンと薬物）を用いて、複数の物質より成る繊維または滴（繊維組成体「ブレンド」）を産生するもの。非生物学的ではあるが生物適合物質、例えばＰＶＡ、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ＰＥＯ等は、フィブリン、フィブリノーゲンまたはトロンビンのような生物分子と混合できる。その他生物物質、例えばコラーゲンまたはコラーゲンの配合体を加えることができる。
３．異なる溶液または同一溶液にも適用される複数の電位を使用するもの。
４．２またはそれ以上の種類の構造接地標的を備えるもの（すなわち小型および大型メッシュスクリーン）。
５．接地標的の正面にモールドまたはマンドレル、あるいはその他非接地標的を配置するもの。
６．標的の上にテフロンのような作用物質を適用し、標的からの電気処理された物質の除去を容易にしたもの（すなわち電気処理された物質が標的に張り付かないように物質をより滑りやすくする）。
【００６２】
これら変形は全て別々または組み合わせて実施でき、極めて多様な電気紡糸および電気エアロゾル電気処理されたフィブリン細胞外マトリックスを産生することができる。
【００６３】
さらに電気紡糸フィブリンおよび電気エアロゾルフィブリンの両方を含むマトリックスを形成できる。換言すれば、繊維と滴の組み合わせは模倣対象となる特定構造に応じて、ある応用には有益であり得る。繊維と滴のこの組み合わせは、同一のマイクロピペットと溶液を帯電条件を変化させて使用する；接地基体からの距離を変えて使用する；タンク内のポリマー濃度を変えて使用する；一部が繊維を流すためのものであり、残りが滴を流すためのものである複数のマイクロピペットを使用する；または当業者が想像できる任意のその他の方法の変更により得ることができる。繊維および滴は層状に重ねるか、または一つに混合して同一の層にすることができる。構築体は、各交互の層が後に異なる速度で分解、崩壊、加水分解するように設計された多層構造に作り上げることができる。例えば構築体の内層は電気紡糸フィブリノーゲン／フィブリンから作られ得る。次のこの層はコラーゲンで覆われ、それからＰＬＡの層、ＰＧＡの層またはその他所望の層で覆われる。
【００６４】
電気紡糸または電気エアロゾルマトリックスの安定性、剛性およびその他属性は、それらの化学的変更の程度に応じて制御することができる。電気紡糸または電気エアロゾルマトリックスは未変化状態で用いても、あるいは特定応用時の必要条件に合わせ変更してもよい。マトリックスの変更は、電気紡糸または電気エアロゾル工程の間に行われるか、またはそれが付着した後に行うことができる。カルボジイミドＥＤＣ（１−エチル−３（３ジメチルアミノプロピル）、塩酸カルボジイミド、ＮＨＳ（ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）といった架橋剤またはＵＶ光を使うことができるが、例えばアルデヒド（例えばグルタルアルデヒド）感光物質は特定波長の光、４酸化オスミウムおよびその他架橋固定化剤に曝されると架橋する。
【００６５】
電気紡糸フィブリンに関する条件の実施形態の一つが以下に示されている。フィブリノーゲンとトロンビンを組み合わせることによる電気紡糸フィブリンでは、おおよその適当範囲は次の通りである：電圧０〜３０，０００ボルト、ｐＨ７．０〜７．４、カルシウム３〜１０ｍＭ、温度２０〜４０℃、イオン強度０．１２から０．２０Ｍ、トロンビン０．１〜１．０単位／ｍｌ、およびフィブリノーゲン５〜２５ｍｇ／ｍｌ。電気紡糸フィブリンモノマーでは、ｐＨは５から始まり７．４まで増加するが、イオン強度は０．３Ｍより高いところから始まり０．１Ｍまで減少する。その他条件は、このパラグラフでは開始時と同様である。各種特性を持つフィブリンマトリックスは、ｐＨをシフトさせること、イオン強度を変えること、カルシウム濃度を変化させること、または追加のポリマー基質もしくはカチオン物質を添加することで作ることができる。
【００６６】
電気処理されたフィブリンマトリックスの形成
電気処理されたフィブリンは、特異形状モールドの内側に電着することができる（図５）。例えば交換が望まれる特定のタイプの臓器または組織は特異的な形状を持っており、例えば皮膚パッチは生検部位、または悪性黒色腫発見後の広範囲除去に後続した大規模な頭皮（ｓｃａｌｐ）除去領域に適した形状を持つ。次にこの形状を模すようデザインされたモールドの内側にその形が再生されて作られる。モールド内にフィブリンを電着させることでこのモールドを充填させることができる。このようにして、フィブリンマトリックスは正確にモールド形状を模す。特異形状を持つ細胞外フィブリンマトリックスを作ることは、新規の臓器を作り上げる上で極めて重要であり得る。マトリックスの形状がフィブリンマトリックス内に播種された細胞を特定の様式に分化するよう誘導することができる。成長因子またはその他物質は本明細書の他所に論じるように取り込まれる。その結果、より効果的で、より本物に近い臓器または組織が作られる。中空または中実臓器を作ることができる。電気スプレー中に細胞と物質とを混合するとマトリックス内に細胞を形成することができ、それによって細胞がゲル内に侵入する必要がなくなる。
【００６７】
フィブリンの細胞外マトリックスはまた、電気紡糸および電気エアロゾルといった電気処理技術により作ることもできる。この目的で論じる場合、電気紡糸および電気エアロゾルは相互交換可能に使用される用語である。フィブリンを電気紡糸するためには、少なくとも２種類の異なるタンクが一個の開口部で一つに接続される。タンクの一方はフィブリノーゲンを含み、もう一方のタンクはトロンビンを含む。これら成分を含む溶液は、それらが開口部から電気紡糸工程内に流し込まれる直前に一つに混合される。このようにして電気紡糸工程ではフィブリンはまさしく微細繊維を形成するか、または微小滴が形成される。
【００６８】
フィブリノーゲンはまた、トロンビンの湿潤雰囲気内に電気スプレーされ、電界内にフィラメントを形成することもできる。フィブリノーゲンはまた、トロンビンを持つ標的上に電気スプレーされてもよい。あるいはトロンビンをフィブリノーゲンを持つ標的上に電気スプレーしても良い。
【００６９】
フィブリンを取り込んだ細胞外マトリックスは、フィブリンと１つまたはそれ以上のその他物質および成分とを組み合わせマトリックスを作ることで作製できる。例えばコラーゲンおよび／またはフィブロネクチン、および／またはその他マトリックス物質、ならびにその中に取り込まれたフィブリンを有する細胞外マトリックスを作ることができる。このことは特定タイプの合成組織または合成臓器によっては有用であり得る。フィブリンとその他マトリックス成分とを混合することに加え、フィブリンを他のマトリックス構築工程に結びつけて利用することもできる。換言すれば、押し出し成形されたチューブはその上に外層電気紡糸を持つことができ、この場合異なる層が相互に補い合って、特定のタイプの細胞増殖を促進するのに適当なマトリックスを提供する。例としては主にコラーゲンチューブを含む血管移植体が挙げられる。チューブの外側には、フィブリンと細胞の電気紡糸層が加えられ、特定レシピエントへの移植体の受け入れ性を高め得る。第二の例は繊維芽細胞を一層に増殖させ、この第一層を電気処理されたコラーゲンで覆い、次にフィブリンマトリックス内に表皮細胞からなる第二層を増殖させることで形成されたインビトロ皮膚標本である。この「サンドイッチ」技術は各種組織の作製に使用できる。
【００７０】
細胞外マトリックスの各種特性は、ニーズと、そのマトリックス中に浮遊し、増殖させられる細胞の仕様に合わせ調整できる。例えば細胞外マトリックスを作製する方法に従って、多孔性を変えることができる。例えば繊維（滴）の大きさおよび密度により特定のマトリックスの電気紡糸を変えることができる。マトリックス内で増殖すべき細胞が大量の栄養流および廃物排除を必要とする場合には、緩いマトリックスを作ることができる。他方、作製すべき組織が高密度環境を必要とする場合には、稠密な（ｄｅｎｓｅ）マトリックスをそれに合わせ設計することができる。多孔性は塩またはその他抽出性作用物質を混合することで操作できる。塩を除去することでマトリックス内に規定の大きさの穴が残るだろう。
【００７１】
電気処理されたフィブリンの利用
電気処理法により作製されたフィブリンには多くの種々の用途がある。この多様性は、工程そのものが持つ可変性が可能にしている。一般的には、使用する装置および溶液は変更可能であり、そして各種の工程後処理が存在する。工程後処理の一つは、ネットワーク分解を遅らせ、より高い耐久性物質を提供するために抗繊維素溶解剤を添加することである。別の工程後処理は、電気処理されたフィブリンを成形または整列させるために、電気処理されたフィブリンに力を加える牽引アラインメントであり得る。これは神経ガイドまたはその他目的物の製造に有用である。フィブリンまたはフィブリノーゲンは、架橋蛋白質分野の当業者に既知である架橋剤、例えばカルボジイミド、アルデヒド、または紫外線エネルギー（感光剤を使用している場合）を使って架橋され得る。
【００７２】
細胞外マトリックスとしての電気処理されたフィブリンの使用には多くの利点がある。凝固剤として、フィブリンが体内の治癒に関係している。フィブリンはフィブリン構造内に浮遊している細胞への、または細胞からの栄養物および老廃物の流れを可能にする多孔性の媒体である。またフィブリンの存在は近接領域の血管系の成長を促進し、そして多くその他の形では天然の治癒促進物質である。
【００７３】
フィブリンは容易に入手できる物質である。フィブリンは血漿中に存在する。細胞外マトリックスをレシピエント内に移植される組織または臓器の作製に使用する場合には、マトリックスを作るフィブリン（フィブリノーゲン）供給源としてレシピエント自身の血漿を使用することができる。このようにして、マトリックスはレシピエント自身のフィブリンから作られるため、他のヒトドナーより得た物質からのウイルス暴露に関する潜在的な合併症を解消できる。他の供給源より集められたフィブリンの使用は、複数の精製段階、および低温殺菌のような工程、またはウイルス粒子およびその他感染作用物質を除くその他工程によって、有意に安全なものにできる。
【００７４】
フィブリンはレシピエントの体部により自然に吸収されることため、優れた細胞外マトリックスである。換言すれば、フィブリンがその治癒／再構築の目的を果たしている間および後に、体部はフィブリンを自然に分解する。これは自然の治癒メカニズムの一部である。そこには残留異物は存在せず、移植細胞を構成する細胞、組織または臓器のみが残る。電気処理されたフィブリンは、異なる分解速度を得るために他の原繊維物質と混合してもよい。天然フィブリンは迅速に分解し、そしてコラーゲンの分解はこれより遅く、ＰＧＡおよびＰＬＡはさらに遅く分解する。フィブリンまたは他の物質を様々な程度に架橋することは、物質を様々な程度に安定化するだろう。半減期を若干延ばす場合には、電気処理されたフィブリンはわずかに架橋され、あるいはより長期間使用する場合にはより強く架橋され得る。
【００７５】
電気処理法により産生されるフィブリンには多くの用途がある。この工程およびその産物の利用に関する別分野としては、生物医療への応用が挙げられる。本明細書では、これら使用分野の潜在的応用の非限定例について論じる。
【００７６】
生物医療応用
電気処理技術により産生されたフィブリンに関しては、少なくとも２つの大きな生物医療応用がある。一般的には、電気処理されたフィブリンマトリックスは細胞外マトリックスの形成および薬物を含む物質の運搬に使用される。
【００７７】
電気処理されたフィブリンは以下を含む複数の生物医療領域で使用されるが、もとよりこれらに限定されるものではない：局所創傷治療、時間的（ｔｅｍｐｏｒａｒｙ）皮膚パッチ、皮膚移植体、硬膜パッチ、床ずれ、糖尿病潰瘍を含む潰瘍、切傷、擦過傷、代替筋膜、開放部位または手術野への電気スプレーといった外科応用、出血を止めるための止血剤（シート、ペースト、粉末、フィルムおよびその他形状）、生物学的縫合材、マイクロ臓器製造用マトリックス、神経交換時に神経幹細胞と組み合わせ使用する神経修復用神経ガイド、体内への細胞導入または再導入のためのスカフォールド。電気処理されたフィブリンは水と接触して反応するか、または水と接触した後に一定時間（フィブリノーゲンを処理するのに使用されるキャリアー分子により決定される）後に反応する乾燥形状で作製される。本発明の電気処理されたフィブリンの止血特性は、血友病患者に特に有益であろう。
【００７８】
架橋型の電気処理されたフィブリンの生物医療応用としては以下のもの、すなわち血管弁、血管移植体、腱／筋肉修復、腱または靱帯、血管スカフォールドまたはサポート、創傷治療、軟骨、ヘルニアパッチ、神経修復、骨、縫合材料、および生物工学プラットホームが挙げられる。
【００７９】
電気処理されたフィブリンマトリックスを用いた生物工学
発明の更なる応用は、固体支持体として電気処理されたフィブリンマトリックスを使用する組織製造用プラットホームとしての応用である。プラットホーム製造は、フィブリン、または他の分子と組み合わされたフィブリンの電気処理されたマトリックス、微小繊維または物質配合体より構成される。プラットホーム全体の三次元構造の形状は、生物工学の対象となる組織の最終デザインとタイプにより決定される。
【００８０】
複数のデザイン変更（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ）が可能である。例えばフィブリン含有組織の固体三次元「プラグ」を作製するには、マンドレル上またはモールド内に製造プラットホームを、おそらくは電気スプレーにより電着する。マンドレルは円筒形、平たい卵形、長方形の封筒型（郵便用封筒のような）、またはその他所望の形状である。フィブリン含有生物工学プラットホームは所望形状を持つマンドレル上に電着され、硬化される。電着マトリックスはマンドレルから取り外される。円筒状の生物工学プラットホームまたはその中に密封領域が望まれるその他形状の構築体では、生物工学プラットホームの一端を密封するのに縫合糸、接着剤、ステープルまたはヒートシール、あるいはその他方法が用いられる。これにより、一端が閉じられ他端が開いた中空プラットフォームが得られる。次に電着フィブリン含有プラットホームは細胞またはその他物質で満たされるか、または細胞もしくはその他物質は構築体外面上に置かれる。例えば電気処理操作より得たフィブリン混合体、または細胞のようなその他物質、あるいは薬物または成長因子のような分子がプラットホーム内に置かれる。構築体を物質で充填するのに使用された封筒の自由開放端は縫合、接着またはヒートシールされ、密封された生物工学プラットホームが作り出される。次に構築体全体が細胞培養用バイオリアクターまたは更なる発生を目的として原位置に直接置かれる。変更を加えれば、中空体ではない固体フォーマットより構成された生物工学フィブリン含有プラットホームも電気処理することができる。
【００８１】
毛細管ネットワークを予備形成するために、播種の最中にフィブリン含有生物工学プラットホームのコアまたは外面に内皮細胞を加えてもよい。
【００８２】
細胞は、フィブリンマトリックス形成時に細胞をフィブリンマトリックス内に捕捉または取り囲むために、電気処理工程中に加えられてもよい。この作業は、電気処理される物質、例えばフィブリノーゲンおよびトロンビンを一種類または複数の有機溶媒（例えば高または低ｐＨを持つ溶媒、あるいは高または低塩含有量の溶媒内）に置かなければならない場合には、別ノズルまたは別の供給源から細胞を加えることで達成される。細胞はまた別の手段で加えることもでき、例えば細胞を電気紡糸流中に滴下し、形成された繊維で捕捉してもよい。
【００８３】
細胞の極性は、電気処理中または後でマンドレル上のフィブリン繊維の方向を管理することで制御できる。整列した（ａｌｉｇｎｅｄ）繊維の場合、この作業はおそらくは電気紡糸を用いて、回転している標的マンドレル上に電着することで達成できる。フィブリン繊維は回転方向にマンドレル周囲に巻き取られるだろう。静止した非回転電気紡糸マンドレル上に電気紡糸すると、より無作為な繊維マトリックスが生じるだろう。フィブリンは紡糸後に牽引またはその他形状の機械膨張により機械的に方向付けできる。電気処理されたフィブリンマトリックスが方向性を持つことは、細胞増殖を促進する上で有益であろう。
【００８４】
極性は、まず、回転しているマンドレル上に方向性をもったマトリックスを電着することで制御してもよい。次にマトリックスをマンドレルから切り取り、９０度（またはその他の回転角度）回転してからマンドレルに戻す。次に第一層の上に第二物質層を電気紡糸する。この方法は回転長軸に沿って整列されたフィブリン繊維の内層を作り出す。あるいはこの方法で作製されたフィブリン層の周囲を他の物質層で囲んでもよい。これら物質はＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＧＡ：ＰＬＡコポリマーのような生体適合物質を含む。
【００８５】
細胞極性は、バイオリアクター内に設置された牽引装置内に生物工学プラットホームを配置することで制御できる。時間をかけて構築体を横切る応力を徐々に加えることで、プラットホーム内の細胞は加えられた応力と平行に広がるだろう。
【００８６】
細胞は電気処理されたフィブリンと共に、同一タンクまたは別のタンクから電着してもよい。電気処理されたフィブリン生物工学プラットホームは、幹細胞のような細胞を操作するための分化プラットホームとして使用できる。電気処理されたフィブリンマトリックスの多孔性および化学組成は、製造前、製造中および製造後に制御できる。これにより、幹細胞の分化プロセスを制御するのに重要と信じられている、望ましい微小環境を作り出すことができる。
【００８７】
電導性物質は電気処理されたフィブリンマトリックス内または上に電着してもよい。このようにしてフィブリン含有構築体を電気刺激して、神経の内側への成長、幹細胞の分化または改変された筋肉の収縮を促進し、あるいはフィブリンが骨再生キャリアーとして使用されている整形外科応用での骨形成を促進することができる。電気処理により作られたフィブリンマトリックス内への電導性物質の取り込みは、製造後にフィブリンマトリックスの特性をさらに変更する手段として使用することもできる。例えば、存在するフィブリンマトリックスにわたり電界を印加することは、マトリックスの形状、多孔性または密度を変えるのに使用され得る。フィブリンマトリックスの安定性（分解耐性）は、フィブリンにわたって電界を印加することで変更されるだろう。磁性物質を、マトリックスを動かすことができるようにマトリックス内に置くことができる。例えば磁場を使うことで、比較的非侵襲的手段によりマトリックスの位置決めを行い、そして腹膜内のマトリックスの運動を方向付けできる。このような物質としては、カーボンブラックまたはグラファイト、カーボンナノチューブ、磁性流体および電導性ポリマーの各種分散体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。また電導性ポリマー繊維はフィブリン電気処理中に電気紡糸することで製造できる。さらに電導性ポリマーは、例えば重合開始剤および酸化剤（例えばＦｅＣｌ３）で処理した後でのモノマー（例えばピロール）の取り込みにより、原位置でフィブリン内に調製することができる。最後に電気処理後にフィブリン被覆コンダクターを例えばポリピロールまたはポリアニリンの電気化学合成アノードとして使用することで、電導性ポリマーをフィブリン内に成長させることができる。フィブリノーゲンをピロールまたはアニリン水溶液に加えることで、アノードに捕捉用フィブリノーゲンと一緒に電導性ポリマーを作ることができ、そして捕捉フィブリノーゲンはその後トロンビンで処理することができる。
【００８８】
フィブリンを含有する改変された組織は各種手段により血管化できる。血管形成因子マットが電気処理されたフィブリン内に供給される。電気処理されたフィブリンを含有する改変された組織は、網組織内に配置されることで血管を形成し得る。
【００８９】
フィブリンを含有する改変された組織をバイオリアクター内に入れて臓器を改変し、または細胞の遺伝子プロフィールを変えることができる。例えば細胞は患者から得て、患者のフィブリンを患者血漿より電気処理することができ、この電気処理されたフィブリンマトリックスを用いて患者より単離した細胞を支持することができる。これら細胞をトランスフェクションし、培養し、特性分析（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ）し、患者内に移植することができる。この方法を用いると、患者自身の物質だけが使用されることから、拒絶の可能性を最小限にすることができる。トランスフェクションは希望する応用に応じて、一時的または永久的な様式で発現され得る。
【００９０】
本発明では、初期には細胞は通常技術で培養される。適当な細胞密度に達した後、細胞は電気処理される前にフィブリン溶液内に懸濁される。あるいは、細胞をフィブリノーゲンまたはトロンビン溶液内に懸濁してから、この懸濁液を電気処理する。細胞がフィブリノーゲンに懸濁されている場合には、この懸濁液は電気処理、例えば噴霧または紡糸され、そしてこれとは別にトロンビン溶液がフィブリノーゲンスプレー内に噴霧されるか、またはフィブリノーゲン内に懸濁された細胞で被覆された標的上に噴霧される。したがってフィブリンは混合スプレー内または標的上に形成される。次にその中に細胞が埋め込まれた形の三次元フィブリン構造体が細胞培養装置に戻され、増殖が続けられる。以下の実施例で示すように、細胞はフィブリンネットワークに付着すると迅速に集合する。マトリックス内に懸濁する細胞のタイプによっては、細胞を、細胞のタイプに対応する正常組織または臓器と同一の生物学的外観での増殖を促進できる。
【００９１】
この電気処理されたフィブリン含有組織はいくつかの利点を提供する。それは組織を非常に高密度に増殖するのに使用できる固体支持体を提供する。これはフィブリンマトリックスを機械的または化学的に圧壊するだけで達成できる。これは問題の細胞の「増殖」段階および「使用／実用」段階が各種細胞密度を必要とする場合に有利である。例えば栄養および気体輸送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）の観点から、より希釈した場合に、より効率的に増殖細胞を得ることができる。増殖段階がなされている場合、マトリックスを圧壊することで細胞を濃縮でき、移植体またはその他試験に適した濃縮細胞「プラグ」を容易に提供できる。この電気処理されたフィブリン含有マトリックスは構築体の局所微小環境を管理し、確立する。マトリックスの物質特性を制御することで、構築体の浮遊性やマトリックスの多孔性および安定性を制御できる（すなわちそれを非常に安定なもの、または比較的短時間に分解するものにデザインできる）。それはバイオリアクター環境での使用に固有であり、かつ適応しやすい（ａｍｅｎａｂｌｅ）細胞培養または組織生物工学向けプラットホームを提供する。それはまた大型ではあるが手で操作できる、細胞培養および多様なタイプ組織の生物工学に適したプラットホームも提供する。また電気処理されたフィブリン含有マトリックスはペプチド成長因子、薬物または遺伝子配列、センスおよびアンチセンス方向の部分遺伝子配列に関する固相運搬装置を提供する。
【００９２】
本発明は、三次元の細胞増殖および組織／臓器合成を可能にする技術を記載する。転移の病理プロセスを模倣することで、細胞は電気処理された三次元フィブリンマトリックス内に配置されて、増殖および正常細胞間相互作用をサポートする。細胞はこれらフィブリン構造内で迅速に増殖し、正常組織および臓器内に見られる形状を呈するだろう。
【００９３】
電気処理されたフィブリンマトリックス内の細胞カプセル化
試験で使用される多くの電気処理の応用では、生物工学用の電気処理されたフィブリンマトリックスの製造には有機溶媒を使用してフィブリン形成可能分子を持ち込まなければならない。しかしフィブリンの電気処理工程中に、フィブリンマトリックス内に細胞を取り込むことが望まれる応用も多い。例えば生物工学軟骨または骨作製時には、電気処理されたフィブリンマトリックス製造時にその内にこれら組織の残存細胞を捕捉することが望ましい。生物工学用マトリックスの製造に最も効果的である多くの溶媒を使用した場合、これは不可能である。フィブリノーゲン溶液内、またはフィブリンマトリックス（例えば部分的または完全に重合させたフィブリンマトリックス）内に細胞を浮遊させれば、細胞をフィブリン製造中に電気処理されたフィブリンマトリックス内に運び込むことができるだろう。
【００９４】
マトリックスは各種因子および蛋白質で処理し、または播種してマトリックスのレシピエント環境内への分解／吸収を制御することもできる。このことは、例えばマトリックス内に播種された細胞の増殖が遅い場合、細胞の再生および増殖を可能にするのに十分な時間マトリックスの完全性を維持するのに有益である。一方、細胞が迅速に増殖し成長できる場合には、短命型のマトリックスが望ましいだろう。アプロチニン添加物、アミノカプロン酸または同様の繊維素分解阻害剤の濃度を変えること、またはマトリックス内の化学的または紫外線架橋の強さを変えることは、この変動の正確な制御に利用できるだろう。マトリックスには移植した際の血管の成長を促進するための血管形成因子、神経成長を促す神経成長因子、骨形成を促進する骨成長因子、および細胞分裂を促進するＰＤＧＦアイソマーを含む各種成長因子を接種することも可能であるが、もとよりこれら因子に限定されるものではない。フィブリン含有マトリックスに、治癒を促進する、免疫拒絶を最小限に留める因子を接種してもよい。フィブリン含有マトリックスに、炎症とそれに続く治癒を誘導するかまたは繊維カプセル（ＰＧＡ）形成を促進する作用物質を接種してもよい。添加可能なその他作用物質としては以下のものが挙げられるが、もとよりこれらに限定されるものではない：コルチゾンのような炎症抑制剤、他の抗炎症剤、ホルモン、シクロスポリンおよびその他抗拒絶剤、ならびにセンスおよびアンチセンス両方向の完全および部分長遺伝子配列。例えばマトリックス内のセンス方向のＶＥＧＦは、創傷に対する局所適用に使用される。この遺伝子配列は傷害部位近傍の細胞に運ばれ、これら細胞に一過的または永久的にトランスフェクションする。プロテアーゼを対象としたアンチセンス配列も利用できるだろう。この応用では、アンチセンス配列は完全長でも部分長でもよく、または複数の混合体でもよい。これらアンチセンス配列が運搬されると、一過的な様式にて標的分子の発現を抑制する。
【００９５】
細胞は、電気処理されたフィブリンマトリックスが製造されている最中にその中に配置してもよい。細胞はフィブリン、またはフィブリノーゲンもしくはトロンビンのようなフィブリンを形成可能な分子の同一溶液から、電気処理されたフィブリンと共に沈着される。別の実施形態では、細胞は第二供給源から電気処理中にフィブリンマトリックスに運搬される。実施形態の一つでは、細胞はフィブリン電気処理中にマンドレル上に滴下される。
【００９６】
細胞は、電気処理されたフィブリンマトリックスへの細胞運搬システムとして、エアロゾル内に浮遊させてもよい。細胞はフィブリンマトリックス形成中にこの様式で運搬される。心臓繊維芽細胞をリン酸干渉生理食塩水（ＰＢＳ）に約１ミリリットル当たり百万個の細胞濃度で懸濁した。この細胞懸濁液をパッシェ（Ｐａａｓｃｈｅ）エアブラシのタンク内に入れた。このタイプの装置を使った細胞運搬の効率を試験するために、本発明者らはまずこの細胞懸濁液を１００ｍｍ培養皿に噴霧した。生き残ったいくつかの細胞は皿に付着し、基体上に広がった。
【００９７】
第二試験では、培養皿をエアブラシからさらに遠くに置き、実験を繰り返した。細胞は皿の上に観察された。それらは衝撃により平坦になったように見え、その一部が基体表面に広がっていた。皿に培地を加えてから細胞をインキュベーター内に入れた。１時間の培養後、細胞を再度調べたところ多くの細胞がさらに基体上に広がっているのが見いだされた。これらの結果は単純なエアブラシ装置が、細胞をエアロゾル滴にして必要に応じて対象表面または部位に細胞を運搬するのに使用できることを示している。細胞生存率はこの技術を技術中に生ずる剪断力に耐性な細胞に制限すること、細胞を衝撃から守る添加物を加え細胞懸濁液を開発すること、またはより多くの層流を生ずるようにエアロゾル発生装置を改良することで改善される。さらに、細胞エアロゾルを、フィブリンフィラメントへ送ることは、フィブリンフィラメントが、マンドレルと電気処理されたフィブリンを形成可能な分子供給源との間の空隙で重合を進める場合には、細胞のクッションにもなるだろう。以下の説明と結びつける意図はないが、細胞は電気紡糸または電気処理で作られ、マンドレル上に引っ張られたフィラメントストーム（ｓｔｏｒｍ）内に捕捉されると考えられる。このやり方は、細胞を固体表面に直接噴霧することに比べ細胞への傷害が小さいものとされる。
【００９８】
細胞をフィブリンマトリックスに運搬する別の方法としては、細胞の電気エアロゾル運搬がある。細胞は８ｋＶで静電スプレーすることで標準的なポリスチレン製培養皿上に付着でき、静電的細胞スプレーが有効な方法であることを示唆している。本発明者らはまた心臓繊維芽細胞のＰＢＳ液を最大２０Ｋｖ電位差で電気エアロゾル化した。
【００９９】
シュワン細胞（ラット）を１日後に通常の方法でＰＳペトリ皿で平板培養した。またシュワン細胞を１日後に、皿後方に金属アースプレートが付いたＰＳペトリ皿の上に１０ｋＶで電気スプレーした。両サンプルは１週間後ほぼ周密状態まで増殖した。この方法はいくつかの著しい利点をもたらす。第一に運搬段階（すなわちエアロゾル産生時）に生ずる剪断力の細胞に対する傷害性がきわめて小さくなると思われる。第二は、エアロゾルの方向を高い忠実度で制御できることである。本質的に細胞エアロゾルは対象表面上に「塗布」することができる。これにより細胞を特定の部位に向けることができる。電気エアロゾル運搬では、細胞は適当な媒体（例えば培地、生理食塩水等）中に懸濁させられ、電圧がかけられ、そして接地標的に向けて送られる。この工程は電気処理、特に電気紡糸で使用される工程にきわめてよく似ている。これにより、それらが作られ接地標的に送られる時に、滴内に細胞を捕捉した微小霧が作られる。
【０１００】
細胞はエアロゾルおよび電気エアロゾル技術を用いて、電気処理技術により形成されたマトリックス、例えばフィブリンマトリックス上に運搬され、おそらくは電気紡糸により電着を受ける。細胞の電気エアロゾルは、フィブリンマトリックスの電気紡糸と平行して（すなわちフィブリンを電気紡糸する部位に沿って）、または別の場所から運搬されるだろう。細胞はフィブリン電気紡糸工程中の空隙内に作られたフィラメントストームに運ばれるか、または標的に送られる。細胞および電気処理されたフィブリンマトリックスはまた別の様式で標的に運ばれてもよく、すなわちマトリックスを電着し、細胞をエアロゾルにして運搬してもよい。これにより構築体を別個の層に分離することができる。細胞を回収するのに用いられる標的マンドレル上に水を送る蒸気源を設けることができる。これは細胞を処理中の脱水から守ることとなり、生存率が改善するだろう。
【０１０１】
エアロゾル法を使用する場合、細胞はいずれの時点またはいずれの方向からも電気処理されたフィブリンマトリックスに加えられるだろう。最後の考察は、細胞、または薬物、凝固因子、抗炎症剤、成長因子、抗菌剤またはＤＮＡのようなその他物質のエアロゾルを直接原位置部位に送達することである。例えば電気処理されたフィブリンマトリックス、おそらくは電気紡糸フィブリンマトリックスは、皮膚創傷部位上に、細胞存在下、または非存在下に直接作られるだろう。次に追加の細胞または物質がエアロゾルとして創傷部位の上または中に適用されるだろう。他の手術部位についても、電気エアロゾル、電気紡糸、電気スパッター、電気スプレーまたはそれら方法の組み合わせといった各種電着技術を用いた物質運搬が利用できるだろう。
【０１０２】
多くの潜在的用途を持つ細胞運搬に関するさらに別の実施形態は、細胞または薬物を、エアロゾルを作る前にキャリアー内に捕捉することである。例えば細胞または薬物、あるいはその他物質をアルギン酸塩のような物質内に封入する。封入された細胞は処理中の剪断力または傷害から物理的に保護される。この形で電気処理されたフィブリンマトリックスに運ばれた細胞は、スプレーまたは静電気的に播種された場合により高い生存率を有することが期待される。このタイプの方法は電気処理に用いられたフィブリン繊維と相互作用しない薬物またはペプチドのような捕捉物質の放出プロファイルを指定するのにも使用できる。例えばペニシリンのような薬物はフィブリンの電気紡糸マトリックスに結合または相互作用しない。しかしこの薬物はＰＧＡペレット、ＰＬＡペレット内に捕捉することができ、または電気エアロゾル化してフィブリンの電気紡糸マトリックス内にペレットを作ることもできる。ペニシリンを含むこのペレットまたは電気エアロゾル化滴は溶解を始め、捕捉した物質を送出する。放出プロファイルは、工程に使用する物質の成分により調整できる。細胞の運搬に加え、断片化した細胞の破砕体または細胞断片を、未処理細胞存在下または非存在下に電気処理されたフィブリンマトリックスに運搬してもよい。細胞断片はいくつかの組織で治癒を促進することが知られている。したがって、いくつかの応用では、電気処理中にフィブリン形成溶液内から直接、または別の供給源から間接的に電気処理されたフィブリンマトリックス内に細胞破砕体を取り込むことが望ましい。
【０１０３】
上記考察は電気処理された細胞外フィブリンマトリックスの構築に関し特異的なものに限定されている。組織または臓器（または臓器様組織）を構築するには、細胞をマトリックスに加える必要がある。好ましくは、細胞はフィブリノーゲンおよびトロンビン混合体を一緒にする前、またはそれと同時に加えられる。このようにして細胞は３次元マトリックス全体に懸濁（ｓｕｓｐｅｎｄ：浮遊）される。典型的には細胞はフィブリノーゲン（血漿または精製フィブリノーゲンでもよい）を含む混合体中に含まれる。フィブリノーゲンおよびトロンビンが、モールド内への挿入直前、または電気紡糸工程における流し込み段階直前に一緒にされると、懸濁液中に細胞が良好に分布し、細胞外マトリックスを得ることができる。細胞はまた形成中のマトリックス内に噴霧または滴下してマトリックスを形成してもよく、それによってマトリックスが供給源溶液と標的の間の空隙を横切る際に細胞が捕捉される。
【０１０４】
組織または臓器の作製には多くのタイプの細胞が利用できる。幹細胞、コミットした細胞、および／または分化した細胞が使用できる。また作られる組織または臓器のタイプによっては、特定のタイプのコミットした幹細胞が使用できる。例えば筋原細胞は各種筋肉構造の構築に使用でき、神経芽細胞は神経の構築に使用でき、骨芽細胞は骨形成のために選択できる。その他タイプのコミットした幹細胞および未決定の（ｕｎｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）胚性幹細胞、骨髄幹細胞および臍帯幹細胞を含む幹細胞を使って、肝臓、腎臓等の臓器または臓器様組織を作ることができる。同様に繊維芽細胞のような分化した細胞をフィブリンマトリックス内に用いて、これら細胞を特定の部位、例えば肝臓内に配置するための運搬装置となるパッチ、例えばヘルニアパッチ、皮膚向け内皮細胞、骨向け骨芽細胞、および死体ドナー膵臓島細胞のような分化した細胞（フィブリンを固相に用いる）を作ることができる。前述のように、フィブリン含有細胞外マトリックスの形状は、細胞を希望する方向の特定のタイプに成長させ増殖させる信号を細胞に送るのに役立つ。その他因子および分化誘導体をマトリックスに加えて、特定タイプの細胞の増殖を促進することができるだろう。さらに、細胞外マトリックス内に取り込まれるタイプの細胞の様々な混合体もあるだろう。これらは、例えば得られた「臓器」または「臓器様」組織の血管化を促進するのに利用できる。
【０１０５】
特定の疾患状態では、臓器は機能不全状態に成っている。その典型例は肝硬変である。肝硬変では正常肝細胞は瘢痕組織の繊維帯に捕捉されている。本明細書に記載の技術を用い、疾患肝臓を生検し、生存肝細胞を獲得し、本新規電気処理されたフィブリン含有細胞外マトリックス内にて増殖させ、通常の肝移植までの一時的橋渡しまたはそれに代わるものとして患者に細胞を再移植することができる。
【０１０６】
単分化能細胞株を三次元マトリックス内に混入する方法は、複合臓器を模した構造体の製造に利用できる。グルカゴン分泌細胞、インシュリン分泌細胞、ソマトスタチン分泌細胞、および／または膵臓ポリペプチド分泌細胞またはその組み合わせを別々の培養器内で培養し、次に電気処理によりそれらをフィブリンマトリックス内に一つに混合することで、人工膵臓島が作られる。次にこれら三次元構造体を、移植可能な糖尿病長期治療装置として皮膚下、腹腔内、肝臓内、またはその他所望の部位内に配置する。
【０１０７】
その他非限定的応用としては、ホルモン産生細胞が挙げられる。このカテゴリーには多くの応用がある、すなわち、例えばとりわけ成長ホルモン分泌、黄体形成ホルモン、濾胞刺激ホルモン、プロラクチンおよび甲状腺刺激ホルモンの合成および分泌に影響する下垂体前葉細胞の移植がある。ライディッヒ細胞や濾胞細胞といった生殖腺細胞が、テストステロンまたはエストロゲンレベルの補充に使用できる。特別にデザインされた組み合わせは、閉経後および前の女性のホルモン補充療法、あるいは内因性テストステロン分泌減少後の男性のホルモン補充療法に有益である。ドーパミン産生ニューロンは、黒質内の欠損または損傷ドーパミン細胞の補充を目的として、フィブリンマトリックス内に使用され、移植される。患者自身の幹細胞またはその他幹細胞を、若干損傷を受けた細胞、例えば膵臓島細胞または肝細胞と混合し、電気処理されたフィブリンマトリックス内に入れ、その後、幹細胞を所望のタイプの細胞に分化させてから回収することもできる。これはインビトロまたはインビボで実行できる。次に、新たに形成された分化した細胞が患者体内に導入される。
【０１０８】
電気処理されたフィブリンを用いた物質運搬
さらに、応用によっては、薬物、酸化防止剤、ビタミン、化粧品、核酸、ベクター、創傷治療製品およびホルモンを含む物質を比較的局所環境に、電気処理されたフィブリンを用いて運搬し閉じこめられるが、もとよりこれら物質に限定されるわけではない。その他物質および薬物を以下に非限定的に掲載する、すなわち抗生物質、抗菌剤、抗炎症剤または治癒を促進する物質、抗生物質、抗カビ剤、化学療法剤、抗真菌剤、鎮痛剤、ホルモン、皮膚軟化剤、湿潤剤、酸化防止剤、ビタミン、拒絶薬およびコンディショナー。いくつかの好ましい薬物または物質としては、エストロゲン、アンドロゲン、コルチゾン、シクロスポリン、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＦＧＦｂ、ＦＧＦａおよびＢＧＦ（骨成長因子）を含むペプチド成長因子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。望ましい物質または薬物は電気処理されたフィブリンと組み合わせられると理解すべきである。以下のパラグラフでは、薬物および物質は相互交換的に使用される。
【０１０９】
例えば圧迫性潰瘍（例えば床ずれ）については、単独または複数の薬物が電気処理されたフィブリンマトリックスにより局所に運搬されるだろう。事実上、電気処理されたフィブリンマトリックスはそれ自体が分解し自然に溶解することから、除去を必要とせずに薬物を送達する生物学的適合包帯として機能する。体全体を対象とした、より一般的な薬物送達では、電気処理されたフィブリンマトリックスは体腔内に挿入されるか、または皮下ドメイン内に置かれるだろう。いずれの場合も、薬物の放出は局所的または全身性、持続性またはより一過性に調整できる。
【０１１０】
電気処理されたフィブリンマトリックスは様々な形で薬物（または他の応用では制御的方法で放出しなければならない薬剤）を送達するのに用いられる。この工程で物質の処理に用いられるノズルまたは溶媒タンクの数に制限はない。
【０１１１】
薬物分子は、電気処理用のフィブリンを調製するのに使用される溶媒キャリアー内に混合される。このシステムでは、生物学的に適合した合成ポリマー（例えばＰＬＡまたはＰＧＡ、ポリマー配合体、またはその他ポリマー）、天然ポリマー（例えばフィブリノーゲン、トロンビン、フィブリン、またはフィブリンを形成可能なその他ポリマー、あるいは天然材料からなる合成ポリマー）を各種薬物と混合し、直接電気処理する。得られた電気処理されたフィブリン含有マトリックスは特定部位に局所適用でき、薬物はマトリックスから周辺環境内に分解していくフィブリンに相関して放出される。取り込まれた薬物に関連した電気処理されたフィブリンの状態は規定され、システムの化学により制御でき、フィブリン形成溶媒（複数可）と薬物の溶解性によって変わる。これらパラメータを操作して薬物の放出（または周囲環境へのその他要素の放出）を制御することができる。電気処理されたフィブリン含有マトリックスは、電気スプレーまたは電気スプレーと電気紡糸の組み合わせ、またはその他順番を変更した組み合わせにより作製することもできる。この方法は薬物送達について別の制御レベルを提供する。
【０１１２】
別の実施形態では、薬物は電気処理されたフィブリンに使用される物質と共に、懸濁した凝集体の集合として目的に合わせ作製される。このタイプの溶液の電気処理は、薬物粒子を電気処理されたフィブリンマトリックス内に物理的に取り込む。電気処理されたフィブリンマトリックスからの薬物分子の放出は、フィブリン分解と薬物粒子の周囲環境への溶解とに相関する。同一薬物を、懸濁液ではなく溶液として電気処理工程に使用すると、異なる放出パターンと、さらに別の工程制御レベルを得ることが期待される。他の例では、薬物粒子は電気処理されたフィブリンマトリックス内に捕捉される。放出は凝集、溶解およびフィブリンマトリックスの分解の複雑な相互作用により規定される。
【０１１３】
別の例では、薬物分子を電気処理されたフィブリンまたはフィブリノーゲンに共有結合または化学結合することが望まれる。理論ではこのような分子はポリマーキャリアー（ｃａｒｒｉｅｒ）が加水分解または酵素分解された時にのみ放出される。この方法は生体医療工学またはその他外科応用に特に魅力的である。血管形成ペプチドや神経成長因子といった薬物は、改変された組織を支持するのに用いられる電気処理されたフィブリンマトリックスのポリマー主鎖に結合される。この場合も、フィブリンマトリックスが溶解する際にペプチドは局所ドメイン中に勾配を形成しながら制御された様式で放出されるだろう。ペプチド勾配の形成は多くの生物学的プロセス、例えば血管新生にとって重要な調節成分である。外科応用では、抗血管ペプチドまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドは電気処理されたフィブリンマトリックス内に取り込まれ、次にそれを使って通常処置が及ばない腫瘍の周囲を包む。抗血管物質の放出は腫瘍の増殖を抑制するだろう。別の使用では、センスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチド（遺伝物質ではあるが完全長の遺伝子ではない）が、ある期間細胞機能を促進または阻害するのに使用される。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドを電気処理されたフィブリンマトリックスに使用して、創傷内の有害な酵素の発現を抑制できる。標的の一つは、慢性創傷で過剰発現されるＭＭＰと呼ばれる一群の酵素である。
【０１１４】
薬物はまた粒子、エアロゾルまたはおそらくは蒸気としても調製されるだろう。電気処理されたフィブリンマトリックスはこれら物質により紡がれ、フィブリンマトリックス内に運搬されるべき薬物を受動的に捕捉する。この工程はフィブリンマトリックス内への粒子または分子の物理的封じ込めに依存している。細胞または錠剤といった大型の対象物は、この方法を用いマトリックス内に捕捉できる。この後半の概念は、電気処理されたフィブリンマトリックス製造時に、ストリームまたはフィブリン形成溶液の上または中に物質を滴下するだけで達成できるだろう。
【０１１５】
電気処理されたフィブリンマトリックスからの薬物放出の制御は、電気処理時に磁性物質または電導性物質をフィブリンマトリックス内に引き込むか、取り込ませることでさらに制御される。電気紡糸マトリックスに機械応力を加えると、物質の結晶性を変化させその分解を早めることができる。安定性の同様の変化は、磁気感受性または電気感受性である物質を電気処理時にマトリックス内に取り込ませることで達成できるだろう。次に電気処理されたフィブリンマトリックスにわたって磁場または電界を印加して、マトリックス内の運動または立体構造変化を促し、これによって続いて電気処理されたフィブリンマトリックスからの物質の放出を促進する。上記は電気処理されたフィブリンマトリックスの配置を直接変化することにより立体構造を薬物放出により好ましいな形にすることで達成される。
【０１１６】
皮下またはその他の場所に置かれた磁気感受性または電気感受性物質は、長期間の薬物運搬に使用されるだろう。例えば磁気特性または電気特性、およびインスリンを持つ電気処理されたフィブリンマトリックスを作製し、皮下の目立たない場所に置くことができるだろう。電気処理されたフィブリンマトリックス全体にわたって磁場または電界に通すことで、薬物の放出を誘導することができる。これは、長期間にわたり電気処理されたフィブリンマトリックスから制御された形式で薬物を送達するのに利用できる。
【０１１７】
この課題の別の変形は、移植可能であり、刺激を受けるとカプセル化物質に力を及ぼすことができる電磁特性を持つ電気処理されたフィブリンマトリックスを作製することである。例えばこのような装置は、永久型にすることができるか、または経時的に溶解するために心臓が十分回復した後での装置の回収を目的とした手術を必要としない一時的な左心室補助装置として使用できるだろう。
【０１１８】
電気処理されたフィブリンを含む電気改変された組織の処置
電気処理されたフィブリンおよび細胞を含む電気改変された組織が組立てられたら、組織をレシピエント内に挿入できる。あるいは構造体を培養体の中に置き、細胞増殖を高めることができる。各種栄養および増殖因子を培養体に加え（またはレシピエントに投与し）、特定のタイプの改変された組織の増殖を促進することができる。一例では、改変された筋肉組織標本と特に結びついて、フィブリンおよび細胞を含む電気改変された組織を機械的または受動的に引っ張り（ｓｔｒａｉｎ）、あるいは電気的に前処理して、細胞の整列を促してより機能的な筋肉移植体を形成することができる。皮膚パッチでは、応力を加えることで、頭皮（ｓｃａｌｐ）のような、擦過傷といった強い引っ張り力に曝される部位への使用に適した皮膚の方向付けが容易になる。この文脈での受動的引張は、細胞がマトリックスと接触し、マトリックスを再編成した時に細胞自体により変形が誘導される工程を指す。これは典型的には、電気改変されたフィブリンマトリックスの端部を固定することで誘導される。細胞がマトリックスと接触してマトリックスを変化させる際、マトリックスの固定端が所定位置に留まるために、固定端が等張負荷に対向し「引っ張る」際に細胞を引っ張ることになる。この引張が細胞を整列させるだけでなく、増殖と発生に関するシグナルを細胞に伝える。構築体を外側から引っ張ることもでき、すなわち構築体を準備してから引っ張り、機械的に整列させることもできる。伸張（ｓｔｒｅｔｃｈ）は一般には時間をかけて徐々に行われる。フィブリンもまた伸張し、構築体に細胞を加える前委マトリックス内に整列させることができる（すなわちマトリックスを形成し、マトリックスを伸張し、次に細胞を加える）。
【０１１９】
電気処理された細胞−フィブリンマトリックスは、各種遺伝子治療を試験する上でも有用である。換言すれば、細胞／フィブリンを使ってインビトロで作業することにより、前もって選択しておいたＤＮＡを懸濁液内（細胞、フィブリン、血漿等のいずれか）に挿入することで異なるタイプの遺伝子治療および操作を行うことができる。技法をインビボで施行しようとした場合に比べ、インビトロではより広範囲の治療技法が利用できる。エレクトロポレーションといった非ウイルス性の技法は、フィブリンマトリックス内に挿入する前の培養細胞処理に使用できるだろう。それら培養細胞はまた、電気改変された組織をレシピエントに挿入する前にフィブリンマトリックス内で処理することもできる。インビトロでの遺伝子移入はレシピエントのウイルス産物への暴露を回避し、生殖細胞系にウイルスが取り込まれる可能性を回避する。これは第ＶＩＩＩ因子（抗血友病因子）の遺伝子のような大型の遺伝子を受け取るのに十分な大きさを持つウイルスコートを発見し、または改変するといった問題を回避する。しかしインビボの遺伝子治療は、フィブリンを本発明の電気処理技術で作製する時にＤＮＡをフィブリン内に取り込むことによって、インビボでフィブリンがゆっくり分解する際に一部のＤＮＡがインビボでフィブリンと接触した細胞に取り込まれることで達成される。このことは特に小型の遺伝子配列、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合に当てはまる。処理中または処理後にマトリックスに追加作用物質を加えることで、遺伝子トランスフェクション速度およびトランスフェクション効率を操作することができる。例えばマトリックスへのファイブロネクチン添加は細胞のピノサイトーシス活性（ｐｉｎｏｃｙｔｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を増加し、周辺マトリックスからの遺伝子配列を含む物質の取り込みを増やす。あるいは、遺伝子トランスフェクションに一般的に使用される作用物質、例えばリポフェクション剤をマトリックスに加えてもよい。
【０１２０】
改変された組織／臓器は患者の腫瘍細胞のインビトロ培養を可能にし、各種化学療法および放射線治療に対する感受性をインビトロで特定することを可能にする。この方法は本質的に診断ツールとしてマトリックスを使用する。この方法では、代替可能な化学療法および放射線治療法を分析して特定の患者に最適な治療法を予測する。例えば、フィブリンおよびガン細胞、好ましくは患者自身のガン細胞を含む改変された組織を作ることができる。この組織の複数のサンプルを次に複数の異なる癌治療法にかける。異なる治療法の結果を次に直接相互に比較して、その効能を評価することができる。
【０１２１】
改変されたフィブリン移植体およびバイオリアクター
改変されたフィブリン移植体は以下の成分を１またはそれ以上含むが、以下は非限定リストである。それらは骨格筋、心筋、神経ガイド、事故または病気の間に失われた脳の損傷／除去領域を満たすものとしての脳構造体、軟骨スカフォールド、美容修復用シート、皮膚（皮膚等価物にすべく細胞が加えられたシート）、血管移植体およびその成分、局所適用シート（皮膚を被覆するが細胞は含まない−パッチのようなもの）、薬物ならびに物質運搬体。
【０１２２】
剪断力の小さい、高い栄養物灌流環境を提供するよう設計された装置である市販バイオリアクターにはいくつかの種類がある。最近までは多くの入手可能なバイオリアクターは細胞を浮遊液の状態に保ち、栄養と酸素をインペラーまたはその他撹拌手段を使って散布により供給した。ＲＣＣＳバイオリアクター（Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ）は回転壁型バイオリアクターである。それは小型の内側シリンダーと、より大型の外側シリンダー内側に取り付けられた電気紡糸工程用の基体から構成されている。電気紡糸または電気エアロゾルフィブリン含有マトリックスは内側シリンダーの上で作製することができるが、接種のための場所としてはフィブリンマトリックス用にバイオリアクター内の別の場所を使用してもよい。内側シリンダーと外側シリンダーの間の間隙が細胞の培養容器空間として機能する。培地は外部疎水メンブレンを通し酸素供給される。Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎ　ＲＣＣＳバイオリアクターの低い剪断環境は、活発な撹拌または散布により起こる損傷、または栄養の「洗い流し」なしに、細胞間および細胞−細胞外マトリックス（ＥＣＭ）間の相互作用を促進する。典型的には、ＲＣＣＳ装置は細胞を浮遊液状態に保つことが求められるので回転速度８から６０ＲＰＭまで、そして容器の中央シャフトに沿って固定化された培養体については８ＲＰＭ未満（好ましくは２〜３ＲＰＭ）で運転される。Ｓｙｎｔｈｅｃｏｎバイオリアクターは標準的な組織培養インキュベーターの中で使用することができる。この場合の回転速度およびその他パラメータの値は、作製される具体的な組織に応じて変わるだろう。
【０１２３】
電気処理されたフィブリン、特に架橋型の電気処理されたフィブリンは人工器官の形成に有用である。電気処理されたフィブリンの一応用例は、媒体および小径の人工血管の形成にある。例としてはバイパスまたは移植用冠状血管、大腿動脈、膝窩動脈、上腕動脈、頸骨動脈、橈骨動脈またはそれらに対応する静脈が含まれるが、これらに限定されるものではない。電気処理されたフィブリンは人工血管、例えばコラーゲンチューブの内側に内皮細胞を組み合わせた時、およびコラーゲンチューブの外側に繊維芽細胞を組み合わせた時に特に有用である。先細および／または枝分かれした血管を含むより複雑な形状も作られる。必要なものはその周囲に大型の繊維を巻き取る、または電気紡糸／電気エアロゾルポリマーの方向付けを行うための異なる形状を持ったマンドレルだけである。
【０１２４】
電気処理されたフィブリンおよび巻き取られたポリマー繊維の組み合わせは、細胞に最適な増殖条件を提供できる。ポリマーは基本構造マトリックスを形成し、電気処理されたフィブリンマトリックスは細胞の運搬に用いられる。これにより細胞の構造マトリックスへの付着が促進される。さらにポリマー内の応力がマトリックス内のフィブリン繊維を方向付けし、細胞に追加の空間的な手がかりを提供する。
【０１２５】
別の製造方法では、円筒状の構築物が好ましい標的、例えば円筒形のマンドレルの上に電気紡糸される。その他の形状も可能であり、その形状は移植体を内部に設置しようとしている部位の形状によって決まる。このマトリックスは電気処理されたフィブリノーゲン／フィブリン（例えば血管新生、細胞統合および周辺組織からの侵入を促進する）、コラーゲン（細胞侵入の促進および機械的保全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）の付与）および例えばＰＧＡ、ＰＬＡおよびＰＧＡ−ＰＬＡ配合体、ＰＥＯ、ＰＶＡまたはその他配合体といったその他成分から構成され得る。この構築体の各種成分の相対比は特定の応用に合わせ調整することができる（例えば皮膚移植体の血管化を促進するためにフィブリンを多くしてコラーゲンを少なくする）。円筒形の筋肉を作る場合は、構築体を筋肉細胞または幹細胞、あるいはその他のタイプの細胞で満たし、電気紡糸構築体の遠位端を縫合するか、密閉する。細胞は各種マトリックス物質と混合して、構築体内でのそれら分布を促進することができる。例えば細胞は構築体挿入前に電気処理されたフィブリンまたはコラーゲンと混合され得る。この方法の目的は、構築体に追加の機械的支持を提供すること、および構築体内の細胞に三次元マトリックスを提供して増殖を促進することである。このことは同時に構築体内の細胞の均一な分布を維持するのにも役立つ。この方法を用いて構築体内の細胞が整列するのを促進することができる。この「充填」物質は、充填物質を押し出した時整列が起きる場合には、円筒構築体内に直接押し出してもよい。血管新生を加速するために、内皮細胞を構築体内に挿入される別の細胞（あるいは別のタイプの細胞）と混合することができる。この目的を達成する別の方法は、内皮細胞を円筒鞘の形成を補助するのに役立つ電気処理されたフィブリンマトリックス内に直接電気紡糸することである。構築体を含む電気紡糸マトリックス内の繊維の並びは、互いに関して標的と供給源溶液相互の相対運動を管理することで制御できる。腱繊維芽細胞のような別のタイプの細胞を構築体外面内または外面上に電気紡糸して、構築体を形成する外側結合組織鞘の形成を促進することもできる。本明細書記載の別の設計原理は、例えばペプチド成長因子、抗生物質および／または抗拒絶薬を電気紡糸マトリックスと結びつけて用いることである。構築体全体は通常の培養法であるバイオリアクター内で培養でき、あるいはインビボに直接置くことができる。他の細胞タイプの使用により、他の組織タイプを製造できる。
【０１２６】
電気処理されたフィブリンを含む改変された組織の血管新生は手術後数日で原位置で生じる。さらに上記の如くそれは血管形成および成長促進因子で刺激され、ペプチド、タンパク質または遺伝子治療として投与される。電気処理されたフィブリンを含む改変された構築体の血管新生はまた、作製時に内皮細胞を構築体内に混入することで高めることができる。血管供給（ｖａｓｃｕｌａｒ ｓｕｐｐｌｙ）を有する電気処理されたフィブリンを含む改変された組織を供給する別の方法は、網内に組織を一時的に移植する方法である。網は血管供給にきわめて富んでおり、この血管供給は、改変された組織を支える、生きているインキュベーターとして利用することができる。改変された組織はバイオリアクターから取り出され、網に包まれ、網内の周辺組織からの栄養および酸素の拡散により支持される。あるいは、またはこの方法に加えて、改変された組織は網の内因性血管供給に直接接続される。血管は部分的に孔が開けられるか、または切られるか、あるいは網の切断面をそのままにする。電気処理されたフィブリンを含む改変された組織で血管の周囲を包む。改変された組織は孔の開いた血管から漏れる栄養により、または血管が無傷のままのこされている場合には単純な栄養の拡散によって支持される。方法にかかわらず改変された組織は網とその豊富な供給血管にくるまれる。
【０１２７】
電気処理されたフィブリンを含む組織は内因性の血管系と共に改変してもよい。この血管系は人工血管、または移植体レシピエントのドナー部位から切り出した血管から構成され得る。次に電気処理されたフィブリンを含む改変された組織を血管周囲に組み立てる。改変された組織を組み立てている間または後で、その組織で血管を包むことで、改変された組織はレシピエントの血管系に結合できる血管を持つ。この例では、網内の血管が切られ、改変された組織の欠陥が網血管の２カ所の自由端に接続する。血液は網血管から改変された組織の血管系に流れ込み、組織を通り、網血管に戻る。組織を網内に包み、それを網血管系に接続することで、改変された組織は網からの、および製造中に組織内に取り込まれた血管からの栄養の拡散によって支えられる。好ましいな期間を経た後、組織は網から取り出され、レシピエントの正しい部位に配置される。この方法を利用することで電気処理されたフィブリンを含む改変された組織は、バイオリアクターから取り出された後最初の数日間は豊かな栄養環境に支えられる。網の環境はまた移植組織内の新血管形成を促進する。この網インキュベーター法は電気処理中にフィブリンに血管形成因子を組み合わせるような、別の方法と組み合わせることができる。いくつかの選択肢がある。第一の選択肢では、移植体を血管芽細胞および／または内皮細胞を一緒に接種して、血管要素の形成を加速してから改変された組織を原位置に置くことができる。第二の選択肢では、浸透圧ポンプを使って血管形成ペプチドを改変された組織内に導入することができる。浸透圧ポンプを使うことでペプチド、または上記のように、血管形成ペプチドまたは成長因子を生物学的に効果的かつ経済効果的に対象部位に直接運搬することができる。ウサギの虚血状態の後ろ脚にＶＥＧＦを与えたところ、毛細血管床の成長を加速し、血管の分枝を増やし、虚血状態のコントロールに比べ筋肉性能が改善した。別の方法は、原位置で移植する直前に電気処理されたフィブリンを含む完全に分化した組織構築体に追加の内皮細胞および／または血管芽細胞を「接種する」方法である。電気処理されたフィブリンマトリックスへの血管形成作用物質を取り込ませる方法も利用できる。マトリックスは徐々に分解／崩壊してこれら因子を放出し、血管の成長を加速させる。神経成長因子をマトリックス上に電気紡糸して、マトリックスおよび組織への神経の成長を促進させることができる。
【０１２８】
幹細胞または移植体構築に使用されるその他細胞は被検体、または組織再構築を必要としているその他適合ドナーから単離できる。これは、細胞が再構築を必要としている被検体（自己組織）に由来するため、免疫反応を誘導しない細胞を使用する利点を与える。比較的小規模の生検を行うことで、移植体の構築に十分な数の細胞を得ることができる。これにより細胞提供部位として作用する内因性組織に対する機能的損失および損傷は最小限にとどめられる。
【０１２９】
本発明を以下実施例によりさらに例示するが、これら実施例はいかなる形でも本発明の範囲を制限するものではない。むしろ手段には様々なその他実施形態、変形およびその等価物があり、それらは本明細書の説明を読んだ後では、本発明の精神から逸脱することなく当業者に思い浮かぶものであることを明瞭に理解しなければならない。
【０１３０】
【実施例１】
細胞培養
複数のタイプの細胞を、フィブリンおよび血漿を用いた実験に使用した：
ａ）切断型ＳＣＩＰ転写因子を持つトランスジェニックマウス由来シュワン細胞。これら細胞はインビボでは未熟で過剰のミエリン化を示した。この細胞系は、特別な因子なしに容易に大量培養できることから選ばれた。
ｂ）座骨神経由来初代ラットシュワン細胞。これら細胞は以下の実験条件では分裂しない。これら試験細胞は細胞系を由来ではなかった。
【０１３１】
いずれの場合も、細胞は１０％ウシ血清および１％ストレプトマイシン−ペニシリンが増補されたダルベッコの改良型無ピルビン酸イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）の入った１０．５ｃｍ２のプラスチック製培養フラスコ内に維持された。培養体は３７℃、７％ＣＯ２および１００％相対湿度（ＲＨ）のインキュベーター内に置かれた。
【０１３２】
タイプ（ａ）の細胞を周密状態（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで培養してから集めた。タイプ（ｂ）の細胞は必要に応じて集めた。タイプ（ｃ）の細胞は半周密培養で増殖してから、数回パッセージ（ｐａｓｓａｇｅ：継代）した。使用するために細胞を取り出すには、成長培地を取り除き（ｄｒａｉｎｅｄ）、細胞が皿の底から剥がれるまで培養体を１ｍＬトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）で処理した。次に４ｍＬの新鮮培地でトリプシンを中和し、フラスコ内容物を遠心チューブに移した。細胞を１３０ｇ、５分間の遠心分離で濃縮した。上清を取り除き、細胞を新鮮培地内にタイプ（ａ）および（ｃ）の細胞の場合は約１０６細胞／ｍＬ、そしてタイプ（ｂ）の細胞の場合は２〜５×１０５細胞／ｍＬの密度に再懸濁した。これら細胞懸濁液を以下実験のいくつかに用いた。
【０１３３】
【実施例２】
トロンビン、フィブリノーゲンおよび血漿保存溶液の調製
トロンビンはＢａｘｔｅｒ社より凍結乾燥粉末として得て、１０ｍＭの塩化カルシウム脱イオン水液に５０単位／ｍＬの濃度に溶解した。あるいは凍結乾燥トロンビン（Ｓｉｇｍａ、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ、等）を０．１５Ｍ　ＮａＣｌに溶解し、凝固塊形成時にカルシウムを加えてもよい。血液は無菌的、非外傷的に正常ボランティアより静脈穿刺して得た。血液は３．８％クエン酸ナトリウムを含む青キャップ真空採血管（ｂｌｕｅ ｔｏｐ ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ ｔｕｂｅｓ）に集めた。カルシウムのクエン酸への結合がサンプルの凝固を阻止した。貧血小板血漿は１０，０００ｇ、５分間の遠心分離で調製した。細胞の上１ｃｍの深さの血漿を残すように紡糸（ｓｐｕｎ）チューブの上部から血漿を捨て、細胞汚染を最小限にとどめた。クエン酸塩加貧血小板血漿を無菌条件下に０．４５ミクロンフィルターを通して濾過し、微細粒子成分を除いた。未使用部分は４℃で最大３週間まで保存された。フィブリノーゲンはＳｉｇｍａ社より凍結乾燥粉末として入手し、滅菌１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．４および０．１３８Ｍ　ＮａＣｌに濃度３ｍｇ／ｍＬ（血漿中の概ねの濃度）に溶解してすぐに使用した。
【０１３４】
【実施例３】
電気処理されたフィブリンおよび細胞の方向付け
細胞は、細胞のニーズを満たすためにその環境に適合することが知られている。筋細胞およびシュワン細胞は共に、高度に方向性を持った構造体になるようにフィブリン鎖を自己再編成する。電気処理されたフィブリンマトリックス内の細胞は、機械力を加えて方向を整えることができる。
【０１３５】
電気処理されたフィブリンマトリックスおよび細胞（繊維芽細胞）を含む、皮膚として使用される電気処理された組織に以下の方法で力を加えた。Ｄｕｐｏｎｔ社製のポリイミドポリマー撚糸である滅菌したＮｏｒｍｅｘ糸１１の短片を電気処理された組織の各端部に取り付けた（図１）。次にＮｏｒｍｅｘ糸１１の各端部に５ｍｍ厚のポリスチレンホルダー１３を嵌め合わせた一組のナイロンネジ１２を取り付けた。ネジ１２とホルダー１３との間には、ネジがセットされた後いかなる動きも阻止するのに十分な摩擦が存在する。フィブリンが電気処理された組織内でピンと張り、加えられた引っ張りで整列が見られるまでナイロンネジ１２を僅かに回してＮｏｒｍｅｘ糸１１に張力を加える。実験の残りの装置に他のどんな調節も行わない。コントロール操作は、同様の電気処理された組織を用いて、この組織に外部から引っ張り力を加えないことで行った。力が加えられた組織は繊維芽細胞の整列を示し、力が加えられなかった組織に比べより大きな引っ張り強度を示した。
【０１３６】
【実施例４】
電気エアロゾルフィブリンおよび細胞
通常の血漿で希釈した細胞懸濁液２０およびトロンビン保存溶液２１（それぞれ〜１ｍＬ）を別々の３ｍＬプラスチック製注射器２２に充填した（図２）。注射器２２を別々の注射器ポンプに差し込み、サイズ１３のタイゴン（Ｔｙｇｏｎ）チューブ２４を介して混合Ｔ字管２３に接続した。混合Ｔ字管の出口は２７ゲージの針２５で終わっていた。この針をＳｐｅｌｌｍａｎ　ＣＺＥ　１０００Ｒ高電圧電源２６の一方の極に接続した。もう一方の極にはプラスチック製培養皿の後方に取り付けられたステンレス鋼フォイル２７が接続された。混合Ｔ字管２３は培養皿から約１０ｃｍのところに配置された。各ポンプを１．１５ｍＬ／分の供給速度に設定し、−１０ｋＶの電位を加えてフィブリン／細胞を針２５先端部から培養皿に伝わり落とした（ｄｒｏｐ）。
【０１３７】
【実施例５】
電気処理されたフィブリンマトリックス内の細胞に対する物質の生物学活性の評価
５４歳の男性が悪性黒色腫と診断された。黒色腫細胞を生検で取り出し、培養した。培養黒色腫細胞を帯電シリンジ内に充填した。別の実験では、培養黒色腫細胞をエアロゾル装置に充填した。電気処理されたフィブリンマトリックスを形成し、メラノーマ細胞を、形成中のフィブリンマトリックス内に電着するか、またはエアロゾル法を使って形成中のフィブリンマトリックスに加えた。これらサンプルを５０作製した。
【０１３８】
電気処理されたフィブリンマトリックス内の黒色腫細胞の異なるサンプルに、黒色腫に効くと言われる１つまたはそれ以上の化学療法剤の用量域を作用させた。化学療法剤に曝した後、選択時間間隔で分裂指数を計算した。トリパンブルー排除も同時に調べた。結果は、いずれの薬剤も黒色腫細胞の分裂を抑制し、細胞生存率に影響を及ぼすことを示した。
【０１３９】
【実施例６】
電気処理されたフィブリンマトリックス内の人口膵臓島
培養インスリン分泌細胞の混合体を電気処理されたフィブリンマトリックス内に接種し、電気処理されたフィブリン含有組織を形成する。インスリン分泌細胞を含む電気処理されたフィブリンマトリックスを、インスリンを必要とする糖尿病レシピエント内に移植する。この電気処理されたフィブリン含有組織は任意選択的にさらに血管を含む。マトリックスは腹膜後空間に移植され、血管が肝門脈循環に吻合される。インスリンはインスリン含有細胞から放出され、循環系に送られる。
【０１４０】
インスリン分泌細胞を含む電気処理されたフィブリンマトリックスは、膵臓島のホルモン補充を模倣するために、任意選択的にグルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを合成し、分泌する細胞を補充される。
【０１４１】
【実施例７】
電気処理されたフィブリンマトリックス内の電気処理されたシュワン細胞
本実験は、まずペリスタリックポンプを使用し、その後に２台の注射器注入ポンプを使って実施した。実験はまた２〜３ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンまたはヒト血漿を用いて懸濁された細胞を使って行われた。
【０１４２】
以下に注入ポンプを使って実施した場合を記載するが、これはペリスタリックポンプを使用し実施したものと同様である。細胞（ワインスタインシュワン）を０．４μｍフィルター濾過した血漿（フィブリノーゲンをすでに含有している）または２〜４ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンが増加された標準のイーグル培地中に１０５ないし１０７の間の濃度で接種した。細胞懸濁液１ｍＬ当たり１０，０００ｋＩＵのアプロチニン１０μＬを添加し、凝固塊の分解を遅らせた。この懸濁液を３ｍＬのプラスチック製注射器に充填した。２本目の３ｍＬ注射器を、十分量の塩化カルシウムが補給された５０〜２００ＩＵ／ｍＬの間のトロンビン濾過溶液で満たし、最終混合液がゲルになるようにした。これら混合液を層流フード下で処理し、無菌状態を保った。
【０１４３】
各注射器を別々の注射器注入ポンプに設置した。二重ポンプを使うことで、フィブリノーゲンに対するトロンビンの濃度を変化させることが可能となり、そのため、凝固速度に影響が及ぼされた。注射器の出口は、短い長さのサイズ１３のタイゴンチュービング（ｔｕｂｉｎｇ）を介して混合Ｔ字管に接続されている。この出口は電気紡糸設定段階（ｓｅｔｕｐ）で一方の電極として機能する金属製の注射針（各種ゲージを使用した、１８〜２７）から構成された。標的は混合Ｔ字管の出口から約１０ｃｍ離れて設置された標準的なプラスチック製培養皿から構成された。この皿の背面にはアルミニウムホイルがテープで取り付けられており、これが対電極を提供している。電着を実行するには、ポンプを始動し（０．２５ｍｌ／分未満〜数ｍＬ／分の流速を使用）、印加する電圧を電着が進行する電圧まで（４−６ｋＶ）ゆっくりと増加した。実験は１０分以内で終了させ、チュービング／注射器内の細胞の沈降を最小限にした。電着後、１０μＬ／ｍＬのアプロチニンが増加した培地で皿をトッピングする前に、３７℃インキュベーター内で約１時間ゲルを硬化させた。結果を分析した結果、電気処理されたフィブリンマトリックス内に健康と思われるシュワン細胞が示された。
【０１４４】
【実施例８】
電気処理されたフィブリンマトリックス内の薬物送達
各種濃度の神経成長因子をフィブリノーゲン溶液に添加し、ウエル当たり約１０，０００個の神経芽細胞を含む９６ウエル型培養皿に電気スプレートロンビン溶液と平行して電気スプレーした。これらのウエルは細胞、および神経成長因子を含む電気処理されたフィブリンマトリックスも含むようになった。フィブリンはゆっくり溶解し、神経芽細胞は神経成長因子に反応して用量依存的に増殖した。
【０１４５】
別の実験では、神経成長因子を含む電気処理されたフィブリンマトリックスを同様の方法で調製し、損傷（ｆａｌｌ）で傷を負った動物の下部頸髄の外傷部分に挿入する。同様の外傷を負った別の動物には神経成長因子を含まない電気処理されたフィブリンマトリックスを与えた。動物の回復速度を求めた。神経成長因子を含む電気処理されたフィブリンマトリックスを与えられている動物は、前足の運動機能のより早い回復を示す。
【０１４６】
上記引用の全ての特許、公開物および要約はその全体が参照により本明細書に援用されている。上記は本発明の好ましい実施形態にのみ関係するものであること、および以下の特許請求の範囲に定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく多くの変更または改変が本発明において可能であることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
電気処理されたフィブリンに引張を施す装置の概略図である。
【図２】
電気紡糸装置の概略図である。
【図３】
電気処理装置および回転壁型バイオリアクターを含む、電気処理装置の概略図である。
【図４】
電気処理装置および回転壁型バイオリアクターを含む、電気処理装置の概略図である。
【図５】
電気処理装置、および成型された標的に向けられた電気処理された物質を表す概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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