(57)【要約】本発明は、末端メチル基を有するテルペン類、例えばＤ−またはＬ−リモネン、を微生物細胞またはその溶解物と接触させることを含むヒドロキシメチル化されたテルペン類、例えば（＋）または（−）ペリリルアルコール、の製造法であって、該微生物細胞が、末端メチル基を有するテルペン類の、ヒドロキシメチル化されたテルペン類へのヒドロキシル化が生じるような条件下でｎ−アルカンの末端ヒドロキシル化を行うことができるモノオキシゲナーゼを発現することができるところの方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
末端メチル基を有するテルペン類を微生物細胞またはその溶解物と接触させることを含むヒドロキシメチル化されたテルペン類の製造法であって、該微生物細胞が、末端メチル基を有するテルペン類の、ヒドロキシメチル化されたテルペン類へのヒドロキシル化が生じるような条件下でｎ−アルカンの末端ヒドロキシル化を行うことができるモノオキシゲナーゼを発現することができるところの方法。
【請求項２】
ヒドロキシメチル化されたテルペン類がペリリルアルコールであり、かつ末端メチル基を有するテルペン類がＤ−またはＬ−リモネンである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
微生物細胞が真菌、細菌または酵母細胞である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
細菌細胞が、コリネバクテリウム（Corynebacterium）、アースロバクター（Arthrobacter）、ロドコッカス（Rhodococcus）、ノカルディア（Nocardia）またはマイコバクテリウム（Mycobacterium）属のＣＮＭ細菌細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ロドコッカス（Rhodococcus）細胞が、ロドコッカス・ｓｐ．ＡＬＫ２−Ｅ１またはロドコッカス・ｓｐ．ＨＸＮ−１９００細胞である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
マイコバクテリウム（Mycobacterium）細胞が、マイコバクテリウムｓｐ．ＨＸＮ−１５００細胞（ＣＢＳ１０９２８２）である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
細菌細胞が、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属由来である、請求項３記載の方法。
【請求項８】
スフィンゴモナス（Sphingomonas）細胞が、スフィンゴモナス・ｓｐ．ＨＸＮ２００細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
微生物細胞が、単離された天然に存在する微生物細胞である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
微生物細胞が、組換え細胞である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
組換え細胞が、組換え細胞の天然に存在する形態が含み得るところの、モノオキシゲナーゼをコードする何らかのポリヌクレオチドに加えて、モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ後者のモノオキシゲナーゼポリヌクレオチドが発現され得る、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
組換え細胞の天然に存在する形態が含み得るところの、モノオキシゲナーゼをコードする何らかのポリヌクレオチドに加えての、モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドが、組換え細胞の天然に存在する形態が含む、モノオキシゲナーゼをコードする何らかのポリヌクレオチドと同じである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
組換え細胞の天然に存在する形態が含み得るところの、モノオキシゲナーゼをコードする何らかのポリヌクレオチドに加えての、モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドが、組換え細胞の天然に存在する形態が含む、モノオキシゲナーゼをコードする何らかのポリヌクレオチドと異なる、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
インキュベーションが１５〜４０℃の温度で行われる、請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
インキュベーションが２０〜３７℃の温度で行われる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
（＋）または（−）ペリリルアルコールが、形成される実質的に唯一のヒドロキシル化生成物である、請求項１〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
何らかのペリリルアルコールが、完全にまたは部分的にペリリルアルデヒドまたはペリリル酸にさらに転化される、請求項１〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
末端メチル基を有するテルペン類が、リモネンのそれと類似のまたは同一の炭素骨格を有する環式モノテルペンである、請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
環式モノテルペンが、（１Ｒ）−（＋）−トランス−イソリモネン（CAS5113-87-1）、アルファ−テルピネン（CAS99-86-5）、ガンマ−テルピネン（CAS99-85-4）、アルファ−フェランドレン、ラセミ混合物（CAS99-83-2）、Ｒ（−）アルファ−フェランドレン（CAS4221-98-1）、テルピノレン（CAS586-62-9）、（＋）−ｐ−メト−１−エン（CAS1195-31-9）、（＋）−トランス−ｐ−メト−２−エン（CAS5113-93-9）、４−メチル−１−イソプロピルシクロヘキセン（CAS500-00-5）、ｐ−メンタン（CAS99-82-1）、デヒドロｐ−シメン（CAS1195-32-0）、２−カレン（CAS554-61-0）、（＋）−２−カレン（CAS4497-92-1）、デルタ−３−カレン（CAS13466-78-9）または（＋）−３−カレン（498-15-7）である、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ヒドロキシメチル化されたテルペン類の製造において、請求項１〜１３のいずれか１項で定義された微生物細胞またはその溶解物を使用する方法。
【請求項２１】
請求項１〜１３のいずれか１項で定義された微生物細胞またはその溶解物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物細胞またはその溶解物を使用する、末端メチル基を有するテルペン類からヒドロキシメチル化されたテルペン類を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｄ−リモネンの酸化誘導体、例えばカルベオール、カルボン、ペリリルアルコールおよびペリリル酸、は、例えば香料、芳香剤および薬剤産業において多くの用途を有する。特に、（−）ペリリルアルコールの製造は、比較的高用量（１日に数ｇ）で投与されるとき、その立証された抗発癌特性の点で商業的に興味深い。乳癌、膵臓癌および結腸直腸癌の治療に関するペリリルアルコールの評価を行うためのII期試験が進行中である。
【０００３】
しかし、Ｄ−リモネンは安価でありかつ広く入手可能な化学薬品であるが、その酸化誘導体は比較的高価である。この理由の１つは、化学触媒作用によってＤ−リモネンにカルボニル基またはヒドロキシ基を部位特異的に導入することが周知のように困難であることである。これは、アリル性メチレン基（炭素１および２）およびアリル性メチル基（炭素５および６）の類似した電気特性故である。すなわち、化学触媒作用中に他の酸化生成物が生じ、そのような他の酸化生成物からペリリルアルコールをさらに分離することを必要とする。
【０００４】
リモネンをペリリルアルコールに変えることができると今まで記載された唯一の微生物酵素系が、バチラス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）ＢＲ３８８において見出された。しかし、この酵素系は、完全には部位特異的でなく（大腸菌においてクローン化されても完全には部位特異的でない）、そして、有意の量のカルベオール、カルボンおよびテルピネオールが共産生された（米国特許第５，６８８，６７３号）。カルベオール、ペリリルアルコールおよびテルピネオールのいくつかの物理的特性、例えば沸点および疎水性、がリモネンのものとほとんど同じなので、この酵素系を使用するペリリルアルコールの工業的製造は魅力的でない。十分に純粋なペリリルアルコールを得るためには、費用のかかる（例えばクロマトグラフィーによる）精製法が必要であろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明者らは、Ｄ−またはＬ−リモネンをその７位で非常に特異的にヒドロキシル化して他のヒドロキシル化生成物を実質的に含まないペリリルアルコールの製造をもたらすことができるグラム陽性菌のある範囲のｎ−アルカン減成性（degrading）株を同定した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
すなわち、本発明によれば、末端メチル基を有するテルペン類を微生物細胞またはその溶解物と接触させることを含むヒドロキシメチル化されたテルペン類の製造法が提供され、ここで、該微生物細胞は、末端メチル基を有するテルペン類の、ヒドロキシメチル化されたテルペン類へのヒドロキシル化が生じるような条件下でｎ−アルカンの末端ヒドロキシル化を行うことができるモノオキシゲナーゼを発現することができる。
【０００７】
本発明はまた、ヒドロキシメチル化されたテルペン類の製造における、ｎ−アルカンの末端ヒドロキシル化を行うことができるモノオキシゲナーゼを発現することができる微生物細胞またはその溶解物の使用方法；およびｎ−アルカンの末端ヒドロキシル化を行うことができるモノオキシゲナーゼを発現することができる組換え微生物細胞またはその溶解物をも提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
図１は、ロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＡＬＫ２−Ｅ１の洗浄されたオクタン増殖された細胞（３ｇ乾燥重量／リットル）によるＤ−リモネンからの（＋）ペリリルアルコール（■）の生成の動力学を示すグラフである。低濃度のペリリルアルデヒド（●）およびペリリン酸（◆）も生成した。他の酸化生成物または部位異性体（例えばカルベオール）は検出されなかった。ペリリルアルコール生成の初期比活性は０．３Ｕ（ｇ乾燥重量）-1であった。
【０００９】
図２は、ロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＨＸＮ１９００の洗浄されたオクタン増殖された細胞（０．４ｇ乾燥重量／リットル）によるＤ−リモネンからの（−）ペリリルアルコール（■）の生成の動力学のグラフである。低濃度のペリリルアルデヒド（●）およびペリリン酸（◆）も生成した。他の酸化生成物または部位異性体（例えばカルベオール）は検出されなかった。ペリリルアルコール生成の初期比活性は６Ｕ（ｇ乾燥重量）-1であった。
【００１０】
図３は、マイコバクテリウムｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００の洗浄されたオクタン増殖された細胞（３ｇ乾燥重量／リットル）によるＤ−リモネン（Ａ）およびＬ−リモネン（Ｂ）からのペリリルアルコール（■）、ペリリルアルデヒド（●）およびペリリン酸（◆）の生成の動力学のグラフである。他の酸化生成物または部位異性体（例えばカルベオール）は検出されなかった。Ｄ−リモネンおよびＬ−リモネンに関するペリリルアルコール生成の初期比活性は、夫々、１３および１０Ｕ（ｇ乾燥重量）-1であった。
【００１１】
図４は、１μｌ（６．２μモル）のＤ−リモネンを供給されたマイコバクテリウムｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００の洗浄されたオクタン増殖された細胞懸濁物（５ｍｌ、３ｇ乾燥重量／リットル）によるＤ−リモネンからのペリリルアルコール（■）およびペリリン酸（◆）の生成の収率および動力学を示すグラフである。破線は、Ｄ−リモネンに対するモル収率が１００％の場合の生成物の理論的濃度を示す。他の酸化生成物または部位異性体（例えばカルベオール）は検出されなかった。
【００１２】
図５は、０．１ｍｌの純粋なＤ−リモネンを供給されたマイコバクテリウムｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００の洗浄されたオクタン増殖された細胞懸濁物（ｐＨ７．０、０．４ｍｌ）（０．４ｍｌ、６ｇ乾燥重量／リットル）によるＤ−リモネン相における（＋）ペリリルアルコール（■）およびペリリン酸（◆）の生成の動力学のグラフである。生成した事実上全てのペリリルアルコールがリモネン相中に抽出される。ペリリン酸はリモネン相中にほとんど抽出されない。なぜならば、ｐＨ７．０では、ペリリン酸の９９％より多くが脱プロトン化され、Ｄ−リモネン相にあまり溶解しないからである。他の酸化生成物または部位異性体（例えばカルベオール）は検出されなかった。
【００１３】
図６は、ロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＡＬＫ２−Ｃ７の洗浄されたオクタン増殖された細胞（３ｇ乾燥重量／リットル）によるＤ−リモネンからのペリリン酸（◆）の生成の動力学のグラフである。低濃度のペリリルアルデヒド（●）およびペリリルアルコール（■）も生成した。他の酸化生成物または部位異性体（例えばカルベオール）は検出されなかった。ペリリン酸生成の初期比活性は０．３Ｕ（ｇ乾燥重量）-1であった。
【００１４】
図７は、ペリリルアルコールをもたらす、リモネンの７位における部位特異的ヒドロキシル化を示す。いくつかの株では、生成したペリリルアルコールが、ペリリルアルデヒドおよびペリリン酸に通し転化される。
【００１５】
図８は、リモネンと同じまたは類似の炭素骨格を有し、マイコバクテリウムｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００の誘発された細胞によってメチル基（Ｃ７）でヒドロキシル化もされた化合物を例示する。出発化合物の名称のリストに関しては、実施例４の本文を参照。
【００１６】
本発明の方法は、末端メチル基を有するテルペン類、例えばＤ−またはＬ−リモネン、からのヒドロキシメチル化されたテルペン、例えばペリリルアルコール、の製造を可能にし、それは、他のヒドロキシル化生成物を実質的に含まない。上記方法は、末端メチル基を有するテルペン類、例えばＤ−またはＬ−リモネン、を部位特異的にヒドロキシル化するために微生物酵素を使用するところの、現在のところ唯一の方法であると考えられる。例えばペリリルアルコールの有意な収率が、共産生部位異性体、例えばカルベオール、ピペリテノール、イソピペリテノールまたはテルピネオール、を実質的に伴わないで、Ｄ−リモネンおよびＬ−リモネンの両方から得られ得る。上記方法は比較的簡単であり、工業的規模の適用における使用に関して魅力的なものにする。
【００１７】
本発明の方法は、末端メチル基を有するテルペン類、例えばＤ−またはＬ−リモネン、を微生物細胞またはその溶解物と接触させることを含み、ここで、微生物細胞は、末端メチル基を有するテルペン類（例えばＤ−またはＬ−リモネン）の、ヒドロキシメチル化されたテルペン類（例えば（＋）または（−）ペリリルアルコール）へのヒドロキシル化が生じるような条件下でｎ−アルカンの末端ヒドロキシル化を行うことができるモノオキシゲナーゼを発現することができる。
【００１８】
本発明での使用に適する微生物細胞は、候補微生物細胞の培養物を、ｎ−アルカン（例えばオクタン）を減成する能力に関してスクリーニングすることによって同定され得る。典型的には、これは、スクリーニングされている微生物細胞が炭素の唯一源として供給されたｎ−アルカン上で増殖し得るかどうかを決定することによって行われ得る。すなわち、スクリーニングされるべき細胞は、１以上のｎ−アルカン以外の炭素源の添加を有しない鉱物培地中または培地上に置かれ得る。一般に、そのようなスクリーニング反応をマイクロタイタープレートの１つのウェル中で行うことが便利であり、従って、多くのアッセイが同時に行われ得る。
【００１９】
上記したスクリーニングにおいてｎ−アルカンを減成することができると同定された細菌は次いで、例えばＤ−またはＬ−リモネンの（＋）または（−）ペリリルアルコールへの転化を触媒するための能力に関してスクリーニングされ得る。すなわち、候補微生物細胞の細胞培養物が、例えばＤ−またはＬ−リモネンの存在下および典型的には唯一の炭素源としての１以上のｎ−アルカン（例えば、ｎ−オクタン）の存在下で増殖され得る。Ｄ−またはＬ−リモネンの存在下での微生物細胞培養物の増殖の後、細胞培養物上清が単離され、そして何らかの適切な方法を使用して分析され得る。例えばＨＰＬＣ分析によって、アッセイ中に生成したペリリルアルコールの量（存在する場合）を決定することができる。ここでも、一般に、そのようなスクリーニング反応をマイクロタイタープレートの１つのウェル中で行うことが便利であり、従って、多くのアッセイが同時に行われ得る。
【００２０】
上記微生物細胞は、ｎ−アルカンの末端ヒドロキシル化を行うことができるモノオキシゲナーゼを発現することができる。すなわち、使用される微生物細胞は、一般には初期減成工程としての、ｎ−アルカンの末端モノ酸素化を含む経路によってｎ−アルカンを減成することができる菌株であるべきである。ｎ−アルカンは、例えば６〜１６個の炭素原子を有する炭化水素であり得る。一般に、炭化水素は、線状炭化水素であり得る。好ましくは、ｎ−アルカンがオクタンである。さらに、本発明での使用に適する微生物細胞は、Ｄ−またはＬ−リモネンまたはそれらの類似体を特に７位においてヒドロキシル化することができるべきである。
【００２１】
微生物細胞は、典型的には単離された形態において天然に存在する細胞であり得、あるいは、組換え細胞であり得る。言葉「組換え細胞」は、細胞の天然に存在する形態が含まないところのポリヌクレオチドを含むように遺伝子操作された細胞を包含するものとする。典型的には、そのポリヌクレオチドがモノオキシゲナーゼをコードし、それを組換え細胞が発現することができるであろう。さらに、言葉「組換え細胞」は、遺伝子操作された細胞から誘導された娘細胞およびその娘細胞から誘導された細胞の続く世代を包含するものとする。
【００２２】
本発明での使用に適する微生物細胞は、真核生物、例えば真菌または酵母細胞であり得、または、原核生物、例えば細菌細胞であり得る。細菌細胞が好ましい。適する細菌細胞は、グラム陰性菌または好ましくはグラム陽性菌であり得る。適するグラム陽性菌細胞の例は、ＣＮＭ細菌細胞、特にコリネバクテリウム（Corynebacterium）、アースロバクター（Arthrobacter）、ロドコッカス（Rhodococcus）、ノカルディア（Nocardia）またはマイコバクテリウム（Mycobacterium）属由来の細胞である。そのような細胞の具体例は、ロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＡＬＫ２−Ｅ１、ロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＨＸＮ−１９００、およびマイコバクテリウム・ｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００を包含する。マイコバクテリウム・ｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００は、２００１年２月１３日に受理番号ＣＢＳ１０９２８２でCentraalbureau voor Schimmelcultures（ＣＢＳ）に寄託された。あるいは、グラム陰性細菌細胞が、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属由来、例えばスフィンゴモナス・ｓｐ．（Sphingomonas sp.）ＨＸＮ２０細胞であり得る。
【００２３】
上記微生物細胞は、天然に存在する細胞の突然変異誘発によって得られるものであってもよい。すなわち、本発明での使用に適する微生物細胞は、天然に存在する細胞の突然変異体であり得る。本発明での使用に適する天然に存在する細胞の突然変異誘発は、それらの天然に存在する類似体よりもはるかに本発明での使用に適する突然変異体微生物株の同定を可能にし得る。すなわち、突然変異株は、それらが由来するところの天然に存在する細胞よりも、より高い反応速度を触媒することができる、すなわちリモネンのより多くの分子をペリリルアルコールに転化することができる、またはより大きい基質特異性を示すことができる、またはリモネンの７位のヒドロキシル化に対するより大きい特異性を示すことができる。
【００２４】
本発明での使用に適する突然変異体微生物細胞は、例えば化学的突然変異原の使用による、ランダム突然変異誘発によって生成され得、あるいは、目標にされた突然変異誘発が行われ得る。目標にされた突然変異誘発では、モノオキシゲナーゼをコードする遺伝子が特異的に突然変異され得る。例えば、活性部位が標的にされ得る。突然変異誘発によって、それらが由来するところの天然に存在する細胞と比較されるとき本発明での使用への適合に関して改善された特徴を示す微生物細胞が得られ得る。
【００２５】
突然変異誘発技術は当業者に周知である。一般に、突然変異誘発が行われるところの微生物細胞は、上記した細胞の１つである。突然変異誘発実験から得られた細胞が、上記で述べたスクリーニングを使用してスクリーニングされ得る。
【００２６】
１回より多くの突然変異誘発、例えば２回、３回、５回または１０回の突然変異誘発が行われ得、各回の完了後に、微生物細胞の改善された株（ｎ−アルカン減成および／またはリモネン転化活性に関して）が選択され得る。１回の突然変異誘発後に改善された特性を有すると同定された細胞が、一般に、次の回の突然変異誘発のための出発細胞として使用される。すなわち、本発明は、本発明方法での使用に適するところの、突然変異誘発を介して誘導された微生物細胞を提供する。
【００２７】
本発明で使用するための微生物細胞、例えば細菌細胞、は組換え細胞であり得る。本発明の組換え細胞は、組換え細胞の天然に存在する形態が含み得るところの、モノオキシゲナーゼをコードする何らかのポリヌクレオチドに加えて、モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、「導入されるポリヌクレオチド」、を含む。導入されるポリヌクレオチドは、組換え細胞の天然に存在する形態が含むところの、モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドと同じ配列を有し得る。あるいは、組換え細胞の天然に存在する形態が含むところの、モノオキシゲナーゼをコードする何らかのポリヌクレオチドと異なる配列を有し得る。
【００２８】
導入されるポリヌクレオチドは、天然に存在する、モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、例えば、上記した細菌の１つから単離された、モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドであり得る。あるいは、導入されるポリヌクレオチドは、天然に存在する、モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドの異なる配列であり得る。例えば、天然に存在する、モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドは、ヌクレオチド置換、例えば１、２または３乃至１０、２５、５０または１００の置換によって変えられて、導入されるポリヌクレオチドとしての使用に適するポリヌクレオチドを生じ得る。導入されるポリヌクレオチドは、あるいはまたはさらに、１以上の、例えば２、５または１０乃至２０、２５、５０または１００の挿入および／または欠失および／または天然に存在する、モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドと比較したときの一端または両端における伸長によって変えられ得る。縮重置換および／または変化した配列が翻訳されるときに保存アミノ酸置換を生じるであろう置換が、天然に存在する、モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドに対してなされて、導入されるポリヌクレオチドとしての使用に適するポリヌクレオチドを得ることができる。導入されるポリヌクレオチドはもちろん、モノオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドをいつもコードする。
【００２９】
天然に存在する、モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドは、何らかの適する源、特に上記した細菌の１つから単離され得る。モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドは、炭素およびエネルギー源としての１以上のｎ−アルカンを受け入れることができる微生物細胞から得られるべきである。当業者は、そのようなポリヌクレオチドを容易に得ることができるであろう。そのような天然に存在するポリヌクレオチドの変更された型は、当業者によって周知の技術に従って容易に得られ得る。
【００３０】
導入されるポリヌクレオチドは、組換え細胞中で発現され得るべきである。すなわち、導入されるポリヌクレオチドは典型的には、組換え細胞中での導入された配列の発現を提供することができる制御配列に操作可能に連結されるであろう。言葉「操作可能に連結される」は、記載された成分が、それらの意図される様式で機能することを可能にする関係にあるところの並置を意味する。調節配列、例えばコード配列に「操作可能に」連結されるプロモーター、が、その調節配列と相容可能な条件下でコード配列の発現が達成されるように位置される。
【００３１】
プロモーターおよび他の発現調節信号は、発現が設計されるところの微生物宿主細胞と相容可能であるように選択され得る。実際のモノオキシゲナーゼ遺伝子プロモーターを使用することが便利であり得、あるいは、導入されるポリヌクレオチドの高いレベルのおよび／または構成的発現を可能にするプロモーターを使用することがより便利であり得る。後者のタイプのプロモーターの例は、細菌ｌａｃＺ、Ｔ７およびＴ３プロモーター、S.セレビジアエ（S. cerevisiae）ＧＡＬ４およびＡＤＨプロモーター、ならびにS.ポムベ（S. pombe）ｎｍｔＩおよびａｄｈプロモーターを包含する。
【００３２】
導入されるポリヌクレオチドは、何らかの便利な様式で宿主微生物細胞中に導入され得る。典型的には、導入されるポリヌクレオチドおよびそれに操作可能に連結されるプロモーターがベクターに組み入れられ、それが次いで、例えば形質転換またはトランスフェクションによって、選択した宿主微生物細胞に導入される。何らかの適するベクター、例えばプラスミド、ウイルスまたはファージベクターが使用され得る。ベクターは、複製起点、１以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子、を提供し得る。ベクターは、組換え細菌細胞における一過性発現を提供することができ、または安定発現を提供することができる、すなわち、導入されるポリヌクレオチドが組換え細胞の染色体ＤＮＡ中に組み入れられる。
【００３３】
すなわち、本発明は、本発明の方法での使用に適する組換え微生物細胞を提供する。そのような組換え微生物細胞は、上記したように突然変異誘発され得る。
【００３４】
本発明での使用に適する、末端メチル基を有するテルペン類は、例えば、リモネンに似た、または好ましくは同一の炭素骨格を有する環式モノテルペンである。リモネンの構造は図７に記載されている。本発明の特徴によれば、末端メチル基を有し、一般には１０の炭素原子を有し、典型的には０〜４の二重結合、特に１、２または３の環二重結合、および典型的には１または２の環を有するテルペン類の選択的末端ヒドロキシル化を行って末端メチル基を末端ヒドロキシメチル基に転化する方法が提供される。環の１つが典型的には１の炭素原子を含む架橋として形成されることが可能である。言い換えると、それは、既存の環の２個の炭素原子の間の直接の連結によって、または中間のメチレン基を伴って形成され得る。また、シクロプロパン環を６員環と融合させることも可能である。
【００３５】
本発明での使用に適する末端メチル基を有するテルペン類は、典型的には、合計２乃至４の環外メチルまたはメチレン基、例えば２個のメチル基および１個のメチレン基、を有する。
【００３６】
本発明の方法における酸化は、典型的には炭素−水素結合の酸化からの水酸化物として、化合物中にＣ−Ｏ結合の形成をもたらす。いくつかの環境では、ヒドロキシ基の更なる酸化が生じるのが好ましく、その結果、ヒドロキシ基がアルデヒドまたはケトン基に転化される。典型的には、本発明の方法では、末端メチル基を有するテルペン類の７位の炭素のみが攻撃される。さらに、本発明方法は、典型的には、キラル中心を保存する。すなわち、本発明における基質が単一のエナンチオマーから成るとき、生成物は典型的には単一の対応するエナンチオマーから成り、または多数の対応するエナンチオマーを含む。
【００３７】
本発明での使用に適する、末端メチル基を有するテルペン類の特定の例は、ピネン、テルピネン、サビネンおよびツエン（thujene）を包含する。本発明での使用に適する類似体の更なる特定の例は、（１Ｒ）−（＋）−トランス−イソリモネン（CAS5113-87-1）、アルファ−テルピネン（CAS99-86-5）、ガンマ−テルピネン（CAS99-85-4）、アルファ−フェランドレン、ラセミ混合物（CAS99-83-2）、Ｒ（−）アルファ−フェランドレン（CAS4221-98-1）、テルピノレン（CAS586-62-9）、（＋）−ｐ−メト−１−エン（CAS1195-31-9）、（＋）−トランス−ｐ−メト−２−エン（CAS5113-93-9）、４−メチル−１−イソプロピルシクロヘキセン（CAS500-00-5）、ｐ−メンタン（CAS99-82-1）、デヒドロｐ−シメン（CAS1195-32-0）、２−カレン（CAS554-61-0）、（＋）−２−カレン（CAS4497-92-1）、デルタ−３−カレン（CAS13466-78-9）または、（＋）−３−カレン（498-15-7）である。
【００３８】
本発明の方法では、末端メチル基を有するテルペン類を、典型的には、ｎ−アルカンを末端ヒドロキシル化することができるモノオキシゲナーゼを発現することができる微生物細胞の細胞培養物またはその溶解物と接触させる。典型的には、細胞培養物または細胞溶解物が、単一のタイプの微生物細胞の培養物またはその溶解物である。しかし、１より多くのタイプの微生物細胞または細胞溶解物を含む細胞培養物または溶解物を使用して本発明の方法を行うことが可能である。細胞培養物のために使用される増殖培地は、何らかの適する鉱物培地であり得、同化可能な炭素および窒素源を包含する。細胞培養物のための市販の培地が広く利用可能であり、製造者の指示に従って使用され得る。誘導物質、例えばｎ−アルカン、例えばオクタン、が要求され得る。明らかなように、組換え細胞が使用される場合、それは、構成的プロモーターの制御下で、モノオキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを発現し、誘導物質が増殖培地に含まれる必要はない。上記方法は一般に、好気性条件下で行われる。
【００３９】
典型的には、末端メチル基を有するテルペン類、例えばＤ−またはＬ−リモネン、を、ヒドロキシメチル化されたテルペン類、例えば（＋）または（−）ペリリルアルコール、へのヒドロキシル化が生じるのに適する条件下で微生物細胞と接触させる。すなわち、典型的には、末端メチル基を有するテルペン類を１５℃〜４０℃、好ましくは２０℃〜３７℃の温度で微生物細胞と接触させる。
【００４０】
本発明の方法は、末端メチル基を有するテルペン類を本明細書に記載された微生物細胞の溶解物と接触させることによっても行なわれ得る。すなわち、末端メチル基を有するテルペン類を、本発明の方法において、細胞を含まない抽出物と接触させることができる。細胞溶解物を製造する方法は当業者に周知であり、何らかの適する方法が使用され得る。
【００４１】
例えば、Ｄ−またはL-リモネンが、好ましくは、微生物細胞培地または溶解物に気相でまたは第二の液体相（純粋なもの、または不活性溶媒、たとえばヘキサデカンに溶解されたもの）として提供される。典型的には、リモネンが、時間をかけて少しずつ培地に直接添加される。そのような方法を行う技術は従来周知である。
【００４２】
典型的には、本発明の方法において、ヒドロキシル化が、ヒドロキシメチル化されたテルペン類、例えばペリリルアルコール、が主要な酸化生成物であるように生じる。すなわち、ヒドロキシメチル化されたテルペン類が、一般に、酸化生成物の総量の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％を構成する。ここで、酸化生成物の総量の％は、酸化生成物の合計されたモル濃度の％で表される。好ましくは、ヒドロキシメチル化されたテルペン類、例えばペリリルアルコール以外の酸化生成物の産生が実質的にない。
【００４３】
ヒドロキシメチル化されたテルペン類は、固相抽出によって、または適切な有機溶媒、例えばブタノール、クロロホルムまたは何らかの他の適する炭化水素、による抽出によって、培地から単離され得る。例えばリモネンが純粋な形態で使用されるならば、生成物は、リモネン相において連続的に抽出され得る。転化されないリモネンは、減圧蒸留によって除去され得る。
【００４４】
末端メチル基を有するテルペン類、例えばリモネン、が有意な第二の相（例えば水性相の１０〜２５％）として添加されるならば、アルデヒドおよび酸に通し転化されるヒドロキシメチル化されたテルペン類、例えばペリリルアルコールは比較的少ない。これは、単に、そのアルコールの水性濃度が比較的低いという理由による。例えばリモネンが少量（制限量）で添加されるならば、これは２つの効果を有し、共により多くの酸生成をもたらす。第一は、比ペリリルアルコール生成がより低いこと（リモネンの細胞へのマス移動の制限）であり、第二は、水性相におけるペリリルアルコール濃度がより高いこと（リモネンがないのでリモネン相における抽出がないこと）であり、従って、アルデヒドおよび酸へのより高い程度までの更なる酸化に寄与するデヒドロゲナーゼを飽和させることである。酸へのより高い通し転化は、例えばペリリル酸の産生に望ましいと考えられる。
【００４５】
以下の実施例により本発明を説明する。
実施例
材料および方法
細菌株：１３７のアルカン減成性菌株が、種々の源から得られた。源に関しておよび下記１８菌株の参照に関しては、Smitsらの表１（1999, Environ. Microbiol. 1, 307-318）を参照。Ｐ. フルオレセンス（P. fluorescens）ＣＨＡ０、ブルコリデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）ＡＴＣＣ２５４１５、Ｐ．プチダ（P. putida）（oleovorans）Ｇｐｏ１（ＡＴＣＣ２９３４７）、Ｐ．プチダ（P. putida）Ｐ１、シュードモナス・アエルギノサ（Pseudomaonas aeruginosa）ＫＳＬＡ４７３、Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ１７４２３、Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）１９６Ａａ、Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）Ｓｏｌ２０、Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）ＰＡＯ１、Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）ＰＡＯ１Ｓ、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）ＮＣＩＭＢ１２５６６、Ｒ．エリスロポリス（R. erythropolis）ＮＲＲＬ  Ｂ−１６５３１、プラウセレラ（アミコラトプシス）ルゴサ（Prauserella (Amycolatopsis) rugosa）ＮＲＲＬ  Ｂ−２２９５、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）ＡＤＰ１、アシネトバクターｓｐ．（Acinetobacter sp.）２７６９Ａ、アシネトバクター・カルコアセチカス（Acinetobacter calcoaseticus）６９−Ｖ、Ａ．カルコアセチカス（A. calcoaseticus）ＥＢ１０４、Ａ．カルコアセチカス（A. calcoaseticus）ＮＣＩＢ８２５０。
【００４６】
菌株１−Ｄ、１９−Ｄ、２３−Ｄ、３０−Ｄ、７−Ｈ、９７−Ｈ、１１４−Ｈ、１１５−Ｈ、１−Ｏ、３５−Ｏ、３６−Ｏ、４２−Ｏ、４３−Ｏ、６２−Ｏ、６５−Ｏ、６６−Ｏ、４−Ｓ、１３９−Ｓ、１５４−Ｓ、１８−Ｖ、３３−Ｖ、５０−Ｖ、および５１−Ｖは、Susanne Schorcht（Schorcht, 1998, Mikrobiologische und molekularbiologische Charakterisierung alkaanabbauender Bakteriengemeinschaften. In Biologie/Chemie. Bremen: Universitat Bremen）から提供された。上記菌株は、ブレーメン（ドイツ国）のガレージ付近の１０ｃｍ深さから得られた土壌サンプルから単離された。サンプルを再懸濁し、滅菌エーレンマイヤーフラスコ中でガラスビーズと共に振り動かし、濾過し、一連の希釈度で、Ｃ源としてのオクタン（Ｏ）、ヘキサデカン（Ｈ）、ディーゼル（Ｄ）、スクアレン（Ｓ）または栄養ブイヨン（Ｖ）を有する栄養に富む培地または最少培地上に置いた。５５の菌株を単離し、増殖基質にしたがって命名し、一部の解析を行った（Shorcht, 1998、前出）。これらの菌株のうち、２３がこの研究において含められた。比較的異なりかつ安定であるように見え、かつｎ−アルカン上で十分増殖した６のグラム陽性菌をさらに解析した（３５−Ｏ、６２−Ｏ、２３−Ｄ、５０−Ｖ、１１５−Ｈおよび１５４−Ｓ）。部分的１６ＳｒＤＮＡ配列が、増幅プライマー１６Ｆ２７および１６Ｒ１５２５、および配列決定プライマー１６Ｆ３５５および１６Ｒ５１９を用いて得られた（Haubenら、1997, Int. J. Syst. Bacteriol. 47, 328-335; Karlsonら、1993, J. Bacteriol. 175, 1467-1474）。１１５−Ｈおよび１５４−Ｓの１６Ｓ配列は互いにおよびＲ．ファスシアンス（R. fascians）株のものと同一であった。一方、２３−Ｄ、３５−Ｄ、５０−Ｖおよび６２−Ｏの１６Ｓ配列は、Ｒ．エリスロポリス（R. erythropolis）型菌株ＡＴＣＣ４２７７Ｔ（Ｘ８１９２９）の１６Ｓ配列と同一であった。
【００４７】
菌株Ｒ１、Ｒ４、ＰＮ１、ＰＮ２、ＰＮ３、ＰＲ１、ＰＲ２およびＰＲ３がオランダの種々の場所で採取された土壌、水および採草地から単離されたが、同定されなかった（J.B. van Beilen, 未公開結果）。
【００４８】
菌株ＨＸＮ１００（ＣＮＭ群）、ＨＸＮ２００（スフィンゴモナス・ｓｐ．（Sphingomonas sp.））、ＨＸＮ３００、ＨＸＮ４００（Ｐ．アエルギノサ（P. aeruginosa）），ＨＸＮ５００（ＣＮＭ群）、ＨＸＮ６００(ＣＮＭ群)、ＨＸＮ１０００（ＣＮＭ群）、ＨＸＮ１１００（Ｐ．メンドシナ（P. mendocina）系統）、ＨＸＮ１２００（ＣＮＭ群）、ＨＸＮ１３００、ＸＮ１４００、ＨＸＮ１５００（マイコバクテリウム・ｓｐ．（Mycobacterium sp.））、ＨＸＮ１６００、ＨＸＮ１７００、ＨＸＮ１８００、ＨＸＮ１９００（ＣＮＭ群）およびＨＸＮ２０００（ＣＮＭ群）がシュツットガルトでヘキサンエアフィルターから単離され、一部は、グラム染色、形態学、代謝能および脂肪酸分析に基づいて同定された（Plaggemeier, 2000, Elimination der schwer wasserloslichen Modellabluftinhaltssoffe n-Hexan und Toluol in Biorieselbettverfahren. In Institute fur Siedlingswasserbau, Wassergute und Abfallwirtshaft. Stuttgart: Universitat Stutgart: Universitat Stuttgart; and T. Plaggemeier and K.-H. Engesser, 未公開結果）。
【００４９】
菌株ＢＣ２０（グラム陰性）、ＢＣＧ５０（グラム陽性）およびＢＣＧ５１（グラム陽性）は、Bioclear（オランダ国フローニンゲン）から提供された。シュードモナス・シトネロリス（Pseudomonas citronellolis）ＤＳＭ５０３３２およびＰ．フルオレセンス（P. fluorescens）ＡＴＣＣ１５４５３がＤＳＭおよびＡＴＣＣ菌株コレクションから得られた。
【００５０】
追加の７３のアルカン減成性菌株が、スイスの種々の場所の土壌、水および下水汚泥サンプル、ならびに木の葉から、唯一の炭素およびエネルギー源としてのオクタンを伴っての増殖能に関して単離され、顕微鏡研究およびグラム染色、ならびに気相を介して供給される唯一の炭素およびエネルギー源としてのグルコース、ヘキサン、オクタン、デカン、ドデカン、およびヘキサデカンを伴っての増殖能などの基本分類試験に付された。Ａｌｋ２−Ａ２およびＡｌｋ２−Ａ３、Ａｌｋ２−Ｂ８、Ａｌｋ２−Ｂ９、Ａｌｋ２−Ｂ１０、Ａｌｋ２−Ｂ１１、Ａｌｋ２−Ｂ１２、Ａｌｋ２−Ｃ１、Ａｌｋ２−Ｃ２、Ａｌｋ２−Ｃ４、Ａｌｋ２−Ｃ５、Ａｌｋ２−Ｃ６、Ａｌｋ２−Ｃ７およびＡｌｋ２−Ｇ２が、土壌サンプルから単離された。Ａｌｋ２−Ａ４、Ａｌｋ２−Ａ５、Ａｌｋ２−Ａ６、Ａｌｋ２−Ａ７、Ａｌｋ２−Ａ８、Ａｌｋ２−Ａ９、Ａｌｋ２−Ａ１０、Ａｌｋ２−Ａ１１、Ａｌｋ２−Ａ１２、Ａｌｋ２−Ｂ１、Ａｌｋ２−Ｂ２、Ａｌｋ２−Ｂ３、Ａｌｋ２−Ｂ４、Ａｌｋ２−Ｂ５、Ａｌｋ２−Ｂ６、Ａｌｋ２−Ｂ７、およびＡｌｋ２−Ｇ３がカイステンラックラウフ（kaisten Ruchkfauf）（スイス国）で下水処理プラントから単離された。Ａｌｋ２−Ｃ８、Ａｌｋ２−Ｃ９、Ａｌｋ２−Ｃ１０、およびＡｌｋ２−Ｃ１１が、セイヨウサンザシの木（Crataegus monogyna）の葉から単離された。Ａｌｋ２−Ｄ１、Ａｌｋ２−Ｄ２、Ａｌｋ２−Ｄ３、Ａｌｋ２−Ｄ４、Ａｌｋ２−Ｄ５、Ａｌｋ２−Ｄ６、Ａｌｋ２−Ｄ７、Ａｌｋ２−Ｄ８、Ａｌｋ２−Ｄ９、Ａｌｋ２−Ｄ１０、Ａｌｋ２−Ｄ１１、Ａｌｋ２−Ｅ１、Ａｌｋ２−Ｇ４、およびＡｌｋ２−Ｇ５が、アッシュの木（Fraxinus excelsior）の葉から単離された。Ａｌｋ２−Ｅ２、Ａｌｋ２−Ｅ３、Ａｌｋ２−Ｅ４、Ａｌｋ２−Ｅ６、Ａｌｋ２−Ｅ７、Ａｌｋ２−Ｅ８、Ａｌｋ２−Ｅ９、Ａｌｋ２−Ｅ１０、およびＡｌｋ２−Ｅ１１がオークの木（genus Quercus）の葉から単離された。Ａｌｋ２−Ｅ１２、Ａｌｋ２−Ｆ１、Ａｌｋ２−Ｆ２、Ａｌｋ２−Ｆ３、Ａｌｋ２−Ｆ４、Ａｌｋ２−Ｆ５、Ａｌｋ２−Ｆ６、Ａｌｋ２−Ｆ８、Ａｌｋ２−Ｆ９、Ａｌｋ２−Ｆ１０、Ａｌｋ２−Ｆ１１，Ａｌｋ２−Ｇ６、およびＡｌｋ２−Ｇ７がライムの木（Tilia vulgaris）の葉から単離された。Ａｌｋ２−Ｆ１２およびＡｌｋ２−Ｇ１がパインの木の針状葉から単離された。
【００５１】
スクリーニング：１つの９６ウェルマイクロタイタープレートにＢ８０℃で貯蔵された多数の菌株を、スプリング装填された９６ピンレプリケーター（Kuhner（スイス国バーゼル））を使用して、先に記載されたように（Duetzら、2000, Appl. Environ, Microbiol. 66, 2641-2646）同時にサンプリングし、そして標準の滅菌ポリスチレンマイクロタイタープレート（タイプ３０７２、Costar（マサチューセッツ州ケンブリッジ）に移した。上記プレートの各ウェル（作業体積３５０μｌ）には、Ｃ源が何ら添加されることなく、１８０μｌの固化された寒天（２％（ｗ／ｖ））鉱物培地が満たされていた。接種されたマイクロタイタープレート（ウェル中およびウェルの外での十分なレベルの気体拡散を可能にするために、上のふたがウェルから２ｍｍの距離で保持された）を水のビーカーおよび、ヘキサン、オクタン、デカン、ドデカンおよびヘキサデカンの１：１：１：１：１混合物（ｖ／ｖ）１０ｍｌを含む５０ｍｌビーカーとともにデシケーター中においた。
【００５２】
環境温度（２８℃）での増殖の７日後、寒天表面上に生じた細胞塊を次のように採取した。１１０μｌのＫ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）を各ウェルに添加した。ウェルにおけるスプリング装填されたレプリケーターの水平移動の繰り返しの結果、細胞塊の大きい部分の懸濁物を生じた。懸濁物を次いで、０．５ｍｌの円錐形ウェルを有するマイクロタイタープレート（Maxi-plaque, Polylabo（ジェノバ））に移した（１２チャンネルマルチピペットおよびワイドオリフィス先端を使用）。マイクロタイタープレートを遠心機（Eppendorf、タイプ５４０３）中で４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清を捨てた後、ワイドオリフィスピペット先端を満たしそして空にすることを繰り返すことにより（１２チャンネルマルチピペットを使用）、１００ｍＭのグルコースを含む１００μｌのＫ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）に細胞を再懸濁した。次いで、光学的に純粋なＤ−リモネンまたはＬ−リモネン（Fluka、p.a.）の２μｌを各ウェルに添加し、サンドイッチカバー（硬質ポリプロピレンプレートと組み合わせた軟質シリコーンの穴のあいた層）を使用して、先に記載されたように（Duetzら、2000、前出）ウェルを閉じた後、３００ｒｐｍ、５ｃｍ振とう振幅、２５℃で、２時間の軌道振とうを行った。次いで、マイクロタイタープレートを４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上清（残りのＤ−リモネン相を有しない）の５０μｌを、１２チャンネルマルチピペットを使用して半面積のマイクロタイタープレート（Costar、タイプ３６９６、Corning（ＮＹ））に移した。
【００５３】
ＨＰＬＣ−ＭＳによる分析：ダイオードアレイ検出器およびマス検出器を直列に備えたＨＰＬＣ（Agilent 1100シリーズ）を使用して分析を行った。溶媒１はアセトニトリル／メタノール（１：１［体積／体積］）＋０．１％ギ酸であった。溶媒２は水＋０．１％ギ酸であった。溶媒１および２を６０：４０［体積／体積］で１０分間使用した後、長さ８ｍｍの、同じ物質のプレカラムを備えたMachery Nagel C18カラム（５０ｘ３ｍｍ）を使用して、９０％の溶媒１に急勾配させた（合計作業時間１３．２分）。ＭＳの設定は次の通りであった。ＡＰＣＩモード、陽イオン化、フラグメンター電圧５０Ｖ、ガス温度３５０℃、蒸発器温度３７５℃、乾燥ガス（Ｎ2）：４リットル／分、ネブライザー圧力５０ｐｓｉ、毛管電圧２０００Ｖ、コロナ電流６μＡ。ＭＳは、次の質量を検出するように設定された選択されたイオンモード（ＳＩＭ）でＭＳを行った（相対的ドエル時間を括弧内に入れる）。１３５（４０％）、１３７（５％）、１５１（１０％）、１５３（７％）、１７６（１５％）。ペリリル酸はどの質量でも良好なＭＳ信号を示さなかったが、２２５ｎｍでのＤＡＤ信号により感度よく定量できた。特徴的なＵＶスペクトルは、ペリリル酸の存在の確認に有用であった。
【００５４】
供給バッチ（fed-batch）バイオリアクターでのマイコバクテリウム・ｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００の増殖：マイコバクテリウム・ｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００を、３リットルのバイオリアクター中で、５ｍＭのグルコースを供給された鉱物培地（Duetzら、2000、前出）上で増殖させた。接種時、作業体積は１２００ｍｌであり、５４０ｎｍでの光学密度（ＯＤ５４０）は０．１であった。反応器を６００ｒｐｍで攪拌した。オクタン飽和された空気を１リットル／分で反応器に供給した。Ｃ源を何ら有しない新鮮な鉱物培地を１２ｍｌ／時の速度で反応器に連続的に供給した。ＯＤ５４０が２．４のレベルに徐々に増加した。５日後、１リットルの懸濁物を採取し、遠心分離し、バイオトランスフォーメーションアッセイにおいて後に使用するためにペレットをＢ３０℃で貯蔵した。２日後、培養物の残り（１．５リットル）を採取し、細胞ペレットを８０ｍｇ乾燥重量の量でＢ３０℃で貯蔵した。
【００５５】
ケモスタット増殖されたマイコバクテリウム・ｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００によるＤ−リモネンおよびＬ−リモネンのバイオトランスフォーメーション動力学：反応器増殖されたマイコバクテリウム・ｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００の凍結細胞ペレットを、Ｋ2ＨＰＯ4／ＫＨ2ＰＯ4緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）中に１０〜１２のＯＤ540まで再懸濁した。この細胞懸濁物の０．５ｍｌの量を、先に記載されたように無毒化され平板化された正方形のディープウェルマイクロタイタープレート（Riplate, Ritter（ドイツ国））の多数の２．４ｍｌウェルに移した。次いで、光学的に純粋なＤ−リモネンまたはＬ−リモネンの４μｌを添加し、プレートを、１．５ｍｍ直径の９６の穴をあけた（穴はウェルの中心上に正確に位置する）海綿状のシリコーンプレート（厚さ８ｍｍ、両面不透過性フィルム、品質２６６０ショア、Maag Technik AG （スイス国デューベンドルフ））および硬質ステンレス製のふた（Kuhner AG （スイス国バーゼル））で覆った。マイクロタイタープレートおよびふたを互いにクランプし、Kuhner AG （スイス国バーゼル）の装置を使用して５ｃｍの振とう直径を有する軌道シェーカー上に取り付けた。規則正しい時間間隔で、１ウェルの中身を取り出し、遠心分離し、上記したように上清をＬＣ−ＭＳ−ＤＡＤによって分析した。あるいは（指示されたとき）、同じ緩衝液の５ｍｌに細胞を再懸濁し、総体積４３ｍｌの頭隙バイアル（National Scientific Company （ジョージア州ローレンスビレ）に移した。マイクロ注射器を使用して１．０μｌのＤ−リモネンを純粋な化合物として添加し、次いで１０００ｒｐｍおよび３０℃で磁気攪拌を行った。Teflonコーティングされたインサートを有するスクリュキャップを使用して頭隙バイアルを閉じた。規則正しい時間間隔で、針付注射器を使用して（気体状Ｄ−リモンネンの頭隙からの損失を防ぐために、バイアルを開けることなく）１００μｌのサンプルを取り出した。次いで、これをエッペンドルフ管中で、１５００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上記したようにＬＣ−ＭＳによって分析した。
【００５６】
唯一のＣ源としてのアルカンを供給された寒天プレート上で増殖された菌株の選択によるＤ−リモネンおよびＬ−リモネンのバイオトランスフォーメーション動力学：多数の選択された菌株を、ペトリ皿において寒天鉱物培地上で増殖させた。アルカン蒸気の存在下での増殖の５日後（マイクロタイタープレート培養物に関して上記したのと同様）、細胞塊を寒天表面からこすり取り、洗浄し、４ｇ乾燥重量／リットルに濃縮した。この細胞懸濁物を、Ｄ−リモネンまたはＬ−リモネンを有する正方形のディープウェルマイクロタイタープレート中でインキュベートし、先の項に記載したように、１、２、４および６時間後に生成物形成に関して試験した。
【実施例１】
【００５７】
Ｄ−リモネンおよびＬ−リモネンの転化に関するｎ−アルカン減成性物のスクリーニング
合計１３７のアルカン減成性細菌株を、Ｄ−リモネンまたはＬ−リモネンの酸化能に関して系統的に試験した。この目的のために、マイクロタイタープレートにおける縮小型平行増殖システムが使用された。合計４３の菌株がＤ−リモネンおよび／またはＬ−リモネンのメチル基を酸化することができることが見出され、ペリリルアルコール、ペリリルアルデヒド、ペリリル酸またはこれらの化合物の２もしくは３の混合物を生じた（表１、２および３）。これらの陽性菌株のほとんど（２９）は、グラム染色後の１６ＳＤＮＳ配列決定および／または顕微鏡研究によって決定されるとき、ＣＮＭ群（コリネバクテリウム、アースロバクター、ロドコッカス、ノカルディアおよびマイコバクテリウム属を包含する）に属することが分かった。（同定された）グラム陰性菌株はいずれも、有意なレベルのこれらの化合物を生じなかった。多数の菌株を更なる動的研究のために選択した。
【実施例２】
【００５８】
ロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＡＬＫ２−Ｅ１およびロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＨＸＮ−１９００によるＤ−リモネンおよびＬ−リモネンのペリリルアルコールへのバイオトランスフォーメーション
ロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＡＬＫ２−Ｅ１およびロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＨＸＮ−１９００が、一次スクリーニングに示されるように（表１）アルデヒドおよび酸への有意な通し転化を有することなくＤ−リモネンおよびＬ−リモネンをペリリルアルコールへ転化することができる故に、選択された。より大きい規模での動力学実験により、両方の菌株に関してこの特徴が確認された（図１および２）。すなわち、ほんの痕跡量のペリリル酸およびペリリルアルデヒドが生成され、一方、ペリリルアルコールの濃度は、最初の４時間のインキュベーションにおいて着実に増加していた。ペリリルアルコール生成の比活性は、ロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＡＬＫ２−Ｅ１（Ｄ−リモネンから）およびロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＨＸＮ−１９００（Ｌ−リモネンから）に関して、夫々、０．３および６Ｕ（ｇ乾燥重量）-1であった。
【実施例３】
【００５９】
マイコバクテリウム・ｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ−１５００およびスフィンゴモナス・ｓｐ．（Sphingomonas sp.）ＨＸＮ−２００によるＤ−リモネンおよびＬ−リモネンのペリリルアルコールおよびペリリル酸へのバイオトランスフォーメーション
最も詳細に研究された菌株はマイコバクテリウム・ｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ−１５００であった。これは、それがペリリルアルコール生成の最も高い比活性を示し、かつＤ−リモネンおよびＬ−リモネンに関してほぼ等しい活性を有した（夫々、１３および１０Ｕ（ｇ乾燥重量）-1、図３も参照）ことが主な理由である。生成されたペリリルアルコールの一部は、主にペリリル酸へ通し転化されることが分かった（Ｌ−リモネンに関しては、痕跡量のペリリルアルデヒドも検出された）。最初の３０分後、ペリリル酸の検出された濃度は、Ｄ−リモネンおよびＬ−リモネンに関して夫々、ペリリルアルコールレベルの２３％および８％であった。明らかなように、関与するデヒドロゲナーゼは、（−）ペリリルアルコールに対してよりも（＋）ペリリルアルコールに対してより高い活性を有した。ペリリル酸の相対量は、実験の間に徐々に増加した（図３）。別の実験では（図４）、バイオ転化の収率を決定するために、閉じた攪拌容器中で少量のＤ−リモネン（１ｕｌ、６．２μｌ）を５ｍｌの細胞と共にインキュベートした。実験の終わりに、添加されたＤ−リモネンの８７％がペリリル酸に転化された。第三の実験では（図５）、マイコバクテリウム・ｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００の、洗浄されたオクタン増殖された細胞懸濁物（ｐＨ７．０）（０．４ｍｌ、６ｇ乾燥重量／リットル）に０．１ｍｌの純粋なＤ−リモネンが供給された。この状況で、生成した事実上全てのペリリルアルコールがリモネン相中に抽出される。ペリリル酸は、リモネン相にほとんど抽出されない。なぜならば、ｐＨ７．０では、ペリリル酸の９９％より多くが脱プロトン化され、Ｄ−リモネン相にあまり溶解しないからである。
【００６０】
スフィンゴモナス・ｓｐ．（Sphingomonas sp.）ＨＸＮ−２００も、Ｄ−リモネンおよびＬ−リモネンをペリリルアルコールおよびペリリル酸の混合物に転化することができた。
【実施例４】
【００６１】
ロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＡＬＫ２−Ｃ７によるＤ−リモネンのペリリル酸へのバイオトランスフォーメーション
一次スクリーニングにおいて事実上ペリリル酸のみを生じた１つの菌株（ロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＡＬＫ２−Ｃ７）を、同様に、より詳細な研究のために選択した。動的実験（図５）では、また、ペリリル酸のみが生成した。ペリリル酸生成の比活性は０．３Ｕ（ｇ乾燥重量）-1であった。
【実施例５】
【００６２】
マイコバクテリウム・ｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ−１５００によるリモネンの構造類似体の対応するアルコールへのバイオトランスフォーメーション動力学
リモネンと同じ炭素骨格を有する下記化合物も、マイコバクテリウム・ｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ−１５００の細胞と共にインキュベートされ、メチル基（Ｃ７）がＤ−リモネンおよびＬ−リモネンに関する記載と同様にヒドロキシル化された化合物に対応するＬＣ−マススペクトルおよび保持時間を有する化合物を生じることが分かった。
（１Ｒ）−（＋）−トランス−イソリモネン（ＣＡＳ５１１３−８７−１）；
アルファ−テルピネン（ＣＡＳ９９−８６−５）；
ガンマ−テルピネン（ＣＡＳ９９−８５−４）；
アルファ−フェランドレン、ラセミ混合物（ＣＡＳ９９−８３−２）；
Ｒ（−）アルファ−フェランドレン（ＣＡＳ４２２１−９８−１）；
テルピノレン（ＣＡＳ５８６−６２−９）；
（＋）−ｐ−メト−１−エン（ＣＡＳ１１９５−３１−９）；
（＋）−トランス−ｐ−メト−２−エン（ＣＡＳ５１１３−９３−９）；
４−メチル−１−イソプロピルシクロヘキセン（ＣＡＳ５００−００−５）；
ｐ−メンタン（ＣＡＳ９９−８２−１）；
デヒドロｐ−シメン（ＣＡＳ１１９５−３２−０）；
２−カレン（ＣＡＳ５５４−６１−０）；
（＋）−２−カレン（ＣＡＳ４４９７−９２−１）；
デルタ−３−カレン（ＣＡＳ１３４６６−７８−９）；および
（＋）−３−カレン（４９８−１５−７）。
生成した化合物は、抗癌剤ペリリルアルコールの構造類似体であるので、薬剤適性を有し得る。
【００６３】
【表１】
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【００６４】
【表２】
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【００６５】
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】ロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＡＬＫ２−Ｅ１の洗浄されたオクタン増殖された細胞（３ｇ乾燥重量／リットル）によるＤ−リモネンからの（＋）ペリリルアルコール（■）、ペリリルアルデヒド（●）およびペリリン酸（◆）の生成の動力学を示すグラフである。
【図２】ロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＨＸＮ１９００の洗浄されたオクタン増殖された細胞（０．４ｇ乾燥重量／リットル）によるＤ−リモネンからの（−）ペリリルアルコール（■）、ペリリルアルデヒド（●）およびペリリン酸（◆）の生成の動力学のグラフである。
【図３−Ａ】マイコバクテリウムｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００の洗浄されたオクタン増殖された細胞（３ｇ乾燥重量／リットル）によるＤ−リモネンからのペリリルアルコール（■）、ペリリルアルデヒド（●）およびペリリン酸（◆）の生成の動力学のグラフである。
【図３−Ｂ】マイコバクテリウムｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００の洗浄されたオクタン増殖された細胞（３ｇ乾燥重量／リットル）によるＬ−リモネンからのペリリルアルコール（■）、ペリリルアルデヒド（●）およびペリリン酸（◆）の生成の動力学のグラフである。
【図４】１μｌ（６．２μモル）のＤ−リモネンを供給されたマイコバクテリウムｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００の洗浄されたオクタン増殖された細胞懸濁物（５ｍｌ、３ｇ乾燥重量／リットル）によるＤ−リモネンからのペリリルアルコール（■）およびペリリン酸（◆）の生成の収率および動力学を示すグラフである。破線は、Ｄ−リモネンに対するモル収率が１００％の場合の生成物の理論的濃度を示す。
【図５】図５は、０．１ｍｌの純粋なＤ−リモネンを供給されたマイコバクテリウムｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００の洗浄されたオクタン増殖された細胞懸濁物（ｐＨ７．０、０．４ｍｌ）（０．４ｍｌ、６ｇ乾燥重量／リットル）によるＤ−リモネン相における（＋）ペリリルアルコール（■）およびペリリン酸（◆）の生成の動力学のグラフである。
【図６】ロドコッカス・ｓｐ．（Rhodococcus sp.）ＡＬＫ２−Ｃ７の洗浄されたオクタン増殖された細胞（３ｇ乾燥重量／リットル）によるＤ−リモネンからのペリリン酸（◆）、ペリリルアルデヒド（●）およびペリリルアルコール（■）の生成の動力学のグラフである。
【図７】ペリリルアルコールをもたらす、リモネンの７位における部位特異的ヒドロキシル化を示す。
【図８−Ａ】リモネンと同じまたは類似の炭素骨格を有し、マイコバクテリウムｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００の誘発された細胞によってメチル基（Ｃ７）でヒドロキシル化もされた化合物の例示である。
【図８−Ｂ】リモネンと同じまたは類似の炭素骨格を有し、マイコバクテリウムｓｐ．（Mycobacterium sp.）ＨＸＮ１５００の誘発された細胞によってメチル基（Ｃ７）でヒドロキシル化もされた化合物の例示である。
【図１】
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【図２】
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【図３−Ａ】
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【図３−Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−Ａ】
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【図８−Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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