(57)【要約】式（１）［式中の記号は明細書中に定義する通り］、およびとりわけ式（３）で示される化合物は、固形腫瘍および白血病、特に乳癌およびヒト骨髄性白血病の処置において、ヒト組換えインターフェロンと相乗的な抗増殖作用を示す。
2004506011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の悪性疾患または症状を処置するための医薬組成物であって、医薬的に許容できる賦形剤および処置有効量の式：
【化１】
2004506011.tif 000008
［式中、
Ｒ１は互いに独立して、Ｈ、または炭素数１〜６の低級アルキルであり；
Ｒ２およびＲ３は互いに独立して、Ｈ、炭素数１〜６の低級アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、炭素数１〜６のアルコキシ、または炭素数１〜６のフルオロアルコキシであり；
ｍは０〜３の整数であり；
ｏは０〜４の整数であり；
ｎは０〜５であり；
Ｙはフェニル、ナフチル、またはピリジル、チエニル、フリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、オキサゾリル、チアゾリルもしくはイミダゾリルから成る群から選択するヘテロアリール基であり；
ＢはＣＯＯＨ、医薬的に許容できるその塩、ＣＯＮＲ６Ｒ７またはＣＯＯＲ８であり、ここでＲ６およびＲ７は互いに独立して、水素、または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ８は炭素数１〜６のアルキルである。］
で示される化合物を含有し、哺乳動物の悪性疾患または症状の処置に有効な他の化学療法剤と組み合わせて使用するのに適合した医薬組成物。
【請求項２】
哺乳動物の悪性疾患または症状の処置に有効な化学療法剤がインターフェロンである請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
乳癌の処置に適合した請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
白血病の処置に適合した請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記化合物が、式：
【化２】
2004506011.tif 000009
［式中、Ｒ１はＨまたはメチルであり、Ｒ３はＨまたはメチルであり、Ｒ＊８はＨ、または炭素数１〜３の低級アルキルである。］
で示される化合物または医薬的に許容できるその塩である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
哺乳動物の悪性疾患または症状の処置に有効な化学療法剤がインターフェロンである請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
乳癌の処置に適合した請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
白血病の処置に適合した請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記化合物が、式：
【化３】
2004506011.tif 000010
［式中、Ｒ８はＨ、または炭素数１〜３のアルキルである。］
で示される化合物または医薬的に許容できるその塩である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
哺乳動物の悪性疾患または症状の処置に有効な化学療法剤がインターフェロンである請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
乳癌の処置に適合した請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
白血病の処置に適合した請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
Ｒ８がエチルである請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
処置を要する哺乳動物の悪性疾患または症状を処置するための方法であって、
医薬的に許容できる賦形剤および処置有効量の式：
【化４】
2004506011.tif 000011
［式中、
Ｒ１は互いに独立して、Ｈ、または炭素数１〜６の低級アルキルであり；
Ｒ２およびＲ３は互いに独立して、Ｈ、炭素数１〜６の低級アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、炭素数１〜６のアルコキシ、または炭素数１〜６のフルオロアルコキシであり；
ｍは０〜３の整数であり；
ｏは０〜４の整数であり；
ｎは０〜５であり；
Ｙはフェニル、ナフチル、またはピリジル、チエニル、フリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、オキサゾリル、チアゾリルもしくはイミダゾリルから成る群から選択するヘテロアリール基であり；
ＢはＣＯＯＨ、医薬的に許容できるその塩、ＣＯＮＲ６Ｒ７またはＣＯＯＲ８であり、ここでＲ６およびＲ７は互いに独立して、水素、または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ８は炭素数１〜６のアルキルである。］
で示される化合物を含有する医薬組成物を前記哺乳動物に投与し、
前記哺乳動物に、哺乳動物の悪性疾患または症状の処置に有効な他の化学療法剤を前記化合物と併せて投与する
ことを含んで成る方法。
【請求項１５】
化学療法剤がインターフェロンである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
化学療法剤がヒト組換えインターフェロンα、ヒト組換えインターフェロンβ、またはヒト組換えインターフェロンγである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
処置する悪性疾患または症状が乳癌または白血病である請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
処置する悪性疾患または症状が急性骨髄性白血病である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物が、式：
【化５】
2004506011.tif 000012
［式中、Ｒ１はＨまたはメチルであり、Ｒ３はＨまたはメチルであり、Ｒ＊８はＨ、または炭素数１〜３の低級アルキルである。］
で示される化合物または医薬的に許容できるその塩である請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
化学療法剤がインターフェロンである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
化学療法剤がヒト組換えインターフェロンα、ヒト組換えインターフェロンβ、またはヒト組換えインターフェロンγである請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
処置する悪性疾患または症状が乳癌または白血病である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
処置する悪性疾患または症状が急性骨髄性白血病である請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物が、式：
【化６】
2004506011.tif 000013
［式中、Ｒ８はＨ、または炭素数１〜３のアルキルである。］
で示される化合物または医薬的に許容できるその塩である請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
Ｒ８がエチルである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
化学療法剤がインターフェロンである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
化学療法剤がヒト組換えインターフェロンα、ヒト組換えインターフェロンβ、またはヒト組換えインターフェロンγである請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
処置する悪性疾患または症状が乳癌または白血病である請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
処置する悪性疾患または症状が急性骨髄性白血病である請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記化合物を日用量約５０〜５００ｍｇで哺乳動物に投与する請求項２４〜２９のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、フェニルまたはヘテロ芳香族基と置換クロマニル、チオクロマニルまたはテトラヒドロキノリニル基とでジ置換されたアセチレン化合物を他の抗腫瘍剤と組み合わせて腫瘍の処置に使用することに関する。さらに具体的には、本発明は、エチル６‐［２‐（４，４‐ジメチルチオクロマン‐６‐イル）エチニル］ニコチネートをインターフェロンおよび他の抗腫瘍剤と組み合わせて悪性腫瘍、特に乳癌およびヒト骨髄性白血病の処置に使用することに関する。
【０００２】
（背景技術）
レチノイドと総称される天然レチノイン酸およびその類縁化合物は、薬剤分野、医学分野および関連分野で、悪性細胞増殖の予防および阻害を含む重要な生物学的活性を持つことが知られている。レチノイド化合物の合成、レチノイド化合物の生物学的活性、ならびにヒトおよび他の生体システムにおけるレチノイドの様々な作用様式の発見を目指すインビボおよびインビトロの研究は、数多くの特許文献および科学文献に記載されている。
【０００３】
具体的に述べると、細胞増殖抑制または腫瘍抑制の分野で、１または複数のレチノイド様化合物を活性成分として含む医薬組成物が、皮膚の過剰増殖障害ならびに他の前癌性および悪性過剰増殖疾患、例えば乳癌、皮膚癌、前立腺癌、子宮頚癌、子宮癌、大腸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、肺癌、喉頭癌、口腔癌、血液およびリンパ系の癌、化生、異形成、新形成、粘膜の白斑症および乳頭腫の処置および予防に有用であり、カポジ肉腫の処置にも有用であることは、当技術分野では広く受け入れられている。
【０００４】
とりわけ、当技術分野では、いくつかの乳癌細胞培養物で、ある種のレチノイド化合物が他の既知の抗腫瘍化学療法剤、例えばインターフェロンおよび他の薬剤などと相加的に作用し、さらに一部は相乗的に作用して、癌細胞の増殖を抑制または阻害することが公表されている。Ｆａｎｊｕｌらの論文Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５６，１５７１−１５７７（１９９６）には、この論文でＳＲＩ１１２２０と呼ばれている化合物を含むいくつかのレチノイド化合物を、いくつかの癌細胞株に対してインターフェロンと併用したアッセイが記載されており、一部の細胞株では化合物ＳＲＩ１１２２０およびインターフェロンの抗増殖活性が相乗的であったと述べられている。この先行技術化合物ＳＲＩ１１２２０の構造を下に示す。
【化７】
2004506011.tif 000003
【０００５】
Ｔｏｍａらの論文Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １０：５９７−６０７（１９９７）には、ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞株における他のレチノイド、例えば全トランスレチノイン酸（ｔＲＡ）と、α−インターフェロン（αＩＦＮ）との相乗効果、およびタモキシフェン（ＴＡＭ）などの他の化学療法剤との相乗効果が記載されている。本発明のさらなる背景として、Ｋｕｒｂａｃｈｅｒらの論文Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０３（１９９６）１８３−１８９には、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト癌細胞株におけるビタミンＣと、ある種の化学療法抗腫瘍剤との相乗作用が記載されている。
【０００６】
米国特許第４８１０８０４号、第４９８０３６９号、第５０４５５５１号および第５０８９５０９号には、レチノイド様活性を有する、フェニルまたはヘテロ芳香族基と置換クロマニル、チオクロマニルまたはテトラヒドロキノリニル基とでジ置換されたアセチレン化合物が記載されている。米国特許第５６０２１３０号および第６０９０８２６号には、ヘテロ芳香族基と置換クロマニル、チオクロマニルまたはテトラヒドロキノリニル基とでジ置換されたアセチレン化合物によって、レチノイドによる処置に応答し得る疾患または症状を処置する方法が開示されている。米国特許第５０８９５０９号は、本発明の処置方法において使用する好ましい化合物であるエチル６‐［２‐（４，４‐ジメチルチオクロマン‐６‐イル）エチニル］ニコチネートの合成法を開示しているので、本発明の背景として特に関連深い。エチル６‐［２‐（４，４‐ジメチルチオクロマン‐６‐イル）エチニル］ニコチネートは、商品名タザロテン［ＴＡＺＡＲＯＴＥＮＥ、登録商標］としても知られており、本明細書（図面を含む）中でしばしば単に「タザロテン」と称する。
【０００７】
（発明の開示）
本発明は、式１：
【化８】
2004506011.tif 000004
［式中、
Ｒ１は互いに独立して、Ｈ、または炭素数１〜６の低級アルキルであり；
Ｒ２およびＲ３は互いに独立して、Ｈ、炭素数１〜６の低級アルキル、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、炭素数１〜６のアルコキシ、または炭素数１〜６のフルオロアルコキシであり；
ｍは０〜３の整数であり；
ｏは０〜４の整数であり；
ｎは０〜５であり；
Ｙはフェニル、ナフチル、またはピリジル、チエニル、フリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、オキサゾリル、チアゾリルもしくはイミダゾリルから成る群から選択するヘテロアリール基であり；
ＢはＣＯＯＨ、医薬的に許容できるその塩、ＣＯＮＲ６Ｒ７またはＣＯＯＲ８であり、ここでＲ６およびＲ７は互いに独立して、水素、または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ８は炭素数１〜６のアルキルである。］
で示される化合物の、１種またはそれ以上の他の抗腫瘍剤と組み合わせて（好ましくはインターフェロンと組み合わせて）の、処置を要する哺乳動物の悪性腫瘍または症状を処置するための使用に関する。
【０００８】
本発明の処置方法に使用する化合物
本発明の処置方法に使用する化合物の一般式を、式１に示す。式１で示される化合物のうち、Ｙがピリジンであるものを使用するのが好ましい。ピリジン部分が２，５置換されている化合物がより好ましい。（「ピリジン」命名法における２，５位は、「ニコチン酸」命名法における６位置換に対応する。）（ＣＨ２）ｎ基に関しては、ｎが０である化合物が好ましい。好ましくは、ＢはＣＯＯＨまたはＣＯＯＲ８であり、Ｒ８は炭素数１〜３の低級アルキルである。Ｒ１は好ましくはＨまたはメチルであり、Ｒ２およびＲ３は好ましくはＨまたは低級アルキルである。Ｘは好ましくはＳまたはＯであり、より好ましくはＳである。
【０００９】
本発明の方法に使用する、より好ましい化合物群は、式２：
【化９】
2004506011.tif 000005
［式中、Ｒ１はＨまたはメチルであり、Ｒ３はＨまたはメチルであり、Ｒ＊８はＨ、または炭素数１〜３の低級アルキルである。］
で示される化合物または医薬的に許容できるその塩である。
【００１０】
式１および式２で示される化合物は、米国特許第４８１０８０４号、第４９８０３６９号、第５０４５５５１号および第５０８９５０９号に記載された合成手順に従って合成することができ、該米国特許を特に引用により本発明の一部とする。
【００１１】
本発明の処置方法に使用する現在最も好ましい化合物は、エチル６‐［２‐（４，４‐ジメチルチオクロマン‐６‐イル）エチニル］ニコチネート（タザロテン）であり、その構造を式３に示す。タザロテンは、米国特許第５０８９５０９号明細書に実施例６として記載されている。
【化１０】
2004506011.tif 000006
【００１２】
本発明の処置方法に使用する化合物の説明に関連して、医薬的に許容できる塩とは、親化合物の活性を保っていて、投与対象および投与状況に有害な作用を何も与えない塩であると理解すべきである。医薬的に許容できる塩は有機塩基または無機塩基から誘導することができる。塩は一価または多価イオンであることができる。特に興味深いものは無機イオン、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウムである。有機塩はアミン類、特にアンモニウム塩、例えばモノ−、ジ−およびトリ−アルキルアミンまたはエタノールアミンなどを使って製造することができる。塩はカフェイン、トロメタミンおよび類似な分子を使って形成させることもできる。
【００１３】
更に、本発明の処置方法に使用する化合物の説明に関連して、式１および式２において、置換基Ｒ２およびＲ３は場合により存在する、すなわち変数ｍおよびｏが値０（ゼロ）である場合、その環は水素置換されている、換言すればその環は水素以外の置換基Ｒ２またはＲ３を持たないと理解すべきである。
【００１４】
本発明の処置方法に使用する化合物の抗増殖効果
本発明に従って使用する化合物の抗増殖効果は、当技術分野で十分に受け入れられているアッセイ方法によって立証される。これらのアッセイは、好ましい化合物であるタザロテン（式３の化合物）を、当技術分野で周知の抗腫瘍剤であるヒト組換えα−、β−およびγ−インターフェロンと組み合わせた場合および組み合わせない場合に行う。材料およびアッセイ方法を以下に詳述する。
【００１５】
アッセイに使用したＳＫ−ＢＲ−３、Ｔ４７−ＤおよびＨＬ−６０細胞培養もよく知られており、当技術分野で周知の供給源から入手することができる。具体的に述べると、知られているように、Ｔ−４７Ｄはエストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）のヒト乳癌細胞株であり、ＳＫ−ＢＲ−３はエストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）のヒト乳癌細胞株である。ＨＬ−６０は、よく知られたヒト骨髄性白血病細胞株である。乳癌細胞株に対するアッセイ方法自体は当技術分野でよく知られており、このアッセイ方法では細胞への５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込み量を測定する。知られているように、ＢｒｄＵの取込み量が少ないことは細胞増殖が少ないこと（細胞増殖の阻害）を表す。このアッセイは、当技術分野では、アッセイしようとする１または複数の薬剤の抗増殖活性または抗腫瘍活性の尺度として受け入れられている。ＨＬ−６０細胞株に対するアッセイ方法も当分野でよく知られている。この方法では、生存ＨＬ−６０細胞によって３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドから分解されたホルマザン色素の濃度を測定する。
【００１６】
２またはそれ以上の抗増殖剤または抗増殖剤候補の組合わせをアッセイした場合、その結果は、個々の薬剤の効果が相加されると仮定したものより低い増殖阻害を示すかもしれないし、その効果は２つの薬剤の予想される効果の数学的な和に相当するかもしれない（相加的阻害）。あるいは、実際に実験的に観察される阻害は、２つの薬剤の効果の単なる和として予想されるものより大きいかもしれない。このような相乗的抗腫瘍または抗増殖効果は極めて望ましく、後述するように、タザロテン（式３）をヒト組換えインターフェロンと併用した場合に、いくつかのアッセイで観察された。悪性腫瘍、特に乳癌および急性ヒト骨髄性白血病の処置における、本発明に使用する化合物とインターフェロンとのこの相乗効果は先行技術からは予期されず、非自明であり驚くべきことである。材料およびアッセイ方法ならびに相乗効果を決定する数学的判定基準を以下に説明する。
【００１７】
材料、アッセイ方法、および相乗性を決定する判定基準
試薬
ヒト組換えインターフェロンα（ＩＦＮ−α）およびヒト組換えインターフェロンβ（ＩＦＮ−β）はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ（ミズーリ州セントルイス）から購入した。ヒト組換えインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）はＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（インディアナ州インディアナポリス）から購入した。ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−γの原液は−７０℃、４℃および−２０℃でそれぞれ保存した。ＩＦＮ作用液は使用前に培地で希釈することによって調製した。タザロテン（式３）の５ｍＭ原液をＤＭＳＯ中に調製し、それを表示した最終濃度まで培地で希釈した。
【００１８】
乳癌細胞株の培養
エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）細胞株Ｔ−４７ＤおよびＥＲ−細胞株ＳＫ−ＢＲ−３は、１０％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ（ユタ州ローガン））、２ｍＭ Ｌ−グルタミンおよび１％抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を補足したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ））で培養した。細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；メリーランド州ロックビル）から入手した（Ｔ４７−ＤおよびＳＫＢＲ−３はそれぞれＨＴＢ−１３３およびＨＴＢ−３０である）。細胞は５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気中３７℃で培養した。
【００１９】
ＨＬ−６０急性骨髄性白血病細胞の培養
ヒト骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０は、１０％ウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅ（ユタ州ローガン））、２ｍＭ　Ｌ−グルタミンおよび１％抗生物質／抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を補足したイスコフ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（メリーランド州ゲーサーズバーグ））で培養した。ＨＬ−６０細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｒｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；メリーランド州ロックビル）から入手した（ＣＣＬ−２４０）。細胞は５％ＣＯ２を含む湿潤雰囲気中３７℃で培養した。
【００２０】
乳癌細胞株の細胞増殖アッセイ
癌細胞株の増殖は、市販の細胞増殖キット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用し、基本的に製造者の説明に従って決定した。細胞を９６穴組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ニューヨーク州コーニング））に３０００細胞／ウェルの濃度で播種した。２４時間後に細胞を連続的にタザロテン（式３）および／またはインターフェロン（ＩＦＮ）または溶媒のみで処理した。この研究で使用した適当な濃度のタザロテン（式３）は１０−１１Ｍ〜１０−６Ｍだった。ＩＦＮ濃度は１０〜１０００単位／ｍｌとした。培地は７２時間毎に交換した。７日後に、１０μｌの５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を各ウェルに加えた。ＢｒｄＵとのインキュベーションは、各ウェルに１００μｌの抗ＢｒｄＵ抗体を加えることによって、２４時間後に停止した。増殖する細胞のＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵの量は、４５０ｎｍで吸光度を測定することによって評価した。各実験は独立した三実験において三重に実施した。
【００２１】
ＨＬ−６０白血病細胞株の細胞増殖アッセイ（ＭＴＴ）
ＨＬ−６０白血病細胞株の増殖は、細胞生存および非放射性の市販の細胞増殖キット（ＭＴＴアッセイ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（インディアナ州インディアナポリス））によって、基本的に製造者の説明に従って決定した。細胞を９６穴組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ（ニューヨーク州コーニング））に１０００細胞／ウェルの濃度で播種した。２４時間後に細胞を連続的にタザロテン（式３）および／またはＩＦＮまたは溶媒のみで処理した。この研究で使用した適当な濃度のタザロテン（式３）は１０−１１Ｍ〜１０−６Ｍだった。ＩＦＮ濃度は０．１〜１０００単位／ｍｌとした。培地は７２時間毎に交換した。６日後に、１０μｌのＭＴＴ（３−［４，５−ジメチルチアゾール‐２‐イル］‐２，５‐ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を各ウェルに加えた。反応は、４時間のインキュベーション後に１００μｌの０．０１Ｍ　ＨＣｌ中１０％ＳＤＳを加えることによって停止した。ＭＴＴを分解してホルマザン色素を生成し得る生存細胞を、５９０ｎｍで吸光度を測定することによって定量した。いずれの測定も、独立した三実験において三重に実施した。
【００２２】
相乗性の判定基準
タザロテン（式３）とＩＦＮとの組み合わせ処置による増殖阻害を、相乗効果および相加効果について解析した。これら効果の判定基準は、三つの異なるグループによって論じられている。（Ａａｐｒｏら，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１０：１６１−１６６，１９８３；Ｍａｒｔｈら，Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，７７：１１９７−１２０２，１９８６；Ｋｕｒｂａｃｈｅｒら，Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｐｓ，１０３：１８３‐１８９，１９９６）。タザロテン（式３）または各インターフェロンでの処置後の二つの生存フラクションを数学的に合わせたものが、両剤の組み合わせにおける単純相加の計算値である。この計算値を実測値と比較して、組み合わせ効果の性質を評価する。相乗効果の統計学的有意性は両側スチューデントｔ検定を用いて決定する。各実験で独立に、単純相加の仮定と比較して、相乗効果または阻害をＰ値０．０５で評価した。２剤の相乗性、相加性、亜相加性および拮抗性の判定基準を数学的表現で表１に示す。
【００２３】
【表１】
2004506011.tif 000007
【００２４】
アッセイによって決定した抗増殖効果
以下、図１〜図１６のグラフを参照して述べると、これらのグラフはそれぞれ上述したアッセイで得た結果を表している。これらのアッセイでは、それぞれＳＫ−ＢＲ−３、Ｔ４７−ＤおよびＨＬ−６０細胞を、タザロテン（式３）とヒト組換えインターフェロン（ＩＦＮ）α、βおよびγとの各組合わせで処理した。ＳＫ−ＢＲ−３およびＴ−４７Ｄ細胞のアッセイに関する図１〜図１２のグラフでは、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の取込みをＹ（縦）軸上にプロットし、タザロテン（式３）またはＩＦＮα、ＩＦＮβもしくはＩＦＮγの濃度をそれぞれＸ（横）軸上にプロットしている。インターフェロンの濃度は当技術分野で受け入れられている国際単位で表す。一方、タザロテン（式３）はモル濃度を対数目盛でプロットする。各グラフには、１剤のみで得た結果の曲線、２剤（タザロテンおよびそれぞれのインターフェロン）の併用によって得た実際の実験結果の曲線、および２つの薬剤の効果が単純に相加的であると仮定して上記のように計算した理論曲線を描く。ＢｒｄＵの取込みは、各グラフにおける濃度可変の薬剤を使用しなかった場合に対する百分率としてプロットする（濃度０は取込み率１００％に対応する）。
【００２５】
図１３〜図１６のグラフも同様であるが、これらのグラフでは、ホルマザン色素量（５９０ｎｍ吸光度により測定）によって測定した、ＭＴＴを分解してホルマザン色素を生成し得る生存細胞量を縦（Ｙ）軸にプロットする。
【００２６】
図１のグラフについて具体的に述べると、このグラフに示すＳＫ−ＢＲ−３細胞におけるアッセイでは、ＩＦＮαの濃度は１００国際単位（Ｕ）／ｍｌとし、タザロテンの濃度を変化させた。このグラフでは、実験的に（すなわち実際に）観察された細胞増殖の阻害がＩＦＮα単独の場合よりも有意に大きく（ＢｒｄＵ取込み量がより少なく）、理論上相加的な曲線よりも有意に大きいことから、タザロテン（式３）とＩＦＮαとの相乗効果を示していることがわかる。図３および５のグラフも同様に、ＩＦＮβまたはＩＦＮγの濃度を１０Ｕ／ｍｌおよび１００Ｕ／ｍｌでそれぞれ一定値に保ち、タザロテン（式３）濃度を変化させた場合のＳＫ−ＢＲ−３細胞におけるアッセイ結果を表している。図３および５のグラフも併用処置の有意な相乗効果を示している。
【００２７】
図７、９および１１のグラフも、ＳＫ−ＢＲ−３細胞のアッセイ結果を示す。このアッセイでは、タザロテン（式３）の濃度を１０ｎＭの一定値に保ち、ＩＦＮα、ＩＦＮβまたはＩＦＮγの濃度を０〜１０００国際単位（０〜１０００Ｕ）／ｍｌの間で変化させた。これらのグラフは、顕著な相乗性を示している。
【００２８】
図２、４および６のグラフはＴ−４７Ｄ細胞のアッセイ結果を示し、図１、３および５のグラフに示したアッセイと同様にタザロテン（式３）濃度を変化させ、ＩＮＦα、ＩＦＮβまたはＩＦＮγの濃度を１００Ｕ／ｍｌの一定値に保った。これらの図のグラフも、ＳＫ−ＢＲ−３細胞のアッセイほど顕著ではないが、相乗性を示す。
【００２９】
図８、１０および１２のグラフも、Ｔ−４７Ｄ細胞のアッセイ結果を示す。このアッセイでは、図７、９および１１に示したアッセイと同様に、タザロテン（式３）濃度を１０ｎＭの一定値に保ち、ＩＦＮα、ＩＦＮβまたはＩＦＮγの濃度を０〜１０００国際単位（０〜１０００Ｕ）／ｍｌの間で変化させた。図８のグラフ（ＩＦＮα）は弱い相乗性を示し、図１０のグラフ（ＩＦＮβ）は顕著な相乗性を示す。
【００３０】
図１３〜１６は、ＨＬ−６０急性骨髄性白血病細胞のアッセイに関する。図１３および１４に示すアッセイでは、ＩＦＮαまたはＩＦＮβの濃度を１００Ｕ／ｍｌの一定値に保ち、タザロテン（式３）濃度を変化させた。図１５および１６のグラフに示すアッセイでは、タザロテン（式３）濃度を５０ｎＭの一定値に保ち、ＩＦＮαまたはＩＦＮβの濃度を０〜１０００Ｕ／ｍｌの間で変化させた。これらのアッセイにおいても顕著な相乗性が見られた。
【００３１】
タザロテン（式３）とヒト組換えインターフェロンとのこれら２つの固形腫瘍細胞株およびＨＬ−６０白血病細胞に対する抗増殖効果に関する上述の結果、特に相乗性は、予想外の驚くべき結果であり、式１の化合物が、悪性細胞増殖を伴う疾患、例えば固形腫瘍、特に乳癌、および白血病、特に急性骨髄性白血病の処置に役立つことを示している。事実、前述のアッセイは、エストロゲン受容体陽性である乳癌細胞株（Ｔ−４７Ｄ）でも、エストロゲン受容体陰性であるヒト乳癌細胞株（ＳＫ−ＢＲ−３）でも、式１の化合物がインターフェロンとの併用療法に有用であることを示している。
【００３２】
処置方法および投与様式
式１の化合物は、本発明にしたがって、例えば処置すべき状態、部位特異的処置の必要性、薬剤の投与量、その他多くの事項を考慮した上で、全身的投与または局所投与することができる。乳癌の処置および他の多くの固形腫瘍並びに白血病の処置を行う場合、式１の化合物は、腫瘍の化学療法に関する技術分野で周知の賦形剤または不活性成分を含む医薬組成物として、全身的投与されることが多いだろう。より具体的に述べると、式１の化合物を全身的投与する場合は、散剤、丸剤、錠剤などとして調合するか、経口投与に適したシロップ剤またはエリキシル剤として調合することができる。静脈内投与または腹腔内投与の場合、化合物は、注射による投与が可能な溶液または懸濁液として調製しうる。ある場合には、注射によるこれらの化合物の製剤化が有益でありうる。また別の場合には、これらの化合物を坐剤の形で、または皮下デポジット用徐放性製剤として、または筋肉内注射用として製剤化することが有益でありうる。
【００３３】
式１の化合物は、腫瘍を処置するための化学療法剤として、有効な処置量で投与しうる。有効な処置量は状態ごとに異なり、場合によって、処置しようとする状態の重症度および処置に対する患者の感受性によって変化しうる。したがって単一の用量が一様に有効なわけではなく、処置しようとする腫瘍または悪性腫瘍の個別の事情に応じて変更する必要がありうる。そのような用量は定型的な実験によって決定することができる。固形腫瘍および白血病、特に乳癌および急性骨髄性白血病の処置を行う場合は、その必要がある患者に、腫瘍の増殖を停止もしくは減速し、または腫瘍を消失させ、あるいは白血病細胞増殖を抑制するのに有効な用量で、式１の化合物を約１〜８週間投与することが考えられる。好ましくは化合物を経口投与し、その日用量は好ましくは約５０〜５００ｍｇ／日の範囲としうる。最も好ましくは処置にはタザロテン（式３）を使用しうる。
【００３４】
好ましくは、式１の化合物、最も好ましくはタザロテン（式３）を、インターフェロン（好ましくはヒト組換えインターフェロン）などの他の化学療法剤または他の既知の腫瘍化学療法剤と組み合わせて投与しうる。併用療法で式１の化合物と併用しうる他の化学療法剤はタモキシフェンおよびタキソールである。インターフェロンを用いることにより、またある種の他の化学療法剤を用いることにより、上記の細胞培養アッセイ法に示すように、相乗的な抗増殖抗腫瘍効果が得られうる。やはり、式１の化合物を併用療法で使用する場合、有効な処置量は状態ごとに異なり、場合により、処置しようとする状態の重症度および処置に対する患者の感受性によって変化しうる。したがって必要量は、腫瘍の化学療法学では常法となっている定型的な実験によって決定しうる。
【００３５】
通例、併用療法において固形腫瘍および白血病の処置を行う場合、式１の化合物の日用量は約５０〜５００ｍｇ／日の範囲としうる。式１の化合物と併用される他の化学療法剤の日用量は、該化学療法剤の性質に依存し、当技術分野で通常実施される定型的な実験によって決定することができる。固形腫瘍または白血病（例えば乳癌または急性骨髄性白血病など）の処置にインターフェロンを、式１の化合物と共に併用する場合、インターフェロンの日用量は約１００万〜９００万国際単位／日の範囲としうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対してタザロテン（式３）とα−インターフェロン（ＩＦＮ−ａまたはＩＦＮα）とを併用した場合の抗増殖効果の相乗性を表すグラフ。
【図２】Ｔ−４７Ｄ細胞に対してタザロテン（式３）とα−インターフェロン（ＩＦＮ−ａまたはＩＦＮα）とを併用した場合の抗増殖効果を表すグラフ。
【図３】ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対してタザロテン（式３）とβ−インターフェロン（ＩＦＮ−ｂまたはＩＦＮβ）とを併用した場合の抗増殖効果の相乗性を表すグラフ。
【図４】Ｔ−４７Ｄ細胞に対してタザロテン（式３）とβ−インターフェロン（ＩＦＮ−ｂまたはＩＦＮβ）とを併用した場合の抗増殖効果の相乗性を表すグラフ。
【図５】ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対してタザロテン（式３）とγ−インターフェロン（ＩＦＮ−ｇまたはＩＦＮγ）とを併用した場合の抗増殖効果の相乗性を表すグラフ。
【図６】Ｔ−４７Ｄ細胞に対してタザロテン（式３）とγ−インターフェロン（ＩＦＮ−ｇまたはＩＦＮγ）とを併用した場合の抗増殖効果を表すグラフ。
【図７】ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対してタザロテン（式３）とα−インターフェロン（ＩＦＮ−ａまたはＩＦＮα）とを併用した場合の抗増殖効果の相乗性を表すもう一つのグラフ。
【図８】Ｔ−４７Ｄ細胞に対してタザロテン（式３）とα−インターフェロン（ＩＦＮ−ａまたはＩＦＮα）とを併用した場合の抗増殖効果を表すもう一つのグラフ。
【図９】ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対してタザロテン（式３）とβ−インターフェロン（ＩＦＮ−ｂまたはＩＦＮβ）とを併用した場合の抗増殖効果の相乗性を表すもう一つのグラフ。
【図１０】Ｔ−４７Ｄ細胞に対してタザロテン（式３）とβ−インターフェロン（ＩＦＮ−ｂまたはＩＦＮβ）とを併用した場合の抗増殖効果の相乗性を表すもう一つのグラフ。
【図１１】ＳＫ−ＢＲ−３細胞に対してタザロテン（式３）とγ−インターフェロン（ＩＦＮ−ｇまたはＩＦＮγ）とを併用した場合の抗増殖効果の相乗性を表すもう一つのグラフ。
【図１２】Ｔ−４７Ｄ細胞に対してタザロテン（式３）とγ−インターフェロン（ＩＦＮ−ｇまたはＩＦＮγ）とを併用した場合の抗増殖効果を表すもう一つのグラフ。
【図１３】ＨＬ−６０細胞に対してタザロテン（式３）とα−インターフェロン（ＩＦＮ−アルファまたはＩＦＮα）とを併用した場合の抗増殖効果の相乗性を表すグラフ。
【図１４】ＨＬ−６０細胞に対してタザロテン（式３）とβ−インターフェロン（ＩＦＮ−ベータまたはＩＦＮβ）とを併用した場合の抗増殖効果の相乗性を表すグラフ。
【図１５】ＨＬ−６０細胞に対してタザロテン（式３）とα−インターフェロン（ＩＦＮ−アルファまたはＩＦＮα）とを併用した場合の抗増殖効果の相乗性を表すもう一つのグラフ。
【図１６】ＨＬ−６０細胞に対してタザロテン（式３）とβ−インターフェロン（ＩＦＮ−ベータまたはＩＦＮβ）とを併用した場合の抗増殖効果の相乗性を表すもう一つのグラフ。
【図１】
2004506011.tif 000014
【図２】
2004506011.tif 000015
【図３】
2004506011.tif 000016
【図４】
2004506011.tif 000017
【図５】
2004506011.tif 000018
【図６】
2004506011.tif 000019
【図７】
2004506011.tif 000020
【図８】
2004506011.tif 000021
【図９】
2004506011.tif 000022
【図１０】
2004506011.tif 000023
【図１１】
2004506011.tif 000024
【図１２】
2004506011.tif 000025
【図１３】
2004506011.tif 000026
【図１４】
2004506011.tif 000027
【図１５】
2004506011.tif 000028
【図１６】
2004506011.tif 000029
【国際公開パンフレット】
2004506011.tif 000030
2004506011.tif 000031
2004506011.tif 000032
2004506011.tif 000033
2004506011.tif 000034
2004506011.tif 000035
2004506011.tif 000036
2004506011.tif 000037
2004506011.tif 000038
2004506011.tif 000039
2004506011.tif 000040
2004506011.tif 000041
2004506011.tif 000042
2004506011.tif 000043
2004506011.tif 000044
2004506011.tif 000045
2004506011.tif 000046
2004506011.tif 000047
2004506011.tif 000048
2004506011.tif 000049
2004506011.tif 000050
2004506011.tif 000051
2004506011.tif 000052
2004506011.tif 000053
2004506011.tif 000054
2004506011.tif 000055
2004506011.tif 000056
2004506011.tif 000057
2004506011.tif 000058
2004506011.tif 000059
2004506011.tif 000060
2004506011.tif 000061
2004506011.tif 000062
2004506011.tif 000063
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004506011.tif 000064
【国際調査報告】
2004506011.tif 000065
2004506011.tif 000066
2004506011.tif 000067
2004506011.tif 000068
2004506011.tif 000069