(57)【要約】本発明は、リポキシゲナーゼ活性を有する微生物タンパク質の配列情報、及び、組換えＤＮＡ技術によるこのタンパク質の製造方法を提供する。より具体的には、発明者は、ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）から、リポキシゲナーゼをコードする遺伝子を分離し、この遺伝子を大腸菌株中にクローニングして配列決定した。比較が示す既知のリポキシゲナーゼ配列に対する同一性は２５％未満であり、最も近似するのはヒト１５Ｓリポキシゲナーゼである。発明者は、リポキシゲナーゼを組換え発現させ、組換えリポキシゲナーゼがグリコシル化されていることを見出した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポキシゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドであって、
ａ）　配列番号：２又は２３の成熟ポリペプチドと少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、
ｂ）　配列番号：１の成熟ポリペプチドをコードする核酸配列の相補鎖、又は該核酸配列の、少なくとも１００個のヌクレオチドを有する部分配列の相補鎖と、５５℃でハイブリッド形成する核酸配列によってコードされるか；
ｃ）　１つ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入によって配列番号：２又は２３の成熟ポリペプチドから得ることができるアミノ酸配列を有するか；又は、
ｄ）　寄託番号ＤＳＭ １３５８６の大腸菌に存在するプラスミド中にクローニングされたＤＮＡ配列のリポキシゲナーゼコード化部分によってコードされる；
リポキシゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
ポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドが：
ａ）　寄託番号ＤＳＭ １３５８６の大腸菌に存在するプラスミド中にクローニングされた成熟リポキシゲナーゼをコードする部分ＤＮＡ配列、
ｂ）　配列番号：２又は２３で示される成熟リポキシゲナーゼをコードする部分ＤＮＡ配列、
ｃ）　リポキシゲナーゼをコードし、かつ
ｉ）　前記ＤＮＡ配列と少なくとも５０％の同一性を有するか、
ｉｉ）　前記ＤＮＡ配列、又は該ＤＮＡ配列の、少なくとも１００個のヌクレオチドを有する部分配列の相補鎖と、低緊縮性でハイブリッド形成するか、又は
ｉｉｉ）　前記ＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体である、
前記ａ）又はｂ）で定義付けされた配列の類似物、又は
ｄ）　前記ａ）、ｂ）又はｃ）の相補鎖、
を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記部分ＤＮＡ配列が、配列番号：１又は２２で示される成熟ペプチド・コード配列である、請求項２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
核１つ以上のコントロール配列に作用可能に連結された請求項２又は３に記載のポリヌクレオチドを含んで成り、前記コントロール配列が、適切な発現宿主内でリポキシゲナーゼの発現を導くことができる、核酸構成物。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸構成物と、プロモーターと、転写停止シグナルと、翻訳停止シグナルとを含む、組換え発現ベクター。
【請求項６】
請求項４に記載の核酸構成物又は請求項５に記載のベクターで形質転換させられる、組換え宿主細胞。
【請求項７】
ａ）　リポキシゲナーゼの生成を導く条件下で、請求項６に記載の宿主細胞を培養し、そして
ｂ）　前記リポキシゲナーゼを回収する、
ことを含んで成る、リポキシゲナーゼを生成する方法。
【請求項８】
少なくとも２０個のヌクレオチドから成り、配列番号：２又は２３の部分ポリペプチド配列をコードする、オリゴヌクレオチドプローブ。
【請求項９】
リポキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドを得る方法であって、
ａ）　真核生物ＤＮＡライブラリを作成し、
ｂ）　請求項８に記載のプローブとハイブリッド形成するＤＮＡ分子を選択するために、前記ライブラリをスクリーニングし、
ｃ）　前記選択されたＤＮＡ分子で宿主細胞を形質転換し、
ｄ）　前記形質転換された宿主細胞を培養することにより、前記ＤＮＡ分子によってコードされたポリペプチドを発現させ、そして
ｅ）　前記発現させられたポリペプチドを検定することにより、リポキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドを選択する、
ことを含んで成る、リポキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドを得る方法。
【請求項１０】
マンガンリポキシゲナーゼを含む生地組成物。
【請求項１１】
前記リポキシゲナーゼが請求項１に記載のポリペプチドである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
生地にマンガンリポキシゲナーゼを添加することを含む、生地又は生地から製作される焼き製品の製造方法。
【請求項１３】
リノレン酸、アラキドン酸、リノレイルアルコール及びリノール酸エステルから成る群から選択された基質を酸素化する方法であって、酸素の存在において、前記基質をマンガンリポキシゲナーゼと接触させることを含む、基質を酸素化する方法。
【請求項１４】
前記リノール酸エステルが、メチルリノレエート、モノリノレイン、ジリノレイン又はトリリノレインである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記リポキシゲナーゼが、請求項１のポリペプチドである、請求項１２から１４までのいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
洗浄剤組成物であって、該洗浄剤組成物がマンガンリポキシゲナーゼと界面活性剤とを含む、洗浄剤組成物。
【請求項１７】
前記界面活性剤が陰イオン界面活性剤、特に線状アルキルベンゼンスルホネートを含む、請求項１６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、リポキシゲナーゼをコードするポリヌクレオチド、及びリポキシゲナーゼの組換え生成のための前記ポリヌクレオチドの使用に関する。本発明はまた、特異的なプローブでＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより、リポキシゲナーゼを得る方法に関する。
【０００２】
発明の背景
リポキシゲナーゼは、リノール酸の酸素化を触媒してヒドロペルオキシドを生成する酵素である。リポキシゲナーゼは、酵素命名法（Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ）において、ＥＣ １．１３．１１．１２として分類されている。この酵素は、植物及び動物中に広範囲に分布されている。コード化遺伝子が種々の源から分離されており、その配列が公表されている。例えば、ＧＥＮＥＳＥＱＰ Ｗ９３８３２及びＧｅｎｂａｎｋ Ｕ７８２９４はヒト１５Ｓ リポキシゲナーゼの配列を与える。
【０００３】
微生物リポキシゲナーゼは、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、好熱性アクチノ真菌サーモアクチノミセス・ブルガリス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・プロリフェラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）及びゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）（Ｓｕ及びＯｌｉｗ， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７３ （２１）， １３０７２−１３０７９ （１９９８））で知られている。微生物リポキシゲナーゼをコードする分離された遺伝子に関しては説明されていない。
この従来技術は、リポキシゲナーゼの種々の用途、例えばパン生地又は麺類へ食品添加物としての使用について記載している。
【０００４】
発明の概要
リポキシゲナーゼ活性を有する微生物タンパク質の配列情報と、工業規模におけるこのタンパク質の生成方法とをここに初めて提供する。より具体的には、発明者はゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）から、リポキシゲナーゼをコードする遺伝子を分離し、この遺伝子を大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株にクローニングし、これを配列決定した。Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓのゲノムは、ほぼ６０％のＧヌクレオチド及びＣヌクレオチドを含有し、このことは前記作業を極めて困難にした。比較が示す既知のリポキシゲナーゼ配列に対する同一性は２５％未満であり、最も近似するのはヒト１５Ｓリポキシゲナーゼである。発明者は、リポキシゲナーゼを組換え発現させた。
【０００５】
従って、本発明は、リポキシゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドであって、
ａ）　配列番号：２又は２３の成熟ポリペプチドと少なくとも５０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、
ｂ）　配列番号：１の成熟ポリペプチドをコードする核酸配列の相補鎖、又は該核酸配列の、少なくとも１００個のヌクレオチドを有する部分配列の相補鎖と、５５℃でハイブリッド形成する核酸配列によってコードされるか；
ｃ）　１つ以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入によって配列番号：２又は２３の成熟ポリペプチドから得ることができるアミノ酸配列を有するか；又は、
ｄ）　寄託番号ＤＳＭ １３５８６の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に存在するプラスミド中にクローニングされたＤＮＡ配列のリポキシゲナーゼコード部分によってコードされる；
リポキシゲナーゼ酵素活性を有するポリペプチドを提供する。
【０００６】
本発明はまた、ポリヌクレオチドであって、
ａ）　寄託番号ＤＳＭ １３５８６の大腸菌に存在するプラスミド中にクローニングされた成熟リポキシゲナーゼをコードする部分ＤＮＡ配列、
ｂ）　 配列番号：２又は２３で示される成熟リポキシゲナーゼをコードする部分ＤＮＡ配列、
ｃ）　リポキシゲナーゼをコードし、かつ
ｉ）　前記ＤＮＡ配列と少なくとも５０％の同一性を有するか、
ｉｉ）　前記ＤＮＡ配列、又は該ＤＮＡ配列の、少なくとも１００個のヌクレオチドを有する部分配列の相補鎖と、低緊縮性でハイブリッド形成するか、又は
ｉｉｉ）　前記ＤＮＡ配列の対立遺伝子変異体である、
前記ａ）又はｂ）で定義付けされた配列の類似物、又は
ｄ）　前記ａ）、ｂ）又はｃ）の相補鎖
を含む、ポリヌクレオチドを提供する。
【０００７】
本発明の別の特徴は、前記ポリヌクレオチドを含む核酸構成物と、該核酸構成物を含む組換え発現ベクターと、前記核酸構成物で形質転換された組換え宿主細胞とを提供する。本発明はまた、リポキシゲナーゼの組換え生成法と、配列番号：２又は２３に基づくオリゴヌクレオチドプローブと、配列番号：２に基づくプローブを使用して、真核生物ＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによってリポキシゲナーゼを得る方法とを提供する。
【０００８】
さらに本発明は、マンガンリポキシゲナーゼを含む生地組成物と、生地にマンガンリポキシゲナーゼを添加することを含む、生地又は生地から製作される焼き製品の製造方法とを提供する。本発明はまた、リノレン酸、アラキドン酸、リノレイルアルコール及びリノール酸エステルから成る群から選択された基質を酸素化する方法であって、該方法が、酸素の存在において、前記基質をマンガンリポキシゲナーゼと接触させることを含む、基質を酸素化する方法を提供する。さらに本発明は、マンガンリポキシゲナーゼと界面活性剤とを含む、洗浄剤組成物を提供する。
【０００９】
発明の詳細な説明
ゲノムＤＮＡ源
リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）をコードするＤＮＡは、菌類、具体的には子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、より具体的には、出所不明（ｉｎｃｅｒｔａｅ ｓｅｄｉｓ）子嚢菌門、例えばマグナポルタセー（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈａｃｅａｅ）、例えばゲウマンノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）、又はアナモルフィック・マグナポルタセー（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈａｃｅａｅ）、例えばピリクラリア（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ）、あるいは、アナモルフィック・アスコミコタ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、例えばゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）に由来してよい。例としては、Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ、例えばＧ． ｇｒａｍｉｎｉｓ ｖａｒ． ｇｒａｍｉｎｉｓ， Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ ｖａｒ． ａｖｅｎａｅ又はＧ． ｇｒａｍｉｎｉｓ ｖａｒ． ｔｒｉｔｉｃｉ， 具体的には菌株Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ ｖａｒ． ｇｒａｍｉｎｉｓ ＣＢＳ ９０３．７３， Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ ｖａｒ． ａｖｅｎａｅ ＣＢＳ ８７０．７３又はＧ． ｇｒａｍｉｎｉｓ ｖａｒ． ｔｒｉｔｉｃｉ ＣＢＳ ９０５．７３が挙げられる。これらのＣＢＳ菌株は、オランダ国Ｂａａｒｎ， Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓから商業的に入手可能である。
【００１０】
発明者は、ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）の菌株から２つのＬＯＸコードＤＮＡ配列を得て、これらの配列が、配列番号：１又は２２で示される配列を有することを見出した。発明者は、ＬＯＸコード遺伝子を大腸菌の菌株内に挿入し、これをＥ． Ｃｏｌｉ ＤＳＭ １３５８６として、独国Ｄ−３８１２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ Ｍａｓｃｈｅｒｏｒｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ， ＤＳＭＺ （Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ）に、ブダペスト条約に基づいて２０００年７月５日に寄託した。この寄託はＮｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓによって行われ、後にＮｏｖｏｚｙｍｅｓ Ａ／Ｓに譲渡された。
【００１１】
リポキシゲナーゼ
本発明のリポキシゲナーゼは、マンガンリポキシゲナーゼである。すなわち、このリポキシゲナーゼは、補欠分子族においてマンガンと共にリポキシゲナーゼ活性（ＥＣ １．１３．１１．１２）を有する。このリポキシゲナーゼはグリコシル化されており、９０〜１１０ ｋＤａの範囲、特に９５〜１０５ ｋＤａの範囲の分子量を有することができる。このリポキシゲナーゼは温度安定的であり、最適温度は６５〜９０℃、特に７５〜８５℃である。このリポキシゲナーゼは、ｐＨ １０で最大４００ｐｐｍのＬＡＳ（線状アルキル−ベンゼンスルホネート）に対して安定的である。Ｍｎ−リポキシゲナーゼはｐＨ ５〜１２において酵素活性を有し、その最適値はｐＨ ６〜８と広範囲である。
【００１２】
組換えリポキシゲナーゼはより高いグリコシル化度と、より高い熱安定性とを有することができる。組換えリポキシゲナーゼは、９０〜１１０ ｋＤａの範囲、特に９５〜１０５ ｋＤａの範囲の分子量を有することができる。組換えリポキシゲナーゼは６５〜９０℃、特に７５〜８５℃の最適温度を有することができる。
【００１３】
組換え発現ベクター
本発明の発現ベクターは典型的には、プロモーター、オペレータ、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意には、選択可能なマーカー、転写ターミネータ、リプレッサー遺伝子又は種々のアクティベータ遺伝子をコードするコントロール配列を含む。このベクターは、自己複製ベクターであってよく、あるいは、宿主細胞遺伝子に組み込まれてもよい。
【００１４】
形質転換細胞の培養による生成
本発明のリポキシゲナーゼは、リポキシゲナーゼをコードするＤＮＡ配列で適切な宿主細胞を形質転換し、酵素の生成を可能にする条件下で、形質転換された生物を培養し、さらに、酵素を培養から回収することにより生成することができる。
【００１５】
宿主生物は、真核細胞、具体的には菌細胞、例えば酵母細胞、又は糸状菌細胞、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）， フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）， トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）又はサッカロミセス（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）、特にアスペルギルス・ニガー（Ａ． Ｎｉｇｅｒ）， アスペルギルス・オリゼー（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）， フザリウム・グラミネアルム（Ｆ． ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）， フザリウム・サンブシヌム（Ｆ． ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）， フザリウム・セレアリス（Ｆ． ｃｅｒｅａｌｉｓ）又はサッカロミセス・セレビシエー（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の菌株であってよい。このような宿主生物におけるリポキシゲナーゼの生成は、ＥＰ２３８，０２３ （Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）， 国際公開第９６／００７８７号パンフレット（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）又はＥＰ２４４，２３４（Ａｌｋｏ）によって行われてよい。
【００１６】
ヌクレオチドプローブ
配列番号：１のＤＮＡ配列、又は配列番号：２のポリペプチド配列、特に成熟ペプチド部分に基づいて、ヌクレオチドプローブを設計することができる。プローブは、下記のようなＬＯＸコードＤＮＡのスクリーニングに使用することができる。
（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ Ｊ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ （１９８９） 「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）（第２版）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に記載されているような）標準技術によって、配列番号：２のアミノ酸配列の成熟部分、又はＤＮＡ配列の相応部分に基づいて、合成オリゴヌクレオチド・プライマーを調製することができる。このプライマーは縮重プローブであってよく、典型的には少なくとも２０個のヌクレオチドを含有することになる。
【００１７】
真核生物ＤＮＡライブラリのスクリーニング
リポキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、下記の方法、すなわち：
ａ）　真核生物ＤＮＡライブラリを作成し、
ｂ）　上述のプローブとハイブリッド形成するＤＮＡ分子を選択するために、前記ライブラリをスクリーニングし、
ｃ）　前記選択されたＤＮＡ分子で宿主細胞を形質転換し、
ｄ）　前記形質転換された宿主細胞を培養することにより、前記ＤＮＡ分子によってコードされたポリペプチドを発現させ、さらに、
ｅ）　前記発現させられたポリペプチドを検定することにより、リポキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドを選択する
ことによって得ることができる。
【００１８】
真核細胞ＤＮＡライブラリは、コンベンショナルな方法によって作成することができる。真核細胞ＤＮＡライブラリは、上述のような適切な源から導出されたゲノムＤＮＡ又は二本鎖ｃＤＮＡを含んでよい。
ＤＮＡ配列の分子スクリーニングは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と、これに続いて行われるハイブリッド形成とによって行うことができる。
よく知られた手順に従って、分子スクリーニングにおいて発生したＰＣＲフラグメントを分離し、適切なベクター中にサブクローニングすることができる。このＰＣＲフラグメントは、例えばコロニーハイブリッド形成又はプラークハイブリッド形成によってＤＮＡライブラリをスクリーニングするのに使用することができる。
【００１９】
ハイブリッド形成（ハイブリダイゼーション）
ハイブリッド形成は、本発明のＤＮＡ配列に相応するヌクレオチドプローブに対して、所与のＤＮＡ配列が類似していることを示唆するのに使用される。ハイブリッド形成は、低緊縮性、中緊縮性、高緊縮性で行われてよい。ハイブリッド形成条件の一例を以下に詳しく説明する。
【００２０】
ヌクレオチドプローブと相同ＤＮＡ配列又は相同ＲＮＡ配列との間のハイブリッド形成を見極めるのに適した条件は、５ ｘ ＳＳＣ（標準的なクエン酸生理食塩水）中にＤＮＡフラグメント又はＲＮＡを含有するフィルタを予浸し、５ ｘ ＳＳＣ 溶液（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）、５ ｘ デンハート溶液（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）、０．５ ％のＳＤＳ及び１００ μｇ／ｍｌの変性音波処理サケ精子ＤＮＡ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８９）中でフィルタの前ハイブリッド形成を行い、これに続いて、ランダムプライマー （Ｆｅｉｎｂｅｒｇ， Ａ． Ｐ． 及び Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ， Ｂ． （１９８３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３２：６−１３）、３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識（特異活性＞１ ｘ １０９ ｃｐｍ／μｇ）プローブを含有する同一溶液中で、１２時間約４５℃でハイブリッド形成を行うことに関与する。次いでフィルタを２ ｘ ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ中で最低５５℃の温度で、詳細には最低６０℃、より詳細には最低６５℃、例えば最低７０℃又は最低７５℃で３０分間、２回洗浄する。
このような条件下でオリゴヌクレオチドプローブとハイブリッド形成する分子を、ｘ線フィルムを使用して検出する。
【００２１】
アラインメント及び同一性
本発明のヌクレオチド配列は、公開された配列に対して、少なくとも７５％又は少なくとも８３％、詳細には少なくとも９０％又は少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の同一性を有することができる。
【００２２】
本発明の目的上、配列のアラインメント（整列化）と同一性スコアの計算とを、タンパク質及びＤＮＡ双方のアラインメントに有用なニードルマン・ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ）アラインメント（すなわちグローバル・アラインメント）を用いて行った。タンパク質アラインメントには、デフォルト・スコアリング・マトリックスＢＬＯＳＵＭ５０が、また、ＤＮＡアラインメントには同一性マトリックスがそれぞれ用いられる。ギャップ内の第１の残基に対するペナルティはタンパク質の場合には−１２であり、ＤＮＡの場合には−１６であるのに対し、ギャップ内の付加的な残基に対するペナルティはタンパク質の場合には−２であり、ＤＮＡの場合には−４である。
【００２３】
アラインメントはＦＡＳＴＡパッケージ、ｖ２０ｕ６版 （Ｗ． Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ及びＤ． Ｊ． Ｌｉｐｍａｎ （１９８８）， 「生物学的配列分析のための改善されたツール（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」， ＰＮＡＳ ８５：２４４４−２４４８、及び、Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ （１９９０）「ＦＡＳＴＰ及びＦＡＳＴＡとの迅速で高感度の配列比較（Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ＦＡＳＴＰ ａｎｄ ＦＡＳＴＡ）」， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８３：６３−９８）から得られる。
【００２４】
リポキシゲナーゼの使用
上述のようなマンガンリポキシゲナーゼは、下記の用途で、例えば提示した刊行物と同様に使用することができる。
リポキシゲナーゼは、焼き製品、例えばパン、ビスケット及びケーキのための生地に対する添加物として使用することができる。例えばリポキシゲナーゼは、焼き製品を製作するために、リポキシゲナーゼを生地に添加し、この生地をこね、さらに生地を焼くことから成るパン製造過程で使用することができる。ＳＵ ４２６６４０ Ａ、特開昭５８−１９０３４６号公報［ＳＬＫ１］、特開平１１−６５３３２号公報［ＳＬＫ２］、ＪＰ ８３２２４５６［ＳＬＫ３］、ＪＰ １００２８５１６［ＳＬＫ４］、ＪＰ ０８３２２４５６， ＪＰ ２９６４２１５。リポキシゲナーゼは、特開平１１−２９９４４０号公報に記載されているように、麺類の製造に使用することもできる。
【００２５】
リポキシゲナーゼは、漂白、例えばベータ−カロチン、小麦粉又は小麦生地の漂白に使用することができる（米国特許第１，９５７，３３３〜１，９５７，３３７号明細書）。
リポキシゲナーゼは、脂肪酸の混合物を酸化してヒドロペルオキシ脂肪酸にする際に脂質過酸化反応の促進剤として、また、或る特定の油のリノール酸含有量及びリノレン酸含有量を評価するための分析ツールとして使用することもできる。
【００２６】
本発明は、リポキシゲナーゼと界面活性剤、特に陰イオン界面活性剤、例えばＬＡＳ（線状アルキル−ベンゼンスルホネート）とを含む洗浄剤組成物を提供する。リポキシゲナーゼは、このような界面活性剤の存在において良好な安定性を有するので有利である。この洗浄剤は、米国特許第３６３５８２８号明細書［ＳＬＫ５］又は同第５７８９３６２号明細書［ＳＬＫ６］に記載されているように配合されてよい。リポキシゲナーゼはＤＫ９８００３５２［ＳＬＫ７］に記載されているように、布地又は硬質表面から染みを漂白するのに使用することもできるので有利である。
【００２７】
リポキシゲナーゼはＪＰ ０９１６３９５３， ＥＰ７７２９８０， 特開２０００−１０６８３２号公報に述べられているような澱粉の改質に使用することができる。また、リポキシゲナーゼは、ＥＰ９４７１４２， ＤＥ １９８４００６９又はＪＰ ６１０７８３６１に記載されているようなタンパク質改質、又はＪＰ ５９０５１２８、米国特許第３７２９３７９号明細書に述べられているような油の改質（共役脂肪酸の生成）に使用することもできる。
【００２８】
リポキシゲナーゼは、オキシダーゼ、例えばラッカーゼ、ビリルビンオキシダーゼなどによって、タンパク質を架橋するのに使用することができる（ＥＰ ９４７１４２）。
リポキシゲナーゼは、魚肉にリポキシゲナーゼを添加することにより、海産練り物製品、例えば蒲鉾、ハンペンの粘りや風味を改善するのに使用することができる（ＪＰ ６１０７８３６１）。
リポキシゲナーゼは、トマト加工品を製造するのに使用することができる。リポキシゲナーゼは、トマトペースト、サルサ、ケチャップなどに使用することができる（ＥＰ ９８３７２５）。
【００２９】
リポキシゲナーゼは、不飽和４−２４Ｃ脂肪酸とリポキシゲナーゼとを反応させることにより、ヒドロペルオキシ脂肪酸の製造に使用することができる（ＪＰ １１０２９４１０）。
リノール酸又はリノレン酸のヒドロペルオキシドは、さらに、例えば成長調節ホルモンであるジャスモン酸に転化することができ、アラキドン酸からの生成物は、生理学的エフェクタであるロイコトリエン及びリポキシンに転化することができる。
【００３０】
リポキシゲナーゼの用途は、上述の例に限定されるものではない。ヒドロペルオキシド、つまりリポキシゲナーゼ反応の生成物は、ラジカルを形成するための良好な酸化剤なので、リポキシゲナーゼは、酸化反応を利用して他の用途、例えば食品又は織物色素の漂白、又はプラスチック材料又はプラスチック繊維を製造するための化学化合物の重合に使用することもできる。
【００３１】
リポキシゲナーゼ活性のアッセイ
リポキシゲナーゼ活性をヒドロペルオキシドの形成を監視することにより、２５℃で分光光度法により見極めた。標準的な分析の際に、９８０ μＬ ２５ ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ ７．０）と１０ μｌ の基質溶液（０．２％ （ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ２０で分散させられた１０ｍＭのリノレン酸）とを含有する１ ｍＬの石英キュベットに、１０ μＬの酵素を添加した。酵素を典型的な形式で稀釈して、初めの１分間のうちに、添加された基質の最大１０％が充分に代謝回転することを保証した。２３４ ｎｍにおける吸収率を追跡し、曲線の線形部分から速度を評価した。１単位は、２３４ ｎｍにおいて０．００１／分の吸収率増大をもたらした。
【００３２】
基質特異性の決定
多数の種々異なる化合物を基質とした標準的なアッセイ条件を用いて、リポキシゲナーゼの基質特異性を調査した。０．２％ （ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ２０を含有する分散系として、すべての基質を生成した。これらの原液を形成するのに添加した化合物の量を質量で測定した。それというのも粘性が容積の正確な測定を不可能にしたからである。アッセイ中に添加された基質の量を変化させることにより、限界速度定数と特異性定数とを見極めた。結果として生じた速度を、使用した基質の濃度に対してプロットした。最後に、非線形少なくとも二乗回帰により、ミカエリス・メンテン方程式の理論双曲線にこれらのプロットを適合させた。これらのシス−トランス−共役ヒドロ（ペロ）キシ脂肪酸を、２３，０００ Ｍ−１ｃｍ−１の分子吸光係数を有するものと想定した。
【００３３】
例
材料及び方法
分子クローニング技術はＳａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）において記載されている。
サブクローニング及びＤＮＡライブラリ構成には下記の商業的なプラスミド及びＥ． ｃｏｌｉ菌株を使用した：
ｐＴ７Ｂｌｕｅ （Ｎｏｖａｇｅｎ）
ｐＵＣ１９ （日本、ＴＯＹＯＢＯ）
Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ （日本、ＴＯＹＯＢＯ）
Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ１２ （米国、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）
ｃＤＮＡクローニングには、下記の商業的なキットを使用した：
ｃＤＮＡ合成キット （日本、Ｔａｋａｒａ）
Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ増幅キット （米国、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
Ｏｌｉｇｏ ｄＴ セルロース粉末 （オランダ国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）
ＤＩＧ−標識付け・検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｈｅｉｍ）を使用して、ハイブリッド形成プローブの標識付け及び検出を行った。サザンブロッティング及びコロニーハイブリッド形成の双方のためのＤＮＡ転移には、ナイロン膜Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ （英国、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用した。
【００３４】
媒地及び緩衝溶液
ＣＯＶＥ−ａｒ： １リットル当たり、３４２．３ ｇのサッカロース、２０ ｍｌのＣＯＶＥ食塩水、１０ ｍＭのアクリルアミド、１５ ｍＭのＣｓＣｌ２、３０ ｇのＡｇａｒ ｎｏｂｌｅ （Ｄｉｆｃｏ）
ＣＯＶＥ２−ａｒ： １リットル当たり、３０ ｇのサッカロース、２０ ｍｌのＣＯＶＥ食塩水、１０ ｍＭのアクリルアミド、３０ ｇのＡｇａｒ ｎｏｂｌｅ （Ｄｉｆｃｏ）
ＣＯＶＥ食塩水： １リットル当たり、２６ ｇのＫＣｌ、２６ ｇのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、７６ ｇのＫＨ２ＰＯ４、５０ｍｌのＣｏｖｅ微量金属
【００３５】
Ｃｏｖｅ微量金属： １リットル当たり、０．０４ ｇのＮａＢ４Ｏ７−１０Ｈ２Ｏ、０．４ ｇのＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ、１．２ ｇのＦｅＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、０．７ ｇのＭｎＳＯ４−Ｈ２Ｏ、０．７ ｇのＮａ２ＭｏＯ２−２Ｈ２Ｏ、０．７ ｇのＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ
ＡＭＧ微量金属： １リットル当たり、１４．３ ｇのＺｎＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、２．５ ｇのＣｕＳＯ４−５Ｈ２Ｏ、０．５ ｇのＮｉＣｌ２、１３．８ ｇのＦｅＳＯ４、８．５ ｇのＭｎＳＯ４、３．０ ｇのクエン酸
ＹＰＧ： １リットル当たり、４ ｇの酵母抽出物、１ ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５ ｇのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、１５ ｇのグルコース、ｐＨ ６．０
ＳＴＣ： ０．８ Ｍのソルビトール、２５ ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ ８、２５ ｍＭのＣａＣｌ２
ＳＴＰＣ： ＳＴＣ緩衝液中４０％のＰＥＧ４０００
【００３６】
Ｃｏｖｅトップアガロース： １リットル当たり、３４２．３ ｇのサッカロース、２０ ｍｌのＣＯＶＥ食塩水、１０ ｍＭのアセトアミド、１０ ｇの低融点アガロース
ＭＳ−９： １リットル当たり、３０ ｇの大豆粉末、２０ ｇのグリセロール、ｐＨ ６．０
ＭＤＵ−２Ｂｐ：１リットル当たり、４５ ｇのマルトース−１Ｈ２Ｏ、７ ｇの酵母抽出物、１２ ｇのＫＨ２ＰＯ４、１ ｇのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、２ ｇのＫ２ＰＯ４、５ ｇの尿素、１ ｇのＮａＣｌ、０．５ ｍｌのＡＭＧ微量金属溶液ｐＨ ５．０
【００３７】
材料
α−３２Ｐ−ｄＣＴＰ （３０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）、ｄＮＴＰｓ、α−３３Ｐ−ｄｄＮＴＰｓ、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ膜、及びＤＮＡ標識ビード（−ｄＣＴＰ）、Ｔ−プライマー第１鎖キット、及びサーモ・シーケナーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）キットをＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ （スウェーデン国Ｕｐｐｓａｌａ）から入手した。ＴＡクローニングキットをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ （オランダ国Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ）から入手した。Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ及び増強された鳥類ＲＴ−ＰＣＲキットをＳｉｇｍａ （ミズーリ州Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ）から入手した。制限酵素をＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ （マサチューセッツ州Ｂｅｖｅｒｌｙ）から入手した。
【００３８】
Ｓｕ及びＯｌｉｗ（前出）によって説明されているように、Ｇ． Ｇｒａｍｉｎｉｓを得て成長させた。Ｑｉａｇｅｎ植物ＲＮｅａｓｙミニ及びＱｌＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットをＭｅｒｃｋ Ｅｕｒｏｌａｂ （スウェーデン国Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ）から入手した。ＰＣＲのための縮重プライマーをＴＩＢ Ｍｏｌｂｉｏｌ （独国Ｂｅｒｌｉｎ）から入手し、配列決定プライマーをＣｙｂｅｒＧｅｎｅ （スウェーデン国Ｈｕｄｄｉｎｇｅ）から購入した。Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（スウェーデン国Ｔａｂｙ）から入手したキット（ｃＤＮＡ末端急速増幅用５’ＲＡＣＥシステム）で、５’−ＲＡＣＥ及び総ＲＮＡの逆転写を行った。
【００３９】
例１．ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． Ｇｒａｍｉｎｉｓ）由来のＬＯＸの部分ペプチド配列の決定
本質的にはＣｈａｏ Ｓｕ及びＥｒｎｓｔ Ｈ． Ｏｌｉｗ， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７３ （２１）， １３０７２−１３０７９ （１９９８） に記載されている通りに、Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｖａｒ． ｔｒｉｔｉｃｉの菌株を培養し、リポキシゲナーゼを回収した。
この酵素のＮ−末端部分からデータを得るために、４９４ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において製造者の指示書に従って、伝統的なエドマン分解法を用いることにより、約１０ ｍｇの酵素を直接的に分析した。
【００４０】
試料の別の４０μｍを凍結乾燥させてほぼ２０μｍに縮小し、ＤＴＴを含有する２０ μｌのＳＤＳ試料緩衝液に添加した後、これを３０分間３７℃でインキュベートし、次いでこの試料を３分間煮沸した。次いで、１ ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ中の５ μｌ ０．５ Ｍのヨードアセトアミド（ｐＨ７．５）を添加し、このサンプルを２０分間室温でインキュベートした後、製造者の指示書に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥ （４−２０ ％、Ｎｏｖｅｘ）において試料を走行させた。Ｎｏｖｅｘから得られる標準的な手順に従って、ゲルを染色した。
【００４１】
次いでゲル片（６０ｋＤａ）を切り取り、刃で細かく切り刻んだ。これらのゲル片を０．５ Ｍのトリス ｐＨ ９．２／ＡＣＮ（１：１）中で４５分間３７℃で２回洗浄した。ゲル片を１００％のＡＣＮで１０分間処理することにより、これらのゲル片を縮小した。ＡＣＮを除去し、ゲル片を高速真空で乾燥させた。２００ ｍｌ ０．１ ＭのＮＨ４ＣＯ３ （ＡＭＢＩＣ）を添加し、１５分間インキュベートした。ＡＭＢＩＣを除去し、１００ｍｌのＡＣＮを添加した。再び１０分間インキュベートし、次いでＡＣＮを除去して高速真空で乾燥させた。ＡＭＢＩＣを含むこのサイクルを２回繰り返した。最後の乾燥ステップ後、０．１ Ｍのトリス ｐＨ ９．２， １０％のＡＣＮ中の２０ ｍｌ ０．０５ ｍｇ／ｍｌのトリプシンを添加した。これを１０分間インキュベートした。次いで３００ｍｌ ０．１Ｍのトリス ｐＨ ９．２， １０％のＡＣＮを添加した。３７℃で一晩インキュベートを続けた。
【００４２】
次いで上澄みを除去し（対照のために保存）、３０ｍｌ １０％のＴＦＡを添加することにより、ゲルからペプチドを抽出した。５分後、ＴＦＡを引き出し、捕集した。さらに、１５０ｍｌ １０％のＴＦＡ， ６０％のＡＣＮをゲル片に添加することにより、２回抽出を行い、３７℃で３０分間インキュベートした。全ての抽出物を捕集し（ ３０ｍｌ＋１５０ｍｌ＋１５０ｍｌ）、高速真空で５０ｍｌに濃縮した。濃縮物の試料（５ｍｌ）を、ＴＦＡ／イソプロパノールの溶媒系を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣにおいてＶｙｄａｃ Ｃ−１８ カラム上で走行させ、これにより存在するペプチドがあるか否かを見た。試料の残りを走行させることにより、ペプチドを捕集した。ブランク・ゲル片を有する対照を並行して走行させた。ペプチドの損失を少なくとも限にするために、選択された画分を、再純化することなしに直接的に配列決定した。
結果として生じたＮ−末端配列を、配列番号：２１と示し、２つの内部ペプチド（ｆｒ ２９及び３４と表す）を、配列番号：１９及び２０と示す。
【００４３】
さらに、約１００ μｇのリポキシゲナーゼを、４０ μｌ ０．０５ Ｍのリン酸カリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ０．０５％のＳＤＳ， ｐＨ７．３に添加し、９０℃で４分間加熱し、放置冷却した。次いで、試料を２５ ｍＵのＯ−グリコシダーゼ（ＢＳＡ非含有）及び８００ ｍＵのＥｎｄｏＦ グリコシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）に添加し、一晩３７℃で放置した。次いでこの試料を７５ μｌのＳＤＳ試料緩衝液に添加し、製造者の指示書に従って７つのレーン内でＳＤＳ−ＰＡＧＥ （Ｎｏｖｅｘ ４−２０％）において走行させた。
【００４４】
６０ｋＤａの帯をゲルから切り取り、細かく刻んで、これをエッペンドルフ管内で、４００ μｌの０．５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ９．２：ＡＣＮ １：１で２回、３７℃で４５分間洗浄した。次いでこれらのゲル片を、２００ μｌのＡＣＮで１０分間処理し、次いで高速真空で乾燥させた。４００ μｌのＮＨ４ＣＯ３を添加し、１０分間放置した後、上澄みを除去し、ゲル片をさらに２００ μｌのＡＣＮで１０分間処理し、次いで乾燥させた。４００ μｌのＨ２Ｏを添加し、試料を１０分間放置した後、ＡＣＮでこの手順を再び繰り返した。
【００４５】
次いでゲル片を２５ μｌ ０．１ ｍｇ／ｍｌのトリプシン＋３００ μｌ ０．１ ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％のＡＣＮ， ｐＨ ９．２に添加し、一晩３７℃で放置した。インキュベーション後、３５ μｌの１０ ＴＦＡを添加し、３０分後、ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ Ｃ １８， ０．１％のＴＦＡ中最大８０％の勾配のアセトニトリル）用に上澄みを採取した。次いでゲル片を１５０ μｌ ０．１％のＴＦＡ， ６０％のアセトニトリルで２回抽出した。上澄みを採取し、高速真空で蒸発させて約５０ μｌにした後、さらに１００ μｌ ０．１％のＴＦＡを添加し、次いで再蒸発させて５０ μｌに縮小し、これをＨＰＬＣにおいて流動させた。
配列番号：１６、１７及び１８で示されるような３つのアミノ酸配列（ｆｒ ２０、２１及び２５と表す）を得た。
【００４６】
例２．ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． Ｇｒａｍｉｎｉｓ）由来のＬＯＸのゲノムｃＤＮＡクローンのクローニング
菌染色体ＤＮＡの調製
ゲウマンノミセス・グラミニス・バラエティー・トリチシ（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｖａｒ． ｔｒｉｔｉｃｉ）の菌株をＹＰＧ（１リットル当たりの構成： ４ ｇの酵母抽出物、１ ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５ ｇのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏ、１５ ｇのグルコース、ｐＨ ６．０）中で、静かに攪拌しながら２５℃で６日間培養した。Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ （米国、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用してろ過により菌糸を捕集し、これを脱イオン化水で２回洗浄した。紙フィルタ上で短時間乾燥させた後、菌糸を液体窒素によって冷凍し、ドライアイス上でモータによって粉砕した。
【００４７】
約０．２ｇの粉砕菌糸を１．５ ｍｌのエッペンドルフ管内に入れ、１００ ｍＭのＮａＣｌと、２５ ｍＭのＥＤＴＡと、１％のＳＤＳと５０ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）とを含有する０．５ ｍｌの緩衝溶液中で懸濁した。２５ ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを３ ｍｇ／ｍｌ添加した後、管を６５℃で３０〜６０分間インキュベートした。この溶液を同一容積のフェノールで抽出し、ＤＮＡを０．７容積のイソプロパノールで、−２０℃で沈殿させた。ペレットを０．５ｍｌの滅菌水中に再懸濁させ、残余のＲＮＡを５０ μｇのリボヌクレアーゼによって３７℃で３０分間消化させた。ＤＮＡをフェノールで抽出し、エタノールで再び沈殿させた。ペレットを適量の滅菌水中に懸濁した。
【００４８】
ｍＲＮＡの調製及びｃＤＮＡの合成
ゲウマンノミセス・グラミニス・バラエティー・トリチィシ（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｖａｒ． ｔｒｉｔｉｃｉの）菌株をＹＰＧ中で、静かに攪拌しながら２５℃で６日間培養した。リポキシゲナーゼ活性を確認した後、上述のように菌糸を捕集し、ドライアイス上でモータによって粉砕し、その後フェノール−クロロホルム法によって総ＲＮＡを調製するのに使用した。総ＲＮＡからのｍＲＮＡの純化を、Ｏｌｉｇｏ ｄＴ セルロース粉末 （オランダ国、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行った。
【００４９】
ｃＤＮＡ合成キット （日本、Ｔａｋａｒａ）でｃＤＮＡを合成した。それぞれ１．０ ｍＭのｄＮＴＰと、４ μｇのオリゴ（ｄｔ）１８と、２ μｇのランダムプライマーと、１００ Ｕの逆転写酵素と第１鎖合成緩衝液とを含有する混合物中で、鋳型として５〜６ μｇの熱変性ｍＲＮＡを使用して、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。全体で５０ μｌの反応混合物を室温で１０分間保持し、次いで４２℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を２分間氷上で冷却し、これに第２鎖ｃＤＮＡ合成を施した。１１３８ ＵのＥ． ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ、５ μｇのＥ． ｃｏｌｉ リボヌクレアーゼ Ｈ／デオキシボヌクレアーゼの混合物、及び第２ＤＮＡ合成緩衝液を、第１鎖合成混合物に添加し、ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏで稀釈して２４０μｌに増大した。反応混合物を１２℃で１時間、２２℃で１時間、さらに７０℃で１０分間インキュベートした。次いで１０ ＵのＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼを反応混合物に添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。合成されたｃＤＮＡにアガロースゲル電気泳動法を施すことにより、質を確認した。
【００５０】
ＰＣＲによるＬＯＸ遺伝子の部分クローンの分離
例１において見極めたアミノ酸配列に基づいて、下記のプライマーを設計し、合成した。Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ ｖａｒ． ｔｒｉｔｉｃｉ （Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号： ＡＦ １２４９７９）のリノレエートジオールシンターゼのヌクレオチド配列を、コドン使用頻度の基準として使用した。
【００５１】
Ｎ−末端側のためのプライマー１：配列番号：９ （Ｎ末端配列番号：２１のアミノ酸１−５に相当）
Ｃ−末端側１のためのプライマー２：配列番号：１０ （ｆｒ ３４， 配列番号：２０のアミノ酸１８−２５に相当）
Ｃ−末端側２のためのプライマー３：配列番号：１１ （ｆｒ ３４， 配列番号：２０のアミノ酸６−１５に相当）
それぞれ２．５ ｍＭのｄＮＴＰと、それぞれ２０ｐｍｏｌのプライマー１及び２と、２．５単位のＬＡ ｔａｑ ポリメラーゼ （日本、Ｔａｋａｒａ）とＬＡ ｔａｑのためにＴａｋａｒａにより供給されたＧＣ緩衝液 Ｉとを含有する５０ μｌの反応混合物中で、鋳型としてＧ． ｇｒａｍｉｎｉｓの０．６ μｇの染色体ＤＮＡを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を採用した。反応条件を下に示した。ＬＡ ｔａｑ ポリメラーゼは、ステップ１後、反応混合物に添加した。
【００５２】
【表１】
2004508039.tif 000002
【００５３】
上述の反応混合物中で第２のＰＣＲ反応を採用した。ただしここでは、鋳型として２ μｌの第１のＰＣＲ生成物を使用し、プライマー２の代わりにプライマー３を使用した。反応条件は、ステップ２〜ステップ４を３０回繰り返すことを除いては上述のものと同じであった。
【００５４】
ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標） ゲル抽出キット （Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、増幅された１ｋｂのフラグメントをゲルで純化し、これをｐＴ７Ｂｌｕｅ中にサブクローニングした。ＰＣＲクローンの配列が配列番号：３で示されることを見極めた。ＰＣＲフラグメントの推論されたアミノ酸配列から、プライマー１は予期された場所以外の場所とハイブリッド形成させられることが判ったが、しかし例１において見極められたアミノ酸配列２５０５９９Ｂｆｒ２５ （配列番号：１８）が、ＰＣＲフラグメント中の連続的な２１６個のアミノ酸の配列（配列番号：８）内に見出された。
【００５５】
同一性検索が示したように、この２１６アミノ酸配列は、ヒト１５Ｓリポキシゲナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｕ７８２９４， ＧＥＮＥＳＥＱＰ Ｗ９３８３２）、ヒト・アラキドネート １２−リポキシゲナーゼ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ１８０５４）及びＰｌｅｘａｕｒａ ｈｏｍｏｍａｌｌａ ８Ｒ−リポキシゲナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＦ００３６９２， ＳＰＴＲＥＭＢＬ Ｏ１６０２５）に対して最高同一性を有する。この結果は、得られたＰＣＲフラグメントがリポキシゲナーゼ遺伝子を含有することを示唆した。同一性の最高スコアはヒト１５Ｓで得られ、２５％未満であった。
【００５６】
ゲノムＬＯＸ遺伝子のクローニング
完全長ゲノムクローンを得るために、プローブとしてＰＣＲフラグメントを使用して、Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓのゲノムＤＮＡにサザンブロッティングを採用した。その結果に基づいて、ゲノムＤＮＡをＳａｌＩで消化させ、１．０％のアガロースゲル上で分離した。ゲルから約６ ｋｂのＤＮＡ消化物を回収し、これを、ＳａｌＩによって線形化されＢＡＰ処理されたｐＵＣ１９と連結した。連結混合物をＥ． Ｃｏｌｉ ＤＨ１２Ｓ中に形質転換し、これにより部分ゲノムライブラリを構成する。プローブとしてＰＣＲフラグメントを使用して、ゲノムライブラリをコロニーハイブリッド形成によりスクリーニングし、ポジティブなＥ． ｃｏｌｉを分離し、ｐＳＧ１６と呼ばれるプラスミドを回収した。
【００５７】
プラスミドｐＳＧ１６は、ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）由来の６ ｋｂのＳａｌＩフラグメントを含有した。この６ｋｂのフラグメントから、ＰＣＲクローンを含む４．１ ｋｂ長の配列が、配列番号：４で示されることが見極められた。最長のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）は、上述の２１６アミノ酸配列、ならびにｆｒ ２０， ２１，２９及び３４と類似の配列、配列番号：１６， １７，１９及び２０を含有するが、しかし、例１において見極められたＮ末端配列（配列番号：２１）は含有しなかった。最大ＯＲＦの上流側に、他の２つの小さなＯＲＦが見出されたが、これらは両方ともＮ末端配列を有さなかった。右側の開始ＡＴＧコドンを見出すために、ｃＤＮＡクローニングが必要であった。
【００５８】
ＬＯＸ遺伝子のｃＤＮＡクローンの分離
リポキシゲナーゼを生成する菌糸から総ＲＮＡを抽出し、この総ＲＮＡからＯｌｉｇｏ ｄＴ セルロース粉末によってｍＲＮＡを調製した。ｃＤＮＡ合成キット （日本、Ｔａｋａｒａ）を使用して、完全長ｃＤＮＡを得ることを目指して、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。１〜４ ｋｂのｃＤＮＡをゲル純化することにより、部分ｃＤＮＡライブラリを構成した。ライブラリは、Ｍａｒａｔｈｏｎ ｃＤＮＡ増幅キット （米国、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のアダプタと連結することにより構成した。このキットは、アダプタ・プライマー（ＡＰ１）と標的クローンの内部配列のために設計されたカスタム・プライマーとで、標的ｃＤＮＡを増幅させることを可能にする。
【００５９】
ＬＯＸのｃＤＮＡの増幅のために、２つのプライマー、つまりプライマー４（配列番号：１２）及びプライマー５（配列番号：１３）を、ゲノムクローンの配列に基づいて設計した。Ｃ末端部分をプライマー４及びＡＰ１で増幅し、Ｎ−末端部分をプライマー５及びＡＰ１で増幅した。
ＰＣＲ反応混合物は、２．５ ｍＭのｄＮＴＰ、それぞれ３０ｐｍｏｌのプライマー４及びＡＰ１、又はプライマー５及びＡＰ１、５単位のＬＡ ｔａｑ ポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）及び供給ＧＣ緩衝液Ｉを含有した。反応条件を下に示した。ＬＡ ｔａｑ ポリメラーゼはステップ１後に反応混合物に添加した。
【００６０】
【表２】
2004508039.tif 000003
【００６１】
この結果、５’−末端に対して０．６ ｋｂのフラグメントが、３’−末端に対して１．６ｋｂのフラグメントがそれぞれ増幅され、これらの配列は、配列番号：５及び配列番号：６で示されることが見極められた。予測される開始ＡＴＧと終止コドンＴＡＡの周りの配列に基づいて、プライマー６（配列番号：１４）とプライマー７（配列番号：１５）とを末端間のｃＤＮＡの増幅のために設計した。また、さらなるプラスミド構成のために、所望の制限酵素部位を両末端に導入した。
反応混合物は、０．０８ μｇのｃＤＮＡライブラリーと、２．５ｍＭのｄＮＴＰと、それぞれ３０ｐｍｏｌのプライマー６及び７と、１単位のＬＡ ｔａｑ ポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）と、ＧＣ緩衝液とを含有した。反応条件を下に示した。ＬＡ ｔａｑ ポリメラーゼはステップ１後に反応混合物に添加した。
【００６２】
【表３】
2004508039.tif 000004
【００６３】
ＰＣＲ増幅された１．９ ｋｂフラグメントを分離し、これをｐＴ７Ｂｌｕｅ中にクローニングし、その結果ｐＳＧ２６を得た。推論されるオープン・リーディング・フレームは１８５７ ｄｐから成った。これは６１８個のアミノ酸及び６７６００ Ｄａの分子質量に相当する。ゲノム配列との比較により、ＬＯＸ遺伝子は、Ｎ−末端側に１つのイントロンを含有することが判った。シグナル配列決定プログラムによる予想Ｎ−末端配列は、「ＡＬＰＬＡＡＥＤＡＡＡＴ」である。完全長アミノ酸配列での同一性検索が示したところによれば、このアミノ酸配列は、ヒト１５Ｓリポキシゲナーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ 受入番号Ｗ９３８３２）に対して２５％未満の最高同一性を有する。
プラスミドｐＳＧ２６を大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９中に形質転換し、これを受入日２０００年７月５日付けＤＳＭ １３５８６としてＤＳＭＺに寄託した。
【００６４】
例３．アスペルギルス・オリゼー（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）におけるゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）ＬＯＸの発現
宿主生物
デンマーク国特許出願ＰＡ １９９９ ０１７２６明細書には、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＢＥＣｈ２が記載されている。アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）ＢＥＣｈ２はＪａＬ２２８（国際公開第９８／１２３０００号パンフレットに記載）の突然変異体である。ＪａＬ２２８は、ＩＯＦ４１７７の突然変異体である。
【００６５】
アスペルギルス・オリゼー（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）の形質転換
アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）菌株ＢＥＣｈ２を、１００ ｍｌのＹＰＧ媒質中に接種し、３２℃で１６時間、８０ ｒｐｍで攪拌しながらインキュベートした。成長した菌糸をろ過により捕集し、次いで０．６ ＭのＫＣｌで洗浄し、３０ μｌ／ｍｌの濃度でＧｌｕｃａｎｅｘ（登録商標）（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ）を含有する、３０ ｍｌの０．６Ｍ ＫＣｌ中にこれを再懸濁させた。この混合物を、プロトプラストが形成されるまで、６０ ｒｐｍで攪拌しながら３２℃でインキュベートした。残された菌糸をろ過により除去した後、遠心分離によりプロトプラストを捕集し、ＳＴＣ緩衝液で２回洗浄した。
【００６６】
これらのプロトプラストを、ヘマタイトメータでカウントし、ＳＴＣ：ＳＴＰＣ：ＤＭＳＯ （８：２：０．１）溶液中で再懸濁させ、１．２ ｘ １０７個のプロトプラスト／ｍｌの最終濃度にした。約４ μｇのＤＮＡを、１００ μｌのプロトプラスト溶液に添加し、静かに混合し、氷上で３０分間インキュベートした。１ μｌのＳＴＰＣ緩衝液を混合物に添加し、これをさらに３０分間、３７℃でインキュベートした。５０℃で予加熱した１０ ｍｌのＣｏｖｅトップアガロースを添加した後、反応混合物をＣＯＶＥ−ａｒ　寒天プレート上に注いだ。これらのプレートを３２℃で５日間インキュベートした。
【００６７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
商品化されたゲルＰＡＧＥＬ ＡＥ６０００ ＮＰＵ−７．５Ｌ （７．５Ｔ％）を使用して、装置ＡＥ−６４００（日本、Ａｔｔｏ）で、提供された手順に従ってＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動を行った。１５ μｌの２倍濃度の試料ローディング緩衝液（１００ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ６．８）、２００ ｍＭのジチオトレイトール、４％のＳＤＳ、０．２％のブロモフェノール・ブルー及び２０％のグリセロール）中に１５ μｌの試料を懸濁させ、これを５分間煮沸した。２０ μｌの試料溶液をポリアクリルアミドゲルに加え、流動緩衝液（２５ ｍＭのＴｒｉｓ、０．１％のＳＤＳ、１９２ ｍＭのグリシン）中で電気泳動を施した。その結果生じたゲルをクーマシー・ブリリアント・ブルーで染色した。
【００６８】
発現プラスミドの構成
ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）のＬＯＸのｃＤＮＡを含有するプラスミドｐＳＧ２６を、ＢｇｌＩＩによって消化させ、ＬＯＸ遺伝子を含有する１．９ ｋｂのフラグメントをＢａｍＨＩ及びＸｈｏｌで消化させたｐＭＴ２１８８と連結した。プラスミドｐＭＴ２１８８は、修飾されたアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼプロモーターと、アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＴＰＩリーダー配列と、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼターミネータと、菌形質転換のマーカーとしてのアスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子と、大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）形質転換のマーカーとしてのＳ． Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｕｒａ３とを有する。形質転換を大腸菌（Ｅ． Ｃｏｌｉ）ＤＢ６５０７で行った。このＥ． Ｃｏｌｉ ＤＢ６５０７には、ｐｙｒＦ遺伝子が欠けており、これをサッカロミセス・セレビシエー（Ｓ． Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｕｒａ３で補完することができる。結果として生じたプラスミドをｐＳＧ２７と呼んだ。
【００６９】
アスペルギルス・オリゼー（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）におけるゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）ＬＯＸの発現
プラスミドｐＳＧ２７でアスペルギルス・オリゼー（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）ＢＥＣｈ２を形質転換し、選択された陽性の形質転換細胞を分離した。形質転換細胞をＣＯＶＥ ２−ａｒ上で５日間、３２℃で成長させ、震盪フラスコ内の１００ ｍｌのＭＳ−９に接種した。３２℃で１日間強力に攪拌しながら培養した後、３ｍｌの各培養を震盪フラスコ内の１００ ｍｌのＭＤＵ−２Ｂｐに移して、３２℃で３日間培養した。培養液を３５００ ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを捕集した。上澄みのリポキシゲナーゼ活性を上述のような分光光度法で見極めた。ポジティブな形質転換細胞は約５０，０００ Ｕ／ｍｌ培養液を示したのに対し、形質転換されていないアスペルギルス・オリゼー（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）ＢＥＣｈ２は活性を示さなかった。培養上澄み液にもＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を施した。ポジティブな形質転換細胞は９０〜１１０ ｋＤａのスミア帯を示した。このスミア帯は、タンパク質が重くグリコシル化されていることを示唆する。形質転換されていないアスペルギルス・オリゼー（Ａ． ｏｒｙｚａｅ）ＢＥＣｈ２は主な帯を示さなかった。
【００７０】
例４．組換えリポキシゲナーゼの純化
上述の例におけるように調製した未加工の１ ｇの凍結乾燥リポキシゲナーゼを、４０ ｍＬ ２５ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に溶解し、次いでろ過した（０．４５ μｍ、Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶ型、ミリポア）。上述のステップ及び引き続き行われるステップは全て室温で実施した。ろ液を１ ｍＬ／分で２５ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）と共にＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ （２．６ ｘ １４ ｃｍ）にローディングした。次いでカラムを同じ緩衝液を用いて２．５ ｍＬ／分で、ベースライン（ほぼ４カラム容積）に達するまで洗浄した。
【００７１】
次いで２カラム容積において、２５ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中０〜３３０ ｍＭの線形勾配のＮａＣｌで、結合されたタンパク質を溶離した。１０ｍＬのフラクションを捕集した。２５ ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中１ＭのＮａＣｌでカラムを清浄化した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び活性アッセイによって評価されたように、純粋なリポキシゲナーゼの大部分を含有するこれらの画分をプールし、Ａｍｉｃｏｎセル（１０，０００ ＮＭＷＬ， ＹＭ１０， ミリポア）を使用して濃縮した。最後に酵素を透析により５０ ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中に移し、等分して−２０℃で使用するまで保存した。
【００７２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が示したように、リポキシゲナーゼは純化されて均質性を有している。この酵素は、アミノ酸配列（６５．６ ｋＤａ）に基づいた理論値よりも若干高い９０〜１１０ ｋＤＡの評価分子量を有することが判った。このことはグリコシル化を示唆するものとして考えられる。陽イオン交換クロマトグラフィを採用して成功した純化によって実証されたように、タンパク質は極めて高い等電点を有することが判った。
【００７３】
例５．Ｍｎ−リポキシゲナーゼの遺伝子及び推論タンパク質配列の決定
１．　マンガンリポキシゲナーゼの内部ペプチドのアミノ酸配列及びＣ−末端アミノ酸
Ｓｕ及びＯｌｉｗ（前出）によって記載されているように、（上記例とは異なる）ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）の菌株を使用して、マンガンリポキシゲナーゼを純化させて均質にした。内部ペプチドを発生させ、純化し、サンガー法によって配列決定した。このサンガー法は本質的には、ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）の他のタンパク質に関して記載されている通りである（Ｈｏｒｎｓｔｅｎ Ｌ， Ｓｕ Ｃ， Ｏｓｂｏｕｒｎ Ａｅ， Ｇａｒｏｓｉ Ｐ， Ｈｅｌｌｍａｎ Ｕ， Ｗｅｒｎｓｔｅｄｔ Ｃ及びＯｌｉｗ ＥＨ 「リノレエートジオールシンターゼのクローニングはプロスタグランジンＨシンターゼとの相同性を明らかにする」Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４（４０）： ２８２１９−２４， １９９９）。Ｍｎ−リポキシゲナーゼのＮ−末端アミノ酸はブロックされたが、しかしＣ−末端配列決定により、４つのＣ−末端アミノ酸が得られた。
【００７４】
（ｉ）　Ｃ−末端アミノ酸配列
これらのＣ−末端アミノ酸はＦＬＳＶであった。
（ｉｉ）　内部アミノ酸配列
下記の８つの内部アミノ酸配列を得た（（Ｋ）はＬｙｓ−ＣがＫ残基のＣ−末端側でペプチドを分割する事実を表わし、（Ｋ／Ｒ）はトリプシンがＫ残基又はＲ残基のＣ−末端側でペプチドを分割する事実を表わし、及び（Ｅ）はＶ８がＥ残基のＣ−末端側でペプチドを分割する事実を表わす）：
【００７５】
（Ｋ）ＬＹＴＰＱＰＧＲＹＡＡＡＣＱＧＬＦＹＬＤＡＲＳＮＱＦＬＰＬＡＩＫ （置換Ｋ２０６Ｌを有する、配列番号：２３のアミノ酸２０５−２３７）
（Ｋ／Ｒ）ＨＰＶＭＧＶＬＮＲ （位置２９５にＬｙｓ又はＡｒｇを有する、配列番号：２３のアミノ酸２９５〜３０４）
（Ｋ／Ｒ）ＬＦＬＶＤＨＳＹＱＫ （位置１９６にＬｙｓ又はＡｒｇを有する、配列番号：２３のアミノ酸１９６〜２０５）
（Ｅ）Ｍ？ＡＧＲＧＦＤＧＫＧＬＳＱＧ（Ｗ／Ｍ）ＰＦＶ （配列番号：２３のアミノ酸５６９〜５８７、ただし、アミノ酸５７０が不確定Ｍｅｔであり、アミノ酸５８４がＴｒｐ又はＭｅｔであることを除く）
（Ｋ／Ｒ）ＧＬＶＧＥＤＳＧＰＲ （配列番号：２３のアミノ酸３６５〜３７５、ただし、アミノ酸３６５がＬｙｓ又はＡｒｇであり、アミノ酸３６８がＶａｌであることが判っている点を除く）
【００７６】
（Ｋ）ＴＮＶＧＡＤＬＴＹＴＰＬＤ／ＡＤ／ＷＫ／ＬＰ／ＮＤ／ＮＥ （配列番号：２３のアミノ酸２３７〜２５５、ただし、アミノ酸２４２がＡｌａであり、アミノ酸２５０がＡｓｐ又はＡｌａであり、アミノ酸２５１がＡｓｐ又はＴｒｐであることが判っている点を除く）
（Ｋ）Ｇ／Ｆ ＳＧＶＬＰＬＨＰＡｗ （配列番号：２３のアミノ酸４７２〜４８３、ただし、アミノ酸４７３がＧｌｙ又はＰｈｅであり、アミノ酸４８３が不確定Ｔｒｐであることが判っている点を除く）
（Ｋ）ＱＴＶＤＤＡＦＡＡＰＤＬＬＡＧＮＧＰＧＲＡ （配列番号：２３のアミノ酸５３２〜５５３、ただし、アミノ酸５３６がＡｓｐであり、アミノ酸５５２がＡｒｇであることが判っている点を除く）
【００７７】
２．　縮重プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲによるＭｎ−リポキシゲナーゼのｃＤＮＡ発生
本発明のこの部分は、ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）のゲノムのＧＣ含有率が高いため、困難であった。
ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）からの総ＲＮＡの分離法及びｍＲＮＡからｃＤＮＡへの転写法を最適化しなければならなかった。ｃＤＮＡは、ＤＮアーゼで消化しまた他の予防策を講じたにもかかわらず、しばしばゲノムＤＮＡで汚染された。
【００７８】
かなりの試験のあと、３０個を上回る縮重プライマーを種々の組み合わせで使用して、ＲＴ−ＰＣＲによってＭｎ−リポキシゲナーゼの第１のｃＤＮＡクローンを得ることができた。このクローンは以下の縮重プライマーによって得た。これらのプライマーは内部ペプチド１及び２、及び上記内部ペプチドに基づいている。
Ｍｎ６０（５’−ＡＡＣＣＡＧＴＴＣＣＴＳＣＣＳＣＴＣＧＣＳＡＴＣＡＡ）
Ｍｎ１５Ｒ（５’−ＧＴＣＧＡＧＧＴＡＧＡＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＲＣＡＶＧＣ）
ＥＯ３ａ（５’−ＣＡＴＣＣＳＧＴＳＡＴＧＧＧＹＧＴＳＣＴＢＡＡ）
ＥＯｒ３ａ（５’−ＣＧＧＴＴＳＡＧＧＡＣＲＣＣＣＡＴＶＡＣＶＧＧＲＴＧ）
【００７９】
プライマーＭｎ６０及びＥＯｒ３Ａは、約２３０−ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ帯を発生させ、プライマーＥＯ３ａ及びＭｎ１５Ｒは約２２０−ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ帯を発生させた。この配列からの（ＭｎＳ２： ５’−ＣＣＧＴＴＣＡＧＣＧＴＣＧＡＧＡＧＣＡＡＧＧ）からのセンスプライマーと、他方の配列（ＭｎＳ１： ５’−ＴＣＴＣＧＧＧＧＡＴＣＧＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＣＡ）からのアンチセンスプライマーとが３３７−ｂｐのフラグメントを増幅する。アンプリコンが配列決定され、このアンプリコンはリーディング・フレームのうちの１つにペプチド１のアミノ酸配列を含有した。アンプリコンをノーザンブロッティング分析及びゲノムライブラリのスクリーニングのプローブとして使用した（Ｈｏｒｎｓｔｅｎ他、前出）。
【００８０】
３．　ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）のゲノムライブラリのスクリーニング
Ｂｏｗｙｅｒ Ｐ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７（５１９６）： ３７１−４， １９９５）によって記載されているように、ラムダＺＡＰ ＩＩ中のゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）のゲノムライブラリを得た。このライブラリを、ｃＤＮＡ配列からの０．３３−ｋｂのプローブでスクリーニングした。１０００００個を上回るプラークのスクリーニングにより、１１個のポジティブなクローンを産出した。これらのクローンは、ファージスクリーニングの２〜３回の付加的なラウンドにより純化されたプラークであった。ブルースクリプトＳＫファージミドを、公開されている方法に従ってヘルパーファージで切り出した。制限酵素分析が示したところによれば、全ての救出されたファージミドは８−ｋｂの同じ挿入断片を含有する。
【００８１】
４．　ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）のＭｎ−ＬＯの遺伝子及びコーディング領域の配列決定
サイクル配列決定に基づく２つの異なる方法を用いて、両鎖の配列決定を行った。この配列決定は遺伝子のＧＣ含有率が高い（６０％超）ため、困難であった。
ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）のゲノムの３．４−ｋｂを配列決定した。Ｍｎ−リポキシゲナーゼ遺伝子の２７２５個のヌクレオチドから成る配列は１３３−ｂｐのイントロンを含んだ。Ｍｎ−リポキシゲナーゼ遺伝子を２ｍＲＮＡの転写開始点、ａ１ｇｃａｇｇｔｔｃ、及びタンパク質翻訳開始点Ａ７２ＴＧ（ヌクレオチド位置７２）から５’−ＲＡＣＥによって同定した。Ｃ−末端アミノ酸ＦＬＳＶを、位置２０６０〜２０６２の終止コドンで見出した。０．６−ｋｂを上回る３’−未翻訳領域を配列決定し、一時的ポリアデニル化シグナルを下に示すように見出した。
【００８２】
推論されたオープン・リーディング・フレームとエキソン−イントロン境界とを確認するために、５−ＲＡＣＥ及びｃＤＮＡの配列決定を用いた。転写開始点、翻訳開始点及び翻訳終端を、配列番号：２２及び２３で示されるものとして見極めた。
イントロンは、１３３ｂｐの長さを有し、配列番号：２４として示される配列を有することが判った。イントロンは、ヌクレオチド３７２及び３７３の間、すなわち配列番号：２２のＳｅｒ１０８とＡｒｇ１０９との間に配置されていることが判った。
【００８３】
例６．天然及び遺伝子組換えＭｎ−リポキシゲナーゼの発現
制限酵素ＳｐｅＩ及びＮｓｉＩを用いて、Ｍｎ−リポキシゲナーゼ遺伝子のコーディング領域を含有するゲノムセグメント（３−ｋｂ）を、ブルースクリプトＳＫファージミドから、プラスミドｐＧＥＭ−５Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の（ＳｐｅＩ及びＮＳｉＩ部位を有する）多クローニング部位中にサブクローニングした。
【００８４】
５’−末端及びイントロンを下記のように修飾した。挿入断片を有するｐＧＥＭ−５ＺをＳｐｅＩ及びＢｓｅＲＩで分割した。これらのＳｐｅＩ及びＢｓｅＲＩは、遺伝子の５’−末端、及びイントロンを有するゲノム配列部分（１３２３−ｂｐ）を切り取った。この片の代わりにｐＧＥＭ中に約４０５−ｐｂのｃＤＮＡ配列を置いた。このｃＤＮＡは、ＳｐｅＩ及びＢｓｅＲＩで４４８−ｂｐのＰＣＲ生成物を分割することにより得た。このベクターをｐＧＥＭ＿Ｍｅｔで表す。ＰＣＲ生成物は翻訳開始領域（しかもプライマーの５’−末端中にＳｐｅＩ及びＮｄｅＩ部位を有する領域、５’−ＴＴＡＣＴＡＧＴＣＡＴＡＴＧＣＧＣＴＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＧＣＴ）に対して特異的なセンスプライマー、及びＢｓｅＲ１部位の３’−末端に位置する遺伝子特異的アンチセンスプライマーで発生させた。このように挿入されたこのｃＤＮＡ部分は、（上の表に示すように、ヌクレオチド３７２と３７３との間、Ｓｅｒ１０８とＡｒｇ１０９との間に位置するイントロンを有さない）ＯＲＦの先頭を含有するので、ＯＲＦ全体がベクターｐＧＥＭ＿Ｍｅｔ中で得られた。
【００８５】
停止シグナルから約１３０−ｂｐのＢｂｖＣＩ部位を利用して、３’−末端をＰＣＲで修飾した。センスプライマーは遺伝子特異的であり、制限部位の５’−側に配置されたのに対し、アンチセンスプライマーは末端アミノ酸のヌクレオチドから設計され、これに加えて、ＮｄｅＩ及びＮｓｉＩの制限部位を含有した。ｐＧＥＭ＿ＭｅｔベクターをＮｓｉＩ及びＢｂｖＣ１で分割し、切り出されたフラグメントの代わりに、同様にして分割されたＰＣＲ生成物を置いた。これにより、ベクターｐＧＥＭ＿Ｍｅｔ＿ｔｅｒが産出された。このベクター中のＭｎ−リポキシゲナーゼの修飾コーディング領域は例えばＮｄｅＩで切り出すことができる。すべての修飾を発現構造の配列決定によって確認した。
【００８６】
１．　原核細胞（Ｅ． Ｃｏｌｉ）中のＭｎ−リポキシゲナーゼの発現
ｐＥＴ発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の製造者によって示唆されているように、発現ベクターｐＥＴ−１９ｂはＮｄｅＩで線形化されており、また、Ｍｎ−リポキシゲナーゼの修飾コーディング領域はＮｄｅＩで切り出されて、Ｅ． Ｃｏｌｉ中での発現のためにこのベクター中に連結されている。Ｅ． Ｃｏｌｉ中で発現させられる組換えＭｎ−リポキシゲナーゼの研究が現在進行中である。
【００８７】
２．　真核細胞（ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）， サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）， アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）， ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ））中のＭｎ−リポキシゲナーゼの発現
発明者は、ｐＣＩＣ９又は関連ベクターを有するＰｉｃｈｉａ発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することを計画する。Ｍｎ−リポキシゲナーゼの発明者の修飾コーディング領域に合わせるために、このキットに僅かに変更を加えなければならない。組換えＭｎ−リポキシゲナーゼのグリコシル化は、ホストに応じて異なることが可能である。従って発明者は、サッカロミセス・セレビシエ−（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）， アスペルギルス・ニドランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）， ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）中で一連の真核発現系を調査することを計画する。グルコシル化は組換え酵素の安定性を改善することができる。
【００８８】
３．　真核細胞（昆虫細胞）中のＭｎ−リポキシゲナーゼの発現
発明者は、Ｃ−末端にヒス標識を有さない発現ベクトルを使用して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手したショウジョウバエ発現系（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ２細胞）を使用することを計画する。
【００８９】
４．　発現のための遺伝子組換えＭｎ−リポキシゲナーゼ
Ｍｎ−リポキシゲナーゼがリポキシゲナーゼ遺伝子群に属するという発明者の発見は、構造の合理的修飾に対して大きな可能性を広げる。いくつかのリポキシゲナーゼの３Ｄ配列が知られており、Ｍｎ−リポキシゲナーゼは大豆リポキシゲナーゼ−１の多くのα−へリックスに沿って際立った同一性を示す（Ｐｒｉｇｇｅ ＳＴ， Ｂｏｙｉｎｇｔｏｎ ＪＣ， Ｇａｆｆｎｅｙ ＢＪ及びＡｍｚｅｌ ＬＭ， 「リポキシゲナーゼにおける構造保存：大豆リポキシゲナーゼ−１の構造分析及びヒトリポキシゲナーゼのモデリング（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｃｏｎｓｅｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ： ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｏｙｂｅａｎ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１ ａｎｄ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ）」 Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２４（３）： ２７５−９１， １９９６）。大豆リポキシゲナーゼ−１は、多くのリポキシゲナーゼのモデリングに使用されている。酵素の漂白特性及び酸化特性を増大させるために、Ｍｎ−リポキシゲナーゼの金属リガンド及び構造上重要な他のアミノ酸の双方が突然変異させられることになる。
【００９０】
４．１　重要なα−へリックスのアミノ酸の部位特異的突然変異
Ｍｎ−リポキシゲナーゼのアミノ酸配列はα−へリックス９と整列する（Ｐｒｉｇｇｅ他、前出）。α−へリックス９は、ＷＬＬＡＫ配列と２つのヒス残基とを含有する。これらの残基はＭｎリガンドであると思われる。このようなヘリックス中のアミノ酸の規則的な変化は、酵素活性及び漂白特性に対する意味深い効果を有すると考えられる。同様に、Ｍｎ−リポキシゲナーゼのアミノ酸配列はα−へリックス１８と整列する。
【００９１】
このα−へリックス１８は鉄リガンドと、おそらくＭｎ−リガンド（ヒス及びＡｓｎ）とを含有する。突然変異させられることになっているＭｎ−リポキシゲナーゼの予測される他のα−へリックスは、大豆リポキシゲナーゼ−１のαへリックス７，８，１０−１７，１９−２２に相当する（Ｐｒｉｇｇｅ他、前出）。発明者はこれらの遺伝子組換えＭｎ−リポキシゲナーゼのうちのいくつかが全体的に異なる特性を有し、漂白効果が増強可能であることを予測する。予測されるＭｎリガンドは例えば３つのヒス残基、１つのＡｓｐ残基、及び１つのＶａｌ残基である。Ｍｎ−リポキシゲナーゼは「２−Ｈｉｓ−１−カルボキシル面三つ組元素（２−Ｈｉｓ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌ ｆａｃｉａｌ ｔｒｉａｄ）」の酵素に属すると思われる。
【００９２】
４．２　Ｃ−末端のアミノ酸の部位特異的突然変異
発明者は末端ＶａｌをＩｌｅ残基又は他の残基に突然変異させ、その突然変異形の漂白特性を見極めることを計画する。
【００９３】
４．３　Ｍｎ−リポキシゲナーゼのモザイク形
Ｍｎ−リポキシゲナーゼの特性を改善するために、発明者は上述のα−へリックス情報を用いて、種々の部分を大豆リポキシゲナーゼの対応配列と置換することを計画する。
【００９４】
例７．真核生物ＤＮＡのスクリーニング
真核菌株中の相同リポキシゲナーゼ遺伝子のスクリーニングのために、ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）ＬＯＸ遺伝子のｃＤＮＡをプローブとして使用して、いくつかの菌株に由来するゲノムＤＮＡにおいてサザンハイブリッド形成を行った。以下の種の菌株を試験した：ピリクラリア・オリゼー（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）， プサリオタ・カンペスチリス（Ｐｓａｌｉｏｔａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）， ペニシリウム・ロクエフォルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）及びゲオトリカム・カンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）ＡＴＣＣ３４６１４。ゲノムＤＮＡを例２において記載したように分離した。
【００９５】
ＤＩＧ ＤＮＡラベリング・ミックス（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を使用して、下記のようにプローブにジゴキシゲニン−ｄＵＴＰを標識付けした。ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）ＬＯＸの完全長ｃＤＮＡとしてプライマー６（配列番号：１４）及びプライマー７（配列番号：１５）を使用して、ＤＩＧ標識プローブをＰＣＲによって調製した。ＰＣＲ反応混合物は、鋳型として０．１μｇのｐＳＧ２６と、１．２５ ｍＭのｄＮＴＰと、８％のＤＩＧ ＤＮＡラベリングミックスと、それぞれ３０ ｐｍｏｌのプライマー６及び７と、１単位のＬＡ ｔａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ）と、ＧＣ緩衝液とを含有した。反応条件は下に示した通りである。ＬＡ ｔａｑポリメラーゼはステップ１後に反応混合物に添加した。
【００９６】
【表４】
2004508039.tif 000005
【００９７】
使用前に９８℃で加熱することにより、ＰＣＲ生成物をゲル純化して変性させた。
制限酵素で消化させた約５ μｇのＤＮＡを、１．０％のアガロースゲル上で分離し、０．２ ＮのＨＣｌ中に３０分間、次いで０．５ ＮのＮａＯＨ＋１．５ ＭのＮａＣｌ中に３０分間、ゲルを浸すことによりＤＮＡを変性させ、１ Ｍのトリス（ｐＨ ７．５）＋１．５ ＭのＮａＣｌ中で３０分間、これを中和させた。次いで、変性ＤＮＡを２０ｘＳＳＣで１５分間、真空移動することによりナイロン膜に移した。ＵＶ照射による固定後、ナイロン膜をハイブリッド形成に使用した。ハイブリッド形成溶液は、５ｘＳＳＣと０．５％のブロッキング試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）と、０．１％のＮ−ラウロイルサルコシンと、０．０２％のＳＤＳとを含有するように構成された。
【００９８】
ナイロン膜をハイブリッド形成溶液と６０℃で１時間、前ハイブリッド形成した。その後、熱変性させたＤＩＧ標識プローブをハイブリッド形成溶液に添加し、６０℃で一晩インキュベートした。結果として得られた膜を、２ｘＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳを含む洗浄用緩衝液で、５分間室温で２回洗浄し、次いで０．１ｘＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳを含む洗浄用緩衝液２で、１５分間ハイブリッド形成温度で２回洗浄した。洗浄した膜を空気乾燥し、ＤＮＡ検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の、提供された手順に従って、この膜をＤＩＧ標識ＤＮＡの検出に使用した。
【００９９】
その結果、ピリクラリア・オリゼー（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）は、明らかなポジティブ・シグナルを示し、ゲオトリカム・カンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）は極めて弱い信号を示した。これらの結果は、ピリクラリア・オリゼー（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）が、ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ ｇｒａｍｉｎｉｓ）ＬＯＸに対する同一性が高い遺伝子を有し、ゲオトリカム・カンディダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ）が、ゲウマンノミセス・グラミニス（Ｇ． ｇｒａｍｉｎｉｓ）ＬＯＸに対する同一性が低い遺伝子を有することを示唆する。
【０１００】
例８．Ｍｎ−リポキシゲナーゼに対するｐＨの効果
例４におけるように生成したリポキシゲナーゼの活性を、種々のｐＨ値で試験した。この酵素は、リノール酸又はリノレン酸を基質として、ｐＨ６〜１０又はｐＨ７〜１１の範囲において高活性を呈する、広範囲なｐＨ最適値を有することが判った。
酵素の安定性を種々のｐＨ値で、４０℃における１時間のインキュベーション後に見極めた。この酵素は、ｐＨ ４〜１０の範囲で良好な安定性を有することが判った。
【０１０１】
例９．リポキシゲナーゼの基質特異性
例４におけるように生成されたリポキシゲナーゼの活性を、上述の種々の基質で試験した。その結果を、ミカエリス・メンテン方程式に従って、ｋｃａｔ（又はＶｍａｘ）、ＫＭ及びｋｃａｔ／ＫＭで表す。
【表５】
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リポキシゲナーゼはｐＨ７において、リノレン酸に対してリノール酸の約２倍の高さの活性を示した。
【０１０２】
例１０．天然Ｍｎ−リポキシゲナーゼによるβ−カロチンの漂白
純化されたＭｎ−リポキシゲナーゼを、ｐＨ４．５，６．５及び９．５でβ−カロチンを漂白するのに使用した。最高漂白活性はｐＨ６．５において見出された。
【０１０３】
例１１．Ｍｎ−リポキシゲナーゼに対するＬＡＳの効果
例４におけるように生成したＧ． ｇｒａｍｉｎｉｓリポキシゲナーゼの活性を最大４００ｐｐｍのＬＡＳで、ｐＨ７．０及びｐＨ１０において測定した。リポキシゲナーゼは、ｐＨ ７及びｐＨ １０において、最大４００ ｐｐｍ（試験最高濃度）のＬＡＳに対して完全に安定的であることが判った。このことは、リポキシゲナーゼが標準的な洗浄条件、典型的には２００ ｐｐｍのＬＡＳでｐＨ １０において充分に安定的であることを示唆する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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