(57)【要約】ポリヌクレオチドをヒト胚性幹細胞群に導入し、細胞の多能性特性を任意に保持しながら細胞の遺伝子発現を調節する方法。この方法は、遺伝子発現が胚性幹細胞に特異的なプロモーターのもとにある分化細胞の複合体から胚性幹細胞を分離するために使用される。方法と細胞群を、自殺遺伝子を多能性細胞へ導入する等の細胞療法用に叙述する。細胞群が被験者内に存在しているとき、もしその細胞が高増殖性となり、宿主によって免疫性認識と関わる遺伝子をノックアウトするようになれば、その細胞は破壊される。マーカーでトランスフェクトされた胚性幹細胞を用いて、分化方法を叙述する。
2004520046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胚性幹細胞群の遺伝子発現を調節する方法において、
ポリヌクレオチド導入前の胚性幹細胞内遺伝子発現がポリヌクレオチド導入後の遺伝子発現とある程度異なるように遺伝子発現調節配列を有するポリヌクレオチドを細胞群に導入する
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記発現調節配列は、胚性幹細胞群の遺伝子発現を調節するエンハンサーである
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記発現調節配列は、ポリヌクレオチドを含まない胚性幹細胞群内で発現されない蛋白質をコードする遺伝子である
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記蛋白質は、螢光性蛋白質及び抗生物質抵抗性蛋白質から選択される
ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
上記螢光性蛋白質は、緑色螢光性蛋白質、ｌａｃＺ、ホタルウミシイタケ蛋白質、ルシフェラーゼ、赤シアン蛋白質、及び黄シアン蛋白質から選択される
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
上記抗生物質抵抗性蛋白質は、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシン、ピューロマイシンから選択される
ことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
上記ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドを上記細胞群に導入するための陽イオン無脂質ポリマートランスフェクション試薬で作り出される
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
上記ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドを上記細胞群に導入するためのリポソーム系トランスフェクション試薬で作り出される
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
上記ポリヌクレオチドは、当該ポリヌクレオチドを上記細胞群に導入するための陽イオン脂質試薬で作り出される
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
上記ポリヌクレオチドは、電気穿孔法によって上記細胞群に導入される
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト胚性幹細胞群内の遺伝子発現を調節する方法において、
少なくとも陽イオンポリマーの存在に対応しているＤＮＡ配列、エンハンサー、プロモーター、及び遺伝子のうち少なくても一つに対応しているＤＮＡ配列を、電気穿孔法又は陽イオンポリマーの存在下により、細胞群に導入し、ＤＮＡ配列を有する細胞をＤＮＡ配列を有しない細胞から区別できるくらい胚細胞群の遺伝子発現を調節する
ことを具える方法。
【請求項１２】
上記ＤＮＡ配列は遺伝子に対応し、当該遺伝子は螢光性蛋白質、自殺遺伝子、及び抗生物質抵抗性蛋白質から選択された蛋白質をコードする
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記ＤＮＡ配列はプロモーターに対応し、当該プロモーターは、ｒｅｘ−１、ｏｃｔ−４、ｏｃｔ−６、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲ１−８１、ＧＣＴＭ−２、アルカリホスファターゼ、及びＨｅｓ１プロモーターから選択される
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
上記螢光性蛋白質は、緑色螢光性蛋白質、ｌａｃＺ、ホタルウミシイタケ蛋白質、ルシフェラーゼ、赤シアン蛋白質、黄シアン蛋白質から選択される
ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
上記蛋白質は抗生物質抵抗性蛋白質であり、当該抗生物質抵抗性蛋白質は、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシン、ピューロマイシンから選択される
ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
上記ＤＮＡは自殺遺伝子に対応しており、当該自殺遺伝子は、誘導性アポトーシス遺伝子であるか、または単純ヘルペスチミジンキナーゼ、誘導性ジフテリア毒素、細菌性シトシンデアミナーゼから選択された蛋白質をコードする
ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡ配列は、ベータ２ミクログロブリン、ＨＬＡ−１、ＨＬＡ−２、又はＩＮＦレセプター遺伝子配列から選択されたゲノム配列をノックアウトする
ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
細胞の異質集団から多能性胚性幹細胞を精製する方法において、
（ａ）未分化細胞内で特に活性しているプロモーターのもとで選択マーカーをコードするＤＮＡを上記細胞に導入し、
（ｂ）上記マーカーを発現していない細胞から、上記選択マーカーを発現している細胞を分離し、
（ｃ）精製された多能性細胞を得る
ことを特徴とする方法。
【請求項１９】
上記選択マーカーは螢光マーカーである
ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
上記螢光マーカーは、緑色螢光性蛋白質、ｌａｃＺ、ホタルウミシイタケ蛋白質、ルシフェラーゼ、赤シアン蛋白質、黄シアン蛋白質から選択される
ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
（ｂ）は、螢光活性化細胞選別機またはレーザースキャニングサイトメーターを使用して、上記マーカーを有しない細胞から当該マーカーを有する細胞を分離することをさらに具える
ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
上記選択マーカーは抗生物質抵抗性マーカーである
ことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
ステップ（ｂ）は、抗生物質を有する選択培地で上記細胞を培養することにより細胞を分離することをさらに具える
ことを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
選択された細胞型の欠乏から起こる状態のヒト被験者を治療する方法において、
（ａ）組織特異的プロモーターのもと、マーカーをコードする核酸でヒト胚性幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてトランスフェクトし、
（ｂ）上記マーカーを発現していない細胞から当該マーカーを発現している細胞を分離し、
（ｃ）上記選択された細胞型を上記被験者に導入して状態を治療する
を具えることを特徴とする方法。
【請求項２５】
上記核酸は更に自殺遺伝子を有する
ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
上記自殺遺伝子は、誘導性アポトーシス遺伝子、又は単純ヘルペスチミジンキナーゼ、誘導性ジフテリア毒素、及び細菌性シトシンデアミナーゼから選択された蛋白質をコードする
ことを特徴とする請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
上記マーカーは螢光マーカー及び抗生物質抵抗性蛋白質から選択される  ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
上記螢光性蛋白質は、緑色螢光性蛋白質、ｌａｃＺ、ホタルウミシイタケ蛋白質、ルシフェラーゼ、赤シアン蛋白質、黄シアン蛋白質から選択される
ことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
上記抗生物質抵抗性蛋白質は、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシン及びピューロマイシンから選択される
ことを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
上記細胞は、陽イオンポリマートランスフェクション試薬によってトランスフェクトされる
ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
上記核酸はウィルス性遺伝子を有しない
ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
上記細胞型は、表皮細胞、皮膚細胞、筋細胞、軟骨細胞、造骨細胞、溶骨細胞、神経細胞、網膜細胞、内胚葉細胞、骨髄細胞、免疫システムの細胞から選択される
ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
上記細胞型は、上記ヒト被験者の機能的に異なった臓器からの特定細胞から選択される
ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
注射によって上記細胞型を上記被験者に導入する
ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３５】
上記状態は、がん、免疫性疾患、自己免疫疾患、老化の病気、神経変性疾患を含む成人病、及び奇形腫から選択される
ことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
外因性ＤＮＡの発現調節配列を有するヒト胚性幹細胞の実質的に純粋な集団からなる
ことを特徴とする細胞群。
【請求項３７】
多能性細胞と分化細胞の複合体からクローン多能性細胞群を作り出す方法において、
（ａ）陽イオンポリマーの存在下又は電気穿孔法により、胚の内部細胞塊の細胞内で選択的に活性なプロモーターのもと、マーカー蛋白質をコードするＤＮＡで上記細胞の複合体をトランスフェクトし、
（ｂ）発現されたマーカーがあるか否かで、分化細胞から胚性幹細胞を分離し、クローン多能性細胞群を生成する
ことを特徴とする方法。
【請求項３８】
上記プロモーターは、ｒｅｘ−１、ｏｃｔ−４、ｏｃｔ−６、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲ１−８１、ＧＣＴＭ−２、アルカリホスフォターゼ、Ｈｅｓ１プロモーターから選択される
ことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
上記細胞群は、陽イオンポリマーの存在下、ＤＮＡでトランスフェクションされる
ことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
上記マーカー蛋白質は、螢光性蛋白質及び抗生物質抵抗性蛋白質から選択される
ことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
上記螢光性蛋白質は、緑色螢光性蛋白質、ｌａｃＺ、ホタルウミシイタケ蛋白質、ルシフェラーゼ、赤シアン蛋白質、黄シアン蛋白質から選択される
ことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
上記抗生物質抵抗性蛋白質は、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシン、ピューロマイシンから選択される
ことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
人的操作により分化した胚性幹細胞培養から得た、被験者における細胞群の細胞生存度を調整する方法において、
（ａ）自殺遺伝子をコードする外因性ＤＮＡを有する細胞群は未分化細胞、一部分化細胞、又は全体分化細胞からなるグループから選択され、上記被験者に導入し、
（ｂ）上記導入遺伝子に関連した有害な状況に反応して上記被験者の上記細胞を滅亡させる一連の事態を促進する薬剤で当該被験者を治療する
ことを具える方法。
【請求項４４】
上記有害な状況とは、上記導入細胞の高増殖である
ことを特徴とする請求高４３に記載の方法。
【請求項４５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、多能性細胞の分化についての効果を判断する薬剤をスクリーニングする方法において、
（ａ）細胞特異的プロモーターのもと、検出可能なマーカーを発現している、遺伝的に作り出されたヒト胚性幹細胞群のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養に薬剤を加え、
（ｂ）胚性幹細胞を分化させ、
（ｃ）多能性細胞の分化に対する薬剤の効果を判断する
ことを具える方法。
【請求項４６】
上記検出可能なマーカーは螢光マーカーである
ことを特徴とする請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
上記螢光マーカーは強化緑色螢光性蛋白質である
ことを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
移植用材料となる試剤細胞群は、基本的に異質遺伝物質によって変化された多能性ヒト胚性幹細胞からなり、当該異質遺伝物質は、通常胚性幹細胞に存在しないＤＮＡ、胚性幹細胞において現れるが、生物的に意味のあるレベルで発現されない物質、胚性幹細胞に現れ、選択された誘導細胞によってのみ発現されるように変化したＤＮＡ、又は胚細胞、誘導細胞のみ、またその結合体によって変化可能なＤＮＡである
ことを特徴とする試剤細胞群。
【請求項４９】
上記異質遺伝物質は、少なくとも１つの選択マーカーをコードする遺伝物質からなる
ことを特徴とする請求項４８に記載の試剤細胞群。
【請求項５０】
少なくとも１つの選択マーカーは優性選択マーカーである
ことを特徴とする請求項４９に記載の試剤細胞群。
【請求項５１】
上記優性選択マーカーは、抗生物質抵抗性をコードする遺伝子である
ことを特徴とする請求項５０に記載の試剤細胞群。
【請求項５２】
上記優性選択マーカーは、自殺蛋白質をコードする遺伝子である
ことを特徴とする請求項４９に記載の試剤細胞群。
【請求項５３】
上記優性選択マーカーは、螢光性蛋白質又は抗生物質抵抗性蛋白質をコードする遺伝子である
ことを特徴とする請求項５０に記載の試剤細胞群。
【請求項５４】
上記遺伝子はｈｓｖ−ｔｋであり、上記自殺蛋白質はチミジンキナーゼ、又は自殺遺伝子は誘導性アポトーシス遺伝子であるか、誘導性ジフテリア毒素、細菌性シトシンデアミナーゼから選択される蛋白質をコードする
ことを特徴とする請求項５２に記載の試剤細胞群。
【請求項５５】
上記遺伝子は、緑色螢光性蛋白質、ｌａｚＺ、ホタルウミシイタケ蛋白質、ルシフェラーゼ、赤シアン蛋白質、黄シアン蛋白質から選択される螢光性蛋白質をコードする
ことを特徴とする請求項５３に記載の試剤細胞群。
【請求項５６】
上記抗生物質抵抗性蛋白質は、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシン、ピューロマイシンから選択される
ことを特徴とする請求項５３に記載の試剤細胞群。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト胚性幹細胞をトランスフェクトし、多能性幹細胞のクローン標品を形成し、ヒト被験者の細胞数を増加するための試料および方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来の技術においては、胚性幹（ＥＳ）細胞は、胚盤胞段階まで成長したｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける受精胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）から得た多能性細胞であることが知られている。これらの細胞は、正常の核型を維持しながら培養下で無限に増殖するという独特な能力を有する。胚性幹細胞は最初マウスから分離され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて自然に様々な細胞型に分化した集合体又は胚様体を形成するものだと判明した（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，（１９８７）ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｐｐ．７１−１１２）。最近では、ヒト胚性幹細胞が培養下で、胚発達の初期段階において現れる３つの胚葉の細胞に分化可能なこと（Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．８８−９５）、それらの分化能力は成長因子を利用する事で操作可能になること（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ）が証明されている。様々な細胞型は、分化したヒトＥＳ細胞、例えば、神経細胞（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ，Ｍ．，（２００１）Ｂｒａｉｎ  ｒｅｓ．）、膵臓β細胞（Ａｓｓａｄｙ，Ｓ．ｅｔ．ａｌ．，（２００１）Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｖｏｌ．５０，ｐｐ．１６９１−１６９７）、心筋細胞（Ｋｅｈａｔ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８，４０７−４１４．（２００１）、骨髄細胞（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ．ａｌ．，（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．９８，ｐｐ．１０７１６−１０７２１）の中で確認されている。
【０００３】
胚性幹（ＥＳ）細胞は、潜在的に制限なく分化細胞を作り出す。自己更新と多大な分化能力を含む幹細胞の特性は、全体的な組織源不足の解決においてとても重要なものである。マウス、ラットや人間でない霊長類の動物による実験において、成体肝細胞と胚性幹細胞の、膵臓(Ｒａｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｎａｔ．Ｍｅｄ，Ｖｏｌ．６，ｐｐ．２７８−２８２)、脳(Ｉｓａａｃｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．７５，ｐｐ．２１３−２２０，  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｂｒａｉｎ，Ｖｏｌ．１２３，ｐｐ．１３６５−１３７９，  Ｄｅａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．１４９，ｐｐ．２８−４１)、脊髄
（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．５，ｐｐ．１４１０−１４１２）、心臓（Ｋｌｕｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．９８，ｐｐ．２１６−２２４）、及び骨髄（Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ−Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９２，ｐｐ．９１７１−９１７５，  Ｐａｌａｃｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９５）ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．９２，ｐｐ．７５３０−７５３４）等の組織内への移植が、宿主組織内で浸透及び正常の分化をある程度引き起こし、また場合により、その後に動物の形質向上がみられた（ＭｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
最近、人間胎児の脳細胞をパーキンソン患者のｎｉｇｒａ―ｓｔｒｉａｔｕｍに注入した。ほとんどの患者において、移植された細胞に改善がみられたが、幾人かの患者においては、深刻な有害反応を引き起こした。これは制御不可能な胎児の細胞増殖のために起こったものだと思われる（Ｆｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．３４４，ｐｐ．７１０−７１９）。腫瘍形成と並ぶそのような有害な結果は医療問題であり、宿主組織内で増殖する可能性がある、不定期に分化した細胞の使用で起こるものであろう。患者に有害な細胞を不活性化又は破壊する安全な方法が必要である。
【０００５】
特に、ヒトＥＳ細胞は、多くの病理系における移植の医学行為に対する、無限な細胞源として、そして人間発育の早期段階についての手がかりや生物医学的技術の構成要素として比類なく役立つものであろう。しかしながら、移植及び生物医学的技術に関連した臨床問題は、宿主免疫システムによる異種細胞に対する反応、移植後の細胞の余剰増殖及び腫瘍形成又は異所性の過度分化に関連した問題を含めて取り扱われるべきである。
【０００６】
ヒトＥＳ細胞分化の遺伝的操作は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ用に前駆細胞又は完全に分化した細胞の均一集団を得るのに望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１実施例は、ヒト胚性幹細胞群において遺伝子発現を調節する方法を示す。この方法は、ポリヌクレオチド導入前の胚性幹細胞内の遺伝子発現とポリヌクレオチド導入後の遺伝子発現が多少異なるような遺伝子発現調節配列を有するポリヌクレオチドを細胞群に導入する。この方法の例として、発現調節配列は、胚性幹細胞群の遺伝子発現を調節するエンハンサーである。発現調節配列は蛋白質をコードする遺伝子でもよい。その蛋白質は通常、胚性幹細胞群において発現されているものではなく、螢光性蛋白質及び抗生物質抵抗性蛋白質から選択される。螢光性蛋白質とは、例えば緑色螢光性蛋白質、ｌａｃＺ、ホタルウミシイタケ蛋白質、ルシフェラーゼ、赤シアン蛋白質、黄シアン蛋白質のうちのどれかである。抗生物質抵抗性蛋白質は、例えばハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシン、ピューロマイシンのどれかである。
【０００８】
上述によると、ポリヌクレオチドの細胞への導入は、細胞群へ導入するための陽イオン脂質試薬、陽イオン無脂質ポリマートランスフェクション試薬、リポソーム系トランスフェクション試薬を含む配合剤によって促進される。また、電気穿孔法を利用してもよい。
【０００９】
本発明の他の実施例として、ヒト胚性幹細胞群における遺伝子発現を調節する方法を示す。その方法は、電気穿孔法により又は陽イオンポリマーの存在下で、ＤＮＡ配列を細胞群へ導入する。そのＤＮＡ配列は、エンハンサー、プロモーター、遺伝子のうち少なくとも１つに対応しており、ＤＮＡ配列を有する細胞を、ＤＮＡ配列を有しない細胞から区別出来るくらい胚細胞群において遺伝子発現を調節する。
【００１０】
この実施例によると、遺伝子は、螢光性蛋白質、自殺遺伝子、ノックアウト蛋白質、抗生物質抵抗性蛋白質から選択された蛋白質をコードする。プロモーターは、ｒｅｘ−１、ｏｃｔ−４、ｏｃｔ−６、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲ１−８１、ＧＣＴＭ−２、アルカリホスファターゼ、Ｈｅｓ１プロモーターから選択される。螢光性蛋白質は、緑色螢光性蛋白質、ｌａｃＺ、ホタルウミシイタケ蛋白質、ルシフェラーゼ、赤シアン蛋白質、黄シアン蛋白質から選択される。抗生物質抵抗性蛋白質は、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシン、ピューロマイシンから選択される。自殺遺伝子は、誘導性アポトーシス遺伝子であり、又は単純ヘルペスチミジンキナーゼ、誘導性ジフテリア毒素、細菌性シトシンデアミナーゼから選択された蛋白質をコードする。ノックアウトは、ＤＮＡ配列をβ２−ミクログロブリン、ＨＬＡ−１，ＨＬＡ−２又はＩＮＦレセプターをコードする遺伝子に導入して無機能にする。
【００１１】
本発明の他の実施例として、異種細胞群から多能性胚性幹細胞を精製する方法を示す。この方法は、未分化細胞内で特に活性なプロモーターのもとで選択マーカーをコードするＤＮＡを細胞に導入し、選択マーカーを発現していない細胞から選択マーカーを発現している細胞を分離し、精製された多能性細胞を得る。従って、選択マーカーは、螢光マーカー、例えば、緑色螢光性蛋白質、ｌａｃＺ、ホタルウミシイタケ蛋白質、ルシフェラーゼ、赤シアン蛋白質、又は黄シアン蛋白質である。マーカーを有する細胞は、螢光活性化細胞選別機又はレーザースキャニングサイトメーターにより、マーカー不足の細胞から分離される。選択マーカーは抗生物質抵抗性マーカーであり、細胞からマーカーを発現している細胞を分離する。これは抗生物質を含有する選択培地で細胞を培養しても達成できない、できる。
【００１２】
本発明の実施例は、選択された細胞型の欠失により起こる状態のヒト被験者を治療する方法を示す。この方法は、組織特異的プロモーターのもと、マーカーを有する核酸でｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてヒト胚性幹細胞をトランスフェクトし、マーカーを発現していない細胞からマーカーを発現している選択された細胞型を分離し、その選択された細胞型を被験者に導入して治療をする。核酸は、更に自殺遺伝子を有する。自殺遺伝子は、誘導性アポトーシス遺伝子であり、又は単純ヘルペスチミジンキナーゼ、誘導性ジフテリア毒素、細菌性シトシンデアミナーゼから選択された蛋白質をコードする。マーカーは螢光マーカー又は抗生物質抵抗性蛋白質である。螢光性蛋白質は、緑色螢光性蛋白質、ｌａｃＺ，ホタルウミシイタケ蛋白質、ルシフェラーゼ、赤シアン蛋白質、黄シアン蛋白質のどれかである。抗生物質抵抗性蛋白質は、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシン、ピューロマイシンのどれかである。脂溶性試薬又は無脂溶性試薬及びリポソーム系試薬を含む陽イオンポリマートランスフェクション試薬、または電気穿孔法を使用して細胞をトランスフェクトする。
【００１３】
本発明の実施例において、核酸はウィルス性遺伝子を有しない。選択された細胞型は、表皮細胞、皮膚細胞、筋細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、神経細胞、網膜細胞、内胚葉細胞、骨髄細胞、または免疫システムの細胞であるか、または、ヒト被験者の機能的に異なる臓器からの特定細胞である。その細胞型を注射で被験者に投与する。選択された細胞型で治療する症状としては、がん、免疫性障害、自己免疫性疾患、老化の病気、神経細胞消耗性疾患を含む消耗性疾患、そして損傷に関連した症状がある。
【００１４】
本発明の実施例において、細胞群は、外因性ＤＮＡの発現調節配列を有するヒト胚性幹細胞の本質的に純粋な集合体である。
【００１５】
本発明の更なる実施例において、多能性細胞と分化細胞の複合体からクローン多能性細胞群を生成する方法を示す。この方法は、胚の内部細胞塊の細胞内で選択的に活性なプロモーターのもとでマーカー蛋白質をコードするＤＮＡにより、陽イオンポリマーの存在下又は電気穿孔法によって細胞の複合体をトランスフェクトし、発現マーカーがあるか否かに応じて分化細胞から胚性幹細胞を分離してクローン多能性細胞群を生成する。プロモーターは、ｒｅｘ−１、ｏｃｔ−４、ｏｃｔ−６、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲ１−８１、ＧＣＴＭ−２、アルカリホスファターゼ、Ｈｅｓ１プロモーターから選択される。ＤＮＡトランスフェクションは陽イオンポリマーの存在下で起こる。マーカー蛋白質は、螢光性蛋白質及び抗生物質抵抗性蛋白質から選択される。螢光性蛋白質は、緑色螢光性蛋白質、ｌａｃＺ、ホタルウミシイタケ蛋白質、ルシフェラーゼ、赤シアン蛋白質、黄シアン蛋白質から選択される。抗生物質抵抗性蛋白質は、ハイグロマイシン、ネオマイシン、ゼオシン、ピューロマイシンから選択される。
【００１６】
本発明の実施例において、人的操作により分化したヒト胚性幹細胞培養により得られる、被験者の細胞群の細胞生存度を調節する方法を示す。その方法は、自殺配列をコードする外因性ＤＮＡを有し、未分化細胞、部分的にまたは全体的に分化した細胞からなるグループから選択された細胞群を被験者に導入し、被験者に有害な状況が起こった場合に細胞内の自殺配列を活性化して細胞を滅亡させる薬剤で被験者を治療する。有害な状況として、例えば導入細胞の高増殖がある。
【００１７】
本発明の実施例において、薬剤をスクリーニングし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞分化に対する効果を判断するための方法を示す。この方法は、細胞特異的プロモーターのもとで検出可能なマーカーを発現している遺伝的に作り出されたヒト胚性幹細胞群のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞培養に薬剤を加え、胚性幹細胞に分化をもたらし、薬剤の分化に対する効果を判断する。検出可能なマーカーは、螢光マーカーでも抗生物質抵抗性マーカーでもよい。
【００１８】
本発明の更なる実施例において、移植用の材料となる試薬細胞群を示す。その群は基本的に、異質遺伝物質によって変化される多能性ヒト胚性幹細胞からなり、その異質遺伝物質というのは、通常胚性幹細胞内に存在しないＤＮＡ、胚性幹細胞の中に発生するが、生物学的に意味のあるレベルで発現されない物質、胚性幹細胞内に発生し、選択された誘導細胞のみによって発現されるよう変化されたＤＮＡ、又は、胚細胞、誘導細胞、又はそれらの結合体によって発現されるように変化可能なＤＮＡである。例えば、異質遺伝物質は、少なくとも一つの選択マーカーをコードする遺伝物質からなる。少なくとも一つの選択マーカーは、優性選択マーカー、例えば、抗生物質抵抗性をコードする遺伝子、自殺蛋白質をコードする遺伝子、螢光性蛋白質、又は抗生物質抵抗性蛋白質である。自殺遺伝子は、ｈｓｖ−ｔｋや自殺蛋白質チミジンキナーゼであり、螢光性蛋白質は、緑色螢光性蛋白質、ｌａｃＺ、ホタルウミシイタケ蛋白質、ルシフェラーゼ、赤シアン蛋白質または黄シアン蛋白質であり、抗生物質抵抗性蛋白質は、ハイグロマイシン、ネオミシン、ゼオシン、又はピューロマイシンである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
定義。本明細書及びクレイムで使用されるように、以下の言葉は記載された意味を持つ。
【００２０】
“トランスフェクション”とは、核酸を細胞群に導入することである。トランスフェクションは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏやｉｎ  ｖｉｖｏで行われる。トランスフェクションの結果、遺伝的に操作された細胞が作り出される。
【００２１】
“ベクター”とは、市販されている商業的ベクターであり、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ又はＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｌａｂｓのベクターである。
【００２２】
細胞内の“自殺配列”とはＤＮＡであり、ＤＮＡ、ＲＮＡ上で直接又はＤＮＡによって発現された蛋白質上で作用する薬剤を外部から投与した結果、これが活性化されたとき、自殺配列を有する細胞は自滅し、又は破壊される。自殺遺伝子は、構成に関するプロモーター又は組織特異的プロモーター、例えば、ＥＳ細胞特異的プロモーターにもとづく。ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞を被験者に移植するとき、外部からの投与薬剤は、皮下注射、筋肉注射、静脈内注射によって経口に又は非経口に、又は経皮に投与される。自殺遺伝子の例としては、誘導性アポトーシス遺伝子や、チミジンキナーゼ、細菌性シトシンデアミナーゼ、誘導性ジフテリア毒素をコードする遺伝子がある。
【００２３】
“転写因子”は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は転写されるＤＮＡと関わるようになる蛋白質を指し、転写の程度を調節する。転写因子の例として、肝核因子（ＨＮＦ３等）、筋肉特異的因子（ＭｙｏＤ等）、骨髄因子、膵臓因子（ＰＤＸ−１等）、ホメオボックス遺伝子、及び他の周知のものである。
【００２４】
“細胞特異的プロモーター”とは、遺伝子からの上流にある、一般的にコードしないヌクレオチド配列であり、組織特異的発現を調節する。例えば、神経細胞特異的プロモーターは、神経フィラメントＨ鎖に対する配列のコード領域の上流にある；心臓プロモーターは、心筋細胞内の心臓蛋白質とアクチンの発現を決定し、骨髄プロモーターは、βグロビンを有するグロビン蛋白質の発現を決定し、肝臓プロモーターは、肝細胞内のアルブミンの発現を調節し、膵臓プロモーターはインスリンの発現を調節する。プロモーターの他の例として、ネスチン、チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパミンベータヒドロキシラーゼ、ＣＤ３４、ＰＧＸ−１、アルブミン、ＩＳＬ−１及びｎｇｎ−３がある。これらの例は限定しない。
【００２５】
“マーカー”は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または細胞内で簡単に発見される蛋白質であり、マーカーを有さない細胞から有している細胞を区別する手段である。マーカーは、変化している環境を引き起こす状況において細胞の状況を把握するために使用される。マーカーは細胞に内在しているか、外来のもので細胞に導入されて蛋白質を発現する。例えばマーカーをコードする異種ＤＮＡは、時々レポーター遺伝子と呼ばれる。“レポーター遺伝子”は特定の細胞の存在を“レポート”する遺伝子であり、遺伝子の組織特異的発現が起こるか否か、どのようにそれが調節されるかを制御する細胞エンハンサーやプロモーターを含む。レポーター遺伝子はトランスフェクションによって細胞に導入される。レポーター蛋白質をコードする遺伝子による細胞のトランスフェクションは、細胞を把握するための手段である。レポ−ター遺伝子の例として、海に住む動物から発見されるものを含め、緑色螢光性蛋白質、ＬａｃＺ、ホタルウミシイタケ蛋白質、赤、黄、又は青シアン螢光性蛋白質、又は他の螢光性蛋白質がある。他のマーカーとして、例えばネオマイシン、ハイグロマイシン、ゼオシン、ピューロマイシンから細胞を守る抗生物質抵抗性蛋白質がある。
【００２６】
“発現調節配列”は、外因性核酸を含み、外因性核酸は、標的細胞へ追加染色体的に又は染色体的に導入されたとき、同細胞内で、又は他の細胞内では結合により、遺伝子発現を調節する能力を有する。この調節は、細胞内ですでに生成されている蛋白質の発現を高める又は抑制することにより、又は普段は発現されないが、細胞内でＤＮＡによって自然にコードされる蛋白質を発現することにより、又は普段は細胞内で発現されないし、細胞内のＤＮＡによっても自然にコードされない、他種の細胞内の一つの種からの蛋白質のような蛋白質を発現することにより達成される。発現調節配列の例として、相同組換えを含む、類似ＤＮＡ分子間の組換えを増す配列同様、エンハンサー、プロモーター、転写活性剤、遺伝子がある。適当な量で特定遺伝子を発現する細胞は、被験者の細胞治療で使用され、被験者の状態に関連した欠陥遺伝子発現を正常にする。ヒト胚性幹細胞から得た分化細胞内の遺伝子によって発現された、治療によい結果をもたらす蛋白質の例として、上皮成長因子、基礎繊維芽細胞成長因子、グリア由来の神経栄養成長因子、神経成長因子、インスリンのような成長因子（１および１１）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４／５、毛様神経栄養因子、ＡＦＴ−１、リンホカイン、サイトカイン、酵素―例えばグルコセレブロシドのようなグルコース貯蔵酵素、チロシン、ヒドロキシラーゼのような成長因子がある。
【００２７】
“状態”は、正常とは明らかに違う状態のことをいい、その為にヒト被験者を治療するのである。状態の例としては、卵巣癌や白血病を含む末期癌などのがん、ＡＩＤＳ等の免疫性を落とす病気、多発性硬化症等の自己免疫性を落とす病気、真性糖尿病、クローン病などの炎症性腸疾患、全身性エリトマトーデス、乾癬、慢性関節リウマチ、自己免疫性甲状腺疾患、強皮症、筋ジストロフィ症など神経システムに影響を及ぼす状態、及びアルツハイマー、パーキンソン病、脊髄損傷、高コレステロール血症等の肝臓疾患、及び心臓病、軟骨置換、熱傷、足潰瘍、胃腸疾患、血管症、腎臓疾患、尿路結石症、老化に関連した病気のように損傷細胞を置換するのが望ましい状態がある。状態として、欠陥遺伝子、つまり欠陥免疫システム遺伝子、嚢胞性繊維病や他の遺伝子疾患に関連したものもある。
【００２８】
ここでは、ヒトＥＳ細胞系を遺伝子的に作り出す方法及び構造を確立し、これらの細胞をトランスフェクトする有効なプロトコルについて記載する。ゲノムへ遺伝的変換を導入することにより、我々はｉｎ  ｖｉｔｒｏでこれらの細胞を操作出来、選択マーカーを使用して幹細胞クローンを精製し、そして他の生物学的な目的、調査目的同様、細胞に基づく治療のため、作りだされた幹細胞を使用し、把握し、そしてもし望むなら殺すことも可能である。
【００２９】
マーカーは異種培養から特定の細胞型を分離する為に使用される。例えば、細胞群を、薬物抵抗性をコードする遺伝子を有するＤＮＡでトランスフェクトし、その遺伝子を含む細胞型に関わらず組織特異的プロモーターによってドライブしたとき、薬物の存在下で生存する細胞のみが薬物抵抗遺伝子を発現出来る細胞型である。
【００３０】
以下に叙述するように遺伝的に変換されたヒト胚性幹細胞は、分化の生物学について学ぶ為だけでなく、ヒト被験者の細胞治療など様々な目的に使用される。その利用として、例えば、（ａ）胚性幹細胞の分化段階を把握する、（ｂ）分化と自己更新に影響を及ぼす因子を確認する、（ｃ）一部的に分化した幹細胞から多能性幹細胞を分離する、（ｄ）分化細胞の様々な型を特徴づけ、選択する、（ｅ）分化細胞の純粋な標品を分離する、（ｆ）選択した分化細胞の収率を高める、（ｇ）ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞動作、増殖性、位置の観察を含め、ｉｎ  ｖｉｖｏで移植された細胞を観察する、（ｈ）奇形癌への変化を含め、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて高増殖している移植細胞を破壊する、（ｉ）移植拒絶を防ぐ為にＭＨＣに関連した分子を取り除く、がある。
【００３１】
現在、ＥＳ細胞系は、多数の哺乳類（ハムスター、ミンク、豚、ウサギ、羊、牛、キヌザル、アカゲザル（Ｐｒｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ，Ｖｏｌ．１６５，ｐｐ．２２０−２３６参照）及び人間（ＵＳ出願番号  Ｎｏ．０９／９１８、７０２）に対し利用可能だが、マウス以外のＥＳ細胞系は外因性ＤＮＡでトランスフェクトされなかった。マウスＥＳ細胞においては、電気穿孔法が異種ＤＮＡをＥＳ細胞に導入するための選択方法として判断されていた（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．５１，ｐｐ．５０３−５１２）。マウスＥＳ細胞と対照的に、ヒトＥＳ細胞は電気穿孔法によってもトランスフェクとされるが、陽イオンポリマーの存在下でのトランスフェクションは、良い結果が得られることを発見した。
【００３２】
我々は、外因性ＤＮＡをヒトＥＳ細胞に導入するために様々な化学的方法を実験した。実験は、陽イオン脂質試剤、非リポソーム系配合剤、および陽イオンポリマートランスフェクション試剤を含む。これら試剤の例として、リポフェクタミン（陽イオン脂質）、電気穿孔法、ＦｕＧＥＮＥ（非リポソーム系配合剤）及びＥｘＧｅｎ（エチレンイミンの線状ポリマーの薬剤を含む陽イオンポリマー）がある。
【００３３】
例１及び図１は、製造者のプロトコルに従って、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（商標）（陽イオン脂質）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ）、ＦｕＧＥＮＥ（商標）６（非リポソーム系配合剤）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＥｘＧｅｎ（商標）５００（陽イオンポリマー試剤）（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、Ｍｄ）により、ヒトＥＳ細胞の成長しているクローンに導入される単純ヘルペスＴＫプロモーター（Ｄｕａｌ  Ｌｕｃ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ）によりドライブされる、ホタルウミシイタケルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーター遺伝子を使用した結果を示す。４８時間後、蛋白質濃度に対する、基質の存在下での酵素の相対活動性を測ることによってトランスフェクション効果を評価した。トランスフェクション効果の明らかな違いは、ＦｕＧＥＮＥ６と比べたＥｘＧｅｎ５００、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥおよび電気穿孔法の間で見られた。ＥｘＧｅｎ５００でのトランスフェクションは、他の試剤よりも良い効果で、ＤＮＡをヒトＥＳ細胞内に送達した（図1）。
【００３４】
プロモーターの特異性に応じてマーカーを胚性幹細胞に導入することにより、トランスフェクトされていない細胞からトランスフェクトされた細胞を分離させ、又は他のトランスフェクトされた細胞からある型のトランスフェクト細胞を分離させる。マーカーは新奇な生理学上の特徴、例えば、トランスフェクト細胞を本来ならば成長できない場所で成長させるという特徴を持つ。例えば、Ｇ４１８内で成長している細胞を保護する、Ｎｅｏのような薬物抵抗性遺伝子である。他のタイプのマーカーは、生化学分析（蛋白質分析、酵素分析、レセプター結合分析）または免疫学解析を利用して複合体から異なる細胞型の物理的分離を助長する。マーカーは光学的又はレーザーで認識できる特徴を持つため、マーカーが発現されているか否かでｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてマーカーを発現しているトランスフェクト細胞を認識できる。単一又は複数のマーカー遺伝子を細胞に導入する。マーカーをコードするＤＮＡは、融合蛋白質を形成する他の遺伝子、又は、特定的に分化をもたらし、又は分化細胞によって生成された特定標的蛋白質の量を調節するＤＮＡと関連付けられる。トランスフェクトされた細胞内のマーカー発現は、プロモーターとエンハンサー配列によって調節され、ある量の蛋白質を生成する。
【００３５】
我々は、未分化表現型が伴うように遺伝的に調整され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ用に選択されたヒトＥＳ細胞の純クローンを得た。例えば、ＥＳ特異的プロモーターの制御下で、レポーター遺伝子、緑色螢光性蛋白質（ＥＧＦＰ）（ＵＳ特許６，３１６，１８１の緑色螢光性蛋白質マーカー参照）をヒトＥＳ細胞に導入した。未分化細胞を緑色螢光性にすることにより、我々は培養下で細胞の分化状態を、自然発生分化に続き、成長、繁殖の間観察した。我々はマウスＲｅｘ−１遺伝子の特徴付けられたプロモーター配列を利用した。Ｒｅｘ−１はレチノイ酸が調節されたジンクフィンガー型蛋白質であり、未分化ＥＳ及びＥＣ細胞において、また、４．５日目のマウス胚盤胞の内部細胞塊（ＩＣＭ）において発現される（Ｈｏｓｌｅｒ  ｅｌ  ａｌ．，（１９９３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１３，ｐｐ．２９１９−２９２８，Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．１１３，ｐｐ．８１５−８２４）。ＥＳ細胞において選択された発現に好適な他のプロモーター配列は、Ｏｃｔ−４、Ｏｃｔ−６、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ１−６０、ＴＲＡ１−８１、ＧＣＴＭ−２、アルカリホスファターゼ、Ｈｅｓ１、および他のホメオボックス遺伝子である。例４において、Ｒｅｘ−１プロモーターは、胚細胞の分化上で速やかに調節される典型的なＥＳ特異的プロモーターとして使用された。Ｒｅｘ−１調節された選択遺伝子マーカーをヒトＥＳ細胞に導入する事により、これら遺伝子の多能性に基づく方式で発現させ、培養下でこれらの細胞の分化状態を判断した。
【００３６】
本発明の他の実施例において、ＳＶ４０−Ｎｅｏ選択マーカーを含むＲｅｘ−１−ＥＧＦＰ発現ベクターを構成し、増殖している未分化ヒトＥＳクローンに（ＥｘＧＥＮによって）送達した。次の日、細胞をトリプシン処理し、ＭｉｔＣ−処理されたＭＥＦＮｅｏ＋のフィーダー上に再プレートし、Ｇ４１８選択によりトランスフェクト細胞のクローンを増殖した。１４日の培養により、Ｎｅｏ抵抗性螢光性とみなされたコロニーは分離され、いくつかの継代に増殖し、個々の細胞系、単一のトランスフェクトされたヒトＥＳ細胞の派生物を樹立した（例１）。
【００３７】
樹立した１０の細胞系のうちの４つを異なる培養条件下で生育して多能性を実験した。（未分化成長をサポートする為の）白血病抑制因子（ＬＩＦ）の存在下でフィーダー細胞上で生育したとき、高発現のＥＧＦＰが未分化コロニーの小さく密な細胞内で発見された。螢光性光はコロニーの縁と不連続に重なり合い、自然分化が行われている周囲ではこの光は見えない（図４）。我々は、フィーダーレイヤーとＬＩＦが存在しない中でモノレイヤーとして細胞を生育する事により、標識化は細胞形態と相互的にとても関連があり、コロニー以外そしてコロニーから離れたところで成長している大きくてばらばらに連結された細胞内では存在しないということを証明する。更に、懸濁培養下で細胞集合体として生育することにより分化させたとき、螢光は徐々に減退する。始め、４日目の単純ＥＢｓの外表面において原内胚葉細胞の層が形成され、その後もし嚢胞性ＥＢｓを形成し続けたら（２０日間の懸濁で）、未分化細胞のいくつかの核から離れた所で事実上滅びる（図4）。
【００３８】
螢光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）（図５）の使用、又はレーザースキャニングサイトメーターのような他の螢光活性化方法（Ｋａｍｅｎｔｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９７）  Ａｃｔａ  Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ，Ｖｏｌ．４１、ｐｐ．１２４−１４３）、磁性方法（Ｄｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９９）  ＵＳ５，９８５，１５３）、または周知である他の方法により、未分化及び分化ヒトＥＳ群を区別した。マウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）、未分化ヒトＥＳ細胞、未分化および分化されたトランスフェクト細胞系の細胞サンプルを螢光放射に応じて特徴付けた。螢光強度は、トランスフェクトされていない細胞系とトランスフェクトされた細胞系の未分化培養の間で明らかに違いがある。更に、ＥＧＦＰトランスフェクトされたヒトＥＳをそれらの分化派生物と比べたとき、放射における変化が見られた（図５）。
【００３９】
本発明の実施例において、マウスＲｅｘ−１プロモーターの制御下で、ＥＧＦＰを発現するヒトＥＳの遺伝的に生成された細胞系を樹立する。このマーカー遺伝子のＥＳ特異的発現により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長と分化している間はヒト多能性胚性幹細胞を特定出来る。異なる培養条件下で細胞を生育することにより、細胞形態と多能性の直接関連を示す：未分化コロニーの密な細胞内における高ＥＧＦＰ発現が、分化を起こす大きくばらばらに連結した細胞内において即座に消える。更に、我々は、ＥＢｓの形成中、どのように多能性幹細胞が発育上規則化されたパターンで即座に除去されるかを証明する。これは、内胚葉細胞の層が作り出される単純ＥＢｓの外表面において始まり、嚢胞性ＥＢｓのほとんどの部分へと除去が進められる。これらの観察は、分化が多能性幹細胞滅亡の原因である証明した、マウスの時と同様である（Ｍｏｕｎｔｆｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）  Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ  Ｄｅｖ．，  Ｖｏｌ．１０、ｐｐ．５２７−５３３）。
【００４０】
成長しているコロニーにおいて細胞によるＲｅｘ１調節された配列の均一発現は、これらの細胞が長期間培養の間でＩＣＭの特徴をなくすことはなく、したがって本当に多能性であることを例証している。更に、これらの遺伝的に作り出された細胞系は、単一のトランスフェクトされた細胞のクローン拡大によって樹立させているので、未分化コロニー内の細胞の発育上の潜在性において変異可能性はなくなる。
【００４１】
我々は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてヒトＥＳ細胞の維持を容易にするため、幹細胞選択方法を開発した。現在、この目的に適用される方法は、解剖顕微鏡での単一コロニーの特定と分離である。しかし、これらの方法は時間と労力が必要である。そこで、我々は螢光性とみなされた細胞の細胞選別によって、細胞の複合体から未分化細胞を精製する方法を示す。未分化クローンの同様な選択は、Ｒｅｘ−１又はＯｃｔ−４のようなヒト胚性幹細胞プロモーターの調節のもとで（Ｎｅｏ抵抗性遺伝子のような）薬物選択を可能にする遺伝子を細胞に導入し、（Ｇ４１８抗生物質のような）選択薬の存在下で細胞を維持することにより達成される。上述のように未分化細胞の純集団を生成することにより、我々はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて自然分化によるヒトＥＳ培養のロスを防止することが出来る。
【００４２】
細胞特異的選択マーカーの未分化ヒトＥＳ細胞のゲノムへの導入は、誘発分化によって得られた異種細胞培養から、移植用の特定細胞型を分離するためのモデルとなる。更に、所望細胞型への幹細胞の人的分化に対する選択された生物的薬剤の正の効果及び負の効果は、移植用に所望細胞の数を最大にするように判断される。胚性幹細胞から得られた分化細胞の数及び素質をある方法で増加、減少、又は変更する様々な生物的薬剤は移植の試剤として、胚性幹細胞の効果的使用を助長する。要は、組織特異的プロモーターのもとでマーカー遺伝子又はマスター遺伝子を有する外因性ＤＮＡでヒト胚性幹細胞をトランスフェクトする能力は、胚性幹細胞の分化の結果に対する薬剤又は培養環境の効果を解析する新たな機会を与える。更に、解析は、選択された分化標的細胞型の量を増加したり減少したりするため、薬剤又は培養条件の効果を確立する為に使用される。
【００４３】
移植や他の細胞に基づく治療におけるヒト幹細胞の使用は、腫瘍形成や異所性の過度分化を引き起こす移植後の細胞の余剰増殖を起こし得る医療問題への配慮が必要である。ヒト胚性幹細胞は移植医学にとって強力な材料である。これらの細胞は、多能性を維持しながら培養で無限に増殖する能力を持っている。更に、ＥＳ細胞は宿主免疫システムを避けるように遺伝的に操作されることが可能である。かくして、ＥＳ細胞は、制限なく広く適用できる細胞源として有用できる（Ｓｏｌｔｅｒ、（２０００）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、Ｖｏｌ．１、ｐｐ．１９９−２０７；Ｐｅｒａ，（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．１１、ｐｐ．５９５−５９９）。幹細胞の使用における危険の一つは、多量に増殖することである。もし幹細胞の余剰量が移植されたサンプルに残り、不適当に存在したら問題となる。
【００４４】
ここで記載される方法は、負の選択によって移植前又は後にヒトＥＳを除去するために利用され、腫瘍誘発の危険を回避する。これらの状況において、外因ＤＮＡからの遺伝子産物を発現している細胞は、選択を行った時に滅亡する。更に、幹細胞移植から起こる医療的な合併症は、投与された治療薬の存在下で細胞を殺す事が出来る産物を発現している遺伝子を有する細胞を移植することで回避される。“自殺”遺伝子の例として、ジフテリア毒素（Ｍａｘｗｅｌｌ、（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  Ｖｏｌ．４６、ｐｐ．４６６０−４６６４）及び細菌性シトシンデアミナーゼ（Ｐａｎｄｈａ、（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．２１８０−２１８９）のテトラサイクリン誘導性型がある。従来で知られているどの“自殺”遺伝子も、ここで記載されている方法で、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで胚性幹細胞またはそれらの産物の負の選択用に使用される。ＥＳ特異的プロモーターによって制御される“自殺”遺伝子は、幹細胞群のみを除去する。
【００４５】
本発明の実施例において、我々は遺伝的にヒトＥＳ細胞系を作りだし、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を構成的に発現した。ＨＳＶ−ＴＫ蛋白質の発現は、他の細胞型へ致命的にならない濃度でＨＳＶ−ＴＫ＋細胞の特定切除を可能にして、ＦＤＡ認可薬剤Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒに対する感受性をもたらす。この遺伝子発現がＦＤＡ認可プロドラッグＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ｉ．ｖ．ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）に対する感受性をもたらしたので、注入された細胞を特定標的にして、所望でない効果の場合における移植の非侵入除去する。
【００４６】
現在Ｒｏｃｈｅで売られているＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＧＣＶ）は抗ウィルス性因子であり、ＤＮＡ合成を妨げる。薬剤はウィルス性チミジンキナーゼによって過リン酸反応し、更に細胞性キナーゼによって過リン酸反応する。その過リン酸反応した薬剤はＤＮＡ合成のターミネーターとして働いて、ＤＮＡポリメラーゼを抑制し、細胞をアポトーシスさせる。
【００４７】
我々の結果は、正常な細胞に影響を及ぼさない程度の濃度のＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（１０−５−１０−７）でＨＳＶ−ＴＫ＋ＥＳや腫瘍を除去することを示す。更に、推奨されている５−５０ｍｇ／Ｋｇ（Ｐｅｓｃｐｖｉｔｚ、（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１．Ｓｕｐｐｌ．，Ｖｏｌ．１，ｐｐ．３１−３４）の静脈内麻酔薬を投与された患者の血液濃度は２×１０−４から２×１０−２Ｍの範囲内にある。毎日５ｍｇ／Ｋｇの投与後のＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒの血しょう測定で、実際の安定状態が１０−６Ｍよりも高いことを示している（Ｋｌａｔｘｍａｎｎ、（１９９８）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，Ｖｏｌ．９、ｐｐ．２５８５−２５９４）。この濃度は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験において全細胞を効果的に殺す範囲内にある。逆突然変異の割合は低いことから、悪性転換の状態において、プロドラックによる治療は、迅速に細胞を除去して、腫瘍塊を６桁以上も減少する。移植薬において利用されるこれらの細胞の潜在性は、ＥＳ細胞の通常の特性を維持するという事実から高められる。このことは、操作処理中に核型変換が起こらないという事実から証明される。これは、宿主内への注入による悪性転換の危険性を抑制するということにおいて重要なことである。おそらくもっと重要なことには、細胞の遺伝的変換によって、様々な組織に分化するという特性が変化しないことである。神経細胞、心細胞、膵臓細胞に対するマーカー発現は、神経変性、心筋症、真性糖尿病などの病気の治療で使用できるという希望がある。ｉｎ  ｖｉｖｏでのヒトＥＳ細胞の選択除去を安全で確かなものにする為、糖尿のマウスや脊髄損傷ラットのような動物を使った細胞移植実験を行わなければならない。
【００４８】
“自殺”遺伝子による上述の実験は、遺伝子治療による悪性治療についてのものだった。ほとんどの遺伝子治療研究は、ＨＳＶ−ＴＫの減少側効果のためのＨＳＶ−ＴＫの導入についてであった（トキシンの無漏洩及び体細胞の抵抗性）。進んだ臨床実験では、黒色腫やグリア芽細胞腫のような様々な悪性に対して行われ、いくつか成功例がある（Ｋｌａｔｚｍａｎｎ，１９９８）。遺伝子治療における主な問題点の一つはデリバリーシステムであり、ヒトＥＳ細胞で動いている間、問題点は存在しない。これらの細胞は、培養で無限に増殖することが出来、必要に応じて、遺伝的に変形したクローンを生成出来る。我々の結果は、ヒトＥＳ細胞をその増殖性を損なわずに、移植医学においてより安全な試薬とすることである。
【００４９】
本明細書で記載されている全参考文献は、参照としてここに組み入れられている。
【００５０】
例
例１  ヒトＥＳ細胞のトランスフェクションのプロトコル
電気穿孔法、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒｕｎｉｎｇｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ＦｕＧＥＮＥ（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ  Ｍａｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＥｘＧｅｎ（Ｆｅｒｎｅｎｔａｓ、Ｈａｎｏｖｅｒ、ＭＤ）でのトランスフェクションを利用して、ＤＮＡをヒト胚性幹細胞に導入した。トランスフェクションプロトコルの例は４５ページに記載されている。
【００５１】
細胞培養：ヒトＥＳ細胞をマウス胚繊維芽細胞（MEF）のフィーダーレイヤー上で生育し、ゼラチンコートのプレートに移し、培養でマウスの細胞数を減少させた。胚様体（ＥＢｓ）への分化は、ペトリ皿にいつされることで始められ、その胚様体は懸濁液中に残っていた。（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ２０００）分化胚（ＤＥ）細胞は、５日後にＥＢｓを分離してモノレイヤーとして培養することで形成された。
【００５２】
特に、ヒトＥＳ細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌ．２８６、ｐｐ．１１４５−１１４７で記載されているように得られた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの受精（ＩＶＦ）によって作り出された分割段階のヒト胚は、必要な認可処理後に得られた。胚を胚盤胞段階まで培養し、内部細胞塊を分離した。ＥＳ細胞系は胚から分離し、６ヶ月の培養後に正常のＸＸ核型を持つ細胞系を選択し、さらに複製転換期にならずに数ヶ月間継続的に継代させることが出来た。細胞は、２０％ＫｎｏｃｋＯｕｔＴＭ  ＳＲ−無血清製剤（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１ｍＭのグルタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、０．１ｍＭ  βメルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）、１％の必須アミノ酸ｓｔｏｃｋ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、ペニシリン（５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を補った８０％ＫｎｏｃｋＯｕｔＴＭ  ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で、１０３ｕｎｉｔｓ／ｍｌの白血病抑制因子（ＬＩＦ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）及び４ｎｇ／ｍｌの塩基繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，）の存在下、マイトマイシン−Ｃ処理されたマウス胚繊維芽細胞フィーダーレイヤー（１３．５日目の胚から得られた）上で成長させたとき、均一な未分化形態を有した。
【００５３】
未分化細胞培養は、ＬＩＦ及びｂＦＧＦを生育培地から除去し、ペトリ皿に集合させる事により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥＢｓへの分化を誘発させた（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。また、未分化細胞は、ＬＩＦ及びｂＦＧＦが存在しない中で、０．１％ゼラチン（Ｍｅｒｃｋ）コートの皿上でモノレイヤーとして生育する事により、自発分化を起こした。
【００５４】
ヒトＥＳ細胞培地で０．１％ゼラチンコートのプレート上で生育された細胞をヌードマウスに注入する事により奇形腫を形成し（Ｒｏｖｅｒｔｓｏｎ，（１９８７）、腫瘍を分離し、除去した。一定濃度でプレートした後、Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（Ｓｉｇｍａ  Ｇ２５３６）を投与し、培地を２日間ごとに新しいＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒと取りかえた。
【００５５】
プラスミド構成：Ｒｅｘ−１−ＥＧＦＰ発現ベクターは、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＣＭＶプロモーター配列の削除、及びマウスＲｅｘ−１プロモーター配列（７００ｂｐ）のＨｉｎｄＩＩＩ制限サイトへの導入によって構成される。
【００５６】
一過性トランスフェクション：上記の各方法によるＤＮＡトランスフェクションの効率を判断する為、ＴＫプロモーターの制御下で細胞をホタルウミシイタケ蛋白質の構成でトランスフェクトした。細胞はトランスフェクション後４８時間で採集され、ウミシイタケ蛋白質の明度を明度メーターで観察した。結果をトランスフェクトされた遺伝子の相対活性を示す図１のヒストグラムで示す（ｍｇ蛋白質に対する明度単位）。各実験は３度繰り返して行われ、標準誤差は各実験でみられた。図１から明らかなように、ｈＥＳのトランスフェクションに対する一番効果的な方法は、ＥｘＧｅｎ試剤を使用したときである。
【００５７】
遺伝子導入細胞系のトランスフェクションと樹立：十分に膨張した未分化ヒトＥＳ細胞を、Ｒｅｘ−１−ＥＧＦＰプラスミドＤＮＡ（Ｒｅｘ−１は未分化ＥＳ細胞に特有の遺伝子（Ｒｅｘ−１遺伝子）及びＥｘＧｅｎ−５００トランスフェクションシステム（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）によって安定的にトランスフェクトした。トランスフェクションは、製造者のプロトコルに従い、６ウェルのプレート内でフィーダー細胞上のヒトＥＳ細胞において行われた。つまり、細胞を、トランスフェクション因子で１０分間（ウェル毎、１ｍｌの培地に２μのプラスミドＤＮＡと１μのＥｘＧｅｎ５００）の室温でのインキュベーション培養、１１００ｒｐｍで五分間の遠心分離、湿気があり、３７度の箱の中で４５分間のインキュベーションを行った。余剰トランスフェクション因子は、ＰＢＳで２回洗浄することにより除去された。次の日、細胞をトリプシン処理し、不活性化ＭＥＦＮｅｏ＋含有の１０ｃｍ２培養皿に再プレートした。トランスフェクション２日後、Ｇ４１８（２００ｎｇ／ｍｌ）を生育培地に与え、培養においてトランスフェクト細胞を選択的増殖させた。１４日までにＮｅｏ抵抗性螢光とみなされるコロニーを螢光マイクロスコープで認識した。単一遺伝子導入コロニーをマイクロピペットで抜き取り、少し凝集された細胞の中に分離し、２ｃｍ２（２４ウェル）の培養皿中のＭＥＦＮｅｏ＋の新フィーダー上に移した。細胞はＧ４１８の存在下で継続的に増殖し、多数の膨張している未分化コロニーを形成した。コロニー内では細胞全てによって均一にＥＧＦＰを高発現している。過密な培養をトリプシン処理し、１０ｃｍ２の培養皿で数継代に増殖し、個々の細胞系及び単一のトランスフェクトヒトＥＳ細胞の派生物を樹立した。
【００５８】
図４は、トランスフェクトＥＳ細胞と、その分化、つまり単純胚様体（ｓＥＢ）及び嚢胞性胚様体（ｃＥＢ）を示す。図４において、左と真中の列はそれぞれ明るいフィールドと暗いフィールドの写真である。右の列は２つの写真を重ねたものである。因みに、未分化細胞のみが螢光性である。螢光ＥＳクローンは分化未螢光細胞によって囲まれている。単純ＥＢは、周囲ではなく、真中の原内胚葉細胞においてのみ認識される。嚢胞性ＥＢｓは一般的に螢光性ではなく、それらの中でも非常に特異的な部分（おそらく、余剰未分化細胞）のみが螢光性である。
【００５９】
細胞の大きさ、粒、及び螢光強度に応じ、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒシステム（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）について、細胞を発現しているＲｅｘ１−ＥＧＦＰのＦＡＣＳ解析を行った。未分化ヒトＥＳ細胞を螢光のバックグラウンドレベルの設定に使用した。バックグラウンドコントロールと比較して、未分化細胞培養（ＬＩＦの存在下でＭＥＦ上で生育した）と、部分的に分化した細胞培養（ＬＩＦがない中、ゼラチン上の生育によって得た）のトランスフェクト細胞を螢光強度に対して解析した。
【００６０】
例２  人的操作による分化に対するＤＮＡでのトランスフェクション
特定細胞（マスター遺伝子）の分化を調節する転写因子を、例１で記載された方法によってヒト胚性幹細胞にトランスフェクトする。トランスフェクトされたマスター遺伝子の発現により、規則的にヒトＥＳ細胞は更に分化し、所定の結果を得る。
【００６１】
例３  細胞特異的マーカーをコードするＤＮＡでの、胚性幹細胞のトランスフェクション
例１に応じて、マーカー遺伝子にリンクされた細胞特異的細胞をコードするＤＮＡでＥＳ細胞をトランスフェクトした。マーカーを発現している細胞を培養で観察し、螢光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって選択又は選別し、特定型細胞の精製標品を得る。このようなシステムにより、神経細胞（神経フィラメントＬ鎖遺伝子に対するエンハンサーのような神経特異的エンハンサーを使用したとき）、心筋細胞（α心臓アクチン遺伝子に対するエンハンサーのような心筋細胞特異的エンハンサーを使用したとき）、肝臓細胞（アルブミン遺伝子に対するエンハンサーのような肝細胞特異的エンハンサーを使用したとき）、又は膵臓細胞（インスリン遺伝子に対するエンハンサーのようなすい島特異的エンハンサーを使用したとき）のような細胞の解析が可能になる。
【００６２】
例４  未分化細胞を見分ける為の、螢光性蛋白質によるヒト胚性幹細胞のトランスフェクション
例１のように、マーカー遺伝子にリンクしている未分化細胞（Ｒｅｘ−１またはＯｃｔ−４）に特異的なエンハンサーを有するＤＮＡでＥＳ細胞をトランスフェクトした。マーカーを発現している細胞を培養し、螢光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）で選択又は選別し、未分化細胞の精製標品を得る（未分化細胞に特異的なエンハンサーのもと、螢光性蛋白質を有する細胞のコロニーについて、図２参照）。
【００６３】
例５  遺伝的に変化されたクローンの生成
細胞培養―ヒトＥＳ細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎ、１９９８）及びＥＢｓを上述のように培養した（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ、２０００）。ヒトＥＳ細胞培地で０．１％ゼラチンコートのプレート上で生育したＥＳ細胞をヌードマウスに注入することにより奇形腫を形成し（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、１９８７）、腫瘍を分離、除去した。一定濃度でプレートした１日後、Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（ＳｉｇｍａＧ２５３６）を投与し、培地を２日ごとに新しいＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒと取りかえた。２．５％のグルタルアルデヒドで固定後、０．１Ｍのホウ酸（Ｐｈ＝８．５）に溶かされたメチレンブルー（Ｓｉｇｍａ）での染色により、細胞密度に注目した。色は０．１Ｎ  ＨＣｌによって抽出され、放出は６５０ｎＭであった。
【００６４】
遺伝子導入細胞系のトランスフェクションと樹立。ヒトＥＳ細胞に導入されたプラスミドはＰＧＫ−ＥＧＦＰプラスミド（例１）またはＰＮＴプラスミド（Ｔｙｂｕｌｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ、Ｖｏｌ．６５、ｐｐ．１１５３−１１６３）であった。ＰＮＴプラスミドはネオマイシン抵抗性遺伝子または単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を操作する２つのＰＧＫプロモーターを有する。例１で叙述したように、ＥｘＧｅｎ５００（Ｆｅｒｎｅｎｔａｓ）によりトランスフェクションを行った。ＦＡＣＳ解析及び細胞選別−ＰＧＫ−ＥＧＦＰ及び細胞を発現しているＰＮＴのＦＡＣＳ解析を、それらの緑色螢光放射に応じて、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒシステム（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）について行った。
【００６５】
ＲＮＡ及びＲＴ−ＰＣＲ。ＴｏｔａｌＲＮＡを上述のように抽出し（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ、Ｐ．ａｎｄ  Ｓａｃｃｈｉ、Ｎ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２、１５６−１５９）、ｃＤＮＡをプライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）としてのランダムヘキサマー（ｐｄ（Ｎ）６）及びＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して１μｇのｔｏｔａｌＲＮＡから合成された。上述したＤＮＡプライマー（Ｓｃｈｕｌｄｉｎｅｒ、２０００）及びＧＦＡＰに対するプライマー：ＳＥＱ  ＩＤ．ＮＯ．１：ｃｇａｇａａｃａａｃｃｔｇｇｃｔｇｃｃｔａｔａｇ  及び  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２：ｇｔｇｇｇｔｃｃｔｇｃｃｔｃａｃａｔｃａｃａｔｃで、ｃＤＮＡサンプルをＰＣＲ増幅した。
【００６６】
細胞遺伝的解析：細胞遺伝的解析用の細胞を、０．１μｇ／ｍｌのコルセミドの生育培地で１０分間のインキュベート、０．０７５ＭのＫＣＬでトリプシン処理、懸濁、室温で１０分間のインキュベート、その後３：１のメタノール／酢酸で固定し、Ｇバンドした。
【００６７】
負の選択マーカーを有する細胞の系を生成するため、ハウスキーピング遺伝子（ホスホグリセレートキナーゼ−ＰＧＫ）プロモーターの制御下で、単純ヘルペス（ＨＳＶ−ＴＫ）からのチミジンキナーゼをコードするプラスミドでヒトＥＳ細胞をトランスフェクトした。導入されたプラスミドベクターはまた、異種ＤＮＡを収容している細胞を選択するネオマイシン抵抗性遺伝子を有する。ＨＳＶ−ＴＫ発現は、プロドラッグヌクレオシドＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒを、リン酸化塩基類似体としてのドラッグ形態へ変化させる。リン酸化Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒは、細胞を複製するＤＮＡに混合され、アポトーシスするＧ２／Ｍチェックポイントで不可逆停止を起こす（Ｈａｌｌｏｒａｎ、（１９９８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．５８、ｐｐ．３８５５−３８６５；Ｒｕｂｓａｍ、（１９９８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．５８、ｐｐ．３８７３−３８８２）。細胞ＴＫの高特異性のため、Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒは正常の真核性細胞内で活性化せず、起こりえる有害結果に対する不感受性の原因となる。ＨＳＶ−ＴＫでトランスフェクトされたヒトＥＳ細胞の分離された系統全てがＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒの投与に反応して末期的に停止した（図６ａ）。トランスフェクとされたクローンは、３桁（２×１０−８Ｍ−１×１０−５Ｍ）以上に変化するＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ濃度において滅亡し、対照ヒトＥＳ細胞は未分化のままだった（図６ｂ）。中間濃度、２×１０−６ＭのＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒで実験を続けたら、全てのＨＳＶ−ＴＫ＋細胞が滅亡した。選択の９日後に培地からこの濃度のＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒを除去しても、細胞は生育せず、ドラッグの効果は終了した（図６ｃ）。
【００６８】
Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒに対するＨＳＶ−ＴＫ＋細胞の感受性：ヒトＥＳ細胞の移植は培養の時とは違う状態を示す。始め、時間経過につれて分化し、処理に影響されない細胞によって囲まれる。更に、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてもしＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｏｒによる処理が始められたら、ヒトＥＳ細胞は、ネオマイシンの正の選択圧から自由になってプラスミドを保持し、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子をなくした細胞の為、強力な負の選択圧を受けるであろう。これらの問題は、提案された治療に対して抵抗性を引き起こすかもしれない。ＨＳＶ−ＴＫ＋細胞を選択的に除去できるか否かを実験する為、緑色螢光性蛋白質（ＧＦＰ＋）を発現している細胞と共にこれらの細胞を生育し、Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒで処理した。螢光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）を使用した培養の解析により、ＨＳＶ−ＴＫ＋細胞のみを有する培養の場合と同じ時間及び量でのＨＳＶ−ＴＫ＋細胞の選択死滅が明らかになった（図7）。クローンを免疫不全マウスに注入した後に形成された分化奇形腫細胞を抜き取ることにより、分化効果を解析した。８週間は選択を行わず、培養で生育した細胞は以前に使用した同じ濃度でＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒに対する感受性を保持していた。その後に奇形腫をマウスから除去した（図８ａ）。この解析で、ネオマイシン選択で継続的に生育されない胎児細胞が、ＨＳＶ−ＴＫ発現を保持する事も確認した。更に、我々は、Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ感受性の逆突然変異率を観察し、注射に続いて現れる薬剤抵抗性細胞の可能数を推測した。細胞を、正の選択薬剤ネオマイシンなしで２代の継代に生育し、Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｏｒの存在下に再プレートし、更に１０日間生育した。その後に抵抗性コロニーを数えた。逆突然変異は１０−６−１０−７間の周期で記録された。
【００６９】
変異コロニーの正常核型と分化可能性の保持：我々の目的は、遺伝的に変異したクローンが正常の増殖特性を保持する事を確かめることだった。トランスフェクトされたクローンの細胞遺伝的解析では正常の核型を示した（図９ａ）。更に、細胞は簡単に集合体になり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて正常とみられる胚様体（ＥＢｓ）（Ｉｔｓｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ、２０００）を形成し、ｉｎ  ｖｉｖｏでは奇形腫を形成する。ＥＢｓと奇形腫細胞からのｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析は、内胚葉組織特異的マーカー：α−フェトプロテイン（原内胚葉）アルブミン（肝臓）及びアミラーゼ（膵臓）、中胚葉マーカー：βグロビン（血）、ｃ−アクチン（心筋）及びエノラーゼ（筋肉）、及び外胚葉マーカー：ケラチン１（皮膚）、ＧＦＡＰ−グリア繊維性酸性蛋白質（Ｇｌｉａ）及び神経フィラメント（成熟神経細胞）の発現で解かるように、全３つの胚葉からの細胞やいろいろな細胞型に分化の可能性があることを示した（図９ｂ）。
【００７０】
例６  移植された細胞内の免疫寛容
我々は、胚性幹細胞とそれらの分化後代における主要な組織適合性合成物の遺伝子を標的とした。これは、ベータ２ミクログロブリンやＨＬＡ−１やＨＬＡ−１１やＩＮＦレセプターのノックアウト又は抑制（アンチセンス又は優性負性過剰発現又はリポザイム）によって達成される。哺乳類細胞からの所望遺伝子を導入、除去、変異させる周知の方法を、例１−５で叙述されたトランスフェクション方法と組み合わせて適用することが出来る。遺伝子ノックアウトを引き起こす方法とベクターは、ＵＳ特許６，０７４，８５３、５，９９８，１４４、５，９４８，６５３、５，９４５，３３９、５，９２５，５４４、５，８６９，７１８、５，８３０，６９８、５，７８０，２９６、５，６１４，３９６、５，６１２，２０５、５，４６８，６２９、５、０９３、２５７を含めた多数の特許の主題であり、それらの特許すべて全体的にここの中で参照されている。
【００７１】
ヒト胚性幹細胞のトランスフェクション
ヒトＥＳ細胞をプレートする
↓２４時間
培地変更
↓２４−４８時間
ＤＮＡ＋ＥｘＧｅｎ５００を加える
↓
遠心分離
↓０．５時間
よく洗浄し、培地を加える
↓２４時間
新たな選択可能なフィーダーに移す
↓２４−４８時間
選択薬剤を加える
↓２４時間
培地変更
↓２週間
クローンを採取
【図面の簡単な説明】
【００７２】
本発明の実施例の上述の特徴は、以下の詳細な叙述、図面を参照する事で容易に理解できる。
【図１】ＤＮＡをヒト胚性幹細胞に導入する様々な方法の効果を示す。スケールバーは１００μｍである。挿入：ハウスキーピング遺伝子Ｅ１Ｆ（伸長因子１）プロモーターの制御下で、ＥＧＦＰで一過性的にトランスフェクトされたヒトＥＳ細胞。緑色螢光ＥＳ細胞は異種ＤＮＡを組み込む。
【図２】ヒト胚性幹細胞のトランスフェクションを示す。（ａ）一過性トランスフェクション（ｂ）安定トランスフェクション
【図３】ヒト胚性幹細胞の電気穿孔法を示す。
【図４】多能性ヒト胚性幹細胞を発見して分離する方法として、未分化細胞のトランスフェクトされたマーカーの発現を示す。（ａ）マウスＲｅｘ１最小プロモーター配列に融合したＥＧＦＰで、安定トランスフェクトされたヒトＥＳ細胞。トランスフェクトされたＥＳ細胞とそれらの分化細胞派生物、つまり、単純胚様体（ｓＥＢ）と成熟胚様体（ｍａＥＢｓ）を示す。左と真中の列はそれぞれ明るい領域と暗い領域の写真である。右の列は２つの写真を重ねたものである。因みに、未分化細胞は螢光性である。螢光ＥＳコロニーは、分化された無螢光細胞に囲まれている。単純ＥＢは、周囲でなく真中の原内胚葉細胞内のみにおいて識別される。成熟ＥＢｓは一般的に螢光性ではなく、非常に特異的な部分のみが螢光性である（おそらく、残余螢光細胞）。スケールバーは１００μである。（ｂ）マウスＰＧＫプロモーターでドライブされる、構造的に発現されたＥＧＦＰ構成での、ヒトＥＳ細胞の安定トランスフェクション。トランスフェクトされたＥＳ細胞（ＥＳ）とそれらの分化細胞派生物、つまり、単純胚様体（ｓＥＢ）、成熟胚様体（ｍＥＢ）、分離された胚様体から得た分化している胚細胞（ＤＥ）の、暗い領域の写真を明るい領域の写真の上に重ねた写真である。因みに、ＧＦＰは、単純および成熟Ｅｂｓ（ｓＥＢの外層内の細胞を含め）の全細胞同様、増殖しているＥＳコロニーにおける分化及び未分化の全細胞によって発現されている。ここで、原内胚葉の分化は、マウスＥＢで起こっている。スケールバーは１００μｍである。
【図５Ａ】緑色螢光放射強度に応じてＲｅｘ１−ＥＧＦＰ構成でトランスフェクトされたヒトＥＳ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。ＭＥＦ（フィーダーレイヤー）と（フィーダー細胞の存在下で成長した）未分化ヒトＥＳの細胞サンプルが対照として使用された。その後、未分化ヒトＥＳ細胞、トランスフェクトされたヒトＥＳ細胞及びそれらの分化細胞培養派生物（未補足のゼラチンコートのプレートにおける成長で得られた）の間で螢光強度を比較した。（Ａ−１）ＭＥＦ、（Ａ−２）未分化ＥＳ細胞とＭＥＦ、（Ａ−３）未分化でトランスフェクトされたＥＳ細胞とＭＥＦ、（Ａ−４）ゼラチン上で部分的に分化され、トランスフェクトされたＥＳ細胞。
【図５Ｂ】ＦＡＣＳによって実行される、ＧＦＰを発現している３つの細胞系の細胞選別を示す。トリプシン消化に続き、細胞サンプル（各クローンに３−４回の実験）で細胞生存度（８４％）を算出し、緑色螢光放射強度に応じて選別した。集められた細胞サンプル（２５，０００−５０，０００）で、細胞生存度（８６％）を再度算出し、ＭＥＦｎｅｏ+培養皿上に再プレートした（各皿に２，５００−８，０００個の細胞）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの成長に続き、細胞培養皿を観察し、増殖しているヒトＥＳ細胞の合計数を記録した（２０％±４％［ｎ＝１１］。
【図５Ｃ】ＦＡＣＳによる細胞選別後４日目に増殖しているヒトＥＳコロニーとみなされる螢光の写真（上図は明るい領域、下図は暗い領域）である。
【図６】単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を発現しているヒトＥＳ細胞に対するＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒの効果を示す。（Ａ）プロドラッグＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（Ｇａｎｃ）の存在に対する感受性を示すＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現しているヒトＥＳ細胞クローン。（Ｂ）Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ治療に対するＨＳＶ−ＴＫ+クローンの用量反応。対照としての６つのクローン（ＴＫ+）とヒトＥＳ細胞を様々な濃度のＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ中で成長させた。グラフは標準偏差を表す。（Ｃ）時間経過における、ＨＳＶ−ＴＫ+細胞に対するＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒの効果。６つのＨＳＶ−ＴＫ+クローンと対照ヒトＥＳ細胞を２×１０−６ＭのＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒで９日間処理した。実験は４回繰り返して行われた。９日後、Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒを培地から取り除き、細胞を更に１０日間生育した。グラフは標準偏差を表す。
【図７】ＨＳＶ−ＴＫ+細胞の選択的除去を示す。（Ａ）細胞を発現しているＧＦＰ（ＧＦＰ+）とＨＳＶ−ＴＫ+（ＴＫ+）細胞の混合培養の解析。Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒでの処理に続き、ＨＳＶ−ＴＫ+細胞の選択的除去がＧＦＰ発現のＦＡＣＳ解析によって示される。
【図８】Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒに対する奇形腫の感受性を示す。（Ａ）プロドラッグＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（Ｇａｎｃ．）の存在に対して反応した分化ＨＳＶ−ＴＫ+奇形腫細胞（Ｂ）時間経過におけるＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒに対する分化ＨＳＶ−ＴＫ+奇形腫細胞。８日間は２×１０−６ＭのＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒに反応した分化ＨＳＶ−ＴＫ+奇形腫細胞であり、８日後にＧａｎｃｉｃｌｏｖｉｒを培地から取り除き、細胞を更に８日間成長させた。グラフは標準偏差を表す。
【図９】ｈｓＴＫ+細胞系による正常核型と分化可能性を示す。（Ａ）Ｇ−バンディングを使用したＨＳＶ−ＴＫ+の核型。全ての細胞系は正常のＸＸ染色体を持つ。（Ｂ）ヒトＥＳ細胞、ｈｓＴＫ+胚様体（ＥＢ）、奇形腫（Ｔｅｒ）細胞上の３つの胚葉からの分化マーカーのＲＴ−ＰＣＲ解析。使用したマーカーは、α−フェトプロテイン（αＦＰ）、アルブミン、アミラーゼ、β−グロビン、心臓アクチン（ｃＡｃｔｉｎ）、エノラーゼ、ケラチン、グリア繊維性酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）、および神経フィラメントＨ鎖（ＮＦ−Ｈ）である。ｃＤＮＡの存在に対する対照として、ハウスキーピング遺伝子、β−アクチンとグリセルアルデヒド−３−リン酸ヒドロゲナーゼを使用した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004520046.tif 000059
【国際調査報告】
2004520046.tif 000060
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