(57)【要約】バイオマーカーの質量分析を用いて、微生物の可溶化液から、多くの種にわたるこれらの構造的類似性に基づいて単離される未知の微生物を速やかに同定するための方法に関する。さらに、このバイオマーカー、特にHsp60に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の少なくとも２つの属における大多数の種から導かれるバイオマーカーの種の相同体が実質的に構造的に類似であり、前記構造的類似性によって前記バイオマーカーを微生物の異なる種から単離することが可能になり、及び、前記属における微生物の各種から導かれる各バイオマーカーが独自の分子量を有することを特徴とするバイオマーカー。
【請求項２】
タンパク質であり、前記構造的類似性がアミノ酸配列の実質的な類似性からなることを特徴とする、請求項１に記載のバイオマーカー。
【請求項３】
前記微生物がバクテリアである、請求項１又は２に記載のバイオマーカー。
【請求項４】
少なくとも３つの種の相同体が、免疫親和性クロマトグラフィーによる単離を可能にする少なくとも１つの共通のエピトープを共有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオマーカー。
【請求項５】
ヒートショックタンパク質である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオマーカー。
【請求項６】
Hsp60である、請求項６に記載のバイオマーカー。
【請求項７】
アデニレートキナーゼである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオマーカー。
【請求項８】
ａ．微生物の少なくとも２つの属における大多数の種から導かれるバイオマーカーの種の相同体が実質的に構造的に類似であり、前記構造的類似性によって前記バイオマーカーを微生物の異なる種から単離することが可能になり、及び前記属における微生物の各種から導かれる各バイオマーカーが独自の分子量を有することを特徴とする、バイオマーカーを同定する工程；
ｂ．前記バイオマーカーを構造的に類似している領域に向けた親和性クロマトグラフィーによって単離する工程；
ｃ．前記バイオマーカーの質量を質量分析によって測定する工程、及び；
ｄ．得られた分子量データの組み合わせをデータベースを参照して分析し、それによって存在する微生物の種を推論する工程、
を含む、微生物の同定方法。
【請求項９】
前記バイオマーカーが細胞可溶化液から単離される、請求項８に記載の微生物の同定方法。
【請求項１０】
前記バイオマーカーが免疫親和性クロマトグラフィーを用いて単離される、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
固定化された抗体が、種々の微生物の種から導かれるマーカー分子に存在する交差反応性エピトープに特異的に結合する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
分子量を質量分析によって決定する前に、単離されたバイオマーカーを定義されたフラグメントに切断する追加の工程によって特徴づけられる、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記バイオマーカーの前記切断が、酵素的消化によって達成される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
バイオマーカー又はそのフラグメントの分子量の測定が、イオントラップ質量分析による、請求項１〜１３に記載の方法。
【請求項１５】
ａ．１以上の毒を親和性クロマトグラフィーによって単離する工程；
ｂ．前記毒の分子量を質量分析によって測定する工程；及び
ｃ．得られた分子量データの組み合わせを、データベースを参照して分析し、それによって存在する毒の正体を推論する工程、
を含む、高分子の毒を同定する方法。
【請求項１６】
ａ．前記バイオマーカー又は毒を単離する手段を含み；
ｂ．前記バイオマーカー又は毒の分子量を決定できる質量分析器を含むユニット；
ｃ．得られたデータと既知の分子量のデータベースをマッチングして、検出された微生物又は毒の正体を推論できるデータ処理デバイス、
を含む、請求項１〜１５に記載の方法の自動操作のための装置。
【請求項１７】
さらに、前記バイオマーカーの切断を可能にする一つ又は固定化されたタンパク質分解酵素を含有するユニットを含む、請求項１１に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（本発明の分野）
本発明は、微生物、例えば、バクテリアの速やかな同定に関する。
【０００２】
（背景）
潜在的に病原性の生物、例えばバクテリア及びウイルスを速やかに同定することができることが望ましい多くの状況が存在する。最新の研究室方法は、典型的に、生物を培養すること及び免疫診断テストを使用すること、又は、組織学的な検体の調製及び特定化した染色及び／又は免疫組織化学的な技術の使用を含む。このような技術は、よくても、数時間、生物の培養が要求されるときは数日を要する。ＤＮＡベースの同定、例えばＰＣＲは、よりセンシティブであるが、やはり数時間を要し、その上多量の研究室設備及び専門知識を要する。
特定のポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を用いた特定の微生物の同定は、標準のプラクティスである。免疫組織化学は、組織に存在する生物を同定することができ、及び、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)のような技術は、病原体、又はそこから導かれる抗原を体液中において検出するために使用される。しかしながら、他の診断の基準によって示唆される特定の病原体の存在を確認するためだけに使用されない限り(通常の状況)、これら診断技術は、異なる特定の抗体のバッテリーの使用を要し、及び多数の潜在的ターゲットからの特定の病原体の同定に適していない。更に、細胞の成分の免疫親和的精製は当該技術においてよく知られているが、通常、同定目的に有用な技術ではない。これは、通常、関係する生物の知識が要求されるからである。
【０００３】
交差反応性血清を微生物の同定に使用することは、以前にレポートされている(Bonenberger et al, 2001)。この場合、マイコバクテリウム  ボビス(Mycobacterium bovis)のBCG株に対して産生されたポリクローナル抗血清は、組織診検体中の広範な種類の微生物を染色するために使用される。この技術は、特定の個々の生物の同定はできないが、一般にある範囲のバクテリア、真菌及び原生生物の病原体を染色した。
質量分析(MS)は、最近、生物学的用途にますます使用されてきた。新しい開発によって、大きな生物分子が分析できるようになった(Bakhtier and Tse, 2000に概説されている)。特に、マトリックス支援脱離イオン化(MALDI)及びエレクトロスプレーMSとその比較的穏やかなイオン化方法は、タンパク質の用途に特によく適合する(Rowley et al, 2000に概説されている)。より最近、イオントラップMSの導入によって、生物分子の混合物を分析するのに要求される時間が、特に、少量で利用される場合に減少する(Henderson et al, 1999)。
WO 00/29987(Demirev / University of Maryland)は、微生物の種々の成分の分子量を測定する方法、及び、これらを同定しようと試みるために検索するデータベースを使用する方法を開示する。しかしながら、このようなアプローチは、大量の情報を処理しなければならず、類似の分子量の多くの成分を区別しなければならない不利益がある。有益なバイオマーカーの予備選択によって質量分析器を単純化する試みはない。
【０００４】
WO 96/37777(Nelson et al)は、質量分析器を使用した抗体／抗原分析物の分析方法を開示する。しかしながら、この出願の目的は、特定の抗体及び／又は抗原の存在又は不存在を決定することにあり、及び、もしあれば、存在する量を測定することにある。不知の生物を一義的に同定するために使用され得る方法の示唆はない。
特定のモノクローナル抗体の使用及び免疫親和的精製の組み合わせにより、MSは、多くの分子の詳細な構造マッピングを可能にする(Downard, 2000に概説されている)。特に、免疫親和性クロマトグラフィーによる興味の分子の分析、その後の単離された分子のMS分析は、多くのタンパク質、例えばカルネキシンで行われてきた(Yamashita et al, 1999)。場合によっては、免疫親和性によって精製されたタンパク質は、その後酵素的消化にかけられて定義されたペプチドのセットであってその後MSによって分析されるもの、例えば、サッカロマイセス  セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae)のTy1 Gagタンパク質(Yu et al, 1998)を産生する。Lacey et al(2001)は、トランスフェリンの異種性に応答性の糖質変種の構造を確立するための、免疫親和的精製とその後のMS分析を用いたトランスフェリンのイソ型の分析をレポートする。しかしながら、これは、同じアミノ酸配列の分子に結合する特定の抗トランスフェリンポリクローナル抗体の使用を含む。分子の違いは、糖タンパク質の糖質の部分内にあり、抗体は、交差反応性ではない。
【０００５】
共通の構造的特徴を有する分子の親和的精製は、固定化された抗体よりも他のリガンドと共に行われてもよく、当該技術において非常によく知られた技術である。BundyとFenselau(2001)は、レクチンを種々の複合糖質を種々の微生物から獲得するため、及び、定義された糖質をバクテリア発現性レクチン分子を捕獲するための双方に使用することをレポートする。獲得された分子、又はそこから酸加水分解によって導かれるペプチドは、その後、MSで分析される。これらは、続くMS分析のための種々の分子を獲得するために使用される一般的なリガンドとして記載され得るが、その方法は、不知の生物の同定には使用されていない。そのような用途に好適なバイオマーカーの選択はない。どのようにしてそのようなバイオマーカーを同定し得るのかについての教示はない。示唆されたリガンドが、要求される特定のバイオマーカーを精製できる十分な特異性を有し、又は、使用されるバイオマーカーが、本発明で要求される必要な種々の生物に沿って一貫して存在することの示唆はない。バイオマーカーの一つ又は小さなセットが広範な微生物の速やかな同定を可能にすることの示唆はない。
【０００６】
研究室設定における病原体のより速やかな同定は、それ自体有利であるが、ヒト又は動物の病気の平時の伝染病、及び生物兵器対策の一部としての軍事的状況の双方において使用され得るポータブルなフィールドベースシステムがさらに必要である。この点において、疫病又は炭疽バクテリアのような病原体は、侵略者によって使用され、典型的にエアロゾルとして送達されるかもしれない。レーザー測定を使用してエアロゾルの存在を検出してもよいが、これは、単に、ダミー兵器として送達される、いわば水のミストであるかもしれない(Willeke and Baron, 1993)。送達されるが、生物兵器と疑われる物質のフィールドにおける正確な同定を速やかに行うことができる必要がある。バクテリアの同定に対するイオントラップMSベースアプローチが以前レポートされている(Krishnamurthy et al, 1999)。この場合、逆相マイクロキャピラリークロマトグラフィーによる分離に続き、バクテリア全体が直接分析され、産生されたスペクトルに基づいて純粋に同定された。筆者は、フィールドユースのための設備の小型化の可能性についてコメントしているが、免疫親和性選択の全ての形態の使用して、要求されるMS分析を単純化し、及びそのような分析を広範な生物の速やかな同定に役立てることを示唆していない。加えて、バイオマーカーとして使用される特定のタンパク質の同定に関する参考文献はなく、及び、異なる周囲条件で得られたMSスペクトルの再現性の考えはない。使用したバイオマーカーの特徴づけがなければ、この技術は、例えばイオン化の特徴における、バイオマーカーのふるまいにおける不一致にも弱く、これは、その信頼性を更に低下する。
【０００７】
ウイルス性タンパク質の直接MS分析は、レポートされているが(WO 99/58727)、やはり、親和的精製又は共通のバイオマーカーは示唆されていない。バクテリア細胞可溶化液のMS分析は、更にレポートされている(Chong et al, 1997)。バクテリアサンプルは、MALDI-TOF MSによる分析の前に、グアニジニウムハイドロクロライド及びトリトンX-100(Triton X-100)で可溶化される。親和的精製の形態の使用は一切なく、及び目的は、大腸菌中のタンパク質合成の誘導及び抑止を描くことであって不知の生物を同定することではない。
【０００８】
(発明の記載)
本発明は、微生物を構成する複数のタンパク質から抽出された少なくとも１つのタンパク質の分子量を決定することを含む微生物の同定方法を提供する。
本発明は、典型的に微生物を構成する何千ものタンパク質の全てにおいて、同定はタンパク質の比較的非常に小さな選択を、たとえわずか一つでも評価することによってなされ得るとの発見に基づく。多くのタンパク質は、しばしばいくらかのユビキタスで重要な代謝機能を細胞内で行うが、広範な種にわたって高度に構造的に保存されることが当業者によく知られている。これらが、共通の代謝経路を共有する異なる種で非常に類似した機能を行う事実により、機能的特徴が依存する構造的特徴を保存するための進化の圧力となる。このような高度に保存されたタンパク質は、基本的な細胞プロセス様解糖(例えば、トリオースホスフェートイソメラーゼ)及びヌクレオチド代謝(例えば、アデニレートキナーゼ)に関連する酵素、ＤＮＡポリメラーゼ及びヒートショックタンパク質を含む。
【０００９】
保存されるこのようなタンパク質の領域は、アミノ酸配列において高度の相同性を示す。その結果、これらは、共通の免疫学的エピトープを持ち、交差反応性抗体はこれに結合してもよく、単一のモノクローナル抗体を使用して、そのような保存されたタンパク質のファミリーの全てを種々の種から同定し、又は単離ししてもよい。場合により、単一の抗体は、そのように非常に広範に保存されたエピトープに結合してもよいので、タンパク質を多くの種から単離するのに有用である。しかしながら多くの場合、多数のそのような抗体は、同一又は他のタンパク質における異なるエピトープに結合するが、組み合わせで使用されて同一視できる種の数を最大化し、及び、検出されずに残存する微生物の可能性を最小化するかもしれない。驚くべきことに、その高度に保存された構造にもかかわらず、本発明は、そのようなタンパク質の小さな違いによって、そのタンパク質が導かれる種の速やかで一貫した同定が、その質量の正確な決定によって可能となる。質量分析から得られる解像度は、タンパク質又はそこから導かれるペプチドの間における、単一のアミノ酸の相違を容易に同定することができる。従って、共通のエピトープを持つ高度に保存されたタンパク質の親和的精製と、後のそのようなタンパク質又はそこから導かれるペプチドの質量分析的分析との組み合わせは、これらが得られる微生物を同定するための速やかかつ信頼のおける方法の基礎を形成し得る。このようにして使用されるタンパク質、又は他の生物分子は、バイオマーカーとして知られている。
【００１０】
この方法は、既知のバイオマーカーであってこれが導かれる種に対するものの正確な分子量に関する、バイオマーカーのデータベースの有効性に依存する。場合により、１を超えるバイオマーカーを種、亜種又は株の明白な同定のために使用する必要があるかもしれない。そのようなデータベースは、関連する微生物を条件の範囲下で育て、プロテオーム(proteomes)を2D-ゲル電気泳導法によってマッピングし、及び、微生物細胞可溶化液全体に対して産生される抗体を使用するウエスタンブロッドを用いて生み出される。以下の基準に従って選択された興味のマーカーは、速やかに同定され得、その質量は、質量分析及びデータベースに入れられた質量によって正確に決定される。
バイオマーカーの選択における重要なファクターは、これらの質量が、細胞サイクルのような可変性のファクター、若しくは、温度又は栄養の利用可能性のような成長条件とは無関係に一定であることである。これは、生物兵器のような環境における微生物の同定に特に関連し、この条件では、関連する生物に対する最適化どころではなく、このストレスに対して、遺伝子発現又は後翻訳修正のそのパターンを変化させる。従って、これらはリン酸化、脂質化(lipidation)、又はリボシル化によって過渡的に修正されず、もしそのような修正が既知かつ一貫しているとしても、これは同定のためのそのような分子の使用を除外しないだろう。バイオマーカーは、全ての条件で、実際的な同定を行うのに十分多い量で抽出及び単離するのに十分高いレベルで、一貫して発現される。
【００１１】
そのような考慮の点から見て、分子のヒートショックタンパク質（Hsp）ファミリーは、特に好適なバイオマーカーである。Hsp60のような分子は、種にわたって高度に保存され、後翻訳的に修正されず、一貫してかつユビキタスに発現される。実際、これらの発現は、細胞ストレスに関連するので、生物が最適状態に及ばない(sub-optimal)周囲の条件にある場合に増加する。Hsp60(GroEL，シャペロニン)は、そのコシャペロニン(co-chaperonin) Hsp10(GroES)と共に、発生期ポリペプチドの、ATP依存性で後翻訳の折りたたみ中に含まれて正確な三次構造になり、並びに、非天然のタンパク質の再折りたたみ中に含まれてそれらの正確な天然の高次構造中に戻る(Sigler et al, 1998)。
【００１２】
好適なバイオマーカーを微生物の範囲から単離するための交差反応性抗体の使用に加え、他のリガンドをそのようなバイオマーカーの親和性獲得のために使用してもよい。レクチンを、特定の構造的特徴をその糖質変種に有する糖脂質の糖タンパク質を獲得するために使用してもよい。固定化された核酸を、DNA結合タンパク質を獲得するために使用してもよい。これらは、一般的なDNA結合タンパク質(例えば、ポリメラーゼ)であってもよく、又は、配列特異性結合タンパク質(例えば、転写因子又は制限エンドヌクレアーゼ)であってもく、これは使用されるリガンドに依存する。さらに、固定化RNAアプタマー及びリボザイムを使用して、特定のターゲット構造を結合してもよい(Hoffman et al, 2001によって概説される)。人工的な色素リガンドは、共通の構造的特徴、例えば、補助因子結合ポケットを共有する結合性で多様な分子を可能にする(Affinity Chromatography: principles and methods, Pharmacia LKB Biotechnology, 1988を参照)。例として、チバクロンブルー(Cibacron Blue) F3G-Aは、種々のNAD又はNADP要求性酵素、及びアデニリル基質、例えば、アデニレートキナーゼに対する特異性を有する酵素を結合し、これは、本発明の有用な保存されたバイオマーカーである。
【００１３】
交差反応性抗体又はいくつかの他の一般的な結合性リガンドを使用する一つ以上の高度に保存されたバイオマーカーの細胞可溶化液からの免疫親和的精製と、その後のデータベースを参照した、使用される一つ以上のバイオマーカーの質量分析的分析、好ましくは、イオントラップ質量分析との組み合わせにより、速やかで信頼性があり、及び再現性のある種々の用途のための微生物同定方法を提供する。
これとは別の態様において、獲得されたバイオマーカーは、酵素的に消化されて使用される酵素と、記録された種の範囲からの候補分子の既知のアミノ酸配列との一貫したペプチドの予測可能なセットを産生する。産生された質量のスペクトルは、由来するバイオマーカーのフィンガープリント特性であり、及び含まれる生物の同定のためのデータベースにクロスリファレンスされ得る。免疫酵素の使用は、方法を単純化して自動化するのに便利な方法であり、分析されるペプチド混合物中に存在する酵素分子の複雑さを減少する。
【００１４】
生物学的戦闘現場(field biological warfare)のカウンター測定(counter-measure)の用途のため、全体の方法は、環境をサンプリングし、細胞を濃縮し溶解しながら、興味のバイオマーカーを親和的精製し、このバイオマーカーを溶出し、これを質量分析器に送達し、得られた質量スペクトルを記録し、スペクトルをデータベースのベストフィットにマッチングし、及び最後にこの情報をクロスリファレンスして検出された生物の同定を得るものであり、ポータブルユニットにおいて自動化されることを考えている。特別な工程、例えば、獲得したバイオマーカーの酵素的切断は、最終的な同定が最初の分析から生まれなかった場合に自動的に求められる。親和的精製工程からの最初の溶出液の割合は、この目的で保持されるだろう。正確な用途に依存して、最終的な出力は、生物又はその株の正確な同定であり得る。戦場の用途のため、単に「安全」又は「非安全」の出力が適当である。
さらに自動化ユニットは、他の用途のためにデザインされてもよい。例えば、血液の分液のためのベンチトップユニット、又は病院用及び研究室用の組織サンプルがある。
【００１５】
従って、本発明は、微生物の少なくとも２つの属における大多数の種から導かれるバイオマーカーの種の相同体が、実質的に構造的に類似し、その結果、前記構造的類似性によって前記バイオマーカーを微生物の異なる種から単離することが可能になり、及び、前記属における微生物の各種から導かれる各バイオマーカーが独自の分子量を有することを特徴とするバイオマーカーを提供する。
好ましくは、前記バイオマーカーは、タンパク質であり、及び前記構造的類似性がアミノ酸配列の実質的な類似性からなることを特徴とする。更に好ましくは、前記微生物はバクテリアである。
【００１６】
好ましくは、前記バイオマーカーは、少なくとも３つの種の相同体が、免疫親和性クロマトグラフィーによる単離を可能にする少なくとも１つの共通のエピトープを共有することを特徴とする。より好ましくは、少なくとも１つの共通のエピトープは、少なくとも５つの種によって共有される。更に好ましくは、ヒートショックプロテインであり、最も好ましくは、Hsp60である。
これとは別に、前記バイオマーカーは、アデニレートキナーゼであってもよい。
さらに、下記工程を含む微生物の同定方法を提供する。
ａ．微生物の少なくとも２つの属における大多数の種から導かれるバイオマーカーの種の相同体が実質的に構造的に類似であり、その結果、前記構造的類似性によって前記バイオマーカーを微生物の異なる種から単離することが可能になり、及び前記属における微生物の各種から導かれる各バイオマーカーが独自の分子量を有することを特徴とする、バイオマーカーを同定する工程；
ｂ．前記バイオマーカーを構造的に類似している領域に向けた親和性クロマトグラフィークロマトグラフィーによって単離する工程；
ｃ．前記バイオマーカーの質量を質量分析によって測定する工程、及び；
ｄ．得られた分子量データの組み合わせをデータベースを参照して分析し、それによって存在する微生物の種を推論する工程。
【００１７】
好ましくは、前記バイオマーカーは、細胞可溶化液から単離される。
より好ましくは、前記バイオマーカーは、免疫親和性クロマトグラフィーを用いて単離され、及び最も好ましくは、種々の微生物の種から導かれるマーカー分子に存在する交差反応性エピトープに特異的に結合する固定化された抗体によって単離される。
これとは別に、この方法は、分子量を質量分析によって決定する前に、単離されたバイオマーカーを定義されたフラグメントに切断する追加の工程を含めてもよい。好ましくは、バイオマーカーの前記切断は、酵素的消化によって達成される。
好ましくは、バイオマーカー又はそのフラグメントの分子量の測定は、イオントラップ質量分析による。
さらに、以下の工程を含む高分子の毒を同定する方法が提供される。
ａ．１以上の毒を親和性クロマトグラフィーによって単離する工程；
ｂ．前記毒の分子量を質量分析によって測定する工程；及び
ｃ．得られた分子量データの組み合わせを、データベースを参照して分析し、それによって存在する毒の正体を推論する工程。
【００１８】
本発明の他の態様は、以下を含む、上記すべての自動動作のための装置を含む。
ａ．前記バイオマーカー又は毒を単離する手段；
ｂ．前記バイオマーカー又は毒の分子量を決定できる質量分析器を含むユニット；
ｃ．得られたデータと既知の分子量のデータベースをマッチングして、検出された微生物又は毒の正体を推論できるデータ処理デバイス。
これとは別に、前記装置は、さらに、前記バイオマーカーの切断を可能にする一つ又は固定化されたタンパク質分解酵素を含有するユニットを含む。
【００１９】
(定義)
ここで使用する「バイオマーカー」は、環境の生物化学的パラメーターを意味し、この検出又は定量化は、潜在的な生物学的危険を同定する手段として使用される。この場合、具体的には、タンパク質を含む構造的に保存された生物学的高分子を言い、広範な微生物から単離され、及び前記微生物の同定に使用されてもよい。
ここで使用する「親和性クロマトグラフィー」は、「吸収クロマトグラフィーのタイプであって、精製される分子が、不溶性担体(マトリックス)に固定化された相補的な結合物質(リガンド)によって特異的かつ可逆的に吸収されるもの」を意味する(Affinity Chromatography: principles and methods, Pharmacia LKB Biotechnology, 1988)。
ここで使用する「免疫親和性クロマトグラフィー」は、固定化されたリガンドが抗体又はそのエピトープ結合性誘導体である、親和性クロマトグラフィーの形態を意味する。
ここで使用する「種の相同体」は、他の種からの同等の遺伝子又は遺伝子産物を意味する。このような相同体は、同等の機能を果たし、アミノ酸レベルでの配列類似性の程度を共有する。ここで、含まれる生物の間の進化の関係に関してはいかなる仮定もしていない。
【００２０】
（本発明の詳細な説明）
本発明は、ここで、例示目的として、図面を参照して記載される。
実施例１  自動サンプリング及び同定システム
図１を参照し、真空デバイス(図示せず)を使用して病原性バクテリアを含むと疑われるエアロゾルのサンプルを獲得する。エアロゾルは担体液体と混合し、懸濁液は、システム(１)にサンプラー(２)を介して供給される。そこから、懸濁液を超音波処理器(４)に送り、その中で超音波を使用して懸濁液に含まれるすべてのバクテリアの細胞壁を破壊し、その後、バクテリアの成分のタンパク質を可溶化液に放出する。不可避的に、この可溶化液は、壊死組織片(debris)をさらに含むので、超音波処理器(４)からの下流はフィルター(５)であり、これは、不要物質の通過を防止している。多くの場合、溶解は、界面活性剤の使用により改善され得るが、これは、下流の免疫親和性工程を妨害するべきではない。好適な中間の非イオン性界面活性剤は、当業界でよく知られており、ポリオキシエチレンベースの界面活性剤(例えば、Triton X-100及びX-114, Nonidet P40, 及びBrijシリーズ)及びｎ−オクチル α−Ｄ−グルコピラノシドを含む。
次に免疫親和性モジュール(６)に進み、ここで、もし懸濁液中に存在すれば、一以上のバクテリアバイオマーカーが単離される。このモジュール(６)内には、一以上の固定化された、このバイオマーカーに特異的な抗体がある。これにより、通過する可溶化液中のバイオマーカーは、結合され、一方で残りの流体は通過し、破棄される。この工程は、関連するバイオマーカーを単離するだけでなく、これらバイオマーカーを非常に希薄な可溶化液であったものから効果的に濃縮する。可溶化液を通して洗浄した後、わずかな容積の溶出緩衝液をユニットに入れ、結合したバイオマーカーを除去する。
【００２１】
放出されたバイオマーカーは、脱塩(８)に送られ、ここで、個々の分子量が決定されるイオントラップ質量分析器(１０)に通す前に脱塩される。得られた分子量の組み合わせは、その後、バクテリアの範囲の関連するバイオマーカーの分子量のデータベースとクロスリファレンスされ、すべてのマッチングを同定する。出力は特定の同定であってもよく、又はオペレーターに、その領域が「安全」か「非安全」か、及び好適な保護対策が要求されることを単に知らせればよい。
バイオマーカータンパク質タンパク質が個々の分析には大きすぎる場合には、溶出されたタンパク質を脱塩(８)に酵素的消化器(１２)を通して送り、タンパク質をアミノ酸配列中の予想可能な点で切断し、得られたペプチドを分析してもよい。産生されたペプチド分子量のパターンは、このような予測されたペプチドのデータベースと比較した場合に診断される(実施例３を参照)。
【００２２】
実施例２  潜在的に病原性のバクテリアを同定するためのバイオマーカーとしてのHsp60の使用
広範な種類の生物からのHsp60の平均分子量は、既知のアミノ酸配列から高度の正確さが予想され(存在するイソトープの混合物によって訂正される)及び適当な精製した組換えタンパク質を使用して直接測定されてもよい。Hsp60は、バクテリアに限らず多くの種にわたって保存され、質量分析によって質量の高度に正確な決定をすることができ、及びタンパク質分子を区別される３のような小さい質量単位で差を付けることができる。そのように測定された値を既知の値のデータベースと比較すると、含まれる種の同定をすることができ、これは表１に示す。
【表１】
2004536295.tif 000003
【００２３】
図２は、広範囲の生物のHsp60質量を図式的な比較を示し、多くの種がそのHsp60質量に基づき、質量分析によって測定して、純粋に同定され得ることを示す。
しかしながら、いくつかが混乱させる類似の質量を有する他のタンパク質のバックグラウンドを減らすために、関連するバイオマーカーの親和的精製が好ましい。Hsp60の場合、タンパク質を細胞可溶化液から交差反応性抗体を使用して免疫親和的精製することができる。例えば、モノクローナル抗体A57-E4(Affinity Bioreagents Inc)は、多くの潜在的に病原性の生物のHsp60に存在する線状エピトープRGIDKAに結合する。この生物は、ボルデテラ  ペルタシス(Bordetella pertussis)、ブラクホルデリア  セパシア(Burkholderia cepacia)、ブラクホルデリア  プセウドマレイ(Burkholderia pseudomallei)、クチラミジア  トラコマティス(Chlamydia trachomatis)、クラミジア  プネウモニアエ(Chlamydia pneumoniae)、クラミドフィラ  プシッタシ(Chlamydophila psittaci)、コクシエラ  ブルネッティ(Coxiella burnetii)、ヘモフィルス  インフルエンザ(Haemophilus nfluenzae)、大腸菌、フランシセラ  ツラレンシス(Francisella Tularensis)、クレブシエラ  プネウモニアエ(Klebsiella pneumoniae)、レジオネラ  プネウモフィラ(Legionella pneumophila)、ナイセリア  メニンジャイティディス(Neisseria meningitidis)、プセウドモナス  アエルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)、サルモネラ  チフス(Salmonella typhi)、ビブリオ  コレラ(Vibrio cholerae)、エルシニア  エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)を含む。
【００２４】
従って、このような抗体を使用すると、Hsp60の精製及び同定を、広範な潜在的病原体から行うことができる。この抗体の、フランシセラ  ツラレンシス(Francisella tularensis)及びブラクホルデリア  プセウドマレイのHsp60タンパク質に対する結合を、標準比色間接ELISAによって確認し定量した。これを図３に示す。
【表２】
2004536295.tif 000004
【００２５】
【表３】
2004536295.tif 000005
【００２６】
実施例３  Hsp60から導かれるトリプシン消化によるHsp60ペプチドマップ
上記表２及び３に示すように、類似した全分子量の密接に関連するHsp60タンパク質の酵素的消化は、質量分析によって解明され得るペプチドの特有のパターンを生じる。トリプシンは、ペプチドをアルギニン及びリジン残基のカルボキシ−ペプチド結合で切断する(次の残基がプロリンである場合を除く)。0.01%の質量精度を斟酌すれば、いくつかのペプチドは区別するのには似すぎている(囲み)。他の場合、いくつかの非常に短いペプチドは、同一の組成物を共有しており、従って同一の質量を有し、及び単一の遊離アミノ酸が切断から生じる。たとえこれを斟酌しても、各ペプチドセットは、タンパク質が導き出される特定の生物の診断に用いる独自のフィンガープリントを構成する。
【００２７】
実施例４  ブルセラ  アボルタス(Brucella abortus)及びスタフィロコッカス  エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)からのArg-C Hsp60ペプチドの比較
エンドプロテアーゼArg-C(クロストリパイン)は、その名の通り、アルギニンのカルボキシ−ペプチド結合を切断する。図４は、B.アボルタスとS.エピデルミディスからのHsp60のArg-C消化から得られたペプチドフィンガープリントの図式的な比較を示す。図３に示すように、これらの生物からの全Hsp60タンパク質の質量は類似する(57649及び57529、それぞれN-末端メチオニンを含む)。しかしながら、得られたペプチドセットは、全く異なり、含まれる生物に特徴的である。
【００２８】
実施例５  アデニレートキナーゼの診断用バイオマーカーとしての使用
図５は、種々の微生物(バクテリア及び原生生物の寄生体)並びにヒトタンパク質からの、高度に保存された細胞内の酵素アデニレートキナーゼの質量の比較を示す。アデニレートキナーゼは、アデノシンモノホスフェート、ジホスフェート及びトリホスフェートの間の可逆的なホスホトランスフェラーゼ反応を触媒するヌクレオシドモノホスフェートキナーゼである。この酵素は、種々の細胞の代謝プロセス並びにRNA及びDNA合成に要求されるヌクレオチドの合成において重要な役割を担う。アデニレートキナーゼは、記載された発明において有用なバイオマーカーの基準を満たし、ここで、種にわたって高度に保存され、さらに、各種は、質量によって区別し得る独自のタンパク質を有する。これは、一貫して発現され及び代謝に重要である。
【００２９】
実施例６  エレクトロスプレー質量分析による全Hsp60バイオマーカーの分子量測定からの大腸菌の同定
本発明の実用性を実証するために、抗Hsp60免疫親和性カラムとエレクトロスプレー質量分析とを使用して、バクテリアを、以下のようにして同定した。
(方法)
抗体カラムの調製
リガンド(モノクローナル抗体A57-E4(affinity Bioreagents Inc)を、カラムに結合する前に、0.2M NaHCO3、0.5M NaCl、pH8.3(カップリング緩衝液)中に透析した。最適な容積は、１〜１０ｍｇ／ｍｌの最適濃度で１ｍｌである。
ファストフローハイトラップ(Fast Flow Hi-Trap)カラム(Pharmacia Biotech)中、１ｍｌNHS活性化セファロース４を使用した。カラムを３×２ｍｌ容積１ｍM HClで洗浄し、保存溶液(イソプロパノール)を除去し、流速を２秒おきに１滴より低く維持し、マトリックスの圧縮を回避した。カラムにリガンド溶液を入れ、室温で３０分インキュベートした。カラムを洗浄し、0.5M エタノールアミン、0.5M NaCl、pH8.3(緩衝液Ａ)及び0.1M アセテート、0.5M NaCl、pH4.0(緩衝液Ｂ)で交互に洗浄して不活性化した (３×２mlの緩衝液Ａ、３×２mlの緩衝液Ｂ、次いで３×２mlの緩衝液Ａ)。カラムをその後平衡にし、０．１％(w/v)アジ化ナトリウムを含むホスフェート緩衝液中に貯蔵した。
【００３０】
サンプル精製方法
すべてのサンプルをNHS活性化カラムにおいて、AKTAプライムシステム(Pharmacia Biotech)で実施した。サンプルを２０mMリン酸ナトリウム、pH7.5中にロードし、３M尿素中、pH8.0又はpH2.0で溶出した。容積１ｍｌのサンプルをカラム上に、サンプルループを介してロードし、不純物を５ｍｌのホスフェート緩衝液で洗い去った。６ｍｌの溶出緩衝液を、カラムを通して送り、緩衝液の最初の１ｍｌを廃棄に流し、次いで２ｍｌを集めてエレクトロスプレー質量分析によって分析した。カラムを、次のサンプルに備えて、４ｍｌホスフェート緩衝液、次いで１０ｍｌの３M尿素、及び１０ｍｌホスフェート緩衝液で洗浄することによって再生した。全行程の流速は1ml／分であった。
質量分析実験的方法
免疫親和性カラムからの溶出液を２ｍｌ画分として集め、オーバーナイト４℃で貯蔵した。サンプルを２ｍｌホールディングループ中に導入した。ホールディングループの内容物を、その後Ｃ８カートリッジ(Hichrom)に、２０％Ｂ(Ａ＝０．１％  水中ＴＦＡ  Ｂ＝０．１％  アセトニトリル／水  90/10(v/v)中ＴＦＡ)中に１ｍｌ／分の流れでロードした。洗浄して緩衝液塩を除去した後、タンパク質をQuattro IIタンデム四重極質量分析器(Micromass UK Ltd)中に、９０％Ｂを２５μｌ／分の流れで使用して溶出した。獲得(acquisition)は、連続モードで行った。スキャンレンジは、m/z 700-2000でスキャン当たり５秒とした。キャピラリー電圧は、３ｋＶであり、コーン電圧は、スキャンしたm/zレンジにわたって３３Ｖ〜７４Ｖの傾斜をつけた。ソース温度は、８０℃であり、LM Res及びHM Resの双方は１５．５にセットした。カートリッジからの溶出ピークは約１分の持続時間とした。この器具はウマ心臓ミオグロビンを使用してキャリブレートした。
【００３１】
(結果)
抗体のHsp60バイオマーカーに対する交差反応性
図６に示すように、標準結合アッセイは、数多くのバクテリアの種からのHsp60がクラミジア  トラコマティスHsp60に対して産生されたモノクローナル抗体と交差反応し、保存されたエピトープ(RGIDKA)を結合することを示す。このような抗体は、バクテリアの種の範囲からのHsp60バイオマーカーの免疫精製に適している。
分子量による大腸菌Hsp60 K12の同定
図７は、バクテリアのタンパク質でロードされた抗-Hsp60免疫親和性カラムからの溶出液から検出された質量スペクトルを示す。示された57203.1±1.8Daでの分子量ピークは、Burland et al(1995)によって報告された大腸菌K12変異体からのHsp60のものとマッチする。標準大腸菌Hsp60質量は、Swiss-ProtデータベースエントリーP06130に詳説されているように、57137Daとして示される。しかしながら、Burland et alによって報告された変異体は、２つの変異、A261L及びI266Mを有し、これらは、57197の予測質量をあたえる。これは、器具の既知の質量精度（±0.01%）の範囲内であり、生物だけでなく個々の株及び／又は変異体の一義的な同定を可能にする。
【００３２】
参考文献
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【００３３】
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【００３４】
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【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】本発明の方法で利用されるシステムにおける機能的要素の概略的レイアウトを示す。
【図２】種々の潜在的病原性バクテリアからのHsp60タンパク質の質量の図式的な比較を示す。
【図３】フランシセラ  ツラレンシス及びブラクホルデリア  プセウドマレイからの組換えHsp60タンパク質に対する、モノクローナルIgG1 A57-E4の結合親和性の間接的ELISA測定を示す。
【図４】ブルセラ  アボルタス及びスタフィロコッカス  エピデルミディスのHsp60タンパク質のArg-C消化に起因するペプチドフィンガープリントの図式的比較を示す。
【図５】ヒトHsp60と比較した潜在的病原性微生物の範囲からのアデニレートキナーゼの分子量の図式的な比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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