(57)【要約】突然変異遺伝子またはキメラ遺伝子を形成するための遺伝子シャッフリングの方法であって、その方法は、（ａ）コードされたアミノ酸配列の領域に基づいた１つ以上の遺伝子の１つ以上のセグメントを割り当てる工程と、（ｂ）各セグメントに特異的なプライマーを用いる１つ以上の割り当てられた遺伝子セグメントを増幅させる工程と（ｃ）１つ以上の増幅セグメントの組換えをもたらし、突然変異遺伝子またはキメラ遺伝子を形成する工程とを含む。遺伝子シャッフリングに用いるのに適切なオリゴヌクレオチドプライマー、増幅される遺伝子のセグメントまたは鋳型に基づく非縮重コアを有するプライマー、ならびに５’および３’縮重末端の両方に隣接したコア。【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異またはキメラ遺伝子を形成するための遺伝子シャッフリングの方法であって、
（ａ）コードされるアミノ酸配列の領域に基づいて１つ以上の遺伝子セグメントを割り当てること；
（ｂ）少なくとも１つの割り当てられた前記遺伝子のセグメントに基づき、非縮重コアを有するプライマーを用いて前記１つ以上の割り当てられた遺伝子セグメントを増幅させることであって、ここにおいて前記コアでは５’および３’縮重末端の両方が側面に位置し；および
（ｃ）突然変異またはキメラ遺伝子を形成するために、前記１つ以上の増幅したセグメントを組換えること、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記方法が、
（ａ）コードされたアミノ酸配列の領域に基づく１つ以上の各遺伝子セグメントを割り当てること；
（ｂ）少なくとも１つの割り当てられた前記遺伝子セグメントに基づき、非縮重コアを有するプライマーを用いて１つ以上の前記遺伝子セグメントを増幅させることであって、ここで前記コアは５’および３’ 縮重末端の両方が側面に位置し；および
（ｃ）突然変異またはキメラ遺伝子を形成するために、増幅したセグメントの少なくともいくつかを結合すること、を含む、２つ以上の遺伝子から突然変異またはキメラ遺伝子を形成するための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２つ以上の遺伝子が同じ機能性タンパク質をコードする同じ遺伝子ファミリーに属する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記２つ以上の遺伝子が異なる機能性タンパク質をコードする異なる遺伝子ファミリーに属する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子セグメントが、前記遺伝子産物それぞれの保存されたアミノ酸配列の領域に基づいて割り当てられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の割り当てられた遺伝子セグメントが、各セグメントに特異的なプライマーを用いて増幅される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の遺伝子セグメントの増幅が、縮重プライマーに対応する相補末端を有する増幅セグメントを生産するために、前記縮重プライマーを用いてなされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅セグメントが、実質的に等しい比率で混合される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
セグメントの突然変異またはキメラ遺伝子への組み換えの可能性を変えるために、前記増幅セグメントが定められた比率で混合される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記突然変異またはキメラ遺伝子が、前記結合した増幅セグメントを重複伸長させることによって生産され、前記遺伝子産物の多重コピーが、ＰＣＲ増幅によって生産される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記突然変異またはキメラ遺伝子が、適切な発現ベクターおよび前記遺伝子から生産された遺伝子産物に配置される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記突然変異またはキメラ遺伝子が、酵素、成長因子、阻害物質、抗体、抗原、構造タンパク質、輸送タンパク質、毒素、またはそれらの組合せをコードする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記突然変異またはキメラ遺伝子がさらに突然変異または変性をする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法で生産される突然変異またはキメラ遺伝子。
【請求項１６】
遺伝子シャッフリングに用いるのに適切なオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記プライマーが増幅される遺伝子セグメントまたは鋳型に基づく非縮重コアを有し、前記コアが５’および３’縮重末端の両方に隣接する、前記オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１７】
前記３’縮重末端が前記プライマーに鋳型結合特異性を付与する、請求項１６に記載のプライマー。
【請求項１８】
前記非縮重コアが、続く回の増幅において安定化クランプとして働く、請求項１６または１７に記載のプライマー。
【請求項１９】
前記５’縮重末端が、それぞれ順方向または逆向きのプライマーを用いて生産された遺伝子セグメントが効率的に結合してその後に重複伸長増幅するのを支援する、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のプライマー。
【請求項２０】
前記プライマーの前記非縮重コアが親遺伝子の対応するコード配列に基づく、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のプライマー。
【請求項２１】
前記３’および５’末端が約６〜１２塩基の長さである、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のプライマー。
【請求項２２】
突然変異遺伝子またはキメラ遺伝子の製造のための、遺伝子のセグメントの増幅において増幅され並びに５’および３’縮重末端の両方に隣接する遺伝子のセグメントまたは鋳型に基づく非縮重コアを有するプライマーの使用。
【請求項２３】
前記３’縮重末端が、前記プライマーに鋳型結合特異性を付与する、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記非縮重コアが、続く回の増幅において安定化クランプとして働く、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記５’縮重末端が、それぞれ順方向または逆向きのプライマーを用いて生産された遺伝子セグメントが効率的に結合してその後に重複伸長増幅するのを支援する、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
前記プライマーの非縮重コアが、親遺伝子の対応するコード配列に基づく、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
１つ以上の遺伝子の増幅中に、少なくとも１つの遺伝子に１つ以上の突然変異を組込むことを特徴とする、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載のプライマーの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は有用な遺伝子産物をコードする突然変異遺伝子またはキメラ遺伝子を形成するための遺伝子シャッフリングの方法に関する。
【０００２】
背景技術
Ｓｔｅｍｍｅｒ（Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｗ．Ｐ．Ｃ．， Ｒａｐｉｄ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｂｙ ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ ３７０， ３８９−３９１， １９９４．； Ｓｔｅｍｍｅ， Ｗ．Ｐ．Ｃ．， ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｂｙ ｒａｎｄｏｍ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ： ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． ＵＳＡ ９１， １０７４７−１０７５１， １９９４）は、より大きな多様性があるタンパク質変種を得るためのｉｎ ｖｉｔｒｏ配列領域の検索のための最も効率的な方法を論じた。最近まで、組合せライブラリーを作る最も一般的な方法は、点突然変異の付加によって、配列進化を計ろうという帰納的な戦略であった。ｉｎ ｖｉｔｒｏ進化のためには、組換えポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲ（遺伝子シャッフリング）を含めることが、単純で帰納的な突然変異生成法を上回る実用的および理論的利点を提供する。点突然変異および野生型配列を再結合することにより、タンパク質の一部分に突然変異を与える方法を急速に微調整するだろう。酵素活性、基質特異性および安定性を高めるために、この技法（および、その変形形態）が用いられてきた。ファミリーシャッフリングは、通常シャッフルする遺伝子の断片化とそれに続くＰＣＲによって達成される。この方法は、ＰＣＲの再会合ステップでの相同組換えに依存する。大部分の方法では、その領域に「交叉点」が生じると思われることから、混ぜられる遺伝子の間で比較的に高いレベルの配列類似性をもつことが必要である。
【０００３】
入力遺伝子の配列類似性が低い場合、大部分の産物は再構築された親遺伝子である傾向があり、組換え体を見つけるために広範囲な検索が必要となる（Ｋｉｋｕｃｈｉ， Ｍ．， Ｏｈｎｉｓｈｉ， Ｋ． ＆ Ｈａｒａｙａｍａ， Ｓ．， Ｎｏｖｅｌ ｆａｍｉｌｙ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅｓ， Ｇｅｎｅ ２３６， １５９−１６７， （１９９９）；Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ， Ｍ．， Ｓｈｉｍ， Ｊ． Ｈ． ＆ Ｂｅｎｋｏｖｉｃ， Ｓ． Ｊ． Ａ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｈｙｂｒｉｄ ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｈｏｍｏｌｏｇｙ， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７， １２０５−１２０９， （１９９９））。Ｋｉｃｈｕｃｈｉら（１９９９）は、親分子や配列内の独自な制限酵素部位を用いた遺伝子シャッフリングの方法およびそれに続く開裂と、組換え遺伝子の増幅が行われるいくつかのＰＣＲ段階と、ハイブリッド遺伝子を高い頻度で形成できるプロセスとを報告した。Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒら（１９９９）は、２つの親配列のコード配列を連続的に切断し、続いて断片を連結して酵素活性を選択することによって、組合せ融合ライブラリーの調整を可能とする全く異なる手段を提案した。どちらか一方の親を、ハイブリッド遺伝子に５’配列を提供するのに用いることができる。この手段は、ハイブリッド酵素生成のための反復切断（ＩＴＣＨＹ）と名付けられ、５０％の配列類似性を有する遺伝子間の組み換えに適応することができ、標準的な遺伝子シャッフリング技術と比較するとさらに広い範囲の交叉が得られることが見出された。
【０００４】
本発明者らは、最近、パルプ紙の漂泊に改善された能力を示す好熱性のβ−キシラナーゼをコードする遺伝子を単離した。向上した安定性および変化した最適ｐＨを有する突然変異の誘導体が得られる可能性を調べることが望まれていた。変異性ＰＣＲ、および後に遺伝子シャッフリングが続く誤取り込み突然変異生成を用いる実験は、配列区域の変形形態が制限されたサンプルをコードする変異遺伝子同定を可能にしたが、遺伝子の同定に広範囲なスクリーニングが必要であった。関連遺伝子のＤＮＡｓｅＩ断片化をともなう遺伝子シャッフリング（ファミリーシャッフリング）は、主要な生成物として、ワイルドタイプ親配列を圧倒的に付与した。バックグラウンドを減少させるように設計した方法を数回試験した後、配列類似性およびＧ：Ｃ含量が広い範囲で異なる遺伝子シャッフリングが可能であり、ワイルドタイプ遺伝子の出現を減少するように、この技術は考案された。さらに、結果として生じる子孫遺伝子が、親の入力遺伝子のいずれかひとつ（もしくはそれ以上）に偏るようにプライマーの伸長条件を修正してもよい。本発明者らは、上記手順を縮重オリゴヌクレオチド遺伝子シャッフリング（ＤＯＧＳ）と定義し、他の帰納的点突然変異技術との互換性について言及する。
【０００５】
発明の開示
一般的な第一の態様において、本発明は、変異遺伝子産物またはキメラ遺伝子産物を形成するための遺伝子シャッフリングの方法であって、
（ａ）１つ以上の遺伝子セグメントを割り当てること；
（ｂ）前記１つ以上の割り当てられた遺伝子セグメントを増幅させること；および
（ｃ）変異遺伝子またはキメラ遺伝子を形成するために、１つ以上の増幅したセグメントを組換えること、を含む前記方法を提供する。
【０００６】
第二の態様において、本発明は、２つ以上の遺伝子からキメラ遺伝子を形成するための方法であって、
（ａ）各遺伝子の１つ以上のセグメントを割り当てること；
（ｂ）遺伝子セグメントの１つ以上を増幅させること；および
（ｃ）キメラ遺伝子を形成するために、少なくともいくつかの増幅したセグメントを結合すること、を含む前記方法を提供する。
【０００７】
好ましくは、２つ以上の遺伝子が、同一の機能性タンパク質をコードする同一の遺伝子ファミリーに属するものである。しかしながら、組換え遺伝子は、異なるファミリーに属する遺伝子から調整されてもよい。
【０００８】
好ましくは、セグメントが、遺伝子のコードされたアミノ酸配列の領域に基づいて割り当てられる。さらに好ましくは、遺伝子セグメントが、各々の遺伝子産物の保存されたアミノ酸配列の領域に基づいて割り当てられる。
【０００９】
好ましくは、１つ以上の割り当てられた遺伝子セグメントが、各々のセグメントに特異的なプライマーを用いて増幅される。
【００１０】
好ましくは、１つ以上の遺伝子セグメントの増幅が、縮重プライマーに対応する相補末端を有する増幅セグメントを産生するために縮重プライマーを用いて行われる。
【００１１】
好ましくは、前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による。
【００１２】
好適な一実施形態において、増幅セグメントは、セグメントのキメラ遺伝子への組み換わりやすさを変えるように、定められた率で混合される。このように、対象となる遺伝子セグメントを他の増幅セグメントより高い率で提供することが可能で、より高い組換え率が対象となるセグメントを包含することが保証される。
【００１３】
好ましくは、キメラ遺伝子は結合された増幅セグメントの重複伸長によって生産され、遺伝子の多重コピーはＰＣＲ増幅によって生産される。
【００１４】
セグメントが遺伝子に割り当てられ、且つ、遺伝子セグメントに特異的なＰＣＲプライマーが考案された後に、各々のセグメントは、通常、対象となる親遺伝子と別々に増幅される。キメラ遺伝子や突然変異遺伝子を得るために、次いで、前記増幅セグメントは、重複伸長により組み合わされて連結される。次いで、前記突然変異遺伝子は、当該技術分野で知られる適切な発現ベクターに配置され、遺伝子産物が生産される。結果として生じる突然変異遺伝子産物は機能活性のアッセイがされ、親遺伝子産物の活性と比較される。可能性がある遺伝子産物の例としては、限定されないが、酵素、成長因子、阻害物質、抗体、抗原、構造タンパク質、輸送タンパク質、毒素等が含まれる。
【００１５】
本発明の一つの利点は、増幅および組換えの前にヌクレアーゼで遺伝子を切断する必要がないことである。結果として、本発明では、より多くの収量のキメラ産物が得られ、野生型組換え体の産生が低くなる結果を生じる。
【００１６】
シャッフルされる遺伝子は、本発明によって加工される前に標準的な技術によって突然変異または変性を受けることができる。
【００１７】
第三態様において、本発明は、本発明の前記第一または第二態様に係る方法によって生産されるキメラ遺伝子または突然変異遺伝子を提供する。
【００１８】
第四態様において、本発明は、５’および３’縮重末端の両方に隣接する非縮重コアを有するオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。かかるプライマーは、キメラ遺伝子を生産するための遺伝子セグメントの増幅において、相補的縮重末端プライマー（ＣＤＥプライマー）として本明細書に引用される。
【００１９】
好適には、オリゴヌクレオチドプライマーは、遺伝子シャッフリングに用いるのに適切なものであり、増幅される遺伝子セグメントまたは鋳型に基づいて非縮重コアを有し、前記コアは、５’および３’縮重末端の両方に隣接する。
【００２０】
３’縮重末端は、各々ＣＤＥプライマーに鋳型結合特異性を与え、一方、非縮重領域はＰＣＲの引き続く回において、安定化クランプとして働く。５’縮重末端は、ＰＣＲにおいてＣＤＥプライマーの結合効率に寄与するのに要求されないが、しかしながら、それぞれ順方向または逆向きのＣＤＥプライマーを用いて産生されるＰＣＲ産物（増幅された遺伝子セグメント）の効率的結合および続く重複伸長するのに、重要な役割を担う。
【００２１】
ＣＤＥプライマーの非縮重コアは、一般的に対応する一遺伝子のコード配列に基づき、シャッフリング用の親遺伝子と呼ばれる。これが、結果として、セグメント重複点において親配列を保持するキメラ断片の形成をもたらす。
【００２２】
ＣＤＥプライマーは、関連性はあるが分岐する遺伝子部分（本明細書では、遺伝子セグメントと呼ぶ）の効率的および特異的な増幅を可能にする。
【００２３】
ＣＤＥプライマーの５’縮重末端は、それぞれの順方向または逆向きの相補的ＣＤＥプライマーと共に生産された個々のＰＣＲ産物が、各々のセグメントの親の起源に関わらず、同等によくアニールして重複伸長を開始することができるのを確実にする。
【００２４】
ＣＤＥプライマーの３’および５’縮重末端は、好ましくは、（これらに限定されないが）２〜４保存アミノ酸残基に対応する、６〜１２塩基の長さである。もちろん前記末端の長さは遺伝子または増幅される遺伝子に依存して変わってもよい。
【００２５】
ＣＤＥプライマーの３’および５’縮重末端は、ＰＣＲ増幅において正確なプライマーが鋳型アニーリングし、または重複伸長において正確な鋳型が鋳型アニーリングして、続くＤＮＡポリメラーゼによる鎖合成が起こるのに十分な長さである。
【００２６】
複合（１以上）対のＣＤＥプライマーにより、重複伸長およびＰＣＲに適切な相補的末端を有する連続したＰＣＲ産物（遺伝子産物）の産生が可能であり、結果として組み換えセグメントを生じる。
【００２７】
ＣＤＥプライマーは、重複伸長およびＰＣＲに適切な相補的末端を有する連続したＰＣＲ産物（遺伝子産物）を生じ、結果として組み換えセグメントを生じるために、非縮重コアを持たない相補的縮重プライマーと組み合わせて用いられることもできる。
【００２８】
関連遺伝子から増幅されたセグメントを混合し、続いて重複伸長およびＰＣＲを行うことにより、結果として、キメラ遺伝子断片が効率的に生成する。
【００２９】
各々の相補的ＣＤＥプライマーセットの非縮重コアは、親遺伝子に指定された遺伝子に基づいていてもよい（しかし必要ではない）。
【００３０】
関連遺伝子から増幅された遺伝子セグメントは、結果として生じるキメラ遺伝子フラグメントへの各々のセグメントの取り込みレベルを制御できる異なる量で混合されることもできる。
【００３１】
第五態様において、本発明は、突然変異遺伝子またはキメラ遺伝子を形成するための、本発明の前記第四態様に記載のプライマーの使用を提供する。
【００３２】
第六態様において、本発明は、遺伝子に突然変異を組み込むための、本発明の前記第四態様に記載のプライマーの使用を提供する。好ましくは、たとえ全てのセグメントが同じ親からのものであるとしても、前記プライマーの縮重３’部分が、最終な再結合遺伝子に点突然変異を組込むことができることである。
【００３３】
酵素の生化学的特質の改良は、選択したタンパク質の配列区域の探索を可能にしている突然変異生成およびＤＮＡシャッフリングの誤取り込みを含んだランダムな突然変異生成技法によって、物質的に支援されてきた。同一親の遺伝子の突然変異を収集するのにシャッフリング技法を用いてもよく、或いは、関連したファミリーのたんぱく質をシャッフルして、機能強化された遺伝子産物を伴う多重突然変異を産生してもよい。現行のシャッフリング手順に伴う問題は、突然変異のプールでシャッフルされていない分子が優勢であることである。本発明者らは、シャッフルされて、親の非組み換え型産物の頻度を減少させる遺伝子ファミリーの特定のセグメントを制御できる、共通プライマーおよびＰＣＲプライマー伸長に基づく遺伝子シャッフリングの手順を考案した。本手順は、シャッフリングの前に、遺伝子を断片化するためのヌクレアーゼまたは制限酵素の使用を回避することができ、本手順の一部として、遺伝子の選択されたセグメントのランダムな突然変異生成を用いることができるという利点を有する。本技法を用いることによって、突然変異を同定する簡便な活性試験法を提供する、大きく異なるＧ：Ｃ含量のβ−キシラナーゼ遺伝子の多様なファミリーで、首尾よく例証される。
【００３４】
本明細書の全体にわたり、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、或いは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記載された構成要件、整数もしくは工程、または構成要件、整数もしくは工程の群を含む意味と理解され、他の構成要件、整数もしくは工程、または構成要件、整数もしくは工程の群を除外する意味を含むものではない。
【００３５】
本明細書に包含される文章、行為、材料、装置、物品等の審議は、本発明の前後関係を提供する目的のみにある。上記内容のいずれかまたは全ては、本出願の各請求項の優先日前にオーストラリアに存在していたという理由で、先行技術基盤の一部を形成しているか、或いは本発明の関連分野における共通の一般的知識であったという承認を得ていると考えられるものではない。
【００３６】
本発明がより明確に理解されるように、以下の図面および実施例を参照して好適な実施形態を説明する。
【００３７】
発明を実施するための形態
材料および方法
ＰＣＲの概念および方法論
ＰＣＲおよびその理論は、当技術分野において公知のテキストおよび参考文献に多数記載されている。以下の文献、「ＰＣＲプライマー−実験室マニュアル（ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」１９９５年、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ Ｃ． Ｗ． ＆ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ、Ｇ． Ｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ編、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，米国）は、良好な例であり、本明細書に引用され、組み込まれている。
【００３８】
遺伝子の出所
ファミリー１１キシラナーゼ遺伝子は以下の細菌の菌株から入手可能である。Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ Ｒｔ４６Ｂ．１ ｘｙｎＢ（Ｍｏｒｒｉｓ， Ｄ． Ｄ． Ｇｉｂｂｓ，Ｄ．Ｄ．，Ｃｈｉｎ，Ｃ．Ｗ．，Ｋｏｈ，Ｍ．Ｈ．，Ｗｏｎｇ，Ｋ．Ｋ．Ｙ．，Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｒ．Ｗ．，Ｎｅｌｓｏｎ， Ｐ． Ｊ． ＆ Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔ，Ｐ．Ｌ．「Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ株Ｒｔ４６Ｂ．１からのｘｙｎＢ遺伝子のクローニングおよびクラフトパルプ上の遺伝子産物の作用」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４，Ｐ１７５９−１７６５，１９９８年）；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ ｘｙｎＢ（Ｓａｋｋａ，Ｋ．，Ｋｏｊｉｍａ，Ｙ．，Ｋｏｎｄｏ，Ｔ．，Ｋａｒｉｔａ，Ｓ．，Ｏｈｍｉｙａ，Ｋ．＆ Ｓｈｉｍａｄａ，Ｋ．「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｅｒｃｏｒａｒｉｕｍ ｘｙｎＡ遺伝子がコードするキシラナーゼＡのヌクレオチド配列」：「触媒性セルロース結合ドメインの同定」Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７，Ｐ２７３−２７７，１９９３年）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ属Ｖ１−４（Ｙａｎｇ，Ｖ．Ｗ．，Ｚｈｕａｎｇ，Ｚ．，Ｅｌｅｇｉｒ，Ｇ．＆Ｊｅｆｆｒｉｅｓ，Ｔ．Ｗ．「クラフトパルプから単離された好アルカリ性Ｂａｃｉｌｌｕｓ属によって生成されたアルカリ性活性のキシラナーゼ」Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５，Ｐ４３４−４４１，１９９５年）；Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ属Ｒｔ６９Ｂ．１ ｘｙｎＤ（Ｍｏｒｒｉｓ， Ｄ．Ｄ．， Ｇｉｂｂｓ，Ｍ．Ｄ．，Ｆｏｒｄ，Ｍ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｊ． ＆ Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔ，Ｐ．Ｌ．「Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ単離Ｒｔ６９Ｂ．１．からのファミリー１０および１１キシラナーゼ遺伝子」Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ３，Ｐ１０３−１１１，１９９９年）；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍｘｙｎＶ（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ Ａ．Ｃ．， Ｆｏｎｔｅｓ Ｃ．Ｍ．，Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｈ．Ｊ．， Ｈａｚｌｅｗｏｏｄ Ｇ．Ｐ．，Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ Ｔ． Ｈ．，Ｆｅｒｒｅｉｒａ Ｌ．Ｍ．「Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍからの類似性キシラナーゼ」：「二官能基活量、キシラナーゼ触媒性のモジュール間の協力作用、および酵素複合体中のキシラン結合したドメインの存在の明証」Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４２，Ｐ１０５−１１０，１９９９年）およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｉｓｃｌｅｒｏｔｉｃｕｓ ｘｙｌ３（Ｅｌｅｇｉｒ，Ｇ．，Ｓｚａｋａｃｓ，Ｇ． ＆ Ｊｅｆｆｒｉｅｓ， Ｔ． Ｗ．「Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ属菌株Ｂ−１２−２．からの多重キシラナーゼの精製、キャラクタリゼーション、および基質特異性」Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０，Ｐ２６０９−２６１５，１９９４年）。上記の４種のキシラナーゼは、サーモフィルス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）からであり、パルプ漂白試験を首尾よく行う、最適な高温および中温性タンパク質でのＢａｃｉｌｌｕｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓキシラナーゼ遺伝子コードを有する酵素をコードする。
【００３９】
遺伝子セグメントの効率的なＰＣＲ増幅および隣接セグメントの重複伸長のための縮重末端プライマー相補対
遺伝子のヌクレオチド配列を配置し、縮重共通プライマーを、全遺伝子中で発見される保存アミノ酸モチーフに基づいて設計した。キシラナーゼをコードする遺伝子は、保存領域の配列に基づいて８つのフラグメントに分割しうる（図４参照）。ｎｅｓｔｅｄ５’および３’共通プライマーと必要に応じて結合する場合、８つのセグメントにおけるＤＮＡ増幅ができるように、順行性および逆行性縮重プライマーを設計した。プライマー配列を表１に列挙する。
【００４０】
【表１】
2004506450.tif 000002
【００４１】
場合によっては、Ｒｏｓｅらの１９９８年のＣＯＤＥＨＯＰ法（Ｒｏｓｅ，Ｔ．Ｍ．，Ｓｃｈｕｔｚ，Ｅ．Ｒ．，Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ．Ｇ．，Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ，Ｓ．ＭｃＣａｌｌｕｍ，Ｃ．Ｍ．＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．「遠い配列の増幅に対する共通縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー（Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｈｙｂｒｉｄ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｔａｎｔｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６，Ｐ１６２８−１６３５，１９９８年）の変更形態を用いて、縮重オリゴヌクレオチドを設計する。上記のプライマーは、６−７ヌクレオチドの縮重末端に隣接する非縮重の中央コアからなる。各遺伝子の全セグメントを共通縮重オリゴヌクレオチドで増幅し、ＰＣＲ混合物から個々にゲル精製した。この段階のＰＣＲ条件は：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘポリメラーゼを用いて、９５℃で１分間の１サイクル後、９５℃（変性）で３０秒の３５サイクル、３５℃で２０秒アニーリング、７２℃で４０秒の伸長、７２℃で５分間の最終インキューベーション、であった。
【００４２】
重複伸長
ゲル精製後の各遺伝子セグメントを適切な割合で混合し、所望なレベルのキメラ化を付与した。例えば、Ｇ１がＤ．サーモフィラム（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）Ｒｔ４６Ｂ．１遺伝子である６つの候補遺伝子Ｇ１−Ｇ６を用い、シャッフルした後代では上記の配列が優勢であると決定し、プールした各遺伝子のＰＣＲセグメントを、Ｇ２−６を１：１：１：１：１に対してＧ１を８．７５の比で混合し、Ｒｔ４６Ｂ．１ｘｙｎＢからの５／８セグメントを有するキメラを付与した。５０／１００ｎｇの混合セグメントを、その後重複伸長用の鋳型として用い（Ｈｏ，Ｓ．Ｎ．，Ｈｕｎｔ，Ｈ．Ｄ．，Ｈｏｒｔｏｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｐｕｌｌｅｎ，Ｊ．Ｋ．，＆ Ｐｅａｓｅ，Ｌ．Ｒ．「ポリメラーゼ鎖の反応を用いた重複伸長による部位に従う突然変異生成（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」遺伝子（Ｇｅｎｅ）７７，Ｐ５１−５９，１９８９年）以下の条件を用いた：９５℃で１分間の１サイクル、９５℃（変性）で３０秒の３５サイクル、３５℃で２０秒アニーリング、７２℃で４０秒の伸長。そして、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘポリメラーゼを用いて、７２℃で５分間の最終インキューベーション。
【００４３】
キメラ増幅
共通の隣接ｎｅｓｔｅｄ５’および３’−プライマーを使用したＰＣＲ鋳型として、重複伸長産物（５０−１００ｎｇ）を用い、キメラフラグメントを以下の条件下で完全遺伝子に再生した：Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡポリメラーゼを用いて、酵素を活性化するために９５℃で１分間の１サイクル後、９５℃（変性）で３０秒の２０サイクル、５０℃で２０秒アニーリング、７２℃で４０秒の伸長、７２℃で５分間の最終インキューベーション。
【００４４】
シャッフルされた産物のクローニング
ＤＯＧＳ　ＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨｌおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化し、同一の制限酵素で消化したｐＢＳＩＩ　ＫＳ（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ， ＣＡ）に連結し、Ｓｈｒｉｍｐアルカリ性ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で処理した。ベクター製造指示書に従って、連結したＤＮＡを大腸菌株ＤＨ５−アルファに形質転換し、アンピシリン、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧ含有のプレート上で平板培養した。個々のコロニーを取り出し、新しいプレート上に２通りに寄せられ、Ｍｏｒｒｉｓら１９９９年記載の基質オーバーレイ／Ｃｏｎｇｏ Ｒｅｄ染色法によってキシラナーゼ活性の発現をスクリーンした。
【００４５】
キシラナーゼ活性の酵素アッセイ
熱安定性、最適ｐＨ等のアッセイ方法は、１９９９年のＭｏｒｒｉｓらの著に記載されている。
【００４６】
結果および考察
論理的根拠
ＤＯＧＳ技法の概要を図１に示す。図１Ａにおいて、オリゴヌクレオチドプライマーは、各候補遺伝子のＮまたはＣ末端に特異的な３’末端と共に設計され、ＰＣＲ産物の方向性クローニングに適切な制限部位を有する共通のｎｅｓｔｅｄ５’末端が組込まれる。各遺伝子は、ＰＣＴ鋳型として用いるために増幅される。図１Ｂにおいて、候補遺伝子中に見出される１つ以上の保存モチーフに縮重末端プライマーの相補対を設計する。図１Ｃにおいて、縮重プライマーおよび共通ｎｅｓｔｅｄプライマーを用いて、各遺伝子の各々セグメント全てが増幅される。図１Ｄにおいて、各遺伝子からのセグメントを混合し、所望のレベルのキメラ化が付与される。ポリメラーゼ仲介のセグメントの重複伸長は、キメラフラグメントの産生に用いられ、共通ｎｅｓｔｅｄプライマーを用いるＰＣＲによって全長遺伝子が再生する。図１Ｅにおいて、全長フラグメントを消化してクローニングベクターに連結し、大腸菌に形質転換して、個々の組み換え体を所望な特性に関してスクリーニングされる。
【００４７】
ＰＣＲおよび重複伸長用の相補的縮重末端プライマーを図２に示す。図２Ａは、二本鎖鋳型ＤＮＡおよび相補的末端縮重（ＣＤＥ）順方向および逆向きプライマーの相対的結合位置の略図を示す。別々のＰＣＲ増幅において、順行性ＣＤＥプライマーを逆向き隣接プライマーとの組合せで用い、一方、逆向きＣＤＥプライマーを順行性の隣接プライマーとの組合せで用いる。図２Ｂは、順行性および逆向きのＣＤＥプライマー各々のＤＮＡ鋳型への正しい結合を示す略図である。細い垂直線（｜）は、隣接ヌクレオチドの適正なプライマー／鋳型の対合を示し、コロン（：）は、プライマープールでの縮重による隣接ヌクレオチドとの潜在的マッチングを示し、ダッシュ（−）は、ヌクレオチドの不適正な組合せを示す。図示するように、ＰＣＲの第一ラウンドにおいて、非縮重コアはプライマー結合に寄与せず、プライマーの特異性は各プライマーの３’縮重末端によって獲得される。図２Ｃは、ＰＣＲ増幅の初期ラウンドに産生する産物に各々結合するＣＤＥの順行性および逆行性プライマーを示す略図を示す。細い垂直線（｜）は、隣接ヌクレオチドの適正なプライマー／鋳型の対合を示し、コロン（：）は、プライマープールでの縮重による隣接ヌクレオチドとの潜在的マッチングを示す。図示する通り、非縮重のコアは、適正な標的の増幅において、縮重プライマープールの有効利用を確保するクランプとして働く。図２Ｄは、順行性または逆向きＣＤＥプライマーを用いてそれぞれ生成する２つのＰＣＲ産物の相補性を示す略図を示す。当該相補性は、結果として両ＤＮＡ領域を含む１つのＤＮＡフラグメントの再生となる、有効なポリメラーゼ仲介の重複伸長を可能にする。２種のＰＣＲ産物が異なる遺伝子由来ならば、キメラフラグメントが産生しうる。
【００４８】
Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４ａ）によって紹介されたＤＮＡｓｅＩ断片化での確立された技法を用いる初期の実験においての高頻度の親のシャッフルされていない産物を見出した後に、この手法は開発された。当該観察により、候補キメラ遺伝子の単離のため、特にファミリーシャッフリングに遠い遺伝子が用いられる場合には、広範囲なスクリーニングが必要となった。親分子のバックグランドは、フラグメントのゲル精製中に未消化の全長材料を完全に除去することが困難であることの結果である。Ｋｉｋｕｃｈｉら（１９９９年）による制限酵素法には、簡単であるという長所があり、入手可能な広範囲の制限酵素は、ワイルドタイプ遺伝子の再生頻度を低下させる。しかしながら、使用時において、その方法では、変異遺伝子産物の所望の数または頻度が得られない。親遺伝子をシャッフリング手法に投入するのを制御することは重要であると考えられ、本発明者らは、限られた配列類似性を有する遺伝子を親として用いる場合、キメラが稀に生じることを例証した。主要な入力ＤＮＡとしてＲｔ４６Ｂ．１からのｘｙｎＢを用いる、６つのキシラナーゼ遺伝子シャッフリングを伴う実験からの産物の記載を以下に記載する。
【００４９】
遺伝子セグメントの効率的ＰＣＲ増幅および隣接セグメントの重複伸長のための縮重末端相補性プライマー対
ＰＣＲによって遠縁の配列を単離するための最も一般的に使われる戦略は、ＤＮＡ配列のうち高度に保存される領域に結合する縮重プライマーを設計することであった。この方法に伴う問題は、プライマー縮重が増加しより多くの分岐遺伝子を供給するために、正しく合成を導くＰＣＲプライマー分子の数が低下し、最初の数回の反応サイクルで、前記プライマーが使い果たされてしまうことである。標的遺伝子の増幅に参加しない多量のプライマーのために非特異的な増幅が起こり、それを利用して非特異的合成を導くことが可能であり、特に低ストリンジェントなアニーリング条件が、通常、不適合な相同体の検出に必要とされるからである。
【００５０】
Ｒｏｓｅら（１９９８年）は、共通縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマー（ＣＯＤＥＨＯＰ）と呼ばれるプライマー設計の縮重方法の問題点を克服する戦略を記載した。ＣＯＤＥＨＯＰプライマーは、比較的短い３’縮重末端および５’非縮重共通クランプからなる。３’コアの長さを最小限まで短くすると、縮重プライマープール中の個々のプライマーの総数が減少する。標的鋳型を有する３’縮重末端のハイブリダイゼーションは、５’非縮重共通クランプによって安定化され、これによりプールでの縮重を増加させずに、より高いアニーリング温度が可能となる。初期のＰＣＲサイクル中に、潜在的に不適正な組合せが、プライマーの５’共通クランプと標的配列との間に起こりうるが、それらの組合せは３’ヒドロキシル伸長部位から離れて位置するので、プライマーと標的の不適正な組合せは、ポリメラーゼ伸長を導くのに支障はない。引き続くプライマーハイブリダイゼーションおよび伸長のラウンド中の導かれるＰＣＲ産物のさらなる増幅は、プール中のすべてのプライマーの配列類似性によって亢進される；これにより反応中の全てのプライマーを利用できるようになる。
【００５１】
本発明者らにより記載され利用されるＣＯＤＥＨＯＰオリゴヌクレオチド設計技術の改良により、関連遺伝子の多重重複セグメントの効率的な増幅が可能となり、引き続く異なる遺伝子からの隣接セグメントの重複伸長によって、有用なキメラ遺伝子のフラグメントまたは産物が生成される。
【００５２】
新しい技法は、プライマーの相補対の設計を伴う。各プライマーは、５’と３’の両方の縮重末端に隣接した非縮重コアを有し、本明細書では、相補的縮重末端プライマー（ＣＤＥプライマー）と呼ぶ。ＣＯＤＥＨＯＰプライマーと同様に、３’縮重末端は、各ＣＤＥプライマーにその鋳型結合特異性を付与し、一方、非縮重領域は、引き続くＰＣＲ増幅のラウンドにおいて、安定化クランプとして働く。ＰＣＲ中のＣＤＥプライマーの結合効率に寄与するために５’縮重末端は必要とされず、しかしながら、順行性または逆向きのＣＤＥプライマーそれぞれを用いて産生されるＰＣＲ産物（遺伝子セグメント）の効率的な結合および続く重複伸長を可能にするのに重要な働きをする。
【００５３】
ＣＤＥプライマーの非縮重のコアは、一般的に、シャッフリングのための親遺伝子に指定される１つの遺伝子の対応コード配列に基づく。この結果として、セグメント重複点で親配列を保持するキメラフラグメントを形成する。関連する遺伝子からの遺伝子セグメントの増幅、および引き続くキメラ遺伝子産生のためのセグメントの重複伸長に適した、相補性オリゴヌクレオチド対の作製のための設計戦略例を、図３に示す。
【００５４】
主要な親としてＤ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ Ｒｔ４６Ｂ．１ｘｙｎＢを用いるシャッフリング
各々異なる入力ＤＮＡ比を有する３種の遺伝子シャッフリング・ライブラリーを作製した。等量の主要な親遺伝子セグメント各々と、別の遺伝子セグメントを表２に示す比で混合することにより、ライブラリーＲ１、Ｒ２、およびＲ３を形成した。用いる比率は、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３ライブラリーに対して、それぞれ、遺伝子あたり平均５／８、６／８および７／８の主要な親セグメントの比を付与するように計算された。
【００５５】
【表２】
2004506450.tif 000003
【００５６】
各ライブラリーから総計１００コロニーをキシラナーゼ活性の発現に関してスクリーニングした。７０のキシラナーゼ陽性の形質転換体と３０のキシラナーゼ陰性の形質転換体が同定され、各々のプラスミド挿入を配列し、結果得られたデータを親配列と比較した。図４に示すように、配列データから組み換え体における各々のセグメントの始点を割り当てることができた。配列された１００の遺伝子うち、７５％がライブラリーＲ１のキメラであり、５４％および５２％がそれぞれライブラリーＲ２とＲ３のキメラであった。キシラナーゼ陽性のキメラを図４に示す。上記の入力比を用いて、その入力比からの親Ｒｔ４６Ｂ．１ｘｙｎＢ配列の優勢が予測された。全て親Ｒｔ４６Ｂ１セグメントを含有する単離物には、プレートテストにおいて不活性であるものもあった。各セグメントを増幅するのに用いられるプライマーの縮重による点突然変異の導入で、上記の結果を説明することができる。３０のキシラナーゼ陰性の単離物うち６において、セグメント境界で、おそらく隣接セグメントの重複伸長中に導入され、そして観察した全ケースにおいて切断開口型の読み取り枠となるフレームシフトが観察された。
【００５７】
図４について特筆すべきは、表２で詳細に示される通り、組み換え体遺伝子の５２〜７５％がキメラであったことである。Ｒｔ４６Ｂ．１ｘｙｎＢセグメントの優勢は、ほぼ入力比から予測されるものであった。ワイルドタイプの単離物には、キシラナーゼ活性に対するプレートテストで不活性のものもあったが、プライマー内に包含される縮重領域によるセグメントの重複境界での点突然変異の導入によって、この結果を説明することができる。
【００５８】
全セグメントに対する出力比を１：１：１：１：１：１として、さらなる実験が行われた。総計２０のキメラを配列し、平均してキメラ当り１セグメントだけをＤ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ ｘｙｎＢ６から得た。この結果は、ｘｙｎＢ６から誘導されたＣＤＥプライマーの縮重クランプが、親遺伝子の改良に向けた組換えに寄っていなかったことを示す。
【００５９】
シャッフルされた遺伝子産物に関するキシラナーゼ　アッセイ
図５および６に、キシラナーゼ遺伝子の遺伝子シャッフリング実験の結果を示す。本発明に係る方法によって、非常に多くの活性キメラ遺伝子が生産された。
【００６０】
遺伝子シャッフリングおよび誤取り込み突然変異生成用のｎｅｓｔｅｄプライマーセットの使用
記載された方法において、遺伝子特異的３’末端と共通５’ オーバーハンギング末端を有する遺伝子特異的プライマーセット（順行性および逆行性）が、ＤＮＡシャッフリング用に選択される遺伝子のために設計された。遺伝子の特異的プライマーの５’オーバーハンギング末端と実質的に一致するように順行性および逆向きのｎｅｓｔｅｄプライマーが設計された。遺伝子特異的プライマーセットを用いて、最初に各遺伝子をＰＣＲ増幅した。次いで、各々のＰＣＲ産物は、共通ｎｅｓｔｅｄプライマーセットを用いる引き続くＰＣＲ増幅において、或いは個々の遺伝子セグメントの増幅に、用いることができる。（図７参照）。
【００６１】
ｎｅｓｔｅｄプライマーを用いると、遺伝子の末端（５’および３’）セグメントを増幅することが可能であることを保証することができ、どちらの遺伝子が末端（５’および３’）セグメントに寄与するかに関係なく、次の重複伸長ＰＣＲ、キメラ遺伝子を、同程度に増幅することが可能であることを保証するのに役立つ。
【００６２】
ｎｅｓｔｅｄプライマーを用いると、誤取り込み突然変異生成の手順が、突然変異する遺伝子内の可能性があるコドンを変化させることが可能であることを保証するのに役立つ。
【００６３】
結論
上述のＤＯＧＳ手順は、殊に近位でない遺伝子ファミリーのメンバーをシャッフルすることが可能であり、さらにキメラ分子を高い頻度で獲得可能であり、その結果、従来技術の方法と比較すると、広範囲にわたり時間のかかるスクリーニングを必要としない。殊にフラグメントのシャッフリングを高めるために、セグメント入力比を変更して、組換え頻度を制御することが可能である。従って、適切な制限酵素の部位に依存する従来の方法に代わって、手順によって、ドメイン交換実験を比較的容易に実施することが可能になる。ＰＣＲで誘発された誤取り込みまたはエラーの起こりやすい突然変異生成を手順の一部として取り込み、産物にさらなる多様性を導入することは明らかである。この点において、上記の手順は、個々のセグメントのランダムな突然変異生成に尽力し、コードする酵素産物の微調整をするのに役立つ。そうすることによって、本発明者は、手順の適切な段階で、校正（プルーフリーディング）作用がなくても、ＤＮＡポリメラーゼを導入することによって、特異的セグメントの突然変異生成の範囲および特質に関して調整できる。さらに、適合度の高いＤＮＡポリメラーゼを使用したとしても、プライマーに本来備わっている不適正な組合せのために、変性ヌクレオチド配列を産生する結果となることは縮重プライマーの設計から明らかである。増幅およびプライマー伸長段階において、校正作用がなくてもポリメラーゼを用いることによって、大量の誤取り込みの突然変異生成でさえも、産生することが可能である。
【００６４】
ＣＤＥプライマーの使用により、全般的な配列類似性が低い多様な範囲の遺伝子からの相当する遺伝子セグメントが確実なＰＣＲ増幅およびシャッフリングをできるようになった。使用したＣＤＥプライマーは、長さ２３〜２９のヌクレオチドに及んだ。本研究の説明に用いたＣＤＥプライマーは、セグメントの増幅および引き続いての重複伸長が確実に働くために、最大限の耐縮重を表さなくてもよい。従って、プライマーの長さは、親遺伝子または遺伝子の出所、および増幅セグメントによって異なる。
【００６５】
上記記載の実験は、単一ラウンドのキメラ形成のみを用いた。追加ラウンドのＤＯＧＳによって、配列領域の検索ができるように、さらなる多様性を導入できることは明らかである。手順は、別の遺伝子シャッフリングと組合せ突然変異生成技法との組合せに役立つ。
【００６６】
広く記載したように、本発明の範囲から逸脱しないならば、詳細な実施形態に示す本発明に従って多数の変形形態および／または変更形態を作成しうることを当業者ならば理解するだろう。従って、本発明の実施形態は、全ての点において例証され、制限されるものではないと考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＯＧＳ技術の概要である。
Ａ．各候補遺伝子のＮまたはＣ末端に特異的な３’末端を有するオリゴヌクレオチドプライマーの設計、ＰＣＲ産物の方向性クローニングに適切な制限酵素部位を有する共通ｎｅｓｔｅｄ５’末端の取り込み。ＰＣＲはＰＣＴ鋳型として使用される各々の遺伝子を増幅する。
Ｂ．候補遺伝子に見られる１つ以上の保存モチーフに基づいた縮重末端プライマーの相補対の設計。
Ｃ．縮重プライマーおよび共通ｎｅｓｔｅｄプライマーを用いた各遺伝子（Ｓ１−Ｓ８）の個々のセグメント全ての増幅。
Ｄ．各遺伝子からのセグメントを混合し、所望のレベルのキメラ化を付与。キメラフラグメントを産生するためのセグメントのポリメラーゼ仲介の重複伸長。共通ｎｅｓｔｅｄプライマーを用いたＰＣＲにより、全長遺伝子を再生。
Ｅ．全長キメラ遺伝子のフラグメントを消化しおよび適切なベクターに連結し、大腸菌に形質転換し、所望の表現型を有するタンパク質の発現を求めて個々の形質転換体をスクリーニング。
【図２】ＰＣＲおよび重複伸長用の相補的縮重末端プライマーである。
Ａ．二本鎖鋳型ＤＮＡおよび相補的縮重末端（ＣＤＥ）順行性および逆行性のプライマーの相対的結合位置。別々のＰＣＲ増幅において、順行性ＣＤＥプライマーを、逆行性の隣接プライマーとの組合せで用い、前記逆行性ＣＤＥプライマーを、順行性の隣接プライマーとの組合せで用いる。
Ｂ．順行性および逆行性のＣＤＥプライマーのＤＮＡ鋳型への適正な各々の結合の略図。細い垂直線（｜）は、隣接ヌクレオチドの適正なプライマー／鋳型の対合を示し、コロン（：）は、プライマープールでの縮重による隣接ヌクレオチドの潜在的マッチングを示し、一方ダッシュは（−）は、ヌクレオチドの不適正な組合せを示す。図示するように、ＰＣＲ増幅の最初のラウンドにおいて、非縮重コアは、プライマー結合に寄与せず、プライマーの特異性は、各プライマーの３’縮重末端により成し遂げられる。
Ｃ．ＰＣＲ増幅の初期ラウンドにおいて、産生される産物への各々ＣＤＥ順行性および逆行性プライマーの結合の略図。細い垂直線（｜）は、隣接ヌクレオチドの適正なプライマー／鋳型の対合を示し、コロン（：）は、プライマープールでの縮重による隣接ヌクレオチドの潜在的マッチングを示す。図示するように、非縮重のコアは、適正な標的の増幅において、縮重プライマープールの有効利用を保証するクランプとして働く。
Ｄ．各々順行性または逆行性のＣＤＥプライマーを用いて産生する２種のＰＣＲ産物の相補性を示す略図。上記相補性は、結果として両ＤＮＡ領域を備える単一ＤＮＡフラグメントの再生となる、有効なポリメラーゼ仲介の重複伸長をできるようにする。２種のＰＣＲ産物が異なる遺伝子由来ならば、キメラフラグメントを産生しうる。
【図３】Ａ．関連する遺伝子配列の配置。
Ｂ．関連する遺伝子からのセグメントの増幅、およびそれに引き続く重複伸長に用いる相補的オリゴヌクレオチド配列。非縮重コア配列（反転文字で示す）は、選択された親遺伝子の配列に適合するように設計されている（ディクチオグロムスサーモフィラム（Ｄｉｃｔｙｏｇｌｏｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）キシラナーゼＢの例を以下に記載する）。
【図４】主要な親遺伝子としてＤ． ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍを用いた時の実験Ｒ−シャッフリングの結果。
【図５】キシラナーゼ活性の発現を明らかにするために、プレートに個々のコロニーを貼り付け、０．５％キシランでオーバーレイし、Ｃｏｎｇｏ−Ｒｅｄで染色した個々のコロニーの図。コロニーを囲む未染色領域は、キシランの酵素消化を示す。
【図６】入力セグメントと異なる比率でのセグメントシャッフリングの相対的頻度を示すグラフ。親遺伝子セグメントと他の遺伝子セグメントをそれぞれ８．７５：１：１：１：１：１、１５：１：１：１：１：１および３５：１：１：１：１：１の割合で混合して、ライブラリーＲ１、Ｒ２およびＲ３を産生した。
【図７】遺伝子シャッフリング用の遺伝子セグメントの引き続くＰＣＲ増幅で用いる遺伝子に、共通ｎｅｓｔｅｄ末端を組込むためのｎｅｓｔｅｄプライマー一セットの相対的結合位置および使用についての図表。
【図１】
2004506450.tif 000004
【図２】
2004506450.tif 000005
【図３】
2004506450.tif 000006
【図４】
2004506450.tif 000007
【図５】
2004506450.tif 000008
【図６】
2004506450.tif 000009
【図７】
2004506450.tif 000010
【国際公開パンフレット】
2004506450.tif 000011
2004506450.tif 000012
2004506450.tif 000013
2004506450.tif 000014
2004506450.tif 000015
2004506450.tif 000016
2004506450.tif 000017
2004506450.tif 000018
2004506450.tif 000019
2004506450.tif 000020
2004506450.tif 000021
2004506450.tif 000022
2004506450.tif 000023
2004506450.tif 000024
2004506450.tif 000025
2004506450.tif 000026
2004506450.tif 000027
2004506450.tif 000028
2004506450.tif 000029
2004506450.tif 000030
2004506450.tif 000031
2004506450.tif 000032
2004506450.tif 000033
2004506450.tif 000034
2004506450.tif 000035
2004506450.tif 000036
2004506450.tif 000037
2004506450.tif 000038
2004506450.tif 000039
2004506450.tif 000040
2004506450.tif 000041
2004506450.tif 000042
2004506450.tif 000043
2004506450.tif 000044
2004506450.tif 000045
2004506450.tif 000046
2004506450.tif 000047
2004506450.tif 000048
2004506450.tif 000049
【手続補正書】
【提出日】平成13年12月13日(2001.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異またはキメラ遺伝子を形成するための遺伝子シャッフリングの方法であって、
（ａ）コードされるアミノ酸配列の領域に基づいて１つ以上の遺伝子セグメントを割り当てること；
（ｂ）少なくとも１つの割り当てられた前記遺伝子のセグメントに基づき、非縮重コアを有するプライマーを用いて前記１つ以上の割り当てられた遺伝子セグメントを増幅させることであって、ここにおいて前記コアでは５’および３’縮重末端の両方が側面に位置し；および
（ｃ）突然変異またはキメラ遺伝子を形成するために、前記１つ以上の増幅したセグメントを組換えること、を含む、前記方法。
【請求項２】
前記方法が、
（ａ）コードされたアミノ酸配列の領域に基づく１つ以上の各遺伝子セグメントを割り当てること；
（ｂ）少なくとも１つの割り当てられた前記遺伝子セグメントに基づき、非縮重コアを有するプライマーを用いて１つ以上の前記遺伝子セグメントを増幅させることであって、ここで前記コアは５’および３’ 縮重末端の両方が側面に位置し；および
（ｃ）突然変異またはキメラ遺伝子を形成するために、増幅したセグメントの少なくともいくつかを結合すること、を含む、２つ以上の遺伝子から突然変異またはキメラ遺伝子を形成するための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２つ以上の遺伝子が同じ機能性タンパク質をコードする同じ遺伝子ファミリーに属する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記２つ以上の遺伝子が異なる機能性タンパク質をコードする異なる遺伝子ファミリーに属する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子セグメントが、前記遺伝子産物それぞれの保存されたアミノ酸配列の領域に基づいて割り当てられる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の割り当てられた遺伝子セグメントが、各セグメントに特異的なプライマーを用いて増幅される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の遺伝子セグメントの増幅が、縮重プライマーに対応する相補末端を有する増幅セグメントを生産するために、前記縮重プライマーを用いてなされる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行われる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記増幅セグメントが、実質的に等しい比率で混合される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
セグメントの突然変異またはキメラ遺伝子への組み換えの可能性を変えるために、前記増幅セグメントが定められた比率で混合される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記突然変異またはキメラ遺伝子が、前記結合した増幅セグメントを重複伸長させることによって生産され、前記遺伝子産物の多重コピーが、ＰＣＲ増幅によって生産される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記突然変異またはキメラ遺伝子が、適切な発現ベクターおよび前記遺伝子から生産された遺伝子産物に配置される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記突然変異またはキメラ遺伝子が、酵素、成長因子、阻害物質、抗体、抗原、構造タンパク質、輸送タンパク質、毒素、またはそれらの組合せをコードする、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記突然変異またはキメラ遺伝子がさらに突然変異または変性をする、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法で生産される突然変異またはキメラ遺伝子。
【請求項１６】
遺伝子シャッフリングに用いるのに適切なオリゴヌクレオチドプライマーであって、前記プライマーが増幅される遺伝子セグメントまたは鋳型に基づく非縮重コアを有し、前記コアが５’および３’縮重末端の両方に隣接する、前記オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項１７】
前記３’縮重末端が前記プライマーに鋳型結合特異性を付与する、請求項１６に記載のプライマー。
【請求項１８】
前記非縮重コアが、続く回の増幅において安定化クランプとして働く、請求項１６または１７に記載のプライマー。
【請求項１９】
前記５’縮重末端が、それぞれ順方向または逆向きのプライマーを用いて生産された遺伝子セグメントが効率的に結合してその後に重複伸長増幅するのを支援する、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のプライマー。
【請求項２０】
前記プライマーの前記非縮重コアが親遺伝子の対応するコード配列に基づく、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載のプライマー。
【請求項２１】
前記３’および５’末端が約６〜１２塩基の長さである、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載のプライマー。
【請求項２２】
突然変異遺伝子またはキメラ遺伝子の製造のための、遺伝子のセグメントの増幅において増幅され並びに５’および３’縮重末端の両方に隣接する遺伝子のセグメントまたは鋳型に基づく非縮重コアを有するプライマーの使用。
【請求項２３】
前記３’縮重末端が、前記プライマーに鋳型結合特異性を付与する、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記非縮重コアが、続く回の増幅において安定化クランプとして働く、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記５’縮重末端が、それぞれ順方向または逆向きのプライマーを用いて生産された遺伝子セグメントが効率的に結合してその後に重複伸長増幅するのを支援する、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
前記プライマーの非縮重コアが、親遺伝子の対応するコード配列に基づく、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
１つ以上の遺伝子の増幅中に、少なくとも１つの遺伝子に１つ以上の突然変異を組込むことを特徴とする、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載のプライマーの使用。
【国際調査報告】
2004506450.tif 000050
2004506450.tif 000051
2004506450.tif 000052