(57)【要約】本発明は、一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位Ｃ−末端に、同一または異なっている他の一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位Ｎ−末端が結合された連鎖体の蛋白質に関する。更に、本発明は、同一な免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位の直列連鎖体（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジ（ｈｉｎｇｅ）に結合されて融合された単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）蛋白質の二つがヒンジ部位でジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄ ｂｏｎｄ）により形成された二量体（ｄｉｍｅｒ）蛋白質またはこの糖化蛋白質、前記単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物、このＤＮＡ作製物を含有した組換えＤＮＡプラスミド、この組換えＤＮＡプラスミドで形質転換または形質感染された宿主細胞、この宿主細胞を培養して前記二量体蛋白質を製造する方法に関する。更に、本発明は、二量体蛋白質またはこの糖化された蛋白質を含む薬剤学的な組成物に関する。
2004521655.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位Ｃ−末端に、同一または異なっている他の一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位Ｎ−末端が結合された連鎖体の蛋白質。
【請求項２】
同一な免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて形成された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合され、増加した効能及び高度の安定性を有する直列連鎖融合された二量体蛋白質。
【請求項３】
免疫グロブリンがＩｇＧである請求項２に記載の二量体蛋白質。
【請求項４】
免疫反応に関与する蛋白質が、サイトカイン、サイトカイン受容体、接着分子、腫瘍壊死因子の受容体、受容体のチロシンキナーゼ、ケモカイン受容体及び細胞表面の受容体の細胞外域可溶性の部位からなるグループから選択された一種である請求項２に記載の二量体蛋白質。
【請求項５】
ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ、ＴＧＦ、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＨＲ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＴＮＦＲ、ＴＧＦＲ、ＩＦＮＲ、インターフェロン−αＲ、−βＲ及び−γＲ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、Ｇ−ＣＳＦＲ、ＥＰＯＲ、ｃＭｐｌ、ｇｐ１３０、Ｆａｓ（Ａｐｏ１）、ＣＣＲ１、ＣＸＣＲ１−４、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、Ｈｔｋ、ＲＥＫ７、Ｒｓｅ／Ｔｙｒｏ−３、肝細胞成長因子Ｒ、血小板−由来の成長因子Ｒ、Ｆｌｔ−１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ１００、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＬＡＧ−３、Ｂ７、Ｂ６１、β−ニューレキシン、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ−１、補体Ｒ−２（ＣＤ２１）、ＩｇＥＲ、リソソーム膜ｇｐ−１、α２−マクログロブリン受容体−連貫の蛋白質及びナトリウム排泄ペプチドＲからなるグループから選択される請求項２に記載の二量体蛋白質。
【請求項６】
前記単量体蛋白質が、配列番号６、配列番号８、配列番号１８または配列番号２０のアミノ酸配列を有する請求項２に記載の二量体蛋白質。
【請求項７】
同一な免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて形成された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物。
【請求項８】
免疫グロブリンが、ＩｇＧである請求項７に記載のＤＮＡ作製物。
【請求項９】
免疫反応に関与する蛋白質が、サイトカイン、サイトカイン受容体、接着分子、腫瘍壊死因子の受容体、受容体のチロシンキナーゼ、ケモカイン受容体及び細胞表面の受容体の細胞外域可溶性の部位からなるグループから選択された一種である請求項７に記載のＤＮＡ作製物。
【請求項１０】
ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ、ＴＧＦ、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＨＲ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＴＮＦＲ、ＴＧＦＲ、ＩＦＮＲ、インターフェロン−αＲ、−βＲ及び−γＲ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、Ｇ−ＣＳＦＲ、ＥＰＯＲ、ｃＭｐｌ、ｇｐ１３０、Ｆａｓ（Ａｐｏ１）、ＣＣＲ１、ＣＸＣＲ１−４、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、Ｈｔｋ、ＲＥＫ７、Ｒｓｅ／Ｔｙｒｏ−３、肝細胞成長因子Ｒ、血小板−由来の成長因子Ｒ、Ｆｌｔ−１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ１００、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＬＡＧ−３、Ｂ７、Ｂ６１、β−ニューレキシン、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ−１、補体Ｒ−２（ＣＤ２１）、ＩｇＥＲ、リソソーム膜ｇｐ−１、α２−マクログロブリン受容体−連貫の蛋白質及びナトリウム排泄ペプチドＲからなるグループから選択される請求項９に記載のＤＮＡ作製物。
【請求項１１】
配列番号５、配列番号７、配列番号１７または配列番号１９の核酸配列を有する請求項７に記載のＤＮＡ作製物。
【請求項１２】
請求項７に記載のＤＮＡ作製物が、ベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミド。
【請求項１３】
プラスミドｐＴＲ１１−Ｔｏｐ１０’（寄託番号ＫＣＣＭ １０２８８）、プラスミドｐＴＲ２２−Ｔｏｐ１０’（寄託番号ＫＣＣＭ １０２８９）、プラスミドｐＣＤ２２Ｉｇ（寄託番号ＫＣＣＭ １０４０２）またはプラスミドｐＣＴ４４Ｉｇ（寄託番号ＫＣＣＭ １０４００）である、請求項１２に記載の組換え発現プラスミド。
【請求項１４】
請求項１２に記載の組換え発現プラスミドで形質転換または形質感染された宿主細胞。
【請求項１５】
哺乳動物の細胞である請求項１４に記載の形質転換体または形質感染体。
【請求項１６】
組換え発現プラスミドが、プラスミドｐＴＲ１１−Ｔｏｐ１０’（寄託番号ＫＣＣＭ １０２８８）、プラスミドｐＴＲ２２−Ｔｏｐ１０’（寄託番号ＫＣＣＭ １０２８９）、プラスミドｐＣＤ２２Ｉｇ（寄託番号ＫＣＣＭ １０４０２）またはプラスミドｐＣＴ４４Ｉｇ（寄託番号ＫＣＣＭ １０４００）である、請求項１４または１５に記載の形質転換体または形質感染体。
【請求項１７】
細胞株ＴＲ１１Ｉｇ−ＣＨＯ（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００４６）またはＴＲ２２Ｉｇ−ＣＨＯ（寄託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００４９）である、請求項１６に記載の形質転換体または形質感染体。
【請求項１８】
請求項１４に記載の形質転換または形質感染された宿主細胞を、同一な 免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジ部位に結合された連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物が発現されるのに適合した条件下で培養し、培養物から前記単量体蛋白質から形成された二量体蛋白質を分離精製する段階を含み、前記単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合された直列連鎖融合された二量体蛋白質を製造する方法。
【請求項１９】
連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物が、免疫グロブリンＦｃ片をコーディングする断片と免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ断片を結合させて単純融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物を製造し、製造されたＤＮＡ作製物を前記免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ断片と同一な第２のＤＮ断片と結合させて製造されたものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物に、糖化モーティブを挿入させることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
糖化モーティブが、細胞外域可溶性の部位の二つが互いに結合される部位近くに挿入される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記連鎖融合された単量体蛋白質にリーダ配列を含ませることを特徴とする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記連鎖融合された単量体蛋白質がＣＴＬＡ４であり、前記リーダ配列がＭＡＣＬＧＦＱＲＨＫＡＱＫＮＬＡＡＲＴＷＰＣＴＬＬＦＦＩＰＶＦＣＫＡのアミノ酸配列を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記リーダ配列がＡＣＬＧＦＱＲＨＫＡＱＫＮＬＡＡが除外されたＭＲＴＷＰＣＴＬＬＦＦＩＰＶＦＣＫＡのアミノ酸配列を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
形質転換体または形質感染体が哺乳動物の細胞である、請求項１８〜２４項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
同一な免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて形成された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合されて糖化され、増加した効能及び高度の安定性を有する直列連鎖融合された二量体蛋白質。
【請求項２７】
前記単量体蛋白質が、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２２または配列番号２４のアミノ酸配列を有する請求項２６に記載の二量体蛋白質。
【請求項２８】
同一な免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて糖化モーティブペプチドが挿入された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物。
【請求項２９】
配列番号９、配列番号１１、配列番号２１または配列番号２３である、請求項２８に記載のＤＮＡ作製物。
【請求項３０】
請求項２８に記載のＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミド。
【請求項３１】
プラスミドｐＴＲ１１Ｉｇ−ＭＧ（ＫＣＣＭ １０４０４）、ｐＴＲ２２Ｉｇ−ＭＧ（ＫＣＣＭ １０４０７）、ｐＣＤ２２Ｉｇ−ＭＧ（ＫＣＣＭ １０４０１）またはｐＣＴ４４Ｉｇ−ＭＧ（ＫＣＣＭ １０３９９）である、請求項３０に記載の組換え発現プラスミド。
【請求項３２】
請求項３０に記載の組換え発現プラスミドで形質転換または形質感染された宿主細胞。
【請求項３３】
哺乳動物の細胞である、請求項３２に記載の形質転換体または形質感染体。
【請求項３４】
請求項２による二量体蛋白質を含む薬剤学的または診断学的な組成物。
【請求項３５】
請求項２６による糖化された二量体蛋白質を含む薬剤学的または診断学的な組成物。
【発明の詳細な説明】
〔技術分野〕
本発明は、一般的に連鎖体の蛋白質に関する。更に具体的には、本発明は、一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位Ｃ−末端に、同一または異なっている他の一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位Ｎ−末端が結合された連鎖体の蛋白質、及び免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性蛋白質の直列連鎖体（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジ（ｈｉｎｇｅ）に結合されて融合された単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により形成された二量体（ｄｉｍｅｒ）蛋白質、並びにこの糖化された二量体蛋白質に関する。
【０００１】
〔背景記述〕
サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）は、ヒトの自家抗原（ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ）のように不適切な 刺激により病理学的に悪化した炎症反応が誘発するとき作用し、サイトカインの作用抑制剤である可溶性物質は、サイトカインを認識することができる抗体と可溶性受容体（ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）が使用されており、この物質に対する多くの特許がある（国際特許出願公開第ＷＯ９３／０１６１８４号、第ＷＯ９６／０２５７６号、第ＷＯ９６／０２３０６７号及び第ＷＯ１９９７／０３６８２号、及び米国特許第６，２２５，１１７号、第５，６５６，２７２号、第６，２１０，６６１号、第５，９７７，３１８号、第５，７８９，１９２号及び第５，４３４，１３１号）。前記の抗体と可溶性受容体の物質はサイトカインと予め結合し、サイトカインが細胞膜に存在する受容体と結合することを妨害したり、受容体と直接結合することによりサイトカインによる信号の伝達を抑制する共通的な機作を有している。
【０００２】
サイトカインの作用抑制剤として使用される可溶性受容体は、ヒト免疫グロブリン（ｈＩｇ、ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）の重鎖部位（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）と連結して使用できるものとして、カポン（Ｃａｐｏｎ ＤＪ）らの文献（Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５， １９８９）に開示されており、以後、可溶性受容体と抗体の融合蛋白質が多くの特許を通じて教示された（米国特許第５，８４４，０９５号、第６，２２５，４４８号、第６，０９０，９１４号、第６，１００，３８３号、第６，０４６，３１０号及び第５，５２１，２８８号）。
【０００３】
一般的に、サイトカインの可溶性受容体と免疫グロブリンの融合体は、元来分子の単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）または免疫グロブリンと融合されていない分子に比べ、以下のような長所を有している（カポンらの前記文献）：
１）二量体（ｄｉｍｅｒ）の形態で融合蛋白質は二価化（ｂｉｖａｌｅｎｃｙ）されるため、リガンド（ｌｉｇａｎｄ）に対する総親和力（ａｖｉｄｉｔｙ）が増加；
２）血清内で破壊されずに存在することができる期間の増加、すなわち、分子の安定性の増加；
３）免疫グロブリン重鎖のＦｃ（ｆｒａｇｍｅｎｔ ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）片を通じた効果細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｃｅｌｌ）の活性化；及び
４）蛋白質の分離精製の簡便性（例、プロテインＡを利用した分離精製）。
【０００４】
殆どの受容体の細胞外域（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）と免疫グロブリン上鎖間の融合体は、重鎖部位のＣＨ１ドメインを除いた形態で製作されているが、その結果、免疫グロブリンの軽鎖（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ）と結合されていない二量体として製造される。このように、免疫反応を媒介するのに関与する蛋白質または前記蛋白質の受容体の場合、元来分子の単量体よりは、免疫グロブリンと連結して使用することが好ましいということが知られている。更に具体的に詳察してみれば、サイトカインの一種類である腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ、以下「ＴＮＦ」と略する）の場合、ＴＮＦ−依存性の炎症反応を抑制するため国際特許出願公開第ＷＯ９２／１６２２１号及び第ＷＯ９５／３４３２６号のように腫瘍壊死因子の受容体（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下「ＴＮＦＲ」と略する）を使用したり、米国特許第５，４４７，８５１号及び国際特許出願公開第ＷＯ９４／０６４７６号のようにＴＮＦＲ−免疫グロブリンの融合蛋白質が使用されている。多くの文献によれば、ＴＮＦＲ−免疫グロブリンの融合蛋白質は、元来分子の単量体または免疫グロブリンと融合されていない分子よりも、ＴＮＦに対してより高い親和力（ａｆｆｉｎｉｔｙ）を有すると報告されている［レスラウア（Ｌｅｓｓｌａｕｅｒ Ｗ）らの文献（Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１： ２８８３， １９９１）、アシケナージ（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ Ａ）らの文献（ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８８： １０５３５， １９９１）、ペペル（Ｐｅｐｐｅｌ Ｋ）らの文献（Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７４： １４８３， １９９１）、モラー（Ｍｏｈｌｅｒ ＫＭ）らの文献（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１： １５４８，１９９３）］。
【０００５】
腫瘍壊死因子の作用を抑制したり、免疫反応を調節するにおいて、有効作用部位である腫瘍壊死因子の受容体、ＣＤ２及びＣＴＬＡ４の細胞外域の部位を多価化あるいは多量体化すれば、その効能の増加を予想することができるが、このような目的で腫瘍壊死因子の受容体の細胞外域の部位を免疫グロブリンの重鎖と連結して融合させた単量体蛋白質（重鎖融合の蛋白質）と、腫瘍壊死因子の受容体の細胞外域の部位を免疫グロブリンの軽鎖と連結して融合させた単量体蛋白質（軽鎖融合の蛋白質）を同時に一つの細胞株内で発現させれば、重鎖と軽鎖間の結合により二量体の構造の融合蛋白質を製造することができる。この際、二量体は、有効部位が生体内のように並列に配列された形態で製造され、その効能は従来の単量体に比べて顕著に増加されることが提示されたことがある［スケロン（Ｓｃａｌｌｏｎ ＢＪ）らの文献（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ７： ７５９， １９９５）］。
【０００６】
しかし、前記のような免疫グロブリン融合蛋白質の製造方法は、融合蛋白質を製造するとき、重鎖と軽鎖のそれぞれに融合させた二つの遺伝子を同時に生産細胞株に注入しなければならず、細胞が二種類の融合蛋白質を生産するとき二つの蛋白質の生産歩留まりが顕著に落ち、生産された重鎖融合蛋白質と軽鎖融合蛋白質が１００％結合されないため、単量体である重鎖融合蛋白質または軽鎖融合蛋白質から、重鎖融合蛋白質と軽鎖融合蛋白質が融合された二量体を純粋分離する工程などの技術的な困難により実用化するのが難しいという問題点がある。このような理由などで、これまでは免疫グロブリン融合蛋白質の製剤は、二つの融合蛋白質が互いに単純に並列配列された二量体の形態で製造されて使用されていた。
【０００７】
したがって、免疫反応に関与する蛋白質の効果を改善するため、単一の遺伝子を発現させて単一分子の形態の効能が改善された多価化あるいは多量体化された蛋白質の製剤を生産する方法に対する要求が多数存在していた。
【０００８】
〔発明の要約〕
本発明者らは、一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位Ｃ−末端に、同一または異なっている他の一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位Ｎ−末端が結合された連鎖体（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）の形態の蛋白質をＤＮＡ組換え技術により製造した。更に、本発明者らは、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジ（ｈｉｎｇｅ）部位に結合された単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ）された二量体（ｄｉｍｅｒ）蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物を製造した後、これを土台にＤＮＡ組換え技術を通じて直列連鎖融合された二量体蛋白質及びこの糖化蛋白質を生成し、更に本発明者らは、そのように生成された直列連鎖融合された二量体蛋白質及びこの糖化蛋白質が、単純融合された二量体蛋白質に比べて向上した効能を示し、特に連鎖融合された二量体蛋白質が糖化される場合、安定性が顕著に向上するということを見出した。
【０００９】
したがって、一つの観点として、本発明は、一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位Ｃ−末端に、同一または異なっている他の一つの生物学的な活性蛋白質の可溶性部位Ｎ−末端が結合された連鎖体の蛋白質を提供する。
【００１０】
他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合された二量体蛋白質を提供する。
【００１１】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物を提供する。
【００１２】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物を含んだ組換えＤＮＡプラスミドを提供する。
【００１３】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物を含んだ組換えＤＮＡプラスミドで形質転換または形質感染された宿主細胞を提供する。
【００１４】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物を含んだ組換えＤＮＡプラスミドで形質転換または形質感染された宿主細胞を、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物が発現されるようにすることにおいて適合した条件下で培養し、培養物から前記単量体蛋白質の二量体蛋白質を分離精製する段階を含み、前記単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により融合された二量体蛋白質を製造する方法を提供する。
【００１５】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングし、糖化モーティブが挿入されたＤＮＡ作製物を含んだ組換えＤＮＡプラスミドで形質転換または形質感染された宿主細胞を、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物が発現されるようにすることにおいて適合した条件下で培養し、培養物から糖質化された前記単量体蛋白質の二量体蛋白質を分離精製する段階を含み、前記単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により融合されて糖質化された二量体蛋白質を製造する方法を提供する。
【００１６】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物に糖化モーティブを挿入するために使用されるＤＮＡプライマーを提供する。
【００１７】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により融合されて糖化された二量体蛋白質を提供する。
【００１８】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により融合された二量体蛋白質を、薬剤学的な有効量で薬剤学的に許容される担体と共に含有する薬剤組成物を提供する。
【００１９】
更に他の観点として、本発明は、免疫反応に関与する蛋白質の直列連鎖体が免疫グロブリンＦｃ片のヒンジに結合されて融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部分でジスルフィド結合により融合されて糖化された二量体蛋白質を、薬剤学的な有効量で薬剤学的に許容される担体と共に含有する薬剤組成物を提供する。
【００２０】
〔発明の詳細な説明〕
一般的に、本発明は連鎖体の蛋白質に関し、より特定的には免疫接合体（Ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）に関する。免疫接合体の典型は、免疫グロブリンＦｃ領域と受容体または吸着分子のリガンド−結合領域を融合させた抗体−類似分子である。公知された典型的な免疫接合体は、抗原認知を担当する抗体分子の可変領域が受容体のリガンド−結合領域により置換され、抗体のＦｃ領域は保有される形態である。多くの文献を通じて構造的に多様な形態の免疫接合体が提示されてきた。しかし、本発明による免疫接合体の構造は、これまで公知された免疫接合体の構造とは異なり、また本発明による構造の免疫接合体を仮想的に、または推定的に製造することができるということを暗示した文献はない。
【００２１】
〔用語の定義〕
本発明による免疫接合体の構造的な特徴により、このような構造の特性上、本願明細書に使用される用語の定義を明確にする必要がある。一般的には、本発明において別に定義していない限り、全ての技術的及び科学的な関連用語は、この発明が属する技術分野で通常的に通用される意味を有する。しかし、以下の用語は通常的な意味を表すが、その意味を明確にし、かつ本発明の範囲を明確にするために以下のように定義する。
【００２２】
本願の明細書に使用された用語である「免疫グロブリン」は、多様な種類の抗原を特異的に認識するようにＢ細胞により生成され、Ｂ細胞の抗原受容体の役割を果たす蛋白質の分子を指す。この分子はＹの模様で、二つの同一な軽鎖と二つの同一な重鎖で構成される。軽鎖と重鎖は全て可変及び固定領域を含む。四つの鎖は、ヒンジ領域という重鎖のフレキシブル領域（ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ）に位置したジスルフィド結合により全て固定されている。重鎖と軽鎖の全ての可変領域は、結合して二つの同一な抗原−結合部位を形成する。重鎖の固定領域により免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）、Ｄ（ＩｇＤ）、Ｅ（ＩｇＥ）、Ｇ（ＩｇＧ）及びＭ（ＩｇＭ）の五つの部類に分けられる。それぞれの部類はイソタイプと言い、独特な構造的な特徴及び相異する生物学的な特性を有している。例えば、ＩｇＧはＦｃ構造において、他のイソタイプと若干相異する。更に、ＩｇＧ及びＩｇＡは多くのサブ部類がある。例えば、ヒトＩｇＧイソタイプ内に四つのサブ部類のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４があり、それぞれはγ１、γ２、γ３及びγ４の重鎖を有する。補体活性化、食細胞−Ｆｃ受容体への結合、抗原−依存の細胞毒性のような免疫グロブリン分子の機能は、重鎖のＦｃ領域に存在する構造的な決定因子により媒介される。このような重鎖のＦｃ領域は、本発明による二量体蛋白質の構成要素として使用され、前記全ての部類またはサブ部類の免疫グロブリンから由来することができる。
【００２３】
本願の明細書に使用された用語でる「免疫グロブリンＦｃ片」というのは、免疫グロブリン分子は、機能的に区分される片に分けられるが、この中に抗原結合力はないものの、容易に結晶体を形成する片としてヒンジ部位（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ）、ＣＨ２とＣＨ３ドメインが結合してなされ、抗体で効果物質及び細胞との結合に関与する部分を指す。したがって、本発明に関連して言及されるＦｃ片は、一部の文献に記述されたものとは異なる場合もあるが、ヒンジ領域を含み、これは単純に本発明を説明するにおいて便利を図るためのものとして、当業者は本願の明細書及び図面を参考して充分理解することができる。
【００２４】
本願の明細書に使用された用語である「生物学的な活性蛋白質」は、一般的に生理学的または薬物学的な活性を表す蛋白質、ペプチド及びポリペプチドを指し、連鎖体または免疫接合体を形成した後、固有活性のうち少なくとも一部分は維持される。本願において、「生物学的な活性」という用語は、生理学的または薬物学的な活性として限定されるものではない。例えば、酵素を含有したような一部の連鎖体は、有機溶媒として反応を触媒することができる。同様に、コンカナバリンＡ、免疫グロブリンなどのような蛋白質を含有した一部の高分子結合体は、また実験室の診断剤として有用である。
【００２５】
蛋白質、ペプチド及びポリペプチドとしてはこれらに限定されるものではないが、ヘモグロビン、血清蛋白質（例、因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸを含んだ血液因子）、免疫グロブリン、サイトカイン（例、インターロイキン）、α−、β−及びγ−インターフェロン、コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦを含む）、血小板誘導の成長因子（ＰＤＧＦ）及びホスホリパーゼ−活性化の蛋白質（ＰＬＡＰ）が含まれる。他の一般的な生物学的または治療学的な蛋白質としては、インシュリン、植物蛋白質（例、レクチン及びリシン）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）及び連関の対立形質体、成長因子（例、ＴＧＦαまたはＴＧＦβのような組織成長因子及び内皮成長因子）、ホルモン（例、小嚢−刺激ホルモン、甲状腺−刺激ホルモン、抗利尿ホルモン、色素性ホルモン及び副甲状腺ホルモン、黄体ホルモン分泌ホルモン及びその誘導体）、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ）、カルシトニン遺伝子関連のペプチド（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎ ｇｅｎｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＣＧＲＰ）、合成エンケファリン（ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ）、ソマトメジン、エリスロポエチン、視床下部の分泌因子、プロラクチン、慢性ゴナドトロピン、組織プラスミノゲン活性化剤、成長ホルモン分泌ペプチド（ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＧＨＲＰ）、胸腺体液性の因子（ｔｈｙｍｉｃ ｈｕｍｏｒａｌ ｆａｃｔｏｒ、ＴＨＦ）などが含まれる。免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びこれらの断片が含まれる。インターロイキン、インターフェロン及びコロニー刺激因子のような一部の蛋白質は、また普通の組換え技術を利用した結果として非糖化の形態で存在することができる。非糖化の形態もまた本発明の生物学的な活性物質に含まれる。
【００２６】
更に、本発明の生物学的な活性物質は、生体内の生活性（ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ）を証明するポリペプチド中、一部分を含む。この例としては、アミノ酸配列、抗体断片、単一鎖の結合抗原（参照：米国特許第４，９４６，７７８号）、抗体または断片の融合体を含んだ結合分子、ポリクロナル抗体、モノクロナル抗体、触媒性の抗体などが含まれる。その他の蛋白質としては、ブタクサ、抗原Ｅ、蜜蜂の毒液、ダニアレルゲンなどのようなアレルゲン蛋白質が含まれる。
【００２７】
更に、本発明の生物学的な活性物質は酵素を含む。酵素の例としては、炭水和物−特異的な酵素、蛋白質分解の酵素、酸化還元の酵素、トランスフェラーゼ剤、ヒドロラーゼ剤、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼが含まれる。具体的な酵素としてはこれらに限定されるものではないが、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、過酸化物ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ及びビリルビンオキシダーゼが挙げられる。炭水化合物−特異的な酵素の例としては、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルコウロニダーゼなどが含まれる。
【００２８】
本願の明細書に使用された用語である「免疫反応に関与する蛋白質」は、細胞性及び体液性の免疫反応で細胞間の信号伝達の過程を担当し、免疫反応を活性化または抑制させる蛋白質を総称する。免疫というのは、細菌またはウイルスなどの自分でないものから自分を保護する過程である。免疫反応は、細胞性及び体液性の免疫反応に分けられるが、Ｔ細胞とＢ細胞などのリンパ球が最も重要な役割を果たす。Ｔ細胞は、主に細胞性の免疫反応を主管し、ウイルスに感染された細胞や癌細胞などを直接的に攻撃して殺したり、免疫または炎症反応を活性化させるサイトカインという物質を分泌して他の免疫細胞の作用を助けたりもする。Ｂ細胞は、細菌とウイルスなどの自分でない外部の物質（抗原）が体内に入る場合、抗体を作ってこれを追い出しており、これを体液性の免疫反応という。細胞性の免疫と体液性の免疫は全て細胞間の信号伝達が非常に必須な過程であり、この過程で細胞内の信号伝達を担当する細胞表面の受容体蛋白質と、この受容体に結合される信号物質であるリガンド蛋白質が作用する。
【００２９】
本発明による免疫反応に関与する蛋白質の代表的な例としては、サイトカイン、サイトカイン受容体、接着分子（ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の受容体、酵素、受容体のチロシンキナーゼ、ケモカイン受容体、その他の細胞表面の蛋白質、可溶性リガンドなどが含まれる。サイトカインはこれらに限定されるものではないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ、ＴＧＦ、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＴＰＯ、Ｍ−ＣＳＦなどを含む。サイトカイン受容体はこれらに限定されるものではないが、成長ホルモンの受容体（ＧＨＲ）、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−９Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＴＮＦＲ、ＴＧＦＲ、ＩＦＮＲ（例、ＩＦＮ−γＲα−鎖、ＩＦＮ−γＲβ−鎖）、インターフェロン−αＲ、−βＲ及び−γＲ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、Ｇ−ＣＳＦＲ、ＥＰＯＲ、ｃＭｐｌ、ｇｐ１３０、Ｆａｓ（Ａｐｏ１）を含む。酵素はこれらに限定されるものではないが、インフルエンザＣヘマグルチニンエステラーゼ、ウロキナーゼなどを含む。ケモカイン受容体の例としては、ＣＣＲ１、ＣＸＣＲ１−４が挙げられる。受容体のチロシンキナーゼの例としては、ＴｒｋＡ、ＴｒｋＢ、ＴｒｋＣ、Ｈｔｋ、ＲＥＫ７、Ｒｓｅ／Ｔｙｒｏ−３、肝細胞の成長因子、血小板−由来の成長因子Ｒ、Ｆｌｔ−１が含まれる。他の細胞表面の蛋白質の例としては、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ１００、ＣＤ１３７、ＣＤ１５０、ＬＡＧ−３、Ｂ７、Ｂ６１、β−ニューレキシン、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＩＣＡＭ−１、補体Ｒ−２（ＣＤ２１）、ＩｇＥＲ、リソソーム膜ｇｐ−１、α２−マイクログロブリン受容体−連関の蛋白質、ナトリウム排泄ペプチドＲが挙げられる。可溶性リガンドとしてはこれらに限定されるものではないが、ＩＬ−１０、ヘレグリン、角化細胞の成長因子が含まれる。
【００３０】
本発明による免疫反応に関与する蛋白質に対するリガンド及び用途は、下記表１乃至７に要約した通り当業者によく知られている。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
【表２】
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【００３３】
【表３】
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【００３４】
【表４】
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【００３５】
【表５】
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【００３６】
【表６】
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【００３７】
【表７】
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【００３８】
本願の明細書に使用された用語である「細胞外域の可溶性部位（ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）」は、リン脂質で構成された細胞膜を貫通する蛋白質（ｉｎｔｅｇｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）において、疎水性のアミノ酸で構成されていて細胞膜を通過する部分（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）を基準に細胞外部に露出されている部分を指す。この部位は、殆ど親水性のアミノ酸が蛋白質の表面に向かう構造（ｆｏｌｄｉｎｇ）を取っていて水溶液上で可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）を表す。殆どの細胞表面の受容体蛋白質においてリガンドに結合する機能を担当することは細胞外域の部位であり、細胞内域の部位（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）は細胞内の信号伝達の機能を担当している。
【００３９】
本願の明細書に使用された用語である「直列連鎖融合された」というのは、二つの生物学的な活性蛋白質の可溶性の部位が連結されて一つの長いポリペプチドを形成している形態を指す。
【００４０】
本願の明細書に使用された用語である「連鎖体の蛋白質」は、直列連鎖融合された蛋白質を指す。例えば、免疫グロブリンＦｃ片のヒンジ部位に結合された免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位Ｃ−末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）に、これと同一な免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位Ｎ−末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ）がペプチド結合されて同一な二つの免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位が一つの長いポリペプチドを形成している形態を指す。
【００４１】
本願の明細書に使用された用語である「単純融合された単量体蛋白質」は、免疫グロブリンＦｃ片のヒンジ部位に免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位が結合されて一つのポリペプチドで形成された単量体の構造の融合蛋白質を指す。単純融合された単量体蛋白質は、便宜上「蛋白質の名称／Ｆｃ」と表記することができる。例えば、免疫反応に関与する蛋白質ＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位と免疫グロブリンＦｃ片が結合された単純融合された単量体蛋白質は、ＴＮＦＲ１／Ｆｃと表記される。更に、免疫グロブリンＦｃ片の由来を表記することができる。例えば、免疫グロブリンＦｃ片がＩｇＧ１から由来した場合には、ＴＮＦＲ１／ＩｇＧ１Ｆｃと表記される。
【００４２】
本願の明細書に使用された用語である「単純融合された二量体蛋白質」は、単純融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部位でジスルフィド結合により融合された二量体の構造の融合蛋白質を指す。単純融合された二量体蛋白質は、便宜上“［蛋白質の名称／Ｆｃ］２”と表記することができる。例えば、免疫反応に関与する蛋白質ＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位と免疫グロブリンＦｃ片が結合された単純融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部位でジスルフィド結合により融合された二量体の構造の融合蛋白質は、［ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２と表記される。同様に、免疫グロブリンＦｃ片の由来を表記することができる。例えば、免疫グロブリンＦｃ片がＩｇＧ１から由来した場合には、［ＴＮＦＲ１／ＩｇＧ１Ｆｃ］２と表記される。
【００４３】
本願の明細書に使用された用語である「連鎖融合された単量体蛋白質」は、単純融合された単量体蛋白質において、ヒンジ部位に結合された免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位Ｎ−末端に、これと同一な一つの免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位Ｃ−末端が直列の連鎖体の形態で結合され、一つのポリペプチドで形成された単量体の構造の融合蛋白質を指す。連鎖融合された単量体蛋白質は、便宜上「蛋白質の名称−蛋白質の名称／Ｆｃ」と表記することができる。例えば、免疫反応に関与する蛋白質ＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位と免疫グロブリンＦｃ片が結合された単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位に、同一なＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位が結合された連鎖融合された単量体蛋白質は、ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃと表記される。同様に、免疫グロブリンＦｃ片の由来を表記することができる。例えば、免疫グロブリンＦｃ片がＩｇＧ１から由来した場合には、ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／ＩｇＧ１Ｆｃと表記される。
【００４４】
本願の明細書に使用された用語である「連鎖融合された二量体蛋白質」は、連鎖融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部位でジスルフィド結合により融合された二量体の構造の融合蛋白質を指す。連鎖融合された二量体蛋白質は、便宜上“［蛋白質の名称−蛋白質の名称／Ｆｃ］２”と表記することができる。例えば、免疫反応に関与する蛋白質ＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位と免疫グロブリンＦｃ片が結合された単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位に、同一なＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位が結合された連鎖融合された単量体蛋白質の二つがヒンジ部位でジスルフィド結合により融合された二量体の構造の融合蛋白質は、［ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２と表記される。同様に、免疫グロブリンＦｃ片の由来を表記することができる。例えば、免疫グロブリンＦｃ片がＩｇＧ１から由来した場合には、［ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／ＩｇＧ１Ｆｃ］２と表記される。
【００４５】
本願の明細書に使用された「ベクタ」という用語は、外来の遺伝子を宿主細胞内に安定的に運搬することができる運搬体としてのＤＮＡ分子を言う。有用なベクタになるためには複製が可能であるべきであり、宿主細胞内に流入することができる法案を備えなければならず、自分の存在を検出することができる手段を具備しなければならない。ここで、外来の遺伝子としては、例えば、連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物がそれに該当される。
【００４６】
本願の明細書に使用された「組換え発現プラスミド」という用語は、一般的に外来の遺伝子が宿主細胞で発現されるようにベクタに作動的に連結されて形成された環状のＤＮＡ分子を言う。組換え発現ベクタは、一旦宿主細胞内にあれば宿主の染色体ＤＮＡに拘わらず複製が可能であり、ベクタの数個のコピー及びそれの挿入された異種ＤＮＡを生成することができる。当業界で公知されている通り、宿主細胞で形質感染遺伝子の発現水準を高めるためには、該当遺伝子が、選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解毒発現の調節配列に作動的に連結されなければならない。好ましくは、発現調節の配列及び該当遺伝子は、細菌の選択マーカー及び複製開始点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｒｉｇｉｎ）を共に含んでいる、一つの発現ベクタ内に含まれるようになる。発現宿主が真核細胞である場合には、発現ベクタは 真核発現の宿主内で有用な発現マーカーを更に含まなければならない。
【００４７】
本願の明細書に使用された「作動的に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、ベクタの各構成成分が固有な作用ができるように形成された成分の配列を意味する。したがって、コーディング配列に作動的に連結された調節配列（ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、コーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる。調節配列がコーディング配列の発現を指示するように作用する限り、調節配列がコーディング配列と隣接している必要はない。例えば、介在配列（ｉｎｔｅｒｖｅｎｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）がプロモーター配列とコーディング配列間に存在することができるが、この場合、プロモーター配列はコーディング配列に「作動的に連結」されたと言える。
【００４８】
本願の明細書に使用される宿主細胞は、原核または真核生物の細胞であってもよい。更に、ＤＮＡの導入効率が高く、導入されたＤＮＡの発現効率が高い宿主が通常的に使用される。Ｅ．コリ、シュードモナス、バチルス、ストレプトマイセス、真菌、酵母のような周知の真核及び原核宿主、ハスモンヨトウ近似種（ＳＦ９）のような昆虫細胞、チャイニズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）及びマウス細胞のような動物細胞、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ヒト胎児腎臓２９３細胞（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）、ＢＳＣ １、ＢＳＣ ４０及びＢＭＴ １０のようなアフリカグリーン猿細胞、及び組織培養されたヒト細胞は、使用可能である宿主細胞の例である。本発明の融合蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物をクローニングするときには、動物細胞を宿主とすることが好ましい。ＣＯＳ細胞を利用する場合には、ＣＯＳ細胞でＳＶ４０ラージＴアンチゲン（ｌａｒｇｅ Ｔ ａｎｔｉｇｅｎ）が発現しているため、ＳＶ４０の複製開始点を有するプラスミドは細胞中で多数のコピー（ｃｏｐｙ）のエピソーム（ｅｐｉｓｏｍｅ）として存在するようになり、通常より高発現を期待することができる。導入されたＤＮＡ配列は、宿主細胞と同一な種から得られるか、宿主細胞と異なる種であるか、またはそれはいずれの異種または相同性ＤＮＡを含むハイブリッドＤＮＡ配列であっても構わない。
【００４９】
本発明による直列連鎖体の形態の融合蛋白質をコーディングするＤＮＡ配列を発現させるため、非常に多様な発現宿主／ベクタの組合が利用され得る。真核宿主に適合したベクタには、例えば、ＳＶ４０、牛乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、アデノ−関連ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス及びレトロウイルスから由来した発現調節の配列を含む。細菌宿主に使用することができる発現ベクタには、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＧＥＸ２Ｔ、ｐＵＣ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びこれらの誘導体のように、Ｅ．コリから得ることを例示することができる細菌性のプラスミド、ＲＰ４のようにより広い宿主の範囲を有するプラスミド、λｇｔ１０とλｇｔ１１、ＮＭ９８９のような非常に多様なファージラムダ（ｐｈａｇｅ ｌａｍｂｄａ）誘導体として例示することができるファージＤＮＡ、及びＭ１３とフィラメント性単一鎖のＤＮＡファージのようなその他のＤＮＡファージが含まれる。酵母細胞に有用な発現ベクタは、２μプラスミド及びその誘導体である。昆虫細胞に有用なベクタはｐＶＬ９４１である。
【００５０】
本願の明細書に使用された用語である「形質転換」は、ＤＮＡを宿主として導入し、ＤＮＡが染色体外の因子として、または染色体の統合完成により複製可能になることを意味する。
【００５１】
本願の明細書に使用された用語である「形質感染」は、任意のコーディング配列が実際に発現されるか否かに拘わらず、発現ベクタが宿主細胞により受容されることを意味する。
本願の明細書に使用された用語である「モーティブ配列」は、発現された蛋白質が細胞膜外に輸送されるように誘導するアミノ酸配列として、リーダ配列とも言う。細胞膜外に輸送される表面の蛋白質あるいは分泌蛋白質は、一般的に細胞膜からモーティブペプチダーゼ（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ）により切断されるＮ−末端の配列を有している。この特定のＮ−末端の配列をモーティブ配列またはペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）、あるいはリーダ配列またはペプチド（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）と言う。分泌（輸送）が可能な蛋白質あるいは細胞外膜や周辺の細胞質に存在する全ての蛋白質は、全て自分のみのための特定のモーティブ配列を有している。このようなそれぞれの蛋白質が有しているモーティブ配列間には、特別な相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）を有しておらず、同じ蛋白質であっても由来した宿主（ｈｏｓｔ）によりそのモーティブ配列が異なることが分かる。モーティブ配列が作用するためには、その１次の構造、すなわちアミノ酸配列からそれらが有している２次の構造あるいは非極性、電荷残基（ａｐｏｌａｒ、ｃｈａｒｇｅｄ ｒｅｓｉｄｕｅ）の分布が更に重要である。このような特徴を有するモーティブ配列間には、特別な相同性はないが、いくつかの共通の特徴はある。モーティブ配列は、まずＮ−末端の方に一つあるいはいくつかの非常に短い正電荷を帯びた親水性の領域（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｒｅｇｉｏｎ）であるＮドメインがあり、このドメインに次いで多少長い疎水性の領域であるＨ−ドメインが繋がっている。大腸菌である場合、モーティブ配列の長さは約１８〜３０個のアミノ酸で構成されている。Ｎ−ドメインは極性を示し（ｐｏｌａｒ）、Ｌｙｓ、Ａｒｇのような正電荷を帯びたアミノ酸が多く存在する。Ｈ−ドメインには、主に疎水性の残基と、Ａｌａ、Ｌｅｕのようなアミノ酸が多く存在し、Ｐｒｏ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｕのように極性を示したり、電荷を帯びたアミノ酸は稀である。代わりに多量のＡｌａ、Ｌｅｕは、モーティブペプチドα−螺旋構造を成して膜転移がより容易に起きるように助ける。Ｈ−ドメインと実際に分泌しようとする蛋白質の間にはＣ−ドメインが存在する。この領域は、一般的に疎水性が小さく、ＬｅｂＢ、ＬｓｐＡのようなモーティブペプチダーゼにより認識が可能な配列がある。今までこのモーティブペプチダーゼが正確にどの部位を切断しているのかは正確に予測できないが、一般的にＣ−領域にあるＡｌａ−Ｘ−Ａｌａ配列の次の部分を大部分切断している。前記で言及したモーティブ配列を有している前蛋白質（ｐｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）は、種々の蛋白質と相互作用をし、細胞膜に到達した後、モーティブペプチダーゼにより特定の部位が切断された後、成熟した形態の蛋白質に変わる。このような特徴を有するモーティブ配列は、細胞表面の発現母体を選択するのにおいて非常に重要な役割を果たす。外来の蛋白質と融合された蛋白質は、安定的に細胞の表面外に非常に高効率で移動しなければならない。一般的に、表面発現の母体を選択するのにおいて、優れた分泌能を有した表面の蛋白質を選択しなければならず、通常的に分泌能に優れた分泌���ーティブ配列を有している表面の蛋白質を利用する。
【００５２】
〔本発明による連鎖融合された二量体蛋白質の製造〕
本発明による連鎖融合された二量体蛋白質は、一般的に、（ａ） 免疫グロブリンＦｃ片をコーディングする遺伝子と、免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングする遺伝子から単純融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物を製造し、（ｂ） 製造された単純融合された単量体蛋白質のコーディングＤＮＡ作製物及び前記免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングする遺伝子に、同一な制限酵素の認識配列を重合酵素の連鎖反応により挿入し、（ｃ） 前記制限酵素の認識配列と一致する制限酵素を使用し、前記単純融合された単量体蛋白質のコーディングＤＮＡ作製物及び前記免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングする遺伝子の制限酵素の認識配列の部位を切断し、（ｄ） 両方のＤＮＡ配列の切断された部分をリガーゼで連結して連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物を製造し（図２）、（ｅ） 製造された連鎖融合された単量体蛋白質のコーディングＤＮＡ作製物をベクタに作動的に連結して組換え発現プラスミドを作製し、（ｆ） 作製された組換え発現プラスミドで宿主細胞を形質転換または形質感染させ、（ｇ） 形成された形質転換体または形質感染体を連鎖融合された単量体蛋白質のコーディングＤＮＡ作製物が発現されるのに適切した条件下で培養し、培養物から目的する連鎖融合された二量体蛋白質を分離精製することにより製造される。
【００５３】
免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ断片は、特定の制限酵素の認識配列とリーダ配列のコーディング配列を有する一つのプライマーと、前記細胞外域可溶性の部位３’末端の配列と免疫グロブリンＦｃの特定の部位５’末端の一部配列をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマーを使用し、重合酵素の連鎖反応により生成する。
【００５４】
免疫グロブリンＦｃの特定の部位をコーディングするＤＮＡ断片は、前記免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位３’末端の一部配列を含み、前記免疫グロブリンＦｃの特定の部位５’末端をコーディングする配列を有する一つのプライマーと、特定の制限酵素の認識配列と免疫グロブリンＦｃの特定の部位３’末端をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマーを使用し、重合酵素の連鎖反応を利用して生成する。
【００５５】
このように生成された前記免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ断片と、免疫グロブリンＦｃの特定の部位をコーディングするＤＮＡ断片を一つの試験管で混合し、ＤＮＡ鎖を分離した後、共通の配列間で相補的な結合が起きるように誘導する。以後、重合酵素を利用して各ＤＮＡ鎖の３’末端から重合反応を起こし、完全な二鎖のＤＮＡ断片を生成する。これを鋳型とし、前記蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングする配列を有するプライマーと、前記免疫グロブリンＦｃの特定の部位３’末端をコーディングするプライマーを使用した重合酵素の連鎖反応を起こし、前記蛋白質の細胞外域可溶性の部位のＤＮＡ断片と前記免疫グロブリンＦｃの特定の部位ＤＮＡ断片の配列を含む免疫グロブリンの融合遺伝子を増幅させる。
【００５６】
このように生成された免疫グロブリンの融合遺伝子と前記蛋白質の細胞外域可溶性の部位の配列を有するＤＮＡ断片に、同一な制限酵素の認識配列を重合酵素の連鎖反応を利用して挿入した後、制限酵素を使用して前記制限酵素の認識配列の部位を切断し、切断された部分をリガーゼで連結して連鎖体の形態の免疫グロブリンの融合遺伝子を製造する。
【００５７】
このような免疫グロブリンの融合遺伝子は、蛋白質の細胞外の分泌を促進するため、蛋白質にモーティブ配列が含まれるように製作することができる。例えば、ＣＴＬＡ−４分子は非正常的に長く、水溶性の高いＮ−末端に親水性の高い余裕分（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）を有する非常に特異なリーダ配列を有している（Ｈａｒｐｅｒ Ｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７： １０３７−１０４４， １９９１； ａｎｄ Ｂｒｕｎｅｔ ＪＦ， Ｎａｔｕｒｅ ３２８： ２６７−２７０， １９８７）。通常的に殆どの膜表面の蛋白質や分泌型の蛋白質は、そのＮ−末端に疎水性が高い２０〜２４個のアミノ酸で構成されるリーダ配列を有する。しかし、本ＣＴＬＡ−４分子は、１６個の親水性が高いＮ−末端の１６個のアミノ酸と、疎水性が高い典型的な膜領域に該当する２１個のアミノ酸など、総３７個のアミノ酸で構成されている。したがって、従来にはＣＴＬＡ４Ｉｇ融合蛋白質を製造するとき、分子のリーダ配列をオンコスタチンＭ（Ｌｉｎｓｌｅｙ ＰＳ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７４： ５６１−５６９， １９９１）あるいはＩＬ−６（Ｙａｍａｄａ Ａ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４０： ５１３−５１８， １９９６）のリーダ配列で全て交替して発現していた。本発明者らに至って、ＣＴＬＡ４の場合、ＡＣＬＧＦＱＲＨＫＡＱＫＮＬＡＡの１６個のアミノ酸が除外された「ＭＲＴＷＰＣＴＬＬＦＦＩＰＶＦＣＫＡ」配列をリーダ配列に利用することが好ましく、この場合が発現細胞外に分泌が最も容易になされるということが確認された（国際特許出願公開第ＷＯ９８／３１８２０号）。
【００５８】
前記製造された免疫グロブリン融合遺伝子をベクタに挿入して組換え発現プラスミドを製造した後、このプラスミドを宿主細胞に導入して形質感染体または形質転換体を製造し、これらの細胞を増幅培養して生成された連鎖体の形態の融合蛋白質を精製することにより、目的する連鎖融合された二量体蛋白質を得ることができる。
【００５９】
好ましくは、本発明による連鎖融合された二量体蛋白質の製造のため使用される宿主細胞は、骨髄腫細胞株、ＣＨＯ細胞、猿ＣＯＳ細胞、ヒト胎児腎臓２９３細胞及びバキュロウイルス−感染の昆虫細胞である。これらのシステムで形成された目的のポリペプチドは、集合して細胞の培養培地に分泌される。その後、本発明の連鎖融合された二量体蛋白質は免疫グロブリンと相当な部分で同一な方式によりプロテインＡまたはプロテインＧの親和性クロマトグラフィーにより実質的に精製することができる。事実に、効率的な哺乳動物の細胞発現及びこのような類型の精製は、免疫反応に関与する蛋白質を二量体蛋白質として発現するのに相当な利点になる。
【００６０】
〔本発明による糖化された連鎖融合された二量体蛋白質の製造〕
宿主細胞として真核細胞により生成される分泌蛋白質は、糖鎖の修飾により変形される。糖鎖の修飾は、蛋白質の物理的な性質はもちろん、蛋白質の生体内における安定性及び機能にも影響を及ぼすことと知られている。したがって、本発明の一つの好ましい様態は、宿主細胞として前記の動物細胞株を利用した遺伝子の組換え技術を利用して目的する連鎖融合された二量体蛋白質の生産を容易にし、更に体内の安定性を増加させるため免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位に付加的な糖鎖を添加することを含む。
【００６１】
糖鎖の修飾には二つの類型がある。一つは、Ｏ−型糖鎖修飾としてアミノ酸セリンやスレオニンの残基にオリゴ糖が結合することであり、もう一つは、Ｎ−型糖鎖修飾としてアスパラギンの残基にオリゴ糖が結合する形態である。特に、Ｎ−型糖鎖修飾は、特定のアミノ酸の配列を有するとき起こり、その配列はＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒと知られている（ここで、Ｘはプロリンを除いたいずれのアミノ酸でもよい）。Ｎ−連結のオリゴ糖とＯ−連結のオリゴ糖の構造は互いに異なり、一般的に各タイプから発見される糖残基もまた相異する。例えば、Ｏ−連結の糖残基では、Ｎ−アセチルガラクトサミンが変わりなくセリンやスレオニンに連結されている。全てのＮ−連結のオリゴ糖では、Ｎ−アセチルグルコサミンがアスパラギンに連結されている。Ｏ−連結のオリゴ糖は、一般的に１〜４個の糖残基のみを含んでいる反面、Ｎ−連結のオリゴ糖はＮ−アセチルグルコサミンとマンノースを常に含み、少なくとも５個以上の糖残基からなっている。
【００６２】
本発明は、付加的な糖鎖の結合部位を有するように免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ配列上に、前記のＯ−型またはＮ−型の糖鎖修飾が発生するように一つ以上のヌクレオチドを変異させ、そのＤＮＡを動物の宿主細胞を通じて発現しながら自然的に糖鎖修飾が起きるようにすることである。一つの様態として、本発明による糖化された連鎖融合された二量体蛋白質は、Ｎ−型の糖鎖修飾を起きることができるＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列が付加及び／または増加するように、免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ配列を変異させることにより達成される。
【００６３】
糖化のためのＤＮＡ配列の変異は、通常的な方法により実施することができる。一つの好ましい様態として、連鎖体の結合部位、すなわち二つの免疫反応に関与する蛋白質の細胞外域可溶性の部位が細胞内の蛋白分解酵素の攻撃から保護されるようにし、血中における半減期を増加させる効果を得るため、互いに結合される部位に重合酵素の連鎖反応を利用して多糖化（ｍｕｌｔｉｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）で修飾される連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物を製作することができる。特定的な様態として、糖化モーティブペプチド配列は、制限酵素ＥｃｏＲＩと細胞外域可溶性の部位のリーダ配列を含んだ一つのプライマーと、連鎖体の形態の融合遺伝子の一番目の細胞外域可溶性の部位３’末端の一部をコーディングする塩基配列と、二番目の細胞外域可溶性の部位５’末端の一部をコーディングする塩基配列を有し、糖化モーティブで置換された塩基配列を有するアンチセンスプライマーを利用して重合酵素の連鎖反応を通じて製作したＤＮＡ断片と、連鎖体の形態の融合遺伝子の一番目の細胞外域可溶性の部位３’末端の一部をコーディングする塩基配列と、二番目の細胞外域可溶性の部位５’末端の一部をコーディングする塩基配列を有し、糖化モーティブで置換された塩基配列を有する一つのプライマーと免疫グロブリンＧ１のＦｃ部位の３’末端と制限酵素ＸｂａＩをコーディングするアンチセンスプライマーを利用した重合酵素の連鎖反応で製作されたＤＮＡ断片を一つの試験管に同時に入れ、２次の重合酵素の連鎖反応を行うことにより挿入した。
【００６４】
本発明の具体的な様態は、免疫反応に関与する蛋白質であるＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２、ＣＤ２及びＣＴＬＡ４の細胞外域可溶性の部位を含む。これらの様態に関する添付の図面、配列目録及び実施例を参考とし、本発明を具体化する。
【００６５】
腫瘍壊死因子−α［ＴＮＦ−α、カケクチン（ｃａｃｈｅｃｔｉｎ）としても知られている。］と腫瘍壊死因子−β［ＴＮＦ−β、リンホトキシン（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ）としても知られている。］は、多面的なサイトカインとして炎症、細胞免疫反応、敗血症、細胞毒性、悪液質、リューマチ性関節炎、炎症関連疾患［タルタグリア（Ｔａｒｔａｇｌｉａ ＬＡ）らの文献（Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １３： １５１， １９９２）］と抗ウイルス性反応［ブトラー（Ｂｕｔｌｅｒ Ｐ）の文献（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｇｒｏｗｔｈ ＦａｃｔｏｒＩＩ， １９９０， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， ｐｐ．３９−７０）］を誘発する。細胞毒性を含んだ殆どのＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの作用は、これらのそれぞれが三重体の形態でＴＮＦ受容体に結合することに起因する［エック（Ｅｃｋ ＭＪ）らの文献（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７： ２１１９， １９９２）］。ＴＮＦ受容体には、分子量５５キロダルトン（ＫＤａ）のタイプＩ（ＴＮＦＲ１、ｐ５５）と分子量約７５キロダルトン（ＫＤａ）のタイプＩＩ（ＴＮＦＲ２、ｐ７５）の２種類が存在する［スミス（Ｓｍｉｔｈ ＣＡ）らの文献（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８： １０１９，１９９０）、ロウチャー（Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ Ｈ）らの文献（Ｃｅｌｌ ６１： ３５１， １９９０）、シャル（Ｓｃｈａｌｌ）らの文献（Ｃｅｌｌ ６１： ３６１， １９９０）］。この二つの受容体は、全てＴＮＦ−αとＴＮＦ−βに対して殆ど類似する親和力を表すと報告されている（シャルらの前記文献）。これらの可溶性受容体の免疫グロブリンとの融合蛋白質は、ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βを結合することにより細胞膜に存在する受容体との結合を妨害し、その作用を抑制する効果を示し、ＴＮＦ−依存性の炎症を緩和させることができる効果的な物質として使用されている。
【００６６】
免疫反応を調節する細胞表面の抗原中にＴリンパ球の充分の活性反応を得るための２次刺激を提供する空調刺激系の抗原であるＣＤ２及びＣＴＬＡ４の場合も、腫瘍壊死因子の受容体と同様な方法で可溶性の形態の場合、各種の免疫疾患を治療することができる治療剤として使用され得る。体内の免疫反応は、Ｔリンパ球の特定の受容体と結合する抗原提示細胞の表面抗原の分子、すなわち、Ｔリンパ球と抗原提示細胞の白血球の抗原分子により構成され、抗原提示過程中に２次信号である空調信号がなければ、Ｔリンパ球は細胞死滅またはクローン活性の無力化の誘導により消滅される。ＣＤ２の場合は、抗原提示細胞のＬＦＡ−３と結合するＴリンパ球の白血球の抗原として白血球の細胞付着及び同調刺激に関与し、ＣＤ２８による同調刺激に並行してＴリンパ球の活性化を促進する。ＣＴＬＡ４の場合は、Ｔ−リンパ球が活性化した後に発現され、休息期になれば発現量が増加する様相を表す。ＣＴＬＡ４は抗原提示細胞のＢ７との結合力がＣＤ２８の２０倍以上であり、Ｂ７と結合した後、Ｔ−リンパ球の活性を抑制する信号を伝達する。
【００６７】
一つの部類の特定の様態として、本発明は、配列番号６の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃ、配列番号８の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／Ｆｃ、配列番号１８の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＣＤ２−ＣＤ２／Ｆｃ及び配列番号２０の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／Ｆｃを提供する。
【００６８】
他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号５の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物（ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１−ＩｇＧ）、配列番号７の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物（ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２−ＩｇＧ）、配列番号１７の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＣＤ２−ＣＤ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物（ＣＤ２−ＣＤ２−ＩｇＧ）及び配列番号１９の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物（ＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４−ＩｇＧ）を提供する。
【００６９】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号５の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＴＲ１１Ｉｇ−Ｔｏｐ１０’、配列番号７の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＴＲ２２Ｉｇ−Ｔｏｐ１０’、配列番号１７の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＣＤ２−ＣＤ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＣＤ２２Ｉｇ及び配列番号１９の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＣＴ４４Ｉｇを提供する。これらの組換え発現プラスミドは、ブダペスト協約下の国際寄託機関であるＫＣＣＭに寄託し、それぞれ受託番号ＫＣＣＭ １０２８８、ＫＣＣＭ １０２９１、ＫＣＣＭ １０４０２及びＫＣＣＭ １０４００が付与された 。
【００７０】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号５の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＴＲ１１Ｉｇ−Ｔｏｐ１０’で形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞（例、ＴＲ１１Ｉｇ−ＣＨＯ）、配列番号７の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＴＲ２２Ｉｇ−Ｔｏｐ１０’で形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞（例、ＴＲ２２Ｉｇ−ＣＨＯ）、配列番号１７の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＣＤ２−ＣＤ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＣＤ２２Ｉｇで形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞及び配列番号１９の直列連鎖融合された単量体蛋白質ＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＣＴ４４Ｉｇで形質感染または形質転換された哺乳動物の宿主細胞を提供する。前記組換え発現プラスミドｐＴＲ１１Ｉｇ−Ｔｏｐ１０’で形質感染されたチャイニズハムスター卵巣細胞株ＴＲ１１Ｉｇ−ＣＨＯ及び前記組換え発現プラスミドｐＴＲ２２Ｉｇ−Ｔｏｐ１０’で形質感染されたチャイニズハムスター卵巣細胞株ＴＲ２２Ｉｇ−ＣＨＯは、ブダペスト協約下の国際寄託機関であるＫＣＣＭに寄託し、それぞれ受託番号ＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００４６及びＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００４９が付与された。
【００７１】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号１０の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃ、配列番号１２の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／Ｆｃ、配列番号２２の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＣＤ２−ＣＤ２／Ｆｃ及び配列番号２４の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／Ｆｃを提供する。
【００７２】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号９の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物、配列番号１１の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物、配列番号２１の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＣＤ２−ＣＤ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物及び配列番号２３の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物を提供する。糖化モーティブペプチドを生成することができるようにするため、ＴＮＦＲ／Ｆｃ、ＣＤ２／Ｆｃ及びＣＴＬＡ４／Ｆｃの連鎖体の形態の融合遺伝子の細胞外域可溶性の部位の結合部位をコーディングする塩基配列に該当する両方向のプライマーを製作した。このプライマーは、連鎖体の形態の融合遺伝子の任意のアミノ酸をコーディングする塩基配列がアスパラギン（ａｓｐａｒａｇｉｎ、Ｎ）をコーディングする塩基配列（ＡＡＴ、ＡＡＣ）で置換され得る塩基配列と、セリン（ｓｅｒｉｎｅ、Ｓ）あるいはスレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔ）をコーディングする塩基配列（セリン：ＴＣＣ、スレオニン：ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＡ）で置換され得る塩基配列を有するようにした。プライマーの製作時、複数のアミノ酸のコード配列中から一つの配列を選択することは、重合酵素の連鎖反応の効率を最大化するため塩基配列が最小に置換され得る条件及びプライマー結合温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ、Ｔｍ）を考慮して決定された。
【００７３】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号９の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＴＲ１１Ｉｇ−ＭＧ、配列番号１１の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＴＲ２２Ｉｇ−ＭＧ、配列番号２１の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＣＤ２−ＣＤ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＣＤ２２Ｉｇ−ＭＧ及び配列番号２３の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＣＴ４４Ｉｇ−ＭＧを提供する。これらの組換え発現プラスミドは、ブダペスト協約下の国際寄託機関であるＫＣＣＭに寄託し、それぞれ受託番号ＫＣＣＭ １０４０４、ＫＣＣＭ １０４０７、ＫＣＣＭ １０４０１及びＫＣＣＭ １０３９９が付与された。
【００７４】
更に他の部類の特定の様態として、本発明は、配列番号９の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＴＲ１１Ｉｇ−ＭＧで形質転換または形質感染された哺乳動物の宿主細胞、配列番号１１の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＴＲ２２Ｉｇ−ＭＧで形質転換または形質感染された哺乳動物の宿主細胞、配列番号２１の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＣＤ２−ＣＤ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＣＤ２２Ｉｇ−ＭＧで形質転換または形質感染された哺乳動物の宿主細胞及び配列番号２３の糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物がベクタに作動的に連結された組換え発現プラスミドｐＣＴ４４Ｉｇ−ＭＧで形質転換または形質感染された哺乳動物の宿主細胞を提供する。
【００７５】
本発明により製造された形質転換体または形質感染体を培養し、培養物から分離された本発明の直列連鎖融合された二量体蛋白質は、前記表１に記載した通り免疫グロブリンに結合された連鎖体の形態の免疫反応に関与し、蛋白質の種類によって治療剤、診断剤及び研究用のツールとして多様に、かつ有用に使用することができ、これらの用法は当業者によく知られている。特に治療剤として使用する場合には、通常的に知られている有効量を適用することができるが、特定の患者に対する特定の有効量は、使用された特定の化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、規定式、投与時間、投与経路、排出率、薬物の配合及び予防または治療される特定の疾患の重症を含んだ、種々の要因により変わるということは理解できるだろう。更に、当業者は、本発明による直列連鎖融合された二量体蛋白質が治療剤として使用される場合、これらの投与方式及び経路も免疫反応に関与する蛋白質の通常的な投与方式及び経路が適用できるということを理解しているだろう。
【００７６】
本発明は、下記の実施例により、更に具体的に説明されるだろう。しかし、これらの実施例は単純に本発明を例示するためのものとして、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されないということは当業者において自明であろう。説明の便宜のため、本発明に関連し、下記の実施例により製造されたＤＮＡ作製物、組換え発現プラスミド、形質転換の細胞株、使用されたプライマーに関する配列目録及び寄託情報を下記表８及び９に要約する。
【００７７】
【表８】
2004521655.tif 000010
【００７８】
【表９】
2004521655.tif 000011
【００７９】
〔実施例１〕
人体ＴＮＦＲ
Ａ．単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物の製造（図１及び図５）
ａ．ＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ断片
人体ＴＮＦの受容体タイプＩ（ＴＮＦＲ１、ｐ５５）の細胞外域可溶性の部位と人体免疫グロブリンＧ１のＦｃ部位が連結された融合遺伝子を製造するため、文献［ホルトンらのＢｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８： ５２８， １９９０］に記述されている方法と同様な方法で重合酵素の連鎖反応の方法（ＰＣＲ）を行った。
【００８０】
制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列とリーダ配列（配列番号２のペプチド１−２０）のコーディング配列を有する一つのプライマー（配列番号２５のヌクレオチド）と、前記細胞外域可溶性の部位（ＴＮＦＲ１−ＥＤ）３’末端の配列と免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のヒンジ部位（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ：Ｈ）の５’末端の一部配列をコーディングするアンチセンス配列（配列番号２６のヌクレオチド）を有する他のプライマーを使用し、重合酵素の連鎖反応によりＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ断片を生成した。この反応のための鋳型ｃＤＮＡは、健康な成人の単核球細胞（Ｔリンパ球）から抽出したｍＲＮＡを逆転写−重合酵素の連鎖反応を利用して製造した。
【００８１】
健康な成人の血液を採取し、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， ＵＳＡ）培地と１：１で希釈し、これをＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＳＡ）を使用して密度勾配の遠心分離（ｄｅｎｓｉｔｙ−ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）して上部に形成されたＴリンパ球の細胞層を得た。そして、ＲＰＭＩ−１６４０培地で３回洗浄し、ここに１０％牛胎児血清（ＦＢＳ， ＧｉｂｃｏＢＲＬ， ５ＵＳＡ）含有ＲＰＭＩ−１６４０培地を加えてＴリンパ球の細胞を５×１０５個／ｍｌとし、ｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， ＵＳＡ）を３．５μｇ／ｍｌになるように添加した後、５％ＣＯ２の培養基で、３７℃、２日間培養した。
【００８２】
ｍＲＮＡは、Ｔｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭＲＣ， ＵＳＡ）ｍＲＮＡの分離キットを利用して純粋分離した。まず、ヒトＴリンパ球の２×１０７個の細胞をリン酸緩衝生理食塩水溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ， ＰＢＳ， ｐＨ ７．２）で３回洗浄した後、１ ｍｌのＴｒｉ−Ｒｅａｇｅｎｔで数回混合してＲＮＡを溶解させた。このチューブに０．２ ｍｌのクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）を添加して激しく揺らした後、室温で１５分間放置した後、４℃で１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上層液を１．５ ｍｌのチューブに移し、０．５ ｍｌのイソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）を添加した後、４℃で１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上層液を捨てた後、沈殿物に、７５％エタノール（Ｅｔｈａｎｏｌ）−２５％ＤＥＰＣ（Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）を処理した３次の蒸留水を１ ｍｌ添加し、２〜３回混合した後、４℃で１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。上層液を完全に除去し、空気中から乾燥させて残りのエタノールを除去した後、ＲＮＡをＤＥＰＣを処理した３次の蒸留水５０μｌに溶解した。
【００８３】
ｃＤＮＡの合成は、１．５ ｍｌのチューブに精製された２μｇのｍＲＮＡと１μｌのオリゴｄＴ ［ｏｌｉｇｏ ｄＴ（ｄＴ３０， Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ）］プライマーを１０μＭの濃度で混合し、７０℃で２分間加熱した後、氷に入れて２分間冷やした。この混合物に２００ＵのＭ−ＭＬＶの逆転写酵素［ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ）］、１０μｌの５Ｘ反応緩衝溶液（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）［２５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）， ｐＨ ８．３， ３７５ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）， １５ ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）， ５０ｍＭのＤＴＴ］、１μｌのｄＮＴＰ（それぞれ１０ｍＭの濃度， Ｔａｋａｒａ， Ｊａｐａｎ）を入れてＤＥＰＣを処理した３次の蒸留水で５０μｌになるように添加した後、４２℃で１時間反応させて１次のｃＤＮＡを合成した。
【００８４】
ｂ．免疫グロブリンＧ１のＦｃ部位をコーディングするＤＮＡ断片
ＴＮＦＲの細胞外域可溶性の部位３’末端の一部配列を含み、ＩｇＧ１のヒンジ部位の５’末端をコーディングする配列を有する一つのプライマー（配列番号２７のヌクレオチド）と、ＸｂａＩの認識配列とＩｇＧ１のＦｃの３’末端をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマー（配列番号２８のヌクレオチド）を使用し、重合酵素の連鎖反応により免疫グロブリンＧ１のＦｃ部位をコーディングするＤＮＡ断片を生成させた。この反応のための鋳型ｃＤＮＡは、回復期にある原因不明の熱患者の末梢血液の細胞（Ｂリンパ球）から抽出したｍＲＮＡを逆転写−重合酵素の連鎖反応を利用して製造した。
【００８５】
ｃ．単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物
前記生成されたＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ断片と免疫グロブリンＧ１のＦｃ部位をコーディングするＤＮＡ断片を一つの試験管で混合した後、共通の配列（ＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位３’末端とＩｇＧ１のヒンジ部位の５’末端を含む配列）間で相補的な結合が起きるように誘導した。これを鋳型とし、ＴＮＦＲ１の５’末端をコーディングする配列を有するプライマー（配列番号２５のヌクレオチド）とＩｇＧ１のＦｃの３’末端をコーディングするプライマー（配列番号２８のヌクレオチド）を使用した重合酵素の連鎖反応を起こし、前記ＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位のＤＮＡ断片とＩｇＧ１のＦｃ部位のＤＮＡ断片の配列を含む目的するＴＮＦＲ１／ＦｃコーディングＤＮＡ作製物を増幅させた。製造された遺伝子は、発現後、蛋白質の分泌を容易にするためのリーダシーケンスを含む。
【００８６】
ｄ．単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物のクローニング
前記製造された単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化させ、市販のクローニングベクタ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社の製品）のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ（＋）のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位に挿入してクローニングした。全体のコーディング領域の配列をＤＮＡ配列化により確認した（配列番号１）。このとき、生成された融合蛋白質は単純融合された単量体蛋白質としてＴＮＦＲ１／Ｆｃと名づけ、楕円形の構造は融合遺伝子の１次の発現産物蛋白質の構造を表した。単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１／Ｆｃの推定アミノ酸配列は配列番号２に該当される。
【００８７】
Ｂ．単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物の製造（図１及び図５）
ａ．ＴＮＦＲ２の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ断片
人体ＴＮＦの受容体タイプＩＩ（ＴＮＦＲ２， ｐ７５）の細胞外域可溶性の部位と人体免疫グロブリンＧ１のＦｃ部位が連結された融合遺伝子を、前記ＴＮＦＲ１の製造過程と同様な 手続により製造した。
【００８８】
制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列とリーダ配列（配列番号４のペプチド１−２２）のコーディング配列を有する一つのプライマー（配列番号２９のヌクレオチド）と、前記細胞外域可溶性の部位（ＴＮＦＲ２−ＥＤ）３’末端の配列と免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のヒンジ部位（ｈｉｎｇｅ ｒｅｇｉｏｎ：Ｈ）の５’末端の一部配列をコーディングするアンチセンス配列（配列番号３０のヌクレオチド）を有する他のプライマーを使用し、重合酵素の連鎖反応によりＴＮＦＲ２の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ断片を生成した。この反応のための鋳型ｃＤＮＡは、ＴＮＦＲ１と同様に健康な成人の単核球の細胞（Ｔリンパ球）から抽出したｍＲＮＡを逆転写−重合酵素の連鎖反応を利用して製造した。
【００８９】
ｂ．単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物
前記生成されたＴＮＦＲ２の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ断片と前記ＴＮＦＲ１に記述されているように製造された免疫グロブリンＧ１のＦｃ部位をコーディングするＤＮＡ断片を一つの試験管で混合した後、共通の配列（ＴＮＦＲ２の細胞外域可溶性の部位３’末端とＩｇＧ１のヒンジ部位の５’末端を含む配列）間で相補的な結合が起きるように誘導した。これを鋳型とし、ＴＮＦＲ２の５’末端をコーディングする配列を有するプライマー（配列番号２９のヌクレオチド）とＩｇＧ１のＦｃの３’末端をコーディングするプライマー（配列番号２８のヌクレオチド）を使用した重合酵素の連鎖反応を起こし、前記ＴＮＦＲ２の細胞外域可溶性の部位のＤＮＡ断片とＩｇＧ１のＦｃ部位のＤＮＡ断片の配列を含む、目的するＴＮＦＲ２／ＦｃコーディングＤＮＡ作製物を増幅させた。製造された遺伝子は、発現後、蛋白質の分泌を容易にするためのリーダシーケンスを含む。
【００９０】
ｃ．単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物のクローニング
前記製造された単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化させ、市販のクローニングベクタ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社の製品）のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳＩＩ（＋）のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位に挿入してクローニングした。全体のコーディング領域の配列をＤＮＡ配列化により確認した（配列番号３）。このとき、生成された融合蛋白質は、単純融合された単量体蛋白質としてＴＮＦＲ２／Ｆｃと名づけ、楕円形の構造は融合遺伝子の１次の発現産物蛋白質の構造を表した。単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ２／Ｆｃの推定アミノ酸の配列は配列番号４に該当される。
【００９１】
Ｃ．連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物の製造（図２及び図５）
ＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位が連鎖体（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）の形態を有する融合遺伝子、すなわち連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物を作るため、ＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位の塩基配列と前記製造された単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物に、同一な制限酵素（ＢａｍＨＩ）の認識配列を重合酵素の連鎖反応を利用して挿入した後、ＢａｍＨＩで切断された部分をリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）で連結した。この反応は、前記製造された単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物（配列番号１のヌクレオチド）を鋳型として使用した。
【００９２】
配列番号２５のヌクレオチドに該当するプライマーと配列番号３３のヌクレオチドに該当するプライマーを使用し、３’末端にＢａｍＨＩ認識配列を有するＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位の断片を増幅し、更に配列番号２８のヌクレオチドに該当するプライマーと配列番号３２のヌクレオチドに該当するプライマーを使用し、５’末端にＢａｍＨＩの認識配列を有する他の単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１／Ｆｃをコーディングする断片をそれぞれ増幅した。重合酵素の連鎖反応は、１μｌの１次のｃＤＮＡ、２ＵのＰｆｕ ＤＮＡの重合酵素［ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＵＳＡ）］、１０μｌの１０Ｘ反応緩衝溶液（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）［２００ｍＭトリス−ＨＣｌ， ｐＨ ８．７５， １００ｍＭの硫酸アンモニウム［（ＮＨ４）２ＳＯ４］， １００ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）， ２０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）］、１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、３μｌのプライマー１（１０μＭ）、３μｌのプライマー２（１０μＭ）、２μｌのｄＮＴＰ（それぞれ１０ｍＭ）を入れて３次の蒸留水で１００μｌになるように添加した後、実施した。反応条件は、９４℃で５分間処理した後、９５℃で１分、５８℃で１分３０秒、７２℃で１分３０秒ずつ３１回反応させ、７２℃で１５分間更に反応させて重合酵素の連鎖反応産物が完全な平滑末端（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ）になるようにした。
【００９３】
重合酵素の連鎖反応産物を０．８％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）に電気泳動した後、Ｑｉａｅｘ ＩＩ ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， ＵＳＡ）を利用して純粋分離した。純粋分離された重合酵素の連鎖反応産物を制限酵素ＢａｍＨＩで処理した後、フェノール／クロロホルムの抽出方法で純粋分離した。次いで、ＢａｍＨＩで処理した２つの種類のＤＮＡ断片をリガーゼを利用して結合させた。
【００９４】
Ｄ．連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物の製造（図２及び図５）
ＴＮＦＲ２の細胞外域可溶性の部位の塩基配列と前記製造された単純融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物に、同一な制限酵素（ＢａｍＨＩ）の認識配列を重合酵素の連鎖反応を利用して挿入した後、ＢａｍＨＩで切断された部分をリガーゼで連結して連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物を製造した。
３’末端にＢａｍＨＩの認識配列を有するＴＮＦＲ２の細胞外域可溶性の部位の断片は、配列番号３４のヌクレオチドに該当するプライマーと配列番号３５のヌクレオチドに該当するプライマーを使用して増幅した。重合酵素の連鎖反応は、ＴＮＦＲ１の場合と同様に実施した。但し、配列番号３の前記製造された単純融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物を鋳型として使用した。重合酵素の連鎖反応産物はＴＮＦＲ１の場合と同様に分離した。
【００９５】
Ｅ．糖化モーティブを有する連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物
ＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位の結合部位において疎水性を表すペプチド部位（配列番号６ １９７−２１６のペプチド）を除き、一番目のＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位３’末端の一部（配列番号５ ５６５−５９１のヌクレオチド）と２番目のＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位５’末端の一部（配列番号５ ６４９−６８１のヌクレオチド）を含んだアンチセンスプライマー（配列番号３７のヌクレオチド）と制限酵素ＥｃｏＲＩを有し、リーダ配列を含んだプライマー（配列番号２５のヌクレオチド）を使用した重合酵素の連鎖反応を利用してＤＮＡ断片を製作した。
【００９６】
更に、前記のプライマーにおいて、配列番号５の５６５−５６７（ＣＴＧ、Ｌｅｕ）、５７４−５７６（ＡＣＧ、Ｔｈｒ）、６５２−６５４（ＣＴＡ、Ｌｅｕ）及び６７０−６７２（ＡＧＡ、Ａｒｇ）に該当するヌクレオチドをＡＡＣ（Ａｓｎ、Ｎ）に、配列番号５の５７１−５７３（ＴＧＣ、Ｃｙｓ）及び５８０−５８２（ＴＴＧ、Ｌｅｕ）に該当するヌクレオチドをＡＣＣ（Ｔｈｒ、Ｔ）に、配列番号５の６５８−６６０（ＧＡＣ、Ａｓｐ）をＴＣＣ（Ｓｅｒ、Ｓ）に代置した塩基配列を含むように製作（配列番号３６及び３７のヌクレオチド）し、総４個の糖化モーティブペプチド部位（配列番号１０ １８９−１９１、１９２−１９４、１９８−２００、２０４−２０６のペプチド）を挿入した。
【００９７】
この反応において、連鎖体の形態のＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃ遺伝子（配列番号５のヌクレオチド）を鋳型として使用した。最初の重合酵素の連鎖反応時にアンチセンスプライマーの半分のみが鋳型として使用された連鎖体の形態のＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃ遺伝子に結合するように誘導し、連鎖反応が進行されながら鋳型に結合されていない部位が重合酵素により完全な２鎖のＤＮＡを成すようにし、リーダ配列を含んだＴＮＦＲ１の細胞外域の部位３’末端に２番目の細胞外域可溶性の部位の一部をコーディングする５’末端の塩基配列が結合された状態のＤＮＡ断片を得ることができるようにした。このように、２番目の細胞外域可溶性の部位の一部の５’末端の塩基配列は、以後２次の重合酵素の連鎖反応時に、以下に説明する２番目のＤＮＡ断片と相補的な結合が可能な作用をするようになる。
【００９８】
２番目のＤＮＡ断片は、一番目のＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位３’末端の一部（配列番号５ ５６５−５９１のヌクレオチド）と２番目のＴＮＦＲ１の細胞外域可溶性の部位５’末端の一部（配列番号５ ６４９−６８１のヌクレオチド）を含んだ一つのプライマー（配列番号３６のヌクレオチド）と、制限酵素ＸｂａＩの認識配列とＩｇＧ１のＦｃの３’末端をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマー（配列番号２８のヌクレオチド）を使用した重合酵素の連鎖反応を利用して製作した。この反応も前記した通り、細胞外域可溶性の部位に該当するプライマーの半分のみが鋳型に結合するように誘導し、結果的に前記のＤＮＡ断片と同様にＴＮＦＲ１の細胞外域の部位５’末端に一番目の細胞外域可溶性の部位３’末端の一部をコーディングする塩基配列を有するようにした。
【００９９】
次いで、前記の二種類の重合酵素の連鎖反応の結果物であるＤＮＡ断片を同一な試験管で混合した後、重複する相補的な塩基配列間での結合を誘導した後、連鎖体の形態の遺伝子の各５’及び３’末端に該当するプライマー（配列番号２５と２８）を利用し、重合酵素の連鎖反応を行うことにより２つのＤＮＡ断片を結合させ、これをｍｇＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１−ＩｇＧと名づけた。
【０１００】
Ｆ．糖化モーティブを有する連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／ＦｃをコーディングするＤＮＡ作製物
ＴＮＦＲ２の細胞外域可溶性の部位の結合部位において疎水性を表すペプチド部位（配列番号８ ２０３−２６３のペプチド）を除き、一番目のＴＮＦＲ２の細胞外域可溶性の部位３’末端の一部（配列番号７ ５８６−６０６のヌクレオチド）と２番目のＴＮＦＲ２の細胞外域可溶性の部位５’末端の一部（配列番号７ ７９０−８０７のヌクレオチド）を含んだアンチセンスプライマー（配列番号３９のヌクレオチド）と制限酵素ＥｃｏＲＩを有し、リーダシーケンスを含んだプライマー（配列番号２９のヌクレオチド）を使用した重合酵素の連鎖反応を利用してＤＮＡ断片を製作した。
【０１０１】
更に、前記のプライマーにおいて、配列番号７の５９５−５９７（ＧＴＣ、Ｖａｌ）及び７９９−８０１（ＧＧＧ、Ｇｌｙ）に該当するヌクレオチドをＡＡＣ（Ａｓｎ、Ｎ）に代置した塩基配列を含むように製作（配列番号３８及び３９のヌクレオチド）したプライマーを利用し、総２個の糖化モーティブペプチド部位（配列番号１２ １９９−２０１、２０６−２０８のペプチド）を挿入した。
【０１０２】
この反応において、連鎖体の形態のＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／Ｆｃ遺伝子（配列番号７のヌクレオチド）を鋳型として使用した。最初の重合酵素の連鎖反応時にアンチセンスプライマーの半分のみが鋳型として使用された連鎖体の形態のＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／Ｆｃ遺伝子に結合するように誘導し、連鎖反応が進行されながら鋳型に結合されていない部位が重合酵素により完全な２鎖のＤＮＡを成すようにし、リーダシーケンスを含んだＴＮＦＲ２の細胞外域の部位３’末端に２番目の細胞外域可溶性の部位の一部をコーディングする５’末端の塩基配列が結合された状態のＤＮＡ断片を得ることができるようにした。このように、２番目の細胞外域可溶性の部位の一部の５’末端の塩基配列は、以後２次の重合酵素の連鎖反応時に、下記に説明する２番目のＤＮＡ断片と相補的な結合が可能な作用をするようになる。
【０１０３】
２番目のＤＮＡ断片は、一番目のＴＮＦＲ２の細胞外域可溶性の部位３’末端の一部（配列番号７ ５８６−６０６のヌクレオチド）と２番目のＴＮＦＲ２の細胞外域可溶性の部位５’末端の一部（配列番号７ ７９０−８０７のヌクレオチド）を含んだ一つのプライマー（配列番号３８のヌクレオチド）と、制限酵素ＸｂａＩの認識配列とＩｇＧ１のＦｃの３’末端をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマー（配列番号２８のヌクレオチド）を使用した重合酵素の連鎖反応を利用して製作した。この反応も前記した通り、細胞外域可溶性の部位に該当するプライマーの半分のみが鋳型に結合するように誘導し、結果的に前記のＤＮＡ断片と同様にＴＮＦＲ２の細胞外域の部位５’末端に一番目の細胞外域可溶性の部位３’末端の一部をコーディングする塩基配列を有するようにした。
【０１０４】
次いで、前記の２種類の重合酵素の連鎖反応の結果物であるＤＮＡ断片を同一な試験管で混合した後、重複する相補的な塩基配列間での結合を誘導した後、連鎖体の形態の遺伝子の各５’及び３’末端に該当するプライマー（配列番号２９と２８）を利用し、重合酵素の連鎖反応を行うことにより二つのＤＮＡ断片を結合させ、これをｍｇＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２−ＩｇＧと名づけた。
【０１０５】
Ｇ．連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ−ＴＮＦＲ／Ｆｃ及びこの糖化蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物のクローニング
前記製造された連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ−ＴＮＦＲ／Ｆｃ及びこの糖化蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＵＳＡ）のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位に挿入してクローニングした。このとき、生成された融合蛋白質は、連鎖融合された単量体蛋白質としてＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／ＦｃとＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／Ｆｃ、この糖化蛋白質としてｍｇＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／ＦｃとｍｇＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／Ｆｃと名づけ、これらの推定アミノ酸の配列はそれぞれ配列番号６、８、１０及び１２に該当される。
【０１０６】
ベクタとして使用する１０μｌのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＵＳＡ）を１５ＵのＥｃｏＲＩと１５ＵのＸｂａＩ、５μｌの１０Ｘ反応緩衝溶液（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）［１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、１００ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、１０ｍＭのＤＴＴ、５００ｎＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）］、５μｌの０．１％牛血清アルブミン［ＢＳＡ（Ｔａｋａｒａ， Ｊａｐａｎ）］を混合した 後、３次の蒸留水で５０μｌになるように添加した後、３７℃で２時間反応させてＤＮＡを消化させた。反応物を０．８％アガロースゲルに電気泳動した後、ＱｉａｅｘＩＩｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ， ＵＳＡ）で純粋分離した。
【０１０７】
ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ ＩＩ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＵＳＡ）１００ｎｇと制限酵素で消化させた２０ｎｇの重合酵素の連鎖反応産物を混合し、０．５ＵのＴ４ ＤＮＡリガーゼ［ｌｉｇａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＳＡ）］、１μｌの１０Ｘ反応緩衝溶液（ｒｅａｃｔｉｏｎｂｕｆｆｅｒ）［３００ｍＭのトリス−ＨＣｌ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）、ｐＨ７．８、１００ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、１００ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＡＴＰ］を入れた後、３次の蒸留水で１０μｌになるように添加した後、１６℃の水槽（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で１６時間反応させた。大腸菌［Ｅ．ｃｏｌｉ Ｔｏｐ１０（Ｎｏｖｅｘ， ＵＳＡ）］をリビジウムクロリド（ＲｂＣｌ， ｒｉｂｉｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ， Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）法でコンピテント細胞 （ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）を作った後、形質転換させてアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ， Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）を５０μｌ／ｍｌ含有したＬＢ固体培地に塗抹し、３７℃で１６時間培養した。生成されたコロニーをアンピシリンが５０μｌ／ｍｌ含有されたＬＢ液体の培地４ ｍｌに接種した後、３７℃で１６時間振とう培養した。この中、１．５ ｍｌをＳａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．らの文献（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ｐ１． ２５−１．３１， ｐ１．６３−１．６９， ｐ７．２６−７．２９， １９８９）に記述されたアルカリ分解（ａｌｋａｌｉｎｅ ｌｙｓｉｓ）法でプラスミドを少量抽出した後、ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化させてクローニングの有無を確認した。
【０１０８】
全体のコーディング領域の配列はダイデオキシチェーンターミネーション［Ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｓａｎｇｅｒ Ｆらの文献， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ７４： ５４８３， １９７７）法を利用した以下のようなＤＮＡ配列化の方法により確認した。前記のアルカリ分解法で抽出したプラスミドとＳｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標 Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｖｅｒ． ２．０， Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＳＡ）及び３５Ｓ ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＳＡ）を使用して製品の使用法に準する方法でＤＮＡ配列化の反応を進行させた。６％ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ）に前記の試料をローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）し、電圧を１８００〜２０００Ｖの間に維持し、ゲルの温度を５０℃に維持しながら２時間電気泳動を行った後、乾燥させてからＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ， ＵＳＡ）に２日間露出させた後、ＤＮＡ塩基配列を判読した。
【０１０９】
〔実施例２及び３〕
ＣＤ２及びＣＴＬＡ４
ＣＤ２及びＣＴＬＡ４の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ断片は、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列とリーダ配列［ＣＤ２（配列番号１４のペプチド１−２４）、ＣＴＬＡ４（配列番号１６のペプチド１−２１）］のコーディング配列［ＣＤ２（配列番号１３のヌクレオチド、ＣＴＬＡ４（配列番号１５のヌクレオチド））を有する一つのプライマー［ＣＤ２（配列番号４０のヌクレオチド）、ＣＴＬＡ４（配列番号４３のヌクレオチド）］と、制限酵素ＰｓｔＩの認識配列と前記細胞外域可溶性の部位３’末端の配列をコーディングするアンチセンス配列［ＣＤ２（配列番号１３のヌクレオチド）、ＣＴＬＡ４（配列番号１５のヌクレオチド）］を有する他のプライマー［ＣＤ２（配列番号４１）、ＣＴＬＡ４（配列番号４４）］を使用して重合酵素の連鎖反応により生成した。この反応のための鋳型ｃＤＮＡは健康な成人の単核球の細胞（Ｔリンパ球）から抽出したｍＲＮＡを逆転写−重合酵素の連鎖反応を利用して製造した。
【０１１０】
更に、免疫グロブリンＧ１のＦｃ部位をコーディングするＤＮＡ断片は、制限酵素ＰｓｔＩの認識配列とＩｇＧ１の上鎖部位の５’末端をコーディングする配列を有する一つのプライマー（配列番号４２のヌクレオチド）と、ＸｂａＩの認識配列とＩｇＧ１のＦｃの３’末端をコーディングするアンチセンス配列を有する他のプライマー（配列番号２８）を使用して重合酵素の連鎖反応により生成した。この反応のための鋳型ｃＤＮＡは回復期にある原因不明の熱患者の末梢血液細胞（Ｂリンパ球）から抽出したｍＲＮＡを逆転写−重合酵素の連鎖反応を利用して製造した。
【０１１１】
次いで、前記生成されたＣＤ２及びＣＴＬＡ４の細胞外域可溶性の部位をコーディングするＤＮＡ断片と免疫グロブリンＧ１のＦｃ部位をコーディングするＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩで消化させ、Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼを利用して結合させることにより単純二量体の形態のＣＤ２／Ｆｃ及びＣＴＬＡ４／Ｆｃ遺伝子を製作した。製造された遺伝子は、発現後蛋白質の分泌を容易にするためのリーダ配列を含む。
【０１１２】
前記生成された融合遺伝子の断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化させ、市販のクローニングベクタ（ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社の製品）のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ ＩＩ（＋）のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位に挿入してクローニングした。全体のコーディング領域の配列をＤＮＡ配列化により確認した（配列番号１３及び１５）。このとき、生成された融合蛋白質をそれぞれＣＤ２／Ｆｃ、ＣＴＬＡ４／Ｆｃと名づけ、これらの推定アミノ酸配列はそれぞれ配列番号１４及び１６に該当される。
【０１１３】
重合酵素の連鎖反応は、１μｌの１次のｃＤＮＡ、２ＵのＰｆｕ ＤＮＡ重合酵素［ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， ＵＳＡ）］、１０μｌの１０Ｘ反応緩衝溶液（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ） ［２００ｍＭのトリス−ＨＣＬ、ｐＨ ８．７５、１００ｍＭの硫酸アンモニウム［（ＮＨ４）２ＳＯ４］、１００ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）、２０ｍＭの塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）］、１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、１ｍｇ／ｍｌの牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、３μｌのプライマー１（１０ｕＭ）、３μｌ のプライマー２（１０ｕＭ）、２μｌのｄＮＴＰ（それぞれ１０ｍＭ）を入れて３次の蒸留水で１００μｌになるように添加した後実施した。反応条件は、９４℃で５分間処理した後、９５℃で１分、５８℃で１分３０秒、７２℃で１分３０秒ずつ３１回反応させ、７２℃で１５分間更に反応させて重合酵素の連鎖反応産物が完全な平滑末端になるようにした。
【０１１４】
連鎖体の形態のＣＤ２−ＣＤ２／Ｆｃ及びＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／Ｆｃの融合遺伝子は、以下のように製造した。
【０１１５】
ＣＤ２及びＣＴＬＡ４の細胞外域可溶性の部位が連鎖体（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）の形態を有する融合遺伝子を作るため、ＣＤ２及びＣＴＬＡ４の細胞外域可溶性の部位の配列を、前述した制限酵素ＰｓｔＩとＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼを利用して平滑末端を有するようにした単純二量体の形態の融合遺伝子において、細胞の外域と免疫グロブリンの結合部位にリガーゼを利用して平滑末端接合（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ）させることにより挿入した。具体的に、ＣＤ２及びＣＴＬＡ４の細胞外域可溶性の部位のリーダ配列が終了される部位［ＣＤ２（配列番号１４のペプチド２５）、ＣＴＬＡ４（配列番号１６のペプチド２２）］をコーディングするコーディング配列［ＣＤ２（配列番号１３のヌクレオチド）、ＣＴＬＡ４（配列番号１５のヌクレオチド）］を有する一つのプライマー［ＣＤ２（配列番号４５のヌクレオチド）、ＣＴＬＡ４（配列番号４７のヌクレオチド）］と、前記細胞外域可溶性の部位３’末端の配列をコーディングするアンチセンス配列［ＣＤ２（配列番号１３のヌクレオチド）、ＣＴＬＡ４（配列番号１５のヌクレオチド）］を有する他のプライマー［ＣＤ２（配列番号４６）、ＣＴＬＡ４（配列番号４８）］を使用して重合酵素の連鎖反応により生成した。この反応は、前記の単純二量体の融合遺伝子［ＣＤ２／Ｆｃ（配列番号１３のヌクレオチド）、ＣＴＬＡ４／Ｆｃ（配列番号１５のヌクレオチド）］を鋳型として使用した。
【０１１６】
更に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ（＋）に挿入された単純二量体の形態のＣＤ２／Ｆｃ及びＣＴＬＡ４／Ｆｃを制限酵素ＰｓｔＩで消化させ、３’末端が突出された形態（３’ｏｖｅｒｈａｎｇ）の切断面を生成するようにした。切断面の３’突出の末端をＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼで処理し、部分的に除去（ｐａｒｔｉａｌ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）させて平滑末端になるようにした。細胞外域可溶性の部位が連鎖体（ｃｏｎｃａｔａｍｅｒ）の形態を有する融合遺伝子を作るため、前記の重合酵素の連鎖反応により製作したＣＤ２及びＣＴＬＡ４の細胞外域可溶性の部位を平滑末端として製作された単純二量体の遺伝子の切断面に、リガーゼを利用して平滑末端接合（ｂｌｕｎｔ ｅｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ）させることにより挿入し、クローニングした。このとき、生成された融合蛋白質は、連鎖融合された単量体蛋白質としてそれぞれＣＤ２−ＣＤ２／ＦｃとＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／Ｆｃと名づけ、これらの推定アミノ酸の配列はそれぞれ配列番号１８及び２０に該当される。
【０１１７】
多糖化（ｍｕｌｔｉｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）の形態の連鎖体融合遺伝子は以下のように製作した。
【０１１８】
糖化モーティブペプチドの配列は、制限酵素ＥｃｏＲＩと細胞外域可溶性の部位のリーダシーケンスを含んだ一つのプライマーと、連鎖体の形態の融合遺伝子の一番目の細胞外域可溶性の部位３’末端の一部をコーディングする塩基配列と２番目の細胞外域可溶性の部位５’末端の一部をコーディングする塩基配列を有し、糖化モーティブで置換された塩基配列を有するアンチセンスプライマーを利用して重合酵素の連鎖反応を通じて製作したＤＮＡ断片と、連鎖体の形態の融合遺伝子の一番目の細胞外域可溶性の部位３’末端の一部をコーディングする塩基配列と２番目の細胞外域可溶性の部位５’末端の一部をコーディングする塩基配列を有し、糖化モーティブで置換された塩基配列を有する一つのプライマーと、免疫グロブリンＧ１のＦｃ部位の３’末端と制限酵素ＸｂａＩをコーディングするアンチセンスプライマーを利用した重合酵素の連鎖反応により製作されたＤＮＡ断片を一つの試験管に同時に入れ、２次の重合酵素の連鎖反応を行うことにより挿入した。
【０１１９】
ＣＤ２／Ｆｃ及びＣＴＬＡ４／Ｆｃの連鎖体の融合遺伝子の場合も、前記のＴＮＦＲ／Ｆｃの方法と同様な方法で変形されたプライマーを使用した重合酵素の連鎖反応を利用して糖化モーティブペプチドを挿入させ、ＴＮＦＲ／Ｆｃの場合とは異なりＣＤ２及びＣＴＬＡ４の細胞外域可溶性の部位が結合されるペプチド配列はそのまま維持した。
【０１２０】
ＣＤ２／Ｆｃ及びＣＴＬＡ４／Ｆｃの連鎖体融合蛋白質の多糖化の過程は、ＣＤ２／Ｆｃの場合、配列番号１７の５９８−６００（ＣＣＴ、Ｐｒｏ）及び６１６−６１８（ＧＡＧ、Ｇｌｕ）に該当するヌクレオチドをＡＡＴ（Ａｓｎ、Ｎ）に代置した塩基配列を含むように製作したプライマー（配列番号４９及び５０のヌクレオチド）を利用し、総２個の糖化モーティブペプチド部位（配列番号２００−２０２、２０６−２０８のペプチド）を挿入して完成し、ＣＴＬＡ４／Ｆｃの場合は、配列番号１９の４０３−４０５（ＧＴＡ、Ｖａｌ）、４２４−４２６（ＣＣＡ、Ｐｒｏ）に該当するヌクレオチドをＡＡＴ（Ａｓｎ、Ｎ）に、配列番号１９の４０９−４１１（ＧＡＴ、Ａｓｐ）、４４５−４０７（ＧＴＧ、Ｖａｌ）に該当するヌクレオチドをそれぞれＡＣＡ（Ｔｈｒ、Ｔ）及びＡＣＧ（Ｔｈｒ、Ｔ）に代置した塩基配列を含むように製作したプライマー（配列番号５１及び５２のヌクレオチド）を利用し、総３個の糖化モーティブペプチド部位（配列番号２４ １３６−１３８、１４２−１４４、１４７−１４９のペプチド）を挿入して完成した。このとき、生成された融合蛋白質は、連鎖融合された単量体蛋白質としてそれぞれｍｇＣＤ２−ＣＤ２／Ｆｃ及びｍｇＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／Ｆｃと名づけ、これらの推定アミノ酸の配列はそれぞれ配列番号２２及び２４に該当される。
【０１２１】
〔実施例４〕
単純／連鎖融合された二量体のＴＮＦＲ／Ｆｃ融合蛋白質の発現及び精製
チャイニズハムスター卵巣細胞株Ｋ１（ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１、Ｏｖａｒｙ、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ、Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）で融合蛋白質を発現させるため、ＴＮＦＲ／Ｆｃ融合遺伝子を含んだｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩプラスミドＤＮＡを形質転換された大腸菌から抽出した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｂａＩで消化させて得たＴＮＦＲ／Ｆｃの断片を、動物細胞の発現ベクタであるｐＣＲＴＭ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＵＳＡ）プラスミドＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位に挿入し、発現ベクタを製造した後、これをそれぞれのプラスミドｐＴＲ１１−Ｔｏｐ１０’及びプラスミドｐＴＲ２２−Ｔｏｐ１０’と名づけ、２００１年７月１０日付で韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）にそれぞれＫＣＣＭ １０２８８及びＫＣＣＭ １０２９１の受託番号で寄託した。
【０１２２】
形質感染は、前記ＴＮＦＲ／Ｆｃ融合遺伝子を含んだプラスミドｐＴＲ１１−Ｔｏｐ１０’及びプラスミドｐＴＲ２２−Ｔｏｐ１０’ＤＮＡのいずれか一つをＧｉｂｃｏ ＢＲＬ（ＵＳＡ）社の ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ試薬と混合することにより行った。１〜３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの濃度のチャイニズハムスター卵巣細胞株Ｋ１（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞を６穴の組織培養板（ｓｉｘ−ｗｅｌｌ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ， Ｎｕｎｃ， ＵＳＡ）に接種し、１０％牛胎児血清（ＦＢＳ）を含有したＤＭＥＭ培地で細胞が５０〜８０％になるように培養した後、血清のないＤＭＥＭ培地から前記ＴＮＦＲ／Ｆｃ融合遺伝子を含んだプラスミドｐＴＲ１１−Ｔｏｐ１０’及びプラスミドｐＴＲ２２−Ｔｏｐ１０’ＤＮＡのいずれか一つを１〜２μｌ取り、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， ＵＳＡ）を２〜２５μｌ取って常温で１５〜４５分間反応させたＤＮＡ−リポソーム混合体（Ｌｉｐｏｓｏｍｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）を細胞培養板に添加させた。５時間培養した後、血清が２０％含有されたＤＭＥＭ培地を添加し、１８〜２４時間培養した。最初の形質感染後に細胞を１．５ｍｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８， ＧｉｂｃｏＢＲＬ， ＵＳＡ）が添加された１０％牛胎児血清ＤＭＥＭ培地で３週間培養し、形成された集落を分離して増幅培養した。融合遺伝子の発現可否はペルオキシダーゼが標識されたヤギ抗ヒト免疫グロブリン（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ， ＫＰＬ， ＵＳＡ）を使用した酵素免疫の検査法（ＥＬＩＳＡ）を通じて検査した。
【０１２３】
酵素免疫の検査法（ＥＬＩＳＡ）は、以下のような方法で行った。まず、１ｍｇ／ｍｌのヤギ抗ヒト免疫グロブリン（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ， ＫＰＬ， ＵＳＡ）を０．１Ｍの中炭酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）に１：２０００で希釈した後、９６穴の酵素免疫の検査板（９６−ｗｅｌｌ ｆｌｅｘｉｂｌｅ ｐｌａｔｅ， Ｆａｌｃｏｎ， ＵＳＡ）に１００μｌずつ分注し、ラップで包んだ後、４℃で１６時間以上放置して抗体が検査板の表面にコーティングされるようにした。これを洗浄緩衝溶液（ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）［０．１％ツイン−２０（Ｔｗｅｅｎ−２０）を含有、１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）］で３回洗浄した後、希釈溶液［ｄｉｌｕｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒ（１Ｘリン酸緩衝生理食塩水の４８．５ ｍｌ、牛胎児血清の１．５ ｍｌ、ツイン−２０の５０μｌ）］を１８０μｌずつ分注した。一番目の穴（ｗｅｌｌ）に培養した上層液２０μｌを入れた後、マイクロピペット（ｍｉｃｒｏｐｉｐｅｔｔｅ）を利用して連続的に希釈し、陽性の対照群として０．０１μｇ／μｌのヒト免疫グロブリン（ｈｕｍａｎ ＩｇＧ， Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）を、陰性の対照群として形質感染されていないチャイニズハムスターの卵巣Ｋ１（ＣＨＯ−Ｋ１）細胞の培養液を使用して同様に希釈した。希釈が終わった９６穴の酵素免疫の検査板（Ｆａｌｃｏｎ， ＵＳＡ）をホイルで包んで３７℃で１時３０分間反応させた後、洗浄溶液で３回洗浄した。ペルオキシダーゼが標識されたヤギ抗ヒト免疫グロブリン（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｌａｂｅｌｅｄ ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ， ＫＰＬ， ＵＳＡ）を希釈溶液で１：５０００希釈した後、これを１００μｌずつ分注してホイルで包んだ後、３７℃で１時間反応させた。反応が終わった後、洗浄溶液で３回洗浄した後、ＴＭＢペルオキシダーゼシステム（ＴＭＢ ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ， ＫＰＬ， ＵＳＡ）を利用して発色させ、吸光器（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ， Ｂｉｏ−ＲＡＤ， Ｍｏｄｅｌ ５５０， Ｊａｐａｎ）で波長６３０ｎｍに対する吸光度を測定し、発現の可否を確認した。
【０１２４】
このように製造された形質転換体（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）をそれぞれＴＲ１１Ｉｇ−ＣＨＯ及びＴＲ２２Ｉｇ−ＣＨＯと名づけ、２００１年７月７日付で韓国細胞株研究財団（ＫＣＬＲＦ）にそれぞれＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００４６及びＫＣＬＲＦ−ＢＰ−０００４９の受託番号で寄託し、前記形質転換体が生成した融合蛋白質を精製する目的で無血清培地（ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉａ）中、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， ＵＳＡ）に適応させるため、以下の過程を進行した。約３×１０５個の細胞を６穴板（６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に接種した後、１６時間、５％のＣＯ２、３７℃培養基で培養して定着させた後、顕微鏡下で約３０〜５０％の面積にｃｅｌｌが付着されたことを確認し、１０％牛胎児血清含有ＤＭＥＭとＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩの比率を８：２になるように培地を交替して培養した。この割合で３回継代培養した後、それぞれ６：４の割合で３回、４：６の割合で３回、３：７の割合で３回、２：８の割合で３回、及び１：９の割合で３回継代培養した後、最終的に１００％のＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地で継代培養し、この発現量を酵素免疫の検査法を利用して測定した。
【０１２５】
この細胞を牛血清培地のないＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， ＵＳＡ）培地で大量培養した後、それぞれの融合蛋白質を含有した培養液を２００×ｇ、１２分間遠心分離して細胞カスを完全に除去し、プロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｃｏｌｕｍｎ， Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＳＡ）を利用した以下の方法で純粋分離した。２０ｍＭのリン酸化ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ， ｐＨ ７．０， ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）を１ ｍｌ／ｍｉｎの速度で２分間通過させた後、１０ ｍｌの培養液を同一な速度でカラムに通過させ、プロテインＡに融合蛋白質が結合するようにした。２０ｍＭのリン酸化ナトリウム（ｐＨ７．０）を２分間同一な速度で通過させて洗浄した後、０．１Ｍのクエン酸（Ｃ６Ｈ８Ｏ７． Ｈ２Ｏ． ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ， ｐＨ ３．０， ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）を３分間同一な速度で通過させながら５００μｌずつ１．５ ｍｌのチューブに順次的に抽出物を分注した。これを１Ｍのトリス（Ｔｒｉｓ， ｐＨ １１．０， ＵＳＡ， Ｓｉｇｍａ）を利用してｐＨ ７．０で滴定し、各チューブの融合蛋白質の存在有無は前記に記述した酵素免疫の検査法（ＥＬＩＳＡ）を通じて確認した。純粋分離した融合蛋白質はセトリコン３０（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ３０， Ａｍｉｃｏｎ， ＵＳＡ）を使用し、４℃で２０００×ｇ、３０分間遠心分離して濃縮した。
【０１２６】
〔実施例５〕
精製されたＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃ及びＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／ＦｃのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１５）
プロテインＡカラムを利用して純水精製された蛋白質を還元剤（ジスルフィド結合破壊）であるＤＴＴを添加した還元条件と、ＤＴＴが含まれていない非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。それぞれのＳＤＳ−ＰＡＧＥ上における分子量の測定結果は、以下の表の通りである。ＴＮＦＲ／Ｆｃの蛋白質は細胞内で二量体として存在することを確認することができた。ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１−Ｉｇのアミノ酸配列で推定した分子量は約７０ｋＤａであり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で約１０２ｋＤａと推定された。この差は、糖蛋白質の電気泳動上で表れる一般的な現象として、糖化された部分により電気泳動上における移動速度が遅れるため起きる特徴である。
【０１２７】
【表１０】
2004521655.tif 000012
【０１２８】
〔実施例６〕
単純／連鎖融合された二量体ＴＮＦＲ／Ｆｃ融合蛋白質のＴＮＦα（α）とＴＮＦ（β）の細胞毒性の中和効果の実験
ＴＮＦＲ／Ｆｃ融合蛋白質の、ＴＮＦα（α）とＴＮＦβ（β）から誘導される細胞毒性を抑制する効果を検査するため、Ｌ９２９細胞［ＡＴＣＣ， Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ（ｍｏｕｓｅ）， ＮＣＴＣ ｃｌｏｎｅ ９２９（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ＳｔｒａｉｎＬ； Ｌ−９２９； Ｌｃｅｌｌ）を利用した。この分析は、ＴＮＦにより誘導される細胞毒性を抑制するＴＮＦＲの活性［スケロン（ＳｃａｌｌｏｎＢＪ）ら， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ７： ７５９， １９９５］に基づいている。
【０１２９】
Ｌ９２９細胞を９６穴板（９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように接種し、３７℃、ＣＯ２培養基で２４時間培養した。次いで、アクチノマイシン（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ Ｄ， Ｓｉｇｍａ， ＵＳＡ）を３μｇ／ｍｌになるように添加し、１００％細胞毒性を表す濃度（０．５〜２ｎｇ／ｍｌ）のＴＮＦα及びβ（Ｒ＆Ｄ， ＵＳＡ）を、１０倍ずつ連続的に希釈したＴＮＦＲ標本と共に１６〜１８時間培養した。次いで、９６穴板にある細胞を染色試薬であるクリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ， Ｗａｋｏ ｐｕｒｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ， Ｊａｐａｎ）で染色し、細胞の活性度は吸光度５９５ｎｍで吸光器（ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ， Ｂｉｏ−ＲＡＤ， Ｍｏｄｅｌ−５５０， Ｊａｐａｎ）を利用して測定した。
下記の表１１は、各ＴＮＦＲ／Ｆｃ融合蛋白質の抑制濃度の中間値（ＩＣ５０）として、単純二量体の形態の融合蛋白質（ＴＮＦＲ１−Ｉｇ、ＴＮＦＲ２−Ｉｇ）より連鎖体の形態の融合蛋白質（ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１−Ｉｇ、ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ２−Ｉｇ、ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ１−Ｉｇ、ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２−Ｉｇ）が、二種類のＴＮＦに対する細胞毒性を抑制する効果が全て顕著に高いことが分かった。更に、既存の単純二量体の形態と、本発明の連鎖体の形態の二量体ＴＮＦＲ／Ｆｃ融合蛋白質の、ＴＮＦα（図１６）とβ（図１７）に対する細胞毒性の抑制効果を対比すれば、本発明の連鎖体の形態のＴＮＦＲ／Ｆｃ融合蛋白質がＴＮＦαとβの細胞毒性を顕著に抑制することがより明白に表れる。
【０１３０】
【表１１】
2004521655.tif 000013
【０１３１】
〔実施例７〕
単純／連鎖融合された二量体ＣＤ２／Ｆｃ融合蛋白質とＣＴＬＡ４／Ｆｃ融合蛋白質の活性免疫細胞の増殖抑制の効果実験
発熱患者のＢリンパ球にエプスタイン−バーウイルス（Ｅｂｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）を形質感染させて作ったＢリンパ球の細胞株であるＷＴ１００Ｂ１ＳをＴリンパ球の抗原提示細胞として使用するため、１０％牛胎児血清含有 ＲＰＭＩ １６４０に培養した。これを２，０００ｒｐｍで２分間沈殿させた後、５．０×１０５／ｍｌになるように１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ １６４０に再び溶いた後、３，０００ｒｄのγ線（γ−ｒａｙ）で照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）させた。
【０１３２】
Ｔリンパ球は、健康なヒトの血液からＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＳＡ）を利用して分離した後、２．０×１０６／ｍｌになるように１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ １６４０で培養した。
【０１３３】
一次の混合リンパ球の反応［Ｐｒｉｍａｒｙ Ｍｉｘｅｄ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＭＬＲ）］を実行するため、ＷＴ１００Ｂ１ＳとＴリンパ球を１５０ｍｍの細胞培養皿にそれぞれ１５ｍｌずつ混合して３日間培養した後、１５ｍｌの１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ １６４０を添加して３日間更に培養した。総６日間培養した後、前記の方法通りＦｉｃｏｌｌ−ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ， ＵＳＡ）を利用して生きているＴリンパ球を純粋分離した。分離したリンパ球は４５％牛胎児血清、４５％ＲＰＭＩ １６４０、１０％ＤＭＳＯで作った培地を利用して冷やした後、液体窒素に保管した。
【０１３４】
一次の混合リンパ球反応させたＴリンパ球を、２次の混合リンパ球反応を実施するために溶解した後、ＲＰＭＩ １６４０培地を利用して２回洗浄し、１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ １６４０に３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにした。
【０１３５】
抗原提示細胞として使用するＷＴ１００Ｂ１Ｓは、新たに培養して前記の方法通り培養した後、３，０００ｒｄのγ線（γ−ｒａｙ）で照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）させて準備し、７．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ １６４０に準備した。準備されたＷＴ１００Ｂ１Ｓを１００μｌずつ９６穴の平板細胞培養板に入れ、ＣＤ２／Ｆｃ及びＣＴＬＡ４／Ｆｃ融合蛋白質を最終の濃度が１０、１、１０−１、１０−２、１０−３、１０−４μｌ／ｍｌになるように混合した後、前記の一次の混合リンパ球反応させたＴリンパ球を１００μｌずつ添加した。これを、５％ＣＯ２、３７℃の培養基で２日間培養した後、１０％牛胎児血清含有ＲＰＭＩ １６４０を１００μｌ添加し、２日間更に培養した。総４日間の培養中、最後の６時間は３Ｈ−チミジン ［ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］を１．２μＣｉ／ｍｌになるように添加して培養した。
【０１３６】
培養が終了された後、９６穴の細胞培養板を４℃、１１０×ｇ、１０分間遠心分離してＴ−リンパ球を沈殿させて上層液を除去し、２００μｌの１Ｘリン酸緩衝溶液で洗浄した。同一な条件で遠心分離した後、リン酸緩衝溶液を除去し、残っている３Ｈ−チミジン［ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］を除去するため、冷たい２００μｌの１０％ＴＣＡ ［ｔｒｉｃｈｌｏｒｉｄｉｃ ａｃｉｄ（ＴＣＡ、Ｍｅｒｃｋ）］を添加して２分間揺らした後、５分間４℃で反応させた。
【０１３７】
前記と同様な条件で遠心分離した後、上層液を除去し、冷たい２００μｌの７０％エタノールを添加した後、４℃で５分間放置してＴリンパ球を固定した。遠心分離した後、上層液を除去し、前記の方法と同様な条件で１０％ＴＣＡを処理し、残っていた３Ｈ−チミジン［ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）］を完全に除去した。
【０１３８】
ここに、１００μｌの２％ＳＤＳ［ＳＤＳ（ｐＨ８．０）］／０．５Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加し、３７℃で３０分間反応させて細胞溶解を実施し、２５℃、１１０×ｇで１０分間遠心分離してＴリンパ球を沈殿させ、上層液中５０μｌを９６穴のサンプル板（Ｗａｌｌａｃ）に移した。上層液に１．５倍のＯｐｔｉＰｈａｓｅ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｗａｌｌａｃ）を入れて５分間揺らした後、液体吸光器［１４５０ ＭｉｃｒｏＢｅｔａＴｒｉＬｕｘ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｌｉｑｕｉｄ ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ）］を利用して３Ｈに対するｃｐｍ値を測定し、Ｔリンパ球の増殖可否を確認した。図１８及び図１９でのように、連鎖融合された二量体ＣＤ２／Ｆｃ及びＣＴＬＡ４／Ｆｃが、単純融合された二量体に比べて卓越に活性免疫細胞の増殖を抑制することが分かった。
【０１３９】
〔実施例８〕
糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質のマウス血中における濃度半減期の増加効果の実験
糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質［ｍｇＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２、［ｍｇＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／Ｆｃ］２、［ｍｇＣＤ２−ＣＤ２／Ｆｃ］２及び［ｍｇＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／Ｆｃ］２の血中における半減期の測定は、マウス（ＩＣＲ、シャムタコ）の腹腔に精製された各融合蛋白質５μｇを注射した後、最高１２０時間（５日）一定の間隔で血液を採取した後、蛋白質の濃度を酵素免疫の検査法（ＥＬＩＳＡ）を利用して確認することにより行った。図２０、２１、２２でのように、糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質が、自然形態の同一な直列連鎖融合された二量体蛋白質に比べて、血中における半減期が増加されたことが分かった。これは持続的な効果を通じて効能の増大を期待することができる結果であると言える。
【０１４０】
〔実施例９〕
ＤＢＡ／１マウスのコラーゲン誘導の関節炎に対する単純／連鎖体の形態の二量体ＴＮＦＲ／Ｆｃ融合蛋白質の効果実験
アトロゲン−ＣＩＡ補助剤（Ａｒｔｈｒｏｇｅｎ−ＣＩＡ ａｊｕｖａｎｔ， Ｃｈｏｎｄｒｅｘ， ＵＳＡ）中の０．０５Ｍの酢酸に２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した、タイプＩＩのコラーゲンをＤＢＡ／１マウス一匹当たり尻尾に１００μｇずつ注入し、コラーゲン誘導の関節炎（ＣＩＡ； Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）を発病させた。ブースティング（Ｂｏｏｓｔｉｎｇ）は３週後に行い、不完全なフロイント補助剤（ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ， Ｄｉｆｃｏ， ＵＳＡ）を利用した。
ＤＢＡ／１マウスに、タイプＩＩのコラーゲン１００μｇで免疫化させた後、３〜４週後に関節炎の症状が表れた。症状が表れた後、３〜５日が過ぎればマウスの足が赤く腫れ上がり、炎症性の関節炎（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）は３〜４週以上持続され、炎症が弱化されても関節は永久に硬直される。関節炎の深度の主観的な尺度を表す表１２に基づいて１週間に２〜３回測定した（各実験群から５匹のマウスにおける平均値を求める）。コラーゲン誘導の関節炎に対する単純及び連鎖体の形態の二量体ＴＮＦＲ／Ｆｃの効果を測定するため、マウスにＴＮＦＲ／Ｆｃまたはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を腹腔内に注射した。ＴＮＦＲ／Ｆｃは、実験群当たり５匹のマウスに１９日〜４５日間、２日おきに１０μｇを注射した（図２３の矢印）。５匹の対照群のマウスにはＰＢＳを注射した。前記の測定結果を表した図７のように、既存の単純二量体の形態のＴＮＦＲ／Ｆｃ融合蛋白質を注入したマウスの場合を、対照群であるリン酸緩衝生理食塩水を注射したマウスで発病した関節炎の指標数値と比較するとき、約２６〜３８％減少した効果を表したが（４５日の測定値を基準）、連鎖体の形態の二量体である［ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２、［ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／Ｆｃ］２を注入した場合は、４２〜５５％減少した効果を表した。このように、従来の単純融合された二量体の形態のＴＮＦＲ／Ｆｃ融合蛋白質に比べ、直列連鎖融合された二量体のＴＮＦＲ／Ｆｃ融合蛋白質がマウスの関節炎を顕著に減少させることが分かった。
【０１４１】
【表１２】
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【０１４２】
前記結果は、連鎖体の形態の二量体ＴＮＦＲ／Ｆｃ融合蛋白質が、マウスのＣＩＡの発病率を低下させるのに既存の単純二量体の形態の融合蛋白質に比べて効果的であり、したがって関節炎の治療に使用することにおいて連鎖体の形態の蛋白質の製剤が、既存の蛋白質の製剤に比べて効果的な治療剤として使用され得るということを表す。
【０１４３】
本発明の連鎖体の蛋白質、直列連鎖融合された二量体蛋白質及びこの糖化修飾蛋白質は、増加した効能及び高度の安定性を表し、高い歩留まりで生成することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、従来の単純融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物を重合酵素の連鎖反応により製造する過程を示した概略図である。
【図２】
図２は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質をコーディングするＤＮＡ作製物を重合酵素の連鎖反応により製造する過程を示した概略図である。
【図３ａ】
図３ａは、従来の単純融合された単量体蛋白質を例示するＴＮＦＲ／Ｆｃ、ＣＤ２／ＦｃまたはＣＴＬＡ４／Ｆｃの融合蛋白質が細胞内で二量体化して形成される、単純融合された二量体蛋白質［ＴＮＦＲ／Ｆｃ］２、［ＣＤ２／Ｆｃ］２または［ＣＴＬＡ４／Ｆｃ］２の融合蛋白質の構造を示したものである。
【図３ｂ】
図３ｂは、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質を例示するＴＮＦＲ−ＴＮＦＲ／Ｆｃ、ＣＤ２−ＣＤ２／ＦｃまたはＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／Ｆｃの融合蛋白質が細胞内で二量体化して形成される、直列連鎖融合された二量体蛋白質［ＴＮＦＲ−ＴＮＦＲ／Ｆｃ］２、［ＣＤ２−ＣＤ２／Ｆｃ］２または［ＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／Ｆｃ］２の融合蛋白質の構造を示したものである。
【図４ａ】
図４ａは、本発明による直列連鎖融合された二量体蛋白質の一例として［ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２の構造を示したものである。
【図４ｂ】
図４ｂは、本発明による直列連鎖融合された二量体蛋白質の他の例として［ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／Ｆｃ］２の構造を示したものである。
【図４ｃ】
図４ｃは、本発明による直列連鎖融合された二量体蛋白質の更に他の例として［ＣＤ２−ＣＤ２／Ｆｃ］２の構造を示したものである。
【図４ｄ】
図４ｄは、本発明による直列連鎖融合された二量体蛋白質の更に他の例として［ＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／Ｆｃ］２の構造を示したものである。
【図５】
図５は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質の他の例としてＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃを発現する、本発明の組換え発現プラスミドｐＴＲ１１Ｉｇ−Ｔｏｐ１０’を作製する過程を図解したダイヤグラムである。
【図６】
図６は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質ＣＤ２−ＣＤ２／Ｆｃを発現する、本発明の組換え発現プラスミドｐＣＤ２２Ｉｇを作製する過程を図解したダイヤグラムである。
【図７】
図７は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃを発現する、本発明の組換え発現プラスミドｐＴＲ１１Ｉｇ−Ｔｏｐ１０’の図である。
【図８】
図８は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃを発現する、本発明の組換え発現プラスミドｐＴＲ２２Ｉｇ−Ｔｏｐ１０’の図である。
【図９】
図９は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質ＣＤ２−ＣＤ２／Ｆｃを発現する、本発明の組換え発現プラスミドｐＣＤ２２Ｉｇの図である。
【図１０】
図１０は、本発明による直列連鎖融合された単量体蛋白質ＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／Ｆｃを発現する、本発明の組換え発現プラスミドｐＣＴ４４Ｉｇの図である。
【図１１】
図１１は、本発明によって四つの糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃを発現する、本発明の組換え発現プラスミドｐＴＲ１１Ｉｇ−ＭＧの図である。
【図１２】
図１２は、本発明によって二つの糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／Ｆｃを発現する、本発明の組換え発現プラスミドｐＴＲ２２Ｉｇ−ＭＧの図である。
【図１３】
図１３は、本発明によって二つの糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＣＤ２−ＣＤ２／Ｆｃを発現する、本発明の組換え発現プラスミドｐＣＤ２２Ｉｇ−ＭＧの図である。
【図１４】
図１４は、本発明によって三つの糖化モーティブペプチドが挿入された直列連鎖融合された単量体蛋白質ｍｇＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／Ｆｃを発現する、本発明の組換え発現プラスミドｐＣＴ４４Ｉｇ−ＭＧの図である。
【図１５】
図１５は、本発明によって純粋精製された直列連鎖融合された二量体蛋白質 ［ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２及び［ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／Ｆｃ］２を還元条件及び非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した結果を示す。
【図１６】
図１６は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質［ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２（●）及び［ＴＮＦＲ２／Ｆｃ］２（○）、並びに本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質 ［ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２（▼）及び［ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／Ｆｃ］２（▽）が、ＴＮＦαの細胞毒性を抑制する効果を示したグラフである。
【図１７】
図１７は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質［ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２（●）及び［ＴＮＦＲ２／Ｆｃ］２（○）、並びに本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質［ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２（▼）及び［ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／Ｆｃ］２（▽）が、ＴＮＦβの細胞毒性を抑制する効果を示したグラフである。
【図１８】
図１８は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質［ＣＤ２／Ｆｃ］２（●）、公知された免疫抑制剤のシクロスポリンＡ（▼）及び本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質［ＣＤ２−ＣＤ２／Ｆｃ］２（○）が、活性Ｔリンパ球の増殖を抑制する効果を示したグラフである。
【図１９】
図１９は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質［ＣＴＬＡ４／Ｆｃ］２（●）、公知された免疫抑制剤のシクロスポリンＡ（▼）及び本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質［ＣＴＬＡ４／Ｆｃ］２（○）が、活性Ｔリンパ球の増殖を抑制する効果を示したグラフである。
【図２０】
図２０は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質［ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２（●）、本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質［ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２（○）及び本発明による例示的な糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質［ｍｇＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２（▽）の血中における半減期を示すグラフである。
【図２１】
図２１は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質［ＣＤ２／Ｆｃ］２（●）、本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質［ＣＤ２−ＣＤ２／Ｆｃ］２（○）及び本発明による例示的な糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質［ｍｇＣＤ２−ＣＤ２／Ｆｃ］２（▽）の血中における半減期を示すグラフである。
【図２２】
図２２は、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質［ＣＴＬＡ４／Ｆｃ］２（●）、本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質［ＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／Ｆｃ］２（○）及び本発明による例示的な糖化された直列連鎖融合された二量体蛋白質［ｍｇＣＴＬＡ４−ＣＴＬＡ４／Ｆｃ］２（▽）の血中における半減期を示すグラフである。
【図２３】
図２３は、ＰＢＳ（●）、従来の例示的な単純融合された二量体蛋白質 ［ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２（■）及び［ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２（▲）、並びに本発明による例示的な直列連鎖融合された二量体蛋白質［ＴＮＦＲ１−ＴＮＦＲ１／Ｆｃ］２（×）及び［ＴＮＦＲ２−ＴＮＦＲ２／Ｆｃ］２（△）によるＤＢＡ／１マウスにおけるコラーゲン誘導の関節炎（ＣＩＡ）の抑制効果を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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