(57)【要約】【課題】ポリマーマトリックスに共有的に結合された二機能性ポリ（アルケングリコール）分子を備えたハイドロゲルに関する。【解決手段】このハイドロゲルは、例えばグルタルアルデヒドを用いて架橋されていてもよい。このハイドロゲルは、また、光共重合可能アクリレート類の浸透ネットワークを介して架橋されていてもよい。このハイドロゲルは、また、さきのポリ（アルキレングリコール）分子に共有的に結合した薬物学的活性物質を有すべく改変されてもよく、あるいは、ハイドロゲルに含有されていてもよい。また、このハイドロゲル中に生細胞を有していてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１ポリマーマトリックス；及び
置換又は無置換α端及び置換又は無置換ω端を有するポリ（アルキレングリコール）分子を備える二機能性改変物；
を備え、
前記α端又は前記ω端の少なくとも一方が、前記第１ポリマーマトリックスに共有的に結合されていることを特徴とする、ハイドロゲル。
【請求項２】
前記第１ポリマーマトリックスには結合されずに、前記α端又は前記ω端の一方に共有的に結合された薬物学的活性物質をさらに備える、請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項３】
前記第１ポリマーマトリックスは、タンパク性であることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項４】
前記第１ポリマーマトリックスは、アミノ基を有し、かつ前記α端又は前記ω端の少なくとも一方は、該アミノ基に共有的に結合していることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項５】
前記第１ポリマーマトリックスは、ゼラチン、アルギン酸カルシウム、アルギン酸カルシウム／ナトリウム、コラーゲン、酸化再生セルロース、カルボキシメチルセルロース、アミノ基改変セルロース及びホエイタンパクからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項６】
前記第１ポリマーマトリックスは、ゼラチン及びコラーゲンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項７】
前記第１ポリマーマトリックスは、架橋剤により架橋されていることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項８】
前記第１ポリマーマトリックスは、グルタルアルデヒドにより架橋されていることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項９】
前記第１ポリマーマトリックスは、該マトリックスに結合したＥＤＴＡＤをさらに備えていることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項１０】
前記ポリ（アルキレングリコール）分子の前記α端及び前記ω端は、互いに異なっていることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項１１】
前記α端及び前記ω端は、ハロゲン、水酸基、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、Ｃ１−Ｃ２４アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキル基、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルケニル基、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキニル基、シアノ−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキニル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロヘテロアルキル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロヘテロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロヘテロアルキニル基、アシル、アシル−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、アシル−Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、アシル−Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、カルボキシ基、Ｃ１−Ｃ２４アルキルカルボキシ基、Ｃ１−Ｃ２４アルケニルカルボキシ基、Ｃ１−Ｃ２４アルキニルカルボキシ基、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、アリル基、アリル−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、アリル−Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、アリル−Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、ヘテロアリル基、ヘテロアリル−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、ヘテロアリル−Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、ヘテロアリル−Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、スルフォネート、アリルスルフォネート、及びヘテロアリルスルフォネートからなる群から選択された残基により置換されることを特徴とする請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項１２】
前記α端に存在する前記残基は、前記ω端に存在する前記残基とは異なっていることを特徴とする請求項１１に記載のハイドロゲル。
【請求項１３】
前記α端及び前記ω端の前記残基は、アルキル基、アリル基、アシル基、ハロゲン、水酸基、アミノ基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アシルアミノ基、チオアミド基、アシルオキシ基、アリルオキシ基、アリルオキシアルキル基、メルカプト、チア、アザ、オキソ、飽和環状炭化水素、不飽和環状炭化水素、ヘテロ環、アリル基、及びヘテロアリル基からなる群から選択された置換基にて置換又は無置換されていることを特徴とする請求項１１に記載のハイドロゲル。
【請求項１４】
内部に薬物学的に活性な物質をさらに有する請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項１５】
内部に生細胞をさらに有する請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項１６】
前記第１ポリマーマトリックスに浸透する第２ポリマーマトリックスをさらに有する請求項１に記載のハイドロゲル。
【請求項１７】
前記第２ポリマーマトリックスは、光共重合されたポリ（アクリレート）を備えていることを特徴とする請求項１６に記載のハイドロゲル。
【請求項１８】
前記第２ポリマーマトリックスは、α−アクリレート−ω−ポリ（アルケングリコール）、トリメチロールプロパントリアクリレート、アクリル酸及びアクリロイルハライドからなる群から選択された一つ以上のモノマーを備えていることを特徴とする請求項１６に記載のハイドロゲル。
【請求項１９】
前記第１ポリマーマトリックスに結合されずに、前記α端及び前記ω端の一方に共有的に結合されている薬物学的活性物質をさらに備えている請求項１６に記載のハイドロゲル。
【請求項２０】
内部に薬物学的活性物質をさらに備えていることを特徴とする請求項１６に記載のハイドロゲル。
【請求項２１】
内部に生細胞をさらに備えていることを特徴とする請求項１６に記載のハイドロゲル。
【請求項２２】
反応性アミノ酸残基を有する第１ポリマーマトリックス；
下式：
【化１】
2004534111.tif 000025
なる化合物を備えている二機能性改変物；
からなり、
前記Ａ残基又は前記Ｚ残基の少なくとも一方が、前記ポリマーマトリックスの前記反応性アミノ酸残基に共有的に結合しており；
前記Ａ残基及び前記Ｚ残基は、水酸基、ハロゲン、水酸基、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、Ｃ１−Ｃ２４アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキル基、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルケニル基、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキニル基、シアノ−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキニル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロヘテロアルキル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロヘテロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロヘテロアルキニル基、アシル、アシル−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、アシル−Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、アシル−Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、カルボキシ基、Ｃ１−Ｃ２４アルキルカルボキシ基、Ｃ１−Ｃ２４アルケニルカルボキシ基、Ｃ１−Ｃ２４アルキニルカルボキシ基、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、アリル基、アリル−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、アリル−Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、アリル−Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、ヘテロアリル基、ヘテロアリル−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、ヘテロアリル−Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、ヘテロアリル−Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、スルフォネート、アリルスルフォネート、及びヘテロアリルスルフォネートからなる群から選択されており；
前記ｍは、２以上８以下の整数であり；
前記ｎは、１００以上の整数である；
ことを特徴とする、ハイドロゲル。
【請求項２３】
前記第１ポリマーマトリックスに結合されておらず、前記Ａ残基又は前記Ｚ残基の一方に共有的に結合されている薬物学的活性物質をさらに備えている請求項２２に記載のハイドロゲル。
【請求項２４】
前記第１ポリマーマトリックスは、タンパク性であることを特徴とする請求項２２に記載のハイドロゲル。
【請求項２５】
前記第１ポリマーマトリックスは、ゼラチン、アルギン酸カルシウム、アルギン酸カルシウム／ナトリウム、コラーゲン、酸化再生セルロース、カルボキシメチルセルロース、アミノ基改変セルロース及びホエイタンパクからなる群から選択されることを特徴とする請求項２２に記載のハイドロゲル。
【請求項２６】
前記第１ポリマーマトリックスは、ゼラチン及びコラーゲンからなる群から選択されることを特徴とする請求項２２に記載のハイドロゲル。
【請求項２７】
前記第１ポリマーマトリックスは、架橋剤により架橋されていることを特徴とする請求項２２に記載のハイドロゲル。
【請求項２８】
前記第１ポリマーマトリックスは、グルタルアルデヒドにより架橋されていることを特徴とする請求項２２に記載のハイドロゲル。
【請求項２９】
前記第１ポリマーマトリックスは、該マトリックスに結合したＥＤＴＡＤをさらに備えていることを特徴とする請求項２２に記載のハイドロゲル。
【請求項３０】
前記Ａ残基及び前記Ｚ残基は、互いに異なっていることを特徴とする請求項２２に記載のハイドロゲル。
【請求項３１】
前記ｎは、２００以上であることを特徴とする請求項２２に記載のハイドロゲル。
【請求項３２】
前記ｎは、２０，００以上であることを特徴とする請求項２２に記載のハイドロゲル。
【請求項３３】
前記ｎは、２０，０００以上であることを特徴とする請求項２２に記載のハイドロゲル。
【請求項３４】
内部に薬物学的に活性な物質をさらに有する請求項２２に記載のハイドロゲル。
【請求項３５】
内部に生細胞をさらに有する請求項２２に記載のハイドロゲル。
【請求項３６】
前記第１ポリマーマトリックスに浸透する第２ポリマーマトリックスをさらに有する請求項２２に記載のハイドロゲル。
【請求項３７】
前記第２ポリマーマトリックスは、光共重合されたポリ（アクリレート）を備えていることを特徴とする請求項３６に記載のハイドロゲル。
【請求項３８】
前記第２ポリマーマトリックスは、α−アクリレート−ω−ポリ（アルケングリコール）、トリメチロールプロパントリアクリレート、アクリル酸及びアクリロイルハライドからなる群から選択された一つ以上のモノマーを備えていることを特徴とする請求項３６に記載のハイドロゲル。
【請求項３９】
前記第１ポリマーマトリックスに結合せずに、前記Ａ残基及び前記Ｚ残基の一方に共有的に結合している薬物学的活性物質をさらに備えている請求項３６に記載のハイドロゲル。
【請求項４０】
内部に薬物学的活性物質をさらに備えていることを特徴とする請求項３６に記載のハイドロゲル。
【請求項４１】
内部に生細胞をさらに備えていることを特徴とする請求項３６に記載のハイドロゲル。
【請求項４２】
第1ポリマーマトリックス；
置換又は無置換α端及び置換又は無置換ω端を有するポリ（アルキレングリコール分子を備える二機能性改変物；及び
前記第１ポリマーマトリックスに浸透する第２ポリマーマトリックス；
を備え、
前記α端及び前記ω端の少なくとも一方は、前記第１ポリマーマトリックスに共有的に結合されており；かつ
前記第２ポリマーマトリックスは前記第１ポリマーマトリックスに浸透する；
ことを特徴とする、ハイドロゲル。
【請求項４３】
前記第１ポリマーマトリックスは、タンパク性であり、かつ前記第２ポリマーマトリックスは、光共重合されたポリ（アクリレート）を備えていることを特徴とする請求項４２に記載のハイドロゲル。
【請求項４４】
前記第１ポリマーマトリックスは、ゼラチン及びコラーゲンからなる群から選択されており、かつ前記第２ポリマーマトリックスは、光共重合されたポリ（アクリレート）を備えていることを特徴とする請求項４２に記載のハイドロゲル。
【請求項４５】
前記第１ポリマーマトリックスに結合されずに、前記α端及び前記ω端の一方に共有的に結合されている薬物学的活性物質をさらに備えている請求項４２に記載のハイドロゲル。
【請求項４６】
内部に薬物学的活性物質をさらに備えていることを特徴とする請求項４２に記載のハイドロゲル。
【請求項４７】
内部に生細胞をさらに備えていることを特徴とする請求項４２に記載のハイドロゲル。
【請求項４８】
置換又は無置換α端及び置換又は無置換ω端を有するポリ（アルキレングリコール分子を備える二機能性改変物と第１ポリマーマトリックスとを反応させ、これにより、前記α端又は前記ω端の少なくとも一方が、該第１ポリマーマトリックスに共有的に結合していることを特徴とする、ハイドロゲルの製造方法。
【請求項４９】
架橋剤により前記第１ポリマーマトリックスを架橋することをさらに備えていることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記第１ポリマーマトリックスは、グルタルアルデヒドにより架橋されていることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記第１ポリマーマトリックスとＥＤＴＡＤとを経時的に反応させ、ＥＤＴＡを該第１ポリマーマトリックスに結合させることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記二機能性改変物と薬物学的活性物質とを反応させ、これにより、該薬物学的活性物質が、前記第１ポリマーマトリックスとは結合されず、前記α端又は前記ω端の一方に共有的に結合されていることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記二機能性改変物の前記α端及び前記ω端は、互いに異なっていることを特徴とする請求項４８に記載のハイドロゲル。
【請求項５４】
前記第１ポリマーマトリックスは、ゼラチン、アルギン酸カルシウム、アルギン酸カルシウム／ナトリウム、コラーゲン、酸化再生セルロース、カルボキシメチルセルロース、アミノ基改変セルロース及びホエイタンパクからなる群から選択されることを特徴とする請求項４８に記載のハイドロゲル。
【請求項５５】
前記第１ポリマーマトリックスは、ゼラチン及びコラーゲンからなる群から選択されることを特徴とする請求項４８に記載のハイドロゲル。
【請求項５６】
前記ハイドロゲルの内部に薬物学的活性物質を含有させることをさらに備えている請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
第２ポリマーマトリックスを生成させるように、前記第１ポリマーマトリックスと複数のモノマーとを接触させ、該モノマーを共重合することをさらに備え、かつ
該第２ポリマーマトリックスは該第１ポリマーマトリックスに浸透することを特徴とする請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
前記の複数のモノマーは、光共重合されたポリ（アクリレート）を備え、かつ、該モノマーは、赤外線、可視光又は紫外光放射の曝露により重合されることを特徴とする、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記の複数のモノマーは、α−アクリレート−ω−ポリ（アルケングリコール）、トリメチロールプロパントリアクリレート、アクリル酸及びアクリロイルハライドからなる群から選択された一つ以上のモノマーを備えていることを特徴とする請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
薬物学的活性物質を、前記第１ポリマーマトリックスではなく、前記α端又は前記ω端の一方に共有的に結合させることをさらに備えた、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記ハイドロゲル内部に薬物学的活性物質を含有させることをさらに備えた、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記ハイドロゲル内部に生細胞を含有させることをさらに備えた、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
必要に応じて、患者に、薬物学的活性物質又は細胞を投与する方法であって、請求項１に記載のハイドロゲルの内部に薬物学的活性物質又は細胞を含有させ、その後、必要に応じて、該ハイドロゲルを患者へと投与することを備えていることを特徴とする、方法。
【請求項６４】
必要に応じて、患者に、薬物学的活性物質又は細胞を投与する方法であって、請求項２２に記載のハイドロゲルの内部に薬物学的活性物質又は細胞を含有させ、その後、必要に応じて、該ハイドロゲルを患者へと投与することを備えていることを特徴とする、方法。
【請求項６５】
必要に応じて、患者に、薬物学的活性物質又は細胞を投与する方法であって、請求項４２に記載のハイドロゲルの内部に薬物学的活性物質又は細胞を含有させ、その後、必要に応じて、該ハイドロゲルを患者へと投与することを備えていることを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（優先権）
優先権は、２００１年４月２３日仮出願番号第６０／２８５、７８２号に対して請求されており、その全内容はここに組み込まれている。
【０００２】
（連邦政府補助金）
本発明は、以下の機関から付与された米国政府支援にて構成されている。つまり、ＮＩＨ  ＨＬ６３６８６である。米国政府は、本発明の特定の権利を有している。
【０００３】
（本発明の属する技術分野）
本発明は、二機能性試薬を用いて改変されたハイドロゲルに関しており、このハイドロゲルを使用し、薬物又は他の生物学的活性物質を必要に応じて哺乳動物へと送達する。また、その組成は、ここに述べたハイドロゲル、及び創傷被覆材、おむつ、生理用品などをこのハイドロゲルに組み込んだ装置を有している。
【０００４】
（参考文献の導入）
“参考文献”のセクションに挙げたすべての文献をここに組み込む。
【０００５】
（背景）
治癒や胚発育などの生物学的システムは、空間的かつ一時的に制御された組織体の下にて、制御されている。無数のシグナル及び細胞は、すべて、空間的かつ時間的に、例えば創傷を治癒し、外来物を取り囲みかつ中和すべく作用している。生物医学的装置を構築すべく使用されている現在の材料の効果は、これら生物学的システムにおける特有の力学を補完するための多機能性構造の欠除により限定されている。
【０００６】
例えば、多くの創傷被覆材は、単に傷をシールドする簡単なバリア以上のものを供しているわけではなく、かつ外来物がこの傷に進入することから阻止するだけのものを供しているだけである。その他の新規なタイプの被覆材もまた、創傷部位において肺血症を阻止するための抗生物質を含むのみである。しかしながら、これらの被覆材は、例えば、傷から発生する滲出液に対して対処するわけではない。したがって、これらの被覆材は、しばしば取り替えられるべきである。
【０００７】
特定の生分解性ポリマーは、火傷用被覆材、止血用パッチ、及びこれに類似するものに使用されてきた。これら生分解性ポリマーは、バリア及び組織再生を供する。しかしながら、これらのタイプの被覆材は、治癒的効果を有していない。これらのタイプの被覆材が、創傷部位の生理的妨害に対して効果的なバリアを供する一方、瘢痕はさらに増大する。
【０００８】
新規の創傷被覆材料の広範な研究にもかかわらず、非常に少ない材料が現在の医療に使用されている。理想的な機能を有する創傷被覆材は、以下の特性を有すべきである：毒性を有さず、生体適合性を有し、創傷滲出液及び毒物を吸着する水分やガス並びに適当な湿度及び酸素レベルを保持すべく透過性を有することである。創傷の膨潤や、創傷部位とこの材料との間の流動物の蓄積を阻止すべく多孔性であるべきである。柔軟性があり耐久性があり、局所的な炎症や感染を最小限にすべきであり、これにより、新規の脈管化、再上皮形成、及び通常治癒を惹起する。
【０００９】
ハイドロゲルは、多量の水分の吸収が可能な三次元ネットワークである。ハイドロゲルは、多種類の用途について探求されてきており、これらには、薬物送達装置、創傷被覆材料、コンタクトレンズ、細胞移植マトリックスなどが含まれる。ゼラチンなどの食用のハイドロゲルは、質感改変、ゲル化、ビールやワインの分類、及び医薬用カプセルなどの種々の食品関連分野にて広範な使用可能性を見出している。
【００１０】
（本発明の概略）
本発明は、ポリマーマトリックスを備えたハイドロゲルに関しており、このマトリックスは、好ましくは、ゼラチンや合成ポリマー（好ましくは生分解性であることであるが、非生分解性であってもよい）、二機能性ポリ（アルキレングリコール）が、このポリマーマトリックスに共有的に結合することによって含まれる改変物で構成されている。ポリ−Ｃ１−Ｃ６−ポリ（アルキレングリコール）分子や、好ましくは、ポリ（エチレングリコール）分子（ｈＰＥＧｓ）などの、α端とω端を有するヘテロ二機能性は、α端及びω端を含む部分に、共有結合によりポリマー骨格に結合されている。一種類以上の生体機能性物質（つまり、薬物学的活性物質）は、ｈＰＥＧｓの上記とは別のα端あるいはω端に結合されており（つまり、フリーな端部に結合されており）、これにより、改変された、薬物学的に活性な、単一の、共有結合ハイドロゲルが得られる。本発明の好適実施例に関する概略図は、図４に示されている。
【００１１】
限定しないが、種々の薬物学的活性物質をこのハイドロゲルに組み込んでもよく、これらに含まれるのは（限定するものではないが）、外傷治療薬、止血薬、抗生物質、アンチセルミンティクス（ａｎｔｉｔｈｅｌｍｉｎｔｉｃｓ）、抗菌物質、ホルモン、抗炎症薬、タンパク質、ポリペプチド、オリゴヌクレオチゴ、サイトカイン、酵素などが含まれる。
【００１２】
本発明のハイドロゲルは、種々の用途を見出し、その好例には、機能性創傷被覆材がある。この好適実施例において、ハイドロゲルは、薬物学的に活性な物質として、外傷治療薬が、差別的な改変を介して、α及びω置換ＰＥＧリンカーを介して生分解性ポリマーへと共有的に結合されている。
【００１３】
また、本発明のハイドロゲルは、帯具、外科用及び歯科用創傷包装材料、おむつ、及び生理用品及びこれらに類似のものに組み込まれていてもよい。
【００１４】
ここに述べられている新規のハイドロゲル組成物は、現在の生物医学的ハイドロゲルの形成に一般的な物質的な混合物ではない；したがって、本発明のハイドロゲルの化学的かつ物理的特性は、均一であり、最終的な特定の医療的要件に適合すべく仕立てられていてもよい。さらに、このハイドロゲル構成物は、機械的に安定である。なぜなら、この部材は、共有的に結合しているためである。加えて、この多孔性を有するハイドロゲルにおける親水性及び柔軟性は、創傷滲出液の吸収に対応しており、（もし必要でありあるいは所望ならば）、創傷部位からこの材料の最終的な除去を補助している。ゼラチンの性質及びこの構造物の多孔性は、さらにガス交換を容易にし、かつ治癒を可能としている。最も重要なのは、マトリックス内部にて、ｈＰＥＧ結合生体活性物質の存在及びその他の薬物学的化合物の負荷は、一時的かつ空間的に制御された生理活性信号の送達に関し、宿主治癒工程の力学を調節し、かつ補完を可能にしている。
【００１５】
本発明は、現存する製品に対して、種々のキーとなる商用の利点を供している。例えば、新規の創傷被覆材料の開発における広範な研究があるにもかかわらず、機能的な創傷被覆材に関して必要な多重的な要件に起因し、非常に少ない数の材料のみが医療的に使用されている。理想的な機能を有する創傷被覆材は、毒性を有さず、生体適合性を有し、創傷滲出液及び毒物を吸着するとともに、湿度や酸素レベルを保持すべく水分やガスに対して透過性を有していることである。この被覆材は、創傷部位での膨潤を阻止し、かつ創傷部位とこの材料との間の流動物の蓄積を阻止すべく多孔性であるべきである。これらは、柔軟性及び耐久性を有すべきである。これらは、生体適合性を有すべきであり、かつ、局所的な炎症及び感染を最小限にすべきである。これらは、血管新生、皮膚再形成、及び通常治癒を惹起すべきである。ここに述べた新規の多機能性ハイドロゲルは、医療的に生存に適した創傷被覆材料に関する上述の要件すべてを解決すべく製造されてもよい。
【００１６】
したがって、第１の実施例において、本発明は、ポリマーマトリックスを備えたハイドロゲルに関する。好適なポリマーマトリックスは、反応性アミノ基を有している。最も好適なポリマーマトリックスはゼラチン及びコラーゲンである。このポリマーマトリックスは、α端を置換又は無置換されかつω端を置換又は無置換されたポリ（アルケングリコール）分子を有する二機能性改変物を使って改変されている。少なくとも一つのα端又はω端部は、ポリマーマトリックスに共有的に結合されている。他の端部は、ハイドロゲルの内部に存在し、その物理的化学的特性を改変している。α端及びω端の性質を調節することにより、得られたハイドロゲルの物理的及び化学的質を変化させてもよい。
【００１７】
追加的に、好適実施例において、このα及びω端は、異なっており、かつしたがって、異なる反応性を有している。このことは、例えば、一種類以上の薬物学的活性物質が、ポリマーマトリックスに結合していないα端又はω端の一つに共有的に結合することを可能としている。代替的に（あるいは同時に）、一種類以上の薬物学的活性物質は、ハイドロゲル内部に導入されていてもよい。
【００１８】
ハイドロゲルのポリマーマトリックスは、グルタルアルデヒドなどの架橋材にて架橋されていてもよい。架橋により、得られるゲルの吸収特性及び材料強度が変化する。したがって、架橋は、ゲルに必要とされる機械的強度を増加させる場所に望ましいかもしれない。
【００１９】
上述したように、ハイドロゲルのα端及び／又はω端は、置換されていても置換されていなくてもよい。置換されている場合、所望なのは、ハロゲン、水酸基、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、Ｃ１−Ｃ２４アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキル基、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルケニル基、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキニル基、シアノ−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキニル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロヘテロアルキル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロヘテロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロヘテロアルキニル基、アシル、アシル−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、アシル−Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、アシル−Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、カルボキシ基、Ｃ１−Ｃ２４アルキルカルボキシ基、Ｃ１−Ｃ２４アルケニルカルボキシ基、Ｃ１−Ｃ２４アルキニルカルボキシ基、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、ヘテロアリル基、ヘテロアリル−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、ヘテロアリル−Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、ヘテロアリル−Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、スルフォネート、アリルスルフォネート、及びヘテロアリルスルフォネートからなる群から選択された置換基である。
【００２０】
さらに、これら残基自体がさらに置換されていてもよい。したがって、α端及びω端における残基が置換されている場合、アルキル基、アリル基、アシル基、ハロゲン、水酸基、アミノ基、アルコキシキ、アルキルアミノ基、アシルアミノ基、チオアミド基、アシロキシ基、アリロキシ基、アリロキシアルキル基、メルカプト基、チア、アザ、オキソ、飽和環状炭化水素、不飽和環状炭化水素、ヘテロ環、アリル基、及びヘテロアリル基からなる群から選択された置換基を有している。
【００２１】
さらに特に、本発明は、ハイドロゲルに関しており：
活性アミノ酸残基を有するポリマーマトリックス；及び
二機能性改変物；
を備えており、この二機能性改変物は、以下の式：
【００２２】
【化２】
2004534111.tif 000002
の化合物を有しており、前記Ａ又は前記Ｚの少なくとも一方の残基は、前記ポリマーマトリックスの前記活性アミノ残基に共有的に結合されており；
前記Ａ及び前記Ｚは、ハロゲン、水酸基、Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、Ｃ１−Ｃ２４アルコキシ基、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキル基、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルケニル基、Ｃ１−Ｃ２４ヘテロアルキニル基、シアノ−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロアルキニル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロヘテロアルキル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロヘテロアルケニル基、Ｃ３−Ｃ１０シクロヘテロアルキニル基、アシル、アシル−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、アシル−Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、アシル−Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、カルボキシ基、Ｃ１−Ｃ２４アルキルカルボキシ基、Ｃ１−Ｃ２４アルケニルカルボキシ基、Ｃ１−Ｃ２４アルキニルカルボキシ基、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、カルボキシ−Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、ヘテロアリル基、ヘテロアリル−Ｃ１−Ｃ２４アルキル基、ヘテロアリル−Ｃ１−Ｃ２４アルケニル基、ヘテロアリル−Ｃ１−Ｃ２４アルキニル基、スルフォネート、アリルスルフォネート、及びヘテロアリルスルフォネートからなる群から選択された置換基であり；
前記ｍは、２以上８以下の整数であり；
前記ｎは、１００以上の整数である。好適実施例において、ｍは、２であり、ｎは２００以上である。
【００２３】
本発明の第２の実施例は、上述のハイドロゲルに関しており、さらに第二ポリマーマトリックスを有している。この実施例において、第２ポリマーマトリクスは、第１ポリマーマトリックスに浸透している。したがって、埋め込まれた改変物質を有する第１ポリマーマトリックスは、第２の浸透ポリマーマトリックス内部に浸透し、かつ物理的に結合されている。第２の好適実施例において、第２ポリマーマトリックスは、α−アクリレート−ω−アクリレート−ポリ（アルキレングリコール）、トリメチロールプロパントリアクリレート、アクリル酸、及び／又はアリロイルハライドなどの光重合されたポリ（アクリレート）を有している。第２ポリマーマトリックスは、ホモ重合体又は共重合体であってもよく、あるいは、二種類以上のモノマー型であってもよい。
【００２４】
第１実施例のように、浸透ハイドロゲルは、さらに、第１ポリマーマトリックスに結合していないα端又はω端の一つに共有的に結合された薬物学的活性物質を有していてもよい。
【００２５】
同様に、本発明におけるすべてのハイドロゲルは、さらに、薬物学的に活性な物質又は生細胞をハイドロゲルの内部に有していてもよい。
【００２６】
本発明の第３の実施例は、上述のハイドロゲルの製造方法に関している。この方法は、ポリマーマトリックスと、α端を置換又は無置換されかつω端を置換又は無置換されたポリ（アルケングリコール）分子を有する二機能性改変物とを反応させ、これにより、ポリマーマトリックスに対して少なくともα端又はω端の一方と共有的に結合される。
【００２７】
本発明の第４の実施例は、前記のパラグラフにて述べた方法に関連しており、さらに、第１ポリマーマトリックスに複数のモノマーを接触させ、その後、このモノマーを共重合反応し、第２ポリマーマトリックスを生じさせるものであり、この第２ポリマーマトリックスは、第１ポリマーマトリックスに浸透することを特徴としている。この実施例により、浸透ポリマーナットワークの形成が、ｉｎ  ｓｉｔｕにて可能となる。
【００２８】
本発明のハイドロゲルは、現在使用している種々の応用例にて使用されてもよい。したがって、本発明のハイドロゲルは、創傷被覆材、おむつ、生理用品、及びこれらの類似物への使用を見出している。一つの実施例において、このハイドロゲルは、患者の必要に応じて、薬物学的に活性な物質の投与に使用されている。この使用において、この薬物学的に活性な物質は、ゲルに共有的に結合されていてもよいし、あるいはゲル内部に存在していてもよい。このゲルは、その後、外科的あるいは外傷的損傷部位にパックされることにより患者に投与される。
【００２９】
また、本発明のハイドロゲルは、生細胞の足場としても有用である。したがって、本発明のハイドロゲルは、生物機械的装置として使用されてもよい。このハイドロゲルは、ゲルの内部にて生細胞を支持し、これにより、細胞が成長し増殖することが可能な、三次元支持体を供することになる。生細胞を有する本発明におけるハイドロゲルは、この種の細胞の必要に応じて、患者に移植されてもよい。
【００３０】
（本発明の詳細な記載）
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などのポリ（アルキレングリコール）は、その低毒性、良好な生体適合性及び良好な溶解性ゆえ、医薬領域に広範に使用されている（１−５）。簡潔に解説する目的により、以下の記述は、二機能性のポリ（エチレングリコール）分子により改変されたゲルに限定して述べる。しかしながら、本発明は、種々のポリ（アルキレングリコール）を使用することにより同様の機能を有するだろう。
【００３１】
したがって、好ましくは、この二機能性改変物は、以下式：
【００３２】
【化３】
2004534111.tif 000003
のポリ（アルキレングリコール）を有している。この式において、ｍは２以上８以下の整数であり；ｎは、１００以上の整数であり、Ａ及びＺは上述の通りである。好適実施例において、ｍは２であり、ｎは、およそ１００、０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧ分子を得るべく十分な大きさである。したがって、好ましくは、ｎは２、０００以上である。ｎ置換数は、１×１０６Ｄａ以上の分子量を有するＰＥＧ分子を得るべく十分大きくてもよく、この場合、ｎはおよそ２０、０００以上である。
【００３３】
良好な生体適合性及び溶解性を有する一方、ＰＥＧジオール又はモノメトシキ−ＰＥＧにおける水酸基は、非常に限定された化学的反応性を有している。したがって、本発明は、新規のハイドロゲルに関連しており、物理的及び生物学的特性を改変すべく共有物として、二機能性ＰＥＧｓ及びヘテロ二機能性ＰＥＧｓ（ｈＰＥＧｓ）を使用している。向上された反応性及び物理化学的特性を有する二機能性ＰＥＧｓは、新規のハイドロゲルを得るべく、一般にポリマーマトリックス、特にタンパク性のマトリックスを改変すべく使用されている。これら新規のハイドロゲルは、種々の生体材料及び生体薬物学的組成物並びに経時的放出媒介物、創傷被覆材、パッキング、帯具、火傷被覆材、生理用品、おむつなどを含むハイドロゲル部材を含有する装置に有用である。
【００３４】
現在、ｈＰＥＧｓの合成は、二つの一般的なカテゴリー：つまり１）ＰＥＧ前駆物質の統計的末端改変；及び２）特定のイニシエーターを用いたエチレンオキシドの共重合法；
に分類されている（６−９）。現在種々の市販で利用可能なｈＰＥＧが存在しているにもかかわらず（例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｒｐｏｒａｔｉｏｎ，  Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，  Ａｌａｂａｍａ社製品）、種々の応用例に関し、新規の生体材料の開発に実験室にて使用されるこれらの材料の利用は、その高いコスト及び限定された質により制限されている。本発明の開発において、統計的末端改変法に基づくｈＰＥＧ化合物のライブラリーを製造すべく、種々の合成スキームが開発された。
【００３５】
種々の反応スキームに関する異なる利点は、これらを市販にて利用可能なＰＥＧジオールとして使用することである。ＰＥＧジオールは、異なる分子量を有するホストとして利用可能であり、（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎを含む）多くの国際的なサプライヤーから入手可能である。
【００３６】
さらに、この合成ストラテジーは、種々の中間産物から最終的な異なるｈＰＥＧ製品の形成を行うべく改変が合理化されている。
【００３７】
本発明のｈＰＥＧｓを使用することにより、多種多様な物理化学的特性及び表面特性を有するポリマーネットワークが開発されている。これらネットワークは、細胞−材料相互作用を学習するために使用されてもよい（１０−１３）。
【００３８】
以下の実施例において、ｈＰＥＧｓは、新規のハイドロゲルを得るべくポリマーマトリックスを改変すべく使用されている。ｈＰＥＧの表面親水性及び細胞との相互作用に関し、その濃度、分子量、及び末端の化学的機能性に関する効果は、開発され、本願の実施例に示されている。多重的で異種的なＰＥＧ改変（例えば、ポリアクリル酸骨格のカルボン酸及びペンデント鎖構造におけるｈＰＥＧを結合したダングリング末端における機能性基など）は、ペプチドやハイドロゲルに対する薬物などの種々の異なるタイプの生体機能性分子を結合するために使用されてもよい。
【００３９】
したがって、これらの部材は、機能性を有する創傷被覆材として非常に有用である。好適実施例において、このポリマーマトリックスは改変ゼラチンである。ゼラチンを使用することは二次的ではない。ゼラチンは、よく特徴づけされており、ＰＦＡにより認可された、生分解性生体材料である。したがって、改変ゼラチンから得られるハイドロゲルは同様に、ゼラチンに公知の安全性ゆえ、通常検査に適合する。
【００４０】
ゼラチンの親水性及び多孔性は、エチレンジアミンテトラ酢酸ニ水和物（ＥＤＴＡＤ）などの両性残基を使用して改変される。得られたポリマー骨格は、少量のグルタルアルデヒドにより架橋されてもよく、続いて、抗生物質などの医薬的物質を負荷されてもよい。得られたハイドロゲルに関する水保持性、膨潤性、分解性、薬物放出速度論は、架橋剤の量及びＥＤＴＡＤ改変の範囲を変化させることにより調節されてもよい。
【００４１】
生体適合性及び機械的特性を向上させるため、ハイドロゲルはその後、下述するように種々のｈＰＥＧｓにより移植される。
【００４２】
これら新規の生体材料の機能特性を探査するため、ヒト白血球及びヒト線維芽細胞を有するｈＰＥＧｓ、ｈＰＥＧ改変ゲラチンハイドロゲル及び構成ポリマーネットワークとの相互作用が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの両方にて検討された。ｈＰＥＧｓの末端基は、ハイドロゲルマトリックスへの生体活性ペプチドを架橋するために使用され、これにより、白血球などの宿主細胞の相互作用を制御し、良好な生物学的相互作用を促進している。実施例において示されたのは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにて白血球及び宿主との相互作用の調節における種々の生体活性オリゴペプチドの分子相互作用が改変可能である、ということである。
【００４３】
得られたハイドロゲルは、機能性を有する創傷被覆材、帯具、及びこれらに類似するものに使用してもよい。これらの機能性を有する創傷被覆材は、内部的及び外部的な両方への使用に適している。本発明におけるゼラチン−ｈＰＥＧハイドロゲルは、皮下的に囲われた移植モデルにおいて検査されている。
【００４４】
本発明におけるハイドロゲルの新規な面の一つは、このポリマー構造物は物質的な混合物ではないということである。本発明のハイドロゲルは、化学的及び物理的に均一であり、最終的な特定の医療要件に適合すべく製造されてもよい。このハイドロゲルは、互いに共有的に結合しているゆえ、機械的に安定である。追加的に、この多孔性を有するハイドロゲルに関する親水性及び柔軟性は、創傷滲出物や血液などの吸収に適合しており、創傷部位からこの材料の最終的な除去を補助している。
【００４５】
また、ゼラチンの性質及びこの構造物の多孔性は、ガス交換を容易にし、かつ急速な治癒を惹起している。さらに重要なのは、ハイドロゲルマトリックス自身内部にｈＰＥＧ結合生体活性物質が存在することにより、創傷治癒工程の質感及び制御性を付加している。
【００４６】
下述するように、合成スキームは、二つの異なる末端残基を有するヘテロ二機能性ＰＥＧｓ（ｈＰＥＧｓ）のライブラリーを創製するために開発された。このｈＰＥＧｓは、その後、種々の表面特性及び種々の物理化学的特性を有する改変ポリマーハイドロゲルの製造に使用される。広範なＮＭＲ及びＨＰＬＣ分析は、ｈＰＥＧの化学構造を確認するためのものである。このポリマーネットワークの親水性は、主として、ｈＰＥＧ濃度に依存するが、出発物質の分子量、非改変型ＰＥＧ及び末端機能性基も重要な役割を演じている。ハイドロゲルに保持されている接着しているヒト線維芽細胞の密度は、ゲル形成におけるｈＰＥＧ濃度が増加しても一定であるが、ｈＰＥＧｓの濃度が０．８から１．２５ｇ／ｍＬ含有するハイドロゲルにおいては急速に減少する。この傾向は、ｈＰＥＧの末端残基や分子量には非依存的である。２．５ｇ／ｍＬ以上のｈＰＥＧを含有するゲルサンプルでは、接着細胞はみられない。
【００４７】
略称及び定義：
Ａｃ＝アクリル酸
ＡＣ＝アクリロイルクロライド（ＣＡＳ番号８１４−６８−６）
ＣＨＤ＝クロルヘキシミドジグルコネート
ＣＮ−ＰＥＧ＝α−シアノエチル−ω−アクリレート−ＰＥＧ
ＣＯＯＨ−ＰＥＧ＝α−カロボキシル−ω−アクリレート−ＰＥＧ
ＥＤＴＡＤ＝エチレンジアミンテトラ酢酸ニ水和物
ｈＰＥＧ＝ヘテロ二機能性ＰＥＧ
ＩＰＮ＝浸透ネットワークハイドロゲル
ｍＰｍＡ＝α−メチル−ω−アルデヒド−ＰＥＧ
ｍＰＥＧ＝α−メトキシ−ＰＥＧ
Ｍ−ＰＥＧ＝α−メチル−ω−アクリレート−ＰＥＧ
ＰＥＧ及びＰＥＧジオール＝ポリエチレングリコール
ＰＥＧｄＡ＝ＰＥＧ−ジアクリレート
ＰＥＧｄｉａｌ＝α−アルデヒド−ω−アルデヒド−ＰＥＧ
ＰＴ−ＰＥＧ＝α−フタルイミド−ω−アクリレート−ＰＥＧ
ＴＥＡ＝トリエチルアミン
ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン
ＴＭＰＴＡ＝トリメチロールプロパントリアクリレート（つまり２−エチル−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオールとリアクリレート；ＣＡＳ番号１５６２５−８９−５）
ＸＰＥＧｍＡ＝ω端にアクリレート、α端部に異なる残基を有するｈＰＥＧ）
他に示していない場合、それ自身あるいは他の置換基を有する“アルキル基”という用語は、完全に飽和され、直鎖であり、分岐鎖であり、あるいは環状炭化水素ラジカル、あるいはこれらの組合せであることを意味し、かつ、示されている数の炭素数を有する（例えば、Ｃ１−Ｃ１０は、１から１０の炭素原子を有することを意味している）、二価あるいは多価のラジカルであってもよい。限定しないが、アルキル基の例には、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、シクロヘキシル基、（シクロヘキシル）エチル基、シクロプロピルメチル基、及びホモログ、及びこれらのアイソマーなどであり、例えば、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、及び同様のものなどが含まれる。他に記載がない場合、“アルキル基”の用語には、下述するように“ヘテロアルキル基”や“シクロアルキル基”などに定義しているアルキル基の誘導体をも含む。
【００４８】
“アルケニル基”という用語は、一つ以上の二重結合を有する上述のアルキル基を意味しており、その例には、ビニル基、２−プロペニル基、クロチル基、２−イソペンテニル基、２−（ブタジエニル）基、２，４−ペンタジエニル基、３−（１，４−ペンタジエニル基）などが含まれ、これ以上の炭素を有するホモログ及びアイソマーを含む。
【００４９】
“アルケニル基”という用語は、一つ以上の三重結合を兪ス得る上述のアルキル基又はアルケニル基を意味しており、その例は、エチニル基、１−プロピニル基、３−プロピニル基、３−ブチニル基、及び同様のもの、及びこれら以上の炭素数を有するホモログ及びアイソマーを含む。
【００５０】
“アルキレン基”、“アルケニレン基”及び“アルキニレン基”という用語は、単独あるいは、その他の置換基の一部として、アルキル基、アルケニルキ又はアルキニル基から由来する二価ラジカルを意味しており、例えば例示的に、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−として示される。
【００５１】
典型的に、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキレン基、アルケニレン基、及びアルキニレン基は、１以上２４以下の炭素数を有している。１０以下の炭素原子を有するこれら残基は、本発明において好ましい。“低級”という用語を、“低級アルキル基“又は”  低級アルキレン基“としてこれら基のいずれか適用する場合、８以下の炭素数を有する基を示している。
【００５２】
ここに述べられた“置換”は化学的残基を参照しており、さらに低級アルキル基、アリル基、アシル基、ハロゲン（例えば、ＣＦ３などのハロアルキル基）、水酸基、アミノ基、アルコキシキ、アルキルアミノ基、アシルアミノ基、チオアミド基、アシロキシ基、アリルオキシ基、アリルオキシアルキル基、メルカプト、チア、アザ、オキソ、飽和及び不飽和環状炭化水素、ヘテロ環、及び同種の残基をさらに有している。これら残基は、種々の炭素又はアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルキレン基、アルケニレン基、及びアルケニレン残基などの種々の置換基に結合されていてもよい。追加的に、これら群は、炭素鎖自身に対して、ペンデントであってもよく一体型であってもよい。
【００５３】
“ヘテロアルキル基”という用語は、もし、他に示されていない場合、それ自身、あるいはその他の用語と組み合わされて、安定型であり、飽和又は不飽和であり、直鎖であり、分岐鎖であり、環状炭化水素ラジカルであり、またはこれらの組合せを意味しており、示された数の炭素原子を有しており、かつ、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ、及びＳからなる群から選択された１以上３以下のヘテロ原子からなっている。さらに、窒素原子及び硫黄原子は、任意で、酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は、任意で四級化されていてもよい。Ｏ、Ｎ及びＳのヘテロ原子は、ヘテロアルキル基の種々の位置にて置きかえられていてもよい。Ｓｉなるヘテロ原子は、ヘテロアルキル基の種々の位置にて置き換えられていてもよく、この位置として、この分子の残りの部分に結合されているアルキル基における位置を含んでいる。例として、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、及び−ＣＨ２＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３などがある。二つ以上のヘテロ原子が、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ３や−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ２）３のように連続していてもよい。用語“ヘテロアルキル基”に明らかに含まれるのは、上述した“ヘテロアルキレン基”（つまり、二価ラジカル、次パラグラフ参照）や、“ヘテロシクロアルキル基”（つまり、環状残基を有している）に含まれてもよいこれらのラジカルである。用語“ヘテロアルキル基”もまた、明らかに、不飽和基を含んでいる（つまり、ヘテロアルケニル基やヘテロアルキニル基である）。
【００５４】
用語“ヘテロアルキレン基”は、それ自身又は他の置換基の一部として、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３や−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−して例示される、ヘテロアルキル基由来の二価ラジカルを意味している。ヘテロアルキレン基に関して、ヘテロ原子は、また、鎖状の端部の一方又は両方を占めていてもよい。さらに、アルキレン基及びヘテロアルキレン架橋基に関して、この架橋基の回転を包含されていない。
【００５５】
用語“アリル基”は、ここに、芳香族置換基を参照すべく使用されており、単一芳香環であっても、互いに結合し、共有的に架橋し、あるいはジアゾ、メチレン、又はエチレン残基などの一般的な基に架橋された多重的な芳香環であってもよい。また、一般的な架橋基は、ベンゾフェノンなどのカルボニル基であってもよい。この芳香環には、例えば、フェニル基、ナフチル基、ビフェニル基、ジフェニルメチル基、ベンゾフェノン基、及びその他の基を含んでもよい。用語“アリル基”は、“アリルアルキル基”や“置換アリル基”を包含している。フェニル基に関し、このアリル環は、モノ、ジ、トリ、テトラ、又はペンタ置換体であってもよい。これよりも大型の環は、無置換であってもよく、一つ以上の置換基を有していてもよい。
【００５６】
“置換アリル基”は、例えば、低級アルキル基、アシル基、ハロゲン、ハロアルキル基（例えばＣＦ３）、水酸基、アミノ基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、アシルアミノ基、アリルオキシ基、フェノキシ基、メルカプト、及び芳香環に結合された飽和及び不飽和環状炭化水素、ジアゾ、メチレン、又はエチレン残基などの一般的な置換基に共有的に架橋あるいは架橋した一つ以上の機能性基を有する直前に述べたアリル基を参照している。この架橋基は、シクロヘキシルフェニルケトンなどのカルボニル基であってもよい。用語“置換アリル基“は、”置換アリルアルキル基“を包含する。
【００５７】
用語“アシル基”は、−Ｃ（Ｏ）Ｒで示されるケトン置換基を述べるために使用されており、このＲは、ここに定義したように、飽和又は不飽和のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基、又はアリル基を示している。用語“カルボニル基”は、アルデヒド置換基を述べるために使用されている。用語“カルボキシ基”は、エステル置換基、又はカルボキシル置換基、つまり、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、及び−Ｃ（Ｏ）−ＯＨを参照している。
【００５８】
用語“ハロゲン”又は“ハロ”は、フッ素基、臭素基、塩化物基及びヨウ素基を参照するために使用されている。
【００５９】
用語“水酸基”は、−ＯＨ置換基を参照するためにここに使用されている。
【００６０】
用語“アミノ基”は、ＮＲＲ‘置換基を示すために使用されており、このＲ及びＲ’は、非依存的に、水素基、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリル基、又はこれらの置換体アナログを示している。“アミノ基”は、“アルキルアミノ基”、を包含しており、これは、第二級及び第三級アミノ基を示しており、“アシルアミノ基”は、ＲＣ（Ｏ）ＮＲ‘置換基を示している。
【００６１】
用語“アルコキシ基”は、−ＯＲ基を参照するために使用されており、このＲは、アルキル基、アルケニル基、若しくはアルキニル基、又はこれらの置換体アナログを示している。適切なアルコキシラジカルには、例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｔ−ブトキシ基などが含まれる。用語“アルコキシアルキル基”は、一価又は二価のエーテル置換基を参照しており、例えば、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３及び−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−などがある。
【００６２】
ここに使用されている用語“ゼラチン”は、すべての種のゼラチンを意味しており、種々のタイプ（例えば、等電点が約７．０から９．０のブタ由来のタイプＡ及び等電点が約５．０のウシ由来のタイプＢ）であって、限定しないが、種々の種由来のゼラチンであって、酸処理あるいはアルカリ処理されたゼラチンを意味している。ゼラチンにおける“ブルーム強度（ｂｌｏｏｍ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）”は、６．６７％ｗ／ｗの濃度で、ブルームジャーにて１６から１８時間、１０℃にて冷却され調製されたゲルにおいて、４ｍｍの圧縮を形成すべく定義づけされた形状及び寸法のプランジャーに必要な応力として定義されている。この応力は、グラムにて記録される。市販的に、ゼラチンは提供業者から入手可能である。商品としての容量及び価格において、ゼラチンは、一般に、５０から３００ブルームの範囲のブルーム強度を有するものが入手可能である。このようなゼラチンは、例えば、オーストラリアのＧｏｏｄｍａｎ  Ｆｉｅｌｄｅｒ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  ｏｆ  Ｓｙｄｎｅｙ傘下のＬｅｉｎｅｒ  Ｄａｖｉｓ  Ｇｅｌａｔｉｎから入手可能である。この範囲から外れたブルーム値を有するゼラチンもまた、本発明における用語“ゼラチン”の範囲内にて特定の化学物質として入手可能である。例えば、ゼロのブルーム（ゲル化しない）を有するゼラチンは、イリノイ州ＧｒａｙｓｌａｋｅのＧｒｅａｔ  Ｌａｋｅｓ  Ｃｏ．社から入手可能である。
【００６３】
同様に、ここに使用されている用語“コラーゲン”は、限定しないが、種々のソース、種々のタイプのすべてのコラーゲンを意味している。米国特許第４、３９０、５１９号明細書に記載の架橋コラーゲン、エステル化コラーゲン、化学改変コラーゲンは、この用語“コラーゲン”に含まれる。
【００６４】
用語“ポリマーマトリックス”は、ハイドロゲルとして機能することができる種々のタイプのポリマーマトリックスを包含し、これには、限定しないが、ゼラチン、アルギン酸カルシウム、アルギン酸カルシウム／ナトリウム、コラーゲン、酸化再生セルロース、カルボキシメチルセルロース、６−デオキシ−６−（４−アミノフェニル）−アミノ−２（３）−Ｏ−トシルセルロースなどのアミノ基改変セルロース、ホエイプロテイン、及び同様のものを含む。
【００６５】
用語“光共重合可能アクリレート”は、限定しないが、光共重合可能なアクリル酸を含有する種々の分子を参照している。この定義に表現的に含まれるのは、ビス−ジアクリレート−ＰＥＧｓ、つまり、αアルキレート残基及びωアルキレート残基を有するポリ（アルキレングリコール）分子である。ＴＭＰＴＡもまた、共重合可能なアクリレートである。
【００６６】
（改変ＰＥＧｓ）
市販のＰＥＧジオール類は、大容量であり、比較的高価な本質的に商品として購入可能である。ＰＥＧジオール類のα端及びω端の改変に関する第１ステップは、これらをアルデヒド基に変換することである。この反応は、無水酢酸とＰＥＧジオールとを反応させることにより非常に簡単に達成される。
【００６７】
【化４】
2004534111.tif 000004
この反応は、容易であり、定量的である。
【００６８】
ＰＥＧジアルデヒドに関し、この分子は、さらに、その他の多くの経路の中で、図１に示す種々の反応経路により改変されてもよい。例えば、図１に示すように、ＰＥＧジオールは、α−アクリレート−ω−カルボキシ−ＰＥＧへと変換可能な、α−ヒドロキシ−ω−カルボキシＰＥＧへと変換されてもよい。あるいは、このＰＥＧジオールは、α−アクリレート−ω−シアノエチル−ＰＥＧへと変換可能なα−ヒドロキシ−ω−シアノエチル−ＰＥＧへと変換されてもよい。
【００６９】
このＰＥＧジオールは、α−ヒドロキシ−ω−ハロ−ＰＥＧの水酸基のハロゲン化により直接変換されてもよい。このＰＥＧジオールは、また、α−アクリレート−ω−トシル化ＰＥＧを得るべく、トシル化され、アクリル化されてもよい。このトシル基は、サクシニミジル基又はフタルイミジル基や、その他の窒素含有ヘテロ環基へと変換されてもよい。α−ヒドロキシ−ω−メトキシ−ＰＥＧは、直接α−アクリレート−ω−メトキシ−ＰＥＧへと変換されてもよい。図１を参照されたい。（また、Ｈｅｒｎ  ＆  Ｈｕｂｂｅｌｌ、（１９９８）  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  ３９：２６６−２７６；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら（１９９６）  Ａｐｐ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．５６：  ５９−７２；及びＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉら（１９８４）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ７：１７５−１８６を参照されたい）。
【００７０】
したがって、例えば、α−ヒドロキシ−ω−グルタレート−ＰＥＧは、ＰＥＧジオールと無水グルタル酸及びグルタル酸をＴＨＦ中にて穏やかに加熱し反応することにより合成可能である。
【００７１】
【化５】
2004534111.tif 000005
無水グルタル酸及びグルタル酸を加え５５℃にて穏やかに加熱する。この溶液を室温にて攪拌しながら一日、保持する。その後、この溶液を室温に冷却し、フィルターに通す。この濾過物は、その後、冷ヘキサンにて沈殿化され、得られた沈澱物はその後フィルターにより除去され、真空下乾固し、所望の製品、つまり、一般にＰＥＧ−ビス−グルタレート及びα−ヒドロキシ−ω−グルタレート−ＰＥＧの混液を得る。この二つの物質は、クロマトグラフィーにより分離可能である（例を参照のこと）。
【００７２】
このグルタレート基は、さらにサクシニミジル基などの含窒素ヘテロ環を付加すべく、α−ヒドロキシ−ω−グルタレート−ＰＥＧとＮ−ヒドロキシ−サクシニミドとを、水溶性カルボジイミド存在下にて反応させることにより、反応可能である。
【００７３】
【化６】
2004534111.tif 000006
Ｎ−ヒドロキシ−サクシニミドを加え、０℃に冷却する。ジシクロヘシキルカルボジイミド（ＤＣＣ）を滴下により加え、この溶液を一日攪拌し、フィルターに通す。濾過物は、冷ヘキサンを加えることにより沈殿される。得られた沈澱物は、フィルターに通され、真空下にて乾固される。これにより、ＰＥＧ−ビス−Ｎ−サクシニミジルグルタレート及びα−グルタレート−ω−サクシニミジルグルタレート−ＰＥＧの混液（又は選択された出発物質に依存して、α−ヒドロキシ−ω−サクシニミジルグルタレート−ＰＥＧ）などの所望の生成物を得る。この二つの化合物は、クロマトグラフィーにより分離可能である（例参照）。
【００７４】
α−グルタレート−ω−サクシニミジルグルタレートは、さらに、α−グルタレート−ω−サクシニミジルグルタレートと酢酸とをＴＥＡ存在下、反応され、α−アクリレート−ω−サクシニミジルグルタレートを得ることができる。
【００７５】
【化７】
2004534111.tif 000007
また、ＰＥＧ分子は、他のアミド結合を導入することにより改変されてもよい。もちろん、アミド結合の形成は、アミノ酸、ペプチド、又はタンパク末端を有するＰＥＧ分子を改変するのに非常に有用である。したがって、例えば、α−サクシニミジルグルタレート−ω−トリプトファニルグルタレート−ＰＥＧは、ペプチド又はアミノ酸を、０．１Ｍの２−（Ｎ−モルフォリノ）−エタンスルフォン酸（ＭＥＳ）（０℃）に溶解することにより合成可能である。この溶液に、一定速度にて攪拌しながら、α，ω−ビス−Ｎ−サクシニミジルグルタレート−ＰＥＧを滴下により加える。この反応を１時間、０℃にて行い、４時間、一定速度にて室温にて攪拌する。この反応溶液は、その後、５０倍容量のイオン交換水にて透析し、得られた溶液を凍結乾燥する。これにより、所望のα−Ｎ−サクシニミジルグルタレート−ω−トリプトファニルグルタレートを約４０％の収率にて得る。
【００７６】
改変ＰＥＧｓは、上述のパラグラフと同様の方法を用いて、反応性アミノ基を含有するポリマーに結合されてもよく、これにより、ポリマーマトリックスの反応性アミノ基に改変ＰＥＧを移植される。例も参照されたい。端的にいうと、モノ又はジアルデヒドＰＥＧは第１に水に溶解する。別に、ＮａＣＮＢＨ３水溶液を調製しておく。その後、この二つの溶液を、水に溶解した希釈（５％）ゼラチン溶液に同時に加える。この反応を穏やかに加熱した条件（５０から６０℃）にて一昼夜行う。改変ゼラチンは、その後、フィルターに通すことにより分離される。
【００７７】
種々の合成スキームを用い、以下の改変ＰＥＧ分子を製造し、本発明の範囲内の新規のハイドロゲルを得るべくゼラチンを改変するために用いる。
【００７８】
シリーズ１：α−メトキシ  ヘテロ二機能性ＰＥＧ誘導体：
【００７９】
【化８】
2004534111.tif 000008
【００８０】
【化９】
2004534111.tif 000009
シリーズ１の化合物：
１．１．  α−メトキシ、ω−ヒドロキシ−ＰＥＧは、市販で入手可能である（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）。
【００８１】
１．２．  α−メトキシ、ω−トシルＰＥＧを合成するため、ＰＥＧ（１当量）を乾燥塩化メチレンＭＣに溶解し、ｐ−トルエンスルフォニルクロライド（１当量）及びトリエチルアミン（１当量）に加えた。この溶液を４８時間、室温にて攪拌し、冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、２４時間、真空オーブンにて乾固する。
【００８２】
１．３．  α−メトキシ、ω−フタリミジルＰＥＧを合成するため、シリーズ１．２．記載のω−トシルＰＥＧ（１当量）とフタルイミドカリウム（１．２当量）とを、トルエンに溶解し、２０時間５０℃にて攪拌する。この溶液を冷却し、フィルターに通し、濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにより採取し、２４時間真空オーブンにて乾固する。
【００８３】
１．４．  α−メトキシ、ω−シアノアルキルＰＥＧを合成するため、ＰＥＧ（１当量）を乾燥ＭＣ溶液に溶解し、高品質ナトリウム金属（１．５当量）に加えた。過剰量のアクリロニトリルをこの溶液に加え、１２時間攪拌し、フィルターに通し、ロータリーエバポレーターにて乾固した。
【００８４】
１．５．  α−メトキシ、ω−カルボキシＰＥＧを合成するため、ＰＥＧ（１モル）を乾燥ＴＨＦに溶解した。この溶液（１．２当量）とナフタレン（１．２当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、１時間、アルゴン存在下、攪拌した。このナトリウム／ナフタレン溶液をＰＥＧ溶液に滴下にて加え、この溶液を４時間、アルゴン存在下にて攪拌した。その後、エチルブロモ酢酸（１．２当量）を加え、この溶液を１２時間、アルゴン存在下攪拌した。この溶液をフィルターに通し、濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにより採取し、２４時間、真空オーブンにて乾固した。この乾燥物質を、イオン交換水に溶解し、水酸化ナトリウム（１当量）に加えた。この溶液を２時間、４０℃にて攪拌し、ＭＣにより一度又は二度抽出し、ロータリーエパボレーターにより乾固した。
【００８５】
１．６．  α−メトキシ、ω−グルタレートＰＥＧを合成するため、ＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、無水グルタル酸（１．５当量）及びグルタル酸（０．００１当量）を加えた。この溶液を４８時間、７０℃にて攪拌し、冷却し、冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにより採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【００８６】
１．７．  α−メトキシ、ω−トリエトキシシランＰＥＧを合成するため、シリーズ２−８由来のα−メトキシ、ω−アクリレートＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに加え、トリエトキシシラン（５当量）及び（粒状の）塩化白金酸（２当量）を加えた。この溶液を４８時間、６０℃にて攪拌し、冷却し、冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにより採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【００８７】
１．８．  α−メトキシ、ω−アクリレートＰＥＧを合成するため、ＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、アクリロイルクロライド（２当量）及びトリエチルアミン（２．２当量）を加えた。この溶液を室温にて２時間攪拌し、フィルターに通し、濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにより採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【００８８】
１．９．  α−メトキシ、ω−アルデヒドＰＥＧを合成するため、ＰＥＧ（１当量）をＤＭＳＯに溶解し、この溶液を無水酢酸（２０当量）に滴下にて加え、室温にて２時間攪拌した。この溶液にエーテルを加え、室温にて５分間攪拌した後、沈殿させるべく、５分間−２０℃の冷凍庫に置いた。沈澱物をフィルターにより採取し、最小量の塩化メチレンに溶解し、エーテルにより二度、再沈殿させた。この沈澱物を真空オーブンにて２４時間乾固した。
【００８９】
１．１０．  α−メトキシ、ω−ハロＰＥＧを合成するため、ＰＥＧ（１当量）をトルエンに溶解し、トリエチルアミン（１．２当量）を加えた。この溶液を６０℃にて３０分間攪拌し、チオニルブロマイド（１．２当量）を加え、６０℃にて１時間攪拌した。この温溶液をセライトにてフィルターし、濾過物を２４時間、−４℃にて静置した。沈澱物をフィルターにより採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【００９０】
１．１１．  α−メトキシ、ω−サクシニミジルグルタレート−ＰＥＧを合成するため、シリーズ１．６由来のα−メトキシ、ω−グルタレートＰＥＧ（１当量）とジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１．２当量）とをそれぞれ乾燥ＴＨＦに溶解した。Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（１．２当量）をＰＥＧ溶液に加え、ＤＣＣ溶液を滴下にて加えた。この混合溶液を室温にて６時間攪拌し、フィルターに通し、濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて３日間乾固し、その後、アルゴン存在下、冷蔵庫にて−４℃にて保存した。
【００９１】
１．１２．  α−メトキシ、ω−サクシニミジルグルタレートＰＥＧを合成するため、シリーズ１．１１由来のα−メトキシ、ω−サクシニミジルグルタレートＰＥＧ（１当量）をＤＭＦに溶解し、トリプトファン（１．５当量）を加えた。この溶液をアルゴン存在下、２４時間攪拌し、イオン交換水にて透析し、３日間凍結乾燥により乾固した。
【００９２】
シリーズ２：α−ヒドロキシ  ヘテロ二機能性ＰＥＧ誘導体：
【００９３】
【化１０】
2004534111.tif 000010
【００９４】
【化１１】
2004534111.tif 000011
シリーズ２の化合物：
２．１  ＰＥＧは市販にて入手可能である。
【００９５】
２．２  α−ヒドロキシ、ω−トシルＰＥＧを合成するため、ＰＥＧ（１当量）を乾燥塩化メチレンに溶解し、ｐ−トルエンスルフォニルクロライド（１当量）及びトリエチルアミン（１当量）を加えた。この溶液を室温にて４８時間攪拌し、冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにより採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【００９６】
２．３．  α−ヒドロキシ、ω−フタルイミジルＰＥＧを合成するため、シリーズ２．２．由来のα−ヒドロキシ、ω−トシルＰＥＧ（１当量）とフタルイミドカリウム（１．２当量）とをトルエンに溶解し、５０℃にて２０時間攪拌した。この溶液を冷却し、フィルターに通し、濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【００９７】
２．４．  α−ヒドロキシ、ω−シアノアルキルＰＥＧを合成するため、ＰＥＧ（１当量）を乾燥塩化メチレン溶液に溶解し、高純度のナトリウム金属（１．２当量）を加え、室温にて１２時間攪拌した。過剰量のアクリロニトリルをこの溶液に加え、１２時間攪拌し、フィルターに通し、ロータリーエバポレーターにて乾固した。
【００９８】
２．５．  α−ヒドロキシ、ω−カルボキシＰＥＧを合成するため、ＰＥＧ（１ｍｏｌｅ）を乾燥ＴＨＦに溶解し、ナトリウム（１．２当量）とナフタレン（１．２当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、アルゴン存在下、１時間攪拌した。このナトリウム／ナフタレン溶液を先のＰＥＧ溶液の滴下にて加え、この溶液をアルゴン存在下、４時間攪拌した。エチルブロモ酢酸（１．２当量）を加え、この溶液をアルゴン存在下、１２時間攪拌した。この溶液をフィルターに通し、濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにより採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。この乾燥物質を、イオン交換水に溶解し、水酸化ナトリウム（１当量）を加えた。この溶液を４０℃にて２時間攪拌し、二回塩化メチレンにて抽出し、ロータリーエバポレーターにて乾固した。
【００９９】
２．６．  α−ヒドロキシ、ω−グルタレートＰＥＧを合成するため、ＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、無水グルタル酸（１．５当量）及びグルタル酸（０．００１当量）を加えた。この溶液を７０℃にて４８時間攪拌し、冷却し、冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１００】
２．７．  α−ヒドロキシ、ω−トリエトキシシランＰＥＧを合成するため、シリーズ２．８由来のα−ヒドロキシ、ω−アクリレートＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、トリエトキシシラン（５当量）及び塩化白金酸（粒状）を加えた。この溶液を６０℃にて４８時間攪拌し、冷却し、冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１０１】
２．８．  α−ヒドロキシ、ω−アクリレートＰＥＧを合成するため、ＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、塩化アクリロイル（１．５当量）及びトリエチルアミン（１．７当量）を加えた。この溶液を室温にて２時間攪拌し、フィルターに通し、濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１０２】
２．９．  α−ヒドロキシ、ω−アルデヒドＰＥＧを合成するため、ＰＥＧ（１当量）をＤＭＳＯに溶解し、この溶液を無水酢酸（２０当量）に滴下にて加え、室温にて２時間攪拌した。エーテルをこの溶液に加え、室温にて５分間攪拌した後、沈殿させるべく、５分間、−２０℃の冷凍庫に静置した。この沈澱物をフィルターにより採取し、最小量の塩化メチレンにて溶解し、エーテルにて二度、再沈殿させた。沈澱物を真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１０３】
２．１０．  α−ヒドロキシ、ω−ハロＰＥＧを合成するため、ＰＥＧ（１当量）をトルエンに溶解し、トリエチルアミン（１．２当量）を加えた。この溶液を６０℃にて３０分攪拌し、その後、チオニルブロマイド（１．２当量）を加え、６０℃にて１時間攪拌した。この温溶液をセライトにてフィルターし、濾過物を−４℃の冷蔵庫にて２４時間静置した。沈澱物をフィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１０４】
２．１１．  α−ヒドロキシ、ω−サクシニミジルグルタレートＰＥＧを合成するため、シリーズ２．６由来のα−ヒドロキシ、ω−グルタレートＰＥＧ（１当量）とジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（１．２当量）とをそれぞれ乾燥ＴＨＦ溶液に加えた。Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（１．２当量）を先のＰＥＧ溶液に加え、その後、ＤＣＣ溶液を滴下にて加えた。この混合腰液を室温にて６時間攪拌し、フィルターに通し、この濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて３日間乾固し、アルゴン存在した、−４℃の冷蔵庫にて保存した。
【０１０５】
２．１２．  α−ヒドロキシ、ω−トリプトファニルグルタレートＰＥＧを合成するため、シリーズ２．１１由来のα−ヒドロキシ、ω−サクシニミジルグルタレートＰＥＧ（１当量）をＤＭＦに加え、トリプトファン（１．５当量）を加えた。この溶液をアルゴン存在下、２４時間攪拌し、イオン交換水にて透析し、３日間、凍結乾燥により乾固した。
【０１０６】
シリーズ３：α−アクリレート  ヘテロ二機能性ＰＥＧ誘導体：
【０１０７】
【化１２】
2004534111.tif 000012
【０１０８】
【化１３】
2004534111.tif 000013
シリーズ３の化合物：
３．１  α−アクリレート、ω−トシルＰＥＧを合成するため、シリーズ２．２由来のα−ヒドロキシ、ω−トシルＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、塩化アクリロイル（２当量）及びトリエチルアミン（２．２当量）を加えた。この溶液を室温にて２時間攪拌し、フィルターに通し、この濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１０９】
３．２．  α−アクリレート、ω−フタリミジルＰＥＧを合成するため、シリーズ３．１．由来のα−アクリレート、ω−トシルＰＥＧ（１当量）及びフタルイミドカリウム（２当量）をトルエンに溶解し、５０℃にて２０時間攪拌した。この溶液を冷却し、フィルターに通し、濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１１０】
３．３．  α−アクリレート、ω−シアノアルキルＰＥＧを合成するためシリーズ２．８由来のα−ヒドロキシ、ω−アクリレートＰＥＧ（１当量）を乾燥塩化メチレン用液に溶解し、高純度のナトリウム金属（１．５当量）を加え、室温にて１２時間攪拌した。過剰量のアクリロニトリルをこのよう液に加え、１２時間攪拌し、フィルターに通し、ロータリーエバポレーターにて乾固した。
【０１１１】
３．４．  α−アクリレート、ω−カルボキシＰＥＧを合成するため、シリーズ２．５．由来のα−ヒドロキシ、ω−カルボキシＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、塩化アクリロイル（１．２当量）及びトリエチルアミン（１．５当量）を加えた。この溶液を室温にて２時間攪拌し、フィルターに通し、この濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１１２】
３．５．α−アクリレート、ω−アクリロイルカルボキシＰＥＧを合成するため、シリーズ２．５由来のα−ヒドロキシ、ω−カルボキシＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、塩化アクリロイル（３当量）及びトリエチルアミン（３．５当量）を加えた。この溶液を室温にて２時間攪拌し、フィルターに通し、この濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１１３】
３．６．  α−アクリレート、ω−グルタレートＰＥＧを合成するため、シリーズ２．６．由来のα−ヒドロキシ、ω−グルタレートＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、塩化アクリロイル（１．２当量）及びトリエチルアミン（１．５当量）を加えた。この溶液を室温にて２時間攪拌し、フィルターに通し、この濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１１４】
３．７．  α−アクリレート、ω−アクリロイルグルタレートＰＥＧを合成するため、シリーズ２．６．由来のα−ヒドロキシ、ω−グルタレートＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、塩化アクリロイル（３当量）及びトリエチルアミン（３．５当量）を加えた。この溶液を室温にて２時間攪拌し、フィルターに通し、この濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１１５】
３．８．  α−アクリレート、ω−アクリレートＰＥＧを合成するため、ＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、塩化アクリロイル（３当量）及びトリエチルアミン（３．５当量）を加えた。この溶液を室温にて２時間攪拌し、フィルターに通し、この濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１１６】
３．９．  α−アクリレート、ω−トリアルコシキシランＰＥＧを合成するため、シリーズ２．７由来のα−ヒドロキシ、ω−トリエトキシシランＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、塩化アクリロイル（１．２当量）及びトリエチルアミン（１．５当量）を加えた。この溶液を室温にて２時間攪拌し、フィルターに通し、この濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１１７】
３．１０．  α−アクリレート、ω−アルデヒドＰＥＧを合成するため、シリーズ２．９．由来のα−ヒドロキシ、ω−アルデヒドＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、塩化アクリロイル（１．２当量）及びトリエチルアミン（１．５当量）を加えた。この溶液を室温にて２時間攪拌し、フィルターに通し、この濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１１８】
３．１１．  α−アクリレート、ω−ハロＰＥＧを合成するため、シリーズ２．１０．由来のα−ヒドロキシ、ω−ハロＰＥＧを乾燥ＴＨＦに溶解し、塩化アクリロイル（１．２当量）及びトリエチルアミン（１．５当量）を加えた。この溶液を室温にて２時間攪拌し、フィルターに通し、この濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１１９】
３．１２．  α−アクリレート、ω−サクシニミジルグルタレートＰＥＧを合成するため、シリーズ２．１１由来のα−ヒドロキシ、ω−サクシニミジルグルタレートＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、塩化アクリロイル（１．２当量）及びトリエチルアミン（１．５当量）を加えた。この溶液を室温にて２時間攪拌し、フィルターに通し、この濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１２０】
３．１３．  α−アクリレート、ω−トリプトファニルグルタレートＰＥＧを合成するため、シリーズ２．１２．由来のα−ヒドロキシ、ω−トリプトファニルグルタレートＰＥＧ（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、塩化アクリロイル（１．２当量）及びトリエチルアミン（１．５当量）を加えた。この溶液を室温にて２時間攪拌し、フィルターに通し、この濾過物を冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターにて採取し、真空オーブンにて２４時間乾固した。
【０１２１】
シリーズ４：ホモ二機能性ＰＥＧ誘導体：
α端及びω端部に同様の機能性置換基を有する改変ＰＥＧｓは、同様の手法にて製造可能である。したがって、ここに述べた化学物質を用いて、ビス−アクリレート、ビス−年レート、ビス−フタルイミジル、ビス−シアノアルキル、ビス−カルボキシレート、ビス−アクリロイルカルボキシレート、ビス−グルタレート、ビス−アクリロイルグルタレート、ビス−トリアルコキシシラン、ビス−アルデヒド、ビス−Ｎ−サクシニミジル、ビス−トリプトファニルグルタレート誘導体を合成してもよい。
【０１２２】
したがって、本発明によると、好ましくはゼラチンであるポリマーマトリックスは、ここに開示した一種類以上の改変ＰＥＧを有すべく改変される。このＰＥＧ分子は、同様の残基を有するタイプを用いた、ビス改変体であってもよい。ハイドロゲルに導入されたものとして、改変ＰＥＧ分子の両バージョンは、本発明の狙いの範囲内である。
【０１２３】
浸透ネットワークハイドロゲル（ＩＰＮｓ）
上述のＰＥＧ改変ハイドロゲルは、また、二つの異なるポリマーマトリックスの浸透ネットワークにおける第１のポリマーマトリックスとして用いられてもよい。本発明の狙いにおいて、上述のＰＥＧ改変ハイドロゲルは、重合可能なモノマーの混液と混合される。その後、重合反応が開始され、こりにより、モノマーの混液はｉｎ  ｓｉｔｕにて重合し、これにより、第１のポリマーマトリックスとともに浸透する第２のポリマーマトリックスを形成する。
【０１２４】
さらに好ましくは、第２のポリマーマトリックスを形成する複数のモノマーは、化学反応とは別の手段により重合可能である。しかしながら、化学的に重合可能なモノマーは、本発明の範囲内である。好適実施例において、このモノマーは光重合可能である。したがって、このモノマーは第１のポリマーマトリックスと混合される。この混液は、その後、適当な波長の放射（例えば赤外線、可視光又は紫外光など）に曝露され、光開始重合反応を生じる。この放射源は、所望の放射波長を発生する種々の源であってもよく、例えば、ランプ（白熱灯、蛍光灯、イオン放射など）、レーザー（二酸化炭素、Ｎｅ−Ｎｅなど）及び発光ダイオードなどがある。
【０１２５】
好適な光重合可能なモノマーは、アクリレート類、ジアクリレート類、及びポリ（アクリレート）類（ＰＥＧ−ポリアクリレート、ＰＥＧ−ジアクリレート、及びＴＭＰＴＡを含んでいる）、アクリル酸、及び塩化アクリロイルなどのアクリロイルハライド、及びこれらの混液などがある。複数の異なるモノマーを第１ポリマーマトリックスと混合する場合、もちろん、この重合反応は、共重合体である第２のポリマーマトリックスを生じるだろう。したがって、この第２のポリマーマトリックスは、ホモポリマーマトリックス、又は種々の共重合マトリックスを備えていてもよい（例えば、代替的、ブロック又はグラフト共重合体など）。
【０１２６】
図６は、本発明における浸透ネットワークハイドロゲルの概略図である。このゲルは、生細胞並びに薬物学的に活性名物質又はこの両者を含有することができる。
【０１２７】
（例）
以下の例は、ここに開示した本発明及び請求項をより完全なものとし、一貫した理解を供するためにのみ包含されている。この例は、いかなる様式においても、本発明の請求範囲を限定するものではない。
【０１２８】
（例１：ヘテロ二機能性ＰＥＧｓの合成及び特徴）
他に示していない場合、すべての試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）社から購入された。臨界的な中間性生物及び最終生成物の化学反応及び構造の概略は、図１に示した。
【０１２９】
α−メチル−ω−アクリレートＰＥＧｓ（Ｍ−ＰＥＧｓ）を合成するため、モノメトキシＰＥＧｓ（２ｋＤａ又は５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈの一部門であるＦｌｕｋａ社製）を乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）溶液に溶解し、トリエチルアミン（ＴＥＡ、２当量）及び塩化アクリロイル（ＡＣ、４当量）（１−４）を、室温にて、アルゴン存在下、１０分間攪拌しながら加え、フィルターに通し、ロータリーエバポレーターにて乾固し、ＣＨ２Ｃｌ２に再溶解し、冷ヘキサンにて沈殿させた。最終生成物をフィルターに通し、乾固し、室温にて、ｉｎ  ｖａｃｕｏにて保存した。
【０１３０】
α−シアノエチル−ω−アクリレートＰＥＧ（ＣＮ−ＰＥＧ）を合成するため、ＰＥＧジオール（２ｋＤａ又は５ｋＤａ）（１当量）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、高純度のナトリウム金属（２当量）を加え、室温にて１２時間攪拌した。過剰量のアクリロニトリルをこの溶液に加え（１５、１６）、１２時間攪拌した後、フィルターに通し、ロータリーエバポレーターにて乾固した。形成した製品（つまり、α−ニトリル−ω−ヒドロキシＰＥＧ）を乾燥ＴＨＦに溶解し、ＴＥＡ（２当量）及びＡＣ（４当量）を加えた。この溶液を室温にて、アルゴン存在下、１０分間攪拌した。フィルターにより塩化トリエチルアンモニウムを除去し、溶媒をロータリーエバポレーターにて除去した。最終産物をＣＨ２Ｃｌ２にて再溶解し、冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターに通し、室温で、ｉｎ  ｖａｃｕｏにて保存した。
【０１３１】
α−カルボキシル−ω−アクリレートＰＥＧｓ（ＣＯＯＨ−ＰＥＧ）を合成するため、ミネラルオイル中のナトリウム金属を乾固し、ナフタレン（３．５当量）ともに乾燥ＴＨＦに溶解し、室温にて、アルゴン存在下１時間攪拌した（１７）。調製したナトリウム／ナフタレン溶液を、ＰＥＧジオール（２ｋＤａ又は５ｋＤａ）（１当量）へと滴下にて加え、乾燥ＴＨＦにて、アルゴン存在下、４時間攪拌しながら溶解した。エチルブロモ酢酸（４当量）をこのイオン化ＰＥＧ溶液に加え、１２時間攪拌し、フィルターに通し、冷ヘキサンにて沈殿させ、水酸化ナトリウム（３当量）を有する蒸留水（１当量）に再溶解し（１８）、室温にて２４時間潅流した。ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去し、得られた固形物をＣＨ２Ｃｌ２にて再溶解し、フィルターに通し、冷ヘキサンにて沈殿させ、ｉｎ  ｖａｃｕｏにて乾固した。主としてα−カルボキシ−ω−ヒドロキシＰＥＧｓ（１当量）を有するこの固形物を乾燥ＴＨＦに溶解し、ＴＥＡ（２当量）及びＡＣ（４当量）を加え、室温にて、アルゴン存在下、１０分間攪拌し、フィルターに通し、冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターに通し、乾固し、室温にて、ｉｎ  ｖａｃｕｏで保存した。
【０１３２】
α−ナフタリミド−ω−アクリレートＰＥＧｓ（ＰＴ−ＰＥＧ）を合成するため、ＰＥＧジオール（２ｋＤａ又は５ｋＤａ）（１当量）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２溶液に溶解し、ＴＥＡ（４当量）及びｐ−トルエンスルフォニルクロライド（２当量）を加え（１９）、室温にて、アルゴン存在下、８時間攪拌した。ロータリーエバポレーターにより溶媒を除去し、黄色がかった白色固体を得た。ＰＥＧジオール、α−ヒドロキシ−ω−トシルＰＥＧｓ、及びビス−トシル−ＰＥＧの混液（１当量）を乾燥ＴＨＦに溶解し、ＴＥＡ（２当量）及びＡＣ（４当量）を加え、室温にてアルゴン存在下１０分間攪拌し、塩化トリエチルアンモニウムを除去すべくフィルターに通し、溶媒を除去すべく、ロータリーエバポレーターにて乾固し、ＣＨ２Ｃｌ２にて再溶解し、冷ヘキサンにて再溶解した。（主としてα−トシル−ω−アクリレートＰＥＧ）を有する固形産物をフィルターに通し、ｉｎ  ｖａｃｕｏにて乾固し、ＣＨ２Ｃｌ２にて溶解し（１当量）、フタルイミドカリウム（１当量）を加え（２０）、１８時間潅流した。この溶液をフィルターに通し、溶媒を除去すべくロータリーエバポレーターにて乾固し、ＣＨ２Ｃｌ２にて再溶解し、冷ヘキサンにて沈殿させ、フィルターに通し、乾固し、室温にてｉｎ  ｖａｃｕｏで保存した。
【０１３３】
すべての中間産物及び最終生成物は、ＣＤＣｌ３に溶解したサンプルとして、１Ｈ−及び１３Ｃ−ＮＭＲ分析を行い、かつ、逆相ＨＰＬＣ分析した（ＧｉｌｓｏｎのシステムにてＪｏｒｄｉ５００Ａカラムを用い、３０分間、流速１ｍＬ／分にて、１０から１００％アセトニトリルのグラジエント）。このＨＰＬＣシステムには、紫外／可視光（２００及び２５４ｎｍ）、フォトダイオードアレイ、及び蒸発型光散乱検出器が結合されている。
【０１３４】
上述のヘテロ二機能性ＰＥＧｓ（ｈＰＥＧｓ）は、ハイドロゲル形成の部材として使用し、ｈＰＥＧの濃度、分子量、表面における親水性及び細胞との相互作用に関する末端残基の影響を検討した。このｈＰＥＧｓは、上述の工程によりハイドロゲルの形成に利用された。参照文を参照されたい（１０−１３）。したがって、形成されたこのネットワークは、例えば、ω端にアクリレート、α端部に異なる化学的残基を有する化合物（ＸＰＥＧｍＡ）を伴う、Ａｃ、ＴＭＰＴＡ，及びｈＰＥＧのランダム共重合体である。
【０１３５】
特に、ＸＰＥＧｍＡｓは、種々のタングリング末端機能性置換基を有するゼラチンポリマーマトリックスに移植され、ＡＣ及びＴＭＰＴＡのランダム共重合ネットワークへとアクリル末端基を共重合することによりポリマーマトリックスへと導入される（１０−１３）。このタイプの、Ｍ−ＰＥＧを有するポリマーネットワークは、非イオン性であり、低い膨潤性を有し、乾燥時にガラス質であり、任意で透過性を有し、色調を有していない（１０−１３）。Ｍ−ＰＥＧｓの比較的高い質量画分が存在するが、最小限度の膨潤性は、ＴＭＰＴＡネットワークが高度に架橋されかつ親水性特性を有するがゆえ、このポリマーに関し観察される。示差走査熱量計分析が示すのは、これら材料が完全にアモルファス状態であり、このＭ−ＰＥＧ化合物が架橋ＴＭＰＴＡマトリックスで完全に位相混合されていることである（１０）。
【０１３６】
ＸＰＥＧｍＡ−Ａｃ−ＴＭＰＴＡネットワークの表面親水性は、水中用空気泡キャプティブシステム（ｕｎｄｅｒｗａｔｅｒ  ａｉｒ  ｂｕｂｂｌｅ  ｃａｐｔｉｖｅ  ｓｙｓｔｅｍ）にて定量される。このハイドロゲルは、３７．５℃なる生理的温度の水に完全に懸濁されている。空気泡は、ゲルの底部に配置されており、接触角は、改変コンピューター補助ビデオ接触角システムを使って測定される（ＡＳＴ  ｉｎｃ社製）。この測定は、６つのランダムに選択された領域にて行われ、三つの異なるポリマーサンプルにて３回繰り返され、平均化される。空気泡接触角が水相にて測定され水面下にて行われることから、得られる値は、実質的に水後退接触角である；さらに、この接触角が大きくなるにつれ、この膜の親水性も大きくなる。
【０１３７】
形成されたゲルは、その後、培養細胞との相互作用を検討される。ヒト線維芽細胞成長因子（ＦＢＦ−ｂ）（０．５ｍｇ／ｍＬ）、インスリン（０．５ｍｇ／ｍＬ）及び５％胎児ウシ血清（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を有するＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ１ｍＬに対しヒト新生児皮膚線維芽細胞を７５０００個の濃度で混合した細胞をこのＸＰＥＧｍＡ−Ａｃ−ＴＭＰＴＡネットワークとインキュベートした。２、２４、及び４８時間後、接着細胞の形態及び密度を、手動で、光学顕微鏡を結合したコンピューター補助ビデオ分析システムを使って定量化した。
【０１３８】
すべての実験結果を、平均±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）にて示した。各サンプルを独立に３回行った（ｎ＝３）。統計分析は、Ｓｔａｔｖｉｅｗ（登録商標）４．５を用いて、バリアンス及びＦｉｓｈｅｒの分析に関し、９５％信頼レベル（ｐ＜０．０５）の有意差にて、実施された。
【０１３９】
２ｋＤａのＰＥＧ前駆物質から合成された、Ｍ−ＰＥＧ，ＣＮ−ＰＥＧ，ＣＯＯＨ−ＰＥＧ，及びＰＴ−ＰＥＧに関する中間生成物並びに最終生成物における１３Ｃ−ＮＭＲの化学シフトを表１に示した。
【０１４０】
表１  ２ｋＤａのＰＥＧジオール前駆物質から合成された、Ｍ−ＰＥＧ，ＣＮ−ＰＥＧ，ＣＯＯＨ−ＰＥＧ，及びＰＴ−ＰＥＧに関する中間生成物並びに最終生成物における１３Ｃ−ＮＭＲ化学シフト（ｐｐｍ）
【０１４１】
【表１】
2004534111.tif 000014
すべてのサンプルに関し、ＰＥＧ鎖のメチル長及び“ｂ”炭素は、約６８から７２ｐｐｍに観察された；ここで、“ａ”炭素シフトは、末端置換基（Ｙ）の高度に依存していた。Ｙが−ＯＨ、−Ｂｒ、−ＣＮ、−ＯＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＯＣＨ３、又はトシル基であるとして、ＨＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２−Ｙの一般式で示される化合物に関して、示された炭素は、対応する化学シフトを示した。Ｘが−ＯＣＨ３、−ＣＮ、−ＯＣＨ２ＣＯＯＨ、又はフタルイミドであるとして、Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２の一般式で示される化合物に関し、アクリレート置換基に対応する三つのユニークな化学シフトが観察された。特に、−ＣＯＯ−及び−ＣＨＣＨ２−に関する化学シフトは、それぞれ１６５．３から１７０．６及び１２８．０から１３０．９ｐｐｍに観察された。加えて、末端置換基（Ｙ）のそれぞれに示される炭素に関する適当な化学シフトが観察された。特に、合成スキームにおいて前駆物質として２ｋＤａのＰＥＧに替わって、５ｋＤａのＰＥＧｓを利用した場合、表１に示すすべての化合物に関し、同様のＮＭＲ分析結果が得られた。
【０１４２】
Ｍ−ＰＥＧ，ＣＮ−ＰＥＧ、ＣＯＯＨ−ＰＥＧ、及びＰＴ−ＰＥＧの最終産物の変換百万分率を同定するため、示したクロマトグラフの個々のピークの化学構造を検討するため、種々のＨＰＬＣ検出器にて実行されたＨＰＬＣ分析（表２、図２Ａ及び図２Ｂ）が利用された。加えて、各フラクションは、さらに、自動フラクションコレクターにより採取され、各採取フラクションの化学構造を確定するため、１Ｈ及び１３ＣＮＭＲにて再分析された。その結果、ＰＥＧなる出発物質からＭ−ＰＥＧへの変換率は１００％を示した。ＣＮ−ＰＥＧに関しては、他のアクリル系副生成物がなく、約６５％の変換率を示した。ＰＴ−ＰＥＧでは、５％程度の他のアクリル系副生成物（例えばα−トシル−ω−アクリレート−ＰＥＧ）の生成が見られたが、約６５％の変換率を示した。ＣＯＯＨ−ＰＥＧに関しては、追加的な他のアクリル系副生成物（例えばα−ヒドロキシ−ω−アクリレート−ＰＥＧ）が約１０％生成する一方、約６０％の変換率を示した。
【０１４３】
表２：２ｋＤａのＰＥＧジオール前駆物質から合成されたＭ−ＰＥＧ、ＣＮ−ＰＥＧ、ＣＯＯＨ−ＰＥＧ、及びＰＴ−ＰＥＧのＨＰＬＣ保持時間、標準化ピーク面積及び変換率の比較
【０１４４】
【表２】
2004534111.tif 000015
これらの結果は、ハイドロゲルの合成における主要物質として使用されるＸＰＥＧｍＡｓの合成が正当であることを示している。このゲル合成スキームに基づいて、一つ以上のアクリレート置換基を有するｈＰＥＧは、このネットワークに共有的に組み込まれるだろう；一方、アクリレート置換基を有しないこれら物質は、ネットワーク形成工程の一部として、水中での平衡化ステップの後、ネットワークから除去されるだろう。各ＸＰＥＧｍＡの最終生成物がポリマー合成に先だってさらに精製されないにもかかわらず、その他のアクリレート系副生成物が低濃度で含まれることは、ネットワーク組成物における最小限の役割を演じている。
【０１４５】
ＸＰＥＧｍＡにおけるヘテロ二機能性中間体及び最終生成物は、室温にて、ｉｎ  ｖａｃｕｏでの保存に安定であり、種々の応用例に関する広範な化学的方法によりさらに改変されてもよい。例えば、フタルイミド基は、一級アミン類を形成すべく加水分解可能な良好な保護基である。
【０１４６】
前もって開発されたポリマーネットワーク形成は、得られるハイドロゲルの表面特性におけるＰＥＧの化合物の効果を検証するために選択される。種々の濃度及び異なる分子量を持つ種々のＸＰＥＧｍＡｓを含有するポリマーネットワークは、透明であるか半透明である。このネットワークの表面親水性は、水中接触角システムを使って定量化され、三つの因子、つまり出発物質ＰＥＧの分子量、ダングリング末端機能性置換基及びネットワークにおけるＸＰＥＧｍＡの濃度、に依存することが発見された（表３、図３Ａ及び図３Ｂ参照）。
【０１４７】
表３  種々の濃度、分子量、及び末端残基のＸＰＥＧｍＡを含有するＸＰＥＧｍＡ−Ａｃ−ＴＭＰＴＡに関する表面親水性
【０１４８】
【表３】
2004534111.tif 000016
第１に、ネットワークにおける所定のダングリング末端置換基を含有する所定の濃度のＸＰＥＧｍＡを考慮する際、末端置換基の分子量の増加に伴い、Ｍ−ＰＥＧ（０．４から２．５ｇ／ｍＬ）、ＣＯＯＨ−ＰＥＧ（０．２ｇ／ｍＬ）又はＰＴ−ＰＥＧ（０．２ｇ／ｍＬ）を含有するネットワークの親水性は有意に低下する。他のネットワークでは、ＸＰＥＧｍＡの分子量は、有意に親水性に影響を与えない。
【０１４９】
第二に、所定の分子量及び濃度を有するＭ−ＰＥＧと比較すると、異なる末端残基を有するＸＰＥＧｍＡは、その表面親水性に関して種々の効果を示す。
【０１５０】
第三に、ネットワーク形成におけるＸＰＥＧｍＡの濃度は、親水性に関し種々の関係を示す。ＸＰＥＧｍＡは、さらなる精製を行うことなくネットワーク形成に使用されているので、表面親水性におけるアクリル化されたｈＰＥＧへの異なる変換率の効果を解決しなければならない。Ｍ−ＰＥＧは、１００％の変換率を示し、Ｍ−ＰＥＧを含有するネットワークでは、Ｍ−ＰＥＧ濃度が増加しても、表面親水性は変化しなかった。ところが、他のＸＰＥＧｍＡでは、親水性、タイプ、変換率（およそ６０から１００％）、及び濃度に関する種々の関係が観察された。したがって、結論づけられるのは、６０から１００％の範囲内でのＸＰＥＧｍＡの変換率では、親水性に及ぼすＸ−ＰＥＧｍＡ濃度の依存性は影響を与えないということである。これらの分析が同定したことは、ネットワークの表面親水性が、分子量及び末端残基の役割が少ない場合におけるネットワーク形成に関するＸＰＥＧｍＡ濃度により主として影響されるということである。
【０１５１】
次に、種々の濃度で種々のＸＰＥＧｍＡを含有するＸＰＥＧｍＡ−Ａｃ−ＴＭＰＴＡネットワークは、ヒト線維芽細胞接着におけるゲルの表面特性の影響を同定すべく使用される。すべての接着細胞は、一定の細胞が極性細胞体の形態を示す一方で、伸張性偽足伸展性及び細胞質拡張性を示した。結果（表４参照）が示すのは、接着細胞密度は、ネットワーク形成におけるＸＰＥＧｍＡ濃度に主として依存することである。特に、すべての培養時間において、ＸＰＥＧｍＡ濃度の増加に伴い、接着細胞密度が減少する。ＸＰＥＧｍＡ濃度が１．２５から２．５ｇ／ｍＬであるネットワークでは、すべての培養時間において接着細胞が見られなかった。この傾向は、ＸＰＥＧｍＡの分子量及び末端残基には非依存的であった。直接的な機械的関係は、ネットワーク表面親水性と接着細胞密度との間に見出すことはできない。なぜなら、いくつかのない分関係性複合体パラメーター（例えば、ＸＰＥＧｍＡの物理化学的特性、タンパク介在血清接着の吸着性など）が、これら二つの減少に貢献しているためである。しかしながら、すべてのサンプルに関しＸＰＥＧｍＡ濃度が増加すると接着細胞密度は減少した。
【０１５２】
表４  種々の濃度、分子量及び末端残基のＸＰＥＧｍＡを含有するＸＰＥＧｍＡ−Ａｃ−ＴＭＰＴＡネットワークにおける接着性ヒト皮膚線維芽細胞密度
【０１５３】
【表４】
2004534111.tif 000017
すべての値は、１００細胞／ｍｍ２の場合に関して示している。（丸め処理、平均±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝３）
このサンプルにおけるこれらの結果が示すのは、ハイドロゲル中に二つの異なる化学的残基（つまり、ポリアクリル酸骨格のカルボン酸やペンデントな鎖状形状にて移植されたＸＰＥＧｍＡのダングリング末端における個となる機能性置換基）は、異なる化学的方法を使用することにより、ペプチドや医薬品などの、二つ以上の異なるタイプの二機能性分子を（共有）結合すべく使用されてもよいということである。さらに、このシステムにおいて高い含量のＰＥＧｓを有することは、結果として起こる可能性のある、タンパクの吸着や効果的な消失した非特異的な細胞接着を減弱させ、したがって多重的に固定化された二機能性物質により独自に媒介される細胞機能の調節を可能としている（１０−１３）。したがって、本発明は、多機能ハイドロゲルを供し、このハイドロゲルは、例えば、複合的生物学的システムを研究すべく、かつ、局部的及び全身的に治療薬を送達すべく使用されてもよい。
【０１５４】
（例２：薬物放出速度論：）
この例は、種々のゼラチンをベースにしたハイドロゲルの膨潤及び薬物放出速度論を探求している。このハイドロゲルは、種々の手段により架橋されており、種々の改変を行ったゼラチン骨格を含有している。これらゲルの薬物放出速度論におけるｐＨの影響も検討した。
【０１５５】
上述したように、架橋ゼラチンは、高分子量を有するハイドロゲルを製造し、ゼラチンの分解を減弱又は阻止している。この例に使用された架橋剤は、０．１％、０．０１％、及び０．００１％のグルタルアルデヒド水性溶液であり、液体窒素浸透の後、ベーキングにより自己架橋する。ゼラチンに対する骨格の改変は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）若しくはエチレンジアミンテトラ酢酸二水和物（ＥＤＴＡＤ）又はこの両者の付加により行われた。ＰＥＧは低い抗原性及び細胞毒性を有している。ＥＤＴＡＤは、低い毒性を有しており、ゼラチンのリシル残基は、容易な工程により比較的高速度にてＥＤＴＡＤにより改変可能である。Ｈｗａｎｇ及びＤａｍｏｄａｒａｎ（１９９６）  Ｊ．Ａｇｒｉｃ．  Ｆｏｏｄ．  Ｃｈｅｍ．  ４４：７５１−７５８を参照されたい。また、ＥＤＴＡＤによるゼラチンの改変は、ゼラチン鎖にポリ陰イオン分子を導入し、これにより、ゼラチンハイドロゲルの膨潤性が向上する。この例にて検討されたｐＨは、４．５、７．０、および７．４である。一定の条件及びｉｎ  ｖｉｖｏでの分析における、これらハイドロゲルの膨潤／分解及び薬物放出速度論に基づいて、これらハイドロゲルは、ラット幹細胞の再生における支持マトリックスとして、かつｉｎ  ｖｉｖｏにて炎症を媒介する薬物キャリアとして適している。
【０１５６】
ＰＥＧジオール（Ｍｎ２ｋＤａ、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）は、ＤＭＳＯ中にて、無水酢酸と、それぞれ、１４０：８０：１のモル比にて、２５℃、４時間反応することによりＰＥＧジアルデヒド（ＰＥＧｄｉａｌ）へと変換される。ＰＥＧジアルデヒドの組成は、逆相ＨＰＬＣシステム及び例１のパラメーターにて、確認された。この反応にて、ＰＥＧモノアルデヒド及びＰＥＧジアルデヒドの混合生成物を得る。ＰＥＧジアルデヒドは、約１１．５分の溶出時間を示し、最終産物の約８０重量％であった。
【０１５７】
ゼラチンサンプル（ＴｙｐｅＡ、ブタ皮膚由来、３００ブルーム、細胞培養検査済み、Ｓｉｇｍａ社製、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）のリシルアミノ基は、ＰＥＧ改変ゼラチン（ＰＧ）を形成すべく、ＰＥＧｄｉａｌにより改変された。また、ゼラチンサンプルは、ＥＤＴＡＤ改変ゼラチン（ＥＧ）を形成すべく、ＥＤＴＡＤ（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用い改変された。さらに、ゼラチンサンプルは、ＰＥＧ改変ＥＤＴＡＤ改変ゼラチン（Ｐ／ＥＧ）を得るべく、ＰＥＧｄｉａｌ及びＥＤＴＡＤにて改変された。１０ｍＬのＨ２Ｏ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水、１８．２ＭΩ−ｃｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に溶解したＰＥＧｄｉａｌと１０ｍＬのＨ２Ｏに溶解したＮａＣＮＢＨ３とを、５％（ｗ／ｖ）のゼラチン又はＥＧ溶液に別々にかつ同時に、ゼラチン／ＥＧ：ＰＥＧｄｉａｌ：ＮａＣＮＢＨ３を１：０．６６：０．１８６の重量比率にて加え、５０から６０℃にて２４時間保持することにより、ＰＧ又はＰ／ＥＧが得られる。この方法による理論的最大改変率は、３００ブルームの平均ゼラチン分子量及び平均リジン含量に基づいて、ゼラチンのリシル残基において１００％の改変率である。例えばＭｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、１２ｔｈＥｄ。  （１９９６）＃４３８８を参照されたい。ｐＨ１０の１％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液にＥＤＴＡＤを、ゼラチン：ＥＤＴＡＤ＝１：０．０３４の重量比率にて加え、４０℃で３時間保持することにより、ＥＧが得られる。この方法を用いてゼラチンのリシル残基の改変率は３８％である。したがって、これより高い改変率が示すのは、加えたＥＤＴＡＤの両機能性置換基は、ゼラチンのリシル残基に結合されたということであり、これにより、ゼラチン鎖が架橋される。ゼラチンの改変レベルは、２，４，６−トイリニトロベンゼンスルフォン酸の分光光度法を用いて定量化された。Ｈｗａｎｇ及びＤａｍｏｄａｒａｎ並びにＯｆｆｎｅｒ及びＢｕｂｎｉｓ（１９９６）Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  １３：１８２１−１８２７を参照されたい。
【０１５８】
ハイドロゲルを製造するために、約７０℃にて、１０％（ｗ／ｖ水）ゼラチン溶液（Ｇ）、１０％ＰＧ、４０％ＥＧ及び６０％Ｐ／ＥＧを加熱し、６ｍｍ圧になるようにペトリ皿（６０×１５ｍｍ、Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ社製）に注ぎ、室温にて一昼夜静置した。ハイドロゲルを、１ｃｍ半径の円形ディスク状、又は０．５×０．５ｃｍ四方に切断し、０．１、０．０１、０．００１％（ｖ／ｖ水）グルタルアルデヒド（ＥＭグレード、１０％（ｖ／ｖ）水性溶液、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）にて、穏やかに攪拌しながら６時間、架橋反応を行った。架橋ハイドロゲルを３から５分、１０回、水にて洗浄した。洗浄されたハイドロゲルを、グルタルアルデヒドに継続的に浸透しながら、水にて一昼夜静置した。その後、ハイドロゲルを、室温にて、環境条件の空気存在下にて４８時間乾固し、重量を測定した。これとは別に、ゼラチン重量あたり１０％のハイドロゲルを、環境条件の空気存在下、４７時間乾固し、３０秒から１分間、液体窒素にて凍結させ、その後、１３０から１３５℃にて８．５時間ベーキングした（自己架橋型ＬＮ２−ｂａｋｅｄ−Ｇ）。洗浄ステップ及び乾固ステップに対してすべてのハイドロゲル形成が抵抗したわけではない。これは主としてその加水分解性ゆえである。膨潤／分解及びｉｎ  ｖｉｖｏで薬物放出検討を含むハイドロゲル形成は、０．１％グルタルアルデヒド架橋Ｇ、ＰＧ、ＥＧ，及びＰ／ＥＧゲル；０．０１％グルタルアルデヒド架橋Ｇ、ＰＧ及びＥＧゲル；０．００１％グルタルアルデヒド架橋Ｇ及びＰＧゲル；ならびに自己架橋ＬＮ２−ｂａｋｅｄ−Ｇについて行われた。Ｐ／ＥＧハイドロゲルに関して、膨潤試験、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物放出試験は行っているが、結果はここには含まれていない。
【０１５９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物放出試験に関し、各ハイドロゲルは、クロルヘキシジンジグルコネート（ＣＨＤ；２０％（ｗ／ｖ）水性溶液、Ｓｉｇｍａ社製）が負荷された。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの同様の試験におけるデキサメタゾンに用いた薬物負荷密度と同等である（２１日間投与、１５０μｇ／ｋｇ／日）。ラット重量を０．２ｋｇと仮定すると、この負荷密度は、６３０μｇ／ハイドロゲルと同等である。膨潤試験から得られる最大膨潤重量比に基づいて、各ハイドロゲルは、ハイドロゲルが吸収可能な最大量以下の容量である３５μＬのＣＨＤ（１８ｍｇ／ｍＬ）を負荷された。ハイドロゲル（０．５×０．５×０．６ｃｍ）は、４８穴組織培養プレートの個々のウェルに配置された。ＣＨＤを各ウェルに加え、ゆっくり振盪させながら一昼夜（約１５時間）、この薬物溶液を吸収させた。
【０１６０】
膨潤及び分解速度論を検討するため、乾燥ハイドロゲルを、５ｍＬのｐＨ４．５、７．０及び７．４の水溶液中に配置し、３７℃の水浴に静置した。この水溶液は、水に希塩酸及び水酸化ナトリウムを加えることによりそのｐＨを調節した。ハイドロゲルは、約３及び６週間おきに新しい水溶液へと移された。膨潤ハイドロゲルの重量を、２、４、６時間、１、２、３、４、５日、１、２、３、４、５、６，７、及び８週間目に計測し、膨潤／分解速度論を特徴づけた。この計量工程のすべてのステップにおいてハイドロゲルの強度を確保するために細心の注意を払った。各ハイドロゲルのそれぞれの時点における膨潤重量比は、（Ｗｓ−Ｗｄ）／Ｗｄにて計算された。ここでＷｓは、膨潤ゲルの重量（ｇ）であり、Ｗｄは乾燥ゲルの重量（ｇ）である。週間以上において起こる最大膨潤重量比及びその時間も算出された（それぞれＲｍａｘ及びＴｍａｘである）。最終達成膨潤重量比（分解に起因）及び尾の時間も算出された（それぞれＲｆａｉｌ及びＴｆａｉｌである）。統計処理は、ＡＮＯＶＡ及びＴｕｋｅｙ多重比較にて行われた（ｐ＜０．０５）。膨潤試験で得られたここのサンプル用液は、分解産物のＧＰＣ分析を継続するため、採取された（結果は示していない）（２０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル：０．１Ｍ  ＮａＮＯ３を用い、流速０．７ｍＬ／分、６０分間、三つのウルトラハイドロカラム、ウルトラハイドロゲル２５０、１００及びリニア、を一連でつなげた、Ｗａｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ社製）。
【０１６１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験に関し、ケ−ジインプラントシステムを構築した後に、０．１％及び０．０１％グルタルアルデヒドにて架橋された非改変ゼラチンをｉｎ  ｖｉｖｏにて試験した。Ｋａｏ及びＡｎｄｅｒｓｏｎの（１９９９）“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ２ｎｄｅｄ．，  Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｅｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ，  ｐｐ．  ６５９−６７１を参照されたい。サンプルは、ステンレス鋼ワイヤーメッシュ製の医療用グレードにて構築された円柱ケ−ジ（３．５ｃｍ長×１ｃｍ半径）内部に配置された。コントロールとして、からのケ−ジが埋め込まれた。すべてのケ−ジは、３週令のＳＤラットの背中の皮下に埋め込まれた。埋込後７、１４及び２１日において、ケ−ジから採取した炎症性滲出物を除去し、かつ標準血液学的手法を用いて、埋込に反応する細胞性及び体液性に関する定量的な評価が行われた。リンパ球、単球及び多形核白血球（ＰＭＮ）の分布及び滲出液の亜集団を同定した。同時に、この埋め込まれた材料は、サンプルの物理化学的組成の変化を分析すべく取り出された（例えば、重量の損失率）。
【０１６２】
ＰＥＧ及び／又はＥＤＴＡＤにより、ゼラチンのリシル残基の改変率は、ＴＮＢＳ法により定量化された：ＰＧは、１０％の改変率であり、ＥＧは４０Ｔの改変率であり、かつＰ／ＥＧは６０％の改変率であった。ここに示したすべての結果は、改変ゼラチンの同じバッチからの材料を組み込んだ（つまり、８％ＰＧ、４２％ＥＧ）。
【０１６３】
図５は、代表的な膨潤／分解速度論を示したグラフである。時間はＸ軸に示し；膨潤比は、Ｙ軸に示した。キー：Ｇ，０．０１％グルタルアルデヒド架橋体＝◆；１０％ＰＧ、０．０１％グルタルアルデヒド架橋＝■；４０％ＥＧ、０．０１％グルタルアルデヒド架橋＝▲。膨潤／分解試験が示したのは、ＰＥＧにより改変されたＧは、有意にＴｍａｘ及びＴｆａｉｌへと増加し、一方でＥＤＴＡＤにより改変されたＧは、有意にＴｍａｘへと増加した。０．０１％又は０．００１％のグルタルアルデヒドにより架橋されたハイドロゲルは、０．１％のグルタルアルデヒドで架橋されたゲルに対して有意にＴｍａｘ及びＴｆａｉｌが異なっていた。ｐＨは、Ｒｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｒｆａｉｌ、及びＴｆａｉｌに有意に影響を与えない。表５は、種々のレベルの濃度、ｐＨ、及びゼラチン骨格改変性を有するグルタルアルデヒドに関するＲｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｒｆａｉｌ、及びＴｆａｉｌを示している。
【０１６４】
表５  グルタルアルデヒドの熱処理、ｐＨ，ゼラチン骨格改変性に関するＲｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｒｆａｉｌ、Ｔｆａｉｌ
【０１６５】
【表５】
2004534111.tif 000018
【０１６６】
【表６】
2004534111.tif 000019
ａすべての値は平均（ｎ＝２から３）とｓ．ｅ．ｍ．にて示した。
ｂ同様の実験条件でのＧに関する有意差；ｔ−検定、ｐ＜０．０５
ｃ１０％ＰＧ又は４０％ＥＧ
ケ−ジインプラントシステム後のｉｎ  ｖｉｖｏ試験において、（０．１％Ｇ及び０．０１％Ｇ）の埋め込まれたゼラチンをベースにしたハイドロゲルに対する宿主外来物反応の時間及び強度を検討した。滲出液中の多形核白血球（ＰＭＮｓ）が高濃度（コントロールに比較して）存在することにより、埋込時に発生し、時間とともに減弱する急性炎症反応を示す。滲出液中の単球及びリンパ球が高濃度（コントロールに比較して）存在することにより、慢性炎症反応を示す。したがって、０．１％Ｇハイドロゲルは、７日目において、若干亢進された慢性炎症反応を示し、コントロール及び０．０１％Ｇに比較して、１４日目では亢進された慢性炎症反応を示した。０．０１％Ｇでは、７日目において、コントロールに比較して若干亢進された慢性炎症反応を示した（表６参照）。２１日目までに、すべてのサンプルは、コントロールに比較して、慢性炎症反応を示した。サンプルの重量損失百万分率は、埋込時間の増加につれ増加し、かつグルタルアルデヒド固定率の百万分率が減少するとともに、さらに亢進された（結果は示していない）。
【０１６７】
表６  ０．１％又は０．０１％のグルタルアルデヒドで架橋したゼラチンハイドロゲルに関する炎症滲出液における全体及び異なるは血球濃度
【０１６８】
【表７】
2004534111.tif 000020
ａすべてのサンプルは平均±ｓ．ｅ．ｍ．にて示した（ｎ＝３−７）
ｂ「空のケ−ジ」なるコントロールに対してｐ＜０．０１
ｃ同様のサンプルタイプの、４日目における値に対してｐ＜０．０１
この例が示すのは、ゼラチン骨格改変及び架橋剤の選択が、改変ゼラチンベースのハイドロゲルにおける膨潤／分解速度論に影響を及ぼす、ということである。これら材料の特性を調節し、かつこれらの変更が薬物放出にどのように影響を及ぼすかをモニターすることにより、薬物がこの形成、処理時間の長さ、及び処理条件、及び埋め込まれたマトリックスの位置取りなどの考慮に基づいた好ましい放出特性を有する、非免疫原性を有し、生体吸収可能な細胞／薬物キャリアマトリックスを製造することができる。
【０１６９】
（例３：ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるファイブロネクチン由来類似オリゴペプチドを移植したゲルを用いた宿主反応性の調節：
宿主炎症反応は、外傷や外来物の存在に対する通常の反応である。この炎症の程度や期間は、生体材料の安定性や生体適合性に直接影響を与える。したがって、この例では、ファイブロネクチン由来類似オリゴペプチドを有する本発明により製造されたゲルの性能を評価している。ファイブロネクチンは、種々の生体材料に吸収されることが知られており、宿主外来物反応において重要な役割を演じている。このＲＧＤ（配列番号１）及びＰＨＳＲＮ（配列番号２）なるアミノ酸配列は特に興味深い。なぜなら、これら配列は、二つの結合したＦＩＩＩ分子の隣り合うループに存在しており、宿主のインテグリンに同調的に結合するからである。
【０１７０】
このオリゴペプチドは、ヒト血清ファイブロネクチンの一次及び三時構造に基づいてデザインされ、ファイブロネクチンのＲＧＤ及びＰＨＳＲＮ領域の構造機能関連性が、宿主炎症反応及びマクロファージの挙動をどのように調節するかをｉｎ  ｖｉｖｏにて検討した。ペプチドは、ＲＧＤ及びＰＨＳＲＮ配列を単独又は組み合わせて用いた。ファイブロネクチンの三次構造を、ペプチドの形成の指標として利用した。溶液中での自然型ファイブロネクチン分子におけるＰＨＳＲＮ配列及びＲＧＤ配列との距離は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ（登録商標）に保存されている構造相関を用いて概算された（配列：ＦＩＮＣ＿ＨＵＭＡＮ  Ｐ０２７５１）。この測定に基づいて、二つの生理的活性を有する配列が両者ともその配向性が可能なように結合すべく、およそ同じ長さを有するグリシンのヘキサマー（Ｇ６）を用いた。すべてのペプチドに関し、スペーサーとして、末端型トリメリックグリシンドメイン（Ｇ３）を用いた。オリゴペプチド類は、ソリッドレジン法（Ｓｏｌｉｄ−ｒｅｓｉｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ）にて合成された。なお、この合成には、自動ペプチド合成器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用い、その反応は、常套的な９−フルオレニルメチルオキシカルボニル化合物を用いて、さらなる精製を行わず、最終的な結合効率は約８５％以上の純度を有していた。ペプチド類は、質量分析器及びフォトダイオードアレイ、蒸発型ライトスキャッター、及び紫外線／可視光検出器を結合した逆相ＨＰＬＣにて分析された。以下のオリゴペプチドを合成した。つまり、Ｇ３ＲＧＤＧ（配列番号３）、Ｇ３ＰＨＳＲＮＧ（配列番号４）、Ｇ３ＲＧＤＧ６ＰＨＳＲＮＧ（配列番号５）、Ｇ３ＰＨＳＲＮＧ６ＲＧＤＧ（配列番号６）及び非特異的コントロールとしてＧ３ＲＤＧＧ（配列番号７）を合成した。ｉｎ  ｖｉｖｏにて、宿主反応及びマクロファージの挙動に対するペプチドの影響を検討するため、ペプチド類を、例１に述べたハイドロゲルに共有的に移植した。
【０１７１】
この例に使用するゲルは、モノメトキシポリエチレングリコールモノアクリレート（ｍＰＥＧｍＡ）、アクリル酸（Ａｃ）、及びトリメチロールプロパントリアクリレート（ＴＭＰＴＡ）のランダム共重合体である。上述のように、ゲルは親水性を有し、非イオン性であり、低膨潤性を有し、光学的に透明であり、色調を有していない。示差走査熱量分析が示すのは、これら材料が完全なアモルファスであり、かつｍＰＥＧｍＡ化合物が、架橋ＴＭＰＴＡマトリックスにおいて、完全に位相混合状態にあるということである。生物活性を有するオリゴペプチド類は、ｍＰＥＧｍＡ−Ａｃ−ＴＭＰＴＡハイドロゲルに移植され、得られたゲルは、受容体−ペプチド特異的に細胞接着を媒介している。このペプチドの表面密度は、ペプチド当たりのアミノ酸数に依存することが判明した。例えば、ペンタペプチドは、６６±６ピコモル／ｃｍ２の表面密度で移植され；一方、３０残基を有するペプチドは、表面密度の約１／５にて移植された。この例において、一つの生理活性領域を有するオリゴペプチド（つまり、Ｇ３ＲＧＤＧ、Ｇ３ＰＨＳＲＮＧ及びＧ３ＲＤＧＧ）は、２つ以上の生理活性領域を有するオリゴペプチド（つまり、Ｇ３ＲＧＤＧ６ＰＨＳＲＮＧ及びＧ３ＰＨＳＲＮＧ６ＲＤＧ）の密度の二倍にて移植された。
【０１７２】
宿主外来物反応に対する移植材料の効果を検討すべく、良好に構築された皮下ケ−ジインプラントシステムを用いた。概説すると、ファイブロネクチン由来ペプチドを含有あるは不含のｍＰＥＧｍＡ−Ａｃ−ＴＭＰＴＡネットワークを、少なくとも４８時間、滅菌水中に配置し、共重合反応由来の低分子量浸出可能残留分子を除去し、かつ水分平衡を達成した。その後、このポリマーサンプルを、医療用グレードのステンレス鋼ワイヤーメッシュ製の、蒸気滅菌した円柱ケ−ジ（３．５ｃｍ長、１ｃｍ径）中に、滅菌条件にて挿入した。種々のポリマーサンプルを含有するケ−ジを、３週令のメスＳＤラットの背中の皮下に移植した。コントロールとして空のケ−ジを埋め込んだ。ケ−ジに蓄積した炎症性滲出物を、埋込後４、７、１０、１４及び２１日目に採取し、標準的かつ常套的な血液学的手法を用いて、試験材料に反応した細胞性及び体液性の定量的評価を行った。特に、この滲出液におけるリンパ球、単球、及びＰＭＮ亜集団の分布を同定した。この炎症性滲出液中におけるＰＭＮｓが高濃度に存在することが示すのは、埋込直後に始まり時間と共に減弱する急性炎症反応である。この後、滲出液中に単球及びリンパ球が高濃度で存在することにより特徴付けられる慢性炎症反応が起こる。したがって、ケ−ジインプラントシステムにより、試験サンプルに対する宿主炎症反応は、時間的かつ材料特性の関数として観察される。滲出液サンプルのそれぞれの液滴を、脳−心臓注入寒天プレート上にて培養することにより、感染をチェックする。種々のサンプルに関し、種々の時間にて、感染は観察されなかった。移植後、４、７、１４、２１、３５及び７０日目において、試験ポリマーサンプルを回収し、光学顕微鏡に結合したビデオ分析システムを用いて、接着細胞の形態及び密度を定量化した。
【０１７３】
外来物巨大細胞（ＦＢＧＣ）形成における材料及びペプチド影響に関する見識を供するため、種々の生物材料に対するマクロファージ融合のｉｎ  ｖｉｖｏでの速度論に関する前もって開発された数学モデルを用いた。このモデルは、フローリーのポリマー鎖の最も起こりうる分子量分布（Ｆｌｏｒｙ‘ｓ  ｍｏｓｔ−ｐｒｏｂａｂｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｃｈａｉｎｓ）に基づいて、定式化されている。これには、二つの初期的な前提が必要である。（１）ＦＢＧＣサイズが所定のＦＢＧＣでの核の数に直接比例していること；及び（２）融合する細胞のそれぞれの能力が一定であり、細胞のサイズに依存しないこと；である。ＦＢＧＣサイズ分布式（Ｎｘ＝ｐａｘ−３（１−ｐ））は、回収時点のそれぞれの各サンプルにおける測定されたＦＢＧＣサイズ分布結果に適用された。この式において、Ｎｘは、面積ｘにおけるＦＢＧＣｓの細胞サイズ数フラクションであり；ｐは、細胞融合の可能性又は初期的な接着マクロファージ密度に対する細胞融合の数の比であり；ａは、細胞面積（ＦＢＧＣ／ｍｍ２）に対する単位ＰＢＧＣ当たりの核の数に関連した一定値であり、異なる機械的負荷条件下での種々の医療用生体材料に関して一定であることが判明した。Ｋａｏらの（１９９４）Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  ２８：７３−７９；Ｋａｏらの（１９９５）Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  ２９（１０）］  １２６７−７５；  及びＫａｏらの（１９９４）Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．  ２：８１９−８２９を参照されたい。ｐ及びａに関する値は、ｒ２＞０．９８になるまでカーブフィットを繰り返すことにより得られた。回収時点のそれぞれにおける各サンプルに関する得られたｐ値は、細胞融合工程を特徴づけた二つの速度論パラメーターを算出すべく利用された：この二つのパラメーターとは、つまり、ＦＢＧＣ形成に参画する接着マクロファージの密度（ｄ０＝ｄｆ／［ｐ２（１−ｐ）］）及び細胞融合レート率（１／（１−ｐ）＝ｄ０ｔｋ＋１）である。ｄ０は、ＦＢＧＣ形成工程に参画する算出された接着マクロファージの密度であり（マクロファージ／ｍｍ２）、ｄｆは、移植後４日での算出された接着マクロファージ密度であり、ｔは、埋込経過時間であり（週）、ｋは、細胞融合のレート率の逆数である（ｍｍ２細胞−１週−１）。
【０１７４】
すべての実験結果は、平均±標準偏差にて示した。各サンプルは、非依存的に３回繰り返した（ｎ＝３）。比較分析は、Ｓｔａｔｖｉｅｗ（登録商標）４．５にて行い、バリアンスの分析及びフィッシャーの防御ｔ検定を用い、信頼レベルは９５％以上にて行った（ｐ＜０．０５）。
【０１７５】
移植後の種々の時点において、全体及び個々の白血球分析を行った（表７）。すべてのサンプルに関し、種々の時点にてＰＭＮｓは観察されなかった。このことは、空のケ−ジ及びファイブロネクチン由来類似オリゴペプチドを移植あるいは移植されていないネットワークの存在により、移植後４日以内に解決される急性炎症反応が惹起されたことを示している。空のケ−ジに関し、全体の白血球及び白血球濃度は、移植後４から７日の間に急速に低下し、７日から２１日目までは安定を保った。この結果が示すのは、空のケ−ジの存在により、移植後の時間の経過に伴い回復へと向かう、移植後７日目までの慢性炎症反応が急速に低下することである。ケ−ジ内部にｍＰＥＧｍＡ−Ａｃ−ＴＭＰＴＡゲルが存在することが示すのは、移植後４から２１日目まで一定の白血球濃度を保っていることである。しかしながら、ゲルが存在することにより、空のケ−ジコントロールと比較して、移植後４及び７日目において、単球濃度を増加させ、リンパ球濃度を減少させる。このことは、回復傾向に向かうが、変化した白血球の亜集団分布を伴った、慢性炎症反応に匹敵するレベルであることを示唆している。ｍＰＥＧｍＡ−ＡＣ−ＴＭＰＴＡネットワークと空のケ−ジコントロールとの傾向を比較する際、このポリマーマトリックスネットワークに固定されたペプチドの存在は、減少したリンパ球濃度は、移植後４及び７日目での、Ｇ３ＲＧＤＧ移植ネットワークでは観察されず、かつ移植後７日目でのその他のペプチド移植表面でも観察されなかったことを除いては、移植後１４日目までは白血球の全体的及び個々の濃度には有意に影響を与えなかった。これらの結果が示すのは、固定されたペプチドを含むあるいは含まないポリマーネットワークの存在は、移植後１４日目までの急性及び慢性炎症反応を有意には調節しないことである。移植後２１日目までは、「ペプチドを移植していない」「空のケ−ジ」のコントロールに対応する値と比較すると、移植されたＧ３ＲＧＤＧ又はＲ３ＲＤＧＧの存在により、リンパ球の全体的な濃度が若干減少する。この傾向は、Ｇ３ＰＨＳＲＮＧ６ＲＧＤＧを移植した表面では観察されない。逆に、移植されたＧ３ＰＨＳＲＮＧ又はＧ３ＲＧＤＧ６ＰＨＳＲＮＧの存在により、「ペプチドを移植していない」「空のケ−ジ」のコントロールに対応する値と比較すると、リンパ球の全体の濃度は若干増加する（ｐ＜０．０５）。移植後２１日目以降には、すべてのサンプルに関し、埋め込まれたケ−ジの外側にてカプセル化の伸張が観察され、かつケ−ジの内部にて炎症性滲出液が観察されなかった。これは、組織の治癒が進行していることを示している。これらのデーターが示唆するのは、移植ペプチドの自己同一性は、宿主急性炎症反応及び宿主慢性炎症反応の一次的な変化及び強度を優位に変化させないことである。
【０１７６】
ファイブロネクチンを含有あるいは含有しない移植されたｍＰＥＧｍＡ−ＡＣ−ＴＡＭＰＴＡ上における接着マクロファージ密度は、種々の保持時間において定量化された。一般に、すべての表面上への接着マクロファージは、移植時間の経過とともに減少する（表８参照）。すべてのサンプルに関する接着マクロファージ密度は、移植後１４日以降の各保持時間におけるＧ３ＲＤＧＧ又はペプチドを有しないコントロールの対応する値よりも高いものである。すべてのサンプルにおける接着マクロファージは、移植後２１から７０日に匹敵する。すべての表面上における接着マクロファージは、伸張性偽足伸展性を伴う細胞質拡張性を示した。これらの結果が示すのは、ＲＧＤ及び／又はＰＨＳＲＮモチーフを有するペプチドは、接着マクロファージ密度に影響を与えないということである。
【０１７７】
移植後７０日以降の各保持時間において、移植ペプチドを含有あるいは含有しない各プリマーサンプルにおいて、極性光学顕微鏡にて４０倍で観察したところ、表面上のヒビ割れ、穴、及び物理的な分解は観察されなかった。
【０１７８】
すべてのサンプル上でのＦＢＧＣの形態は、外来物タイプであった。つまり、単位細胞当たり種々に異なる３つ以上の核を含有しており、伸張した細胞質形態を示していた。一般に、すべてのサンプルに関し、移植後の時間の経過とともにＦＢＧＣ密度が増加するが
、Ｇ３ＲＧＤＧ又はＧ３ＰＨＳＲＮＧ６ＲＧＤＧを有する表面上のＦＢＧＣ密度は、移植後の時間が経過しても一定に保たれている（データーは示していない）。加えて、すべてのサンプルに関し、移植後の時間の経過とともに、ＦＢＧＣの平均サイズは増加する（データーは示していない）。
【０１７９】
これらの結果が示すのは、ファイブロネクチン由来ペプチドを含有するハイドロゲルは、移植後の時間の経過とともに、伸長性ＦＢＧＣ被覆率を媒介するということである。特に、Ｇ３ＲＧＤＧ６ＰＨＳＲＮＧを有する表面では、移植後７０日におけるその他のタイプのサンプル及びコントロールと比較して、ゼンサンプル表面の約９０％がＧＢＧＣで被覆されていることを示している。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるこれらの知見が示すのは、ＲＧＤモチーフ、特にＧ３ＲＧＤＧ６ＰＨＳＲＮＧではなくＧ３ＲＧＤＧ又はＧ３ＰＨＳＲＮＧ６ＲＧＤＧの形態において、ＦＢＧＣｓを形成すべく急速にマクロファージの融合が調節されるということである。この減少は、移植後の早期（つまり移植後４日以内）に観察される。
【０１８０】
生体材料上にてＦＢＧＣを形成するマクロファージの融合に関するｉｎ  ｖｉｖｏにおける速度論にて述べた前もって開発された数学的モデルは、ＦＢＧＣ形成の速度論におけるペプチドの効果に関する見識を供するために使用される。すべてのサンプルに関するＦＢＧＣ細胞のサイズの分布は、移植後４、７、１４及び２１日目に観察された。細胞のＦＢＧＣサイズの分布式は、ｐ及び１／ａ値を与える各保持時間における各サンプルの測定結果にフィッティングさせた。ｐ値は、は、すべてのサンプルに関し、ペプチドを含有しないコントロールを除く、移植時間の経過とともに増加する。したがって、この結果が示すのは、細胞融合の可能性は、移植時間の経過とともに増加するということである。また、この算出式が示すのは、ＦＢＧＣ形成に参画する接着マクロファージに関する密度が、非特異的コントロールであるＧ３ＲＤＧＧを有するゲル及びペプチドを含有しないゲルに比較してＧ３ＲＧＤＧ、Ｇ３ＰＨＳＲＮＧ及びＧ３ＰＨＳＲＮＧ６ＲＧＤＧを含有するｍＰＥＧｍＡ−Ａｃ−ＴＭＰＴＡのゲルが有意に大きいことを示している。
【０１８１】
この例が示すのは、本発明におけるハイドロゲルは、改変された三次元ハイドロゲルマトリックスの内部にて、ペプチド、タンパク、及びこれに類似する物質を支持すべく使用されることが可能である。
【０１８２】
表７：種々のファイブロネクチン由来オリゴペプチドを含有するｍＰＥＧｍＡ−ＡＣ−ＴＭＰＴＡネットワークに関する炎症性滲出液中の全体及び異なる白血球濃度
【０１８３】
【表８】
2004534111.tif 000021
【０１８４】
【表９】
2004534111.tif 000022
ａすべてのサンプルは平均±ｓ．ｅ．ｍ．にて示した（ｎ＝３−７）
ｂ「空のケ−ジ」なるコントロールに対してｐ＜０．０５
ｃ「ペプチドを含有しない」コントロールに対してｐ＜０．０５
ｄ同様のサンプルタイプの、４日目における値に対してｐ＜０．０５
表８：種々のファイブロネクチン由来オリゴペプチド含有ケ−ジ移植ｍＰＥＧｍＡ−ＡＣ−ＴＭＰＴＡネットワーク上における接着マクロファージ密度
【０１８５】
【表１０】
2004534111.tif 000023
ａすべてのサンプルは平均±ｓ．ｅ．ｍ．にて示した（ｎ＝３−７）
ｂ「空のケ−ジ」なるコントロールに対してｐ＜０．０５
ｃ同様のサンプルタイプの、４日目における値に対してｐ＜０．０５
例４：改変ハイドロゲルを備えた浸透メンブレン：
浸透ネットワーク（ＩＰＮｓ）は、インターメッシュ構造を形成すべく第２材料の周囲に第１ポリマーを反応することによりハイドロゲルが合成される。ＩＰＮｓは、その他の生体材料ハイドロゲルを形成するのに使用するか共在を含有していない。常套的な架橋工程に使用される毒性を有する化学物質を含有しないという有益性に加えて、光共重合反応が有する利点には、所望の含量を有する薬物をマトリックス中に簡単に負荷することが可能であり、薬物放出率に影響を及ぼす架橋密度を制御することができる。さらに、ＩＰＮｓは、ｉｎ  ｓｉｔｕにて形成されてもよく、かつ、前もって合成される材料に適さない位置に使用されてもよい。
【０１８６】
この例の焦点は、ゼラチン骨格改変、ゼラチンの重量％、ｐＨ及びポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧｄＡ）の分子量を種々変化させたゼラチンをベースにしたＩＰＮｓに関する膨潤性及び薬物放出速度論を解析することである。我々の結果に基づいて、これらＩＰＮｓは、組織足場及び薬物放出媒介物に極めててきしている。
【０１８７】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（２、４、６及び８ｋＤａ、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）は、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧｄＡ）を合成すべく、アクリロイルクロライド（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びＴＥＡ（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いてそれぞれ、１：４：６のモル比にて、室温にて３時間反応させることにより、改変される。ＰＥＧｄＡの最終産物の純度は、例１にて使用された逆相ＨＰＬＣシステムにてチェックされる。ＰＥＧｄＡに関する溶出時間は、約１３．２分であって、その純度は１００重量％である。
【０１８８】
モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）（２ｋＤａ、Ｆｌｕｋａ社製）は、ｍＰＥＧモノアルデヒド（ｍＰｍＡ）を合成すべく、室温にて、無水酢酸（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及びＤＭＳＯ（Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用い、それぞれ１：８０：１４０のモル比にて改変される。この反応は、８から２４時間行い、定期的にＨＰＬＣによりモニターされた。このｍＰｍＡは、約１１．９分にその溶出時間を有し、その純度は約７５重量％である。ＰＥＧｄＡ及びｍＰＥＧモノアルデヒドの組成は、１Ｈ−ＮＭＲにより確認された。
【０１８９】
ゼラチン（Ｇ）（３００Ｂｌｏｏｍ、ブタ皮膚由来タイプＡ、Ｓｉｇｍａ社製）のリシル残基は、ＥＤＴＡＤ−Ｇ（ＥＧ）を形成すべく、ＥＤＴＡＤを用い、１：０．０３４の重量比にて、ｐＨ１０にて３時間反応され改変された。また、ゼラチンのリシル残基は、ｍＰｍＡＧを形成すべく、ｍＰｍＡ及びシアノボロハイドライドナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を、重量比１：０．６６：０．１８６にて、５０から６０℃にて２４時間反応され改変された。さらに、ＥＧは、ｍＰｍＡＧ工程と同様の工程にて、ｍＰｍＡを用い改変された。ＥＤＴＡＤ及び／又はｍＰｍＡにより改変されたゼラチンのリシル残基の百万分率は、トリニトロベンゼンスルホン酸分光光学手法を用いて同定された。この試験にて使用されるＩＰＮｓは、同種の改変ゼラチンより調製された。
【０１９０】
ＩＰＮｓは、改変及び非改変ゼラチン、ＰＥＧｄＡ（２、４．６、又は８ｋＤＡ）、イニシエーター（２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、ＤＭＰＡ）及び長波長紫外光源を用いて製造される。ゼラチンは、２０重量％のゼラチン様液を調製すべく加熱した（８０℃）イオン交換水に溶解された。ＰＥＧｄＡは、１００重量％のＰＥＧｄＡ溶液を調製すべく、アルミニウムホイルでラップされたガラスバイアルにて、加熱していないイオン交換水に溶解された。このゼラチン様液は、その後、ＰＥＧｄＡ溶液に加えられ、この混液は完全に混和された。その後、ＤＭＰＡをこのゼラチン／ＰＥＧｄＡ混液に加え、この最終混合物は再び混和されその後、残りの工程中加熱（８０℃）された。ＩＰＮｓは、射出成形により製造された。ゼラチン／ＰＥＧｄＡ／ＤＭＰＡ最終混合物は、二つのガラススライドに固定されたテフロン（登録商標）鋳型に、パスツールピペットにて射出された。この鋳型は、およそ、２０ｍｍ長、１０ｍｍ幅及び１．６ｍｍ厚を有している。鋳型／ＩＰＮ混合物は、その後、約３分間、上部及び下部から紫外光を照射された。この照射中、紫外光は、ＰＥＧｄＡの架橋を開始し、ＰＥＧ架橋物内部にゼラチンをトラップした。鋳型／ＩＰＮは、鋳型からＩＰＮが除去されるまで冷却された。
【０１９１】
ＩＰＮｓは、この合成に用いたゼラチンの重量％、ゼラチンのタイプ、ＰＥＧｄＡｎｏ重量％、及びＰＥＧｄＡの分子量に基づいて命名された。例えば、４Ｇ６Ｐ２Ｋが示すのは、４０重量％のゼラチン、６０重量％のＰＥＧｄＡ、及び２ｋＤａのＰＥＧｄＡである。以下のキーは、ＩＰＮ組成を特定するために使用するコードを示している。
【０１９２】
キー：各組成は、式“ＸＹＺｋ”なるコードにより識別されている。ここでＸは、ゼラチンの重量％、Ｙはゼラチンのタイプ、ＺはＰＥＧｄＡの重量％、及びｋは、ＰＥＧｄＡの分子量を示している：
Ｘ＝ゼラチンの重量％
４＝４０重量％
６＝６０重量％
Ｙ＝ゼラチンのタイプ
Ｇ＝ゼラチン
ＥＧ＝ＥＤＴＡ改変ゼラチン
ｍＰＭａＧ＝ｍＰｍＡ改変ゼラチン
ｍＰｍＡＥＧ＝ｍＰｍＡ／ＥＤＴＡＤ改変ゼラチン
Ｚ＝ＰＥＧｄＡの重量％
４＝４０重量％
６＝６０重量％
ｋ＝ＰＥＧｄＡの分子量
２ｋ＝２０００Ｄａ
４．６ｋ＝４，６００Ｄａ
８ｋ＝８，０００Ｄａ
ＩＰＮｓに関する膨潤／分解速度論は、所定の時間（８週間以下）での膨潤したＩＰＮｓを計量することにより特徴づけられる。ＩＰＮｓは、ｐＨが４．５、７．０及び７．４の５ｍＬ脱イオン水を含有するテストチューブに加えられた。このテストチューブは、その後、３７℃の水浴に配置された。所定の時間において、このサンプルは、ベントスパチュラを用いて、注意してテストチューブから除かれ、乾固され、計量され、再び同様のテストチューブに戻された。この工程は、サンプルが完全に分解されるか、あるいは、サンプルが多数の断片に分解され、あるいはテストチューブから除去できなくなるまで行われた。各ＩＰＮに関する種々の時点における膨潤重量比は、（Ｗｓ−Ｗ０／Ｗ０）として算出される。ここでＷｓは、膨潤したＩＰＮの重量であり、Ｗ０は、ＩＰＮの元の重量である。８週間以上にて起こる最大膨潤重量比及びその時間は、算出された（Ｒｍａｘ、Ｔｍａｘ）。最終的に得られる膨潤重量比（ＩＰＮの分解に起因している）及びその時間も算出された（Ｒｆａｉｌ、Ｔｆａｉｌ）。
【０１９３】
ＩＰＮｓに関する宿主生体適合性及び炎症反応のレベルは、上述の例におけるｉｎ  ｖｉｖｏにて皮下に配されたケージインプラントを介して同定された。ＩＰＮｓは、円柱の（１ｃｍ径で３．５ｃｍ長）医療用ステンレス鋼ワイヤーメッシュケージの内部に配置された。空のケージ、つまりコントロールを伴ったこれらケージは、３週令のメスＳＤラットの背部に皮下的に移植された。ケージに採取される炎症性滲出液は、移植後４、７、１４及び２１日目に採取され、標準的な血液学的手法を用いて、ＩＰＮサンプルに反応する細胞性及び体液性成分の定量分析が行われた。これら手法を用いて、滲出液中の多形核白血球（ＰＭＮ）、リンパ球、及び単球の分布を同定した。宿主反応に加えて、ＩＰＮｓの分解は、損失を重量％にて同定された（（ＩＰＮ最終重量／ＩＰＮ初期重量）×１００）。
【０１９４】
上述のＩＰＮは、不透明であり、柔軟性を有し、ゴム質であり、若干粘性を有している。この不透明性は、ゼラチン濃度の減少及びＰＥＧｄＡの分子量の増加に伴い増加した。ゼラチン濃度が増加すると、ＩＰＮの柔軟性及び粘性も増加した。また、ＩＰＮの柔軟性は、ＰＥＧｄＡの分子量の増加に伴い増加傾向にある。
【０１９５】
ＩＰＮｓの機械的特性は、ＡＳＴＭ試験標準法により試験された。機械的試験に関するＩＰＮは、上述と同様に製造されたが、使用された鋳型は、ポリジメチルシロキサン製であり、ＩＰＮの最終寸法は、２８０ｍｍ厚であり、１１ｍｍゲージ長であり、かつ２ｍｍネック幅であった（この寸法は、ＡＳＴＭ  Ｄ３８−９８タイプＩＶに必要な試験片の寸法である）。ＩＰＮｓは、Ｉｎｓｔｒｏｎ  Ｍｏｄｅｌ  ５５４８試験機を用いて、ＡＳＴＭ  Ｄ６３８−９８による伸張試験を行った。
【０１９６】
予備的機械的試験が示すのは、４Ｇ６Ｐ２ＫなるＩＰＮのヤング係数は、１．２６±０．１４Ｎ／ｎｍ２であった。終極引張応力（Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ｔｅｎｓｉｌｅ  ｓｔｒｅｓｓ）及び引っ張り歪みは、それぞれ、０．３９±０．１０Ｎ／ｎｍ２及び０．４９±０．０７ｍｍ／ｍｍであった。
【０１９７】
（表９に示した）膨潤／分解試験が示すのは、ＰＥＧｄＡの分子量が４．６から８ｋＤａへと増加するにつれ、最大膨潤比（Ｒｍａｘ）が増加する。ＥＤＴＡＤ及びｍＰｍＡによりゼラチンを改変してもＲｍａｘは影響を受けない。ＰＥＧＡの分子量及びゼラチンの改変に伴い、経時的にＲｍａｘ（Ｔｍａｘ）が増加する。ゼラチンの重量％が６０から４０に減少し、かつＰＥＧｄＡの分子量が２ｋＤａにて一定に保たれている場合、分解における膨潤比（Ｒｆａｉｌ）は減少する。加えて、ＰＥＧｄＡの分子量が２ｋＤａであり、ゼラチンが６０重量％である場合、ゼラチンの改変によりＲｆａｉｌは向上しない。ＰＥＧｄＡの分子量の増加あるいはゼラチンの改変に伴い、Ｒｆａｉｌ（Ｔｆａｉｌ）へと至る時間は変化しない。表９は、ｐＨ７にて試験したＩＰＮｓの各組成に関するＲｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｒｆａｉｌ、及びＴｆａｉｌを示している。この傾向は、ｐＨ４．５及び７．４においても同様である（結果は示していない）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるこれらＩＰＮｓからのヒト血清アルブミン、クロルヘキシジングルコネート及びｂＦＧＦ（１％）の放出速度論及び生物学的活性は、現在定量化されている。
【０１９８】
表９：ｐＨ７．９における種々のＩＰＮ成分に関するＲｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｒｆａｉｌ、及びＴｆａｉｌ
【０１９９】
【表１１】
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初期的なｉｎ  ｖｉｖｏ試験において、４０重量％のゼラチン、６０重量％のＰＥＧｄＡ２ｋＤａ（４Ｇ６Ｐ２Ｋ）ＩＰＮを使用した。コントロールに相対して、滲出液中に項の℃でＰＭＮが存在することが示すのは、時間とともに減弱する移植の開始に起因する救急生炎症反応である。急性炎症は、滲出液中に高濃度で単球及びリンパ球が存在する慢性炎症へと続く。この試験が示すのは、空のケージにおけるコントロールと比較して移植後４、７及び１４日目のＩＰＮｓに反応する統計的により重度の炎症反応である。また、この試験は、４日後にサンプルの７０％あまりが損失したことを明らかにし、２１日後には、さらに１０％損失したことも明らかにした。
【０２００】
現在、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける試験を継続中である。この試験では、４０重量％のゼラチン、６０重量％の２ｋＤａのＰＥＧｄＡ、及び６０重量％の２ｋＤａのＰＥＧｄＡなる組成を有するＩＰＮからデキサメタゾンの薬物放出及び効果を検討している。
【０２０１】
この例が示すのは、本発明にしたがって製造されたＩＰＮｓは、組織の足場及び薬物送達媒介物として機能可能であることである。
【０２０２】
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【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】Ｍ−ＰＥＧ，ＣＮ−ＰＥＧ，ＣＯＯＨ−ＰＥＧ，又はＰＴ−ＰＥＧに関する化学反応、律速的な中間物、及び最終産物に関する概略であり、（１）は室温にて、ナトリウム／ナフタレン及びＴＨＦ中を用い；（２）では、室温にて、エチルブロモアセテート、ＴＥＡ，ＴＨＦを用い；（３）では、潅流下、水酸化ナトリウム溶液を用い；（４）では室温にて１０分間、ＡＣ，ＴＥＡ，ＴＨＦを用い反応させ；（５）では室温にてナトリウムエトキシド（又はナトリウム金属）、ＣＨ２Ｃｌ２を用い；（６）では室温にてアクリロニトリルを用い；（７）では室温にてＡＣ，ＴＥＡ，ＴＨＦを用い１０分間反応させ；（８）では潅流下、ＴＥＡ，チオニルブロマイド、トルエンを用い；（９）では室温にて、ｐ−トルエンスルフォニルクロライド、ＴＥＡ，ＣＨ２Ｃｌ２を用い；（１０）では室温にてＡＣ，ＴＥＡ，ＴＨＦを用い１０分間反応させ；（１１）では、潅流下、フタルイミドカリウム、ＣＨ２Ｃｌ２を用い；（１２）では、室温にて、ＡＣ，ＴＥＡ，ＴＨＦを用い１０分間反応させている。
【図２】図２Ａは、ＰＥＧジオール及び種々のＸＰＥＧｍＡに関する蒸発型光散乱検出信号のＨＰＬＣクロマトグラムを示している。サンプルは、逆相ＨＰＬＣ（ＧｉｌｓｏｎのシステムにてＪｏｒｄｉ５００Ａカラムを用い、３０分間、流速１ｍＬ／分にて、１０から１００％アセトニトリルのグラジエント）にて分析された。このＨＰＬＣシステムには、紫外／可視光（２００及び２５４ｎｍ）、フォトダイオードアレイ、及び蒸発型光散乱検出器が結合されている。図２Ｂは、ＰＥＧジオール及び種々のＸＰＥＧｍＡに関する２５４ｎｍでの紫外シグナルのＨＰＬＣクロマトグラムを示している。サンプルは、逆相ＨＰＬＣ（ＧｉｌｓｏｎのシステムにてＪｏｒｄｉ５００Ａカラムを用い、３０分間、流速１ｍＬ／分にて、１０から１００％アセトニトリルのグラジエント）にて分析された。このＨＰＬＣシステムには、紫外／可視光（２００及び２５４ｎｍ）、フォトダイオードアレイ、及び蒸発型光散乱検出器が結合されている。
【図３】種々の濃度、末端残基、及び分子量を有するＸＰＥＧｍＡを含有するＸＰＥＧｍＡ−Ａｃ−ＴＭＰＴＡ共重合体ネットワークに関する表面親水性を示しており、図３Ａでは、２ｋＤａのＸＰＥＧｍＡに関して、図３Ｂでは５ｋＤａのＸＰＥＧｍＡに関し示している。レジェンドは、◆＝Ｍ−ＰＥＧ、■＝ＣＮ−ＰＥＧ、▲＝ＣＯＯＨ−ＰＥＧ、及び●＝ＰＴ−ＰＥＧである。
【図４】本発明におけるハイドロゲルの概略図である。
【図５】代表的な膨潤／分解の関係を示した図である。時間は、Ｘ軸に時間として示し；膨潤比は、Ｙ軸に示している。Ｇ−０．０１％は、０．０１％のグルタルアルデヒドを用いて架橋したもの；１０％ＰＧは、０．０１％のグルタルアルデヒドを用いて架橋したもの；４０％ＥＧは、０．０１％のグルタルアルデヒドを用いて架橋したものである。
【図６】本発明における浸透ネットワークハイドロゲルの概略図である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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2004534111.tif 000111
2004534111.tif 000112
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004534111.tif 000113
【国際調査報告】
2004534111.tif 000114