(57)【要約】本発明は、半夏生から抽出した新規化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ（エピ−マナサンチンＡ，ｅｐｉ−ｍａｎａｓｓａｎｔｉｎ Ａ）、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃ（マナサンチンＡ，ｍａｎａｓｓａｎｔｉｎ Ａ）の抗癌剤としての用途とその製造方法およびこれを有効成分として含有する抗癌剤用薬学的組成物に関するものであって、具体的に、半夏生をメタノールで抽出し、これを再び多数の有機溶媒で分画して最も優れた抗癌活性を示す酢酸エチル分画を薄膜クロマトグラフィまたはカラムクロマトグラフィで分離し、高速液体クロマトグラフィで精製して得た新規化合物ＨＮＰ−９８７０１ＡおよびＨＮＰ−９８７０１Ｂ、既知の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｃとその誘導体、その製造方法およびこれらを有効成分として含有する抗癌剤用薬学的組成物に関する。本発明の抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃは、癌細胞株由来の細胞にのみ選択的に作用してアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）による細胞死滅を誘発するので、既存の抗癌剤よりも正常細胞に対する副作用は少ない上に抗癌活性が極めて優れた選択的な抗癌剤の開発に有用に使用されることができる。【選択図】図１
2004506608.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌活性を持つ下記一般式１の新規化合物エピ−マナサンチンＡ（ｅｐｉ−ｍａｎａｓｓａｎｔｉｎ Ａ）、その誘導体および薬学的に許容されるその塩。
【化１】
2004506608.tif 000033
式中、Ｒ１は、メチル基、アセチル基、アルキル基、アルケン基、アルキン基、アミン基、アミド基、シアノ基、チオシアノ基、アルデヒド基またはハロゲン原子から選択され、それぞれ同じでも異なってもいい。
【請求項２】
Ｒ１がＨ、ＣＨ３およびＣＯＣＨ３で構成された群から選択されることを特徴とする請求項１記載の化合物、その誘導体および薬学的に許容されるその塩。
【請求項３】
抗癌活性を持つ下記一般式２の新規化合物、その誘導体および薬学的に許容されるその塩。
【化２】
2004506608.tif 000034
式中、Ｒ１は、メチル基、アセチル基、アルキル基、アルケン基、アルキン基、アミン基、アミド基、シアノ基、チオシアノ基、アルデヒド基またはハロゲン原子から選択され、それぞれ同じでも異なってもいい。
【請求項４】
Ｒ１がＨ、ＣＨ３およびＣＯＣＨ３で構成された群から選択されることを特徴とする請求項３記載の化合物、その誘導体および薬学的に許容されるその塩。
【請求項５】
抗癌活性を持つ下記一般式３の化合物マナサンチンＡ（ｍａｎａｓｓａｎｔｉｎ Ａ）、その誘導体および薬学的に許容されるその塩。
【化３】
2004506608.tif 000035
式中、Ｒ１は、メチル基、アセチル基、アルキル基、アルケン基、アルキン基、アミン基、アミド基、シアノ基、チオシアノ基、アルデヒド基またはハロゲン原子から選択され、それぞれ同じでも異なってもいい。
【請求項６】
Ｒ１がＨ、ＣＨ３およびＣＯＣＨ３で構成された群から選択されることを特徴とする請求項５記載の化合物、その誘導体および薬学的に許容されるその塩。
【請求項７】
半夏生から分離された抗癌活性を持つ一般式１の化合物、一般式２の化合物、一般式３の化合物およびこれらの分解物。
【請求項８】
１）半夏生を低級アルコールに浸漬させて繰り返し抽出する段階；
２）前記低級アルコール抽出物に各種有機溶媒を加えて抽出する段階；
３）前記各種有機溶媒抽出分画をクロマトグラフィ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で分離して抗癌活性物質を得る段階；および
４）前記分離されたそれぞれの抗癌活性物質を溶媒沈殿法で精製する段階；から構成されることを特徴とする、半夏生由来の抗癌活性を持つ一般式１の化合物、一般式２の化合物、一般式３の化合物およびその誘導体の製造方法。
【請求項９】
段階１）の半夏生は生草、乾草、地上部、根、および茶に利用されて残った残渣を含むことを特徴とする請求項８記載の製造方法。
【請求項１０】
段階１）の低級アルコールはメタノールであり、段階２）の有機溶媒はへキサン、クロロホルム、酢酸エチルおよびブタノールよりなる群から選択されることを特徴とする請求項８記載の製造方法。
【請求項１１】
請求項８の製造方法において各段階別に製造される抗癌活性を持つ半夏生由来の抽出物。
【請求項１２】
半夏生から分離された抗癌活性を持つ一般式１の化合物、一般式２の化合物、一般式３の化合物、その誘導体および薬学的に許容されるその塩を有効成分として含有する抗癌剤用薬学的組成物。
【請求項１３】
一般式１の化合物、一般式２の化合物、一般式３の化合物を０．１ないし３．０ｍｇ／ｋｇ含有することを特徴とする請求項１２記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
癌は、肝癌、前立腺癌、乳房癌、乳腺癌、子宮頚上皮癌 、神経膠腫、神経芽腫、神経膠芽細胞腫、胃癌、咽喉上皮癌、繊維癌腫および悪性黒色腫由来の細胞、好ましくは肝癌、前立腺癌、乳腺癌、神経膠芽細胞腫および悪性黒色腫であることを特徴とする請求項１２記載の抗癌剤用薬学的組成物。
【請求項１５】
抗癌活性を持つ一般式１の化合物、一般式２の化合物、一般式３の化合物およびその誘導体を有効成分として含有する機能性食品および食品添加剤または機能性飲料および飲料添加剤。
【請求項１６】
抗癌活性を持つ一般式１の化合物、一般式２の化合物、一般式３の化合物およびその誘導体を有効成分として含有する皮膚美容製品添加剤。
【請求項１７】
皮膚美容製品添加剤は、化粧品添加剤、石けん添加剤またはシャンプ添加剤であることを特徴とする請求項１６記載の皮膚美容製品添加剤。
【請求項１８】
一般式１の化合物、一般式２の化合物、一般式３の化合物より選択された二つ以上の化合物を含む抗癌剤用組成物。
【請求項１９】
半夏生抽出物を含有する抗癌剤用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、半夏生から抽出した新規化合物のＨＮＰ−９８７０１Ａ（エピ−マナサンチンＡ、ｅｐｉ−ｍａｎａｓｓａｎｔｉｎ Ａ）、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃ（マナサンチンＡ、ｍａｎａｓｓａｎｔｉｎ Ａ）、またはこれらの混合物（ＨＮＰ−９８７０１）の抗癌剤としての用途とその製造方法およびこれらを有効成分として含有する抗癌剤用薬学的組成物に関し、具体的には、半夏生をメタノールで抽出し、これを再び各種の有機溶媒で分画して最も優れた抗癌活性を示した酢酸エチル分画を薄膜クロマトグラフィ（ｔｈｉｎ−ｌａｙｅｒ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）またはカラムクロマトグラフィ（ｃｏｌｕｍｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で分離し、高速液体クロマトグラフィ（ｈｉｇｈ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で精製して得た新規化合物のＨＮＰ−９８７０１ＡおよびＨＮＰ−９８７０１Ｂ、既知の化合物のＨＮＰ−９８７０１Ｃ、またはこれらの混合物およびその誘導体、その製造方法およびこれらを有効成分として含有する抗癌剤用薬学的組成物に関する。
【０００２】
［背景技術］
東南アジア人のおよそ１０％が肝炎保菌者であるが、この肝炎は肝硬化および肝癌の直接的な発病原因として知られてきている。肝癌患者の９５％以上が肝炎によって発病したという統計報告があるし、特に、韓国人の肝癌発生率と肝癌による死亡率は世界１位である。１９９１年度の統計資料によれば、韓国人の肝癌発生率は人口１０万人あたり２４．１人であったし、１９９６年度の韓国保健福祉部資料によれば、肝癌の発生頻度は２２．４％と胃癌の４０．７％に続いて癌発生頻度において２位を占めている。また、１９９５年度の統計資料によれば、韓国人の肝癌死亡率は１０万人あたりおよそ２２．０人であって、癌死亡率において１０万人あたり２６．５人に登る胃癌死亡率に続いて２位を占めており、肝癌死亡率では世界１位である。
このように高い肝癌発生率と肝癌死亡率が社会的な問題として台頭しながら肝炎ワクチン、肝炎治療剤および肝癌治療剤などの研究開発と商品化が活発に進んできているが、現在まで開発された種々の治療法では諸問題が生じている。例えば、現在市中で使用されている肝炎ワクチンは、抗原性（ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）が低いためワクチンとして有効でなく、肝炎治療剤は、その殆どが肝機能改善に焦点をおいて開発されたため肝炎ウイルスに対する直接的な効能が疑問視されている実情である。最近では肝炎ウイルスの増殖を阻害する作用機作を持つ肝炎治療剤が開発されたが、全ての肝炎患者に適用できないなどの問題点を抱えている。したがって、大多数の肝炎患者らは肝癌に進展するような危険に晒されているのである。
現在使用されている肝癌治療剤は、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ、５−ＦＵ）、シタラビン（ｓｙｔａｒａｂｉｎｅ）およびアルキルオキサン（ａｌｋｙｌｏｘａｎｅ）などがあるが、これらは癌細胞を死滅する機能よりは癌細胞の成長を阻害する機能に焦点をおいたものであって、肝癌の根元的な治療方法にはならない。また、肝癌の画期的な治療方法とされている”ホリウム−キトサン複合体治療剤”（ＤＷ−１６６ＨＣ）は、未だ臨床的にその安定性および効果が立証されていないため、今後多い患者を対象とした長期間の臨床試験を行わなければならなく、癌組織が２ヶ所以上の多数の臓器に広がっているか他の臓器に転移された場合、腹水または黄疸の症状がある場合、癌組織につながった血管が多数本である場合には、前記の治療方法が適用できないという問題点がある。しかも、前記治療法は病院で医者の施術のみによって治療が受けられるという制限性をもっている。
このように肝癌治療剤の開発というのは、肝が体内の全ての物質の代謝に関与するという特性を考慮するとき極めて難しいことであるが、正常細胞には最小限の毒性を示しながら肝癌細胞には最大限の毒性を示す選択的な活性物質を開発できるなら、画期的な肝癌治療剤として極めて有用に使用されると見られる。
一方、前立腺癌は、西欧では女性の乳房癌と略同一の割合で発病する男性疾患であって、現在米国で最も頻繁に診断される男性疾患の一つである。毎年およそ３０万人の患者が前立腺癌の宣告を受け、前立腺癌によって死亡する患者数も毎年４１，４００人に上っていて、米国では癌による死亡原因中、肺癌に続いて２位を占めている。
最近、韓国でも６０歳以上の老齢人口１０万人あたり４０人の割合で前立腺癌が発病しているが、特に、前立腺癌患者の大多数が初期には前立腺肥大症の病歴を持っていたと報告され、６０歳以上の老人男子の６０％以上を占める前立腺肥大症患者の、前立腺癌の発病に対する警覚心を高めている。しかし、前立腺癌治療における最大の問題点は、前立腺癌を治療する途中で性機能が麻痺される副作用が起こるため、殆どの男性たちが前立腺癌に対する挙論をはばかるという点であり、それだけにこれまでの前立腺癌に対する研究は相対的に無視されてきた。１０年前までも前立腺癌を治療する方法は性機能と排尿抑制能力喪失などの副作用を誘発する手術法の以外には代案的な治療法がなかったものの、近来、前記問題点を克服するための不断な努力と研究結果、既存の治療法を新しい方式で応用する画期的な前立腺癌治療法が開発されるに至った。例えば、セルジェネシス（Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｓｙｓ）社の免疫システムを刺激する方法、アイシス製薬会社（Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｉｎｃ．）およびノバルティス社（Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＡＧ）のアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）技術、イントロジェン・セラピューティクス社（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）のａｄｅｎｏｖｉｒａｌ−ｐ５３遺伝子療法、テラジェニク社（Ｔｈｅｒａｇｅｎｉｃｓ）の放射能治療法、ユロメド社（ＵｒｏＭｅｄ Ｃｏｒｐ．）のカバーマップサージカルエイド（ＣａｖｅｒＭａｐ Ｓｕｒｇｉｃａｌ Ａｉｄ）およびメルク社（Ｍｅｒｃｋ Ｃｏ．）の前立腺肥大症治療剤のプロスカー（Ｐｒｏｓｃａｒ）などに関する研究が全世界的に盛んに行われているが、その研究成果は未だ初期段階に止まっている。
このように前立腺癌は男性の生殖器に発生する癌であって、最も頻繁に発病する男性疾患でありながらも治療時に起こる性機能障害という副作用のため、多くの患者がその事実を隠しているだけでなく、その全快もまた容易でない疾病である。したがって、前立腺癌治療剤における莫大な市場需要を考慮すると、正常細胞には最小限の毒性を示しながら前立腺癌細胞には最大限の毒性を示す選択的な天然物由来の活性物質を開発できるなら、これは前立腺癌治療剤として有用に使用され、ひいては全人類の健康増進にも貢献できると見込まれる。
一方、半夏生は、胡椒目（Ｐｉｐｅｒａｌｅｓ）ドクダミ科（Ｓａｕｒｕｒａｃｅａｅ）に属する植物であって、ドクダミ科植物は５属７種から構成されており、主として北米とアジアに分布している。全世界的に分布しているドクダミ属は半夏生（Ｓａｕｒｕｒｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｂａｉｌｌ）とアメリカ半夏生（Ｓａｕｒｕｒｕｓ ｃｅｒｎｕｕｓ）があり、韓国で自生するドクダミ科植物は半夏生と魚腥草（Ｈｏｕｔｔｕｙｎｉａ ｃｏｒｄａｔａ Ｔｈｕｎｂ）の２種が報告されている。これらはいずれも湿地で育つ多年草植物であって、一般薬剤市場では魚腥草が半夏生として流通されているなど混同して販売されているが、これらは厳然たる異種植物である。韓国において半夏生は、主として濟州道に自生しており、現在滅種危機の植物と指定されて復元事業が進行中であり、また、慶尚南道の居昌で大単位に栽培され、忠清南道の農村振興院で栽培試験が実施されるなど半夏生の栽培のための多くの研究が行われている。
半夏生は、多年草であって、根茎は白く、横に延びるし、髭根を持っている。高さはおよそ３０ないし９０ｃｍであり、茎は直立し、毛がなく、下部は斜めに横たわっている。葉は互生し卵形か卵状披針形であって先が尖っており、葉柄がある。また、葉は、５ないし１４ｃｍの長さと４ないし６ｃｍ程度の幅を有し、５本の脈があり、初夏に茎上部の２ないし３枚の葉が白く変る特徴がある。花は陽性で白色であり、長さは１０ないし１５ｃｍであり、開花期は６ないし８月であり、雄蕊は６ないし７個、雌蕊は１個、子房は３ないし５個の心皮をもっている。半夏生は開花期に茎上部に存在する３枚の葉が白色に変ることから三白草と呼ばれたり、根、葉および花などの３ヶ所が白いことからも三白草と呼ばれる。
このような特徴を有する半夏生は、古くから中国で民間薬として使われてきた薬草である。中薬大辞典には半夏生が清利湿熱、消腫および解毒作用があって水腫、脚気、黄疸、淋濁、帯下、癰腫および賽毒に効果があるとされている。清利湿熱および黄疸に効果があるということは肝臓疾患に効果があると意味である。
唐本草には半夏生が水腫、脚気、大小便の円滑な排泄、消痰破癖および除積聚の機能があるとされているが、破癖と除積聚に効果があるということは、肝硬化と癌に効果があるというのを意味すると考えられる。また、小便の円滑な排泄に効果があるというのは前立腺肥大症と癌に効果があるというのを意味する。
中国薬学大辞典でも半夏生は、水腫、脚気、大小便の円滑な排泄、消痰破癖および除積聚の機能があるとされており、中国医学大辞典では半夏生が消痰、破癖、除積聚、利大小便、治虐疾、治胸膈痰熱、治水腫、治脚気および療賽腫の機能があるとされている。
その他、本草拾遺、植物名実図考、嶺南采薬録、広西中薬志、本草推陳および湖南薬物志などでも半夏生の効用を記録しており、抗癌中薬一千方には半夏生が肝癌に効果があるとされている。
半夏生は韓国でも古くから民間薬として使われてきたが、原色天然薬物大辞典には半夏生が小便不利、水腫、淋濁、脚気、肝炎、黄疸および癰腫などに効果があることから、肝臓疾患、排尿機能および癌に有効であるとされている。
米国におけるアメリカ半夏生（Ｓａｕｒｕｒｕｓ ｃｅｒｎｕｕｓ）に対する研究では、ショーバル等が前記植物にセスキテルペン（ｓｅｓｑｕｉｔｅｒｐｅｎｅ）系化合物が多数入っていると報告したし（Ｃｈａｕｂａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １４：５９５−５９６，１９７５）、ラオ等はＳＣ−８とＳＣ−９といった新しいネオリグナン（ｎｅｏｌｉｇｎａｎ）系活性物質を分離し、これらに神経弛緩作用（ｎｅｕｒｏｌｅｐｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）があるということを報告した（Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ４５（６） ： ２３８４Ｂ， １９８１）。その後にもラオ等は持続的な研究を重なって半夏生からマナサンチンＡ、マナサンチンＢ（ｍａｎａｓｓａｎｔｉｎ Ａ、Ｂ）およびソーサーネオール（ｓａｕｃｅｒｎｅｏｌ）という物質を分離してそれぞれの構造を突き止めたが、この中でもマナサンチンＡに強力な神経弛緩効果があることを見つけた（Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２４（４５）：４９４７−４９５０， １９８３）。前記の結果を基に、ラオ等はマナサンチンＡの神経系内中枢抑制効果に対して研究するためにマナサンチンＡのマウス毒性実験を行った結果、マナサンチンＡをマウスの腹腔内に投与するときＩＣ５０は０．２１±０．０２ｍｇ／ｋｇであって自発運動が減少され、アンフェタミン誘発常同症（ｓｔｅｒｅｏｔｙｐｙ）が阻止されることを観察した。これに対し、マナサンチンＡをＬＤ５０に到達する量で投与する場合にもハロペリドール（ｈａｌｏｐｅｒｉｄｏｌ）における強直症や眼瞼下垂症が観察されなかったことから、マナサンチンＡが選択的に神経弛緩効果を示すということを報告した（Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １９（９） ： ６２９−６３９， １９８７）。また、ラオ等はアメリカ半夏生からラクタム（ｌａｃｔａｍ）系化合物のアリストラクタムＢＩＩ（ａｒｉｓｔｏｌａｃｔａｍ ＢＩＩ　；　ｃｅｐｈａｒａｎｏｎｅ）とソリストラクタム（ｓａｕｒｉｓｔｏｌａｃｔａｍ）を新規に分離した（Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎａｔ． Ｐｒｏｄ．， ５３（２）： ３０９−３１２， １９９０）。
中国における半夏生（Ｓａｕｒｕｒｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）に対する研究では、Ｘｕ等が全体フラボノイド（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ）とハイペリン（ｈｙｐｅｒｉｎ）のクーロン滴定（ｃｏｕｌｏｍｅｔｒｉｃ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）による半夏生の分析方法を報告したし（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ， ２１（４） ： ３０６−３０９， １９８６；薬物分析雑誌， ８（４） ： ２２３−２２５， １９８８）、ウァン等は半夏生から抽出したクロロホルム分画層に強力な抗高血圧活性があることを見出したし、半夏生からリグナン（ｌｉｇｎａｎ）系のソーチノン（ｓａｕｃｈｉｎｏｎｅ）、アントラキノン（ａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅ）系のフィシオン（ｐｈｙｓｃｉｏｎ）、エモジン（ｅｍｏｄｉｎ）、フィシオン配糖体（ｐｈｙｓｉｏｎ−８−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）およびアルカロイド（ａｌｋａｌｏｉｄ）系のセファラノンＢ（ｃｅｐｈａｒａｎｏｎｅ Ｂ）などを分離した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｅｓ， ４３（５） ： ９６９−９７５， １９９６）。
日本では半夏生に対する研究は皆無と言えるものの、魚腥草に対する研究は活発に行われている。
以上から調べたように、米国、中国、日本などを始めとした世界各国の半夏生研究では半夏生が抗癌活性を示すという何ら研究結果も報告されたことがなく、半夏生から有用な抗癌成分を分離したという結果もなかった。
韓国ではクァクが半夏草の水生エキス、メタノールエキス、ブタノール分画 抽出物およびクエルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）に対する薬理作用および抗菌作用に対して実験した結果、鎮痛、解熱および消炎効果があると報告した（キョンヒ大学校博士学位論文、１９８８）。特に、クァクはアセチルコリン、バリウムおよびヒスタミンによって収縮されたマウスおよびギニーピッグ摘出反転腸管に対して前記の半夏生抽出物が弛緩効果を示したと報告したが、この結果は、ラオ等の研究結果と符合すると見られる。その他にもクァクは、前記分画のうち一部分画で抗ヒスタミン作用、血圧降下作用および抗菌作用が表れると報告した。チェは半夏生から揮発性成分、脂肪酸、アミノ酸およびフラボノイドを抽出分離し、半夏生の水抽出物が抗菌活性を示すことを報告した（キョンヒ大学校博士学位論文、１９８９）。これは、半夏生地上部の成分に関する研究において、テルペン系（ｔｅｒｐｅｎｏｉｄｓ）と推定される成分を分離したが、この成分は生理活性機能を示さないと報告した（ソウル大学校修士学位論文、１９８８）。クォンは半夏生から肝細胞保護活性を持つ物質を分離してその構造を突き止めたし、この物質がフラボノイド系のクエルセチン配糖体であると報告した（ソウル大学校修士学位論文、１９９４）。
その他、チェおよびジョンによって半夏生のフラボノイド成分に関する研究（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ４（３） ： ２８５−２８８， １９９１ ； Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ７（１） ： １１−１５， １９９４ ； Ｊ． ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｅｊｕ Ｎａｔ． Ｕｎｉｖ． ８（１） ： １３７−１４２， １９９５）、精油成分に関する研究（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２（２） ： ２５９−２６２ ， １９８８ ； キョンヒ大学校論文集１８ ： ３４１−３４７， １９８９ ； Ｃｈｅｊｕ Ｎａｔ． Ｕｎｉｖ． Ｊｏｕｒｎａｌ ３３ ： １０５−１１１， １９９１）および脂肪酸とアミノ酸成分に関する研究（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ２（２） ： ２８５−２９２， １９８９ ； Ｃｈｅｊｕ Ｕｎｉｖ． Ｊｏｕｒ． （Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉ．）， ３５ ： １１１−１１８， １９９２）などが報告された。
前記のように韓国における半夏生に対する研究は、半夏生の成分を分析する基礎研究分野で活発に進行されているが、韓国だけでなく前述のように全世界的に半夏生から分離されたおよそ５０種の成分のうち抗癌成分として報告されたか、抗癌活性を持っていると報告された成分は未だなかった。
また、半夏生に関連した特許も多くない。韓国以外の国では１件の特許（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ４，６１９，９４３）が米国で出願されたが、これはアメリカ半夏生由来のネオリグナン（Ｎｅｏｌｉｇｎａｎ）系物質であるマナサンチンＡ（ｍａｎａｓｓａｎｔｉｎ Ａ）の神経弛緩および殺虫・殺線虫効果に関するものであって、抗癌効果に対する作用は記載されていない。韓国でも１件の特許（韓国特許公開９６−３１４４０）が出願された状態であり、これは、半夏生成分が一つのソリストラクタム系の化学的な誘導体を組成物とする抗癌剤に関するものであるが、本発明者が半夏生からソリストラクタムを分離し結晶化した後、抗癌活性を調査してみた結果、抗癌活性は検出されなかった。
前述の如く、半夏生は東・西洋ともにおいて肝臓および泌尿器系の除積聚および癌種治療などの新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）治療に伝統的に使われてきたが、半夏生の抗癌成分に対する具体的な研究は報告されたことがない。今まで全世界的に半夏生から分離されたおよそ５０種の成分のうち抗癌活性物質として知られた成分はなく、ただフラボノイド系のクエルセチン配糖体が抗癌活性と連関されていると推測している実情にある。
そこで、本発明者らは、これといった肝癌および前立腺癌治療剤がない現実を勘案し、肝癌および前立腺癌治療剤として有用に使用しうる薬学的組成物を提供するために研究を重ねた結果、臨床的に抗肝癌および抗前立腺癌に効き目のある半夏生を用いて正常細胞には影響を与えずに肝癌細胞および前立腺癌細胞にのみ選択的に作用する新規抗癌活性物質を分離するに至った。また、本発明者らは、半夏生から分離した抗癌活性を持つ新規先導物質が肝癌細胞および前立腺癌細胞に対して選択的に作用するということを突き止め、これを有効成分として含有させて肝癌および前立腺癌などの癌治療に極めて有用に使用しうる薬学的組成物を提供することによって本発明を完成するに至った。
【０００３】
［発明の開示］
本発明の目的は、半夏生由来の抗癌活性を持つ新規化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ（エピ−マナサンチンＡ）、ＨＮＰ−９８７０１Ｂと既知の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｃ（マナサンチンＡ）、またはこれらの混合物（ＨＮＰ−９８７０１）およびこの誘導体を提供することにある。
また、本発明の他の目的は、前記抗癌活性を持つ新規化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１Ｂおよび既知の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｃを半夏生から抽出する製造方法を提供することにある。
また、本発明のさらに他の目的は、前記抗癌活性を持つ新規化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１Ｂおよび既知の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｃ、またはこれらの混合物（ＨＮＰ−９８７０１）を有効成分として含有する薬学的組成物を提供することにある。
前記目的を達成するために、本発明者らは、下記一般式１、一般式２および一般式３で表される抗癌活性を持つ半夏生由来の新規化合物質、その誘導体およびそれらの薬学的に許容される塩を提供する。
【０００４】
【化１】
2004506608.tif 000003
【０００５】
式中、Ｒ１は、メチル基、アセチル基、アルキル基、アルケン基、アルキン基、アミン基、アミド基、シアノ基、チオシアノ基、アルデヒド基またはハロゲン原子から選択され、それぞれ同じでも異なってもいい。
前記一般式１において、Ｒ１がＨである抗癌活性を持つ新規化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａは下記一般式４で表され、マナサンチンＡのエピマー（ｅｐｉｍｅｒ）として存在する。
【０００６】
【化４】
2004506608.tif 000004
【０００７】
また、前記一般式１において、Ｒ１に−ＣＯＣＨ３または−ＣＨ３が置換されたアセチル誘導体またはメチル誘導体も抗癌活性を示す。
【０００８】
【化２】
2004506608.tif 000005
【０００９】
式中、Ｒ１は、メチル基、アセチル基、アルキル基、アルケン基、アルキン基、アミン基、アミド基、シアノ基、チオシアノ基、アルデヒド基またはハロゲン原子から選択され、それぞれ同じでも異なってもいい。
前記一般式２において、Ｒ１がＨである抗癌活性を持つ新規化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｂは下記一般式５で表され、マナサンチンＡとエピ−マナサンチンＡとの混合型の構造を持つ。
【００１０】
【化５】
2004506608.tif 000006
【００１１】
また、前記一般式２において、Ｒ１に−ＣＯＣＨ３または−ＣＨ３が置換されたアセチル誘導体またはメチル誘導体も抗癌活性を示す。
【００１２】
【化３】
2004506608.tif 000007
【００１３】
式中、Ｒ１は、メチル基、アセチル基、アルキル基、アルケン基、アルキン基、アミン基、アミド基、シアノ基、チオシアノ基、アルデヒド基またはハロゲン原子から選択され、それぞれ同じでも異なってもいい。
前記一般式３において、Ｒ１がＨである抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｃは下記一般式６で表されるマナサンチンＡであって、そのエピマーもまた抗癌活性を示す。
【００１４】
【化６】
2004506608.tif 000008
【００１５】
また、 前記一般式３において、Ｒ１に−ＣＯＣＨ３または−ＣＨ３が置換されたアセチル誘導体またはメチル誘導体も抗癌活性を示す。
また、前記一般式１、２、３の混合物も抗癌活性を示す。
本発明の一般式 １、２および３の化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態に使用することができ、塩としては薬学的に許容可能な遊離酸（ｆｒｅｅ ａｃｉｄ）によって形成された酸付加塩が有用である。一般式１、２および３の化合物は当該技術分野で通常の方法によって薬剤学的に形容される酸付加塩を形成することができる。遊離酸としては有機酸と無機酸を使用することができ、無機酸としては塩酸、臭酸、硫酸、リン酸などを使用することができ、有機酸としてはクエン酸（ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ）、酢酸、乳酸、スズ酸（ｔａｒｔａｒｉｃ ａｃｉｄ）、マレイン酸、フマル酸（ｆｕｍａｒｉｃ ａｃｉｄ）、ホルム酸、プロピオン酸（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、シュウ酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸、グルコン酸、メタンスルホン酸、グリコール酸、コハク酸、４−トルエンスルホン酸、ガラックトロン酸、エムボン酸、グルタミン酸またはアスパルト酸などを使用することができる。
本発明の抗癌活性を持つ新規化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ（エピ−マナサンチンＡ）、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃ（マナサンチンＡ）、またはこれらの混合物（ＨＮＰ−９８７０１）は、半夏生をメタノールで抽出した後、多種の有機溶媒で分画して得た有機溶媒抽出分画のうち最も優れた抗癌活性を示す酢酸エチル抽出分画を薄膜クロマトグラフィまたはカラムクロマトグラフィで分離して高速液体クロマトグラフィ法で精製して製造された。前記一般式４および６に表されているように、本発明の半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａは、ＨＮＰ−９８７０１Ｃにおいて水酸基（−ＯＨ）の位置が変ったマナサンチンＡの異性体（ｉｓｏｍｅｒ）であるエピマー（ｅｐｉｍｅｒ）であって半夏生からは始めて分離されたし、ＨＮＰ−９８７０１ＡおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃはそれぞれエリスロ（ｅｒｙｔｈｒｏ）型のエピ−マナサンチンＡ（ｅｐｉ−ｍａｎａｓｓａｎｔｉｎ Ａ）構造およびスレオ（ｔｈｒｅｏ）型のマナサンチンＡ（ｍａｎａｓｓａｎｔｉｎ Ａ）構造を持っている。
また、本発明のＨＮＰ−９８７０１Ｂは、ＨＮＰ−９８７０１ＡおよびＨＮＰ−９８７０１ＣのＮＭＲデータを共有しているので、前記一般式５に示すように、マナサンチンＡの一方の水酸基はスレオ（ｔｈｒｅｏ）型であり、もう一方の水酸基はエリスロ（ｅｒｙｔｈｒｏ）型である対称構造を持っている。
本発明の抗癌活性を持つ半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃの物理・化学的特性を性状、溶解度、紫外線分光分析法、赤外線分光分析法、質量分析法および核磁気共鳴分光分析などで分析した結果は下記のようとなる。
（１） 性状
本発明の抗癌活性を持つ半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃはいずれも白色を帯び、無臭の特性を表す。
（２） 溶解度
本発明の抗癌活性を持つ半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃはメタノール、エタノール、酢酸エチル、クロロホルムおよびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などには極めてよく溶解されるに対し、水、アセトン、エーテルおよびへキサンなどには溶解されない。
（３） 紫外線分光分析法
本発明の抗癌活性を持つ半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃの紫外線吸収スペクトルを調査した結果、前記物質のいずれも２３０ｎｍおよび２８０ｎｍにおいて吸収帯を表す。
（４） 赤外線分光分析法
本発明の抗癌活性を持つ半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃの赤外線吸収スペクトルはいずれも同一である。具体的に、これらの物質の吸収帯は波数３，４４２ｃｍ−１、２，９６２ｃｍ−１、２，９２７ｃｍ−１、１，６５２ｃｍ−１、１，６０７ｃｍ−１、１，５１１ｃｍ−１、１，４１８ｃｍ−１、１，２６４ｃｍ−１、１，１３８ｃｍ−１、１，０２９ｃｍ−１、８５５ｃｍ−１、８１０ｃｍ−１および７５０ｃｍ−１で表れる。３，４４２ｃｍ−１の吸収帯は水素結合のある水酸化基（ＯＨ）によるものであり、２，９６２ｃｍ−１および２，９２７ｃｍ−１の吸収帯は−ＣＨ基によるものである。１，６５２ｃｍ−１、１，６０７ｃｍ−１および１，４１８ｃｍ−１の吸収帯は芳香族環の炭素二重結合（Ｃ＝Ｃ）によるものであり、１，５１１ｃｍ−１の吸収帯は芳香族環の１、２および４番炭素位置に水素（Ｈ）以外のものが置換されて表れたものであり、１，１３８ ｃｍ−１および１，０２９ｃｍ−１の吸収帯はＣ−Ｏ基によるものである。また、８５５ｃｍ−１、８１０ｃｍ−１、および７５０ｃｍ−１の吸収帯は芳香族環の＝ＣＨ基の面外（ｏｕｔ−ｏｆ−ｐｌａｎｅ）曲げ振動によるものである。
（５） 質量分析法
本発明の抗癌活性を持つ半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃの分子量は、ＦＡＢ＋質量分析法によっては分子量が７５４と表れ、核磁気共鳴分光分析結果と一致しなかったが、ＥＩ＋質量分析法によっては分子量が７３２と表れ、一致した。
（６） 核磁気共鳴分光分析
本発明の抗癌活性を持つ半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１ＡおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃを核磁気共鳴分光分析法で調査し、Ｈ−ＮＭＲおよびＣ−ＮＭＲ結果を下記表１に表したし、ＨＮＰ−９８７０１ＢはＨＮＰ−９８７０１ＡおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃの結果を共有する。
【００１６】
【表１】
2004506608.tif 000009
【００１７】
本発明は、抗癌活性を持つ半夏生由来の新規化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１Ｂおよび既知の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｃの分離によるそれぞれの抽出物および分離物質を提供する。
前記目的を達成するために、本発明は、半夏生を低級アルコールで抽出して得た半夏生抽出物、半夏生をメタノールで抽出した後ヘキサノクロロホルム、酢酸エチルおよびブタノールなどの有機溶媒で再び抽出して得た半夏生有機溶媒抽出分画および半夏生から分離した有機溶媒抽出分画をシリカゲルの充填されたカラムクロマトグラフィ（Ｃｏｌｕｍｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で分離して得た分離物質が抗癌活性を示すことを確認した。
また、本発明は、抗癌活性を持つ半夏生由来の新規化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１Ｂおよび既知の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｃの酸およびアルカリによる分解物を提供し、前記化合物の各種分解物もやはり抗癌活性を示す。
なお、本発明は、半夏生由来の新規化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１Ｂおよび既知の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｃを抽出する製造方法を提供する。
前記製造方法は、
１） 半夏生を低級アルコールに浸漬して繰り返し抽出する段階；
２） 前記低級アルコール抽出物に各種有機溶媒を加えて抽出する段階；
３） 前記各種有機溶媒抽出分画をクロマトグラフィ（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で分離して抗癌活性物質を得る段階；および
４） 前記分離されたそれぞれの抗癌活性物質を精製する段階；から構成される。
最後に、本発明は、前記製造方法によって半夏生から分離された抗癌活性を持つ新規化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１Ｂおよび既知の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｃ、またはこれらの混合物（ＨＮＰ−９８７０１）を有効成分として含有する薬学的組成物を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
まず、半夏生から抗癌活性を持つ半夏生抽出物を分離する。
このために、本発明者らは、半夏生を低級アルコールに浸漬して繰り返し抽出することによって抗癌活性を示す半夏生のアルコール分画を得た。このとき、使用される半夏生は天然または人工栽培のいずれのものであってもよく、生草、乾草、地上部、根、および茶に利用されて残った残渣などを使用し、アルコールにはメタノールを使用するのが好ましい。
このように半夏生をメタノールを利用して抽出した後、再び有機溶媒を用いて抽出した抗癌活性を持つ半夏生抽出物を分離する。
具体的に、本発明者らは、半夏生の全草をメタノールで抽出して濃縮した後、各種の有機溶媒を使って分画することによって抗癌効果に優れた半夏生の各種の溶媒抽出分画を製造した。
このとき、有機溶媒を利用した抽出は比極性溶媒から極性溶媒の順に施し、有機溶媒は低級アルコールを含め酢酸エチル、へキサン、クロロホルムまたはブタノールなどが使用され得る。好ましい実施例として、本発明は、ノルマル−へキサン、クロロホルム、酢酸エチルおよびブタノールなどを順次に使用してそれぞれの溶媒抽出分画および水分画を製造したし、特に、酢酸エチルを使用して得た半夏生抽出物が最も優れた抗癌効果を示すことを確認した。前記のような溶媒を使用した溶媒抽出時、半夏生を抽出する温度は４ないし１００℃範囲が好ましく、室温または４ないし３０℃範囲がさらに好ましい。
前記の半夏生から分離した有機溶媒抽出分画をシリカゲルの充填されたカラムクロマトグラフィを利用して抗癌活性を持つ物質を分離するために、本発明者らは、前記の最も優れた抗癌活性を示した酢酸エチル抽出分画を濃縮した後、これをメタノールや酢酸エチルに溶解してシリカゲルの充填されたカラムクロマトグラフィに点滴し、ノルマル−へキサン、酢酸エチルおよびメタノールを様々な組成比率で混合した有機溶媒を使って溶出・濃縮した後、薄膜クロマトグラフィで分離して抗癌活性を示す分離物質を製造した。
薄膜クロマトグラフィ分析結果、抗癌活性を持つ分離物質の移動率（ｒｕｎ ｏｆ ｆｌｏｗ ： Ｒｆ）は０．０１ないし０．５の間に位置しており、この移動率付近の分画を集めて反復的に濃縮して抗癌活性を持つ物質を分離し、前記化合物をＨＮＰ−９８７０１と命名した。
その後、プレップ薄膜クロマトグラフィ（Ｐｒｅｐ−Ｔｈｉｎ Ｌａｙｅｒ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ： ｐｒｅｐＴＬＣ）を利用して前記化合物ＨＮＰ−９８７０１から３種の抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃを分離する。
このために、本発明者らは、半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１分画を濃縮した後、これをメタノールや酢酸エチルに溶解してシリカゲルを塗布したプレップ−薄膜クロマトグラフィに点滴した後、ノルマル−へキサン、酢酸エチルおよびメタノールを様々な組成比率で混合した有機溶媒を使って溶出した。プレップ−薄膜クロマトグラフィ分析結果、前記ＨＮＰ−９８７０１分画の移動率は０．２ないし０．９の間でそれぞれ３ヶ所に分けて位置しており、３ヶ所のバンドをそれぞれ別々に集めて反復的に濃縮して抗癌活性を持つ３種の物質を分離し、前記化合物のそれぞれをＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃと命名した。
このように分離した抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃをさらに精製するために、本発明者らは、ノルマル−へキサンと酢酸エチルに対する溶解度の相違を利用した溶媒沈殿法で黄色の色素を除去して白色の抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃを製造し、これら化合物の純粋度を高速液体クロマトグラフィ法（Ｈｉｇｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ： ＨＰＬＣ）を使って測定した結果、純度が極めて高い物質であることを確認した。
最後に、本発明は、半夏生由来の抗癌活性を持つ一般式１ないし３で表される化合物、またはこれらの混合物およびその誘導体を有効成分として含有する抗癌剤用薬学的組成物を提供する。
本発明の半夏生由来の一般式１ないし３で表される化合物およびその誘導体は、臨床投与時に筋肉または静脈注射剤のような形態の非経口投与だけでなく、経口にも投与することができ、一般的な医薬品製剤の形態で既存の抗腫瘍医薬品と併用して使用されることができる。
すなわち、本発明の一般式１ないし３で表される化合物およびその誘導体は、 実際臨床投与時に経口および非経口の様々な剤形で投与され得るが、製剤化する場合には通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦型剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は一つ以上の一般式１ないし３の抽出物に少なくとも一つ以上の賦型剤、例えば殿粉、カルシウムカーボネート（Ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦型剤以外にマグネシウムスティレートタルクのような潤滑剤等も使用される。経口のための液状製剤としては懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、普通使用される単純希釈剤のパラピン液以外に、様々な賦型剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもいい。非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、座剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁用剤としてはプロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用され得る。座剤の基剤としてはｗｉｔｅｐｓｏｌ、Ｍａｃｒｏｇｏｌ、ｔｗｅｅｎ６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどが使用され得る。
前記薬学的組成物の有効成分として含有される抗癌活性を持つ半夏生由来の一般式１ないし３で表される化合物、またはこれらの混合物およびその誘導体の有効量は、０．１ないし３．０ｍｇ／ｋｇが好ましく、０．３ないし１．０ｍｇ／ｋｇがさらに好ましく、１日１回投与される。
本発明の半夏生由来の抗癌活性を持つ一般式１ないし３で表される化合物は、正常細胞由来の細胞株には毒性を示さないに対し、肝癌および前立腺癌細胞由来の癌細胞株には選択的に作用して細胞死滅を誘導する特性をもっているため、これを有効成分として含有する抗癌剤用薬学的組成物は、肝癌、乳房癌、咽喉癌、黒色腫、肺癌、前立腺癌、直臓癌、胃癌、子宮頸部癌、食道癌、舌癌、口腔癌、膵臓癌、甲状腺癌、白血病および骨髄癌などの治療に使用されることができ、好ましくは肝癌、前立腺癌、乳房癌、咽喉癌、黒色腫および胃癌などの治療に有用に使用されることができ、さらに好ましくは肝癌および前立腺癌などに効果的な治療剤として使用されることができる。
それ以外にも、本発明の抗癌活性を持つ半夏生由来の一般式１ないし３で表される化合物およびその誘導体を有効成分として含有する薬学的組成物は、機能性食品または食品添加剤および機能性飲料または飲料添加剤、抗癌化粧品添加剤、抗癌石けん添加剤および抗癌シャンプ添加剤などに有用に使用されることができる。
【００１８】
［発明を実施するための最善の実施形態］
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。
但し、下記実施例は本発明を例示するためのものであって、本発明の内容が下記実施例に限定されるのではない。
【００１９】
＜実施例１＞ 半夏生からメタノール抽出物の製造
乾いた半夏生全草１００ｇを粉末にしてメタノール１ Ｌに浸漬した後、室温で３日間抽出した。前記抽出物をろ過した後、残渣は再びメタノールで繰り返し抽出したし、この過程を総３回繰り返し施した。このときに得たろ過後のろ液は２０ないし６０℃で濃縮してメタノール抽出物８ｇを製造した。
前記過程で製造したメタノール抽出物の抗癌活性は、これをジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、以下、 ”ＤＭＳＯ”と略す）に溶解した後、下記実験例１のＭＴＴ分析を行って確認した（表２）。
【００２０】
＜実施例２＞メタノール抽出物から各種の有機溶媒抽出分画の製造
＜２−１＞へキサン抽出分画の製造
前記実施例１で製造したメタノール抽出物５ｇを蒸留水１００ｍｌに懸濁して５００ｍｌの分画漏斗に入れ、ノルマル−へキサン１００ｍｌを入れて振とうした後、５時間静置させてノルマル−へキサンに移行される物質を集めたし、これを４回繰り返し施した。前記得たノルマル−へキサン層を集めてろ過した後、これを濃縮してへキサン抽出分画０．８ｇを製造した。
前記過程で製造したへキサン抽出分画の抗癌活性は、これをＤＭＳＯに溶解させた後、下記実験例１のＭＴＴ分析を行って確認した（表２）。
【００２１】
【表２】
2004506608.tif 000010
【００２２】
＜２−２＞酢酸エチル抽出分画の製造
前記実施例２−１でへキサン抽出分画を製造して残った水層１００ｍｌに酢酸エチル１００ｍｌを入れて振とうした後５時間静置させて酢酸エチルに移行される物質を集めたし、これを４回繰り返し施した。ここで得た酢酸エチル層を集めてろ過した後濃縮して酢酸エチル抽出分画１．７ｇを製造した。
前記過程で製造した酢酸エチル抽出分画の抗癌活性は、それをＤＭＳＯに溶解した後、下記実験例１のＭＴＴ分析を行って確認した（表２）。
【００２３】
＜２−３＞ブタノール抽出分画の製造
前記実施例２−２で酢酸エチル抽出分画を製造して残った水層１００ｍｌにブタノール１００ｍｌを入れて振とうした後５時間静置させてブタノールに移行される物質を集めたし、これを４回繰り返し施した。ここで得たブタノール層を集めてろ過した後濃縮してブタノール抽出分画３．６ｇを製造した。
前記過程で製造したブタノール抽出分画の抗癌活性は、それをＤＭＳＯに溶解させた後下記実験例１のＭＴＴ分析を行って確認した（表２）。
【００２４】
＜２−４＞水抽出分画の製造
前記実施例２−３でブタノール抽出分画を製造して残った水層１００ｍｌを集めてろ過した後濃縮して水抽出分画１．９ｇを製造した。
前記過程で製造した水抽出分画の抗癌活性は、それをＤＭＳＯに溶解した後、下記実験例１のＭＴＴ分析を行って確認した（表２）。
【００２５】
＜実施例３＞酢酸エチル抽出分画からカラムクロマトグラフィによる抗癌活性物質ＨＮＰ−９８７０１の分離
前記実施例２で製造した多数の有機溶媒抽出分画のうち最も優れた抗癌活性を表した酢酸エチル抽出分画１ｇを、酢酸エチル２ｍｌに溶解した後シリカゲル（Ｍｅｒｃｋ Ｃｏ．）の充填されたカラムの上端部に注入し、海砂で覆って有機溶媒を使って溶出した。溶出溶媒としてはノルマル−へキサン、２：１、１：１、２：３、１：２および１：４組成のノルマル−へキサン：酢酸エチルを使用して順次に溶出した後、再び酢酸エチル、２０：１および１０：１組成の酢酸エチル：メタノールを使用して順次に溶出した。溶出された各分画の抗癌活性は、下記実験例１のＭＴＴ分析によって確認したし、抗癌活性を持つ活性分画を２次、３次および４次カラムクロマトグラフィを繰り返し溶出した。溶出溶媒としてノルマル−へキサン：酢酸エチル＝１：２ないし１：４を使って抗癌活性を示す黄色の物質を分離したし、本発明者らは前記化合物をＨＮＰ−９８７０１と命名した。
前記実施例において各段階別に製造された分離分画の抗癌活性は、それをＤＭＳＯに溶解した後、下記実験例１のＭＴＴ分析を行って確認した（表３）。
【００２６】
【表３】
2004506608.tif 000011
【００２７】
＜実施例４＞薄膜クロマトグラフィを利用した化合物ＨＮＰ−９８７０１からの三つの抗癌活性物質ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃの分離
前記実施例３でカラムクロマトグラフィによって分離された抗癌活性を持つＨＮＰ−９８７０１ ７０ｍｇを酢酸エチル０．５ｍｌに溶解してプレップ−ＴＬＣ（Ｍｅｒｃｋ Ｃｏ．）１枚に点滴した後、展開溶媒を使って展開した。１：２組成のノルマル−へキサン：酢酸エチルを展開溶媒として使用して数回繰り返し展開した結果、化合物ＨＮＰ９８７０１の移動率は０．２ないし０．９の間でそれぞれ３ヶ所に分けて位置しているが、移動率の最も大きいバンドの化合物をＨＮＰ−９８７０１Ａ、移動率が中間であるバンドの化合物をＨＮＰ−９８７０１Ｂ、移動率の最も低いバンドの化合物をＨＮＰ−９８７０１Ｃと命名したし、３ヶ所のバンドをそれぞれ別々に集めて乾燥して抗癌活性を持つ微黄色の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃを分離した。
【００２８】
＜実施例５＞溶媒沈殿法を利用した抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃの精製
前記実施例４で分離した抗癌活性を持つ微黄色の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃ １０ｍｇずつを１ｍｌの酢酸エチルに溶解した後、ノルマル−へキサンを少しずつ添加して沈殿物が生成されることを確認した。前記混合液を冷蔵室に一夜放置した後ろ過し、白色の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃの沈殿物を得た。
【００２９】
＜実施例６＞抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃの純粋度測定
前記実施例５で溶媒沈殿法で精製された白色の抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃの純粋度を調査するために、高速液体クロマトグラフィ（Ｈｉｇｈ Ｐｒｅｓｓｕｒｅ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、以下”ＨＰＬＣ”と略す）を行った。
具体的に、それぞれの化合物１０ｍｇをメタノール１ｍｌに溶解して試料を用意した後、これらの試料をハイパーシル−ＢＤＳ Ｃ１８カラム（ｈｙｐｅｒｓｉｌ−ＢＤＳ Ｃ１８ ｃｏｌｕｍｎ、 Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ）に注入し、メタノールと蒸留水を移動相として使って分離した。５０分にかけて分あたり０．５ｍｌの速度で蒸留水：メタノールの比率が蒸留水１００％からメタノール１００％になるまで分あたり２％ずつ順次的に変化させながら吸収帯の様状を確認した結果、３０分帯で明らかに区分される大きい吸収帯が単一バンドで存在するのが確認されたことから、それらの化合物の純度が極めて高いことを確認した。
このように分離された純度の極めて高い３種の抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃの抗癌活性は、それをＤＭＳＯに溶解した後、下記実験例１のＭＴＴ分析を行って確認したし、前記３種の化合物が混合されたＨＮＰ−９８７０１をＤＭＳＯに溶解して下記実験例２の動物毒性実験に使用した（表４、５、６および７）。
【００３０】
【表４】
2004506608.tif 000012
【００３１】
【表５】
2004506608.tif 000013
【００３２】
【表６】
2004506608.tif 000014
【００３３】
【表７】
2004506608.tif 000015
【００３４】
＜実施例７＞抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｃの誘導体合成
＜７−１＞アセチル誘導体合成
前記実施例５で精製された抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｃのアセチル誘導体を合成するために、化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｃ １５．９ｍｇに無水酢酸（ａｃｅｔｉｃ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ、Ａｃ２Ｏ）とピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ）を入れて室温で８時間反応させて生成された反応物を酢酸エチルに溶解した後２：１組成の酢酸エチル：へキサンを展開溶媒としてプレップ−ＴＬＣで分離した結果、非反応物質（ＯＡｃ−ｓ）、１個の−ＯＨ基にのみ反応されたアセチル誘導体（ＯＡｃ−１）および２個の−ＯＨ基ともに反応されたアセチル誘導体（ＯＡｃ−２）をそれぞれ４．２ｍｇ、６．９ｍｇおよび３．０ｍｇずつ獲得した。前記のように製造されたそれぞれのアセチル誘導体の抗癌活性は、下記実験例１のＭＴＴ分析を行って確認した（表８）。
【００３５】
【表８】
2004506608.tif 000016
【００３６】
＜７−２＞メチル誘導体合成
前記実施例５で精製された抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｃのメチル誘導体を合成するために、化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｃ １７．７ｍｇにＮａＨとＣＨ３Ｉを入れて室温で８時間反応させて生成された反応物を酢酸エチルに溶解した後、２：１組成の酢酸エチル：へキサンを展開溶媒として分離した結果、非反応物質（ＯＭｅ−ｓ）、１個の−ＯＨ基にのみ反応されたメチル誘導体（ＯＭｅ−１）および２個の−ＯＨ基ともに反応されたメチル誘導体（ＯＭｅ−２）をそれぞれ８．５ｍｇ、７．０ｍｇおよび１．９ｍｇずつ獲得した。このように製造されたそれぞれのメチル誘導体の抗癌活性は、下記実施例１のＭＴＴ分析を行って確認した（表８）。
【００３７】
＜実験例１＞ＭＴＴ分析を利用した抗癌活性測定
前記実施例１ないし７で製造した各段階別抽出物および分離物質の抗癌活性を調査するためにＭＴＴ分析を行った。
具体的に、肝癌細胞株のＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞を３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で９６−ウェルマイクロプレート（Ｆａｌｃｏｎ、ＵＳＡ）にウェル（ｗｅｌｌ）あたり１００μｌずつ添加した。前記実施例で分離されてＤＭＳＯに溶解させた抽出物および分離物質等を１００μｌずつウェルに添加して最終濃度５０μｇ／ｍｌから０．０２４４μｇ／ｍｌまで１／２ずつ希釈した後、最終体積が２００μｌになるように合わせ、３７℃、５％ ＣＯ２培養器で４８時間培養した。培養し終わった後、ＭＴＴ（３−［４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙ１］−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ， Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）試薬を５ｍｇ／ｍｌ濃度に含めているリン酸塩緩衝溶液を各ウェルに２０μｌずつ添加し、４時間培養した。前記培養液の上層液を１００μｌ取って０．０４ Ｎ塩酸−イソプロパノール１００μｌを添加した後、一夜放置し、これを自動ＥＬＩＳＡリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．， ＵＳＡ）を用いて５６０ｎｍで吸光度を測定した。各段階別抽出物および分離物質の抗癌活性は、前記のように測定された吸光度値から下記数学式１によって換算された細胞生存率であって、下記の表に表した。
【００３８】
【数１】
2004506608.tif 000017
【００３９】
また、各段階別抽出物および分離物質の中で平均生存率が５０％となる試料の ＬＤ５０を求めて肝癌細胞株に対する抗癌活性を調査した結果、本発明で分離した抽出物および分離物質が既存に肝癌治療剤に使用されていたシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ ： ５−ＦＵ）およびアドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ；ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）よりも優れた抗癌活性効果を示すことが分かった（表２、表３、表４、表５、表６、表７および表８参照）。
【００４０】
＜実験例２＞動物実験を通じた化合物ＨＮＰ−９８７０１の抗癌活性測定
前記実験例１の表４および表５に表すように、本発明の半夏生由来の抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃは、肝癌細胞株および前立腺癌細胞株に対して極めて優れた細胞死滅効果を示した。したがって、これらＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１ＢおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃの混合物（ＨＮＰ−９８７０１）の抗癌活性を確認するために動物実験を行った。
具体的に、肝癌細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ−１）および前立腺癌細胞株（ＤＵ−１４５）をヌードマウス（ｂａｌｂ／ｃ ａｔｈｙｍｉｃ ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ）の背中に皮下移植して腫瘍サイズが１５０ないし２００ｍｍ３に達したとき本発明の抗癌活性を持つＨＮＰ−９８７０１を腹腔注射（ｉｐ）した。注射後２週から５週まで腫瘍の体積を下記数学式２によって測定し、腫瘍組織を切片にして染色した後、顕微鏡で観察した。
【００４１】
【数２】
2004506608.tif 000018
【００４２】
このとき、ａは腫瘍の長い方の直径を、ｂは腫瘍の短い方の直径を意味する。
その結果、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１非処理群の腫瘍サイズに対するＨＮＰ−９８７０１薬剤処理群の腫瘍サイズを相対的な比率で示すと、前立腺癌の場合、ＨＮＰ−９８７０１が１ｍｇ／ｋｇ投与された処理群は非処理群に比べて８９％、ＨＮＰ−９８７０１が３ｍｇ／ｋｇ投与された処理群は非処理群に比べて８５％の腫瘍増殖抑制効果を示した（図１）。また、腫瘍組織のＨＥ染色スライドを顕微鏡で観察した結果、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１処理群は非処理群に比べて腫瘍内部組織の壊死が多く見られた。
一方、肝癌の場合には、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１非処理群の腫瘍が２００ないし２５０ｍｍ３サイズからそれ以上増殖しなかったためＨＮＰ−９８７０１処理群の抗癌活性効能を比較できなかったが、腫瘍組織のＨＥ染色スライドを顕微鏡で観察した結果、非処理群とは異なり、ＨＮＰ−９８７０１処理群の腫瘍組織において非処理群に比べて腫瘍外部に白血球膜が形成されていることが見つけられた。このように腫瘍外部に白血球膜が形成されるというのは、化合物ＨＮＰ−９８７０１が癌細胞に影響を及ぼして白血球などの攻撃が容易になりながら細胞死滅が誘導されると解釈でき、これによって本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１が前立腺癌と肝癌に優れた効能があると言える。
【００４３】
＜実験例３＞ＤＮＡ切片化抽出法による化合物ＨＮＰ−９８７０１の細胞死滅類型調査
細胞死滅（ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）の類型は、大きく、アポトーシス（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）と壊死（Ｎｅｃｒｏｓｉｓ）に区分されるが、アポトーシスは細胞が外部から刺激を受けると細胞内に細胞死滅を誘導する各種信号（ｓｉｇｎａｌ）が伝達されて細胞が死ぬ類型であり、壊死は外部の急な環境変化や衝撃によって細胞が破壊されて死ぬ類型である。したがって、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１によって細胞がアポトーシス類型に死滅されるとしたら、これは細胞内の作用機作による反応結果なので、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１の抗癌剤としての利用可能性をさらに期待できるのである。
細胞死滅の類型を確認する一般的な方法は、試料を処理した細胞から抽出したＤＮＡを電気泳動してＤＮＡ様状（ｐａｔｔｅｒｎ）を確認するものであって、ＤＮＡが一定なサイズの弟子形として表れるとアポトーシスによる細胞死滅であり、ＤＮＡが無作為的に表れると壊死による細胞死滅と言える。
これに基づき、本発明の抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１の細胞死滅類型を確認するために、ＤＮＡ切片化抽出法（ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）を行った。具体的に、ＤＮＡ切片化抽出法が容易であるＵ９３７細胞を３ ｘ １０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞数で１０ｍｌずつ用意して本発明のＨＮＰ−９８７０１を１０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌずつ処理し、対照区としてＨＮＰ−９８７０１を処理しなかったものとシスプラチン１０μｇ／ｍｌ、アドリアマイシン１０μｇ／ｍｌを処理したものを使用したし、これらを全て３７℃で２４時間培養した。培養済みの細胞を遠心分離して試験管に集めてリン酸塩緩衝溶液で洗浄した後、前記細胞に溶血緩衝溶液（ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ，０．２５％ＮＰ−４０ ｉｎ ＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒ）５００μｌを添加した。前記細胞溶液にＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅ、１００μｇ／ｍｌ）とタンパク質分解酵素（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ、０．１ないし１μｇ／ｍｌ）を処理して３７℃で３０分間反応させた後フェノル：クロロホルム（ｐｈｅｎｏｌ：ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）抽出およびエタノール沈殿を通じてＤＮＡを分離した。前記ＤＮＡを１．３ないし１．５％アガローズゲルに電気泳動（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を行ってＤＮＡ様状（ｐａｔｔｅｒｎ）を確認した。
その結果、本発明の半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１を処理した細胞のＤＮＡはアポトーシスの典型的な特徴である弟子形様状（ｌａｄｄｅｒ ｐａｔｔｅｒｎ）を表したが、これは化合物ＨＮＰ−９８７０１がアポトーシス作用機作によって細胞死滅を誘発することを意味する。
【００４４】
＜実験例４＞細胞周期に対する化合物ＨＮＰ−９８７０１の作用
前記実験例３で確認したように、アポトーシスを通じて細胞死滅を誘導する本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１が細胞内のどの信号伝達機作を通じて作用するか確認するために、細胞周期に関連した成分に対するＨＮＰ−９８７０１のキナーゼ反応活性（ｋｉｎａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を調査した。細胞周期に関連した成分としてはＧ１−Ｓ期（ｐｈａｓｅ）に関与するＣＤＫ２、Ｇ１期に関与するＣＤＫ４、Ｇ２−Ｍ期に関与するＣｄｃ２（ＣＤＫ１）があるが、これらのキナーゼ活性（ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）が抑制されると正常的な細胞分裂を進行できないので、細胞はアポトーシスを誘発する。したがって、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１を処理した細胞のＣＤＫｓに対するキナーゼ活性を調査すると、ＨＮＰ−９８７０１が細胞周期（ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ）のどの時期に関与するか分かる。
キナーゼ活性を確認する一般的な方法は、細胞からＣＤＫｓだけを分離してＣＤＫｓそのもののキナーゼ活性を確認する方法と、細胞に試料を処理した後ＣＤＫｓだけを分離して細胞内ＣＤＫｓの量を確認する方法がある。
【００４５】
＜４−１＞ＣＤＫ２キナーゼ活性反応測定（分離したＣＤＫ２に薬剤処理）
まず、本発明者らは、半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１が細胞周期のうちＧ１−Ｓ期に関与して細胞死滅を誘発するか調査するためにＧ１−Ｓ期のＣＤＫ２キナーゼ活性を確認した。
具体的に、マウス皮下結合組織細胞株であるＬ９２９細胞と胎児変形腎臓細胞株である２９３細胞を１００−ｍｍ組織培養皿（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ）で十分に培養した後、リン酸塩緩衝溶液で２回洗浄した。前記細胞にＲＩＰＡ緩衝溶液（ＲＩＰＡ ｂｕｆｆｅｒ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）１ｍｌを添加して細胞を溶解（ｌｙｓｉｓ）させた後、遠心分離を通じて細胞残余物（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去し、細胞タンパク質（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）の含まれた溶液を得てタンパク質を定量した。前記溶液に抗−Ｃｄｋ２抗体（ｒａｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ＩｇＧ、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）をタンパク質３ｍｇあたり１ないし１０μｇずつ添加し、４℃で１時間にかけて徐々に混合した。前記溶液内Ｃｄｋ２に結合した抗体と反応させるためにタンパク質−Ｇアガローズ（ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇ ａｇａｒｏｓｅ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）１５μｌを添加して同一の条件で混合した後、遠心分離してＣｄｋ２に結合したタンパク質−Ｇアガローズを試験管に集め、これをＲＩＰＡ緩衝溶液で２回、２０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝溶液で３回洗浄してキナーゼ活性反応に使用する免疫沈降物（Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）を用意した。前記免疫沈降物に適当量のＨＥＰＥＳ緩衝溶液を添加して試験管に分注し、ここに反応緩衝溶液（ｒｅａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）と基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）としてヒストンＨ−１（Ｈｉｓｔｏｎ−Ｈ１、４μｇ、Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．）を混合し、ＨＮＰ−９８７０１の最終濃度が１００μＭになるように添加した。前記混合液にγ３２−ＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）１ｍＣｉを添加して３０℃で３０分間キナーゼ反応を施した後、反応終結緩衝溶液（ｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒ）を入れて加熱し反応を終結した。前記反応混合物を１２％ ＳＤＳ ＰＡＧＥ電気泳動を行って展開した後、ゲルを乾燥し、 ｘ−レイフィルム（ｘ−ｒａｙ ｆｉｌｍ）に露出させてバンドの様状（ｂａｎｄ ｐａｔｔｅｒｎ）を確認した。
その結果、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１は、Ｌ９２９細胞のＣＤＫ２キナーゼ活性に対しては何ら影響も及ぼさなかったが、２９３細胞のＣＤＫ２キナーゼ活性は減少させた（表９）。
【００４６】
【表９】
2004506608.tif 000019
【００４７】
＜４−２＞各種のＣＤＫ２細胞株に対する化合物ＨＮＰ−９８７０１の反応抑制活性（細胞株に薬剤処理後ＣＤＫ２活性測定）
前記＜４−１＞と同方法でキナーゼ反応活性を測定した。
具体的に、Ｌ９２９、２９３、肝癌細胞株であるＳＫ−Ｈｅｐ−１および前立腺癌細胞株のＰＣ３細胞などの各種の細胞株を１００ｍｍ組織培養皿に７０ないし８０％程度育つように培養し、０．２μｇ／ｍｌ、０．３μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの濃度で用意されたＨＮＰ９８７０１を５ｍｌずつ添加して２４時間培養した後、リン酸塩緩衝溶液で２回洗浄した。以下、細胞を溶解させて免疫沈降物を製造しキナーゼ反応活性を誘導する過程は、前記＜４−１＞と同様に行った。
その結果、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１は、前記＜４−１＞と同様にＬ９２９細胞のＣＤＫ２量には何ら影響も及ぼさなかったが、２９３、ＳＫ−Ｈｅｐ−１およびＰＣ３細胞においてはＣＤＫ２の量を減少させた。したがって、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１が２９３、ＳＫ−Ｈｅｐ−１およびＰＣ３細胞でアポトーシスによる細胞死滅を起こす作用機作は、細胞周期のＧ１−Ｓ期に関与するＣＤＫ２キナーゼの活性を抑制して正常的な細胞分裂を妨害することによって誘発することを確認した（表１０）。
【００４８】
【表１０】
2004506608.tif 000020
【００４９】
＜４−３＞ＣＤＫ４キナーゼ反応活性測定
本発明者らは、半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１が細胞周期のうちＧ１期に関与して細胞死滅を誘発するか否か調査するためにＧ１期のＣＤＫ４キナーゼ活性を確認した。
前記＜４−１＞ＣＤＫ２の場合と同様に行ったが、抗−ＣＤＫ２抗体の代わりに抗−ＣＤＫ４抗体（ｒａｂｉｔ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ＩｇＧ、Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を使用しながら基質としてはヒストン−Ｈ１をそのまま使用した。
その結果、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１はＬ９２９および２９３細胞のＣＤＫ４に対して何ら影響も及ぼさなかった（表１１）。したがって、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１がＬ９２９および２９３細胞でアポトーシスによる細胞死滅を起こす作用機作はＧ１基に関与するＣＤＫ４キナーゼ活性の抑制によるものでないことが確認された。
【００５０】
【表１１】
2004506608.tif 000021
【００５１】
＜４−４＞Ｃｄｃ２キナーゼ反応活性測定
また、本発明者らは、半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１が細胞周期のうちＧ２ − Ｍ期に関与して細胞死滅を誘発するかを調査するためにＧ２−Ｍ期のＣｄｃ２キナーゼ活性を確認した。
前記＜４−１＞ＣＤＫ２の場合と同様に行ったが、抗−ＣＤＫ２抗体の代わりに抗−Ｃｄｃ２抗体（ｍｏｕｓｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＩｇＧ、 Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．）を使用しながら基質としてはヒストン−Ｈ１をそのまま使用した。
その結果、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１は２９３細胞のＣｄｃ２キナーゼ活性に対して何ら影響を及ぼさなかった。したがって、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１が２９３細胞においてアポトーシスによる細胞死滅を起こす作用機作は、細胞周期のＧ２−Ｍ期に関与するＣｄｃ２キナーゼ活性抑制によるものでないことが確認された。
【００５２】
＜４−５＞Ｅ２Ｆ−１タンパク質含量変化測定
前記実験例＜４−１＞ないし＜４−４＞の結果、本発明の半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１が細胞周期のうちＧ１−Ｓ期に関与して細胞死滅を誘発することを確認した。
これに基づいて、本発明者らは、化合物ＨＮＰ−９８７０１が細胞周期のうちＧ１／Ｓ期への転換にも関与するかを調べるためにＥ２Ｆ−１タンパク質の含量変化を調査した。
具体的に、６ ｘ １０５ｃｅｌｌｓ／４ ｍｌ（ｉｎ ６０−ｍｍ ｄｉｓｈ）濃度で用意された肝癌および前立腺癌細胞株にＨＮＰ−９８７０１を濃度別および時間別に処理し、一夜培養した後細胞を収去してＰＢＳで２回洗浄した。前記細胞にＲＩＰＡ緩衝溶液５０μｌ（／ｄｉｓｈ）を添加して細胞を溶解させた後遠心分離（１３０００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）で細胞残余物（ｃｅｌｌ ｄｅｂｒｉｓ）を除去し、タンパク質を定量した。前記タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに電気泳動（８０ Ｖ ｓｔａｃｋｉｎｇ−１２０ Ｖ ｒｕｎｎｉｎｇ）を行った後、ゲル状のタンパク質を電気ブロッター（５０Ｖ、１．５ｈないし２ｈ）を利用してＰＶＤＦ膜（ＰＶＤＦ ｍｅｍｂｒａｎｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移してウェスタンブロット分析（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を行った。
ウェスタンブロット分析時、抗体の非特異的な反応を抑制するために、前記 膜を５％脱脂粉乳（ｓｋｉｍ−ｍｉｌｋ）を含むＴＢＳＴ溶液に浸して常温で１時間振りながらタンパク質の転移されなかった余白を脱脂粉乳で埋めた。前記膜に１μｇ／ｍｌ（ｉｎ ２．５％ ｓｋｉｍ−ｍｉｌｋ ｉｎ ＴＢＳＴ）濃度に希釈されたＥ２Ｆ−１抗体を添加して常温で１時間振りながら１次抗体結合反応を起こした後、ＴＢＳＴ緩衝溶液で３回洗浄して前記膜に結合しないで残存する１次抗体を除去した。前記膜に１：１０，０００濃度に希釈された２次抗体を添加して常温で１時間振りながら２次抗体結合反応を起こした後、ＴＢＳＴ緩衝溶液で３回洗浄して非特異的に結合された２次抗体を除去し、Ｘ−レイフィルム（Ｘ−ｒａｙ ｆｉｌｍ）に露出させてバンドの含量を調査した。
その結果、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１を１μｇ／ｍｌ濃度で４８時間処理した肝癌細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ−１）および前立腺癌細胞株（ＰＣ−３）では、Ｅ２Ｆ−１タンパク質含量が減少したが、これは、前記細胞において化合物ＨＮＰ−９８７０１によって引き起こるアポトーシスによる細胞死滅が、Ｇ１／Ｓ期の進行が抑制されることから誘発されるというのを意味する。
【００５３】
＜実験例５＞ストレス性活性タンパク質関連キナーゼに対するＨＮＰ−９８７０１の作用
アポトーシスによって細胞毒性を誘発する本発明の半夏草由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１が細胞内の多数の信号伝達経路中どの経路に作用するかを調査するために、ストレスによって活性化されるタンパク質（Ｓｔｒｅｓｓ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ）に関連した成分等に対するキナーゼ反応活性（ｋｉｎａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を調査した。ストレス性活性タンパク質と関連した成分としてはＳＡＰＫ、ｐ３８およびＭＥＫＫなどのキナーゼがあるが、これらは外部からストレスが伝達されるとキナーゼ活性化反応が起こって細胞のアポトーシスを誘発する。したがって、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１を処理した細胞のＳＡＰＫ、ｐ３８およびＭＥＫＫのキナーゼ活性を調査すると、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１がストレス性活性タンパク質と関連した信号伝達経路に作用してアポトーシスによる細胞死滅を誘発することがわかる。
【００５４】
＜５−１＞ＳＡＰＫキナーゼ反応活性測定
本発明の半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１によって引き起こるアポトーシスがＳＡＰＫ経路に影響を与えて発生するかを調査するために、ＳＡＰＫキナーゼ活性に対する化合物ＨＮＰ−９８７０１の影響を調査した。
具体的に、各種の細胞株（Ｌ９２９、ＳＫ−Ｈｅｐ−１およびＰＣ３細胞）を１００ｍｍ組織培養皿におよそ７０ないし８０％になるように培養し、ＨＮＰ−９８７０１を１μｇ／ｍｌ濃度で用意して５ｍｌずつ３０分間処理した後、ＰＢＳ緩衝溶液で２回洗浄した。以降の方法は前記実験例２と同一であるが、抗−ＣＤＫ２抗体の代わりに抗−ＪＮＫ抗体を使用し、ヒストン−Ｈ１の代わりにＧＳＴ−Ｊｕｎを基質として使用した。このとき、前記細胞株にＵＶを１分間照射した後１時間培養した細胞株を陽性対照群として使用した。
その結果、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１が処理された前記細胞株のうち、Ｌ９２９細胞のＳＡＰＫキナーゼ活性は増加するに対し（表１２）、その他ＰＣ３とＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞のＳＡＰＫキナーゼ活性には何ら変化もなかった。この結果は、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１がＬ９２９細胞のＳＡＰＫ経路に関与してアポトーシスを誘発すると期待できるが、その他の細胞株であるＰＣ３とＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞におけるアポトーシス誘発はＳＡＰＫ経路と無関係になされたことを表す。したがって、本発明のＰＣ３とＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞に細胞毒性を起こす作用機作はＳＡＰＫキナーゼの活性を促進させることによって誘導されるのではないということがわかる。
【００５５】
【表１２】
2004506608.tif 000022
【００５６】
＜５−２＞ＭＥＫＫキナーゼ反応活性測定
本発明の半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１によって引き起こるアポトーシスがＭＥＫＫ経路に影響を与えて発生するかを調査するために、ＳＡＰＫキナーゼよりも信号伝達経路で全段階に関与するＭＥＫＫキナーゼ活性に対するＨＮＰ−９８７０１の影響を調査した。
具体的に、実験方法は前記実験例２と同一であるが、抗−ＣＤＫ２抗体の代わりに抗−ＭＥＫＫ抗体を使用し、ヒストン−Ｈ１の代わりにＧＳＴ−ＳＥＫ１を基質として使用したし、ＵＶを１分間照射した後、１時間培養した細胞株を陽性対照群として使用した。また、ＨＮＰ−９８７０１を処理する前に培地に０．５％のＦＢＳを添加し、１８時間培養して血清欠乏（ｓｅｒｕｍ ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）状態が誘導された細胞を使用した。
その結果、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１は、Ｌ９２９細胞のＭＥＫＫキナーゼ活性を２０％程度増加させたが、ＰＣ−３と２９３細胞の場合には何ら影響も与えなかった（表１３）。したがって、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１はＬ９２９細胞ではＭＥＫＫ経路に関与してアポトーシスによる細胞毒性を誘発すると見られるが、２９３およびＰＣ３細胞株で引き起こる細胞毒性はＭＥＫＫ経路とは無関係であることがわかる。
【００５７】
【表１３】
2004506608.tif 000023
【００５８】
＜実験例６＞化合物ＨＮＰ−９８７０１の上皮細胞成長因子収容体との結合有無調査
本発明の半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１がアポトーシスによる細胞死滅を誘発するためには、細胞に作用して信号（ｓｉｇｎａｌ）を伝達するために細胞内に流入されるか、細胞収容体（ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）と結合されなければならないが、このときタンパク質キナーゼＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｃ， ＰＫＣ）の一種である上皮細胞成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下 ”ＥＧＦＲ”と略す）を媒介として作用するかを調べるためにＨＮＰ−９８７０１とＥＧＦＲが結合されたか否か調査した。本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１がＥＧＦＲを媒介として信号を伝達すると、ＨＮＰ−９８７０１とＥＧＦＲの作用によって自家リン酸化反応（ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）が起こらなくなるので、これを調査するとＨＮＰ−９８７０１のＥＧＦＲが媒介されたか否かを確認することができる。
具体的に、ＥＧＦＲ生産細胞株のＡ４３１細胞を１００ｍｍ組織培養皿（Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｉｓｈ）で培養した後、冷却させたＰＢＳ緩衝溶液で２回洗浄した。前記細胞に適当量の均質化緩衝溶液（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ ｂｕｆｆｅｒ ： ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ７．４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、 ２５０ｍＭ Ｓｕｃｒｏｓｅ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５ｕｇ／ｍｌ Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）を添加してガラス均質器（ｇｌａｓｓ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で均質化（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ）した後、遠心分離して細胞残余物を除去した。このとき得た上層液を超高速遠心分離（ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）して沈殿物形態の細胞膜分画（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を分離した後、これを緩衝溶液（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ； ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ ｂｕｆｆｅｒ ＋ １％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）に溶解させ、再び超高速遠心分離して溶解された細胞膜分画を分離した。
前記細胞膜分画に適正分量の２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４および最終濃度１０μＭまたは１００μＭのＨＮＰ−９８７０１を混合し、ＥＧＦＲを最終濃度５００ｎＭになるように添加した後、３０℃で１５分間放置してＥＧＦＲを活性化させた。ここに３００ｍＭ ＭｇＣｌ２、３００μＭ ＡＴＰおよびｒ３２ＡＴＰを添加して氷中で５分間反応させた後、反応終結緩衝溶液（ｓｔｏｐ ｂｕｆｆｅｒ）を入れて加熱し反応を終結した。前記反応液を１２％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動を行った後、Ｘ−レイフィルムに露出させた。
その結果、ＨＮＰ−９８７０１処理時にもＥＧＦＲの自家リン酸化反応には変化がなかったので、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１は信号を伝達するために細胞内に流入されるときＥＧＦＲを媒介としなく、タンパク質キナーゼＣの活性にも何ら影響も与えないことがわかる（表１４）。
【００５９】
【表１４】
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【００６０】
＜実験例７＞酸化窒素生成有無の測定
本発明の半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１が癌細胞に作用してアポトーシスによる細胞死滅を誘発するとき正常細胞にも細胞毒性を示し得る酸化窒素（ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ）が副産物として発生するかを調査した。
具体的に、細胞毒性実験は前記実験例１と同一の方法で行ったし、このときＨＮＰ−９８７０１を処理した細胞株は４８時間のみ培養した。酸化窒素の生成されたか否かは、前記培養液５０μｌをスルファニルアミド溶液（ｓｕｌｆａｎｉｌａｍｉｄｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）５０μｌと混合し常温の暗室で５ないし１０分間反応させ、再びＮＥＤ溶液５０μｌを添加して同一の条件で反応させて５２０ないし５５０ｎｍで吸光度を測定して表した。下記の表１５に表す如く、前記反応によるＮＯ濃度による標準吸光度を作成した後、培養液から測定されたＮＯの吸光度値を前記標準吸光度表を利用して濃度で換算して培養液内ＮＯ量を決定した。ＮＯ測定後、残った細胞はＭＴＴ分析とＬＤＨ分析で生存率と壊死率を測定して細胞死滅を確認した。
その結果、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１はアポトーシスによる細胞死滅を誘発するが、副産物としてＮＯは生成しないことを確認した（表１６）。したがって、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１の細胞毒性を誘発する作用機作は酸化窒素合成酵素（ＮＯ Ｓｙｎｔｈａｓｅ）の活性とは無関係であることがわかる。
【００６１】
【表１５】
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【００６２】
【表１６】
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【００６３】
＜実験例８＞化合物ＨＮＰ−９８７０１の癌細胞転移に対する付着抑制活性測定
本発明者らは、半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１が癌細胞転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）にどんな影響を与えるかを確認するために、癌細胞の血管壁付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）に対するＨＮＰ−９８７０１の抑制活性を測定した。
一般的に癌細胞転移は、１次に発生した癌細胞が組織から血管壁を突き通って血管内に入り、血流とともに浮遊しながら他の臓器や組織に移動することによって発生するが、こうした癌細胞転移において最も重要な過程は移動された癌細胞が他の臓器や組織の血管壁に付着するということである。したがって、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１が癌細胞の血管壁付着に影響を及ぼすならば癌細胞転移にも影響を及ぼすと見られる。これを確認するために本発明者らは、マトリゲル（ｍａｔｒｉｇｅｌ）、ラミニン（ｌａｍｉｎｉｎ）、コラゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）およびゼラチン（ｇｅｌｌａｔｉｎ）などのような癌細胞の付着に関与する血管壁をなす基質（ｍａｔｒｉｘ）成分に対するＨＮＰ−９８７０１の付着抑制活性を調査した。
ＨＮＰ−９８７０１の付着抑制活性は、前記の基質それぞれがコーティング（ｃｏａｔｉｎｇ）された組織培養器（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ）にＨＮＰ−９８７０１を処理した後、ここに癌細胞を付着させ、このとき付着程度に及ぼす影響で調査した。具体的に、９６−ウェルマイクロプレート（９６−ｗｅｌｌ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏ．）にウェルあたりマトリゲル５０μｇ／ｍｌ、ラミニン２μｇ／ｍｌ、コラゲン２μｇ／ｍｌおよびゼラチン２μｇ／ｍｌをそれぞれ添加してウェル表面に均一にコーティングさせて２時間固めた後、各ウェルにＨＮＰ−９８７０１を添加し１時間処理した。このとき、各ウェルに添加されたＨＮＰ−９８７０１はＤＭＳＯに溶解させて最終濃度が１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌになるように濃度別に調節したし、最終濃度が５０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌに調節されたシスプラチンと最終濃度が１０μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌに調節されたアドリアマイシンを対照薬物として使用した。これらの薬物を１時間処理した後、各ウェルに癌細胞を添加して３時間培養した。このとき、癌細胞としては肝癌細胞株（ＳＫ−Ｈｅｐ−１）、悪性黒色腫細胞株（ＳＫ−ＭＥＬ−２８）、咽喉癌細胞株（Ｈｅｐ−２）および正常細胞株（ＮＩＨ−３Ｔ３）を最終細胞数が１ ｘ １０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように調整して使用した。これらの細胞株を３時間培養した後遠心分離し、菌体のみ集めて蒸留水やＰＢＳ緩衝溶液で３回洗浄した。前記細胞をジフ−クィック溶液（Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、１％ ＳＤＳ／０．５ Ｎ ＮａＯＨを処理して付着された細胞を溶かし後、自動ＥＬＩＳＡリーダ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．， ＵＳＡ）で５６０ないし４０５ｎｍの波長で吸光度を測定し、前記実験例１の数学式１によって細胞付着率（％）を決定した。各実験は３回繰り返し行った。
その結果、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１は、対照薬物として使用したシスプラチンとアドリアマイシンの結果と同様に各種の基質に対する癌細胞の付着活性に何ら抑制効果を示さなかった（表１７、表１８、表１９および表２０）。したがって、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１は、抗癌活性作用のうち癌細胞転移において血流中の癌細胞が血管に付着するのを抑制する活性はないことがわかる。
【００６４】
【表１７】
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【００６５】
【表１８】
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【００６６】
【表１９】
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【００６７】
【表２０】
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【００６８】
＜実験例 ９＞化合物ＨＮＰ−９８７０１の血管新生および転移抑制効果測定
本発明者らは、半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１が癌細胞転移を抑制するために癌細胞の血管壁付着抑制の以外に他の抑制効果を示すか確認するために、血管新生および癌細胞の転移に重要な役割をする酵素であるＭＭＰ−２（Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−２）に対する活性抑制効果を測定した。
血管新生とは、既存の毛細血管で新しい血管が形成されることを言うが、このためには、まず、既存血管の基底膜が崩壊されなければならなく、このとき基底膜を崩壊する酵素がＭＭＰ−２である。また、癌細胞転移は、上皮組織内の癌細胞が真皮に移動した血管を引入れることによって癌細胞の生長とともに起こるが、このとき上皮組織の癌細胞が真皮に移動するためには上皮組織と癌細胞との間に存在する基底膜が崩壊されなければならないし、これに関与する酵素もまたＭＭＰ−２である。
ＭＭＰ−２抑制活性測定は主として、トリプトパン（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）で構成された７個のペプチドを使用するが、前記ペプチドにＤＮＰを処理すると蛍光発生が抑制される。蛍光の抑制された前記ペプチドにＭＭＰ−２を処理するとＤＮＰが除去されて再び蛍光が表されるようになり、こうした蛍光の発色有無によってＭＭＰ−２の活性を測定することができる。具体的に、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）発現体系を利用してｐｒｏＭＭＰ−２を得た後、３７℃で１ｍＭ ｐ−（アミノフェニル）酢酸水銀（ｐ−（ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌ）ｍｅｒｃｕｒｉｃ ａｃｅｔａｔｅ）を処理して活性化されたＭＭＰ−２を得た。反応基質として使用されたペプチドはＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇで構成されており、蛍光抑制物質が処理されるとＤＮＰ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ａｒｇが形成される。５０ｍＭトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）、０．２Ｍ ＮａＣｌおよび１０ｍＭ ＣａＣｌ２で構成された緩衝溶液（ｂｕｆｆｅｒ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）をｐＨ ７．５に調整して検索に使用したし、検索反応は２３℃で施した。前記ペプチドとＨＮＰ−９８７０１を含有した緩衝溶液にＭＭＰ−２を添加した後、常温貯蔵して安定化させ、蛍光分析器（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｍｏｄｅｌ ＬＳ ５０Ｂ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）を利用して蛍光変化を測定した。
その結果、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１処理にも関わらず、酵素ＭＭＰ−２によって前記ペプチドから蛍光抑制物質であるＤＮＰが除去されて蛍光発生が誘導された。したがって、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１は、血管新生および癌細胞転移に重要な役割を果たす酵素であるＭＭＰ−２の活性を抑制しなかった。
【００６９】
＜実験例１０＞動物毒性実験
本発明の半夏生由来の化合物ＨＮＰ−９８７０１の毒性を調べるために、実験動物に濃度別に用意したＨＮＰ−９８７０１を静脈注射して２週日間観察しながら実験動物の５０％致死率濃度（ＬＤ５０）および行動特性と体重変化を調査した。実験動物は、体重が３０．０ないし３０．８ｇ程度である６週齢のＩＣＲ白鼠 （面塵実験動物）を１グループあたり５匹ずつ使用したし、静脈注射前２４時間切食させた後、毒性実験を行った。ＨＮＰ−９８７０１は、細胞毒性の少ないＤＭＳＯに溶解させて使用したし、投与量は白鼠の血液量を考慮して試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）実験で５０％致死率を示した濃度を基準に１０，０００倍濃度（０．５ｍｇ／匹）、５，０００倍濃度（０．２５ｍｇ／匹）および２，５００倍濃度（０．１２５ｍｇ／匹）に調節して注射した。このとき、対照群としてＨＮＰ−９８７０１を溶解させないＤＭＳＯの投与された白鼠を使用した。前記濃度別に用意したＨＮＰ−９８７０１を白鼠の尾静脈にそれぞれの濃度別に注射し、白鼠の致死率、行動変化、脱毛や発赤などの異常症状および体重変化を２ないし３日おきに１５日間調査した。
その結果、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１投与濃度が０．５ｍｇ／匹および０．２５ｍｇ／匹である場合には全ての実験動物が致死したが、０．１２５ｍｇ／匹濃度では全て生存した。また、前記濃度で生存した白鼠はＤＭＳＯだけが投与された対照群の白鼠と同一の行動様状を見せ、特異的に行動特性や脱毛、発赤などの異常症状を見せなかった。したがって、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１の５０％致死率濃度（ＬＤ５０）は０．１２５ｍｇ／匹ないし０．２５ｍｇ／匹（４．１２ｍｇ／ｋｇないし８．２５ｍｇ／ｋｇ）の濃度範囲にあることを確認した（表２１）。これは、ラオ等が報告したマナサンチンＡの５０％致死率濃度ＬＤ５０＝５．２ｍｇ／ｋｇと殆ど一致する結果である。また、試験管内実験を通じて前立腺癌細胞株に対する５０％有効濃度と実験動物に対する毒性濃度を下記数学式３によって換算して比較した結果、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１の治療指数（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｎｄｅｘ ： Ｔ．Ｉ．）は２，５００以上と表れた。
【００７０】
【数３】
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【００７１】
マナサンチンＡをマウスの腹腔内に投与し、自発運動が５０％減少される濃度（ＩＣ５０）は０．２１±０．０２ｍｇ／ｋｇだといったラオ等の実験結果と比較するとき、本発明のＨＮＰ−９８７０１はそれよりも遥かに低い１百分の１程度の濃度で抗癌活性（ＩＣ５０）を見せることがわかる。したがって、本発明の化合物ＨＮＰ−９８７０１は、癌細胞に対する細胞毒性が極めて強いと同時に、正常細胞に対しては毒性が極めて低いという選択性を示すので、副作用は少ないながら抗癌活性は強い優れた抗癌剤の開発に有用に使用されることができる。
【００７２】
【表２１】
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【００７３】
［発明の効果］
本発明は、半夏生から抽出した新規化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１Ｂおよび既知の化合物ＨＮＰ−９８７０１Ｃ、またはこれらの混合物（ＨＮＰ−９８７０１）の抗癌剤としての用途とその製造方法およびそれらを有効成分として含有する抗癌剤用薬学的組成物を提供する。本発明の半夏生由来抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１Ｂ、ＨＮＰ−９８７０１Ｃまたはそれらの混合物（ＨＮＰ−９８７０１）およびその誘導体は、肝癌および前立腺癌細胞株を始めとして乳房癌、咽喉癌、神経膠芽細胞腫および悪性黒色腫などの各種の癌細胞株に対して既存の抗癌剤であるシスプラチンやアドリアマイシンよりも一層強力な抗癌活性を示すだけでなく、正常細胞に対する副作用も殆どないか、極めて低いので、抗癌活性が極めて優れている上に選択的に作用する抗癌剤の開発が期待できる。
また、本発明の半夏生由来の抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１Ａ、ＨＮＰ−９８７０１Ｂ、ＨＮＰ−９８７０１Ｃまたはこれらの混合物（ＨＮＰ−９８７０１）およびその誘導体を有効成分として含有する抗癌剤は、経口用としての開発が可能なことから簡便な治療法を提供することは勿論、既存の抗癌剤や治療法と様々に併用することができ、それ以外にも抗癌機能性食品および食品添加剤、抗癌機能性飲料および飲料添加剤、抗癌化粧品添加剤、抗癌石けん添加剤、抗癌シャンプ添加剤などの有効成分として使用されることができる。
なお、半夏生は、栽培が容易であり、半夏生の栽培を通じて農民の所得増大も図れるので、農村の対外競争力を向上させることができ、また、半夏生の全草を生体や乾燥体に関係なく使用できるだけでなく、茶に利用した後捨てられる残渣も利用できるので資源のリサイクルにも寄与できる。
最終に、本発明の半夏生由来の抗癌活性を持つ化合物ＨＮＰ−９８７０１ＡおよびＨＮＰ−９８７０１Ｃの水酸基（−ＯＨ）は反応性の高い作用基であって、新しい誘導体合成のための先導物質として提供されて誘導体合成、活性検索および新薬開発などに有用に使用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】前立腺癌細胞株（ＤＵ−１４５）が皮下移植されたヌードマウスにおいてＨＮＰ−９８７０１の抗癌活性を腫瘍のサイズ変化で表したものである。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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