(57)【要約】本発明は、ターゲッティングした相同組換えによりそれらのＰＴＰ−１Ｂ遺伝子が破壊されているマウスを提供する。該マウスは、ＰＴＰ−１Ｂタンパク質が検出不能だが、生理学的には正常に見える。しかし、普通食の給餌状態において、該マウスは、それらの野生型同腹子に比べ循環インスリンレベルが半分である。耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験において、該マウスはインスリン感受性の増大を示す。高脂肪高炭水化物食を与えた場合、該マウスは、それらの野生型同腹子と比較して体重増加に対する抵抗性を示す。また、該マウスおよび該マウスから誘導される細胞系の作製方法も提供される。本発明はまた、ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターを同定する方法ならびにそのような方法により同定されるインヒビターを提供する。
2004514402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
破壊されたＰＴＰ−１Ｂ遺伝子についてホモ接合性であるトランスジェニックマウスであって、野生型マウスと比較してインスリンに対する応答が改変された表現型を示す上記マウス。
【請求項２】
前記ＰＴＰ−１Ｂ遺伝子が、選択可能なマーカー遺伝子を含むプラスミドの挿入により破壊されている、請求項１に記載のマウス。
【請求項３】
前記ＰＴＰ−１Ｂ遺伝子がｐＴＡＲＧＥＴの挿入により破壊されている、請求項２に記載のマウス
【請求項４】
高脂肪高炭水化物食を与えた場合の体重増加が、野生型マウスの約半分である、請求項１に記載のマウス。
【請求項５】
野生型マウスと比較した場合に、前記の給餌状態における循環インスリンレベルが約半分である、請求項１に記載のマウス。
【請求項６】
野生型マウスと比較した場合に、前記の給餌状態における血中ブドウ糖レベルが約１３％である、請求項１に記載のマウス。
【請求項７】
請求項１に記載のマウスから誘導される細胞系。
【請求項８】
その細胞の少なくとも幾つかが、プロテインチロシンホスファターゼ−１（ＰＴＰ−１）の変異形態をコードする改変遺伝子を含み、かつ該改変遺伝子がそのマウス内の野生型のＰＴＰ１Ｂ遺伝子を置換するようにターゲッティングされているマウスの作製方法であって、
（ａ） マウス胚性幹（ＥＳ）細胞のＰＴＰ−１Ｂ遺伝子をターゲッティングするように設計されたＰＴＰ−１Ｂの変異形態をコードする改変遺伝子を用意し；
（ｂ） ＰＴＰ−１Ｂの改変形態をコードする該改変遺伝子をマウスＥＳ細胞に導入し；
（ｃ） ＰＴＰ−１Ｂの改変形態をコードする該改変遺伝子により野生型ＰＴＰ−１Ｂ遺伝子が破壊されているＥＳ細胞を選択し；
（ｄ） ステップ（ｃ）からの該ＥＳ細胞をマウス胚盤胞に注入し；
（ｅ） ステップ（ｄ）からの胚盤胞を偽妊娠マウスに移植し；および
（ｆ） 該胚盤胞を胚へと発達させ、該胚を産み月まで発達させて、その細胞の少なくとも幾つかがＰＴＰ−１の変異形態をコードする改変遺伝子を含むマウスを生産させる；
ことを含む上記方法。
【請求項９】
ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターを同定する方法であって、
（ａ） ＰＴＰ−１Ｂの酵素的に活性な調製物を用意し；および
（ｂ） ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該ＰＴＰ−１Ｂの酵素的に活性な調製物中のＰＴＰ−１Ｂの酵素活性を測定すること；
を含み、その結果、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのＰＴＰ−１Ｂの酵素活性が低下していれば、該物質がＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであることを示すものとする、上記方法。
【請求項１０】
前記物質が化合物のライブラリーから得られる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性のインヒビターを同定する方法であって、
（ａ） 細胞を、ヒトＰＴＰ−１Ｂタンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクトし；
（ｂ） ステップ（ａ）の細胞を、ＰＴＰ−１Ｂタンパク質が産生されるような条件下で培養し；および
（ｃ） 該ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性を測定すること；
を含み、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下での該ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性が低下していれば、該物質が該ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性のインヒビターであることを示すものとする、上記方法。
【請求項１２】
前記物質が化合物のライブラリーから得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法により同定される、ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビター。
【請求項１４】
ある物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートするか否かを判定する方法であって、
（ａ） ＰＴＰ−１Ｂの酵素的に活性な調製物を用意し；
（ｂ） ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該ＰＴＰ−１Ｂの酵素的に活性な調製物中のＰＴＰ−１Ｂの酵素活性を測定し、それにより、ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質を同定し；
その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのＰＴＰ−１Ｂの酵素活性が低下していれば、該物質がＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであることを示すものとし；
（ｃ） 該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し；および
（ｄ） ステップ（ｃ）の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを測定し、ステップ（ｃ）の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較すること；
を含み、その際、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較した場合に、ステップ（ｃ）の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルに差があれば、該物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートすることを示すものとする、上記方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物がマウスまたはヒトである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ある物質が哺乳動物における肥満を調節するか否かを判定する方法であって、
（ａ） ＰＴＰ−１Ｂの酵素的に活性な調製物を用意し；
（ｂ） ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該ＰＴＰ−１Ｂの酵素的に活性な調製物中のＰＴＰ−１Ｂの酵素活性を測定してＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質を同定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのＰＴＰ−１Ｂの酵素活性が低下していれば、該物質がＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであることを示すものとし；
（ｃ） 該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し；および
（ｄ） ステップ（ｃ）の哺乳動物に高脂肪高炭水化物食を与えた場合のステップ（ｃ）の哺乳動物の体重増加を測定し、該ステップ（ｃ）の哺乳動物の体重増加を、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されてはいないが、高脂肪高炭水化物食を与えた哺乳動物の体重増加と比較すること；
を含み、その際、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の体重増加と比較した場合に、ステップ（ｃ）の哺乳動物の体重増加に差があれば、該物質が哺乳動物における肥満を調節することを示すものとする、上記方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物がマウスまたはヒトである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ある物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートするか否かを判定する方法であって、
（ａ） 細胞を、ヒトＰＴＰ−１Ｂタンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクトし；
（ｂ） ステップ（ａ）の細胞を、ＰＴＰ−１Ｂタンパク質が産生されるような条件下で培養し；
（ｃ） ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で、該トランスフェクト細胞内での該ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性を測定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性が低下していれば、該物質がＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性のインヒビターであることを示すものとし；
（ｄ） 該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し；
（ｅ） ステップ（ｄ）の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを測定し、ステップ（ｄ）の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較すること；
を含み、その際、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較した場合に、ステップ（ｃ）の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルに差があれば、該物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートすることを示すものとする；
上記方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物がマウスまたはヒトである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ある物質が哺乳動物における肥満を調節するか否かを判定する方法であって、
（ａ） 細胞を、ヒトＰＴＰ−１Ｂタンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクトし；
（ｂ） ステップ（ａ）の細胞を、ＰＴＰ−１Ｂタンパク質が産生されるような条件下で培養し；
（ｃ） ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で、該トランスフェクト細胞内での該ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性を測定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのＰＴＰ−１Ｂの酵素活性が低下していれば、該物質がＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性のインヒビターであることを示すものとし；
（ｄ） 該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し；および
（ｅ） ステップ（ｄ）の哺乳動物に高脂肪高炭水化物食を与えた場合の該ステップ（ｃ）の哺乳動物の体重増加を測定し、該ステップ（ｄ）の哺乳動物の体重増加を、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されてはいないが、高脂肪高炭水化物食を与えた哺乳動物の体重増加と比較すること；
を含み、その際、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の体重増加と比較した場合に、ステップ（ｄ）の哺乳動物の体重増加に差があれば、該物質が哺乳動物における肥満を調節することを示すものとする；
上記方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物がマウスまたはヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターを肥満哺乳動物に投与することを含む、肥満の治療方法。
【請求項２３】
ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターをＩＩ型糖尿病に罹患しているヒトに投与することを含む、ＩＩ型糖尿病および関連する合併症の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、破壊されたＰＴＰ−１Ｂ遺伝子を含むトランスジェニックマウスの分野に関する。このマウスは、ＰＴＰ−１Ｂ遺伝子の一方または両者のコピーに破壊を含み得る。ＰＴＰ−１Ｂ遺伝子の両コピーに破壊を含むマウスの場合、そのようなマウスは、ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の検出可能な発現が欠如している。
【０００２】
発明の背景
プロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）は、種々の調節プロセスに関与する基質を脱リン酸化する、膜貫通または細胞内酵素の大きな一群に属する（Ｆｉｓｃｈｅｒら， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：４０１−４０６）。プロテインチロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）は、約５０ｋｄの細胞内タンパク質で、種々のヒト組織に多量に存在する（Ｃｈａｒｂｏｎｎｅａｕら， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：５２５２−５２５６；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， １９９３， Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ３：１−１５）。他のＰＴＰａｓｅと同様に、ＰＴＰ−１Ｂは該酵素の活性にとって必須な、アルギニンおよびシステイン残基を含む配列モチーフ（Ｉ／Ｖ）ＨＣＸＡＧＸＸＲ（Ｓ／Ｔ）Ｇ（配列番号１）を特徴とする触媒ドメインを有する（Ｓｔｒｅｕｌｉら， １９９０， ＥＭＢＯ Ｊ． ９：２３９９−２４０７；Ｇｕａｎら， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：１５０１−１５０５；Ｇｕａｎ ＆ Ｄｉｘｏｎ， １９９１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：１７０２６−１７０３０）。ＰＴＰ−１Ｂアミノ末端の３５個のアミノ酸残基のために、該タンパク質は小胞体に局在する（Ｆｒａｎｇｉｏｎｉら， １９９２， Ｃｅｌｌ ６８：５４５−５６０）。
【０００３】
どのタンパク質がＰＴＰ−１Ｂの基質かを決定することは、かなり興味深いことである。特別な興味を起こさせる１つの基質はインスリン受容体である。インスリン受容体へのインスリンの結合は、該受容体の自己リン酸化をもたらし、最も顕著なものはキナーゼ触媒ドメインにおけるチロシン１１４６、１１５０および１１５１についてのものである（Ｗｈｉｔｅ ＆ Ｋａｈｎ， １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１−４）。これは、インスリン受容体チロシンキナーゼの活性化をもたらし、これはインスリンシグナリング事象をさらに下流へと伝播して、インスリンの種々の生物学的作用を媒介する種々のインスリン受容体基質（ＩＲＳ）タンパク質をリン酸化する。
【０００４】
Ｓｅｅｌｙら， １９９６， Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４５：１３７９−１３８５（Ｓｅｅｌｙ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＰＴＰ−１Ｂとインスリン受容体との関係を検討した。Ｓｅｅｌｙは、ＰＴＰ−１Ｂ触媒ドメインに点突然変異を有するＰＴＰ−１ＢのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質を構築した。この融合タンパク質は、触媒的には不活性ではあるものの、精製した受容体調製物およびインスリン受容体を発現している細胞から誘導される全細胞溶解物からインスリン受容体を沈殿させるその能力により実証されるように、インスリン受容体に結合することができる。
【０００５】
Ａｈｍａｄら， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２０５０３−２０５０８は、浸透圧の負荷を用いてＰＴＰ−１Ｂ中和抗体をラットＫＲＣ−７肝ガン細胞に導入した。該細胞に該抗体が存在することにより、インスリン刺激ＤＮＡ合成およびホスファチジイノシトール３′キナーゼ活性がそれぞれ４２％および３８％増大した。インスリン受容体の自己リン酸化およびインスリン受容体基質−１チロシンのリン酸化は、抗体負荷細胞（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｌｏａｄｉｎｇ ｃｅｌｌｓ）においてそれぞれ２．２倍および２．０倍増大した。この抗体負荷細胞はまた、外因性ペプチド基質に対するインスリン刺激インスリン受容体キナーゼ活性において５７％の増大を示した。
【０００６】
本発明までは、ＰＴＰ−１Ｂとインスリン受容体との相互作用の研究は、ＰＴＰ−１Ｂの無細胞調製物または培養下の細胞系についての研究に限られていた。したがって、そのような研究は、ＰＴＰ−１Ｂ活性が生きている哺乳動物におけるブドウ糖代謝、トリグリセライド代謝または体重増加に対して生理学的作用をもたらす様式でインスリン受容体の調節に影響を及ぼすか否かの問題に対処するものではなかった。インスリン受容体およびＰＴＰ−１Ｂのようなタンパク質とのその相互作用の調節は複雑で、生きている哺乳動物の環境とできるだけ近い環境でこの調節を研究することが必要である。本発明のノックアウトマウスは、この要件を満足するよう支援するのに有用である。本発明のノックアウトマウスはまた、それらが生きている哺乳動物においてインスリン受容体の活性をモジュレートする化合物の設計および評価に用い得る動物モデルを提供する、という点においても有用である。
【０００７】
発明の概要
本発明は、標的化（ターゲッティング）した相同組換え法（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により、ＰＴＰ−１Ｂ遺伝子が破壊されているマウスを提供する。ＰＴＰ−１Ｂ遺伝子の両コピーが破壊されている場合、該マウスは検出可能なＰＴＰ−１Ｂタンパク質を有しないが、生理学上は正常に見える。しかし、給餌状態において、該マウスは、野生型の同腹子よりもわずかに低いブドウ糖レベルおよび野生型の同腹子の半分の循環インスリンレベルを有する。耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験（ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｅｓｔｓ）において、該マウスはインスリン感受性が増大している。高脂肪高炭水化物食を与えた場合、該マウスは、野生型の対照よりもずっとインスリン感受性が高いが、肥満抵抗性である。
また、該マウスおよび該マウスから誘導される細胞系を作製する方法も提供される。
【０００８】
本発明はまた、ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターを同定する方法、ならびにそのような方法により同定されるインヒビターを提供する。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明の目的のために：
「トランスジェニックマウス」とは、サブ細胞レベルでの意図的遺伝子操作により（例えば、ターゲッティングした相同組換え、マイクロインジェクション、または組換えウイルスの感染により）直接的または間接的に改変または受容された遺伝情報を保有する１個以上の細胞を含む任意のマウスである。「トランスジェニックマウス」なる用語は、古典的な雑種形成（ｃｒｏｓｓ−ｂｒｅｅｄｉｎｇ）または体外受精を包含しようとするものではなく、１個以上の細胞が組換えＤＮＡ分子により改変されているか組換えＤＮＡ分子を受容しているマウスを包含しようとするものである。トランスジェニックマウスは、遺伝子改変または遺伝情報が生殖細胞系に導入されていてもよく、それにより該遺伝情報を子孫に伝達する能力を賦与する。そのような子孫がその改変または遺伝情報のいくつかまたは全部を有する場合には、それらもまたトランスジェニックマウスである。
【００１０】
「ノックアウトマウス」とは、予め選択した遺伝子のＤＮＡ配列のある部分を破壊するように働く新しいＤＮＡ配列をそのマウスのゲノムＤＮＡに導入することにより、該予め選択した遺伝子の発現が抑制または排除されているマウスである。ノックアウトマウスは、破壊された該予め選択した遺伝子の両コピーを有してもよく、この場合、それはホモ接合型または「ヌル」ノックアウトマウスである。ノックアウトマウスはまた、破壊された該予め選択した遺伝子の一方だけのコピーを有してもよく、この場合、それは「ヘテロ接合型」ノックアウトマウスである。
【００１１】
生物学的経路または疾患状態における特定の遺伝子の役割を決定する問題に対する一つのアプローチは、全能ＥＳ細胞において生来の野生型遺伝子を選択的に不活性化し、次いで該ＥＳ細胞を用いてトランスジェニックマウスを作製することである。そのようなトランスジェニックマウス（該特定の遺伝子が不活性化されている）は「ノックアウトマウス」として知られている。遺伝子ターゲッティングしたトランスジェニックノックアウトマウスの作製において遺伝子ターゲッティングしたＥＳ細胞を用いることは、例えばＴｈｏｍａｓら， １９８７， Ｃｅｌｌ ５１：５０３−５１２に記載されており、他にも概説されている（Ｆｒｏｈｍａｎら， １９８９， Ｃｅｌｌ ５６：１４５−１４７；Ｃａｐｅｃｃｈｉ， １９８９， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ． ５：７０−７６；Ｂａｒｉｂａｕｌｔら， １９８９， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ６：４８１−４９２）。
【００１２】
ターゲッティングした相同組換えを用いて特定の変化を染色体遺伝子に挿入することによる、任意の遺伝子領域を不活性化または実質的に任意の所望の突然変異へと改変するための技術が利用可能である。一般に、「ターゲッティングベクター」、すなわち突然変異させようとする遺伝子領域を部分的に含むプラスミドが用いられる。該プラスミドの該遺伝子領域のこの部分と染色体上の対応する遺伝子領域との相同性のために、相同組換えを用いて該プラスミドを該遺伝子領域に挿入し、それにより該遺伝子領域を破壊することができる。通常、ターゲッティングベクターは選択マーカー遺伝子も含む。
【００１３】
相同染色体外組換え（これは１００％に近い頻度で起こる）と比較して、相同プラスミド−染色体組換えは、かつて１０−６〜１０−３の頻度でしか検出されないと報告された（Ｌｉｎら， １９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：１３９１−１３９５；Ｓｍｉｔｈｉｅｓら， １９８５， Ｎａｔｕｒｅ ３１７：２３０−２３４；Ｔｈｏｍａｓら， １９８６， Ｃｅｌｌ ４４：４１９−４２８）。非相同プラスミド−染色体相互作用はそれよりも頻度が高く、同等の相同挿入よりも１０５倍（Ｌｉｎら， １９８５， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：１３９１−１３９５）から１０２倍（Ｔｈｏｍａｓら， １９８６， Ｃｅｌｌ ４４：４１９−４２８）高いレベルで起こる。
【００１４】
マウスＥＳ細胞におけるターゲッティングした組換えのこの低比率を克服するために、極めて少ない相同組換え体を検出または選別するための種々の戦略が開発されてきた。相同改変事象を検出するための１つのアプローチでは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、形質転換細胞のプールを相同挿入についてスクリーニングし、続いて個々のクローンをスクリーニングする（Ｋｉｍら， １９８８， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：８８８７−８９０３；Ｋｉｍら， １９９１， Ｇｅｎｅ １０３：２２７−２３３）。あるいはまた、ポジティブ遺伝子選別法が開発されており、そこでは、相同挿入が起こった場合にだけ活性であり、かつこれらの組換え体を直接選別できるようにするマーカー遺伝子が構築される（Ｓｅｄｉｖｙら， １９８９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：２２７−２３１）。相同組換え体を選別するために開発された最も有効な方法の１つは、改変の直接的な選別が存在しない遺伝子用に開発されたポジティブ−ネガティブ選別（ＰＮＰ）法である（Ｍａｎｓｏｕｒら， １９８８， Ｎａｔｕｒｅ ３３６：３４８−３５２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ， １９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２；Ｃａｐｅｃｃｈｉ， １９８９， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔ． ５：７０−７６）。このＰＮＳ法は、マーカー遺伝子がそれ自体のプロモーターを有するために、高レベル発現の難しい遺伝子をターゲッティングする際により有効である。非相同組換え体は、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子を用いて、ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）またはＦＩＡＵ［１−（２−デオキシ２−フルオロ−Ｂ−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−ヨードウラシル］のようなヘルペス薬を用いてその非相同挿入について選別することにより選別される。この逆選別（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）により、生存している形質転換体中の相同組換え体の割合を増大させることが可能になる。
【００１５】
本発明は、ターゲッティングした相同組換えによりそれらのＰＴＰ−１Ｂ遺伝子が破壊されているマウスを提供する。ＰＴＰ−１Ｂ遺伝子の両コピーが破壊されているマウス（「ヌル」マウス）の場合、該マウスは検出可能なＰＴＰ−１Ｂタンパク質を有していないが、生理学上は正常に見える。しかし、給餌状態において、該ヌルマウスは、それらの野生型同腹子よりもわずかに低いブドウ糖レベルおよび該野生型同腹子の半分の循環インスリンレベルを有する。耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験において、該ヌルマウスは、インスリン感受性が増大している。さらに、インスリンを注射したヌルマウスの肝臓および筋肉においては、同様に処理した野生型マウスと比較してインスリン受容体のリン酸化が明らかに高くなっている。これらの結果から、ＰＴＰ−１Ｂが生きている哺乳動物におけるインスリンシグナリング経路に関与し、インスリン受容体の脱リン酸化、ひいてはインスリン受容体の不活性化においてある役割を担うことが示される。
【００１６】
本発明のＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスは、機能的ＰＴＰ−１Ｂタンパク質を含まない細胞系の供給源として有用である。そのような細胞系は、ヒトＰＴＰ−１Ｂ遺伝子でトランスフェクトして、内因性マウスＰＴＰ−１Ｂの発現に伴う干渉を受けることなしにヒトＰＴＰ−１Ｂを発現する細胞系を得ることが可能である。そのような細胞系は、ヒトＰＴＰ−１Ｂのアクチベーターまたはインヒビターを同定するためのアッセイにおいて用い得る。したがって、本発明は、ＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスに加えて、本発明のＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスから誘導される細胞系を提供する。そのような細胞系は、当業界で周知の方法により作製することができる（Ｗｉｌｌｉａｍｓら， １９８８， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：３８６４−３８７１；Ａａｒｏｎｓｏｎ ＆ Ｔｏｄａｒｏ， １９６８， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ７２：１４１−１４８；Ｊｅｎｋｉｎｓら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６５１−６５４）。
【００１７】
本発明のＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスは、野生型マウスにおいてＰＴＰ−１Ｂに対する医薬の作用によりブドウ糖代謝、トリグリセライド代謝または体重増加をモジュレートする該医薬の作用をモニターするアッセイのネガティブ対照として有用である。そのようなアッセイのネガティブ対照としてＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスを使用すると、ＰＴＰ−１Ｂ活性に対する医薬の作用によりもたらされると思われる、野生型マウスにおいて該医薬によりもたらされるブドウ糖代謝、トリグリセライド代謝または体重増加に対する作用が、実際に引き起こされることを判定することが可能になる。
【００１８】
本発明のＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスは、インスリン受容体の弱いアゴニストを同定するためのアッセイにおいて有用である。これらのノックアウトマウスはＰＴＰ−１Ｂが欠失しているので、インスリン受容体のシグナルの低下に関与する重要なエレメントが欠失している。したがって、ノックアウトマウスにおいてＰＴＰ−１Ｂの不在下では、インスリン受容体の弱いアゴニストが同定でき、この場合、それら弱いアゴニストの作用はＰＴＰ−１Ｂの存在下では喪失している。そのような弱いアゴニストを先駆化合物（ｌｅａｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）として用いて、これを医化学的に修飾し、より強力で薬理学上有用なインスリン受容体のアゴニストを開発することができる。
【００１９】
本発明のＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスは、代謝または生理機能の種々の局面におけるインスリン受容体の役割の研究に有用である。例えば、該マウスをモニターして、ＰＴＰ−１Ｂの喪失が寿命に何らかの影響を及ぼすか否かを決定することができる。Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓにおいて、遺伝子ｄａｆ−２が突然変異すると、寿命に悪影響が生ずる。ｄａｆ−２は、哺乳動物インスリン受容体の同族体（ｈｏｍｏｌｏｇ）である。
【００２０】
ｄｂ／ｄｂマウスは、糖尿病に罹患しているヒトの合併症に似た末梢神経障害および心筋疾患などの多くの合併症を発症する。本発明のＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスは、ＰＴＰ−１Ｂ活性と糖尿病との関係をより良く研究するために、ｄｂ／ｄｂマウスと交雑させることが可能である。本発明のＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスは、他の化学的または遺伝的に誘導された糖尿病マウスモデルと同様にして用いることができる。
本発明のＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスにおいて、チアゾリジンジオンまたはスルホニル尿素のようなブドウ糖レベリング薬物の作用を調べることは興味深いことである。
【００２１】
本明細書における、インスリン受容体のＰＴＰ−１Ｂ調節が肥満においてある役割を担うという実証に照らし、ＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスにおいて、体重調節に関連しているレプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、メラノコルチン−４受容体、神経ペプチドＹ５受容体および他の分子種を調べることは興味深い。
【００２２】
本発明のノックアウトマウスを作製するために、種々の方法を用いることができる。１つの方法は、導入遺伝子を標的細胞に導入し、次いでこれを胚盤胞（ｂｌａｓｔｏｃｙｔｓ）に組み込み、これを偽妊娠雌性マウスに移植することを含む。導入遺伝子の導入のための標的細胞の１つのタイプは胚性幹細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した移植前の胚から得てもよい（Ｅｖａｎｓら， １９８１， Ｎａｔｕｒｅ ２９２：１５４−１５６；Ｂｒａｄｌｅｙら， １９８４， Ｎａｔｕｒｅ ３０９：２５５−２５８；Ｇｏｓｓｌｅｒら， １９８６， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：９０６５−９０６９；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら， １９８６， Ｎａｔｕｒｅ ３２２，４４５−４４８；Ｗｏｏｄら， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：４５８２−４５８４）。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクションまたはレトロウイルス媒介トランスダクションなどの一般的な技法により、効率的にＥＳ細胞に導入できる。その後、得られた形質転換ＥＳ細胞はマウスからの胚盤胞と混ぜ合わせることができる。該胚盤胞を偽妊娠仮母親に移植した後、導入したＥＳ細胞は、該胚盤胞から発達する胚をコロニー化し、得られるキメラマウスの生殖系をもたらす（Ｊａｅｎｉｓｃｈ， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１４６８−１４７４）。
【００２３】
本発明のノックアウトマウスを作製するのに用い得る別の方法は、導入遺伝子を受精卵の雄前核（ｍａｌｅ ｐｒｏｉｎｕｃｌｅｕｓ）にマイクロインジェクションすることを含む（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら， １９８１， Ｃｅｌｌ ２７：２２３；Ｗａｇｎｅｒら， １９８１， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：５０１６；Ｓｔｅｒｗａｒｔら， １９８２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１７：１０４６−１０４８；Ｔｏｗｎｅｓら， １９８５， ＥＭＢＯ Ｊ． ４：１７１５）。マイクロインジェクションした導入遺伝子は、該受精卵の雄前核のＤＮＡに組み込まれる。次いで、該受精卵を、レシピエントである雌性マウスに移植し、発育させる。この手順がうまく行けば、得られる胚はその全細胞に該導入遺伝子を含むこととなる。場合によっては、該受精卵は、該導入遺伝子がゲノムに組み込まれる前に分割する。そのような場合、キメラ胚が生じる。そのようなキメラ胚は、それらの細胞の幾つか（全部ではない）に含まれる。
【００２４】
本発明は、その細胞の少なくとも幾つかが、プロテインチロシンホスファターゼ−１Ｂ（ＰＴＰ−１Ｂ）の変異形態をコードする改変遺伝子を含み、かつ該改変遺伝子がそのマウス内の野生型のＰＴＰ１Ｂ遺伝子を置換するようにターゲッティングされているマウスの作製方法であって、
（ａ） マウス胚性幹細胞のＰＴＰ−１Ｂ遺伝子をターゲッティングするように設計されたＰＴＰ−１Ｂの変異形態をコードする改変遺伝子を用意し；
（ｂ） 該ＰＴＰ−１Ｂの改変形態をコードする改変遺伝子をマウスＥＳ細胞に導入し；
（ｃ） 該ＰＴＰ−１Ｂの改変形態をコードする改変遺伝子が野生型ＰＴＰ−１Ｂ遺伝子を破壊しているＥＳ細胞を選択し；
（ｄ） ステップ（ｃ）からの該ＥＳ細胞をマウス胚盤胞に注入し；
（ｅ） ステップ（ｄ）からの胚盤胞を偽妊娠マウスに移植し；および
（ｆ） 該胚盤胞を胚へと発達させ、該胚を産み月まで発達させて、その細胞の少なくとも幾つかがＰＴＰ−１の変異形態をコードする改変遺伝子を含むマウスを生産させる
ことを含む上記方法を提供する。
【００２５】
上記の方法により作製されるマウスが、ＰＴＰ−１Ｂの変異形態をコードする改変遺伝子を有する生殖細胞を含む場合、該マウスを交配させて、その体細胞ならびに生殖細胞の全てが該ＰＴＰ−１Ｂの変異形態をコードする改変遺伝子を含んでいるマウスを生産させることが可能となる。ＰＴＰ−１Ｂの変異形態をコードする改変遺伝子を含む生殖細胞を有するマウスは交配させて、それらのＰＴＰ−１Ｂ遺伝子の両コピーに破壊を含み、そのために検出可能なＰＴＰ−１Ｂ活性を全く有しないホモ接合型マウスすなわち「ヌル」マウスを得ることができる。
【００２６】
本発明のノックアウトマウスは、野生型マウスと比較してブドウ糖代謝および脂肪代謝が改変されている。本発明のノックアウトマウスにおけるＰＴＰ−１Ｂ遺伝子破壊の効果は、ＰＴＰ−１Ｂの活性の改変により、ｉｎ ｖｉｖｏ（すなわち生きている哺乳動物）におけるインスリンシグナリングがモジュレートされ得ることを実証している。本発明のノックアウトマウスはまた、ＰＴＰ−１Ｂの活性の改変が体重増加に対しても効果を有することも実証している。これらの結果から、ＰＴＰ−１Ｂの阻害がＩＩ型糖尿病（非インスリン依存性糖尿病、ＮＩＤＤＭ）および肥満の治療に有益であることが示唆される。本発明により、生きている哺乳動物における食物代謝（ｆｕｅｌ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）の血中ブドウ糖およびトリグリセライドレベルまたは体重増加のような局面に対するＰＴＰ−１Ｂの効果が初めて実証された。本発明以前には、精製酵素調製物または組織培養細胞中でのＰＴＰ−１Ｂとインスリン受容体との相互作用により、生きている哺乳動物内でしか研究できないこれら作用を類推できるとは予想されなかった。したがって、本発明以前には、ＰＴＰ−１Ｂとインスリン受容体との相互作用のインヒビターを用いて、生体哺乳動物内での血中ブドウ糖もしくはトリグリセライドレベルをモジュレートしたり肥満を調節できるとは、なかなか予想されなかった。何故ならば、哺乳動物における食物代謝の調節について組織培養物において行われた実験の妥当性が明らかでなかったからである。
【００２７】
本明細書中で提示する研究以前には、ＰＴＰ−１Ｂだけをノックアウトするというような簡単な変化により、本発明者らにより知見されたような飛躍的な効果が生ずるとは考えられていなかった。この理由は、インスリン受容体の作用が複合様式で調節されることが知られていたからである。この調節に関与する種々のクラスのタンパク質の中で、幾つかのプロテインチロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）だけが関与することが知られていた。例えば、Ｋｕｌａｓら， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２４３５−２４３８は、インスリン受容体の活性がＰＴＰａｓｅ ＬＡＲによって負に調節されることを実証した。他にも、ＰＴＰａｓｅ ＳＨ２−ＰＴＰ（ａｋａ Ｓｙｐ）がインスリンの活性を正に調節することが実証されている（Ｘｉａｏら， １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２１２４４−２１２４８；Ｍｉｌａｒｓｋｉら， １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：２１２３９−２１２４３；Ｙａｍａｕｃｈｉら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２：６６４−６６８；Ｎｏｇｕｃｈｉら， １９９４， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １４：６６７４−６６８２）。Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら， １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７：１３８１１−１２３８１４は、多くのプロテインチロシンホスファターゼがＰＴＰ−１Ｂと同じ位効率的にインスリン受容体をｉｎ ｖｉｔｒｏで脱リン酸化できることを実証している。多数の他の報告により、ＰＴＰ−１Ｂ以外のＰＴＰも活性化インスリン受容体を脱リン酸化し得ることが実証されている（Ｊａｃｏｂら， １９９８， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：４８００−４８０９；Ｃｈｉａｒｕｇｉら， １９９７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２３８：６７６−６８２；Ｍｏｌｌｅｒら， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２３１２６−２３１３１）。
【００２８】
インスリン受容体活性を調節するもののような複合調節機構が存在する場合、生体哺乳動物においてその機構の１成分をノックアウトするだけでは効果はほとんど期待薄と予期されたであろう。何故ならば、その１成分の量がそれ自体有意でなかったり、あるいは該調節機構の他の成分が該ノックアウト成分の欠如を補償して、インスリン受容体のバランスをその正常な状態へと回復させたと考えられたか、のいずれかであるからである。例えば、Ａｈｍａｄら， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：２０５０３−２０５０８、２０５０８頁を参照されたい（彼らは、自分達の研究の結果を次のように要約している：インスリンのシグナリングは多くのＰＴＰａｓｅにより数段階で均衡をとっている…）。
【００２９】
これらの予想に反して、本発明は、ＰＴＰ−１Ｂ活性を変えることにより、生体哺乳動物においてインスリン受容体活性を調節することが可能であることを実証する。したがって、本発明のノックアウトマウスにより実証された結果に基づき、今や、生体哺乳動物内のインスリン受容体の活性をモジュレートするのに有用なＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビター同定が実現可能である。そのようなインヒビターは、ＩＩ型糖尿病および肥満の治療における利用性を有する。
【００３０】
本発明の以前には、そのようなＰＴＰ−１Ｂのインヒビターは恐らくインスリン受容体に対して望ましい作用を有するかもしれないが、それらは薬理学的には有用ではないと考えられていた。何故ならば、ＰＴＰ−１Ｂが、インスリン受容体の活性のモジュレーションにおけるその役割だけでなく、多くの必須の役割を有すると考えられていたからである。したがって、ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターは、予想されるインスリン受容体に対する望ましい作用に加えて、あまりにも多くの有害な副作用を有し、薬理学的には有用ではないではと考えられていた。したがって、従来技術では、インスリン受容体へのＰＴＰ−１Ｂの結合のインヒビターは有用であるかもしれないが（何故ならば、そのようなインヒビターは、インスリン受容体に特異的な作用を有するからである）、ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターは有用ではない（何故ならば、そのようなインヒビターは、より全般的な作用を有するからである）とされていた。例えば、国際特許出願ＷＯ９７／３２５９５、１１頁、３６行目〜１２頁７行目：「ホスファターゼ活性は一般に細胞にとって必須なので、ホスファターゼ活性ではなく（インスリン受容体へのＰＴＰ−１Ｂの）結合を調節することが好ましい。」を参照されたい。従来技術がＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターを用いるのを避けていた別の例は、米国特許第５，７２６，０２７号の請求項１に見ることができ、そこでは次のように書かれている：「ある組成物が、ホスファターゼ活性ではなく、リン酸化されたインスリン受容体に結合しているプロテインチロシンホスファターゼ１Ｂ（ＰＴＰ１Ｂ）を阻害するか否かを判定する方法であって、該方法は………を含む」。
【００３１】
ＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスは、ブドウ糖およびトリグリセライド代謝が改変され、ならびに高脂肪高炭水化物食を与えた場合の改変された体重増加パターンが改変されていることを除けば、生理学的に正常である、という本発明による実証に鑑みれば、従来技術がＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターには利用性がないとみなしたのは誤りであったことが明白である。本発明は、ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターがＩＩ型糖尿病の治療および肥満の調節に利用性を有する可能性があることを明らかにした。したがって、本発明は、ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターを同定する方法ならびにそのような方法により同定されたインヒビターを提供する。
【００３２】
本発明は、ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターを同定する方法であって、
（ａ） ＰＴＰ−１Ｂの酵素的に活性な調製物を用意し；および
（ｂ） ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該ＰＴＰ−１Ｂの酵素的に活性な調製物中のＰＴＰ−１Ｂの酵素活性を測定すること；
を含み、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのＰＴＰ−１Ｂの酵素活性が低下していれば、該物質がＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであることを示すものとする方法を提供する。
【００３３】
もちろん、上記の方法は、ステップ（ｂ）が、ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであると思われる物質１種だけでなく、複数のＰＴＰ−１Ｂ酵素活性のインヒビターであると思われる物質を用いて行われるよう実施してもよい。この様式での該方法の実施の一例は、酵素的に活性なＰＴＰ−１Ｂの調製物に対する化合物のライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリー）のスクリーニングである。そのような場合、典型的には、該ライブラリー中の物質のごく一部だけがＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであることがわかる。該ライブラリーが大きい場合には、ステップ（ｂ）での使用のために、それを便宜上化合物の小さな部分に分けてもよい。
【００３４】
本発明は、ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性のインヒビターを同定する方法であって、
（ａ） 細胞を、ヒトＰＴＰ−１Ｂタンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクトし；
（ｂ） ステップ（ａ）の細胞を、ＰＴＰ−１Ｂタンパク質が産生されるような条件下で培養し；および
（ｃ） 該ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性を測定すること；
を含み、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下での該ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性が低下していれば、該物質が該ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性のインヒビターであることを示すものとする方法を提供する。
【００３５】
上記の方法は、ステップ（ｃ）が、ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる単独物質ではなく、ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる複数の物質を用いて行われるよう実施してもよい。この様式での方法の実施の一例は、化合物のライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリー）のスクリーニングである。そのような場合、典型的には、該ライブラリー中の物質のごく一部だけがＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性のインヒビターであることがわかる。該ライブラリーが大きい場合には、ステップ（ｃ）での使用のために、それを便宜上化合物の小さな部分に分けてもよい。
【００３６】
ステップ（ａ）の細胞は、原核性もしくは真核性であってもよく、哺乳動物、両性類、細菌もしくは酵母のものであってもよい。好適であり市販されている哺乳動物種から誘導される細胞系としては、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １．２）、２９３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、ラジ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２６）およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １７１）が挙げられるが、それらに限定されない。好ましい実施形態では、この細胞は、本発明のＰＴＰ−１Ｂヌルノックアウトマウスから誘導されている細胞である。
【００３７】
トランスフェクションには、ＰＴＰ−１Ｂタンパク質をコードするＤＮＡ配列を該細胞に導入するための当業界で公知の任意の方法を包含する。例えば、トランスフェクションには、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム媒介トランスフェクション、リポフェクション、ＰＴＰ−１Ｂタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むレトロウイルス構築物の感染、およびエレクトロポレーションが含まれる。
【００３８】
ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性を測定する方法は、当業界で公知の任意の方法により行うことができる。例えば、ＰＴＰ−１Ｂによるインスリン受容体の脱リン酸化は、Ｍａｅｇａｗａら， １９９５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：７７２４−７７３０のようにして測定できる。またＨｕｙｅｒら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：８４３−８５１を参照されたい。他の方法としては、例えばＰＴＰ−１Ｂを免疫沈降させることによる無傷の細胞内でのＰＴＰ−１Ｂの活性の測定、およびＦＤＰ、ＭＵＰ、ｐ−ニトロフェニルホスフェート、ホスホチロシルペプチドまたは３２Ｐ／３３Ｐ標識したリンペプチドもしくはリンタンパク質のような種々の人工基質を用いたその活性の測定が挙げられる。さらに、ＰＴＰ−１Ｂの活性は、インスリン受容体だけでなくＰＴＰ−１Ｂの他の基質のホルホチロシル状態を追跡することにより測定できる。また、インスリン受容体が（肝臓においてのように）長期にわたってリン酸化されたままでいる場合、あるいはインスリン受容体が（筋肉においてのように）高リン酸化されている場合、インスリンカスケードに関与するタンパク質のリン酸化状態および該カスケードの生化学的作用は増大する。したがって、ブドウ糖の輸送、グリコーゲンの合成、アミノ酸の輸送、タンパク質の合成、インスリン受容体基質のリン酸化状態、Ｐ３Ｉキナーゼ活性、Ａｋｔキナーゼ活性などの因子を測定することにより、無傷の細胞中のＰＴＰ−１Ｂの活性を間接的に追跡することができる。
【００３９】
上記の方法のステップ（ｃ）において、トランスフェクトされた細胞はそのまま用いてもよいし、あるいはそれらをまず溶解させてもよく、該細胞の特定の画分または該細胞からのＰＴＰ−１Ｂタンパク質の部分精製または全精製した調製物を用いてもよい。
【００４０】
上記の方法により同定された物質は、それら物質がＰＴＰ−１Ｂの酵素活性の特異的なインヒビターである場合、すなわちそれら物質が別のプロテインチロシンホスファターゼの活性を阻害しない場合に特に有用である。したがって、通常、上記の方法により同定されたインヒビターを取り出し、さらにＬＡＲ、ｓｙｐ、ＣＤ４５等の他のプロテインチロシンホスファターゼに対してそれらをスクリーニングすることは意義がある。
【００４１】
ＰＴＰ−１Ｂ酵素活性のインヒビターを同定する上記の方法は、同法で同定された物質がＩＩ型糖尿病および関連する合併症の治療または肥満の調節に用い得るか否かを判定する方法となるように変更してもよい。これは、ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターとして同定された物質を取り出し、それらの物質が哺乳動物（例えばマウス、ラットもしくはヒト）におけるブドウ糖レベルもしくはトリグリセライドレベルをモジュレートするか否か、またはそれらの物質が高脂肪高炭水化物食を与えた哺乳動物（例えばマウス、ラットもしくはヒト）における肥満を予防もしくは軽減するか否かを判定することを必要とする。
【００４２】
したがって、本発明は、ある物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートするか否かを判定する方法であって、
（ａ） ＰＴＰ−１Ｂの酵素的に活性な調製物を用意し；
（ｂ） ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該ＰＴＰ−１Ｂの酵素的に活性な調製物中のＰＴＰ−１Ｂの酵素活性を測定し、それにより、ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質を同定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのＰＴＰ−１Ｂの酵素活性が低下していれば、該物質がＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであることを示すものとし；
（ｃ） 該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し；および
（ｄ） ステップ（ｃ）の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを測定し、ステップ（ｃ）の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較すること；
を含み、その際、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較した場合に、ステップ（ｃ）の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルに差があれば、該物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートすることを示すものとする方法を提供する。
特定の実施形態では、該哺乳動物はマウスまたはラットである。別の実施形態では、該動物はヒトである。
【００４３】
本発明は、上記の方法により同定された物質を提供する。そのような物質は、ヒトのＩＩ型糖尿病および関連する合併症の治療における利用性を有することが期待される。
【００４４】
本発明は、ある物質が哺乳動物における肥満を調節するか否かを判定する方法であって、
（ａ） ＰＴＰ−１Ｂの酵素的に活性な調製物を用意し；
（ｂ） ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で該ＰＴＰ−１Ｂの酵素的に活性な調製物中のＰＴＰ−１Ｂの酵素活性を測定し、それにより、ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質を同定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのＰＴＰ−１Ｂの酵素活性が低下していれば、該物質がＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであることを示すものとし；
（ｃ） 該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し；および
（ｄ） ステップ（ｃ）の哺乳動物に高脂肪高炭水化物食を与えた場合のステップ（ｃ）の哺乳動物の体重増加を測定し、該ステップ（ｃ）の哺乳動物の体重増加を、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されてはいないが、高脂肪高炭水化物食を与えた哺乳動物の体重増加と比較すること；
を含み、その際、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の体重増加と比較した場合に、ステップ（ｃ）の哺乳動物の体重増加に差があれば、該物質が哺乳動物における肥満を調節することを示すものとする方法を提供する。
【００４５】
特定の実施形態では、該哺乳動物はマウスまたはラットである。別の実施形態では、該動物はヒトである。
本発明は、上記の方法により同定された物質を提供する。そのような物質は、ヒトの肥満の調節における利用性を有することが期待される。
【００４６】
本発明は、ある物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートするか否かを判定する方法であって、
（ａ） 細胞を、ヒトＰＴＰ−１Ｂタンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクトし；
（ｂ） ステップ（ａ）の細胞を、ＰＴＰ−１Ｂタンパク質が産生されるような条件下で培養し；
（ｃ） ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で、該トランスフェクト細胞内での該ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性を測定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性が低下していれば、該物質がＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性のインヒビターであることを示すものとし；
（ｄ） 該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し；および
（ｅ） ステップ（ｄ）の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを測定し、ステップ（ｄ）の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルを、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較すること；
を含み、その際、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルと比較した場合に、ステップ（ｃ）の哺乳動物の血中ブドウ糖レベルまたは血中トリグリセライドレベルに差があれば、該物質が哺乳動物におけるブドウ糖レベルまたはトリグリセライドレベルをモジュレートすることを示すものとする方法を提供する。
特定の実施形態では、該哺乳動物はマウスまたはラットである。別の実施形態では、該動物はヒトである。
【００４７】
本発明は、ある物質が哺乳動物における肥満を調節するか否かを判定する方法であって、
（ａ） 細胞を、ヒトＰＴＰ−１Ｂタンパク質をコードするＤＮＡでトランスフェクトし；
（ｂ） ステップ（ａ）の細胞を、ＰＴＰ−１Ｂタンパク質が産生されるような条件下で培養し；
（ｃ） ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターであると思われる物質の存在下および不在下で、該トランスフェクト細胞内での該ＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性を測定し、その際、該物質の不在下と比較して該物質の存在下でのＰＴＰ−１Ｂの酵素活性が低下していれば、該物質がＰＴＰ−１Ｂタンパク質の酵素活性のインヒビターであることを示すものとし；
（ｄ） 該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質を哺乳動物に投与し；および
（ｅ） ステップ（ｄ）の哺乳動物に高脂肪高炭水化物食を与えた場合の該ステップ（ｃ）の哺乳動物の体重増加を測定し、該ステップ（ｄ）の哺乳動物の体重増加を、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されてはいないが、高脂肪高炭水化物食を与えた哺乳動物の体重増加と比較すること；
を含み、その際、該ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターである物質が投与されていない哺乳動物の体重増加と比較した場合に、ステップ（ｄ）の哺乳動物の体重増加に差があれば、該物質が哺乳動物における肥満を調節することを示すものとする方法を提供する。
【００４８】
特定の実施形態では、該哺乳動物はマウスまたはラットである。別の実施形態では、該動物はヒトである。
本発明は、上記の方法により同定されたＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターを包含する。そのようなインヒビターは多くの用途を有する。例えば、そのようなインヒビターは、ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターを肥満哺乳動物に投与することを含む肥満の治療方法において使用可能である。そのようなインヒビターはまた、ＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターをＩＩ型糖尿病に罹患しているヒトに投与する等、ＩＩ型糖尿病および関連する合併症の治療方法においても使用可能である。
【００４９】
そのようなインヒビターは、通常、使用前に製剤上許容される担体と混ぜ合わせる。そのような担体、ならびにインヒビターと担体とを含有する製薬上許容される組成物の配合方法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに見ることができる。有効な投与に適する製薬上許容される組成物を形成するためには、そのような組成物は有効量の該インヒビターを含有する。
【００５０】
治療用または予防用組成物は、肥満またはＩＩ型糖尿病の治療または予防に有効な量で個体に投与される。この有効な量は、個体の症状、体重、性別および年齢のような種々の要因に応じて様々に異なり得る。他の要因としては、投与形態が挙げられる。適切な量は、習熟した医師であれば決定できる。
組成物は単独で適切な投与量にて用いることができる。あるいはまた、他の薬物の同時投与または連続投与も望ましいものであり得る。
【００５１】
該組成物は、慣用の投与用ビヒクル中での多種多様な治療剤型で投与できる。例えば、該組成物は、錠剤、カプセル剤（それぞれ、間歇放出処方および持続的放出処方を含む）、丸剤、粉剤、顆粒剤、エリキシル剤、チンキ剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤および乳濁剤のような経口剤型で、または注射により投与可能である。同様に、それらはまた、静脈内（ボーラスまたは輸液の両者）、腹腔内、皮下、収蔵（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）を伴うもしくは伴わない局所的、または筋肉内の形態（それらは全て、製剤技術分野の当業者には周知の形態を用いる）で投与してもよい。
【００５２】
有利には、組成物は単回日用量で投与してもよく、または総日用量を１日２回、３回または４回の分割用量で投与してもよい。さらに、組成物は、適切な鼻腔内用ビヒクルの局所的使用により、または当業者に周知の経皮用皮膚パッチの形態を用いて経皮経路により鼻腔内の形態で投与してもよい。経皮送達システムの形態で投与されるためには、用量の投与は、もちろん投与レジュメ全体を通して断続的ではなく連続的である。
【００５３】
該組成物を用いる投与レジュメは、患者のタイプ、種、年齢、体重、性別および医学的症状；治療しようとする症状の重篤度；投与経路；患者の腎機能、肝機能および心臓血管機能；用いるその特定の組成；などの種々の要因に応じて選択される。熟練した医師または獣医師であれば、症状の進行を予防、抑制（ｃｏｕｎｔｅｒ）または阻止するのに必要な該組成物の有効量を容易に決定し処方することができる。毒性を伴わずに効力をもたらす範囲内の組成物濃度を達成する上での最良の正確さには、標的部位への該組成物の利用可能性の動態に基づくレジュメが必要である。これには、組成物の分布、均衡および排除を考慮することが含まれる。
本発明をより良く説明するために、以下の非限定的実施例を示す。
【００５４】
実施例１
ターゲッティングベクターの構築
ターゲッティングベクターを構築するために、マウスＰＴＰ−１Ｂ遺伝子を１２９／Ｓｖマウスゲノムライブラリーからクローニングし、特性決定した。このマウスＰＴＰ−１Ｂ遺伝子は、ヒト（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ３１７３２４；Ｃｈｅｒｎｏｆｆら， １９９０， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２７３５−２７３９も参照されたい）およびマウス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ９７５９０；Ｍｉｙａｓａｋａら， １９９０， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １８５：８１８−８２５も参照されたい）のＰＴＰ−１Ｂ ｃＤＮＡをプローブとして用いて、ラムダＦＩＸ ＩＩ １２９／ＳｖＪマウスのゲノムライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）をスクリーニングすることにより単離する。オーバーラップしている３つのλクローンを単離し、マウスＰＴＰ−１Ｂ遺伝子のゲノム構成およびエキソン配列を決定した。この３つのλクローンは、該ｃＤＮＡの５′隣接領域および最初の１９０ｂｐを除くＰＴＰ−１Ｂ遺伝子の大部分を含んでいた（図１Ａ）。この遺伝子は、２０ｋｂ以上にも及ぶ少なくとも９のエキソンからなる。ターゲッティングベクター（図１Ａ）は、エキソン５およびエキソン６（これはチロシンホスファターゼ活性部位であるシステイン２１５を含む）を含むゲノム配列を欠失させ、この欠失配列をネオマイシン耐性遺伝子で置き換えて得た。これは、ＰＧＫプロモーターにより駆動されるｎｅｏマーカー遺伝子（ＰＧＫ−ｎｅｏ）をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）のＳｍａＩ部位にクローニングすることにより達成した（ｐｎｅｏＫＳ）。次に、この５．５ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩマウスＰＴＰ−１Ｂゲノム断片（エキソン５のすぐ５′側）を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ消化ｐｎｅｏＫＳに挿入した。次に、このベクターをＸｂａＩおよびＮｏｔＩで消化し、１．６ｋｂのＸｂａＩ／ＸｈｏＩマウスＰＴＰ−１Ｂゲノム断片（エキソン６のすぐ３′側）およびＰＧＫプロモーター断片により駆動されるＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子と連結させた。得られたターゲッティングベクター（ｐＴＡＲＧＥＴ）はＨｉｎｄＩＩＩ消化により線状にした。
【００５５】
実施例２
ノックアウトマウスの作製
該ターゲッティングベクターを１２９／Ｓｖ胚性幹細胞（Ｊ１）にエレクトロポレーションし、先に記載（Ｙｏｕ−Ｔｅｎら， １９９７， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：６８３−６９３）のようにしてＧ４１８耐性コロニーを選択した。Ｊ１細胞は、単に説明のためのもので、例えばＥＳ−Ｄ３細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−１９３４）のような他の胚性幹細胞系も適する。ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ消化した後でサザンブロッティングおよびプローブＡを用いたハイブリダイゼーションにより、Ｇ４１８に耐性のコロニーを相同組換えについて分析した。プローブＡは、図１Ａで「３′プローブ」として示す８００ｂｐのＸｈｏＩ／ＢａｍＨＩ断片である。耐性コロニーの約２％が相同組換え事象を示す。次に、これらのＧ４１８耐性ＥＳ細胞クローンの２つを、先に記載（Ｙｏｕ−Ｔｅｎら， １９９７， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８６：６８３−６９３）のようなＢａｌｂ／ｃ胚盤胞へにマイクロインジェクションに用いた。各系統について生殖系の伝達（ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）が得られ、Ｆ１ヘテロ接合体を交配させて、ＰＴＰ−１Ｂ突然変異についてホモ接合型の動物（すなわちヌルマウス）を得た。サザンブロッティングにより遺伝子型決定を行った（図１Ｂ）。ＰＴＰ−１Ｂヘテロ接合型マウスではマウス３．４ｋｂおよび２．７ｋｂの２本のバンドが見え、ＰＴＰ−１Ｂヌルマウスでは１本の２．７ｂｋのバンドが見える。肝臓ミクロソームのイムノブロット分析により、ＰＴＰ−１ＢヌルマウスにはＰＴＰ−１Ｂタンパク質が存在しないことが明らかになった（図１Ｃ）。これらの結果から、ＰＴＰヌルマウスにはＰＴＰ−１Ｂ酵素が欠失していることが実証される。
【００５６】
実施例３
普通食を与えたノックアウトマウスにおけるブドウ糖レベルおよびインスリンレベル
絶食させたマウスおよび普通の（すなわち非高脂肪で非高炭水化物の）食餌を与えたマウスにおいてブドウ糖レベルおよびインスリンレベルを測定した（図２）。給餌状態において、ヌルマウスは、血中ブドウ糖レベルにおいて野生型マウスと比較して有意な（Ｐ≦０．０１）１３％の低下があったが、ヘテロ接合体では野生型と比較した場合に８％の低下であった（図２Ａ）。驚くべきことに、ヌルマウスはまた、循環インスリンレベルが野生型の給餌マウスの場合の約半分であった（図２Ｂ）。これらの結果から、給餌ＰＴＰ−１Ｂ欠失マウスは、インスリンに対して一層感受性であり、その結果、非常に少ないインスリンに応答してブドウ糖が大きく低下することが示唆される。絶食状態では、野生型、ヌルおよびヘテロ接合型マウスの間ではブドウ糖レベルにもインスリンレベルにも有意な差はなかった。しかし、ＰＴＰ−１Ｂヌルマウスおよびヘテロ接合型ノックアウトマウスでは、絶食状態において、野生型マウスと比較した場合にトリグリセライドレベルの実質的な低下があった。絶食させたヌルマウスにおけるトリグリセライドレベル（０．８６±０．１８ｍＭ／Ｌ）は、野生型マウスの場合（１．８４±０．７６ｍＭ／Ｌ）よりも約５０％低く、ヘテロ接合体（１．４３±０．４４ｍＭ／Ｌ）では２０％低かった。表１を参照されたい。
【００５７】
【表１】
2004514402.tif 000003
表１．普通食または高脂肪高炭水化物食を与えた雄性ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）、野生型およびヘテロ接合型の同腹子の空腹時ブドウ糖、トリグリセライドおよびインスリンレベル。値は平均±標準偏差として示す。両側非対応スチューデントｔ検定を用いて統計的解析を行い、野生型と比較した。ＮＤ、測定せず。†（Ｐ＝０．１）、＊（Ｐ＜０．０５）（ｎ＝６〜１０）。
【００５８】
給餌状態におけるトリグリセライドレベルは影響を受けなかった。これらのデータから、ノックアウトマウスではＰＴＰ−１Ｂの喪失がブドウ糖およびトリグリセライドのホメオスタシスに影響を及ぼすことが実証され、このことは初めて、無傷の哺乳動物のインスリンシグナリング経路においてＰＴＰ−１Ｂを強く関連付けた。
【００５９】
普通食を与えたＰＴＰ−１Ｂヌルマウスおよび野生型マウスのインスリン感受性を、経口耐ブドウ糖能試験および腹腔内耐インスリン能試験を行うことによりさらに調べた。ブドウ糖のボーラスをＰＴＰ−１Ｂヌルマウスに投与したところ、野生型マウスで観察されたものよりも迅速なブドウ糖のクリアランスが起こった（図３Ａ）。野生型動物では、ＰＴＰ−１Ｂヌルマウスと比較した場合、胃管栄養法（ｇａｖａｇｅ）後の全ての時点においてより顕著な高血糖があった。インスリンを注射した際には、インスリン感受性の増大も見られた（図３Ｂ）。ヌルマウスおよび野生型マウスのいずれでも、注射の３０分後および６０分後では低血糖が明らかになった。野生型のブドウ糖レベルは１２０分後に正常レベルに近づいたが、ＰＴＰ−１Ｂヌルマウスは低血糖のままであった（Ｐ＜０．０２）。
【００６０】
実施例４
ノックアウトマウスにおけるインスリン受容体およびインスリン受容体基質−１のチロシンリン酸化
ＰＴＰ−１Ｂがｉｎ ｖｉｖｏでの（すなわち、哺乳動物生体内での）インスリン受容体のリン酸化に影響を及ぼすかを判定するため、インスリンチャレンジ後にノックアウトマウスおよび野生型マウスの両者につき、インスリン受容体のホスホチロシンレベルを測定した。インスリンはボーラスとして下大静脈に注射し、注射後の各時点で組織サンプルを採取して、インスリン受容体の脱リン酸化の経時的変化を測定した。次に、インスリン受容体β−サブユニットを組織ホモジネートの膜画分から免疫沈降させ、抗ホスホチロシン抗体でイムノブロットして、インスリン受容体のリン酸化レベルを求めた。次に、該ブロットをストリップし、Ｃ末端β−サブユニット抗体で再プローブして該ブロット上の該β−サブユニットの量を求め、ホスホチロシンシグナルを該β−サブユニットの量に対して正規化した。ヌルマウスおよび野生型マウスの両者とも、肝臓または筋肉において、インスリン不在下でのインスリン受容体リン酸化のレベルは非常に低かった（図４ＡおよびＢ）。野生型マウスをインスリン処理したところ、肝臓におけるインスリン受容体のチロシンリン酸化レベルは飛躍的に増大し（図４Ａ）、これは、注射後５分（図４Ａ）までに１分の時点のレベルの約５０％まで低下した（Ｐ＜０．０５）。肝臓におけるインスリン受容体リン酸化のこの経時的変化は、先にｔ１／２が６分のラットにおいて観察されていた（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇら， １９９１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：８３０２−８３１１）。しかし、同様に処理したヌルマウスでは、肝臓におけるインスリン受容体リン酸化の動態は、野生型マウスにおいて見られるものとは有意に異なっていた。即ちインスリン受容体リン酸化のレベルは、注射１分後ではヌルマウスおよび野生型マウスの両者とも同じであったが、ヌルマウスにおいては注射５分後のチロシンリン酸化のレベルが野生型マウスとは違って低下せず、１分の時点のレベルと実質的に同じであった（Ｐ＜０．０５）。このヌルマウスにおけるインスリン受容体の高リン酸化持続から、これらのマウスではインスリン受容体もまた、より長期にわたって活性化されたままであったことが示唆される。しかし、インスリン受容体の高リン酸化に対する最も顕著な作用は、ヌルマウスの筋肉において見られた。インスリン処理したヌルマウスからの筋肉サンプ
ルにおけるインスリン受容体のホスホチロシンレベルの分析から、野生型の筋肉でのレベルと比較して、絶対的リン酸化レベルにおいて約４０％の増大があったことが明らかになった（Ｐ＜０．０５）（図４Ｂ）。肝臓でのレベルと同様に、筋肉におけるインスリン受容体リン酸化のレベルは、ヌルマウスにおいても野生型マウスにおいても実験の経過時間にわたって低下しなかった。筋肉で見られるインスリン受容体の高リン酸化が、ヌルマウス内でのインスリン受容体の過剰発現によるものである、という可能性はほとんどない。何故ならば、全組織溶解物のイムノブロティングにより測定したところ、野生型マウスおよびヌルマウスのいずれにおいてもインスリン受容体の発現レベルに検出可能な差異は見られなかったからである。ヌルマウスにおける筋肉でのインスリン受容体リン酸化のこの実質的な増大および肝臓でのインスリン受容体の持続的リン酸化は、これらのマウスにおけるインスリン感受性増大の最も可能性の高い要因である。このことはまた、（特に筋肉における）ｉｎ ｖｉｖｏでのＰＴＰ−１Ｂの基質が活性化されたインスリン受容体であることを示唆しているようでもある。
【００６１】
インスリン処理したヌルマウスの筋肉におけるインスリン受容体の高リン酸化がキナーゼ活性の増大につながることを確認するために、注射２分後のサンプルにおいてインスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）のホスホチロシンレベルを調べた（図４Ｃ）。ＩＲＳ−１は、インスリン処理したヌルマウスの筋肉では、野生型マウスと比較して、高リン酸化された（Ｐ＜０．０５）。さらに、肝臓におけるＩＲＳ−１脱リン酸化の経時変化はインスリン受容体よりもさらに迅速であり、わずか２〜３分以内でベースラインレベルまで回復することがわかっている（Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇら， １９９１， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：８３０２−８３１１）。にもかかわらず、２分の時点でのレベルと同レベルのＩＲＳ−１の高リン酸化は、注射６分後のヌル筋肉サンプルにおいても明らかであった。
【００６２】
実施例５
高脂肪高炭水化物食を与えたＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスにおける肥満抵抗性
高脂肪高炭水化物食を与えた野生型マウスは肥満になり、肥満誘導性のインスリン抵抗性を呈する（Ｕｙｓａｌら， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ， ３８９：６１０−６１４）。雄性および雌性ＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウス（ヘテロ接合体ならびにヌル）（７〜８週令）に高脂肪高炭水化物食（脂肪から５０％のカロリー、５，２８６ｋｃａｌ ｋｇ−ｌ、Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ Ｆ３２８２マウス餌料、Ｂｉｏｓｅｒｖ． Ｆｒｅｎｃｈｔｏｗｎ， ＮＪ）を与えた。対照として、野生型マウスに同じ食餌を与えた。この給餌の１０週間後、雄性および雌性の野生型同腹子は共に肥満になったが、ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスおよびＰＴＰ−１Ｂ（＋／−）マウスは食餌誘導性肥満から有意に防御された（図５）。給餌した動物の出発時の体重には有意な差はなかったが（雄、＋／＋、２７．６±１．４ｇ；＋／−、２８．５±１．２ｇ；−／−、２６．３±１．２ｇ；および雌、＋／＋、２２．１±０．８ｇ；＋／−、２２．２±０．８ｇ；−／−、２１．５±０．８ｇ）、ＰＴＰ−１Ｂヘテロ接合体およびヌル動物の両者と比較した場合の野生型マウスの最終体重（雄、＋／＋、４１．４±１．３ｇ；＋／−、３７．２±２．０ｇ；−／−、３３．５±１．６ｇ；および雌、＋／＋、３３．３±１．７ｇ；＋／−、２７．３±１．３ｇ；−／−、２７．２±１．４ｇ）は顕著な有意差を示した（ヘテロ接合型もしくはヌルに対する野生型ではＰ＜０．０５、但し、雌性のヘテロ接合体に対する野生型ではＰ＝０．１であった）。給餌において全ての動物群で消費された食餌の量は異なっておらず、このことから、ＰＴＰ−１Ｂの発現レベルの変化（ヘテロ接合体は野生型のＰＴＰ−１Ｂ発現レベルの約半分である、図１Ｃ）が食餌誘導肥満の発症に影響を及ぼし得ることが示唆される。
【００６３】
高脂肪高炭水化物食がＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）マウス、ＰＴＰ−１Ｂ（＋／−）マウスおよびＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスにおけるインスリン感受性に影響を及ぼすかを調べるために、全ての動物群について空腹時ブドウ糖およびインスリンレベル、ならびに耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験を行った（上記の表１および図６；雄の値だけが示してある、雌の値はほとんど同じ結果をもたらした。）。ＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）マウスでは、高脂肪高炭水化物食により、空腹時ブドウ糖レベルは３０％増大し、空腹時インスリンレベルは３倍増大した（表１）。これに対して、ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）動物は低いブドウ糖レベルおよびインスリンレベルを維持し、一方、高脂肪食では、普通食の場合の値と比較してレベルには有意な差異はない（表１）。これらの結果から、野生型同腹子では高脂肪食がインスリン抵抗性を引き起こすが、ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスではそうではないことが示される。脂肪を給餌したＰＴＰ−１Ｂヘテロ接合体も高い空腹時インスリンレベルを示したが、野生型よりも低い空腹時ブドウ糖レベルを有していた（表１）。ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスではまた、耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験の両者において、それらの野生型同腹子と比較してインスリン感受性の増大も見られ（図６ＡおよびＢ）、ＰＴＰ−１Ｂ（＋／−）マウスは中間の感受性を示すと思われる。耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験により測定した場合のＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスとＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）マウスとのインスリン感受性の差異は、高脂肪食においてさらに一層明らかになった（図３ＡおよびＢを図６ＡおよびＢと比較せよ）。このことはまた、高脂肪高炭水化物食を給餌したマウスにおいてインスリンチャレンジを行った後で筋肉内のインスリン受容体のチロシンリン酸化レベルを測定した場合にも同様であった（図６Ｃ）。高脂肪食が筋肉および脂肪組織において肥満に関連するインスリン受容体シグナリングの低下を引き起こすことが示されている（Ｕｙｓａｌら， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ， ３８９：６１０−６１４）。図４Ｂにおいて、普通食を与えたマウスのインスリン刺激により、ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）の筋肉では、ＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）マウスと比較して約４０％のインスリン受容体のホスホチロシンレベル増大が起こった。高脂肪食により、野生型マウスとＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスとのインスリン感受性のこの差異は、ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスが野生型よりも約４倍高いインスリン受容体リン酸化レベルを有し、一方ＰＴＰ−１Ｂ（＋／−）マウスが中間の（野生型よりも約２倍高い）レベルを示す程度まで拡大した（図６Ｃ）。高脂肪食を与えたＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）マウスでは、予想通りの表現型（つまり肥満およびインスリン抵抗性）が見られた。これに対して、ＰＴＰ−１Ｂ（＋／−）マウスおよびＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスは、それらが肥満の発症に抵抗性であったという点で予想外の表現型を示した。ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスではインスリン感受性は維持され、ＰＴＰ−１Ｂ（＋／−）マウスはＰＴＰ−１Ｂ野生型マウスおよびヌルマウスと比較して中間の感受性を示した。
【００６４】
高脂肪高炭水化物食を与えたマウスにおける上記の結果から、ＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスがこの食餌を与えた場合にインスリン感受性が維持されることが実証される。事実、それらはそれらの野生型同腹子よりもずっとインスリン感受性が高い。したがって、ＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスは、高脂肪高炭水化物食を与えた場合に（野生型マウスよりも高くないとしても）少なくとも野生型マウスと同程度には肥満に罹り易いと予想された。何故ならば、それらのインスリン感受性の増大は、脂質生成の増大を誘発すると予期されたからである。しかし、下記の実験は、全く反対のことが起こったことを示している。
【００６５】
高脂肪高炭水化物食を与えたＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスおよび野生型マウスの体重、ならびに該マウスが消費した食餌の量を各週毎に測定した。食餌の消費においては、野生型マウス、ヘテロ接合型マウス、ヌルマウスの間で本質的に差異はなかった。高脂肪高炭水化物食を与えた１０週後、野生型マウスでは約５０％体重増加し；ヘテロ接合型およびヌルマウスでは共に約２５〜３０％体重増加した。したがって、ノックアウトマウスでは、高脂肪高炭水化物食を与えた場合、野生型の体重増加の約半分であった。図５を参照のこと。これらの結果から、 ＰＴＰ−１Ｂが肥満においてある役割を担うこと、およびＰＴＰ−１Ｂの酵素活性のインヒビターが肥満の調節において薬理学上有用であることが示される。
【００６６】
実施例６
ＰＴＰ−１Ｂ−／−マウスの白色脂肪組織における脱共役タンパク質の誘導
ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスにおける肥満抵抗性の理由を調べるために、高脂肪食または普通食のいずれか一方を与えたマウスの空腹時トリグリセライドレベルを測定した。いずれの食餌を与えたＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスも、野生型マウスおよびヘテロ接合型マウスよりも有意に低いトリグリセライドレベルを有していた。ＰＴＰ−１Ｂ（＋／−）マウスは、普通食を与えた場合は野生型マウスよりもわずかに低いトリグリセライドレベルを有していたが、高脂肪高炭水化物食を与えた場合は野生型と比較して差がなかった。この結果から、ＰＴＰ−１Ｂの喪失が脂肪の代謝に影響を及ぼすことが示される。したがって、普通食または高脂肪食を与えた動物においてインスリンチャレンジを行った後で、脂肪組織内のインスリン受容体のホスホチロシンレベルを調べることとした。インスリン受容体の高リン酸化を示した肝臓および筋肉とは反対に、ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスからの脂肪では、野生型と比較してインスリン受容体の低リン酸化があると思われ、このことは、ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスの脂肪組織がある程度インスリン抵抗性であることを示唆している（図７Ａ）。このことについての支持は、高脂肪食を与えた野生型マウス（インスリン抵抗性である）がここでは、脂肪組織において基本的にＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスのものと同等のインスリン受容体リン酸化レベルを有している、という事実からくるものである（図７Ｂ）。したがって、ＰＴＰ−１Ｂ欠失マウスは、組織特異的なインスリン感受性を示すと思われる。野生型マウスと比較して、肝臓および筋肉はより感受性が高いが、脂肪組織は抵抗性であると思われる。
【００６７】
ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスの脂肪組織における改変されたインスリンシグナリングは、これらの動物で見られる肥満抵抗性に関与する要因の１つであると思われる。脂肪細胞にインスリンが作用することにより、ｃＡＭＰレベルの低下および脂質生成の刺激が起こる（Ｍａｎｇａｎｉｅｌｌｏら， １９９６， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｇｕｌ． ３４：６３−１００）。ＰＴＰ−１Ｂ欠失マウスにおいて、脂肪細胞はインスリン応答性の低下を有し、その結果、脂肪形成に対して抵抗性になる。βアドレナリン作用性受容体活性の作用によりｃＡＭＰレベルを増大させること、あるいは遺伝子ノックアウトによりプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）調節サブユニットを改変することのいずれかによるＰＫＡの活性を増大させることが、脱共役タンパク質−１（ＵＣＰ−１）の誘導により肥満抵抗性をもたらすことは十分に実証されている。ＵＣＰ−１は、ＢＡＴにおいて脂肪酸の酸化を脱共役（ｄｅｃｏｕｐｌｅ）するミトコンドリアタンパク質トランスロケーターである。このことにより、ＡＴＰ形成ではなく、脂肪酸の分解に由来するエネルギーが熱として放散され、したがって、身体の休止中の代謝速度を高める［Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｂｅｓｉｔｙ （Ｂｒａｙ， Ｇ．Ａ．編， Ｂｏｕｃｈａｒｄ， Ｃ． ＆ Ｊａｍｅｓ， Ｗ．Ｐ．Ｔ．）のＨｉｍｍｉｓ−Ｈａｇｅｎ ＆ Ｒｉｃｑｕｉｒｅ， １９９８， “Ｂｒｏｗｎ Ａｄｉｐｏｓｅ Ｔｉｓｓｕｅ”， ４１５−４４１頁（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｃｕｍｍｉｎｇｓら， １９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３８２：６２２−６２６］。脂肪組織内の改変されたイスリン受容体活性のためにＰＴＰ−１Ｂ活性の喪失がＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスの脂肪組織内のｃＡＭＰレベルに影響を及ぼしているならば、このことがＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスにおいて見られた肥満抵抗性の表現型を説明できる。ノーザンブロット分析を行って、ＵＣＰがＰＴＰ−１Ｂ野生型マウスおよびヌルマウス（普通食）の白色脂肪組織（ＷＡＴ）において誘導されるか否かを調べた。２匹の別個のＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスの腹部ＷＡＴにおけるＵＣＰ−１ ｍＲＮＡの誘導が明らかになったが、それはＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）のＷＡＴでは検出不能であった（図８Ａ）。ＵＣＰ−２ ｍＲＮＡレベルは、野生型マウスとＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスとでは変わらなかった（図８Ａ）。ＵＣＰ−１ ｍＲＮＡは、褐色脂肪細胞においてのみ発現され、白色脂肪デポーにおけるその発現は、この脂肪デポーにおいて褐色脂肪が誘導されたことを示す（Ｇｈｏｒｂａｎｉら， １９９７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５４：１２１−１３１）。野生型マウスからの鼡径部ＷＡＴの組織学的分析では、予想どおりの典型的な大きな単房性脂肪細胞が示された（図８Ｂ）。これに対して、ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスからの鼡径部ＷＡＴはより多数の小さな単房性脂肪細胞を含んでおり、そしてより重要なことに、通常この脂肪デポーでは見られない多数の多房性脂肪細胞が存在することが明らかになった（図８Ｂ）。この多房性脂肪細胞は褐色脂肪の特徴を示し、このことはＰＴＰ−１Ｂ（−／−）ＷＡＴで見られたＵＣＰ−１ ｍＲＮＡの発現と一致する。免疫学的染色により、ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスからの鼡径部ＷＡＴ内の多房性細胞は、ＵＣＰタンパク質について陽性に染色された。肩甲間のＢＡＴ（ＩＢＡＴ）を調べたところ、ＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）マウスがＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスにおいて見られるものよりも大きな脂質小滴を有する脂肪細胞を含むことが明らかになった（図８Ｃ）。
【００６８】
実施例７
ブドウ糖およびインスリンの測定
麻酔したマウスの眼窩洞から血液を採取し、血清を調製した。Ｖｉｔｒｏｓ２５０アナライザーを用いて血清中ブドウ糖レベルを測定し、およびラジオイムノアッセイ（Ｌｉｎｃｏ， Ｓｔ． Ｃｈａｒｌｅｓ， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を用いてインスリンレベルを測定した。
【００６９】
麻酔した雄性マウス（１０〜１４週令）において、一夜絶食させた後、胃管栄養法により１ｇ／ｋｇのブドウ糖を投与することにより耐ブドウ糖能を行い、ｔ＝０、３０、６０および１２０分の時点で血液を採取した。血漿を調製し、使用するまで凍結し、血清中ブドウ糖レベルを測定した。一夜絶食させた後で、０．７５Ｕ／ｋｇのレギュラーヒトインスリン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）の腹腔内注射により耐インスリン能試験を行った。耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験の両者のために、マウスの尾部から血液を採取し、１滴の血液をＯｎｅ Ｔｏｕｃｈ Ｓｔｒｉｐブドウ糖アッセイ装置にのせ、ブドウ糖レベルを対応するＯｎｅ Ｔｏｕｃｈ Ｂａｓｉｃ（Ｌｉｆｅｓｃａｎ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．， Ｂｕｒｎａｂｙ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ， Ｃａｎａｄａ）にモニターした。
【００７０】
実施例８
インスリン受容体リン酸化のｉｎ ｖｉｖｏ分析
一夜絶食させた後、マウスを麻酔し、腹腔を暴露し、５単位のレギュラーヒトインスリン（Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）または食塩水をボーラスとして下大動脈に注射した（Ａｒａｋｉら， １９９４， Ｎａｔｕｒｅ ３７２：１８６−１９０）。注射１分後、肝臓の小片を切り取り、直ちに液体窒素中で凍結した。注射の約２分後、四頭筋および腹部の脂肪の一片を切り取り、素早く凍結した。これを、肝臓、筋肉および脂肪についてそれぞれ注射の５、６および７分後にもう一度繰り返し、次いで該マウスを回復する前に犠牲にした。
【００７１】
実施例９
免疫沈降およびイムノブロット分析
野生型、ヘテロ接合型およびヌルマウスの肝臓の膜画分（２５μｇ／レーン）におけるＰＴＰ−１Ｂ発現のイムノブロット分析を、Ｎ末端特異的（アミノ酸４３〜５６）ＰＴＰ−１Ｂウサギポリクローナル抗体（ＵＢＩ）を用いて行った。増強化学発光（ＮＥＮ）を用いてブロットを発色させた。インスリン受容体β−サブユニットの免疫沈降は次のようにして行った。肝臓、脂肪または筋肉のいずれかの組織を氷上で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ピロホスフェート、１００μＭパーバナデート（ｐｅｒｖａｎａｄａｔｅ）（強力なＰＴＰａｓｅインヒビター；Ｈｕｙｅｒら， １９９７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：８４３−８５１）およびプロテアーゼインヒビター溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中でホモジナイズした。膜画分は１００，０００×ｇで１時間遠心分離することより調製し、タンパク質濃度を求めた。２００μｇの肝臓もしくは筋肉膜タンパク質、または１００μｇの脂肪膜タンパク質を免疫沈降用緩衝液（ＲＩＰＡ）（１５０ｍＭ ＮａＣｌ， １０ｍＭリン酸緩衝液 ｐＨ ７．５、１％ＮＰ−４０、１％Ｎａデオキシコレート、０．１％ＳＤＳ）中に溶解し、インスリン受容体β−サブユニットの免疫沈降を１μｇの抗インスリン受容体抗体（Ｃ−１９）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）を用いて４℃にて一夜行い、続いてプロテインＧセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の５０％スラリー５０μｌを６０分間インキュベートした。該サンプルを１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄し、サンプルを８％ＳＤＳ ＰＡＧＥにかけた。該サンプルをＰＶＤＦ膜に移し、ホスホチロシンの免疫検出（ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）を抗ホスホチロシン４Ｇ１０西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて製造業者推奨手順に従って行った。同じブロットを６２．５ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ ６．７、２％ｗ／ｖ ＳＤＳ、１００ｍＭ β−メルカプトエタノール中で５５℃にて３０分間ストリップし、洗浄し、抗インスリンβ−サブユニットＲｂ（Ｃ−１９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）で再プローブした。次に、ホスホチロシンシグナルおよびβ−サブユニットレベルをデンシトメトリー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）により定量し、ホスホチロシンレベルを各サンプル中に存在するβ−サブユニットの量について正規化した。ＩＲＳ−１の免疫沈降は、２種のＩＲＳ−１ウサギポリクローナル抗体（Ｃ−２０、Ｃ末端特異的；およびＡ−１９、Ｎ末端特異的、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）を用い、インスリン処理マウスの筋肉からの細胞質ゾル画分を用いて上記のようにして行った。
【００７２】
本発明は、本明細書中に記載の特定の実施形態により範囲が限定されるものではない。事実、上記の記載から、本明細書に記載のものに加えて種々の本発明の変更が当業者には明らかとなるであろう。そのような変更は、添付の請求の範囲の範囲内にあるものとする。種々の刊行物が本明細書中に引用されており、それらの開示内容は引用によりそれらの全文を本明細書に組み入れる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＰＴＰ−１Ｂ座の遺伝子ターゲッティングを示す。Ａ）マウスＰＴＰ−１Ｂ遺伝子のゲノム構成およびターゲッティングベクターの設計。エキソンは枠で示し、活性部位システインを含むエキソン６は未充填である。制限エンドヌクレアーゼ認識部位は次のように略す：Ｂ＝ＢａｍＨＩ；Ｅ＝ＥｃｏＲＩ；Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｘｂ＝ＸｂａＩ；Ｘｈ＝ＸｈｏＩ。下図は相同組換え事象のゲノム構造である。Ｂ）野生型（＋／＋）、ヘテロ接合型（＋／−）およびホモ接合型（「ヌル」）（−／−）ＰＴＰ−１Ｂ子孫を生じるヘテロ接合交雑からのＢａｍＨＩで消化した尾部ＤＮＡ上でＰＴＰ−１Ｂ ３′プローブを用いた代表的なゲノムサザンブロット。Ｃ）ＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）、ＰＴＰ−１Ｂ（＋／−）およびＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスからの肝臓膜サンプルのＰＴＰ−１Ｂイムノブロット分析。
【図２】
図２は、普通（すなわち、非高脂肪で非高炭水化物）の食餌を与えて自由に給餌させたＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）、ＰＴＰ−１Ｂ（＋／−）およびＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウス、および一夜絶食させたそれらマウスのブドウ糖レベルおよびインスリンレベル。Ａ）のブドウ糖レベルおよびＢ）のインスリンレベルは、本明細書の実施例に記載のようにして測定した。マウスの数は、給餌群ＡおよびＢでは（ｎ＝１９〜２１）であり、絶食群Ａでは（ｎ＝８〜１０）およびＢ群では（ｎ＝６）であった。値は平均±標準偏差として示した。両側非対応スチューデントｔ検定を用いて統計的解析を行った。＊、（Ｐ＝０．０６）、＊＊、（Ｐ≦０．０１）。
【図３】
図３は、普通（すなわち、非高脂肪で非高炭水化物）の食餌を与えたＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）（野生型）マウスおよびＰＴＰ−１Ｂ（−／−）（ヌル）マウスの耐ブドウ糖能試験および耐インスリン能試験を示す。Ａ）耐ブドウ糖能は１０〜１４週令の雄性マウス（ｎ＝１１〜１２）について行った；■＝野生型；●＝ヌル。Ｂ）耐インスリン能は１０〜１４週令の雄性マウス（ｎ＝５〜６）について行った；■＝野生型；●＝ヌル。データは平均±標準偏差として示した。両側非対応スチューデントｔ検定を用いて統計的解析を行い、野生型と比較した。＊、（Ｐ≦０．０５）、＊＊、（Ｐ≦０．０２）。
【図４】
図４は、マウスＰＴＰ−１Ｂ遺伝子の破壊が普通（すなわち、非高脂肪で非高炭水化物）の食餌を与えたマウスにおけるインスリン受容体（ＩＲ）の過度で長期にわたるチロシンリン酸化を引き起こすことを示す。Ａ）ＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）マウスおよびＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスについて指示した時間にわたって肝臓においてインスリンチャレンジを行った後の、ＩＲ β−サブユニットについてのチロシンリン酸化の経時的変化を示す代表的なイムノブロット。イムノブロットからのインスリン受容体β−サブユニットホスホチロシンレベルの定量化はデンシトメトリーにより行った。データは、各動物について１分の時点でのホスホチロシンインスリン受容体β−サブユニットレベルを１００％と設定し、同じ動物についてのその後５分の時点でのレべルをこの値と比較することにより表わす。結果は、３つの別個の実験から、それぞれ５匹のＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスおよびＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）マウスからのものである。Ｂ）インスリン処理したＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）マウスおよびＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスからの筋肉におけるＩＲ β−サブユニットのリン酸化レベルを示すイムノブロット。イムノブロット（ｎ＝３）からの定量データは、任意のデンシトメーター単位で、野生型マウスからの２分の時点のものを１００と設定して示す。Ｃ）注射２分後の、インスリン処理したＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）マウスおよびＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウス（ｎ＝３）からの筋肉からのＩＲＳ−１イムノブロット。このイムノブロットに用いたＳＤＳポリアクリルアミド（７．５％）ゲル（１５ｃｍ×１５ｃｍ）において、ＩＲＳ−１は拡散した１８５ｋＤのバンドとして移動した。データは平均±標準偏差として示した。両側非対応スチューデントｔ検定を用いて統計的解析を行い、Ａ）では１分の時点での値を５分の時点の値と比較し、Ｂ）ではＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスの２分および６分の時点の値をＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）マウスのそれぞれの値と比較した、＊（Ｐ≦０．０５）。
【図５】
図５は、高脂肪高炭水化物食を与えたＡ）雄性およびＢ）雌性のヌルノックアウト、ヘテロ接合型ノックアウト、および野生型マウスの体重増加を示す。Ａ）雄性マウス；◆＝野生型、ｎ＝７；■＝ヘテロ接合型、ｎ＝９；▲ヌル、ｎ＝８。Ｂ）雌性マウス；◆＝野生型、ｎ＝９；■＝ヘテロ接合型、ｎ＝９；▲ヌル、ｎ＝８。
【図６】
図６は、高脂肪高炭水化物食を与えたマウスにおけるブドウ糖およびインスリンチャレンジを示し、ＰＴＰ−１Ｂ野生型マウスではインスリン抵抗性が生じ、ＰＴＰ−１Ｂノックアウトマウスではインスリン抵抗性が相対的に欠如していることを実証している。高脂肪高炭水化物食を与えた雄性マウスにおけるＡ）耐ブドウ糖能試験およびＢ）耐インスリン能試験。◆＝野生型、ｎ＝７；■＝ヘテロ接合型、ｎ＝７（Ａ）または８（Ｂ）；▲ヌル、ｎ＝７。Ｃ）高脂肪高炭水化物食を与えたマウスの筋肉におけるインスリン刺激インスリン受容体チロシンリン酸化レベル［ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）およびＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）、ｎ＝２；ＰＴＰ−１Ｂ（＋／−）、ｎ＝３）。イムノブロットの定量化は図４に記載のようにして行った。＊（Ｐ≦０．０５）。
【図７】
図７は、ＰＴＰ−１Ｂ（＋／＋）マウスおよびＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスにおけるインスリンチャレンジ後の脂肪中インスリン受容体のチロシンリン酸化レベルを示す。普通食を与えたマウスＡ）および高脂肪食を与えたマウスＢ）からの脂肪中のインスリン受容体ホスホチロシンのレベル。イムノブロットの定量化は、図４に記載のようにして、野生型マウスの３分の時点のものを１００と設定した。データは、各群からの２匹のマウスの平均±標準偏差を表わす。
【図８】
図８は、ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスの白色脂肪組織における脱共役タンパク質−１（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−１）および褐色脂肪細胞の誘導を示す。Ａ）野生型マウス（ｎ＝２）およびＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウス（ｎ＝２）の腹部脂肪におけるＵＣＰ−１およびＵＣＰ−２ ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット分析。Ｂ）野生型マウスおよびＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスからの鼡径部白色脂肪組織（ＩＷＡＴ）の組織学であり、ＰＴＰ−１Ｂ（−／−）のＩＷＡＴでは多房性脂肪細胞が誘導されることを示している。Ｃ）野生型マウスおよびＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスからの肩甲間褐色脂肪組織（ＩＢＡＴ）の組織学。野生型のＩＢＡＴ脂肪細胞ではＰＴＰ−１Ｂ（−／−）マウスのＩＢＡＴと比較して大きな脂肪小滴が見られることに注目されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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