(57)【要約】アンチゲノムのメッセージセンス中にゲノムの完全な配列を提供する、負鎖のインフルエンザＡウイルス株Ａ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）の８個のセグメントのそれぞれの完全なヌクレオチド配列を開示する。該配列は診断において有用であり、かつ、突然変異により改変して新たなインフルエンザＡ変異体株を生成させることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
正鎖のアンチゲノムメッセージセンス中にインフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株の完全なヌクレオチド配列を含んで成り、ここで、前記完全な配列は：（ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１７、もしくは（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７および配列番号２１よりなる、単離された核酸分子。
【請求項２】
インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株の完全なヌクレオチド配列を含んで成り、ここで、前記完全な配列は配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１７よりなる、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株の完全なヌクレオチド配列を含んで成り、ここで、前記完全な配列は配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７および配列番号２１よりなる、請求項１記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
正鎖のアンチゲノムメッセージセンス中に別個のインフルエンザＡウイルスのヌクレオチド配列を含んで成り、ここで、前記配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１１および配列番号２１よりなる群から選択される、単離された核酸分子。
【請求項５】
インフルエンザＡウイルスのヌクレオチド配列が配列番号１である、請求項４記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
インフルエンザＡウイルスのヌクレオチド配列が配列番号３である、請求項４記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
インフルエンザＡウイルスのヌクレオチド配列が配列番号５である、請求項４記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
インフルエンザＡウイルスのヌクレオチド配列が配列番号７である、請求項４記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
インフルエンザＡウイルスのヌクレオチド配列が配列番号１１である、請求項４記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
インフルエンザＡウイルスのヌクレオチド配列が配列番号２１である、請求項４記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
正鎖のアンチゲノムメッセージセンス中に別個のインフルエンザＡウイルスのヌクレオチド配列を含んで成り、ここで、前記配列が配列番号２、配列番号４および配列番号６よりなる群から選択される配列を有するタンパク質をコードする、単離された核酸分子。
【請求項１２】
インフルエンザＡウイルスのヌクレオチド配列が、その配列が配列番号２であるタンパク質をコードする、請求項１１記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
インフルエンザＡウイルスのヌクレオチド配列が、その配列が配列番号４であるタンパク質をコードする、請求項１１記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
インフルエンザＡウイルスのヌクレオチド配列が、その配列が配列番号６であるタンパク質をコードする、請求項１１記載の単離された核酸分子。
【請求項１５】
別個のインフルエンザＡウイルスのアミノ酸配列を含んで成り、ここで、前記配列は配列番号２、配列番号４および配列番号６よりなる群から選択される、単離されたアミノ酸配列。
【請求項１６】
インフルエンザＡウイルスのアミノ酸配列が配列番号２である、請求項１５記載の単離されたアミノ酸配列。
【請求項１７】
インフルエンザＡウイルスのアミノ酸配列が配列番号４である、請求項１５記載の単離されたアミノ酸配列。
【請求項１８】
インフルエンザＡウイルスのアミノ酸配列が配列番号６である、請求項１５記載の単離されたアミノ酸配列。
【請求項１９】
別個のインフルエンザＡウイルス配列を含んで成り、ここで前記配列が配列番号８である、単離されたアミノ酸配列。
【請求項２０】
別個のインフルエンザＡウイルス配列を含んで成り、ここで前記配列が配列番号１２である、単離されたアミノ酸配列。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、インフルエンザウイルス株Ａ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）のセグメントのそれぞれのヌクレオチド配列に関する。
【０００２】
（発明の背景）
インフルエンザウイルスはＡ、ＢおよびＣと呼称されるサブタイプよりなる。インフルエンザＡウイルスは８個のセグメントの一本の負鎖ＲＮＡゲノムを所有し、それはウイルスの生活環に必要とされる１０種のポリペプチド（タンパク質）をコードする。タンパク質の順序は以下のとおりである：
【０００３】
【表１】
2004514415.tif 000002
【０００４】
インフルエンザサブタイプＡの完全なゲノムの８個のＲＮＡセグメントのそれぞれは、ヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）の複数のサブユニットでキャプシドで包まれ（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｅｄ）、そして数分子の三量体ポリメラーゼ（ＰＢ１、ＰＢ２およびＰＡサブユニット）と会合されて、それによりリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する（Ｔｈｅ　Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｖｉｒｕｓｅｓ，Ｒ．Ｍ．Ｋｒｕｇ編（プレナム　プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）、１９８９）の１〜８７ページ、Ｌａｍｂ，Ｒ．Ａ．）。ＮＰタンパク質は構造および転写／複製調節タンパク質である。これらの構造をマトリックスタンパク質（Ｍ１）の層が囲んでおり、これはビリオンの主要な構造成分でありかつコアとウイルスエンベロープとの間の結合体としてはたらくようである。この宿主細胞由来のエンベロープは、抗原決定基である２種の多量のウイルスにコードされる表面糖タンパク質ヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）、ならびにずっとより少量のグリコシル化されない小型のタンパク質Ｍ２で鋲をつけられる（ｓｔｕｄｄｅｄ）（Ｌａｍｂ　１９８９；Ｌａｍｂ，Ｒ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ、４０、６２７−６３３（１９８５））。Ｍ２タンパク質はイオンチャンネル活性を有する第７セグメント（Ｍ１タンパク質もまたコードする）からのスプライスされた遺伝子産物であり；スプライスされた遺伝子は感染した細胞中にのみ存在する。同様に、非構造ＮＳ２タンパク質は第８セグメント（非構造ＮＳ１タンパク質もまたコードする）からのスプライスされた遺伝子産物であり；スプライスされた遺伝子は感染した細胞中にのみ存在する。ＨＡ糖タンパク質はプロテアーゼにより切断されてＨＡ１およびＨＡ２を形成する。
【０００５】
インフルエンザウイルスの感染は、シアル酸を含有する細胞受容体への表面ヘマグルチニンの接着により開始する。この第一のウイルス−細胞相互作用が、受容体に媒介されるエンドサイトーシスによる細胞中へのウイルス粒子の取り込みを誘発する。エンドソームの低いｐＨ条件下で、ＨＡは、ＨＡ２の疎水性ＮＨ２末端ドメインおよびエンドソーム膜の相互作用を助長するコンホメーション変化を受け、膜融合ならびにサイトゾル中へのコアＲＮＰおよびマトリックスタンパク質（Ｍ１）のその後の放出をもたらす。ＲＮＰおよびマトリックスタンパク質の解離は、完全なゲノムの転写および複製が起こる核にＲＮＰが転移される前にサイトゾル中で起こる（Ｍａｒｔｉｎ，Ｋ．とＨｅｌｅｎｉｕｓ，Ａ．、Ｃｅｌｌ、６７、１１７−１３０（１９９１）；Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｇ．Ｉ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、６１、７６４−７７３（１９８７））。
【０００６】
一次転写の後に、新たに合成されたタンパク質がウイルスゲノムの複製を開始し、それが順に転写およびタンパク質合成を増大させる。ウイルスの生活環のこの点で、表面糖タンパク質ＨＡおよびＮＡは、新たにアセンブリーされたウイルスがそこから放出されることができる原形質膜の個別の領域に蓄積することを開始する。ウイルスのアセンブリーは、４種のウイルスにコードされる構造タンパク質、すなわち膜に固定されるタンパク質（ＨＡ、ＮＡおよびＭ２）ならびに下にあるマトリックスタンパク質（Ｍ１）の細胞質および／もしくは膜貫通ドメイン間のある種の相互作用を介して開始すると想定され、それが順にＲＮＰとの緊密な会合を維持する（Ｇａｒｏｆｆ，Ｈ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｒｅｖｉｅｗｓ、６２、１１７１−１１９０（１９９８）；Ｎａｙａｋ，Ｄ．Ｐ．、ＡＳＭ　Ｎｅｗｓ、６２、４１１−４１４（１９９６））。マトリックスタンパク質Ｍ１とＲＮＰ複合体と間の接触、ならびに８種のＲＮＰの完全な組が成熟ビリオン粒子中に組み込まれたようになる機構は十分に定義されていない。構造成分間の特定の分子接触が、形態形成の過程をどのように開始しかつ成熟粒子のアセンブリーおよび宿主細胞の表面からの出芽の点までどのように進行するかを指図すると想定されている。
【０００７】
ウイルスゲノムの複製の間にＲＮＡポリメラーゼにより導入される突然変異により継続的に進化する多数のインフルエンザＡウイルスのサブタイプおよび抗原性変異体が存在する。突然変異はまた、それらが同一の細胞宿主をたまたま感染させる場合に２種の異なるサブタイプのセグメント間の遺伝的再集合によっても起こる。インフルエンザＡウイルスのこの生物学的特徴は新たなウイルス株を生じさせ、それはインフルエンザに対する免疫原性組成物の周期的な更新を必要とする。従って、インフルエンザＡウイルスの一特定株の完全なヌクレオチド配列および完全長クローンの入手可能性が、インフルエンザに対する新たなかつ革新的な免疫原性組成物の開発に不可欠である。従って、インフルエンザＡウイルスの完全なヌクレオチド配列を決定する、およびその配列を含有する完全長クローンを構築する必要性が存在する。
【０００８】
とりわけ、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）と呼称されるインフルエンザＡ株は１９７２年に最初に単離された。ポリメラーゼ遺伝子ＰＢ２、ＰＢ１およびＰＡのヌクレオチド配列は配列決定されていない。ＨＡ、ＮＰ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１およびＮＳ２をコードするセグメントのヌクレオチド配列は配列決定された。しかしながら、それらの配列は、正確な配列を提供していないかもしれない器械類を使用して何年も前に得られた。従って、更新された正確な配列を提供するためにそれらのセグメントの配列決定を反復する必要性が存在する。
【０００９】
（発明の要約）
インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）ウイルス株ならびに第７および第８セグメントのｍＲＮＡのスプライスされた産物の完全なヌクレオチド配列を決定することが、本発明の一目的である。８種の遺伝子およびスプライスされたメッセージのそれぞれのクローンを生成させることが、本発明のさらなる一目的である。
【００１０】
これらの遺伝子およびスプライスされたメッセージの全１０種の産物の推定されるアミノ酸配列を決定することが、本発明のなお別の目的である。
【００１１】
本発明のこれらおよび他の目的は、その株の完全なヌクレオチド配列ならびにそれらのスプライスされたメッセージを一緒に含んで成るインフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株のセグメントの全部のヌクレオチド配列を構成する単離された核酸分子の解明により、達成される。これらのヌクレオチド配列の全部は、正鎖のアンチゲノムメッセージセンス中に提示される。
【００１２】
とりわけ、完全なヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１７、ならびにそれらの生物学的同等物よりなる。
【００１３】
あるいは、完全なヌクレオチド配列は、ＨＡ（Ｐ１）（配列番号２１）と呼称されるＨＡ配列の変異体を包含し、そして配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１７および配列番号２１、ならびにそれらの生物学的同等物よりなる。
【００１４】
本発明の別の態様において、これらの単離された核酸分子は、別個のタンパク質をコードしかつ配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１１および配列番号２１（配列番号７の変異体）ならびにそれらの生物学的同等物よりなる群から選択される、別個の単離されたインフルエンザＡウイルスの核酸分子に向けられる。
【００１５】
本発明のなお別の態様において、これらの別個の単離された核酸分子は、配列番号２、配列番号４および配列番号６、ならびにそれらの生物学的同等物よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
【００１６】
本発明のさらなる一態様において、別個の単離されたインフルエンザＡウイルスのアミノ酸配列が提供され、ここで、前記配列は、配列番号２、配列番号４および配列番号６、ならびにそれらの生物学的同等物よりなる群から選択される。
【００１７】
本発明のなおさらなる一態様において、別個のインフルエンザＡウイルスのアミノ酸配列が提供され、ここで前記配列は配列番号８もしくは配列番号１２の配列を有する。
【００１８】
本発明のなお別の態様において、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株の一セグメントのヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子が：（１）サンプル中の対応するウイルスセグメントの存在を検出するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）アッセイでの使用のためのＰＣＲプライマーを設計するため；もしくは（２）サンプル中のそのセグメントにより産生される対応するタンパク質の存在を検出するためのＥＬＩＳＡでの使用のためのペプチドを設計かつ選択するために使用される。
【００１９】
（発明の詳細な記述）
インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株のセグメントのいくつかのヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列は公表されている。Ｙｕｆｅｒｏｖらはセグメント４のＨＡ遺伝子の配列を報告した（Ｙｕｆｅｒｏｖ，Ｖ．Ｐ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＵＳＳＲ、２７８、７３８−７４２（１９８４））。Ｂｕｃｋｌｅｒ−Ｗｈｉｔｅらはセグメント５のＮＰ遺伝子の配列を報告した（Ｂｕｃｋｌｅｒ−Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｊ．とＭｕｒｐｈｙ，Ｂ．Ｒ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１５５、３４５−３５５（１９８６））。Ｍａｒｋｏｆｆらはセグメント６のＮＡ遺伝子の配列を報告した（Ｍａｒｋｏｆｆ，Ｌ．とＬａｉ，Ｃ．Ｊ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１１９、２８８−２９７（１９８２））。Ｌａｍｂらは、１９８１年に、セグメント７のＭ１遺伝子およびＭ２遺伝子スプライス産物の配列を報告した（Ｌａｍｂ，Ｒ．Ａ．とＬａｉ，Ｃ．Ｊ．、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１１２、７４６−７５１（１９８１）（「Ｌａｍｂ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１９８１」）にＭ１、およびＬａｍｂ，Ｒ．Ａ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８、４１７０−４１７４（１９８１）（「Ｌａｍｂ　ＰＮＡＳ　１９８１」）にＭ２）。Ｌａｍｂらは、１９８０年に、セグメント８のＮＳ１遺伝子およびＮＳ２遺伝子スプライス産物の配列を報告した（Ｌａｍｂ，Ｒ．Ａ．とＬａｉ，Ｃ．Ｊ．、Ｃｅｌｌ、２１、４７５−４８５（１９８０））。
【００２０】
これらのセグメントを再配列決定するため、ならびに、以前に解明されていないそれらのセグメントを配列決定するため、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株を、マディン−ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞中で成長させかつそれから精製した。ウイルスＲＮＡを、精製されたビリオンから抽出し、そして末端特異的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。ゲル精製された遺伝子をｐＧｅｍＴベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））にクローン化し、そして複数の組のプライマーを使用して配列決定した。末端の配列は、３’および５’のライゲーションならびに接合部を越えるＲＴ−ＰＣＲフラグメントの配列決定により決定した（Ｇａｌａｒｚａ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７０、２３６０−２３６８（１９９６））。Ｍ２およびＮＳ２遺伝子はそれぞれセグメント７および８のｍＲＮＡのスプライスされた産物である。これらの遺伝子を、オリゴ−ｄＴおよび遺伝子特異的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲにより、ＭＤＣＫのインフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎに感染した細胞から精製されたｍＲＮＡから回収した。ＲＴ−ＰＣＲ産物をゲル精製し、そしてｐＧｅｍＴベクターにクローン化した。全部の遺伝子配列を、アンプリタック（ＡｍｐｌｉＴａｑ）ＤＮＡポリメラーゼ（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））およびアプライド　バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））ＡＢＩ　３７７　ＤＮＡシークェンサーを用いる蛍光色素ターミネーターを使用することにより決定した。この手順を各フラグメントについて複数のクローンを用いて反復し；得られた配列は一致した。
【００２１】
インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株の完全なゲノムは総計１３６２８ヌクレオチドとなった。これは、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株の完全なヌクレオチド配列の最初の記述である。
【００２２】
８個のセグメントを、それらのコーディング領域、ならびにプロモーター、エンハンサーおよびポリアデニル酸化シグナルのような調節配列を包含するそれらの５’および３’非コーディング領域中で配列決定した。該セグメント、それらのヌクレオチド数、それらの単離された核酸分子の配列（正鎖のアンチゲノムメッセージセンス、すなわち５’から３’の向きで示される）、それらのコーディング領域およびアミノ酸翻訳物は以下のとおりである：
セグメント番号１：２３４１ヌクレオチド、配列番号１、コーディング領域ヌクレオチド２８−２３０４、ＰＢ２、７５９アミノ酸（配列番号２）をコードする。
セグメント番号２：２３４１ヌクレオチド、配列番号３、コーディング領域ヌクレオチド２５−２２９５、ＰＢ１、７５７アミノ酸（配列番号４）をコードする。
セグメント番号３：２２３３ヌクレオチド、配列番号５、コーディング領域ヌクレオチド２５−２１７２、ＰＡ、７１６アミノ酸（配列番号６）をコードする。
セグメント番号４：１７６５ヌクレオチド、配列番号７、コーディング領域ヌクレオチド３０−１７２７、ＨＡ、５６６アミノ酸（配列番号８）をコードする。
【００２３】
配列番号７および配列番号８は、いくつかの点でＨＡについて公表されたＹｕｆｅｒｏｖらのヌクレオチドおよびアミノ酸配列と異なる。
【００２４】
【表２】
2004514415.tif 000003
【００２５】
セグメント番号５：１５６５ヌクレオチド、配列番号９、コーディング領域ヌクレオチド４６−１５３９、ＮＰ、４９８アミノ酸（配列番号１０）をコードする。
【００２６】
配列番号９および配列番号１０は、ＮＰについての公表されたＢｕｃｋｌｅｒ−Ｗｈｉｔｅらのヌクレオチドおよびアミノ酸配列に同一である。
セグメント番号６：１４６６ヌクレオチド、配列番号１１、コーディング領域ヌクレオチド２０−１４２６、ＮＡ、４６９アミノ酸（配列番号１２）をコードする。
【００２７】
配列番号１１および配列番号１２は、いくつかの点でＮＡについて公表されたＭａｒｋｏｆｆらのヌクレオチドおよびアミノ酸配列と異なる。
【００２８】
【表３】
2004514415.tif 000004
【００２９】
アミノ酸１のメチオニンの上流のリーダー配列中にもまたいくつかの差異が存在する。
セグメント番号７：１０２７ヌクレオチド、配列番号１３、コーディング領域ヌクレオチド２６−７８１、Ｍ１、２５２アミノ酸（配列番号１４）をコードする。
【００３０】
配列番号１３および配列番号１４は、Ｍ１についての公表されたＬａｍｂ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１９８１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に同一である。
セグメント番号７、スプライスされた産物：３２２ヌクレオチド、配列番号１５、コーディング領域ヌクレオチド２６−３１６、Ｍ２、９７アミノ酸（配列番号１６）をコードする［残基１０、ヌクレオチド５３−５５に最初のスプライスされたアミノ酸］。
【００３１】
配列番号１５および配列番号１６は、Ｍ２についての公表されたＬａｍｂ　ＰＮＡＳ　１９８１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に同一である。
セグメント番号８：８９０ヌクレオチド、配列番号１７、コーディング領域ヌクレオチド２７−７３７、ＮＳ１、２３７アミノ酸（配列番号１８）をコードする。
【００３２】
配列番号１７および配列番号１８は、ＮＳ１についての公表されたＬａｍｂら　１９８０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に同一である。
セグメント番号８、スプライスされた産物：４０２ヌクレオチド、配列番号１９、コーディング領域ヌクレオチド２７−３８９、ＮＳ２、１２１アミノ酸（配列番号２０）をコードする［残基１１、ヌクレオチド５７−５９に最初のスプライスされたアミノ酸］。
【００３３】
配列番号１９および配列番号２０は、ＮＳ２についての公表されたＬａｍｂら　１９８０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に同一である。
【００３４】
上に挙げられたとおり、ＨＡ（Ｐ１）と呼称される代替のＨＡ配列もまた存在する：
セグメント番号４：１７６４ヌクレオチド、配列番号２１、コーディング領域ヌクレオチド３０−１７２７、ＨＡ、５６６アミノ酸（配列番号２２）をコードする。
【００３５】
理論により束縛されることなく、ＨＡ（Ｐ１）配列は、長い間存在したインフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株からの小さな突然変異を組み込むかもしれない。ＨＡ（Ｐ１）配列（配列番号２１）は１７６４ヌクレオチドを有し、これは第４セグメントの非コーディング領域中の１ヌクレオチドの欠失（位置１７５６）によりＨＡ配列（配列番号７）中でより１つ少ない。
【００３６】
本発明の２種のＨＡ配列は、それらのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が以下のとおり異なる：
【００３７】
【表４】
2004514415.tif 000005
【００３８】
ＨＡ（Ｐ１）配列は、以下のとおりＹｕｆｅｒｏｖらのＨＡのヌクレオチド配列ともまたわずかに異なる：
【００３９】
【表５】
2004514415.tif 000006
【００４０】
ゲノムの負センスに（すなわち３’から５’の向きに）ある該セグメントのｍＲＮＡの核酸配列は、上述された正鎖のアンチゲノムのメッセージセンス配列の相補物である。
【００４１】
上述されたインフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）ウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列に加え、本発明はさらに、遺伝暗号の冗長性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）によってウイルスタンパク質をコードする配列に生物学的に同等である（すなわち、これらの他のヌクレオチド配列は、本明細書で示されるものと異なるがしかし配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１１および配列番号２１中のヌクレオチド配列のいずれかによりコードされるものと同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を特徴とする）、別個のインフルエンザＡウイルスのヌクレオチド配列を含有する単離された核酸分子を含んで成る。
【００４２】
とりわけ、本発明は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド　スプリング　ハーバー　ラボラトリー　プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９））に記述されるもののような標準的な高ストリンジェンシーのサザンハイブリダイゼーション条件下でそれとのハイブリダイゼーションを可能にするように、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１１および配列番号２１の配列のいずれかに十分に複製である（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｖｅ）ヌクレオチド配列を企図する。
【００４３】
本発明はまた、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）ウイルスタンパク質のものと異なるがしかしこれらのウイルスタンパク質（配列番号２、配列番号４および配列番号６）の１つについて記述されるものに生物学的に同等であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列も含んで成る。こうしたアミノ酸配列は、それらの配列が該ウイルスタンパク質配列からの小さな欠失、それへの挿入もしくはそれに対する置換によってのみ異なってその結果該配列の三次配置が該ウイルスタンパク質のものと本質的に変わらない場合に、該ウイルスタンパク質のいずれかに生物学的に同等であると言ってよい。
【００４４】
例えば、アミノ酸アラニン（疎水性アミノ酸）のコドンは、グリシンのような別のより少なく疎水性の残基またはバリン、ロイシンもしくはイソロイシンのようなより疎水性の残基をコードするコドンにより置換されてよい。同様に、グルタミン酸の代わりにアスパラギン酸のような１個の負に荷電した（酸性）残基の代わりに別のもの、またはアルギニンもしくはヒスチジンの代わりにリシンのような１個の正に荷電した（塩基性）残基の代わりに別のものの置換をもたらす変化、ならびにそれらのハイドロパシー指標での残基の類似性に基づく変化もまた、生物学的に同等な産物を生じさせると期待することができる。タンパク質分子のＮ末端もしくはＣ末端部分の変化をもたらすヌクレオチド変化もまた、該タンパク質の活性を変えると期待されないとみられる。
【００４５】
提案される改変のそれぞれは、コードされる産物の構造的および生物学的活性の保持の決定がそうであるとおり、当該技術分野の慣例の熟練内に十分にある。
【００４６】
本発明はさらに、配列番号２、配列番号４および配列番号６よりなる群から選択される別個のインフルエンザＡウイルスのアミノ酸配列を含んで成る単離されたアミノ酸配列を含んで成る。
【００４７】
本発明は、なおさらに、配列番号８および配列番号１２の別個の単離されたアミノ酸配列を含んで成る。
【００４８】
インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）ウイルスの基礎的な生物学的特性は、８個のセグメントよりなるそのゲノムに依存する。インフルエンザウイルスのセグメントは負の極性のＲＮＡの一本鎖よりなり、そして各ウイルス株はそれ自身の特異的なヌクレオチド配列を有する。
【００４９】
従って、ウイルスのヌクレオチド配列を決定するためにウイルス株間の完全な特異的な同定が必要である。１３，６２８塩基よりなる特定のヌクレオチド配列全体が本明細書に記述されるとおり明瞭に決定されているため、ウイルスを遺伝子レベルで同定することができ、そして従って絶対的決定を提供することができる。
【００５０】
本明細書に記述される配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用するインフルエンザウイルスのアンチゲノムＤＮＡのヌクレオチド配列の一部を検出することを含んで成る同定方法を提供するため、ならびにＥＬＩＳＡを使用してそのＤＮＡにより産生される抗原を検出するためのペプチドを生成させるために有用である。
【００５１】
１種の特定のインフルエンザ株の完全に配列決定かつクローン化されたゲノムを有することは、この遺伝子の青写真に基づく新たなかつ革新的な免疫原性組成物の研究および開発に有利である。
【００５２】
定義された突然変異を、その配列が本明細書に示されるセグメントの１種もしくはそれ以上に所望の場合に挿入する。１種もしくはそれ以上の突然変異を、部位特異的突然変異誘発を使用することにより導入する。しかしながら、突然変異体のインフルエンザウイルスはウイルスＲＮＡから直接生成させることができない。ゲノムウイルスＲＮＡもアンチゲノムｃＤＮＡも合成のための直接の鋳型としてはたらくことができないからである。代わりに、ウイルスＲＮＡは、ＮＰによるそのキャプシドでの被包化（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）後に、ウイルスのＲＮＡポリメラーゼ複合体により正のセンスｍＲＮＡに転写されるはずである。
【００５３】
Ｐａｌｅｓｅら（これにより引用することにより組み込まれる米国特許第５，１６６，０５７号明細書）は、インフルエンザＡウイルスのセグメントの「レスキュー」のための逆遺伝学（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ）のヘルパーウイルス依存性の系を記述した。簡潔には、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を、３種のポリメラーゼタンパク質およびＮＰの存在下でインビトロ合成により生成させる。その後、ＲＮＰ複合体を使用して真核生物細胞をトランスフェクトする。インフルエンザＡヘルパーウイルスへのその後の感染は、クローン化されたｃＤＮＡセグメント由来の遺伝子を所有するウイルスの生成をもたらす。その後、選択方法を使用して、より多数のヘルパーウイルスから所望のトランスフェクション体を分離する。
【００５４】
突然変異体のインフルエンザＡ株全体をレスキューするべきである場合には異なる系を使用する。Ｎｅｕｍａｎｎら（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、９３４５−９３５０（１９９９）（これにより引用することにより組み込まれる））により記述される系を使用して、改変されたインフルエンザウイルス株Ａ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）をクローン化されたｃＤＮＡから完全に生成する。このプラスミドに基づく系はヘルパーウイルス感染の使用を必要としない。要約すれば、ヒト胚腎細胞系２９３Ｔのような細胞系を、ウイルスのＮＰ、ＰＢ２、ＰＢ１およびＰＡタンパク質をコードする別の４種のプラスミド（ＲＮＰをインビボで細胞内で合成するようはたらく）と一緒に、それぞれ該株のウイルスＲＮＡセグメントをコードしかつ適するＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびターミネーターにより隣接される８種のプラスミドでトランスフェクトする。ウイルスの構造タンパク質ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２およびＮＳ２を発現する５種のさらなるプラスミドの添加により収量が実質的に増大する。
【００５５】
この系の一変形においては８種のプラスミドのみが必要とされる（Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、６１０８−６１１３（２０００）（これにより引用することにより組み込まれる））。各プラスミドは２個のプロモーター、すなわちヒトＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ　Ｉ）プロモーターおよびヒトＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ　ＩＩ）プロモーターを含有する。８種の発現プラスミドでの真核生物細胞のトランスフェクション後に、ヒトｐｏｌ　ＩおよびＩＩプロモーターがそれぞれプラスミド鋳型を転写する。これはウイルスのｍＲＮＡおよびｖＲＮＡ双方の合成をもたらして、最終的に感染性のインフルエンザＡウイルスの生成につながる。
【００５６】
８、１２もしくは１７種のプラスミドのトランスフェクション系のいずれにおいてもヘルパーウイルスは必要とされないため、トランスフェクション体のウイルスはプラーク精製なしで回収される。この系は、新たなサブタイプの配列に合致するようにインフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株の対応するセグメントが突然変異されている新たなＨＡもしくはＮＡサブタイプを伴う流行との闘いにおける使用のための生きている弱毒化インフルエンザＡウイルスの産生を助長する。
【００５７】
新たな循環するサブタイプの配列に対応するインフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株中のＨＡもしくはＮＡをコードするセグメントに対する予め決められた突然変異は、部位特異的突然変異誘発を使用することにより作成する。こうした突然変異は、標準的組換えＤＮＡ法によりウイルスゲノムのＤＮＡコピーに導入する。
【００５８】
所望の場合は、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株（もしくはその突然変異体）のＨＡもしくはＮＡをコードするセグメントの代わりに異なるインフルエンザウイルス株からの対応するセグメントを用いることにより、再集合ウイルスを生成させる。
【００５９】
本発明の別の態様において、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株の１セグメントのヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を使用して、オリゴヌクレオチドプローブ（正鎖のアンチゲノムのメッセージセンスもしくは負鎖の相補的ゲノムセンスのいずれかから）を生成させかつペプチド（正鎖のアンチゲノムのメッセージセンスのみから）を発現させ、それらを使用して体液および組織のサンプル中でのそのインフルエンザＡ株（もしくはその突然変異体）の１セグメントの存在を検出する。サンプル中のウイルスセグメントの存在を検出するための高度に特異的かつ感受性の診断試験を設計するのに該ヌクレオチド配列を使用する。
【００６０】
本明細書に記述されるウイルス配列に基づく配列を用いてＰＣＲプライマーを合成する。試験サンプルをＲＮＡの逆転写にかけ、次いで、そのウイルス株の定義された１セグメントに独特であるヌクレオチドを有する本明細書に記述されるヌクレオチド配列に対応する選択されたｃＤＮＡ領域をＰＣＲ増幅する。増幅されたＰＣＲ産物をゲル上で同定し、そしてそれらの特異性を、特異的ヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションにより確認する。
【００６１】
ＥＬＩＳＡ試験を使用して、ウイルスセグメントにより産生されるタンパク質の存在を検出する。本明細書に記述されるウイルス配列に基づく１個もしくはそれ以上の独特の残基を含有するペプチドを設計かつ選択する。その後、これらのペプチドを、単一特異性ポリクローナル抗体の産生のためハプテン（例えばキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ））に結合し、そして動物（例えばウサギ）を免疫化するのに使用する。その後、これらのポリクローナル抗体、もしくはポリクローナルおよびモノクローナル抗体の組合せの選択を「捕捉ＥＬＩＳＡ」で使用して、そのウイルスセグメントにより産生されるタンパク質を検出することができる。
【００６２】
本明細書で引用される全部の参考文献はこれにより引用することにより組み込まれる。
【００６３】
本発明がより良好に理解されることができるために、以下の実施例を示す。実施例は具体的説明のみの目的上であり、そして本発明の範囲を制限するとして解釈されるべきでない。
【００６４】
実施例
実施例１
インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株の配列決定
８セグメントのそれぞれの配列決定を以下のとおり実施した：
ＲＴ−ＰＣＲプロトコル
インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）をマディン−ダービー（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ）イヌ腎（ＭＤＣＫ）細胞中で成長させ、そして澄明にされた培養上清から濃縮した。ゲノムウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）を、ＲＮＡｅａｓｙ抽出キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して１００μｌのウイルスストックから調製した。セグメント番号７および８のｍＲＮＡのスプライスされた産物（それぞれＭ２およびＮＳ２）を、オリゴテックス（Ｏｌｉｇｏｔｅｘ）ｍＲＮＡキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して、インフルエンザ／Ｕｄｏｒｎに感染したＭＤＣＫ細胞の全ｍＲＮＡから単離した。およそ１μｇのｖＲＮＡもしくはｍＲＮＡのいずれかを、２ｐｍｏｌの遺伝子特異的プライマーおよびジエチルピロカーボネート処理された水（ＲＮアーゼを阻害するため）を含有するエッペンドルフチューブに１２μｌの最終容量まで添加した。オリゴ−ｄＴプライマーを使用して、Ｍ２およびＮＳ２のスプライスされたメッセージを逆転写した。ＲＮＡ−プライマー混合物を７０℃で１０分間加熱し、そして急速に氷上で冷却した。以下の試薬、すなわち４μｌの５×第一鎖緩衝液（２５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８．３、３７５ｍＭ　ＫＣｌ、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）、２μｌの０．１Ｍ　ＤＴＴおよび１μｌのｄＮＴＰ混合物（１０ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ）をこのチューブに添加し、そして４２℃で２分間インキュベートした。その後、１μｌのスーパースクリプト（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ）ＩＩ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））逆転写酵素を添加し、そして追加の５０分間４２℃で再インキュベートした。ＲＴ反応を７０℃で１５分間のインキュベーションにより停止した。ＰＣＲ反応を、以下の試薬、すなわち５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１μＭの各プライマー、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰおよび２単位のＴａｑポリメラーゼの混合物に２μｌの前のＲＴを添加することにより開始した。以下、すなわち９４℃で２分間の１周期の変性、次いで３０周期の９４℃で３０秒間の変性、４２℃で３０秒間のアニーリングおよび７２℃で１分間の伸長、のとおり、ＤＮＡをパーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）９６００　ＰＣＲ機械で増幅した。７２℃で７分間の１周期の伸長がこれに続いた。ＰＣＲ増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲル上で分析し、そしてキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）精製キットを使用して精製した。
配列決定プロトコル
ＲＴ−ＰＣＲにより生成された対応するＤＮＡセグメントを含有するおよそ５００ｎｇのプラスミドｐＧＥＭ−Ｔを、３．２ｐｍｏｌの配列決定プライマーおよび８μｌのターミネーター　レディ（Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｒｅａｄｙ）反応混合物（パーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ））を含有する０．２ｍｌチューブに添加し、そしてパーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）９６００　ＰＣＲ機械に入れた。反応を、９６℃１０秒間、５０℃５秒間および６０℃４分間の２５周期により増幅した。その後、産物をＧ５０セファデックススピンカラムで精製し、凍結乾燥し、そして５０ｍｇ／ｍｌのブルーデキストラン負荷色素を含む３μｌの２５ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。サンプルをＡＢＩ　３７７自動化シークェンサー上で運転し、そしてＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（ジーン　コーズ　コーポレーション（Ｇｅｎｅ　Ｃｏｄｅｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）からの配列分析プログラム）を使用して配列を分析した。
３’および５’末端のヌクレオチド配列の決定
精製されたゲノムｖＲＮＡ（２．５μｇ）（上を参照されたい）を、１０Ｕのタバコ酸ピロホスファターゼ（エピセンター　テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ウィスコンシン州マディソン）で３７℃で３０分間処理して、５’末端からリン酸基を除去した。処理されたＲＮＡをフェノール−クロロホルム抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。その後、ＲＮＡの５’および３’末端を、５０ＵのＴ４　ＲＮＡ−リガーゼ（ファルマシア　バイオテック（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．））で３７℃で１時間連結し、フェノール−クロロホルムで抽出し、そしてエタノールで沈殿させた。連結されたＲＮＡを逆転写し、そして、順および逆のプライマー対（下を参照されたい）を使用して、ジーンアンプ　ゴールド（ＧｅｎｅＡｍｐ　Ｇｏｌｄ）ＲＮＡ　ＰＣＲ試薬キット（ＰＥ　バイオシステムズ（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））を用いる単一の反応でＰＣＲした。配列決定反応は、各ＲＮＡセグメントに特異的なプライマーを使用して上述されたとおり実施した（Ｇａｌａｒｚａ，Ｊ．Ｍ．ら、１９９６、Ｊ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ．７０：２３６０−２３６８）。
インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）を配列決定するためのプライマー
順方向のプライマーは「Ｆ」と記し、そしてアンチゲノムの正センスにある。逆方向のプライマーは「Ｒ」と記し、そしてゲノムの負センスにある。
【００６５】
【表６】
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【００６６】
【表７】
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【００６７】
【表８】
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【００６８】
【表９】
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【００６９】
【表１０】
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【００７０】
【表１１】
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【００７１】
【表１２】
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【００７２】
【表１３】
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【００７３】
【表１４】
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【００７４】
【表１５】
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【００７５】
【表１６】
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【００７６】
【表１７】
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【００７７】
【表１８】
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【００７８】
【表１９】
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【００７９】
【表２０】
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【００８０】
【表２１】
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【００８１】
【表２２】
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【００８２】
【表２３】
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【００８３】
【表２４】
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【００８４】
実施例２
インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株のセグメントを検出するためのＰＣＲアッセイ
ＰＣＲアッセイを使用して、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株のセグメントの存在を検出する。ＰＣＲプライマーは、本明細書に記述されるウイルスの配列に対する相同性に基づいて設計かつ選択する。該アッセイは、サンプルをＲＮＡの逆転写にかけること、次いで本明細書に記述される特異的ヌクレオチド配列に対応する選択されたｃＤＮＡ領域のＰＣＲ増幅により実施する。増幅されたＰＣＲ産物をゲル上で同定し、そしてそれらの特異性を特異的ヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションにより確認する。
【００８５】
実施例３
インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株のセグメントにより産生される抗原を検出するためのＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡ試験を使用して、インフルエンザＡ／Ｕｄｏｒｎ／７２（Ｈ３Ｎ２）株のセグメントにより産生される抗原の存在を検出する。ペプチドは本明細書に記述されるウイルス配列に対する相同性に基づき設計かつ選択する。その後、これらのペプチドをＫＬＨに結合し、そして単一特異性ポリクローナル抗体の産生のためウサギを免疫化するのに使用する。その後、これらのポリクローナル抗体もしくはポリクローナルおよびモノクローナル抗体の組合せの選択を「捕捉ＥＬＩＳＡ」で使用して、そのウイルスセグメントにより産生されるタンパク質の存在を検出する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004514415.tif 000129
【国際調査報告】
2004514415.tif 000130
2004514415.tif 000131
2004514415.tif 000132