(57)【要約】本発明は、微粒子と結合した少なくとも１種の抗原を含み、微粒子がウイルスと同じ範囲の大きさである免疫原性組成物を提供する。さらに本発明はワクチン組成物および対象において免疫応答を誘発する方法をも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微粒子と結合した少なくとも１種の抗原を含み、微粒子がウイルスと同じ範囲の大きさである免疫原性組成物。
【請求項２】
微粒子と結合した少なくとも１種の抗原を含み、微粒子がウイルスと同じ範囲の大きさであるワクチン組成物。
【請求項３】
微粒子が実質的に均一な大きさである請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記微粒子が固体コアを有する請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記微粒子の直径が０．０３〜０．０５μｍである請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記微粒子がラテックス、鉄分子、金、ガラス、リン酸カルシウム、ポリスチレン、ポリリシンＧまたは他の生分解性で生体適合性のポリマー材料で作られる請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗原が前記微粒子上に吸着、複合体を形成、または共有結合している請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗原がペプチド、タンパク質、組換えペプチドまたはタンパク質、脂質、炭水化物、核酸、他のタイプの分子あるいはこれらのうちのいずれかの組合せである請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗原が病原体、組織、細胞器官または分子に由来し、下記群：
花粉、Ｃ型肝炎ウイルス、（ＨＩＶ）コア、Ｅｌ、Ｅ２およびＮＳ２タンパク質、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロゾイト周囲タンパク質（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＳ））やヒトＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｉａｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅを含むＰ．ｖｉｖａｘその他のマラリア原虫種などのマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種由来抗原、ＴＲＡＰ、ＭＳＰ−１、ＭＳＰ−２、ＭＳＰ−３、ＭＳＰ−４、ＭＳＰ−５、ＡＭＡ−１、ＲＥＳＡ、ＳＡＬＳＡ、ＳＴＡＲＰ、ＬＳＡ１およびＬＳＡ３、ＨＩＶ−ｇｐ１２０／１６０エンベロープ糖タンパク質、連鎖球菌表面タンパク質Ａｇ、インフルエンザ核タンパク質、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ表面感染タンパク質、ＴｃｐＡピリン（ｐｉｌｉｎ）サブユニット、ＶＰ１タンパク質、ＬＭＣＶ核タンパク質、リーシュマニア属の主要表面糖タンパク質（ｇｐ６３）、百日咳（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）表面タンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、連鎖球菌Ｍタンパク質、ブドウ状球菌またはヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）タンパク質、合胞体（Ｓｙｎｃｙｔｉｃｉａｌ）ウイルス（ＲＳＶ）ＦまたはＧタンパク質、エプスタイン−バー・ウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０または核抗原３Ａ、ヘマグルチニン、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）表層タンパク質（Ｏｓｐ：ｏｕｔｅｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）Ａ、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）３８ｋＤリポタンパク質または３０ｋＤタンパク質（Ａｇ８５）、１０ｋＤまたは６５ｋＤタンパク質、ナイセリア・メニンギチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）クラス１表層タンパク質、水痘帯状疱疹ウイルスＩＥ６２およびｇｐｌ、風疹ウイルス・キャプシド・タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅ Ｓ１ ａｇ、単純疱疹ウイルス・タイプＩ糖タンパク質Ｇまたはｇｐ ＤもしくはＣＰ２７、マレーバレー脳炎ウイルスＥ糖タンパク質、Ａ型肝炎ウイルスＶＰ１、ポリオ・ウイルス・キャプシド・タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、クラミディア・トラコマティス（ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）表面タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス・エンベロープＡｇ ｐｒｅ Ｓ２、ヒト・ライノウイルス（ＨＲＶ）キャプシド、ガン遺伝子Ｅ６およびＥ７由来の乳頭腫ウイルス・ペプチド、リステリア菌表面タンパク質、水痘ウイルス・エンベロープ・タンパク質、ワクシニアウイルス・エンベロープ・タンパク質、ブルセラ菌表面タンパク質、ロータウイルスＶＰ−３、ＶＰ−４、ＶＰ−５、ＶＰ−７およびＶＰ−８、前記抗原の１種または複数の組合せ、長さにして５個以上のアミノ酸を含む前記抗原のアミノ酸サブユニットまたは前記サブユニットの１種または複数の組合せ
から選択される請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
抗原が乳ガン、肺ガン、膵臓ガン、結腸ガンおよび黒色腫などのガンに由来する請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
抗原が組換えペプチドまたはタンパク質である請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
微粒子に結合した少なくとも１つの抗原を含む免疫学的に有効な量の組成物を対象に投与することを含み、ここで微粒子はウイルスと同じ範囲の大きさである、対象において免疫応答を誘発する方法。
【請求項１３】
免疫応答がＣＤ８細胞応答および抗体応答からなる群から選択され、ここで抗体はＩｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡである請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
免疫応答が樹状細胞の増殖および／または発達である請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
微粒子に結合した少なくとも１つの抗原を含む免疫学的に有効な量の組成物を対象に１度だけ投与することを含み、ここで微粒子はウイルスと同じ範囲の大きさであり、免疫応答が樹状細胞の刺激および／または増殖を含む、対象において抗原に対する保護的免疫応答を単回投与によって誘発する方法。
【請求項１６】
微粒子に結合した少なくとも１つの抗原を含む免疫学的に有効な量の組成物を対象に投与することを含み、ここで微粒子はウイルスと同じ範囲の大きさである、免疫応答を誘発するために樹状細胞に抗原をｉｎ ｖｉｖｏで送達する方法。
【請求項１７】
免疫応答が抗原のＭＨＣクラスＩ提示メカニズムを誘発し、抗原がカヴェオールおよび／またはクラスリン・ピットによって取り込まれ、さらにＲａｂ４独立性でＴＡＰ依存性の過程により処理されるものである請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
ウイルスと同じ範囲の大きさである微粒子を１種または複数の抗原と、微粒子と抗原が結合するように接触させることを含む免疫原性微粒子／抗原組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、免疫原性組成物、ワクチン組成物、患者における免疫応答を誘発する方法およびこれらの組成物の製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトや動物の免疫系の操作は、ある種の疾病や症状を回避しまたは治療する方法として知られている。
【０００３】
免疫系が疾病をコントロールするメカニズムは、中和抗体の誘導（体液性免疫応答）および細胞性応答すなわちＴ細胞応答の発生を含む。後者はヘルパーＴ細胞（ＴＨ）および細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を含む。ウイルス感染（例えばポリオ、肝炎）の例で言えば、抗体はウイルスが細胞に感染するのを防ぐことにより保護をもたらす。抗体はまた、殺菌メカニズムを用いたりバクテリア毒素を中和することによって、バクテリア（例えば肺炎球菌、ブドウ球菌）からの保護を果たすことができる。
【０００４】
抗原からのペプチド断片がＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩ（ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔａｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ；主要組織適合性複合体クラスＩまたはクラスＩＩ）として知られている分子に結合し、ＤＣ（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ；樹状細胞）またはマクロファージなどの専門のＡＰＣ（ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ；抗原提示細胞）の表面に示されたときには、Ｔ細胞が刺激され得る。Ｔ細胞は抗原受容体を有しており、これを用いて細胞表面における抗原由来ペプチド断片の存在をモニターしている。ＴＨ細胞上の抗原受容体は、ＭＨＣ ＩＩ分子に結合した抗原ペプチドを認識する。これとは対照的に、ＣＴＬ上の受容体はクラスＩ分子に対して示される抗原と反応する。
【０００５】
Ｔ細胞が病原体に感染した標的細胞またはそれが認識するエピトープを含む細胞を認識した場合、一連のイベントが生起され、刺激されたＴ細胞は免疫応答を増幅し、これらは最終的には、感染細胞の死をもたらす。さらに、Ｔ細胞の中には、サイトカインやリンホカインの分泌を刺激し得るものもあり、その結果、最終的には病原体の不活性化または根絶に結びつく効果を及ぼす。
【０００６】
多くのワクチンが出回っているが、多数の疾病や症状に対しより効果を有し広い範囲に効果の及ぶワクチンの製造が求められている。また、現時点でワクチンがないか効果がない感染因子（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）や病原体からの保護の必要も残る。さらに、有効な単回服用ワクチン（それは、経済的理由や送達のしやすさの点で、また、患者や被治療者の服薬順守の点で特に望ましい）も求められている。
【０００７】
ほとんどのワクチンは、免疫学的に有効になるように様々なタイプの体液性応答と細胞性応答とを最適の組合せで誘導することができないという問題点を有する。例えば、抗体と細胞性応答の両者が働けばより有効と思われる場合に、抗体応答しか刺激しないワクチンもある。別の例では、対象とする感染因子からの保護を達成するためにはワクチンの多数回投与、例えば、追加刺激注射（ｂｏｏｓｔｅｒ ｓｈｏｔｓ）が必要とされる。
【０００８】
他のいくつかの例では、ＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭなどの他の所望の免疫グロブリンと共にＩｇＥ生産が誘導される。免疫グロブリンはアレルギー反応に関係するので、ＩｇＥを誘導するワクチンは望ましくない。
【０００９】
ＩｇＡ生産の刺激は粘膜部位または表面を通って侵入して感染する病原体に対する「最前線」防御である。したがって、ＩｇＥ生産を増大せずに、高ＩｇＡ分泌免疫応答を生じさせることができるワクチンも有用であろう。
【００１０】
さらに他の例を挙げると、ワクチンはＡＰＣの刺激をもたらすが、免疫の刺激の程度は最適値以下である。例えば、樹状細胞すなわちＤＣは、表面分子によって互いに識別可能な一連の細胞部分集合として特徴付けられるが、この表面分子がＴ細胞上の受容体と結合する特異的リガンドであるものもある。従って、ＤＣの部分集合（例えば、効率的なＣＤ８ Ｔ細胞プライミングが可能な部分集合）を選択的に標的とするワクチンを生産することが望ましいであろう。これらのＴ細胞は多くの細胞内病原体およびガンに対する保護免疫に重大な役割を果たすが、誘導することが悪評高いほどに困難だからである。
【００１１】
さらに、ワクチンに関して、細胞外抗原は、ほとんどの細胞において伝統的にＭＨＣ−Ｉ処理経路に入らない。アポトーシスを起こす細胞、免疫複合体および粒子の取込みを経由するＡＰＣ中でのクラス１プロセッシングおよび提示の代替ルートが提案されているが［１］、一般に、不活化ワクチンを使用するＣＴＬ免疫の生産はありそうもない。Ｂ型肝炎表面タンパク質または酵母レトロトランスポゾン・タンパク質粒子からなる非感染性ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、マクロファージによってＭＨＣ Ｉ提示に適したかたちに効率的に処理されｉｎ ｖｉｔｒｏでもｉｎ ｖｉｖｏでもＣＤ８ ＣＴＬ応答を誘導することが示されている［２、３］。ＶＬＰは、脂質含有量が乾燥重量の５０％以上の多量体（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｃ）脂質含有タンパク質粒子である。
【００１２】
しかし、Ｂ型肝炎コアタンパク質粒子は免疫原ではなく脂質含有量が低い。このため、ＶＬＰはその大きさによってではなく生化学組成によって免疫原になっているのではないかとの提案がなされた。これは、抗原を脂質または洗剤を含む処方中で提示すると、恐らくは細胞膜の破損によりＡＰＣと融合し、この結果細胞質に取り込まれるようになるという提案と矛盾しないであろう。
【００１３】
内部に抗原を封じ込めたミクロスフェアの使用については、ワクチン組成物としての可能性が検討されている。ミクロスフェアは、乳酸やグリコール酸（ＰＬＡおよびＰＬＧＡ）の生分解性ポリエステルで作られる。ミクロスフェアは、そのサイズおよびポリマー組成物により分解速度をコントロールするように形成する。ミクロスフェアが分解するにつれ、封じ込められていた抗原がそこから放出され、抗原の抑制された放出をもたらして免疫応答を刺激する。これらの分子が、細胞膜と生体適合性をもつタンパク質粒子と同じように免疫細胞と接して反応する可能性は低いだろう。
【００１４】
しかし、この形態のワクチン組成物の難点として、抗原の安定性、スフェアの大きさや抗原放出の動力学といった点があり、良好な抗原性および持続的免疫性を備えたワクチンを生産し、また経済的に製造し投与できるワクチンを生産するためには、これらを全て解決する必要がある［４］。
【００１５】
米国特許第４，２２５，５８１号には、大きさに広がりのある外来粒子混合物を含む組成物が、重合体の粒子表面上に吸着された抗原を身体に送達するのに有用であると記載されている。しかし、こうしたワクチンによって送達が成功したこと、抗原性および免疫性は具体例も証明もない。特に、ＣＤ８ Ｔ細胞応答の誘導について言及はなく、ＭＨＣクラスＩ提示経路へのプロセッシングについてさえ言及がない。この微粒子の重合体の材料が上記のようなＰＬＡまたはＰＬＧＡの微粒子と同様の特性を持つと予想されるであろう。
【００１６】
したがって、ワクチンの一部として投与する粒子の大きさ自体が免疫原の応答を誘導し得るかについては本発明以前には知られていなかった。
【００１７】
本発明に至る研究において、本発明者は、驚くべきことに、抗原を伴うウイルスとほぼ同じ大きさの微粒子が被治療者に強い細胞性および体液性抗体応答をもたらすという事実を見出した。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明の第１の実施形態では、ウイルスと同じ大きさの範囲にある微粒子と結合した少なくとも１つの抗原を含む免疫原の組成物を提供する。
【００１９】
免疫原組成物に関して使用する「含む」という用語は、組成物が抗原および微粒子を含むことを意味する。それは他の成分を含んでもよい。
【００２０】
「抗原」という用語は、免疫応答を誘発することができる任意の分子、部分または実体を指す。この中には、細胞性および／または体液性免疫応答が含まれる。組成物に意図した機能によっては、１つ以上の抗原を含んでもよい。
【００２１】
抗原はペプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、核酸、他のタイプの分子またはこれらのうちのいずれかの組合せでもよい。
【００２２】
抗原は、組成物に意図した目的により、病原体、組織、細胞、器官または分子に由来するものでもよいし、精製された抗原でもよいし、バクテリア、酵母または細胞培養などの適切なベクターにより生成した組替え体由来のものでもよい。病原体は、例えば任意の病原体でもよく、細胞内病原体や細胞外病原体、抗原性部分またはその一部、ＨＩＶ、インフルエンザ・ウイルス、肝炎ウイルス、マラリアなど、ウイルス、バクテリア、原生動物に由来するものでもよい。特に本発明が想定する抗原の例は以下のとおりである：花粉、Ｃ型肝炎ウイルス、（ＨＩＶ）コア、Ｅｌ、Ｅ２およびＮＳ２タンパク質、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のスポロゾイト周囲タンパク質（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＳ））やヒトＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｉａｅ、Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅを含むＰ．ｖｉｖａｘその他のマラリア原虫種などのマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種由来抗原、ＴＲＡＰ、ＭＳＰ−１、ＭＳＰ−２、ＭＳＰ−３、ＭＳＰ−４、ＭＳＰ−５、ＡＭＡ−１、ＲＥＳＡ、ＳＡＬＳＡ、ＳＴＡＲＰ、ＬＳＡ１およびＬＳＡ３、ＨＩＶ−ｇｐ１２０／１６０エンベロープ糖タンパク質、連鎖球菌表面タンパク質Ａｇ、インフルエンザ核タンパク質、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ表面感染タンパク質、ＴｃｐＡピリン（ｐｉｌｉｎ）サブユニット、ＶＰ１タンパク質、ＬＭＣＶ核タンパク質、リーシュマニア属の主要表面糖タンパク質（ｇｐ６３）、百日咳（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）表面タンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、連鎖球菌Ｍタンパク質、ブドウ状球菌またはヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）タンパク質、合胞体（Ｓｙｎｃｙｔｉｃｉａｌ）ウイルス（ＲＳＶ）ＦまたはＧタンパク質、エプスタイン−バー・ウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０または核抗原３Ａ、ヘマグルチニン、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）表層タンパク質（Ｏｓｐ：ｏｕｔｅｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）Ａ、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）３８ｋＤリポタンパク質または３０ｋＤタンパク質（Ａｇ８５）、１０ｋＤまたは６５ｋＤタンパク質、ナイセリア・メニンギチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）クラス１表層タンパク質、水痘帯状疱疹ウイルスＩＥ６２およびｇｐｌ、風疹ウイルス・キャプシド・タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅ Ｓ１ ａｇ、単純疱疹ウイルス・タイプＩ糖タンパク質Ｇまたはｇｐ ＤもしくはＣＰ２７、マレーバレー脳炎ウイルスＥ糖タンパク質、Ａ型肝炎ウイルスＶＰ１、ポリオ・ウイルス・キャプシド・タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ６、クラミディア・トラコマティス（ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）表面タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス・エンベロープＡｇ ｐｒｅ Ｓ２、ヒト・ライノウイルス（ＨＲＶ）キャプシド、ガン遺伝子Ｅ６およびＥ７由来の乳頭腫ウイルス・ペプチド、リステリア菌表面タンパク質、水痘ウイルス・エンベロープ・タンパク質、ワクシニアウイルス・エンベロープ・タンパク質、ブルセラ菌表面タンパク質、ロータウイルスＶＰ−３、ＶＰ−４、ＶＰ−５、ＶＰ−７およびＶＰ−８、前記抗原の１種または複数の組合せ、５個以上のアミノ酸を含む前記抗原のアミノ酸サブユニットまたは前記サブユニットの１種または複数の組合せ。
【００２３】
例として挙げた病原体から得られる溶解物または培養液を抗原として使用してもよい。それらが抗原性および／または免疫性をもたらす限り、そうした画分は精製、濃縮または希釈した形としてもよい。したがって、本発明によれば、患者の腫瘍溶解物や腫瘍タンパク質の特異的セット抗原を微粒子に結合することにより、患者に応じて免疫原組成物を「テーラーメードで」作成することができる。
【００２４】
抗原は任意の腫瘍タイプまたは悪性腫に由来するものでもよい。抗原がガン由来の場合、そのタイプの例としては乳ガン、肺ガン、膵臓ガン、および結腸ガンおよび黒色腫が挙げられる。腫瘍から得られる特異的抗原の別の例は、黒色腫特異的抗原（例えば、ＭＡＧＥシリーズ抗原）、結腸由来のガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、ｎｍ２３ガン抗原および他のガン抗原、または任意の腫瘍から抽出された実際の抗原、例えば、ＭＵＣ−１〜ＭＵＣ−７抗原などのムチンである。組換えペプチドまたはタンパク質を単独でまたは組合せて使用してもよい。
【００２５】
抗原はさらに、上に挙げた１種または複数の抗原に基づく模倣物（ｍｉｍｉｃ）またはペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）などの合成エピトープでもよい。
【００２６】
「結合した」という用語は、微粒子と抗原の間の結合を指す。これは吸着によるものでも、複合体形成、共有結合によるものでもよい。好ましくは、抗原は、微粒子に共有結合で結合する。さらにより好ましくは、抗原は微粒子表面に結合する。
【００２７】
微粒子という用語は小さな粒子を指す。これは、ビーズ状もしくは球状または他の適当な形とすることができる。
【００２８】
本願では、「ウイルス・サイズの粒子」（ＶＳＰ）という用語は、本発明の免疫原組成物のある実施形態について説明するために使用する。用語ＶＳＰは便宜上用いられるだけであり、本発明が既知のウイルス・サイズに限定されないことが理解されるべきである。例えば、未知のウイルスと同じサイズの粒子も本発明が想定するものである。
【００２９】
本発明の微粒子は、中空であるか分子をカプセルに入れる従来技術のミクロスフェアとは異なるものとして、好ましくは、複合化または結合する抗原に安定性をもたらす固体コアを有する。抗原が粒子の表層に存在する場合、本願では便宜上これをウイルス・サイズの固体粒子（ＶＳＳＰ：ｖｉｒｕｓ ｓｉｚｅｄ ｓｏｌｉｄ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）と呼ぶ。ＶＳＳＰを作るために使用する粒子は、メーカーから入手可能で実質的に均一のサイズ（つまり規定サイズの±１０％以内）である。
【００３０】
「固体コア」という用語は、実質的に固体である（つまり、粒子は中空ではない）ことを意味する。免疫原の組成物の機能を低めるものでない限り、微粒子は任意の適当な材料から構成されるものでよい。したがって、微粒子は、ラテックス、鉄分子、金（金のナノ粒子など）、ガラス、リン酸カルシウム、ポリスチレンまたはＰＬＧ（ポリリシンｇ）などの生分解性かつ生体適合的なポリマー材料などで作ることができる。好ましくは、微粒子はポリスチレン、ＰＬＧまたは金から構成される。最も好ましくは、微粒子はポリスチレン製である。
【００３１】
微粒子は、既知のウイルスと同じサイズ内にある。これは、微粒子が好ましくは約０．５０μｍ未満であることを意味する。好ましくは、微粒子は、免疫応答を誘発するのに適合したサイズである。特にそれは、人間のまたは動物被験者の抗原提示細胞による取込みに適合したものである。より好ましくは、微粒子は、約０．０３と０．５０μｍの間、好ましくは約０．０３と０．１５μｍの間、さらに好ましくは、約０．０３と０．１０μｍの間である。さらにより好ましくは、微粒子は約０．０３と０．０５μｍの間であり、より好ましくは微粒子は約０．０３μｍと０．０４９μｍの間であり、さらにより好ましくは微粒子は、０．０３と０．０４μｍの間または０．０４と０．０４９μｍの間である。
【００３２】
好ましい実施形態では、本発明に従って使用する微粒子の集合、例えば、ワクチンの１回投与分は均一のサイズである。これは、与えられた集合中の大多数の粒子が規定のサイズであることを意味する。
【００３３】
好ましくは、微粒子／抗原組成物は細胞性および／または体液性の免疫応答を誘発するのに特に適合したものである。細胞性応答は、好ましくはＴＨ細胞、特にＩＦＮおよびＩＬ−４産生Ｔ細胞、ＣＴＬ、特にＣＤ８ ＣＴＬおよびＢ細胞の活性化、成熟または増殖からなる群から選択される。好ましくは、微粒子／抗原組成物は、抗原のＭＨＣクラスＩ提示メカニズムを誘発する。これは、カヴェオール（ｃａｖｅｏｌｅ）および／またはクラスリン（ｃｌａｔｈｒｉｎ）ピットが関わる従来未知のメカニズムによって開始され、実施例４および７で説明するようなＲａｂ ４非依存およびＴＡＰ依存プロセスによってさらにプロセッシングされる。体液性応答は、好ましくは、ＩｇＡ、ｌｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびそのサブクラスからなる群から選択される。
【００３４】
免疫応答の増加や増幅を支援する細胞を組成物によって刺激してもよい。これらの例としては、骨髄またはリンパ（その両方）起源のＤＣなどのＡＰＣおよびマクロファージが含まれるがこれらに限定されない。これらの細胞の成熟、活性化または増殖が想定されるが、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ ４０、ＣＤ ８０およびＣＤ ８６と相互作用する、前記細胞に対する共同刺激的なリガンドまたは分子も同様である。
【００３５】
本発明の免疫原組成物は、抗原との接触により、またはこれに伴って引き起こされる疾病や症状の治療、予防または防止に使用することができる。例えば、組成物は、ある種のガンの治療や予防に使用することができる。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの抗原を結合した微粒子（ここで、微粒子はウイルスと同じ範囲の大きさである）を含むワクチン組成物を提供する。本発明の組成物はそのままでも単回投与ワクチンとして特に有用で効果があるが、多数回投与療法において使用してもよい。
【００３７】
したがって、本発明は、１つの実施形態では、少なくとも１つの抗原を結合した微粒子（ここで微粒子はウイルスと同じ範囲の大きさである）を含む単回投与ワクチン組成物を提供する。
【００３８】
「単回投与」は、組成物またはワクチンの１回の投与によって、体液性および／または細胞性の免疫応答を最大のレベル（「最大」とはワクチン投与を繰り返してもさらに増加させることができないレベルを意味する）に刺激ないし増強し、または組成物の受容者に保護を与えることを意味する。投与は任意の適当な手段、例えば、注入（ｉ．ｍ、ｉ．ｐ、ｉ．ｖ）、経口投与、吸入、あるいは粘膜表面または粘膜部を通しての投与によって行うことができる。
【００３９】
好ましくは、抗原は微粒子の表面に結合する。微粒子のサイズは、直径で約０．０３と０．５μｍの間、好ましくは約０．０３〜０．１５μｍ、より好ましくは約０．０３〜０．１０μｍ、さらに好ましくは０．０３〜０．０５μｍ、さらに好ましくは約０．０３〜０．０４９μｍである。さらに好ましくは０．０３〜０．０４μｍまたは０．０４μｍ〜０．０４９μｍである。微粒子は、最も好ましくはポリスチレン、ＰＬＧ、ガラス、リン酸カルシウムまたは金から構成される。好ましい実施形態では、本発明に従って使用する抗原はそれぞれ均一のサイズの微粒子に結合する。
【００４０】
別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの抗原を結合した、ウイルスと同じ範囲の大きさの微粒子を含む、体液性免疫応答および細胞性免疫応答を開始できる単回投与ワクチン組成物を提供する。
【００４１】
細胞性応答は、好ましくはＴＨ細胞、ＣＴＬおよびＢ細胞の刺激、成熟または増殖からなる群から選択される。体液性応答は、好ましくは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびそのサブクラスからなる群から選択される。好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＭ応答が刺激される。
【００４２】
免疫応答の開始または増幅を支援する細胞を組成物によって刺激してもよい。これらの中には骨髄またはリンパ（その両方）起源のＤＣなどのＡＰＣおよびマクロファージが含まれるがこれらに限定されない。これらの細胞の成熟、活性化または増殖が想定される。
【００４３】
「含む」という用語は上記と同じ意味である。
【００４４】
微粒子という用語は上記と同じ意味である。好ましくは、微粒子は動物中の抗原提示細胞によって取り込まれるのに適合するものである。好ましくは、微粒子は０．０３と０．５μｍの間、好ましくは０．０３と０．１５μｍの間である。より好ましくは微粒子は約０．０３と０．１０μｍの間であり、より好ましくは微粒子は約０．０３と約０．０５μｍの間である。さらに好ましくは微粒子は約０．０３〜０．０４９μｍまたは０．０４μｍと０．０４９μｍである。
【００４５】
「抗原」および「結合した」という用語は上記と同じ意味である。適当なものであればどのような抗原も、ワクチン投与を意図する症状／疾病に応じて使用してもよい。
【００４６】
患者に送達される本発明のワクチン組成物の量は臨界的でなく限定されない。有効量のワクチン組成物は、好ましくは一回の服用または投与後に抗原成分に対する免疫応答を刺激する量であり、望ましくは、強い細胞性応答および体液性応答をもたらす量である。組成物の量は、患者の（患者が免疫抑制されるか免疫刺激されるかに依存して）免疫の状態、主治医または獣医の判断、また、組成物を疾病状態を防止するワクチンとして用いるのかその治療に用いるか、あるいは腫瘍の形成を防ぐワクチンとして使用するのか、既存の腫瘍の治療に用いるのかによって変えることができる。例として挙げれば、患者は、本発明の組成物を１μｇ〜１０，０００μｇ、より好ましくは５０μｇ〜５，０００μｇ、さらに好ましくは１００μｇ〜１，０００μｇ、さらにより好ましくは本発明の組成物１００μｇ〜５００μｇを受容することができる。アジュバントは一般に必要ない。しかし、免疫付与のためにアジュバントを使用してもよい。適当なアジュバントとしては、ミョウバンやヒト投与用ワクチン技術においてよく知られた他の任意のアジュバントが含まれる。
【００４７】
本発明のワクチンは、注射によって投与してもよいし、経口ルート経由や吸入によって、あるいは粘膜表面または粘膜部位を経由して投与してもよい。１つの実施形態では、本発明のワクチンは遺伝子銃によって投与する。鉄微粒子および金微粒子は、本発明に従って使用するのであれば遺伝子銃による投与に特にふさわしい。しかし、抗原を有する他のタイプの微粒子もこの方法で投与してもよい。例えば、マラリア・ライブラリー、ＤＮＡまたはプラスミドに由来する抗原は、Ｓｍｏｏｋｅｒ ＰＭらが「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｂｒａｒｙ ｉｍｍｕｎｉｓａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｍｉｃｅ ａｇａｉｎｓｔ ａ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｗｉｔｈ ｖｉｒｕｌｅｎｔ ｍａｌａｒｉａ．」、Ｖａｃｃｉｎｅ、１８（２２）：２５３３−２５４０（２０００年）−その全内容が本参照によって本願に組み込まれている−に記載した手順に従って遺伝子銃によって有効に投与されることが示された。ワクチンは単回投与によるものでも、複数回投与によるものでも、あるいはプライム−ブースティング（ｐｒｉｍｅ−ｂｏｏｓｔｉｎｇ）によるものでもよい。
【００４８】
さらに別の実施形態では、本発明は対象に微粒子（ここで微粒子はウイルスと同じサイズである）に結合した少なくとも１つの抗原を含む免疫学的に有効な量の組成物を投与することを含む対象の免疫応答を誘発する方法を提供する。
【００４９】
対象は免疫応答の誘発が望まれるいずれの人間または動物でもよい。これはペットや家畜（牛、羊、馬、雌牛、ブタ、ヤギ、ラマ、鶏、ダチョウ、エミューなど）および在来および新種の動物、野獣および野生動物を含む。
【００５０】
「含む」という用語は上記と同じ意味である。
【００５１】
免疫学的に有効な量とは、好ましくは１回の投与後に対象の免疫応答を生成するのに十分な量を指す。これは上に挙げたものを含む多数の要因、および対象がヒトか動物か、その年齢、体重などによって変わる。
【００５２】
「抗原」および「結合した」という用語は上記と同じ意味である。
【００５３】
「免疫応答」という用語は、上記の細胞性応答と体液性応答を指すと共に、免疫応答を開始（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）するか増幅するのを支援する細胞による上記のような応答も指す。免疫応答は、特に、樹状細胞、特にＤＥＣ２０５＋、ＣＤ４０＋およびＣＤ８６＋細胞の増殖および／または発達（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）によってもたらされるものでもよい。
【００５４】
微粒子という用語は上記と同じ意味である。好ましくは、微粒子は、０．０３と０．５μｍの間、より好ましくは０．０３と０．１５μｍ、さらに好ましくは約０．０３と０．１μｍの間である。より好ましくは微粒子は約０．０３と０．０５μｍの間であり、さらに好ましく約０．０３と０．０４μｍの間または約０．１９と０．０４９μｍの間である。さらに好ましくは、抗原／微粒子組成物は強い細胞性および／または体液性の免疫応答を誘発するために特に適合したものである。
【００５５】
好ましい実施形態では、本発明は、微粒子に結合した少なくとも１種の抗原を含む免疫学的に有効な量の組成物を対象に投与することを含む対象の免疫応答誘発方法であって、微粒子がウイルスと同じ範囲の大きさであり、免疫応答が樹状細胞の刺激および／または増殖を含む方法を提供する。好ましくは微粒子の大きさは約４０ｎｍ〜５０ｎｍであり、最も好ましくは４０〜４９ｎｍである。
【００５６】
別の実施形態では、本発明は、一回の投与によって抗原に対する保護免疫応答を誘発する方法であって、微粒子に結合した少なくとも１種の抗原を含む免疫学的に有効な量の組成物を一度だけ対象に投与することを含み、微粒子がウイルスと同じ範囲の大きさであり、免疫応答が樹状細胞の刺激および／または増殖を含む方法を提供する。好ましくは微粒子の大きさは約４０ｎｍ〜５０ｎｍであり、最も好ましくは４０〜４９ｎｍである。
【００５７】
別の実施形態では、本発明は、微粒子に結合した少なくとも１種の抗原を含む免疫学的に有効な量の組成物を対象に投与することを含む免疫応答を誘発するために樹状細胞にｉｎ ｖｉｖｏで抗原を送達する方法であって、微粒子がウイルスと同じ範囲の大きさであり、免疫応答が樹状細胞の刺激および／または増殖を含む方法を提供する。好ましくは微粒子の大きさは約４０ｎｍ〜５０ｎｍであり、最も好ましくは４０〜４９ｎｍである。
【００５８】
また、本発明には、１種または複数の抗原を有し、大きさがウイルスと同じ範囲内である微粒子を、微粒子と抗原が結合するように接触させることを含む免疫原微粒子／抗原組成物を生産する方法が含まれる。当業者は、このような組成物を生産するために使用する技術はよく知っているであろう。
【００５９】
【発明の実施の形態】
以下、実施例および図を参照して本発明を説明するが、これらは本発明を限定するものではない。
【００６０】
図１：パネルＡ−マクロファージによる異なる大きさの粒子の差異的取込みを樹状細胞の場合と比較して示したグラフである。０．０２、０．１または１ミクロンのサイズの蛍光性ビーズを１細胞当たり１０００個、Ｃ５７ＢＬ／Ｂ６マウスから得た培養腹膜浸出物マクロファージまたは骨髄由来樹状細胞と一夜インキュベートし、蛍光を発する細胞のパーセンテージをＦＡＣＳＣａｎによって評価した。３つの同様の実験のうちの１つを示してある。ビーズ濃度を１０倍にして使用して、ビーズまたはＢａｌｂ／ｃ由来の抗原提示細胞による３時間パルスを行った場合でもビーズサイズの差異による同様の取込みにおける差異が得られた。パネルＢ−ウイルス・サイズ粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏではリンパ節細胞に優先的に見出される。ＬＥＦＴ Ｃ５７ＢＬ／Ｂ６マウスの足の裏に、異なる大きさ（０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．５、１および２ミクロン）の０．１％蛍光性ビーズ溶液５０μｌを皮内接種し、滲出膝下リンパ節を１０日後に取り出し、ビーズを取り込んだ細胞のパーセンテージをＦＡＣＳｃａｎによって評価した。データは、３回の試料における蛍光性の細胞＋／−標準誤差（ＳＥ）の平均パーセンテージとして示す。０．０４および０．１ミクロンの粒子サイズは他のいずれのサイズの粒子よりも有意に高い取込みを示した（ｐ＞０．００１）。０．１または１ミクロンのビーズのみを使用した同様の実験では、接種後３、６または９日に回収したリンパ節中、０．１ミクロンのビーズ取込みが、１ミクロンビーズの取込みを有意に上回っていた。パネルＣおよびＤ−ウイルス・サイズの粒子は、リンパ節ＮＬＤＣ１４５＋（ＤＥＣ２０５＋としても知られている）（パネルＣ）およびＦ４／８０＋（パネルＤ）細胞によって優先的に取り込まれる。蛍光性粒子を取り込んだリンパ節細胞をＦＡＣＳｃａｎ分析によって調べ、樹状細胞マーカーＮＬＤＣ１４５／ＤＥＣ２０５またはマクロファージ／単球マーカーＦ４／８０の同時発現量を評価した。データは、ビーズ取込みにより蛍光性になったＮＬＤＣ１４５＋またはＦ４／８０＋細胞のパーセンテージを示す。
【００６１】
図２：パネルＡ−異なる大きさのビーズに結合したＯＶＡによって免疫されたＩＦＮγ産生ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞の誘導。Ｃ５７ＢＬ／Ｂ６マウスを、０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．５、１または２ミクロン・サイズのビーズと結合したＯＶＡ１００μｇによって２度（１０日の間隔）皮内に免疫し、追加刺激免疫の１０日後に脾臓Ｔ細胞活性をＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。応答は、Ｈ−２Ｋｂ制限ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープＳＩＩＮＦＥＫＬまたは全ＯＶＡに対して測定した。ＯＶＡに対する反応性の評価の場合には、分析前に磁気ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）によって脾臓細胞をＣＤ８ Ｔ細胞から除き、ＯＶＡ応答性ＣＤ４ Ｔ細胞の定量を行った。ＳＩＩＮＦＥＫＬは２．５μｇ／ｍｌで、ＯＶＡは２５μｇ／ｍｌで使用した。３回の同様の実験のうちの１回の結果を示す。１群当たり２匹のマウスがそれぞれの大きさのビーズで免疫された。ＥＬＩＳＰＯＴ培養を２回行い、試験した細胞１００万個の当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）の平均値を示す。標準偏差（ＳＤ）は常に平均値の２０％未満であった。パネルＢ−ＳＩＩＮＦＥＫＬに応じた細胞傷害活性を有するＴ細胞とＩＦＮγ分泌Ｔ細胞とのＥＬＩＳＰＯＴによる相関。Ｃ５７ＢＬ／Ｂ６マウスを大きさの異なるビーズ−ＯＶＡで免疫し、ＳＩＩＮＦＥＫＬに対する応答性を上記ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。さらに、細胞傷害活性を有するＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔ細胞の数を制限的稀釈分析（ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）により平行して測定した。クロム付与ＥＬ４細胞を単独でまたはＳＩＩＮＦＥＫＬ２．５μｇ／ｍｌであらかじめパルス処理したものを標的として使用した。得られたデータは、これら２種の分析結果の間に強い相関（Ｒ二乗＝０．９２５４）が存在することを示している。２回の同様の実験のうちの一方を示す。パネルＣ−異なる大きさのビーズに結合したＯＶＡによる免疫によって誘導された抗体産生。パネルＡに記載したマウスから血清を回収し、血清希釈物についてＯＶＡ特異的ＩｇＧ応答性をＥＬＩＳＡによって試験した。０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．５、１または２ミクロンの大きさのＯＶＡビーズ免疫を与えたマウスを個体ごとにプロットする。同様な２回の実験のうちの一方を示す。
【００６２】
図３：最適なＴ細胞応答を誘導するのに必要な抗原のビーズへの共有結合。パネルＡ−ビーズ結合ＯＶＡのみがＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞応答を説明する。Ｃ５７ＢＬ／Ｂ６マウスを、事前透析を行わず（対照）または３００Ｋｄ排除膜によってＰＢＳに対して透析した後（透析）、０．０４ミクロンのビーズに共有結合的に結合したＯＶＡで免疫した。皮内免疫１０日後にＩＮＦγ産生脾臓ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の誘導をＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。グループ当たり４匹のマウスについて複製ウェル中のＥＬＩＳＰＯＴによって評価した平均＋／−ＳＥを示す。ＰＡＮＥＬ Ｂ−ビーズおよび可溶のＯＶＡを同時投与した場合は最適のＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞応答を誘導するのには十分ではない。Ｃ５７ＢＬ／Ｂ６マウスを、０．１ミクロンのビーズに共有結合させたＯＶＡ（ビーズ結合ＯＶＡ）、または注射に先立って混合したＯＶＡ（ビーズ／ＯＶＡ混合物）で免疫した。皮内免疫１０日後にＩＮＦγ産生脾臓ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の誘導をＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。グループ当たり２匹のマウスについて複製ウェル中のＥＬＩＳＰＯＴによって評価した平均Ｔ細胞前駆体頻度を示す。
【００６３】
図４：ウイルス・サイズ・ビーズ−ＯＶＡによる単回免疫はＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞を長期間持続的に高レベルに誘導するのに十分である。パネルＡ−Ｃ５７ＢＬ／Ｂ６マウスを、ビーズ−ＯＶＡ（０．１ミクロン）で、１、２または３回、１４日の間隔をあけて皮内免疫し、それぞれの場合について最後の免疫の１０日後にＳＩＩＮＦＥＫＬに対するこれらのＩＦＮγ応答をＥＬＩＳＰＯＴによって調べた。１群当たり３匹のマウスが免疫になった。また、データは、各マウスにおける２回の分析結果の平均値を示す。同様な２回の実験のうちの一方を示す。パネルＢ−マウスをビーズ−ＯＶＡ（０．１ミクロン）で一度免疫し、１２日または８２日後にＳＩＩＮＦＥＫＬまたはＯＶＡに対するＩＮＦγ応答をＥＬＩＳＰＯＴによって試験した。図２と同様に測定したＯＶＡに対する抗体レベルは８２日目でも維持された。
【００６４】
図５：皮内免疫後に滲出リンパ節中においてビーズを取り込んだ細胞によるＣＤ４０発現の評価。未処理のＣ５７ＢＬ／６マウス（左）または蛍光性の０．０４μｍフルオビーズ（ｆｌｕｏ−ｂｅａｄｓ）で足の裏の皮内に免疫されたマウス（右）から、注射４８時間後に膝下のＬＮ細胞を切除し、これらのマーカーに特異的な抗体に結合したＰＥで染色することによりＣＤ４０発現について分析した。ＦＬ−１＝ＦＩＴＣ陽性細胞（ビーズ＋）およびＦＬ−２＝ＰＥ陽性細胞（マーカー＋）。バックグラウンドの染色は無視できた（＜１％）。左のパネルは、免疫していない動物から得た膝下ＬＮ細胞を表わし、右のパネルは、ＶＳＰ−ＯＶＡ免疫動物から得た同じタイプの細胞を表わす。
【００６５】
図６：０．１μｍＯＶＡビーズに応じたマウスの未熟および成熟ＤＣ増殖の誘導。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの後脚の脛骨および大腿骨から抽出した骨髄細胞からＤＣを得てＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を加えて培養した。培養５日後に、細胞を１．２５×１０６細胞／１．２５ｍｌの実験条件に分け、１０００ビーズ／細胞の割合でビーズ結合ＯＶＡ（０．１μｍ）をパルス処理した。パルス処理４日目に、適当な培地にＬＰＳおよびＴＮＦａを添加した。細胞のインキュベートを一夜続け、翌日、増殖チミジン分析をセット・アップし、一夜インキュベートした。各値は３回の平均±ＳＤ（パルス処理しないＤＣと実験群間でｐ＜０．００００１。対のないｔ−検定（ｕｎｐａｉｒｅｄ ｔ−ｔｅｓｔ））を表わす。
【００６６】
図７：ｉｎ ｖｉｖｏにおいて０．０４μｍ粒子を取り込んだＡＰＣ表現型の同定（１μｍ粒子と比較）。０．０４または１μｍのフルオビーズ（ｆｌｕｏｂｅａｄｓ）−ＯＶＡ５０μｌをＣ５７／Ｂ６マウスの足の裏に注入した。４８時間後に活性化と抗原提示細胞系の細胞マーカーを有するビーズ陽性細胞の同時染色を行うために膝下の滲出ＬＮを分析した。３−１４マウス／マーカーについて平均＋／− ＳＥを示す。０．０４および１μｍフルオビーズ＋細胞は、ＤＥＣ２０５、Ｆ４／８０、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６の有意に異なる発現を有していた（ｐ＜０．０５）。
【００６７】
図８Ａ：ＤＣによるウイルス・サイズ粒子取込みのメカニズム。骨髄由来の培養ＤＣを、ミリスチン酸フロボール（ｐｈｒｏｂｏｌ ｍｙｒｉｓｔａｔｅ）酢酸塩（ＰＭＡ）［０（黒）、５（白）、１０μＭ（灰色）］、アミロライド（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ（ＡＭＬ））［０（黒）、１（白）、３μＭ（灰色）］またはサイトカラシンＤ（ＣＤＤ）［０（黒）、０．２５（白）、０．５μｇ／ｍｌ（灰色）］と共に３０分間および０．０４μｍ０ＶＡ−蛍光性粒子を加えてさらに３時間インキュベートした。カヴェオラ（ｃａｖｅｏｌａｅ）、クラスリン（ｃｌａｔｈｒｉｎ）被覆ピット形成または食細胞運動の選択的な阻害は、１０μＭ ＰＭＡ、３ｍＭアミロライドおよび０．５μｇ／ｍｌＣＣＤについてそれぞれ１４、１５で報告されている。ＰＭＡとＡＭＬを共に使用する場合、ＰＭＡは１０μＭで一定とし、ＡＭＬは１（白）または３ｍＭ（灰色）加えた。蛍光を示す細胞数をＦＡＣＳｃａｎによって評価した。データは３回行った培養の平均＋／− ＳＤとして示す。
【００６８】
図８Ｂ：取込みメカニズムの確認。ＤＣを、何も加えず、あるいはＣＤＤ１μｇ／ｍｌ、フィリピン（ｆｉｌｉｐｉｎ：ＦＩＬ）１μｇ／ｍｌまたは塩化アンモニウム（ＡＣ）４０ｍＭと共に３０分間、および０．０４μｍまたは１μｍの蛍光性ビーズを加えてさらに３時間インキュベートした。カヴェオラ（ｃａｖｅｏｌａｅ）またはクラスリン（ｃｌａｔｈｒｉｎ）被覆ピット形成の選択的な阻害は、１μｇ／ｍｌフィリピンおよび４０ｍＭ塩化アンモニウムについてそれぞれ１４〜１７、２９で報告されている。蛍光を示す細胞数をＦＡＣＳｃａｎによって評価した。データは３回行った培養の平均＋／− ＳＤとして示す。
【００６９】
図９：可溶ＯＶＡおよび１ｕｍ−ＯＶＡビーズは０．０５ｕｍ−ＯＶＡビーズに匹敵する保護を誘導しない。Ｃ５７／Ｂ６マウスを、０．０５ｕｍまたは１ｕｍビーズに結合したＯＶＡ、可溶ＯＶＡで皮内（ＩＤ）に免疫するかまたは処理せず、次いで上記と同様に抗原に曝した。データは、各群８匹の１０日目における個々の腫瘍サイズとして示す。２回行った同様の実験のうちの１回を示す。０．０５ｕｍ−ＯＶＡビーズ群と他の群のそれぞれの間の腫瘍発生率の差は有意なものであった：未処理（ｎａｉｖｅ）に対しＰ＝０．０００１；可溶に対しｐ＝０．０００７；１ｕｍビーズ−ＯＶＡに対してｐ＝０．００３５。
【００７０】
図１０：ウイルス・サイズ粒子は、初期エンドソームと同時局在しない（左）。骨髄由来ＤＣを０．１ミクロンのビーズ−ＯＶＡ（５００ビーズ／細胞）と共に一夜インキュベートし、遊離ビーズを除くために穏やかに洗浄し、ガラス・スライド上にスピン・アウトして共焦点顕微鏡用に調製した。次いで、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、トリトンで浸透可能とし、初期エンドソーム・マーカーＲａｂ４の存在を、ビオチン結合モノクローナル抗体を用いて染色し、次いでストレプトアビジン−アレクサ（Ａｌｅｘａ）で染色した。非結合０．０４および０．１ミクロン・ビーズでも同様の結果を観察した。３回行った実験のうちの１回を示す。蛍光性０．１ミクロン・ビーズは、ビーズと共に３０分または３時間インキュベートしたＤＣを使用したＲａｂ４染色では同様に同時局在を示さなかった。（右）マウスを、０．１ミクロンのビーズ−ＯＶＡを用いて後肢の足の裏に皮内注射し、４８時間後、滲出膝下リンパ節を切除して上記と同様に共焦点分析を行った。Ｒａｂ４マーカーおよびＯＶＡ結合または非結合０．１ミクロンまたは０．０４ミクロンのビーズについて同時局在は全く観察されなかった。３回行った実験のうちの１回を示す。対照的に、１ミクロン・サイズの蛍光性ビーズで免疫した陽性コントロール・マウスでは同時局在が確認された。
【００７１】
図１１：腫瘍からの保護。パネルＡ−Ｃ５７／Ｂ６マウスを、ＯＶＡ−ＶＳＳＰで１回皮内（ＩＤ）免疫するか（免疫）、処理せず（未処理）、３０日後に皮下注入によって５×１０６ＥＧ７（腫瘍細胞）でチャレンジした。腫瘍はカリパスを用いて測定した。１群当たり１０匹の動物に対して個々の腫瘍成長曲線を示す。パネルＢ−上記と同様に腫瘍を誘導し、腫瘍成長８日目（免疫の日を０日目とする）に、６匹の動物を処理せず（未処理）、またはＯＶＡ−ＶＳＳＰで皮内（ＩＤ）免疫した（免疫）。免疫後３〜１３日目の個々の成長曲線を示す。
【００７２】
図１２：ＶＳＳＰ免疫後に致死性マラリアの抗原投与を受けたマウスの存命。ＶＳＳＰ−ＯＶＡ、ＶＳＳＰ溶解物または溶解物のみを１００μｇで皮内に１度免疫したＣ５７／Ｂ６マウスを、５００，０００個の致死性マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）１７ＸＬ感染Ｃ５７／Ｂ６赤血球でチャレンジした。存命を毎日監視した。１群当たり５匹の動物が抗原に曝され、６回の代表的な実験のうちの１回を示す。同様の実験では、未処理マウスは２週間後に４０％の存命率を示した（８／２０匹のマウス）。溶解物は、標準のプロトコルを使用して、Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ １７ＸＬ感染した赤血球の凍結解凍を繰り返し、超遠心分離し、ＶＳＰに結合させて生成した。
【００７３】
図１３：抗原ＯＶＡについて前述したのと同様に抗原ｎｍ２３を０．０５μビーズ（ＶＳＰ）に結合し、１００μｇ／マウスの割合でマウスに皮内注射し、１０日後のＩＦＮガンマ活性を免疫された動物の脾臓についてＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。データｉｄは、１００万個の脾臓細胞についてｎｍ２３に応答する細胞の前駆体発生率をスポット形成単位（ＳＦＵ／百万個）±平均値の標準偏差（ＳＩＤ）として示した。３匹のマウス（ｍ１〜ｍ３）の個々の応答を示す。
【００７４】
図１４：ガン抗原ｎｍ２３またはＯＶＡを、標準プロトコルによりＶＳＰに結合し１００μｇ／マウスの割合で皮内注射した。１０日後に、ＩＬ４分泌細胞の誘導をＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。データは、それぞれ免疫した３匹の個体マウスについてのＳＦＵ／１００万＋／−ＳＤとして示す。
【００７５】
図１５Ａ：ＯＶＡに結合した０．０５μｍビーズ（ＶＳＰ−ＯＶＡ）で１度皮内免疫したマウス血清中のＯＶＡへの抗体応答性および非免疫対照群（Ａグループ）と比較した９０日後のＥＬＩＳＡによるその評価（Ｂグループ）。
【００７６】
図１５Ｂ：図１５Ａのマウスと同じ血清について、２匹の未処理マウス（Ａ２とＡ３）および３匹のＶＳＰ−ＯＶＡマウス（Ｂ２、３および５）中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体の存在をＥＬＩＳＡにより試験した。
【００７７】
図１６：パネルＡ−単回免疫による長期持続性抗体応答の誘導。Ｃ５７／Ｂ６マウスを、０．０４μｍビーズに結合したＯＶＡで１度免疫し、その血清を異なる時点で採取した。ＯＶＡ特異的ＩｇＧ ＥＬＩＳＡにおける４匹の動物各群の血清の４０５ｎｍの＋／− ＳＥ光学密度平均値を示す。未処理血清をネガティブ・コントロールとして示す。２回行った同様の実験のうちの１回を示す。全ｌｇおよび非ＩｇＡまたＩｇＭについても同様のＥＬＩＳＡ結果が検出された（図示していない）。ＯＶＡだけは、ＰＢＳ免疫動物に対してＩｇＧ応答を誘導せず、完全フロイント・アジュバント（ＣＦＡ）中のＯＶＡは、単回投与０．０５μｍビーズ−ＯＶＡ（図示していない）より対数的に高いＩｇＧ応答を誘導した。パネルＢ−０．０４μｍビーズ−ＯＶＡによる１度の免疫によるＩＦＮγ産生Ｔ細胞の長期持続的高レベル誘導。Ｃ５７／Ｂ６マウスを、０．０４μｍビーズ結合ＯＶＡ（黒または格子縞模様の縦棒）、ＰＢＡ中可溶ＯＶＡ（白い棒）または０．０４μｍビーズと混合したＯＶＡ（灰色の縦棒）で１度皮内免疫した。１０日後（黒、白、灰色の縦棒）または１２か月後（格子縞模様の縦棒）にＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴによってＳＩＩＮＦＥＫＬ応答的な脾臓Ｔ細胞前駆体発生率を評価した。１群当たり４匹のマウスを試験し、２回行った同様の実験のうちの１回を示す。各群について１００万個の細胞当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）の平均値＋／−標準偏差（ＳＥ）を示す。１０分の１の抗原（１０μｇ ＶＳＰ−ＯＶＡ）を使用した同様の実験において、１度の免疫が１０２＋／−５６のＳＩＩＮＦＫＬ特異的脾臓細胞（１００万個当たり；ｎ＝４）を誘導した。標準的なクロム放出試験でも、１度の免疫後１０日目に細胞傷害性Ｔ細胞応答が観察された（Ｅ：Ｔ比＝２０：１における３／３動物についての特異的溶解は５０％を超過。図示していない）。
【００７８】
図１７：プライム／ブースト。Ｃ５７／Ｂ６動物を未処理（処理なし）とするか、またはＭＵＣ１由来ペプチドｃｐ１３−３２の１００ｕｇを完全フロイント・アジュバント中ＫＬＨ７０Ｏｕｇと結合したもの（ｃｐ１３）、マンナンに結合した組換えＭＵＣ１−ＧＳＴ融合タンパク質（ＭＦＰ）または０．１ｕｍ ＶＳＰと結合したＭＵＣ１−ＧＳＴ融合タンパク質（ＶＳＰ）で皮内に１度プライムした。１４日後に動物を、１００万のＭＵＣ１タンパク質発現感染性ワクシニアウイルスで追加刺激し、１０日後にｃｐ１３−３２中エピトープに対する応答性をＩＦＮｇＥＬＩＳＰＯＴによって評価した。示すデータは、２〜３匹の動物／群についての１００万個の脾臓細胞当たりのＩＦＮｇ産生細胞数の平均値＋／−ＳＥである。
【００７９】
図１８：ポリスチレンとガラスの０．０５ｕｍＶＳＰ−ＯＶＡ粒子の比較。前述のもの（ＰＳ）と同様に、ポリスチレン０．０５μｍビーズをＯＶＡに結合し、同じ方法でＯＶＡを結合したガラス・ビーズ（Ｇ１）と比較した。さらに、ガラス・ビーズについて様々な化学処理を比較した。簡単に言えば、ガラス・ビーズを秤量し、固形分２．５％のＰＢＳ溶液に懸濁し２度洗浄した。小型遠心器（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）中５分間の遠心分離によってＰＢＳを除いた。ビーズ小球をｐｈ ７．４の８％グルタルアルデヒドＰＢＳ溶液に再懸濁し、室温で穏やかに一夜混合した。次いでビーズをＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁し、ｍｌ当たり５００μｇのタンパク質を加え５時間穏やかに混合した。次いで、ビーズをペレットとし、ペレットをｏ．５Ｍエタノールアミンに再懸濁することにより反応を停止し３０分間混合した。次いで、ビーズをＰＢＳで洗浄し、免疫（Ｇ２）のために使用した。ポリスチレン（ＰＳ）またはガラス（Ｇ１またはＧ２）ＶＳＰ−ＯＶＡを１００ｕｇ／マウスの量で皮内に免疫し１０日後にＥＬＩＳＰＯＴによって脾臓からＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＩＦＮｇ分泌Ｔ細胞を定量した。データは１群当たり３匹の動物について個々の平均値＋／−ＳＥを示す。
【００８０】
図１９：ビーズ結合および免疫性のモード。５０ｍＭ ＭＥＳバッファー（ｐｈ ６．０）に２ｍｇ／ｍｌ溶解させたオボアルブミンをポリスチレンカルボキシ変性０．０５μｍビーズ（固形分２％）と１５分間混合した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジアミドを各調製物に４ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ ６．５）加え、室温で２時間インキュベートした。標準（グリシン）は、７ｍｇ／ｍｌグリシンまたは１Ｍエタノールアミン（アミン）２０μｌ（ｐＨ ７．４）、または１Ｍアミノアセタルデヒドジメチルアセタール（アルデヒド）２０μｌ（ｐＨ ８．０）、または１Ｍエチレンジアミン（アルコール）２０μｌ（ｐＨ ７．４）でクエンチした。調製物をおよそ１６時間室温でインキュベートした。調製物はすべて、４℃のＰＢＳで一夜透析した。アルデヒド調製物は、１ＭＨＣＬの２０μｌでさらにクエンチし４時間インキュベートし、４０℃のＰＢＳで一夜透析した。２〜３匹のＣ５７／Ｂ６マウスを、これらのＶＳＳＰ−ＯＶＡ粒子の各１００ｕｇで皮内免疫し、ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープＳＩＩＮＦＥＫＬへのＩＦＮｇ ＥＬＩＳＰＯＴによって脾臓中で評価した。結果を各動物の１００万脾臓細胞当たりのＳＦＵの平均値＋／−ＳＥとして示す。
【００８１】
【実施例】
実施例１：使用した材料および方法
マウスおよび免疫：６週齢から８週齢のＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスをＷａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌから購入した。マウスは抗原結合ビーズ１００μｌを後肢の足の裏に皮内（ＩＤ）免疫した。
【００８２】
試薬：特に断らない限り、抗原オボアルブミン（ＯＶＡ（等級ＩＩＩ））および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジアミド（ＥＤＡＣ）を含む試薬はすべてＳｉｇｍａから購入した。ＦＡＣＳｃａｎおよび共焦点分析用のモノクローナル抗体は、タンパク質Ｇカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて実験室でハイブリドーマ・ラインから取り出すか、またはＰｈａｒｍｉｇｅｎから購入した。ＦＩＴＣ結合フルオスフェアおよびカルボキシル化フルオスフェア０．０２〜２μはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから、また、非蛍光性カルボキシル化ミクロスフェアはおよびＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。次のマーカーに対する略語を使用した：ＭＨＣＩＩ、ＭＨＣＩ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、Ｆ４／８０、ＮＬＤ−１４５、ＣＤ８ａｌｐｈａ、ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６。共焦点分析で使用する抗Ｒａｂ４モノクローナル抗体はラッセル博士（Ｐｅｔｅｒ ＭｃＣａｌｌｕｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から頂いた。
【００８３】
抗原提示細胞：樹状細胞は、以前に公表された方法［５］に小さな修正を加え骨髄単球から調製した。簡単に言えば、細胞を媒体を用いて骨穴から洗い流すことにより後肢の脛骨および長骨から収穫し、次いで赤血球を溶解させた。細胞は、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩および１００μＭ β−メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ（ＣＳＬ、ＡＵＳＴ）中１Ｘ１０６細胞／ｍｌをプレート塗布し、１０００単位／ｍｌＧＭ−ＣＳＦおよび０．２ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４を加えた。１０ｍｌ培養物を３７℃の高湿度ＣＯ２インキュベーター内に置いた１００ｍｍ直径のペトリ皿中で５〜６日間成長させた。チオグリコレートを腹腔内注射してから３日後にマクロファージをマウス腹腔内（ＩＰ）から取り出し、記載されているように３日間培養して接着細胞分画を増やした［６］。
【００８４】
ビーズ抗原結合はメーカー指示に従って行った。簡単に言えば、ＯＶＡを０．０５Ｍ ＭＥＳバッファーｐＨ ６．０中２．０ｍｇ／ｍｌに希釈し体積比１：１で固形分２％（体積）のビーズと混合した、混合物を１５分間穏やかに揺り動かし、次いで、４ｍｇ／ｍｌ ＥＤＡＣを加えた。混合物のｐＨは希ＮａＯＨで６．５に調節し、混合物は２〜３時間穏やかに揺り動かした。反応は、最終濃度１００ｍＭのグリシンで停止させた。３０分間混合した後、調製物を冷ＰＢＳ中で一夜透析した。調製物は直ちに使用したか、または後の使用のために０．０１％のアジ化物を加えて４℃で貯蔵した。
【００８５】
細胞傷害性分析：これは記載されているようにして行った［３］。簡単に言えば、３７℃の高湿度ＣＯ２インキュベーター内に置いた２ｍｌのウェル・プレート中、ペプチド抗原１０μｇ／ｍｌを１０％の熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、４ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩および１００μＭ β−メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩ（ＣＳＬ、ＡＵＳＴ）培地を用い２．５×１０６／ｍｌの条件で７日間脾臓細胞を培養することにより細胞傷害性分析用のエフェクター細胞を生成した。３日目にインターロイキン２（１０Ｕ／ｍｌ、組換えヒトＩＬ２、リンフォカルト（Ｌｙｍｐｈｏｃｕｌｔ）ＨＴ、Ｂｉｏｔｅｓｔ、英国）を加えた。標的は５１Ｃｒを付与したＥＬ４細胞であり、単独でまたは予め１０μｇ／ｍｌ ＳＩＩＮＦＥＫＬＬペプチドもしくはオボアルブミン変形ＥＬ４細胞系で１時間プレパルス処理した。特に断らない限り分析は２０：１のエフェクター：標的比で２回行った。自然溶解（培地のみ）および最大溶解（５％トリトンを用いた）はすべての標的に対して４回セット・アップした。４時間後に上清を収穫した。溶解率（％Ｌｙｓｉｓ）は１００×（（実験放出−自然放出）／（最大放出−自然放出））として計算した。特異的溶解率（％ＳＬ）はペプチドによる％Ｌｙｓｉｓ−ペプチドによらない％Ｌｙｓｉｓとして計算した。
【００８６】
細胞傷害性Ｔ細胞前駆体（ＣＴＬｐ）分析：ＣＴＬｐ分析は、以前に記述されるように行った［７］。ＣＴＬｐ発生率は、少なくとも６個のエフェクター細胞数（１×１０３−１．２８×１０５）について、３２のレプリケートの最小値から決定した。細胞はＵ−底マイクロタイター・トレーにおいて、５×１０５マイトマイシンＣ処理共通遺伝子（ｓｙｎｇｅｎｅｒｉｃ）脾臓細胞と共に、１０％のウシ胎児血清、５μＭ ＳＩＩＮＦＥＫＬまたはＯＶＡおよび１０Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−２を添加したＤＭＥＭ中で培養した。７日後、各マイクロカルチャーを、１０４ ５１ Ｃｒ標識したＥＬ４またはＥＧ７を標的として含む１００μｌ標的細胞懸濁液で培地１００ｍｌを替えることにより細胞傷害性を分析した。各ウェルにおいて５１Ｃｒ放出が刺激剤のみと培養した１０４のエフェクターから、またはペプチドのみまたはｒＩＬ２のみを備えた刺激剤細胞からのアイソトープ放出量の平均値を標準偏差の３倍上回った場合、細胞傷害性が存在すると考えられた。線形の関係（０．９８７≦ｒ２≦１）が、応答者細胞の数（線形スケール）と陰性ウェル発生率（対数スケール）の間に存在した。ＣＴＬｐ発生率は３７％陰性ウェルを生成するのに必要な応答者細胞投与量の逆数として決定した［８、９］。ＣＴＬｐ発生率分析は、３回実行した。また、個々の発生率は平均値と２０％以上は異ならなかった。
【００８７】
ＥＬＩＳＰＯＴ ＩＦＮγ分析：これは記載されているのと同様にして実行した［３］。簡単に言えば、新たに分離した５×１０６／ｍｌの脾臓細胞１００μｌを、抗ネズミＩＦＮγｍＡｂ（Ｒ４）（ＥＡＣＣ）でプレコートした混合酢酸塩プレート（ＭＡＨＡミリポア）上で１８時間所定の刺激をしながらインキュベートした。各条件について２重のウェルをセット・アップした。使用する培地は上記のように成分を添加したＲＰＭＩ１６４０（ＣＳＬ）であった。一夜インキュベートした後、細胞を洗浄し、別のビオチン結合抗ネズミＩＦＮγ（ＸＭＧ．２１−ビオチン、Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）ｍＡｂプレートでインキュベートし、エクストラビジン（ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ）アルカリフォスファターゼ（Ａ−ＡＰ）を１μｇ／ｍｌ（シグマ）で結合した。アルカリフォスファターゼ活性のスポットは比色定量のＡＰ検知キット（Ｂｉｏｒａｄ、ヘラクレス、ＣＡ（アメリカ））を使用して検出し、また解剖顕微鏡を利用して数えた。データは、１００万個の細胞当たりのスポット形成単位（ＳＦＵ）として示される。ＳＩＩＮＦＥＫＬ−ペプチドは２．５のμｇ／ｍｌで利用した。
【００８８】
統計分析：各群で保護されたマウスの数をＥｐｉＩｎｆｏバージョン５．０パッケージのＳｔａｔｃａｌｃプログラム中のχ２検定を使用して比較した。免疫性の研究では、ＥＬＩＳＰＯＴおよびクロム放出応答を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆエクセル・バージョン５．０ａパッケージを用いたスチューデント検定を使用して群間で比較した。線形回帰分析を用いて、ウインドウズ版統計プログラム・パッケージ用ＳＰＳＳを使用して免疫性と保護の間の相関性を評価した。
【００８９】
樹状細胞とマクロファージによるビーズ取込み：スライドガラス上で培養した３日齢マクロファージおよび５日齢樹状細胞培養物に５分から２４時間までの間、異なるサイズの蛍光マイクロビーズを与えた。次いで、培養物を洗浄して遊離ビーズを除き、ＦＡＣＳｃａｎまたは共焦点分析のために調製した。
【００９０】
ビーズをｉｎ ｖｉｖｏで取り込む細胞の分析：滲出リンパ節と脾臓を免疫後１２時間から１２日以内の様々な時間間隔でビーズ免疫マウスから回収した。細胞を回収後および赤血球を溶解し洗浄後、ＦＡＣｓｃａｎまたは共焦点分析のために調製した。
【００９１】
細胞表面マーカー染色およびフロー・サイトメトリー：表面染色については、５×１０５細胞を、表面マーカーＦ４／８０およびＮＬＤ−１４５、ＣＤへのＰＥ標識ＭｏＡｂと共にインキュベートした。直接抗体に付けられないないときは、細胞を２回の洗浄後、第１の抗体に特異的な別のＰＥ標識抗体と共にインキュベートした。第２の抗体が加えられた種の未処理血清は第２の抗体を用いたインキュベートの前にブロッキング・ステップで使用した。２回の洗浄後、細胞をＰＢＳ／０．２％パラホルムアルデヒドで洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎフロー・サイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）およびＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアで分析した。光散乱ゲートを設けて死細胞および非リンパ細胞を除外した。ビーズで免疫されているが何らの表面マーカーでも染色されていないものおよび表面マーカーに対するＰＥ標識抗体で染色された未処理マウス由来の細胞を、ＦＩＴＣとＰＥ放射スペクトルの間の重なりに対する補償量を決定するために使用した。
【００９２】
細菌に取り込まれたＦＩＴＣ標識ビーズの共焦点顕微鏡分析：２重の蛍光発生および伝達検知部を備えたＯｌｙｍｐｕｓ製の走査共焦点顕微鏡をクリプトン・アルゴン・レーザー光源と共に使用し、様々なサイズの蛍光化ビーズがマクロファージまたは樹状細胞の貪食によって取り込まれたかどうか判断した。食細胞運動を決定するために０．５〜１．０ミクロン間のステップ・サイズで試料を通して連続する部分を得、Ｏｐｔｉｓｃａｎアナライザーで分析した。細胞は、フルオレセインとアレクサ（Ａｌｅｘａ）５９４に対しそれぞれ４８８ｎｍおよび５６８ｎｍで起動され、５３０ｎｍおよび６１０ｎｍの帯域フィルターによってそれぞれ検出した。データ獲得の全プロセスにわたって、レーザー力は飽和レベル以下に維持し、利得およびオフセット・パラメーターは個々の実験内で維持した。
【００９３】
ＥＬＩＳＡ分析：ＯＶＡに対する抗体反応はＥＬＩＳＡを使用して測定した。ポリ塩化ビニル・マイクロタイター・プレートをＯＶＡ（１０μｎｇ／ｍｌ、０．２Ｍ ＮａＨＣＯ３バッファー、ｐＨ ９．６）で４℃で一夜覆った。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０で４回およびＰＢＳで４回洗浄し、次いで、２％ウシ血清アルブミンで非特異的結合を室温１時間でブロックした。上記のように洗浄した後、マウス血清の連続稀釈液を加えて室温でさらに１時間インキュベートした。非免疫マウス血清をネガティブ・コントロールとして使用した。プレートを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヒツジ抗マウスＩｇ（Ｓｅｌｉｎｕｓ、ＡＵＳ）および色原体基質２（２”−アジノ−ジ（３−エチルベンズチアゾリン）スルホネート（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）を用いて結合抗体を検出した。ＥＬ ３１２ｅマイクロプレート・リーダを使用して４０５ｎｍ吸収を記録した。
【００９４】
実施例２：ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの抗原提示細胞によるＶＳＳＰの優先的取込み　マクロファージ／単球由来細胞を用いた多数の研究が、粒子サイズに依存する食細胞運動を示しており、その最適の取込みサイズは直径１ミクロンである［１０、１１］。取込みは樹状細胞中で観察されたが、粒子サイズは包括的には試験されていなかった。本発明者はタンパク質で覆ったウイルス・サイズ（０．０３−０．１μｍ）の粒子が樹状細胞またはマクロファージによって効率的に取り込まれるか否かを確証することに特に興味を持っていた。図１ａはチオグリコレートが腹膜浸出物マクロファージが１μｍおよび０．１μｍ両方のフルオレセイン標識粒子（ｆｌｕｏ−ビーズ）を内部に取り込むことを示している。これに対し、骨髄由来の未熟な樹状細胞は、０．１μｍサイズのｆｌｕｏ−ビーズを優先的に取り込むことが見出された。共焦点顕微鏡を使用して粒子が細胞内（図示していない）にあることを確認した。このｉｎ ｖｉｔｒｏでのデータは、ｉｎ ｖｉｖｏでウイルス・サイズの固体粒子（ＶＳＳＰ）が抗原提示細胞によって優先的に取り込まれることを示唆した。蛍光性ポリスチレンタンパク質を、一連のサイズ（０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．５、１および２μｍ）の粒子に結合させ、Ｃ５７ＢＬ／Ｂ６マウスの足の裏に皮内注射し、１０日後にＦＡＣＳｃａｎ分析のために滲出膝下リンパ節から回収した。０．０４〜０．１μｍサイズの粒子は、リンパ節細胞によって優先的に取り込まれていた（図１ｂ）。同様の結果は、非結合粒子と共に、粒子注入後１、３、６および１０日目にリンパ節細胞を分析して得られた。ＶＳＳＰは、マクロファージ表面マーカーおよび樹状細胞表面マーカー（図１ｂ）の両方を発現する抗原提示細胞によって効率的に取り込まれた。骨髄由来樹状細胞もｉｎ ｖｉｔｒｏでさらにＶＳＳＰを取り込んだ。予想通り、これらの細胞は主に脊髄性の表現型であった［１２］。
【００９５】
実施例３：抗体および細胞傷害性およびＩＦＮγ分泌Ｔ細胞のＶＳＳＰプライム高前駆体発生率
Ｉｎ ｖｉｖｏでの樹状細胞による効率的なＶＳＳＰ取込みは、標的抗原の送達のためにこれを使用することおよび新規なワクチンとして可能性を示唆した。Ｃ５７／ＢＬマウスを、オボアルブミン（ＯＶＡ）被覆を施した０．０２、０．０４、０．１、０．２、０．５、１または２μｍの粒子で免疫し、１５日後に追加刺激し、１０日後に血清または脾臓細胞を回収した。図２ａは、ＭＨＣクラスＩ制限ＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープに対して０．０４μｍサイズの粒子を使用して達成されたＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８ Ｔ細胞誘導が最適の誘導となることを示す。ＣＤ４ Ｔ細胞のＯＶＡへの応答は、０．０４〜１ミクロンを変動するＯＶＡを結合した粒子を備えた同様の前駆体発生率でも見出された。ＩＩＮＦＥＫＬに対する細胞傷害性Ｔ細胞もＶＳＳＰで誘導され、ＩＦＮγ分泌Ｔ細胞前駆体発生率と相関している（Ｒ２＝０．９２）（図２ｂ）。意外にも、０．０４μｍ粒子で免疫し、次いで１μｍ粒子で免疫したマウスでは、ＯＶＡ特異的ＩｇＧも最も高い前駆体発生率が見出された（図２ｃ）。同様の免疫性結果はフルオレセインを含まないＶＳＳＰの使用でも見つかった。したがって、多くの免疫原およびアジュバントが細胞性または体液性応答の一方を優先的に促進するのとは対照的にＶＳＳＰは、両者をハイ・レベルで誘導することができた。
【００９６】
図２に示される結果は、結合後に残余の可溶抗原を除去せずに、同じ合計量の抗原を注入することに基づいている。図３ａは、可溶抗原が透析または超遠心分離によって除去した後でも同様のＴ細胞応答が０．０４ミクロンのＶＳＳＰで得られたことを示す。したがって、観察されたＴ細胞応答に対し可溶抗原からの重要な貢献はなかった。これは、結合しているＯＶＡと結合していないＯＶＡとＶＳＳＰ混合物との比較によってさらに支持された。図３ｂは、共有結合したＶＳＳＰのみがＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔ細胞を高レベルで誘導したことを示す。したがって、ＶＳＳＰが共有結合的に付着することが、ｉｎ ｖｉｖｏでＯＶＡをクラスＩ提示経路へと導きクラスＩ制限Ｔ細胞を誘導するのに必要であった。より大きな粒子と比較して小さな粒子では結合するタンパク質の量が多くなり、それによりＶＳＳＰ免疫性が高くなるという議論も可能であろう。しかし、実際はそうではなかった。理由は以下の通りである。１）０．０４μｍおよび０．０２μｍにサイズのピークがあるビーズでは免疫応答をほとんど誘導しなかった（図２）。２）０．０４〜０．１ミクロンのＶＳＳＰは、抗原結合のレベルと無関係に１μｍ粒子より一貫して免疫原性が高かった。（３）１μｍ粒子の免疫濃度を１００倍（１ｍｇ／マウス）まで増加させＶＳＳＰ濃度以上としてもＶＳＳＰに結合した抗原の濃度範囲に見合う免疫原性の増強は得られなかった。および４）免疫において様々なサイズのビーズ上の結合タンパク質の量を等しくしても、あるいは、様々なサイズのビーズ数を同数としても、ＶＳＳＰが一連の濃度範囲（全ＯＶＡ ０．５〜１０００ｕｇ、結合ＯＶＡ ０．５〜５０ｕｇ、動物１匹当たりのビーズ１０３〜１０８）で一貫して、より大きな粒子より高い免疫原性を示した。
【００９７】
実施例４：粒子の取込みおよびプロセッシングの新規経路
外来抗原の消化に由来したペプチドはクラスＩＩ ＭＨＣプロセッシング経路を通って、逆流（ｒｅｇｕｒｇｉｔａｔｅ）するか、引き続いて、細胞表面で空のクラスＩＭＨＣ分子に結合することが示唆されている［１、１０］。クラスＩ提示のこの代替メカニズムは、ＴＡＰ（抗原処理に関連したトランスポーター）によって仲介される小胞体（ＥＲ）への輸送からは独立している。Ｂ型肝炎表面タンパク質ＶＬＰは、ＴＡＰ独立したメカニズム［２］によってマクロファージ中クラスＩ提示のためにプロセッシングを受ける。本発明者は、ＯＶＡを結合したＶＳＳＰを用いてＴＡＰノックアウトＣ５７／ＢＬマウスを免疫にした。ＴＡＰ−ＫＯ動物中ではＳＩＩＮＦＥＫＬまたはＯＶＡに対してはバックグラウンド・レベル以上のＴ細胞応答を検知することができず、ＶＳＳＰのクラスＩ提示プロセッシングが示唆されたが、対照的に、ＴＡＰ依存性であった。外来抗原のＴＡＰの依存性クラスＩ提示メカニズムは、１μｍ粒子上に吸着されたタンパク質について、細胞質へ抗原の細胞内取込み（ｅｎｄｏｃｙｔｉｃ）小胞の「漏れやすさ」に基づき偶発的に抗原を細胞質に放出するものと記述されている［１、１０］。食細胞運動によって取り込まれたこうした大きな粒子の処理は、Ｒａｂ４アダプタータンパク質を発現するリゾソームとの初期の結合ステップを含んでいる［１３］。本発明者は、ＶＳＳＰがこの経路を経由しているかのどうか決定するために共焦点顕微鏡を使用した。図４は、皮内のＶＳＳＰ投与の２４時間後、小胞を含むＲａｂ４およびＶＳＳＰフルオビーズが培養中の骨髄由来樹状細胞にも、ｉｎ ｖｉｖｏのリンパ節細胞においても同時局在しなかったことを示す。したがって，、ＶＳＳＰは、Ｒａｂ４独立かつＴＡＰ依存性であるという点において、ＶＬＰやこれより大きな粒子が使用するプロセッシング経路のいずれとも異なる経路を使用するのであろう。このメカニズムについては、実施例７でさらに調査した。
【００９８】
実施例５：ＶＳＳＰはｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原提示細胞の発達を誘導する。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを処理しないか（未処理）、蛍光性０．１μｍフルオビーズで足の裏を皮内免疫した。膝下のリンパ節（ＬＮ）を注射４８時間後に切除し、このマーカーに特異的な抗体と結合したＰＥで染色することによりＣＤ４０発現を分析した。
【００９９】
結果（図５）は、０．０４、０．０５および０．１μｍポリスチレン・ビーズが、単独でもＯＶＡに結合しても、皮内免疫後に滲出膝下リンパ節から回収される細胞総数を４倍まで増加することができたことを示している。さらに、それらは、ＮＬＤＣ１４５＋（樹状細胞マーカー）の割合を１．５倍に増加させたがＦ４／８０＋（単級／マクロファージ・マーカー）細胞の割合は増加させなかった。また、それらは、活性化分子ＣＤ４０およびＣＤ８６を発現するリンパ節細胞の割合を１．５倍以上に高めた。図５は、免疫後にＦＡＣＳｃａｎによって観察されたＣＤ４０＋細胞の増加（３３％〜６３％）の例を示す。さらに、それは、これらの細胞の多くが０．０４μｍビーズを取り込んだことを示す（このケースでは、我々は、蛍光性の緑の核を備えた０．０４μｍビーズを使用した）。
【０１００】
０．０４、０．０５μｍおよび０．１のポリスチレン・ビーズは単独でもＯＶＡに結合しても、マウス骨髄からｉｎ ｖｉｔｒｏで精製された樹状細胞を増殖まで誘導することができた。未熟であって、成熟に至らない（ＬＰＳとＴＮＦ−ａｌｐｈａによる活性化の後に）樹状細胞はＶＳＳＰのこの活性化効果を受けやすかった（図６）。
【０１０１】
これらのデータは、サイズが０．０４〜０．１μｍの粒子（ＶＳＳＰ）が、樹状細胞を含む抗原提示細胞、特にＣＤ４０とＣＤ８６などの共同刺激的な分子に対する効果を発現する細胞を刺激して増殖発達させる、これまで知られていなかった能力を疑いなく有することを示唆する。これは、なぜそれらがそれほどかくも強力かを説明する。さらに、それは、それら化学的に結合しない場合であっても、抗原に対する反応についてもＶＳＳＰがアジュバント効果（下記の実施例１４を参照）を有するメカニズムを示唆する。
【０１０２】
実施例６：注射後迅速にＶＳＳＰを取り込んだ細胞の表現型の展開
足の裏に皮内注射した際にどの細胞がＶＳＳＰを急速に取り込むか（したがって、その後の免疫活性化に寄与している可能性があるか）についてさらに評価するために、滲出膝下リンパ節を切除した。次いで、蛍光性のコアを備えた０．０４μｍＶＳＳＰ−ＯＶＡを取り込んだ細胞の表現型をＦＡＣＳｃａｎによって分析し、同一の粒子ではあるがサイズが１μｍの粒子と比較した。図７は、０．０４μｍビーズ＋または１μｍビーズ＋の割合が、個々の表現型のマーカーとして現れていることを示す。０．０４μｍビーズを取り込む細胞はほとんどＮＬＤＣ１４５＋、ＣＤ４０＋およびＣＤ８６＋であった。さらに、より多くのＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞が、１μｍビーズ＋より０．０４μｍビーズ＋であった。０．０４μｍビーズを取り込んだ細胞のこの高度に活性化されたＤＣ表現型はさらに、なぜ我々が観察した免疫応答、特にＣＤ８ Ｔ細胞応答がかくも有力かを説明するであろう。
【０１０３】
実施例７：微粒子の取込みおよびプロセッシング
樹状細胞（ＤＣ）による０．０４μｍビーズ−ＯＶＡ取込みのメカニズムを検討するため、骨髄由来ＤＣを、食細胞運動（サイトカラシンＤ、ＣＤＤ）抑制剤；クラスリン・ピット抑制剤（アミロライド（ａｍｉｌｏｒｉｄｅ、ＡＭＬ））またはカヴェオール仲介吸収抑制剤（ホルボール・ミリスチン酸酢酸塩、ＰＭＡ）と共にインキュベートした［１４、１５］。ＤＣを、所定の濃度で３０分間、ＰＭＡ、ＡＭＬ、ＣＤＤ、フィリピン（ＦＩＬ）または塩化アンモニウム（ＡＭ）（すべてＳｉｇｍａ社から入手）を用いた培養を３重に行った。さらに３時間後、ＯＶＡ蛍光０．０４μｍビーズを加え、ＦＡＣＳｃａｎによって定量した。
【０１０４】
ＰＭＡおよびＡＭＬは両者ともＤＣによる０．０４μｍビーズ−ＯＶＡ取込みを減少させた。しかし、ＣＣＤはどのような阻害作用も引き起こさなかった（図８ａ）。ＰＭＡとＡＭＩＬによる阻害は付加的（ａｄｄｉｔｉｖｅ）であった（図８ａ）。このことは、クラスリン・ピットおよびカヴェオールが両方ともＶＳＳＰ取込みに関係することを示唆している。
【０１０５】
受容体仲介エンドサイトーシスに必要なＮａ＋−Ｈ＋交換を阻害することによりアミロライドは作用を及ぼす［１４］。発明者はさらに、細胞質ゾル酸性化を妨害することによりクラスリン・ピットの組立てを阻害する塩化アンモニウム［１４］を用いて試験した。塩化アンモニウムは、０．０４μｍサイズのビーズの取込みを阻害したが１μｍサイズではそのような効果を示しておらず（図８ｂ）、クラスリン・ピットの役割がＶＳＳＰ取込みに関与していることを裏付ける。カヴェオールはＤＣにおいてウイルス粒子取込みに新しいメカニズムを仲介していることが示唆されている［１５］。本発明者はＰＭＡの使用がカヴェオールがＤＣにおいてＶＳＳＰ取込みに関係していることを示唆するものと結論する（図８ａ）。これを確認するために、発明者は、カヴェオールの別の阻害剤であるフィリピンを使用した。フィリピンはコレステロールの分離によって作用を及ぼし、ＰＭＡはカヴェオール吸収を規制するリン酸化イベントに影響する［１４、１５、１６、１７］。ＰＭＡと同様にフィリピンは、１μｍビーズ取込みではなく０．０４μｍ取込みをブロックして発明者の仮説を確認した（図８ｂ）。
【０１０６】
カヴェオールとクラスリン・ピットは核内性（ｅｎｄｏｓｏｍａｌ）であり、リソソーム・コンパートメントへ分子を輸送することができる［１４、１６］。あるいは、カヴェオールは、抗原を直接細胞質ゾル［１７］に送達して、ＭＨＣクラスＩの提示のために、細胞質のプロセッシングおよびＴＡＰ依存性の小胞体内への輸送に結びついている可能性もある［１、１８］。
【０１０７】
これらの結果は、実施例４において示したものと共に、本発明に従って示された抗原プロセッシング用の新規経路を示す。本発明の免疫原の組成物は、カヴェオールおよび／またはクラスリン・ピット（抗原はその後にＲａｂ４独立でＴＡＰ依存性のＭＨＣクラスＩ提示経路によって処理される）経由で抗原提示細胞によって取り込まれるように見える。この観察結果は、カヴェオールのＴＡＰ依存性の抗原処理経路およびそのＣＤ８細胞誘導能力は、これまでに報告されていなかったという点において新規である。
【０１０８】
１００，０００個のＯＶＡを発現する腫瘍細胞（ＥＬ４）を用いた皮下の抗原投与からマウスを保護する能力について、５０ｎｍ（すなわち、０．０５μｍ）（ＶＳＳＰ）ＯＶＡ結合粒子をＯＶＡ単独と直接に、または、１０００ｎｍ（つまり１μｍ）ＯＶＡ結合粒子と比較した。マウスはすべて上記のいずれか１００μｇで１度皮内免疫し（または処理なし＝未処理）、次いで、３０日後に腫瘍で抗原投与した。図９ａは、ＶＳＳＰ−ＯＶＡは完全にＯＶＡ発現腫瘍の成長を防いだが、ＯＶＡ単独または１０００ｎｍビーズでは保護に有意な効果がなかったことを示す。
【０１０９】
実施例９：単回ＶＳＳＰ免疫が高レベルの免疫を誘導し、腫瘍抗原投与に対し保護する。
ＯＶＡ結合ＶＳＳＰを用いた皮内免疫でＩＦＮγ産生および細胞傷害性ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔ細胞を誘導した（図１０ａおよび１ａまたは１ｂ）。追加的な免疫は応答性を増加させなかった（図１０ａおよび１０ｃ）。免疫８２日後でも高い前駆体発生率でＴ細胞を維持することができる（図１０ｄ）。抗体応答も同様に維持された（図１６）。単回ＶＳＳＰ免疫によって達成されたＣＤ８ Ｔ細胞前駆体発生率レベルはＶＬＰ粒子の単回または多数回投与で観察される値よりも高く、高度に効率的な異種起源のプライム／追加刺激療法のみがこれに匹敵した［１、２、３、１９、２０］。高いＩＮＦγ産生および細胞傷害性Ｔ細胞前駆体発生率は、多くの細胞内病原体およびガンからの保護に関係している［２１、２２、２３］。本発明者は、ＯＶＡ結合ＶＳＳＰの単価回皮内投与によりＣ５７／ＢＬマウスを免疫にし、次に、ＥＧ７腫瘍細胞系（これは細胞質のＯＶＡを発現し、細胞傷害性ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの標的である）でそれらに抗原投与した。結果は、ＶＳＳＰで免疫にしたマウスが、完全に腫瘍の抗原投与から保護されたことを示す。一方、未処理の対照ではすべて腫瘍が成長した。さらに、図２ｃで観察したのと同様に、抗原結合ＶＳＳＰの単回投与に引き続いて抗体レベルも増加した。
【０１１０】
ＶＳＳＰワクチン例のさらなる検討
以下の実施例１０〜１３は、ＶＳＳＰが様々な抗原と共に使用することができ、ＩＮＦ産生およびＩＬ４産生Ｔ細胞の両方を含む広い免疫を誘導することを公式に実証する。単回投与後、ＩｇＧは高レベルであるが、アレルギーと関わるＩｇＥ抗体は潜在的な量でしか誘導されない。
【０１１１】
ＶＳＳＰの治療における有効性はさらに２つのモデルで示される。１）確立している腫瘍の１００％の除去（実施例１０参照）および２）ワクチンの単回投与後の致死マラリアからの保護（実施例１１参照）。様々な疾病に対する単回投与ワクチンを開発するために、これらは、ＶＳＳＰを極めて有力で柔軟なワクチン・プロトコルとしてさらに確認する。さらに、これらの発見に基づけば、ガンの予防および治療のためにもＶＳＳＰが使用できると発明者は信じる。
【０１１２】
実施例１０：確立した腫瘍の除去
本発明者は、ビーズ−ＯＶＡを用いた１度の免疫で、その後にＯＶＡを発現する腫瘍による抗原投与に対して完全な保護がなされることを観察した。
【０１１３】
Ｃ５７／Ｂ６マウスを、１００μｇビーズ（０．０５μｍ）−ＯＶＡで１度（皮内）免疫するか、または処理しないまま放置した（未処理）。３０日後に、マウスは５×１０６ＥＧ７腫瘍細胞系で抗原投与した。免疫後３〜１３日目に腫瘍サイズをカリパスを用いて測定した。退縮状態を検討するため、マウスにＥＧ７細胞を与え、８日後に同様の腫瘍サイズ分布のグループに分けた。１群は未処理のままとし、他方は３日後（つまり腫瘍細胞系投与後の１１日目）にビーズ−ＯＶＡで免疫した。
【０１１４】
発明者は、腫瘍に罹患しているマウスを１度免疫するだけで、確立した腫瘍を治癒できることを以下に示す。腫瘍は１度の注射後２週以内に免疫したマウスから除かれた。この治療効果は、どのようなガンワクチンと比べても非常に特殊なことであり、このワクチン・ビヒクルを治療用ワクチンの開発において非常に有用なものとしている（図１１Ｂ）。
【０１１５】
ムチン−１またはＭｕｃ１は乳ガンに伴う抗原である。ＶＳＳＰ−Ｍｕｃ１タンパク質で１度免疫した場合でも、さらに乳ガン抗原を発現する腫瘍細胞系で抗原投与したマウスにおいて腫瘍の形成が阻止された（図１１Ａ参照）。
【０１１６】
実施例１１：マラリアからの保護
本発明者は、直径０．０５μｍのポリスチレン・ビーズがマウスにおいてマラリアからの保護を誘導するためのビヒクルとして使用できることを実証する。マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）からの溶解物を赤血球を感染させ、ビーズに結合してマウスの免疫に使用し、次いで、このマウスを致死量の寄生生物で抗原投与した。
【０１１７】
Ｐ．ｙｏｅｌｌｉ １７ＸＬに５０％の赤血球感染率（ｐａｒａｓｉｔａｅｍｉａ）で感染したＣ５７ＢＬ／６マウスから血液を採取した。８００ｇで１５分間遠心分離した後に赤血球（ＲＢＣ）を回収し、冷凍−解凍を３回繰り返した上、超音波で処理した（溶解物）。溶解物は上記のような０．０５μｍ粒子に結合させた。ビーズ−溶解物、ビーズ−ＯＶＡまたは溶解物のみを皮内注射した。２週間後、免疫したＣ５７ＢＬ／６マウスまたは未処理Ｃ５７ＢＬマウスを腹膜内注射により、１，０００，０００個のＰ．ｙｏｅｌｌｉ １７ＸＬ感染ＲＢＣで抗原投与した。
【０１１８】
動物はすべて抗原投与を生き残ったが、溶解物のみ（ビーズ結合なしで）免疫した動物の６０％は、感染を抑えることができず死んだ（図１２）。これは単回投与ワクチンで血液段階マラリアからの保護を実現した最初の例である。単回投与ワクチンは、マラリアや第３世界において広範囲に見られる他の伝染病に対して、ワクチンの投与および分配を単純化し広い人口をカバーできるので特に魅力的である。
【０１１９】
実施例１２：細胞の免疫
１）ガン抗原ｎｍ２３などのＯＶＡ以外の抗原を結合した直径０．０５μｍのポリスチレン・ビーズも、ＩＦＮガンマ分泌Ｔ細胞の高レベルの誘導によって証拠づけられるように強い細胞免疫を誘導する（図１３）。
２）細胞免疫を誘導するのと同様に、ビーズ−ＯＶＡまたはビーズ−ｎｍ２３は、ＩＬ４を高レベルで誘導する（図１４）。このリンホカインは、他の抗体の産生を促進するが、これは、なぜ細胞性免疫（これはＩＮＮガンマを要求する）と同様に良好な抗体誘導も観察されたかを説明していると言えるだろう。
【０１２０】
実施例１３：抗体免疫
１）ＯＶＡに結合した直径０．０５μｍのポリスチレン・ビーズは、１度の皮内（ＩＤ）注射後にＩｇＧ抗体を高い滴定濃度で誘導した（図１５Ａ）。
２）高いＩｇＧレベルにもかかわらず、検知できるＩｇＥレベルはない。したがって、このワクチンは（アレルギーに関係するため）潜在的に有害なＩｇＥ応答を誘導する危険を有しないことが公式に実証された（図１５Ｂ）。
【０１２１】
実施例１４：様々な投与ルートおよびＩｇＧおよびＩｇＡ抗体の誘導
ワクチンのヒトへの有用な投与ルートを決定する目的で、上記と同様な皮内経由の他、ＯＶＡ結合ＶＳＳＰ（１００μｇ／マウス）を、マウス腹膜内、皮下、鼻内、また直腸内に投与した。１群当たり３〜４匹のマウスを１度の免疫の３０日後に試験した。ＥＬＩＳＰＯＴ分析（１／５０，０００〜１／２，０００脾臓細胞）によって、皮内と同様にすべてのルートでＳＩＩＮＦＥＫＬまたはＯＶＡに対してＩＦＮｇを分泌するＴ細胞が誘導された。意外にも、皮内注射を用いたこれまでの観察結果ではＩｇＧが高レベルで誘導される反面ＩｇＡはほとんどないか全く誘導されなかったのに対して、これらの他のルートによるＶＳＳＰ−ＯＶＡは血清ＩｇＡ応答を誘導し、直腸内と、鼻内ルートでは検知できるＩｇＧが誘導されなかった（滴定濃度＜１／１００）（表１）。したがって、直腸内、腹膜内、鼻内または皮下ルートによるＶＳＳＰは、粘膜の伝染病（例えば、肺、子宮頚部または腸内）などのＩｇＡが保護機能を果たす場合にも疾病への保護免疫を誘導するために使用することができる。
【表１】
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【０１２２】
２回投与による異常に高いＩｇＧ応答：
ＶＳＳＰ−ＯＶＡで２度免疫（１００μｇ／マウス；１４日を隔てて）で驚くほど高い血清ｌｇの生成が得られ、ＥＬＩＳＡによって評価したＩｇＧ抗体滴定濃度は１／５００，０００を超えていた。乳ガン抗原ｎｍ２３およびマラリア抗原ＭＳＰ４／５をＶＳＳＰに結合して２度免疫した後、特異的ＩｇＧ抗体についても同様の結果が得られた。
【０１２３】
実施例１５：長期持続的応答
ＶＳＳＰ−ＯＶＡに対する応答は驚くほど持続的であった。図１６は、１度の皮内免疫（１００μｇ／マウス）の１年後でも、強いＩｇＧＯＶＡ特異的抗体を示すＥＬＩＳＡ（パネルＡ）およびＳＩＩＮＦＥＫＬに対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を示すＩＦＮｇ ＥＬＩＳＰＯＴ（パネルＢ）が存在することを示す。さらにパネルＢは、最適の免疫原性を得るためには固体粒子に抗原が共有結合しなければならないことを示す。
【０１２４】
実施例１６：異種起源のプライム−ブースト
プライミングを行わなかったもの、完全フロイント・アジュバント（ＣＦＡ）中のＭＵＣ１由来のペプチドｃｐ１３−３２（ｃｐ１３）、マンナン結合ＭＵＣ１（組換えＭＵＣ１−ＧＳＴ融合タンパク質）（Ｍ−ＦＰ）または０．１μｍ ＶＳＳＰ−ＭＵＣ１（組換えＭＵＣ１−ＧＳＴ融合タンパク質）（ＶＳＳＰ）によってプライミングを行った動物の応答をブースト（追加刺激）するために牛痘−ＭＵＣ１を使用した。図１７は、ＶＳＳＰ−ＭＵＣ１でプライムされた牛痘−ＭＵＣ１ブースト群では、ＭＵＣ１のペプチド１３〜３２領域に対する応答が、牛痘ＭＵＣ１を単独で（無／Ｖ、ＶＳＳＰ／Ｖと比較）受け取った動物と比較して増強されたことを示す。したがって、ＶＳＳＰ抗原は異種起源のプライム−ブースト・プロトコルで使用するに適しているであろう。
【０１２５】
実施例１７：ＶＳＳＰ用固体コアの材料組成
０．０４−０．０５μｍサイズの固体コアＶＳＳＰが免疫原性の主要な決定要素であるという発明者の仮説からはポリスチレン以外の材料で作られた粒子も、このサイズ範囲内であれば高度に免疫原性を示すであろうと予測される。したがって、発明者は、ポリスチレン（ＰＳ）またはガラス（Ｇ１またはＧ２）で作られており、同じ化学的操作（Ｇ１）またはグルタルアルデヒド（Ｇ２）を使用してＯＶＡに結合させた０．０５μｍ粒子を用いて皮内に１度免疫したマウスの免疫原性を比較した。図１８は、ポリスチレンまたはガラスで作られたＶＳＳＰが同様に高度に免疫原性であり、ＳＩＩＮＦＥＫＬに対するＩＦＮｇ産生Ｔ細胞の前駆体発生率を高レベルで誘導することを示す（ＥＬＩＳＰＯＴによる）。したがって、タンパク質結合用のＶＳＳＰの固体コアはポリスチレンによるばかりでなくガラスでも提供することができ、他の材料、例えば、ＰＬＧも固体コアとして機能を有することが予想される。
【０１２６】
実施例１８：ＶＳＳＰへの抗原の結合
０．０５μｍ粒子と混合した抗原は抗原単独よりも高い免疫原性を示すが、共有結合による結合が最適の免疫原性に必要なことを結果が示している。したがって、ＶＳＳＰに抗原を結合させるために使用する化学的操作が理論上免疫原性の決定要素となり得る。特に、粒子の全面的な帯電は、特異的血清または他の内在的なタンパク質との相互作用を促進することができた。これらは、その結果として、理論上樹状細胞による取込みを促進し、高い免疫原性を誘導することができる。このために試験するために、マウスを、表面帯電量が異なる５０ｎｍ（つまり０．０５μｍ）の粒子で免疫した。ＯＶＡ−ＶＳＳＰはカルボン酸塩で修飾したナノ粒子を使用しているため全体として負電荷を有しており、グリシンを備えたＯＶＡとの結合後には活性化されたカルボン酸基がクエンチされる（グリシン、図１９）。また、エタノールアミンとの反応をクエンチすることにより、結合後の電荷はＯＶＡの純電荷を除いて中和することができる（アルコール、図１９）。エチレンジアミンでクエンチすることによって、正電荷が導入される（アミン、図１９）。アミノアセタルデヒドジメチルアセタールでクエンチすることによって、潜在的に有用なアルデヒド基を導入することができる（アルデヒド、図１９）。結合プロトコルにおけるこれら３種の修飾はすべて免疫原性が高い粒子となるが、アミンとアルコールによる修飾はグリシンに匹敵し、アルデヒドはわずかに免疫原性が低くなる。したがって、粒子への反対の電荷の導入が同様の免疫性をもたらすと共に血清タンパク質の非特異性の吸着による限りではほとんどあり得ない程高い免疫性である。さらに、結合操作に若干の代替的修正を加えれば、免疫原性を減少させることなく電荷を変化させることができる。
【０１２７】
考察
上記の結果を考慮すれば、本発明の組成物は、様々な伝染病、ガンまたは他の疾病に適用が可能なワクチンまたはワクチン戦略をさらに改善ないし最適化する方法を提供する。
【０１２８】
ＶＳＳＰの最適のサイズは、ほとんどの既知のウイルス（３０〜１５０ｎｍ）のそれと一致する。従って、それはＶＳＳＰの使用が生物学上重要であると推測してもよいように思われる。上記の観察から、発明者は、ＶＳＳＰのサイズ範囲の粒子に完全に反応するように、免疫系が適応し得ると信じる。本発明の前には、免疫応答の刺激はウイルスのサイズ範囲内の免疫の刺激物のサイズに大きく依存し、特に他の病原体（例えば、バクテリア、菌類）由来のエピトープは相当に大きいということは知られていなかったし理解されていなかった。実際に、この経路を通って誘発される標的抗原は、驚くほど広く（免疫応答の両腕である細胞性免疫と体液性免疫の両者を含む）かつ強い応答（長く持続的な高いエフェクターＴ細胞前駆体発生率を迅速に誘導する）は、免疫系がウイルスのサイズの粒子に完全に反応するために適応していることを示唆している。ＨｅｐＢ表面タンパク質または酵母レトロトランスポゾン・タンパク質（Ｔｙ）で構成されたＶＩＰ（つまり粒子に結合されない純粋な抗原）を利用する従来の研究も単回免疫投与によって導入される広く長く持続的な免疫を示していたが、ＶＳＳＰに比べれば、その応答はまだ１０〜１００倍も低かった［１、２、３、１９、２０］。しかし、サイズ以外の要素、例えば、その脂質やマンナン成分、または膜結合タンパク質なども、ＶＬＰがクラスＩ制限Ｔ細胞応答を誘導するの能力の原因と考えられていた［１］。理論によって拘束されることを望むものではないが、本発明者は、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＶＳＳＰによる樹状細胞などの抗原提示細胞への効率的に標的とする組合せは、その後にタンパク質分解による潜在的な遅い抗原放出が続き、特に強力な免疫原性を生成したのではないかとも考えている。
【０１２９】
新規ワクチンとしてのＶＳＳＰの使用は、ＯＶＡモデルにおいてガン細胞による抗原投与を引き続いて行った場合、これからの保護を果たす単回免疫投与の能力により実証された。本発明者は、乳ガンで発現する抗原であるムチン−１（ＭＵＣ−１）に対する広く強い免疫原性および保護も観察した。それらの動物研究で利用した皮内投与ルートは、人間にも容易に実施することができる。ＶＳＳＰは、このようにヒトのワクチン開発のために特に魅力的で単純な戦略を提示し、特に、体液性免疫と細胞性免疫の両者が保護生成に参加する、マラリア、ガンおよびウイルス性疾病、顕著には、ＡＩＤＳおよび肝炎［１０、１２、２１、２５−２８］などの疾病に対して有効である。また、組換え抗原をクラスＩ提示経路の標的とすることにより、多数のエピトープに対するＴ細胞応答誘導の可能性を提示し、したがって、ＭＨＣの様々な標的ヒト集団におけるそうしたワクチンの使用にも及び得るであろう。
【０１３０】
現在、ＣＴＬの有効な刺激のためのＤＣのプライミングは、ＤＣのｅｘ ｖｉｖｏでのパルス処理によっているが、これは高価で、物流的にも困難である。本発明は、効率的にＤＣにｉｎ ｖｉｖｏで抗原を送達し、これに続けて抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の多数の誘導および免疫保護をもたらす代替法を提供する。０．０４−０．０５μｍの狭いサイズ範囲内のＶＳＳＰがＣＤ８ Ｔ細胞を誘導する能力は非常に高いが、これはＭＨＣ１処理経路および／またはＡＰＣ機能の直接刺激を標的として、ＡＰＣによる、または有力な部分集合による効率的な取込みの結果であり得る。ＶＳＳＩＰの取込みは、他のサイズと比較して、リンパ節中で増強されると判明し、また、この増強は粒子陽性ＤＥＣ２０５＋細胞、すなわちＤＣマーカーの発生率が増加することによる。ＤＣは強力なＡＰＣであり、ＣＤ４０およびＣＤ８６の発現はさらに効率的なＣＤ８Ｔ細胞プライミングの有能な部分集合を特徴づける。これらのマーカーは、ＶＳＳＰ＋細胞中に高い割合で見つかった。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるこの有力なＤＣ部分集合におけるＶＳＳＰの取込みおよび選択的な局在化は、発明による微粒子の免疫原性を説明する。
【０１３１】
本発明のＶＳＳＰの他の利点には、多数のルートを経由しての投与に続きＩｇＡ生産を含む免疫応答を誘導する能力およびプライム−ブースト・ワクチン戦略に適している点が含まれる。
【０１３２】
さらなる研究は、ＶＳＳＰにユニークな免疫応答を誘発させる生理学的メカニズムを決定するためにＶＳＳＰを使用することを含むであろう。
【０１３３】
ここに記載した本発明については、他の様々な実施形態が、本発明の基礎となる中心的概念から外れることなく当業者によってなされ得ることが理解されるべきである。
【０１３４】
「参考文献」
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【図面の簡単な説明】
【図１】マクロファージによる異なるサイズの粒子の差異的取込みを樹状細胞の場合と比較して示したグラフである。
【図２】異なるサイズのビーズに結合したＯＶＡによって免疫されたＩＦＮγ産生ＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞の誘導（パネルＡ）、ＳＩＩＮＦＥＫＬに応じた細胞傷害活性を有するＴ細胞とＩＦＮγ分泌Ｔ細胞とのＥＬＩＳＰＯＴによる相関（パネルＢ）および異なるサイズのビーズに結合したＯＶＡによる免疫によって誘導された抗体産生（パネルＣ）を示すグラフである。
【図３】最適なＴ細胞応答を誘導するのに必要な結合が抗原のビーズへの共有結合であることを示すグラフである。
【図４】Ｃ５７ＢＬ／Ｂ６マウスをビーズ−ＯＶＡ（０．１ミクロン）で間隔をあけて皮内免疫した場合についてＳＩＩＮＦＥＫＬに対するこれらのＩＦＮγ応答をＥＬＩＳＰＯＴによって調べた結果（パネルＡ）およびマウスをビーズ−ＯＶＡ（０．１ミクロン）で免疫しＳＩＩＮＦＥＫＬまたはＯＶＡに対するＩＮＦγ応答をＥＬＩＳＰＯＴによって調べた結果（パネルＢ）を示すグラフである。
【図５】皮内免疫後にビーズを取り込んだ滲出リンパ節中細胞によるＣＤ４０発現を示すグラフである。
【図６】０．１μｍＯＶＡビーズに応じたマウスの未熟および成熟ＤＣ増殖の誘導を示すグラフである。
【図７】ｉｎ ｖｉｖｏにおいて０．０４μｍ粒子を取り込んだＡＰＣ表現型の同定を示すグラフである。
【図８Ａ】ＤＣによるウイルス・サイズ粒子取込みのメカニズムを示すグラフである。
【図８Ｂ】図８Ａの結果を再確認したグラフである。
【図９】可溶ＯＶＡおよび１μｍ−ＯＶＡビーズおよび０．０５μｍ−ＯＶＡビーズの保護効果を示すグラフである。
【図１０】細胞の共焦点顕微鏡写真像である。
【図１１】Ｃ５７／Ｂ６マウスを、ＯＶＡ−ＶＳＳＰで１回皮内（ＩＤ）免疫するか（免疫）、処理せず（未処理）、５×１０６ＥＧ７（腫瘍細胞）を皮下注入３０日後に抗原投与した結果を示すグラフである。
【図１２】ＶＳＳＰ免疫後に致死性マラリアの抗原投与を受けたマウスの存命結果を示すグラフである。
【図１３】抗原ｎｍ２３を０．０５μビーズに結合し（ＶＳＰ）、１００μｇ／マウスの割合でマウスに皮内注射し、１０日後のＩＦＮガンマ活性を免疫された動物の脾臓についてＥＬＩＳＰＯＴによって評価した結果を示すグラフである。
【図１４】ガン抗原ｎｍ２３またはＯＶＡを、標準プロトコルによりＶＳＰに結合し１００μｇ／マウスの割合で皮内注射し、１０日後に、ＩＬ４分泌細胞の誘導をＥＬＩＳＰＯＴによって評価した結果を示すグラフである。
【図１５Ａ】ＯＶＡに結合した０．０５μｍビーズ（ＶＳＰ−ＯＶＡ）で１度皮内免疫したマウス血清中のＯＶＡへの抗体応答性および非免疫対照群（Ａグループ）と比較した９０日後のＥＬＩＳＡによるその評価（Ｂグループ）を示すグラフである。
【図１５Ｂ】図１５Ａのマウスと同じ血清について、２頭の未処理マウス（Ａ２とＡ３）および３頭のＶＳＰ−ＯＶＡマウス（Ｂ２、３および５）中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体の存在をＥＬＩＳＡにより試験した結果を示すグラフである。
【図１６】単回免疫による長期持続性抗体応答の誘導を示すグラフ（パネルＡ）および０．０４μｍビーズ−ＯＶＡによる１度の免疫によるＩＦＮγ産生Ｔ細胞の長期持続的高レベル誘導を示すグラフ（パネルＢ）である。
【図１７】Ｃ５７／Ｂ６動物を未処理（処理なし）とするか、またはＭＵＣ１由来ペプチドｃｐ１３−３２の１００μｇを完全フロイント・アジュバント中ＫＬＨ７０Ｏｕｇと結合したもの（ｃｐ１３）、マンナンに結合した組換えＭＵＣ１−ＧＳＴ融合タンパク質（ＭＦＰ）または０．１ｕｍ ＶＳＰと結合したＭＵＣ１−ＧＳＴ融合タンパク質（ＶＳＰ）で皮内に１度プライムし、次いで追加刺激した結果を示すグラフである。
【図１８】ポリスチレンとガラスの０．０５ｕｍＶＳＰ−ＯＶＡ粒子の比較を示すグラフである。
【図１９】Ｃ５７／Ｂ６マウスをＶＳＳＰ−ＯＶＡ粒子で皮内免疫し、ＣＤ８ Ｔ細胞エピトープＳＩＩＮＦＥＫＬへのＩＦＮｇ ＥＬＩＳＰＯＴによって脾臓中で評価した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年8月20日(2002.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約０．５μｍ未満の平均粒径を有する微粒子と結合した少なくとも１種の抗原を含む免疫原性組成物。
【請求項２】
微粒子が約０．１μｍ未満の平均粒径を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
微粒子が約０．０５μｍ未満の平均粒径を有する、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
微粒子が０．０３μｍから０．５μｍの平均粒径を有する、請求項１記載の組成物。
【請求項５】
微粒子が０．０３μｍから０．０５μｍの平均粒径を有する、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
微粒子が実質的に均一な大きさである請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記微粒子が固体コアを有する請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記微粒子がラテックス、鉄分子、金、ガラス、リン酸カルシウム、ポリスチレン、ポリリシンＧ、生分解性ポリマー、生体適合性ポリマー、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記微粒子が動物において抗原提示細胞によって取り込まれ得る、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
ワクチンを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗原が前記微粒子上に吸着、複合体を形成、または共有結合している請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗原がペプチド、タンパク質、組換えペプチドまたはタンパク質、脂質、炭水化物、核酸、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗原が病原体、組織、細胞器官または分子に由来し、下記：
花粉、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＩＶ）コア、Ｅｌ、Ｅ２およびＮＳ２タンパク質、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｆａｌｉｃｉｐａｒｕｍのスポロゾイト周囲タンパク質（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＳ））、ヒトＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ．ｖｉｖａｘ、Ｐ．ｏｖａｌａｅ、およびＰ．ｍａｌａｒｉａｅ ＴＲＡＰ、ＭＳＰ−１、ＭＳＰ−２、ＭＳＰ−３、ＭＳＰ−４、ＭＳＰ−５、ＡＭＡ−１、ＲＥＳＡ、ＳＡＬＳＡ、ＳＴＡＲＰ、ＬＳＡ１およびＬＳＡ３からなる群から選択されるマラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）種由来抗原、ＨＩＶ−ｇｐ１２０／１６０エンベロープ糖タンパク質、連鎖球菌表面タンパク質抗原、インフルエンザ核タンパク質、ヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ表面感染タンパク質、ＴｃｐＡピリン（ｐｉｌｉｎ）サブユニット、ＶＰ１タンパク質、ＬＭＣＶ核タンパク質、リーシュマニア属の主要表面糖タンパク質（ｇｐ６３）、百日咳（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）表面タンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、連鎖球菌Ｍタンパク質、ブドウ状球菌タンパク質、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）タンパク質、合胞体（Ｓｙｎｃｙｔｉｃｉａｌ）ウイルス（ＲＳＶ）ＦまたはＧタンパク質、エプスタイン−バー・ウイルス（ＥＢＶ）ｇｐ３４０または核抗原３Ａ、ヘマグルチニン、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）表層タンパク質（Ｏｓｐ：ｏｕｔｅｒ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）Ａ、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）３８ｋＤリポタンパク質または３０ｋＤタンパク質（Ａｇ８５）、１０ｋＤまたは６５ｋＤタンパク質、ナイセリア・メニンギチディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）クラス１表層タンパク質、水痘帯状疱疹ウイルスＩＥ６２およびｇｐｌ、風疹ウイルス・キャプシド・タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅ Ｓ１ ａｇ、単純疱疹ウイルス・タイプＩ糖タンパク質Ｇまたはｇｐ ＤもしくはＣＰ２７、マレーバレー脳炎ウイルスＥ糖タンパク質、Ａ型肝炎ウイルスＶＰ１、ポリオ・ウイルス・キャプシド・タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、クラミディア・トラコマティス（ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）表面タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス・エンベロープＡｇ ｐｒｅ Ｓ２、ヒト・ライノウイルス（ＨＩＶ）キャプシド、ガン遺伝子Ｅ６およびＥ７由来の乳頭腫ウイルス・ペプチド、リステリア菌表面タンパク質、水痘ウイルス・エンベロープ・タンパク質、ワクシニアウイルス・エンベロープ・タンパク質、ブルセラ菌表面タンパク質、ロータウイルスＶＰ−３、ＶＰ−４、ＶＰ−５、ＶＰ−７およびＶＰ−８、前記抗原の１種または複数の組合せ、長さにして５個以上のアミノ酸を含む前記抗原のアミノ酸サブユニットおよび前記サブユニットの１種または複数の組合せ
からなる群から選択される請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
抗原が乳ガン、肺ガン、膵臓ガン、結腸ガンおよび黒色腫からなる群から選択されるガンに由来する請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
抗原が組換えペプチドまたはタンパク質である請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
約０．５μｍ未満の平均粒径を有する微粒子と結合した少なくとも１種の抗原を含む免疫学的に有効な量の組成物を対象に投与することを含む、対象において免疫応答を誘発する方法。
【請求項１７】
免疫応答がＣＤ８細胞応答および抗体応答からなる群から選択され、ここで抗体は免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＭまたは免疫グロブリンＡである請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
免疫応答が樹状細胞の増殖および／または発達および／または増殖である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
約０．５μｍ未満の平均粒径を有する微粒子と結合した少なくとも１種の抗原を含む免疫学的に有効な量の組成物を対象に１度だけ投与することを含み、免疫応答が樹状細胞の刺激および／または発達および／または増殖を含む、抗原に対する保護的免疫応答を単回投与によって誘発する方法。
【請求項２０】
約０．５μｍ未満の平均粒径を有する微粒子と結合した少なくとも１種の抗原を含む免疫学的に有効な量の組成物を対象に投与することを含む、免疫応答を誘発するために樹状細胞に抗原をｉｎ ｖｉｖｏで送達する方法。
【請求項２１】
免疫応答が抗原のＭＨＣクラスＩ提示メカニズムを誘発し、抗原が細胞のカヴェオールおよび／またはクラスリン・ピットによって取り込まれ、さらにＲａｂ４独立性でＴＡＰ依存性の過程により処理されるものである請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
約０．５μｍ未満の平均粒径を有する微粒子を１種または複数の抗原と、微粒子と抗原が結合するように接触させることを含む免疫原性組成物の製造方法。
【請求項２３】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の免疫学的に有効な量の組成物を対象に投与することを含む、動物対象において抗原に対する保護的免疫応答を誘発する方法。
【請求項２４】
動物対象において抗原に対する保護的免疫応答を誘発するための免疫原性組成物の製造における、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２５】
少なくとも一つの抗原を含む免疫原性組成物の調製における、動物における抗原提示細胞によって取り込まれ得る約０．５μｍ未満の平均粒径を有する微粒子の使用。
【国際調査報告】
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