(57)【要約】本発明は、細胞および／または組織に特異的である複数のポリヌクレオチドを含む組成物に関する。これらのポリヌクレオチドまたはその一部を参照として用い、代謝または発生のプロセス、治療、病態、疾患、または障害を明らかにする発現プロファイルの作成した。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−４１６から選択された複数の細胞および組織に特異的なポリヌクレオチドまたはそれらの相補配列。
【請求項２】
（ａ）心臓の細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９−２１８およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０と、
（ｂ）骨格筋細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９−２４９およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−４１と、
（ｃ）子宮細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０−２５１およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２−４３と、
（ｄ）卵巣細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２−２５６およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４−４８と、
（ｅ）胃の細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５７−２６３およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９−５５と、
（ｆ）腸の細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６４−２８３およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６−７５と、
（ｇ）肺細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８４−２９３およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６−８５と、
（ｈ）肝細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９４−３４５およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６−１３７と、
（ｉ）腎細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４６−３５６およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８−１４８と、
（ｊ）膵臓細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５７−３７４およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９−１６６と、
（ｋ）脳細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７５−４１６およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７−２０８とからなるグループの少なくとも１つから選択されることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチドのサブセット。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが基板に固定されていることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
サンプルにおける或るポリヌクレオチドの発現を検出するためのハイスループットの方法であって、
（ａ）ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、請求項１のポリヌクレオチドと前記サンプルの前記核酸とをハイブリダイズするステップと、
（ｂ）そのハイブリダイゼーション複合体を検出するステップとを含み、
前記ハイブリダイゼーション複合体の存在が、前記サンプルにおける前記ポリヌクレオチドの発現を示唆することを特徴とする検出方法。
【請求項５】
ハイブリダイゼーションの前に前記サンプルの前記核酸を増幅することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ハイブリダイゼーション複合体の形成が、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、または膵臓の組織からなる群から選択された組織への胚性幹細胞の分化を示唆することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
分子または化合物をスクリーニングしてリガンドを同定するハイスループットの方法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項１のポリヌクレオチドを分子または化合物と結合させるステップと、
（ｂ）特異的な結合を検出して、前記組成物に特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
前記分子または化合物が、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド核酸、擬態、ペプチド、およびタンパク質から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２、２２８、２３３、２５９、２７１、２８７、３１６−３１９、３２４、３７０、３７９、３８０、３８３、４１０、および４１２、またはそれらの断片から選択され単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記断片がそれぞれ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２０、２５、５１、６３、７９、１０８−１１１、１１６、１６２、１７１、１７２、１７５、２０２、および２０４であることを特徴とする請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
タンパク質を生産する方法であって、
（ａ）タンパク質が発現する条件下で、請求項１２に記載の宿主細胞を培養するステップと、
（ｂ）培養した前記宿主細胞から前記タンパク質を回収するステップとを含むことを特徴とするタンパク質の生産方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法によって生産されたタンパク質。
【請求項１５】
分子または化合物のライブラリをスクリーニングして、或るタンパク質に特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定するハイスループットの方法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項１４のタンパク質を前記ライブラリと結合させるステップと、
（ｂ）前記タンパク質と分子または化合物との間の特異的な結合を検出して、前記タンパク質に特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
前記ライブラリが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド核酸、擬態、ペプチド、タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体またはそれらの断片、免疫グロブリン、インヒビター、薬物成分、および薬剤から選択されることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
サンプルからリガンドを精製する方法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項１４のタンパク質をサンプルと結合させるステップと、
（ｂ）その結合したタンパク質を回収するステップと、
（ｃ）前記タンパク質を前記リガンドから単離して、精製されたリガンドを得るステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１４に記載のタンパク質および医薬用担体を含む組成物。
【請求項１９】
請求項１４に記載のタンパク質に特異的に結合する精製された抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、細胞および／または組織に特異的な複数のポリヌクレオチドを含む組成物に関する。これらのポリヌクレオチドを用いて、代謝または発生のプロセスを明確にしたり、これらのプロセスを導いて、症状、疾患、または障害を調べたり、その進行をモニタリングしたり、或いは治療プロトコルの有効度を評価およびモニタリングすることが可能である。
【０００２】
（背景技術）
アレイ技術によって、一塩基遺伝子多型の発現、または多数の関連遺伝子や非関連遺伝子の発現プロファイルを得る単純な方法が実現される。１つの遺伝子の発現を調べる場合、アレイを用いて特定の遺伝子またはその変異体の発現を検出する。発現プロファイルを検査すると、どの遺伝子が、組織特異的であるか、細胞型や組織への分化を導くか、ハウスキーピング機能を行っているか、シグナル伝達カスケードの一部として機能するか、或いは特定の遺伝的な素因、症状、疾患、または障害を特徴付けるかを調べる際の基準がアレイから分かる。
【０００３】
遺伝子発現のプロファイル化は、特に疾患の診断や予後の精度の改善に適している。しかしながら、特定の疾患における特定の遺伝子の発現が有意であるか否かを決定するために、その疾患プロセスでどの遺伝子が発現されるかを較べるべく、基準となる組織や細胞に特異的な遺伝子のセットを準備すると便利である。例えば、脳腫瘍で発現するレベルおよび配列の両方を、正常な脳組織で発現するレベルおよび配列と比較するとよい。このような比較は、新規の配列とともに特定の組織や細胞に特異的な遺伝子の基準セットを組み込んだ１つのアレイにおいて、或いはそれぞれが既知の基準セットの少なくとも幾つかのサブセットを含む複数のアレイにおいて行うことができる。
【０００４】
本発明は、このような組織や細胞に特異的な遺伝子の基準セットを提供することで当分野のニーズに応えることができる。このような基準セットの全て或いはその一部を用いて発現プロファイルを作成し、その作成プロファイルを用いて、代謝または発生のプロセスを明らかにしたり、そのプロセスを導いて、症状、疾患、または障害を調べたり、その進行をモニタリングしたり、或いは治療プロトコルの有効度を評価およびモニタリングすることが可能である。
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、発現プロファイルを作成するべく、複数の組織や細胞に特異的であってアレイに使用可能なポリヌクレオチドを提供する。このプロファイルを用いて、正常な組織における、特定の代謝または発生のプロセスの間の、またはヒトの症状、疾患、または障害の開始、進行、または治療の間のポリヌクレオチドの発現を決定することが可能である。一実施例では、これらのポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−４１６から選択される。
【０００６】
本発明は、組織または細胞に特異的であって、（ａ）心臓の細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９−２１８およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０、（ｂ）骨格筋細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９−２４９およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−４１、（ｃ）子宮細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０−２５１およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２−４３、（ｄ）卵巣細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２−２５６およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４−４８、（ｅ）胃の細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５７−２６３およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９−５５、（ｆ）腸の細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６４−２８３およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６−７５、（ｇ）肺細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８４−２９３およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６−８５、（ｈ）肝細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９４−３４５およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６−１３７、（ｉ）腎細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４６−３５６およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８−１４８、（ｊ）膵臓細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５７−３７４およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９−１６６、および（ｋ）脳細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７５−４１６およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７−２０８から選択される複数のポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、これらの複数のポリヌクレオチドが基板に固定される。
【０００７】
別の実施例では、複数のポリヌクレオチドの発現を用いてある組織における発現を検出する。一実施態様では、この組織は、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、または膵臓の組織に分化する胚性幹細胞である。第２の実施態様では、この組織は、癌、免疫、または炎症の疾患と診断された、或いは法医学的検査を行う病変した脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、小腸、胃、または子宮から採取した組織である。第３の実施態様では、転移癌の原発巣（ｐｏｉｎｔ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎ）を決定する。
【０００８】
別の実施例では、これらのポリヌクレオチドを用いて、分子または化合物をスクリーニングしてリガンドを同定するハイスループットのアッセイを行う。このアッセイは、特異的な結合が許容される条件下で、ポリヌクレオチドを分子または化合物と結合させるステップと、特異的な結合を検出して、これらのポリヌクレオチドに特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含む。スクリーニングする分子または化合物は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ、擬態、ペプチド、およびタンパク質から選択される。
【０００９】
別の実施例では、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２、２２８、２３３、２５９、２７１、２８７、３１６−３１９、３２４、３７０、３７９、３８０、３８３、４１０、および４１２、またはそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２０、２５、５１、６３、７９、１０８−１１１、１１６、１６２、１７１、１７２、１７５、２０２、および２０４から選択された実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。一実施態様では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２、２２８、２３３、２５９、２７１、２８７、３１６−３１９、３２４、３７０、３７９、３８０、３８３、４１０、および４１２、またはそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２０、２５、５１、６３、７９、１０８−１１１、１１６、１６２、１７１、１７２、１７５、２０２、および２０４から選択されて実質的に精製されたポリヌクレオチドを発現ベクターに導入して、その発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、タンパク質が発現する条件下でこの宿主細胞を培養し、この宿主細胞からタンパク質を回収してタンパク質またはその断片を得る。
【００１０】
第３の実施例では、本発明は或るタンパク質またはその断片を提供する。一実施態様では、このタンパク質を用いて、多数の分子または化合物をスクリーニングしてこのタンパク質に特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定するハイスループットのアッセイを行う。このアッセイは、特異的な結合が許容される条件下で、このタンパク質を分子または化合物と結合させるステップと、このような特異的な結合を検出して、このタンパク質に特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含む。第２の実施態様では、このタンパク質を用いてリガンドを精製する。この方法は、特異的な結合が許容される条件下で、このタンパク質をサンプルと結合させるステップと、この結合したタンパク質を回収するステップと、このタンパク質を前記リガンドから分離して、精製されたリガンドを得るステップとを含む。スクリーニングまたは精製される前記分子または化合物が、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ、擬態、ペプチド、タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体またはそれらの断片、免疫グロブリン、インヒビター、薬物成分、および薬剤から選択され得る。これらの任意の分子または化合物を、診断または治療目的に利用することが可能である。
【００１１】
（発明の記載について）
（定義）
用語「アレイ」は、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチを規則正しく配列したものを指す。基板１ｃｍ２当たりに、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも１００、さらに好ましくは少なくとも１，０００、最も好ましくは１０，０００のポリヌクレオチドが存在する。ポリヌクレオチドの最大数に制限はないが、その数は少なくとも１０，０００である。さらに、ハイブリダイズしたそれぞれのヌクレオチドからの信号は個々に識別される。
【００１２】
用語「ポリヌクレオチド」はヌクレオチド鎖を指す。ヌクレオチド鎖の長さは、好ましくは約１５〜１０，０００ヌクレオチドであり、より好ましくは約４００〜６，０００ヌクレオチドである。用語「プローブ」は、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズしてハイブリダイゼーション複合体を形成することが可能なヌクレオチドである。大抵の場合、整列させるとプローブの配列と標的ポリヌクレオチドの配列は相補的（不一致がない）である。最大１０％の不一致がある場合もある。
【００１３】
用語「断片」は、有用な特性を有するインサイト社クローンまたはポリヌクレオチドの任意の部分である。有用な断片は、リガンドを同定したり精製するためのハイブリダイゼーション技術、或いは複製、転写、または翻訳の調節をする治療薬とし用いることが可能である。
【００１４】
「リガンド」は、ポリヌクレオチドやタンパク質の相補的な部位に特異的に結合する任意の薬剤、分子、または化合物を指す。このようなリガンドは、ポリヌクレオチドやタンパク質を安定化させたり、その活性を調節したりし、核酸、タンパク質、炭水化物、脂肪、および脂質を含む無機物質や有機物質の少なくとも１つからなる。
【００１５】
用語「精製された」は、自然環境から除去、分離、或いは単離され、天然では結合しているその他の物質が少なくとも６０％、好ましくは９０％除去された任意の分子または化合物を指す。
【００１６】
用語「特異的結合」は、分子の側鎖などの特定の構造に依存する２つの分子間の正確で特殊な相互作用を指す。例えば、２つの一本鎖の核酸間の水素結合や、エピトープまたはタンパク質とアゴニスト、アンタゴニスト、または抗体との間の結合がある。
【００１７】
用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。ポリヌクレオチドを含むサンプルは、体液（細胞からの抽出物、細胞から単離した染色体、オルガネラ、または膜）、溶液内に存在する或いは基板に結合したゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡや、細胞、組織、組織プリント、フィンガープリント、髪等を含む。
【００１８】
用語「部分」は任意の目的に用いられるタンパク質の任意の部分を指すが、特に、分子や化合物をスクリーニングしてその部分に特異的に結合するものを同定し、抗体を生産するために用いられるものを指す。
【００１９】
句「タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、当分野で周知の分析方法で同定された保存されたタンパク質モチーフやドメインをコードする配列と殆ど一致する配列を指す。このような分析手段の例には、ＰＦＡＭなどの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）（Ｋｒｏｇｈ （１９９４） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３５ ： １５０１−１５３１ ； Ｓｏｎｎｈａｍｅｒ ら （１９８８） Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２６ ： ３２０−３２２）、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６ ： ２９０−３００ ； および Ａｌｔｓｃｈｕｌ ら （１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５ ： ４０３−４１０）、またはＢＬＩＭＰＳ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ら （１９９８） Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２６ ： ３０９−１２）などのその他の分析手段がある。さらに、「タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、ヒト代謝プロセス、病状、疾患、障害において発現される、或いはそれらに関連するポリヌクレオチドを指す場合もある。
【００２０】
本明細書では、「細胞特異的」は２つ以上の組織において統計的に有意なレベルで発生するポリヌクレオチドと定義する。組織間の共通性は、特定の組織の一部である或いはその組織に存在すると推定される細胞型、例えば血液細胞、神経細胞、および内皮細胞などに起因し得る。
【００２１】
（発明）
本発明は、複数の組織や細胞に特異的であって、発現プロファイルを作成するためにアレイに使用可能なポリヌクレオチドを提供する。この発現プロファイルによって、正常な組織における、特定の代謝または発生のプロセスの間、または症状、疾患、または障害の開始、進行、または治療の間のこれらのポリヌクレオチドの発現を明確にすることが可能である。これらのポリヌクレオチドは、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、小腸、胃、または子宮の細胞や組織に通常に発現する既知および新規の遺伝子である。これらのポリヌクレオチドの発現を、アレイ上のその他の既知或いは新規の遺伝子の発現と比較することができる。全基準セットであるこれらの複数のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−４１６を含む。組織または細胞に特異的な基準セットは、（ａ）心臓の細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９−２１８およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０、（ｂ）骨格筋細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９−２４９およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１−４１、（ｃ）子宮細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０−２５１およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２−４３、（ｄ）卵巣細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２−２５６およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４−４８、（ｅ）胃の細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５７−２６３およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９−５５、（ｆ）腸の細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６４−２８３およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６−７５、（ｇ）肺細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８４−２９３およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６−８５、（ｈ）肝細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９４−３４５およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６−１３７、（ｉ）腎細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４６−３５６およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８−１４８、（ｊ）膵臓細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５７−３７４およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９−１６６、および（ｋ）脳細胞に特異的なポリヌクレオチドであるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７５−４１６およびそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６７−２０８から選択することができる。これらの複数のポリヌクレオチドは、基板、好ましくはマイクロアレイに配列したり、プローブとして用いる。
【００２２】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２、２２８、２３３、２５９、２７１、２８７、３１６−３１９、３２４、３７０、３７９、３８０、３８３、４１０、および４１２、またはそれらの断片であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、２０、２５、５１、６３、７９、１０８−１１１、１１６、１６２、１７１、１７２、１７５、２０２、および２０４から選択された実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。これらのポリヌクレオチドを発現ベクターに導入して、その発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、タンパク質が発現する条件下でこの宿主細胞を培養し、この宿主細胞からタンパク質を回収してタンパク質またはその断片を生産することが可能である。
【００２３】
マイクロアレイを用いて、多数の新規の標的ポリヌクレオチドの大規模な遺伝子分析または遺伝子発現分析を行うことができる。これらの標的ポリヌクレオチドは、発生或いは分化の或るステージの哺乳動物細胞または組織から、またはサイトカイン、成長因子、および薬剤などの既知の分子や化合物で処置して、または処置する前若しくは処置した後の既知または未知の症状、疾患、障害をもつ哺乳動物から採取或いは生検するなどして当分野で周知の方法で準備した。これらの複数のポリヌクレオチドは、特に、胚性幹細胞の脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、または膵臓の組織への分化を決定したり、病変した脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、小腸、胃、または子宮の組織を生検して癌が転移癌であるか原発性の癌であるかを決定する際に有用である。これらの複数のポリヌクレオチドを、癌、免疫疾患、および神経疾患の診断用いることが可能である。
【００２４】
発生ステージ、治療、症状、障害、または疾患に関連する新規の遺伝子プロファイルを確立するために、標的ポリヌクレオチドをプローブポリヌクレオチドとハイブリダイズさせる。次に、この遺伝子プロファイルを用いて、既知および新規の遺伝子の発現の変化が癌、免疫疾患、および神経疾患などに関連するような診断、予後、治療のモニタリングを行うことができる。場合によっては、遺伝子プロファイルを用いた、癌、免疫疾患、および神経疾患などの症状、障害、または疾患に対する疾病素質を検査することもできる。
【００２５】
本発明のポリヌクレオチドをマイクロアレイ上のハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして用いる場合、基板上の指定の位置に各ポリヌクレオチドが位置するようにこれらのポリヌクレオチドを規則正しく配列する。プローブポリヌクレオチドが基板上の指定の位置に存在するため、ハイブリダイゼーションのパターンおよび強度を、その他の既知および新規のポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションのパターンおよび強度と比較し、発現プロファイルを作成することができる。このようなプロファイルは、細胞および組織特異的な既知および新規の遺伝子の発現レベルについてみると、特定の代謝プロセス、発生ステージ、治療、症状、障害、疾患、または疾患のステージに相関し得る。
【００２６】
これらの複数のポリヌクレオチドを用いて、少なくとも１つのこれらのポリヌクレオチドに特異的に結合する分子や化合物の同定および精製を行うことができる。これらの分子は、サンプルから同定したり、或いはｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、およびゲノム断片などを含む多数の分子や化合物からハイスループット方式で同定することができる。通常は、これらの分子や化合物は、特定の診断または治療に有用である。
【００２７】
サンプルの核酸分子がハイブリダイゼーションのバックグラウンドを高める場合、妨害している分子を除去するのが望ましい。このような分子を除去するための或る方法では、固定したプローブポリヌクレオチドにサンプルをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成しなかった分子を洗い流す。その後、ハイブリダイゼーション複合体を分離させて、固定したプローブポリヌクレオチドに特異的に結合した分子を遊離させる。
【００２８】
ポリヌクレオチドプローブを選択する方法
ポリヌクレオチドの選択には様々な方法がある。その一般的な方法の中には、血液や骨髄などの特定の細胞型や組織に発現する、特定のモチーフやドメイン、またはシグナルペプチドの存在などの共通の機能的特性を有する、文献に記載されている特定の症状、障害、または疾患に関連する遺伝子からプローブを選択する方法がある。
【００２９】
プローブは重複せず特定の遺伝子に対して１つのプローブのみが存在するようにするのが好ましい。しかしながら、コントロール配列は、特にそれらの重複のために選択され得る。
【００３０】
ポリヌクレオチドの組成は、ハイブリダイゼーション技術で操作してそれらの性能を最適化することが可能である。ポリヌクレオチドの選択は、コンピュータアルゴリズムを用いて配列を検査して潜在的な二次構造をもたない断片を識別し、最適化することができる。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウエア（Ｉｎｆｏｒｍａｘ， Ｎ． Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ）またはＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）に用いられているようなコンピュータアルゴリズムが、当分野でよく知られている。これらのプログラムは、核酸配列を検索してステムループ構造および縦列反復配列を探し出し、配列のＧＣ含量を分析する。哺乳動物のアレイでは、ＧＣ含量が６０％を超えるこれらの配列を排除され得る。別法では、ポリヌクレオチドプローブがそれらに相補的な標的と最適にハイブリダイズするか否かを決定して、実験的条件下でポリヌクレオチドを最適化することが可能である。
【００３１】
極めて多数の重複していないポリヌクレオチドが必要な場合は、ポリヌクレオチドをクラスター配列または構築配列と比較して、各ポリヌクレオチドが異なった遺伝子に由来することを確認する。特定の遺伝子に対する長い或いは異なったプローブを得るために、インサイト社クローンから得た部分的なヌクレオチド配列を用いてＸＬ−ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）または当分野で周知のその他の方法で物理的に伸長することが可能である。
【００３２】
ポリヌクレオチドプローブ
ポリヌクレオチドプローブには、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはペプチド核酸や分枝ＤＮＡなどの任意のＲＮＡ様物質またはＤＮＡ様物質を用いることができる。これらは、センス鎖若しくはアンチセンス鎖である。標的が二本鎖の場合、プローブはセンス鎖或いはアンチセンス鎖の何れかとすることができる。標的が一本鎖の場合は、プローブは標的に相補的な一本鎖とする。
【００３３】
一実施例では、ポリヌクレオチドプローブはｃＤＮＡである。ｃＤＮＡのサイズは様々な長さにすることができるが、好ましくは１５〜１０，０００ヌクレオチド、より好ましくは６０〜４０００ヌクレオチド、最も好ましくは２００〜６００ヌクレオチドである。
【００３４】
別の実施例ではプローブはプラスミドである。この場合、目的のｃＤＮＡ配列が挿入配列である。ベクターＤＮＡおよび調節配列を除いたｃＤＡＮのサイズは１５〜１０，０００ヌクレオチドと様々であるが、好ましくは６０〜４０００ヌクレオチド、最も好ましくは２００〜６００ヌクレオチドである。
【００３５】
ポリヌクレオチドプローブは、当分野で周知の様々な合成方法や酵素的な方法で作製することができる。プローブは、その全て或いは一部を当分野で周知の化学的方法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓら（１９８０） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ Ｓｅｒ （７） ： ２１５−２３３）で合成することができる。別法では、プローブは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ または ｉｎ ｖｉｖｏでの転写によって酵素或いは組換えにより作製することができる。
【００３６】
当分野で周知の方法で、プローブにヌクレオチド類似体を組み入れることができる。唯１つ必要なことは、プローブに組み込まれるヌクレオチド類似体が標的のヌクレオチドと塩基対を形成しなければならないことである。例えば、所定のグアニンヌクレオチドを、シトシン残基と塩基対を形成するヒポキサンチンで置換することができる。しかしながら、これらの塩基対は、グアニンとシトシンとの間の結合より不安定である。別法では、アデニンヌクレオチドを、アデニンとチミジンとの結合より強い塩基対を形成する２，６−ジアミノプリンで置換することができる。
【００３７】
さらに、プローブは化学的或いは酵素的に誘導されたヌクレオチドを含み得る。通常の化学修飾には、アシル基、アルキル基、アリル基、またはアミノ基での誘導体化が含まれる。
【００３８】
プローブは、基板上で合成できる。基板表面での合成は、Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒら（ＰＣＴ／Ｗ０９５／２５１１１６）によって記述されたピエゾ式印刷装置（ｐｉｅｚｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｒｉｎｔｉｎｇ ａｐｐａｒａｔｕｓ）または化学結合法によって行うことができる。別法では、基板上でのプローブの合成は、Ｈｅｌｌｅｒら（米国特許第５， ６０５， ６６２号）によって記述されたように試薬を加えて制御する自己アドレス指定可能な電子装置（ｓｅｌｆ−ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｄｅｖｉｃｅ）を用いて行うことができる。
【００３９】
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を基板上に配置して固定することができる。プローブは、化学結合法やＵＶなどによる共有結合的方法によって固定することができる。このような或る方法では、ｃＤＮＡを、エポキシドまたはアルデヒド基を含むように修飾したガラス基板に結合させる。別の方法では、ｃＤＮＡプローブをポリリシンでコーティングした表面に配置し、次にＳｈａｌｏｎら（ＰＣＴ／Ｗ０９５／３５５０５ ； 言及することを以って本明細書の一部とする）によって記述されたようにＵＶクロスリンクする。更なる方法では、ＤＮＡを溶液から基板の所定の位置に電気的な方法（Ｈｅｌｌｅｒら、前出）で活発に移動させる。別法では、プローブ、クローン、プラスミド、または細胞をフィルター上に配置することもできる。後者の場合、細胞を溶解し、タンパク質および細胞成分を分解し、ＤＮＡをＵＶクロスリンクでフィルターに結合させる。
【００４０】
さらに、プローブを基板に直接結合させるのではなく、リンカーを介して基板に結合させてもよい。リンカーは、結合したプローブを露出させるように通常は６〜５０原子の長さである。リンカーには、エチレングリコールオリゴマー、ジアミン、２酸などが好適である。基板表面の反応基がリンカーの末端基と反応し、リンカーが基板に結合される。リンカーの他方の末端がプローブに結合される。
【００４１】
プローブ合成用の試薬を基板表面上に連続的に供給して、或いは基板表面に予備作製したＤＮＡ断片を供給して、プローブを基板上に固定することができる。このようなディスペンサーには、例えばマイクロピペットがある。マイクロピペットは、基板に対して該マイクロピペットの位置を制御するロボットシステムを備えている。複数のディスペンサーを用いて、効果的に反応領域に溶液を供給することもできる。
【００４２】
サンプルの準備
サンプル分析をするために、標的を含むサンプルを準備する。サンプルは標的を含む任意のサンプルであって、任意の体液（血液、尿、唾液、粘液、胃液など）、培養細胞、生検材料、またはその他の組織や法医学的資料から得られる。
【００４３】
ＤＮＡまたはＲＮＡは、当分野で周知の様々な方法に従ってサンプルから得ることができる。例えば、核酸の精製方法は、Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３） （Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ： Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐａｒｔ Ｉ． Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）に記載されている。例えば、全ＲＮＡはＴＲＩＺＯＬ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）で単離し、ｍＲＮＡはオリゴｄ （Ｔ）カラムクロマトグラフィーまたはガラスビーズで単離する。別法では、標的がｍＲＮＡに由来する場合、標的として、ｍＲＮＡから逆転写されたＤＮＡ、そのＤＮＡから転写されたＲＮＡ、そのＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、その増幅されたＤＮＡから転写されたＲＮＡなどである。標的がＤＮＡに由来する場合、標的はＤＮＡから増幅されたＤＮＡ、ＤＮＡから逆転写されたＲＮＡを用いることができる。更なる別法では、標的を２つ以上の方法で準備する。
【００４４】
標的を増幅する場合、サンプルにおいて核酸を増幅し、転写物の低い存在量を含む核酸の相対存在量を維持するのが望ましい。全ｍＲＮＡは、逆転写酵素と、オリゴｄ（ｔ）からなるプライマーと、一本鎖ＤＮＡ鋳型を提供するファージＴ７プロモーターをコードする配列とを用いて逆転写により増幅する。第二鎖ＤＮＡを、ＤＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの分解を助けるＲＮＡ分解酵素で重合させる。二本鎖ＤＮＡを合成した後、Ｖａｎ Ｇｅｌｄｅｒら（ＵＳＰＮ ５， ５４５， ５２２）によって記載されたように、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを加え、第二鎖ＤＮＡ鋳型からＲＮＡを転写する。ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、またはｉｎ ｖｉｖｏで増幅することができる（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ， ＵＳＰＮ ５， ５１４， ５４５）。
【００４５】
増幅および標識化によってサンプル内における転写物の実際の存在量が変らないように、量的制御を行うことが望ましい。このために、サンプルに所定量のコントロール核酸を加え、プローブはコントロール核酸と特異的にハイブリダイズするコントロールプローブを含む。ハイブリダイゼーションおよびプロセシングの後、ハイブリダイゼーション信号がサンプルに加えたコントロール核酸の量を正確に反映する。
【００４６】
ハイブリダイゼーションの前に、サンプルの核酸を断片化することが望ましい。断片化することによって、二次構造、およびサンプル内の核酸同士或いは非相補的なプローブとのクロスハイブリダイゼーションが減少し、ハイブリダイゼーションを恒常させることができる。機械的或いは化学的な方法で核酸を断片化することができる。
【００４７】
１或いは複数の標識成分で核酸を標識して、ハイブリダイゼーション複合体の検出および定量ができるようにする。標識成分には、分光学的、光化学的、生化学的、生物電子工学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的方法で検出できる組成物を含む。標識成分は、３２Ｐ、３３Ｐ、３５Ｓなどのラジオアイソトープ、化学発光化合物、標識結合タンパク質、重金属原子、蛍光マーカーや染料などの分光学的マーカー、磁気標識、結合酵素、質量分析タグ、スピン標識、電子供与体および受容体などがある。
【００４８】
好ましい染料は、キノリン色素、トリアリルメタン色素、フタレイン、アゾ染料、シアニン色素などである。蛍光マーカーの吸光度は、好ましくは約３００ｎｍを超え、より好ましくは４００ｎｍを超え、通常は吸収される光の波長より少なくとも１０ｎｍ大きい波長で光が放出される。好ましい蛍光マーカーは、フルオレセイン、フィコエリトリン、ローダミン、およびＣｙ３およびＣｙ５などである。
【００４９】
標識化は、ニックトランスレーションまたは５’または３’末端標識反応によって、ポリメラーゼ連鎖反応やｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応などの増幅反応の際に行われる。例えば、標識したヌクレオチドをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応に用いる。増幅ステップの後に標識を組み入れる場合、或いは増幅ステップがない場合は、標識を、ターミナルトランスフエラーゼまたはキナーゼを用いて標的ポリヌクレオチドの５’末端に繋ぎ、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼの存在下で標識したオリゴヌクレオチドとともに一晩インキュベートする。
【００５０】
別法では、ハイブリダイゼーションでプローブ／標的複合体が形成された後に、標識成分を組み込むこともできる。一実施態様では、上記したように増幅ステップで最初にビオチンを組み込む。ハイブリダイゼーションの後、結合しなかった核酸を洗い流すと、基板に結合して残っているビオチンは、プローブとハイブリダイズした標的に結合しているビオチンのみとなる。別の実施態様では、標識成分を、予備形成された標的／プローブ複合体の中に挿入して組み込む。この場合、ソラレン結合色素などのインターカレーション色素を用いることができる。
【００５１】
スクリーニングアッセイ
プローブまたはポリヌクレオチドを用いて分子や化合物のライブラリをスクリーニングして、特異的な結合親和性を調べることができる。ライブラリには、生物系においてポリヌクレオチドの複製、転写、または翻訳などの活性を調節するＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ、ペプチド、転写因子などのタンパク質、エンハンサー、リプレッサー、およびその他の有機或いは無機リガンドを用いることができる。アッセイには、特異的な結合が許容される条件下でプローブと分子や化合物のライブラリとを結合させるステップ、およびプローブと特異的に結合するリガンドの特異的な結合を検出するステップとが含まれる。
【００５２】
同様に、プローブから転写され翻訳されたタンパク質およびその一部を用いて、様々なスクリーニングアッセイの内の任意のアッセイを用いて分子や化合物のライブラリをスクリーニングする。タンパク質およびその一部は、溶液中に遊離した状態、非生物基板または生物基板と結合した状態、または細胞表面上に支持された状態、或いは細胞内に位置し得る。このタンパク質とリガンドとの間の特異的な結合を測定することができる。スクリーニングするライブラリの種類によってアッセイを用いて、このタンパク質と特異的に結合するＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、インヒビター、擬態、ペプチド、タンパク質、薬剤、またはその他のリガンドを同定できる。
【００５３】
リガンドの精製
プローブを用いてサンプルからリガンドを精製することができる。プローブを用いてリガンドを精製する方法は、特異的な結合が許容される条件下で、このプローブとサンプルとを結合させるステップと、結合したタンパク質を回収するステップと、適切な物質を用いて精製したリガンドからポリヌクレオチドを分離するステップとを含む。
【００５４】
同様に、コードされたタンパク質またはその一部を用いて、サンプルからリガンドを精製することができる。タンパク質またはその一部を用いてリガンドを精製する方法は、特異的な結合が許容される条件下で、このタンパク質またはその一部とサンプルとを結合させるステップと、このタンパク質とリガンドとの間の特異的な結合を検出するステップと、結合したタンパク質を回収するステップと、適切な物質を用いて精製したリガンドからポリヌクレオチドを分離するステップとを含む。
【００５５】
ハイブリダイゼーションおよび検出
ハイブリダイゼーションによって、変性したポリヌクレオチドと変性した相補的な標的とが塩基対を形成して安定した二本鎖になる。ハイブリダイゼーションの方法は当分野で周知である（前出のＡｕｓｕｂｅｌによるｕｎｉｔｓ ２． ８−２． １１， ３． １８−３． １９ および ４． ６−４． ９を参照）。相補的なプローブと標的とが完全にハイブリダイズする、すなわち各塩基がその相補的な塩基と相互作用しなければならないハイブリダイゼーションの条件を選択することができる。別法では、プローブと標的との不一致が最大約１０％であるがなおハイブリダイズ可能なハイブリダイゼーションの条件を選択することができる。プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄液における塩濃度を変えて、或いはハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度を変えて、好適な条件を選択することができる。数種類の基質を用いて、プレハイブリダイゼーション溶液およびハイブリダイゼーション溶液にホルムアミドを加えて温度を下げることができる。
【００５６】
ある程度の不一致を含んだプローブ配列と標的配列とのハイブリダイゼーションが許容される低いストリンジェンシー（緩衝液：５×ＳＳＣ，１％ＳＤＳ、６０℃）で、ハイブリダイゼーションを行ってプローブ／標的複合体を形成することができる。続く洗浄は、高いストリンジェンシー（緩衝液：０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、４５℃（中間のストリンジェンシー）か或いは６８℃（高いストリンジェンシー）の何れか）で行い、完全に相補的な配列を含むプローブ／標的複合体のハイブリダイゼーションのみを残した。バックグラウンド信号は、ＳＤＳ、Ｓａｒｃｏｓｙｌ、またはＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）などの界面活性剤、サケ精子などのブロッキング剤を用いて低減させることができる。
【００５７】
ハイブリダイゼーションの特異性は、所定量サンプルに加えられた標的配列とコントロールプローブとのハイブリダイゼーションを比較して評価することができる。コントロールプローブは、対応する標的に対して１或いは複数の配列不一致を有し得る。このようにして、相補的なプローブのみが標的にハイブリダイズしたのか、或いは不一致ハイブリッド二本鎖が形成されたのかを評価することが可能である。
【００５８】
ハイブリダイゼーション反応は、完全なハイブリダイゼーション方式或いはディファレンシャルハイブリダイゼーション方式で行うことができる。完全なハイブリダイゼーション方式の場合、あるサンプルからのプローブをマイクロアレイのプローブとハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体が形成された後に信号を検出する。信号の強度は、サンプルのプローブのレベルに相関する。ディファレンシャルハイブリダイゼーション方式の場合は、異なって発現する２つの生体サンプルにおける遺伝子のセットを分析する。２つのサンプルからそれぞれプローブを調製し、異なった標識成分を標識する。２つの標識した標的の混合物をマイクロアレイのプローブにハイブリダイズさせ、２つの異なった標識から放出される信号を別々に検出できる条件下で信号を検査する。２つの生体サンプルに由来するプローブが実質的に同数ハイブリダイズしたマイクロアレイの標的は、顕著な合成蛍光色を示す（Ｓｈａｌｏｎ， ＰＣＴ／Ｗ０９５／３５５０５）。好適な実施例では、標識は、ｌｉｓｓａｍｉｎｅ結合ヌクレオチド類似体およびフルオレセイン結合ヌクレオチド類似体などの顕著な放射スペクトルを有する蛍光標識である。別の実施例では、Ｃｙ３およびＣｙ５フルオロフォア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）を用いる。
【００５９】
ハイブリダイゼーションの後、マイクロアレイを洗浄してハイブリダイズしなかったポリヌクレオチドを除去し、ハイブリダイズ可能なアレイプローブと標的との間の複合体の形成を検査する。複合体の形成を検出する方法は、当分野では周知である。好適な実施例では、プローブを蛍光標識し、複合体の形成を示唆する蛍光レベルおよびパターンを、蛍光顕微鏡、好ましくは共焦点蛍光顕微鏡で測定する。アルゴンイオンレーザーで蛍光標識を励起し、その発光を光電子増倍管に向け、発光した量を検出および定量する。検出した信号が、マイクロアレイの各位置におけるプローブ／標的複合体の量に比例する。蛍光顕微鏡をコンピュータ制御されたスキャナーに接続して、ハイブリダイゼーション強度を示す量的な二次元イメージを生成することができる。スキャンしたイメージを検査して、ハイブリダイズしたプローブの存在／発現レベルを決定する。
【００６０】
２つ以上のマイクロアレイを類似の条件下で使用する場合、通常は、マイクロアレイの蛍光強度をハイブリダイゼーション強度におけるばらつきを考慮して標準化する。好適な実施例では、個々のポリヌクレオチドプローブ／標的複合体のハイブリダイゼーション強度は、マイクロアレイのそれぞれに含まれる内部標準化対照からの強度を用いて標準化する。
【００６１】
発現プロファイル
本発明のポリヌクレオチドを用いた発現プロファイルについて記載する。新規遺伝子の発現の変化を検出する発現プロファイルの一部として、参照セットを用いることができる。これらの新規遺伝子の転写物は、特定の代謝応答、治療、症状、障害、または疾患において変化する。これらの新規遺伝子には、発現の変化が癌、免疫疾患、神経疾患などに相関する遺伝子が含まれる。
【００６２】
発現プロファイルは、複数の検出可能なハイブリダイゼーション複合体を含む。それぞれの複合体は、１或いは複数のプローブと１或いは複数の相補的な標的とのハイブリダイゼーションによって形成される。少なくとも１つのプローブ、好ましくは複数のプローブが、相補的な標的とハイブリダイズして少なくとも１つ、好ましくは複数の複合体を形成する。複合体は、少なくとも１つの標識成分を組み込むことにより検出される。発現プロファイルは、代謝プロセス、治療、症状、障害、または疾患の特徴を示す特有の発現パターンを表す「スナップショット（ｓｎａｐｓｈｏｔ）」を提供する。
【００６３】
ハイブリダイゼーション実験を実施し、マイクロアレイから信号を検出した後、それらの発現パターンに基づいて特定のプローブを識別して選択する。このようなプローブを用いて遺伝子の完全長の配列をクローニングし、密接に関連する相同体を同定するため、リガンドを精製するため、またはタンパク質を作り出すためにライブラリをスクリーニングすることができる。
【００６４】
本発明の有用性
本発明の複数のポリヌクレオチドをマイクロアレイのハイブリダイズ可能なエレメントとして用いることができる。このようなマイクロアレイは、例えば、診断、予後および治療計画、並びに癌、免疫疾患、神経疾患などの症状、障害、疾患に対する薬剤の発見および開発などの様々な目的に利用することができる。
【００６５】
発現プロファイル
一実施態様では、マイクロアレイを用いて疾患の進行をモニタリングする。正常な組織または細胞と病変した組織または細胞との遺伝子発現における差異を評価して一覧表を作成することができる。遺伝子発現パターンにおける変化を分析して、患者が症状を示す前の早期に疾患を診断することができる。本発明を用いて予後を明確にし、治療計画を立てることができる。また、本発明を用いて治療の効果を評価することができる。既知の副作用を伴う治療の場合は、マイクロアレイを用いて治療計画に微調整を加えることができる。治療の成功を示す遺伝子発現パターンにおける変化が生じるように薬用量を決定することができる。好ましくない副作用の発生に関連する発現パターンは回避する。この方法は、患者の改善が十分でないことが分かるまで、或いは副作用が出るまで治療計画を変えないで待つ方法に比べ、より高感度であってかつ迅速に対応することができる。
【００６６】
別法では、ヒト疾患モデル動物を用いて、特定の病態、障害または疾患、或いは病態、障害、または疾患の治療に関連する発現プロファイルを特徴付ける。これらのモデル動物において、マイクロアレイを用いて実験的な治療計画を検査し、現プロファイルを作成し、その発現プロファイルの経過を追う。さらに、モデル動物から採取した培養細胞や組織を用いて、マクロアレイで多数の薬剤候補を迅速にスクリーニングし、同じ発現パターンを有する分子は類似の治療効果を持つであろうと予想して、既知の治療薬に類似の発現プロファイルを有する分子を探すことができる。従って、本発明は、薬剤の分子モードの作用を迅速に決定することができる。
【００６７】
胚性幹細胞
齧歯類或いはヒトの胚から単離した胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胚組織を形成する能力を保持している。マウス１２９／ＳｖＪ細胞株などのＥＳ細胞をＣ５７ＢＬ／６マウス株の胚盤胞に導入すると、正常な発生を再開し、生まれてくる動物の組織を形成する。マウスにおけるこのプロセスの方法は、当分野で周知である。まず、ｃＤＮＡをベクターに導入し、次にＥＳ細胞をこのベクターで形質転換し、形質転換細胞を同定してマウス細胞胚盤胞に微量注入し、この胚盤胞を外科的に偽妊娠雌に移植する。得られるキメラ子孫は遺伝子形質が決められたマウスであり、交配によってヘテロ接合系またはホモ接合系を作り出すことができる。
【００６８】
また、ＥＳ細胞を用いてパーキンソン病、発作、およびその他の神経疾患の治療を行う（Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ， １４ （１８） ： ｌｆｆ ； Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０００）。また、製薬会社は、肝臓疾患、特にα１−アンチトリプシ欠損症、腎臓疾患、特に腎嚢胞、および膵臓疾患、特に糖尿病の疾患に的を絞っている。近い将来、神経系や内臓への外傷性の障害は、ＥＳ細胞から分化した細胞や組織を移植して治療することが可能であろう。本発明を用いて、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、小腸、胃、または子宮の組織に分化するプロセスの発生経路を特徴付けることが可能である。
【００６９】
ノックアウト分析
遺伝子ノックアウト分析では、ある領域がネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの非天然の介在配列を含むように酵素で改変する（ｎｅｏ ； Ｃａｐｅｃｃｈｉ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）。改変遺伝子で培養したＥＳ細胞を形質転換する。その後、改変遺伝子が相同組換えで内在性ゲノムに組み込まれる。この挿入配列は、内在性遺伝子の転写及び翻訳を阻害する。
【００７０】
ノックイン分析
ＥＳ細胞を用いて、ノックインヒト化モデル動物すなわち遺伝子組換えヒト疾患モデル動物を作り出すことができる。ノックイン技術を用いて、ヒト遺伝子のある領域を動物ＥＳ細胞に導入し、ヒトの配列を動物細胞のゲノムに組み込む。潜在的な薬剤を用いて遺伝子組換え子孫或いは近交系を処置して分析し、ヒトに類似した病態の進行および治療についての情報を取得する。
【００７１】
上記したように、本明細書の配列表に示されているｃＤＮＡおよびそれらをコードしたタンパク質の使用方法は、既知の技術を用いたが、当業者に周知の技術に限定されることを意図したものではない。さらに、本発明のｃＤＮＡを、まだ確立されていない分子生物学技術に利用することができる。但し、新規の技術が、当業者が周知している例えばトリプレット遺伝子コードおよび特定の塩基対相互作用などのヌクレオチド配列の特性に依存する場合に限る。同様に、言及した方法は、当業者には周知であろうｃＤＮＡの取得方法、構築方法、および発現方法を２つ以上の組み合わせた方法を含み得る。本発明はまた、上記した特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されるものではなく、その他の様々な方法論、プロトコル、および試薬を含むことを理解されたい。本願に用いた用語は特定の実施例を説明するのが目的であって、本発明の範囲を限定することを意図したものではなく、本発明は請求の範囲によってのみ規定される。本発明を例示するために実施例を後述するが、本発明を制限するものではない。
【００７２】
（実施例）
例示目的で、ＢＲＡＩＮＯＮ０１ ｃＤＮＡライブラリの準備方法およびシークエンシング方法を記載する。ＬＩＦＥＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）におけるライブリのその他のｃＤＮＡの準備およびシークエンシングは、時間の経過とともに変化してきた。徐々に変化してきたものは、例えば、ライブラリの作製および分析の際に利用したキットやプラスミド、および装置などである。
【００７３】
１　ｃＤＮＡライブラリの作製
ＢＲＡＩＮＯＮ０１標準化ｃＤＮＡライブラリは、２６歳の白人男性が脳の右前頭頭頂部にグレード４のオリゴ星状細胞腫があると診断された後、大脳髄膜の切除術の際に採取された癌性脳組織から作製された。腫瘍には放射線治療が施されていた（５８００ｒａｄｓ）。患者には、片側麻痺、てんかん、眼瞼の下垂症、および一般的な片頭痛の症状があり、Ｄｉｌａｎｔｉｎ（商標） （Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ， Ｍｏｒｒｉｓ Ｐｌａｉｎｓ ＮＪ）の投薬を受けていた。
【００７４】
凍結組織をＰＯＬＹＴＲＯＮホモジナイザー（ＰＴ−３０００； Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ）を用いて、グアニジニウムイソチオシアネート溶液中でホモジナイズして溶解した。この溶解物をＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＲＮＡ 単離プロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）に従って酸性フェノール（ｐＨ ７．４）で抽出した。このＲＮＡを等倍量の酸性フェノールで抽出し、０．３ Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５倍量のエタノールで沈殿させ、ＤＥＰＣ処理水で再懸濁し、３７℃で２５分間ＤＮアーゼで処置した。このＲＮＡを、フェノール（ｐＨ ８．７）で再び抽出し、初回と同様に酢酸ナトリウムおよびエタノールで再び沈殿させた。このｍＲＮＡをＯＬＩＧＯＴＥＸキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）で単離し、ｃＤＮＡライブラリを作製した。
【００７５】
このｍＲＮＡを、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて推奨プロトコルに従って処置した。ｃＤＮＡをＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラム （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で分画し、４００ ｂｐを超えるｃＤＮＡをＰＳＰＯＲＴ Ｉプラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に結合させた。この組み換えプラスミドで、ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換し、ＢＲＡＩＮＯＴ０３ライブラリを作製した。
【００７６】
２　ｃＤＮＡライブラリの標準化
ＤＨ１２Ｓコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を電気穿孔法で形質転換した後、カルベニシリン （２５ｍｇ／Ｌ）およびメチシリン（１ｍｇ／ｍｌ）を用いた選択培養液で、ＢＲＡＩＮＯＴ０３ライブラリの独立した４．９×１０６個のクローンを増殖させた。ＯＤ６００＝０．２に達するまで培養液を、ＤＵ−７分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ ＣＡ）でモニタリングし、５倍過剰のヘルパーファージＭ１３Ｋ０７ （Ｖｉｅｉｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３ ： ３−１１）で重感染させた。
【００７７】
高発現したｃＤＮＡの数を減らすために、以下の変更点を除いてＳｏａｒｅｓら（１９９４， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１ ： ９９２８−９９３２）の手順に従って１回標準化した。その変更点は、（１）プライマー伸長反応におけるプライマー：鋳型の割合を２：１から１０：１，２に下げ、（２）４００〜１０００ヌクレオチドの長いプライマー伸長生成物が生成されるように、ｄｄＮＴＰの濃度を１５０ μＭに下げ、（３）ハイブリダイゼーションのアニーリング時間を１３時間から４８時間に延長した。一本鎖環状ＤＮＡをヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーで精製し、ランダムプライミングにより部分的な二本鎖にしてから、このｃＤＮＡを電気穿孔法でＤＨ１０Ｂ コンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換し、ＢＲＡＩＮＯＮ０１標準化ライブラリを作製した。
【００７８】
３　ｃＤＮＡクローンの単離およびシークエンシング
プラスミドＤＮＡを細菌細胞から放出させ、ＲＥＡＬ Ｐｒｅｐ ９６ プラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。このキットを利用することにより、９６穴プレートにおいてマルチチャネル試薬ディスペンサーを用いて同時に９６のサンプルを精製することができる。以下の変更点を除いて推奨プロトコルに従った。その変更点は、（１）細菌を、２５ ｍｇ／Ｌのカルベニシリンと０．４％のグリセロールを含む１ ｍｌの滅菌ＴＥＲＲＩＦＩＣ ＢＲＯＴＨ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓｐａｒｋｓ ＭＤ）で培養し、（２）培養液を接種して１９時間インキュベートし、０．３ ｍｌの溶解緩衝液で溶解し、（３）イソプロパノール沈殿の後、プラスミドＤＮＡペレットを０．１ ｍｌの蒸留水に懸濁した。
【００７９】
このｃＤＮＡは、ＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ） と共にＤＮＡ ＥＮＧＩＮＥサーマルサイクラー（ＰＴＣ２００ ； ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）を用いて調製した。ｃＤＮＡは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＳａｎｇｅｒおよびＣｏｕｌｓｏｎ （１９７５ ； Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９４ ： ４４１ｆ）の方法によってシークエンシングした。殆どの配列は、標準ＡＢＩプロトコルおよびキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、０．２５〜１．０倍量の溶液でシークエンシングした。別法では、ある配列は、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社の溶液および色素を用いてシークエンシングした。
【００８０】
４　マイクロアレイ用の配列の選択
インサイト社クローンを非重複Ｕｎｉｇｅｎｅクラスター（Ｕｎｉｇｅｎｅ データベース（ｂｕｉｌｄ ４６）， ＮＣＢＩ ； Ｓｈｕｌｅｒ （１９９７） Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７５ ： ６９４−６９８）にマッピングし、最も高いＢＬＡＳＴアラインメント（少なくとも同一性が９０％、オーバーラップが１００ ｂｐ）を有する５’クローンを選択して評価し、マイクロアレイの作製に用いた。ＵＮＩＧＥＭ Ｖマイクロアレイ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）は、アノテーションの付いた４，６１０の遺伝子とアノテーションの付いていない２，１８４のクラスターとからなる７，０７５のアレイエレメントを含む。表１は、ＢＬＡＳＴ分析によって作成された本発明のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１―４１６に対するＧｅｎＢａｎｋのリリース１１９のアノテーションが示されている。
【００８１】
５　ポリヌクレオチドおよびタンパク質の相同性検索
ＢＬＡＳＴは、与えられた配列とデータベースの配列との間の類似したセグメントを探し出し、全ての類似性の統計的有意性を評価し、ユーザーが選択可能な有意性の閾値を満たす配列のみを報告する。ＢＬＡＳＴは、核酸配列とアミノ酸配列の両方のアラインメントを作成して配列類似性を決定する。
【００８２】
分析の基本単位は、ハイスコアセグメントペアー（ＨＳＰ）である。ＨＳＰは、任意の２つの配列セグメントからなる。但し、配列の長さは同一であって、それらのアラインメントは局所的に最大であり、アラインメントスコアがユーザーの設定した有意性の閾値を満たしている。
【００８３】
検索の基準は、
（％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００
として定義される積スコアである。
【００８４】
積スコアは、ＢＬＡＳＴスコアに反映される配列一致長さ及び２配列間の同一性の両方を考慮している。ＢＬＡＳＴスコアは、ＨＳＰにおけるそれぞれの塩基の一致は＋５のスコア、不一致は−４のスコアとして計算する。例えば、積スコアが４０の場合、その一致は１〜２％誤差の範囲内で正確であり、７０ではその一致は正確であろう。相同な分子は通常、積スコアが１５〜４０の範囲であるが、それより低いスコアでも関連分子が同定される場合もある。任意のＨＳＰに対するＰ値は、少なくとも高いスコアを有する同じデータベースの配列に対して観察されるＨＳＰの数との予想される発生頻度との関数である。
【００８５】
配列同一性のパーセントは、２或いはそれ以上のアミノ酸配列同士または核酸配列同士を比較して求める。パーセント同一性は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ）の構成要素であるＭＥＧＡＬＩＧＮプログラムを用いて決定することができる。２つのアミノ酸配列間のパーセント類似性は、配列Ａと配列Ｂとの間の一致する残基の合計数を、配列Ａの長さから配列Ａおよび配列Ｂにおけるギャップ残基の数を差引いた数で除し、それに１００を乗じたものである。２つのアミノ酸配列間の相同性の低い或いは相同でないギャップは、配列決定のパーセント同一性の計算には含めないものとする。
【００８６】
保存されたタンパク質モチーフを有する配列は、ＢＬＯＣＫＳ検索プログラムを用いて検索することができる。このプログラムは、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔおよびＰＲＯＳＩＴＥデータベースに含まれている配列情報を分析でき、ゲノム或いはｃＤＮＡ配列から翻訳された特徴付けられていないタンパク質を分類する際に有用である（Ｂａｉｒｏｃｈら （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５ ： ２１７−２２１ ； Ａｔｔｗｏｏｄら （１９９７） Ｊ Ｃｈｅｍ Ｉｎｆ Ｃｏｍｐｕｔ Ｓｃｉ ３７ ： ４１７−４２４）。ＰＲＯＳＩＴＥデータベースは、配列の著しい多様性のためにモチーフを用いた分析では検出されなかった機能的または構造的ドメインを同定するための情報源として有用である。重み付けマトリクスを用いて、一致の偶然の分布の基準を得るべく、これらのドメインをＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベースに対して較正する。
【００８７】
ＰＲＩＮＴＳデータベースをＢＬＩＭＰＳ検索プログラムを用いて検索して、タンパク質ファミリー「フィンガープリント」を得ることができる。ＰＲＩＮＴＳデータベースは、配列アラインメント内の保存されたモチーフのグループを利用して様々なタンパク質ファミリーの特徴的なシグネチャ（ｓｉｇｎａｔｕｔｅ）を作り出すことで、ＰＲＯＳＩＴＥデータベースを補完する。ＢＬＯＣＫＳおよびＰＲＩＮＴＳ分析の場合、局所的類似性のカットオフスコアは、＞１３００で強く、１０００−１３００で暗示的であり、全体の類似性のカットオフスコアは、ｐ＜ｅｘｐ−３であり、強度（相関性の程度）は、＞１３００で強く、１０００−１３００で弱い。
【００８８】
６　ｃＤＮＡクローンの伸長
Ｆ、Ｒ、またはＴとデザインされた配列表の核酸配列のあるものは、元のクローンインサートの好適な断片を、その断片から設計したオリゴヌクレオチドプライマーを用いて伸長して作製した。一方のプライマーは既知の配列の５’の伸長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の配列の３’の伸長を開始するために合成した。開始プライマーは、ＯＬＩＧＯソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ， Ｃａｓｃａｄｅ ＣＯ）またはその他の適当なプログラムを用いて、約２２〜約３０のヌクレオチドの長さ、約５０％以上のＧＣ含量で、約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体を形成するヌクレオチドのストレッチは排除した。
【００８９】
選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いてこの配列を伸長した。２段階以上の伸長が必要な場合は、追加の或いは入れ子状の組みになったプライマーを設計する。
【００９０】
ＰＣＲ法を用いた当分野で周知の方法で、高い忠実度の増幅を得た。ＤＮＡ ＥＮＧＩＮＥ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて９６穴プレートでＰＣＲ法を実施した。反応混合液には、鋳型ＤＮＡ及び２００ ｎｍｏｌの各プライマー、反応緩衝液（Ｍｇ２＋、（ＮＨ４）２ＳＯ４、β−メルカプトエタノールを含む）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）が含まれている。プライマーの組、ＰＣＩ ＡとＰＣＩ Ｂに対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
別法では、プライマーの組、Ｔ７とＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　５７℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
【００９１】
各穴のＤＮＡ濃度は、１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（１×ＴＥに溶解した０．２５％ ｖ／ｖ； （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）） 及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物を、ＤＮＡがその試薬と結合できるように不透明な蛍光計プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）の各穴に分注して決定する。このプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンしてサンプルの蛍光を測定し、ＤＮＡの濃度を定量する。反応混合液の５〜１０μｌのアリコットを１％のアガロースミニゲル上で電気泳動させて分析し、どの反応がより長い配列の伸長に成功したかを決定する。
【００９２】
伸長した配列を脱塩及び濃縮してから３８４穴プレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウィルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）で消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結する前に音波処理または別の方法で切断した。ショットガンシークエンシングのために、消化したヌクレオチドを０．６〜０．８％の濃度のアガロースゲル上で分離させ、断片を切断し、寒天をＡＧＡＲＡＣＥ （Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化した。Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いて伸長したクローンをｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で制限部位の延び出しを処理してから、コンピテント大腸菌細胞に形質転換した。形質転換細胞を抗生物質を含む培地で選択し、それぞれのコロニーを取り出して、ＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の入った３８４穴プレートで、３７℃で一晩培養した。
【００９３】
この細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡを増幅した。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　７２℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６　　７２℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量した。ＤＮＡ回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを２０％のジメチルサルホサイド（ｄｉｍｅｔｈｙｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣエネルギー転移シークエンシングプライマーとＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）若しくはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ ターミネーターキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【００９４】
７　標的ポリヌクレオチドのためのｍＲＮＡ
標的ポリヌクレオチドを準備するためのｍＲＮＡまたは組織は、Ｂｉｏｃｈａｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ （Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ ＣＡ）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ （Ｅｘｅｔｅｒ ＰＡ）、およびＯｎｃｏｒｍｅｄ （Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ ＭＤ）から入手した。ＲＮＡは、上記した抽出プロトコルおよび精製手順で組織サンプルから抽出した。
【００９５】
８　マイクロアレイの準備、標的の標識化、ハイブリダイゼーション分析
基板の準備
プローブポリヌクレオチドは、インサートに隣接したベクター配列に相補的なプライマーを用いてＰＣＲを３０サイクル行って細菌ベクターから増幅し、ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で精製した。精製したポリヌクレオチドを、スライドガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）上に機械的に配置した。このスライドガラスは、０．０５％のアミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で予めコーティングして硬化されたものである。マイクロアレイをＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でＵＶ照射した。
【００９６】
標的の準備
表２に示されているそれぞれのｍＲＮＡを、標準的なプロトコルに従ってｄＣＴＰ−Ｃｙ３またはｄＣＴＰ−Ｃｙ５ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）の存在下でＮＭＬＶ逆転写酵素を用いて逆転写した。３７℃でインキュベートした後、０．５ Ｍ水酸化ナトリウムで反応を停止させ、８５℃にしてＲＮＡを分解した。標的ポリヌクレオチドを、ＣＨＲＯＭＡＳＰＩＮ ３０カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）およびエタノール沈殿で精製した。
【００９７】
ハイブリダイゼーション
Ｃｙ３およびＣｙ５のそれぞれで標識した標的ポリヌクレオチド各０．２ ｍｇを含むハイブリダイゼーション混合液を６５℃に加熱し、ＵＮＩＧＥＭ Ｖマイクロアレイ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）の表面に分注した。このマイクロアレイをカバーガラスで覆い、６０℃でインキュベートした。マイクロアレイを、４５℃、中程度のストリンジェンシーの緩衝液（１ｘＳＳＣおよび０． １％ ＳＤＳ）および高ストリンジェンシーの緩衝液（０．１ｘＳＳＣ）で連続洗浄してから乾燥させた。
【００９８】
検出
共焦点レーザー顕微鏡を用いて、蛍光標識したハイブリダイゼーション複合体を検出した。励起波長は、Ｃｙ３に対しては４８８ ｎｍ、Ｃｙ５に対しては６３２ ｎｍとした。各蛍光体に付き１回スキャンし、それぞれのアレイを２回スキャンした。Ｃｙ３およびＣｙ５の最大発光波長はそれぞれ、５６５ ｎｍおよび６５０ ｎｍとした。発光した光は波長によって、２つの光電子増倍管に分離した。光電子増倍管の出力がディジタル化されてイメージとして表示される。信号の強度が、リニア２０色変換（ｌｉｎｅａｒ ２０ ｃｏｌｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を用いて強い信号を表す赤と弱い信号を表す青で表される。各プローブに対する蛍光信号をまとめて、ＧＥＭＴＯＯＬＳ発現分析ソフトウエア（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いてその信号強度に対応する数値を算出する。
【００９９】
９　データの分析および結果
ＵＮＩＧＥＭ Ｖマイクロアレイ上の７，０７５の遺伝子の内、３，６２７すなわち５１％の遺伝子が３０全てのサンプルにおいて有意なレベルで発現した。信号とバックグラウンドの比率が２．５を超え、かつ両方のプローブに対してハイブリダイゼーション領域が４０％を超えた場合を有意性があるとした。全てのデータを変換して、様々な遺伝子発現値を２を底とする対数で表すようにした。
【０１００】
分散分析（ＡＮＯＶＡ）
それぞれの遺伝子に対して、群の変数として組織の種類を用いてＡＮＯＶＡ分析を行った。既知の種類に属するサンプルにおける測定値がそれらの種類に関連するか否かをＡＮＯＶＡで調べた。ＡＮＯＶＡは、組織種類間の分散（Ｖｂ）と組織種類内の分散（Ｖｗ）とを比較する。ＶｂをＶｗで除した比率（Ｆ比）を、等しい自由度（ＤＦ）の集団を調べるためにＦ分布表と比べ、Ｆ比の確率が得られる。
【０１０１】
ＡＮＯＶＡ計算
【０１０２】
【数１】
2004507206.tif 000002
【０１０３】
ここで、Ｘｉはサンプル個々の値、Ｘｇは種類の平均値、Ｎはサンプルの個数、ｋは種類の数、Ｎｇは種類におけるサンプルの個数、ＸＴは集団の平均値である。
【０１０４】
帰無仮説によれば、サンプル間の測定値のばらつきが偶然の一致のみによる場合、種類内の分布および種類間のばらつきは等しい。従って、遺伝子発現と組織の種類との間に有意な関連がない場合は、ＡＮＯＶＡによって得られる確率は１に等しい。逆に、遺伝子発現と組織の種類との関連性が高い場合は、サンプル間の分散の幅が種類間の分散の幅より著しく大きいため、ＡＮＯＶＡによって得られる確率が小さい。表３に示されている３４０の遺伝子のデータを用いて表４を作成した。表４は、ＡＮＯＶＡ確率値が１０−５以下のアノテーションから選択された各遺伝子を示す。
【０１０５】
遺伝子アノテーション
選択基準を組織種類内の測定値の分散幅の小さいものとしたため（上述）、これらの測定値を要約して各組織種類内の測定値の平均とすることができる。さらに、各遺伝子における組織種類間の差異を強調するために、ある組織の平均と全ての組織の平均との差を計算した。その式および値を表５に示した。
【０１０６】
これらの平均値との差から、平均値との差が最も大きい組織をその遺伝子の第１の関連組織とした。平均値との差が少なくとも１．５以上ある組織をある遺伝子の関連組織とした。可能な場合は、平均値との差が２番目、３番目、および４番目に大きい組織をそれぞれ、第２の関連組織、第３の関連組織、および第４の関連組織とした。
【０１０７】
１０　本ポリヌクレオチドおよび本タンパク質と特異的に結合する分子のスクリーニング
本ポリヌクレオチドまたはそれらの断片、および本タンパク質およびそれらの一部をそれぞれ、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、またはＢＩＯＤＩＰＹまたはＦＩＴＣ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で標識する。基板上に予め配置した候補分子または候補化合物を、標識した核酸またはアミノ酸の存在下でインキュベートする。ポリヌクレオチド若しくはタンパク質の何れかが結合する条件下でインキュベートした後、基板を洗浄し、特異的な結合または複合体の形成を示す標識が残っている基板上の全ての位置をアッセイする。結合した分子は、配置された基板上の位置によって同定される。異なった濃度の核酸またはタンパク質で得たデータを用いて、標識した核酸若しくはタンパク質と分子との親和性を計算する。小容量のアッセイで極めて少量の検査化合物を用いたハイスループットのスクリーニング方法の全てが、Ｂｕｒｂａｕｍ他による米国特許第５，８７６，９４６号に記載されている。
【０１０８】
本明細書で言及した全ての特許および文献は、言及することを以って本明細書の一部とする。当業者であれば、本発明の範囲および概念から逸脱することなく、本発明の上述の方法およびシステムの様々な変更が可能であることを理解できよう。本発明は特定の好適な実施例を用いて説明してきたが、請求の範囲が特定の実施例によって不当に制限されるものではないことを理解されたい。実際に、本発明を実施するために記載した方法の様々な変更は、分子生物学および関連分野の技術者には明白であり、上記の請求の範囲に含まれるものとする。
【０１０９】
（配列表および表の簡単な説明）
本願の開示のある部分は、著作権保護が適用される資料を含む。この著作権の所有者は、米国特許局で閲覧できる特許となった出願書類や記録などの任意の特許書類や特許の開示のＦＡＸによる複製には異論はないが、その他については著作権を行使する。
【０１１０】
配列表は、様々なｃＤＮＡクローンのインサートのシークエンシングおよび伸長によって得たポリヌクレオチドを編集したものである。各配列は、配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ若しくはＳＥＱ ＩＤ）または由来するクローン番号（インサイト社ＩＤ）によって識別される。
【０１１１】
表１の各列は左からそれぞれ、断片の配列識別番号（ＳＥＱ ＩＤ）、およびそのｃＤＮＡ識別番号、伸長したポリヌクレオチドのＳＥＱ ＩＤ、およびそのｃＤＮＡ識別番号、組織名、ＧｅｎＢａｎｋにおける相同ポリヌクレオチドの少なくともある断片に関連する説明を示す。これらの説明は、配列表の配列を用いてＢＬＡＳＴ分析で入手した。
【０１１２】
表２は、ＵＮＩＧＥＭ Ｖマイクロアレイ（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）にハイブリダイズさせるための標的ポリヌクレオチドを作製するために用いたＲＮＡの由来を示す。各列はそれぞれ、各ドナーの分かっている由来番号、組織、年齢、人種／性、死因、病態または疾患を示す。
【０１１３】
表３は、実験に用いた各組織における各クローンのデータを示す。各列は、クローンＩＤおよび由来番号の付いた組織を示す。組織には、心臓、骨格筋、子宮、胃、小腸、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、および脳の組織が含まれる。これらのデータは、ＧＥＭＴＯＯＬＳソフトウエア（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて作成した。
【０１１４】
表４は、データの分散分析（ＡＮＯＶＡ）を表す。各列は、クローンＩＤ、Ｖａｒ． Ｂｅｔｗ（組織間の分散）、Ｖａｒ． Ｗｉｔｈｉｎ（組織内の分散）、Ｆ（値）、および確率が示されている。これらの値は、バッチＡＮＯＶＡ （Ｓｏｋａｌ ａｎｄ Ｒｏｈｌｆ （１９６９） Ｂｉｏｍｅｔｒｙ ； ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ） 及びエクセル９８ ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成した。
【０１１５】
表５は、組織にわたるポリヌクレオチドの細胞特異性および組織特異性を示す。この組織の中には、心臓、骨格筋、子宮、胃、小腸、肺、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、および脳の組織が含まれる。細胞および組織特異的なグループは、平均値｛平均（組織）−平均（セット全体）｝を用いて作成し、グループ分けにはエクセル９８ソフトウエア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）を用いた。
【表１】
2004507206.tif 000003
【表２】
2004507206.tif 000004
【表３】
2004507206.tif 000005
【表４】
2004507206.tif 000006
【表５】
2004507206.tif 000007
【表６】
2004507206.tif 000008
【表７】
2004507206.tif 000009
【表８】
2004507206.tif 000010
【表９】
2004507206.tif 000011
【表１０】
2004507206.tif 000012
【表１１】
2004507206.tif 000013
【表１２】
2004507206.tif 000014
【表１３】
2004507206.tif 000015
【表１４】
2004507206.tif 000016
【表１５】
2004507206.tif 000017
【表１６】
2004507206.tif 000018
【表１７】
2004507206.tif 000019
【表１８】
2004507206.tif 000020
【表１９】
2004507206.tif 000021
【表２０】
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【表２１】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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