(57)【要約】本発明は、定方向進化（ＤｉｒｅｃｔＥｖｏｌｕｔｉｏｎＴＭ）の非確率論的方法を使用することにより、新規のポリヌクレオチドおよびコードされたポリペプチドを取得する方法を提供する。エキソヌクレアーゼ仲介再集合法の特に有利な点は、そうしなければキメラ化の際に問題となるであろう核酸鎖を再集合させるその能力である。エキソヌクレアーゼ仲介再集合法は、本明細書中で提供される他の突然変異誘発法と組合わせて使用することができる。これらの方法には、非確率論的ポリヌクレオチド部位飽和突然変異誘発（Ｇｅｎｅ Ｓｉｔｅ Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＴＭ）と非確率論的ポリヌクレオチド再集合（ＧｅｎｅＲｅａｓｓｅｍｂｌｙＴＭ）が含まれる。本発明は、最適化された物理的および／または生物学的性質をもつ新規酵素を取得する方法を提供する。本発明の方法を用いると、遺伝子ワクチン、酵素、小分子、その他の所望の分子を望ましい性質の方向へと進化させることができる。例えば、遺伝子ワクチンとしての効力が増加しているワクチンベクターが得られる。本方法により得られたベクターは、例えば、抗原発現の増加、細胞への取込みの増加、細胞内安定性の増加、免疫反応を調節する能力などを示し得る。さらに、本発明は、抗生物質、薬物療法およびトランスジェニック形質の分野でさまざまな新規の生物学的活性分子を取得する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
突然変異させた子孫ポリヌクレオチドの作製方法であって、
（ａ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏでエキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製する、
これにより、エキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスは、３’アンダーハングおよび平滑末端に作用する３’エキソヌクレアーゼで処理（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて処理）し、出発二本鎖ポリヌクレオチドから５’末端ではなく３’末端のヌクレオチドを遊離させ、部分的もしくは完全にその元の相手を含まない残った鎖を残存させることにより、非限定的な様式で例示され、所望であれば、残った鎖を、別の相手とのハイブリダイゼーションを達成するために使用することができ、；
これにより、エキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスがさらに、５’アンダーハングに作用する５’エキソヌクレアーゼで処理（例えば、レッドアルファ遺伝子産物を用いて処理）することにより、出発二本鎖ポリヌクレオチドから５’末端のヌクレオチドを遊離させ、部分的もしくは完全にその元の相手を含まない残った鎖を残存させることにより、非限定的な様式で例示され、所望であれば、残った鎖を、別の相手とのハイブリダイゼーションを達成するために使用することができ、；
これにより、エキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスがさらに、ハイブリダイズしていない末端等のオーバーハング末端に作用するエキソヌクレアーゼで処理（例えば、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ ＮｕｃｌｅａｓｅまたはＳ１ヌクレアーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼを用いて処理）することにより、ヘテロ核酸複合体中のアニーリングさせた核酸鎖のハイブリダイズしていない一本鎖末端から末端ヌクレオチドを遊離させ、短くされているがハイブリダイズした末端を残存させることにより処理末端のポリメラーゼに基づく伸長および／またはリガーゼ仲介型連結を促進する、ことにより非限定的な様式で例示され、；
さらにこれにより、エキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスが、例えば、アンダーハング末端もしくは平滑末端から末端ヌクレオチドを遊離させるエキソヌクレアーゼおよびハイブリダイズしていない末端等のオーバーハング末端から末端ヌクレオチドを遊離させるエキソヌクレアーゼの両方を同時ではなく用いることにより実施することができる二重処理によっても例示される；
ことを含んでなる前記方法。
【請求項２】
突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを作製するための請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）（出発または親ポリヌクレオチドのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏでエキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製すること）が、
（ｉ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットを３’アンダーハングおよび平滑末端に作用する３’エキソヌクレアーゼで処理して、５’末端ではなく３’末端のヌクレオチドを遊離させる、
これにより、該３’エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）で処理し、出発二本鎖ポリヌクレオチドから５’末端ではなく３’末端のヌクレオチドを遊離させ、部分的もしくは完全にその元の相手を含まない残った鎖を残存させることにより、非限定的な様式で例示され、所望であれば、残った鎖を別の相手とのハイブリダイゼーションを達成するために使用することができる；
ことからなる前記方法。
【請求項３】
突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを作製するための請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）（出発または親ポリヌクレオチドのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏでエキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製すること）が、
（ｉ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットを５’アンダーハングに作用する５’エキソヌクレアーゼで処理して、５’末端のヌクレオチドを遊離させる、
これにより、該５’エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ（例えば、レッドアルファ遺伝子産物）で処理し、出発二本鎖ポリヌクレオチドから５’末端のヌクレオチドを遊離させ、部分的もしくは完全にその元の相手を含まない残った鎖を残存させることにより、非限定的な様式で例示され、所望であれば、残った鎖を別の相手とのハイブリダイゼーションを達成するために使用することができる；
ことからなる前記方法。
【請求項４】
突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを作製するための請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）（出発または親ポリヌクレオチドのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏでエキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製すること）が、
（ｉ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットをエキソヌクレアーゼ処理に付すことにより、核酸のオーバーハングから末端のヌクレオチドを遊離させる、
これにより、該処理は、ハイブリダイズしていない末端等のオーバーハング末端に作用するエキソヌクレアーゼで処理（例えば、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ ＮｕｃｌｅａｓｅまたはＳ１ヌクレアーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼを用いて処理）することにより、ヘテロ核酸複合体中のアニーリングさせた核酸鎖のハイブリダイズしていない一本鎖末端からヌクレオチドを遊離させ、短くされているがハイブリダイズした末端を残存させることにより処理末端のポリメラーゼに基づく伸長および／またはリガーゼ仲介型連結を促進する、ことにより非限定的な様式で例示される；
ことからなる前記方法。
【請求項５】
突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを作製するための請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）（出発または親ポリヌクレオチドのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏでエキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製すること）が、
（ｉ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットを３’アンダーハングおよび平滑末端に作用する３’エキソヌクレアーゼ処理に付すことにより、５’末端ではなく３’末端のヌクレオチドを遊離させること、および
（ｉｉ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットをエキソヌクレアーゼ処理に付すことにより、核酸のオーバーハングから末端のヌクレオチドを遊離させること、からなり、
これにより、前記エキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスが、例えば、アンダーハング末端もしくは平滑末端から末端ヌクレオチドを遊離させるエキソヌクレアーゼおよびハイブリダイズしていない末端等のオーバーハングから末端ヌクレオチドを遊離させるエキソヌクレアーゼの両方を同時ではなく用いることにより実施することができる二重処理である、前記方法。
【請求項６】
突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを作製するための請求項１に記載の方法であって、前記工程（ａ）（出発または親ポリヌクレオチドのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏでエキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製すること）が、
（ｉ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットを５’アンダーハングに作用する５’エキソヌクレアーゼで処理して、５’末端のヌクレオチドを遊離させること、および
（ｉｉ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットをエキソヌクレアーゼで処理して、核酸のオーバーハングから末端のヌクレオチドを遊離させること、
からなり、
これにより前記エキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスが、例えば、アンダーハング末端もしくは平滑末端から末端ヌクレオチドを遊離させるエキソヌクレアーゼおよびハイブリダイズしていない末端等のオーバーハングから末端ヌクレオチドを遊離させるエキソヌクレアーゼの両方を同時ではなく用いることにより実施することができる二重処理である、前記方法。
【請求項７】
少なくとも１つの所望の特性を有する突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを作製するための方法であって、
（ａ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏでエキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製すること、ならびに
（ｂ）　子孫ポリヌクレオチドのセットを末端選択に基づくスクリーニングおよび富化プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドの所望のサブセットを選択すること、
からなる前記方法であって、
これにより、上記工程は反復して、またどんな順序、組合わせで行うこともでき；
これにより、末端選択に基づくプロセスにより連結に適合する末端を作製し；
これにより、集合および／または再集合的突然変異誘発を達成するために、任意で連結に適合する末端の作製を利用して子孫ポリヌクレオチドのセットのメンバー内での１以上の分子間連結（好ましくは定方向の連結）を促進し、；
これにより、連結に適合する末端作製は子孫ポリヌクレオチドのセットの発現ベクター系への連結および発現クローニングを促進するのに役立ち、；
これにより、前記子孫ポリヌクレオチドのセットの発現クローニングはポリペプチドのセットを生成させるのに役立ち、；
これにより、生成されたポリペプチドのセットを発現スクリーニングプロセスに付すことができ、；そして
これにより、子孫ポリペプチドのセットの発現スクリーニングは、所望の特性（例えば、特異的酵素活性）を有する所望の分子種（例えば、突然変異ポリペプチドまたはポリペプチド断片）を同定する手段を提供する。
【請求項８】
先祖ポリヌクレオチドのコレクションから突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを生成する方法であって、
（ａ）　１本の多結合核酸鎖を２本の単一結合核酸鎖にアニーリングすることにより、アニーリングさせた核酸鎖ヘテロ複合体を生成すること、
ここで１本の多結合核酸鎖および２本の単一結合核酸鎖は、それぞれ前記先祖ポリヌクレオチドのコレクション中の異なる分子種に由来するものであり、；
ここで前記先祖ポリヌクレオチドのコレクションは、好ましくは、デハロゲナーゼをコードする遺伝子のコレクションにより例示されるような、同一ではないが関連する可能性のある複数の子孫ポリヌクレオチドからなり、；
ここで１本の多結合核酸鎖および２本の単一結合核酸鎖は、それぞれそれらが由来する先祖ポリヌクレオチドと同一の、少なくとも７ヌクレオチド長の配列を有し、；
（ｂ）　前記へテロ複合体中のアニーリングさせた単一結合核酸鎖のハイブリダイズしていない一本鎖末端をエキソヌクレアーゼ処理に付すことにより、そのハイブリダイズしていない一本鎖末端を分解すること、
これにより、同一ではないポリヌクレオチドに由来する実施多結合鎖および単一結合鎖のアニールメントにより、その後に前記の同一ではないポリヌクレオチドのキメラ化を生じさせることが可能となり、；
これにより、前記のアニーリングさせた核酸鎖複合体のライブラリー中で、多くの成分鎖はポリメラーゼに基づく伸長をプライミングするには至適でないまたは役に立たない、ハイブリダイズすることができない末端を有し、；そして
これにより、エキソヌクレーゼ処理によりそうしたハイブリダイズできない末端を除去し、アニーリングさせた核酸鎖複合体をポリメラーゼに基づく伸長により適したプライマーに変換する；
ことを含んでなる前記方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、下記ステップ（ｃ）：
（ｃ）　アニーリングさせたヘテロ複合体をポリメラーゼに基づく伸長に付す、
ことをさらに含んでなる、前記方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、下記ステップ（ｄ）：
（ｄ）　アニーリングさせた核酸鎖をリガーゼ処理に付す、
これにより、リガーゼ処理は、２本のアニーリングさせた単一結合鎖間の分子間連結を達成してそれにより共有結合により連結されたキメラ化鎖を形成するために、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ処理に付すことにより例示される；
ことをさらに含んでなる、前記方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、下記ステップ（ｅ）：
（ｅ）　連結した単一結合核酸鎖から多結合核酸鎖を分離する、
これにより、多結合核酸鎖がアニーリングした連結した単一結合核酸鎖からの該多結合核酸鎖の分離は、例えば、変性または多結合核酸鎖に選択的に作用する酵素活性への暴露のいずれかによって達成することができる；
ことをさらに含んでなる、前記方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、下記ステップ（ｆ）：
（ｆ）　連結された単一結合核酸鎖に相補的な核酸鎖を生成する、
これにより、得られる産物は二本鎖の突然変異させた子孫ポリヌクレオチドからなる；
をさらに含んでなる、前記方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法であって、突然変異させた子孫ポリヌクレオチドが遺伝子または遺伝子経路である、前記方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、生成された突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを適切な宿主中で発現させることをさらに含み、ここで前記発現が発現スクリーニングにより検出され得るポリペプチド産物の生成をもたらすものである、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、タンパク質工学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製するための定方向進化法に関する。この方法は、部位特異的突然変異誘発を発生させる工程（場合によってはポリヌクレオチドをキメラ化する工程と組合せる）、末端選択と呼ばれるプロセスなどによって潜在的に望ましい子孫分子を選択する工程（この後、さらにスクリーニングしてもよい）、および有用な特性を有するポリペプチドの製造のためのポリヌクレオチドをスクリーニングする工程を含む。
【０００２】
特定の態様において、本発明は、酵素、特に熱安定性酵素に関し、また定方向進化によるその生成に関する。より詳細には、本発明は、高温で安定であり、また、より低温では改善された活性を有する熱安定性酵素に関する。
【０００３】
発明の背景
自然の多様性の完全な可能性の獲得は、発見のステップと、発見されるものを最適化するステップの双方を含み得る。例えば、発見のステップによって、産業上の利用性を有する生物学的分子を利用することが可能となる。しかし、特定の産業上の必要性のためには、これらの酵素を実験的にさらに修飾して、自然の進化がもたらしたものおよび近い将来にもたらすであろうものを越える特性を達成することが有利である。
【０００４】
望ましい特性の方へ生物学的分子を実験的に修飾する定方向進化と呼ばれるプロセスは、１つ以上の親分子の鋳型を突然変異させ、子孫分子の中で望ましい分子を同定することによって達成することができる。しかし、定方向進化において現在利用できる技術には、いくつかの欠点がある。これらの欠点とは、以下のようなものである：
１）部位特異的突然変異誘発技術（例えば、雑な又は低い忠実度のＰＣＲ）は、ポリペプチド配列に添った各位置（部位）において、完全な（飽和した）範囲の可能な突然変異（すなわち、すべての可能なアミノ酸置換）を体系的に達成するには無効である。
【０００５】
２）ある分子配列および潜在的に莫大な数の子孫分子（１以上の分子鋳型の定方向進化により得られうると考えられるもの）内に含まれうる多量の情報を迅速に分析するための比較的容易な体系的手段は存在しない。
【０００６】
３）分子位置に関する機能と構造とを関連づける包括的な実験的情報を得るための比較的容易な体系的手段は存在しない。
【０００７】
４）特定の突然変異誘発（例えば、キメラ化）法における内部対照（例えば、陽性対照）を取込ませるための容易な体系的手段は存在しない。
【０００８】
５）子孫分子（例えば、完全長キメラ）の特定の一群を、より小さな部分配列から選択するための容易な体系的手段は存在しない。
【０００９】
分子の突然変異は自然に起こり、特定の産業的応用に有用であることが示された多くの生物学的化合物の生成をもたらした。しかし、自然における進化は、多くの満たされない産業上の必要性と相容れない分子の特性を選択してしまうことも多い。さらに、産業上有用な突然変異が、そうでなければ分子レベルで優先される場合、自然進化が、そのような突然変異の正の選択を凌ぐことは、よく認められることである（例えば、全体として生物に対する悪影響を伴う場合、有利な突然変異が、有害な突然変異を伴う場合）。さらにまた、自然進化は遅く、複製において忠実度に高い力点が置かれている。最後に、自然進化は、主として、有益な突然変異によってできた経路を優先するが、多数の連続した負の突然変異を避ける傾向があり、そのような負の突然変異が、組合された場合に有益となりうる場合、または迂回経路を通って有益な最終状態につながりうる場合であっても、そのような傾向が認められる。
【００１０】
一方、定方向進化は、はるかに迅速に生じることが可能であり、自然では得られない産業上望ましい分子特性に進化するように直接的に方向づけられうる。
【００１１】
有用なハイブリッドタンパク質を得るためのタンパク質内のアミノ酸、およびこれらのハイブリッドタンパク質をコードするそれらに対応する生物学的分子（すなわち、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の意図的および無作為な組合せには、非常に多数の可能性が存在する。したがって、所望の用途のための多種多様なそのようなハイブリッドタンパク質（特に、多種多様なランダムタンパク質）を製造しスクリーニングする必要がある。
【００１２】
生物学的高分子（例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、およびポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の両方を含む分子）の活性な配列の複雑性は、その情報量（「ＩＣ」）と称されており、これは、アミノ酸配列の変異に対する該活性タンパク質の抵抗性（同じ機能を有する関連配列のファミリーを表すのに要する不変アミノ酸の最小数（ビット）から計算される）として定義されている。ランダム突然変異誘発に、より感受性であるタンパク質は、高い情報量を有する。
【００１３】
分子ライブラリーなどの分子生物学における成果は、非常に多数の可変塩基の同定を可能にしており、ランダムライブラリーから機能的配列を選択するための方法さえも提供している。そのようなライブラリーにおいては、その場合に補償する変化に応じて、ほとんどの残基が変異しうる（尤も、典型的には、同時にすべてというわけではないが）。したがって、１００アミノ酸のタンパク質は僅か２，０００個の異なる突然変異を含有しうるにすぎないが、２０１００個の配列の組合せが可能である。
【００１４】
情報密度は、配列の単位長さ当たりのＩＣである。酵素の活性部位は高い情報密度を有する傾向にある。これに対して、酵素における情報の柔軟性リンカーは、低い情報密度を有する。
【００１５】
ライブラリー形態において代替タンパク質を作製するために広く用いられている現在の方法は、誤りがちなポリメラーゼ連鎖反応およびカセット突然変異誘発であり、この場合、最適化される特定の領域を、合成的に突然変異誘発されたオリゴヌクレオチドで置換する。どちらの場合も、相当数の突然変異部位が、元の配列内の或る部位の周囲に生じる。
【００１６】
誤りがちなＰＣＲは、長い配列にわたり低レベルの点突然変異をランダムに導入するために低い忠実度の重合条件を用いる。未知配列の断片の混合物中で、誤りがちなＰＣＲを用いて該混合物を突然変異誘発させることができる。公開されている誤りがちなＰＣＲプロトコールは、ポリメラーゼのプロセシビティーの低さが欠点となる。したがって、該プロトコールは、平均的なサイズの遺伝子のランダム突然変異誘発を行なうことができない。そのため、誤りがちなＰＣＲの実際の適用は制限される。連続した劇的な配列進化に要する大規模なひとまとまりの変化が可能となるには、点突然変異誘発のみでは、しばしば余りにも漸進的すぎることが、いくつかのコンピューターシミュレーションから示唆されている。さらに、公開されている誤りがちなＰＣＲプロトコールは、０．５〜１．０ｋｂを越えるＤＮＡ断片を増幅できないため、それらの実際の適用が制限される。また、誤りがちなＰＣＲの反復サイクルは、望ましくない結果（例えば、タンパク質の結合親和性ではなく該タンパク質の免疫原性に対する影響）を有する中立突然変異の蓄積につながりうる。
【００１７】
オリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発においては、短い配列を、合成的に突然変異誘発されたオリゴヌクレオチドで置換する。このアプローチは、隔たった突然変異の組合せを与えないため、複合的（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ）ではない。非常に長い配列長の割にライブラリーサイズが限られていることは、タンパク質を最適化するのに多数のラウンドの選択が避けられないことを意味する。合成オリゴヌクレオチドでの突然変異誘発においては、各選択ラウンド後に個々のクローンを配列決定し、ついでそれらをファミリーに分類し、必要に応じて、単一のファミリーを選択し、それをコンセンサスモチーフに変換することが必要である。そのようなモチーフを再合成し、単一遺伝子内に再挿入し、ついで追加的な選択を行なう。この工程は統計的な障害となり、労働集約的であり、多ラウンドの突然変異誘発には実用的でない。
【００１８】
このように、誤りがちなＰＣＲおよびオリゴヌクレオチド誘導突然変異誘発は、単一サイクルの配列微調整には有用であるが、多サイクルに適用されると急に限定的なものとなる。
【００１９】
誤りがちなＰＣＲのもう１つの制約は、ダウン突然変異（ｄｏｗｎ−ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）の速度が配列の情報量と共に増加することである。情報量、ライブラリーサイズおよび突然変異誘発速度が増加するにつれて、アップ突然変異（ｕｐ−ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）とダウン突然変異との平衡が、さらなる改善の選択を統計的に妨げるであろう（統計的な頭打ち）。
【００２０】
カセット突然変異誘発においては、単一の鋳型の配列のブロックを、典型的には、（部分的に）ランダム化された配列で置換する。したがって、得られうる最大の情報量は、ランダムな配列の数（すなわち、ライブラリーサイズ）により統計的に制限される。これは、現在では最良ではないが長期的にはより大きな潜在性を有する他の配列ファミリーを排除する。
【００２１】
また、合成オリゴヌクレオチドでの突然変異誘発は、各選択ラウンド後に個々のクローンの配列決定を要する。したがって、そのようなアプローチは面倒であり、多ラウンドの突然変異誘発には実用的でない。
【００２２】
したがって、比較的低い情報量の微調整領域には、誤りがちなＰＣＲおよびカセット突然変異誘発が最も適しており、広く用いられている。１つの明らかな例外は、誤りがちなＰＣＲおよび選択による多ラウンドの増幅を用いるランダムライブラリーからのＲＮＡリガーゼリボザイムの選択である。
【００２３】
自然界においては、ほとんどの生物の進化は自然選択および有性生殖により生じる。有性生殖は、選択された個体の子孫における遺伝子の混合および組合せを保証するものである。減数分裂の間に、親由来の相同染色体が互いに整列し、それらの長さに沿った一部が交差し、それにより遺伝物質をランダムに交換する。ＤＮＡのそのような交換またはシャッフリングは、生物がより迅速に進化するのを可能にする。
【００２４】
組換えにおいては、挿入される配列は、相同な環境中で有用であると判明しているものであるため、該挿入配列は、それらが新たな配列内に挿入されたら、尚も相当な情報量を有すると考えられる。
【００２５】
「応用分子進化」（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，「ＡＭＥ」）という用語は、特定の有用な目標に対する進化設計アルゴリズムの応用を意味する。ＡＭＥのための多数の異なるライブラリーフォーマットがポリヌクレオチド、ペプチドおよびタンパク質（ファージ、ｌａｃＩおよびポリソーム）について報告されているが、これらのフォーマットはどれもコンビナトリアルライブラリーを意識的に作製するためのランダム乗換え（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ）による組換えに対応したものではない。
【００２６】
理論的には、１００アミノ酸のタンパク質には２，０００個の異なる単一突然変異体が存在する。しかしながら、１００アミノ酸のタンパク質は２０１００個の可能な配列の組合せを有し、通常の方法で徹底的に検討するには、この数は余りに膨大である。これらの可能な組合せ突然変異のすべての生成およびスクリーニングを可能にする系を開発するのが好都合であろう。
【００２７】
当技術分野における幾人かの研究者は、ファージ系内での発現のための軽鎖抗体遺伝子と重鎖抗体遺伝子との組合せのハイブリッドを作製するために、ｉｎ ｖｉｖｏ部位特異的組換え系を利用している。しかしながら、それらの系は、特定の組換え部位に基づくものであり、それに応じて限定されてしまう。重複伸長およびＰＣＲによる一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）内の抗体ＣＤＲ領域の同時突然変異誘発が報告されている。
【００２８】
他の研究者は、ランダムｉｎ ｖｉｖｏ組換えを用いて多数のハイブリッドの大きな集団を作製する方法を記載している。この方法は、２つの異なるプラスミドライブラリー（各ライブラリーは異なる選択マーカーを有する）の組換えを要する。この方法は、存在する選択マーカーの数に等しい限られた数の組換えに限定されてしまい、選択された配列に結合したマーカー遺伝子の数の直線的増加を伴う。
【００２９】
プラスミド上の相同ではあるが末端切断型である２つの昆虫毒素遺伝子間のｉｎ ｖｉｖｏ組換えが、ハイブリッド遺伝子の製造方法として報告されている。欠損したミスマッチ修復酵素を有する宿主細胞内での実質的にミスマッチしたＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｖｏ組換えによるハイブリッド分子の形成が報告されている。
【００３０】
発明の概要
本発明は、概して、核酸工学、およびそれに対応してコードされる組換えタンパク質工学の分野に関する。さらに具体的には、本発明は、核酸の定方向進化、ならびに、その結果生じる関心のある活性（例えば、関心のある核酸活性および／または特定のタンパク質（特に酵素）の活性）に基づいて進化させた核酸を含むクローンのスクリーニングに関する。
【００３１】
本発明は、概して、１） １つ以上の先祖または親世代の鋳型から、少なくとも１つの点突然変異、付加、欠失および／またはキメラ化を達成するように突然変異を起こしている子孫世代の分子（ポリヌクレオチド配列からなる分子、ポリペプチド配列からなる分子、および一部がポリヌクレオチド配列からなり一部がポリペプチド配列からなる分子を含む）を調製し；２） 該子孫世代の分子を、好ましくはハイスループット法を用いて、少なくとも１つの関心のある特性（酵素活性の向上または安定性の増大または新規な化学療法上の効果など）に関してスクリーニングし；３） 場合により、該親および／または子孫世代の分子に関する構造的および／または機能的な情報を取得および／または分類し；そして、４） 場合により、任意のステップ１）〜３）を繰り返す、方法に関する。
【００３２】
好ましい実施形態において、本発明は、突然変異させた子孫ポリヌクレオチドの作製方法であって、
（ａ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏでエキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製する、
これにより、エキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスは、３’アンダーハングおよび平滑末端に作用する３’エキソヌクレアーゼで処理（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩを用いて処理）し、出発二本鎖ポリヌクレオチドから５’末端ではなく３’末端のヌクレオチドを遊離させ、部分的もしくは完全にその元の相手を含まない残った鎖を残存させることにより、非限定的な様式で例示され、所望であれば、残った鎖を、別の相手とのハイブリダイゼーションを達成するために使用することができ、；
これにより、エキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスがさらに、５’アンダーハングに作用する５’エキソヌクレアーゼで処理（例えば、レッドアルファ遺伝子産物を用いて処理）することにより、出発二本鎖ポリヌクレオチドから５’末端のヌクレオチドを遊離させ、部分的もしくは完全にその元の相手を含まない残った鎖を残存させることにより、非限定的な様式で例示され、所望であれば、残った鎖を、別の相手とのハイブリダイゼーションを達成するために使用することができ、；
これにより、エキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスがさらに、ハイブリダイズしていない末端等のオーバーハング末端に作用するエキソヌクレアーゼで処理（例えば、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ ＮｕｃｌｅａｓｅまたはＳ１ヌクレアーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼを用いて処理）することにより、ヘテロ核酸複合体（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｌｅｘ）中のアニーリングさせた核酸鎖のハイブリダイズしていない一本鎖末端から末端ヌクレオチドを遊離させ、短くされているがハイブリダイズした末端を残存させることにより処理末端のポリメラーゼに基づく伸長および／またはリガーゼ仲介型連結を促進する、ことにより非限定的な様式で例示され、；
さらにこれにより、エキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスが、例えば、アンダーハング末端もしくは平滑末端から末端ヌクレオチドを遊離させるエキソヌクレアーゼおよびハイブリダイズしていない末端等のオーバーハング末端から末端ヌクレオチドを遊離させるエキソヌクレアーゼの両方を同時ではなく用いることにより実施することができる二重処理によっても例示される；
ことを含んでなる前記方法である。
【００３３】
本実施形態の好ましい態様において、本発明は、突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを生成するための方法であって、前記工程（ａ）（出発または親ポリヌクレオチドのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏでエキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製すること）が、
（ｉ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットを３’アンダーハングおよび平滑末端に作用する３’エキソヌクレアーゼで処理して、５’末端ではなく３’末端のヌクレオチドを遊離させる、
これにより、該３’エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）で処理し、出発二本鎖ポリヌクレオチドから５’末端ではなく３’末端のヌクレオチドを遊離させ、部分的もしくは完全にその元の相手を含まない残った鎖を残存させることにより、非限定的な様式で例示され、所望であれば、残った鎖を別の相手とのハイブリダイゼーションを達成するために使用することができる；
からなる前記方法を提供する。
【００３４】
本実施形態の別の好ましい態様において、本発明は、突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを作製するための方法であって、前記工程（ａ）（出発または親ポリヌクレオチドのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏでエキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製すること）が、
（ｉ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットを５’アンダーハングに作用する５’エキソヌクレアーゼで処理して、５’末端のヌクレオチドを遊離させること、
これにより、該５’エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ（例えば、レッドアルファ遺伝子産物）で処理し、出発二本鎖ポリヌクレオチドから５’末端のヌクレオチドを遊離させ、部分的もしくは完全にその元の相手を含まない残った鎖を残存させることにより、非限定的な様式で例示され、所望であれば、残った鎖を別の相手とのハイブリダイゼーションを達成するために使用することができる；
からなる前記方法を提供する。
【００３５】
本実施形態のさらに別の好ましい態様において、本発明は、突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを作製するための方法であって、前記工程（ａ）（出発または親ポリヌクレオチドのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏでエキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製すること）が、
（ｉ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットをエキソヌクレアーゼで処理して、核酸のオーバーハングから末端のヌクレオチドを遊離させること、
これにより、該処理は、ハイブリダイズしていない末端等のオーバーハング末端に作用するエキソヌクレアーゼで処理（例えば、Ｍｕｎｇ Ｂｅａｎ ＮｕｃｌｅａｓｅまたはＳ１ヌクレアーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼを用いて処理）することにより、ヘテロ核酸複合体中のアニーリングさせた核酸鎖のハイブリダイズしていない一本鎖末端からヌクレオチドを遊離させ、短くされているがハイブリダイズした末端を残存させることにより処理末端のポリメラーゼに基づく伸長および／またはリガーゼ仲介型連結を促進する、ことにより非限定的な様式で例示される；
からなる前記方法を提供する。
【００３６】
本実施形態のさらに別の好ましい態様において、本発明は、突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを作製するための方法であって、前記工程（ａ）（出発または親ポリヌクレオチドのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏでエキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製すること）が、
（ｉ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットを３’アンダーハングおよび平滑末端に作用する３’エキソヌクレアーゼで処理して、５’末端ではなく３’末端のヌクレオチドを遊離させること、および
（ｉｉ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットをエキソヌクレアーゼで処理して、核酸のオーバーハングから末端のヌクレオチドを遊離させること、
からなり、
これにより、前記エキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスが、例えば、アンダーハング末端もしくは平滑末端から末端ヌクレオチドを遊離させるエキソヌクレアーゼおよびハイブリダイズしていない末端等のオーバーハングから末端ヌクレオチドを遊離させるエキソヌクレアーゼの両方を同時ではなく用いることにより実施することができる二重処理である、前記方法を提供する。
【００３７】
本実施形態のさらに別の好ましい態様において、本発明は、突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを作製するための方法であって、前記工程（ａ）（出発または親ポリヌクレオチドのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏでエキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製すること）が、
（ｉ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットを５’アンダーハングに作用する５’エキソヌクレアーゼで処理して、５’末端のヌクレオチドを遊離させること、および
（ｉｉ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットをエキソヌクレアーゼで処理して、核酸のオーバーハングから末端のヌクレオチドを遊離させること、
からなり、
これにより、前記エキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスが、例えば、アンダーハング末端もしくは平滑末端から末端ヌクレオチドを遊離させるエキソヌクレアーゼおよびハイブリダイズしていない末端等のオーバーハングから末端ヌクレオチドを遊離させるエキソヌクレアーゼの両方を同時ではなく用いることにより実施することができる二重処理である、前記方法を提供する。
【００３８】
別の好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも１つの所望の特性を有する突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを作製するための方法であって、
（ａ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットをｉｎ ｖｉｔｒｏでエキソヌクレアーゼ仲介再集合プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製し、そして
（ｂ）　子孫ポリヌクレオチドのセットを末端選択に基づくスクリーニングおよび富化プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドの所望のサブセットを選択する、
これにより、上記工程は反復して、またどんな順序、組合わせで行うこともでき；
これにより、末端選択に基づくプロセスにより連結に適合する末端を作製し；
これにより、集合および／または再集合的突然変異誘発を達成するために、任意で連結に適合する末端の作製を利用して子孫ポリヌクレオチドのセットのメンバー内での１以上の分子間連結（好ましくは定方向の連結）を促進し、；
これにより、連結に適合する末端作製は子孫ポリヌクレオチドのセットの発現ベクター系への連結および発現クローニングを促進するのに役立ち、；
これにより、前記子孫ポリヌクレオチドのセットの発現クローニングはポリペプチドのセットを生成させるのに役立ち、；
これにより、生成されたポリペプチドのセットを発現スクリーニングプロセスに付すことができ、；そして
これにより、子孫ポリペプチドのセットの発現スクリーニングは、所望の特性（例えば、特異的酵素活性）を有する所望の分子種（例えば、突然変異ポリペプチドまたはポリペプチド断片）を同定する手段を提供する；
ことからなる前記方法を提供する。
【００３９】
別の好ましい実施形態において、本発明は、先祖ポリヌクレオチドのコレクションから突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを生成する方法であって、
（ａ）　１本の多結合核酸鎖を２本の単一結合核酸鎖にアニーリングすることにより、アニーリングさせた核酸鎖ヘテロ複合体を生成し、
ここで１本の多結合核酸鎖および２本の単一結合核酸鎖は、それぞれ前記先祖ポリヌクレオチドのコレクション中の異なる分子種に由来するものであり、；
ここで前記先祖ポリヌクレオチドのコレクションは、好ましくは、デハロゲナーゼをコードする遺伝子のコレクションにより例示されるような、同一ではないが関連する可能性のある複数の子孫ポリヌクレオチドからなり、；
さらにここで１本の多結合核酸鎖および２本の単一結合核酸鎖は、それぞれそれらが由来する先祖ポリヌクレオチドと同一の、少なくとも７ヌクレオチド長の配列を有し、；
（ｂ）　前記へテロ複合体中のアニーリングさせた単一結合核酸鎖のハイブリダイズしていない一本鎖末端をエキソヌクレアーゼ処理に付すことにより、そのハイブリダイズしていない一本鎖末端を分解する、
これにより、同一ではないポリヌクレオチドに由来する実施多結合鎖および単一結合鎖のアニールメントにより、その後に前記の同一ではないポリヌクレオチドのキメラ化を生じさせることが可能となり、；
これにより、前記のアニーリングさせた核酸鎖複合体のライブラリー中で、多くの成分鎖はポリメラーゼに基づく伸長をプライミングするには至適でないまたは役に立たない、ハイブリダイズすることができない末端を有し、；そして
これにより、エキソヌクレーゼ処理によりそうしたハイブリダイズできない末端を除去し、アニーリングさせた核酸鎖複合体をポリメラーゼに基づく伸長により適したプライマーに変換する；
ことを含んでなる前記方法。
【００４０】
本実施形態の好ましい態様において、本発明は、先祖ポリヌクレオチドのコレクションから突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを生成する方法であって、下記ステップ（ｃ）：
（ｃ）　アニーリングさせたヘテロ複合体をポリメラーゼに基づく伸長に付すこと、
をさらに含んでなる、前記方法を提供する。
【００４１】
本実施形態の別の好ましい態様において、本発明は、先祖ポリヌクレオチドのコレクションから突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを生成する方法であって、下記ステップ（ｄ）：
（ｄ）　アニーリングさせた核酸鎖をリガーゼ処理に付す、
これにより、リガーゼ処理は、２本のアニーリングさせた単一結合鎖間の分子間連結を達成してそれにより共有結合により連結されたキメラ化鎖を形成するために、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ処理に付すことにより例示される；
ことをさらに含んでなる、前記方法を提供する。
【００４２】
本実施形態のさらに別の好ましい態様において、本発明は、先祖ポリヌクレオチドのコレクションから突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを生成する方法であって、下記ステップ（ｅ）：
（ｅ）　連結した単一結合核酸鎖（ｍｏｎｏ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｔｒａｎｄ）から多結合核酸鎖（ｐｏｌｙ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｔｒａｎｄ）を分離する、
これにより、多結合核酸鎖がアニーリングした連結した単一結合核酸鎖からの該多結合核酸鎖の分離は、例えば、変性または多結合核酸鎖に選択的に作用する酵素活性への暴露のいずれかによって達成することができる；
ことをさらに含んでなる、前記方法を提供する。
【００４３】
本実施形態のさらに別の好ましい態様において、本発明は、先祖ポリヌクレオチドのコレクションから突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを生成する方法であって、下記ステップ（ｆ）：
（ｆ）　連結された単一結合核酸鎖に相補的な核酸鎖を生成する、
これにより、得られる産物は二本鎖の突然変異させた子孫ポリヌクレオチドからなる；
ことをさらに含んでなる、前記方法を提供する。
【００４４】
本実施形態のさらに別の好ましい態様において、本発明は、先祖ポリヌクレオチドのコレクションから突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを生成する方法であって、かかる突然変異させた子孫ポリヌクレオチドが遺伝子または遺伝子経路である前記方法を提供する。
【００４５】
本実施形態のさらに別の好ましい態様において、本発明は、先祖ポリヌクレオチドのコレクションから突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを生成する方法であって、生成された突然変異させた子孫ポリヌクレオチドを適切な宿主中で発現させることをさらに含み、ここで前記発現が発現スクリーニングにより検出され得るポリペプチド産物の生成をもたらすものである前記方法を提供する。
【００４６】
好ましい実施形態において、（例えば、親ポリヌクレオチド鋳型から）−「コドン部位飽和突然変異誘発」と名付けられたものにおいて−子孫世代のポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドの各々が、全てのコドン（または、同一のアミノ酸をコードする縮重コドンの全てのファミリー）が各コドン位置に呈示されるように、少なくとも１セットで３つ以下の隣接する点突然変異（すなわち、新規なコドンを含む異なる塩基）を有する、該子孫世代のポリヌクレオチドが生成される。この子孫世代のポリヌクレオチドに対応して−およびこの子孫世代のポリヌクレオチドによりコードされるものとして−、それぞれが少なくとも１つの単一アミノ酸点突然変異を有する子孫ポリペプチドが１セット生成される。好ましい態様において、−「アミノ酸部位飽和突然変異誘発」と名付けられたものにおいて−該ポリペプチドに沿った各および全てのアミノ酸位置に、１９種の天然にコードされるポリペプチド形成α−アミノ酸置換の各々に対して１つの突然変異ポリペプチドがもたらされる。これにより、−該親ポリペプチドに沿った各および全てのアミノ酸位置において−元々のアミノ酸を含む全部で２０種の異なる子孫ポリペプチド、または該２０種の天然にコードされるアミノ酸の代わりに、もしくはそれに加えて別のアミノ酸が用いられた場合には、２１種より多い異なる子孫ポリペプチドが得られることもある。
【００４７】
したがって、別の態様において、この方法はまたは、−上記２０種の天然にコードされるポリペプチド形成α−アミノ酸に加えて、および／またはそれらと組合せて−他の稀な、および／または天然にコードされないアミノ酸およびアミノ酸誘導体をふくむ突然変異体を生成するのに用い得る。さらに別の態様において、この方法はまた、（例えば、１つ以上の改変ｔＲＮＡ分子を有する宿主細胞内で）−好適な宿主の天然または未改変のコドン認識系に加えて、および／またはそれらと組合せて−改変コドン認識系、突然変異コドン認識系および／または設計コドン認識系を用いることにより、突然変異体を生成するのにも用い得る。
【００４８】
さらに別の態様において、本発明は、組換え、さらに詳細には、部分的に相同な領域を含むポリヌクレオチド配列のｉｎ ｖｉｖｏ再組合せ（ｒｅ−ａｓｓｏｒｔｍｅｎｔ）の方法によりポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを再集合させて少なくとも１つのポリヌクレオチドを形成し、該ポリヌクレオチドを、有用な特性を有するポリペプチドの生成に関してスクリーニングする方法に関する。
【００４９】
さらに別の好ましい実施形態において、本発明は、達成される任意の突然変異的変化（特に飽和突然変異誘発を含む）の効果を−任意の分子特性（例、酵素活性）または現行の技法により可能な特性の組合せについて−分析および分類するのに用い得る。したがって、親ポリペプチド中の各アミノ酸を少なくとも１９種の可能性のある置換物の各々に変える効果を調べるための包括的な方法が提供される。このことにより、親ポリペプチド中の各アミノ酸が、該ポリペプチドの測定可能な特性に及ぼす潜在的効果の範囲にしたがって、特性決定でき、そして分類できるようになる。
【００５０】
別の態様において、本発明の方法は、分子同士を再結合させ、ならびに／または配列の複雑度および相同領域を有する反復配列もしくは連続配列の程度を低下させる減少性プロセス（ｒｅｄｕｃｔｉｖｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）を仲介する、という細胞の生来の特性を利用する。
【００５１】
本発明の目的とするところは、増大した活性を有する生物学的に活性なハイブリッドポリペプチドをコードするハイブリッドポリヌクレオチドを生成する方法を提供することである。本発明の１つの態様によれば、これらおよび他の目的を達成する上で、ポリヌクレオチドを適切な宿主細胞に導入し、ハイブリッドポリヌクレオチドを生成する条件下で該宿主細胞を増殖させるための方法が提供されている。
【００５２】
本発明の別の態様において、本発明は、ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされる生物学的に活性なハイブリッドポリペプチドをスクリーニングするための方法を提供する。この方法は、増大した生物学的活性を有する生物学的に活性なハイブリッドポリペプチドの同定を可能にする。
【００５３】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から当業者には明らかとなろう。しかしながら、以下の詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示してはいるが、これらは単に例示目的で与えられるものである。何故なら、本発明の思想および範囲内の種々の変更および変形は、本明細書中の詳細な記載から当業者には明らかとなるからである。
【００５４】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの所望の特性を有する子孫ポリヌクレオチドのライブラリーを作製し単離するための方法であって、
（ａ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットを突然変異誘発プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製し、そして
（ｂ）　この子孫ポリヌクレオチドのセットを末端選択に基づくスクリーニングおよび富化プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドの所望のサブセットを選択する、
これにより、上記工程は反復して、またどんな順序、組合わせで行うこともでき；
これにより、末端選択に基づくプロセスにより連結に適合する末端を作製し；
これにより、集合および／または再集合的突然変異誘発を達成するために、任意で連結に適合する末端の作製を利用して子孫ポリヌクレオチドのセットのメンバー内での１以上の分子間連結（好ましくは定方向の連結）を促進し、；
これにより、連結に適合する末端作製は子孫ポリヌクレオチドのセットの発現ベクター系への連結および発現クローニングを促進するのに役立ち、；
これにより、末端選択に基づくスクリーニングおよび富化プロセスにより、突然変異誘発プロセス（例えば、非確率論的ポリヌクレオチド部位飽和突然変異誘発（Ｇｅｎｅ Ｓｉｔｅ Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＴＭ）および非確率論的ポリヌクレオチド再集合（ＧｅｎｅＲｅａｓｓｅｍｂｌｙＴＭ））により生成した子孫ポリヌクレオチドのライブラリーを作製することが可能となり、；
これにより、前記子孫ポリヌクレオチドのセットの発現クローニングは全長ポリペプチドのセットを生成するのに役立ち、；
これにより、生成されたポリペプチドのセットを発現スクリーニングプロセスに付すことができ、；そして
これにより、子孫ポリペプチドのセットの発現スクリーニングは、所望の特性（例えば、特異的酵素活性）を有する所望の分子種（例えば、突然変異ポリペプチドまたはポリペプチド断片）を同定する手段を提供する；
ことからなる前記方法を提供する。
【００５５】
別の特定の実施形態において、本発明は、少なくとも１つの所望の特性を有する子孫ポリヌクレオチドのライブラリーを作製し単離するための方法であって、
（ａ）　出発または親ポリヌクレオチドのセットを突然変異誘発プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドのセットを作製し、そして
（ｂ）　この子孫ポリヌクレオチドのセットを末端選択に基づくスクリーニングおよび富化プロセスに付すことにより、子孫ポリヌクレオチドの所望のサブセットを選択する、
これにより、上記ステップは反復して、またどんな順序、組合わせで行うこともでき；
これにより、末端選択に基づくプロセスにより連結に適合する末端を作製し；
これにより、集合および／または再集合的突然変異誘発を達成するために、任意で連結に適合する末端の作製を利用して子孫ポリヌクレオチドのセットのメンバー内での１以上の分子間連結（好ましくは定方向の連結）を促進し、；
これにより、末端選択に基づくスクリーニングおよび富化プロセスにより、突然変異誘発プロセス（例えば、非確率論的ポリヌクレオチド部位飽和突然変異誘発（Ｇｅｎｅ Ｓｉｔｅ Ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ ＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＴＭ）および非確率論的ポリヌクレオチド再集合（ＧｅｎｅＲｅａｓｓｅｍｂｌｙＴＭ））により生成した子孫ポリヌクレオチドのライブラリーを作製することが可能となり、；
これにより、前記子孫ポリヌクレオチドのセットの発現クローニングは全長ポリペプチドのセットを生成するのに役立ち、；
これにより、連結に適合する末端作製は子孫ポリヌクレオチドのセットの発現ベクター系への連結および発現クローニングを促進するのに役立ち、；
これにより、生成されたポリペプチドのセットを発現スクリーニングプロセスに付すことができ、；そして
これにより、子孫ポリペプチドのセットの発現スクリーニングは、所望の特性（例えば、特異的酵素活性）を有する所望の分子種（例えば、突然変異ポリペプチドまたはポリペプチド断片）を同定する手段を提供する；
ことからなる前記方法を提供する。
【００５６】
本実施形態の特定の態様において、本発明は、先に記載した方法であって、ステップ（ａ）の突然変異誘発プロセスが、コドン含有親ポリペプチド鋳型から単一のアミノ酸置換の全範囲が各アミノ酸の位置で表される子孫ポリペプチドのセットを生成するための飽和突然変異誘発と称されるプロセスからなり、
（ａ）　実施コドン含有鋳型ポリヌクレオチドを、突然変異を起こそうとする各コドンのための縮重オリゴヌクレオチドを用いてポリメラーゼに基づく増幅に付すことにより子孫ポリヌクレオチドのセットを生成し、ここで、縮重オリゴヌクレオチドのそれぞれは第１相同配列と縮重トリプレット配列とからなり、
ここで縮重トリプレット配列はｉ）Ｎ，Ｎ，Ｎ、ｉｉ）Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ、ｉｉｉ）Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｃ、ｉｖ）Ｎ，Ｎ，Ｃ／Ｇ／Ｔ、ｖ）Ｎ，Ｎ，Ａ／Ｇ／Ｔ、ｖｉ）Ｎ，Ｎ，Ａ／Ｃ／Ｔ、ｖｉｉ）Ｎ，Ｎ，Ａ／Ｃ／Ｇ、およびｖｉｉｉ）全２０種のアミノ酸をコードする任意の縮重コドンよりなる群から選択され、そして
ｂ）　子孫ポリヌクレオチドのセットを組換え発現に付すことにより、該子孫ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを産生させる、
ことを含んでなり、
これにより、前記ステップは、反復して、またどんな順序、組合わせで行うこともでき、そして
これにより、トリプレット配列の縮重は全２０種のアミノ酸のコドンを含むことから、前記方法は親ポリペプチド鋳型に沿った各アミノ酸部位に全２０種のアミノ酸の変化をもたらす手段を提供する。
【００５７】
本実施形態の特定の態様において、本発明はさらに、先に記載した方法であって、ステップ（ａ）の突然変異誘発プロセスが合成連結遺伝子再集合または単純合成連結遺伝子再集合と称されるプロセスからなる前記方法を提供する。
【００５８】
用語の定義
本明細書に記載した実施例の理解を容易にするために、一定の頻繁に用いられる方法および／または用語を説明する。
【００５９】
「作用物質（ａｇｅｎｔ）」という用語は、本明細書で用いられる場合、化合物、化合物の混合物、空間的に局在化した化合物のアレイ（例えば、ＶＬＳＩＰＳペプチドアレイ）、ポリヌクレオチドアレイ、および／またはコンビナトリアル小分子アレイ）、生物学的巨大分子、バクテリオファージペプチド展示ライブラリー、バクテリオファージ抗体（例えばｓｃＦｖ）展示ライブラリー、ポリソームペプチド展示ライブラリー、または生物材料、例えば細菌細胞、植物細胞、真菌細胞、または動物（特に哺乳動物）細胞または組織などからの抽出物を示すものである。作用物質は、下記のスクリーニングアッセイに組み込まれることにより、抗腫瘍剤、抗炎症剤またはアポトーシスモジュレーターとしての潜在的な活性について評価される。作用物質は、下記のスクリーニングアッセイに組み込まれることにより、特異的なタンパク質相互作用インヒビター（すなわち、２つの所定のポリペプチド間の結合相互作用を選択的に阻害するが、実質的に細胞生存を妨害しない作用物質）としての潜在的な活性について評価される。
【００６０】
制限部位における「多義的塩基要求（ａｍｂｉｇｕｏｕｓ ｂａｓｅ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ）」とは、完全に指定されていない、すなわち、１つの特定の塩基（例えば、限定するものではないが、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴから選択される特定の塩基など）ではなく、少なくとも２個以上の塩基のうちのいずれか１つであり得るヌクレオチド塩基要求を意味する。当技術分野および本明細書で塩基の多義性を示すために用いられる一般に許容されている略語は下記のとおりである：Ｒ＝ＧまたはＡ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｋ＝ＧまたはＴ；Ｓ＝ＧまたはＣ；Ｗ＝ＡまたはＴ；Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ；Ｂ＝ＧまたはＴまたはＣ；Ｖ＝ＧまたはＣまたはＡ；Ｄ＝ＧまたはＡまたはＴ；Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ。
【００６１】
「アミノ酸」という用語は、本明細書で用いる場合、アミノ基（−ＮＨ２）およびカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を、好ましくは遊離基としてあるいは縮合後にペプチド結合の一部として含む任意の有機化合物を意味する。「天然でコード化されたポリペプチドを形成する２０種のα−アミノ酸」は当技術分野で知られており、アラニン（ａｌａまたはＡ）、アルギニン（ａｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ａｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ａｓｐまたはＤ）、システイン（ｃｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ｇｌｕまたはＥ）、グルタミン（ｇｌｎまたはＱ）、グリシン（ｇｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ｈｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ｉｌｅまたはＩ）、ロイシン（ｌｅｕまたはＬ）、リシン（ｌｙｓまたはＫ）、メチオニン（ｍｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ｐｈｅまたはＦ）、プロリン（ｐｒｏまたはＰ）、セリン（ｓｅｒまたはＳ）、トレオニン（ｔｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ｔｒｐまたはＷ）、チロシン（ｔｙｒまたはＹ）、およびバリン（ｖａｌまたはＶ）を意味する。
【００６２】
「増幅」という用語は、ポリヌクレオチドのコピー数が増大することを意味する。
【００６３】
「抗体」という用語は、本明細書で用いる場合、完全な状態の免疫グロブリン分子、ならびにＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ＦｖおよびＳＣＡフラグメントなどの抗原のエピトープに対して結合能を有する免疫グロブリン分子のフラグメントを意味する。これらの抗体フラグメントは、該フラグメントの由来である抗体の抗原（例えばポリペプチド抗原）に選択的に結合するある程度の能力を維持しており、当技術分野で公知の方法を用いて作製できる（例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ， 前掲を参照）。該フラグメントは、さらに下記のように説明される。
【００６４】
（１） Ｆａｂフラグメントは抗体分子の１価抗原結合フラグメントからなり、パパイン酵素により抗体分子全体を消化し、完全な状態のＬ鎖と、Ｈ鎖の一部分とからなるフラグメントを得ることにより作製し得る。
【００６５】
（２） 抗体分子のＦａｂ’フラグメントは、抗体分子全体をペプシンで処理した後に還元し、完全な状態のＬ鎖とＨ鎖の一部分とからなる分子を得ることにより取得できる。この方法で処理した抗体分子１分子当たり２つのＦａｂ’フラグメントが得られる。
【００６６】
（３） 抗体の（Ｆａｂ’）２フラグメントは、抗体分子全体をペプシン酵素で処理し、その後還元を行わないことにより取得できる。（Ｆａｂ’）２フラグメントは、２個のジスルフィド結合で互いに拘束された２つのＦａｂ’フラグメントからなる二量体である。
【００６７】
（４） Ｆｖフラグメントは、２本の鎖として発現されるＬ鎖の可変領域とＨ鎖の可変領域を含む遺伝子工学的に操作されたフラグメントと定義される。
【００６８】
（５） １本鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、適当なフレキシブルなポリペプチドリンカーで連結されたＬ鎖の可変領域とＨ鎖の可変領域とを含む遺伝子工学的に操作された１本鎖分子である。
【００６９】
「キメラ特性」を有する分子は、１） 第１の参照分子に部分的に相同であり、部分的に非相同であり；２） それと同時に第２の参照分子に部分的に相同であり、部分的に非相同であり；３） それと同時にさらに１個以上の追加の参照分子に部分的に相同であり、部分的に非相同である可能性を排除するものではない分子である。ある非限定的な実施形態では、キメラ分子は、部分分子配列の再組合わせを構築することにより調製し得る。ある非限定的な態様では、キメラポリヌクレオチド分子は、複数の分子鋳型を用いてキメラポリヌクレオチドを合成することにより調製することができ、その結果得られたキメラポリヌクレオチドは、複数の鋳型の特性を有している。
【００７０】
「同族」という用語は、本明細書で用いる場合、種間で進化的かつ機能的に関連付けられる遺伝子配列を意味する。例えば、限定するものではないが、ヒトゲノムにおいては、ヒトＣＤ４遺伝子はマウス３ｄ４遺伝子に対する同族遺伝子である。なぜなら、これらの２つの遺伝子の配列および構造はそれらがかなり相同性が高いということを示しており、そしてそれらの遺伝子は両方ともＭＨＣクラスＩＩ拘束性抗原認識によるＴ細胞活性化のシグナル伝達において機能するタンパク質をコードしているからである。
【００７１】
「比較ウィンドウ」とは、本明細書で用いる場合、少なくとも２０個の連続したヌクレオチド位置の概念的なセグメントを意味し、ここで１つのポリヌクレオチド配列は、少なくとも２０個の連続したヌクレオチドからなる参照配列と比較され得るものであって、比較ウィンドウに含まれる該ポリヌクレオチド配列の一部は、それらの２つの配列の最適アラインメントでは参照配列（これは付加または欠失を含まない）と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）が２０パーセント以下であり得る。比較ウィンドウをアラインメントするための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈの局所的相同アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ， １９８１； ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ， Ｊ Ｔｅｏｒ Ｂｉｏｌ， １９８１； ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ， Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ， １９８１； Ｓｍｉｔｈら， Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ， １９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎの相同アラインメントアルゴリズム（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｃｓｃｈ， １９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎの類似性サーチ方法（ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ， １９８８）、これらのアルゴリズムのコンピュータインプリメンテーション（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ））、または検査によって行うことができ、種々の方法によって作製された中での最適アラインメント（すなわち比較ウィンドウ全体にわたって最大パーセンテージの相同性が得られる）が選択される。
【００７２】
本明細書で用いる場合、「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」という用語は、例えば、一般に超可変領域またはハイパー可変ループとしても知られているＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａらのＣＤＲの定義（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ， １９８７； Ｃｌｏｔｈｉａら， １９８９； Ｋａｂａｔら， １９８７；およびＴｒａｍｏｎｔａｎｏら， １９９０）に例示される当技術分野で認められている用語を意味する。可変領域ドメインは、一般に、天然免疫グロブリン鎖（例えばアミノ酸１〜１１０）のアミノ末端側の約１０５〜１１５アミノ酸を含むが、幾分短いかまたは長い可変ドメインも、１本鎖抗体を形成するのに適している。
【００７３】
「保存的アミノ酸置換」とは、類似の側鎖を有する残基による互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリシン、アルギンンおよびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００７４】
「〜に対応する」という用語は、本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部に相同（すなわち同一であるが、厳密には進化的に近縁でない）であるか、あるいはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列と同一であることを意味する。一方、「〜に相補的な」という用語は、本明細書で用いる場合、相補配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部または一部に相同であることを意味する。例を挙げると、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００７５】
「分解有効量」という用語は、酵素と接触していない基質と比較して、基質の少なくとも５０％を処理するのに必要な酵素の量を意味する。好ましくは、基質の少なくとも８０％が分解される。
【００７６】
本明細書で用いる場合、「確定配列フレームワーク」という用語は、非ランダムな基準に基づいて、一般には実験データまたは構造データに基づいて選択される確定配列のセットを意味し、例えば、確定配列フレームワークは、β−シート構造を形成すると予測されるアミノ酸配列のセット、または、特に、ロイシンジッパーヘプタッドリピートモチーフ、ジンクフィンガードメインを含み得る。「確定配列の核（ｋｅｒｎａｌ）」は、限定された多様性を含む配列のセットである。（１） ２０個の通常アミノ酸からなる完全にランダムな１０マー配列は、（２０）１０個の配列のうちのいずれかであり得るものであり、そして（２） ２０個の通常アミノ酸からなる擬似ランダムな１０マー配列は、（２０）１０個の配列のうちのいずれかであり得るが、特定の位置および／または全体における特定の残基に対して偏りがあるのに対して、（３） 確定配列の核は、各残基位置が許容できる２０個の通常のアミノ酸（および／または許容できる通常とは異なるアミノ／イミノ酸）のいずれかであり得る場合の配列の部分集合である。確定配列の核は、一般に、個々の選択されたライブラリーのメンバー配列の一部または全長にわたって、可変および不変の残基位置、および／またはアミノ酸残基の確定された部分集合から選択される残基を含み得る可変の残基位置などを含む。確定配列の核は、アミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、例示するものであって限定するものではないが、配列（ＮＮＫ）１０および（ＮＮＭ）１０（ここで、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣであり、ＫはＧまたはＴであり、ＭはＡまたはＣである）が確定配列の核である。
【００７７】
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ中の特定の配列にのみ作用する制限酵素によるＤＮＡの触媒的切断を意味する。本明細書で用いられる種々の制限酵素は市販されており、その反応条件、補因子およびその他の必要条件は、当業者に知られているように使用される。分析目的の場合、一般に、１μｇのプラスミドまたはＤＮＡ断片が約２単位の酵素とともに約２０μｌのバッファー溶液中で用いられる。プラスミド構築用のＤＮＡ断片を単離する目的の場合、一般に、５〜５０μｇのＤＮＡが２０〜２５０単位の酵素で大容量にて消化される。特定の制限酵素に適したバッファーおよび基質の量は、製造業者により指定されている。通常、インキュベーション時間は３７℃にて約１時間であるが、供給元の取り扱い説明書により様々であり得る。消化後、反応物を直接ゲル上で電気泳動させて所望の断片を単離する。
【００７８】
「指向性ライゲーション」とは、ポリヌクレオチドの５’末端と３’末端が、好ましいライゲーションの向きを指定するのに十分なほど相違しているライゲーションを意味する。例えば、２つの平滑末端を有する、特に処理および消化を行っていないＰＣＲ産物は、一般に、そのマルチクローニング部位に平滑末端をもたらすように消化されたクローニングベクターにライゲートする場合、好ましいライゲーションの方向性をもたず、よって、一般には指向性ライゲーションはこれらの状況下では呈示されない。これとは対照的に、５’ＥｃｏＲＩ−処理末端および３’ＢａｍＨＩ処理末端を有する消化されたＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化したマルチクローニング部位を有するクローニングベクターにライゲートする場合、一般に指向性ライゲーションが呈示される。
【００７９】
「ＤＮＡシャッフリング」という用語は、本明細書で用いる場合、実質的に相同であるが同一でない配列間の組換えを示すものであり、いくつかの実施形態では、ＤＮＡシャッフリングは、ｃｅｒ／ｌｏｘおよび／またはｆｌｐ／ｆｒｔ系などの非相同的組換えによる乗換えを含み得る。
【００８０】
本発明で用いる場合、「エピトープ」という用語は、フィターゼペプチドなどの抗原の抗原決定基を意味し、これにフィターゼ特異的抗体などの抗体のパラトープが結合する。抗原決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面配置からなり、特異的な三次元構造特性ならびに特異的な荷電特性を有し得る。本明細書で用いる場合、「エピトープ」とは、抗体の可変領域結合部と相互作用する結合相互作用の形成能を有する抗原またはその他の巨大分子の一部を意味する。一般に、そのような結合相互作用は、ＣＤＲの１個以上のアミノ酸残基との分子間接触として現れる。
【００８１】
「断片」、「誘導体」および「類似体」という用語は、参照ポリペプチドを意味する場合、参照ポリペプチドと少なくとも本質的に同一の少なくとも１つの生物学的機能または活性を保持するポリペプチドを含む。さらに、「断片」、「誘導体」または「類似体」という用語は、切断によって改変して有意に高い活性を有する成熟酵素を生産し得る低活性プロタンパク質などの「プロ型」分子で例示される。
【００８２】
本発明は、鋳型ポリペプチドから、「単一アミノ酸置換の全レンジ」が各アミノ酸位置に呈示される子孫ポリペプチドのセットを取得する方法を提供する。本明細書で用いる場合、「単一アミノ酸置換の全レンジ」とは、本明細書で記載したように、天然でコードされているポリペプチドを形成する２０個のα−アミノ酸に関するものである。
【００８３】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味し、コード領域の前後の領域（リーダーおよびトレーラー）ならびに個々のコードセグメント（エキソン）間の介在配列（イントロン）を含む。
【００８４】
「遺伝子の不安定性」とは、本明細書で用いる場合、反復性の高い配列が一般に反復配列の欠落による配列の単純化を伴う短縮事象のプロセスにより欠落される自然的傾向を意味する。欠失は、１つの反復配列の１つのコピーの欠落および反復配列間の全ての欠落を伴う傾向がある。
【００８５】
「非相同」という用語は、１つの１本鎖核酸配列が別の１本鎖核酸配列またはその相補配列にハイブリダイズすることができないことを意味する。したがって、非相同の領域とは、ポリヌクレオチドの領域またはポリヌクレオチドが、その配列内に、別の核酸またはポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができない領域を有することを意味する。そのような領域は、例えば、突然変異の領域である。
【００８６】
「相同」または「同祖」という用語は、１つの１本鎖核酸配列が相補的な１本鎖核酸配列にハイブリダイズしうることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量、ならびに後に述べるような温度および塩濃度などのハイブリダイゼーション条件を含む多くの要因に依存し得る。好ましくは、同一性の領域は、約５ｂｐよりも大きく、より好ましくは同一性の領域は１０ｂｐよりも大きい。
【００８７】
免疫グロブリンのＬまたはＨ鎖可変領域は、ＣＤＲとも呼ばれる、３つの超可変領域によって分断された「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域の範囲およびＣＤＲは正確に確定されており、”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”（Ｋａｂａｔら， １９８７）を参照されたい。種々のＬまたはＨ鎖のフレームワーク領域の配列は、同種において比較的保存されている。本明細書で用いる場合、「ヒトフレームワーク領域」は、天然ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域に実質的に同一（約８５以上、通常９０〜９５以上）のフレームワーク領域である。抗体のフレームワーク領域、すなわち構成成分のＬ鎖とＨ鎖を組み合わせたフレームワーク領域は、ＣＤＲの位置決めおよびアラインメントに用いられる。ＣＤＲは、主に抗原のエピトープへの結合を担う。
【００８８】
本発明の利点は「産業上の用途」（または産業上のプロセス）にも及ぶ。この用語は、商業的産業そのもの（または単純な産業）ならびに非商業的な産業上の用途（例えば非営利組織における生物医学的研究）における用途を含むものとして用いられる。関連用途としては、診断、医薬、農業、製造業および学術の分野における用途が挙げられる。
【００８９】
「同一の」または「同一性」という用語は、２つの核酸配列が同一配列または相補配列を有することを意味する。したがって、「同一性領域」とは、ポリヌクレオチドのある領域またはポリヌクレオチド全体が別のポリヌクレオチドのある領域または該ポリヌクレオチドと同一または相補的であることを意味する。
【００９０】
「単離された」という用語は、その最初の環境（例えば天然物である場合にはその天然の環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然ポリヌクレオチドまたは酵素は単離されていないが、天然系に共存している物質のいくつかまたは全てから分離された同ポリヌクレオチドまたは酵素は単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよく、および／またはそのようなポリヌクレオチドもしくは酵素は、組成物（ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）の一部であってもよい。さらに、そのようなベクターまたは組成物がその天然環境の一部ではない場合に単離されるものであってよい。
【００９１】
「単離された核酸」とは、その由来の生物の天然ゲノム中に存在する場合には通常直ぐ隣接している５’および３’隣接配列と隣接していない核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。したがって、この用語は、例えば、ベクター、例えばプラスミドまたはウイルスベクターなどに組み込まれている核酸；異種細胞のゲノム（または同種細胞のゲノムの場合には天然部位とは異なる部位）に組み込まれている核酸；ならびに分離分子、例えばＰＣＲ増幅または制限酵素消化によって産生されたＤＮＡ断片またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって産生されたＲＮＡ分子として存在する核酸を記述するものである。またこの用語は、例えば、融合タンパク質の産生に用いることができる別のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部を形成する組換え核酸も記述するものである。
【００９２】
本明細書で用いる場合、「リガンド」とは、特定のレセプターによって認識される、ランダムペプチドまたは可変セグメント配列などの分子を意味する。当業者には理解されるように、分子（または巨大分子複合体）はレセプターでもリガンドでもあり得る。一般に、より小さい分子量の結合パートナーはリガンドと呼ばれ、より大きい分子量の結合パートナーはレセプターと呼ばれる。
【００９３】
「ライゲーション」とは、２つの２本鎖核酸断片間にホスホジエステル結合を形成させるプロセスを意味する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８２， ｐ．１４６； Ｓａｍｂｒｏｏｋ， １９８９）。特に示さない限り、ライゲーションは、公知のバッファーを用い、ライゲートされるＤＮＡ断片をほぼ等モル量で含む０．５μｇに対しＴ４ ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）を１０単位という条件を用いて行うことができる。
【００９４】
本明細書で用いる場合、「リンカー」または「スペーサー」とは、２つの分子、例えばＤＮＡ結合タンパク質とランダムペプチドを連結する分子または分子のグループを意味し、２つの分子を好ましい立体配置で、例えばランダムペプチドがＤＮＡ結合タンパク質に起因する立体障害が最小になるようにレセプターに結合し得るように配置させるのに役立つ。
【００９５】
「進化させるべき分子特性」とは、本明細書で用いる場合、ポリヌクレオチド配列から構成される分子、ポリペプチド配列から構成される分子、一部にポリヌクレオチド配列を含み、一部にポリペプチド配列を含む分子に関するものを含む。特に関連のある（ただし限定するものではない）進化させるべき分子特性の例としては、特定の条件、例えば温度、塩度、圧力、ｐＨならびにグリセロール、ＤＭＳＯ、界面活性剤および／または反応環境下で接触させる任意のその他の分子種の濃度などの条件における酵素活性が挙げられる。進化させるべき分子特性の特に関連のある（ただし限定するものではない）別の例としては、安定性、例えば、貯蔵中に発生し得るような特定の環境に一定時間曝された後に存在する残留する分子特性の量が挙げられる。
【００９６】
「突然変異」という用語は、野生型核酸配列の配列内の変化またはペプチドの配列内の変化を意味する。そのような突然変異は、トランジションまたはトランスバージョンなどの点突然変異であり得る。該突然変異は、欠失、挿入または重複であり得る。
【００９７】
本明細書で用いる場合、縮重「Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ」ヌクレオチド配列は３２個のトリプレットが考えられることを示す（ここで、「Ｎ」はＡ、Ｃ、ＧまたはＴであり得る）。
【００９８】
「天然」という用語は、本明細書である対象物に対して用いる場合、その対象物が自然界に見出される事実を意味する。例えば、自然界の起源から単離され得る生物（例えばウイルス）中に存在し、実験室で人間によって意図的に改変されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は天然のものである。一般に、天然という用語は、非病的な（病気に罹患していない）個体に存在する、例えばその種にとって典型的であるような対象物を意味する。
【００９９】
本明細書中で用いられる「核酸分子」は、少なくとも１塩基あるいは１塩基対（各々、それが一本鎖であるか二本鎖であるかによる）からなるものである。さらに核酸分子は、ヌクレオチド含有分子のいずれかのグループにもっぱら属するか、またはキメラとして属することもあり得る。そのヌクレオチド含有分子は、限定するものではないが、以下の核酸分子のグループによって例示されるものである：ＲＮＡ、ＤＮＡ、ゲノム核酸、非ゲノム核酸、天然核酸および天然に生じたものではない核酸、ならびに合成核酸。このヌクレオチド含有分子は、非限定的な例に過ぎないが、ミトコンドリアなどのオルガネラの関連核酸、リボソームＲＮＡ、および天然要素と共に１つ以上の非天然要素をキメラ的に含む核酸分子を含む。
【０１００】
さらに、「核酸分子」は、限定するものではないがアミノ酸および糖質により例示される、１つ以上の非ヌクレオチドベースの構成要素を部分的に含み得る。したがって、例であって限定するものではないが、部分的にはヌクレオチドに基づいており部分的にはタンパク質に基づいているリボザイムは、「核酸分子」とみなされる。
【０１０１】
また、例であって限定するものではないが、検出可能な部分（例えば放射性標識または代わりに非放射性標識など）によって標識された核酸分子は、同様に「核酸分子」とみなされる。
【０１０２】
「（特定の酵素）をコードする核酸配列」または「（特定の酵素）の配列をコードするＤＮＡ」または「（特定の酵素）をコードするヌクレオチド配列」という用語、およびその他の同義の用語は、適切な調節配列の制御下に置かれれば転写され、酵素に翻訳されるＤＮＡ配列を言う。「プロモーター配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができるＤＮＡ調節領域である。プロモーターはＤＮＡ配列の一部である。この配列領域はその３’末端に開始コドンを有する。プロモーター配列は、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルでの転写を開始するために必要な構成要素を有している最小限の数の塩基を含む。しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼが該配列に結合し、転写が開始コドン（プロモーターの３’末端）で開始された後は、転写は３’方向の下流へ進行する。該プロモーター配列内には、転写開始部位（Ｓ１ヌクレアーゼによるマッピングで首尾よく定められた）、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を司るタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出されるであろう。
【０１０３】
「酵素（タンパク質）をコードする核酸」または「酵素（タンパク質）をコードするＤＮＡ」または「酵素（タンパク質）をコードするポリヌクレオチド」という用語、およびその他の同義の用語は、該酵素をコードする配列のみを含むポリヌクレオチドだけでなく、更なるコード配列または非コード配列を含むポリヌクレオチドも包含する。
【０１０４】
１つの好適な実施形態において、「特定の核酸分子種」は、限定するものではないが、一次配列により例示されるその化学構造によって定められるものである。別の好適な実施形態においては、特定の「核酸分子種」は、該核酸種の機能、または該核酸種から誘導された産物の機能によって定められる。したがって、非限定的な例に過ぎないが、「特定の核酸分子種」はそれに起因する１つ以上の活性または特性（その発現産物に起因する活性または特性も含む）により定められる。
【０１０５】
「核酸ライブラリー中への実施中の核酸サンプルの集合」の本明細書中での定義は、核酸サンプルをベクターに基づくコレクションに組み込む工程（例えばベクター中へのライゲーションおよび宿主の形質転換などによる）を含む。適切なベクター、宿主、およびその他の試薬、並びにその非限定的な特定の実施例についての説明は後述する。また「核酸ライブラリー中への実施中の核酸サンプルの集合」の本明細書中での定義は、核酸サンプルを非ベクターに基づくコレクションに組み込む工程（例えばアダプターとの連結による）をも含む。好ましくは、該アダプターはＰＣＲプライマーとアニールし、ＰＣＲによる増幅を促進することができるものである。
【０１０６】
したがって、非限定的な実施形態において、「核酸ライブラリー」は、ベクターに基づく１つ以上の核酸分子のコレクションを包含する。異なる好適な実施形態においては、「核酸ライブラリー」は、非ベクターに基づく核酸分子のコレクションを包含する。更に異なる好適な実施形態においては、「核酸ライブラリー」は、部分的にベクターに基づき、部分的に非ベクターに基づく、核酸分子の混成コレクションを包含する。好ましくはライブラリーを構成する分子コレクションは検索可能で、かつ各核酸分子種毎に分離可能である。
【０１０７】
本発明は、「核酸構築物」あるいは「ヌクレオチド構築物」あるいは「ＤＮＡ構築物」を提供する。用語「構築物」は、本明細書中では、ベクターまたはベクターの一部などの１つ以上のさらなる分子部分と任意に化学結合させ得る、例えばポリヌクレオチド（例えばフィターゼポリヌクレオチド）などの分子を記述するために用いられる。特定の様態であって、しかし限定することを意味するものではない様態においては、ヌクレオチド構築物は、宿主細胞の形質転換に適したＤＮＡ発現構築物により例示される。
【０１０８】
「オリゴヌクレオチド」（または同義的に「オリゴ」）とは、化学合成されたものであり得る一本鎖ポリデオキシヌクレオチドまたは相補二本鎖ポリデオキシヌクレオチドを言う。そのような合成オリゴヌクレオチドは、５’リン酸基を有するものもあるが、有しないものもある。５’リン酸基を有しないものは、キナーゼ存在下にてＡＴＰによりリン酸基を付加しない限り、他のオリゴヌクレオチドと連結することはない。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸化されていない断片と連結される。ポリメラーゼに基づく増幅（例えばＰＣＲによる）を実現するために、「順番に、少なくとも第１の相同配列、縮重Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ配列、および第２の相同配列、を含んでなる、３２倍に縮重したオリゴヌクレオチド」が挙げられる。この文脈で用いられるように、「相同」は、ポリメラーゼに基づいて増幅される親ポリヌクレオチドと前記オリゴとの間の相同性に関する。
【０１０９】
本明細書中で用いられる用語「機能しうる形で連結された」とは、機能的な関係にあるポリヌクレオチドのエレメントの連結を言う。核酸は、別の核酸配列との機能的関係性のうちに配置される場合、核酸は「機能しうる形で連結され」ている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼすならば、該コード配列に機能しうる形で連結されているのである。機能しうる形で連結された、とは、連結されたＤＮＡ配列が典型的に連続的であること、またタンパク質をコードする２つの領域を結合する必要がある場合には連続的かつリーディングフレーム内にあることを意味している。
【０１１０】
ＲＮＡポリメラーゼが１つのｍＲＮＡ中に前記２つのコード配列を転写し、次いで該ｍＲＮＡが両方のコード配列に由来するアミノ酸配列を含む１つのポリペプチドに翻訳される場合、コード配列は別のコード配列に「機能しうる形で連結され」ている。発現される配列が最終的に所望のタンパク質を産生するようにプロセシングされるのであれば、該コード配列は互いに連続的である必要はない。
【０１１１】
本明細書中で用いられる用語「親ポリヌクレオチドセット」は、１つ以上の異なるポリヌクレオチド種を含むセットである。通常この用語は、好ましくは親セットの突然変異誘発によって得られる子孫ポリヌクレオチドセットに関連して用いられ、この場合用語「親」「出発」および「鋳型」を互換的に用いることができる。
【０１１２】
本明細書中で用いられる用語「生理学的条件」とは、生存生物に適合しており、および／または培養酵母生細胞もしくは培養哺乳動物生細胞において細胞内に典型的に存在する、温度、ｐＨ、イオン強度、粘性、および同様の生化学的パラメーターを言う。例えば、典型的な実験室培養条件下で増殖させる酵母細胞における細胞内条件は生理学的条件である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写カクテルに対する適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ反応条件は、一般に生理学的条件である。一般に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ生理学的条件は、５０〜２００ｍＭ ＮａＣｌまたはＫＣｌ， ｐＨ６．５〜８．５， ２０〜４５℃， および０．００１〜１０ｍＭの二価陽イオン（例えばＭｇ２＋、Ｃａ２＋）；好ましくは、約１５０ｍＭ ＮａＣｌまたはＫＣｌ， ｐＨ７．２〜７．６、５ｍＭ 二価陽イオンを含み、さらにしばしば０．０１〜１．０％の非特異的タンパク質（例えばＢＳＡ）を含む。非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）が、通常約０．００１〜２％、典型的には０．０５〜０．２％（ｖ／ｖ）でしばしば存在する。特定の水性条件は、従来方法に従って当業者により選択され得る。一般的な指針としては、以下の緩衝化水性条件を適用できる：１０〜２５０ｍＭ ＮａＣｌ， ５〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ， ｐＨ５〜８， さらに任意に二価陽イオンおよび／または金属キレーターおよび／または非イオン性界面活性剤および／または膜画分および／または消泡剤および／またはシンチラントを含む。
【０１１３】
二本鎖ポリヌクレオチドの配列を記載するために、本明細書中では標準規則（５’から３’へ）を用いている。
【０１１４】
本明細書中で用いられる用語「群」は、例えばポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの一部分、またはタンパク質などの構成要素のコレクションを意味する。「混合群」とは、同じファミリーの核酸またはタンパク質に属する（すなわち、近縁である）がその配列は異なっており（すなわち、同一ではない）、したがってその生物学的活性も異なっている構成要素のコレクションを意味する。
【０１１５】
「プロ型」を有する分子とは、参照とする該プロ型分子と比較して性質の違い（例えば活性の増加）を有するより成熟した分子型に至る途上において、共有結合性および非共有結合性の化学修飾（例えばグリコシル化、タンパク質加水分解切断、二量体化またはオリゴマー化、温度誘導性もしくはｐＨ誘導性コンホメーション変化、補因子との結合など）を、１以上の任意の組み合わせで受ける分子を言う。成熟分子の生成の途中で２以上の化学修飾（例えば２回のタンパク質加水分解切断、またはタンパク質加水分解切断と脱グリコシル化）を区別できる場合には、該参照となる前駆体分子は「プレプロ型」分子と称される。
【０１１６】
本明細書中で用いられる用語「擬似ランダム」は、例えば、擬似ランダム部位以外の別の部位での残基変動性の程度はある程度の残基変動が許容されているものの制限されているような、制限された変動性を有する一連の配列に関して言う。
【０１１７】
本明細書中で用いられる、「擬反復単位」とは、再組合せされる反復配列を言うが、これは定義上同一ではない。実際、同一の出発配列の突然変異誘発により作製された実質的に同一のコード単位に対してだけでなく、いくつかの領域でかなり相違している類似または近縁配列の再組合せに対しても前記方式が持ち出される。それでも、該配列がこのアプローチにより再組合せされるだけの十分な相同性を有するのであれば、それらの配列は「擬反復した」単位と称され得る。
【０１１８】
本明細書中で用いられる「ランダムペプチドライブラリー」とは、１セットのランダムペプチドをコードするポリヌクレオチド配列のセット、およびそれらのポリヌクレオチド配列によりコードされるランダムペプチドのセット、並びにそれらのランダムペプチドを含む融合タンパク質のセットを言う。
【０１１９】
本明細書中で用いられる「ランダムペプチド配列」とは、２つ以上のアミノ酸モノマーを含み、確率論的すなわちランダムな方法により構築されたアミノ酸配列を言う。ランダムペプチドは不変配列を含み得るフレームワークモチーフまたは足場モチーフを含んでもよい。
【０１２０】
本明細書中で用いられる「レセプター」とは、特定のリガンドに対して親和性を有する分子を言う。レセプターは天然分子または合成分子であり得る。レセプターは不変状態でまたは他種との会合体として用いられ得る。レセプターは結合メンバーと、直接にまたは特異的結合物質を介して、共有結合的にまたは非共有結合的に、結合し得る。レセプターの例としては、限定するものではないが、モノクローナル抗体および特定の抗原決定基（例えばウイルス、細胞、または他の物質上にある）と反応性のある抗血清を含む抗体、ならびに細胞膜受容体、複合糖質および糖タンパク質、酵素、ならびにホルモン受容体が挙げられる。
【０１２１】
「組換え」酵素とは、組換えＤＮＡ技術により産生される酵素、すなわち所望の酵素をコードする外来性ＤＮＡ構築物により形質転換した細胞から産生される酵素を言う。「合成」酵素は、化学合成により作製されるものである。
【０１２２】
用語「近縁ポリヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドのある領域または範囲が同一であって、該ポリヌクレオチドのある領域または範囲が非相同性であることを意味する。
【０１２３】
本明細書中で用いられる「減少性再組合せ」は、反復配列により媒介される欠失（および／または挿入）事象を通じて生ずる分子多様性の増大に関して言う。
【０１２４】
以下の用語は、２種類以上のポリヌクレオチド間の配列の関連性を述べるために用いられる：「参照配列」「比較ウィンドウ」「配列同一性」「配列同一性のパーセンテージ」および「実質的同一性」。
【０１２５】
「参照配列」は、配列比較の基準として用いられる確定配列である。参照配列は、例えば配列リストに挙げた完全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントのようにより大きな配列の部分配列であってもよく、または完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含んでもよい。一般的には、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長、しばしば少なくとも２５ヌクレオチド長、および多くの場合少なくとも５０ヌクレオチド長である。２種類のポリヌクレオチドは、それぞれが（１）該２種類のポリヌクレオチド間で類似した配列（すなわち完全なポリヌクレオチド配列の一部）を含み、また（２）該２種類のポリヌクレオチド間で相違している配列をさらに含むことから、該２種類（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的には「比較ウィンドウ」にわたって該２種類のポリヌクレオチドの配列を比較し配列の類似した局所領域を同定し比較することによって、行うことができる。
【０１２６】
本明細書中で用いられる「反復指数（ＲＩ）」は、クローニングベクター中に含められる擬反復単位の平均コピー数である。
【０１２７】
用語「制限部位」とは、制限酵素が作用を現すのに必要であって、触媒的切断部位を含んでいる認識配列を言う。切断部位は、多義性の低い配列（すなわち、制限部位の出現頻度の主たる決定要因を含む配列）を含む制限部位の一部分に含まれても含まれていなくてもよいことは、理解されている。したがって多くの場合、適切な制限部位は、内部切断部位（例えばＥｃｏＲＩ部位では、Ｇ／ＡＡＴＴＣ）または直ぐ隣接した切断部位（例えばＥｃｏＲＩＩ部位では、／ＣＣＷＧＧ）を有する、低多義性配列のみを含むものである。その他の場合で、適切な制限酵素［例えばＥｃｏ５７Ｉ部位すなわちＣＴＧＡＡＧ（１６／１４）］は、低多義性配列（例えばＥｃｏ５７Ｉ部位ではＣＴＧＡＡＧ配列）と外部切断部位（例えばＥｃｏ５７Ｉ部位のＮ１６部分にある）を含む。酵素（例えば制限酵素）がポリヌクレオチドを「切断」すると言う場合、該制限酵素がポリヌクレオチドの切断を触媒または促進することを意味するということは、理解されよう。
【０１２８】
非限定的な１つの様態において、「選択可能なポリヌクレオチド」は、５’末端領域（すなわち端の領域）、中間領域（すなわち内部または中央の領域）、および３’末端領域（すなわち端の領域）からなる。この様態において用いる場合、５’末端領域は５’ポリヌクレオチド末端方向に位置する領域であり、したがってポリヌクレオチドの５’側半分の中に部分的にまたは全体として含まれる。同様に、３’末端領域は３’ポリヌクレオチド末端方向に位置する領域であり、したがってポリヌクレオチドの３’側半分の中に部分的にまたは全体として含まれる。本明細書の非限定的な実施例に示されるように、任意の２つの領域間または３つの領域全ての間でさえ、重複した配列が存在し得る。
【０１２９】
用語「配列同一性」は、２種類のポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウ全体にわたって同一である（すなわち、ヌクレオチド１つ毎に基づいて）ことを意味している。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウ全体にわたって最適にアラインした２つの配列を比較し、両方の配列中で同一な核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）の位置数を決定してマッチ位置数を出し、該マッチ位置数を比較ウィンドウ内の全位置数（すなわちウィンドウサイズ）で除算し、その結果を１００倍して配列同一性のパーセンテージを出すことにより、算出されるものである。本明細書中で用いられるこの「実質的同一性」は、ポリヌクレオチド配列の１つの特性を示すものであり、ここで該ポリヌクレオチドは、少なくとも２５〜５０ヌクレオチドである比較ウィンドウの参照配列と比較して、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の同一性、多くの場合９０〜９５％の配列同一性、および最も一般的には少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、またその配列同一性のパーセンテージは、欠失または付加を比較ウィンドウ全体にわたって参照配列の全部で２０％以下で含み得るポリヌクレオチドと参照配列を比較することにより算出される。
【０１３０】
当業界で公知の通り、２種類の酵素間の「類似性」は、一方の酵素のアミノ酸配列およびその保存されたアミノ酸置換を、もう一方の酵素の配列と比較することにより、決定される。類似性は当業界で周知の手法、例えばＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）により決定することができる。
【０１３１】
本明細書中で用いられる用語「一本鎖抗体」とは、通常はスペーサーペプチド（例えば［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］Ｘ）を介することが好まれるポリペプチド結合においてＶＨドメインとＶＬドメインを含んでなるポリペプチドを言い、これはアミノ末端および／またはカルボキシル末端にさらなるアミノ酸配列を含んでもよい。例えば一本鎖抗体は、コード化ポリヌクレオチドに連結するためのつなぎ鎖（ｔｅｔｈｅｒ）セグメントを含み得る。例えば、ｓｃＦｖが一本鎖抗体である。一般に一本鎖抗体は、免疫グロブリンスーパーファミリーの遺伝子（例えば、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＢａｒｃｌａｙ， １９８９， ｐｐ．３６１−３６８を参照のこと。これは参照により本明細書中に組み込まれる。）によって本質的にコードされている、最も多くの場合、げっ歯類、非ヒト霊長類、鳥類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、またはヒトの重鎖または軽鎖の遺伝子配列によってコードされている少なくとも１０個の連続したアミノ酸のポリペプチドセグメント１つ以上からなるタンパク質である。機能的な一本鎖抗体は、一般的に、特定の標的分子、典型的にはレセプターまたは抗原（エピトープ）に対する結合特性を維持するのに十分な、免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子産物の一部分を含む。
【０１３２】
一対の分子（例えば抗体−抗原ペア、または核酸ペア）のメンバーは、それらが他の非特異的な分子より高い親和性で互いに結合する場合、互いに「特異的に結合する」と言われる。例えば、ある抗原（非特異的タンパク質に対するよりもより効率的に抗体が結合する）に対して産生された抗体は、該抗原と特異的に結合するというように記述され得る。（同様に核酸プローブは、それが塩基対形成相互作用により核酸標的と特異的な二重鎖を形成する場合、該核酸標的と特異的に結合するというように記述され得る（上記を参照のこと）。）
「特異的ハイブリダイゼーション」は、本明細書中では、第１のポリヌクレオチドと第２のポリヌクレオチド（例えば、第１のポリヌクレオチドとは異なっているが本質的に同一の配列を有するポリヌクレオチド）の間でのハイブリッド形成として定義され、本質的に非近縁なポリヌクレオチド配列は混合物中でハイブリッドを形成しない。
【０１３３】
用語「特定のポリヌクレオチド」は、特定の末端を有し、また特定の核酸配列を有するポリヌクレオチドを意味する。一方のポリヌクレオチドが他方のポリヌクレオチドの一部と同一の配列を有するが末端は異なっている場合の、それら２つのポリヌクレオチドは２つの異なる特定のポリヌクレオチドを含むものである。
【０１３４】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、その配列の間に少なくとも９０％の同一性、好ましくは少なくとも９５％の同一性、および最も好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合のみ、ハイブリダイゼーションが起こるであろう場合を意味する。Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９を参照のこと。それはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３５】
また、配列番号１の配列などの、フィターゼポリペプチドの配列と「実質的に同一」である配列を有するポリペプチドも、本発明に包含される。「実質的に同一」なアミノ酸配列は、保存的アミノ酸置換のみによって参照配列と異なっている配列である。この保存的アミノ酸置換とは、例えばアミノ酸１個を同じクラスの別のものに置換することである（例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、またはメチオニンなどの１個の疎水性アミノ酸をその別のアミノ酸に置換すること、またはアルギニンをリジンに置換、グルタミン酸をアスパラギン酸に置換、あるいはグルタミンをアスパラギンに置換というように、１個の極性アミノ酸を別の極性アミノ酸に置換すること）。
【０１３６】
さらに、「実質的に同一」なアミノ酸配列は、参照配列と１つ以上の非保存的置換、欠失、または挿入により相違している配列であって、特にそのような置換がその分子の活性部位ではない部位で起き、かつそのポリペプチドがその特性を本質的に保持している場合である。例えば、１個以上のアミノ酸がフィターゼポリペプチドから欠失し、その結果該ポリペプチドの構造が改変されるが、その生物学的活性に有意な変化がない場合であり得る。例えば、フィターゼの生物学的活性に必要でないアミノ末端またはカルボキシル末端のアミノ酸は除去することができる。そのような改変によって、より小さな活性フィターゼポリペプチドを開発することができる。
【０１３７】
本発明は、「実質的に純粋な酵素」を提供する。用語「実質的に純粋な酵素」は、本明細書中で、他のタンパク質、脂質、炭化水素、核酸、および天然には共に存在しているその他の生体物質を実質的に含まないポリペプチド（例えば、フィターゼポリペプチドまたはその断片）などの分子を記述するために用いられる。例えば、実質的に純粋な分子（例えばポリペプチド）は、目的の分子を乾燥重量で少なくとも６０％含み得る。該ポリペプチドの純度は、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、カラムクロマトグラフィー（例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））、およびアミノ末端アミノ酸配列分析を含む、標準法を用いて測定できる。
【０１３８】
本明細書中で用いられる「実質的に純粋」は、目的種が支配種として存在しており（すなわちモル基準で、目的種がその組成物中に他の各々の巨大分子種よりも大量に存在する）、さらに好ましくは実質的に精製した画分は、目的種が存在している巨大分子種全ての少なくとも約５０％（モル基準で）からなるような組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する巨大分子種全ての約８０〜９０％以上からなる。最も好ましくは、目的種は、本質的に均一（混入種が従来の検出法では該組成物中に検出できない）になるまで精製され、該組成物は本質的に単一の巨大分子種からなる。溶媒種、小分子（５００ダルトン未満）および元素イオン種は、巨大分子種とみなされない。
【０１３９】
本明細書中で用いられる「可変セグメント」は、ランダム、擬似ランダム、または確定された核配列を含む初期ペプチドの一部を言う。「可変セグメント」は、ランダム、擬似ランダム、または確定された核配列を含む初期ペプチドの一部を言う。「可変セグメント」は、可変残基位置と不変残基位置を両方含み得るが、可変残基位置における残基変動性の程度は制限される。当業者の裁量で、両方の選択肢が選択される。典型的には、可変セグメントは約５〜２０アミノ酸残基長（例えば８〜１０）であるが、可変セグメントはより長くてもよく、また、抗体断片、核酸結合タンパク質、レセプタータンパク質などの抗体部分またはレセプタータンパク質を含んでもよい。
【０１４０】
用語「野生型」は、そのポリヌクレオチドが突然変異を全く含まないことを意味する。「野生型」タンパク質は、該タンパク質が天然にみられる活性レベルで活性を有し、また天然にみられるアミノ酸配列を含むことを意味する。
【０１４１】
例えば「実施中のサンプル」中の用語「実施中の」は、単に、それが実施中であるサンプルのことである。同様に、例えば「実施中の分子」は、それが実施中である分子のことである。
【０１４２】
発明の詳細な説明
本明細書に記載の発明は、高度に複雑な直線配列（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質等）の組換えを介した定方向分子進化を可能とする、減少性再組合せ、組換えおよび選択という反復サイクルの使用に向けられる。
【０１４３】
ｉｎ ｖｉｖｏでの分子のシャッフリングは、細胞の、多量体を組み換えるという天然の性質を利用して成し遂げられる。ｉｎ ｖｉｖｏでの組換えは分子の多様性への主要な天然の経路を提供してきたが、他方、遺伝子の組換えは、１）相同性の認識、２）鎖の開裂、鎖の侵入および組換えキアズマの発生を導く代謝ステップならびに最後に、３）別々の組換え分子へのキアズマの分離を含む相対的に複雑な工程のままである。染色体交差の形成には相同配列の認識が必要とされている。
【０１４４】
好ましい実施形態では、本発明は少なくとも第１ポリヌクレオチドおよび第２ポリヌクレオチドからハイブリッドポリヌクレオチドを作製する方法に関する。本発明を使用して、少なくとも１つの部分的な相同配列領域を共有する少なくとも第１ポリヌクレオチドおよび第２ポリヌクレオチドを好適な宿主細胞に導入することによりハイブリッドポリヌクレオチドを作製できる。部分的な相同配列領域はハイブリッドポリヌクレオチドを作製する配列再編成に帰するプロセスを助長する。本明細書において、「ハイブリッドポリヌクレオチド」とは本発明の方法に起因し、かつ少なくとも２つのオリジナルのポリヌクレオチド配列に由来する配列を含むヌクレオチド配列のいずれでもある。かかるハイブリッドポリヌクレオチドはＤＮＡ分子間の配列統合を促進する分子間組換えという事象に起因し得る。さらに、かかるハイブリッドポリヌクレオチドはＤＮＡ分子内のヌクレオチド配列を変化させるために反復配列を利用する分子内減少性再組合せプロセスにも起因し得る。
【０１４５】
本発明は、生物学的に活性なハイブリッドポリペプチドをコードし得るハイブリッドポリヌクレオチドを作製する手段を提供する。ある態様では、オリジナルのポリヌクレオチドは生物学的に活性なポリペプチドをコードする。本発明の方法は細胞プロセスを利用することによって新規のハイブリッドポリペプチドを製造する。これはオリジナルのポリヌクレオチド配列を統合し、その結果得られるハイブリッドポリヌクレオチドがオリジナルの生物学的に活性なポリペプチドに由来する活性を示すポリペプチドをコードするものである。例えば、オリジナルのポリヌクレオチドは異なる微生物に由来する特定の酵素をコードし得る。例えば、ある生物に由来する第１ポリヌクレオチドにコードされる酵素は、特定の環境条件下、例えば高塩分濃度で効果的に機能するものであってもよい。異なる生物に由来する第２ポリヌクレオチドにコードされる酵素は極端な高温などの異なる環境条件下で効果的に機能するものであってもよい。オリジナルの第１および第２ポリヌクレオチドに由来する配列を含むハイブリッドポリヌクレオチドはオリジナルのポリヌクレオチドにコードされる酵素双方の特性を示す酵素をコードし得る。従ってハイブリッドポリヌクレオチドにコードされる酵素は第１および第２ポリヌクレオチドにコードされる各々の酵素により共有される環境条件下、例えば高塩分濃度かつ高温で効果的に機能し得る。
【０１４６】
本発明のオリジナルのポリヌクレオチドにコードされる酵素としては、限定されるものではないが、酸化還元酵素、トランスフェラーゼ、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼおよびリガーゼが挙げられる。本発明の方法により得られるハイブリッドポリペプチドはオリジナルの酵素では示されない特殊化した酵素活性を示し得る。例えば、加水分解酵素活性をコードするポリヌクレオチドの組換えおよび／または減少性再組合せに続いて、各々のオリジナルの酵素から得た特殊化した加水分解酵素活性、すなわち加水分解酵素が作用する結合の種類および加水分解酵素が機能する温度に関して、ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされる得られるハイブリッドポリペプチドをスクリーニングできる。従って、例えば、加水分解酵素は、オリジナルの加水分解酵素からハイブリッド加水分解酵素を区別するそれらの化学的機能性、例えば（ａ）アミド（ペプチド結合）すなわちプロテアーゼ、（ｂ）エステル結合すなわちエステラーゼおよびリパーゼ、（ｃ）アセタールすなわちグリコシダーゼ、ならびに例えばハイブリッドポリペプチドが機能する温度、ｐＨまたは塩濃度などを確認して、加水分解酵素をスクリーニングし得る。
【０１４７】
オリジナルのポリヌクレオチドの供給源は個々の生物（「単離体」）、所定の培地で増殖させた生物の集合（「富化培養物」）または最も好ましくは、培養されていない生物（「環境サンプル」）から単離し得る。培養をしないアプローチを使用して環境サンプルから新規の生物活性をコードするポリヌクレオチドを得ることが最も好ましいが、これは、そうすることで未開発の生物多様性資源を利用できることになるからである。
【０１４８】
「環境ライブラリー」は環境サンプルから作製され、これは好適な原核生物の宿主中で増殖し得るクローニングベクターに保持される天然の生物の集合的ゲノム（ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ）を意味する。クローン化ＤＮＡは最初環境サンプルから直接抽出されるので、ライブラリーが純粋培地で増殖し得る原核生物の小画分に制限されることはない。さらに、これらのサンプルに存在する環境ＤＮＡを標準化することにより、オリジナルのサンプルに存在するすべての種に由来するＤＮＡをより平等に提示することができるであろう。これにより、優性種と比較して数倍低く提示されるサンプルの微量構成要素に由来する、興味深い遺伝子を発見する効率を大いに高めることができる。
【０１４９】
例えば、１種以上の培養されていない微生物から作製した遺伝子ライブラリーを目的の活性に関してスクリーニングする。まず、原核細胞において、目的の生物活性分子をコードする可能性ある経路を遺伝子発現ライブラリーの形で捕らえる。かかるライブラリーから目的の活性をコードするポリヌクレオチドを単離し宿主細胞に導入する。この宿主細胞を、新規なまたは増強された活性を有する可能性のある有効な生体分子を作製する組換えおよび／または減少性再組合せを促進する条件下で増殖させる。
【０１５０】
ポリヌクレオチドを調製する元となる微生物としては、真正細菌および古細菌などの原核微生物ならびに真菌類などの下等真核微生物、いくつかの藻類および原生動物が挙げられる。ポリヌクレオチドは、核酸が生物を培養せずに回収できる場合、または１種以上の培養生物から回収できる場合に環境サンプルから単離できる。ある態様では、かかる微生物は超好熱菌、好冷菌、耐冷菌、好塩菌、好圧菌および好酸菌などの極限微生物であり得る。極限環境を好む微生物から単離された酵素をコードするポリヌクレオチドが特に好ましい。かかる酵素は陸上の温泉および深海の熱水口において１００℃以上の温度で、北極の水における０℃以下の温度で、深海の飽和塩環境で、石炭堆積物および富硫黄地熱泉における約０のｐＨ値で、または下水汚泥における１１以上のｐＨ値で機能し得る。例えば、極限環境を好む生物からクローン化され発現されるいくつかのエステラーゼおよびリパーゼは広範囲の温度およびｐＨを通して高い活性を示す。
【０１５１】
前記のように選択し単離したポリヌクレオチドを好適な宿主細胞に導入する。好適な宿主細胞は組換えおよび／または減少性再組合せを促進し得る細胞の任意のものである。選択されたポリヌクレオチドは適当な制御配列を含むベクター中にすでにあることが好ましい。宿主細胞は哺乳動物細胞などの高等真核細胞、酵母細胞などの下等真核細胞であってもよく、または好ましくは宿主細胞は細菌細胞などの原核細胞であってもよい。宿主細胞への構築物の導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクションまたはエレクトロポレーション（Ｄａｖｉｓら， １９８６）により達成される。
【０１５２】
適当な宿主の典型的な例として、大腸菌、放線菌、ネズミチフス菌などの細菌細胞、酵母などの真菌細胞、キイロショウジョウバエＳ２およびスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ） Ｓｆ９などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳまたはＢｏｗｅｓ黒色腫などの動物細胞、アデノウイルスおよび植物細胞が挙げられる。適当な宿主の選択は、本明細書の教示に基づいた当業者には自明な技術範囲内にあると考えられる。
【０１５３】
特に、組換えタンパク質を発現するのに用いられる種々の哺乳動物細胞培養系に関しては、哺乳動物発現系の例として、「ＳＶ−４０−ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｓｉｍｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｓｕｐｐｏｒｔ ｔｈｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｅａｒｌｙ ＳＶ４０ ｍｕｔａｎｔｓ」（Ｇｌｕｚｍａｎ， １９８１）に記載されるサル腎臓繊維芽細胞のＣＯＳ−７系および適合ベクターを発現できる他の細胞系、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系が挙げられる。哺乳動物発現ベクターは複製起点、好適なプロモーターおよびエンハンサー、そしてまた、あらゆる必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライシング供与および受容部位、転写終結配列および５’フランキング非転写配列を含んでなる。ＳＶ４０スプライシング部位およびポリアデニル化部位に由来するＤＮＡ配列を使用して所望の非転写遺伝子エレメントを得ることができる。
【０１５４】
目的のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、プロモーターの活性化のために、形質転換体の選択のために、または遺伝子の増幅のために適当なように改変した従来の栄養培地で培養できる。温度、ｐＨ等などの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に関してこれまでに使用されたものであり、これは当業者には明らかであろう。次いで、特定の酵素活性を有すると同定されるクローンを配列決定して、増強された活性を有する酵素をコードするポリヌクレオチド配列を同定する。
【０１５５】
もう１つの態様では、本発明の方法を使用して１個以上のオペロンまたは遺伝子クラスターもしくはその部分に由来する生化学経路をコードする新規ポリヌクレオチドを作製できると考えられる。例えば、細菌および多くの真核生物は、遺伝子（その産物が関連プロセスに関与するもの）を制御するための協調機構を有する。遺伝子は単一の染色体上の「遺伝子クラスター」と呼ばれる構造中に集中しており、クラスター全体の転写を開始する単一のプロモーターを含む、単一の調節配列の制御下でともに転写される。このように、遺伝子クラスターとは、通常その機能により同一であるかまたは関連する、隣接する遺伝子の集団である。遺伝子クラスターによりコードされる生化学経路の例としてはポリケチドがある。ポリケチドは、抗生物質（テトラサイクリンおよびエリスロマイシンなど）、抗癌剤（ダウノマイシン）、免疫抑制剤（ＦＫ５０６およびラパマイシン）および獣医用製剤（モネンシン）を含む生物活性物質の非常に豊富な供給源である分子である。多数のポリケチド（ポリケチドシンターゼにより産生される）は治療薬として価値がある。ポリケチドシンターゼは多機能酵素であり、長さならびに機能性パターンおよび環化パターンの異なる非常に多くの種類の炭素鎖の生合成を触媒する。ポリケチドシンターゼ遺伝子は遺伝子クラスター内にあり、ポリケチドシンターゼの少なくとも１つの種（タイプＩと称される）は大きなサイズの遺伝子および酵素を有しており、これが遺伝子操作およびｉｎ ｖｉｔｒｏでのこれらの遺伝子／タンパク質の研究を複雑にしている。
【０１５６】
研究用の新規ポリケチドを作製するために、ポリケチドまたはその断片、およびポストポリケチド生合成遺伝子のライブラリーから所望の構成要素を選択し、組み合わせることができるのは魅力的である。本発明の方法は分子間組換えを介した新規ポリケチドシンターゼの生成を促進可能とする。
【０１５７】
好ましくは、遺伝子クラスターＤＮＡを異なる生物から単離し、ベクター、特に、連結された遺伝子クラスターから検出可能なタンパク質またはタンパク質関連アレイ活性の産生を制御および調節し得る発現調節配列を含むベクターに連結する。かかる遺伝子クラスターとともに使用するには、外来ＤＮＡ導入に関して非常に大きな能力を有するベクターの使用が特に適当であり、例として、大腸菌のｆ−因子（すなわち稔性因子）が含まれることを本明細書に記載する。この大腸菌のｆ−因子は接合の際にそれ自身の高頻度導入に影響を及ぼすプラスミドであり、混合された微生物サンプルに由来する遺伝子クラスターなどの大きなＤＮＡ断片を獲得し安定に増殖させるための理想のものである。一旦、適当なベクターに連結されれば、異なるポリケチドシンターゼ遺伝子クラスターを含む２個以上のベクターを好適な宿主細胞に導入できる。遺伝子クラスターに共有される部分的な相同配列領域はハイブリッド遺伝子クラスターをもたらす配列再編成という結果となるプロセスを促進する。さらに、オリジナルの遺伝子クラスターには見られない増強された活性に関して新規ハイブリッド遺伝子クラスターをスクリーニングできる。
【０１５８】
従って、好ましい実施形態では、本発明は、生物学的に活性なハイブリッドポリペプチドを作製し、かかるポリペプチドを増加された活性に関してスクリーニングする方法であって、
１）少なくとも、機能しうる形で連結された第１のポリヌクレオチドおよび機能しうる形で連結された第２ポリヌクレオチド（かかる第１ポリヌクレオチドおよび第２ポリヌクレオチドは少なくとも１個の部分的な相同配列領域を共有している）を適切な宿主細胞に導入し、
２）機能しうる形で連結されるハイブリッドポリヌクレオチドをもたらす配列再編成を促進する条件下で宿主細胞を増殖させ、
３）ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされるハイブリッドポリペプチドを発現させ、
４）増強された生物学的活性の同定を促進する条件下でハイブリッドポリペプチドをスクリーニングし、さらに
５）ハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離することによる方法に関する。
【０１５９】
種々の酵素活性をスクリーニングする方法は当業者に公知であり、本明細書中で論ぜられている。本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドを単離する場合にはかかる方法を使用し得る。
【０１６０】
使用できる発現ベクターの典型的な例としては、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ホスミド、細菌人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えばワクシニア、アデノウイルス、ファウルポックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびＳＶ４０の誘導体）、Ｐ１を基にした人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、および目的の特定の宿主（桿菌、コウジカビ属菌および酵母など）に特異的なその他のベクターのいずれをも記載できる。従って、例えば、ＤＮＡは、ポリペプチド発現のための種々の発現ベクターの任意のものに含まれ得る。かかるベクターとしては染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列が挙げられる。多数の好適なベクターが当業者に公知であり、また市販されている。以下のベクターを例として示す：細菌性のもの；ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、ｐＮＨベクター、λ−ＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、真核生物性のもの；ｐＸＴ１、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、他のプラスミドまたは他のベクターの任意のものを、それらが宿主中で複製可能であり、かつ生存可能である限りは使用できる。コピー数の少ないベクターまたはコピー数の多いベクターを本発明に関して使用することができる。
【０１６１】
本発明に使用するのに好ましい種類のベクターはｆ−因子複製起点を含む。大腸菌のｆ−因子（すなわち稔性因子）は接合の際にそれ自身の高頻度導入に影響を及ぼすプラスミドであり、細菌染色体自体は低い頻度でしか導入しない。特に好ましい実施形態では、「ホスミド」と呼ばれるクローニングベクターまたは細菌人工染色体（ＢＡＣ）ベクターを使用する。これらは大腸菌ｆ−因子に由来し、ゲノムＤＮＡの大きなセグメントを安定に組み込むことができる。混合し培養されていない環境サンプルに由来するＤＮＡとともに組み込まれる場合には、これにより大きなゲノム断片を安定な「環境ＤＮＡライブラリー」の形にすることができる。
【０１６２】
本発明において使用するのに好ましいもう１つの種類のベクターはコスミドベクターである。コスミドベクターは本来、ゲノムＤＮＡの大きなセグメントをクローン化し増殖させるために設計された。コスミドベクターへのクローニングは「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９）に詳細に記載されている。
【０１６３】
発現ベクター中のＤＮＡ配列はＲＮＡ合成を指令する適当な発現制御配列（プロモーター）に機能しうる形で連結されている。特に有名な細菌性プロモーターとしてｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐが挙げられる。真核生物のプロモーターとしてはＣＭＶ極初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲおよびマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適当なベクターおよびプロモーターの選択は十分に当業者の水準の範囲内にある。発現ベクターはまた翻訳開始のためのリボソーム結合部位および転写ターミネーターを含む。ベクターはまた、発現を増幅させるのに適当な配列も含み得る。プロモーター領域は、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクターまたは選択マーカーを有する他のベクターを用いて所望の遺伝子のいずれからも選択できる。
【０１６４】
さらに、発現ベクターは好ましくは、真核細胞培養に関してはジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性などの、または大腸菌においてはテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性などの、形質転換された宿主細胞を選択するための表現型特性を提供する１個以上の選択マーカー遺伝子を含む。
【０１６５】
一般に、組換え発現ベクターは宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子およびＳ．セレビシエＴＲＰ１遺伝子、ならびに下流の構造配列の転写を指令する高率発現遺伝子に由来するプロモーターを含む。かかるプロモーターは特に３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、α−因子、酸ホスファターゼなどの解糖酵素または熱ショックタンパク質をコードするオペロンから誘導できる。異種構造配列は適当な相において翻訳開始および終結配列、ならびに好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞周辺腔または細胞外の培地への分泌を指令できるリーダー配列と結合される。
【０１６６】
クローニング戦略によっては導入されたベクターと内因性プロモーターの双方を介する発現を可能にすることができ、ベクターによる促進は、その内因性プロモーターが大腸菌において機能しない遺伝子の発現に関して重要なものとなり得る。
【０１６７】
微生物から単離されたまたは誘導されたＤＮＡは、選択されたＤＮＡを探る前にベクターまたはプラスミドに挿入されることが好ましい。かかるベクターまたはプラスミドは、プロモーター、エンハンサー等をはじめとする発現調節配列を含むものであることが好ましい。かかるポリヌクレオチドはベクターおよび／または構成物の一部であってもよく、また単離されたままのものであってもよい。なぜなら、かかるベクターまたは構成物はその天然環境の一部ではないからである。特に好ましいファージまたはプラスミド、およびそれらに導入し、パッケージングする方法は、本明細書に示されるプロトコールに詳細に説明されている。
【０１６８】
クローニングベクターの選択は採用されるアプローチに依存し、例えば、宿主細胞にうまく形質転換され、選択され得る多様に反復する配列のコピーまたは多重配列に関しては、ベクターは十分な能力を有するいずれのクローニングベクターでもよい。かかるベクターの１つの例が「Ｐｏｌｙｃｏｓ ｖｅｃｔｏｒｓ：ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ａｎｄ ｐｈａｇｅｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒｓ ｕｓｉｎｇ ｌａｍｂｄａ ｐｈａｇｅ ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｓ」（Ａｌｔｉｎｇ−ＭｅｃｓおよびＳｈｏｒｔ，１９９３）に記載されている。増殖／維持は抗生物質耐性によってクローニングベクターにより行われる。増殖期間の後、自然に短縮された分子を回収し、ゲルまたはカラムでのサイズ分画によって同定するか、または直接増幅する。利用されるクローニングベクターは長い構築物の挿入によって分断されている選択可能な遺伝子を含む場合もある。減少性再組合せが進行するにつれて、反復単位数が減少し、割り込まれた遺伝子が再び発現され、従って処理された構築物に関する選択を行うことができる。所望の生物学的特性を有する発現産物の選択を可能にするベクターは、発現／選択ベクターであってもよい。インサートは機能的プロモーターの下流に位置してもよく、適当な手段によって所望の特性をスクリーニングする。
【０１６９】
ｉｎ ｖｉｖｏ再編成は、ひとまとめにして「組換え」と呼ばれる「分子間」プロセスに集中され、これは細菌では一般に「ＲｅｃＡ−依存性」現象として観察される。本発明は、宿主細胞の配列を組換え、再組合せさせる組換えプロセス、または減少プロセスを媒介して欠失により細胞中の擬反復配列の複雑性を減少させる細胞の能力に依存する。「減少性再組合せ」というこのプロセスは「分子間」ＲｅｃＡ依存性プロセスにより起こる。
【０１７０】
従って、本発明の別の態様では、減少性再組合せのプロセスによって新規ポリヌクレオチドを作製できる。この方法は連続配列（元のコード配列）を含む構築物の作製、それらの適当なベクターへの挿入およびそれに続く適当な宿主細胞への導入を含む。個々の分子の同一性の再組合せは相同領域を有する構築物中の連続配列間または擬反復単位間の組合せプロセスにより起こる。再編成プロセスにより組換え、ならびに／または複雑性および反復配列の程度が減少し、結果として新規分子種の産生をもたらす。種々の処理を適用して再編成率を高めることができる。これらには紫外線光またはＤＮＡに損傷を与える化学物質を用いる処理および／または増強されたレベルの「遺伝的不安定性」を示す宿主細胞系の使用が含まれうる。従って、再組合せプロセスは、それら自身の進化を指令する相同組換え、または擬反復配列という天然の特性を含み得る。
【０１７１】
反復配列または「擬反復」配列は遺伝子の不安定性において役割を果たす。本発明では、「擬反復」とはそれらの元の単位構造を制限しない反復である。擬反復単位は構築物中の配列のアレイ、すなわち同様の配列の連続単位として提供される。ひと度連結されれば、連続配列間の接合点は本質的にはそれとわからないものになり、分子レベルではもはや得られる構築物の擬反復特性が連続するものとなる。得られる構築物の複雑性を減少させるよう細胞が行う欠失プロセスは擬反復配列間に作用する。擬反復単位により事実上制限のない鋳型レパートリーが提供され、そこでずれという事象が起こり得る。従って、擬反復を含む構築物は、欠失（および可能性としては挿入）事象が擬反復単位内の実質的にどこでも起こり得るという十分な分子適応性を効果的に示す。
【０１７２】
擬反復配列がすべて同じ向きに、例えば頭対尾、またはその逆に連結される場合には、細胞は個々の単位を区別できない。従って、縮小プロセスが配列中で起こり得る。対照的に、例えば、単位が頭対尾ではなく頭対頭を示す場合には、転換は隣接単位の終点を描き出し、その結果、欠失形成は不連続単位の消失に傾く。従って、本方法に関しては配列が同じ方向にあることが好ましい。任意の方向の擬反復配列は再組合せ効率の損失をもたらし、他方、一定方向の配列は高効率を提供する。しかしながら、少数の連続配列しか同一方向に持たないことは効率を低下させるものの、新規分子の効率的な回収にまだ十分な適応性を示すことができる。構築物を同一方向にある、ある程度反復された配列で構成して高効率とすることができる。
【０１７３】
配列は以下のものを含む、種々の方法のいずれかを用いてヘッドからテール方向に集合させることができる：
ａ）作成時に一本鎖が方向をなすポリＡヘッドおよびポリＴテールを含むプライマーが利用できる。これはＲＮＡから作られるプライマーの最初の数塩基を持つことにより達成され、従ってＲＮアーゼＨが容易に除去される。
【０１７４】
ｂ）特有の制限切断部位を含むプライマーが利用できる。複数の部位、一連の特有の配列、ならびに反復合成および連結工程が必要とされる。
【０１７５】
ｃ）プライマー内部の数塩基をチオレート化することができ、エキソヌクレアーゼを用いて適切なテールを有する分子を作製することができた。
【０１７６】
再組合せされた配列の回収は縮小ＲＩによってクローニングベクターを同定することによる。再組合せされたコード配列をその後増幅して回収することができる。その産物を再びクローン化して発現させる。縮小ＲＩを用いたクローニングベクターの回収は、下記により行われる。
【０１７７】
１）構築物が複雑性を減少させた際に唯一安定して維持されるベクターの使用。
【０１７８】
２）物理的手段によって短縮されたベクターの物理的回収。この場合、クローニングベクターは標準的なプラスミド単離法を用いて回収され、アガロースゲル、または標準法を利用して低分子量を排除するカラムのいずれかによりサイズ分画する。
【０１７９】
３）インサートのサイズが小さくなった場合に選択可能な、分断された遺伝子を含むベクターの回収。
【０１８０】
４）発現ベクターと適切な選択を用いた直接選択技術の使用。
【０１８１】
近縁生物に由来するコード配列（例えば遺伝子）は、高度の相同性を示し、かつ全く異なったタンパク質産物をコードする。これらの型の配列は本発明において、擬反復型として特に有用である。しかしながら、以下に示される実施例では、ほぼ同じ原型のコード配列（擬反復）の再組合せが示されているが、このプロセスはこのようなほぼ同じ反復に限られるものではない。
【０１８２】
以下の実施例は本発明の方法を示すものである。３つの特有の種に由来する核酸をコードする配列（ある程度の反復）を示す。各配列は一組の異なる特性を持つタンパク質をコードする。この配列はそれぞれ、「Ａ」、「Ｂ」および「Ｃ」と表される配列内の特有の位置の１つまたは数個の塩基対が異なっている。擬反復配列は個別にまたはまとめて増幅され、連結されて、連結した分子集団中ですべての可能な順列および組合せが得られるような無作為な集合体となる。擬反復単位の数は構築条件によって制御できる。ある構築物での擬反復単位の平均数を反復指数（ＲＩ）と定義する。
【０１８３】
一度形成されれば構築物は、公開されているプロトコルに従ってアガロースゲルでサイズ分画してもしなくともよく、クローニングベクターへ挿入し、適当な宿主細胞にトランスフェクトする。次いでこの細胞を増殖させて、「減少性再組合せ」を行う。減少性再組合せ過程の速度は、所望によりＤＮＡ損傷を導入することで刺激され得る。ＲＩの縮小が、「分子内」機構によって反復配列間で欠失が形成されることによるものか、「分子間」機構を通じて組換えに似た結果が起こることによるものかは重要ではない。最終的な結果はあり得るすべての組合せへ分子を再編成することである。
【０１８４】
場合によって本方法は、例えばタンパク質性受容体、ペプチドオリゴ糖、ビリオン（ｖｉｒｏｎ）、または他の所定の化合物または構造物といった所定の高分子と結合するか、または相互作用する（例えば、触媒性抗体など）能力を持つ個々のシャッフルされたライブラリーメンバーを同定するためのシャッフルされたプールのライブラリーメンバーをスクリーニングするさらなる工程を含んでなる。
【０１８５】
かかるライブラリーから同定された展示ポリペプチド、抗体、模倣ペプチド抗体、および可変領域配列は、治療、診断、研究、および関連する目的（例えば、触媒、水溶液の浸透性を上昇させる溶質など）に使用でき、および／または１以上のさらなるシャッフリングおよび／または親和性選択のサイクルに付すことが可能である。本方法は、表現型（例えば、触媒活性、安定性、酸化耐性、薬剤耐性、または宿主細胞に付与される検出可能な表現型）の特徴を選択する工程が所定の分子に対する結合親和性以外のものとなり得るように改変することができる。
【０１８６】
本発明は親和性相互作用スクリーニングに好適な展示抗体のライブラリーを作製する方法を提供する。この方法は、（１）まず、展示抗体および該展示抗体をコードする関連ポリヌクレオチドを含んでなる、複数の選択されるライブラリーメンバーを取得し、さらに該展示抗体をコードする該関連ポリヌクレオチドを取得して、該関連ポリヌクレオチドまたはそのコピーを取得すること（ここで、該関連ポリヌクレオチドは実質的に同一の可変領域枠組み配列の領域を含んでなる）、および（２）該ポリヌクレオチドを好適な宿主細胞に導入し、組換えおよび減少性再組合せを促進しシャッフルされたポリヌクレオチドを得る条件下でこの細胞を増殖させること、を含んでなる。このシャッフルされたプールに包含されるＣＤＲの組合せは最初の複数の選択ライブラリーメンバーには存在せず、該シャッフルされたプールはＣＤＲ置換を含んでなる展示抗体ライブラリーを構成し、親和性相互作用スクリーニングに適している。場合により、該シャッフルされたプールを親和性スクリーニングに付し、所定のエピトープ（抗原）に結合するライブラリーメンバーを選択し、それにより複数の選択されたシャッフルされたライブラリーメンバーを選択する。さらに、複数の選択的にシャッフルされたライブラリーメンバーをシャッフルし、所望の結合親和性を有するライブラリーメンバーが得られるまで１〜１０００サイクル、または望むだけ繰り返しスクリーニングすることができる。
【０１８７】
本発明の別の態様では、組換えまたは再編成の前またはその間に、本発明の方法により作製したポリヌクレオチドを、元のポリヌクレオチドへの突然変異の導入を促進する薬剤またはプロセスに付し得るものと考えられる。かかる突然変異の導入は、得られるハイブリッドポリヌクレオチドおよびそれからコードされるポリペプチドの多様性を高めるであろう。突然変異誘発を促進する薬剤またはプロセスとしては、限定されるものではないが、（＋）−ＣＣ−１０６５、または（＋）−ＣＣ−１０６５−（Ｎ３−アデニン）（ＳｕｎおよびＨｕｒｌｅｙ， １９９２を参照）のような合成類似体、ＤＮＡ合成阻害することができるＮ−アセチル化または脱アセチル化４’−フルオロ−４−アミノビフェニル付加物（例えば、ｖａｎ ｄｅ Ｐｏｌｌら， １９９２を参照）、またはＤＮＡ合成を阻害することができるＮ−アセチル化または脱アセチル化４−アミノビフェニル付加物（これもｖａｎ ｄｅ Ｐｏｌｌら， １９９２， ７５１−７５８頁を参照）、三価クロム、三価クロム塩、７−ブロモメチル−ベンズ［ａ］アントラセン（「ＢＭＡ」）、トリス（２，３−ジブロモプロピル）ホスフェート（「Ｔｒｉｓ−ＢＰ」）、１，２−ジブロモ−３−クロロプロパン（「ＤＢＣＰ」）、２−ブロモアクロレイン（２ＢＡ）、ベンゾ［ａ］ピレン−７，８−ジヒドロジオール−９−ｌ０−エポキシド（「ＢＰＤＥ」）、プラチナ（ＩＩ）ハロゲン塩、Ｎ−ヒドロキシ−２−アミノ−３−メチルイミダゾ［４，５−ｆ］−キノリン（「Ｎ−ヒドロキシ−ＩＱ」）、およびＮ−ヒドロキシ−２−アミノ−１−メチル−６−フェニルイミダゾ［４，５−ｆ］−ピリジン（「Ｎ−ヒドロキシ−ＰｈＩＰ」）などのＤＮＡ複製を阻害することができる多環式芳香族炭化水素（「ＰＡＨ」）ＤＮＡ付加物である。特に望ましいのは紫外線（＋）−ＣＣ−１０６５および（＋）−ＣＣ−１０６５−（Ｎ３−アデニン）からなるＰＣＲ増幅を減退もしくは停止する手段である。特に包含される手段としては、ＤＮＡ付加物、またはポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプールから得られたＤＮＡ付加物を含んでなるポリヌクレオチドがあり、これはさらなるプロセッシングに先立ちポリヌクレオチドを含んでなる溶液を加熱することを含む工程により遊離もしくは除去することが可能である。
【０１８８】
別の態様では、本発明はハイブリッドポリヌクレオチドまたは再組合せポリヌクレオチドの製造を提供する本発明に従う条件下で、野生型タンパク質をコードする二本鎖の鋳型ポリヌクレオチドを含んでなるサンプルを処理することにより、生物学的活性をもつ組換えタンパク質を製造する方法に向けられる。
【０１８９】
本発明はまた、ウイルス遺伝子（例えばキャプシドタンパク質、スパイク糖タンパク質、ポリメラーゼ、およびプロテアーゼ）またはウイルスゲノム（例えばパラミクソウイルス、オルトミクソウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レオウイルスおよびライノウイルス）の集団をシャッフルするためのポリヌクレオチドシャッフルの使用を提供する。ある実施形態では、本発明は、組換えにより作製された新規なエピトープと同様にエピトープの新規な組合せを作製するため、免疫原性ウイルスタンパク質のすべてまたは一部をコードする配列をシャッフルする方法を提供するものであるが、かかるシャッフルされたウイルスタンパク質はエピトープもしくはエピトープの組合せ、ならびに組換えによって作製された新規なエピトープを含んでなり、かかるシャッフルされたウイルスタンパク質は、ウイルス進化の結果として自然環境で生じ得るエピトープ、またはエピトープの組合せ（例えば、インフルエンザウイルス株の組換えなど）を包含する。
【０１９０】
本発明はまた、遺伝子治療ベクターおよび複製欠陥遺伝子治療構築物を作製するためのポリヌクレオチド配列のシャッフリングに好適な方法を提供する。かかる方法を、ＤＮＡに基づくワクチン導入のためのワクチンベクター、ならびに抗腫瘍遺伝子治療およびその他の一般的治療方式を含む、ヒト遺伝子治療に使用することができるが、それらに限定されない。
【０１９１】
本明細書で用いられるポリペプチドの注釈としては、標準的な用法および慣例に従い、左手方向がアミノ末端方向で、右手方向がカルボキシ末端方向である。同様に、特に断りのない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側の末端が５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向を５’方向とする。未完成のＲＮＡ転写物の５’→３’付加の方向を転写方向と呼び、ＲＮＡと同じ配列を持つＤＮＡ鎖上の配列領域でＲＮＡ転写物の５’→５’末端であるものを「上流配列」と呼び、ＲＮＡと同じ配列を持つＤＮＡ鎖上の配列領域でコード鎖ＲＮＡ転写物の３’→３’末端であるものを「下流配列」と呼ぶ。
【０１９２】
方法論
核酸シャッフリングは、一つもしくは複数のポリヌクレオチドを生成するための、短いまたは小さいポリヌクレオチドのプールのｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ相同的組換え方法である。近縁の核酸配列またはポリヌクレオチドの混合物を有性ＰＣＲに付して、ランダムヌクレオチドを作製し、再集合させて、組換え体ハイブリッド核酸分子またはポリヌクレオチドのライブラリーもしくは混合集団を取得する。
【０１９３】
カセット突然変異誘発とは対照的に、シャッフリングおよび誤りがちな（Ｅｒｒｏ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲだけが、配列のプールをブラインド方式で（プライマー以外の配列情報なしに）突然変異させることができる。
【０１９４】
反復選択を目的とする誤りがちなＰＣＲ単独に対する、本発明の突然変異誘発シャッフリングの利点は、抗体工学からの一例により、極めて明瞭に説明することができる。誤りがちなＰＣＲ（有性ＰＣＲではない）と比較して、ＤＮＡシャッフリングを考える。選択したプール配列の初期ライブラリーは、多様な起原（すなわち、ナイーブｍＲＮＡ由来の抗体）の近縁配列から成るか、あるいは、単一の抗体遺伝子のあらゆるタイプの突然変異誘発（シャッフリングを含む）によって得ることができる。１回目の親和性選択の後に、選択した相補性決定領域（ＣＤＲ）のコレクションを得る。図では、濃厚なＣＤＲが、抗体分子に、抗原に対する高い親和性を賦与する。シャッフリングにより、例えば、ＣＤＲ１のすべてとＣＤＲ２のすべてとの、ＣＤＲ３のすべてとの自由な組合せ会合が可能になる。
【０１９５】
この方法は、逆連鎖反応であるという点で誤りがちなＰＣＲとは異なる。誤りがちなＰＣＲでは、ポリメラーゼ出発部位の数と、分子の数が、指数関数的に増加する。しかし、ポリメラーゼ出発部位の配列と、分子の配列は、実質的に同じままである。これに対し、ランダムポリヌクレオチドの核酸再集合もしくはシャッフリングでは、出発部位の数およびランダムポリヌクレオチドの数（ただし、サイズではない）は、時間の経過と共に減少する。全プラスミド由来のポリヌクレオチドについては、理論上の終点は、単一の、大きな鎖状体（コンカテマー）分子である。
【０１９６】
交差は、相同性領域に起こることから、組換えは、第一に、同じ配列ファミリーのメンバー間に起こる。これによって、著しく不適合の（例えば、同じ抗原の異なるエピトープに対して向けられた）ＣＤＲの組合せがなくなる。同じ反応で、複数の配列ファミリーをシャッフルすることも可能である。さらに、シャッフリングは、一般に、例えば、ＣＤＲ１が、ＣＤＲ２の位置には存在しないように、相対順序を保存する。
【０１９７】
希有シャフラントは、多数の最良（例えば、親和性が最も高い）ＣＤＲを含む可能性がある。これらの希有シャフラントは、その高い親和性に基づいて、選択することができる。
【０１９８】
選択された１００個の異なる抗体配列のプールからのＣＤＲは、最高１，００６通りの順列を入れ替えることができる。この多数の順列は、ＤＮＡ配列の単一ライブラリーに呈示され得ない。従って、所望の配列長さおよび配列多様性に応じて、複数サイクルのＤＮＡシャッフリングおよび選択が必要であると考えられる。
【０１９９】
これに対し、誤りがちなＰＣＲは、同じ相対配列中に選択したＣＤＲすべてを保持し、はるかに小さい突然変異体クラウド（ｃｌｏｕｄ）を生成する。
【０２００】
本発明の方法に使用できる鋳型ポリヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡでよい。それは、組換えまたは再集合しようとする遺伝子のサイズ、または、より短いもしくはより小さいポリヌクレオチドのサイズに応じて、長さは違ってくる。好ましくは、鋳型ポリヌクレオチドは、５０ｂｐ〜５０ｋｂである。関心のあるタンパク質をコードする核酸を含有する全ベクターを本発明の方法で使用することができ、実際に、好適に使用されている。
【０２０１】
鋳型ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ反応（米国特許第４，６８３，２０２号及び同第４，６８３，１９５号）を用いた増幅、または、その他の増幅もしくはクローニング方法によって、得ることができる。しかし、ＰＣＲ産物のプーリングおよび有性ＰＣＲに付す前に、ＰＣＲ産物からの遊離プライマーを除去することにより、さらに効率的な結果が得られる。有性ＰＣＲの前に、元のプールからプライマーを適切に除去しなかった場合には、交差クローンの頻度の低下を招く恐れがある。
【０２０２】
鋳型ポリヌクレオチドは、多くの場合二本鎖とすべきである。二本鎖核酸分子は、得られた一本鎖ポリヌクレオチドが、互いに相補的であり、従って、ハイブリダイズして、二本鎖分子を形成するのを確実にする上で、推奨される。
【０２０３】
鋳型ポリヌクレオチドに対する同一性領域および鋳型ポリヌクレオチドに対する異種性領域を有する一本鎖または二本鎖の核酸ポリヌクレオチドは、このステップで、鋳型ポリヌクレオチドに添加することができる。また、このステップで、二つの異なるが、近縁のポリヌクレオチド鋳型を混合することも考えらえる。
【０２０４】
二本鎖ポリヌクレオチド鋳型、ならびに、あらゆる添加した二本鎖または一本鎖ポリヌクレオチドに、減速または停止を含む有性ＰＣＲを実施することにより、約５ｂｐ〜５ｋｂ以上の混合物を得る。好ましくは、ランダムポリヌクレオチドのサイズは、約１０ｂｐ〜１，０００ｂｐ、さらに好ましくは、ポリヌクレオチドのサイズは、約２０ｂｐ〜５００ｂｐである。
【０２０５】
あるいは、本発明の方法で、複数のニックを有する二本鎖核酸を使用してもよい。ニックは、二本鎖核酸の一本鎖部分の切れ目である。ニック間の距離は、好ましくは、５ｂｐ〜５ｋｂ、さらに好ましくは、１０ｂｐ〜１，０００ｂｐである。これは、自己プライマー化領域をもたらし、例えば、ランダムプライマーから得られるポリヌクレオチドと共に含めるべき、さらに短い、もしくは、小さいポリヌクレオチドを生成することができる。
【０２０６】
いずれの特異的ポリヌクレオチドの濃度も、ポリヌクレオチド全量の１重量％以下、さらに好ましくは、いずれの特定核酸配列の濃度も、核酸全量の０．１重量％以下とする。
【０２０７】
混合物中の様々な特異的ポリヌクレオチドの数は、少なくとも約１００、好ましくは、少なくとも約５００、さらに好ましくは、約１，０００である。
【０２０８】
このステップで、合成もしくは天然に拘わらず、一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチドを、ランダム二本鎖の短いまたは小さいポリヌクレオチドに添加し、ポリヌクレオチド混合物の不均質性を高めることができる。
【０２０９】
また、このステップで、二本鎖の、ランダムに切断されたポリヌクレオチドの集団を、有性ＰＣＲ工程で得たポリヌクレオチドと混合または組み合わせて、任意で、１以上の追加の有性ＰＣＲサイクルに付してもよい。
【０２１０】
鋳型ポリヌクレオチドへの突然変異の挿入を望む場合には、鋳型ポリヌクレオチドに対する同一性領域、ならびに、鋳型ポリヌクレオチドに対する異種性領域を有する一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドを、全核酸に対して２０倍過剰の量で添加する。さらに好ましくは、一本鎖ポリヌクレオチドを、全核酸に対して１０倍過剰の量で添加する。
【０２１１】
異なるが、近縁の鋳型ポリヌクレオチドの混合物を望む場合には、各々の鋳型に由来するポリヌクレオチドの集団を、約１：１００より低い比で組み合わせる。この比は、さらに好ましくは、約１：４０より低くする。中立突然変異（例えば、選択される表現型の特性に不要な変化をもたらす突然変異）を除去するために、例えば、突然変異したポリヌクレオチド集団を用いた、野生型ポリヌクレオチドの戻し交雑が望ましい場合もある。このような例では、ランダムに提供された有性ＰＣＲサイクルハイブリッドポリヌクレオチドに添加できる、ランダムに提供された野生型ポリヌクレオチドの比は、約１：１から約１００：１、さらに好ましくは、１：１から４０：１である。
【０２１２】
ランダムポリヌクレオチドの混合集団を変性し、一本鎖ポリヌクレオチドを形成した後、再アニーリングする。他の一本鎖ポリヌクレオチドとの相同性領域を有する一本鎖ポリヌクレオチドだけが、再アニーリングする。
【０２１３】
ランダムポリヌクレオチドは、加熱により変性することができる。当業者であれば、二本鎖核酸を完全に変性するのに必要な条件を決定することができるだろう。好ましくは、温度は８０〜１００℃、さらに好ましくは、９０〜９６℃の間である。これ以外に、ポリヌクレオチドを変性するのに用いられる手段としては、圧力（３６）およびｐＨがある。
【０２１４】
ポリヌクレオチドは、冷却により再アニーリングしてもよい。好ましくは、温度は、２０℃〜７５℃、さらに好ましくは、４０℃〜６５℃の間である。平均４個のみの相同性の連続した塩基に基づいて、高い頻度の交差が必要な場合には、低いアニーリング温度を用いて、組換えを強制的に実施することができるが、この方法は難しくなる。後に起こる復元の度合いが、一本鎖ポリヌクレオチドの集団間の相同性の度合いに左右されるだろう。
【０２１５】
復元は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または塩の添加により加速することができる。塩濃度は、好ましくは、０ｍＭ〜２００ｍＭ、さらに好ましくは、塩濃度は、１０ｍＭ〜１００ｍｍである。塩は、ＫＣｌまたはＮａＣｌでよい。ＰＥＧの濃度は、好ましくは、０％〜２０％、さらに好ましくは、５％〜１０％である。
【０２１６】
次に、アニーリングしたポリヌクレオチドを、核酸ポリメラーゼとｄＮＴＰ（すなわち、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）の存在下にインキュベートする。核酸ポリメラーゼは、クレノウ断片、Ｔａｑポリメラーゼ、または、その他の当業者には公知のＤＮＡポリメラーゼでよい。
【０２１７】
集合（ａｓｓｅｍｂｌｙ）に用いる手法は、まだ交差をもたらすであろう最小限度の相同性に応じて異なる。同一性の領域が広い場合には、Ｔａｑポリメラーゼを使用し、アニーリング温度を４５〜６５℃とする。同一性領域が狭い場合には、クレノウポリメラーゼを用いて、アニーリング温度を２０〜３０℃にする。当業者であれば、アニーリング温度を調節して、達成する交差の数を増やすことができるだろう。
【０２１８】
ポリメラーゼは、アニーリングの前、アニーリングと同時に、あるいはアニーリング後に添加することができる。
【０２１９】
変性、復元、ならびに、ポリメラーゼの存在下でのインキュベートのサイクルをここでは、核酸のシャッフリングもしくは再集合と呼ぶ。このサイクルを所望の回数だけ繰り返す。好ましくは、このサイクルを２〜５０回、さらに好ましくは、１０〜４０回繰り返す。
【０２２０】
得られる核酸は、約５０ｂｐ〜約１００ｋｂの大きい二本鎖ポリヌクレオチド、好ましくは、この大きいポリメラーゼは、５００ｂｐ〜５０ｋｂである。
【０２２１】
この大きいポリヌクレオチドは、鋳型ポリヌクレオチドと同じサイズのポリヌクレオチドのコピーをタンデムで含んでいる可能性がある。次に、この鎖状体ポリヌクレオチドを鋳型ポリヌクレオチドの単一コピーに変性する。その結果、サイズが鋳型ポリヌクレオチドとほぼ同じポリヌクレオチドの集団が得られる。この集団は、同一性領域と異種性領域を有する一本または二本鎖ポリヌクレオチドが、シャッフリング前に鋳型ポリヌクレオチドに添加された混合集団である。
【０２２２】
次いで、これらのポリヌクレオチドを、適したベクターにクローニングし、連結反応混合物を用いて、細菌を形質転換する。
【０２２３】
鎖状体（コンカテマー）の消化ではなく、ＰＣＲ（米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号）を含む様々な方法により、クローニング前に、単一ポリヌクレオチドを増幅することによって、大きい鎖状体ポリヌクレオチドから、単一ポリヌクレオチドを作製することができると考えられる。
【０２２４】
クローニングに用いるベクターは、所望のサイズのポリヌクレオチドを受容するものであれば、特に限定しない。特定のポリヌクレオチドの発現を所望する場合には、クローニング運搬体は、宿主細胞中のポリヌクレオチドの発現を可能にするために、ポリヌクレオチドの挿入部位に隣接して、転写および翻訳シグナルを含んでいなければならない。好ましいベクターとして、プラスミドのｐＵＣ系列およびｐＢＲ系列がある。
【０２２５】
このようにして得られる細菌集団は、ランダム突然変異を有する多数の組換え体ポリヌクレオチドを含む。この混合集団を試験して、所望の組換え体ポリヌクレオチドを同定することができる。この選択方法は、所望するポリヌクレオチドに応じて異なる。
【０２２６】
例えば、リガンドに対する結合効率が高いタンパク質をコードするポリヌクレオチドを所望する場合には、集団またはライブラリー中のポリヌクレオチドの各部分により発現されるタンパク質が、リガンドに結合する能力を、当業者には公知の様々な方法（すなわち、パンニング、アフィニティ・クロマトグラフィー）で試験される。薬剤耐性の高いタンパク質をコードするポリヌクレオチドを所望する場合には、集団またはライブラリー中のポリヌクレオチドの各々によって発現されるタンパク質が、宿主生物に薬剤耐性を賦与する能力を試験される。当業者にとって、所望するタンパク質の情報が得られれば、上記集団を試験することによって、該タンパク質に所望の特性を賦与するポリヌクレオチドを同定することは容易であろう。
【０２２７】
当業者は、タンパク質の断片をファージ表面に融合タンパク質として発現するファージ展示系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ウィスコンシン州ミルウォーキー）を使用することができる。融合タンパク質（その一部が組換え体ＤＮＡ分子によってコードされる）の転写を起こす部位で、該組換え体ＤＮＡ分子をファージＤＮＡにクローニングする。組換え体核酸分子を含むファージは、細胞内で、複製および転写を受ける。融合タンパク質のリーダー配列は、融合タンパク質の輸送を、ファージ粒子の先端に向ける。このようにして、組換え体ＤＮＡ分子により部分的にコードされる融合タンパク質がファージ粒子上に展示され、前述の方法により検出および選択する。
【０２２８】
さらに、所望の組換え体タンパク質をコードするＤＮＡを含む第１集団のサブ集団由来のポリヌクレオチドに対して、複数の核酸シャッフリングサイクルを実施してもよい。この方法では、これまでより高い結合親和性もしくは酵素活性を有するタンパク質を達成できる可能性がある。
【０２２９】
また、野生型ポリヌクレオチドと、第１ラウンド、もしくは、それに続くラウンドの核酸シャッフリングから得た核酸サブ集団との混合物に対して、複数の核酸シャッフリングサイクルを実施することにより、サブ集団からサイレント突然変異を除去することも可能である。
【０２３０】
精製された状態のあらゆる核酸の供給源を出発核酸として使用することができる。従って、この方法では、ＤＮＡ、または、メッセンジャーＲＮＡを含むＲＮＡを使用することができ、また、これらＤＮＡもしくはＲＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。さらに、それぞれの一本鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを用いてもよい。核酸配列は、突然変異を起こそうとする核酸配列のサイズに応じて、長さが違ってくる。好ましくは、特定核酸配列は、５０〜５０，０００塩基対である。本発明の方法に、関心のあるタンパク質をコードする核酸を含むベクターを使用することも考えられる。
【０２３１】
核酸は、あらゆる供給源、例えば、ｐＢＲ３２２のようなプラスミド、クローン化したＤＮＡまたはＲＮＡ、もしくは、細菌、酵母、ウイルス、ならびに、植物や動物等の高等生物を含むあらゆる採取源からの天然ＤＮＡまたはＲＮＡから取得してものでよい。ＤＮＡまたはＲＮＡは、血液または組織材料から採取してもよい。鋳型ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド連鎖反応を用いた増幅（ＰＣＲ、米国特許第４，６８３，２０２号および同第４，６８３，１９５号）により得ることができる。あるいは、ポリヌクレオチドは、細胞に存在するベクターに含まれるものでもよく、細胞を培養し、当業者には公知の方法により、細胞から核酸を採取することによって、十分な核酸を得ることができる。
【０２３２】
どのような特定の核酸配列も、本発明の方法によりハイブリッド集団を生成するのに使用することができる。唯一必要なのは、特定核酸配列のハイブリッド配列の小集団が、本方法の前に存在する、もしくは作製されることである。
【０２３３】
突然変異を有する特定核酸配列の初期小集団は、多数の様々な方法によって作製することができる。突然変異は、誤りがちなＰＣＲによって発生させてもよい。誤りがちなＰＣＲは、忠実度の低い重合条件を用いて、長い配列にわたって、低いレベルの点突然変異をランダムに導入する。あるいは、突然変異は、オリゴヌクレオチド指令突然変異誘発によって、鋳型ポリヌクレオチドに導入することもできる。オリゴヌクレオチド指令突然変異誘発では、ポリヌクレオチドから、制限酵素消化を用いて、短い配列のポリヌクレオチドを除去し、合成ポリヌクレオチドと置換する。この合成ポリヌクレオチドでは、元の配列から、様々な塩基が変化させてある。また、上記ポリヌクレオチド配列は、化学的突然変異誘発によって変化させることも可能である。化学的突然変異誘発原には、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはギ酸等が含まれる。ヌクレオチド前駆体の類似体であるその他の薬剤として、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、もしくはアクリジンが挙げられる。一般に、これら薬剤は、ヌクレオチド前駆体の代わりに、ＰＣＲ反応に添加し、これによって、配列に突然変異を起こす。また、プロフラビン、アクリフラビン、キナクリン等のインターカレート剤を使用してもよい。ポリヌクレオチドのランダム突然変異誘発は、Ｘ線または紫外線の照射により達成することもできる。一般に、このように突然変異を誘発させたプラスミドポリヌクレオチドを大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）に導入し、ハイブリッドプラスミドのプールまたはライブラリーとして増殖させる。
【０２３４】
あるいは、特定核酸の小混合集団は、自然界に見いだすことができ、この場合、これら核酸は、同じ遺伝子、もしくは、異なる近縁種由来の同じ遺伝子（すなわち、コグネイト遺伝子）の様々な対立遺伝子から成り得る。あるいはまた、これら核酸は、例えば、免疫グロブリン遺伝子等、１つの種に認められる類縁ＤＮＡ配列であることもある。
【０２３５】
特定核酸配列の混合集団を生成したら、ポリヌクレオチドを直接使用するか、もしくは、当業者には公知の方法で、適切なクローニングベクターに挿入することができる。
【０２３６】
ベクターの選択は、ポリヌクレオチド配列のサイズ、ならびに、本発明の方法で用いる宿主細胞に応じて行う。本発明の鋳型は、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、パラインフルエンザウイルス、ヘルペルウイルス、レオウイルス、パラミクソウイルス等）、あるいはそれらの選択部分（例えば、コートタンパク質、スパイク（ｓｐｉｋｅ）糖タンパク質、キャプシドタンパク質）でよい。例えば、突然変異を起こそうとする特定核酸配列が大きい場合には、コスミドおよびファージミドが好ましい。というのは、これらのベクターは、大きなポリヌクレオチドを安定して増やすことができるからである。
【０２３７】
特定核酸配列の混合集団をベクターにクローニングする場合には、宿主細胞に各ベクターを挿入し、宿主細胞にベクターを増幅させることによって、クローン的に増幅することができる。これは、核酸配列の絶対数が増加するのに対し、ハイブリッドの数は増えないために、クローン増幅と呼ばれる。発現ポリヌクレオチドをスクリーニングすることにより、有用性を容易に判定することができる。
【０２３８】
本発明のＤＮＡシャッフリング法は、未知の配列のプールについて、ブラインド方式で実施することができる。再集合混合物にオリゴヌクレオチド（再集合させる配列と相同性の末端を有する）を添加することにより、どんな特定の位置ででも、あらゆる配列混合物を別の配列混合物に組み込むことができる。従って、合成オリゴヌクレオチドの混合物、ＰＣＲポリヌクレオチドの混合物、あるいは、全遺伝子の混合物さえも、規定した位置で、別の配列ライブラリーに混合することができると考えられる。１つの配列の挿入（混合）は、鋳型の別の部分への配列の挿入とは無関係である。このように、組換え度、要求される相同性、ならびに、ライブラリーの多様性は、再集合したＤＮＡの長さに沿って、独立してかつ同時に変えることができる。
【０２３９】
二つの遺伝子を混合するこの手法は、マウスハイブリドーマ由来の抗体のヒト化に有用である。二つの遺伝子を混合する、もしくは、代替配列を遺伝子に挿入する手法は、治療に用いられているあらゆるタンパク質、例えば、インターロイキンＩ、抗体、ｔＰＡおよび成長ホルモンに有用である。また、この手法は、発現を高める、あるいはタンパク質の発現の特異性を変化させる上で、あらゆる核酸、例えば、プロモーターもしくはイントロン、または、遺伝子の３１非翻訳領域または５１非翻訳領域において有用である。また、この手法を使用して、リボザイムまたはアプタマーに突然変異を起こすこともできる。
【０２４０】
シャッフリングには、多様性領域を分離する相同性領域の存在が必要である。シャッフリングには、スカフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）様タンパク質構造が特に適している。保存されたスカフォールドが、自己会合による全体的なフォールディングを決定すると同時に、特異的結合を媒介する比較的制限されていないループを展示する。このようなスカフォールドの例として、当業者には公知の免疫グロブリンβバレル、ならびに４ヘリックス束がある。このシャッフリングを使用して、結合のための突然変異配列の様々な組合せを有するスカフォールド様タンパク質を生成することができる。
【０２４１】
飽和突然変異誘発
１つの態様では、本発明は、ポリヌクレオチドに点突然変異を導入し、単一のアミノ酸置換の全範囲が各アミノ酸の位置で表される一連の子孫ポリペプチドを作出するための特許コドンプライマー（縮重したＮ、Ｎ、Ｇ／Ｔ配列を含む）の使用を提供する。使用されるオリゴは第１の相同配列、縮重したＮ、Ｎ、Ｇ／Ｔ配列、および好ましいが必ずしも必要ではない第２の相同配列を隣接して包含する。Ｎ、 Ｎ、Ｇ／Ｔ配列の縮重は２０種類のアミノ酸すべてのコドンを含むので、かかるオリゴの使用から得られる下流の子孫翻訳産物は、ポリペプチドに沿ったそれぞれのアミノ酸部位で可能性のあるすべてのアミノ酸変化を含む。
１つの態様では、かかる１つの縮重オリゴ（１つの縮重Ｎ、Ｎ、Ｇ／Ｔカセットを含んでなる）は、親ポリヌクレオチド鋳型中の各原型コドンに全範囲のコドン置換を受けさせるのに用いられる。別の態様では、同じオリゴ内であろうとなかろうと、少なくとも２つの縮重Ｎ、Ｎ、Ｇ／Ｔカセットを使用して、親ポリヌクレオチド鋳型の少なくとも２つの原型コドンに全範囲のコドン置換を受けさせる。このように、２以上のＮ、Ｎ、Ｇ／Ｔ配列が１つのオリゴに含まれれば、２以上の部位でアミノ酸突然変異を導入することができる。この複数のＮ， Ｎ， Ｇ／Ｔ配列は直接隣接していてもよいし、または１以上のさらなるヌクレオチド配列により分離されていてもよい。もう１つの態様では、付加および欠失の導入に役立つオリゴを、単独でまたはＮ、Ｎ、Ｇ／Ｔ配列を含むコドンと組み合わせて用い、アミノ酸の付加、欠失および／もしくは置換のいずれかの組合せまたは順列を導入することができる。
【０２４２】
特に例示すれば、隣接するＮ、Ｎ、Ｇ／Ｔトリプレット、すなわち縮重した（Ｎ、 Ｎ、Ｇ／Ｔ）ｎ配列を含むオリゴを用いて、２以上の隣接するアミノ酸位置に同時に突然変異を誘発することが可能である。
【０２４３】
もう１つの態様では、本発明は、Ｎ、Ｎ、Ｇ／Ｔ配列よりも縮重の少ない縮重カセットの使用を提供する。例えば、いくつかの例では、１個のＮ（このＮはトリプレットの１番目、２番目または３番目の位置に存在し得る）のみを含む縮重トリプレット配列を使用する（例えばオリゴ内で）ことが望ましい。いずれかの組合せおよびその順列を含む他の塩基はいずれもトリプレットの２つの位置を残して使用できる。あるいは、いくつかの例では、縮重したＮ、Ｎ、Ｎトリプレット配列またはＮ、Ｎ、Ｇ／Ｃトリプレット配列を使用する（例えばオリゴ内で）のが望ましい。
【０２４４】
しかし、本発明で開示されるように縮重トリプレット（Ｎ、Ｎ、Ｇ／ＴまたはＮ、Ｎ、Ｇ／Ｃトリプレット配列など）の使用にはいくつかの理由で利点があると考えられる。１つの態様では、本発明は、可能性のあるアミノ酸（２０種類のアミノ酸の全て）の全範囲の、ポリペプチド中の各アミノ酸への、またアミノ酸の位置ごとの置換を系統的かつ極めて容易にもたらす手段を提供する。従って、１００のアミノ酸ポリペプチドに対して本発明は、２０００の異なる種（すなわち、位置につき２０の可能性あるアミノ酸×１００のアミノ酸位置となる）を系統的かつ極めて容易に作出する手段を提供する。縮重Ｎ、Ｎ、Ｇ／ＴまたはＮ、Ｎ、Ｇ／Ｃトリプレット配列を含むオリゴを使うことにより、２０種類の可能性あるアミノ酸をコードする３２の独立する配列が提供されると考えられる。従って、かかる１つのオリゴを用いて親ポリヌクレオチド配列が飽和突然変異誘発を受ける反応槽内では、２０の異なるポリペプチドをコードする３２の異なる子孫ポリヌクレオチドが生じる。これに対し、部位特異的突然変異誘発で非縮重オリゴを使用すると、反応槽につきたった１つの子孫ポリペプチド産物しか得られない。
【０２４５】
本発明はまた、場合により開示された縮重プライマーと併用できる非縮重オリゴの使用を提供する。状況によっては、非縮重オリゴを用いて実施中のポリヌクレオチドに特異的な点突然変異を作製することが有利であると考えられる。これは特異的なサイレント点突然変異、対応するアミノ酸を変化をもたらす点突然変異、および停止コドンの生成と対応するポリペプチド断片の発現を引き起こす点突然変異を作出する手段を提供する。
【０２４６】
従って、本発明の好ましい実施形態では、各々の飽和突然変異誘発反応槽は、少なくとも２０の子孫ポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドを含有するので、２０のアミノ酸すべてが親ポリヌクレオチド内で突然変異を誘発したコドンの位置に対応する１つの特異的なアミノ酸位置で表される。各々の飽和突然変異誘発反応槽から生じた３２倍の縮重した子孫ポリペプチドをクローン増幅に付し（例えば、発現ベクターを用いて好適な大腸菌宿主へクローン化する）、発現スクリーニングに付すことができる。スクリーニングにより個々の子孫ポリペプチドが、（親ポリペプチドと比較して）好ましい特性変化を示すことが同定されると、それに応じてそこに含有される好ましいアミノ酸置換の同定のために配列決定することが可能である。
【０２４７】
本明細書で開示された飽和突然変異誘発を用いた親ポリペプチド内で、各アミノ酸の位置、またアミノ酸ごとに突然変異を誘発する上で、好ましいアミノ酸変化を２以上のアミノ酸位置で同定することができると考えられる。これらの好ましいアミノ酸置換のすべてまたは一部の組合せを含む１以上の新しい子孫分子を作出できる。例えば、もし２つの特異的かつ好ましいアミノ酸変化が、ポリペプチド内の３つのアミノ酸の位置の各々で同定されるならば、各位置（元のアミノ酸からは変化せず、かつ、２つはそれぞれ好ましい変化）で３通りの可能性および３つの位置が順列に含まれる。従って、これまでに調べた７つ、すなわち６個の単一点突然変異（すなわち、３つの位置の各々で２つ）といずれの位置でも変化していなものを含め、３×３×３通りすなわち全体で２７通りの可能性がある。
【０２４８】
さらにもう１つの態様では、部位飽和突然変異誘発はスクリーニングとともに、シャッフリング、キメラ化、組換えおよび他の突然変異誘発プロセスと併用できる。本発明は飽和突然変異誘発を含む反復法による任意の突然変異誘発法の使用を提供する。１つの例としては、任意の突然変異誘発法の反復使用がスクリーニングと併用される。
【０２４９】
従って、限定されるものではないが例として、本発明は、ハイブリッドポリヌクレオチドが組換えおよび減少性再組合せにより生じるように、２以上の関連ポリヌクレオチドを好適な宿主細胞へ導入する方法など、さらなる突然変異誘発法と組み合わせた飽和突然変異誘発の使用を提供する。
【０２５０】
ある遺伝子の全配列に沿って突然変異誘発を行うことに加えて、本発明は、ポリヌクレオチド配列内の任意の数の塩基をそれぞれ置換するのに使用することができる突然変異誘発を提供し、ここでは突然変異が誘発される塩基数は、１５から１００，０００までのすべての整数であることが好ましい。従って、分子に沿って位置ごとに突然変異を誘発する代わりに、不連続な塩基数（好ましくは総計１５から１００，０００までの部分集合）ごとに突然変異を起こすことが可能である。好ましくは、ポリヌクレオチド配列に沿ってそれぞれの位置あるいは位置の群を突然変異誘発するのに別個のヌクレオチドを使用する。突然変異誘発される３つの位置の１群は１つのコドンであってよい。突然変異は好ましくは突然変異誘発カセットとも呼ばれる異種カセットを含む突然変異誘発プライマーを用いて導入される。好ましいカセットは１〜５００塩基を持ち得る。かかる異種カセットのそれぞれのヌクレオチド位置はＮ、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ａ／Ｃ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｔ、Ｃ／Ｇ、Ｃ／Ｔ、Ｇ／Ｔ、Ｃ／Ｇ／Ｔ、Ａ／Ｇ／Ｔ、Ａ／Ｃ／Ｔ、Ａ／Ｃ／ＧまたはＥであり、ＥはＡ、Ｃ、ＧまたはＴ以外のいずれの塩基でもよい（Ｅはデザイナーオリゴ（ｄｅｓｉｇｎｅｒ ｏｌｉｇｏ）と呼び得る）。下記の表は例示的なトリヌクレオチドカセットを示している（Ｎ、Ｎ、Ｇ／Ｔ；Ｎ、Ｎ、ＮおよびＮ、 Ｎ、Ａ／Ｃの他に３０００を越える可能性がある）。
【０２５１】
一般的な意味において、飽和突然変異誘発は、変異誘発させる規定のポリヌクレオチド配列（ここで変異誘発させる配列は好ましくは１５〜１００，０００塩基長である）内の完全なセットの突然変異誘発カセット（各カセットは好ましくは１〜５００塩基長である）を変異誘発することを含む。従って、突然変異群（１〜１００の突然変異にわたる）が各カセットに導入されて変異誘発される。飽和突然変異誘発を１回おこなう間、１つのカセットへ導入される突然変異の群は、第２のカセットへ導入される第２の突然変異の群と異なっていてもよいし、あるいは同じであってもよい。かかる群の例としては、欠失、付加、特定のコドンの群、および特定のヌクレオチドカセットの群が挙げられる。
【０２５２】
変異誘発させる規定の配列（図２０を参照）としては、好ましくは遺伝子全体、経路、ｃＤＮＡ、全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、および完全なプロモーター、エンハンサー、リプレッサー／トランスアクチベーター、複製起点、イントロン、オペレーター、または任意のポリヌクレオチド官能基が挙げられる。一般に、この目的に好ましい「規定の配列」は１５塩基のポリヌクレオチド配列および１５塩基〜１５，０００塩基長のポリヌクレオチド配列（本発明はこの間の全ての整数に特に名前をつけている）を有する任意のポリヌクレオチドであってよい。コドンの群を選択するときには、縮重突然変異誘発カセットによりコードされるアミノ酸の種類を考慮する。
【０２５３】
突然変異誘発カセット（表１−８５を参照）に導入可能な突然変異の群の特に好ましい例では、本発明は特に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および ２０のアミノ酸を各位置にコードする縮重コドン置換（縮重オリゴを用いる）、およびそれによりコードされるポリペプチドライブラリーを提供する。
【０２５４】
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２．１１．２．３．エキソヌクレアーゼ媒介の再集合
ある実施形態では、本発明は、少なくとも二つのポリヌクレオチドのシャッフリング、集合、再集合、組換え、および／または鎖状体化を行なって、子孫ポリヌクレオチド（例えば、発現して、ポリペプチドもしくは遺伝子経路を形成することのできるキメラ子孫ポリヌクレオチド）を生成する方法を提供する。ある実施形態では、二本鎖のポリヌクレオチド末端（例えば、互いをハイブリダイゼーションの相手としてハイブリダイズした二つの一本鎖配列）をエキソヌクレアーゼで処理し、二本の鎖の一方からヌクレオチドを遊離させ、その元の相手を含まない残った鎖を残存させ、所望であれば、残った鎖を、別の相手とのハイブリダイゼーションを達成するのに使用することができる。
【０２５５】
具体的には、二本鎖のポリヌクレオチド末端（ポリヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド配列の一部であるか、もしくは、これらに接続されている場合もある）をエキソヌクレアーゼ活性源にさらす。有用なエキソヌクレアーゼ活性源としては、３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、３’エキソヌクレアーゼ活性および５’エキソヌクレアーゼ活性の両方を有する酵素、ならびに、これらのうちいずれかの組合せが挙げられる。エキソヌクレアーゼを用いて、線状二本鎖のポリヌクレオチドの一端または両端から、ならびに、３つ以上の末端を有する分枝ポリヌクレオチドの一端〜全末端から、ヌクレオチドを遊離させることができる。この遊離作用のメカニズムは、末端ヌクレオチドの酵素触媒による加水分解から成るものと考えられ、時間依存的に進行させ、酵素処理の進行を実験的に制御することができる。
【０２５６】
これに対し、非酵素的方法を使用して、ポリヌクレオチドビルディングブロックのシャッフリング、集合、再集合、組換え、および／または鎖状体化を行なうことができるが、これは、実施サンプルを変性（もしくは「融解」）条件（例えば、温度、ｐＨ、および／または塩度条件を変えることによる）に付し、二本鎖ポリヌクレオチドの実施セットをポリヌクレオチド一本鎖に融解することから成る。シャッフリングのためには、ポリヌクレオチド一本鎖が、ある程度まで、異なるハイブリダイゼーション相手とのアニールメントに参加する（すなわち、変性ステップの前に、前の相手であった者同士の間での排他的再アニールメントに単に逆戻りしない）ことが望ましい。しかし、反応容器中の、前のハイブリダイゼーション相手の存在は、元の二本鎖ポリヌクレオチドを再形成するための前の相手と一本鎖ポリヌクレオチドとの再アニールメントを妨害するわけではなく、時には、有利に働く場合もある。
【０２５７】
二本鎖ポリヌクレオチドのビルディングブロックを変性に付した後、アニールメントを実施することから成る上記の非酵素的シャッフリング方法とは対照的に、本発明は、さらに、変性を必要としないエキソヌクレアーゼに基づく手法を提供する。むしろ、変性条件の回避、ならびにアニーリングした（すなわち非変性）状態での二本鎖ポリヌクレオチド基質の維持が、エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩとｒｅｄα遺伝子産物）の作用に必要な条件である。さらに、対照的に、他の一本鎖ポリヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる一本鎖ポリヌクレオチド配列の生成は、一方のハイブリダイゼーション相手における共有結合切断（従って、配列の破壊）の結果、起こる。例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ酵素を用いて、一本のハイブリダイゼーション鎖の３’末端ヌクレオチドを酵素により遊離させる（これによって、該ポリヌクレオチド鎖において共有結合加水分解を達成する）ことができる。これが、残った一本鎖と、新しい相手とのハイブリダイゼーションを促進する（前の相手は、共有結合切断にかけられたため）。
【０２５８】
さらに詳しく説明すると、３’エキソヌクレアーゼの例として、特定のエキソヌクレアーゼ、すなわち、エキソヌクレアーゼＩＩＩが挙げられる。しかし、５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素および３’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素、ならびに、まだ発見されていない酵素およびまだ開発されていない酵素等、その他のエキソヌクレアーゼを用いてもよい。特に、上に開示した手法のために、反応速度がさらに最適で、および／または、特異的活性がさらに高く、および／または、不要活性がさらに少ない、酵素の発見、最適化（例えば、定方向進化による）、あるいは発見および最適化の両方が可能であることに特に留意すべきである。実際、本発明が、このようなデザイナー酵素の発見および／または開発を奨励すると予想される。すなわち、本発明は、現在入手可能な多様なエキソヌクレアーゼ酵素、さらには、まだ発見されていない酵素や、まだ開発されていない酵素を用いて、実施可能である。
【０２５９】
エキソヌクレアーゼＩＩＩのエキソヌクレアーゼ作用は、平滑であるか、あるいは５’オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有する実施二本鎖ポリヌクレオチド末端を必要とし、エキソヌクレアーゼ作用は、酵素により、３’末端ヌクレオチドを遊離させて、一本鎖５’末端を残す。この５’末端は、エキソヌクレアーゼ作用が進行するほど、長くなる（図１参照）。この手法により生成された５’オーバーハングを用いて、ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分な相同性を共有する別の一本鎖ポリヌクレオチド配列（これもまた一本鎖ポリヌクレオチドでもよいし、あるいは、部分的に二本鎖のポリヌクレオチドの末端オーバーハングでもよい）にハイブリダイズすることもできる。これらエキソヌクレアーゼＩＩＩにより生成した一本鎖配列（例えば、５’オーバーハングにおける）が、他の一本鎖配列にハイブリダイズする能力によって、２つ以上のポリヌクレオチドのシャッフリング、集合、再集合、および／または鎖状化が可能となる。
【０２６０】
さらに、必要に応じて、二本鎖ポリヌクレオチドの末端を保護する、あるいは、該末端が、有用なエキソヌクレアーゼの所望の酵素作用を受けやすくなるようにすることができる。例えば、３’オーバーハングを有する二本鎖ポリヌクレオチド末端は、エキソヌクレアーゼＩＩＩのエキソヌクレアーゼ作用を受けにくい。しかし、様々な手段により、これが、エキソヌクレアーゼＩＩＩのエキソヌクレアーゼ作用を受けやすくなるようにすることができる。例えば、該ポリヌクレオチドをポリメラーゼを用いた処理により平滑末端化する；該ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端または５’オーバーハングを与える；別の二本鎖ポリヌクレオチドに結合（連結またはハイブリダイズ）して、平滑末端または５’オーバーハングを与える；一本鎖ポリヌクレオチドにハイブリダイズして、平滑末端または５’オーバーハングを与える；あるいは、様々な手段のいずれかにより修飾する。
【０２６１】
ある形態によれば、エキソヌクレアーゼを、線状二本鎖ポリヌクレオチドの一端または両端で作用させ、完全に、ほぼ完全に、もしくは部分的に進行させる。エキソヌクレアーゼ作用を完全に進行させると、各５’オーバーハングの長さが、「ランデブーポイント（ｒｅｎｄｅｚｖｏｕｓ ｐｏｉｎｔ）」（ポリヌクレオチド中心点近傍）と考えられる方向に、ポリヌクレオチドの中央領域に向かって、長く延びてくる。最後には、各々が、元の二本鎖ポリヌクレオチドの長さの約半分の一本鎖ポリヌクレオチド（解離することもできる）が生成される（図１）。あるいは、完全に進行させる前に、エキソヌクレアーゼ仲介反応を終了することも可能である。
【０２６２】
このように、このエキソヌクレアーゼ仲介手法は、ポリヌクレオチドのビルディングブロックのシャッフリング、集合、および／または再集合、組換え、ならびに鎖状体化を行なう上で有用である。尚、このポリヌクレオチドビルディングブロックは、１０個までの塩基長、数十個の塩基長、数百個の塩基長、数千個の塩基長、数万個の塩基長、数十万個の塩基長または数百万個の塩基長、あるいは、それ以上の塩基長のものでもよい。
【０２６３】
このエキソヌクレアーゼ仲介手法は、大腸菌エキソヌクレアーゼＩＩＩの二本鎖ＤＮＡ特異的エキソデオキシリボヌクレアーゼ活性の作用に基づく。エキソヌクレアーゼＩＩＩの基質は、二本鎖ポリヌクレオチドを断片化することにより生成することができる。断片化は、機械的手段（例えば、剪断、超音波処理等）、酵素的手段（例えば、制限酵素の使用）、ならびに、これらのいずれかの組合せにより達成することができる。これより大きいポリヌクレオチドの断片も、ポリメラーゼ仲介合成により得られる。
【０２６４】
エキソヌクレアーゼＩＩＩは、２８Ｋモノマー酵素、すなわち、大腸菌のｘｔｈＡ遺伝子の産物であり、次の４つの既知の活性を有する：エキソデオキシリボヌクレアーゼ（本書では、代わって、エキソヌクレアーゼと呼ぶ）、ＲＮａｓｅＨ、ＤＮＡ−３’−ホスファターゼ、ならびにＡＰエンドヌクレアーゼ。エキソデオキシリボヌクレアーゼ活性は、二本鎖ＤＮＡに特異的である。作用のメカニズムは、３’末端から徐々に５’方向に向かってＤＮＡの酵素加水分解を起こし、ヌクレオシド５’−リン酸と、残った一本鎖を形成すると考えられる。この酵素は、一本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、または二本鎖ＲＮＡの効率的な加水分解を示さないが、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中のＲＮＡを分解してヌクレオシド５’−リン酸を放出する。この酵素はまた、ＤＮＡの３’ホスホモノエステル基から特異的に無機リン酸を放出するが、ＲＮＡまたは短いオリゴヌクレオチドからは放出しない。これらの基を除去することにより、末端がＤＮＡポリメラーゼ作用のためのプライマーに変換される。
【０２６５】
エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素の別の例として、レッドアルファおよびヘビ毒ホスホジエステラーゼがある。レッドアルファ（ｒｅｄα）遺伝子産物（ラムダエキソヌクレアーゼとも呼ばれる）は、バクテリオファージλに由来する。ｒｅｄα遺伝子は、左方向のプロモーターから転写され、その産物は組換えに関与する（２４ｋＤ）。レッドアルファ遺伝子産物は、５’−リン酸化末端から前進的に作用して、二本鎖ＤＮＡからモノヌクレオチドを遊離させる（高橋および小林、１９９０）。ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ、１９８０）は、スーパーコイルドＤＮＡを急速に開くことができる。
【０２６６】
関連性はあるが同一ではない核酸鎖は、キメラ分子の生成の１ステップとしてハイブリダイズすることができると考えられる。しかしながら、これらの核酸鎖はまったく同一ではないため、非同一核酸のアニールメントである、ヘテロ複合体（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ）とでも呼ばれるものを形成することができる。この複合体においては、２つの異種鎖が部分的にハイブリダイズすることはあるが、著しく異種の鎖の末端配列はハイブリダイズしないと思われるため、これら異種鎖はハイブリダイズする可能性があるということになる。しかし、ハイブリダイズしない末端は、伸長を開始したり連結点として役立つためには最適とはいえないため、これは問題である。従って、別の実施形態では、本発明は、ヘテロ核酸複合体中のアニーリングさせた核酸鎖のハイブリダイズしていない一本鎖末端から３’末端ヌクレオチドおよび５’末端ヌクレオチドを遊離させ、短くされているがハイブリダイズした末端を残存させることにより処理末端のポリメラーゼに基づく伸長および／またはリガーゼ仲介型連結を促進する手段としてのエキソヌクレアーゼ処理の使用を提供する。この手順は、「解放された末端のプルーニング （ｐｒｕｎｉｎｇ ｏｆ ｌｏｏｓｅ ｅｎｄｓ）」と仮称されている。この「プルーニング」の目的のために、種々のエキソヌクレアーゼを使用することが可能である。本発明による「プルーニング」目的のための特に好ましいエキソヌクレアーゼ処理としては、ヤエナリ （Ｍｕｎｇ ｂｅａｎ）ヌクレアーゼによる処理、Ｓ１ヌクレアーゼによる処理、およびＥ．Ｃｏｌｉ ＤＮＡ による処理などがある。本発明による「プルーニング」目的のためのさらなる好ましいエキソヌクレアーゼ処理としては、以下に列挙する酵素の使用がある（選択した酵素の特質を選択的に提供する）。
【０２６７】
エキソヌクレアーゼ
2004500019.tif 000066
ａ． Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
ｂ． Ｐｒｏｍｅｇａ
ｃ． Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ
ｄ． Ｒｏｃｈｅ
ｅ． Ｋｏｎｇ， Ｈ．Ｍ．， Ｋｕｃｅｒａ， Ｒ．Ｂ．．， ａｎｄ Ｊａｃｋ， Ｗ．Ｅ．， （１９９３） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．
２６８， １９６５−１９７５．
ｆ． ＭｃＣｌｕｒｅ， Ｗ．Ｒ． ａｎｄ Ｊｏｖｉｎ， Ｔ．Ｍ．， （１９７５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２５０， ４０７３−
４０８０．
ｇ． Ｐｏｌｅｓｋｙ Ａ．Ｈ．， Ｓｔｅｉｔｚ， Ｔ．Ａ．， Ｇｒｉｎｄｌｅｙ， Ｎ．Ｄ．Ｆ． ａｎｄ Ｊｏｙｃｅ， Ｃ．Ｍ．， （１９９０）
Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５， １４５７９−１４５９１．
ｈ． Ｇｉｌｌｉｎ， Ｆ．Ｄ． ａｎｄ Ｎｏｓｓａｌ， Ｎ．Ｇ．， （１９７５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．
Ｃｏｍｍｕｎ． ６４， ４５７−４６４．
ｉ． Ｐａｔｅｌ， Ｓ．Ｓ．， Ｗｏｎｄ， Ｅ． ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｋ．Ａ．， （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０，
５１１−５２５．
ｋ． より高濃度の酵素で、両末端から切断するいくらかの二本鎖エキソヌ
クレアーゼ活性を示す
ｍ．より高濃度の酵素で、切断するいくらかの二本鎖エキソヌクレアー
ゼ活性を示す
別の好ましい態様では、本発明は、エキソヌクレアーゼ仲介再集合用の核酸ビルディングブロックが、同一でない核酸鎖にハイブリダイズする際にヘテロ複合体を形成する核酸鎖を含むことを提供する。こうした複合体において、他の１つ以上の鎖にアニーリングする鎖は多結合鎖と称され、他の１つだけの鎖にアニーリングする鎖は単一結合鎖と称される。従って、常にというわけではないが通常は、単一結合鎖の長さは多結合鎖よりも短い。限定的でない例では、単一結合鎖と多結合鎖は共に、合成、断片化（物理的若しくは酵素による）、単離（Ｄｐｎ Ｉでの選択処理等による）および／または変性のいずれかによる鋳型先祖分子から生成することができる。
【０２６８】
２．１１．２．３．非確率論的連結再集合
ある形態では、本発明は、合成連結再集合（ＳＬＲ）と呼ばれる非確率論的方法を提供する。これは、核酸ビルディングブロックをランダムにシャッフリングまたは鎖状体化もしくはキメラ化するのではなく、非確率論的に集合させることを除けば、確率論的シャッフリングに幾分近い。
【０２６９】
特にはっきりとした違いは、このＳＬＲ法が、シャッフリングしようとするポリヌクレオチド間に高いレベルの相同性があるかどうかに左右されないことである。対照的に、従来の方法、特に、従来の確率論的シャッフリング方法は、シャッフリングしようとするポリヌクレオチド間、特に、連結部位に、高いレベルの相同性を必要とした。従って、これら従来の方法は、元の前駆分子の再生成に有利であり、また、多数の新しい子孫キメラ、特に、完全長さの子孫の生成には次善の手段であった。これに対し、本発明を用いて、１０１００を超える異なるキメラから成る子孫分子のライブラリー（またはセット）を非確率論的に生成することができる。また、ＳＬＲを用いて、１０１００以上の異なる子孫キメラ（知る限り、上限はない）から成るライブラリーを生成することもできると考えられる。
【０２７０】
従って、ある態様では、本発明は、設計により選択される全体集合順序を有する最終的キメラ核酸分子のセットを生成する非確率論的方法であって、有用で、互いに適合する連結可能な末端を有する複数の特異的核酸ビルディングブロックを設計により生成するステップと、設計した全体集合順序が達成されるように、上記核酸ビルディングブロックを集合させるステップから成る方法を提供する。
【０２７１】
集合させようとする核酸ビルディングブロックの互いに適合する連結可能な末端は、これら末端が、該ビルディングブロックを予め決められた順序で結合させることができれば、このタイプの定序集合に「有用である」とみなす。従って、一形態では、核酸ビルディングブロックを結合できる全体構成順序は、連結可能な末端の設計によって定められる。１つ以上の集合ステップを用いる場合には、核酸ビルディングブロックを結合する全体集合順序も、集合ステップの逐次順序によって定められる。図４、パネルＣは、５つの核酸ビルディングブロックについて、設計された（非確率論的）全体集合順序を達成するための２つの連続したステップから成る集合方法を例示する。本発明の好ましい態様では、アニーリングした構成要素を、リガーゼ（例えば、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）で処理し、構成要素の共有結合を達成する。
【０２７２】
好ましい実施形態では、最終的キメラ核酸分子の子孫セットを生成するための基礎として働く前駆核酸鋳型セットの配列を分析することにより、核酸ビルディングブロックの設計が得られる。これらの前駆核酸鋳型は、突然変異誘発を起こそうとする、すなわち、キメラ化もしくはシャッフリングしようとする核酸ビルディングブロックの設計に役立つ配列情報源としての役割を果たす。
【０２７３】
ある態様では、本発明は、近縁の遺伝子ファミリーと、これら近縁産物のコードされたファミリーのキメラ化に関する。具体的には、コードされた産物とは酵素である。本発明の態様に従い、突然変異誘発を起こすことのできる酵素グループの代表例として、下記の酵素およびそれらの機能を挙げることができる。
【０２７４】
１　リパーゼ／エステラーゼ
ａ．エステル（脂質）／チオエステルの対掌選択的加水分解
１）　ラセミ混合物の分割
２）　メソジエステル由来の光学活性酸またはアルコールの合成
ｂ．選択的合成
１）　炭水化物エステルの位置特異的加水分解
２）　環状第２級アルコールの選択的加水分解
ｃ．光学活性エステル、ラクトン、酸、アルコールの合成
１）　活性化／非活性化エステルのエステル交換反応
２）　インターエステリフィケーション
３）　ヒドロキシエステル由来の光学活性ラクトン
４）　無水物の位置および対掌選択的開環
ｄ．デタージェント
ｅ．脂肪／油変換
ｆ．チーズの熟成
２　プロテアーゼ
ａ．エステル／アミド合成
ｂ．ペプチド合成
ｃ．アミノ酸エステルのラセミ混合物の分割
ｄ．非天然アミノ酸の合成
ｅ．デタージェント／タンパク質加水分解
３　グリコシダーゼ／グリコシルトランスフェラーゼ
ａ．糖／ポリマー合成
ｂ．モノ、ジ−およびオリゴサッカリドを生成するためのグリコシド結合の切断
ｃ．複合オリゴサッカリドの合成
ｄ．ＵＤＰ−ガラクトシルトランスフェラーゼを用いたグリコシド合成
ｅ．ジサッカリド、グリコシルフロリド、アリールガラクトシドのグリコシル転移
ｆ．オリゴサッカリド合成におけるグリコシル転移
ｇ．βグルコシルスルフォキシドのジアステレオ選択性切断
ｈ．非対称グリコシル化
ｉ．食品加工
ｊ．紙加工
４　ホスファターゼ／キナーゼ
ａ．リン酸エステルの合成／加水分解
１）　位置−、対掌選択的リン酸化
２）　リン酸エステルの導入
３）　ホスホリピッド前駆体の合成
４）　制御されたポリヌクレオチド合成
ｂ．生物学的分子の活性化
ｃ．保護基を用いない選択性リン酸結合の形成
５　モノ／ジオキシゲナーゼ
ａ．活性化していない有機基質の直接オキシ官能化
ｂ．アルカン、芳香族、ステロイドのヒドロキシル化
ｃ．アルケンのエポキシド化
ｄ．対掌選択的スルホキシド化
ｅ．位置−および立体選択性Ｂａｙｅｒ−Ｖｉｌｌｉｇｅｒ酸化
６　ハロペロキシダーゼ
ａ．求核部位へのハロゲン化物イオンの酸化的付加
ｂ．オレフィン結合への次亜ハロゲン酸の付加
ｃ．シクロプロパンの環切断
ｄ．オルトおよびパラ誘導体に変換された活性化芳香族基質
ｅ．２−ハロ−誘導体に変換された１，３ジケトン
ｆ．基質を含む硫黄および窒素の異種原子酸化
ｇ．エノールアセテート、アルキンおよび活性化芳香族環の酸化
７　リグニンペロキシダーゼ／ジアリールプロパンペルオキシダーゼ
ａ．Ｃ−Ｃ結合の酸化的切断
ｂ．ベンジル性アルコールのアルデヒドへの酸化
ｃ．ベンジル炭素のヒドロキシル化
ｄ．フェノール二量化
ｅ．二重結合のヒドロキシル化によるジオールの生成
ｆ．リグニンアルデヒドの切断
８　エポキシドヒドロラーゼ
ａ．対掌的に純粋な生物学的活性化合物
ｂ．エポキシドの位置−および対掌選択的加水分解
ｃ．モノオキシジナーゼによる芳香族およびオレフィンエポキシド化によるエポキシドの生成
ｄ．ラセミエポキシドの分割
ｅ．ステロイドエポキシドの加水分解
９　ニトリルヒドラターゼ／ニトリラーゼ
ａ．脂肪族ニトリルの加水分解によるカルボキシアミドの生成
ｂ．芳香族、複素環式、不飽和脂肪族ニトリルの加水分解による対応する酸の生成
ｃ．アクリロニトリルの加水分解
ｄ．芳香族およびカルボキシアミド、カルボン酸（ニコチンアミド、ピコリンアミド、イソニコチンアミド）の生成
ｅ．アクリルジニトリルの位置選択性加水分解
ｆ．α−ヒドロキシニトリルからのα−アミノ酸
１０　トランスアミナーゼ
ａ．アミノ基のオキソ酸への転移
１１　アミダーゼ／アシラーゼ
ａ．アミド、アミジン、およびその他のＣ−Ｎ結合の加水分解
ｂ．非天然アミノ酸分割および合成
これらの例示事項は、本発明のある特定の特徴を示すが、制限を意味するのでも、また、開示した本発明の範囲を限定するのでもない。
【０２７５】
従って、本発明の一形態によれば、複数の前駆核酸鋳型の配列を整列させて、１つ以上の境界点（ｄｅｍａｒｃａｔｉｍ ｐｏｉｎｔｓ）を選択する。この境界点は、相同性領域に位置していてもよく、１つ以上のヌクレオチドから成り、さらに、上記前駆鋳型の少なくとも２つによって共有される。境界点を用いて、生成しようとする核酸ビルディングブロックの限界を画定することができる。このように、前駆分子中で同定し、選択した境界点は、子孫分子の集合における見込みキメラ形成点として役立つ。
【０２７６】
好ましくは、有用な境界点は、少なくとも２つの前駆鋳型が共有する相同性領域（少なくとも、一つの相同ヌクレオチド塩基から成る）である。さらに好ましくは、有用な境界点は、前駆鋳型の少なくとも半分が共有する相同性領域である。またさらに好ましくは、有用な境界点は、前駆鋳型の少なくとも三分の二が共有する相同性領域である。さらに好ましくは、有用な境界点は、前駆鋳型の少なくとも四分の三が共有する相同性領域である。さらに好ましくは、有用な境界点は、前駆鋳型のほぼすべてが共有する相同性領域である。さらに好ましくは、有用な境界点は、前駆鋳型のすべてが共有する相同性領域である。
【０２７７】
核酸ビルディングブロックの設計、ならびに、集合させようとする核酸ビルディングブロックの互いに適合する連結可能な末端を、図６および７に示す。図示したように、前駆鋳型のセットを一列に並べることによって、自然に発生した複数の境界点が明らかになり、これら鋳型が共有する境界点の同定は、生成して、子孫キメラ分子の生成に使用されるビルディングブロックを非確率論的に決定するのに役立つ。
【０２７８】
好ましい実施形態では、本発明は、完全ライブラリーを作製するために、連結再集合方法を徹底して実施することを特徴とする。言い換えれば、考えられるあらゆる順序の組合せの核酸ビルディングブロックを、最終的キメラ核酸分子のセットとして呈示する。同時に、特に好ましい実施形態では、各組合せにおける集合順序（すなわち、各最終的キメラ核酸の５’→３’配列における各ビルディングブロックの集合順序）は、設計によるもの（もしくは、非確率論的）である。本発明の非確率論的性質によって、不要な副産物の可能性が大幅に減少する。
【０２７９】
別の好ましい実施形態では、本発明は、連結再集合方法を体系的に実施し、例えば、体系的にコンパートメント化したライブラリーを形成し、コンパートメントが、例えば１つずつ、体系的に選別できることを特徴とする。言い換えれば、本発明は、特定核酸ビルディングブロックの選択的かつ賢明な使用と、順次段階を追った集合反応の選択的かつ賢明な使用とを組み合せることにより、子孫産物の特定セットが、複数の反応容器の各々に生成される実験的設計を達成することができる。これによって、体系的検定およびスクリーニング手順を実施することが可能になる。従って、これにより、恐らく非常に多くの子孫分子を、これまでより小さなグループで体系的に検定することができる。
【０２８０】
特に、前駆分子間の相同性が低い場合に、極めて柔軟で、しかも徹底的かつ体系的な方法で、キメラ化を実施する能力があることから、上記発明は、多数の子孫分子から成るライブラリー（またはセット）の生成に関する。上記連結再集合の発明の非確率論的性質によって、生成される子孫分子は、設計により選択された全体集合順序を有する最終的キメラ核酸分子のライブラリーから成るのが好ましい。この発明の特に好ましい実施形態では、生成されたライブラリーは、好ましくは、１０３以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０５以上の異なる子孫分子種、またさらに好ましくは、１０１０以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０１５以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０２０以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０３０以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０４０以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０５０以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０６０以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０７０以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０８０以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０１００以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０１１０以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０１２０以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０１３０以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０１４０以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０１５０以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０１７５以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０２００以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０３００以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０４００以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０５００以上の異なる子孫分子種、さらに好ましくは、１０１０００以上の異なる子孫分子種から成る。
【０２８１】
一形態によれば、前述のように生成した最終的キメラ核酸分子のセットは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから成る。１つの好ましい実施形態によれば、このポリヌクレオチドは遺伝子であり、合成遺伝子でもよい。別の好ましい実施形態では、このポリヌクレオチドは遺伝子経路であり、合成遺伝子経路でもよい。この発明は、本発明により生成された１つ以上の合成遺伝子を、真核生物（植物を含む）内で操作可能な経路等の合成遺伝子経路に組み込むことを特徴とする。
【０２８２】
境界点の選択、核酸ビルディングブロックのサイズと数、ならびに結合のサイズと設計に関して、選択および制御に大きな自由があるため、本発明の能力は極めて優れていることに留意されたい。さらに、本発明の操作性のために、分子間相同性の要件が非常に緩和されることにも留意すべきである。実際、分子間相同性がほとんどもしくは全くない領域でも、境界点を選択することもできる。例えば、コドンのゆらぎ、すなわち、コドンの縮重のために、対応する前駆鋳型に元々コードされていたアミノ酸を変化させることなく、ヌクレオチド置換を核酸ビルディングブロックに導入することができる。あるいは、元のアミノ酸のコーディングが変化するように、コドンを変化させることも可能である。この発明は、このような置換を核酸ビルディングブロックに導入して、分子間で相同性の境界点の発生率を高め、従って、ビルディングブロック間で達成される結合の数を増加することにより、今度は、生成しようとする子孫キメラ分子の数を増やすことを特徴とする。
【０２８３】
別の態様では、ビルディングブロックを生成するステップの合成の種類によって、ヌクレオチド（例えば、コドンまたはイントロンもしくは調節配列等の、１つ以上のヌクレオチド）の設計および導入が可能になる。尚、これらヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ法（例えば、突然変異誘発により）やｉｎ ｖｉｖｏ法（例えば、宿主生物の遺伝子スプライシング能力を利用して）で、後に任意で除去することができる。多数の態様において、有用な境界点を形成するという利点が見込まれる以外に、多くの理由から、これらヌクレオチドの導入が好ましいことに留意すべきである。
【０２８４】
従って、別の実施形態によれば、本発明は、核酸ビルディングブロックを用いて、イントロンを導入することを特徴とする。従って、本発明は、機能性イントロンを本発明の合成遺伝子に導入することを特徴とする。本発明はまた、機能性イントロンを本発明の合成遺伝子経路に導入することを特徴とする。従って、本発明は、１つ（以上）の人工的に導入したイントロンを含む合成遺伝子であるキメラポリヌクレオチドの生成に関する。
【０２８５】
従って、本発明はまた、１つ（以上）の人工的に導入したイントロンを含む合成遺伝子経路であるキメラポリヌクレオチドの生成に関する。好ましくは、人工的に導入したイントロンは、天然イントロンが、遺伝子スプライシングで機能的に働くのと同様に、遺伝子スプライシングについて、１つ以上の宿主細胞内で機能的である。本発明は、組換えおよび／またはスプライシングのために、宿主生物に導入しようとする合成イントロン含有ポリヌクレオチドの生成方法を提供する。
【０２８６】
前駆体分子間に相同性がほとんどまたは全くない領域で、本明細書に記載したカップリングを用いて、キメラ化を達成する能力は、新しい遺伝子経路の集合に有用で、しかも、実際には不可欠である。本発明は、従って、合成連結再集合を用いた新しい合成遺伝子経路の生成に関する。ある形態では、これは、目的とする宿主内で操作可能な調節配列（プロモーター等）の導入により達成され、該配列が目的とする宿主に導入されると、新しい遺伝子経路に操作性が付与される。ある態様では、本発明は、複数の目的とする宿主（例えば、微生物や植物細胞）内で操作可能な新規の合成遺伝子経路の生成に関する。これは、例えば、第１目的宿主内で操作可能な調節配列と、第２目的宿主内で操作可能な調節配列から成る複数の調節配列の導入により、達成することができる。同様の方法を実施して、第３の目的宿主種等において、遺伝子経路の操作性を達成することができる。目的とする宿主種の数は、それぞれ、１〜１０の間の整数、もしくは１０以上の整数でもよい。あるいはまた、例えば、複数の目的宿主における遺伝子経路の操作性は、複数の目的宿主内に固有操作性を有する調節配列の導入により、達成することができる。
【０２８７】
従って、ある実施形態によれば、本発明は、核酸ビルディングブロックを用いて、調節配列、特に、遺伝子発現のための調節配列を導入することを特徴とする。好ましい調節配列には、限定しないが、合成のもの、ならびに、古細菌、細菌、真核（ミトコンドリアを含む）、ウイルス、およびプリオンまたはプリオン様生物に存在するものが含まれる。好ましい調節配列としては、限定しないが、プロモーター、オペレーター、ならびに活性化因子結合部位が挙げられる。従って、本発明は、機能的調節配列を本発明の合成遺伝子に導入することを特徴とする。本発明はまた、機能的調節配列を本発明の合成遺伝子経路に導入することを特徴とする。
【０２８８】
このように、本発明は、１つ（以上）の人工的に導入した調節配列を含む合成遺伝子であるキメラポリヌクレオチドの生成に関する。従って、本発明はまた、１つ（以上）の人工的に導入した調節配列を含む合成遺伝子経路であるキメラポリヌクレオチドの生成に関する。好ましくは、人工的に導入した調節配列は、合成ポリヌクレオチドの一つ以上の遺伝子に機能しうるように結合され、１つ以上の宿主細胞内で機能的である。
【０２８９】
本発明に有用な好ましい細菌プロモーターとしては、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＲＲ、ＰＬおよびｔｒｐが挙げられる。有用な真核プロモーターには、ＣＭＶ即時型初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、ならびにマウスメタロチネイン−Ｉがある。具体的な植物調節配列として、植物またはその一部の使用に応じて、構成的にあるいは段階および／または組織特異的のうちいずれかで、植物における転写指令に活性なプロモーターが挙げられる。これらのプロモーターには、限定しないが、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）（Ｇｕｉｌｌｅｙら、１９８２）等の３５Ｓプロモーター；リブロースビスリン酸カルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子（Ｃｏｒｕｚｚｉら、１９８４）のプロモーター等の、葉特異的発現のためのプロモーター；グルタミンシンターゼ遺伝子（Ｔｉｎｇｅｙら、１９８７）由来のプロモーター等、根特異的発現のためのプロモーター；Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ由来のアブラナ科Ａプロモーター（Ｒｙａｎら、１９８９）等の、種子特異的発現のためのプロモーター；ジャガイモ由来のクラスＩパタチンプロモーター（Ｒｏｃｈａ−Ｓａｓａら、１９８９；Ｗｅｎｚｌｅｒら、１９８９）等の、塊茎特異的発現のためのプロモーター、あるいは、トマト由来のポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）プロモーター（Ｂｉｒｄら、１９８８）等の、果実特異的発現のためのプロモーターが挙げられる。
【０２９０】
本発明に好ましいその他の調節配列には、ターミネーター配列およびポリアデニル化シグナル、ならびに、植物で機能するあらゆる配列があるが、その選択は、当業者が問題なく行うことができる。このような配列の一例は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子の３’フランキング領域である。また、調節配列には、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターに存在するようなエンハンサー配列、ならびに、アルファルファモザイクウイルス（ＡｌＭＶ）ＲＮＡ４のリーダー配列（Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅら、１９８０）等のｍＲＮＡ安定化配列、あるいは、同様に機能するその他の配列も含まれる。
【０２９１】
本発明を用いて生成される合成遺伝子は、別の核酸との組換えのための基質としても使用することができる。同様に、本発明を用いて生成される合成遺伝子経路は、別の核酸との組換えのための基質としても使用することができる。好ましい例では、組換えは、合成イントロン含有遺伝子と、組換え相手として働く核酸との間の相同性領域により促進される、あるいは、該領域で起こる。特に好ましい例では、組換え相手は、合成遺伝子または合成遺伝子経路等、本発明により生成した核酸でもよい。組換えは、合成遺伝子に人工的に導入した１つ（以上）のイントロンに存在する相同性領域により促進される、あるいは、該領域で起こる。
【０２９２】
本発明の合成連結再集合方法は、複数の核酸ビルディングブロックを利用するが、これらブロックの各々は、二つの連結可能な末端を有するのが好ましい。各核酸ビルディングブロックの二つの連結可能な末端は、二つの平滑末端（すなわち、各々がゼロヌクレオチドのオーバーハングを有する）、もしくは、好ましくは、一つの平滑末端と一つのオーバーハング、あるいは、さらに好ましくは、やはり二つのオーバーハングである。
【０２９３】
この目的のための有用なオーバーハングは、３’オーバーハングまたは５’オーバーハングである。したがって、核酸ビルディングブロックは、３’オーバーハングまたは５’オーバーハング、あるいは、二つの３’オーバーハングまたは二つの５’オーバーハングである。核酸ビルディングブロックを集合させて、最終的キメラ核酸分子を形成する全体順序は、意図的な実験設計により決定するものとし、ランダムではない。
【０２９４】
ある好ましい実施形態によれば、二つの一本鎖核酸（一本鎖オリゴとも呼ぶ）を化学合成し、これらを接触させて、アニーリングし、二本鎖核酸ビルディングブロックを形成することにより、核酸ビルディングブロックを生成する。
【０２９５】
二本鎖核酸ビルディングブロックは、様々なサイズでよい。これらビルディングブロックのサイズは、実験者の選択によって、変えることができる。ビルディングブロックの好ましいサイズは、１塩基対（オーバーハングを含まない）〜１００，０００塩基対（オーバーハングを含まない）の範囲である。これ以外にも、下限が１ｂｐ〜１０，０００ｂｐ（この範囲にあるすべての整数値を含む）、上限が２ｂｐ〜１００，０００ｂｐ（この範囲にあるすべての整数値を含む）とするサイズの範囲も提供される。
【０２９６】
ポリメラーゼに基づくこれらの増幅法を用いて、数万個の塩基対でなければ、高い忠実度で、長さが最大数千個までの塩基対の二本鎖核酸を生成できることに留意されたい。化学合成（例えば、ホスホロアミダイドに基づく）を用いて、高い忠実度で、長さが最大数百ヌクレオチドまでの核酸を生成することができる。しかし、所望であれば、これらを、例えば、オーバーハングまたは付着末端を用いて、構成し、数万個の塩基対でなければ、長さが最大数千個の塩基対の二本鎖核酸を形成することができる。
【０２９７】
また、本発明に従い、各方法を組み合わせて（例えば、ホスホロアミダイトに基づく化学合成とＰＣＲ）使用することも可能である。従って、様々な方法により作製した核酸ビルディングブロックを組み合わせて用いて、本発明の子孫分子を生成することもできる。
【０２９８】
核酸ビルディングブロックを生成する化学合成の使用は、本発明で特に好ましく、同時に、工程上の安全および容易さ等の他の理由からも有利である。生体サンプルのクローニングまたは採取もしくは実際の取り扱いは一切必要ない。核酸ビルディングブロックの設計は、紙の上で実施することができる。従って、この発明は、組換え技術における工程の安全面で利点を有することがわかる。
【０２９９】
しかし、ある好ましい実施形態によれば、本発明に従う二本鎖核酸ビルディングブロックは、ポリヌクレオチド鋳型のポリメラーゼに基づく増幅により生成することもできる。図２に示す非制限的実施例では、プライマーの第１セット、Ｆ２およびＲ１を用いた第１ポリメラーゼ増幅反応を実施し、産物Ａとほぼ同じである平滑末端産物（標識化反応１、産物１）を生成する。プライマーの第２セット、Ｆ１およびＲ２を用いて第２ポリメラーゼ増幅反応を実施し、産物Ｂとほぼ同じである平滑末端産物（標識化反応２、産物２）を生成する。これら二つの産物を混合し、融解およびアニーリングさせて、二つのオーバーハングを持ち、有用であることが見込まれる二本鎖核酸ビルディングブロックを生成する。図２の例では、エキソヌクレアーゼＩＩＩ等の３’作用性エキソヌクレアーゼを用いた他の三つの産物のヌクレアーゼベースの分解により、３’オーバーハングを持つ産物（産物Ｃ）が選択される。また、５’作用性エキソヌクレアーゼ（例えば、レッドアルファ）を用いて、例えば、代わりに産物Ｄを選択できることに留意されたい。さらに、ハイブリダイゼーションに基づく手段等、上記以外の選択手段を用いてもよいし、これらの手段に、磁気ビーズ手段等の別の手段を組み込み、所望の産物の分離を促進することもできる。
【０３００】
上記以外にも、本発明に有用な二本鎖核酸ビルディングブロックを生成する方法は多数存在する。これらは、当業者には公知であり、また、容易に実施することができる。
【０３０１】
特に好ましい実施形態によれば、本発明に有用な二本鎖核酸ビルディングブロックは、まず、二つの一本鎖核酸を生成し、次に、これらをアニーリングして、二本鎖核酸ビルディングブロックを形成する。二本鎖核酸ビルディングブロックの二本の鎖は、オーバーハングを形成するものを除いて、ヌクレオチド毎に相補的であり、従って、オーバーハングを除いて、ミスマッチを一切含まない。別の実施形態によれば、二本鎖核酸ビルディングブロックの二本の鎖は、オーバーハングを形成するものを除いて、ヌクレオチド毎よりも少ない割合で相補的である。従って、この態様によれば、二本鎖核酸ビルディングブロックを用いて、コドン縮重を導入する。好ましくは、コドン縮重は、本書に記載した部位飽和突然変異誘発を用いて、一つ以上のＮ，Ｎ，Ｇ／Ｔカセットを用いて、あるいは、一つ以上のＮ，Ｎ，Ｎカセットを用いて導入する。
【０３０２】
本発明に従う順序立った集合を達成するための実験設計の例として、下記のものが挙げられる：
１）特異的核酸ビルディングブロックの設計、
２）各核酸ビルディングブロックの特異的連結末端の設計、
３）核酸ビルディングブロックの構成の特定順序の設計。
【０３０３】
オーバーハングは、３’オーバーハングまたは５’オーバーハングでよい。オーバーハングはまた、末端リン酸基を有してもよいし、あるいは、末端リン酸基がなくてもよい（代わりに、例えば、ヒドロキシル基を有する）。オーバーハングは、何個のヌクレオチドから成るものでもよい。好ましくは、オーバーハングは、０個のヌクレオチド（平滑末端のように）〜１０，０００個のヌクレオチドから成る。従って、オーバーハングのサイズは、広い範囲で使用可能である。従って、下限は、１〜２００までの整数、また上限は２〜１０，０００までの整数でよい。ある特定の例によれば、オーバーハングは、１ヌクレオチド〜２００ヌクレオチドのうちのいずれからでも構成することができる（該範囲内の整数すべてを含む）。
【０３０４】
最終的な（ｆｉｎａｌ）キメラ核酸は、指定したビルディングブロックすべてが集合するまで、２つ以上のビルディングブロックを順次集合させることにより、生成することができる。二つの集合ステップの実施の間に、実施サンプルを、サイズ選択または精製工程、もしくはその他の選択または富化工程に任意で付してもよい。あるいは、一ステップで一度に全指定ビルディングブロックを集合させることにより、最終的キメラ核酸分子を生成することもできる。
【０３０５】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏシャッフリング
いくつかの標準的遺伝子接合と同様のことをｉｎ ｖｉｔｒｏシャッフリングにより実施することもできる。例えば、「分子戻し交雑」は、ハイブリッドの核酸を野生型核酸と繰り返し混合すると同時に、関心のある突然変異を選択することにより、実施することができる。伝統的な育種と同様、この手法を用いて、様々な供給源由来の表現型を組み合わせて、好適なバックグラウンドとすることができる。
【０３０６】
これは、例えば、選択していない特徴（すなわち、免疫原性）に作用する中立突然変異の除去に有用である。従って、上記の手法は、タンパク質におけるどの突然変異が、増加した生物学的活性に関与し、どれが関与しないのかを決定する上で有用であり、これは、誤りがちな突然変異誘発もしくはカセット突然変異誘発法により達成されなかった利点である。
【０３０７】
大きな機能遺伝子は、小さなランダムポリヌクレオチドの混合物から正確に集合させることができる。この反応は、化石の高度に断片化したＤＮＡ由来の遺伝子の再集合に有用である。さらに、化石から採取したランダム核酸断片を、近縁種由来の類似した遺伝子からのポリヌクレオチドと組み合わせてもよい。
【０３０８】
また、本発明の方法は、各種研究や診断分野でのニーズに応じて、単一細胞由来の全ゲノムのｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅に使用することができると考えられる。ＰＣＲによるＤＮＡ増幅は、実際には、長さ約４０ｋｂまでに制限される。ＰＣＲによる大腸菌（５，０００ｋｂ）のような全ゲノムの増幅には、１２５本の４０ｋｂポリヌクレオチドを生成する約２５０個のプライマーを必要とすることになる。この手法は、十分な配列データが入手できないことから、実用的ではない。これに対し、有性ＰＣＲサイクルを用いたゲノムのポリヌクレオチドのランダム産生と、これに続く小さなポリヌクレオチドのゲル精製は、可能性がある多数のプライマーをもたらすであろう。ランダムな小ポリヌクレオチドの混合物をＰＣＲ反応のプライマーとして、単独で、あるいは、鋳型としての全ゲノムと共に使用することにより、該ゲノムの多数のコピーを含む単一鎖状体を理論上の終点とする、逆連鎖反応が確実に起こる。
【０３０９】
ランダムポリヌクレオチドのみを用いた場合には、コピー数の１００倍増幅と、５０ｋｂより大きい平均ポリヌクレオチドのサイズを実現することができる。多数の小さいポリヌクレオチドのオーバーラップによって、さらに大きい鎖状体が生成されると考えられる。合成プライマーを用いて得られた特定のＰＣＲ産物の品質は、増幅していないＤＮＡから得た産物と見分けがつかないであろう。この手法は、ゲノムのマッピングに有用であると予想される。
【０３１０】
シャッフリングしようとするポリヌクレオチドは、実験者の判断で、ランダムまたは非ランダムポリヌクレオチドとして生成することができる。
【０３１１】
Ｉｎ ｖｉｖｏシャッフリング
ｉｎ ｖｉｖｏシャッフリングの実施形態では、少なくとも二つの異なる核酸配列が、各宿主細胞に存在する条件下で、細菌または真核細胞中に特定核酸配列の混合集団を導入する。ポリヌクレオチドは、様々な方法で、宿主細胞中に導入することができる。宿主細胞は、当業者には公知の方法、例えば、塩化カルシウムによる処理を用いて、小さいポリヌクレオチドで形質転換することができる。ポリヌクレオチドをファージゲノムに挿入する場合には、特定核酸配列を有する組換え体ファージゲノムで、宿主細胞をトランスフェクションすることができる。あるいは、電気穿孔、トランスフェクション、リポフェクション、バイオリスティックス（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）、接合等の手段を用いて、核酸配列を導入することも可能である。
【０３１２】
一般に、この実施形態では、特定核酸配列は、宿主細胞内で該配列を安定して複製することのできるベクター中に存在する。さらに、ベクターは、ベクターを有する宿主細胞が選択されるように、マーカー遺伝子をコードすると考えられる。これによって、宿主細胞への導入の後、突然変異した特定核酸配列の回収が確実に達成される。しかし、特定核酸配列の混合集団全体が、ベクター配列上に存在する必要はないと考えられる。むしろ、宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入後に、各宿主細胞が、そこに存在する少なくとも１つの特定核酸配列を有する一つのベクターを確実に含むようにするために、十分な数の配列をベクターにクローニングする必要がある。また、特定核酸配列の集団のサブセットをベクターにクローニングするのではなく、このサブセットを宿主細胞に安定した状態で組み込んでもよい。
【０３１３】
同一性領域を有する二つのポリヌクレオチドを宿主細胞に挿入すると、両ポリヌクレオチド間に相同的組換えが起こることがわかっている。二つの突然変異した特定核酸配列間で起こるこのような組換えの結果、状況に応じて、二重または三重ハイブリッドが生成される。
【０３１４】
また、突然変異を起こした特定核酸配列のいくつかが、直鎖状核酸分子上に存在する場合には、組換えの頻度が高くなることも認められている。従って、好ましい実施形態では、特定核酸配列のいくつかが、直鎖状ポリヌクレオチド上に存在する。
【０３１５】
形質転換の後、宿主細胞形質転換体を選択に付し、所望の品質を有する突然変異した特定核酸を含む宿主細胞形質転換体を同定する。例えば、特定の薬剤に対して、高い耐性を望む場合には、形質転換した宿主細胞を、高濃度の該当する薬剤にさらし、高い薬剤耐性を賦与できる突然変異タンパク質を産生する形質転換体を選択する。特定タンパク質の受容体に結合する高い能力を望む場合には、該タンパク質の発現を形質転換体から誘発し、こうして得られたタンパク質を、当業者には公知の方法によりリガンド結合アッセイで検定して、リガンドへの高い結合を示す突然変異集団のサブセットを同定する。あるいは、タンパク質を別の系で発現させて、適切なプロセシングを確実にすることもできる。
【０３１６】
所望の特徴を有する第１の組換え特定核酸配列（娘配列）のサブセットを同定した後、第２ラウンドの組換えに付す。
【０３１７】
第２サイクルの組換えでは、組換え特定核酸配列を、元の突然変異特定核酸配列（親配列）と混合し、サイクルを前述と同様に繰り返す。この方法では、性質が増強された、あるいは、性質が増強されたタンパク質をコードする第２の組換え特定核酸配列のセットを同定することができる。このサイクルは、所望する回数だけ繰り返すことができる。
【０３１８】
また、第２またはそれに続く組換えサイクルにおいて、戻し交雑を実施することも考えられる。分子戻し交雑は、少なくとも１つの野生型核酸配列と、突然変異を起こした核酸配列が、形質転換後に同じ宿主細胞内に存在するように、所望の特定核酸配列を、多数の野生型配列と混合することにより、実施することができる。野生型の特定核酸配列を用いた組換えは、免疫原性のような選択していない特徴には作用するが、選択した特徴には作用しない中立突然変異を排除する。
【０３１９】
本発明の別の実施形態では、第１ラウンドの間に、特定核酸配列のサブセットを、宿主細胞への導入の前に、ＰＣＲ増幅を減速または停止することにより、小さいポリヌクレオチドとして生成することができる。ポリヌクレオチドのサイズは、他の配列と相同的に組換えできるように、他の配列との同一性領域をいくつか含有するのに十分大きいものでなければならない。ポリヌクレオチドのサイズは、０．０３ｋｂ〜１００ｋｂ、さらに好ましくは０．２ｋｂ〜１０ｋｂの範囲である。また、後続のラウンドでは、前のラウンドから選択した配列を除くすべての特定核酸配列を使用して、宿主細胞への導入前に、ＰＣＲポリヌクレオチドを生成することも考えられる。
【０３２０】
短いポリヌクレオチド配列は、一本鎖または二本鎖のいずれでもよい。元々一本鎖だった配列が、二本鎖になった場合には、宿主細胞への挿入の前に、熱、化学薬品、もしくは酵素を用いて、変性することができる。核酸鎖を分離するのに適した反応条件は、当業者には公知である。
【０３２１】
この方法のステップは無限に繰り返すことができるが、達成できるハイブリッドの数だけには制限される。サイクルを所定回数繰り返した後、見込まれるすべてのハイブリッドが達成されると、それ以上のサイクルは余剰である。
【０３２２】
ある実施形態では、突然変異を起こした同じ鋳型核酸を繰り返し組換えて、得られた組換え体を所望の特徴について選択する。
【０３２３】
従って、突然変異鋳型核酸の初期プールまたは集団は、大腸菌等の細菌内で複製することのできるベクターにクローニングされる。ベクターは、大腸菌内で自律複製が可能であれば、特に限定しない。好ましい実施形態では、ベクターは、該ベクターに結合された、突然変異を起こした特定核酸によりコードされるタンパク質の発現および産生を可能にするよう設計される。また、ベクターは、選択マーカーをコードする遺伝子を含むことが好ましい。
【０３２４】
突然変異を起こした核酸配列のプールを含むベクターの集団を、大腸菌宿主細胞中に導入する。ベクター核酸配列は、形質転換、トランスフェクション、または、ファージの場合には感染により、導入することができる。細菌を形質転換するのに使用するベクターの濃度は、多数のベクターが各細胞に導入されるような濃度とする。いったん細胞内に存在すると、相同的組換え効率は、各種ベクター間に相同的組換えが起こるようなものとする。これによって、突然変異を起こした元の親配列とは異なる突然変異の組合せを有するハイブリッド（娘）が生成される。
【０３２５】
次に、宿主細胞をクローン的に複製し、ベクターに存在するマーカー遺伝子について選択する。この選択のもとでは、プラスミドを有する細胞だけが増殖することになる。
【０３２６】
次に、ベクターを含む宿主細胞を、好ましい突然変異の存在について試験する。例えば、選択しようとする遺伝子が、薬剤耐性が向上した遺伝子である場合には、このような試験は、細胞を選択的圧力下に置くことから成る。ベクターが、突然変異を起こした核酸配列によりコードされたタンパク質の発現を可能にする場合には、このような選択は、こうしてコードされたタンパク質の発現、該タンパク質の単離、ならびに、該タンパク質が、関心のあるリガンドに高い効率で結合するかどうかを決定するための試験等を含む。
【０３２７】
所望の特徴を賦与する、突然変異を起こした特定の娘核酸配列を同定した後、すでにベクターに結合した、あるいは該ベクターから分離した上記核酸を単離する。次に、この核酸を核酸の第１または親集団と混合した後、サイクルを繰り返す。
【０３２８】
この方法により、所望の性質が増強された核酸配列を選択できることが明らかになっている。
【０３２９】
別の実施形態では、ハイブリッドの第１世代を細胞内に保持し、突然変異を起こした親配列を再び該細胞に添加する。従って、実施形態Ｉの第１サイクルを前述同様に実施する。ただし、娘核酸配列を同定した後、これら配列を含む宿主細胞を保持する。
【０３３０】
突然変異を起こした親特定核酸集団は、ポリヌクレオチドとして、あるいは、同じベクターにクローンニングして、娘核酸をすでに含む宿主細胞中に導入する。細胞内で組換えが起こるようにし、次世代の組換え体、すなわち孫娘を、前述した方法により選択する。
【０３３１】
このサイクルは、所望の特徴を有する核酸またはペプチドが得られるまで、多数回繰り返すことができる。後続のサイクルでは、好ましいハイブリッドに添加される、突然変異を起こした配列の集団は、親ハイブリッド、または、後続するいずれの世代に由来するものでもよい。
【０３３２】
別の実施形態では、本発明は、得られた組換え特定核酸の「分子」戻し交雑を実施して、あらゆる中立突然変異を排除する方法を提供する。中立突然変異とは、核酸またはペプチドに所望の性質を賦与しない突然変異のことである。ところが、このような突然変異は、核酸またはペプチドに望ましくない特性を与えかねない。従って、これらの中立突然変異を排除することが好ましい。本発明の方法は、それを実施する手段を提供する。
【０３３３】
この実施形態では、所望の特徴を有するハイブリッド核酸をこの実施形態の方法により取得した後、核酸、核酸を有するベクター、または、ベクターおよび核酸を含む宿主細胞を単離する。
【０３３４】
次に、核酸またはベクターを、大過剰量の野生型核酸を含む宿主細胞に導入する。ハイブリッドの核酸と、野生型配列の核酸が、組換えを起こす。得られた組換え体を、ハイブリッド核酸と同じ選択下に置く。所望の特徴を保持した組換え体だけが選択されることになる。野生型ＤＮＡとの組換えにより、所望の特徴を賦与しないサイレント突然変異は消失する。このサイクルは、サイレント突然変異がすべて排除されるまで、多数回繰り返すことができる。
【０３３５】
このように、本発明の方法を分子戻し交雑に用いて、不必要な突然変異またはサイレント突然変異を排除することができる。
【０３３６】
有用性
本発明のｉｎ ｖｉｖｏ組換え法は、特定ポリヌクレオチドまたは配列の未知ハイブリッドまたは対立遺伝子のプールについて、ブラインド方式で実施することができる。しかし、特定ポリヌクレオチドの実際のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を知る必要がない。
【０３３７】
遺伝子の混合集団内で組換えを用いる手法は、あらゆる有用なタンパク質、例えば、インターロイキンＩ、抗体、ｔＰＡおよび成長ホルモンの生成に有用である。この手法は、変化させた特異性または活性を有するタンパク質の生成に用いることができる。この手法は、遺伝子のハイブリッド核酸配列、例えば、プロモーター領域、イントロン、エクソン、エンハンサー配列、３１非翻訳領域または５１非翻訳領域の生成にも有用である。従って、この手法は、発現の速度が高い遺伝子を生成するのに使用することができる。また、この手法は、反復ＤＮＡ配列の研究にも有用である。最後に、この手法は、リボザイムまたはアプタマーを突然変異する上で有用である。
【０３３８】
多様性領域を分離するスカフォールド（ｓｃａｆｆｏｌｄ）様領域は、特に、この発明の方法に適している。保存されたスカフォールドは、自己会合により全体フォールディングを決定すると共に、特異的結合を仲介する比較的制限されていないループを展示する。このようなスカフォールドの例として、免疫グロブリンβバレル、および４ヘリックス束がある。本発明の方法を用いて、結合のための、突然変異を起こした配列の様々な組合せを有するスカフォールド様タンパク質を生成することができる。
【０３３９】
本発明の方法により、同様の標準的遺伝子の接合を実施することも可能である。例えば、ハイブリッドの核酸と、野生型核酸との混合により、「分子」戻し交雑を繰り返すと共に、関心のある突然変異の選択をする。伝統的育種同様、この手法を用いて、様々な採取源由来の表現型を、選択バックグラウンドに組み込むことができる。これは、例えば、選択していない特徴（すなわち、免疫原性）に影響する中立突然変異の除去に有用である。従って、タンパク質中のどの突然変異が、増大した生物学的活性に関与し、どれが関与しないかを決定するのに有用である。
【０３４０】
ペプチド展示方法
本発明を用いて、前記方法のいずれか、ならびにいずれかの組合せを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ組換えによって、ペプチド展示方法により選択されたポリヌクレオチド配列をシャッフルすることができる。上記ペプチド展示方法は、会合ポリヌクレオチドが、ある表現型（例えば、予め決められた受容体（リガンド）の親和性）について選別される展示ペプチドをコードすることを特徴とする。
【０３４１】
益々重要性が高まる生物薬剤学的薬剤開発および分子生物学の側面は、ペプチド構造の同定であり、これには、生物学的高分子と相互作用するペプチドまたは偽ペプチドの１次アミノ酸配列が含まれる。予め決められた生物学的高分子（例えば、受容体）との結合等、所望の構造または機能特性を有するペプチドを同定する一方法は、ペプチドのアミノ酸配列が付与した所望の構造または機能特性を有する個別ライブラリーのメンバーについて、大きなライブラリーまたはペプチドをスクリーニングすることを含む。
【０３４２】
ペプチドライブラリーを生成する指向性化学合成方法以外に、いくつかの組換えＤＮＡ方法も報告されている。そのうちの一つは、バクテリオファージ粒子または細胞の表面に、ペプチド配列、抗体、またはその他のタンパク質を展示することから成る。一般に、これらの方法では、各バクテリオファージ粒子または細胞は、天然のバクテリオファージまたは細胞タンパク質配列に加えて、単一種の展示ペプチドを展示する個別ライブラリーメンバーとしての役割を果たす。各バクテリオファージまたは細胞は、特定の展示ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列情報を含む。従って、展示ペプチド配列は、単離したライブラリーメンバーのヌクレオチド配列決定によりみいだすことができる。
【０３４３】
周知のペプチド展示方法は、典型的には、バクテリオファージコートタンパク質との融合のように、繊維状バクテリオファージの表面に、ペプチド配列を展示することを含む。バクテリオファージライブラリーは、固定化した予定高分子または小分子（例えば、受容体）とインキュベートし、固定化した高分子に結合するペプチド配列を示すバクテリオファージ粒子を、予め決められた高分子に結合するペプチド配列を示さないものから、区分することができる。次に、固定化した高分子に結合したバクテリオファージ粒子（すなわち、ライブラリーメンバー）を回収し、複製して、選択されたバクテリオファージ小集団を増幅し、これを、次のラウンドの親和性富化およびファージ複製に付す。親和性富化およびファージ複製を数回繰り返した後、このようにして選択されたバクテリオファージライブラリーメンバーを単離し、展示ペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を決定することによって、予め決めた高分子（例えば、受容体）に結合するペプチドの配列を同定する。このような方法は、ＰＣＴ特許公報ＷＯ９１／１７２７１、ＷＯ９１／１８９８０、ＷＯ９１／１９８１８およびＷＯ９３／０８２７８号にさらに詳しく記載されている。
【０３４４】
後者のＰＣＴ公報には、ペプチドリガンド展示のための組換えＤＮＡ方法が記載されており、この方法は、融合タンパク質のライブラリー生成から成る。該融合タンパク質は各々、予め決めた高分子への結合に利用可能な、様々な配列を含む第１ポリペプチド部分と、個々の融合タンパク質をコードするＤＮＡベクター等のＤＮＡに結合する第２ポリペプチド部分とから構成されている。融合タンパク質の発現を可能にする条件下で、形質変換された宿主細胞を培養すると、融合タンパク質は、それをコードするＤＮＡベクターに結合する。この宿主細胞を溶解すると、ファージに基づく展示系でバクテリオファージ粒子を選別するのとほぼ同じように、予め決めた高分子に対して、融合タンパク質／ベクターＤＮＡ複合体を選別することができる。このようにして、選択された融合タンパク質／ベクターＤＮＡ複合体におけるＤＮＡベクターの複製および配列決定が、選択したライブラリーペプチド配列の同定のための基準として役立つ。
【０３４５】
ペプチドのライブラリー、ならびに同様のポリマーを生成するその他の系は、組換え体およびｉｎ ｖｉｔｒｏ化学合成方法の両方の特徴を有する。これらハイブリッド方法では、無細胞酵素機構を用いて、ライブラリーメンバー（すなわち、ペプチドまたはポリヌクレオチド）のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成を達成する。ある方法では、選択およびＰＣＲ増幅サイクルを交互に実施することにより、予定したタンパク質または予め決めた色素分子を結合する能力を有するＲＮＡ分子を選択した（ＴｕｅｒｋおよびＧｏｌｄ、１９９０；ＥｌｌｉｎｇｔｏｎおよびＳｚｏｓｔａｋ、１９９０）。同様の方法を用いて、予め決めたヒト転写因子を結合するＤＮＡ配列を同定した（ＴｈｉｅｓｅｎおよびＢａｃｈ、１９９０；ＢｅａｕｄｒｙおよびＪｏｙｃｅ、１９９２；ＰＣＴ特許公報ＷＯ９２／０５２５８およびＷＯ９２／１４８４３号）。同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳技術を用いて、目的タンパク質が合成されており、この技術は、ペプチドの大きなライブラリーを形成する方法として提案されている。一般に、安定化したポリソーム複合体を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳に基づいたこれらの方法は、ＰＣＴ特許公報ＷＯ８８／０８４５３、ＷＯ９０／０５７８５、ＷＯ９０／０７００３、ＷＯ９１／０２０７６、ＷＯ９１／０５０５８、ならびにＷＯ９２／０２５３６号にさらに詳しく記載されている。出願人は、ライブラリーメンバーが、ＤＮＡ結合活性を備えた第１ポリペプチド部分を有する融合タンパク質と、ライブラリーメンバー独特のペプチド配列を有する第２ポリペプチド部分とを含む方法を記載している。このような方法は、中でも、無細胞ｉｎ ｖｉｔｒｏ選択フォーマットでの使用に適している。
【０３４６】
展示したペプチド配列は様々な長さでよく、典型的に、３〜５，０００アミノ酸長、またはそれ以上の長さで、多くの場合、５〜１００アミノ酸長、さらには８〜１５アミノ酸長である。ライブラリーは、様々な長さの展示ペプチド配列を有するライブラリーメンバーから構成されることができ、あるいは、一定長さの展示ペプチド配列を有するライブラリーメンバーからなるものでもよい。展示されたペプチド配列の一部または全部は、ランダム、擬似ランダム、規定セット核（ｋｅｒｎａｌ）、一定のもの等のいずれでもよい。この展示方法は、ポリソーム上の初期ｓｃＦｖ、または、ファージ上に展示されるｓｃｆｖ等の一本鎖抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ展示方法を含むが、これらの展示方法は、非常に多様な可変領域配列および結合特異性を有するｓｃｆｖライブラリーの大規模なスクリーニングを可能にする。
【０３４７】
本発明は、また、ランダム、擬似ランダム、ならびに規定配列フレームワークペプチドライブラリーを提供すると共に、これらのライブラリーを生成およびスクリーニングして、ペプチドまたはＲＮＡを所望のように修飾する受容体分子または目標エピトープ、または遺伝子産物に結合する有用な化合物（例えば、一本鎖抗体を含むペプチド）を同定する方法を提供する。ランダム、擬似ランダム、ならびに規定配列フレームワークペプチドは、ペプチドライブラリーメンバーのライブラリーから生成する。該メンバーは、展示ペプチドが合成されたポリヌクレオチド鋳型に結合した展示ペプチドまたは展示一本鎖抗体を含む。結合方法は、選択した本発明の具体的態様に応じて変えてよく、ファージ粒子中の包膜や、細胞への組込み等が挙げられる。
【０３４８】
親和性富化方法により、ペプチドおよび一本鎖抗体の非常に大きいライブラリーをスクリーニングすることができ、所望のペプチドまたは一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチド配列を選択することができる。次に、ポリヌクレオチドを単離、シャッフルして、選択したペプチド（または予め定めたその一部）もしくは一本鎖抗体（または、そのＶＨＩ、ＶＬＩまたはＣＤＲ部分のみ）のアミノ酸配列を複合的に組み換える。これらの方法を用いて、一分子について所望の結合親和性を有するものとして、ペプチドまたは一本鎖抗体を同定することができ、シャッフリング方法を利用して、急速に、所望の高親和性ペプチドまたはｓｃｆｖに収斂することが可能である。次に、ペプチドまたは抗体を合成して、適した用途（例えば、薬剤または診察用薬剤）のための従来の手段により大量合成することができる。
【０３４９】
本発明の重要な利点は、目的のペプチドリガンドまたは抗体を単離するのに、予想されるリガンド構造に関する予備情報を必要としないことである。同定したペプチドは、生物学的活性を有する、すなわち、選択した受容体分子について少なくとも特異的な結合親和性を含むが、さらには、他の化合物の結合を阻止する能力、代謝経路を刺激または阻害する能力、信号またはメッセンジャーとして働く能力、細胞活性を刺激または阻止する能力等を含むことになる。
【０３５０】
本発明はまた、予め決めた受容体（例えば、ペプチド性ホルモン受容体、細胞表面受容体、他のタンパク質と結合して、ヘテロ二量体等の細胞間タンパク質複合体を形成する細胞間タンパク質のような哺乳動物のタンパク質性受容体）またはエピトープ（例えば、固定化タンパク質、糖タンパク質、オリゴ糖等）に結合するライブラリーメンバーについて、初期ペプチド（一本鎖の抗体）を展示するポリソームのライブラリーをアフィニティースクリーニングすることにより、選択されたポリヌクレオチド配列のプールをシャッフルする方法を提供する。
【０３５１】
これら方法のいずれかによって、第１選択ラウンド（典型的には、受容体（例えば、リガンド）への結合についてのアフィニティー選択により）で選択されたポリヌクレオチド配列をプールし、該プールをｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ組換えによりシャッフルして、組換えた選択ポリヌクレオチド配列の集団を含むシャッフル済プールを生成する。組換えた選択ポリヌクレオチド配列を、少なくとも１回次の選択ラウンドにかける。後の選択ラウンドで選択したポリヌクレオチド配列を直接使用して、配列決定し、および／または１回以上のシャッフリングおよび次の選択ラウンドに付す。選択した配列は、中立配列（すなわち、結合に不要な機能作用を及ぼす）をコードするポリヌクレオチド配列で、戻し交雑することもできる。この戻し交雑は、例えば、選択配列とほぼ同じ野生型または自然発生配列を用いた戻し交雑により実施して、免疫原性の低い、天然様の機能ペプチドを生成することができる。一般に、戻し交雑の間に、次の選択ラウンドを実施して、予め定めた受容体（リガンド）への結合特性を保持する。
【０３５２】
選択した配列のシャッフリングの前、または、これと同時に、配列に突然変異を誘発することができる。ある態様では、選択されたライブラリーメンバーを原核ベクター（例えば、プラスミド、ファージミド、またはバクテリオファージ）でクローン化する。この態様では、個々別々のライブラリーメンバーを表す個別のコロニー（またはプラーク）集団が生成される。次に、個別の選択ライブラリーメンバーを操作して（例えば、部位指向性突然変異誘発、カセット突然変異誘発、化学的突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発等）、選択したライブラリーメンバーの配列に基づく配列多様性の核を呈示するライブラリーメンバーの集団を生成することができる。個別の選択ライブラリーメンバーまたはプールの配列を操作して、部分的に、あるいは、個別選択ライブラリーメンバー配列の全長にわたって、ランダム突然変異、擬似ランダム突然変異、規定核突然変異（すなわち、可変および不変残基位置を含む、および／または、規定サブセットのアミノ酸残基から選択した残基を含有する可能性のある可変残基位置を含む）、コドンに基づく突然変異等を組み込むことができる。次に、突然変異を誘発した選択ライブラリーメンバーを、本文に記載したｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ組換えシャッフリングによりシャッフルする。
【０３５３】
本発明はまた、複数の本発明の個別ライブラリーメンバーを含むペプチドライブラリーであって、（１）該複数の個別ライブラリーメンバーの各々が、選択された配列のプールをシャッフリングして生成された配列を含み、（２）各個別ライブラリーメンバーが、上記複数のメンバーにおける他の個別ライブラリーメンバーの可変ペプチドセグメント配列または一本鎖抗体配列とは異なる可変ペプチドセグメント配列または一本鎖抗体セグメント配列を含む（しかし、ライブラリーメンバーの中には、不均質な増幅、確率論的確率等により、１ライブラリー当たり１つ以上存在するものもある）ことを特徴とするペプチドライブラリーを提供する。
【０３５４】
さらに、本発明は、工程毎の産物であって、予め決めた結合特異性が次の方法により形成されることを特徴とする産物を提供する：（１）予め決めた受容体（例えば、リガンド）またはエピトープ（例えば、抗原高分子）に対して、展示されるペプチドもしくは展示される一本鎖抗体ライブラリーをスクリーニングし、予め決めた受容体またはエピトープに結合するライブラリーメンバーを同定および／または富化して、選択ライブラリーメンバーのプールを生成し、（２）予め決めたエピトープに結合し、これによって、ライブラリーから単離および／または富化されている該選択ライブラリーメンバー（もしくは、増幅またはクローン化したそのコピー）を、組換えによりシャッフリングして、シャッフルライブラリーを生成し、（３）予め定めた受容体（例えば、リガンド）またはエピトープ（例えば、抗原高分子）に対して、該シャッフルライブラリーをスクリーニングし、予め定めた受容体またはエピトープに結合するシャッフルライブラリーメンバーを同定および／または富化して、選択されたシャッフルライブラリーメンバーのプールを生成する。
【０３５５】
抗体展示およびスクリーニング法
本発明を用いて、記載した方法のいずれか、ならびに、いずれかの組合せによるｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えによって、抗体展示方法により選択されるポリヌクレオチド配列をシャッフルすることができ、ここで、会合ポリヌクレオチドは、予め決めた抗体（リガンド）を結合する表現型（例えば親和性）についてスクリーニングした展示抗体をコードする。
【０３５６】
免疫グロブリン鎖に存在し得る膨大な数の個別可変領域によって示される広大な免疫レパートリーを獲得するために、様々な分子遺伝子的手法が考案されてきた。自然に発生する生殖系列免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、縦列の多様性セグメント遺伝子の上流に位置する個別縦列の可変セグメント遺伝子から構成される。尚、上記多様性セグメント遺伝子自体は、縦列の連関（ｉ）領域遺伝子の上流に位置し、この連関領域遺伝子は、定常領域遺伝子の上流に位置する。Ｂリンパ球発生の間、Ｖ−Ｄ−Ｊ転位が起こるが、このとき、融合Ｄセグメントを形成する転位、続いて、Ｖ−Ｄ−Ｊ結合産物遺伝子を形成するＶセグメントでの転位により、重鎖可変領域遺伝子（ＶＨ）が形成される。尚、上記Ｖ−Ｄ−Ｊ結合産物遺伝子は、生産的に転位されれば、重鎖の機能的可変領域（ＶＨ）をコードする。同様に、軽鎖遺伝子座は、複数のＶセグメントの一つを、複数のＪセグメントの一つで再構成して、軽鎖の可変領域（ＶＬ）をコードする遺伝子を形成する。
【０３５７】
免疫グロブリンに生じ得る可変領域の広大なレパートリーは、Ｂ細胞発生における再構成中の、連関Ｖおよびｉセグメント（ならびに、重鎖遺伝子座の場合には、Ｄセグメント）の多数の組合せの可能性に一部が由来する。これ以外に、重鎖可変領域の配列の多様性は、Ｖ−Ｄ−Ｊ結合中のＤセグメントの非均質な再構成、ならびに、Ｎ領域の付加に由来するものである。さらに、特異的Ｂ細胞クローンの抗体選択は、重鎖および軽鎖可変領域の一方または両方に、非生殖系列突然変異を有する、親和性がより高い変異型を選択する（「親和性成熟」または「親和性シャープニング」と呼ばれる現象）。典型的に、これら「親和性シャープニング」突然変異は、可変領域の特異的区域、最も一般的には、相補性決定領域（ＣＤＲ）にクラスター形成する。
【０３５８】
抗原刺激β細胞発生（すなわち、免疫）を介した高親和性免疫グロブリンの生成および同定における多数の制限事項を解決するために、様々な原核発現系が開発されてきたが、これらを操作して、特異的抗原に対する高親和性抗体を選別するためにスクリーニングされる組合せ抗体ライブラリーを生成することができる。大腸菌およびバクテリオファージ系での抗体の発現における近年の進歩（後述する「代替的ペプチド展示方法」を参照）により、特性決定したハイブリドーマから抗体遺伝子をクローニングすることによって、あるいは抗体遺伝子ライブラリー（例えばＩｇ ｃＤＮＡ由来の）を用いたｄｅ ｎｏｖｏ選択のいずれかによって、ほぼすべての特異性が得られる可能性が出てきた。
【０３５９】
抗体の組合せライブラリーは、バクテリオファージプラークまたは溶原菌のコロニーとしてスクリーニングできるバクテリオファージλ発現系で生成されてきた（Ｈｕｓｅら、１９８９；ＣａｎｔｏｎおよびＫｏｐｒｏｗｓｋｉ、１９９０；Ｍｕｌｌｉｎａｘら、１９９０；Ｐｅｒｓｓｏｎら、１９９１）。バクテリオファージ抗体展示ライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの様々な態様が記載されている（Ｋａｎｇら、１９９１；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０；Ｂｕｒｔｏｎら、１９９１；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９１；Ｃｈａｎｇら、１９９１；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、１９９１；Ｍａｒｋｓら、１９９１、ｐ．５８１；Ｂａｒｂａｓら、１９９２；ＨａｗｋｉｎｓおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９２；Ｍａｒｋｓら、１９９２、ｐ．７７９；Ｍａｒｋｓら、１９９２、ｐ．１６００７；ならびに、Ｌｏｗｍａｎら、１９９１；Ｌｅｒｎｅｒら、１９９２；これらは、すべて、参照として本文に組み込む）。典型的には、バクテリオファージ抗体展示ライブラリーは、固定化した（例えば、クロマトグラフィー樹脂に共有結合して、アフィニティクリマトグラフィーによって反応性ファージを富化することにより）、および／または標識した（例えば、プラークまたはコロニーリフト（ｌｉｆｔｓ）を選別するために）受容体（例えば、ポリペプチド、炭水化物、糖タンパク質、核酸）を用いてスクリーニングする。
【０３６０】
特に有利な手法は、いわゆる一本鎖フラグメント可変（ｓｃｆｖ）ライブラリーの使用である（Ｍａｒｋｓら、１９９２、ｐ．７７９；ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９９１；Ｃｌａｃｋｓｏｎら、１９９１；Ｍａｒｋｓら、１９９１、ｐ．５８１；Ｃｈａｕｄｈａｒｙら；Ｃｈｉｓｗｅｌｌら、１９９２；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０；ならびに、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８）。バクテリオファージコートタンパク質に展示されるｓｃｆｖライブラリーの様々な態様が記載されている。
【０３６１】
１９８８年から、Ｆｖフラグメントおよびそれらの融合タンパク質の一本鎖類似体が、抗体工学法により高い信頼度で生成されている。第１ステップは、一般に、所望の結合特性を有するＶＨおよびＶＬをコードする遺伝子を得ることから成る。これらのＶ遺伝子は、組合せＶ遺伝子ライブラリーから選択された、あるいは、Ｖ遺伝子合成により作製された特異的ハイブリドーマ細胞系から単離することができる。一本鎖Ｆｖは、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３または同等のリンカーペプチド等の、適切に設計されたリンカーペプチドをコードするオリゴヌクレオチドと、成分Ｖ遺伝子とを結合することにより形成される。リンカーは、第１のＶ領域のＣ末端と、第２領域のＮ末端とを、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ’のいずれかの順に架橋する。原則として、ｓｃｆｖ結合部位は、その親抗体結合部位の親和性および特異性の両方を忠実に複製することができる。
【０３６２】
従って、ｓｃｆｖフラグメントは、柔軟なリンカーペプチドによりポリペプチド一本鎖に結合したＶＨおよびＶＬドメインから構成される。ｓｃｆｖ遺伝子を構成した後、これらをファージミドにクローン化し、バクテリオファージＰＩＩＩ（遺伝子３）コートタンパク質を含む融合タンパク質として、Ｍ１３ファージ（または類似した繊維状バクテリオファージ）の先端に発現させる。関心のある抗体を発現するファージの富化は、予め決めたエピトープ（例えば、標的抗原、受容体）への結合のための集団ｓｃｆｖを展示する組換え体ファージを選別することにより達成される。
【０３６３】
ライブラリーメンバーの結合ポリペプチドは、スクリーニングまたは選択手順の後に、ライブラリーメンバーの複製の基礎をもたらすと共に、展示されたペプチド配列またはＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の同一性決定のための基礎を提供する。展示されたペプチド配列、または一本鎖抗体（例えばｓｃｆｖ）および／またはそのＶＨおよびＶＨドメイン、あるいはそれらのＣＤＲをクローン化し、適した発現系で発現することができる。一般に、単離したＶＨおよびＶＬドメインをコードするポリヌクレオチドは、定常領域（ＣＨおよびＣＬ）をコードするポリヌクレオチドに連結することにより、完全抗体（例えば、キメラ、もしくは、完全にヒトの）、抗体フラグメント等をコードするポリヌクレオチドを作製する。また、一般に、単離したＣＤＲをコードするポリヌクレオチドは、適した可変領域フレームワーク（および任意で、定常領域）をコードするポリヌクレオチドに移植することにより、完全抗体（例えば、ヒト化した、もしくは、完全にヒトの）、抗体フレームワーク等をコードするポリヌクレオチドを作製する。抗体を用いて、免疫アフィニティクロマトグラフィーにより、抗原の調製量を分離することができる。上記以外のこれらの抗体の各種用途として、疾病（例えば、腫瘍新生）の診察および／または病期分類、疾病（例えば、腫瘍新生、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、心臓血管疾患、感染等）の治療のための使用がある。
【０３６４】
結合する種のレパートリー（イディオタイプスペクトル）を拡大するために、ｓｃｆｖライブラリーの組合せ多様性を増加する様々な方法が報告されている。ＰＣＲを使用することにより、可変領域が、特異的ハイブリドーマ源から、または非免疫細胞からの遺伝子ライブラリーとして、急速にクローン化することができ、結合させることのできるＶＨおよびＶＬカセットの配列の組合せ多様性をもたらす。さらに、ＶＨおよびＶＬカセットは、ランダム、擬似ランダム、または指向性突然変異誘発等により、それ自体で、多様化することができる。典型的には、ＶＨおよびＶＬカセットは、相補性決定領域（ＣＤＲ）内または近傍で多様化するが、第３ＣＤＲ、すなわち、ＣＤＲ３で多様化することが多い。酵素によるインバースＰＣＲ突然変異誘発は、誤りがちなＰＣＲや化学的突然変異誘発（Ｄｅｎｇら、１９９４）と同様に、ｓｃｆｖ部位指向性ハイブリッドの比較的大きなライブラリーを形成するための、単純かつ信頼度の高い方法であることが明らかにされている（Ｓｔｅｍｍｅｒら、１９９３）。Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９９３）は、縮合オリゴヌクレオチドＰＣＲ、次に、得られたｓｃｆｖハイブリッドのファージ展示による部位指向性ランダム化を用いた、抗体ｓｃｆｖフラグメントの半合理的設計を明らかにした。Ｂａｒｂａｓ（Ｂａｒｂａｓら、１９９２）は、ヒト破傷風トキソイド結合Ｆａｂの合成ＣＤＲ領域内の配列をランダム化することにより、偏った可変領域配列の使用に起因するレパートリーサイズの制限に関する問題を解決しようとした。
【０３６５】
ＣＤＲランダム化によって、重鎖ＣＤＲ３だけについて約１ｘ１０２０個のＣＤＲ、ほぼ同じ数の重鎖ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の変異型、ならびに軽鎖ＣＤＲ１−３変異体が産生する可能性がある。個別または一緒に用いた、重鎖および／または軽鎖のＣＤＲランダム化の組合せの可能性は、非常に多数のバクテリオファージクローンを生成して、あらゆる可能な組合せを呈示するクローンライブラリーを作製することを必要とする。これらの大部分は、非結合性である。このように膨大な数の主要形質転換細胞を生成することは、現在の形質転換技術およびバクテリオファージ展示系では実現不可能である。例えば、Ｂａｒｂａｓ（Ｂａｒｂａｓら、１９９２）は、５ｘ１０７の形質転換細胞しか生成しなかったが、これは、完全にランダム化したＣＤＲライブラリーの潜在的多様性のごく一部を呈示するに過ぎない。
【０３６６】
これらの重大な制限にも拘わらず、ｓｃｆｖのバクテリオファージ展示によって、様々な有用な抗体および抗体融合タンパク質がすでに得られている。二重特異性一本鎖抗体が、効率的な腫瘍細胞の溶菌を仲介することがわかっている（Ｇｒｕｂｅｒら、１９９４）。抗Ｒｅｖ ｓｃｆｖの細胞内発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＨＩＶ−１ウイルス複製を阻害し（Ｄｕａｎら、１９９４）、抗ｐ２１ｒａｒ、ｓｃｆｖの細胞内発現が、アフリカツメガエルの卵母細胞の減数分裂を阻害することが明らかにされている（Ｂｉｏｃｃａら、１９９３）。また、ＨＩＶ感染を診断するのに使用することができる組換えｓｃｆｖも報告されており、ｓｃｆｖの診断有用性を証明している（Ｌｉｌｌｅｙら、１９９４）。毒素や繊維素溶解アクチベータータンパク質等、第２ポリヌクレオチドにｓｃＦｖを結合する融合タンパク質も報告されている（Ｈｏｌｖｏｓｔら、１９９２；Ｎｉｃｈｏｌｌｓら、１９９３）。
【０３６７】
広範な抗体多様性を有し、そして見込まれる配列組合せのごく一部しか扱えない従来のＣＤＲ突然変異誘発およびランダム化方法の制限事項の多くを解決するｓｃＦｖを生成することができれば、治療および診断に使用するのに適したｓｃｆｖの数および品質を大幅に改善できるであろう。この課題に取り組むため、本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏシャッフリング方法を用いて、選択した展示抗体由来の核酸から取得した（典型的には、ＰＣＲ増幅またはクローニングを通して）ＣＤＲを組み換える。このような展示抗体は、細胞、バクテリオファージ粒子、ポリソーム、あるいは、抗体が、そのコード核酸を伴うあらゆる適切な抗体展示系に展示することができる。ある態様では、ＣＤＲは、初め、抗体産生細胞（例えば、免疫された野性型マウス、ヒト、あるいは、ＷＯ９２／０３９１８、ＷＯ９３／１２２２７およびＷＯ９４／２５５８５号に記載されているように、ヒト抗体を産生可能なトランスジェニックマウス由来のプラズマ細胞／脾細胞）（これらに由来するハイブリドーマを含む）からのｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）から取得する。
【０３６８】
上記方法のいずれかにより、第１選択ラウンドで選択したポリヌクレオチド配列（典型的には、抗原（例えば、リガンド）に結合する展示抗体の親和性選択による）をプールし、このプールを、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ組換え、特に、ＣＤＲのシャッフリング（典型的には、重鎖ＣＤＲを他の重鎖ＣＤＲで、軽鎖ＣＤＲを他の軽鎖ＣＤＲでシャッフリングする）によりシャッフルして、組換え選択ポリヌクレオチド配列の集団から成るシャッフル済プールを生成する。組換え選択ポリヌクレオチド配列は、展示抗体として、選択フォーマットに発現させ、次に、少なくとも１回の選択ラウンドに付す。後の選択ラウンドで選択したポリヌクレオチド配列を直接使用し、配列決定し、および／または、所望の結合親和性が得られるまで、１回以上のシャッフリングおよび選択の追加ラウンドに付す。選択した配列は、例えば、ヒト可変領域フレームワークを用いた戻り交雑により、中立抗体フレームワーク配列（すなわち、抗原結合に不要な機能的作用を及ぼすもの）をコードするポリヌクレオチド配列で戻り交雑して、ヒト様配列抗体を産生することも可能である。一般に、戻り交雑の間、次の選択を実施して、予め決めた抗原に対する結合特性を保持する。
【０３６９】
これに代わり、あるいは、上記態様と組み合わせて、標的エピトープの抗体価を変えて、選択したｓｃｆｖライブラリーメンバーの平均結合親和性を制御することも可能である。標的エピトープを、競合エピトープの含有、希釈、またはその他の当業者には公知の方法等によって、密度を変えながら、表面または基質に結合することができる。低密度（抗体価）は、親和性が高い方のｓｃｆｖライブラリーメンバーを優先的に富化するのに対し、高密度（抗体価）の予め決定したエピトープを用いて、親和性が比較的低いｓｃｆｖライブラリーメンバーを富化することができる。
【０３７０】
多様な可変セグメントを生成するために、ランダム、擬似ランダム、またはペプチド配列の規定配列核セットをコードする合成オリゴヌクレオチドの集団を連結反応により、予め決めた部位（例えば、ＣＤＲ）に挿入することができる。同様に、部位指向性突然変異誘発やＣＤＲ置換等で、ＣＤＲを突然変異させることにより、一本鎖抗体カセットの一つ以上のＣＤＲの配列多様性を拡大することも可能である。シャッフリング前のクローニングおよび増幅のために、得られたＤＮＡ分子を宿主中で増殖させる、あるいは、直接使用する（すなわち、宿主細胞中の増殖時に起こり得る多様性の損失を回避する）ことができ、次に、選択したライブラリーメンバーをシャッフルする。
【０３７１】
関心のある可変セグメントペプチド配列、または関心のある一本鎖抗体をコードする展示ペプチド／ポリヌクレオチド複合体（ライブラリーメンバー）を、親和性富化方法により、ライブラリーから選択する。これは、受容体やその他の高分子、あるいは、その他のエピトープ種等、関心のあるペプチド配列について特異的な固定化高分子またはエピトープを用いて、達成する。親和性選択手順を繰り返すことにより、所望の配列をコードするライブラリーメンバーの富化が達成され、これらメンバーを単離して、プールおよびシャッフリング、配列決定、および／または、更なる増幅ならびに親和性富化が可能である。
【０３７２】
所望の特異性を持たないライブラリーメンバーは、洗浄により除去する。必要な洗浄の度合いおよびストリンジェンシーは、各ペプチド配列または関心のある一本鎖抗体、ならびに、固定化され予め決定した高分子またはエピトープに応じて、決定する。結合インキュベーションの条件および後の洗浄を調節することにより、回収した発生ペプチド／ＤＮＡ複合体の結合特性に対し、ある程度の制御を及ぼすことができる。温度、ｐＨ、イオン強度、二価カチオン濃度、ならびに、洗浄の量および時間は、固定された高分子の親和性の特定範囲内で、発生ペプチド／ＤＮＡ複合体について選択する。遅い解離速度に基づく選択は、通常、高い親和性を予測させるが、最も実用的な方法であることが多い。これは、飽和量の予め決めた遊離高分子の存在下での連続的インキュベーション、あるいは、洗浄の量、回数、および時間の増加のいずれかにより、実施できる。いずれの場合にも、解離した初期ペプチド／ＤＮＡまたはペプチド／ＲＮＡ複合体の結合が阻害され、時間を引き延ばすほど、親和性の高い発生ペプチド／ＤＮＡまたはペプチド／ＲＮＡ複合体が回収される。
【０３７３】
結合および洗浄手順をさらに変更して、特殊な特徴を有するペプチドを取得することもできる。親和性が、イオン強度もしくは陽イオン濃度に左右されるペプチドもある。これは、ペプチドからタンパク質を除去するのに、穏やかな条件が求められるとき、各種タンパク質の親和性精製に用いられるペプチドについて、有用な特徴である。
【０３７４】
ある態様では、複数の結合標的（複数のエピトープ種、複数の受容体種）を使用することにより、様々な結合特異性を有する多数のｓｃｆｖについて、ｓｃｆｖライブラリーを同時にスクリーニングすることができる。ｓｃｆｖライブラリーのサイズが、見込まれるｓｃｆｖ配列の多様性を制限することから、典型的には、サイズが可能な限り大きなｓｃｆｖライブラリーを用いるのが望ましい。所定数の非常に大きなポリソームｓｃｆｖ表示ライブラリーを生成する上での時間および経済的要件は、膨大なものになる。この重大な問題を避けるために、複数の予め決めたエピトープ種（受容体種）を単一ライブラリーで、同時にスクリーニングする、あるいは、所定数のエピトープ種に対する逐次的スクリーニングを実施することができる。ある態様では、それぞれ個別のビーズ（もしくはビーズのサブセット）にコードされた多数の標的エピトープ種を混合し、適切な結合条件下でポリソーム表示ｓｃｆｖライブラリーとインキュベートすることができる。複数のエピトープ種を含むビーズの集団を用いて、親和性選択によりｓｃｆｖライブラリーメンバーを単離することができる。一般に、後の親和性スクリーニングラウンドは、ビーズの同じ混合物、そのサブセット、あるいは、一つまたは二つの個別エピトープ種を含むビーズを含み得る。この手法は、効率的スクリーニングを可能にし、研究室の自動化、バッチ処理、ならびにハイスループットスクリーニング法と両立するものである。
【０３７５】
本発明においては、様々な方法を用いて、ペプチドライブラリーまたは一本鎖抗体ライブラリーを多様化する、あるいは、シャッフリング前またはこれと同時に、初期選別ラウンドで得られるほぼ可変のセグメントペプチドを多様化して、予め決めた高分子またはエピトープに対する十分な結合活性を得ることができる。ある手法では、ポジティブな選択ペプチド／ポリヌクレオチド複合体（親和性強化の初期ラウンドで同定されたもの）を配列決定して、活性ペプチドのアイデンティティを決定する。次に、一次オリゴヌクレオチド配列の軽度の変異を生成するための各ステップで組み込まれた低レベルの全塩基を用いて、これらの活性ペプチド配列に基づき、オリゴヌクレオチドを合成する。適した位置でのこの（軽度）縮合オリゴヌクレオチドの混合物を可変セグメント配列中にクローニングする。この方法は、出発ペプチド配列の、体系的な、制御された変異を生成し、次にこれをシャッフリングすることができる。しかし、これには、個別のポジティブな初期ペプチド／ポリヌクレオチド複合体を突然変異誘発前に配列決定する必要があり、従って、回収した少数の複合体の多様性を拡大し、親和性および／または結合特異性がより高い変異体を選択するのに有用である。ある態様では、ポジティブな選択ペプチド／ポリヌクレオチド複合体（特に、可変領域配列の複合体であり、その増幅産物は、スクリーニングの１以上の追加ラウンドで、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏでシャッフリングする）の突然変異誘発ＰＣＲ増幅は、配列決定の前に実施する。同じ一般的手法を一本鎖抗体と共に用いて、典型的には、シャッフリングの前またはこれと同時に、ＣＤＲまたは隣接するフレームワーク領域を多様化することにより、多様性を拡大し、結合親和性／特異性を増大することができる。所望であれば、シャッフリング反応を、選択ライブラリーメンバーによるｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えが可能な突然変異原性オリゴヌクレオチドで強化してもよい。従って、合成オリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ生成ポリヌクレオチド（エラー−プローン法、もしくは忠実度の高い方法で合成した）をｉｎ ｖｉｔｒｏシャッフリングミックスに添加し、得られるシャッフリング済ライブラリーメンバー（シャフラント）に組み込むことができる。
【０３７６】
本発明のシャッフリングは、ＣＤＲ突然変異体一本鎖抗体の膨大なライブラリーの生成を可能にする。このような抗体を生成する一つの方法は、シャッフリングの前、もしくは、これと同時に、合成ＣＤＲを、一本鎖抗体および／またはＣＤＲランダム化に挿入することである。合成ＣＤＲカセットの配列は、ヒトＣＤＲの既知の配列データを参照して、選択すると共に、次の指針に従い、実験者の判断で選択する：合成ＣＤＲは、既知のＣＤＲ配列に対して、少なくとも４０％位置配列同一性を有し、好ましくは、既知のＣＤＲ配列に対して、少なくとも５０〜７０％位置配列同一性を有する。例えば、Ｋａｂａｔ（Ｋａｔａｔら、１９９１）に列挙された自然発生のヒトＣＤＲ配列に基づいて、オリゴヌクレオチド配列の集団を合成することにより、合成ＣＤＲ配列の集団を生成することができる。合成ＣＤＲ配列のプールを計算し、少なくとも一つの既知自然発生ヒトＣＤＲ配列に対して、少なくとも４０％の配列同一性を有するＣＤＲペプチド配列をコードする。あるいは、自然発生ＣＤＲ配列の集団を比較して、共通配列を生成することにより、残基位置でよく用いられるアミノ酸（既知ＣＤＲ配列の少なくとも５％）を対応する位置で、合成ＣＤＲに組み込む。典型的には、複数（例えば、３〜約５０）の既知ＣＤＲ配列を比較し、既知のＣＤＲ間に認められる天然配列の多様性について表を作成する。次いで、認められた天然配列多様性の全部もしくは、ほとんどの順列を包含するＣＤＲペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチドの集団を合成する。非制限的例として、ヒトＶＨ ＣＤＲ配列の集団が、Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、またはＡｓｐのいずれかであるカルボキシ−末端アミノ酸を有する場合には、カルボキシ末端ＣＤＲ残基が、上記アミノ酸のいずれかとなるように、合成ＣＤＲオリゴヌクレオチド配列のプールを設計する。いくつかの態様では、ＣＤＲ配列の集団において残基位置で自然に発生するもの以外の残基が組み込まれる。同類アミノ酸置換が組み込まれることが多く、５つまでの残基位置が、既知の自然発生ＣＤＲ配列と比較して、非同類アミノ酸置換を組み込むように変化され得る。このようなＣＤＲ配列は、一次ライブラリーメンバーで使用する（第１選択ラウンド前に）および／または、選択したライブラリーメンバー配列のｉｎ ｖｉｔｒｏシャッフリング反応をスパイクするのに使用することができる。規定および／または縮重配列のこのようなプールの構築は、当業者であれば、容易に達成するであろう。
【０３７７】
合成ＣＤＲ配列の集団は、自然発生のＣＤＲ配列であることが知られていない、少なくとも１つのメンバーを含んでいる。実験者の判断で、重鎖ＣＤＲへのＮ領域付加に対応するランダムまたは擬似ランダム配列の一部を含んでもよいし、また、含まなくてもよい。尚、Ｎ領域配列は、Ｖ−ＤおよびＤ−Ｊ結合部に発生する１ヌクレオチド〜約４ヌクレオチドの範囲である。合成重鎖ＣＤＲ配列の集団は、少なくとも約１００ユニークＣＤＲ配列、典型的には、少なくとも約１，０００ユニークＣＤＲ配列、好ましくは少なくとも約１０，０００ユニークＣＤＲ配列、多くの場合、５０，０００以上のユニークＣＤＲ配列を含むが、１ｘ１０６を超えるユニークＣＤＲ配列は該集団に含まれない。しかし、場合によっては、特に、自然発生のヒトＣＤＲ中の位置において、同類アミノ酸置換が存在しない、あるいは稀である（すなわち、０．１％以下）位置で、同類アミノ酸置換可能な場合、１ｘ１０７〜１ｘ１０８ユニークＣＤＲ配列が存在する。一般には、ライブラリーに含まれるユニークＣＤＲの数は、ライブラリー中の一次形質転換細胞の予測数を因数１０以上超えてはならない。このような一本鎖抗体は、一般に、少なくとも、約１ｘ１０ｍ−、好ましくは、少なくとも約５ｘ１０７Ｍ−１、さらに好ましくは、少なくとも１ｘ１０８Ｍ−１〜１ｘ１０９Ｍ−１、時には１ｘ１０１０Ｍ−１まで、またはそれ以上の親和性で結合する。多くの場合、予め決めた抗原は、例えば、ヒト細胞表面抗原（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＬ−２受容体、ＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体）、その他のヒト生物学的高分子（例えば、トロンボモジュリン、タンパク質Ｃ、炭水化物抗原、シアリルルイス抗原、Ｌセレクチン）等のヒトタンパク質、あるいは、非ヒト疾病関連高分子（例えば、細菌性ＬＰＳ、ビリオンカプシドタンパク質またはエンベロープ糖タンパク質）等である。
【０３７８】
所望の特異性を有する高親和性一本鎖抗体を操作し、様々な系で発現させることができる。例えば、ｓｃｆｖは、植物中で生成されており（Ｆｉｒｅｋら、１９９３）、原核細胞の系でも容易に生成させることができる（ＱｗｅｎｓおよびＹｏｕｎｇ、１９９４；ＪｏｈｎｓｏｎおよびＢｉｒｄ、１９９１）。さらに、一本鎖抗体を、全抗体もしくはその各種フラグメントを形成するための基礎として用いることもできる（Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、１９９４）。配列をコードする可変領域を単離し（例えば、ＰＣＲ増幅またはサブクローニングにより）、免疫原性が好ましく最小限になるヒトの治療用途にさらに適したヒト配列抗体をコードするように、所望のヒト定常領域をコードする配列にスプライスする。得られた完全にヒトのコーディング配列を有するポリヌクレオチドを宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞の発現ベクター由来の）に発現させ、薬剤配合物調製のために精製することができる。
【０３７９】
ＤＮＡ発現構築物には、典型的に、自然付随または異種プロモーター領域を含むコーディング配列に操作可能に結合した発現制御ＤＮＡ配列が含まれる。好ましくは、この発現制御配列は、真核宿主細胞を形質転換もしくはトランスフェクトすることが可能なベクターにおける真核プロモーター系である。ベクターを適切な宿主に組み込んだ後、ヌクレオチド配列の高レベル発現に適した条件に宿主を維持し、突然変異体「操作」抗体を回収および精製する。
【０３８０】
既に述べたように、ＤＮＡ配列は、該配列を発現制御配列に操作可能に結合した（すなわち、構造遺伝子の転写および翻訳を確実するように配置させた）後、宿主中で発現させる。これらの発現ベクターは、典型的に、エピソームまたは宿主染色体ＤＮＡの一部のいずれかとして、宿主生物で複製可能である。一般に、発現ベクターは、選択マーカー、例えば、テトラサイクリンまたはネオマイシンを含む、所望のＤＮＡ配列で形質転換した細胞の検出を可能にする（例えば、ＵＳＰＮ第４，７０４，３６２号を参照。尚この文献は、参照として本文に組み込む）。
【０３８１】
酵母等の真核微生物の他に、哺乳動物の組織細胞培養を用いて、本発明のポリペプチドを生成することもできる（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ、１９８７を参照。尚、この文献は参照として本文に組み込む）。無傷の免疫グロブリンを分泌できる適切な宿主細胞系がいくつか開発されていることから、実際には、真核細胞が好ましい。この真核細胞には、ＣＨＯ細胞系、各種ＣＯＳ細胞系、ＨｅＬａ細胞、ならびに骨髄腫細胞系が含まれるが、形質転換したＢ細胞またはハイブリドーマが好ましい。これら細胞の発現ベクターとしては、複製起点、プロモーター、エンハンサー等の発現制御配列（Ｑｕｅｅｎら、１９８６）、ならびに、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列等の必要処理情報部位が挙げられる。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス等に由来するプロモーターである。
【０３８２】
真核ＤＮＡ転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより、増加させることができる。エンハンサーは、プロモーターによる転写を増加する１０〜３００ｂｐのシス作用配列である。エンハンサーは、転写ユニットに対して５１または３１のいずれかのとき、転写を効果的に増加する。これらのエンハンサーはまた、イントロン内、あるいは、コーディング配列自体内に位置するときも、効果的である。典型的に、ウイルスエンハンサーを用いるが、これらには、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、ならびにアデノウイルスエンハンサーが含まれる。また、マウス免疫グロブリン重鎖エンハンサー等、哺乳動物系由来のエンハンサー配列もよく用いられている。
【０３８３】
哺乳動物発現ベクター系はまた、典型的に、選択可能な標識遺伝子を含む。適した標識の例として、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、あるいは、薬物耐性を付与する原核細胞遺伝子が挙げられる。初めの二つの標識遺伝子は、増殖培地にチミジンを添加せずには増殖する能力がない変異体細胞系を使用するのが好ましい。次に、非補充培地での増殖能力によって、形質転換した細胞を同定する。標識として有用な原核の薬物耐性遺伝子の例として、Ｇ４１８に耐性を賦与する遺伝子、ミコフェノール酸およびハイグロマイシンがある。
【０３８４】
目的のＤＮＡセグメントを含むベクターを、細胞宿主の種類に応じて、周知の方法により宿主細胞に移入させることができる。例えば、原核細胞には、一般に、塩化カルシウムトランスフェクションを使用するが、他の細胞宿主には、リン酸カルシウム処理、リポフェクション、もしくは、電気穿孔を用いてもよい。哺乳動物細胞を形質転換するのに使用される他の方法には、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔、ならびに、マイクロインジェクション（概要は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８２および１９８９を参照）等が挙げられる。
【０３８５】
発現した後、本発明に従う突然変異を起こした個々の免疫グロブリン鎖、突然変異を起こした抗体フラグメント、ならびに、その他の免疫グロブリンポリペプチドを、硫酸アンモニウム沈殿、フラクションカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等の標準的手順に従って精製することができる（概要は、Ｓｃｏｐｅｓ、１９８２を参照）。所望により、部分的に、あるいは均一になるまで精製した後、ポリペプチドを、治療のために使用したり、もしくは、検定手順、免疫蛍光染色等を開発および実施するのに使用することができる（概要は、ＬｅｆｋｏｖｉｔｓおよびＰｅｒｎｉｓ、１９７９および１９８１；Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ、１９９７を参照）。
【０３８６】
本発明の方法により生成した抗体は、診断および治療に使用できる。非制限的な例として、これら抗体を用いて、癌、自己免疫疾患、もしくはウイルス感染を処置することができる。癌の処置のためには、上記抗体は、典型的に、ｅｒｂＢ−２、ＣＥＡ、ＣＤ３３、ならびに、当業者には周知のその他多数の抗原および結合メンバー等、癌細胞に優先的に発現した抗原に結合する。
【０３８７】
末端選択
本発明は、ポリヌクレオチドの出発セットから、ポリヌクレオチドのサブセットを選択する方法であり、実施ポリヌクレオチドのどこにでも存在する１つ以上の選択可能な特徴（すなわち選択マーカー）を識別する能力に基づいて、各選択可能なポリヌクレオチドの受容（正の）および／または拒絶（負の）選択が実施できるようにする方法を提供する。好ましい形態では、末端選択と呼ばれる方法が提供されるが、この方法は、選択可能なポリヌクレオチドの末端領域に一部もしくは全体が位置する選択マーカーの使用に基づくものであり、このような選択マーカーを「末端選択マーカー」と呼ぶこともある。
【０３８８】
末端選択は、たとえ同一ポリヌクレオチド内でも、天然配列の検出、または、実験（本明細書に記載した、もしくは記載されていないあらゆる突然変異誘発方法を含む）により導入した配列の検出、あるいは、両方に基づくものである。末端選択マーカーは、構造的選択マーカーまたは機能的選択マーカー、あるいは構造的および機能的選択マーカーの両方のいずれでもよい。末端選択マーカーは、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列、もしくは、化学的構造、あるいは生物学的または生化学的タグから成るものでよく、放射能検出、酵素活性、蛍光、光学的特徴、磁気特性（磁気ビーズを用いて）、免疫反応性、ならびにハイブリダイゼーションの検出に基づく方法を用いて選択できるマーカーが含まれる。
【０３８９】
末端選択は、突然変異誘発の実施に有用なあらゆる方法と組み合わせて使用することもできる。このような突然変異誘発法には、限定しないが、本明細書に記載した方法（前述および後述）が含まれる。このような方法の非制限的な例として、次の用語で呼ばれる、本明細書に記載した、あるいは、他の文献に記載されているあらゆる方法が挙げられる：「飽和突然変異誘発」、「シャッフリング」、「組換え」、「再集合」、「誤りがちな（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ」、「集合ＰＣＲ」、「セクシャルＰＣＲ」、「乗換えＰＣＲ」、「オリゴヌクレオチドプライマー特異的突然変異誘発」、「周期的（および／または指数）アンサンブル突然変異誘発（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ、１９２２を参照）、「カセット突然変異誘発」、「ｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発」、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発」。さらに、末端選択は、あらゆる突然変異誘発および／または増幅方法（例えば、Ａｒｎｏｌｄ、１９９３；ＣａｒｄｗｅｌｌおよびＪｏｙｃｅ、１９９２；Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４を参照；望ましい子孫分子の選択（これら分子の存在のスクリーニングも含む）をする上で、使用することが好ましい方法））により生成された分子について実施することもできる。
【０３９０】
さらに、末端選択は、突然変異誘発法以外にも、ポリヌクレオチドに使用することができる。好ましい実施形態では、本明細書に記載した末端選択を用いて、別のポリヌクレオチドへの連結ステップ（ベクターへの連結を含む）等、クローニングステップを促進することができる。従って、本発明は、ライブラリーの作製、望ましいポリヌクレオチドの選択および／または強化、ならびに一般的クローニングを促進するための有用な手段としての末端選択に関する。
【０３９１】
特に好ましい実施形態では、末端選択は、ポリヌクレオチドの（正の）選択、あるいはポリヌクレオチドの（負の）選択に基づく。さらには、末端選択は、（正の）選択および（負の）選択の両方に基づく。末端選択は、他の選択および／またはスクリーニング法と共に、同様の、もしくは異なる選択および／またはスクリーニング法、ならびに有用な突然変異誘発法と組み合わせて、相互作用的に実施することができる。これらの方法はすべて、相互作用的に、しかも、どんな順序、組合せ、ならびに順列で行ってもよい。
【０３９２】
また、本発明のある実施形態によれば、末端選択を用いて、少なくとも一部が、環状のポリヌクレオチド（例えば、プラスミドまたはその他の環状ベクター、もしくは、部分的に環状のその他プラスミド）、および／または分枝、および／または、化学基または部分で、修飾した、もしくは、置換したポリヌクレオチドを選択することもできる。この実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、中間または中央領域から成る環状分子である。該領域は、５’フランキング領域（これは、末端選択のために、非環状ポリヌクレオチドの５’末端領域と同様の働きをする）により５’側に、また、３’末端領域（これは、末端選択の目的のために、非環状ポリヌクレオチドの３’末端領域と同様の働きをする）によって３’側に存在する。この非制限的例で用いられるように、いずれか二つの領域間に、あるいは三つすべての領域間でも、配列のオーバーラップがある可能性がある。
【０３９３】
本発明の非制限的形態では、線状ポリヌクレオチドの末端選択は、ポリヌクレオチド末端または複数の末端（５’末端または３’末端のいずれでもよい）、あるいはその近傍に位置する少なくとも一つの末端選択マーカーの存在に基づく一般的手法を用いて実施する。ある非制限的例では、末端選択は、ポリヌクレオチド配列を認識する酵素に認識される配列等（しかし、これに制限されない）の末端またはその近傍の特定配列の選択に基づく。ポリヌクレオチドの化学的修飾を認識し、触媒する酵素は、本書では、ポリヌクレオチド作用酵素と呼ぶ。好ましい態様では、有用なポリヌクレオチド作用酵素の非制限的例として、ポリヌクレオチド切断活性を有する酵素、ポリヌクレオチドメチル化活性を有する酵素、ポリヌクレオチド連結活性を有する酵素、ならびに、複数の異なる酵素活性を有する（非制限的に、例えば、ポリヌクレオチド切断活性とポリヌクレオチド連結活性の両方を有するもの等）酵素が挙げられる。
【０３９４】
従って、該当するポリヌクレオチド活性酵素には、市場で入手可能な、または、入手できないポリヌクレオチドエンドヌクレアーゼ、ならびにそのコンパニオンメチラーゼも含まれ、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｒｅｂａｓｅで閲覧できるもの、ならびに下に引用する文献（ＲｏｂｅｒｔｓおよびＭａｃｅｌｉ、１９９６）に記載されているものが挙げられる。好ましいポリヌクレオチドエンドヌクレアーゼとしては、限定しないが、ＩＩ型制限酵素（ＩＩＳ型を含む）があり、二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖を切断する酵素（例えば、５’．．．ＧＣ／ＧＧＣＣＧＣ．．．３’で両方の鎖を切断するＮｏｔＩ）や、二本鎖ポリヌクレオチドの一方の鎖だけを切断する酵素、すなわち、ポリヌクレオチド−ニッキング活性を有する酵素（例えば、５’．．．ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ／Ｎ．．．３’で一方の鎖だけを切断するＮ．ＢｓｔＮＢＩ）を挙げることができる。また、該当するポリヌクレオチド作用酵素には、ＩＩＩ型制限酵素も含まれる。
【０３９５】
さらに、該当するポリヌクレオチド作用酵素には、現在は入手できないが、将来開発される可能性のある酵素で、ポリヌクレオチドに、連結適合末端、特に、付着末端を生成するのに有用な酵素が含まれる。
【０３９６】
好ましい一例では、有用な選択マーカーは、ポリヌクレオチドの制限部位で、この部位は、対応するＩＩ型（またはＩＩＳ型）制限酵素に、ポリヌクレオチド末端を切断させ、ポリヌクレオチド内の所望の内部配列を破壊することのないように、ポリヌクレオチドの内部を切断することなく、所望の連結反応に有用な連結可能末端（少なくとも一つの塩基オーバーハングを有する平滑末端または付着末端を含む）を提供する。従って、対応する制限酵素の使用が、実施ポリヌクレオチドを内部で切断することを目的としない場合には、該当する制限部位の中でも、実施する特定のポリヌクレオチド内で、内部に存在しない（すなわち、末端以外には存在しない）部位が好ましい。これによって、使用するポリヌクレオチドの不要な内部切断を招くことなく、制限消化反応を完了、もしくは完了近くまで実施することができる。
【０３９７】
従って、好ましい形態によれば、末端選択に付そうとするポリヌクレオチドの内部に含まれない、または、含まれないと予想される、あるいは含まれないと思われる（例えば、実施ポリヌクレオチドに関する配列情報が不完全な場合）制限部位を使用するのが好ましい。この形態によれば、よく存在するものよりも、比較的稀にしか存在しない制限部位の方が、通常好ましいことに留意されたい。これに対し、例えば、末端選択と共に、組換え、もしくはその他の突然変異誘発方法を実施するために、ポリペプチドの内部切断を所望する場合もある。
【０３９８】
また、この発明によれば、不要な内部制限部位を除去するための方法（例えば、突然変異誘発方法）を使用することもできる。さらに、部分的消化反応（すなわち、部分的完了まで進行する消化反応）を用いて、末端領域の認識部位で消化を達成すると同時に、ポリペプチドの内部に発生し、しかも、同じ酵素により認識される感受性の高い制限部位を共有する。ある形態では、特定の酵素が、認識配列が発生する位置および環境に応じて、同じ認識配列の好ましい切断を提示することから、部分的消化が有用である。例えば、λＤＮＡは、５つのＥｃｏＲＩ部位を有するが、右末端に最も近い部位の切断は、分子の中央にある部位の１０倍以上の速さで発生することが報告されている。また、例えば、Ｓａｃ ＩＩはλＤＮＡに４つの部位を有するが、そのうちの３つは中央にクラスター化し、末端に最も近い残った部位（ヌクレオチド４０，３８６での）よりも５０倍速く切断される。すなわち、多くの研究者が、各種酵素について、部位優先を報告している（例えば、ＴｈｏｍａｓおよびＤａｖｉｓ、１９７５；Ｆｏｒｓｂｌｕｍら、１９７６；ＮａｔｈおよびＡｚｚｏｌｉｎａ、１９８１；ＢｒｏｗｎおよびＳｍｉｔｈ、１９７７；ＧｉｎｇｅｒａｓおよびＢｒｏｏｋｓ、１９８３；Ｋｒｕｇｅｒら、１９８８；ＣｏｎｒａｄおよびＴｏｐａｌ、１９８９；Ｏｌｌｅｒら、１９９１；Ｔｏｐａｌ、１９９１；ならびにＰｅｉｎ、１９９１；ほんの一例を挙げたにすぎない）。現在入手可能か、あるいは、将来入手可能かに拘わらず、使用するポリヌクレオチド作用酵素による部位優先の、経験による観察、ならびに、機械論的知識が、本発明による末端選択に役立つであろう。
【０３９９】
保護方法を用いて、酵素による不要な消化から指定制限部位（例えば、内部部位）を選択的に保護することができるが、保護しない場合には、該酵素は、これらの部位の存在に応答して、実施中のポリヌクレオチドを切断する恐れがある。このような保護方法には、不要な酵素活性を阻害する、メチル化や塩基置換（例えば、Ｔの代わりにＵ）等の修飾が含まれる。大きな（例えば、長さがメガ単位の）制限フラグメントを作製するのに十分希有な（例えば、非常に長い認識配列を有する）制限酵素の数は限られており、酵素切断部位の希有性を高めるためには、保護手法（例えば、メチル化による）が有用であることに留意すべきである。ＮｏｔＩの見掛け希有性を高めるためのＭ．ＦｎｕＩＩ（ｍＣＧＣＧ）の約二倍使用は、多数のうちの一例にすぎない（Ｑｉａｎｇら、１９９０；Ｎｅｌｓｏｎら、１９８４；ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ、１９８０；ＲａｌｅｉｇｈおよびＷｉｌｓｏｎ、１９８６）。
【０４００】
本発明の好ましい形態によれば、一般に、希有な切断部位の使用が好ましいことを特徴とする。一般には、制限部位の発生頻度は、そこに含まれるヌクレオチドの数、ならびに、そこに含まれる塩基要求の多義性によって決定される。従って、非制限的例では、例えば、８つの特異的ヌクレオチドから成る制限部位（例えば、４８に１、すなわち、６５，５３６に１の推定相対発生率を有するＮｏｔＩ部位すなわちＧＣ／ＧＧＣＣＧＣ、ランダム８−ｍｅｒｓ）は、例えば、６つのヌクレオチドから成るもの（例えば、４６に１、すなわち、４，０９６に１の推定相対発生率を有するＳｍａＩ部位すなわちＣＣＣ／ＧＧＧ、ランダム６−ｍｅｒｓ）よりも比較的頻度が低く、例えば、４つのヌクレオチドから成るもの（例えば４４に１、すなわち、２５６に１の推定相対発生率を有するＭｓｐＩ部位すなわちＣ／ＣＧＧ、ランダム４−ｍｅｒｓ）よりも比較的頻度が低い。さらに、別の非制限的例では、一般に、多義性の（しかし非常に特異的な）塩基要求を持たない制限部位（例えば、４５に１、すなわち、１０２４に１の推定相対発生率を有するＦｉｎＩ部位すなわちＣＴＣＣＣ、ランダム５−ｍｅｒｓ）は、多義性Ｗ（ただし、Ｗ＝ＡまたはＴ）塩基要件を有するもの（例えば、４ｘ４ｘ２ｘ４ｘ４に１、すなわち、５１２に１の推定相対発生率を有するＡｖａＩＩ部位すなわちＧ／ＧＷＣＣ−ランダム５−ｍｅｒｓ）より比較的頻度が低いが、多義性Ｎ（ただし、Ｎ＝ＡまたはＣまたはＧまたはＴ）塩基要求を有するもの（例えば、４ｘ４ｘ１ｘ４ｘ４に１、すなわち、２５６に１の推定相対発生率を有するＡｓｕＩ部位すなわちＧ／ＧＮＣＣ−ランダム５−ｍｅｒｓ）より比較的頻度が低い。これらの相対発生率は、特異的ヌクレオチド塩基（特異的ヌクレオチド配列はいうまでもなく）が、特異的ポリヌクレオチド、特異的種の生物、ならびに特異的グループの生物に、異なる頻度で発生することが認められるため、実際ポリヌクレオチドの大まかな推定値と考えられる。例えば、異なる種の生物の％Ｇ＋Ｃ含有率は、非常に異なることが多く、しかも広い範囲で変動する。
【０４０１】
選択標識として使用する比較的稀な制限部位には、非制限的に、好ましくは、少なくとも４ヌクレオチド配列から成る部位、さらに好ましくは、少なくとも５ヌクレオチド配列から成るもの、さらに好ましくは、少なくとも６ヌクレオチド配列から成るもの（例えば、ＢａｍＨＩ部位すなわちＧ／ＧＡＴＣＣ、ＢｇｌＩＩ部位すなわちＡ／ＧＡＴＣＴ、ＰｓｔＩ部位すなわちＣＴＧＣＡ／Ｇ、ならびにＸｂａＩ部位すなわちＴ／ＣＴＡＧＡ）、さらに好ましくは、少なくとも７ヌクレオチド配列から成るもの、さらに好ましくは、少なくとも８ヌクレオチド配列から成るもの（例えば、ＡｓｃＩ部位すなわちＧＧ／ＣＧＣＧＣＣ、ＮｏｔＩ部位すなわちＧＣ／ＧＧＣＣＧＣ、ＰａｃＩ部位すなわちＴＴＡＡＴ／ＴＡＡ、ＰｍｅＩ部位すなわちＧＴＴＴ／ＡＡＡＣ、ＳｒｆＩ部位すなわちＧＣＣＣ／ＧＧＧＣ、Ｓｓｅ８３８Ｉ部位すなわちＣＣＴＧＣＡ／ＧＧ、ならびにＳｗａＩ部位すなわちＡＴＴＴ／ＡＡＡＴ）、さらに好ましくは、９ヌクレオチド配列から成るもの、さらに好ましくは、少なくとも１０ヌクレオチド配列から成るもの（例えば、ＢｓｐＧＩ部位すなわちＣＧ／ＣＧＣＴＧＧＡＣ）が含まれる。さらに、いくつかの制限部位（例えば、クラスＩＩＳ酵素）は、特異性が比較的高い部分（すなわち、制限部位の発生頻度の主な決定因子を含む部分）と、特異性が比較的低い部分とから構成されること、また、切断部位は、特異性が比較的低い部分に含まれる、もしくは含まれないことが考えられる。例えば、Ｅｃｏ５７Ｉ部位すなわちＣＴＧＡＡＧ（１６／１４）には、特異性が比較的高い部分（すなわち、ＣＴＧＡＡＧ部分）と、切断部位を含む特異性が比較的低い部分（すなわち、Ｎ１６配列）がある。
【０４０２】
本発明の別の好ましい態様では、有用な末端選択標識は、特異的ポリヌクレオチド配列を認識するポリヌクレオチド作用酵素により認識される末端配列である。本発明の好ましい形態では、有用な末端選択標識は、従来のＩＩ型制限酵素に加えて、他の酵素も含む。この本発明の好ましい形態によれば、有用なポリヌクレオチド作用酵素には、ジャイレース、ヘリカーゼ、リコンビナーゼ、レラクサーゼ、ならびに、これらに近縁の酵素が含まれる。
【０４０３】
好ましい例としては、中でも、トポイソメラーゼ（一部が、ジャイレースのサブセットとして類別される）、ならびに、ポリヌクレオチド切断活性（好ましくは、ポリヌクレオチドニッキング活性を含む）および／またはポリヌクレオチド連結活性を有するその他のあらゆる酵素が挙げられる。好ましいトポイソメラーゼ酵素としては、特に、市販の入手源（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ウィスコンシン州マジソン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバート；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、メリーランド州ガテスバーク）から、また恐らく、個人的採取源からも、入手可能なトポイソメラーゼＩ酵素が挙げられる。本書に記載した末端選択に有用な類似酵素が、将来開発されることも考えられる。特に好ましいトポイソメラーゼＩ酵素は、ワクシニアウイルスを起原とするトポイソメラーゼＩ酵素であり、これは、特異的認識配列（例えば、５’．．．ＡＡＧＧＧ．．．３’）を有し、ポリヌクレオチドニッキング活性とポリヌクレオチド連結活性の両方を備えている。この酵素の特異的ニッキング活性（一方の鎖の切断）により、内部認識部位は、切断された末端部位の変性を起こす温度では、ニッキング活性によって起こるポリヌクレオチド破壊を被りにくい（むしろ、アニーリングされた状態を保つ）。従って、末端切断に使用する際、トポイソメラーゼに基づく末端選択のためのニッキング部位は、末端から１００ヌクレオチド以下、さらに好ましくは、末端から５０ヌクレオチド以下、さらに好ましくは、末端から２５ヌクレオチド以下、さらに好ましくは、末端から２０ヌクレオチド以下、さらに好ましくは、末端から１５ヌクレオチド以下、さらに好ましくは、末端から１０ヌクレオチド以下、さらに好ましくは、末端から８ヌクレオチド以下、さらに好ましくは、末端から６ヌクレオチド以下、さらに好ましくは、末端から４ヌクレオチド以下であるのが好ましい。
【０４０４】
非制限的で、あくまで例示のための特に好ましい態様では、トポイソメラーゼに基づく末端選択用のニッキング部位が、末端から４ヌクレオチドの時、ニッキングにより、４塩基（末端領域で）の一本鎖オリゴを生成するが、このオリゴは、末端選択可能ポリヌクレオチドにおけるその相補鎖から変性することができる。これによって、続く連結反応に有用なポリヌクレオチドの付着末端（４塩基から成る）が形成される。クローニングベクター（好ましくは、発現ベクター）との連結反応を達成するため、制限酵素に基づく手段等のいずれかの手段により、クローニングベクターに、適合付着末端を生成することができる。末端選択可能ポリヌクレオチド末端における末端ヌクレオチド（この具体例では、４末端塩基から成る）を賢明に選択することによって、ポリヌクレオチドを連結しようとするクローニングベクターに生成された付着末端に、適合性を付与することができる。
【０４０５】
これに対し、例えば、末端から５００塩基の、末端選択可能ポリヌクレオチドの内部ニッキングは、５００塩基の一本鎖オリゴを生成し、このオリゴは、その相補鎖から容易に変性されないが、むしろ修復に有用である（例えば、ニックを発生する同じトポイソメラーゼ酵素）。
【０４０６】
従って、本発明は、実施するポリヌクレオチドニッキング付着末端を生成するための−例えば、ワクシニアトポイソメラーゼに基づく、および／またはＩＩ（もしくはＩＩＳ）型制限エンドヌクレアーゼに基づく、および／または、ＩＩＩ型制限エンドヌクレアーゼに基づく、および／またはニッキング酵素に基づく（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩを用いて）−方法であって、上記末端は連結適合性であり、少なくとも１塩基オーバーハングから成る方法を提供する。好ましくは、このような付着末端は、少なくとも２塩基オーバーハングから成り、さらに好ましくは、この付着末端は、少なくとも３塩基オーバーハングから成り、さらに好ましくは、この付着末端は、少なくとも４塩基オーバーハングから成り、さらに好ましくは、この付着末端は、少なくとも５塩基オーバーハングから成り、さらに好ましくは、この付着末端は、少なくとも６塩基オーバーハングから成る。また、上記付着末端は、少なくとも７塩基オーバーハング、または、少なくとも８塩基オーバーハング、または、少なくとも９塩基オーバーハング、または、少なくとも１０塩基オーバーハング、または、少なくとも１５塩基オーバーハング、または、少なくとも２０塩基オーバーハング、または、少なくとも２５塩基オーバーハング、または、少なくとも３０塩基オーバーハングから成るものでもよい。これらのオーバーハングは、Ａ、Ｃ、ＧまたはＴを含むいずれの塩基から構成されてもよい。
【０４０７】
トポイソメラーゼまたはニッキング酵素（例えば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩを用いて）を用いて導入した付着末端オーバーハングは、連結反応環境に独特の設計とし、自己二量体化およびその他不必要な鎖状体化等、不要なフラグメントの再集合を防止することができる。
【０４０８】
本発明のある形態によれば、ポリメラーゼに基づく反応の使用により、末端選択可能ポリヌクレオチドの末端領域に、複数の配列（オーバーラップしてもよいが、必ずしもオーバーラップする必要はない）を導入することができる。該当するが、決して制限的ではない例では、このようなオリゴを用いて、トポイソメラーゼＩに基づく末端選択に有用な好ましい５’末端領域を達成することができる。このオリゴは、付着末端に変換可能な（好ましくは、ワクシニアトポイソメラーゼＩにより）１〜１０塩基配列、リボソーム結合部位（すなわち、「ＲＢＳ」で、好ましくは、発現クローニングに有用なもの）、ならびに、任意のリンカー配列と、これに続くＡＴＧ出発部位および０〜１００塩基の鋳型特異的配列（ポリメラーゼに基づく反応での鋳型へのアニーリングを促進するため）から構成される。従って、この態様によれば、有用なオリゴ（フォワードプライマーと呼ばれる）は、次の配列を有する：５’［末端配列＝（Ｎ）１−１０］［トポイソメラーゼＩ部位およびＲＢＳ＝ＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧ］［リンカー＝（Ｎ）１−１００］［出発コドンおよび鋳型特異的配列＝ＡＴＧ（Ｎ）０−１００］３’。
【０４０９】
同様に、該当するが、決して制限的ではない例では、オリゴを用いて、トポイソメラーゼＩに基づく末端選択に有用な好ましい３’末端領域を達成することができる。このオリゴは、付着末端に変換可能な（好ましくは、ワクシニアトポイソメラーゼＩにより）１〜１０塩基配列、ならびに、任意のリンカー配列と、これに続く０〜１００塩基の鋳型特異的配列（ポリメラーゼに基づく反応での鋳型へのアニーリングを促進するため）から構成される。従って、この態様によれば、有用なオリゴ（リバースプライマーと呼ばれる）は、次の配列を有する：５’［末端配列＝（Ｎ）１−１０］［トポイソメラーゼＩ部位＝ＡＡＧＧＧ］［リンカー＝（Ｎ）１−１００］［鋳型特異的配列＝ＡＴＧ（Ｎ）０−１００］３’。
【０４１０】
末端選択を用いて、子孫分子（例えば、突然変異誘発により生成されたもの）から、親鋳型分子（例えば、突然変異誘発を実施すべきもの）を識別および分離することができる。例えば、トポイソメラーゼＩ認識部位がないプライマーの第１セットを用いて、親分子の末端領域（例えば、ポリメラーゼに基づく増幅）を修飾することができる。その後、上記とは別の第２セットのプライマー（例えば、トポイソメラーゼＩ認識部位を有する）を用いて、増幅した鋳型分子から、突然変異させた子孫分子を生成することができる（例えば、合成の中断、鋳型スイッチングポリメラーゼに基づく増幅、または合成の中断等のポリヌクレオチドキメラ化方法；または、飽和突然変異誘発；あるいは、本書に記載したように、トポイソメラーゼＩ認識分子を、突然変異誘発させた子孫分子に導入するその他のいずれかの方法を用いて）。次に、トポイソメラーゼＩに基づく末端選択を使用して、識別だけではなく、所望の子孫分子の、選択的トポイソメラーゼＩに基づく連結反応を促進することができる。
【０４１１】
従って、増幅した親分子に対する第２組のプライマーのアニーリングは、第１組のプライマー（すなわち、一組の親部位を増幅するのに使用されるプライマー）に、トポイソメラーゼＩ認識部位に類似しているが、機能トポイソメラーゼＩ酵素の認識を阻害するのに十分異なる配列を組み込むことにより促進することができる。例えば、ＡＡＧＧＧ部位のいずれかの１塩基〜全５塩基を変えた配列を第１セットのプライマー（突然変異誘発に付す前に、親鋳型の増幅に使用するもの）に組み込むことができる。具体的かつ非制限的形態では、親分子は、例として以下に示すが、決して制限的ではない組のフォワードおよびリバースプライマーを用いて増幅することができる。
【０４１２】
フォワードプライマー：５’ＣＴＡＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧ（Ｎ）１０−１００３’、および
リバースプライマー：５’ＧＡＴＣＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧ（Ｎ）１０−１００３’
第１組のプライマーの上記例によれば、（Ｎ）１０−１００は、好ましくは１０〜１００ヌクレオチド長さの鋳型特異的配列、さらに好ましくは、１０〜５０ヌクレオチド長さの鋳型特異的配列、さらに好ましくは、１０〜３０ヌクレオチド長さの鋳型特異的配列、さらに好ましくは、１５〜２５ヌクレオチド長さの鋳型特異的配列を示す。
【０４１３】
具体的かつ非制限的形態によれば、この増幅（真のトポイソメラーゼＩ認識部位が欠如した上記第１セットのプライマーを用いて）の後、増幅した親分子を、真のトポイソメラーゼＩ認識部位を有する１セット以上のフォワードおよびリバースプライマーを用いて、突然変異誘発にかけることを特徴とする。従って、具体的かつ非制限的形態では、例として以下に示すが、決して制限的ではない第２組の前進およびリバースプライマーを用いて、親分子を、突然変異誘発した子孫分子を生成するための鋳型として使用することを特徴とする。
【０４１４】
フォワードプライマー：５’ＣＴＡＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＴＧ３’
リバースプライマー：５’ＧＡＴＣＡＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧ３’（ＡｓｃＩ認識部位配列を含む）
本発明に従う末端選択用の第１、第２、あるいは、これに続くセットのプライマーとして、特に記載していない異なるプライマーを何セットでも使用することも可能である。ＩＩ型制限酵素部位を組み込んでもよいことに留意すべきである（例えば、前述の例にＡｓｃＩ部位）。また、実施ポリヌクレオチドを飽和突然変異誘発に付すために、実験者は、記載した他の配列以外にも、一つ以上のＮ、Ｎ、Ｇ／Ｔトリプレットを有用なプライマーに組み込むことができる。すなわち、第２セットおよび／または続くセットのプライマーを使用することにより、トポイソメラーゼＩ部位の導入と、子孫ポリヌクレオチドにおける突然変異の誘発という二つの目的を達成することができる。
【０４１５】
従って、提供される一態様によれば、有用な末端選択標識とは酵素認識部位であり、この部位が、酵素に、指定部位でポリヌクレオチドを切断（ニックを含む）させ、生成された一本鎖オリゴが変性すると同時に、連結反応適合末端を形成する。次に、形成されたポリヌクレオチド末端の連結反応を、同じ酵素（例えば、ワクシニアウイルスの場合には、トポイソメラーゼＩ）、あるいは別の酵素を使用して達成することができる。本発明のある形態によれば、ポリヌクレオチドを選択するために、同種（例えば、二つのワクシニアウイルストポイソメラーゼＩ認識部位）または異種（例えばクラスＩＩ制限酵素認識部位およびワクシニアウイルストポイソメラーゼＩ認識部位）に拘わらず、あらゆる末端選択標識を組み合わせて用いることが可能である。従って、各選択可能ポリヌクレオチドは、１種以上の末端選択標識を有し、これら標識は、同種または異種末端選択標識のいずれでもよい。具体例では、複数の末端選択標識をポリヌクレオチドの一方の末端に位置させ、互いにオーバーラップ配列を持つようにすることができる。
【０４１６】
本発明に従う末端選択では、現在存在するか、将来開発されるかに拘わらず、何種類の酵素でも有用であることに特に留意すべきである。例えば、本発明の具体的態様では、末端選択を達成するために、ポリヌクレオチド連結活性源と共に、ニッキング酵素（例えば、５’．．．ＧＡＧＴＣＮＮＮＮ／Ｎ．．．３’で、一方の鎖だけを切断するＮ．ＢｓｔＮＢＩ）を用いることができる。この態様によれば、Ｎ．ＢｓｔＮＢＩの認識部位（トポイソメラーゼＩの認識部位ではなく）は、末端選択可能ポリヌクレオチドに組み込まなければならない（突然変異を誘発させた子孫分子の選択に末端選択を用いるかどうか、もしくは、突然変異誘発手順とは別に末端選択を用いるかどうかに拘わらず）。
【０４１７】
トポイソメラーゼに基づくニッキングおよび連結反応を用いたこの末端選択手法は、従来の選択方法に対して、いくつかの利点を有する。すなわち、この手法は、指向性クローニング（発現クローニングを含む）の達成を可能にする。特に、この手法を用いて、下記事項を達成することができる：直接連結反応（すなわち、伝統的な制限−精製−連結反応に付す必要がない。これは、開始制限反応から、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの使用に依存する連結反応まで、多く問題を被りやすい）；元の鋳型分子（例えば、トポイソメラーゼＩ部位が欠如した元の鋳型分子であり、該部位は、突然変異誘発後まで、導入されない）からの子孫分子の分離；サイズ分離段階（例えば、ゲルクロマトグラフィーまたはその他の電気泳動手段、あるいは、サイズ排除膜の使用により）の必要がなくなる；内部配列の保存（トポイソメラーゼＩが存在する場合でも）；連結反応（例えば、特に、不要な残留制限酵素活性の存在下で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの使用に依存した）がうまくいかない心配が不要になる；ならびに発現クローニングの促進（フレームシフトの心配がなくなる等）。また、トポイソメラーゼに基づくニッキングおよび連結反応を用いた上記末端選択法により、不要な制限酵素に基づく切断についての心配−特に、実施するポリヌクレオチドの内部制限部位での（あるいは、不要なスター活性のしばしば予測不可能な部位でも）−もなくすことができる。この切断は、実施ポリヌクレオチドの破壊部位となる恐れがある。
【０４１８】
２−ハイブリッドに基づくスクリーニング検定
また、シャッフリングを用いて、２−ハイブリッドスクリーニング系をスクリーニングすることにより得られた選択ライブラリーメンバーのプールを組換えにより多様化して、予め決められたポリペプチド配列に結合するライブラリーメンバーを同定することができる。選択したライブラリーメンバーをプールし、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏ組換えによりシャッフリングする。次に、シャッフリングしたプールを、酵母２−ハイブリッド系でスクリーニングして、上記の予め決定されたポリペプチド配列（例えば、ＳＨ２ドメイン）、もしくは、代わりの予め決められたポリペプチド配列（例えば、別のタンパク質種由来のＳＨ２ドメイン）に結合するライブラリーメンバーを選択することができる。
【０４１９】
予め決められたポリペプチド配列に結合するポリペプチド配列を同定する手法は、予め決められたポリペプチド配列が融合タンパク質に存在するいわゆる「２−ハイブリッド」系を使用することであった（Ｃｈｉｅｎら、１９９１）。この手法は、転写活性化因子（ＦｉｅｌｄｓおよびＳｏｎｇら、１９８９）、すなわち酵母Ｇａ１４転写タンパク質の再構成を通して、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質−タンパク質相互作用を同定する。この方法は、典型的に、酵母Ｇａ１４タンパク質の性質に基づくものである。該タンパク質は、ＤＮＡ結合および転写活性化を担う分離可能なドメインから成る。二つのハイブリッドタンパク質（一つは、既知のタンパク質のポリペプチド配列に融合した酵母Ｇａ１４ＤＮＡ結合ドメインから成り、他方は、第２タンパク質のポリペプチド配列に融合したＧａ１４活性化ドメインから成る）をコードするポリヌクレオチドを作製し、酵母宿主細胞に導入する。二つの融合タンパク質同士の分子間結合により、Ｇａ１４活性化ドメインを有するＧａ１４結合ドメインが再構成され、これによって、Ｇａ１４ＤＮＡ結合部位に操作可能に結合されたレポーター遺伝子（例えば、ｌａｃｚ、ＨＩＳ３）の転写活性化が起こる。典型的に、２−ハイブリッド法を用いて、既知のタンパク質と相互作用する新規のポリペプチド配列を同定する（ＳｉｌｖｅｒおよびＨｕｎｔ、１９９３；Ｄｕｒｆｅｅら、１９９３；Ｙａｎｇら、１９９２；Ｌｕｂａｎら、１９９３；Ｈａｒｄｙら、１９９２；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３；ならびにＶｏｊｔｅｋら、１９９３）。しかし、第２の既知タンパク質に対する結合に影響する既知タンパク質の突然変異を同定するのに、２−ハイブリッド法の変形例が用いられている（ＬｉおよびＦｉｅｌｄｓ、１９９３；Ｌａｌｏら、１９９３；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９３；ならびにＭａｄｕｒａら、１９９３）。また、２−ハイブリッド系は、二つの公知のタンパク質の相互作用構造ドメインの同定（Ｂａｒｄｗｅｌｌら、１９９３；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙら、１９９２：Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒら、１９９３；ならびにＭｉｌｎｅおよびＷｅａｖｅｒ１９９３）；あるいは、単一タンパク質のオリゴマー化の原因であるドメインの同定（Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３；Ｂｏｇｅｒｄら、１９９３）にも使用されている。タンパク質分解酵素のｉｎ ｖｉｖｏ活性の研究に、２−ハイブリッド系の変形が使用されている（Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａら、１９９２）。あるいは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／ＢＣＣＰ相互作用スクリーニング系（Ｇｅｒｍｉｎｏら、１９９２；Ｇｕａｒｅｎｔｅ、１９９３）を用いて、相互作用タンパク質配列（すなわち、ヘテロ二量体化する、もしくは、さらに高次のヘテロ多量体を形成するタンパク質配列）を同定することもできる。２−ハイブリッド系により選択した配列をプールし、シャッフリングした後、２−ハイブリッド系に導入して、１ラウンド以上の更なるスクリーニングに供し、予め決めた結合配列を含むハイブリッドに結合するポリペプチドハイブリッドを同定することも可能である。このようにして同定した配列を比較して、共通配列および共通配列の核（ｋｅｒｎａｌ）を同定する。
【０４２０】
一般に、組換えＤＮＡ技術の標準的方法は、様々な文献に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８７；ならびにＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、１９８７；いずれも参照として全文を本書に組み込む）。ポリヌクレオチドを修飾する酵素は、製造者の推奨事項に従って使用した。ＡＢＩ化学薬品を用いて、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．の３９４型ＤＮＡ合成装置で、オリゴヌクレオチドを合成した。所望であれば、予め決めたＤＮＡ配列を増幅するために、実験者の判断で、ＰＣＲ増幅装置を選択してもよい。
【０４２１】
１マイクログラムの鋳型ＤＮＡのサンプルを採取し、ＵＶ光線で処理することにより、ＴＴ二量体、特にプリン二量体等を作製する。ＵＶ暴露は、鋳型ＤＮＡサンプルの遺伝子毎に、わずかな光産物しか生成されないように、制限する。時間を変えながら、複数のサンプルをＵＶ光線で処理し、ＵＶ暴露による可変数の二量体を有する鋳型ＤＮＡサンプルを作製する。
【０４２２】
非校正ポリメラーゼ（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＰｒｉｍｅ−ＩｔＩＩランダムプライマーラベリングキット）を用いたランダムプライミングキットを使用して、ＵＶ光線で作製した（上記の通り）鋳型のランダム部位でプライミングし、鋳型に沿って伸長させることにより、様々なサイズのポリヌクレオチドを生成する。プライマーの伸長には、上記のようなＰｒｉｍｅ−ＩｔＩＩランダムプライマーラベリングキット等のプライミングプロトコルを使用してよい。ＵＶ暴露により作製した二量体は、非校正ポリメラーゼによる伸長のためのロードブロックとして役立つ。従って、ランダムプライマーによる伸長が完了すると、ランダムなサイズのポリヌクレオチドのプールが存在する。
【０４２３】
本発明はさらに、典型的には、増幅および／またはクローニングしたポリヌクレオチドの形態の、選択された突然変異体ポリヌクレオチド配列（もしくは、選択されたポリヌクレオチド配列の集団）を生成し、これにより、選択されたポリヌクレオチド配列が、選択することができる少なくとも一つの所望の表現型特徴（例えば、ポリペプチドをコードする、結合したポリヌクレオチドの転写を促進する、タンパク質を結合する等）を有することを特徴とする方法に関する。予め決めた生物学的高分子（例えば、受容体）への結合等、所望の構造または機能的性質を有するハイブリッドポリペプチドを同定する一つの方法は、ポリペプチドのアミノ酸配列が賦与した所望の構造または機能的性質を有する個別のライブラリーメンバーについて、ポリペプチドの大きなライブラリーをスクリーニングすることを包含する。
【０４２４】
ある態様では、本発明は、親和性相互作用スクリーニングまたは表現型スクリーニングに適した展示ポリペプチドもしくは展示抗体のライブラリーを生成する方法を提供する。この方法は、（１）　展示ポリペプチドまたは展示抗体と、該展示ポリペプチドまたは展示抗体をコードする会合ポリヌクレオチドとを含む選択されたライブラリーメンバーの第１集団を作製し、上記会合ポリヌクレオチドが、ほぼ同じ配列の領域を含む上記会合ポリヌクレオチドまたはそのコピーを作製し、上記ポリヌクレオチドまたはコピーに突然変異を最適に導入し、（２）　ポリヌクレオチドまたはコピーをプールし、（３）　ランダムまたは特殊化プライミングおよび合成方法もしくは増幅方法を中断することにより、さらに小さいもしくは短いポリヌクレオチドを生成し、（４）　増幅、好ましくはＰＣＲ増幅、ならびに、任意で突然変異誘発を実施することにより、新たに合成したポリヌクレオチドを相同的に組換えることから成る。
【０４２５】
本発明の特に好ましい目的は、下記を含む一連のステップにより有用なハイブリッドポリペプチドを発現するハイブリッドポリヌクレオチドを生成する方法を提供することである：
（ａ）　増幅または合成を停止または中断する手段を用いて、ポリヌクレオチド増幅もしくは合成工程を中断することにより、ポリヌクレオチドを生成し、これによって、ポリヌクレオチドの複製が様々な完了段階にあるために、小さいまたは短い複数のポリヌクレオチドを作製し；
（ｂ）　得られた一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドの集団に、１つ以上の一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを付加するが、このとき、該付加オリゴヌクレオチドは、上記集団の１つ以上の一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドに対する異種性領域に同一領域を含み；
（ｃ）　得られた一本鎖または二本鎖オリゴヌクレオチドを変性して、一本鎖ポリヌクレオチドの混合物を生成し、任意で、小さい、または短いポリヌクレオチドを、様々な長さを有するポリヌクレオチドのプール中に分離し、さらに任意で、該ポリヌクレオチドをＰＣＲ工程に付して、上記ポリヌクレオチドプールの少なくとも１つに含まれる１つ以上のオリゴヌクレオチドを増幅し；
（ｄ）　複数の上記ポリヌクレオチド、または、上記ポリヌクレオチドの少なくとも１つのプールをポリメラーゼとインキュベートするが、その際の条件を、一本鎖ポリヌクレオチド間の同一領域で、上記一本鎖ポリヌクレオチドのアニーリングが起こり、これによって、突然変異を誘発した二本鎖ポリヌクレオチド鎖が形成されるようなものとし；
（ｅ）　任意で、上記ステップ（ｃ）および（ｄ）を繰り返し；
（ｆ）　上記ポリヌクレオチド鎖から少なくとも一つのハイブリッドポリペプチドを発現させ；
（ｇ）　有用な活性について、少なくとも一つのハイブリッドポリペプチドをスクリーニングする。
【０４２６】
本発明の好ましい態様では、増幅または合成工程を停止または中断する手段は、ＵＶ光線、ＤＮＡ付加物、ＤＮＡ結合タンパク質の使用によるものである。
【０４２７】
本発明のある態様では、ＤＮＡ付加物、もしくはＤＮＡ付加物を含むポリヌクレオチドは、更なる処理の前に、ＤＮＡフラグメントを含有する溶液を加熱する工程を包含する方法等により、ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドプールから除去する。
【０４２８】
以上、本発明の例示的態様を開示してきたが、これらの態様は例示のために過ぎず、他の代替案、調整および変更を本発明の範囲内で実施できることに留意すべきである。従って、本発明は、本書に示した具体的態様に制限されない。
【０４２９】
これ以上詳述することなく、これまでの説明に従い、当業者が、本発明をその完全な範囲まで利用できると思われる。以下に示す実施例は、例示として考えるべきであり、これら以外の開示を何ら制限するものではない。
【０４３０】
実施例１
ＵＶ誘発光化学生成物を用いたランダムサイズポリヌクレオチドの生成
１マイクログラムの鋳型ＤＮＡサンプルを採取し、ＵＶ光で処理することにより、ＴＴ二量体、特にプリン二量体等の二量体を形成させる。ＵＶ暴露は、鋳型ＤＮＡサンプルの遺伝子毎に生成される光化学生成物がごく少数であるように、制限する。複数のサンプルを時間を変えながらＵＶで処理し、ＵＶ暴露から可変数の二量体を有する鋳型ＤＮＡサンプルを得る。
【０４３１】
非校正ポリメラーゼ（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＰｒｉｍｅ−ＩｔＩＩランダムプライマーラベリングキット）を用いたランダムプライミングキットを使用して、ＵＶで作製した（上記の通り）鋳型のランダム部位でプライミングし、鋳型に沿って伸長することにより、様々なサイズのポリヌクレオチドを生成する。プライマーの伸長には、上記のようなＰｒｉｍｅ−ＩｔＩＩランダムプライマーラベリングキット等のプライミングプロトコルを使用してよい。ＵＶ暴露により作製した二量体は、非校正ポリメラーゼによる伸長のための障害物（ｒｏａｄｂｌｏｃｋ）として働く。従って、ランダムプライマーによる伸長が終了すると、ランダムサイズのポリヌクレオチドのプールが存在する。
【０４３２】
実施例２
ランダムサイズポリヌクレオチドの単離
実施例１で作製した目的のポリヌクレオチドを、１．５％アガロースゲルでゲル単離する。１００〜３００ｂｐレンジのポリヌクレオチドをゲルから切り抜き、３容量の６Ｍ ＮａＩをこのゲルスライスに添加する。混合物を１０分間５０℃でインキュベートし、１０μｌのガラスミルク（Ｂｉｏ １０１）を添加する。混合物を１分間回転させ、上澄みを傾捨する。このペレットを５００μｌのカラムウォッシュ（カラムウォッシュは、５０％エタノール、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭ ＮａＣｌおよび２．５ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、１分間回転させた後、上澄みを傾捨する。次に、洗浄、回転および傾捨を繰り返す。ガラスミルク（ｇｌａｓｓ ｍｉｌｋ）ペレットを２０μｌのＨ２Ｏに再懸濁し、１分間回転させる。ＤＮＡを水相に維持する。
【０４３３】
実施例３
単離したランダムサイズ１００〜３００ｂｐポリヌクレオチドのシャッフリング
実施例２で作製した１００〜３００ｂｐポリヌクレオチドを、プライマーを添加せずに、アニーリング混合物（０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．８、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．３μ；ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、全量５０μｌ）中で再結合させた。アニーリングステップは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製のＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒを用い、次の手順で実施した：３０秒間９５℃、２５〜５０サイクルの［３０秒間９５℃、３０秒間５０〜６０℃（好ましくは５８℃）、および３０秒間７２℃］、ならびに、５分間７２℃。このようにして、１００〜３００ｂｐポリヌクレオチドが結合し、これまでより長い配列の二本鎖ポリヌクレオチドが得られた。再集合二本鎖ポリヌクレオチドを分離し、これらを変性して、一本鎖ポリヌクレオチドを形成した後、任意で、鋳型としての一本鎖とプライマーを用いたサンプル、ならびに、一本鎖に加えてランダムプライマーＤＮＡを用い、別のサンプルで、サイクルを繰り返す。
【０４３４】
実施例４
シャッフリングしたポリヌクレオチドのスクリーニング
実施例３のポリヌクレオチドを分離し、そこからポリペプチドを発現させる。元の鋳型ＤＮＡを、そこから比較ポリペプチドを作製することにより、比較対照として用いる。実施例３のシャッフリング済ポリペプチドから得られたポリペプチドを、元の鋳型から得られたポリペプチドの活性についてスクリーニングし、対照の活性レベルと比較する。スクリーニング中に発見した目的のポリペプチドをコードするシャッフリング済ポリヌクレオチドを、望ましい二次性質について比較する。目的のものとは異なるスクリーニングされたポリペプチドに対応するシャッフリングされたポリヌクレオチドを再シャッフリングに付す。
【０４３５】
実施例５
飽和突然変異誘発による酵素の定方向進化
部位飽和突然変異誘発：部位飽和突然変異を達成するために、下記のように、３２倍縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いた部位定方向突然変異により、デハロゲナーゼ酵素の各残基（３１６）を全２０個のアミノ酸に変換した。
【０４３６】
１．デハロゲナーゼ発現構築物の培養物を培養し、プラスミドの調製を行った。
【０４３７】
２．各コドンをランダム化させるためのプライマーを作製した。これらは、共通の構造：Ｘ２０ＮＮ（Ｇ／Ｔ）Ｘ２０を有する。
【０４３８】
３．約５０ｎｇのプラスミド鋳型、１２５ｎｇの各プライマー、１×ネイティブＰｆｕバッファー、２００μＭの各ｄＮＴＰ、ならびに２．５ＵネイティブＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを含む２５μｌの反応混合物を調製した。
【０４３９】
４．Ｒｏｂｏ９６ Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｃｙｃｌｅｒで、以下のようなサイクル反応を行った：
１分間９５℃で初期変性、
４５秒間９５℃、１分間５３℃、１１分間７２℃のサイクルを２０回
１０分間、７２℃で最終伸長ステップ。
【０４４０】
５．１０ＵのＤｐｎＩを用いて、３７℃で１時間反応混合物を消化させて、メチル化鋳型ＤＮＡを消化した。
【０４４１】
６．２ｕｌの反応混合物を用いて、５０ｕｌのＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’細胞を形質転換し、全形質転換ミックスを大型のＬＢ−Ａｍｐ−Ｍｅｔプレート上に平板培養し、２００〜１０００のコロニーを取得した。
【０４４２】
７．ＬＢ−Ａｍｐ−ＩＰＴＧを含有する９６ウェルマイクロプレートのウェルに、個々のコロニーをツマヨウジで移し、一晩増殖させた。
【０４４３】
８．これらプレート上のクローンを翌日検定した。
【０４４４】
スクリーニング：下記のように、各位置について突然変異体の約２００クローンを液体培地（３８４ウエルマイクロプレート）で増殖し、スクリーニングした。
【０４４５】
１．３８４ウェルプレートに一晩放置した培養物を遠心分離にかけ、培地を除去した。各ウェルに、０．０６ｍＬ １ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＳＯ４２− ｐＨ７．８を添加した。
【０４４６】
２．０．０２ｍＬ細胞懸濁液から成る各親培養プレートから２つの検定プレートを作製した。
【０４４７】
３．所定時間（初め３０分間）、一方の検定プレートを室温に、他方は、上昇させた温度（初期スクリーニングでは５５℃）に置いた。
【０４４８】
４．規定時間後、０．０８ｍＬ室温基質（１．５ｍＭ ＮａＮ３および０．１ｍＭブロモチモールブルーを含むＴＣＰ飽和１ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＳＯ４２− ｐＨ７．８）を各ウェルに添加した。
【０４４９】
５．各時点で、６２０ｎｍでの測定を実施し、各ウェルについてプログレス曲線を作成した。
【０４５０】
６．データを分析し、非加熱のものと、加熱細胞の速度論を比較した。各プレートには、１〜２カラム（２４ウェル）の突然変異していない２０Ｆ１２対照を含有させた。
【０４５１】
７．安定性が向上したと思われるウェルを再培養した後、同じ条件下で試験した。
【０４５２】
この手順によれば、９つの単一部位突然変異が、酵素に対して増大した熱安定性を賦与していることがわかった。配列分析を実施して、具体的に改良の原因となった各位置での厳密なアミノ酸変化を測定した。すなわち、改良は、７つの部位では一つのアミノ酸変化だけにより、８番部位では２つのアミノ酸変化の各々により、９番部位では３つのアミノ酸変化の各々により賦与されていた。次に、各々が、これら９つの有利な部位突然変化のうちの複数を併せ持つ突然変異体をいくつか作製した。そのうちの二つの突然変異体が、単一点突然変異を含む他の突然変異体すべてと比較して優れていることがわかった。
【０４５３】
実施例６
末端選択を用いた直接発現
５’ホスホリル化プライマーを用いて、標準ＰＣＲ反応で、エステラーゼ遺伝子を増幅した（１０ｎｇ鋳型；ＰＣＲ条件：３分間９４℃；［１分間９４℃；１分間５０℃；１分間３０秒６８℃］×３０；１０分間６８℃）。
【０４５４】
順方向プライマー＝９５１１ＴｏｐＦ
（ＣＴＡＧＡＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＴＡＣＡＴＧＡＡＧＣＧＧＣＴＴＴＴＡＧＣＣＣ）
逆方向プライマー＝９５１１ＴｏｐＲ（ＡＧＣＴＡＡＧＧＧＴＣＡＡＧＧＣＣＧＣＡＣＣＣＧＡＧＧ）
得られたＰＣＲ産物（約１０００ｂｐ）を、ゲル精製および定量化した。
【０４５５】
発現クローニングのためのベクター、ｐＡＳＫ３（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ｆｕｅｒ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）をＸｂａ ＩおよびＢｇｌ ＩＩで切断し、ＣＩＰで脱リン酸した。
【０４５６】
０．５ｐモルのＶａｃｃｉｎａ Ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールスバード）を、全量５μｌのバッファーＮＥＢＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ベバーリー）中で、５分間３７℃、６０ｎｇ（約０．１ｐｍｏｌｅ）精製ＰＣＲ産物に添加した。
【０４５７】
トポゲートした（ｔｏｐｏｇａｔｅｄ）ＰＣＲ産物を、室温で５分間、ベクターｐＡＳＫ３（ＮＥＢＩ中の５μｌ、約２００ｎｇ）中にクローニングした。
【０４５８】
混合物をＨ２Ｏに対し３０分間透析した。
【０４５９】
２μｌを用いて、ＤＨ１０Ｂ細胞の電気穿孔を実施した（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、メリーランド州Ｇｅｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）。
【０４６０】
効率：実際のクローンの数によれば、この方法は、μｇベクター当たり２×１０６クローンを産生することができる。試験した組換え体はすべて、アンヒドロテトラサイクリンによる誘発の後、エステラーゼ活性を示した。
【０４６１】
実施例７
デハロゲナーゼ熱安定性
本発明は、定方向進化により生成される望ましい性質が、苛酷な環境と考えられるもの等の、変化させた環境に特定時間供した後、分子の改良された残存活性（例えば、酵素活性、免疫反応性、抗生物質活性等）により、制限的に実現されることを特徴とする。このような苛酷な環境には、下記のいずれかの組合せを含むことができる（反復または反復しなくても、どんな順序もしくは順列でもよい）：温度上昇（実施酵素の変性を起こし得る温度を含む）、温度低下、塩濃度上昇、塩濃度低下、ｐＨ上昇、ｐＨ低下、圧力上昇、圧力低下、ならびに放射線源暴露の変化（紫外線、可視光線、ならびに、全電磁スペクトルを含む）。
【０４６２】
以下の実施例は、上昇させた温度に暴露後に、酵素が活性を回復および／または保持する能力を進化させるための、定方向進化の使用を示す。
【０４６３】
デハロゲナーゼ酵素の各残基（３１６）を、３２倍縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いて部位特異的突然変異により全２０アミノ酸に変換した。これら突然変異を、すでに速度改善した変異体Ｄｈｌａ２０Ｆ１２に導入した。各位置の約２００のクローンを液体培地（３８４ウェルマイクロプレート）で培養し、スクリーニングした。
【０４６４】
スクリーニング手順は、次の通りである：
１．３８４ウェルプレートに一晩放置した培養物を遠心分離にかけ、培地を除去した。各ウェルに、０．０６ｍＬ １ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＳＯ４２− ｐＨ７．８を添加した。
【０４６５】
２．０．０２ｍＬ細胞懸濁液から成る各親培養プレートから２つの検定プレートをロボットにより作製した。
【０４６６】
３．所定時間（初め３０分間）、一方の検定プレートを室温に、他方は、上昇させた温度（初期スクリーニングでは５５℃）に置いた。
【０４６７】
４．規定時間後、０．０８ｍＬ室温基質（１．５ｍＭ ＮａＮ３および０．１ｍＭブロモチモールブルーを含むＴＣＰ飽和１ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＳＯ４２− ｐＨ７．８）を各ウェルに添加した。ＴＣＰ＝トリクロロプロパン。
【０４６８】
５．各時点で、６２０ｎｍでの測定を実施し、各ウェルについてプログレス曲線を作成した。
【０４６９】
６．データを分析し、非加熱のものと、加熱細胞の速度論を比較した。各プレートには、１〜２カラム（２４ウェル）の突然変異していない２０Ｆ１２対照を含有させた。
【０４７０】
７．安定性が向上したと思われるウェルを再培養した後、同じ条件下で試験した。
【０４７１】
この手順によれば、９つの単一部位突然変異が、Ｄｈｌａ−２０Ｆ１２に対して増大した熱安定性を賦与することがわかった。配列分析から、次の変化が有利であることが明らかになった。
【０４７２】
Ｄ８９Ｇ
Ｆ９１Ｓ
Ｔ１５９Ｌ
Ｇ１８９Ｑ、Ｇ１８９Ｖ
Ｉ２２０Ｌ
Ｎ２３８Ｔ
Ｗ２５１Ｙ
Ｐ３０２Ａ、Ｐ３０２Ｌ、Ｐ３０２Ｓ、Ｐ３０２Ｋ
Ｐ３０２Ｒ／Ｓ３０６Ｒ
二つの部位（１８９および３０２）だけが、一つ以上の置換を有した。上記リストの最初の５つは、単一遺伝子（この突然変異体は、「Ｄｈｌａ５」と呼ぶ）に（Ｇ１８９Ｑを用いて）統合された。Ｓ３０６Ｒを除くすべての変化は、Ｄｈｌａ８と呼ばれる別の変異体に組み込まれた。
【０４７３】
熱安定性は、所定時間、上昇させた温度（５５℃および８０℃）で酵素をインキュベートすることにより評価し、活性検定を３０℃で実施した。高い方の温度で、初期速度を、時間毎に記録した。酵素は、インキュベーションおよび検定の両方で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＳＯ４２− ｐＨ７．８に含有させた。Ｆｅ（ＮＯ３）３およびＨｇＳＣＮを用いた標準方法により産物（Ｃｌ−）を検出した。ｄｅ ｆａｃｔｏ野生型としてＤｈｌａ２０Ｆ１２を用いた。指数的崩壊関数にデータを当てはめることにより、見掛け半減期（Ｔ１／２）を計算した。
【０４７４】
これらの結果は図１に示す。
【０４７５】
参考文献
特に指摘しない限り、本明細書に記載された全ての文献（上記および下記の）は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０４７６】
Ｂａｒｒｅｔ ＡＪら（編）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ： Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．（「酵素命名法：国際生化学分子生物学連合の命名委員会勧告」）、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９２．
Ｂｏｙｃｅ ＣＯＬ（編）、Ｎｏｖｏ’ｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．（「実用バイオテクノロジーに関するノボのハンドブック」）、第２版、Ｂａｇｓｖａｅｒｄ， Ｄｅｎｍａｒｋ， １９８６．
Ｄｒａｕｚ Ｋ， Ｗａｌｄｍａｎ Ｈ（編）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ．（「有機合成における酵素触媒：総合ハンドブック」）、第１巻、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９５．
Ｄｒａｕｚ Ｋ， Ｗａｌｄｍａｎ Ｈ（編）、Ｅｎｚｙｍｅ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ．（「有機合成における酵素触媒：総合ハンドブック」）、第２巻、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， １９９５．
Ｆｏｓｔｅｒ ＧＤ， Ｔａｙｌｏｒ ＳＣ（編）、Ｐｌａｎｔ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ｆｒｏｍ Ｖｉｒｕｓ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｔｏ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．（「植物ウイルス学プロトコル：ウイルスの単離からトランスジェニック耐性まで」）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第８１巻、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， １９９８．
Ｆｒａｎｋｓ Ｆ（編）、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ， Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ． （「タンパク質のバイオテクノロジー：単離、特性評価、および安定化」）、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ： Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， １９９３．
Ｇｏｄｆｒｅｙ Ｔ， Ｗｅｓｔ Ｓ（編）、Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．（「工業酵素学」）、第２版、Ｌｏｎｄｏｎ： Ｍａｃｍｉｌｌａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｌｔｄ， １９９６．
Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ Ｇ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．（「細菌代謝」）、第２版、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｉｎｃ．， １９８６．
Ｇｒｅｓｓｈｏｆｆ ＰＭ（編）、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．（「植物バイオテクノロジーの技術導入」）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．
Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ： ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９７．
Ｇｒｉｆｆｉｎ ＨＧ， Ｇｒｉｆｆｉｎ ＡＭ（編）、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｃｕｒｒｒｅｎｔ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ．（「ＰＣＲ技術：最新の考案」）、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ： ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９９４．
Ｈａｎｓｅｎ Ｇ， Ｃｈｉｌｔｏｎ ＭＤ、「所与の微生物による植物への遺伝子導入における課題」、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２４０：２１−５７， １９９９．
Ｈａｒｔｍａｎｎ ＨＴ（編）、Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ．（「植物の繁殖：原理と実践」）、第６版、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ： Ｐｒｅｎｔｉｃｅ Ｈａｌｌ， Ｉｎｃ．， １９９７．
Ｐｅｒｕｎ ＴＪ， Ｐｒｏｐｓｔ ＣＬ（編）、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ． （「コンピューターを援用した薬物設計：方法および応用」）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， １９８９．
Ｏｗｅｎ ＭＲＬ， Ｐｅｎ Ｊ、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｌａｎｔｓ： Ａ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．（「トランスジェニック植物：工業的、製薬学的タンパク質のための生産システム」）、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ： Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９６．
Ｓｅｇｅｌ ＩＨ、Ｅｎｚｙｍｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ： Ｂｅｈａｖｉｏｒ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒａｐｉｄ Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ａｎｄ Ｓｔｅａｄｙ−Ｓｔａｔｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ．（「酵素反応速度論：酵素系の急速な平衡および定常状態の振る舞いおよび分析」）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９３．
Ｗｈｉｔｅ ＪＳ， Ｗｈｉｔｅ ＤＣ、Ｓｏｕｒｃｅ Ｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ．（「酵素原典」）、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ： ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， １９９７．
Ｗｏｎｇ ＣＨ， Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ ＧＭ、Ｅｎｚｙｍｅｓ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（「合成有機化学における酵素」）、第１２巻、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， １９９５．
ＷＯ ９７／３５９６６、１９９７年３月２０日出願、１９９７年１０月２日公開、Ｍｉｎｓｈｕｌｌ Ｊ， Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰ、「細胞工学および代謝工学のための方法および組成物」
ＷＯ ９８／３１８３７、１９９８年１月１６日出願、１９９８年７月２３日公開、Ｄｅｌｃａｒｄａｙｒｅ ＳＢ， Ｔｏｂｉｎ ＭＢ， Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰ， Ｍｉｎｓｈｕｌｌ， Ｊ、「帰納的配列組換えによる全細胞および生物の進化」
ＷＯ ９８／３７２２３、１９９８年２月１８日出願、１９９８年８月２７日公開、Ｐａｎｇ ＳＺ， Ｇｏｎｓａｌｖｅｓ Ｄ， Ｊａｎ ＦＪ、「植物に複数の形質を付与するためのＤＮＡ構築物」
Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｃｓ ＭＡ ａｎｄ Ｓｈｏｒｔ ＪＭ、「ポリコスベクター：λファージパッケージング抽出物を用いた線維状ファージおよびファージミドベクターのパッケージング系」、Ｇｅｎｅ　１３７：１， ９３−１００， １９９３．
Ａｒｋｉｎ ＡＰおよびＹｏｕｖａｎ ＤＣ、「タンパク質工学のためのアルゴリズム：帰納的アンサンブル突然変異誘発のシミュレーション」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　８９（１６）：７８１１−７８１５， （Ａｕｇ １５） １９９２．
Ａｒｎｏｌｄ ＦＨ、「異常環境のためのタンパク質工学」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４（４）：４５０−４５５， １９９３．
Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （「分子生物学の最新プロトコル」）、第１巻および第２巻および補遺、（別名「赤本」）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．， Ｂｒｏｏｋｌｙｎ， ＮＹ、（著作権）、１９８７．
Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （「分子生物学の最新プロトコル」）、第１巻および第２巻および補遺、（別名「赤本」）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．， Ｂｒｏｏｋｌｙｎ， ＮＹ、（著作権）、１９８９．
Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭら（編）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． （「分子生物学のショートプロトコル：分子生物学の最新プロトコルからの方法の概論」）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．， Ｂｒｏｏｋｌｙｎ， ＮＹ、（著作権）、１９８９．
Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭら（編）、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ． （「分子生物学のショートプロトコル：分子生物学の最新プロトコルからの方法の概論」）、第２版、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．， Ｂｒｏｏｋｌｙｎ， ＮＹ、（著作権）、１９９２．
Ｂａｒｂａｓ ＣＦ ３世， Ｂａｉｎ ＪＤ， Ｈｏｅｋｓｔｒａ ＤＭ， Ｌｅｒｎｅｒ ＲＡ、「半合成コンビナトリアル抗体ライブラリー：多様な問題に対する化学的解決策」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９（１０）：４４５７−４４６１， １９９２．
Ｂａｒｄｗｅｌｌ ＡＪ， Ｂａｒｄｗｅｌｌ Ｌ， Ｊｏｈｎｓｏｎ ＤＫ， Ｆｒｉｅｄｂｅｒｇ ＥＣ、「酵母のＤＮＡ組換えおよび修復タンパク質Ｒａｄ１およびＲａｄ１０は、ｉｎ ｖｉｖｏで局在化疎水性ドメインを介した複合体を構成する」、Ｍｏｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　８（６）：１１７７−１１８８， １９９３．
Ｂａｒｔｅｌ Ｐ， Ｃｈｉｅｎ ＣＴ， Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ Ｒ， Ｆｉｅｌｄｓ Ｓ、「２−ハイブリッド系の使用において生じる偽陽性の消失」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１４（６）：９２０−９２４， １９９３．
Ｂｅａｕｄｒｙ ＡＡおよびＪｏｙｃｅ ＧＦ、「ＲＮＡ酵素の定方向進化」、 Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７（５０７０）：６３５−６４１， １９９２．
ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （「酵素学における方法」）、第１５２巻、「分子クローニング技術へのガイド」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ、（著作権）、１９８７．　（累積標題索引：第１３５−１３９巻、第１４１−１６７巻、１９９０， 第２７２頁）
Ｂｅｖａｎ Ｍ、「植物の形質転換のためのバイナリーアグロバクテリウムベクター」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１２（２２）：８７１１−２１， １９８４．
Ｂｉｏｃｃａ Ｓ， Ｐｉｅｒａｎｄｒｅｉ−Ａｍａｌｄｉ Ｐ， Ｃａｔｔａｎｅｏ Ａ、「抗ｐ２１ｒａｓ単鎖Ｆｖフラグメントの細胞内発現は、アフリカツメガエル卵母細胞の減数分裂成熟を阻害する」、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ　１９７（２）：４２２−４２７， １９９３．
Ｂｉｒｄら、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ　１１：６５１， １９８８．．
Ｂｏｇｅｒｄ ＨＰ， Ｆｒｉｄｅｌｌ ＲＡ， Ｂｌａｉｒ ＷＳ， Ｃｕｌｌｅｎ ＢＲ、「１型および２型ヒト免疫不全ウイルスのＴａｔタンパク質は真核細胞の核において多量体化し得るという遺伝的根拠」、Ｊ Ｖｉｒｏｌ　６７（８）：５０３０−５０３４， １９９３．
Ｂｒｅｄｅｒｏｄｅ ＦＴ， Ｋｏｐｅｒ−Ｚａｗｒｔｈｏｆｆ ＥＣ， Ｂｏｌ ＪＦ、「アルファルファモザイクウイルスＲＮＡ ４の全ヌクレオチド配列」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ　８（１０）：２２１３−２３， １９８０．
Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ Ｆ， Ｄｕｂｅｌ Ｓ， Ｓｅｅｈａｕｓ Ｔ， Ｋｌｅｗｉｎｇｈａｕｓ Ｉ， Ｌｉｔｔｌｅ Ｍ、「抗体スクリーニングのための表面発現ベクター」、Ｇｅｎｅ　１０４（２）：１４７−１５３， １９９１．
Ｂｒｏｗｎ ＮＬ， Ｓｍｉｔｈ Ｍ、「Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ （Ｈｇａ Ｉ）から単離された制限エンドヌクレアーゼの切断特異性」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ７４（８）：３２ｌ３−６， （Ａｕｇ） １９７７．
Ｂｕｒｔｏｎ ＤＲ， Ｂａｒｂａｓ ＣＦ ３世， Ｐｅｒｓｓｏｎ ＭＡ， Ｋｏｅｎｉｇ Ｓ， Ｃｈａｎｏｃｋ ＲＭ， Ｌｅｒｎｅｒ ＲＡ、「無症状性血清陽性個体のコンビナトリアルライブラリーに由来する１型ヒト免疫不全ウイルスに対するヒトモノクローナル抗体の巨大アレイ」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８８（２２）：１０１３４−７， （Ｎｏｖ １５） １９９１．
Ｃａｌｄｗｅｌｌ ＲＣおよびＪｏｙｃｅ ＧＦ、「ＰＣＲ突然変異誘発による遺伝子の無作為化」、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ ２（１０）：２８−３３， １９９２．
Ｃａｔｏｎ ＡＪおよびＫｏｐｒｏｗｓｋｉ Ｈ、「コンビナトリアル発現ライブラリーから単離されたインフルエンザウイルス赤血球凝集素特異的抗体は、供与体の免疫応答に密接に関与する」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　８７（１６）：６４５０−６４５４， １９９０．
Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ Ｔ， Ｍａｒｔｉｎ ＪＦ， Ｏｌｓｏｎ ＥＮ、「２−ハイブリッドアッセイ系を用いたｉｎ ｖｉｖｏにおけるミオゲニンおよびＥ２Ａ産物のオリゴマー化の分析」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ　２６７（２５）：１７４９８−５０１， １９９２．
Ｃｈａｎｇ ＣＮ， Ｌａｎｄｏｌｆｉ ＮＦ， Ｑｕｅｅｎ Ｃ、「バクテリオファージ表面上での抗体Ｆａｂドメインの発現、抗体選択のための使用可能性」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７（１０）：３６１０−４， （Ｎｏｖ １５） １９９１．
Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ＶＫ， Ｂａｔｒａ ＪＫ， Ｇａｌｌｏ ＭＧ， Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ ＭＣ， ＦｉｔｚＧｅｒａｌｄ ＤＪ， Ｐａｓｔａｎ Ｉ、「単鎖イムノトキシンとしての大腸菌の機能性可変領域抗体遺伝子を迅速にクローニングする方法」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　８７（３）：１０６６−１０７０， １９９０．
Ｃｈｉｅｎ ＣＴ， Ｂａｒｔｅｌ ＰＬ， Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ Ｒ， Ｆｉｅｌｄｓ Ｓ、「２−ハイブリッド系：目的のタンパク質と相互作用するタンパク質の遺伝子を同定およびクローニングするための方法」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　８８（２１）：９５７８−９５８２， １９９１．
Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ＤＪ， ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ Ｊ、「ファージ抗体：新しい「コリクローナル」抗体はモノクローナル抗体に取って代わるか？」、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１０（３）：８０−８４， １９９２．
Ｃｈｏｔｈｉａ ＣおよびＬｅｓｋ ＡＭ、「免疫グロブリンの超可変領域の基準構造」、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ　１９６（４）：９０１−９１７， １９８７．
Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ， Ｌｅｓｋ ＡＭ， Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ Ａ， Ｌｅｖｉｔｔ Ｍ， Ｓｍｉｔｈ−Ｇｉｌｌ ＳＪ， Ａｉｒ Ｇ， Ｓｈｅｒｉｆｆ Ｓ， Ｐａｄｌａｎ ＥＡ， Ｄａｖｉｅｓ Ｄ， Ｔｕｌｉｐ ＷＲら、「免疫グロブリン超可変領域のコンホメーション」、Ｎａｔｕｒｅ　３４２（６２５２）：８７７−８８３， １９８９．
Ｃｌａｃｋｓｏｎ Ｔ， Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＨＲ， Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ， Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ、「ファージ展示ライブラリーを用いた抗体フラグメントの作製」、Ｎａｔｕｒｅ　３５２（６３３６）：６２４−６２８， １９９１．
Ｃｏｎｒａｄ Ｍ， Ｔｏｐａｌ ＭＤ、「ＤＮＡおよびスペルミジンは、制限酵素Ｎａｅ Ｉの活性を調節するためのスイッチ機構を提供する」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８６（２４）：９７０７−１１， （Ｄｅｃ） １９８９．
Ｃｏｒｕｚｚｉ Ｇ， Ｂｒｏｇｌｉｅ Ｒ， Ｅｄｗａｒｄｓ Ｃ， Ｃｈｕａ ＮＨ、「リブロース‐１，５‐ビスリン酸カルボキシラーゼの小サブユニットをコードするエンドウ豆核遺伝子の組織特異的で光調節型の発現」、ＥＭＢＯ Ｊ　３（８）：１６７１−９， １９８４．
Ｄａｓｍａｈａｐａｔｒａ Ｂ， ＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ Ｂ， Ｄｗｙｅｒ Ｓ， Ｍａ Ｊ， Ｓａｄｏｗｓｋｉ Ｉ， Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｊ、「タンパク質分解酵素の活性を研究するための遺伝系」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　８９（９）：４１５９−４１６２， １９９２．
Ｄａｖｉｓ ＬＧ， Ｄｉｂｎｅｒ ＭＤ， Ｂａｔｔｅｙ ＪＦ、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．（「分子生物学の基本的方法」）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ、（著作権）、１９８６．
Ｄｅｌｅｇｒａｖｅ ＳおよびＹｏｕｖａｎ ＤＣ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１１：１５４８−１５５２， １９９３．
ＤｅＬｏｎｇ ＥＦ， Ｗｕ ＫＹ， Ｐｒｅｚｅｌｉｎ ＢＢ， Ｊｏｖｉｎｅ ＲＶ、「南極海ピコプランクトン中の大量の古細菌」、Ｎａｔｕｒｅ　３７１（６４９９）：６９５−６９７， １９９４．
Ｄｅｎｇ ＳＪ， ＭａｃＫｅｎｚｉｅ ＣＲ， Ｓａｄｏｗｓｋａ Ｊ， Ｍｉｃｈｎｉｅｗｉｃｚ Ｊ， Ｙｏｕｎｇ ＮＭ， Ｂｕｎｄｌｅ Ｄｒ， Ｎａｒａｎｇ ＳＡ、「ファージ展示による、改善された炭水化物結合を用いた抗体単鎖可変フラグメントの選択」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ　２６９（１３）：９５３３−９５３８， １９９４．
Ｄｕａｎ Ｌ， Ｂａｇａｓｒａ Ｏ， Ｌａｕｇｈｌｉｎ ＭＡ， Ｏａｋｅｓ ＪＷ， Ｐｏｍｅｒａｎｔｚ ＲＪ、「細胞内抗Ｒｅｖ単鎖抗体によるヒト免疫不全ウイルス１型の複製の強力な阻害」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　９１（１１）：５０７５−５０７９， １９９４．
Ｄｕｒｆｅｅ Ｔ， Ｂｅｃｈｅｒｅｒ Ｋ， Ｃｈｅｎ ＰＬ， Ｙｅｈ ＳＨ， Ｙａｎｇ Ｙ， Ｋｉｌｂｕｒｎ ＡＥ， Ｌｅｅ ＷＨ， Ｅｌｌｅｄｇｅ ＳＪ、「網膜芽腫タンパク質は、１型タンパク質ホスファターゼ触媒ユニットに結合する」、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ　７（４）：５５５−５６９， １９９３．
Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ＡＤおよびＳｚｏｓｔａｋ ＪＷ、「特異的リガンドに結合するＲＮＡ分子のｉｎ ｖｉｔｒｏにおける選択」、Ｎａｔｕｒｅ　３４６（６２８７）：８１８−８２２， １９９０．
Ｆｉｅｌｄｓ ＳおよびＳｏｎｇ ０、「タンパク質間相互作用を検出するための新規遺伝系」、Ｎａｔｕｒｅ　３４０（６２３０）：２４５−２４６， １９８９．
Ｆｉｒｅｋ Ｓ， Ｄｒａｐｅｒ Ｊ， Ｏｗｅｎ ＭＲ， Ｇａｎｄｅｃｈａ Ａ， Ｃｏｃｋｂｕｒｎ Ｂ， Ｗｈｉｔｅｌａｍ ＧＣ、「トランスジェニックタバコ植物および細胞懸濁培養における機能性単鎖Ｆｖタンパク質の分泌」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ　２３（４）：８６１−８７０， １９９３．
Ｆｏｒｓｂｌｏｍ Ｓ， Ｒｉｇｌｅｒ Ｒ， Ｅｈｒｅｎｂｅｒｇ Ｍ， Ｐｈｉｌｉｐｓｏｎ Ｌ、「制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ ＲＩによるアデノウイルスＤＮＡの切断に関する反応速度論的研究」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ　３（１２）：３２５５−６９， （Ｄｅｃ） １９７６．
Ｇｅｒｍｉｎｏ ＦＪ， Ｗａｎｇ ＺＸ， Ｗｅｉｓｓｍａｎ ＳＭ、「ｉｎ ｖｉｖｏにおけるタンパク質間相互作用のスクリーニング」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　９０（３）：９３３−９３７， １９９３．
Ｇｉｎｇｅｒａｓ ＴＲ， Ｂｒｏｏｋｓ ＪＥ、「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来クローン化制限／修飾系」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　８０（２）：４０２−６， １９８３ （Ｊａｎ）．
Ｇｌｕｚｍａｎ Ｙ、「ＳＶ４０により形質転換されたサル細胞は、初期ＳＶ４０突然変異体の複製を支持する」、Ｃｅｌｌ　２３（１）：１７５−１８２， １９８１．
Ｇｒｕｂｅｒ Ｍ， Ｓｃｈｏｄｉｎ ＢＡ， Ｗｉｌｓｏｎ ＥＲ， Ｋｒａｎｚ ＤＭ、「大腸菌で発現された二重特異性単鎖抗体を介した効率的な腫瘍細胞溶解」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ　１５２（１１）：５３６８−５３７４， １９９４．
Ｇｕａｒｅｎｔｅ Ｌ、「相互作用タンパク質の同定のための戦略」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　９０（５）：１６３９−１６４１， １９９３．
Ｇｕｉｌｌｅｙ Ｈ， Ｄｕｄｌｅｙ ＲＫ， Ｊｏｎａｒｄ Ｇ， Ｂａｌａｚｓ Ｅ， Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＫＥ、「カリフラワーモザイクウイルスＤＮＡの転写：プロモーター配列の検出および転写物の特性付け」、Ｃｅｌｌ　３０（３）：７６３−７３， １９８２．
Ｈａｒｄｙ ＣＦ， Ｓｕｓｓｅｌ Ｌ， Ｓｈｏｒｅ Ｄ、「転写沈黙化およびテロメア長調節に関与するＲＡＰ１相互作用タンパク質」、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ　６（５）：８０１−８１４， １９９２．
Ｈａｗｋｉｎｓ ＲＥおよびＷｉｎｔｅｒ Ｇ、「種々の遺伝子ライブラリーから抗体を作製するための細胞選択戦略：記憶プールのトラッピング」、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ　２２（３）：８６７−８７０， １９９２．
Ｈｏｌｖｏｅｔ Ｐ， Ｌａｒｏｃｈｅ Ｙ， Ｌｉｊｎｅｎ ＨＲ， Ｖａｎ Ｈｏｅｆ Ｂ， Ｂｒｏｕｗｅｒｓ Ｅ， Ｄｅ Ｃｏｃｋ Ｆ， Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ Ｍ， Ｇａｎｓｅｍａｎｓ Ｙ， Ｃｏｌｌｅｎ Ｄ、「フィブリン特異的抗体の単鎖Ｆｖフラグメントおよび単鎖ウロキナーゼからなる単鎖キメラプラスミノーゲンアクチベーターの生化学的特性付け」、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ　２１０（３）：９４５−９５２， １９９２．
Ｈｏｎｊｏ Ｔ， Ａｌｔ ＦＷ， Ｒａｂｂｉｔｔｓ ＴＨ （編）、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ： Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ｐｐ． ３６１−３６８， （著作権）、１９８９．
Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＨＲ， Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ， Ｊｏｈｎｓｏｎ ＫＳ， Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ＤＪ， Ｊｕｄｓｏｎ Ｐ， Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ、「糸状ファージの表面上の多サブユニットタンパク質：抗体（Ｆａｂ）重鎖および軽鎖の提示方法」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ　１９（１５）：４１３３−４１３７， １９９１．
Ｈｕｓｅ ＷＤ， Ｓａｓｔｒｙ Ｌ， Ｉｖｅｒｓｏｎ ＳＡ， Ｋａｎｇ ＡＳ， Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ Ｍ， Ｂｕｒｔｏｎ ＤＲ， Ｂｅｎｋｏｖｉｃ ＳＪ， Ｌｅｒｎｅｒ ＲＡ、「ファージλにおける免疫グロブリンレパートリーの大規模コンビナトリアルライブラリーの作製」、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６（４９３５）：１２７５−１２８１， １９８９．
Ｈｕｓｔｏｎ ＪＳ， Ｌｅｖｉｎｓｏｎ Ｄ， Ｍｕｄｇｅｔｔ−Ｈｕｎｔｅｒ Ｍ， Ｔａｉ ＭＳ， Ｎｏｖｏｔｎｅｙ Ｊ， Ｍａｒｇｏｌｉｅｓ ＭＮ， Ｒｉｄｇｅ ＲＪ， Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ ＲＥ， Ｈａｂｅｒ Ｅ， Ｃｒｅａ Ｒら、「抗体結合部位のタンパク質工学：大腸菌において産生される抗ジゴキシン単鎖Ｆｖ類似体の特異的活性の回復」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　８５（１６）：５８７９−５８８３， １９８８．
Ｉｗａｂｕｃｈｉ Ｋ， Ｌｉ Ｂ， Ｂａｒｔｅｌ Ｐ， Ｆｉｅｌｄｓ Ｓ、「オリゴマー化に関与するｐ５３のドメインを同定するための２−ハイブリッド系の使用」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　８（６）：１６９３−１６９６， １９９３．
Ｊａｃｋｓｏｎ ＡＬ， Ｐａｈｌ ＰＭ， Ｈａｒｒｉｓｏｎ Ｋ， Ｒｏｓａｍｏｎｄ Ｊ， Ｓｃｌａｆａｎｉ ＲＡ、「Ｄｂｆ４タンパク質との結合による酵母Ｃｄｃ７タンパク質キナーゼの細胞周期調節」、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ　１３（５）：２８９９−２９０８， １９９３．
Ｊｏｈｎｓｏｎ ＳおよびＢｉｒｄ ＲＥ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ　２０３：８８， １９９１．
Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ （「免疫学的目的のタンパク質の配列」）、第４版、Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ （１９８７）
Ｋａｎｇ ＡＳ， Ｂａｒｂａｓ ＣＦ， Ｊａｎｄａ ＫＤ， Ｂｅｎｋｏｖｉｃ ＳＪ， Ｌｅｒｎｅｒ ＲＡ、「ファージ表面にコンビナトリアル抗体Ｆａｂライブラリーを組み立てることによる、認識機能と複製機能の連結」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　８８（１０）：４３６３−４３６６， １９９１．
Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ＣＡ， Ａｎｓｅｌｌ ＫＨ， Ａｌｌｅｎ ＲＷ， Ｒｏｓｅｌｌ−Ｖｉｖｅｓ Ｅ， Ｇｕｓｓｏｗ ＤＨ， Ｂｅｎｄｉｇ ＭＭ、「ファージ抗体ライブラリーを用いた免疫感作マウスからの腫瘍細胞特異的単鎖Ｆｖの単離およびこれらの抗体フラグメントからの全抗体の再構築」、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ　２４（４）：９５２−９５８， １９９４．
Ｋｒｕｇｅｒ ＤＨ， Ｂａｒｃａｋ ＧＪ， Ｒｅｕｔｅｒ Ｍ， Ｓｍｉｔｈ ＨＯ、「ＥｃｏＲＩＩは、抵抗性ＤＮＡ認識部位を切断するように活性化され得る」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６（９）：３９９７−４００８， （Ｍａｙ １１） １９８８．Ｌａｌｏ Ｄ， Ｃａｒｌｅｓ Ｃ， Ｓｅｎｔｅｎａｃ Ａ， Ｔｈｕｒｉａｕｘ Ｐ、「酵母ＲＮＡポリメラーゼＩおよびＩＩＩの３つの共通サブユニット間の相互作用」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　９０（１２）：５５２４−５５２８， １９９３．
Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ Ｍ Ｓｒ、「ヘビ毒ホスホジエステラーゼの精製および特性」、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ６５（１）：２７６−８４， １９８０．
Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ＩおよびＰｅｒｎｉｓ Ｂ（編）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ （「免疫学的方法」）、第Ｉ巻および第ＩＩ巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．、第ＩＩＩ巻（Ｏｒｌａｎｄｏにて刊行）、ならびに第ＩＶ巻（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏにて刊行）、（著作権）、１９７９−．
Ｉｖａｎ Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ（編）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｍｅｔｈｏｄｓ ｍａｎｕａｌ ： ｔｈｅ ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｓｏｕｒｃｅｂｏｏｋ ｏｆ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． （「免疫学的方法マニュアル：総合技術原典」）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， （著作権）、１９９７．
Ｌｅｒｎｅｒ ＲＡ， Ｋａｎｇ ＡＳ， Ｂａｉｎ ＪＤ， Ｂｕｒｔｏｎ ＤＲ， Ｂａｒｂａｓ ＣＦ ３世、「免疫感作のない抗体」、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５８（５０８６）：１３１３−１３１４， １９９２．
Ｌｅｕｎｇ， Ｄ．Ｗ．ら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， １：１１−１５， １９８９．
Ｌｉ ＢおよびＦｉｅｌｄｓ Ｓ、「酵母２−ハイブリッド系を用いた、ＳＶ４０ラージＴ抗原へのｐ５３の結合に影響するｐ５３の突然変異の同定」、ＦＡＳＥＢ Ｊ　７（１０）：９５７−９６３， １９９３．
Ｌｉｌｌｅｙ ＧＧ， Ｄｏｅｌｚａｌ Ｏ， Ｈｉｌｌｙａｒｄ ＣＪ， Ｂｅｒｎａｒｄ Ｃ， Ｈｕｄｓｏｎ ＰＪ、「ＨＩＶの迅速な診断のための大腸菌で発現された組換え単鎖抗体ペプチドコンジュゲート」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ　１７１（２）：２１１−２２６， １９９４．
Ｌｏｗｍａｎ ＨＢ， Ｂａｓｓ ＳＨ， Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｎ， Ｗｅｌｌｓ ＪＡ、「一価ファージ展示による高親和性結合タンパク質の選択」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０（４５）：１０８３２−１０８３８， １９９１．
Ｌｕｂａｎ Ｊ， Ｂｏｓｓｏｌｔ ＫＬ， Ｆｒａｎｋｅ ＥＫ， Ｋａｌｐａｎａ ＧＶ， Ｇｏｆｆ ＳＰ、「１型ヒト免疫不全ウイルスのＧａｇタンパク質は、シクロフィリンＡおよびＢに結合する」、Ｃｅｌｌ　７３（６）：１０６７−１０７８， １９９３．
Ｍａｄｕｒａ Ｋ， Ｄｏｈｍｅｎ ＲＪ， Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ Ａ、「Ｎ末端則経路におけるＮ−レコグニン／Ｕｂｃ２相互作用」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ　２６８（１６）：１２０４６−５４， （Ｊｕｎ ５） １９９３．
Ｍａｒｋｓ ＪＤ， Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＨＲ， Ｂｏｎｎｅｒｔ ＴＰ， ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ Ｊ， Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ， Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ、「バイパス免疫：Ｖ遺伝子のファージ展示ライブラリーに由来するヒト抗体」、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ　２２２（３）：５８１−５９７， １９９１．
Ｍａｒｋｓ ＪＤ， Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ Ａｄ， Ｍａｌｍｑｖｉｓｔ Ｍ， Ｃｌａｃｋｓｏｎ ＴＰ， Ｂｙｅ ＪＭ， Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ、「バイパス免疫：鎖シャッフリングによる高親和性ヒト抗体の構築」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｎ Ｙ）　１０（７）：７７９−７８３， １９９２．
Ｍａｒｋｓ ＪＤ， Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＨＲ， Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ， Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ、「糸状ファージ上のタンパク質の分子進化：免疫系の戦略の模倣」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ　２６７（２３）：１６００７−１６０１０， １９９２．
Ｍａｘａｍ ＡＭ， Ｇｉｌｂｅｒｔ Ｗ、「塩基特異的化学切断を用いた末端標識ＤＮＡの配列決定」、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ　６５（１）：４９９−５６０， １９８０．
ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ Ｊ， Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ＡＤ， Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ， Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ＤＪ、「ファージ抗体：抗体可変ドメインを展示する糸状ファージ」、Ｎａｔｕｒｅ　３４８（６３０１）：５５２−５５４， １９９０．
Ｍｉｌｌｅｒ ＪＨ．、Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａ （「細菌遺伝学の短期講座：大腸菌および関連細菌に関する実験室マニュアルおよびハンドブック」）、（４４５頁も参照のこと）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， ＮＹ，（著作権）、１９９２．
Ｍｉｌｎｅ ＧＴおよびＷｅａｖｅｒ ＤＴ、「ＲＡＤ５２の優性ネガティブ対立遺伝子は、Ｒａｄ５１およびＲａｄ５２を含むＤＮＡ修復／組換え複合体を明らかにする」、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ　７（９）：１７５５−１７６５， １９９３．
Ｍｕｌｌｉｎａｘ ＲＬ， Ｇｒｏｓｓ ＥＡ， Ａｍｂｅｒｇ ＪＲ， Ｈａｙ ＢＮ， Ｈｏｇｒｅｆｅ ＨＨ， Ｋｕｂｔｉｚ ＭＭ， Ｇｒｅｅｎｅｒ Ａ， Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓ Ｍ， Ａｒｄｏｕｒｅｌ Ｄ， Ｓｈｏｒｔ ＪＭら、「バクテリオファージλ免疫発現ライブラリーにおける破傷風トキソイドに特異的なヒト抗体フラグメントクローンの同定」、Ｐｒｏｃ ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　８７（２０）：８０９５−９０９９， １９９０．
Ｎａｔｈ Ｋ， Ａｚｚｏｌｉｎａ ＢＡ、Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｃｈｉｒｉｋｊｉａｎ ＪＧ（編））、第１巻、 ｐ． １１３， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｎｏｒｔｈ Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（著作権）、１９８１．
Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＳＢおよびＷｕｎｓｃｈ ＣＤ、「２種のタンパク質のアミノ酸配列における類似性を検索するために適用可能な一般的方法」、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ　４８（３）：４４３−４５３， １９７０．
Ｎｅｌｓｏｎ Ｍ， Ｃｈｒｉｓｔ Ｃ， Ｓｃｈｉｌｄｋｒａｕｔ Ｉ、「ＤＮＡメチラーゼによる見掛け上の制限エンドヌクレアーゼ認識特異性の変化」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ　１２（１３）：５１６５−７３， １９８４ （Ｊｕｌ １１）．
Ｎｉｃｈｏｌｌｓ ＰＪ， Ｊｏｈｎｓｏｎ ＶＧ， Ａｎｄｒｅｗ ＳＭ， Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ＨＲ， Ｒａｕｓ ＪＣ， Ｙｏｕｌｅ ＲＪ、「ｉｎ ｖｉｔｒｏでウサギ網状赤血球溶解物において産生される単鎖抗体（ｓＦｖ）‐トキシン融合タンパク質の特性評価」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ　２６８（７）：５３０２−５３０８， １９９３．
Ｏｌｌｅｒ ＡＲ， Ｖａｎｄｅｎ Ｂｒｏｅｋ Ｗ， Ｃｏｎｒａｄ Ｍ， Ｔｏｐａｌ ＭＤ、「いくつかの細菌種に由来する制限エンドヌクレアーゼの活性に影響するＤＮＡおよびスペルミジンの能力」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０（９）：２５４３−９， （Ｍａｒ ５） １９９１．
Ｏｗｅｎｓ ＲＪおよびＹｏｕｎｇ ＲＪ、「モノクローナル抗体の遺伝子工学」、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ　１６８（２）：１４９−１６５， １９９４．
Ｐｅａｒｓｏｎ ＷＲおよびＬｉｐｍａｎ ＤＪ、「生物学的配列比較のための改善されたツール」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　８５（８）：２４４４−２４４８， １９８８．
Ｐｅｉｎ ＣＤ， Ｒｅｕｔｅｒ Ｍ， Ｍｅｉｓｅｌ Ａ， Ｃｅｃｈ Ｄ， Ｋｒｕｇｅｒ ＤＨ、「制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩＩの活性化は、刺激因子ＤＮＡの切断に依存しない」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ ｓ １９（１９）：５１３９−４２， （Ｏｃｔ １１） １９９１．
Ｐｅｒｓｓｏｎ ＭＡ， Ｃａｏｔｈｉｅｎ ＲＨ， Ｂｕｒｔｏｎ ＤＲ、「レパートリークローニングによる多様な高親和性ヒトモノクローナル抗体の作製」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　８８（６）：２４３２−２４３６， １９９１．
Ｑｕｅｅｎ Ｃ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｊ， Ｓｔａｕｂｅｒ Ｃ， Ｓｔａｆｆｏｒｄ Ｊ、「プロモーターおよびエンハンサーエレメントによるκ‐免疫グロブリン遺伝子の細胞型特異的調節」、Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ　８９：４９−６８， １９８６．
Ｑｉａｎｇ ＢＱ， ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ Ｍ， Ｐｏｄｄａｒ Ｓ， Ｓｐｏｋａｕｓｋａｓ Ａ， Ｎｅｌｓｏｎ Ｍ、「ＮｏｔＩ （５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣ−３’）の見掛け上の特異性は、Ｍ．ＦｎｕＤＩＩまたはＭ．ＢｅｐＩメチルトランスフェラーゼ（５’−ｍＣＧＣＧ−３’）により増強される：細菌染色体の、いくつかの大きい断片への切断」、Ｇｅｎｅ　８８（１）：１０１−５， （Ｍａｒ ３０） １９９０．
Ｒａｌｅｉｇｈ ＥＡ， Ｗｉｌｓｏｎ Ｇ、「大腸菌Ｋ−１２株は、５‐メチルシトシン含有ＤＮＡを制限する」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ　８３（２３）：９０７０−４， （Ｄｅｃ） １９８６．
Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ ＪＦおよびＳａｕｅｒ ＲＴ、「タンパク質配列の情報内容のプローブとしてのコンビナトリアルカセット突然変異誘発」、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１（４８６１）：５３−５７， １９８８．
Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ＬおよびＷｅｉｌｌ Ｍ、「部位特異的ランダム単鎖抗体Ｆｖフラグメントの親和性の改善のための該フラグメントのファージ展示および選択」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３２（３４）：８８４８−８８５５， １９９３．
Ｒｏｂｅｒｔｓ ＲＪ， Ｍａｃｅｌｉｓ Ｄ、「ＲＥＢＡＳＥ‐制限酵素およびメチラーゼ」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ　２４（１）：２２３−３５， （Ｊａｎ １） １９９６．
Ｒｙａｎ ＡＪ， Ｒｏｙａｌ ＣＬ， Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ Ｊ， Ｓｈａｗ ＣＨ、「アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓすなわちｊｅｔ ｎｅｕｆ）．由来１２Ｓ種子保存タンパク質のゲノム配列」、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ　１７（９）：３５８４， １９８９．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． （「分子クローニング：実験室マニュアル」）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ，（著作権）、１９８２．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ， Ｆｒｉｔｓｃｈ ＥＦ， Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． （「分子クローニング：実験室マニュアル」）、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， （著作権）、１９８９．
Ｓｃｏｐｅｓ ＲＫ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ．（「タンパク質の精製：原理と実践」）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ， （著作権）、１９８２．
Ｓｉｌｖｅｒ ＳＣおよびＨｕｎｔ ＳＷ ３世、「相互作用転写調節タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング技術」、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ　１７（３）：１５５−１６５， １９９３．
Ｓｍｉｔｈ ＴＦ， Ｗａｔｅｒｍａｎ ＭＳ．　Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ　２： ４８２−論文の最終頁， １９８１．
Ｓｍｉｔｈ ＴＦ， Ｗａｔｅｒｍａｎ ＭＳ、「重複遺伝子および情報理論」、Ｊ Ｔｈｅｏｒ Ｂｉｏｌ　９１（２）：３７９−８０， （Ｊｕｌ ２１） １９８１．
Ｓｍｉｔｈ ＴＦ， Ｗａｔｅｒｍａｎ ＭＳ、「共通分子サブ配列の同定」、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ　１４７（１）：１９５−７， （Ｍａｒ ２５） １９８１．
Ｓｍｉｔｈ ＴＦ， Ｗａｔｅｒｍａｎ ＭＳ， Ｆｉｔｃｈ ＷＭ、「比較生物配列メトリックス」、Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ　Ｓ１８（１）：３８−４６， １９８１．
Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ Ｊ， Ｐｅｒｒｙ Ｍ， Ｅｌｌｅｄｇｅ ＳＪ， Ｏｌｓｏｎ ＥＮ、「２‐ハイブリッド系を用いた酵母における脊椎動物へリックス‐ループ‐へリックスタンパク質間の相互作用」、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ　２６８（７）：４６０８−４６１１， １９９３．
Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰ， Ｍｏｒｒｉｓ ＳＫ， Ｗｉｌｓｏｎ ＢＳ、「酵素的逆方向ＰＣＲにより調製されたタンパク質リンカーライブラリーに由来する活性単鎖Ｆｖ抗体の選択」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１４（２）：２５６−２６５， １９９３．
Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰ、「ランダム断片化および再構成によるＤＮＡシャッフリング：分子進化のためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの組換え」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ　９１（２２）：１０７４７−１０７５１， １９９４．
Ｓｕｎ Ｄ， Ｈｕｒｌｅｙ ＬＨ、「大腸菌ＤＮＡポリメラーゼを介するｉｎ ｖｉｔｒｏ ＤＮＡ合成に対する（＋）−ＣＣ−１０６５−（Ｎ３−アデニン）ＤＮＡ付加物の効果」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１０， ２８２２−９， （Ｍａｒ １７） １９９２，
Ｔａｇｕｅ ＢＷ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＣＤ， Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ ＭＪ、「植物液胞タンパク質フィトヘマグルチニンの短いドメインは、酵母液胞のインベルターゼを標的にする」、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２（６）：５３３−４６， （Ｊｕｎｅ） １９９０．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｎ， Ｋｏｂａｙａｓｈｉ Ｉ、「バクテリオファージλ組換えの２本鎖破壊修復モデルの根拠」、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ８７（７）：２７９０−４， （Ａｐｒ） １９９０．
Ｔｈｉｅｓｅｎ ＨＪおよびＢａｃｈ Ｃ、「標的検出アッセイ （ＴＤＡ）： ＳＰ１タンパク質で実証されたようなＤＮＡ結合部位を決定するための万能法」、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ　１８（１１）：３２０３−３２０９， １９９０．
Ｔｈｏｍａｓ Ｍ， Ｄａｖｉｓ ＲＷ、「ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼによるバクテリオファージλの切断に関する研究」、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ　９１（３）：３１５−２８， （Ｊａｎ ２５） １９７５．
Ｔｉｎｇｅｙ ＳＶ， Ｗａｌｋｅｒ ＥＬ， Ｃｏｒｒｕｚｚｉ ＧＭ、「エンドウ豆グルタミン合成酵素遺伝子は、葉、根、および節で特異的に発現される異なるポリペプチドをコードする」ＥＭＢＯ Ｊ　６（１）：１−９， １９８７．
Ｔｏｐａｌ ＭＤ， Ｔｈｒｅｓｈｅｒ ＲＪ， Ｃｏｎｒａｄ Ｍ， Ｇｒｉｆｆｉｔｈ Ｊ、「ｐＢＲ３２２のＤＮＡに結合するＮａｅＩエンドヌクレアーゼは、ループ化を誘導する」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０（７）：２００６−１０， （Ｆｅｂ． １９） １９９１．
Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ Ａ， Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ， Ｌｅｓｋ ＡＭ、「構造残基７１は、免疫グロブリンのＶＨドメインにおける第２の超可変領域の位置およびコンホメーションの主要な決定基である」、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ　２１５（１）：１７５−１８２， １９９０．
Ｔｕｅｒｋ ＣおよびＧｏｌｄ Ｌ、「指数的富化によるリガンドの系統進化：バクテリオファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼに対するＲＮＡリガンド」、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４９（４９６８）：５０５−５１０， １９９０．
ｖａｎ ｄｅ Ｐｏｌｌ ＭＬ， Ｌａｆｌｅｕｒ ＭＶ， ｖａｎ Ｇｏｇ Ｆ， Ｖｒｉｅｌｉｎｇ Ｈ， Ｍｅｅｒｍａｎ ＪＨ、「Ｎ−アセチル化およびデアセチル化４’‐フルオロ‐４‐アミノビフェニルおよび４‐アミノビフェニル付加物は、１本鎖Ｍ１３のｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＤＮＡ複製および大腸菌における１本鎖φＸ１７４のＤＮＡ複製を阻害するその能力において異なる」、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １３（５）：７５１−８， （Ｍａｙ） １９９２．
Ｖｏｊｔｅｋ ＡＢ， Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ ＳＭ， Ｃｏｏｐｅｒ ＪＡ、「哺乳動物のＲａｓは、セリン／トレオニンキナーゼＲａｆと直接的に相互作用する」、Ｃｅｌｌ　７４（１）：２０５−２１４， １９９３．
Ｗｅｎｚｌｅｒ Ｈ， Ｍｉｇｎｅｒｙ Ｇ， Ｆｉｓｈｅｒ Ｌ， Ｐａｒｋ Ｗ、「トランスジェニックタバコ植物の葉におけるキメラジャガイモ塊茎遺伝子のスクロース調節性発現」、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ　１３（４）：３４７−５４， １９８９．
ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＢａｒｃｌａｙ、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ， Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅ Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ （「免疫グロブリン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー」）
Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ ＥＬ．、Ｆｒｏｍ Ｇｅｎｅｓ ｔｏ Ｃｌｏｎｅｓ： Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．（「遺伝子からクローンまで：遺伝子技術入門」）、ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ，（著作権）、１９８７．
Ｗｉｎｔｅｒ ＧおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ、「人工抗体」、Ｎａｔｕｒｅ　３４９（６３０７）：２９３−２９９， １９９１．
Ｙａｎｇ Ｘ， Ｈｕｂｂａｒｄ ＥＪ， Ｃａｒｌｓｏｎ Ｍ、「２‐ハイブリッド系により同定されたタンパク質キナーゼ基質」、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７（５０７０）：６８０−２， （Ｊｕｌ ３１） １９９２．
米国特許第４，６８３，１９５号； １９８６年２月７日出願， １９８７年７月２８日発行．　Ｍｕｌｌｉｓ ＫＢ， Ｅｒｌｉｃｈ ＨＡ， Ａｒｎｈｅｉｍ Ｎ， Ｈｏｒｎ ＧＴ， Ｓａｉｋｉ ＲＫ， Ｓｃｈａｒｆ ＳＪ、「核酸配列を増幅、検出、および／またはクローニングするための方法」
米国特許第４，６８３，２０２号； １９８５年１０月２５日出願， １９８７年７月２８日発行．　Ｍｕｌｌｉｓ ＫＢ、「核酸配列を増幅するための方法」
米国特許第４，７０４，３６２号； １９７９年１１月５日出願， １９８７年１１月３日発行．　Ｉｔａｋｕｒａ Ｋ， Ｒｉｇｇｓ ＡＤ、「組換えクローニングベヒクル微生物ポリペプチドの発現」
ＷＯ ８８／０８４５３； １９８８年４月１４日出願， １９８８年１１月３日公開．　Ａｌａｋｈｏｖ ＪＢ， Ｂａｒａｎｏｖ， ＶＩ， Ｏｖｏｄｏｖ ＳＪ， Ｒｙａｂｏｖａ ＬＡ， Ｓｐｉｒｉｎ ＡＳ、「無細胞翻訳系におけるポリペプチドの取得方法」
ＷＯ ９０／０５７８５； １９８９年１１月１５日出願， １９９０年５月３１日公開．　Ｓｃｈｕｌｔｚ Ｐ、「タンパク質中に非天然アミノ酸を部位特異的に組み込むための方法」
ＷＯ ９０／０７００３；１９８９年１月２７日出願， １９９０年６月２８日公開．　Ｂａｒａｎｏｖ ＶＩ， Ｍｏｒｏｚｏｖ ＩＪ， Ｓｐｉｒｉｎ ＡＳ、「無細胞系のコンジュゲートされた転写／翻訳における遺伝子の予備的発現のための方法」
ＷＯ ９１／０２０７６； １９９０年６月１４日出願， １９９１年２月２１日公開．　Ｂａｒａｎｏｖ ＶＩ， Ｒｙａｂｏｖａ ＬＡ， Ｙａｒｃｈｕｋ ＯＢ， Ｓｐｉｒｉｎ ＡＳ、「無細胞系におけるポリペプチドの取得方法」
ＷＯ ９１／０５０５８； １９８９年１０月５日出願， １９９１年４月１８日公開．　Ｋａｗａｓａｋｉ Ｇ、「新規遺伝子およびポリペプチドの無細胞系および単離」
ＷＯ ９１／１７２７１； １９９０年５月１日出願， １９９１年１１月１４日公開．　Ｄｏｗｅｒ ＷＪ， Ｃｗｉｒｌａ ＳＥ、「組換えライブラリーのスクリーニング方法」
ＷＯ ９１／１８９８０； １９９１年５月１３日出願， １９９１年１２月１２日公開．　Ｄｅｖｌｉｎ ＪＪ、「生物学的活性分子を同定するための組成物および方法」
ＷＯ ９１／１９８１８； １９９０年６月２０日出願， １９９１年１２月２６日公開．　Ｄｏｗｅｒ ＷＪ， Ｃｗｉｒｌａ ＳＥ， Ｂａｒｒｅｔｔ ＲＷ、「ペプチドライブラリーおよびスクリーニング系」
ＷＯ ９２／０２５３６； １９９１年８月１日出願， １９９２年２月２０日公開．　Ｇｏｌｄ Ｌ， Ｔｕｅｒｋ Ｃ、「逆翻訳による系統的ポリペプチド進化」
ＷＯ ９２／０３９１８； １９９１年８月２８日出願， １９９２年３月１９日公開．　Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ， Ｋａｙ ＲＭ、「異種抗体を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物」
ＷＯ ９２／０３９１８； １９９１年８月２８日出願， １９９２年３月１９日公開．　Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ， Ｋａｙ ＲＭ、「異種抗体を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物」
ＷＯ ９２／０５２５８； １９９１年９月１７日出願， １９９２年４月２日公開．　Ｆｉｎｃｈｅｒ ＧＢ、「オオムギ酵素をコードする遺伝子」
ＷＯ ９２／１４８４３； １９９２年２月２１日出願， １９９２年９月３日公開．　Ｔｏｏｌｅ ＪＪ， Ｇｒｉｆｆｉｎ ＬＣ， Ｂｏｃｋ ＬＣ， Ｌａｔｈａｍ ＪＡ， Ｍｕｅｎｃｈａｕ ＤＤ， Ｋｒａｗｃｚｙｋ Ｓ、「生物分子特異的アプタマーおよびその作製方法」
ＷＯ ９３／０８２７８； １９９２年１０月１５日出願， １９９３年４月２９日公開．　Ｓｃｈａｔｚ ＰＪ， Ｃｕｌｌ ＭＧ， Ｍｉｌｌｅｒ ＪＦ， Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰ、「ペプチドライブラリーおよびそのスクリーニング方法」
ＷＯ ９３／１２２２７； １９９２年１２月１７日出願， １９９３年６月２４日公開．　Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ； Ｋａｙ ＲＭ、「異種抗体を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物」
ＷＯ ９３／１２２２７； １９９２年１２月１７日出願， １９９３年６月２４日公開．　Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ， Ｋａｙ ＲＭ、「異種抗体を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物」
ＷＯ ９４／２５５８５； １９９４年４月２５日出願， １９９４年１１月１０日公開．　Ｌｏｎｂｅｒｇ， Ｎ， Ｋａｙ ＲＭ、「異種抗体を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物」
ＷＯ ９４／２５５８５； １９９４年４月２５日出願， １９９４年１１月１０日公開．　Ｌｏｎｂｅｒｇ Ｎ， Ｋａｙ ＲＭ、「異種抗体を産生し得るトランスジェニック非ヒト動物」
Ａｒｓｌａｎ Ｔ， Ａｂｒａｈａｍ ＡＴ， Ｈｅｃｈｔ ＳＭ、「構造的に変化したＤＮＡトポイソメラーゼＩの基質　１個の３’‐デオキシヌクレオチドを切れやすい鎖に含有させる効果」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９８ Ｊａｎ−Ｍａｒ；１７（１−３）：５１５−３０．
Ａｕｐｅｉｘ Ｋ， Ｔｏｕｌｍｅ ＪＪ、「ＲＮＡヘアピンの２本鎖基部への化学修飾オリゴヌクレオチドの結合」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ｊｕｎ−Ｊｕｌ；１８（６−７）：１６４７−５０．
Ｂａｚｚａｎｉｎｉ Ｒ， Ｍａｎｆｒｅｄｉｎｉ Ｓ， Ｄｕｒｉｎｉ Ｅ， Ｇｒｏｓｃｈｅｌ Ｂ， Ｃｉｎａｔｌ Ｊ， Ｂａｌｚａｒｉｎｉ Ｊ， Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ Ｅ， Ｉｍｂａｃｈ ＪＬ， Ｐｅｒｉｇａｕｄ Ｃ， Ｇｏｓｓｅｌｉｎ Ｇ、「Ｓ−アシル−２−チオエチル （ＳＡＴＥ）生物的不安定リン酸保護基を有するＡｒａ−ＣＭＰおよびＡｒａ−ＡＭＰのプロドラッグ：合成および生物学的評価」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ａｐｒ−Ｍａｙ；１８（４−５）：９７１−２．
Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ ＧＭ， Ｌｉｕ Ｘ， Ｒｏｓｌｅｒ Ａ， Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｃ、「ヒト脆弱ヒスチジン三価タンパク質（Ｆｈｉｔ）に関する研究のためのジアデノシン５’，５’’’‐Ｐ１，Ｐ３‐三リン酸の２つのヒドロラーゼ耐性類似体」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９８ Ｊａｎ−Ｍａｒ；１７（１−３）：３０１−８．
Ｂｒｉｄｓｏｎ ＰＫ， Ｌｉｎ Ｘ， Ｍｅｌｍａｎ Ｎ， Ｊｉ ＸＤ， Ｊａｃｏｂｓｏｎ ＫＡ、「７‐β‐Ｄ‐リボフラノシルキサンチンの合成およびアデノシン受容体親和性」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９８ Ａｐｒ；１７（４）：７５９−６８．
Ｂｒｏｄｉｎ Ｐ， Ｇｏｔｔｉｋｈ Ｍ， Ａｕｃｌａｉｒ Ｃ， Ｍｏｕｓｃａｄｅｔ ＪＦ、「一官能性および二官能性三重らせん形成オリゴヌクレオチドによるＨＩＶ−１組込みの阻害」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ｊｕｎ−Ｊｕｌ；１８（６−７）：１７１７−８．
Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ ＴＥ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．（「タンパク質構造と分子的原理」）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， １９８４．
Ｄｅ Ｃｌｅｒｃｑ Ｅ、「Ｓ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ阻害剤および抗ウイルス剤としてのカルボサイクリックアデノシン類似体：最近の進歩」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９８ Ｊａｎ−Ｍａｒ；１７（１−３）：６２５−３４．
ｄｅ Ｚｗａｒｔ Ｍ， Ｌｉｎｋ Ｒ， ｖｏｎ Ｆｒｉｊｔａｇ Ｄｒａｂｂｅ Ｋｕｎｚｅｌ ＪＫ， Ｃｒｉｓｔａｌｌｉ Ｇ， Ｊａｃｏｂｓｏｎ ＫＡ， Ｔｏｗｎｓｅｎｄ−Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ Ａ， ＩＪｚｅｒｍａｎ ＡＰ、「アデノシンＡ２Ｂ受容体におけるアデノシン類似体の機能的スクリーニング：強力なアゴニストの探索」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９８ Ｊｕｎ；１７（６）：９６９−８５．
Ｅｇｒｏｎ Ｄ， Ａｒｚｕｍａｎｏｖ ＡＡ， Ｄｙａｔｋｉｎａ ＮＢ， Ｋｒａｙｅｖｓｋｙ Ａ， Ｉｍｂａｃｈ ＪＬ， Ａｕｂｅｒｔｉｎ ＡＭ， Ｇｏｓｓｅｌｉｎ Ｇ， Ｐｅｒｉｇａｕｄ Ｃ、「３’−アジド−２’，３’−ジデオキシチミジン５’−フルオロリン酸の合成、抗ＨＩＶ活性および安定性に関する研究」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ａｐｒ−Ｍａｙ；１８（４−５）：９８３−４
Ｇｉａｎｏｌｉｏ ＤＡ， ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ＬＷ、「拡張機能を有するピリミジン誘導体の合成およびトリプレックス形成特性」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ａｕｇ；１８（８）：１７５１−６９．
Ｇｏｔｔｉｋｈ ＭＢ， Ｖｏｌｋｏｖ ＥＭ， Ｒｏｍａｎｏｖａ ＥＡ， Ｏｒｅｔｓｋａｙａ ＴＳ， Ｓｈａｂａｒｏｖａ ＺＡ、「ＨＩＶ−１のＤＮＡ組込みを阻害し得るオリゴヌクレオチド挿入剤コンジュゲートの合成」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ｊｕｎ−Ｊｕｌ；１８（６−７）：１６４５−６．
Ｈｏｔｏｄａ Ｈ， Ｋｏｉｚｕｍｉ Ｍ， Ｏｈｍｉｎｅ Ｔ， Ｆｕｒｕｋａｗａ Ｈ， Ｎｉｓｈｉｇａｋｉ Ｔ， Ａｂｅ Ｋ， Ｋｏｓａｋａ Ｔ， Ｔｓｕｔｓｕｍｉ Ｓ， Ｓｏｎｅ Ｊ， Ｋａｎｅｋｏ Ｍ、「生物学的活性オリゴデオキシリボヌクレオチド　１０：グリセロール骨格を有する修飾ヘキサヌクレオチドの抗ＨＩＶ−１活性および安定性」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９８ Ｊａｎ−Ｍａｒ；１７（１−３）：２４３−５２．
ＪＰ１０１１３１９４； １９９７年１０月２２日出願， １９９８年５月６日公開， Ｄｏｎｎｅｌｌｙ， ＪＪ ；Ｄｗａｒｋｉ， ＶＪ ；Ｌｉｕ， ＭＡ ；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ， ＤＬ ；Ｐａｒｋｅｒ， Ｓ ；Ｓｈｉｖｅｒ， ＪＷ ；Ｕｌｍｅｒ ＪＢ、「核酸調製法」
Ｋａｎｇ ＳＨ， Ｓｉｎｈａｂａｂｕ ＡＫ， Ｃｈｏ ＭＪ、２’‐デオキシウリジン５’‐一リン酸のビス（ピバロイルオキシメチル）エステルの合成およびその生物学的活性」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９８ Ｊｕｎ；１７（６）：１０８９−９８．
Ｋｒａｙｅｖｓｋｙ Ａ， Ａｒｚｕｍａｎｏｖ Ａ， Ｓｈｉｒｏｋｏｖａ Ｅ， Ｄｙａｔｋｉｎａ Ｎ， Ｖｉｃｔｏｒｏｖａ Ｌ， Ｊａｓｋｏ Ｍ， Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖａ Ｌ、「三リン酸残基で修飾したｄＮＴＰ：ＤＮＡポリメラーゼに対する基質特性およびヒト血清における安定性」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９８ Ｊａｎ−Ｍａｒ；１７（１−３）：６８１−９３．
Ｋｒａｙｅｖｓｋｙ ＡＡ， Ｄｙａｔｋｉｎａ ＮＢ， Ｓｅｍｉｚａｒｏｖ ＤＧ， Ｖｉｃｔｏｒｏｖａ ＬＳ， Ｓｈｉｒｏｋｏｖａ ＥＡ， Ｔｈｅｉｌ Ｆ， Ｖｏｎ Ｊａｎｔａ Ｌｉｐｉｎｓｋｉ ＭＪ， Ｇｏｓｓｅｌｉｎ Ｇ， Ｉｍｂａｃｈ ＪＬ、「ＤＮＡ生合成における修飾Ｌ−ｄＮＴＰの基質活性の理由および限界」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ａｐｒ−Ｍａｙ；１８（４−５）：８６３−４．
Ｋｖａｓｙｕｋ ＥＩ， Ｍｉｋｈａｉｌｏｐｕｌｏ ＩＡ， Ｓｕｈａｄｏｌｎｉｋ ＲＪ， Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ＥＥ， Ｍｕｔｏ ＮＦ， Ｉａｃｏｎｏ ＫＴ， Ｈｏｍｏｎ Ｊ， Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ Ｗ、「５’‐末端５’‐アミノ‐５’‐デオキシ‐および５’‐アミノ‐３’，５’‐ジデオキシアデノシン誘導体を含む２’，５’‐オリゴアデニル酸三量体の合成およびその生物学的活性」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ｊｕｎ−Ｊｕｌ；１８（６−７）：１４８３−４．
Ｌｉｕ Ｊ， Ｓｋｒａｄｉｓ Ａ， Ｋｏｌａｒ Ｃ， Ｋｏｌａｔｈ Ｊ， Ａｎｄｅｒｓｏｎ Ｊ， Ｌａｗｓｏｎ Ｔ， Ｔａｌｍａｄｇｅ Ｊ， Ｇｍｅｉｎｅｒ ＷＨ、「５‐ＦＵと比較したＦｄＵＭＰ［１０］の増大した細胞毒性および減少したｉｎ ｖｉｖｏ毒性」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ａｕｇ；１８（８）：１７８９−８０２．
Ｌｕｔｚ ＭＪ， Ｗｉｌｌ ＤＷ， Ｂｒｅｉｐｏｈｌ Ｇ， Ｂｅｎｎｅｒ ＳＡ， Ｕｈｌｍａｎｎ Ｅ、「単荷電ペプチド核酸（ＰＮＡ）類似体の合成およびＤＮＡポリメラーゼによる基質としてのその認識」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ｍａｒ；１８（３）：３９３−４０１．
Ｍｏｎａｃｏ Ｖ， ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｔｅｒｉｎｇ ＫＩ， Ｍｅｅｕｗｅｎｏｏｒｄ ＮＪ， ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｌｓｔ ＨＡ， Ｓｔｕｉｖｅｎｂｅｒｇ ＨＲ， Ｖｉｓｓｅ Ｒ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｋａａｄｅｎ ＪＣ， Ｍｏｏｌｅｎａａｒ ＧＦ， Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ ＥＥ， Ｇｏｏｓｅｎ Ｎ， ｖａｎ ｄｅｒ Ｍａｒｅｌ ＧＡ， ｖａｎ Ｂｏｏｍ ＪＨ、「大腸菌におけるヌクレオチド切出し修復に関する研究のための修飾ＤＮＡ断片の合成および生物学的評価」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ｊｕｎ−Ｊｕｌ；１８（６−７）：１３３９−４１．
Ｍｏｒｏｚｏｖａ ＯＶ， Ｋｏｌｐａｓｈｃｈｉｋｏｖ ＤＭ， Ｉｖａｎｏｖａ ＴＭ， Ｇｏｄｏｖｉｋｏｖａ ＴＳ、「新規光架橋５‐Ｃ塩基置換ＵＴＰ類似体の合成およびダニ媒介脳炎ウイルスＲＮＡレプリカーゼタンパク質の高選択的親和性標識におけるその適用」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ｊｕｎ−Ｊｕｌ；１８（６−７）：１５１３−４．
Ｎｇｕｙｅｎ−Ｂａ Ｎ， Ｃｈａｎ Ｌ， Ｑｕｉｍｐｅｒｅ Ｍ， Ｔｕｒｃｏｔｔｅ Ｎ， Ｌｅｅ Ｎ， Ｍｉｔｃｈｅｌｌ Ｈ， Ｂｅｄａｒｄ Ｊ、「強力な抗ＨＣＭＶ剤としてのヌクレオチド類似体の新規クラスの設計およびＳＡＲ研究」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ａｐｒ−Ｍａｙ；１８（４−５）：８２１−７．
Ｐａｎｄｏｌｆｉ Ｄ， Ｒａｕｚｉ Ｆ， Ｃａｐｏｂｉａｎｃｏ ＭＬ、「３’‐および５’‐エキソヌクレアーゼに対するオリゴヌクレオチドの安定性に関する異なる型の末端キャッピング修飾の評価」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ｓｅｐ；１８（９）：２０５１−６９．
Ｐａｎｋｉｅｗｉｃｚ ＫＷ， Ｌｅｓｉａｋ−Ｗａｔａｎａｂｅ Ｋ、「強力な抗癌剤および細胞分化誘導剤としての新規ミコフェノールアデニンビス（リン酸）」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ａｐｒ−Ｍａｙ；１８（４−５）：９２７−３２．
Ｐｅｒｒｉｎ ＤＭ， Ｇａｒｅｓｔｉｅｒ Ｔ， Ｈｅｌｅｎｅ Ｃ、「核酸触媒の触媒レパートリーの拡張：アンモニウムおよびイミダゾリル官能基を有する２つの修飾デオキシリボヌクレオシド三リン酸の同時組込み」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ｍａｒ；１８（３）：３７７−９１．
Ｐｆｕｎｄｈｅｌｌｅｒ ＨＭ， Ｋｏｓｈｋｉｎ ＡＡ， Ｏｌｓｅｎ ＣＥ， Ｗｅｎｇｅｌ Ｊ、「２つの新規２’‐Ｏ‐メチル修飾ヌクレオチドモノマーを含むオリゴヌクレオチドの評価：３’‐Ｃ‐アリルおよび２’‐Ｏ，３’‐Ｃ結合二員環誘導体」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ｓｅｐ；１８（９）：２０１７−３０．
Ｒａｍａｓａｍｙ ＫＳ， Ｓｔｏｉｓａｖｌｊｅｖｉｃ Ｖ、「非環式アミノアルコールヌクレオシド類似体を含む修飾オリゴヌクレオチドの合成およびその生物物理学的研究」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ａｕｇ；１８（８）：１８４５−６１．
Ｓｃｈｉｎａｚｉ ＲＦ， Ｌｅｓｎｉｋｏｗｓｋｉ ＺＪ、「ホウ素含有オリゴヌクレオチド」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９８ Ｊａｎ−Ｍａｒ；１７（１−３）：６３５−４７．
Ｓｅｃｒｉｓｔ ＪＡ ３世， Ｐａｒｋｅｒ ＷＢ， Ａｌｌａｎ ＰＷ， Ｂｅｎｎｅｔｔ ＬＬ Ｊｒ， Ｗａｕｄ ＷＲ， Ｔｒｕｓｓ ＪＷ， Ｆｏｗｌｅｒ ＡＴ， Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ ＪＡ， Ｅａｌｉｃｋ ＳＥ， Ｗｅｌｌｓ ＡＨ， Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ ＧＹ， Ｇａｄｉ ＶＫ， Ｓｏｒｓｃｈｅｒ ＥＪ、「癌の遺伝子療法：大腸菌プリンヌクレオシドホスホリラーゼによるヌクレオシドプロドラッグの活性化」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ａｐｒ−Ｍａｙ；１８（４−５）：７４５−５７．
Ｓｈｉｒｏｋｏｖａ ＥＡ， Ｓｈｉｐｉｔｓｉｎ ＡＶ， Ｖｉｃｔｏｒｏｖａ ＬＳ， Ｄｙａｔｋｉｎａ ＮＢ， Ｇｏｒｙｕｎｏｖａ ＬＥ， Ｂｅａｂｅａｌａｓｈｖｉｌｌｉ ＲＳ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＣＪ， Ｒｏｂｅｒｔｓ ＳＭ， Ｋｒａｙｅｖｓｋｙ ＡＡ、「新型抗ウイルス剤としての修飾ヌクレオシド５’‐三リン酸」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ａｐｒ−Ｍａｙ；１８（４−５）：１０２７−８．
Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ＴＫ， Ｆｒｉｅｄｈｏｆｆ Ｐ， Ｐｉｎｇｏｕｄ Ａ， Ｋａｔｔｉ ＳＢ、「セラチア菌エンドヌクレアーゼによるホスホジエステル加水分解に関する研究におけるメチルホスホン酸オリゴヌクレオシドの応用」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ｓｅｐ；１８（９）：１９４５−６０．
Ｓｔａｔｔｅｌ ＪＭ， Ｙａｎａｃｈｋｏｖ Ｉ， Ｗｒｉｇｈｔ ＧＥ、「Ｎ２−（ｐ−ｎ−ブチルフェニル）−２’−デオキシグアノシン５’−（α，β‐イミド）三リン酸（ＢｕＰｄＧＭＰＮＨＰＰ）の合成および生化学的研究：ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼの非基質阻害剤」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９８ Ａｕｇ；１７（８）：１５０５−１３．
Ｔｅｒａｔｏ Ｈ， Ｍｏｒｉｔａ Ｈ， Ｏｈｙａｍａ Ｙ， Ｉｄｅ Ｈ、「水溶液におけるシステイン誘導体による５‐ホルミルウラシルの新規改変」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９８ Ｊａｎ−Ｍａｒ；１７（１−３）：１３１−４１．
Ｔｏｍｉｋａｗａ Ａ， Ｓｅｎｏ Ｍ， Ｓａｔｏ−Ｋｉｙｏｔａｋｉ Ｋ， Ｏｈｔｓｕｋｉ Ｃ， Ｈｉｒａｉ Ｔ， Ｙａｍａｇｕｃｈｉ Ｔ， Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｔ， Ｙｏｓｈｉｄａ Ｓ， Ｓａｎｅｙｏｓｈｉ Ｍ、「合成ヌクレオシドおよびヌクレオチド．４０；９−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−２−（ｐ−ｎ−ブチルアニリノ）アデニン ５’−三リン酸 （ＢｕＡａｒａＡＴＰ）およびその２’−ｕｐアジド類似体による真核生物ＤＮＡポリメラーゼαの選択的阻害：合成および酵素的評価」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９８ Ｊａｎ−Ｍａｒ；１７（１−３）：４８７−５０１．
米国特許第５，５８０，８５９号； １９９４年３月１８日出願， １９９６年１２月３日発行． Ｆｅｌｇｎｅｒ， ＰＬ． ；Ｗｏｌｆｆ， ＪＡ． ；Ｒｈｏｄｅｓ， ＧＨ． ；Ｍａｌｏｎｅ， ＲＷ． ；Ｃａｒｓｏｎ， ＤＡ．、「哺乳動物における外因性ＤＮＡ配列の送達」
米国特許第５，５８９，４６６号； １９９５年１月２６日出願， １９９６年１２月３１日発行． Ｆｅｌｇｎｅｒ， ＰＬ． ；Ｗｏｌｆｆ， ＪＡ． ；Ｒｈｏｄｅｓ， ＧＨ． ；Ｍａｌｏｎｅ， ＲＷ． ；Ｃａｒｓｏｎ， ＤＡ．、「ＤＮＡ配列の注入による哺乳動物における保護免疫応答の誘導」
米国特許第５，６４１，６６５号； １９９４年１１月２８日出願， １９９７年６月２４日発行． Ｈｏｂａｒｔ， ＰＭ． ；Ｍａｒｇａｌｉｔｈ， Ｍ ；Ｐａｒｋｅｒ， ＳＥ． ；Ｋｈａｔｉｂｉ， Ｓ、「ＩＬ−２の発現に適したプラスミド」
米国特許第５，６９３，６２２号； １９９５年６月７日出願， １９９７年１２月２日発行． Ｗｏｌｆｆ， ＪＡ． ；Ｄｕｋｅ， ＤＪ． ；Ｆｅｌｇｎｅｒ， ＰＬ．、「哺乳動物の心筋における外因性ポリヌクレオチド配列の発現」
米国特許第５，７０３，０５５号； １９９４年１月２６日出願， １９９７年１２月３０日発行． Ｆｅｌｇｎｅｒ， ＰＬ． ；Ｗｏｌｆｆ， ＪＡ ；Ｒｈｏｄｅｓ， ＧＨ． ；Ｍａｌｏｎｅ， ＲＷ ；Ｃａｒｓｏｎ， ＤＡ．、「脂質媒介性ＤＮＡ送達による抗体の作製」
米国特許第５，８４６，９４６号； １９９６年６月１４日出願， １９９８年１２月８日発行． Ｈｕｅｂｎｅｒ， ＲＣ． ；Ｎｏｒｍａｎ， ＪＡ． ；Ｌｉａｎｇ， Ｘ ；Ｃａｒｎｅｒ， ＫＲ． ；Ｂａｒｂｏｕｒ， ＡＧ． ；Ｌｕｋｅ， ＣＪ．、「ボレリアＤＮＡを投与するための組成物および方法」
米国特許第５，９１０，４８８号； １９９５年１２月１日出願， １９９９年６月８日発行． Ｎａｂｅｌ， ＧＪ． ；Ｎａｂｅｌ， ＥＧ． ；Ｌｅｗ， Ｄ ；Ｍａｒｑｕｅｔ， Ｍ、「遺伝子療法に適したプラスミド」
Ｖｉｃｔｏｒｏｖａ ＬＳ， Ｓｅｍｉｚａｒｏｖ ＤＧ， Ｓｈｉｒｏｋｏｖａ ＥＡ， Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖａ ＬＡ， Ａｒｚｕｍａｎｏｖ ＡＡ， Ｊａｓｋｏ ＭＶ， Ｋｒａｙｅｖｓｋｙ ＡＡ、「ヒトＤＮＡポリメラーゼおよびレトロウイルス逆転写酵素：三リン酸残基で修飾されたｄＮＴＰｓに関する選択性」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ａｐｒ−Ｍａｙ；１８（４−５）：１０３１−２．
ｖｏｎ Ｊａｎｔａ−Ｌｉｐｉｎｓｋｉ Ｍ， Ｇａｅｒｔｎｅｒ Ｋ， Ｌｅｈｍａｎｎ Ｃ， Ｓｃｈｅｅｒ Ｈ， Ｓｃｈｉｌｄｔ Ｊ， Ｍａｔｔｈｅｓ Ｅ、「修飾オリゴヌクレオチドに対する標的としてのヒトテロメラーゼのタンパク質およびＲＮＡ」、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １９９９ Ｊｕｎ−Ｊｕｌ；１８（６−７）：１７１９−２０
ＷＯ９０１１０９２； １９９０年３月２１日出願， １９９０年１０月４日Ａ１公開． Ｆｅｌｇｎｅｒ， ＰＬ． ；Ｗｏｌｆｆ， ＪＡ；Ｒｈｏｄｅｓ， ＧＨ． ；Ｍａｌｏｎｅ， ＲＷ ；Ｃａｒｓｏｎ， ＤＡ．、「脊椎動物における外因性ポリヌクレオチド配列の発現」
ＷＯ９３１４７７８； １９９３年１月２１日， １９９３年８月５日Ａ１公開． Ｒｈｏｄｅｓ， ＧＨ． ；Ｄｗａｒｋｉ， ＶＪ．；Ｆｅｌｇｎｅｒ， ＰＬ；Ｗａｎｇ−Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｊ；Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ， Ｍ、「ｅｘ ｖｉｖｏにおける遺伝子導入」
ＷＯ９４２１７９７； １９９４年３月１４日， １９９４年９月２９日Ａ１公開． Ｄｏｎｎｅｌｌｙ， ＪＪ． ；Ｄｗａｒｋｉ， ＶＪ． ；Ｌｉｕ， ＭＡ． ；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ， ＤＬ． ；Ｐａｒｋｅｒ， ＳＥ． ；Ｓｈｉｖｅｒ， ＪＷ． ；Ｕｌｍｅｒ， ＪＢ．、「核酸医薬」
ＷＯ９６３３７３６； １９９６年４月２６日出願， １９９６年１０月３１日Ａ１公開． Ｂａｒｕｃｈ ＤＩ； Ｐａｓｌｏｓｋｅ ＢＬ； Ｈｏｗａｒｄ， ＲＪ、「マラリアペプチドおよびワクチン」
ＷＯ９７３５９９２； １９９７年３月１７日出願， １９９７年１０月２日Ａ１公開． Ｈｏｂａｒｔ， ＰＭ． ；Ｌｉａｎｇ， Ｘ、「テトラサイクリン誘導／抑制系」
ＷＯ９９２６６６３； １９９８年１１月２０日出願， １９９９年６月３日Ａ２公開． Ｈｏｒｔｏｎ， Ｈ ；Ｐａｒｋｅｒ， Ｓ；Ｍａｎｔｈｏｒｐｅ， Ｍ； Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｐ、「サイトカイン発現ポリヌクレオチドおよびそのための組成物を用いた癌の治療」
ＷＯ９９４１３６８； １９９９年２月１０日出願， １９９９年８月１９日Ａ２公開． Ｐｕｎｎｏｎｅｎ Ｊ， Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰ， Ｗｈａｌｅｎ ＲＧ； Ｈｏｗａｒｄ， Ｒ、「遺伝子ワクチンの免疫調節特性の最適化」
ＷＯ９９４１３６９； １９９９年２月１０日出願， １９９９年８月１９日Ａ２公開． Ｐｕｎｎｏｎｅｎ Ｊ， Ｓｔｅｍｍｅｒ ＷＰ， Ｗｈａｌｅｎ ＲＧ； Ｈｏｗａｒｄ， Ｒ、「遺伝子ワクチンベクター工学」
ＷＯ９９４１３８３； １９９９年２月１０日出願， １９９９年８月１９日Ａ１公開． Ｐｕｎｎｏｎｅｎ Ｊ， Ｂａｓｓ， ＳＨ， Ｗｈａｌｅｎ， ＲＧ， Ｈｏｗａｒｄ， Ｒ， Ｓｔｅｍｍｅｒ， ＷＰ、「抗原ライブラリー免疫感作」
ＷＯ９９４１４０２； １９９９年２月１０日出願， １９９９年８月１９日Ａ２公開． Ｐｕｎｎｏｎｅｎ Ｊ， Ｓｔｅｍｍｅｒ， ＷＰ， Ｈｏｗａｒｄ Ｒ， Ｐａｔｔｅｎ ＰＡ、「遺伝子ワクチンベクターのターゲッティング」
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩの活性を示す。これは、ポリヌクレオチドビルディングブロックをシャッフル、集合、再集合、再結合および／または連鎖（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅ）させるのに用い得る典型的な酵素である。星印は、この酵素が該ポリヌクレオチド基質の３′方向から５′方向へと作用することを表わしている。
【図２】
図２は、エキソヌクレアーゼに媒介されるポリヌクレオチド再集合における酵素エキソヌクレアーゼＩＩＩの適用例を示す。適当な宿主（例えば、大腸菌、シュードモナス、ストレプトミセス、またはバチルス）を形質転換し、その宿主の修復機構を利用して、発現スクリーニングにより分析し得るクローン化され突然変異を誘発された子孫核酸（および好ましくはかかる核酸によって発現されたポリペプチド）のライブラリーを作製することによりさらなる多様性をもたらすことによる、ｉｎ ｖｉｖｏにおける「修復」の組合わせた使用も示す。
【図３】
図３は、多結合核酸鎖の生成を示す。この場合、生成した鎖は、親鋳型と同じ長さのものであるが、メチル化されていない。従って、ＤｐｎＩ処理を用いて、生成した鎖を選択することができる。示してはいないが、この鋳型ならびに生成した産物は、ベクター（線状または環状）の一部であってもよい。
【図４】
図４は、異種核酸複合体におけるアニーリングした核酸鎖のハイブリダイズしていない一本鎖末端から、３’および５’末端ヌクレオチドを遊離させるための手段としてのエキソヌクレアーゼ処理の使用を示す。この処理により、短く切断されているがハイブリダイズした末端が遊離して、処理した末端のポリメラーゼに基づく伸長および／またはリガーゼに媒介されるライゲーションが容易になる。
また、適当な宿主（例えば、大腸菌、シュードモナス、ストレプトミセス、またはバチルス）を形質転換し、その宿主の修復機構を利用して、発現スクリーニングにより分析し得るクローン化され突然変異を誘発された子孫核酸（および好ましくはかかる核酸によって発現されたポリペプチド）のライブラリーを作製することによりさらなる多様性をもたらすことによる、ｉｎ ｖｉｖｏにおける「修復」の組合わせた使用も示す。
【図５】
図５は、１本のメチル化多結合核酸鎖をいくつかのメチル化されていない単一結合核酸鎖にアニーリングさせる実施例における、エキソヌクレアーゼに媒介される核酸の再集合の使用を示す。アニーリングした核酸鎖は、異種核酸複合体を形成し、異種核酸複合体における複数のアニーリングした核酸鎖のハイブリダイズしていない一本鎖末端から、３’および５’末端ヌクレオチドを遊離させるための手段としてのエキソヌクレアーゼ処理にかけられる。この処理により、短く切断されているがハイブリダイズした末端が遊離して、処理した末端のポリメラーゼに基づく伸長および／またはリガーゼに媒介されるライゲーションが容易になる。その後、自然界でメチル化されてなくキメラの、生成されたアニーリングした単一結合核酸鎖に対して選択するには、ＤｐｎＩで処理するのが便利である。
【図６】
図６は、複数のメチル化多結合核酸鎖をいくつかのメチル化されていない単一結合核酸鎖にアニーリングさせる実施例における、エキソヌクレアーゼに媒介される核酸の再集合の使用方法を示す。アニーリングした核酸鎖は、異種核酸複合体を形成し、異種核酸複合体における複数のアニーリングした核酸鎖のハイブリダイズしていない一本鎖末端から、３’および５’末端ヌクレオチドを遊離させるための手段としてのエキソヌクレアーゼ処理にかけられる。この処理により、短く切断されているがハイブリダイズした末端が遊離して、処理した末端のポリメラーゼに基づく伸長および／またはリガーゼに媒介されるライゲーションが容易になる。その後、自然界でメチル化されてなくキメラの、生成されたアニーリングした単一結合核酸鎖に対して選択するには、ＤｐｎＩで処理するのが便利である。
【図１】
2004500019.tif 000067
【図２】
2004500019.tif 000068
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004500019.tif 000331