(57)【要約】本発明は、増殖および細胞分裂にとって重要であり、そしてその遺伝子がカンジダ・アルビカンスに関連する感染症の治療のための選択的薬剤標的として使用できる、カンジダ・アルビカンスからの遺伝子またはその機能性断片の同定に関する。カンジダ・アルビカンスからの新規の核酸配列も提供し、そしてこれはカンジダ・アルビカンスの増殖にとって重要なポリペプチドをコードする。真菌および酵母の増殖を阻害する抗真菌性化合物の同定のための方法も意図する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母カンジダ・アルビカンスの生存および増殖にとって重要であり、そして核酸分子が、配列番号１から９中に記載のヌクレオチドの配列のいずれかを含んでなる、ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項２】
酵母カンジダ・アルビカンスの生存および増殖にとって重要であり、そして核酸分子が、配列番号１から３中に記載のヌクレオチドの配列のいずれかを含んでなる、ポリペプチドをコードする核酸分子。
【請求項３】
酵母カンジダ・アルビカンスの生存および増殖にとって重要であり、そして核酸分子が、配列番号１または２中に記載の配列のいずれかを含んでなる、ポリペプチドをコードする核酸分子および該核酸分子の断片または誘導体。
【請求項４】
ｍＲＮＡである、請求項１から３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５】
ＤＮＡである、請求項１から３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項６】
ｃＤＮＡである、請求項５記載の核酸分子。
【請求項７】
高度にストリンジェントな条件下で請求項１から６のいずれかに記載の分子または配列番号１〜９のいずれかに記載の配列にハイブリダイズが可能な核酸分子。
【請求項８】
請求項１から６のいずれかに記載の分子または配列番号１〜９のいずれかに記載の配列にハイブリダイズが可能な核酸分子を含んでなるアンチセンス分子。
【請求項９】
請求項１から８のいずれかに記載の核酸分子を含む細胞であって、該細胞が細菌または真核生物由来である細胞。
【請求項１０】
請求項１から７のいずれかに記載の核酸分子または配列番号１〜９のいずれかに記載の配列によりコードされるポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１４〜２０のいずれかに記載のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項１２】
請求項５または６記載の核酸分子を含んでなる組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１３】
請求項５または６記載の核酸分子を含んでなる組換えＤＮＡ構築物であって、該核酸分子がアンチセンス方向に挿入された組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１４】
該組換えＤＮＡ構築物が発現ベクターである、請求項１２または１３記載の組換えＤＮＡ構築物。
【請求項１５】
誘導可能なプロモーターを含んでなる、請求項１４記載の構築物。
【請求項１６】
レポーター分子をコードする配列を含んでなる、請求項１４または１５記載の構築物。
【請求項１７】
請求項１２から１６のいずれかに記載の組換えＤＮＡ構築物を含む細胞であって、該細胞が細菌または真核生物由来である細胞。
【請求項１８】
薬剤として使用するための、配列番号１〜８のいずれかに記載の核酸分子または配列番号１〜９に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１９】
カンジダ・アルビカンス関連疾患の治療のための薬剤の調製における、配列番号１〜８のいずれかに記載の核酸分子または配列番号１〜９に記載の配列の使用。
【請求項２０】
薬剤として使用するための、請求項１０または１１に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
カンジダ・アルビカンス関連感染症の治療のための薬剤の調製における、請求項１０または１１に記載のポリペプチドの使用。
【請求項２２】
薬剤的に許容できる薬剤組成物のためのキャリヤー、希釈剤または賦形剤と一緒に、請求項１〜８のいずれかに記載の核酸分子または請求項１０または１１に記載のポリペプチドを含んでなる薬剤組成物。
【請求項２３】
請求項１０記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列内に誘導された突然変異を含んでなるカンジダ・アルビカンス細胞。
【請求項２４】
ポリペプチドの発現または機能性またはこれらのポリペプチドが関与する代謝経路を選択的に調節しそしてカンジダ・アルビカンスの増殖および生存にとって重要である化合物を同定するための方法において、
（ａ）試験すべき化合物と、該ポリペプチドの過剰発現または過少発現をもたらす突然変異を請求項１から８のいずれかに記載の核酸分子中に有する１種またはそれ以上のカンジダ・アルビカンス細胞とを、１種またはそれ以上の野生型カンジダ・アルビカンス細胞と該化合物との接触に加えて、接触させること、
（ｂ）該野生型と比較して該突然変異細胞の増殖および／または活性をモニターする段階であって、
ここでは、１個またはそれ以上の該突然変異カンジダ細胞の相違する増殖または活性が、ポリペプチドまたはその他のポリペプチドに対する同一または平行経路による該化合物の選択的作用の指標であるとされる段階を含んでなる方法。
【請求項２５】
請求項２４記載の方法により同定できる化合物。
【請求項２６】
薬剤として使用するための、請求項２５記載の化合物。
【請求項２７】
カンジダ・アルビカンス関連疾患の治療のための薬剤の調製における、請求項２５記載の化合物の使用。
【請求項２８】
薬剤的に許容できる薬剤組成物のためのキャリヤー、希釈剤または賦形剤と一緒に、請求項２５記載の化合物を含んでなる薬剤組成物。
【請求項２９】
ＤＮＡが細胞または生物体の増殖または生存にとって重要であるポリペプチドをコードする、細胞または生物体からのＤＮＡ配列を同定する方法において、
（ａ）適合する発現ベクター中に該細胞または生物体からのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを調製する段階であって、そのベクターが該細胞内のゲノム内に組込できるかまたはそれが該ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー中のヌクレオチド配列からのアンチセンスＲＮＡの転写を許容するものである段階、
（ｂ）低減した増殖を示す形質転換体を選択し、そして該形質転換体からのベクター内に含まれるライブラリーからのｃＤＮＡまたはゲノム配列のヌクレオチド配列を決定する段階
を含んでなる方法。
【請求項３０】
該細胞または生物体が、酵母または糸状菌である、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
該細胞または生物体が、サッカロミセス・シェルビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベまたはカンジダ・アルビカンスのいずれかである、請求項２９または３０記載の方法。
【請求項３２】
請求項１０または１１に記載のポリペプチドに結合可能な抗体。
【請求項３３】
請求項１から８のいずれかに記載の核酸分子の１０〜１２０連続ヌクレオチドからの断片を含んでなるオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
１０〜５０連続ヌクレオチドの断片を含んでなる、請求項３３記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、増殖および細胞分裂にとって重要（ｃｒｉｔｉｃａｌ）であり、そしてその遺伝子がカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）に関連する感染症の治療のための選択的な薬剤標的として使用できる、カンジダ・アルビカンスからの遺伝子またはその機能性断片の同定に関する。カンジダ・アルビカンスからの新規の核酸配列も提供し、そしてこれはカンジダ・アルビカンスの増殖にとって重要であるポリペプチドをコードする。
【０００２】
免疫無防備状態の宿主における日和見感染は、死亡および病的状態のますます一般的な原因となっている。カンジダ種は、このような日和見感染と関連して最も一般的に同定される真菌病原体であり、なかでもカンジダ・アルビカンスは最も一般的な種である。従って、このような真菌感染症は、例えば、カンジダ・アルビカンス酵母が外陰部膣炎の最も一般的な原因である正常で健康な女性に加えて、エイズ集団において問題となる。
【０００３】
このような疾患の治療のための化合物、例えばアンフォテリシンは存在するけれども、これらの薬剤は、その毒性および副作用のために、一般にその治療は限られている。従って、カンジダ・アルビカンスに対して作用が選択的な化合物に加えてカンジダ関連感染症の治療に使用できる新規の化合物に対する要望が存在する。
【０００４】
抗真菌性化合物を同定するための従来の方法は、終点として真菌または酵母の増殖の阻害に専ら依存していた。天然産物、半合成、または合成化学薬品のライブラリーを、標的病原体または関係する非病原性モデル生物体を殺すかまたは増殖を抑止するその能力に関してスクリーニングする。これらの試験は、手数がかかり、また化合物の作用機構に関しての情報を与えない。従って、このようなスクリーニングから得られた期待されるリード化合物は、予想される宿主毒性に関して試験されなければならず、また引き続いて作用を及ぼした分子標的を同定するために、詳細な作用機構試験を行わなくてはならない。
【０００５】
本発明では、その生存および増殖にとって重要であるポリペプチドをコードする、カンジダ・アルビカンスからの一連の核酸配列を同定した。これらの配列は、このようなポリペプチドの発現の阻害が可能な化合物を選択的に同定するためのアッセイ中に組み込むことができる新規の標的であり、そして、これらの考えられる用途は、カンジダ・アルビカンス感染に関連する疾患また病態を緩和することにある。
【０００６】
従って、本発明の第一の態様によると、酵母カンジダ・アルビカンスの生存および増殖にとって重要であり、そして核酸分子が、配列番号１〜９のいずれかに記載のヌクレオチドの配列のいずれかを含んでなる、ポリペプチドをコードする核酸分子が提供される。
【０００７】
本明細書に定義される分子は、カンジダ・アルビカンスの増殖および代謝にとって重要であると規定されているけれども、一部の分子では、他の原核または真核生物体内の機能的に関係がある配列がそのれぞれのデータベース内に見いだすことができないという事実のために、明らかな機能性は帰属されていない。従って、好ましくはこれらの配列は種特異的であり、この場合にはカンジダ・アルビカンス感染により媒介される疾患の治療のための選択的な標的としてこれらを使用してもよい。従って、本発明の一つの態様では、核酸分子は、好ましくは、配列番号１、４、５〜９中に同定されている配列を含んでなる。
【０００８】
本発明の別の態様では、配列は機能的に配置され、そして配列番号２または３に記載のヌクレオチドが好ましく、そして配列番号２および該核酸分子の断片または誘導体がさらに好ましい。
【０００９】
遺伝コードの文字としては認識できない本発明に従う配列中に使用される文字は、１個またはそれ以上の塩基Ａ、Ｇ、ＣまたはＴがヌクレオチド位置を占めることができる場合の核酸配列中の位置を指定する。使用できる一連の塩基を定義するために使用される代表的な文字は、下記のとおりである。
【００１０】
Ｍ：ＡまたはＣ
Ｒ：ＡまたはＧ
Ｗ：ＡまたはＴ
Ｓ：ＣまたはＧ
Ｙ：ＣまたはＴ
Ｋ：ＧまたはＴ
Ｖ：ＡまたはＣまたはＧ
Ｈ：ＡまたはＣまたはＴ
Ｄ：ＡまたはＧまたはＴ
Ｂ：ＣまたはＧまたはＴ
Ｎ：ＧまたはＡまたはＴまたはＣ
本発明の上記に同定した態様の一つの実施態様では、核酸はｍＲＮＡ分子あるいはＤＮＡおよび好ましくはｃＤＮＡ分子を含んでいてもよい。
【００１１】
また、高度にストリンジェントの条件下で、図１〜９のいずれかに記載され、核酸分子にハイブリダイズが可能な核酸分子、例えばアンチセンス分子およびその条件が当該技術分野の熟練者には一般に周知であるものも本発明により提供される。
【００１２】
本明細書内で使用するハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ポリ核酸が安定である状態を呼ぶ。ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。Ｔｍは、次式で近似できる。
【００１３】
８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］ ＋０．４１（％Ｇ＆Ｃ）−６００Ｌ／Ｌ
式中、Ｌはヌクレオチド中のハイブリッドの長さである。Ｔｍは、配列の相同性の１％の低下毎に約１〜１．５℃低下する。
【００１４】
用語「ストリンジェンシー」は、その中のプリンまたはピリミジン塩基がこれらの対応する塩基に水素結合により対合する場合に、一本鎖核酸が相補的鎖と接合するハイブリダイゼーション条件を呼ぶ。高ストリンジェンシー条件は、相同的塩基対合に有利であり、一方低ストリンジェンシー条件は、非相同塩基対合に不利である。
【００１５】
「低ストリンジェンシー」条件は、例えば温度約３７℃以下、ホルムアミド濃度約５０％以下、および中程度から低い塩（ＳＳＣ）濃度、あるいは、温度約５０℃以下、および中程度から高い塩（ＳＳＰＥ）濃度、例えば１Ｍ  ＮａＣｌを含んでなる。
【００１６】
「高ストリンジェンシー」条件は、例えば温度約４２℃以下、ホルムアミド濃度約２０％以下、および低い塩（ＳＳＣ）濃度、あるいは、温度約６５℃以下、および低い塩（ＳＳＰＥ）濃度を含んでなる。例えば高ストリンジェンシー条件は、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ内，６５℃におけるハイブリダイゼーションを含んでなる（オースベル、Ｆ．Ｍ．ら「分子生物学における最近のプロトコール」（Ａｕｓｂｅｌ， Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． Ｉ， １９８９， Ｇｒｅｅｎ Ｉｎｃ．， ＮｅｗＹｏｒｋ， ａｔ ２．１０．３） 。
【００１７】
「ＳＳＣ」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液を含んでなる。ストック２０ＸＳＳＣ溶液は、３Ｍ塩化ナトリウム、０．３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含む。
【００１８】
「ＳＳＰＥ」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄溶液を含んでなる。１Ｘ  ＳＳＰＥ溶液は、１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、９ｍＭ  ＮａＨＰＯ４および１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４を含む。
【００１９】
本発明に従って核酸分子にハイブリダイズが可能な核酸は、一般に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％または９０％およびさらに好ましくは少なくとも９５％が図１〜９のいずれかに記載の核酸配列に相同である。
【００２０】
本発明に従うＤＮＡ分子は、有利には、カンジダ・アルビカンスの増殖および生存にとって重要な適合する宿主内にこれらからコードされたポリペプチドを発現する適合する発現ベクター内に含まれていてもよい。
【００２１】
本発明に従う発現ベクターは、該ＤＮＡ断片の発現を起こすことが可能な調節配列、例えばプロモーター領域に操作可能に連結している、本発明に従う核酸を有するベクターを含む。用語「操作可能に連結」は、当該成分が、その意図する様式で機能するようにそれを許容する関係にある隣接位置を呼ぶ。このようなベクターは、本発明に従うポリペプチドの発現をもたらすために適合する宿主細胞内に形質転換されてもよい。従って、別の態様では、本発明は、ポリペプチドをコードするコーディング配列のベクターによる発現をもたらすための条件下で、上記の発現ベクターを用いて形質転換、トランスフェクションまたは感染された宿主細胞を培養し、そして発現したポリペプチドを回収することを含んでなる、本発明に従うポリペプチド調製のための方法を提供する。
【００２２】
ベクターは、例えば複製起点、場合により該ヌクレオチドの発現のためのプロモーターおよび場合によりプロモーターのレギュレーターを備えているプラスミド、ウイルスまたはファージベクターであってもよい。ベクターは、１個またはそれ以上の選択可能なマーカー、例えばアンピシリン抵抗性を含んでいてもよい。
【００２３】
発現のために必要な調節要素は、ＲＮＡポリメラーゼを結合するためのプロモーター配列およびリボソーム結合のための転写開始配列を含む。例えば、細菌発現ベクターは、プロモーター、例えばｌａｃプロモーターおよび翻訳開始のためのシャイン−ダルガルノ配列および開始コドンＡＵＧを含んでもよい。同様に、真核生物発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する異型接合型または同型接合型プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソーム脱離のための終止コドンを含んでもよい。このようなベクターは、市場で購入できるかまたは当該技術分野では周知の方法により記載の配列から構築してもよい。
【００２４】
本発明に従うポリヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ産生をもたらすためにアンチセンス方向にある上記のベクター内に挿入されてもよい。アンチセンスＲＮＡまたはその他のアンチセンス核酸を合成手段により作製してもよい。
【００２５】
本発明に従うと、定義された核酸は、同一の核酸だけでなく、特には縮重コードのために同義コドン（同じアミノ酸残基を指定する異なるコドン）をもたらす塩基内の置換を含むあらゆる重要ではない塩基変化も含む。用語「核酸配列」は、塩基変化を与えられたあらゆる一本鎖配列に相補的な配列も含む。
【００２６】
本発明は、その範囲内に、本発明に従う核酸分子により発現されたタンパク質またはポリペプチドまたはこれらの機能的な等価物、誘導体または生物的前駆体も含んでなる。
【００２７】
本発明は、また好ましくは本発明に従う核酸の少なくとも約１０個の隣接ヌクレオチド、好ましくは１０〜約１２０ヌクレオチドの核酸配列も提供する。本発明の別の態様においては、核酸配列は１０〜５０ヌクレオチドから供給される。これらの配列は、好ましくは、複製を開始するためのプローブまたはプライマーまたはその類似物として使用してもよい。このような核酸配列は、当該技術分野では周知の技術、例えば組換えまたは合成手段により作製できる。これらはまた、本発明に従う核酸の存在を検出するための診断用キットなどにも使用してもよい。これらの試験は、一般に、ハイブリダイズする条件下でプローブを試料と接触させ、そしてプローブと試料中のいずれかの核酸との間の二倍体または三倍体のいずれかの形成の存在を検出することを含んでなる。
【００２８】
本発明に従うと、これらのプローブは、固体支持体に固定されていてもよい。好ましくは、これらは、複数のプローブが同時に単一の生物試料にハイブリダイズできるようにアレイ上に存在する。プローブは、アレイ上に点状に配置することも、またはアレイ上でその場で合成することもできる。ロックハートら（Ｌｏｃｋｈａｒｔ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １４， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ １９９６ ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｂｙ ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ ｔｏ ｈｉｇｈ ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｒｒａｙｓ” ）参照。単一アレイは、１，０００，０００個以上の異なるプローブを離散した位置に含むことができる。
【００２９】
好ましくは、本発明に従う核酸配列は、このような組換えまたは合成手段、例えば、約１０〜１２０個のヌクレオチドであるプライマーの一対をクローニングしようと希望する遺伝子の領域に作製し、プライマーを細胞からのｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡと接触させ、希望する領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を行い、増幅された領域または断片を単離し、そして増幅されたＤＮＡを回収することを一般的に含むＰＣＲクローニング機構を用いて作製してもよい。一般に、このような本明細書で定義する技術は、当該技術分野では周知であり、例えばサンブルックら「モレキュラークローニング：実験室マニュアル」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， １９８９） に記載されている。
【００３０】
本発明に従う核酸またはオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識を有していてもよい。適する標識には、放射性同位元素、例えば３２Ｐまたは３９Ｓ、酵素標識またはその他のタンパク質標識例えばビオチンまたは蛍光マーカーが含まれる。このような標識は、本発明の核酸またはオリゴヌクレオチドに加えてもよく、そして公知の技術自体を用いて検出できる。
【００３１】
本発明に従うポリペプチドまたはタンパク質は、本発明に従う核酸分子によりコードされるすべての可能なアミノ酸の変種を含み、これには該分子によりコードされるポリペプチドを含み、また保存的なアミノ酸の変更を有する。本発明に従うポリペプチドは、さらに該ポリペプチドに本質的に相同である天然に産生する対立遺伝子変形を含む、このような配列の変形も含む。この意味において、本質的に相同とは、少なくとも７０％、好ましくは８０または９０％のアミノ酸が、本発明に従う核酸分子によりコードされるポリペプチドとの相同を有する配列を意味する。
【００３２】
特に有利な核酸およびヌクレオチドは、図１〜３に記載のヌクレオチドの配列および図１４〜１６に記載のポリペプチドを含んでなるものである。しかし、特に好ましい核酸は、図２および／または３に記載のヌクレオチドの配列、および図１５および１６に特定するこれらの相当するアミノ酸配列を含んでなる。
【００３３】
本発明に従う核酸配列は、カンジダ・アルビカンス関連感染症を治療するための選択的治療標的として特に有利である。例えば、図１〜９のいずれかに記載の核酸配列に結合可能なアンチセンス核酸は、相応するポリペプチドの発現を選択的に阻害するために使用してもよく、関連する病気または疾患の軽減を伴うカンジダ・アルビカンスの低減した増殖をもたらす。
【００３４】
本発明に従う核酸分子またはポリペプチドは、薬剤として、または薬剤の調製剤中でカンジダ・アルビカンス感染症に関連する疾患または病態の治療のために使用してもよい。
【００３５】
好ましくは、本発明に従う核酸分子またはポリペプチドは、薬剤組成物中で、薬剤的に許容できるこのためのキャリヤー、希釈剤または賦形剤と一緒に提供しもよい。
【００３６】
本発明は、さらにアンチセンス技術の使用による生体内での本発明に従う核酸の発現を阻害することを意図する。アンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡの三重らせん形成を通じて遺伝子発現を制御するために使用でき、これら両方の方法共にＤＮＡまたはＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明のタンパク質をコードする５’コーディング領域または成熟タンパク質配列が、長さ１０〜５０塩基対のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計するために使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子の領域に相補的であるように設計され（三重らせん−リーら（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ６：３０７３ （１９７９））；クーニーら（Ｃｏｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１：４５６ （１９８８））； およびダーヴァンら（Ｄｅｒｖａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１：１３６０ （１９９１））参照）、これにより相当するタンパク質の転写および産生を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡに生体内でハイブリダイズし、そしてｍＲＮＡ分子の相当するタンパク質への翻訳をブロックする（アンチセンス−オカノ（Ｏｋａｎｏ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．， ５６：５６０ （１９９１））；遺伝子発現のアンチセンス阻害剤としてのオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ （１９８８）））。
【００３７】
本発明のタンパク質またはポリペプチドへの抗体は、好ましくは当該技術分野では公知の技術を用いて調製してもよい。例えば、ポリクローナル抗体は、宿主動物、例えばマウスに本発明に従うポリペプチドまたはこれらのエピトープを接種し、免疫血清を回収して調製してもよい。モノクローナル抗体は、公知の技術、例えばコーラー、Ｒ．およびミルスタイン、Ｃ．（Ｋｏｈｌｅｒ， Ｒ． Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ （１９７５）２５６， ４９５−４９７）に記載のようにして調製してもよい。
【００３８】
本発明に従う抗体は、本発明に従うポリペプチドの存在に対する検出の方法に使用してもよく、この方法は、抗体を試料と反応させ、そして該抗体に結合したあらゆるタンパク質を同定することを含んでなる。本発明に従う抗体および抗体と該試料とを反応させるための手段を含んでなる該方法を実施するためのキットも提供できる。
【００３９】
本発明に従うポリペプチドと相互作用するタンパク質は、チエンら（Ｃｈｉｅｎ ｅｔ
ａｌ．， （１９９１） ）により最初に提出された２ハイブリッドベクター系を用いるタンパク質−タンパク質相互作用を試験して同定してもよい。
【００４０】
この技術は、レポーター遺伝子を活性化する転写因子の生体内での機能性再構築に基づく。さらに具体的には、本技術は、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有する転写因子により調節されるプロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含んでなるＤＮＡ構築物を有する適合する宿主細胞を作製し、断片の第一融合物をコードする第一ハイブリッドＤＮＡ配列または本発明に従うすべての核酸配列および転写因子の該ＤＮＡ結合ドメインまたは該活性化ドメインのいずれかを宿主細胞内に発現させ、試験すべき推定結合タンパク質を第一融合物内に組み込まれていない転写因子のＤＮＡ結合または活性化ドメインと一緒にコードする、少なくとも１個の第二のハイブリッドＤＮＡ配列、例えばライブラリーなどを宿主内に発現させ、宿主細胞内のあらゆるレポーター遺伝子産生物の存在を検出することにより、試験すべきタンパク質と本発明に従うタンパク質とのあらゆる結合を検出し、場合により結合タンパク質をコードする第二ハイブリッドＤＮＡ配列を単離することを含んでなる。
【００４１】
このような技術の一例では、酵母内のＧＡＬ４タンパク質を利用する。ＧＡＬ４は、酵母内のガラクトース代謝の転写活性化因子であり、そしてガラクトース代謝遺伝子の上流の活性化因子に結合する分離したドメインならびにタンパク質結合ドメインを有する。ヌクレオチドベクターを構築してもよく、その一つはＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするヌクレオチド残基を含んでなる。これらの結合ドメイン残基は、既知のタンパク質コード配列、例えば本発明に従う核酸に融合させてもよい。その他のベクターは、ＧＡＬ４のタンパク質結合ドメインをコードする残基を含んでなる。これらの残基は、試験タンパク質をコードする残基に融合される。本発明に従う核酸によりコードされるポリペプチドと試験すべきタンパク質との間のあらゆる相互作用は、その中にベクターが形質転換されているＧＡＬ４転写欠失酵母細胞内のレポーター分子の転写活性化をもたらす。好ましくは、レポーター分子、例えばβ−ガラクトシダーゼは、酵母ガラクトース代謝遺伝子の転写の回復に応じて活性化される。
【００４２】
さらに、本発明に従うポリペプチドをコードするＤＮＡ配列中で誘導された突然変異を含んでなる１種またはそれ以上のカンジダ・アルビカンス細胞も本発明により提供される。
【００４３】
本発明の別の態様では、発現を選択的に阻害または干渉する化合物、図１〜９のいずれかに記載のヌクレオチド配列から発現されるポリペプチドの機能性またはこれらのポリペプチドが関与しそしてカンジダ・アルビカンスの増殖および生存にとって重要な代謝経路同定する方法を提供し、その方法は、（ａ）試験すべき化合物と、該ポリペプチドの過剰発現または過少発現をもたらす突然変異を本発明に従う核酸分子中に有する１種またはそれ以上のカンジダ・アルビカンス細胞とを、１種またはそれ以上の野生型カンジダ・アルビカンス細胞に加えて接触させ、（ｂ）該突然変異細胞の増殖および／または活性を該野生型と比較して検出し、その際、１種またはそれ以上の該突然変異カンジダ・アルビカンス細胞の相違する増殖または活性が、該ポリペプチドまたはその他のポリペプチドに対する同一または平行な経路による該化合物の選択的作用の指標を提供するものである。
【００４４】
本発明に従う方法を用いて同定可能または同定された化合物は、好ましくは、カンジダ・アルビカンス感染に関連する疾患または病態の治療のための薬剤として、または薬剤の調製に使用してもよい。これらの化合物は、また好ましくは薬剤組成物中に薬剤的に許容できるキャリヤー、希釈剤または賦形剤と一緒に含まれてもよい。
【００４５】
本発明の別の態様では、ＤＮＡが増殖または生存にとって重要であるポリペプチドをコードする、細胞または生物体からのＤＮＡ配列を同定する方法を提供し、その方法は、（ａ）適合する発現ベクター中に該細胞または生物体からのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを調製し、そのベクターは該細胞内のゲノム内に組込みできるかまたはそれが該ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリー中のヌクレオチド配列からのアンチセンスＲＮＡの転写を許容するものであり、（ｂ）低減した増殖を示す形質転換体を選択し、そして該形質転換体からのベクター内に含まれるライブラリーからのｃＤＮＡまたはゲノム配列のヌクレオチド配列を決定することを含んでなる。好ましくは、細胞または生物体は、酵母または糸状菌、例えばサッカロミセス・シェルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ） またはカンジダ・アルビカンスのいずれかであってもよい。
【００４６】
本発明の別の態様では、本発明に従う化合物、アンチセンス分子または抗体のいずれかを薬剤的に許容できる組成物のキャリヤー、希釈剤または賦形剤と一緒に含んでなる薬剤組成物を提供する。
【００４７】
アンチセンス分子または実際に本発明に従う核酸またはポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして同定された化合物は、当該技術分野では周知の方法に従って調製してもよい薬剤組成物の形で使用してもよい。好ましい組成物は、薬剤的に受容できるビヒクルまたは希釈剤または賦形剤、例えば生理食塩水を含む。その他の非毒性塩、滅菌水または類似のものを含むその他の薬剤的に許容できるキャリアーを使用してもよい。適当な緩衝液は、その後の投与のために滅菌水を加えて再構成する前に、組成物を凍結乾燥し、そして滅菌条件下で保管するために使用してもよい。治療を必要とする組織中へ移植ができる固体または半固体状の生物学的に認容性のマトリックス中への本発明のポリペプチドの組込みを実行してもよい。
【００４８】
キャリアーは、他の薬剤的に許容できる賦形剤を、その他の条件、例えばｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、滅菌性、冷凍乾燥性、溶解度などを変更するためにも含むことができる。投与の後に徐放性または遅効性を与える薬剤的に許容できる賦形剤を含んでもよい。
【００４９】
本発明に従うポリペプチド、核酸分子または化合物は、経口投与してもよい。この態様において、これらは、当該技術分野の熟練者には周知にように、カプセル化して適当なキャリアーと組み合わせて固体状投与形としてもよい。
【００５０】
当該技術分野の熟練者には周知にように、特定の投与型は、患者の体表面積または占有される身体空間の体積に従って、使用すべき投与の特定の経路に応じて算出してもよい。しかし、実際に投与する組成物の量は、担当医師により、治療すべき疾患に関する環境、例えば症状の重症度、投与する組成物、年齢、体重、個別患者の応答および投与の選択した経路に基づいて決定される。
【００５１】
本発明は、純粋に例示である下記の実施例を本明細書に添付した図と一緒に参照して、さらに明確に理解できであろう。
【００５２】
【実施例】
実施例１
アンチ−センスおよび分断組込み（ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｏｎ） によるＣ．アルビカンス内の新規の薬剤標的の同定
本方法の原理は、特定のＣ．アルビカンスｍＲＮＡが相補アンチ−センスＲＮＡを産生することにより阻害される場合に、相応するタンパク質が減少するという事実に基づいている。このタンパク質が増殖または生存にとって重要である場合には、アンチ−センスＲＮＡを産生する細胞は、増殖がさらに遅くなるかまたは死滅する。
【００５３】
アンチ−センス阻害はｍＲＮＡレベルで起きるので、遺伝子コピー数は関連性がなく、従って二倍体生物体内でもこの戦略の適用ができる。
【００５４】
アンチ−センスＲＮＡは、誘導可能なプロモーターを用いて組込みまたはエピソームのプラスミドから内因的に産生され、プロモーターの誘導は、プラスミドの挿入物によりコードされるＲＮＡの産生に導く。この挿入物は、ライブラリー内で一つ一つのプラスミド毎に異なる。この挿入物は、可能な限りゲノム全体をカバーするようにゲノムＤＮＡ断片またはｃＤＮＡから誘導される。
【００５５】
ベクターは、カンジダゲノム内で相同挿入物またはプロモーター配列のいずれかの相同的組換えにより組込をさせる特有のベクターである。ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーからＣ．アルビカンス内にプラスミドを導入した後に、形質転換体をプロモーター（そして従ってアンチ−センス）誘導後の低減した増殖に関して酢酸リチウム中でスクリーニングする。酢酸リチウムはＧ１相を延長し、従って細胞サイクルの時間の延長された期間の間にアンチ−センスを作用させる。誘導および非誘導媒体内の両方で低減増殖を示し、従って組込み分断による増殖欠失を示す形質転換体も同様に選択される。
【００５６】
低減増殖を示す形質転換体は、増殖または生存にとって重要なｍＲＮＡに対してアンチ−センスＲＮＡを産生するプラスミドを含むと推定される。増殖は、形質転換体２００個の増殖曲線の同時測定ができる装置〔バイオスクリーン・アナライザー、ラブシステムズ（Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ Ａｎａｌｙｚｅｒ， Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）〕においてある一定の時間の期間内の増殖曲線を測定して検出される。
【００５７】
その後、プラスミドは形質転換体から回収でき、そしてその挿入物の配列を決定し、従ってこれらがどのｍＲＮＡを阻害したかが解明できる。カンジダゲノム内に組み込まれたゲノムまたはｃＤＮＡ挿入物を回収できるために、ゲノムＤＮＡを単離し、ライブラリーベクター中でただ一回（そしてゲノム中で約４０９６ｂｐ毎と推定される）切断する切断酵素を用いて切断し、再連結させる。挿入物に隣接結合したプライマーを用いるＰＣＲは、直接配列決定できるＰＣＲ断片としてゲノムまたはｃＤＮＡ挿入物を生成（部分的）する。このＰＣＲ分析（結合反応物に関する）は、何回の組込みが起こったかも我々に教える。あるいは、連結反応物で大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ．）に形質転換させ、そしてＰＣＲ分析は、コロニーについてまたはこれから誘導されたプラスミドＤＮＡについて行われる。
【００５８】
この方法は、増殖または生存にとって重要な新規のＣ．アルビカンス遺伝子に関するゲノム全般研究のために利用される。
材料および方法
ｐＧａｌ１ＰＮｉＳＴ−１の構築
ｐＧＡＬ１ＰＮｉＳＴ−１ベクター（組込みアンチセンスＳｆｉＩ−ＮｏｔＩベクター）のバックボーンはｐＧＥＭ１１Ｚｆ（＋）（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．））である。最初に、ｐＤＢＶ５０（Ｄ．Ｈ．ブラウンら（Ｄ．Ｈ． Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６） ）からのＣａＭＡＬ２  ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩプロモーター断片を、ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩで開いたｐＧＥＭ１１Ｚｆ（＋）内に連結して、中間構築物ｐＧＥＭＭＡＬ２Ｐ−１を得た。後者（ＭｓｃＩ／ＣＩＰ）内に、ＣａＵＲＡ３選択マーカーをｐＲＭ２から誘導したＥｃｏ４７ＩＩＩ／ＸｍｎＩ断片としてクローンした。ｐＰＣＫ１ＮｉＳＣＹＣＴ−１（ＥａｇＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片）からのＮｏｔＩ−Ｓｔｕｆｆｅｒ−ＳｆｉＩカセットを受容するために、得られたｐＧＥＭＭＡＬ２Ｐ−２ベクターを、ＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで開いた：ｐＭＡＬ２ＰＮｉＳＴ−１。最後に、ｐＲＭ２ＧＡＬ１Ｐから誘導されたＸｈｏＩ／ＳｍａＩ  ＧＡＬ１プロモーター断片によりｐＭＡＬ２ＰＮｉＳＴ−１中でＳａｌＩ／Ｅｃｌ１３６ＩＩ  ＭＡＬ２プロモーターを交換して、プラスミドｐＧＡＬ１ＰＮｉＳＴ−１を構築した。
ｐＧＡＬ１ＰＳｉＳＴ−１の構築
ベクターｐＧＡＬ１ＰＳｉＳＴ−１は、小型のゲノムＤＮＡ断片（ＳｆｉＩ部位により隣接される）をＧＡＬ１プロモーターの後にクローニングして創製した。ｐＧＡＬ１ＰＮｉＳＴ−１との唯一の相違は、ｐＧＡＬ１ＰＳｉＳＴ−１中のｈＩＦＮβ（さらに剛直な断片）挿入断片が、ｐＧＡＬ１ＰＮｉＳＴ−１におけるＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位の代わりに２個のＳｆｉＩが側面に位置していることである。ｐＧＡＬ１ＰＳｉＳＴ−１を構築するために、ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位が側面に位置するｈＩＦＮβを含むｐＭＡＬ２ｐＨｉＥＴ−３（未公開）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を２個のＳｆｉＩ部位が側面に位置するｈＩＦＮβを含むＹＣｐ５０Ｓ−Ｓ〔プラスミドＹＣｐ５０から誘導される大腸菌／Ｓ．シェルビシエのシャトルベクター、該ＹＣｐ５０はＡＴＣＣコレクションに寄託されており（番号３７４１９；トラシュら（Ｔｈｒａｓｈ ｅｔ ａｌ．， １９８５） ）、遺伝子ｈＩＦＮｂを含み、２個のＳｆｉＩ部位が側面に位置するＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をＹＣｐ５０内に挿入してＹＣｐ５０Ｓ−Ｓを創製した〕からのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片と交換すると、プラスミドｐＭＡＬ２ＰＳｉＳＴ−１となった。ｐＭＡＬ２ＰＳｉＳＴ−１からのＭＡＬ２プロモーター（ＮａｅＩ−ＢａｌＩ消化により）をさらにｐＧＡＬ１ＰＮｉＳＴ−１からのＧＡＬ１プロモーターにより置換して（ＸｈｏＩ−ＦＳＰＩ消化を介して）、ベクターｐＧＡＬ１ＰＳｉＳＴ−１を創製した。
カンジダ・アルビカンスのゲノムライブラリー
＊ゲノムＤＮＡ断片の調製
小型ＤＮＡ断片（４００〜１，０００ｂｐ）を有するカンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡライブラリーを調製した。カンジダ・アルビカンスＢ２６３０のゲノムＤＮＡをブリンおよびスタフォード（Ｂｌｉｎ ａｎｄ Ｓｔａｆｆｏｒｄ， １９７６） の改変プロトコールに従って単離した。単離されたゲノムＤＮＡの品質を、ゲル電気透析により検査した。非消化ＤＮＡを２６，２８２ｂｐのマーカーバンド上のゲル上に位置させた。ＤＮＡの断片化により起きた小型のスミアが存在した。希望する大きさのゲノムＤＮＡ断片の濃縮を達成するために、ゲノムＤＮＡを部分的に消化した。数種の制限酵素（ＡｌｕＩ、ＨａｅＩＩＩおよびＲｓａＩ、すべて平滑末端を創製する）を試行した。適合する消化条件は、酸素の滴定により決定した。小型ＤＮＡ断片の濃縮は、ゲノムＤＮＡ１０μｇに対して２０分間ＡｌｕＩの７０単位を用いてで得られた。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ） ）およびｄＮＴＰ（ベーリンガー）をＤＮＡ末端のポリシュ（ｐｏｌｉｓｈ）のために加えた。フェノールクロロホルムを用いる抽出の後に、消化物をアガロースゲル上でサイズ分別した。長さ５００〜１２５０ｂｐ有するゲノムＤＮＡ断片を遠心濾過によりゲルから溶離させた（チューら（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９８５））。ＳｆｉＩアダプター（５’ＧＴＴＧＧＣＣＴＴＴＴ）または（５’ＡＧＧＣＣＡＡＣ）をＤＮＡ末端（平滑）に結合させ、ベクター内への断片のクローニングを容易にした。従って、８員および１１員オリゴヌクレオチド（ＳｆｉＩ部位を含んでなる）をキナチーズ（ｋｉｎａｔｅｓｅ）およびアニールした。ＤＮＡ断片へのこれらのアダプターの連結の後、二回目のサイズ分別をアガロースゲル上で行った。４００〜１１５０ｂｐのＤＮＡ断片を遠心沈降によりゲルから溶離した。
＊ｐＧＡＬ１ＰＳｉＳＴ−１ベクター断片の調製
小型ゲノムＤＮＡ断片をベクターｐＧＡＬ１ＰＳｉＳＴ−１中のＧＡＬ１プロモーターの後にクローニングした。キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ）精製したｐＧＡＬ１ＰＳｉＳＴ−１プラスミドＤＮＡをＳｆｉＩを用いて消化し、最大のベクター断片を遠心濾過によりゲルから溶離させた（チューら（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．， １９８５））。ＳｆｉＩ部位が隣接している対照ＤＮＡ断片を用いる連結を対照として行った。連結混合物をＭＣ１０６１大腸菌細胞にエレクトロポレーションした。クローン２４個のプラスミドＤＮＡを分析した。すべての場合に、対照断片をｐＧＡＬ１ＰＳｉＳＴ−１ベクター断片中に挿入した。
【００５９】
＊アップスケーリング（Ｕｐｓｃａｌｉｎｇ）
すべてのゲノムＤＮＡ断片（４５０ｎｇ）をｐＧＡＬ１ＰＳｉＳＴ−１ベクター（２０ｎｇ）内に連結した。２５００Ｖ、４０μＦでのエレクトロポレーションの後、約４００，０００個のクローンが得られた。これらのクローンを３群にプールし、そしてグリセロールスラント（ｓｌａｎｔ） として保管した。キアジェン精製したＤＮＡもこれらのクローンから調製した。クローン分析は、平均挿入長さ６００ｂｐおよび挿入を有するクローンに対して９１％を示した。ライブラリーの大きさは、二倍体ゲノムの５倍に相当する。ゲノムＤＮＡ挿入は、ベクター内でセンスまたはアンチセンス方向にある。
カンジダ・アルビカンスｃＤＮＡライブラリー
全ＲＮＡをサンブルックら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （１９９６）） 中のチャーグヴィンら（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ ｅｔ ａｌ）の記載のようにしてそれぞれ最少（ＳＤ）およびリッチ（ＹＰＤ）培地上で増殖したカンジダ・アルビカンスＢ２６３０から抽出した。ｍＲＮＡをインヴィトロジェン・ファスト・トラック（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ） 法を用いて全ＲＮＡから調製した。
【００６０】
第一ストランドｃＤＮＡを、スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ） 逆転写酵素（ＢＲＬ）およびオリゴｄＴ−ＮｏｔＩプライマーアダプターを用いて合成する。第二ストランド合成の後に、ｃＤＮＡをクレノウ酵素を用いてポリシュし、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ） Ｓ−４００スピンカラム上で精製する。リン酸化したＳｆｉＩアダプターを次いでｃＤＮＡに連結させ、次いでＮｏｔＩ制限酵素を用いて消化する。次いでＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ  ｃＤＮＡを精製し、バイオジェル（Ｂｉｏｇｅｌ）カラムＡ１５０Ｍ上でサイズ分別する。
【００６１】
第一画分は、形質転換により約３８，７２０個のクローンを含み、第二画分は１５４０個のクローンを含むに過ぎない。クローン分析：
画分Ｉ：２２／２４挿入物、１６３１０００ｂｐ、４３２０００ｂｐ、平均サイズ：１５００ｂｐ
画分ＩＩ：９／１２挿入物、３３１０００ｂｐ、平均サイズ：９６０ｂｐ
ｃＤＮＡをＮｏｔＩ／ＳｆｉＩで開いたｐＧＡＬ１ＰＮｉＳＴ−１ベクター内に連結した（アンチセンス）。
カンジダの形質転換
形質転換に使用した宿主株は、Ｃ．アルビカンスｕｒａ３変異体、ＣＡＩ−４であり、これはオロチジン−５’−ホスフェート  デカルボキシラーゼ内に欠失を含み、ジョージタウン大学のウイリアム・フォンジ博士（Ｄｒ． Ｗｉｌｌｉａｍ Ｆｏｎｚｉ，Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （Ｆｏｎｚｉ ａｎｄ Ｉｒｗｉｎ））から入手した。ＣＡＩ−４を、上記のｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリーと、ピチア・スフェロプラスト・モジュール（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐｈｅｒｏｐｌａｓｔ ｍｏｄｕｌｅ， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ）を用いて形質転換した。得られた形質転換物を、グルコースを追加した最少培地（ＳＤ，０．６７％または１．３４％酵母窒素ベース、アミノ酸不含＋２％グルコース）平板上に細胞をプレーティングし、２〜３日間、３０℃でインキュベーションした。
突然変異体のスクリーニング
スターター３を１ｍｌＳＤ培地中のそれぞれのコロニーに接種し、３０℃、３００回転毎分でインキュベーションしてスターター培養物を作製した。細胞密度を、コールター・カウンター（Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ， Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｚ１， Ｃｏｕｌｔｅｒ ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ｌｉｍｉｔｅｄ）を用いて測定した。２５０，０００細胞／ｍｌを１ｍｌＳＤ培地中に接種し、培養物を２４時間、３０℃および３００回転毎分でインキュベーションした。培養物を、グルコースを含まない最少培地（Ｓ）内で洗浄し、ペレットを６５０μｌのＳ培地中に再懸濁した。この培養物の８μｌを、ハニウエル（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ） −１００プレート（バイオスクリーン・アナライザー、ラブシステムズ）中の４００μｌの培養物の接種のために使用した。それぞれの形質転換体を、３日間、ＬｉＡｃ；ｐＨ６．０を含むＳ培地中で、２％グルコース／２％マルトースまたは２％ガラクトース／２％マルトースとそれぞれ一緒に、３分毎に２０秒間振とうしながら増殖させた。連続した３日の間、光学密度を一時間毎に測定し、増殖曲線を作製した（バイオスクリーン・アナライザー、ラブシステムズ）。
【００６２】
それぞれアンチ−センス非誘導性（グルコース／マルトース）および誘導性（ガラクトース／マルトース）培地内で増殖した形質転換物の増殖曲線を比較し、そしてアンチ−センス誘導で阻害された増殖を示したこれらの形質転換物を以後の分析のために選択した。重要な遺伝子内への組込みが原因で阻害された増殖を示す形質転換物も選択した。
ゲノムまたはｃＤＮＡ挿入物の単離
重要性が推定される形質転換体を１．５ｍｌＳＤ中で一晩増殖させ、ニュクレオン（Ｎｕｃｌｅｏｎ） ＭＩ酵母キット（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ））を用いてゲノムＤＮＡを単離する。ゲノムＤＮＡの濃度は、アガロースゲル上で試料を分析して推定する。
【００６３】
ゲノムＤＮＡ２０ｎｇを３時間、ライブラリーベクター内だけで切断する酵素（ゲノムライブラリーに対してはＳａｃＩ、ｃＤＮＡライブラリーに対してはＰｓｔＩ）を用いて消化し、ＲＮＡｓｅを用いて処理する。試料をフェノール／クロロホルム抽出し、ＮａＯＡｃ／エタノールを用いて沈降させた。
【００６４】
得られたペレットを５００μｌ連結混合物（１ｘ連結緩衝液よびＴ４  ＤＮＡリガーゼの４単位、両方ともベーリンガーより）中に再懸濁し、そして一晩１６℃でインキュベーションした。
【００６５】
変性（１０分間、６５℃）、精製（フェノール／クロロホルム抽出）および沈降（ＮａＯＡｃ／エタノール）の後、ペレットを１０μｌミリキュー（ＭｉｌｌｉＱ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ） 水中に再懸濁した。
ＰＣＲ分析
逆ＰＣＲは、沈降連結反応物の１μｌについて、ライブラリーベクター特異性プライマー（ゲノムライブラリーに対してオリゴ２３：５’ＴＧＣ−ＡＧＣ−ＴＣＧ−ＡＣＣ−ＴＣＧ−ＡＣＴ−Ｇ  ３’およびオリゴ２５：５’ＧＣＧ−ＴＧＡ−ＡＴＧ−ＴＡＡ−ＧＣＧ−ＴＧＡ−Ｃ  ３’、ｃＤＮＡライブラリーに対して３ｐＧＡＬＮｉｓｔＰＣＲプライマー：５’ＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＧＣＣＧＴＣＧＣＧＣ  ３’および５ｐＧＡＬＮｉｓｔＰＣＲプライマー：５’ＧＡＧＴＴＡＴＡＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＣＧＡＣ  ３’、両者ともユーロジェンテック（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）より）を用い、それぞれ（ａ）１分間、９５℃、（ｂ）１分間、５７℃、および（ｃ）３分間、７２℃からなる３０サイクルで行った。反応混合物中で、Ｔａｑポリメラーゼ（ベーリンガー）２．５単位とＴａｑＳｔａｒｔ抗体（クロンテック）（１：１）を用い、そして最終濃度は、各プライマー０．２μＭ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２（パーキン・エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ））および２００μＭ  ｄＮＴＰ（パーキン・エルマー・シータス）であった。ＰＣＲは、ロボサイクラー（Ｒｏｂｏｃｙｌｅｒ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内で行った。
配列決定
得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キット（キアジェン）を用いて精製し、そしてＥｔＢｒ染色アガロースゲル上のバンド強度をＤＮＡマーカーバンド強度との比較により定量した。配列決定反応に使用するＰＣＲ産物の量（ｎｇ単位で表す）を塩基対中のＰＣＲ産物の長さを１０で割って算出した。配列決定反応は、ＡＢＩプリズム・ビッグダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・レディー反応キット（ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ） を用い、下記の変更を除いては製造者（ＰＥ アプライド  バイオシステムズ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）） の指針に従って行った。
【００６６】
全反応体積を１５μｌに減少させた。各試薬の反応体積をこれに従って変更した。ターミネーター・レディー反応混合物６．０μ１を、ターミネーター・レディー反応混合物３．０μ１＋ハーフターム（Ｈａｌｆ Ｔｅｒｍ， ＧＥＮＰＡＫ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｂｒｉｇｈｔｏｎ， ＵＫ） ３．０μ１の混合物に置き換えた。サイクル配列決定の後、反応混合物をマルチスクリーン（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ） ＨＶ不透明マイクロタイタープレート（ミリポア（Ｍｏｌｓｈｅｉｍ，フランス） ）上に調製したセファデックスＧ５０カラム上で精製し、スピードヴァック（ＳｐｅｅｄＶａｃ）中で乾燥させた。反応生成物を負荷緩衝液３μｌ中に再懸濁させた。２分間、９５℃における変性の後、試料１μｌを、供給者（ＦＭＣバイオプロダクツ（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ， Ｒｏｃｋｌａｎｄ， ＭＥ） ）の指針に従ってシンジェル・パック（Ｓｉｎｇｅｌ Ｐａｃｋ） から調製した５％ロング・レンジャー・ゲル（（Ｌｏｎｇ Ｒａｎｇｅｒ Ｇｅｌ） 、ウエルから読み取りまで（ｗｅｌｌ−ｔｏ−ｒｅａｄ）３６ｃｍ）上に適用した。試料を７時間、２回、ＡＢＩ  ３７７ＸＬ  ＤＮＡシーケンサー上を通した。データ採取バージョン２．０および配列分析バージョン３．０（ベースコーリング（ｂａｓｅｃａｌｌｉｎｇ） のため）ソフトウエアパッケージは、ＰＥアプライド・バイオシステムズからのものである。得られた配列テキストファイルは、その後の分析のためにサーバーに複写した。
配列分析
ヌクレオチド配列を、ベクターＮＴＩソフトウエア・パッケージ（インフォーマックス社（ＩｎｆｏｒＭａｘ Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｔｈ Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ， ＵＳＡ））内に取り入れ、ベクターおよび配列の挿入領域を同定した。公開および市販配列データベースに対する配列類似性サーチは、ＢＬＡＳＴソフトウエアパッケージ（アルトシュルら（Ａｌｔｓｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， １９９０））バージョン１．４を用いて行った。最初のヌクレオチド配列と挿入領域の６フレーム概念翻訳との両方共、質問配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として使用した。使用した公開データベースは、ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース（ステッサーら（Ｓｔｏｅｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８） ）、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベースおよびその補足ＴｒＥＭＢＬ（ベイロッホおよびアプワイラー（Ｂａｉｒｏｃｈ ａｎｄ Ａｐｗｅｉｌｅｒ， １９９８））およびＡＬＣＥＳカンジダ・アルビカンス配列データベース（スタンフォード大学、ミネソタ大学）であった。使用した市販配列データベースは、ライフセク（ＬｉｆｅＳｅｑ）（Ｒ）ヒトおよびパトセク（Ｐａｔｈｏｓｅｑ）（Ｒ）微生物ゲノムデータベース（インサイト製薬社（Ｉｎｃｙｔｅ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓＩｎｃ．， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， ＵＳＡ） ）、およびＧＥＮＳＥＱ特許配列データベース（ダーウェント（Ｄｅｒｗｅｎｔ， Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ） ）であった。３種の主要な結果、機能性、新規性および特異性が配列類似性に基づいて得られた。推定機能は、既知の機能を有する配列との類似性に基づいて推論し、新規性は、公開データベース中での配列の非存在または存在に基づき、そして特異性は、組織化された相同体との類似性に基づいた。
方法
適当なタンパク質データベースに対する核酸配列のＢｌａｓｔｘ：完全な配列が公開されているクローンに対するスイスＰｒｏｔ、および完全配列が公開されていないクローンに対するｐａｏｒｆｐ（パソセク（ＰａｔｈｏＳｅｑ）ＴＭ）。
【００６７】
翻訳された核酸配列が該当するタンパク質を出発点として使用する。このタンパク質と我々が翻訳した核酸配列との差を二重線で印をつけ、そしてタンパク質配列上に注記する。下記の記号を用いる。
【００６８】
一文字アミノ酸コードまたは我々が翻訳した核酸配列が一定の位置では別のアミノ酸を有する場合には多義コードＸを使用する。
【００６９】
終止コドンの印＊ は、我々が翻訳した核酸配列が一定の位置で終止コドンを有する場合に使用される。
【００７０】
文字ｆｓ（フレームシフト）は、フレームシフトが我々が翻訳した核酸配列内で起き、そして他の読み取り枠が使用される場合に使用される。
【００７１】
多義または複数の多義の用語は、我々が翻訳した核酸配列の一部分がタンパク質内に存在するが、しかしブラスト結果の配列内には認められない場合に使用される。
【００７２】
用語「消失配列」は、翻訳された核酸配列がタンパク質のその部分を含んでなっていない場合に使用される。
【００７３】
Ｂｌａｓｔｘ：ヌクレオチド質問配列（両方の鎖）の６フレーム概念翻訳結果をタンパク質配列データベースと比較する。
遺伝子ノックアウト
培養効果が、同定された遺伝子との干渉によることを証明し、そしてアンチセンス効果の特異性を支持するために、ＵＲＡ−ブラスター法（フォンジおよびアーヴィン（Ｆｏｎｚｉ ａｎｄ Ｉｒｗｉｎ， １９９３） ）を用いて同定された遺伝子（図２８〜３１）内で単一対立遺伝子ノックアウトを作製した。
Ｃ．アルビカンスの増殖および生存にとって重要なポリペプチドの発現を調節する化合物のスクリーニング
この提示する方法は、ある過程（例えば翻訳）のいかなる成分の過少発現または過剰発現も、その過程内での関連段階の阻害剤の変更された感受性をもたらしうると示唆する観察〔サンドベークンら（Ｓａｎｄｂａｋｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９０）、ヒンネブッシュおよびリーブマン（Ｈｉｎｎｅｂｕｓｃｈ ａｎｄ Ｌｉｅｂｍａｎ， １９９１）、リボジェン（Ｒｉｂｏｇｅｎ ＰＣＴ ＷＯ９５／１１９６９， １９９５）〕に基づいている。このような阻害剤は、野生型（ＷＴ）細胞と比較して、その段階で触媒作用を有する巨大分子内の欠失により制限される細胞に対して効力がより高いか、および／またはその巨大分子を過剰に含む細胞に対して効力がより低いかであろう。
【００７４】
例えば突然変異酵母株では、翻訳のある段階が、関与する巨大分子の化学量論的量に敏感であることが証明されている（サンドベークンら、１９９６）。このような株は、翻訳を特異的に混乱させる化合物に対してより敏感である（翻訳に関与する成分に作用して）が、しかしその他の作用機構を有する化合物に対しては同等の感度である。
【００７５】
従って、この方法は、試験化合物が特定の過程を混乱させるか否かを同定するための手段だけでなく、これがその作用を及ぼす部位の指摘も与える。その増殖が試験化合物により影響を受ける細胞中に改変された形または量で存在する成分は、試験化合物の作用部位である可能性がある。
【００７６】
設定すべきアッセイは、Ｒ化合物の存在下で野生型（ＷＴ）Ｃ．アルビカンス株に関して、一定の特異性の対立遺伝子内でのみ変性されている同系的株の増殖の測定を含む。株は、その中で特異的な重要タンパク質の発現が、アンチ−センスまたは重要な遺伝子内の分断を有する株の誘導により低減するものであることができる。Ｃ．アルビカンス中の新規の重要な遺伝子を発見するためのシリコ法（ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ ａｐｐｒｏａｃｈ）を行う。この方法で同定された多数の重要な遺伝子を分断し（一つの対立遺伝子中で）、得られた株は、比較増殖スクリーニングに使用できる。
薬剤について高処理量スクリーニングのアッセイ
最少培地（Ｓ培地＋２％ガラクトース＋２％マルトース）３５μｌを自動ピペットシステム（マルチドロップ、ラブシステムズ（Ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ， Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ） ）を用いて透明な平底９６ウエルプレート内に転移させる。９６チャンネルピペッター（ヒドラ、ロビンズ・サイエンティフィック（Ｈｙｄｒａ， Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ） ）が、ＤＭＳＯ中の１０−３ＭのＲ−化合物２．５μｌをストックプレートからアッセイプレートに転移させる。
【００７７】
選択したＣ．アルビカンス株（突然変異および親（ＣＡＩ−４）株）をグリセロールストック（１５％）として−７０℃で貯蔵する。これらの株を選択プレート（ＳＤ培地）上に縞状に広げ、２日間、３０℃でインキュベーションする。親株、ＣＡＩ−４、に対しては、培地に常にウリジン２０μｌ／１ｍｌを補足する。単一コロニーをすくい上げ、最少培地（Ｓ培地＋２％ガラクトース＋２％マルトース）１ｍｌ中に再懸濁する。細胞を３０℃で８時間、２５０回転毎分で振とうしながらインキュベーションする。培養物１０ｍｌを２５０，０００細胞／ｍｌで接種する。培養は３０℃で２４時間、２５０回転毎分で振とうしながらインキュベーションする。細胞をコールターカウンターで計数し、最終培養物（Ｓ培地＋２％ガラクトース＋２％マルトース）を２０，０００〜５０，０００細胞／ｍｌで接種する。培養物は、３０℃で２５０回転毎分で振とうしながら、０．２４（＋／−０．０４）６００ｎＭの最終ＰＤに達するまで増殖させる。
【００７８】
この酵母懸濁液２００μｌを、全量４５０（または２５０）μｌ中のＲ−化合物を含むＭＷ９６プレートの全ウエルに加える。ＭＷ９６プレートを３０℃で４８時間インキュベーション（静置）する。
【００７９】
光学密度を４８時間後に測定する。
【００８０】
試験増殖率は、突然変異体（ｘ）および野生型（Ｙ）株の双方に対して陽性対照増殖の百分率として表す。これらの得られた変数の比（ｘ／ｙ）を算出する。
【 ００８１】
【表１】
2004500016.tif 000002
【００８２】
【表２】
2004500016.tif 000003
【００８３】
【表３】
2004500016.tif 000004
【００８４】
【表４】
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【００８５】
【表５】
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【００８６】
【表６】
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【００８７】
【表７】
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【００８８】
【表８】
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【００８９】
１．３３２ｃ−ｃｐは、ＵＦＰ００５７タンパク質ファミリーの成員である。これは潜在的な経膜領域（６−２３ａｑ、３０−５３ａａ）を含み、そして低温または塩−ストレス誘導性でありうる。
２．３２５ｃ−ａｆは、ＩＭＰ４酵母および関連タンパク質と類似性を示し、そしてカンジダ・アルビカンス内のｒＲＮＡ処理において、ＩＭＰ４と同様の様式で関与するであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１および２】
図１および２は、カンジダ・アルビカンスから単離されたヌクレオチド配列でありそしてこれは他の生物体からのタンパク質との配列相同性に基づいて同定された機能を有し、そしてこの配列は公開されていない。
【図３】
図３は、カンジダ・アルビカンスから単離されたヌクレオチド配列でありそしてこれは他の生物体からのタンパク質との配列相同性に基づいて同定された機能を有し、そしてこの配列は部分的に公開されている。
【図４】
図４は、カンジダ・アルビカンスから単離されたこれまで未知の機能のヌクレオチド配列であり、そしてこれは部分的に公開されている。
【図５〜９】
図５〜９は、カンジダ・アルビカンスから単離されたこれまで未知の機能のヌクレオチド配列である。
【図１０】
図１０は、プラスミドｐＧＡＬ１ＰＮｉＳＴ−１の図式表示である。
【図１１】
図１１は、図１０のプラスミドｐＧＡＬ１ＰＮｉＳＴ−１のヌクレオチド配列である。
【図１２】
図１２は、プラスミドｐＧＡＬ１ＰＳｉＳＴ−１の図式表示である。
【図１３】
図１３は、図１２のプラスミドｐＧＡＬ１ＰＳｉＳＴ−１のヌクレオチド配列である。
【図１４〜２０】
図１４〜２０は、表１を参考とする図１〜９中に記載の適当に相当するＤＮＡ配列のアミノ酸配列である。
【図２１〜２７】
図２１〜２７は、培養の際にアンチセンス誘導低下を示すカンジダ・アルビカンスの増殖曲線である。
【図２８〜３１】
図２８〜３１は、同定された関連遺伝子内のノックアウトを含むカンジダ・アルビカンスの増殖曲線である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２８Ｅ】
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【図２８Ｆ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３１Ｅ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500016.tif 000179
2004500016.tif 000180
2004500016.tif 000181
2004500016.tif 000182
2004500016.tif 000183
2004500016.tif 000184
【国際調査報告】
2004500016.tif 000185