(57)【要約】【課題】アルカリpH域においてカルシウム塩を添加することによりスキムミルクまたはカゼイン塩からカゼイン分画を選択的に沈殿させるための方法。【解決手段】カゼインを分画して、αS−カゼインとβ−カゼインの分画を生成する、またκ−カゼイン高濃縮生成物を調整する。κ−カゼインをさらに加工してカゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）を生成することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）ミルクのｐＨを挙げるステップと、
ii）塩化カルシウムを加えて前記分画を沈殿するステップと、
iii）ｐＨを引き下げるステップと、
iv）分画を分離するステップとを含むミルクから精製タンパク質分画を得る方法。
【請求項２】
分画がαｓ‐、β‐およびκ‐カゼインである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
分画を遠心分離により分離する、請求項１から２に記載の方法。
【請求項４】
分画を濾過により分離する、請求項１から２に記載の方法。
【請求項５】
ミルクがスキムミルクである、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
遠心分離が低速度で行われる、請求項３記載の方法。
【請求項７】
遠心分離または濾過で得た上清を酸性ｐＨにて沈殿させ、κ−カゼインが高濃縮された分画を得るステップを更に含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ｐＨが３．８である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
αｓ‐およびβ‐カゼイン成分を水に再溶解するステップと、酸性ｐＨおよび低温で選択的等電点沈殿を繰り返し行うステップと、αｓ‐カゼインを主に含む分画を得るステップと、を更に含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
水のｐＨが７．０および温度が２０℃である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
水に再溶解した後にαｓ‐とβ‐カゼインの溶液を冷却し、酸性ｐＨに調整する、請求項９から１０に記載の方法。
【請求項１２】
αｓ‐とβ‐カゼインの溶液を２℃に冷却し、ｐＨ４．５に調整する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
再溶解および再沈殿の操作を繰り返して、αｓ‐カゼインを主に含む分画とβ‐カゼインを主に含む分画を得る、請求項９から１２に記載の方法。
【請求項１４】
選択的等電点沈殿で得た上清を温めてから酸沈殿し、β−カゼインを主に含む分画を回収する、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
上清を３５℃に温める、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ミルクのｐＨを、アルカリ溶液添加により引き上げ、酸溶液添加により引き下げる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ミルクのｐＨをｐＨ１１に引き上げる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
ミルクのｐＨを水酸化ナトリウム添加により引き上げる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
アルカリ溶液添加時のミルクの温度が３０℃である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ミルクのｐＨを引き上げるステップの後で、溶液を最長５分まで放置する、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
溶液の塩化カルシウムの最終濃度が０．０５９Ｍである、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ｐＨを１またはそれ以上の鉱酸を加えて引き下げる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
κ‐カゼイン高濃縮分画のｐＨを引き上げてから限外濾過を行い、ミルク中のカゼイン、乳清タンパク質およびカゼインマクロペプチドから低分子物質を分離するステップを更に含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ｐＨを中性値まで引き上げる、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
限外濾過を２５ｋＤより小さく、１２ｋＤより大きい孔径を持つ膜を用いて実施する、請求項２３から２４に記載の方法。
【請求項２６】
κ‐カゼイン高濃縮分画のｐＨを引き下げてから限外濾過を行い、カゼインマクロペプチドから乳清タンパク質を分離するステップを更に含む、前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ｐＨをｐＨ４からｐＨ５の間まで引き下げる、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
限外濾過を７ｋＤより大きく、２０ｋＤ未満の孔径を持つ膜を用いて実施する、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１から２８のいずれかに記載の方法により得ることができる精製タンパク質分画。
【請求項３０】
請求項１から２８のいずれかに記載の方法により得た精製タンパク質分画。
【請求項３１】
請求項２９または３０のいずれかに記載され、αｓ‐カゼインである精製タンパク質分画。
【請求項３２】
請求項２９または３０のいずれかに記載され、β‐カゼインである精製タンパク質分画。
【請求項３３】
請求項２９または３０のいずれかに記載され、κ‐カゼインが高濃縮されている精製タンパク質分画。
【請求項３４】
β‐ラクトグロブリンならびに少量のαｓ‐およびβ‐カゼインも含む、請求項３３記載の精製タンパク質分画。
【請求項３５】
κ‐カゼインの含有量が約６０％であり、β‐ラクトグロブリンの含有量が約２０％である、請求項３３から３４に記載の精製タンパク質分画。
【請求項３６】
ｉ）カゼインナトリウム溶液のｐＨを引き上げるステップと、
ｉｉ）  塩化ナトリウムを加えて分画を選択的に沈殿するステップと、
ｉｉｉ）ｐＨを引き下げるステップと、
ｉｖ）分画を分離するステップと、を含む、カゼインナトリウム溶液から精製タンパク質分画を得る方法。
【請求項３７】
分画がα−、β−およびκ−カゼインである、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
遠心分離により分画を分離する、請求項３６から３７に記載の方法。
【請求項３９】
濾過により分画を分離する、請求項３６から３７に記載の方法。
【請求項４０】
遠心分離を低速度で行う、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
遠心分離または濾過により得た上清を酸性ｐＨで沈殿し、κ‐カゼイン高濃縮分画を得るステップをさらに含む、請求個３６から４０に記載の方法。
【請求項４２】
ｐＨが３．８である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
κ−カゼイン濃縮分画をエタノールから選択的に沈殿し、そのκ−カゼインをさらに濃縮する、請求項３６から４２に記載の方法。
【請求項４４】
κ−カゼイン高濃縮分画をｐＨ７で水中に再溶解した後、ｐＨ４．６で再沈殿し、次に少量の２ＮａＣｌの５０％エタノール溶液を加えてｐＨ７、２５℃で５０％エタノールより選択的に沈殿する、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
αｓ‐およびβ‐カゼイン成分を水に再溶解するステップと、酸性ｐＨ、低温で選択的等電点沈殿を繰り返し行って、主にαｓ‐カゼインを含む分画を得るステップとを更に含む、請求項３６から４４に記載の方法。
【請求項４６】
水のｐＨおよび温度がｐＨ７．０と２０℃である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
αｓ‐およびβ‐カゼインの溶液を２℃まで冷却し、酸性ｐＨに調整する、請求項４５から４６に記載の方法。
【請求項４８】
αｓ‐およびβ‐カゼインの溶液を２℃まで冷却し、ｐＨ４．５に調整する、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
選択的等電点沈殿で得た上清を温め、酸沈殿処理によりβ‐カゼインを主に含む分画を回収する、請求項４５から４８に記載の方法。
【請求項５０】
再溶解と再沈殿のステップを繰り返し、αｓ‐カゼインを主に含む分画とβ‐カゼインを主に含む分画を得る、請求項４５から４９に記載の方法。
【請求項５１】
カゼインナトリウム溶液のｐＨをアルカリ溶液の添加により引き上げ、酸溶液の添加により引き下げる、請求項３６から５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
カゼインナトリウム溶液を水酸化ナトリウムの添加によりｐＨ１１まで引き上げる、請求項３６から５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
アルカリ溶液添加時のカゼインナトリウム溶液の温度が３０℃である、請求項３６から５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
カゼインナトリウム溶液のｐＨを引き上げるステップの後で溶液を最長５分まで静置する、請求項３６から５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
アルカリ性カゼインナトリウム溶液中の塩化カルシウムの最終濃度が０．０７１Ｍである、請求項３６から５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
ｐＨを１またはそれ以上の鉱酸の添加によりｐＨ７．０まで引き下げる、請求項３６から５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
κ−カゼイン高濃縮分画のｐＨを引き上げてから限界濾過を行いカゼインナトリウム溶液中のカゼイン、乳清タンパク質およびカゼインマクロペプチドから低分子量物質を分離するステップも含む、請求項３６から５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
ｐＨを中性値まで引き上げる、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
限外濾過を２５ｋＤ未満であって１２ｋＤより大きい孔径の膜を用いて行う、請求項５７から５８に記載の方法。
【請求項６０】
κ‐カゼイン高濃縮分画のｐＨを下げて、限外濾過を行いカゼインマクロペプチドから乳清タンパク質を分離するステップも含む、請求項３６から５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
ｐＨをｐＨ４からｐＨ５の間に引き下げる、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
限外濾過を７ｋＤより大きく、２０ｋＤより小さい孔径の膜を用いて行う、請求項６０から６１に記載の方法。
【請求項６３】
請求項３６から６２に記載の方法により得ることができる精製タンパク質分画。
【請求項６４】
請求項３６から６２に記載の方法により得た精製タンパク質分画。
【請求項６５】
請求項６３または６４のいずれかに記載された、αｓ‐カゼインである精製タンパク質分画。
【請求項６６】
請求項６３または６４のいずれかに記載された、β‐カゼインである精製タンパク質分画。
【請求項６７】
請求項６３または６４のいずれかに記載された、少量のαｓ‐およびβ‐カゼインを含むκ‐カゼイン高濃縮分画である精製タンパク質分画。
【請求項６８】
請求項１から２８に記載の方法で得る事のできる、フェニールケトン尿症患者の栄養に好適であるカゼインマクロペプチド調整物。
【請求項６９】
請求項１から２８に記載の方法で得られた、フェニールケトン尿症患者の栄養に好適であるカゼインマクロペプチド調整物。
【請求項７０】
請求項３６から６２に記載の方法で得ることができる、フェニールケトン尿症患者の栄養に好適であるカゼインマクロペプチド調製物。
【請求項７１】
請求項３６から６２に記載の方法で得た、フェニールケトン尿症患者の栄養に好適なカゼインマクロペプチド調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアルカリｐＨ域でカルシウム塩を添加することにより、スキムミルクまたはカゼイン塩よりカゼイン分画を選択的に沈殿させるための新規方法に関する。
【０００２】
具体的には、本発明はαｓ−カゼインおよびβ−カゼインの精製分画の調製方法、および初のκ−カゼイン高濃縮分画の調製方法に関する。この生成物は食品への使用または新規食品材料の調製に好適であり、この方法は工業規模で使用できる。
【背景技術】
【０００３】
精製カゼイン分画には独特の性質があり、乳化剤や気泡の安定化、フェニールケトン尿症（ＰＫＵ）などの代謝性疾患患者への使用に好適な特殊調製粉乳および調剤、ならびに食用コーティングや生分解性プラスチックの製造を含む、広い利用範囲を有する。
【０００４】
また分画は、新しい味のチーズ、栄養補助食品および広範な生理活性ペプチドを製造する、タンパク質限定加水分解を含む各種処理の出発原料として特に好適である。生成物としてはリンペプチドおよび抗菌薬、降圧剤、免疫調節、抗血栓剤およびオピオイドなどの各機能を有するその他生理活性ペプチドが挙げられる。
【０００５】
乳製品はヒトの食物の重要な一部であり、１９９８年の世界全体の牛乳生産量は約５７００万トンである。ミルク自体は比較的複雑な混合物で、その主要成分は脂肪、ミネラル、糖（乳糖）およびタンパク質である。ミルク内のタンパク質は約３５ｇ／Ｌの濃度で含まれており、便宜的に２つの主要部類、すなわちチーズ製造の過程に於いて凝乳内に保持されるカゼインと残留液体の中に存在する乳精タンパク質とに分けることができる。
【０００６】
カゼインはミルクに含まれるタンパク質の８０％を占め、多量のカルシウムおよびリン酸塩と共にミクロン以下の大きさのコロイド状粒子となるが、これはカゼインミセルと呼ばれている。ミルクの外見が、独特の白色なのは、カゼインミセルが光を散乱させるためである。ミルクの安定性にはカゼインミセルの完全性が極めて重要であり、ミルクから作られる製品の性質は、ある程度ミセルの特性に左右される。例えばチーズの硬さは、原料となるミルクのミセルの平均直径と直接相関関係にあることが知られている。１９９８年の世界全体のチーズ生産量は約１５００万トンと推定されている。乳タンパク質は液体乳としてだけではなく、様々な程度の加工製品の成分としてますます消費されるようになっている。加工の度合は酸性化によりミセルを誘導し凝集させるヨーグルトやコテージチーズ製造から、乳タンパク質分画をソースやスプレッドの中に取り込ませるものまで様々である。
【０００７】
ミルクをｐＨ４．６まで酸性化すると、リン酸カルシウムがカゼインミセルから溶け出してミセル構造が破壊され、カゼインの凝集および沈殿が起こる。この方法はカゼインナトリウムの製造に用いられるが、カゼインナトリウムは水酸化ナトリウムを添加してｐＨを約７．０にし、水溶液に沈殿した酸カゼインを再懸濁してから乾燥することで調製される。
【０００８】
複数種の特性を持った、カゼインカルシウムまたはカゼイン酸アンモニウムなどの他のカゼイン塩は、適切なカルシウムまたは水酸化アンモニウムを使用してカゼインをｐＨ７．０に調製することで得られる。カゼインおよびカゼイン塩の世界全体の年間生産量はおおよそ２５万トンである。カゼイン塩はそれらの優れた発泡、乳化および水結合特性を利用して各種加工食品の製造に用いられている。
【０００９】
牛乳のカゼインは４種類の異なるタンパク質、即ちκ−、β−、αｓ１−およびαｓ２−カゼインから成る。全カゼインの構成は、平均的にはκ−、１１．０％；β−、３５．０％；αS１−、３６．０％およびαｓ２−、１０．０％であり、残りは主要カゼインの分解産物である。各種カゼインは極めて類似した分子量と等電点を有しており、Ｃａ２＋および無機リン酸に対し強い親和力があるが、それらの持つアミノ酸配列と特性は全く異なっている。
【００１０】
生合成後、全てのカゼインは特徴的なトリペプチド配列の−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｘ−Ａ内のセリンアミノ酸残基および時としてスレオニンアミノ酸残基位置でリン酸化されるが、この場合のＸは任意のアミノ酸残基を表し、ＡはＡｓｐ、Ｇｌｕ、ＳｅｒＰまたはＴｈｒＰなどの酸性アミノ酸残基を表している。これらリン酸塩の中心は重要であり、それらはリン酸カルシウムとの結合およびカゼインミセル構造の維持に関与している。このように、栄養素に重要なタンパク質とリン酸タンパク質は、ミルク内で安定した高濃度で維持される。αｓ１−およびαｓ２−カゼインは、その構造内に最も多くのリン酸セリン基を有しており、アルカリｐＨ域に於ける正味負電荷が最も高く、Ｃａ２＋に対し最も強い親和性を有している。β-カゼインはこれらの点では中間的であり、一方κ−カゼインはセリンリン酸基を１個しか持たず、負電荷が最も低く、そしてＣａ２＋に対する親和性は最も弱い。
グループとしてのカゼインは極めて疎水性が強く、ミセル構造が破壊された場合には水溶液中で凝集する傾向が強く、最も疎水性が強いのはβ−カゼインで、αｓ１−およびαｓ２−カゼインは中間であり、そしてκ−カゼインの疎水性が最も弱い。κ−カゼインはまたミルク中に於いて１つに繋がったジスルフィド結合ポリマーになるという点でも他のカゼインと異なり、さらに炭水化物側鎖も含んでいる。
【００１１】
カゼインは開放構造を有しているためタンパク質分解を受けやすいが、様々なタンパク質分解酵素に対し異なる感受性を示す。例えばβ−およびαS２−カゼインは他のカゼインに比べ、ミルク中に存在するプラスミンの作用を受けやすい。κ−カゼインはまたキモシンの特異的タンパク質分解も受けやすいが、これがチーズ製造中に生じるレンネット処理の基礎となっている。ミセル表面から突出し、通常ミセルの安定性を維持しているκ−カゼインの親水性部分を分離すると、残ったカゼインが凝集して凝乳を形成することができる。乳精中に分断されたκ−カゼインの断片−カゼイノマクロペプチド（ＣＭＰ）−は独特の特徴を有しており、芳香族アミノ酸を含まないことから遺伝性代謝障害であるフェニールケトン尿症（ＰＫＵ）患者向けの食用タンパク質として有用である。
【００１２】
特にκ−カゼイン分画は、酵素であるキモシンにより特異な方法で明確に画定される２つの部分、即ちパラκ−カゼインとＣＭＰに分解される点で例外的なカゼイン種である。ＣＭＰには有益な薬理学的特性があると報告されている。具体的には、ＣＭＰは芳香族アミノ酸を含まず、とりわけフェニルアラニンを含まない。このことは、ＣＭＰがＰＫＵ患者向け必須タンパク質の発生源であることから、特に重要である。ＰＫＵは、患者が芳香族アミノ酸であるフェニルアラニンを代謝できない病気である。この病気は、フェニルアラニンを摂取すると、そのフェニルアラニンが血流や脳組織内に蓄積して最終的に重症の精神障害を起こすことがある。この病気は重篤であり、英国では全ての新生児に対して、生後間もなくこの病気を発見することで、食生活を変更しフェニルアラニンを排除する処置のためのスクリーニングが日常的に行なわれている。しかし、このアミノ酸を全く含まないことが確認されている天然タンパク質は殆ど無い。その結果、ＰＫＵ患者の栄養所要量は特殊な酵素処理によりフェニルアラニンを除去したアミノ酸混合物によってまかなわれている。これら混合物は栄養素としては相対的に有効であるが、製造コストが高く、味も悪い。
【００１３】
しかしＣＭＰをここに記載するκ−カゼイン分画よって製造すれば、フェニルアラニンを摂取する付随的危険性の無い、実用的な必須アミノ酸の代替供給源となる必須アミノ酸代替供給源となる。
【００１４】
カゼイン製造の従来技術
４種類のカゼイン、即ちκ−、β−、αS１−およびαS２−カゼインは、ミルクの中でリン酸カルシウムの微粒子と密に結合してミセルを形成している。カゼインを分画するには、酸性化、レネット処理、冷却またはキレート剤の添加の組み合わせによって、少なくともこのミセル構造の一部を破壊しなければならない。カゼインは元来疎水性が強いため、ミセルから一度分離したら、カオトロピック剤を添加するか冷却して再凝集を防ぐ必要がある。その結果、各種カゼインをそれぞれの正味負電荷、Ｃａに対する親和性、または疎水性の差に基づいて分離することができる。
これら４種類の主要カゼインを分離するために、ラボスケールで最も広く用いられている技術が、陰イオン交換クロマトグラフィである。各種カゼインの分離は、主にアルカリｐＨ域に於けるタンパク質の正味負電荷と正の電荷を持つカラム媒体に対する親和性に依存する。分離する全ての場合において、高濃度（＞３．３Ｍ）の尿素などのカオトロピック媒体中においてカゼインが分離していること、および２−メルカプトエターノールのような還元剤を介在させて、一連のκ−カゼインポリマー中のジスルフィド結合を還元することが求められる（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦＤＡＩＲＹ  ＳＣＩＥＮＣＥ、４９巻、１９６６年、７９２〜７９５頁。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｍ．Ｐ．「２−メルカプトエタノール存在下でのカゼインのＤＥＡＥ−セルロース−尿素クロマトグラフィ（ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｕｒｅａ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｃａｓｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）」。カラム媒体の分離および流れ特性は長年に亘り改良されてきたが、この技術を高めることは容易ではない。
【００１５】
更に、分画を徹底的に透析した場合でも有害物質が一部残留するため、このカゼイン分画の食物への使用は好適ではない。
【００１６】
ラボスケールでの全カゼインからの主要カゼインの分離は、酸性ｐＨ域に於けるカゼインの正味陽電荷と負電荷のカラム媒体へのそれらの結合に基づく陽イオン交換クロマトグラフィを使用しても達成できる（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＤＡＩＲＹ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ、３６巻、１９６９年、２５９〜２６８頁Ａｎｎａｎ、Ｗ．Ｄ．とＭａｎｓｏｎ、Ｗ。「牛乳のαＳ−カゼイン複合体の分画化（Ａ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  αｓ−ｃａｓｅｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ｃｏｗｓ’ｍｉｌｉｋ）」；ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＤＡＩＲＹ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ５９巻、１９９２年、５５７〜５６１頁。Ｂｅａｖｅｒ、Ｊ．とＬａｗ、ＡＪＲ。「陽イオン交換樹脂によるウシカゼインの分取スケール精製（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ−ｓｃａｌｅ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｃａｓｅｉｎｓ  ｏｎ  ａ  ｃａｔｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｒｅｓｉｎ）」。
【００１７】
陽イオン交換クロマトグラフィの改良は容易ではなく、高濃度（＞３．３Ｍ）の尿素のような解離剤の存在および２−メルカプトエタノールのような物質での前処理を必要とする。従ってこのカゼイン分画は人間への使用に適していない。
【００１８】
カゼインの部分分画に使用されることがある他の実験室方式は、全カゼインにカオトロピック剤として高濃度尿素を添加し各種カゼインを分離させる方法を包む。続いて尿素中の溶解度の違いに基づいてαｓ−、β−およびκ−カゼイン成分の粗分離が得られる（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＤＡＩＲＹ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ４６巻、１９６３年、１１８３〜１１８８頁。Ｚｉｔｔｌｅ、ＣＡ．とＣｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｈ。「αｓ−カゼインおよびκ−カゼインの精製と特性（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｏｍｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  αｓ−ｃａｓｅｉｎ  ａｎｄ  κ−ｃａｓｅｉｎ）」。
【００１９】
カゼインの分離に極めて高濃度の尿素（６．６Ｍ）が必要なことから、これらの分離を経済的に大規模に行うことは現実的でなく、またその生成物は食品材料として適切ではない。
【００２０】
主要カゼインの粗分画化はまた、各種塩存在下でのそれらのエタノール溶解性によって得ることもできる（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＤＡＩＲＹ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ３５巻、１９５２年、２７２〜２８１頁。Ｈｉｐｐ、Ｎ．Ｊ．、Ｇｒｏｖｅｓ、Ｍ．Ｌ．、Ｃｕｓｔｅｒ、Ｊ．Ｍ．およびＭｃＭｅｅｋｉｎ、Ｔ．Ｌ。「α−、β−およびγ−カゼインの分離（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  α−、β−ａｎｄ  γ−ｃａｓｅｉｎ）」。
【００２１】
αＳ−およびβ−カゼインを含む混合物からκ−カゼインの精製分画を得るために、この方法の改良法が用いられてきた。（ＢＩＯＣＨＩＭＩＣＡ  ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡ  ＡＣＴＡ  ４７巻、１９６１年、２４０〜２４２頁。ＭｃＫｅｎｚｉｅ、Ｈ．Ａ．とＷａｋｅ、Ｒ．Ｇ。「κ−カゼイン分離に関する改良法（Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  κ−ｃａｓｅｉｎ）」、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ９巻、１９７０年、２８０７〜２８１３頁。Ｔａｌｂｏｔ、ＢとＷａｕｇｈ、Ｄ．Ｆ。「モノマー型および共有結合ポリマー型κ−カゼインのミセル形成特性（Ｍｉｃｅｌｌｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  κ−ｃａｓｅｉｎｓ）」。これらの方法は高濃度のエタノールを必要とし、使用する塩の大部分は有毒である。
【００２２】
β−カゼインは他の主要カゼインに比べより疎水性が強く、疎水的相互作用が弱い場合には、その等電点においてでも低温で解離する傾向がある。
【００２３】
従ってβ−カゼインはｐＨ４．５および２℃で他のカゼインを等電点沈殿させ、そして２０℃に温めることで上清からβ−カゼインを沈殿させることにより、カゼインナトリウム液から調製できる（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＡＭＥＲＩＣＡＮ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＳＯＣＩＥＴＹ  ６７巻、１９４４年、１７２５〜１７３１頁。Ｗａｒｎｅｒ、ＲＣ。
【００２４】
「α−およびβ−カゼインの分離（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  α−  ａｎｄ  β−ｃａｓｓｅｉｎ）」。
ミルクを冷却すると、特に酸性ｐＨ域で冷却すると、一部のカゼイン、特にβ−カゼインがミセルから分離する。そうすることでβ−カゼインに富む液相を他のβ−カゼイン−固相から分離することができる。このレンネットカゼイン（チーズ製造の第１段階で得られる固体）から出発するβ−カゼインの低温誘導可溶化は、すでに公表されている（特許番号ＷＯ９４０６３０６、「β−カゼイン強化製品の製造方法（Ａ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｂｅｔａ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」。Ｒａｍ、Ｓ．、Ｌｏｈ、ＤＷ．、Ｌｏｖｅ、ＤＣ．とＤｕｄｌｅｙ、ＥＰ。；特許番号ＵＳ５３９７５７７「ベータカゼインを得る方法’Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｏｂｔａｉｎｉｎｇ  ｂｅｔａ  ｃａｓｅｉｎ）」  Ｌｅ  Ｍａｇｎｅｎ、Ｃ．とＭａｕｇａｓ  Ｊ−Ｊ。）。
【００２５】
特許ＷＯ９４０６３０６は、ｐＨ４から５に酸性化し、−２から１０℃に冷却することでレンネットカゼイン懸濁液または溶液からβ−カゼインを抽出する方法を記載している。２種類の相が形成されるが、そのうち液相はβ−カゼインを含んでおり、固相はその他のαＳ１−およびκ−カゼインの混合体であり、β−カゼインは実質的に含んでいない。
【００２６】
特許ＷＯ９４０６３０６はカゼイン供給原料のスラリーをｐＨ３．５〜８．０の間で適切な時間低温で保ち、このスラリーをβ−カゼインの含有量が少ない固相とβ−カゼインに富む液相の２相に分離することでβ−カゼインの部分抽出を行う方法を記載している。
【００２７】
特許ＦＲ２５９２７６９（「ベータカゼインに富む物質の製造方法、この方法を実行するための装置、およびこの方法で得た生成物の食品および医薬品産業での食品材料、補助食品または添加物としての応用（Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａ  ｍａｔｅｒｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｉｎ  ｂｅｔａ−ｃａｓｅｉｎ，  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ  ｔｈｉｓ  ｐｒｏｃｅｓｓ，  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｂｙ  ｔｈｉｓ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ａｓ  ｆｏｏｄｓｔｕｆｆｓ，  ｆｏｏｄ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ  ｏｒ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｏｏｄ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ)  」Ｔｅｒｒｅ、Ｅ．、Ｍａｕｂｏｉｓ、Ｊ−Ｌ．、Ｂｒｕｌｅ、Ｇ．とＡｌｉｃｅ、Ｐ。）はミルクをカルシウム錯化剤で処理するか、またはカゼイン全てを重合させる作用物質でカゼイン塩溶液を処理してから０℃から−７℃に冷却し、そして材料を接線流のもとで無機膜でマイクロフィルトレーションすることによってβカゼインの濃縮分画と、これに対応する低含有分画を製造する方法を記載している。マイクロフィルトレーション物質ではβ−カゼインが濃縮され、保持液含有量は激減している。
【００２８】
低温でのマイクロフィルトレーションは非常に遅いため、この方法を工業利用する魅力は少ない。
【００２９】
カゼインの部分的分離は中性ｐＨ域にて塩化カルシウムをミルクまたはカゼイン塩に添加することにより、ラボスケールでは得ることができる（ＪＯＵＲＮＡＬＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＳＯＣＩＥＴＹ  ７８巻、１９５６年、４５７６〜４５８２頁。Ｗａｕｇｈ、ＤＦとｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ、ＰＨ。「κ−カゼインおよびカゼインミセルの安定化（κ−Ｃａｓｅｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｅｉｎ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ）；ＢＩＯＣＨＩＭＩＣＡ  ＢＩＯＰＨＹＳＩＣＡ  ＡＣＴＡ  ４７巻、１９６１年、２４０〜２４２頁。ＭｃＫｅｎｚｉｅ、ＨＡとＷａｋｅ、ＲＧ。「κ−カゼイン分離の改良法（Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  κ−ｃａｓｅｉｎ）」。いずれの方法もαＳ−およびβ−カゼインの沈殿とκ−、αＳ−およびβ−カゼインの混合体を含む上清を生じる。これらの方法には、上清から微小沈殿物を分離するために高速遠心分離が、そしてκ−カゼイン濃縮分画から過剰の塩化カルシウムを取り除くために透析が必要であるという欠点があり、そのため容易に改良することができない。高濃度の塩化カルシウムを使用すると、κ−カゼイン濃縮分画の回収が困難になるが、これはカゼインが通常の等電点沈殿をしないからである。また、過剰のカルシウムを除くために有毒であるシュウ酸カリウムを添加すると、食品材料として分画を使用する妨げとなる。
【００３０】
従って、選択的カルシウム沈殿を含む従来のカゼイン分画法は中性ｐＨ域で実施されてきた（ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＳＯＣＩＥＴＹ  ７８巻、１９５６年、４５７６〜４５８２頁。Ｗａｕｇｈ、ＤＦとｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ、ＰＨ．「κ−カゼインおよびカゼインミセルの安定化（κ−Ｃａｓｅｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｅｉｎ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ）；ＢＩＯＣＨＩＭ．
【００３１】
ＢＩＯＰＨＹＳ．ＡＣＴＡ  ４７巻、１９６１年、２４０〜２４２頁。ＭｃＫｅｎｚｉｅ、ＨＡとＷａｋｅ、ＲＧ。「κ−カゼイン分離の改良法（Ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  κ−ｃａｓｅｉｎ）」。これらの方法は、ミルクまたはカゼイン塩にそれぞれ７．０近くで塩化カルシウムを加えてκ−カゼインを得る部分的分離法を記載している。いずれの方法も本アルカリ沈殿法（０．０５９〜０．０７１Ｍ）に比べ高濃度（０．２５〜０．３６Ｍ）の塩化カルシウムを必要とし、そしてαｓ−およびβ−カゼインが容易に沈殿しないために高速遠心分離が必要であった。
【００３２】
また上清に高濃度の塩化カルシウムが含まれるため、次のκ−カゼイン分画の酸沈殿を妨害し、そのためタンパク質の回収前にカルシウムをキレート化するためにシュウ酸を添加し透析する必要があった。従って、この方法を改良することは不可能であり、その生成物はヒトが摂取するのには不適であった。
【００３３】
各カゼイン成分は疎水性が強いため、各タンパク質には食品および医薬品産業が関心を示すような固有の機能特性があるものの、大規模にカゼインを分画することは困難である（ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ＴＨＥ  ２５ｔｈ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＤＡＩＲＹＣＯＮＧＲＥＳＳ、１９９８年、７４〜８６頁。Ｍｏｕｂｏｉｓ、Ｊ．−Ｌ．「ミルクタンパク質の分画（Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」。そのため現在では、カゼインは個別の成分別ではなくむしろ４種類のタンパク質の混合物として用いられることが多い。このタンパク質混合体を簡単で安価に分画できる方法があれば、現在高価であるためにラボスケール以外での使用が妨げられている成分を食品および医薬品製造者が利用可能になるので、有益である。本発明の目的は、精製された各カゼイン分画が食品もしくは新規食品に、または機能性食品、リンペプチドおよびその他生理活性ペプチドの調製に使用するのに好適な形に工業規模で製造できる方法を提供することである。
【００３４】
本発明はミルクまたはカゼイン塩にアルカリｐＨ域にて塩化カルシウムを添加することにより、カゼインを分画することを含む。アルカリｐＨ域にて選択的沈殿を行うことの利点は、カルシウム感受性の強いαｓ−およびβ−カゼインがより容易に沈殿し、高速遠心分離を経ずに得ることができることである。また、アルカリｐＨ域で必要とされるカルシウム塩の濃度がより低く、そして有毒なキレート剤を使用することなく、あるいは透析を行うことなしに酸沈殿によりκ−カゼイン濃縮分画を得ることができる。本発明の方法は、中性ｐＨ域で行う方法と異なり工業規模で実施することが可能であり、その生成物は食品および新規食品材料への使用に好適であり、そして機能性食品、リンペプチドおよび様々な生理活性ペプチドを調製するための出発材料として好適である。
【００３５】
更に、本明細書記載の方法により乳精タンパク質、カゼインおよびミルクや乳精中にあるプロテオースペプトンの混合物からＣＭＰを効率的実用的かつ安価に分離することができる。従来のＣＭＰ製造法は多くの不純物を含むκ−カゼイン調製物を使用している。例えばスキムミルクから製造されるκ−カゼイン調製物は、変性した低温のβ−ラクトグロブリンを含む。一方、κ−カゼイン調製物が全カゼイン（典型的にはナトリウムまたはカリウム塩）から作られたのであれば、その調製物は少量のαｓ−およびβ−カゼインを含んでいる。
【００３６】
キモシンを用いてκ−カゼインを加水分解してＣＭＰを形成している間には、制限タンパク分解汚染物が発生することがある。その結果、最終調整物がフェニルアラニンを含むペプチドによって汚染され、その為にＰＫＵ患者によるこの調製物の摂取が不適切になる危険性がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３７】
従って本発明の目的としては：
ミルクから精製カゼイン分画およびβ−ラクトグロブリンを抽出し、タンパク質分画だけでなくβ−ラクトグロブリンを部分的に除去した酸性乳精を得る新規の方法を考案すること。この方法は工業規模での使用が可能で、得られたタンパク質分画および酸性乳精は食品内での使用に、または母乳化乳幼児用調製粉乳、チーズ、フレーバー乳化剤、食用コーティング剤および機能性食品といった新規食品材料の調製に関し好適である。
【００３８】
精製分画はまた生体分解性プラスチック、リンペプチドおよび、その他生理活性ペプチドの製造に使用できる。
【００３９】
カゼイン塩より精製カゼイン分画を抽出する新規方法を考案すること。この方法は工業規模での使用が可能で、そのカゼイン分画は上記の食品、新規食品、機能性食品および生物医学的応用に好適である。
【００４０】
代謝性疾患であるフェニールケトン尿症患者への使用に好適なＣＭＰを製造する新規方法を考案すること。
【課題を解決するための手段】
【００４１】
本書に於いては、カゼインミセル、カゼイン、カゼイン塩およびミルクのその他の成分という場合には、特段の事情がない限りこれら成分に関係する全ての種間および種内変異体をも含むものとする。例えばβ−カゼインは哺乳動物の種が異なると１次構造が若干異なる；発明がこれら全ての変異体に適用されることは当業者にとって自明である。αｓ−カゼインという用語は、αｓ１−およびαｓ２−カゼインの混合体を表す。
【００４２】
本発明の第１の側面によれば、次のステップを含む、ミルクから精製タンパク質分画を得る方法が提供される：
i）ミルクのｐＨを上げるステップ；
ii）塩化カルシウムを加え精製タンパク質分画を沈殿させるステップ；
iii）ｐＨを下げるステップ；および
iv）遠心分離または濾過を行い、この分画を分離するステップ。
【００４３】
分画はαｓ−、β−およびκ−カゼインであることが好ましい。
【００４４】
通常は、ミルクはスキムミルクである。
【００４５】
遠心分離は低速度で実施されるのが好ましい。
【００４６】
この方法は更にステップ（ｉｖ）での遠心分離または濾過により得た上清を酸性ｐＨ域で沈殿させ、κ−カゼインがより濃縮された分画を得るステップを含んでもよい。
【００４７】
上清を酸性ｐＨ域に調整してκ−カゼイン濃縮分画を得るステップに於いて、好適なｐＨは３．８である。通常は、κ−カゼイン含有量は約６０％であり、β−ラクトグロブリン含有量は約２０％である。
【００４８】
この方法はαS−およびβ−カゼイン成分を水に再溶解するステップおよび主にαＳ−カゼインを含む分画を得るために、低温かつ酸性ｐＨ域でαS−カゼインの選択的等電点沈殿を再度行うステップを含んでもよい。
【００４９】
αｓ−およびβ−カゼイン沈殿物を水に再溶解するステップでは、水はｐＨ７．０、２０℃であることが好ましい。
【００５０】
αｓ−およびβ−カゼイン溶液は、水に再溶解後、好適には２℃に冷却し、酸性ｐＨ域、好適にはｐＨ４．５に調整してもよい。
【００５１】
再溶解および再沈殿のステップは、好ましくは更に２回繰り返し、主にαｓ−カゼインを（８５％より多く）含む分画と主にβ−カゼインを（９５％より多く）含む分画とを得てもよい。
【００５２】
更に、選択的等電点沈殿より得た上清を加温するステップおよび主にβ−カゼインを含む分画を回収する酸性沈殿を行うステップを含んでも良い。上清の酸性乳精からは一部のβ−ラクトグロブリンが除去されるが、その他全ての乳精タンパク質は未変性の形で含んでおり、カルシウムに富んでいる。
【００５３】
好適には、上清は３５℃まで加温する。
【００５４】
好適には、ミルクのｐＨはアルカリ溶液の添加により上げ、酸性溶液の添加により下げる。
【００５５】
ミルクのｐＨを上げるステップでは、ｐＨは１１まで上げるのが好ましい。
【００５６】
ミルクのｐＨを上げるステップでは、水酸化ナトリウムを加えることが好ましい。
【００５７】
アルカリ溶液添加時のミルク温度は３０℃であることが好ましい。
【００５８】
アルカリ液添加後、ミルクは随意に数分間放置してもよい。ミルクの放置時間は５分未満であることが好ましい。
【００５９】
アルカリカゼイン塩液内の塩化カルシウムの最終濃度は０．０５９Mであることが好ましい。
【００６０】
ｐＨは、１またはそれ以上の鉱酸を加えて下げてもよい。
【００６１】
この方法はκ−カゼイン高濃縮分画のｐＨを上げてから限外濾過を行い、カゼイン、乳精タンパク質およびカゼイノマクロペプチド（ｃａｓｅｉｎｏｍａｃｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）から低分子量物質を分離するステップを含んでも良い。
【００６２】
通常は、ｐＨは中性値まで上げられる。
【００６３】
好ましくは、限外濾過は２５ｋＤ未満、且つ１２ｋＤより大きい細孔径を持つ膜を用いて行う。
【００６４】
更に、この方法はκ−カゼイン高濃縮分画のｐＨを下げてから限外濾過を行い、カゼイノマクロペプチドから乳精タンパク質を分離するステップを含んでも良い。
【００６５】
通常は、この時ｐＨはｐＨ４〜ｐＨ５の範囲まで下げられる。
【００６６】
好ましくは、ｐＨはｐＨ４．６まで下げられる。
【００６７】
限外濾過は７ｋＤより大きく、２０ｋＤより小さい細孔径を持つ膜を用いて行うことが好ましい。
【００６８】
本発明の第２の側面は、第１の側面の方法により得た精製タンパク質分画を提供することである。
【００６９】
精製タンパク質分画はαｓ−カゼインでもよい。
【００７０】
精製タンパク質分画はβ−カゼインでもよい。
【００７１】
精製タンパク質分画はκ−カゼインに非常に富むと同時にβ−ラクトグロブリン並びに少量のαｓ−およびβ−カゼインを含んでも良い。
【００７２】
典型的にはκ−カゼイン含有量は約６０％であり、β−ラクトグロブリン含有量は約２０％である。
【００７３】
本発明の第３の側面は、次のステップを含む、カゼインナトリウム溶液から精製タンパク質分画を得る方法を提供することである：
i）カゼインナトリウム液のｐＨを上げるステップ；
iii）塩化カルシウムを加えて分画を選択的に沈殿させるステップ；
iv）ｐＨを下げるステップ；
ｖ）遠心分離または濾過を行い、分画を分離するステップ。
【００７４】
好ましくは、分画はαｓ−、β−およびκ−カゼインである。
【００７５】
遠心分離は低速で行うことが好ましい。
【００７６】
この方法はまたステップ（ｉｖ）での遠心分離または濾過で得た上清を酸性ｐＨ域で沈殿させて、κ−カゼイン高濃縮分画を得るステップを含んでも良い。
【００７７】
上清を酸性ｐＨ域に調整してκ−カゼイン濃縮分画を得るステップでは、ｐＨは３．８であることが好ましい。この分画のκ−カゼイン含有量は通常３０％より多くなる。
【００７８】
κ−カゼイン濃縮分画は、任意にエタノールから選択的沈殿によりさらに濃縮してもよい。κ−カゼイン分画はｐＨ７の水に再溶解し、ｐＨ４．６で再沈殿してから、少量の２ＭのＮａＣｌを加えた５０％のエタノールからｐＨ７．０、２５℃にて選択的に沈殿させもよい。κ−カゼインは容易に沈殿を形成するので濾過または低速遠心分離により取り出すことができる（ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ９巻、１９７０年、２８０７〜２８１３頁。Ｔａｌｂｏｔ，Ｂ．とＷａｕｇｈ、Ｄ．Ｆ．
【００７９】
「モノマーおよび共有重合性κ−カゼインのミセル形成特性（Ｍｉｃｅｌｌｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  κ−ｃａｓｅｉｎｓ）」。この分画のκ−カゼイン含有量は一般的に約６５％である。
【００８０】
この方法はさらにαｓ−およびβ−カゼイン成分を水に再溶解してからαｓ−カゼインを酸性ｐＨ域の低温で選択的等電点沈殿を繰り返し、主にαｓ−カゼインを含む分画を得るステップを含んでも良い。
【００８１】
αｓ−およびβ−カゼイン沈殿物を水に再溶解するステップでは、水はｐＨ７．０で２０℃であることが好ましい。
【００８２】
前記αｓ−およびβ−カゼイン溶液は冷却、好ましくは２℃に冷却し、酸性ｐＨ域，好適にはｐＨ４．５に調整するのが好ましい。
【００８３】
好適には、この方法はさらに選択的等電点沈殿で得た上清を温めて酸沈殿を行い主にβカゼインを含む分画を回収するステップを含んでも良い。β−カゼインは上清より、好ましくは３５℃まで加温して再沈殿させてもよい。
【００８４】
再溶解および再沈殿の手順を、好適にはさらに２回繰り返すことで主にαｓ−カゼイン（８５％より多い）を含む分画と主にβ−カゼイン（９５％より多い）を含む分画とが得られる。
【００８５】
カゼインナトリウム溶液のｐＨは、アルカリ溶液を加えることにより上げ、酸溶液を加えることにより下げるのが好ましい。
【００８６】
カゼインナトリウム溶液のｐＨを上げるステップでは、水酸化ナトリウムの添加によりｐＨを１１まで上げるのが、より好ましい。アルカリ溶液添加時のカゼインナトリウム溶液の温度は３０℃であるのが好ましい。
【００８７】
カゼインナトリウム溶液のｐＨは数分間、好ましくは５分より短く上昇させることができる。
【００８８】
アルカリ性カゼインナトリウム溶液中の塩化カルシウムの最終濃度は０．０７１Ｍであるのが好ましい。
【００８９】
ｐＨは１またはそれ以上の鉱酸の添加により７．０に引き下げても良い。
【００９０】
方法はさらにκ‐カゼイン高濃縮分画のｐＨを引き上げてから限外濾過を行い、カゼイン、乳清タンパク質およびカゼインマクロペプチドより低分子物質を分離するステップを含んでも良い。
【００９１】
前述のｐＨは典型的には中性値まで上げられる。
【００９２】
前述の限外濾過は２５ｋＤ未満であるが、１２ｋＤより大きな孔径を持つ膜を用い行うことが好ましい。
【００９３】
更には、方法はκ‐カゼイン高濃縮分画のｐＨを引き下げてから限外濾過を行い、乳精タンパク質をカゼインマクロペプチドから分離するステップを含んでも良い。
【００９４】
前述のｐＨは、典型的にはｐＨ４からｐＨ５の間まで引き下げられる。
【００９５】
ｐＨはｐＨ４．６まで引き下げられるのが好ましい。
【００９６】
前述の限外濾過は７ｋＤより大きいが２０ｋＤより小さい孔径の膜を用い行われる。
【００９７】
カゼインマクロペプチドは濃縮し、乾燥してもよい。
【００９８】
典型的には、この作業は凍結噴霧乾燥法により行われる。
【００９９】
本発明の第４の側面は、第１側面の方法により得られた精製タンパク質分画を提供することである。
【０１００】
前述の精製タンパク質分画はαｓ‐カゼインでもよい。
【０１０１】
前述の精製タンパク質分画はβ‐カゼインでもよい。
【０１０２】
前述の精製タンパク質分画を、少量のαｓ‐およびβ‐カゼインを含むκ‐カゼインについて高濃縮してもよい。
【０１０３】
本発明の第５の側面では、第１または第３の側面の方法により得た、フェニールケトン尿症患者の栄養として好適であるカゼインマクロペプチド調製体が提供される。
【０１０４】
前述のカゼインマクロペプチドは濃縮し、乾燥してもよい。
【０１０５】
典型的には、この作業は凍結噴霧乾燥法により行われる。
【０１０６】
前述の調製体は、食品材料中に取り込ませてもよい。本調製体はまた食品材料として、あるいはそれ単独で与えても良い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０７】
以下、本発明を以下の図面を参考に記載する：
図１は、スキムミルク中のカゼインをαｓ−カゼイン、β‐カゼインならびに若干のαｓ‐およびβ‐カゼインを含む、κ‐カゼインおよびβ‐ラクトグロブリン（β‐Ｌｇ）濃縮分画の分画化に包含されるステップを例示する図面である。本法はまた、実施例１に詳述する様に、β‐ラクトグロブリンが中から部分的に取り除いた酸性乳清も生ずる。
図２は実施例２記載のカゼインナトリウムをαｓ‐カゼイン、β‐カゼインならびにαｓ‐およびβ‐カゼインを含むκ‐濃縮分画の分画化に包含されるステップを例示した図面である。
図３はスキムミルク中の原型カゼインおよび実施例１記載で得た分画の陰イオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィのプロフィールを示す。分析はＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦＤＡＩＲＹ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ、５４巻、１９８７年、３６９〜３７６項、Ｄａｖｉｅｓ、Ｄ．Ｔ．とＬａｗ、Ａ．Ｊ．Ｒ。
「高速液体クロマトグラフィによるカゼイン混合物の定量的分画化（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｓｅｉｎ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」に記載の如くに実施した；
【０１０８】
図４は原型スキムミルク（――）および塩化カルシウム添加後にκ‐カゼイン濃縮分画を酸沈殿させて得た上清中の乳清タンパク質のゲル透過プロフィールを示している。図はアルカリ変性と、それに続く酸性ｐＨでの沈殿によるβ‐ラクトグロブリン除去を示す。分析はＭＩＬＣＨＷＩＳＳＥＮＣＨＡＦＴ、４８巻、１９９３年、６６３〜６６６項、Ｌａｗ、Ａ．Ｊ．Ｒ．、Ｌｅａｖｅｒ、Ｊ．、Ｂａｎｋｓ、Ｊ．Ｍ．およびＨｏｒｎｅ、Ｄ．Ｓ．「ゲル透過ＦＰＬＣによる乳清タンパク質の定量的分画化（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｇｅｌ  ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  ＦＰＬＣ）」記載の如くに実施した。（Ｉｇ、イムノグロブリン；ＳＡ／Ｌｆ、血清アルブミンおよびラクトフェリン、β−Ｌｇ、β−ラクトグロブリン；α−Ｌａ、α−ラクトアルブミン）；
図５は原型カゼインナトリウムおよびこれより実施例２記載の如くにして得た分画の陰イオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィのプロフィールを示している。分析は図３の場合と同様にして行われた；
図６は原型カゼインナトリウム（−−−）およびそれより実施例２の如くにして得た後さらにエタノール沈殿法により精製したκ‐カゼイン分画（＿＿）の陰イオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィのプロフィールを示している。分析は図３の場合と同様にして行われた；
図７は原型カゼインナトリウム（上）および３０℃、ｐＨ１１．０に５．０分間置いた後のカゼインナトリウムの陰イオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィプロフィールを示している。分析は図３の場合と同様にして行われた；
図８は原型カゼインナトリウム（上）および３０℃、ｐＨ１１．０に５．０分間置いた後のカゼインナトリウムについて得られたキャピラリー電気泳動パターンを示している。分析はＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ、６５２巻、１９９３年、２０７〜２１３項、ｄｅ  Ｊｏｎｇ、Ｎ．、Ｖｉｓｓｅｒ、Ｓ．とＯｌｉｅｍａｎ、Ｃ．「キャピラリー電気泳動によるミルクタンパク質の決定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」の方法に実質従った；
【０１０９】
図９は原型カゼインナトリウム（上）および３０℃、ｐＨ１１．０に１５．０分間置いた後のカゼインナトリウムの陽イオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィプロフィールを示している。分析はＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＤＡＩＲＹ  ＳＣＩＥＮＣＥ、７４巻、１９９１年、２４０３〜２４０９項、Ｈｏｌｌａｒ、Ｃ．Ｍ．、Ｌａｗ、Ａ．Ｊ．Ｒ．、Ｄａｌｇｌｅｉｓｈ、Ｄ．Ｇ．とＢｒｏｗｎ、Ｒ．Ｊ．「陽イオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィによる主要カゼイン分画の分離（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｊｏｒ  ｃａｓｅｉｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃａｔｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」の方法に従い行われた；そして
図１０は実施例１および２（それぞれ図１および２）に記載の選択的カルシウム沈殿によりスキムミルクまたはカゼイン塩から得た精製分画の使用を例示している図面である。
【０１１０】
本発明はアルカリｐＨに於いてカルシウム塩を加えることでスキムミルクまたはカゼイン塩よりカゼイン分画を選択的に沈殿させる新規の方法に関する。
【０１１１】
具体的には、本発明はαｓ‐カゼインおよびβ‐カゼインの純粋分画、ならびにκ‐カゼイン高濃縮分画の調製に関する。本方法は工業規模で使用でき、生成物は食品内への使用、新規食品材料、生体分解性プラスチック、機能性食品および生理活性ペプチドの調製に好適である（図１０）。
【０１１２】
選択的カルシウム沈殿法を含む従来のカゼイン分画法は、中性ｐＨで行われており、またαｓ‐およびβ‐カゼインの沈殿が容易に起こらないために高速遠心分離が必要である。高濃度の塩化カルシウムはその後のκ‐カゼイン分画の酸沈殿を妨害するため、タンパク質を回収するには塩化カルシウムにシュウ酸を添加し、透析する必要があった。そためにこの方法を大規模化することは不可能であり、その生成物はヒトでの消費に不適であった。
【０１１３】
本発明の方法では、カゼインの分画化はアルカリｐＨでの選択的カルシウム沈殿により行われる。スキムミルクのｐＨを約１１．０にまで上げると、負に荷電したカゼイン上の電荷、特にリン酸基上の電荷が増して、カゼインはミセルから解離する。αｓ‐カゼインはβ‐カゼインに比べ強く帯電しており、そしてκカゼインの帯電が最も小さい。塩化カルシウムの様な塩を加えると、αｓ１‐およびβ‐カゼインはκ‐カゼインより強くＣａ２＋と結合するため、容易に沈殿するようになり、結果としてκ‐カゼインに富む上清が生じる。アルカリｐＨでは、ミルク中のβ‐ラクトグロブリンの一部が変性する（ＪＯＵＲＮＡＬＯＦ ＴＨＥ  ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＳＯＣＩＥＴＹ  ８１巻、１９５９年、４０３２〜４０３６項、Ｔａｎｆｏｒｄ、Ｃ．、Ｂｕｎｖｉｌｌｅ、Ｌ．Ｇ．、Ｎｏｚａｋｉ、Ｙ．「ｐＨ７．５でのβ‐ラクトグロブリンの可逆的トランス形成（Ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  β‐ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｔ  ｐＨ７．５）」）。
【０１１４】
変性したβ‐ラクトグロブリンはκ‐カゼイン濃縮上清中に残っている。引き続いてｐＨを約３．８まで下げると、κ‐カゼインが濃縮された沈殿が、変性β‐ラクトグロブリンならびに若干のαｓ‐およびβ‐カゼインと一緒になった形で直ちに形成される（図３）。酸性上清はβ‐ラクトグロブリン中で一部失われているが（図４）、その他の全ての乳清タンパク質と加えられた塩化カルシウムを含んでおり、食品への使用に好適である。
【０１１５】
中性ｐＨの代わりにアルカリｐＨで選択的カルシウム沈殿を行うことには幾つか利点がある。アルカリｐＨではカゼインミセルは破壊されるため、カゼインは有毒なカオトロピック剤またはキレート剤を必要とせずに解離する。カゼインはまた高い正味負電荷を有しており、塩化カルシウムを加えた時それらはより多くのＣａ２＋を結合する。
【０１１６】
従って中性ｐＨで必要とされるものより低い塩化カルシウム濃度でカゼインを選択的に沈殿できる。アルカリｐＨでは塩化カルシウムを加えるとαｓ‐およびβ‐カゼイン沈殿は簡単に安定化するので、濾過または低速遠心分離により容易に分離される。濃縮κ‐カゼイン中の上清分画も同様に、塩化カルシウム濃度が低い時には酸性ｐＨでは容易に沈殿し、濾過又は低速遠心分離を用いる事で容易に分離する。いずれの分画も続いて、必要に応じ工業規模で精製することができる。
【０１１７】
例えばκ‐カゼイン分画からカゼインマクロペプチド（ＣＭＰ）を分離するために、追加処理を行っても良い。ＣＭＰはモノマーの形状では約６、５００ダルトンの分子量を有しているが、しかしＣＭＰは酸性ｐＨ値、例えばｐＨ４、でのみモノマー形状を採る。中性ｐＨでは、ＣＭＰはテトラマーの形を取り、２５，０００ダルトンの有効分子量を持つ。従って、ｐＨを操作することでＣＭＰをβ−ラクトグロブリンの様な乳清タンパク質に匹敵する大きさの分子として振る舞わせる、または小ペプチドの様に振る舞わせることができる。この特徴を利用して、いずれかの陰性の乳清タンパク質（スキムミルクから作られたκ−カゼイン調製体）との混合体、またはその他ペプチド（例えばスキムミルク中のプロテオースペプトン若しくはその他カゼイン分画の非特異的分解で生じたペプチド）からＣＭＰを効果的に分離することができる。各種分画の特性を以下に示す：
【０１１８】
【表１】
2004521650.tif 000002
上記の性質の違いはあらゆる純粋状態のＣＭＰの製造に活用でき、フェノイルアラニメを含む汚染物を無くすことができる。このようにして、前述の方法で生じたκ‐カゼイン分画は超純粋なＣＭＰを精製することができる。典型的にはＣＭＰをそのテトラマー型に変換するために、κ‐カゼイン分画のｐＨは中性ｐＨに引き上げられるだろう。それから適当な孔径―典型的には２５ｋＤより小さいが１２ｋＤよりは大きい孔径―を持つ膜を用いた限外濾過処理により、カゼイン、乳清タンパク質およびＣＭＰから全ての低分子量物質を分離する。
【０１１９】
ｐＨを４．６に酸性化すると、ＣＭＰがモノマー型に戻る変換が起こり、その他の分画は沈殿する。この場合、適当な孔径―典型的には７ｋＤより大きいが２０ｋＤより小さい孔径を持った膜を用いた限外濾過処理により、ＣＭＰから乳清タンパク質が分離される。ＣＭＰは適宜、典型的には凍結または噴霧乾燥法で濃縮、乾燥してもよい。上記ステップは多くの好適実施態様の一例にしか過ぎず、―好適実施例の幾つかはｐＨ調製の順番が逆である―単に例示を目的として示したものである。
【０１２０】
ＣＭＰ精製の原理の応用はスキムミルク由来の物質に限定されたものではなく、例えばこのステップはチーズまたはレンネット乳清からのＣＭＰの分離および精製にも応用できる。この様な場合、遠心分離および／またはミクロフィルトレーション（典型的にはカットオフが１．８μの膜を使用する）による前処理を用いて粗粒子、残留脂肪や細菌といった汚染物を除去するのに適当である。本前処理後、上記原理を利用してｐＨＡを含まず、ＰＫＵ患者の栄養として好適であるＣＭＰを作ることができる。
【０１２１】
β‐カゼインは低温に於いては、その等電点では溶けた状態のままであるために、２℃、ｐＨ４．６で沈殿させることにより共存するαｓ‐カゼインから分離することができる（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＳＯＣＩＥＴＹ  ６７巻、１９４４年、１７２５〜１７３１項。Ｗａｒｎｅｒ、Ｒ．Ｃ．「α−およびβ−カゼインの分離（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  α‐  ａｎｄ  β‐ｃａｓｅｉｎ）」。  次に３５℃で上清から沈殿させてβ‐カゼインを回収する。この操作を全てのβ‐カゼインがαｓ‐カゼインから抽出されるまで繰り返し、αｓ‐およびβ‐カゼインの精製分画を得る（図３）。
【０１２２】
カゼイン塩溶液から精製カゼイン分画を選択的に沈殿する方法は、塩化カルシウム添加時に上清がκ‐、βおよび会αｓ‐カゼインのみ含むことを除いてはスキムミルクについて記載の方法と原則同一である（図５）。  前述の如く、カゼインはそれらの持つエタノールに対する溶解性に基づいて部分精製することができる（ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ９巻、１９７０年、２８０７〜２８１３項。Ｔａｌｂｏｔ、Ｂ．とＷａｕｇｈ、Ｄ．Ｆ．「モノマーおよび共有結合型重合κカゼインのミセル形成特性（Ｍｉｃｅｌｌｅ‐ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  κ‐ｃａｓｅｉｎｅｓ）」。この方法を用いてκ‐カゼイン分画を精製できる。初期κ‐カゼイン分画を再沈殿して残存カルシウムを除き、エタノール溶液から上清中に残っているαｓ１‐およびβ‐カゼインを選択的に沈殿させる。この沈殿は直ぐに形成され、低速遠心分離により除くことができ、κ‐カゼイン濃縮分画を得る（図６）。
【０１２３】
スキムミルクで見られたように、高ｐＨでのカゼインナトリウムの分画化には、有害物質を含まず、従って食品材料としての使用に好適である３種類全てのカゼイン分画が得られるという中性ｐＨでのカルシウム沈殿、またはカオトロピック剤存在下での分離を含む従来法にない利点がある。アルカリｐＨで必要なカルシウム濃度はより低いため、有害なキレート剤の添加や大規模での実施が容易でない透析を必要することなく、κ‐カゼイン濃縮分画を連続的に回収できるようになる。同様に、κ‐カゼイン上清からαｓ‐およびβ‐カゼインをアルカリｐＨで分離するという改善により高速遠心分離を必要としなくなるため、本法を食品等級材料製造に向けスケールアップすることが容易になる。
【０１２４】
アルカリｐＨでの長時間の処理、特に高温での処理によりカゼインを脱リン酸化できる（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＤＡＩＲＹ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ、３９巻、１９７２年、１８９〜１９４項。Ｍａｎｓｏｎ、Ｗ．とＣａｒｏｌａｎ、Ｔ。「β‐カゼインからのアルカリによるリン酸基除去（Ｔｈｅ  ａｌｋａｌｉ‐ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｆｒｏｍ  β‐ｃａｓｅｉｎ）。
【０１２５】
脱リン酸化により生じた、およびカゼインからの−ＳＨ基除去により生じることもあるカゼイン中のデヒドロアラニンはリジン残基のε−アミノ基と反応し、リシノアラニル基を形成する。この反応は栄養として利用可能なリジンの量を減らし、カゼイン中の架橋を増やして消化性を低下させる。ミルクを加熱した場合にも同様の反応が起こり、そして動物研究では大量に摂取した場合にはリジノルアニンが有害になることもあることが実証されている（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦＮＵＴＲＩＴＩＯＮ、９８巻、１９６９年、４５−５６項、Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ、Ａ．Ｐ．およびＳｌｕｍｐ、Ｐ。「タンパク質への強アルカリ処理がアミノ酸組成物および栄養価に及ぼす影響（Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ａｌｋａｌｉ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｎ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｕｔｒｉｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ）」。熱またはアルカリ処理された乳タンパク質を食することの健康人へのリスクは小さいと信じられている（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＤＡＩＲＹ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ、４９巻、７２５−７３６項。ｄｅ  Ｋｏｎｉｎｇ、Ｐ．Ｊ．とヴァンＲｏｏｉｊｅｎ、Ｐ．Ｊ．「ミルクおよび乳製品於けるリジノアラニン形成についての考察（Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｓｉｎｏａｌａｎｉｎｅ  ｉｎ  ｍｉｌｋ  ａｎｄ  ｍｉｌｋ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」。
しかし本研究に於いて我々は、陰イオン‐および陽イオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィおよびキャピラリー電気泳動を用い、アルカリ処理が乳タンパク質に及ぼす影響を注意深く研究した。これら技術はこれまでも加熱によりタンパク質内に起こる同様の変化を検出するのに用いられ、成功している（ＭＩＬＣＨＷＩＳＳＥＮＳＣＨＡＦＴ、４９巻、１９９４年、１２５〜１２９項。Ｌａｗ、Ａ．Ｊ．Ｒ．、Ｈｏｒｎｅ、Ｄ．Ｓ．、Ｂａｎｋｓ、Ｊ．Ｍ．およびＬｅａｖｅｒ、Ｊ．「乳清タンパク質およびカゼインに於ける熱誘導変化（Ｈｅａｔ‐ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｗｈｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｃａｓｅｉｎｓ）」。ＪＯＵＮＡＬ  ＯＦ  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ、  ６５２巻、１９９３年、２０７‐２１３頁、Ｄｅ  Ｊｏｎｇ、Ｎ。Ｖｉｓｓｅｒ、ＳとＯｌｉｅｍａｎ、Ｃ。「キャピラリー電気泳動による乳タンパク質の決定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」
【０１２６】
脱リン酸化、‐ＳＨ基および炭水化物基（シアル酸）除去の様な強アルカリ処理時にじる変化はいずれもタンパク質の陰性電荷を減らすが、この変化は加熱によっても生じ、そして陰イオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィ（ＦＰＬＣ）によって検出できる。同様に長時間のアルカリｐＨ処理時に起こるε−アミノＬｙｓおよびＡｒｇ残基の脱アミノ化はタンパク質の正電荷を失わせるが、この変化は陽イオン‐交換ＦＰＬＣおよび酸性ｐＨでのキャピラリー電気泳動により決定できる。
【０１２７】
これら技術を用いて、スキムミルクまたはカゼインナトリウムからのカゼイン分画の選択的沈殿に求められるアルカリ条件下に置かれたカゼインについて試験した。陰イオン交換ＦＰＬＣの結果（図７）は、ミルク中のカゼインミセル解離達成に必要な短い時間（５分）の間には各種カゼインのプロフィールまたは相対ピーク面積に目立った変化は認められないことを示している。この分離は正味の陰荷電に基づいているため、各種カゼインの変化に評価可能な変化はなく、そして具体的には脱リン酸化は起こっていないと思われる。キャピラリー電気泳動（図８）および陽イオン交換ＦＰＬＣ（図９）の結果も同様に、５分間のアルカリ処理によってもカゼインのプロフィールまたは相対ピーク面積に目立った変化はないことを示している。両技術は酸性ｐＨで行われ、そして分離が正味の正荷電に基づくことから、短時間のアルカリ処理はカゼイン中のＬｙｓやＡｒｇといった正に帯電した基には影響を及ぼさないことが示された。これら結果は総合的に、スキムミルクまたはカゼインナトリウムの選択的沈殿に必要なアルカリ条件の短時間処理は、タンパク質に化学的損傷を与えないことを示している。
【０１２８】
スキムミルクのアルカリ処理中に、β−ラクトグロブリンは構造変化を起し、
その結果等電点において不溶性になる（ＪＯＵＲＮＡＬＯＦ ＴＨＥ  ＡＭＥＲＩＣＡＮ  ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＳＯＣＩＥＴＹ  ８１巻、１９５９年、４０３２−４０３６項。Ｔａｎｆｏｒｄ、Ｃ．、Ｂｕｎｖｉｌｌｅ、Ｌ．Ｇ，とＮｏｚａｋｉ、Ｙ。「ｐＨ７．５でのβ−ラクトグロブリンの可逆的トランス形成（Ｔｈｅ  ｒｅｖｅｓｉｂｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  β‐ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｔ  ｐＨ  ．５）」。カゼインの選択的カルシウム沈殿に求められるアルカリ条件下では、一部のβ‐ラクトグロブリンは変性されるが、他の乳清タンパク質は、ゲル透過ＦＰＬＣにより示されるように（図４）、変性されず、それぞれの等電点において可溶性を保っていた。アルカリｐＨに短時間置かれたスキムミルクタンパク質の逆相ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動およびトリプシン消化に基づく従来の結果からは、タンパク質の化学特性に大きな変化が無いことが示されている（特許出願、２００１年、Ｌｅａｖｅｒ、Ｊ．とＬａｗ、Ａ．Ｊ．Ｒ．「ミルクおよび乳製品からβ‐ラクトグロブリンおよびカゼインを抽出する方法を含むミルクおよびチーズ抽出ステップ、およびそれにより生成された新規生成物（Ｍｉｌｋ  ａｎｄ  ｃｈｅｅｓｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ  β‐ｌａｃｔｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｃａｓｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｍｉｌｋ  ａｎｄ  ｍｉｌｋ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｈｅｒｅｂｙ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ）」）。
【実施例１】
【０１２９】
スキムミルクを３０℃に温め、５Ｍの水酸化ナトリウムを攪拌しながら加えてｐＨを直ぐに１１．０に調整した。
【０１３０】
攪拌を続けながら０．５Ｍの塩化カルシウム溶液を加え、添加した塩化カルシウムの総量はスキムミルク液１リットル当たり１３３ｍｌであり、また最終濃度は０．０５９Ｍであった。次にスキムミルクのｐＨを７.０に下げるために、塩酸（５Ｍ）を攪拌しながら加えた。沈殿（Ａ）が形成され、これを遠心分離または静置させた後に濾過して集めた。この沈殿はαｓ‐およびβ‐カゼインを多く含んでおり、κ‐カゼインは殆ど含んでいない。上清に１ＭのＨＣｌを攪拌しながら加えて、そのｐＨを３．８まで下げた。第２沈殿（Ｂ）が形成され、これを沈殿Ａと同じ方法で集めた。沈殿Ｂはκ‐カゼイン（６０％）とβ‐ラクトグロブリン（２０％）、ならびに少量のαｓ‐およびβ‐カゼインを含んでいた（図３）。酸性乳精の上清はβラクトグロブリン中で一部失われた（図４）。
【０１３１】
沈殿Ａを、１ＭのＨＣｌを加えてｐＨを連続的に７．０に調整しながら、２０℃で激しく攪拌してカゼイン塩原料とほぼ同一濃度に水に再懸濁した。完全に溶解した後、溶液を２℃まで冷却し、攪拌しながら１ＭのＨＣｌを加えてｐＨを４．５に調整した。沈殿物（Ｃ）を形成させ、２℃で１５分間攪拌した後、２℃で濾過または遠心分離してこの沈殿を上清（Ｄ）から集めた。この沈殿物は非常にαｓ‐カゼインに富むものであったが、一部β‐カゼインも含んでいた。この分画のβ‐カゼイン含有量は、沈殿物を水に再溶解して、２℃での沈殿を更に２回繰り返すことで減少した。分析から８５％を越えるタンパク質がαｓ‐カゼインであることが示された（図３）。
【０１３２】
上清Ｄを３５℃まで温めてから攪拌しながら少量の１ＭのＨＣｌを加えてｐＨを４．６に調整した。形成した沈殿物（Ｅ）を沈殿物Ａと同じ方法で遠心分離または濾過し集めた。分析から、９５％を越えるタンパク質がβ‐カゼインであることが分かった（図３）。
【実施例２】
【０１３３】
カゼインナトリウムを約３７℃で１０分間攪拌して２７ｇ／Ｌの濃度に水に溶解した（図４）。この溶液を３０℃に冷却してから、直ぐに攪拌しながら５Ｍの水酸化ナトリウムを加えてｐＨを１１．０に調整した。攪拌継続中に塩化カルシウムの０．５Ｍ溶液を加えたが、塩化カルシウムの添加総量はカゼイン塩溶液１リットル当たり１６６ｍｌ、最終濃度は０．０７１Ｍであった。
【０１３４】
次にカゼイン塩溶液のｐＨを７．０に下げるために塩酸（５Ｍ）を攪拌しながら加えた。沈殿物（Ａ）を形成させ、これを遠心分離または静置後濾過し取り出すことで集めた。この沈殿はαｓ‐およびβ‐カゼインに富み、κ‐カゼインは殆ど含まないか、全く含んでいなかった。上清のｐＨを攪拌しながら１ＭのＨＣｌを加えることで３．８に下げた。第２沈殿物（Ｂ）を形成させ、これを沈殿物Ａと同じ方法で集めた。沈殿物Ｂはκ‐カゼインを多量に含み、ほぼ同量のαｓ‐、β‐及びκ‐カゼインを含んでいた（図４）。沈殿物Ｂは、ｐＨ７．０で水に溶解してからｐＨ４．６で再沈殿させてカルシウム塩含有量を下げることで更に精製することができた。沈殿物をｐＨ７．０で再溶解し、少量の２Ｍ塩化ナトリウム５０％エタノール液を加えて、大部分のαｓ１‐およびβ‐カゼインを上清中に残したまま、５０％エタノール溶液からκ‐カゼインを選択的に沈殿させた。沈殿は直ぐに形成され、低速遠心分離または濾過により分離できた。この分画は約６５％κ−カゼインであり（図６）、有害物質を含まないため食品材料として好適であった。
【０１３５】
沈殿物Ａを、２０℃で強く攪拌してカゼイン材料と同一濃度になるように水に再溶解し、１ＭのＨＣｌを加えてｐＨを７．０に調整した。完全に溶解した後、この溶液を２℃まで冷却し、攪拌しながら１Ｍ  ＨＣｌを加えてｐＨを４．５に調整した。沈殿物（Ｃ）が形成されるので、１５分間、２℃で攪拌した後２℃で濾過または遠心分離を行い上清（Ｄ）から集めた。この沈殿物は非常にαｓ‐に富んでいたいが、若干のβ‐カゼインを含んでいた。この分画のβ‐カゼイン含有量を、沈殿物を水に再溶解し、沈殿を２℃でさらに２回繰り返すことで下げた。分析からは８５％を越えるタンパク質がαｓ‐カゼインであることが示された（図５）。
【０１３６】
上清Ｄを３５℃に温め、攪拌しながら少量の１ＭのＨＣｌを加えてｐＨを４．６に調整した。形成した沈殿物（Ｅ）は沈殿物Ａと同じ方法で遠心分離または濾過により集めた。分析から９５％を越えるタンパク質がβ‐カゼインであることが示された（図５）。
［精製カゼイン分画の応用］
【０１３７】
精製カゼイン分画は大規模に、有害物質を含まない形で調製でき、食品への添加や新規食品の製造に使用できる。各種カゼインは異なる構造と性質を持っており、従って選択により目的にあった最適な機能特性を与えることができる。例えばβ‐カゼインは他のカゼインに比べエタノール中に於いてより親水性であり、可溶性であるが、一方κ‐カゼインは疎水性でありエタノール溶液から容易に沈殿する。同様に、αｓ‐カゼインはリン酸基に富んでおり、２価イオンと容易に結合し、リン酸基を１個しか持たないκ‐カゼインに比べカルシウム濃度に対し非常に敏感である。κ‐カゼインはまた、ジスルフィド結合重合体の連続体として存在すること、疎水性炭水化物側鎖が存在すること、および水溶液中に於いて他のカゼインを安定化する能力を持つことによる特有な性質も有している。カゼイン分画はまた各種酵素に対し異なる感受性を示し、そして以下記載する様に広範囲のペプチドの調製にとって好適な原材料である。
【０１３８】
チーズ熟成中にカゼインはタンパク質分解を起こし、成熟チーズの風味にとって重要な役割を果たすペプチドおよびアミノ酸を生ずる。熟成の初期段階では、キモシンおよびプラスミンが大型および中型ペプチドのタンパク質分解を起こし、後期段階ではその他のタンパク質分解酵素が短いペプチドと最終的にはアミノ酸を産生する。しかし成熟はゆっくりとしたステップであるため、単離されたカゼインを迅速にタンパク質分解してチーズ風味を発生させることは相当な可能性がある。
【０１３９】
このステップ中、苦みを持った親水性ペプチドが、特にβ−カゼインから生成されることがある。ここに記載の精製カゼイン分画は形成されるペプチドや発生する風味のタイプについてより制御可能な原材料として用いることができる。
【０１４０】
酸またはアルカリ条件、あるいは限定酵素タンパク質分解によるカゼインの制御された加水分解からは、高い発泡能力を持ったペプチド、親のカゼインに比べてより素早く界面まで拡散できる小分子が生じる。カゼイン由来のペプチドには熱に対し安定であり、アレルギー原性が低く、そしてカルシウム結合を促進するという利点がある。さらに特定の加水分解物は、ヨーグルト加工での発酵速度の最適化や、特定の生理活性細菌株の細胞数を増やすのにも用いられている。本法で得られた精製分画の有用性は、必要とされる性質を持った広範囲のペプチドの製造を容易にする。
【０１４１】
多くの代替乳児食が牛乳をベースにしているが、母乳中の総タンパク質濃度はこれに比べ低く、個々のタンパク質の相対比も牛乳と大きく異なっている。具体的には母乳はβ‐ラクトグロブリンを含まず、αｓ‐カゼインの相対比は極めて低い。これに対し、母乳ではα‐ラクトアルブミン、ラクトフェリンならびにκ‐およびβ‐カゼインの相対比は高い。
【０１４２】
また母乳において総カゼインの約６０％を占めるβ‐カゼインは、異なるリン酸化を受けたポリペプチド群として存在しており、そのリン酸化の程度は牛乳のものに比べ低い。この組成の違いは、牛乳を与えられた乳児に起こる問題の幾つかに関係していると信じられている。例えば、牛乳のアレルギー原性はβ‐ラクトグロブリンの存在と一部関係付けられている。同様に消化の困難さは、ミルク中のリン酸化β‐カゼインの含有量が少なく、高リン酸化αｓ‐カゼイン含有量が高い場合には、酸性ｐＨで胃の中に形成された凝乳のテキスチャーが硬い事に拠っているのだろう。最近、乳児食メーカーでは母乳に近い製品を製造しようとする方向にかわりつつある。ここに記したように、部分的にβ‐ラクトグロブリンを除いた各種カゼイン分画および乳清を大規模に製造することが、この目的の達成に役立つ。精製β−カゼインはホスファターゼの作用によって部分的に脱リン酸化することができ、これを再びκ−カゼインおよび乳清と組み合わせてタンパク質組成が母乳により近いミルクを得ることができる。
【０１４３】
多くの長鎖型の天然または合成分子と同じく、カゼインは架橋し、一般には熱と高圧を加え、さらにホルマリンを処理することで重合体を形成することができる（Ｉｎ  ＣＡＳＥＩＮ  ＡＮＤ  ＩＴＳ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ、１９３９年、１８１〜２３２項、Ｒｅｉｎｈｏｌｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂｒｏｔｈｅｒ、Ｇ．Ｈ．「カゼインプラスチック（Ｃａｓｅｉｎ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ）」）。このステップは広く用いられ満足できるテキスチャーと色を持つ様々なプラスチックが製造されたが、原料のコストとホルマリンの危険性から合成ポリマーを用いる方法に替わられている。しかし、食用食品コーティングおよび生物分解性プラスチックについては市場があること、そしてアルカリｐＨでのカルシウム添加を含むより穏やかな架橋技術を用いることにより、本明細書に記した各種カゼイン分画を用いて好適な性質を有する各種軟質プラスチックを生成することができる。
最近、ミルク中のまたは消化中のカゼインのタンパク質分解による分解により特殊な生理機能を持った生理活性ペプチドが生まれることが分かった。生理活性ペプチドとしてはホスホペプチド、および抗菌機能、抗高血圧機能、免疫変調機能、抗血栓機能およびオピオイド機能を持つペプチドが挙げられる（ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＤＡＩＲＹ  ＳＣＩＥＮＣＥ、８３巻、２０００年、１１８７〜１１９５項。Ｃｌａｒｅ、Ｄ．Ａ．とＳｗａｉｓｇｏｏｄ、Ｈ．Ｅ。「生理活性ミルクペプチド：展望（Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｍｉｌｋ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｕｓ）」）。
【０１４４】
カゼインホスホペプチドは各種カゼインをトリプシン切断した後に認められるが、ホスホセリン残基の分類が特徴的であることとリン酸塩中心が持つ強い負電荷から、各種ミネラル、特にカルシウムのキャリアーとして機能すると信じられている（ＰＲＯＣＥＥＤＩＮＧＳ  ＯＦ  ２５ｔｈ  ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＤＡＩＲＹＣＯＮＧＲＥＳＳ、１９９８年、２００〜２０８項。Ｈｏｌｔ、Ｃ。「カゼイン構造とカゼイン−リン酸カルシウム相互作用（Ｃａｓｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｃａｓｅｉｎ−ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」。カゼインホスホペプチドは胃内での酵素によるタンパク質分解に対し最も耐性であり、通常はリン酸カルシウムと複合体を形成している。この複合体の形成により溶解性が増し、骨石灰化に必要なカルシウムの吸収を高める。カゼインホスホペプチドはまた歯のエナメル質のカルシウム再沈着を助けてう食傷害を阻止し、そして歯科疾患治療への応用が進められている。各カゼイン種はそれぞれ異なるホスホペプチドを生じるが、そのうちの幾つかは、それらがＦｅやＺｎ、Ｃｕと結合する能力を持つことから既に食品補助物や医薬品として応用されており、ここに記載の精製カゼイン分画の有用性はその調製を促進する。
【０１４５】
αｓ２‐カゼイン由来のカソシジンIやαｓ１‐カゼインＢ由来のイスラシジンを含め、ミルク中に存在する抗菌特性を持った複数のカゼインペプチドが同定されている。イスラシジンはヒツジとヤギに於いて転移を効果的に防いでおり、このタイプの特異的抗生物質が更に開発される可能性が高い。
【０１４６】
カゼイン由来の様々なペプチドがアンジオテンシン変換酵素を阻害し、それによって血圧を低下させるよう働いている。これら生理活性ペプチドのうち、一つはαｓ１−カゼインの断片（αｓ１−カソキニン−５）であり、二種類のものがβ−カゼインから得られている（β−カソキニン−７と抗高血圧ペプチド）。
【０１４７】
カゼイン断片が免疫系と関連細胞の増殖反応に影響することも判明している。これら生理活性ペプチドの内、κ−カゼインのトリペプチドとβ−カゼインのペプチドは末梢血リンパ細胞の増殖を高めることが示されている。
【０１４８】
カゼイン由来の複数のペプチドが抗血栓特性を有しており、血液凝固中に血小板の特異的受容体を遮断することで機能している。これらペプチドとしては、グリコマクロファージペプチド、およびカゾプラテリンとトロンビン阻害ペプチドをそれぞれ生ずるκ−カゼインの２種類の小型断片が挙げられる。
【０１４９】
様々な研究から、カゼインの断片の一部、オピオイドペプチドにモルヒネ様特性があることが示されている。
【０１５０】
主要なオピオイドペプチドはβ−カゼインの断片であるが、これらはαｓ１−カゼインをペプシン加水分解しても得ることができる。β−カソモルフィンは消化酵素に対し耐性であり、それらの成人での生理作用は胃腸管内に限定されており、腸移行時間、アミノ酸の取込、および水バランスに重要な影響を与える。しかし新生児では、β−カソモルフィンは血流内に入ることができ、乳児では鎮静と睡眠を促進する。一部のペプチド、オピオイド拮抗剤は、β−カソモルフィンとは逆の作用を及ぼし、エンケファリンの活性を抑制して機能する。そのような３種類ペプチド、カソキシン類はκ−カゼインのペプチドである。κ−カゼインのカゼインマクロペプチドは胃腸管に対し直接作用も及ぼし、胃酸分泌を阻害する。カゼイン由来の生理活性ペプチドの役割は拡大中の研究分野であり、現在特に分子レベルでの生物学的プロセスが詳しく分かるようになった。本方法による精製カゼインの調製法により、純粋な形の各種ペプチドの製造が容易になる。
【０１５１】
本発明の新規方法によって、極めて低コストに、そして潜在的に有害な試薬を使用することなしに、これまで達成不可能な純度でカゼインを分画化できるようになる。具体的には、本発明が初めてκ−カゼイン高濃縮物質の調製を可能にしている。
【０１５２】
その他の変更および改良は、本発明の範囲から逸脱することなしに組み込まれるだろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】スキムミルク中のカゼインをαｓ−カゼイン、β‐カゼインならびに若干のαｓ‐およびβ‐カゼインを含む、κ‐カゼインおよびβ‐ラクトグロブリン（β‐Ｌｇ）濃縮分画の分画化に包含されるステップを例示する図である。
【図２】実施例２記載のカゼインナトリウムをαｓ‐カゼイン、β‐カゼインならびにαｓ‐およびβ‐カゼインを含むκ‐濃縮分画の分画化に包含されるステップを例示した図である。
【図３】スキムミルク中の原型カゼインおよび実施例１記載で得た分画の陰イオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィのプロフィールを示す図面である。
【図４】原型スキムミルク（――）および塩化カルシウム添加後にκ‐カゼイン濃縮分画を酸沈殿させて得た上清中の乳清タンパク質のゲル透過プロフィールを示す図である。
【図５】原型カゼインナトリウムおよびこれより実施例２記載の如くにして得た分画の陰イオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィのプロフィールを示す図である。
【図６】原型カゼインナトリウム（−−−）およびそれより実施例２の如くにして得た後さらにエタノール沈殿法により精製したκ‐カゼイン分画（＿＿）の陰イオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィのプロフィールを示す図である。
【図７】原型カゼインナトリウム（上）および３０℃、ｐＨ１１．０に５．０分間置いた後のカゼインナトリウムの陰イオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィプロフィールを示す図である。
【図８】原型カゼインナトリウム（上）および３０℃、ｐＨ１１．０に５．０分間置いた後のカゼインナトリウムについて得られたキャピラリー電気泳動パターンを示す図である。
【図９】原型カゼインナトリウム（上）および３０℃、ｐＨ１１．０に１５．０分間置いた後のカゼインナトリウムの陽イオン交換高速タンパク質液体クロマトグラフィプロフィールを示す図面である。
【図１０】実施例１および２（それぞれ図１および２）に記載の選択的カルシウム沈殿によりスキムミルクまたはカゼイン塩から得た精製分画の使用を例示している図面である。
【図１】
2004521650.tif 000003
【図２】
2004521650.tif 000004
【図３】
2004521650.tif 000005
【図４】
2004521650.tif 000006
【図５】
2004521650.tif 000007
【図６】
2004521650.tif 000008
【図７】
2004521650.tif 000009
【図８】
2004521650.tif 000010
【図９】
2004521650.tif 000011
【図１０】
2004521650.tif 000012
【国際公開パンフレット】
2004521650.tif 000013
2004521650.tif 000014
2004521650.tif 000015
2004521650.tif 000016
2004521650.tif 000017
2004521650.tif 000018
2004521650.tif 000019
2004521650.tif 000020
2004521650.tif 000021
2004521650.tif 000022
2004521650.tif 000023
2004521650.tif 000024
2004521650.tif 000025
2004521650.tif 000026
2004521650.tif 000027
2004521650.tif 000028
2004521650.tif 000029
2004521650.tif 000030
2004521650.tif 000031
2004521650.tif 000032
2004521650.tif 000033
2004521650.tif 000034
2004521650.tif 000035
2004521650.tif 000036
2004521650.tif 000037
2004521650.tif 000038
2004521650.tif 000039
2004521650.tif 000040
2004521650.tif 000041
2004521650.tif 000042
2004521650.tif 000043
2004521650.tif 000044
2004521650.tif 000045
2004521650.tif 000046
2004521650.tif 000047
2004521650.tif 000048
2004521650.tif 000049
2004521650.tif 000050
2004521650.tif 000051
2004521650.tif 000052
2004521650.tif 000053
2004521650.tif 000054
2004521650.tif 000055
2004521650.tif 000056
2004521650.tif 000057
2004521650.tif 000058
2004521650.tif 000059
2004521650.tif 000060
2004521650.tif 000061
2004521650.tif 000062
2004521650.tif 000063
2004521650.tif 000064
2004521650.tif 000065
2004521650.tif 000066
2004521650.tif 000067
2004521650.tif 000068
2004521650.tif 000069
2004521650.tif 000070
2004521650.tif 000071
2004521650.tif 000072
2004521650.tif 000073
2004521650.tif 000074
2004521650.tif 000075
2004521650.tif 000076
2004521650.tif 000077
【国際調査報告】
2004521650.tif 000078
2004521650.tif 000079
2004521650.tif 000080
2004521650.tif 000081
2004521650.tif 000082