(57)【要約】本発明は、非常に高い比放射活性を有する放射性ハロゲン化合物の生産に対する新規方法に関するものである。上記方法では、生物学的および／または化学的活性が維持された放射性標識化合物の安定性を増進したものである。本発明の最大の特徴点は、放射性ハロゲンの結合直後から、および標識化混合液から放射性ハロゲン化合物を生成している間、または保存のための梱包している間で、ビタミンＣおよび／またはエタノールを放射性標識化合物に添加することにある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）5-ヨウ素化デオキシピリミジンを、40〜60℃の温度で1,4ジオクサンに溶解し；
２）１）で得られる溶液を20〜30℃まで冷却した後、ビス（トリブチルチン）およびトリフェニルホスフィンパラジウムを添加し；
３）上記溶液をアルゴン雰囲気下で100〜110℃、6時間加熱し；
４）回転蒸発（rotary evaporation）により上記溶液の溶媒を除去し；
５）４）で得られる混合物を、クロロホルム：メタノールが４：１である移動相を用いたシリカゲルマトリクスのフラッシュクロマトグラフィーによりクロマトグラフィー分析し；
６）５）で得られる生成物を、過酸化水素を含むリン酸緩衝液中でＮａ125Ｉと2分間反応させ；
７）６）の反応物にアスコルビン酸溶液を添加し；
８）７）で得られる反応混合物から、生成物である5-125I-デオキシピリミジンをＣ１８逆相クロマトグラフィーマトリクスへ吸着させ；
９）上記マトリクスを水で洗浄し；
１０）吸着した上記5-125I-デオキシピリミジンをエタノールにより溶出し；
１１）１０）の溶出物にアスコルビン酸を添加する；
というステップを含む放射性ヨウ素化デオキシピリミジンの合成方法。
【請求項２】
ステップ７）におけるアスコルビン酸の添加量が0.1〜1mg/mlである請求項１に記載の合成方法。
【請求項３】
ステップ１１）におけるアスコルビン酸の添加量が0.1〜1mg/mlである請求項１に記載の合成方法。
【請求項４】
上記デオキシピリミジンが、デオキシウリジンである請求項１に記載の合成方法。
【請求項５】
１）放射性ハロゲン標識ピリミジンヌクレオシドをクロマトグラフィーの固定相に抗酸化剤を含む溶液中で添加し；
２）125Ｉ標識ピリミジンヌクレオシドが吸着した上記固定相を洗浄し；
３）溶出物を得るため、放射性ハロゲン標識ピリミジンヌクレオシドを上記固定相からの溶出する；
というステップを含む放射性ハロゲン標識ピリミジンヌクレオシドの生成方法。
【請求項６】
４）請求項５のステップ３）で得られる溶出物に抗酸化剤を添加する；
というステップをさらに含む請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記抗酸化剤がアスコルビン酸である請求項５に記載の生成方法。
【請求項８】
ステップ４）における上記抗酸化剤がアスコルビン酸である請求項６に記載の生成方法。
【請求項９】
ステップ１）および４）における上記抗酸化剤がともにアスコルビン酸である請求項６に記載の生成方法。
【請求項１０】
上記抗酸化剤の濃度が0.1〜1mg/mlである請求項５に記載の生成方法。
【請求項１１】
上記アスコルビン酸の濃度が0.1〜1mg/mlである請求項９に記載の生成方法。
【請求項１２】
上記固定相がＣ１８逆相マトリクスであり、カラムはステップ２）において水で洗浄され、放射性ハロゲン標識ピリミジンヌクレオシドはステップ３）においてエタノールで溶出される請求項５に記載の生成方法。
【請求項１３】
上記固定相がＣ１８逆相マトリクスであり、カラムはステップ２）において水で洗浄され、放射性ハロゲン標識ピリミジンヌクレオシドはステップ３）においてエタノールで溶出される請求項７に記載の生成方法。
【請求項１４】
上記固定相がＣ１８逆相マトリクスであり、カラムはステップ２）において水で洗浄され、放射性ハロゲン標識ピリミジンヌクレオシドはステップ３）においてエタノールで溶出される請求項９に記載の生成方法。
【請求項１５】
放射性ハロゲン標識ピリミジンヌクレオシドが、125I-標識デオキシウリジンである請求項５に記載の生成方法。
【請求項１６】
放射性ハロゲン標識ピリミジンヌクレオシドが、125I-標識デオキシウリジンである請求項７に記載の生成方法。
【請求項１７】
放射性ハロゲン標識ピリミジンヌクレオシドが、125I-標識デオキシウリジンである請求項９に記載の生成方法。
【請求項１８】
放射性ハロゲン標識ピリミジンヌクレオシドが、125I-標識デオキシウリジンである請求項１２に記載の生成方法。
【請求項１９】
放射性ハロゲン標識ピリミジンヌクレオシドが、125I-標識デオキシウリジンである請求項１３に記載の生成方法。
【請求項２０】
放射性ハロゲン標識ピリミジンヌクレオシドが、125I-標識デオキシウリジンである請求項１４に記載の生成方法。
【請求項２１】
125I-標識デオキシピリミジン、エタノール、および、アスコルビン酸を含む構成物。
【請求項２２】
（１）125I-標識ステロイドを得るために、クロラミンＴの存在下でステロイドの6-CMO-ヒスタミン誘導体をナトリウム１２５Ｉと反応させ；
（２）濃度が1〜5mg/mlとなるまでアスコルビン酸を添加し；
（３）逆相固相（reverse-phase solid phase）のクロマトグラフィーにより125I-標識ステロイドを精製し、メタノール／水（MeOH/H2O）の濃度勾配を利用して125I-標識ステロイドを溶出し；
（４）上記精製された125I-標識ステロイドに、溶出したメタノール／水の体積に基づいて5〜20倍量のエタノールを添加する；
というステップを含む放射性ハロゲン標識ステロイド化合物の合成方法。
【請求項２３】
125I-標識ステロイド化合物；および
エタノールと、アスコルビン酸溶液と、エタノールおよびアスコルビン酸溶液とからなる一群から選ばれる安定化溶液；
を含む構成物。
【請求項２４】
上記ステロイドが、エストラジオール、プロゲステロンまたは17-ヒドロキシプロゲステロンである請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
上記ステロイドが、エストラジオール、プロゲステロンまたは17-ヒドロキシプロゲステロンである請求項２４に記載の構成物。
【請求項２６】
上記放射性ハロゲン標識ステロイドが、1000〜2000Ci/mmolの比活性を有する請求項２４に記載の構成物。
【請求項２７】
１）クロラミンＴ（ＣＴ）存在下で、アスコルビン酸緩衝剤を1〜5mg/mlの濃度で含む緩衝液中にて、Ｎａ１２５Ｉタンパク質を標識タンパク質を得るために反応させ；
２）アスコルビン酸を1〜5mg/mlの濃度で任意に含む緩衝液で、ゲルろ過クロマトグラフィーにより、クロラミンＴから標識タンパク質を精製し；および
３）アスコルビン酸を1〜5mg/mlの濃度で含む緩衝液中の標識タンパク質を回収する；
というステップを含む125I-標識タンパク質の調整方法。
【請求項２８】
放射性ハロゲン標識タンパク質の比活性が10〜40mCi/ナノグラムであり、アスコルビン酸を含む緩衝液に放射性ハロゲン標識タンパク質を含む構成物。
【請求項２９】
上記タンパク質が抗体である請求項２８に記載の構成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願＞
本願は、アメリカ合衆国仮出願60/299,762の35 U.S.C § 119（2001年6月22日出願）に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、放射性ハロゲン化化合物を大量に生成する方法に関するものであり、同化合物としては放射性標識ヌクレオチドおよびヌクレオシド、または、ステロイド、抗体等のタンパク質が好適である。本発明は、放射性化合物の調整および／または保存の間に抗酸化剤を添加することで、放射性化合物の生物学的および化学的活性が維持できるという発見によるものである。上記抗酸化剤としては、エタノールまたはビタミンＣ（アスコルビン酸）、またはこの両者の混合物であることが好ましい。本発明の一実施形態として、ハロゲン族の同位体（放射性ハロゲン族）によるデオキシウリジンの大量生成の新規技術を挙げる。
【背景技術】
【０００３】
放射線源は、多くの診断医療において、組織に導入するためであったり、患者による摂取のために必要とされている。そのような放射線源は、診断が完了するまでの数時間の寿命をもつことが好ましいと同時に、放射同位体は衰退しないので放射線による組織への損傷をさけることが十分可能な程度の短さでなくてはならない。またそのような放射線源は化学的毒性がないものであることが好ましい。放射性同位体によって標識された5'-放射性ハロゲン-2'-デオキシウリジンは上述した放射線源にあたる。具体的には、ヨウ素の放射性同位体（“放射性ヨウ素”）によって標識されたイドクスウリジンが上述した放射線源にあたる。
【０００４】
ハロゲン族の放射性同位体の寿命は、ハロゲンの種類によって数分から数日とそれぞれ異なっている。トレーサー量（tracer quantites）において、放射線ハロゲン族に化学的毒性はない。従って、ハロゲン族の放射活性同位体は、医薬的および放射性医薬的生成物の製造において、様々な利用方法が開発されている。そのような生成物としては、ヨウ素の放射性同位体で標識されたイドクスウリジンがある。潜在的重要な利用法（potential important use）の１つとしては、メトトレキサートおよび5-[125I]ヨード-2'-デオキシウリジン（125IudR）による腫瘍性髄膜炎の治療である。ヨウ素の放射性同位体で標識されたイドクスウリジンはまた、癌に対する重要な治療法にも用いられるだろう。参考として本願に包含される米国特許5,077,034がある。その他の利用法として、結腸直腸癌、肝臓癌、細動脈硬化症の治療への利用も可能である。
【０００５】
放射性ハロゲン化したステロイドやタンパク質は、受容体に対してリガンドのように結合する被験者（a subject）または生体内分析におけるそれら分子の結合部位を映し出すものとして利用できる。
【０００６】
放射性ハロゲン族を用いた化合物の標識にはいくつかの方法が用いられている。これらの方法には、生成量、生成物の化学的純度（chemical purity）、および安定性に限界がある。加えて、化合物の生成に必要とする時間には、いくつかの放射性同位体の短い寿命に合わせなくてはならないため、限界がある。
【０００７】
放射性ハロゲン化合物の生成方法を選択する場合に、技術的および経済的な考慮が重要となる。従って、例えばヨウ素の放射性同位体で標識されたイドクスウリジンといった、ステロイド、タンパク質または、ヌクレオチドおよびヌクレオシドを用いた放射性ハロゲン化合物の、より効率的で、低コストな生成方法が必要とされている。
【０００８】
本発明に係る放射性標識化合物の大量生成は、簡便で、迅速であり、高収率で生成することができ、容量を増加することも可能で、安定性が増強した放射性標識化合物を提供できる。一般的な手法では50〜500μCiの容量を生成する。本発明の方法では、100mCi〜1Ci単位の量を、上述した従来の方法で要する時間よりも短時間で生成することができる。生成される標識ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはそれらの誘導体に対する生成物、または標識ステロイド生成物の比活性は1000〜3000Ci/mmolに達する。生成物における標識タンパク質または標識ペプチド生成物の比活性は10〜40mCi/ngに達する。
【０００９】
本発明に係る他の特徴および効果は、以下に示す詳細な説明および図面により明らかになるであろう。ただし本発明はこれらに限定されるものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は、放射性ハロゲン化合物の調整方法に関するものである。放射性ハロゲンとしては、フッ素や臭素の放射性同位体といった何れのハロゲン放射性同位体であってもよく、125I、123I、131Iから選択された放射性ヨウ素が好ましい。調整される化合物とは、標識されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはそれらの誘導体、またはステロイド、またはタンパク質やペプチドである。ステロイドとしてはエストラジオール、プロゲステロン、および17（OH）プロゲステロンが好ましい。タンパク質としては抗TSH抗体といった抗体が好ましい。
【００１１】
本発明の好ましい実施の形態としては、デオキシピリミジン、特にデオキシウリジンなどの放射性標識ヌクレオチドまたはヌクレオシドを、ハロゲン族元素の放射性同位体で標識するというものである。本発明の方法は、短時間で大量に放射性標識化合物の合成を達成するものである。
【００１２】
本発明は、ステロイド、抗体、およびヌクレオシド、ヌクレオチドまたはそれらの誘導体を標識化するための従来生成方法の改善を図るものである。ウリジン、チミン、シトシンといったピリミジンヌクレオシドまたはヌクレオチド、およびそれらの誘導体が、本発明に好適なヌクレオシド、ヌクレオチドである。本発明の合成方法は、リボヌクレオシドやデオキシリボヌクレオシド、および2',3'ジデオキシヌクレオシドおよび、5'ガラクトシル誘導体ヌクレオシドといった5'糖誘導ヌクレオシドおよび、一リン酸、二リン酸、三リン酸ヌクレオチドに関連する類似体など、ピリミジンヌクレオシドまたはその誘導体であれば適用することができる。
【００１３】
本発明は、また放射性ハロゲン標識ステロイドおよびタンパク質の生産にも応用することができるものである。画像処理プロトコルまたは治療学プロトコル（imaging or therapeutic protocols）において一般的に使用されているものとして、抗体が、本発明に用いられているタンパク質として好適である。
【００１４】
つまり本発明は、標識化反応が完了した標識化反応溶液への抗酸化剤の添加にある。抗酸化剤の存在下にて、ピリミジンヌクレオシドまたはヌクレオチド、およびそれらの誘導体を分離および梱包することにより、高い生物活性を有する標識生成物を生成することができる。
【００１５】
本発明の好ましい実施の形態では、ピリミジンヌクレオシドがヨウ素の放射性同位体によって標識される。例としてイドクスウリジンを挙げる。
【００１６】
ハロゲン化ピリミジンヌクレオシドの合成（方法）は、従来から知られている。典型的な合成方法は、カシスら（Kassis et al.）による米国特許出願5,720,935、4,851,520およびPCT出願WO 01/05439に記載されており、本願ではこれら基礎出願を包含するものである。またバラノスカ-コルチルウィックら（Baranowska-Kortylewicz et al.）による米国特許出願5,468,853にも別の合成方法が記載されており、本願ではこの基礎出願も包含するものである。バラノスカ−コルチルウィックらはまた、5'糖誘導ピリミジンヌクレオシドの合成および癌治療におけるその利用についてもPCT出願WO 01/03745に記載しており、本願ではこの基礎出願も包含するものである。
【００１７】
同じく、放射性ヨウ素を含む放射性ハロゲンでのステロイド化合物およびタンパク質の放射性標識方法も従来から知られている。例えば、メロ・エ・シルバら（Melo e Silva et al.）によって記載されたAppl. Radiat. Isot. 54:227-239(2000)および米国特許出願5,302,700がそれぞれ挙げられる。
【００１８】
本発明は、これらの合成方法を改良するものである。ピリミジンヌクレオシドまたはヌクレオチドの標識は、カシスらまたはバラノスカ−コルチルウィックらの方法に沿うものであるが、分離と保管の工程の間で標識生成物の衰退を防ぐため、放射性ハロゲン化反応の後に抗酸化剤を含むものである。その結果として、非常に高い比放射活性を有する生成物の調整が可能となる。
【００１９】
上述したようなピリミジンヌクレオシド、ヌクレオチドまたはそれらの誘導体の標識化に関する本発明の方法として、ピリミジンヌクレオシド、ヌクレオチドまたはそれらの誘導体は、好ましくは1,4ジオクサンである溶媒に、40〜60℃、好ましくは約50℃にて溶解される。溶液は、20〜30℃、好ましくは室温まで冷却され、アルカリ金属触媒（alkylmetallic catalyst）（ビス（トリブチルチン）が好ましいがこれに限定されるものではない）、およびホスフィン（水素化リン）パラジウムが添加される。次に溶液は、100〜110℃、好ましくは約105℃に加熱され、好ましくは窒素またはアルゴンである不活性雰囲気下にて5〜7時間放置される。溶媒は好ましくは真空装置を用いた蒸発よって取り除かれる。次に、クロロホルムとメタノールからなる移動相を用いたシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーにより、金属化された（スタニレイトされた（stannylated））生成物が得られる。上記メタノールは、直線濃度勾配として最終濃度がクロロホルム：メタノール＝４：１となるまで添加される。フラクションは回収され、金属化（スタニレイト）されたピリミジンは薄層クロマトグラフィーにより検出される。生成物はヘキサン：エーテル＝１：１の移動相を用いたシリカゲルの薄層クロマトグラフィーにおいてＲｆ0.3を示す。その後、金属化されたピリミジンは、過酸化水素またはヨウ素、または他の酸化物と、好ましくはリン酸緩衝剤である緩衝剤とが含まれる溶液において、Na125Iまたは他の放射性ハロゲンと反応させる。ここで、放射性ハロゲンのうち、ヨウ素が高い比活性生成物の高生成率をもたらす傾向にある。しかしながら、生成物は疎水性で、不純物が含まれているため、医学的利用には不適である。従って、ヨウ素を医療用サンプルの調整に用いる場合には細心の注意を払い、ヨウ素を出来る限り除く必要がある。酸化剤である過酸化水素は水溶性であるため、精製過程で容易に取り除くことが出来るが、一般的には若干生成物から得られてしまう。過酸化水素を酸化剤として使用する場合は、一般的には0.1〜0.5mg/mlの濃度で用いる。
【００２０】
この酸化工程は、米国特許5,720,935に記載されている。ｐＨは酸性から中性とする。すなわちｐＨはおよそ7、好ましくはｐＨ5〜8、より好ましくはｐＨ6〜8または7〜8で、ｐＨ7.4が一般的である。またハロゲンのカリウム塩が使用される。混合液は、1〜5分、好ましくは2〜4分、より好ましくは約2分間攪拌される。そして好ましくはビタミンＣである抗酸化剤が、0.1〜1mg/ml、好ましくは0.3〜1mg/ml、より好ましくは約0.5mg/mlの濃度で、最終の梱包と保存のために溶液に添加される。
【００２１】
生成物は、例えばガラス製のシリンジボトルやスクリューキャップ管といった従来からあるような手段によって梱包される。
【００２２】
抗酸化剤の添加量は標識化合物の量により変化するものではない。しかしながら、標識化合物溶液が100mCi以上であった場合は、分離工程と梱包のための最終生成物との両方に抗酸化剤を添加すべきである。一方、もし標識化合物溶液が100mCi未満であった場合は、分離工程のみに抗酸化剤を添加すれば十分であり、最終生成物はエタノール中に梱包される。
【００２３】
最終生成物は100〜200mCiの放射性濃度において梱包されるのが好ましい。
【００２４】
放射性標識化合物がエタノール中に解ける範囲において、抗酸化剤としてビタミンＣの代わり、またはビタミンＣとともに95〜100％エタノール、好ましくは100％エタノールを用いることができる。従って、放射性標識ステロイドが予定生成物である場合には、カラム精製および梱包工程の両方にてエタノールが適用される。一方、エタノールと接触することで変性する傾向にある抗体やタンパク質があるため、本発明では放射性標識タンパク質を生成する際の抗酸化剤としてはビタミンＣが好ましい。
【実施例】
【００２５】
〔実施例１〕放射性標識IUdrの生成
7mmolの標識されていないイドクスウリジン（IudR、2.5g）を、50Ｃで100mlの無水ジオクサンに溶解した後、その後室温まで冷却した。0.125gのビス（トリフェニルホスファイン）パラジウム二塩化物および6g（15mmol）のヘキサブチルジチンを添加し、混合液はアルゴン雰囲気下で110℃、6時間還流（reflux）した。溶媒は真空装置を用いて取り除いた。生成物はクロロホルム：メタノール＝４：１の溶液に再溶解し、さらにシリカゲルカラムのクロマトグラフィーに添加し、クロロホルム中のメタノールが0〜20％となるような直線濃度勾配により溶出し、精製した。生成物はメタノール濃度10〜15％のところで溶出した。（メタノール濃度0〜20％の濃度勾配を50本の管に回収し、生成物は25〜30本目の管に溶出された。）生成物は、紫外線蛍光（ultraviolet fluorescence）または、ヘキサン：エーテル＝１：１のシリカＴＬＣプレートのヨウ素染色（iodine staining）により同定される。要求したBu3SnUdR生成物はＲｆが0.3を呈する淡黄色油（a pale yellow oil）として得られた。
【００２６】
Na125I（200mCi、エム・ディー・エス  ノルジオン（MDS Nordion）製）を、0.1mgヨウ素を含む250mlリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ7.4）中で、100μgのBu3SnUdR溶液に添加し、反応を２分間行った。アスコルビン酸を0.5mg/mlの濃度になるように添加した溶液は、予め10mlのエタノールで洗浄したのち10mlの水で３回洗浄したＳｅｐ−ＰａｋTMＣ１８カートリッジに通した。カートリッジは、遊離したヨウ素を除去するために1mlの水で１回洗浄し、125IUdrは1mlのエタノールで溶出し、放射活性を含むフラクションを回収した。エタノールに1mg/mlで溶解したアスコルビン酸溶液を上記溶出液に添加した。約2000Ci/mmolの比活性をもつ180mCiの125IUdrが得られた。
【００２７】
〔実施例２〕タンパク質の標識
132mlの0.1molリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ8.2）を100mgのポリクローナル抗ＴＳＨ抗体を含むバイアルに添加し、10秒間攪拌した。この溶液に、7mCiのNa125Iを添加したのち、1mg/mlクロラミンＴ（ＣＴ）緩衝液40mlを添加し、1分間攪拌した。この溶液に、5mg/mlのアスコルビン酸緩衝液40mlを添加し、10秒間攪拌した。ヨウ素化されたポリクローナル抗ＴＳＨ抗体を、その後Ｇ７５カラム（10ml）に通し、0.01Mリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ7.4）により溶出した。溶出液は１３Ｘ１００ＭＭ試験管に各試験管0.5mlで2分間/管の割合で回収した（生成物は６〜１０本目の試験管に溶出された）。1mg/mlの5％ＢＳＡリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ7.4）に、アスコルビン酸緩衝液1mlを添加した。4mCiの125Iポリクローナル抗ＴＳＨ抗体が得られた。
【００２８】
〔実施例３〕ステロイドの標識
50mlのＤＭＦおよび100mlの0.2Mリン酸緩衝液（ｐＨ7.4）は、4mgのエストラジオール-6-CMO-ヒスタミン水溶液を含むバイアルに添加された。この溶液に、10mCiのナトリウムI-125を添加し、〜10秒間攪拌した。この溶液にさらに50mlの1mg/mlクロラミンＴ（ＣＴ）溶液を添加し、3分間攪拌した。その後、50mlのアスコルビン酸緩衝液を添加し、メタノール／水（MeOH/H2O）勾配を用いたＨＰＬＣに注入した。放射活性を含む0.5mlフラクションが45分後に回収された。エタノールを10ml添加した。約2000Ci/mmolの比活性をもつ2.1mCiの125Iエストラジオールが得られた。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、標識されたイドクスウリジンの合成を示す図である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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2004536092.tif 000015
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004536092.tif 000016
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004536092.tif 000017
【国際調査報告】
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2004536092.tif 000019
2004536092.tif 000020
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