(57)【要約】本発明は、代謝共役型グルタミン酸受容体細胞内シグナル伝達分子の活性をモジュレートする方法および組成物を提供する。本発明は、細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５の活性をモジュレートする方法および組成物を提供する。本発明は、細胞または組織中のカルシウムチャネルの機能をモジュレートする方法を提供する。本発明は、カルシウムチャネル機能障害を治療する方法を提供する。本発明は、そのような治療に使用するための、代謝共役型グルタミン酸受容体細胞内シグナル伝達分子カゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５の活性をモジュレートする薬剤を同定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞または組織中のカゼインキナーゼＩ活性またはサイクリン依存性キナーゼ５活性をモジュレートする方法であって、上記細胞または組織を代謝共役型グルタミン酸受容体細胞内シグナル伝達分子の活性を改変する化合物の有効量と接触させることを含んでなり、上記細胞または組織と上記化合物との接触がカゼインキナーゼＩ（CKI）またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性のモジュレーションをもたらす上記方法。
【請求項２】
カゼインキナーゼＩ活性（CKI）をモジュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
サイクリン依存性キナーゼ５活性をモジュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記化合物がCKI上の抑制自己リン酸化部位のリン酸化をモジュレートする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
CKIがCKIεである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
CKIがCKIαである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
CKIがCKIδである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
CKIがCKIγである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
代謝共役型グルタミン酸受容体細胞内シグナル伝達分子がPLCβである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
代謝共役型グルタミン酸受容体細胞内シグナル伝達分子がカルシニューリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
代謝共役型グルタミン酸受容体細胞内シグナル伝達分子がPP1である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
代謝共役型グルタミン酸受容体細胞内シグナル伝達分子がPP2Aである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
代謝共役型グルタミン酸受容体細胞内シグナル伝達分子の活性を改変する化合物が代謝共役型グルタミン酸受容体アゴニストであり、細胞または組織と上記アゴニストとの接触がカゼインキナーゼＩまたはサイクリン依存性キナーゼ５の活性を増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
代謝共役型グルタミン酸受容体細胞内シグナル伝達分子の活性を改変する化合物が代謝共役型グルタミン酸受容体アンタゴニストであり、細胞または組織と上記アゴニストとの接触がカゼインキナーゼＩまたはサイクリン依存性キナーゼ５の活性を減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
目的の細胞または組織中のカゼインキナーゼＩの活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって：(a)上記細胞または組織中のカゼインキナーゼＩ活性の第１レベルを決定するステップ：(b)上記細胞または組織を試験化合物と接触させるステップ；および(c)上記細胞または組織中のカゼインキナーゼＩ活性の第２レベルを決定するステップを含んでなる方法であって、カゼインキナーゼＩ活性の上記第１レベルと上記第２レベルとの差がカゼインキナーゼＩ活性をモジュレートする上記試験化合物の能力を示す上記方法。
【請求項１６】
目的の細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよびサイクリン依存性キナーゼ５の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって：(a)上記細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよびサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルを決定するステップ；(b)上記細胞または組織を試験化合物と接触させるステップ；および(c)上記細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよびサイクリン依存性キナーゼ５活性の第２レベルを決定するステップを含んでなり、カゼインキナーゼＩおよびサイクリン依存性キナーゼ５活性の上記第１レベルと上記第２レベルとの差がカゼインキナーゼＩおよびサイクリン依存性キナーゼ５活性をモジュレートする試験化合物の能力を示す上記方法。
【請求項１７】
目的の細胞または組織中のカルシウムチャネルの活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって：(a)目的の細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルを決定するステップ；(b)上記細胞または組織中のカルシウムチャネル活性の第１レベルを決定するステップ；(c)上記細胞または組織を試験化合物と接触させるステップ；(d)上記細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第２レベルを決定するステップ；ならびに(e)上記細胞または組織中のカルシウムチャネル活性の第２レベルを決定するステップを含んでなり、カゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルと第２レベルとの差ならびにカルシウムチャネル活性の第１レベルと第２レベルとの差がカルシウムチャネルの活性をモジュレートする試験化合物の能力を示す上記方法。
【請求項１８】
細胞中のカルシウムチャネルの活性を調節する方法であって、カゼインキナーゼＩまたはサイクリン依存性キナーゼ５の活性をモジュレートする化合物の有効量を投与することを含んでなり、カゼインキナーゼＩまたはサイクリン依存性キナーゼ５の活性のモジュレーションが上記細胞中のカルシウムチャネルの活性に改変をもたらす上記方法。
【請求項１９】
上記細胞がニューロンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
カルシウムチャネル活性の増加または減少を特徴とする障害を治療する方法であって、カゼインキナーゼＩまたはサイクリン依存性キナーゼ５の活性をモジュレートする化合物の有効量を投与することを含んでなる上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国国立保険研究所（National Institutes of Health）より授与された認可番号MH40899、DA10044およびAG09464の政府支援によりなされたものである。米国政府は本発明にある一定の権利を有する。
【０００２】
関係出願
本特許出願は、本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、2001年６月18日出願した米国仮出願第60/298,978号の35 U.S.C.§119(e)のもとにおける恩恵を主張する。
【０００３】
１  技術分野
本発明は代謝共役型グルタミン酸受容体細胞内シグナル伝達分子の活性をモジュレートする方法および組成物に関する。本発明は細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５の活性をモジュレートする方法および組成物に関する。本発明は細胞または組織中のカルシウムチャネルの機能をモジュレートする方法に関する。本発明は、カルシウムチャネル機能障害を治療する方法に関する。本発明は、このような治療に使用するための、代謝共役型グルタミン酸受容体細胞内シグナル伝達分子、カゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５の活性をモジュレートする薬剤を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
２  発明の背景
カゼインキナーゼＩ（「CKI」または「CK1」）は、単離されかつ特性決定された最初のセリン／トレオニンプロテインキナーゼの１つであった（Gross, S.D.およびR.A. Anderson. 1998. Cell Signal 10:699-671）。これは細胞の核および細胞質中に見出すことができる遍在性酵素であって、細胞骨格または細胞膜と結合している。CKI（CK1）ファミリーは、少なくとも７種の異なる遺伝子（CKIα、β、γ1、γ2、γ3、δ、ε；Desdouits, F.ら 1995. J. Biol. Chem. 270:8772-8778）によりコードされた複数のイソ型のファミリーである。これらのイソ型は触媒ドメイン内で50％を超えるアミノ酸同一性を示すが、多様なカルボキシ末端を含有する（Graves, P.R.およびP.J. Roach. 1995. J Biol. Chem. 270:21689-21694；Cegielska, A.ら 1998. J. Biol. Chem. 273:1357-1364；Gietzen, K.F.およびD.M. Virshup. 1999. J. Biol. Chem. 274:32063-32070）。少なくとも２種のCKIイソ型、CKIδおよびCKIεはそれらのCOOH-末端における自己リン酸化により調節されると報じられている。これらの研究は、リン酸化COOH-末端が酵素活性を抑制する擬似基質として作用しうることを示唆する。COOH-末端の末端切断または脱リン酸化による自己リン酸化の消失は、キナーゼ活性を増加することが見出されている（Graves, P.R.およびP.J. Roach. 1995. J. Biol. Chem. 270:21689-21694；Cegielska, A.ら 1998. J. Biol. Chem. 273:1357-1364）。
【０００５】
中枢神経系（CNS）において、CKIは概日リズム（Camacho, F.ら2001. FEBS Lett. 489:159-165）および細胞内輸送（Murakami, A.ら 1999. J. Biol. Chem. 274:3804-3810；Panek, H.R.ら 1997.EMBO J. 16:4194-4204；Wang, X.ら 1996. Mol. Cell. Biol. 16: 5375-5385）を調節する役割を果たすようである。新線条体（neostriatum）において、CKIはDARPP-32（ドーパミンおよびcAMPで調節されるリンタンパク質、分子量32kDa；「DARPP32」としても知られる）をSer137においてリン酸化することが見出されている（Desdouits, F.ら 1995. J. Biol. Chem. 270:8772-8778）。Thr34におけるcAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）によるリン酸化はDARPP-32をプロテインホスファターゼ-1（PP1）のインヒビターに変換し、これは新線条体においけるドーパミンの作用にとって重要なプロセスである（Greengard, P.ら 1998. Brain Res. Rev. 26:274-284；Greengard, P.ら 1999. Neuron 23:435-437）。ホスホ-Thr34はPP2B（カルシニューリンまたはCa2+/カルモジュリン依存性ホスファターゼとも呼ばれる）により脱リン酸化され、Serl37のリン酸化は、ホスホ-Thr34のPP2Bにより脱リン酸化される能力に影響を与える（Desdouits, F.ら 1995. Proc.Natl. Acad. Sci. USA 92:2682-2685；Desdouits, F.ら 1998. Biochem.J. 330:211-216）。サイクリン依存性キナーゼ５（「cdk5」、「Cdk5」または「CDK5」）は元来、p34cdc2プロテインキナーゼの同族体と同定された。その後の研究は、Cdc2と異なり、Cdk5キナーゼ活性は分裂中の細胞に検出されないことを示した。代わりに、Cdk5の活性型は分化したニューロンにのみ存在し、ここでp35と呼ばれるニューロン特異的35kDa調節サブユニットと会合する。Cdk5/p35は発生中および成熟神経系において様々な役割を果たす。
【０００６】
Cdk5またはp35のいずれかをコードする遺伝子が破壊されているマウスの研究は、両方の突然変異体が大脳皮質（cerebral cortex）の層構造に異常が現れることを示した（Chae, T.ら 1997. Neuron 18:29-42；Ohshima, T.ら 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11173-11178）。Cdk5/p35は軸索成長円錐（axonal growth cone）のリーディングエッジに局在し、培養ニューロン中のCdk5の不活性化は神経突起成長を抑制する。最近の研究は、Cdk5の誤調節をアルツハイマー病と結び付けている（Kusakawa, G.ら 2000. J. Biol. Chem. 275:17166-17172；Lee, M. S.ら 2000. Nature 405:360-364；Nath, R.ら 2000. Biochem. Biophys. Res. Commun. 274:16-21；Patrick, G. N.ら 1999. Nature 402:615-622）。これらの研究において、カルパインの作用によるp35のp25への変換は、活性化の延長およびCdk5の局在化の改変を引起す。順に、Cdk5/p25はタウ・タンパク質を高リン酸化し、細胞骨格構造を破壊し、そして一次ニューロンのアポトーシスを促進しうる。最近の研究は、Cdk5がDARPP-32をThr75にてリン酸化することも示している（Nishi, A.ら 2000. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:12840-12845；Bibb, J. A.ら 1999. Nature 402:669-671）。Cdk5によるThr75におけるDARPP-32のリン酸化は、PKAによるDARPP-32中のThr34のリン酸化に影響を与え、DARPP-32/PP1カスケードに重要な調節上の役割を果たす（Bibb, J. A.ら 1999. Nature 402: 669-671）。最後に、最近の研究は、グルタミン酸アンタゴニストが抗癌性であることを示唆し、その効果はカルシウム依存性であった（Cavalheiro, E. A.ら 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:5947-5948；Rzeski, W.ら 2001. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:6372-6377）。
【０００７】
従って、以上記載したCNSにおけるCKIおよびCdk5の作用に関する知識にも関わらず、これら２種のキナーゼの最初のメッセンジャーによる調節についてわかっていることは極めて少ない。それ故に、当技術分野において、CKIおよびCdk5の調節に関係する疾患または障害を治療するのに利用しうる新規の組成物または医薬を開発するために使用する新しいスクリーニング方法を提供する必要性がある。さらに、少なくとも部分的に、CKIおよび／またはCdk5により調節される細胞内シグナル伝達経路の異常または調節障害に由る疾患または障害の治療を開発する必要がある。本発明はそのような方法および組成物を提供する。
【０００８】
本特許出願の第２節、またはあらゆる他の節におけるあらゆる参考文献の引用または確認は、そのような参考文献が本発明に先行する技術として利用しうることを容認するとみなすものではない。
【発明の開示】
【０００９】
３  発明の概要
本発明は、目的の細胞または組織中のカゼインキナーゼＩ（「CKI」または「CK1」）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（「Cdk5」、「cdk5」または「CDK5」）活性をモジュレートする方法であって、目的の細胞または組織を代謝共役型グルタミン酸受容体（mGluR）細胞内シグナル伝達分子の活性を改変する化合物の有効量と接触させることを含んでなり、ここで上記細胞または組織と上記化合物との接触がカゼインキナーゼＩまたはサイクリン依存性キナーゼ５の活性のモジュレーションをもたらす上記方法を提供する。
【００１０】
本発明は、カルシウムチャネルの活性を調節する方法であって、本発明の化合物、例えば、本発明の方法により同定した化合物の有効量を（例えば、個人、患者または動物に）投与することを含んでなり、ここで上記化合物がカゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性をモジュレートし、そしてCKIまたはCdk5活性のモジュレーションがニューロンのカルシウムチャネルの活性の改変をもたらす上記方法を提供する。特定の実施形態においては、上記カルシウムチャネルは興奮性細胞、例えばニューロン中にある。他の実施形態においては、上記方法は、CKIおよびCdk5の活性を増加するためのmGluRアゴニストの投与に関わり、それによりカルシウムチャネルの活性を改変する。
【００１１】
本発明は、目的の細胞または組織中のカゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性をモジュレートする薬剤、医薬または化合物を同定する、in vivo、in situ、およびin vitroの方法を提供する。そのような方法は、単独でまたはお互いと一緒に使用することができる。一実施形態においては、本発明の方法は、目的の細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルを決定するステップ；上記細胞または組織を試験化合物と接触させるステップ；および上記細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第２レベルを決定するステップを含んでなり、ここでカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルと第２レベルとの差がカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性をモジュレートする試験化合物の能力を示す。
【００１２】
他の実施形態においては、本発明の方法は、目的の細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルを決定するステップ；目的の細胞または組織中のカルシウムチャネル活性の第１レベルを決定するステップ；上記細胞または組織を試験化合物と接触させるステップ；上記細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第２レベルを決定するステップ；ならびに上記細胞または組織中のカルシウムチャネル活性の第２レベルを決定するステップを含んでなり、ここでカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルと第２レベルとの差ならびにカルシウムチャネル活性の第１レベルと第２レベルとの差がカルシウムチャネルの活性をモジュレートする試験化合物の能力を示す。
【００１３】
本発明はまた、CKIまたはCdk5の活性をモジュレートしうる薬剤を同定するin vivoの方法も提供する。そのような方法は、単独でまたは本明細書に開示したin vitroおよびin situの方法と一緒に使用することができる。１つのそのような方法は、薬剤の非ヒト哺乳類動物への投与を含むものである。次いでCKIおよび／またはCdk5の活性化の量（および／または割合）を決定する。活性化の量（および／または割合）が薬剤の不在のもとと比較して、薬剤の存在のもとで増加するかまたは減少するときに、薬剤はCKIおよび／またはCdk5の活性をモジュレートすることができると同定される。好ましい実施形態においては、非ヒト哺乳類動物はげっ歯類である。さらに好ましい実施形態においては、げっ歯類はマウスである。
【００１４】
本発明はまた、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害を潜在的に改善しうるおよび／または治療に使用しうる薬剤を選択する目的で、潜在的薬剤（または医薬または化合物）をスクリーニングする方法も提供する。
【００１５】
本発明はまた、薬剤（または医薬または化合物）を同定する方法、例えば、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害の治療法に使用することができる医薬の医薬スクリーニングアッセイも提供する。
【００１６】
本発明はまた、カゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５(Cdk5)の活性をモジュレートする組成物も提供する。本発明はまた、カゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５(Cdk5)の活性のモジュレーションを経由してカルシウムチャネルの活性をモジュレートする組成物も提供する。
【００１７】
本発明はさらに、CKIおよび／またはCdk5の活性をモジュレートし、それにより、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害を改善することができる医薬を開発するための合理的医薬設計を実施する方法も提供する。
【００１８】
一実施形態においては、本発明は、目的の細胞または組織中のサイクリン依存性キナーゼ５の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって：(a)目的の細胞または組織中のサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルを決定するステップ：(b)上記細胞または組織を試験化合物と接触させるステップ；および(c)上記細胞または組織中のサイクリン依存性キナーゼ５活性の第２レベルを決定するステップを含んでなり、ここでサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルと第２レベルとの差がサイクリン依存性キナーゼ５活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、そしてサイクリン依存性キナーゼ５活性のモジュレーションが代謝共役型グルタミン酸受容体の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する診断および治療の方法であって、限定されるものでないが、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害の治療における本発明の組成物または化合物の使用を含む上記方法も提供する。
【００２０】
一態様においては、本発明は、カルシウムチャネル活性（例えば、カルシウムチャネル電流）の増加または減少によることを特徴とする神経症状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする被験者に本発明の化合物の有効量を投与し、CKIおよび／またはCdk5活性をモジュレートして、その結果、mGluRシグナル伝達経路のモジュレーションを経由してカルシウムチャネル活性を増加または減少させることを含んでなる上記方法を提供する。一実施形態においては、mGluRシグナル伝達経路は：PLCβと結合したＧタンパク質を刺激するmGluRl受容体の活性化、IP3-感受性ストア（IP3-sensitive store）から放出されるCa2+によるCa2+/カルモジュリン依存性ホスファターゼ、カルシニューリン（PP2B）の活性化、カルシニューリンによるCK1εの抑制的自己リン酸化部位の脱リン酸化を含んでなり、キナーゼ活性の増加がもたらされる。
【００２１】
本発明は、個人（例えば、患者）または動物被験者におけるmGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害を、CKIおよび／またはCdk5活性をモジュレートする本発明の化合物の有効量を投与することによって治療する方法を提供する。一実施形態においては、上記薬剤はCKIおよび／またはCdk5の活性を促進または増加する。他の実施形態においては、上記薬剤はCKIおよび／またはCdk5の活性を抑制または減少する。
【００２２】
本発明は、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害、疾患および／または症状の症候を示す患者または被験者の上記症候を改善することができる本発明の薬剤（または医薬または化合物）を投与する方法を提供する。ある特定の実施形態においては、本発明は、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害、疾患および／または症状の症候を示す患者または被験者の上記症候を改善することができる、本明細書に開示した方法により同定された薬剤を投与する方法を提供する。他の実施形態においては、mGluR活性のアゴニスト（agonist）をmGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたは カルシウムチャネルに関係する障害を治療するために使用することができる。さらに他の実施形態においては、mGluR活性のアンタゴニスト（antagonist）をmGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療するために使用することができる。
【００２３】
本発明はまた、カゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性をモジュレートする組成物も提供する。本発明はまた、カゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性のモジュレーションを経由するカルシウムチャネルの活性をモジュレートする組成物も提供する。
【００２４】
本発明はまた、本明細書に開示した本発明の薬剤（医薬または化合物）の医薬組成物も提供する。本発明は、CKIおよび／またはCdk5活性を調節するための、およびmGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を診断するまたは治療するための医薬組成物を包含する。正常機能が喪失すると上記疾患または障害の表現型が出現するので、代謝共役型グルタミン酸受容体（mGluR）シグナル伝達経路の活性化、またはCKIおよび／またはCdk5活性（例えば、下流活性化）の増加は、このような障害の症候を示す個人の症候の改善を促進する。
【００２５】
3.1.  定義
本明細書に使用される用語「モジュレート（modulate）」または「モジュレーション（modulation）」はその通常の意味を有し、用語「増強する（enhance）」、「抑制する（inhibit）」および「模倣する（mimic）」の意味を包含する。活性の「モジュレーション」は、アゴニストまたはアンタゴニストを投与することによる活性の増加または減少であってもよい。
【００２６】
本明細書に使用される用語「アゴニスト」は直接的または間接的に、受容体を介してまたは受容体に作用して薬理学的効果を生じるいずれかの化合物であり、一方、「アンタゴニスト」は受容体の刺激をブロックしてその薬理学的効果を生じるいずれかの化合物である。
【００２７】
本明細書に使用される用語、モジュレートする化合物（modulatory compound）の「有効量」は、本明細書に開示したような分析方法を利用する研究から得たデータに基づいて当業者が決定することができる量である。上記データは、限定されるものでないが、以下の第5.6.節に考察したIC50測定から得た結果を含んでもよい。
【００２８】
本明細書に使用される用語「DARPP-32」は、「ドーパミンおよびサイクリックAMP（cAMP）調節性リンタンパク質（Dopamine-and cAMP-Regulated PhosphoProtein）」および「DARPP32」と互換的に用いられ、新線条体（neostriatum）の中間サイズ有刺ニューロン（medium-sized spiny neurons）が選択的に濃縮された32キロダルトンの細胞質ゾルタンパク質である。ヒト、マウス、ラットおよびウシDARPP-32アミノ酸配列は、本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Bibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で1999年10月15日出願の米国特許出願第09/419,379号、およびBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で2000年10月13日出願の米国特許出願第09/687,959号に開示されている（それぞれ配列番号１〜４を参照のこと）。
【００２９】
本明細書に使用される用語「Thr75 DARPP-32」は、「Thr75 DARPP32」、「thr75 DARPP-32」、「トレオニン（Threonine）-75 DARPP-32」および「トレオニン（threonine）-75 DARPP-32」ならびに類似の略語と互換的に用いられ、Breneら（J. Neurosci. 14: 985-998 (1994)）により開示されてGenBank受託番号AAB30129.1を有するDARPP-32のアミノ酸配列中の75番目のアミノ酸残基を示し、これは、本明細書に開示したように、Cdk5によりリン酸化しうるトレオニン残基である。
【００３０】
本明細書に使用される用語「ホスホ-Thr75 DARPP-32」または以上開示した類似の略語はThr75 DARPP-32のリン酸化型を示す。
【００３１】
本明細書に使用される用語「Thr34 DARPP-32」は、「Thr34 DARPP32」、「thr34 DARPP-32」、「トレオニン（Threonine）-34 DARPP-32」、および「トレオニン（threonine）-34 DARPP-32」ならびに類似の略語と互換的に用いられ、Breneら（J. Neurosci. 14: 985-998 (1994)）により開示されて受託番号AAB30129.1を有するDARPP-32のアミノ酸配列中の34番目のアミノ酸残基を示し、これは、本明細書に開示したように、サイクリックAMP依存性プロテインキナーゼ（PKA）によりリン酸化しうるトレオニン残基である。
【００３２】
本明細書に使用される用語「ホスホ-Thr34 DARPP-32」または以上に開示した類似の略語はThr34 DARPP-32のリン酸化型を示す。
【００３３】
本明細書に使用される用語「CKI」、「カゼインキナーゼ1」または「CK1」は、「カゼインキナーゼＩ」と互換的に用いられる。CKIはセリン／トレオニンプロテインキナーゼのメンバーである。CKIは、限定されるものでないが、少なくとも７種の別の遺伝子によりコードされた多重イソ型からなるCKI（CK1）ファミリー（CKIα、β、γl、γ2、γ3、δ、ε；Desdouits, F.ら 1995. J. Biol. Chem. 270:8772-8778；Grossら, 1998, Cell Signal 10(10):699-711；Vielhaberら, 2001, IUBMB Life 51(2), 73-8）のメンバーを含む。
【００３４】
本明細書に使用される「CKIの類似体」は「CKIの同族体」と互換的に用いられ、CKIのようにDARPP-32をSerl37においてリン酸化するプロテインキナーゼである。
【００３５】
本明細書に使用される用語「DARPP-32のCKIリン酸化可能な断片」は、脱リン酸化型のときに、CKIによりリン酸化することができるセリン残基を含有するDARPP-32のタンパク質断片である。配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトDARPP-32については、上記セリン残基は好ましくはSerl37 DARPP-32である。このような断片は約５〜100個、好ましくは10〜50個の残基を有してもよい。例えば、特定の実施形態においては、ペプチド断片はSerl37を含む配列番号１由来の５個の連続アミノ酸を含んでなる。このタイプの他の実施形態においては、ペプチド断片はSerl37を含む配列番号１由来の７個の連続アミノ酸を含んでなる。代わりの実施形態においては、ペプチド断片はSerl37を含む配列番号１由来の10〜25個の連続アミノ酸を含んでなる。全てのペプチド断片は融合ペプチドまたは融合タンパク質の部分であってもよい。CKIリン酸化可能なDARPP-32の断片は、脱リン酸化断片をリン酸化することによるか、またはホスホ-Serl37 DARPP-32タンパク質のさらに大きい断片からもしくは全長ホスホ-Serl37 DARPP-32タンパク質からリン酸化断片を（プロテアーゼを用いるなどして）切断することにより調製してもよい。このように、これらの断片は、以下に記載した標準ペプチド合成法により合成するか、または組換えDNA技術を介してもしくは古典的タンパク分解法により作製することができる。
【００３６】
本明細書に使用される用語「CDK5」、「Cdk5」または「cdk5」は、ニューロンサイクリン依存性様タンパク質（Nclk）およびタウプロテインキナーゼII（TPKII）としても知られる「サイクリン依存性キナーゼ５」と互換的に用いられる。Cdk5はサイクリン依存性キナーゼのメンバーであるが、例外的にCdk5はサイクリンよりもニューロンサイクリン依存性様キナーゼ５関連タンパク質（Nck5a）（neuronal cyclin-dependent-like kinase 5 associated protein）と呼ばれる非サイクリン補助因子を使用する。用語「Cdk5」をキナーゼ反応の記載に用いるとき、その活性型、すなわち、「Cdk5/Nck5a複合体」（本明細書に以下に記載した）は実触媒因子および／またはCdk5の触媒活性の少なくとも10％を保持するCdk5の断片であってもよいと理解すべきである。
【００３７】
本明細書に使用される用語「Cdk5の類似体」は、「Cdk5の同族体」と互換的に用いられ、Cdk5のようにDARPP-32をトレオニン-75でリン酸化し、しかしトレオニン-34でリン酸化しない。そのような類似体の１つはcdk1である。
【００３８】
本明細書に使用される用語「Nck5a」は、「ニューロンサイクリン依存性様キナーゼ５関連タンパク質（neuronal cyclin-dependent-like kinase 5 associated protein）」と互換的に用いられ、Cdk5の非サイクリン補助因子である。脳には少なくとも２つのNck5aのイソ型（p35およびp39）があり、これらはタンパク分解性断片（すなわち、それぞれp25およびp29）としても存在する。
【００３９】
本明細書に使用される用語「Cdk5/Nck5a複合体」は、Cdk5とNck5aの間に形成された複合体を表し、Cdk5キナーゼの活性型である。
【００４０】
本明細書に使用される「DARPP-32のCdk5リン酸化可能断片」は、脱リン酸化型であるときにCdk5によりリン酸化することができるトレオニン残基を含有するDARPP-32のタンパク質断片である。配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトDARPP-32については、上記トレオニン残基は好ましくはThr75 DARPP-32である。このような断片は約５〜100個、好ましくは10〜50個の残基を有してもよい。例えば、特定の実施形態においては、ペプチド断片はThr75を含む配列番号１由来の５個の連続アミノ酸を含んでなる。このタイプの他の実施形態においては、ペプチド断片はThr75を含む配列番号１由来の７個の連続アミノ酸を含んでなる。代わりの実施形態においては、ペプチド断片はThr75を含む配列番号１由来の10〜25個の連続アミノ酸を含んでなる。全てのペプチド断片は融合ペプチドまたは融合タンパク質の部分であってもよい。Cdk5リン酸化可能なDARPP-32の断片は、脱リン酸化断片をリン酸化することによるか、またはホスホ-Thr75 DARPP-32タンパク質のさらに大きい断片からもしくは全長ホスホ-Thr75 DARPP-32タンパク質からリン酸化断片を（プロテアーゼを用いるなどして）切断することにより調製してもよい。このように、これらの断片は、以下に記載した標準ペプチド合成法により合成するか、または組換えDNA技術を介してもしくは古典的タンパク分解法により作製することができる。
【００４１】
本明細書に使用される場合、キナーゼ反応におけるDARPP-32またはDARPP-32のCdk5リン酸化可能断片のリン酸化の量および／または割合が「有意に変化した」というのは、DARPP-32またはDARPP-32のCdk5リン酸化可能断片のリン酸化の量および／または割合が対照反応と比較して少なくとも10〜25％だけ増加または減少したときである。好ましくは、例えば、潜在的モジュレーターの存在のもとで観察されるCdk5によるDARPP-32のリン酸化の速度の有意な変化は、ある点で該反応のミカエリス（Michaelis）定数（例えば、VmaxまたはKin）と相関がある。 例えば、インヒビターの場合、KIを決定してもよい。このように、ある特定の実施形態においては、反応混合物中の様々な濃度のモジュレーターを研究して、潜在的モジュレーターのモジュレーターとしての同定を可能にすることが好ましい。
【００４２】
本明細書に使用される用語「mGluRが関係する障害」は用語「mGluR障害」「mGluR症状」、「mGluR機能障害」、「mGluRが関係する機能障害」、「mGluRが関係する疾患」、「mGluRが関係する症状」、「mGluRシグナル伝達経路の調節障害」または「mGluRシグナル伝達経路調節障害」と互換的に用いられる。mGluRが関係する障害としては、限定されるものでないが、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ツレット症候群、卒中、てんかん、睡眠または概日リズム障害（例えば、不眠症）、精神分裂病、うつ病、注意欠陥障害（ADD）、注意欠陥過活動性障害（ADHD）、薬物乱用、疼痛、および癌が挙げられる。mGluRが関係する障害はまた、限定されるものでないが、興奮性細胞、組織もしくは器官（例えば、ニューロン、脳、中枢神経系など）における代謝共役型グルタミン酸受容体が媒介する神経伝達を含むシグナル伝達経路の異常もしくは調節障害に関わる疾患（例えば、パーキンソン病）または症状（例えば、コカイン中毒）も含むが、これらに限定されるものではない。mGluRが関係する障害はまた、限定されるものでないが、mGluRが関係する障害の症候群も含む。ある特定の実施形態においては、影響を受ける経路は、DARPP-32の１以上の特異的トレオニンおよび／またはセリン残基のリン酸化および／または脱リン酸化の刺激および／または抑制に関わる調節障害の対応する治療による、DARPP-32のリン酸化および／または脱リン酸化を含む（例えば、それぞれが本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Greengardら, Neuron 23:435-447 (1999)；Bibbら, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6809-6814 (2000)；ならびにBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で1999年10月15日出願の米国特許出願第09/419,379号、およびBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で2000年10月13日出願の米国特許出願第09/687,959号を参照）。
【００４３】
本明細書に使用される用語「カルシウムチャネルに関係する障害」は、用語「カルシウムチャネル調節用シグナル伝達経路の調節障害」、「カルシウムチャネル調節障害」、「カルシウムチャネル障害」、「カルシウムチャネル症状」、「カルシウムチャネル機能障害」、「カルシウムチャネルに関係する機能障害」、「カルシウムチャネルに関係する疾患」または「カルシウムチャネルに関係する症状」と互換的に用いられる。カルシウムチャネルに関係する障害としては、限定されるものでないが、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ツレット症候群、卒中、てんかん、睡眠または概日リズム障害（例えば、不眠症）、精神分裂病、うつ病、注意欠陥障害（ADD）、注意欠陥過活動性障害（ADHD）、薬物乱用、疼痛、および癌が挙げられる。カルシウムチャネルに関係する障害はまた、限定されるものでないが、興奮性細胞、組織もしくは器官（例えば、ニューロン、脳、中枢神経系など）における代謝共役型グルタミン酸受容体が媒介する神経伝達を含むシグナル伝達経路の異常もしくは調節障害に関わる疾患（例えば、パーキンソン病）または症状（例えば、コカイン中毒）も含むが、これらに限定されるものではない。カルシウムチャネルに関係する障害はまた、限定されるものでないが、カルシウムチャネルに関係する障害の症候群も含む。ある特定の実施形態においては、影響を受ける経路は、DARPP-32の１以上の特異的トレオニンおよび／またはセリン残基のリン酸化および／または脱リン酸化の刺激および／または抑制に関わる調節障害の対応する治療による、DARPP-32のリン酸化および／または脱リン酸化を含む（例えば、それぞれが本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Greengardら, Neuron 23:435-447 (1999)；Bibbら, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6809-6814 (2000)；ならびにBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で1999年10月15日
出願の米国特許出願第09/419,379号、およびBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で2000年10月13日出願の米国特許出願第09/687,959号を参照）。
【００４４】
本明細書に使用される用語「CKIに関係する障害」は、用語「CKI障害」、「CKI症状」、「CKI機能障害」、「CKIに関係する機能障害」、「CKIに関係する疾患」、「CKIに関係する症状」「CKI機能の調節障害」または「CKI機能調節障害」と互換的に用いられる。CKIに関係する障害としては、限定されるものでないが、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ツレット症候群、卒中、てんかん、睡眠または概日リズム障害（例えば、不眠症）、精神分裂病、うつ病、注意欠陥障害（ADD）、注意欠陥過活動性障害（ADHD）、薬物乱用、疼痛、および癌が挙げられる。CKIに関係する障害はまた、限定されるものでないが、興奮性細胞、組織もしくは器官（例えば、ニューロン、脳、中枢神経系など）における代謝共役型グルタミン酸受容体が媒介する神経伝達を含むシグナル伝達経路の異常もしくは調節障害に関わる疾患（例えば、パーキンソン病）または症状（例えば、コカイン中毒）も含むが、これらに限定されるものではない。CKIに関係する障害はまた、限定されるものでないが、CKIに関係する障害の症候群も含む。ある特定の実施形態においては、影響を受ける経路は、DARPP-32の１以上の特異的トレオニンおよび／またはセリン残基のリン酸化および／または脱リン酸化の刺激および／または抑制に関わる調節障害の対応する治療による、DARPP-32のリン酸化および／または脱リン酸化を含む（例えば、それぞれが本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Greengardら, Neuron 23:435-447 (1999)；Bibbら, Proc. Natl. Acad. Sci. 97:6809-6814 (2000)；ならびにBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で1999年10月15日出願の米国特許出願第09/419,379号、およびBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で2000年10月13日出願の米国特許出願第09/687,959号を参照）。
【００４５】
本明細書に使用される用語「Cdk5に関係する障害」は、用語「Cdk5障害」、「Cdk5症状」、「Cdk5機能障害」、「Cdk5に関係する機能障害」、「Cdk5に関係する疾患」、「Cdk5に関係する症状」「Cdk5機能の調節障害」または「Cdk5機能調節障害」と互換的に用いられる。Cdk5に関係する障害としては、限定されるものでないが、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ツレット症候群、卒中、てんかん、睡眠または概日リズム障害（例えば、不眠症）、精神分裂病、うつ病、注意欠陥障害（ADD）、注意欠陥過活動性障害（ADHD）、薬物乱用、疼痛、および癌が挙げられる。Cdk5に関係する障害はまた、限定されるものでないが、興奮性細胞、組織もしくは器官（例えば、ニューロン、脳、中枢神経系など）における代謝共役型グルタミン酸受容体が媒介する神経伝達を含むシグナル伝達経路の異常もしくは調節障害に関わる疾患（例えば、パーキンソン病）または症状（例えば、コカイン中毒）も含むが、これらに限定されるものではない。Cdk5に関係する障害はまた、限定されるものでないが、Cdk5に関係する障害の症候群も含む。ある特定の実施形態においては、影響を受ける経路は、DARPP-32の１以上の特異的トレオニンおよび／またはセリン残基のリン酸化および／または脱リン酸化の刺激および／または抑制に関わる調節障害の対応する治療による、DARPP-32のリン酸化および／または脱リン酸化を含む（例えば、それぞれが本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Greengardら, Neuron 23:435-447 (1999)；Bibbら, Proc. Nat'l. Acad. Sci. 97:6809-6814 (2000)；ならびにBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で1999年10月15日出願の米国特許出願第09/419,379号、およびBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で2000年10月13日出願の米国特許出願第09/687,959号を参照）。
【００４６】
本明細書に使用される用語「小有機分子」は、3キロダルトン未満、好ましくは1.5キロダルトン未満の分子量を有する有機化合物（または無機化合物（例えば、金属）と錯体を形成した有機化合物）である。小有機分子は血液-脳関門を通過しうることが好ましい。
【００４７】
本明細書に使用される用語「約」は10〜15％以内、好ましくは5〜10％以内を意味する。例えば、約60個のアミノ酸残基を含有するアミノ酸配列は51〜69アミノ酸残基、さらに好ましくは57〜63アミノ酸残基を含有してもよい。
【００４８】
４  図面の説明
図１は、(S)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン（DHPG）によるグループＩ mGluR受容体の活性化が、DARPP-32上のThr75およびSerl37のリン酸化を増加することを示す。マウス新線条体切片をDHPGを用いて図に示した様々な期間、処理した。切片ホモジネートをSDS-PAGE、ならびにホスホ-Thr75、ホスホ-Serl37および全DARPP-32抗体を用いる免疫ブロットにより分析した。(a)DHPG（100μM）を用いた処理の時間経過。(b)切片を、グループＩ  mGluRアンタゴニストL-AP3（100μM）を用いないでまたは用いて20分間プレインキュベートした後、DHPGにより２分間処理した。５回の実験から得た累積データ（平均±SEM）を(a)および(b)の下側のパネルに示す。データは無処理切片の値に対して正規化した。*p＜0.05、無処理切片と比較したスチューデント（Student）のｔ検定。詳細は第６節を参照。
【００４９】
図２は、mGluR1受容体の活性化が一過的にCdk5活性を増加することを示す。マウス新線条体切片を図に示した様々な期間、DHPGを用いて処理した。切片をホモジナイズし、Cdk5を抗Cdk5(C-8)抗体を用いて免疫沈降した。Cdk5活性を、ヒストンH-1を基質に用いてアッセイし、サンプルをSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィにより分析した。上側のパネルはヒストンH-1リン酸化のオートラジオグラムを示し、下側のパネルは累積データを示す。オートラジオグラムはホスホイメージャーを用いて分析した。３回の実験のデータ（平均±SEM）を０分に得た値に対して正規化した。*p＜0.05、０分と比較したスチューデント（Student）のｔ検定。詳細は第６節を参照。
【００５０】
図３は、mGluRl受容体の活性化がCK1活性を刺激することを示す。N2a細胞を一過的にHA-タグ付きCK1εを用いてトランスフェクトした。細胞をCK1インヒビターCK1-7（100μM）を用いないでまたは用いて30分間プレインキュベートし、その後、DHPG（100μM）を用いてさらに2分間処理した。HA-CK1εを免疫沈降し、CK1をDARPP-32を基質に用いてアッセイした。サンプルをSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィにより分析した。上側のパネル：DARPP-32リン酸化のオートラジオグラム；中間のパネル：HA-CK1εの発現レベルの免疫ブロット；下側のパネル：５回の実験から得たキナーゼ活性の累積データ（平均±SEM）。データは無処理細胞について得た値に対して正規化した。*p＜0.05、０分と比較したスチューデント（Student）のｔ検定。詳細は第６節を参照。
【００５１】
図４はCdk5インヒビター、ブチロラクトンが、DARPP-32上のリン酸化に対するDHPGの効果をThr75（Cdk5部位）においてブロックするが、Serl37（CK1部位）においてはブロックしないことを示す。マウス新線条体切片を０、１、５または10μMブチロラクトン（BL）を用いて30分間プレインキュベートし、次いでDHPG（100μm）を加えてさらに２分間処理した。切片ホモジネートをSDS-PAGEおよびにホスホ-Thr75、ホスホ-Serl37および全DARPP-32抗体による免疫ブロットにより分析した。免疫ブロットを上側のパネルに示し、３回の実験から得た累積データ（平均±SEM）を下側のパネルに示す。データは無処理切片について得た値に対して正規化した。*p＜0.05、DHPG不在の切片と比較したスチューデント（Student）のｔ検定；‡p＜0.05、無処理の切片と比較したスチューデント（Student）のｔ検定；#p＜0.05、DHPGによる処理だけした切片と比較したスチューデント（Student）のｔ検定。詳細は第６節を参照。
【００５２】
図５は、CK1がin vitroでp35をリン酸化することを示す。Cdk5（左）またはp35（右）をin vitroでCK1および32Ｐ-ATPを用いて図に示した様々な時間、インキュベートした。サンプルをSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィにより分析した。32P組み込みをオートラジオグラム（上側のパネル）に示す。Cdk5およびp35の全量をクーマシー染色ゲルに示す（下側のパネル）。詳細は第６節を参照。
【００５３】
図６は、グループＩ  mGluR受容体のDHPGによる活性化がCa2+電流を増強すること、およびこの増強はCK1またはCdk5を抑制することによりブロックされ、かつDARPP-32 KOマウスでは存在しないことを示す。(a)および(c)は、電位ランプ（voltage ramp）プロトコルにより時間および医薬適用の関数として誘起されたピークCa2+電流を示す。(a)  DHPG (100μM)はCa2+電流を増加した。CK1-7（100μM）の存在のもとで、基底Ca2+電流は減少しかつDHPG効果は減衰した。CK1-7を洗浄除去するとDHPG効果が回復した。(c)  DHPG（100μM）はCa2+電流を増加した。ブチロラクトン（25μM）の存在のもとで、基底Ca2+電流は減少し、かつDHPG効果は消滅した。(b)および(d)は、(b)CK1-7または(d)ブチロラクトンの適用前後（*で記した時点において）における、DHPGによるモジュレーションを示す代表的電流トレースである。挿入図は(a)CK1-7および(c)ブチロラクトンによるCa2+電流に対するDHPG効果のパーセントブロックを総括する。(e)は、DARPP-32 KOマウスから得た代表的新線条体ニューロンにおける、時間およびアゴニスト適用の関数としてのピークCa2+電流のプロットを示す。DARPP-32K/Oマウス（n＝9）から得たニューロンにおいて、DHPG（100μM）はCa2+電流に影響を与えなかった。詳細は第６節を参照。
【００５４】
図７は、DARPP-32 Ser-137およびThr-75リン酸化に対する(S)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン（DHPG）の効果は、PLCβインヒビターU73122、Ca2+キレーターBAPTA/AMおよびカルシニューリンインヒビター、シクロスポリンＡによりブロックされることを示す。Ser-137（CK1部位）およびThr-75（Cdk5部位）におけるDARPP-32のリン酸化に対するmGluRグループＩアゴニスト、DHPGの効果を、マウス新線条体切片においてリン酸化状態特異的抗体を用いて試験した。切片を、図に示したようにビヒクル（左の２レーン）、U73122（12.5μM、20分間）、BAPTA/AM（BAPTA、20μM、20分間）、シクロスポリンＡ（Cy Ａ、５μM、60分間）、またはアデノシンＡ2a受容体アンタゴニストZM241385（10μM、20分間)を用いてプレインキュベーションした後に、DHPG（100μM）またはイオノマイシン（Iono、２μM）を用いて２分間処理した。切片をホモジナイズし、SDS-PAGEおよびホスホSerl37、ホスホThr75および全DARPP-32抗体を用いる免疫ブロットにより分析した。免疫ブロットを上側のパネルに示し、３回の実験から得た複合データ（平均±SEM）を下側のパネルに示した。データを無処理切片について得た値に正規化した。*p＜0.05、無処理の切片と比較したスチューデント（Student）のｔ検定。詳細は第７節を参照。
【００５５】
図８は、CK1ε活性に対するDHPGの効果がU73122、BAPTA/AMおよびシクロスポリンＡによりブロックされることを示す。N2a細胞を一過的にHAタグ付きCK1εを用いてトランスフェクトした。細胞をグループI mGluRアンタゴニストL-AP3（100μM)、U73122（12.5μM）、BAPTA/AM（BAPTA、20μM)、またはシクロスポリンＡ（Cy Ａ、１μM）を用いないでまたは用いて30分間プレインキュベーションした後、DHPG（100μM、２分間）を用いないでまたは用いて処理した。HA-CK1εを免疫沈降し、CK1をDARPP-32を基質に用いてアッセイした。サンプルをSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィにより分析した。上側のパネル：DARPP-32 リン酸化のオートラジオグラム；中間のパネル：HA抗体を用いる免疫ブロット；下側のパネル：５回の実験から得た複合データ（平均±SEM）。データは、無処理細胞に対する値に対して正規化した。*p＜0.05、無処理の切片と比較したスチューデント（Student）のｔ検定。詳細は第７節を参照。
【００５６】
図９は、Cdk5活性に対するDHPGの効果がU73122、BAPTA/AMおよびシクロスポリンＡによりブロックされることを示す。マウス新線条体切片をU73122（12.5μM、20分間）、BAPTA/AM（BAPTA、20μM、20分間）またはシクロスポリンＡ（Cy Ａ、５μM、60分間）を用いてプレインキュベートし、次いでDHPG（100μM、２分間）またはイオノマイシン（Iono、２μM、２分間）を用いないでまたは用いて処理した。切片をホモジナイズし、Cdk5を抗Cdk5（C-8）抗体を用いて免疫沈降した。Cdk5活性をヒストンH-1を基質に用いてアッセイし、サンプルをSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィにより分析した。上側のおよび中部のパネルはヒストンH-1リン酸化を示すオートラジオグラムである。下側のパネルは３回の実験から得た複合データ（平均±SEM）である。オートラジオグラムをホスホルイメージャーを用いて分析し、そのデータを無処理切片について得た値に対して正規化した。*p＜0.05、無処理切片と比較したスチューデント（Student）のｔ検定。詳細は第７節を参照。
【００５７】
図10は、DHPG処理すると、CK1εが一過的に脱リン酸化されることを示す。N2a細胞を一過的にHA-CK1εを用いてトランスフェクトした。細胞を200μCi/ml H332PO4を用いてリン酸塩を含まない培地中で２時間インキュベートした。最後の30分間の標識付けの間、細胞をシクロスポリンＡ（Cy Ａ、1μM）を用いないでまたは用いて処理し、次いでDHPGを用いないでまたは用いて、図に示した様々な時間、処理した。(a)HA-CK1εを免疫沈降し、サンプルをSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィにより分析した（上側のパネル）。下側のパネルはHA抗体を用いる免疫ブロットを示す。(b)32Ｐ-標識したHA-CK1εを含有するゲルバンドを二次元トリプシンリンペプチド（tryptic phosphopeptide）マッピング処理した；電気泳動は水平方向であり（正極を左に、起点を矢印により示した）、クロマトグラフィは垂直方向である。(c)HA-CK1εによりトランスフェクトした細胞を、シクロスポリンＡ（Cy Ａ）およびDHPGを用いて、示したように０または４分間、インキュベートした。細胞抽出物は(a)および(b)のように分析した。詳細は第７節を参照。
【００５８】
図11は、抑制自己リン酸化部位を欠くCK1ε突然変異体はDHPGにより活性化されないことを示す。N2a細胞を、野生型HAタグ付きCK1εまたはMycタグ付きMM2-CK1ε（S323、T325、T334、T337、S368、S405、T407およびS408がアラニンに突然変異している突然変異酵素）を用いて一過的にトランスフェクトした。(a)上記細胞を200μCi/ml H332PO4を用いてリン酸塩を含まない培地中で２時間標識し、DHPGを用いて２分間処理した。HAまたはMycタグ付きCK1εを免疫沈降し、SDS-PAGEにより分析し、そして図10で説明したようにリンペプチドマッピング処理した。(b)上記細胞をシクロスポリンＡ（Cy Ａ、1μM、30分間）を用いないでまたは用いて前処理した後、DHPGを用いないでまたは用いて（100μM、２分間）インキュベートした。HA-CK1εまたはMM2-CK1εを免疫沈降し、CK1ε活性をDARPP-32を基質に用いてアッセイした。サンプルをSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィにより分析した。上側のパネル：DARPP-32リン酸化のオートラジオグラム；中間のパネル：野生型およびMM2-CK1の両方を認識する抗CK1抗体を用いてHAまたはMycタグ付きCK1εの発現を示す免疫ブロット；および下側のパネル：５回の実験から得た組合わせキナーゼ活性データ（平均±SEM）。データは無処理細胞について得た値に対して正規化した。*p＜0.05、０分と比較したスチューデント（Student）のｔ検定；#p＜0.001、野生型HA-CK1εを用いてトランスフェクトした無処理細胞と比較したスチューデント（Student）のｔ検定。詳細は第７節を参照。
【００５９】
図12は、CK1の構成的リン酸化は酵素活性を調節しないことを示す。N2a細胞をHA-CK1εまたはMM2-CKIεを用いてトランスフェクトした。(a)上記細胞をH332PO4を用いてリン酸塩を含まない培地中で標識付けし（200μCi/ml、２時間）、次いでDHPGを用いて２分間処理した。HA-CK1εまたはMM2-CK1εを免疫沈降し、λプロテインホスファターゼを用いないでまたは用いて15分間インキュベートした。32P標識したサンプルをSDS-PAGEおよびオートラジオグラフィにより分析した（上側のパネル）。平行して調製した他のサンプルを、DARPP-32を基質に用いてCK1活性を分析した（下側のパネル）。(b)３回の実験から組合わせキナーゼ活性データ（平均±SEM）を得た。詳細は第７節を参照。
【００６０】
図13は、グループI mGluRの活性化によるCK1活性の調節に対するモデルを示す。DHPGは、Gqを経由してPLCβと結合しているグループI mGluRsを活性化する。PLCβの活性化はIP3を作製し、IP3は小胞体上のIP3受容体と結合してCa2+を細胞質ゾル中に放出する。上昇した細胞内Ca2+はCa2+依存性ホスファターゼ、カルシニューリンを活性化し、これが順にCK1ε上の８つの調節性自己リン酸化部位を脱リン酸化する。CK1εは一過的に活性化されるが、ゆるやかな自己リン酸化が起こり、抑制されたキナーゼレベルの活性を回復する。基底的にリン酸化される部位は恐らくキナーゼ触媒ドメイン内に存在するが、酵素活性を調節しないと思われる。詳細は、第７節を参照。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
５．発明の詳細な説明
本発明は、部分的には、本発明者らによる意外な発見、すなわち、カゼインキナーゼＩ（「CKI」または「CK1」）およびサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の両方が神経組織内の代謝共役型グルタミン酸受容体（mGluR）シグナル伝達経路の部分であるという発見に基づく。
【００６２】
本発明は、目的の細胞または組織中のカゼインキナーゼＩ（「CKI」または「CK1」）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（「Cdk5」、「cdk5」または「CDK5」）活性をモジュレートする方法であって、目的の細胞または組織を代謝共役型グルタミン酸受容体（mGluR）細胞内シグナル伝達分子の活性を改変する化合物の有効量と接触させることを含んでなり、ここで上記細胞または組織と上記化合物との接触がカゼインキナーゼＩまたはサイクリン依存性キナーゼ５の活性のモジュレーションをもたらす上記方法を提供する。
【００６３】
本発明は、カルシウムチャネルの活性を調節する方法であって、本発明の化合物、例えば、本発明の方法により同定した化合物の有効量を（例えば、個人、患者または動物に）投与することを含んでなり、ここで上記化合物がカゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性をモジュレートし、そしてCKIまたはCdk5活性のモジュレーションがニューロンのカルシウムチャネルの活性の改変をもたらす上記方法を提供する。特定の実施形態においては、上記カルシウムチャネルは興奮性細胞、例えばニューロン中にある。他の実施形態においては、上記方法は、CKIおよびCdk5の活性を増加するためのmGluRアゴニスト（agonist）の投与に関わり、それによりカルシウムチャネルの活性を改変する。
【００６４】
本発明は、目的の細胞または組織中のカゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性をモジュレートする薬剤、医薬または化合物を同定する、in vivo、in situ、およびin vitroの方法を提供する。このような方法は、単独でまたはお互いと一緒に使用することができる。一実施形態においては、本発明の方法は、目的の細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルを決定するステップ；上記細胞または組織を試験化合物と接触させるステップ；および上記細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第２レベルを決定するステップを含んでなり、ここでカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルと第２レベルとの差がカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性をモジュレートする試験化合物の能力を示す。
【００６５】
他の実施形態においては、本発明の方法は、目的の細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルを決定するステップ；目的の細胞または組織中のカルシウムチャネル活性の第１レベルを決定するステップ；上記細胞または組織を試験化合物と接触させるステップ；上記細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第２レベルを決定するステップ；ならびに上記細胞または組織中のカルシウムチャネル活性の第２レベルを決定するステップを含んでなり、ここでカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルと第２レベルとの差ならびにカルシウムチャネル活性の第１レベルと第２レベルとの差がカルシウムチャネルの活性をモジュレートする試験化合物の能力を示す。
【００６６】
本発明はまた、CKIまたはCdk5の活性をモジュレートしうる薬剤を同定するin vivoの方法も提供する。そのような方法は、単独でまたは本明細書に開示したin vitroおよびin situの方法と一緒に使用することができる。１つのそのような方法は、薬剤の非ヒト哺乳類動物への投与を含むものである。次いでCKIおよび／またはCdk5の活性化の量（および／または割合）を決定する。活性化の量（および／または割合）が薬剤の不在のもとと比較して、薬剤の存在のもとで増加するかまたは減少するときに、薬剤はCKIおよび／またはCdk5の活性をモジュレートすることができると同定される。好ましい実施形態においては、非ヒト哺乳類動物はげっ歯類である。さらに好ましい実施形態においては、げっ歯類はマウスである。
【００６７】
本発明はまた、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害を潜在的に改善しうるおよび／または治療に使用しうる薬剤を選択する目的で、潜在的薬剤（または医薬または化合物）をスクリーニングする方法も提供する。
【００６８】
本発明はまた、薬剤（または医薬または化合物）を同定する方法、例えば、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害の治療法に使用することができる医薬の医薬スクリーニングアッセイも提供する。
【００６９】
本発明はまた、カゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５(Cdk5)の活性をモジュレートする組成物も提供する。本発明はまた、カゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５(Cdk5)の活性のモジュレーションを経由してカルシウムチャネルの活性をモジュレートする組成物も提供する。
【００７０】
本発明はさらに、CKIおよび／またはCdk5の活性をモジュレートし、それにより、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害を改善することができる医薬を開発するための合理的医薬設計を実施する方法も提供する。
【００７１】
一実施形態においては、本発明は、目的の細胞または組織中のサイクリン依存性キナーゼ５の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって：(a)目的の細胞または組織中のサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルを決定するステップ：(b)上記細胞または組織を試験化合物と接触させるステップ；および(c)上記細胞または組織中のサイクリン依存性キナーゼ５活性の第２レベルを決定するステップを含んでなり、ここでサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルと第２レベルとの差がサイクリン依存性キナーゼ５活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、そしてサイクリン依存性キナーゼ５活性のモジュレーションが代謝共役型グルタミン酸受容体の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【００７２】
本発明はまた、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する診断および治療の方法であって、限定されるものでないが、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害の治療における本発明の組成物または化合物の使用を含む上記方法も提供する。
【００７３】
一態様においては、本発明は、カルシウムチャネル活性（例えば、カルシウム電流）の増加または減少によることを特徴とする神経症状を治療する方法であって、そのような治療を必要とする被験者に本発明の化合物の有効量を投与し、CKIおよび／またはCdk5活性をモジュレートして、その結果、mGluRシグナル伝達経路のモジュレーションを経由してカルシウムチャネル活性を増加または減少させることを含んでなる上記方法を提供する。一実施形態においては、mGluRシグナル伝達経路は：PLCβと結合したＧタンパク質を刺激するmGluRl受容体の活性化、IP3-感受性ストア（IP3-sensitive store）から放出されるCa2+によるCa2+/カルモジュリン依存性ホスファターゼ、カルシニューリン（PP2B）の活性化、カルシニューリンによるCK1εの抑制的自己リン酸化部位の脱リン酸化を含んでなり、その結果、キナーゼ活性の増加がもたらされる。
【００７４】
本発明は、個人（例えば、患者）または動物被験者におけるmGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害を、CKIおよび／またはCdk5活性をモジュレートする本発明の化合物の有効量を投与することによって治療する方法を提供する。一実施形態においては、上記薬剤はCKIおよび／またはCdk5の活性を促進または増加する。他の実施形態においては、上記薬剤はCKIおよび／またはCdk5の活性を抑制または減少する。
【００７５】
本発明は、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害、疾患および／または症状の症候を示す患者または被験者の上記症候を改善することができる本発明の薬剤（または医薬または化合物）を投与する方法を提供する。ある特定の実施形態においては、本発明は、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害、疾患および／または症状の症候を示す患者または被験者の上記症候を改善することができる、本明細書に開示した方法により同定された薬剤を投与する方法を提供する。他の実施形態においては、mGluR活性のアゴニスト（agonist）をmGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたは カルシウムチャネルに関係する障害を治療するために使用することができる。さらに他の実施形態においては、mGluR活性のアンタゴニスト（antagonist）をmGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療するために使用することができる。
【００７６】
本発明はまた、カゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性をモジュレートする組成物も提供する。本発明はまた、カゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性のモジュレーションを経由するカルシウムチャネルの活性をモジュレートする組成物も提供する。
【００７７】
本発明はまた、本明細書に開示した本発明の薬剤（医薬または化合物）の医薬組成物も提供する。本発明は、CKIおよび／またはCdk5活性を調節するための、およびmGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を診断するまたは治療するための医薬組成物を包含する。正常機能が喪失すると上記疾患または障害の表現型が発生するので、代謝共役型グルタミン酸受容体（mGluR）シグナル伝達経路の活性化、またはCKIおよび／またはCdk5活性（例えば、下流活性化）の増加は、このような障害の症候を示す個人の症候の改善を促進する。
【００７８】
開示を明確にするために、限定する方法としてではなく、本発明の詳細な説明を以下の小節に区分して行う。
【００７９】
5.1. CKIまたはCdk5の活性をモジュレートする方法
本発明は、目的の細胞または組織中のカゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）活性をモジュレートする方法であって、目的の細胞または組織を、代謝共役型グルタミン酸受容体（mGluR）細胞内シグナル伝達分子の活性を改変する化合物の有効量と接触させることを含んでなり、上記細胞または組織と上記化合物との接触がカゼインキナーゼＩまたはサイクリン依存性キナーゼ５の活性のモジュレーションをもたらす上記方法を提供する。細胞または組織としては、限定されるものでないが：興奮性細胞、例えば、感覚ニューロン、運動ニューロン、または介在ニューロン；グリア細胞；ニューロンまたはグリア細胞の一次培養物；ニューロンまたはグリア細胞系統に由来する細胞；分離した細胞；全細胞；透過化処理した細胞；細胞抽出物または精製された酵素調製物；および組織または器官、例えば、脳、脳切片、脊髄、脊髄切片、中枢神経系、末梢神経系、または神経が挙げられる。特定の実施形態においては、CKIおよび／またはCdk5の活性は増加する。他の特定の実施形態においては、CKIおよび／またはCdk5の活性は減少する。
【００８０】
一実施形態においては、本発明は、代謝共役型グルタミン酸受容体の活性のモジュレーションを経由してカゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性をモジュレートする方法を提供する。特定の実施形態においては、代謝共役型グルタミン酸受容体はグループＩ代謝共役型グルタミン酸受容体である。他の実施形態においては、本発明はカゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５(Cdk5)のモジュレーションを経由してカルシウムチャネルの活性をモジュレートする方法を提供する。
【００８１】
一実施形態においては、目的の細胞または組織におけるCKIまたはCdk5活性をin vitroでモジュレートする方法を提供する。他の実施形態においては、目的の細胞または組織におけるCKIまたはCdk5活性をin vivoでモジュレートする方法を提供する。in vitroおよびin vivoでの適用は、限定されるものでないが、全動物における、組織切片における、破砕した細胞調製物における、無傷の細胞における、および単離しかつ精製した細胞調製物における活性のモジュレーションを含む。
【００８２】
本発明によれば、本発明の化合物はmGluRアゴニストまたはアンタゴニストであってもよいが、また、代謝共役型グルタミン酸受容体のレベルと異なるmGluR細胞内シグナル伝達経路のレベルで作用する化合物であってもよい。その結果、本発明はまた、ある特定の実施形態においては、代謝共役型グルタミン酸受容体のレベルと異なるmGluR細胞内シグナル伝達経路のレベルで作用する化合物についてスクリーニングすることにより同定した組成物を含んでもよい。当業者であれば、本発明の方法でCKIおよび／またはCdk5活性をモジュレートすることができると一旦同定されれば、その化合物は、CKIおよびCdk5活性が関わりうる症状を治療する目的で、神経細胞におけるCKIおよびCdk5活性をモジュレートするのに治療上利用しうることを理解するであろう。そのような症状は、限定されるものでないが、mGluRに関係する障害およびカルシウムチャネルに関係する障害を含む。
【００８３】
本発明は、カルシウムチャネルの活性を調節する方法であって、化合物、例えば、本発明の方法により同定した化合物の有効量を（例えば、個人、患者または動物に）投与することを含んでなり、カゼインキナーゼＩまたはサイクリン依存性キナーゼ５活性のモジュレーションがニューロンにおけるカルシウムチャネルの活性の改変をもたらす上記方法を提供する。一実施形態においては、上記カルシウムチャネルは興奮性細胞、例えばニューロンにおけるものである。他の実施形態においては、上記方法は、CKIおよびCdk5の活性を増加しそれによりカルシウムチャネルの活性を改変する目的でのmGluRアゴニストの投与に関わる。
【００８４】
いずれの特定の理論により束縛されるのを欲しないが、本発明の一態様においては、mGluR1受容体の活性化はPLCβと結合したＧタンパク質を刺激し、IP3感受性ストアから放出されるCa2+がCa2+/カルモジュリン依存性ホスファターゼ、カルシニューリン（PP2B）を活性化し、次いでカルシニューリンがCKI上の抑制自己リン酸化部位を脱リン酸化する。CKIの脱リン酸化はキナーゼ活性の増加をもたらす。従って、本発明の一実施形態においては、本発明はカルシニューリン（PP2B）の活性のモジュレーションを介してCKIの活性または発現をモジュレートする方法を提供する。
【００８５】
5.2. CKIまたはCdk5の活性をモジュレートする化合物をスクリーニングする方法
本発明は、目的の細胞または組織中のカゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性をモジュレートする薬剤（または医薬または化合物）を同定する方法を提供する。一実施形態においては、本発明は、代謝共役型グルタミン酸受容体の活性のモジュレーションを経由して、カゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性をモジュレートする薬剤を同定する方法を提供する。特定の実施形態においては、代謝共役型グルタミン酸受容体はグループＩ代謝共役型グルタミン酸受容体である。他の実施形態においては、本発明は、カゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性のモジュレーションを経由してカルシウムチャネルの活性をモジュレートする薬剤を同定する方法を提供する。細胞または組織としては、限定されるものでないが、興奮性細胞、例えば、感覚ニューロン、運動ニューロン、または介在ニューロン；グリア細胞；ニューロンもしくはグリア細胞の一次培養物；ニューロンもしくはグリア細胞系統に由来する細胞；分離した細胞；全細胞；透過化処理した細胞；細胞抽出物もしくは精製酵素調製物；および組織もしくは器官、例えば、脳、脳切片、脊髄、脊髄切片、中枢神経系、末梢神経系、もしくは神経が挙げられる。ある特定の実施形態においてはCKIの活性はCKIの発現を包含し、および／またはCdk5の活性はCdk5の発現を包含する。
【００８６】
当技術分野の通常の技術者であれば明白に理解しうるように、CKIまたはCdk5の活性をモジュレートしうる薬剤、医薬もしくは化合物を同定するための、本明細書に開示したいずれかのおよび／または全ての実施形態は、本明細書に開示した合理的医薬設計を組込む方法を含めて、組合わせてさらなる医薬スクリーニングおよびアッセイを形成することができ、これらは全て本発明が意図するものである。
【００８７】
一実施形態においては、本発明の方法は、目的の細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルを決定するステップ；上記細胞または組織を試験化合物と接触させるステップ；および上記細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第２レベルを決定するステップを含んでなり、ここでカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルと第２レベルとの差がカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性をモジュレートする試験化合物の能力を示す。
【００８８】
他の実施形態においては、本発明の方法は、目的の細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルを決定するステップ；目的の細胞または組織中のカルシウムチャネル活性の第１レベルを決定するステップ；上記細胞または組織を試験化合物と接触させるステップ；上記細胞または組織中のカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第２レベルを決定するステップ；ならびに上記細胞または組織中のカルシウムチャネル活性の第２レベルを決定するステップを含んでなり、ここでカゼインキナーゼＩおよび／またはサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルと第２レベルとの差ならびにカルシウムチャネル活性の第１レベルと第２レベルとの差がカルシウムチャネルの活性をモジュレートする試験化合物の能力を示す。
【００８９】
他の実施形態においては、本発明は、目的の細胞または組織中のサイクリン依存性キナーゼ５の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって：(a)目的の細胞または組織中のサイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルを決定するステップ：(b)上記細胞または組織を試験化合物と接触させるステップ；および(c)上記細胞または組織中のサイクリン依存性キナーゼ５活性の第２レベルを決定するステップを含んでなる方法であって、サイクリン依存性キナーゼ５活性の第１レベルと第２レベルとの差がサイクリン依存性キナーゼ５活性をモジュレートする試験化合物の能力を示し、そしてサイクリン依存性キナーゼ５活性のモジュレーションが代謝共役型グルタミン酸受容体の活性のモジュレーションにより調節される上記方法を提供する。
【００９０】
他の実施形態においては、本発明は、目的の細胞または組織中のサイクリン依存性キナーゼ５の活性をモジュレートする化合物を同定する方法であって、上記細胞または組織を試験化合物と接触させるステップ、上記細胞または組織中のサイクリン依存性キナーゼ５活性のレベルを決定するステップを含んでなり、上記レベルと試験化合物に接触させてない比較しうる細胞または組織におけるサイクリン依存性キナーゼ５活性の標準または基線レベルとの差がサイクリン依存性キナーゼ５活性をモジュレートする上記試験化合物の能力を示し、そしてサイクリン依存性キナーゼ５活性のモジュレーションが代謝共役型グルタミン酸受容体の活性モジュレーションにより調節されることを特徴とする上記方法を提供する。
【００９１】
本発明はまた、mGluRが関係する障害および／またはカルシウムチャネルが関係する障害を潜在的に改善しうるおよび／または治療に使用しうる薬剤を選択するための薬剤（または医薬または化合物）をスクリーニングする方法も提供する。
【００９２】
本発明はまた、薬剤を同定する方法、例えば、mGluRに関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療するための治療法に使用しうる医薬スクリーニングアッセイも提供する。
【００９３】
本発明はまた、CKIまたはCdk5の活性をモジュレートすることができる薬剤を同定するin vivoの方法も提供する。そのような方法は、本明細書に開示したように、単独でまたはin vitroおよびin situの方法と一緒に使用することができる。１つのこのような方法は、薬剤の非ヒト哺乳類動物への投与を含むものである。次いでCKIおよび／またはCdk5の活性化の量（および／または割合）を決定する。活性化の量（および／または割合）が、薬剤の不在のもとと比較して薬剤の存在のもとで増加するかまたは減少するときに、上記薬剤はCKIおよび／またはCdk5の活性をモジュレートすることができると同定される。好ましい実施形態においては、非ヒト哺乳類動物はげっ歯類である。さらに好ましい実施形態においては、げっ歯類はマウスである。
【００９４】
他の実施形態においては、薬剤をmGluRアゴニストと一緒に投与する。次いでCKIおよび／またはCdk5の活性化の量（および／または割合）を決定する。mGluRアゴニストの投与は薬剤の不在のもとでCKIおよび／またはCdk5の増加をもたらすので、活性化の量（および／または割合）が薬剤の不在のもとと比較して薬剤の存在のもとで有意に増加するか減少すると、薬剤はCKIおよび／またはCdk5の活性をモジュレートすることができると同定される。このin vivo方法はさらに薬剤を非ヒト哺乳類に投与することも含む。そのような動物モデルは第5.5節に開示する。
【００９５】
特定の実施形態においては、動物モデルはホモ接合性ノックアウトマウスである（それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、1998年７月７日公告のFienbergらによる米国特許第5,777,195号；2000年１月11日公告のNishiらによる米国特許第6,013,621号；およびFienbergら, 1998, Science 281:838-842を参照）。一実施形態においては、ホモ接合性DARPP-32ノックアウトマウスを追加の試験またはアッセイに用いて、候補薬剤がCKIおよび／またはCdk5活性をモジュレートすることを立証するかまたは確証してもよい。特定の実施形態においては、Nishiら（2000年１月11日公告の米国特許第6,013,621号）が記載した方法によって立証を実施することができる。そのような薬剤がDARPP-32リン酸化を経由するCKIおよび／またはCdk5の活性をモジュレートすると同定されるときは、DARPP32ノックアウトにおける薬剤の存在または投与は、薬剤の不在または非投与と比較してカルシウムチャネルの活性化の量（および／または割合）を有意に増加または減少しないに違いない。
【００９６】
ある特定の実施形態においては、様々な構造骨格（例えば、プリン）に基づく化合物のコンビナトリアルライブラリー、ならびに無関係な天然化合物を候補医薬として試験することができる。このタイプの好ましい実施形態においては、本明細書に開示した自動ロボット技術を用いるハイスループット技術を利用してアッセイを実施する。ポジティブな結果（「ヒット」）は、対照反応物（候補医薬をアッセイに含有しない）と比較して、CKIおよび／またはCdk5の活性の減少または増加を表す。
【００９７】
いったん候補医薬が選択されると、その候補医薬の構造変異体を試験することができる。これらの化合物を詮索し、膜透過性、効果の特異性、および毒性などのパラメーターを修飾してもよい。次にこの２次スクリーニングで選択した（例えば、最も強力な）化合物をin situおよび動物モデル（第5.5節を参照）で評価して、選択した化合物がCKIおよび／またはCdk5および／またはカルシウムチャネルの活性を改変するかどうかおよび／または最小限の副作用で予想の行動改変を誘導するかどうかを確認してもよい。そのような行動異常は、限定されるものでないが、例えばマウスへの医薬投与の乱用が歩行運動活性の増加をもたらす、運動活性の試験を含みうる（例えば、それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられるKostenら, J. Pharmacol., Exp. Ther. 269:137-144 (1994)；Bibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で1999年10月15日出願の米国特許出願第09/419,379号、およびBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で2000年10月13日出願の米国特許出願第09/687,959号を参照）；および／または選択した医薬の自己投与もしくは前パルス抑制（例えば、本明細書に参照によりその全文が組み入れられる1998年、７月７日公告の米国特許第5,777,195号を参照）。次いでこれらの試験の後に臨床研究におけるヒトによる試験を実施することができる。あるいは、ある特定の実施形態においては、臨床研究におけるヒトの試験を、動物試験なしに実施することができる。CKIまたはCdk5と異なる標的に影響を与える化合物も、以下に例示した代わりの標的を用いて同様にスクリーニングすることができる。
【００９８】
あるいは、CKIおよび／またはCdk5活性のモジュレーター（例えば、CKIまたはCdk5の活性化因子またはインヒビター）を、例えば、組換えバクテリオファージにより作製した無作為ペプチドライブラリー（例えば、ScottおよびSmith, Science 249:386-390 (1990)；Cwirlaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382 (1990)；Devlinら, Science 249:404-406 (1990)を参照）または化学ライブラリーのスクリーニングにより得ることができる。この「ファージ法」を用いて非常に大きなライブラリー（106-108種の化学物質）を構築することができる。第２の手法は化学的方法の利用であり、その例はGeysen法（Geysenら, Molecular Immunology 23:709-715 (1986)；Geysen ら J. Immunologic Method 102:259-274 (1987)）およびFodorらの方法（Science 251:767-773 (1991)）である。Furkaら（第14回生化学国際会議（14th international Congress of Biochemistry）, Volume 5, Abstract FR:013 (1988)；Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493 (1991))、Houghton（米国特許第4,631,211号、1986年12月公告）およびRutterら（米国特許第5,010,175号、1991年4月23日公告）は、CKIおよび／またはCdk5活性のモジュレーターとして試験することができるペプチドの混合物を作る方法を開示する。
【００９９】
他の態様においては、合成ライブラリー（それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられるNeedelsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10700-4 (1993)；Ohlmeyerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993)；Lamら, 国際特許公開WO 92/00252；Kocisら, 国際特許公開94/28028）などを本発明によるCKIおよび／またはCdk5および／またはカルシウムチャネル活性化のモジュレーターをスクリーニングするために利用することができる。いったん潜在的モジュレーターが同定されると、化学類似物を、市販される（例えば、Chembridge Corporation, San Diego, CAまたはEvotec OAI, Abingdon, UKから）化学品のライブラリーから選択するかあるいは新規に合成することができる。有望な薬剤（医薬）を標準アッセイにかけて、CKIおよび／またはCdk5の活性および／またはカルシウムチャネル活性化に対するその効果を試験することができる。次いでCKIおよび／またはCdk5の活性および／またはカルシウムチャネル活性化をモジュレートする医薬を選択する。
【０１００】
本発明はまた、mGluR、CKIまたはCdk5とin vivoで結合して抑制する小分子、その類似体のスクリーニング、ならびにCKIおよび／またはCdk5の天然のモジュレーターのスクリーニングも意図する。あるいは、天然産物ライブラリーを本発明のアッセイを利用してmGluR、CKIおよび／またはCdk5活性をモジュレートする分子をスクリーニングすることができる。
【０１０１】
ある特定のアッセイにおいては、標的、例えば、mGluR、CKIまたはCdk5を固体支持体に付着させることができる。そのような標的を固体支持体上に配置する方法は当技術分野では周知であり、ビオチンを標的に結合しかつアビジンを固体支持体に結合するものなどを含む。固体支持体を洗浄して未反応種を除去することができる。標識した潜在的モジュレーター（例えば、インヒビター）の溶液を固体支持体と接触させることができる。固体支持体を再び洗浄して、支持体と結合しない潜在的モジュレーターを除去する。固体支持体とともに残って標的と結合した標識した潜在的モジュレーターの量を定量することができる。あるいは、またはさらに、例えば、標識した潜在的モジュレーターと標的との間の解離定数を定量することができる。標的または潜在的モジュレーターに対する適当な標識は本明細書に開示されている。
【０１０２】
本発明の他の態様においては、潜在的モジュレーターを、Cdk5（すなわち、Cdk5-Nck5a複合体）によるThr75 DARPP-32またはトレオニン-75を含有するDARPP-32の断片のリン酸化をモジュレートする能力について、独立して、または本明細書に開示した結合アッセイの後にアッセイすることができる。このような一実施形態においては、Thr75 DARPP-32、またはトレオニン-75残基を含有するDARPP-32断片のリン酸化の量および／または割合を定量する。そのようなアッセイは、それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられるBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で1999年10月15日出願の米国特許出願第09/419,379号、およびBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で2000年10月13日出願の米国特許出願第09/687,959号に開示されている。
【０１０３】
このようにして、DARPP-32のリン酸化を抑制するかまたは代わって刺激するモジュレーターを次に選択する。特定の実施形態においては、潜在的モジュレーターの触媒活性に対する効果を定量する。次いで潜在的モジュレーターをホスホ-Thr75 DARPP-32によるPKA抑制の生理学的結果に対する効果について試験することができる。この目的については、電位依存性Ca2+電流（PKAにより調節されることが知られる）を、解離した線条体ニューロンのパッチ-クランプ記録（patch-clamp recording）を用いて分析することができる。そのような方法は、本明細書に参照によりその全文が組み入れられるBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で1999年10月15日出願の米国特許出願第09/419,379号、およびBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で2000年10月13日出願の米国特許出願第09/687,959号に開示されている。
【０１０４】
他の実施形態においては、潜在的モジュレーターを、線条体組織切片に加えることができる（第６および７節に開示のように）。組織サンプルを様々な濃度の潜在的モジュレーターを用いて処理し、次いでサンプルをCKIおよび／またはCdk5の活性について分析することができる。CKIおよび／またはCdk5の活性の潜在的モジュレーターは、例えば無傷のニューロンに対してin situで、急いで調製した新線条体切片を試薬を含有するクレブス（Kreb's）重炭酸塩バッファー溶液中でインキュベートする処理により、試験することができる。これらの化合物の効果は、最適濃度とインキュベーション時間を実験的に規定することにより試験することができる。
【０１０５】
他の実施形態においては、動物モデル（第5.5節を参照）を用いて、mGluRに関係する症状に対する潜在的薬剤の効果を確かめることができる。次いで、mGluRに関係する症状を改善する潜在的モジュレーターを選択することができる。例えば、動物の歩行運動行動応答を薬剤の存在および不在のもとで決定することができる。
【０１０６】
動物モデルで潜在的治療薬（例えば、候補薬、潜在的モジュレーターなど）を試験する方法は当技術分野では周知である。このようにして、潜在的治療薬を用いて全動物を治療することができる。潜在的モジュレーターを、様々な方法により投与することができ、それらの方法としては、提案される用途によって、局所、経口、皮下、または腹腔内（腹腔内注射など）が挙げられる。最適の用量は実験的に規定しうる。動物は、例えば焦点マイクロ波ビーム照射により犠牲にすることができる。
【０１０７】
特定の実施形態においては、線条体組織のホモジネートを免疫ブロット分析にかける。利用しうる代わりの手法は、この疾患の動物モデルにおけるmGluRに関係する病理学的症候を軽減する上での、これらの化合物の潜在的効果を評価する。例えば、ヒト疾患の病因となるハンチントン病（HD）遺伝子型を異所的に発現する動物は、HD患者と類似の神経病理学的症候群を表す。そのようなモデルを利用して、いずれの潜在的治療薬の効能を評価することもできる（第5.5節を参照）。一般的に、少なくとも２グループの動物をアッセイに利用し、少なくとも１グループは潜在的モジュレーターなしで投与用ビヒクルを投与する対照グループである。
【０１０８】
5.2.1.  キナーゼおよびホスファターゼに対する酵素アッセイ
本発明の方法によれば、CKlまたはCdk5のインヒビターを、単離した酵素の直接アッセイにより同定することができる。キナーゼ（例えば、CK1またはCdk5）の活性は、当業者に公知の様々な方法によりモニターすることができ、それらの方法としては、例えば次に開示された方法が挙げられる：Parker, Lawら, 2000, 「蛍光偏光を用いるハイスループットスクリーニングアッセイの開発：核受容体-リガンド結合およびキナーゼ／ホスファターゼアッセイ（Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays）」, J. Biomolec. Screening 5 (2):77-88；Baderら (2001, Journal of Biomolecular Screening 6 (4):255-64)；Liu, F., X.H. Ma,ら (2001), 「代謝共役型グルタミン酸受容体によるサイクリン依存性キナーゼ５およびカゼイン キナーゼ１の調節（Regulation of cyclin-dependent kinase 5 and casein kinase 1 by metabotropic glutamate receptors）」, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98 (20):11062-8；Evans, D.B., K.B. Rankら (2002).「96ウエルフォーマットを用いるヒトのタウタンパク質キナーゼII/Cdk5のインヒビターを研究するためのシンチレーション近接アッセイ（A scintillation proximity assay for studying inhibitors of human tau protein kinase II/Cdk5 using a 96-well format）」, Journal of Biochemical & Biophysical Methods 50 (2-3):151-61。
【０１０９】
そのような方法を用いて、目的のキナーゼを含有するサンプルを、適当な条件のもとで、放射性ATPおよびリン酸化部位を提供する適当な組成の合成ペプチド基質に曝す。次いで新しくペプチドと結合した放射性リン酸塩を測定する。基質ペプチドと共有結合したビオチンなどの化学部分を付加することにより、ストレプトアビジンをコーティングしたビーズと基質ペプチドとの結合が可能になる。ビーズに結合したペプチドを単離し、関連する放射能を測定するか、または、好ましくはシンチレーション近接アッセイに適したビーズを用いることにより、基質ペプチドに関連する放射能を直接測定することができる。
【０１１０】
CK1またはCdk5のモジュレーターはまた、DARPP-32リン酸化、すなわち、Serl37 DARPP-32リン酸化（CK1）またはThr75 DARPP-32リン酸化（Cdk5）のモジュレーターについてスクリーニングすることにより同定することができる。このような方法は、それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられるBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で1999年10月15日出願の米国特許出願第09/419,379号、およびBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で2000年10月13日出願の米国特許出願第09/687,959号に開示されている。
【０１１１】
ペプチド基質のリン酸化はまた、ホスホ特異的（phosphospecific）抗体の直接結合を経由してまたは競合体リンペプチドからのホスホ特異的抗体の置換を測定することにより検出することができる（例えば、Parker, Lawら, 2000, 「蛍光偏光を用いるハイスループットスクリーニングアッセイの開発：核受容体-リガンド結合およびキナーゼ／ホスファターゼアッセイ（Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays）」, J. Biomolec. Screening 5 (2):77-88を参照）。蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）または蛍光偏光（FP）などの蛍光法を特異的リンペプチド抗体複合体を検出するために利用することができる。これらの方法が有する利点は、結合した種の単離に依らないで、むしろ溶液中の特異的結合によって起こる蛍光の変化に依る「均一系の」検出を使用することである。ホスホ特異的抗体を作る方法は当技術分野で周知である。
【０１１２】
一実施形態においては、Bibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で1999年10月15日出願の米国特許出願第09/419,379号、およびBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で2000年10月13日出願の米国特許出願第09/687,959号に開示された方法（それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられる）を利用して、Thr75-リン酸化またはSerl37-リン酸化DARPP-32に特異性を有するリン酸化状態特異的抗体を作製する。
【０１１３】
蛍光共鳴エネルギー移動、またはFRETは、均一系アッセイに広く利用されていて、巨大分子の特異的結合を検出することができる。FRETは、励起された「ドナー」蛍光分子（蛍光体）がそのエネルギーを光として発光するよりむしろ近接する「アクセプター」蛍光体に移動する能力に依存する。従って、基質標的との結合によって２つの蛍光体が一緒の空間に運ばれると、正常なドナー波長で発光される蛍光が低下しアクセプター蛍光体により発光される蛍光が増加する。ドナー蛍光の減少またはアクセプター蛍光の増加を利用して結合事象を測定することができる。
【０１１４】
一実施形態においては、Baderらが開示した方法（2001, 「時間分解蛍光共鳴エネルギー移動に基づくハイスループットスクリーニングのためのcGMP依存性プロテインキナーゼアッセイ（A cGMP-dependent protein kinase assay for high throughput screening based on time-resolved fluorescence resonance energy transfer）」, Journal of Biomolecular Screening 6 (4):255-64）を利用してキナーゼ活性を定量する。Baderらは、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（「FRET」）に基づくハイスループットスクリーニング用のcGMP依存性プロテインキナーゼアッセイを開示している。目的のキナーゼを含有するサンプルを、ATPおよびCdk5特異的リン酸化部位とアミノ末端ビオチン部分とをもつ合成ペプチド基質に曝した。リン酸化ペプチドをアロフィコシアニン標識したストレプトアビジン、リンペプチド特異的抗体、およびユーロピウム-キレート標識した二次抗体を用いて検出した。ストレプトアビジンとホスホ特異的抗体がリン酸化基質分子に同時結合すると、アロフィコシアニン蛍光体「アクセプター」が二次抗体上のユーロピウムキレート「ドナー」の十分近くまで運ばれるので、蛍光共鳴エネルギー移動が起こって615nmにおけるユーロピウム放射の減少および665nm波長におけるアロフィコシアニン放射の増加として測定可能となる。ユーロピウム-アロフィコシアニンのドナー-アクセプター対が通常利用されるのは、励起ユーロピウムの蛍光寿命が長い利点を生かして、従ってシグナルが「時間分解（time-resolved）」されるからである。
【０１１５】
クマリンとフルオレセインイソチオシアネートなどの他の蛍光体の対を利用することができる。蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）に関わるこのような分子の対をFRET対と呼ぶ。エネルギー伝達が起こるためには、ドナーとアクセプター分子が典型的に近い近位（70〜100Åまで（Clegg, 1992, Methods Enzymol. 211:353-388；Selvin, 1995, Methods Enzymol. 246:300-334））になければならない。エネルギー伝達の効率はドナー分子とアクセプター分子との間の距離が大きくなると急速に低下する。FRETに通常使用される分子としては、フルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン（FAM）、2'7'-ジメトキシ-4'5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン（JOE）、ローダミン、6-カルボキシローダミン（R6G）、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン（TAMRA）、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、4-(4'-ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸（DABCYL）、および5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸（EDANS）が挙げられる。蛍光体がドナーであるかまたはアクセプターであるかは、その励起および発光スペクトル、ならびに対となる蛍光体により規定する。例えば、FAMは488nmの波長の光により最も効率的に励起されて、500〜650nmでかつ発光最高525nmのスペクトルをもつ光を発光する。FAMは、JOE、TAMRA、およびROX（これらは全て514nmの励起最高波長をもつ）と共に使用するのに適したドナー蛍光体である。
【０１１６】
蛍光偏光測定値を使ってまた、プロテインキナーゼまたはホスファターゼの活性を測定することもできる（例えば、Parker, Lawら, 2000, 「蛍光偏光を用いるハイスループットスクリーニングアッセイの開発：核受容体-リガンド結合およびキナーゼ／ホスファターゼアッセイ（Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays）」, J. Biomolec. Screening 5 (2):77-88；Turekら, 2001, Anal. Biochem. 299:45-53を参照）。大きな特異的抗体が小さい蛍光性リンペプチドと結合すると、その回転速度（tumbling rate）を遅くして蛍光偏光シグナルを増加する。従って、蛍光偏光は結合した蛍光性リンペプチドの量に比例する。このアッセイを競合モードで利用することができ、固定した濃度の蛍光性ペプチドおよび抗体を生物サンプルに加えて非蛍光性リンタンパク質またはリンペプチドの存在をシグナルの減少として記録する。このアッセイはまた、直接結合モードで利用することもでき、リン酸添加（キナーゼにより）または除去（ホスファターゼにより）により抗体結合、従って偏光シグナルをモジュレートする。特定の実施形態においては、蛍光偏光アッセイをTurekら（2001, Anal. Biochem. 299:45-53）の方法を用いて実施し、産物特異的な抗リン酸化ペプチド特異的（例えば、抗ホスホ-セリン）抗体を使用する。
【０１１７】
本発明のある特定の実施形態においては、蛍光偏光（FP）などの均一系蛍光技術が、本発明の方法による医薬標的の多数のタイプをスクリーニングするための好ましい方法である。蛍光偏光（FP）を利用して、核受容体-リガンド置換およびキナーゼ抑制に対するハイスループットアッセイ（HTS）が開発されている。FPは溶液に基づく均一系技術であり、反応成分の固定または分離を必要としない。FPに基づくエストロゲン受容体（ER）アッセイは、フルオレセイン標識したエストラジオールとエストロゲン様化合物とのERに対する結合の競合に基づく（Parker, Lawら, 2000, 「蛍光偏光を用いるハイスループットスクリーニングアッセイの開発：核受容体-リガンド結合およびキナーゼ／ホスファターゼアッセイ（Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays）」, J. Biomolec. Screening 5 (2):77-88）。Parkerらによる研究は、この相互作用に対するKdはERについて3nM、ERpについて2nM；IC50値は17β-エストラジオール、タモキシフェン、4-OH-タモキシフェン、およびジエチルスチルベストロールについてそれぞれ、5.6、189、26、および3.5nMと決定した。転写活性化スクリーニングからの50種のリード化合物のスクリーニングにおいて、21種の化合物は10μM未満のIC50値を有し、そのなかの１種はERβに対して、ERαを超えてほとんど100倍の高いアフィニティを有した。これらのデータは、FPに基づく競合結合アッセイを利用して、ERに対して広範囲の結合アフィニティをもつ多様な化合物をスクリーニングできることを示す。
【０１１８】
FPに基づくタンパク質-チロシンキナーゼ（PTK）アッセイも利用することができる（Parker, Lawら, 2000, 「蛍光偏光を用いるハイスループットスクリーニングアッセイの開発：核受容体-リガンド-結合およびキナーゼ／ホスファターゼアッセイ（Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays）」, J. Biomolec. Screening 5 (2):77-88）。このPTKアッセイは、抗ホスホチロシン抗体と結合したフルオレセイン標識リンペプチドを用いる。目的のキナーゼにより作製されたリンペプチドがこの結合と競合する。
【０１１９】
プロテインキナーゼＣ（PKC）アッセイも利用することができる（Parker, Lawら, 2000, 「蛍光偏光を用いるハイスループットスクリーニングアッセイの開発：核受容体-リガンド-結合およびキナーゼ／ホスファターゼアッセイ（Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays）」, J. Biomolec. Screening 5 (2):77-88）。PKCアッセイは、FPに基づくPTKアッセイと同様に、競合を利用する。PKCイソ型はペプチド基質に対して様々な代謝回転速度（turnover rate）を有する。スタウロスポリンのIC50は、例えば、全てのPKCイソ型に対して10nM未満である。
【０１２０】
チロシンホスファターゼアッセイを利用することもできる（Parker, Lawら, 2000, 「蛍光偏光を用いるハイスループットスクリーニングアッセイの開発：核受容体-リガンド-結合およびキナーゼ／ホスファターゼアッセイ（Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays）」, J. Biomolec. Screening 5 (2):77-88）。チロシンホスファターゼアッセイは競合よりもむしろ直接結合を利用する。Ｔ細胞タンパク質-チロシンホスファターゼ（TC PTP）の濃度が増加すると、脱リン酸化の速度を増加する。偏光におけるこの変化は、TC PTPに依存し、かつ50μM Na3V04により抑制される。Na3V04のTC PTPに対するIC50は4nMである。これらのデータはFPに基づくアッセイがキナーゼおよびホスファターゼ活性を検出できることを実証する。ある特定の実施形態においては、本発明に開示したFPアッセイのような均一系蛍光技術が、医薬標的の多数のタイプをスクリーニングするための好ましい方法である。これらのような新しいハイスループットスクリーニング（HTS）計器使用とアッセイ方法により、FPは当業者がハイスループットスクリーニング中に容易に組み込みうる技術となっている。
【０１２１】
ある特定の実施形態においては、Cdk5のモジュレーター（例えば、インヒビター）は、ベクターによる発現後の細菌から精製した組換えCdk5を用いて、Cdk5を含有する細胞溶解物を用いて、または脳組織溶解物を用いて、酵素アッセイを経由して同定することができる（例えば、Leostら, 2000, Eur. J. Biochem. 267:5983-5994を参照）。他の実施形態においては、Cdk5のモジュレーターは、バキュロウイルスを使う発現後の昆虫細胞（例えば、Sf9細胞）から精製した組換えCdk5を用いて同定することができる。このようなアッセイにおいては、酵素または溶解物を30℃にてペプチド基質ビオチン-DARPP-32（アミノ酸残基67-82）（ほぼ1μM）とともに、適当なバッファー（500μM ATP、50mM HEPES、pH7.5／10mM MgCl2、1mMジチオトレイトール）中で最終反応容積40-60μlにてインキュベートする。反応は等容積の停止バッファー（30 mM EDTA、pH 7.0）を加えることにより停止する。
【０１２２】
リン酸化ペプチドの検出については、停止した反応物のアリコート（20-30μl）を、三重で384ウエル黒色マルチウエルプレートに加え、次いで、適当なバッファー（0.1％BSAを含むリン酸バッファー生理食塩水、pH 7.4）中にウサギポリクローナル抗ホスホthr75-DARPP-32抗体（1nM）、ユーロピウム標識した抗ウサギIgG（1nM）、およびストレプトアビジン-アロフィコシアニンコンジュゲート（2ug/ml）を含有する抗体混合液の２容積を加えた。20℃にて1-24時間インキュベーションの後に、Applied Biosystems社サイトフルオア（Cytofluor）を用いて励起した後、50μsから開始して200μsの期間にわたり蛍光を測定する（励起フィルター波長340nM；発光フィルター波長660nM）。マウスモノクローナル抗ホスホthr75-DARPP-32抗体、ユーロピウム標識した抗マウスIgGなどの他の抗体組合わせは本発明により意図されていて、比較しうる結果を与えうると予測される。
【０１２３】
CK1のインヒビターは、単離したCK1、CK1を含有する細胞溶解物、または脳組織溶解物を用いて、同様な酵素アッセイを経由して同定することができる。このアッセイにおいては、酵素または溶解物を、30℃にて、ペプチド基質ビオチン-DARPP-32（アミノ酸残基132-146）（ほぼ1μM)とともに、適当なバッファー（500μM ATP、50mM HEPES、pH7.5／10mM MgCl2、1mMジチオトレイトール）中で、最終反応容積40-60μlにてインキュベートする。反応は等容積の停止バッファー（30 mM EDTA、pH 7.0）を加えることにより停止する。
【０１２４】
リン酸化ペプチドの検出については、停止した反応物のアリコート（20-30μl）を、三重で384ウエル黒色マルチウエルプレートに加え、次いで、適当なバッファー（0.1％BSAを含むリン酸バッファー生理食塩水、pH 7.4）中に抗ホスホserl37-DARPP-32抗体（1nM）、ユーロピウム標識した抗マウスIgG（1nM）、およびストレプトアビジン-アロフィコシアニンコンジュゲート（2ug/ml）を含有する抗体混合液の２容積を加えた。20℃にて1-24時間のインキュベーションの後に、Applied Biosystems社サイトフルオア（Cytofluor）を用いて励起した後、50μsから開始して200μsの期間にわたり蛍光を測定する（励起フィルター波長340nM；発光フィルター波長660nM）。ウサギポリクローナル抗ホスホthr75-DARPP-32抗体、ユーロピウム標識した抗ウサギIgGなどの他の抗体組合わせは本発明により意図されていて、比較しうる結果を与えうると予測される。
【０１２５】
上に開示したアッセイの一形態においては、組換え酵素、組織から単離された酵素、または組織もしくは細胞溶解物を、プロリン指定リン酸化部位を提供するビオチン-ペプチド基質とともに30℃にてインキュベートする。ラットおよびマウスDARPP-32のリン酸化部位と同一である、ヒトDARPP-32のアミノ酸残基67-82、KRPNPCAYTPPSLKAV（配列番号５）はこのような基質を提供する。
【０１２６】
上に開示したアッセイの他の形態においては、組換え酵素、組織から単離された酵素、または組織もしくは細胞溶解物を、カゼインキナーゼリン酸化部位を提供するビオチン-ペプチド基質とともに30℃にてインキュベートする。ラットおよびマウスDARPP-32のリン酸化部位と同一である、ヒトDARPP-32のアミノ酸残基133-143、EEEDSQAEVLK（配列番号６）はこのような基質を提供する。
【０１２７】
mGluRリガンドに応答する細胞内キナーゼ活性のモジュレーションは、当業者に公知の様々な方法によりモニターすることができる。その細胞表面上にmGluRを提示する培養細胞をアゴニストまたはアンタゴニストとともにインキュベートし、界面活性剤溶解により遊離される細胞内キナーゼとそれらの活性を上記のリン酸化の蛍光検出によりまたは放射性同位体トレーサー法により測定することができる。放射性同位体トレーサー法は、例えば、Liu, F., X. H. Ma,ら (2001), 「代謝共役型グルタミン酸受容体によるサイクリン依存性キナーゼ５およびカゼイン キナーゼ１の調節（Regulation of cyclin-dependent kinase 5 and casein kinase 1 by metabotropic glutamate receptors）」, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 (20):11062-8；Evans, D.B., K.B. Rankら (2002), 「96ウエルフォーマットを用いるヒトのタウタンパク質キナーゼII/Cdk5のインヒビターを研究するためのシンチレーション近接アッセイ（A scintillation proximity assay for studying inhibitors of human tau protein kinase II/Cdk5 using a 96-well format）」, J. Biochem. Biophys. Meth. 50 (2-3):151-61；およびMcDonaldら, 1999, 「Raf/MEK/ERKキナーゼカスケードのシンチレーション近位アッセイ：ハイスループットスクリーニングおよび選択的酵素インヒビターの同定（A scintillation proximity assay for Raf/MEK/ERK kinase cascade: High-throughput screening and identification of selective enzyme inhibitors）」, Anal. Biochem. 268:318-329の開示のように利用してもよい。
【０１２８】
他の実施形態においては、細胞に基づくリン酸化のアッセイを利用する。特定の実施形態においては、タンパク質リン酸化に基づくシグナル伝達をin vivo、例えば、単一生存細胞で、蛍光指示薬を使って、Satoら（2002, 「単一生存細胞のタンパク質リン酸化をイメージングするための蛍光指示薬（Fluorescent indicators for imaging protein phosphorylation in single living cells）」, Nature Biotechnology 20(3):287-94)に開示されたような方法を用いて可視化する。そのようなセンサーは、フレキシブルリンカーにより分離された２つの蛍光タンパク質分子からなる。リンカーペプチドはリン酸化部位およびリンタンパク質認識エレメントを含有する。リンカーのリン酸化は、コンフォメーションの変化を生じて２つの蛍光タンパク質を密接した近位に運び、FRETを発生させてその系の蛍光出力を変える。
【０１２９】
他の実施形態においては、細胞に基づくリン酸化のアッセイを利用する。特定の実施形態においては、遺伝子工学によりコードしたタンパク質リン酸化のセンサーを用いる。そのようなセンサーはフレキシブルリンカーにより分離された２つの蛍光タンパク質分子からなる。リンカーペプチドはリン酸化部位およびリンタンパク質認識エレメントを含有する。リンカーのリン酸化は、コンフォメーション変化を生じて２つの蛍光タンパク質を密接した近位に運び、FRETを発生させてその系の蛍光出力を変える。
【０１３０】
5.3.  代謝共役型グルタミン酸受容体シグナル伝達経路を経由してCKIおよび／またはCdk5の活性をモジュレートする化合物
本発明はまた、カゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性をモジュレートする組成物であって、限定されるものでないが、以下に開示する次の薬剤、医薬、化合物または小分子を含む上記組成物も提供する。本発明はまた、カゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性のモジュレーションを経由してカルシウムチャネルの活性をモジュレートする組成物であって、限定されるものでないが、以下に開示する次の薬剤、医薬、化合物または小分子を含む上記組成物も提供する。本発明はまた、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害の治療方法に使用する組成物であって、カゼインキナーゼＩ（CKI）および／またはサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の活性をモジュレートし、限定されるものでないが、以下に開示する次の薬剤、医薬、化合物または小分子を含む上記組成物も提供する。ある特定の実施形態においては、上記組成物はmGluRシグナル伝達経路を経由して活性をモジュレートする。一実施形態においては、上記mGluRシグナル伝達経路は、PLCβと結合したＧタンパク質を刺激するmGluRl受容体の活性化、IP3感受性ストアから遊離されるCa2+によるCa2+/カルモジュリン依存性ホスファターゼ、カルシニューリン（PP2B）の活性化、キナーゼ活性の増加をもたらすカルシニューリンによるCK1ε上の抑制自己リン酸化部位の脱リン酸化を含むものである。
【０１３１】
いずれの理論に束縛されることも欲しないが、本発明の一態様においては、mGluRl受容体の活性化はPLCβと結合したＧタンパク質を刺激し、IP3感受性ストアから遊離されるCa2+はCa2+/カルモジュリン依存性ホスファターゼ、カルシニューリン（PP2B）を活性化し、次いでカルシニューリンはCKI上の抑制自己リン酸化部位を脱リン酸化する。CKIの脱リン酸化はキナーゼ活性の増加をもたらす。従って、本発明の一実施形態において、本発明は、カルシニューリン（PP2B）の活性のモジュレーションを介してCKIの活性または発現をモジュレートする薬剤を提供する。
【０１３２】
好適なmGluRアゴニストとしては、限定されるものでないが、次が挙げられる：(±)-1-アミノシクロペンタン-trans-1,3-ジカルボン酸、(±)-1-アミノ-[4,5-3H]-シクロペンタン-trans-1,3-ジカルボン酸、(lS,3R)-1-アミノシクロペンタン-1,3-ジカルボン酸、trans-アゼチジン-2,4-ジカルボン酸、(RS)-2-クロロ-5-ヒドロキシフェニルグリシン、(RS)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン、(S)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン、(2S,1'S,2'S)-2-(2'-カルボキシ-3',3'ジフルオロシクロプロピル)グリシン、(S)-1-アミノプロパン-1,3-ジカルボン酸、L-ホモシステインスルフィン酸、(RS)-3-ヒドロキシフェニルグリシン、(S)-3-ヒドロキシフェニルグリシン、L-キスカル酸、(L)-(+)-α-アミノ-3,5-ジオキソ-1,2,4-オキサジアゾリジン-2-プロパン酸、S-スルホ-L-システインナトリウム塩、(2R,4R)-4-アミノピロリジン-2,4-ジカルボキシレート、(2S,3S,4S)-CCG/(2S,1'S,2'S)-2-(カルボキシシクロプロピル)グリシン、(2S,2'R,3'R)-2-(2',3'-ジカルボキシシクロプロピル)グリシン、(2S,2'R,3'R)-2-(1'-3H,2',3'-ジカルボキシシクロプロピル)グリシン、(2S,1'S,2'S)-2-(2'-カルボキシ3',3'-ジフルオロシクロプロピル)グリシン、(S)-2-アミノ-2-メチル-4-ホスホノブタン酸、(2S,3S,4S)-2-メチル-2-(カルボキシシクロプロピル)グリシン、α-NAAG/N-アセチル-L-アスパルチル-L-グルタミン酸、(1S,3R,45)-1-アミノシクロペンタン-1,2,4-トリカルボン酸、(3RS,4RS)-1-アミノシクロペンタン-1,3,4-トリカルボン酸、L(+)-2-アミノ-4-ホスホノ酪酸、L(+)-2-アミノ-4-ホスホノ-[2,3-3H]-酪酸、UBP1109/(S)-3,4-ジカルボキシフェニルグリシン(RS)-4-クロロ-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン、2-アミノ-4-(3-ヒドロキシ-5-メチルイソキサゾール-4-イル)酪酸、O-ホスホ-L-セリン(R,S)-4-ホスホノフェニルグリシン、(lR,3R,4S)-1-アミノシクロペンタン-1,3,4-トリカルボン酸、L-システインスルフィン酸、(RS)-3,4-ジカルボキシフェニルグリシン、α-アミノ-(3-ヒドロキシ-5-イソキサゾリル)酢酸、および(RS)-α-メチル-3-カルボキシメチル-フェニルグリシン。
【０１３３】
適当なmGluRアンタゴニストとしては、限定されるものでないが、次が挙げられる：(RS)-l-アミノインダン-1,5-ジカルボン酸、DL-2-アミノ-3-ホスホノプロパン酸、(S)-3-カルボキシ-4-ヒドロキシフェニルグリシン、(S)-4-カルボキシ-4-ヒドロキシフェニルグリシン、(S)-4-カルボキシフェニルグリシン、7-(ヒドロキシイミノ)シクロプロパ[b]クロメン-1a-カルボン酸エチルエステル、(RS)-α-エチル-4-カルボキシフェニルグリシン、(S)-(+)-α-アミノ-4-カルボキシ-2-メチルベンゼン酢酸、(RS)-α-メチル-4-カルボキシフェニルグリシン、(S)-α-メチル-4-カルボキシフェニルグリシン、2-メチル-6-(フェニルエチニル)ピリジン、2-メチル-6-([3,5-3H]フェニルエチニル)ピリジン、N-フェニル-7-(ヒドロキシイミノ)シクロプロパ[b]クロメン-1a-カルボキサミド、6-メチル-2-(フェニルアゾ)-3-ピリジノール、2-メチル-6-(2-フェニルエテニル)ピリジン、(RS)-1-アミノ-5-ホスホノインダン-1-カルボン酸、(2S)-α-エチルグルタミン酸、(2S)-2-アミノ-2-[(1S,2S)-2-カルボキシシクロプロプ-1-イル]-3-(キサント-9-イル)プロパン酸、(2S)-2-アミノ-2-[(1S,2S)-2-カルボキシシクロプロプ-1-イル]-3-[2,7-3H]キサント-9-イル)プロパン酸、α-メチル-L-CCGI/(2S,3S,4S)-2-メチル-2-(カルボキシシクロプロピル)グリシン、(RS)-α-メチルセリン-O-リン酸モノフェニルエステル、(RS)-α-メチル-4-スルホノフェニルグリシン、(RS)-α-メチル-4-ホスホノフェニルグリシン、(RS)-α-メチルセリン-O-ホスフェート、(RS)-α-メチル-4-スルホノフェニルグリシン、α-メチル-3-メチル-4-ホスホノフェニルグリシン、L-AP3およびBAY36-7620（De Vryら, 2001, Eur. J. Pharmacol. 428:203-214）。特定の実施形態においては、mGluRアンタゴニストはグループＩ mGluRアンタゴニスト、例えば、L-AP3である。
【０１３４】
他の治療薬としては、限定されるものでないが、ドネプジル塩酸（donepzil hydrochloride）、リバスチグミン（rivastigmine）、ガランタミンのプラミペキソール（Pramipexole）、ロピニロール（ropinirole）、トリヘキシルフェニジル（trihexylphenidyl）、セレギン（selegine）、ベンゾトロピン（benzotropine）、ペルゴライド（pergolide）、エンタカポン（entacapone）、セレギリン（selegiline）、レボドーパ（levodopa）、プラミペキソール（pramipexole）、ブロモクリプチン（bromocriptine）、ｍ-セレギリン（m selegiline）、カルビドーパ（carbidopa）、アマンチジン（amantidine）、トルカポン（tolcapone）、デキストロアンフェタミン（Dextroamphetamine）、メチルフェニデート（methylphenidate）、ペモリン（pemoline）、リスペリドン（risperidone）、オランザピン（olanzapine）、クロザピンハル（clozapinehal）、オペリドール（operidol）、クロロプロマジン（chlorpromazine）、ケチアピン（quetiapine）、フルフェナジン（fluphenazine）、およびペルフェナジン（perphenazine）が挙げられる。
【０１３５】
他の治療薬としては、限定されるものでないが、CKIインヒビター、例えばCKI-7（CK1-7）およびCdk5インヒビター、例えばブチロラクトンが挙げられる。
【０１３６】
他の治療薬としては、限定されるものでないが、PLCβインヒビター（例えば、U73122）、Ca2+キレーター（例えば、BAPTA/AM）が挙げられる。
【０１３７】
他の治療薬としては、限定されるものでないが、カルシニューリンインヒビター、例えば、シクロスポリンＡ、シペルメトリン（Cypermethrin）3-(2,2-ジクロロエテニル)-2,2-ジメチルシクロプロパンカルボン酸シアノ(3-フェノキシフェニル)メチルエステル、タクロリムス（FK506、Prograf）、デルタメトリンおよびISATX247（Isotechnika）が挙げられる。
【０１３８】
他の治療薬としては、限定されるものでないが、抗てんかん薬、例えば、通常てんかんの治療に選択される医薬であるフェニトイン（Dilantin）、複雑部分硬直間代性発作用のフェノバルビタール、プリミドン（Mysoline）、カルバマゼピン（Tegretol）、ならびに欠神発作用のエトサクシミド(Zarontin)および クロナゼパム（Klonopin）が挙げられる。バルプロ酸（Depakene）も欠神発作用に使われる。医薬の選択および最適用量の計算は非常に困難な作業であり高度に個別化される。
【０１３９】
他の治療薬としては、限定されるものでないが：ベプリジル（bepridil）、クレンチアゼム（clentiazem）、ジルチアズム（diltiazem）、フェンジリン（fendiline）、ガロパミル（gallopamil）、ミベフラジル（mibefradil）、プレニラミン（prenylamine）、セモチアジル（semotiadil）、テロジリン（terodiline）、ベラパミル（verapamil）、アムロジピン（amlodipine）、アラニジピン（aranidipine）、バルニジピン（barnidipine）、ベニジピン（benidipine）、シルニジピン（cilnidipine）、エフォニジピン（efonidipine）、エルゴジピン（elgodipine）、フェロジピン（felodipine）、イスラジピン（isradipine）、ラシジピン（lacidipine）、レルカニジピン（lercanidipine）、マニジピン（manidipine）、ニカルジピン（nicardipine）、ニフェジピン（nifedipine）、ニルバジピン（nilvadipine）、ニモジピン（nimodipine）、ニソルジピン（nisoldipine）、ニトレンジピン（nitrendipine）、シナリジン（cinnarizine）、フルナリジン（flunarizine）、リドフラジン（lidoflazine）、ロメリジン（lomerizine）、ベンシクラン（bencyclane）、エタフェノン（etafenone）、ファントファロン（fantofarone）、およびペルヘキシリン（perhexiline）が挙げられる。
【０１４０】
ある特定のmGluRアゴニストまたはアンタゴニストがアゴニストとアンタゴニストの両方の特性を有しうることは、当業者には明らかであろう。以上に掲げた化合物は機構の理論により限定されるものでなく、それらの分類と無関係に本発明に応用することができる。
【０１４１】
本発明はまた、mGluR細胞内シグナル伝達経路またはカルシウムチャネル活性化のモジュレーターとして活性を有する新しい化合物であって、限定されるものでないが、mGluR細胞内シグナル伝達および／またはカルシウムチャネル活性化を刺激または抑制する能力をもついずれの化合物も含みかつ、限定されるものでないが、細胞内に送達することができる低分子量有機分子を含む上記化合物を設計する方法も包含する。
【０１４２】
本発明はさらに、CKIおよび／またはCdk5の活性をモジュレートしそれによりmGluRシグナル伝達経路に関係する障害を改善することができる医薬を開発するための、合理的な医薬設計を実施する方法を提供する。そのような合理的な医薬設計は、mGluRのアゴニストまたはアンタゴニストとして同定されている化合物を出発点に用いて実施することができる。他の実施形態においては、CKIまたはCdk5のアゴニストまたはアンタゴニストとして同定されている化合物を出発点に用いてもよい。従って、本発明はさらに特異的なインヒビターを同定することを可能にするスクリーニングおよびアッセイを提供する。そのような合理的医薬設計の方法は当技術分野で周知である。特定の実施形態においては、本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Bibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で1999年10月15日出願の米国特許出願第09/419,379号、およびBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で2000年10月13日出願の米国特許出願第09/687,959号に開示された合理的な医薬設計法を用いる。
【０１４３】
実際に、潜在的モジュレーターをGRAM、DOCK、またはAUTODOCK（Dunbrackら, Folding & Design 2:27-42 (1997））などのドッキングプログラムを用いるコンピューターモデルの利用を介して試験し、例えばmGluRシグナル伝達経路の、潜在的モジュレーターを同定することができる。次いでこれらのモジュレーターをCKIまたはCdk5活性に対する効果について試験することができる。この方法は、潜在的モジュレーターの形状および化学構造が如何にうまくmGluRまたはCKIと結合しうるかを確かめるための、潜在的モジュレーターのmGluRまたはCKI複合体とのコンピューターフィッティングを含みうる（Buggら, 1993, Scientific American (Dec.) 269 (6):92-98；Westら, TIPS, 16:67-74 (1995)）。コンピュータープログラムはまた、サブユニットのモジュレーター／インヒビターとの引力、反力、および立体障害を評価するために使用することもできる。
【０１４４】
一般的に、フィットが強いほど、立体障害は低くかつ引力は大きく、より強力な潜在的モジュレーターである、というのは、これらの特性はより強い結合定数と一致するからである。さらに、潜在的医薬の設計における特異性が高いほど、その医薬は他のタンパク質と相互作用しない可能性が高い。これにより、他のタンパク質との望ましくない相互作用による潜在的副作用が最小限に抑えられる。
【０１４５】
最初に、mGluRと結合することが知られている化合物（例えば、(S)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン（DHPG））をコンピューターモデルプログラムにより、１以上の有望な潜在的類似体を同定するまでシステム的に改変する。さらに、選択した類似体のシステム的改変物を次いでコンピューターモデルプログラムにより、１以上の潜在的類似体を同定するまでシステム的に改変する。そのような解析は、当業者に周知であり、例えば、HIVプロテアーゼインヒビターの開発に効果的であることが知られている（例えば、Lamら, Science 263:380-384 (1994)；Wlodawerら, Ann. Rev. Biochem. 62:543-585 (1993)；Appelt, Perspectives in Drug Discovery and Design 1:23-48 (1993)；Erickson, Perspectives in Drug Discovery and Design 1:109-128 (1993)を参照）。あるいは、潜在的モジュレーターを、最初に、例えば、上に開示した組換えバクテリオファージにより作製した無作為ペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより得ることができる。この方法で選択したペプチドを次いで上に開示したコンピューターモデルプログラムによりシステム的に改変し、上に開示した構造的類似体と同様に処理する。
【０１４６】
いったん潜在的モジュレーターが同定されると、市販される化学品のライブラリー（例えば、Chembridge Corporation, San Diego, CAまたはEvotec OAI, Abingdon, UK）から選択してもよい。あるいは、潜在的モジュレーターを新規に合成してもよい。潜在的ペプチドモジュレーターは、タンパク質合成技術により、例えば、ペプチド合成機または当技術分野で周知のタンパク質／ペプチド合成の他の方法の使用により合成することができる。一実施形態においては、Bibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で1999年10月15日出願の米国特許出願第09/419,379号、およびBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で2000年10月13日出願の米国特許出願第09/687,959号（本明細書に参照によりその全文が組み入れられる）に開示されたタンパク質／ペプチド合成の方法を利用する。１または比較的小グループの特定化合物の新規合成が医薬設計の分野では妥当である。
【０１４７】
潜在的薬剤、潜在的薬剤の標的（例えば、mGluR、CKI、Cdk5）またはDARPP-32（32Ｐ-Thr75リン酸化DARPP-32など）のいずれに標識を付けてもよい。適当な標識としては、酵素（例えば、アルカリホスファターゼまたは西洋わさびペルオキシダーゼ）、蛍光団（若干の蛍光団を挙げると、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、フィコエリトリン（PE）、テキサスレッド（TR）、ローダミン、遊離またはキレート化ランタニド系列の塩、特にEu3+）、発色団、放射性同位体、キレート剤、染料、コロイド状金、ラテックス粒子、リガンド（例えば、ビオチン）、化学発光剤、磁気ビーズまたは磁気共鳴イメージング標識が挙げられる。対照マーカーを用いるときは、受容体と対照マーカーに対して同じまたは異なる標識を用いてもよい。
【０１４８】
同位体3Ｈ、14Ｃ、32Ｐ、35Ｓ、36Cl、5lCr、57Co、58Co、59Fe、90Ｙ、125Ｉ、13lＩ、およびl86Reなどの放射性標識を用いるときは、当技術分野で公知のカウント方法を利用することができる。
【０１４９】
標識が酵素である実施形態においては、検出は当技術分野で公知の現在利用されている比色、分光分析、蛍光分光分析、電流測定またはガス分析技術により実施することができる。
【０１５０】
直接標識は、本発明の方法によって利用しうる標識の一例である。直接標識は、自然の状態において、肉眼（例えば、複合または解剖光学顕微鏡を通しての目視観察により）、または光学フィルターの助けをかりておよび／または刺激、例えば蛍光を増強する紫外光を適用して、容易に見ることができる実体である。本発明の方法によって利用しうる着色標識の例としては、金属ゾル粒子、例えば、Leuvering（米国特許第4,313,734号）が開示したような金ゾル粒子；Gribnauら（米国特許第4,373,932号）およびMayら（WO 88/08534）が開示したような染料ゾル粒子；Mayら（WO 88/08534）、Snyder（EP-A 0280 559および0 281 327）が開示したような染色ラテックス；またはCampbellら（米国特許第4,703,017号）が開示したようなリポソーム中に封入された染料が挙げられる。
【０１５１】
他の直接標識は、放射性ヌクレオチド、発光部分、または蛍光部分を含み、限定されるものでないが、例えば、緑色蛍光タンパク質の改変／融合キメラを含む（それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、1997年４月29日公告の米国特許第5,625,048号、および1997年７月24日公開のWO 97/26333に開示のように）。
【０１５２】
これらの直接標識デバイスに加えて、酵素を含む間接標識も本発明によって利用することができる。様々なタイプの酵素結合イムノアッセイ、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、リゾチーム、グルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、またはウレアーゼを用いる酵素結合イムノアッセイが当技術分野で周知である。これらならびにその他の類似のアッセイが当技術分野で周知であり、例えば、Engvall（1980,「酵素イムノアッセイELISAおよびEMIT（Enzyme Immunoassay ELISA and EMIT）」, Methods in Enzymotogy, 70:419-439）および米国特許第4,857,453号に開示されている。
【０１５３】
ある特定の実施形態においては、タンパク質を代謝標識により標識することができる。代謝標識の標識付けは、[35Ｓ]-メチオニンまたは[32Ｐ]-オルトリン酸などの代謝標識を補充した培地の存在のもとでタンパク質を発現する細胞のin vitro培養中に起こる。[35Ｓ]-メチオニンによる代謝（または生合成）標識に加えて、本発明はさらに、[14Ｃ]-アミノ酸および[3Ｈ]-アミノ酸による（不安定でない位置に置換したトリチウムによる）標識を意図する（例えば、本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、Bibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で1999年10月15日出願の米国特許出願第09/419,379号、およびBibbらによる「ドーパミンシグナル伝達におけるリン酸化／脱リン酸化を調節する薬剤を同定する方法（Methods of Identifying Agents That Regulate Phosphorylation/Dephosphorylation in Dopamine Signaling）」の表題で2000年10月13日出願の米国特許出願第09/687,959号を参照）。
【０１５４】
5.4.  診断および治療法
本明細書に開示したように、本発明は、CKIおよび／またはCdk5の活性または発現をモジュレートする薬剤、医薬、化合物および組成物を提供する。本発明はまた、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療するための診断および治療の方法であって、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害の治療に、限定されるものでないが、上記組成物または化合物の使用を含む上記方法も提供する。
【０１５５】
一態様においては、本発明は、カルシウムチャネル活性（例えば、カルシウム電流）の増加または減少を特徴とする神経症状を治療する方法であって、本発明による化合物の有効量を投与してCKIおよび／またはCdk5活性をモジュレートし、その結果、mGluRシグナル伝達経路のモジュレーションを経由してカルシウムチャネル活性を増加または減少させることを含んでなる上記方法を提供する。一実施形態においては、上記化合物を本明細書に開示した方法により同定する。
【０１５６】
さらに、本発明は、個人（例えば、患者）または動物被験体における、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を、CKIおよび／またはCdk5活性をモジュレートする本発明の化合物の有効量を投与することにより治療する方法を提供する。一実施形態においては、上記薬剤はCKIおよび／またはCdk5の活性を促進しかつ増加する。他の実施形態においては、上記薬剤はCKIおよび／またはCdk5の活性を抑制しまたは減少する。
【０１５７】
特定の実施形態においては、本発明の方法を利用して、アルツハイマー病の特徴である症候および／または病状に関係する個人における、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する。
【０１５８】
他の実施形態においては、本発明の方法を利用して、ハンチントン病の特徴である症候および／または病状に関係する個人における、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する。
【０１５９】
他の実施形態においては、本発明の方法を利用して、パーキンソン病の特徴である症候および／または病状に関係する個人における、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する。
【０１６０】
他の実施形態においては、本発明の方法を利用して、ツレット症候群の特徴である症候および／または病状に関係する個人における、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する。
【０１６１】
他の実施形態においては、本発明の方法を利用して、卒中の特徴である症候および／または症状に関係する個人における、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する。
【０１６２】
他の実施形態においては、本発明の方法を利用して、癲癇の特徴である症候および／または症状に関係する個人における、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する。
【０１６３】
他の実施形態においては、本発明の方法を利用して、精神分裂病の特徴である症候および／または病状に関係する個人における、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する。
【０１６４】
他の実施形態においては、本発明の方法を利用して、不眠症の特徴である症候および／または病状に関係する個人における、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する。
【０１６５】
他の実施形態においては、本発明の方法を利用して、うつ病の特徴である症候および／または病状に関係する個人における、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する。
【０１６６】
他の実施形態においては、本発明の方法を利用して、注意欠陥障害（ADD）の特徴である症候および／または症状に関係する個人における、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する。
【０１６７】
他の実施形態においては、本発明の方法を利用して、注意欠陥過活動障害（ADHD）の特徴である症候および／または症状に関係する個人における、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する。
【０１６８】
他の実施形態においては、本発明の方法を利用して、薬物乱用の特徴である症候および／または症状に関係する個人における、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する。
【０１６９】
他の実施形態においては、本発明の方法を利用して、疼痛の特徴である症候および／または症状に関係する個人における、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する。
【０１７０】
他の実施形態においては、本発明の方法を利用して、癌の特徴である症候および／または病状に関係する個人における、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を治療する。
【０１７１】
好ましくは、上記の治療方法で投与される薬剤、化合物または組成物は十分な量が十分な割合で脳血液関門を通過することができて、障害、従って症状または疾患の治療を可能にする。そのような一実施形態においては、薬剤を静脈中に投与する。他の実施形態においては、薬剤を経口投与する。さらに好ましくは、薬剤は担体なしで脳血液関門を通過することができる（投与の方法および経路については、第5.6節を参照）。
【０１７２】
5.5.  疾患または障害のモデル
本発明の方法によれば、限定されるものでないが、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、ツレット病、卒中、癲癇、睡眠または概日リズム障害(例えば、不眠症)、精神分裂病、うつ病、注意欠陥障害（ADD）、注意欠陥過活動障害（ADHD）、薬物乱用、疼痛、および癌を含む、代謝共役型グルタミン酸受容体シグナル伝達経路に関係する疾患または障害に対する動物モデルをアッセイに利用して、CKIまたはCdk5の活性をモジュレートする化合物またはmGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害の症候群を改善する化合物をスクリーニングすることができる。一実施形態においては、mGluRシグナル伝達経路は、PLCβと結合したＧタンパク質を刺激するmGluR1受容体の活性化、IP3-感受性ストアから放出されるCa2+によるCa2+/カルモジュリン依存性ホスファターゼ、カルシニューリン（PP2B）の活性化、キナーゼ活性の増加をもたらすカルシニューリンによるCK1ε上の抑制自己リン酸化部位の脱リン酸化を含むものである。
【０１７３】
一実施形態においては、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害に対する動物モデルを本発明の方法によるスクリーニングアッセイに利用する。そのような動物は、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウシなどであってもよく、好ましくは非ヒト哺乳類動物である。
【０１７４】
一実施形態においては、トランスジェニックマウスをアルツハイマー病に対する動物モデルとして利用する（例えば、Lewisら (2000, Aug.), 「突然変異（P301L）タウタンパク質を発現するマウスにおける神経細線維もつれ、筋萎縮および進行性運動障害（Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein）」, Nature Genetics 25(4):402-5、2000, Nat. Genet. 26(1):127に誤り；Lewisら 2001, 「突然変異タウおよびAPPを発現するトランスジェニックマウスにおける神経細線維変性の増加（Enhanced neurofibrillary degeneration in transgenic mice expressing mutant tau and APP）」, Science 293 (5534):1487-91；Gotzら, 2001, 「無β42原繊維により誘導される、P301lタウのトランスジェニックマウスにおける神経細線維もつれの形成（Formation of neurofibrillary tangles in P301l tau transgenic mice induced by Abeta 42 fibrils）」, Science 293 (5534):1491-5を参照）。Lewisら（2000, 「突然変異（P301L）タウタンパク質を発現するマウスにおける神経細線維もつれ、筋萎縮および進行性運動障害（Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein）」, Nature Genetics 25(4):402-5、2000, Nat. Genet. 26(1):127に誤り）は、ヒトP301Lタウタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを開示する。このマウス株由来の動物は、年齢に依存して過リン酸化タウおよび進行性運動障害を含有するアルツハイマー様の神経細線維もつれを発生する。mGluRシグナル伝達、CK1活性化、またはその後のCdk5活性化のモジュレーターの、神経細線維もつれおよび神経機能障害の発生に対する効果をこのモデル系において研究した。mGluRシグナル伝達経路モジュレーターの、無β42に刺激された神経細線維もつれの形成に対する効果もこのモデル系において研究した。この場合、無β42は、P301lタウ発現マウスとヒトAPP発現マウスとの遺伝的交雑（例えば、Lewisら 2001, 「突然変異タウおよびAPPを発現するトランスジェニックマウスにおける神経細線維変性の増加（Enhanced neurofibrillary degeneration in transgenic mice expressing mutant tau and APP」）, Science 293 (5534):1487-91）により、またはタウ発現マウスの脳中への無β42の直接注射（例えば、Gotzら, 2001, 「無β42原繊維により誘導される、P301lタウのトランスジェニックマウスにおける神経細線維もつれの形成（Formation of neurofibrillary tangles in P301l tau transgenic mice induced by Abeta 42 fibrils）」, Science 293 (5534):1491-5）により補給することができる。そのようなモデル動物系を利用して、それらのmGluR細胞内シグナル伝達経路に対する効果によりアルツハイマー病の治療に有用である化合物をスクリーニングすることができる。
【０１７５】
他の実施形態においては、卒中のラットモデルを利用する。Brintら（1988, J. Cerebr. Blood Flow & Metab. 8:474-485）は、限局性脳虚血のラットモデルを開示している。De Vryら（2001, Eur. J. Pharmacol. 428:203-214）は、ラット急性硬膜下血腫モデル、およびmGluRアンタゴニスト、BAY 36-7620の神経保護よび行動効果を研究するために用いたラット中大脳動脈閉塞モデルを開示している。Baoら（2001, Brain Res. 922:173-179）は、グループＩ mGluR受容体アゴニストおよびアンタゴニストを試験した限局性脳虚血のラットモデルを開示している。Tanakaら（2002, Brain Research 924:98-108）は中大脳動脈閉塞による卒中の測定方法を開示している。そのようなモデル動物系を利用して、それらのmGluR細胞内シグナル伝達経路に対する効果により卒中の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【０１７６】
他の実施形態においては、精神分裂病のラットモデルを利用する（Sipesら, 1995, 「ラットにおける前パルス抑制の8-OH-DPAT破壊：作用部位の(+)WAY 100、135および局在による逆転（8-OH-DPAT disruption of prepulse inhibition in rats: reversal with (+) WAY 100,135 and localization of site of action）」, Psychopharmacology (Berl) 117(1):41-8；Caoら, 2002, Brain Research 937:32-40）。そのようなモデル動物系を利用して、それらのmGluR細胞内シグナル伝達経路に対する効果により精神分裂病の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【０１７７】
他の実施形態においては、注意欠陥障害（ADD）または注意欠陥過活動障害（ADHD）のラットモデルを利用する（例えば、Hansenら, 1999, 「欠陥注意過活動障害の動物モデルにおけるアルコール応答性、過反応性および運動不穏（Alcohol responsiveness, hyperreactivity and motor restlessness in an animal model for attention-deficit hyperactivity disorder）」, Psychopharmacology 146:1-9；Russell, 2002, Behavioral Brain Res. 130: 191-196を参照）。Russellは、例えば、ADHDの遺伝モデルである自然発症の高血圧ラットモデルを開示している。そのようなモデル動物系を利用して、それらのmGluR細胞内シグナル伝達経路に対する効果によりADHDの治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【０１７８】
他の実施形態においては、疼痛のマウスモデルを利用する（例えば、O'Callaghanら, 1975, 「改変ホットプレート方法による麻薬性アンタゴニストの麻酔活性の定量（Quantification of the analgesic activity of narcotic antagonists by a modified hot-plate procedure）」, J. Pharmacol Exp Ther 192:497-505；Guarnaら, 2002, J. Neurochem. 80:271-277；Menendezら, 2002, 「片側ホットプレート試験：マウスの中枢および末梢痛覚過敏を検出するための簡単で感受性のある方法（Unilateral hot plate test: a simple and sensitive method for detecting central and peripheral hyperalgesia in mice）」, J. Neurosci. Methods 113: 91-97）。Guarnaらは、急性熱侵害受容に対するマウスモデルを開示している。Menendezらは、中枢および末梢痛覚過敏に対するマウスモデルを開示している。そのようなモデル動物系を利用して、それらのmGluR細胞内シグナル伝達経路に対する効果により疼痛の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【０１７９】
他の実施形態においては、嗜癖（例えば、コカイン嗜癖）のラットモデルを利用する（CaineおよびKoob, 1995, 「ラットにおいて、ドーパミン作動薬7-OH-DPATの前処理は、様々なスケジュールのもとでのコカイン自己投与用量-効果関数を左へシフトする（Pretreatment with the dopamine agonist 7-OH-DPAT shifts the cocaine self-administration dose-effect function to the left under different schedules in the rat）」, Behav. Pharmacol 6:333-347；Orsiniら, 2002, Brain Research 925:133-140）。そのようなモデル動物系を利用して、それらのmGluR細胞内シグナル伝達経路に対する効果により薬物乱用の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【０１８０】
他の実施形態においては、パーキンソン病のマウスモデルを利用する（Uhlら, 1985, Lancet 1: 956-57; Mokry, 1995, 「パーキンソン病の研究に用いる実験モデルと行動試験（Experimental models and behavioral tests used in the study of Parkinson's Disease）」, Physiol. Res. 44:143-50.；Du, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:14669-14674）。そのようなモデル動物系を利用して、それらのmGluR細胞内シグナル伝達経路に対する効果によりパーキンソン病の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【０１８１】
他の実施形態においては、癲癇の動物または組織モデルを利用する（例えば、Paschoaら, 1997, 「実験癲癇のキンドリングおよび皮質刺激モデルにおける発作パターン（Seizure patterns in kindling and cortical stimulation models of experimental epilepsy）」, Brain Res. 770:221-227；Kokaia, 1995, Exper. Neurol. 133:215-224；Merlin, 1999, J. Neurophysiol. 82:1078-1081；Merlin, 2001, J. Neurophysiol. 87:621-625を参照）。Kokaia（1995, Exper. Neurol. 133:215-224）は癲癇のマウスモデルを開示している。Merlin（1999, J. Neurophysiol. 82:1078-1081；2001, J. Neurophysiol. 87: 621-625）は癲癇のモルモット海馬切片モデルを開示している。そのような動物モデルまたは組織系を利用して、それらのmGluR細胞内シグナル伝達経路に対する効果により癲癇の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【０１８２】
他の実施形態においては、ラットグループＩ mGluRを発現する培養HEK 293細胞を、mGluRシグナル伝達経路を経由してカルシウムチャネルモデルを活性化する化合物をスクリーニングするモデルとして利用する（McCoolら, 1998, 「HEK 293細胞では、ラットグループＩ 代謝共役型グルタミン酸受容体が多重シグナル伝達経路を経由して神経Ca2+チャネルを抑制する（Rat group I metabotropic glutamate receptors inhibit neuronal Ca2+ channels via multiple signal transduction pathways in HEK 293 cells）」, J. Neurophysiol. 79(1):379-91）。
【０１８３】
他の実施形態においては、癌、腫瘍形成、または発癌のげっ歯類動物（例えば、マウス）モデルを利用する。このようなげっ歯類モデルは当業者に周知である（例えば、Satoら, 1997, 「SCIDマウスにおける、LNCaP細胞の前立腺内接種を利用する転移性アンドロゲン感受性ヒト前立腺癌モデル（A metastatic and androgen-sensitive human prostate cancer model using intraprostatic inoculation of LNCaP cells in SCID mice）」, Cancer Res. 15: 1584-1589を参照）。例えば、ある特定の実施形態においては、腫瘍を胸腺欠損裸マウスの皮下で増殖してもよい（例えば、Singhら, 2002, Cancer Res. 62:3063-3069を参照）。そのようなモデル動物系を利用して、それらのmGluR細胞内シグナル伝達経路に対する効果により癌または腫瘍の治療に有用な化合物をスクリーニングすることができる。
【０１８４】
特定の実施形態においては、動物モデルはホモ接合性DARPP-32ノックアウトマウスである（例えば、それぞれ本明細書に参照によりその全文が組み入れられる、1998年７月７日公告のFienbergらによる米国特許第5,777,195号；2000年１月11日公告のNishiらによる米国特許第6,013,621号；およびFienbergら, 1998, Science 281:838-842を参照）。一実施形態においては、候補薬がCKIおよび／またはCdk5活性をモジュレートすることを実証または確証するさらなる試験またはアッセイに、ホモ接合性DARPP-32ノックアウトマウスを利用することができる。特定の実施形態においては、実証はNishiら（2000年１月11日公告の米国特許第6,013,621号）が記載した方法によって実施してもよい。そのような薬剤がDARPP-32リン酸化を経由してCKIおよび／またはCdk5の活性をモジュレートすると確認された場合、DARPP32ノックアウトマウスにおける上記薬剤の存在または投与は、薬剤の非存在または非投与と比較して、カルシウムチャネル活性化の量（および／または割合）を有意に増加または減少することはないに違いない。
【０１８５】
5.6.  医薬組成物
本発明は、CKIおよび／またはCdk5活性を調節し、かつmGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害を診断または治療する医薬組成物を包含する。正常機能が喪失すると、上に掲げた疾患または障害が発生するので、代謝共役型グルタミン酸受容体（mGluR）シグナル伝達経路の活性化、またはCKIおよび／またはCdk5活性の増加（例えば、下流活性化）はそのような障害を示す個人における症候の改善を促進する。
【０１８６】
あるいは、ある特定のmGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害の症候群は、CKIおよび／またはCdk5活性のレベルを減少することにより、および／または代謝共役型グルタミン酸受容体シグナル伝達経路の活性をダウンレギュレーションすることにより（例えば、下流シグナル伝達事象を標的とすることにより）改善することができる。様々な手法を以下に考察する。
【０１８７】
ある特定の実施形態においては、本発明は、mGluRシグナル伝達経路に関係する疾患および／または症状の症候を示す患者または被験者の上記症候を改善することができる薬剤（第5.2および5.3節を参照）を投与する方法を提供する。一実施形態においては、mGluRシグナル伝達経路は、PLCβと結合したＧタンパク質を刺激するmGluRl受容体の活性化、IP3感受性ストアから遊離されるCa2+によるCa2+/カルモジュリン依存性ホスファターゼ、カルシニューリン（PP2B）の活性化、キナーゼ活性の増加をもたらすカルシニューリンによるCK1ε上の抑制自己リン酸化部位の脱リン酸化を含むものである。（第７節を参照）。
【０１８８】
ある特定の実施形態においては、本発明は、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するまたはカルシウムチャネルに関係する障害の症候を示す患者または被験者の上記症候を改善することができる薬剤（第5.2および5.3節を参照）を投与する方法を提供する。
【０１８９】
ある特定の実施形態においては、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害を治療するために、本明細書に開示したmGluR活性のアゴニストを使用することができる。他の実施形態においては、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害を治療するために、本明細書に開示したmGluR活性のアンタゴニストを使用することができる。その化合物がmGluRに対する絶対的特異性を示すことは必要でない。例えば、mGluRと他の受容体の両方に作用する化合物を使用してもよく；そのような化合物を神経系への送達が最適化されるように投与して、mGluRに関係する、CKIに関係する、Cdk5に関係するおよび／またはカルシウムチャネルに関係する障害の改善を達成してもよい。
【０１９０】
5.6.1.  医薬製剤
本発明は、本明細書に以上開示した本発明の薬剤、医薬または化合物の医薬組成物を提供する。薬剤、医薬または化合物またはそれらの生理学的に許容される塩または溶媒和化合物を、注射用に、または経口、局所、経鼻、吸入、吹送（口または鼻を経て）、バッカル、非経口、直腸投与もしくはその他の投与剤形用に製剤することができる。本発明は、本発明の薬剤の有効量を製薬上許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、賦形剤および／または担体と一緒に含有する医薬組成物を提供する。そのような組成物としては、様々なバッファー内容物（例えば、トリス-塩酸、酢酸、リン酸）、pHおよびイオン強度の希釈物；界面活性剤および可溶化剤（例えば、Tween 80, Polysorbate 80）、抗酸化剤（アスコルビン酸、メタ亜硫酸水素塩）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マニトール）などの添加剤が挙げられる。
【０１９１】
組成物はまた、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などのポリマー化合物の微粒子調製物またはリポソーム中に組み込んでもよい。ヒアルロン酸を利用してもよい。生体適合性のある吸収性ポリマーを、脂肪酸ポリエステル、共重合体およびブレンドからなる群から選択してもよく、それらとしては、限定されるものでないが、乳酸エステルのホモポリマーおよび共重合体（D-、L-、乳酸およびD-、L-およびメソ乳酸エステルを含む）、グリコール酸エステル（グリコール酸を含む）、ε-カプロラクタム、p-ジオキサノン（米国特許第4,052,988号に開示された1,4-ジオキサン-2-オン）、p-ジオキサノンのアルキル置換誘導体（すなわち、米国特許第5,703,200号に開示された6,6-ジメチル-1,4-ジオキサン-2-オン）、トリエチレンカーボネート（1,3-ジオキサン-2-オン）、1,3-ジオキサンのアルキル置換誘導体（米国特許第5,412,068号に開示された）、δ-バレロラクトン、β-ブチロラクトン、γ-ブチロラクトン、ε-デカラクトン、ヒドロキシ酪酸塩、ヒドロキシ吉草酸塩、1,4-ジオキセパン-2-オン（米国特許第4,052,988号に開示されたおよびその二量体、1,5,8,12-テトラオキサシクロテトラデカン-7,14ジオン）、1,5-ジオキセパン-2-オン、およびそれらのポリマーブレンドが挙げられる。
【０１９２】
そのような組成物は、本発明のタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、in vivo放出速度、およびin vivoクリアランス速度に影響を与えうる。例えば、「レミントンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、第18版（1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042）、1435-1712頁を参照。上記組成物を液剤形で、または凍結乾燥剤形として乾燥粉末で製造してもよい。
【０１９３】
本発明で使用が意図されるのは、一般的に、「レミントンの製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」、第18版（1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042）、第89章に開示された経口固体剤形である。固体投与剤形としては、錠剤、カプセル剤、ピル剤、トローチ剤またはロゼンジ剤、カシェ剤またはペレット剤が挙げられる。また、リポソームまたはプロテイノイド封入を利用して本発明の組成物を製剤することもできる（例えば、米国特許第4,925,673号に報じられるプロテノイドミクロスフェアのように）。リポソーム封入を利用してもよく、リポソームは様々なポリマーを用いて誘導体化しうる（例えば、米国特許第5,013,556号）。治療用の可能な固体投与剤形の説明は、Marshall, K（「現代の医薬品（Modern Pharmaceutics）」, G. S. BankerおよびC. T. Rhodes編, 第10章, (1979)）により与えられている。一般的に、製剤は、薬剤と不活性成分（生物学的活性物質の胃環境に対する保護および腸における放出を可能にする）を含みうる。
【０１９４】
全胃耐性を保証するために、少なくともpH 5.0まで不透過性のコーティングが有用である。腸溶コーティングとして利用される、より普通の不活性成分の例は、酢酸トリメリト酸セルロース（CAT）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMCP）、HPMCP 50、HPMCP 55、ポリ酢酸フタル酸ビニル（PVAP）、ユードラジット（Eudragit）L30D、アクアテリック（Aquateric）、酢酸フタル酸セルロース（CAP）、ユードラジットＬ、ユードラジットＳ、およびシェラック（Shellac）である。これらのコーティングは混合フィルムとして使用してもよい。
【０１９５】
コーティングまたはコーティングの混合物はまた、胃に対する保護を意図しない錠剤上に使用することもできる。これは、糖コーティングまたは錠を嚥下しやすくするコーティングを含む。カプセルは、乾燥治療薬、すなわち粉末を送達するためのハードシェル（ゼラチンなど）からなってもよいし；液剤形用に、ソフトゼラチンシェルを用いてもよい。カシェ剤のシェル材料は厚いデンプンまたはその他の食用紙であってもよい。丸薬（pill）、ロゼンジ錠（lozenge）、成型錠（molded tablet）または粉薬錠剤（tablet triturate）に対しては、湿式造粒（moist massing）技術を利用することができる。
【０１９６】
治療薬を、顆粒またはペレットの形態の細かい多微粒子の製剤に含有してもよい。カプセル投与用物質の製剤はまた、粉末、軽く圧縮したプラグまたはさらに錠剤であってもよい。治療薬はまた圧縮により製造することもできる。
【０１９７】
着色剤および香料を全て含んでもよい。例えば、上記タンパク質（または誘導体）を（リポソームまたはミクロスフェア封入によるなどして）製剤し、次いでさらに着色剤および香料を含有する冷蔵飲料などの食用品中に含ませてもよい。
【０１９８】
治療薬の容積を不活性物質またはフィラーを用いて希釈または増量してもよい。これらの希釈剤またはフィラーとしては、炭水化物、特にマニトール、α-ラクトース、無水ラクトース、セルロース（例えば、微結晶セルロース）、スクロース、水素リン酸カルシウムで修飾したデキストランおよびデンプンが挙げられる。ある特定の無機塩もフィラーとして利用することができ、それらとしては、三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウムおよび塩化ナトリウムが挙げられる。いくつかの市販される希釈剤として、ファースト・フロ（Fast-Flo）、エムデックス（Emdex）、STA-Rx 1500、エンコンプレス（Emcompress）およびアビセル（Avicell）がある。
【０１９９】
治療薬の製剤において崩壊剤を固体投与剤形中に含ませてもよい。崩壊剤として利用される物質は、限定されるものでないが、デンプン（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプンに基づく商業用崩壊剤、エクスプロタブ（Explotab））が挙げられる。デンプングリコール酸ナトリウム、アンバーライト（Amberlite）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン（ultramylopectin）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジ皮、酸性カルボキシメチルセルロース、天然スポンジおよびベントナイトは全て使用することができる。崩壊剤の他の形態は、不溶性陽イオン交換樹脂である。粉末ガムを崩壊剤としておよび結合剤として使用してもよく、それらは、寒天、カラヤ（Karaya）またはトラガカントなどの粉末ガムを含みうる。アルギン酸とそのナトリウム塩も崩壊剤として有用である。
【０２００】
治療薬を一緒に保持してハード錠を作るために結合剤を用いてもよく、それらとしては、アカシア、トラガカント、デンプン（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン）およびゼラチンなどの天然産物由来の物質が挙げられる。その他としては、メチルセルロース（MC）、エチルセルロース（EC）およびカルボキシメチルセルロース（CMC）が挙げられる。ポリビニルピロリドン（PVP）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）は両方とも、アルコール溶液中で治療薬を造粒するのに使うことができる。
【０２０１】
減摩剤（anti-frictional agent）を治療薬を剤形中に含ませて、製剤過程中の固着を防止してもよい。潤滑剤を治療薬とダイ壁の間の層として用いてもよく、これらとしては、ステアリン酸とそのマグネシウムおよびカルシウム塩、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）、液パラフィン、植物油およびワックス、タルクならびにシリカが挙げられる。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、カルボワックス（Carbowax）4000および6000などの可溶潤滑剤を利用してもよい。
【０２０２】
製剤中の医薬の流動特性を改善して圧縮中の分散を助けることができる滑剤を加えてもよい。滑剤としては、デンプン、タルク、焼成シリカおよび水和シリコアルミン酸塩（silicoaluminate）が挙げられる。
【０２０３】
治療薬の水環境中への溶解を助けるために、界面活性剤を湿潤剤として加えてもよい。界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウムおよびジオクチルスルホン酸ナトリウムなどの陰イオン性界面活性剤を含んでもよい。陽イオン界面活性剤を利用してもよく、ベンズアルコニウムクロリドまたはベンズエトニウムクロリドを含んでもよい。界面活性剤として製剤中に含んでもよい潜在的非イオン界面活性剤としては、ラウロマクロゴル（lauromacrogol）400、ポリオキシル（polyoxyl）40ステアリン酸塩、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油10、50および60、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート40、60、65および80、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらの界面活性剤は上記タンパク質または誘導体の製剤中に、単独でまたは様々な比率の混合物として存在してもよい。
【０２０４】
薬剤の取込みを潜在的に増強する添加物は、例えば、脂肪酸のオレイン酸、リノール酸およびリノレン酸である。
【０２０５】
徐放経口製剤が望ましいであろう。薬剤を、拡散または浸出機構により放出させる不活性基剤、例えばガム中に組込むことができる。分解の遅い基剤を製剤中に組込んでもよい。数種の腸溶コーティングも徐放効果を有する。
【０２０６】
本発明の治療薬の他の徐放剤形は、オロス（Oros）治療薬システム（Alza Corp.）に基づく方法による、すなわち、医薬を半透過膜中に封入し、水が進入して浸透圧効果により１つの小さい隙間を通して医薬を押し出すようにする。
【０２０７】
その他のコーティングを製剤に用いてもよい。それらには、コーティングパンで適用できる様々な糖類を含む。治療薬はまたフィルムコーティングを施した錠であってもよく、この場合使用する材料は２グループに区分される。第１グループは非腸溶性材料であり、それらとしては、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシ-エチルセルロース、ヒドロキシ-プロピルセルロース、ヒドロキシプロピル-メチルセルロース、カルボキシ-メチルセルロースナトリウム、プロビドン（providone）およびポリエチレングリコールが挙げられる。第２グループは腸溶性材料からなり、通常はフタル酸のエステルである。
【０２０８】
材料の混合物を利用して、最適なフィルムコーティングを提供してもよい。フィルムコーティングは、パンコーターでまたは流動層でまたは圧縮コーティングにより実施することができる。
【０２０９】
経口投与用の液製剤は、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液の剤形をとってもよいし、または使用前に水または適当なビヒクルを用いて構成する乾燥製品として提供してもよい。そのような液製剤は通常の手段により、懸濁剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（例えば、アーモンドオイル、油状エステル、エチルアルコールまたは分留した植物油）；および保存剤（例えば、p-ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸のメチルまたはプロピルエステル)などの製薬上許容される添加剤を用いて調製することができる。上記製剤はまた、バッファー塩、香料、着色および甘味剤を、適当に含有してもよい。
【０２１０】
薬剤の経鼻送達も意図している。経鼻送達により、治療製品の鼻への投与直後に上記タンパク質の血液流への通過が可能になり、該製品を肺内に沈積させる必要がない。経鼻送達用製剤は、デキストランまたはシクロデキストランによる製剤を含む。
【０２１１】
吸入による投与用には、本発明による使用する化合物を、適当な噴霧剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを用いて、加圧パックまたは噴霧器からエーロゾルスプレー散布の剤形で送達するのが好都合である。加圧エーロゾルの場合、投与単位は測った量を送達するバルブを設けて決定することができる。吸入器または吹送器に用いるために、上記化合物とラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤との粉末混合物を含有する、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジを製剤してもよい。
【０２１２】
上記化合物は、注射による、例えば大量瞬時（bolus）注射または連続輸液による非経口投与用に製剤することができる。注射用製剤は、単位投与剤形で、例えばアンプル中で、または多回投与容器中に保存剤を加えて提供してもよい。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳化液などの剤形をとってもよく、懸濁、安定化および／または分散剤などの製剤用薬剤を含有してもよい。あるいは、活性成分は粉末剤形であって、使用前に、適当なビヒクル、例えば発熱物質を含有しない無菌水を用いて構成してもよい。
【０２１３】
上記化合物はまた、座剤または保持浣腸、例えば、ココアバターまたは他のグリコシドなどの通常の座剤用基剤を含有する直腸用組成物に製剤することもできる。
【０２１４】
従来開示された製剤に加えて、上記化合物はまた、デポ製剤として製剤することもできる。そのような長期間作用する製剤は、移植（例えば、皮下または筋内に）によりまたは筋内注射により投与することができる。従って、例えば、上記化合物を、適当なポリマーまたは疎水性材料（例えば、許容しうる油の乳化液として）またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤することができる。
【０２１５】
上記組成物は、所望であれば、活性成分を含有するパックでまたは１回以上の単位投与剤形を含む調剤デバイスで提供することができる。パックは、例えばブリスターパックのような金属またはプラスチックホイルであってもよい。パックまたは調剤デバイスに投与のための指示書を添付してもよい。
【０２１６】
5.6.2.  投与量の決定
そのような化合物の毒性および治療上の有効性は、例えば、LD50（集団の50％に致死的な量）およびED50（集団の50％に治療上有効な用量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準の医薬的方法により決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比は治療指数であり、比LD50／ED50で表すことができる。大きい治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用することはできるが、そのような化合物は罹患組織の部位を標的として非感染細胞に対する潜在的損傷を最小化し、それにより副作用が減少する送達系を設計するように注意しなければならない。
【０２１７】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトに用いる投与量の範囲の製剤に利用することができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、ED50を含んで毒性が少しかまたは全く無い範囲の循環濃度にある。投与量はこの範囲内で、使用する投与剤形および利用する投与径路に依存して変わってもよい。本発明の方法に使用するいずれの化合物についても、治療上有効な用量は、最初に細胞培養アッセイから評価することができる。動物モデルにおいては、細胞培養で決定したIC50（すなわち、症候群の最高抑制の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成するように製剤することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィにより測定することができる。
【０２１８】
5.6.3.  投与経路
本発明の治療用組成物の成分は、非経口、局所、または経粘膜、例えば、経口、経鼻、または経直腸、または経皮で導入することができる。好ましくは、投与は非経口、例えば、静脈注射を経由し、または、限定されるものでないが、細動脈内、筋内、皮内、皮下、腹腔内、脳室内、および頭蓋内投与である。好ましい実施形態においては、本発明の治療用組成物の成分は経口または非経口で導入する。
【０２１９】
本発明の好ましい実施形態においては、薬剤（または医薬または化合物）は脳血液関門を通過し、さらに好ましくは容易に通過することができて、例えば、経口、非経口または静脈投与が可能である。あるいは、脳血液関門を通過しまたは輸送できるように薬剤を修飾するかまたは改変することができる。分子が脳血液関門を通過するための当技術分野で公知の多数の方法を利用することができ、限定されるものでないが、分子の疎水性を増加する方法；分子を、脳血液関門の受容体を標的として移動する担体とのまたはドコサヘキサン酸との複合体として導入する方法などがある。
【０２２０】
他の実施形態においては、頭蓋に小孔を明けて薬剤を投与する標準の方法を経由して、本発明の薬剤を投与する。
【０２２１】
他の実施形態においては、分子を頭蓋内にまたは、さらに好ましくは、脳室内に投与することができる。他の実施形態においては、脳血液関門の浸透圧破壊（osmotic disruption）を利用して薬剤の脳への送達を実施することができる（Nilaverら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 9829-9833 (1995)）。さらに他の実施形態においては、薬剤を、脳血液関門を標的とするリポソームに入れて投与することができる。リポソームに入った医薬の投与は公知である（Langer, Science 249:1527-1533 (1990)；Treatら, in 「感染性疾患および癌の治療におけるリポソーム（Liposomes in the Therapy of infectious Disease and Cancer）」, Lopez-BeresteinおよびFidler (編), Liss, New York, pp.317-327およびpp.353-365 (1989)を参照）。このような方法は全て本発明に包含される。
【０２２２】
分子の脳血液関門通過能力について複数の予測が行われているが、これらの予測はせいぜい推測でしかない。脳中への化合物の進入の割合と程度は一般的に、主に分配係数、イオン化定数、および分子サイズにより決定されると考えられる。普遍的に適用しうる脳貫入モデルとしての単一の分配溶媒系は現れていないが、オクタノール-水系が特に注目されていて、Hanschと共同研究者は、この系において約100の分配係数が中枢神経系（CNS）中への進入に最適であると示唆している（Glave and Hansch, J. Pharm. Sci. 61:589 (1972)；Hanschら, J. Pharm. Sci. 76:663 (1987)）。実際上、オクタノール-水分配系は化合物の脳血液関門通過能力の定性的示唆を与えるだけである。例えば、公知のヒスタミンH2受容体アンタゴニストの間で比較すると、それらの脳貫入とオクタノール-水分配の間には単純な関係がないことを示唆する（Youngら, J. Med. Chem. 31:656(1988）)。オクタノール-水分配のほかに、他の因子が脳血液関門を通過する傾向に影響を及ぼす。ヒスタミンH2受容体アンタゴニストの脳血液関門通過能力を比較すると、化合物の全水素結合能力の低下とともに脳貫入が増加しうることを示唆する（Youngら, J. Med. Chem. 31:656 (1988）)。本明細書に参照によりその全文が組み入れられるBegleyら（J. Neurochem. 55:1221-1230 (1990)）は、シクロスポリンＡの脳血液関門通過能力を開示している。Begleyらが用いた方法論は、次の通りである：(1)次式：
BUI＝[(脳3H/脳14C)/(注入した3H/注入した14C)] Ｘ 100
［式中、14C基準化合物は14Cブタノールまたは類似溶媒である］を用いるトリチウム標識薬剤化合物の脳取込み指数（BUI）の測定；(2)脳灌流研究；(3)静脈内大量瞬時（bolus）注射研究；および(4)培養脳大脳毛細管内皮を用いる研究。
【０２２３】
他の実施形態においては、治療化合物を小胞、特にリポソームに入れて送達してもよい（Langer, Science 249:1527-1533 (1990)；Treatら, in 「感染性疾患および癌の治療におけるリポソーム（Liposomes in the Therapy of infectious Disease and Cancer）」, Lopez-BeresteinおよびFidler (編), Liss,New York, pp.317-327およびpp.353-365 (1989)を参照）。その全身副作用を軽減するために、これは薬剤を導入する好ましい方法であろう。
【０２２４】
他の実施形態においては、治療薬を徐放系で送達することができる。例えば、薬剤を静脈内輸液、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与モードを用いて投与してもよい。一実施形態においては、ポンプを利用してもよい（Langer, 前掲, Sefton, CRC Crit. Ref.Biomed. Eng. 14:201 (1987)；Buchwaldら, Surgery 88:507 (1980)；Saudekら, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)を参照）。他の実施形態においては、ポリマー材料を利用してもよい（「徐放の医療応用（Medical Applications of Controlled Release）」, LangerおよびWise (編), CRC Press: Boca Raton, Florida (1974)；「制御した医薬生物利用可能性、医薬設計および性能（Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance）」, SmolenおよびBall (eds.), Wiley: New York (1984)；RangerおよびPeppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983)を参照；またLevyら, Science 228:190 (1985)；Duringら, Ann. Neurol. 25:351 (1989)；Howardら, J Neurosurg. 71:105 (1989)も参照）。さらに他の実施形態においては、徐放系を治療標的、すなわち、脳の近位に配置して全身用量のほんの僅かしか必要でないようにすることができる（例えば、Goodson, in 「徐放の医療応用（Medical Applications of Controlled Release）」, 前掲, vol.2, pp.115-138 (1984)を参照）。他の徐放系は、Langer（Science 249:1527-1533 (1990)）の総説に考察されている。
【実施例】
【０２２５】
次の実施例は説明するために提供するものであり、限定するためではない。
【０２２６】
６．実施例１：代謝共役型グルタミン酸受容体によるサイクリン依存性キナーゼ５およびカゼインキナーゼＩの調節
本実施例は、シグナル伝達分子CKIおよびCdk5がDARPP-32リン酸化を調節すること、および代謝共役型グルタミン酸受容体（mGluRs）がそれらのシグナル伝達分子の活性を介してDARPP-32リン酸化状態に影響を与えることを実証する。本実施例は、グループＩ代謝共役型グルタミン酸受容体に対するアゴニストである(S）-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン（DHPG）が新線条体ニューロンのCKIおよびCdk5活性を刺激してDARPP-32のSer-137およびThr-75のリン酸化を増強することを実証する。
【０２２７】
6.1.  序
代謝共役型グルタミン酸受容体（mGluRs）は、ヒトを含む動物の神経系全体に見出される主な興奮性アミノ酸受容体のクラスである。現在、８種のサブタイプのmGluRがあり、これらの受容体はＧタンパク質共役型受容体のファミリーに属してイオンチャネルの直接モジュレーションまたは第２メッセンジャーにより効果を及ぼす。３種の認識されたmGluRのサブグループがあり、グループＩ（mGluR1およびmGluR5）、グループII（mGluR2およびmGluR3）、およびグループIII（mGluR4、mGluR6、mGluR7およびmGluR8）として知られ、それらの薬理学的プロフィール、配列同一性、および第２メッセンジャーを形成する結合に基づいて分類される。グループＩ mGluRの活性化はホスファチジルイノシチド加水分解を刺激するが、グループIIおよびIII mGluRの活性化はフォルスコリンが誘導するサイクリックアデノシン一リン酸（cAMP）形成を抑制する。
【０２２８】
研究は神経組織におけるmGluRの位置を同定することに重点がおかれてきたが、mGluR活性に連結したシグナル伝達経路については僅かしか知られていない。従って、mGluRが神経機能をモジュレートする上で果たす役割をさらによく理解するとともに、治療標的として利用しうるmGluRに連結したシグナル伝達分子を同定する目的で、神経組織のmGluR活性に関わる経路を解明する実験を実施した。グルタミン酸およびmGluRによるカゼインキナーゼＩ（CKI）およびサイクリン依存性キナーゼ５（Cdk5）の調節を、新線条体ニューロンにおいて試験した。
【０２２９】
結果は、CKI、Cdk5、PP2A、およびPKAが全てDARPP-32リン酸化の調節に関わり、mGluRはこれらのシグナル伝達分子の活性を介してDARPP-32リン酸化状態に影響を与えることを示した。mGluRのアゴニストはCKIの活性を刺激し、それが順にCdk5の活性を刺激して、DARPP-32のThr75のリン酸化に至ることが見出された。さらにCKI刺激はDARPP-32のSer137の直接リン酸化に至ることができる。
【０２３０】
6.2.  材料と方法
6.2.1.  抗体、プラスミドおよび化学品
ホスホ-Ser-137 DARPP-32を認識するホスホ特異的抗体は、ウサギを、カブトガニヘモシアニン（Sigma）と結合したDARPP-32のホスホ-Ser-137を含むペプチドを用いて免疫感作することにより発生させた。ホスホ-Thr-75 DARPP-32抗体は、開示（Bibbら, 1999, Nature (Lond.) 402:669-671）のように発生させた。抗体を、開示（Czernikら, 1997, 「レギュレータータンパク質改変（Regulator Protein Modification）」 (Humana, Totowa, NJ)）のようにアフィニティクロマトグラフィにより精製した。発現プラスミドpCEP4HA-CK1εはDavid Virshup（University of Utah, Salt Lake City）から得た。抗ヘマグルチニン（HA）はRoche Molecular Biochemicalsから得た。CKI-7（CK1-7）はSeikagaku Kogyo（東京）から得た。(S)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン（「DHPG」または「(S)-3,5-DHPG」）およびL-AP3はTocris Neuramin（Bristol, U.K.）から得た。プロテアーゼインヒビターカクテル錠はRoche Molecular Biochemicalsから得た。
【０２３１】
6.2.2.  線条体切片の調製および処理
新線条体切片は、雄性C57/BL6マウス（6-8週齢）から、当技術分野で公知の方法（Nishi, A.ら 1997, J. Neurosci. 17:8147-8155）によって調製した。切片を医薬を用いて処理した。医薬処理の後、切片を直ぐ液体窒素中で凍結し、そしてアッセイまで-80℃にて保存した。
【０２３２】
6.2.3.  免疫ブロット
凍結切片を、1％ SDSおよび50mM NaFを含有する熱均質化バッファー中で音波処理し、サンプルを10分間煮沸した。次いでSDS-PAGEサンプルバッファーを加え、サンプルを５分間煮沸した。サンプル（全タンパク質ほぼ120μg）をSDS-PAGE（10％ポリアクリルアミド）により分離し、次いでニトロセルロースへ移した。ほとんどの研究において、免疫ブロットは最初、抗ホスホ-Serl37 DARPP-32抗体を用いてプローブした。次いでブロットを剥がし、抗ホスホ-Thr75 DARPP-32抗体を用いてプローブした。ブロットを再び剥がして抗全DARPP-32抗体を用いてプローブした。抗体結合を、増強化学発光（ECL）免疫ブロット検出システムを使って発現させた。化学発光をオートラジオグラフィにより検出し、バンドを、NIH IMAGE 1.52ソフトウエアを用いる走査画像解析により数値化した。データを、示したようにMicrosoft EXCELTMソフトウエアのスチューデント（Student）ｔ検定により統計解析した。
【０２３３】
6.2.4. N2A細胞の一過性トランスフェクション
神経芽細胞腫N2a細胞を、5％ウシ胎児血清（FBS）を含有するDMEM中で50-60％集密度まで培養した。HA-CK1εの発現プラスミド４μgをN2a細胞中に、100mmディッシュ内でFuGENETM６を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞をリン酸緩衝化クレブス・ヘンゼライト（Krebs-Henseleit）溶液（Sigma）中で10分間、室温にて培養した。次いで細胞を、CKIインヒビターを用いてまたは用いないで、30分間培養した後、グループＩ mGluRアゴニスト(S)-3,5-DHPG（100μM）を用いて２分間処理した。次いで細胞を、1％ Nonidet P-40（NP-40）、150mM NaCl、0.1％ SDS、50mM Tris（pH 8.0）、5mM Na3VO4、20mM NaF、20mM β-グリセロール-リン酸およびプロテアーゼインヒビターを含有する１mlの溶解バッファー（lysis buffer）中で溶解した。溶解物を10,000gにて遠心分離し、上清を免疫沈降およびキナーゼアッセイに用いた。
【０２３４】
6.2.5. CKIとCdK5の免疫沈降およびキナーゼアッセイ
CKIのN2a細胞からの免疫沈降については、溶解物（全タンパク質1mg）を５μlのマウスIgGおよび50μlのプロテインＡアガロースを用いて30分間、前清澄した。５μlの抗-HA抗体を加え、サンプルを１時間、約４℃にてインキュベートした。次いで、５μlの抗マウスウサギIgGおよび50μlのプロテインＡアガロースを加えて45分間、置いた。免疫複合体を溶解バッファー中で３回、キナーゼバッファー（30mM Hepes（pH 7.5）、7mM MgCl2、0.5mM DTT）中で２回、洗浄した。CKIアッセイは、2μgの精製DARPP-32、500μM ATPおよび5μCi γ-32Ｐ-ATPを含む30μlアッセイ容積で実施した。サンプルを30℃にて20分間、インキュベートし、SDS-サンプルバッファーを加えることにより反応を停止し、サンプルを５分間煮沸した。サンプルをSDS-PAGE（12％ポリアクリルアミド）により分離した。SDS-PAGEゲルを乾燥し、オートラジオグラフィのコダック（Kodak）フィルムに露光した。バンドはMolecular Dynamics社製ホスホルイメージャを用いて分析し、定量した。
【０２３５】
Cdk5免疫沈降については、線条体組織切片（ほぼ150μg全タンパク質）を、ダウンス（Dounce）ホモジナイザーならびに1mlの溶解バッファー（150mM NaCl、20mM Tris-HCI（pH 7.4）、1mM EDTA、0.5％ NP-40、5mM NaF、5mM Na3PO4、およびプロテアーゼインヒビター）を用いて溶解した。溶解物を10,000gにて10分間、４℃にて遠心分離した。上清をウサギIgG結合したアガロースを40分間４℃にて加えることにより前清澄した。アガロースと結合した10μlのCdk5抗体を加え、サンプルを１時間、４℃にて混合しながらインキュベートした。アガロースペレットを収集して1mlの溶解バッファーを用いて３回、キナーゼアッセイバッファー（50mM Hepes（pH 7.5）、10mM MgCl2、1mM DTT）を用いて２回洗浄した。Cdk5キナーゼアッセイは、2μgのヒストンH-1、500μM ATPおよび5μCi γ-32Ｐ-ATPを含む30-μl反応混合物中で実施した。サンプルを30℃にて10分間、インキュベートし、SDS-サンプルバッファーを加えることにより反応を停止し、サンプルを５分間煮沸した。サンプルをSDS-PAGE（12％ポリアクリルアミド）により分離し、上で開示したCKIアッセイのように分析した。データを、示したようにMicrosoft EXCELTMソフトウエアを用いてスチューデント（Student）ｔ検定により統計解析して、p＜0.05で有意と規定した。
【０２３６】
6.2.6. CKIによるCdk5およびp35のin vitroリン酸化
Cdk5およびp35-His6は、バキュロウイルスベクターを用いてタンパク質を発現した後の昆虫Sf9培養物から精製した。CK1α（New England Biolabs）によるCdk5またはp35のリン酸化を試験するために、1μM Cdk5または1.5μM p35を、２ユニット/μlのCK1を含む50mM Tris-HCl（pH 7.5）、10mM MgCl2、0.5mM DTT、200μM ATP、および0.6mCi/ml [γ-32P]ATPとともにインキュベートした。サンプルをSDS/PAGEおよびオートラジオグラフィにより分析した。
【０２３７】
6.2.7.  電位依存性Ca2+チャネルの全細胞記録
3〜4週齢マウスからの新線条体ニューロンを、Eberwineら（1995, Prog. Brain Res. 105:117-126）が開示したのと類似の方法により急性単離した。全細胞電流記録は標準電位-クランプ技術を用いた。内部溶液は、180mMN-メチル-D-グルカミン、40mM Hepes、4mM MgCl2、0.5mM 1,2-ビス(2-アミノフェノキシ)エタン-N,N,N',N'-四酢酸、12mM ホスホクレアチン、2mM Na2ATP、0.2mM Na3GTP、0.1mM ロイペプチン（pH 7.2-7.3）、265-270mosm/リットルからなった。外部溶液は、135mM NaCl、20mM CsCl、1mM MgCl2、10mM Hepes、0.OO1mM テトロドトキシン、5mM BaCl2、10mM グルコース（pH 7.3）、300-305mosm/リットルからなった。記録はAxon Instruments 200Bパッチクランプ増幅器を用いて取得し、上記増幅器はDigiData 1320シリーズインターフェース（Axon Instruments、Foster City、CA）を備えたPCLAMPTM（v.8）を稼動するIBM PCにより制御しかつモニターした。電極抵抗は典型的には、浴中で2-4MΩであった。シール破裂後、シリーズ抵抗（4-10MΩ）を補償し（70-90％）、定期的にモニターした。医薬は、重力供給式「潅液パイプ（sewer pipe）」を使って適用した。適用毛細管のアレイは研究対象の細胞から250μmに位置した。溶液変更は、マイクロプロセサーに基づく制御器によって制御するDC駆動系（Newport-Klinger、Irvine、CA）によりアレイの位置を変えることにより実施した。データ解析はAXOGRAPHTM（Axon Instruments）、KALEIDAGRAPHTM（Albeck Software、Reading、PA）、およびSTATVIEWTM（Abacus Concepts、Berkeley、CA）を用いて実施した。
【０２３８】
6.3.  結果
6.3.1. Thr75およびSerl37におけるDARPP-32のリン酸化に対する、グループＩmGluRアゴニストの効果
マウス脳（C57/BL6）から調製した新線条体切片を用いた。切片をグループＩmGluRアゴニスト、(S)-3,5-DHPGを用いて処理し、DARPP-32の２部位、Serl37およびThr75におけるリン酸化に対するこのアゴニストの効果を、リン酸化状態特異的抗体を用いて評価した。切片を(S)-3,5-DHPG（100μM）を用いて処理すると、DARPP-32のSerl37およびThr75の両方のリン酸化に急速であるが一過性の増加が起こった（図1A）。Serl37のリン酸化レベルは２分間でピークに到達した後、５分間で基底レベルまで速やかに低下した。類似の結果をThr75のリン酸化レベルに対するDHPGの効果についても得た。切片をmGluRアンタゴニストL-AP3（100μM）を用いて20分間、前処理すると、アゴニスト（DHPG）の両方の効果はともブロックされた（図1B）。マウス新線条体切片のSerl37リン酸化の化学量論は0.4mol/molであると決定された。従来の研究は、Thr75リン酸化の化学量論はほぼ0.26mol/molであることを示している。従って、グループＩmGluR活性化に応答するSerl37およびThr75両方のリン酸化の増加は実質的に2-3倍であると考えられた。
【０２３９】
6.3.2. Cdk5およびCKI活性に対する、グループＩmGluRアゴニストの効果
次いで、DARPP-32リン酸化を増加するグループＩmGluRアゴニストの能力がCKIおよびCdk5両方の直接活性化に関係するかを確認する実験を実施した。あるいは、これらのキナーゼの１つを活性化しその標的部位におけるリン酸化を増加するが、他部位における増加は、それぞれ上記他部位のプロテインキナーゼまたはプロテインホスファターゼに対する酵素に関わるまたは基質に関わる効果を経由して間接的であってもよい。従来の研究において、酵素に関わるおよび基質に関わるDARPP-32リン酸化の効果は、Thr75、Ser102、およびSerl37に起こることが見出されていた（Desdouitsら 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:2682-2685；Bibbら, 1999, Nature 402:669-671；Giraultら, 1989, J. Biol. Chem. 264:21748-21759）。
【０２４０】
最初の実験において、CKIα、CKIεおよびCKIδが線条体において高度に発現することを見出し、CKIεおよび／またはCKIδがmGluR活性化による調節に関わりうることを示唆した。市販のCKI抗体はいずれも免疫沈降に有用でないことが判ったので、N2a細胞を利用する一過性トランスフェクション系を利用した。グループＩ mGluRの様々なサブタイプをスクリーニングした結果は、N2a細胞でmGluR1が発現することを示した。HA-タグ付きCKIεを一過的に神経芽細胞腫N2a細胞中にトランスフェクトし、細胞をDHPGにより２分間処理した。CKIεを抗HA抗体を用いて免疫沈降し、そしてCKI活性をDARPP-32を基質としてアッセイした（図３）。DHPGにより細胞を処理すると、基底レベルと比較してCKI活性にほぼ２倍の増加がみられた。CKI-7（100μM）の添加は、CKI活性を増加するDHPGの能力をブロックした（図３）。
【０２４１】
Cdk5を抗体を用いて新線条体切片から得たホモジネートから免疫沈降し、ヒストンH-1を基質としてアッセイした。切片をDHPGを用いて処理すると、急速であるが一過性のCdk5キナーゼ活性の増加が起こった。２分後、Cdk5活性はほぼ４倍に増加したが、その活性は５分後に基底レベルへ戻った（図２）。従ってCdk5およびCKIは、mGluRをバイパスしてDARPP-32リン酸化をモジュレートするために、直接利用しうるシグナル伝達分子である。
【０２４２】
6.3.3. Thr75およびSer137におけるDARPP-32のリン酸化に対する、Cdk5およびCKIインヒビターの効果
DHPGによるCKIおよびCdk5キナーゼの両方の活性化の類似した時間経過は、２つのキナーゼが共通のシグナル伝達経路の部分として調節されうることを示唆する。CKIがmGluR受容体活性化に応答してCdk5キナーゼ活性も調節しうるし,また、逆もしかりである。これらの可能性を試験するために、CKIインヒビター、CKI-7を用いて実験を実施した。CKI-7と複合したカゼインキナーゼＩの触媒ドメインの結晶構造は、CKI-7がイソキノリン環との疎水性接触および水素結合によりCKIに対する選択性を達成するという確証を与えた（Xu, R.M.ら 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:6308-6313）。in vitro研究において、CKI-7のCKIおよびCdk5/p25に対する抑制効力（IC50値）を測定した。CKI-7のCKIに対するIC50は15μMでありCdk5に対しては200μMである。これらのデータはCKI-7を利用して、無傷の細胞研究においてCKIとCdk5の間を識別しうることを示す。
【０２４３】
新線条体切片を様々な濃度のCKI-7を用いて30分間、前インキュベートした後、DHPGを用いて２分間処理した。50μM CKI-7で、Serl37またはThr75のいずれにおいてもDARPP-32リン酸化の基底またはDHPG刺激レベルに対する効果は少ししかなかった。CKI-7（100 to 3001M）の用量を増加すると、Serl37およびThr75における基底およびDHPG刺激したDARPP-32リン酸化の両方に、用量に依存する減少があった。次いで、切片をCKIインヒビターおよび免疫沈降により処理した後に、Cdk5キナーゼ活性を測定した。Cdk5キナーゼ活性に対するDHPGの効果は、CKI-7により、用量に依存する様式で弱められた。
【０２４４】
Cdk5がCKIに効果を与えうるかどうかを試験するため、Cdk5の特異的インヒビターであるブチロラクトンをDARPP-32リン酸化の研究に用いた。切片を様々な濃度のブチロラクトンを用いて30分間、前インキュベートした後、DHPGを用いて2分間処理した（図４）。１μMブチロラクトン用量で、Serl37またはThr75におけるDARPP-32リン酸化の基底レベルまたはDHPG刺激レベルに対して少しの影響しかなかった。しかし、さらに高い用量のブチロラクトン（５μMおよび10μM）においては、Thr75の基底およびDHPG刺激リン酸化は用量に依存する様式で低下した。しかし、Serl37の基底およびDHPG刺激リン酸化はブチロラクトンの影響を受けなかった。これらのデータを合わせて考えると、DHPGはCKIを活性化し、次いでCKIがCdk5を活性化するが、Cdk5はCKIに対して直接効果を与えないことを示した。さらに、これらのデータはmGluR活性と連結するシグナル伝達経路について追加の詳細な情報を与える。
【０２４５】
6.3.4. in vitroでCKIはp35をリン酸化する
次いでCKIがCdk5を調節する機構を研究するための実験を行った。CKIによる、Cdk5触媒サブユニットまたはその調節サブユニット、p25のリン酸化を試験した。in vitroで行った実験は、CKIがp25を効率的にリン酸化することはできるが、Cdk5触媒サブユニットを遥かに低い程度しかリン酸化しないことを実証した（図５）。細胞のインキュベーションをより高い濃度のCKIを用いてかつより長い時間行うと、p25のリン酸化はほぼ２mol/molになった。
【０２４６】
6.3.5. mGluRの活性化はCKI、Cdk5、およびDARPP-32に関わる機構を介してCa2+チャネルを調節する
Ca2+チャネルに対するCKIおよびCdk5の潜在的効果を新線条体ニューロンにおいて試験した。CKI-7（図6A-B）またはブチロラクトン（図6C-D）を用いる処理は、基底Ca2+電流の有意な低下を引き起こし、構成的に活性のあるCKIおよびCdk5が基底条件のもとで活性Ca2+チャネルを維持するのに関わることを示唆した。グループＩmGluRアゴニストの添加により、DHPGはこれらのCa2+電流を90秒以内に増強し、この時間はDARPP-32のSerl37（CKI部位）およびThr75（Cdk5部位）におけるリン酸化増強の時間経過と類似する。さらに、DHPGによるCa2+電流の増強はCKI-7またはブチロラクトンの添加により消失した。これらのデータを併せて考えると、グループＩmGluRがCKIおよびCdk5の活性化を介してカルシウムチャネル活性をアップレギュレートすることを実証する。
【０２４７】
これらのカルシウムチャネルに対するmGluR用薬の効果をDARPP-32ノックアウトマウスについても試験した。10個のニューロンのうちの９個において、Ca2+チャネルに対するDHPGの効果が完全に消失した。代表的な実験を図6Eに示す。
【０２４８】
6.4.  考察
代謝共役型グルタミン酸受容体の活性化と連結したシグナル伝達経路の詳細が、今や解明され、CKIおよびCdk5が重要な分子であることを実証している。さらに、シグナル伝達の終点が電位依存性カルシウムチャネルの調節であることを確認した。また、CKIとCdk5が基底カルシウムチャネル活性の維持にかかわる一方、mGluRは基底カルシウム電流をCKIとCdk5の活性化を介して増強できることもわかった。これらのデータは、CKIおよびCdk5の活性およびそのmGluRsによる調節を、神経機能を調節する生物学的に重要なプロセスと結び付ける。さらに、これらのデータは、mGluRを直接標的としない治療計画によって標的となしうるシグナル伝達分子の情報を提供する。
【０２４９】
これらの実験結果は、CKIおよびCdk5がDARPP-32リン酸化の調節に関わること、およびmGluRがこれらのシグナル伝達分子の活性を介してDARPP-32リン酸化状態に影響を与えることを示す。例えば、mGluRのアゴニストはCKIの活性を刺激し、これが順にCdk5の活性を刺激してDARPP-32のThr75のリン酸化に導くことが見出された。さらにCKI刺激はDARPP-32のSerl37における直接リン酸化に導くことができる。
【０２５０】
さらに、PP2AはDARPP-32のThr75を脱リン酸化し、代謝共役型グルタミン酸受容体アンタゴニストの作用を模倣することが知られている。これは、PP2Aの抑制が代謝共役型グルタミン酸受容体アゴニストを模倣し、かつPP2Aの活性化がmGluRアンタゴニストを模倣することを示す。最後に、PKAがDARPP-32のThr34をリン酸化することが知られている。従って、DARPP-32のリン酸化に関わるシグナル伝達経路は複雑である。従って、治療の目的で、神経機能をモジュレートする方法として標的となしうるシグナル伝達分子は、本実施例により実証したように、PP2AおよびPKA、ならびにCKIおよびCdk5を含む。
【０２５１】
７．  実施例２：グループ１代謝共役型グルタミン酸受容体による、カゼインキナーゼＩ活性の調節の機構
本実施例においては、mGluRからCK1活性化に導くシグナル伝達経路を研究した。新線条体切片において、DARPP-32のSer-137またはThr-75のリン酸化に対するDHPGの効果はPLCβインヒビターU73122、Ca2+キレーターBAPTA/AMおよびカルシニューリンインヒビター、シクロスポリンＡによりブロックされた。N2a細胞において、トランスフェクトしたHA-タグ付きCK1εの活性に対するDHPGの効果は、BAPTA/AMおよびシクロスポリンＡによりブロックされた。新線条体切片において、Cdk5活性に対するDHPGの効果もBAPTA/AMおよびシクロスポリンＡにより無効となった。代謝標識研究およびリンペプチドマッピングは、N2a細胞においてHA-CK1εがDHPGによる処理時に一過的に脱リン酸化され、これはシクロスポリンＡによりブロックされることを明らかにした。非脱リン酸化性（nonphosphorylatable）Ｃ末端ドメインをもつ突然変異CK1εはDHPGにより活性化されなかった。本実施例に開示した研究は、DHPGがCK1εを活性化するのは、PLCβの活性化、細胞内Ca2+の増加、カルシニューリンのCa2+依存性刺激、および続く抑制的Ｃ末端自己リン酸化部位の脱リン酸化を含むシグナル伝達カスケードを経由することを実証する。
【０２５２】
7.1.  序
カゼインキナーゼ１（CK1）は単離されかつ特性決定された最初のセリン／トレオニンプロテインキナーゼの１つであった。少なくとも７種のCK1イソ型：α、β、γ1、γ2、γ3、δおよびε（1、2）があり、個々のCK1ファミリーメンバーはおそらく真核生物細胞において様々な役割を担う。同定されているCK1イソ型の潜在的な生理学的基質の数は増加している。CKlαは、M1およびM3-ムスカリン受容体およびロドプシンをアゴニスト（agonist）に依存する様式でリン酸化する（3、4）。CK1δおよびCK1εはin vitroおよびin vivoでp53のＮ末端残基をリン酸化し、DNAを損傷する医薬はこの活性を増強する（4-6）。CK1はWnt経路においてβ-カテニンの重要なレギュレーターであり：CK1εはWntを模倣してアフリカツメガエルの二次軸（secondary axis）を誘導し、β-カテニンを安定化し、かつβ-カテニンに依存する遺伝子転写を刺激する（7-10）が、一方、最近の研究は、CK1εではそうでないが、CKlαの欠乏はβ-カテニンリン酸化および分解を防止し、CKIαがWntシグナル伝達においてネガティブな役割を果たすことを示唆することを示した（11,12）。ショウジョウバエにおいては、倍加時間（double-time）遺伝子産物、CK1ε同族体は、dPERと相互作用し、概日性周期長を調節することが見出されている（13）。CK1δおよびCK1εはまた、両方とも、哺乳類動物の概日性クロックの調節に関わることが示唆されている（14-16）。
【０２５３】
CK1ファミリーメンバーは、様々な長さのＮおよびＣ末端伸張部がフランキングする、高度に関係した中央キナーゼドメインを含有する。Ｃ末端伸張部のアミノ酸配列は一般的に高度に関係していない。しかし、哺乳類CK1εの124-アミノ酸Ｃ末端ドメインはCK1δのそれと50％同一である。顕著なこととして、複数のin vitro研究は、CK1δとCK1εの活性がそれらのそれぞれのＣ末端ドメインの自己リン酸化により調節されることを示す（17,18）。少なくとも８つの部位の自己リン酸化はキナーゼ活性の抑制に導く。さらに、PP1、PP2AおよびPP2B（カルシニューリン）を含む複数の異なるセリン／トレオニンホスファターゼのいずれによるCK1εの処理もキナーゼ活性の著しい増加を引き起こすことがin vitroで示されている（14、18、19）。PP1の触媒サブユニットによる、CK1δおよびCK1γイソ型の脱リン酸化も、in vitroで酵素活性化をもたらすことが示されている（17）。
【０２５４】
先の実施例は、新線条体ニューロンにおいてCK1とCdk5が代謝共役型グルタミン酸受容体（mGluRs）の活性化により調節されることを実証した（20も参照）。DHPG（グループＩmGluRに対するアゴニスト）は、新線条体切片においてCK1およびCdk5活性を増加し、DARPP-32のSer-137およびThr-75それぞれのリン酸化を増強する。Ser-137およびThr-75の両方に対するDHPGの効果はCK1-7（CK1の特異的インヒビター）によりブロックされ、mGluRによるCdk5の活性化はCK1の活性化を必要とすることを実証する。新線条体切片の抽出物中で続いて測定された、DHPGが誘導するCdk5活性の増加は、CK1-7による切片の処理により無効化された。最後に、急性単離したニューロンのDHPGによる処理は、電位依存性Ca2+電流を増加した。この増加は、CK1-7またはブチロラクトン（Cdk5のインヒビター）により消失し、CK1およびCdk5がCa2+チャネルのmGluRアゴニストによる調節に関わりうることを示した。
【０２５５】
本実施例においては、グループＩmGluRアゴニストに応答するCK1活性化の基礎を成す径路と機構を研究した。得られた結果は、グループＩmGluRsが細胞内Ca2+を増加し、カルシニューリンを刺激してCK1εの自己抑制リン酸化を脱リン酸化するシグナル伝達径路を実証した。一過性脱リン酸化およびその後のCK1εの自己リン酸化は、それぞれ、酵素の一過性活性化および不活性化に導く。
【０２５６】
7.2.  材料と方法
7.2.1.  抗体、プラスミドおよび化学品
ホスホ-Serl37 DARPP-32またはホスホ-Thr75 DARPP-32抗体を認識するホスホ特異的抗体は開示のように発生させた（20,21）。発現プラスミドpCEP4HA-CK1εおよびpCS-Myc-MM2-CK1εは開示のように調製した（19）。抗HA（12CA5）はBoehringer Mannheimから入手し、抗Myc（9E10）はUpstate Biotechnologyから入手した。抗Cdk5（C-8）及び抗CK1εはSanta Cruzから入手した。U73122、BAPTA/AMおよびシクロスポリンＡはCalbiochemから入手し；(S)-3,5-DHPG、ZM241385およびL-AP3はTocrisから入手した。プロテアーゼインヒビターカクテル錠はBoehringer Mannheimから入手した。λプロテインホスファターゼはUpstate Biotechnologyから入手した。
【０２５７】
7.2.2.  線条体切片の調製と処理
新線条体切片を雄性C57/BL6マウス（6-8週齢）から開示のように調製した（22）。切片を本文および図凡例に記載した医薬を用いて処理した。医薬処理の後に、切片を液体窒素中で直接凍結し、アッセイに使うまで-80℃で保存した。
【０２５８】
7.2.3.  免疫ブロット
凍結切片を、1％ SDSおよび50mM NaFを含有する熱均質化バッファー（hot homogenisation buffer）中で音波処理し、サンプルを10分間煮沸した。次いでSDS-PAGEサンプルバッファーを加え、サンプルを５分間煮沸した。サンプル（約120μgのタンパク質）をSDS-PAGE（10％ポリアクリルアミド）により分離し、次いでニトロセルロースへ移した。免疫ブロットは最初、抗ホスホ-Serl37 DARPP-32抗体を用いてプローブした。ブロットを剥がし、抗ホスホ-Thr75 DARPP-32抗体を用いてプローブした。ブロットを再び剥がして抗全DARPP-32抗体を用いてプローブした。抗体結合を、増強化学発光（ECL）によりＸ線フィルムを用いて検出し、画像はNIH IMAGE 1.52ソフトウエアを用いてレーザー走査濃度測定により解析した。データを、示したようにMicrosoft EXCELTMソフトウエアを用いてスチューデント（Student）ｔ検定により統計解析した。
【０２５９】
7.2.4.  トランスフェクション、免疫沈降およびキナーゼアッセイ
神経芽細胞腫N2a細胞を、5％ウシ胎児血清（FBS）を含有するDMEM中で50-60％集密度まで培養した。HA-CK1εまたはmyc-MM2-CKIεの発現プラスミド４μgをN2a細胞中に、100mmディッシュでFuGENE６TMを用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後に、細胞をリン酸緩衝化クレブス・ヘンゼライト（Krebs-Henseleit）溶液（Sigma）中で10分間、次いでインヒビターを用いてまたは用いないで30分間、室温にて培養し、その後、(S)-3,5-DHPG（100μM）を用いて２分間処理した。次いで細胞を、1％ NP-40（NP-40）、150mM NaCl、0.1％ SDS、50mM Tris、pH 8.0、5mM Na3VO4、20mM NaF、20mMβ-グリセロール-リン酸およびプロテアーゼインヒビターを含有する１mlの放射免疫沈降（RIPA）バッファー中で溶解した。溶解物を10,000gにて遠心分離し、上清を免疫沈降およびキナーゼアッセイに用いた。
【０２６０】
N2a細胞からのCKIεの免疫沈降については、溶解物（全タンパク質1mg）を５μlのマウスIgG（ICN）および50μlのプロテインＡアガロースを用いて30分間、前清澄した。５μl（ほぼ２μg）の抗-HA抗体または抗myc抗体を加え、サンプルを１時間、約４℃にてインキュベートした。次いで、５μlの抗マウスウサギIgGおよび50μlのプロテインＡアガロースを加えて45分間置いた。免疫複合体を、溶解バッファー中で３回、キナーゼバッファー（30mM Hepes、pH 7.5、7mM MgCl2、0.5mM DTT）中で２回、洗浄した。
【０２６１】
CKIアッセイは、2μgの精製DARPP-32、500μM ATPおよび5μCi γ-32Ｐ-ATPを含む30μlアッセイ容積中で実施した。ATPを加えて反応を開始した。サンプルを30℃にて10分間、インキュベートし、SDS-サンプルバッファーを加えることにより反応を停止し、サンプルを５分間煮沸した。サンプルをSDS-PAGE（12％ポリアクリルアミド）により分離した。SDS-PAGEゲルを乾燥し、オートラジオグラフィ用のコダック（Kodak）フィルムに露光した。結果を、Molecular Dynamics社製ホスホルイメージャを用いて定量した。Cdk5の免疫沈降およびアッセイを開示のように行った（20）。
【０２６２】
CK1ε活性に対するプロテインホスファターゼの効果を測定する実験については、DHPGを用いて処理したN2a細胞から免疫沈降したCK1εを、50mM Tris-HC1、0.1mM Na2EDTA、5mM DTT、2mM MnCl2、および200ユニット λホスファターゼ（Upstate Biotechnology #14-405）からなる混合物に加えた。λプロテインホスファターゼを含まない対照反応も実施した。脱リン酸化反応は37℃にて15分間実施した。反応を停止するため、CK1εを伴うビーズを、RIPAバッファーを用いて３回、そしてキナーゼバッファー（30mM Hepes、pH 7.5、7mM MgCl2、0.5mM DPI）を用いて２回洗浄した。キナーゼ活性を上に開示したように測定した。
【０２６３】
7.2.5.  代謝標識と二次元リンペプチドマッピング
CK1ε発現プラスミドを用いてN2a細胞をトランスフェクトして24時間後に、細胞を200μCi/ml（NEN）32Ｐ-無機リン酸塩およびリン酸塩を含まない無血清DMEM中で２時間インキュベートした。シクロスポリンＡを、代謝標識付けの最後の30分間中に、一過的にトランスフェクトした培養物に１μMの最終濃度で加えた。細胞を、示した様々な時間、DHPGを用いて処理し、RIPAバッファー中で溶解（lysis）により収穫し、14,000 X gで10分間遠心分離して清澄化した。HA-またはMyc-タグ付きタンパク質を含有する可溶性抽出物を、12CA5または9E10モノクローナル抗体およびプロテインＡ-アガロースを用いて免疫沈降した。免疫沈降物をプロテインＡ-アガロースから溶出させ、SDS-PAGEにより10％ゲル上で分離した。タンパク質を、クーマシーブリリアントブルーを用いて簡単に染色し、ゲルを乾燥し、そして標識したタンパク質をオートラジオグラフィにより可視化した。
【０２６４】
放射標識したタンパク質バンドを切除し、再水和し、脱染色し、そしてスピードバック（speedvac）中で乾燥した。ゲル切片を細かく砕いて、75μg/ml TPCK/トリプシンを含む50mM NH4CO3H（最終容積1ml）中で、24時間、37℃にて再水和した。上清をゲル切片から除去し、次いで凍結乾燥した。トリプシンリンペプチドの回収をセレンコフ（Cerenkov）カウントにより測定した。二次元ペプチドマッピング法を用いてリンペプチドを分離した（23）。凍結乾燥したトリプシンペプチドを、10μlの電気泳動バッファー（10％酢酸および1％ピリジン、pH 3.5）中に懸濁し、薄層セルロースプレート（20x20cm、Analtech）上にスポットした。電気泳動は400Vにて1.5時間実施した。電気泳動の後、セルロースプレートを乾燥し、次いで、25％ 1-ブタノール、7.5％ 酢酸および37.5％ ピリジンを含有するバッファー中で上昇クロマトグラフィにかけた。リンペプチドをホスホルイメージャーTM（Molecular Dynamics）を用いて可視化した。
【０２６５】
7.3.  結果
7.3.1. DARPP-32のSer-137およびThr-75リン酸化に対するDHPGの効果は、U73122、BAPTAおよびシクロスポリンAによりブロックされる
先の実施例（第６節）は、DHPG、グループＩmGluRに対するアゴニストが新線条体切片中のCKIおよびCdk5活性を増加し、それぞれDARPP-32のSer-137およびThr-75リン酸化の増加に導くことを実証した。グループＩmGluRsの活性化はホスホイノシチド加水分解の刺激をもたらす（24）。従って、CK1のDHPG依存性活性化はPLCβの活性化に関わりうる。しかし、DHPGはアデノシン受容体のアゴニストに対する応答を増強しうることも報じられていて（25、26）、他のシグナル伝達径路が関わる可能性も生じる。特異的PLCβインヒビター、U73122の効果を新線条体切片において試験した。10M U73122による30分間の前処理はSer-137またはThr-75の基底リン酸化を変えなかったが、DHPGの効果を無効にした（図７）。対照的に、アデノシンA2a受容体アンタゴニスト、ZM241385（100μM）は、Ser-137またはThr-75のリン酸化をするDHPGの能力に影響を与えなかった。これらの結果は、PLCβを含むシグナル伝達径路の役割を支持する。
【０２６６】
PLCβの活性化は、イノシトール1,4,5-三リン酸（IP3）の産生および小胞体からのCa2+の放出を導く。Caの役割を試験するために、本発明者らはCa2+キレーター、BAPTA/AMを切片の研究に用いた。20μM BAPTA/AMによる前インキュベーションは、DARPP-32の基底リン酸化を変えないが、DHPGの効果を無効にした（図７）。さらに、Ca2+イオノホア、イオノマイシン（２μM）による切片の処理は、DARPP-32のSer-137およびThr-75両方のリン酸化を増加をもたらした（図７）。本発明者らは、増加した細胞内Ca2+がCa2+依存性プロテインホスファターゼ、カルシニューリン（PP2B）を活性化して、CK1εの抑制自己リン酸化部位を脱リン酸化するという仮説をたてた。カルシニューリンは線条体において高レベルで発現する（27）。シクロスポリンＡ（5μM）、特異的カルシニューリンインヒビターによる切片の１時間の処理は、DARPP-32のSer-137およびThr-75のリン酸化に対するDHPGの効果を弱める（図７）。
【０２６７】
7.3.2. CK1ε活性に対するDHPGの効果は、U73122、BAPTAおよびシクロスポリンＡによりブロックされる
CK1ε活性に対するDHPGの効果の特徴をさらに明らかにするために、本発明者らはトランスフェクション系を利用した。HAタグ付きCK1εを含有する発現プラスミドを一過的にN2a細胞中にトランスフェクトし、細胞をDHPGにより２分間処理した。CK1εを抗HA抗体を用いて免疫沈降し、DARPP-32を基質に使ってCK1ε活性をアッセイした（図８）。グループＩmGluRの様々なサブタイプに対する最初のスクリーニングは、mGluR1およびmGluR5の両方がN2a細胞に発現することを示した。DHPGによる細胞の処理はCK1ε活性の増加をもたらし、この効果はグループＩ mGluRアンタゴニストL-AP3によりブロックされた（図８）。U73122（10μM）、BAPTA/AM（20μM）またはシクロスポリンＡ（1μM）による細胞の前インキュベーションは、CK1ε活性に対するDHPGの効果を無効にし、CK1εの調節におけるカルシニューリンのCa2+依存性活性化の役割と一致する。
【０２６８】
7.3.3. DHPGはPLCB/Ca2+/カルシニュリン経路を介してCDK5キナーゼ活性を調節する
先に、特異的CK1インヒビターを用いて、グループＩ mGluRがCK1に関わる径路を経由してCdk5 キナーゼ活性を活性化することを実証した。さらにDHPGによるCdk5活性化がPLCβ/Ca2+/カルシニューリン径路を介するかどうかを検証するために、マウス新線条体切片からの免疫沈降後のCdk5キナーゼ活性を分析した。DHPGはCdk5活性を増加し、そしてU73122（10μM）、BAPTA/AM（20μM）またはシクロスポリンＡ（5μM）によるマウス新線条体切片の前インキュベーションはこの効果を無効にした（図９）。イオノマイシン（2μM）による切片の２分間処理もCdk5 キナーゼ活性の増加を２倍だけもたらし、そしてイオノマイシンの効果はシクロスポリンＡ（5μM）によりブロックされた。
【０２６９】
7.3.4. DHPG処理はCKIεの一過性脱リン酸化を誘導する
シクロスポリンＡがDHPGのCK1εに対する効果をブロックできることは、DHPGによる調節がカルシニューリンによるCK1εの直接脱リン酸化に関わることを示す。DHPGに応答するCK1εのリン酸化状態を確かめるために、HA-CK1εを発現するN2a細胞を32Ｐにより代謝的に標識し、次いで様々な時間の間、DHPGを用いて処理した。HA-CK1εを免疫沈降し、SDS-PAGEにより分離し（図10A）、次いで二次元リンペプチドマッピングで処理した（図10B）。DHPGによる細胞のインキュベーション後、CK1εのリン酸化の全レベルに見かけ上の変化は少ししかなかった（図10A）。しかし、ペプチドマッピングは、DHPG処理により、リンペプチドのサブセットの急速かつ一過性の脱リン酸化が起こったことを示した（図10B）。０時点で、野生型CK1εは１つの部位で高度にリン酸化されたことが見出された（塩基性ペプチド、図10B、パネル１にて「c」と標識した）。さらに、7-10か所の部位でそれほど顕著でないペプチドがリン酸化された（酸性部位、図10B、パネル１にて円で囲った）。DHPGによる２または４分間の処理は、酸性ペプチドの脱リン酸化を生じるが、対照（塩基性）ペプチドの有意な脱リン酸化はなかった。DHPG処理の10分後に、酸性ペプチドのリン酸化レベルは「０分」サンプルで観察されたのと同じレベルに戻った。DHPGの添加前に、細胞をシクロスポリンＡ（1μM）により30分間、前インキュベーションすると、CK1εの酸性ペプチドの一過性脱リン酸化が阻止された（図10C、４分間時点で測定）。これらの結果は合わせて、DHPGがカルシニューリンを刺激し、CK1ε中の自己リン酸化部位サブセットの一過性脱リン酸化を起こすことを示す。
【０２７０】
7.3.5. CK1εのＣ末端自己リン酸化は、DHPGによるその活性の調節に関わる
CKIεのＣ末端ドメインの８つのリン酸化部位が、可能性のあるin vivo自己リン酸化部位として同定された（19）。CK1ε活性化の特性をさらに試験するため、その８部位（S323A／T325A／T334A／T337A／S368A／S405A／T407A／S408A）を欠くCK1εの突然変異体、MM2を試験した。Myc-MM2-CK1εを、一過的にN2a細胞中にトランスフェクトし、免疫沈降し、そしてリンペプチドマッピングおよびキナーゼ活性アッセイにかけた。リンペプチドマッピングは、MM2-CK1εが対照（塩基性）ペプチドにおいてのみ自己リン酸化され、DHPGによる処理はリン酸化に影響を与えないことを示した（図11A）。DHPGによる処理は、シクロスポリンＡの不在または存在のもとでのDARPP-32を基質に用いてアッセイしたMM2-CK1ε活性に影響を与えなかった（図11B）。N2a細胞におけるmyc-タグ付きMM2-CK1εの発現レベルはHA-タグ付きwild-type CK1εとほぼ同じであったが、免疫沈降したMM2-CKIεの活性は、DHPGの不在のもとで、HA-CK1εよりほぼ２倍高かった（図llB）。
【０２７１】
触媒ドメイン内の抑制自己リン酸化部位はまた、CK1εの自己抑制にも寄与しうる（18）。リンペプチドマップは、対照（塩基性）リンペプチドは、野生型およびMM2-CKIεの両方に存在し、DHPGによる処理にも関わらずリン酸化されたまま残ることを表す（図10および11）。基底条件のもとでリン酸化された対照部位の同一性はわかってない。上記リンペプチドマップを野生型CK1εおよびキナーゼ機能喪失突然変異体の先の研究で得たそれらと比較すると、この部位は分子内機構により自己リン酸化されるのでなく（Gietzenら, 1999, J. Biol. Chem. 274 (45), 32063-70の図1B中のペプチドfを参照）、無傷の細胞中の他のプロテインキナーゼによりリン酸化されうることを示唆する。
【０２７２】
この部位のリン酸化がCK1ε活性に影響を与えるかどうかを検証するために、タグ付きCKIεをN2a細胞溶解物から免疫沈降し、非特異的λプロテインホスファターゼを用いてインキュベートした。細胞を32Ｐを用いて前標識した（かつDHPGにより処理した）研究により示されるように、λホスファターゼを用いるインキュベーションは実質的に野生型またはMM2-CKIεのリン酸化を低下した（図12A、上側のパネル）。他のサンプルを、平行して無標識N2a細胞から調製し、λホスファターゼを用いて処理し、CK1活性をDARPP-32を基質としてアッセイした。ホスファターゼ処理は、明らかに野生型またはMM2-CKIεの活性に影響を与えず（全細胞はDHPGを用いて前インキュベートした）（図12A、下側のパネル、および図12B）、無傷細胞の対照部位のリン酸化はCK1εを調節しないことを示唆した。対照的に、プロテインホスファターゼ処理は、DHPGの不在のもとでインキュベートした細胞から単離した野生型CK1εの活性を増加した。
【０２７３】
7.4.  考察
本実施例において、本発明者らは、グループＩmGluRの刺激とCK1ε活性化を連結するシグナル伝達径路を試験した。得た結果は図13に図解した機構と一致する。mGluR1受容体の活性化はPLCβと結合したＧタンパク質を刺激し、IP3-感受性ストアから放出されるCa2+はCa2+/カルモジュリン依存性ホスファターゼ、カルシニューリン（PP2B）を活性化し、次いでカルシニューリンはCK1εの抑制自己リン酸化部位を脱リン酸化する。CK1εの脱リン酸化は、キナーゼ活性の増加をもたらす。しかしこの増加は、その後の自己リン酸化およびキナーゼの自己抑制によって一過性である。
【０２７４】
先の実施例（第６節）は、新線条体切片において、DHPG、グループＩmGluRに対するアゴニストはCK1活性を増加し、DARPP-32のSer-137のリン酸化増加に導くことを示している。本実施例においては、本発明者らは新線条体ニューロンにおけるDARPP-32のSer-137のリン酸化はU73122、BAPTAおよびシクロスポリンＡに感受性があることを見出した。Thr-75のリン酸化もこれらのインヒビターに感受性があり、先の実施例（第６節）で到達したCK1の活性化はCdk5の活性化に導くという結論を支持するものである。ほとんどトランスフェクトした細胞系を用いて実施した本結果は、CK1εが新線条体ニューロンにおけるＩ型mGluRによる調節の標的である可能性を支持する。他のCK1イソ型も図13に示したのと同様な径路を介して活性化されうる。CK1δのＣ末端125アミノ酸はCK1εの対応するドメインと50％同一である。さらに、複数のin vitro研究は、CK1εのように、CK1δ活性が自己リン酸化により調節されることを見出している（17、28）。先のin vitro研究はまた、全ての３種のCK1γイソ型が自己リン酸化されることも指摘している（17）。このように、これらのイソ型は類似の様式で調節されうる。CK1α、δおよびεイソ型は全て脳内に発現されることがわかっていて、恐らくニューロン中に広く分布するのと思われる（29-31）。さらに、上記結果は、CKlα、δおよびεイソ型が新線条体に発現することを示す。このように、カルシニューリンの活性化は、新線条体切片における複数のCK1イソ型の一過性活性化に導く（さらに以下参照）。
【０２７５】
CK1δおよびCK1εの多重Ｃ末端部位の自己リン酸化は抑制のために必要と思われるが、個々の部位と酵素活性との間の正確な関係は明確にされていない（17-19）。自己リン酸化はタンパク質基質に対する酵素活性の抑制に関連するが、複数の短い合成ペプチドのリン酸化に影響を与えない。この後者の観察は、自己リン酸化が、キナーゼの活性部位へのアクセスをブロックしないプロセスにより、タンパク質基質結合にネガティブな影響を与えるのに役立つことを示す。Ser-137（CK1によるDARPP-32のリン酸化部位）は、該タンパク質の高度に酸性領域のＣ末端部位（30残基のうちの23はグルタミン酸またはアスパラギン酸である）に位置する（32）。CK1ε（または他のイソ型）のリン酸化Ｃ末端ドメインは、より長い酸性ドメインを含有するポリペプチド基質の結合をブロックする作用を果たすが、より短い合成ペプチドに作用しないであろう。従って、Ｃ末端ドメインの脱リン酸化はこの抑制的束縛を消失させる。あるいは、非リン酸化Ｃ末端ドメイン（CK1εでは、有意な過剰の塩基性アミノ酸を含有する）が酸性ドメインを含有するポリペプチド基質と結合する上でポジティブな役割を果たしうる。
【０２７６】
本発明は、CK1εの自己リン酸化部位の脱リン酸化が、無傷の細胞における調節された生理学的事象であることを確立する。その結果は、無傷の細胞においてCK1ε活性の調節に関わる分子的事象に洞察を与えるものである。CK1εの従来の研究は少なくとも８部位がin vitroで自己リン酸化されることを示している。しかし、無傷の細胞において、これらの部位の多くの自己リン酸化は、オカダ酸またはカルシニューリンＡ（PP1およびPP2Aのインヒビター）の存在のもとにおいてのみ明らかである（19、28）。さらに、PP1／PP2Aインヒビターの存在のもとでのこれらの部位の自己リン酸化は、SDS-PAGEを用いて検出した電気泳動移動度の減少と関連付けられている。
【０２７７】
本実施例においては、CK1εの有意なレベルの自己リン酸化を、無傷の細胞において基底条件のもとで観察した。さらに、DHPGまたはシクロスポリンＡによる処理は、リン酸化部位のサブセットの脱リン酸化にも関わらず、タンパク質の電気泳動移動度に影響を与えなかった。これらの結果は、少なくとも２つの自己リン酸化部位のサブセットが存在することを示す。１つのセットは、カルシニューリンにより脱リン酸化され、電気泳動移動度のいずれの改変にも関連せず、そしてカルシニューリンが不活性である限り、無傷の細胞において基底条件下でリン酸化される。第２のセットは、PP1またはPP2Aによる脱リン酸化され、電気泳動移動度の減少に関連があり、無傷の細胞において活性PP1またはPP2Aにより脱リン酸化状態に維持される。さらなる突然変異誘発を利用して、無傷の細胞においてカルシニューリンまたはPP1/PP2Aのいずれかにより特異的に脱リン酸化されるCK1εの部位を同定することができる。
【０２７８】
本実施例から得た結果は、基底条件下でリン酸化されかつ活性化カルシニューリンにより脱リン酸化される１以上の部位は、CK1ε活性の調節と関連づけられることを示す。それはまた、無傷の細胞においてPP1/PP2Aにより脱リン酸化される１以上の部位の自己リン酸化は、CK1ε活性の調節と関連づけられることも実証する。PP1/PP2Aに感受性のある部位が培養細胞において（そして明らかに基底条件下での新線条体ニューロンにおいて）脱リン酸化状態で維持されているとき、PP1またはPP2Aの生理学的抑制はCK1εのさらなる抑制をもたらす。例えば、新線条体ニューロンにおいて、D1ドーパミン受容体によるDARPP-32のリン酸化の刺激はPP1の抑制に導き、CK1ε活性に影響を与えうる。これらの異なる部位のセットの自己リン酸化はCK1εの調節の独立モードをもたらしうるし、および／または異なる部位の自己リン酸化とCK1の調節との間にある種の相互依存性が存在しうる。異なる部位の自己リン酸化はさらなるまたは相乗効果を有しうるし、お互いを閉鎖しうるし、または個々の基質と相互作用するCK1の能力をモジュレートしうる。興味深いことに、CK1εの３部位（T325、S368およびS405）はCK1δに保存されていると思われる。これらの保存された部位はまた、無傷の細胞においてカルシニューリンによるCK1δの調節を可能にしうる。あるいは、異なる自己リン酸化部位を利用して、プロテインホスファターゼによるCK1イソ型の異なる生理学的調節を行いうる。
【０２７９】
従来の観察は、CK1がDARPP-32のSer-137をリン酸化しうることを示唆している（33、34も参照）。Ser-137のリン酸化は、DARPP-32のThr-34がカルシニューリンにより脱リン酸化されてそれによりDARPP-32/PP １カスケードをモジュレートする能力を損なう。先の実施例（第６節）は、新線条体ニューロンにおいて、グループＩmGluRによるCK1の活性化はDARPP-32のThr-75およびSer-137のリン酸化をもたらし、これが電位依存性Ca2+チャネルの調節に導くことを実証する。様々な他の研究は、概日クロックおよびWntシグナル伝達の調節などの様々な細胞プロセスにおけるCK1イソ型、特にCK1δおよびCK1εの役割に対して強い支持を与えている（7-10、12、14-16）。 CK1δおよびCK1εはまた、アルツハイマー病の病態生理学にも関係があるとされている（30、35、36）。
【０２８０】
本実施例に開示した結果は、自己リン酸化およびカルシニューリンによる一過性脱リン酸化に基づくCK1ε（そして恐らくはCK1δ）の調節は、酵素に関わるこれらの他のプロセスの調節に重要な役割を果たすことを実証する。カルシニューリン活性の改変はmGluRの調節から、または哺乳動物細胞の細胞内Ca2+の濃度も増加する代わりの径路を経由して起こりうる。
【０２８１】
7.5.  参考文献
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本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態により範囲を限定されるものでない。実際、当業者であれば以上の説明から、本明細書に記載されたことに加えて本発明のさらなる改変が明らかであろう。そのような改変は添付した請求の範囲内に入ると意図するものである。
【０２８２】
本明細書に引用した全ての参考文献は、それぞれの個々の出版物、特許または特許出願が特定してかつ個々に、参照によりその全文があらゆる目的で組み入れられると示されたのと同じ程度で、本明細書に参照によりその全文があらゆる目的で組み入れられる。
【０２８３】
いずれの公開文献の引用も出願日に先立つ開示であるが、本発明が先行する発明によるこのような公開文献に先んずる権利が与えられないことを容認するとみなしてはならない。
【図面の簡単な説明】
【０２８４】
【図１】(S)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン（DHPG）によるグループＩ mGluR受容体の活性化が、DARPP-32上のThr75およびSerl37のリン酸化を増加することを示す。
【図２】mGluR1受容体の活性化が一過的にCdk5活性を増加することを示す。
【図３】mGluRl受容体の活性化がCK1活性を刺激することを示す。
【図４】Cdk5インヒビター、ブチロラクトンが、DARPP-32上のリン酸化に対するDHPGの効果をThr75（Cdk5部位）においてはブロックするが、Serl37 (CK1部位)においてはブロックしないことを示す。
【図５】CK1がin vitroでp35をリン酸化することを示す。
【図６】グループＩ  mGluR受容体のDHPGによる活性化がCa2+電流を増強すること、およびこの増強はCK1またはCdk5を抑制することによりブロックされ、かつDARPP-32 KOマウスでは存在しないことを示す。
【図７】DARPP-32 Ser-137およびThr-75リン酸化に対する(S)-3,5-ジヒドロキシフェニルグリシン（DHPG）の効果は、PLCβインヒビターU73122、Ca2+キレーターBAPTA/AMおよびカルシニューリンインヒビター、シクロスポリンＡによりブロックされることを示す。
【図８】CK1ε活性に対するDHPGの効果がU73122、BAPTA/AMおよびシクロスポリンＡによりブロックされることを示す。
【図９】Cdk5活性に対するDHPGの効果がU73122、BAPTA/AMおよびシクロスポリンＡによりブロックされることを示す。
【図１０】DHPG処理すると、CK1εが一過的に脱リン酸化されることを示す。
【図１１】抑制自己リン酸化部位を欠くCK1ε突然変異体はDHPGにより活性化されないことを示す。
【図１２】CK1の構成的リン酸化は酵素活性を調節しないことを示す。
【図１３】グループＩ  mGluRの活性化によるCK1活性の調節に対するモデルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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