(57)【要約】本発明は骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の細胞増殖促進効果及び破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）の細胞増殖抑制効果に優れた、下記一般式（Ｉ）で表されるクエルセチン誘導体を有効成分として含有する骨粗鬆症治療剤に関する。本発明のクエルセチン誘導体は、従来の骨粗鬆症治療剤に比べて骨芽細胞の細胞増殖促進效果及び破骨細胞の細胞増殖抑制效果に優れ、体内ホルモンの変化を大きく誘発せず、海綿骨の面積増加効果がさらに高く現れるのみならず、副作用がなく造血機能や免疫系に影響を与えない安全な薬物として確認され、骨粗鬆症治療剤または予防剤として幅広く活用されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で表されるクエルセチン誘導体を有効成分として含有し、薬学的に許容される担体を含む骨粗鬆症治療剤：
2004507499.tif 000017
式中、
Ｒ１はゲンチオトリオース（ｇｅｎｔｉｏｔｒｉｏｓｅ）、グルコピラノース（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、０−アラビノフラノース（０−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｅ）、０−ジグルコピラノース（０−ｄｉｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、０−ガラクトピラノース（０−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、０−ガラクトシド−ガレート（０−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−ｇａｌｌａｔｅ）、０−ゲンチオビオース（０−ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）、０−グルコピラノース（０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、０−グルクロニド（０−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）、０−ネオヘスペリドス（０−ｎｅｏｈｅｓｐｅｒｉｄｏｓｅ）、０−ラムノピラノース（０−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、０−ルチノース（０−ｒｕｔｉｎｏｓｅ）、０−ソフォロース（０−ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）、０−キシロピラノース（０−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、ＯＣＨ３、ＯＨ、ラムノゲンチオビオース（ｒｈａｍｎｏｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）、ラムノグルコース（ｒｈａｍｎｏｇｌｕｃｏｓｅ）または硫黄（ｓｕｌｆａｔｅ）であり；Ｒ２はＯＨまたは０−グルコピラノース（０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であり；Ｒ３はＯＣＨ３、ＯＨ、０−グルコピラノース（０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、０−グルクロノピラノース（０−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ）またはグルコピラノース（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であり；
Ｒ４はＯＣＨ３またはＯＨであり；及び
Ｒ５はＯＣＨ３、ＯＨ、０−グルコピラノース（０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）または０−グルコ−ス，（０−ｇｌｕｃｏｓｅ）である。
【請求項２】
クエルセチンの誘導体は、前記一般式（Ｉ）において、Ｒ２ないしＲ５が−ＯＨであるクエルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、アビキュラロシド（ａｖｉｃｕｌａｒｏｓｉｄｅ）、キアザベリン（ｇｕｉａｊａｖｅｒｉｎ）、ハイパーロシド（ｈｙｐｅｒｏｓｉｄｅ）、イソハイパーロシド（ｉｓｏｈｙｐｅｒｏｓｉｄｅ）、イソクエルシトリン（ｉｓｏｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）、マルチノシドＡ（ｍｕｌｔｉｎｏｓｉｄｅ　Ａ）、マルチノシドＡアセテート（ｍｕｌｔｉｎｏｓｉｄｅ　Ａ　ａｃｅｔａｔｅ）、クエルシトリン（ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）、ルチン（ｒｕｔｉｎ）、クエルセチン−３−０−（２″−０−β−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｌ−ラムノピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−（２″−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−（６″−０−ガロイル）−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−（６″−０−ｇａｌｌｏｙｌ）−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−（６’″−０−ｐ−クマロイル−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシド）（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−（６’″−０−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−２）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ））、クエルセチン−３−０−Ｄ−グルコピラノシル−（１−６）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−α−Ｌ−ラムノピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−４）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−［２″−０−６’″−０−ｐ−（７″″−０−β−Ｄ−グルコピラノシル）クマロイル−β−Ｄ−グルコピラノシル］−α−Ｌ−ラムノピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［２″−０−６’″−０−ｐ−（７″″−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−［６’″−ｐ−クマロイル−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−（１−４）−ラムノピラノシド］（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［６’″−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−β−（１−４）−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］）、クエルセチン−３−０−［α−Ｌ−ラムノピラノシド（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシド−（１−６）−β−Ｄ−グルコピラノシド］（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１−２）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］）、クエルセチン−３−０−［α−ラムノピラノシド（１−４）α−Ｌ−ラムノピラノシド（１−６）β−Ｄ−ガラクトピラノシド］（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［α−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１−４）α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１−６）β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］）、クエルセチン−３−０−［α−ラムノピラノシド−（１−２）］−［β−グルコピラノシル−（１−６）］−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［α−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−２）］−［β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−６）］−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−［α−ラムノピラノシド−（１−４）−α−ラムノピラノシド−（１−６）−β−ガラクトピラノシド］（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［α−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−４）−α−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−６）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］）、クエルセチン−３−０−α−Ｌ−ラムノピラノシド−（１−２）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−２）−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−β−Ｄ−ジグルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−β−Ｄ−ｄｉｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−β−Ｄ−ガラクトシド−２″−ガレート（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−２″−ｇａｌｌａｔｅ）、クエルセチン−３−０−β−Ｄ−グルコピラノシド−（１−６）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ−（１−６）−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１−３）−α−Ｌ−ラムノピラノシド−（１−６）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−３）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−６）−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−β−Ｄ−グルクロナイド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−β−Ｄ−キシロピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−β−Ｄ−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−ジグルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−ｄｉｇｌｕｃｏｓｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−ゲンチオビオシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−グルコピラノシルガラクトピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−ネオヘスペリドシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−ｎｅｏｈｅｓｐｅｒｉｄｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−ゲンチオトリオシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−ｇｅｎｔｉｏｔｒｉｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−メチルエーテル（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−ｍｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ）、クエルセチン−３−ラムノゲンチオビオシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−ｒｈａｍｎｏｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−ラムノグルコシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−ｒｈａｍｎｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）またはクエルセチン−３−硫酸塩（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−ｓｕｌｆａｔｅ）であることを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症治療剤。
【請求項３】
クエルセチンの誘導体は、前記一般式（Ｉ）において、Ｒ１が−ＯＨであり、Ｒ２ないしＲ５のうち三つの機能グループがＯＨである、イソラムネチン（ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ）、クエルシメリトリン（ｑｕｅｒｃｉｍｅｒｉｔｒｉｎ）、ラムネチン（ｒｈａｍｎｅｔｉｎ）、クエルセチン−５−０−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−５−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−７−０−β−Ｄ−グルクロノピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−７−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）またはスピレオシド（ｓｐｉｒｅａｏｓｉｄｅ）であることを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症治療剤。
【請求項４】
クエルセチンの誘導体は、前記一般式（Ｉ）において、Ｒ１ないしＲ５のうち三つの機能グループがＯＨである、ラムナジン（ｒｈａｍｎａｚｉｎ）、クエルセチン−３’、４’−ジメチルエーテル（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３’、４’−ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ）、クエルセチン−３、３’−ジメチルエーテル（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３、３’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ）、クエルセチン−３、７−ジメチルエーテル（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３、７−ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ）、クエルセチン−３−０−［２″−０−（６’″−０−ｐ−クマロイル）−β−Ｄ−グルコピラノシル］−α−Ｌ−ラムノピラノシド−７−０−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［２″−０−（６’″−０−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−７−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−［２″−０−６’″−０−ｐ−（７″″−０−β−Ｄ−グルコピラノシル）クマロイル−β−Ｄ−グルコピラノシル］−α−Ｌ−ラムノピラノシド−７−０−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［２″−０−６’″−０−ｐ−（７″″−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ−７−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−ルチノシド−７−０−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−ｒｕｔｉｎｏｓｉｄｅ−７−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−α−Ｌ−アラビノピラノシル−７−０−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−７−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−７−０−β−Ｄ−グルコピラノシド−３−０−ソフォロシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−７−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ−３−０−ｓｏｐｈｏｒｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−ガラクトピラノシル−７−０−ジグルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−７−０−ｄｉｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−０−グルコピラノシル−７−ジグルコピラノシ（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−７−ｄｉｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄ　ｅ）、クエルセチン−３、７−ジグルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３、７−ｄｉｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、クエルセチン−３−ゲンチオビオシル−７−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｙｌ−７−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）またはクエルセチン−３、４’−ジ−０−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３、４’−ｄｉ−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）であることを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症治療剤。
【請求項５】
クエルセチンの誘導体は、クエルセチン−３、４’、７−トリメチルエーテル（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３、４’、７−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ）またはクエルセチン−３、３’、４’、７−テトラメチルエーテル（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３、３’、４’、７−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ）であることを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症治療剤。
【請求項６】
薬学的に許容される担体は、ポリビニールピロリドン及びヒドロキシプロピルセルロースで構成されたグループから選ばれる１種の結合剤であることを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症治療剤。
【請求項７】
薬学的に許容される担体は、カルボキシメチルセルロースカルシウム及び澱粉グリコール酸ナトリウムよりなるグループから選ばれる１種の滑沢剤であることを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症治療剤。
【請求項８】
薬学的に許容される担体は、トウモロコシ澱粉、乳糖、大豆油、結晶セルロース及びマンニトールで構成されたグループから選ばれる１種の稀釈剤であることを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症治療剤。
【請求項９】
薬学的に許容される担体は、ステアリン酸マグネシウム及びタルクよりなるグループから選ばれる１種の滑沢剤であることを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症治療剤。
【請求項１０】
薬学的に許容される担体は白糖、果糖、ソルビトール及びアスパータムよりなるグループから選ばれる１種の甘味剤であることを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症治療剤。
【請求項１１】
薬学的に許容される担体はカルボキシメチルセルロースナトリウム、αまたはβシクロデキストリン、ビタミンＣ、クエン酸及び白癜より構成されたグループから選ばれる１種の安定剤であることを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症治療剤。
【請求項１２】
薬学的に許容される担体はパラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル及び安息香酸ナトリウムで構成されたグループから選ばれる１種の保存料であることを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症治療剤。
【請求項１３】
薬学的に許容される担体はエチルバニリン、マスキングフラボール、メントルフラボノ及びハーブ香で構成されたグループから選ばれる１種の香料であることを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症治療剤。
【請求項１４】
治療剤は錠剤、カプセル剤、軟質カプセル剤、液剤、軟膏剤、丸剤、散剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、坐剤及び注射剤とから構成されたグループから選ばれる１種の経口投与製剤、または非経口投与製剤であることを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症治療剤。
【請求項１５】
カルシウムまたはビタミンＤ３をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の骨粗鬆症治療剤。
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明はクエルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）誘導体を有効成分として含有する骨粗鬆症治療剤に係り、さらに具体的に骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の細胞増殖促進効果及び破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）の細胞増殖抑制効果に優れた、下記一般式（Ｉ）で表されるクエルセチン誘導体を有効成分として含有する骨粗鬆症治療剤に関する。
2004507499.tif 000002
背景技術
骨粗鬆症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）は骨組織の脱灰により骨の緻密質が薄くなり、よって骨髄腔が広まる疾患であって、病勢が進むことにより骨が弱まるため、軽い衝撃にも骨折しやすくなる。骨量は遺伝的要因、栄養摂取、ホルモンの変化、運動及び生活習慣の違いなど色々の要因により影響を受ける。老齢、運動不足、低体重、喫煙、低カルシウム食餌、閉経、卵巣摘出などにより骨粗鬆症が誘発されると知られている。特に、女性の場合３０歳以降から骨減少が持続的に進み、閉経期に至るとエストロゼン（ｅｓｔｒｏｇｅｎ）濃度が急激に減少してＩＬ−７（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−７）によりＢリンパ球が生成されるものと類似にＢ−リンパ球（Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ）が多量生成されることにより骨髄（ｂｏｎｅ　ｍａｒｒｏｗ）にＢ細胞の前駆体（ｐｒｅ−Ｂ　ｃｅｌｌ）が蓄積され、よってＩＬ−６の量が増えて破骨細胞の活性を増加させるため、結局骨量が減るようになる。このような骨粗鬆症は程度に差があるが、老年層、特に閉経期以後の女性にとっては症候は多様だが、避けられない症状なので、人口の高齢化に伴う骨粗鬆症を予防及び治療するために全世界的に各研究機関と製薬会社では骨疾患治療剤の開発に多くの投資がなされている。
現在骨粗鬆症治療剤として使用されている物質としては、エストロゼン（ｅｓｔｒｏｇｅｎ）、アンドロゲンアナボリックステロイド（ａｎｄｒｏｇｅｎｉｃ　ａｎａｂｏｌｉｃ　ｓｔｅｒｏｉｄ）、カルシウム製剤、燐酸塩、弗素製剤、イプリフラボン（ｉｐｒｉｆｌａｖｏｎｅ）、ビタミンＤ３などがある。かつ、最近は１９９５年アメリカのマーク社（Ｍｅｒｃｋ　Ｃｏ．）でアミノビスフォスフォネート（ａｍｉｎｏｂｉｓｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）を、１９９７年アメリカのＥｌｉ　Ｌｉｌｌｙ　Ｃｏ．で選択的なエストロゼン受容体調節器（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｅｓｔｒｏｇｅｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｍｏｄｕｌａｔｏｒ、ＳＥＲＭ）として働くラロキシフェン（ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ）を骨粗鬆症に対する新薬として開発したことがある。
前述した骨粗鬆症治療剤はほぼ癌、胆石、血栓症などの副作用が現れるエストロゼン系の物質であることだと知られている。しかし、骨粗鬆症は薬物の長期投与が必須なので、薬物を長期投与する時にはエストロゼンを代替できるほど優れた薬効を有する新たな物質の開発が要求されている。
エストロゼン代替物質として大豆のイソフラボン（ｓｏｙｂｅａｎ　ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）のような植物エストロゼン（ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）が報告されている。植物エストロゼンは１９４６年に最初に報告されたが、’クローバ病（ｃｌｏｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ）［赤いクローバ種（ｒｅｄ　ｃｌｏｖｅｒ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ　ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅｕｍ　ｖａｒ．Ｄｗａｌｇａｎｕｐ）に属する植物を食べた羊の不姙率が３０％以上増加され、’クローバ病’と命名される］の原因がこの植物に含有された成分のうちエストロゼンに似ているイソフラボノイド（ｉｓｏｆｌａｖｏｎｏｉｄ）であることを明かし、植物から得られたこのような化合物を‘植物エストロゼン’と命名した。その後、ダイゼイン（ｄａｉｄｚｅｉｎ）、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、フォルムオノネチン（ｆｏｒｍｏｎｏｎｅｔｉｎ）、ビオカニンＡ（ｂｉｏｃｈａｎｉｎ　Ａ）などのイソフラボン（ｉｓｏｆｌａｖｏｎｅ）類化合物、クメストロール（ｃｏｕｍｅｓｔｒｏｌ）などのクメスタン（ｃｏｕｍｅｓｔａｎ）類化合物、エンテロラクトン（ｅｎｔｅｒｏｌａｃｔｏｎｅ）などのリグナン（ｌｉｇｎａｎ）系化合物及びエンテロジオール（ｅｎｔｅｒｏｄｉｏｌ）などのフェノール（ｐｈｅｎｏｌ）系化合物などが植物エストロゼンとして報告された。これら植物エストロゼンはほぼアグリコン（ａｇｌｙｃｏｎｅ）、６’−０−アセチルグルコシド（６’−０−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）または、６’−０−マロニルグルコシド（６’−０−ｍａｌｏｎｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）などの形態に在し、ダイゼインとゲニステインは７−０−グルコシド（７−０−ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）の形態に存する。
前記化合物のうち糖化合物は腸内バクテリアのβ−グルコシダーゼ（β−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）または胃酸により加水分解され、結局フリー（ｆｒｅｅ）イソフラボンであるアグリコンの形態に吸収されることと知られている。今までの研究結果によれば、前記植物エストロゼンは動物のエストロゼンと類似した作用を示すことと知られている。すなわち、エストロゼン受容体に結合して乳癌細胞の成長を抑え閉経期以後に現れる心血管系疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　ｄｉｓｅａｓｅ）及びその他の症状の治療にエストロゼンを代替して使用されうることが報告された。しかし、前記植物エストロゼンによる骨粗鬆症予防及び治療効果が微弱であり、天然物から分離精製時高コストになり、骨粗鬆症予防及び治療に幅広く活用できない現状である。
従って、副作用がなく、骨粗鬆症予防及び治療効果がよく、低コストの代替物質を開発すべき必要性が絶え間なく台頭された。
発明の開示
これに本発明者らは副作用がなく、骨粗鬆症予防及び治療効果が良く、生産コストが低廉な代替物質を開発するために鋭意工夫した結果、化学的に合成可能なクエルセチン誘導体が骨芽細胞の細胞増殖を促進し破骨細胞の細胞増殖を抑える活性が優秀でのみならず、体内の臓器組織に副作用を示さなくて安全性を有するところ、クエルセチン誘導体を骨粗鬆症治療剤の有効成分として使用できることを確認し、本発明を完成するに至った。
つまり、本発明の目的はクエルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）及びその誘導体を有効成分として含有する骨粗鬆症治療剤を提供するところにある。
本発明は下記一般式（Ｉ）で表されるクエルセチン誘導体を有効成分として含有し、薬学的に許容される担体を含む骨粗鬆症治療剤を提供する：
2004507499.tif 000003
式中、
Ｒ１はゲンチオトリオース（ｇｅｎｔｉｏｔｒｉｏｓｅ）、グルコピラノース（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、０−アラビノフラノース（０−ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｅ）、０−ジグルコピラノース（０−ｄｉｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、０−ガラクトピラノース（０−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、０−ガラクトシド−ガレート（０−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−ｇａｌｌａｔｅ）、０−ゲンチオビオース（０−ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）、０−グルコピラノース（０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、０−グルクロニド（０−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）、０−ネオヘスペリドス（０−ｎｅｏｈｅｓｐｅｒｉｄｏｓｅ）、０−ラムノピラノース（０−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、０−ルチノース（０−ｒｕｔｉｎｏｓｅ）、０−ソフォロース（０−ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）、０−キシロピラノース（０−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、ＯＣＨ３、ＯＨ、ラムノゲンチオビオース（ｒｈａｍｎｏｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）、ラムノグルコース（ｒｈａｍｎｏｇｌｕｃｏｓｅ）または硫黄（ｓｕｌｆａｔｅ）であり；
Ｒ２はＯＨまたは０−グルコピラノース（０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であり；
Ｒ３はＯＣＨ３、ＯＨ、０−グルコピラノース（０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）、０−グルクロピラノース（０−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ）またはグルコピラノース（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であり；
Ｒ４はＯＣＨ３またはＯＨであり；及び、
Ｒ５はＯＣＨ３、ＯＨ、０−グルコピラノース（０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）または０−グルコース（０−ｇｌｕｃｏｓｅ）である。
前記一般式（Ｉ）のクエルセチン誘導体のうち一般によく知られている化合物は次のように分類できる：（ｉ）Ｒ２ないしＲ５が−ＯＨであり、Ｒ１により相違になる誘導体グループであって、Ｒ１がＯＨであるクエルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）、Ｒ１が０−α−Ｌ−アラビノフラノース（ａｒａｂｉｎｏｆｕｒａｎｏｓｅ）であるアビキュラロシド（ａｖｉｃｕｌａｒｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−アラビノピラノース（０−ａｒａｂｉｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるキアザベリン（ｇｕｉａｊａｖｅｒｉｎ）、Ｒ１が０−β−Ｄ−ガラクトピラノース（０−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるハイパーロシド（ｈｙｐｅｒｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−β−Ｄ−ガラクトピラノース（０−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるイソハイパーロシド（ｉｓｏｈｙｐｅｒｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−グルコピラノース（０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるイソクエルシトリン（ｉｓｏｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）、Ｒ１が０−［β−Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−α−Ｌ−ラムノピラノース］（０−［β−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−４）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ］）であるマルチノシドＡ（ｍｕｌｔｉｎｏｓｉｄｅ　Ａ）、Ｒ１が（６−０−アセチル）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−α−Ｌ−ラムノピラノース（（６−０−ａｃｅｔｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−４）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるマルチノシドＡアセテート（ｍｕｌｔｉｎｏｓｉｄｅ　Ａ　ａｃｅｔａｔｅ）、Ｒ１が０−α−Ｌ−ラムノピラノース（０−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルシトリン（ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）、Ｒ１が０−β−Ｄ−ルチノース（０−β−Ｄ−ｒｕｔｉｎｏｓｅ）であるルチン（ｒｕｔｉｎ）、Ｒ１が０−（２″−０−β−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｌ−ラムノピラノース（０−（２″−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−（２″−０−β−Ｄ−グルコピラノシル）−α−Ｌ−ラムノピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−（２″−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−（６″−０−ガロイル）−グルコピラノース（０−（６″−０−ｇａｌｌｏｙｌ）−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−（６″−０−ガロイル）−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−（６″−０−ｇａｌｌｏｙｌ）−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−（６’″−０−ｐ−クマロイル−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノース（０−（６’″−０−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−２）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−（６’″−０−ｐ−クマロイル−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシド）（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−（６’″−０−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−２）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ））、Ｒ１が０−Ｄ−グルコピラノシル−（１−６）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−α−Ｌ−ラムノピラノース（０−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−４）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−Ｄ−グルコピラノシル−（１−６）−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１−４）−α−Ｌ−ラムノピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−４）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｌｄｅ）、Ｒ１が０−［２″−０−６’″−０−ｐ−（７″″−０−β−Ｄ−グルコピラノシル）クマロイル−β−Ｄ−グルコピラノシル］一α−Ｌ−ラムノピラノース（０−［２″−０−６’″−０−ｐ−（７″″−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−［２″−０−６’″−０−ｐ−（７″″−０−β−Ｄ−グルコピラノシル）クマロイル−β−Ｄ−グルコピラノシル］−α−Ｌ−ラムノピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［２″−０−６’″−０−ｐ−（７″″−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−［６’″−ｐ−クマロイル−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−（１−４）−ラムノピラノース］（０−［６’″−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−β−（１−４）−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ］）であるクエルセチン−３−０−［６’″−ｐ−クマロイル−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−（１−４）−ラムノピラノシド］（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［６’″−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−β−（１−４）−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］）、Ｒ１が０−［α−Ｌ−ラムノピラノシド（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシド−（１−６）−β−Ｄ−グルコピラノース］（０−［α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１−２）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ］）であるクエルセチン−３−０−［α−Ｌ−ラムノピラノシド（１−２）−α−Ｌ−ラムノピラノシド−（１−６）−β−Ｄ−グルコピラノシド］（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１−２）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−６）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］）、Ｒ１が０−［α−ラムノピラノシド（１−４）α−Ｌ−ラムノピラノシド（１−６）β−Ｄ−ガラクトピラノース］（０−［α−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１−４）α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１−６）β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ］）であるクエルセチン−３−０−［α−ラムノピラノシド（１−４）α−Ｌ−ラムノピラノシド（１−６）β−Ｄ−ガラクトピラノシド］（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［α−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１−４）α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ（１−６）β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］）、Ｒ１が０−［α−ラムノピラノシド−（１−２）］−［β−グルコピラノシル−（１−６）］−β−Ｄ−ガラクトピラノース（０−［α−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−２）］−［β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−６）］−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−［α−ラムノピラノシド−（１−２）］−［β−グルコピラノシル−（１−６）］−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［α−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−２）］−［β−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−６）］−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−［α−ラムノピラノシド−（１−４）−α−ラムノピラノシド−（１−６）−β−ガラクトピラノース］（０−［α−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−４）−α−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−６）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ］）であるクエルセチン−３−０−［α−ラムノピラノシド−（１−４）−α−ラムノピラノシド−（１−６）−β−ガラクトピラノシド］（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［α−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−４）−α−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−６）−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ］）、Ｒ１が０−α−Ｌ−ラムノピラノシド−（１−２）−β−Ｄ−ガラクトピラノース（０−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−２）−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−α−Ｌ−ラムノピラノシド−（１−２）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−２）−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−β−Ｄ−ジグルコピラノース（０−β−Ｄ−ｄｉｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−β−Ｄ−ジグルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−β−Ｄ−ｄｉｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−β−Ｄ−ガラクトピラノシド−２″−ガレート（０−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−２″−ｇａｌｌａｔｅ）であるクエルセチン−３−０−β−Ｄ−ガラクトシド−２″−ガレート（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ−２″−ｇａｌｌａｔｅ）、Ｒ１が０−β−Ｄ−グルコピラノシド−（１−６）−β−Ｄ−ガラクトピラノース（０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ−（１−６）−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−β−Ｄ−グルコピラノシド−（１−６）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ−（１−６）−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１−３）−α−Ｌ−ラムノピラノシド−（１−６）−β−Ｄ−ガラクトピラノース（０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−３）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−６）−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−β−Ｄ−グルコピラノシル−（１−３）−α−Ｌ−ラムノピラノシド−（１−６）−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−３）−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−（１−６）−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−β−Ｄ−グルクロナイド（０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）であるクエルセチン−３−０−β−Ｄ−グルクロナイド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄｅ）、Ｒ１が０−β−Ｄ−キシロピラノース（０−β−Ｄ−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−β−Ｄ−キシロピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−β−Ｄ−ｘｙｌｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−ジグルコースピラノース（０−ｄｉｇｌｕｃｏｓｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−ジグルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−ｄｉｇｌｕｃｏｓｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−ゲンチオビオース（０−ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−ゲンチオビオシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−グルコピラノシルガラクトピラノース（０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−グルコピラノシルガラクトピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−ネオヘスペリドス（０−ｎｅｏｈｅｓｐｅｒｉｄｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−ネオヘスペリドシドドシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−ｎｅｏｈｅｓｐｅｒｉｄｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−ソフォロース（０−ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−ソフォロシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−ｓｏｐｈｏｒｏｓｉｄｅ）、Ｒ１がゲンチオトリオース（ｇｅｎｔｉｏｔｒｉｏｓｅ）であるクエルセチン−３−ゲンチオトリオシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−ｇｅｎｔｉｏｔｒｉｏｓｉｄｅ）、Ｒ１がＯＣＨ３であるクエルセチン−３−メチルエーテル（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−ｍｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ）、Ｒ１がラムノゲンチオビオース（ｒｈａｍｎｏｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）であるクエルセチン−３−ラムノゲンチオビオシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−ｒｈａｍｎｏｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｉｄｅ）、Ｒ１がラムノグルコース（ｒｈａｍｎｏｇｌｕｃｏｓｅ）であるクエルセチン−３−ラムノグルコシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−ｒｈａｍｎｏｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が硫黄であるクエルセチン−３−硫酸塩（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−ｓｕｌｆａｔｅ）などが含まれる：
（ｉｉ）Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２ないしＲ５のうち３個の機能グループがＯＨであり、残り１個の機能グループにより相違になる誘導体グループであって、Ｒ４がＯＣＨ３であるイソラムネチン（ｉｓｏｒｈａｍｎｅｔｉｎ）、Ｒ３が０−β−Ｄ−クルコビラノス（０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルシメリトリン（ｑｕｅｒｃｉｍｅｒｉｔｒｉｎ）、Ｒ３がＯＣＨ３であるラムネチン（ｒｈａｍｎｅｔｉｎ）、Ｒ２が０−β−Ｄ−グルコピラノース（０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−５−０−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−５−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ３が０−β−Ｄ−クルクロノピラノース（０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−７−０−β−Ｄ−グルクロノピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−７−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ５が０−クルコース（０−ｇｌｕｃｏｓｅ）であるスピレオシド（ｓｐｉｒｅａｏｓｉｄｅ）などが含まれる；（ｉｉｉ）Ｒ１ないしＲ５のうち３個の機能グループがＯＨであり、残り２個の機能グループにより相違になる誘導体グループであって、Ｒ３とＲ４がＯＣＨ３であるラムナジン（ｒｈａｍｎａｚｉｎ）、Ｒ４とＲ５がＯＣＨ３であるクエルセチン−３’、４’−ジメチルエーテル（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３’、４’−ｄｉ−ｍｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ）、Ｒ１とＲ４がＯＣＨ３であるクエルセチン−３、３’−ジメチルエーテル（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３、３’−ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ）、Ｒ１とＲ３がＯＣＨ３であるクエルセチン−３、７−ジメチルエーテル（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３、７−ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ）、Ｒ１が０−［２″−０−（６’″−０−ｐ−クマロイル）−β−Ｄ−グルコピラノシル］−α−Ｌ−ラムノピラノース（０−［２″−０−（６’″−０−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であり、Ｒ３が０−β−Ｄ−グルコピラノース（０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−［２″−０−（６’″−０−ｐ−クマロイル）−β−Ｄ−グルコピラノシル］−α−Ｌ−ラムノピラノシド−７−０−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［２″−０−（６’″−０−ｐ−ｃｏｕｍａｒｏｙｌ）−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−７−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−［２″−０−６’″−０−ｐ−（７″″−０−β−Ｄ−グルコピラノシル）クマロイル−β−Ｄ−グルコピラノシル］−α−Ｌ−ラムノピラノース（０−［２″−０−６’″−０−ｐ−（７″″−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であり、Ｒ３が０−β−Ｄ−グルコピラノース（０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−［２″−０−６’″−０−ｐ−（７″″−０−β−Ｄ−グルコピラノシル）クマロイル−β−Ｄ−グルコピラノシル］−α−Ｌ−ラムノピラノシド−７−０−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−［２″−０−６’″−０−ｐ−（７″″−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）ｃｏｕｍａｒｏｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ］−α−Ｌ−ｒｈａｍｎｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ−７−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−ルチノース（０−ｒｕｔｉｎｏｓｅ）であり、Ｒ３が０−β−Ｄ−グルコピラノース（０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−ルチノシド−７−０−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−ｒｕｔｉｎｏｓｉｄｅ−７−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−α−Ｌ−アラビノピラノシル（０−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ）であり、Ｒ３が０−β−Ｄ−グルコピラノース（０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−α−Ｌ−アラビノピラノシル−７−０−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−α−Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−７−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−ソホロース（０−ｓｏｐｈｏｒｏｓｅ）であり、Ｒ３が０−β−Ｄ−グルコピラノース（０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−７−０−β−Ｄ−グルコピラノシド−３−０−ソフォロシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−７−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ−３−０−ｓｏｐｈｏｒｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−ガラクトピラノース（０−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であり、Ｒ３が０−グルコピラノース（０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−ガラクトピラノシル−７−０−ジグルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−７−０−ｄｉｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１が０−グルコピラノース（０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であり、Ｒ３が０−グルコピラノース（０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−０−グルコピラノシル−７−ジグルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−０−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｙｌ−７−ｄｉｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１がグルコピラノース（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であり、Ｒ３がグルコピラノース（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３、７−ジグルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３、７−ｄｉｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１がゲンチオビオース（ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｅ）であり、Ｒ３がグルコピラノース（ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３−ゲンチオビオシル−７−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３−ｇｅｎｔｉｏｂｉｏｓｙｌ−７−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、Ｒ１とＲ５が０−β−Ｄ−グルコピラノース（０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｅ）であるクエルセチン−３、４’−ジ−０−β−Ｄ−グルコピラノシド（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３、４’−ｄｉ−０−β−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）などが含まれる；（ｉｖ）その他、３個以上の機能グループが変化された誘導体グループであって、Ｒ１、Ｒ３及びＲ５がＯＣＨ３であり、Ｒ���及びＲ４がＯＨであるクエルセチン−３、４’、７−トリメチルエーテル（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３、４’、７−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ）、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４及びＲ５がＯＣＨ３であり、Ｒ２がＯＨであるクエルセチン−３、３’、４’、７−テトラメチルエーテル（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ−３、３’、４’、７−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ）などが含まれる。
前記一般式（Ｉ）においてＲ１ないしＲ５が全てＯＨであるクエルセチン（ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ）は自然界に存する４０００余種の植物から得られるフェノール系化合物（ｐｈｅｎｏｌｉｃ　ｃｏｍｐｏｕｎｄ）であって、Ｃ１５Ｈ１０Ｏ７の分子式と３０２．３３ｇ／ｍｏｌｅの分子量を有する植物エストロゼンの一種で、化学構造において、大きい共鳴構造を有しており、１９３６年に最初にその構造が明らかになった後、ビタミンＰ（ｖｉｔａｍｉｎＰ）とも知られている。一般に、クエルセチンは通常に糖類がβ−結合した配糖体であるルチン（ｒｕｔｉｎ）であって、クローバ花、ブタクサ花粉、多様な植物の皮と筋だけではなく、玉ネギ、ケール、ブロッコリ、レタース、トマト、りんごなどに幅広く分布されている。クエルセチンの作用に対する研究結果、今までは主に毛細管壁の伸縮性（ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｗａｌｌ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）及び毛細管抵抗性（ｃａｐｉｌｌａｒｙ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）維持に大事な役割を果たすのみならず（参照：Ｇａｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、　２８０：１−１５、１９８８；Ｈａｖａｓｔｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３２：１１４１−１４４８、１９８３）、酸化防止作用、ビタミンＰ作用、紫外線吸収作用、高血圧抑制、抗不整脈作用（ａｎｔｉａｒｒｈｙｔｈｍｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）、抗炎症、抗アレルギ性、血中コレステロール低下、肝毒性抑制、不姙の治療作用などを有しているため、食べ物、医薬品、化粧品などにその応用が期待されているが、今まで骨粗鬆症予防または治療と関連してクエルセチンを使用した例は報告されたことがなかった。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明のクエルセチン誘導体を有効成分として含有する骨粗鬆症治療剤を詳述する。
本発明者らはクエルセチン誘導体が骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）及び破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）の細胞増殖に与える効果を検索するため、骨粗鬆症治療効果があると知られている植物エストロゼン（ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）であるゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）とクエルセチンの骨粗鬆症治療効果を比較した結果、クエルセチンはゲニステインより骨芽細胞の細胞増殖促進効果及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性増加効果に優れ、破骨細胞は細胞増殖抑制効果が優秀であることを確認した。
かつ、卵巣摘出白鼠に対する動物実験結果、クエルセチン誘導体の投与が体内ホルモンの変化を大きく引き起こさなかったところ、現在骨粗鬆症の治療剤として使用されているエストラジオールの副作用である子宮肥厚などを誘発しない安全な薬物であることが確認できた。また、クエルセチン誘導体は海綿骨の面積変化の多い脛骨でエストラジオールより海綿骨の面積増加効果が高く現れ、造血機能や免疫系にいずれの影響を与えないことと確認された。
従って、前記結果により、本発明のクエルセチン誘導体は、従来の骨粗鬆症治療剤として主に使用されていた植物エストロゼンであるゲニステインに比べ、骨芽細胞の細胞増殖促進効果及び破骨細胞の細胞増殖抑制効果が優秀でのみならず副作用が少なく、体内ホルモンの変化を大きく誘発せず造血機能や免疫系に影響を与えない安全な薬物であって、骨粗鬆症治療剤または予防剤として有用に使用されうることが分かった。
【製剤化】
前記骨粗鬆症治療効果に優れたクエルセチン誘導体は薬学的に許容可能な結合剤（例えば、ポリビニールピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース）、崩解剤（例えば、カルボキシメチルセルロースカルシウム、澱粉グリコール酸ナトリウム）、稀釈剤（例えば、トウモロコシ澱粉、乳糖、大豆油、結晶セルロース、マンニトール）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク）、甘味剤（例えば、白糖、果糖、ソルビトール、アスパータム）、安定剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、αまたはβシクロデキストリン、ビタミンＣ、クエン酸、白癜）、保存料（例えば、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピル、安息香酸ナトリウム）及び香料（例えば、エチルバニリン、マスキングフラボール、メントルフラボノ、ハーブ香）と混合して錠剤、カプセル剤、軟質カプセル剤、液剤、軟膏剤、丸剤、散剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤、坐剤または注射剤などの経口投与製剤または非経口投与製剤などの薬学的製剤に製造されうる。かつ、骨粗鬆症予防及び治療剤としての効能増進のためにカルシウムやビタミンＤ３を製剤化時に添加できる。特に、本発明の薬学的組成物を非経口に投与する場合、非経口投与は皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射注入方式による。非経口投与用剤型に製造化するためクエルセチン誘導体を安定剤または緩衝剤と共に水で混合して溶液または懸濁液で製造し、これをアンプルまたはバイアルの単位投与型に製剤化できる。
【投与量】
本発明の骨粗鬆症治療剤の薬学的組成物において、クエルセチン誘導体の有効量は２ないし２０ｍｇ／ｋｇ、望ましくは８ないし１２ｍｇ／ｋｇであり、前記有効容量は患者の年齢、性別、症状、投与法、予防目的により１日１回以上を患者に投与できる。
【クエルセチンの安全性】
本発明のクエルセチン誘導体はマウスに経口投与時及び腹腔内投与時の毒性を試験した結果、経口毒性試験による５０％致死量（ＬＤ５０）は少なくとも１６０ｍｇ／ｋｇ以上なので、既に安全性が報告されており（参照：Ｍ．Ｓｕｌｌｉｖａｎ　ｅｔ　ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、７７：２６９、１９５１）、本発明では肝、腎臓、脳、子宮、皮膚、脛骨を対象に副作用を調べて見たところ、肝、腎臓、脳、脛骨及び皮膚の重さに影響を与えず、特に現在骨粗鬆症治療剤が有している副作用である子宮肥厚を表さなかったところ、本発明のクエルセチン誘導体がホルモン製剤として骨粗鬆症治療に安全に使用されうることを再確認することができた。
以下、実施例を通して本発明をさらに詳述する。これら実施例はただ本発明をさらに具体的に説明するためのもので、本発明の要旨により本発明の範囲がこれら実施例により限られないことは当業界において通常の知識を持つ者にとって自明であろう。
【実施例１】：骨芽細胞の細胞増殖効果
クエルセチンが骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の細胞増殖に及ぼす効果を検索するため、人の類似骨芽細胞株（ｈｕｍａｎ　ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）であるＳａｏｓ−２細胞を使用して、植物エストロゼン（ｐｈｙｔｏｅｓｔｒｏｇｅｎ）の一種であって現在骨粗鬆症治療剤として多くの研究がなされているゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）を比較物質にして骨芽細胞の細胞増殖に及ぼす効果を次のように検索した。
【実施例１−１】：骨芽細胞の選別及び細胞培養
骨の構成成分である骨芽細胞に似ている性質を示すＳａｏｓ−２細胞株をソウル大学医学部癌研究所（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の韓国細胞株バンク（Ｋｏｒｅａｎ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅ　Ｂａｎｋ）から分譲され実験に使用した。
Ｓａｏｓ−２細胞は１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、ペニシリン１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含むＲＰＭＩ　１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用して湿式条件、３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２培養器で培養し、培地は１週間に２〜３回交換し、１週間に１回継代培養した。前記細胞株は培養プラスコに単一層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成し成長する特性があるため、継代培養時は０．２５％（ｗ／ｖ）トリップシン（ｔｒｙｐｓｉｎ）溶液を使用して単一層を剥離させた。
【実施例１−２】：薬物の濃度による細胞増殖実験
Ｓａｏｓ−２細胞株を９６−ウェルプレートに２０、０００細胞／ウェルに分配しクエルセチン（１％　ｉｎ　ＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ））を１０−２〜１０−９ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう各濃度別に６つのウェルに添加した。一方、対照群としてはクエルセチンを添加しないものを使用し、比較群としては現在骨粗鬆症治療剤として主に研究されているゲニステインを濃度別にウェルに添加した。次いで、３７℃培養器で３日間培養し、これにＭＴＴ（３−［４、５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ］−２、５−ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ；　Ｔｒｉａｚｏｌｙｌ　Ｂｌｕｅ）を０．０５ｍｇ／ｍｌ濃度に加えて同一な条件下で４時間さらに培養した後、生きている細胞数に比例して生成された濃い紫色のフォルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）結晶をＤＭＳＯで溶解させエリサリーダー（ＥＬＩＳＡ　ｒｅａｄｅｒ）で５５０ｎｍにおける吸光度を測定した。この際、細胞増殖率（％）は下記の式のように、クエルセチンを添加しない対照群ウェルの吸光度に対するクエルセチン添加ウェルの吸光度の比として計算し、クエルセチンを同様な濃度で処理した６個ウェルの値の平均を計算してクエルセチンによる骨芽細胞増殖率（％）を比較した（参照：表１）。
2004507499.tif 000004
【実施例１−３】：アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性検索
骨芽細胞は細胞特異的にアルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＡＬＰ）活性を示すので、本発明に係るクエルセチンが骨芽細胞でＡＬＰ活性に与える影響を下記のような方法により調べて見た：前記実施例１−２のＭＴＴ実験でと同一な細胞数のＳａｏｓ−２細胞株に試験物質を同一な濃度に処理し同一な条件下で３日間培養後収穫した。この際、比較群としてはゲニステインを使用した。一方、ＡＬＰがｐ−ニトロフェニルフォスフェート（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ）をｐ−ニトロフェノール（ｐ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｏｌ）とフォスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に分解させることを用いて４０５ｎｍにおける吸光度の変化を分析してＡＬＰ活性を測定した（参照：表１）。
【表１】
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前記表１に示した通り、ＭＴＴ検索法を通した細胞増殖実験においてクエルセチンは１×１０−９〜１×１０−３ｍｇ／ｍｌ濃度では薬物を処理しない対照群と細胞増殖効果にさほど違いがないと現れたが、１×１０−２ｍｇ／ｍｌの濃度では対照群の約１０９％に当る最大細胞増殖効果を示すことが分かった（ｐ＜０．０１）。一方、比較物質として使用したゲニステインをＭＴＴ検索において１×１０−９〜１×１０−２ｍｇ／ｍｌの濃度で処理した場合、１×１０−９ｍｇ／ｍｌ濃度で対照群の９１％（ｐ＜０．０５）、１×１０−６ｍｇ／ｍｌ濃度で９０．５％（ｐ＜０．０１）、１×１０−３ｍｇ／ｍｌ濃度で８６％（ｐ＜０．０１）、それから１×１０−２ｍｇ／ｍｌ濃度で６６％（ｐ＜０．０１）に現れたところ、ゲニステインは骨芽細胞の細胞増殖を促進する効果を示すことよりもかえって骨芽細胞の細胞増殖を抑える効果を示すことが確認できた。
かつ、ＡＬＰ活性においてクエルセチンは１×１０−６ｍｇ／ｍｌ濃度で対照群の１２７％で最大ＡＬＰ活性を示した（ｐ＜０．０１）一方、ゲニステインは１×１０−４ｍｇ／ｍｌ濃度で対照群の１２１％でＡＬＰ活性効果を示したため、ＡＬＰ活性面において本発明のクエルセチンはゲニステインより約１００倍以上の活性を示したことが分かるところ、現在骨粗鬆症治療剤として研究されているゲニステインより本発明のクエルセチンが骨芽細胞の細胞増殖促進効果及びＡＬＰ活性増加効果に優れることを確認することができた。
【実施例２】：破骨細胞の細胞増殖効果
クエルセチンが破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）の増殖を抑えられるかを調べるため、下記のような実験を施した。
【実施例２−１】：破骨細胞の選別及び細胞培養
ＩＣＲマウス（韓国化学研究所、大田、韓国）に４週間カルシウム−欠乏食餌（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｏｈｉｏ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を提供しつつ破骨細胞の活性を増加させた。このようなマウスの左右脛骨と大腿骨を周りの筋肉組織なしで奇麗に切り取った後、クリーンベンチで大腿骨と左右脛骨を細分して予め氷に入れておいたペニシリン１００ｕｎｉｔ／ｍｌとストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌを含有するα−ＭＥＭに入れて１分間強く振盪して破骨細胞を培地で抽出した。これを氷に５分間放置した後、細胞浮遊液を８００ｘｇで３分間遠心分離し、沈澱された細胞をペニシリン１００ｕｎｉｔ／ｍｌとストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ及び０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するα−ＭＥＭの培養培地に浮遊させた。培養培地に浮遊させた細胞を２４−ウェルプレートにウェル当り３．５×１０６細胞数を分配した。
【実施例２−２】：薬物の濃度による細胞増殖実験
前記実施例２−１の破骨細胞にクエルセチンを１×１０−８ないし１×１０−２ｍｇ／ｍｌ濃度で添加し、二日目に市販されるキット（ｋｉｔ）（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を使用してＴＲＡＰ染色（Ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ａｃｉｄ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）を施した。次いで、ＴＲＡＰ染色により赤色を帯びる三つ以上の核を有するＴＲＡＰ−陽性細胞（ＴＲＡＰ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ＭＮＣ）を破骨細胞と判定して、その数を算定することにより破骨細胞の数を測定した（参照：表２）。
【表２】
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前記表２に示した通り、クエルセチンの濃度が１×１０−８ないし１×１０−４ｍｇ／ｍｌの場合、破骨細胞の細胞増殖抑制効果がさほど高くなかったが、１×１０−３ｍｇ／ｍｌ濃度では対照群の６１％（ｐ＜０．０５）、１×１０−２ｍｇ／ｍｌ濃度では対照群の２５％（ｐ＜０．０１）に細胞増殖が抑えられるところ、クエルセチンが破骨細胞の細胞増殖を著しく抑えることを確認することができた。
前記実施例１及び２の結果から、本発明のクエルセチンは１×１０−２ｍｇ／ｍｌ濃度で骨芽細胞の細胞増殖促進効果及び破骨細胞の細胞増殖抑制効果を全て示す骨粗鬆症治療剤の理想的な薬物であることを確認することができた。
【実施例３】：卵巣摘出白鼠に対するクエルセチンの効果
閉経期以後第Ｉ型（ｔｙｐｅ　Ｉ）骨粗鬆症が発病するＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）系の雌白鼠を対象にしてクエルセチンの効果を実験した。実験材料としては韓国化学研究所で分譲された生後１０週になった体重２００〜３００ｇほどの雌白鼠を使用し、実験過程は白鼠の卵巣摘出術の施行、各群による薬物投与、摘出術後一定期間毎にネズミを犠牲して体重変化、体内臓器組織観察、海綿骨面積の変化、全血球数及び血漿の生化学的検査に分けて次のように実験を行った。
【実施例３−１】：卵巣摘出術及び薬物投与
卵巣摘出術はＳｈａｍ群（正常群）を除き対照群と試験群の全ての雌白鼠で両側卵巣摘出術を次のように試行した：ケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎｅ、柳韓洋行、韓国）５ｍｇ／１００ｇとキシラジン（Ｘｙｌａｚｉｎｅ、韓国ヴァイエル、韓国）１ｍｇ／１００ｇを白鼠の左側及び右側後肢大腿根に筋肉注射して雌白鼠を全身痲酔させた後、下腹部の毛を除去し動物の体位を横にならせた状態でポタジン液（ヨード、三一製薬、韓国）で手術部位を消毒した後、無菌操作下で正中線を中心に下腹部で２ｃｍほどに皮膚・腹筋及び腹膜を切開し、消毒されたピンセットで卵巣を露出させ卵管を絹糸で結紮した後左右卵巣を摘出した。次いで、抗生剤（スルファポルテ−４、ユニ化学株式会社、韓国）０．３ｍｌを腹腔内に注入して感染を防止したし、絹糸及びナイロン糸で腹膜、腹筋及び皮膚を縫合した。
また、Ｓｈａｍ群は卵巣摘出を除いた全ての手術を行った動物で卵巣を摘出し薬物投与を行わない対照群の卵巣摘出による変化を比較するために使用されたし、対照群は卵巣摘出術を行い薬物投与を施した投与群の動物と比較して薬物投与による変化を比較するために使用された。
薬物投与時、薬物投与前後一定期間中（卵巣摘出前、摘出後、投与１〜９週）血液を尾静脈内でカテタ（Ｂ．Ｄ社：２４Ｇ）を用いて１．５ｍｌ採取（ｈｅｐａｒｉｎ：７５ＩＵ）し全血球数測定（Ｃｏｕｌｔｅｒ社：ＪＴ）及び血漿の生化学的検査（Ｃｒｏｎｙ社：エアロン２００）を施し、剖検時後大静脈で採血して前述したような分析を施した後、大腿骨内の海綿骨面積の変化及び体内臓器組織の観察のために各試料を冷凍保管した。
卵巣摘出後、１週後からＳｈａｍ群と対照群は１０％Ｔｗｅｅｎ８０溶液を、Ｅ２群は１７β−エストラジオールを１μｇ／ｋｇ／ｄａｙに、試験薬物投与群は試験薬物でクエルセチンまたはゲニステインをそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ濃度で９週間腹腔注射して、毎週各群の体重変化を測定した。投与後、１週間に１回ずつ採血し、９週間投与した後はできるだけ血液全量をヘパリンで処理して取った後、ＣＢＣ（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｃｏｕｎｔ）検査を行い３、０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して血漿を取った後次の実験まで−７０℃で冷凍保管した。かつ骨密度検査のため、５、６番腰椎骨（ｌｕｍｂａｒ）、右側の脛骨（ｔｉｂｉａ）を分離し、４％（ｖ／ｖ）フォルマリン（ｆｏｒｍａｌｉｎ）溶液に保管した。
【実施例３−２】：クエルセチンの投与による体重変化
前記実施例３−１のＳｈａｍ群、１７β−エストラジオールが処理されたＥ２群、クエルセチンまたはゲニステインがそれぞれ処理された試験薬物群の体重を手術後１０週間毎週測定した（参照：表３）。
【表３】
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前記表３に示した通り、Ｓｈａｍ群は手術後３週（ｐ＜０．０５）から手術前と比較して体重が増加し、対照群は手術後２週（ｐ＜０．０１）から体重が増加された。すなわち、対照群はＳｈａｍ群に比べて急激な体重の増加を示したが、このような体重の増加はエストラジオールの投与により鈍化され、Ｅ２群の手術後２０週では対照群と比較して低い体重増加を示した（ｐ＜０．０５）。一方、植物エストロゼンの一種であるクエルセチンとゲニステインが１０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ濃度で投与された試験薬物群では卵巣摘出後も対照群と類似に急激な体重増加を示すことを確認することができた。従って、クエルセチンの投与が体内ホルモンの変化を大幅に誘発させないことを確認できた。
【実施例３−３】：クエルセチンによる体内臓器組織の重さ変化
実験動物に投与されたクエルセチンが体内臓器組織に与える影響を調べるため、手術後９週間薬物を投与した実験動物から肝（ｌｉｖｅｒ）、腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）、脳（ｂｒａｉｎ）、子宮（ｕｔｅｒｕｓ）、皮膚（ｓｋｉｎ）、脛骨（ｔｉｂｉａ）を摘出してそれぞれの重さ（ｗｅｔ　ｗｅｉｇｈｔ）を測定した（参照：表４）
【表４】
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前記表４に示した通り、肝、腎臓、脳、脛骨及び皮膚の重さは正常対照群であるＳｈａｍ群と卵巣摘出対照群及び薬物投与群の全てで差を示さなかったが、卵巣から分泌されるエストロゼンにより影響される子宮の重さはＳｈａｍ群に比べて卵巣摘出対照群で大幅に減少され（ｐ＜０．０１）、卵巣摘出後Ｅ２の投与はこのような子宮の退化を抑えた（対照群と比較してｐ＜０．０１）。一方、植物エストロゼンであるクエルセチンとゲニステインの投与は子宮の重さを変らせないところ、現在骨粗鬆症の治療剤として使用されているＥ２は子宮肥厚などの副作用がある一方、クエルセチンはＥ２のような副作用が現れなくてクエルセチンを安全に薬物として使用可能なことを確認することができた。
【実施例３−４】：クエルセチンの投与による海綿骨面積の変化
９週間薬物を投与した各群から摘出された腰椎骨（ｌｕｍｂａｒ）及び脛骨（ｔｉｂｉａ）における海綿骨の面積（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ　ｂｏｎｅ　ａｒｅａ，ＴＢＡ）は次のような方法により測定した：すなわち、定量的映像分析器（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｉｍａｇｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｙｓｔｅｍ、Ｗｉｌｄ　Ｌｅｉｔｚ　Ｃｏ．）のデジタル化装置（ｄｉｇｉｔｉｚｅｒ）で各海綿の輪郭線に沿って描いてコンピュータ画面に映像を得、各脛骨の近位部で成長板の直下部のうち横辺の長さが成長板の長さの約２／３ほどになる長さに基準面積２×１０６μｍ２である長方形の内部に存する海綿骨の平均面積をコンピュータを用いて求めた。かつ、その長方形の内部の海綿骨の個数を求めた後、平均面積に個数をかけてそれぞれの骨標本の海綿骨の面積を求めた後統計処理した（参照：表５）。
【表５】
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前記表５に示した通り、脛骨の場合対照群は３４．６２×１０４μｍ２で正常群であるＳｈａｍ群の８５．５５×１０４μｍ２に比べて大幅に減少され（ｐ＜０．０１）骨粗鬆症が誘発されていることが分かり、このような海綿骨の減少はＥ２、クエルセチン及びゲニステインの処理によりそれぞれ対照群の１４８％、１６０％及び１３８％に海綿骨の面積が増加する傾向があり、特にクエルセチンを処理する場合、海綿骨面積の増加が著しい（ｐ＜０．０５）ことが分かった。
前記と同様な測定方法を用いて実験動物に９週間の薬物投与後摘出した腰椎骨（ｌｕｍｂａｒ）における海綿骨の面積を測定した（参照：表６）。
【表６】
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前記表６に示した通り、腰椎骨の場合対照群は６７．５３×１０４μｍ２であってＳｈａｍ群の９３．７０×１０４μｍ２に比べて減少されるが（ｐ＜０．０１）Ｅ２、クエルセチン及びゲニステインの投与でそれぞれ対照群の１３２％（ｐ＜０．０１）、１２９％（ｐ＜０．０５）及び１２８％（ｐ＜０．０５）に増加され卵巣摘出により誘発された海綿骨面積の減少を抑える効果があることと現れた。特に、クエルセチンは海綿骨の面積変化が多い脛骨で現在治療剤として使用されるＥ２より海綿骨の面積増加效果が高く現れたし、Ｅ２の副作用である子宮の肥厚現象も現れなかったため、骨粗鬆症治療剤としてクエルセチンがＥ２よりさらに効果的であることが分かった。
【実施例３−５】：全血球数の測定
体内の状態及び異常現象をそのまま反映する血液の全血球数（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌ、ＣＢＣ）を測定して薬物投与による実験動物の異常有無を判明した。すなわち、手術前のネズミから得られた血液と手術後薬物を投与し、１０週が経過されたネズミから得られた血液の赤血球（ｒｅｄ　ｂｌｏｏｄ　ｃｅｌｌ、ＲＢＣ）の数、血色素（ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ、Ｈｂ）の濃度及び赤血球容積比（ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ、Ｈｔ）を測定して造血機能の異常有無を調べ、白血球の数、リンパ球の数、単核球の数及び顆粒球の数を測定して比較することにより、炎症反応や組織の壊死など免疫系の異常有無を判断した（参照：表７）。
【表７】
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前記表７に示した通り、赤血球の数は全ての群で手術前と手術後に全く変化がなく、血色素の濃度及び赤血球容積比は全ての群で手術後に減少された。一方、白血球の数は対照群とクエルセチン及びゲニステインの投与群で手術前と手術後に変化がなかったが、Ｓｈａｍ群及びＥ２群では手術後に減少することが分かった。かつ、リンパ球と顆粒球はＥ２群でのみ急激に減り、単核球は全ての群で変化がなかった。従って、クエルセチンの投与は造血機能や免疫系に影響を与えない安全な薬物であることが確認できた。
【実施例３−６】：クエルセチンによる血漿の生化学的変化
血液は身体の状態をそのまま反映するので、血漿内の色々の生化学的指標を検査してクエルセチンの体内安定性を確認した：すなわち、手術前ネズミの血液、手術後１週が経過されたネズミの血液及び手術後１０週経過したネズミの血液を修得し、アルカリホスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＡＬＰ）、カルシウム、無機燐酸（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、血中尿素窒素（ｂｌｏｏｄ　ｕｒｅａ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ、ＢＵＮ）、クレアチニン、総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール及びＬＤＬ−コレステロールの血中数値を測定した（参照：表８）。
【表８】
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前記表８に示した通り、骨代謝に直接に関わりのあるＡＬＰは全ての群で週令の増加により活性度が減少する傾向を示したが、特にＳｈａｍ群とゲニステイン投与群では手術前及び手術後１週経過したネズミに比べ、手術後１０週経過したネズミにおいて大幅に減り、カルシウムの濃度はさほど変らなく、無機燐酸は対照群及びゲニステイン投与群で手術前に比べて手術後１０週経過されたネズミで大きく減少された。
一方、タンパク質代謝及び筋肉量と関わりある血中尿素窒素は全ての群において適正レベルを維持したが、クレアチニンは全ての群で増加された。
かつ、閉経期以降の女性にとって増加すると報告された総コレステロールの量も全ての群で増加する様相を示したが、Ｓｈａｍ群は比較的低い増加率を示した。また、ＨＤＬ−コレステロールは全ての群において経時的に減少することに比べ、ＬＤＬ−コレステロールは経時的に増加する傾向を示した。このような現象は正常群であるＳｈａｍ群や卵巣摘出実験群において全て同じく現れた。
従って、本発明に係るクエルセチンは骨粗鬆症の予防及び治療に効果的に使用されうることが分かった。
【実施例４】：クエルセチンの製剤化
【実施例４−１】：シロップ剤の製造
本発明のクエルセチン、その誘導体及び薬学的に許容されるその塩を有効成分２％（ｗ／ｖ）で含有するシロップを次のような方法で製造した：クエルセチンの塩酸塩、サッカリン、糖を温水８０ｇに溶解させ冷却させた後、グリセリン、サッカリン、香味料、エタノール、ソルビン酸及び蒸溜水を含有する溶液を製造して混合した後、この混合物に水を添加して１００ｍｌのクエルセチンシロップ剤を製造した。前記シロップ剤の成分は次の通りである：
クエルセチンの塩酸塩・・・・・・・・・・・・・２ｇ
サッカリン・　・・・・・・・・・・・・・・・・０．８ｇ
糖　　　　　・・・・・・・・・・・・・・・・・２５．４ｇ
グリセリン　　・・・・・・・・・・・・・・・・８．０ｇ
香味料　　　・・・・・・・・・・・・・・・・・０．０４ｇ
エタノール　　　・・・・・・・・・・・・・・・４．０ｇ
ソルビン酸　　・・・・・・・・・・・・・・・・０．４ｇ
蒸溜水　　　・・・・・・・・・・・・・・・・・適量
【実施例４−２】：錠剤の製造
本発明のクエルセチン、その誘導体及び薬学的に許容されるその塩を有効成分として含有する錠剤を次のような方法で製造した：　クエルセチンのフラボノイド誘導体・塩酸塩２５０ｇをラクトース１７５．９ｇ、芋澱粉１８０ｇ及びコロイド性硅酸３２ｇと混合し、１０％（ｗ／ｖ）ゼラチン溶液を添加させた後、粉砕して１４メッシュ体を通過させた後乾燥させ、芋澱粉１６０ｇ、滑石５０ｇ及びステアリン酸マグネシウム５ｇを添加して得た混合物を錠剤に製造した。前記錠剤の成分は次の通りである：
クエルセチンのフラボノイド誘導体・塩酸塩・・・２５０ｇ
ラクトース　　　　　　・・・・・・・・・・・・１７５．９ｇ
芋澱粉　　　　　　・・・・・・・・・・・・・　１８０ｇ
コロイド性硅酸　　・・・・・・・・・・・・・・３２ｇ
１０％ゼラチン溶液　・・・・・・・・・・・・・適量
芋澱粉　　　　　・・・・・・・・・・・・・・　１６０ｇ
滑石　　　　　　　　・・・・・・・・・・・・・５０ｇ
ステアル酸マグネシウム・・・・・・・・・・・・５ｇ
【実施例４−３】：注射剤の製造
クエルセチンのフラボノイド誘導体・塩酸塩１ｇ、塩化ナトリウム０．６ｇ及びアスコルビン酸０．１ｇを蒸溜水に溶解させ１００ｍｌの溶液を製造し、これをビンにいれた後、１００℃で３０分間加熱して滅菌させ、注射剤を製造した。前記注射剤の成分は次の通りである：
クエルセチンのフラボノイド誘導体・塩酸塩・・・・・　１ｇ
塩化ナトリウム　　・・・・・・・・・・・・・・・・・０．６ｇ
アスコルビン酸　・・・・・・・・・・・・・・・・・・０．１ｇ
蒸溜水　　　　・・・・・・・・・・・・・・・・・・　適量
産業上の利用可能性
以上述べた通り、本発明は骨芽細胞（ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）の細胞増殖促進効果及び破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）の細胞増殖抑制効果に優れたクエルセチン誘導体を有効成分として含有する骨粗鬆症治療剤を提供する。本発明のクエルセチン誘導体は従来の骨粗鬆症治療剤に比べて骨芽細胞の細胞増殖促進効果及び破骨細胞の細胞増殖抑制効果に優れ、体内ホルモンの変化を誘発せず海綿骨の面積増加効果がさらに高く現れるのみならず、副作用がなく造血機能や免疫系に影響を与えない安全な薬物として確認され、骨粗鬆症治療剤に幅広く活用されうるぬる。
以上本発明の特定部分を詳述したところ、当業界の通常の知識を持つ者にとって、このような具体的な記述はただ望ましい実施態様に過ぎず、これにより本発明の範囲が制限されることではない点は明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とそれらの等価物により定義される。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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