(57)【要約】本発明は、哺乳動物における炎症性応答の好結果な消散の増強を目的としたグルココルチコイド代謝のモジュレータの使用、または不活性グルココルチコイドの投与に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における炎症性応答の好結果な消散を増強するための組成物の製造におけるグルココルチコイド代謝のモジュレータの使用。
【請求項２】
前記モジュレータが、マクロファージにおけるグルココルチコイドの細胞内濃度を上昇させる請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記モジュレータが、１１β−ＨＳＤ１レダクターゼ酵素活性のモジュレータである請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
活性グルココルチコイドの内因性生合成が増加されている設計されたマクロファージ。
【請求項５】
遺伝子工学的に設計された請求項４に記載のマクロファージ。
【請求項６】
内因性の１１β−ＨＳＤ１活性がアップレギュレーションされた請求項５に記載の遺伝子工学的に設計されたマクロファージ。
【請求項７】
哺乳動物における炎症性応答の好結果な消散を増強するために使用する請求項４〜６のいずれか１項に記載のマクロファージ。
【請求項８】
哺乳動物における炎症性応答の好結果な消散を増強するための組成物の製造におけるグルココルチコイドまたは１１−デヒドロコルチコステロイドの使用。
【請求項９】
前記１１−デヒドロコルチコステロイドが１１β−ＨＳＤ１により活性化される請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記グルココルチコイドが不活性型で投与される請求項８または９に記載の使用。
【請求項１１】
前記グルココルチコイドの不活性な前駆体が１１−デヒドロキシコルチコステロイドである請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記組成物が請求項１〜３のいずれか１項に記載のグルココルチコイド代謝のモジュレータを含む請求項８〜１１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記グルココルチコイドまたは１１−デヒドロコルチコステロイドを含む組成物を、それを必要とする哺乳動物へ投与するステップを含む、哺乳動物における炎症性応答の好結果な消散の増強方法。
【請求項１４】
前記１１−デヒドロコルチコステロイドが１１β−ＨＳＤ１により活性化される請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記グルココルチコイドが不活性型で投与される請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記グルココルチコイドの不活性前駆体が１１−デヒドロキシコルチコステロイドである請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が請求項１〜３のいずれか１項に記載のグルココルチコイド代謝のモジュレータをさらに含む請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
不活性型のグルココルチコイドを含む医薬組成物。
【請求項１９】
前記グルココルチコイドの不活性前駆体が１１−デヒドロキシコルチコステロイドである請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記１１−デヒドロコルチコステロイドが１１β−ＨＳＤ１により活性化される請求項１８または１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記組成物が求項１〜３のいずれか１項のグルココルチコイド代謝のモジュレータをさらに含む請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルココルチコイド濃度の調節に関する。特に、本発明は、マクロファージを介する炎症性応答の消散を増強するための、マクロファージにおける細胞内グルココルチコイド濃度の調節に関する。
【背景技術】
【０００２】
コルチゾールといったグルココルチコイドは、種々の体組織に対して多種多様の効果を発揮する。我々の国際特許出願ＷＯ９０／０４３９９は、治療的に投与されたコルチゾールが、体内で１１β−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ酵素（１１β−ＨＳＤ）により不活性なコルチゾンに変換される傾向があるという問題に関するものであった。我々の初期の発明により、これらの酵素の１１β−デヒドロゲナーゼ活性の、阻害剤の投与によるコルチゾール作用が増強された。ＷＯ９０／０４３９９で扱われた１１β−ＨＳＤ酵素は、１１β−ＨＳＤ２酵素であり、これは専ら内因性グルココルチコイドのデヒドロゲナーゼで、コルチゾールをコルチゾンに変換する。
【０００３】
不活性なコルチゾンを活性なコルチゾールに変換する逆反応が、１１β−ＨＳＤ１酵素の１１β−レダクターゼ活性により、所定の器官において達成されることも既知である。この活性は、コルチコステロイド１１β−レダクターゼ、コルチゾン１１β−レダクターゼ、またはコルチコステロイド１１β−オキシドレダクターゼとしても既知である。
【０００４】
双方向性酵素（Ａｇａｒｗａｌ  ＡＫ．Ｍｏｎｄｅｒ  Ｃ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  Ｂ  ＆  Ｗｈｉｔｅ  ＰＣ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４，１８９３９−１８９４３（１９８９）；Ａｇａｒｗｌ  ＡＫ，Ｔｕｓｉｅ−Ｌｕｎａ  Ｍ−Ｔ，Ｍｏｎｄｅｒ  Ｃ  ＆  Ｗｈｉｔｅ  ＰＣ  Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ４，１８２７−１８３２（１９９０）］または優勢１１β−レダクターゼ［Ｄｕｐｅｒｒｅｘ  Ｈ，ｋｅｎｏｕｃｈ  Ｓ，Ｇａｅｇｇｌｅｌｅｒ  ＨＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２，６１２−６１９（１９９３）；Ｊａｍｉｅｓｏｎ  ＰＭ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＫＥ，Ｅｄｗａｑｒｄｓ  ＣＲＷ  ＆  Ｓｅｃｋｌ  ＪＲ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６，４７５４−４７６１（１９９５））をコードする一連の細胞系における１１β−ＨＳＤ１の発現は、グルココルチコイドを不活化するどころか、不活性な１１−ケトステロイドから活性な１１β−ヒドロキシステロイドを再生する。無傷細胞において最もよく観察される１１β−レダクターゼ活性は、１１−ケトステロイドを活性化し、標的遺伝子の転写と分化細胞の機能を変える［Ｄｕｐｅｒｒｅｘ  Ｈ，Ｋｅｎｎｏｕｃｈ  Ｓ，Ｇａｅｇｇｌｅｌｅｒ  ＨＰ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３２，６１２−６１９（１９９３）；Ｌｏｗ  ＳＣ，Ｃｈａｐｍａｎ  ＫＥ，Ｅｄｗａｒｄｓ  ＣＲＷ  ＆  Ｓｅｃｋｌ  ＪＲ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３，１６７−１７４（１９９４）］。１１β−ＨＳＤ１および１１β−ＨＳＤ２は、別の遺伝子産物で、これらのアミノ酸相同性は２０％に過ぎない［Ａｇａｗａｌ  ＡＫ，Ｍｕｎｅ  Ｔ，Ｍｏｎｄｅｒ  Ｃ  ＆  Ｗｈｉｔｅ  ＰＣ（１９９４）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９，２５９５９−２５９６２（１９９４）；Ａｌｂｉｓｔｏｎ  ＡＬ，Ｏｂｅｙｅｓｅｋｅｒｅ  ＶＲ，Ｓｍｉｔｈ  ＲＥ  ＆  Ｋｒｏｚｏｗｓｋｉ  ＺＳ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １０５，Ｒ１１−Ｒ１７（１９９４）］。引用することにより本明細書の一部をなすものとする我々の国際特許出願ＷＯ９７／０７７８９において、我々は、生体内における１１β−レダクターゼ活性の阻害と、グルココルチコイド過剰による多くの有害作用の治療について論じている。
【０００５】
コルチゾールは、グルコース輸送に及ぼすインスリン作用に対する拮抗作用、および解糖と糖新生をコントロールする幾つかの酵素の調節におけるインスリンおよびグルコースとの相互作用等の幾つかの機序により、肝臓の糖新生を促進する。これらの酵素には、グルコキナーゼ、６−ホスホフルクトキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ホスホエノールピルビン酸キナーゼ（ＰＥＰＣＫ）、グルコース−６−ホスファターゼが含まれる。従って、肝臓におけるコルチゾンからのコルチゾール産生を阻害することにより、幾つかの機序により、肝臓のグルコース取り込みは増強され、肝臓のグルコース産生は阻害される。さらに、インスリン耐性患者またはグルコース不耐性患者の肝臓における１１β−レダクターゼ活性阻害による影響は、健常人よりも大きい可能性がある。その理由は、インスリン耐性またはインスリン欠乏においては、ＰＥＰＣＫに及ぼすコルチゾールの影響がより大きいことが明らかにされている、肥満患者はコルチゾールをより多く分泌する、インスリン耐性患者はグルココルチコイドに対し感受性が高い、インスリンは１１β−ＨＳＤ１発現をダウンレギュレーションするため１１β−レダクターゼ活性はインスリン耐性または欠乏条件において増強され得る、等である。
【０００６】
我々の国際特許出願ＷＯ９７／０７７８９は、１１β−ＨＳＤ１がラット脂肪組織および培養中の脂肪細胞系において発現されることも明らかにしており、この場合１１β−ＨＳＤは、１１−デヒドロコルチコステロンをコルチコステロン（それぞれ、ラットにおいて、ヒトコルチゾンおよびコルチゾールと同等の物）に変換する。これは、同様の１１β−レダクターゼ活性がヒト脂肪組織においても観察され、その結果、この酵素の阻害がヒトの脂肪組織におけるインスリン耐性の影響を軽減することを示唆している。このことは、グルコースと脂肪酸の組織利用能を増大させ、その結果、循環血液濃度を低下させる。従って、本発明は、更なる点において、脂肪組織におけるインスリン感受性を増大させるための薬物製造における１１β−レダクターゼ阻害剤の使用も提供する。
【０００７】
グルココルチコイド過剰が特定の神経毒素の作用を増強し、それにより神経細胞機能不全および喪失を引き起こすことも既知である。我々は、ラット海馬培養において１１β−デヒドロコルチコステロンとコルコステロンの相互変換を研究し、（驚く事に、グルココルチコイドの損傷作用の観点から）無傷海馬細胞において、１１β−レダクターゼ活性が、１１β−デヒドロゲナーゼ活性を上回ることを見いだした。この活性の理由は不明であるが、この結果は、グルココルチコイドが海馬細胞において（また一般に神経系に拡大することにより）、１１β−レダクターゼ阻害剤を使用することにより調節可能であることを示しており、従って、本発明は、別の側面において、グルココルチコイドにより増強された神経毒性による神経細胞機能不全および喪失の予防または減少のための薬物製造における１１β−レダクターゼ阻害剤の使用を提供する。グルココルチコイドが、神経細胞喪失がある、または神経細胞喪失がない加齢の認知障害に、また樹状突起の減弱にも関与する可能性もある。さらに、グルココルチコイドは、重症の鬱病の神経細胞機能不全に関与していた。従って、１１β−レダクターゼの阻害剤は、これらの状態にも有用である可能性がある。
【０００８】
従って、我々の初期の国際特許出願は、１１β−レダクターゼの阻害剤の薬効が多種多様であり、多くの症例において、複合作用が証明され、結果的に糖尿病、肥満（求心性肥満を含む）、神経細胞喪失、老年期の認知障害における内因性グルココルチコイドの影響を軽減するものと予想される。しかし、マクロファージに対するグルココルチコイドの影響は記述されていない。
【０００９】
肺、関節、腎臓、腸管の器官炎症性疾患は、社会に多大な損害を与えている。炎症性疾患の現行の治療法は、炎症機序の開始と増幅を遮断すること、換言すると抗炎症治療を用いて炎症プロセスを防止または阻止することに集中している。残念ながら、これらは、持続的な炎症から瘢痕化および臓器機能の喪失への進行を防止するものではない。
【００１０】
増加する多数のデータから、現在、アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は、炎症性部位から白血球を安全に除去する重要な機序であることが示される。従って、白血球におけるアポトーシスは、食細胞による安全な取り込みと分解とのために、白血球とその有害内容物をパッケージする。さらに、アポトーシス細胞全身性エリテマトーデスのような持続性炎症と自己免疫とを特徴とする疾患において、重要な病原性因子としてのアポトーシス細胞の有効なマクロファージ浄化値を確立するデータがある（例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０００  Ａｕｇ  ７；１９２（３）：３５９−６６）。
【００１１】
従って、炎症性部位からアポトーシス白血球のクリアランスを高める手段が必要とされている。さらに、これは、クリアランスに内因性欠陥が存在しないとしても、一般的に、炎症の消散を促進するための重要な研究方法と思われる。
【発明の開示】
【００１２】
本発明は、炎症状態の治療に対する新たなアプローチを提供する。このアプローチにおいて、炎症は防止されるよりむしろ促進される。本発明によれば、炎症は、その消散へと進められ、炎症過程における自然の生物学的利益を利用できる。我々は現在、マクロファージにおけるグルココルチコイド活性が、炎症性応答の終結を促進し、好結果に到達させると決定した。我々の研究は、グルココルチコイド（ＧＣ）の投与により、マクロファージによるアポトーシス好中球（多核白血球、ＰＭＮ）の非炎症性の食作用が促進されることを示している。さらに、マクロファージにおける１１β−ＨＳＤ１活性の増強により、細胞内グルココルチコイド濃度が上昇し、同じ有利な効果が達成される。
【００１３】
従って、本発明の第一の点に従って、我々は、哺乳動物における炎症性応答の好結果な消散を増強する組成物の製造におけるグルココルチコイド代謝のモジュレータの使用を提供する。
【００１４】
本発明のモジュレータは、好ましくはアポトーシス白血球の食作用において活性な食細胞における活性グルココルチコイドの細胞内濃度を上昇させる。有利には、食細胞はマクロファージである。従って、好ましくは、グルココルチコイド代謝のモジュレータは、食細胞に送達され、理想的には炎症部位に選択的に送達される。例えば、マクロファージに選択的に送達される。
【００１５】
有利な実施例において、これは、１１β−ＨＳＤ酵素を投与することにより、あるいは１１β−ＨＳＤレダクターゼ活性のモジュレータを投与することにより、１１β−ＨＳＤレダクターゼの細胞内活性を上昇させることにより達成できる。
【００１６】
第二の実施例において、本発明は、内因性の活性グルココルチコイド濃度が上昇されている設計されたマクロファージを提供する。これは、例えば、その中の１１β−ＨＳＤ活性を増大させた遺伝子工学的に設計されたマクロファージである。本発明のマクロファージは、炎症性応答が好結果な消散に向かって有利に管理されている状態の治療に有用である。
【００１７】
設計されたマクロファージは、患者の炎症部位に送達することが可能である。マクロファージは患者に導入されると、自然に炎症組織へと向かう。
【００１８】
好ましくは、１１β−ＨＳＤ酵素は１１β−ＨＳＤ１である。
【００１９】
活性グルココルチコイドと不活性１１−ケトステロイド（例えば、１１−デヒドロコルチコステロイド）との両者も、本発明に従って使用できる。特に、グルココルチコイドの不活性前駆体、例えば、１１β−ＨＳＤ１またはこれと均等な酵素により活性型に変換される１１−デヒドロキシコルチコステロンが炎症部位に投与され、マクロファージによりｉｎ  ｓｉｔｕで活性グルココルチコイドに変換され得る基質として有用である。グルココルチコイドおよび／または不活性前駆体は、グルココルチコイド代謝のモジュレータと組み合わせて、あるいは本発明の上記の形態の設計されたマクロファージと共に投与できる。
【００２０】
１１β−ＨＳＤ２型による再活性化をさらに選択することができる。なぜならば、この酵素の分布はかなり限定されており、ミネラルコルチコイド感受性器官に主に存在するからである。９α−フッ素化ステロイドはこの酵素により再活性化される。１１−デヒドロデキサメタゾンの場合、この酵素により活性グルココルチコイドを生じる。従って、本発明は、活性１１β−ＨＳＤ２のマクロファージへの送達と、それに続く１種類以上の９α−フッ素化ステロイドの投与を提供する。有利には、マクロファージは１１β−ＨＳＤ２を発現する設計されたマクロファージである。
【００２１】
従って、本発明は、哺乳動物における炎症性応答の好結果な消散の増強において、別個に使用し、同時に使用し、および逐次的に使用するために、上記に説明されているグルココルチコイドおよび／または不活性前駆体ステロイドおよび／または設計されたマクロファージおよび／またはグルココルチコイド代謝のモジュレータのうち、少なくとも２つを提供する。
【００２２】
好ましくは、本発明の物質は、マクロファージのような食細胞を標的とする。
【００２３】
さらに、本発明は、１種類以上の上記に説明されているグルココルチコイドおよび／または不活性前駆体ステロイドおよび／または設計されたマクロファージおよび／またはグルココルチコイド代謝のモジュレータを含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
更なる形態において、哺乳動物における好結果な炎症性応答の増強方法が提供されており、これはそれを必要とする哺乳動物への、上記に説明されているグルココルチコイドおよび／または不活性前駆体ステロイドおよび／または設計されたマクロファージおよび／またはグルココルチコイド代謝のモジュレータを含む組成物の投与を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
［定義］
定義がされていない場合には、本明細書に使用されている全ての技術的用語と科学的用語は、本技術（例えば、細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術、生化学）において通常の技術を有するものによって一般に理解される意味と同じ意味を有する。標準的な技術が、分子学的方法、遺伝学的方法および生化学的方法（一般的には、引用することにより本明細書の一部をなすものとするＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，第二版（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）第四版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照）および化学的方法に使用されている。
【００２６】
「モジュレータ」とは、調節される物質のレベルを増減する物質である。例えば、調節される物質は、グルココルチコイドの様な遺伝子産物でも化合物でもよいが、調節される物質の存在度、効果、活性、濃度またはバイオアベイラビリティを増減する物質である。
【００２７】
「グルココルチコイド」とは、グルココルチコイドレセプターに結合し、それによって遺伝子転写に影響を及ぼすステロイドホルモン（天然および合成）の系統に属する全ての構成要素である。それらの作用には、糖新生の促進と、脂質およびタンパク質合成を代償としたグリコーゲンの形成と、重要な抗炎症活性とが含まれる。グルココルチコイドの例として、ハイドロコルチゾン（コルチゾール）、プレドニソロン、デキサメタゾン、ベタメタゾンが上げられる。グルココルチコイドは、１１β−ＨＳＤ１または１１β−ＨＳＤ２の１１β−レダクターゼ活性により不活性な前駆体コルチコステロイドから形成され、これには、コルチゾンからコルチゾールの形成、プレドニソンからプレドニソロンの形成が含まれる。
【００２８】
「グルココルチコイド代謝のモジュレータ」とは、細胞内でグルココルチコイドの活性を（例えば、存在度、効果、濃度またはバイオアベイラビリティを増加することにより）アップレギュレーションまたはダウンレギュレーションする全ての化合物、物質または処理をいう。有利には、細胞はマクロファージである。マクロファージにおいてグルココルチコイドの活性は、好ましくは、例えば、活性グルココルチコイドの生合成を増大させることにより、あるいはグルココルチコイドの不活性型の活性グルココルチコイドへの変換を増大させることにより、増強される。従って、例えば、モジュレータは、マクロファージにおいて１１β−ＨＳＤ酵素のレベルを増大することができ、これは本発明においてアポトーシス細胞の食作用に有利な効果を引き起こし、従って、炎症性応答の好結果な消散を引き起こすことが示されている。従って、モジュレータは、例えば、外的に投与される１１β−ＨＳＤ酵素それ自体、あるいは細胞に送達され、その中で発現されて１１β−ＨＳＤ１または１１β−ＨＳＤ２を高レベルに産生できる、１１β−ＨＳＤ１または１１β−ＨＳＤ２をコードする核酸であってよい。
【００２９】
「炎症性応答」とは、典型的には組織の炎症に伴う損傷または感染／疾患に対する応答である。急性炎症は、初期に血管変化と初期に好中球が著しく目立ち、後期に単核食細胞が著しく目立つ。白血球は局所的に付着し、後毛細管細静脈の内層を形成する内皮細胞の間の組織内に移動する。血管からの血漿の浸出により組織腫張を引き起こすことがあるが、初期の血管変化は、後期の細胞応答とは無関係で、後期の細胞応答にとって不可欠ではない。刺激が持続する慢性炎症において、存在する特徴的な細胞はマクロファージとリンパ球である。炎症は、一般的に有益で、損傷または疾病後のホメオスタシス回帰を助ける。
【００３０】
「炎症性応答の好結果な消散」とは、慢性の発生を防止する（アポトーシス細胞の食作用）望ましい結果が増加された、あるいは強化された炎症性応答である。抗炎症治療とは同義語ではない。本発明は、自然の炎症性応答の利益を強化する、すなわちより良好に達成するものであり、炎症性応答を回避するのではなく、その目的を助け、その迅速な消散を助けるものである。
【００３１】
「マクロファージ」とは、哺乳動物組織の血液単球由来の比較的長寿命の食細胞である。マクロファージの主な種類には、腹腔マクロファージおよび肺胞マクロファージ、組織マクロファージ（組織球）、肝臓のＫｕｐｐｆｅｒ細胞、破骨細胞が含まれる。異物または疾病に応答して、マクロファージは刺激されまたは活性化される。マクロファージは、ある種の細菌、原生動物、腫瘍細胞の死滅に重要な役割を果たし、免疫システムのその他の細胞を刺激する物質を放出し、抗原提示に関与する。マクロファージは、さらに、異物巨細胞またはランゲルハンス巨細胞を形成する類上皮細胞または融合細胞といった慢性炎症性病変内に見いだされる分化細胞もある。
【００３２】
「設計された」マクロファージとは、その中の活性グルココルチコイドレベルを上昇させるために、改変が行われたマクロファージである。これは、好ましい実施例において、高レベルの１１β−ＨＳＤ１または１１β−ＨＳＤ２を発現する様にマクロファージを作製することにより達成できる。この酵素は、マクロファージにおいてレダクターゼとして作用し、不活性なグルココルチコイドのその活性型への変換を増大させる。高レベルの１１β−ＨＳＤ１または１１β−ＨＳＤ２を産生するマクロファージの作製方法は、本技術に精通する者にとって既知であり、下記にさらに説明されている。
【００３３】
［グルココルチコイド］
グルココルチコイドは、一群の副腎皮質ホルモンであり、その代謝作用には、糖新生の促進、タンパク質異化作用の増大、および遊離脂肪酸の動員があり、また炎症性応答（アレルギー性反応）の強力な阻害剤であることも知られている。殆どの哺乳動物におけるグルココルチコイド活性の大部分はハイドロコルチゾンとしても知られるコルチゾールによるものである。コルチコステロンは、齧歯類における主要なグルココルチコイドである。デキサメタゾンのような合成グルココルチコイドも知られている。コルチゾールは、細胞質においてグルココルチコイドレセプターに結合し、次にホルモン−レセプターは核内に移動され、そこでそのＤＮＡ応答成分に結合し、関連遺伝子の転写を調節する。
【００３４】
グルココルチコイドレセプターは、遍在しており、その結果これらのステロイドホルモンは、生理学系に多数の効果を有する。グルココルチコイドの最もよく知られ、研究されている効果は、炭水化物代謝と免疫機能に対する効果である。事実、グルココルチコイドの名称は、これらのホルモンがグルコース代謝に関与していたという初期の観察結果に由来する。絶食状態において、コルチゾールは、正常な血中グルコース濃度に集合的に上昇させ、維持する役割を果たす幾つかのプロセスを刺激する。
【００３５】
グルココルチコイドは、強力な抗炎症特性と免疫抑制特性を有することが知られている。これは薬理学的な投与量で投与された場合に特に明らかであるが、正常な免疫応答においても重要である。その結果、グルココルチコイドは、関節炎、腎炎、喘息または皮膚炎といった慢性（不必要に持続性の）炎症性状態に薬物として、また自己免疫疾患といった状態のための付加療法として広く使用される。
【００３６】
抗炎症目的の局所投与用のステロイド剤としては、ベタメタゾン（ディプロレン（登録商標）クリーム）、クロベタゾール（テモベート（登録商標））、デソニド（デソウェン（登録商標））、フルオシノロン（ダーマスムース／ＦＳ  （登録商標））、フルオシノニド（リデックス（登録商標））、ハイドロコルチゾン（アヌゾル（登録商標）、コルタイド（登録商標）、ハイドロコルトン（登録商標））、モメタゾン（エロコン（登録商標））、トリアムシノロン（アリストコート（登録商標）、ケナログ（登録商標））が挙げられる。現在、グルココルチコイドの抗炎症特性は、炎症誘発性遺伝子を調節する能力に依存していると考えられている。
【００３７】
グルココルチコイドは、不活性型で循環し、作用部位で活性化合物に還元される。１１−デヒドロ−デキサメタゾン（ＤＨ−Ｄ）の様な９−α−フッ素化１１−デヒドロコルチコステロイドは、１１β−ＨＳＤ２の１１β−レダクターゼ活性により活性デキサメタゾン（Ｄ）に速やかに活性化される。コルチゾンの様な１１−ケトステロイドは、１１β−ＨＳＤ１によりコルチゾールの様な１１−ヒドロキシ化合物に還元される。同様に、プレドニゾンはプレドニソロンに還元される。さらに、肝臓の１１β−ＨＳＤ１は、肝臓においてコルチゾンをコルチゾールに還元することが知られている。従って、本発明に関して、活性なグルココルチコイドは、コルチゾールまたはデキサメタゾンまたはプレドニソロンのような還元型であり、不活性型グルココルチコイドは、例えば、コルチゾンまたは１１−デヒドロ−デキサメタゾンまたはプレドニソンである。
【００３８】
［グルココルチコイド代謝のモジュレータ］
好ましい実施例において、このようなモジュレータは、不活性なグルココルチコイドの１１β−ＨＳＤレダクターゼ酵素への変換を触媒する酵素である。従って、本発明は特に１１β−ＨＳＤレダクターゼ酵素に関する。例えば、ヒト１１β−ＨＳＤ２酵素は既知であり、その詳細は、ジェーンバンク受託番号Ｍ７６６６１．１Ｇｌ：１７９４６９に記載されている。１１β−ＨＳＤ１の配列は、受託番号ＮＭ−００５５２５．１Ｇｌ：５０３６７１４に記載されている。このような酵素活性のモジュレータも、グルココルチコイド代謝のモジュレータと考えられており、従って、１１β−ＨＳＤ１を阻害するカルベノキソロンといった化合物は、本発明に包含され、１１β−ＨＳＤ１活性の増強物質も同様に本発明に包含される。Ｍｏｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ，（１９９３）Ｖｉｔａｍｉｎｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ４７：１８７；特にその表ＩＶを参照。
【００３９】
１１β−ＨＳＤ酵素そのものは、例えば、マクロファージにおいてそれらの誘導を調節することにより、あるいはその他の手段により調節できる。例えば、ＩＬ−４の様なサイトカインは、本明細書に示されているように、１１β−ＨＳＤ１の発現を誘導することができる。ＩＬ−４そのもの、またはその小さな模倣体または類似体を、下記に説明されているカチオンのリポソームによる選択的な取り込みにより、マクロファージに投与できる。合成のＩＬ−４類似体は、本技術において既知であり、例えば、Ｄｏｍｉｎｉｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １９９９  Ｊｕｌ；６（７）：６５２−６に説明されている。コンピューター支援分子モデリングを用いて、ＩＬ−４Ｒ（レセプター）に結合するための推定ＩＬ−４モチーフが、酵母転写因子ＧＣＮ４のロイシン−亜鉛ジッパードメインである選択された足場分子に段階的に移動された。取り込まれたＩＬ−４結合モチーフの安定性と分画に依存して、得られた分子は２ｍＭから５Ｍの親和性でＩＬ−４Ｒに結合した。
【００４０】
模倣体は、非ペプチジル模倣体でもよい。非ペプチジル模倣体は、天然供給源由来でもコンビナトリアルライブラリ由来でもよい。例えば、ヒトインスリンレセプターチロシンキナーゼを活性化する小さな分子のスクリーニングにおいて、幾つかの生化学分析と細胞分析において、インスリン模倣体として作用する非ペプチジル真菌代謝物（Ｌ−７８３，２８１）が同定された。この化合物はインスリンレセプターに関して選択的で、Ｌ−７８３，２８１の２種類の糖尿病マウスモデルに経口投与すると、血中グルコース濃度が有意に低下し、糖尿病の新しい治療法につながる新しいインスリンレセプター活性化剤を発見できる可能性が示唆された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９年５月７日；２８４（５４１６）：９７４−７）。化学合成において、ビス（シクロヘキシルピリジン）置換大環状配位子とのマンガン（ＩＩ）錯体（Ｍ４０４０３）が、通常多くのヒト疾患に関連するラジカルを除去するスーパーオキシドジムスターゼ（ＳＯＤ）酵素の機能的模倣体となる様にデザインされた（Ｓａｌｖｅｍｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９９年１０月８日；２８６（５４３８）：３０４−６）。この非ペプチジル性の模倣体により、スーパーオキシドラジカルにより仲介される疾病のより優れた治療法が得られる。血液凝固の分野においても、オリゴ糖化学の躍進により、へパリンの五糖抗トロンビン結合部位の全合成が可能となり、Ｐｅｔｉｔｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９９年４月１日；３９８（６７２６）：４１７−２２）は、硫酸化オリゴ糖であり、へパリン治療においてへパリンにより誘発される血小板減少症（ＨＩＴ）および出血といった副作用のないへパリン模倣体を報告した。タンパク質模倣体の設計と選択の概説は、Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２０００）７：Ｒ８５−Ｒ９４に報告されている。
【００４１】
［マクロファージへの送達］
好ましい実施例において、本発明は、核酸、ポリペプチド、化合物、および活性グルココルチコイドまたは不活性グルココルチコイドそれ自体を含むグルココルチコイド代謝のモジュレータのマクロファージへの送達を包含する。薬物、核酸およびその他の物質をマクロファージに送達する技術は本技術において既知である。多くの技術が、マクロファージにより認識され、同化される炭水化物基を持つ修飾リポソームまたはナノ粒子を使用している。例えば、Ｓｉｈｏｒｋａｒ  Ｖ，Ｖｙａｓ  ＳＰ，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ２００１年５−８月；４（２）：１３８−５８；Ｍｏｇｈｉｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．２００１年６月；２８３−３１８；Ｃｏｕｖｒｅｒ  Ｐ．＆  Ｖａｕｔｈｉｅｒ  Ｃ．（１９９４），Ｄｒｕｇ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ．Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ，  Ａ（Ｂｅｒｔ）ＧＣｂｏｅｒ編。Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ．ライデン、アムステルダム；および国際特許出願ＷＯ９７／４５４４２を参照。Ａｌｖａｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）２７，１３９−１４３は、マクロファージへの薬物の送達に架橋された赤血球の使用について説明している。
【００４２】
好ましくは、最適な物質をマクロファージに送達するために、カチオン性のリポソームが使用される。本発明における使用に適したリポソームは市販されている。例えば、ＤＯＴＭＡリポソームは、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ，ゲーサーズバーグ、メリーランド州からリポフェクチンという登録商標で発売されている。あるいは、リポソームは、文献に過去に報告されている種類の容易に入手できる開始物質または新しく合成された開始物質から調製することも可能である。例えば、Ｐ．Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７参照。同様の方法を使用して、他のカチオン性の脂質材料からリポソームを調製できる。
【００４３】
リポソームは、炎症部位でマクロファージにより選択的に取り込まれ、本発明のグルココルチコイドおよび／または核酸の送達にとって理想的な輸送手段となる。
【００４４】
さらに、従来のリポソーム形成物質を、負電荷または中性電荷を持つリポソームを調製するために使用できる。このような物質には、ホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン等が含まれる。これらの物質は、有利には０％から約７５％の比率で、ＤＯＴＭＡ開始物質と混合することもできる。
【００４５】
従来の方法を使用して、その他のカチオン性でないリポソームを調製することができる。これらのリポソームは、カチオン性のリポソームの様に容易に細胞壁と融合しない。しかし、これらは生体内でマクロファージに取り込まれ、従って、これらの細胞に物質を送達するのに特に有効である。例えば、市販のジオレオイルホスファチジルコリン（ＣＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリングリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を種々の組み合わせて使用して、コレステロールを加えて、あるいはコレステロールを加えずに、従来のリポソームを作製することができる。従って、例えば、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣベシクルは、窒素ガス流を超音波処理バイアルの中に流しながら、ＤＯＰＧおよびＤＯＰＣ各５０ｍｇを乾燥することにより調製することができる。試料を真空ポンプに一晩かけ、翌日脱イオン水で水和する。次に、バスを１５℃で循環させながら、最大設定でインバーテッドカップ（バスタイプ）プローブを装備したＨｅａｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓモデル３５０超音波発生装置を用いて、試料を、蓋をしたバイアルの中で２時間にわたって超音波処理する。あるいは、負電荷ベシクルを、超音波処理を行わずに多重膜ベシクルを生成させることができ、あるいはヌクレオポア（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）膜からの押し出しにより不連続的なサイズの単層のベシクルを生成させることができる。その他の方法は、本技術に精通する者にとって既知であり、利用可能である。
【００４６】
特に好ましい実施例において、１１β−ＨＳＤ１タンパク質、または１１β−ＨＳＤ１をコードする核酸ベクターが、上記のリポソーム技術を用いてマクロファージに送達される。本明細書に説明されている様に、１１β−ＨＳＤ１は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏで、マクロファージにおいて、不活性な１１−デヒドロコルチコステロイドからその活性なグルココルチコイド型への活性化を触媒する。
【００４７】
更なる実施例において、活性なグルココルチコイドまたは不活性な１１−デヒドロコルチコステロイド前駆体は、そのようなステロイドを保有するリポソームを投与することにより、炎症部位においてマクロファージに送達される。
【００４８】
マクロファージ中の１１β−ＨＳＤ酵素により再活性化するために、グルココルチコイドを、好ましくは不活性１１−ケト型または９−α−フッ素化型で全身投与することも可能である。一般に、不活性ステロイドの内因性プールは、１１β−ＨＳＤ酵素レベルを高めたマクロファージにおいて、活性ステロイド濃度を有意に上昇させるのに十分な大きさを持っている。従って、本発明の更なる点において、不活性グルココルチコイドの経口および／または全身投与は、高レベルの１１β−ＨＳＤ１または１１β−ＨＳＤ２を発現するマクロファージの作製と併用される。
【００４９】
［設計されたマクロファージ］
炎症部位におけるマクロファージの食作用をアップレギュレーションする別の手段は、マクロファージ内部で選択的に、不活性なグルココルチコイドから活性なグルココルチコイドへの変換を促進する方法である。このために、１１β−ＨＳＤ１の発現は、非食細胞単球から食細胞マクロファージへの分化に特有であることが明らかにされた。さらに、我々は、活性な１１β−ＨＳＤ１が存在すれば、不活性なグルココルチコイドがアポトーシス細胞の食作用を促進できることを明らかにした。従って、１１β−ＨＳＤ酵素の発現を推進することにより（単球からマクロファージへの分化の早期に発現させるか、あるいは成熟度がより高いマクロファージで発現させる）、自然では過多の内因性の不活性なグルココルチコイドの作用、またはマクロファージに投与された不活性なグルココルチコイドの作用に標的を定める手段を提供する。
【００５０】
成熟しつつある単球／成熟マクロファージにおいて、このような標的を定めた１１β−ＨＳＤの過剰発発現を達成する方法には、（ａ）遺伝子工学、これはマクロファージに特異的なプロモーターを含むことができる（ｂ）ＨＳＤ１の発現を増加させるモジュレータのリポソーム投与、例えば、１１β−ＨＳＤ１の発現を促進するＩＬ−４といったサイトカインの小分子の類似体が挙げられる。
【００５１】
遺伝子工学的に設計されたマクロファージは、１１β−ＨＳＤ導入遺伝子、または内因性の１１β−ＨＳＤ遺伝子のモジュレータの導入の結果として、１１β−ＨＳＤ酵素を過剰発現することができる（Ｋｌｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１年４月１日；１６６（７）：４７２８−３６）。
【００５２】
１１β−ＨＳＤのようなグルココルチコイド代謝のモジュレータの活性を改変するマクロファージの作製は、従来の遺伝子工学的な技術により達成される。典型的には、これは、組み換え複製ベクターへの、モジュレータをコードする核酸ベクターの移入を含む。ベクターは、適合する宿主細胞において核酸を複製するために使用される。適切な宿主細胞には、大腸菌といった細菌、酵母といった真核細胞、哺乳動物細胞系、およびその他の真核細胞系、例えば、昆虫Ｓｔ９細胞が含まれる。
【００５３】
ベクター内の本発明のモジュレータをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現を提供することができる調節配列と作動可能に連結している。すなわち、ベクターは発現ベクターである。「作動可能に連結した」という言葉は、説明されている成分が、その意図された様式で機能できる関係にあることを意味する。コード配列と「作動可能に連結した」調節配列は、コード配列の発現が、調節配列にも適合する条件において達成されるように連結されている。
【００５４】
調節配列は、例えば、更なる転写因子を加えることにより改変し、調節配列により命令される転写レベルが、転写モジュレータに対して、より応答し易くすることができる。
【００５５】
本発明のベクターは、マクロファージ内に形質導入あるいはトランスフェクションされ、その中のモジュレータの発現を提供する。
【００５６】
ベクターは、例えば、複製起点、任意で前記ポリヌクレオチド発現のプロモーター、および任意でプロモーターの制御因子を備えているプラスミドまたはウィルスベクターである。ベクターは、一以上の選択マーカー遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含むことができる。
【００５７】
本発明のタンパク質をコードする配列に連結された調節配列には、プロモーター／エンハンサーおよびその他の発現制御シグナルが含まれる。これらの調節配列は、宿主細胞内で使用されるように発現ベクターが設計された宿主細胞に適合する様に選択できる。「プロモーター」という言葉は本技術において既知であり、最小プロモーターから上流成分とエンハンサーを含むプロモーターまでのサイズと複雑さとにおいて変動する核酸領域を包含する。
【００５８】
プロモーターは、典型的には哺乳動物細胞において機能するプロモーターから選択されるが、原核生物プロモーターとその他の真核細胞において機能するプロモーターも使用できる。プロモーターは、典型的にはウィルスまたは真核生物遺伝子のプロモーター配列由来である。例えば、マクロファージ由来のプロモーターであってもよく、ＣＤ６８プロモーター（ヒトマクロファージスカベンジャーレセプターの分泌型のアデノウィルスを介する遺伝子移入は、修飾低密度リポタンパク質分解と泡沫細胞形成が阻害される。Ｌａｕｋｋａｎｅｎ  Ｊ．Ｌｅｈｔｏｌａｉｎｅｎ  Ｐ，Ｇｏｕｇｈ  ＰＪ，Ｇｒｅａｖｅｓ  ＤＲ，Ｇｏｒｄｏｎ  Ｓ，Ｕｉａ−Ｈｅｒｔｔｕａｌａ  Ｓ．ＣＩＲＣＵＬＡＴＩＯＮ  １０１：（１０）１０９１−１０９６（２００１））（故に、１１β−ＨＳＤ１は循環血液中単球およびその祖先により命令される）、またはマウスメトロエラスターゼ（ＭＭＥ）プロモーター（マウスマクロファージにおけるヒアルロン酸断片によるマクロファージメタロエラスターゼの誘導および制御。Ｈｏｒｔｏｎ  ＭＲ，Ｓｈａｐｉｒｉｏ  Ｓ，Ｂａｏ  Ｃ，Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎ  ＣＪ，Ｎｏｂｌｅ  ＰＷ．ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ  １６２：（７）４１７１−４１７６，１９９９年４月１日）（故に、１１β−ＨＳＤ１発現は単球が炎症部位に移動すると活性化される。）等がある。プロモーターは、遍在性に（例えば、α−アクチン、β−アクチン、チューブリンのプロモーター）、あるいは組織特異的に機能するプロモーターであってもよい。マクロファージに特異的な組織特異的プロモーターが特に好ましい。それらは特異的刺激に応答するプロモーターであってもよく、例えば、ステロイドホルモンレセプターに結合するプロモーターである。ウィルスプロモーターも使用でき、例えば、モロニーネズミ白血病ウィルス長末端反復配列（ＭＭＬＶ  ＬＴＲ）プロモーター、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターまたはヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモーターがある。
【００５９】
異種遺伝子の発現レベルを細胞の寿命中に制御できる様に、プロモーターが誘導性であることも有利な可能性がある。誘導性とは、プロモーターを用いて得られる発現のレベルが制御可能であることを意味する。
【００６０】
さらに、これらのプロモーターの全てが、例えば、エンハンサーのような更なる調節配列を加えることにより改変することができる。上記の２種類以上のプロモーターの配列成分を含むキメラプロモーターも使用できる。
【００６１】
マクロファージの形質転換技術は本技術において既知であり、エレクトロポレーションまたはリポフェクションおよびウィルス形質導入等のＤＮＡトランスフェクション技術が含まれる。哺乳動物細胞による裸の核酸構築物の取り込みは、例えば、トランスフェクション作用剤の使用を含む幾つかの既知のトランスフェクション技術により増強される。これらの作用剤の例として、カチオン性物質（例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン）およびリポフェクション剤（例えば、リポフェクタム（登録商標）およびトランスフェクタム（登録商標））が挙げられる。典型的には、核酸構築物は、トランスフェクション剤と混合され、組成物が生成される。
【００６２】
好ましい実施例において、末梢血単核細胞をヒト末梢血液から標準技術による手順により実験室規模で分離する（Ｓａｎｄｌｉｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｈａｅｌｓｅｎ，１９９６，ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．編第９章）。付着した細胞（本質的に単球）は、一晩プラスチックに密着させることにより強化し、１〜３週間にわたって付着した細胞を培養することにより、マクロファージ分化経路に沿って分化させる。
【００６３】
単球とマクロファージとを、ヒト細胞において１１β−ＨＳＤ１を発現できる発現ベクターによりトランスフェクションする。構成的な高レベルの発現に関して、１１β−ＨＳＤ１は、ｈＣＭＶ−ＭＩＥプロモーター・エンハンサー、ｐＣｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用するベクターにおいて発現される。
【００６４】
ベクターを単球およびマクロファージに導入するために、粒子を介するＤＮＡ送達法（バイオリスティクス）、エレクトロポレーション、カチオン性物質を介するトランスフェクション（例えば、スーパーフェクト、Ｑｕｉａｇｅｎを使用）を含む種々のトランスフェクション法を使用できる。これらの方法はそれぞれ、製造者の指示に従って、個々の製造者により明示されている最適結果を達成するために変更すべきパラメータを考慮に入れて実施される。あるいは、欠損アデノウィルスベクター（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ  ＩｎｃまたはＱｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）の様なウィルスベクターも使用できる。
【００６５】
慢性状態の治療が必要な場合、単球／マクロファージ系列を上昇させる造血幹細胞を、１１β−ＨＳＤ１をコードする核酸を用いて形質転換し、安定した１１β−ＨＳＤ１増強マクロファージ細胞源を供給できる。
【００６６】
設計されたマクロファージを、局所または全身投与により炎症部位に投与することができる。例えば、マクロファージは直接炎症性関節、肺または腹膜に投与できる。炎症部位に注入されるマクロファージは、炎症性組織に進むことができる（Ｋｌｕｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１年４月１日；１６６（７）：４７２８−３６）。
【００６７】
［医薬組成物の処方］
本発明の医薬組成物は、活性成分として活性ステロイドまたは不活性ステロイドを含む物質の組成物である。本発明の組み合わせを含む医薬組成物の活性成分は、炎症性応答の好結果な消散において優れた治療活性を示す。投与方法は、最適な治療応答を提供する様に調節できる。例えば、１日に数回に分けて投与することもでき、投与量を、治療状況の緊急性により必要とされるのに比例して、減少させることもできる。
【００６８】
活性化合物は、局所、経口、静脈内、筋肉内、皮下、鼻内、皮内または座薬経路または移植（例えば、徐放性分子を使用）等の従来の方法で投与できる。投与経路に応じて、活性成分は、前記成分を不活化する可能性がある酵素、酸、その他の天然条件から前記成分を保護するために所定の物質でコーティングする必要がある。
【００６９】
局所的な処方は、リポソームに基づくものが可能である。上記にさらに詳細に説明されているように、リポソームは、水中油中水型のＣＧＦエマルジョン基剤または従来のエマルジョンが含まれる。
【００７０】
活性化合物は、非経口または腹腔内投与も可能である。分散剤も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物および油の中に調製できる。通常の保存および使用条件において、これらの製剤は微生物の成長を防止する適切な保存剤を含む。
【００７１】
注射用に適した薬剤形態には、滅菌溶液または分散剤を即時に調製のための、滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散剤と、滅菌粉末とが含まれる。どのような場合でも、形態は滅菌されていなくてはならず、簡単に注射できる程度に流動性でなくてはならない。製造条件および保存条件において安定でなくてはならず、細菌や真菌といった微生物の汚染作用から保護されなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であってよい。例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用により、分散剤の場合には必要な粒子サイズを維持することにより、また界面活性剤の使用により、適切な流動度を維持することが可能である。
【００７２】
微生物作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、トリメロサール等の種々の抗菌剤および抗真菌剤により達成される。多くの場合、例えば、糖または塩化ナトリウムの様な等張剤を含むことが好ましい。注射用組成物の持続的な吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンのような吸収遅延物質を組成物に使用することにより達成される。
【００７３】
滅菌注射用溶液は、上記に列挙されたその他の種々の成分と共に必要量の活性化合物を適切な溶媒に混ぜ、続いて濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散剤は、滅菌された活性成分を、基本的な分散媒と上記に列挙した成分のうち、必要なその他の成分を含む滅菌賦形剤の中に含めることにより調製される。滅菌注射液調製用滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥技術と凍結乾燥技術で、活性成分と更なる所望の成分を、前に滅菌濾過したそれらの溶液から得ることができる。
【００７４】
錠剤、トローチ、カプセル等は、以下のものもまた含むことができる。結合剤（例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチンなど）、賦形剤（例えば、リン酸カルシウム）、崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギニン酸等）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）、甘味剤（例えば、スクロース、乳糖、サッカリンなど）を添加することができ、あるいは香料（例えば、ペパーミント、冬緑油、またはサクランボ香料など）を添加することができる。投与単位形態がカプセルの場合、上記の種類の物質の他に、液体担体を含むことができる。
【００７５】
種々のその他の物質を、コーティングまたは、投薬単位の物理的形態を変えるために含めることができる。例えば、錠剤、ピル、またはカプセルは、セラック、糖またはこれらの両者によりコーティングすることができる。シロップまたはエリキシル剤は、活性化合物と、甘味剤としてのスクロースと、保存薬としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベンと、色素と、サクランボ香料またはオレンジ香料等の香料とを含むことができる。勿論、任意の単位剤形の調製に使用される物質は全て、薬剤学的に純粋で、使用される量において実質的に非毒性でなくてはならない。さらに、活性化合物は、徐放性の調製物および製剤に組み入れることができる。
【００７６】
本明細書に使用されている「薬剤学的に許容可能な担体および／または希釈剤」には、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤、抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などが含まれる。このような薬剤活性物質の媒体および物質は、本技術において既知である。従来の媒質または薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、治療用組成物にそれらを使用することが企図できる。
【００７７】
投与の簡易性と投与の均一性のために、単位剤形で非経口組成物を処方することは特に有利である。本明細書に使用されている単位剤形とは、治療される哺乳動物対象への単位投薬に適した物理的に不連続の単位を意味し、各単位は、所望の治療効果を生じさせるように計算された予定量の活性物質を、必要な薬剤担体と共に含む。本発明の新しい単位剤形の仕様は、（ａ）活性物質の独特の特徴と達成されるべき特定の治療効果と、（ｂ）身体の健康が損なわれた疾病状態にある、生きている対象における疾病の治療のための活性物質といった調剤技術における固有の制限とにより決定され、これらに直接的に依存する。
【００７８】
主な活性成分は、都合が良く、効果的な投与のために有効な量を、薬剤学的に許容可能な担体と共に単位剤形中に調合される。補助的な活性成分を含む組成物の場合、投与量は、通常の投薬量と、前記成分の投与方法を参考にして決定される。
【００７９】
さらなる点において、腹膜炎といった炎症性応答を含む疾病の治療に使用するために上文に定義された本発明の組み合わせが提供されている。
【００８０】
本発明は、以下の限定的なものではない具体例を参照して、下記にさらに詳細に説明されている。
【実施例】
【００８１】
［具体例］
＜方法＞
骨髄由来のマクロファージ（ＢＭＤ  Ｍφ）骨髄を大腿骨（Ｃ５７Ｂｌ／６マウス）から摘出し、ＤＭＥＭ／１０％のＦＣＳ／１０％のＬ９２９細胞系上清において４ｘ１０５細胞／ｍｌで８日間培養した。
【００８２】
チオグリコール酸誘出腹膜マクロファージ（ＴＰＭ  Ｍφ）−腹膜炎症性マクロファージを、４％のチオグリコール酸溶液を腹腔内注射した４日後のＣＣ５７Ｂｌ／６マウスから洗浄した。ＤＭＥＭ／１０％のＦＣＳにおいて、細胞を、１ｘ１０６細胞／ｍｌ付着させ、洗浄し、２４時間培養した。
【００８３】
ヒト単球−デキストラン沈降法およびパーコール勾配法により末梢血液から分離された単球。単球は、ｌｓｃｏｖｅｓ／１０％の自己由来血清において４日間にわたり４ｘ１０５細胞／ｍｌのマクロファージに分化された。
【００８４】
［具体例１］
＜マクロファージによるアポトーシス好中球の食作用＞
適切な条件で好中球（多核白血球、ＰＭＮ）を培養すると、アポトーシスと、マクロファージによるアポトーシス細胞の摂取とが起こり、好中球物質の非壊死性の除去を引き起こす。このようなアポトーシス好中球物質をタイミング良く除去できなかった場合には、慢性炎症と進行性組織損傷が起こる。
【００８５】
新鮮ＰＭＮを末梢血液から分離し、Ｉｓｃｏｖｅｓ／１０％の自己由来血清において２４時間にわたりテフロン（登録商標）のウェルで成熟させて、アポトーシスにした。マクロファージを図に説明されている様にグルココルチコイドで処理した。マクロファージとＰＭＮとを１ｘＰＢＳで洗浄し、Ｉｓｃｏｖｅｓを含まない血清中で３７℃において３０分間相互作用させた。細胞層を穏やかに洗浄し、付着した細胞を除去し、１ｘホルマリンに固定し、ＰＭＮを選択的ミエロペルオキシダーゼで染色した。
【００８６】
２００ｎＭのデキサメタゾンを用いて、我々はマクロファージによるアポトーシス好中球の取り込みの顕著な増加を観察した。これは図１に示されている。グルココルチコイド作用は、食作用に関与するマクロファージの数と、マクロファージあたりの摂取されるＰＭＮ数との両方を増加させた。
【００８７】
［具体例２］
＜マクロファージにおける１１β−ＨＳＤ１の発現＞
図２ａは、マウス腎臓、肝臓、マクロファージから得られた転写物のＲＴ−ＰＣＲを示す。マクロファージにおける１１β−ＨＳＤ１の発現が明らかに観察され、１１β−ＨＳＤ２の発現は観察されない。
【００８８】
［具体例３］
１１β−ＨＳＤ１は不活性１１−デヒドロコルチコステロイドを活性グルココルチコイドに変換する。
【００８９】
３Ｈ−コルチコステロン（ｃｏｒｔ）または３Ｈ−１１−デヒドロコルチコステロン（１１ＤＨＣ）を、０．２５μＣｉ／ｍｌの濃度でマクロファージ培養物に添加した。試料を異なる時間で取り出し、３Ｈ−ｃｏｒｔと３Ｈ−１１−ＤＨＣを培地試料から薄層クロマトグラフィーにより分離し、蛍光撮像により分析した。
【００９０】
図２ｂに、不活性１１−デヒドロコルチコステロン（Ａ）からコルチコステロン（Ｂ）への変換がマウスにおいて観察された実験結果が示されている。１１β−ＨＳＤ１は、２４時間にわたり（Ａ）から（Ｂ）へ変換されることを明らかに示す。しかし、図２ｃに示すように、この効果は高濃度の１１β−ＨＳＤ１阻害剤カルベノキソロンにより遮断することができる。
【００９１】
図３に示すように、この効果はマウス末梢血液マクロファージによる食作用にも観察された。活性グルココルチコイドは、マクロファージの食作用性能を２４時間にわたり２倍以上上昇させ、不活性１１−デヒドロコルチコステロンも、インキュベーション後には（１１β−ＨＳＤ１によりコルチコステロンに活性化させ）同様であった。しかし、１１β−ＨＳＤ１阻害剤カルベノキソロンの存在下でマクロファージを不活性な１１−デヒドロコルチコステロンと共にインキュベーションすると、その効果は完全に阻害された。
【００９２】
［具体例４］
＜１１β−ＨＳＤ―／―マクロファージにおける食作用＞
トランスジェニック１１β−ＨＳＤ―／―マウスは過去に説明されている（Ｋｏｔｅｌｅｖｓｔｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（米国）９４：１４９２４−１４９２９）。マクロファージを、対照と、１１β−ＨＳＤ―／―マウスとから分離し、上記のＰＭＮ食作用分析で分析した。
【００９３】
図４に示すように、「活性」（ＡＧＣ＝コルチコステロン）または「不活性」（ＩＧＣ＝１１ＤＨＣ）１１−デヒドロコルチコステロイド（ｎ＝４／群）による処理後４８時間後に、マウスＢＭＤマクロファージによるアポトーシス多核白血球（ＰＭＮ）の食作用がｉｎ  ｖｉｔｒｏで増強された。
【００９４】
１１β−ＨＳＤ（ＩＧＣ）により与えられた増強された食作用効果は、１１β−ＨＳＤ
―／―マクロファージにおいて阻害された。これとは対照的に、１１β−ＨＳＤ１の喪失は、活性ＧＣ（ｃｏｒｔ）作用に全く影響を及ぼさなかった。
【００９５】
［具体例５］
＜ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの１１β−ＨＳＤ１発現の誘導＞
チオグリコール酸（１ｍｌの３％のチオグリコール酸、滅菌溶液）の腹腔内注射によりマウスにｉｎ  ｖｉｖｏで腹膜炎を引き起こすことができる。腹膜マクロファージの分析により、我々は、１１β−ＨＳＤ１が、腹膜の炎症時に速やかにアップレギュレーションされることを明らかにした。
【００９６】
図５は、腹膜マクロファージによる不活性１１−ＤＨＣの活性コルチコステロン（ｃｏｒｔ）への変換が腹膜炎前（対照）は最小であるが、すみやかに誘導され（４時間以内）、開始後２−３日でピークに達することを示している。これらのデータは、１１β−ＨＳＤ１発現が炎症に応答してｉｎ  ｖｉｖｏでアップレギュレーションされることを意味している。
【００９７】
［具体例６］
＜グルココルチコイド活性化は、マクロファージ分化により影響される＞
図６〜図８に示すように、不活性グルココルチコイドの活性化は、細胞培養中のマクロファージ分化時のマクロファージにおける１１β−ＨＳＤ１の生産と相関する。図６ａにおいて、単球／マクロファージ分化培養のＲＴ−ＰＣＲは、１１β−ＨＳＤ−１  ｍＲＮＡが、０日目のヒト単球に存在しないが、２日目までにアップレギュレーションされることを示している。図６ｂにおいて、１１β−レダクターゼ酵素分析は、１１β−ＨＳＤ−１活性が培養（上記のように、３Ｈ−１１−ＤＨＣにより２４時間インキュベーション）の最初の３日間に増加することを示している。同様の結果が、図７に示され、この場合はマクロファージ食作用が測定されている。
【００９８】
分化中の単球が得られ、食作用レベル（図７）と１１−ＤＨＣのコルチコステロンへの変換（図６）を分析することにより検討した。２つの事例において、１１β−ＨＳＤ１の発現の上昇と同調して、マクロファージ分化中に１１−ＤＨＣのコルチコステロンへの変換が増強された。
【００９９】
分化するマクロファージの１１β−ＨＳＤ１活性獲得は、サイトカインにより影響される。図８に示す実験において、マクロファージへの分化開始時にヒト単球が一連の投与量のＩＬ−４によりインキュベーションされた。１１β−レダクターゼ活性を、トリチウム化１１−ＤＨＣと共にインキュベーションすることにより測定した。ＩＬ−４投与により、不活性１１−ＤＨＣの活性コルチコステロンへの変換の増加は、投与量に相関して増加した。
【０１００】
［具体例７］
＜１１β−ＨＳＤ１活性は、炎症の消散後に低下する＞
１１β−ＨＳＤ１活性はヒトマクロファージにおいて純粋に減少し、単球からマクロファージへの分化時に誘導される。図９に示すように、酵素活性は食作用後に低下し、グルココルチコイド作用の増幅が、マクロファージが機能して炎症を消散した後に減少することを示唆している。
【０１０１】
同じことがｉｎ  ｖｉｖｏで確認される。図１０において、チオグリコール酸により誘発された腹膜炎を発症中のマウス腹膜マクロファージにおいて１１β−ＨＳＤ１レダクターゼが誘導される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヒトマクロファージの場合の様に、マウス腹膜マクロファージにおいて、１１β−ＨＳＤ１  レダクターゼ活性は、食作用ピーク後に低下し、グルココルチコイド作用の増幅が、マクロファージが機能して炎症を消散させた後に減少することを示唆している。
【０１０２】
どちらの場合も、デヒドロゲナーゼ活性は検出されず、１１β−ＨＳＤ１がマクロファージにおいてのみレダクターゼとして機能することが確認された。
【０１０３】
［具体例８］
＜グルココルチコイドは、マクロファージ食作用をｉｎ  ｖｉｖｏで増強する＞
正常血液から調製された好中球を、アポトーシスになるように一晩培養した。アポトーシス細胞を、蛍光性追跡色素で標識した。次に、それを、４日前にチオグリコール酸注射により腹膜炎症性応答が進行中のマウスに腹腔内注射した。アポトーシス細胞注射の段階で、腹膜の炎症細胞の大多数がマクロファージである。
【０１０４】
３０分の相互作用後、マウスを屠殺し、腹膜細胞を収集し、顕微鏡検査を行った。５，０００，０００の好中球を投与するベースラインの条件で２４．４±８．３％（平均±ＳＤ；Ｎ＝２４）のマクロファージが蛍光性アポトーシス細胞を含んでいた。
【０１０５】
マウスを、完全なマウスにおいて最終濃度が２００ｎＭとなる様に計算された投与量のデキサメタゾンで処理すると、マクロファージが投与されたアポトーシス細胞の食作用は４７，４±１１．１％増加した。これは、分散分析によりＰが０．０１未満の水準で有意であった。グルココルチコイドは、腹腔内注射された。
【０１０６】
上記明細書に言及されている全ての文献は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。本発明の説明されている方法およびシステムの、本発明の範囲および精神から逸脱しない種々の改変および変更は、本技術に精通する者にとって明らかである。本発明は、特定の好ましい具体例と関連させて説明されているが、請求されている本発明はこのような特定の具体例に不当に制限されるべきでないことは明らかである。事実、分子生物学または関連分野に精通する者にとって明らかな説明されている本発明の実施方法の種々の改変は、以下の請求項の範囲内とするものである。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】デキサメタゾンが存在する場合と存在しない場合とのマクロファージの食作用を示す顕微鏡写真である。
【図２ａ】腎臓、肝臓、マクロファージから得られた転写物のＲＴ−ＰＣＲを示す。
【図２ｂ】不活性前駆体１１−デヒドロコルチコステロン（Ａ）から活性グルココルチコイド（Ｂ）への変換を示す。
【図２ｃ】カルベノキソロンによるその阻害、を示す。
【図３】活性グルココルチコイド（Ｂ）および不活性（Ａ）前駆体コルチコステロイドが存在する場合の、マクロファージの食作用のレベルと、カルベノキソロン投与の効果を示す棒グラフである。
【図４】野生型マウスおよび１１β−ＨＳＤ１―／―マウスにおける活性グルココルチコイド（ＡＧＣ）および不活性前駆体コルチコステロイド（ＩＧＣ）のマクロファージ食作用に及ぼす効果を示す棒グラフである。
【図５】単球／マクロファージ系列におけるグルココルチコイドにより高められる活性の発達制御を示す。
【図６】マクロファージにおける１１β−ＨＳＤ  １発現に連結された、単球／マクロファージ系列におけるグルココルチコイド活性化活性の発達制御を示す。
【図７】マクロファージにおける１１β−ＨＳＤ  １発現に連結された、単球／マクロファージ系列における食作用の発達制御を示す。
【図８】ＩＬ−４投与によるマクロファージにおけるグルココルチコイド活性化活性の誘導を示す。
【図９】マクロファージ食作用実験中および実験後におけるグルココルチコイド活性化活性の誘導を示す。
【図１０】チオグリコール酸投与によるマウスにおける生体内腹膜炎誘発中および誘発後のマクロファージのグルココルチコイド活性化活性を示す。
【図１】
2004517884.tif 000002
【図２ａ】
2004517884.tif 000003
【図２ｂ】
2004517884.tif 000004
【図２ｃ】
2004517884.tif 000005
【図３】
2004517884.tif 000006
【図４】
2004517884.tif 000007
【図５】
2004517884.tif 000008
【図６】
2004517884.tif 000009
【図７】
2004517884.tif 000010
【図８】
2004517884.tif 000011
【図９】
2004517884.tif 000012
【図１０】
2004517884.tif 000013
【国際公開パンフレット】
2004517884.tif 000014
2004517884.tif 000015
2004517884.tif 000016
2004517884.tif 000017
2004517884.tif 000018
2004517884.tif 000019
2004517884.tif 000020
2004517884.tif 000021
2004517884.tif 000022
2004517884.tif 000023
2004517884.tif 000024
2004517884.tif 000025
2004517884.tif 000026
2004517884.tif 000027
2004517884.tif 000028
2004517884.tif 000029
2004517884.tif 000030
2004517884.tif 000031
2004517884.tif 000032
2004517884.tif 000033
2004517884.tif 000034
2004517884.tif 000035
2004517884.tif 000036
2004517884.tif 000037
2004517884.tif 000038
2004517884.tif 000039
2004517884.tif 000040
2004517884.tif 000041
2004517884.tif 000042
2004517884.tif 000043
2004517884.tif 000044
2004517884.tif 000045
2004517884.tif 000046
2004517884.tif 000047
2004517884.tif 000048
2004517884.tif 000049
2004517884.tif 000050
2004517884.tif 000051
【国際調査報告】
2004517884.tif 000052
2004517884.tif 000053
2004517884.tif 000054
2004517884.tif 000055