(57)【要約】【課題】癌化学療法剤を増強するための方法および組成物【解決手段】癌化学療法剤の効果は、ミネラル・アスコルベート、ビタミンＣ代謝物および／またはビタミンＣ由来フラノン、例えば４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノンとの組合せにより増強する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学療法剤、並びに、ミネラル・アスコルベート、ビタミンＣ代謝物、およびアスコルビン酸由来フラノン、並びにその混合物からなる群から選択されたメンバーである増強剤を含む癌化学療法組成物。
【請求項２】
前記化学療法剤はドキソルビシンであり、前記ミネラル・アスコルベートはアスコルビン酸カルシウムであり、前記代謝物はトレオン酸カルシウムであり、前記フラノンは４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記増強剤は、４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ドキソルビシンおよび４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノンを含む癌化学療法組成物。
【請求項５】
腫瘍細胞を請求項１に記載の組成物と接触させることを含む、癌化学療法。
【請求項６】
腫瘍細胞を請求項２に記載の組成物と接触させることを含む、癌化学療法。
【請求項７】
腫瘍細胞を請求項３に記載の組成物と接触させることを含む、癌化学療法。
【請求項８】
腫瘍細胞を請求項４に記載の組成物と接触させることを含む、癌化学療法。
【請求項９】
癌化学療法組成物の製造における、４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノンの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０００年９月１日に提出された発明者の同時係属米国特許出願番号第０９／６５４，３７７号の一部継続出願であり、それに基づく優先権を主張する。
【０００２】
【発明の背景】
本発明は、癌化学療法剤の効力を増強する方法および組成物に関する。
【０００３】
別の点において、本発明は、癌化学療法剤の効力を向上することが可能であり、よって、これらの薬剤を、前記薬剤の効力を犠牲にすることなく、より低い容量比で使用できるような方法および組成物に関する。
【０００４】
さらに別の態様において、本発明は、癌細胞アポトーシスを引き起こすか、または増殖速度を減少させる、またはその両方である、化学療法成分の組合せを含む、癌化学療法組成物に関する。
【０００５】
数多くの癌化学療法剤が知られている。しかし、多くの場合、効果的な容量比での前記薬剤の投与により、その有用性を重度に制限する望ましくない副作用が引き起こされ得る。従って、前記薬剤の化学療法効果を増強し、よって、より低い容量比で効果的に投与でき、これにより、前記の望ましくない副作用は減少または消失する、方法および組成物を提供することは非常に望ましい。別に、前記方法および組成物により、副作用を増加することなく、一定量の化学療法剤の投与から、より大きな化学療法効果を得ることが可能となる。
【０００６】
［図面の簡単な説明］
発明者は今回、癌化学療法剤の化学療法効果（癌細胞増殖速度の減少および／または癌細胞アポトーシス）は、前記癌化学療法剤を、ミネラル・アスコルベート、ビタミンＣ代謝物、およびビタミンＣ由来フラノン、並びにそれらの２つ以上の混合物からなる群から選択したメンバーと配合することにより、有意に増強することを発見した。この技術により、同じ癌化学療法効果が、有意により低い容量比で得られ、化学療法剤を単独投与する場合に必要な速度の僅か約１０分の１の容量比で得られる場合もある。さらに、発明者は、前記フラノンは、ミネラル・アスコルベート並びにミネラル・アスコルベートと他のビタミンＣ代謝物の混合物の腫瘍細胞毒性および／または抗増殖効果を増強することを発見した。
【０００７】
本発明の今回の好ましい実施形態において、発明者は４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）フラノンを、別の癌化学療法剤と組合せる増強成分として使用して、フラノンまたは他の化学療法剤単独よりも大きな化学療法能を有する組成物を得る。次いで、これにより、化学療法剤を単独で、しかしより高い投与量で使用した場合に得られるであろうものと同じ選択的化学療法効果を達成するのに、他の化学療法剤をより少ない投与量で使用できる。
【０００８】
【発明の詳細な記述】
本発明の組成物のフラノン成分は、任意の適切な技術により合成できる。別法として、フラノンと、米国アリゾナ州プレスコット（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ，Ａｒｉｚｏｎａ）所在インターカル社（Ｉｎｔｅｒ−Ｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の登録商標「エステル−Ｃ（Ｅｓｔｅｒ−Ｃ）」で市販で入手可能である血漿に可溶性のミネラル・アスコルベートの混合物を使用できる。
【０００９】
本発明の特に好ましい実施形態によると、発明者は、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、並びに、血漿に可溶性のミネラル・アスコルベート、ビタミンＣ代謝物およびビタミンＣ由来フラノンおよびその２つ以上の混合物からなる群から選択されるメンバーである増強剤を含む組成物を提供する。ミネラル・アスコルベートは、無毒性の金属アスコルベート、例えばアスコルビン酸カルシウム、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸亜鉛、アスコルビン酸マグネシウム等である。ビタミンＣ代謝物は、デヒドロアスコルビン酸、トレオース、エリトレオース、３−ヒドロキシコウジ酸、５−ヒドロキシマルトール、アルドン酸、例えばトレオン酸、キシロン酸およびリキソン酸およびその無毒性ミネラル塩、例えばトレオン酸カルシウム、および対応するアルドノ−ラクトンおよびラクチドを含む。ビタミンＣ由来フラノンは、例えば、４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノンおよび関連フラノンを含む。
【００１０】
本発明の方法は、上記の増強した癌化学療法組成物の、癌化学療法投与量を、１回投与量または反復投与量として投与することを含む。投与は、癌化学療法剤の投与に通常使用される任意の適切な技術、例えば経口または非経口的な注射であり得る。
【００１１】
【例示的実施例】
以下の実施例は、本発明の実施およびその現時点での好ましい実施形態を説明するために提示するものである。これらの実施例は単なる例示であり、特許請求の範囲によってのみ規定される本発明の範囲を限定するものではない。
【００１２】
実施例１
本実施例は、種々のヒト腫瘍由来型および正常細胞型に対する、代表的なフラノンである４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノン、ビタミンＣ代謝物の細胞死性能、すなわち細胞毒性能を示す。
【００１３】
以前に、ミネラル・アスコルベートと代謝物の組合せに対して感受性であることが示された４つのヒト腫瘍細胞型を評価する。これらの系は、（ｉ）肝腫瘍（ＳＫ−Ｈｅｐ−１）、（ｉｉ）悪性メラノーマ（Ｍａｌｍｅ−３Ｍ）、（ｉｉｉ）神経芽細胞腫（ＳＫ−Ｎ−ＭＣ）および（ｉｖ）大腸癌（Ｔ８４）からなる。非悪性細胞型は、正常ヒト肝臓（ＷＲＬ６８）、正常皮膚線維芽細胞（Ｍａｌｍｅ−３）および正常網膜上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）からなる。腫瘍由来系、正常肝臓および皮膚線維芽細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から得られる。ＡＲＰＥ−１９細胞系は、カリフォルニア・インスティチュート・フォー・メディカル・リサーチの同僚からの贈呈である。細胞は、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿インキュベータ中の培養液中で増殖および維持する。
【００１４】
高度に精製された合成生成物である４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノンの試料は、２バッチ（調製物１および２）の凍結生成物において、アリゾナ州プレスコット所在インターカル社により提供される。試料を使用しない場合には、受け取った後に直ちに凍結して保存する。マスターストック（１％ｗ／ｖ）のフラノンを、滅菌水中で調製し、各実験期間中は凍結して保存する。処理日に、マスターストックを、滅菌水で連続的に希釈し、１０×強度の作業ストックを得る。
【００１５】
１〜２日経過した粘着培養液の亜集密単層（９６ウェルプレートの１ウェルあたり１０，０００細胞の密度で播種）を、０．１容量の連続希釈液（１０×濃縮溶液）のフラノンに曝露し、プレートをインキュベータに戻す。フラノン処理（二回目の適用）を、培養培地を交換せずに、それぞれ１０×溶液の直接的な添加により４８時間後に繰返す。さらに４８時間インキュベートした後、培養培地を新しい増殖培地と交換し、その後、対応するフラノン濃度の３回目の適用を行なう。対照ウェルは、等量の滅菌水（フラノン溶液の代わりに）を受け、同様に扱う。４８時間の最終インキュベート後（３回の処理後）、細胞溶解液を、単層を０．２ｍＬの溶解溶液で抽出し、次いで低速遠心分離（２５００ｒｐｍ、１０分間）により調製する。上清（細胞質溶解液）をとり、アリコート（２０μｌ）中のヒストン−ＤＮＡ複合体（ヌクレオソーム断片）の存在について、細胞死検出ＥＬＩＳＡアッセイ（ロッシュ・ダイアゴニスティック）を使用して吸光光度検出（４０５〜４１０ｎｍでの吸光度）によりアッセイした。
【００１６】
３回の連続的な処理後の、正常ヒト肝臓および肝腫瘍細胞に対するフラノンの効果を図１および２に示す。評価した濃度範囲（０．０１〜０．０００１％）において、該化合物は、正常肝細胞で、０．３ｌｏｇ未満の細胞死滅率という最大変化を生じる（図１）。これに対し、細胞死の鋭い上昇が、０．０８〜０．８８ｍＭのモル濃度範囲のフラノンに対応する、０．００１〜０．０１％の範囲のフラノン濃度で処理した肝腫瘍細胞に見られる（図２）。肝腫瘍細胞におけるこの効果は、フラノン濃度の上昇と共に下降し（０．１％に近づく）、おそらくこれは、最も高い投与量（０．１％フラノン、データは示していない）での培養培地のｐＨの変化により細胞が減少するからであろう。
【００１７】
図３および４は、悪性メラノーマ（Ｍａｌｍｅ−３Ｍ）およびその正常細胞対応物のヒト皮膚線維芽細胞（Ｍａｌｍｅ−３）に対する、２つの異なるフラノンの調製物の効果を示す。肝腫瘍細胞に見られるものと類似した細胞死誘導特異性が、悪性メラノーマで観察される。従って、両方のフラノン調製物が、投与量依存的なメラノーマ系の死（アポトーシスの５から１０倍の増加）を誘導し、これに対し、正常皮膚線維芽細胞に対する効果は顕著ではない（アポトーシスにおいてｌｏｇの増加は＜０．３）。アポトーシス速度の２倍の変化をもたらすのに必要な最小濃度は、肝腫瘍細胞（＜０．００１％フラノン）よりも、メラノーマ細胞（０．００３％フラノン）の方が僅かに高い。
【００１８】
肝腫瘍およびメラノーマ細胞型に対する効果とは対照的に、フラノンによる大腸癌の処理により、同等な濃度範囲（最大０．０１％までのフラノン）で評価した場合に、（非処理対照と比べて）細胞アポトーシス速度のｌｏｇ変化は＜０．５である。より低い濃度範囲では（ＡＲＰＥ−１９では最大０．００３％およびＳＫ−Ｎ−ＭＣでは０．００１％まで）、フラノンによる処理は、正常上皮および神経芽細胞の死滅率の有意な変化を誘発しない。
【００１９】
従って、悪性および非悪性ヒト肝腫瘍およびメラノーマ細胞系の、ビタミンＣの代謝物である４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノンによる処理は、腫瘍特異的な細胞死の誘導により示されるような、悪性細胞に対する化合物の優先的な細胞毒性を示す。
【００２０】
実施例２
以下の手順は、アスコルビン酸カルシウム（ＣＡ）、アスコルビン酸カルシウム−トレオン酸カルシウム組成物（ＣＡ＋ＣＴ）、アスコルビン酸カルシウム−トレオネート−フラノン組成物（ＣＡ＋ＣＴ＋ＦＲ）および米国アリゾナ州プレスコット所在インターカル社の登録商標エステル−Ｃで入手できる市販で入手可能なアスコルビン酸カルシウム−代謝物−フラノン組成物（ＥＣ）を単独で、および、典型的な癌化学療法剤のアドリアマイシン（ドキソルビシン）と組合せた活性を実証するために実施する。
【００２１】
アスコルビン酸カルシウム（ＣＡ）、トレオン酸カルシウム（ＣＴ）、４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノン（ＦＲ）およびエステル−Ｃ（ＥＣ）は、米国アリゾナ州プレスコット所在インターカル社から得られる。組織培養等級のアスコルビン酸（ＡＡ）は、米国ＭＯ州セントルイス所在シグマ・ケミカル社からである。アスコルビン酸カルシウムの組成物（ジ（Ｌ−アスコルベート）カルシウム二水和物）は、塩を滅菌水に連続的に溶かし、等しい強度（１％ｗ／ｖ）のマスター−ストック溶液を得ることにより作成する。アスコルビン酸カルシウムとトレオン酸カルシウムと４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノン（ＣＡ／ＣＴ／ＦＲ）の水溶液は、８５／７．５／７．５の比で調製する。比較解析のために、同一なアスコルビン酸（ＡＡ）等価物を含むストック溶液を使用する。全てのマスターストックは、これらの手順の経過中、室温で保存する。これらから、１０×強度の作業ストックを、使用日に連続希釈することにより調製し、下記のようにマイクロタイタープレート中の細胞に適用する。
【００２２】
アドリアマイシン（ドキソルビシン）は、シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から得られる。ストック溶液は、滅菌水にアドリアマイシン（ＡＤＲ）を、水または希酢酸溶液（０．０１Ｎ）にＤＴＩＣを溶かすことにより作成する。ストックは−１０℃で凍結して保存し、使用前に解凍する。連続希釈液は滅菌水中で作成し、１０×強度の溶液を得、この１０分の１の容量を処理時に細胞に適用する。
【００２３】
標的ヒト腫瘍由来系は、腺癌（肝腫瘍）であるＳＫ−Ｈｅｐ−１および悪性メラノーマであるＭａｌｍｅ−３Ｍからなる。全ての播種培養液は、米国バージニア州マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）所在ＡＴＣＣから得、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿インキュベータ中の血清含有増殖培地中で増殖／維持する。ＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞を、１０％ＦＢＳと抗生物質を補充した、アール塩と非必須アミノ酸中の、イーグル最小必須培地中で増殖し、Ｍａｌｍｅ−３Ｍ細胞を、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と抗生物質を補充したＭｃＣｏｙ培地中で培養する。
【００２４】
処理のために、指数関数的に増殖している細胞を、０．１〜０．２ｍＬの増殖培地中、９６ウェルマイクロタイタープレートの１ウェルあたり、１×１０４個の細胞の密度で播種する。一晩３７℃で細胞を付着した後、複製ウェルを、１０分の１容量の１０×強度溶液の直接適用により、種々の処理に曝露する。化学療法剤に関与する処理では、１０分の１容量のアドリアマイシンの連続希釈液（０．０００６〜３．０μｍｏｌ）をウェルに適用し、その後、アスコルベート含有組成物（補助剤）または滅菌水（対照）を適用する。補助剤での処理は、隔日または３日毎に（適用可能な場合）に、増殖培地を交換することなく繰返す。非処理対照は、等量の滅菌水を受ける。補助剤による２〜３回の処理後、細胞を、下記のようなＢｕｄＲで標識する。（いくつかの実験では、ウェルに、ＢｕｄＲの添加前に等容量の増殖培地を再度供給する。これにより、再度全く流さない場合に比べて、より多くの量のＢｒｄＵがＤＮＡに取り込まれる）。
【００２５】
ＤＮＡ標識の場合、米国インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）のロッシュ・ダイアゴニスティック細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｕｄＲ（比色）アッセイから、以下の手順を採用および修正する。
【００２６】
各処理ウェルは、１０分の１の体積の１０ＸＢｒｄＵ含有培地に暴露し、３７℃にて一晩（１５〜２０時間）再インキュベートする。アッセイ用の吸収対照（基質のみ）ブランクを得るために、１セットの対照ウェルを培地のみ（ＢｕｄＲなし）に暴露した。標識期間の後、培養培地を除去し、ＦｉｘＤｅｎａｔを加えて１工程で、細胞を固定し、ＤＮＡを変性させる（室温で３０分）。次にＦｉｘＤｅｎａｔを除去し、抗ＢｒｄＵペルオキシダーゼ試薬を加え、室温にて９０分間インキュベーションを続ける。後者を除去した後、プレートを３回洗浄し、次に基質溶液を加える。着色が十分に光度検出できるようになるまで、プレートを室温で維持する（５−１０分）。このとき、各ウェルに２５マイクロリットルの１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、次に振盪器で約１分間混合する。サンプルの吸収は、停止溶液添加後５分以内に、ＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍにて測定する。ＯＤ４５０ｎｍは、ＤＮＡに包含されるＢｕｄＲレベルの指標であり、細胞増殖速度に比例する。データ分析のために、吸収の平均を各治療の化学療法剤の濃度に対してプロットし、抗増殖効果の用量反応関係を得る。
【００２７】
アスコルビン酸塩、エステル−Ｃおよび３種類のアスコルビン酸ならびに代謝産物の組合わせの、肝腫瘍細胞に対するアドリアマイシンの抗腫瘍活性への影響　図５は、ＡＤＲ１回およびアジュバント（すなわちＡＡまたはＣＡ）２回の投与後の、アドリアマイシン（ＡＤＲ）のみ、ＡＤＲおよび０．５ｍＭアスコルビン酸ならびにＡＤＲおよびアスコルビン酸カルシウム（０．５ｍＭ　ＡＡ相当物）の用量の効果を示す。
【００２８】
アジュバント（ＡＡまたはＣＡ）との組合わせ治療は、ＡＤＲのみよりも肝腫瘍増殖を大きく抑制することに注目する。向上効果は、より高いＡＤＲ用量（０．３マイクロモル）と比較して、低〜中程度の濃度のＡＤＲ用量（０．００３〜０．０３マイクロモル）で顕著である。アスコルビン酸カルシウムは、アスコルビン酸よりも有効である。同様の種類の肝腫瘍抑制は、同じ試験におけるＡＤＲとエステルＣ（０．５ｍＭ　ＡＡ相当物を含む）で見られる。
【００２９】
別の手順において、３種類のアスコルビン酸塩代謝産物の組合わせ（８５：７．５：７．５の比のＣＡ＋ＣＴ＋ＦＲ）のＡＤＲ活性に対する効果を、ＣＡまたはＥＣと比較して評価する。図７は、３種類の混合物の２つの異なる濃度（０．０１５％および０．０３３％）の、ＡＤＲ１回および混合物３回の投与後の影響を示す。グラフからわかるように、肝腫瘍細胞は、ＡＤＲのみよりもＡＤＲ＋３種類の組合わせの後に、より多く増殖する。ここでも、向上効果は、低〜中程度の用量（０．００１７〜０．０１７マイクロモル）のＡＤＲのほうが、試験を行ったより高い用量（０．１７マイクロモル）の顕著である。
【００３０】
図８は同一実験における、０．００３％のＣＡ、ＢＣおよびＣＡ＋ＣＴ＋ＦＲのＡＤＲ活性に対する相対効果を示す。３種類すべてのアスコルビン酸塩含有組成物は絶えず、低い容量のＡＤＲの抗増殖活性を改善し、ＢＣおよび３種類のアスコルビン酸塩および代謝産物混合物は、ＣＡよりも大きな改善を示している。最も顕著なことに、ＥＣおよびＣＡ＋ＣＴ＋ＦＲは両方とも、０．０１７マイクロモルのＡＤＲと組合わせて用いると、ＡＤＲのみの１０倍高い用量（０．１７マイクロモル）と比較して、同等かわずかに高い抗腫瘍効果を示す。
【００３１】
３種類のアスコルビン酸塩および代謝産物組成物の、メラノ−マ細胞のアドリアマイシンの抗増殖活性に対する効果
図９および１０は、２種類の別個の実験による、３種類の混合物（ＣＡ＋ＣＴ＋ＦＲ、０．０３３％）とＡＤＲの各種用量のヒトメラノ−マ細胞に対する効果を示す。どちらの試験においても、３種類の混合物は、化学療法剤の低〜中程度の用量において優先的に、ＡＤＲの抗腫瘍活性を増強する。
【００３２】
したがって、アスコルビン酸塩含有組成物は、細胞増殖イムノアッセイを用いて評価したように、肝腫瘍およびメラノ−マ由来の細胞系の両方に対する、癌化学療法剤（アドリアマイシン）の抗腫瘍活性を改善する。向上効果は、化学療法剤の低〜中程度の用量にて最も顕著である。アスコルビン酸塩と代謝産物を含む組成物は、アスコルビン酸のみよりもアドリアマイシン活性の向上に効果的である。アスコルビン酸カルシウム、トレオニン酸カルシウムおよびフラノンを（８５：７．５：７．５の比で）含む３種類の混合物は、低用量のアドリアマイシンと組合せると、１０倍の用量またはアドリアマイシン単独の場合と同様か、やや高いレベルで腫瘍細胞増殖を抑制する。これらの結果は、アスコルビン酸と代謝産物を、潜在的な薬剤関連毒性が低下させる低用量の化学療法と組合せて使用することを示している。
【００３３】
実施例３
本例は、ＤＮＡ合成中のＢｒｄＵ含有に基づく細胞増殖イムノアッセイを使用して、ヒト腫瘍由来メラノ−マおよび肝腫瘍細胞系に対する各種アスコルビン酸塩と代謝産物の混合物の活性を示す。
【００３４】
以下の混合物の水溶液は、各実験で使用するために新たに調製した：
以下の比における、アスコルビン酸カルシウムおよびトレオニン酸カルシウム（ＣＡ／ＣＴ）：
９９／１（標準混合物）
９７．２／２．５
９５／５
９２．５／７．５および
９０／１０
以下の比における、アスコルビン酸カルシウムおよび４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノン（ＣＡ／ＦＲ）：
９９．９／０．１（標準混合物）
９９／１
９７．２／２．５
９５／５および
９２．５／７．５
以下の比における、アスコルビン酸カルシウムおよびトレオニン酸カルシウムおよび４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノン（ＣＡ／ＣＴ／ＦＲ）：
９１．５／７．５／１
９０／７．５／２．５
９０／７．５／２．５
８８．５／７．５／５
８５／７．５／７．５
９０／１０／１および
８０／１０／１０
アスコルビン酸カルシウム、トレオニン酸カルシウムおよび４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノンは、アリゾナ州プレスコットのインターカル社（Ｉｎｔｅｒ−Ｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）より入手した。アスコルビン酸カルシウム（ジ（Ｌ−アスコルビン酸）カルシウム二水和物）の組成は、Ｌ−アスコルビン酸（８２．１５％）、カルシウム（９．４５％）および水（８．４４％）である。
【００３５】
比較分析用の等強度（１％ｗ／ｖ）のマスターストックを得るために、水性混合物は、各成分を滅菌水に順番に溶解させて作成した。場合によっては、２種類および３種類の組合わせ混合物の間の比較用アスコルビン酸相当物を得るために、１．０８％の強度のストック溶液を調製した。３種類の実験の間、すべてのマスターストックは室温で保管した。これらより、使用する日に連続希釈によって１０Ｘ強度の作用ストック溶液を調製し、以下で述べるようにマイクロタイタープレート内の細胞に加える。構成代謝物質を「エステル−Ｃ」ブランドのカルシウム中における代謝物質を反映させた比で含む標準混合物は、アリゾナ州プレスコットのインターカル社（Ｉｎｔｅｒ−Ｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）より入手した。
【００３６】
標的ヒト腫瘍由来または正常系は、悪性メラノ−マのＭａｌｍｅ−３Ｍ、肝臓腺癌（肝腫瘍）のＳＫ−Ｈｅｐ−１および正常肝臓細胞系のＷＲＬ６８細胞より成る。すべての種培養物はＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）より入手し、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿インキュベータ内で血清含有成長培地中で増殖／維持する。Ｍａｌｍｅ−３Ｍ細胞は、１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と抗生物質を添加したＭｃＣｏｙの培地中で培養し、ＳＫ−Ｈｅｐ−１およびＣＬ４８系は、１０％ＦＢＳと抗生物質を添加した、アール塩と非必須アミノ酸中のイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で培養する。
【００３７】
以下の手順は、ロッシュ・ダイアゴニスティック（インディアナ州インディアナポリス）の細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｕｄＲ（比色）アッセイから採用し、変更する。
【００３８】
処理は、指数的に成長する細胞を０．１〜０．２ｍＬの成長培地中に９６ウェルマイクロタイタープレート当たり１ｘ１０４の濃度で播種する。一晩の細胞吸着の後、２組のウェルに、１０分の１の体積の１０ｘ強度溶液を直接加えることによって、アスコルビン酸塩／代謝産物混合物の連続希釈に暴露させる。成長培地は変更せずにそれぞれのアスコルビン酸塩／代謝産物混合物を加えることによって、処理を毎日繰り返す。未処理の対照には、等量の滅菌水を加える。２、３日の処理後、細胞を以下で述べるようにＢｕｄＲで標識する。（一部の実験では、ＢｕｄＲの添加前に、ウェルに等体積の成長培地を再度加える。加えたものは、再度加えなかったものに比べて、ＤＮＡ内へのＢｒｄ含有量が多くなる）。
【００３９】
ＤＮＡ標識は、処理した各ウェルを１０分の１の体積の１０ＸＢｒｄＵ含有培地に暴露し、３７℃で一晩（１５〜２０時間）再インキュベートする。アッセイの吸収対照（基質のみ）ブランクを得るために、１組の対照ウェルを培地のみ（ＢｕｄＲを含まない）に暴露する。標識期間の後、培養培地を除去し、ＦｉｘＤｅｎａｔを加えて１工程で、細胞を固定し、ＤＮＡを変性させる（室温で３０分）。次にＦｉｘＤｅｎａｔを除去し、抗ＢｒｄＵペルオキシダーゼ試薬を加え、室温にて９０分間インキュベーションを続ける。後者を除去した後、プレートを３回洗浄し、次に基質溶液を加える。着色が十分に光度検出できるようになるまで、プレートを室温で維持する（５〜１０分）。このとき、各ウェルに２５マイクロリットルの１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、次にプレートを約１分間振盪器に置く。サンプルの吸収は、停止溶液添加後５分以内に、ＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍにて測定する。４５０ｎｍにおけるＯＤは、ＤＮＡに包含されるＢｕｄＲレベルの指標であり、細胞増殖速度に比例する。データ分析のために、吸収の平均をアスコルビン酸塩／代謝産物混合物の濃度に対してプロットし、抗増殖効果の用量反応関係を得る。
【００４０】
図１１から１６Ａにグラフで示した、そのような実験の結果は、以下のことを説明している：
・アスコルビン酸塩、トレオニン酸塩および／またはフラノンを各種の比で含む混合物は、メラノ−マおよび肝腫瘍細胞種の細胞増殖の腫瘍特異性抑制を誘発する。
【００４１】
・ＣＡ＋ＣＴ混合物でトレオニン酸カルシウムの比を１％から７．５％に上昇させると、両方の腫瘍細胞種における２種類の組合せの相対抗腫瘍活性が上昇する。
【００４２】
・アスコルビン酸カルシウムにフラノースを添加すると、メラノ−マ細胞での抗増殖活性が上昇し、２種類のＣＡ／ＦＲ組合せ（９２．５％／７．５％の比）は、シミュレートされたＣＲ／ＦＲ混合物（９９．９％／０．０１％の比）よりも高い活性を示す。０．０５％用量におけるこれらの２つの混合物には、約９倍の相違がある（ＯＤが０．００８対０．０８８）。
【００４３】
・ＣＡ＋ＣＴの２種類混合物にフラノンを加えると、両方の腫瘍型での活性が向上し、３種類のＣＡ／ＣＴ／ＦＲの組合せ（８５／７．５／７．５の比）が最適な活性を示す。肝腫瘍に対するフラノン添加の向上効果は、２種（ＣＡ＋ＦＲ）の組合せより、３種混合物でさらに顕著である。ＦＲおよびＣＴの相対レベルを１０％までさらに上昇させても、３種組合せの抗腫瘍活性は向上しない（データは示さず）。
【００４４】
・腫瘍細胞に見られる効果に対して、３種類の混合物ＣＡ／ＣＴ／ＦＲは、２種類のＣＡ＋ＣＴ混合物（９２．５／７．５）に含まれるアスコルビン酸に匹敵する（比較的より高い）アスコルビン酸相当物（９２．５／７．５／７．５）で試験を行った場合でも、正常肝臓細胞の増殖を抑制しない。
【００４５】
したがって、９２．５：７．５の比のアスコルビン酸カルシウムおよびトレオニン酸（ＣＡ＋ＣＴ）またはアスコルビン酸カルシウムおよびフラノン（ＣＡ＋ＦＲ）の２種混合物ならびに８５：７．５：７．５の比の３成分の３種混合物（ＣＡ＋ＣＴ＋ＦＲ）は、高速スクリーニングイムノアッセイにおいて、悪性メラノ−マおよび肝腫瘍細胞種に対して最適な抗増殖活性を明示する。このような混合物によって、シミュレートされた標準に含まれるアスコルビン酸よりも、低濃度のアスコルビン酸相当物にて抗腫瘍効果が見られるようになる。
【００４６】
実施例４
本例は、ＤＮＡ合成中のＢｒｄＵ含有に基づく細胞増殖イムノアッセイを使用して、ヒト腫瘍由来メラノ−マおよび肝腫瘍細胞系に対する、代表的なフラノンである、４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノンのみの活性およびフラノンとアドリアマイシンの活性について説明する。
【００４７】
新たに合成した４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノン（ＦＲ）は、アリゾナ州プレスコットのインターカル社（Ｉｎｔｅｒ−Ｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）より提供される。マスターストック（強度０．１％または０．７５％）は、滅菌水に望ましい量のフラノンを溶解させて作成し、使用するまで凍結保存した（−１０℃にて）。
【００４８】
アスコルビン酸カルシウム、トレオニン酸カルシウムおよびエステル−Ｃ（ＥＣ）も、インターカル社（Ｉｎｔｅｒ−Ｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）より入手した。アスコルビン酸カルシウム（ジ（Ｌ−アスコルビン酸）カルシウム二水和物）の組成は、Ｌ−アスコルビン酸（８２．１５％）、カルシウム（９．４５％）および水（８．４４％）である。望ましい強度のマスターストックを得るために、アスコルビン酸塩と代謝産物の水性混合物は、それぞれの成分を滅菌水に順番に溶解させて調製する。アスコルビン酸カルシウムおよびトレオニン酸カルシウムおよび４−ヒドロキシ−５−メチル−３（２Ｈ）−フラノン（ＣＡ／ＣＴ／ＦＲ）の３種混合物は８５／７．５／７．５または８７．５／７．５／５．０の比で調製する。これらより、使用する日に連続希釈によって１０Ｘ強度の作用ストック溶液を調製し、以下で述べるようにマイクロタイタープレート内の細胞に加える。
【００４９】
アドリアマイシン（ドキソルビシン）はシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）（ミズーリ州セントルイス）より得る。ストック溶液は、アドリアマイシン（ＡＤＲ）を滅菌水に溶解させて作成する。ストック溶液は−１０℃で凍結保存し、使用前に解凍する。１０Ｘ強度溶液を得るために、滅菌水で連続希釈を行い、この０．１体積を処理時に細胞に加える。
【００５０】
標的ヒト腫瘍由来系は、肝臓腺癌（肝腫瘍）のＳＫ−Ｈｅｐ−１および悪性メラノ−マのＭａｌｍｅ−３Ｍより成る。種培養物はＡＴＣＣ（バージニア州マナッサス）より入手し、５％ＣＯ２／９５％空気の加湿インキュベータ内で血清含有成長培地中で増殖／維持する。ＳＫ−Ｈｅｐ−１は、１０％ＦＢＳと抗生物質を添加した、アール塩と非必須アミノ酸中のイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で培養し、Ｍａｌｍｅ−３Ｍ細胞は、１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）と抗生物質を添加したＭｃＣｏｙの培地中で培養する。
【００５１】
処理は、指数的に成長する細胞を０．１〜０．２ｍＬの成長培地中に９６ウェルマイクロタイタープレート当たり１ｘ１０４の濃度で播種する。３７℃で一晩の細胞吸着の後、２組のウェルに、１０分の１の体積の１０ｘ強度溶液を直接加えることによって、各処理に暴露させる。化学療法剤を含む処理の場合、アドリアマイシンの（指示された用量範囲内の）連続希釈物の１０分の１の体積をウェルに加え、次にアジュバント（すなわちフラノンまたはアスコルビン酸および代謝産物）を加える。アジュバントによる処理は、成長培地を変更せずに、毎日または（適用可能な場合は）一日おきに繰り返す。アジュバントによる３回までの処理の後、細胞は以下で述べるように、ブロモデオキシウリジン（ＢｕｄＲ）によって一晩標識する。（一部の実験では、ＢｕｄＲの添加前に、ウェルに等体積の成長培地を再度加える。加えたものは、再度加えなかったものに比べて、ＤＮＡ内へのＢｒｄ含有量が多くなる）。
【００５２】
ＤＮＡ標識は、以下の手順をロッシュ・ダイアゴニスティック（インディアナ州インディアナポリス）の細胞増殖ＥＬＩＳＡ、ＢｕｄＲ（比色）アッセイから採用し、変更する。処理した各ウェルを１０分の１の体積の１０ＸＢｒｄＵ含有培地に暴露し、３７℃で一晩（１５〜２０時間）再インキュベートする。アッセイの吸収対照（基質のみ）ブランクを得るために、１組の対照ウェルを培地のみ（ＢｕｄＲを含まない）に暴露する。標識期間の後、培養培地を除去し、ＦｉｘＤｅｎａｔを加えて１工程で、細胞を固定し、ＤＮＡを変性させる（室温で３０分）。次にＦｉｘＤｅｎａｔを除去し、抗ＢｒｄＵペルオキシダーゼ試薬を加え、室温にて９０分間インキュベーションを続ける。後者を除去した後、プレートを３回洗浄し、次に基質溶液を加える。着色が十分に光度検出できるようになるまで、プレートを室温で維持する（５〜１０分）。このとき、各ウェルに２５マイクロリットルの１Ｍ硫酸を加えて反応を停止させ、次に振盪器でを約１分間に混合する。サンプルの吸収は、停止溶液添加後５分以内に、ＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍにて測定する。ＯＤ４５０ｎｍは、ＤＮＡに包含されるＢｕｄＲレベルの指標であり、細胞増殖速度に比例する。データ分析のために、吸収の平均を各処理によるアジュバントまたは化学療法剤の濃度に対してプロットし、抗増殖効果の用量反応関係を得る。
【００５３】
試験の濃度範囲（０．００３％〜０．０１％）では、肝腫瘍増殖の濃度依存性低下が見られ、０．０１％フラノンは未処理対照と比較して、最高４．６倍の細胞ＤＮＡ合成の低下を生じる。同様の濃度依存性特性が３種類の別個の実験で得られる。
【００５４】
ＡＤＲは単独で、試験範囲（０．０２〜０．３３マイクロモル）にて肝腫瘍増殖の濃度依存性阻害を引き起こす。フラノン（０．００１〜０．０１％）と組合わせると、組合せによってさらに高い阻害性が付与され、ＡＤＲ単独の対応する用量によって得られる阻害に対して、約２から２２倍の肝腫瘍阻害の向上が生じる。（２種類の別個の実験より、ＡＤＲによる阻害を２倍に向上させるのに必要なフラノンの最低用量は、〜０．００１６％であり、これは１％エステル−Ｃ溶液中のフラノンの絶対に濃度にほぼ一致する）。これらの実験により、比較分析の次の実験で使用するフラノン濃度の範囲が定義される。
【００５５】
試験を行った濃度範囲（０．００１〜０．０１％）では、水溶液中での同一絶対濃度で比較した場合、フラノンは、アスコルビン酸塩／代謝産物の３種混合物またはエステル−Ｃ（Ｒ）のどちらよりも、肝腫瘍増殖の阻害においてより有効である。
【００５６】
ＡＤＲの最小用量（０．００７マイクロモル）およびアジュバントの最大用量（０．０１％）において、フラノンはＡＤＲの阻害効果を７倍に向上させるのに対して、３種混合物では３．１倍、ＥＣでは２．７倍の向上である。
【００５７】
（０．１％における）フラノンは、化学療法剤の全濃度において、ＡＤＲの阻害効果を一貫して向上させる。これに対して、３種混合物とＥＣはＡＤＲの中程度の用量（０．１３６マイクロモル）にて匹敵する向上を示すが、フラノンはＡＤＲの低用量（０．００５〜０．２７マイクロモル）にて、どちらよりも優れた性能を示す。
【００５８】
したがって、フラノン単独で肝腫瘍およびメラノ−マ細胞系の両方の細胞増殖を抑制することができる。さらにフラノンは、化学療法剤（アドリアマイシン）と組合わせると、アジュバントとして機能することが可能であり、組合せ実験での阻害効果を向上させる。重量対重量ベースでは、フラノンの抗増殖およびアジュバント（相乗）効果は、アスコルビン酸塩／代謝産物の３種混合物またはエステル−Ｃよりも高く、フラノンの化学構造が、アスコルビン酸塩およびその代謝産物を含む組成物の抗腫瘍効果の原因となる活性成分を含んでいる可能性がある。
【００５９】
本発明を、当業者が理解および実施できるように説明し、現在好ましい実施形態を示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、正常肝細胞に対する、代表的なビタミンＣ由来フラノン（ＦＲ）の、フラノンによる３回の処理適用後の効果を示す。
【図２】
図２は、ヒト肝腫瘍細胞に対するフラノンの効果を示す。
【図３】
図３は、ヒトメラノーマ細胞および正常皮膚線維芽細胞におけるフラノン（１番の調製物）の細胞死活性を示す。
【図４】
図４は、ヒトメラノーマ細胞および正常皮膚線維芽細胞におけるフラノン（２番の調製物）の細胞死誘導活性を示す。
【図５】
図５は、アドリアマイシン（ＡＤＲ）単独、ＡＤＲと５ｍＭアスコルビン酸（ＡＡ）、ＡＤＲと５ｍＭ　ＡＡに等価なアスコルビン酸カルシウム（ＣＡ）の投与量に対する、１および２回適用後の、肝腫瘍に対する効果を示す。
【図６】
図６は、ＡＤＲとエステル−Ｃ（０．５ｍＭのＡＡに等価）による類似した肝腫瘍抑制を示す。
【図７】
図７は、ＡＤＲと、２つの異なる濃度の３元混合物（ＣＡ＋ＣＴ＋ＦＲ）の、ＡＤＲの１回の適用および混合物の３回の適用後の影響を示す。
【図８】
図８は、ＣＡ、ＥＣおよびＣＡ＋ＣＴ＋ＦＲのＡＤＲ活性に対する相対効果を示す。
【図９】
図９は、２つの異なる試験での、ヒトメラノーマ細胞に対する、種々の投与量のＡＤＲにおける３元複合体（ＣＡ＋ＣＴ＋ＦＲ）の効果を示す。
【図１０】
図１０は、２つの異なる試験での、ヒトメラノーマ細胞に対する、種々の投与量のＡＤＲにおける３元複合体（ＣＡ＋ＣＴ＋ＦＲ）の効果を示す。
【図１１】
図１１は、ＢｕｄＲをベースとした細胞増殖イムノアッセイにより測定した、異なる比のトレオネート対アスコルベートを含む組合せで２回連続的に処理した後の、それぞれメラノーマおよび肝腫瘍細胞に対する効果を示す。
【図１２】
図１２は、ＢｕｄＲをベースとした細胞増殖イムノアッセイにより測定した、異なる比のトレオネート対アスコルベートを含む組合せで２回連続的に処理した後の、それぞれメラノーマおよび肝腫瘍細胞に対する効果を示す。
【図１３】
図１３は、ＢｕｄＲ細胞増殖ＥＬＩＳＡによりアッセイした、種々の比のフラノン対アスコルベートを含む混合物で３回処理した後の、それぞれメラノーマおよび肝腫瘍細胞に対する感受性を比較する。
【図１４】
図１４は、ＢｕｄＲ細胞増殖ＥＬＩＳＡによりアッセイした、種々の比のフラノン対アスコルベートを含む混合物で３回処理した後の、それぞれメラノーマおよび肝腫瘍に対する感受性を比較する。
【図１５】
図１５は、上記のアッセイにおいて、漸増濃度（１％から７．５％）のフラノンを含む３元混合物の、それぞれメラノーマおよび肝腫瘍に対する効果を示す。
【図１６】
図１６は、上記のアッセイにおいて、漸増濃度（１％から７．５％）のフラノンを含む３元混合物の、それぞれメラノーマおよび肝腫瘍に対する効果を示す。図１６Ａは、２元（ＣＡ＋ＣＴ）混合物と類似したアスコルビン酸等価物を含む、３元混合物（ＣＡ（９２．５％）／ＣＴ（７．５％）／ＦＲ（７．５％）の正常肝臓および肝腫瘍細胞に対する効果を示す。
【図１７】
図１７は、肝腫瘍細胞系（ＳＫ−Ｈｅｐ−１）の増殖に対するフラノン単独の効果を示す。
【図１８】
図１８は、種々の濃度のＡＤＲに曝露した肝腫瘍細胞の増殖に対する、フラノンの効果を示す。
【図１９】
図１９は、肝腫瘍細胞の増殖に対する、フラノン単独、ＣＡ＋ＣＴ＋ＦＲおよびエステルＣ（ＥＣ）の効果を示す。
【図２０】
図２０は、ＡＤＲと組合わせた、フラノン、ＣＡ＋ＣＴ＋ＦＲおよびＥＣの、肝腫瘍細胞の増殖に対する比較活性を示す。
【図２１】
図２１は、全濃度のＡＤＲにおけるＡＤＲと組合わせた、フラノン、ＣＡ＋ＣＴ＋ＦＲおよびＥＣの、メラノーマ細胞の増殖に対する効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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