(57)【要約】本発明は分子をスクリーニングする方法、およびタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
候補薬剤がＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）およびＪａｂ１（ｃ−Ｊｕｎ活性化ドメイン結合タンパク質）の間の相互作用を崩壊させるか否か、ならびに／または該候補薬剤がＭＩＦ−Ｊａｂ１依存性の作用を特異的に妨害するか否かを試験することによって候補薬剤をスクリーニングする方法であって、その方法が、ＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用、および／またはＭＩＦ−Ｊａｂ１依存性の作用を、該候補薬剤の存在しない条件でＭＩＦおよびＪａｂ１システムで検出し、その検出された相互作用および／または作用を、ＭＩＦおよびＪａｂ１システムで候補薬剤が存在する条件での相互作用および／または作用と比較することを含んでなる方法。
【請求項２】
方法がｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＭＩＦとＪａｂ１との相互作用が結合アッセイによって検出される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
結合が放射活性標識もしくは光標識ＭＩＦ、Ｊａｂ１、ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体、ならびに／またはそれらの抗体を用いて測定される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
結合が電気泳動移動度シフトアッセイを用いて測定される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
固定化されていないＭＩＦ、Ｊａｂ１、ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体、および／またはそれらの抗体が固定化されたＭＩＦ、Ｊａｂ１、ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体、および／またはそれらの抗体と結合し、その結果得られた複合体が沈降反応、特に遠心またはろ過によって分離される、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
結合がクロマトグラフィーによる分画によって測定される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＭＩＦおよびＪａｂ１がｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳によって得られる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ＭＩＦおよびＪａｂ１が細胞の粗抽出物中に含まれている、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
方法がｉｎ ｖｉｖｏの方法である、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法であって、
ａ）　ＭＩＦおよび／もしくはＪａｂ１を過剰発現している細胞を提供し、
ｂ）　ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体標的活性、特に候補薬剤が存在しない条件でのリポーター遺伝子の発現を検出し、
ｃ）　ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体標的活性、特に候補薬剤が存在する条件でのリポーター遺伝子の発現を検出し、ならびに
ｄ）　ｂ）およびｃ）で得られた結果を比較する、
ことを含んでなる方法。
【請求項１２】
ＭＩＦおよび／またはＪａｂ１を過剰発現している細胞がＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体によって誘導されうるリポーター遺伝子を含んでいる、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ＭＩＦおよび／またはＪａｂ１を過剰発現している細胞が、
ａ）　プロモーターの機能的制御下にあるＭＩＦコード配列を含んでいるベクター、
プロモーターの機能的制御下にあるＪａｂ１コード配列を含んでいるベクター、
および
リポーター遺伝子を含んでいるベクター、
または、
ｂ）　単一のプロモーターの機能的制御下にあるＭＩＦおよびＪａｂ１をコードする遺伝子を含んでいるベクターならびにリポーター遺伝子を含んでいるベクター、
または、
ｃ）　単一のプロモーターの機能的制御下にあるＭＩＦおよびＪａｂ１をコードする配列ならびにリポーター遺伝子を含んでいるベクター、
を用いて宿主細胞をトランスフェクトして得られる、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）　次のものを含んでいる細胞を提供し；
ｉ）　ＤＮＡ結合タンパク質認識部位に機能しうる形で連結された、リポーター遺伝子；
ｉｉ）　ＤＮＡ結合タンパク質認識部位と特異的に結合するＤＮＡ結合部分に共有結合で結合されたＭＩＦを含んでいる第１のハイブリッドタンパク質を発現している第１の融合遺伝子；および
ｉｉｉ）　候補薬剤が存在しない条件ではＪａｂ１がＭＩＦと結合する、遺伝子活性化部分に共有結合で結合されたＪａｂ１を含んでいる第２のハイブリッドタンパク質を発現している第２の融合遺伝子；
ｂ）　前記細胞を候補薬剤とリポーター遺伝子の発現が可能な条件下で接触させ、ならびに、
ｃ）　前記リポーター遺伝子の発現の阻害を、候補薬剤がＭＩＦとＪａｂ１間の結合を崩壊させる能力の尺度として検出すること、
を含んでなる、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
ＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用を検出するための方法であって：
ａ）　リポーター遺伝子を含んでいる細胞であって、転写活性化ドメインがリポーター遺伝子に十分近接している場合には、該リポーター遺伝子が該転写活性化ドメインを含むアミノ酸配列により活性化されるとき、該リポーター遺伝子がリポータータンパク質を発現する、細胞を提供し、
ｂ）　宿主細胞中で発現されうる第１のキメラ遺伝子であって、第１のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでおり、該第１のハイブリッドタンパク質は、
ｉ）　前記細胞内の該リポーター遺伝子の結合部位を認識するＤＮＡ結合ドメイン；および、
ｉｉ）　ＭＩＦタンパク質もしくはその一部分、
を含んでいる、第１のキメラ遺伝子を提供し、
ｃ）　宿主細胞中で発現されうる第２のキメラ遺伝子であって、第２のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでおり、該第２のハイブリッドタンパク質は、
ｉ）　転写活性化ドメイン、
および
ｉｉ）　Ｊａｂ１タンパク質もしくはその一部分、を含む
ｉｉｉ）　前記細胞内でのＭＩＦタンパク質とＪａｂ１との間の相互作用によって転写活性化ドメインのリポーター遺伝子の転写の活性化が生じる、第２のキメラ遺伝子を提供し、
ｄ）　第１のキメラ遺伝子と第２のキメラ遺伝子を細胞内に導入し、
ｅ）　前記細胞を、第１のハイブリッドタンパク質および第２のハイブリッドタンパク質の発現が、リポーター遺伝子が活性化されるために十分な量であるような条件下に置かれ、
ならびに、
ｆ）　前記リポーター遺伝子が、ＭＩＦタンパク質とＪａｂ１タンパク質の間の相互作用がない場合における発現よりも高い程度に発現されたか否かを決定すること、
を含んでなる方法。
【請求項１６】
リポーター遺伝子の発現がスクリーニングしようとする候補薬剤を与えた細胞中で測定され、その薬剤を与えていない細胞における該リポーター遺伝子の発現と比較される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインが、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを有する転写活性化因子由来のものである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
転写活性化ドメイン中の該ＤＮＡ結合ドメインが、転写活性化因子ＧＡＬ４、ＧＣＮ４、およびＡＤＲ１からなる群から選択されたものである、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
第１のハイブリッドタンパク質および／または第２のハイブリッドタンパク質が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および合成ＤＮＡからなる群から由来するＤＮＡインサートを含んでいるプラスミドのライブラリー上にコードされている、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
キメラ遺伝子が細胞中にプラスミドの形態で導入される、請求項１５から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
第１キメラ遺伝子が細胞の染色体中に組み込まれる、請求項１５から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
第１キメラ遺伝子が細胞の染色体中に組み込まれ、第２キメラ遺伝子が宿主細胞中にプラスミドの一部分として導入される、請求項１５から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインが異なる転写活性化因子からのものである、請求項１５から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ＭＩＦとＪａｂ１との間の相互作用がＭＩＦまたはＪａｂ１と競合するペプチドの存在下で試験される、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
ＭＩＦと競合するペプチドが、
ＭＩＦ （５０−６５） （配列番号１）または
Ｓｅｒ５７ Ｓｅｒ６０ ＭＩＦ（５０−６５） （配列番号２）
である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＭＩＦを調製する方法であって、
ａ）　ＭＩＦを含有している第１の供給源を提供し、
ｂ）　ＭＩＦを含有している第１の供給源をＪａｂ１を含有している第２の供給源と、ＭＩＦとＪａｂ１の結合が可能な条件下で接触させ、および
ｃ）　ＭＩＦをＪａｂ１から分離する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２７】
Ｊａｂ１を調製する方法であって、
ａ）　Ｊａｂ１を含有している第１の供給源を提供し、
ｂ）　Ｊａｂ１タンパク質を含有している第１の供給源をＭＩＦを含有している第２の供給源と、ＭＩＦとＪａｂ１の結合が可能な条件下で接触させ、
ｃ）　Ｊａｂ１をＭＩＦから分離する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２８】
供給源が細胞、組織、細胞培養物、細胞培養上清、細胞抽出物、タンパク質調製物、単離されたＭＩＦまたはＪａｂ１である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
供給源のそれぞれが、供給源と接触する前に消化される、請求項２６から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
Ｊａｂ１の全体または一部分と会合させ、任意で、ｐ２７Ｋｉｐ１および／またはｃ−Ｊｕｎおよび／またはｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼおよび／またはステロイド受容体コアクチベーター１および／またはインテグリンＬＦＡ−１および／またはプロゲステロン受容体および／または糖質コルチコイド受容体と会合させたＭＩＦの全体または一部分を含んでなるタンパク質複合体。
【請求項３１】
Ｊａｂ１の全体または一部分と結合させ、任意で、ｐ２７Ｋｉｐ１および／またはｃ−Ｊｕｎおよび／またはｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼおよび／またはステロイド受容体コアクチベーター１および／またはインテグリンＬＦＡ−１および／またはプロゲステロン受容体および／もしくは糖質コルチコイド受容体と結合させたＭＩＦの全体または一部分を含んでなる融合タンパク質。
【請求項３２】
請求項３０もしくは３１に記載のタンパク質複合体もしくは融合タンパク質またはそれらの相補的鎖をコードする核酸配列。
【請求項３３】
請求項３２に記載の核酸配列を含んでいるベクター。
【請求項３４】
請求項３３に記載のベクターを含んでいる宿主細胞。
【請求項３５】
請求項３０および／または請求項３１に記載の複合体および／または融合タンパク質を特異的に認識する、抗体またはそのフラグメント。
【請求項３６】
抗体がモノクローナル抗体である請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】
抗体がポリクローナル抗体である請求項３５に記載の抗体。
【請求項３８】
抗体がヒト化抗体である請求項３５から３７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３９】
抗体がヒト抗体である、請求項３５から３８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４０】
抗体もしくはそのフラグメントが検出可能な標識を有する、ならびに／または該抗体もしくはそのフラグメントが改変されたものである、請求項３５から３９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４１】
請求項３０に記載のタンパク質複合体、請求項３１に記載の融合タンパク質、請求項３２に記載の核酸配列、請求項３３に記載のベクター、請求項３４に記載の宿主細胞、Ｊａｂ１をコードするＤＮＡ配列、ＭＩＦをコードするＤＮＡ配列、および／または請求項３５から４０のいずれか１項に記載の抗体を含んでなるキット。
【請求項４２】
請求項３０に記載のタンパク質複合体、請求項３１に記載の融合タンパク質、請求項３２に記載の核酸配列、請求項３３に記載のベクター、請求項３４に記載の宿主細胞、Ｊａｂ１をコードするＤＮＡ配列、ＭＩＦをコードするＤＮＡ配列、および／または請求項３５から４０のいずれか１項に記載の抗体、任意で製薬上許容される担体と結合させたものを含んでなる医薬組成物もしくは診断用組成物。
【請求項４３】
Ｊａｂ１またはＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列の、ＭＩＦの活性をモジュレートするため、とりわけＭＩＦ関連疾患の治療のための使用。
【請求項４４】
Ｊａｂ１またはＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列の、ＭＩＦ関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用。
【請求項４５】
Ｊａｂ１またはＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列の、ＭＩＦ関連疾患の診断および／または治療のための使用。
【請求項４６】
請求項３０に記載のタンパク質複合体および／または請求項３１に記載の融合タンパク質のＭＩＦ関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用。
【請求項４７】
請求項３０に記載のタンパク質複合体および／または請求項３１に記載の融合タンパク質のＭＩＦ関連疾患の診断および／または治療のための使用。
【請求項４８】
請求項３５から４０のいずれか１項に記載の抗体またはＪａｂ１に対する抗体またはその断片のＭＩＦ関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用。
【請求項４９】
請求項３５から４０のいずれか１項に記載の抗体またはＪａｂ１に対する抗体またはその断片のＭＩＦ関連疾患の診断および／または治療のための使用。
【請求項５０】
Ｊａｂ１もしくはその一部分、またはＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列、またはＪａｂ１を特異的に認識する抗体を、製薬上有効な量で、任意で製薬上許容される担体と共に含んでなる薬剤。
【請求項５１】
ＭＩＦもしくはＭＩＦをコードするヌクレオチド配列の、Ｊａｂ１の活性のモジュレート、特にＭＩＦ関連疾患の治療のための使用。
【請求項５２】
ＭＩＦまたはＭＩＦをコードするヌクレオチド配列の、Ｊａｂ１関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用。
【請求項５３】
ＭＩＦまたはＭＩＦをコードするヌクレオチド配列の、Ｊａｂ１関連疾患の診断および／または治療のための使用。
【請求項５４】
請求項３０に記載のタンパク質複合体および／または請求項３１に記載の融合タンパク質のＪａｂ１関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用。
【請求項５５】
請求項３０に記載のタンパク質複合体および／または請求項３１に記載の融合タンパク質のＪａｂ１関連疾患の診断および／または治療のための使用。
【請求項５６】
請求項３５から４０のいずれか１項に記載の抗体またはＭＩＦに対する抗体またはその断片のＪａｂ１関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用。
【請求項５７】
請求項３５から４０のいずれか１項に記載の抗体またはＭＩＦに対する抗体またはその断片のＪａｂ１関連疾患の診断および／または治療のための使用。
【請求項５８】
ＭＩＦもしくはその一部分、またはＭＩＦをコードするヌクレオチド配列、またはＭＩＦを特異的に認識する抗体を、製薬上有効な量で、任意で製薬上許容される担体と共に含んでなる薬剤。
【請求項５９】
改変されたＭＩＦおよびＪａｂ１の発現を示す非ヒト哺乳類の細胞。
【請求項６０】
少なくとも１つの変異を細胞のＭＩＦ遺伝子およびＪａｂ１遺伝子各々の中に含んでいる、請求項５９に記載の細胞。
【請求項６１】
内在性ＭＩＦ遺伝子およびＪａｂ１遺伝子の発現を妨害するＭＩＦおよび／またはＪａｂ１アンチセンス構築物を含んでいる、請求項５９に記載の細胞。
【請求項６２】
請求項５９から６１のいずれか１項に記載の細胞を含んでいる非ヒト哺乳類。
【請求項６３】
改変されたＭＩＦおよびＪａｂ１の発現を示すヒト細胞。
【請求項６４】
細胞のＭＩＦ遺伝子およびＪａｂ１遺伝子の各々に少なくとも１つの変異が含まれている、請求項６３に記載の細胞。
【請求項６５】
内在性ＭＩＦ遺伝子およびＪａｂ１遺伝子の発現を妨害するＭＩＦおよび／またはＪａｂ１アンチセンス構築物を含んでいる、請求項６３に記載の細胞。
【請求項６６】
請求項６３から６５のいずれか１項に記載の細胞を含んでいる非ヒト哺乳類。
【請求項６７】
請求項５９から６１、または６３から６５のいずれか１項に記載の細胞の、遺伝子治療を目的とする使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の説明
本発明はＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）関連疾患を治療することもしくは検出することに有効な候補薬剤をスクリーニングする方法、およびそれに用いられる手段に関する。
【０００２】
抗原性の、もしくは細胞分裂促進性の刺激に応答して、リンパ球は免疫調節、炎症、ストレスに対する応答、および細胞性免疫のエフェクター機作において重要な役割を果たしているリンフォカインと呼ばれるタンパク質メディエーターを分泌する。リンフォカインの活性で最初に報告されたものは、抗原で感作され活性化されたモルモットのリンパ球の培養上清中に観察された。この活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの毛細血管の外部へのモルモットマクロファージの遊走を妨げる能力のため、遊走阻止因子（ＭＩＦ）と名付けられた。ＭＩＦは、マクロファージ、後部下垂体細胞、および内皮細胞の分泌可能な産物で、マクロファージ、Ｔリンパ球およびその他の特定の細胞タイプの双方を活性化するものとして同定されてきた。
【０００３】
ＭＩＦ活性の検出は遅延性過敏症および細胞性免疫、同種移植片拒絶反応、リウマチ性多関節性滑液炎、ならびに自己免疫疾患を含む種々の炎症性応答と相関している。さらに、ＭＩＦは酵素活性を有し、トートメラーゼ（ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ）およびチオールタンパク質オキシドレダクターゼ活性を示す。ＭＩＦは種々の炎症誘発性を有している。この機能において、ＭＩＦは、グラム陰性およびグラム陽性敗血症ショック、成人呼吸窮迫症候群を含むいくつかの炎症性疾患のメディエーターであることが示され、その炎症誘発性は、部分的にはインターロイキン−１、腫瘍壊死因子などの他の炎症誘発性サイトカインの放出をＭＩＦが誘導する能力によるものであり、糖質コルチコイド作用の対抗制御によるものである。ＭＩＦはまた、細胞性レドックスホメオスタシスの調節に役割を果たしている。機能的には他のサイトカインと類似しているにも関わらず、ＭＩＦは多数の特徴的な性質を示す。例えば、ＭＩＦの発現は免疫系および内分泌系の細胞に限定されておらず、ＭＩＦタンパク質は大多数のＭＩＦを発現する細胞中であらかじめ形成された形で認められる。
【０００４】
ＭＩＦ関連疾患の診断および治療のための手段の開発はきわめて重要ではあるが、ＭＩＦの作用の分子的標的はまだ同定されていない；ＭＩＦは細胞内タンパク質との相互作用に基づく直接的細胞内機能を有しているのかもしれない。ＭＩＦと他のタンパク質との相互作用を崩壊させる、妨げる、増強する、もしくはモジュレートする分子−いわゆる薬剤−は、細胞サイクルのコントロール、免疫調節、レドックス効果、および調節経路におけるＭＩＦの重要な役割に影響を与えることができる。
【０００５】
原理的には、ＭＩＦの他のタンパク質との相互作用はツーハイブリッドシステムで試験することができる。酵母ツーハイブリッドシステムはタンパク質のペアの会合を検出するために用いられてきた（例えば、Ｆｉｅｌｄｓら， 米国特許第５，２８３，１７３号を参照せよ）。この方法には転写因子の２種類の分離したドメインのｉｎ ｖｉｖｏでの再構成が含まれる。その転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、ある選択されたプロモーターを認識するために必要である。活性化ドメインはその細胞の転写装置の他のコンポーネントに接触するために必要である。このシステムでは転写因子はハイブリッドタンパク質の使用によって再構成される。一方のハイブリッドは活性化ドメインおよび第１の対象のタンパク質からなっている。第２のハイブリッドは結合ドメインと第２の対象のタンパク質からなっている。第１および第２の対象のタンパク質が相互作用するような場合には、活性化ドメインおよび結合ドメインは物理的に近い距離となり、それによって転写因子が再構成される。タンパク質の会合は再構成された転写因子がリポーター遺伝子の転写を活性化する能力をアッセイすることによって測定することができる。
【０００６】
薬剤をスクリーニングする方法は既知である（米国特許第号５，５６９，５８８号）。ある生物体の候補薬剤に対する転写応答性をモデル化するための方法には、例えば、（ａ）ある標的生物体の種々の、別々に単離された多数の細胞の各々からのリポーター遺伝子産物のシグナルを検出すること、ここでそれらの細胞の各々は標的生物体の種々の内因性転写調節エレメントに機能しうる形で連結されたリポーター遺伝子を含んでいる組換え構築物を含有しているものであって、それによってその転写調節エレメントがリポーター遺伝子の発現を調節するようになっているが、それらの細胞での応答の総和が、その生物体の転写調節エレメントの全体としての姿を示しており、それはその生物体のある薬剤に対する転写応答性を示すのに十分なものであり；（ｂ）各細胞を候補薬剤と接触させ；（ｃ）各細胞からのリポーター遺伝子産物のシグナルを検出し；（ｄ）その細胞が候補薬剤と接触する前および後の各細胞からのリポーター遺伝子産物のシグナルを比較し、薬剤の応答プロフィールを得るが、それはその生物体の候補薬剤に対する転写応答のモデルを提供する。
【０００７】
このように、（ｉ）ＭＩＦの細胞内標的分子、例えばタンパク質との相互作用の検出、および（ｉｉ）このＭＩＦと細胞内標的分子との相互作用を改変する分子の同定を行いうる方法と手段を開発し提供することは特に重要と考えられる。
【０００８】
本発明の背景となる技術的問題点は、ＭＩＦ関連疾患の診断および治療において有効な薬剤をスクリーニングするための手段と方法を提供することである。
候補薬剤が、相互作用、とりわけＭＩＦとＪａｂ１との間の相互作用を崩壊させる、および／またはＭＩＦ／Ｊａｂ１特異的な細胞性の効果を妨害するか否かを試験することによってＭＩＦ関連疾患の診断および治療に有効な候補薬剤のスクリーニングのための方法を提供することで本発明はこの問題を解決している。その方法は、ＭＩＦとＪａｂ１のシステムにおけるＭＩＦとＪａｂ１との相互作用、および／またはＭＩＦ／Ｊａｂ１特異的な細胞性効果を、候補薬剤の存在しない状態で検出し、その検出された相互作用および／または細胞性効果を、候補薬剤の存在下でＭＩＦとＪａｂ１を含んだシステム中で検出された相互作用および／または細胞性効果と比較し、それによって検出され、比較された相互作用および／または細胞性効果は、好ましくはＭＩＦ／Ｊａｂ１複合体をベースとした特異的な生物学的効果である。
【０００９】
本発明は、従ってＭＩＦとＪａｂ１が相互作用し、とりわけ相互に結合してＭＩＦ／Ｊａｂ１複合体を形成するとの知見に特に基づいたものである。ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体が重要な役割を果たす広範な医学的応用は本発明に包含され、例えば、細胞増殖関連疾患一般、特に本発明の方法はＭＩＦ関連疾患：内因性ブドウ膜炎、タンパク尿、糸球体腎炎、創傷治癒、発癌、耳鳴り、敗血症性ショック、および関節炎その他の治療のための薬剤を測定し見つけ出すために用いることができる。
【００１０】
ＭＩＦとＪａｂ１との間の相互作用は、サイトカインが細胞性の調節経路を転写コアクチベーターとの直接的な相互作用によってモジュレートできることを示している。ＭＩＦ−Ｊａｂ１相互作用はＭＩＦの重要な活性の分子的基礎を提供している。
【００１１】
Ｊａｂ１（ｃ−Ｊｕｎ活性化ドメイン結合タンパク質）、特にＰ３８Ｊａｂ１はもともとはｃ−ＪｕｎおよびＪｕｎＤ転写因子の特異的コアクチベーターとして同定された、３８Ｋのタンパク質であり、これはサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤ｐ２７Ｋｉｐのネガティブレギュレーターとしても作用する。Ｊａｂ１の転写コアクチベーター機能はＡＰ−１依存性転写活性の増強によるものである。Ｊａｂ１はＭｏｖ３４ファミリーのタンパク質の一員である（ＨｏｆｍａｎｎとＢａｃｈｅｒ， １９９８； Ａｓａｎｏら， １９９７）。ＭＩＦはＪａｂ１によるＡＰ−１転写活性の増強を阻害する。Ｊａｂ１はｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ活性（ＪＮＫ）を活性化するものとして同定され、この効果はＭＩＦによって顕著にダウンレギュレートされる。本発明ではＭＩＦはＪａｂ１およびＴＮＦがメディエートするＪＮＫの活性化をブロックする。本発明では、ＭＩＦはまた、Ｊａｂ１依存性細胞サイクルプロセスを対抗制御する。ＭＩＦはｐ２７Ｋｉｐ１タンパク質を安定化することによってｐ２７Ｋｉｐ１発現を増加させ、Ｊａｂ１がメディエートする飢餓によって誘導される成長の停止からの繊維芽細胞のレスキューを阻害する。ＭＩＦは細胞質ゾル中でＪａｂ１と共存し、それらは双方とも内因性に発現されるが、外因性ＭＩＦはエンドサイトーシス後に得られ、それは細胞質ゾル中で細胞質ゾル結合Ｊａｂ１の標的となる。ＭＩＦは、Ｊａｂ１によっておよび刺激によって増強されるＡＰ−１活性を阻害するが、ＮＦκＢの誘導は妨害しない。Ｊａｂ１はＪＮＫ活性を活性化し、内因性のホスホｃ−Ｊｕｎのレベルを増強するが、ＭＩＦはこれらの効果を阻害する。ＭＩＦはまた、Ｊａｂ１依存性細胞サイクル調節をｐ２７Ｋｉｐタンパク質の安定化によってｐ２７Ｋｉｐ発現を増加させることでアンタゴナイズする。この結果、Ｊａｂ１がメディエートする繊維芽細胞の増殖停止からのレスキューはＭＩＦによってブロックされる。野生型ＭＩＦの残基５０−６５のみからなるＭＩＦペプチド、および突然変異体Ｃｙｓ６０（６０の位置にＣｙｓを持つ野生型ＭＩＦ）の分析によって５０−６５の領域がＪａｂ１との結合およびモジュレーションに重要であることが示されている。ＭＩＦは広範囲に作用してＪａｂ１で制御される経路をネガティブに調節し、ＭＩＦ／Ｊａｂ１相互作用はＭＩＦのいくつかの重要な活性に対する、長いあいだ探し求められてきた分子的基盤を提供しうる。ＭＩＦは幅広く作用してＪａｂ１が制御する細胞性の経路をネガティブに調節する。ＭＩＦ−Ｊａｂ１相互作用はＭＩＦのいくつかの重要な活性に対する分子的基盤を提供するが、それはＭＩＦ−Ｊａｂ１相互作用がＭＩＦ関連疾患において、経路と細胞性および分子性サイクルに関連しているからである。
【００１２】
本発明では、多数の一般的用語は下記のとおり用いられている。
【００１３】
本発明では、「ＭＩＦ関連疾患」とは、関節炎、発癌および／もしくは癌、腎炎、タンパク尿、皮膚炎、糖尿病／肥満、心臓同種移植の急性および慢性拒絶反応、尿細管炎、神経変性、パーキンソン病、敗血症ショック、エンドトキシン血症、過敏症、ブドウ膜炎、耳鳴り、創傷修復／細胞増殖などの疾患である；ＭＩＦはまた、免疫調節、炎症ならびに細胞性および液性免疫のエフェクター機作、敗血症ショック、眼球の炎症、転写および細胞サイクルの制御において、および呼吸窮迫症候群、生理学的ストレス、その他で重要な役割を果たしている。
【００１４】
本発明では、「薬剤」という用語は、疾患、とりわけＭＩＦ関連疾患を診断および／または治療するために有用な物質を意味し、好ましくはそのような効果を得るために十分な量のものを意味する。本明細書で用いている「薬剤」という用語は、活性作用物それ自体および製薬上許容される担体、アジュバント、他の活性作用物、その他のものと結びつけられた活性作用物の双方を意味する。推定上の、もしくは候補の薬剤とは、ある物質もしくは組成物が薬剤として用いることに適しているか否かを試験される、物質もしくは組成物を意味する。特に好ましい実施形態においては、「薬剤」は小さなＭＩＦ由来ペプチドで、特にＭＩＦ５０−６５、もしくは５７Ｓｅｒ ６０Ｓｅｒ ＭＩＦ６０−６５である。このように、本発明はまた、配列番号１および２に示した特定のペプチドをも包含する。
【００１５】
本発明では「治療」という用語はある薬剤の予防的および／もしくは治療的効果を意味する。
【００１６】
本発明では、「ＭＩＦとＪａｂ１のシステム」は合成によって作成された、もしくは天然のＭＩＦおよびＪａｂ１が、天然のまたは人工的な条件下のいずれかでお互いに接触し結合するような条件下で存在するシステムに関する。本発明の１実施形態においては、ＭＩＦとＪａｂ１のシステムは天然の細胞、もしくは組換えで産生された細胞である。本発明の別の１実施形態においては、ＭＩＦとＪａｂ１のシステムは上述の細胞から作成した、もしくはその他の供給源から作成した粗抽出物でも、それがＭＩＦとＪａｂ１を含有するものである限りは、そのシステムとすることができる。本発明の別の１実施形態においては、ＭＩＦとＪａｂ１のシステムは、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システムであって、そのシステムは、純粋な、もしくはある程度純粋なＭＩＦとＪａｂ１、またはＭＩＦとＪａｂ１の全てもしくは一部を、各々単独でまたは共に含んでいる融合タンパク質またはタンパク質複合体の産生または精製ができるようなエレメントを含んでいる。
【００１７】
本発明では、「ＭＩＦ」という用語は、天然のＭＩＦ、ならびに野生型ＭＩＦの本質的な生物学的機能の少なくとも一部を有している限りＭＩＦに何らかの改変を加えたもの、変異体、もしくは誘導体に関し、例えば、アミノ酸の改変、例えば逆位、欠失、挿入、付加、その他を含んでいる組換えで作成したＭＩＦがある。そのようなＭＩＦは、通常でないアミノ酸および／もしくはアルキル化、酸化、チオール修飾、変性、およびオリゴマー化、その他の類似の改変を含むこともできる。特に、本発明では、ＭＩＦはタンパク質、とりわけ、他のタンパク質、ペプチド、もしくはそれらの一部に加えてＭＩＦの全体もしくは一部を含んでいる融合タンパク質とすることができる。本発明のさらに別の１実施形態においては、該ＭＩＦは天然のＭＩＦの末端切断型のものであり、それは例えば小ペプチドである。本発明の特に好ましい１実施形態においては、そのような小ペプチドはＭＩＦ ５０−６５（野生型アミノ酸配列の残基５０−６５（配列番号１））もしくはＳｅｒ５７ Ｓｅｒ６０ ＭＩＦ５０−６５（野生型のＣｙｓ５７およびＣｙｓ６０をＳｅｒ５７ およびＳｅｒ６０ で置換したことを除いては野生型のアミノ酸残基５０−６５）などのＭＩＦペプチド断片である。これらのペプチドの双方とも、本発明の主題である。
【００１８】
本発明では、「Ｊａｂ１」という用語は、天然のＪａｂ１、ならびに野生型Ｊａｂ１の本質的な生物学的機能の少なくとも一部を有する限りＪａｂ１に何らかの改変を加えたもの、変異体、もしくは誘導体に関し、例えば、アミノ酸の改変、例えば逆位、欠失、挿入、付加、その他を含んでいる組換えで作成したＪａｂ１がある。そのようなＪａｂ１は、通常でないアミノ酸および／もしくはアルキル化、酸化、チオール修飾、変性、およびオリゴマー化、その他の類似の修飾を含むこともできる。特に、本発明では、Ｊａｂ１はタンパク質、とりわけ、他のタンパク質、ペプチド、もしくはそれらの一部に加えてＪａｂ１の全体もしくは一部を含んでいる融合タンパク質とすることができる。本発明のさらに別の１実施形態においては、該Ｊａｂ１は天然のＪａｂ１の末端切断型のものであり、例えばいわゆるＭＰＮドメインもしくはＭｏｖ−３４ドメイン（Ａｓａｎｏら， １９９７； ＨｏｆｍａｎｎとＢａｃｈｅｒ， １９９８）または小ペプチドなどである。
【００１９】
「プロモーター」という用語は、ＤＮＡの配列であって、通常は構造遺伝子のコード配列の上流（５’）にあり、ＲＮＡポリメラーゼおよび／またはその他の因子へ転写が正しい部位から開始されるために必要な認識を提供することによってコード領域の発現を制御している。プロモーター配列は、遺伝子の発現を駆動するために必要であるが常に十分なものであるとは限らない。
【００２０】
「核酸」とは、糖、リン酸、およびプリンもしくはピリミジンのいずれかを含んでいる単量体（ヌクレオチド）からなる、一重鎖もしくは二重鎖となりうる大分子を意味している。核酸はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡとすることができる。
【００２１】
「核酸配列」という用語は、天然のもしくは合成のＤＮＡもしくはＲＮＡのポリマーを意味し、一重鎖もしくは二重鎖であり得、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリマー中に取り込むことのできる合成、非天然、もしくは改変されたヌクレオチドを含有し得る。
【００２２】
「遺伝子」という用語は、ある特定のタンパク質をコードするＤＮＡ配列およびそのＤＮＡ配列の発現を制御する調節エレメントを意味する。
【００２３】
「コード配列」という用語は、あるタンパク質、ポリペプチド、またはそれらの一部分をコードする遺伝子の一部分であって、転写の開始または終了を駆動する調節配列を除いたものを意味する。コード配列および／または調節エレメントは、細胞中に通常見出されるものとすることができ、そのような場合にはそれは「自己の」もしくは「内因性の」と呼ばれるが、細胞内に通常は認められないものとすることもでき、その場合には、「異種の」ものと呼ばれる。
【００２４】
異種遺伝子はまた、自己のエレメントを含むものとすることができ、そのエレメントはそれが移送されることとなる細胞中には通常は見出されない順番および／または方向で配置されている。異種遺伝子は当業界で既知のいかなる供給源からその全体または部分が由来したものとすることもでき、細菌のもしくはウイルスのゲノムもしくはエピソーム、真核生物の核もしくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または化学的に合成されたＤＮＡが含まれる。構造遺伝子は中間に遮るもののない一続きのコード領域から構成することができ、または構成遺伝子は、適切なスプライス部位によって境界を形作られた１個以上のイントロンを含むことができる。構造遺伝子は異なる供給源から由来する、天然のまたは合成の、セグメントの組み合わせとすることができる。
【００２５】
「トランス活性化因子タンパク質」とは、ある遺伝子のオペレーター領域に結合してその遺伝子の転写を促進することのできるタンパク質である。
【００２６】
「ＤＮＡ結合ドメイン」とは、ある特定のＤＮＡ配列と結合することのできるアミノ酸の配列である。
【００２７】
「融合タンパク質」とは、少なくとも２種の異なる供給源から由来するアミノ酸配列で作られたタンパク質である。融合タンパク質については、「異種」アミノ酸配列とは、その融合タンパク質の他の部分とは異なる供給源を起源とする配列である。
【００２８】
「検出可能な遺伝子産物」とは、あるアッセイによって検出することのできるヌクレオチドもしくはアミノ酸配列である。ある検出可能な遺伝子産物の発現が細胞にある特徴を与え、それによってその検出可能な遺伝子産物を発現していない他の細胞からその細胞を都合よく選択することができることが好ましい。
【００２９】
「機能しうる形で連結された」もしくは「機能的な制御下に置く」という用語は、ある遺伝子およびある調節配列が、センスもしくはアンチセンス発現において、適切な分子（例えば転写活性化因子タンパク質）がその調節配列に結合すれば遺伝子発現が行われるような様式で、接続されていることを意味する。
【００３０】
本発明で「会合した」という用語は、ＭＩＦとＪａｂ１との相互作用のいかなるタイプのものをも意味し、特に共有結合もしくは非共有結合、または例えば、限定はされないが、共有結合、疎水性／親水性相互作用、ファンデルワールス力、イオン対、リガンド−受容体相互作用、エピトープ−抗体結合部位相互作用、酵素−基質相互作用、リポソーム−疎水性相互作用、ヌクレオチド塩基対合、膜−疎水性相互作用などの会合を意味する。そのような会合にはさらに別の分子、例えばペプチド、タンパク質（例えば、Ｋｉｐ、Ｊｕｎ、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ステロイド受容体コアクチベーター−１（ＳＲＣ−１）、インテグリンＬＦＡ−１、プロゲステロン受容体（ＰＲ）もしくは糖質コルチコイド受容体（ＧＲ））またはヌクレオチド配列の存在が含まれうる。
【００３１】
「ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルス、もしくは自己複製する配列、ファージ、または、直鎖状もしくは環状で一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡで、いかなる供給源から由来するものでもよい組換えＤＮＡ構築物を意味し、ベクター中では多数のヌクレオチド配列が結合もしくは組換えられたユニークな構築物とされ、該構築物はプロモーター断片およびある選択された遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を、適切な３’の非翻訳配列と共にセンスもしくはアンチセンス方向で細胞中に導入することができる。
【００３２】
「プラスミド」は、それの宿主細胞の染色体の一部となることなく安定に遺伝する遺伝的エレメントである。プラスミドはＤＮＡもしくはＲＮＡを含むものとすることができ、直鎖状もしくは環状とすることができる。プラスミドは細胞複製の間にプラスミドの複製と安定な遺伝を確実にする分子をコードし、また、医学的に、農学的に、および環境に重要な産物をコードすることができる。例えば、プラスミドは病原性細菌の毒力を顕著に増加させる毒素をコードする。プラスミドはまた、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子をコードすることができる。プラスミドは分子生物学の分野で組換え遺伝子のクローン化と発現のためのベクターとして広く用いられている。プラスミドは一般的には本明細書では小文字のｐの前および／または後に大文字および／もしくは数字を、当業者にはよく知られた標準的な命名の約束ごとに従って付けられている。本明細書で開示した出発材料のプラスミドは市販されているもの、一般的に入手可能なもののとするか、もしくは入手可能なプラスミドから周知の公表されている方法を日常的なやり方で応用することによって構築することができる。本発明で用いることのできる多数のプラスミドおよびその他のクローニングおよび発現ベクターは周知であり、当業者であれば容易に入手できる。さらに、当業者であれば本発明での使用に適したその他の多数のプラスミドのいずれも容易に構築することができよう。本発明でのそのようなプラスミド、ならびに他のベクターの性質、構築、および使用については当業者であれば、本開示から容易に明らかなものとなろう。
【００３３】
本明細書で用いている「発現」という用語は、その遺伝子産物のための配列の転写および／もしくはコードすることを説明することが意図される。発現においては遺伝子産物の配列をコードするＤＮＡ鎖をまず相補的ＲＮＡ（それは多くの場合ｍＲＮＡである）に転写し次いでこのように転写されたｍＲＮＡが、上述の遺伝子産物がタンパク質である場合にその遺伝子産物へと翻訳される。しかし、発現には、そのＤＮＡの調節エレメントに対してアンチセンスの方向で挿入されたＤＮＡの転写をも含んでいる。発現は、構成的でおそらくはさらに外部から制御されるプロモーター断片によってさらに増強されるが、それによってｍＲＮＡの多数のコピーおよび大量の選択された遺伝子産物が産生されるが、そのような発現はまた、遺伝子産物の過剰産生をも含むことができる。
【００３４】
「宿主細胞」という用語は、キメラ核酸、異種核酸もしくは自己由来核酸配列、またはそのような配列を依然として含有しているその子孫の導入によって遺伝子工学的に改変された細胞を意味する。これらの細胞はまた、「トランスジェニック細胞」とも呼ばれる。自己由来核酸配列が導入される場合には、その配列は宿主細胞中に天然の細胞での状態より多いコピー数で存在するか、異なる方向性で存在するか、および／もしくは異なる場所に存在することとなろう。
【００３５】
「ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体」という用語は、ＭＩＦとＪａｂ１との会合、例えばＭＩＦとＪａｂ１のドメイン間の相互作用を意味している。
【００３６】
「標的活性」という用語はＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体が誘導する活性、例えば、リポーター遺伝子の発現、もしくはＡＰ−１活性の調節、もしくはＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤の調節、またはその他のＭＩＦ−Ｊａｂ１特異的標的活性を意味する。
【００３７】
天然の（細胞内の）環境中では生じない本発明のタンパク質を単離する。本明細書で用いている「単離された」という用語は、タンパク質の関連で用いられるときは、天然の状態では会合している少なくともいくつかの物質と会合していない状態のポリペプチドを意味する。単離されたタンパク質は、所定のサンプル中の総タンパク質の少なくとも０．５重量％、好ましくは少なくとも５重量％、より好ましくは少なくとも２５重量％、さらにより好ましくは少なくとも５０重量％である。最も好ましくは「単離された」タンパク質は実質的に他のタンパク質、脂質、炭水化物、もしくはその他の天然状態ではそのタンパク質と会合している物質を含まず、非還元ポリアクリルアミドゲルで単一の主要なバンドを示す。実質的に含まないとは、そのタンパク質が他のタンパク質、脂質、炭水化物、もしくは天然状態ではそのタンパク質と会合しているその他の物質を少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％含まないことを意味する。
【００３８】
「アフィニティークロマトグラフィー」とは固体媒体もしくは固体支持体への選択的吸着および／もしくはそれからの溶出によってタンパク質を分離することを含むことが知られており（例えば、固定化Ｊａｂ１、固定化ＭＩＦ、固定化抗ＭＩＦ−Ｊａｂ１−ドメイン抗体、および／もしくは固定化抗ＭＩＦ−Ｊａｂ１−融合タンパク質抗体など）、通常はカラムの形態である。固体媒体は通常は不活性の担体マトリックスで、そのマトリックスに特定の条件下で対象とするタンパク質を同一サンプル中に含まれる他のものよりも良く結合する能力を有するリガンドを付着させたものであるが、時にはそのマトリックスそれ自体がそのような選択的結合能を有することもある。そのリガンドは分離しようとするタンパク質に対して生物学的に相補的なものとすることができ（例えば、抗原と抗体）、または生物学的には無関係の分子でその分子の活性基の性質と立体的関係によって該タンパク質と結合する能力を有するものとすることができる。支持体マトリックスは一般的には上記のタンパク質結合リガンドと共に用いられ、そのようなものとしては例えば、寒天、デキストランおよびアミドのポリマーおよびコポリマー、特にアクリルアミド、またはガラスビーズもしくはナイロンマトリックスが挙げられる。セルロースおよび置換セルロースは染料を用いる場合には通常は不適切である。というのは、これらのものは大量の染料を結合させるが、染料はタンパク質に対して接近し難く、その結果タンパク質との結合が乏しくなるからである。
【００３９】
「固体支持体」とは不溶性のマトリックスを意味し、本質的に生物学的なもの（例えば、限定はされないが、細胞もしくはバクテリオファージ粒子）、または合成のもの（例えば、限定はされないが、アクリルアミド誘導体、セルロース、ナイロン、シリカ、および磁化粒子）のいずれかでそれらに対して可溶性の分子を連結するかもしくは結合することができる。
【００４０】
「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子、またはそれらの断片によって実質的にコードされるポリペプチドを意味し、抗体は分析物（抗原）と特異的に結合して認識する。存在が知られている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、Δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。抗体は例えば、完全な免疫グロブリンとして、もしくは種々のペプチダーゼを用いた消化によって産生される十分に特性付けられた多数のフラグメントとして存在する。また「抗体」とは改変された抗体（例えば、オリゴマー抗体、還元抗体、酸化抗体、および標識抗体）を意味する。本明細書で用いている「抗体」という用語はまた、抗体分子全体の改変によって産生された、もしくは組換えＤＮＡ方法論を用いて新規に合成されたいずれかの抗体フラグメントをも含む。「抗体」という用語は完全な分子、ならびにそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどを含み、そのようなフラグメントはエピトープ決定基と結合することができる。これらの抗体フラグメントはその抗原もしくは受容体と選択的に結合する多少の能力を保持しており、下記のとおり定義される：
（１）　Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含んでいるフラグメントであり、抗体全体を酵素であるパパインで消化することで産生することができ、完全な軽鎖の１本および重鎖の１本の一部からなるものが得られる；
（２）　Ｆａｂ’は抗体分子のフラグメントで、抗体全体をペプシンで処理した後、還元し、完全な軽鎖の１本と重鎖の一部からなるものを得ることができる；抗体分子１個から２個のＦａｂ’フラグメントが得られる；
（３）　（Ｆａｂ’）２は抗体のフラグメントで、抗体全体を酵素であるペプシンで処理した後、還元せずに得ることができる；Ｆ（ａｂ’）２は２個のジスルフィド結合で結びつけられた２本のＦａｂ’フラグメントの二量体である；
（４）　Ｆｖは軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含み２本の鎖として発現される遺伝子工学的に操作されたフラグメントと定義される；
（５）　単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域が適切なポリペプチドリンカーで連結されたものを、遺伝子操作で融合させた１本鎖の分子として含んでいる、遺伝子工学的に操作された分子と定義される。
【００４１】
これらのフラグメントを作製する方法は当業界では公知である（例えば、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ，「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照せよ）。
【００４２】
本発明で用いている「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基は通常はアミノ酸もしくは糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常は特定の３次元構造の特徴ならびに特定の電荷の特徴を有している。
【００４３】
本発明のタンパク質およびその断片に対するモノクローナル抗体は当業者であれば容易に産生することができる。ハイブリドーマ技法を用いるモノクローナル抗体の一般的な作製方法論は周知である。不死化抗体産生細胞系は細胞融合によって、および癌遺伝子ＤＮＡを用いるＢリンパ球の直接的形質転換、もしくはエプスタイン−バーウイルスによるトランスフェクションなどのその他の技法によっても作製することができる。例えば、Ｍ． Ｓｃｈｒｅｉｅｒら，「ハイブリドーマ技法（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」（１９８０）； Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，「モノクローナル抗体とＴ細胞ハイブリドーマ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）」（１９８１）； Ｋｅｎｎｅｔｔら，「モノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」（１９８０）； を参照し、また米国特許第４，３４１，７６１号、第４，３９９，１２１号、第４，４２７，７８３号、第４，４４４，８８７号、第４，４５２，５７０号、第４，４６６，９１７号、第４，４７２，５００号、第４，４９１，６３２号、および第４，４９３，８９０号をも参照せよ。対象のタンパク質もしくはその断片に対して産生させたモノクローナル抗体のパネルを種々の性質、すなわちアイソタイプ、エピトープ、親和性などについてスクリーニングすることができる。あるいは、その対象のモノクローナル抗体をコードする遺伝子は、当業界では公知のＰＣＲ技法によってハイブリドーマから単離し、クローニングし、適切なベクター中で発現させることができる。モノクローナル抗体は、それの相手となる個々のタンパク質のイムノアフィニティー技法を用いる精製に有用である。本発明の抗体は（それがポリクローナルまたはモノクローナルのいずれでも）、試薬としてイムノアッセイ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡなどで用いることができるというさらに別の有用性を有する。さらに、それらの抗体はＭＩＦ、Ｊａｂ１、ＭＩＦ−Ｊａｂ１ドメインなどを細胞から単離するために用いることができる。これらの抗体は、例えばＭＩＦとＪａｂ１との相互作用をブロックする新規化合物の発見もしくは改変のための組織培養に基づくアッセイを確立するために用いうる。
【００４４】
ヒト化もしくはキメラ抗体は２つの異なる種由来の部分（例えば、ヒトの定常領域およびマウスの結合領域）を含んでなることができる。２つの異なる種由来の部分は従来の技法で化学的に連結することができるか、もしくは遺伝子工学的技法を用いて単一の融合タンパク質として調製することができる。キメラ抗体の２つの部分の双方のタンパク質をコードするＤＮＡは単一の融合タンパク質として発現させることができる。
【００４５】
ある抗体は、その抗体がタンパク質およびその他の生物学的物質の不均質集団が存在している中であるタンパク質の存在を決定づける結合反応において機能する場合には、そのタンパク質に「特異的に結合する」もしくはあるタンパク質と「特異的に免疫反応する」。従って、ある定められたイムノアッセイ条件下においては、その特異的抗体は優先的にある特定のタンパク質と結合し、そのサンプル中に存在する他のタンパク質の有意な量と結合することはない。そのような条件下でのあるタンパク質との特異的結合には、特定のタンパク質に対しての特異性で選択された抗体を必要とする。ある特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために種々のイムノアッセイ形式を用いることができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイはあるタンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために日常的に用いられている。特異的免疫反応性を決定するために用いることができるイムノアッセイ形式と条件についての説明は、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ （１９８８），「抗体、実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照せよ。
【００４６】
「イムノアッセイ」とは、ある反応物に特異的に結合する抗体を用いるアッセイを意味する。イムノアッセイは、反応物を単離、標的および／もしくは定量するためにある特定の抗体の特異的な結合性を用いることによって特徴づけられる。
【００４７】
本発明の好ましい実施形態においては、薬剤スクリーニングの方法はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
【００４８】
本発明の特に好ましい実施形態においては、そのｉｎ ｖｉｔｒｏの薬剤スクリーニング法は、相互作用、特にＭＩＦとＪａｂ１間の結合を検出するためのアッセイである。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態においては、ＭＩＦ−Ｊａｂ１結合は、スクリーニングしようとする薬剤の存在もしくは不在下でＭＩＦ、Ｊａｂ１および／もしくはその複合体の放射活性標識、光標識、蛍光標識、ビオチン標識、共沈、免疫沈降、クロマトグラフィーによる分画などの従来法を用いることによって測定される。
【００５０】
特に本発明はいわゆるＨＴＰ法に関し、これはハイスループットスクリーニング法を意味する。本発明の実施形態では、ＭＩＦ／Ｊａｂ１結合は、それぞれの結合パートナー（すなわちＭＩＦもしくはＪａｂ１）についてＭＩＦもしくはＪａｂ１と競合する競合性ペプチドの存在もしくは不在下で試験することができる。特にそのような競合的結合パートナーはＭＩＦ由来の類似体、例えばＭＩＦの変異体とすることができ、ＭＩＦの変異体は例えば、野生型ＭＩＦのアミノ酸の番号（Ｋｌｅｅｍａｎｎら， １９９８ｂ）に従えば、野生型ヒトＭＩＦのアミノ酸残基５０−６５からなるペプチド断片、または５７と６０の位置において天然のアミノ酸がセリンに置換されている以外はヒトＭＩＦの野生型アミノ酸残基５０−６５からなるペプチド断片などのＭＩＦの断片である。従って、本発明ではこれらの末端切断型の１６個のアミノ酸の長さのＭＩＦペプチドは非常に有用なＭＩＦ競合性ペプチドで、本発明のアッセイ系で用いることができるであろう。特に本発明のさらなる好ましい実施形態においては、ＭＩＦ／Ｊａｂ１結合はそのような競合性ペプチドの存在もしくは不在下で試験することができ、また一方同時に候補薬剤を存在させてそのＭＩＦ／Ｊａｂ１相互作用に及ぼす影響を試験する。別の好ましい実施形態においては、上記のように同定されたＭＩＦ末端切断型ペプチドはそれ自体が候補薬剤、すなわちやがては薬剤として役立つ可能性がある。
【００５１】
そのような競合的結合パートナーはまたＪａｂ１由来の類似体とすることもでき、それは例えば、Ｊａｂ１の変異体、もしくは野生型ヒトＪａｂ１もしくはマウスＪａｂ１のドメインもしくはペプチド断片などのＪａｂ１の断片でありうる。本発明では、そのような末端切断型Ｊａｂ１タンパク質もしくはペプチドは非常に有用なＪａｂ１競合性分子で、それは本発明のアッセイ系で用いることができよう。特に本発明のさらなる好ましい実施形態においては、ＭＩＦ／Ｊａｂ１結合はそのような競合性Ｊａｂ１ペプチドの存在もしくは不在下で試験することができ、また一方同時に候補薬剤を存在させてそのＭＩＦ／Ｊａｂ１相互作用に及ぼす影響を試験する。別の好ましい実施形態においてはこれらのＪａｂ１末端切断型分子はそれ自体が候補薬剤、すなわちやがては薬剤として役立つ可能性がある。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態においては、ＭＩＦとＪａｂ１との間の結合は、例えば、共沈によって探索することができる。ＭＩＦをビーズ上に共有結合でもしくは非共有結合で、例えばＧＳＴ−ＭＩＦのＧＳＨ−ビーズへの結合、もしくはビオチン−ＭＩＦのストレプトアビジンビーズへの結合、もしくはＭＢＰ−ＭＩＦのマレート（ｍａｌａｔｅ）ビーズへの結合（ＭＢＰ：マレート結合タンパク質）を介して固定化し、可溶性Ｊａｂ１とともに候補薬剤の不在（対照）および存在下でインキュベートする。その懸濁液を洗い、固相に結合したＪａｂ１の量は、複合体からＪａｂ１を溶出させた後、ウエスタンブロットもしくは類似の方法で検出され、またはＪａｂ１は上清中に検出され、候補薬剤の存在および不在下でのＪａｂ１の量を比較する。
【００５３】
Ｊａｂ１とＭＩＦとの間の結合は、例えば、共沈によって調べることもできる。Ｊａｂ１をビーズ上に固定化し、可溶性ＭＩＦと薬剤の不在（対照）および存在下でインキュベートする。Ｊａｂ１は共有結合でもしくは非共有結合でビーズに、例えばＧＳＴ−Ｊａｂ１のＧＳＨ−ビーズへの結合、もしくはビオチン−Ｊａｂ１のストレプトアビジンビーズへの結合、もしくはＭＢＰ−Ｊａｂ１のマレートビーズへの結合を介して結合させることができる。その懸濁液を洗い、固相に結合したＭＩＦの量を、例えば複合体からＭＩＦを溶出させた後、ウエスタンブロットもしくは類似の方法で検出し、またはＭＩＦは上清中に検出され、推定上の薬剤もしくは候補薬剤の存在および不在下でのＭＩＦの量を比較する。
【００５４】
これらの共沈を用いた実施形態の一般的な概念は、２種類のパートナー、例えばＪａｂ１とＭＩＦのインキュベーションであり、それによって一方のパートナー、例えばＭＩＦはＧＳＴと共有結合で結合している。２種類のパートナー、ＭＩＦ−ＧＳＴとＪａｂ１は固相、例えばＧＳＨ−ビーズの存在下でインキュベートした。共有結合でＭＩＦに結合したＧＳＴとＧＳＨとの間で非共有結合が起こるので、このようにしてＭＩＦとＪａｂ１との複合体をＧＳＨ−ビーズと結合させることができる。固相のＧＳＨ−ビーズと、Ｊａｂ１と非共有結合で結合した非共有結合複合体のＧＳＴ−ＭＩＦの懸濁液を洗い、次いでＳＤＳバッファー中で煮沸することによってＪａｂ１を溶出する。その懸濁液の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する。そのＳＤＳゲルをウエスタンブロットでブロットし、Ｊａｂ１はそのブロット上で抗Ｊａｂ１抗体を用いることによって検出される。
【００５５】
この一般的概念から、以下の種々の実施形態が好ましい：
（ｉ）　ＧＳＨ−ビーズをＧＳＴ−ＭＩＦおよびＪａｂ１とインキュベートし、ＧＳＴ−ＭＩＦを介してＧＳＨ−ビーズと結合したＪａｂ１を（上記参照）、ウエスタンブロットで抗Ｊａｂ１抗体を用いて検出する、
（ｉｉ）　ＭＩＦ−ビーズをＪａｂ１とインキュベートし、ＭＩＦ−ビーズに結合したＪａｂ１をウエスタンブロットで抗Ｊａｂ１抗体を用いて検出する、
（ｉｉｉ）　ＧＳＨ−ビーズをＧＳＴ−Ｊａｂ１およびＭＩＦとインキュベートし、ＧＳＴ−Ｊａｂ１を介してＧＳＨ−ビーズと結合したＭＩＦをウエスタンブロットで抗ＭＩＦ抗体を用いて検出する、
（ｉｖ）　Ｊａｂ１−ビーズを可溶性ＭＩＦとインキュベートし、Ｊａｂ１−ビーズに結合したＭＩＦをウエスタンブロットで抗ＭＩＦ抗体を用いて検出する、
（ｖ）　マレート−ビーズをＭＢＰ−ＭＩＦおよびＪａｂ１とインキュベートし、ＭＢＰ−ＭＩＦを介してマレート−ビーズと結合したＪａｂ１をウエスタンブロットで抗Ｊａｂ１抗体を用いて検出する、
（ｖｉ）　マレート−ビーズをＭＢＰ−Ｊａｂ１およびＭＩＦとインキュベートし、ＭＢＰ−Ｊａｂ１を介してマレート−ビーズと結合したＭＩＦをウエスタンブロットで抗ＭＩＦ抗体を用いて検出する、
（ｖｉｉ）　プロテインＡ−ビーズを抗ＭＩＦ抗体およびＭＩＦならびにビオチン−Ｊａｂ１とインキュベートし、プロテインＡ−ビーズと結合したストレプトアビジンをウエスタンブロットで検出する、
（ｖｉｉｉ）　プロテインＡ−ビーズを抗ＭＩＦ抗体およびＭＩＦならびにＪａｂ１とインキュベートし、プロテインＡ−ビーズと結合したＪａｂ１をウエスタンブロットで抗Ｊａｂ１抗体を用いて検出する、および
（ｉｘ）　ダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ ｂｅａｄｓ）−ストレプトアビジンをビオチン−ＥＧＦＰ−ＭＩＦおよびＪａｂ１とインキュベートし、ダイナビーズ−ストレプトアビジンと結合したＪａｂ１をウエスタンブロットで抗Ｊａｂ１抗体を用いて検出する。
【００５６】
ＭＩＦ／Ｊａｂ１相互作用を妨害する薬剤のスクリーニングも、タンパク質アッセイ、例えば、いわゆるバイオチップで行うことができる。例えば、ＭＩＦを固体支持体、例えばポリマー性支持体、もしくはシリカウェファー、もしくはスライドガラスもしくはナイロン膜上に、例えばＧＳＴ−ＭＩＦの固体ＧＳＨ−支持体への結合もしくはビオチン−ＭＩＦの固体ストレプトアビジン−支持体への結合、もしくはＭＢＰ−ＭＩＦの固体マレート−支持体への結合を介して、共有結合でもしくは非共有結合で固定化する。既知の方法に従えばＭＩＦは直接的に固体支持体上に固定することもでき、それはＬｙｓもしくはＣｙｓまたは類似のアミノ酸残基などのアミノ酸残基を介するか、あるいは非天然のアミノ酸を介して行われ、そのためタグ分子をさらに用いる必要はない。次いで、その固定化されたＭＩＦタンパク質を、候補薬剤の不在（対照）もしくは存在下で可溶性Ｊａｂ１とインキュベートする。次いで、ＭＩＦとＪａｂ１との相互作用に及ぼす候補薬剤の影響は蛍光もしくはＭＡＬＤＩ−ＭＳ検出法などの方法で検出することができる。別の実施形態においては、Ｊａｂ１もしくはＪａｂ１由来ドメインは固体支持体上に固定化されるが、それはＧＳＴ−Ｊａｂ１のＧＳＨ−支持体への結合もしくはビオチン−Ｊａｂ１のストレプトアビジン−支持体への結合、もしくはＭＢＰ−Ｊａｂ１のマレート−支持体への結合を介した共有結合もしくは非共有結合で、またはさらなる別のタグ分子を用いることなくＬｙｓもしくはＣｙｓなどのアミノ酸残基を介して、もしくは非天然のアミノ酸を介してのＪａｂ１の直接的な共有結合のいずれかで行われる。次いで固定化されたＪａｂ１タンパク質を、候補薬剤の不在（対照）もしくは存在下で可溶性ＭＩＦとインキュベートし、それによってＭＩＦとＪａｂ１との相互作用に及ぼす候補薬剤の影響を蛍光もしくはＭＡＬＤＩ−ＭＳ法で検出する。
【００５７】
ＭＩＦもしくはＪａｂ１に対する支持体としてバイオチップ中で用いられる材料は、ナイロンなどのいずれのポリマー性材料を含むことができる。これらのポリマー性支持体はそれ自体を、多孔性無機質支持体上に固定することができるが、その無機質支持体としては例えばシリカ、アルミナ、マグネシアなどの金属酸化物、またはこれらの酸化物の天然のもしくは合成の誘導体、例えばガラス、ケイ酸塩、ホウケイ酸塩、カオリンなどが挙げられる。該ポリマーは多孔性無機質支持体上に染み込ませることによって固定することができ、次いでそのポリマーコーティングは必要に応じて既知の方法にしたがって架橋することによって安定化される。その架橋剤は例えば、ジカルボニル化合物、ハロヒドリン、ジエポキシドなどである。そのポリマー性支持体は無機質の支持体上に中間的二機能性カップリング剤（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を用いて固定することもできる。アシアロ（ｄｅｓｉａｌｙｌｅｄ）タンパク質も、既知の方法に従って、ポリマー性支持体上に適切な二機能性カップリング剤によって固定することができる。カップリング剤は例えば、ブロムシアン、ジアルデヒド、ジエポキシドなどの二機能性誘導体である。タンパク質も多孔性無機質支持体上に直接固定することができる。例えば、シリカ支持体の場合には、シリカのアミノアルキルシラン誘導体を調製しアシアロタンパク質をアミノアルキルシラン上に二機能性剤、例えばグルタルアルデヒドなどを用いて固定する；例えばＰ．Ｊ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ２４２， ６５９−６６１（１９７１）を参照せよ。アシアロタンパク質も、フランス特許出願第７７．２８１６３号（公開番号第２．４０３．０９８号）に記載の方法に従って多孔性無機質支持体上に固定することができる。このプロセスは多孔性無機質支持体を開裂反応を行うことのできるポリマーでコーティングし、過ヨウ素酸塩などの酸化剤を用いてグリコール基を酸化することを含んでいる。ポリカルボニルコーティングが得られ、次いでリガンド、例えばアシアロ糖タンパク質を、形成されたカルボニル基上に固定することができる。所望により、形成されたイミン基をアミンに還元することができる。
【００５８】
好ましい実施形態においては、相互作用、例えばＭＩＦとＪａｂ１との結合を試験する方法は、電気泳動移動度シフトアッセイである。ＭＩＦ−Ｊａｂ１結合はゲル（例えば本来のポリアクリルアミドゲル）中のｃ−Ｊｕｎ／ＤＮＡもしくはＪａｂ１／ｃ−Ｊｕｎ／ＤＮＡ複合体の柔軟性／移動性を低下もしくは増大させる。ゲル中でのＤＮＡプローブ単独でのシフトもしくは複合体の一部としてのシフトは候補薬剤の存在もしくは不在下で、そのＤＮＡプローブの放射活性もしくは蛍光標識によって検出することができる。
【００５９】
本発明に従えば、ＭＩＦ−Ｊａｂ１結合を検出する方法は多数のタンパク質をも含んでいる。ＭＩＦ−Ｊａｂ１タンパク質結合はゲル（例えば本来のポリアクリルアミドゲル）中のＭＩＦおよびＪａｂ１の柔軟性／移動性を低下もしくは増大させる。ゲル中のタンパク質（ＭＩＦ、Ｊａｂ１、ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体）の候補薬剤の不在および存在下でのシフトはＭＩＦおよび／もしくはＪａｂ１の放射活性もしくは蛍光標識で検出することができる。
【００６０】
本発明の好ましい実施形態においては、またＭＩＦ−Ｊａｂ１結合のクロマトグラフィーによる検出方法は次の事項を含む：候補薬剤の不在および存在下でＭＩＦをＪａｂ１−クロマトグラフィー支持体へ吸着させ、そのカラムをバッファーで洗い、溶出液中のＭＩＦもしくは結合しているＭＩＦを直接検出することを含んでなり；例えば、溶出液中のＭＩＦの量は、候補薬剤が解離剤である場合にはその候補薬剤が存在している条件では不在の条件よりも高い。またＭＩＦ−Ｊａｂ１結合をクロマトグラフィーで検出する方法は、候補薬剤の不在および存在下でＪａｂ１をＭＩＦ−クロマトグラフィー支持体、固定化抗ＭＩＦ−Ｊａｂ１ドメイン抗体、および／もしくは固定化抗ＭＩＦ−Ｊａｂ１融合タンパク質抗体などへ吸着させ、そのカラムをバッファーで洗い、溶出液中のＪａｂ１を検出することを含んでなり；例えば、溶出液中のＪａｂ１の量は、候補薬剤が解離剤でない場合にはその候補薬剤が存在している条件では不在の条件よりも低い。またＭＩＦ−Ｊａｂ１結合を検出する方法は、候補薬剤の不在もしくは存在下で可溶性のＭＩＦもしくはＪａｂ１を、固定化されたＭＩＦもしくはＪａｂ１を有しているＭＴＰ（マイクロタイタープレート）もしくはバイオチップ上に吸着させることを含んでいる。
【００６１】
本発明の特に好ましい実施形態においては、用いられるＭＩＦおよび／もしくはＪａｂ１はｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳によって得られたものである。
【００６２】
別の好ましい実施形態においては、ＭＩＦおよびＪａｂ１は粗製のもしくは部分的に精製された細胞抽出物中に含まれる。本発明に包含される細胞抽出物とは、生物学的組織、または細胞もしくはその断片を含有する液体もしくは懸濁液である。そのような細胞抽出物は、細胞もしくは組織に機械的攪拌もしくは剪断、超音波処理、電場を適用すること、化学物および／もしくは酵素を適用することなどによって得ることができる。本発明はまた、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」および「細胞抽出」法のいかなる組み合わせをも含む；例えば、ＭＩＦおよびＪａｂ１が懸濁液中に含まれ、それはＪａｂ１は細胞抽出物中に含まれ、純粋なＭＩＦはビーズ上に結合している。
【００６３】
別の実施形態においては、相互作用、特にＭＩＦとＪａｂ１との結合を試験する方法はｉｎ ｖｉｖｏの方法である。そのｉｎ ｖｉｖｏ法はＭＩＦ−Ｊａｂ１相互作用の生物学的活性の特に信頼できる方法として広く認められている。本発明のｉｎ ｖｉｖｏ法は毒性を示す可能性のある代謝を含まないので、これらの方法はｉｎ ｖｉｖｏでのＭＩＦとＪａｂ１との相互作用を測定するための診断用ツールとして特に有用である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法と比較すると、ｉｎ ｖｉｖｏ法は安全で、より広範囲に応用でき、操作がより容易で、感度がより高く、より正確な結果が得られ、生理学的状況をより信頼性高く示す。ＭＩＦおよび／もしくはＪａｂ１の標識は毒性を示す可能性のある非生理的代謝物ではなく生理的基質を介して行われる；細胞および組織解剖は保存する必要がなく；また、放射活性も関与しない。
【００６４】
本発明はまた、ＭＩＦおよびＪａｂ１に関して遺伝子工学的に操作された、特にトランスジェニック動物、とりわけ哺乳動物（特にマウスおよびその細胞）を包含する。これらの動物は、その細胞の少なくともいくらかには、調節エレメントの制御下にあるＭＩＦおよびＪａｂ１コード配列のトランスフェクトされたセンスもしくはアンチセンス構築物を含有し、特にいわゆるノックアウト動物はＭＩＦ、Ｊａｂ１もしくはＭＩＦ−Ｊａｂ１相互作用の活性が改変されているので研究と診断に有用である。トランスジェニック動物中のＭＩＦ、Ｊａｂ１、もしくはＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体の改変は、例えばＭＩＦ、Ｊａｂ１、もしくはＭＩＦ−Ｊａｂ１融合体のセンスもしくはアンチセンスヌクレオチド配列を用いることによって、またはこれらのヌクレオチド配列を改変することによって（例えば逆位、欠失、挿入、付加など）動物を形質転換し、双方の遺伝子座、すなわちＭＩＦとＪａｂ１で遺伝子工学的に操作された動物を得ることが可能となる。このように、また本発明は遺伝子工学的に改変された動物に関し、特に野生型動物に対して改変されたＭＩＦおよびＪａｂ１の発現を示すトランスジェニック動物に関する。哺乳動物、特にヒト以外の哺乳動物の細胞中でのこのような改変された発現はおそらくヌクレオチド配列の改変を含んでいるＭＩＦおよび／もしくはＪａｂ１アンチセンスもしくはセンス構築物の導入によるもの、および／または、ＭＩＦおよびＪａｂ１タンパク質の内因性ヌクレオチド配列中の操作によるものであろう。ＭＩＦおよびＪａｂ１の突然変異した、もしくは非突然変異の、センスもしくはアンチセンスコピーをさらに挿入することなどの改変、または調節領域の改変を含む内在性遺伝子の改変を行うことによって、上記で定めた目的に有用な動物を得ることが可能となる。従って、本発明はまた、上記で定めた改変を含んでいる単一種のヒト以外の哺乳動物細胞もしくは細胞培養物に関する。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態においては、ｉｎ ｖｉｖｏ法は次の事項を含んでなる：
ａ）　ＭＩＦおよび／もしくはＪａｂ１を過剰発現している細胞を提供すること、
ｂ）　ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体の標的活性、特に候補薬剤の不在下でのリポーター遺伝子の活性の発現を検出すること、
ｃ）　ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体の標的活性、特に候補薬剤の存在下でのリポーター遺伝子の活性の発現を検出すること、
ｄ）　ｂ）およびｃ）で得られた結果を比較すること。
【００６６】
本発明の好ましい実施形態においては、リポーター遺伝子は、例えば、そのリポーター遺伝子の調節部位の近傍もしくはその部位において結合部位およびエフェクター部位を提供するＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体で誘導することができ、リポーター遺伝子はそのコード領域によってコードされる遺伝子産物を発現することができ、その産物を今度は検出の手段および方法によって直接的もしくは間接的に検出することができる。
【００６７】
また本発明は、ＭＩＦおよび／もしくはＪａｂ１を過剰発現している細胞が、宿主細胞を次のものを用いてトランスフェクトして得られるような方法に関する：
ａ）　プロモーターの機能的制御下にあるＭＩＦコード配列を含んでいるベクター、
プロモーターの機能的制御下にあるＪａｂ１コード配列を含んでいるベクター、
リポーター遺伝子を含んでいるベクター、または
ｂ）　単一のプロモーターの機能的制御下にあるＭＩＦとＪａｂ１をコードする遺伝子を含んでいるベクター、およびリポーター遺伝子を含んでいるベクター、
ｃ）　単一のプロモーターの機能的制御下にあるＭＩＦとＪａｂ１のコード配列とリポーター遺伝子を含んでいるベクター。
【００６８】
特に好ましい実施形態においては、プロモーターはＣＭＶもしくはＴｅｔなどの強力な構成性もしくは誘導性プロモーターである。ＭＩＦ、Ｊａｂ１および／またはリポーター遺伝子を含有するバイシストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）もしくはマルチシストロン性（ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）の構築物を作製することによってＭＩＦ、Ｊａｂ１および／もしくはリポーター遺伝子の連動した発現を行うことができる。特に、分子エレメントもしくは因子は融合タンパク質の形成を妨げることができるように、遺伝子を離れさせている。
【００６９】
本発明の特に好ましい実施形態においては、候補薬剤がＭＩＦとＪａｂ１との間の結合を破壊するか否かを調べる逆行（ｒｅｖｅｒｓｅ）ツーハイブリッド法は次のものを含んでなる：
ａ）　ｉ）　ＤＮＡ結合タンパク質認識部位に機能しうる形で連結されたリポーター遺伝子、
ｉｉ）　ＤＮＡ結合タンパク質認識部位と特異的に結合するＤＮＡ結合部分に共有結合で結合したＭＩＦを含んでいる第１のハイブリッドタンパク質を発現する第１の融合遺伝子、および
ｉｉｉ）　遺伝子活性化部分に共有結合で結合したＪａｂ１を含んでいる第２のハイブリッドタンパク質を発現する第２の融合遺伝子（ここではＪａｂ１は薬剤の不在下でＭＩＦと結合する）、
を含有する細胞を提供し；
ｂ）　その細胞をリポーター遺伝子の発現が可能な条件下で候補薬剤と接触させ；
ｃ）　ＭＩＦとＪａｂ１との間の結合を候補薬剤が破壊する能力の尺度として、リポーター遺伝子の発現の阻害を検出する。
【００７０】
本発明では、ＭＩＦとＪａｂ１の間の結合を解離させるか、もしくは相互作用を妨げるような分子の同定を行うことができる。ＭＩＦとＪａｂ１との間の結合を崩壊させることのできる候補薬剤−いわゆる解離剤化合物−を単に培養物中に添加することによって細胞中に導入することができる。「解離剤化合物」という用語は相互作用、とりわけ、ＭＩＦとＪａｂ１の結合を、崩壊させる、妨げる、もしくはモジュレートするようないかなる分子をも意味する。解離剤化合物の例としてはポリペプチド、核酸、有機および無機分子、ならびにイオンが挙げられる。解離剤化合物となる可能性のあるものの多くは非常に小さいので、それが十分に疎水性である場合には、エンドサイトーシスもしくは拡散によって膜を通過して細胞によって取り込まれる。あるいはまた、解離剤化合物がＲＮＡ分子もしくはタンパク質である場合には、その化合物は、対応するＤＮＡ構築物で細胞を形質転換し、所望のＲＮＡもしくはタンパク質を発現させることによって細胞中で産生させることができる。ＭＩＦとＪａｂ１の間の分子的相互作用を安定化させる化合物もこれらの方法によって同定することができる。
【００７１】
ＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用を検出する方法も本発明で提供される。その方法は宿主細胞、好ましくは原核細胞もしくは真核細胞を提供することを含んでいる。その宿主細胞は、転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインが結合するための部位を有している検出可能なリポーター遺伝子を含有しており、その検出可能な遺伝子が転写活性化されると検出可能なタンパク質が発現されることとなる。そのような活性化は、転写活性化因子の転写活性化ドメインが、転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインと十分に近い位置となった場合に起こる。
【００７２】
宿主細胞中で発現されうる第１のキメラ遺伝子が提供される。キメラ分子は２種以上の天然の状態では別々に存在している分子が一緒になって、その全構成分子の所望の機能を有する単一の分子を形成するような分子である。キメラ分子は２種類の分子各々を別々に合成してから共有結合させて調製することができるが、当業者であれば、キメラ分子が融合タンパク質であり、そのキメラは新規に単一の「結びつけられた」分子として、すなわち遺伝子工学の方法によって作成することができることが理解されよう。第１のキメラ遺伝子は宿主細胞の染色体もしくはプラスミド中に存在させることができる。第１のキメラ遺伝子は第１のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。第１のハイブリッドタンパク質は、宿主細胞中のリポーター遺伝子上の結合部位を認識するＤＮＡ結合ドメインを含んでいる。第１のハイブリッドタンパク質はまた、ＭＩＦタンパク質もしくはＭＩＦタンパク質断片をも含んでおり、それはＪａｂ１タンパク質もしくはＪａｂ１タンパク質断片との相互作用について試験されるものである。
【００７３】
宿主細胞中で発現されうる第２のキメラ遺伝子が提供される。一実施形態においては、第１および第２のキメラ遺伝子の双方がプラスミドの形で宿主細胞中に導入される。しかし、好ましくは、第１のキメラ遺伝子は宿主細胞の染色体中に存在し、第２のキメラ遺伝子は、プラスミドの一部として宿主細胞中に導入される。その第２のキメラ遺伝子は第２のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。第２のハイブリッドタンパク質は転写活性化ドメインを含んでいる。その第２のハイブリッドタンパク質はまた、ＭＩＦタンパク質もしくはＭＩＦタンパク質断片との相互作用について試験されるＪａｂタンパク質もしくはＪａｂ１タンパク質断片をも含んでいる。第１のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のハイブリッドタンパク質の転写活性化ドメインは、好ましくはＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインが離れた状態にある転写活性化因子から由来するものである。これらの離れた状態にあるＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインは、例えば酵母ＧＡＬ４タンパク質中に認められることが知られており、また、酵母ＧＣＮ４およびＡＤＲ１タンパク質中に認められることも知られている。転写に関与するその他の多数のタンパク質にも離れた状態の結合ドメインと転写活性化ドメインがあり、そのことがそれらのタンパク質を本発明で有用なものとしている。別の一実施形態においては、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインは異なる転写活性化因子由来のものとすることができる。第２のハイブリッドタンパク質は、転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ配列に融合された、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成で作成されたＤＮＡ配列を含んでいるプラスミドのライブラリーでコードされ得る。
【００７４】
種々のＤＮＡ結合部分および遺伝子活性化部分が本発明の種々の態様において使用するために適している。通常、転写因子のＤＮＡ結合ドメインもしくは遺伝子活性化ドメインを用いることができる。所望により、ＶＰ１６の遺伝子活性化ドメインを用いることができる。ＤＮＡ結合タンパク質認識部位および遺伝子活性化部分およびＤＮＡ結合部分は全て同一の転写因子に応答するか、もしくはそれらは異なる転写因子に応答することができる。有用な結合部位としては、酵母タンパク質ＧＡＬ４、細菌のタンパク質ＬｅｘＡ、酵母金属結合因子Ａｃｅ１が含まれる。これらの結合部位は抑制されたプロモーターとともに容易に用いることができる（例えば、ＳＰＯ１３プロモーターはＧＡＬ、ＬＥＸ、およびＡＣＥ１のＤＮＡ結合部位と組み合わせてそれぞれＳＰＡＬ、ＳＰＥＸ、およびＳＰＡＣＥプロモーターの基礎をなすものとして用いることができる）。その他の有用な転写因子としてはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＣＮ４タンパク質（例えば、ＨｏｐｅとＳｔｒｕｈｏｌ， １９８６， Ｃｅｌｌ ４６：８８５−８９４を参照せよ）、およびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＲ１タンパク質（例えば、Ｋｕｍａｒら， １９８７， Ｃｅｌｌ ５１：９４１−９５１を参照せよ）が含まれる。ＤＮＡ結合タンパク質認識部位には、用いられる転写因子の結合ドメインが結合するための少なくとも１カ所の結合部位が含まれているはずである。用いることのできるＤＮＡ結合タンパク質認識部位の数には制限がないが、結合部位の数は好ましくは１から１００の間で、より好ましくは１から２０の間で、さらにより好ましくは結合部位の数は１から１６の間である。結合部位の数は、アッセイの所望の選択性もしくは感度などの要素を考慮して調節することができる。
【００７５】
宿主細胞中でのＭＩＦタンパク質もしくはその一部分とＪａｂ１タンパク質もしくはその一部分との間の相互作用は、転写活性化ドメインによるリポーター遺伝子の転写の活性化を生ずる。その方法は第１のキメラ遺伝子および第２のキメラ遺伝子を宿主細胞中に導入することによって行われる。宿主細胞は、第１のハイブリッドタンパク質と第２のハイブリッドタンパク質の発現がリポーター遺伝子が活性化されるために十分な量となるような条件下に置かれる。次いで細胞をリポーター遺伝子の発現について試験し、その発現はＭＩＦタンパク質とＪａｂ１タンパク質との間の相互作用がない場合よりもリポーター遺伝子の発現が多い。
【００７６】
本発明の好ましい一実施形態においては、リポーター遺伝子の発現はスクリーニングしようとする候補薬剤を加えた宿主細胞中で測定され、候補薬剤を加えていない宿主細胞でのリポーター遺伝子の発現と比較する。
【００７７】
好ましい一実施形態においては、本発明はＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインに関し、それらは分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを有する転写活性化因子由来のものである。
【００７８】
本発明のさらに好ましい一実施形態においては、転写活性化ドメイン中のＤＮＡ結合ドメインは、転写活性化因子ＧＡＬ４、ＧＣＮ４、およびＡＤＲ１からなる群から選択されるものである。このシステムは、多数の条件に応じて本発明の方法を適切に実施することができる。相互作用しているＭＩＦタンパク質はそれ自体にマーカー遺伝子の活性化ドメインを有してはならない。ＭＩＦタンパク質と融合させたＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインのみをコードするベクターが導入されると直ちにマーカーの転写が行われる。ＭＩＦタンパク質とＪａｂ１タンパク質間の相互作用は酵母の核の内部でも起こるにちがいない。Ｊａｂ１タンパク質を含んでいるハイブリッドのＧＡＬ４活性化ドメイン部分は、マーカーまたはリポーター遺伝子の転写が行われうるようにその細胞の転写メカニズムに応じるものでなければならない。これらの条件の何らかのものが欠けている場合には、このシステムは、相互作用しているタンパク質であるＭＩＦおよびＪａｂ１の部分のみを有しているハイブリッドを構築することによって改変し、それによってそれらの条件を満足させることができる。他の真核細胞はその転写について酵母と類似のメカニズムが用いられているので、哺乳類細胞などの他の真核細胞を酵母の替わりに用いて、ＭＩＦとＪａｂ１の相互作用について試験することができる。リポーター遺伝子の機能は非常に多種類の遺伝子、例えば耐性、もしくは代謝酵素、もしくはＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などの遺伝子によって提供することができる。ＧＡＬ４の機能は、分離可能なＤＮＡ結合および転写活性化のドメインを持ついずれの転写活性化因子によっても提供することができる。いずれのタンパク質にも、転写活性化因子ではなく２つの分離可能な機能を有するものが含まれ、ＭＩＦ−Ｊａｂ１相互作用を検出するための類似の遺伝子システムを確立するために用いることができる。
【００７９】
従って、本発明の方法は、再構築しうるアミノ酸配列の分離可能なドメインを必要とする検出可能ないかなる機能にも、より一般的に適用することができる。本発明のこの一般的な実施形態で、ＭＩＦおよびＪａｂ１間の相互作用が検出される。その方法には、検出可能な機能の欠如している宿主細胞を提供することを含んでいる。検出可能な機能は、分離可能なドメインを有するアミノ酸配列によって再構築／提供される。このように、該アミノ酸配列には第１および第２ドメインが含まれ、それらは宿主細胞中でお互いが十分に近接していれば検出可能な機能を生じさせることができる。
【００８０】
本発明の特に好ましい一実施形態においては、第１のハイブリッドタンパク質および／または第２のハイブリッドタンパク質はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および合成ＤＮＡからなる群から由来するＤＮＡインサートを含んでいるプラスミドのライブラリー上にコードされている。
【００８１】
本発明のさらに好ましい一実施形態においては、キメラ遺伝子はプラスミドの形で宿主細胞中に導入される。
【００８２】
本発明の特に好ましい一実施形態においては、第１のキメラ遺伝子は宿主細胞中での発現が可能なものとして提供される。第１のキメラ遺伝子は第１のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。第１のハイブリッドタンパク質はアミノ酸配列の第１ドメインを含んでいる。第１ハイブリッドタンパク質はまた、Ｊａｂ１タンパク質もしくはＪａｂ１タンパク質断片との相互作用について試験されるＭＩＦタンパク質もしくはＭＩＦタンパク質断片を含んでいる。
【００８３】
本発明の別の一実施形態においては、第１のキメラ遺伝子は宿主細胞の染色体中に組み込まれており、第２のキメラ遺伝子はプラスミドの一部として宿主細胞中に導入される。第２のキメラ遺伝子は宿主細胞中で発現されうるものとして提供される。第２のキメラ遺伝子は、第２のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。第２のハイブリッドタンパク質はアミノ酸配列の第２ドメインを含んでいる。第２のハイブリッドタンパク質はまた、ＭＩＦタンパク質もしくはＭＩＦタンパク質断片との相互作用について試験されるＪａｂ１タンパク質もしくはその断片を含んでいる。宿主細胞中でのＭＩＦタンパク質とＪａｂ１タンパク質の相互作用は、再構築されるべきアミノ酸配列の機能を生ずる。このことは第１のキメラ遺伝子および第２のキメラ遺伝子を宿主細胞中に導入することによって行われる。第１のハイブリッドタンパク質および第２のハイブリッドタンパク質の発現が、再構築されるアミノ酸配列の機能に十分な量となるような条件下に宿主細胞を置く。次いで細胞を試験して、該アミノ酸配列の機能の発現が供試物質、例えばタンパク質の相互作用のない状態における程度よりも高い程度に再構築されているか否かを調べる。この一般化された方法をより特異的なものとして本発明の好ましい方法とすることができ、その方法では検出可能な機能とは検出可能なリポーター遺伝子の転写である。この方法では、アミノ酸配列の第１ドメインは検出可能なリポーター遺伝子上の結合部位を認識するＤＮＡ結合ドメインを含んでおり、アミノ酸配列の第２ドメインは転写活性化ドメインを含んでいる。
【００８４】
本発明の特に好ましい実施形態においては、ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインは異なる転写活性化因子由来のものである。
【００８５】
本発明はまた、ＭＩＦタンパク質を調製する方法であって、（ｉ）ＭＩＦタンパク質を含有している供給源を提供し、（ｉｉ）ＭＩＦタンパク質を含有している供給源をＪａｂ１を含有している供給源とを、以下の、（ｉｉｉ）ＭＩＦとＪａｂ１とを結合させ、また、（ｉｖ）ＭＩＦをＪａｂ１から分離することがともに行われうるような条件下で接触させる、ことを含んでなる方法である。
【００８６】
ある供給源からＭＩＦを精製するための方法は、例えば：
ａ）　ＭＩＦの供給源を濃縮すること；
ｂ）　ＭＩＦをＪａｂ１−クロマトグラフィー用支持体上に吸着させること；
ｃ）　吸着されたＭＩＦを少なくとも１種のバッファーで洗うこと；
ｄ）　洗ったＭＩＦを選択的に溶出すること、および
ｅ）　ＭＩＦを溶出液から回収すること
を含んでなる。
【００８７】
さらに、その精製方法は次の目的にも用いられうる：
（ｉ）　組換えＭＩＦの細菌からの精製、
（ｉｉ）　天然ＭＩＦの組織からの精製、
（ｉｉｉ）　ある種のトートメラーゼなどのＭＩＦ様相同体の精製、
（ｉｖ）　「天然」ＭＩＦを過剰な処理を行うことなく精製し、それによってＪａｂ１がソフトキャプター（ｓｏｆｔ ｃａｐｔｅｒ）分子として用いられうるような精製。
【００８８】
本技術は、ＭＩＦとＪａｂ１が特異的な方法で相互作用するという事実を利用する。このアフィニティクロマトグラフィーは、ＭＩＦタンパク質と固定されたリガンド（例えば、Ｊａｂ１）との相互作用に基づく。本発明のリガンドはこの特定の目的のタンパク質に対して特異的であればよく、この場合、リガンドはＭＩＦと反応する基質、基質類似体、インヒビターまたは抗体である。細胞抽出物などの供給源からＭＩＦを単離するため、例えば、細胞抽出物のサンプルをＪａｂ１機能を付与した、またはコートしたポリマーから成るカラム上に置き、そしてカラムをバッファーによって繰り返し洗浄する。カラム上に保持されたタンパク質だけがポリマーに固着したＪａｂ１と高い親和性をもつタンパク質であり；他のタンパク質は簡単に洗浄除去される。本発明のアフィニティクロマトグラフィー支持体上に固定されたＭＩＦを溶出するために、例えば、塩類および／または塩化マグネシウムなどの既知のカオトロピック剤を十分な濃度で含有するバッファー溶液または炭酸塩バッファーを使用してもよい。ＭＩＦとＪａｂ１の間の親和性と特異性は非常に高いので、ＭＩＦまたはＪａｂ１を細胞抽出物から単離し、かつ精製することができる。このクロマトグラフィーは、ＭＩＦを調製する現行の方法を改善し、かつＪａｂ１を調製する方法を提供する。
【００８９】
Ｊａｂ１用支持体として使用するポリマーは、それ自身を多孔質無機支持体上に固定することができる。多孔質無機支持体としては、例えば、シリカ、アルミナ、マグネシアなどの金属酸化物、またはガラス、珪酸塩、硼珪酸塩、カオリンなどのこれらの酸化物の天然もしくは合成誘導体が挙げられる。前記ポリマーを多孔質無機支持体上に含浸して固定し、もし必要であれば、公知の方法によってポリマーコーティングを架橋し、安定化してもよい。架橋剤は、例えば、ジカルボニル化合物、ハロヒドリン、ジエポキシドなどがある。また、ポリマー支持体を介在二官能カップリング剤を使って無機支持体上に固定してもよい。脱シアリル化タンパク質はまた、適当な二官能カップリング剤を使って公知の方法によりポリマー支持体上に固定することができる。カップリング剤は、例えば、ブロモシアン、ジアルデヒド、ジエポキシドなどの二官能誘導体である。また、タンパク質を多孔質無機支持体上に直接固定してもよい。例えば、シリカ支持体の場合、シリカのアミノアルキルシラン誘導体を調製し、脱シアリル化タンパク質をグルタルアルデヒドなどの二官能作用剤を用いてアミノアルキルシラン上に固定する；例えば、Ｐ． Ｊ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ２４２， ６５９−６６１ （１９７１）を参照。また、脱シアリル化タンパク質をフランス特許出願７７．２８１６３ （公開番号２．４０３．０９８）に記載の方法によって多孔質無機支持体上に固定してもよい。この方法は、過ヨウ素酸塩などの酸化剤を使ってグリコール基を酸化する開裂反応を受け得るポリマーを用いて、多孔質無機支持体をコートすることからなる。ポリカルボニルコーティングが得られ、次いでリガンド、例えば脱シアリル化糖タンパク質を、生成したカルボニル基上に固定することができる。もし所望であれば、生成するイミン基をアミンに還元してもよい。
【００９０】
従って、本発明は；
ａ） Ｊａｂ１タンパク質を含有しているソーズを提供し、
ｂ） Ｊａｂ１タンパク質を含有している供給源をＭＩＦタンパク質を含有する供給源とａｂ１とＭＩＦの結合が起こる条件下で接触させ、
そしてＪａｂ１を分離することを含んでなる、Ｊａｂ１タンパク質を調製する方法に関し、単離したペプチド、タンパク質もしくは断片は、例えばアフィニティクロマトグラフィーなどの生化学的方法によって精製することができる。ＭＩＦもしくはＪａｂ１（例えば、ヒトＭＩＦタンパク質）を単離するために使用しうるアフィニティマトリックスは、ＭＩＦもしくはＪａｂ１をコードするアミノ酸配列、または合成ペプチド、組換え断片等のそれらの断片に対して調製された抗ＭＩＦモノクローナルもしくはポリクローナル抗体であってもよい。あるいは、当業界で周知である、ＭＩＦと特異的に結合する相同の結合ドメインまたはポリペプチドならびに他の化合物をアフィニティマトリックスとして同じ様に利用し、本発明のタンパク質または抗体（例えば、ＭＩＦ−Ｊａｂ１ドメインと相互作用する、純粋なヒトＭＩＦタンパク質、半純粋なマウスＪａｂ１ポリペプチドまたは抗体）を実質的に単離してもよい。クロマトグラフィーは、相同的ドメインをＭＩＦと結合させることにより、未知のＪａｂ１相同体（ＭＯＶ３４ファミリーのタンパク質またはＰａｄ１のようなＭＰＮドメインをもつタンパク質などの）を単離する方法を提供する。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態においては、ＭＩＦおよび／またはＪａｂ１を含有している供給源は、細菌もしくは酵母もしくは遺伝子組換えで調製した細胞を含む細胞、組織、細胞培養物、細胞培養上清、細胞抽出物、タンパク質調製物、単離されたＭＩＦまたはＪａｂ１である。
【００９２】
特に好ましい本発明の実施形態においては、ＭＩＦタンパク質を含有している供給源は、ＭＩＦとＪａｂ１を接触させる前に予備処理し、特に破壊し、もし必要であれば、例えば供給源として使用する細胞を音波処理するか、化学的にもしくは酵素的に溶解するか、またはパルスもしくは定電場にかけてもよい。
【００９３】
本発明はまた、好ましくは単離されかつ精製された、Ｊａｂ１タンパク質の全てもしくは部分と非共有結合により会合したＭＩＦタンパク質の全体または一部分を含んでなる複合タンパク質に関する。ＭＩＦとＪａｂ１の複合体は、天然もしくは野生型複合体、ならびに、複合体の２成分、すなわちＭＩＦもしくはＪａｂ１のそれぞれまたはそれら両方の逆位、欠失、挿入、置換、付加、変性、酸化などのアミノ酸改変を含有するいずれの改変体、突然変異体または遺伝子組換えにより作製された誘導体に関する。
【００９４】
従って、本発明はまた、好ましくは、単離されかつ精製された、Ｊａｂタンパク質の全部又は一部分と共有結合により結合したＭＩＦタンパク質の全部または一部分を含んでなる融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、天然もしくは野生型融合タンパク質、ならびに複合体の２成分のそれぞれ、すなわちＭＩＦもしくはＪａｂ１またはそれら両方の逆位、欠失、挿入、置換、付加、変性、酸化などのアミノ酸改変を有するいずれの改変体、突然変異体または遺伝子組換えにより作製された誘導体に関する。
【００９５】
本発明はまた、精製されかつ単離された、上記の融合タンパク質をコードする核酸配列またはその相補的な鎖に関する。核酸配列という用語は、ＤＮＡもしくはＲＮＡの天然もしくは合成のポリマーに関し、一本鎖もしくは二本鎖であってもよいし、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリマー中に組み込むことができる合成、非合成もしくは改変されたヌクレオチド塩基を含有してもよい。核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡであってもよい。
【００９６】
本発明はまた、上記の核酸配列を含んでなるベクター、特にプラスミドなどの細菌ベクター、リポソーム、バクテリオファージ、レトロウイルスまたはウイルスに関する。
【００９７】
さらに、本発明は、本発明のベクターを用いて形質転換された宿主細胞、特に原核生物または真核生物細胞に関する。本発明はまた、上記のプラスミドを含有する細胞を含んでなる細胞培養物、組織などに関する。
【００９８】
本発明はまた、ＭＩＦとＪａｂ１の複合体またはＭＩＦとＪａｂ１の融合タンパク質またはＭＩＦとＪａｂ１の相互作用ドメインと、特異的に反応する抗体またはそのフラグメントに関する。これらの抗体を使って発現ライブラリーをスクリーニングし、本発明の複合体を産生するクローンおよびまた治療目的のクローンを同定することができる。本明細書に使用される、用語「抗体に関する」は、Ｊａｂ１とＭＩＦの相互作用により誘導される分子および細胞経路の検出、活性化または阻害に関する。用語「抗体」は、ＭＩＦとＪａｂ１の複合体と相互作用する性質を有する二価および一価の分子物質に関する。本明細書に使用される「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされた１以上のポリペプチドから成るタンパク質に関する。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、それぞれ順にＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの免疫グロブリンクラスを定義する（詳細は用語の定義を参照）。成句「と特異的に結合する」は、抗体については、タンパク質および他の生物学的物質の不均質集団が存在している中で、問題のドメインの存在を決定づける認識および結合反応を意味する。従って、指定した免疫条件のもとで、特定の抗体はサンプル中に存在する特定ドメインと結合し、他のタンパク質とは有意な量の結合をしない。そのような条件下におけるドメインとの特異的な結合には、ＭＩＦ−Ｊａｂ−ドメインに対する特異性について選択された抗体が必要である。様々なイムノアッセイフォーマットを用いて、ＭＩＦ−Ｊａｂ１−ドメインと特異的な免疫反応性のある抗体を選択することができる。例えば、日常的に、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを利用してドメインと特異的な免疫反応性のあるモノクローナル抗体を選択する。利用しうるイムノアッセイは、限定されるものでないが、数例として、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定アッセイ、蛍光イムノアッセイおよびプロテインＡイムノアッセイなどの技術を利用する、競合および非競合アッセイ系が挙げられる。本発明の抗体は、ＭＩＦとＪａｂ１の相互作用に関わるドメイン上の１以上のエピトープと特異的に結合する。エピトープは、抗体が結合するＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体またはＭＩＦ−Ｊａｂ１相互作用ドメインまたはＭＩＦ−Ｊａｂ１融合タンパク質の領域であって、その結合は第２の抗体とＭＩＦ−Ｊａｂ１−複合体との会合を阻止するか、またはその抗体は他のタンパク質（上流キナーゼ、ｃ−Ｊｕｎ、ＪＮＫ、ＳＲＣ−１、ＬＦＡ−１、ＰＲ、ＧＲなど）の結合を阻止することを特徴とする。
【００９９】
本発明の一実施形態においては、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびそれらのフラグメントである。抗体フラグメントはＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体と相互作用するフラグメントを包含する。また、ＭＩＦ−Ｊａｂ１−複合体と相互作用するヒト化抗体も包含し、ヒト化抗体は典型的には遺伝子組換え法により作製され、ヒト配列が抗体の一部分または全部を含んでなることを特徴とする。ヒト化抗体の例としては、キメラ抗体またはＣＤＲグラフト化抗体が挙げられる。遺伝子的に改変したマウスで産生されるＭＩＦ−Ｊａｂ１−複合体の全ヒト抗体も含まれる。本発明の抗体に、検出可能な標識を結合させてもよい。そのような標識は、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ＦＩＴＣ）、酵素標識（例えば、西洋わさびオキシダーゼ）、アフィニティ標識（例えば、ビオチン）、または同位体標識（例えば１２５Ｉ）が可能である。
【０１００】
本発明はまた、ＭＩＦ−Ｊａｂ１−複合体と相互作用するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も包含する。
【０１０１】
本発明の抗体は、ＭＩＦ関連疾患の診断に有用である。抗体を、生物学的サンプル中のＭＩＦとＪａｂ１の相互作用の存在を検出する診断キットの一部として使用することができる。生物学的サンプルは、組織、標本および無傷の細胞またはそれらの抽出物が挙げられる。そのようなキットは、検出を可能にする標識を付した抗体を使用する。抗体は、ＭＩＦとＪａｂ１の相互作用の通常ドメインを同定するために有用であり；本発明の抗体はまた、診断および治療にも有用である。
【０１０２】
本発明はまたキットにも関し、キットは本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列、前記核酸配列を含んでいるベクター、前記ベクターを含んでいる宿主細胞、ＭＩＦおよび／またはＪａｂ１をコードするＤＮＡ配列、ＭＩＦおよび／またはＪａｂ１を含んでいる複合体または融合分子、ならびに本発明の抗体を含んでなる。本発明に関連して、ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体を、純粋な脂質または生体膜をもつリポソーム中に含有させることができる。ＭＩＦ−Ｊａｂ複合体をコードするＤＮＡを、アジュバントまたは免疫化の物質として使用することができる。リポソームまたはアジュバントは、ＭＩＦ−および／またはＪａｂ１関連疾患の診断と治療に有用である。
【０１０３】
以上記載した本発明の方法は、ＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用を検出するキットを使用して実施することができる。該キットは、容器、２種のベクターおよび宿主細胞を含んでなる。第１のベクターは、第１のキメラ遺伝子の転写を指令するために、第１のキメラ遺伝子と機能的に関連したプロモーターを含有しておりかつそのような転写終結シグナルを含んでもよい。第１のキメラ遺伝子は、ＤＮＡ結合ドメイン、およびＭＩＦ活性をもつタンパク質またはＭＩＦ活性をもつタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列を挿入するためのユニークな制限酵素切断部位を、ＭＩＦがＤＮＡ結合ドメインをもつハイブリッドタンパク質の部分として発現されるように含む。第１のベクターはまた、宿主細胞内でおよび細菌内で自分自身を複製する手段も含む。第１のベクターはまた、第１のマーカー遺伝子も含んでおり、宿主細胞におけるその発現によって、第１マーカー遺伝子を含有する細胞を第１マーカー遺伝子を含有しない細胞と分けて選択することが可能となる。この第１のベクターは好ましくはプラスミドである。以上特定したＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用を検出する方法、特に薬剤をスクリーニングする方法は、通常条件のもとで実施するものであり、例えば、ＭＩＦとＪａｂ１の結合を検出するために適当な条件のもとでの水性媒質中の結合アッセイである。
【０１０４】
キットはまた、第２のキメラ遺伝子を含有する第２のベクターを含む。第２のキメラ遺伝子も、転写を指令するためのプロモーターおよび転写終結シグナルを含む。第２のキメラ遺伝子はまた、特定のコード化転写活性化ドメイン、およびＪａｂ１活性をもつタンパク質またはタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列をベクターに挿入するためのユニークな制限酵素切断部位を、Ｊａｂ１、またはＪａｂ１活性をもつタンパク質もしくはタンパク質断片が転写活性化ドメインをもつハイブリッドタンパク質の部分として発現され得るように含む。第１のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインと第２のハイブリッドタンパク質の転写活性化ドメインは、好ましくは、分離したＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとを有する転写アクチベーターから得られる。分離したＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインは、酵母ＧＡＬ４タンパク質中に見出されることも公知であり、酵母ＧＣＮ４およびＡＤＲ１タンパク質中に見出されることも公知である。転写に関わる他の多くのタンパク質も分離可能な結合および転写活性化ドメインを有していることから、本発明に有用である。他の実施形態においては、転写活性化ドメイン中のＤＮＡ結合ドメインは異なる転写アクチベーター由来であってもよい。第２のハイブリッドタンパク質は、転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ配列に融合させた、ゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、または合成により作製したＤＮＡ配列を含有するプラスミドのライブラリーにコードされていてもよい。第２のベクターはさらに、宿主細胞内および細菌内で自分自身を複製する手段を含む。第２のベクターはまた第２のマーカー遺伝子を含み、宿主細胞内で該マーカー遺伝子が発現することにより、第２のマーカー遺伝子を含有する細胞を第２のマーカー遺伝子を含有しない細胞から分ける選択が可能になる。キットは、第１のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインに対する結合部位を有する検出可能なリポーター遺伝子を含有する宿主細胞を含む。その結合部位は、検出可能なリポーター遺伝子が第２のベクターにコードされた転写活性化ドメインにより活性化されたときに、該リポーター遺伝子検出可能なタンパク質を発現するように配置される。もし転写活性化ドメインがリポーター遺伝子と十分近接していれば、検出可能な遺伝子の活性化が可能である。宿主細胞自身は、第１マーカー遺伝子、第２マーカー遺伝子、ＤＮＡ結合ドメインまたは転写活性化ドメインの機能を有するタンパク質を発現することはできない。従って、キットを使用することにより、宿主細胞内のＭＩＦとＪａｂ１が相互作用すると、ＭＩＦタンパク質とＪａｂ１タンパク質との相互作用不在のもとで、転写活性化ドメイン中にＤＮＡ結合ドメインが存在する場合よりも、測定しうる程度に高いリポーター遺伝子の発現が起こる。リポーター遺伝子は、容易に測定できる酵素または他の産物をコードするものでもよい。２つのハイブリッドタンパク質を含有する細胞を、適当な培地でインキュベートし、さらにその培養物の測定可能な活性をモニターする。この活性に対して陽性の試験は、ＭＩＦとＪａｂ１タンパク質が相互作用を起こしたことの徴候である。かかる相互作用はそれぞれのＤＮＡ結合および転写活性化ドメインを十分密接した近位に置いて、マーカー遺伝子の転写を引き起こす。
【０１０５】
本発明はまた、ＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用に対する候補薬剤の影響を検出するためのタンパク質アレイキットにも関する。あるキットは、容器内に、ＭＩＦを固体支持体上に直接固定したバイオチップ、Ｊａｂ１を固体支持体上に直接固定したバイオチップ、凍結乾燥形態のＭＩＦタンパク質またはペプチド、凍結乾燥形態のＪａｂ１タンパク質またはペプチド、およびバッファー系を含んでなる。別のキットは、ＭＩＦおよびＪａｂ１のそれぞれをＧＳＨ−支持体上にＧＳＴタンパク質として固定した２種のバイオチップ、凍結乾燥ＭＩＦ、凍結乾燥Ｊａｂ１およびバッファー系を含んでなる。別のキットは、ＭＩＦとＪａｂ１のそれぞれがストレプトアビジン−支持体上にビオチンタンパク質として固定された２種のバイオチップ、凍結乾燥ＭＩＦ、凍結乾燥Ｊａｂ１およびバッファー系を含んでなる。別のキットは、ＭＩＦとＪａｂ１のそれぞれをマレート−支持体上にＭＢＰタンパク質として固定した２種のバイオチップ、凍結乾燥ＭＩＦ、凍結乾燥Ｊａｂ１およびバッファー系を含んでなる。潜在的薬剤をスクリーニングするための様々なキットは次のように使用する。凍結乾燥ＭＩＦタンパク質またはペプチドをバッファーに溶解し、次いでそれを潜在的薬剤の存在または不在のもとで固定したＪａｂ１を有するバイオチップと接触させる。比較のために、凍結乾燥Ｊａｂ１ペプチドまたはタンパク質もバッファーに溶解しそれを潜在的薬剤の存在または不在のもとで固定したＭＩＦを有するバイオチップと接触させる。次に、ＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用を検出する先に記載の方法、特に蛍光またはＭＡＬＤＩ−ＭＳ法を通常の条件で実施する。
【０１０６】
本発明はまた医薬組成物または診断用組成物であって、本発明の核酸配列、本発明の核酸配列を含有するベクター、本発明の該ベクターを含有する宿主細胞、Ｊａｂ１および／もしくはＭＩＦをコードするＤＮＡ配列、本発明の抗体ならびに／またはＭＩＦとＪａｂ１を含有する複合体もしくは融合分子を含み、場合によってはそれを製薬上許容される担体、および／もしくは香料、結合剤、甘味剤、充填剤、増量剤、製薬上許容される塩、無機酸もしくは有機酸、保存剤、乳化剤などのさらなる添加剤と組合せて含む、前記医薬組成物または診断用組成物に関する。
【０１０７】
本発明はまた、ＭＩＦ活性をモジュレートするための、Ｊａｂ１またはＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列の使用、特にＭＩＦ関連疾患を治療するための該使用に関する。
【０１０８】
従って、本発明はまた、Ｊａｂ１またはＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列の、ＭＩＦ関連疾患治療用の医薬、薬剤または治療剤を調製するための使用に関する。
【０１０９】
さらに、本発明は、Ｊａｂ１またはＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列の、ＭＩＦ関連疾患を検出するための使用に関する。
【０１１０】
本発明は、タンパク質複合体および／または融合タンパク質の、ＭＩＦ関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用に関する。
【０１１１】
さらに、本発明は、タンパク質複合体および／または融合タンパク質の、ＭＩＦ関連疾患を診断および／または治療するための使用に関する。
【０１１２】
本発明はまた、Ｊａｂ１の全体もしくは一部分と結合しているＭＩＦの全体もしくは一部分を含有する複合体および／もしくは融合タンパク質を特異的に認識する抗体もしくはそのフラグメント、またはＪａｂ１を認識する抗体もしくはそのフラグメントの、ＭＩＦ関連疾患を診断および／または治療するための薬剤を調製するための使用に関する。
【０１１３】
本発明はまた、本発明の抗体またはＪａｂ１に対する抗体もしくはそのフラグメントの、ＭＩＦ関連疾患を診断および／または治療するための使用に関する。
【０１１４】
さらに、本発明は、Ｊａｂ１もしくはその一部、またはＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列、またはＪａｂ１を特異的に認識する抗体を薬学上有効な量で含んでなる薬剤に関する。
【０１１５】
本発明は、ＭＩＦまたはＭＩＦをコードするヌクレオチド配列の、Ｊａｂ１活性モジュレートするための使用、特にＪａｂ１関連疾患治療のための該使用に関する。Ｊａｂ１関連疾患とは、炎症および／または抗炎症作用、免疫調節経路の調節、敗血症性ショック、生理学的ストレス、サイトカイン活性に関係する疾患、サイトカイン依存性シグナル伝達経路、細胞周期依存性疾患、ＵＶ誘導皮膚障害などの皮膚疾患、異常な細胞増殖疾患および癌ならびに炎症過程を意味する。
【０１１６】
本発明はまた、ＭＩＦまたはＭＩＦをコードするヌクレオチド配列の、Ｊａｂ１関連疾患の診断用および／または治療用薬剤を調製するための使用に関する。
【０１１７】
従って、本発明はまた、Ｊａｂ１活性をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて改変するための方法、特にＪａｂ１関連疾患を診断するかまたは治療するための方法であって、ＭＩＦ、ＭＩＦの部分、ＭＩＦ抗体、および例えばベクター中の適当な調節配列に対してセンスもしくはアンチセンス方向に恐らくクローニングされたＤＮＡもしくはｍＲＮＡなどのＭＩＦヌクレオチド配列を用いて、例えば転写の改変、Ｋｉｐの分解、ｃ−Ｊｕｎの結合および／または細胞周期の改変により、Ｊａｂ１活性および／またはその発現をモジュレートおよび／または制御することによる前記方法に関する。
【０１１８】
さらに、本発明は、ＭＩＦまたはＭＩＦをコードするヌクレオチド配列の、Ｊａｂ１関連疾患を診断および／または治療するための使用に関する。
【０１１９】
従って、本発明は、Ｊａｂ１の全体または一部分と会合させた、任意でＫｉｐおよび／またはｃ−ＪｕｎもしくはＪｕｎＤおよび／またはＪＮＫおよび／またはＳＲＣ−１および／またはＬＦＡ−１および／またはＰＲおよび／またはＧＲと会合させたＭＩＦの全体または一部分を含んでなるタンパク質複合体、ならびに／あるいはＪａｂ１の全体または一部分と結合させた、任意でＫｉｐおよび／またはｃ−ＪｕｎもしくはＪｕｎＤと結合させたＭＩＦの全体または一部分を含んでなる融合タンパク質の、Ｊａｂ１関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用に関する。
【０１２０】
本発明はまた、本発明のタンパク質複合体および／または本発明の融合タンパク質の、Ｊａｂ１関連疾患の診断および／または治療のための使用に関する。
【０１２１】
本発明は、本発明のタンパク質複合体または融合タンパク質を特異的に認識する抗体もしくはそのフラグメント、またはＭＩＦに対する抗体もしくはそのフラグメントの、Ｊａｂ１関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用に関する。
【０１２２】
本発明はまた、本発明のタンパク質複合体および／または融合タンパク質を特異的に認識する抗体もしくはそのフラグメント、またはＭＩＦに対する抗体もしくはそのフラグメントの、Ｊａｂ１関連疾患の診断および／または治療のための使用に関する。
【０１２３】
さらに、本発明はＭＩＦもしくはその一部またはＭＩＦをコードするヌクレオチド配列またはＭＩＦを特異的に認識する抗体を、薬学上有効な量で含んでなる薬剤に関する。
【０１２４】
さらなる好ましい実施形態を特許請求の範囲の従属項において例示する。
【０１２５】
配列番号１は、ＭＩＦ（５０−６５）のアミノ酸配列を記す。
【０１２６】
配列番号２は、Ｓｅｒ５７ Ｓｅｒ６０ ＭＩＦ（５０−６５）のアミノ酸配列を記す。
【０１２７】
以下の実施例を本発明をさらに説明するために提供するが、本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
【０１２８】
実施例１：
ツーハイブリッドシステムを使用する、ＭＩＦとＪａｂ１の相互作用の検出
実施例全体で使用した材料および方法
組換え体タンパク質、融合構築物、および抗体
組換え体ヒトＭＩＦは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から、Ｋｌｅｅｍａｎｎら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６１， ７５３ （１９９９）に記載の通り精製した。［３５Ｓ］放射標識を行うために、ヒトＭＩＦを、ＰＲＯ−ＭＩＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を補充した標準最小培地で増殖した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させ、そしてＢｅｒｎｈａｇｅｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３， １４１４４ （１９９４）においてｒＭＩＦについて記載された通り精製した。Ｊａｂ１の完全なコード配列は、Ｊｕｒｋａｔ細胞からＲＴ−ＰＣＲにより得て、そして二方向配列決定により確認した。Ｊａｂ１ ｃＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳およびトランスフェクション実験における発現用に、ｐＣｌ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングした。ＴＮＦはＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。ＥＧＦＰ融合タンパク質：ｐＮ３−ＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＥＧＦＰをＭＩＦのＣ末端に融合させた。ミトコンドリアマーカーとしてのＰ３３−ＥＧＦＰは記載されている。ＰＫＣμ（ＫＤ）−ＥＧＦＰはサイトゾル局在化を示すものであり、それをそれぞれの対照として用いた。ウサギポリクローナル抗ｒＭＩＦ抗体はＢｅｒｎｈａｇｅｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３６５， ７５６ （１９９３）に記載の通り取得した。他の抗体は全てＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。
【０１２９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応
共役ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応は、ＴＮＴ Ｔ７迅速網状赤血球溶解物システム（Ｑｕｉｃｋ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ−ｌｙｓａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ）を超非放射性翻訳検出システム（Ｔｒａｎｓｃｅｎｄ ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）と組合せて実施した。Ｊａｂ１とｃ−Ｊｕｎの発現は、プラスミドｐＣｌ−ｎｅｏ−Ｊａｂｌ（上記を参照）およびｐＢＡＴ−ｃ−Ｊｕｎを用いて達成した。ビオチン標識したＪａｂ１およびｃ−Ｊｕｎの発現効率は、それぞれ抗Ｊａｂ１または抗ｃ−Ｊｕｎ抗体を用いる免疫ブロットにより、またはストレプトアビジン／西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓ−ＨＲＰ）を用いる染色により確認した。
【０１３０】
タンパク質−タンパク質相互作用
ｒＭＩＦの固定は、Ａｆｆｉｇｅｌ １０ アガロース（ＢＩＯ−ＲＡＤ）上にｐＨ８．５で製造業者の推奨に従って実施した。対照ビーズは、Ｌ−グリシン、ｐＨ ８およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてブロックした。Ｊａｂ１とビーズの結合は、ｐＣｌ−ｎｅｏ−Ｊａｂｌを用いて４８時間かけて、一過性トランスフェクトした２９３Ｔ細胞（効率＞８０％）由来の溶解物中で分析した。細胞溶解（３０分間、氷上）は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．７、０．４ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、３ｍＭ ＤＴＴ、および１×プロテイナーゼインヒビターカクテル（ＰＩ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中で行った。結合および洗浄は、ＮａＣｌを０．１Ｍに希釈したことを除いて、同一のバッファー中で実施した。可溶性ｒＭＩＦとＪａｂ１の結合については、ＴＮＴ網状赤血球溶解物にＢＳＡのｒＭＩＦ １μＭを補充し、ビオチン標識したＪａｂ１もしくはｃ−Ｊｕｎをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳により発現させ、反応物をＰＩを含有する燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に６倍希釈し、そして反応物を４℃で３時間回転させた。抗体を加え、反応物を１時間インキュベートし、免疫沈降物をプロテインＡ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させ（１時間、４℃）、そしてＰＢＳ中で洗浄し、次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ ８．０、１７０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、５０ｍＭ ＮａＦ中で洗浄した。免疫共沈したビオチン化タンパク質を免疫ブロットおよびＳ−ＨＲＰ染色により検出した。ビオチン化ＭＩＦ−ＥＧＦＰのＪａｂ１との免疫共沈のためには、ストレプトアビジンを結合した磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を使用し、複合体を上記の通り洗浄し、免疫ブロット後に、Ｊａｂ１を抗Ｊａｂ１抗体を用いて検出した。
【０１３１】
可溶性ｒＭＩＦとｉｎ ｖｉｔｒｏ合成したＪａｂ１との結合については、抗ＭＩＦ抗体（１００μｇ／ウエル）によりコートしたＥＬＩＳＡプレート中で溶解物を４℃にて１時間インキュベートして、ＴＮＴ溶解物の内因性ＭＩＦ（１０ｎＭと評価された）を枯渇させた。溶解物に、１μＭ ｒＭＩＦ、対照バッファー、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および発現させたビオチン標識Ｊａｂ１もしくはｃ−Ｊｕｎを補充した。反応物をプロテイナーゼインヒビターカクテル（ＰＩ）（Ｒｏｃｈｅ）を含有する燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に６倍希釈し、そしてそれを４℃で３時間回転した。複合体を抗体／プロテインＡ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により免疫沈降させ（それぞれ１時間、４℃）、そしてＰＢＳ中で洗浄し、次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ ８．０、１７０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、５０ｍＭ ＮａＦ中で洗浄した。免疫共沈したビオチン化タンパク質を免疫ブロットおよびＳ−ＨＲＰ染色によって検出した。
【０１３２】
内因性ＭＩＦと内因性Ｊａｂ１との相互作用を無処理２９３Ｔ細胞の溶解物について分析した。ＭＩＦ／Ｊａｂ１複合体を抗Ｊａｂ１を用いて沈降させ、比較には対照抗体またはプロテインＡセファロース単独を用い、そして抗ＭＩＦ抗体を用いて免疫ブロット分析をした。
【０１３３】
組織培養と一過性トランスフェクション
細胞系を推奨の標準法に従って培養した。全ての一過性トランスフェクションはスーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ， Ｑｉａｇｅｎ）を使って実施した。ｒＭＩＦとの共インキュベーションについては、ＭＩＦをプラスミド添加の２時間後に加えた。血清飢餓ＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションを報告（Ｔｏｍｏｄａら，１９９９）に従って実施した。
【０１３４】
内因性ＭＩＦタンパク質の発現量の低下した生細胞は、細胞をｐＢＫ／アンチセンスＭＩＦ発現ベクター（Ｗａｅｂｅｒら，１９９７）を用いてトランスフェクトすることによって得た。対照細胞は空のｐＢＫプラスミドを用いてトランスフェクトした。安定的にトランスフェクトされたクローンを単離した。対照細胞の５０％未満のＭＩＦ含量を発現する１つのクローン、ΔＡＳ ２．２３を使用した。
【０１３５】
生細胞またはＨｅｌａ細胞を、［３５Ｓ］ｒＭＩＦ、ＦＬＵＯＳ−ＭＩＦ、ビオチン−ＭＩＦ（それぞれ１μＭ）、または標識試薬単独とともに、１時間かけてインキュベートし、細胞を氷冷ＰＢＳおよび５０ｍＭグリシン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ３中で洗浄し、そして標準方法による液体シンチレーションカウント、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡用に調製した。［３５Ｓ］ｒＭＩＦ実験については、細胞を差異遠心により細胞小器官分画に分けて、サイトゾル画分をＰＤ１０ゲル濾過により分析した。共局在化実験については、Ｈｅｌａ細胞をトランスフェクトし（１μｇ ｐＭＩＦ−ＥＧＦＰ）、さらに細胞を２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、固定し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて透過化し、そして５％ヤギ血清を用いてブロックした。Ｊａｂ１染色については、抗Ｊａｂ１抗体およびＡｌｅｘａ−５４６染色を使用した。サンプルを、Ａｌｅｘａ５４６、ＧＦＰ、およびＦＬＵＯＳ発光用のフィルターを使って共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて分析した。
【０１３６】
活性アッセイ
ＡＰ−１リポーター遺伝子活性は報告（Ｊｏｈａｎｎｅｓら，１９９８）に従って測定した。０．１５μｇのｐＣｌ−ｎｅｏ−Ｊａｂｌまたは空のプラスミド、ならびにそれぞれ０．０５μｇのＴｋ−ＬＵＣ−５×ｌ２−ｏ−テトラデカノールホルボールアセテート（ＴＲＥ）（Ａｎｇｅｌら，１９８７）、Ｒ１５−ＲＳＶ−ＬａｃＺレポーター構築物およびｐＥＧＦＰプラスミドを使用した。ｒＭＩＦとともにインキュベーションを１８時間実施した。２９３Ｔ細胞中のＮＦκＢリポーター遺伝子活性の測定を、ｒＭＩＦを加えて４０時間、記載の通り実施した（Ｊｏｈａｎｎｅｓら，１９９８）。生細胞のＮＦκＢアッセイを記載の通り実施した（Ｒｏｇｅｒら，１９９８）。ＪＮＫアッセイをｒＭＩＦを加えて４８時間、記載の通り実施した（Ｂｅｒｂｅｒｉｃｈら，１９９６）。ｐ２７Ｋｉｐ１誘導実験および増殖研究を、開示された方法（Ｔｏｍｏｄａら，１９９９）に従って実施した。ｐ２７Ｋｉｐ１のパルス−チェイス標識については、前記の方法（Ｔｏｍｏｄａら，１９９９）を適用し、７×１０５細胞／ウエルで播いた同調させた繊維芽細胞を用いて、１μＭ ｒＭＩＦをプレーティング時、パルス、およびチェイス期間に加えた。
【０１３７】
結果：
ＭＩＦとＪａｂ１との相互作用
ＭＩＦが細胞内タンパク質と相互作用することによる直接的な細胞内機能を有する可能性を試験するために、ツーハイブリッドスクリーニングを使用した。ｐＡＳ２−１ベクターを使い、ヒトＭＩＦの全コード領域をＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインにインフレームで融合した。得たベイトプラスミドｐＭＩＦ−ＢＤを用いて、ヒト胎児脳ライブラリーを、本質的には製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の記載に従い、酵母ツーハイブリッド法によってスクリーニングした。ＭＩＦはオリゴマー化するが、ＭＩＦによる自己活性化は検出されなかった。Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ培地での選択および得たクローンのβ−ガラクトシダーゼ活性に対する試験の後、３つの陽性ＧＡＬ４ ＤＮＡ活性化ドメイン融合タンパク質を得た。液体培地におけるβ−ガラクトシダーゼアッセイの結果は、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）単位であり、独立クローンから得た７つの測定値の平均±ＳＤである。
【０１３８】
ＭＩＦは脳およびリンパ球にて多量に発現されるので、ヒト全脳およびリンパ球のｃＤＮＡライブラリーを用い、全長ヒトＭＩＦ ｃＤＮＡをベイトとして使用した。それぞれ３．５×１０６および３．０×１０６個のトランスフェクタントから、栄養選択およびβ−ガラクトシダーゼ活性について試験した場合に、特異的に相互作用するクローンを全部で４タイプ同定した。それらのクローンの１つは、ヒトｐ３８Ｊａｂ１のほとんど全体のコード配列（アミノ酸２０〜３３５に相当する）を有するｃＤＮＡインサートを含有した（同一性：対応するｐ３８Ｊａｂ１配列に対して＞９９％）。他の２つのクローンの全コード配列はヒトＭＩＦ ｃＤＮＡ配列と１００％同一であり、ＭＩＦ自体が結合してオリゴマーになったことが確認された。ＭＩＦは酵母ツーハイブリッドアッセイにおいてＪａｂ１と特異的に結合すると結論付けられた。
【０１３９】
図１は、ＭＩＦとＪａｂ１の相互作用を示す。ａ、ＭＩＦは酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて特異的にＪａｂ１と結合する。選択培地における、ＭＩＦとＪａｂ１を同時発現する形質転換体の増殖。ＭＩＦ−ＢＤはＧａｌ４−ＢＤ／ＭＩＦ融合構築物に対応し；Ｊａｂ１−ＡＤおよびＭＩＦ−ＡＤはスクリーニングから得たクローンを表す。Ｌａｍｉｎ−ＢＤ、Ｇａｌ４−ＢＤ、およびＧａｌ４−ＡＤは陰性対照であり、ｐ５３−ＢＤおよびＳＶ４０−ＡＤは陽性対照である。上パネルは、第１のＢＤクローンの形質転換；下パネルは、第１のＡＤクローンの形質転換。Ｌｅｕ＋Ｔｒｐ＋形質転換体を、ロイシンおよびトリプトファン（＋Ｈｉｓ）を含まないか、またはロイシン、トリプトファンおよびヒスチジン（−Ｈｉｓ）を含まない培地上にストリークした。液体培地アッセイにより定量すると、Ｊａｂｌ−ＡＤ／ＭＩＦ−ＢＤサンプルについてのβ−ガラクトシダーゼ活性は、ＧＡＬ４−ＡＤ／ＧＡＬ４−ＢＤについての０．１±０．１単位、ＧＡＬ４−ＡＤ／ＭＩＦ−ＢＤについての０．１±０．０４単位、およびＪＡＢ１ ＡＤ／ＧＡＬ４−ＢＤについての０．３±０．１単位と比較して、２．１±０．２β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）単位であることがわかった。ＳＶ４０−ＡＤ／ｐ５３−ＢＤ陽性対照は９９±２５単位であった。液体培地のβ−ガラクトシダーゼアッセイの結果は、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）単位であり、独立クローンからの７つの測定値の平均±ＳＤである。ｂ、固定したＭＩＦはＪａｂ１と特異的に相互作用する。ストレプトアビジンビーズ上に固定したＭＩＦを、２９３Ｔ細胞中で過剰発現させたＪａｂ１と共にインキュベートし、プルダウンにより複合体を単離し、そして結合したＪａｂ１を抗Ｊａｂ１抗体／ＨＲＰ−ＥＣＬ染色を用いて免疫ブロットにより検出した。ｃ、内因性ＭＩＦと内因性Ｊａｂ１のｉｎ ｖｉｖｏ相互作用。ＭＩＦ陽性−対−ＭＩＦ陰性細胞の代謝標識および内因性ＭＩＦ／Ｊａｂ１複合体の抗ＭＩＦ抗体によるプルダウン。左パネルは、ＭＩＦ陽性ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞−対−ＭＩＦ陰性Ｋｙｍ−１細胞を［３５Ｓ］システイン／メチオニンを用いて標識し、ＭＩＦ含有複合体を抗ＭＩＦ−対−非免疫抗体を用いて免疫沈降して、結合した放射性タンパク質を電気泳動した。１４ Ｃ−放射標識した分子量マーカーを同時電気泳動した。繊維芽細胞（１×１０６細胞当量）はウェスタンブロットによりＭＩＦ陽性（０〜３のスケールでスコア３）であり、これはＥＬＩＳＡにより＞３００ｆｇ ＭＩＦ／細胞を含有すると測定された。Ｋｙｍ−１細胞はウェスタンブロットによりＭＩＦ陰性（スコア０）であり、ＥＬＩＳＡによる測定で７±５ｆｇ ＭＩＦ／細胞（平均±ＳＤ；ｎ＝３）を含有した。右パネルは、抗Ｊａｂ１および抗ＭＩＦ対照ウェスタンブロット。下のパネルの抗Ｊａｂ１ウェスタンブロットは、Ｋｙｍ−１およびＮＩＨ３Ｔ３細胞がほぼ等しい濃度の内因性Ｊａｂ１を含有することを示す。このウェスタン分析については、それぞれの細胞型について５×１０５細胞当量を電気泳動した。染色は抗Ｊａｂ１抗体／ＨＲＰ−ＥＣＬ化学発光を用いて実施した。
【０１４０】
実施例２
共沈降を使用する、ＭＩＦとＪａｂの相互作用の検出
ＭＩＦとｐ３８Ｊａｂ１の間の相互作用の特異性をｉｎ ｖｉｔｒｏ共沈降実験により確認した。精製した組換えヒトＭＩＦ（ｒＭＩＦ）をアガロースビーズ上に固定し、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞からクローニングして２９３ヒト胚性腎細胞中で過剰発現させた全長ｐ３８Ｊａｂ１との結合を評価した。ｐ３８Ｊａｂ１はＭＩＦビーズと強く結合したが、非官能化対照ビーズに対しては非特異的バックグラウンド結合しか観察されなかった。さらに、可溶性ｒＭＩＦはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳されたビオチン標識ｐ３８Ｊａｂ１と特異的に結合し得たが、ビオチン標識ｃ−ＪｕｎはＭＩＦにより共沈降しなかった。逆に、ビオチン標識ＭＩＦ−増強緑色蛍光タンパク質（ＭＩＦ−ＥＧＦＰ）融合タンパク質はｐ３８Ｊａｂ１と結合した。
【０１４１】
ｐ３８Ｊａｂ１のかなりの部分が核およびサイトゾル中に見出され、このことはＭＩＦとの相互作用はこれらの区画の１つで起こりうることを示唆した。抗ＭＩＦ抗体およびＣｙ−２による内因性ＭＩＦの染色、ＨｅｌａおよびＣＯＳ−１細胞におけるＭＩＦ−ＥＧＦＰ融合タンパク質の一過性トランスフェクション、および他のＥＧＦＰ−連結マーカータンパク質による細胞小器官局在化の顕微鏡を用いた比較は、内因性ＭＩＦおよび過剰発現ＭＩＦ融合タンパク質が両方ともサイトゾルに優先的に存在することを示した。循環中の細胞外ＭＩＦは、ＭＩＦの多数の免疫学的機能にとって非常に重要であるので、細胞外ＭＩＦがサイトゾルを標的としているかどうかも試験した。リソソーム画分から回収しうるものだけでなく、外部から加えた［３５Ｓ］ｒＭＩＦも、有意な濃度でサイトゾルを標的としそこで数時間安定している。このことは、細胞横断的に作用をするＭＩＦが標的細胞に取り込まれた後にｐ３８Ｊａｂ１と相互作用しうることを示した。
【０１４２】
ＭＩＦとＪａｂ１の間のｉｎ ｖｉｔｒｏ特異的複合体形成はまた、両方のタンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において発現させたときにも観察された。ビオチン標識したＭＩＦ−増強緑色蛍光タンパク質（ＭＩＦ−ＥＧＦＰ）融合タンパク質と非ビオチン化Ｊａｂ１の複合体が特異的に沈降することを実証した。さらに、ビオチン化ｒＭＩＦは、生２６４．７マクロファージまたはＨｅｌａ細胞に加えると、ｉｎ ｖｉｖｏで内因性Ｊａｂ１と結合した。この後者の知見も、細胞に外部から添加したＭＩＦがエンドサイトーシス後に内因性細胞内Ｊａｂ１と結合し得ることを示す。
【０１４３】
最後に、内因性パートナーのｉｎ ｖｉｖｏ相互作用を調べた。内因性Ｊａｂ１／ＭＩＦ複合体を無処理２９３Ｔ細胞から沈降した。ＭＩＦの特異的共沈降は、共沈降に抗Ｊａｂ１抗体を使用すると抗ＭＩＦウェスタンブロットにより検出されたが、対照抗体を使用すると検出されなかった。従って、ＭＩＦは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのどちらにおいてもｐ３８Ｊａｂ１と特異的に結合する。
【０１４４】
図２はＭＩＦがＪａｂ１と特異的に相互作用することを示す。ａ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ相互作用。ｒＭＩＦとＴＮＴ溶解物にて発現されたビオチン−Ｊａｂ１との複合体をＭＩＦ特異的抗体により沈降し、ビオチン化タンパク質をウェスタンブロットにより検出した（左パネル）。右パネルは、発現対照。ｂ、固定したＭＩＦとＪａｂ１との相互作用。ストレプトアビジンビーズに固定したＴＮＴ翻訳ビオチン−ＭＩＦ−ＥＧＦＰまたは無標識の対照を、ＴＮＴ翻訳Ｊａｂ１とともにインキュベートし、複合体を単離し、免疫ブロットによりＪａｂ１を検出した。ｃ、ＭＩＦとＪａｂ１のｉｎ ｖｉｖｏ相互作用。内因性Ｊａｂ１／ＭＩＦ複合体を２９３Ｔ細胞溶解物から抗Ｊａｂ１抗体を用いて免疫沈降し、ＭＩＦを免疫ブロットにより検出した。抗ＴＮＦ抗体またはビーズ単独による沈降を対照とした。
【０１４５】
実施例３
ＡＰ−１依存性リポーター遺伝子活性のモジュレートを利用する、ＭＩＦとＪａｂの相互作用の検出
Ｊａｂ１の転写コアクチベーター機能はＡＰ−１転写活性の増加による。ＭＩＦがＪａｂ１との結合よりこの活性モジュレートし得るかどうかを試験した。コラゲナーゼＴＲＥルシフェラーゼレポーターを一過性発現する、２９３Ｔ細胞におけるＡＰ−１依存性リポーター遺伝子活性を測定した。
【０１４６】
ＭＩＦの効果を、５×ＴＲＥ−ルシフェラーゼレポーターを用いてトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のＡＰ−１依存性リポーター遺伝子活性を測定することにより評価した。組換え体ＭＩＦは、濃度に依存する様式でＴＮＦ−αが誘導するＡＰ−１依存性リポーター遺伝子活性を完全に停止させ、１μＭの濃度において、ｒＭＩＦの添加と一緒に細胞に一過性にコトランスフェクトした全長ｃＤＮＡであるｐ３８Ｊａｂ１が誘導するＡＰ−１依存性リポーター遺伝子活性の増強を完全に阻害した。ＭＩＦによるＡＰ−１活性の阻害は、ＭＩＦが媒介して変化させた細胞増殖の二次的効果ではなかった。トランスフェクトしたｃ−Ｊｕｎが不在のもとではｐ３８Ｊａｂ１による顕著な増強（２倍）が観察され、これは内因性ｃ−Ｊｕｎレベルはｐ３８Ｊａｂ１による増強が起こるのに十分であることを示した。ＭＩＦによる阻害は既に１ ｐＭで有意（約３０％）であり、１０ｎＭ〜１μＭのｒＭＩＦを適用すると完全であった。
【０１４７】
図３は、ＭＩＦが、刺激されたＡＰ−１活性を阻害することを示した。ａ、ＭＩＦは、２９３Ｔ細胞におけるＡＰ−１リポーター遺伝子活性のＪａｂ１媒介活性化を阻害する。ｐＣＩ−ｎｅｏ−Ｊａｂｌまたは対照ベクターを用いたトランスフェクションを、（−）ｒＭＩＦを用いた場合または用いない場合と比較した。ｂ、ＭＩＦはＴＮＦ誘導ＡＰ−１活性を阻害する。ａと同じであるが、Ｊａｂ１の代わりにＴＮＦ誘導による。ＰＭＡによる刺激を対照とした。データは、４つの測定値の平均±ＳＤを示し、３つの実験を表す。ｃ、ＭＩＦは、刺激されたＮＦκＢリポーター遺伝子活性を阻害しない。低下した内因性ＭＩＦ含量を有するアンチセンスＭＩＦマクロファージ（＋ａｓ−ＭＩＦ）からのＴＮＦ誘導ＮＦκＢを、対照細胞（＋対照）および非トランスフェクト細胞（−）の活性と比較した。３つの測定値の平均±ＳＤを示した。ＬＵＣは、相対ルシフェラーゼ活性。
【０１４８】
図４は、ＭＩＦが、Ｊａｂ１およびＵＶストレスによるＡＰ−１リポーター遺伝子（コラゲナーゼ５×１２−ｏ−テトラデカノールホルボールアセテート応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター）活性の増強を阻害することを示す。２９３Ｔ細胞をレポータープラスミドを用いてトランスフェクトしかつ示されたようにｐＣｌ−ｎｅｏ−Ｊａｂｌまたは空の対照ベクターを用いてコトランスフェクトし、そして、示された濃度のｒＭＩＦまたはバッファー対照とともに１８時間インキュベートした。ａ、図３ａに対するウェスタンブロット対照実験であり、抗Ｊａｂ１−および抗ＧＦＰ−ウェスタンによるＪａｂ１過剰発現および対照ＥＧＦＰコトランスフェクションの分析を示す。コトランスフェクトしたＥＧＦＰ構築物（ｐＮ３−ＥＧＦＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をインキュベーション当たり０．０５μｇだけ加えた。さらに、インキュベーション終了時にＥＧＦＰ陽性細胞を計数した。この分析により判定したトランスフェクション効率は図３ａについて４５−５０％、図３ｂについて３５−４５％であった。このアッセイ条件下でのＭＩＦ自体の２９３Ｔ細胞増殖に対する効果は、追加の細胞計数を行って排除した。インキュベーション期間終了後のウエルは、２．３〜２．５×１０５細胞（図３ａ）および３．８〜４．１×１０４細胞（図３ｂ）を含有した。結果は相対ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）活性として表した。ｂ、ＭＩＦはＵＶストレス誘導ＡＰ−１転写活性を阻害する。図３ｂと同じであるが、ＴＮＦ処理の代わりにＵＶ光誘導（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ， ３．６Ｊｏｕｌｅ／ｃｍ２、２０分＋９０分）による。データは４つの測定値の平均±ＳＤを表す。ｃ、ＭＩＦは、刺激されたＮＦκＢ活性を妨害しない。組換え体ＭＩＦ（ｒＭＩＦ）は２９３Ｔ細胞におけるＴＮＦ誘導ＮＦκＢリポーター遺伝子活性を阻害しない。細胞をレポータープラスミドを用いてトランスフェクトし、ｒＭＩＦを用いて１μＭの濃度にてインキュベーション（４０時間）した。ＴＮＦを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えた（６時間）。結果は、相対ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）活性であり、３つの測定値の平均±ＳＤを表す。
【０１４９】
ＭＩＦはまた、ＴＮＦ−およびＵＶ−ストレス誘導ＡＰ−１転写活性も阻害する。外部から加えてもまたは内因性であっても、ＭＩＦはＮＦκＢ活性を妨害しない。組換えＭＩＦ（１μＭ）は、２９３Ｔ細胞中のＴＮＦ誘導ＮＦκＢリポーター遺伝子活性に影響を与えない。
【０１５０】
実施例４
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用する、ＭＩＦとＪａｂ１の相互作用の検出
ｐ３８Ｊａｂ１による転写コアクチベーター機能は、ｃ−ＪｕｎとＡＰ−１部位の結合の増強によるものである。従って、ＭＩＦは、ｐ３８Ｊａｂ１との結合によりこの活性をモジュレートしうると仮定した。ＤＮＡ結合に対するそのような効果は、ｐ３８Ｊａｂ１および／またはｃ−Ｊｕｎを用いてトランスフェクトしかつｒＭＩＦの存在または不在のもとでインキュベートした２９３細胞由来の核抽出物に対して、ｌ２−ｏ−テトラデカノールホルボールアセテート応答エレメント（ＴＲＥ）を用い、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を実施することにより、評価した。ｐ３８Ｊａｂ１はｃ−ＪｕｎとＴＲＥの結合を促進した。ＭＩＦをｐ３８Ｊａｂ１およびｃ−Ｊｕｎの両方を過剰発現する細胞と共にインキュベートすると、ｃ−ＪｕｎとＡＰ−１部位の結合に対するｐ３８Ｊａｂ１活性化効果の顕著な阻害（２倍）が見られた。対照的に、１つの転写因子だけを過剰発現させるかまたは１つも過剰発現させない場合、ＭＩＦが示す活性化効果は小さかったが、この効果はプログラムされた網状赤血球溶解物からのＥＭＳＡには見られなかった。テトラサイクリン制御トランスアクチベーター系を安定的に発現しかつヒトＭＩＦ ｃＤＮＡが安定してトランスフェクトされていてドキシサイクリン除去後に内因性ＭＩＦの５〜６倍超のＭＩＦタンパク質を過剰発現するようにした、ＨｅＬＡ Ｔｅｔ−オフ細胞系ＨｔＴＡの核抽出物から得たＥＭＳＡは、ＭＩＦがＡＰ−１依存性ＤＮＡシフトを顕著に阻害し得ることが確認された。ドキシサイクリンにより抑制したインキュベーションにおけるバンド強度は、内因性ＭＩＦの有意濃度（約１００ ｆｇ／細胞）により既にＤＮＡシフトが阻害されていることを表すと思われるので、恐らくこの系における阻害の程度はもっと顕著であろう。
【０１５１】
実施例５
ＭＩＦとｐ３８Ｊａｂ１は細胞シグナル伝達経路を調節する
ｐ３８Ｊａｂ１とＭＩＦがさらに広く細胞シグナル伝達経路に作用しうるかどうかを試験するため、直接転写制御の上流機構によるＡＰ−１活性の調節を研究した。ｐ３８Ｊａｂ１はＪＮＫ活性を調節しうると考えた。ｐ３８Ｊａｂ１を用いた２９３細胞の一過性トランスフェクションは、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ （１−７９）に対する免疫沈降キナーゼ活性がｐ３８Ｊａｂ１により顕著に刺激されることを明らかにした。ｐ３８Ｊａｂ１による増強は２−３倍であり、標準濃度のＴＮＦ−αを用いた刺激後のＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）のＮ末端リン酸化より強かった。ＭＩＦがこのｐ３８Ｊａｂ１介在効果も阻害するかどうかを研究した。組換え体ＭＩＦは、用量に依存する様式で、ｐ３８Ｊａｂ１によるＪＮＫ活性の増強を完全に逆転した。従って、組換え体ＭＩＦはＪａｂ１によるＪＮＫ活性の増強を逆転した。２００ｎＭ以上のＭＩＦは完全な阻害をもたらした。同様に、ＴＮＦ−α誘導ＪＮＫ活性は、ｒＭＩＦを用いた処理の後、基線レベルに抑制された。ＭＩＦ−ｐ３８Ｊａｂ１相互作用は、ＭＩＦが内因的に過剰発現されるか外因的に細胞に加えられるかに依ることなく、起こるに違いない。これは、ＭＩＦ−ＥＧＦＰを用いてまたはＥＧＦＰ単独でコトランスフェクトしておいた２９３細胞内でＴＮＦ−α誘導またはｐ３８Ｊａｂ１誘導ＪＮＫ活性を測定する一過性トランスフェクション実験により試験して実証された。外因的に加えたｒＭＩＦと同様に、内因的に過剰発現したＭＩＦはＴＮＦ−αおよびｐ３８Ｊａｂｌが介在するＪＮＫ活性化の両方を全て抑制した。
【０１５２】
図５はＪａｂ１がＪＮＫ活性およびホスホ−ｃ−Ｊｕｎレベルを増強し、ＭＩＦがこれらの効果を阻害することを示す。ａ、ｒＭＩＦはＪａｂ１が介在するＪＮＫ活性の増強を阻害する。左は、空ベクターおよびｒＭＩＦまたはバッファーを用いて処理したベクターに対する、ｐＣＩ−ｎｅｏ−Ｊａｂｌを用いてトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からのＪＮＫ免疫沈降物によるＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）のリン酸化の比較である。相対活性はバンド強度を示す。対照はＴＮＦ誘導である。右は、左と同じであるが示したようにアンチセンスＪａｂ１プラスミドのコトランスフェクションである（対照、ＪＮＫレベルの免疫ブロット；トランスフェクション効率：４０−５０％；分散：±１０％；Ｊａｂ１によるＪＮＫの誘導：１．６倍±ＳＤ ０．０８；ｎ＝３）。ｂ、ＭＩＦによる、内因性ｃ−ＪｕｎのＪａｂ１誘導リン酸化の阻害。４ａにおけるインキュベーションと同じであるが、ホスホ−ｃ−Ｊｕｎの免疫ブロットを分析した。βアクチン免疫ブロットを対照にした。ｃ、ｂと同じであるが、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化はＴＮＦまたはＵＶストレスにより誘導した。
【０１５３】
図６は、Ｊａｂ１およびＭＩＦによるＪＮＫの調節を示す。ａ、ＴＮＦ刺激ＪＮＫ活性のｒＭＩＦによる阻害。２９３Ｔ細胞をＦＬＡＧ標識ＪＮＫをコードするベクターを用いてトランスフェクトし、示したようにＴＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびｒＭＩＦまたはバッファー対照を用いて４８時間インキュベートした。ＪＮＫ免疫沈降物を用いてＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）をリン酸化し、ホスホイメージ走査によって相対バンド強度（相対活性化として示した）を評価した。対照ウェスタンブロットを抗ＦＬＡＧ抗体により分析した。分散は全体的に±１０％の範囲にあった。ｂ、Ｊａｂ１によるｃ−ＪｕｎビーズとＪＮＫの結合の増強、しかしＭＩＦによる妨害の不在。２９３Ｔ細胞由来の溶解物中で内因性ＪＮＫとＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）ビーズの結合に対するＪａｂ１過剰発現およびＭＩＦ共インキュベーションの影響を分析することによって、ｃ−ＪｕｎとＪＮＫの結合活性に対するＪａｂ１とＭＩＦの影響の可能性を研究した。細胞のＪａｂ１によるトランスフェクションは、対照−トランスフェクトした細胞と比較して、ＪＮＫとｃ−Ｊｕｎビーズの結合の増強をもたらした。ｒＭＩＦの添加はこのＪａｂ１効果に影響を与えなかった。２９３Ｔ細胞をＪａｂ１ベクターを用いて原稿の図４ａのようにトランスフェクトし、細胞溶解物をＧＳＨアガロースに結合したＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）を用いてインキュベートした。溶出した複合体を、抗ＪＮＫ抗体を用いてｒＭＩＦの存在または不存在のもとでインキュベートし沈降し、結合したタンパク質を抗ＪＮＫ（内部対照）、抗ＧＳＴ、および抗ｃ−Ｊｕｎウェスタンブロットにより分析した。
【０１５４】
実施例６
ＭＩＦが非ＡＰ−１関連活性についてもＪａｂ１作用をネガティブに調節し得るかどうかを研究するため、Ｊａｂ１と結合してＪａｂ１により分解が起こる細胞周期インヒビターｐ２７Ｋｉｐ１に対するＭＩＦの影響を調べた。増殖中のＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の溶解物から調製した免疫ブロットにより示したように、ｐ２７Ｋｉｐ１レベルを抑制するＪａｂ１とは対照的に、ＭＩＦは用量に依存する様式でｐ２７Ｋｉｐ１レベルを誘導した。この誘導は、内因性Ｊａｂ１タンパク質をほぼ完全に抑制するアンチセンスＪａｂ１構築物を用いて細胞をトランスフェクトすると、ｐ２７Ｋｉｐ１レベルがＭＩＦに応答して上昇しないので、Ｊａｂ１依存性であった。ｐ２７Ｋｉｐ１はＧ１増殖停止を誘導し、Ｊａｂ１は血清飢餓繊維芽細胞を増殖停止から救うことができる。過剰発現したＭＩＦ−ＥＧＦＰまたは外因性ｒＭＩＦは、濃度に依存する様式で、Ｊａｂ１が誘導する繊維芽細胞の血清依存性低下および増殖繊維芽細胞の増殖の両方を阻害することが見出された。ＭＩＦは直接ｐ２７Ｋｉｐ１と結合せず、ｐ２７Ｋｉｐ１ ｍＲＮＡまたはタンパク質合成を刺激せず、かつＪａｂ１はプロテアソーム依存性ｐ２７Ｋｉｐ１分解を促進するので、ｐ２７Ｋｉｐ１分解の過程におけるＭＩＦの影響を分析した。ｐ２７Ｋｉｐ１レベルは、同調しパルス−チェイス標識した繊維芽細胞からの免疫沈降により測定すると、ｒＭＩＦを添加するとより高くなった。ｐ２７Ｋｉｐ１レベルに対するＭＩＦの安定化効果は、プロテアソームインヒビターＬＬｎＬの添加によりさらに増強されることはなかった。対照的に、ＭＩＦ単独によるｐ２７Ｋｉｐ１レベルの増強はＬＬｎＬ単独より顕著ですらあった。同時に、ＭＩＦの添加は、タンパク質合成ブロッカーの存在のもとでｐ２７Ｋｉｐ１レベルを若干増加した。免疫共沈降研究はＭＩＦがｐ２７Ｋｉｐ１／Ｊａｂ１複合体形成を部分的に妨害することを示したので、これらのデータは、ＭＩＦ介在効果はｐ２７Ｋｉｐ１介在増殖停止を反映しかつこの効果はｐ２７Ｋｉｐ１のＪａｂ１依存性分解の阻害を経由して起こることを示す。
【０１５５】
図７は、ＭＩＦがｐ２７Ｋｉｐ１タンパク質を安定化しかつＪａｂ１に依存した様式で繊維芽細胞増殖を阻害することを示す。ａ、ＭＩＦは繊維芽細胞におけるｐ２７Ｋｉｐ１発現を誘導する（ｐ２７Ｋｉｐ１免疫ブロットおよびｃ−Ｊｕｎ対照ブロット）。ｂ、ＭＩＦによるｐ２７Ｋｉｐ１誘導はＪａｂ１依存性である。左、ａと同じであるが、アンチセンスＪａｂ１または対照プラスミド（効率対照、ｐＥＧＦＰコトランスフェクション）の追加のトランスフェクション。右、アンチセンス構築物は繊維芽細胞中のＪａｂ１を低下させる。ｃ、ＭＩＦによる、繊維芽細胞のＪａｂ１介在血清依存性低下の阻害。ＧＦＰ発現細胞の増殖を、Ｊａｂ１−およびＭＩＦ−ＥＦＧＰ過剰発現−対−対照ベクター処理細胞についてＢｒｄＵ組み込みを経由して分析した。データは４測定値の平均±ＳＤである。ｄ、ＭＩＦはｐ２７Ｋｉｐ１のプロテアソームが介在する分解を阻害する。左、ＭＩＦはパルス−チェイス標識した繊維芽細胞中のｐ２７Ｋｉｐ１の分解を低下する。ｒＭＩＦ（＋）対バッファー処理細胞由来の免疫沈降物が示す［３５Ｓ］ｐ２７Ｋｉｐ１レベル。右、ＭＩＦ効果はプロテアソームと連結している。ａと同じであるが、インキュベーション後に、ＤＭＳＯ、シクロヘキシイミド（ＣＨＸ）、またはＬＬｎＬを用いて処理した。
【０１５６】
図８は、ＭＩＦによるｐ２７ Ｋｉｐ１誘導を示す。ａ、ノーザンブロットにより分析した、ｐ２７ Ｋｉｐ１ ｍＲＮＡレベルに対するｒＭＩＦの影響。１ｘ１０７ ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞を、（示した）ｒＭＩＦの存在または不存在のもとで４０時間インキュベートし、細胞を氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で溶解した。全細胞ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌプロトコルによって単離し、ＲＮＡを定量し、そして標準ノーザンブロット手順（Ｂｕｒｇｅｒ−Ｋｅｎｔｉｓｃｈｅｒら， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ５５， １４１７−１４２５， １９９９）に適用した。プローブをＰＣＲに基づくＤＩＧ標識法（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）により作製した。ＫｉｐプローブはマウスＫｉｐ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ０９９６８）の塩基８−１８１に対応し、ヒトＧＡＰＤＨプローブはＢｕｒｇｅｒ−Ｋｅｎｔｉｓｃｈｅｒらの記載に従った。トランスフェクションについては、細胞をプラスミドｐＪａｂ１およびｐＣｌｎｅｏを用いて５時間インキュベートし、１時間養生した後にｒＭＩＦを加えた。繊維芽細胞をインキュベートするのに用いたｒＭＩＦ濃度増加の有無とは関係なく、Ｋｉｐ ｍＲＮＡレベルは比較しうるレベルであることがわかった。ｐＪａｂ１ベクターの一過性トランスフェクションに続くＪａｂ１の過剰発現も、Ｋｉｐ ＲＮＡ生成に対するＭＩＦの刺激効果をもたらさなかった。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞においてＫｉｐのｍＲＮＡレベルを分析したときも、類似の結果を得た（Ｋｉｐ／ＧＡＰＤＨ比は次の通り：バッファー、１．０；１００ｎＭ ｒＭＩＦ、０． ８；１μＭ ｒＭＩＦ、０．７８）。ｂ、ｐ２７ Ｋｉｐ１タンパク質合成に対するｒＭＩＦの影響。４ｘ１０６ ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞を、１％ ＦＣＳを含有する培地中の一夜インキュベーションにより同調し、ｒＭＩＦ（１μＭ）または対照バッファーを加え、そして細胞をさらに３６時間インキュベートした。細胞をシステイン／メチオニンを含まない培地中で洗浄し、この培地で１５分間インキュベートし、そして放射能（ＰＲＯＭＩＸ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を与えた。細胞を６０分間、標識の存在のもとでインキュベートし、洗浄し、そしてＫｉｐを抗Ｋｉｐ抗体を用
いて免疫沈降した。サンプルを１３％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で電気泳動し、放射能をホスホイメージャーにより検出した。ｃ、繊維芽細胞中のＫｉｐ／Ｊａｂ１複合体形成に対する組換え体ＭＩＦの影響。ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞をいずれもＬＬｎＬを用いて４時間インキュベートした。ビオチン−Ｊａｂ１をＴＮＴ網状赤血球溶解物中に過剰発現させた。対照には、ＴＮＴ溶解物をｐＣｌｎｅｏ対照ベクターを用いてプログラムし、両方の溶解物からのアリコートを、示した繊維芽細胞溶解物に加えた。組換え体ＭＩＦ（１μＭ）または対照バッファーを加え、混合物を免疫共沈降条件のもとで２時間インキュベートした。複合体を抗Ｋｉｐ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて沈降した。次に、ビオチン−Ｊａｂ１（上パネル）またはＫｉｐ１（対照、下パネル）のいずれかについて染色した免疫ブロットを実施して、Ｋｉｐ／Ｊａｂ複合体形成に対するＭＩＦの潜在的影響を評価した。
【０１５７】
実施例７
突然変異体分析と競合実験。
【０１５８】
Ｊａｂ１結合および調節にとって本質的であるこれらのＭＩＦの構造部分をさらに詳しく研究するために、突然変異体を作製した。１つの突然変異体は、野生型ＭＩＦ配列において位置６０のシステインがセリン残基により置換された突然変異体Ｃ６０ＳＭＩＦである。他の突然変異体は、野生型ＭＩＦの位置５０−６５に存在する１６個のアミノ酸残基からなる野生型ＭＩＦのペプチド断片であるＭＩＦ（５０−６５）である。
【０１５９】
突然変異体Ｓｅｒ５７Ｓｅｒ６０ＭＩＦ（５０−６５）は、位置５７でセリンがそして位置６０で他のセリンがその位置の野生型アミノ酸Ｃｙｓの代わりに挿入されたことを特徴とする野生型ＭＩＦの位置５０−６５における野生型アミノ酸残基からなる突然変異体を表す。上記のアミノ酸位置は、Ｋｌｅｅｍａｎら，図２，（１９９８ｂ）に記載の開示されたヒトＭＩＦ配列に関連づけて与えられており、ＭＩＦのアミノ酸配列およびその調製に関するこの開示内容は全て本発明の教示の開示に含まれる。
【０１６０】
突然変異Ｃ６０ＳＭＩＦは、明確な構造活性プロフィールを表す。この突然変異体は容易にフォールドして活性アッセイに利用することができるが、酵素オキシドレダクターゼおよびＭＩＦの免疫活性を欠く。Ｃ６０ＳＭＩＦは、ビオチン−Ｊａｂ１と結合できるが、ＴＮＴ誘導ＡＰ−１活性を阻害せず、Ｊａｂ１が誘導するｃ−Ｊｕｎ ＤＮＡ結合の増強を低下せず、そしてｐ２７Ｋｉｐ１が誘導する性質の低下を示すことがわかった。Ｃｙｓ６０の１６残基にまたがるＭＩＦペプチド、ＭＩＦ（５０−６５）およびＳｅｒ５７Ｓｅｒ６０ＭＩＦ（５０−６５）は、野生型ＭＩＦとＪａｂ１結合に対して強く競合し、この領域がＪａｂ１の結合および調節に関わることを共に示した。
【０１６１】
図９は、ＭＩＦとＪａｂ１の間の結合部位の特性決定を示す。Ｃｙｓ６０残基単独でなく、ＭＩＦ配列（５０−６５）がＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用に非常に重要である。ａ、突然変異体Ｃ６０ＳＭＩＦもＪａｂ１と結合しているかどうかを研究するために、ｒＣ６０ＳＭＩＦ（ｒ：組換え体）のビオチン標識Ｊａｂ１との結合をｒｗｔＭＩＦのそれと、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＴＮＴ網状赤血球溶解物中で比較した。抗ビオチンＳ−ＨＲＰウェスタンブロットを示した（左パネル）。ｒｗｔＭＩＦおよびｒＣ６０ＳＭＩＦの直接ウェスタンブロット分析は、免疫共沈降に用いた抗ＭＩＦ抗体が両方のタンパク質に対して比較しうる結合性質を示すことを実証した（右パネル）。ｂ、ＭＩＦペプチド（５０−６５）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＴＮＴ網状赤血球溶解物系において濃度に依存する様式で、野生型ＭＩＦとビオチン−Ｊａｂ１の結合に対して競合する。抗体Ｓ−ＨＲＰウェスタンブロットを示した。２つのＣｙｓ残基がＳｅｒに置換されたＭＩＦ（５０−６５）の類似体も試験し、これもＪａｂ１結合と競合し、ＣＡＬＣ Ｃｙｓ残基自身（ａ参照）はＪａｂ１の結合に対して重要でないことを確認した。ｃ、突然変異体Ｃ６０ＳＭＩＦ単独は、野生型ＭＩＦと比較して、ｐ２７ Ｋｉｐ１を誘導する性質の低下を示した。ｒＭＩＦまたは突然変異体Ｃ６０ＳＭＩ（２０ｎＭ）を用いてインキュベートしたＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の溶解物由来の抗Ｋｉｐ１ウェスタンブロットを示す。
【０１６２】
図１０は、繊維芽細胞の増殖停止に対するＭＩＦの影響を示す。ａ、繊維芽細胞の飢餓からのＪａｂ１介在救出に対する、外因的に加えたｒＭＩＦの影響。ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞をＪａｂ１または対照ベクターを用いてトランスフェクトし、ＥＧＦＰを用いてコトランスフェクトした。細胞を２時間血清飢餓させ、示した濃度でｒＭＩＦを加え、細胞をさらに３６時間飢餓させ、ＢｒｄＵを用いて１８時間インキュベートし、抗ＢｒｄＵ抗体を用いて染色した。ＧＦＰを発現する細胞だけを分析した。データは、４測定値の平均血清（それぞれ＞１５０細胞）を表し、３つの独立した実験を表す。外因的に加えたｒＭＩＦは用量に依存する様式でＪａｂ１効果を阻害した。１．８μｍ ｒＭＩＦを加えると、ＥＧＦＰ−ＭＩＦをトランスフェクトしたときと同じ程度の阻害を得た（≒８０％〜４０％の阻害；原稿を参照）。ｂ、繊維芽細胞の飢餓誘導増殖停止に対するｒＭＩＦの影響。セミコンフルエントのＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞を無血清培地中で２４時間同調した。培地を、さらなる添加物のないまたは示した濃度のｒＭＩＦを含有する０．５％ ＦＣＳに変えた。標識したチミジンの存在のもとで、インキュベーションを１６時間続けた。図１０は２つの独立した実験を表し、データは６測定値の平均±ＳＤを表す。ｃ、増殖中または血清飢餓繊維芽細胞の細胞増殖に対する抗ＭＩＦ抗体の影響。セミコンフルエント３Ｔ３細胞を無血清培地で２４時間同調した。培地を、さらなる添加なしのまたはポリクローナル抗ＭＩＦ抗体の２００μｇ／ｍｌもしくは対照としての無関係なウサギＩｇＧの２００μｇ／ｍｌを含有する、無血清（後者は示してない）または１０％ ＦＣＳ含有培地に変えた。インキュベーションを標識したチミジンの存在のもとで１６時間続けた。図１０は、抗ＭＩＦ ＩｇＧを１０％ ＦＣＳと組合せて使用した４つの実験の１つを示す。同調後にインキュベーションを無血清培地中で続けると、同様な結果を得た。ｄ、増殖中の繊維芽細胞の増殖に対する内因性過剰発現ＭＩＦの影響。ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞を０．５％血清を含有する培地中での１８時間インキュベーションによって同調した。細胞を全血清培地条件に切り替え、Ｊａｂ１または対照ベクターとＥＧＦＰ−ＭＩＦまたはＥＧＦＰとを用いてトランスフェクトし、さらに４０時間インキュベートした。ＢｒｄＵ陽性細胞を前のように評価した。データは４測定値の平均±ＳＤを表し、３つの独立実験を表す。
【０１６３】
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１８． Ａｓａｎｏ， Ｋ．ら「ヒト真核生物開始因子の３サブユニットをコードするｃＤＮＡの構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃＤＮＡｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ３ ｓｕｂｕｎｉｔｓ）」 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ２７０４２−２７０５２ （１９９７）．
１９． Ｋａｒｉｎ， Ｍ．「マイトジェン活性化タンパク質キナーゼによるＡＰ−１活性の調節（Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＰ−１ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ）」 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０， １６４８３−１６４８６ （１９９５）．
２０． Ｈｉｒｏｔａ， Ｋ．ら「ＡＰ−１転写活性はチオレドキシンとＲｅｆ−１の間の直接結合により調節される（ＡＰ−１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａ ｄｉｒｅｃｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ａｎｄ Ｒｅｆ−１）」 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４， ３６３３−３６３８ （１９９７）．
２１． Ｗｉｌｈｅｌｍ， Ｄ．， Ｂｅｎｄｅｒ， Ｋ．， Ｋｎｅｂｅｌ， Ａ． ＆ Ａｎｇｅｌ， Ｐ．「細胞内グルタチオンのレベルは、Ｊｕｎ Ｎ末端プロテインキナーゼおよびｐ３８キナーゼを含むストレス活性化シグナル伝達経路のアルキル化剤による誘導に対する重要因子である（Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｉｓ ａ ｋｅｘ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｐ３８ ｋｉｎａｓｅ ｂｙ ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）」 Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １７， ４７９２−４８００ （１９９７）．
２２． Ｌａｎａｔｈａｎ， Ａ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｊ．Ｂ．， Ｓａｎｄｅｒｓ， Ｌ． Ｋ． ＆　Ｎａｔｈａｎｓ， Ｄ．「増殖因子が誘導する初期応答遺伝子の遅延（Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅｌａｙｅｄ ｅａｒｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅｓ）」 Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １２， ３９１９−３９２９ （１９９２）．
２３． Ｗｉｓｔｏｗ， Ｇ．Ｊ．， Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ， Ｍ．Ｐ．， Ｌｅｅ， Ｄ．Ｃ．， Ｈｏｄｉｎ， Ｊ． ＆ Ｚｅｌｅｎｋａ， Ｐ．Ｓ．「マクロファージ遊走阻止因子は眼レンズの分化中の細胞に発現する（Ａ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｙｅ ｌｅｎｓ）」 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， １２７１−１２８０ （１９９３）．２４． Ｓｃｈｅｉｎｍａｎ， Ｒ．Ｉ．， Ｃｏｇｓｗｅｌｌ， Ｐ．Ｃ．， Ｌｏｆｑｕｉｓｔ， Ａ．Ｋ． ＆ Ｂａｌｄｗｉｎ， Ａ．Ｓ．「グルココルチコイドが介在する免疫抑制における、ＩκＢαの転写活性化の役割（Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＩκＢα ｉｎ ｍｅｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ）」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０， ２８３−２８９ （１９９５）．
２５． Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｒ． Ａ． Ｍｅｔｚ， Ｃ．Ｎ．， Ｐｅｎｇ， Ｔ． ＆ Ｂｕｃａｌａ， Ｒ．「マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）によるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）および細胞質ホスホリパーゼＡ２活性化の持続。細胞増殖とグルココルチコイド作用における調節的役割（Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ （ＭＡＰＫ） ａｎｄ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ａｃｔｉｖａｉｏｎ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ （ＭＩＦ）． Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ａｃｔｉｏｎ）」 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， １８１００−１８１０６ （１９９９）．
２６． Ｄｅｄｉｏ， Ｊ．， Ｊａｈｎｅｎ−Ｄｅｃｈｅｎｔ， Ｗ．， Ｂａｃｈｍａｎｎ， Ｍ． ＆ Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｓｔｅｒｌ， Ｗ．「マルチリガンド結合タンパク質ｇＣｌｑＲ、推定Ｃｌｑ受容体はミトコンドリアタンパク質である（Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇＣｌｑＲ， ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｃｌｑ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ｉｓ ａ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）」 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０， ３５３４−３５４２ （１９９８）．
２７． Ｊｏｈａｎｎｅｓ， Ｆ．Ｊ．ら，「腫瘍壊死因子誘導アポトーシスのプロテインキナーゼＣμダウンレギュレーションは核因子κＢ依存性保護遺伝子の発現の増強と相関がある（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃμ ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ−ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ−ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅｓ）」 Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５７， ４７−５４ （１９９８）．
２８． Ａｎｇｅｌ， Ｐ．ら「ホルボールエステル誘導遺伝子はＴＰＡ調節性トランス活性化因子により認識される共通ｃｉｓ配列を含有する（Ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅｓ ｃｏｎｔａｉｎ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｃｉｓ ｅｌｅｍｅｎｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ａ ＴＰＡ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）」 Ｃｅｌｌ ４９， ７２９−７３６ （１９８７）．
２９． Ｂｅｒｂｅｒｉｃｈ， Ｉ．ら「Ｂ細胞上の架橋ＣＤ４０は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼよりもむしろストレス活性化プロテインキナーゼを優先して誘導する（Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ＣＤ４０ ｏｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ）」 ＥＭＢＯ Ｊ． １５， ９２−１０１ （１９９６）．
３０． Ｒｏｇｅｒら「ＡＰ−１とＮＦκＢ活性の増加およびＩＬ−８ ｍＲＮＡの安定性の増加は、Ｈ２９２細胞によるＩＬ−８ ｍＲＮＡの超誘導に関係がある（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ＡＰ−１ ａｎｄ ＮＦκＢ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＩＬ−８ ｍＲＮＡ ａｒｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｓｕｐｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−８ ｍＲＮＡ ｂｙ Ｈ２９２ ｃｅｌｌｓ）」 Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３３０， ４２９−４３５ （１９９８）
３１． Ｗａｅｂｅｒら「インスリン分泌は島β細胞ＭＩＦのグルコース依存性産生により調節される（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｌｅｔ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ ＭＩＦ）」 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４， ４７８２−４７８７ （１９９７）
３２． Ｋｌｅｅｍａｎｎら「マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）とグルタチオンおよびジヒドロリポアミドによるインスリンジスルフィドの特異的還元：細胞酸化還元プロセスにおける潜在的役割（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ （ＭＩＦ） ｗｉｔｈ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ａｎｄ ｄｉｈｙｄｒｏｌｉｐｏａｍｉｄｅ ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｄｏｘ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）」 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４３０， １９１−１９６ （１９９８ ｂ）．
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はＪａｂ１とＭＩＦの相互作用を示す。
【図２】
図２はＭＩＦが特異的にＪａｂ１と相互作用することを示す。
【図３】
図３はＭＩＦが刺激されたＡＰ−１活性を阻害することを示す。
【図４】
図４はＭＩＦがＪａｂ１およびＵＶストレスによるＡＰ−１レポーター遺伝子活性（コラゲナーゼ５ｘ１２−ｏ−テトラデカノールホルボールアセテート応答配列（ＴＲＥ）プロモーター）の増強を阻害することを示す。
【図５】
図５はＪａｂ１がＪＮＫ活性およびホスホ−ｃ−Ｊｕｎレベルを増加し、ＭＩＦがこれらの効果を阻害することを示す。
【図６】
図６はＪａｂ１とＭＩＦによるＪＮＫの調節を示す。
【図７】
図７はＭＩＦがｐ２７Ｋｉｐ１タンパク質を安定化しかつＪａｂ１に依存する様式で繊維芽細胞増殖を阻害することを示す。
【図８】
図８はＭＩＦによるｐ２７Ｋｉｐ１誘導の機構を示す。
【図９】
図９はＭＩＦとＪａｂ１との間の結合部位の特性決定を示す。
【図１０】
図１０は繊維芽細胞の増殖停止に対するＭＩＦの影響を示す。
【図１】
2004500807.tif 000002
2004500807.tif 000003
【図２】
2004500807.tif 000004
【図３】
2004500807.tif 000005
【図４】
2004500807.tif 000006
【図５】
2004500807.tif 000007
【図６】
2004500807.tif 000008
【図７】
2004500807.tif 000009
【図８】
2004500807.tif 000010
【図９】
2004500807.tif 000011
2004500807.tif 000012
【図１０】
2004500807.tif 000013
2004500807.tif 000014
【国際公開パンフレット】
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2004500807.tif 000016
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2004500807.tif 000131
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500807.tif 000132
【手続補正書】
【提出日】平成14年3月14日(2002.3.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【書類名】明細書
【発明の名称】候補薬剤のスクリーニング方法
【特許請求の範囲】
【請求項１】候補薬剤がＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）およびＪａｂ１（ｃ−Ｊｕｎ活性化ドメイン結合タンパク質）の間の相互作用を崩壊させるか否かを試験することによって候補薬剤をスクリーニングする方法であって、ＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用を、該候補薬剤の存在しない条件でＭＩＦおよびＪａｂ１システムで検出し、その検出された相互作用を、ＭＩＦおよびＪａｂ１システムで候補薬剤が存在する条件での相互作用と比較することを含んでなる方法であって、該方法が人体では行われない、方法。
【請求項２】方法がｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である請求項１に記載の方法。
【請求項３】ＭＩＦとＪａｂ１との相互作用が結合アッセイによって検出される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】結合が放射活性標識もしくは光標識ＭＩＦ、Ｊａｂ１、ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体、ならびに／またはそれらの抗体を用いて測定される、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】結合が電気泳動移動度シフトアッセイを用いて測定される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】固定化されていないＭＩＦ、Ｊａｂ１、ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体、および／またはそれらの抗体が固定化されたＭＩＦ、Ｊａｂ１、ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体、および／またはそれらの抗体と結合し、その結果得られた複合体が沈降反応、特に遠心またはろ過によって分離される、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】結合がクロマトグラフィーによる分画によって測定される、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】ＭＩＦおよびＪａｂ１がｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳によって得られる、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】ＭＩＦおよびＪａｂ１が細胞の粗抽出物中に含まれている、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】方法がｉｎ ｖｉｖｏの方法である、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】請求項１から１０のいずれか１項に記載の方法であって、
ａ）　ＭＩＦおよび／もしくはＪａｂ１を過剰発現している細胞を提供し、
ｂ）　ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体標的活性、特に候補薬剤が存在しない条件でのリポーター遺伝子の発現を検出し、
ｃ）　ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体標的活性、特に候補薬剤が存在する条件でのリポーター遺伝子の発現を検出し、ならびに
ｄ）　ｂ）およびｃ）で得られた結果を比較する、
ことを含んでなる方法。
【請求項１２】ＭＩＦおよび／またはＪａｂ１を過剰発現している該細胞がＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体によって誘導されうるリポーター遺伝子を含んでいる、請求項１から１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】ＭＩＦおよび／またはＪａｂ１を過剰発現している該細胞が、
ａ）　プロモーターの機能的制御下にあるＭＩＦコード配列を含んでいるベクター、
プロモーターの機能的制御下にあるＪａｂ１コード配列を含んでいるベクター、
および
リポーター遺伝子を含んでいるベクター、
または、
ｂ）　単一のプロモーターの機能的制御下にあるＭＩＦおよびＪａｂ１をコードする遺伝子を含んでいるベクターならびにリポーター遺伝子を含んでいるベクター、
または、
ｃ）　単一のプロモーターの機能的制御下にあるＭＩＦおよびＪａｂ１をコードする配列ならびにリポーター遺伝子を含んでいるベクター、
を用いて宿主細胞をトランスフェクトして得られる、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）　次のものを含んでいる細胞を提供し；
ｉ）　ＤＮＡ結合タンパク質認識部位に機能しうる形で連結された、リポーター遺伝子；
ｉｉ）　ＤＮＡ結合タンパク質認識部位と特異的に結合するＤＮＡ結合部分に共有結合で結合されたＭＩＦを含んでいる第１のハイブリッドタンパク質を発現している第１の融合遺伝子；および
ｉｉｉ）　候補薬剤が存在しない条件ではＪａｂ１がＭＩＦと結合する、遺伝子活性化部分に共有結合で結合されたＪａｂ１を含んでいる第２のハイブリッドタンパク質を発現している第２の融合遺伝子；
ｂ）　前記細胞を候補薬剤とリポーター遺伝子の発現が可能な条件下で接触させ、ならびに、
ｃ）　前記リポーター遺伝子の発現の阻害を、候補薬剤がＭＩＦとＪａｂ１間の結合を崩壊させる能力の尺度として検出すること、
を含んでなる、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】ＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用を検出するための方法であって：
ａ）　リポーター遺伝子を含んでいる細胞であって、転写活性化ドメインがリポーター遺伝子に十分近接している場合には、該リポーター遺伝子が該転写活性化ドメインを含むアミノ酸配列により活性化されるとき、該リポーター遺伝子がリポータータンパク質を発現する、細胞を提供し、
ｂ）　宿主細胞中で発現されうる第１のキメラ遺伝子であって、第１のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでおり、該第１のハイブリッドタンパク質は、
ｉ）　前記細胞内の該リポーター遺伝子の結合部位を認識するＤＮＡ結合ドメイン；および、
ｉｉ）　ＭＩＦタンパク質もしくはその一部分、
を含んでいる、第１のキメラ遺伝子を提供し、
ｃ）　宿主細胞中で発現されうる第２のキメラ遺伝子であって、第２のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでおり、該第２のハイブリッドタンパク質は、
ｉ）　転写活性化ドメイン、
および
ｉｉ）　Ｊａｂ１タンパク質もしくはその一部分、を含む
ｉｉｉ）　前記細胞内でのＭＩＦタンパク質とＪａｂ１との間の相互作用によって転写活性化ドメインのリポーター遺伝子の転写の活性化が生じる、第２のキメラ遺伝子を提供し、
ｄ）　第１のキメラ遺伝子と第２のキメラ遺伝子を細胞内に導入し、
ｅ）　前記細胞を、第１のハイブリッドタンパク質および第２のハイブリッドタンパク質の発現が、リポーター遺伝子が活性化されるために十分な量であるような条件下に置かれ、
ならびに、
ｆ）　前記リポーター遺伝子が、ＭＩＦタンパク質とＪａｂ１タンパク質の間の相互作用がない場合における発現よりも高い程度に発現されたか否かを決定すること、
を含んでなる方法。
【請求項１６】リポーター遺伝子の発現がスクリーニングしようとする候補薬剤を与えた細胞中で測定され、その薬剤を与えていない細胞における該リポーター遺伝子の発現と比較される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインが、分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを有する転写活性化因子由来のものである、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】転写活性化ドメイン中の該ＤＮＡ結合ドメインが、転写活性化因子ＧＡＬ４、ＧＣＮ４、およびＡＤＲ１からなる群から選択されたものである、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】第１のハイブリッドタンパク質および／または第２のハイブリッドタンパク質が、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および合成ＤＮＡからなる群から由来するＤＮＡインサートを含んでいるプラスミドのライブラリー上にコードされている、請求項１５から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】キメラ遺伝子が細胞中にプラスミドの形態で導入される、請求項１５から１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】第１キメラ遺伝子が細胞の染色体中に組み込まれる、請求項１５から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】第１キメラ遺伝子が細胞の染色体中に組み込まれ、第２キメラ遺伝子が宿主細胞中にプラスミドの一部分として導入される、請求項１５から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインが異なる転写活性化因子からのものである、請求項１５から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】ＭＩＦとＪａｂ１との間の相互作用がＭＩＦまたはＪａｂ１と競合するペプチドの存在下で試験される、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】ＭＩＦと競合するペプチドが、
ＭＩＦ （５０−６５） （配列番号１）または
Ｓｅｒ５７ Ｓｅｒ６０ ＭＩＦ（５０−６５） （配列番号２）
である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】ＭＩＦを調製する方法であって、
ａ）　ＭＩＦを含有している第１のソースを提供し、
ｂ）　ＭＩＦを含有している第１のソースをＪａｂ１を含有している第２のソースと、ＭＩＦとＪａｂ１の結合が可能な条件下で接触させ、および
ｃ）　ＭＩＦをＪａｂ１から分離する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２７】Ｊａｂ１を調製する方法であって、
ａ）　Ｊａｂ１を含有している第１のソースを提供し、
ｂ）　Ｊａｂ１タンパク質を含有している第１のソースをＭＩＦを含有している第２のソースと、ＭＩＦとＪａｂ１の結合が可能な条件下で接触させ、
ｃ）　Ｊａｂ１をＭＩＦから分離する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２８】ソースが細胞、組織、細胞培養物、細胞培養上清、細胞抽出物、タンパク質調製物、単離されたＭＩＦまたはＪａｂ１である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】ソースのそれぞれが、ソースと接触する前に消化される、請求項２６から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】Ｊａｂ１の全体または一部分と自然に会合させ、任意で、ｐ２７Ｋｉｐ１および／またはｃ−Ｊｕｎおよび／またはｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼおよび／またはステロイド受容体コアクチベーター１および／またはインテグリンＬＦＡ−１および／またはプロゲステロン受容体および／または糖質コルチコイド受容体と自然に会合させたＭＩＦの全体または一部分を含んでなるタンパク質複合体。
【請求項３１】Ｊａｂ１の全体または一部分と結合させ、任意で、ｐ２７Ｋｉｐ１および／またはｃ−Ｊｕｎおよび／またはｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼおよび／またはステロイド受容体コアクチベーター１および／またはインテグリンＬＦＡ−１および／またはプロゲステロン受容体および／もしくは糖質コルチコイド受容体と結合させたＭＩＦの全体または一部分を含んでなる融合タンパク質。
【請求項３２】請求項３０もしくは３１に記載の複合タンパク質もしくは融合タンパク質またはそれらの相補的鎖をコードする核酸配列。
【請求項３３】請求項３２に記載の核酸配列を含んでいるベクター。
【請求項３４】請求項３３に記載のベクターを含んでいる宿主細胞。
【請求項３５】請求項３０および／もしくは請求項３１の複合体および／もしくは融合タンパク質を特異的に認識し、ＭＩＦとＪａｂ１の相互作用に関与するドメイン上の１個以上のエピトープと特異的に結合する、抗体もしくはそのフラグメント。
【請求項３６】抗体がモノクローナル抗体である請求項３５に記載の抗体。
【請求項３７】抗体がポリクローナル抗体である請求項３５に記載の抗体。
【請求項３８】抗体がヒト化抗体である請求項３５から３７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項３９】抗体がヒト抗体である、請求項３５から３８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４０】抗体もしくはそのフラグメントが検出可能な標識を有する、ならびに／または該抗体もしくはそのフラグメントが改変されたものである、請求項３５から３９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項４１】請求項３０に記載のタンパク質複合体、請求項３１に記載の融合タンパク質、請求項３２に記載の核酸配列、請求項３３に記載のベクター、請求項３４に記載の宿主細胞、Ｊａｂ１をコードするＤＮＡ配列、ＭＩＦをコードするＤＮＡ配列、および／または請求項３５から４０のいずれか１項に記載の抗体を含んでなるキット。
【請求項４２】請求項３０に記載のタンパク質複合体、請求項３１に記載の融合タンパク質、請求項３２に記載の核酸配列、請求項３３に記載のベクター、請求項３４に記載の宿主細胞、Ｊａｂ１をコードするＤＮＡ配列、ＭＩＦをコードするＤＮＡ配列、および／または請求項３５から４０のいずれか１項に記載の抗体、任意で製薬上許容される担体と結合させたものを含んでなる医薬組成物もしくは診断用組成物。
【請求項４３】Ｊａｂ１またはＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列の、ＭＩＦの活性をモジュレートするため、とりわけＭＩＦ関連疾患の治療のための使用。
【請求項４４】Ｊａｂ１また
はＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列の、ＭＩＦ関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用。
【請求項４５】Ｊａｂ１またはＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列の、ＭＩＦ関連疾患の診断および／または治療のための使用。
【請求項４６】請求項３０に記載のタンパク質複合体および／または請求項３１に記載の融合タンパク質のＭＩＦ関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用。
【請求項４７】請求項３０に記載のタンパク質複合体および／または請求項３１に記載の融合タンパク質のＭＩＦ関連疾患の診断および／または治療のための使用。
【請求項４８】請求項３５から４０のいずれか１項に記載の抗体またはＪａｂ１に対する抗体またはその断片のＭＩＦ関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用。
【請求項４９】請求項３５から４０のいずれか１項に記載の抗体またはＪａｂ１に対する抗体またはその断片のＭＩＦ関連疾患の診断および／または治療のための使用。
【請求項５０】Ｊａｂ１もしくはその一部分、またはＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列、またはＪａｂ１を特異的に認識する抗体を、製薬上許容される担体と共に含んでなる薬剤。
【請求項５１】ＭＩＦもしくはＭＩＦをコードするヌクレオチド配列の、Ｊａｂ１の活性のモジュレート、特にＭＩＦ関連疾患の治療のための使用。
【請求項５２】ＭＩＦまたはＭＩＦをコードするヌクレオチド配列の、Ｊａｂ１関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用。
【請求項５３】ＭＩＦまたはＭＩＦをコードするヌクレオチド配列の、Ｊａｂ１関連疾患の診断および／または治療のための使用。
【請求項５４】請求項３０に記載のタンパク質複合体および／または請求項３１に記載の融合タンパク質のＪａｂ１関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用。
【請求項５５】請求項３０に記載のタンパク質複合体および／または請求項３１に記載の融合タンパク質のＪａｂ１関連疾患の診断および／または治療のための使用。
【請求項５６】請求項３５から４０のいずれか１項に記載の抗体またはＭＩＦに対する抗体またはその断片のＪａｂ１関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用。
【請求項５７】請求項３５から４０のいずれか１項に記載の抗体またはＭＩＦに対する抗体またはその断片のＪａｂ１関連疾患の診断および／または治療のための使用。
【請求項５８】野生型に対して改変されたＭＩＦおよびＪａｂ１の発現を示すヒト以外の哺乳類の細胞。
【請求項５９】少なくとも１つの変異を細胞のＭＩＦ遺伝子およびＪａｂ１遺伝子各々の中に含んでいる、請求項５８に記載の細胞。
【請求項６０】内在性ＭＩＦ遺伝子およびＪａｂ１遺伝子の発現を妨害するＭＩＦおよび／またはＪａｂ１アンチセンス構築物を含んでいる、請求項５８に記載の細胞。
【請求項６１】請求項５８から６０のいずれかに記載の細胞を含んでいる非ヒト哺乳類。
【請求項６２】野生型に対して改変されたＭＩＦおよびＪａｂ１の発現を示すヒト細胞。
【請求項６３】細胞のＭＩＦ遺伝子およびＪａｂ１遺伝子の各々に少なくとも１つの変異が含まれている、請求項６２に記載の細胞。
【請求項６４】内在性ＭＩＦ遺伝子およびＪａｂ１遺伝子の発現を妨害するＭＩＦおよび／またはＪａｂ１アンチセンス構築物を含んでいる、請求項６２に記載の細胞。
【請求項６５】請求項６２から６４のいずれか１項に記載の細胞を含んでいる非ヒト哺乳類。
【請求項６６】請求項５８から６０、または６２から６４のいずれか１項に記載の細胞の、遺伝子治療を目的とする使用。
【請求項６７】候補薬剤がＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）およびＪａｂ１（ｃ−Ｊｕｎ活性化ドメイン結合タンパク質）の間の相互作用を崩壊させるか否か、および／もしくは該候補薬剤がＭＩＦとＪａｂ１の相互作用によって誘導される分子性および細胞性経路を特異的に妨害するか否かを試験することによって候補薬剤をスクリーニングする方法であって、ＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用、および／またはＭＩＦ−Ｊａｂ１依存性の作用を、該候補薬剤の存在しない条件でＭＩＦおよびＪａｂ１のシステムで検出し、その検出された相互作用および／または作用を、ＭＩＦおよびＪａｂ１のシステムで候補薬剤が存在する条件での相互作用および／または作用と比較することを含んでなる方法。
【請求項６８】方法がｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】ＭＩＦとＪａｂ１との相互作用が結合アッセイによって検出される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】結合が放射活性標識もしくは光標識ＭＩＦ、Ｊａｂ１、ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体、ならびに／またはそれらの抗体を用いて測定される、請求項６７から６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】結合が電気泳動移動度シフトアッセイを用いて測定される、請求項６７から７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】固定化されていないＭＩＦ、Ｊａｂ１、ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体、および／またはそれらの抗体が固定化されたＭＩＦ、Ｊａｂ１、ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体、および／またはそれらの抗体と結合し、その結果得られた複合体が沈降反応、特に遠心またはろ過によって分離される、請求項６７から７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】結合がクロマトグラフィーによる分画によって測定される、請求項６７から７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】ＭＩＦおよびＪａｂ１がｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳によって得られる、請求項６７から７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】ＭＩＦおよびＪａｂ１が細胞の粗抽出物中に含まれている、請求項６７から７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】方法がｉｎ ｖｉｖｏの方法である、請求項６７から７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】請求項６７から７６のいずれか１項に記載の方法であって、
ａ）　ＭＩＦおよび／もしくはＪａｂ１を過剰発現している細胞を提供し、
ｂ）　ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体標的活性、特に候補薬剤が存在しない条件でのリポーター遺伝子の発現を検出し、
ｃ）　ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体標的活性、特に候補薬剤が存在する条件でのリポーター遺伝子の発現を検出し、ならびに
ｄ）　ｂ）およびｃ）で得られた結果を比較する、
ことを含んでなる方法。
【請求項７８】ＭＩＦおよび／またはＪａｂ１を過剰発現している細胞がＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体によって誘導されうるリポーター遺伝子を含んでいる、請求項６７から７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】ＭＩＦおよび／またはＪａｂ１を過剰発現している該細胞が、
ａ）　プロモーターの機能的制御下にあるＭＩＦコード配列を含んでいるベクター、
プロモーターの機能的制御下にあるＪａｂ１コード配列を含んでいるベクター、
および
リポーター遺伝子を含んでいるベクター、
または、
ｂ）　単一のプロモーターの機能的制御下にあるＭＩＦおよびＪａｂ１をコードする遺伝子を含んでいるベクターならびにリポーター遺伝子を含んでいるベクター、
または、
ｃ）　単一のプロモーターの機能的制御下にあるＭＩＦおよびＪａｂ１をコードする配列ならびにリポーター遺伝子を含んでいるベクター、
を用いて宿主細胞をトランスフェクトして得られる、請求項６７から７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
ａ）　次のものを含んでいる細胞を提供し；
ｉ）　ＤＮＡ結合タンパク質認識部位に機能しうる形で連結された、リポーター遺伝子；
ｉｉ）　ＤＮＡ結合タンパク質認識部位と特異的に結合するＤＮＡ結合部分に共有結合で結合されたＭＩＦを含んでいる第１のハイブリッドタンパク質を発現している第１の融合遺伝子；および
ｉｉｉ）　候補薬剤が存在しない条件ではＪａｂ１がＭＩＦと結合する、遺伝子活性化部分に共有結合で結合されたＪａｂ１を含んでいる第２のハイブリッドタンパク質を発現している第２の融合遺伝子；
ｂ）　前記細胞を候補薬剤とリポーター遺伝子の発現が可能な条件下で接触させ、ならびに、
ｃ）　前記リポーター遺伝子の発現の阻害を、候補薬剤がＭＩＦとＪａｂ１間の結合を崩壊させる能力の尺度として検出すること、
を含んでなる、請求項６７から７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】ＭＩＦとＪａｂ１との間の相互作用がＭＩＦまたはＪａｂ１と競合するペプチドの存在下で試験される、請求項６７から８０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】ＭＩＦと競合するペプチドが、
ＭＩＦ （５０−６５） （配列番号１）または
Ｓｅｒ５７ Ｓｅｒ６０ ＭＩＦ（５０−６５） （配列番号２）
である、請求項８１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の説明
本発明はＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）関連疾患を治療することもしくは検出することに有効な候補薬剤をスクリーニングする方法、およびそれに用いられる手段に関する。
【０００２】
抗原性の、もしくは細胞分裂促進性の刺激に応答して、リンパ球は免疫調節、炎症、ストレスに対する応答、および細胞性免疫のエフェクター機作において重要な役割を果たしているリンフォカインと呼ばれるタンパク質メディエーターを分泌する。リンフォカインの活性で最初に報告されたものは、抗原で感作され活性化されたモルモットのリンパ球の培養上清中に観察された。この活性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの毛細血管の外部へのモルモットマクロファージの遊走を妨げる能力のため、遊走阻止因子（ＭＩＦ）と名付けられた。ＭＩＦは、マクロファージ、後部下垂体細胞、および内皮細胞の分泌可能な産物で、マクロファージ、Ｔリンパ球およびその他の特定の細胞タイプの双方を活性化するものとして同定されてきた。
【０００３】
ＭＩＦ活性の検出は遅延性過敏症および細胞性免疫、同種移植片拒絶反応、リウマチ性多関節性滑液炎、ならびに自己免疫疾患を含む種々の炎症性応答と相関している。さらに、ＭＩＦは酵素活性を有し、トートメラーゼ（ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ）およびチオールタンパク質オキシドレダクターゼ活性を示す。ＭＩＦは種々の炎症誘発性を有している。この機能において、ＭＩＦは、グラム陰性およびグラム陽性敗血症ショック、成人呼吸窮迫症候群を含むいくつかの炎症性疾患のメディエーターであることが示され、その炎症誘発性は、部分的にはインターロイキン−１、腫瘍壊死因子などの他の炎症誘発性サイトカインの放出をＭＩＦが誘導する能力によるものであり、糖質コルチコイド作用の対抗制御によるものである。ＭＩＦはまた、細胞性レドックスホメオスタシスの調節に役割を果たしている。機能的には他のサイトカインと類似しているにも関わらず、ＭＩＦは多数の特徴的な性質を示す。例えば、ＭＩＦの発現は免疫系および内分泌系の細胞に限定されておらず、ＭＩＦタンパク質は大多数のＭＩＦを発現する細胞中であらかじめ形成された形で認められる。
【０００４】
ＭＩＦ関連疾患の診断および治療のための手段の開発はきわめて重要ではあるが、ＭＩＦの作用の分子的標的はまだ同定されていない；ＭＩＦは細胞内タンパク質との相互作用に基づく直接的細胞内機能を有しているのかもしれない。ＭＩＦと他のタンパク質との相互作用を崩壊させる、妨げる、増強する、もしくはモジュレートする分子−いわゆる薬剤−は、細胞サイクルのコントロール、免疫調節、レドックス効果、および調節経路におけるＭＩＦの重要な役割に影響を与えることができる。
【０００５】
ＷＯ ９９／４２５７８は細胞の寿命を延長させるための方法と試薬、例えば有糸分裂の数の、細胞増殖を誘発するＭＩＦもしくはその同族体の使用による延長について述べている。この文献はまた、ＭＩＦによって誘発されたｐ５３細胞サイクルチェックポイントのバイパスを阻害することによる増殖性障害の治療についても述べている。この文献はＭＩＦが腫瘍サプレッサーの増殖停止表現型をトランスの状態で機能的に不活化することのできる天然のタンパク質としてはものとして最初の例であることを述べている。さらに、ＭＩＦは全身的におよび局所的に炎症誘発性の役割を有するものとして同定されているので、この所見は炎症分野と腫瘍生物学の分野をつなぐリンクを提供するものである。
【０００６】
ＷＯ ９８／１７３１４は、被験者における細胞の過剰増殖に関連する疾患を治療もしくは予防する方法について述べており、その方法は、そのような治療もしくは予防をすることが望ましい被験者への治療上有効な量のＭＩＦ拮抗剤の投与を含むものである。さらに、被験者の腫瘍の血管新生を治療するための方法が開示されており、その方法はＭＩＦの活性を阻害もしくは中和する作用物の治療上有効な量の投与を含むものである。ＭＩＦの活性を中和する作用物は、例えば抗ＭＩＦモノクローナル抗体、ＭＩＦアンチセンスＲＮＡ分子およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０００７】
原理的には、ＭＩＦの他のタンパク質との相互作用はツーハイブリッドシステムで試験することができる。酵母ツーハイブリッドシステムはタンパク質のペアの会合を検出するために用いられてきた（例えば、Ｆｉｅｌｄｓら， 米国特許第５，２８３，１７３号を参照せよ）。この方法には転写因子の２種類の分離したドメインのｉｎ ｖｉｖｏでの再構成が含まれる。その転写因子のＤＮＡ結合ドメインは、ある選択されたプロモーターを認識するために必要である。活性化ドメインはその細胞の転写装置の他のコンポーネントに接触するために必要である。このシステムでは転写因子はハイブリッドタンパク質の使用によって再構成される。一方のハイブリッドは活性化ドメインおよび第１の対象のタンパク質からなっている。第２のハイブリッドは結合ドメインと第２の対象のタンパク質からなっている。第１および第２の対象のタンパク質が相互作用するような場合には、活性化ドメインおよび結合ドメインは物理的に近い距離となり、それによって転写因子が再構成される。タンパク質の会合は再構成された転写因子がリポーター遺伝子の転写を活性化する能力をアッセイすることによって測定することができる。
【０００８】
薬剤をスクリーニングする方法は既知である（米国特許第号５，５６９，５８８号）。ある生物体の候補薬剤に対する転写応答性をモデル化するための方法には、例えば、（ａ）ある標的生物体の種々の、別々に単離された多数の細胞の各々からのリポーター遺伝子産物のシグナルを検出すること、ここでそれらの細胞の各々は標的生物体の種々の内因性転写調節エレメントに機能しうる形で連結されたリポーター遺伝子を含んでいる組換え構築物を含有しているものであって、それによってその転写調節エレメントがリポーター遺伝子の発現を調節するようになっているが、それらの細胞での応答の総和が、その生物体の転写調節エレメントの全体としての姿を示しており、それはその生物体のある薬剤に対する転写応答性を示すのに十分なものであり；（ｂ）各細胞を候補薬剤と接触させ；（ｃ）各細胞からのリポーター遺伝子産物のシグナルを検出し；（ｄ）その細胞が候補薬剤と接触する前および後の各細胞からのリポーター遺伝子産物のシグナルを比較し、薬剤の応答プロフィールを得るが、それはその生物体の候補薬剤に対する転写応答のモデルを提供する。
【０００９】
このように、（ｉ）ＭＩＦの細胞内標的分子、例えばタンパク質との相互作用の検出、および（ｉｉ）このＭＩＦと細胞内標的分子との相互作用を改変する分子の同定を行いうる方法と手段を開発し提供することは特に重要と考えられる。
【００１０】
本発明の背景となる技術的問題点は、ＭＩＦ関連疾患の診断および治療において有効な薬剤をスクリーニングするための手段と方法を提供することである。
候補薬剤が、相互作用、とりわけＭＩＦとＪａｂ１との間の相互作用を崩壊させる、および／またはＭＩＦ／Ｊａｂ１特異的な細胞性の効果を妨害するか否かを試験することによってＭＩＦ関連疾患の診断および治療に有効な候補薬剤のスクリーニングのための方法を提供することで本発明はこの問題を解決している。その方法は、ＭＩＦとＪａｂ１のシステムにおけるＭＩＦとＪａｂ１との相互作用、および／またはＭＩＦ／Ｊａｂ１特異的な細胞性効果を、候補薬剤の存在しない状態で検出し、その検出された相互作用および／または細胞性効果を、候補薬剤の存在下でＭＩＦとＪａｂ１を含んだシステム中で検出された相互作用および／または細胞性効果と比較し、それによって検出され、比較された相互作用および／または細胞性効果は、好ましくはＭＩＦ／Ｊａｂ１複合体をベースとした特異的な生物学的効果である。
【００１１】
本発明は、従ってＭＩＦとＪａｂ１が相互作用し、とりわけ相互に結合してＭＩＦ／Ｊａｂ１複合体を形成するとの知見に特に基づいたものである。ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体が重要な役割を果たす広範な医学的応用は本発明に包含され、例えば、細胞増殖関連疾患一般、特に本発明の方法はＭＩＦ関連疾患：内因性ブドウ膜炎、タンパク尿、糸球体腎炎、創傷治癒、発癌、耳鳴り、敗血症性ショック、および関節炎その他の治療のための薬剤を測定し見つけ出すために用いることができる。
【００１２】
ＭＩＦとＪａｂ１との間の相互作用は、サイトカインが細胞性の調節経路を転写コアクチベーターとの直接的な相互作用によってモジュレートできることを示している。ＭＩＦ−Ｊａｂ１相互作用はＭＩＦの重要な活性の分子的基礎を提供している。
【００１３】
Ｊａｂ１（ｃ−Ｊｕｎ活性化ドメイン結合タンパク質）、特にＰ３８Ｊａｂ１はもともとはｃ−ＪｕｎおよびＪｕｎＤ転写因子の特異的コアクチベーターとして同定された、３８Ｋのタンパク質であり、これはサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤ｐ２７Ｋｉｐのネガティブレギュレーターとしても作用する。Ｊａｂ１の転写コアクチベーター機能はＡＰ−１依存性転写活性の増強によるものである。Ｊａｂ１同族体はまた植物中でも同定されており、それによってその植物のＪａｂ１の同族体もＡＰ−１転写因子活性の調節に関与している（ＷＯ ９９／２４５７２）。Ｊａｂ１はＭｏｖ３４ファミリーのタンパク質の一員である（ＨｏｆｍａｎｎとＢａｃｈｅｒ， １９９８； Ａｓａｎｏら， １９９７）。ＭＩＦはＪａｂ１によるＡＰ−１転写活性の増強を阻害する。Ｊａｂ１はｃ−ＪｕｎのＮ末端キナーゼ活性（ＪＮＫ）を活性化するものとして同定され、この効果はＭＩＦによって顕著にダウンレギュレートされる。本発明ではＭＩＦはＪａｂ１およびＴＮＦがメディエートするＪＮＫの活性化をブロックする。本発明では、ＭＩＦはまた、Ｊａｂ１依存性細胞サイクルプロセスを対抗制御する。ＭＩＦはｐ２７Ｋｉｐ１タンパク質を安定化することによってｐ２７Ｋｉｐ１発現を増加させ、Ｊａｂ１がメディエートする飢餓によって誘導される成長の停止からの繊維芽細胞のレスキューを阻害する。ＭＩＦは細胞質ゾル中でＪａｂ１と共存し、それらは双方とも内因性に発現されるが、外因性ＭＩＦはエンドサイトーシス後に得られ、それは細胞質ゾル中で細胞質ゾル結合Ｊａｂ１の標的となる。ＭＩＦは、Ｊａｂ１によっておよび刺激によって増強されるＡＰ−１活性を阻害するが、ＮＦκＢの誘導は妨害しない。Ｊａｂ１はＪＮＫ活性を活性化し、内因性のホスホｃ−Ｊｕｎのレベルを増強するが、ＭＩＦはこれらの効果を阻害する。ＭＩＦはまた、Ｊａｂ１依存性細胞サイクル調節をｐ２７Ｋｉｐタンパク質の安定化によってｐ２７Ｋｉｐ発現を増加させることでアンタゴナイズする。この結果、Ｊａｂ１がメディエートする繊維芽細胞の増殖停止からのレスキューはＭＩＦによってブロックされる。野生型ＭＩＦの残基５０−６５のみからなるＭＩＦペプチド、および突然変異体Ｃｙｓ６０（６０の位置にＣｙｓを持つ野生型ＭＩＦ）の分析によって５０−６５の領域がＪａｂ１との結合およびモジュレーションに重要であることが示されている。ＭＩＦは広範囲に作用してＪａｂ１で制御される経路をネガティブに調節し、ＭＩＦ／Ｊａｂ１相互作用はＭＩＦのいくつかの重要な活性に対する、長いあいだ探し求められてきた分子的基盤を提供しうる。ＭＩＦは幅広く作用してＪａｂ１が制御する細胞性の経路をネガティブに調節する。ＭＩＦ−Ｊａｂ１相互作用はＭＩＦのいくつかの重要な活性に対する分子的基盤を提供するが、それはＭＩＦ−Ｊａｂ１相互作用がＭＩＦ関連疾患において、経路と細胞性および分子性サイクルに関連しているからである。
【００１４】
本発明では、多数の一般的用語は下記のとおり用いられている。
【００１５】
本発明では、「ＭＩＦ関連疾患」とは、関節炎、発癌および／もしくは癌、腎炎、タンパク尿、皮膚炎、糖尿病／肥満、心臓同種移植の急性および慢性拒絶反応、尿細管炎、神経変性、パーキンソン病、敗血症ショック、エンドトキシン血症、過敏症、ブドウ膜炎、耳鳴り、創傷修復／細胞増殖などの疾患である；ＭＩＦはまた、免疫調節、炎症ならびに細胞性および液性免疫のエフェクター機作、敗血症ショック、眼球の炎症、転写および細胞サイクルの制御において、および呼吸窮迫症候群、生理学的ストレス、その他で重要な役割を果たしている。
【００１６】
本発明では、「薬剤」という用語は、疾患、とりわけＭＩＦ関連疾患を診断および／または治療するために有用な物質を意味し、好ましくはそのような効果を得るために十分な量のものを意味する。本明細書で用いている「薬剤」という用語は、活性作用物それ自体および製薬上許容される担体、アジュバント、他の活性作用物、その他のものと結びつけられた活性作用物の双方を意味する。推定上の、もしくは候補の薬剤とは、ある物質もしくは組成物が薬剤として用いることに適しているか否かを試験される、物質もしくは組成物を意味する。特に好ましい実施形態においては、「薬剤」は小さなＭＩＦ由来ペプチドで、特にＭＩＦ５０−６５、もしくは５７Ｓｅｒ ６０Ｓｅｒ ＭＩＦ６０−６５である。このように、本発明はまた、配列番号１および２に示した特定のペプチドをも包含する。
【００１７】
本発明では「治療」という用語はある薬剤の予防的および／もしくは治療的効果を意味する。
【００１８】
本発明では、「ＭＩＦとＪａｂ１のシステム」は合成によって作成された、もしくは天然のＭＩＦおよびＪａｂ１が、天然のまたは人工的な条件下のいずれかでお互いに接触し結合するような条件下で存在するシステムに関する。本発明の１実施形態においては、ＭＩＦとＪａｂ１のシステムは天然の細胞、もしくは組換えで産生された細胞である。本発明の別の１実施形態においては、ＭＩＦとＪａｂ１のシステムは上述の細胞から作成した、もしくはその他の供給源から作成した粗抽出物でも、それがＭＩＦとＪａｂ１を含有するものである限りは、そのシステムとすることができる。本発明の別の１実施形態においては、ＭＩＦとＪａｂ１のシステムは、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳システムであって、そのシステムは、純粋な、もしくはある程度純粋なＭＩＦとＪａｂ１、またはＭＩＦとＪａｂ１の全てもしくは一部を、各々単独でまたは共に含んでいる融合タンパク質またはタンパク質複合体の産生または精製ができるようなエレメントを含んでいる。
【００１９】
本発明では、「ＭＩＦ」という用語は、天然のＭＩＦ、ならびに野生型ＭＩＦの本質的な生物学的機能の少なくとも一部を有している限りＭＩＦに何らかの改変を加えたもの、変異体、もしくは誘導体に関し、例えば、アミノ酸の改変、例えば逆位、欠失、挿入、付加、その他を含んでいる組換えで作成したＭＩＦがある。そのようなＭＩＦは、通常でないアミノ酸および／もしくはアルキル化、酸化、チオール修飾、変性、およびオリゴマー化、その他の類似の改変を含むこともできる。特に、本発明では、ＭＩＦはタンパク質、とりわけ、他のタンパク質、ペプチド、もしくはそれらの一部に加えてＭＩＦの全体もしくは一部を含んでいる融合タンパク質とすることができる。本発明のさらに別の１実施形態においては、該ＭＩＦは天然のＭＩＦの末端切断型のものであり、それは例えば小ペプチドである。本発明の特に好ましい１実施形態においては、そのような小ペプチドはＭＩＦ ５０−６５（野生型アミノ酸配列の残基５０−６５（配列番号１））もしくはＳｅｒ５７ Ｓｅｒ６０ ＭＩＦ５０−６５（野生型のＣｙｓ５７およびＣｙｓ６０をＳｅｒ５７ およびＳｅｒ６０ で置換したことを除いては野生型のアミノ酸残基５０−６５）などのＭＩＦペプチド断片である。これらのペプチドの双方とも、本発明の主題である。
【００２０】
本発明では、「Ｊａｂ１」という用語は、天然のＪａｂ１、ならびに野生型Ｊａｂ１の本質的な生物学的機能の少なくとも一部を有する限りＪａｂ１に何らかの改変を加えたもの、変異体、もしくは誘導体に関し、例えば、アミノ酸の改変、例えば逆位、欠失、挿入、付加、その他を含んでいる組換えで作成したＪａｂ１がある。そのようなＪａｂ１は、通常でないアミノ酸および／もしくはアルキル化、酸化、チオール修飾、変性、およびオリゴマー化、その他の類似の修飾を含むこともできる。特に、本発明では、Ｊａｂ１はタンパク質、とりわけ、他のタンパク質、ペプチド、もしくはそれらの一部に加えてＪａｂ１の全体もしくは一部を含んでいる融合タンパク質とすることができる。本発明のさらに別の１実施形態においては、該Ｊａｂ１は天然のＪａｂ１の末端切断型のものであり、例えばいわゆるＭＰＮドメインもしくはＭｏｖ−３４ドメイン（Ａｓａｎｏら， １９９７； ＨｏｆｍａｎｎとＢａｃｈｅｒ， １９９８）または小ペプチドなどである。
【００２１】
「プロモーター」という用語は、ＤＮＡの配列であって、通常は構造遺伝子のコード配列の上流（５’）にあり、ＲＮＡポリメラーゼおよび／またはその他の因子へ転写が正しい部位から開始されるために必要な認識を提供することによってコード領域の発現を制御している。プロモーター配列は、遺伝子の発現を駆動するために必要であるが常に十分なものであるとは限らない。
【００２２】
「核酸」とは、糖、リン酸、およびプリンもしくはピリミジンのいずれかを含んでいる単量体（ヌクレオチド）からなる、一重鎖もしくは二重鎖となりうる大分子を意味している。核酸はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、もしくはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡとすることができる。
【００２３】
「核酸配列」という用語は、天然のもしくは合成のＤＮＡもしくはＲＮＡのポリマーを意味し、一重鎖もしくは二重鎖であり得、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリマー中に取り込むことのできる合成、非天然、もしくは改変されたヌクレオチドを含有し得る。
【００２４】
「遺伝子」という用語は、ある特定のタンパク質をコードするＤＮＡ配列およびそのＤＮＡ配列の発現を制御する調節エレメントを意味する。
【００２５】
「コード配列」という用語は、あるタンパク質、ポリペプチド、またはそれらの一部分をコードする遺伝子の一部分であって、転写の開始または終了を駆動する調節配列を除いたものを意味する。コード配列および／または調節エレメントは、細胞中に通常見出されるものとすることができ、そのような場合にはそれは「自己の」もしくは「内因性の」と呼ばれるが、細胞内に通常は認められないものとすることもでき、その場合には、「異種の」ものと呼ばれる。
【００２６】
異種遺伝子はまた、自己のエレメントを含むものとすることができ、そのエレメントはそれが移送されることとなる細胞中には通常は見出されない順番および／または方向で配置されている。異種遺伝子は当業界で既知のいかなる供給源からその全体または部分が由来したものとすることもでき、細菌のもしくはウイルスのゲノムもしくはエピソーム、真核生物の核もしくはプラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または化学的に合成されたＤＮＡが含まれる。構造遺伝子は中間に遮るもののない一続きのコード領域から構成することができ、または構成遺伝子は、適切なスプライス部位によって境界を形作られた１個以上のイントロンを含むことができる。構造遺伝子は異なる供給源から由来する、天然のまたは合成の、セグメントの組み合わせとすることができる。
【００２７】
「トランス活性化因子タンパク質」とは、ある遺伝子のオペレーター領域に結合してその遺伝子の転写を促進することのできるタンパク質である。
【００２８】
「ＤＮＡ結合ドメイン」とは、ある特定のＤＮＡ配列と結合することのできるアミノ酸の配列である。
【００２９】
「融合タンパク質」とは、少なくとも２種の異なる供給源から由来するアミノ酸配列で作られたタンパク質である。融合タンパク質については、「異種」アミノ酸配列とは、その融合タンパク質の他の部分とは異なる供給源を起源とする配列である。
【００３０】
「検出可能な遺伝子産物」とは、あるアッセイによって検出することのできるヌクレオチドもしくはアミノ酸配列である。ある検出可能な遺伝子産物の発現が細胞にある特徴を与え、それによってその検出可能な遺伝子産物を発現していない他の細胞からその細胞を都合よく選択することができることが好ましい。
【００３１】
「機能しうる形で連結された」もしくは「機能的な制御下に置く」という用語は、ある遺伝子およびある調節配列が、センスもしくはアンチセンス発現において、適切な分子（例えば転写活性化因子タンパク質）がその調節配列に結合すれば遺伝子発現が行われるような様式で、接続されていることを意味する。
【００３２】
本発明で「会合した」という用語は、ＭＩＦとＪａｂ１との相互作用のいかなるタイプのものをも意味し、特に共有結合もしくは非共有結合、または例えば、限定はされないが、共有結合、疎水性／親水性相互作用、ファンデルワールス力、イオン対、リガンド−受容体相互作用、エピトープ−抗体結合部位相互作用、酵素−基質相互作用、リポソーム−疎水性相互作用、ヌクレオチド塩基対合、膜−疎水性相互作用などの会合を意味する。そのような会合にはさらに別の分子、例えばペプチド、タンパク質（例えば、Ｋｉｐ、Ｊｕｎ、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ステロイド受容体コアクチベーター−１（ＳＲＣ−１）、インテグリンＬＦＡ−１、プロゲステロン受容体（ＰＲ）もしくは糖質コルチコイド受容体（ＧＲ））またはヌクレオチド配列の存在が含まれうる。
【００３３】
「ベクター」という用語は、プラスミド、ウイルス、もしくは自己複製する配列、ファージ、または、直鎖状もしくは環状で一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡで、いかなる供給源から由来するものでもよい組換えＤＮＡ構築物を意味し、ベクター中では多数のヌクレオチド配列が結合もしくは組換えられたユニークな構築物とされ、該構築物はプロモーター断片およびある選択された遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列を、適切な３’の非翻訳配列と共にセンスもしくはアンチセンス方向で細胞中に導入することができる。
【００３４】
「プラスミド」は、それの宿主細胞の染色体の一部となることなく安定に遺伝する遺伝的エレメントである。プラスミドはＤＮＡもしくはＲＮＡを含むものとすることができ、直鎖状もしくは環状とすることができる。プラスミドは細胞複製の間にプラスミドの複製と安定な遺伝を確実にする分子をコードし、また、医学的に、農学的に、および環境に重要な産物をコードすることができる。例えば、プラスミドは病原性細菌の毒力を顕著に増加させる毒素をコードする。プラスミドはまた、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子をコードすることができる。プラスミドは分子生物学の分野で組換え遺伝子のクローン化と発現のためのベクターとして広く用いられている。プラスミドは一般的には本明細書では小文字のｐの前および／または後に大文字および／もしくは数字を、当業者にはよく知られた標準的な命名の約束ごとに従って付けられている。本明細書で開示した出発材料のプラスミドは市販されているもの、一般的に入手可能なもののとするか、もしくは入手可能なプラスミドから周知の公表されている方法を日常的なやり方で応用することによって構築することができる。本発明で用いることのできる多数のプラスミドおよびその他のクローニングおよび発現ベクターは周知であり、当業者であれば容易に入手できる。さらに、当業者であれば本発明での使用に適したその他の多数のプラスミドのいずれも容易に構築することができよう。本発明でのそのようなプラスミド、ならびに他のベクターの性質、構築、および使用については当業者であれば、本開示から容易に明らかなものとなろう。
【００３５】
本明細書で用いている「発現」という用語は、その遺伝子産物のための配列の転写および／もしくはコードすることを説明することが意図される。発現においては遺伝子産物の配列をコードするＤＮＡ鎖をまず相補的ＲＮＡ（それは多くの場合ｍＲＮＡである）に転写し次いでこのように転写されたｍＲＮＡが、上述の遺伝子産物がタンパク質である場合にその遺伝子産物へと翻訳される。しかし、発現には、そのＤＮＡの調節エレメントに対してアンチセンスの方向で挿入されたＤＮＡの転写をも含んでいる。発現は、構成的でおそらくはさらに外部から制御されるプロモーター断片によってさらに増強されるが、それによってｍＲＮＡの多数のコピーおよび大量の選択された遺伝子産物が産生されるが、そのような発現はまた、遺伝子産物の過剰産生をも含むことができる。
【００３６】
「宿主細胞」という用語は、キメラ核酸、異種核酸もしくは自己由来核酸配列、またはそのような配列を依然として含有しているその子孫の導入によって遺伝子工学的に改変された細胞を意味する。これらの細胞はまた、「トランスジェニック細胞」とも呼ばれる。自己由来核酸配列が導入される場合には、その配列は宿主細胞中に天然の細胞での状態より多いコピー数で存在するか、異なる方向性で存在するか、および／もしくは異なる場所に存在することとなろう。
【００３７】
「ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体」という用語は、ＭＩＦとＪａｂ１との会合、例えばＭＩＦとＪａｂ１のドメイン間の相互作用を意味している。
【００３８】
「標的活性」という用語はＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体が誘導する活性、例えば、リポーター遺伝子の発現、もしくはＡＰ−１活性の調節、もしくはＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤の調節、またはその他のＭＩＦ−Ｊａｂ１特異的標的活性を意味する。
【００３９】
天然の（細胞内の）環境中では生じない本発明のタンパク質を単離する。本明細書で用いている「単離された」という用語は、タンパク質の関連で用いられるときは、天然の状態では会合している少なくともいくつかの物質と会合していない状態のポリペプチドを意味する。単離されたタンパク質は、所定のサンプル中の総タンパク質の少なくとも０．５重量％、好ましくは少なくとも５重量％、より好ましくは少なくとも２５重量％、さらにより好ましくは少なくとも５０重量％である。最も好ましくは「単離された」タンパク質は実質的に他のタンパク質、脂質、炭水化物、もしくはその他の天然状態ではそのタンパク質と会合している物質を含まず、非還元ポリアクリルアミドゲルで単一の主要なバンドを示す。実質的に含まないとは、そのタンパク質が他のタンパク質、脂質、炭水化物、もしくは天然状態ではそのタンパク質と会合しているその他の物質を少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは９９％含まないことを意味する。
【００４０】
「アフィニティークロマトグラフィー」とは固体媒体もしくは固体支持体への選択的吸着および／もしくはそれからの溶出によってタンパク質を分離することを含むことが知られており（例えば、固定化Ｊａｂ１、固定化ＭＩＦ、固定化抗ＭＩＦ−Ｊａｂ１−ドメイン抗体、および／もしくは固定化抗ＭＩＦ−Ｊａｂ１−融合タンパク質抗体など）、通常はカラムの形態である。固体媒体は通常は不活性の担体マトリックスで、そのマトリックスに特定の条件下で対象とするタンパク質を同一サンプル中に含まれる他のものよりも良く結合する能力を有するリガンドを付着させたものであるが、時にはそのマトリックスそれ自体がそのような選択的結合能を有することもある。そのリガンドは分離しようとするタンパク質に対して生物学的に相補的なものとすることができ（例えば、抗原と抗体）、または生物学的には無関係の分子でその分子の活性基の性質と立体的関係によって該タンパク質と結合する能力を有するものとすることができる。支持体マトリックスは一般的には上記のタンパク質結合リガンドと共に用いられ、そのようなものとしては例えば、寒天、デキストランおよびアミドのポリマーおよびコポリマー、特にアクリルアミド、またはガラスビーズもしくはナイロンマトリックスが挙げられる。セルロースおよび置換セルロースは染料を用いる場合には通常は不適切である。というのは、これらのものは大量の染料を結合させるが、染料はタンパク質に対して接近し難く、その結果タンパク質との結合が乏しくなるからである。
【００４１】
「固体支持体」とは不溶性のマトリックスを意味し、本質的に生物学的なもの（例えば、限定はされないが、細胞もしくはバクテリオファージ粒子）、または合成のもの（例えば、限定はされないが、アクリルアミド誘導体、セルロース、ナイロン、シリカ、および磁化粒子）のいずれかでそれらに対して可溶性の分子を連結するかもしくは結合することができる。
【００４２】
「抗体」とは、免疫グロブリン遺伝子、またはそれらの断片によって実質的にコードされるポリペプチドを意味し、抗体は分析物（抗原）と特異的に結合して認識する。存在が知られている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、Δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。抗体は例えば、完全な免疫グロブリンとして、もしくは種々のペプチダーゼを用いた消化によって産生される十分に特性付けられた多数のフラグメントとして存在する。また「抗体」とは改変された抗体（例えば、オリゴマー抗体、還元抗体、酸化抗体、および標識抗体）を意味する。本明細書で用いている「抗体」という用語はまた、抗体分子全体の改変によって産生された、もしくは組換えＤＮＡ方法論を用いて新規に合成されたいずれかの抗体フラグメントをも含む。「抗体」という用語は完全な分子、ならびにそのフラグメント、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなどを含み、そのようなフラグメントはエピトープ決定基と結合することができる。これらの抗体フラグメントはその抗原もしくは受容体と選択的に結合する多少の能力を保持しており、下記のとおり定義される：
（１）　Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含んでいるフラグメントであり、抗体全体を酵素であるパパインで消化することで産生することができ、完全な軽鎖の１本および重鎖の１本の一部からなるものが得られる；
（２）　Ｆａｂ’は抗体分子のフラグメントで、抗体全体をペプシンで処理した後、還元し、完全な軽鎖の１本と重鎖の一部からなるものを得ることができる；抗体分子１個から２個のＦａｂ’フラグメントが得られる；
（３）　（Ｆａｂ’）２は抗体のフラグメントで、抗体全体を酵素であるペプシンで処理した後、還元せずに得ることができる；Ｆ（ａｂ’）２は２個のジスルフィド結合で結びつけられた２本のＦａｂ’フラグメントの二量体である；
（４）　Ｆｖは軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含み２本の鎖として発現される遺伝子工学的に操作されたフラグメントと定義される；
（５）　単鎖抗体（「ＳＣＡ」）は、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域が適切なポリペプチドリンカーで連結されたものを、遺伝子操作で融合させた１本鎖の分子として含んでいる、遺伝子工学的に操作された分子と定義される。
【００４３】
これらのフラグメントを作製する方法は当業界では公知である（例えば、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ，「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８８）を参照せよ）。
【００４４】
本発明で用いている「エピトープ」という用語は、抗体のパラトープが結合する抗原上の抗原決定基を意味する。エピトープ決定基は通常はアミノ酸もしくは糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常は特定の３次元構造の特徴ならびに特定の電荷の特徴を有している。
【００４５】
本発明のタンパク質およびその断片に対するモノクローナル抗体は当業者であれば容易に産生することができる。ハイブリドーマ技法を用いるモノクローナル抗体の一般的な作製方法論は周知である。不死化抗体産生細胞系は細胞融合によって、および癌遺伝子ＤＮＡを用いるＢリンパ球の直接的形質転換、もしくはエプスタイン−バーウイルスによるトランスフェクションなどのその他の技法によっても作製することができる。例えば、Ｍ． Ｓｃｈｒｅｉｅｒら，「ハイブリドーマ技法（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」（１９８０）； Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら，「モノクローナル抗体とＴ細胞ハイブリドーマ（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ）」（１９８１）； Ｋｅｎｎｅｔｔら，「モノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」（１９８０）； を参照し、また米国特許第４，３４１，７６１号、第４，３９９，１２１号、第４，４２７，７８３号、第４，４４４，８８７号、第４，４５２，５７０号、第４，４６６，９１７号、第４，４７２，５００号、第４，４９１，６３２号、および第４，４９３，８９０号をも参照せよ。対象のタンパク質もしくはその断片に対して産生させたモノクローナル抗体のパネルを種々の性質、すなわちアイソタイプ、エピトープ、親和性などについてスクリーニングすることができる。あるいは、その対象のモノクローナル抗体をコードする遺伝子は、当業界では公知のＰＣＲ技法によってハイブリドーマから単離し、クローニングし、適切なベクター中で発現させることができる。モノクローナル抗体は、それの相手となる個々のタンパク質のイムノアフィニティー技法を用いる精製に有用である。本発明の抗体は（それがポリクローナルまたはモノクローナルのいずれでも）、試薬としてイムノアッセイ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡなどで用いることができるというさらに別の有用性を有する。さらに、それらの抗体はＭＩＦ、Ｊａｂ１、ＭＩＦ−Ｊａｂ１ドメインなどを細胞から単離するために用いることができる。これらの抗体は、例えばＭＩＦとＪａｂ１との相互作用をブロックする新規化合物の発見もしくは改変のための組織培養に基づくアッセイを確立するために用いうる。
【００４６】
ヒト化もしくはキメラ抗体は２つの異なる種由来の部分（例えば、ヒトの定常領域およびマウスの結合領域）を含んでなることができる。２つの異なる種由来の部分は従来の技法で化学的に連結することができるか、もしくは遺伝子工学的技法を用いて単一の融合タンパク質として調製することができる。キメラ抗体の２つの部分の双方のタンパク質をコードするＤＮＡは単一の融合タンパク質として発現させることができる。
【００４７】
ある抗体は、その抗体がタンパク質およびその他の生物学的物質の不均質集団が存在している中であるタンパク質の存在を決定づける結合反応において機能する場合には、そのタンパク質に「特異的に結合する」もしくはあるタンパク質と「特異的に免疫反応する」。従って、ある定められたイムノアッセイ条件下においては、その特異的抗体は優先的にある特定のタンパク質と結合し、そのサンプル中に存在する他のタンパク質の有意な量と結合することはない。そのような条件下でのあるタンパク質との特異的結合には、特定のタンパク質に対しての特異性で選択された抗体を必要とする。ある特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために種々のイムノアッセイ形式を用いることができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイはあるタンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために日常的に用いられている。特異的免疫反応性を決定するために用いることができるイムノアッセイ形式と条件についての説明は、ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ （１９８８），「抗体、実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照せよ。
【００４８】
「イムノアッセイ」とは、ある反応物に特異的に結合する抗体を用いるアッセイを意味する。イムノアッセイは、反応物を単離、標的および／もしくは定量するためにある特定の抗体の特異的な結合性を用いることによって特徴づけられる。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態においては、薬剤スクリーニングの方法はｉｎ ｖｉｔｒｏの方法である。
【００５０】
本発明の特に好ましい実施形態においては、そのｉｎ ｖｉｔｒｏの薬剤スクリーニング法は、相互作用、特にＭＩＦとＪａｂ１間の結合を検出するためのアッセイである。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態においては、ＭＩＦ−Ｊａｂ１結合は、スクリーニングしようとする薬剤の存在もしくは不在下でＭＩＦ、Ｊａｂ１および／もしくはその複合体の放射活性標識、光標識、蛍光標識、ビオチン標識、共沈、免疫沈降、クロマトグラフィーによる分画などの従来法を用いることによって測定される。
【００５２】
特に本発明はいわゆるＨＴＰ法に関し、これはハイスループットスクリーニング法を意味する。本発明の実施形態では、ＭＩＦ／Ｊａｂ１結合は、それぞれの結合パートナー（すなわちＭＩＦもしくはＪａｂ１）についてＭＩＦもしくはＪａｂ１と競合する競合性ペプチドの存在もしくは不在下で試験することができる。特にそのような競合的結合パートナーはＭＩＦ由来の類似体、例えばＭＩＦの変異体とすることができ、ＭＩＦの変異体は例えば、野生型ＭＩＦのアミノ酸の番号（Ｋｌｅｅｍａｎｎら， １９９８ｂ）に従えば、野生型ヒトＭＩＦのアミノ酸残基５０−６５からなるペプチド断片、または５７と６０の位置において天然のアミノ酸がセリンに置換されている以外はヒトＭＩＦの野生型アミノ酸残基５０−６５からなるペプチド断片などのＭＩＦの断片である。従って、本発明ではこれらの末端切断型の１６個のアミノ酸の長さのＭＩＦペプチドは非常に有用なＭＩＦ競合性ペプチドで、本発明のアッセイ系で用いることができるであろう。特に本発明のさらなる好ましい実施形態においては、ＭＩＦ／Ｊａｂ１結合はそのような競合性ペプチドの存在もしくは不在下で試験することができ、また一方同時に候補薬剤を存在させてそのＭＩＦ／Ｊａｂ１相互作用に及ぼす影響を試験する。別の好ましい実施形態においては、上記のように同定されたＭＩＦ末端切断型ペプチドはそれ自体が候補薬剤、すなわちやがては薬剤として役立つ可能性がある。
【００５３】
そのような競合的結合パートナーはまたＪａｂ１由来の類似体とすることもでき、それは例えば、Ｊａｂ１の変異体、もしくは野生型ヒトＪａｂ１もしくはマウスＪａｂ１のドメインもしくはペプチド断片などのＪａｂ１の断片でありうる。本発明では、そのような末端切断型Ｊａｂ１タンパク質もしくはペプチドは非常に有用なＪａｂ１競合性分子で、それは本発明のアッセイ系で用いることができよう。特に本発明のさらなる好ましい実施形態においては、ＭＩＦ／Ｊａｂ１結合はそのような競合性Ｊａｂ１ペプチドの存在もしくは不在下で試験することができ、また一方同時に候補薬剤を存在させてそのＭＩＦ／Ｊａｂ１相互作用に及ぼす影響を試験する。別の好ましい実施形態においてはこれらのＪａｂ１末端切断型分子はそれ自体が候補薬剤、すなわちやがては薬剤として役立つ可能性がある。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態においては、ＭＩＦとＪａｂ１との間の結合は、例えば、共沈によって探索することができる。ＭＩＦをビーズ上に共有結合でもしくは非共有結合で、例えばＧＳＴ−ＭＩＦのＧＳＨ−ビーズへの結合、もしくはビオチン−ＭＩＦのストレプトアビジンビーズへの結合、もしくはＭＢＰ−ＭＩＦのマレート（ｍａｌａｔｅ）ビーズへの結合（ＭＢＰ：マレート結合タンパク質）を介して固定化し、可溶性Ｊａｂ１とともに候補薬剤の不在（対照）および存在下でインキュベートする。その懸濁液を洗い、固相に結合したＪａｂ１の量は、複合体からＪａｂ１を溶出させた後、ウエスタンブロットもしくは類似の方法で検出され、またはＪａｂ１は上清中に検出され、候補薬剤の存在および不在下でのＪａｂ１の量を比較する。
【００５５】
Ｊａｂ１とＭＩＦとの間の結合は、例えば、共沈によって調べることもできる。Ｊａｂ１をビーズ上に固定化し、可溶性ＭＩＦと薬剤の不在（対照）および存在下でインキュベートする。Ｊａｂ１は共有結合でもしくは非共有結合でビーズに、例えばＧＳＴ−Ｊａｂ１のＧＳＨ−ビーズへの結合、もしくはビオチン−Ｊａｂ１のストレプトアビジンビーズへの結合、もしくはＭＢＰ−Ｊａｂ１のマレートビーズへの結合を介して結合させることができる。その懸濁液を洗い、固相に結合したＭＩＦの量を、例えば複合体からＭＩＦを溶出させた後、ウエスタンブロットもしくは類似の方法で検出し、またはＭＩＦは上清中に検出され、推定上の薬剤もしくは候補薬剤の存在および不在下でのＭＩＦの量を比較する。
【００５６】
これらの共沈を用いた実施形態の一般的な概念は、２種類のパートナー、例えばＪａｂ１とＭＩＦのインキュベーションであり、それによって一方のパートナー、例えばＭＩＦはＧＳＴと共有結合で結合している。２種類のパートナー、ＭＩＦ−ＧＳＴとＪａｂ１は固相、例えばＧＳＨ−ビーズの存在下でインキュベートした。共有結合でＭＩＦに結合したＧＳＴとＧＳＨとの間で非共有結合が起こるので、このようにしてＭＩＦとＪａｂ１との複合体をＧＳＨ−ビーズと結合させることができる。固相のＧＳＨ−ビーズと、Ｊａｂ１と非共有結合で結合した非共有結合複合体のＧＳＴ−ＭＩＦの懸濁液を洗い、次いでＳＤＳバッファー中で煮沸することによってＪａｂ１を溶出する。その懸濁液の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する。そのＳＤＳゲルをウエスタンブロットでブロットし、Ｊａｂ１はそのブロット上で抗Ｊａｂ１抗体を用いることによって検出される。
【００５７】
この一般的概念から、以下の種々の実施形態が好ましい：
（ｉ）　ＧＳＨ−ビーズをＧＳＴ−ＭＩＦおよびＪａｂ１とインキュベートし、ＧＳＴ−ＭＩＦを介してＧＳＨ−ビーズと結合したＪａｂ１を（上記参照）、ウエスタンブロットで抗Ｊａｂ１抗体を用いて検出する、
（ｉｉ）　ＭＩＦ−ビーズをＪａｂ１とインキュベートし、ＭＩＦ−ビーズに結合したＪａｂ１をウエスタンブロットで抗Ｊａｂ１抗体を用いて検出する、
（ｉｉｉ）　ＧＳＨ−ビーズをＧＳＴ−Ｊａｂ１およびＭＩＦとインキュベートし、ＧＳＴ−Ｊａｂ１を介してＧＳＨ−ビーズと結合したＭＩＦをウエスタンブロットで抗ＭＩＦ抗体を用いて検出する、（ｉｖ）　Ｊａｂ１−ビーズを可溶性ＭＩＦとインキュベートし、Ｊａｂ１−ビーズに結合したＭＩＦをウエスタンブロットで抗ＭＩＦ抗体を用いて検出する、
（ｖ）　マレート−ビーズをＭＢＰ−ＭＩＦおよびＪａｂ１とインキュベートし、ＭＢＰ−ＭＩＦを介してマレート−ビーズと結合したＪａｂ１をウエスタンブロットで抗Ｊａｂ１抗体を用いて検出する、
（ｖｉ）　マレート−ビーズをＭＢＰ−Ｊａｂ１およびＭＩＦとインキュベートし、ＭＢＰ−Ｊａｂ１を介してマレート−ビーズと結合したＭＩＦをウエスタンブロットで抗ＭＩＦ抗体を用いて検出する、
（ｖｉｉ）　プロテインＡ−ビーズを抗ＭＩＦ抗体およびＭＩＦならびにビオチン−Ｊａｂ１とインキュベートし、プロテインＡ−ビーズと結合したストレプトアビジンをウエスタンブロットで検出する、
（ｖｉｉｉ）　プロテインＡ−ビーズを抗ＭＩＦ抗体およびＭＩＦならびにＪａｂ１とインキュベートし、プロテインＡ−ビーズと結合したＪａｂ１をウエスタンブロットで抗Ｊａｂ１抗体を用いて検出する、および
（ｉｘ）　ダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ ｂｅａｄｓ）−ストレプトアビジンをビオチン−ＥＧＦＰ−ＭＩＦおよびＪａｂ１とインキュベートし、ダイナビーズ−ストレプトアビジンと結合したＪａｂ１をウエスタンブロットで抗Ｊａｂ１抗体を用いて検出する。
【００５８】
ＭＩＦ／Ｊａｂ１相互作用を妨害する薬剤のスクリーニングも、タンパク質アッセイ、例えば、いわゆるバイオチップで行うことができる。例えば、ＭＩＦを固体支持体、例えばポリマー性支持体、もしくはシリカウェファー、もしくはスライドガラスもしくはナイロン膜上に、例えばＧＳＴ−ＭＩＦの固体ＧＳＨ−支持体への結合もしくはビオチン−ＭＩＦの固体ストレプトアビジン−支持体への結合、もしくはＭＢＰ−ＭＩＦの固体マレート−支持体への結合を介して、共有結合でもしくは非共有結合で固定化する。既知の方法に従えばＭＩＦは直接的に固体支持体上に固定することもでき、それはＬｙｓもしくはＣｙｓまたは類似のアミノ酸残基などのアミノ酸残基を介するか、あるいは非天然のアミノ酸を介して行われ、そのためタグ分子をさらに用いる必要はない。次いで、その固定化されたＭＩＦタンパク質を、候補薬剤の不在（対照）もしくは存在下で可溶性Ｊａｂ１とインキュベートする。次いで、ＭＩＦとＪａｂ１との相互作用に及ぼす候補薬剤の影響は蛍光もしくはＭＡＬＤＩ−ＭＳ検出法などの方法で検出することができる。別の実施形態においては、Ｊａｂ１もしくはＪａｂ１由来ドメインは固体支持体上に固定化されるが、それはＧＳＴ−Ｊａｂ１のＧＳＨ−支持体への結合もしくはビオチン−Ｊａｂ１のストレプトアビジン−支持体への結合、もしくはＭＢＰ−Ｊａｂ１のマレート−支持体への結合を介した共有結合もしくは非共有結合で、またはさらなる別のタグ分子を用いることなくＬｙｓもしくはＣｙｓなどのアミノ酸残基を介して、もしくは非天然のアミノ酸を介してのＪａｂ１の直接的な共有結合のいずれかで行われる。次いで固定化されたＪａｂ１タンパク質を、候補薬剤の不在（対照）もしくは存在下で可溶性ＭＩＦとインキュベートし、それによってＭＩＦとＪａｂ１との相互作用に及ぼす候補薬剤の影響を蛍光もしくはＭＡＬＤＩ−ＭＳ法で検出する。
【００５９】
ＭＩＦもしくはＪａｂ１に対する支持体としてバイオチップ中で用いられる材料は、ナイロンなどのいずれのポリマー性材料を含むことができる。これらのポリマー性支持体はそれ自体を、多孔性無機質支持体上に固定することができるが、その無機質支持体としては例えばシリカ、アルミナ、マグネシアなどの金属酸化物、またはこれらの酸化物の天然のもしくは合成の誘導体、例えばガラス、ケイ酸塩、ホウケイ酸塩、カオリンなどが挙げられる。該ポリマーは多孔性無機質支持体上に染み込ませることによって固定することができ、次いでそのポリマーコーティングは必要に応じて既知の方法にしたがって架橋することによって安定化される。その架橋剤は例えば、ジカルボニル化合物、ハロヒドリン、ジエポキシドなどである。そのポリマー性支持体は無機質の支持体上に中間的二機能性カップリング剤（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｏｕｐｌｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を用いて固定することもできる。アシアロ（ｄｅｓｉａｌｙｌｅｄ）タンパク質も、既知の方法に従って、ポリマー性支持体上に適切な二機能性カップリング剤によって固定することができる。カップリング剤は例えば、ブロムシアン、ジアルデヒド、ジエポキシドなどの二機能性誘導体である。タンパク質も多孔性無機質支持体上に直接固定することができる。例えば、シリカ支持体の場合には、シリカのアミノアルキルシラン誘導体を調製しアシアロタンパク質をアミノアルキルシラン上に二機能性剤、例えばグルタルアルデヒドなどを用いて固定する；例えばＰ．Ｊ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ２４２， ６５９−６６１（１９７１）を参照せよ。アシアロタンパク質も、フランス特許出願第７７．２８１６３号（公開番号第２．４０３．０９８号）に記載の方法に従って多孔性無機質支持体上に固定することができる。このプロセスは多孔性無機質支持体を開裂反応を行うことのできるポリマーでコーティングし、過ヨウ素酸塩などの酸化剤を用いてグリコール基を酸化することを含んでいる。ポリカルボニルコーティングが得られ、次いでリガンド、例えばアシアロ糖タンパク質を、形成されたカルボニル基上に固定することができる。所望により、形成されたイミン基をアミンに還元することができる。
【００６０】
好ましい実施形態においては、相互作用、例えばＭＩＦとＪａｂ１との結合を試験する方法は、電気泳動移動度シフトアッセイである。ＭＩＦ−Ｊａｂ１結合はゲル（例えば本来のポリアクリルアミドゲル）中のｃ−Ｊｕｎ／ＤＮＡもしくはＪａｂ１／ｃ−Ｊｕｎ／ＤＮＡ複合体の柔軟性／移動性を低下もしくは増大させる。ゲル中でのＤＮＡプローブ単独でのシフトもしくは複合体の一部としてのシフトは候補薬剤の存在もしくは不在下で、そのＤＮＡプローブの放射活性もしくは蛍光標識によって検出することができる。
【００６１】
本発明に従えば、ＭＩＦ−Ｊａｂ１結合を検出する方法は多数のタンパク質をも含んでいる。ＭＩＦ−Ｊａｂ１タンパク質結合はゲル（例えば本来のポリアクリルアミドゲル）中のＭＩＦおよびＪａｂ１の柔軟性／移動性を低下もしくは増大させる。ゲル中のタンパク質（ＭＩＦ、Ｊａｂ１、ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体）の候補薬剤の不在および存在下でのシフトはＭＩＦおよび／もしくはＪａｂ１の放射活性もしくは蛍光標識で検出することができる。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態においては、またＭＩＦ−Ｊａｂ１結合のクロマトグラフィーによる検出方法は次の事項を含む：候補薬剤の不在および存在下でＭＩＦをＪａｂ１−クロマトグラフィー支持体へ吸着させ、そのカラムをバッファーで洗い、溶出液中のＭＩＦもしくは結合しているＭＩＦを直接検出することを含んでなり；例えば、溶出液中のＭＩＦの量は、候補薬剤が解離剤である場合にはその候補薬剤が存在している条件では不在の条件よりも高い。またＭＩＦ−Ｊａｂ１結合をクロマトグラフィーで検出する方法は、候補薬剤の不在および存在下でＪａｂ１をＭＩＦ−クロマトグラフィー支持体、固定化抗ＭＩＦ−Ｊａｂ１ドメイン抗体、および／もしくは固定化抗ＭＩＦ−Ｊａｂ１融合タンパク質抗体などへ吸着させ、そのカラムをバッファーで洗い、溶出液中のＪａｂ１を検出することを含んでなり；例えば、溶出液中のＪａｂ１の量は、候補薬剤が解離剤でない場合にはその候補薬剤が存在している条件では不在の条件よりも低い。またＭＩＦ−Ｊａｂ１結合を検出する方法は、候補薬剤の不在もしくは存在下で可溶性のＭＩＦもしくはＪａｂ１を、固定化されたＭＩＦもしくはＪａｂ１を有しているＭＴＰ（マイクロタイタープレート）もしくはバイオチップ上に吸着させることを含んでいる。
【００６３】
本発明の特に好ましい実施形態においては、用いられるＭＩＦおよび／もしくはＪａｂ１はｉｎ ｖｉｔｒｏでの翻訳によって得られたものである。
【００６４】
別の好ましい実施形態においては、ＭＩＦおよびＪａｂ１は粗製のもしくは部分的に精製された細胞抽出物中に含まれる。本発明に包含される細胞抽出物とは、生物学的組織、または細胞もしくはその断片を含有する液体もしくは懸濁液である。そのような細胞抽出物は、細胞もしくは組織に機械的攪拌もしくは剪断、超音波処理、電場を適用すること、化学物および／もしくは酵素を適用することなどによって得ることができる。本発明はまた、「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」および「細胞抽出」法のいかなる組み合わせをも含む；例えば、ＭＩＦおよびＪａｂ１が懸濁液中に含まれ、それはＪａｂ１は細胞抽出物中に含まれ、純粋なＭＩＦはビーズ上に結合している。
【００６５】
別の実施形態においては、相互作用、特にＭＩＦとＪａｂ１との結合を試験する方法はｉｎ ｖｉｖｏの方法である。そのｉｎ ｖｉｖｏ法はＭＩＦ−Ｊａｂ１相互作用の生物学的活性の特に信頼できる方法として広く認められている。本発明のｉｎ ｖｉｖｏ法は毒性を示す可能性のある代謝を含まないので、これらの方法はｉｎ ｖｉｖｏでのＭＩＦとＪａｂ１との相互作用を測定するための診断用ツールとして特に有用である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの方法と比較すると、ｉｎ ｖｉｖｏ法は安全で、より広範囲に応用でき、操作がより容易で、感度がより高く、より正確な結果が得られ、生理学的状況をより信頼性高く示す。ＭＩＦおよび／もしくはＪａｂ１の標識は毒性を示す可能性のある非生理的代謝物ではなく生理的基質を介して行われる；細胞および組織解剖は保存する必要がなく；また、放射活性も関与しない。
【００６６】
本発明はまた、ＭＩＦおよびＪａｂ１に関して遺伝子工学的に操作された、特にトランスジェニック動物、とりわけ哺乳動物（特にマウスおよびその細胞）を包含する。これらの動物は、その細胞の少なくともいくらかには、調節エレメントの制御下にあるＭＩＦおよびＪａｂ１コード配列のトランスフェクトされたセンスもしくはアンチセンス構築物を含有し、特にいわゆるノックアウト動物はＭＩＦ、Ｊａｂ１もしくはＭＩＦ−Ｊａｂ１相互作用の活性が改変されているので研究と診断に有用である。トランスジェニック動物中のＭＩＦ、Ｊａｂ１、もしくはＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体の改変は、例えばＭＩＦ、Ｊａｂ１、もしくはＭＩＦ−Ｊａｂ１融合体のセンスもしくはアンチセンスヌクレオチド配列を用いることによって、またはこれらのヌクレオチド配列を改変することによって（例えば逆位、欠失、挿入、付加など）動物を形質転換し、双方の遺伝子座、すなわちＭＩＦとＪａｂ１で遺伝子工学的に操作された動物を得ることが可能となる。このように、また本発明は遺伝子工学的に改変された動物に関し、特に野生型動物に対して改変されたＭＩＦおよびＪａｂ１の発現を示すトランスジェニック動物に関する。哺乳動物、特にヒト以外の哺乳動物の細胞中でのこのような改変された発現はおそらくヌクレオチド配列の改変を含んでいるＭＩＦおよび／もしくはＪａｂ１アンチセンスもしくはセンス構築物の導入によるもの、および／または、ＭＩＦおよびＪａｂ１タンパク質の内因性ヌクレオチド配列中の操作によるものであろう。ＭＩＦおよびＪａｂ１の突然変異した、もしくは非突然変異の、センスもしくはアンチセンスコピーをさらに挿入することなどの改変、または調節領域の改変を含む内在性遺伝子の改変を行うことによって、上記で定めた目的に有用な動物を得ることが可能となる。従って、本発明はまた、上記で定めた改変を含んでいる単一種のヒト以外の哺乳動物細胞もしくは細胞培養物に関する。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態においては、ｉｎ ｖｉｖｏ法は次の事項を含んでなる：
ａ）　ＭＩＦおよび／もしくはＪａｂ１を過剰発現している細胞を提供すること、
ｂ）　ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体の標的活性、特に候補薬剤の不在下でのリポーター遺伝子の活性の発現を検出すること、
ｃ）　ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体の標的活性、特に候補薬剤の存在下でのリポーター遺伝子の活性の発現を検出すること、
ｄ）　ｂ）およびｃ）で得られた結果を比較すること。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態においては、リポーター遺伝子は、例えば、そのリポーター遺伝子の調節部位の近傍もしくはその部位において結合部位およびエフェクター部位を提供するＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体で誘導することができ、リポーター遺伝子はそのコード領域によってコードされる遺伝子産物を発現することができ、その産物を今度は検出の手段および方法によって直接的もしくは間接的に検出することができる。
【００６９】
また本発明は、ＭＩＦおよび／もしくはＪａｂ１を過剰発現している細胞が、宿主細胞を次のものを用いてトランスフェクトして得られるような方法に関する：
ａ）　プロモーターの機能的制御下にあるＭＩＦコード配列を含んでいるベクター、
プロモーターの機能的制御下にあるＪａｂ１コード配列を含んでいるベクター、
リポーター遺伝子を含んでいるベクター、または
ｂ）　単一のプロモーターの機能的制御下にあるＭＩＦとＪａｂ１をコードする遺伝子を含んでいるベクター、およびリポーター遺伝子を含んでいるベクター、
ｃ）　単一のプロモーターの機能的制御下にあるＭＩＦとＪａｂ１のコード配列とリポーター遺伝子を含んでいるベクター。
【００７０】
特に好ましい実施形態においては、プロモーターはＣＭＶもしくはＴｅｔなどの強力な構成性もしくは誘導性プロモーターである。ＭＩＦ、Ｊａｂ１および／またはリポーター遺伝子を含有するバイシストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）もしくはマルチシストロン性（ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）の構築物を作製することによってＭＩＦ、Ｊａｂ１および／もしくはリポーター遺伝子の連動した発現を行うことができる。特に、分子エレメントもしくは因子は融合タンパク質の形成を妨げることができるように、遺伝子を離れさせている。
【００７１】
本発明の特に好ましい実施形態においては、候補薬剤がＭＩＦとＪａｂ１との間の結合を破壊するか否かを調べる逆行（ｒｅｖｅｒｓｅ）ツーハイブリッド法は次のものを含んでなる：
ａ）　ｉ）　ＤＮＡ結合タンパク質認識部位に機能しうる形で連結されたリポーター遺伝子、
ｉｉ）　ＤＮＡ結合タンパク質認識部位と特異的に結合するＤＮＡ結合部分に共有結合で結合したＭＩＦを含んでいる第１のハイブリッドタンパク質を発現する第１の融合遺伝子、および
ｉｉｉ）　遺伝子活性化部分に共有結合で結合したＪａｂ１を含んでいる第２のハイブリッドタンパク質を発現する第２の融合遺伝子（ここではＪａｂ１は薬剤の不在下でＭＩＦと結合する）、
を含有する細胞を提供し；
ｂ）　その細胞をリポーター遺伝子の発現が可能な条件下で候補薬剤と接触させ；ｃ）　ＭＩＦとＪａｂ１との間の結合を候補薬剤が破壊する能力の尺度として、リポーター遺伝子の発現の阻害を検出する。
【００７２】
本発明では、ＭＩＦとＪａｂ１の間の結合を解離させるか、もしくは相互作用を妨げるような分子の同定を行うことができる。ＭＩＦとＪａｂ１との間の結合を崩壊させることのできる候補薬剤−いわゆる解離剤化合物−を単に培養物中に添加することによって細胞中に導入することができる。「解離剤化合物」という用語は相互作用、とりわけ、ＭＩＦとＪａｂ１の結合を、崩壊させる、妨げる、もしくはモジュレートするようないかなる分子をも意味する。解離剤化合物の例としてはポリペプチド、核酸、有機および無機分子、ならびにイオンが挙げられる。解離剤化合物となる可能性のあるものの多くは非常に小さいので、それが十分に疎水性である場合には、エンドサイトーシスもしくは拡散によって膜を通過して細胞によって取り込まれる。あるいはまた、解離剤化合物がＲＮＡ分子もしくはタンパク質である場合には、その化合物は、対応するＤＮＡ構築物で細胞を形質転換し、所望のＲＮＡもしくはタンパク質を発現させることによって細胞中で産生させることができる。ＭＩＦとＪａｂ１の間の分子的相互作用を安定化させる化合物もこれらの方法によって同定することができる。
【００７３】
ＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用を検出する方法も本発明で提供される。その方法は宿主細胞、好ましくは原核細胞もしくは真核細胞を提供することを含んでいる。その宿主細胞は、転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインが結合するための部位を有している検出可能なリポーター遺伝子を含有しており、その検出可能な遺伝子が転写活性化されると検出可能なタンパク質が発現されることとなる。そのような活性化は、転写活性化因子の転写活性化ドメインが、転写活性化因子のＤＮＡ結合ドメインと十分に近い位置となった場合に起こる。
【００７４】
宿主細胞中で発現されうる第１のキメラ遺伝子が提供される。キメラ分子は２種以上の天然の状態では別々に存在している分子が一緒になって、その全構成分子の所望の機能を有する単一の分子を形成するような分子である。キメラ分子は２種類の分子各々を別々に合成してから共有結合させて調製することができるが、当業者であれば、キメラ分子が融合タンパク質であり、そのキメラは新規に単一の「結びつけられた」分子として、すなわち遺伝子工学の方法によって作成することができることが理解されよう。第１のキメラ遺伝子は宿主細胞の染色体もしくはプラスミド中に存在させることができる。第１のキメラ遺伝子は第１のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。第１のハイブリッドタンパク質は、宿主細胞中のリポーター遺伝子上の結合部位を認識するＤＮＡ結合ドメインを含んでいる。第１のハイブリッドタンパク質はまた、ＭＩＦタンパク質もしくはＭＩＦタンパク質断片をも含んでおり、それはＪａｂ１タンパク質もしくはＪａｂ１タンパク質断片との相互作用について試験されるものである。
【００７５】
宿主細胞中で発現されうる第２のキメラ遺伝子が提供される。一実施形態においては、第１および第２のキメラ遺伝子の双方がプラスミドの形で宿主細胞中に導入される。しかし、好ましくは、第１のキメラ遺伝子は宿主細胞の染色体中に存在し、第２のキメラ遺伝子は、プラスミドの一部として宿主細胞中に導入される。その第２のキメラ遺伝子は第２のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。第２のハイブリッドタンパク質は転写活性化ドメインを含んでいる。その第２のハイブリッドタンパク質はまた、ＭＩＦタンパク質もしくはＭＩＦタンパク質断片との相互作用について試験されるＪａｂタンパク質もしくはＪａｂ１タンパク質断片をも含んでいる。第１のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインおよび第２のハイブリッドタンパク質の転写活性化ドメインは、好ましくはＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインが離れた状態にある転写活性化因子から由来するものである。これらの離れた状態にあるＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインは、例えば酵母ＧＡＬ４タンパク質中に認められることが知られており、また、酵母ＧＣＮ４およびＡＤＲ１タンパク質中に認められることも知られている。転写に関与するその他の多数のタンパク質にも離れた状態の結合ドメインと転写活性化ドメインがあり、そのことがそれらのタンパク質を本発明で有用なものとしている。別の一実施形態においては、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインは異なる転写活性化因子由来のものとすることができる。第２のハイブリッドタンパク質は、転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ配列に融合された、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成で作成されたＤＮＡ配列を含んでいるプラスミドのライブラリーでコードされ得る。
【００７６】
種々のＤＮＡ結合部分および遺伝子活性化部分が本発明の種々の態様において使用するために適している。通常、転写因子のＤＮＡ結合ドメインもしくは遺伝子活性化ドメインを用いることができる。所望により、ＶＰ１６の遺伝子活性化ドメインを用いることができる。ＤＮＡ結合タンパク質認識部位および遺伝子活性化部分およびＤＮＡ結合部分は全て同一の転写因子に応答するか、もしくはそれらは異なる転写因子に応答することができる。有用な結合部位としては、酵母タンパク質ＧＡＬ４、細菌のタンパク質ＬｅｘＡ、酵母金属結合因子Ａｃｅ１が含まれる。これらの結合部位は抑制されたプロモーターとともに容易に用いることができる（例えば、ＳＰＯ１３プロモーターはＧＡＬ、ＬＥＸ、およびＡＣＥ１のＤＮＡ結合部位と組み合わせてそれぞれＳＰＡＬ、ＳＰＥＸ、およびＳＰＡＣＥプロモーターの基礎をなすものとして用いることができる）。その他の有用な転写因子としてはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＣＮ４タンパク質（例えば、ＨｏｐｅとＳｔｒｕｈｏｌ， １９８６， Ｃｅｌｌ ４６：８８５−８９４を参照せよ）、およびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＤＲ１タンパク質（例えば、Ｋｕｍａｒら， １９８７， Ｃｅｌｌ ５１：９４１−９５１を参照せよ）が含まれる。ＤＮＡ結合タンパク質認識部位には、用いられる転写因子の結合ドメインが結合するための少なくとも１カ所の結合部位が含まれているはずである。用いることのできるＤＮＡ結合タンパク質認識部位の数には制限がないが、結合部位の数は好ましくは１から１００の間で、より好ましくは１から２０の間で、さらにより好ましくは結合部位の数は１から１６の間である。結合部位の数は、アッセイの所望の選択性もしくは感度などの要素を考慮して調節することができる。
【００７７】
宿主細胞中でのＭＩＦタンパク質もしくはその一部分とＪａｂ１タンパク質もしくはその一部分との間の相互作用は、転写活性化ドメインによるリポーター遺伝子の転写の活性化を生ずる。その方法は第１のキメラ遺伝子および第２のキメラ遺伝子を宿主細胞中に導入することによって行われる。宿主細胞は、第１のハイブリッドタンパク質と第２のハイブリッドタンパク質の発現がリポーター遺伝子が活性化されるために十分な量となるような条件下に置かれる。次いで細胞をリポーター遺伝子の発現について試験し、その発現はＭＩＦタンパク質とＪａｂ１タンパク質との間の相互作用がない場合よりもリポーター遺伝子の発現が多い。
【００７８】
本発明の好ましい一実施形態においては、リポーター遺伝子の発現はスクリーニングしようとする候補薬剤を加えた宿主細胞中で測定され、候補薬剤を加えていない宿主細胞でのリポーター遺伝子の発現と比較する。
【００７９】
好ましい一実施形態においては、本発明はＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインに関し、それらは分離可能なＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを有する転写活性化因子由来のものである。
【００８０】
本発明のさらに好ましい一実施形態においては、転写活性化ドメイン中のＤＮＡ結合ドメインは、転写活性化因子ＧＡＬ４、ＧＣＮ４、およびＡＤＲ１からなる群から選択されるものである。このシステムは、多数の条件に応じて本発明の方法を適切に実施することができる。相互作用しているＭＩＦタンパク質はそれ自体にマーカー遺伝子の活性化ドメインを有してはならない。ＭＩＦタンパク質と融合させたＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインのみをコードするベクターが導入されると直ちにマーカーの転写が行われる。ＭＩＦタンパク質とＪａｂ１タンパク質間の相互作用は酵母の核の内部でも起こるにちがいない。Ｊａｂ１タンパク質を含んでいるハイブリッドのＧＡＬ４活性化ドメイン部分は、マーカーまたはリポーター遺伝子の転写が行われうるようにその細胞の転写メカニズムに応じるものでなければならない。これらの条件の何らかのものが欠けている場合には、このシステムは、相互作用しているタンパク質であるＭＩＦおよびＪａｂ１の部分のみを有しているハイブリッドを構築することによって改変し、それによってそれらの条件を満足させることができる。他の真核細胞はその転写について酵母と類似のメカニズムが用いられているので、哺乳類細胞などの他の真核細胞を酵母の替わりに用いて、ＭＩＦとＪａｂ１の相互作用について試験することができる。リポーター遺伝子の機能は非常に多種類の遺伝子、例えば耐性、もしくは代謝酵素、もしくはＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）などの遺伝子によって提供することができる。ＧＡＬ４の機能は、分離可能なＤＮＡ結合および転写活性化のドメインを持ついずれの転写活性化因子によっても提供することができる。いずれのタンパク質にも、転写活性化因子ではなく２つの分離可能な機能を有するものが含まれ、ＭＩＦ−Ｊａｂ１相互作用を検出するための類似の遺伝子システムを確立するために用いることができる。
【００８１】
従って、本発明の方法は、再構築しうるアミノ酸配列の分離可能なドメインを必要とする検出可能ないかなる機能にも、より一般的に適用することができる。本発明のこの一般的な実施形態で、ＭＩＦおよびＪａｂ１間の相互作用が検出される。その方法には、検出可能な機能の欠如している宿主細胞を提供することを含んでいる。検出可能な機能は、分離可能なドメインを有するアミノ酸配列によって再構築／提供される。このように、該アミノ酸配列には第１および第２ドメインが含まれ、それらは宿主細胞中でお互いが十分に近接していれば検出可能な機能を生じさせることができる。
【００８２】
本発明の特に好ましい一実施形態においては、第１のハイブリッドタンパク質および／または第２のハイブリッドタンパク質はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および合成ＤＮＡからなる群から由来するＤＮＡインサートを含んでいるプラスミドのライブラリー上にコードされている。
【００８３】
本発明のさらに好ましい一実施形態においては、キメラ遺伝子はプラスミドの形で宿主細胞中に導入される。
【００８４】
本発明の特に好ましい一実施形態においては、第１のキメラ遺伝子は宿主細胞中での発現が可能なものとして提供される。第１のキメラ遺伝子は第１のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。第１のハイブリッドタンパク質はアミノ酸配列の第１ドメインを含んでいる。第１ハイブリッドタンパク質はまた、Ｊａｂ１タンパク質もしくはＪａｂ１タンパク質断片との相互作用について試験されるＭＩＦタンパク質もしくはＭＩＦタンパク質断片を含んでいる。
【００８５】
本発明の別の一実施形態においては、第１のキメラ遺伝子は宿主細胞の染色体中に組み込まれており、第２のキメラ遺伝子はプラスミドの一部として宿主細胞中に導入される。第２のキメラ遺伝子は宿主細胞中で発現されうるものとして提供される。第２のキメラ遺伝子は、第２のハイブリッドタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含んでいる。第２のハイブリッドタンパク質はアミノ酸配列の第２ドメインを含んでいる。第２のハイブリッドタンパク質はまた、ＭＩＦタンパク質もしくはＭＩＦタンパク質断片との相互作用について試験されるＪａｂ１タンパク質もしくはその断片を含んでいる。宿主細胞中でのＭＩＦタンパク質とＪａｂ１タンパク質の相互作用は、再構築されるべきアミノ酸配列の機能を生ずる。このことは第１のキメラ遺伝子および第２のキメラ遺伝子を宿主細胞中に導入することによって行われる。第１のハイブリッドタンパク質および第２のハイブリッドタンパク質の発現が、再構築されるアミノ酸配列の機能に十分な量となるような条件下に宿主細胞を置く。次いで細胞を試験して、該アミノ酸配列の機能の発現が供試物質、例えばタンパク質の相互作用のない状態における程度よりも高い程度に再構築されているか否かを調べる。この一般化された方法をより特異的なものとして本発明の好ましい方法とすることができ、その方法では検出可能な機能とは検出可能なリポーター遺伝子の転写である。この方法では、アミノ酸配列の第１ドメインは検出可能なリポーター遺伝子上の結合部位を認識するＤＮＡ結合ドメインを含んでおり、アミノ酸配列の第２ドメインは転写活性化ドメインを含んでいる。
【００８６】
本発明の特に好ましい実施形態においては、ＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインは異なる転写活性化因子由来のものである。
【００８７】
本発明はまた、ＭＩＦタンパク質を調製する方法であって、（ｉ）ＭＩＦタンパク質を含有している供給源を提供し、（ｉｉ）ＭＩＦタンパク質を含有している供給源をＪａｂ１を含有している供給源とを、以下の、（ｉｉｉ）ＭＩＦとＪａｂ１とを結合させ、また、（ｉｖ）ＭＩＦをＪａｂ１から分離することがともに行われうるような条件下で接触させる、ことを含んでなる方法である。
【００８８】
ある供給源からＭＩＦを精製するための方法は、例えば：
ａ）　ＭＩＦの供給源を濃縮すること；
ｂ）　ＭＩＦをＪａｂ１−クロマトグラフィー用支持体上に吸着させること；
ｃ）　吸着されたＭＩＦを少なくとも１種のバッファーで洗うこと；
ｄ）　洗ったＭＩＦを選択的に溶出すること、および
ｅ）　ＭＩＦを溶出液から回収すること
を含んでなる。
【００８９】
さらに、その精製方法は次の目的にも用いられうる：
（ｉ）　組換えＭＩＦの細菌からの精製、
（ｉｉ）　天然ＭＩＦの組織からの精製、
（ｉｉｉ）　ある種のトートメラーゼなどのＭＩＦ様相同体の精製、
（ｉｖ）　「天然」ＭＩＦを過剰な処理を行うことなく精製し、それによってＪａｂ１がソフトキャプター（ｓｏｆｔ ｃａｐｔｅｒ）分子として用いられうるような精製。
【００９０】
本技術は、ＭＩＦとＪａｂ１が特異的な方法で相互作用するという事実を利用する。このアフィニティクロマトグラフィーは、ＭＩＦタンパク質と固定されたリガンド（例えば、Ｊａｂ１）との相互作用に基づく。本発明のリガンドはこの特定の目的のタンパク質に対して特異的であればよく、この場合、リガンドはＭＩＦと反応する基質、基質類似体、インヒビターまたは抗体である。細胞抽出物などの供給源からＭＩＦを単離するため、例えば、細胞抽出物のサンプルをＪａｂ１機能を付与した、またはコートしたポリマーから成るカラム上に置き、そしてカラムをバッファーによって繰り返し洗浄する。カラム上に保持されたタンパク質だけがポリマーに固着したＪａｂ１と高い親和性をもつタンパク質であり；他のタンパク質は簡単に洗浄除去される。本発明のアフィニティクロマトグラフィー支持体上に固定されたＭＩＦを溶出するために、例えば、塩類および／または塩化マグネシウムなどの既知のカオトロピック剤を十分な濃度で含有するバッファー溶液または炭酸塩バッファーを使用してもよい。ＭＩＦとＪａｂ１の間の親和性と特異性は非常に高いので、ＭＩＦまたはＪａｂ１を細胞抽出物から単離し、かつ精製することができる。このクロマトグラフィーは、ＭＩＦを調製する現行の方法を改善し、かつＪａｂ１を調製する方法を提供する。
【００９１】
Ｊａｂ１用支持体として使用するポリマーは、それ自身を多孔質無機支持体上に固定することができる。多孔質無機支持体としては、例えば、シリカ、アルミナ、マグネシアなどの金属酸化物、またはガラス、珪酸塩、硼珪酸塩、カオリンなどのこれらの酸化物の天然もしくは合成誘導体が挙げられる。前記ポリマーを多孔質無機支持体上に含浸して固定し、もし必要であれば、公知の方法によってポリマーコーティングを架橋し、安定化してもよい。架橋剤は、例えば、ジカルボニル化合物、ハロヒドリン、ジエポキシドなどがある。また、ポリマー支持体を介在二官能カップリング剤を使って無機支持体上に固定してもよい。脱シアリル化タンパク質はまた、適当な二官能カップリング剤を使って公知の方法によりポリマー支持体上に固定することができる。カップリング剤は、例えば、ブロモシアン、ジアルデヒド、ジエポキシドなどの二官能誘導体である。また、タンパク質を多孔質無機支持体上に直接固定してもよい。例えば、シリカ支持体の場合、シリカのアミノアルキルシラン誘導体を調製し、脱シアリル化タンパク質をグルタルアルデヒドなどの二官能作用剤を用いてアミノアルキルシラン上に固定する；例えば、Ｐ． Ｊ． Ｒｏｂｉｎｓｏｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， ２４２， ６５９−６６１ （１９７１）を参照。また、脱シアリル化タンパク質をフランス特許出願７７．２８１６３ （公開番号２．４０３．０９８）に記載の方法によって多孔質無機支持体上に固定してもよい。この方法は、過ヨウ素酸塩などの酸化剤を使ってグリコール基を酸化する開裂反応を受け得るポリマーを用いて、多孔質無機支持体をコートすることからなる。ポリカルボニルコーティングが得られ、次いでリガンド、例えば脱シアリル化糖タンパク質を、生成したカルボニル基上に固定することができる。もし所望であれば、生成するイミン基をアミンに還元してもよい。
【００９２】
従って、本発明は；
ａ） Ｊａｂ１タンパク質を含有しているソーズを提供し、
ｂ） Ｊａｂ１タンパク質を含有している供給源をＭＩＦタンパク質を含有する供給源とａｂ１とＭＩＦの結合が起こる条件下で接触させ、
そしてＪａｂ１を分離することを含んでなる、Ｊａｂ１タンパク質を調製する方法に関し、単離したペプチド、タンパク質もしくは断片は、例えばアフィニティクロマトグラフィーなどの生化学的方法によって精製することができる。ＭＩＦもしくはＪａｂ１（例えば、ヒトＭＩＦタンパク質）を単離するために使用しうるアフィニティマトリックスは、ＭＩＦもしくはＪａｂ１をコードするアミノ酸配列、または合成ペプチド、組換え断片等のそれらの断片に対して調製された抗ＭＩＦモノクローナルもしくはポリクローナル抗体であってもよい。あるいは、当業界で周知である、ＭＩＦと特異的に結合する相同の結合ドメインまたはポリペプチドならびに他の化合物をアフィニティマトリックスとして同じ様に利用し、本発明のタンパク質または抗体（例えば、ＭＩＦ−Ｊａｂ１ドメインと相互作用する、純粋なヒトＭＩＦタンパク質、半純粋なマウスＪａｂ１ポリペプチドまたは抗体）を実質的に単離してもよい。クロマトグラフィーは、相同的ドメインをＭＩＦと結合させることにより、未知のＪａｂ１相同体（ＭＯＶ３４ファミリーのタンパク質またはＰａｄ１のようなＭＰＮドメインをもつタンパク質などの）を単離する方法を提供する。
【００９３】
本発明の好ましい実施形態においては、ＭＩＦおよび／またはＪａｂ１を含有している供給源は、細菌もしくは酵母もしくは遺伝子組換えで調製した細胞を含む細胞、組織、細胞培養物、細胞培養上清、細胞抽出物、タンパク質調製物、単離されたＭＩＦまたはＪａｂ１である。
【００９４】
特に好ましい本発明の実施形態においては、ＭＩＦタンパク質を含有している供給源は、ＭＩＦとＪａｂ１を接触させる前に予備処理し、特に破壊し、もし必要であれば、例えば供給源として使用する細胞を音波処理するか、化学的にもしくは酵素的に溶解するか、またはパルスもしくは定電場にかけてもよい。
【００９５】
本発明はまた、好ましくは単離されかつ精製された、Ｊａｂ１タンパク質の全てもしくは部分と非共有結合により会合したＭＩＦタンパク質の全体または一部分を含んでなる複合タンパク質に関する。ＭＩＦとＪａｂ１の複合体は、天然もしくは野生型複合体、ならびに、複合体の２成分、すなわちＭＩＦもしくはＪａｂ１のそれぞれまたはそれら両方の逆位、欠失、挿入、置換、付加、変性、酸化などのアミノ酸改変を含有するいずれの改変体、突然変異体または遺伝子組換えにより作製された誘導体に関する。
【００９６】
従って、本発明はまた、好ましくは、単離されかつ精製された、Ｊａｂタンパク質の全部又は一部分と共有結合により結合したＭＩＦタンパク質の全部または一部分を含んでなる融合タンパク質に関する。融合タンパク質は、天然もしくは野生型融合タンパク質、ならびに複合体の２成分のそれぞれ、すなわちＭＩＦもしくはＪａｂ１またはそれら両方の逆位、欠失、挿入、置換、付加、変性、酸化などのアミノ酸改変を有するいずれの改変体、突然変異体または遺伝子組換えにより作製された誘導体に関する。
【００９７】
本発明はまた、精製されかつ単離された、上記の融合タンパク質をコードする核酸配列またはその相補的な鎖に関する。核酸配列という用語は、ＤＮＡもしくはＲＮＡの天然もしくは合成のポリマーに関し、一本鎖もしくは二本鎖であってもよいし、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリマー中に組み込むことができる合成、非合成もしくは改変されたヌクレオチド塩基を含有してもよい。核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡであってもよい。
【００９８】
本発明はまた、上記の核酸配列を含んでなるベクター、特にプラスミドなどの細菌ベクター、リポソーム、バクテリオファージ、レトロウイルスまたはウイルスに関する。
【００９９】
さらに、本発明は、本発明のベクターを用いて形質転換された宿主細胞、特に原核生物または真核生物細胞に関する。本発明はまた、上記のプラスミドを含有する細胞を含んでなる細胞培養物、組織などに関する。
【０１００】
本発明はまた、ＭＩＦとＪａｂ１の複合体またはＭＩＦとＪａｂ１の融合タンパク質またはＭＩＦとＪａｂ１の相互作用ドメインと、特異的に反応する抗体またはそのフラグメントに関する。これらの抗体を使って発現ライブラリーをスクリーニングし、本発明の複合体を産生するクローンおよびまた治療目的のクローンを同定することができる。本明細書に使用される、用語「抗体に関する」は、Ｊａｂ１とＭＩＦの相互作用により誘導される分子および細胞経路の検出、活性化または阻害に関する。用語「抗体」は、ＭＩＦとＪａｂ１の複合体と相互作用する性質を有する二価および一価の分子物質に関する。本明細書に使用される「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされた１以上のポリペプチドから成るタンパク質に関する。軽鎖はκまたはλのいずれかに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεに分類され、それぞれ順にＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥの免疫グロブリンクラスを定義する（詳細は用語の定義を参照）。成句「と特異的に結合する」は、抗体については、タンパク質および他の生物学的物質の不均質集団が存在している中で、問題のドメインの存在を決定づける認識および結合反応を意味する。従って、指定した免疫条件のもとで、特定の抗体はサンプル中に存在する特定ドメインと結合し、他のタンパク質とは有意な量の結合をしない。そのような条件下におけるドメインとの特異的な結合には、ＭＩＦ−Ｊａｂ−ドメインに対する特異性について選択された抗体が必要である。様々なイムノアッセイフォーマットを用いて、ＭＩＦ−Ｊａｂ１−ドメインと特異的な免疫反応性のある抗体を選択することができる。例えば、日常的に、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイを利用してドメインと特異的な免疫反応性のあるモノクローナル抗体を選択する。利用しうるイムノアッセイは、限定されるものでないが、数例として、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線測定アッセイ、蛍光イムノアッセイおよびプロテインＡイムノアッセイなどの技術を利用する、競合および非競合アッセイ系が挙げられる。本発明の抗体は、ＭＩＦとＪａｂ１の相互作用に関わるドメイン上の１以上のエピトー
プと特異的に結合する。エピトープは、抗体が結合するＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体またはＭＩＦ−Ｊａｂ１相互作用ドメインまたはＭＩＦ−Ｊａｂ１融合タンパク質の領域であって、その結合は第２の抗体とＭＩＦ−Ｊａｂ１−複合体との会合を阻止するか、またはその抗体は他のタンパク質（上流キナーゼ、ｃ−Ｊｕｎ、ＪＮＫ、ＳＲＣ−１、ＬＦＡ−１、ＰＲ、ＧＲなど）の結合を阻止することを特徴とする。
【０１０１】
本発明の一実施形態においては、抗体はポリクローナル抗体、モノクローナル抗体およびそれらのフラグメントである。抗体フラグメントはＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体と相互作用するフラグメントを包含する。また、ＭＩＦ−Ｊａｂ１−複合体と相互作用するヒト化抗体も包含し、ヒト化抗体は典型的には遺伝子組換え法により作製され、ヒト配列が抗体の一部分または全部を含んでなることを特徴とする。ヒト化抗体の例としては、キメラ抗体またはＣＤＲグラフト化抗体が挙げられる。遺伝子的に改変したマウスで産生されるＭＩＦ−Ｊａｂ１−複合体の全ヒト抗体も含まれる。本発明の抗体に、検出可能な標識を結合させてもよい。そのような標識は、蛍光標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ＦＩＴＣ）、酵素標識（例えば、西洋わさびオキシダーゼ）、アフィニティ標識（例えば、ビオチン）、または同位体標識（例えば１２５Ｉ）が可能である。
【０１０２】
本発明はまた、ＭＩＦ−Ｊａｂ１−複合体と相互作用するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系も包含する。
【０１０３】
本発明の抗体は、ＭＩＦ関連疾患の診断に有用である。抗体を、生物学的サンプル中のＭＩＦとＪａｂ１の相互作用の存在を検出する診断キットの一部として使用することができる。生物学的サンプルは、組織、標本および無傷の細胞またはそれらの抽出物が挙げられる。そのようなキットは、検出を可能にする標識を付した抗体を使用する。抗体は、ＭＩＦとＪａｂ１の相互作用の通常ドメインを同定するために有用であり；本発明の抗体はまた、診断および治療にも有用である。
【０１０４】
本発明はまたキットにも関し、キットは本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列、前記核酸配列を含んでいるベクター、前記ベクターを含んでいる宿主細胞、ＭＩＦおよび／またはＪａｂ１をコードするＤＮＡ配列、ＭＩＦおよび／またはＪａｂ１を含んでいる複合体または融合分子、ならびに本発明の抗体を含んでなる。本発明に関連して、ＭＩＦ−Ｊａｂ１複合体を、純粋な脂質または生体膜をもつリポソーム中に含有させることができる。ＭＩＦ−Ｊａｂ複合体をコードするＤＮＡを、アジュバントまたは免疫化の物質として使用することができる。リポソームまたはアジュバントは、ＭＩＦ−および／またはＪａｂ１関連疾患の診断と治療に有用である。
【０１０５】
以上記載した本発明の方法は、ＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用を検出するキットを使用して実施することができる。該キットは、容器、２種のベクターおよび宿主細胞を含んでなる。第１のベクターは、第１のキメラ遺伝子の転写を指令するために、第１のキメラ遺伝子と機能的に関連したプロモーターを含有しておりかつそのような転写終結シグナルを含んでもよい。第１のキメラ遺伝子は、ＤＮＡ結合ドメイン、およびＭＩＦ活性をもつタンパク質またはＭＩＦ活性をもつタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列を挿入するためのユニークな制限酵素切断部位を、ＭＩＦがＤＮＡ結合ドメインをもつハイブリッドタンパク質の部分として発現されるように含む。第１のベクターはまた、宿主細胞内でおよび細菌内で自分自身を複製する手段も含む。第１のベクターはまた、第１のマーカー遺伝子も含んでおり、宿主細胞におけるその発現によって、第１マーカー遺伝子を含有する細胞を第１マーカー遺伝子を含有しない細胞と分けて選択することが可能となる。この第１のベクターは好ましくはプラスミドである。以上特定したＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用を検出する方法、特に薬剤をスクリーニングする方法は、通常条件のもとで実施するものであり、例えば、ＭＩＦとＪａｂ１の結合を検出するために適当な条件のもとでの水性媒質中の結合アッセイである。
【０１０６】
キットはまた、第２のキメラ遺伝子を含有する第２のベクターを含む。第２のキメラ遺伝子も、転写を指令するためのプロモーターおよび転写終結シグナルを含む。第２のキメラ遺伝子はまた、特定のコード化転写活性化ドメイン、およびＪａｂ１活性をもつタンパク質またはタンパク質断片をコードするＤＮＡ配列をベクターに挿入するためのユニークな制限酵素切断部位を、Ｊａｂ１、またはＪａｂ１活性をもつタンパク質もしくはタンパク質断片が転写活性化ドメインをもつハイブリッドタンパク質の部分として発現され得るように含む。第１のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインと第２のハイブリッドタンパク質の転写活性化ドメインは、好ましくは、分離したＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインとを有する転写アクチベーターから得られる。分離したＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインは、酵母ＧＡＬ４タンパク質中に見出されることも公知であり、酵母ＧＣＮ４およびＡＤＲ１タンパク質中に見出されることも公知である。転写に関わる他の多くのタンパク質も分離可能な結合および転写活性化ドメインを有していることから、本発明に有用である。他の実施形態においては、転写活性化ドメイン中のＤＮＡ結合ドメインは異なる転写アクチベーター由来であってもよい。第２のハイブリッドタンパク質は、転写活性化ドメインをコードするＤＮＡ配列に融合させた、ゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、または合成により作製したＤＮＡ配列を含有するプラスミドのライブラリーにコードされていてもよい。第２のベクターはさらに、宿主細胞内および細菌内で自分自身を複製する手段を含む。第２のベクターはまた第２のマーカー遺伝子を含み、宿主細胞内で該マーカー遺伝子が発現することにより、第２のマーカー遺伝子を含有する細胞を第２のマーカー遺伝子を含有しない細胞から分ける選択が可能になる。キットは、第１のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインに対する結合部位を有する検出可能なリポーター遺伝子を含有する宿主細胞を含む。その結合部位は、検出可能なリポーター遺伝子が第２のベクターにコードされた転写活性化ドメインにより活性化されたときに、該リポーター遺伝子検出可能なタンパク質を発現するように配置される。もし転写活性化ドメインがリポーター遺伝子と十分近接していれば、検出可能な遺伝子の活性化が可能である。宿主細
胞自身は、第１マーカー遺伝子、第２マーカー遺伝子、ＤＮＡ結合ドメインまたは転写活性化ドメインの機能を有するタンパク質を発現することはできない。従って、キットを使用することにより、宿主細胞内のＭＩＦとＪａｂ１が相互作用すると、ＭＩＦタンパク質とＪａｂ１タンパク質との相互作用不在のもとで、転写活性化ドメイン中にＤＮＡ結合ドメインが存在する場合よりも、測定しうる程度に高いリポーター遺伝子の発現が起こる。リポーター遺伝子は、容易に測定できる酵素または他の産物をコードするものでもよい。２つのハイブリッドタンパク質を含有する細胞を、適当な培地でインキュベートし、さらにその培養物の測定可能な活性をモニターする。この活性に対して陽性の試験は、ＭＩＦとＪａｂ１タンパク質が相互作用を起こしたことの徴候である。かかる相互作用はそれぞれのＤＮＡ結合および転写活性化ドメインを十分密接した近位に置いて、マーカー遺伝子の転写を引き起こす。
【０１０７】
本発明はまた、ＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用に対する候補薬剤の影響を検出するためのタンパク質アレイキットにも関する。あるキットは、容器内に、ＭＩＦを固体支持体上に直接固定したバイオチップ、Ｊａｂ１を固体支持体上に直接固定したバイオチップ、凍結乾燥形態のＭＩＦタンパク質またはペプチド、凍結乾燥形態のＪａｂ１タンパク質またはペプチド、およびバッファー系を含んでなる。別のキットは、ＭＩＦおよびＪａｂ１のそれぞれをＧＳＨ−支持体上にＧＳＴタンパク質として固定した２種のバイオチップ、凍結乾燥ＭＩＦ、凍結乾燥Ｊａｂ１およびバッファー系を含んでなる。別のキットは、ＭＩＦとＪａｂ１のそれぞれがストレプトアビジン−支持体上にビオチンタンパク質として固定された２種のバイオチップ、凍結乾燥ＭＩＦ、凍結乾燥Ｊａｂ１およびバッファー系を含んでなる。別のキットは、ＭＩＦとＪａｂ１のそれぞれをマレート−支持体上にＭＢＰタンパク質として固定した２種のバイオチップ、凍結乾燥ＭＩＦ、凍結乾燥Ｊａｂ１およびバッファー系を含んでなる。潜在的薬剤をスクリーニングするための様々なキットは次のように使用する。凍結乾燥ＭＩＦタンパク質またはペプチドをバッファーに溶解し、次いでそれを潜在的薬剤の存在または不在のもとで固定したＪａｂ１を有するバイオチップと接触させる。比較のために、凍結乾燥Ｊａｂ１ペプチドまたはタンパク質もバッファーに溶解しそれを潜在的薬剤の存在または不在のもとで固定したＭＩＦを有するバイオチップと接触させる。次に、ＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用を検出する先に記載の方法、特に蛍光またはＭＡＬＤＩ−ＭＳ法を通常の条件で実施する。
【０１０８】
本発明はまた医薬組成物または診断用組成物であって、本発明の核酸配列、本発明の核酸配列を含有するベクター、本発明の該ベクターを含有する宿主細胞、Ｊａｂ１および／もしくはＭＩＦをコードするＤＮＡ配列、本発明の抗体ならびに／またはＭＩＦとＪａｂ１を含有する複合体もしくは融合分子を含み、場合によってはそれを製薬上許容される担体、および／もしくは香料、結合剤、甘味剤、充填剤、増量剤、製薬上許容される塩、無機酸もしくは有機酸、保存剤、乳化剤などのさらなる添加剤と組合せて含む、前記医薬組成物または診断用組成物に関する。
【０１０９】
本発明はまた、ＭＩＦ活性をモジュレートするための、Ｊａｂ１またはＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列の使用、特にＭＩＦ関連疾患を治療するための該使用に関する。
【０１１０】
従って、本発明はまた、Ｊａｂ１またはＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列の、ＭＩＦ関連疾患治療用の医薬、薬剤または治療剤を調製するための使用に関する。
【０１１１】
さらに、本発明は、Ｊａｂ１またはＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列の、ＭＩＦ関連疾患を検出するための使用に関する。
【０１１２】
本発明は、タンパク質複合体および／または融合タンパク質の、ＭＩＦ関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用に関する。
【０１１３】
さらに、本発明は、タンパク質複合体および／または融合タンパク質の、ＭＩＦ関連疾患を診断および／または治療するための使用に関する。
【０１１４】
本発明はまた、Ｊａｂ１の全体もしくは一部分と結合しているＭＩＦの全体もしくは一部分を含有する複合体および／もしくは融合タンパク質を特異的に認識する抗体もしくはそのフラグメント、またはＪａｂ１を認識する抗体もしくはそのフラグメントの、ＭＩＦ関連疾患を診断および／または治療するための薬剤を調製するための使用に関する。
【０１１５】
本発明はまた、本発明の抗体またはＪａｂ１に対する抗体もしくはそのフラグメントの、ＭＩＦ関連疾患を診断および／または治療するための使用に関する。
【０１１６】
さらに、本発明は、Ｊａｂ１もしくはその一部、またはＪａｂ１をコードするヌクレオチド配列、またはＪａｂ１を特異的に認識する抗体を薬学上有効な量で含んでなる薬剤に関する。
【０１１７】
本発明は、ＭＩＦまたはＭＩＦをコードするヌクレオチド配列の、Ｊａｂ１活性モジュレートするための使用、特にＪａｂ１関連疾患治療のための該使用に関する。Ｊａｂ１関連疾患とは、炎症および／または抗炎症作用、免疫調節経路の調節、敗血症性ショック、生理学的ストレス、サイトカイン活性に関係する疾患、サイトカイン依存性シグナル伝達経路、細胞周期依存性疾患、ＵＶ誘導皮膚障害などの皮膚疾患、異常な細胞増殖疾患および癌ならびに炎症過程を意味する。
【０１１８】
本発明はまた、ＭＩＦまたはＭＩＦをコードするヌクレオチド配列の、Ｊａｂ１関連疾患の診断用および／または治療用薬剤を調製するための使用に関する。
【０１１９】
従って、本発明はまた、Ｊａｂ１活性をｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて改変するための方法、特にＪａｂ１関連疾患を診断するかまたは治療するための方法であって、ＭＩＦ、ＭＩＦの部分、ＭＩＦ抗体、および例えばベクター中の適当な調節配列に対してセンスもしくはアンチセンス方向に恐らくクローニングされたＤＮＡもしくはｍＲＮＡなどのＭＩＦヌクレオチド配列を用いて、例えば転写の改変、Ｋｉｐの分解、ｃ−Ｊｕｎの結合および／または細胞周期の改変により、Ｊａｂ１活性および／またはその発現をモジュレートおよび／または制御することによる前記方法に関する。
【０１２０】
さらに、本発明は、ＭＩＦまたはＭＩＦをコードするヌクレオチド配列の、Ｊａｂ１関連疾患を診断および／または治療するための使用に関する。
【０１２１】
従って、本発明は、Ｊａｂ１の全体または一部分と会合させた、任意でＫｉｐおよび／またはｃ−ＪｕｎもしくはＪｕｎＤおよび／またはＪＮＫおよび／またはＳＲＣ−１および／またはＬＦＡ−１および／またはＰＲおよび／またはＧＲと会合させたＭＩＦの全体または一部分を含んでなるタンパク質複合体、ならびに／あるいはＪａｂ１の全体または一部分と結合させた、任意でＫｉｐおよび／またはｃ−ＪｕｎもしくはＪｕｎＤと結合させたＭＩＦの全体または一部分を含んでなる融合タンパク質の、Ｊａｂ１関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用に関する。
【０１２２】
本発明はまた、本発明のタンパク質複合体および／または本発明の融合タンパク質の、Ｊａｂ１関連疾患の診断および／または治療のための使用に関する。
【０１２３】
本発明は、本発明のタンパク質複合体または融合タンパク質を特異的に認識する抗体もしくはそのフラグメント、またはＭＩＦに対する抗体もしくはそのフラグメントの、Ｊａｂ１関連疾患の診断および／または治療用の薬剤を調製するための使用に関する。
【０１２４】
本発明はまた、本発明のタンパク質複合体および／または融合タンパク質を特異的に認識する抗体もしくはそのフラグメント、またはＭＩＦに対する抗体もしくはそのフラグメントの、Ｊａｂ１関連疾患の診断および／または治療のための使用に関する。
【０１２５】
さらに、本発明はＭＩＦもしくはその一部またはＭＩＦをコードするヌクレオチド配列またはＭＩＦを特異的に認識する抗体を、薬学上有効な量で含んでなる薬剤に関する。
【０１２６】
さらなる好ましい実施形態を特許請求の範囲の従属項において例示する。
【０１２７】
配列番号１は、ＭＩＦ（５０−６５）のアミノ酸配列を記す。
【０１２８】
配列番号２は、Ｓｅｒ５７ Ｓｅｒ６０ ＭＩＦ（５０−６５）のアミノ酸配列を記す。
【０１２９】
以下の実施例を本発明をさらに説明するために提供するが、本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
【０１３０】
実施例１：
ツーハイブリッドシステムを使用する、ＭＩＦとＪａｂ１の相互作用の検出
実施例全体で使用した材料および方法
組換え体タンパク質、融合構築物、および抗体
組換え体ヒトＭＩＦは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から、Ｋｌｅｅｍａｎｎら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６１， ７５３ （１９９９）に記載の通り精製した。［３５Ｓ］放射標識を行うために、ヒトＭＩＦを、ＰＲＯ−ＭＩＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を補充した標準最小培地で増殖した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させ、そしてＢｅｒｎｈａｇｅｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３， １４１４４ （１９９４）においてｒＭＩＦについて記載された通り精製した。Ｊａｂ１の完全なコード配列は、Ｊｕｒｋａｔ細胞からＲＴ−ＰＣＲにより得て、そして二方向配列決定により確認した。Ｊａｂ１ ｃＤＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳およびトランスフェクション実験における発現用に、ｐＣｌ−ｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローニングした。ＴＮＦはＲ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから入手した。ＥＧＦＰ融合タンパク質：ｐＮ３−ＥＧＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＥＧＦＰをＭＩＦのＣ末端に融合させた。ミトコンドリアマーカーとしてのＰ３３−ＥＧＦＰは記載されている。ＰＫＣμ（ＫＤ）−ＥＧＦＰはサイトゾル局在化を示すものであり、それをそれぞれの対照として用いた。ウサギポリクローナル抗ｒＭＩＦ抗体はＢｅｒｎｈａｇｅｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３６５， ７５６ （１９９３）に記載の通り取得した。他の抗体は全てＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから入手した。
【０１３１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応
共役ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳反応は、ＴＮＴ Ｔ７迅速網状赤血球溶解物システム（Ｑｕｉｃｋ ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ−ｌｙｓａｔｅ ｓｙｓｔｅｍ）を超非放射性翻訳検出システム（Ｔｒａｎｓｃｅｎｄ ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）と組合せて実施した。Ｊａｂ１とｃ−Ｊｕｎの発現は、プラスミドｐＣｌ−ｎｅｏ−Ｊａｂｌ（上記を参照）およびｐＢＡＴ−ｃ−Ｊｕｎを用いて達成した。ビオチン標識したＪａｂ１およびｃ−Ｊｕｎの発現効率は、それぞれ抗Ｊａｂ１または抗ｃ−Ｊｕｎ抗体を用いる免疫ブロットにより、またはストレプトアビジン／西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート（Ｓ−ＨＲＰ）を用いる染色により確認した。
【０１３２】
タンパク質−タンパク質相互作用
ｒＭＩＦの固定は、Ａｆｆｉｇｅｌ １０ アガロース（ＢＩＯ−ＲＡＤ）上にｐＨ８．５で製造業者の推奨に従って実施した。対照ビーズは、Ｌ−グリシン、ｐＨ ８およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてブロックした。Ｊａｂ１とビーズの結合は、ｐＣｌ−ｎｅｏ−Ｊａｂｌを用いて４８時間かけて、一過性トランスフェクトした２９３Ｔ細胞（効率＞８０％）由来の溶解物中で分析した。細胞溶解（３０分間、氷上）は、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．７、０．４ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、３ｍＭ ＤＴＴ、および１×プロテイナーゼインヒビターカクテル（ＰＩ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中で行った。結合および洗浄は、ＮａＣｌを０．１Ｍに希釈したことを除いて、同一のバッファー中で実施した。可溶性ｒＭＩＦとＪａｂ１の結合については、ＴＮＴ網状赤血球溶解物にＢＳＡのｒＭＩＦ １μＭを補充し、ビオチン標識したＪａｂ１もしくはｃ−Ｊｕｎをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳により発現させ、反応物をＰＩを含有する燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に６倍希釈し、そして反応物を４℃で３時間回転させた。抗体を加え、反応物を１時間インキュベートし、免疫沈降物をプロテインＡ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させ（１時間、４℃）、そしてＰＢＳ中で洗浄し、次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ ８．０、１７０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、５０ｍＭ ＮａＦ中で洗浄した。免疫共沈したビオチン化タンパク質を免疫ブロットおよびＳ−ＨＲＰ染色により検出した。ビオチン化ＭＩＦ−ＥＧＦＰのＪａｂ１との免疫共沈のためには、ストレプトアビジンを結合した磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を使用し、複合体を上記の通り洗浄し、免疫ブロット後に、Ｊａｂ１を抗Ｊａｂ１抗体を用いて検出した。
【０１３３】
可溶性ｒＭＩＦとｉｎ ｖｉｔｒｏ合成したＪａｂ１との結合については、抗ＭＩＦ抗体（１００μｇ／ウエル）によりコートしたＥＬＩＳＡプレート中で溶解物を４℃にて１時間インキュベートして、ＴＮＴ溶解物の内因性ＭＩＦ（１０ｎＭと評価された）を枯渇させた。溶解物に、１μＭ ｒＭＩＦ、対照バッファー、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および発現させたビオチン標識Ｊａｂ１もしくはｃ−Ｊｕｎを補充した。反応物をプロテイナーゼインヒビターカクテル（ＰＩ）（Ｒｏｃｈｅ）を含有する燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に６倍希釈し、そしてそれを４℃で３時間回転した。複合体を抗体／プロテインＡ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により免疫沈降させ（それぞれ１時間、４℃）、そしてＰＢＳ中で洗浄し、次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ１、ｐＨ ８．０、１７０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、５０ｍＭ ＮａＦ中で洗浄した。免疫共沈したビオチン化タンパク質を免疫ブロットおよびＳ−ＨＲＰ染色によって検出した。
【０１３４】
内因性ＭＩＦと内因性Ｊａｂ１との相互作用を無処理２９３Ｔ細胞の溶解物について分析した。ＭＩＦ／Ｊａｂ１複合体を抗Ｊａｂ１を用いて沈降させ、比較には対照抗体またはプロテインＡセファロース単独を用い、そして抗ＭＩＦ抗体を用いて免疫ブロット分析をした。
【０１３５】
組織培養と一過性トランスフェクション
細胞系を推奨の標準法に従って培養した。全ての一過性トランスフェクションはスーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ， Ｑｉａｇｅｎ）を使って実施した。ｒＭＩＦとの共インキュベーションについては、ＭＩＦをプラスミド添加の２時間後に加えた。血清飢餓ＮＩＨ３Ｔ３細胞のトランスフェクションを報告（Ｔｏｍｏｄａら，１９９９）に従って実施した。
【０１３６】
内因性ＭＩＦタンパク質の発現量の低下した生細胞は、細胞をｐＢＫ／アンチセンスＭＩＦ発現ベクター（Ｗａｅｂｅｒら，１９９７）を用いてトランスフェクトすることによって得た。対照細胞は空のｐＢＫプラスミドを用いてトランスフェクトした。安定的にトランスフェクトされたクローンを単離した。対照細胞の５０％未満のＭＩＦ含量を発現する１つのクローン、ΔＡＳ ２．２３を使用した。
【０１３７】
生細胞またはＨｅｌａ細胞を、［３５Ｓ］ｒＭＩＦ、ＦＬＵＯＳ−ＭＩＦ、ビオチン−ＭＩＦ（それぞれ１μＭ）、または標識試薬単独とともに、１時間かけてインキュベートし、細胞を氷冷ＰＢＳおよび５０ｍＭグリシン、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ３中で洗浄し、そして標準方法による液体シンチレーションカウント、蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡用に調製した。［３５Ｓ］ｒＭＩＦ実験については、細胞を差異遠心により細胞小器官分画に分けて、サイトゾル画分をＰＤ１０ゲル濾過により分析した。共局在化実験については、Ｈｅｌａ細胞をトランスフェクトし（１μｇ ｐＭＩＦ−ＥＧＦＰ）、さらに細胞を２４時間インキュベートした。細胞を洗浄し、固定し、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて透過化し、そして５％ヤギ血清を用いてブロックした。Ｊａｂ１染色については、抗Ｊａｂ１抗体およびＡｌｅｘａ−５４６染色を使用した。サンプルを、Ａｌｅｘａ５４６、ＧＦＰ、およびＦＬＵＯＳ発光用のフィルターを使って共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）を用いて分析した。
【０１３８】
活性アッセイ
ＡＰ−１リポーター遺伝子活性は報告（Ｊｏｈａｎｎｅｓら，１９９８）に従って測定した。０．１５μｇのｐＣｌ−ｎｅｏ−Ｊａｂｌまたは空のプラスミド、ならびにそれぞれ０．０５μｇのＴｋ−ＬＵＣ−５×ｌ２−ｏ−テトラデカノールホルボールアセテート（ＴＲＥ）（Ａｎｇｅｌら，１９８７）、Ｒ１５−ＲＳＶ−ＬａｃＺレポーター構築物およびｐＥＧＦＰプラスミドを使用した。ｒＭＩＦとともにインキュベーションを１８時間実施した。２９３Ｔ細胞中のＮＦκＢリポーター遺伝子活性の測定を、ｒＭＩＦを加えて４０時間、記載の通り実施した（Ｊｏｈａｎｎｅｓら，１９９８）。生細胞のＮＦκＢアッセイを記載の通り実施した（Ｒｏｇｅｒら，１９９８）。ＪＮＫアッセイをｒＭＩＦを加えて４８時間、記載の通り実施した（Ｂｅｒｂｅｒｉｃｈら，１９９６）。ｐ２７Ｋｉｐ１誘導実験および増殖研究を、開示された方法（Ｔｏｍｏｄａら，１９９９）に従って実施した。ｐ２７Ｋｉｐ１のパルス−チェイス標識については、前記の方法（Ｔｏｍｏｄａら，１９９９）を適用し、７×１０５細胞／ウエルで播いた同調させた繊維芽細胞を用いて、１μＭ ｒＭＩＦをプレーティング時、パルス、およびチェイス期間に加えた。
【０１３９】
結果：
ＭＩＦとＪａｂ１との相互作用
ＭＩＦが細胞内タンパク質と相互作用することによる直接的な細胞内機能を有する可能性を試験するために、ツーハイブリッドスクリーニングを使用した。ｐＡＳ２−１ベクターを使い、ヒトＭＩＦの全コード領域をＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインにインフレームで融合した。得たベイトプラスミドｐＭＩＦ−ＢＤを用いて、ヒト胎児脳ライブラリーを、本質的には製造業者（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）の記載に従い、酵母ツーハイブリッド法によってスクリーニングした。ＭＩＦはオリゴマー化するが、ＭＩＦによる自己活性化は検出されなかった。Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ培地での選択および得たクローンのβ−ガラクトシダーゼ活性に対する試験の後、３つの陽性ＧＡＬ４ ＤＮＡ活性化ドメイン融合タンパク質を得た。液体培地におけるβ−ガラクトシダーゼアッセイの結果は、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）単位であり、独立クローンから得た７つの測定値の平均±ＳＤである。
【０１４０】
ＭＩＦは脳およびリンパ球にて多量に発現されるので、ヒト全脳およびリンパ球のｃＤＮＡライブラリーを用い、全長ヒトＭＩＦ ｃＤＮＡをベイトとして使用した。それぞれ３．５×１０６および３．０×１０６個のトランスフェクタントから、栄養選択およびβ−ガラクトシダーゼ活性について試験した場合に、特異的に相互作用するクローンを全部で４タイプ同定した。それらのクローンの１つは、ヒトｐ３８Ｊａｂ１のほとんど全体のコード配列（アミノ酸２０〜３３５に相当する）を有するｃＤＮＡインサートを含有した（同一性：対応するｐ３８Ｊａｂ１配列に対して＞９９％）。他の２つのクローンの全コード配列はヒトＭＩＦ ｃＤＮＡ配列と１００％同一であり、ＭＩＦ自体が結合してオリゴマーになったことが確認された。ＭＩＦは酵母ツーハイブリッドアッセイにおいてＪａｂ１と特異的に結合すると結論付けられた。
【０１４１】
図１は、ＭＩＦとＪａｂ１の相互作用を示す。ａ、ＭＩＦは酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて特異的にＪａｂ１と結合する。選択培地における、ＭＩＦとＪａｂ１を同時発現する形質転換体の増殖。ＭＩＦ−ＢＤはＧａｌ４−ＢＤ／ＭＩＦ融合構築物に対応し；Ｊａｂ１−ＡＤおよびＭＩＦ−ＡＤはスクリーニングから得たクローンを表す。Ｌａｍｉｎ−ＢＤ、Ｇａｌ４−ＢＤ、およびＧａｌ４−ＡＤは陰性対照であり、ｐ５３−ＢＤおよびＳＶ４０−ＡＤは陽性対照である。上パネルは、第１のＢＤクローンの形質転換；下パネルは、第１のＡＤクローンの形質転換。Ｌｅｕ＋Ｔｒｐ＋形質転換体を、ロイシンおよびトリプトファン（＋Ｈｉｓ）を含まないか、またはロイシン、トリプトファンおよびヒスチジン（−Ｈｉｓ）を含まない培地上にストリークした。液体培地アッセイにより定量すると、Ｊａｂｌ−ＡＤ／ＭＩＦ−ＢＤサンプルについてのβ−ガラクトシダーゼ活性は、ＧＡＬ４−ＡＤ／ＧＡＬ４−ＢＤについての０．１±０．１単位、ＧＡＬ４−ＡＤ／ＭＩＦ−ＢＤについての０．１±０．０４単位、およびＪＡＢ１ ＡＤ／ＧＡＬ４−ＢＤについての０．３±０．１単位と比較して、２．１±０．２β−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）単位であることがわかった。ＳＶ４０−ＡＤ／ｐ５３−ＢＤ陽性対照は９９±２５単位であった。液体培地のβ−ガラクトシダーゼアッセイの結果は、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）単位であり、独立クローンからの７つの測定値の平均±ＳＤである。ｂ、固定したＭＩＦはＪａｂ１と特異的に相互作用する。ストレプトアビジンビーズ上に固定したＭＩＦを、２９３Ｔ細胞中で過剰発現させたＪａｂ１と共にインキュベートし、プルダウンにより複合体を単離し、そして結合したＪａｂ１を抗Ｊａｂ１抗体／ＨＲＰ−ＥＣＬ染色を用いて免疫ブロットにより検出した。ｃ、内因性ＭＩＦと内因性Ｊａｂ１のｉｎ ｖｉｖｏ相互作用。ＭＩＦ陽性−対−ＭＩＦ陰性細胞の代謝標識および内因性ＭＩＦ／Ｊａｂ１複合体の抗ＭＩＦ抗体によるプルダウン。左パネルは、ＭＩＦ陽性ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞−対−ＭＩＦ陰性Ｋｙｍ−１細胞を［３５Ｓ］システイン／メチオニンを用いて標識し、ＭＩＦ含有複合体を抗ＭＩＦ−対−非免疫抗体を用いて免疫沈降して、結合した放射性タンパク質を電気泳動した。１４ Ｃ−放射標識した分子量マーカーを同時電気泳動した。繊維芽細胞（１×１０６細胞当量）はウェスタンブロットによりＭＩＦ陽性（０〜３のスケールでスコア３）であり、これはＥＬＩＳＡにより＞３００ｆｇ ＭＩＦ／細胞を含有すると測定された。Ｋｙｍ−１細胞はウェスタンブロットによりＭＩＦ陰性（スコア０）であり、ＥＬＩＳＡによる測定で７±５ｆｇ ＭＩＦ／細胞（平均±ＳＤ；ｎ＝３）を含有した。右パネルは、抗Ｊａｂ１および抗ＭＩＦ対照ウェスタンブロット。下のパネルの抗Ｊａｂ１ウェスタンブロットは、Ｋｙｍ−１およびＮＩＨ３Ｔ３細胞がほぼ等しい濃度の内因性Ｊａｂ１を含有することを示す。このウェスタン分析については、それぞれの細胞型について５×１０５細胞当量を電気泳動した。染色は抗Ｊａｂ１抗体／ＨＲＰ−ＥＣＬ化学発光を用いて実施した。
【０１４２】
実施例２
共沈降を使用する、ＭＩＦとＪａｂの相互作用の検出
ＭＩＦとｐ３８Ｊａｂ１の間の相互作用の特異性をｉｎ ｖｉｔｒｏ共沈降実験により確認した。精製した組換えヒトＭＩＦ（ｒＭＩＦ）をアガロースビーズ上に固定し、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞からクローニングして２９３ヒト胚性腎細胞中で過剰発現させた全長ｐ３８Ｊａｂ１との結合を評価した。ｐ３８Ｊａｂ１はＭＩＦビーズと強く結合したが、非官能化対照ビーズに対しては非特異的バックグラウンド結合しか観察されなかった。さらに、可溶性ｒＭＩＦはｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳されたビオチン標識ｐ３８Ｊａｂ１と特異的に結合し得たが、ビオチン標識ｃ−ＪｕｎはＭＩＦにより共沈降しなかった。逆に、ビオチン標識ＭＩＦ−増強緑色蛍光タンパク質（ＭＩＦ−ＥＧＦＰ）融合タンパク質はｐ３８Ｊａｂ１と結合した。
【０１４３】
ｐ３８Ｊａｂ１のかなりの部分が核およびサイトゾル中に見出され、このことはＭＩＦとの相互作用はこれらの区画の１つで起こりうることを示唆した。抗ＭＩＦ抗体およびＣｙ−２による内因性ＭＩＦの染色、ＨｅｌａおよびＣＯＳ−１細胞におけるＭＩＦ−ＥＧＦＰ融合タンパク質の一過性トランスフェクション、および他のＥＧＦＰ−連結マーカータンパク質による細胞小器官局在化の顕微鏡を用いた比較は、内因性ＭＩＦおよび過剰発現ＭＩＦ融合タンパク質が両方ともサイトゾルに優先的に存在することを示した。循環中の細胞外ＭＩＦは、ＭＩＦの多数の免疫学的機能にとって非常に重要であるので、細胞外ＭＩＦがサイトゾルを標的としているかどうかも試験した。リソソーム画分から回収しうるものだけでなく、外部から加えた［３５Ｓ］ｒＭＩＦも、有意な濃度でサイトゾルを標的としそこで数時間安定している。このことは、細胞横断的に作用をするＭＩＦが標的細胞に取り込まれた後にｐ３８Ｊａｂ１と相互作用しうることを示した。
【０１４４】
ＭＩＦとＪａｂ１の間のｉｎ ｖｉｔｒｏ特異的複合体形成はまた、両方のタンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系において発現させたときにも観察された。ビオチン標識したＭＩＦ−増強緑色蛍光タンパク質（ＭＩＦ−ＥＧＦＰ）融合タンパク質と非ビオチン化Ｊａｂ１の複合体が特異的に沈降することを実証した。さらに、ビオチン化ｒＭＩＦは、生２６４．７マクロファージまたはＨｅｌａ細胞に加えると、ｉｎ ｖｉｖｏで内因性Ｊａｂ１と結合した。この後者の知見も、細胞に外部から添加したＭＩＦがエンドサイトーシス後に内因性細胞内Ｊａｂ１と結合し得ることを示す。
【０１４５】
最後に、内因性パートナーのｉｎ ｖｉｖｏ相互作用を調べた。内因性Ｊａｂ１／ＭＩＦ複合体を無処理２９３Ｔ細胞から沈降した。ＭＩＦの特異的共沈降は、共沈降に抗Ｊａｂ１抗体を使用すると抗ＭＩＦウェスタンブロットにより検出されたが、対照抗体を使用すると検出されなかった。従って、ＭＩＦは、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのどちらにおいてもｐ３８Ｊａｂ１と特異的に結合する。
【０１４６】
図２はＭＩＦがＪａｂ１と特異的に相互作用することを示す。ａ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ相互作用。ｒＭＩＦとＴＮＴ溶解物にて発現されたビオチン−Ｊａｂ１との複合体をＭＩＦ特異的抗体により沈降し、ビオチン化タンパク質をウェスタンブロットにより検出した（左パネル）。右パネルは、発現対照。ｂ、固定したＭＩＦとＪａｂ１との相互作用。ストレプトアビジンビーズに固定したＴＮＴ翻訳ビオチン−ＭＩＦ−ＥＧＦＰまたは無標識の対照を、ＴＮＴ翻訳Ｊａｂ１とともにインキュベートし、複合体を単離し、免疫ブロットによりＪａｂ１を検出した。ｃ、ＭＩＦとＪａｂ１のｉｎ ｖｉｖｏ相互作用。内因性Ｊａｂ１／ＭＩＦ複合体を２９３Ｔ細胞溶解物から抗Ｊａｂ１抗体を用いて免疫沈降し、ＭＩＦを免疫ブロットにより検出した。抗ＴＮＦ抗体またはビーズ単独による沈降を対照とした。
【０１４７】
実施例３
ＡＰ−１依存性リポーター遺伝子活性のモジュレートを利用する、ＭＩＦとＪａｂの相互作用の検出
Ｊａｂ１の転写コアクチベーター機能はＡＰ−１転写活性の増加による。ＭＩＦがＪａｂ１との結合よりこの活性モジュレートし得るかどうかを試験した。コラゲナーゼＴＲＥルシフェラーゼレポーターを一過性発現する、２９３Ｔ細胞におけるＡＰ−１依存性リポーター遺伝子活性を測定した。
【０１４８】
ＭＩＦの効果を、５×ＴＲＥ−ルシフェラーゼレポーターを用いてトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のＡＰ−１依存性リポーター遺伝子活性を測定することにより評価した。組換え体ＭＩＦは、濃度に依存する様式でＴＮＦ−αが誘導するＡＰ−１依存性リポーター遺伝子活性を完全に停止させ、１μＭの濃度において、ｒＭＩＦの添加と一緒に細胞に一過性にコトランスフェクトした全長ｃＤＮＡであるｐ３８Ｊａｂ１が誘導するＡＰ−１依存性リポーター遺伝子活性の増強を完全に阻害した。ＭＩＦによるＡＰ−１活性の阻害は、ＭＩＦが媒介して変化させた細胞増殖の二次的効果ではなかった。トランスフェクトしたｃ−Ｊｕｎが不在のもとではｐ３８Ｊａｂ１による顕著な増強（２倍）が観察され、これは内因性ｃ−Ｊｕｎレベルはｐ３８Ｊａｂ１による増強が起こるのに十分であることを示した。ＭＩＦによる阻害は既に１ ｐＭで有意（約３０％）であり、１０ｎＭ〜１μＭのｒＭＩＦを適用すると完全であった。
【０１４９】
図３は、ＭＩＦが、刺激されたＡＰ−１活性を阻害することを示した。ａ、ＭＩＦは、２９３Ｔ細胞におけるＡＰ−１リポーター遺伝子活性のＪａｂ１媒介活性化を阻害する。ｐＣＩ−ｎｅｏ−Ｊａｂｌまたは対照ベクターを用いたトランスフェクションを、（−）ｒＭＩＦを用いた場合または用いない場合と比較した。ｂ、ＭＩＦはＴＮＦ誘導ＡＰ−１活性を阻害する。ａと同じであるが、Ｊａｂ１の代わりにＴＮＦ誘導による。ＰＭＡによる刺激を対照とした。データは、４つの測定値の平均±ＳＤを示し、３つの実験を表す。ｃ、ＭＩＦは、刺激されたＮＦκＢリポーター遺伝子活性を阻害しない。低下した内因性ＭＩＦ含量を有するアンチセンスＭＩＦマクロファージ（＋ａｓ−ＭＩＦ）からのＴＮＦ誘導ＮＦκＢを、対照細胞（＋対照）および非トランスフェクト細胞（−）の活性と比較した。３つの測定値の平均±ＳＤを示した。ＬＵＣは、相対ルシフェラーゼ活性。
【０１５０】
図４は、ＭＩＦが、Ｊａｂ１およびＵＶストレスによるＡＰ−１リポーター遺伝子（コラゲナーゼ５×１２−ｏ−テトラデカノールホルボールアセテート応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーター）活性の増強を阻害することを示す。２９３Ｔ細胞をレポータープラスミドを用いてトランスフェクトしかつ示されたようにｐＣｌ−ｎｅｏ−Ｊａｂｌまたは空の対照ベクターを用いてコトランスフェクトし、そして、示された濃度のｒＭＩＦまたはバッファー対照とともに１８時間インキュベートした。ａ、図３ａに対するウェスタンブロット対照実験であり、抗Ｊａｂ１−および抗ＧＦＰ−ウェスタンによるＪａｂ１過剰発現および対照ＥＧＦＰコトランスフェクションの分析を示す。コトランスフェクトしたＥＧＦＰ構築物（ｐＮ３−ＥＧＦＰ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をインキュベーション当たり０．０５μｇだけ加えた。さらに、インキュベーション終了時にＥＧＦＰ陽性細胞を計数した。この分析により判定したトランスフェクション効率は図３ａについて４５−５０％、図３ｂについて３５−４５％であった。このアッセイ条件下でのＭＩＦ自体の２９３Ｔ細胞増殖に対する効果は、追加の細胞計数を行って排除した。インキュベーション期間終了後のウエルは、２．３〜２．５×１０５細胞（図３ａ）および３．８〜４．１×１０４細胞（図３ｂ）を含有した。結果は相対ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）活性として表した。ｂ、ＭＩＦはＵＶストレス誘導ＡＰ−１転写活性を阻害する。図３ｂと同じであるが、ＴＮＦ処理の代わりにＵＶ光誘導（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ， ３．６Ｊｏｕｌｅ／ｃｍ２、２０分＋９０分）による。データは４つの測定値の平均±ＳＤを表す。ｃ、ＭＩＦは、刺激されたＮＦκＢ活性を妨害しない。組換え体ＭＩＦ（ｒＭＩＦ）は２９３Ｔ細胞におけるＴＮＦ誘導ＮＦκＢリポーター遺伝子活性を阻害しない。細胞をレポータープラスミドを用いてトランスフェクトし、ｒＭＩＦを用いて１μＭの濃度にてインキュベーション（４０時間）した。ＴＮＦを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えた（６時間）。結果は、相対ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）活性であり、３つの測定値の平均±ＳＤを表す。
【０１５１】
ＭＩＦはまた、ＴＮＦ−およびＵＶ−ストレス誘導ＡＰ−１転写活性も阻害する。外部から加えてもまたは内因性であっても、ＭＩＦはＮＦκＢ活性を妨害しない。組換えＭＩＦ（１μＭ）は、２９３Ｔ細胞中のＴＮＦ誘導ＮＦκＢリポーター遺伝子活性に影響を与えない。
【０１５２】
実施例４
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用する、ＭＩＦとＪａｂ１の相互作用の検出
ｐ３８Ｊａｂ１による転写コアクチベーター機能は、ｃ−ＪｕｎとＡＰ−１部位の結合の増強によるものである。従って、ＭＩＦは、ｐ３８Ｊａｂ１との結合によりこの活性をモジュレートしうると仮定した。ＤＮＡ結合に対するそのような効果は、ｐ３８Ｊａｂ１および／またはｃ−Ｊｕｎを用いてトランスフェクトしかつｒＭＩＦの存在または不在のもとでインキュベートした２９３細胞由来の核抽出物に対して、ｌ２−ｏ−テトラデカノールホルボールアセテート応答エレメント（ＴＲＥ）を用い、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を実施することにより、評価した。ｐ３８Ｊａｂ１はｃ−ＪｕｎとＴＲＥの結合を促進した。ＭＩＦをｐ３８Ｊａｂ１およびｃ−Ｊｕｎの両方を過剰発現する細胞と共にインキュベートすると、ｃ−ＪｕｎとＡＰ−１部位の結合に対するｐ３８Ｊａｂ１活性化効果の顕著な阻害（２倍）が見られた。対照的に、１つの転写因子だけを過剰発現させるかまたは１つも過剰発現させない場合、ＭＩＦが示す活性化効果は小さかったが、この効果はプログラムされた網状赤血球溶解物からのＥＭＳＡには見られなかった。テトラサイクリン制御トランスアクチベーター系を安定的に発現しかつヒトＭＩＦ ｃＤＮＡが安定してトランスフェクトされていてドキシサイクリン除去後に内因性ＭＩＦの５〜６倍超のＭＩＦタンパク質を過剰発現するようにした、ＨｅＬＡ Ｔｅｔ−オフ細胞系ＨｔＴＡの核抽出物から得たＥＭＳＡは、ＭＩＦがＡＰ−１依存性ＤＮＡシフトを顕著に阻害し得ることが確認された。ドキシサイクリンにより抑制したインキュベーションにおけるバンド強度は、内因性ＭＩＦの有意濃度（約１００ ｆｇ／細胞）により既にＤＮＡシフトが阻害されていることを表すと思われるので、恐らくこの系における阻害の程度はもっと顕著であろう。
【０１５３】
実施例５
ＭＩＦとｐ３８Ｊａｂ１は細胞シグナル伝達経路を調節する
ｐ３８Ｊａｂ１とＭＩＦがさらに広く細胞シグナル伝達経路に作用しうるかどうかを試験するため、直接転写制御の上流機構によるＡＰ−１活性の調節を研究した。ｐ３８Ｊａｂ１はＪＮＫ活性を調節しうると考えた。ｐ３８Ｊａｂ１を用いた２９３細胞の一過性トランスフェクションは、ＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ （１−７９）に対する免疫沈降キナーゼ活性がｐ３８Ｊａｂ１により顕著に刺激されることを明らかにした。ｐ３８Ｊａｂ１による増強は２−３倍であり、標準濃度のＴＮＦ−αを用いた刺激後のＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）のＮ末端リン酸化より強かった。ＭＩＦがこのｐ３８Ｊａｂ１介在効果も阻害するかどうかを研究した。組換え体ＭＩＦは、用量に依存する様式で、ｐ３８Ｊａｂ１によるＪＮＫ活性の増強を完全に逆転した。従って、組換え体ＭＩＦはＪａｂ１によるＪＮＫ活性の増強を逆転した。２００ｎＭ以上のＭＩＦは完全な阻害をもたらした。同様に、ＴＮＦ−α誘導ＪＮＫ活性は、ｒＭＩＦを用いた処理の後、基線レベルに抑制された。ＭＩＦ−ｐ３８Ｊａｂ１相互作用は、ＭＩＦが内因的に過剰発現されるか外因的に細胞に加えられるかに依ることなく、起こるに違いない。これは、ＭＩＦ−ＥＧＦＰを用いてまたはＥＧＦＰ単独でコトランスフェクトしておいた２９３細胞内でＴＮＦ−α誘導またはｐ３８Ｊａｂ１誘導ＪＮＫ活性を測定する一過性トランスフェクション実験により試験して実証された。外因的に加えたｒＭＩＦと同様に、内因的に過剰発現したＭＩＦはＴＮＦ−αおよびｐ３８Ｊａｂｌが介在するＪＮＫ活性化の両方を全て抑制した。
【０１５４】
図５はＪａｂ１がＪＮＫ活性およびホスホ−ｃ−Ｊｕｎレベルを増強し、ＭＩＦがこれらの効果を阻害することを示す。ａ、ｒＭＩＦはＪａｂ１が介在するＪＮＫ活性の増強を阻害する。左は、空ベクターおよびｒＭＩＦまたはバッファーを用いて処理したベクターに対する、ｐＣＩ−ｎｅｏ−Ｊａｂｌを用いてトランスフェクトした２９３Ｔ細胞からのＪＮＫ免疫沈降物によるＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）のリン酸化の比較である。相対活性はバンド強度を示す。対照はＴＮＦ誘導である。右は、左と同じであるが示したようにアンチセンスＪａｂ１プラスミドのコトランスフェクションである（対照、ＪＮＫレベルの免疫ブロット；トランスフェクション効率：４０−５０％；分散：±１０％；Ｊａｂ１によるＪＮＫの誘導：１．６倍±ＳＤ ０．０８；ｎ＝３）。ｂ、ＭＩＦによる、内因性ｃ−ＪｕｎのＪａｂ１誘導リン酸化の阻害。４ａにおけるインキュベーションと同じであるが、ホスホ−ｃ−Ｊｕｎの免疫ブロットを分析した。βアクチン免疫ブロットを対照にした。ｃ、ｂと同じであるが、ｃ−Ｊｕｎのリン酸化はＴＮＦまたはＵＶストレスにより誘導した。
【０１５５】
図６は、Ｊａｂ１およびＭＩＦによるＪＮＫの調節を示す。ａ、ＴＮＦ刺激ＪＮＫ活性のｒＭＩＦによる阻害。２９３Ｔ細胞をＦＬＡＧ標識ＪＮＫをコードするベクターを用いてトランスフェクトし、示したようにＴＮＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびｒＭＩＦまたはバッファー対照を用いて４８時間インキュベートした。ＪＮＫ免疫沈降物を用いてＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）をリン酸化し、ホスホイメージ走査によって相対バンド強度（相対活性化として示した）を評価した。対照ウェスタンブロットを抗ＦＬＡＧ抗体により分析した。分散は全体的に±１０％の範囲にあった。ｂ、Ｊａｂ１によるｃ−ＪｕｎビーズとＪＮＫの結合の増強、しかしＭＩＦによる妨害の不在。２９３Ｔ細胞由来の溶解物中で内因性ＪＮＫとＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）ビーズの結合に対するＪａｂ１過剰発現およびＭＩＦ共インキュベーションの影響を分析することによって、ｃ−ＪｕｎとＪＮＫの結合活性に対するＪａｂ１とＭＩＦの影響の可能性を研究した。細胞のＪａｂ１によるトランスフェクションは、対照−トランスフェクトした細胞と比較して、ＪＮＫとｃ−Ｊｕｎビーズの結合の増強をもたらした。ｒＭＩＦの添加はこのＪａｂ１効果に影響を与えなかった。２９３Ｔ細胞をＪａｂ１ベクターを用いて原稿の図４ａのようにトランスフェクトし、細胞溶解物をＧＳＨアガロースに結合したＧＳＴ−ｃ−Ｊｕｎ（１−７９）を用いてインキュベートした。溶出した複合体を、抗ＪＮＫ抗体を用いてｒＭＩＦの存在または不存在のもとでインキュベートし沈降し、結合したタンパク質を抗ＪＮＫ（内部対照）、抗ＧＳＴ、および抗ｃ−Ｊｕｎウェスタンブロットにより分析した。
【０１５６】
実施例６
ＭＩＦが非ＡＰ−１関連活性についてもＪａｂ１作用をネガティブに調節し得るかどうかを研究するため、Ｊａｂ１と結合してＪａｂ１により分解が起こる細胞周期インヒビターｐ２７Ｋｉｐ１に対するＭＩＦの影響を調べた。増殖中のＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の溶解物から調製した免疫ブロットにより示したように、ｐ２７Ｋｉｐ１レベルを抑制するＪａｂ１とは対照的に、ＭＩＦは用量に依存する様式でｐ２７Ｋｉｐ１レベルを誘導した。この誘導は、内因性Ｊａｂ１タンパク質をほぼ完全に抑制するアンチセンスＪａｂ１構築物を用いて細胞をトランスフェクトすると、ｐ２７Ｋｉｐ１レベルがＭＩＦに応答して上昇しないので、Ｊａｂ１依存性であった。ｐ２７Ｋｉｐ１はＧ１増殖停止を誘導し、Ｊａｂ１は血清飢餓繊維芽細胞を増殖停止から救うことができる。過剰発現したＭＩＦ−ＥＧＦＰまたは外因性ｒＭＩＦは、濃度に依存する様式で、Ｊａｂ１が誘導する繊維芽細胞の血清依存性低下および増殖繊維芽細胞の増殖の両方を阻害することが見出された。ＭＩＦは直接ｐ２７Ｋｉｐ１と結合せず、ｐ２７Ｋｉｐ１ ｍＲＮＡまたはタンパク質合成を刺激せず、かつＪａｂ１はプロテアソーム依存性ｐ２７Ｋｉｐ１分解を促進するので、ｐ２７Ｋｉｐ１分解の過程におけるＭＩＦの影響を分析した。ｐ２７Ｋｉｐ１レベルは、同調しパルス−チェイス標識した繊維芽細胞からの免疫沈降により測定すると、ｒＭＩＦを添加するとより高くなった。ｐ２７Ｋｉｐ１レベルに対するＭＩＦの安定化効果は、プロテアソームインヒビターＬＬｎＬの添加によりさらに増強されることはなかった。対照的に、ＭＩＦ単独によるｐ２７Ｋｉｐ１レベルの増強はＬＬｎＬ単独より顕著ですらあった。同時に、ＭＩＦの添加は、タンパク質合成ブロッカーの存在のもとでｐ２７Ｋｉｐ１レベルを若干増加した。免疫共沈降研究はＭＩＦがｐ２７Ｋｉｐ１／Ｊａｂ１複合体形成を部分的に妨害することを示したので、これらのデータは、ＭＩＦ介在効果はｐ２７Ｋｉｐ１介在増殖停止を反映しかつこの効果はｐ２７Ｋｉｐ１のＪａｂ１依存性分解の阻害を経由して起こることを示す。
【０１５７】
図７は、ＭＩＦがｐ２７Ｋｉｐ１タンパク質を安定化しかつＪａｂ１に依存した様式で繊維芽細胞増殖を阻害することを示す。ａ、ＭＩＦは繊維芽細胞におけるｐ２７Ｋｉｐ１発現を誘導する（ｐ２７Ｋｉｐ１免疫ブロットおよびｃ−Ｊｕｎ対照ブロット）。ｂ、ＭＩＦによるｐ２７Ｋｉｐ１誘導はＪａｂ１依存性である。左、ａと同じであるが、アンチセンスＪａｂ１または対照プラスミド（効率対照、ｐＥＧＦＰコトランスフェクション）の追加のトランスフェクション。右、アンチセンス構築物は繊維芽細胞中のＪａｂ１を低下させる。ｃ、ＭＩＦによる、繊維芽細胞のＪａｂ１介在血清依存性低下の阻害。ＧＦＰ発現細胞の増殖を、Ｊａｂ１−およびＭＩＦ−ＥＦＧＰ過剰発現−対−対照ベクター処理細胞についてＢｒｄＵ組み込みを経由して分析した。データは４測定値の平均±ＳＤである。ｄ、ＭＩＦはｐ２７Ｋｉｐ１のプロテアソームが介在する分解を阻害する。左、ＭＩＦはパルス−チェイス標識した繊維芽細胞中のｐ２７Ｋｉｐ１の分解を低下する。ｒＭＩＦ（＋）対バッファー処理細胞由来の免疫沈降物が示す［３５Ｓ］ｐ２７Ｋｉｐ１レベル。右、ＭＩＦ効果はプロテアソームと連結している。ａと同じであるが、インキュベーション後に、ＤＭＳＯ、シクロヘキシイミド（ＣＨＸ）、またはＬＬｎＬを用いて処理した。
【０１５８】
図８は、ＭＩＦによるｐ２７ Ｋｉｐ１誘導を示す。ａ、ノーザンブロットにより分析した、ｐ２７ Ｋｉｐ１ ｍＲＮＡレベルに対するｒＭＩＦの影響。１ｘ１０７ ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞を、（示した）ｒＭＩＦの存在または不存在のもとで４０時間インキュベートし、細胞を氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で溶解した。全細胞ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌプロトコルによって単離し、ＲＮＡを定量し、そして標準ノーザンブロット手順（Ｂｕｒｇｅｒ−Ｋｅｎｔｉｓｃｈｅｒら， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ． ５５， １４１７−１４２５， １９９９）に適用した。プローブをＰＣＲに基づくＤＩＧ標識法（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）により作製した。ＫｉｐプローブはマウスＫｉｐ１（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ０９９６８）の塩基８−１８１に対応し、ヒトＧＡＰＤＨプローブはＢｕｒｇｅｒ−Ｋｅｎｔｉｓｃｈｅｒらの記載に従った。トランスフェクションについては、細胞をプラスミドｐＪａｂ１およびｐＣｌｎｅｏを用いて５時間インキュベートし、１時間養生した後にｒＭＩＦを加えた。繊維芽細胞をインキュベートするのに用いたｒＭＩＦ濃度増加の有無とは関係なく、Ｋｉｐ ｍＲＮＡレベルは比較しうるレベルであることがわかった。ｐＪａｂ１ベクターの一過性トランスフェクションに続くＪａｂ１の過剰発現も、Ｋｉｐ ＲＮＡ生成に対するＭＩＦの刺激効果をもたらさなかった。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞においてＫｉｐのｍＲＮＡレベルを分析したときも、類似の結果を得た（Ｋｉｐ／ＧＡＰＤＨ比は次の通り：バッファー、１．０；１００ｎＭ ｒＭＩＦ、０． ８；１μＭ ｒＭＩＦ、０．７８）。ｂ、ｐ２７ Ｋｉｐ１タンパク質合成に対するｒＭＩＦの影響。４ｘ１０６ ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞を、１％ ＦＣＳを含有する培地中の一夜インキュベーションにより同調し、ｒＭＩＦ（１μＭ）または対照バッファーを加え、そして細胞をさらに３６時間インキュベートした。細胞をシステイン／メチオニンを含まない培地中で洗浄し、この培地で１５分間インキュベートし、そして放射能（ＰＲＯＭＩＸ， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を与えた。細胞を６０分間、標識の存在のもとでインキュベートし、洗浄し、そしてＫｉｐを抗Ｋｉｐ抗体を用いて免疫沈降した。サンプルを１３％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で電気泳動し、放射能をホスホイメージャーにより検出した。ｃ、繊維芽細胞中のＫｉｐ／Ｊａｂ１複合体形成に対する組換え体ＭＩＦの影響。ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞をいずれもＬＬｎＬを用いて４時間インキュベートした。ビオチン−Ｊａｂ１をＴＮＴ網状赤血球溶解物中に過剰発現させた。対照には、ＴＮＴ溶解物をｐＣｌｎｅｏ対照ベクターを用いてプログラムし、両方の溶解物からのアリコートを、示した繊維芽細胞溶解物に加えた。組換え体ＭＩＦ（１μＭ）または対照バッファーを加え、混合物を免疫共沈降条件のもとで２時間インキュベートした。複合体を抗Ｋｉｐ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いて沈降した。次に、ビオチン−Ｊａｂ１（上パネル）またはＫｉｐ１（対照、下パネル）のいずれかについて染色した免疫ブロットを実施して、Ｋｉｐ／Ｊａｂ複合体形���に対するＭＩＦの潜在的影響を評価した。
【０１５９】
実施例７
突然変異体分析と競合実験。
【０１６０】
Ｊａｂ１結合および調節にとって本質的であるこれらのＭＩＦの構造部分をさらに詳しく研究するために、突然変異体を作製した。１つの突然変異体は、野生型ＭＩＦ配列において位置６０のシステインがセリン残基により置換された突然変異体Ｃ６０ＳＭＩＦである。他の突然変異体は、野生型ＭＩＦの位置５０−６５に存在する１６個のアミノ酸残基からなる野生型ＭＩＦのペプチド断片であるＭＩＦ（５０−６５）である。
【０１６１】
突然変異体Ｓｅｒ５７Ｓｅｒ６０ＭＩＦ（５０−６５）は、位置５７でセリンがそして位置６０で他のセリンがその位置の野生型アミノ酸Ｃｙｓの代わりに挿入されたことを特徴とする野生型ＭＩＦの位置５０−６５における野生型アミノ酸残基からなる突然変異体を表す。上記のアミノ酸位置は、Ｋｌｅｅｍａｎら，図２，（１９９８ｂ）に記載の開示されたヒトＭＩＦ配列に関連づけて与えられており、ＭＩＦのアミノ酸配列およびその調製に関するこの開示内容は全て本発明の教示の開示に含まれる。
【０１６２】
突然変異Ｃ６０ＳＭＩＦは、明確な構造活性プロフィールを表す。この突然変異体は容易にフォールドして活性アッセイに利用することができるが、酵素オキシドレダクターゼおよびＭＩＦの免疫活性を欠く。Ｃ６０ＳＭＩＦは、ビオチン−Ｊａｂ１と結合できるが、ＴＮＴ誘導ＡＰ−１活性を阻害せず、Ｊａｂ１が誘導するｃ−Ｊｕｎ ＤＮＡ結合の増強を低下せず、そしてｐ２７Ｋｉｐ１が誘導する性質の低下を示すことがわかった。Ｃｙｓ６０の１６残基にまたがるＭＩＦペプチド、ＭＩＦ（５０−６５）およびＳｅｒ５７Ｓｅｒ６０ＭＩＦ（５０−６５）は、野生型ＭＩＦとＪａｂ１結合に対して強く競合し、この領域がＪａｂ１の結合および調節に関わることを共に示した。
【０１６３】
図９は、ＭＩＦとＪａｂ１の間の結合部位の特性決定を示す。Ｃｙｓ６０残基単独でなく、ＭＩＦ配列（５０−６５）がＭＩＦとＪａｂ１の間の相互作用に非常に重要である。ａ、突然変異体Ｃ６０ＳＭＩＦもＪａｂ１と結合しているかどうかを研究するために、ｒＣ６０ＳＭＩＦ（ｒ：組換え体）のビオチン標識Ｊａｂ１との結合をｒｗｔＭＩＦのそれと、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＴＮＴ網状赤血球溶解物中で比較した。抗ビオチンＳ−ＨＲＰウェスタンブロットを示した（左パネル）。ｒｗｔＭＩＦおよびｒＣ６０ＳＭＩＦの直接ウェスタンブロット分析は、免疫共沈降に用いた抗ＭＩＦ抗体が両方のタンパク質に対して比較しうる結合性質を示すことを実証した（右パネル）。ｂ、ＭＩＦペプチド（５０−６５）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＴＮＴ網状赤血球溶解物系において濃度に依存する様式で、野生型ＭＩＦとビオチン−Ｊａｂ１の結合に対して競合する。抗体Ｓ−ＨＲＰウェスタンブロットを示した。２つのＣｙｓ残基がＳｅｒに置換されたＭＩＦ（５０−６５）の類似体も試験し、これもＪａｂ１結合と競合し、ＣＡＬＣ Ｃｙｓ残基自身（ａ参照）はＪａｂ１の結合に対して重要でないことを確認した。ｃ、突然変異体Ｃ６０ＳＭＩＦ単独は、野生型ＭＩＦと比較して、ｐ２７ Ｋｉｐ１を誘導する性質の低下を示した。ｒＭＩＦまたは突然変異体Ｃ６０ＳＭＩ（２０ｎＭ）を用いてインキュベートしたＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞およびＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞の溶解物由来の抗Ｋｉｐ１ウェスタンブロットを示す。
【０１６４】
図１０は、繊維芽細胞の増殖停止に対するＭＩＦの影響を示す。ａ、繊維芽細胞の飢餓からのＪａｂ１介在救出に対する、外因的に加えたｒＭＩＦの影響。ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞をＪａｂ１または対照ベクターを用いてトランスフェクトし、ＥＧＦＰを用いてコトランスフェクトした。細胞を２時間血清飢餓させ、示した濃度でｒＭＩＦを加え、細胞をさらに３６時間飢餓させ、ＢｒｄＵを用いて１８時間インキュベートし、抗ＢｒｄＵ抗体を用いて染色した。ＧＦＰを発現する細胞だけを分析した。データは、４測定値の平均血清（それぞれ＞１５０細胞）を表し、３つの独立した実験を表す。外因的に加えたｒＭＩＦは用量に依存する様式でＪａｂ１効果を阻害した。１．８μｍ ｒＭＩＦを加えると、ＥＧＦＰ−ＭＩＦをトランスフェクトしたときと同じ程度の阻害を得た（≒８０％〜４０％の阻害；原稿を参照）。ｂ、繊維芽細胞の飢餓誘導増殖停止に対するｒＭＩＦの影響。セミコンフルエントのＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞を無血清培地中で２４時間同調した。培地を、さらなる添加物のないまたは示した濃度のｒＭＩＦを含有する０．５％ ＦＣＳに変えた。標識したチミジンの存在のもとで、インキュベーションを１６時間続けた。図１０は２つの独立した実験を表し、データは６測定値の平均±ＳＤを表す。ｃ、増殖中または血清飢餓繊維芽細胞の細胞増殖に対する抗ＭＩＦ抗体の影響。セミコンフルエント３Ｔ３細胞を無血清培地で２４時間同調した。培地を、さらなる添加なしのまたはポリクローナル抗ＭＩＦ抗体の２００μｇ／ｍｌもしくは対照としての無関係なウサギＩｇＧの２００μｇ／ｍｌを含有する、無血清（後者は示してない）または１０％ ＦＣＳ含有培地に変えた。インキュベーションを標識したチミジンの存在のもとで１６時間続けた。図１０は、抗ＭＩＦ ＩｇＧを１０％ ＦＣＳと組合せて使用した４つの実験の１つを示す。同調後にインキュベーションを無血清培地中で続けると、同様な結果を得た。ｄ、増殖中の繊維芽細胞の増殖に対する内因性過剰発現ＭＩＦの影響。ＮＩＨ ３Ｔ３繊維芽細胞を０．５％血清を含有する培地中での１８時間インキュベーションによって同調した。細胞を全血清培地条件に切り替え、Ｊａｂ１または対照ベクターとＥＧＦＰ−ＭＩＦまたはＥＧＦＰとを用いてトランスフェクトし、さらに４０時間インキュベートした。ＢｒｄＵ陽性細胞を前のように評価した。データは４測定値の平均±ＳＤを表し、３つの独立実験を表す。
【０１６５】
参考文献
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１１． Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ． ＆ Ｓｏｎｇ， Ｏ．「タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための新規遺伝子系（Ａ ｎｏｖｅｌ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｙｓｔｅｍ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ）」 Ｎａｔｕｒｅ ３４０， ２４５−２４６ （１９８９）．
１２． Ｂａｃｈｅｒ， Ｍ．ら「ラット脳におけるＭＩＦ発現−ニューロン機能に対する示唆（ＭＩＦ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ−ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｎｅｕｒｏｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）」 Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ４， ２１７−２３０ （１９９８）．
１３． Ｏｇａｔａ， Ａ． Ｎｉｓｈｉｈｉｒａ， Ｊ． Ｓｕｚｕｋｉ， Ｔ． Ｎａｇａｓｈｉｍａ， Ｋ． ＆ Ｔａｓｈｉｒｏ， Ｋ．「ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる、ラット脳の神経細胞におけるマクロファージ遊走阻止因子ｍＲＮＡ発現の同定（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｍＲＮＡ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｎｅｕｒａｌ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｂｒａｉｎ ｂｙ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」 Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ． ２４６， １７３−１７７ （１９９８）．
１４． Ｂｅｒｎｈａｇｅｎ， Ｊ．ら「マウスおよびヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）の精製、生物活性、および二次構造解析（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， ｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ， ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ （ＭＩＦ））」 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３， １４１４４−１４１５５ （１９９４）．
１５． Ｓｕｎ， Ｈ．， Ｂｅｒｎｈａｇｅｎ， Ｊ．， Ｂｕｃａｌａ， Ｒ． ＆ Ｌｏｌｉｓ， Ｅ．「ヒトマクロファージ遊走阻止因子の２．６Å解像における結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｔ ２．６Å ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）」 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３， ５１９１−５１９６ （１９９６）．
１６． Ｓｅｅｇｅｒ， Ｍ．ら「２６Ｓプロテアソームサブユニットと類似性を有する、シグナル伝達に関わる新規タンパク質複合体（Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ ｔｏ ２６Ｓ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｓｕｂｕｎｉｔｓ）」 ＦＡＳＥＢ Ｊ． １２， ４６９−４７８ （１９９８）．
１７． Ｈｏｆｍａｎｎ， Ｋ． ＆ Ｂｕｃｈｅｒ Ｐ．「ＰＣｌドメイン：３つの複数タンパク質複合体における共通テーマ（Ｔｈｅ ＰＣｌ ｄｏｍａｉｎ ： ａ ｃｏｍｍｏｎ ｔｈｅｍｅ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｍｕｌｔｉｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）」 Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２３， ２０４−２０５ （１９９８）．
１８． Ａｓａｎｏ， Ｋ．ら「ヒト真核生物開始因子の３サブユニットをコードするｃＤＮＡの構造（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃＤＮＡｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ３ ｓｕｂｕｎｉｔｓ）」 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２， ２７０４２−２７０５２ （１９９７）．
１９． Ｋａｒｉｎ， Ｍ．「マイトジェン活性化タンパク質キナーゼによるＡＰ−１活性の調節（Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＰ−１ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ）」 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０， １６４８３−１６４８６ （１９９５）．
２０． Ｈｉｒｏｔａ， Ｋ．ら「ＡＰ−１転写活性はチオレドキシンとＲｅｆ−１の間の直接結合により調節される（ＡＰ−１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ａ ｄｉｒｅｃｔ ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ ａｎｄ Ｒｅｆ−１）」 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４， ３６３３−３６３８ （１９９７）．
２１． Ｗｉｌｈｅｌｍ， Ｄ．， Ｂｅｎｄｅｒ， Ｋ．， Ｋｎｅｂｅｌ， Ａ． ＆ Ａｎｇｅｌ， Ｐ．「細胞内グルタチオンのレベルは、Ｊｕｎ Ｎ末端プロテインキナーゼおよびｐ３８キナーゼを含むストレス活性化シグナル伝達経路のアルキル化剤による誘導に対する重要因子である（Ｔｈｅ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｉｓ ａ ｋｅｘ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ａｎｄ ｐ３８ ｋｉｎａｓｅ ｂｙ ａｌｋｙｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）」 Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １７， ４７９２−４８００ （１９９７）．
２２． Ｌａｎａｔｈａｎ， Ａ．， Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｊ．Ｂ．， Ｓａｎｄｅｒｓ， Ｌ． Ｋ． ＆　Ｎａｔｈａｎｓ， Ｄ．「増殖因子が誘導する初期応答遺伝子の遅延（Ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｄｅｌａｙｅｄ ｅａｒｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｇｅｎｅｓ）」 Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １２， ３９１９−３９２９ （１９９２）．
２３． Ｗｉｓｔｏｗ， Ｇ．Ｊ．， Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ， Ｍ．Ｐ．， Ｌｅｅ， Ｄ．Ｃ．， Ｈｏｄｉｎ， Ｊ． ＆ Ｚｅｌｅｎｋａ， Ｐ．Ｓ．「マクロファージ遊走阻止因子は眼レンズの分化中の細胞に発現する（Ａ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｙｅ ｌｅｎｓ）」 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， １２７１−１２８０ （１９９３）．
２４． Ｓｃｈｅｉｎｍａｎ， Ｒ．Ｉ．， Ｃｏｇｓｗｅｌｌ， Ｐ．Ｃ．， Ｌｏｆｑｕｉｓｔ， Ａ．Ｋ． ＆ Ｂａｌｄｗｉｎ， Ａ．Ｓ．「グルココルチコイドが介在する免疫抑制における、ＩκＢαの転写活性化の役割（Ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＩκＢα ｉｎ ｍｅｄｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ）」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０， ２８３−２８９ （１９９５）．
２５． Ｍｉｔｃｈｅｌｌ， Ｒ． Ａ． Ｍｅｔｚ， Ｃ．Ｎ．， Ｐｅｎｇ， Ｔ． ＆ Ｂｕｃａｌａ， Ｒ．「マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）によるマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）および細胞質ホスホリパーゼＡ２活性化の持続。細胞増殖とグルココルチコイド作用における調節的役割（Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ （ＭＡＰＫ） ａｎｄ ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ａｃｔｉｖａｉｏｎ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ （ＭＩＦ）． Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ ａｃｔｉｏｎ）」 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４， １８１００−１８１０６ （１９９９）．
２６． Ｄｅｄｉｏ， Ｊ．， Ｊａｈｎｅｎ−Ｄｅｃｈｅｎｔ， Ｗ．， Ｂａｃｈｍａｎｎ， Ｍ． ＆ Ｍｕｌｌｅｒ−Ｅｓｔｅｒｌ， Ｗ．「マルチリガンド結合タンパク質ｇＣｌｑＲ、推定Ｃｌｑ受容体はミトコンドリアタンパク質である（Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇＣｌｑＲ， ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｃｌｑ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ｉｓ ａ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ）」 Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０， ３５３４−３５４２ （１９９８）．
２７． Ｊｏｈａｎｎｅｓ， Ｆ．Ｊ．ら，「腫瘍壊死因子誘導アポトーシスのプロテインキナーゼＣμダウンレギュレーションは核因子κＢ依存性保護遺伝子の発現の増強と相関がある（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃμ ｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ−ｎｅｃｒｏｓｉｓ−ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ−ｆａｃｔｏｒ−ｋａｐｐａＢ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｅｎｅｓ）」 Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２５７， ４７−５４ （１９９８）．
２８． Ａｎｇｅｌ， Ｐ．ら「ホルボールエステル誘導遺伝子はＴＰＡ調節性トランス活性化因子により認識される共通ｃｉｓ配列を含有する（Ｐｈｏｒｂｏｌ ｅｓｔｅｒ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｇｅｎｅｓ ｃｏｎｔａｉｎ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｃｉｓ ｅｌｅｍｅｎｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ａ ＴＰＡ−ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）」 Ｃｅｌｌ ４９， ７２９−７３６ （１９８７）．
２９． Ｂｅｒｂｅｒｉｃｈ， Ｉ．ら「Ｂ細胞上の架橋ＣＤ４０は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼよりもむしろストレス活性化プロテインキナーゼを優先して誘導する（Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ ＣＤ４０ ｏｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ｓｔｒｅｓｓ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ ｒａｔｈｅｒ ｔｈａｎ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅｓ）」 ＥＭＢＯ Ｊ． １５， ９２−１０１ （１９９６）．
３０． Ｒｏｇｅｒら「ＡＰ−１とＮＦκＢ活性の増加およびＩＬ−８ ｍＲＮＡの安定性の増加は、Ｈ２９２細胞によるＩＬ−８ ｍＲＮＡの超誘導に関係がある（Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ＡＰ−１ ａｎｄ ＮＦκＢ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ＩＬ−８ ｍＲＮＡ ａｒｅ ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ ｉｎ ｓｕｐｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−８ ｍＲＮＡ ｂｙ Ｈ２９２ ｃｅｌｌｓ）」 Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３３０， ４２９−４３５ （１９９８）
３１． Ｗａｅｂｅｒら「インスリン分泌は島β細胞ＭＩＦのグルコース依存性産生により調節される（Ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｇｌｕｃｏｓｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｌｅｔ ｂｅｔａ ｃｅｌｌ ＭＩＦ）」 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４， ４７８２−４７８７ （１９９７）
３２． Ｋｌｅｅｍａｎｎら「マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）とグルタチオンおよびジヒドロリポアミドによるインスリンジスルフィドの特異的還元：細胞酸化還元プロセスにおける潜在的役割（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅｓ ｂｙ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ （ＭＩＦ） ｗｉｔｈ ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ａｎｄ ｄｉｈｙｄｒｏｌｉｐｏａｍｉｄｅ ： ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｒｅｄｏｘ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）」 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４３０， １９１−１９６ （１９９８ ｂ）．
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１はＪａｂ１とＭＩＦの相互作用を示す。
【図２】
図２はＭＩＦが特異的にＪａｂ１と相互作用することを示す。
【図３】
図３はＭＩＦが刺激されたＡＰ−１活性を阻害することを示す。
【図４】
図４はＭＩＦがＪａｂ１およびＵＶストレスによるＡＰ−１レポーター遺伝子活性（コラゲナーゼ５ｘ１２−ｏ−テトラデカノールホルボールアセテート応答配列（ＴＲＥ）プロモーター）の増強を阻害することを示す。
【図５】
図５はＪａｂ１がＪＮＫ活性およびホスホ−ｃ−Ｊｕｎレベルを増加し、ＭＩＦがこれらの効果を阻害することを示す。
【図６】
図６はＪａｂ１とＭＩＦによるＪＮＫの調節を示す。
【図７】
図７はＭＩＦがｐ２７Ｋｉｐ１タンパク質を安定化しかつＪａｂ１に依存する様式で繊維芽細胞増殖を阻害することを示す。
【図８】
図８はＭＩＦによるｐ２７Ｋｉｐ１誘導の機構を示す。
【図９】
図９はＭＩＦとＪａｂ１との間の結合部位の特性決定を示す。
【図１０】
図１０は繊維芽細胞の増殖停止に対するＭＩＦの影響を示す。
【国際調査報告】
2004500807.tif 000133
2004500807.tif 000134