(57)【要約】本発明は、アルテリウィルスおよびこれらのウィルスによって引起こされる感染に対するワクチンの分野に関する。本発明は、第１アルテリウィルス由来の第１構造タンパク質および少なくとも一部は前記第１アルテリウィルス由来ではない第２構造タンパク質を少なくとも含むアルテリウィルス様粒子を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも、第１アルテリウィルス由来の第１構造タンパク質と、第２構造タンパク質であって、少なくとも一部は前記第１アルテリウィルス由来ではない第２構造タンパク質とを含むアルテリウィルス様粒子。
【請求項２】
前記第２構造タンパク質は、
少なくとも一部は第２アルテリウィルス由来であることを特徴とする請求項１記載のアルテリウィルス様粒子。
【請求項３】
前記第１および第２構造タンパク質は、
ヘテロダイマーを含むことを特徴とする請求項１または２記載のアルテリウィルス様粒子。
【請求項４】
前記第１および第２構造タンパク質は、
膜タンパク質（Ｍ）またはその一部を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のアルテリウィルス様粒子。
【請求項５】
前記第１および第２構造タンパク質は、
糖タンパク質（ＧＰ）またはその一部を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のアルテリウィルス様粒子。
【請求項６】
前記糖タンパク質は、
ＧＰ５を含むことを特徴とする請求項５記載のアルテリウィルス様粒子。
【請求項７】
前記第１構造タンパク質は、
ＧＰ５またはその一部を含み、
前記第２構造タンパク質は、
マトリックスタンパク質（Ｍ）またはその一部を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のアルテリウィルス様粒子。
【請求項８】
前記第１アルテリウィルスは、
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）を含むことを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のアルテリウィルス様粒子。
【請求項９】
前記第２アルテリウィルスは、
乳酸デヒドロゲナーゼ活性上昇ウィルス（ＬＤＶ）を含むことを特徴とする請求項２〜８のいずれかに記載のアルテリウィルス様粒子。
【請求項１０】
少なくとも、第１アルテリウィルス由来の第１構造タンパクと第２構造タンパクとをコードする核酸において、第２構造タンパクは少なくとも一部は第１アルテリウィルス由来ではなく、第１および第２構造タンパク質は、アルテリウィルス様粒子内に組み込むことができることを特徴とする核酸。
【請求項１１】
請求項１０記載の核酸を含む請求項１〜９のいずれかに記載のアルテリウィルス様粒子。
【請求項１２】
請求項１０記載の核酸を含む請求項１〜９および１１のいずれかに記載の粒子を含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１０記載の核酸を含む請求項１〜９および１１のいずれかに記載の粒子、または請求項１２記載の宿主細胞を含むワクチン。
【請求項１４】
弱毒化されたアルテリウィルスを得る方法において、第１アルテリウィルスに、少なくとも一部は前記第１アルテリウィルス由来ではない構造タンパク質を付与することを含む、弱毒化されたアルテリウィルスを得る方法。
【請求項１５】
前記構造タンパク質は、
少なくとも一部は第２アルテリウィルス由来であることを特徴とする請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記構造タンパク質は、
他の構造タンパク質とのヘテロダイマーを含むことを特徴とする請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
前記構造タンパク質の一つは、
膜タンパク質（Ｍ）またはその一部を含むことを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記構造タンパク質の一つは、
糖タンパク質（ＧＰ）またはその一部を含むことを特徴とする請求項１６または１７記載の方法。
【請求項１９】
前記糖タンパク質は、
ＧＰ５を含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記構造タンパク質の１つは、
ＧＰ５またはその一部を含み、
他の構造タンパク質は、
マトリックスタンパク質（Ｍ）またはその一部を含むことを特徴とする請求項１６〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記第１アルテリウィルスは、
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）を含むことを特徴とする請求項１４〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記第２アルテリウィルスは、
乳酸デヒドロゲナーゼ活性上昇ウィルス（ＬＤＶ）を含むことを特徴とする請求項１５〜２１のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アルテリウィルスおよびこれらのウィルスによって引起こされる感染に対するワクチンの分野に関する。
【０００２】
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ｐｏｒｃｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ；略称：ＰＲＲＳＶ）は、ウマ動脈炎ウィルス（ｅｑｕｉｎｅ ａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ；略称：ＥＡＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ活性上昇ウィルス（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｏｇｅｎａｓｅ−ｅｌａｖａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ；略称：ＬＤＶ）およびサル出血熱ウィルス（ｓｉｍｉａｎ ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ；略称：ＳＨＦＶ，１４）とともにアルテリウィルスのファミリーに属するプラス鎖ＲＮＡウィルスである。ＰＲＲＳＶは妊娠している雌ブタにおいて生殖不全を引起こし、ブタにおいて呼吸系の問題を引起こす（２０）。そのことは、全世界でブタの個体群における大きな経済的損失を引起こす。ＬＤＶまたはＳＨＦＶでの感染は研究室における実験動物の感染として非常に重要である。
【０００３】
これらのアルテリウィルス感染に対するワクチン接種は、扱いにくいことが多い。一般に死滅させたワクチンは多くの目的に充分効果的なものではなく、生きている弱毒化したアルテリウィルスワクチンは有用であるけれども、いくつかは安全ではなく、未だに感染することが示されている。さらに、これらのワクチンは野生型ウィルスと区別することができない。
【０００４】
アルテリウィルスゲノムの一例として、ＰＲＲＳＶゲノムは、長さが１５．１ｋｂであり、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂ）をコードする遺伝子および構造タンパク質（ＯＲＦ２〜ＯＲＦ７（１４）、（１１））をコードする遺伝子を含む。他のアルテリウィルスゲノムは、多少小さいけれども、同じゲノム構成を共有し、そのゲノム構成では全てが構造タンパク質をコードするサブゲノムメッセンジャーＲＮＡを合成する。
【０００５】
ＯＲＦ２、３および４は、それぞれＧＰ２、ＧＰ３およびＧＰ４を意味する糖タンパク質をコードする。ＯＲＦ５は、ＧＰ５を意味する主要なエンベロープ糖タンパク質をコードし、ＯＲＦ６は、膜タンパク質Ｍをコードし、ＯＲＦ７は、ヌクレオカプシドタンパク質Ｎをコードする。付加的な構造タンパク質（ＧＰ２ｂ）は、小さなＯＦＲ、ＯＲＦ２ｂによってコードされる。欧州および北アメリカのＰＲＲＳＶ単離物のゲノム配列分析およびモノクローナル抗体との反応性は、これらの大陸からの単離物は遺伝学的に識別され、比較的昔に共通の祖先から分岐したに違いないことを示している（１５）。
【０００６】
本発明は、少なくとも、第１アルテリウィルス由来の第１構造タンパク質と、第２構造タンパク質であって、少なくとも一部は前記第１アルテリウィルス由来ではない第２構造タンパク質とを含むアルテリウィルス様粒子を提供する。より好ましい実施の形態では、本発明は、少なくとも２つの異なるアルテリウィルスから生ずる部分で構成されるキメラアルテリウィルスを提供する。前記部分は、前記異なるアルテリウィルスから生ずる遺伝子（またはその一部）によってコードされ、それは好ましくはお互いに少なくとも部分的に交換され、置換される。（（ｄｅ Ｖｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｖｉｒｏｌ．２７０：８４−９７で発表されたように）置換は、第２構造タンパク質のほんの少しの添加も含まないことに注目する。この論文では、非アルテリウィルスタンパク質断片をコードする核酸の伸長部分はアルテリウィルスの完全ゲノムにおいて挿入され、それによってここで提供されるような一部の交換をすることなく前記ゲノムを伸ばす。）本発明のさらに好ましい実施の形態では、提供されるような前記キメラアルテリウィルスは、構成しているアルテリウィルスの明確な特性を示す。
【０００７】
第１アルテリウィルス由来ではない前記第２部分は、たとえば完全に、しかし好ましくは部分的にのみ人工のまたは合成配列を含むことが可能である。この配列はここで示す前記第１構造タンパク質と機能的に二量体化させる軸部における明確な長さのアミノ酸の伸長部分をコードし、それによってヘテロ二量体化させる。ヘテロダイマーは、二つの異なる相互作用性ペプチド鎖の構成物である。その相互作用はたとえばファンデルワールス力または共有ジスルフィド結合の両方から成りうるけれども、これに限定されるものではない。好ましくは二つの糖タンパク質または１つの糖タンパク質とマトリックスまたは膜タンパク質との前記ヘテロ二量体化は、結果として生じるキメラウィルス粒子の構造的な完全性を強め、それによってその粒子における免疫学的に重要なドメインをより好ましく存在させ、より好ましいワクチン成分を作製する。
【０００８】
ヘテロ二量体化に関連する前記部分が構造タンパク質であるはずだ（非構造タンパク質は粒子の一部ではない）ということを除いて、このように前記第１アルテリウィルス由来ではない部分は、少なくともたとえば機能的に二量体化させるような、前記第２アルテリウィルスとの適度な相同性を有することが好ましい。ヘテロ二量体化のさらなる適切な条件は、一般的に核タンパク質（Ｎ）は含まれるべきではないことである。ＥＰ０８３９９１２に示されるように核タンパク質の粒子は、その現象に貢献しない。しかしながら、組換えウィルスが（第１アルテリウィルスの（ウィルス性ポリメラーゼのようなオープンリーディングフレーム１ａ、１ｂをコードする遺伝子由来の）非構造タンパク質と、第２アルテリウィルスの（オープンリーディングフレーム２〜７をコードする遺伝子由来の）構造タンパク質との組合せからなることが記載されるＷＯ９８／５５６２６に示されるように、ここで提供されるようなそのような粒子は、たとえばアルテリウィルスの感染性ｃＤＮＡクローンに基づくことが可能である（１３、ＥＰ０８３９９１２）。感染性クローンは、位置指定突然変異誘発に対する優れた道具であり、アルテリウィルスに対する新しい生ワクチンを構築することを目的とするプロジェクトにとって重要である。ここで我々は、たとえばゲノムの突然変異誘発によっていわゆるマーカーワクチンを提供し、そのため、たとえばＰＲＲＳＶの場合はワクチン接種された（すなわちここで提供されるワクチンでワクチン接種された）ブタは、血清中抗体における違いに基づいて野生ウィルスに感染したブタと見分けるまたは区別することができ、逆もまた血清中抗体における違いに基づいて見分けるまたは区別することができる。そのような区別は、前記第２構造タンパク質が少なくとも部分的に前記第１アルテリウィルス由来でない場合に特にうまく成すことができ、前記人工の、合成または異種構造の部分に対する抗体はこのように検出することができ、または二者択一的にワクチン接種された動物が、相同の現在欠損している構造タンパク質またはその一部に対する抗体の欠如による診断テストにおいて検出可能である。ヌクレオカプシド（Ｎ）に対する抗体はしばしば過剰であるので前記第２構造タンパク質はヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質であるということが好ましく、このことは特に自然の感染において感染した動物以外で未ワクチン接種の動物からワクチン接種された動物を区別することを可能にする。特に本発明は、前記第２構造タンパク質は少なくとも部分的に第２アルテリウィルス由来であり、または少なくとも前記第２アルテリウィルスとある相同性（たとえば＞５０％）を有する粒子を提供する。またここで提供される粒子は、相互アルテリウィルスまたは相互アルテリウィルス様キメラ粒子と呼ばれ、たとえば非アルテリウィルス病原体またはその抗原をコードするアルテリウィルス由来ではない核酸における伸長部分を当然含むことができる。特にそのような粒子は、たとえば２つのシステインの間でジスルフィド結合によって結合されて、前記第１および第２構造タンパク質がヘテロダイマーを構成することにおいて有用である。本発明によれば、前記第１および第２構造タンパク質が完全な膜タンパク質（Ｍ）またはその部分を構成する粒子が最も好ましい。
【０００９】
Ｍタンパク質（１８ｋＤａ）は、非グリコシル化タンパク質であり、アルテリウィルスの最も保存された構造タンパク質である。ＰＲＲＳＶに対して、そのトポロジーおよび膜関連性機能は最初にＭｅｕｌｅｎｂｅｒｇらによって提案されている（１４）。タンパク質のＮ末端半分は３つの潜在性膜間領域を有することが提案され、Ｎ末端はエクトドメイン部分を含み、Ｃ末端はエンドドメイン部分を含む。１６アミノ酸の伸長部分はビリオン表面で暴露される。ＬＤＶに対して、Ｍタンパク質はクラスＩＩＩ膜タンパク質として同定されてきた（５）。Ｍタンパク質はウィルス集合および出芽において重要な役割を果たすことが仮定されている。ＥＲにおいては、それはＯＲＦ５によってコードされる主要な糖タンパク質ＧＲ５（２５〜４２ｋＤａ）とジスルフィド結合性ヘテロダイマーを形成する（３、４、１０）。さらに、ジスルフィド結合性Ｍタンパク質ヘテロダイマーが形成される。しかしながらそれらは一般的にビリオンへ組込まれないと考えられる。
【００１０】
他の実施の形態では、本発明は、ＧＰ２、ＧＰ２ｂ、ＧＰ３、ＧＰ４または好ましくはＧＰ５のような糖タンパク質（ＧＰ）またはその一部を構成する前記第１または第２構造タンパク質を含む粒子を提供する。ＧＰ５は、アルテリウィルスの主要な糖タンパク質であり、クラスＩ糖タンパク質であることが仮定されている（５）。それはシグナルペプチドを含み、プロセッシング後、タンパク質は、短いＮ末端エクトドメイン、３回膜貫通型セグメントおよびＣ末端エンドドメインからなる。さらにエクトドメインは、Ｎ−グリコシル化部位を含む（１２）。最近、ＬＤＶの主要な中和エピトープは、ＯＲＦ５糖タンパク質の推定されるエクトドメイン（３０ａａ）に位置づけられている（８）。またＥＡＶに対しては、ＬＤＶよりも多少大きいＧＰ５のエクトドメインが中和エピトープを含む。
【００１１】
Ｍタンパク質の短いＮ末端エクトドメインにおけるシステイン残基は、ＯＲＦ５によってコードされる糖タンパク質のエクトドメインにおけるシステイン残基との分子間ジスルフィド結合の形成に関与し、それによってヘテロダイマーが提供されるので、本発明は、前記第１構造タンパク質がＧＰ５またはその一部を構成し、前記第２構造タンパク質が膜タンパク質（Ｍ）またはその一部を構成する未変性に近いキメラ粒子を提供する。好ましくは、本発明は、ＰＲＲＳに対するワクチンの産生のためのＰＲＲＳＶ様粒子を提供する。このように本発明は、前記第１アルテリウィルスがブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）を含む粒子を提供する。詳細な説明において、本発明に従えば、前記第２アルテリウィルスが乳酸デヒドロゲナーゼ活性上昇ウィルス（ＬＤＶ）を含む粒子が提供されるが、ヘテロダイマーがたとえばジスルフィド結合形成によって安定することができる限りは、ＧＰ５、またはその一部、好ましくは前述の同定されたエクトドメインがＬＤＶ由来であり、Ｍ、またはその一部、好ましくは前述の同定されたエクトドメインがＰＲＲＳＶ由来であるという点においては変更可能である。もちろん、他のアルテリウィルスは、ここで説明したように第１および／または第２アルテリウィルスとして使用することができる。それによって前記第２アルテリウィルスは、前記第１アルテリウィルスの同じ属であり得るが前記第１アルテリウィルスの他の菌株または抗原型であり得る。ＰＲＲＳＶに対して、Ｍタンパク質とＧＰ５タンパク質との間のジスルフィド結合が形成されることが示されている（１０）。ＬＤＶに対しては、ジスルフィド結合を阻止するために５〜１０ｍＭＤＴＴ処理後ビリオンがその感染性を失う（４）。ＥＡＶに対しては、同じ結果が得られた（３）。
【００１２】
また本発明は、少なくとも、第１アルテリウィルス由来の第１構造タンパクと第２構造タンパクとをコードする核酸において、第２構造タンパクは少なくとも一部は第１アルテリウィルス由来ではなく、第１および第２構造タンパク質は、アルテリウィルス様粒子内に組み込むことができることを特徴とする核酸を提供する。前記第１および第２構造タンパク質は、アルテリウィルス様粒子において結合される。本発明によれば、ここで提供されるようなそのような核酸またはその転写物は、ＢＨＫ−２１細胞またはマクロファージのような宿主細胞おける粒子の産生を可能にする。また、本発明に従う核酸が付与された本発明に従う粒子も提供される。キメラ粒子でのマクロファージ感染が示されているたとえば表２および３を参照。
【００１３】
本発明は、発明に従った、かかる粒子、核酸、宿主細胞を含むワクチンを提供する。ワクチン開発のために、本発明は、ウィルスを弱毒化する方法を提供し、その完成型の１つはウィルスの感染性を減少させる。特に、少なくとも部分的には前記第１アルテリウィルス由来でない構造タンパク質とともに第１アルテリウィルスを含む弱毒化したアルテリウィルス（ワクチン）を得る方法を提供する。好ましくは、必要ではないけれども、前述したように他の構造タンパク質とともにヘテロダイマーを構成する前記構造タンパク質が少なくとも部分的には第２アルテリウィルス由来である方法である。前記構造タンパク質の１つが膜タンパク質（Ｍ）またはその一部分を含む場合、そのような二量体化は特に有用である。少なくともそのような場合は、前記構造タンパク質の他の１つがＧＰ５またはその一部分のような糖タンパク質を含む。
【００１４】
このことは、Ｍタンパク質とＧＰ５タンパク質との間の相互作用の安定性を減少させることによって成される。特に、感染性のウィルスはこのシステインを欠損した変異体から産生されないので、アルテリウィルスのＭタンパク質のエクトドメインの（ＰＲＲＳＶにおいてポジション８での、図１参照）第１システイン残基はウィルスのライフサイクルにとって必須であるということを我々は決定づけた。この残基は、Ｍタンパク質とＧＰ５タンパク質とのジスルフィド結合にとって必須であり、これらの２つの構造タンパク質は、たとえば受容体とのウィルスの相互作用による適切なウィルス集合またはウィルスのエントリーのいずれかにとって必須である。そのため、Ｍタンパク質のエクトドメインのポジション８（またはＰＲＲＳＶに対してここで示されたポジションに関して類似のポジション）のシステイン残基は、完全な感染性を維持するために必須であることを我々は示した。この目的のために、我々はＰＲＲＳＶの感染性ｃＤＮＡクローンを用いることによって、セリン残基によってシステイン残基を置換し、第２に我々はこの残基を消去した（１３）。これらのいわゆる突然変異体完全長ｃＤＮＡ構成物のＲＮＡ転写物は、ＢＨＫ−２１細胞へのトランスフェクションの後、ウィルスタンパク質を発現する能力および感染性ウィルスを産生する能力を試験された。さらに、Ｍタンパク質のエクトドメインのいくつかの他の突然変異体は、関連するアルテリウィルスであるＬＤＶのエクトドメインによるＬＶのエクトドメインの交換を含んでＬＶの感染性ｃＤＮＡクローンにおいて導入される（図１）。たとえば表２および３から見ることができるように、野生型または親の粒子は、抗体との反応性の明確なパターンを比較することによってキメラ粒子を区別することができる。同様に野生のウィルスで感染した動物は、反応性のそのような明確なパターンを利用する診断試験で区別することができるそのようなキメラ粒子でワクチン接種された動物と区別することができる。そのような診断テストのための適当な抗原は、ワクチンにおいて存在しないまたは部分的にのみ存在する野生型ウィルスの抗原部分であろう。詳細な説明において記載されるワクチンに対して、Ｍのエクトドメインの１６〜１８アミノ酸伸長部分またはその抗原部分をＭａｂｓ１２６．３または１２６．４のような類似の特異性を有する抗体と組合せて利用することができる。このように本発明は、たとえば、常套的な選別およびコントロール手段を適用して、野生型アルテリウィルスで感染させた動物とワクチン接種された動物を区別する抗体の存在、不存在に関する本発明に従うワクチンを接種された動物の検体（たとえば血液検体）を試験することを含む、動物の集団におけるアルテリウィルス感染のコントロールまたは根絶のための方法を提供する。
【００１５】
さらに本発明を詳細な説明において説明するが、これは発明を限定するものではない。
【００１６】
（詳細な説明）
（材料および方法）
（細胞およびウィルス）
ＢＨＫ−２１細胞は、５％ＦＢＳ、１０％トリプトースフォスフェートブロス（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）、２０ｍＭＨｅｐｅｓ　ｐＨ７．４（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）、２００ｍＭグルタミン、１０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンで満たされた（ＢＨＫ−２１培地（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）で生育させた。ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭｓ）は、１０％ＦＢＳ、１００μｇ／ｍｌカナマイシン、５０Ｕ／ｍｌペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＭＣＡ−ＲＰＭＩ−１６４０培地で維持された。ウィルス群は、ＰＡＭｓに関しトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞の培養液上清において分泌された組換えＬＶウィルスの連続的な継代によって産生される。（ｍｌあたり５０％の組織培養感染価［ＴＣＩＤ５０］として表現される）ウィルス力価は、終末点希釈度を用いてＰＡＭｓに関して決定された（１９）。
【００１７】
（ＰＲＲＳＶのＭタンパク質のエクトドメインにおける突然変異の構築）
ＰＣＲ突然変異誘発は、ＬＶ（ｐＡＢＬ４３７）のゲノム長ｃＤＮＡクローンのＰａｃＩ突然変異体におけるＭタンパク質のエクトドメインのアミノ酸を突然変異させるために用いられる（１３）。プライマーは、表１に列挙する。ＰＣＲ断片は、ＳｔｕＩおよびＨｐａｌで消化され、ＰＲＲＳＶの構造タンパク質をコードする領域を含むｐＡＢＶ６５１、ｐＡＢＶ４３７のサブクローンのこれらの部位と連結される。一般的なクローニング方法は、本質的に（１７）に記載されるように行われる。形質転換の条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによって記載されたように利用される（１７）。配列分析は、挿入突然変異を確認するために行われた。正しい挿入を含むクローンは、ＡａｔＩＩおよびＨｐａＩで消化され、ｐＡＢＶ４３７の適切な部位に連結された。第１に、Ｍタンパク質のエクトドメインにおけるポジション８のシステイン残基は、プライマーＬＶ２１７およびＬＶ９３を用いたＰＣＲ突然変異誘発によってセリン残基で置換された。結果としてｐＡＢＶ７０２のサブクローンおよびｐＡＢＶ７０５の完全長ｃＤＮＡクローンが生じた。さらに、このシステイン残基は、プライマーＬＶ２２７およびＬＶ９３を用いたＰＣＲ指定突然変異誘発によってＭのエクトドメインから消去された。これにより、ｐＡＢＶ７０３のサブクローンおよびｐＡＢＶ７０６の完全長ｃＤＮＡクローンが生じた。第２にＭタンパク質の完全なエクトドメイン（アミノ酸１〜１６）は、プライマーＬＶ２１８およびＬＶ９３を用いてＬＤＶのエクトドメインによって置換された。設計されたクローンは、ｐＡＢＶ７０４（サブクローン）およびｐＡＢＶ７０７（完全長ｃＤＮＡクローン）と名付けた。第３に、フォワードのプライマーとしてＬＶ２１９からＬＶ２２６，リバースのプライマーとしてＬＶ９３を用いてＯＲＦ６のエクトドメインにおけるいくつかの他のアミノ酸の置換および消去が生じ、結果としてｐＡＢＶ７３２からｐＡＢＶ７３６までのサブクローンおよびｐＡＢＶ７３７からｐＡＢＶ７４３までの完全長ｃＤＮＡクローンが得られた。
【００１８】
（配列分析）
ＰＣＲ産物から生じるサブクローンの領域は、ヌクレオチド配列によって分析される。配列は、ＰＲＩＳＭレディダイデオキシターミネーターサイクル配列決定キット（ＰＲＩＳＭ Ｒｅａｄｙ Ｄｙｅ Ｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ）およびＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３１０遺伝子分析機（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で決定された。
【００１９】
（ＢＨＫ−２１細胞のインビトロでの転写およびトランスフェクション）
構築された完全長ゲノムｃＤＮＡクローンおよびその派生物は、ＰｖｕＩで線状にされ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによってインビトロで転写された（９）。ＢＨＫ−２１細胞は、前述したようなエレクトロポレーションによって生じるＲＮＡでトランスフェクトされた（１３）。培地はトランスフェクション後２４時間で回収され、ＢＨＫ−２１細胞はＰＢＳで洗浄し乾燥させてＩＰＭＡが行われるまで−２０℃で貯蔵された。
【００２０】
（ＰＡＭｓの感染）
感染性ウィルスを援助するために、ＢＨＫ−２１細胞の培養液上清がトランスフェクション後２４時間回収され、ＰＡＭｓを接種するため用いられた。一時間後接種物は取除かれ、新しい培養培地が加えられた。感染後およそ２４時間で培養液上清は回収され、ＰＡＭｓはＰＢＳで洗浄、乾燥されて、イムノペルオキシダーゼ単層分析が行われるまで−２０℃で保存した。
【００２１】
（イムノペルオキシダーゼ単層分析（ｉｍｍｕｎｏ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ａｓｓａｙ；略称：ＩＰＭＡ））
一過性の発現および感染性ウィルスをそれぞれ決定するため、ＢＨＫ−２１細胞およびＰＡＭｓの免疫染色がＷｅｎｓｖｏｏｒｔらによって記載された方法（１９）によって行われた。Ｍタンパク質の未知の抗原部位に対するモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；略称：ＭＡｂｓ）（１２６．３、１２６．４、１２２．９、１２６．１２、１２６．６（１８））のパネルは、Ｍタンパク質発現の研究およびそこでの抗原部位の存在の研究に用いられた。（ＧＰ３、ＧＰ４およびＮタンパク質それぞれに対する）ＭＡｂｓ１２２．１４、１２２．１および１２２．１７（１８）は、他のＰＲＲＳＶタンパク質発現の検出に用いられた。
【００２２】
（組換えＲＮＡ転写物の非感染性ウィルス産生の分析）
トランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞の培養液上清から、完全長ｃＤＮＡ組換え体が非感染性ウィルスまたはウィルス様粒子へ納められるか否かを決定するためにウィルスのＲＮＡが単離された。５００μｌのプロテイナーゼＫバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ドデシル硫酸ナトリウム）および０．２ｍｇプロテイナーゼＫが５００μｌの上清に加えられた。３７℃で３０分放置後、ＲＮＡがフェノール−クロロホルムで抽出され、エタノールで沈殿させた。ＲＮＡは、プライマーＬＶ７６で逆転写された。それから突然変異が導入された領域から成る断片を増幅させるためプライマーＬＶ３５およびＬＶ７を用いてＰＣＲが行われた。配列分析は、ｃＤＮＡクローンに導入された突然変異がまた単離されたウィルスＲＮＡにおいても存在するか否かを決定するため行われた。
【００２３】
（放射性免疫沈降（ｒａｄｉｏ ｉｍｍｕｎｏ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；略称：ＲＩＰ））
ＧＰ５およびＭタンパク質の発現は、トランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞の代謝性標識によって分析され、続いて、本質的にはＭｅｕｌｅｎｂｅｒｇらが記載したように（Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ、１９９６＃１０）ＧＰ５またはＭタンパク質それぞれに対してペプチド血清またはＭＡｂｓを用いて免疫沈降させる。さらに、両タンパク質の共沈降は非減少条件下で細胞を溶解させることによって研究された。検体は、１４％変性アクリルアミドゲルを用いてドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；略称：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析された。
【００２４】
（結果）
ＧＰ５のエクトドメインとＰＲＲＳＶのＭタンパク質とのジスルフィド結合がウィルス感染に必須であるか否かを試験するために、我々はＭタンパク質のポジション８のアミノ酸残基（１０）をセリン残基によって置換した。さらに、このシステイン残基は、Ｍタンパク質のエクトドメインから欠失された。続いてシステイン置換および欠失突然変異は、ＰＲＲＳＶのレリスタッドウィルス単離物の感染性クローンｐＡＢＶ４３７において導入され、結果としてプラスミドｐＡＢＶ７０５（Ｃ−＞Ｓ）およびｐＡＢＶ７０６（Ｃ−＞欠失）を生じた。これらの完全長ｃＤＮＡクローンのＲＮＡ転写物は、ＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクトされ、ウィルスタンパク質の発現が試験された。両方の場合において、細胞はＧＰ３、ＧＰ４およびＮ特異性ＭＡｂｓでＩＰＭＡにおいて陽性に染色された（表２）。さらに、Ｍタンパク質に対するＭＡｂｓ１２６．１２は、陽性染色を生じた。Ｍタンパク質に対する２つの他のＭＡｂｓ１２６．３、１２６．４は、ｐＡＢＶ７０５由来の転写物でトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞を染色した。しかしｐＡＢＶ７０６由来の転写物でトランスフェクトされた細胞は染色しなかった（表２）。このことは、ＭＡｂｓがＭタンパク質のエクトドメインに対してのものであり、または少なくとも前記ドメインを含む１８アミノ酸のいくつかを含む単数または複数のペプチド断片に対してのものであることを示した。トランスフェクトされた細胞の上清は、感染性ウィルスを援助するためＰＡＭｓへの感染に使用された。しかしながら、感染後２４時間でＰＡＭＳに関していずれのＭＡｂｓも染色されずＰＡＭｓを検出することができなかった（表３）。さらに、細胞病原性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ；略称：ｃｐｅ）は誘導されなかった。結論として、置換または欠失のいずれかによってＭタンパク質のポジション８でシステイン残基を欠損しているＰＲＲＳＶの完全長ｃＤＮＡ転写物は、ＢＨＫ−２１細胞においてウィルスタンパク質を複製し発現することができる。しかし感染性ウィルスを産生することはできない。
【００２５】
第２に、Ｍタンパク質のエクトドメインは、ＬＤＶのエクトドメインによって交換され、結果として完全長ｃＤＮＡクローンｐＡＢＶ７０７を生じる。このＰＲＲＳ組換え体由来の転写物でトランスフェクトさせたＢＨＫ−２１細胞は、ＧＰ３、ＧＰ４およびＮタンパク質に対するＭＡｂｓで染色され、Ｍタンパク質に対するＭＡｂｓ１２６．１２で染色されることが可能であったけれども、ＭＡｂｓ１２６．３および１２６．４では染色されなかった（表２）。このことはこれらのＭＡｂｓがＭタンパク質のエクトドメインと反応したという前述の結果を確認した。感染性キメラウィルスの産生を試験するため、ＰＡＭｓはトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞の上清で感染させた。ＰＡＭｓはＭＡｂｓ１２６．３および１２６．４以外の全てで染色された（表３）。結論として、Ｍタンパク質のエクトドメインは、ＬＤＶのエクトドメインによって置換することができ、ブタ肺胞マクロファージに未だ感染するキメラウィルスの産生が起こる。コロナウィルスに関する研究は、Ｍタンパク質の全てのドメインがコロナウィルス集合にとって重要であることを提案する（１）。ウィルスの外側にさらされるＭタンパク質のアミノ末端ドメインは、ウィルス集合において役割を果たす。さらに、ウィルスエンベロープの内側に位置するカルボキシ末端ドメインは、ヌクレオカプシドと相互作用することによってウィルス集合にとって重要である。このドメインはまた、ウィルスのエンベロープの集合にとって非常に重要である。しかしながらそれらは、Ｍタンパク質のアミノ末端ドメインがＭタンパク質とＳタンパク質との間の相互作用に関連しないということを示した（２）。このことは、タンパク質間の結合は、膜レベルで起こり、またはおそらくＭタンパク質のカルボキシ末端ドメインの一部を含む。他のコロナウィルス、ＴＧＥＶに対しては、Ｍタンパク質のカルボキシ末端に対するＭＡｂｓはウィルス感染性を中和することが記載されており（１６）、Ｍタンパク質のＣ末端ドメインは、ウィルス粒子の外側にさらされる。このＭタンパク質のトポロジーは、さらされたアミノ末端およびビリオン内でのカルボキシ末端ドメインからなるコロナウィルスのＭタンパク質に関して一般に記載される構造とおそらく共存している。我々の最近の研究において、我々はＭタンパク質のエクトドメインにおいて他のアミノ酸を突然変異させている。我々は明確な欠失と突然変異は、Ｍタンパク質とＧＰ５とのジスルフィド結合を弱めることになることを示す。これらの構成物は、一般に構造タンパク質の通常の複製および発現を示し、野生型に匹敵する免疫反応を引起こす。しかしながら、より少ないウィルス粒子が産生されるであろう。また、それはウィルス粒子の産生を生じる。このことは、マクロファージの感染において損なわれる。両方の場合において、ウィルスを生じ、これはたとえばＰＲＲＳＶに対するブタの防御のための安全なワクチンとなると考えられる。また我々の結果は、システイン残基の欠失のようないくつかのアミノ酸の欠失と同様ＬＤＶエクトドメインでの置換は２つのＭＡｂｓの結合の損失を生じるので、Ｍタンパク質のエクトドメインにおける突然変異はマーカーワクチンの産生を生じることができるということを示した。そしてエピトープにおけるウィルスの突然変異により、マーカーワクチンの産生が起こる。この研究において、我々はＬＤＶのＭタンパク質のエクトドメインを含むＰＲＲＳＶ転写物が、感染性キメラウィルスを産生し、（マーカー）ワクチンとして有用であるということを示した。
【００２６】
（材料および方法）
第１にＧＰ５におけるポジション５０、１１１および１１７のシステイン残基はセリン残基によって置換された。アミノ酸５０の置換のために、ＰＣＲ突然変異誘発が第１断片に対してプライマーＬＶ３２およびＬＶ３０３で行われ、第２断片に対してプライマーＬＶ３０２およびＬＶ１８２で行われた。アミノ酸１１１の置換のために、ＰＣＲ突然変異誘発は第１断片に対してプライマーＬＶ３２およびＬＶ３１１で行われ、第２断片に対してプライマーＬＶ３１０およびＬＶ１８２で行われた。アミノ酸１１７の置換のために、ＰＣＲ突然変異誘発は第１断片に対してプライマーＬＶ３２およびＬＶ３１３で行われ、第２断片に対してプライマーＬＶ３１２およびＬＶ１８２で行なわれた。断片は融解させ、大抵の５’および３’プライマーで増幅された。結果として生じる断片は、ｐＡＢＶ６５１においてＢｓｔＸＩおよびＮｈｅＩを用いてクローン化され、生じたクローンからＡａｔＩＩ−ＨｐａＩ断片がｐＡＢＶ４３７の適切な部位へクローン化された。これにより、それぞれシステイン残基５０、１１１および１１７それぞれに対してｐＡＢＶ８５８、８６１および８５９を生じた。
【００２７】
第２にアミノ酸９から１６までの領域はＭタンパク質のエクトドメインから欠失された。ＰＣＲはプライマーＬＶ３２およびＬＶ３０６を用いて行われた。断片はＢｓｔＸＩ−ＮｈｅＩで消化され、ｐＡＢＶ６５１のこれらの部位にクローン化された。このクローンからＡａｔＩＩ−ＨｐａＩ断片はｐＡＢＶ４３７の対応する部位へクローン化され、ｐＡＢＶ８５５を生じた。
【００２８】
第３に、ＬＶのＭタンパク質のエクトドメインをコードする領域は、他のアルテリウィルスのエクトドメインによって置換された。ＶＲ２３３２の導入のために、２つの連続したＰＣＲがプライマーＬＶ３２およびＰＲＲＳＶ５７、プライマーＬＶ３２およびＰＲＲＳＶ５８で行われた。ＢｓｔＸＩおよびＮｈｅＩでのｐＡＢＶ６５１へのＰＣＲ断片のクローニング、およびこの結果生じるクローンからＡａｔＩＩおよびＨｐａＩでのｐＡＢＶ４３７へのクローニングは完全長クローンｐＡＢＶ８５７を生じた。ＥＡＶのＭのエクトドメイン導入のために、我々はプライマーＬＶ３２およびＰＲＲＳＶ５９、プライマーＬＶ３２およびＰＲＲＳＶ６０で連続したＰＣＲを行った。結果として生じる断片は、ＢｓｔＸＩおよびＮｈｅＩでｐＡＢＶ６５１にクローン化され、結果として生じたクローンからＡａｔＩＩおよびＨｐａＩでｐＡＢＶ４３７へクローン化されて、結果としてｐＡＢＶ８５６を生じた。
【００２９】
第４に、ＬＶのＯＲＦ５および６間の部分的重複は、プライマーＬＶ３２およびＬＶ３５８でＰＣＲを行うことによって取除かれた。生じたＰＣＲ断片はｐＡＢＶ６５１のＢｓｔＸＩおよびＳｔｕＩ部位へクローン化された。生じたクローンから、ＡａｔＩＩ−ＨｐａＩ断片がｐＡＢＶ４３７へ導入され、ｐＡＢＶ８７１を生じた。このクローンにおいて、他のアルテリウィルスのエクトドメインが導入された。ＶＲ２３３２のＭタンパク質のエクトドメイン導入のために、１つはＬＶ３２およびＬＶ３５７を用いて１つはＬＶ３５６および１１８Ｕ２５０を用いて２つのＰＣＲ断片が生成された。ＰＣＲ断片は融解され、プライマーＬＶ３２および１１８Ｕ２５０で増幅された。両方のＰＣＲ断片はＢｓｔＸＩおよびＨｐａＩで消化され、ｐＡＢＶ６５１のこれらの部位に連結された。生じたクローンは、ＡａｔＩＩおよびＨｐａＩで消化され、断片はｐＡＢＶ４３７のこれらの部位へ連結された。このことはＶＲ２３３２のＭタンパク質エクトドメインに対してクローンｐＡＢＶ８７２を生じ、ＥＡＶのＭタンパク質のエクトドメインに対してｐＡＢＶ８７３を生じた。
プライマーは表４に列挙する。
【００３０】
（結果）
（Ｍタンパク質のエクトドメインにおける欠失を含む完全長ｃＤＮＡクローン）
ｐＡＢＶ７３８（ａａ１５および１６欠失）、ｐＡＢＶ７３９（ａａ１５欠失）、ｐＡＢＶ７４０（ａａ１５Ｑ〜Ｅ）、ｐＡＢＶ７４１（ａａ９欠失）およびｐＡＢＶ７４２（ａａ５欠失）のＲＮＡ転写物は、ＢＨＫ−２１細胞にトランスフェクトさせ、ＩＰＭＡでトランスフェクション後２４時間構造タンパク質の発現を試験した。全ての突然変異体に対して、ＧＰ３、ＧＰ４およびＮの発現が検出された。Ｍタンパク質に対する２つのＭＡｂｓ（１２６．３および１２６．４）は、細胞を陽性に染色したＭタンパク質に対する他のＭａｂ（１２６．１２）とは反対にトランスフェクトされた細胞を染色しなかった。トランスフェクトされた細胞の培養液上清はＰＡＭｓを感染させるために用いられた。感染後の２４時間染色は、全ての突然変異体に対してＮタンパク質の発現を示した。このことは、全ての突然変異体が生存能力のあるウィルスを産生することを示す。
【００３１】
さらに、Ｍタンパク質のアミノ酸９〜１６までのコード領域が欠失された突然変異体が構築され、ｐＡＢＶ８５５を生じた。そのＲＮＡ転写物のＢＨＫ−２１細胞へのトランスフェクションは、ＬＶの全ての構造タンパク質の発現を示した。しかしながら、ＭＡｂｓ１２６．３および１２６．４は、トランスフェクトされた細胞を染色しなかった。トランスフェクトされた細胞の培養液上清とともにＰＡＭｓを接種後、構造タンパク質の発現は検出されなかった。結論として、生存能力のあるウィルスは産生されなかった。
【００３２】
（ＧＰ５タンパク質におけるシステイン残基の突然変異体）
ＧＰ５のシステイン残基５０、１１１および１１７は、セリン残基へ換えられ、完全長ｃＤＮＡクローンｐＡＢＶ８５８、ｐＡＢＶ８６１、およびｐＡＢＶ８５９をそれぞれ生じた。ＢＨＫ−２１細胞におけるＲＮＡ転写物のトランスフェクションは、トランスフェクション後２４時間ＩＰＭＡにおいて検出されたように、全ての突然変異体に対して構造タンパク質の発現を示した。ＰＡＭｓはトランスフェクトされた細胞の培養液上清とともに接種され、感染後２４時間でＩＰＭＡにおいて染色された。ｐＡＢＶ８５８のＲＮＡ転写物でトランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞の培養液上清で接種され、陽性染色が観察されなかったＰＡＭｓとは反対に、ＰＡＭｓがｐＡＢＶ８６１および８５９のＲＮＡ転写物でトランスフェクトしたＢＨＫ−２１細胞の培養液上清で接種された場合、細胞が陽性に染色された。結論として、ＧＰ５のポジション５０におけるシステイン残基は、生存能力のあるウィルスの産生にとって必須であり、残基１１１および１１７は必須ではない。
【００３３】
（他のアルテリウィルスのＭタンパク質エクトドメインの導入）
ＬＤＶのＭタンパク質のエクトドメインの導入は、生存能力のあるウィルスを産生するので、我々は現在ＶＲ２３３２のＭタンパク質エクトドメインおよびＥＡＶのＭタンパク質エクトドメインをＬＶの感染性ｃＤＮＡクローンに挿入し、それぞれｐＡＢＶ８５７およびｐＡＢＶ８５６を生じた（図２Ａ）。しかしながら、ＧＰ５およびＭ、ＯＲＦ５および６のコード配列はそれぞれ一部重複しているので、これらの配列の導入はＧＰ５のＣ末端における突然変異を導入した。それらのＲＮＡ転写物のトランスフェクションは、両突然変異体が構造タンパク質発現を示した。しかしながら、トランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞の培養液上清感染させたＰＡＭｓの染色は陰性であった。結論として、生存能力のあるウィルスはこれらのキメラアルテリウィルスから産生されない。
【００３４】
（ＯＲＦ５および６間の重複部分の除去およびキメラ配列の導入）
ＶＲ２３３２およびＥＡＶのエクトドメイン導入はまた、ＧＰ５のＣ末端をコードする領域において突然変異を導入するので、我々はＬＶの感染性ｃＤＮＡクローンからＯＲＦ５および６間の重複を除去した。この方法において、我々はＯＲＦ５のコード配列を妨げることなくアルテリウィルス配列が導入可能であるＯＲＦ６における領域を作製したかった。第１に、ＯＲＦ５および６間の重複は感染性ｃＤＮＡクローンにおいて除去され、ｐＡＢＶ８７１を生じた（図２Ｂ）。そのＲＮＡ転写物のＢＨＫ−２１細胞へのトランスフェクションは、構造タンパク質が発現されたことを示し、複製及び転写の両方が妨げられないことを示した。トランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞の培養液上清でのＰＡＭｓ感染は、構造タンパク質の発現がＩＰＭＡによって検出され、ｃｐｅが観察されたので、感染性ウィルスが産生されたことを示した。第２にＶＲ２３３２のＭタンパク質エクトドメインおよびＥＡＶのＭタンパク質エクトドメインはこの構築物に導入され、ｐＡＢＶ８７２およびｐＡＢＶ８７３を生じた（図２Ｂ）。これらのＲＮＡ転写物は、ＢＨＫ−２１細胞へトランスフェクトさせた。１２６．３および１２６．４以外の全てのＭＡｂｓは、トランスフェクトされた細胞を陽性に染色した。トランスフェクトされたＢＨＫ−２１細胞の培養液上清で感染させたＰＡＭｓは、ＩＰＭＡにおいて全ての構造タンパク質の発現を示した。これらの結果は、ＧＰ５のＣ末端が完全なままである他のアルテリウィルスのＭタンパク質のエクトドメインが、ＬＶのＭタンパク質のエクトドメインのＣ末端によって機能的に交換することが可能であったことを示す。
【００３５】
（キメラアルテリウィルスの遺伝的安定性）
ｐＡＢＶ７０７、７３８、７４１、７４２、８７１、８７２およびｐＡＢＶ８７３から生成されたウィルスがインビトロで安定して維持されたか否かを研究するため、それらはＰＡＭｓにおいて連続的に継代させた。ウィルスＲＮＡは、５回継代後の培養液上清から単離され、遺伝子分析によって研究された。ウィルスのＲＮＡは逆転写され、導入された欠失の横に位置する領域がＰＣＲによって増幅された。断片の配列分析により各突然変異体に対して導入された突然変異がまた存在し、付加的な突然変異はインビトロでの継代の間フランキング領域に導入されないことを示した。これらの結果は、欠失がＰＡＭｓにおけるインビトロ継代の間安定して維持されることを示した。
【００３６】
成長特性は、増殖曲線においてｖＡＢＶ７０７、ｖＡＢＶ７４１およびｖＡＢＶ７４２に対して決定し、野生型のｖＡＢＶ４３７のものと比較した。ＰＡＭｓは、０．０５の感染の多重性で継代５回目において感染させ、培養培地は様々な時間間隔で回収された。ウィルス力価は、マクロファージの終点希釈度によって決定された。全ての場合において、成長割合は類似しているけれども、生存能力のあるウィルスの量はその最も高い力価に達した後急速に傾いたことを我々は観察した。この結果は、産生されたウィルスがワクチンの目的に対してさらに有用な性質があり得る熱不安定性があることを示し得る。
【００３７】
【表１】
2004506411.tif 000002
ａ制限酵素部位は下線で、外来配列は斜体である。
【００３８】
【表２】
2004506411.tif 000003
【００３９】
【表３】
2004506411.tif 000004
【００４０】
【表４】
2004506411.tif 000005
【００４１】
（接種例）
（明記されたＰＲＲＳＶ突然変異体での８週齢のブタへの接種後の野生型ＰＲＲＳＶ（ＥＵ型およびＵＳ型）の鼻腔内接種。ウィルス動態および抗体反応）
（導入）
ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウィルス（ＰＲＲＳＶ）は、妊娠９ヶ月の雌ブタにおいて流産および貧弱な同腹子の特性を引起こす。さらに、それは若いブタにおいて呼吸系疾患を引起こし得る。妊娠後期の雌ブタ（８０〜９５日）のＰＲＲＳＶによる感染は、根深い生殖不全を引起こす。特に誕生時および誕生から１週間でのこれらの雌ブタの子孫の高いレベルの死亡数のためである。ＰＲＲＳＶは遍在する病原体である。２つの明確な抗原型が分類される。すなわち欧州型とアメリカ型である。ＰＲＲＳＶ感染後の臨床的影響は、含まれる菌株の型に依存する。ＰＲＲＳワクチンでのブタへの接種は、ＰＲＲＳＶチャレンジが動物および農場レベルで解決するという方法に影響を与える。ウィルス血症のレベルと持続時間および野生型ウィルスの広がりはこのワクチンの投与によって減少する。
【００４２】
第２世代のＰＲＲＳワクチン開発のために、新しい候補が試験されるべきである。そのため８週齢のブタがＰＲＲＳＶチャレンジを与えた後多くの明記されたＰＲＲＳＶ突然変異体（組換えウィルス）を接種された。このウィルス暴露の動態は、同種および異種構成の両方においてウィルス血症および追加免疫反応のレベルと持続時間とに関して評価される。
【００４３】
（研究目的）
定義されたＰＲＲＳＶ突然変異体の免疫学的効力および安全性の決定は、接種（同種および異種）チャレンジモデルにおいてワクチンとして使用された。このことに加えて、突然変異体の免疫原性が試験された。
【００４４】
（実験計画）
以下の基準を全て満たす４つのＰＲＲＳＶ突然変異体が試験された。基準はインビトロで５回継代（細胞培養物）後の遺伝的安定性、動物に３週間暴露後の遺伝的安定性、（ＩＤＥＸＸ−ｅｌｉｓａによって決定される）免疫原性である。
【００４５】
以下の突然変異体が試験された。ｖＡＢＶ７０７すなわちＬＤＶ−ＰＲＲＳキメラウィルス（Ｍエクトドメインの交換）、ｖＡＢＶ７４１すなわちＰＲＲＳＶのＭタンパク質のａａ９欠失、ｖＡＢＶ７４６すなわちＯＲＦ７のＣ末端部分での１８ヌクレオチド欠失、ｖＡＢＶ６８８すなわちＯＲＦ２のポジション８８〜９５での突然変異である。
【００４６】
ポジティブコントロールとして、以下のウィルスを用いた。ｖＡＢＶ４３７すなわちレリスタッド（Ｌｅｌｙｓｔａｄ）ウィルスの野生型組換え体である。
【００４７】
それぞれの突然変異体は、８週齢の５匹のＳＰＦブタでそれぞれ構成される２群において試験された。すべての群はお互い一切接触することなく完全に隔離された。２匹の未感作の標識となるブタ（各突然変異群につき１匹）は接種後２４時間これらの接種されたブタと一緒にされ、それから２８日後取出して殺した。
【００４８】
それぞれ５つの接種物からなる（突然変異体あたり）２群において、２匹の動物が接種後２８日目に、野生型ウィルス（すなわちＰＲＲＳＶの欧州種の代表としてレリスタッドウィルス（ＬＶ−ｔＨ））でチャレンジされ、アメリカ型の代表としてＳＤＳＵ＃７３（ＰＲＲＳＶの（アメリカ）種）でチャレンジされた。
【００４９】
他の３つの接種を受けた動物は、２４時間これらのチャレンジされた動物から放され、それから再び合わせられた。チャレンジから２８日後、全てのブタが除去され、解剖された。
【００５０】
ｖＡＢＶ４３７は、ポジティブコントロールとして与えられた。チャレンジコントロールはＬＶ−ｔＨおよびＳＤＳＵ＃７３でチャレンジ効力を制御するためチャレンジの時点から開始して１４日間一緒にされ、動物はチャレンジ段階の間他の動物に関して記載されたように扱われた。
ブタの割当は表１に概説する。
【００５１】
【表１】
2004506411.tif 000006
【００５２】
ワクチンは、ＳＯＰ（肩と右耳の間の首の中間点において深く筋肉内に２ｍｌ。分毎の力価１０５ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）に従って筋肉内に投与された。全ての接種物は、使用の前後で滴定され、全ての時間溶けかけている氷の上で保存された。
【００５３】
（実験動物）
８週齢の７０匹のＳＰＦブタをＰＲＲＳＶフリーで試験した。
【００５４】
（研究の実行（表２））
【表２】
2004506411.tif 000007
【００５５】
（結果）
各群において突然変異体ウィルスまたは野生型ウィルスの暴露後、有害な反応は起こらなかった。表３および４は、血清から単離されたＰＲＲＳの結果および計算されたウィルス血症を示す。定義された試料採取時点でのウィルス血症の発症率は、慣例の出版された技術を用いてブタ肺胞マクロファージおいて単離されたウィルスによって決定された。
【００５６】
１対１０の血清検体希釈度におけるウィルス陽性は（＋）で表され、（＋＋）は１対１００の血清検体希釈度におけるウィルス陽性を意味する。これらの結果は、（各時点での各ウィルス陽性動物＝１点、最高値１００％（＝１２／１２）を得ることができる各群におけるウィルス暴露動物の百分率（１型）、暴露動物の最高ウィルス血症百分率（２型）として群全体の「ウィルス血症評価」を計算するために用いられた。後者の場合において、最大値１００％（＝２４／２４）は、最高ウィルス血症が個々の動物に対して２点（検体の１対１００希釈）として評価されるという事実に基づいて得ることができる。全ての突然変異体ウィルス群は、ｖＡＢＶ４３７と比較して１型および２型ウィルス血症評価の減少を示した。ｖＡＢＶ７０７接種ブタは、全ての他の群におけるブタの評価と比較してチャレンジ前の１型および２型ウィルス血症評価の減少を示した。チャレンジのとき、ウィルス血症であった動物はいなかった。全ての標識がウィルス血症になり、セロコンバーションが起こった。これはウィルスが暴露されたブタから標識へと拡散したことを意味する。ブタに対する突然変異ウィルスの第１暴露は、チャレンジコントロールと比較して、同種の野生型チャレンジ後のウィルス血症のほぼ完全な阻止および異種のチャレンジ後のウィルス血症の安定した減少によって決定されるように、効果的な免疫学的反応を起こさせる。接種された標識は効果的に防御された。
【００５７】
研究された各グループの間に接種およびチャレンジ後血清学的反応において違いは記録されなかった。
【００５８】
全てのチャレンジコントロールは、１４日目の研究進行の間にウィルス血症を示す。このときウィルス血症は鼻腔内暴露されたブタにおいて最も優勢である。
【００５９】
【表３】
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【００６０】
【表４】
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【００６１】
（結論）
研究された組換え突然変異体ＰＲＲＳウィルスは、野生型（ｖＡＢＶ４３７）と比較して、ウィルス血症（長さおよび高さ）の減少によって決定されるように減少したウィルス血症を示す。全ての突然変異体が野生型ＰＲＲＳＶに対してブタを防御するために効果的な免疫反応を起こす。同種の防御が、異種のものよりもいくらか効果的であるようだ。
【００６２】
体液性反応は、すべての場合において市販のＥＬＩＳＡ（ＩＤＥＸＸ）によって測定される。有害な反応は導出されない。
【００６３】
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【００６４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＥＡＶ、ＬＤＶ−Ｐ、ＰＲＲＳＶ−ＴｅｒＨｕｕｒｎｅ、ＰＲＲＳＶ−ＶＲ２３３２およびＳＨＦＶのＭタンパク質のアミノ酸配列の比較。
【図２】ＧＰ５−Ｍタンパク質の構成。
【図３】ＬＶ欠失突然変異体の増殖曲線。
【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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