(57)【要約】本発明は、ＡＴＰクエン酸リアーゼのモジュレーションおよび相関する病態生理学的機能の治療のため、哺乳動物由来のタンパク質ヒスチジンホスファターゼ活性を有するポリペプチドと、これらに対する抗体と、タンパク質ヒスチジンホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列とを使用することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＥＣ４．１．３．８）活性をモジュレートするための、ホスホヒスチジンに対する特異性が高いタンパク質ヒスチジンホスファターゼ（ＰＨＰ）または相同な変異体の生物的活性を有するポリペプチドの使用。
【請求項２】
分子量が１３，０００〜１５，０００である請求項１に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３】
【表１】
2004520837.tif 000009
の群から選択された少なくとも１つのアミノ酸配列モチーフを含む請求項１に記載のポリペプチドの使用。
【請求項４】
ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＥＣ４．１．３．８）活性をモジュレートするための、請求項１から３のいずれか一項に記載のタンパク質ヒスチジンホスファターゼ活性を有するポリペプチドに対する抗体またはその断片の使用。
【請求項５】
下記の配列
【表２】
2004520837.tif 000010
の少なくとも１つを有するタンパク質ヒスチジンホスファターゼのｍＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列。
【請求項６】
ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＥＣ４．１．３．８）活性のモジュレーションを目的とした、タンパク質ヒスチジンホスファターゼの翻訳を阻害するための、請求項５に記載のＤＮＡ配列の使用。
【請求項７】
ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＥＣ４．１．３．８）活性のモジュレーションを受け易い病態生理学的状態の治療用薬剤を製造するための、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項８】
病態生理学的状態が、高脂血症、高コレステロール血症、心臓血管疾患、肥満症、炎症性疾患、腫瘍、中枢神経系疾患、低クエン酸尿症の群から選択される、請求項７に記載の化合物の使用。
【請求項９】
体重を抑制し、脂肪消失を促進させ、食欲を抑制する薬剤を製造するための、請求項１から５のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＴＰクエン酸リアーゼのモジュレーションおよび相互に関連のある病態生理学的機能の治療のため、哺乳動物由来のタンパク質ヒスチジンホスファターゼ活性を有するポリペプチドと、これらのポリペプチドを対象とする抗体と、タンパク質ヒスチジンホスファターゼ活性を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列とを使用することに関する。
【０００２】
（発明の背景）
タンパク質リン酸化などの翻訳後修飾は、タンパク質の機能活性を制御することができる重要なメカニズム、したがって生物学的プロセスを調節することができる重要なメカニズムを提供する。タンパク質キナーゼおよびホスファターゼは、分化、増殖制御、発癌プロモーション、細胞周期、および細胞死を含む多様な細胞機能の調節に関与する。特定の残基での代謝または同化経路の鍵となる酵素のリン酸化／脱リン酸化は、そのような鍵となる酵素のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションの中心的機能として行われる。
【０００３】
細胞質アセチルＣｏＡを提供する鍵酵素であるＡＴＰクエン酸リアーゼ(ACL;EC4.1.3.8)は、４個の明らかに同一のサブユニットの四量体であり(Singh,M.他(1976)J.Biol.Chem.、251、5242−5250)、肝臓、脳、および腎臓で最高の活性を示すものである(Srere, P.A.(1959)J.Biol.Chem.234、2544〜2547)。ＡＣＬの遺伝子発現およびタンパク質含量は、転写レベルで熱量摂取およびインスリンによって増大し、飢餓および糖尿病によって低下する(Towle, H.C.他(1997)Annu.Rev.Nutr.17、405〜433;Rosiers,S.D.他(1995) J.Biol.Chem.、270、10027〜10033)。酵素には３つの調節リン酸化部位があり、これらの部位でのＡＣＬのｉｎ  ｖｉｖｏリン酸化は、栄養素、ホルモン環境に応じて、また分化中に変化する(Benjamin, W.B.他(1994) Biochem. J.、 300、477〜482)。
【０００４】
ＡＣＬは、ＡＴＰからＡＤＰおよびリン酸への加水分解により、クエン酸およびＣｏＡからサイトゾル内でアセチルＣｏＡおよびオキサロ酢酸を形成するプロセスを触媒する。このステップは、炭水化物、脂肪酸、コレステロールおよびアセチルコリンの生合成経路で使用される細胞質アセチルＣｏＡの主要な供給源である。酵素は、全反応の第１のステップで、基質ＡＴＰによる触媒部位での酵素のリン酸化によって得られたリン酸化酵素中間体の関与するメカニズムに従う(Plowman, K.M. 他、(1967)J.Biol.Chem.242、4239〜4247;Wells, T.N.C.(1991) Eur.J.Biochem.199、163〜168)。このリン酸化部位はＨｉｓ７６０にある(Williams, S.P.他(1985)Biochem.、24、5527〜5531)。
【０００５】
最近の研究結果によれば、ＡＣＬは、主な糖新生前駆体である細胞質オキサロ酢酸の大部分の形成を触媒するので、糖新生で重要な役割を果たすこともできることが示されている(Rosiers, S.D.他(1995)J.Biol.Chem.、270、10027〜10033)。さらに、細胞質クエン酸濃度の調節によってＡＣＬ活性が変化すると、ホスホフルクトキナーゼの阻害による解糖(Comte, B.他(1997) J.Biol.Chem.、272、26117〜26124)とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼのアロステリック活性による脂肪酸生合成(Reilly, D.I.他(1997) Prog.Lipid Res.、35、371〜385)が共にモジュレートされる。
【０００６】
ＡＣＬにより触媒される反応は、脂質生成およびコレステロース生成のためのアセチルＣｏＡの供給の鍵となる。数々の研究によれば、この酵素が阻害されることによって、コレステロールと脂肪酸の合成が共に低下し、また低密度リポタンパク質受容体の活性が増大することが実証されているが、これはＡＣＬ阻害剤が抗脂血薬として(Berkout, T.A．他(1990) Biochem.J.、272,181〜186)、減量を誘発する薬物として（ＷＯ９７／１８８０６）、または肥満症治療用の薬物として役立つ可能性があることを示唆している。
【０００７】
ＡＣＬが関与するその他の重要な経路は、神経伝達物質アセチルコリンの合成である。ＡＣＬによってクエン酸から変換されたアセチルＣｏＡを、サイトゾル内のコリンアセチルトランスフェラーゼの作用によりコリンと組み合わせる。アセチルコリンが不足していることはアルツハイマー病の１つの特徴であり、症状の臨床的な改善はアセチルコリンエステラーゼ阻害剤を用いた治療によってもたらされるので(Bartus, R.T.他(1982)Science、217、408〜414)、ＡＣＬは、アルツハイマー病およびその他のタイプの痴呆に重要な役割を果たすと考えられる。種々の器官の癌腫では、脂肪酸シンターゼの高レベルの発現が観察される(Kuhajda, F.P.他(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、91、6379〜6383;Rashid,A.他(1997)Am.J.Pathol.、150、201〜208;Pizer,E.S.他(1998)Cancer 83、528〜537)。したがって高レベルの脂肪酸合成を伴う腫瘍細胞の増殖は、脂肪酸合成を阻害することによって抑制できると考えられる(Pizer,E.S.他(2000)Cancer Res.、60、 213〜218;Kuhajda,F.P.他(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、97、3450〜3454)。ＷＯ９４／０２１０８には、脂肪酸合成の阻害によって腫瘍細胞の増殖が阻害されることが報告されているが、これはＡＣＬ阻害剤が潜在的な抗腫瘍剤であることを示している。米国特許第５，１４３，９０７号では同様の観察が行われており、亜リン酸−ボラン化合物の抗腫瘍および抗炎症作用が、脂肪酸およびコレステロールの細胞質合成の阻害と相互に関係すると考えられた。さらに、慢性代謝性アシドーシスの低クエン酸尿症は、腎皮質組織中のＡＣＬ酵素活性の増大に関連し、この酵素を阻害することによって一部逆の作用が生じる(Melnick, J.Z.他(1996)J.Clin.Invest.、98、2381〜2387)。これらの結果は、近位尿細管のクエン酸代謝においてこの酵素が重要な役割を果たすことを示唆しており、ＡＣＬ酵素活性のモジュレーションが、低クエン酸尿症の治療の目標と考えられる。
【０００８】
前述の事項から、ＡＣＬはいくつかの生化学的経路における鍵となる酵素であり、またＡＣＬ活性のモジュレーションは様々な疾患を治療するのに非常に重要であることが、明らかである。
【０００９】
したがって本発明の目的は、高脂血症や高コレステロール血症、心臓血管疾患、肥満症、炎症性疾患、腫瘍、中枢神経系疾患、低クエン酸尿症など、増大しまたは低下するＡＣＬ酵素活性と相互に関連のある病態生理学的機能を治療するための、ＡＣＬ酵素活性のモジュレーターの使用と、ＡＣＬ酵素活性のモジュレーションのための新しい方法および薬剤と、薬剤の製造におけるそのような化合物の使用を提供することである。
【００１０】
本発明のその他の目的は、以下の詳細な説明から当業者に明らかである。
【００１１】
これらの目的は、ＡＣＬが、最近記述のあったタンパク質、ヒトタンパク質ヒスチジンホスファターゼ（ｈＰＨＰ）およびそれと相同な変種の基質であるという予期せぬ研究結果に基づいて、またｈＰＨＰが、ＡＣＬのリン酸化ヒスチジン残基を脱リン酸化することによってＡＣＬ活性をモジュレートするという研究結果に基づいて達成される。
【００１２】
したがって本発明は、ＡＣＬ酵素活性をモジュレートするための、ｈＰＨＰ活性を有するポリペプチドの使用を提供する。
【００１３】
さらに本発明は、ｈＰＨＰを対象とする抗体またはその断片や、ｈＰＨＰ活性を有するポリペプチドをコードするｍＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡ配列など、ＡＣＬ酵素活性をモジュレートするためのｈＰＨＰ活性を阻害する化合物の使用を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、ＡＣＬ酵素活性をモジュレートする薬剤を製造するための、ｈＰＨＰ活性を有する化合物またはｈＰＨＰ活性を阻害する化合物の使用を提供する。
【００１５】
また本発明は、高脂血症や高コレステロール血症、心臓血管疾患、肥満症、炎症性疾患、腫瘍、中枢神経系疾患、低クエン酸尿症など、増大しまたは低下するＡＣＬ酵素活性と相互に関連のある病態生理学的状態を治療するための、ｈＰＨＰ活性を有するポリペプチド、またはｈＰＨＰ活性を阻害する化合物、またはそのような化合物を含む薬剤の使用も提供する。
【００１６】
また本発明は、高脂血症や高コレステロール血症、心臓血管疾患、肥満症、微生物感染、炎症性疾患、腫瘍、中枢神経系疾患、低クエン酸尿症など、増大しまたは低下するＡＣＬ酵素活性と相互に関連のある病態生理学的状態を治療するための方法であって、治療上有効な量のｈＰＨＰ活性を有するポリペプチドまたはｈＰＨＰ阻害活性を有する化合物またはそのような化合物を含む薬剤を患者に投与することを含む方法も提供する。
【００１７】
哺乳動物タンパク質ヒスチジンホスファターゼ（ｈＰＨＰ）およびこれと相同な変異体は、ＷＯ００／５２１７５（配列番号２〜８）により知られている。このタンパク質の見掛けの分子量は１４，０００であり、Ｎ末端基で閉じられている。この出願には、単離、精製、特徴付け(p.7、第10行〜p.10、第10行)、および抗体の生成(p.7、第13〜30行)に関する方法も記載されている。
【００１８】
ＡＣＬはｈＰＨＰの脱リン酸化活性のための基質であるので、ＡＣＬの活性をモジュレートするためにホスファターゼを使用することができ、したがって、ｈＰＨＰまたはｈＰＨＰ活性を有するポリペプチドとそのようなポリペプチドを含む医薬品組成物を、高脂血症や高コレステロール血症、心臓血管疾患、肥満症、炎症性疾患、腫瘍、中枢神経系疾患、低クエン酸尿症など、増大しまたは低下するＡＣＬ酵素活性と相互に関連のある病態生理学的機能の治療に使用することができる。
【００１９】
本発明は同様に、ＡＣＬ酵素活性をモジュレートするための、ｈＰＨＰの断片、変異体、および突然変異体と、これらの３つの断片、変異体、または突然変異体に対して作製された抗体と、前記断片、変異体、または突然変異体のｍＲＮＡ配列に相補的なＤＮＡまたはＲＮＡ配列との使用を含む。そのようなｈＰＨＰの断片、変異体、および突然変異体は、例えば、生物学的活性を本質的に保った状態で、ランダムなまたは制御された置換や種々のスプライシング、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の欠失または付加によって生成することができる。
【００２０】
このため本発明は、少なくともアミノ酸配列モチーフ
【００２１】
【表１】
2004520837.tif 000002
【００２２】
を含む、ＡＣＬ酵素活性をモジュレートするためのｈＰＨＰ活性を有するポリペプチドの使用に関する。
【００２３】
ＡＣＬ酵素活性をモジュレートするための、ｈＰＨＰ活性を有するさらに好ましいポリペプチドは、少なくともアミノ酸配列モチーフ
【００２４】
【表２】
2004520837.tif 000003
【００２５】
を含み、ただしＸ1＝ＫまたはＲであり、Ｘ2＝ＡまたはＧであり、Ｘ3＝ＰまたはＲである。
【００２６】
ＡＣＬ酵素活性をモジュレートするための、ｈＰＨＰ活性を有するさらに好ましいポリペプチドは、少なくとも以下のアミノ酸配列モチーフを含む。
【００２７】
【表３】
2004520837.tif 000004
【００２８】
これら部分配列の全ては、完全な酵素アミノ酸配列内に高度に保たれており、前記酵素の活性部位に関与しあるいは哺乳動物においてその他の生物学的または医薬品上の関連性を有すると考えられる。
【００２９】
ＡＣＬ酵素活性をモジュレートするため、ｈＰＨＰ活性を有する特に好ましいポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を含む。
【００３０】
【表４】
2004520837.tif 000005
【００３１】
この配列のＮ末端にあるメチオニン残基は必須のものではない。
【００３２】
本発明の目的は、ｈＰＨＰホスファターゼ活性を阻害するために、したがってＡＣＬの間接的なモジュレーションのために、上述のアミノ酸配列のいずれか１つに対して作製された抗体、好ましくはモノクローナルヒト化抗体の使用を提供することである。そのような抗体は、当業者に周知の技法を使用して生成することができる。
【００３３】
ｈＰＨＰホスファターゼ活性を阻害するために、したがってＡＣＬの間接的なモジュレーションのために、ｈＰＨＰに対して作製された抗体、例えばアミノ酸配列
【００３４】
【表５】
2004520837.tif 000006
【００３５】
(ＷＯ００／５２１７５のp.13、第18行、配列番号10参照)を有するｈＰＨＰの活性部位を対象とする抗体、または上述のアミノ酸配列の１つを対象とする抗体を使用することができる。
【００３６】
さらに本発明の目的は、ｈＰＨＰの翻訳を阻害するため、したがってＡＣＬの間接的なモジュレーションのため、ｈＰＨＰをコードするｍＲＮＡに相補的なＤＮＡ配列または化学修飾したＤＮＡ配列の使用を提供することである。そのようなＤＮＡ配列は、ＷＯ００／５２１７５の配列表（配列番号１）に記載されているｈＰＨＰのＤＮＡ配列から容易に得ることができ、下記の配列の１つを有すると考えられる。
【００３７】
【表６】
2004520837.tif 000007
【００３８】
このようなＤＮＡ配列は、当業者に周知の技法を使用して生成することができる。
【００３９】
上述の、天然ならびに組換えポリペプチド、抗体、またはＤＮＡ配列は、高脂血症や高コレステロール血症、心臓血管疾患、肥満症、微生物感染、炎症性疾患、腫瘍、中枢神経系疾患、低クエン酸尿症など、増大しまたは低下するＡＣＬ酵素活性と相互に関連のある病態生理学的機能を病んでいる患者に対して直接施用することができ、あるいは、前記化合物およびその医薬品として許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む医薬品組成物として施用することができる。
【００４０】
本明細書で使用する「医薬品として許容される担体」という用語は、活性成分と有害な反応をせず患者に副作用をもたらさない、不活性で無毒な固体または液体の充填剤、希釈剤、またはカプセル化剤を意味する。適切で好ましい液体担体は、滅菌水や生理食塩水、水性デキストロース、糖液、エタノール、グリコールと、石油、動物、野菜由来の油、または合成の油であって、例えば落花生油、大豆油、鉱油などを含めたものなど、技術分野で周知である。
【００４１】
本発明による製剤は、非経口投与に一般的な、従来の無毒性の医薬品として許容される担体、希釈剤、アジュバント、および賦形剤を含有する単位服用量として投与することができる。
【００４２】
「非経口」という用語は、本明細書では、皮下注射、静脈注射、関節内注射、および気管内注射と、注入技法を含む。また、経口投与や局所施用などのその他の投与形態も適切である。非経口組成物および組合せは、既知の手法によりボーラス形態でまたは一定の融解物として静脈内に投与することが最も好ましい。
【００４３】
本発明の化合物を錠剤カプセルまたは粉末として配合する場合、通常の担体と賦形剤、例えば炭酸マグネシウムや炭酸カルシウム、重炭酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、乳糖、微結晶性セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、無水シリカなどと、滑沢剤、例えば水和ヒマシ油やステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、糖、ペクチン、デキストリン、トラガカント、低融点ワックス、カカオバター、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリエチルグリコール、第４級アンモニウム化合物など、ならびに結合剤、例えばデンプンやグルコース、アラビアゴム、マンニトールなどを使用することができる。錠剤またはカプセルは、当技術分野で周知の方法により被覆することができる。
【００４４】
経口液体調剤は、水性または油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、シロップ、エリキシル剤の形をとり、あるいは、使用前に水または別の適切な賦形剤を加えてもとに戻すことができる乾燥生成物として提供することができる。そのような液体調剤は、懸濁剤や乳化剤、非水性溶媒、保存剤など、従来の添加剤を含有することができる。
【００４５】
局所施用剤は、水性または油性の懸濁液、溶液、エマルジョン、ゼリー、または好ましくは乳剤性軟膏の形をとることができる。
【００４６】
本発明による単位服用量は、本発明による化合物の１日当たりに必要とされる量、またはその化合物を複数回分に分けてこれらを合計すると所望の服用量になる量を含むことができる。所与の患者（ヒトを含む哺乳類）に最適な治療上許容される投薬量および投薬割合は、使用される特定の活性化合物の活性や、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食餌、投与時間および経路、クリアランス速度、酵素活性（単位／ｍｇタンパク質）、治療目的すなわち治療するのか予防するのか、治療すべき疾患の性質など、当業者に知られる様々なファクタに依存する。
【００４７】
したがって、治療する患者(in vivo)における組成物および組合せでは、本発明の活性化合物の医薬品として有効な１日量は、体重１ｋｇ当たり約０．０１〜１００      ｍｇの間であり、好ましくは体重１ｋｇ当たり０．１〜１０ｍｇである。施用形態に応じ、１回量には活性化合物が０．０１〜１０ｍｇ含まれる。
【００４８】
本発明のＡＣＬ酵素活性モジュレーターを使用して、癌に罹患した患者を治療することができるが、これは高レベルの脂肪酸合成を有しまたは内因性脂肪酸に依存するものである。治療に適する特徴的な癌腫には、膀胱、唾液腺、皮膚付属器、胆管、子宮頚内膜、子宮頚部外膜、および膣の癌腫と、食道、鼻咽頭、および中咽頭の癌腫、または生殖細胞由来の癌腫および中皮腫が含まれる。特に、胃、子宮内膜、腎臓、肝臓、および肺の癌腫または腺癌、ならびにメラノーマは、本発明により治療可能である。乳房、結腸および直腸、前立腺、卵巣は、この治療を施すのに特に適切なタイプの腺癌である。
【００４９】
そのような細胞による内因性脂肪酸合成は、１分間に細胞200,000個当たり、アシルグリセリドにアセチルＣｏＡを１０ｆｍｏｌ取り込むよりも速い速度で生じることが好ましい。患者は、ＡＣＬ、またはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）など脂肪酸合成経路のその他の酵素を周囲の正常（例えば非腫瘍性の）組織で見出されたレベルよりも高いレベルで発現する腫瘍含有細胞を持っているので、その好ましい患者を識別することができる。そのような細胞は攻撃的な腫瘍細胞であり、生存率が低下し、転移が増大し、臨床上の再発率が増大し、予後が全体的に悪化する。多くの腫瘍細胞は内因性脂肪酸合成に大きく依存するので、より低い活性レベルの脂肪酸合成では、本発明の活性化合物による治療のための候補として特定の腫瘍を排除する必要がない。脂肪酸合成は、ＡＣＬの阻害剤によって弱められまたは停止する。その結果、膜脂質が奪われて細胞死に至る。しかし正常細胞は、循環脂質を取り込むことができるので生存することができる。
【００５０】
癌腫細胞中のＡＣＬの存在は、活性アッセイまたは染色、抗ＡＣＬ抗体を使用した免疫アッセイ、ＡＣＬ  ｍＲＮＡを測定するアッセイを含めた任意の適切な方法で検出することができる。
【００５１】
ＡＣＬの発現は、免疫組織化学や細胞質酵素免疫アッセイまたは放射免疫アッセイ、ＡＣＬ配列を有するｍＲＭＡ標的を用いた核酸プローブのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、あるいは酵素活性の直接測定を使用して、生検や切除、針吸引などの手順により得られた腫瘍組織サンプル中で直接決定することができる。腫瘍によるＡＣＬの発現は、任意の適切なアッセイを使用して、血液や尿、血清、リンパ、唾液、精液、腹水、特に血漿など、患者から得られた生物学的流体サンプル中で間接的に測定できる。
【００５２】
内生的に合成した脂肪酸を必要とする細胞は、癌腫、特に悪性の最も強い癌腫に広く行き渡る。ＡＣＬの存在は治療前に決定することが好ましいが、熟練した臨床医なら、そのような決定が必ずしも必要ではないことを理解するであろう。ＡＣＬ阻害剤を用いた癌腫の治療により腫瘍負荷が低減するが、これは腫瘍中にＡＣＬが存在することを示している。そのような癌腫の経験的な治療も、本発明が企図する範囲内に含まれる。
【００５３】
本発明のＡＣＬ酵素活性のモジュレーターも、その他の化学療法薬物と併せて有用である。脂肪酸シンターゼ経路に対して特に活性な癌化学療法薬物は現在のところ定められていないので、本発明の化合物を使用することにより、既存の抗癌剤、特に他の同化経路または分解経路を標的とする代謝拮抗剤を補うことになる。
【００５４】
本発明の化合物と併せて使用することができる化学療法薬物には、本発明によれば、例えば細胞静止作用や細胞傷害効果などによって腫瘍細胞に抗腫瘍作用を直接及ぼす薬物、すなわち腫瘍細胞の発生、成熟、または拡散を防止する薬物と、生体応答の変化などのメカニズムを通して非間接的に抗腫瘍作用を及ぼす薬物が含まれる。本発明による化学療法薬物は、天然または合成の化合物が好ましいが、タンパク質や抗体、ケモカイン、サイトカイン、ポリペプチドなどの生体分子を除外するものではない。商用、臨床評価、および非臨床開発のために入手可能な多数の化学療法薬物があり、それらも本発明に含まれる。
【００５５】
化学療法薬物の例には、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタードやエチレンイミン化合物、スルホン酸アルキル、およびニトロソウレアやシスプラチン、ダカルバジンなどアルキル化作用のあるその他の化合物と；代謝拮抗物質、例えば葉酸やプリン、ピリミジン拮抗薬と；有糸分裂阻害剤、例えばビンカアルカロイドやポドフィロトキシン誘導体と；細胞傷害性抗体、およびカンプトテシン誘導体が含まれる。好ましい化学療法薬物または化学療法には、アミホスチン（エチオール）、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルヌスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシンリポ（ドキシル）、ゲムシタビン（ゲムザール）、ダウノルビシン、ダウノルビシンリポ（ダウノキソーム）、プロカルバジン、ミトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキセート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（タキソール）、ドセタキセル（タキソテレ）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、ダカルバジン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロン−α、インターフェロン−β、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル、およびこれらの組合せが含まれる。
【００５６】
本発明のＡＣＬ酵素活性のモジュレーターをさらに使用して、高コレステロール血症および／または高脂血症に罹患した患者を治療し、アテローム性動脈硬化症や膵臓炎などの二次的障害を予防し、ならびに肥満症などの代謝異常の治療を行うことができる。現在、さらに中程度のＩＩ型高コレステロール血症を治療することにより、冠状動脈性心疾患に起因する死亡率および罹患率を低下させることが広く理解されている。
【００５７】
ＩＩ型高コレステロール血症の顕著な特徴である、低密度リポタンパク質の血漿濃度の増大は、ＬＤＬ合成の増大、ＬＤＬ異化の減少、またはこれらの組合せをもたらす様々な遺伝要因および環境要因に起因する。高コレステロール血症の治療のための現行の療法は、ＬＤＬ異化の刺激（胆汁酸抑制剤およびＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤）ならびにＬＤＬ合成の阻害（ニコチン酸およびｍａｘｅｐａ魚油）に向けられている。
【００５８】
本発明の化合物はＡＣＬ酵素活性のモジュレーションによって作用し、したがってコレステロール合成および脂肪酸合成を阻害して、血漿コレステロールおよびトリグリセリドのレベルが低下する。したがって本発明は、特に混合高脂血症（（ＩＩｂ）型）の治療で血清のトリグリセリドおよびコレステロールのレベルを低下させるため、治療用ＡＣＬ酵素活性阻害剤の使用を提供する。さらに、本発明の化合物の使用は、アテローム性動脈硬化症や膵臓炎などの二次的障害の発症の予防、ならびに肥満症などの代謝異常の治療に際し、有益な効果を示すことが予想される。
【００５９】
さらに本発明の化合物は、脂肪酸化の刺激による脂肪消失を促進させるのに使用することができるが、これはＡＣＬ酵素活性の阻害によりアセチルＣｏＡが細胞形質にほとんど到達しないからである。このため、ミトコンドリアでの脂肪燃焼プロセスに必要な酵素であるカルニチンアシルトランスフェラーゼの阻害剤として作用するマロニルＣｏＡの利用可能性が制限される。マロニルＣｏＡのレベルが低いと脂肪酸の分解が引き起こされ、その結果、本発明の化合物により脂肪消失を促進させることができる。この作用は、肝臓での脂肪酸の酸化が活性化することによっても糖新生が刺激され、肝臓グリコーゲンの蓄えが満たされて満腹であるというメッセージを脳の中心に送ることができるという事実によって裏付けされる。したがって本発明は、脂肪消失を促進させるためかつ食欲抑制剤としての、ＡＣＬ酵素活性の阻害剤の使用を提供する。
【００６０】
さらに本発明は、神経変性疾患の治療のための、本発明の化合物の使用を提供する。例えばアルツハイマー病は、脳内のアミロイドプラークの蓄積により病理学的にかつ最近の記憶の障害により臨床的に特徴付けられた、痴呆および死に至る遺伝的に異質の群の進行性致死性神経疾患である。遺伝的な原因に関係するアルツハイマー病の他、病気の明らかな家族歴がない散発的症状も引き起こされる。例えばアルツハイマー病の特徴である病理学的な変化は、サイトカインインターロイキン−１の産生を刺激する頭部外傷後または炎症性疾患後に生じる。この病気の早期症状は、最近の記憶の初期障害の原因となる海馬細胞の障害および死に伴った、最近の記憶の喪失である。磁気共鳴撮像を使用した海馬体積の測定によれば、臨床的に物忘れが発症する前に海馬に萎縮が生じ、その後進行して、最初に症状が現れてから２年間で年当たり約８％の体積を失うことが示される。アルツハイマー病の診断は、側頭葉の海馬部分の病変に伴うこの最近の記憶の障害によって、臨床的に行われる。
【００６１】
家族性または散発性タイプのアルツハイマー病は、老年人口で見られる主な痴呆であるが、その他のタイプの痴呆も見られる。そのような痴呆には、ピック病に伴う前頭側頭の退化、血管性痴呆、レーヴィ小体タイプの老年痴呆、そして前頭萎縮、進行性核上性麻痺、および大脳皮質基底核変性症を伴うパーキンソン症候群の痴呆、ダウン症候群に伴うアルツハイマーが含まれるが、これらに限定されない。ＣＪＤやスクラピー、ＢＳＥなどの海綿状脳症ではプラーク形成も見られる。
【００６２】
アミロイドプラークの他、脳アセチルコリンのレベルが低下することは、アルツハイマー病のその他の病理学的特徴である。症状は、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤で治療することによって、おそらくは中隔核で生じるコリン作動性遠心性神経刺激(efferent)を増加させ、脳の大脳辺縁系前部の海馬ないしブロカ対角帯を横断させることによって、やや改善することができる。
【００６３】
アセチルコリンの形成に必要なアセチルＣｏＡは、クエン酸からアセチルＣｏＡおよびオキサロアセテートへの酵素変換によって得られるので、ＡＣＬ酵素活性を刺激することによって同じ効果を得ることができる。
【００６４】
亜リン酸−ボラン化合物の抗炎症作用は、脂肪酸およびコレステロールの細胞質内合成の阻害と相互に関連があるとされる（米国特許第５，１４３，９０７号）所見により、本発明はさらに、炎症性疾患の治療のための本発明の化合物使用を提供する。
【００６５】
本発明による炎症性疾患の非限定的な例は、急性糸球体腎炎、急性滑膜炎成人呼吸窮迫症候群、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性甲状腺炎、自己免疫性溶血性貧血、気管支炎、悪液質、結膜炎、急性炎症性成分による皮膚病、痛風性関節炎、移植片対宿主反応、グレーブス病、橋本甲状腺炎、血液透析、クローン病および潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病、白血球搬出、多発性硬化症、重症筋無力症、壊死性小腸大腸炎、臓器／皮膚移植拒絶反応、変形性関節症、皮膚炎、乾癬性関節炎、乾癬、レイノー症候群、反応性関節炎、ライター症候群、リウマチ熱、リウマチ様関節炎、鼻炎、風疹性関節炎、全身性エリテマトーデス、外傷性関節炎、脈管炎、およびブドウ膜炎である。
【００６６】
さらに、本発明の化合物を低クエン酸尿症の治療に使用することができるが、その理由は、慢性代謝性アシドーシスによって腎皮質ＡＣＬの活性およびタンパク質発生量が増大し、またこの酵素のアップレギュレーションが低クエン酸尿症の発生に重要な役割を演じることが示されているからである。したがって本発明の化合物は、低クエン酸尿症の治療に使用することができる。
【００６７】
（図面の簡単な説明）
図１  基質ＡＣＬのｈＰＨＰ依存脱リン酸化を示す図である；ｈＰＨＰによる、またｈＰＨＰなしでの脱リン酸化；レーン１：対照（ｈＰＨＰなし）、２：２８０ｎｇ  ｈＰＨＰ、３：２１０ｇ  ｈＰＨＰ、４：１４０ｎｇ  ｈＰＨＰ、５：７０ｎｇ  ｈＰＨＰ、６：２８ｎｇ  ｈＰＨＰ。見掛けの分子量が約１２０ｋＤａのタンパク質を、ｈＰＨＰ濃度に依存する手法で脱リン酸化した。
【００６８】
図２  ＡＣＬの同定を示す図である；左パネル：オートラジオグラフィ処理後（グレースポット）およびクーマシー染色ゲル電気泳動後のオーバーレイ；１：分子マーカー、２：ラット肝臓可溶性抽出物、３：一部精製ＡＣＬ；右パネル：クーマシー染色ゲル電気泳動法；１：分子マーカー、２：ラット肝臓可溶性抽出物。ＡＣＬを矢印で示す。
【実施例】
【００６９】
（実施例１）
ｈＰＨＰの基質決定
ｈＰＨＰ１用に対する脊椎動物性基質を決定するために、32Ｐ標識したウサギ肝臓抽出物をスクリーニングした。ヒスチジン残基上でリン酸化したタンパク質が選択的に得られるように、公開されているプロトコルに従ってウサギ肝臓抽出物を標識した(FEBS Lett 1995;364,63〜3)。これは、ＰＶＤＦ膜上に染みを付けたタンパク質を酸およびアルカリで処理し、その後アートラジオグラフィにかけることによって確認した。ｈＰＨＰを選択的に添加することにより、ＳＤＳゲルでの移動度１１０Ｋでタンパク質の脱リン酸化が生じた。ｈＰＨＰ基質タンパク質を単離し、その後ＡＴＰクエン酸リアーゼ（ＡＣＬ）であることを確認した。ＡＣＬは、触媒反応の過程でヒスチジン７６４で自己リン酸化することが知られている。
【００７０】
（実施例２）
ＰＨＰアッセイ
ホスファターゼ基質ｃｈｅＡのリン酸化の調製をした。Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０カラムを使用して、組み込まれていない［γ−32Ｐ］ＡＴＰを除去した。ｈＰＨＰを、０．６ｎｇの［32Ｐ］ｃｈｅＡ（０．２１ｐｍｏｌ［32Ｐ］／ｍｌ）と、２５ｍＭのＴＥＡ  ｐＨ７．５と、１０ｍＭのＭｇＣｌ2と、０．１％のβ−メルカプトエタノールとを含有する４０μｌの反応混合物中、３７℃で３０分間インキュベートした。１０μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡと１５０μｌのメタノール／アセトン（１：１）を添加してアッセイを停止し、１５，０００ｇで５分間遠心分離にかけ、その上澄みを、［32Ｐ］含量に関して分析した。リン酸放出が線形範囲内に保たれるように（＜２５％）、ＰＨＰを希釈した。
【００７１】
１１０Ｋホスファターゼ基質を含むウサギ肝臓可溶性抽出物のリン酸化を、記述のように準備した。１５μｌの脱リン酸化反応混合物は、ＰＨＰ  ５〜５０ｎｇ、２５ｍＭ  ＴＥＡ  ｐＨ７．５、０．１％β−メルカプトエタノール、およびリン酸化抽出物６０μｇを含有していた。サンプル緩衝液を添加することによって、３７℃で３０分経過した後アッセイを停止した。反応生成物を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、その後オートラジオグラフィにかけて分析した。
【００７２】
（実施例３）
ｈＰＨＰおよびその基質の精製
ウサギの肝臓からの可溶性抽出物を、出発材料として使用した。緩衝液Ａは、ＮａＣｌまたはＭｇ2+を補充した２０ｍＭ  ＴＥＡ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％β−メルカプトエタノール、０．０２％  ＮａＮ3、ｐＨ７．５からなり、これを、ブルーセファロース(Blue Sepharose 6 Fast Flow)を０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ（緩衝液Ｂ）の存在下で使用しているとき以外、全ての精製ステップで使用した。
【００７３】
抽出物をＳＯＵＲＣＥ  ３０Ｑに導入し、緩衝液Ａに０．２ＭのＮａＣｌを加えたものを用いて溶離した。ｈＰＨＰ活性を有する画分を９０％（ＮＨ4）2ＳＯ4で濃縮し、その後、緩衝液Ａで作動させるＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５上でクロマトグラフィにかけた。溶離体積１１〜２１Ｋを溜め、１０ｍＭ  Ｍｇ2+に調整し、１０ｍＭ  Ｍｇ2+を含有する緩衝液Ｂで平衡にしたブルーセファロースに加えた。緩衝液Ｂに溶出したｈＰＨＰに、０．２Ｍ  ＮａＣｌを補った。
【００７４】
上述のＳｏｕｒｃｅ  ３０Ｑ、Ｈｉｌｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、およびＭｏｎｏＱによって、ウサギの肝臓からの可溶性抽出物からＡＣＬを部分的に精製した(Hoffmann, G.E.他、(1979) Hoppe−Seyler's Z.Physiol.Chem.360、1445〜51)。
【００７５】
（実施例４）
抗ヒスチジンホスファターゼ抗体
タンパク質の異なる領域に対して抗ヒスチジンホスファターゼ抗体を生成した。標準的なＦＭＯＣ化学を使用してペプチドを合成した。免疫化のため、２兎のウサギにそれぞれペプチドを注射し（４回注射）、４つの血液サンプルを得た。最終の放血を約３ヵ月後に行った。生成された抗体は、ヒスチジンホスファターゼの検出および位置確認に有用である。
【００７６】
さらに、分子内の種々の領域を個別に分析することができる。特に、下記のアミノ酸配列
【００７７】
【表７】
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【００７８】
を含有するヒスチジンホスファターゼの十分に保存されている中央部分は、生体内のタンパク質機能に応答する活性部位を含むと考えられる。この領域に対する抗ペプチド抗体は、阻害または中和に使用される。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１】基質ＡＣＬのｈＰＨＰ依存脱リン酸化を示す図である。
【図２】ＡＣＬの同定を示す図である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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