(57)【要約】本発明は、ヒトのさまざまな線維症の治療における遺伝子治療の使用に関する。本発明は、線維症に関係がある突起の発達を回復および／または防止するために、標的器官に特異的に向かう治療遺伝子を使用することを目的とする。線維症および／または硬変の患者への遺伝子治療の考えられる使用は、重度の線維症の肝臓の治療タンパク質をコードする遺伝子の、首尾の良い送達に大きく依存し、また、アデノウイルスおよび／または他の器官に形質導入する可能性がない（冒す可能性がない）他の組換えベクターによって、潜伏性および活性ＭＭＰ−８タンパク質、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−１３、野生型および／または改変型ｕＰＡ（またはその切断型）、ＴＧＦ−βタイプＩＩ用の切断型レセプターおよびＳＭＡＤ７をコードしている前記遺伝子を向けるという事実にも大きく依存する。組換えアデノウイルス（ＡｄＲ）は、治療遺子をいくつかの標的細胞に非常に効率よく形質導入する。遺伝子を硬変肝の肝臓に送ることができることが示されている。前記アデノウイルスベクターおよび他の組換えベクターによる治療遺伝子の送達は、カチオン性およびアニオン性リポソーム（ＤＯＴＭＡ）を使用して行うこともできる。腎臓線維症、肺線維症、肥大性およびケロイド瘢痕（肌の線維症）、および他の種類の線維症の治療においても本発明を同様に使用することができる。
2004500040.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維症の器官中に沈着する過剰のコラーゲンタンパク質を分解する治療タンパク質をコードしている偏在プロモーターおよび／または組織特異的プロモーターによって調節される、欠失したアデノウイルスゲノムおよび治療遺伝子またはＤＮＡ配列を含む、組換えアデノウイルスベクターｐＡｄＧＦＰ−ＭＭＰ−８。
【請求項２】
前記組織特異的プロモーターがＰＥＰＣＫである、請求項１に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項３】
遺伝子発現が前記偏在ＣＭＶプロモーターによって誘発される、請求項１に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項４】
アデノウイルスベクター中でクローン化された前記治療遺伝子または前記ＤＮＡ配列が、潜伏性および活性ヒトメタロプロテアーゼ遺伝子ＭＭＰ−８、ｕＰＡ野生型および／または改変型のヒトウロキナーゼプラスミノゲン活性因子遺伝子およびＴＧＦ−βタイプＩＩ用の切断型レセプターの遺伝子から選択されるものである、請求項１に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項５】
線維症の治療用の前記治療タンパク質が潜伏性および／または活性タンパク質ＭＭＰ−８、野生型および／または改変型のｕＰＡおよびＴＧＦ−βタイプＩＩ用の切断型レセプターである、請求項１に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項６】
硬化性肝臓中の線維症を治療するためにメタロプロテアーゼの過剰発現によりコラーゲンの分解を誘導する治療タンパク質をエンコードしているコラゲナーゼ遺伝子ＭＭＰ−８の硬化性肝臓への分配を含むものである、請求項１に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項７】
前記治療遺伝子ＭＭＰ−８の分配を全身性の線維症の他の器官中で行う、請求項６に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項８】
前記治療遺伝子ＭＭＰ−８の前記線維症の器官への分配を使用する投与経路によって行うものである、請求項７に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項９】
前記投与経路が静脈内である、請求項８に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１０】
前記線維症の器官が肝臓、肺、心臓、腎臓、皮膚および肥大性の瘢痕から選択されるものである、請求項７に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１１】
主な標的器官が肝臓である、請求項１０に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１２】
治療遺伝子ＭＭＰ−８の分配がウイルスまたは非ウイルスベクターの使用によるものである、請求項１から１１に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１３】
非ウイルスベクターがプラスミド、およびカチオン性とアニオン性リポソームから選択されるものである、請求項１２に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１４】
肝臓、肺、腎臓、心臓の線維症、ケロイドおよび肥大性瘢痕の治療用に使用され、かつ致死的な毒性を誘発しないものであること特徴とする、請求項１に記載の組換えアデノウイルスベクター。
【請求項１５】
レポーター遺伝子Ｌａｃ−ＺおよびＧＦＰ、および肝臓、肺、腎臓、および／または心臓の線維症、ケロイドおよび肥大性の瘢痕の治療用の治療タンパク質をコードしている前記治療遺伝子をクローニングすることによる、組換えアデノウイルスベクターを作製する方法。
【請求項１６】
前記治療遺伝子がヒトメタロプロテアーゼ遺伝子ＭＭＰ−８（潜伏性および／または活性）、野生型および／または改変型のヒトｕＰＡ遺伝子およびＴＧＦ−βタイプＩＩの切断型レセプターの遺伝子から選択されるものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組換えアデノウイルスベクターがｐＡｄＧＦＰ−ＭＭＰ−８である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
肝臓、肺、腎臓、および心臓の線維症、ケロイドおよび肥大の性瘢痕の治療用であって、薬学的に許容される担体と混合したものである組換えアデノウイルスベクターのウイルス粒子の１回投与分量の治療学的有効量を含有する請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
前記１回投与分量が線維症の器官あたり約１０７〜１０４個のウイルス粒子である、請求項１８に記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
肝臓、肺、腎臓、および心臓の線維症、ケロイドおよび肥大性の瘢痕を治療する薬剤を製造するためのものである、請求項１に記載の組換えアデノウイルスベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、肝硬変および腎臓線維症、肺線維症などの全身性線維症、肥大性瘢痕、皮膚のケロイド、および／またはそれに苦しんでいる疑いのある他の標的器官の治療において有用な、治療タンパク質をエンコードしている外来性遺伝子を有する組換えアデノウイルスベクターの作製に関する。本発明は、治療遺伝子の硬変器官への送達によって影響を受けた細胞の、組織特異的な認識のメカニズムにも関する。
【０００２】
さらに本発明は、本明細書中の特許請求の範囲に記載した組換えアデノウイルスベクターの使用によって線維症を治療するための効果的な方法、およびこれらのベクター、これらを含む薬剤組成物を作製するための方法、およびある種の線維症の治療におけるこれらの治療的な使用を提供する。本発明の方法は製薬業界において商業的に非常に期待されており、線維症によって特徴付けられる慢性−変性疾患を治療するための遺伝子治療として重要な代替方法であり、医学の分野において治療的な適用例が多い。
【０００３】
（序論）
肝硬変の生理病理学
肝硬変は肝臓の慢性的なダメージから生じる疾患である。ダメージは毒性（アルコールの慢性的摂取）、感染性（ウイルス肝炎、主にウイルスＢおよび／またはＣ肝炎）、免疫学的（原発性胆汁性肝硬変）、胆汁性閉塞（続発性胆汁性肝硬変）、代謝的（ウィルソンの疾患）なものである可能性がある。あらゆる形の硬変には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のタンパク質（主にコラーゲンＩおよびこれより少量のＩＶおよびＩＩＩ）の合成および過剰な沈着という共通の性質がある。したがって肝細胞の小節が形成され、異常な血管新生および門脈圧亢進症につながる（Ａｎｔｏｎｉ　ＰＰ、Ｉｓｈａｋ　ＫＧ、Ｎａｙａｋ　Ｎｃ、Ｐｏｕｌｓｅｎ　ＨＥ、Ｓｈｅｕｅｒ　ＰＪ、Ｓｏｂｉｎ　ＬＨ）。これらの生理病理学的プロセスは血液供給の変化、次いで肝細胞の栄養の変化につながる。エチオン剤および形態学的な違いに関係なく、あらゆる形の硬変には、共通の終点として肝臓障害があり、患者の死を引き起こす。
【０００４】
洞様血管（Ｄｉｓｓｅの空間）の内皮下空間にコラーゲンタンパク質が過剰に沈着する結果、肝臓のミクロ環境においてさまざまな変化が起こる。すなわち、肝細胞ウイルスの減少、コラーゲンＩＶおよびＩによって構成され洞様血管をカバーする基底膜の形成、および洞様血管を形成する内皮細胞の開窓の損失である。これらのプロセスはすべて、洞様血管の「キャピラリゼーション」として知られる（Ｓｃｏｔｔ　Ｌ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ　Ｔｈｅ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　１９９３、ｖｏｌ．３２８　Ｎｏ．２５：１８２８−１８３５）。したがって、肝臓は末端肝静脈中の溶質の生理的濃度を維持できず、すなわち肝臓障害が起こる。連続的な内皮（基底膜のコラーゲン）の形成および他のコラーゲンタンパク質の蓄積を伴なうこのキャピラリゼーションは、図１において理解することができるように、血漿と肝細胞の間の分子の正常かつ両方向的な交換の障害となり、この場合タイプＩコラーゲンの肝臓中の蓄積によって肝硬変が特徴付けられる。このタンパク質の過剰な沈着によって、血液と肝細胞の間の栄養素の自由な交換が妨げられ、この器官による毒性剤の不活性化を行うことができず、これが疾患の生理病理学の主な原因となる。今日まで、肝臓コラーゲンの累進的な蓄積の１００％の効果を回復かつ／または妨げる可能性がある治療剤は記載されていない。
【０００５】
肝硬変において現れるこのような生理病理学的変化は、肺、心臓、腎臓、皮膚などで線維症を被むる器官については一定であり一般的であり、本発明の保護の範囲を特に制限するとは解釈すべきではない。したがって、肝硬変の治療についてここで示す方法は、線維症の疑いがある、あるいは線維症に冒されている器官にも適用できる。
【０００６】
ウイルスベクターおよび肝臓遺伝子治療
ウイルスまたは非ウイルスベクターを用いて、この技術を実施することができる。従前の研究では、プラスミドおよびカチオン性およびアニオン性などのリポソーム（ＤＯＴＭＡ）を使用して設計されている。ウイルスベクターを使用する方法の中では、最も一般的に使用される方法には、レトロウイルスおよびアデノウイルスの使用が含まれる。
【０００７】
いくつかのプロトコルでは、レトロウイルスベクターを使用して肝細胞中に遺伝子を導入している（ＪＴ、ａｎｄ　Ｃｕｒｉｅｌ　ＤＴ、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｓ　Ｖｅｃｔｏｒ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ／１９９７　４４〜５３）。しかしながら、これらのベクターは潜在的な複製能力のあるウイルスを生成することができるので、事前策をとらなければならない。これらのベクターの利点の中には、安定した方法でそのゲノムをゲスト細胞の染色体中に組み込む能力があり、これによって無限の方法でレトロウイルスにクローン化された治療トランス遺伝子が発現する可能性が与えられる。一方で今日まで、オンコジーンの挿入および活性化、複製能力のないレトロウイルスの取り込みによる突然変異の発生を報告している研究はない。それにもかかわらず、遺伝子を肝臓に形質導入するためのレトロウイルスベクターの使用は、以下の事項を考慮して制限されている。１）これらのベクターは活発に分裂している細胞のみに感染する、２）これらのウイルスを増幅するために使用される細胞株のパッキングにおいて、非常に低いウイルス粒子タイターが得られる（Ｇｒａｈａｍ　ＦＬ、ａｎｄ　Ｖａｎ　Ｄｅｒ　Ｅｂ　ＡＪ．Ａ　Ｎｅｗ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ａｓｓａｙ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　５　ＤＮＡ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１９７３、５２：４５６〜４６７）。ｉｎ　ｖｉｖｏでの肝細胞増殖を誘導すること、肝臓増殖因子を使用すること、部分的な肝臓切除、肝臓の塊の７０％を除去することによってｉｎ　ｖｉｖｏでの残りの肝細胞の分裂が誘導される手術手順によって、他の遺伝子治療プロトコルにおけるこれら２つの制限事項は首尾よく克服されてきた。レトロウイルスベクターを使用することによって、前記制限事項を部分的に克服することができる。なぜなら、これらのベクターは実際には分裂しいていない細胞に形質導入することができるからである。
【０００８】
（発明の背景）
肝硬変は肝臓の慢性的な疾患であり、広汎性の細胞壊死および実質肝細胞の限られた再生は、結合組織の広汎性のパーセンテージを増大させる結果となり、小葉性肝臓構造体の障害を引き起こし、血行動態の変化を誘導する。したがって、肝硬変を治療するためのいくつかの戦略は、「繊維形成プロセス」の予防および／または回復、肝臓の有糸分裂の刺激、および肝臓組織の構造体の再配置を含む可能性がある。本発明と関係がある従来技術の文献は、この後に参照としてのみ述べる。
【０００９】
米国特許第５，２４０，８４６号は「ＣＦＴＲ」と呼ばれる遺伝子治療の使用について言及しており、これは塩素チャンネルの調節の安定した関係を誘導する。上皮細胞中にこの欠陥が存在する。前記発明では、アデノウイルス組換えベクターおよびプラスミドベクターが使用される。しかしながら、それは本発明の治療遺伝子とは何ら関係がない。同様に、米国特許第５，９１０，４８７号には治療用分子を送るためのプラスミドベクターの使用が記載されているが、ここで示すメタロプロテアーゼＭＭＰ−８潜伏性および／または活性、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１３、またはｕＰＡ（野生型ｕＰＡおよび／またはその改変型）、または「Ｓｍａｄ７」、または増殖因子β（ＴＧＦ−βタイプＩＩ）の形質転換用の切断型レセプターの遺伝子の送達とは何ら関係がない。米国特許第５，８２７，７０３号は、遺伝子を送るためのアデノウイルスベクターおよび改変型アデノウイルスベクターの使用について言及しているが、これらのベクターはいずれも、本発明において使用する線維症を治療するための遺伝子を含んでいない。
【００１０】
米国特許第５，７７０，４４２号は、「ファイバー」と呼ばれるタンパク質、または「ファイバーキメラ」と呼ばれるタンパク質の発現を指示する一遺伝子を含む組換えアデノウイルスの使用を特許請求しているが、前記特許はどれが治療遺伝子であるかは具体的には言及していない。さらに、このような組換えアデノウイルスを生成させるためにこのようなアデノウイルスおよび転移ベクターを使用することを含む、遺伝子治療の方法が示されている。しかしながら、クローン化され本発明において使用する組換えアデノウイルスベクターに挿入される治療遺伝子の、線維症肝臓中または腎臓、肺、肥大性瘢痕などの他の標的器官への使用に関しては何も言及されていない。これらの治療遺伝子は、ヒトメタロプロテアーゼＭＭＰ−８、潜伏性および／または活性、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−１３、ヒトウロキナーゼプラスミノゲン活性因子（野生型および／または改変型ｈｕＰＡ）、Ｓｍａｄ７、およびＴＧＦ−βタイプＩＩ用の切断型レセプターをコードしている遺伝子である（本明細書で特許請求する）。示される遺伝子のファミリーの他のメンバーも含まれる。
【００１１】
米国特許第５，１６６，３２０号は、外来性遺伝子をホ乳類の肝細胞に導入するための、標的化した送達システム使用について言及している。しかしながら、硬変肝臓または線維症腎臓または肺に直接送られる推定遺伝子とは何ら関係がない。
【００１２】
米国特許第５，８７２，１５４号は、アデノウイルス組換えベクターおよび選択した免疫モジュレータによって誘導される免疫応答を低下させるための方法を記載する。このモジュレータは、中和している抗体の形成を阻害することおよび／またはウイルスによって冒される細胞の死を減らすことによって機能する。
米国特許第５，８７１，９８２号は、アデノウイルスの一部分、および選択したトランス遺伝子を含むアデノ関連ウイルスベクターの一部分が含まれるハイブリッドベクターを対象とする。シンプルな粒子を形成するためのアデノ関連ウイルスベクターの遺伝子メッシュへのポリケーション（ｐｏｌｙｃａｔｉｏｎ）に関する、結合体の単位からなるハイブリッドウイルスも記載される。これは、ハイブリッドウイルスを使用せず、アデノウイルスベクターのみを使用する本発明とは対照的である。さらに前述の特許では、使用する遺伝子、トランス遺伝子または治療遺伝子は述べられていない。
【００１３】
米国特許第５，８５６，１５２号は、アデノウイルスベクターの一部分をアデノ関連ウイルスおよび選択した遺伝子と組み合わせて含むハイブリッドベクターの作製を対象とする。それによって多量の組換えベクターが生成されるが、これらのベクターは本発明中に記載するようなクローン化した治療遺伝子を有しておらず、腎臓および肝臓線維症および肥大性瘢痕を治療するための特異的な治療遺伝子を使用する。
【００１４】
米国特許第５，５４７，９３２号は、真核細胞をトランスフェクトするための核酸の複合体の化合物を特許請求している。核酸および核酸と親和性がある他の物質、および任意選択でウイルスまたは結合することができるウイルスの成分などの内面因子によって、これらの複合体が形成される。この特許では特異的なアデノウイルスベクターの成分、またはＡｄ２またはＡｄ５などの特異的なウイルスを使用するが、細胞の細胞質中、最終的にはこれらの真核細胞中の核に内面化される遺伝子については言及していない。同様に、米国特許第５，５２１，２９１号は、抗体によって核酸と親和性がある物質に結合する結合型アデノウイルスに関する。このようにして、組換え遺伝子が真核細胞の内部に送られる。これらの結合型複合体および核酸は細胞中に内面化するが、送られる可能性がある遺伝子については具体的には言及されていない。前記特許では、本発明中に記載することとは対照的に、線維症または肝硬変または任意の他のタイプの線維症を治療するためのこのようなアデノウイルスの使用は言及されていない。
【００１５】
米国特許第５，５８５，３６２号は、改良型アデノウイルスベクター、およびこのようなベクターを得て使用するための方法に関する。前記特許では、アデノウイルスベクターの使用は言及されていない。しかしながら、治療遺伝子を送るためのベクターのように、本発明中に記載するアデノウイルスベクターを使用した。
【００１６】
米国特許第５，７５６，０８６号は、「ファイバー」と呼ばれるタンパク質によって表されるアデノウイルスを特許請求しており、このアデノウイルスは特異的な細胞タイプ中に位置するレセプターに特異的なリガンドも含む。このアデノウイルスは「ファイバー」と呼ばれるこのタンパク質の少なくとも一部分を含むことができ、そのタンパク質を取り除きリガンドで置き換えることができ、これは肝細胞などのエコノミーの特異的な細胞中のレセプターに特異的である。このアデノウイルスは治療因子をコードしている遺伝子を含むことができる。以前の記述に基づくと、従来技術と比較した本発明の際だった技術的な違いは、さまざまな線維症を治療するためのヒトメタロプロテアーゼＭＭＰ−８活性および／または潜伏性、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−１３、ヒトｕＰＡ（ウロキナーゼプラスミノゲン活性因子、野生型および／または改変型）、およびＴＧＦ−βタイプＩＩ用の切断型レセプターおよび「Ｓｍａｄ７」などの治療因子の特異性である。
【００１７】
米国特許第５，８９５，７５９号は、遺伝子治療用の組織特異的ベクター（肝臓）を特許請求しており、これを使用して遺伝子を損傷した肝臓に送ることができる。これらのベクターは化学的にまたは酵素によってプロモーターに結合しており、ポリペプチドエンベロップ中に包まれている抗体に結合することもできる。さらに、アッセイするベクターまたはウイルスはＢ型肝炎ウイルスである。したがって、この特許中に記載される損傷した肝臓への遺伝子の送達は、本発明のものとはまったく異なるシステムを使用し、治療される線維症または硬変のプロセスとは何ら関係がない。
【００１８】
米国特許第５，５５９，０９９号は、ペントンと呼ばれるアデノウイルスからのキメラタンパク質を含むアデノウイルス組換えベクターを記載しており、これはペントンではない配列および治療遺伝子を含み、治療遺伝子を含むこのようなアデノウイルスベクターを組換えるために、このようなアデノウイルス、転移アデノウイルスベクターを使用することを含む遺伝子治療の方法を進展させる。
【００１９】
米国特許第５，８８５，８０８号は、アデノウイルスの分子の異なる細胞への結合を伴なうアデノウイルスの使用も特許請求しており、その分子は米国特許第５，８４６，７８２号および５，７１２，１３６号のように改変されており、アデノウイルスベクターが使用され、このベクターは改変され異なるペプチドドメインを含んでいる。
【００２０】
最後に米国特許第５，６７０，４８８号は、遺伝子治療用のベクターに関するものであり（膀胱線維症に特に有用である）、これらのベクターを使用する方法の開発についても言及している。本発明と前述の現況技術の考えられる関係は、改変することができるアデノウイルスベクターの使用、およびこれらのアデノウイルスベクター中に挿入される遺伝子の発現を引き起こす誘導プロモーターの使用である。しかしながら本発明の技術的な性質は、肝臓、腎臓および肺線維症などの異なる種類の線維症、および肥大性瘢痕を治療するための、治療遺伝子の特異的使用に焦点が当てられる。
【００２１】
前述の文献中に記載される従来現況技術と対照的に、本発明の重要性は本発明自体の技術的な性質、およびそこから誘導される追加的な利点に基づいており、これらを以下でより詳細に記載する。
【００２２】
アデノウイルスベクター
本発明では、いくつかの考慮事項に基づいてアデノウイルスベクターの使用を判定した。１）非常に高いタイター（１ｍｌあたり１０９〜１０１０個の感染粒子）で、これらのベクターを生成することができる。２）しかしながら、静脈内注射でベクターを投与すると、これらは非常にさまざまな細胞を冒し、これらの大部分は肝臓器官中に位置する。３）これらのベクターは、分裂していない細胞に効率的に遺伝子を運ぶ。４）これらのベクターがゲストゲノム中に組み込まれることはほとんどなく、これによって挿入的突然変異誘発による細胞の形質転換の危険性が回避される（Ｄｏｕｇｌａｓ　ＪＴ．ａｎｄ　Ｃｕｒｉｅｌ　ＤＴ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ　１９９７．４４〜５３　ａｎｄ　Ｚｅｒｎ　ＡＭ．　ａｎｄ　Ｋｒｅｓｉｎａ　ＴＦ．　Ｈｅｐａｔｉｃ　Ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　１９９７、Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２、４８４〜４９１）。
【００２３】
アデノウイルスは、ヒトの遺伝子治療のプロトコルにおいて、遺伝子を送達するための最も有望な媒体すなわちベクターであろう。なぜならアデノウイルスには、血液流中に投与するとそれ自体が非常に安定するという独特の性質があるからである。この特異的な性質によって、臨床試験において（患者への苦痛のない静脈内注射による投与によって）これらを効率的に使用することができる（Ｄｏｕｇｌａｓ　ＪＴ．ａｎｄ　Ｃｕｒｉｅｌ　ＤＴ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｓ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ　１９９７．４４〜５３）。
【００２４】
アデノウイルスは二本鎖ＤＮＡウイルスである。これらは２０面体構造を有し、非常にさまざまなホ乳類細胞のタイプを冒し、まだ同定されていない細胞表面の特異的なレセプターの偏在的な発現をサポートする。カプサイドのタンパク質成分によって細胞へのその結合が起こり、レセプター仲介型のエンドサイトーシスによってウイルスが細胞中に入る。
【００２５】
４０を超える異なるヒトアデノウイルスのステレオタイプが同定されており、この中でタイプ２（Ａｄ２）および５（Ａｄ５）がより広く研究されており、したがって遺伝子治療用のベクターとしてより広く使用されている。この２つのＡｄステレオタイプの非常に重要な性質は、これらは悪性のヒトプロセスとは決して関係がないということである。
【００２６】
組換えアデノウイルスを作製するための戦略は、アデノウイルスゲノムの組織化に基づく。アデノウイルス遺伝子の発現は２期（初期および後期）において起こり、これらはアデノウイルスゲノムの複製の時間によって定義される。初期の遺伝子は４つの異なる転写単位をエンコードしている。Ｅ１、Ｅ２およびＥ４は、アデノウイルスＤＮＡの複製を誘発する必須の調節タンパク質をエンコードしている。遺伝子Ｅ３は必須でない遺伝子である。後期の遺伝子の産物はカプサイドの主要なタンパク質を含み、これらは独特のプロモーターから転写される（Ｇｒａｈａｍ　ＦＬ、ａｎｄ　Ｖａｎ　Ｄｅｒ　Ｅｂ　ＡＪ．Ａ　Ｎｅｗ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｓｓａｙ　ｏｆ　ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　５　ＤＮＡ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１９７３、５２：４５６〜４６７）。
【００２７】
外来性遺伝子、またはウイルスの複製を必要とするアデノウイルスゲノム領域の置換されている着目ＤＮＡの配列を導入することによって、組換えアデノウイルスが生成される。このアデノウイルス組換えベクターは、Ｅ１およびＥ３ゲノム領域が欠失している。Ｅ１またはＥ３領域の置換、アデノウイルスゲノムのＥ４領域と右端の間への外来性遺伝子の挿入の両方によって、組換えアデノウイルスの生成が行われる。アデノウイルスゲノムの右端の間への外来性遺伝子の挿入に基づく、あるいはＥ３領域の置換によるベクターはその複製能力を維持している。対照的に、初期の領域Ｅ１の置換によってその複製能力に欠陥があるベクターが生成され、したがってこれはある細胞株中でのみで分散することができ、置換型アデノウイルス領域の機能の不在下、または共同ウイルスの存在下で「トランス」を供給する。当然ながら、遺伝子転移ベクターとして最も一般的に使用されるのは、複製能力のないアデノウイルスベクターである（Ｄｏｕｇｌａｓ　ＪＴ．ａｎｄ　Ｃｕｒｉｅｌ　ＤＴ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｓ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ、１９９７、４４〜５３）。
【００２８】
アデノウイルスベクターの作製および線維症を治療するためのその適用例を、以下に記載する実施例において示す。
【００２９】
（発明の目的）
本発明から誘導される目的および利点を以下に示す。
本発明の一目的は、レポーター遺伝子ｌａｃ−７およびＧＦＰ、およびコラゲナーゼまたは潜伏性および／または活性形のメタロプロテアーゼＭＭＰ−８の治療遺伝子のクローニングによって、組換えアデノウイルスベクターｐＡｄＧＦＰ−ＭＭＰ−８を作製するための手順を提供することである。
【００３０】
本発明の他の目的は、全身性線維症の治療、それに罹患している疑いのある器官において有用な治療タンパク質をエンコードしている、外来性遺伝子または着目ＤＮＡ配列を有するアデノウイルス組換えベクターを提供することである。このような遺伝子は、ＭＭＰ−８の活性および潜伏性、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−１３、ｕＰＡ（野生型および／または改変型）であるが、これらには限られない。
【００３１】
本発明によれば、全身性線維症を治療するための、組換えアデノウイルスベクターを、治療的に効果のあるウイルス粒子量を含む薬剤組成物、線維症の治療におけるその使用および治療的用途も提供される。
【００３２】
全身性線維症、特に肝硬変の治療における１つの重要な利点は、使用する投与方法による組織特異的認識によって治療遺伝子の送達が行われることである。
【００３３】
最初に肝硬変を回復させることを対象とする本発明の治療的用途の他の利点は、全身性線維症に罹患している疑いのある他の標的器官において全身性線維症を治療することであり、これはホ乳動物の肺、心臓、皮膚、腎臓線維症の治療を含むが、これらには限られない。
【００３４】
他の目的は、通常ヒトを冒す２タイプの硬変（アルコール性硬変および原発性胆汁性肝硬変）に似ている硬変によって冒されている動物の肝臓に遺伝子を効率的に送る技術の設計である。
【００３５】
線維症の治療から生じる他の利点は、ベクターを注射したいずれの動物においても組換えアデノウイルスが致死的な毒性を誘導することはないということである。
【００３６】
本発明の他の目的によって、アデノウイルスベクターの感染作用によって誘発される内性組織−グルコシダーゼ活性と細菌−グルコシダーゼの間のＸ−Ｇａｌを用いる染色反応の変化を識別することが可能である。緑色の蛍光タンパク質を使用することによって、ラットの異なる器官のｉｎ　ｖｉｖｏでの形質導入を確認し、ベクター投与が適切であるか、発現が続いているかどうかを確認することができ、動物を殺さずに手術後に追加的な観察を行うことができる。
【００３７】
最後にこれらすべての証拠によって、我々のシステムが、正常な肝臓機能または同じ病状によって冒された他の器官の正常な機能を再構築する目的で、ヒトメタロプロテアーゼＭＭＰ−８活性および潜伏性、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−１３、沈着した過剰なコラーゲンを分解するコラゲナーゼおよび／またはヒトｕＰＡ（ウロキナーゼプラスミノゲン活性遺伝子、改変型および野生型）、肝臓成長因子（ＨＧＦ）、ＴＧＦ−βタイプＩＩ用の切断型レセプターおよび硬変ラットの肝臓へのＳｍａｄ７などの治療遺伝子を送達するための効率的な媒体を含むことが示唆される。
【００３８】
したがって本発明ではアデノウイル組み換えスベクター、薬剤組成物の製造方法、線維症の治療、特に肝硬変の治療のための治療的使用を提供する。
【００３９】
本発明の他の独自性および利点は、好ましい目的および実施形態に関する以下の詳細な説明、特許請求の範囲の記載および添付の図面から明らかになるであろう。
【００４０】
（発明の詳細な説明）
組換えアデノウイルスベクター（ＡｄＲ）を健康な実験動物に全身投与することにより、その肝臓に対するこれらのベクターの特異的ホーミングや高い優先的親和性が見られることが多くの報告により示されている。これまで、ＡｄＲがラットの肝硬変肝臓に導入され得るかどうかは知られていなかった。前記のように、肝硬変は肝実質全体、主に中心静脈および門脈における線維症が亢進し、シヌソイドと肝細胞との間の巨大分子の交換を妨害するバリヤーを作ることに特徴があり（Ａｎｔｏｎｉ　ＰＰ，Ｈｉｓｈａｃｋ　ＫＧ，Ｎａｙａｋ　ＮＣ，Ｐｏｕｌｓｅｎ　ＨＥ，Ｓｃｈｅｕｅｒ　ＰＪ，Ｓｏｂｉｎ　ＬＨ．Ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ；Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ，ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．１９７７；５５：５２１−５４０；およびＳｃｏｔｔ　Ｌ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ；Ｔｈｅ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｂａｓｉｓ　ｏｆ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｆｉｂｒｏｓｉｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｔｈｅ　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９３，Ｖｏｌ．３２８，Ｎｏ．２５：１８２８−１８３５）、本プロトコルは、たとえこのバリヤーの存在下においても外因性遺伝子が、肝硬変肝臓へ全体的に送達され得るかどうかを確認するために設計された。
【００４１】
したがって我々は、ＬａｃＺおよびＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質）レポーター遺伝子を含有するＡｄＲが、肝臓の小葉構造が変形していても肝硬変ラット肝臓に形質導入できるという仮説を立てる。
【００４２】
そうであれば我々は図２に示すように肝臓の正常な機能を再確立するために、コラゲナーゼであるヒトＭＭＰ−８（活性および潜在性）、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−１３；ヒトウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ野生型および／または修飾型）；図２および図１８に示されるような蓄積した過剰のコラーゲン蛋白質を分解および／またはコラーゲン蛋白質の合成亢進を防止するＴＧＦ−β型ＩＩおよびＳｍａｄ７に対する切断型レセプター；および／またはｕＰＡなどの肝再生を刺激する蛋白質をコードする遺伝子；のような治療遺伝子を、これらの肝臓に送達することができよう。
【００４３】
本発明は、慢性の退化的疾患、特にヒト肝硬変の治療のために、図２に見られるように肝臓の正常な機能を再確立するための治療的蛋白質を作る遺伝子を肝臓に送達する効率的な媒体の確立により、代替遺伝子治療を実施するための研究の流れに糸口をつけるものである。図２は、どのように治療遺伝子、この場合はコラゲナーゼ（マトリクスのメタロプロテアーゼ、ＭＭＰ類）を肝臓に効率的に送達かを示す。これらのメタロプロテアーゼ類の過剰発現を介してコラーゲンの分解を促進することが可能である。
【００４４】
図３では、アデノウイルスベクターのクローニングと生産の方法が示される。プラスミドｐＤｅｌｔａＥ１ｓｐ１Ｂは、アデノウイルスＡｄ５配列を含有しており、ここに細菌遺伝子Ｌａｃ−ｚが挿入された。細胞系２９３にｐＢＨＧ１０と共トランスフェクションすると、このプラスミドはｐＢＨＧ１０と組換えを起こして完全ウイルス粒子が得られた。ベクターｐＡｄＧＦＰは以下のようにして得られた：ＭＭＰ−８遺伝子（プラスミドＰＥＰＣＫ−ＭＭＰ−８由来）を媒体ベクターｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶ中にクローン化し、その結果得られたプラスミドを制限エンドヌクレアーゼＰｍｅ１で線状にし、次にプラスミドｐＡｄＥＡＳＹ−１とともに大腸菌（ＢＪ５１８３）を形質転換した。組換え体コロニーをカナマイシン耐性により選別し、それからエンドヌクレアーゼによる制限分析によって組換えを確認した。最後に、線状化組換えプラスミドでパッケージング細胞系（２９３細胞）を形質移入すると、７〜１２日以内に図３と図４に示されるように組換えアデノウイルスが得られる（Ｔｏｎｇ  Ｃｈｕａｎ  Ｈ．，Ｓｈｉｂｉｎ  Ｚ．，Ｌｕｉｓ  Ｔ．Ｊｉａｎ  Ｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｗ．およびＶｏｌｇｅｓｔｅｉｎ  Ｂｅｒｔ：Ａ  ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｐｒｏｄ．Ｎｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  Ｖｏｌ．９５：２５０９−２５１４，Ｍａｒｃｈ  １９９８）。インビトロでの形質導入程度を評価するために、肝臓のＨｅｐＧ２細胞系およびマウスから単離された腹腔マクロファージが用いられた。図５では、培養細胞におけるガラクトシダーゼの発現が示され、Ａ）、Ｂ）、Ｃ）は、ＨｅｐＧ２細胞（３２０×）に対応し、Ｄ）、Ｅ）、Ｆ）はマウスの腹腔マクロファージ（１００×）である。Ｃ）とＦ）ではＡｄ５−Ｇａｌベクターに由来する１×１０５ウイルス粒子／ｍｌで形質導入された細胞が示されている。プラスミドＤＮＡＰＧＫ−Ｇａｌとして各培養皿に加えたレポーター遺伝子Ｌａｃ−Ｚの取込みの程度を比較するために３種類の方法で実施された。すなわち、Ｃａ＋＋リン酸塩による沈降によるもの（Ｃｈｅｎ　ＣおよびＯｋａｙａｍａ　Ｈ．Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ，ａ　ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ　ｗｉｔｈ　ｐｌａｓｍｉｄｉｃ　ＤＮＡ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｗｓ　１９８８，６：６３２−６３８）、ＤＮＡ複合体−ポリリジン−ラクトース（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｆｏｎｇ　Ｄ．，Ｍｕｌｌｅｒｓｍａｎ　ＪＥ，Ｐｕｒｃｈｌｏ　ＡＦ，Ａｒｍｅｎｄａｒｉｔｚ−Ｂｏｒｕｎｄａ　Ｊ．およびＭａｒｔｉｎｅｚ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ　Ａ．，Ｎｏｎ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ：Ａ　ｎｅｗ　ｔｏｏｌ　ｆｏｒ　ｔａｒｇｅｔｅｄ　ｇｅｎｅ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．６：１６０２−１６０８）で、ベクターＡｄ５−ｇａｌおよびｐＡｄＧＦＰＭＭＰ８を用いた。βＧａｌ活性の視覚化は反応性Ｘｇａｌで、ＧＦＰは���光顕微鏡ステレオスコープで確認した。ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイには、反応性Ｘｇａｌによるｇａｌ染色は様々なｐＨの懸濁液を用いて標準化した。（Ｗｅｉｓｓ  ＤＪ，Ｌｉｇｉｔｔ  Ｄ．およびＣｌａｒｋ  ＪＧ．Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｌｕｎｇ：ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｘｇａｌ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｉｎ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｅｄ  Ｌａｃ−Ｚ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  １，１９９７，８：１５４５−１５５４）。
【００４５】
使用された実験的肝硬変モデルは：ａ）四塩化炭素（ＣＣｌ４）により生じた慢性中毒、腹膜投与の８週目から肝硬変が始まって確立されたもの（Ｍｉｏｎ　Ｆ．Ｇｅｌｏｅｎ　Ａ，Ａｇｏｓｔｏ　Ｅ．およびＭｉｎａｉｒｅ　Ｙ．Ｃａｒｂｏｎ　ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ　ｉｎ　ｒａｔｓ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｃｕｔｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｏｘｉｎ　ｏｎ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　１９９６，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．２：５８２−５８７）；およびＢ）胆汁管の結紮（ＬＣＢ）で、肝硬変が手術後４週目以降に見られたもの（Ｌｅｅ　Ｓ，Ｇｉｒａｕｄ　Ｃ．，Ｄｒａｉｌｌｏｎ　Ａ．，ＨＡＤｅｎｇｕｅ　Ａ．およびＬｅｂｅｃ　Ｄ．，Ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｂｉｌｅ　ｄｕｃｔ　ｌｉｇａｔｅｄ　ｒａｔｓ；ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｅｎｔｏｂａｒｂｉｔａｌ　ｓｏｄｉｕｍ．ＡＭ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｆｉｓｉｏｌ．１９８６；２５１：１７６−１８０；Ｎａｋａｎｏ　Ｓ．，Ｈａｒａｋａｎｅ　Ｊ．およびＨａｓｈｉｍｏｔｏ　Ｈ．，Ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｐｅｒｉｂｉｌａｒｙ　ｄｕｃｔｓ　ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｒａｔｓ　ａｆｔｅｒ　ｃｏｍｍｏｎ　ｂｉｌｅ　ｄｕｃｔ　ｌｉｇａｔｉｏｎ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，１９５５，Ｖｏｌ．２１，Ｎｏ．５：１３８０−１９９５；Ｄｕｍａｓ　Ｗａｌｌａ　Ｒ．，Ｂｅｌｃｏｗｉｔｚ　Ｄ．およびＨ．Ｅｕｂｉ　ＪＥ．Ａｄａｐｔｉｖｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｎｔｅｒｏｈｅｐａｔｉｃ　ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｌｅ　ａｃｉｄ　ｔｏ　ｅｘｔｒａ　ｈｅｐａｔｉｃ．Ｃｌｏｌｅｓｔｉａｓｉｓ　Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　１９９６，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．３：６２３−６２９およびＰｏｏ　Ｊ．Ｌ．，Ｓｔａｎｅｓ　Ａ．，Ｐｅｄｒａｚａ−Ｃｈａｖｅｒｒｉ　Ｊ．，Ｃｒｕｚ　Ｃ．，Ｐｅｒｅｚ　Ｃ．，Ｈｕｂｅｒｍａｎ　Ａ．およびＵｒｉｂｅ　Ｍ：Ｃｒｏｎｏｌｏｇｉａ　ｄｅ　ｌａ　Ｈｉｐｅｒｔｅｓｉｏｎ　Ｐｏｒｔａｌ，Ｄｉｓｍｉｎｕｃｉｏｎ　ｄｅ　ｌａ　Ｅｘｃｒｅｃｉｏｎ　ｄｅ　ｓｏｄｉｏ　ｙ　ａｃｔｉｖａｃｉｏｎ　ｄｅｌ　ｓｉｓｔｅｍａ　ｒｅｎｉｎａ−ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎａ　ｅｎ　ｃｉｒｒｏｓｉｓ　ｂｉｌｌａｒ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ．Ｒｅｖ．，Ｉｎｖｅｓｔ　Ｃｌｉｎ，４９：１５−２３，１９９７）。
【００４６】
Ａｄ５　ｇａｌを肝硬変のない対照ラットに同時に同一ロットから投与した。ＣＣｌ４中毒の５週目と８週目のラットおよび胆汁管の結紮（ＢＤＬ）２週目と４週目のラットを組換えアデノウイルスの投与７２時間後に殺して組織学的分析を行い、ＡｄＲによってコード化されたガラクトシダーゼ蛋白質（ｇａｌ）の発現を測定した。この目的のため、肝臓、脾臓、心臓、肺臓、腎臓、脳を抽出し、組織片を５〜６ｍｍのキューブに切り、これを凍結用液Ｔｉｓｓｕｅ　Ｔｅｋ　Ｏ．Ｃ．Ｔに入れ、組織を−３０℃に凍結して、クリオスタットで切断して８μｍの断片を得た。これらの断片をシラン化スライドグラス上に乗せ、１５〜３０分間、ホルマリン、ｐＨ８．５で固定し、１６〜１８時間、Ｘｇａｌに曝露し、ニュートラルレッド染色で対比染色した（Ｗｅｉｓｓ　ＤＪ，Ｌｉｇｉｔｔ　Ｄ．およびＣｌａｒｋ　ＪＧ．Ｉｎ　ｓｉｔｕ　Ｈｉｔｉ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｌｕｎｇ：ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｘｇａｌ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｉｎ　ｄｉｓｔｉｎｇｕｉｓｈｉｎｇ　ＡＣ−Ｚ　Ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ　ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　１，１９９７，８：１５４５−１５５４）。同一サイズの複数領域での形態測定分析により陽性細胞のパーセンテージを測定し平均値を計算した。さらに、肝硬変ラットの肝臓断片を得て、組織をパラフィンに吸収し、切断してコラーゲン蛋白質を特異的に染色するシリウスレッドで染色した（Ａｒｍｅｎｄａｒｉｚ−Ｂｏｒｕｎｄａ　Ｊ．およびＲｏｊｋｉｎｄ　Ｍ．，Ａ　ｓｉｍｐｌｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｉｎｇ　ｉｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｓａｍｐｌｅｓ：Ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｈｕｍａｎ　ｌｉｖｅｒ　ｗｉｔｈ　ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｉａｓｉｓ．Ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．，１９８４，Ｖｏｌ．４，３５−４７）。この方法により、肝臓実質における線維症と胆汁管亢進の程度を明らかに確認することができる。ＧＦＰの細胞へのインビボ形質導入を確認するために、我々はｐＡｄＧＦＰ−ＭＭＰ−８ベクターを投与された健康なウィスターラットを用い、７２時間後、側腹切開を行ない、剥き出しになった器官を蛍光顕微鏡で目視し、その後、傷口を閉じてその動物を生かしておいた。
【００４７】
実験的肝硬変の生理病理学の研究に関して、ここに示す以前の結果を図２にまとめてある。前述の図は、インビボでクッパー細胞により産生される前炎症性および前線維形成サイトカイン類の役割を示すが、クッパー細胞は、同様に肝性星状細胞（ＨＳＣ）を活性化して、過剰なコラーゲンを産生させ、それが内皮下空間に蓄積して肝細胞とシヌソイドの間の交換を妨げる（Ａｒｍｅｎｄａｒｉｚ−Ｂｏｒｕｎｄａ　Ｊ．，Ｋａｔａｙａｍａ　Ｋ．およびＳｅｙｅｒ　Ｊ．Ｍ．：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　Ｉ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｒｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ　ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　ｂｙ　ＩＬ−１ｂｅｔａ，ＴＮＦａｌｆａ　ａｎｄ　ＴＧＦ　ｉｎｔｏ　ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４３１６−１４３２１，１９９２；Ａｒｍｅｎｄａｒｉｚ−Ｂｏｒｕｎｄａ　Ｊ．，Ｋａｔａｉ　Ｈ．，Ｊｏｎｅｓ　Ｃ．Ｍ．Ｓｅｙｅｒ　Ｊ．Ｍ．Ｋａｎｇ　Ａ．Ｈ．およびＲａｇｈｏｗ　Ｒ．：Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｂｅｔａ　ｉｓ　ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ａｔ　ａ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｓｔａｇｅ　ｄｕｒｉｎｇ　ｌｉｖｅｒ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ＣＣＬ４　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，６９：２８３２９４，１９９３およびＡｒｍｅｎｄａｒｉｚ−Ｂｏｒｕｎｄａ　Ｊ．，Ｒｏｙ　Ｎ．，Ｓｉｍｊｅｗｉｓｈ　Ｃ．，Ｒａｇｈｏｗ　Ｒ．，Ｓｅｙｅｒ　Ｊ．Ｍ．およびＫａｎｇ　Ａ．Ｈ．；Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｉｔｏ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｓ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＡＰＩ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　３０４：８１７−８２４，１９９４）。培養細胞におけるＬａｃ−ｚ遺伝子取込み程度は、リン酸カルシウム法、ＤＮＡ−ポリリジン−ラクトース複合体法、およびＨｅｐＧ２とＰＭＭ（マウス腹膜マクロファージ）における組換えアデノウイルスベクターを用いる方法の間で肉眼的違いを示した。図５に示すように、アデノウイルスを用いた形質導入度は１００％に達し、他の２つの方法によるものは、約１％である。図６は、培養細胞内の緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）の発現を示し、Ａ）は、アデノウイルスベクターｐＡｄＧＦＰ−ＭＭＰ８を用いて導入されたマウス腹膜マクロファージの投与（５０×）７２時間後であり、Ｂ）は，アデノウイルスベクターｐＡｄＧＦＰ−ＭＭＰ８を用いて導入されたＨｅｐＧ２細胞の投与（５０×）７２時間後であり、Ｃ）、はアデノウイルスベクターを用いないＨｅｐＧ２細胞である。写真は全て蛍光顕微鏡ステレオスコープで取られた。ガラクトシダーゼ活性同定のための展開において、細胞は固定されねばならないので死滅することを指摘する必要がある。ＧＦＰアッセイでは細胞はまだ無傷で生きている。
【００４８】
図７は、腸骨静脈によるＡｄ５ｇａｌの注入後の種々の器官におけるｇａｌの発現を示す。内因性発現と細菌の外因性ガラクトシダーゼとを区別するために固定、洗浄および種々のｐＨを用いたＸｇａｌ溶液を使用した。図ＡではｐＨ７．０であり、図ＢではｐＨ８．５であった。これは、種々の実験条件のアッセイ結果をまとめたものであり、ｐＨ８．５のＸｇａｌ溶液への組織表示が内因性ガラクトシダーゼの発現を除外できることが理解し得る。我々は正常なラットの種々の器官、すなわち肝臓、腎臓、肺、心臓、脳、脾臓から凍結組織片を得て、５週間または８週間、ＣＣｌ４で中毒させた。図８に示されるように、ＣＣｌ４の長期投与ラット［Ａ）はＣＣｌ４の５週間投与、Ｂ）はＣＣｌ４の８週間投与］と健康なラットの双方において主な標的器官は肝臓であることがグラフで明らかにされている。脾臓と肺への導入度は、１％以下を示す。したがって、これはグラフからは明白ではない。ラットには、Ａｄ５ｇａｌベクターの３×１０１１ウイルス粒子／ｍｌを投与した。健康な対照ラットでは、合計７０％の肝細胞形質導入を示したが、脾臓および肺は１％未満の導入しか示さなかった。その他の器官での形質導入は見られなかった。前述のように、健康なラットから組織片を得て、２週間ＢＤＬおよび４週間ＢＤＬのラットの組織と比較した。図９は、主な標的器官が、ＢＤＬラット［Ａ）２週間のＬＣＢ、Ｂ）４週間のＢＤＬ］と健康ラットの双方において、確かに肝臓であることを明らかに示す。脾臓と肺は１％未満の形質導入度であり、したがってグラフでは殆ど認められない。ＡＤ５ｇａｌ１ベクターの３×１０１１ウイルス粒子／ｍｌの用量で、ＢＤＬラットは合計１０％の形質導入肝細胞を示す。肝臓以外では、脾臓と肺が１％未満の形質導入を示した。その他の器官では形質導入を示さなかった。図１０では、ＣＣｌ４の長期投与によって誘導された肝硬変モデルを用いた組織学的結果が示されており、Ａ）は、腸骨静脈を介したＡｄ５ｇａｌ投与７２時間後の正常ラットの肝臓片を示す（合計５匹のラット実験のうちの代表的切片）。７０％以上の肝細胞が、ｇａｌの発現に対して陽性である（２００×）；Ｄ）図Ａと同一の肝臓であるが、コラーゲン合成と蓄積を観察するために、シリウスレッドで染色した（２００×）；Ｂ）ＣＣｌ４による５週間の長期中毒化後の肝臓。肝細胞の約３０〜４０％の形質導入が達成された；Ｅ）Ｂと同一の肝臓だが、シリウスレッドで染色したもので、コラーゲン量の増加が認められ、肝臓の構造が変形し始めている（２００×）；Ｃ）ＣＣｌ４による８週間の長期中毒化後のラット肝臓で肝硬変を生じている。ここでも４０％以上の肝細胞がβｇａｌ発現に陽性であった；およびＦ）Ｃと同一の肝臓だが、シリウスレッドで染色。中心静脈と門脈との間に形成されたコラーゲンの大量蓄積（２００×）が特徴的。図１１では、肝硬変が誘導された胆汁管結紮（ＢＤＬ）モデルで得られた結果が示されている。Ａ）は腸骨静脈を介したＡｄ５ｇａｌ投与７２時間後の正常ラットの肝臓片を示す（合計５匹のラット実験のうち代表的な１切片）。７０％以上の肝細胞がｇａｌ発現に対し陽性である（２００×）；Ｄ）図Ａと同一の肝臓だが、コラーゲンを観察するた��シリウスレッドで染色した（２００×）；Ｂ）２週間のＢＤＬ後のラット肝臓。腸骨静脈を介したＡｄ５βＧａｌ投与７２時間後にβ−ｇａｌアッセイを実施した。約１０％の肝細胞にレポーター遺伝子を用いて形質導入が達成できた；Ｅ）Ｂと同一の肝臓だが、シリウスレッドで染色した。肝臓の構造が、胆汁うっ滞に誘導された線維症と胆汁管の顕著な増大（２００×）によって変形し始めている；Ｃ）４週間ＢＤＬ後のラット肝臓で肝硬変が生じている。腸骨静脈を介したＡｄ５βＧａｌ投与７２時間後、β―ｇａｌアッセイを実施した。ここでもまた、１０％の肝細胞の形質導入が達成された；およびＦ）Ｃと同一の細胞だが、シリウスレッドで染色。コラーゲン蛋白質の大量蓄積と胆汁管増殖を観察（２００×）。図１２は、ｐＡｄＧＦＰ−ＭＭＰ−８ベクターを投与した健康なウィスターラットの側腹切開を示す。ＧＦＰの発現が肝臓および僅かではあるが脾臓にも明らかに見られる。大変重要なことは、アデノウイルスベクターの注入によって、健康および対照双方の実験動物には致死的中毒を誘導しなかったことである。
【００４９】
本発明を適用する好ましい方法は、本発明の組換えアデノウイルスベクターまたはそれを含む製剤化合物の静脈内投与であり、線維症の個人に対して、便利な治療プログラム単位で治療的に効果のある量を投与するものである。この治療プログラムは疾患の程度によって調整することができる。一般的には、個人に対し約１０７〜１０１４ウイルス粒子の治療プログラム単位が用いられる。本発明のアデノウイルス組換えベクターを含む製剤化合物の調製は、当業者によく知られた標準的方法を用い、たとえば、澱粉、グルコース、乳糖、ショ糖、ゲル、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリル粉末、ＮａＣｌ，グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなど、慣用の製剤的に許容し得る任意の担体とを組合せて実施することができる。これらの化合物は、液剤、懸濁剤、丸剤、錠剤、カプセル剤、粉剤および徐放製剤などといった剤形を取ることができる。
【００５０】
上記説明と以下の例とは、本発明の具体的実施形態を説明する目的であり、本特許の範囲を限定するものと考えてはならない。
【００５１】
（実施例）
実施例１）：
メタロプロテアーゼ活性またはコラゲナーゼ（ＭＭＰ−８）活性およびその機能調節法を明示する方法論
ａ）細胞培養
ＨｅｐＧ２細胞は、ヒトヘパトーマ由来の実質起源細胞系であり、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ　Ｌ−グルタマックス（Ｇｌｕｔａｍａｘ）および抗生物質（１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｇ／ｍｌストレプトマイシン）で補足され、ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）（ＤＭＥＭ）により修飾されたイーグル培地の６０ｍｍ培養皿中、３７℃で９５％空気と５％ＣＯ２雰囲気下の湿気の中で培養した。
【００５２】
ｂ）潜伏性および活性なＭＭＰ−８遺伝子の発現ベクター
２種のＭＭＰ−８遺伝子と共に２種のプラスミドを用いて肝細胞にトランスフェクションした：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の強力なウイルスプロモーターと一緒になって潜伏性ＭＭＰ−８（プロＭＭＰ−８）をコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｃＤＮＡ−ＭＭＰ−８；およびＣＭＶプロモーターと一緒になって活性ＭＭＰ−８をコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｃＤＮＡ３−ＭＭＰ−８である。図１３に示すように、この最後のものは、制限酵素ＢａｍＨｌおよびＸｂａｌで切断して、ｐｃＤＮＡ３およびＰＥＴｌｌａ−ＨＮＣプラスミドを用い、ＮＭＰ−８触媒ドメイン（ポリペプチドとカルボキシ末端フラグメントを欠如する）をコードするＰＣＲ生成物を挿入するサブクローン化、潜伏性および活性なＭＭＰ−８遺伝子の施与により創製した。ＮＭＰ−８遺伝子を有する２種のプラスミドを、培養中肝細胞に送達するために用いた：１）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の強力なウイルスプロモーターおよび活性形でコラゲナーゼをコードするｃＤＮＡを有するプラスミドのｐｃＤＮＡ３−ＭＭＰ−８。
【００５３】
レポーター遺伝子としてｐＳＶ２−ｇａｌプラスミドを用いた。前記プラスミドは、ＳＶ４０ウイルスプロモーターに隣接して挿入された酵素ガラクトシダーゼをコード化する遺伝子を有する。
【００５４】
ｃ）プラスミドの形質変換、増幅および精製
種々のアッセイに用いられるプラスミド類各々の十分な量を獲得するために、各々のプラスミドを、供給者（ライフテクノロジーズ、メリーランド州ゲイセルスバーグ）の使用説明書に従って大腸菌ＤＣＨ５（商標）に導入した（本法は、形質転換として知られている）：反応チューブにおいて有能な株ＤＨ５の５０μｌを用いて、２μｌのプラスミド（１〜１０ｎｇのＤＮＡ）を加えた。混合後、それを氷浴上３０分間培養し、熱ショック（３７℃２０秒）を与えてから直ちに氷浴上２分間冷却した。この時間の最後に、０．９５ｍｌの細菌培養培地ルリア塩基（Ｌｕｒｉａ　Ｂａｓｅ）（ＬＢ）を加えて３７℃で１時間２２５ｒｐｍで撹拌し、プラスミドを発現させた。該発現後、５０μｌの反応混合物を取り、１００ｇ／ｍｌのアンピシリンを有する寒天平板に播種し、３７℃で一晩培養した。この期以降に生育するコロニーは、抗生物質に対する抵抗性のため、興味のあるプラスミドを含むものである。
【００５５】
該プラスミドを増幅するために、寒天平板から二つのコロニーを取り、１００ｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１リットルのＬＢ培地中、３７℃で２４時間２２５ｒｐｍの一定攪拌により生育させた。培養光学密度が０．６になったら、６，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、細菌ペレットを再度採集した。この細菌ペレットからプラスミドＤＮＡを、細菌壁のアルカリ溶解、内部プラスミドの遊離および特定の樹脂を介してのこのＤＮＡの分離に基づくプラスミド精製キット（モンスタープレップ（Ｍｏｎｓｔｅｒ−ｐｒｅｐ）、ＢＩＯ１０１、カリフォルニア州）を用いて、細菌のゲノムＤＮＡから分離した。その結果生じるλ＝２６０ｎｍの吸光度を吸光分光分析的に測定し、プラスミドＤＮＡの定量化を実行した。
【００５６】
ｄ）培養細胞のトランスフェクション
遺伝子を真核細胞に導入する最も普通に用いられる方法の１つは、リン酸カルシウムによるＤＮＡトランスフェクションであり、そこでは、外因性ＤＮＡが細胞表面に微細な複合体として沈着され、後に細胞により導入されて一時的に染色体ＤＮＡに組込まれる。より選択的にＤＮＡを肝細胞に送達させるためには、肝細胞が細胞膜にガラクトースに特異的なレセプターを有するので、ＤＮＡをポリリジン−ラクトースとの複合体の形態で使用する。このため、ＨｅｐＧ２細胞を７０〜８０％の集合で培養し、次いでプラスミドｐｃＤＮＡ−ＭＭＰ−８、ｐｃＤＮＡ３−ＭＭＰ−８およびｐＳＶ２−ガラクトシダーゼによりトランスフェクションした。トランスフェクションは、リン酸カルシウムによるＤＮＡ沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒＥｂ，１９７３年；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ１９８８年）およびポリリジン−ラクトースによる複合体形成（Ｍａｒｔｈｉｎｅｚ−Ｆｏｎｇら、１９９４年）により実施された。簡単に言うと、培養細胞を新たに形成された沈殿物（リン酸カルシウムとのトランスフェクションの場合に緩衝溶液ＨＥＰＥＳｐＨ７．１２中で２ＭのＣａＣｌ２を有するＤＮＡの溶液のプラスミドＤＮＡへの添加の生成物）と共に加えるか、またはポリリジン−ラクトースとのＤＮＡ複合体を加える。細胞は４時間から１６時間インキュベート培養して沈殿物を細胞表面に現し、後にこのＤＮＡは細胞内に取込まれ、そして一時的に核に導入される。この時期の終りに、培養培地を新鮮なものに取り替えＨｅｐＧ２細胞を１０％ウシ胎仔血清を有するＤＭＥＭ培地で培養する（図１４参照）。６０〜８０％の集合に達したら、潜伏形および活性形または成熟形のＭＭＰ−８遺伝子を有する１０ｍｇのプラスミドを加える。同時に、ガラクトシダーゼ（−ｇａｌ）の原核遺伝子を、トランスフェクションおよび発現効率をモニターするために加える。ＭＭＰ−８遺伝子は各種形態（そのままで、ＣａＰＯ４との複合体またはポリリジン−ラクトースとの複合体）で送られた。
【００５７】
ｅ）複合体ポリリジン−ラクトースおよびＤＮＡ：ポリリジン−ラクトース（ＤＮＡ：ＰＬ）の形成
ポリリジン−ラクトース複合体は、１４．８ｍｇのポリ−Ｌ−リジン（０．１Ｎ）を２００μｌの０．５Ｎ−ラクトース（ラクトース−ポリリジン比：１．０Ｎ）と反応する際に形成される。次いで、還元剤である２０ｍｇの水素化シアノホウ素ナトリウム３Ｍを加えて、３７℃で４８時間２２５ｒｐｍの一定攪拌により培養した。次いで、該反応は、リン酸緩衝液（ｐＨ７．２のＰＢＳ）で前もって調節された脱塩カラム（ＢｉｏＲａｄ１０−ＤＧ）を通し、同一の緩衝液で溶出した。炭水化物含量を、デュボイス（ＤｕＢｏｉｓ）法（１９５６年）により溶出分画で測定し、ＰＬ複合体の最終濃度を評価する基礎と考えられているＳｈｅｎら（１９８４年）の方法に従って、複合体のラクトシル化度およびポリリジン含量を分析する。図１４および図１６に示されるように、ＰＬの主要濃度を有する分画を、興味ある遺伝子を含有するプラスミドのＤＮＡとのさらなる反応に使用する。
【００５８】
トランスフェクションアッセイに使用されるＤＮＡ：ＰＬの最適モル比を評価するために、ＤＮＡを数種の濃度のＰＬと反応させた。培養１時間後、サンプルを１％遅延寒天ゲルに施与してＤＮＡの電気泳動（６０ミリボルト、１．５時間）に供すると、その中で最も大きなＰＬ含量を有するＤＮＡ：ＰＬ複合体は、遊離プラスミドによる移動よりも短い距離を移動する（０％遅延）。図１６に示すように、寒天ゲルでの８０〜９０％の遅延移動を引き起こすＤＮＡ：ＰＬ比を、ＣａＰＯ４およびポリリジン−ラクトースとの複合体でＨｅｐＧ２に送達されたガラクトシダーゼおよびｐｃＤＮＡ−ＭＭＰ−８の外因性遺伝子の効率的な発現を得るために使用した。
【００５９】
ｆ）−ガラクトシダーゼ（ｇａｌ）のレポーター遺伝子システムを用いる一時発現アッセイ
このシステムは、この酵素にコード化するＬａｃＺ遺伝子と一緒になって興味のある形質移入遺伝子を発現するレベルの測定法として−ガラクトシダーゼ酵素活性を決定する。該ガラクトシダーゼは、無着色基質Ｘ−ｇａｌの青色着色生成物への変換を触媒する細菌酵素である。このため、トランスフェクションに供された真核細胞に見られる−ガラクトシダーゼ活性は、細胞遺伝子に関連する興味のある遺伝子が好結果で取込まれたことを示す。培養皿での細胞着色に関する−ｇａｌのアッセイは、２％ｐ−ホルムアルデヒドによる４℃５分間の細胞固定、引き続くＰＢＳとの洗浄（３回）、および２０ｍＭフェリシアン化カリウム、２０ｍＭフェロシアン化カリウムおよび２ｍＭ塩化マグネシウムを含有するＰＢＳに１ｍｌの着色溶液の添加に続き０．５ｍｇ／ｍｌの最終濃度での基質Ｘｇａｌの添加から成る。４℃で一晩（１８時間）培養後、青色細胞を顕微鏡下で同定する（Ａｕｓｕｂｅｌ、１９９５年）。
【００６０】
ｇ）ＲＮＡ抽出
以後記載するように、トランスフェクション４８時間後、細胞を再度採取し、反応剤Ｔｒｉｚｏｌ（商標）を用いてＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（１９８７年）法によりＲＮＡを抽出する。すなわち細胞皿の各々に、１ｍｌのＰＢＳ溶液を加えて、細胞を細胞皿から削り取ることにより再度採取し、エッペンドルフチューブに移した。次いでそれを１０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、細胞ペレットを５００μｌのＴｒｉｚｏｌで処理し、ホモジナイズし、４℃で５分間培養した。１００μｌのクロロホルムを加えて、培養を４℃で５分間実施した。この後、１２、０００ｇで４℃１５分間遠心分離し、水性上相を清浄なチューブに移し、この中に等しい容量のイソプロパノールを加え−７０℃で１５分間培養して抽出ＲＮＡを沈殿させた。次いで、それを１２，０００ｇで４℃１５分間遠心分離し、上澄液をデカンテーションおよび清浄な無菌ペーパーによるチューブのグライイング（ｇｒｙｉｎｇ）により除去する。次いで、５００μｌの７５％エタノールを加えて、１２，０００ｇで４０℃で１０分間遠心分離した。最後にＲＮＡペレットを、ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）で処理した２０μｌから５０μｌの脱イオン水で懸濁し、ＲＮＡ濃度をλ＝２６０ｎｍでの分光側光により定量した。
【００６１】
ｈ）逆転写酵素の反応に関連するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（ＲＴ−ＰＣＲ）によるＭＭＰ−８遺伝子発現の分析
細胞に取込まれたＭＭＰ−８の外因性遺伝子の発現度を決定するために、相補的ＤＮＡを、以前に抽出されたＲＮＡから出発して得て（ｃＤＮＡ）、次いでポリメラーゼ連鎖反応により発現シグナルを増幅した。
【００６２】
ｃＤＮＡを得るために、以下の方法を用いた：総ＲＮＡの２μｇを脱イオン無菌水の８μｌ容量に取り、−７０℃で１０分間培養した。次いで、サンプルを氷水中５分間攪拌し、さらに氷中、以下の試薬を加えた：４μｌのＲＴ酵素用５Ｘ緩衝液、４μｌの２．５ｍＭｄＮＴＰ混合物、１μｌの無作為プライマー類（１ｇ／μｌ）、１μｌのＲＮＡａｓｅ（１Ｕ／μｌ）および最後に２μｌの逆転写酵素（２００Ｕ／ｌ）。反応混合物を室温で１０分間、次いで３７℃で１時間培養した。この時期の終りに、直ちに９５℃の温度で１０分間置き、次いで一定攪拌しながら氷水上に５分間置き、それを次の使用まで−７０℃で保存した。
【００６３】
ＭＭＰ−８遺伝子の特異的発現を分析するため、ＰＣＲ反応を、以下に記載された実験条件に従ってこの遺伝子に特異的なプライマー類またはオリゴヌクレオチド類を用いて設定した：２μｌのｃＤＮＡを含む反応チューブに、５μｌの２．５ｍＭ塩化マグネシウム、５μｌのマウスモロニー白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）由来のポリメラーゼ酵素用５Ｘ緩衝液、２μｌの２．５ｍＭ　ｄＮＴＰ類、５μｌの３μＭセンスプライマー、５μｌの３μＭアンチセンスプライマー、１μｌのポリメラーゼ酵素（Ｕ／ｌ）およびそれを脱イオン水で最終容量の５０μｌに取る（Ｉｎｎｉｓら、１９９０年）。ＭＭＰ−８に特異的なオリゴヌクレオチドセンスプライマーは、５’−ＡＧＣＴＧＴＣＡＧＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＴＡＧＡＡＡ−３’であり、アンチセンスプライマーは、５’−ＣＣＴＧＡＡＡＧＣＡＴＡＧＴＴＧＧＧＡＴＡＣＡＴ−３’である（Ｃｏｌｅら、１９９６年）。これらの試薬の添加後、この混合物を以下のプログラムに従って熱サイクラーに３０サイクルに亘って置いた：変性（９４℃、５分）、アニーリング（６０℃、１時間）および伸長（７２℃、１．５分）。次いで、ＰＣＲ生成物を１．５％寒天ゲル中電気泳動（６０ｍＶ、１．５時間）に供す。
【００６４】
ｉ）コラゲナーゼ活性のアッセイ
ＲＮＡ発現が陽性であった場合でも、このコラゲナーゼ蛋白質は、酵素的に不活性であることを見出すことができたため、コラゲナーゼの酵素活性分析を生成酵素の機能性を測定するために実施した。細胞を血清の無い培地中２４時間培養し、培養培地を回収し、細胞により分泌されたコラゲナーゼ活性をＨａｓｔｙら（１９８６年）の修飾方法により測定し、８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により特異的コラーゲン基質の分解産物を同定した。
【００６５】
簡単に言うと、１〜１．５μｇの蛋白質を含有する細胞上澄液を、５μｇの生来のコラーゲン１型、および６０μｌの培養緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５ｍＭＣａＣｌ２、０．０２％ＮａＮ３、５０ｍＭアルギニン、１％トリトンＸ−１００、１ｍＭＡＰＭＡ、ｐＨ７．６の存在下又は非存在下で）と共に２７℃１８時間培養した。最後に３０μｌの反応生成物を３０μｌの蛋白質用サンプル緩衝液と混合し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（７．５％）中の電気泳動を行ない、コラーゲンＩ型の分解産物１Ａと２Ａを同定した。
【００６６】
実施例２：
メタロプロテアーゼ活性またはコラゲナーゼ活性（ＭＭＰ−８）の証明およびその機能調節を示す結果
完全機能酵素についてコードするＭＭＰ−８ｃＤＮＡを取込むことが許されたサブクローン化を我々の必要に適したベクターにおいてサブクローン化した。そして図１５は、ＭＭＰ−８プラスミドを制限酵素で切断することにより遊離したＤＮＡフラグメントの電気泳動を示す。レーンＡ）１ＫｂのＤＮＡ梯子のｂｐマーカー（ギブコＢＲＬ）；レーンＢ）完全ＤＮＡマーカー（ノバゲン社）；レーン１）ＢａｍＨｌとＸｂａｌで切断するｐｃＤＮＡ−ＭＭＰ−８；レーン２）ＢａｍＨｌとＸｂａｌで切断するｐｃＤＮＡ３−ＭＭＰ−８；レーンＣ）Φ×１７４マーカー（ギブコＢＲＬ）；λＨｉｎｄＩＩＩマーカー（ギブコＢＲＬ）、この中で潜伏ＭＭＰ−８ｃＤＮＡ（レーン１）および成熟ＭＭＰ（レーン２）が、発現ベクターｐｃＤＮＡおよびｐｃＤＮＡ３におけるサブクローン化に成功した。遊離の挿入体は、制限酵素ＢａｍＨｌとＸｂａｌによる処理後に観察された。臭化エチジウムで染色されたバンドは、それぞれ成熟および潜伏ＭＭＰ−８ｃＤＮＡの各ｃＤＮＡ（５０６および５６０塩基対の間）に対応する。ＣａＰＯ４との複合体形態とポリリジン−ラクトースとの複合体形態でＨｅｐＧ２細胞に送達されたＭＭＰ−８に対するｃＤＮＡの取込み効率を評価するために、このプラスミドの共トランスフェクションが、−ガラクトシダーゼのレポーター遺伝子と共に実現した。この様式で、顕微鏡により青色着色が見られた細胞は、それらが興味のあるプラスミドにも組込まれたことを間接的に示す。図１６は、ＣａＰＯ４との複合体形態またはポリリジン−ラクトースとの複合体形態でトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞中の−ガラクトシダーゼの発現を示す。この図は、ポリリジンの濃度が高いほど−ｇａｌプラスミドの遅延が明確になることから、ポリリジン−ラクトースとのＤＮＡ結合が達成したことを示す。細胞にトランスフェクトするために選ばれた比率は、プラスミド移動の８０％が遅延したものであった。
【００６７】
培養中の細胞が、形質移入された遺伝子を組込み、発現できることが示されたので、このような遺伝子がＲＴ−ＰＣＲアッセイ法により宿主細胞の機構により転写されることを裏付ける必要があった。図１７は、ＭＭＰ−８およびＭＭＰ−１３に係るメッセンジャーＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる分析を示す。（このプラスミドは、トランスフェクションのさらなる陽性対照として使用された）；その中で、ＣａＰＯ４との複合体およびポリリジン−ラクトースとの複合体として送達されたＭＭＰ−８に対するｃＤＮＡのＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ電気泳動は、両方の場合ともトランスフェクトされたＨｅｐＧ２細胞に転写された。プラスミドがポリリジン−ラクトースとの複合体として送達される場合、ＭＭＰ−８（３５９塩基対）のＰＣＲの産生物シグナルは、より強烈であったことが観察される。
【００６８】
ＨｅｐＧ２細胞により発現されたＭＭＰ−８転写体が機能性蛋白質に翻訳されたことを証明するために、酵素活性に対するアッセイを、基質としてコラーゲン１型を用いて実施した。図１８は、培養培地に分泌された蛋白質のＩ型コラゲーン分解の酵素活性を示しているが、これは潜伏性ＭＭＰ−８の遺伝子によりトランスフェクトされる細胞に観察された。水銀化剤ＡＰＭＡによる以前の活性化（レーン７）、ＣａＰＯ４と複合した活性ＭＭＰ−８の遺伝子によるもの（レーン９）、ポリリジン−ラクトースと複合化した活性ＭＭＰ−８の遺伝子によるもの（レーン１０）、および２ｍＭのＥＤＴＡによる特異的阻害。陰性対照：細胞の上澄み液無添加の１型コラーゲン（レーン１）、およびトリプシン添加の１型コラーゲン（レーン３）、トランスフェクション無しの細胞の上澄液によるコラーゲン（レーン２）。陽性対照：ヒト白血病の上澄液による１型コラーゲン（レーン３）、０．０１５％細菌コラゲナーゼの添加による１型コラーゲン（レーン４）；および潜伏性および活性のＭＭＰ−８遺伝子によりトランスフェクトされた細胞の上澄液と共に培養後、６％ポリアクリルアミドゲル中分離した生来の１型コラーゲンの分解産物。両事例において、コラーゲン溶解性活性が、潜伏ＭＭＰ−８の場合ＡＰＭＡの存在下でまた、潜伏性および活性ＭＭＰ−８の双方に対するそのＥＤＴＡ阻害が、いかに明白であるかが観察された。この事実は、この蛋白質分解活性は、介在性マトリクスのメタロプロテアーゼに対応することを示している。生来の１型コラーゲンとトリプシンとの培養は、分解を示さなかった。それでこの実験は、コラーゲン分子の無損傷性を考慮するとＭＭＰ−８作用が特異的であったことを明確に示している。
【００６９】
図１９は、コラーゲンを特異的に分解する酵素活性が、それ自体が、ＰＥＰＣＫ（ホスホエノール−ピルベートカルボキシキナーゼ）遺伝子などの調節性遺伝子のプロモーターの転写制御下であるそれぞれのｃＤＮＡ類のクローン化により制御できる（オフおよび／またはオンにする）という証拠を示す。グルカゴン（レーン５および６）および環状ＡＭＰ（レーン７および８）との培養における細胞刺激は、双方ともＭＭＰ−８についてコードするメッセンジャーＲＮＡの産生をアップレギュレートすることは明瞭である。インスリンは、前記産生を低下することもまた明瞭である（レーン９および１０）。
【００７０】
内因性−ガラクトシダーゼの活性に関する観察は、この活性が通常顆粒状であり、外因性酵素活性の結果としての暗青色よりも着色が弱いことを示唆する（Ｓｈｉｍｏｈａｍａ　Ｓ．，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇｈ　ＭＢ，Ｆａｇａｎ　ＡＭ，Ｗｏｌｆｆ　ＪＡ，Ｓｈｏｒｔ　ＭＰ，Ｂｒａｄｆｉｅｌｆ　ＸＯ，Ｆｒｉｅｄｍａｎ　Ｔ．，およびＧａｇｅ　ＦＨ：Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｃｅｌｌｓ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｒａｔ　ｂｒａｉｎ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ　ｏｆ　Ｅ．ｃｏｌｉ−Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ａｓ　ａ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｇｅｎｅ，Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．５：２７１−２７８，１９８９）。外因性ＬａｃＺ遺伝子アッセイの測定における特異性を増加するため多くの修飾が記載された。すなわち、Ｗｅｉｓｓ，ＤＪ．，Ｌｉｇｉｔｔ　Ｄ．およびＣｌａｒｋ　ＪＧ．による以前の情報に従って、肺におけるベータガラクトシダーゼ活性のインシトゥ（ｉｎ　ｓｉｔｕ）の組織化学的検出。ＬａｃＺ遺伝子発現と内因性−ガラクトシダーゼ活性との識別におけるＸｇａｌ試薬の評価。Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　１，１９９７，８：１５４５−１５５４；本発明において、ｐＨ８．５を有するＸ−ｇａｌ溶液を用いた；この様式で、外因性−ｇａｌ活性を証明しインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）で、内因性活性を最小化した。
【００７１】
組換えアデノウイルスで形質移入された細胞の効率および位置のインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）モニタリングに実際使用された指標の１つは、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）発現の検出である。この目的のために、この蛋白質をコード化する遺伝子をアデノウイルスベクターでサグクローン化し、次いで蛍光顕微鏡により、ＧＦＰにより得られた蛍光を、ベクターを受け入れた実験動物を殺処理することなく直接観察できる（Ｒｏｊａｓ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，Ａ，Ｗｙｄｅ　ＰＲ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ　ＣＡ，Ｃｈｅｎ　ＳＨ，Ｗｏｏ　ＳＬＣおよびＡｇｕｉｌａｒ−Ｃｏｒｄｏｖａ　Ｅ．：Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ａｎｄ　ｌａｃｋ　ｏｆ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎ　Ｅ１Ａ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ　ｖｅｃｔｏｒ　ａｆｔｅｒ　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｏｔｔｏｎ　ｒａｔ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．１９９８，ｙ　ＴｏｎｇＣｈｕａｎ　Ｈ．，Ｓｈｉｂｉｎ　Ｚ．，Ｌｕｉｓ　Ｔ．，Ｊｉａｎ　Ｙ．，Ｋｅｎｎｅａｔｈ　Ｗ．およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ　Ｂｅｒｔｈ：Ａ　ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　Ｖｏｌ．９５：２５０９−２５１４，Ｍａｒｃｈ　１９９８）。得られたデータの大半は、健康な動物にアデノウイルスの静脈内投与後、主な標的細胞は肝細胞であったことを示している。これは、マウス、ウサギ、イヌおよび霊長類で観察されたが（Ｚｅｒｎ　ＡＭ．およびＫｒｅｓｉｎａ　ＴＦ，Ｈｅｐａｔｉｃ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　１９９７，ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．２，４８４−４９１）、しかし硬変症ラットでは観察されなかった。恐らく、門静脈注射は、肝臓の標的細胞に対してより効率的であり、血流に希釈される前に、肝臓全体にウイルス粒子の好ましい接種を供するのであろう。この経路は効率的であるが、開腹術を必要とするという不利な点を有する。一方、腹膜注射は、より速く簡便であるが、しかし肝細胞の形質導入を促進しない。本発明の結果は、凡そ２００ｇの正常ウィスターラットの腸骨静脈を介する３×１０１１個のウイルス粒子の注入が、非常に高い発現レベル（７０％の形質導入肝細胞）を生じることを示す。我々の結果は、門静脈を介する注入と比較して、伏在静脈による霊長類のレポーター遺伝子の特異的送達が、肝臓においてほぼ同一レベルの形質移入および移入遺伝子発現を生じた以前の報告と一致する（Ｍａｒｉｅ　Ｊｅａｎ　ＴＦＤ，Ｐｏｅｔｅｒｓ　Ｖ．，Ｌｉｅｂｅｒ　Ａ．，Ｐｅｒｋｉｎｓ　Ｊ．，およびＫａｙ　ＭＡ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｐｏｒｔａｌ　ｖｅｉｎ　ｉｎｆｕｓｉｏｎ　ｉｎ　ｍｉｃｅ；Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｈｅｐａｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　Ｆｅｂｒｕａｒｙ　１９９６，２０：２７８−２８５およびＺｈｕ　Ｄ．Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ　ＡＧ．Ｚｈｅｎｇ　Ｘ．，Ｓｔｒｏｍ　ＴＢ．およ���Ｓｕｋｈａｍｅ　ＶＰ．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ　ｇｅｎｅ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｌｉｖｅｒ　ｌｅａｄｓ　ｔｏ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｋｉｄｎｅｙ　ｇｉｏｍｅｒｕｌｉ．Ｋｉｄｎｅｙ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，１９９７，Ｖｏｌ．５２，９９２−９９９）。さらに、ＣＣｌ４の長期投与により誘導された肝硬変動物におけるレポーター遺伝子発現は、驚くべきことに正常ラットとほぼ同じ高さであった（４０％の形質導入肝細胞）。これらの結果は大変刺激的である、なぜなら、肝硬変動物は、門静脈によるアデノウイルス投与に必要な外科処置後、殆ど生存できなかったからである。これは、肝細胞の機能的試験の変更および大出血とプロトロンビン時間の上昇による。胆管結紮のラットは、形質導入肝細胞数の大きな減少（５〜１０％）を示したが、ｕＰＡ（ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーター）およびＳｍａｄ７などの肝細胞再生に係る刺激蛋白質を、コード化するメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ−８）および／または遺伝子などの治療遺伝子により、結果的に形質導入できると思われる肝細胞の数もまた重要である。
【００７２】
他の実施形態は、本説明に基づき当業者にとり明白であろう。前記実施形態は本発明の範囲と意図の中に含まれる。
【００７３】
（発明の概要）
異なる種類のヒトの線維症を治療するための遺伝子治療の使用を開示する。その目的は、線維症の突起の発達を回復および／または防止するために、標的器官に特異的に向かう「治療」遺伝子を使用することである。
【００７４】
線維症および／または硬変を有する患者への遺伝子治療の考えられる適用は、首尾の良い遺伝子の送達に大きく依存する。これらの遺伝子は重度の線維症の肝臓の治療タンパク質をエンコードしており、アデノウイルスおよび／または他の器官に形質導入する可能性がない（冒す可能性がない）他の組換えベクターによって、タンパク質ヒトＭＭＰ−８活性および潜伏性、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−１３、ヒトｕＰＡ野生型および／または改変型（またはその切断型）、ＴＧＦ−βタイプＩＩ用の切断型レセプターおよびＳｍａｄ７をエンコードしているこれらの遺伝子を向けることができる。組換えアデノウイルス（ＡｄＲ）は、治療遺伝子を多様な標的細胞に非常に効率よく形質導入するベクターである。我々は、これらのベクターが肝硬変の肝臓へ遺伝子を運ぶことができることを証明した。
【００７５】
このようなアデノウイルスベクターおよび他の組換えベクターによる治療遺伝子の送達は、カチオン性およびアニオン性リポソーム（ＤＯＴＭＡ）を使用して行うこともできる。
【００７６】
したがって、この特許の使用を以下のものに同じ方法で適用することを我々は提案する。
＊腎臓線維症
＊肺線維症
＊肥大性およびケロイド瘢痕（肌の線維症）、および
＊他の種類の線維症
【図面の簡単な説明】
【図１】
肝硬変の細胞の生理病理を示す図である。
【図２】
硬変プロセスを回復させることによって、遺伝子治療がどのように働くかという概念の証明を示す図である。
【図３】
アデノウイルスベクターＡｄ５−ｇａｌのクローニングおよび作製を示す概略図である。
【図４】
組換えアデノウイルス、特にｐＡｄＧＦＰ−ＭＭＰ−８を作製するためのＡｄＥａｓｙシステムの概略的な進展を示す図である。
【図５】
培養細胞中のガラクトシダーゼの発現の分析を示す図である。
【図６】
培養細胞中の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現体の発現判定を示す図である。
【図７】
腸骨静脈を介してＡｄ５−ｇａｌを注入した後の、異なる器官におけるβガラクトシダーゼの発現を示す図である。
【図８】
ＣＣｌ４を用いた慢性中毒による硬変実験動物の異なる器官とベクターＡｄ５−ｇａｌとの親和性の分析を示す図である。主な標的器官は肝臓であることが示された。
【図９】
ベクターＡｄ５−ｇａｌと硬変実験動物の異なる器官の親和性の分析を示す図である。肝硬変は輸胆管の結さつによって誘導され、主な標的器官は肝臓であることが示された。
【図１０】
慢性的にＣＣｌ４を投与した硬変ラットにおける、ベクターＡｄ５−ｇａｌのｉｎ　ｖｉｖｏでの効率的な形質導入アッセイの代表的な画像である組織構造断片を示す図である。
【図１１】
一般的な輸胆管結さつによる硬変ラットにおける、ベクターＡｄ５−ｇａｌのｉｎ　ｖｉｖｏでの効率的な形質導入アッセイの代表的な画像である組織構造断片を示す図である。
【図１２】
緑色蛍光タンパク質の発現のｉｎ　ｖｉｖｏでの判定を示す図である。
【図１３】
潜伏性ＭＭＰ−８および活性ＭＭＰ−８のクローニング戦略を示す図である。
【図１４】
肝臓由来（ＨｅｐＧ２）の細胞におけるｉｎ　ｖｉｔｒｏトランスフェクションアッセイ用のＭＭＰ−８がＤＮＡと複合体を形成するメカニズムを示す図である。
【図１５】
アガロースゲル中での電気泳動による、適切なプラスミド中にＭＭＰ−８　ｃＤＮＡをクローニングするのに成功したことを示す図である。
【図１６】
β−ガラクトシダーゼおよびｃＤＮＡ−ＭＭＰ−８のプラスミドによる、ＨｅｐＧ２細胞（肝臓由来の細胞）中のトランスフェクション効率を示す図である。
【図１７】
ＭＭＰ−８メッセンジャーＲＮＡの、逆転写酵素（ＲＴ−ＰＣＲ）関連ポリメラーゼ連鎖反応による分析を示す図である。
【図１８】
潜伏性ＭＭＰ−８および活性ＭＭＰ−８のｃＤＮＡを用いたランスフェクション後の、ＨｅｐＧ２細胞によって培養培地に分泌されるタンパク質中のコラーゲン分解活性の分析を示す図である。
【図１９】
調節可能なプロモーターＰＥＰＣＫの転写制御下での、ＭＭＰ−８遺伝子発現のホルモン調節を示す図である。
【図２０】
ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を用いるｉｎ　ｖｉｖｏでの肝臓の形質導入の最良の応答性を判定するために使用された異なる用量の用量応答アッセイを示す図である。
本発明に対応する図において使用する記号の定義は、以下に示す通りである。
図１：
ＣＥＨ＝星状肝細胞
ＣＥＳ＝内皮洞様血管細胞
ＣＫ＝クッパー細胞
ＥＳＥＴ＝内皮下空間
ＨＥ＝肝細胞
ＨＩＤＣ＝慢性的なダメージがある肝臓
ＨＮ＝正常な肝臓
ＳＩＮＵ＝洞様血管
図２：
ＣＯＬＡＳＡ＝コラゲナーゼ
ＤＣＡ＝コラーゲンの分解
ＴＧＥ＝実験的な遺伝子治療
ＭＭＰ＝メタロプロテアーゼ
図３：
ＣＴ２９３＝細胞２９３中の共トランスフェクション
ＰＧ　ＣｓＣｌ＝ＣｓＣｌ勾配による精製
図４：
ＢＤ＝右腕
Ｂｌ＝左腕
ＣＴＢＫ＝細菌中の共トランスフェクションおよびカナマイシンによる選択
ＣＵＬ＝培養
ＬｌＰａｃｌ＝Ｐａｃｌによる線状化
ＬｌＰｍｅｌ＝Ｐｍｅｌによる線状化
ＰＶ＝ウイルス粒子
Ｔ２９３＝２９３細胞のトランスフェクション
ＧＥＮＡＤＲ＝組換えアデノウイルスの生成
図７：
Ｂ＝脾臓
ＣＥ＝脳
ＣＯ＝心臓
％ＣＴ＝形質導入された細胞のパーセント
Ｈ＝肝臓
Ｐ＝肺
Ｒ＝腎臓
Ｓａｄ−ｇａｌ＝Ａｄ−ｇａｌベクターなし
ＣＡＤ−ｇａｌ＝Ａｄ−ｇａｌベクターあり
Ｘ−ＧＡＬ７＝反応性Ｘ−ｇａｌ、ｐＨ７．０
Ｘ−ＧＡＬ８．５＝反応性Ｘ−ｇａｌ、ｐＨ８．５
図８：
Ｂ＝脾臓
ＣＣｌ４５＝ＣＣＬ４中毒５週間
ＣＣｌ４８＝ＣＣＬ４中毒８週間
ＣＥ＝脳
ＣＯ＝心臓
％ＣＴ＝形質導入された細胞のパーセント
Ｈ＝肝臓
Ｐ＝肺
Ｒ＝腎臓
ＰＶ＝ウイルス粒子
ＨＮ＝正常な肝臓
図９：
Ｂ＝脾臓
ＣＥ＝脳
ＣＯ＝心臓
％ＣＴ＝形質導入された細胞のパーセント
Ｈ＝肝臓
ＬＣＢ２Ｓ＝２週間の輸胆管結さつ
ＬＣＢ４Ｓ＝４週間の輸胆管結さつ
Ｐ＝肺
Ｒ＝腎臓
ＰＶ＝ウイルス粒子
ＨＮ＝正常な肝臓
図１３：
ＰＲＯＴ＝タンパク質
ＡＰＭＡ：水銀アモノフェニルアセテート
図１４：
ＡＣＴ−ｇａｌ＝ガラクトシダーゼ活性
ＣＥＳ＝細胞
ＥＡＣ＝酵素活性
ＰＬ＝ポリリジン
ＰＲＯＴ＝タンパク質
ＲＧＡＬ＝ガラクトース残基
ＳＮＡＤ＝上清
図１６：
ＡＤＮＤ＝裸のＤＮＡ
ＧＥＬＲＡＤＮ−ＰＬ＝ポリリジン用保持ゲル
図１８：
ＣＡ＝ＡＰＭＡあり
ＣＡＣＥ＝ＡＰＭＡおよびＥＤＴＡあり
ＣａＰＯ４＝ホスフェート
ＣＥ＝ＥＤＴＡあり
ＣＯＢ＝細菌性コラゲナーゼ
ＣＯＬ１＝タイプＩコラーゲン
ＰＬ＝ポリリジン
ＳＡ＝ＡＰＭＡなし
ＳＮＬ＝白血球の上清
ＳＴ＝トランスフェクトせず
ＴＲＩＰ＝トリプシン
図２０：
％ＣＴ＝形質導入された細胞のパーセント
ＰＶ＝ウイルス粒子
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004500040.tif 000104
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