(57)【要約】相補的突出オリゴヌクレオチドを有する細胞、リポソームおよび脂質粒子が提供され、このオリゴヌクレオチドはハイブリダイズして効率的な融合の助けとしてそれらを一緒にし、これは浸透圧または電気ショックによってさらに補助されてもよい。本発明は、さらに、オリゴヌクレオチドの相補対であってそれらを細胞またはリポソーム膜に固定させる部分を含有するオリゴヌクレオチドの相補対に加えて、細胞内に導入しようとする薬剤を担持し、かつ膜で囲まれた突出オリゴヌクレオチドを備えるリポソームを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞、小胞、リポソームおよび脂質粒子からなる群より選択される２つのメンバーの合体を促進するための方法であって：
ａ．該メンバーの第１のものに、第１末端疎水性固定部分を含有する第１の外側に突出する固定オリゴヌクレオチドを組み込み、
ｂ．該メンバーの第２のものに、該第１固定オリゴヌクレオチドに相補的であり、かつ第２末端疎水性固定部分をも含有する第２の外側に突出する固定オリゴヌクレオチドを組み込み、並びに
ｃ．該第１および第２メンバーを、該第１および第２の外側に突出する固定オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベートする、
ことを含む方法。
【請求項２】
前記第１および第２メンバーが細胞である請求項１記載の方法。
【請求項３】
第１メンバーが細胞であり、かつ第２メンバーが該細胞に挿入しようとする疎水性物質が封入されているリポソームまたは脂質粒子である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記疎水性物質がＤＮＡ、薬物、治療薬、化学療法剤、アンチセンス薬剤、染料およびオリゴヌクレオチドプローブからなる群より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
第１および第２末端疎水性固定部分の各々がコレステロール、脂肪酸、疎水性ペプチドおよび脂質からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記第１および第２末端疎水性固定部分の少なくとも一方が半融合不安定化剤である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記インキュベーションを半融合不安定化剤の存在下で行う、請求項１記載の方法。
【請求項８】
親水性物質が封入され、かつ末端疎水性固定部分を含有する外側に突出する固定オリゴヌクレオチドが組み込まれているリポソームまたは脂質粒子。
【請求項９】
固定部分が半融合不安定化剤である、請求項８のリポソームまたは脂質粒子。
【請求項１０】
封入される親水性物質がＤＮＡ、薬物、治療薬、化学療法剤、アンチセンス薬剤、染料およびオリゴヌクレオチドプローブからなる群より選択される、請求項８のリポソームまたは脂質粒子。
【請求項１１】
各々が末端疎水性固定部分を含有する、一対の別々に包装された相補的オリゴヌクレオチドを含む試薬のキット。
【請求項１２】
半融合不安定化剤をさらに含む、請求項１１記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願において報告される研究は、国立衛生研究所の認可番号ＥＳ１０５３６によって支持された。合衆国政府は本発明において特定の権利を有し得る。
【０００２】
技術分野
本発明は、細胞の互いの合体、すなわち融合、リポソーム、膜小胞もしくは脂質粒子の細胞への、または互いへの融合に関する。また、本発明は、膜不透性化合物、例えば、親水性薬物および染料の細胞および組織への送達にも関する。
【０００３】
背景
生物学的膜は、大部分の親水性または荷電化合物が横断することができない障壁を構成する。これらの化合物をリポソーム内に封入した後、そのリポソームを細胞膜と融合させることをこれらの化合物の細胞への送達に用いることができる。このプロセスは薬物の送達および遺伝子治療に有用である。
【０００４】
それらの膜のため、細胞は互いに離れたままになり、通常は融合しない。しかしながら、幾つかの用途、例えば、クローニングおよびハイブリドーマの産生には、２つの細胞を互いに融合させることが必要である。融合は別々の膜を単一の膜に合体させることを必要とし、化学薬剤及び他の手段、例えば、電気ショックの助けを借りて融合を促進しようとする努力にもかかわらず、この手順の効率は一般には低い。これは、膜が類似の電荷をそれら上に有し、したがって互いに反発するか、または膜の脂質頭部基周囲の水和シェルが密接な接触を妨害するためである。融合を行うためには２つの膜を有意の時間一緒に保持しなければならず、これは通常はブラウン運動が妨げる。
【０００５】
本発明の一側面は、細胞、リポソーム、脂質粒子および脂質二重層小胞と細胞との、およびそれら同士の融合または合体を改善するための方法であって、それらの膜が融合することができ、かつそれらの内容物が混合し得るように、それらを互いに接近させ、およびそれらを近接した状態で保持することによる方法である。
【０００６】
本発明の別の側面は、細胞内に送達するための封入された物質を含むオリゴヌクレオチド被覆リポソームである。
【０００７】
本発明の別の側面は、本発明による方法において有用なオリゴヌクレオチド構築体を含む試薬キットである。
【０００８】
要約
本発明は、膜で囲まれた実体（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ ｅｎｔｉｔｙ）、例えば、細胞、リポソームおよび脂質二重層小胞の合体または融合に関する。「リポソーム」は、この用語がここで用いられる場合、内部水性空間を取り囲む外部脂質二重層（または多重層）膜を含む閉鎖構造を指す。本発明において有用な合成リポソームの例は、米国特許第６，１１０，４９０号に開示されるカチオン性リポポリアミン／中性脂質の組合せである。リポソームは、あらゆる生物学的に活性の薬剤を細胞に送達するためにパッケージ化するのに用いることができる。例えば、細胞内に送達するためにリポソーム内に包装することができる核酸は、米国特許第５，９２５，５１７号に開示されるオリゴヌクレオチドビーコンのような蛍光発生プローブを含むがこれに限定されるものではないオリゴヌクレオチドプローブ；アンチセンス薬剤；リボザイム；妨害ＲＮＡ並びに遺伝子治療薬剤、例えば、プラスミドおよびウイルスベクターであり得る。核酸はＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびそれらの混合物であり得、修飾ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチド間連結をさらに含み得る。リポソームは、「積荷」、例えば、治療薬、化学療法剤、薬物、染料、プローブおよび親水性化合物を、一般には、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞または細胞コンパートメント内にパッケージ化するのに用いることもできる。
【０００９】
水性内部空間を取り巻く脂質二重層膜を含んではいないものの、脂質分子のクラスターである脂質粒子を、それらと複合体を形成する物質、特にはトランスフェクションのためのＤＮＡであるがタンパク質、治療薬、化学療法剤および他の核酸をも細胞に移送するのに、リポソームの代わりに本発明において用いることができる。商業的に入手可能な脂質混合物には、例えば、塩化Ｎ［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＩ）、トリフルオロ酢酸２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ［２−（スペルミンカルボキサミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパンアミニウム（ＤＯＳＰＡ）、塩化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）および１，２−ジオレイルオキシ−３（トリメチルアンモニア）プロパン（ＤＯＴＡＰ）が含まれる。細胞内へのＤＮＡの送達への脂質粒子の使用は公知であり、例えば、Ｆｅｒｇｎｅｒ， Ｐ．Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４．７４１３−７４１７（１９８７）；Ｂａｒｔｈｅｌ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２， ５５３−５６０（１９９３）；および Ｚｈｕ， Ｎ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１， ２０９−２１１（１９９３）。
【００１０】
ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞間またはリポソーム（もしくは脂質粒子）と細胞との間で融合を行うため、まず膜で囲まれた実体を互いに接触させなければならない。結合体は典型的には水和しているか、または同様に帯電さえしているため、これにはエネルギーが必要である。このため、融合は非効率的である傾向にある。
【００１１】
本発明によると、膜で囲まれた実体を一緒にさせて融合を容易にするのに核酸ハイブリダイゼーションを用いる。これは、膜に固定する能力を有するオリゴヌクレオチドを各々の膜で囲まれた実体に添加することによって達成される。そのようなオリゴヌクレオチドは、コレステロールのような疎水性部分をそれらの末端に連結することによって構築することができる。この膜固定部分はそれ自体を膜の疎水性部分内に埋め込み、そのオリゴヌクレオチドを表面から外側に延びる突起として露出したままにする。第１実体（例えば、細胞またはリポソーム）から突出するオリゴヌクレオチドは第２実体（例えば、細胞またはリポソーム）から突出するオリゴヌクレオチドに対して相補的であるように設計され、これらのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションが２つの実体を一緒にする。２つの膜の接触において高い親密性を達成するため、膜固定部分を一方のオリゴヌクレオチドの３’末端および他方のオリゴヌクレオチドの５’末端に連結することが好ましい。これらの相補的オリゴヌクレオチドの遠位末端は互いを引き寄せる役割を果たす。この最初の接触にこれら２つのオリゴヌクレオチドのアニーリングが続き、これが２つの実体を一緒に引きつける。第１のオリゴヌクレオチド対の間でのハイブリッドの形成は他の対の間でのハイブリッドの形成を容易にするが、これはそれらがより接近しやすくなるためである。２つの膜は自然状態では流動性であるため、多数のオリゴヌクレオチドが、それらが相補体と対を形成することができる２つの膜の間の接触部位に殺到する。２つの膜は、複数のオリゴヌクレオチド対がそれらの間の「縫い目」として作用するため、極度に緊密に保持される。最後に、２つの膜が互いに融合し、膜で囲まれた実体の内容物が他の膜で囲まれた実体の内容物と混合する。
【００１２】
この促進体オリゴヌクレオチドは長さが少なくとも５ヌクレオチドでなければならず、好ましくは長さが少なくとも２５ヌクレオチドである。それらはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはそれらの混合物であり得る。それらは修飾ヌクレオチドを含むことができる。それらは修飾ヌクレオチド間連結、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、またはホスホネートを含むことができる。
【００１３】
膜固定部分は、膜の疎水性核に容易に溶解することができる疎水性部分、例えば、コレステロール、脂肪酸、疎水性ペプチド、エルゴステロールまたは脂質である。
【００１４】
２つの膜で囲まれた実体の間の融合の効率は我々が「半融合不安定化剤（ｈｅｍｉｆｕｓｉｏｎ ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ）」と呼ぶものを用いることによって高めることができ、この半融合不安定化剤は半融合の中間状態から完全な融合の状態への進行を促進する薬剤を意味する。半融合不安定化剤は二重層膜の両層にまたがるのに十分な長さである膜固定部分であり得る。そのような実体は、半融合（膜二重層の外層が互いに融合し、それに対して内層が分離したままである状態）から完全な融合な状態に膜の融合をより高速に進行させる。膜の両層にまたがる膜固定部分は中間半融合状態を不安定化させる。膜の両層にまたがるのに十分な長さである膜固定部分の例は５５炭素長脂質イソプレノイドウンデカプレノール、膜タンパク質の膜貫通セグメント、およびコレステロールの多量体である。
【００１５】
半融合の中間状態を不安定化し、かつ完全な融合を促進する別のアプローチは、別個の半融合不安定化剤、例えば、外層とは反対に二重層膜の内層に優先的に分配される円錐形状両親媒性分子を用いることである。例えば、膜透過性カチオン性両親媒性分子クロルプロマジンが有用な薬剤であり、これはオリゴヌクレオチドによって一緒にされている膜で囲まれた実体における融合を促進する。これらの別個の薬剤は融合反応の媒体に単純に添加することができる。
【００１６】
ハイブリダイゼーションは特異的であるため、標的化融合が可能である。細胞集団中の特定の細胞を、リポソーム上に存在する相補的オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする突出オリゴヌクレオチドを備えて提供することができる。リポソームと様々な異なるオリゴヌクレオチドとの組合せを、異なる相補的オリゴヌクレオチドでタグ付けされている集団中の異なる細胞の標的化に一緒に用いることができる。このオリゴヌクレオチドは、膜固定部分に加えて、細胞特異的部分、例えば、モノクローナル抗体を含むことができる。あるいは、細胞特異的固定部分、例えば、酵母のような真菌細胞に特異的であるエルゴステロールを標的化に用いることができる。これらのアプローチはリポソームと特定の細胞、例えば、腫瘍細胞との選択的な融合を可能にする。細胞またはリポソームが相補的突出オリゴヌクレオチドが付与されている「標的」を見出すことができるため、複数の平行した融合を所定の集団において行うことができる。
【００１７】
融合補助手段を本発明による方法において、ハイブリダイゼーションの後、またはそれと同時に用いることができる。浸透圧ショック、電気ショックおよびカルシウムイオンの添加を含む幾つかの融合補助手段が公知である。
【００１８】
本発明は、突出オリゴヌクレオチドを含有するリポソームも生成物として含む。このような生成物は、好ましくは、前述のように疎水性の積荷、例えば、薬物またはＤＮＡプローブを含む。加えて、本発明は、リポソームおよび細胞をトランスフォームするためのキットであって、各々コレステロールまたは他の膜固定部分が結合する少なくとも１対の相補的オリゴヌクレオチドを収容するキットを含む。
【００１９】
本発明の１つ以上の態様の詳細を添付の図面および以下の説明に記載する。本発明の他の特徴、目的、および利点は説明および図面から、並びに請求の範囲から明かであろう。
【００２０】
詳細な説明
様々な図面における同じ参照記号は同じ要素を示す。
【００２１】
図１は本発明による膜で囲まれた実体を模式的に示す。細胞、リポソームまたは脂質二重層小胞であり得る実体１は、親水性容積または積荷空間３を囲む膜または脂質二重層２を含む。実体１は固定したオリゴヌクレオチド６の複数のコピーを含み、これはオリゴヌクレオチド４の末端に結合する膜固定部分５を含む。膜固定部分５は脂質二重層２の親水性領域に埋め込まれる。オリゴヌクレオチド４は膜から外側に突出する。膜２の疎水性部分に対する膜固定部分５、例えば、コレステロールの親和性のため、実体１は、オリゴヌクレオチド６を膜で囲まれた実体と共にインキュベートすることによって単純に調製することができる。
【００２２】
図２は、本発明によるハイブリダイゼーションを模式的に示す。親水性の積荷１８を収容する親水性容積または積荷空間１７を囲む膜で囲まれた実体１０は、膜１１を含み、かつ各々膜固定部分１５および突出オリゴヌクレオチド１４を含む固定したオリゴヌクレオチド１６の複数のコピーを含む。親水性の積荷２８を収容する親水性容積または積荷空間２７を囲む膜で囲まれた実体２０は、膜２１を含み、かつ各々膜固定部分２５および突出オリゴヌクレオチド２４を含む固定したオリゴヌクレオチド２６の複数のコピーを含む。突出オリゴヌクレオチド１４および２４は互いに相補的である。これらは互いにハイブリダイズしてハイブリッド３０、３１を形成する。図２に示される好ましい構成においては、一方の突出オリゴヌクレオチドが突出３’末端を有し、他方が突出５’末端を有する。この構成では、ハイブリダイゼーションが突出末端で始まり、それが膜固定部分に向かうブランチ移動によって進行し、それにより実体１０、２０が互いに向かって引きつけられる。容易に理解されるように、固定したオリゴヌクレオチド１６、２６の長さおよびヌクレオチド含有物を変化させることにより、ハイブリッド３０、３１の強度を必要に応じて融合を促進するように調整することができる。
【００２３】
図３は、合体の促進におけるハイブリダイゼーションの効果を模式的に示す。固定したオリゴヌクレオチドが膜または脂質二重層内で可動であることが観察されている。ハイブリダイゼーションが進行するに従い、固定したオリゴヌクレオチドは接触の領域に向かって移動し、２つの膜で囲まれた実体はそれらの接続点を囲むハイブリッドの輪と共に「ダンベル形状の」全体形態と想定される。図３を参照すると、積荷空間４１、５１および積荷４２、５２を収容する膜で囲まれた実体４０、５０が図示されている。実体４０、５０はそれらの固定オリゴヌクレオチドのハイブリッド６０、６１、６２によって一緒に引き寄せられる（図２を参照）。まとめると、実体４０、５０は、それらが会合し、かつハイブリッドによって一緒に引き寄せられる狭い中央部分を備える「ダンベル」形状を有する。固定したオリゴヌクレオチドのうちの１つを蛍光標識することにより、この狭い部分の周囲の蛍光性の輪の形成および他の領域における蛍光の消失が観察されており、これは固定されたオリゴヌクレオチドが結合領域に移動していることを示す。顕微鏡検査は、２つの膜が互いに非常に接近していることを示す。
【００２４】
図４は、２つの融合した実体の、それらの膜および内容物が互いに融合した後の状態を示す。融合した実体７０は、単一の積荷空間７２を取り巻く単一の融合した膜７１を含む。一方の親実体からの積荷７３および他方の親実体からの積荷７４（図３を参照）は今や積荷空間７２において一緒に混合されている。ハイブリッド７５は今や膜７１全体にわたる移動が自由である。
【００２５】
図３に示される状態は、２つの実体の自然状態がどのように不安定化されているかに応じて短期間、または長期間持続し得る。リポソームはそれらの高い表面−容積比によって生じる張力のために熱力学的に不安定であり、それに対して細胞はより安定である。したがって、図３に示される状態は２つの細胞が互いに対を形成するときにより長期間持続し、それに対してリポソームはそれらがオリゴヌクレオチド促進体を介して結合する細胞と容易に融合する。対を形成する細胞も、それらが浸透圧的に膨潤するか、または電気的に妨害されているときに容易に融合する。融合が完了した後、対を形成したオリゴヌクレオチド、すなわちハイブリッドは、図４に示されるように、赤道面を離れて膜全体にわたって均一に分散する。
【００２６】
２つの膜で囲まれた実体の融合は、オリゴヌクレオチドの蛍光標識によって示すことができるように、両タイプの固定したオリゴヌクレオチドを含有する突出ハイブリッドを備える単一の球状構造（顕微鏡下で現れる円）の形成を生じる。
【００２７】
実施例１
一対の相補的固定オリゴヌクレオチドを調製する。第１のものは長さが６８ヌクレオチドのＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。コレステロールをその５’末端に結合させ、その３’末端はフルオレセインで標識する。第２のものは長さが７４ヌクレオチドのＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。コレステロールをその３’末端に結合させ、その５’末端はテトラメチルローダミンで標識する。その３’末端から最初の６８ヌクレオチドは第１固定オリゴヌクレオチドに相補的である。これら２つのヌクレオチドが互いにハイブリダイズするとき、６ヌクレオチドの突出が２つの蛍光体を分離する。この突出は、フルオレセインからローダミンへの共鳴エネルギー移動を測定することによるそれらの間の距離の監視を可能にする。
【００２８】
各々のコレステロール含有オリゴヌクレオチドをＴＨＰ１細胞の別々の懸濁液に添加する。５ナノグラムの各オリゴヌクレオチドを１０マイクロリットルの細胞懸濁液に添加する。この混合物は細胞培養培地（ＲＰＭＩ １６４０培地）中に約１００，０００の細胞を含む。この混合物を室温で１０分間インキュベートする。この混合物を１００マイクロリットルの細胞培養培地で３回溢れさせることによって過剰のオリゴヌクレオチドを除去し、細胞を回転沈降させて２０マイクロリットルの容積として上清を除去する。
【００２９】
フルオレセイン標識オリゴヌクレオチドを含有する混合物を顕微鏡スライド上に置き、波長４９１ｎｍの光で励起させて５１５ｎｍで画像を記録する。細胞は、緑色蛍光の周囲円を備える図１の外見を有する。同様に、テトラメチルローダミン標識オリゴヌクレオチドを含有する混合物を顕微鏡スライド上に置き、波長５５５ｎｍの光で励起させて５７５ｎｍで画像処理する。これらの細胞は、蛍光の色が赤であることを除いて、同様の外見を有する。
【００３０】
次に、これら２つの細胞懸濁液を混合し、室温で１０分間一緒にインキュベートする。その混合物を顕微鏡スライド上に置き、４９１ｎｍ励起および５１５放射、５５５ｎｍ励起および５７５ｎｍ放射、並びに４９１励起および５７５放射で画像を記録する。第１の画像はフルオレセイン標識細胞のみを示し、これは互いに対を形成してはいないように見える。第２の画像はテトラメチルローダミン標識細胞のみを示し、これも互いに対を形成してはいないように見える。第３の画像は、赤色および緑色細胞の接合点でのフルオレセインからテトラメチルローダミンへのエネルギー移動のみを示す。図３に示されるように、細胞間の接合点に集中するエネルギー移動蛍光で多くのダンベル形状の複合体が観察される。これらの結果は、ＤＮＡ突出が相補的オリゴヌクレオチドを備える細胞を一緒にし、それらを密接な状態に保持することを確認する。
【００３１】
実施例２
核がＤＡＰＩで染色（青）されている細胞で実施例１の手順を繰り返す。この例においては、テトラメチルローダミン標識を省略する。細胞懸濁液の混合物のインキュベーションの後、蒸留水で１０倍に希釈することによりその混合物に浸透圧ショックを加える。室温で１０分のインキュベーションの後、希釈混合物を回転沈降させて２０マイクロリットルとし、上清を除去して、残留する懸濁液を１時間静置する。次に、その混合物を顕微鏡スライド上において検査する。２つの核を有する多くの細胞が観察され、ダンベル形状の対は見られない。サンプルを波長４９１ｎｍの光で励起し、５１５ｎｍの放射を読み取るとき、２つの核を有する細胞が、それらの周囲に蛍光の輪を伴って、図１に示される形状を有することが観察される。この実験は、ＤＮＡ促進体によって一緒にされている２つの膜で囲まれた実体が、それらが張力下にあるとき、容易に融合することを示す。
【００３２】
実施例３
１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリル（ＰＯＰＣ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホ−Ｌ−セリン）（ＤＯＰＳ）を８５：１５の比で混合することによってリポソームを調製する。購入したままの脂質はクロロホルム中にある。２本のガラス管の底部でそれらを混合し、アルゴンガスで乾燥させる。第１の管の脂質を３’末端にフルオレセイン部分を含むオリゴヌクレオチドの存在下で水和し、第２の管の脂質は第１のものに相補的であり、かつ３’末端にＤＡＢＣＹＬ部分を含むオリゴヌクレオチドの存在下で水和する。これらの標識オリゴヌクレオチドは図２の積荷１８、２８および図３の積荷４２、５２を表す。これらは、内容物の混合がそれらのハイブリダイゼーションを伴う蛍光の減少によって監視することができるように設計される。混合物を超音波処理し、オリゴヌクレオチドが封入されるリポソームを生成する。リポソームが均一なサイズのものであることを保証するため、それらを５０ｎｍ細孔径の濾過膜に繰り返し通過させる。
【００３３】
第１の管のリポソームに、実施例１におけるもののような第１のコレステロール含有固定オリゴヌクレオチドを添加する。第２の管のリポソームに、これも実施例１におけるもののような、相補的な第２のコレステロール含有固定オリゴヌクレオチドを添加する。これらのオリゴヌクレオチドのいずれも、いかなる蛍光標識も含まない。複合体を形成しないオリゴヌクレオチドおよび脂質分子をゲル排除クロマトグラフィーによって除去する。平行して、いかなる促進体オリゴヌクレオチドも含まないが内部に封入されたオリゴヌクレオチドは含む対照リポソームを保持する。
【００３４】
次に２つの混合物を調製する：オリゴヌクレオチドが封入されてはいるが促進体オリゴヌクレオチドは含まない両リポソームを含有する対照混合物、およびオリゴヌクレオチドが封入されており、かつ促進体オリゴヌクレオチドを有する両リポソームを含有する混合物。これらの混合物を蛍光光度計に入れ、４９１ｎｍで励起して５１５ｎｍで読み取る。対照混合物の放射レベルは全時間にわたって比較的一定のままであるが、他の混合物の放射レベルは封入されるオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション並びにその結果としての失活および合体のため全時間にわたって劇的に減少する。この実験は、促進体オリゴヌクレオチドがリポソームの融合およびそれらの内容物の混合を触媒することを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、固定したオリゴヌクレオチドのコピーを含有する膜で囲まれた実体、例えば、細胞またはリポソームの模式図である。
【図２】図２は、ハイブリダイズし始めている、相補的な固定したオリゴヌクレオチドのコピーを含有する２つの膜で囲まれた実体の模式図である。
【図３】図３は、ハイブリダイゼーションが進行し、固定したオリゴヌクレオチドが接触領域に移動している、相補的な固定したオリゴヌクレオチドのコピーを含有する２つの膜で囲まれた実体の模式図である。
【図４】図４は、２つの膜が融合して１つの膜を創製し、対を形成したオリゴヌクレオチドが分散し、かつ実体の内容物が混合された後の、２つの膜で囲まれた実体の融合生成物の模式図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520816.tif 000024
【国際調査報告】
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2004520816.tif 000026