(57)【要約】要約書なし。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のＢドメインと少なくとも６８％同一のサブ配列を含むＬＥＣ１ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列またはその相補物に機能的に連結されているプロモーターを含む発現カセットであって、前記ポリヌクレオチド配列が前記発現カセットのいずれのエレメントとも異種である前記発現カセット。
【請求項２】
前記Ｂドメインが、配列番号２のアミノ酸残基２８付近とアミノ酸残基１１７付近との間のポリペプチド配列を含む請求項１の発現カセット。
【請求項３】
前記Ｂドメインが、配列番号２のアミノ末端のアミノ酸残基２８−３５およびカルボキシ末端のアミノ酸残基１０３−１１７を有するポリペプチド配列を含む請求項１の発現カセット。
【請求項４】
前記ＬＥＣ１ポリペプチドが配列番号２０である請求項１の発現カセット。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチド配列が配列番号１９である請求項４の発現カセット。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチド配列が、２つまたは３つ以上のＬＥＣ１ポリペプチドまたはポリペプチドサブ配列間の融合物をコードする請求項１の発現カセット。
【請求項７】
前記ＬＥＣ１ポリペプチドが配列番号２２である請求項１の発現カセット。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチド配列が配列番号２１である請求項６の発現カセット。
【請求項９】
前記プロモーターが構成的プロモーターである請求項１の発現カセット。
【請求項１０】
前記プロモーターがＬＥＣ１遺伝子由来である請求項１の発現カセット。
【請求項１１】
前記プロモーターが配列番号３のヌクレオチド１付近からヌクレオチド１９９８付近を含む請求項１０の発現カセット。
【請求項１２】
前記プロモーターが配列番号２３を含む請求項１０の発現カセット。
【請求項１３】
前記プロモーターがさらに配列番号２４を含む請求項１２の発現カセット。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチド配列がアンチセンス方向で前記プロモーターと連結されている請求項１の発現カセット。
【請求項１５】
ＬＥＣ１ポリペプチドのＡまたはＣドメインと少なくとも９０％同一のサブ配列を含むＬＥＣ１ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列またはその相補物と機能的に連結されているプロモーターを含む発現カセットであって、前記ポリヌクレオチド配列が前記発現カセットのいずれのエレメントとも異種である前記発現カセット。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、２つまたは３つ以上のＬＥＣ１ポリペプチドまたはポリペプチドサブ配列間の融合物をコードする請求項１５の発現カセット。
【請求項１７】
植物細胞で異種ポリヌクレオチドを発現させる発現カセットであって、前記発現カセットが配列番号２３と少なくとも７０％同一のプロモーターポリヌクレオチドを含み、さらに前記プロモーターポリヌクレオチドが異種ポリヌクレオチドと機能的に連結されている前記発現カセット。
【請求項１８】
前記プロモーターが配列番号２３を含む請求項１７の発現カセット。
【請求項１９】
前記プロモーターが、さらに配列番号２４と少なくとも７０％同一のポリヌクレオチドを含む請求項１７の発現カセット。
【請求項２０】
前記プロモーターが配列番号２４を含む請求項１９の発現カセット。
【請求項２１】
配列番号２のＢドメインと少なくとも６８％同一のサブ配列を含むＬＥＣ１ポリペプチドをコードする単離核酸またはその相補物であって、前記核酸がクローンＭＮＪ７ではない前記単離核酸またはその相補物。
【請求項２２】
前記Ｂドメインが、配列番号２のアミノ末端のアミノ酸２８−３５およびカルボキシ末端のアミノ酸１０３−１１７を有するポリペプチド配列を含む請求項２１の単離核酸。
【請求項２３】
前記ＬＥＣ１ポリペプチドが配列番号２０である請求項２１の単離核酸。
【請求項２４】
前記ポリヌクレオチド配列が配列番号１９である請求項２３の単離核酸。
【請求項２５】
前記核酸が２つまたは３つ以上のＬＥＣ１ポリペプチドまたはポリペプチドサブ配列間の融合物をコードする請求項２１の単離核酸。
【請求項２６】
前記ＬＥＣ１ポリペプチドが配列番号２２である請求項２１の単離核酸。
【請求項２７】
前記ポリヌクレオチド配列が配列番号２１である請求項２６の単離核酸。
【請求項２８】
前記核酸がさらに、ＬＥＣ１をコードする核酸に機能的に連結されているプロモーターを含む請求項２１の単離核酸。
【請求項２９】
前記プロモーターが構成的プロモーターである請求項２９の単離核酸。
【請求項３０】
前記植物プロモーターがＬＥＣ１遺伝子由来である請求項２９の単離核酸。
【請求項３１】
前記プロモーターが配列番号３のヌクレオチド１付近からヌクレオチド１９９８付近を含む請求項３０の単離核酸。
【請求項３２】
前記プロモーターが配列番号２３を含む請求項３０の単離核酸。
【請求項３３】
前記プロモーターがさらに配列番号２４を含む請求項３２の単離核酸。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチド配列がアンチセンス方向で前記プロモーターと連結されている請求項２１の単離核酸。
【請求項３５】
請求項１、１５および１７のいずれかに記載の発現カセットまたは請求項２１に記載の核酸分子を含むホスト細胞であって、前記発現カセットまたは核酸分子が異種配列と接しているホスト細胞。
【請求項３６】
請求項１の発現カセットを含む請求項３５のホスト細胞。
【請求項３７】
請求項１５の発現カセットを含む請求項３５のホスト細胞　　。
【請求項３８】
請求項１７の発現カセットを含む請求項３５のホスト細胞　　。
【請求項３９】
請求項２１の核酸分子を含む請求項３５のホスト細胞。
【請求項４０】
（ａ）配列番号２のＢドメインと少なくとも６８％同一であり；かつ
（ｂ）配列番号１、配列番号１９もしくは配列番号２１によってコードされるポリペプチドまたはそのフラグメントの生物学的活性の少なくとも１つを示すことができる
ことを特徴とするアミノ酸配列を含む単離核酸。
【請求項４１】
請求項４０の単離ポリペプチドと結合することができる抗体。
【請求項４２】
（ａ）請求項１、１５および１７のいずれかに記載の発現カセットまたは請求項２１に記載の単離核酸を提供し；さらに
（ｂ）前記核酸をホスト細胞に挿入することができる条件下で、前記発現カセットまたは核酸を前記ホスト細胞と接触させる
工程を含むことを特徴とする、ホスト細胞に単離核酸を導入する方法。
【請求項４３】
請求項１の発現カセットを提供する請求項４２の方法。
【請求項４４】
請求項１５の発現カセットを提供する請求項４２の方法。
【請求項４５】
請求項１７の発現カセットを提供する請求項４２の方法。
【請求項４６】
請求項２１の核酸を提供する請求項４２の方法。
【請求項４７】
配列番号２のＢドメインと少なくとも６８％同一のサブ配列を含むＬＥＣ１ポリペプチドをコードする異種ＬＥＣ１ポリヌクレオチドと、該異種ＬＥＣ１ポリヌクレオチドに機能的に連結されている植物のプロモーターとを含む発現カセットを植物に導入し；さらに
転写が調節された植物を検出する
工程を含むことを特徴とする、転写を調節する方法。
【請求項４８】
前記ＬＥＣ１ポリヌクレオチドが配列番号２をコードする請求項４７の方法。
【請求項４９】
前記ＬＥＣ１ポリヌクレオチドが配列番号１である請求項４８の方法。
【請求項５０】
前記ＬＥＣ１ポリヌクレオチドが配列番号２０をコードする請求項４７の方法。
【請求項５１】
前記ＬＥＣ１ポリヌクレオチドが配列番号１９である請求項５０の方法。
【請求項５２】
前記ＬＥＣ１ポリヌクレオチドが配列番号２２をコードする請求項４７の方法。
【請求項５３】
前記ＬＥＣ１ポリヌクレオチドが配列番号２１である請求項５２の方法。
【請求項５４】
転写を調節することによって胚の特徴を植物内において誘導する請求項４７の方法。
【請求項５５】
転写を調節することによって種子の発生を誘導する請求項４７の方法。
【請求項５６】
（ａ）請求項２１記載の単離核酸分子を提供し；
（ｂ）前記単離核酸分子の配列をサンプル中のＤＮＡの配列と比較することができる条件下で、前記単離核酸分子をサンプルと接触させ；さらに
（ｃ）前記比較の結果を分析する
工程を含むことを特徴とする、サンプル中の核酸を検出する方法。
【請求項５７】
相補性核酸配列間で二重体を形成できる条件下で、前記単離核酸分子とサンプルを接触させる請求項５６の方法。
【請求項５８】
請求項１のリコンビナント発現カセットを含むトランスジェニク植物細胞またはトランスジェニック植物。
【請求項５９】
前記ＬＥＣ１ポリペプチドが配列番号２０である請求項５８のトランスジェニック植物細胞または植物。
【請求項６０】
前記ポリヌクレオチド配列が配列番号１９である請求項５９のトランスジェニック植物細胞または植物。
【請求項６１】
前記ＬＥＣ１ポリペプチドが配列番号２２である請求項５８のトランスジェニック植物細胞または植物。
【請求項６２】
前記ポリヌクレオチドが配列番号２１である請求項６１のトランスジェニック植物細胞または植物。
【請求項６３】
前記プロモーターが構成的プロモーターである請求項５８のトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物。
【請求項６４】
前記プロモーターがＬＥＣ１遺伝子由来のプロモーターを含む請求項５８のトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物。
【請求項６５】
前記ポリヌクレオチド配列がアンチセンス方向で前記プロモーターと連結されている請求項５８のトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物。
【請求項６６】
前記プロモーターが配列番号３のヌクレオチド１付近からヌクレオチド１９９８付近を含む請求項６４のトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物。
【請求項６７】
前記プロモーターが配列番号２３を含む請求項６４のトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物。
【請求項６８】
前記プロモーターがさらに配列番号２４を含む請求項６７のトランスジェニック植物細胞またはトランスジェニック植物。
【請求項６９】
請求項５８に記載の植物細胞から再生された植物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互引用：本出願は、米国特許出願（ＵＳＳＮ）０９／１９３，９３１（１９９８年１１月１７日出願）の部分継続出願であり、後者はＵＳＳＮ０９／１０３，４７８（１９９８年６月２４日出願）の部分継続出願であり、後者はＵＳＳＮ０９／０２６，２２１（１９９８年２月１９日出願）の継続出願であり、さらに後者はＵＳＳＮ０８／８０４，５３４（１９９７年２月２１日出願）の部分継続出願である。前述の出願はそれぞれ参照により本明細書に含まれる。
【０００２】
本発明は植物の遺伝子工学に関する。特に、本発明は農業で重要な植物の改良に有用な新規な胚特異的遺伝子に関する。
【０００３】
発明の背景
高等植物における胚形成は、その主要な器官が形成される植物生活環における重要な時期である。胚の発生は２つの主要な局面に分けられる。すなわち、胚の主要な体構造の基礎が確立される初期相並びに成熟、乾燥および休眠を含む後期相である。初期相では、胚の対称性は放射状から左右対称に変化し、先端極の２つの子葉原基によって取り囲まれたシュートの分裂組織および基底極の根の分裂組織をもつ胚軸を生じる。後期相では、成熟時に胚はその最大サイズに達し、種子は貯蔵タンパク質および脂質を蓄積させる。成熟は乾燥期によって終了し、乾燥期には種子の水分含有量は急速に減少し、胚は代謝静止状態に進む。休眠は種子の発芽とともに終了し、発生はシュートおよび根の分裂組織領域から続いて起こる。
【０００４】
胚形成の最初の相における細胞および器官の分化を制御する正確な調節機構はほとんど分かっていない。植物ホルモン、アブシジン酸（ＡＢＡ）は、胚形成時の発芽を抑制することによって後期胚形成時（主に成熟期）に役割を果すと考えらている（Ｍ． Ｂｌａｃｋ， （１９９１）． Ｉｎ Ａｂｓｃｉｓｉｃ Ａｃｉｄ： Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｗ．Ｊ． Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｈ．Ｇ． Ｊｏｎｅｓ． Ｅｄｓ． （Ｏｘｆｏｒｄ： Ｂｉｏｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ）， ｐｐ． ９９−１２４；Ｍ． Ｋｏｏｒｎｎｅｅｆ ａｎｄ Ｃ．Ｍ． Ｋａｒｓｓｅｎ． Ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ． Ｅ．Ｍ． ｅｙｅｒｏｗｉｔｚ ａｎｄ Ｃ．Ｒ． Ｓｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅ， Ｅｄｓ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ； Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）， ｐｐ． ３１３−３３４）。種子の発生に影響を与え、さらにＡＢＡに感受性をもたない突然変異がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびトウモロコシで特定された。シロイヌナズナのＡＢＡ非感受性（ａｂｉ３）変異およびトウモロコシの胎生（ｖｐ１）変異が主に後期胚形成時に検出されている（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：５２３−５３２（１９８９）； Ｐａｒｃｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１５６７−１５８２（１９９４））。ＶＰ１遺伝子およびＡＢＩ３遺伝子の両方が単離され、保存領域を共有することが見出された（Ｊ． Ｇｉｒａｕｄａｔ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：２３２−２３８； Ｄ．Ｒ． ＭｃＣａｒｔｙ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４６：７１−９３（１９９５））。ＶＰ１遺伝子は転写アクチベーターとして機能することが示された（ＭａＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６６：８９５−９０６（１９９１））。ＡＢＩ３は同様な機能を有することが提唱された。
【０００５】
また別の種類の胚欠損変異体は次の３つの遺伝子を含む：ＬＥＡＦＹ ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ（葉状子葉遺伝子）１および２（ＬＥＣ１、ＬＥＣ２）並びにＦＵＳＣＡ３（ＦＵＳ３）。これらの遺伝子は後期胚形成に中心的な役割を果すと考えられている（Ｂａｕｍｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｊ ６：３７９−３８７（１９９４）； Ｄ．Ｗ． Ｍｅｉｎｋｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１６４７−１６５０（１９９２）； Ｍｅｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１０４９−１０６４； Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１７３１−１７４５（１９９４））。ａｂｉ３変異体のように、葉状子葉遺伝子変異体は後期胚形成において不完全である。これらの変異体では、種子の形態は変化し、シュートの分裂組織は初期に活性化され、貯蔵タンパク質を欠き、さらに発育中の子葉はアントシアニンを蓄積する。ａｂｉ３変異体は乾燥に非耐性で、したがって後期胚形成時に死滅する。にもかかわらず、前記未成熟変異体の胚をレスキューすれば成熟した繁殖能力のある植物を生じることができる。しかしながら、ａｂｉ３と異なり、未成熟変異体が発芽した場合は、それらは子葉の軸側表面に表皮毛を示す。表皮毛は通常は葉、茎およびガク片にのみ存在し、子葉には存在しない。したがって、葉状子葉遺伝子は、胚形成時に子葉の特性を具体化する役割を有すると考えられる。
【０００６】
上記の変異体の中で、ｌｅｃ１変異体は胚形成時にもっとも劇的な表現型を示す。例えば、ｌｅｃ１変異体では成熟および発芽後プログラムは同時に活性化し（Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９９４）、このことは後期胚形成時の遺伝子調節におけるＬＥＣ１の重要な役割を示唆している。
【０００７】
胚形成の遺伝子制御を明らかにする最近の進歩にもかかわらず、胚および種子で特異的に発現される遺伝子の特定および分析に更なる進展が必要になっている。そのような遺伝子の性状決定によって、所望の多様な特質をもつ遺伝子操作植物が可能になろう。例えば、胚形成を制御する遺伝子の発現を操作して、葉および子葉に貯蔵タンパク質を蓄積させるような特色を変化させることができる。また別には、胚または種子特異的遺伝子のプロモーターを用いて、所望の異種遺伝子の発現を胚または種子で誘導することができる。
【０００８】
発明の要旨
本発明は、部分的にはＬＥＣ１遺伝子の単離および性状決定を基にしている。本発明はＬＥＣ１ポリヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号２のＢドメインと少なくとも６８％同一である。
【０００９】
本発明はまた、ＬＥＣ１ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列（配列番号２のＢドメインと少なくとも６８％同一）またはその相補物に機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを提供する。いくつかの実施態様では、前記ポリヌクレオチド配列は前記発現カセットのいずれのエレメントに対しても異種である。好ましい実施態様では、Ｂドメインは配列番号２のアミノ酸残基２８付近からアミノ酸残基１１７付近の間のポリペプチドを含む。より好ましい実施態様では、Ｂドメインは、配列番号２のアミノ末端のアミノ酸残基２８−３５およびカルボキシ末端のアミノ酸残基１０３−１１７をもつポリペプチド配列を含む。
【００１０】
特に好ましい実施態様では、そのＬＥＣ１ポリペプチドは配列番号２０または２２に示されている。そのようなＬＥＣ１ポリペプチドはそれぞれ配列番号１９または配列番号２１に示されているポリヌクレオチド配列によってコードすることができる。別の実施態様では、前記ＬＥＣ１ポリペプチドは、２つまたは３つ以上のＬＥＣ１ポリペプチドまたはポリペプチドサブ配列間の融合物である。
【００１１】
本発現カセットはＬＥＣ１ポリヌクレオチオドまたはその相補物と機能的に連結されたプロモーターを含む。例えば、前記プロモーターは構成的プロモーターであってもよい。例えば、ＬＥＣ１プロモーターは配列番号３のヌクレオチド１付近からヌクレオチド１９９８付近のものでもよい。ある実施態様では、前記異種ヌクレオチドはアンチセンス方向で前記プロモーターと連結されてあってもよい。別の実施態様では、前記プロモーターは配列番号２３である。前記プロモーターはさらに配列番号２４を含むことができる。
【００１２】
別の実施態様では、本発明は、ＬＥＣ１ポリペプチドのＡまたはＣドメインと少なくとも９０％同一のサブ配列を含むＬＥＣ１ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列またはその相補物と機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを提供する。前記ポリヌクレオチド配列は前記発現カセットのいずれのエレメントとも異種であってもよい。そのような発現カセットは、２つまたは３つ以上のＬＥＣ１ポリペプチドまたはポリペプチドサブ配列の融合物をコードすることができる。
【００１３】
本発明はまた、植物で異種ポリペプチドを発現させる発現カセットを提供する。本発現カセットは異種ポリヌクレオチドに機能的に連結されたＬＥＣ１プロモーターを含む。いくつかの実施態様では、前記ＬＥＣ１プロモーターは配列番号２３と少なくとも７０％同一である。いくつかの実施態様では、前記発現カセットのプロモーターは、配列番号２４と少なくとも７０％同一のプロモーターを含む。好ましくは、前記プロモーターは配列番号２４に表されている配列を含む。
【００１４】
本発明はまた、配列番号２のＢドメインと少なくとも６８％同一のサブ配列を含むＬＥＣ１ポリペプチドをコードする単離核酸（クローンＭＮＪ７でないことを条件とする）またはその相補物を提供する。好ましい実施態様では、前記Ｂドメインは、配列番号２のアミノ酸２８−３５のアミノ末端およびアミノ酸１０３−１１７のカルボキシ末端を有するポリペプチド配列を含む。別の実施態様では、ＬＥＣ１ポリペプチドは配列番号２０または配列番号２２に示されている。そのようなＬＥＣ１ポリペプチドは、それぞれ配列番号１９または配列番号２１に示されているポリヌクレオチド配列によってコードされるものでもよい。別の実施態様では、ＬＥＣ１ポリペプチドは、２つまたは３つ以上のＬＥＣ１ポリペプチドまたはポリペプチドサブ配列間の融合物である。
【００１５】
本発明の単離核酸はさらにＬＥＣ１をコードする核酸と機能的に連結されたプロモーターを含むことができる。前記プロモーターは構成的プロモーターであってもよい。また別には、前記プロモーターはＬＥＣ１遺伝子に由来するプロモーターでもよい。例えば、ＬＥＣ１プロモーターは配列番号３のヌクレオチド１付近からヌクレオチド１９９８付近であってもよい。ある実施態様では、前記異種ポリヌクレオチドは、アンチセンス方向に前記プロモーターと連結されていることができる。
【００１６】
本発明は、本発明の発現カセットまたは核酸を含むホスト細胞を提供する。したがって、ある実施態様では、本発明のホスト細胞は、配列番号２のＢドメインと少なくとも６８％同一のサブ配列を有するＬＥＣ１ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列またはその相補物と機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。他の実施態様では、本発明のホスト細胞は、ＬＥＣ１ポリペプチドのＡまたはＣドメインと少なくとも９０％同一のサブ配列を有するＬＥＣ１ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列またはその相補物と機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。他の実施態様には、配列番号２３と少なくとも７０％同一のプロモーターを含む発現カセット、または配列番号２のＢドメインと少なくとも６８％同一のサブ配列を含む単離核酸（ただし前記核酸はクローンＭＮＪ７ではない）を含むホスト細胞が含まれる。
【００１７】
本発明はまた、配列番号２のＢドメインと少なくとも６８％同一のアミノ酸配列を含み、さらに配列番号１、配列番号１９もしくは配列番号２１またはそのフラグメントでコードされるポリヌクレオチドの生物学的活性の少なくとも１つを示すことができる単離ポリペプチドを提供する。上記ポリペプチドと結合することができる抗体もまた提供される。
【００１８】
さらにまた、単離核酸をホスト細胞に導入する方法が提供される。本方法は、本明細書に記載する本発明の核酸の発現カセットを提供し、ホスト細胞への核酸の挿入を可能にする条件下で前記発現カセットまたは核酸をホスト細胞と接触させることを含む。
【００１９】
本発明はまた、遺伝子導入（トランスジェニック）植物細胞または植物を提供する。前記植物細胞または植物は、配列番号２のＢドメインと少なくとも６８％同一の配列を含むＬＥＣ１ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列またはその相補物に機能的に連結されたプロモーターを含む発現カセットを含む。好ましい実施態様では、前記ＬＥＣ１ポリペプチドは配列番号２０または配列番号２２に示されている。そのようなＬＥＣ１ポリペプチドは、配列番号１９または配列番号２１にそれぞれ示されているポリヌクレオチド配列によってコードできる。本発明はまた、上記の植物細胞から再生される植物を提供する。
【００２０】
本発現カセットのプロモーターは構成的プロモーターでもよい。また別には、前記プロモーターはＬＥＣ１遺伝子由来のプロモーターでもよい。例えば、ＬＥＣ１プロモーターは配列番号３のヌクレオチド１付近からヌクレオチド１９９８付近であってもよい。ある実施態様では、異種ポリヌクレオチドはアンチセンス方向で前記プロモーターと連結されてあってもよい。別の実施態様では、前記プロモーターは配列番号２３である。前記プロモーターはまた配列番号２４をさらに含むことができる。
【００２１】
本発明はまた、植物細胞で異種ポリヌクレオチドを発現させる発現カセットを提供する。前記発現カセットは、配列番号２３と少なくとも７０％同一のプロモーターポリヌクレオチドを含み、このプロモーターポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドに機能的に連結されている。ある実施態様では、前記プロモーターポリヌクレオチドは配列番号２３である。前記プロモーターはさらにまた配列番号２４と少なくとも７０％同一のポリヌクレオチド含むことができる。好ましい実施態様では、前記プロモーターは配列番号２４を含む。
【００２２】
本発明はまた、発現カセットを植物に導入し、転写が調節された植物を検出する工程を含む転写調節方法を提供する。前記発現カセットは、異種のＬＥＣ１ポリヌクレオチドに機能的に連結された植物プロモーター、配列番号２のＢドメインと少なくとも６８％同一の配列を含むＬＥＣ１ポリペプチドをコードする前記異種ＬＥＣ１ポリヌクレオチドを含む。これらの方法の実施態様には、ＬＥＣ１ポリヌクレオチドが配列番号２、配列番号２０または配列番号２２の場合が含まれる。他の実施態様では、ＬＥＣ１ポリペプチドは配列番号１、配列番号１９または配列番号２１によってコードされる。本発明の好ましい実施態様には、転写の調節によって植物に胚の特徴が導入される方法が含まれる。また別の実施態様では、転写の調節によって種子の発生が誘導される。
【００２３】
本発明はまた、サンプル中の核酸を検出する方法を提供する。本方法は、配列番号２のＢドメインと少なくとも６８％同一の配列を有するＬＥＣ１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列またはその相補物を含む単離ＬＥＣ１核酸分子を提供し、サンプル中のＤＮＡ配列と前記単離核酸配列を比較することができる条件下で前記単離核酸分子をサンプルと接触させ、さらに前記比較の結果を分析することを含む。いくつかの実施態様では、前記単離核酸分子およびサンプルは、相補性核酸配列間で二重体を形成することができる条件下で接触させる。
【００２４】
定義
“核酸”という語句は、５´から３´末端に向かって読み取られるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。核酸には、ポリメラーゼによって正確なレッドスルーが可能で、さらにそのような核酸によってコードされるポリペプチドの発現に変化を与えない修飾ヌクレオチドもまた含まれる。
【００２５】
“ポリヌクレオチド配列”または“核酸配列”という語句には、一本鎖の各々または二本鎖のいずれかの状態のセンスおよびアンチセンス鎖の両方が含まれる。前記配列には自己複製プラスミド、染色体性配列、およびＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマーが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００２６】
“〜をコードする核酸配列”という語句は、特異的なタンパク質またはペプチドの発現を指令する核酸を指す。この核酸配列には、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖およびタンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列が含まれる。前記核酸配列には、完全長の核酸配列の他に完全長の配列に由来する完全な長さをもたない配列の両方が含まれる。前記配列には、固有のホスト細胞にコドンの優先性を提供するために導入することができる天然の配列の縮退コドンが含まれることは理解されるべきである。
【００２７】
“プロモーター”という用語は、転写開始の上流または下流に位置する領域または配列決定基を指し、転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質による認識および結合に必要である。“植物プロモーター”とは、植物細胞で転写を開始することができるプロモーターである。そのようなプロモーターは必ずしも植物起源である必要はなく、例えば植物ウイルス由来プロモーター（例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）も本発明で用いることができる。
【００２８】
“植物”には、完全な植物、シュートの栄養器官／構造物（例えば葉、茎および塊茎）、根、花および花の器官／構造物（例えば包葉、ガク片、花弁、オシベ、心皮、葯および胚珠）、種子（胚、内乳および種皮を含む）および果実（成熟卵巣）、植物組織（例えば導管組織、土中組織など）および細胞（例えば保護細胞、卵細胞、表皮毛など）およびそれらの子孫が含まれる。本発明の方法で用いることができる植物の種類は、一般に形質転換技術になじみやすい広範囲の種類の高等および下等植物で、被子植物（単子葉および双子葉植物）、裸子植物、シダおよび多細胞藻類が含まれる。前記には種々の倍数性レベルを有する植物が含まれ、異数体、倍数体、二倍体、一倍体および半接合体を含む。
【００２９】
ポリヌクレオチド配列は、それが他の種に由来する場合、または同じ種に由来する場合はその本来の形態から改変されている場合は、生物または第二のポリヌクレオチドに対して“異種”である。例えば、異種のコード配列に機能的に連結されているプロモーターとは、プロモーターが得られた種と異なる種に由来するコード配列を意味し、また同じ種に由来する場合は、天然に存在する対立遺伝子座変種のいずれとも異なるコード配列を意味する。本明細書で定義されるように、機能的に連結されたＬＥＣ１プロモーターとは異種である改変ＬＥＣ１コード配列には、Ｗｅｓｔら（Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１７３１−１７４５（１９９４））が記載したＴ−ＤＮＡ挿入変異体は含まれない。
【００３０】
個々の植物に対して“外因性”であるポリヌクレオチドは、交配以外の任意の手段によって植物に導入されたポリヌクレオチドである。上記を達成することができる手段の例は下記で述べるが、アグロバクテリウム仲介形質転換、バイオリスティックな方法、エレクトロポレーション、インプランタ術などが含まれる。外因性核酸を含む植物は、本明細書ではＲ１世代のトランスジェニック植物と称される。交配または自殖によって生じるトランスジェニック植物は前記のような植物の子孫である。
【００３１】
本明細書で用いられる、“胚特異的遺伝子”または“種子特異的遺伝子”とは、もっぱら植物の胚の発生時に発現される遺伝子である。本発明では、胚の発生は接合体の最初の細胞分割で開始し、胚発生（成熟、乾燥、休眠という特徴を有する）の後期相をまで続き、成熟した乾燥種子の製造により終了する。胚特異的遺伝子は、さらに“初期相特異的”および“後期相特異的”に分類される。初期相特異的遺伝子は、胚の形態発生の終了まで胚で発現される遺伝子である。後期相特異的遺伝子は、成熟から成熟乾燥種子の生成までに発現される遺伝子である。
【００３２】
“ＬＥＣ１ポリヌクレオチド”とは、約１００から約９００ヌクレオチド、時には約３００から約６３０ヌクレオチドのコード領域を含む（から成る）核酸配列であって、これはストリンジェントな条件下（下記で定義する）で配列番号１とハイブリダイズするか、またはＬＥＣ１ポリペプチドをコードする。ＬＥＣ１ポリヌクレオチドはまた、低ストリンジェントな条件下（例えばＴｍ〜４０℃）で、配列番号１の１から８１位の配列または配列番号１の３５５から６２７位の配列を有する核酸プローブとハイブリダイズすることができるその能力によって特定することができる。
【００３３】
“ＬＥＣ１遺伝子由来プロモーター”または“ＬＥＣ１プロモーター”とは、典型的には長さが約５００から約２０００ヌクレオチド、通常は約７５０から１５００ヌクレオチドである。典型的なプロモーター配列は、配列番号３のヌクレオチド１−１９９８として、または配列番号２３として示されている。ＬＥＣ１プロモーターはまた、全ての（または本質的に全ての）プログロビュラー胚性細胞とともに後期胚の子葉および軸柱で発現を指令することができるその能力によって特定できる。
【００３４】
“ＬＥＣ１ポリペプチド”は、ＬＥＣ１ポリヌクレオチドによってコードされる約５０から約２１０、時には１００から１５０アミノ酸残基の配列である。完全長ＬＥＣ１ポリペプチドおよびＣＣＡＡＴ結合因子（ＣＢＦ）ドメインを含むフラグメントは、植物細胞で転写因子として機能することができるタンパク質のサブユニットとして作用することができる。ＬＥＣ１ポリペプチドはしばしばヌクレオチド配列ＣＣＡＡＴとの結合に必要な配列が存在することによって識別される。特に、配列番号３の残基３４−４０の７残基（ＭＰＩＡＮＶＩ）の短い領域は、ＣＣＡＡＴボックスとの結合に必要であることが示された領域と高度な類似性を示している。同様に、配列番号３の残基６１−７２（ＩＱＥＣＶＳＥＹＩＳＦＶ）は、サブユニット相互作用ドメインを含む領域とほぼ同一である（Ｘｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １２：４６４７−４６５５（１９９３））。
【００３５】
本明細書で用いられる、個々の胚特異的遺伝子（例えば配列番号１）の相同体は同種の植物または異種植物の第二の遺伝子であって、これは、第一の遺伝子の配列と実質的に同一（下記で述べるように決定される）の連続した少なくとも５０のヌクレオチドのポリヌクレオチド配列を有する。一般に、相同体は共通の進化の経歴を共有すると考えられている。
【００３６】
“ＬＥＣ１活性またはＬＥＣ１遺伝子発現の増加もしくは強化”とは、ＬＥＣ１活性の増大変化を指す。そのような活性または発現の増加の例には以下が含まれる。ＬＥＣ１活性またはＬＥＣ１遺伝子の発現が野生型、非トランスジェニックコントロール植物の活性レベルを超えて増加する（すなわち、ＬＥＣ１活性またはＬＥＣ１遺伝子発現の量の増加）。ＬＥＣ１活性またはＬＥＣ１遺伝子の発現が、野生型、非トランスジェニックコントロール植物では通常検出されない器官または組織で認められる（すなわち、ＬＥＣ１活性またはＬＥＣ１遺伝子発現の空間的分布の増加）。ＬＥＣ１活性またはＬＥＣ１遺伝子発現が器官、組織または細胞に存在する場合、ＬＥＣ１活性またはＬＥＣ１遺伝子発現が、野生型、非トランスジェニックコントロール植物よりも長期間増加する（すなわち、ＬＥＣ１活性またはＬＥＣ１遺伝子発現の期間の延長）。
【００３７】
個々の胚特異的遺伝子に“由来するポリヌクレオチド配列”とは、胚特異的遺伝子のサブ配列または完全長ポリヌクレオチド配列で、前記配列は、トランスジェニック植物に存在するときは所望の作用（例えば異種ポリヌクレオチドの発現を作動させて内因性遺伝子の発現を抑制する）を示す。本明細書で開示する個々の遺伝子の完全長配列は、下記配列表に示す完全な配列の約９５％、通常は少なくとも約９８％を含むことができる。
【００３８】
本明細書で用いられる“生殖組織”という用語には、果実、胚珠、種子、花粉、ピストル、花、または任意の胚性組織が含まれる。
【００３９】
導入遺伝子（トランスジーン）の発現および内因性遺伝子の抑制（例えばアンチセンスまたはセンスサプレッション）の両方の事例で、挿入されるポリヌクレオチド配列は必ずしも同一である必要はなく、前記ポリヌクレオチド配列が得られた遺伝子の配列と“実質的に同一”であってもよいことは当業者には理解されよう。下記で説明するように、これらの変種は特に前記用語に包含される。
【００４０】
挿入ポリヌクレオチド配列が転写され翻訳されて機能的なポリペプチドを生じる事例では、コドンの縮退のために、多数のポリヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードすることは当業者には理解されよう。これらの変種は特に、個々の胚特異的遺伝子（例えばＬＥＣ１）に“由来する配列”という用語に包含される。さらに、前記用語は特に、ＬＥＣ１遺伝子配列と実質的に同一（下記で述べるように決定される）であり、ＬＥＣ１ポリペプチドの機能を保持するタンパク質をコードする配列（例えば完全長配列）を含む。
【００４１】
内因性遺伝子の発現を抑制するために用いられるポリヌクレオチドの事例では、この導入される配列は必ずしも標的の内因性遺伝子の配列と完全に同一である必要はない。前記導入ポリヌクレオチド配列は、典型的には標的内因性配列と少なくとも実質的に同一（下記のように決定される）であろう。
【００４２】
２つの核酸配列またはポリペプチドについて、下記に述べるように最大一致が得られるようにアラインメントを実施したとき、前記２つの配列においてそれぞれヌクレオチドまたはアミノ酸配列が同じならば、前記２つの核酸配列またはポリペプチドは“同一”と称される。“相補的である”という用語は、配列がリファレンス配列の全てまたは一部分と相補性を有することを示すために本明細書では用いられる。
【００４３】
比較のための配列の最適アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎのローカル・ホモロジー・アルゴリズム（Ａｄｄ． ＡＰＬ． Ｍａｔｈ ２：４８２（１９８１））、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈのホモロジー・アラインメント・アルゴリズム（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３（１９７０））、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎの同様な方法による検索（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ（ＵＳＡ） ８５：２４４４（１９８８））、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）または精査によって実施できる。
【００４４】
“配列同一性の百分率”は最適なアラインメントを実施した２つの配列を比較ウィンドウで比較することによって決定される。この場合、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドの部分は、２つの配列の最適なアラインメントが得られるようにリファレンス配列（付加または欠失を含まない）と比較できるように付加または欠失を含むことができる（すなわちギャップ）。百分率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列で生じるポジション数を決定して適合ポジション数を得、適合ポジション数を比較ウィンドウ内の総ポジション数で割り、結果に１００を乗じることによって算出される。
【００４５】
ポリヌクレオチド配列の“実質的同一”とう用語は、ポリヌクレオチドが少なくとも２５％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。また別には、パーセント同一性は、２５％から１００％までのいずれの整数でもよい。より好ましい実施態様は、本明細書で述べたプログラム、好ましくはＢＬＡＳＴを用い、下記に述べるように標準的なパラメーターを使用しリファレンス配列と比較したとき少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の同一性を含む。したがって、本発明のＬＥＣ１配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号１９および配列番号２１と実質的な同一性を有する核酸配列を含む。本発明のＬＥＣ１配列は、配列番号２、配列番号２０または配列番号２２と実質的な同一性を有するポリペプチド配列を含む。２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するためには、コドンの縮退、アミノ酸類似性、読み枠の位置設定などを考慮してこれらの値は適当に調節できることは当業者には理解されよう。このためにアミノ酸配列の実質的同一は通常は少なくとも４０％の配列同一を意味する。ポリペプチドの好ましいパーセント同一性は４０％から１００％までのいずれの整数でもよい。より好ましい実施態様には、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一が含まれる。もっとも好ましい実施態様には６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％および７５％同一が含まれる。“実質的に類似”するポリペプチドは、同一ではない残基のポジションは保存的アミノ酸変化による相違をもつかもしれないという点を除いて上記に特記したように配列を共有する。保存的アミノ酸置換は、同様な側鎖をもつ残基との互換性をいう。例えば、脂肪族側鎖をもつアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖をもつアミノ酸群はセリンおよびスレオニンで、アミド含有側鎖をもつアミノ酸群はアスパラギンおよびグルタミンで、芳香族側鎖をもつアミノ酸群はフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンで、塩基性側鎖をもつアミノ酸群はシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、アスパラギン酸−グルタミン酸およびアスパラギン−グルタミンである。
【００４６】
ヌクレオチド配列が実質的に同一であるというまた別の指標は、２つの分子が互いに（または第三の核酸と）ストリンジェント（厳格）な条件下でハイブリダイズするか否かである。ストリンジェントな条件は配列によって左右され、異なる環境では異なってくる。一般に、ストリンジェントな条件は、特定のイオン強度およびｐＨで個々の配列の熱溶融点（Ｔｍ）より約５℃低い温度が選択される。前記Ｔｍは、５０％の標的配列が完全に適合するプローブとハイブリダイズする温度（特定のイオン強度およびｐＨ下で）である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩濃度が約０．０２モル（ｐＨ７）で温度が少なくとも約６０℃というものである。
【００４７】
本発明では、本発明の胚特異的遺伝子によってコードされるｍＲＮＡは、本発明のｃＤＮＡまたは少なくとも約１００ヌクレオチドのフラグメントを用いてストリンジェントな条件下におけるノーザンブロットによって特定できる。本発明の目的の場合、前記のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションのためのストリンジェントな条件は、６３℃２０分で０．２×ＳＳＣで少なくとも１回の洗浄を含むもの、または同等な条件である。本発明の遺伝子を含むゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、同じｃＤＮＡ（または少なくとも約１００ヌクレオチドのフラグメント）を用いストリンジェントな条件下で特定できる。前記ストリンジェントな条件は、本発明の場合、少なくとも約５０℃、通常は約５５℃の温度で２０分、０．２×ＳＳＣで少なくとも１回（通常は２回）の洗浄、または同等な条件を含む。
【００４８】
好ましい実施態様の記載
本発明は、植物の遺伝子操作に有用な新規な胚特異的遺伝子を提供する。本発明の遺伝子に由来するポリヌクレオチド配列は、例えば、所望の異種遺伝子を胚（プロモーター配列の場合）で所望の遺伝子を発現させるために、または胚の発生を調節するために、または胚の特性の他の器官での発生を調節するために（例えばトランスジェニック植物での遺伝子の発現を強化することによって）用いることができる。特に、本発明は、本明細書でＬＥＣ１と称するシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）の新規な遺伝子を提供する。ＬＥＣ１は、転写因子として機能するタンパク質のサブユニットであるポリペプチドをコードする。したがって、この遺伝子の発現の調節によって、多数の有用な特質を操作することができる（例えば子葉または葉における貯蔵タンパク質の含有量を増減させる）。
【００４９】
一般に、用語体系および下記で述べる組換えＤＮＡ技術は周知で、当技術分野で一般的に用いられているものである。クローニング、ＤＮＡおよびＲＮＡの単離、増幅および精製には標準的な技術を用いる。ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどを含む一般的な酵素反応は製造元の指定にしたがって実施する。前記の技術およびその他の種々の技術は一般的に文献にしたがって実施する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９））。
【００５０】
本発明の核酸の単離
本発明の遺伝子に由来する配列の単離は多数の技術によって実施できる。例えば、本明細書に開示する配列をベースにしたオリゴヌクレオチドプローブを用いて、所望の植物種のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーで所望の遺伝子を特定できる。ゲノムライブラリーを構築するためには、ゲノムＤＮＡの大型セグメントを、例えば制限エンドヌクレアーゼを用いてランダムに分断して作製し、ベクターＤＮＡに連結して適切なベクターに収納できる連鎖体を作製する。胚特異的ｃＤＮＡライブラリーを調製するために、胚からｍＲＮＡを単離し、遺伝子転写物を含むｃＤＮＡライブラリーを前記ｍＲＮＡライブラリーから調製する。
【００５１】
続いて、クローン化した胚特異的遺伝子（例えば本明細書で開示するポリヌクレオチド）の配列をベースにしたプローブを用い、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列とハイブリダイズするプローブを用い、同じ植物種または異なる植物種の相同な遺伝子を単離することができる。
【００５２】
また別の選択肢として、増幅技術を用いて問題の核酸を核酸サンプルから増幅させることができる。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術によって、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから直接遺伝子配列を増幅させることができる。ＰＣＲおよびｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅技術はまた、例えば発現されるべきタンパク質をコードする核酸配列のクローニングのために、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するプローブとして核酸を使用するために、核酸の配列決定のために、または他の目的のために有用である。
【００５３】
植物組織の胚特異的遺伝子を特定するための適切なプライマーおよびプローブは、本明細書で提供される配列を比較することによって作製される。ＰＣＲの概要については次の文献を参照されたい：ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．（Ｍ． Ｉｎｎｉｓ， Ｄ． Ｇｅｌｆａｎｄ， Ｊ． Ｓｎｉｎｓｋｙ ａｎｄ Ｔ． Ｗｈｉｔｅ， ｅｄｓ．）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９０））。この目的のために適したプライマーには、例えば以下が含まれる：ＵＰプライマー−５´ＧＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＣＣＡＡＣＣＣＣＡ３´およびＬＰプライマー−５´ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＡＣＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡ３´。別の選択肢として、以下のプライマー対を用いることができる：５´ＡＴＧＡＣＣＡＧＣＴＣＡＧＴＣＡＴＡＧＴＡＧＣ３´および５´ＧＣＣＡＣＡＣＡＴＧＧＴＧＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧ３´または５´ＧＡＧＡＴＡＧＡＧＡＣＣＧＡＴＣＧＴＧＧＴＴＣ３´および５´ＴＣＡＣＣＴＡＴＡＣＴＧＡＣＣＡＴＡＡＴＧＧＴＣ３´。第三のプライマーセットは以下を含む：５´−ＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＣＧＴＧＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＴ−３´および５´−ＡＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＴＡＣＴＴＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＴＣＧ−３´。増幅条件は典型的には以下のとおりである。反応成分：１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、１．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．００１％ゼラチン、２００μＭのｄＡＴＰ、２００μＭのｄＣＴＰ、２００μＭのｄＧＴＰ、２００μＭのｄＴＴＰ、０．４μＭのプライマー、および１００単位／ｍＬのＴａｑポリメラーゼ。プログラム：９６℃３分、９６℃４５秒、５０℃６０秒、７２℃６０秒を３０サイクル、続いて７２℃５分。
【００５４】
ポリヌクレオチドはまた学術論文に記載されている周知の技術によって合成してもよい。例えば以下を参照されたい：Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ４７：４１１−４１８（１９８２）およびＡｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０５：６６１（１９８３）。続いて、相補鎖を合成して適切な条件下でこれらの鎖を一緒にアニーリングさせるか、または適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを用いて相補鎖を付加することによって二本鎖ＤＮＡフラグメントを合成することができる。
ＬＥＣ１遺伝子配列の分析
本発明のＬＥＣ１核酸配列の種類には、核酸配列（配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号１９および配列番号２１を含む）およびタンパク質配列（配列番号２、配列番号２０および配列番号２２を含む）を用いて分析することによって特定および性状決定された遺伝子および遺伝子産物が含まれる。本発明のＬＥＣ１配列には、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号１９および配列番号２１と実質的な同一性を有する核酸配列が含まれる。本発明のＬＥＣ１配列には、配列番号２、配列番号２０および配列番号２２と実質的な同一性を有するポリペプチドが含まれる。
【００５５】
ＬＥＣ１核酸配列にはまた２つまたは３つ以上のＬＥＣ１遺伝子の融合物が含まれる。異なる遺伝子の異なるドメインを融合させることができる。ＬＥＣ１遺伝子融合物は直接連結させるか、または３つ以上の融合パートナーの２つを連結させるさらに別のアミノ酸によって結合させてもよい。
【００５６】
遺伝子融合物は、下記に述べる基本的な遺伝子組換えによって作製することができる。遺伝子融合物の選別は、遺伝子融合物によってもたらされる所望の表現型によって異なる。例えば、１つのＬＥＣ１タンパク質のＡドメインに付随する表現型が第二のＬＥＣ１タンパク質のＢドメインに付随する表現型とともに所望される場合は、第一のＬＥＣ１タンパク質のＡドメインと第二のＬＥＣ１のＢドメインとの融合物が作製されるであろう。前記融合物は、続いてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで所望の表現型について検査することができる。
【００５７】
遺伝子発現抑制における本発明の核酸の使用
本明細書に記載したように調製した単離核酸を用い、多数の技術により有用な発現カセットを調製できる。例えば、本発明の発現カセットを用いて内因性ＬＥＣ１遺伝子発現を抑制できる。発現の抑制は、例えば雑草の防除（抑制配列を雑草植物種に移し、交配によって伝達させることによる）または矮小で生命力のない種子を含む実を産生させるために有用である。
【００５８】
多くの方法を用いて植物で遺伝子発現を抑制できる。例えば、アンチセンス技術は簡単に用いることができる。これを実施するためには、所望の遺伝子の核酸セグメントをクローン化し、アンチセンスＲＮＡ鎖が転写されるようにプロモーターに機能的に連結する。続いて、この発現カセットで植物を形質転換し、アンチセンスＲＮＡ鎖を産生させる。植物細胞では、アンチセンスＲＮＡは、問題の酵素をコードするｍＲＮＡの蓄積を妨げることによって遺伝子の発現を抑制すると言われている（例えば次の文献を参照されたい：Ｓｈｅｅｈｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：８８０５−８８０９（１９８８）； Ｈｉａｔｔ ｅｔ ａｌ．， 米国特許４，８０１，３４０号）。
【００５９】
植物を形質転換するアンチセンス核酸配列は、内因性胚特異的遺伝子または抑制されるべき遺伝子の少なくとも一部分と実質的に同一であろう。しかしながら、前記配列は発現を抑制するために完全に同一である必要はない。本発明のベクターは、標的遺伝子に対して相同性または実質的な相同性を示す同種遺伝子群内の他のタンパク質にも抑制効果が及ぶようにデザインすることができる。
【００６０】
アンチセンスサプレッションの場合、導入配列はまた、最初の転写生成物または完全にプロセッシングを経たｍＲＮＡのいずれに関しても完全長である必要はない。一般に、より高い相同性を用いることによってより短い配列の代償とすることができる。さらにまた、導入される配列は同じイントロンまたはエクソンパターンをもつ必要はなく、さらに非コードセグメントの相同体も同様に有効である。通常は、約３０または４０ヌクレオチドからほぼ完全長のヌクレオチド配列を用いることができるが、少なくとも約１００ヌクレオチドの配列が好ましく、少なくとも約２００ヌクレオチドの配列がより好ましく、さらに少なくとも約５００ヌクレオチドの配列が特に好ましい。
【００６１】
触媒ＲＮＡ分子またはリボザイムもまた胚特異的遺伝子の発現を抑制するために用いることができる。実質的に任意の標的ＲＮＡと対を形成し、そのホスホジエステル骨格を特異的な位置で切断し、それによって標的ＲＮＡを機能的に不活化するリボザイムをデザインすることができる。前記の切断を実施する場合、リボザイム自体は変化を受けず、したがって再使用および他の分子の切断が可能で、確実な酵素を作ることができる。アンチセンスＲＮＡ内にリボザイム配列を包含させることによって、それらにＲＮＡ切断活性が付与され、それによって構築物の活性が高められる。
【００６２】
多数の種類のリボザイムが特定されている。ある種類のリボザイムは、植物内で自己切断および複製を行うことができる多数の小型環状ＲＮＡに由来する。前記ＲＮＡは単独で複製するか（バイロイドＲＮＡ）、またはヘルパーウイルス（サテライトＲＮＡ）とともに複製する。それらの例には、アボカドサンブロッチバイロイドのＲＮＡおよび以下のウイルスのサテライトＲＮＡが含まれる：タバコリングスポットウイルス、アルファルファ一過性ウイルス（ｌｕｃｅｒｎｅ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｓｔｒｅａｋ ｖｉｒｕｓ）、ベルベットタバコマダラウイルス（ｖｅｌｖｅｔ ｔｏｂａｃｃｏ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）、ジャガイモマダラウイルス（ｓｏｌａｎｕｍ ｎｏｄｉｆｌｏｒｕｍ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）およびサブテラニアンクローバーマダラウイルス（ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａｎ ｃｌｏｖｅｒ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓ）。標的ＲＮＡ特異的リボザイムのデザインおよび使用については次の文献に記載されている：Ｈａｓｅｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５８５−５９１（１９８８）。
【００６３】
また別の抑制はセンスサプレッションである。核酸がプロモーターに対してセンス方向に配置されている発現カセットの導入は、標的遺伝子の転写を阻止する有効な手段であることが示された。内因性遺伝子の発現を調節するためにこの方法を使用する例として以下の文献を参照されたい：Ｎａｐｏｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：２７９−２８９（１９９０）； 米国特許５，０３４，３２３号、５，２３１，０２０号および５，２８３，１８４号。
【００６４】
一般に、発現の抑制を所望する場合は、導入遺伝子のなんらかの転写が生じる。この作用は、導入配列がコード配列を含まずイントロンまたは非翻訳配列（内因性配列の主要転写物に存在する配列と相同である）を含む場合に生じる。導入配列は、一般に抑制しようとする内因性配列と実質的に同一であろう。この最小限の同一性は典型的には６５％を超えるが、より高い同一性は内因性配列のより効果的な抑制を示すであろう。８０％を超える実質的同一性が好ましいが、約９５％から絶対同一性がもっとも好ましいであろう。アンチセンス調節については、前記作用は、相同性または実質的相同性を示す同様な同種遺伝子群内の任意の他のタンパク質に応用できる。
【００６５】
センスサプレッションの場合、発現カセット内の導入配列は、完全長である必要はなく、さらに主要転写生成物または完全なプロセッシングを経たｍＲＮＡのいずれに対しても絶対同一性より低くてもよい。これは、過剰発現植物であるいくつかの植物の同時産生を回避するために好ましい。完全長よりも短いがより高い同一性をもつものは、より長いが同一性が低いものの代償となる。さらにまた、導入配列は、同じイントロンまたはエクソンパターンをもつ必要はなく、非コードセグメントの同一性は同様に有効であろう。通常は、アンチセンス調節について上記で述べたサイズ範囲をもつ配列が使用される。
【００６６】
固有のヌクレオチド配列を用いる技術（例えばアンチセンスまたはセンスサプレッション技術）によって、相同な同種遺伝子群をただ１つのセンスおよびアンチセンス転写物で抑制できることは当業者には理解されるところである。例えば、ある同種遺伝子群の保存配列（例えばＬＥＣ１のＢドメイン）をもつようにセンスまたはアンチセンス転写物をデザインした場合には、同種遺伝子群に属する多数の遺伝子を抑制できる。逆に、目的が相同な同種遺伝子群内のただ１つの遺伝子の抑制である場合は、同系遺伝子間でもっとも多様性をもつ配列をセンスまたはアンチセンス転写物の標的とするべきである。例えば、ＬＥＣ１のＡおよびＣドメインと同一のアンチセンス転写物を用い、関連する遺伝子（例えば配列番号１９または配列番号２１）を抑制することなくＬＥＣ１を抑制することができる。
【００６７】
植物でＬＥＣ１機能を抑制するまた別の手段は、負の優性変異の創出によるものである。このアプローチでは、機能をもたない変異体ＬＥＣ１ポリペプチド（野生型サブユニットと相互作用する能力は保持している）が植物に導入される。負の優性変異を創出するために変化させることができる残基の特定は、種々の種に由来するＣＢＦ相同体の種々のサブユニットの相互作用を調べた実験報告から決定できる（例えば以下を参照されたい：Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９２：１６２４−１６２８（１９９５））。
【００６８】
遺伝子発現強化における本発明の核酸の使用
さらにまた、本明細書で述べたように調製した単離配列を用いて、内因性ＬＥＣ１遺伝子発現を強化または増加させる発現カセットを調製することができる。遺伝子の過剰発現を所望する場合は、種々の種に由来する所望の遺伝子を用いて、潜在的なセンスサプレッション作用を減少させることができる。例えば、植物組織の貯蔵タンパク質を増加させるために、ＬＥＣ１ポリヌクレオチドの発現を強化させることが有用である。そのような技術は植物組織の栄養価を改善するために特に有用であろう。
【００６９】
当技術分野で周知の多くの手段のいずれも植物のＬＥＣ１活性の増強に用いることができる。例えば、胚の特色を植物または植物器官に導入するために発現強化は有用である。任意の器官、例えばシュートの栄養器官／構造物（例えば葉、茎および塊茎）、根、花および花の器官／構造物（例えば包葉、ガク片、花弁、オシベ、心皮、葯および胚珠）、種子（胚、内乳および種皮を含む）および果実を標的とすることができる。また別の選択肢として、１つまたは複数のＬＥＣ１遺伝子を構成的に発現させることができる（例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを用いる）。
【００７０】
本発明の遺伝子によってコードされるポリペプチドは、他のタンパク質と同様に、異なる機能を発揮する種々のドメインを有することは当業者には理解されよう。したがって、タンパク質の所望の機能的ドメインが発現されるかぎり、遺伝子配列は完全長である必要はない。上記で説明したように、ＬＥＣ１ポリペプチドはＣＣＡＡＴボックス結合因子（ＣＢＦ）タンパク質と関連性を有する。ＣＢＦは、真核生物で遺伝子活性を調節する高度に保存された同種転写因子群である（例えば以下を参照されたい：Ｍａｎｔｖａｎｉ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：１０８７−１０９１（１９９２）； Ｌｉ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：１０８７−１０９１（１９９２））。ＬＥＣ１はＣＢＦのＨＡＰ３サブユニットの一部分と高度な類似性をもつことが判明した。したがって、いずれの特定の理論または機構にもに拘束されないが、ＬＥＣ１はおそらく転写調節因子として機能するのであろう。図２Ａに模式的に示したように、ＨＡＰ３は３つのドメイン、すなわちアミノ末端Ａドメイン、中央Ｂドメインおよびカルボキシ末端Ｃドメインに分けられる。特にＬＥＣ１は、図２Ｂに示した他のＨＡＰ３相同体のＢドメインと約７５％から８５％の配列類似性（これは５５％から６３％の配列同一性に相当する）を有する（下記実施例１もまた参照されたい）。図２ＢはＬＥＣ１と他のＣＢＦ相同体間のアミノ酸配列相同性を示している。
【００７１】
ＬＥＣ１ポリペプチドはまたアミノ末端Ａドメイン、中央Ｂドメインおよびカルボキシ末端Ｃドメインを有する。ＬＥＣ１ポリペプチドのこの３つのドメインは以下のように定義される：配列番号２では、Ａドメインはアミノ酸１位から２７位付近に位置し；Ｂドメインはアミノ酸２８位付近から１１７位付近に位置し；Ｃドメインは１１８位付近から２０８位付近に位置する。ＬＥＣ１のＢドメイン、Ｌ１ＬおよびＰｈａｓｅｏｌｕｓＬ１Ｌは全て近縁で、一方、ＡおよびＣドメインは互いにほとんど相同性を示さない。
【００７２】
各ドメインに対応するＬＥＣ１のヌクレオチド配列は配列番号１に示されている。例えば、Ａドメインはヌクレオチド１位付近からヌクレオチド８２位付近に位置し、Ｂドメインはヌクレオチド８３位付近からヌクレオチド３５１位付近に位置し、Ｃドメインはヌクレオチド３５２位付近からヌクレオチド６２４位付近に位置する。
【００７３】
ドメインの境界はおおよそのものであることは当業者には理解されよう。ＬＥＣ１ポリペプチドおよびヌクレオチドのドメインの境界は、上記の境界から１から２０アミノ酸残基（１−６０ヌクレオチド）変動することが可能である。
【００７４】
ＬＥＣ１ポリペプチドのＤＮＡ結合活性、したがって転写活性機能は、７残基、ＭＰＩＡＮＶＩ（例えば配列番号２の残基３４−４０で見出される）の短い領域によって調節されると考えられている。したがって、本発明のポリペプチドはしばしばこれらの配列を保持するであろう。
内因性ＬＥＣ１遺伝子の改変
遺伝的変異を植物遺伝子に導入し、所望の特色をもつ植物を選択する方法は周知である。例えば、標準的な技術にしたがって、種子または他の植物成分を化学変異物質で処理することができる。そのような化学物質には以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：硫酸ジエチル、エチレンイミン、メタンスルホン酸エチルおよびＮ−ニトロソ−Ｎ−エチルウレア。また別の選択肢として、Ｘ線またはガンマ線のような照射源のイオン化放射を用いてもよい。
【００７５】
改変タンパク質鎖はまた、当技術分野で周知であり、文献（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． 上掲書）に記載された種々の組換えＤＮＡ技術を利用して容易にデザインすることができる。ヒドロキシルアミンもまた遺伝子のコード領域にただ１つの塩基の変異を導入するために用いることができる（Ｓｉｒｏｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９４：３０２−３１８（１９９１））。例えば、前記の鎖は、アミノ酸置換、付加、欠失などによって天然に存在する配列から一次構造レベルで変化させることができる。これらの改変を種々の組み合わせで用いて、最終的な改変タンパク質鎖を生成することができる。
【００７６】
また別の選択肢として、相同組換えを用い、ＬＥＣ１遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで特異的に標的とすることによって標的特定改変を誘発することができる（概論として以下を参照されたい：Ｇｒｅｗａｌ ａｎｄ Ｋｌａｒ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４６：１２２１−１２３８（１９９７））。相同組換えは植物で明瞭に示された（Ｐｕｃｈｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ５０：２７７−２８４（１９９４）； Ｓｗｏｂｏｄａ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １３：４８４−４８９（１９９４）； Ｏｆｆｒｉｎｇａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：７３４６−７３５０（１９９３）； Ｋｅｍｐｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８９：８０２−８０３（１９９７））。
【００７７】
本発明の遺伝子で相同組換え技術を用い、ＬＥＣ１遺伝子配列（例えば本明細書で開示した遺伝子）の選択した場所（５´上流、３´下流および遺伝子内部領域を含む）にｉｎ ｖｉｔｒｏで変異を発生させ、前記変異を所望の植物に標準的技術を用いて導入する。相同組換えの効率は使用ベクターに左右されることが分かっているので、変化させたＬＥＣ１遺伝子発現のトランスジェニック植物での選別効率を高めるためには、文献（Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：４３０３−４３０７（１９９４）； Ｖａｕｌｏｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ４：２４７−２５５（１９９５））に記載された二シストロン性遺伝子標的特定ベクター（ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ）を使用するのが便利である。相同組換えおよび野生型遺伝子の標的特定置換がトランスジェニック植物細胞で生じ、その結果ＬＥＣ１活性の抑制が得られるような態様で変異遺伝子を標的の野生型遺伝子と作用させる。
【００７８】
また別の選択肢として、その末端にダブルヘアピンキャップを有する二重体構造のＲＮＡおよびＤＮＡ残基の連続した一続きを含むオリゴヌクレオチドを用いることができる。ＲＮＡ／ＤＮＡ配列は、標的ＬＥＣ１遺伝子配列とアラインメントを実施し所望のヌクレオチド変化をもつようにデザインする。染色体外Ｔ−ＤＮＡプラスミド上のキメラオリゴヌクレオチドの導入は、わずかな数の形質転換植物細胞でキメラ分子により誘導される効率的で特異的なＬＥＣ１遺伝子変化をもたらす。この方法は、Ｃｏｌｅ−Ｓｔｒａｕｓｓら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１３８６−１３８９（１９９６））およびＹｏｏｎら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３：２０７１−２０７６（１９９６））が報告した。
【００７９】
所望の改変ＬＥＣ１ポリペプチドは、野生型ＬＥＣ１活性の有無をスクリーニングするアッセイを用いて特定できる。そのようなアッセイは、酵母でｈａｐ３変異を機能的に補完するＬＥＣ１タンパク質の能力を基準にすることができる。上記で特記したように、異なる種に由来する相同体が酵母のＣＢＦサブユニットと機能的に相互作用することが示された（Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２：１６２４−１６２８（１９９５）； Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：１９６８−１９７２（１９９１））。このスクリーニングのためのレポーターは、標準的な多数のレポーター遺伝子（例えば、調節性ＤＮＡ配列および酵母のＣＹＣ１遺伝子と融合している、ベータ−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子）のいずれでもよい。
【００８０】
ＬＥＣ１ｃＤＮＡクローンを含むプラスミドに当技術分野で周知の技術にしたがってｉｎ ｖｉｔｒｏで変異を誘発する。ｃＤＮＡ挿入物をプラスミドから切り出し、酵母の発現ベクター、例えばｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のクローニング部位に挿入する。このプラスミドを、酵母ＣＢＦによって調節されるｌａｃＺレポーターを含むｈａｐ３−酵母に導入する（例えばｐＬＧ２６５ＵＰ１−ｌａｃＺ）（Ｇｕａｒｅｎｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３６：３１７−３２１（１９８４））。続いて形質転換細胞を選別し、フィルターアッセイを用いてベータ−ガラクトシダーゼ活性についてコロニーを検査する。活性アッセイの結果を確認した後、ＬＥＣ１抗体を用いてベータ−ガラクトシダーゼ活性を欠く酵母株で免疫化学的な検査を実施し、安定なＬＥＣ１タンパク質を産生するが活性を欠く細胞を特定する。続いて変異ＬＥＣ１遺伝子を酵母からクローニングし、その核酸配列を決定し、変異部の性質を特定する。
【００８１】
他の実施態様では、本発明のＬＥＣ１遺伝子に由来するプロモーターを用い、所望の遺伝子生成物が胚、種子または果実に存在できるように胚特異的または種子特異的態様で異種遺伝子の発現を駆動させることができる。この目的に使用できる適切な構造遺伝子には、種子または果実の栄養価を高めるために有用なタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。その例には、抗酸化物質の生合成に必要な酵素（例えばビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥおよびメラトニン）をコードする遺伝子が含まれる。他の適切な例には、脂肪酸の修飾に必要なタンパク質をコードする遺伝子、または脂質、タンパク質および炭水化物の生合成に必要なタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。さらにまた他の遺伝子は、オーキシンおよびオーキシン類似体の生合成に必要な、果実のサイズの増加のためのタンパク質をコードする遺伝子、医薬として有用な化合物をコードする遺伝子および、種子のカビまたは他の感染を防ぐために植物に耐性を付与する生成物をコードする遺伝子であろう。
【００８２】
典型的には、所望のプロモーターは、本明細書で述べる胚特異的遺伝子に一致するゲノムクローンの５’配列を分析することによって特定される。プロモーター配列の配列特性を用いてプロモーターを特定できる。真核細胞の遺伝子発現を制御する配列は広範囲に調べられている。例えば、プロモーター配列のエレメントには、ＴＡＴＡボックスコンセンサス配列（ＴＡＴＡＡＴ）が含まれる。これは通常は転写開始部位から２０から３０塩基対上流に存在する。ほとんどの事例で、ＴＡＴＡボックスは正確な転写開始に必要である。植物では、典型的には、ＴＡＴＡボックスからさらに上流（−８０位から−１００位）に、トリヌクレオチドＧ（またはＴ）ＮＧを取り囲む一連のアデニンを有するプロモーターエレメントが存在する（Ｊ． Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ， ｐｐ．２２１−２２７（Ｋｏｓａｇｅ， Ｍｅｒｅｄｉｔｈ ａｎｄ Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ， ｅｄｓ． （１９８３））。
【００８３】
植物のゲノムＤＮＡのプロモーター領域を特定し性状を決定する多数の方法が当業者には公知である（例えば以下の文献を参照されたい：Ｊｏｒｄａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：８５５−８６６（１９８９）； Ｂｕｓｔｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：８３９−８５４（１９８９）； Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ７：４０３５−４０４４（１９８８）； Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：３０９−３１６（１９９１）； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １１０：１０６９−１０７９（１９９６））。
【００８４】
リコンビナントベクターの調製
単離した配列を上記の技術で使用するために、植物細胞の形質転換に適したリコンビナントＤＮＡベクターを調製する。多様な高等植物種を形質転換する技術は周知で、学術技術論文に記載されている。例えば次のものを参照されたい：Ｗｅｉｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２２：４２１−４７７（１９８８）。好ましくは、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、例えば完全長のタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を、形質転換植物の目的の組織で遺伝子から前記配列の転写を指令する転写および翻訳開始調節配列と結合させる。
【００８５】
例えば過剰発現のためには、再生された植物の全ての組織で遺伝子の発現を指令する植物プロモーターフラグメントを用いることができる。そのようなプロモーターは、本明細書では“構成的“プロモーターと称し、ほとんどの環境条件、発育または細胞分化状態で活性を示す。構成的プロモータの例には、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ転写開始領域、アグロバクテリウム＝ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ−ＤＮＡ由来１´−または２´−プロモーター、および当業者に公知の他の種々の植物遺伝子の転写開始領域が含まれる。
【００８６】
また別の選択肢として、植物プロモーターは、固有の組織で本発明のポリヌクレオチドの発現を指令することができるか（組織特異的プロモーター）、あるいはまた、より厳密な環境制御下で発現を指令することができる（誘導性プロモーター）。発育制御を受ける組織特異的プロモーターの例には、一定の組織（例えば果実、種子または花）においてのみ転写を開始するプロモーターが含まれる。上記で特記したように、本明細書で述べるＬＥＣ１遺伝子に由来するプロモーターは、所望の遺伝子産物が胚または種子に分布するように遺伝子の発現を指令するために特に有用である。他の適切なプロモーターには、貯蔵タンパク質または脂質体の膜タンパク質、オレオシンをコードする遺伝子に由来するものが含まれる。誘導性プロモーターによる転写に影響を与えることができる環境条件の例には嫌気性条件、温度上昇または光の存在が含まれる。
【００８７】
適当なポリペプチドの発現を所望する場合には、コード領域の３´末端のポリアデニル化領域を包含させるべきである。ポリアデニル化領域は天然の遺伝子、多様な他の植物遺伝子、またはＴ−ＤＮＡから得ることができる。
【００８８】
本発明の遺伝子に由来する配列（例えばプロモーターまたはコード領域）を含むベクターは、典型的には植物細胞に選別可能な表現型を付与するマーカー遺伝子を含むであろう。例えば、マーカーは、有毒物質耐性、特に抗生物質耐性（例えばカナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシン耐性）または除草剤耐性（例えばクロロスルホランまたはバスタ耐性）をコードすることができる。
【００８９】
本発明のＬＥＣ１核酸配列は植物細胞で組換えによって発現され、内因性ＬＥＣ１ポリペプチドのレベルを強化および増強する。また別の選択肢として、アンチセンスまたは他のＬＥＣ１構築物（上記に記載したもの）を用いて、ＬＥＣ１発現レベルを抑制する。多様な種々の発現構築物、例えば発現カセットおよび植物細胞の形質転換に適したベクターを調製できる。広範囲の多様な高等植物種を形質転換する技術は周知で、学術技術文献に記載されている。例えば次のものを参照されたい：Ｗｅｉｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ２２：４２１−４７７（１９８８）。ＬＥＣ１ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、例えば完全長タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列は、シス作動性（プロモーター）およびトランス作動性（エンハンサー）転写調節配列と結合させて、タイミング、組織型および形質転換植物の目的の組織における転写レベルを指令することができる。翻訳制御エレメントもまた用いることができる。
【００９０】
本発明は、好ましい実施態様でＬＥＣ１コード配列を植物で転写させることができるプロモーターと機能的に連結されたＬＥＣ１核酸を提供する。前記プロモーターは、例えば植物またはウイルスから得ることができる。プロモーターは構成的に活性を示すものでもよく、誘導性または組織特異的でもよい。本発明の組換え発現カセット、ベクター、トランスジェニック生物を構築する場合、種々のプロモーターを選択し、弁別的に（例えば植物または動物のいくつかの組織または全ての組織で）遺伝子発現を指令するために用いることができる。
【００９１】
典型的には、所望のプロモーターは、本明細書で述べる胚特異的遺伝子と一致するゲノムクローンの５’配列を分析することによって特定される。プロモーター配列の配列特性を用いてプロモーターを特定できる。真核細胞の遺伝子発現を制御する配列は広範囲に調べられた。例えば、プロモーター配列のエレメントには、ＴＡＴＡボックスコンセンサス配列（ＴＡＴＡＡＴ）が含まれる。これは通常は転写開始部位から２０から３０塩基対上流に存在する。ほとんどの事例で、ＴＡＴＡボックスは正確な転写開始に必要である。植物では、ＴＡＴＡボックスからさらに上流（−８０位から−１００位）に、典型的には、トリヌクレオチドＧ（またはＴ）ＮＧを取り囲む一連のアデニンを有するプロモーターエレメントが存在する（Ｊ． Ｍｅｓｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ Ｐｌａｎｔｓ， ｐｐ．２２１−２２７（Ｋｏｓａｇｅ， Ｍｅｒｅｄｉｔｈ ａｎｄ Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ， ｅｄｓ． （１９８３））。植物のゲノムＤＮＡのプロモーター領域を特定し性状を決定する多数の方法が当業者には公知である（例えば以下の文献を参照されたい：Ｊｏｒｄａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：８５５−８６６（１９８９）； Ｂｕｓｔｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：８３９−８５４（１９８９）； Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ７：４０３５−４０４４（１９８８）； Ｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：３０９−３１６（１９９１）； Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １１０：１０６９−１０７９（１９９６））。
構成的プロモーター
例えば再生植物の場合のように全ての形質転換細胞または組織でＬＥＣ１核酸の発現を指令するプロモーターフラグメントを用いることができる。そのようなプロモーターは、本明細書では“構成的“プロモーターと称され、ほとんどの環境条件および発育または細胞分化状態で活性を示す。生理的条件下で持続的に発現を駆動させるプロモーターは“構成的“プロモーターと称され、ほとんどの環境条件および発育または細胞分化状態で活性を示す。構成的プロモーターの例には植物に感染するウイルスに由来するもの、例えば以下が含まれる：カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓ転写開始領域（例えば次の文献を参照されたい：Ｄａｇｌｅｓｓ， Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ． １４２：１８３−１９１（１９９７））；アグロバクテリウム＝ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｕ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ−ＤＮＡ由来１´−または２´−プロモーター（例えば次の文献を参照されたい：Ｍｅｎｇｉｓｔｅ， （１９９７）上掲書； Ｏ´Ｇｒａｄｙ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９：９９−１０８（１９９５））；タバコモザイクウイルスのプロモーター；フィグワートモザイクウイルス（例えば次の文献を参照されたい：Ｍａｉｔｉ， Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ． ６：１４３−１５６（１９９７））；アクチンプロモーター、例えばシロイヌナズナのアクチン遺伝子プロモーター（例えば次の文献を参照されたい：Ｈｕａｎｇ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３：１２５−１３９（１９９７））；アルコールデヒドロゲナーゼ（Ａｄｈ）遺伝子のプロモーター（例えば次の文献を参照されたい：Ｍｉｌｌａｒ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３１：８９７−９０４（１９９６））；シロイヌナズナのＡＣＴ１１（Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３：１２５−１３９（１９９６））；シロイヌナズナのＣａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｕ４３１４７， Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２５１：１９６−２０３（１９９６））；アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）のステアロイル−アシルキャリアタンパク質デサチュラーゼをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ７４７８２， Ｓｏｌｏｃｏｍｂｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １０４：１１６７−１１７６（１９９４））；トウモロコシのＧＰｃ１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｘ１５５９６， Ｍａｒｔｉｎｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０８：５５１−５６５（１９８９））；トウモロコシのＧｐｃ２（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｕ４５８５５， Ｍａｎｊｕｎａｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３：９７−１１２（１９９７））；当業者に公知である種々の植物遺伝子に由来する他の転写開始領域。さらにまた次のＨｏｌｔｏｒｆ（１９９５）の報告も参照されたい：“シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉ ｔｈａｌｉａｎａ）におけるトランスジーンの過剰発現のための種々の構成的および誘導性プロモーターの比較”（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９：６３７−６４６）。
誘導性プロモーター
また別の選択肢として、植物プロモーターは、変化する環境条件または発育条件の影響下で本発明のＬＥＣ１核酸の発現を指令できる。誘導性プロモーターによる転写に影響を与える環境条件の例には、嫌気性条件、温度上昇、乾燥または光の存在が含まれる。そのようなプロモーターは本明細書では“誘導性”プロモーターと称される。例えば、本発明はトウモロコシの乾燥誘導プロモーター（Ｂｕｓｋ（１９９７）上掲書）；ジャガイモの寒冷、乾燥および高塩濃度誘導性プロモーター（Ｋｉｒｃｈ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３３：８９７−９０９（１９９７））を含む。
【００９２】
また別の選択肢として、植物ホルモン、例えばオーキシンへの曝露に際して誘導できる植物プロモーターを用いて本発明の核酸を発現させることができる。例えば、本発明は、ダイズで使用されるオーキシン応答エレメントＥ１プロモーターフラグメント（ＡｕｘＲＥ）（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ．）（Ｌｉｕ， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１５：３９７−４０７（１９９７））；オーキシン応答性シロイヌナズナＧＳＴ６プロモーター（サリチル酸および過酸化水素にもまた反応性を有する）（Ｃｈｅｎ， Ｐｌａｎｔ Ｊ． １０：９５５−９６６（１９９６））；タバコのオーキシン誘導性ｐａｒＣプロモーター（Ｓａｋａｉ， ３７：９０６−９１３（１９９６））；植物ビオチン反応エレメント（Ｓｔｒｅｉｔ，Ｍｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔ． １０：９３３−９３７（１９９７））；およびストレスホルモン、アブシジン酸に反応するプロモーター（Ｓｈｅｅｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１９００−１９０２（１９９６））を用いることができる。
【００９３】
本発明の核酸を発現させるために、植物に適用できる化学試薬、例えば除草剤または抗生物質への曝露に際して誘導できる植物プロモーターもまた使用することができる。例えば、トウモロコシＩｎ２−２プロモーター（ベンゼンスルホンアミド除草剤の毒性緩和剤によって活性化される）を用いることができる（Ｄｅ Ｖｅｙｌｄｅｒ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３８：５６８−５７７（１９９７））。種々の除草剤の毒性緩和剤の適用によって、根、排水組織およびシュート先端分裂組織での発現を含む明瞭な遺伝子発現パターンが誘導される。ＬＥＣ１コード配列はまた以下のプロモーターの制御下に置くことができる：例えばテトラサイクリン誘導性プロモーター、例えばエンバク（Ａｖｅｎａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）アルギニンデカルボキシラーゼ遺伝子を含むトランスジェニックタバコ植物で記載されたもの（Ｍａｓｇｒａｕ， Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１：４６５−４７３（１９９７）；またはサリチル酸反応性エレメント（Ｓｔａｎｇ， Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１：１３１５−１３２４（１９９７））。
組織特異的プロモーター
また別の選択肢として、植物プロモーターは固有の組織で本発明のポリヌクレオチドの発現を指令することができる（組織特異的プロモーター）。組織特異的プロモーターは、植物が発育している間の特定の時期に特定の細胞または組織でのみ活性を示す転写制御エレメントである。本発明のＬＥＣ１遺伝子由来のプロモーターは組織特異的な遺伝子発現の指令のために特に有用で、前記組織特異的遺伝子発現の結果、所望の遺伝子産物が下記で述べるように胚もしくは種子でのみ、または胚もしくは種子で優先的に生成される。
【００９４】
発育による制御下にある組織特異的プロモーターの例には、一定の組織（例えば果実、胚珠、種子、花粉、ピストルまたは任意の胚性組織）においてのみ（またはもっぱら前記組織で）転写を開始するプロモーターが含まれる。生殖組織特異的プロモーターは、例えば胚珠特異的、胚特異的、内乳特異的、珠皮特異的、種子および種皮特異的、花粉特異的、花弁特異的、ガク片特異的、またはそれらが組み合わされたものであろう。
【００９５】
適切な種子特異的プロモーターは以下の遺伝子に由来する：トウモロコシＭＡＣ１（Ｓｈｅｒｉｄａｎ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４２：１００９−１０２０（１９９６））；トウモロコシのＣａｔ３（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｌ０５９３４， Ａｂｌｅｒ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２：１０１３−１０３８（１９９３））；シロイヌナズナのｖｉｖｐａｒｏｕｓ−１（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｕ９３２１５）；シロイヌナズナのａｔｍｙｃ１（Ｕｒａｏ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３２：５７１−５７（１９９６）； Ｃｏｎｃｅｉｃａｏ， Ｐｌａｎｔ ５：４９３−５０５（１９９４）；アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）のｎａｐＡ（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｊ０２７９８， Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ， ＪＢＬ ２６：１２１９６−１３０１（１９８７））；アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）のナピン同種遺伝子群（Ｓｊｏｄａｈｌ， Ｐｌａｎｔａ １９７：２６４−２７１（１９９５））。
【００９６】
胚珠特異的ＢＥＬ１遺伝子（Ｒｅｉｓｅｒ， Ｃｅｌｌ ８３：７３５−７４２（１９９５）， ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｕ３９９４４）もまた用いることができる（以下もまた参照されたい：Ｒａｙ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：５７６１−５７６５（１９９４））。卵細胞および中心細胞特異的ＦＩＥ１プロモーターもまた有用な生殖組織特異的プロモーターである。
【００９７】
ガク片および花弁特異的プロモーターもまた、生殖組織特異的態様でＬＥＣ１核酸の発現に用いることができる。例えば、シロイヌナズナの花の異種再成遺伝子、ＡＰＥＴＡＬＡ１（ＡＰ１）は仮説的転写因子をコードする。前記因子は若い花の原基で発現し、後にガク片および花弁に分布するようになる（例えば以下を参照されたい：Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ−Ｂｒｏｗｎ， Ｃｅｌｌ ７６：１３１−１４３（１９９４）； Ｍａｎｄｅｌ， Ｎａｔｕｒｅ ３６０：２７３−２７７（１９９２））。ＡＰ２の関連プロモーター、花の異種再成遺伝子（花の輪生体で正常なガク片および花弁の発育に必要）もまた有用である（Ｄｒｅｗｓ， Ｃｅｌｌ ６５：９９１−１００２（１９９１）； Ｂｏｗｍａｎ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：７４９−７５８（１９９１））。また別の有用なプロモーターは、シロイヌナズナの正常でない花の器官（ｕｆｏ）の遺伝子の発現を制御するもので、その発現はガク片と花弁の原基の間の結合物に限定されている（Ｂｏｓｓｉｎｇｅｒ， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２：１０９３−１１０２（１９９６））。
【００９８】
トウモロコシの花粉特異的プロモーターがトウモロコシで特定された（Ｇｕｅｒｒｅｒｏ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２２４：１６１−１６８（１９９０））。花粉で特異的に発現される他の遺伝子は例えば以下の文献に記載されている：Ｗａｋｅｌｅｙ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３７：１８７−１９２（１９９８）； Ｆｉｃｋｅｒ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２５７：１３２−１４２（１９９８）； Ｋｕｌｉｋａｕｓｋａｓ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３４：８０９−８１４（１９９７）； Ｔｒｅａｃｙ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３４：６０３−６１１（１９９７））。
【００９９】
他の適切なプロモーターには、胚の貯蔵タンパク質をコードする遺伝子に由来するものが含まれる。例えば以下を用いることができる：アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）の２Ｓ貯蔵タンパク質をコードする遺伝子（Ｄａｓｇｕｐｔａ， Ｇｅｎｅ １３３：３０１−３０２（１９９３））；シロイヌナズナの２ｓ種子貯蔵タンパク質の同種遺伝子群；アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｎａｐｕｓ）のオレオシン２０ｋＤをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｍ６３９８５）；ダイズのオレオシンＡをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｕ０９１１８）およびオレオシンＢをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｕ０９１１９）；シロイヌナズナのオレオシンをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｚ１７６５７）；トウモロコシのオレオシン１８ｋＤをコードする遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ Ｎｏ．Ｊ０５２１２， Ｌｅｅ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６：１９８１−１９８７（１９９４）；およびダイズの硫黄に富む低分子量タンパク質をコードする遺伝子（Ｃｈｏｉ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２４６：２６６−２６８（１９９５））。トマトの組織特異的Ｅ８プロモーターは、所望の遺伝子産物を果実に分布させる遺伝子発現の指令に特に有用である。
【０１００】
果実の成熟時、葉の老化および落葉時、および程度は弱いが花の同様な現象時に活性をもつトマトのプロモーターを用いることができる（Ｂｌｕｍｅ， Ｐｌａｎｔ Ｊ． １２：７３１−７４６（１９９７））。他の典型的なプロモーターには、ピストル特異的塩基性エンドキチナーゼをコードするジャガイモ（Ｓｏｌａｎａｍｕ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ．）のＳＫ２遺伝子のピストル特異的プロモーター（Ｆｉｃｋｅｒ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３５：４２５−４３１（１９９７））；エンドウ豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ ｃｖ Ａｌａｓｋａ）のＢｌｅｃ４遺伝子（トランスジェニックアルファルファの栄養器官シュートおよび花のシュート先端の上皮組織で活性を示す）が含まれる。前記は活発に成長しているシュートの上皮層で外来遺伝子を発現させるために有用な手段となる。
【０１０１】
栄養組織（例えば葉、茎、根および塊茎）で特異的に活性をもつ多様なプロモーターもまた、本発明のＬＥＣ１核酸の発現に用いることができる。例えば、パタチン（ジャガイモの塊茎の主要な貯蔵タンパク質）を制御するプロモーターを用いてもよい（例えば以下の文献を参照されたい：Ｋｉｍ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６：６０３−６１５（１９９４）； Ｍａｒｔｉｎ， Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１：５３−６２（１９９７））。アグロバクテリウム＝リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓｉｓ）のＯＲＦ１３プロモーター（これは根で高い活性を示す）を用いてもよい（Ｈａｎｓｅｎ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２５４：３３７−３４３（１９９７））。他の適切な栄養組織特異的プロモーターには以下が含まれる：サトイモ（Ｃｏｌｏｃａｓｉａ ｅｓｕｃｕｌｅｎｔａ Ｌ． Ｓｃｈｏｔｔ）の球状地下茎のタンパク質類、タリンのグロブリンをコードする遺伝子のタリンプロモーター（Ｂｅｚｅｒｒａ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８：１３７−１４４（１９９５）；球状地下茎の発育時に活性を示すカークリンプロモーター（ｄｅ Ｃａｓｔｒｏ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４：１５４９−１５５９（１９９２））およびタバコの根特異的遺伝子、ＴｏｂＲＢ７（その発現は根の分裂組織および未熟な中心円筒領域に局在する）のプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：３７１−３８２（１９９１））。
【０１０２】
葉特異的プロモーター、例えばリブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ（ＲＢＣＳ）のプロモーターを用いてもよい。例えば、トマトのＲＢＣＳ１、ＲＢＣＳ２およびＲＢＣＳ３Ａ遺伝子は葉および光の下で生育した実生で発現するが、ＲＢＣＳ１およびＲＢＣＳ２だけが生育中のトマトの果実で発現される（Ｍｅｉｅｒ， ＦＲＢＳ Ｌｅｔｔ． ４１５：９１−９５（１９９７））。Ｍａｔｓｕｏｋａ（Ｐｌａｎｔ Ｊ． ６：３１１−３１９（１９９４））が報告した、葉身および葉鞘の葉肉細胞でほぼ例外なく高レベルで発現されるリブロースビスホスフェートカルボキシラーゼのプロモーターを用いてもよい。また別の葉特異的プロモーターは、光含有クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子のプロモーターである（以下を参照されたい：Ｓｈｉｉｎａ， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１５：４８８−４８３（１９９７）； Ｃａｓａｌ， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １１６：１５３３−１５３８（１９９８））。Ｌｉ（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３７９：１１７−１２１（１９９６））が報告したシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のｍｙｂ関連遺伝子のプロモーター（Ａｔｍｙｂ５）は葉特異的である。Ａｔｍｙｂ５プロモーターは、発育中の葉の表皮毛、托葉、並びに若いロゼットおよびカウリン葉の縁の上皮細胞、並びに未熟な種子で発現される。Ａｔｍｙｂ５のｍＲＮＡは受粉から胚発生の１６細胞期の間に出現し、ハートステージを超えて存続する。Ｂｕｓｋ（Ｐｌａｎｔ Ｊ． １１：１２８５−１２９５（１９９７））がトウモロコシで特定した葉のプロモーターも用いることができる。
【０１０３】
別の種類の有用な栄養組織特異的プロモーターは分裂組織（根の先端およびシュートの先端部）のプロモーターである。例えば、Ｄｉ ＬａｕｒｅｎｚｉｏＣｅｌｌ ８６：４２３−４３３（１９９６））およびＬｏｎｇ（Ｎａｔｕｒｅ ３７９：６６−６９（１９９６））が報告した、“ＳＨＯＯＴＭＥＲＩＳＴＥＭＬＥＳＳ”および“ＳＣＡＲＥＣＲＯＷ”プロモーター（これらは発育中のシュートまたは根の先端部の分裂組織で活性を示す）を用いてもよい。別の有用なプロモーターは、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル補酵素ＡレダクターゼＨＭＧ２遺伝子の発現を制御するもので、その発現は分裂組織および花の組織（気孔の分泌帯、成熟した花粉粒、雌ずい群の導管組織に限定される（例えば次の文献を参照されたい：Ｅｎｊｕｔｏ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７：５１７−５２７（１９９５））。さらに有用なものは、トウモロコシおよび他の種のｋｎ１−関連遺伝子で、これは分裂組織特異的発現を示す（Ｇｒａｎｇｅｒ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３１：３７３−３７８（１９９６）； Ｋｅｒｓｔｅｔｔｅｒ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１８７７−１８８７（１９９４）； Ｈａｋｅ， Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． Ｂ． Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ，　 ３５０：４５−５１（１９９５））。例えば、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）のＫＮＡＴ１プロモーターである。シュートの先端部ではＫＮＡＴ１転写物がシュート先端部の分裂組織にもっぱら分布し、シュートの分裂組織のＫＮＡＴ１の発現は花への移行時に減少し、花序柄の皮質に限定される（Ｌｉｎｃｏｌｎ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１８５９−１８７６（１９９４））。
【０１０４】
組織特異的プロモーターは標的組織以外の組織で機能的に連結された配列の発現を駆動させることができることは当業者には理解されよう。したがって、本明細書で用いられる、組織特異的プロモーターは、もっぱら標的細胞で発現を駆動させるが、さらにまた他の組織でも同様にある程度の発現を指令することができるプロモーターである。
【０１０５】
別の実施態様では、ＬＥＣ１核酸は転移因子により発現される。これは、構成的に活性を示すポリペプチドの構成的ではあるが、なお定期的で小量の発現を可能にする。本発明はまた、ウイルスに由来する組織特異的プロモーターの使用を提供する。前記プロモーターには例えば以下が含まれる：トバモウイルスサブゲノムプロモーター（Ｋｕｍａｇａｉ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２：１６７９−１６８３（１９９５））；コメタングロカン状ウイルス（ＲＴＢＶ）（感染したコメ植物体の篩部の細胞でのみ増殖する）のプロモーター（これは強力な篩部特異的レポーター遺伝子発現を惹起する）；キャッサバベインモザイクウイルス（ＣＶＭＶ）プロモーター（導管エレメント、葉の葉肉細胞および根の先端で最高の活性を示す）（Ｖｅｒｄａｇｕｅｒ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３１：１１２９−１１３９）。
【０１０６】
トランスジェニック植物の作成
本発明のＤＮＡ構築物を一般的な種々の技術によって所望の植物ホストのゲノムに導入できる。例えば、ＤＮＡ構築物は、例えば植物細胞のプロトプラストの電気穿孔およびマイクロインジェクションのような技術によって、植物細胞のゲノムＤＮＡに直接導入するか、または弾道発射技術（例えばＤＮＡ粒子爆弾）を用いて植物組織に直接導入してもよい。また別の選択肢としては、ＤＮＡ構築物を適切なＴ−ＤＮＡフランキング領域に結合させ、通常のアグロバクテリウム＝ツメファシエンスホストベクターに導入してもよい。アグロバクテリウム＝ツメファシエンスホストの毒力をもたらす機能は、前記細菌が細胞に感染したときこの構築物および隣接マーカーの植物細胞ＤＮＡへの挿入を指令するであろう。
【０１０７】
マイクロインジェクションの方法は当分野で周知で、学術論文および特許文献に詳しく記載されている。ポリエチレングリコール沈殿を用いるＤＮＡ構築物の導入は次の文献に記載されてる：Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｍｂｏ Ｊ． ３：２７１７−２７２２（１９８４））。電気穿孔技術はＦｒｏｍｍら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２：５８２４（１９８５））の文献に記載されている。弾道発射による形質転換の技術は次の文献に記載されている：Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２７：７０−７３（１９８７）。
【０１０８】
アグロバクテリウム＝ツメファシエンス仲介形質転換技術（バイナリーベクターのディスアーミングおよび使用を含む）は学術論文に詳しく記載されている。例えば以下の文献を参照されたい：Ｈｏｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３３：４９６−４９８（１９８４）； Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０：４８０３（１９８３）。
【０１０９】
上記の形質転換技術のいずれかを用いて得られる形質転換植物細胞を培養し、形質転換遺伝子型をもつ表現型、したがって所望の表現型（例えば種なし表現型）の完全な植物を再生することができる。そのような再生技術は、生育培養液中である種の植物ホルモンを操作することを必要とし、典型的には生物毒および／または除草剤マーカー（所望のヌクレオチド配列とともに導入されている）を必要とする。培養プロトプラストから植物を再生することについては以下の文献に記載されている：Ｅｖａｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ， ｐｐ．１２４−１７６， ＭａｃＭｉｌｌｉｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８３； Ｂｉｎｄｉｎｇ， Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｌａｎｔｓ， Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ， ｐｐ．２１−７３， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， １９８５。再生はまた植物のカルス、外植片、器官またはその部分で達ができる。そのような再生技術は一般的に次の文献に記載されている：Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓ． ３８：４６７−４８６（１９８７）。
【０１１０】
本発明の核酸を用いて、本質的にいずれの植物にも所望の特色を付与することができる。したがって、本発明は広範囲の植物に有用である。前記植物には、アスパラガス（Ａｓｐａｒａｇｕｓ）、アトロパ（Ａｔｒｏｐａ）、アベナ（Ａｖｅｎａ）、ブラシカ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）、シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）、シトラルス（Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ）、カプシカム（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）、キューカミス（Ｃｕｃｕｍｉｓ）、キューカルビタ（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ）、ダウクス（Ｄａｕｃｕｓ）、フラガリア（Ｆｒａｇａｒｉａ）、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、ゴシピウム（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ）、ヘリアンサス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ）、ヘテロカリス（Ｈｅｔｅｒｏｖａｌｌｉｓ）、ホルデウム（Ｈｏｒｄｅｕｍ）、ヒオシヤムス（Ｈｙｏｓｃｙａｍｕｓ）、ラクチュカ（Ｌａｃｔｕｃａ）、リナム（Ｌｉｎｕｍ）、ロリウム（Ｌｏｌｉｕｍ）、リコパーシコン（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、マルス（Ｍａｌｕｓ）、マニホト（Ｍａｎｉｈｏｔ）、マジョラナ（Ｍａｊｏｒａｎａ）、メディカゴ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）、ニコチアーナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）、オリザ（Ｏｒｙｚａ）、パニエウム（Ｐａｎｉｅｕｍ）、パネセツム（Ｐａｎｎｅｓｅｔｕｍ）、ペルシア（Ｐｅｒｓｅａ）、ピスム（Ｐｉｓｕｍ）、ピルス（Ｐｙｒｕｓ）、プルヌス（Ｐｒｕｎｕｓ）、ラファヌス（Ｒａｐｈａｎｕｓ）、セカレ（Ｓｅｃａｌｅ）、セネシオ（Ｓｅｎｅｃｉｏ）、シナピス（Ｓｉｎａｐｉｓ）、ソラヌム（Ｓｏｌａｎｕｍ）、ソルグム（Ｓｏｒｇｈｕｍ）、トリゴネラ（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ）、トリチクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、ビチス（Ｖｉｔｉｓ）、ビグナ（Ｖｉｇｎａ）およびゼア（Ｚｅａ）属に由来する種が含まれる。本発明のＬＥＣ１遺伝子は、ブラシカ（アブラナ）属のトランスジェニック植物の生産に特に有用である。前記の例にはブロッコリー、カリフラワー、芽キャベツ、カノーラなどが含まれる。
【０１１１】
他の遺伝子と組み合わせたＬＥＣ１の使用とその遺伝子組換え発現
本発明のＬＥＣ１核酸は、所望の効果を達成するために他の構造遺伝子または調節遺伝子と一緒に発現させることができる。細胞または植物、例えば形質転換植物またはトランスジェニック植物を形質転換するか、遺伝子工学操作を実施するか、または交配して、ＬＥＣ１ヌクレオチドおよび／またはＬＥＣ１ポリペプチドおよび別の遺伝子または遺伝子産物を同時発現させることができる。また別の選択肢として、２つまたは３つ以上のＬＥＣ１核酸を同じ植物または細胞で一緒に同時発現させることができる。
【０１１２】
本発明のＬＥＣ１核酸は、植物の生殖組織または栄養組織で発現させたとき、異所性の胚形態発生を誘導することができる。したがって、ある実施態様では、本発明のＬＥＣ１核酸をトランスジェニック植物でセンス構造で発現させ、上記で考察したように異所性の胚様構造物の発現を誘導することができる。別の実施態様では、ＬＥＣ１は生殖組織の総量を増加させる（例えば果実のサイズ、種子総量、種子タンパク質または種子油を増加させる）遺伝子または核酸と同時発現される。例えば、ＡＤＣ遺伝子（例えばアブラナのＡＰ２およびＲＡＰ２遺伝子）のアンチセンス核酸の同時発現は種子総量、種子タンパク質、および種子油を劇的に増加させるであろう。例えば以下の文献を参照されたい：Ｊｏｆｕｋｕ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ９８／０７８４２； Ｏｋａｍｕｒｏ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４：７０７６−７０８１（１９９７）； Ｏｋａｍｕｒｏ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ９：３７−４７（１９９７）； Ｊｏｆｕｋｕ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ６：１２１１−１２２５（１９９４）。したがって、胚細胞および組織の異所性発現を誘導するために、本発明のＬＥＣ１を別の植物核酸および／またはタンパク質（例えば種子総量増加アンチセンスＡＰ２核酸）と同時発現させることによって、果実および種子の増加を示すか、胚の貯蔵タンパク質の収量が増加した細胞、組織または植物（例えばトランスジェニック植物）が得られる。
【０１１３】
別の実施態様では、本発明のＬＥＣ１核酸は、機能的なＡＤＣ遺伝子（例えばＡＰ２およびＲＡＰ２遺伝子）を生成する能力を欠く生殖または栄養細胞および組織で発現される。ＬＥＣ１核酸は、ＡＤＣ“ノックアウト”トランスジェニック植物で発現させることができる。また別の選択肢として、ＬＥＣ１核酸は、変異ＡＤＣ核酸または遺伝子産物を発現している細胞、組織または植物で発現させることができる。これら機能をもたないＡＤＣモデルのいずれにおいてもＬＥＣ１核酸の発現はまた、果実および種子総量が増加するか、胚貯蔵タンパク質の収量が増加するなどの性質をもつ細胞、組織または植物をもたらす。
【０１１４】
発現カセットがトランスジェニック植物に安定に取り込まれ、機能できることを確認した後、それを交配によって他の植物に導入することができることは当業者には理解されよう。交配されるべき種に応じて、多くの標準的な交配技術のいずれも用いることができる。
【０１１５】
実施例１
本実施例は典型的なＬＥＣ１遺伝子の単離および性状決定について述べる。
実験方法
植物材料
以前に述べたように（Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９９４）、Ｔ−ＤＮＡ挿入物で変異を誘導したＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａエコタイプＷａｓｓｉｌｅｗｓｋｉｊａ（Ｗｓ−Ｏ）株のｌｅｃ１−２変異体を特定した。ａｂｉ３−３、ｆｕｓ３−３およびｌｅｃ１−１変異体はＰｅｔｅｒ ＭｃＣｏｕｒｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｔｒｏｎｔｏ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｍｅｉｎｋｅ， Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から贈与された。野生型植物および変異体は一定の光の下で２２℃生育させた。
【０１１６】
二重変異体は変異株ｌｅｃ１−１、ｌｅｃ１−２、ａｂｉ３−３、ｆｕｓ３−３およびｌｅｃ２を交雑して作製した。二重変異体の遺伝子型は各親株との戻し交配で確認した。二重変異体は、両方の親株を相補できない株である。ホモ接合型の単一または二重変異体は、完全な種子または乾燥前の成熟胚を分割したものを基礎培地で発芽させて作製した。
ゲノムクローンおよびｃＤＮＡクローンの単離と配列分析
Ｗｓ−Ｏ野生型植物、ｌｅｃ１−１およびｌｅｃ１−２変異体のゲノムライブラリーは、製造元（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示にしたがってＧＥＭ１１ベクターで作製した。２つの長角果特異的ｃＤＮＡライブラリー（球状期から心臓型期および心臓型期から魚雷型期）をＺＡＰＩＩベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で作製した。
【０１１７】
ｌｅｃ１−２のゲノムライブラリーを右および左のＴ−ＤＮＡ特異的プローブを用いて標準的技術にしたがってスクリーニングした。変異と一緒に分離してくる約１２クローンを単離して精製し、さらに完全なＤＮＡを標識して、野生型およびｌｅｃ１−１ゲノムＤＮＡを含むサザンブロットをスクリーニングするプローブとして用いた。１つのクローンが植物ＤＮＡとハイブリダイズし、これをさらに分析した。左の境界およびＴ−ＤＮＡと接する植物の配列を含む７．１ｋｂのＸｈｏＩフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳプラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でサブクローニングしてＭＬ７を作製し、左の境界に特異的なプライマー（５´ＧＣＡＴＡＧＡＴＧＣＡＣＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣ３´）を用いて配列を決定した。Ｔ−ＤＮＡの構成は、Ｔ−ＤＮＡの左右の境界およびＰＢＲ３２２プローブによるサザンブロット分析を用いて部分的に立証した。結果は、Ｔ−ＤＮＡの他方の端もまた左の境界を含むことを示唆した。これは、ゲノム植物ＤＮＡプライマー（ＬＰプライマー５´ＧＣＴＣＴＡＧＡＣＡＴＡＣＡＡＣＡＣＴＴＴＴＣＣＴＴＡ３´）およびＴ−ＤＮＡの左の境界に特異的なプライマー（５´ＧＣＴＴＧＧＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＣＡＴＴＡＧ３´）を用いてＰＣＲフラグメントを作製し、配列決定することによって確認した。
【０１１８】
ＭＬ７のＥｃｏＲＩ挿入物を用いて野生型のゲノムライブラリーをスクリーニングした。２つのオーバーラップするクローンを精製し、野生型ＤＮＡ領域の７．４ＥｃｏＲＩゲノムフラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＫＳプラスミドでサブクローニングし、ＷＴ７４を作製した。このフラグメントを配列決定し（配列番号４）、ｌｅｃ１−１ゲノムライブラリーおよび野生型長角果特異的ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いた。ｌｅｃ１−１ゲノムライブラリーから８つのクローンを特定し制限マッピングで分析した。
【０１１９】
これらのクローンから、ｌｅｃ１−１の正確な欠失部位をマッピングし、さらにｌｅｃ１−１ゲノムＤＮＡの欠失領域に接するプライマー（Ｈ２１−５´Ｈ２１−５´ＣＴＡＡＡＡＡＣＡＴＣＴＡＣＧＧＴＴＣＡ３´；Ｈ１７−５´ＴＴＴＧＴＧＧＴＴＧＡＣＣＧＴＴＴＧＧＣ３´）を用いてＸｂｐＰＣＲフラグメントを増幅することにより配列を決定した。クローンを両ｃＤＮＡライブラリーから単離し、部分的に配列決定した。ｃＤＮＡクローンおよび野生型ゲノムクローンの配列は正確に適合し、両者は同じ対立遺伝子座から由来することが確認された。全てのハイブリダイゼーションは、３２Ｐランダムプライマープローブ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いストリンジェントな条件下で実施した。
【０１２０】
配列決定は、自動化ジデオキシ鎖ターミネーション法（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて実施した。データベース検索は、ＢＬＡＳＴネットワークサービスを用い、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎで実施した。タンパク質配列のアラインメントはＰＩＬＥＵＰプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を用いて実施した。
ＤＮＡおよびＲＮＡブロット分析
ゲノムＤＮＡをＣＴＡＢ−含有緩衝液を用いて葉から単離した（Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １：１９−２１（１９８３））。２μグラムのＤＮＡを種々の制限エンドヌクレアーゼで消化し、１％アガロースゲルで電気泳動によって分離し、ナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ； Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。
【０１２１】
全ＲＮＡを長角果、２日齢実生、茎、葉、芽および根から調製した。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを全ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィーによって精製し、それぞれ２μグラムのポリ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルを１％の変性ホルムアルデヒド−アガロースで分離した。ハイブリダイゼーションは、別に特定しないかぎりストリンジェントな条件で実施した。放射性プローブは上記のように調製した。
ｌｅｃ１変異体の相補性
ＯＲＦの１．９９２ｋｂ上流からポリＡ部位の５７９ｂｐ下流の領域までを含むゲノムＤＮＡ（配列番号３）の３．４ｋｂＢｓｔｙＩフラグメントをヒグロマイシン耐性バイナリーベクターｐＢＩＢ−Ｈｙｇでサブクローニングした。完全なコード領域を含むＰＣＲフラグメントをプラスミドｐＡＲＴ７に挿入することによって、ＬＥＣ１ｃＤＮＡを３５Ｓプロモーターの制御下およびｏｃｓポリアデニル化シグナル下に置いた。続いて、ＮｏｔＩで消化することによって全調節フラグメントを除去し、ヒグロマイシン耐性バイナリーベクターＢＪ４９に移した。このバイナリーベクターをアグロバクテリウム株ＧＶ３１０１に導入し、プラスミドの再単離および制限酵素マッピングよって、またはＰＣＲによって構築物をチェックした。ホモ接合体ｌｅｃ１−１およびｌｅｃ１−２変異体への形質転換は、ｉｎ ｐｌａｎｔａ形質転換法（Ｂｅｃｈｔｏｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｔｅｓ Ｒｅｎｄｕｓ ｄｅ ｌ´Ａｃａｄｅｍｉｅ ｄｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｓｅｒｉｅ ＩＩＩ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｄｅ ｌａ Ｖｉｅ， ３１６：１１９４−１１９９（１９９３））を用いて実施した。５ｇ／ｍＬのヒグロマイシン含有プレートでの乾燥後の発芽能力によって形質転換体についてｌｅｃ１変異体の乾燥種子を選別した。トランスジーンの存在についてはＰＣＲにより、生命力を有する種子の存在については長角果をスクリーニングすることによって形質転換植物を検査した。
Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション
実験は先に記載（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ １：７３：８０（１９８９））されたように実施した。切片はＬＥＣ１アンチセンスプローブとハイブリダイズさせた。陰性コントロールとして、ＬＥＣ１アンチセンスプローブをｌｅｃ１変異体の種子切片とハイブリダイズさせた。さらに、センスプローブを調製し、野生型の種子切片と反応させた。
結果
葉状子葉型（ｌｅａｆｙ Ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ−Ｔｙｐｅ）変異体とａｂｉ３との遺伝的相互作用
後期胚形成を調節する遺伝経路を理解するために、ｌｅｃ１−１またはｌｅｃ１−２の欠損と同様な後期胚形成における欠損を惹起する３つのシロイヌナズナ変異体、ｌｅｃ２、ｆｕｓ３−３およびａｂｉ３−３を利用した。これらの変異体は乾燥非耐性で、時に種子胎生であり、活性化されたシュート頂端分裂組織を有する。ｌｅｃ２およびｆｕｓ３−３変異体はＡＢＡに感受性で、子葉に表皮毛を有し、したがって葉状子葉型変異体として分類できる（Ｍｅｉｎｋｅ ｅｔ ａｌ． １９９４）。ａｂｉ３−３変異体は、ＡＢＡに非感受性で、子葉に表皮毛をもたない、異なる種類の後期胚不完全変異体に属する。
【０１２２】
この２種類の変異体をｌｅｃ１−１およびｌｅｃ１−２変異体と交雑し、両変異体に対してホモ接合体である植物を構築した。ｌｅｃ１およびｌｅｃ２変異は相助的に相互作用し、後期心臓型期と類似の時期に留められた二重変異体を生じるが、この二重変異をもつ胚はより大きい。このｌｅｃ１またはｌｅｃ２およびｆｕｓ３−３二重変異は上位性を全く示さないが、得られた胚は中間の表現型を示す。ｌｅｃ１／ａｂｉ３−３二重変異体およびｌｅｃ２／ａｂｉ３−３二重変異体はＡＢＡ非感受性で、ｌｅｃ様表現型を示す。ｌｅｃ１−１またはｌｅｃ１−２のいずれかから成る二重変異体間には相違は存在しない。
【０１２３】
前記二重変異体間に上位性は認められず、上記遺伝子、ＬＥＣ型遺伝子およびＡＢＩ３遺伝子の各々は異なる遺伝経路で作動していることを示唆している。
ＬＥＣ１は胚形成の初期に機能する
ｌｅｃ１の作用は後期胚形成に限定されず、初期の胚形成においても役割を有する。ｌｅｃ１／ｌｅｃ２二重変異をもつ胚は発生の初期で進行が停止し、一方、単一変異をもつ変異体は成熟胚に進み、これら遺伝子は発生の初期に機能することが示唆された。
【０１２４】
単一および二重変異体の初期段階の更なる調査によって、変異胚柄の形状、サイズおよび細胞分割パターンにおける欠陥が示された。野生型胚の胚柄は１列に並ぶ６から８個の細胞から成るが、一方、変異体の胚柄はしばしば拡大し、並層分裂を経る。葉状子葉型変異体は球状期または遷移期に胚柄の奇形を示し、一方、野生型およびａｂｉ３変異体はなんらの異常も示さない。
【０１２５】
異常な胚柄の数は胚の発生が進行するにつれて増加する。魚雷型胚期で、野生型の胚柄細胞はプログラム化細胞死を経るが、変異体では二次胚がしばしば異常な胚柄から発生し、レスキューしたときに双子を生じる。
野生型植物およびｌｅｃ１変異体のＬＥＣ１遺伝子座の構成
ＬＥＣ１遺伝子の２通りの変異対立遺伝子座、すなわちｌｅｃ１−１およびｌｅｃ１−２が報告された（Ｍｅｉｎｋｅ， １９９２； Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ． １９９４）。両変異は、Ｔ−ＤＮＡを挿入して変異を誘発した植物集団から得られたが（Ｆｅｌｄｍａｎ ａｎｄ Ｍａｒｋｓ， １９８７）、ただしｌｅｃ１−１は添付されない。ｌｅｃ１−２変異体は多数のＴ−ＤＮＡ挿入物を含む。Ｔ−ＤＮＡフラグメントの特異的サブセットがこの変異と密接に連係していることが判明した。ｌｅｃ１−２のゲノムライブラリーをプローブとして左右境界Ｔ−ＤＮＡを用いてスクリーニングした。変異と一緒に分離してくるＴ−ＤＮＡフラグメントを含むゲノムクローンを単離し、野生型およびｌｅｃ１−１植物の両方をサザンブロットで調べた。ただ１つのクローンがシロイヌナズナＤＮＡとハイブリダイズし、さらにｌｅｃ１−１の多形性制限フラグメントを生じた。
【０１２６】
ｌｅｃ１−１多形性現象は小さな欠失（長さが約２ｋｂ）から生じた。Ｔ−ＤＮＡに接する植物フラグメントの配列を用いて、野生型ゲノムＤＮＡクローンおよびｌｅｃ１−１ゲノムクローンを単離した。ｌｅｃ１−１の多形性制限フラグメントに対応する野生型ゲノムＤＮＡの７．４ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントをさらに分析し配列を決定した。欠失をもつフラグメントの予想される境界内のプライマーによって作製したＰＣＲフラグメントを用いて、ｌｅｃ１−１における正確な欠失部位を特定した。
【０１２７】
ｌｅｃ１−１欠損に対応する野生型ゲノムＤＮＡでは、６２６ｂｐのＯＲＦが特定された。ＯＲＦの短かいＤＮＡフラグメントをプローブとして用いた野生型ＤＮＡおよび２つの変異体ＤＮＡのサザン分析によって、野生型およびｌｅｃ１−２両ＤＮＡはＯＲＦを含むが、一方、ｌｅｃ１−１ゲノムＤＮＡはハイブリダイズしないことが示された。ｌｅｃ１−２変異体におけるＴ−ＤＮＡの正確な挿入部位をＰＣＲおよび配列決定によって決定し、Ｔ−ＤＮＡは、前記遺伝子の５´領域内のＯＲＦの転写開始コドンの１１５ｂｐ上流に挿入されていることが分かった。
【０１２８】
Ｔ−ＤＮＡ挿入部位には、２１の植物核酸の小さな欠失および２０の未知の核酸の付加が存在していた。これらの結果は、ｌｅｃ１−２ではＴ−ＤＮＡはＯＲＦの調節に干渉するが、一方、ｌｅｃ１−１では前記遺伝子の全部が欠失していることを示唆している。したがって、両ｌｅｃ１対立遺伝子座は同じ遺伝子座にＤＮＡの破壊を有し、ＬＥＣ１遺伝子座の特定が確認された。
ｌｅｃ１変異体は形質転換により相補性を示すことができる
７．４ｋｂの野生型ゲノムフラグメントは実際にＬＥＣ１遺伝子のＯＲＦを含むことを証明するために、前記フラグメント内の３３９５ｂｐのゲノムフラグメント（配列番号３）を用いて、ホモ接合ｌｅｃ１−１およびｌｅｃ１−２植物を形質転換した。クローンは、前記遺伝子を含む３３９５ｂｐのＢｓｔＹＩ制限フラグメントおよびプロモーター領域から成る。ポリペプチドの翻訳開始コドン（ＡＴＧ）は１９９９位にあり、終止コドン（ＴＧＡ）は２６２５位に存在する。遺伝子内にイントロンは存在しない。
【０１２９】
形質転換植物をヒグロマイシン平板で選別し、ＰＣＲ分析により野生型ＤＮＡフラグメントを含むか否かを調べた。両トランスジェニック変異体は生命力のある子孫を生産することができ、その子葉に表皮毛をもたなかった。我々は、３．４ｋｂフラグメントはｌｅｃ１変異を相補することができると結論した。さらに、我々は、ｌｅｃ１−１の欠失２ｋｂフラグメントにはＯＲＦは１つしか存在しないので、このＯＲＦがＬＥＣ１遺伝子に一致することを提唱する。
ＬＥＣ１遺伝子は同種遺伝子群に属する遺伝子である
ＬＥＣ１遺伝子を単離するために、７．４ｋｂＤＮＡフラグメントをプローブとして用いて若い長角果の２つのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。１７クローンを単離し、更なる分析および部分的配列決定した後、それらは全てゲノムＯＲＦと同一であることが分かった。このｃＤＮＡは、２０８アミノ酸タンパク質（配列番号１および配列番号２）の特徴をもつ６２６ｂｐのＯＲＦを含んでいる。
【０１３０】
このＬＥＣ１ｃＤＮＡを用いて、種々の制限酵素で消化したＷｓ−ＯゲノムＤＮＡを含むＤＮＡゲルブロットとハイブリダイズさせた。低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーションにより、少なくとももう１つの遺伝子が存在することを我々は発見した。これによって、ＬＥＣ１遺伝子と相同性を示すさらに２つのシロイヌナズナＥＳＴが存在するという我々の知見が確認された。
ＬＥＣ１遺伝子は胚特異的である
ｌｅｃ１変異体は胚形成時にもっとも影響を受ける。レスキューした変異体は、その子葉に表皮毛を生じることおよび不完全な子孫を生じること以外に明瞭な異常をもたないホモ接合体植物を生じることできる。したがって、我々は、ＬＥＣ１遺伝子は主に胚形成時に役割を有し栄養生育期には役割をもたないと予想した。この仮説を調べるために、野生型植物の長角果、実生、根、葉、茎およびつぼみから、並びにｌｅｃ１植物の長角果からポリ（Ａ）−ＲＮＡを単離した。プローブとしてＬＥＣ１遺伝子または７．４ｋｂゲノムＤＮＡフラグメントを用いたとき、ただ１つのバンドがノーザンブロットで検出された。このことは、転写活性を有するただ１つの遺伝子がゲノムＤＮＡフラグメントに存在することを示唆している。転写物は若い胚および成熟胚を含む長角果でのみ検出され、実生、根、葉、茎およびつぼみでは検出されず、ＬＥＣ１遺伝子は実際に胚特異的であることが示された。さらに、ｌｅｃ１変異体の両対立遺伝子座をもつ長角果ではこのＲＮＡは検出されず、このＯＲＦはＬＥＣ１遺伝子と一致することが確認された。
ＬＥＣ１遺伝子の発現パターン
ＬＥＣ１遺伝子がどのようにして子葉が子葉であるための特徴を付与するかを調べるために、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによってその発現を分析した。変異体の異常な胚柄表現型は、ＬＥＣ１遺伝子が極めて発生初期に活性を示すはずであることを示唆しているので、我々は特に若い発育中の胚に照準を当てた。
【０１３１】
胚形成時に、ＬＥＣ１転写物は先ず最初に前球状期胚で検出された。転写物は前胚の全ての細胞で認められ、さらに胚柄および内乳でも見出された。しかしながら、球状期以降は転写物は胚の外層（すなわち前表皮）および基本分裂組織の外側部分により多く蓄積され、シグナルをもたない前形成層を生じる。魚雷型胚期では、シグナルは子葉および根の分裂組織でより強力で、前表皮層にいっそう限定された。湾曲子葉期（ｂｅｎｔ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｓｔａｇｅ）には、シグナルは胚全体に存在し、胚が成熟し種子全体を満たす発生の最終段階ではＬＥＣ１転写物は検出できなかった。これは感度の限界によるものかもしれないが、ＬＥＣ１転写物がこの時期に発現されている場合には、それは成熟胚に局在しないで胚全体に分散していることを示しているのかもしれない。
ＬＥＣ１遺伝子はＣＣＡＡＴ結合因子の相同体をコードする
ＬＥＣ１の推定アミノ酸配列をＧｅｎＢａｎｋと比較することによって、転写因子ＣＣＡＡＴボックス結合因子（ＣＢＦ）のサブユニットとの顕著な類似性が明らかになった。ＣＢＦは、真核生物で遺伝子の活性を調節する高度に保存された転写因子の同種群である（Ｍａｎｔｖａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：１０８７−１０９１（１９９２））。ＣＢＦはヘテロオリゴマータンパク質で、３つから４つの相同でないサブユニットから成る。ＬＥＣ１はＣＢＦ−Ａサブユニットと高度な類似性を有することが判明した。このサブユニットは３つのサブユニットＡ、Ｂ、Ｃを有し、ＡおよびＣは自然界の三大区分界の間で保存性を示さず、中心ドメインＢは進化の過程で高度に保存されている。同様に、ＬＥＣ１遺伝子は３つのドメインを含んでいる。ＬＥＣ１Ｂドメインは、酵母からヒトを含む生物で見出される種々のＢドメインと７５％−８５％の類似性および５５％−６３％の同一性を共有する。この中心ドメイン内には２つの高度に保存されたアミノ酸セグメントが存在する。ＣＢＦ−Ａ酵母相同体ｈａｐ３タンパク質の欠失および変異誘発分析によって、７残基の短い領域（４２−４８）（ＬＰＩＡＮＶＡ）がＣＣＡＡＴボックスに結合するために必要であることが明らかになった（Ｘｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， 上掲書）。ＬＥＣ１タンパク質はこれらの領域と高度な相同性を共有する。
考察
ｌｅｃ１変異は、主として胚のプログラムと干渉し、したがって胚形成時に中心的な役割を果すと考えられる葉状子葉クラスに属する。ＬＥＣ１遺伝子活性は、成熟期の成長を抑制するために必要であることが以前に示された。したがって、我々は、葉状子葉クラスの種々のメンバーのホモ接合二重変異体と胚成熟時に重要な役割をもつａｂｉ３変異体の遺伝的相互作用を分析した。二重変異体の５つの異なる組み合わせは全て中間表現型または付加作用のどちらかを示した。４つの遺伝子間には上位関係は認められなかった。上記の発見は、これら異なる遺伝子は平行的な遺伝経路で機能することを示唆している。特に興味深いことは、形態的に心臓型期で進行が停止するが、この形状で成長を続ける二重変異体ｌｅｃ１／ｌｅｃ２であった。この二重変異体の表現型は、遺伝子ＬＥＣ１およびＬＥＣ２は初期の形態発生に必須で、それらの生成物は若い発生中の胚で直接また間接的に相互作用する可能性があることを示している。
胚形成におけるＬＥＣ１の役割
ＣＣＡＡＴボックス機能を仲介するタンパク質の１つはＣＢＦ（ＮＦＹまたはＣＰＩとも称される）と呼ばれるヘテロ重合体タンパク質である。ＣＢＦは転写活性化因子で、構成的に発現される遺伝子を調節するが、また発生に関する遺伝子の弁別的活性化にもまた関与する（Ｅ． Ｗｉｎｇｅｎｄｅｒ， （１９９３），Ｇｅｎｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。哺乳類の細胞では３つのサブユニット、ＣＢＦ−Ａ、ＣＢＦ−ＢおよびＣＢＦ−Ｃが特定され、これらはいずれもＤＮＡの結合に必要である。酵母では、ＣＢＦの相同体ＨＡＰが、ＣＹＣ１およびミトコンドリアの電子伝達に必要な他の遺伝子を活性化する（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５８：７９９−８４０（１９８９））。ＨＡＰは４つのサブユニットｈａｐ２、ｈａｐ３、ｈａｐ４およびｈａｐ５から成る。ｈａｐ２、３および５のみがＤＮＡ結合に必要である。ＣＢＦ−Ａ、ＢおよびＣはそれぞれ酵母のｈａｐ３、２および５と高度の類似性を示す。さらにまた、哺乳類のＣＢＦ−ＡおよびＢは、対応する酵母のサブユニットと機能的に互換性をもつことが報告された（Ｓｉｎｈａ ｅｔ ａｌ．， 上掲書）。
【０１３２】
ＬＥＣ１遺伝子は、ＣＢＦ−Ａの保存領域と７５％以上の類似性を示すタンパク質をコードする。ＣＣＡＡＴモチーフは植物プロモーターに共通ではなく、それらの転写調節における役割は明らかではない。しかしながら、トウモロコシおよびアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の相同体が特定されている。ＧｅｎＢａｎｋの検索によって、ＣＢＦ−Ａ、ＢおよびＣに対して高度の類似性を示すいくつかのシロイヌナズナのＥＳＴが明らかになった。ＣＢＦ−Ａ（ＨＡＰ３）相同体のアクセッション番号はＨ３７３６８、Ｈ７６５８９；ＣＢＦ−Ｂ（ＨＡＰ２）相同体のアクセッション番号はＴ２０７６９；ＣＢＦ−Ｃ（ＨＡＰ５）相同体のアクセッション番号はＴ４３９０９、Ｔ４４３００である。上記の発見およびＬＥＣ１の多形質発現性作用は、ＬＥＣ１が転写因子として機能するヘテロ重合体複合物に属するものであることを示唆している。
【０１３３】
前記モデルは、ＬＥＣ１がいくつかの遺伝子セットに対して、胚のプログラムを進行させ、発芽過程を抑制する転写活性化因子として作用することを提唱している。不完全なＬＥＣ１発現は部分的に胚のプログラムを停止させ、結果として子葉はその胚としての特性を失い、発芽プログラムが胚で活性化する。
【０１３４】
実施例２
本実施例は、ＬＥＣ１はトランスジェニック植物で胚性経路を誘導するために十分であることを示す。
【０１３５】
ｌｅｃ１変異体の表現型およびその遺伝子発現パターンは、ＬＥＣ１が胚形成時に特異的に機能することを示唆した。カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターの制御下にあるＬＥＣ１ｃＤＮＡを上記で述べた標準的な方法を用いてｌｅｃ１−１変異植物にｉｎ ｐｌａｎｔａで移した。
【０１３６】
生命力をもつ乾燥種子を３５Ｓ／ＬＥＣ１構築物で形質転換したｌｅｃ１−１変異体から得た。しかしながら、形質転換効率は通常得られるものの約０．６％であった。いくつかの実験では、発芽した種子の半分（１２／２３）が異常な形態をもつ実生を生じた。野性型実生と異なり、これら３５Ｓ／ＬＥＣ１の実生は厚くて柔らかいままで、広がることができない子葉をもっていた。根はしばしば伸長しないか、または異常な伸長を示し、時に緑色であった。これらの実生は通常は葉が占有する場所の茎頂にただ一対の器官を生じた。野生型の葉と異なりこれらの器官は広がらず表皮毛をもたなかった。これらの葉に似た構造物は、葉よりも胚性子葉にいっそう類似していた。
【０１３７】
乾燥後に生命力を有していた他の３５Ｓ／ＬＥＣ１の種子は無性的に生育する植物を生じた。これらの植物（７）の大半は開花し、１００％ｌｅｃ１変異体の種子を生じた。増幅実験によって、実生はトランスジーンを含むことが確認され、これは、３５Ｓ／ＬＥＣ１遺伝子はこれらＴ２種子で不活性であることを示唆している。これらの植物で栄養器官に異常はなかったが、ただしいくつかの植物で頂芽優性の欠如が見られた。いくつかの植物（２）は雄性不稔で、子孫を生じなかった。子孫を生じた１つの植物は、乾燥前に発芽させ成熟するまで育成したとき、ただ１つのトランスジーン遺伝子座で予想されるとおり１００％変異体の種子を生じる、２５％の変異体Ｌｅｃ−種子を分離していった。他の７５％の種子は、野生型の表現型またはｌｅｃ１変異体と野生型の中間の表現型をもつ胚を含んでいた。この植物の乾燥種子の２５％だけが発芽し、全ての実生は、上記のように胚様の実生に類似していた。いくつかの実生は成長を続け、顕著な表現型を示した。これらの３５Ｓ／ＬＥＣ１植物は、葉の上に２つのタイプの構造物を生じた。１つのタイプは胚性子葉に類似し、他方は完全な魚雷型胚に類似していた。したがって、ＬＥＣ１の異所性発現は、栄養細胞で胚発生の形態発生期を誘導する。
【０１３８】
多くの３５Ｓ／ＬＥＣ１実生が胚の特性を示すので、この実生を胚で特異的に活性を示す遺伝子の発現について分析した。クルシフェリンＡ貯蔵タンパク質のｍＲＮＡが、葉様構造物を含む３５Ｓ／ＬＥＣ１実生全体で蓄積されていた。１２Ｓの貯蔵タンパク質クルシフェリンのサイズ特性をもつタンパク質がこれらのトランスジェニック実生で蓄積された。したがって、胚様表現型を示す３５Ｓ／ＬＥＣ１実生には胚特異的ｍＲＮＡおよびタンパク質が蓄積されていた。ＬＥＣ１ｍＲＮＡは、初期胚と同様なパターンでこれら３５Ｓ／ＬＥＣ１実生に高レベルで蓄積されるが、野生型実生では蓄積されなかった。したがって、ＬＥＣ１は、胚の発生プログラムを誘導することによって栄養細胞の運命を変更させるために十分である。
【０１３９】
栄養細胞で胚の発生プログラムを誘導するＬＥＣ１の能力によって、この遺伝子が胚形成の中心的な調節因子であることが確立された。ＬＥＣ１は、３５Ｓ／ＬＥＣ１実生で貯蔵タンパク質遺伝子を誘導することにより、両方の種子成熟経路を誘導するために十分である。葉の表面および葉の位置にある子葉で異所性胚が存在することはまた、ＬＥＣ１は胚の形態発生経路を活性化できることを示している。したがって、ＬＥＣ１は初期および後期の胚形成過程の両方を調節する。
【０１４０】
実施例３
本実施例は、ＬＥＣ１が接合子で発現されること、および本発明のプロモーターを用いて接合子内での発現を標的にすることができることを示す。
【０１４１】
ＬＥＣ１遺伝子がいつ活性化されるかを正確に決定するために、ＬＥＣ１ＲＮＡレベルを、受精前の成熟した雌の配偶体の卵装置、受精後の接合子、および頂端細胞と２から３個の胚柄細胞を含むきわめて初期の胚で分析した。Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験で、ＬＥＣ１ＲＮＡは接合子および初期胚で存在するが、雌の配偶体では検出されないことが示された。これらの結果は、ＬＥＣ１プロモーターは接合子で活性化されることを示している。ＬＥＣ１は、したがって調節遺伝子または細胞毒性遺伝子のセンスまたはアンチセンス型発現を接合子および初期胚で標的とするために有用である。
【０１４２】
実施例４
本実施例は、ＬＥＡＦＹ ＣＯＴＹＬＥＤＯＮ１様遺伝子と称されるＬＥＣ１相同体のシロイヌナズナでの特定を示す。
【０１４３】
ＣＣＡＡＴボックス結合転写因子のＨＡＰ３サブユニットの相同体をシロイヌナズナから特定するために、プローブとしてＬＥＣ１ｃＤＮＡヌクレオチド配列を用いて、Ｂｌａｓｔ検索をシロイヌナズナのデータベースで実施した（ ＨＹＰＥＲＬＩＮＫ ”ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ／” ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ／）。シロイヌナズナのＢＡＣクローン、ＭＮＪ７（アクセッション番号ＡＢ０２５６２８）はＬＥＣ１様（Ｌ１Ｌ）と称される遺伝子を含み、これは公知の任意のシロイヌナズナＨＡＰ３遺伝子のＬＥＣ１タンパク質ともっとも高いアミノ酸配列同一性を示す。Ｌ１Ｌのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は配列番号１９および配列番号２０にそれぞれ示されている。
【０１４４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＬ１Ｌ遺伝子を増幅させた。前記はイントロンを欠いている。Ｌ１Ｌ開放読み枠を増幅させるためにデザインしたプライマーは、クローニングの目的のためにＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素部位を含んでいた。前進プライマー、ＢＡＭＭＮＪ７−５配列は、５´−ＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＡＣＧＴＧＧＡＧＧＣＴＴＣＣＡＴ−３´である（下線部はＢａｍＨＩ部位）。逆方向プライマー、３−ＭＮＪ７ＸＢＡ配列は、５´−ＡＴＣＴＡＧＡＴＣＡＧＴＡＣＴＴＡＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＴＣＧ−３´（下線部はＸｂａＩ部位）。ＰＣＲの条件は以下のとおりであった：９４℃で４５秒、５３℃で４５秒、および７２℃で３分を３０サイクル。ＡｍｐｈｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ， ７６１ Ｍａｉｎ Ａｖｅ．， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ ０６８５９）を用いた。ＰＣＲ生成物はＴＯＰＯＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ ９２００８）を用いてクローニングした。クローン化Ｌ１Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列はそれが特定されたことを確認するために決定した。
ＬＥＣ１様ＲＮＡの蓄積
前胚から心臓期（初期）胚、心臓期から魚雷期（中期）胚、または魚雷期から成熟（後期）胚のいずれかの葉、茎、根、実生、および長角果由来の全ＲＮＡの２０μグラムを含むゲルブロットでＬ１Ｌクローンをハイブリダイズした。Ｌ１ＬＲＮＡは、３つの全ての期の胚を含む長角果でのみ検出された。ｌｅｃ１−１変異体の長角果でＬ１ＬＲＮＡが検出されたことは、検出されたＲＮＡはＬＥＣ１ではないことを示している。したがって、ＬＥＣ１のように、Ｌ１Ｌは胚形成時に特異的に蓄積される。
ｌｅｃ１−１変異のＬ１Ｌによる相補性
Ｌ１Ｌクローンを植物形質転換ベクターＢＪ４９内のＬＥＣ１プロモーター／ターミネーターカセットに挿入した。ＬＥＣ１プロモーター／ターミネーターカセットは、ＬＥＣ１翻訳開始コドンの１９９２ｂｐ５´およびＬＥＣ１ｃＤＮＡ翻訳終止コドンの７７０ｂｐ３´から成る（Ｈ．Ｓ． Ｌｅｅ， Ｒ．Ｗ． Ｋｗｏｎｇ ａｎｄ Ｊ．Ｊ． Ｈａｒａｄａ， 未発表データ）。プロモーターおよびターミネーターは、ＢｇｌＩＩおよびＡｖｒＩＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（その中にＬ１Ｌ遺伝子が挿入される）をもつ短いポリリンカーによって分離されている。
【０１４５】
この構築物をアグロバクテリウム＝ツメファシエンスＧＶ３１０１株を用いてｉｎ ｐｌａｎｔａ形質転換法によりホモ接合ｌｅｃ１−１ヌル変異体に移した。その子孫が乾燥の後死滅したｌｅｃ１−１変異体植物と異なり、Ｌ１Ｌ構築物で形質転換した植物は生命力のある実生を生じた。ＰＣＲ増幅実験によって、この生命力のある実生はｌｅｃ１−１変異およびそのトランスジーンを含むことが確認された。実生は、形態学的にｌｅｃ１変異体よりはむしろ野生型に類似していた。これらの結果は、Ｌ１Ｌ遺伝子はｌｅｃ１変異を相補することを示し、２つの遺伝子のオーバーラッピング機能を示唆している。
【０１４６】
実施例５
本実施例は、ベニバナインゲンハナササゲ（Ｓｃａｒｌｅｔ ｒｕｎｎｅｒ ｂｅａｎ）のＬＥＣ１オルトログの特定を示す。
ベニバナインゲンハナササゲの球状胚から胚プロパーｃＤＮＡライブラリーを構築する
球状期の胚から切り出したベニバナインゲンハナササゲ（ＳＲＢ；Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ　ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）の胚プロパー（ＥＰ）から単離した全ＲＮＡ１５０ｎｇを用いてｃＤＮＡライブラリーを構築した。ＳＭＡＲＴＰＣＲｃＤＮＡライブラリー構築キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ｃａｔ＃Ｋ１０５１−１）を製造元のプロトコルにしたがって使用した。簡単に記せば、第一鎖ｃＤＮＡは、ＳｆｉＩＢ−部位含有オリゴｄＴプライマー（ＣＤＳＩＩＩ／３´プライマー、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＳｆｉＩＡ−部位プライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）含有ＳＭＡＲＴＩＩＩの存在下で、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩリボヌクレアーゼＨ−逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ， ｃａｔ＃１８０６４−０１４）を用いてＥＰの全ＲＮＡから合成した。第二の鎖は、５´および３´ＰＣＲプライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いポリマラーゼ連鎖反応によって作製した。二本鎖ｃＤＮＡはＳｆｉＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ． Ｃａｔ＃１２３Ｓ）で消化し、続いてＣＨＲＯＭＡＳ−４００セファロースカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）でサイズ分画を実施した。採集した分画を１．１％アガロースゲルで分析した後、０．５ｋｂから４ｋｂの範囲の大量のｃＤＮＡを含む４つの分画を一緒にし、エタノール／塩溶液で−２０℃で沈殿させた。ｃＤＮＡペレットは遠心で回収し、７μＬの滅菌水に再懸濁させた。ｃＤＮＡ挿入物はＳｆｉＩ消化ラムダアーム（１ＴｒｉｐｌＥｘ２， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に連結した。ＧｉｇａＰａｃｋＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、連結混合物をファージヘッドにパッケージした。
ベニバナインゲンハナササゲＬＥＣ１オルトログｃＤＮＡの単離
Ｃｒｅ−Ｌｏｘシステム（ｉｎ ｖｉｖｏ切り出し、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によりラムダ型からプラスミド型にｃＤＮＡライブラリーを変換した。プラスミドＤＮＡの単離のためにコロニーを任意に釣り上げた。ＢｉｇＤｙｅターミネーター、５´ＴｒｉｐｌＥｘ配列決定用プライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびＡＢＩプリスム３７７ＤＮＡ配列（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を決定した。目的のｃＤＮＡクローンはＢｌａｓｔＸおよびＢｌａｓｔＮ分析で特定した。
【０１４７】
ＢｌａｓｔＸ検索によって、ｃＤＮＡクローンｐＰＣＥＰ１１２は、シロイヌナズナＬＥＣ１、特にその保存Ｂドメインにおいて高いアミノ酸配列同一性を有するタンパク質をコードすることが明らかになった。しかしながら、ＢｌａｓｔＮの結果はこのＳＲＢｃＤＮＡ配列はヌクレオチドレベルでシロイヌナズナＬ１Ｌ遺伝子により類似することを示した。ｐＰＣＥＰ１１２挿入物の全配列は９８８ｂｐ（配列番号２１）であることが分かった。
ＳＲＢの種子におけるＬＥＣ１様遺伝子の場所的発現パターン
ベニバナインゲンハナササゲのＬ１Ｌ遺伝子の胚における場所的発現パターンを調べるために、ｐＢＳＥＰ１１２の完全長ｃＤＮＡをセンスおよびアンチセンスＲＮＡプローブ合成のための鋳型として用いた。Ｌ１ＬｍＲＮＡは、受粉後５日の胚の胚プロパー（ＥＰ）および胚柄（Ｓ）の両方で蓄積された。受粉後７日の種子では、ＲＮＡは、胚プロパーの表皮層に強く、胚プロパーおよび胚柄の両方の全細胞には中等度に局在する。センスプローブを用いたときにはバックグラウンドシグナルが検出されただけであった。結論として、球状胚におけるＳＲＢＬＥＣ１様遺伝子の場所的発現パターンはシロイヌナズナのＬＥＣ１のそれと類似している。
【０１４８】
上記の実施例は本発明の説明のために提供され、発明の範囲を制限しようとするものではない。本発明の他の変型例は当業者には極めて明白であり、それらは添付の請求の範囲に包含される。本明細書に引用した全ての刊行物、データベース、ＧｅｎＢａｎｋ配列、特許、および特許出願は、参照によって本明細書に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、ＬＥＣ１ポリペプチドの３つのドメイン模式図である。
【図２Ｂ】
図２Ｂは、ＬＥＣ１によってコードされるＢドメインの予想アミノ酸配列と、トウモロコシ、ニワトリ、ヤツメウナギ、アフリカツメガエル、ヒト、マウス、ラット、エメリセラ＝ニジュランス（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｎｉｄｕｌａｎｓ）、シゾサッカロミケス＝ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびクリベロミケス＝ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）由来のＨＡＰ３相同体との比較を示す。ＤＮＡ結合領域およびサブユニット相互作用領域が表示されている。数字はＢドメインのアミノ酸の位置を示す。
【図１Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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