(57)【要約】本発明は、細胞周期障害の診断及び治療の方法に用い得る、ｃＤＮＡ及びｃＤＮＡによりコード化されたタンパク質、及び抗体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０またはその相補体の核酸配列を有する複数のｃＤＮＡを含む組成物。
【請求項２】
核酸を含むサンプルの遺伝子発現を検出するために組成物を使用する方法であり、
（ａ）ハイブリダイゼーション化合物を形成する条件下で核酸に請求項１に記載の化合物をハイブリダイズする方法
（ｂ）ハイブリダイゼーション化合物形成を検出する方法を含み、その方法では化合物形成はサンプル中のｃＤＮＡの遺伝子発現を示すことを特徴とする。
【請求項３】
組成物のｃＤＮＡが基質に付着することを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子発現を標準と比較し、その遺伝子発現が細胞周期疾患を意味する場合の請求項７に記載の方法。
【請求項５】
組成物を用いて複数の分子か化合物をスクリーニングする方法であり、
（ａ）特異結合を可能とする条件下で、請求項１に記載の組成物と複数の分子あるいは化合物を混合する方法、
（ｂ）特異結合の検出および、それにより組成物のｃＤＮＡに特異結合する分子あるいは化合物を同定する方法を含む。
【請求項６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、４−１０とその相補体から選択した核酸配列を含むｃＤＮＡ。
【請求項７】
請求項６に記載のｃＤＮＡ及び標識成分または医薬用担体を含む組成物。
【請求項８】
核酸を含むサンプルの発現を検出するためにｃＤＮＡを使用する方法であり、
（ａ）ハイブリダイゼーション化合物をさらに形成する条件下で核酸に請求項６に記載のｃＤＮＡをハイブリダイズする方法、
（ｂ）ハイブリダイゼーション化合物形成を検出する方法を含み、その方法では化合物形成はサンプル中のｃＤＮＡの発現を示すことを特徴とする。
【請求項９】
組成物のｃＤＮＡが基質に付着することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であり、発現を標準と比較し、その発現が細胞周期疾患を意味することを特徴とする。
【請求項１１】
複数の分子あるいは化合物をスクリーニングするｃＤＮＡを用いて、リガンドを同定、精製する方法であり、下記のａ）−ｃ）を含む。
（ａ）特異結合を可能とする条件下で、請求項６に記載のｃＤＮＡと複数の分子あるいは化合物を混合する方法を含み、
（ｂ）結合したｃＤＮＡを回収する方法、
（ｃ）ｃＤＮＡをリガンドから解離して、精製したリガンドを得る方法を含む。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であり、複数の分子または化合物はＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド核酸、転写因子、エンハンサー、リプレッサー、擬態、タンパク質から選択される。
【請求項１３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、４−１０から選択したｃＤＮＡを有する発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
タンパク質を産生するｃＤＮＡの使用に関する方法であり、
（ａ）タンパク質発現のための条件下で請求項１４に記載の宿主細胞を培養する方法、及び
（ｂ）細胞培地からタンパク質を回収する過程を含む。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法で産生され、精製されたタンパク質あるいはその部分である。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法で産生されたタンパク質と標識成分または医薬用担体を含む組成物。
【請求項１８】
複数の分子あるいは化合物をスクリーニングするタンパク質を用いて、タンパク質を特異結合する少なくとも１つのリガンドを同定、精製する方法であり、下記のａ）−ｃ）を含む。
（ａ）特異結合を可能とする条件下で、請求項１６に記載のタンパク質と複数の分子あるいは化合物を混合する方法を含み、
（ｂ）結合したタンパク質を回収する方法、
（ｃ）タンパク質をリガンドから解離して、精製したリガンドを得る方法を含む。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であり、複数の分子をＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド核酸、ペプチド、擬態、タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体から選択することを特徴とする。
【請求項２０】
タンパク質を用いて抗体を調製及び精製する方法であり、
（ａ）抗体反応を誘発する条件下で、請求項１６に記載のタンパク質で動物を免疫化する方法、
（ｂ）動物抗体を単離する方法、
（ｃ）前記タンパク質を基質に付着する方法、
（ｄ）タンパク質への特異結合を可能にする条件下で、基質と単離した抗体とを接触させる方法、
（ｅ）抗体をタンパク質から解離する方法を含み、それによって精製した抗体を得る。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、既知の細胞周期遺伝子と同時発現により同定されたｃＤＮＡ、および細胞周期疾患の診断、予後、治療、治療法の評価におけるそれらのｃＤＮＡの使用に関連する。
【０００２】
（発明の背景）
細胞分裂は、すべての生物の成長、修復、増殖にとって基本的なプロセスである。単細胞生物では各細胞分裂により生命体の数が２倍となる。また多細胞の種では、新たな生命体を作製するために、あるいは消耗あるいはプログラムした細胞死により消失した細胞を交換するために多数の回数の細胞分裂が必要とされる。細胞分裂周期の詳細は様々であるが、基本的なプロセスは３つの主要な現象からなる。最初の段階である間期には、細胞分裂、ＤＮＡの複製、本質的なタンパク質の作製が含まれる。２番目の段階である有糸分裂では、核物質が分裂して細胞の両側に分離する。最終の段階である細胞質分裂は、細胞質の分裂である。細胞周期事象の順序およびタイミングは、種々のチェックポイントで正または負のメカニズムによるプロセスを制御する細胞周期調節システムの制御下にある。
【０００３】
癌と免疫状態、疾病及び疾患は、正常な細胞増殖の調節障害と関連する。癌では、調節障害は、正常な細胞遺伝子の突然変異のイソ型である発癌遺伝子にしばしば起因する。これらの発癌遺伝子の中には、ウイルスのゲノムの宿主細胞のＤＮＡへの組み込みの結果としてウイルスにより活性化する場合もある。感染した細胞を連続的に細胞分裂をさせる能力のある２つ以上の発癌遺伝子が活性化することもある。他の発癌遺伝子は、発現の位置またはレベルに関して異常に発現する。後者のカテゴリーは、細胞増殖の転写調節を変更することにより癌の原因となる。少なくとも５つの発癌遺伝子の分類が知られている。分類にはサイトカイン、成長因子、ｅｒｂＡ、ｅｒｂＢ、ｎｅｕ、ｒｏｓ等の受容体、ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｆｐｓ、ａｂｌ、ｍｅｔ等の細胞内シグナルトランスデューサ、ｆｏｓなどの核転写因子、ＲＢ、ｐ５３等の細胞周期制御タンパク質、ｍｄｍ２、ｓｅｃ、ｒａｓ等の変異腫瘍抑制遺伝子がある（Ｂｏｈｍａｎｎ ら（１９８７） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１３８６−１３９２； ＣｏｈｅｎおよびＣｕｒｒａｎ （１９８８） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ８：２０６３−２０６９、ｖａｎ Ｓｔｒａａｔｅｎ ら（１９８３） Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８０：３１８３−３１８７）。
【０００４】
例えば癌においては、発癌遺伝子は成長因子シグナルの受容と伝達、そしてこれらのシグナルに反応する遺伝子発現の調節に関与することにより抑制のない細胞増殖に寄与する。成長因子による細胞の刺激は２セットの遺伝子すなわち初期反応遺伝子と遅延応答遺伝子を活性化させる。ｍｙｃ、ｆｏｓ、ｊｕｎ のプロトオンコジーンを含む初期反応遺伝子は、すべて遺伝子調節タンパク質をコード化する。これらの調節タンパク質は、細胞周期進行に関与するサイクリン、サイクリン依存キナーゼなどのタンパク質をコード化する遅延反応遺伝子の転写を活性化する。
【０００５】
既知の細胞周期遺伝子と同時発現するｃＤＮＡの発見により、細胞周期疾患の診断、予後、治療、治療の評価において有用な新規の組成物を提供して当分野における必要を満たす。
【０００６】
（発明の概要）
本発明は、複数の生物サンプルの１つ以上の既知の細胞周期遺伝子と同時発現するＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０またはその相補体の核酸配列を有する複数のｃＤＮＡを含む組成物を提供する。本発明はさらに、前記の組成物のｃＤＮＡに特異結合する少なくとも１つのリガンドを同定するために、複数の分子をスクリーニングする目的である組成物を使用する方法、そして特異結合を可能にする条件下で分子と前記の組成物を混合し、そして特異結合を検出してｃＤＮＡに特異結合するリガンドを同定する方法を提供する。ある実施様態では、それらの分子はＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド核酸、転写因子、エンハンサー、リプレッサー、擬態、タンパク質から選択される。
【０００７】
本発明は、核酸を含むサンプルの遺伝子発現を検出するためにある組成物を使用する方法を提供し、その方法には、１つ以上のハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下で核酸にその組成物をハイブリダイズさせる方法、そして複合体形成がサンプル中の遺伝子発現を示すようにしてハイブリダイゼーション複合体形成を検出する方法が含まれる。一実施例では、前記の組成物中のｃＤＮＡをある基質に付着させる。別の実施例では、標準に比較した時の複合体形成が細胞周期疾患の診断となる。
【０００８】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２と４−１０及びその相補体から選択する核酸配列を有する単離したｃＤＮＡを提供する。異なる実施態様では、各ｃＤＮＡを診断用として、プローブとして、発現ベクターで、および細胞周期疾患の予後と治療の評価において使用する。さらに本発明は、ｃＤＮＡ及び標識成分を含む組成物を提供する。本発明はさらに、前記のｃＤＮＡに特異結合するリガンドを同定するために、複数の分子をスクリーニングする目的で前記のｃＤＮＡを使用する方法、そして特異結合を可能にする条件下でサンプルと前記のｃＤＮＡを混合させ、結合したｃＤＮＡを回収し、そして結合したｃＤＮＡからリガンドを分離し精製したリガンドを獲得する方法を含めた方法を提供する。ある実施様態では、それらの分子はＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド核酸、転写因子、エンハンサー、リプレッサー、擬態、タンパク質からスクリーニングして選択される。
【０００９】
本発明は、核酸を含むサンプルの遺伝子発現を検出するためにｃＤＮＡを使用する方法を提供する。また１つ以上のハイブリダイゼーション複合体を形成する条件下でサンプルの核酸にｃＤＮＡをハイブリダイズする、そして複合体形成がサンプル中の遺伝子発現を示すハイブリダイゼーション複合体形成を検出する方法を含む。一実施例では、ｃＤＮＡを基質に付着する。別の実施例では、標準に比較した時の遺伝子発現が細胞周期疾患の診断となる。更に該方法により、ｃＤＮＡを含有するベクタ−、およびベクタ−を含有する宿主細胞を提供する。またｃＤＮＡによりコード化されるタンパク質やペプチドを産生する宿主細胞を使用する方法を提供し、その内には、タンパク質の発現用の条件下で宿主細胞を培養する方法と細胞培養からタンパク質を回収する方法が含まれる。   本発明は、本発明のｃＤＮＡによりコード化される精製したタンパク質を提供する。本発明はさらに、タンパク質を特異結合するリガンドを同定、精製する複数の分子をスクリーニングするためにタンパク質やペプチドを使用する方法を提供する。ある実施様態では、分子はＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド核酸、タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体からスクリーニングして選択される。
【００１０】
さらに本発明は、抗体を調製かつ精製するために、あるタンパク質を使用する方法を提供し、その方法の内には抗体反応を誘発する条件下でタンパク質またはペプチドによって動物を免疫化すること、動物抗体を単離すること、ある基質にタンパク質を付着させること、そのタンパク質への特異結合を可能にする条件下でその基質を単離した抗体と接触させること、タンパク質から抗体を解離して精製した抗体を得ることが含まれる。本発明はまた、細胞周期疾患を診断するためにタンパク質を特異結合する抗体を使用する方法、そして特異結合の条件下でサンプルに抗体を混合させ、抗体複合物形成を検出し、標準と抗体複合物形成を比較し、それによって細胞周期疾患を診断する方法を提供する。さらに本発明は、細胞周期疾患を治療で使用するｃＤＮＡ、タンパク質、またはタンパク質あるいはペプチドを特異結合する抗体そして医薬用担体を含む組成物を提供する。
【００１１】
（発明を実施するための形態）
請求の範囲及び明細書中で用いている単数形の「或る」及び「その（この）」の表記は、文脈から明らかにそうでないとされる場合を除いて複数のものを指す場合もあることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿主細胞」と記されている場合にはそのような宿主細胞が複数あることもあり、「或る抗体」と記されている場合には単数または複数の抗体、及び、当業者に公知の抗体の等価物等についても言及しているのである。
【００１２】
（定義）
「アレイ」は、基質上の少なくとも２つのｃＤＮＡあるいは抗体の規則正しい配列を指す。ｃＤＮＡあるいは抗体の少なくとも１つが調節または標準を表す。そして他方が目的の診断または薬剤のｃＤＮＡあるいは抗体を表す。基質上の２〜約４０，０００のｃＤＮＡあるいは２〜約４０，０００のモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の配列では、各ｃＤＮＡと少なくとも１つの核酸の間で形成される各標識ハイブリダイゼーション複合体のサイズとシグナル強度、あるいは各抗体と抗体が特異結合する少なくとも１つのタンパク質の間で形成される抗体タンパク質複合体は、確実に個別に区別できる。
【００１３】
「細胞周期遺伝子」は、制御されていない細胞周期と関連する診断、予後、治療、治療の評価において有用であると前もって同定されたｃＤＮＡを指す。通常は、これは任意の組織で正常な発現と比較する時に細胞周期疾患を患う患者の組織でより高い（低い）レベルで既知の遺伝子が示差的に発現されていることを意味する。本発明で使用され、実施例４で記載される細胞周期遺伝子は、ｃｄｃ２、ｃｄｃ７、ｃｄｃ２３、サイクリンＢ、ｈＢｕｂ１、ＨＫＳＰ、ｈｐ５５ｃｄｃ、ＭＣＡＫ、ｍｉｔｏｓｉｎ、ｍｋｉ６７ａ、ＭＫＬＰ−１、ｍｙｂ、ｎｌｋ１、ｃｄｃ２１、ＰＲＣ１、Ａｉｋ２、サバイビン、ｔｏｐｏＩＩ、ＵｂｃＨ１０がある。
【００１４】
「細胞周期疾患」とはすべての癌または免疫疾患を指す。限定するものではないが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または血、骨、骨髄、脳、胸、胃腸管（食道、胃、小腸または結腸）、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ、筋肉、神経、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、脾臓、精巣と子宮の癌、喘息、アテローム性動脈硬化症、クローン病、糸球体腎炎、多発性硬化症、重症筋無力症、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、硬皮症、そして、全身エリテマトーデスが含まれる。
【００１５】
「ｃＤＮＡ」とは、単離したポリヌクレオチド、あるいはそのポリヌクレオチドの任意の断片またはオリゴヌクレオチドを指す。それは、ゲノム起源または合成起源、二本鎖または一本鎖であってもよく、特別の作用を起こすため、あるいは有用な組成物形成するために、糖質、脂質、タンパク質その他の物質と結合したものでもよい。
【００１６】
「示差発現」とは、存在の有無、サンプル中の転写メッセンジャーＲＮＡあるいは翻訳したタンパク質の量の少なくとも二倍の変更により検出される増加、または上方調節、あるいは減少、また下方調節発現を指す。
【００１７】
「分離したあるいは精製した」とは、自然環境から分離され、かつ自然に存在する他の化合物から分離しているｃＤＮＡあるいはタンパク質を指す。
【００１８】
「リガンド」とは、ポリヌクレオチドあるいはタンパク質のエピトープに特異結合する任意の物質、分子または化合物を指す。そのようなリガンドはポリヌクレオチドまたタンパク質の活性を安定化あるいは調節する。そしてミネラル、補助因子、核酸、タンパク質、糖質、脂肪、脂質を含む無機および／または有機物質から構成されている可能性がある。
【００１９】
用語「タンパク質」は、天然または合成のペプチド或いはそれらの任意の断片またはオリゴペプチドを指す。
「サンプル」は、核酸、タンパク質、抗体その他を含むようなその最も広い意味で用いられる。サンプルは体液、細胞調製の可溶性分画、細胞が成長する培地のアリコット、染色体、細胞小器官、あるいは細胞から単離または抽出された膜、溶液中のまたは基板に固定されたゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡと、細胞、組織、組織プリント、フィンガープリント、口内細胞、皮膚あるいは髪などから成る可能性がある。
【００２０】
「類似性」とは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアラインメント（Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ （１９８１） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １４７：１９５−１９７）あるいはＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ら （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３３８９−３４０２）などの標準化されたアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つの配列間で一致するヌクレオチドあるいは残基の定量化（通常は％）を指す。ＢＬＡＳＴ２は、再現性のある方法で、アラインメントを最適化するために配列の１つにギャップを挿入するか、または２つの配列をより有意に比較するために使用し得る。タンパク質では特に、保存的置換では類似性が同一性よりも大きい。例えば、ロイシンまたはイソロイシンのバリンは報告された割合を計算する時にカウントされる。保存と考えられた置換が当分野で公知である。
【００２１】
「特異結合」とは、構造、特に分子側基に依存する、２つの分子間での特別で精確な相互作用を指す。例えば、調節タンパク質のＤＮＡ分子の主溝への挿入、あるいはタンパク質のエピトープとアゴニスト、アンタゴニストまたは抗体との間の結合がある。
【００２２】
「基質」とは、ｃＤＮＡまたはタンパク質が結合する任意の固体または半固体の支持体を指すものであって、膜、フィルタ、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁性または非磁性ビーズ、ゲル、毛管、またはその他の管、プレート、ポリマー、微細粒子が含まれ、穴、溝、ピン、チャネル、孔等、様々な表面形態を有する。
【００２３】
「転写イメージ」とは、特定の時に特定の組織の遺伝子転写活性のプロフィールである。
【００２４】
「変異体」とは、ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡがコードするタンパク質の認識される変異である分子を指す。スプライス変異体は、スコアが少なくとも１００、最も好ましいのは少なくとも４００である、ＢＬＡＳＴスコアにより決定する可能性がある。対立遺伝子変異体はｃＤＮＡに対して高一致率を有し、１００塩基に付き約３塩基が異なる。「１塩基多型性」（ＳＮＰ）とは、欠失、挿入または置換による単一の塩基での変異を指す。変異は保存（プリンからプリン）あるいは非保存（プリンからピリミジン）される可能性があり、コード化されたアミノ酸または２次、３次、４次構造の変異となる可能性もならない可能性もある。
【００２５】
（発明）
本発明は、特定の疾患、調節経路、細胞内部分、細胞の種類、組織の種類あるいは種と関連するｃＤＮＡまたはタンパク質を同定する方法を利用する。特にその方法は細胞周期疾患のための治療の診断、予後、治療、評価において有用なｃＤＮＡを同定する。
【００２６】
その方法は、複数のライブラリで発現するｃＤＮＡの同定法を提供する。既知の機能の遺伝子の発現パターンを未知の機能のｃＤＮＡのそれと比較することにより、特異な同時発現確率閾値を満たすかどうかを決定する。この比較により、既知の遺伝子と同時発現確率の高いｃＤＮＡのサブセットを同定することが可能となる。
ｃＤＮＡは、多様な源に由来するｃＤＮＡライブラリから始まる。限定されるものではないが多様な源には、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、植物、酵母等の真核生物、バクテリア、ウイルス等の原核生物を含む。これらのｃＤＮＡは多様な配列の種類から選択することができる。限定するものではないが、発現配列タグ（ＥＳＴ）、構築したポリヌクレオチド、完全長コード領域、プロモーター、イントロン、エンハンサー及び５’及び３’の非翻訳領域を含む。統計的に有意義な分析結果を得るために、少なくとも５つのｃＤＮＡライブラリでｃＤＮＡを発現する必要がある。
【００２７】
本発明の同時発現分析で使用されるｃＤＮＡライブラリは、副腎、胆道、膀胱、血球、血管、骨髄、脳、気管、軟骨、クロム親和系、結腸、結合組織、培養細胞、胚幹細胞、内分泌腺、上皮組織、食道、胎児、神経節、心臓、視床下部、免疫機構、腸、ランゲルハンス島、腎臓、咽頭、肝臓、肺、リンパ、筋肉、神経、卵巣、膵臓、陰茎、末梢神経系、腹膜、食細胞、下垂体、胎盤、胸膜、前立腺、唾液腺、精嚢、骨格、脾臓、胃、精巣、胸腺、舌、尿管、子宮等から得ることが可能である。選択されたｃＤＮＡライブラリの数の範囲は、わずか５から１０．０００以上まで可能性がある。好ましくはｃＤＮＡライブラリの数は５００以上である。
【００２８】
好適な実施例では、ｃＤＮＡを単一転写に由来する配列断片などの関連配列から構築する。ポリヌクレオチドの構築は、限定するものではないがＥＳＴ、ＥＳＴの伸長、クローン化インサートのショットガン・シークエンシングまたは全長ｃＤＮＡ等多様な種類の配列を使用して行うことが可能である。最も好適な実施例では、１９９９年３月２５日に提出したＵＳＳＮ ９，２７６，５３４で開示したアルゴリズムを使用して構築したヒト配列からｃＤＮＡを導出する。該特許は引用することをもって本明細書の一部とする。
【００２９】
実験的に、限定するわけではないが、空間的固定またはゲル電気泳動法によるディファレンシャルディスプレイ、ゲノム不一致スキャニング、ＲＤＡ（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）法、転写イメージング等の方法によりｃＤＮＡの示差発現を評価することができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、５、１０の代表的転写イメージは実施例１５に見出される。転写イメージは、本明細書で開示する同時発現方法により作成したデータを確認する。さらに示差発現をマイクロアレイ技術により評価することができる。これらのいずれの方法を単独あるいは併用して使用することができる。
【００３０】
制御不能な細胞増殖と関連のある病気の診断あるいは予後マーカーとしてあるいは治療標的としての遺伝子の機能と使用に基づいて、既知の細胞周期遺伝子を選択することができる。好ましくは既知の細胞周期遺伝子は、ｃｄｃ２、ｃｄｃ７、ｃｄｃ２３、サイクリンＢ、ｈＢｕｂ１、ＨＫＳＰ、ｈｐ５５ｃｄｃ、ＭＣＡＫ、ｍｉｔｏｓｉｎ、ｍｋｉ６７ａ、ＭＫＬＰ−１、ｍｙｂ、ｎｌｋ１、ｃｄｃ２１、ＰＲＣ１、Ａｉｋ２、サバイビン、ｔｏｐｏＩＩ、ＵｂｃＨ１０がある。
【００３１】
既知の細胞周期遺伝子との統計的に有意な同時発現パターンを示すｃＤＮＡを同定する手順は下記の通りである。最初に、ｃＤＮＡライブラリの遺伝子配列の存在あるいは不存在を定義する。ある遺伝子に対応する少なくとも１つのｃＤＮＡ断片がライブラリから採取したｃＤＮＡサンプルで検出される時、遺伝子はそのｃＤＮＡライブラリに存在する。そして対応するｃＤＮＡ断片がサンプル中で検出されない時、遺伝子はそのライブラリに存在しない。
【００３２】
２番目に、確率方法を用いて遺伝子同時発現の有意性を評価して、同時発現の偶然による確率を測定する。確率方法はフィッシャーの正確確率検定、カイ２乗検定またはカッパ検定である可能性がある。これらの試験と適用の例は公知であり、標準的な統計学のテキストで見出すことができる （Ａｇｒｅｓｔｉ （１９９０） Ｃａｔｅｇｏｒｉｃａｌ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ； Ｒｉｃｅ （１９８８） Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｄｕｘｂｕｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｐａｃｉｆｉｃ Ｇｒｏｖｅ ＣＡ）。ボンフェローニ検定（前出のＲｉｃｅ、３８４ページ）も、１つの遺伝子対複数の他の遺伝子の統計結果を修正するために確率方法の１つと併用して適用することができる。好適な実施例では、偶然による確率をフィッシャーの正確確率検定により測定する。また偶然による確率の閾値を好ましくは０．００１未満、更に好ましくは０．００００１未満に設定する。
2004521611.tif 000002
【００３３】
２つの遺伝子ＡとＢが類似の同時発現のパターンを有するかどうかを決定するために、出現性データベクタ―を下記の表で説明されているように産生する。ライブラリで少なくとも１回出現する遺伝子の存在を１と示す。またライブラリでの不存在を０と示す。
【００３４】
所定の対の遺伝子には、出現データを２ ｘ ２ 分割表（下記）で概略する。
2004521611.tif 000003
【００３５】
分割表は、総計３０ライブラリに及ぶ遺伝子Ａと遺伝子Ｂの同時出現データを示す。遺伝子Ａと遺伝子Ｂの両方はライブラリで１０回出現しており、この表は下記を概略して示している。（１）遺伝子ＡとＢ両者がライブラリで存在する回数、（２）遺伝子ＡとＢ両者がライブラリで不在の回数、（３）遺伝子Ａが存在して、遺伝子Ｂが不在の回数、（４）遺伝子Ｂが存在して、遺伝子Ａが不在の回数上左エントリはライブラリで２つの遺伝子が同時出現する回数であり、中右エントリはライブラリで両者の遺伝子が出現しない回数である。非対角エントリは１つの遺伝子が出現するが別の遺伝子が出現しない回数である。ＡとＢの両者が存在するのは８回であり、不在するのは１８回である。遺伝子Ａが存在してＢが不在する場合が２回、遺伝子Ｂが存在して遺伝子Ａが不在するのは２回であるフィッシャーの正確確率検定を利用した計算によると、上記の関連性が偶然によって起こった確率（「ｐ値」）は、０．０００３である。ｐ値が０．０１未満である場合、関連性は通常有意と考慮される（前出のＡｇｒｅｓｔｉとＲｉｃｅ）。
【００３６】
２つの遺伝子の同時発現の確率を評価する方法には幾つかの前提がある。方法はライブラリが独立しており、同様にサンプル化していると想定する。しかし実際の状況では、選択したｃＤＮＡライブラリは完全には独立していない。１つ以上のライブラリを単一の対象または組織から得ることが可能だからである。また完全には同様にサンプル化されてもいない。異なる数のｃＤＮＡを各ライブラリから配列化する可能性があるからである。通常シーケンスしたｃＤＮＡの数の範囲は、ライブラリ毎に５，０００から１０，０００ｃＤＮＡである。更に、フィッシャーの正確同時発現確率を各遺伝子対少なくとも５つのライブラリで出現する他のすべての構築した３７，０７１の遺伝子に対して計算する。また複数の統計試験のためにボンフェローニ検定を用いた。
【００３７】
上記の方法を用いて、細胞周期と特異的である既知の遺伝子と強い関連または同時発現を示したｃＤＮＡを同定した。実施例５に見られる同時発現表に記載される結果は、下記の表に要約されている。列１はＳＥＱ ＩＤ番号、列２はｃＤＮＡが最も高度に同時発現する既知の細胞周期遺伝子、列３はｐ値、列４は同時発現したｃＤＮＡが特異的診断マーカーである細胞周期疾患である。
2004521611.tif 000004
【００３８】
この表は本明細書で請求しているｃＤＮＡが既知の細胞周期遺伝子との間で、著しく高い同時発現（０００００００１未満）を有することを示す。よって、細胞周期疾患の診断、予後、治療の評価においてｃＤＮＡは代理マーカーとして有用であり、制御不能な細胞周期の排除と制御のための医薬として役立つ可能性がある。さらにｃＤＮＡから発現したタンパク質またはペプチドは、治療に役立つ可能性がある、あるいは同定や発達のための標的を有する。同様に、タンパク質から作製されたあるいはタンパク質を使用して同定した抗体は、治療用や薬理用のキャリアーに役立つ可能性がある。
【００３９】
よって本発明は、一実施例ではＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０またはその相補体の核酸配列を有するｃＤＮＡの組成物を含む。これらの１０のｃＤＮＡは、既知の細胞周期遺伝子との強い同時発現、また互いに強い同時発現を有することが、本発明の方法により示される。さらに本発明は、ｃＤＮＡ、相補体、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、４−１０から選択したｃＤＮＡを含むプローブを提供する。変異体は通常はこれらの配列の少なくとも１つに対して少なくとも約７０％の核酸配列同一性を有する。
【００４０】
ｃＤＮＡまたはコード化したタンパク質を、以前に同定してアノテーションが付けられたモチーフ、配列、遺伝子機能を含む、ＧｅｎＢａｎｋの霊長類（ｐｒｉ）、げっ歯類（ｒｏｄ）、哺乳動物（ｍａｍ）、脊椎動物（ｖｒｔｐ）、真核生物（ｅｕｋｐ）のデータベースと、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ（Ｂａｉｒｏｃｈ ら （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：２１７−２２１）、ＰＦＡＭその他のデータベースに対して検索するために使用することができる。Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ； Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ３６：２９０−３００、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ら （１９９０） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−４１０）、ＢＬＯＣＫＳ （Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １９：６５６５−６５７２）、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ； Ｅｄｄｙ （１９９６） Ｃｕｒ Ｏｐｉｎ Ｓｔｒ Ｂｉｏｌ ６：３６１−３６５、Ｓｏｎｎｈａｍｍｅｒら（１９９７） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２８：４０５４２０）等のアルゴリズムの他に二次構造ギャップペナルティを有する一次配列パターン（Ｓｍｉｔｈら（１９９２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ５：３５−５１）を検索する方法をヌクレオチドとアミノ酸配列を操作、分析するために使用することができる。これらのデータベース、アルゴリズム、またその他の方法は当分野で公知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ ら（１９９７； Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７）とＭｅｙｅｒｓ （１９９５； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ，８５６−８５３ページ）により記載されている。
【００４１】
また本発明には、ストリンジェント条件下で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−１０とその断片にハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドが含まれている。塩分濃度、温度及びその他の化合物、当分野で知られている条件によりストリンジェント条件を定義することができる。例えばプレハイブリタイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄溶液中の塩分の濃度を変えることにより、あるいはハイブリダイゼーションと洗浄温度を変えることにより条件を選ぶことができる。幾つかの基質で、ホルムアミドをプレハイブリタイゼーションとハイブリダイゼーション溶液に加えることにより温度を下げることができる。
【００４２】
ハイブリダイゼーションは、１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を６０℃で５ｘＳＳＣ（クエン酸ナトリウム食塩水）などのバッファーで低ストリンジェンシーで実施することができる。そして不一致を含む核酸配列の間で化合物の形成を可能にする。続いて、完全な相補的な配列を含有するそれらの化合物のみのハイブリダイゼーションを維持するために０．１％ ＳＤＳを４５℃（中間ストリンジェンシー）または６８℃（高ストリンジェンシー）で、０．２ｘＳＳＣなどのバッファーで高いストリンジェンシーで洗浄を実施した。バックグラウンドシグナルはＳＤＳ、ＳａｒｋｏｓｙｌまたはＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００ （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）などの界面活性剤または変性したサケ精子ＤＮＡなどのブロッカーの使用により減少させることができる。ハイブリダイゼーション方法についてはＡｕｓｕｂｅｌ （前出ｕｎｉｔｓ ２．８−２．１１、３．１８−３．１９、４−６−４．９）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ）に詳述されている。
【００４３】
ｃＤＮＡを、部分的ヌクレオチド配列を利用し且つ当分野でよく知られているＰＣＲ法をベースにした種々の方法を用いて伸長させ、プロモーター及び調節要素等の上流配列を検出することができる。（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ及びＤｖｅｋｓｌｅｒ （１９９５） ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ， ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹを参照）。さらにＸＬ−ＰＣＲキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ （ＡＢＩ）， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）、ネステッドプライマー、市販のｃＤＮＡライブラリ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）あるいはゲノムライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を使用して、配列を伸長することができる。全てのＰＣＲベースの方法に対して、市販されているソフトウェア（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ｓｏｆｔｗａｒｅ， ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）或いは別のプログラムを用いて、長さが約１５〜３０ヌクレオチド、ＧＣ含有率が約５０％以上、温度約６８℃〜７２℃でハイブリダイゼーション複合体を形成するようにプライマーを設計し得る。
【００４４】
本発明の別の実施例では、宿主細胞内でタンパク質またはその構造的また機能的部分の発現を誘導する組換えベクターにこのｃＤＮＡをクローニングすることが可能である。遺伝暗号固有の縮重に起因して、同一或いは機能的等価のアミノ酸配列をコードするような別のＤＮＡ配列を作製して、このｃＤＮＡによりコードするタンパク質の発現に利用し得る。種々の目的でヌクレオチド配列を変えるために、本発明のヌクレオチド配列を当分野で通常知られている方法を用いて組み換えることができる。 ここで目的には、限定するものではないが遺伝子産物のクローニング、プロセッシング、発現の調節がある。遺伝子断片及び合成オリゴヌクレオチドのランダムなフラグメンテーション及びＰＣＲ再アセンブリによるＤＮＡシャッフリングを用い、ヌクレオチド配列を組み換えることが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドを介した部位特異的変異誘導を利用して、新規な制限部位の作製、グリコシル化パターンの変更、コドン優先の変更、スプライス変異体の生成等を起こす突然変異を導入し得る。
【００４５】
生物学的に活性なタンパク質を発現させるために、ｃＤＮＡまたはその誘導体を発現ベクターに挿入することができる。発現ベクターとは即ち特定の宿主内で挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳の調節に必要な要素を含むベクターである。これらの要素には、エンハンサー、構成型及び発現誘導型プロモーター、５’及び３’の非翻訳領域などの調節配列がある。当業者に周知の方法を用いて、発現ベクターを作製することが可能である。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組換え技術が含まれる（前出のＳａｍｂｒｏｏｋ、前出のＡｕｓｕｂｅｌ）。
【００４６】
多様な発現ベクター／宿主細胞系を用いてｃＤＮＡを発現することができる。限定するものではないがこのような宿主系には、組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミド発現ベクターで形質転換させた細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換させた酵母菌や、バキュロウイルス発現ベクターで感染させた昆虫細胞系や、ウイルスあるいは細菌性発現ベクターを含む発現ベクターで形質転換させた植物細胞系、あるいは動物細胞系などの微生物がある。長期にわたり哺乳動物系内で組換えタンパク質を生成するためには、細胞株内の安定発現が望ましい。例えば、発現ベクターであって複製発現因子、内在性発現因子、或いはその両者のウイルス起源を含むものと、同一或いは別のベクター上の選択可能または可視マーカー遺伝子とを用いて、ｃＤＮＡを細胞株に形質転換することが可能である。本発明は使用されるベクターまたは宿主細胞によって限定されるものではない。
【００４７】
一般に、ｃＤＮＡを含み且つタンパク質を発現する宿主細胞は、当業者によく知られている種々の方法を用いて同定することが可能である。限定するものではないが当業者によく知られている方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法、核酸或いはアミノ酸配列の検出、定量、或いはその両方を行うための膜系、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク質バイオアッセイまたはイムノアッセイ技術がある。特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらかを用いるタンパク質の発現の検出及び計測のための免疫学的な方法は、当分野で周知である。 このような技法には、酵素に結合した免疫吸着剤検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フローサイトメーター（ＦＡＣＳ）などがある。
【００４８】
ｃＤＮＡで形質転換された宿主細胞は、細胞培地でのこのタンパク質の発現及び回収に好適な条件下で培養される。遺伝形質転換細胞から製造されたタンパク質が分泌されるか細胞内に留まるかは、使用される配列、ベクター、或いはその両者に依存する。ｃＤＮＡを含む発現ベクターは、原核細胞膜及び真核細胞膜を透過するタンパク質の分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計できることは、当業者には理解されよう。
【００４９】
更に、宿主細胞株の選択は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の形に処理する能力によって行い得る。限定するものではないがこのようなタンパク質の修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化がある。タンパク質の「プレプロ」形を切断するような翻訳後処理を利用して、タンパク質のターゲティング、折りたたみ及び／または活性を特定することも可能である。翻訳後の活性のための固有の細胞装置及び特徴のある機構を有する種々の宿主細胞（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＭＥＫ２９３、ＷＩ３８等）は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）から入手可能であり、発現タンパク質の正しい修飾及び処理を確実にするように選択し得る。
【００５０】
本発明の別の実施例では、自然或いは変更された、または組換えの核酸配列を上記した任意の宿主系の異種タンパク質成分を含む融合タンパク質の翻訳となる異種配列に結合させる。異種タンパク質部分は市販されている親和性基質を用いて融合タンパク質の精製を促進し得る。限定されるものではないがこのような部分には、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、カルモジュリン結合ペプチド、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ｃ−ｍｙｃ、赤血球凝集素、モノクローナル抗体エピトープがある。
【００５１】
別の実施例によれば、ｃＤＮＡは、当分野で周知の化学的または酵素的方法を用いて、全体或いは一部が合成可能である（例えば、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ．．ら（１９８０）Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ． Ｓｅｒ ７：２１５−２３３、前出Ａｕｓｕｂｅｌを参照）。例えば、種々の固相技術（Ｒｏｂｅｒｇｅ ら（１９９５） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：２０２２０４）を用いてペプチド合成を行うことができる。またＡＢＩ ４３１Ａ ペプチドシンセサイザ（ＡＢＩ）等の装置を用いて合成を自動化することができる。所望であれば、変異体を産生するために、合成中に及び／または他のタンパク質からの配列との組み合わせでアミノ酸配列を変更することができる。
【００５２】
スクリーニング、診断及び治療
組成物またはｃＤＮＡを細胞周期疾患の診断、予後、治療、治療法の選択と評価に用いることができる。細胞周期疾患とは限定するものではないが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫または血、骨、骨髄、脳、胸、胃腸管（食道、胃、小腸または結腸）、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ、筋肉、神経、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、脾臓、精巣と子宮の癌、喘息、アテローム性動脈硬化症、クローン病、糸球体腎炎、多発性硬化症、重症筋無力症、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、硬皮症、そして全身エリテマトーデスが含まれる。
【００５３】
組成物またはｃＤＮＡを使用して、特異結合親和性のために複数の分子をスクリーニングする。このアッセイを、生物系におけるポリヌクレオチドの活性を調節する複数のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ペプチド、リボザイム、抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、インヒビター、そして転写因子、エンハンサー、リプレッサー、薬剤その他などのタンパク質をスクリーニングするために使用することができる。このアッセイには、複数の分子を提供すること、特異結合を可能とするのに好適な条件下でｃＤＮＡまたはその断片を複数の分子と混合すること、ｃＤＮＡを特異結合する少なくとも１つの分子を同定する特異結合を検出することが含まれる。
【００５４】
同様に、タンパク質またはその部分を多様なスクリーニングアッセイの任意の分子または化合物のライブラリをスクリーニングするために用い得る。そのようなスクリーニングで用いられたタンパク質の部分は、溶液中で遊離するか、非生物的基質または生物的基質に固定させるか（例えば細胞表面上に保持される）、あるいは細胞内に位置することになろう。タンパク質と分子間の特異結合を測定することは可能である。このタンパク質に特異結合する複数のＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ、ペプチド、様態、リボザイム、抗体、アゴニスト、アンタゴニスト、免疫グロブリン、インヒビター、ペプチド、ポリペプチド、薬剤その他などのタンパク質をスクリーニングするためにこのアッセイを使用することができる。非常に小さなアッセイ量と微少量の試験化合物を使用して高い処理能力でスクリーニングするための方法がＢｕｒｂａｕｍ らのＵＳＰＮ ５，８７６，９４６に記載されている。当該文献は特に引用することを以って本明細書の一部となす。また当方法により酵素阻害または受容体結合のための多数の分子をスクリーニングする。
【００５５】
好適な一実施例では、不在、存在または遺伝子の正常な標準発現と比較して変更―増加あるいは減少を決定するために診断目的でｃＤＮＡを使用する。ポリヌクレオチドは、相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ分子、分枝核酸またはＰＮＡから成る。別の実施例では、ｃＤＮＡの発現が疾患と相関するサンプル中の遺伝子発現を検出及び定量するためにｃＤＮＡを使用する。別法では、疾患と関連する遺伝多型性を検出するｃＤＮＡを使用することができる。これらの多型性を転写ｃＤＮＡ中で検出することができる。
【００５６】
固有の領域、調節領域または保存されたモチーフに由来するかに応じてプローブの特異性を決定する。プローブが同定するのは、天然に存在する正確に相補的な配列、対立遺伝子変異体または関連配列のみであるか否かは、プローブの特異性及び診断ハイブリダイゼーション或いは増幅（極大、高、中間あるいは低）のストリンジェンシーの両方によって決定されることになる。関連する配列を検出するよう設計したプローブは、それらのｃＤＮＡのいずれに対して好ましくは少なくとも５０％の配列同一性を有するべきである。
【００５７】
ハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、ｍＲＮＡプローブの作製のためのベクターに核酸配列をクローニングする方法がある。ベクターは、当業者に知られており、市販されており、ＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＲＮＡプローブを合成するために用いられ得る。ハイブリダイゼーションプローブは、種々のレポーターの集団によって標識され得るヌクレオチドを組み込むことが可能である。限定するわけではないが、レポーター集団の例としては、３２Ｐまたは３５Ｓ等の放射性核種、或いはアビジン／ビオチン結合系を介してプローブに結合されたアルカリホスファターゼ等の酵素標識、蛍光標識その他が挙げられる。標識化ｃＤＮＡは、変異タンパク質発現を検出するために被験者からのサンプルを使用するサザーン法やノーザン法、ドットブロット法、或いはその他の膜系の技術、ＰＣＲ法、マイクロアレイに使用することが可能である
【００５８】
ｃＤＮＡを標準的な方法で標識化して、ハイブリダイゼーション複合体の形成と検出に好適な条件下で患者のサンプルに加える。インキュベーション後、サンプルを洗浄し、ハイブリダイゼーション複合体と関連するシグナルの量を定量して標準値と比較する。標準値は、疾患の疑いのない任意の対照サンプルから通常は得る。患者サンプルのシグナル量が対照サンプルと比べて著しく変化している場合は、サンプル内の発現の変異レベルの存在は疾患の存在を示している。前もって確立された標準と患者サンプル中に形成されたハイブリダイゼーション複合体を比較するための定性または定量方法は、当分野で公知である。
【００５９】
このようなアッセイは、動物実験、臨床試験における特定の治療効果を推定するため、或いは個々の患者の治療をモニターするために用いることもできる。症状の存在を一旦確定して治療プロトコルを開始すると、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイを通常ベースで繰り返して、患者の発現レベルが正常な被検者に観察されるレベルに近づき始めたかどうかを測定する。連続アッセイから得られた結果を用いて、数日から数年の期間にわたる治療の効果を示し得る。
【００６０】
発現パターンをモニターするために、ｃＤＮＡをマイクロアレイ上で使用することも可能である。マイクロアレイはまた、スプライス変異体、突然変異及び多型性の同定に用いることができる。発現パタ−ンの分析から得た情報を用いることで、遺伝子機能を決定し、疾患の遺伝的根拠を理解し、疾患を診断し、疾病治療における薬剤の活性を開発及びモニターすることができる。マイクロアレイはまた、ゲノムレベルで特定の個体群を特徴付ける遺伝多様性、１塩基多型性の検出に用いることができる。
【００６１】
しかし別法では、ｃＤＮＡを用いて、天然のゲノム配列をマッピングするのに有用なハイブリダイゼーションプローブを作製することが可能である。蛍光原位置ハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）は、Ｈｅｉｎｚ−Ｕｌｒｉｃｈ ら（Ｉｎ： Ｍｅｙｅｒｓ前出９６５−９６８ページ）に記載されているように他の物理的染色体マッピング技術及び遺伝地図データと相関し得る。
【００６２】
別の実施例では、タンパク質の過剰発現または過少発現によって特徴付けられる疾患の診断と予後のために、タンパク質を特異結合する抗原結合領部位を含む抗体またはＦａｂを使用することができる。タンパク質発現を測定するための様々なプロトコル、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ等が本技術分野において知られており、発現の変異レベル或いは異常レベルを診断する基準を提供する。化合物形成の条件下で、健康な被験者、好ましくはヒトから採取したサンプルをタンパク質への抗体と比較してタンパク質発現の標準値を確立する。様々な方法、好ましくは測光法により化合物形成の量を定量することは可能である。疾患サンプルで発現したタンパク質の量を基準値と比較する。標準値と被験者との偏差によって、疾患を診断またはモニターするパラメータが確立される。または、タンパク質を特異結合することができる中和抗体が試験化合物と競合する、競合的薬剤スクリーニングアッセイを使用することが可能である。１個若しくは数個の抗原決定因子をタンパク質と共有する任意のペプチドの存在を検出するために、抗体を使用することが可能である。或る実施態様において、細胞周期疾患の治療または治療上の処置をモニタ−するために抗体を使用することができる。
【００６３】
別の実施様態では、ｍＲＮＡとタンパク質を発現する目的、または逆にｍＲＮＡの転写あるいは翻訳を阻害する目的で、ｃＤＮＡまたはその相補体を治療上使用することができる。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルス由来のまたは細菌性プラスミド等由来の要素を使用して発現ベクターを作製することができる。これらのベクターを使用して、ヌクレオチド配列を特定の標的器官、組織または細胞集団へ送達することができる。当業者によく知られている方法を用いて、核酸配列またはその相補体を発現するためにベクターを作製することが可能である。（Ｍａｕｌｉｋ ら（１９９７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ， Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ等を参照）。また体細胞または幹細胞の遺伝子治療のためにｃＤＮＡあるいはその相補体を使用することができる。べクターをｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ．に導入することが可能である。ｅｘ ｖｉｖｏ治療の場合、ベクターを患者から採取した幹細胞内に導入し、得られた遺伝形質転換細胞をクローニング増殖して同一患者に自家移植で戻すことができる。トランスフェクション、リボソーム注入またはポリカチオンアミノポリマーによるｃＤＮＡの輸送は、当分野でよく知られている方法を用いて実行することができる（Ｇｏｌｄｍａｎ ら （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５：４６２−４６６等を参照）。さらに、不活性遺伝子配列をｃＤＮＡのコードする領域または他の標的領域に挿入する相同組換え方法を使用して内在性遺伝子発現を不活性化することができる（Ｔｈｏｍａｓ ら （１９８７） Ｃｅｌｌ ５１： ５０３−５１２等を参照）。
【００６４】
欠損したタンパク質を発現するため、または機能しないタンパク質と取り替えるために、細胞または組織へとｃＤＮＡを含むベクターを形質転換することは可能である。同様に、ｃＤＮＡの相補体を発現するよう作製されたベクターをタンパク質発現を下方調節するため細胞に形質転換することができる。相補的またはアンチセンス配列は、好適にはＡＴＧから約１０と＋１０の間の位置で転写開始部位由来のオリゴヌクレオチドから成ることも可能である。同様に、三重らせん塩基対の形成方法を用いて阻害が可能となる。三重らせん塩基対形成は、ポリメラーゼ、転写因子、エンハンサーまたは調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力を阻害するので、三重らせん塩基対形成は有用である。三重らせんＤＮＡを用いる最近の治療の進歩については文献に記載がある（Ｇｅｅ らＩｎ：Ｈｕｂｅｒ及びＣａｒｒ （１９９４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ ＮＹ、１６３−１７７ページ当を参照）。
【００６５】
リボザイムは酵素性ＲＮＡ分子であり、本発明のｃＤＮＡから成るｍＲＮＡの切断を触媒するため、また特定のｍＲＮＡのレベルを低下するためにリボザイムを用いることもできる。（Ｒｏｓｓｉ （１９９４） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４： ４６９−４７１等を参照）。リボザイムは、ｍＲＮＡを特異的切断部位で切断することが可能である。またはリボザイムは、標的ｍＲＮＡと共に相補的塩基対を形成する側面に位置する領域により影響を受ける場所でｍＲＮＡを切断することが可能である。リボザイムの作製と生産は当分野で公知であり、Ｍｅｙｅｒｓ （前出）に記載されている。
【００６６】
細胞内の安定性を高め、半減期を長くするためにＲＮＡ分子を修飾することができる。限定するものではないが可能な修飾には、分子の５’末端、３’末端、あるいはその両方においてフランキング配列を追加したり、分子の主鎖内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホジエステルまたは２’ Ｏ−メチルを使用したりすることが含まれる。または内在性エンドヌクレアーゼによって容易には認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミン、及びウリジンにアセチル−、メチル−、チオ−及び同様の修飾をしたものの他、非従来型塩基、例えばイノシン、クエオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ワイブトシン（ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅ）等を含めることができる。
【００６７】
さらに細胞周期疾患を治療する患者に、タンパク質を特異結合するアンタゴニストまたは抗体を投与することも可能である。タンパク質の活性を阻害するために直接、あるいはタンパク質を発現するために薬剤を細胞か組織に送達するために間接的にアンタゴニスト、抗体または断片を使用することができる。薬剤は、以下の群から選択した細胞毒でありうる。限定するものではないが、その群にはアブリン、リシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム、マイトマイシン、ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ、ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ、そして、４０放射性同位元素そして、グルココルチコイドが含まれる。
【００６８】
タンパク質の抗体も、当分野で一般的な方法を用いて製造することが可能である。このような抗体には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリによって作られたフラグメントが含まれる。但し、これらに限定されるものではない。中和抗体（即ち二量体の形成を阻害する抗体）は通常、治療用に好適である。タンパク質に対するモノクローナル抗体は、抗体分子を産生する任意の技術を用いて、培地内の連続した細胞株によって作製し得る。限定するものではないがこのような技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術がある更に、キメラ抗体作製のために発達した技術を使用することができる。（Ｐｏｕｎｄ （１９９８） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｖｏｌ． ８０等を参照）。別法では、一本鎖抗体の産生のための記載された技術を使用できる。タンパク質に対する特異的な結合部位を含むＦａｂも生産することができる。種々のイムノアッセイを用いて所望の特異性を有する抗体を同定することができる。隔離された特異性を有するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体の何れかを用いる競合的な結合、または免疫放射線アッセイのための数々のプロトコルが、当分野では周知である。
【００６９】
更にタンパク質の発現低下、寿命または活性に関連した疾患の治療または予防のために、タンパク質のアゴニストを患者に投与することも可能である。
【００７０】
本発明の更なる実施様態では、すでに記載した任意の治療の適用のために薬剤として許容できる担体と併用して薬剤または滅菌された組成剤の投与に関連する。このような医薬品成分は、タンパク質または抗体、擬態、アゴニスト、アンタゴニスト、またはタンパク質のインヒビターから構成し得る。組成物は単独で、あるいは安定化剤など少なくとも他の一つの薬剤と併用して投与することが可能であり、限定するものではないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水等の滅菌された生体適合性のある担体で投与される。組成物は単独で、あるいは他の薬品、薬剤、ホルモンと併用して患者に投与することが可能である。
【００７１】
本発明に用いられる医薬品成分は、任意の数の経路によって投与することができ、限定するものではないが経路には、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、クモ膜下腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下または直腸がある。   活性成分の他に、これらの医薬品成分は、薬剤として使用できる医薬品へと活性成分の処理を促進する賦形剤と補助剤を含む、薬剤として許容できる担体を含有することが可能である。製剤法と投与法に関する技術上の詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ）の最新版に見出すことができる。
【００７２】
任意の化合物に対して、細胞培養アッセイ或いは、動物モデル、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ等において、先ず治療の有効投与量を推定することができる。動物モデルはまた、濃度範囲及び投与経路を決定するためにも用い得る。このような情報を用いて、次にヒトに対する有益な投与量及び投与経路を決定することができる。
【００７３】
医学的に効果的な薬用量は、症状や容態を回復させる活性処方成分の量に関連する。薬用有効度及び毒性は、細胞培養または動物実験における標準的な薬剤手法によって、例えばＥＤ５０（集団の５０％の医薬的有効量）またはＬＤ５０（集団の５０％の致死量）統計を測定、対比するなどして決定することができる。上記の医薬品組成物はいずれも、限定するわけではないが、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルそして最も好適なヒト等の哺乳動物を含めて治療が必要な全ての対象に適用できる。
【００７４】
（実施例）
本発明が、説明した特定の装置、機械、材料及び方法に限定されるものではないことを理解されたい。特定の実施例が記述されていても、同等な実施例が本発明を実施するために使用されうる。記載した実施例は本発明を説明する目的で用いたものであり、特許請求の範囲にのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【００７５】
１  ｃＤＮＡライブラリ作製
肺の右上葉の悪性腫瘍診断の後に、６８歳の白人男性の肺の部分切除中に採取した癌性肺組織からＬＵＮＧＴＵＴ０９ｃＤＮＡライブラリを構築した。肺の右上葉の病理は、気管と周囲の柔組織にも影響する浸潤塊を形成する侵襲性グレード３扁平上皮癌を示した。患者の病歴には、以前に診断されていた、合併症を併発しないＩＩ型糖尿病、甲状腺障害、鬱病、高脂血症、食道の潰瘍とアテローム性動脈硬化症が含まれる。家族歴には、母親と父親のアルコールの使用、兄弟と祖父母にアテローム性動脈硬化症、母親に悪性脳腫瘍があった。
【００７６】
ＰＯＬＹＴＲＯＮホモジナイザー（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ ＮＹ）を使用して、凍結組織をホモジナイズして、ＴＲＩＺＯＬ試薬（１ ｇ ｔｉｓｓｕｅ／１０ ｍｌ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に溶解する。氷上で短いインキュベートの後に、クロロホルムを加え（１：５ ｖ／ｖ）、溶解物を遠心分離機にかけた。クロロホルム上層を新しい試験管に移し、イソプロパノールで抽出したＲＮＡをＤＥＰＣ処理水で再懸濁し、３７℃で２５分間ＤＮアーゼ処理した。ＲＮＡをｐＨ ４．７の酸性フェノール−クロロホルムで再抽出し、０．３ Ｍの酢酸ナトリウムと２．５倍量のエタノールを用いて沈殿した。ｍＲＮＡをＯＬＩＧＯＴＥＸキット（Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ）で単離して、ｃＤＮＡライブラリの作製のために用いた。
【００７７】
ｍＲＮＡをＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴプラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で推奨されたプロトコルに従って処理した。ｃＤＮＡをＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ （ＡＰＢ）， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）上で分画して、そのうち４００ｂｐを超えるｃＤＮＡはｐＩＮＣＹ プラスミド（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）に連結反応させた。プラスミドは、次にＤＨ５ａ’大腸菌細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換させた。
【００７８】
２  ｃＤＮＡクローンの単離とシークエンシング
プラスミドＤＮＡを細胞から放出して、ＲＥＡＬ ＰＲＥＰ ９６ プラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。推奨されているプロトコルを下記の変更を除いて使用する。１）細菌をカルベニシリン２５ ｍｇ／ｌと０．４％のグリセロールで、殺菌したＴＥＲＲＩＦＩＣ ＢＲＯＴＨ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｊｏｓｅ ＣＡ）１ ｍｌで培養した。２） ウェルを接種後、培養を１９時間インキュベートし、次いで０．３ ｍｌの溶解バッファで溶解した。そして３） イソプロパノール沈殿後、ＤＮＡペレットを０．１ ｍｌの蒸留水で再懸濁した。プロトコルの最終ステップ後に、サンプルを９６−ウェルブロックに移して、４℃で保管した。
【００７９】
ｃＤＮＡをＤＮＡ ＥＮＧＩＮＥ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）と併用してＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００システム（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ）を使用して調製した。ｃＤＮＡをＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７シークエンシングシステム（ＡＢＩ）を用いてＳａｎｇｅｒとＣｏｕｌｓｏｎ（１９７５； Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９４：４４１ｆ）の方法で配列化した。ほとんどの配列は、０．２５ｘ〜１．０ｘの溶液量で標準ＡＢＩプロトコルとキット（ＡＢＩ）を用いて配列化した。別法では、幾つかの配列をＡＰＢの溶液と色素を用いて配列化した。
【００８０】
３  配列の選択、構築、性質決定
同時発現分析に用いられた配列は、ＥＳＴ配列、５’及び３’ ロングリードシークエンス、 全長コード配列から構築した。選択した構築配列を少なくとも３つのｃＤＮＡライブラリで発現した。
【００８１】
構築プロセスは下記の通りである。ＥＳＴ配列クロマトグラムを処理して、検証した。ＰＨＲＥＤ （Ｅｗｉｎｇら （１９９８） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ８：１７５−１８５、Ｅｗｉｎｇ及びＧｒｅｅｎ （１９９８） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ ８：１８６−１９４）を用いて、品質スコアを得た。そして編集した配列をリレーショナル・データベース管理システム（ＲＤＢＭＳ）にロ−ドする。．  配列を積スコア５０でＢＬＡＳＴによりクラスタ化した。２以上の配列のすべてのクラスタは、１つの転写遺伝子を代表するビンを作成した。
【００８２】
ＤＮＡ断片を構築するために一般に入手可能なプログラムであるＰｈｒａｐの修飾を利用して、各ビン内の部分配列の構築を実施した（Ｇｒｅｅｎ， Ｐ． Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）。すべてのコンセンサス配列間の局所ペアワイズアラインメントで、８２％の同一性を示したビンを組み合わせた。
ＮＣＢＩのＧＢｐｒｉとＧｅｎＰｅｐｔ等の公共のデータベースに対し、各ビンでコンセンサス配列をスクリーニングすることによりビンに注釈を付けた。注釈を付ける処理には、ＧｅｎＢａｎｋのＧＢｐｒｉデータベースに対してＦＡＳＴｎスクリーニングすることが関係する。７５％以上の一致率を有するヒット、およびアラインメント長さが１００塩基対以上であるアラインメントは、相同体ヒットとして記録した。ＧｅｎＰｅｐｔに対するＦＡＳＴｘにより残りの注釈を付けていない配列をスクリーニングした。１０−８以下のＥ値を有するこれらのヒットを相同体ヒットとして記録した。
【００８３】
次いで、迅速なアミノ酸と核酸配列の比較及びデータ−ベース検索用プログラムであるＢＬＡＳＴｎとＣｒｏｓｓ−Ｍａｔｃｈ（前出のＧｒｅｅｎ）を使用して配列を連続して再びクラスタ化した。スコアが１５０超である配列とコンセンサス配列間のすべてのＢＬＡＳＴアラインメントに対してｃｒｏｓｓ−ｍａｔｃｈを利用して、再びアラインメントする。コンセンサス配列が少なくとも８２％の同一性を示す局所アラインメントの中で最高のＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎスコアを出したビンに、配列を加えた（Ｓｍｉｔｈ ら（１９９２） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ５：３５−５１）。適合しない配列を新しいビンに移して、構築プロセスを繰り返した。
【００８４】
４  既知の細胞周期遺伝子の説明
細胞周期に関連する疾患プロセスに関与しているとして知られている遺伝子を選択して、ｃＤＮＡを同定した。既知の遺伝子と、機能の簡単な説明を下記に記す。
【外１】
2004521611.tif 000005
【外２】
2004521611.tif 000006
【外３】
2004521611.tif 000007
【外４】
2004521611.tif 000008
【００８５】
５  既知の細胞周期遺伝子の同時発現分析
ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ データベース（Ｄｅｃ９９， Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を使用して、既知の細胞周期遺伝子と強い結合を示す１０のｃＤＮＡを同定した。始めに、０．００００１未満のカットオフｐ値を使用して確率値により、関連性の度合いを測定した。続いて、確率テストを通過する遺伝子が既知の細胞周期遺伝子と強い関連性を確実に有するようにするためにアノテーションと文献検索を実施した。プロセスを繰り返して、３７，０７１の遺伝子からの最初の選択を最終的に本明細書で請求している１０のｃＤＮＡに減らした。下の表１のエントリは、二つの遺伝子の同時発現のためのｐ値の対数の負をとった数（−ｌｏｇ ｐ）である。ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤ ＩＤ番号によりｃＤＮＡを同定して、既知の遺伝子を上記のように略語で同定した。そして行１でも用いられている番号を列１にも割り当てた。各既知の遺伝子間で最高のｐ値を太字でマークした。少なくとも１つの既知の遺伝子と各ｃＤＮＡ間の最高のｐ値を「発明」のセクションで要約した。
【００８６】
【表１】
2004521611.tif 000009
【００８７】
６  ｃＤＮＡクローンの相同性検索と推定タンパク質
配列表のｃＤＮＡまたは推定アミノ酸配列を用いて、ＧｅｎＢａｎｋ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳなどのデータベースに問合せした。ＢＬＡＳＴかＢＬＡＳＴ２（前出のＡｌｔｓｃｈｕｌら；前出のＡｌｔｓｃｈｕｌ） を用いて前もって同定し、またアノテーションが付けられた配列あるいはドメインを含むこれらのデータベースを検索して、アラインメントを作製し、どの配列が厳密に一致するか、または相同的かを決定した。アラインメントを原核（細菌）または真核（動物、カビあるいは植物）生物のシ−クエンシングした。別法として、ＳｍｉｔｈとＳｍｉｔｈ （１９９２， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ５：３５−５１）で説明されているようなアルゴリズムを用いて、一次配列パターンと二次構造ギャップペナルティで処理することが可能であった。この出願で開示されているすべての配列は、少なくとも４９ヌクレオチドの長さを有し、不要な塩基は１．２％に過ぎない（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴよりもＮが記録されている）。
【００８８】
前出のＫａｒｌｉｎで詳説されているように、問合せ配列とデータベース配列の間のＢＬＡＳＴ一致を統計的に評価して、ヌクレオチドに１０−２５、ペプチドに１０１４の閾値を満たす時のみ報告した。下記のように計算して積スコアによって、相同性も評価した。ＢＬＡＳＴのヌクレオチドあるいはアミノ酸の一致率［問い合わせ配列と参照配列間］に％最大限ＢＬＡＳＴスコアを乗じ［問い合わせ配列と参照配列の長さに基づく］、次いで１００で除する。実験室で用いるハイブリダイゼーション法と比較して、厳密な一致の電子ストリンジェンシーを約４０の下限（不要な塩基のために１−２％のエラーがある）から７０の１００％一致まで設定した。
【００８９】
無料で入手可能な配列比較アルゴリズムであるＢＬＡＳＴソフトウエア一式（ＮＣＢＩ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ）には、核酸分子をアラインメントする「ｂｌａｓｔｎ」、核酸分子またはアミノ酸分子を対で直接比較するために用いるＢＬＡＳＴ ２など多種の配列分析プログラムが含まれる。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、ギャップ及びデフォルト設定に設定された他のパラメータと共に用いる。例えば：Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２； Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ：１； Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ：−２； オープンギャップ５ 及びＥｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ：２ ペナルティ； ギャップ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ：５０； Ｅｘｐｅｃｔ：１０； Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ：１１； 及びＦｉｌｔｅｒ：ｏｎ同一性または類似性は配列の全長またはより小さいその部分の長さにより測定する。Ｂｒｅｎｎｅｒ ら （１９９８； Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９５：６０７３−６０７８， 文献は、引用することをもって本明細書の一部とする）は配列同一性によって構造的相同性を同定する能力に関してＢＬＡＳＴを分析した。少なくとも１５０残基の配列アラインメントには信頼できる閾値は３０％の同一性であり、少なくとも７０残基のアラインメントに関しては４０％であることがわかった。
【００９０】
この出願のｃＤＮＡをアセンブルしたコンセンサス配列あるいはＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベースで見つけた鋳型と比較した。ｃＤＮＡ、伸長、全長およびショットガン・シークエンシングプロジェクトの構成エレメント配列をＰＨＲＥＤ分析にかけて、質のスコアを割り当てた。質のスコアが許容できるすべての配列を多様な予備処理にかけ、経路を編集する。そして低品質の３’ 末端、ベクターとリンカー配列、ポリＡテイル、Ａｌｕ 繰返し、ミトコンドリア及びリボゾーム配列、細菌汚染配列を除去する。編集した配列は少なくとも長さが５０ ｂｐであり、ジヌクレオチド反復、Ａｌｕ反復などの情報に乏しい配列と反復エレメントを”Ｎｓ”あるいはマスクしたものに置換した。
【００９１】
編集した配列は、構築処理にかけられ、配列が遺伝子ビンに割り当てられた。各配列は１つのビンにのみ所属でき、各ビンの配列を構築して、鋳型を作製した。ＢＬＡＳＴとＣＲＯＳＳＭＡＴＣＨを用いて、新たにシークエンスした部分を既存のビンに加えた。前記の部分配列をビンに加えるために、１５０以上のＢＬＡＳＴ質スコアと少なくとも８２％の局所同一性のアラインメントを有しなければならない。ＰＨＲＡＰを用いて、各ビンの配列を構築した。ＤＥＥＰ ＰＨＲＡＰを用いて、幾つかの重畳部分配列を有するビンを構築した。部分配列の数と配向に基づいて、各鋳型の配向を決定した。
【００９２】
ビンを互いに比較して、少なくとも８２％の局所類似性を有するビンを結合して、再構築した。９５％以下の局所同一性である鋳型を有するビンを分離した。ＳＴＩＴＣＨＥＲ／ＥＸＯＮ ＭＡＰＰＥＲアルゴリズムによって鋳型を分析にかけ、スプライス変異体、或いはスプライスエキソン、スプライス接合部、組織のタイプや疾患状態全体の選択的スプライシングされた遺伝子の示差発現などの存在の確率を分析した。構築処理を周期的に繰り返した。そしてＢＬＡＳＴを用いてＧｂｐｒｉなどのＧｅｎＢａｎｋデータベースに対して鋳型にアノテーションを付けた。厳密な一致について、２００の塩基対に対して９５％の局所同一性から１００の塩基対に対して１００％の局所同一性を有すると定義した。また相同一致については、Ｅ−ｖａｌｕｅ （または確率値）＜１ ｘ １０−８を有すると定義した。鋳型をＧＥＮＰＥＰＴに対するフレームシフト型ＦＡＳＴｘ にもかけた。相同一致をＥ−ｖａｌｕｅ ＜１ ｘ １０−８を有すると定義した。鋳型分析と構築については１９９９年３月２５日に提出したＵＳＳＮ ０９／２７６，５３４に記載されている。
【００９３】
構築に続いて、鋳型をＢＬＡＳＴ、モチーフその他の機能的分析にかけて、１９９７年３月６日に提出したＵＳＳＮ ０８／８１２，２９０、ＵＳＳＮ ０８／８１１，７５８、１９９７年１０月９日に提出したＵＳＳＮ ０８／９４７，８４５、１９９８年３月４日に提出したＵＳＳＮ ０９／０３４，８０７等に記載されているタンパク質階層に分類した。３つの全フォワードリーディングフレームで各鋳型を翻訳することにより、またＨＭＭＥＲ ソフトウエアパッケ−ジ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ； ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／）を用いて隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を基にした保存されたタンパク質ファミリードメインのＰＦＡＭデータベースに対する各翻訳を検索することにより鋳型を分析した。
【００９４】
ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウエア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）とＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いてｃＤＮＡを更に分析した。そして公共のデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋのげっ歯類、哺乳動物、脊椎動物、原核生物、真核生物のデータベースと、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＰＦＡＭそしてＰｒｏｓｉｔｅに問い合わせた。
【００９５】
７  染色体マッピング
スタンフォード・ヒトゲノムセンター（ＳＨＧＣ）、ホワイトヘッド・ゲノム研究所（ＷＩＧＲ）、Ｇｅｎｅｔｈｏｎ等の公的な情報源から入手可能な放射線ハイブリッド及び遺伝地図データを用いて、配列表に存在するｃＤＮＡが前もってマッピングされたかを測定した。マッピングされた腫瘍抗原をコードするｃＤＮＡの断片は、すべての関連する調節配列とコード配列を同じ位置に割り当てる。遺伝地図上の位置は、ヒト染色体の範囲または間隔として表される。ｃＭ間隔の地図上の位置は、染色体のｐアームの末端に関連して測定する（ヒト中のＤＮＡの１メガベース（Ｍｂ）にほぼ等しい）。
【００９６】
８  ハイブリダイゼーション技術と分析
基質上でのｃＤＮＡの固定
下記の方法の１つによってｃＤＮＡを基質に適用する。ゲル電気泳動法によりｃＤＮＡの混合を分画し、キャピラリー転移によりナイロン膜に転移する。別法として、ｃＤＮＡを個々にベクターに連結反応させ、細菌性宿主細胞に挿入してライブラリを形成する。次に下記の方法の１つによってｃＤＮＡを基質に配置する。最初の方法では、個々のコロニーを含む細菌細胞をロボット利用して切りとり、ナイロン膜に配置する。膜を選択培地（用いられたベクターに依存してカルベニシリン、カナマイシン、アンピシリンまたはクロラムフェニコール）を含むＬＢ寒天に置き、３７℃で１６時間インキュベートする。寒天から膜を取り除き、コロニーを上側にして、１０％ ＳＤＳ、変性溶液（１．５ Ｍ ＮａＣｌ， ０．５ Ｍ ＮａＯＨ ）、中和溶液（１．５ Ｍ ＮａＣｌ， １ Ｍ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．０）、２ｘＳＳＣ（２回）に各１０分、連続的に膜を移す。次に膜をＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶ架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でＵＶ 照射する。
【００９７】
２番目の方法では、インサートに隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いて、ｃＤＮＡを３０サイクルのＰＣＲで細菌ベクターから増幅する。ＰＣＲ増幅で１〜２ｎｇの初期量の核酸から５μｇより大きい最終量まで増大する。ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００ ビーズ（ＡＰＢ）を用いて長さが４００ ｂｐから約５０００ ｂｐまで増幅した核酸を精製する。手であるいはドット／スロットブロット法マニホールドと吸気装置を用いて精製核酸をナイロン膜に置く。そして上述した変性、中和、ＵＶ照射により固定する。ＵＳＰＮ ５，８０７，５２２に記載されている方法を用いて、精製した核酸を、ロボットで配置して、ポリマーコートされたスライドグラス上に固定する。顕微鏡スライドグラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）を良く洗って０．１％のＳＤＳ中で超音波をかけ、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）中でエッチングし、９５％エタノール中で０．０５％アミノプロピルシラン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いてコーティングする、そして１１０℃のオブンで硬化させることにより、ポリマーコートされたスライドグラスを準備する。スライドグラスを処理中と後で蒸留水中で広範囲にわたって洗浄する。核酸をスライドグラス上に置き、次にＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶ架橋剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてアレイをＵＶ照射に暴露することにより固定する。アレイを室温において０．２％ＳＤＳで洗浄し、蒸留水で３度洗浄する。リン酸緩衝生理食塩水 （ＰＢＳ）（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｉｎｃ．， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）中の０．２％カゼイン中において６０℃で３０分間アレイをインキュベートした後、０．２％ＳＤＳ及び蒸留水で洗浄することにより、非特異結合部位をブロックする。
【００９８】
膜ハイブリダイゼーションのプローブ調製
配列表のｃＤＮＡに由来するハイブリダイゼーションのプローブを使用して、膜系ハイブリダイゼーションでｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡをスクリーニングする。ｃＤＮＡを４５ μｌ ＴＥ バッファーの濃度４０−５０ ｎｇに希釈し、５分間１００℃に加熱して変性させ、短時間遠心分離して、プローブを調製する。次に変性したｃＤＮＡをＲＥＤＩＰＲＩＭＥ 試験管（ＡＰＢ）を加え、青色が均一に分布するまで軽く混合して、次に短時間遠心分離した。５μｌの［３２Ｐ］ｄＣＴＰをその試験管に加え、内容物を３７℃で１０分インキュベートする。５ μｌ の０．２Ｍ ＥＤＴＡを加えて標識化反応を停止する。そしてＰＲＯＢＥＱＵＡＮＴ Ｇ−５０ ｍｉｃｒｏｃｏｌｕｍｎ （ＡＰＢ）を用いてプローブを組み込まれていないヌクレオチドから精製する。精製したプローブを５分間１００℃に加熱する、そして２分間氷上で急速に冷却して、記載した膜系ハイブリダイゼーションで使用する。
【００９９】
ポリマーコートされたスライドハイブリダイゼーションのプローブ調製
サンプルから分離したｍＲＮＡに由来するハイブリダイゼーションのプローブを使用して、アレイベースのハイブリダイゼーションで配列表のｃＤＮＡをスクリーニングする。９ μｌ ＴＥ バッファーで濃度２００ ｎｇにｍＲＮＡを希釈し、５ μｌ ５ｘ バッファー、１μｌ ０．１ Ｍ ＤＴＴ、３ μｌ Ｃｙ３またはＣｙ５標識化混合液、１ μｌ ＲＮアーゼ阻害因子、１ μｌ 逆転写酵素、５ μｌ １ｘ 酵母調節ｍＲＮＡを加え、ＧＥＭｂｒｉｇｈｔキット（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いてプローブを調製する。非コード酵母ゲノムＤＮＡからｉｎ ｖｉｔｒｏ 転写により酵母調節ｍＲＮＡを合成する（Ｗ． Ｌｅｉ， 未発表）。定量用対照として、サンプルｍＲＮＡに０．００２ ｎｇ、０．０２ ｎｇ、０．２ ｎｇ、２ ｎｇでの対照ｍＲＮＡの１つの設定をそれぞれ１：１００，０００、１：１０，０００、１：１０００、１：１００ （ｗ／ｗ）の比で逆転写反応混合液に希釈する。ｍＲＮＡ示差発現パターンを調べるために、対照ｍＲＮＡの２番目の設定を１：３， ３：１， １：１０， １０：１， １：２５， ａｎｄ ２５：１ （ｗ／ｗ）の比で逆転写反応混合液に希釈する。反応混合液を混合して、３７℃で２時間インキュベートする。次に反応混合液を２０分間、８５℃でインキュベートする。そして２つの連続するＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ＋ＴＥ ３０ カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を利用してプローブを精製する。精製したプローブは、プローブをＤＥＰＣ処理水の９０ μｌ に希釈させ、２ μｌ １ｍｇ／ｍｌ グリコーゲン、６０ μｌ ５ Ｍ 酢酸ナトリウム、３００ μｌ １００％ エタノールを加えて、エタノールで析出させた。プローブを２０分間、２０，８００ｘｇで遠心分離する。そしてペレットを１２ μｌの再懸濁バッファーで再懸濁し、５分間６５℃に加熱してから、十分に混合する。プローブを加熱して、以前のように混合して、氷上に保管する。以下に詳述するように、プローブを高密度アレイベースのハイブリダイゼーションにおいて使用する。
【０１００】
膜系ハイブリダイゼーション
１％ Ｓａｒｋｏｓｙｌと１ｘ 高リン酸バッファ（０．５ Ｍ ＮａＣｌ， ０．１ Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４， ５ ｍＭ ＥＤＴＡ， ｐＨ ７）を含むハイブリダイゼーション溶液で、５５℃で２時間、膜を前もってハイブリダイズする。１５ ｍｌの新鮮なハイブリダイゼーション溶液中で希釈されたプローブを次に膜に加える。膜をプローブと共に５５℃で、１６時間、ハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、１ｍＭ Ｔｒｉｓ （ｐＨ ８．０）， １％ Ｓａｒｋｏｓｙｌで１５分間、２５℃で膜を洗浄し、さらに１ｍＭ Ｔｒｉｓ （ｐＨ ８．０）で、各回１５分間、２５℃で４回洗浄する。ハイブリダイゼーション化合物を検出するために、ＸＯＭＡＴ−ＡＲフィルム （Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）を膜に一晩７０℃で暴露する。そして現像してから、視覚で確認する。
【０１０１】
ポリマーコートされたスライドハイブリダイゼーション
プローブを５分間６５℃に加熱してから、５４１５Ｃマイクロ遠心分離で５分間、９４００ ｒｐｍで遠心分離する（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ ＮＹ）。そして１８ μｌ のアリクォットをアレイ表面に置き、カバーガラスで覆う。アレイは、顕微鏡用スライドより僅かに大きい空洞を有する防水チェンバーに移す。チェンバーのコーナーに１４０μｌの５×ＳＳＣを加えることにより、チェンバー内部を湿度１００％に保持する。このアレイを含むチャンバーを、６０℃で約６．５時間インキュベートする。アッセイを１ｘＳＳＣ， ０．１％ ＳＤＳ中で、４５℃で、１０分間洗浄し、次に０．１ｘＳＳＣで、４５℃で、１０分間の洗浄を３回繰り返した後に、乾燥させた。
【０１０２】
ハイブリダイゼーション反応を絶対的または示差ハイブリダイゼーションフォーマットで実施する。絶対ハイブリダイゼーションフォーマットでは、１つのサンプルのプローブをアレイエレメントにハイブリダイズし、ハイブリダイゼーション複合体形成後のシグナルを検出する。シグナル強度は、サンプル中のプローブｍＲＮＡレベルと相関する。示差ハイブリダイゼーションフォーマットで、２つの生物サンプルでの遺伝子のセットの示差発現を分析する。２つのサンプルのプローブを調製して、異なる標識成分で標識化する。２つの標識されたプローブの混合液をアレイエレメントにハイブリダイズし、２つの異なる標識からの発光を個々に検出可能な条件下で２つの異なるシグナルを調べる。両方の生物サンプルから由来した同数のプローブにハイブリダイズするアレイ上のエレメントは、特有の結合した蛍光を出す（Ｓｈａｌｏｎ ＷＯ９５／３５５０５）。
【０１０３】
ハイブリダイゼーション複合体は、Ｃｙ３の励起のためには４８８ｎｍ、Ｃｙ５の励起のためには６３２ｎｍでスペクトル線を発生し得るＩＮＮＯＶＡ７０混合ガス１０ Ｗレーザ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）を備えた顕微鏡で検出する。２０×顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いて、アレイ上に励起レーザ光の焦点を当てる。アレイを含むスライドを顕微鏡のコンピュータ制御のＸ−Ｙステージに置き、２０μｍの解像度で対物レンズを通過してラスタースキャンする。示差ハイブリダイゼーションフォーマットで、レーザにより２つの蛍光色素を同時に励起する。発光された光は、波長に基づき分離され、２つの蛍光色素に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に送られる。アレイと光電子増倍管間に設置された好適なフィルターを用いて、シグナルをフィルターする。用いる蛍光色素の最大発光の波長は、Ｃｙ３では５６５ｎｍ、Ｃｙ５では６５０ｎｍである。プローブ混合液に加えた酵母対照ｍＲＮＡによって生み出されるシグナル強度を用いてスキャンの感度を較正する。アレイ上の特定の位置には相補的ＤＮＡ配列を含め、その位置におけるシグナルの強度がハイブリダイズする種の重量比１：１００，０００に相関するようにする。
【０１０４】
光電子増倍管の出力は、ＩＢＭコンパチブルＰＣコンピュータにインストールされた１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈアナログ−ディジタル（Ａ／Ｄ）変換ボード（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）を用いてディジタル化される。ディジタル化されたデータは、青色（低シグナル）から赤色（高シグナル）までの擬似カラー範囲へのリニア２０色変換を用いてシグナル強度がマッピングされたようなイメージとして表示される。データは、定量的にも分析される。２つの異なる蛍光色素を同時に励起及び測定する場合には、各蛍光色素の発光スペクトルを用いて、データは先ず蛍光色素間の光学的クロストーク（発光スペクトルの重なりに起因する）を補正する。グリッドが蛍光シグナルイメージ上に重ねられ、それによって各スポットからのシグナルはグリッドの各エレメントに集められる。各エレメント内の蛍光シグナルは統合され、シグナルの平均強度に応じた数値が得られる。シグナル分析に用いるソフトウェアは、ＧＥＭＴＯＯＬＳプログラム（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）である。
【０１０５】
９  相補的分子
ｃＤＮＡに相補的な分子、約５ （ＰＮＡ）から５０００ ｂｐ （ｃＤＮＡインサートの相補体）を用いて、遺伝子発現を検出あるいは阻害する。ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて、これらの分子を選択する。検出については、実施例７に記載されている。プロモーターが結合するのを妨げることにより転写を阻害するため、相補的分子を最も固有な５’ 配列に結合し、オープンリーディングフレームの開始コドンの５’ ＵＴＲ上流のヌクレオチドを含むよう設計する。相補的分子はゲノム配列（エンハンサーまたはイントロン等）を含み、ポリメラーゼ、転写因子または調節分子の結合のために十分に開くような二重らせんの能力に影響を及ぼす「三重らせん」塩基対の形成に用いられる。翻訳を阻害するためには、相補的分子を設計して、リボソームがタンパク質をコードするｍＲＮＡに結合するのを阻害する。
【０１０６】
相補的分子を発現ベクターに置いて、一過性或いは短期治療向けに効果を試験するために細胞株を器官、腫瘍、滑腔また脈管系に用い、あるいは長期或いは安定した遺伝子治療向けに幹細胞、酵素または他の再生系統に形質転換するために用いる。非複製ベクターで一過性発現は１ヶ月以上続く、また形質転換／発現系でベクター複製を誘導する適切なエレメントが用いられる場合は３ヶ月以上続く。
相補的分子をコードするベクターを有する適切な分裂する細胞の安定的な形質転換によって、遺伝形質転換した細胞株、組織または生命体を産生する（ＵＳＰＮ ４，７３６，８６６）。安定した組込みを可能にする十分な量のベクターを同化、複製する細胞もタンパク質をコードするｃＤＮＡの活性に影響を及ぼすか完全に除くための十分な相補的分子を生成する。
【０１０７】
１０  タンパク質発現
細胞発現系か昆虫細胞発現系のどちらかを用いて、タンパク質の発現と精製を達成する。ｐＵＢ６／Ｖ５−Ｈｉｓ ベクター系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を用いて、ＣＨＯ細胞の腫瘍抗原を発現する。ベクターは選択可能ｂｓｄ遺伝子、多数のクローニング部位、ヒトユビキチン Ｃ遺伝子のプロモーター／エンハンサー配列、抗−Ｖ５抗体での抗体検出のためのＣ−末端Ｖ５エピトープ、ＰＲＯＢＯＮＤ 樹脂（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上での急速な精製のためのＣ−末端ポリヒスジン（６ｘＨｉｓ）配列を含む。形質移入した細胞を選択してブラストサイジンを含む培地に移す。
【０１０８】
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ９）昆虫細胞を組換えＡｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）で感染させる。相同組換えによって多角体遺伝子をｃＤＮＡと置換する。多角体プロモーターによりｃＤＮＡの転写が行われる。上述の精製を可能にする６ｘｈｉｓで、融合タンパク質としてタンパク質を合成する。精製したタンパク質を次の活性で用いて、抗体を作製する。
【０１０９】
１１  抗体の産生
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて腫瘍抗原を精製して、マウスやウサギを免疫化するために使用する。下記のプロトコルを用いて抗体を産生する。或いは、レーザＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて腫瘍抗原のアミノ酸配列を解析し、免疫原性の高い領域を決定する。通常Ｃ−末端付近或いは隣接する親水性領域内で見られる抗原性エピトープを選択して、合成し、抗体を生成するために用いられる。 通常は、長さ約１５残基のエピトープを、Ｆｍｏｃケミストリを用いるＡＢＩ ４３１Ａ ペプチドシンセサイザ（ＡＢＩ）を用いて生成し、Ｎ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いた反応によってＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）に結合させて、免疫原性を高める。
【０１１０】
完全フロイントアジュバントにおいてエピトープ−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫化する。不完全フロイントアジュバントにおいて免疫化を間隔を置いて反復する。マウスには最低７週間、ウサギには最低１２週間後、抗血清を抽出して、抗ペプチド活性のために検査した。検査には、ペプチドをプラスチックに結合すること、１％のウシ血清アルブミンでブロックすること、ウサギ抗血清と反応させて洗浄すること、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させることが関係する。当分野で公知の方法を用いて、抗体価と形成複合体の量を決定する。
【０１１１】
１２  特異的抗体を用いる天然タンパク質の精製
タンパク質を特異結合する抗体を用いて、イムノアフィニティークロマトグラフィにより天然あるいは組換えタンパク質を精製する。イムノアフィニティーカラムは、ＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ樹脂（ＡＰＢ）に抗体を共有結合させることにより形成する。タンパク質を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、タンパク質を優先的に吸着する条件下（例えば洗浄剤が存在する高イオン強度緩衝液）でカラムを洗浄する。結合後、そのタンパク質を、抗体とタンパク質との結合を切るために、例えば、ｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンを用いてカラムから溶出させ、タンパク質を回収する。
【０１１２】
１３  ｃＤＮＡまたはタンパク質と特異結合するためのスクリーニング分子
ｃＤＮＡまたはその断片、タンパク質またはその部分を３２Ｐ−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰまたはＣｙ５−ｄＣＴＰ （ＡＰＢ）あるいはＢＩＯＤＩＰＹかＦＩＴＣ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）で標識化する。前もって基質上に配置した候補分子または複合体のライブラリを標識したｃＤＮＡまたはタンパク質の存在下でインキュベートする。核酸配列かアミノ酸配列のための条件下でインキュベート後、基質を洗浄し、標識を保持する基質上の、特異結合か複合体成形を示す任意の位置がアッセイし、リガンドを同定する。異なる濃度の核酸またはタンパク質を用いて得られたデ−タを使用して、標識された核酸かタンパク質と結合した分子の間の親和性を計算する。
【０１１３】
１４  ２つのハイブリッドスクリーン
酵母２ハイブリッドシステム、ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ ＬｅｘＡ ２ハイブリッドシステム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）を使用して、本発明のタンパク質を結合するペプチドをスクリーニングする。タンパク質をコードするｃＤＮＡをｐＬｅｘＡベクター、リガンドの多数のクローニング部位に挿入して、大腸菌に形質転換する。ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡをｐＢ４２ＡＤベクターの多数のクローニング部位に挿入して、ライゲーションし、ｃＤＮＡライブラリを作製するために大腸菌に形質転換する。ｐＬｅｘＡプラスミドとｐＢ４２ＡＤ−ｃＤＮＡライブラリ作製を大腸菌から単離し、ポリエチレングリコール／リチウムアセテートプロトコルを用いて形質転換受容性をもつ酵母ＥＧＹ４８［ｐ８ｏｐ−ｌａｃＺ］細胞に同時形質転換するために比率２：１で使用する。形質転換した酵母細菌を、ヒスチジン（−Ｈｉｓ）、トリプトファン（−Ｔｒｐ）、ウラシル（−Ｕｒａ）を含まない合成ドロップアウト（ＳＤ）培地で培養する、そしてコロニ−が成長して数えられるまで、３０℃でインキュベートする。コロニ−を最小限の容積の１ｘ ＴＥ （ｐＨ ７．５）で集め、２％ ガラクトース（Ｇａｌ）， １％ ラフィノース（Ｒａｆ）、８０ ｍｇ／ｍｌ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル β−ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）で補われるＳＤ／−Ｈｉｓ／−Ｌｅｕ／−Ｔｒｐ／−Ｕｒａ 培地で再培養する。次いで青色コロニ−の成長を検査する。発現したタンパク質とｃＤＮＡ融合タンパク質間の相互作用により、ＥＧＹ４８のＬＥＵ２レポーター遺伝子を活性化し、ロイシン（−Ｌｅｕ）を含まない培地でコロニ−成長を起こす。相互作用はまた、Ｘ−Ｇａｌで成長するコロニ−に青色を産生するｐ８ｏｐ−ｌａｃＺレポーター作成物からのβ−ガラクトシダーゼの発現を活性化する。
【０１１４】
発現したタンパク質とｃＤＮＡ融合タンパク質間の陽性の相互作用が、個々の陽性コロニ−を単離して、３０℃で１から２日間、ＳＤ／−Ｔｒｐ／−Ｕｒａ 液体で成育することにより確認できる。培地のサンプルをＳＤ／−Ｔｒｐ／−Ｕｒａ培地で培養し、コロニ−が出現するまで３０℃でインキュベートする。サンプルをＳＤ／−Ｔｒｐ／−ＵｒａとＳＤ／−Ｈｉｓ／−Ｔｒｐ／−Ｕｒａ プレートで複製培養する。ヒスチジンを含まない培地では成育せず、ヒスチジンを含むＳＤで成育するコロニーは、ｐＬｅｘＡプラスミドを失っている。ヒスチジンを必要とするコロニーをＳＤ／Ｇａｌ／Ｒａｆ／Ｘ−Ｇａｌ／−Ｔｒｐ／−Ｕｒで成育する。そして白色コロニーを単離して、増殖する。タンパク質と物理的に相互作用するタンパク質をコードするｃＤＮＡｐＢ４２ＡＤ−ｃＤＮＡプラスミドを酵母細胞から単離して、特徴付ける。
【０１１５】
１５  転写イメージング
ＬＩＦＥＳＥＱ ＧＯＬＤデータベース（Ｊｕｎ０１ｒｅｌｅａｓｅ， Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて転写イメージを実施した。このプロセスにより、１４００を超えるｃＤＮＡライブラリで発現したｃＤＮＡの相対存在量の評価が可能となる。転写イメージングの基準をカテゴリー、ライブラリ毎のｃＤＮＡの数、ライブラリ説明、疾患の兆候、サンプルの臨床の関連性等から選択することが可能である。
【０１１６】
ＬＩＦＥＳＥＱデータベースのすべての配列とｃＤＮＡライブラリを体系、器官／組織、細胞のタイプにより分類した。各カテゴリーでは、配列が発現したライブラリの数を数えて、そのカテゴリー内のライブラリの総数を示した。ある転写イメージでは、すべての規準化またはサブトラクションしたライブラリ（プロセシングの前に多数のコピー配列が除かれている）、およびすべての混合またはプールした組織（２以上の組織の種類または２以上の被験者の組織を含有する点でと非特異的であると考慮される）を分析から排除した。臨床の関連性性が強調される場合、処理または非処理細胞株と／あるいは胎児組織デ−タも無視または除去することができる。逆に分析から臨床サンプルを除去することにより、遺伝疾患または幹細胞からの特定の細胞あるいは器官（神経、心臓または腎臓）の分化の解明が促進される場合は胎児組織を強調することもできる。
【０１１７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、５、１０の転写イメージを下記に示す。列１はライブラリの名、列２はライブラリで配列化したｃＤＮＡの数、列３はライブラリの説明、列４はライブラリの転写の絶対存在量、列５はライブラリの転写の存在量％を示す。
【外５】
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【０１１８】
腹膜の神経内分泌腺癌のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の示差発現は、消化管の他のすべての組織の発現よりも存在量％が３倍高い。細胞学的に正常な組織では、発現は見られなかった。細胞または組織に特異な診断手順で用いられ、確立した標準と比較する場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は癌、特に腹膜の神経内分泌癌の診断に有用である。
【外６】
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【０１１９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５は、乳房腫瘍系統Ｔ−４７Ｄと癌性と正常な乳房組織の一致するセットの発現で示されるように乳癌を診断するのに有用である。乳房容量減少手術中に患者から切除した細胞学的に正常な乳房組織、または他のいかなる乳房ライブラリにも発現は見られなかった。乳房組織に関して使用する場合には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は乳癌の診断に有用である。
【外７】
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【０１２０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の示差発現は、潰瘍性大腸炎（ＣＯＬＡＤＩＴ０５、ＣＯＬＡＮＯＴ０２、ＣＯＬＡＵＣＴ０１、ＣＯＬＤＤＩＥ０１）、良性家族性ポリープ症（ＣＯＬＣＤＩＴ０１、ＣＯＬＤＮＯＴ０１、ＣＯＬＴＤＩＴ０４ ）、潰瘍性大腸炎（ＣＯＬＮＤＩＰ０２、ＣＯＬＮＮＯＴ２３、ＣＯＬＮＵＣＴ０３、ＣＯＬＳＵＣＴ０１）または細胞学的に正常な組織（ＣＯＬＮＮＯＮ０５、ＣＯＬＮＮＯＰ０１、ＣＯＬＮＮＯＰ０２、ＣＯＬＮＮＯＴ０１、ＣＯＬＮＮＯＴ０５、ＣＯＬＮＮＯＴ０７、ＣＯＬＮＮＯＴ０８、ＣＯＬＮＮＯＴ０９、ＣＯＬＮＮＯＴ１１、ＣＯＬＮＮＯＴ１３、ＣＯＬＮＮＯＴ１６、ＣＯＬＮＮＯＴ１９、ＣＯＬＮＮＯＴ２２）と診断された患者の組織から作製したライブラリに見られなかった。細胞または組織に特異な診断手順で用いられ、確立した標準と比較する場合、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は結腸癌の診断に有用である。確立した標準と患者サンプルを使用するアッセイでは、このタンパク質に特異的に結合するｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質または抗体は、細胞周期疾患のための臨床的に意義のある診断マ−カ−として役立つ。
【０１２１】
本明細書において記載した全ての特許出願、刊行物は、言及することをもって本明細書の一部とする。当業者は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変を行い得る。本発明について説明するにあたり特定の好適実施例に関連して説明を行ったが、本発明の範囲が、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連分野の専門家には明らかな、本明細書に記載されている本発明の実施方法の様々な改変は、特許請求の範囲内にあるものとする。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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