(57)【要約】本発明は、ステロイド核内転写制御を介さない作用機構およびそのステロイド核内転写制御を介する効果との関連との理解における基本的発見に関する。（ｉ）核内転写制御を介さない効果および核内転写制御を介する効果を同一のステロイド受容体によって媒介することができること；（ｉｉ）両効果がリガンドに誘導されること；（ｉｉｉ）迅速且つ緩やかに適合することができるリガンド結合ドメインのリガンド誘導性活性化によって核内転写制御を介さない効果が発揮されること、（ｉｖ）典型的にはより遅く且つ強力な相互作用の結果であるステロイド受容体のＤＮＡ結合ドメインのリガンド誘導性活性化によって核内転写制御を介する効果が発揮されること；（ｖ）リガンド相互作用の核内転写制御を介さない効果が、選択的応答に影響を与えるような様式でリガンド相互作用の核内転写制御を介する効果に関連し得ることことを発見した。本発明はまた、一定のステロイドが無関係のステロイド受容体への結合を介して核内転写制御を介さない効果を誘導することができることを初めて記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体を実質的に核内転写制御を介する効果を誘導することなく非核内制御媒介効果を誘導する化合物と接触させる工程を含み、前記受容体が、プロゲステロン受容体、糖質コルチコイド受容体、電解質コルチコイド受容体、レチノイン酸受容体、ビタミンＤ受容体、ＰＰＡＲ受容体、プレグナンＸ受容体、胆汁酸受容体、甲状腺受容体、ファルネソイドＸ受容体、肝臓Ｘ受容体、エクジソン受容体、およびＣＯＵＰ−ＴＦ受容体からなる群から選択される、受容体の選択効果を誘導する化合物の使用。
【請求項２】
前記核内転写制御を介さない効果は、前記化合物と前記受容体のリガンド結合ドメインとの相互作用によって起こる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記核内転写制御を介さない効果が、エストロゲン受容体のリガンド結合ドメインと機能が等価の受容体領域の化合物による活性化によって起こる、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
核内転写制御を介する効果が前記受容体のＤＮＡ結合ドメインによって媒介される、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
受容体を実質的に核内転写制御を介さない効果を誘導せずに核内転写制御を介する効果を誘導する化合物と接触させる工程を含む、受容体の選択効果を誘導する化合物の使用。
【請求項６】
前記受容体が、プロゲステロン受容体、糖質コルチコイド受容体、電解質コルチコイド受容体、レチノイン酸受容体、ビタミンＤ受容体、ＰＰＡＲ受容体、プレグナンＸ受容体、胆汁酸受容体、甲状腺受容体、ファルネソイドＸ受容体、肝臓Ｘ受容体、エクジソン受容体、およびＣＯＵＰ−ＴＦ受容体からなる群から選択される、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記核内転写制御を介する効果がタンパク質合成である、請求項５に記載の使用。
【請求項８】
化合物の実質的にステロイド受容体のＤＮＡ結合ドメインを活性化することなくステロイド受容体のリガンド結合ドメインによって媒介される経路を活性化する能力またはステロイド受容体のリガンド結合ドメインによって媒介される機能を実質的に活性化することなくステロイド受容体のＤＮＡ結合ドメインを活性化する能力を評価する工程と、その後、
試験化合物の生物活性を測定して、実質的に核内転写制御を介する効果を誘導することなく標的核内転写制御を介さない効果を誘導する能力または実質的に核内転写制御を介さない効果を誘導することなく標的核内転写制御を介する効果を誘導する能力を評価する工程とを含む、ステロイド受容体の選択的核内転写制御を介さない効果を誘導する化合物のスクリーニング法。
【請求項９】
前記ステロイド受容体がエストロゲン受容体でもプロゲステロン受容体でもない、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ステロイド受容体が、プロゲステロン受容体、糖質コルチコイド受容体、電解質コルチコイド受容体、レチノイン酸受容体、ビタミンＤ受容体、ＰＰＡＲ受容体、プレグナンＸ受容体、胆汁酸受容体、甲状腺受容体、ファルネソイドＸ受容体、肝臓Ｘ受容体、エクジソン受容体、およびＣＯＵＰ−ＴＦ受容体からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
エストロゲン受容体を、実質的に核内転写制御を介する効果を誘導することなく細胞外調節キナーゼの活性によって媒介される効果以外の核内転写制御を介さない効果を誘導する化合物と接触させる工程を含む、エストロゲン受容体の選択効果を誘導する化合物の使用。
【請求項１２】
エストロゲン受容体を、実質的に核内転写制御を介する効果を誘導することなく骨喪失治療または骨量増加治療以外の治療について核内転写制御を介さない効果を誘導する化合物と接触させる工程を含む、エストロゲン受容体の選択効果を誘導する化合物の使用。
【請求項１３】
アンドロゲン受容体を、実質的に核内転写制御を介する効果を誘導することなく細胞外調節キナーゼの活性化によって媒介される効果以外の核内転写制御を介さない効果を誘導する化合物と接触させる工程を含む、アンドロゲン受容体の選択効果を誘導する化合物の使用。
【請求項１４】
アンドロゲン受容体を、実質的に核内転写制御を介する効果を誘導することなく骨喪失治療もしくは骨量増加治療またはエストロゲン関連癌もしくは子宮内膜症治療以外の治療について核内転写制御を介さない効果を誘導する化合物と接触させる工程を含む、アンドロゲン受容体の選択効果を誘導する化合物の使用。
【請求項１５】
ステロイド受容体に結合して所望の核内転写制御を介さない効果を誘導する一方でステロイド誘導性核内転写制御を介する効果を誘導しないシクロペンタノペルヒドロフェナントレン核を含むエストロゲンまたはアンドロゲン以外の化合物を投与する工程を含む、ステロイド受容体の核内転写制御を介さない効果を誘導する化合物の使用。
【請求項１６】
ステロイド受容体を試験化合物と接触させる工程と、
試験化合物が受容体の核内転写制御を介さない効果を活性化させるかどうかを同定する工程と、
前記受容体−試験化合物複合体の転写活性レベルを同定する工程と、
前記受容体の核内転写制御を介さない活性を活性化し、且つ１０％未満の内因性ステロイド受容体リガンドの受容体の転写活性を誘導する化合物を選択する工程とを含む、選択的ステロイド反応を誘導する化合物を選択するための化合物のスクリーニング法。
【請求項１７】
前記核内転写制御を介さない活性がアポトーシスを予防する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記核内転写制御を介さない活性がシグナル伝達経路である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記核内転写制御を介さない活性がセカンド・メッセンジャー系である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記シグナル伝達経路がタンパク質キナーゼシグナル伝達経路である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク質キナーゼシグナル伝達経路がＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路がＳｒｃ／Ｓｈｃ／細胞外調節キナーゼシグナル伝達経路である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
組織培養細胞株を細胞が適切なコンフルエンスに達するまで増殖させる工程と、
前記組織培養物を特異的受容体の発現プラスミドおよび前記選択受容体に反応性を示す標的遺伝子のための発現プラスミドでトランスフェクトする工程と、
前記トランスフェクト細胞を試験化合物と接触させる工程と、
前記化合物が実質的に核内転写制御を介する効果を誘導することなく核内転写制御を介さない効果を誘導するかを同定する工程とを含む、化合物の評価法。
【請求項２４】
前記受容体がエストロゲン受容体でもプロゲステロン受容体でもない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的遺伝子が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ペプチドホルモン、成長因子、およびキメラタンパク質からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的遺伝子の転写レベルを、熱量測定法、蛍光法；免疫化学的方法；化学的方法、または放射化学的方法からなる群から選択される方法を使用して同定する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
天然または人工ステロイド受容体を発現する細胞を試験化合物と接触させる工程と、
試験化合物がステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を活性化させるかどうかを評価する工程と、
前記試験化合物によって誘導された転写レベルを同定する工程と、
実質的に前記ステロイド受容体の核内転写制御を介する活性を活性化することなく前記ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を活性化させる化合物を選択する工程とを含む、ステロイド受容体関連疾患または障害の治療用化合物のスクリーニング法。
【請求項２８】
天然または人工性ステロイド受容体を発現する細胞を試験化合物のみまたはプロアポトーシス薬との組み合わせと接触させる工程と、
試験化合物が前記ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を活性化させるかどうかを評価する工程と、
前記試験化合物によって誘導された転写レベルを同定する工程と、
前記試験化合物が試験化合物のみまたはプロアポトーシス薬との組み合わせと接触させた細胞中でアポトーシスを阻害するかを同定する工程と、
実質的に前記ステロイド受容体の核内転写制御を介する活性を活性化することなく前記ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を活性化させる化合物を選択する工程とを含む、ステロイド受容体関連疾患または障害の治療用化合物のスクリーニング法。
【請求項２９】
天然または人工ステロイド受容体を発現する細胞を試験化合物と接触させる工程と、
前記試験化合物と接触した細胞の細胞外調節キナーゼ活性化量を同定する工程と、
試験化合物と接触した細胞の転写量を同定する工程と、
細胞外調節キナーゼ活性化を示し、且つアンドロゲンまたはエストロゲンと接触した細胞の転写レベルと比較して最小の転写レベルを示す前記試験化合物と接触した細胞を選択する工程とを含む、ステロイド受容体の核内転写制御を介する活性を調整することなくステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を調整する化合物のスクリーニング法。
【請求項３０】
細胞を少なくとも１つの試験化合物に接触させる工程であって、前記細胞が、
（ａ）ステロイド受容体タンパク質、その機能操作形態もしくは改変形態を発現する非内因性ＤＮＡと、
（ｂ）第１のレポーター遺伝子に連結した有効なホルモン応答エレメントをコードするＤＮＡと、
（ｃ）シグナル伝達経路反応性転写調節単位に作動可能に連結された第２のレポーター遺伝子をコードし、それにより前記第２のレポーター遺伝子がシグナル伝達経路に反応して活性化され、前記第２のレポーター遺伝子の転写がステロイドホルモンによって活性化されないＤＮＡとを含み、
細胞中での前記レポーター遺伝子の転写の証拠をアッセイする工程と、
前記第２のレポーター遺伝子の転写を誘導し、且つ前記第１のレポーター遺伝子の転写を誘導しない化合物を選択する工程とを含む、ステロイド受容体の核内転写制御を介する活性を調整することなくステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を調整する化合物のスクリーニング法。
【請求項３１】
細胞を少なくとも１つの試験化合物に接触させる工程であって、前記細胞が、
（ａ）ステロイド受容体タンパク質、その機能操作形態もしくは改変形態を発現する非内因性ＤＮＡと、
（ｂ）シグナル伝達経路反応性転写調節単位に作動可能に連結されたレポーター遺伝子をコードし、それにより前記レポーター遺伝子がシグナル伝達経路に反応して活性化され、前記第２のレポーター遺伝子の転写がステロイドホルモンによって活性化されないＤＮＡとを含み、
細胞中での前記レポーター遺伝子の転写の証拠をアッセイする工程と、
前記ステロイド受容体応答遺伝子の転写を定量する工程と、
前記レポーター遺伝子の転写を誘導し、且つステロイドレポーター反応遺伝子の転写を誘導しない化合物を選択する工程とを含む、ステロイド受容体の核内転写制御を介する活性を調整することなくステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を調整する化合物のスクリーニング法。
【請求項３２】
前記シグナル伝達経路反応性転写調節単位が、血清応答因子、アクチベータタンパク質１、ｃＡＭＰ応答エレメント、ＥボックスＤＮＡ結合エレメント、Ｅ２Ｆ　ＤＮＡ結合エレメント、糖質コルチコイド応答エレメント、熱ショック応答エレメント、インターフェロンγ活性化配列、インターフェロン刺激応答エレメント、活性化Ｔ細胞の核因子、κＢ細胞の核因子、ｐ５３応答エレメント、Ｒｂ応答エレメント、およびＳＴＡＴ３応答エレメントからなる群から選択される、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
任意選択的に栄養素を補足した化学的に定義された培養培地中で組織培養スクリーニング系を増殖させる工程であって、前記組織培養スクリーニング系の細胞株が少なくとも１つの同定された核内転写制御を介さない活性を有するステロイド受容体を含み、
前記培地に試験化合物または化学的シグナルを添加する工程と、
転写量を測定する工程と、
核内転写制御を介さない活性を測定する工程と、
核内転写制御を介さない活性を誘導するが、転写を誘導しない化合物を選択する工程とを含む、実質的に核内転写制御を介する性受容体活性を活性化することなく核内転写制御を介さない性受容体を活性化させる試験試験化合物または化学的シグナルを同定するためのバイオアッセイ。
【請求項３４】
前記細胞株がＯＢ−６である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
細胞を試験化合物に接触させる工程であって、前記細胞は、
ｉ）機能的ステロイド受容体またはステロイド受容体の遺伝子変異体をコードするＤＮＡ配列と、
ｉｉ）応答エレメント−受容体遺伝子構築物と、
ｉｉｉ）血清応答エレメント−受容体構築物とでトランスフェクトされており、
前記応答エレメントレポーター遺伝子構築物の転写に対する前記試験化合物の効果を同定する工程と、
前記血清応答エレメント−レポーター遺伝子構築物の転写に対する前記試験化合物の効果を同定する工程と、
実質的に応答エレメントレポーター遺伝子構築物の転写に影響を与えることなく血清応答エレメント−受容体遺伝子構築物の転写を活性化する化合物を選択する工程とを含む、実質的に核内転写制御を介する活性を誘導することなく核内転写制御を介さない活性を誘導するステロイド受容体のリガンドのスクリーニング法。
【請求項３６】
第１の細胞を試験化合物に接触させる工程であって、前記第１の細胞は、
ｉ）機能的ステロイド受容体またはステロイド受容体の遺伝子変異体をコードするＤＮＡ配列と、
ｉｉ）応答エレメント−受容体遺伝子構築物とでトランスフェクトされており、
前記応答エレメントレポーター遺伝子構築物の転写に対する前記試験化合物の効果を同定する工程と、
第２の細胞を前記試験化合物に接触させる工程であって、前記第２の細胞はレポーター遺伝子に作動可能に連結されたシグナル伝達経路応答転写調節単位でトランスフェクトされており、
前記第２の細胞の転写に対する前記試験化合物の効果を同定する工程と、
実質的に前記第１の細胞の転写に影響を与えることなく前記第２の細胞の転写を活性化する化合物を選択する工程とを含む、実質的に核内転写制御を介する活性を誘導することなく核内転写制御を介さない活性を誘導するステロイド受容体のリガンドのスクリーニング法。
【請求項３７】
安定なトランスフェクト細胞株を有し、前記細胞株がステロイド応答レポーター遺伝子構築物を含むコンテナと、核内転写制御を介さない活性の活性化を評価するための手段と、ステロイド受容体とを含む、ステロイド受容体依存性核内転写制御を介さない活性を測定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（政府援助）
本発明は、米国国立衛生研究所から一部助成金を受けている。したがって、合衆国連邦政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本出願は、２０００年６月１３日提出の「骨量を増加させるための性非特異的方法および組成物（Ｓｅｘ　Ｎｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ　Ｂｏｎｅ　Ｍａｓｓ）」というタイトルの米国特許出願番号６０／２１１，２８７号および２００１年３月８日提出の「ステロイド受容体の転写活性からの核内転写制御を介さない性活性の分離（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ　Ｎｏｎｇｅｎｏｔｒｏｐｉｃ　ｆｒｏｍ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）」というタイトルの米国特許出願番号６０／２７４，３７３号の優先権を主張する。
【０００３】
（発明の分野）
本出願はステロイドシグナル伝達分野であり、特に、ステロイド核内転写制御を介する効果（ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｃ効果）からのステロイド核内転写制御を介さない効果（ｎｏｎｇｅｎｏｔｒｏｐｉｃ効果）の分離法、および実質的にステロイド核内転写制御を介する効果を誘導することなくステロイド核内転写制御を介さない効果を誘導することができるか、実質的にステロイド核内転写制御を介さない効果を誘導することなくステロイド核内転写制御を介する効果を誘導することができる化合物のスクリーニング法を記載する。本発明はまた、一定のステロイドが無関係のステロイド受容体への結合を介して核内転写制御を介さない効果を誘導することができることを初めて記載する。
【０００４】
（発明の背景）
分子構造の類似性およびタンパク質配列の相同性により、多数のタンパク質がステロイド核受容体のスーパーファミリーに分類されている。ステロイドタンパク質受容体ファミリーには、少なくとも６４個の既知の受容体が含まれ（Ｃｅｌｌ、第９７巻、１６１〜１６３、１９９９年４月１６日）、これらにはエストロゲン受容体のαおよびβ形態（ＥＲαおよびＥＲβ）、エストロゲン受容体関連受容体１および受容体２（ＥＥＲ−１およびＥＥＲ−２）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、レチノイン酸受容体（および関連オーファン受容体ＲＯＲα、ＲＯＲβ、およびＲＯＲγ）、糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）、電解質（ミネラル）コルチコイド受容体（ＭＲ）、ビタミンＤ受容体、神経刺激受容体、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲαおよびＬＸＲβ）、甲状腺ホルモン受容体ＡおよびＢ（トリヨードチロニン（Ｔ３）およびチロキシン（Ｔ４）に結合する）、ＣＯＵＰ−ＴＦ受容体、エクジソン受容体、ペルオキシソーム増殖活性化タンパク質受容体（ＰＰＡＲ、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、およびＰＰＡＲσが含まれる）、プレグナンＸ（ＰＸＲ）、胆汁酸結合ファミリー、ならびにキメラ受容体およびオーファン受容体が含まれる。
【０００５】
ステロイドは細胞内受容体に結合し、典型的には遺伝子活性を誘導するステロイド／受容体複合体を介した転写およびタンパク質合成を調整することが伝統的に承認されている。ステロイド受容体が主にリガンド活性化転写因子として既に知られている場合でさえ、最近、核内転写制御を介する効果の速さとは一致しない多数の非常に急速な（例えば、数秒から約１５分）ステロイド効果が同定されている。これらの認められたステロイドホルモンの核内転写制御を介さない効果は、最近、Ｆａｌｋｅｎｓｔｅｉｎら、「急速な核内転写制御を介さない効果に注目したステロイドホルモンの複数の効果」、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．、５２、５１３〜５５５、２０００によって概説された。ＭｃＥｗｅｎ，Ｂ．Ｓ．ａｎｄ　Ａｌｖｅｓ，Ｓ．Ｅ．、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．、２０、２７９〜３０７、１９９９もまた参照のこと。多数のこれらの急速な作用は、エストロゲンまたは他のステロイドの推定膜会合受容体との相互作用能力に帰している（Ｗａｔｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、２２０、９〜１９、１９９９）。しかし、これまでこれらの核内転写制御を介さない効果がステロイドの転写効果を媒介するタンパク質と同一のタンパク質或いは異なるタンパク質によって媒介されるかどうかは未知であった。さらに、ステロイドの核内転写制御を介さない効果と古典的な受容体の転写活性との関係は完全に未知であった。例えば、Ｆａｌｋｅｎｓｔｅｉｎらは、２０００年の概説に以下の所見を記載している。
【０００６】
（ｉ）ステロイドの核内転写制御を介さない効果および関連する個別の受容体は、ビタミンＤおよび甲状腺ホルモンのような関連化合物を含む全てのステロイド群で証明される。これらの急速な効果についての生理学的および臨床的関連は未だほとんど不明である。Ｆａｌｋｅｎｓｔｅｉｎら、５１４、概要。
【０００７】
（ｉｉ）核内転写制御を介する性ステロイド作用と対照的に、ステロイドの核内転写制御を介さない性効果は、主に、転写およびタンパク質合成インヒビターに対して感受性がないことによって特徴付けられ急速な作用の発生（数秒から数分以内）を実証する実験により極めて明白に示されている。これらの急速な効果は、おそらく、細胞内ステロイド受容体の性質とは異なる薬理学的性質を有する受容体によって媒介されるようである。・・・薬理学的性質のみにおける矛盾では、異なる受容体タンパク質の核内転写制御を介さない作用についての仮説の支持には不十分であるが、この重要な論点については第ＩＩＩ．Ｂ節で取り組まれており、核内転写制御を介さないシグナル伝達における古典的および非古典的受容体タンパク質両方の関連についての種々の証拠が得られている。Ｆａｌｋｅｎｓｔｅｉｎら、ｐ．５１６。
【０００８】
（ｉｉｉ）多様なステロイドの核内転写制御を介さない効果は、古典的細胞内ステロイド受容体とは明らかに異なる薬理学的性質を有する推定非古典的膜受容体を介して媒介されるようである。Ｆａｌｋｅｎｓｔｅｉｎら、ｐ．５２０。
【０００９】
（ｉｖ）まとめると、現在、少なくともいくつかの急速な１α，２５−（ＯＨ）２Ｄ３誘導効果がステロイドおよびチロイドホルモンスーパーファミリーに属する細胞内受容体と異なる膜受容体によって伝達されることを示す多数の一連の証拠が存在する。Ｆａｌｋｅｎｓｔｅｉｎら、ｐ．５２１。
【００１０】
（ｖ）ステロイドの核内転写制御を介さない作用の多数の局面にはさらに継続的且つ徹底的な研究が必要であり、その理解もいまだ不十分であることが自明である。これには、急速なステロイドシグナル伝達を開始する推定膜受容体の未だ達成されていないクローニングも含まれる。ステロイドに結合する膜タンパク質（ｍＰＲ、アネクシンＩＩ）は予備的に認められているが、急速な作用を担うステロイド膜受容体は最終的に証明されていない。明らかに、このような受容体のクローニングは大きな進展につながるが、ステロイド作用の新規の局面の生理学的、病態生理学的、そして最後であるが重要な臨床的関連性は、別の最重要課題であることを忘れてはならない。クローン化された受容体を用いなくともこれを達成することができるにもかかわらず、後者は最終的には臨床に向けた研究も容易にするであろう。Ｆａｌｋｅｎｓｔｅｉｎら、ｐ．５４６。
【００１１】
特に、Ｆａｌｋｅｎｓｔｅｉｎらは、ステロイドの核内転写制御を介さない作用を媒介する別の推定受容体の証拠として以下を含めている。
【００１２】
（ｉ）各古典的受容体を欠く細胞または組織（例えば、ＭＲおよびＰＲについてのノックアウト動物由来の細胞）におけるステロイドの核内転写制御を介さない効果の存在および急速なステロイド効果が古典的アンタゴニストに対して感受性を示さないこと；および
（ｉｉ）ＲＵ−２８３１８が急速なシグナル伝達を遮断するという所見は、急速なアルドステロン効果が古典的受容体によって媒介されることを必ずしも意味せず、そのような推定はＭＲノックアウトマウスのアルドステロンが依然として核内転写制御を介さない活性を示すという事実のもとにおいてはあり得ない（Ｆａｌｋｅｎｓｔｅｉｎら、ｐ．５３５）。
【００１３】
非限定的な例として、性ステロイドを使用して骨量が治療されているが、その基礎をなす作用機構は不明である。性ステロイドの核内転写制御を介する効果は、核受容体タンパク質によって媒介され、これはエストロゲンとアンドロゲンシグナル伝達との間で非常に異なり、それぞれ雌標的生物と雄標的生物との間で性特異的なパターンで分布している。古典的エストロゲン受容体（ＥＲα）に加えて、多数の組織はエストロゲン受容体の第２の形態（ＥＲβ）を発現する。ステロイドのその同族受容体への結合により、タンパク質の高次構造が変化し、転写機構と直接相互作用するか、他の転写因子とのタンパク質−タンパク質相互作用を介して間接的に相互作用する。この数年間で種々の細胞型においておそらく核内転写制御を介する性作用機構を示さないような急速な作用を示す多数のエストロゲン効果が報告されている（Ｌｉｅｂｅｒｈｅｒｒ，Ｍ．Ｂ．ら、１９９３、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、８、１３６５〜１３７６；Ａｒｏｎｉｃａ，Ｓ．Ｍ．ら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９１、８５１７〜８５２１；Ｅｎｄｏｈ，Ｈ．Ｈ．ら、１９９７、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、２３５−９９−１０２；ＭｃＥｗｅｎ，Ｂ．Ｓ．ａｎｄ　Ｓ．Ｅ．Ａｌｖｅｓ．、１９９９、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．、２０、２７９〜３０７；Ｃｈｅｎ，Ｚ．ら、１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０３、４０１〜４０６；Ｃａｓｔｏｒｉａ，Ｇ．ら、１９９９、ＥＭＢＯ　Ｊ．、１８、２５００〜２５１０；Ｔｏｒａｎ−Ａｌｌｅｒａｎｄ，Ｃ．Ｄ．ら、１９９９、Ｆｒｏｎｔ．　Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、２０、９７〜１２１；Ｎｏｒｆｌｅｅｔ，Ａ．Ｍ．ら、１９９９、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４０、３８０５〜３８１４）。多数のこれらの急速な作用は、エストロゲンのＥＲの膜結合形態との相互作用能力に帰されている（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｐ．ａｎｄ　Ｃ．Ｗｅｂｂ．、１９９９、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、５、１１３０〜１１３１；Ｐｉｅｔｒａｓ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ　Ｃ．Ｍ．Ｓｚｅｇｏ．、１９９９、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、５、１３３０；Ｒａｚａｎｄｉ，Ｍ．ら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１３：３０７〜３１９；Ｎｏｒｆｌｅｅｔ，Ａ．Ｍ．ら、１９９９、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４０、３８０５〜３８１４；Ｗａｔｓｏｎ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄ　Ｂ．Ｇａｎｕｔｃｈｕ、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、２２０、９〜１９）。しかし、この受容体の正確な正体および細胞内局在（古典的受容体であるかどうかを含めて）、すなわち、二重膜構造中または小胞と呼ばれる膜構造（Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｔ．Ａ．ら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、５４１９〜５４２２；Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ａ．ら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４、３３５５１〜３３５５６）、またはサイトゾルに局在しているのかどうかは同定されていない。
【００１４】
成体骨恒常性におけるＥＲおよびＡＲの役割
ＥＲαおよびＥＲβまたはＡＲ（アンドロゲン受容体）の受容体の存在が、増殖軟骨細胞、骨芽細胞、骨髄間質細胞（Ｅｒｉｋｓｅｎ，Ｅ．Ｆ．ら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１−８４−８６；Ｋｏｍｍ，Ｂ．Ｓ．ら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１−８１−８４；Ｅｒｎｓｔ，Ｍ．ら、１９９１、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、５、１５９７〜１６０６；Ｂｅｎｚ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９１、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、６、５３１〜５４１；Ｂｅｎｚ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９１、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１２８、２７２３〜２７３０；Ｍｏｎａｇｈａｎ，Ｂ．Ａ．ら、１９９２、Ｃｌｉｎ．Ｏｒｔｈｏｐ．、２７７〜２８０；Ｂｅｌｌｉｄｏ，Ｔ．Ｇ．ら、１９９３、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３３、５５３〜５６２；Ｂｅｎ−Ｈｕｒ，Ｈ．Ｇ．ら、１９９３、Ｃａｌｃｉｆ．Ｔｉｓｓｕｅ　Ｉｎｔ．、５３、９１〜９６；Ｋｕｓｅｃ，Ｖ．ら、１９９８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、８３、２４２１〜２４２８；Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｊ．ら、１９９９、Ｂｏｎｅ、２４、９〜１６；Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．ら、１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、８４、３７０〜３７３）、ならびに破骨細胞およびその前駆体（Ｏｕｒｓｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ら、１９９３、Ａｎｎ．Ｍｅｄ．、２５、３６１〜３７１）で充分に証明された。特に、骨芽細胞および破骨細胞におけるＥＲα、ＥＲβ、およびＡＲの発現レベルは、再生組織と比較して少なくとも１／１０であった。さらに、雌および雄再生器官と比較して雄および雌由来の細胞でＥＲまたはＡＲレベルは類似しているので、受容体の性特異的分布は認められない（Ｂｅｎｚ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９１、Ｊ．ＢｏｎｅＭｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、６、５３１〜５４１；Ｂｅｎｚ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９１、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１２８、２７２３〜２７３０；Ｋｏｍｍ，Ｂ．Ｓ．ら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１−８１−８４；Ｂｒａｉｄｍａｎ，Ｉ．ら、２０００、Ｂｏｎｅ、２６、４２３〜４２７）。さらに、一方で雄および雌成体骨の両方においてエストロゲンは骨活性性ステロイドであり、他方で芳香族化不可能なアンドロゲンがエストロゲン欠損症の副作用から雌の骨を保護することができることを提案する見かけ上矛盾した証拠が存在する（Ｒｉｇｇｓ，Ｂ．Ｌ．ら、１９９８、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１３、７６３〜７７６；Ｖａｎｄｅｒｓｃｈｕｅｒｅｎ，Ｄ．ら、１９９８、Ｂｏｎｅ、２３、３９１〜３９４）。実際、変異エストロゲン受容体を有する雄における骨量の減少（Ｃａｒａｎｉ，Ｃ．ら、１９９７、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３７、９１〜９５；Ｂｉｌｅｚｉｋｉａｎ，Ｊ．Ｐ．ら、１９９８、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３９、５９９〜６０３）およびＰ−４５０アロマターゼ欠損症の２匹の雄におけるエストロゲン治療後の骨量の増加（Ｒｉｇｇｓ，Ｂ．Ｌ．ら、１９９８、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１３、７６３〜７７６）により、アンドロゲンの末梢芳香族化に由来するエストロゲンも雄の骨量の維持に重要であることが示唆される。しかし、３つ全ての場合、エストロゲン欠損症の幼若雄における骨量の減���および骨マーカーレベルの増加は、アンドロゲンが十分であることを考慮すると、発達中の骨成長の欠損およびこれらの個体が決して思春期ではないという事実（骨量の喪失ではなく、骨粗鬆症に共通の形態を有する症例である）により、ピーク骨量に達し損ねた十分な結果であり得る。この主張を支持して、完全なアンドロゲン不感性のヒトは、Ｘ染色体上のアンドロゲン受容体遺伝子の変異のために、エストロゲンレベルの上昇にもかかわらず骨量が減少した（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｂ．Ｄ．ら、１９９９、エンドクリン学会、第８１回年次集会９３（概要））。さらに、ＤＨＴなどの非芳香族化アンドロゲンを含むアンドロゲンは、少なくともげっ歯類における生合成活性および出生ならびにインビトロおよびインビボでの骨細胞死に対してエストロゲンと同一の効果を有し（Ｂｅｌｌｉｄｏ，Ｔ．ら、１９９５、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９５、２８８６〜２８９５；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｓ．ら、１９９７、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３８、４０１３〜４０２１；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｓ．ａｎｄ　Ｓ．Ｃ．Ｍａｎｏｌａｇａｓ、２０００、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．、１０８、１５３〜１６４；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｓ．ら、１９９７、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３８、４０１３〜４０２１；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｓ．ら、１９９９、Ｊ．Ｂｏｎｅ．Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１４、Ｓ４５１（概要））、さらにより重要なことは、卵巣摘出雌における骨損失を予防することができる（Ｖａｎｄｅｒｓｃｈｕｅｒｅｎ，Ｄ．Ｅ．ら、１９９２、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３０、２９０６〜２９１６；Ｔｏｂｉａｓ，Ｊ．Ｈ．ら、１９９４、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．、２６７、Ｅ８５３〜Ｅ８５９；Ｃｏｘａｍ，Ｖ．ら、１９９６、Ｂｏｎｅ、１９、１０７〜１１４、Ｌｅａ，Ｃ．Ｋ．ａｎｄ　Ａ．Ｍ．Ｆｌａｎａｇａｎ．、１９９９、Ｊ．Ｅｎｄｒｏｃｒｉｎｏｌ．、１６０、１１１〜１１７）。現在まで、何故骨細胞は再生組織と比較して低レベルのＥＲおよびＡＲしか発現しないのか、または何故雄骨細胞と雌骨細胞との間でＥＲおよびＡＲの性分布を欠くのか、または何故雌および雄における性ステロイドのいずれかのクラスの効果が不可解であるのかについて説明されていない。
【００１５】
雌および雄における性ステロイドのいずれかのクラスの性非特異的効果およびこれらの効果における性ステロイド受容体の役割のこの誤解は、マウスにおけるＥＲαまたはＥＲβのノックアウト（αＥＲＫＯおよびβＥＲＫＯ）の不明瞭な骨表現型によってさらに混乱している（Ｃｕｓｅ，Ｊ．Ｆ．ａｎｄ　Ｋ．Ｓ．Ｋｏｒａｃｈ、１９９９、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．、２０、３５８〜４１７）。αＥＲＫＯまたはＥＲαとＥＲβの両方（二重ＥＲノックアウトマウス、ＤＥＲＫＯ）は、雌と雄の両方で大腿骨の長さおよび直径が減少しているが、大腿骨の骨塩密度の小規模且つ局所的減少を示すことで特徴付けられる弱い骨表現型を示す。それに対して、ＥＲβノックアウト（βＥＲＫＯ）マウスは、メスにおいてより長い大腿骨および骨膜周囲皮質の増加を示すが、雄では変化がない（Ｗｉｎｄａｈｌ，Ｓ．Ｈ．ら、１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０４、８９５〜９０１）。それにもかかわらず、体積測定ｐＱＣＴまたは組織形態計測によって野生型コントロールと比較したこれらのノックアウトマウスの任意の変化も明らかにできず、これは、得られた骨塩密度（ＤＥＸＡによる）の変化がより小さな骨の結果である可能性が高いことを示している。重要なことには、αＥＲＫＯおよびＤＥＲＫＯマウスの大腿骨の長さの減少は、骨端閉鎖の遅延に由来する性機能低下症患者の長骨の伸長と正反対である（Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｐ．ら、１９９４、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３１、１０５６〜１０６１；Ｃａｒａｎｉ，Ｃ．ら、１９９７、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３７、９１〜９５；Ｂｉｌｅｚｉｋｉａｎ，Ｊ．Ｐ．ら、１９９８、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３９、５９９〜６０３）。したがって、ＥＲＫＯマウスにおける表現型に小さな変化があるとすれば、骨成長に対するエストロゲン効果の喪失に関連し得るが、これらの変化は、思春期または成体骨再構成に対するエストロゲンに関して有益ではない。アロマターゼ欠損（ＡｒＫＯ）マウスにおいて多義的骨表現型もまた認められている（Ｏｚ，Ｏ．Ｋ．ら、２０００、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１５、５０７〜５１４）。雌ではなく雄ＡｒＫＯで長骨成長が減少した。それに対して、雌では代謝回転が増加したが、雄では代謝回転は減少した。この結果は、エストロゲンがいずれかの性において骨活性性ステロイドであるという主張に強く反論するものである。重要には、２匹の罹患雄マウス（骨生検を行った）のうち１匹およびアロマターゼ欠損およびおよび雌マウスにおける壁の厚さ、骨芽細胞数または生存の代理物（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）はエストロゲン依存性であり、エストロゲン処理後に較正することができる（Ｖａｎｄｅｒｓｃｈｕｅｒｅｎ，Ｄ．ら、１９９８、Ｂｏｎｅ、２３、３９１〜３９４）。それに対して、代謝回転は、破骨細胞形成および骨芽細胞形成の変化およびそれによる細胞数の変化を反映するので、雌においてエストロゲン依存性を示すが（エストロゲン欠損に対する推定二次的増加）、雄ではアンドロゲン依存性を示す（過剰なアンドロゲンに対する推定二次的抑制を示す）。同様に、アンドロゲン耐性雄および雌ラットおよびマウス（精巣性女性化モデル、Ｔｆｍ）では、エストロゲン濃度���より高い（非機能的アンドロゲンの芳香族化に起因する）にもかかわらず、骨長が減少するが、海綿質体積は正常である（Ｙｏｕｎｇ，Ｃ．Ｙ．ら、１９８９、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１２４、７７１〜７７５；Ｇａｓｐａｒ，Ｍ．Ｌ．ら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、８８、８６０６〜８６１０；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｌ．ａｎｄ　Ｐ．Ｊ．Ｏ’Ｓｈａｕｇｈｎｅｓｓｙ、１９９１、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１３１、４４３〜４４９；Ｕｅｓｕｇｉ，Ｙ．ら、１９９２、Ａｎａｔ．Ｒｅｃ．、２３４、５４１〜５４８；Ｖａｎｄｅｒｓｃｈｕｅｒｅｎ，Ｄ．ら、１９９３、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、８、８０１〜８０９）。
【００１６】
アーカンソー大学評議会が提出したＷＯ　００／２０００７は、少なくとも１０８Ｍ−１のエストロゲンαまたはβ受容体（およびこの実施形態の１つの態様では、化合物はエストロゲンではない）またはアンドロゲン受容体（およびこの実施形態の１つの態様では、化合物はアンドロゲンではない）に結合し、１７β−エストラジオールレベルの５％に過ぎない遺伝子転写活性を誘導する一方で細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）活性が増加する化合物の投与による宿主の骨量の増加法を開示している。ＷＯ　００／２０００７は、エストロゲンまたはアンドロゲンのエストロゲンまたはアンドロゲンの転写活性を増加させることなくＥＲＫ活性を増加させる能力を保存する１つの方法は、置換基または置換部分をエストロゲンまたはアンドロゲンに結合させてこれらの細胞通過を阻止し、遺伝子活性を活性化させるように核に輸送することを防ぐものであることを強調している。
【００１７】
ＭｃＤｏｎｎｅｌｌとその共同研究者は、異なるＥＲ部位に結合し、ＥＲαを選択的に遮断することができるが、コンセンサスＥＲＥを試験した場合にそれと逆にＥＲβ媒介転写は遮断することができないいくつかのクラスの小さな（１１から１９個のアミノ鎖）ペプチドを単離した（Ｎｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｄ．ら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５、７４４〜７４６；Ｃｈａｎｇ，Ｃ．ら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、１９、８２２６〜８２３９）。
【００１８】
スクリーニング法
ステロイド受容体としてまたはそれを介して作用する薬剤のいくつかのスクリーニング法が当該分野で既知である。例えば、Ｅｖａｎｓらに付与された米国特許第５，０７１，７７３号は、ホルモン受容体と考えられるタンパク質が転写を刺激するかどうか、および化合物が受容体タンパク質の機能的リガンドであるかどうかを同定する方法を開示および主張している。
【００１９】
Ｅｖａｎｓらに付与された米国特許第５，２９８，４２９号は、ホルモン受容体タンパク質またはその同族体をコードする非内因性ＤＮＡおよびレポーター遺伝子に連結した有効なホルモン応答性要素をコードするＤＮＡを発現する培養細胞の形質添加に対する化合物の効果の評価によって化合物がホルモン受容体タンパク質の機能的リガンドであるかどうかを同定するアッセイを開示している。
【００２０】
一般的なバイオアッセイには、化合物活性化タンパク質が細胞での表現型変化を誘導するようにコントロール細胞よりも高いレベルで細胞で発現されたタンパク質を活性化する化合物のバイオアッセイを開示しているＨｏｕｓｅｙに付与された米国特許第５，８７７，００７号が含まれる。
【００２１】
アメリカン・ホーム・プロダクツ社名義のＷＯ　００／３７６８１は、ＥＲαまたはＥＲβのいずれかに特異的な受容体モジュレーターを同定するためのアッセイを開示している。開示されたアッセイは、第１の組が機能的ＥＲαをコードするＤＮＡおよび応答性レポーター遺伝子構築物を含み、第２の細胞組がＥＲＥレポーター構築物およびＥＲβを含む２組の細胞を使用している。化合物を、ＥＲαまたはＥＲβを発現する細胞における転写の選択的活性化または阻害についてスクリーニングすることができる。
【００２２】
米国特許第５，６４３，７２０号は、ＡＰ−１に結合してＤＮＡ結合を阻止する複合体を形成するためのレチノイド受容体に結合するリガンドのスクリーニング法を開示している。米国特許第５，７０２，９１４号は、遺伝子改変細胞におけるレポーター遺伝子構築物の転写のアッセイによって化合物がレチノイド受容体の機能的リガンドであるかどうか同定するバイオアッセイを開示している。
【００２３】
米国特許第５，８６３，７３３号は、遺伝子改変細胞におけるレポーター遺伝子構築物を使用して化学物質が目的の遺伝子の転写活性を特異的に調整するかどうかを同定する方法を開示している。
【００２４】
米国特許第５，５６３，０３６号は、試験化合物で処理した場合の固体基質上の標識転写因子の有無の検出によって核酸への転写因子の結合を阻害する化合物のスクリーニング法を開示している。
【００２５】
米国特許第５，８５４，００４号は、レポーター遺伝子およびイノシトール−１、４，５−トリリン酸（ＩＰ３）、およびジアシルグリセロール濃度の変化に応答するＤＮＡ調節配列を含むように遺伝子改変された細胞におけるレポーター遺伝子転写のモニタリングによって受容体依存性シグナル伝達経路を調整する化合物のスクリーニング法を開示する。
【００２６】
Ｌａｕｆｆｅｒらに付与された米国特許第５，６３９，５９７号は、化合物が受容体のリガンドであるかどうかを同定する無細胞アッセイを開示している。
【００２７】
Ｄｉｘｉｔに付与された米国特許第６，０６０，２３８号は、牛刀ウイルスサイトカイン応答改変Ａと比較してアポトーシスを阻害する薬剤のスクリーニング法を開示している。
【００２８】
ＭｃＤｏｎｎｅｌｌらによって提出された米国特許第５，５０６，１０２号は、プロゲステロン受容体Ａ型を使用したステロイド細胞内媒介転写のアンタゴニストのスクリーニング法を記載している。
【００２９】
米国特許第５，８３４，２１３号は、原形質膜受容体と相互作用する化学的シグナルによって処理された転写応答をモニターするための組織培養スクリーニング系を開示している。この組織培養スクリーニング系には、膜受容体を含む細胞株、標的遺伝子、およびステロイド受容体、ビタミン受容体、およびオーファン受容体からなる群から選択される特異的受容体が含まれる。
【００３０】
Ｎｏｖａｌｏｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって提出されたＷＯ　９９／５４７２８は、受容体の高次構造を改変するペプチドまたは核酸リガンドとの相互作用に基づいて、化合物が多細胞生物における受容体の生物活性を調整するかどうかを予想する方法が記載されている。データを、既知の生物活性を有する基準化合物のフィンガープリントと比較する。
【００３１】
（他の関連する引例）
Ｌａｂｒｉｅに付与された米国特許第５，３６２，７２０号、同第５，５４５，６３４号、同第５，８４６，９６０号、および同第５，５６７，６９５号は、低用量のプロゲスチンまたは男性ホルモン活性を有し且つ男性化活性の低い他のステロイド誘導体を投与する工程を含む、感受性温血動物における乳癌および子宮内膜癌、骨粗鬆症および子宮内膜症の治療または予防法を開示している。主な実施形態では、この方法は、アンドロゲン受容体に対して２×１０−８未満のＫｉ値を有する少なくとも１つの男性ステロイドであって、３．０ナノモル／Ｌ未満の濃度で最大半減値に達するヒト乳癌ＺＲ−７５−１細胞の増殖に対するアンドロゲン受容体媒介阻害効果を示し、および５０ｎＭ未満の血清濃度で男性化活性が認められないステロイドの投与によるアンドロゲン受容体の活性化、を含み、このような各ステロイドを５０ナノモル／Ｌ未満の蓄積血清濃度の維持に十分に低い濃度で投与する。
【００３２】
Ｓｉｍｐｋｉｎｓに付与された米国特許第５，８４３，９３４号は、非実質的な性関連活性を有するエストロゲンを患者に投与して雄または雌の骨粗鬆症の障害作用を遅延させることができることを主張している。’９３４特許は、どのようにして骨量を増加させる化合物を選択したかを説明できないが、その代わりにどのようにして骨喪失の影響を遅延させるかを教示している。好ましい実施形態では、使用したエストロゲンは、１７α−エストラジオールである。’９３４特許では、発明者はどのようにして１７α−エストラジオールが細胞保護効果を発揮するかという機構を理解することはできないとを述べているが、直接的保護効果（受容体作用よるものとは対照的であろう）を発揮することを示唆している。直接保護効果についての所与の１つの例は、グルコース調節の調整である（’９３４特許のカラム７および８を参照のこと）。
【００３３】
フロリダ大学研究基金によって提出されたＷＯ９８／２２１１３は、虚血に関連する細胞集団に対して細胞保護を付与するためのエストロゲン化合物のβ異性体の利用法を開示している。
【００３４】
米国特許第５，８５９，００１号は、細胞に神経保護を付与する四員環シクロペンタノフェナントレン化合物中にフェノール末端基を有する非エストロゲン化合物の使用を開示している。
【００３５】
フロリダ大学研究基金によって提出されたＷＯ９８／３１３８１は、効果を高めるための多環式フェノール化合物と抗酸化剤との組み合わせを投与する工程を含む、細胞集団に対する多環式フェノール化合物の細胞保護効果を高める方法を開示している。１つの開示された組み合わせは、グルタチオンおよびエストロゲンである。
【００３６】
アーカンソー大学評議会が提出したＷＯ　９９／６１０４４は、骨再構成を調節するための骨芽細胞形成および破骨細胞形成の調節用治療薬としてのノブリン（ｎｏｇｇｉｎ）およびノブリン（ｎｏｇｇｉｎ）のアンタゴニストの使用を開示している。アーカンソー大学評議会が提出したＷＯ　２２／２０６２５はまた、糖質コルチコイド誘導性骨疾患は骨細胞の誕生および死の変化に起因することおよび糖質コルチコイドの投与により成熟骨芽細胞および骨細胞のアポトーシスが増加し、且つ形成速度および骨塩密度が減少することを開示している。
【００３７】
さらに、アーカンソー大学評議会が提出したＷＯ　００／１９８２３は、ヒト副甲状腺ホルモン１−３４（ｈＰＴＨ（Ｉ−３４））はインビボで間欠性様式でマウスに投与した場合に骨芽細胞に対して抗アポトーシス効果を発揮することを開示している。これと同一の出願はまた、ウシＰＴＨ（１−３４）（ｂＰＴＨ（Ｉ〜３４））は、骨芽細胞および骨細胞のインビトロでの糖質コルチコイド誘導性アポトーシスを予防するという証拠を提供している。
【００３８】
アーカンソー大学評議会が提出したＷＯ　００／２０６２５は、糖質コルチコイド投与により、骨髄の骨芽細胞形成および破骨細胞形成の欠損によって成熟骨芽細胞および骨細胞のアポトーシスが増加し、骨形成速度および骨塩密度が減少することを開示している。
【００３９】
上記の考察から、ステロイドシグナル伝達の理解に対する相当な前進にもかかわらず、どのようにしてステロイドが核内転写制御を介さない効果および核内転写制御を介する効果を媒介するのかという理解が欠けていることが明らかである。
【００４０】
本発明の目的は、ステロイドの選択的効果を誘導することにある。
【００４１】
本発明の目的はまた、ステロイドまたはステロイド受容体関連障害または疾患の治療法を提供することにある。
【００４２】
本発明のさらに別の目的は、ステロイドの選択的応答を誘導することができる化合物をスクリーニングするためのトランスジェニック動物を提供することにある。
【００４３】
本発明のさらに別の目的は、ステロイドの選択的応答に有用な化合物の選択法を提供することにある。
【００４４】
（発明の概要）
本発明は、ステロイド核内転写制御を介さない作用機構およびそのステロイド核内転写制御を介する作用との関係についての理解における基本的発見に関する。（ｉ）核内転写制御を介さない効果および核内転写制御を介する効果は同一のステロイド受容体によって媒介することができること；（ｉｉ）両効果がリガンドに誘導されること；（ｉｉｉ）迅速且つ緩やかに適合することができるステロイド受容体のリガンド結合ドメインにおけるリガンド相互作用によって核内転写制御を介さない効果が発揮されること、（ｉｖ）リガンド結合ドメインとのリガンド相互作用によって核内転写制御を介する効果が発揮されるが、それは典型的にはより遅く且つ強力な相互作用の結果であるステロイド受容体のＤＮＡ結合ドメインを必要とすること；（ｖ）リガンド相互作用の核内転写制御を介さない効果が、選択的応答に影響を与えるような様式でリガンド相互作用の核内転写制御を介する効果から分離し得ることことを発見した。
【００４５】
この先駆的な発見に基づいて、ステロイド受容体の核内転写制御を介する効果からステロイド核内転写制御を介さない効果を分離する方法が得られる。１つの実施形態では、本発明は、受容体を、受容体に核内転写制御を介さない効果を媒介させる様式で受容体のリガンド結合ドメインと十分に相互作用する一方で、有意な核内転写制御を介する効果が得られない様にＤＮＡ結合ドメインが活性化されない化合物と接触させる工程を含む、ステロイドの核内転写制御を介さない効果を選択的に誘導する方法を含む。別の実施形態では、受容体を、受容体に核内転写制御を介する効果を媒介させる様式で受容体のＤＮＡ結合ドメインを十分に活性化させる一方で、有意な核内転写制御を介さない効果が得られない化合物と接触させる工程を含む、ステロイドの核内転写制御を介する効果を選択的に誘導する方法が得られる。天然のステロイド効果の１０％未満、好ましい実施形態では天然のステロイド効果の５、１、または０．１％未満である効果である場合、リガンドは「有意な」または「実質的な」効果を誘導しないと考えられる。
【００４６】
核内転写制御を介さない活性型の例には、細胞内の第２の伝令（セカンド・メッセンジャー）系、シグナル伝達経路、タンパク質キナーゼシグナル伝達経路、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路、Ｓｒｃ／Ｓｈｃ／ＥＲＫシグナル伝達経路の活性化；細胞内カルシウム濃度の調節；分泌；細胞形態学の変化；細胞移動性；細胞骨格再配列；およびアポトーシスが含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明の別の態様では、リガンド結合相互作用活性をマスクする手段としての受容体上の結合部位のステロイド受容体の内因性または外因性リガンドと競合する選択的誘導化合物（ペプチド、タンパク質、またはリガンドアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない）を投与することができる。１つの例として、リガンドの核内転写制御を介さない効果の誘導を阻止する方法でリガンド結合ドメインと結合するペプチドまたはリガンドアンタゴニストを投与することができる。別の実施形態では、リガンドの核内転写制御を介する効果の誘導を阻止する方法で受容体のリガンド結合ドメインと結合するペプチドまたはリガンドアンタゴニストを投与することができる。選択的誘導化合物は、ＤＮＡ−受容体相互作用の直接的干渉または受容体の他の転写レギュレーターとのタンパク質−タンパク質相互作用形成の間接的阻止によってステロイド受容体の転写活性を阻害することができる。さらに、選択的誘導化合物は、少なくとも２つの成分を有する複合体として存在することができ、該成分が組合わされた場合、複合体はステロイド受容体の核内転写制御を介する活性を不活化し、核内転写制御を介さない活性を活性化してもよい。
【００４８】
さらに別の実施形態では、受容体の高次構造または配置の変化の誘導によって受容体のＤＮＡ結合領域を不活化する有効量の化合物を投与する工程を含む、ステロイド受容体の選択的効果の誘導法が得られる。本発明のさらに別の態様では、タンパク質の高次構造または立体配置の変化の誘導による、受容体のリガンド結合領域のみによって媒介される機能を不活化する有効量の化合物を投与する工程を含む、ステロイド受容体の選択効果を誘導する方法が得られる。
【００４９】
別の実施形態では、実質的にステロイドの核内転写制御を介する効果を誘導することなくステロイドの核内転写制御を介さない効果を誘導することができるか実質的にステロイドの核内転写制御を介さない効果を誘導することなくステロイドの核内転写制御を介する効果を誘導することができる化合物のスクリーニング法が得られる。本方法を、
（１）化合物の実質的にステロイド受容体のＤＮＡ結合ドメインを活性化することなくステロイド受容体のリガンド結合ドメインにほぼ結合する能力またはステロイド受容体のリガンド結合ドメインのみによって媒介される機能を実質的に活性化することなくステロイド受容体のＤＮＡ結合ドメインをほぼ活性化する能力を評価する工程と、その後
（２）試験化合物の生物活性を測定して、実質的に核内転写制御を介する効果を誘導することなく標的核内転写制御を介さない効果を誘導する能力または実質的に核内転写制御を介さない効果を誘導することなく標的核内転写制御を介する効果を誘導する能力を評価する工程とを含む、多数の方法で行うことができる。
【００５０】
第１の工程を、好ましくはコンピュータ支援による分子モデリングによって行うことができる。あるいは、リガンド結合ドメインのみからなり、機能的ＤＮＡ結合ドメインを欠く受容体の改変形態を使用して、試験化合物がリガンド結合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインを活性化するかを同定することができる。改変形態を、例えば、形質転換細胞中で発現させることができる。インビトロで培養した細胞を、ステロイド受容体またはその遺伝子変異体を発現するように遺伝子を変化させることができる。核内転写制御を介する活性を、試験化合物との反応で得られた全ｍＲＮＡ量または１つまたは複数のステロイド調節遺伝子に特異的なｍＲＮＡの測定などの既知の技術を使用して定量することができる。
【００５１】
あるいは、工程１および２を、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいて実質的に他の効果を誘導することなく核内転写制御を介さない効果または核内転写制御を介する効果のいずれかを選択的に誘導する化合物の簡単なアッセイによって組み合わせることができる。
【００５２】
本発明を使用して、任意のステロイド受容体ファミリー（エストロゲン受容体のαまたはβ形態（ＥＲαおよびＥＲβ）、エストロゲン受容体関連受容体１および受容体２（ＥＲＲ−１およびＥＲＲ−２）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、レチノイン酸受容体（および関連オーファン受容体ＲＯＲα、ＲＯＲβ、およびＲＯＲγ）；糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）、電解質コルチコイド受容体（ＭＲ）、ビタミンＤ受容体、神経刺激受容体、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲαおおびＬＸＲβ）、甲状腺ホルモン受容体ＡおよびＢ（トリヨードチロニン（Ｔ３）およびチロキシン（Ｔ４）に結合する）、ＣＯＵＰ−ＴＦ、エクジソン、ＰＰＡＲファミリー（ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、およびＰＰＡＲσが含まれるペルオキシソーム増殖活性化タンパク質）、プレグナンＸ（「ＰＸＲ」）、胆汁酸結合ファミリー、ならびにキメラ受容体およびオーファン受容体が含まれる）の応答を選択的に起こすことができる。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、ステロイドは、典型的な結合受容体以外のステロイド受容体との相互作用を介して核内転写制御を介さない効果を誘導することができることが発見された。本発明のこの態様の１つの非限定的な例では、エストロゲン受容体（ＥＲαおよびＥＲβ）およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）は、結合リガンドがエストロゲンまたはアンドロゲンであるかどうかに関係なく類似の効率で骨芽細胞および骨細胞に抗アポトーシスシグナルを伝達することができることが発見された。さらに、骨芽細胞／骨細胞の場合に細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）の活性化を含むエストロゲンおよびアンドロゲン作用の核内転写制御を介さない受容体依存性抗アポトーシス機構が受容体の転写活性から機械的に分離可能であることが発見された。
【００５４】
ステロイドは以前に無関係とみなされているステロイド受容体を使用して核内転写制御を介さない効果を誘導することができるという事実は、現在、ステロイドの核内転写制御を介さない効果が各クラスの受容体を欠く細胞または組織で発揮されるという発明の背景の例外的記載を説明する。このような場合、ステロイドは、核内転写制御を介さない効果を媒介するために無関係のステロイド受容体を使用する。
【００５５】
１つの例として、種々のタンパク質ドメインで変異を有するヒトエストロゲン受容体クローンの試験によって、核内転写制御を介さない効果（例えば、抗アポトーシス効果）を担う受容体の領域が位置付けられる。本明細書中で使用される、用語「抗アポトーシスドメイン」は、抗アポトーシス誘導リガンド（エストロゲンまたはアンドロゲンなど）に結合した場合に骨芽細胞および骨細胞に対して抗アポトーシス効果を媒介するタンパク質上の位置をいう。エストロゲン受容体の抗アポトーシスドメインがリガンド結合領域（ドメインＥ）中に存在することが発見された。特に、合成ペプチド（αＩＩ）がドメインＥでリガンド結合エストロゲン受容体に結合した場合、このペプチドはエストロゲン受容体の転写活性を有効に遮断することが既知であるが、リガンド結合エストロゲン受容体のその後の抗アポトーシス効果に対する効果はないことが見出された。
【００５６】
プロトタイプとしてＥＲαを使用して、次に、性ステロイドの受容体の抗アポトーシス活性が転写活性に必要なドメインと同一または異なるドメインが必要であるかを調査した（図３Ａ）。これを行うために、アポトーシス予防に対するいくつかのＥＲα変異体の効果を比較した。これらの変異体は、ヒト細胞に一過性にトランスフェクトされた場合に予想されるたんぱく質を産生することが示されている（Ｓｃｈｏｄｉｎら、１９９５；Ｋｒａｕｓら、１９９７；Ｅｋｅｎａら、１９９６）。二量体形成（Ｄ）およびリガンド結合ドメイン（Ｅ）またはＥドメインのみを含む変異体もまた予想されるタンパク質を産生し、転写活性を欠くことが示された。
【００５７】
ＥＲαと同様に、全Ｎ末端転写活性化機能（ＡＦ−１）ドメインを欠く変異体ΔＡ／Ｂまたはセリンがアラニンに置換された変異体（Ｓ１０４、１０６、１１８Ａ）またはＦドメインを欠く変異体ΔＦ、またはＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１８５〜２５１）のほとんどを欠く変異体ΔＤＢＤは、Ｅ２結合ＥＲの抗アポトーシスシグナルを伝達することができた。しかし、これら全ての変異体は、ＥＲＥ媒介遺伝子転写活性が減少しているか存在しなかった。Ｌｅ　Ｇｏｆｆら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、４４５８〜４４６６；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｎｍ．、２７１、２４１７２〜２４１７８；Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｂｏｇｅｎ。より印象的には、リガンドの抗アポトーシスシグナルを伝達する能力は、全ＡＦ−１およびＤＮＡ結合ドメイン（ＤＥ）を喪失している欠失変異体およびＡＦ−２／リガンド結合ドメイン（Ｅ）のみからなる欠失変異体で保存されていた。それに対して、ホルモン結合能力を欠くＥＲ変異体Ｌ５２５ＡおよびＣ末端転写活性化機能（ＡＦ−２）が欠失したＳ５５４ｆｓは、抗アポトーシスシグナルおよびタンパク質の転写活性を喪失していた。
【００５８】
次に、Ｅドメインの抗アポトーシス活性がその特定の細胞内区画への局在に依存するかを同定した（図３Ｂ）。このドメインを、原形質膜または核局在化配列をそれぞれ含む増強シアン蛍光タンパク質への融合によってＨｅＬａ細胞の原形質膜または核に標的した。落射蛍光顕微鏡（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって明らかになったように、非標的化ＥＲαおよび非標的化Ｅは、核および細胞質中に類似のシアン蛍光分布を示し、これは、ＥＲのリガンド結合ドメイン以外の全てのドメインの除去によっても細胞内分布が変化しないことを示している。しかし、同一の細胞におけるシアンおよび赤色蛍光の分布から認められるように、適切な標的配列の組み込みにより予想された膜または核ＥＣＦＰ融合タンパク質の細胞内局在化が達成された。Ｅドメインまたは全長ＥＲαと同一なこの融合タンパク質の抗アポトーシス活性によって証明されるように、原形質膜へのＥドメインの支配的標的化により、リガンド誘導性抗アポトーシスシグナルを伝達する能力は変化しなかった。しかし、非常に対照的には、細胞核へのＥドメインの排他的な標的化により、その抗アポトーシス活性が完全に喪失した。
【００５９】
本明細書中に記載の図面は、本発明の実施形態を例示し、本発明の範囲の制限を意図しない。
【００６０】
（図面の簡単な説明）
図１は、インビボおよびインビトロでの性ステロイドによる骨芽細胞および骨細胞のアポトーシスの調節を示す一連のグラフである。Ａ．マウスの卵巣摘出および精巣摘出後の骨芽細胞および骨細胞アポトーシスの罹患率。バーは、群あたり４〜５匹の動物の平均±ＳＤを意味する。＊ｐ＜０．０５。Ｂ．頭蓋冠骨芽細胞を、１０−１１Ｍ〜１０−６ＭのＥ２またはＤＨＴで１時間処理後、プロアポトーシス薬エトポシド（５０μＭ）で６時間処理した。死細胞率を、トリパンブルー染色によって定量した。ステロイドの非存在下でのエトポシド誘導性アポトーシスを１００％とした。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを示す（Ｅ２またはＤＨＴ処理培養対各処理について異なる一元配置分散分析を使用した賦形剤について＊ｐ＜０．０５）。ＣおよびＤ。頭蓋冠由来の骨芽細胞またはＭＬＯ−Ｙ４骨細胞を１０−８ＭのＥ２またはＤＨＴで処理し、エトポシド、デキサメタゾン（１０−７）、またはＴＮＦα（１ｎＭ）の添加によってアポトーシスを誘導した。死細胞率をＢに記載のように定量した。結果を、二元配置分散分析によって分析した。各薬剤群および各薬剤対賦形剤内の前処理と所与の前処理と比較した場合、＊ｐ＜０．０５。Ｅ．コラーゲンゲルに組み込まれたＯＢ−６骨芽細胞を、異なる濃度のＥ２またはＤＨＴで２４時間処理した。無作為に選択した全部で２００個の細胞を評価した。賦形剤コントロールでは、３２．３±２．５％の細胞がアポトーシスであった。各処理について異なる一元配置分散分析を使用したＥ２またはＤＨＴ処理培地対賦形剤は＊ｐ＜０．０５。
【００６１】
図２は、Ｅ２またはＤＨＴの抗アポトーシス効果がＥＲまたはＡＲアンタゴニストの両方で阻害され、これはＥＲ（αまたはβ）またはＡＲのいずれかを介して媒介され得ることを示す一連のグラフである。頭蓋冠骨芽細胞をＥＲアンタゴニストＩＣＩ　１８２，７８０（１０−７Ｍ）またはＡＲアンタゴニストフルタミド（１０−７Ｍ）で３０分間前処理後、１０−８ＭのＥ２またはＤＨＴと１時間インキュベートした。その後、エトポシドを添加し、６時間後にアポトーシス細胞を図１Ｂに記載のように定量した。結果を、ステロイドの非存在下（１００％）でのエトポシド誘導性アポトーシスの百分率として示す。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを示す（ＡＮＯＶＡによって賦形剤に対して＊ｐ＜０．０５）。Ｂ．ＨｅＬａ細胞を、Ｎｕｃ−ＥＧＦＰ発現ベクターと共に、ＥＲα、ＥＲβ、ＡＲ，ＶＤＲ、またはＲＸＲ発現ベクターまたは空のベクター（ｅｖ）のいずれかで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションから１６時間後、細胞を表示の濃度のＥ２、ＤＨＴ、または１，２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３（１，２５Ｄ３）で１時間処理後、エトポシドで６時間処理した。２００から５００個のトランスフェクトした（蛍光）細胞の核の形態学の実験によってアポトーシス細胞を同定した。ステロイドの非存在下（−）で培養した細胞のエトポシド誘導性アポトーシスを１００％ととした。結果を、エトポシド誘導性アポトーシスの百分率として示した（平均±ＳＤ）。ＡＮＯＶＡによるステロイドの非存在下でエトポシドで処理した細胞に対して＊ｐ＜０．０５。
【００６２】
図３は、Ｅ（リガンド結合）ドメインへのＥＲαの抗アポトーシス活性の局在化および核標的化による除去を示す図である。Ａ．ＨｅＬａ細胞を、Ｎｕｃ−ＥＧＦＰおよび種々のＥＲα変異体の発現ベクターで同時トランスフェクトし、次いで１０−８ＭのＥ２で１時間処理後、エトポシドで６時間処理した。Ｂ．全長ＥＲαを、非標的化ＥＣＦＰに融合した（ＥＲα−ＥＣＦＰ）。ＥＲαのＥドメインを、非標的化ＥＣＦＰ（Ｅ−ＥＣＦＰ）、膜標的化ＥＣＦＰ（Ｅ−Ｍｅｍ−ＥＣＦＰ）、または核標的化ＥＣＦＰ（Ｅ−Ｎｕｃ−ＥＣＦＰ）のいずれかに融合した。これらの各融合タンパク質を、ＨｅＬａ細胞中で核標的化赤色蛍光タンパク質（Ｎｕｃ−ＥＲＦＰ）と共に発現し、その細胞内分布を落射蛍光顕微鏡で分析した。左および中央のパネルは、シアンまたは赤色フィルターセットを使用して得た同一の細胞の顕微鏡写真を示す。バー＝１５μｍ。その除去がシアン融合タンパク質の除去と容易に区別することができるので、本実験でＮｕｃ−ＥＲＦＰを使用してアポトーシスを定量した。トランスフェクト細胞を、１０−８のＥ２または賦形剤で１時間処理後、エトポシドで６時間処理した。３Ａおよび３Ｂのアポトーシスを、図２に記載のように定量した。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを示す。ＡＮＯＶＡによるエトポシドで処理されていない細胞に対して＊ｐ＜０．０５。
【００６３】
図４は、ＥＲおよびＡＲの抗アポトーシス活性がＳｒｃ／Ｓｈｃ／ＥＲＫシグナル伝達経路を介して媒介されることを示す図である。Ａ．ＭＬＯ−Ｙ４細胞を、Ｅ２またはＤＨＴと２、５、または１５分間、またはＰＤ９８０５９（５０μＭ）またはＰＰ１（１０μＭ）と２５分間インキュベート後、Ｅ２またはＤＨＴで５分間インキュベートした。細胞溶解物を得、タンパク質を抗ＥＲＫ１／２または抗ホスホＥＲＫ１／２（ｐ−ＥＲＫ１／２）抗体を使用したウェスタンブロット分析によって分析した。アポトーシスの同定のために、細胞を賦形剤、ＰＤ９８０５９、またはＰＰ１で３０分間インキュベート後、Ｅ２またはＤＨＴを添加した。３０分後、エトポシドを添加し、図１Ｂに記載のように６時間後にアポトーシスをアッセイした。Ｂ．図１Ｂに記載のように、Ｓｒｃ＋／＋対Ｓｒｃ−／−マウス由来の胚線維芽細胞においてアポトーシスに対するＥ２またはＤＨＴの効果を比較した。実験手順に記載のように、ＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｃ〜Ｅ．ＨｅＬａ細胞を、Ｎｕｃ−ＥＧＦＰおよび全長ＥＲαまたはそのＥドメインをコードする発現ベクター、またはＡＲのみ（Ｃ、左のパネル）またはｄｎ　ＭＥＫ（Ｃ、右のパネル）；キナーゼ活性を欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　Ｋ−）、ＳＨ２ドメインを欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　ΔＳＨ２）、またはＳＨ３ドメインを欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　ΔＳＨ３）（Ｄ）；またはＥＲαとともにｗｔ　Ｓｈｃ、ｄｎ　Ｓｈｃ変異体Ｙ２３９Ｆ／Ｙ２４０Ｆ／Ｙ３１７Ｆ（Ｓｈｃ　ＦＦＦ）、Ｙ３１７Ｆ（Ｓｈｃ　ＹＹＦ）、またはＹ２３８Ｆ／Ｙ２４０Ｆ（Ｓｈｃ　ＦＦＹ）（Ｅ）でトランスフェクトした。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを意味する。ＡＮＯＶＡによる、ステロイドを使用しないで培養した細胞に対して＊ｐ＜０．０５。
【００６４】
図５は、ペプチドを使用したＥＲα媒介転写作用対抗アポトーシス作用およびＥＲα媒介対ＥＲβ媒介効果の分離を示す図である。Ａ．ＨｅＬａ細胞を、ＥＲα発現ベクターのみまたはα−ＩＩペプチドのＳＶ４０プロモータによって駆動するＧＡＬ４　ＤＮＡ結合ドメインとの融合物を保有するベクターと共に一過性にトランスフェクトした。さらに、転写研究のために、細胞をＥＲＥ−ｌｕｃまたはＩＬ−６−ｌｕｃとトランスフェクトしアポトーシス研究のためにＥＧＦＰ−ｎｕｃでトランスフェクトした。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを示し、ＥＲＥ−ｌｕｃ刺激倍率またはＩＬ−６−ｌｕｃの阻害倍率、または賦形剤（Ｅ２−）または１０−８ＭのＥ２（Ｅ２＋）におけるアポトーシスを示すトランスフェクト細胞の％を示す。ＡＮＯＶＡによる賦形剤処理細胞にたいして＊ｐ＜０．０５。Ｂ．ＨｅＬａ細胞を、ＥＲαもしくはＥＲβのみまたは２Ｘ２９３もしくは２ＸＦ６ペプチドを保有する発現ベクターとともにトランスフェクトした。バーは、表示の受容体およびペプチドでトランスフェクトした細胞対受容体のみでトランスフェクトした細胞におけるＥ２（１０−８Ｍ）に応答する活性の三連の同定（ＥＲＥ−ｌｕｃ、ＩＬ−６−ｌｕｃ、または抗アポトーシス）の平均±ＳＤを示す。受容体を保有するがペプチドを保有しない細胞におけるＥ２誘導活性を、１００％とした。ＡＮＯＶＡによる受容体のみでトランスフェクトした細胞に対して＊ｐ＜０．０５。Ｃ．ＨｅＬａ細胞を、ＧＲＩＰペプチドのみまたはＥＲαを共に保有するベクターでトランスフェクトした。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを示す。ＡＮＯＶＡによる賦形剤処理細胞に対して＊ｐ＜０．０５。
【００６５】
図６は、合成リガンドを用いたＥＲの核内転写制御を介する活性から核内転写制御を介さない活性の分離を示す図である。Ａ．Ｃ３媒介転写のために、ＨｅＬａ細胞を、Ｃ３−ｌｕｃおよびＥＲαでトランスフェクトし、表示の濃度のエストレンまたはピラゾールで処理した。バーは、β−ガラクトシダーゼ活性を基準とした相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）の平均±ＳＤを示す。ＡＮＯＶＡによる空のベクター（ｅｖ）でトランスフェクトした細胞に対して＊ｐ＜０．０５。図１Ｂに記載のように、エストレンおよびピラゾールの抗アポトーシス活性を、頭蓋冠由来の骨芽細胞において評価した。ＡＮＯＶＡによるエトポシドで処理されていない細胞に対して＊ｐ＜０．０５。Ｂ．図４Ａに記載のように、ＭＬＯ−Ｙ４細胞を、表示濃度の異なるリガンドと５分間インキュベートし、ＥＲＫリン酸化を評価した。
【００６６】
図７は、性ステロイド受容体の古典的核内転写制御を介する活性からの抗アポトーシス活性のリガンド誘導分離についての提案モデルを示す図である。３つの絵は、核内転写制御を介する応答または抗アポトーシス応答のいずれかを示すために必要な、リガンドとの相互作用前後の受容体タンパク質の高次構造の状態を示す。不活性非ライゲーション受容体を、中央に灰色で示す。転写活性を優先的に誘発するリガンド（例えば、図６のピラゾール）との相互作用によって誘導された高次構造の変化を、右に青色で示す。受容体の抗アポトーシス活性を優先的に誘発するリガンド（例えば、図６のエストレン）との相互作用によって誘導された高次構造の変化を、右に赤色で示す。緑色の円および緑色の菱形は、２つのリガンドを示す；結合ポケット内の完全および不完全な適合を留意のこと。受容体に対する２つの異なる型のリガンドの会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度を、異なる幅および長さの矢印で示す。Ｅ２などのリガンドは、もちろん両方の高次構造を誘導する。抗アポトーシスモデルにおいて、受容体とＳｒｃとの間の直接的接触が認められるにもかかわらず、アダプタータンパク質が２つの分子間の相互作用に架橋することができる。不活性非ライゲーション状態における対応する受容体タンパク質のエネルギーレベル（破線）、核内転写制御を介する高次構造（青色の線）または抗アポトーシス高次構造（赤色の線）のいずれかへの進行を下部に示す。エネルギー線図中の不連続な縦軸は、２つの活性間のエネルギー要件における尺度の相違が大きいことを示す。
【００６７】
図８は、αＩＩおよび２９３ペプチドのＤｏｘ誘導性発現についての同一のマウスに同時移入した２つの導入遺伝子構築物の図である。
【００６８】
図９Ａは、Ｃｒｅリコンビナーゼの骨芽細胞特異的発現についてのＤｏｘ誘導系の作製および機能的特徴づけを示す図である。ＯＧ−２の調節下でのＣｒｅによるＲＯＳＡ２６遺伝子座の活性化。「ＳＡ」は、元のＲＯＳＡ２６遺伝子座のスプライス受容体部位を示す。
【００６９】
図９Ｂは、インビトロでのＣｒｅ発現のＤｏｘ誘導活性化を示すゲルである。Ｏｂ−６細胞を、Ｔｅｔ――ＯＧ２−Ｃｒｅ構築物で一過性にトランスフェクトし、次いで０．５ｍｇ／ｍｌ　Ｄｏｘまたは賦形剤で２４時間処理した。細胞を回収し、ＲＴ−ＰＣＲ分析によってＣｒｅ発現を評価した。レーン１はサイズマーカーを含む。レーン２は、空の賦形剤＋Ｄｏｘで処理した細胞を示す。レーン３は、Ｄｏｘを使用しないＯＧ−２−ｒｔＡ−Ｃｒｅを含む細胞を示す。レーン４は、Ｄｏｘを使用したＯＧ−２−ｒｔＡ−Ｃｒｅを含む細胞を示す。レーン４は、Ｄｏｘを使用して誘導したＯＧ−２−ｒｔＡ−Ｃｒｅプラスミドを含む。
【００７０】
図１０は、マウスＥＲα遺伝子のエクソン３および４を含む８６Ｋｂの核内転写制御を介する遺伝子座へのフロックス化（ｆｌｏｘｅｄ）エクソン３の標的を示す図である。
【００７１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ステロイド核内転写制御を介さない作用機構およびそれらのステロイド核内転写制御を介する作用に対する関係についての理解おける基本的発見に関する。（ｉ）核内転写制御を介さない効果および核内転写制御を介する効果は同一のステロイド受容体によって媒介することができること；（ｉｉ）両効果がリガンドで誘導されること；（ｉｉｉ）迅速且つ緩やかに適合することができるリガンド結合ドメインのリガンド誘導性活性化によって核内転写制御を介さない効果が発揮されること、（ｉｖ）典型的にはより遅く且つ強力な相互作用の結果であるステロイド受容体のＤＮＡ結合ドメインのリガンド誘導性活性化によって核内転写制御を介する効果が発揮されること；（ｖ）リガンド相互作用の核内転写制御を介さない効果が、選択的応答に影響を与えるような様式でリガンド相互作用の核内転写制御を介する効果から分離し得ることことを発見した。
【００７２】
この先駆的発見に基づいて、ステロイド受容体のステロイド核内転写制御を介する効果からステロイド核内転写制御を介さない効果を分離する方法が得られる。１つの実施形態では、本発明は、受容体を、受容体に核内転写制御を介さない効果を媒介させる様式で受容体のリガンド結合ドメインと十分に相互作用する一方で、核内転写制御を介する効果を誘導する様式でＤＮＡ結合ドメインを活性化させない化合物に接触させる工程を含む、ステロイドの核内転写制御を介さない効果を選択的に誘導する方法を含む。別の実施形態では、受容体を、受容体に核内転写制御を介する効果を媒介させる様式で受容体のＤＮＡ結合ドメインを十分に活性化させる一方で、核内転写制御を介さない効果を誘導する様式でリガンド結合ドメインを活性化させない化合物に接触させる工程を含む、ステロイドの核内転写制御を介する効果を選択的に誘導する方法を提供する。本明細書中に開示した全ての発明のうちの１つでは、受容体はエストロゲン受容体ではないか、プロゲステロン受容体ではない。
【００７３】
Ｉ．定義
本明細書中で使用される、「エストロゲン化合物」は、発情ホルモンの生物活性を保有する四員環のステロイド化合物またはその結合型およびエステル化誘導体、或いは同一の化合組成および構造を有しているが活性形態と立体化学が異なるので活性形態の生物活性を保有しないそれらの誘導体をいう。エストロゲンの非限定的な例には、ブロパレストロール、クロロトリアニセン、ジエノエストロール、エピメストロール、エキリン、エストラプロニケート、エストロピペート、エチニルエストラジオール、フォスフェストロール、ヒドロキシエセトロン、メストラノール、エストラジオール、エストリオール、結合型およびエステル化エストロゲン、エストロン、ポリエストラジオール、プロメストリン、キネストラドール、キネストロール、スチベストロール、およびゼラノールが含まれる。
【００７４】
本明細書中で使用される、「アンドロゲン」は、精巣または副腎皮質で産生することができるか合成ホルモンであり、男性の二次的な性の特徴を調節するように作用する四員環のステロイド化合物または同一の化学組成および構造を有しているが活性形態と立体化学が異なるので活性形態の生物活性を保有しない誘導体をいう。非限定的な例には、ボルデノン、クロステボール、ダナゾール、ドロスタノロン、エピチオスタノール、エチルエストレノール、フルオキシメステロン、フォルメボロン、フラザボール、メピチオスタン、メステロロン、メタンジエノン、メテノロン、メチルテストステロン、ナンドロロン、ノルエタンドロロン、オキサボロン、オキシメトロン、プラステロン、キンボロン、スタオロン、スタノゾールオール、テストステロン、およびトレンボロンが含まれる。
【００７５】
既知のように、エストロゲンおよびアンドロゲンはキラル炭素を有するので、多数の立体化学構造で存在し得る。典型的には、例えば、１７βヒドロキシエストロゲンは生物活性を有する一方で、１７αヒドロキシエストロゲンは性的特徴に対して効果はほとんどない（ホルモン様遺伝子転写活性をほとんど誘導しない）。本明細書の目的のために、化合物が本発明の明記した規準を満たす限り、生物活性構造、生物不活性構造、または活性の低い構造を含む任意の立体化学構造を使用することができる。
【００７６】
Ｓｔｅｒｏｉｄｓ　Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｔｏｎ　Ｈ．Ｈ．の「ステロイド」というタイトルのカタログは、多数のエストロゲンおよびアンドロゲン誘導体を含む３０００種を超えるステロイドのリストが記載されている。このカタログを、会社への連絡すれば入手することができ、現在、インターネットのｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｒａｌｏｉｄｓ．ｃｏｍで利用可能である。本発明で使用するためにこのライブラリーから選択および購入することができる（全て市販されているので容易に入手および評価できる）。
【００７７】
本明細書中で使用される、用語「ステロイド」は、伝統的に「タンパク質の核ホルモン受容体ファミリー」と呼ばれるものの１つに結合する任意のリガンドをいう。本発明での発見に基づいて、現在、これらの受容体には核を必要とせず、実際、核外または膜上に存在する場合に、おそらく核内と同様に核内転写制御を介さない効果を誘導することができることが判明した。各受容体ファミリーの各ファミリーメンバーの名称は、Ｃｅｌｌ、９７、１６１〜１６３、１９９９で公表されており、以下の表に再現する。この論文は、核受容体命名委員会が記載した。現在、ヒトゲノムおよびプロテオームの分析によって示されるように、ヒトには少なくとも６０のタンパク質ファミリーメンバーが存在することが既知であり、Ｎａｔｕｒｅ、４０９、８６０〜９２１、２００１に発表されている。この論文は、国際ヒトゲノム配列決定協会によって記載された。１つの実施形態では、Ｎａｔｕｒｅの論文に記載のように、受容体はジンクフィンガーおよびリガンド結合ドメインを有する。一般に、ステロイド受容体は、可変性の高いＮ末端トランス活性化ドメイン（ＮＴ−ＴＡＤ）、その後に２つのジンクフィンガーからなる保存性の高いＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ヒンジ領域、および中程度に保存されたＣ末端リガンド結合ドメイン（ＣＴ−ＬＢＤ）を有する。これらの領域は、標的ステロイド受容体に対して既にマッピングされているか、既知の技術を使用して容易にマッピングされる。
【００７８】
【表１】
2004507232.tif 000002
【００７９】
用語「骨量」は、骨塩（ｍｉｎｅｒａｌ）量をいい、典型的には、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＥＸＡ）によって同定する。
【００８０】
用語「骨強度」は、機械的な力に対する耐性をいい、椎骨圧縮強度または長骨の三点曲げを含む任意の既知の方法によって測定することができる。
【００８１】
用語「骨質」は、非鉱化骨基質が過剰に蓄積しない正常なコラーゲン配位をいい、非脱灰骨組織形態計測を含む任意の既知の方法によって測定することができる。
【００８２】
用語「抗骨吸収薬」は、破骨細胞の再構築または活性および／または寿命の抑制によって骨吸収を遮断する化合物をいう。
【００８３】
用語「骨減少症」は、構造の完全性を損なう許容範囲未満の骨量の減少をいう。
【００８４】
本明細書中で使用される、用語「キメラ」は、２つの異なる受容体の遺伝子配列の融合によって形成されたＤＮＡ鎖を意味する。ステロイド受容体は、ＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインの両方から構成される。キメラ受容体では、ＤＮＡ結合ドメインがある受容体の遺伝コードから構成され、別の受容体の遺伝コードからリガンド結合ドメインが構成される。これら２つのドメインを融合して、キメラ受容体を形成する。ドメインは、異なる種または同一の種内の異なる受容体由来であり得る。
【００８５】
本明細書中で使用される、用語「オーファン」は、アミノ酸相同性によって同定された約６９受容体のファミリーをいう。オーファン受容体は、ＤＮＡ結合ドメイン中に高度に保存されたアミノ酸配列を有し、受容体のリガンド結合ドメイン中に存在するコンセンサス領域を有する。ファミリーの任意のメンバーを直接活性化するリガンドが同定されていないので、これらをオーファン受容体と呼ぶ。オーファン受容体の例は、ニワトリオボアルブミン上流プロモータ転写因子（ＧＯＵＰ−ＴＦ）である。
【００８６】
本明細書中で使用される、用語「代謝骨疾患」、「整形外科上の骨障害」、または「歯疾患」を、骨量の減少および／または骨および／または歯構造の崩壊によって特徴付けられる病態として定義する。
【００８７】
本明細書中で使用される、用語「アポトーシス」は、形態学的基準および末端ウリジンデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色によって検出される核断片化および細胞の萎縮で特徴付けられる計画的細胞死をいう。
【００８８】
本明細書中で使用される、用語「宿主」は、任意のステロイド受容体を含んでいる細胞または動物をさす。
【００８９】
本明細書中で使用される、用語「導入遺伝子」は、動物のゲノム、特に生きた動物の哺乳動物細胞に人工的に挿入されているか挿入されようとしている遺伝物質を説明する。
【００９０】
「トランスジェニック動物」は、細胞の一部に核外エレメントとして存在するか、その生殖系列ＤＮＡ（すなわち、その細胞のほとんどまたは全部の核内転写制御を介する配列中）に安定に組み込まれた非内因性（すなわち、異種）核酸配列を有する非ヒト動物（通常、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど））を意味する。異種核酸を、宿主動物の例えば胚または胚幹細胞の遺伝子操作によってこのようなトランスジェニック動物に移入する。
【００９１】
「構築物」は、特定の核酸配列を発現させるために作製されるか他の組換えヌクレオチド配列の構築で使用される組換え核酸（通常、組換えＤＮＡ）を意味する。
【００９２】
「作動可能に連結された」は、ＤＮＡ配列および調節配列が適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合した場合に遺伝子発現するような方法で接続されていることを意味する。
【００９３】
「作動可能に挿入された」は、目的のヌクレオチド配列が、目的の移入ヌクレオチド配列の転写および翻訳を指示する（すなわち、例えばＡＰＰ配列によってコードされるポリペプチドの産生を促進する）ヌクレオチド配列に隣接して存在することを意味する。
【００９４】
「シグナル伝達経路応答性転写調節単位」は、転写アクチベータタンパク質がシグナル伝達経路の活性化に応答して調節配列に結合した場合に遺伝子を発現する調節ＤＮＡ配列を意味し、これにはＭＡＰＫ、κＢ細胞の核因子（ＮＦκＢ）、ＪＮＫ、ＡＰ−１、ｐ３８Ｋ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＩ３−Ｋ、またはＮＦＡＴシグナル伝達経路が含まれるが、これらに限定されない。シグナル伝達経路応答性転写調節単位の転写アクチベータタンパク質を、シグナル伝達経路においてタンパク質キナーゼによってリン酸化し、その後ＤＮＡ調節配列に結合することができる。シグナル伝達経路応答性転写調節単位の例には、血清応答因子、アクチベータタンパク質１、ｃＡＭＰ応答エレメント、ＥボックスＤＮＡ結合エレメント、Ｅ２Ｆ　ＤＮＡ結合エレメント、糖質コルチコイド応答エレメント、熱ショック応答エレメント、インターフェロンγ活性化配列、インターフェロン刺激応答エレメント、活性化Ｔ細胞の核因子、κＢ細胞の核因子、ｐ５３応答エレメント、Ｒｂ応答エレメント、およびＳＴＡＴ３応答エレメントが含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
本明細書中で使用される、用語「レポーター遺伝子」は、試験化合物または化学的シグナルによって転写される場合にタンパク質を産生する任意の種々の遺伝子をいう。このタンパク質を測定して転写に対する効果を同定する。レポーター遺伝子を、エストロゲン応答エレメントなどのステロイド応答エレメントの調節下でプロモータに作動可能に連結する。
【００９６】
「ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性」は、受容体のＤＮＡ結合ドメインの活性化または補助転写レギュレーターとの相互作用を必要としない受容体のリガンド結合ドメインのみの急速な活性化を意味する。
【００９７】
「ステロイド受容体の核内転写制御を介する活性」は、転写および翻訳のインヒビターに感受性を示すリガンド依存性転写調整を意味する。
【００９８】
「ステロイド受容体関連障害」は、ステロイドまたはステロイド受容体の異常に高いまたは低い濃度、利用可能性、変異、または他の不均衡によって発症するか特徴付けられる任意のヒトまたは動物の障害、病態、または疾患を意味する。「異常に高い」は、通常十分な生理学的、生化学的、身体的、精神的、または心理学的影響による発現を超えた任意の相違を意味する。「異常に低い」は、通常十分な生理学的、生化学的、身体的、精神的、または心理学的影響による発現未満の任意の相違を意味する。好ましい実施形態では、ステロイド関連障害は、閉経後の女性の障害などのさらなるステロイド転写活性が望ましくないような障害である。ステロイド受容体関連障害は、ステロイドホルモン受容体を発現する任意の細胞、組織、器官、または系と関連し得る。
【００９９】
ＩＩ．ステロイド応答の選択的誘導法。
【０１００】
この先駆的発見に基づいて、ステロイド受容体のステロイド核内転写制御を介する効果からステロイド核内転写制御を介さない効果を分離する方法が得られる。１つの実施形態では、本発明は、受容体を、受容体に核内転写制御を介さない効果を媒介させる様式で受容体のリガンド結合ドメインと十分に相互作用する一方で、有意な核内転写制御を介する効果を誘導する様式でＤＮＡ結合ドメインを活性化させない化合物に接触させる工程を含む、ステロイドの核内転写制御を介さない効果を選択的に誘導する方法を含む。別の実施形態では、受容体を、受容体に核内転写制御を介する効果を媒介させる様式で受容体のＤＮＡ結合ドメインを十分に活性化させる一方で、有意な核内転写制御を介さない効果を誘導しない化合物に接触させる工程を含む、ステロイドの核内転写制御を介する効果を選択的に誘導する方法を提供する。天然のステロイド効果の１０％未満、好ましい実施形態では天然のステロイド効果の５、１、または０．１％未満である効果である場合、リガンドは「有意な」または「実質的な」効果を誘導しないと考えられる。
【０１０１】
核内転写制御を介さない活性型の例には、細胞内の第２の伝令系、シグナル伝達経路、好ましくはタンパク質キナーゼシグナル伝達経路、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路、Ｓｒｃ／Ｓｈｃ／ＥＲＫシグナル伝達経路の活性化；細胞内カルシウム濃度の調節；分泌；細胞形態学の変化；細胞移動性；細胞骨格再配列；およびアポトーシスが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０２】
本発明の別の態様では、リガンド結合相互作用活性をマスクする手段としての受容体上の結合部位でステロイド受容体の内因性または外因性リガンドと競合する選択的誘導化合物（ペプチド、タンパク質、またはリガンドアンタゴニストが含まれるが、これらに限定されない）を投与することができる。１つの例として、リガンドの核内転写制御を介さない効果の誘導を阻止する方法でリガンド結合ドメインと結合するペプチドまたはリガンドアンタゴニストを投与することができる。別の実施形態では、リガンドの核内転写制御を介する効果の誘導を阻止する方法でＤＮＡ結合ドメインを不活化するペプチドまたはリガンドアンタゴニストを投与することができる。選択的誘導化合物は、所望するＤＮＡ−受容体相互作用の直接的干渉またはリガンド結合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインとのタンパク質−タンパク質相互作用形成の間接的阻止によってステロイド受容体の転写活性を阻害することができる。さらに、選択的誘導化合物は、成分が組み合わされるように少なくとも２つの成分を有する複合体として存在することができ、複合体はステロイド受容体の核内転写制御を介する活性を不活化し、核内転写制御を介さない活性を活性化する。
【０１０３】
さらに別の実施形態では、受容体の高次構造または配置の変化の誘導によって受容体のＤＮＡ結合領域を不活化する有効量の化合物を投与する工程を含む、ステロイド受容体の選択的効果の誘導法が得られる。本発明のさらに別の態様では、受容体の高次構造または立体配置の変化を誘導することにより、受容体のリガンド結合領域のみによって媒介される機能を不活化する有効量の化合物を投与する工程を含む、ステロイド受容体の選択効果を誘導する方法が得られる。本明細書中で使用される、用語「高次構造の変化」は、受容体の三次元構造の変化をいう。用語「立体配置」は、タンパク質構造の化学変化をいう。
【０１０４】
本発明を使用して、任意のステロイド受容体ファミリー（本明細書中の表１に記載のものを含むが、特に、エストロゲン受容体のαまたはβ形態（ＥＲαおよびＥＲβ）、エストロゲン受容体関連受容体１および受容体２（ＥＲＲ−１およびＥＲＲ−２）、アンドロゲン受容体（ＡＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、レチノイン酸受容体（および関連オーファン受容体ＲＯＲα、ＲＯＲβ、およびＲＯＲγ）；糖質コルチコイド受容体（ＧＲ）、電解質コルチコイド受容体（ＭＲ）、ビタミンＤ受容体、神経刺激受容体、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲαおおびＬＸＲβ）、甲状腺ホルモン受容体ＡおよびＢ（トリヨードチロニン（Ｔ３）およびチロキシン（Ｔ４）に結合する）、ＣＯＵＰ−ＴＦ、エクジソン、ＰＰＡＲファミリー（ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、およびＰＰＡＲσが含まれるペルオキシソーム増殖活性化タンパク質）、プレグナンＸ（「ＰＸＲ」）、胆汁酸結合ファミリー、ならびにキメラ受容体およびオーファン受容体が含まれる）の応答を選択的に起こすことができる。
【０１０５】
ＩＩＩ．無関係の受容体を介する、ステロイドによる核内転写制御を介さない効果の誘導
本発明の別の実施形態では、ステロイドは、典型的な結合受容体以外のステロイド受容体との相互作用を介して核内転写制御を介さない効果を誘導することができることが発見された。本明細書中で使用される、用語「無関係の受容体」は、ステロイドが核内転写制御を介する効果を誘導しないものをいう。これまで、定義によればステロイドは無関係の受容体を介して核内転写制御を介する効果を誘導せず、細胞の核内転写制御を介さない効果が全く不明であったので、ステロイドが無関係の受容体を作用することができることは未知であった。したがって、本発明は、受容体を所望の効果を得るためにステロイドのリガンド結合ドメインに結合してその機能を活性化させるのに十分な無関係のステロイドに接触させる工程を含む、ステロイド受容体の核内転写制御を介さない効果を選択的に誘導する方法を含む。本明細書中に記載の任意のスクリーニング法を使用して、選択したステロイドが以前に無関係であると考えられていたステロイド受容体を介した標的核内転写制御を介さない効果を誘導することができるかどうかを同定することができる。
【０１０６】
本発明のこの態様の１つの非限定的な例では、エストロゲン受容体（ＥＲαおよびＥＲβ）およびアンドロゲン受容体（ＡＲ）は、結合リガンドがエストロゲンまたはアンドロゲンであるかどうかに関係なく類似の効率で骨芽細胞および骨細胞に抗アポトーシスシグナルを伝達することができることが発見された。さらに、骨芽細胞／骨細胞の場合に細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）の活性化を含むエストロゲンおよびアンドロゲン作用の核内転写制御を介さない受容体依存性機構が受容体の転写活性から機械的に分離可能であることが発見された。
【０１０７】
ステロイドは以前に無関係とみなされているステロイド受容体を使用して核内転写制御を介さない効果を誘導することができるという事実は、現在、ステロイドの核内転写制御を介さない効果が各クラスの受容体を欠く細胞または組織で発揮されるという発明の背景の例外的記載を説明する。このような場合、ステロイドは、核内転写制御を介さない効果を媒介するために無関係のステロイド受容体を使用する（勿論、この効果が全く受容体を媒介しない場合を除く）。
【０１０８】
ＩＶ．ステロイド応答を選択的に誘導する能力について化合物をスクリーニングする方法
実質的にステロイドの核内転写制御を介する効果を誘導することなくステロイドの核内転写制御を介さない効果を誘導することができるか実質的にステロイドの核内転写制御を介さない効果を誘導することなくステロイドの核内転写制御を介する効果を誘導することができる化合物のスクリーニング法が得られる。本方法を、
（１）化合物の実質的にステロイド受容体のＤＮＡ結合ドメインを活性化することなくステロイド受容体のリガンド結合ドメインにほぼ結合する能力またはステロイド受容体のリガンド結合ドメインによって媒介される機能を実質的に活性化することなくステロイド受容体のＤＮＡ結合ドメインをほぼ活性化する能力を評価する工程と、その後
（２）試験化合物の生物活性を測定して、実質的に核内転写制御を介する効果を誘導することなく標的核内転写制御を介さない効果を誘導する能力または実質的に核内転写制御を介さない効果を誘導することなく標的核内転写制御を介する効果を誘導する能力を評価する工程とを含む、多数の方法で行うことができる。
【０１０９】
第１の工程を、好ましくはコンピュータ支援による分子モデリングによって行うことができる。あるいは、機能的ＤＮＡ結合ドメインを欠く受容体の改変形態を使用して、試験化合物がリガンド結合ドメインまたはＤＮＡ結合ドメインを活性化するかを同定することができる。改変形態を、例えば、形質転換細胞中で発現させることができる。インビトロで培養した細胞を、ステロイド受容体またはその遺伝子変異体を発現するように遺伝子を変化させることができる。核内転写制御を介する活性を、試験化合物との反応で得られた全ｍＲＮＡ量または１つまたは複数のステロイド調節遺伝子に特異的なｍＲＮＡの測定などの既知の技術を使用して定量することができる。スクリーニングはインビボまたはインビトロで行い得る。
【０１１０】
あるいは、工程１および２を、インビトロ細胞ベースのアッセイにおいて実質的に他の効果を誘導することなく核内転写制御を介さない効果または核内転写制御を介する効果のいずれかを選択的に誘導する化合物の簡単なアッセイによって組み合わせることができる。
【０１１１】
本発明のさらなる実施形態は、組織培養細胞株を細胞が適切なコンフルエンス（典型的には、約５０％コンフルエンス）に達するまで増殖させる工程と；前記組織培養物を特異的受容体の適切な発現プラスミドおよび前記選択受容体に反応性を示す標的遺伝子のための発現プラスミドでトランスフェクトする工程と；前記トランスフェクト細胞を試験化合物と接触させる工程と；前記試験化合物の標的遺伝子に対する効果を同定して、前記化合物が核内転写制御を介する効果を誘導するかを同定する工程とを含む、組織培養スクリーニング系の作製法である。この実施形態の態様では、化合物が所望の核内転写制御を介する効果を誘導するかどうかも評価される。この実施形態の非限定的な例として、細胞をプロアポトーシス薬と接触させ；試験化合物に接触させたアポトーシストランスフェクト細胞数を同定し；アポトーシスを阻害し、且つ実質的に標的遺伝子の転写を誘導しない化合物を選択する。
【０１１２】
本明細書中に記載のスクリーニング法では、組織培養細胞は、生物活性が試験される受容体を欠いてもよい。この場合、失われた受容体のｃＤＮＡまたは欠失受容体のキメラを保有するプラスミドのトランスフェクションによって細胞株に失われた受容体を付加する。この受容体の応答エレメントもまた、トランスフェクションを介して付加することができる。
【０１１３】
受容体応答エンハンサーＤＮＡエレメントを、系で使用した特定の受容体に対応する応答エレメントから選択する。
【０１１４】
基本プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに結合することができる「ＴＡＴＡ」エレメントを含む最小プロモータ配列からなり任意の一般的に使用されるエレメントから選択される。例えば、チミジンキナーゼプロモータ、オボアルブミンプロモータ、およびＭＭＴＶ　ＬＴＲがあげられる。
【０１１５】
レポーター遺伝子を、タンパク質産物が容易にアッセイまたは検出される任意の種々の遺伝子から選択することができる。タンパク質を熱量測定法、蛍光法；免疫化学的方法；化学的方法、または放射化学的方法によって容易にアッセイすることができることが当業者に容易に認識される。さらに、レポーター遺伝子はキメラであり得る。使用することができる種々のレポーター遺伝子の例には、細菌酵素クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ペプチドホルモン、成長因子、およびキメラタンパク質が含まれる。好ましい実施形態では、非天然タンパク質産生遺伝子を使用する。例えば、ＣＡＴは通常哺乳動物細胞に存在しない酵素であり、アッセイが容易であるので、哺乳動物系で使用される。したがって、組織培養細胞におけるＣＡＴの受容体依存性活性化を使用して、受容体と直接または間接的に相互作用して遺伝子の転写を活性化させる化合物を同定することができる。
【０１１６】
別の実施形態では、（ｉ）天然または人工ステロイド受容体を発現する細胞を試験化合物と接触させる工程と、（ｉｉ）試験化合物が前記ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性（細胞内の第２の伝令系、シグナル伝達経路、タンパク質キナーゼシグナル伝達経路、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路、Ｓｒｃ／Ｓｈｃ／ＥＲＫシグナル伝達経路；細胞内カルシウム濃度の調節；分泌；細胞形態学の変化；細胞移動性；細胞骨格再配列；またはアポトーシスが含まれるがこれらに限定されない）を活性化させるかどうかを評価する工程と、（ｉｉｉ）前記試験化合物によって誘導された転写レベルを同定する工程と、（ｉｖ）実質的に前記ステロイド受容体の核内転写制御を介する活性を活性化することなく前記ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を活性化させる化合物を選択する工程とを含む、ステロイド受容体関連疾患または障害の治療用化合物のスクリーニング法が得られる。ステロイド受容体の核内転写制御を介する活性が「実質的に活性化される」は、天然のステロイド受容体の１０％を超える転写、好ましくは５、２、１、または０．１％未満の転写の活性化を意味する。
【０１１７】
別の実施形態では、（ｉ）天然または人工性ステロイド受容体を発現する細胞を試験化合物のみまたはプロアポトーシス薬との組み合わせと接触させる工程と、（ｉｉ）試験化合物が前記ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性（例えば、タンパク質キナーゼシグナル伝達経路、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路などのシグナル伝達経路、または一般にアポトーシスを予防する機構）を活性化させるかどうかを評価する工程と、（ｉｉｉ）前記試験化合物によって誘導された転写レベルを同定する工程と、（ｉｖ）前記試験化合物が試験化合物のみまたはプロアポトーシス薬との組み合わせと接触させた細胞中でアポトーシスを阻害するかを同定する工程と、（ｖ）実質的に前記ステロイド受容体の核内転写制御を介する活性を活性化することなく前記ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を活性化させる化合物を選択する工程とを含む、性ステロイド受容体関連疾患または障害の治療用化合物のスクリーニング法が得られる。
【０１１８】
さらに別の実施形態では、本明細書中にさらに記載の方法または他の既知の方法を使用して、化合物が実質的に受容体のＤＮＡ結合ドメインを活性化することなくエストロゲンまたはアンドロゲン受容体の抗アポトーシスドメインを活性化させるかどうかを評価する工程を含む、骨疾患の治療または骨量の増加に有用な化合物の選択法が得られる。好ましい実施形態では、ステロイドホルモン受容体タンパク質を、内因性ＤＮＡから発現させる。別の実施形態では、受容体配列はヒト、非ヒト、またはキメラであり得る。キメラは、少なくとも２つの異なる供給源由来の配列の混合物から構成される配列を意味する。あるいは、受容体を、特定の配列が欠失、付加、または改変されるように遺伝子を変化させることができる。
【０１１９】
別の実施形態では、ステロイドホルモン受容体のＤＮＡ結合ドメインの活性化を、受容体遺伝子に作動可能に連結された操作可能なホルモン応答エレメントをコードする非内因性ＤＮＡ配列の使用によって同定する。転写レベルの測定法は当該分野で既知であり、これにはｍＲＮＡの物理的単離および定量ならびにより複雑な手順が含まれる。例えば、ｍＲＮＡの産生を、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して定量することができる。最適に行われた場合、ＲＴ−ＰＣＲを使用して非常に低レベルで産生された転写物を検出することができ、微量の出発材料でＲＮＡを同定することができる。試薬およびＲＴ−ＰＣＲキットは、市販されている。したがって、転写レベルに対する化合物の効果を評価するために内因性ｍＲＮＡレベルを容易にモニターすることができる。本発明の他の実施形態では、ステロイド受容体と相互作用する試験化合物に応答する細胞の外観または物理的特徴の変化のアッセイによって化合物はスクリーニングされない。
【０１２０】
あるいは、遺伝子発現を、ＤＮＡマイクロアレイアッセイを使用して同定することができる。簡単に述べれば、長い二本鎖相補ＤＮＡまたはオリゴヌクレオチドの形態の核酸を、ロボット制御ピンまたは固相化学合成のいずれかを使用して顕微鏡用ガラススライドにアプライする。何万〜何十万の固有の核酸スポットを、各スライドにアプライすることができる。次いで、放射性または蛍光標識サンプル（プローブ）ＤＮＡを、スライドにアプライし、適当な時間および数回の洗浄後、ハイブリッド形成プローブ核酸を、顕微鏡またはスキャナを使用して検出する。スライド上の各スポットの核酸の正体が既知である場合、サンプル中の対応する核酸を、スライド上のスポットの位置でのシグナルの存在によって検出することができる。この方法を使用して、数千の遺伝子の発現レベルを、わずか数時間で同時に測定することができる。
【０１２１】
さらに別の実施形態では、選択的核内転写制御を介さないシグナル伝達のアクチベータを、（ｉ）天然または人工ステロイド受容体を発現する細胞を試験化合物と接触させる工程と、（ｉｉ）前記試験化合物に接触させた細胞中のＥＲＫ活性化量を同定する工程と、（ｉｉｉ）前記試験化合物に接触させた細胞中の転写量を同定する工程と、（ｉｖ）天然ステロイドに接触させた細胞の転写レベルと比較してＥＲＫ活性化およびより少ない細胞の転写レベルを示す試験化合物に接触させた細胞を選択する工程とによって選択することができる。好ましい実施形態では、ＳＲＥ−ＳＥＡＰ構築物（正の読み出し）およびＣ３（補体３）転写（負の読み出し）を使用してＥＲＫ活性化を同時に検出する高処理組み合わせスクリーニングを使用して化合物を同定する。
【０１２２】
ＳＲＥ−ＳＥＡＰアッセイは、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の発現を駆動する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモータの上流に存在する血清応答エレメント（ＳＲＥ）の転写因子（Ｅｌｋ−１／ＳＲＥ）誘導活性化のアッセイによってＭＡＰＫ／ＪＮＫシグナル伝達経路の活性化を検出する。このアッセイは、ＭＥＫ１またはＭＥＫＫ１のインビボアッセイ用のキットとして市販されている。一般に、トランスフェクションから２４時間後、血清含有培地を約０．２％血清を含む培地と交換する。細胞を約０．２％の血清中で２４時間培養後、アッセイする。コントロールサンプルを、賦形剤のみで処理する。
【０１２３】
本発明のさらなる実施形態は、適切な培地中で組織培養スクリーニング系を増殖させる工程であって、前記組織培養スクリーニング系の細胞株が少なくとも１つの同定された核内転写制御を介さない活性を有するステロイド受容体を含み、前記培地に試験化合物または化学的シグナルを添加する工程と、転写量および核内転写制御を介さない活性量を測定する工程とを含む、実質的に核内転写制御を介する性受容体活性を活性化することなく核内転写制御を介さない性受容体を活性化させる試験試験化合物または化学的シグナルを同定するためのアッセイである。当業者は、選択した培地は選択した細胞株に依存し、これは当該分野で既知の任意の化学的に定義され且つ細胞株に適切な培養培地であることを容易に認識する。受容体およびレポーター遺伝子を、一過性または安定なトランスフェクションのいずれかによって付加することができる。
【０１２４】
別の実施形態では、（ｉ）細胞培養培地中で細胞を培養する工程であって、前記細胞がステロイド受容体を天然にまたは人工的に発現し；（ｉｉ）前記細胞を試験化合物に接触させる工程と、（ｉｉｉ）前記試験化合物が前記ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を活性化するかを同定する工程と、（ｉｖ）前記試験化合物が前記ステロイド受容体の核内転写制御を介する活性を活性化するかを同定する工程と、（ｖ）ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を活性化するが実質的に核内転写制御を介する活性を活性化しない化合物を選択する工程を含む、ステロイド受容体の選択性リガンドのスクリーニング法が得られる。
【０１２５】
１つの実施形態では、細胞株はＯＢ−６であり、核内転写制御を介さない活性を、試験化合物がアポトーシスを阻害するかどかの評価によって同定することができる。アポトーシスは当事者に公知の方法で測定し得る。例えば、細胞を、アポトーシスと相互関係を示す核形態学の変化の評価を支援するための核に局在化した緑色蛍光タンパク質でトランスフェクトすることができる。アポトーシスを、末端ウリジンデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼニック末端標識、ｉｎ　ｓｉｔｕ末端標識、ヘキスト染色、またはカスパーゼ−３活性の評価を使用して同定することもできる。さらに、核内転写制御を介さない活性を、シグナル伝達経路、好ましくはＳｒｃ／Ｓｈｃ／ＥＲＫシグナル伝達経路を活性化するかの同定によって評価することができる。血清応答エレメントの誘導活性化が分泌アルカリホスファターゼの発現を駆動するように、核内転写制御を介さない活性マーカー、好ましくは血清応答エレメント／分泌アルカリホスファターゼ（ＳＲＥ−ＳＥＡＰ）構築物で細胞をトランスフェクトすることができる。ＳＲＥ−ＳＥＡＰ構築物により、転写因子（Ｅｌｋ−１／ＳＲＦ）のアッセイによってＭＡＰＫ／ＪＮＫシグナル伝達経路の活性化が検出される。核内転写制御を介する活性の程度を、当該分野で既知の技術を使用して評価することができる。好ましい実施形態では、試験化合物に接触したステロイド受容体を単離し、特定のステロイド受容体に関連するステロイド応答エレメントに対応する核酸配列と組み合わせることができる。ステロイド−試験化合物複合体の応答エレメント配列への結合の欠如は、試験化合物が核内転写制御を介する活性に影響を与えないことを示す。非標識ステロイドまたは非標識応答エレメントを固相に固定することができ、次いで、必要に応じて標識ステロイドまたは標識応答エレメントを固相に付加することができることが当業者に認識される。試験化合物の存在下での固相上の標識の検出は、試験化合物−受容体複合体は核酸に結合しないので、核内転写制御を介する活性に影響を与えないことを示す。あるいは、ステロイド受容体−試験化合物複合体を、既知の核転写因子（ＡＰ−１、ＮＦｋＢ、ＳＲＣ−１などが含まれるが、これらに限定されない）を使用した結合アッセイに使用することができる。ステロイド受容体−試験化合物が転写因子と結合しないことは、試験化合物が核内転写制御を介する活性を阻害しないことを示す。
【０１２６】
本発明のさらなる実施形態は、細胞が任意選択的にステロイド受容体、核内転写制御を介する活性検出用の誘導レポーター遺伝子、または核内転写制御を介さない活性検出用のレポーター遺伝子プラスミドでトランスフェクトすることができるように複数のトランスフェクタントを使用したスクリーニング法を含む。ステロイド受容体は、１つまたは複数のレポーター遺伝子発現を誘導することができるように転写活性を示す。トランスフェクト細胞を試験化合物で処理した場合にレポーター遺伝子発現の変化のモニターによって核内転写制御を介する活性または核内転写制御を介さない活性に対する所望の効果について化合物をスクリーニングすることができる。例えば、第１のレポーター遺伝子構築物は、トランスフェクトステロイド受容体がステロイド応答エレメントと相互作用してレポーター遺伝子の発現を誘導するタンパク質をコードするようにレポーター遺伝子の上流に応答エレメントを有することができる。細胞は、一重、二重、または三重トランスフェクタントであるか、任意の他の多重トランスフェクタントであり得る。別の実施形態では、（ａ）細胞を試験化合物に接触させる工程であって、前記細胞は、
ｉ）機能的ステロイド受容体またはステロイド受容体の遺伝子変異体をコードするＤＮＡ配列であって、前記ステロイド受容体が転写活性を示し、
ｉｉ）応答エレメント−受容体遺伝子構築物と、
ｉｉｉ）血清応答エレメント−受容体構築物とでトランスフェクトされており、
（ｂ）前記応答エレメントレポーター遺伝子構築物の転写に対する前記試験化合物の効果を同定する工程と、
（ｃ）前記血清応答エレメント−レポーター遺伝子構築物の転写に対する前記試験化合物の効果を同定する工程と、
（ｄ）実質的に応答エレメントＥＲＥレポーター遺伝子構築物の転写に影響を与えることなく血清応答エレメント−受容体遺伝子構築物の転写を活性化する化合物を選択する工程とを含む、実質的に核内転写制御を介する活性を誘導することなく核内転写制御を介さない活性を誘導するステロイド受容体のリガンドのスクリーニング法が得られる。
【０１２７】
当業者は、複数のトランスフェクタントを含む１つの細胞株よりもむしろ複数の細胞株を使用して本発明を実施することができることを認識する。１つの実施形態では、転写活性ステロイド受容体および前記ステロイド受容体に転写応答する第１のレポーター遺伝子構築物でトランスフェクトした第１の細胞株を得る工程と；転写活性ステロイド受容体および第２のレポーター遺伝子構築物でトランスフェクトした第２の細胞株を得る工程であって、前記第２のレポーター遺伝子構築物の転写は核内転写制御を介さない活性、好ましくはシグナル伝達経路の活性化を示し；前記第１および第２のレポーター遺伝子構築物の転写に対する前記試験化合物の効果を同定する工程と；実質的に前記第１のレポーター遺伝子構築物の転写を活性化することなく前記第２のレポーター遺伝子構築物の活性化を誘導する化合物を選択する工程を含む、ステロイド受容体関連障害を治療するための化合物のスクリーニング法が得られる。
【０１２８】
本発明のさらに別の実施形態では、試験化合物を宿主、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはマウスに投与する工程と；標的核内転写制御を介さない作用に対する化合物の効果を同定する工程と；ステロイド受容体によって調節される遺伝子の転写に対する化合物の効果を同定する工程と、ステロイド調節遺伝子の核内転写制御を介さない効果を媒介し、且つ実質的に転写を活性化しない化合物を選択する工程とを含む、ステロイドレポーター関連疾患または障害治療に有効な化合物のスクリーニング法が得られる。
【０１２９】
骨細胞のアポトーシスを、ＴＵＮＥＬまたはヘキスト染色を使用した試験化合物投与後の宿主からの骨細胞の獲得によって評価することができる。さらに、骨組織形態計測を、骨組織に対する試験化合物の効果の直接且つ正確な分析に使用することができる。組織学サンプルを、通常、骨生検によって得る。骨細胞のアポトーシスに対する試験化合物の効果を、骨量または骨強度に対する試験化合物の効果の同定によって評価することもできる。骨量を、ＤＥＸＡまたは末梢骨コンピュータ断層撮影法（ｐＱＣＴ）を使用して評価することができる。骨強度を、生化学試験を使用して測定することができる。ステロイド調節遺伝子転写の活性化を、子宮肥大活性または乳房活性に対する試験化合物の効果の同定によって評価することができる。
【０１３０】
当業者は、本発明のスクリーニング法を使用して、ステロイドの核内転写制御を介さない活性を活性化することなくステロイド受容体の核内転写制御を介する活性を活性化する化合物を同定することもできることを認識する。ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性は望ましくないが、核内転写制御を介する活性は望ましい場合、これらの化合物を使用することができる。したがって、これらの化合物を使用して、ステロイドの核内転写制御を介する活性が望まれるが、核内転写制御を介さない活性が望まれないステロイドまたはステロイド受容体関連疾患および障害を治療することができる。したがって、（ｉ）天然または人工ステロイド受容体、１つの実施形態では性ステロイド受容体を発現する細胞を試験化合物に接触させる工程と；（ｉｉ）前記化合物が前記ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を活性化するかを評価する工程と；（ｉｉｉ）前記試験化合物によって誘導された転写レベルを同定する工程と、（ｉｖ）実質的にステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を活性化することなく前記ステロイド受容体の核内転写制御を介する活性を活性化する化合物を選択する工程とを含む、ステロイド受容体関連疾患または障害、１つの実施形態では性ステロイド受容体関連疾患を治療するための化合物のスクリーニング法が得られる。実質的にステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を活性化するとは、細胞中で第２の伝令系が核内転写制御を介さない生物学的応答を誘導するような第２の伝令系の活性化を意味する。生物学的応答の例は、化学的カスケード（リン酸化、形態学の変化、分泌、増殖、ＤＮＡ合成、タンパク質合成、および骨細胞再配列によるカスケードが含まれるがこれらに限定されない）である。
【０１３１】
Ｖ．選択的ステロイド受容体活性を誘導する化合物の使用法。
【０１３２】
本明細書中に詳述している基準を満たす活性化合物を使用して、広範な種々の医学的状態を治療することができる。さらに、性ステロイド受容体を含むステロイド受容体は哺乳動物中の種々の組織（神経組織、筋肉組織、骨組織、血液、生殖組織が含まれるが、これらに限定されない）で発現することが既知であるので、本発明の活性化合物を使用して、障害が核内転写制御を介するかまたは核内転写制御を介さないいずれかのステロイド作用に関連しているこれらまたは他の組織の標的障害を治療することができる。
【０１３３】
選択された実施形態では、活性化合物を使用して心血管疾患を治療することができる。例えば、巨大および小さな動脈中の平滑筋弛緩におけるステロイドの核内転写制御を介さない活性を有する化合物を使用して、血管反応性および交感神経の均衡を調整することができる。本発明によって同定された活性化合物は、複数のステロイド受容体に対して活性であり、それぞれ異なる効果を有し得る。例えば、活性化合物は、異なるステロイド受容体の核内転写制御を介する活性を阻害することなくあるステロイド受容体の核内転写制御を介する活性を阻害することができる。同様に、ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を阻害することができる一方で、異なるステロイドホルモン受容体の核内転写制御を介さない活性が活性化される。
【０１３４】
本発明の活性化合物を使用して、非インスリン依存性糖尿病を含むエンドクリン障害を治療し、免疫系を調整することもできる。Ｔ細胞はステロイド受容体を発現することが既知であり、活性化合物を使用して増殖疾患および感染症を治療することができる。活性化合物を使用して、癲癇、不安、うつ病、不眠症、片頭痛、記憶障害、および薬物依存症を含む神経学的障害を治療することもできる。
【０１３５】
活性化合物をヒトを含む宿主で骨同化薬として使用して、スポーツまたは肉体労働などの激しい身体活動のために骨を強化することができ、骨粗鬆症ではないが、宿主がこの疾患群に属する危険性があるので将来的に骨粗鬆症を罹患し得るヒトまたは他の宿主の骨を強化することができる。ヒトにおける骨同化薬の他の用途には、宿主（生まれつき骨が細いか、小さいか、通常脆弱な骨（脆弱な歯を含む）のヒト、遺伝的に骨同化疾患、身体的形態異常疾患（関節変性など）、非癒合骨折、糖尿病による身体的形態異常問題、インプラント周囲組織炎症（ｐｅｒｉｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ）、不十分な骨移植応答、移植、または骨折にかかりやすいヒトが含まれる）の治療が含まれる。
【０１３６】
これらの化合物を使用して、労働用ウマおよびイヌならびに競走などのスポーツ用の動物の骨量を増加させることができる。化合物を使用して、食肉生産で処理を容易にするために使用したニワトリおよびシチメンチョウで骨量を増加させることができる。
【０１３７】
代表的な代謝骨疾患は、閉経後骨粗鬆症、雄または雌の老人性骨粗鬆症、糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症、非可動化誘導性骨粗鬆症、無重力誘導性骨粗鬆症（宇宙飛行など）、移植後骨粗鬆症、遊走性骨粗鬆症、特発性骨粗鬆症、若年性骨粗鬆症、パジェット病、骨形成不全症、慢性副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症、慢性関節リウマチ、ゴーラム−スタウト疾患、マックキューン−オールブライト症候群、および種々の癌の骨溶解性転移、または多発性骨髄腫である。身体形態異常疾患は、骨量の喪失、全身の骨の脆弱、関節変性、非癒合骨折、糖尿病による身体的形態異常および歯の問題、インプラント周囲組織炎症（ｐｅｒｉｉｍｐｌａｎｔｉｔｉｓ）、骨移植片／移植／骨代理材料の不十分な応答、歯周病、および骨の加齢、およびその結果である。
【０１３８】
本明細書中に提供した基準に従って選択した化合物を、低骨量および高い脆弱性によって特徴付けられる疾患の骨量の増大および／または骨折の予防にも使用することができる。化合物を使用して、骨芽細胞形成が減少した骨疾患状態（老人性骨粗鬆症および特に幼児および青年期（この時期の骨構成の阻止は有害である）の糖質コルチコイド誘導性骨粗鬆症など）を治療することもできる。さらに、当業者は、本発明によって同定された化合物を利用して、一般にステロイド治療、好ましくは性ステロイド治療が必要な病態を治療することができることを認識する。ステロイド治療が必要な病態には、炎症、関節炎、紅斑性狼瘡、器官移植、癌、癲癇、不安、うつ病、不眠症、片頭痛、記憶障害、薬物依存症、免疫障害、および心血管障害が含まれる。
【０１３９】
本発明によって選択された化合物は、転写を誘導することなくステロイドホルモン受容体経路のシグナル伝達機構およびその利点を開始させ、現在のステロイド治療に関連する副作用を予防することができるので、本発明によって選択された化合物は既存のステロイド治療よりも有利である。現在の性ステロイド治療に関連する副作用の例には、望ましくない二次性特徴（雌の多毛症および雄の女性化乳房を含む）が含まれる。種々のレベルの転写活性および抗アポトーシス活性を示す化合物を、異なる病態または疾患の治療に有用であり、当業者は当該分野で一般的に既知の方法本明細書中に開示の方法を使用した特定の疾患の治療に必要な転写レベルおよび化合物の抗アポトーシス活性を容易に同定することができる。他の実施形態では、ステロイド受容体の核内転写制御を介する活性を活性化するが、ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性を活性化しない活性化合物を選択することができる。これらの活性化合物は、ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性が望ましくない場合に有利である。
【０１４０】
ＶＩ．キット
本発明のさらなる実施形態は、安定なトランスフェクト細胞株を有し、前記細胞株がステロイド応答レポーター遺伝子構築物を含むコンテナと、核内転写制御を介さない活性の活性化を評価するための手段と、ステロイド受容体とを含む、ステロイド受容体依存性核内転写制御を介さない活性を測定するためのキットである。キットはまた、少なくとも１つのステロイド受容体、レポーター遺伝子構築物を発現プラスミドとして含む細胞株を含んでもよい。
【０１４１】
１つの非限定的な例では、１７β−エストラジオールは、ＥＲＫ活性化およびＣ３転写のポジティブコントロール化合物である。ＥＲＫ活性化のネガティブコントロールとしてピラゾールを使用することができ、Ｃ３転写のネガティブコントロールとしてエストレンを使用することができる。１７β−エストラジオールと比較して強力なＳＲＥ−ＳＥＡＰ活性を有するがＣ３−Ｌｕｃ活性が低いが存在しない化合物を選択する。選択基準は、Ｃ３転写に対するＥＲＫ活性化の比に基づく目的の化合物の分類を含み得る。
【０１４２】
ＶＩＩ．トランスジェニック動物
本発明のさらに別の実施形態では、少なくとも１つのステロイド受容体アンタゴニスト（例えば、ペプチドＦ６、αＩＩ、または２９３などのＥＲペプチドアンタゴニスト）をコードする誘導性導入遺伝子を含み、２つのコピーをコードすることが好ましいトランスジェニック非ヒト動物が得られる。１つの実施形態では、導入遺伝子の誘導により、受容体の核内転写制御を介する性および核内転写制御を介さない性の両方が遮断される。別の実施形態では、１つまたは２つの導入遺伝子の誘導により、ステロイド受容体の転写活性が遮断される。少なくとも１つの誘導性ステロイド受容体特異的アンタゴニストを有する非ヒト動物（好ましくは、マウス）を使用して、この受容体を介して特異的に作用する疾患を治療するための化合物をスクリーニングすることができる。
【０１４３】
１つの実施形態では、（ｉ）少なくとも１つの誘導性受容体アンタゴニスト導入遺伝子を含むトランスジェニック動物中で少なくとも１つの受容体アンタゴニストの発現を誘導する工程と、（ｉｉ）前記トランスジェニック動物に試験化合物を投与する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の動物中での核内転写制御を介さない効果の程度を同定する工程と、（ｉｖ）工程（ｉｉ）の動物中での転写レベルを同定する工程と、（ｖ）前記試験化合物を投与されたトランスジェニック動物で有意に転写を増加させることなく核内転写制御を介さない効果を誘導する化合物を選択する工程とを含む、受容体応答を選択的に誘導する化合物をスクリーニング法が得られる。トランスジェニック動物の作製は、当該分野で既知である。Ｌｅｅらに付与された米国特許第６，０２５，５３９号は、ＩＬ−５トランスジェニックマウスおよびトランスジェニックマウスの産生法を開示しており、その全体が本明細書中で参考として援用される。当業者は、誘導性導入遺伝子は、細胞、組織、または器官特異的であることを認識する。１つの実施形態では、導入遺伝子は、アクチンプロモータによって駆動される逆テトラサイクリンリプレッサー／テトラサイクリン−ＯＮ系の調節下にあり、Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ら、１９９３、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、１８、４７１〜４７５およびＧｏｓｓｅｎ　Ｍ．ら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８、１７６６〜１７６９に記載されている。
【０１４４】
より特定の実施形態では、（ｉ）少なくとも１つの誘導性ＥＲアンタゴニスト導入遺伝子を含むトランスジェニック動物中で少なくとも１つのＥＲアンタゴニストの発現を誘導する工程と、（ｉｉ）前記トランスジェニック動物に試験化合物を投与する工程と、（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の動物中でのアポトーシスを受けた骨芽細胞または骨細胞数を同定する工程と、（ｉｖ）工程（ｉｉ）の動物中での転写レベルを同定する工程と、（ｖ）前記試験化合物を投与されたトランスジェニック動物で有意に転写を増加させることなくアポトーシスを阻害する化合物を選択する工程とを含む、受容体応答を選択的に誘導する化合物をスクリーニング法が得られる。
【０１４５】
逆テトラサイクリンリプレッサー（ｒＴｅｔＲまたはＴＥＴ−ＯＮ）系は、テトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）−オペレーター−テトラサイクリン（Ｔｃ）相互作用、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−ＶＰ１６転写活性化ドメイン、およびテトラサイクリン（Ｔｃ）の高い特異性をうまく利用する。従来の（ＴＥＴ−ＯＦＦ）系では、ＨｅＬａ細胞でのレポーターアッセイで認められるように、Ｔｃ調節トランスアクチベータ（ｔＴＡ）（ＴｅｔＲとＶＰ１６タンパク質の活性化ドメインとの間の融合）により遺伝子発現が刺激される。ＴｃはｔＴａの最小プロモータ上流のｔｅｔオペロン（ｔｅｔＯ）への結合を阻止し、その結果ｔＴＡ依存性発現をオフにする。しかし、ＴＥＴ−ＯＮ系は、改変されたｒｔＴＡアクチベータ（Ｔｃなど）またはＶＰ１６のオペレーターへの結合を破壊するよりもむしろ誘導する誘導体ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を利用する。ＴＥＴ−ＯＮ系は、テトラサイクリンへの長期曝露後に真核細胞に付与し得る任意の潜在的な毒性を回避する。
【０１４６】
別の実施形態では、ステロイド受容体の不活化が誘導されたトランスジェニック非ヒト動物が得られる。１つの実施形態では、性ステロイド受容体が骨芽細胞および骨細胞のみで不活化されるトランスジェニック動物が開示されている。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ二成分（ｂｉｎａｒｙ）組換え系は、これらのトランスジェニック動物の作製に好ましい方法である。同定されたトランスジェニック動物を、Ｄｏｘに応答したＣｒｅ発現への変更能力について特徴付けることができる。別の実施形態では、ステロイド受容体遺伝子の特定のエクソンのスプライシングを誘導して特異的に受容体が欠失されたトランスジェニック動物が得られる。１つの例では、ＥＲα遺伝子のエクソン３またはエクソン４のスプライシングを誘導して、エクソン３もしくはエクソン４または両方のエクソンがＥＲα欠失したトランスジェニック動物を作製する。
【０１４７】
本発明のさらに別の態様では、骨疾患の非ヒトトランスジェニック動物モデルが得られる。トランスジェニック動物は、導入遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合性であり、１つまたは複数の導入遺伝子を有し得る。導入遺伝子を、誘導プロモータに作動可能に連結させることができる。本発明の他の態様では、（ｉ）エストロゲンまたはアンドロゲンへの曝露に対する性の核内転写制御を介する効果を媒介しないＤＮＡ結合ドメインを含み、（ｉｉ）エストロゲンまたはアンドロゲンへの曝露に対する骨芽細胞または骨細胞に対する抗アポトーシス効果を誘導しないリガンド結合ドメインを含む性ステロイド受容体を含むか（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含むトランスジェニック動物が得られる。
【０１４８】
さらなる態様では、エストロゲン受容体の核内転写制御を介する活性および抗アポトーシス活性の両方を遮断するがアンドロゲン受容体では遮断しない導入遺伝子として少なくとも１つのポリヌクレオチドを使用する。例えば、導入遺伝子として２ＸＦ６を使用して、エストロゲン受容体の活性を遮断することができるが、アンドロゲン受容体を介したエストロゲンまたはアンドロゲンの抗アポトーシス活性を保持することができる。
【０１４９】
ＶＩＩＩ．併用療法
本発明の１つの態様では、本明細書中に記載の１つの活性化合物を第２の医薬品と組み合わせて宿主に投与して、骨疾患を含むステロイドまたはステロイド受容体関連疾患または障害を治療することができる。
【０１５０】
骨疾患に関して、第２の医薬品は、抗骨吸収薬、第２の骨量同化薬、抗酸化剤、栄養補助食品、または骨構造、強度、密度、または骨量に対する活性化合物の有利な効果を増大させる任意の他の薬剤であり得る。骨粗鬆症治療に使用されている１０の薬物クラスの任意のメンバーを、同化ステロイド、ビスホスホネート、カルシトニン、エストロゲンもしくはプロゲステロン、抗エストロゲン（ラロキシフェンまたはタモキシフェン）、副甲状腺ホルモン（「ＰＴＨ」）、フルオリド、ビタミンＤもしくはその誘導体、またはカルシウム調製物を含む有効成分と組み合わせて投与することができる。
【０１５１】
組み合わせのための適切な薬剤の非限定的な例には、アレンドロン酸、クロンドロ酸二ナトリウム、エチドロン酸二ナトリウム、メドロン酸二ナトリウム、オキシドロン酸二ナトリウム、二ナトリウムパミドロネート、ネリドロン酸、リセドロン酸、酢酸テリパラチド、チルドロン酸、イプリフラボン、重炭酸カリウム、プロゲストゲン、チアジド、硝酸ガリウム、ＮＳＡＩＤＳ、プリカマイシン、水酸化アンモニウム、酢酸カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウム、炭酸マグネシウム、およびスクラルファートが含まれるが、これらに限定されない。グルタチオンまたは他の抗酸化剤などの還元剤もまた、本発明の任意の化合物との組み合わせに有用であり得る。本明細書中で使用される、用語「抗酸化剤」は、生理学的条件下で酸化性化合物の酸化を阻止する物質をいう。１つの実施形態では、インビトロで内因性酸素ラジカルを還元させる場合、化合物をこの開示目的の抗酸化剤とみなす。抗酸化剤を、酸素付加条件下で細胞抽出物に添加し、酸化性化合物に対する効果を評価することができる。非限定的な例として、抗酸化剤は、酸素、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素、スーパーオキシドラジカル、リポオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカルを除去するか、反応性金属に結合して脂質、タンパク質、核酸への酸化損傷を阻止する。
【０１５２】
本発明の別の態様では、本明細書中に記載の１つの活性化合物を第２の医薬品と組み合わせて宿主に投与して、ステロイド受容体関連障害を治療することができる。第２の医薬品は、ステロイド、性ステロイド、改変ステロイド、改変性ステロイド、抗生物質、抗酸化剤、栄養補助食品、またはステロイド受容体関連障害に対する活性化合物の有利な効果を増大させる任意の他の薬剤であり得る。
【０１５３】
ＩＸ．薬学的組成物
本明細書中に詳述の基準にしたがって選択した選択的ステロイド効果を誘導する化合物またはその薬学的に許容可能な塩を、任意選択的に薬学的許容可能なキャリアまたは希釈剤中で、本明細書中に記載の任意の病態の治療に有効な量で投与することができる。
【０１５４】
任意の適切な全身、局所、局所送達経路（例えば、経口、非経口、静脈内、皮内、皮下、舌下、鼻腔内、吸入、膣、直腸、または局所、液体、または固体形態）で有効成分を投与することができる。本発明の化合物の投与方法は、特定の用量または徐放賦形剤によってもよい。
【０１５５】
化成化合物の好ましい投与様式は、経口である。経口用組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。活性化合物を、ゼラチンカプセルに封入するか、打錠することができる。経口治療投与の目的のために、化合物を賦形剤に組み込み、錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用することができる。薬学的に適合可能な結合剤および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含むことができる。
【０１５６】
錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、任意の以下の成分、または類似の性質の化合物を含み得る：微結晶性セルロース、トラガカントガム、またはゼラチンなどの結合剤；デンプンまたはラクトースなどの補形薬；アルギニン酸、プリモゲル、またはコーンスターチなどの崩壊薬；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの糊稠剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味料；および／またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジフレーバーなどの香料。単位投薬形態がカプセルである場合、上記型の材料に加えて、脂肪油などの液体キャリアを含むことができる。さらに、単位投薬形態は、投薬単位の物理的形態を改変する種々の他の材料（例えば、糖、シェラック、または他の腸溶性コーティング）を含むことができる。
【０１５７】
化合物を、エリキシル、懸濁液、シロップ、オブラート、チューイングガムなどの化合物として投与することができる。シロップは、活性化合物に加えて、甘味料としてのスクロース、一定の防腐剤、色素、および着色料、および香料を含み得る。
【０１５８】
化合物またはその薬学的に許容可能な誘導体もしくは塩を、所望の作用に損なわない他の活性材料または所望の作用を補足する材料（１７β−エストラジオールまたはエチニルエストラジオールなどの古典的なエストロゲン；アレンドロネート、エチドロネート、パミドロネート、リセドロネート、チルドロネート、ゾレドロネート、シマドロネート、クロドロネート、イバンドロネート、オルパドロネート、ネリドロネート、ＥＢ−１０５３などの二リン酸塩；サケ、ウナギ、またはヒト起源のカルシトニン；グルタチオン、アスコルビン酸、または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤など）と混合することができる。非経口、皮内、皮下、または局所塗布に使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：注射用の水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌薬；エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤；酢酸、クエン酸、またはリン酸などの緩衝液；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度調整剤。非経口調製物を、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨てシリンジ、または複数回投与バイアルに封入することができる。
【０１５９】
静脈内投与する場合、好ましいキャリアは、生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【０１６０】
好ましい実施形態では、化成化合物を、埋没物およびマクロカプセル化送達系を含む身徐放処方物などの体からの急速な排出から化合物を保護するキャリアを用いて調製する。生体分解性生体適合性ポリマー（エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）を使用することができる。このような処方物の調製方法は、当業者に自明である。
【０１６１】
リポソーム懸濁液（モノクローナル抗体で特異的細胞の表面抗原に標的したリポソーム）もまた、薬学的に許容可能なキャリアである。これらを、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号（その全体が本明細書中で参考として援用される）に記載の当業者に既知の方法によって調製することができる。例えば、リポソーム処方物を、無機溶媒での適切な脂質（ステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エテアロイヅホスファチジルコリン、アラカドイルホスファチジルコリン、および／またはコレステロールなど）の溶解および蒸発、コンテナ表面上の乾燥脂質の薄膜の放置によって調製することができる。活性化合物またはその一リン酸、二リン酸、および／または三リン酸誘導体の水溶液を、コンテナに入れる。次いで、コンテナを手で撹拌してコンテナの端から脂質物質を遊離させて脂質凝集体を分散させることにより、リポソーム懸濁的を形成させる。
【０１６２】
用量および投薬計画は、代謝性骨疾患の性質、特定の活性化合物の特徴（例えば、その治療指標）、患者、患者の病歴、および他の因子に依存する。投与した核内転写制御を介さないエストロゲン様シグナル伝達化合物のアクチベータの量は、典型的には、約１ｐｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。有効性を最適にする一方で治療副作用に対してバランスを取るようにスケジュールを進行する。「レミントンの薬学」、第１７版、１９９０、Ｍａｒｋ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．、Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎ；およびＧｏｏｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｇｉｌｍａｎ’ｓ、「治療の薬理学的基礎」、第８版、１９９０、Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓを参照のこと。
【０１６３】
非経口投与のために、活性化合物を、最も典型的には、薬学的に許容可能な非経口用賦形剤と組み合わせた注射単位投薬形態（溶液、懸濁液、乳濁液）処方する。このような賦形剤は、好ましくは、無毒且つ非治療薬である。このような賦形剤の例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。固定油およびエチルオレエートなどの非水性賦形剤も使用することができる。キャリアとしてリポソームを使用することができる。賦形剤は、張度および化学的安定性を増大させる物質（例えば、緩衝液および防腐剤）などの少量の添加物を含み得る。核内転写制御を介さないエストロゲン様シグナル伝達化合物のアクチベータを、典型的には、約１０ｐｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度で賦形剤中に処方する。
【０１６４】
薬物組成物中の化合物濃度は、薬物の吸収、不活化、および排出速度ならびに当業者に既知の他の要因に依存する。投薬量もまた緩和すべき病態の重症度によって変化することに留意すべきである。さらに、有効成分を一回で投与するか、より小さな用量として多数回に分けて種々の間隔で投与することができる。任意の特定の患者のために、特定の投薬計画を個体の要求、および投与者の専門的判断、または組成物の投与の監督に従って長期にわたり調整し、本明細書中に記載の濃度範囲は例示のみを目的とし、特許請求の範囲に記載の組成物の範囲または実施の制限を意図しないことをさらに理解すべきである。
【０１６５】
Ｘ．実施例
以下の実施例を本発明の種々の実施形態の例示を目的として記載し、これは、本発明を決して制限することを意味しない。
【０１６６】
Ａ．エストロゲンおよびアンドロゲンは、サイトカインの転写調節を介した破骨細胞形成および間葉先祖の自己再生の転写減衰を介した骨芽細胞形成を調整する；エストロゲンおよびアンドロゲンはまた、成熟骨細胞の寿命に対する効果および破骨細胞に対するプロアポトーシス効果も発揮するが、骨芽細胞および骨細胞の抗アポトーシス効果を発揮する：後者は、「核内転写制御を介さない効果」であるが依然として受容体依存性を示す作用機構によって媒介され、転写活性から機械的に分離される。
【０１６７】
骨芽細胞に対する性ステロイドの強力な抗アポトーシス効果は、受容体依存性機構によって媒介され、ＳｒｃおよびＳｈｃキナーゼを介したＥＲＫのリン酸化を必要とする。さらに、ＨｅＬａ細胞での結果は、ＥＲα、ＥＲβ、またはＡＲはリガンドがエストロゲンまたはアンドロゲンであるかどうかに無関係に同一の効率で抗アポトーシスシグナルを伝達することができることを示す。典型としてＥＲαを使用して、ＡＦ−１機能、ＤＮＡ結合、このタンパク質のＦおよび二量体形成ドメインは、エストロゲンの抗アポトーシス効果に重要ではないことを発見した。その代わりに、これらの効果にはＥドメイン内に存在するタンパク質の一部が必要である。したがって、エストロゲン受容体の抗アポトーシス活性は、リガンド活性化レセプターによる核内転写制御を介する効果を担うタンパク質領域とは異なり、それと分離可能な別の領域に存在していることになる。ＥＲの抗アポトーシスシグナルを伝達する能力が核へのタンパク質の局在化によって喪失するという証拠もまた開示する。
【０１６８】
他でも核内の転写活性から独立した核オーファン受容体ＴＲ３およびＥＲの生物学的効果が報告されている（Ｌｉ，Ｈ．ら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８９、１１５９〜１１６４；Ｓｉｍｏｎｃｉｎｉ，Ｔ．ら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ、４０７、５３８〜５４１）。さらに、Ｍｉｇｌｉｉａｃｃｉｏら（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏ，Ａ．ら、２０００、ＥＭＢＯ　Ｊ．、１９、５４０６〜５４１７）は、前立腺癌におけるＥＲまたはＡＲのＳｒｃとの同時免疫沈澱を示した。ＥＲの抗アポトーシス活性がＳｒｃのＳＨ２ドメインを必要とする一方でＡＲはＳＨ３ドメインを必要とするという事実と一致して、Ｍｉｇｌｉａｃｃｉｏらはまた、ＥＲはＳｒｃのＳＨ２ドメインと、ＡＲはＳＨ３ドメインと相互作用することを示した。本発明の結果（図２および４）は、異種リガンドによるアポトーシスの予防を１つのステロイド受容体のみでトランスフェクトした細胞で証明することができるので、アンタゴニスト間でのクロストーク、より重要には同族リガンド間のクロストーク（Ｍｉｇｌｉｃｃｉｏの研究では考慮されていない論点）はＥＲとＡＲとの複合体形成に依存しないことを強力に主張するものである。
【０１６９】
ＳｒｃおよびＥＲＫを含むＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路のいくつかのメンバーは、小胞中に密集している（足場タンパク質カベオリン１中に富化され、１つのシグナル伝達を分画する特定の膜陥入）（Ｏｋａｍｏｔｏ，Ｔ．ら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７３、５４１９〜５４２２）。小胞は、ヒトおよびマウス骨芽細胞を含む種々の細胞型で見出される（Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｋ．Ｒ．ら、２０００、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１５、２３９１〜２４０１；Ｓｏｌｏｍｏｎ　Ｋ．Ｒ．ら、２０００、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１５、２３８０〜２３９０）。最近、ＥＲαは、カベオリン１と同時免疫沈澱することが示された（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ，Ａ．ら、１９９９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７４、３３５５１〜３３５５６）。ＥＲαの亜集団が、カベオリンおよびｅＮＯＳ（核内転写制御を介さない作用機構を介してエストロゲンによって活性化された酵素）を含む小胞中に共存していた（Ｃｈａｍｂｌｉｓｓ，Ｋ．Ｌ．ら、２０００、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、８７、Ｅ４４〜Ｅ５２）。性ステロイド受容体に対するエストロゲンおよびアンドロゲンの抗アポトーシス効果の依存性は、ＥＲのＥドメインの抗アポトーシスシグナルがこのタンパク質を膜に局在化した場合に保存されるが、核に局在化した場合に喪失するという証拠と併せて、この効果をおそらく小胞内の原形質膜に会合した古典的受容体画分を介して媒介することができることを示す。この関係は、Ｓｒｃ、Ｓｈｃ、およびＥＲＫに対する現象の同時依存性の所見によって支持される。
【０１７０】
本明細書中に開示のデータは、ステロイド受容体の核内転写制御を介さない活性をこの転写因子の核内転写制御を介する活性と機能的に分離することができること、および合成ステロイド性または非ステロイド性化合物を使用してこれを行うことができるという初めての証明である。本発明を性ステロイドを使用して示しているにもかかわらず、当業者は、本発明をエストロゲン、プロゲスチン、アンドロゲン、糖質コルチコイド、電解質コルチコイドを含む全てのステロイドホルモンに適用して核内転写制御を介する活性から核内転写制御を介さない活性を分離可能であることを認識する。同様に、本明細書は、転写を誘導することなくアポトーシスを阻害する性ステロイド受容体を介して作用する化合物を使用した骨疾患の新規の治療を最初に開示している。１つの実施形態では、２つの活性のリガンド誘導性分離は、抗アポトーシス応答に対して核内転写制御を介する効果に影響を与える必要がある、リガンドとの物理的会合後の受容体タンパク質によって予想される異なる高次構造状態の結果である（図７）。性ステロイド受容体が骨および脳などの再生組織以外の多数の組織で見出されるので、本発明を使用して選択した化合物を使用して、性ステロイド受容体を発現する組織または器官に関連する病態を治療することができる。性ステロイド受容体が見出される組織の例には、下垂体および視床下部組織、筋肉組織、血球、血管、および腸粘膜が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７１】
分子相互作用および細胞事象の尺度において、核内転写制御を介する応答は比較的長期の応答であるので、クロマチン構造を再モデリングし、遺伝子転写速度を変化させるために必要な複数のタンパク質−タンパク質およびタンパク質−核酸相互作用および酵素活性化の獲得に十分な安定性および寿命を有する複合体を生成するための結合ポケット中のホルモンへの精密な適合を含む古典的リガンド−受容体相互作用が必要であると考えられる（図７、右端の複合体）。このような安定且つ寿命の長いリガンド−受容体複合体の形成には、エストロゲンおよびアンドロゲンの古典的核内転写制御を介する効果を特徴付ける周知の特異性および異なる薬理学により導かれる厳密なリガンド構造が必要である。
【０１７２】
対照的に、核内転写制御を介さない抗アポトーシス応答の基礎となるＥＲＫ活性化は非常に急速であり、非常に一過的なリガンド−受容体複合体により導かれたあまり完全に作製されていないかより広い範囲の高次構造に影響を受け得る（図７、左端の複合体）。このような一過性種の形成には、リガンドが受容体に短時間会合して要ることのみが必要であり得るので古典的結合親和性アッセイによって評価されたリガンドの親和性を同定する結合定数と解離定数との比よりもむしろリガンド結合定数に支配される。リガンド結合定数は解離定数よりもさらに類似しているので（Ｂｉｎｄｄａｌ　Ｒ．Ｄ．ら、１９８７、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８、３６１〜３７０；Ｒａｙｎａｕｄ　ＪＰら、１９７８、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、３８、３０４４〜３０５０）、このような短期間の複合体の形成は、構造特異性および潜在性／親和性順位（ｒａｎｋｉｎｇ）が非常に減少し、抗アポトーシス応答が現れる。
【０１７３】
リガンドに誘導された急速な応答は長期応答とは異なる潜在性を示し得るとしう考えは、興味深い先例である。未成熟ラットの子宮のエストロゲン刺激の結果として起こる事象の経時変化では、吸水膨潤および初期ＲＮＡ合成などの初期応答の誘導におけるエストラジオールおよびジメチルスチルベストロールなどの短期作用エストロゲンはエストラジオールおよびジエチルスチルベストロールなどの長期作用エストロゲンの等価であるのに対して、ＤＮＡ合成および子宮成長などの後期応答の誘導における長期作用エストロゲンよりも著しく効力が低い（Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ　ＢＳら、１９７９、Ｐｒｏｇ．Ｈｏｒｍ．Ｒｅｓ．、３５、２５９〜３００；Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ　ＢＳら、１９７８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１０、１０３〜１１３）。実際、用語「妨害エスドロゲン」は、短期応答と長期応答との間の潜在性のこの特徴的変化を説明するために作り出された。これらの相違は、長期応答を誘導するためのリガンドによる継続的および長期受容体占有の必要性を説明する一方で、一過性占有は、短期応答の誘導に十分であることを示す。
【０１７４】
生物学的にはより離れているが、本研究で記載した事象のタイムスケールにさらに関係するのは、酵素の「遅く且つ強固な結合インヒビター」の概念である（Ｓｘｅｄｌａｃｓｅｋ，Ｓ．Ｅ．、１９９５、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｚｙ、２４９、１４４〜１８０；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．、１９８８、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、６１、２０１〜３０１）。多くの場合、酵素を、比較的広範囲のリガンドによって急速且つ有効に阻害することができ、そのうちの幾つがのみがゆるやかにより安定な複合体を形成する。したがって、急速に形成された最初の酵素−インヒビター（「ファースト−ルーズ（ｆａｓｔ−ｌｏｏｓｅ）」）複合体は、核内転写制御を介さない応答において本明細書中に示した緩やかな特異性を示すが、スロー−タイト（ｓｌｏｗ−ｔｉｇｈｔ）複合体は核内転写制御を必要とする古典的に認識されている性特異的且つ安定な複合体に類似している。
【０１７５】
骨芽細胞および骨細胞に対する性ステロイドのインビトロ抗アポトーシス効果と一致して、エストロゲンまたはアンドロゲンの喪失により、いずれかの性由来の性腺摘出マウスにおいて骨芽細胞および骨細胞の寿命が短くなる。エストロゲン喪失後の骨細胞のアポトーシスの増加は、ラットおよびヒトで以前に示されており（Ｎｏｂｌｅ，Ｂ．Ｓ．ａｎｄ　Ｒｅｅｖｅ，Ｊ．、２０００、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１５９、７〜１３）、破骨細胞に対するエストロゲンのプロアポトーシス効果およびエストロゲン欠失におけるその寿命の延長とは対照的である（Ｈｕｇｈｅｓ，Ｄ．Ｅ．ら、１９９６、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２、１１３２〜１１３６；Ｋａｍｅｄａ，Ｔ．ら、１９９７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８６、４８９〜４９５）。骨形成細胞の作用期間（ｗｏｒｋｉｎｇ　ｌｉｆｅ）の短縮および骨吸収細胞の作用器官の延長は、一部は、性ステロイドの喪失の結果としての骨吸収と形成との不均衡で説明することができる。さらに、骨細胞アポトーシスの増加により、骨細胞／小管機構の機械感覚の障害によって骨がさらに脆弱になり得る（Ｍａｎｏｌａｇａｓ，　Ｓ．Ｃ．（２０００）Ｅｎｄｏｃｒ．　Ｒｅｖ．　２１，１１５−１３７）。実際、おそらく、内因性細胞と同様に剪断ストレスおよびエストロゲンに対する応答によって主に調節される骨細胞もまたＥＲＫ活性化に伴う伸長に応答するので、エストロゲンのシグナルおよび機械的重圧のシグナルが骨に組み込まれるようである。
【０１７６】
合成リガンドでの性ステロイド受容体の核内転写制御を介する活性からの核内転写制御を介さない活性の分離により、望ましくない性ステロイド作用から望ましい作用の新規の分離法がえら得るので、改良された薬物療法薬が得られる。特に、組織特異的リガンド（ＳＥＲＭ）または古典的エストロゲンまたはアンドロゲンと対照的に、ＥＲまたはＡＲの機構特異的リガンドは、骨減少のマネージメントのための有利な薬物療法薬のクラス（抗吸収と対照的な真の同化性および中性を示す）である。
【０１７７】
Ｂ．マウス。４月齢の雌スイス−ウェブスターマウスまたは５月齢の雄ＳＡＭＲＩマウスを維持し、実験動物の世話および使用についてＮＩＨガイドラインにしたがって使用した。マウスを擬給食操作または両側卵巣摘出または精巣摘出に供する。４または３週間後、雌または雄マウスをそれぞれ屠殺し、腰椎を取り出した。
【０１７８】
非脱灰骨切片中のアポトーシス骨芽細胞および骨細胞の定量
以前に記載のように（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｒ．Ｓ．ら、１９９８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０２、２７４〜２８２；Ｊｉｌｋａ，Ｒ．Ｌ．ら、１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０４、４３９〜４４６）、クレノウＦｒａｇＥＬ検出キット（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）を使用したＴＵＮＥＬ染色によって椎骨（Ｌ１〜Ｌ５）の非脱灰プラスチック包埋切片中にアポトーシス骨芽細胞および骨細胞を検出した。成長プレートの底に認められたＴＵＮＥＬポジティブ肥大性軟骨細胞を各骨切片の内部ポジティブコントロールとして使用した。
【０１７９】
細胞培養
コラゲナーゼ消化によって新生児マウスの頭蓋冠から骨芽細胞を獲得し、１０％ＦＢＳを含むαＭＥＭ中で２から３日培養し、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して再懸濁し、使用まで凍結した。骨細胞ＭＬＯ−Ｙ４細胞（Ｋａｔｏ，Ｙ．ら、１９９７、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１２、２０１４〜２０２３）を、２．５％ＦＢＳ、２．５％ウシ胎児血清を補足した無フェノールレッドαＭＥＭで培養し、コラーゲンＩ型被覆プレート上で培養した。骨芽細胞ＯＢ−６細胞（Ｌｅｃｋａ−Ｃｚｅｒｎｉｋ，Ｂら、１９９９、Ｊ．Ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７４、３５７〜７１）を、５％ＦＢＳを補足した無フェノールレッドαＭＥＭで培養した。ＨｅＬａ細胞を、１０％ＦＢＳ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補足した無フェノールレッドαＭＥＭで培養した。
【０１８０】
インビトロでのアポトーシス細胞の定量
以前に記載のように（Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｌ．ら、１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０４、１３６３〜１３７４；Ｊｉｌｋａ，Ｒ．Ｌ．ら、１９９８、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．、１３、７９３〜８０２；Ｊｉｋａ，Ｒ．Ｌ．ら、１９９９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０４、４３９〜４４６）、アポトーシス細胞を、トリパンブルー染色または核形態の変化についての直接視覚化（トランスフェクトＨｅＬａ細胞の場合）によって定量した。後者の方法では、核濃縮または断片化核の視覚化を、核局在化タンパク質を含む増強蛍光タンパク質（緑色または赤色）（ＥＧＦＰ−ｎｕｃおよびＥＲＦＰ−ｎｕｃ）を同時トランスフェクションしたカバーガラス上にプレートの細胞を用いて容易にした。３．７％のホルムアルデヒドでの固定後、アポトーシス％を、２００から５００個のトランスフェクト（蛍光）細胞の核形態学の同定によって同定した。
【０１８１】
Ａｎｏｉｋｉｓアッセイ
以前記載のように（Ｋｌｅｉｎ，Ｃ．Ｅ．ら、１９９１、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、１１５、１４２７〜１４３６）、骨芽細胞ＯＢ−６細胞（３．３×１０５／ｍｌ）を、Ｉ型コラーゲンゲルで培養した。ゲル形成後、スパチュラを用いてウェルの底から細胞を引き離し、０．５ｍｌのαＭＥＭ（１０％、ＦＢＳ、２００μＭアスコルビン酸、賦形剤（０．１％エタノール）またはステロイドのいずれかを含む）を重層した。固定後、１０μｍの切片を切断し、アポトーシス細胞を、ＴＵＮＥＬ染色を使用して定量した。
【０１８２】
ウェスタンブロット分析
ＥＲＫ１／２のリン酸化状態を、チロシンリン酸化ＥＲＫ１／２を認識するマウスモノクローナル抗体または全ＥＲＫ１／２を認識するウサギポリクローナル抗体を使用したウェスタンブロッティング、その後の西洋ワサビペルオキシダーゼに接合した抗マウスまたは抗ウサギ抗体のいずれかとのインキュベーションによって分析した。
【０１８３】
ＤＮＡ構築物
２．２５ＫｂのヒトＩＬ−６プロモータ、３コピーのビテロゲニンＥＲＥ配列、またはホタルルシフェラーゼ遺伝子を駆動する補体３プロモータを保有するレポータープラスミド（それぞれ、ＩＬ−６−ｌｕｃ、ＥＲＥ−ｌｕｃ、およびＣ３−ｌｕｃ）を使用して、ステロイドの転写効果をアッセイした。αＩＩまたは２コピーの２９３（２×２９３）、または２コピーのＦ６（２×Ｆ６）またはＳＶ４０プロモータによって駆動されるＧＡＬ４　ＤＮＡ結合ドメインに融合したＧＲＩＰを保有するＥＲペプチドアンタゴニストの発現プラスミドは以前に記載されている（Ｎｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｄ．ら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５、７４４〜７４６）。ペプチド配列は、Ｃｈａｎｇら、１９９９、「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．、１９、８２２６〜８２３９（その全体が本明細書中で参考として援用される）に開示されている。ペプチドαＩＩの配列は、
【０１８４】
【化１】
2004507232.tif 000003
である。ペプチド２９３の配列は、
【０１８５】
【化２】
2004507232.tif 000004
である。ペプチドＦ６の配列は、
【０１８６】
【化３】
2004507232.tif 000005
である。ペプチドＧＲＩＰの配列は、
【０１８７】
【化４】
2004507232.tif 000006
である。同様に、ＥＲα変異体の発現プラスミドΔＡ／Ｂ；Ｓ１０４、１０６、１１８Ａ；ΔＦ；Ｓ５５４ｆｓ；ΔＤＢＤ；またはＬ５２５Ａは、以前に報告されている（Ｓｃｈｏｄｉｎ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、３１１６３〜３１１７１；Ｅｋｅｎａ，Ｋ．ら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、２００５３〜２００５９；Ｍｏｎｔａｎｏ，Ｍ．Ｍ．ら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、９、８１４〜８２５；Ｍｏｎｔａｎｏ，Ｍ．Ｍ．ａｎｄ　Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ，Ｂ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４、２５８１〜２５８６；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｅ．Ｍ．ａｎｄ　Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ，Ｂ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、２４１７２〜２４１７８；Ｌｅ　Ｇｏｆｆら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、４４５８〜４４６６；Ｗｒｅｎｎ，Ｃ．Ｋ．ａｎｄ　Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ，Ｂ．Ｓ．、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８、２４０８９〜２４０９８；Ｉｎｃｅ，Ｂ．Ａ．ら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８、１４０２６〜１４０３２）。ＥＲαのＤＥおよびＥ変異体の構築のために、アミノ酸２６３〜５３および３３３〜５５３にそれぞれ対応するヌクレオチドを、ＰＣＲによってＥＲαから増幅した。正方向プライマーは、ＳａｌＩの制限部位、およびＥＲαコザック配列を含み、逆方向プライマーは、ＢａｍＨＩ制限部位を含んでいた。増幅ＰＣＲ産物を、ｐＣＭＶのＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ制限部位にサブクローニングした。
【０１８８】
ＥＲα−ＥＣＦＰ、Ｅ−ＥＣＦＰ、Ｅ−Ｎｕｃ−ＥＣＦＰ、およびＥ−Ｍｅｍ−ＥＣＦＰ構築物を、プライマー対
【０１８９】
【化５】
2004507232.tif 000007
を使用したＥＲαのＰＣＲ増幅によって作製した。ＰＣＲ産物を、ＮｈｅＩおよびＡｇｅＩで消化し、適切なＥＣＦＰベクターの同一の部位に挿入した。Ｅ−Ｍｅｍ−ＥＣＦＰを作製するために、原形質膜に融合タンパク質を標的するシステイン３および４の翻訳後パルミトイル化シグナルを含むニューロモジュリンのＮ末端２０アミノ酸を保有するＭｅｍ−ＥＣＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にＥをクローン化した。Ｅ−Ｎｕｃ−ＥＣＦＰを作製するために、ＥＣＦＰのＣ末端に融合したサルウイルス４０巨大Ｔ抗原の核局在化シグナルの３つのコポー保有するＮｕｃ−ＥＣＦＰベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にＥをクローン化した。ＥＲα−ＥＣＦＰおよびＥ−ＥＣＦＰの作製のために、核局在化シグナルを、ＢｇＩＩＩ／ＢａｍＨＩ消化および再結合によってＮｕｃ−ＥＣＦＰベクターから除去して、ＥＣＦＰを作製した。次いで、ＥＲαまたはＥ　ＰＣＲ産物を、ＥＣＦＰのＮｈｅＩ／ＡｇｅＩ部位にライゲートした。すべてのＰＣＲ増幅領域の完全な配列を、配列決定によって実証した。Ｓｒｃ　ＡＳＨ３、Ｓｒｃ　ＡＳＨ２、およびＳｒｃＫ２９５Ｍ（ＳｒｃＫ−）のｃＤＮＡは、Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｃ．Ｈｏｍｅ博士、イェール大学（Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ら、２０００、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７５、４７９〜４８６）から賦与された。ｗｔおよびＳｈｃ変異体を、Ｋ．Ｓ．Ｒａｖｉｃｈａｎｄｒａｎ博士、バージニア大学（ＷａｌｋＳ．Ｆ．ら、１９９８、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｕｎｏｌ．、２８、２２６５〜２２７５）から入手した。ｄｎＭＥＫを、Ｎ．Ｇ．Ａｈｎ博士、コロラド大学（Ｍａｎｓｏｕｒ，Ｓ．Ｊ．ら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５、９６６〜９７０）から入手した。
【０１９０】
一過性トランスフェクション
ＨｅＬａ細胞を、５×１０４／ｃｍ２でプレートし、１６から２４時間後、リポフェクタミン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．）を使用して３μｇのＤＮＡの全量でトランスフェクトした。４から６時間のインキュベーション後、トランスフェクション混合物を１０％活性炭処理血清を含む新鮮な培地と交換し、処理を開始した。以前に記載のように（Ｐｏｔｔｒａｔｚ，Ｓ．Ｔ．ら、１９９４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９３、９４４〜９５０）、ＩＬ−６転写分析を行った。ＥＲＥまたはＣ３媒介転写のために、トランスフェクト細胞をＥ２で処理し、２４時間後にルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。
【０１９１】
胚線維芽細胞におけるＥＲおよびＡＲのＲＴ−ＰＣＲ分析
以下のプライマー
【０１９２】
【化６】
2004507232.tif 000008
を使用した。
【０１９３】
統計分析
スチューデントｔ検定を使用して、骨細胞アポトーシスのインビボ変化を評価し、分散の等価性およびデータの正規分布の確立後、群平均（ｎ＝４〜５）の間の有意差を評価した。インビトロアポトーシスアッセイのデータを、ＡＮＯＶＡで分析し、スチューデント−ノイマン−クールズ法を使用して、平均の有意差レベルを評価した。ステロイド効果が使用したプロアポトーシス薬に依存するかを確立するために、図１Ｃおよび１Ｄのデータを、２つの変数がプロアポトーシス薬（賦形剤、デキサメタゾン、エトポシド、およびＴＮＦα）および予備処理物質（賦形剤、Ｅ２、およびＤＨＴ）である二元置換ＡＮＯＶＡによって分析した。その後、ボンフェローニ法を使用して、予備処理物質−薬剤組み合わせ間の有意差を評価した。
【０１９４】
実施例１
インビボおよびインビトロでのエストロゲンまたはアンドロゲンによる骨芽細胞および骨細胞アポトーシスの調節
擬給食コントロールと比較してマウスの卵巣摘出または精巣摘出による脊椎骨芽細胞アポトーシスが１０倍および８．３倍、骨細胞アポトーシスは４倍および３．５倍にそれぞれ増加した（図１Ａ）。これらの変化は、１７β−エストラジオール（Ｅ２）を投与した卵巣摘出マウスで阻止された（データ示さず）。これらの効果の機構を解明するために、初代頭蓋冠細胞培養物および骨細胞株をインビトロモデルとして使用した。Ｅ２または５α−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）のいずれかは、１０−９〜１０−８Ｍで最大の効果を示すような用量依存様式で、頭蓋冠細胞のエトポシド誘導アポトーシスを阻害した（図１Ｂ）；ＭＬＯ−Ｙ４細胞で同一の結果が得られた（示さず）。Ｅ２またはＤＨＴは、任意の３つの異なるプロアポトーシス刺激（エトポシド、デキサメタゾン、またはＴＮＦ；Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド（データ示さず））によって誘導した場合、頭蓋冠由来マウス骨芽細胞（図１Ｃ）または骨細胞株ＭＬＯ−Ｙ４（図１Ｄ）のアポトーシスを予防した。
【０１９５】
骨芽細胞および骨細胞のインビボでのアポトーシスの発症を調節するシグナルは未知である。しかし、細胞のそのマトリックスとの相互作用（特に、コラーゲン−インテグリン相互作用）は、細胞の生存またはアポトーシスによる自殺過程開始決定の重要なインビボでの合図であることを示唆する証拠が存在する。この現象はアノイキスと呼ばれている（Ｆｒｉｓｃｈ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ　Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、９、７０１〜７０６）。したがって、Ｉ型コラーゲンゲル中で培養した骨髄由来骨芽細胞株（ＯＢ−６）を使用したアノイキスに対する性ステロイドの効果を研究した（図１Ｅ）。この系では、アポトーシスは、コラーゲン格子収縮の際のインテグリンシグナル伝達の喪失に起因する。他のプロアポトーシスシグナルの場合と同じく、Ｅ２またはＤＨＴのいずれかは、わずか１０−１１Ｍの濃度で用量依存的にアノイキスを減衰させる。
【０１９６】
実施例２
ＥＲ（αまたはβ）またはＡＲは、リガンドがエストロゲンまたはアンドロゲンであるかに無関係に同一の効率で抗アポトーシスシグナルを伝達する
エストロゲン受容体アンタゴニストＩＣＩ１８２，７８０またはアンドロゲン受容体アンタゴニストフルタミドは、頭蓋冠細胞中でＥ２およびＤＨＴの抗アポトーシス効果を遮断し、これは、性ステロイドの効果がＥＲおよびＡＲによって媒介されたことを強力に示す。しかし、驚いたことに、Ｅ２の抗アポトーシス効果もまたフルタミドによって、ＤＨＴの効果もＩＣＩ　１８２，７８０によって排除された（図２Ａ）。この予想外の結果と一致して、他でもＩＣＩ　１８２，７８０を含む抗ホルモンがステロイド受容体の複数のクラスと相互作用することが示されている（Ｎａｗａｚ，Ｚ．、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、５９、３７２〜３７６）。
【０１９７】
ＥＲおよびＡＲに対するＥ２およびＤＨＴの抗アポトーシス効果の依存性を確立し、アンタゴニストを使用して予想外の結果が得られた各受容体の役割を詳細に分析するために、ＥＲもＡＲも発現しないＨｅＬａ細胞を使用した研究を行った。これらの実験では、ＨｅＬａ細胞を、核局在化配列（ＥＧＦＰ−ｎｕｃ）を含む増強緑色蛍光タンパク質およびＥＲα、ＥＲβ、またはＡＲ発現構築物のいずれか、または空のベクターコントロールで一過性にトランスフェクションさせた（図２Ｂ）。Ｅ２およびＤＨＴ（１０−１２Ｍ〜１０−８Ｍ）はいずれも受容体を含まないベクター（空のベクター、ｅｖ）でトランスフェクトした細胞におけるエトポシド誘導性アポトーシスに対する効果は認められなかった。しかし、ＥＲ（αまたはβ）またはＡＲのいずれかでトランスフェクトするが、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）またはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）でトランスフェクトしていないＨｅＬａ細胞では、Ｅ２またはＤＨＴは共に同程度の濃度で用量依存様式にてアポトーシスを予防した。興味深いことに、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３は、ＶＤＲまたはＲＸＲでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞においてアポトーシスを予防したがＥＲまたはＡＲでは予防されなかった。アポトーシスを誘導するためのデキサメタゾンを使用して、同一の結果が得られた。
【０１９８】
骨芽細胞の初代培養物を用いた実験では、ＩＣＩ　１８２，７８０またはフルタミドは、ＨｅＬａ細胞がＥＲαまたはＡＲでトランスフェクトされていることとは無関係に、ＨｅＬａ細胞でＥ２またはＤＨＴの効果を排除した。これらの結果は、エストロゲンの抗アポトーシス効果についてのＥＲ（αまたはβ）またはＡＲの要求性を明瞭に確立する。さらに、このデータにより、性ステロイドの核内転写制御を介さない効果を担う受容体が実際には古典的受容体タンパク質である（すなわち、代替タンパク質よりもむしろエストロゲンまたはアンドロゲンの再生機能を媒介する）ことが示唆される。より重要には、これらの所見は、古典的ＥＲおよびＡＲのいくつかの作用が性非特異的であることを示す。アンドロゲンによるＥＲおよびエストロゲンによるＡＲの転写調節は、最近乳癌細胞で記載されている（Ｍａｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｍ．ら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、５９、４８６４〜４８６９）が、この現象を、いくつかの細胞における特異的受容体の同時アクチベータの発現によって説明することができる（Ｙｅｈ，Ｓ．ら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ、９５、５５２７〜５５３２）。本明細書中に示した結果は、古典的ＥＲおよびＡＲの核内転写制御を介さない作用は性非特異的であることの最初の証明を示す。ＥＲまたはＡＲによるエストロゲンまたはアンドロゲンの性非特異的シグナル伝達により、雌および雄の成体骨における性ステロイドのいずれかのクラスの効率ならびにげっ歯類およびヒトにおけるＥＲの多義的表現型、またはアロマターゼ欠失または変異が説明されるようである。
【０１９９】
実施例３
ＥＲαの抗アポトーシス活性は、Ｅ（リガンド結合）ドメイン内に存在し、タンパク質の核外局在化を必要とする
典型としてＥＲαを使用して、性ステロイド受容体の抗アポトーシス活性が、転写活性が必要とするドメインと同一または異なるドメインを必要とするかを同定した（図３Ａ）。アポトーシスの予防に対するＥＲαのいくつかの変異体の効果を同定した。これらのいくつかの変異体は以前に記載されており、ヒト細胞（本研究で使用したＨｅＬａ細胞など）に一過性にトランスフェクトした場合に予想されるタンパク質を産生することが示されている（Ｓｃｈｏｄｉｎ，Ｄ．Ｊ．ら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、３１１６３〜３１１７１；Ｋｒａｕｓ，Ｗ．Ｌ．ら、１９９７、Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、６３、１７５〜１８８；Ｅｋｅｎａ，Ｋ．ら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、２００５３〜２００５９；Ｅｋｅｎａ，Ｋ．ら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、５０６９〜５０７５；Ｍｏｎｔａｎｏら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、９、８１４〜８２５）。示していない実験では、ＤＥまたはＥドメインを含む変異体も予想されるタンパク質を産生し、転写活性を欠くことが確立された。
【０２００】
ＥＲαと同様に、全Ｎ末端転写活性化機能（ＡＦ−１）ドメインを欠く変異体ΔＡ／Ｂ、セリン１０４、１０６、および１１８がアラニンに置換された変異体（Ｓ１０４、１０６、１１８Ａ）、またはカルボキシ末端の全Ｆドメインを欠く変異体ΔＦ、またはＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１８５〜２５１）の一部を欠く変異体ΔＤＢＤは、Ｅ２結合ＥＲの抗アポトーシスシグナルを伝達することができる。さらに、これら全ての変異体は、ＥＲＥ媒介遺伝子転写活性が減少しているか存在しない（Ｍｏｎｔａｎｏ，Ｍ．Ｍ．ａｎｄ　Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ，Ｂ．Ｓ．、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９４、２５８１〜２５８６；Ｌｅ　Ｇｏｆｆら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９、４４５８〜４４６６；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｅ．Ｍ．ａｎｄ　Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ，Ｂ．Ｓ．ら、（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、２４１７２〜２４１７８；Ｍｏｎｔａｎｏら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、９、８１４〜８２５）。より印象的には、リガンドの抗アポトーシスを伝達する能力は、ＡＦ−１およびＤＮＡ結合ドメイン（ＤＥ）を欠く欠失変異体ならびにＡＦ−２／リガンド結合ドメイン（Ｅ）のみを含む欠失変異体で保存されていた。対照的に、ホルモン結合能力を欠くＥＲ変異体Ｌ５２５Ａ（Ｅｋｅｎａら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２、５０６９〜５０７５）およびＣ末端転写活性化機能（ＡＦ−２）が欠失した変異体Ｓ５５４ｆｓ（Ｓｃｈｏｄｉｎら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、３１１６３〜３１１７１；Ｉｎｃｅら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８、１４０２６〜１４０３２、Ｗｒｅｎｎ　ａｎｄ　Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８、２４０８９〜２４０９８）は、抗アポトーシスシグナルおよびタンパク質の転写活性の両方を伝達させる能力を喪失していた（Ｅｋｅｎａ，Ｋ．ら、１９９６、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１、２００５３〜２００５９；Ｓｃｈｏｄｉｎら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７０、３１１６３〜３１１７１）。これらの結果は、タンパク質のリガンド結合領域（ドメインＥ）内のＥＲ残基の「抗アポトーシス」ドメインおよびその抗アポトーシス活性は、ＥＲの転写活性に重要な一定のＮ末端Ａ／Ｂドメイン部位のリン酸化を必要としないことを示す。
【０２０１】
次に、Ｅドメインの抗アポトーシス活性がその特定の細胞内区画への局在に依存するかを同定した（図３Ｂ）。このドメインを、原形質膜または核局在化配列をそれぞれ含む増強シアン蛍光タンパク質への融合によってＨｅＬａ細胞の原形質膜または核に標的した。落射蛍光顕微鏡（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）によって明らかになったように、非標的化ＥＲαおよび非標的化Ｅは、核および細胞質中に類似のシアン蛍光分布を示し、これは、ほとんどのＥＲリガンド結合ドメインの除去により細胞内分布が変化しないことを示している。しかし、同一の細胞におけるシアンおよび赤色蛍光の分布の比較および対比から認められるように、適切な標的配列の組み込みにより膜または核ＥＣＦＰ融合タンパク質の所望の細胞内局在化が達成された。Ｅドメインまたは全長ＥＲαと同一なこの融合タンパク質の抗アポトーシス活性によって証明されるように、原形質膜へのＥドメインの支配的標的化により、リガンド誘導性抗アポトーシスシグナルを伝達する能力は変化しなかった。しかし、非常に対照的には、細胞核へのＥドメインの排他的な標的化により、その抗アポトーシス活性が完全に喪失した。
【０２０２】
実施例４
ＥＲおよびＲの抗アポトーシス活性は、Ｓｒｃ／Ｓｈｃ／ＥＲＫシグナル伝達経路によって媒介される。
【０２０３】
Ｅ２またはＤＨＴはＭＬＯ−Ｙ４細胞でのＥＲＫのリン酸化を急速かつ一過性に増加し、５分で効果は最大となり、１５分でベースラインに戻った（図４Ａ）。マウス頭蓋冠骨芽細胞を使用して同一の結果が再現された（示さず）。Ｅ２またはＤＨＴによるＥＲＫリン酸化の誘導は、ＥＲＫ、ＰＤ９８０９、およびＵＯ１２６のリン酸化の特異的インヒビター（示さず）ならびにＳｒｃファミリーチロシンキナーゼインヒビターＰＰ１によって遮断された。さらに、ＰＤ９８０５９およびＰＰ１は共にＥ２およびＤＨＴの抗アポトーシス効果を完全に排除し、これは、ＥＲＫリン酸化およびＳｒｃキナーゼ活性が両方の性ステロイドの抗アポトーシス効果に必要であることを示す。性ステロイドの抗アポトーシス効果におけるＳｒｃキナーゼの不可欠な役割についての確認された証拠は、ｙｅｓおよびＦｙｎ（Ｓｏｒｉｎａｏら、１９９１、Ｃｅｌｌ、６４、６９３〜７０２）も欠くＳｒｃ−／−マウス由来のＥＲおよびＡＲ発現胚線維芽細胞の発見によって得られ、Ｓｒｃ＋／＋野生型コントロールと異なり、Ｅ２またはＤＨＴの抗アポトーシス効果に応答しなかった（図４Ｂ）。
【０２０４】
性ステロイド受容体（ＥＲまたはＡＲのいずれか）ならびにＳｒｃ／ＥＲＫシグナル伝達経路に対するＥ２およびＤＨＴの抗アポトーシス効果の同時依存性を、ＨｅＬａ細胞で証明した（図４ＣおよびＤ）。ＰＤ９８０５９またはドミナントネガティブ（ｄｎ）ＭＥＫの同時トランスフェクション、ＥＲＫのリン酸化を担うキナーゼは、ＥＲαまたはＡＲでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞においてＥ２またはＤＨＴ効果を排除した（図４Ｃ）。同様に、Ｅ２またはＤＨＴの効果は、ＥＲαまたはＡＲでトランスフェクトしたがキナーゼ活性を欠くＳｒｃ変異体で同時トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞で排除された（ＳｃＫ）（図４Ｄ）。より印象的には、ＳＨ２ドメインを欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　ＡＳＨ２）は、リガンド活性化ＥＲαの抗アポトーシス活性を排除したが、ＡＲのそれは排除されなかった。対照的に、ＳＨ３ドメインを欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　ＡＳＨ３）は、ＡＲの抗アポトーシス活性を排除したが、ＥＲのそれは排除しなかった。同様に、Ｅ２またはＤＨＴ活性化ＥＲαの抗アポトーシス活性は、３つ全てまたはＳｈｃリン酸化の最初の部位である３つのチロシン（Ｙ２３９、Ｙ２４０、およびＹ３１７）の３番目がフェニルアラニンに置換されているドミナントネガティブＳｈｃ変異体によって排除された。しかし、チロシン２３９および２４０（３１７ではない）が変異した場合、受容体の抗アポトーシス活性は影響を受けなかった（図４Ｅ）。
【０２０５】
ＥＲのＥドメインがその抗アポトーシス活性に十分であることに一致して（図３）、このドメイン（ＰＤ０９８０５９、ｄｎ　ＭＥＫ、Ｓｒｃ　Ｋ、Ｓｒｃ　ＡＳＨ２、またはＳｒｃ　ＡＳＨ３）によってトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は、全長ＥＲαでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞と厳密に同一の効果を示した（図４ＣおよびＤ）。
【０２０６】
実施例５
ペプチドアンタゴニストを使用したＥＲαの抗アポトーシス活性からの転写活性の分離
ＭｃＤｏｎｎｅｌｌとその共同研究者は、以前に、異なるリガンド活性化ＥＲ部位に結合し、ＥＲαを選択的に遮断することができるが、コンセンサスＥＲＥ（エストロゲン応答エレメント）を試験した場合にそれと逆にＥＲβ媒介転写を遮断することができないいくつかのクラスの小さな（１１から１９個のアミノ鎖）ペプチドを単離した（Ｎｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｄ．ら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５、７４４〜７４６；Ｃｈａｎｇ，Ｃ．ら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、１９、８２２６〜８２３９）。これらのペプチドのＥ２の抗アポトーシス効果を遮断する能力を試験した（図５）。並行実験では、ＥＲＥ駆動ルシフェラーゼ構築物（ＥＲＥ−Ｌｕｃ）またはＩＬ−６プロモータ駆動ルシフェラーゼ（ＩＬ−６−Ｌｕｃ）でトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を使用して、これらのペプチドの転写を遮断する能力を試験した。リガンド結合ドメインＥＲαに結合する配列ＳＳＬＴＳＲＤＦＧＳＷＹＡＳＲ（配列番号１）を有するαＩＩと呼ばれるペプチドは、ＥＲＥ−Ｌｕｃ転写のＥ２誘導性増加を遮断した（図５Ａ）。同様に、ペプチドは、ＩＬ−６転写のＥ２誘導性減少を遮断した（ＥＲと他の転写因子との間のタンパク質−タンパク質相互作用を介して媒介される転写調節の典型）。それにもかかわらず、αＩＩペプチドは、Ｅ２の抗アポトーシス効果に影響を与えなかった。ＨｅＬａ細胞の代わりにＨＥＫ２９３を使用した実験で同一の結果が得られた（示さず）。
【０２０７】
ＥＲβ特異的ペプチド（２９３）およびＥＲαおよびＥＲβの両方と相互作用するペプチド（Ｆ６）（図５Ｂ）を調査した。これらの実験のために、ＨｅＬａ細胞を、ＥＲＥまたはＩＬ−６ルシフェラーゼ構築物およびＥＲαまたはＥＲβのいずれかとトランスフェクトした。２９３は、ＥＲβ保有細胞においてＥＲＥおよびＩＬ−６プロモータの両方由来の転写に対するＥ２の効果を遮断したが、ＥＲα保有細胞では遮断されなかった。それに対して、Ｆ６は、ＥＲαおよびＥＲβ保有細胞の両方においてＥＲＥまたはＩＬ−６由来の転写に対するＥ２の効果を遮断した。より重要なことに、ＥＲα（αＩＩはＥＲαに特異的であるので、おそらくＥＲβ）の抗アポトーシス活性に影響を与えないαＩＩと異なり、２９３はＥＲβの抗アポトーシス活性を遮断するが、ＥＲαの抗アポトーシス活性に対する効果はなかった。Ｆ６は、ＥＲαおよびＥＲβの両方の抗アポトーシス活性ならびにＥＲＥおよびＩＬ−６由来の転写を遮断した。これらの結果により、各ペプチドがＡＦ−２結合ポケットの異なる部位に結合して遮断することの証拠が確認される（Ｎｏｒｒｉｓ，Ｊ．Ｄ．ら、１９９９、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８５、７７４〜７４６；Ｃｈａｎｇ，Ｃ．ら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、１９、８２２６〜８２３９）。さらに、データはまた、αＩＩが結合する部位の遮断は、ＥＲαの転写活性を有効に遮断するとしても、この部位のみでは「抗アポトーシス」活性に影響を与えないことを示す。ＥＲαまたはＥＲβ由来の転写および／または抗アポトーシス活性の遮断におけるこれらのペプチドの特異性の証明は、リガンド活性化受容体の抗アポトーシス活性が受容体タンパク質領域の異なる部位（便宜上「抗アポトーシス」ドメインと呼ぶ）に依存するという主張を支持する。
【０２０８】
ＥＲの転写活性は、特異的同時アクチベータとの相互作用に劇的に影響をうけ、そのほとんどが核受容体ボックスと呼ばれる保存ＬＸＸＬＬモチーフを含む（ＭｃＫｅｎｎａら、１９９９、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．、２０、３２１〜３４４）。ペプチドＧＲＩＰは、ＥＲのＧＲＩＰ−１（これらの同時アクチベータの１つ）との相互作用を阻止する（Ｃｈａｎｇ，Ｃ．ら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．、１９、８２２６〜８２３９）。ＧＰＩＰペプチドは、中心に同時アクチベータＧＲＩＰ−１由来のＬＸＸＬＬモチーフの３つのコピーを含む。この領域のヌクレオチド配列を以下に示す。
【０２０９】
【化７】
2004507232.tif 000009
このペプチドがＨｅＬａ細胞にＥＲαと同時トランスフェクトされた場合、ＥＲの抗アポトーシス活性に影響を与えず（図５Ｃ）、これは、リガンド活性化受容体の抗アポトーシス活性が核転写因子としてのこのタンパク質の機能に依存しないことをさらに主張する。
【０２１０】
実施例６
ＥＲαの転写活性を、合成リガンドを使用してその核内転写制御を介さない活性から分離することができる
プロモータ中にＥＲＥを含み、且つ古典的様式でエストロゲンによって調節され、初代頭蓋冠細胞に対して抗アポトーシス効果を有するＣ３遺伝子の転写に対する種々のリガンドの効果の比較を行った。図６Ａに示すように、転写活性を示さず、強力な抗アポトーシス効果を示すエストレンが認められた。それに対して、強力な転写活性を有するピラゾールの抗アポトーシス効果は最小であった。これら２つの化合物のアポトーシス効力は、ＥＲＫリン酸化を誘導する能力と相互関係を示す（図６Ｂ）。
【０２１１】
実施例７
導入遺伝子としてペプチドＦ６を使用したトランスジェニック動物
インビボで詳細に分析するために、エストロゲンまたはアンドロゲンの骨保護効果へのＡＲ作用に対するＥＲ作用の相対的寄与を、野生型卵巣摘出マウスおよびＥＲ−ペプチドアンタゴニスト２ＸＦ６をコードするテトラサイクリン誘導性導入遺伝子を保有するマウスにおける骨芽細胞形成および破骨細胞形成、骨芽細胞および破骨のアポトーシス、骨量および骨強度の比較によって行うことができる。エストロゲンは、ＥＲαもしくはＥＲβまたはＡＲによって有効且つ同一の潜在性で抗アポトーシス効果を発揮することができる。さらに、ＥＲαまたはＥＲβ媒介効果を、選択的ＥＲペプチドアンタゴニスト２ＸＦ６を使用して遮断することができる（図５Ｂ）。ＡＲを介したエストロゲンまたはアンドロゲンの活性を保持する一方で、導入遺伝子として２ＸＦ６を使用してＥＲαおよびＥＲβを介するこれらのステロイドの活性を同時に遮断することができる。ＥＲＫＯマウスの結果を混同している可能性が高いこのような発達問題を、アクチンプロモータによって駆動されるＴＥＴ　ＯＮ系の調節下に導入遺伝子を置くことによってによって回避することができ、これは、Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ら、１９９３、Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、１８、４７１〜４７５、およびＧｏｓｓｅｎ，Ｍ．ら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８、１７６６〜１７６９に記載されている。
【０２１２】
逆テトラサイクリンリプレッサー（ｒＴｅｔＲまたはＴＥＴ−ＯＮ）系は、ＴｅｔＲ−オペレーター−Ｔｃ相互作用、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−ＶＰ１６転写活性化ドメイン、およびテトラサイクリン（Ｔｃ）の高い特異性をうまく利用する。従来の（ＴＥＴ−ＯＦＦ）系では、ＨｅＬａ細胞でのレポーターアッセイで認められるように、Ｔｃ調節トランスアクチベータ（ｔＴＡ）（ＴｅｔＲとＶＰ１６タンパク質の活性化ドメインとの間の融合）により遺伝子発現が刺激される。刺激効率を、レポーター遺伝子発現レベルの１０５倍増加によって立証した。ＴｃはｔＴＡの最小プロモータ上流のｔｅｔオペロン（ｔｅｔＯ）への結合を阻止し、その結果ｔＴＡ依存性発現をオフにする。しかし、ＴＥＴ−ＯＮ系は、改変されたｒｔＴＡアクチベータ（Ｔｃなど）またはＶＰ１６のオペレーターへの結合を破壊するよりもむしろ誘導する誘導体ドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を利用する。ＴＥＴ−ＯＮ系は、テトラサイクリンへの長期曝露後に真核細胞に付与し得る任意の潜在的な毒性を回避する。
【０２１３】
ペプチドのＤｏｘ誘導発現用の同一のマウスに２つの構築物を移入した。第１の構築物では、ｒｔＴＡ（ｒＴＥＴＲおよびＶＰ１６活性化ドメインから構成される）をコードする遺伝子を、遍在発現用のアクチンプロモータの調節下に置く。このプロモータを首尾よく使用して、トランスジェニックマウスにおいてヒト胎盤アルカリホスファターゼ遺伝子の遍在発現を指示した（ＤｅＰｒｉｍｏ，Ｓ．Ｅ．ら、１９９６、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ．Ｒｅｓ．、５、４５９〜４６６）。核局在化シグナル（ＮＬＳ）およびポリアデニル化部位（ｐｏｌｙＡ）を含むヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の第１のイントロン領域を、アクチンｒｔＴＡ構築物の下流にクローン化して、転写物を安定化し、最適なタンパク質発現レベルを付与する。第２の構築物では、ｔｅｔＯ配列および最小プロモータを保有するテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）を、ＧＡＬ４ＤＢＤ２ＸＦ６−ｈＧｈ−ｐｏｌｙ（ａ）カセットの上流に入れる。
【０２１４】
ＥＲの転写および抗アポトーシス活性両方の抑制において１つのみのコピーよりも有効であるので、２Ｘ６Ｆペプチドの２つのコピーをＧＡＬ４　ＤＮＡ結合ドメイン２ＸＦ６ペプチド融合で使用することができる。同時組み込み構築物を保有するトランスジェニックマウスを成体まで成長させて、飲料水に混合したＤｏｘで治療した。ドキシサイクリン（ＤＯＸ）の非存在下では、第１の構築物中のトランスアクチベーターは、ｔｅｔＯ配列への結合を遮断される。一旦ドキシサイクリンが添加されると、トランスアクチベータはＴＲＥ中のその標的ｔｅｔＯ配列を認識し、アクチンプロモータの調節下で、プロモータはペプチド配列の転写活性化を駆動する。
【０２１５】
微量注入用のＤＮＡ構築物の作製
アクチン−ｒｔＴＡ−ポリ（Ａ）およびＴＲＥＧＡＬ４ＤＢＤ２ＸＦ６−ｈＧＨ−ｐｏｌｙ（Ａ）ＤＮＡ構築物を、標準的なサブクローニング技術にしたがって作製する。２つの構築物のうちのそれぞれ１つには、多工程のクローニングが必要である。最終構築物の各工程を、配列分析およびＤｏｘ治療に応答する両ＥＲの活性遮断能力のモニタリングによってＨｅＬａ細胞の一過性トランスフェクタントに確立された機能を使用して評価する。
【０２１６】
トランスジェニックマウスの作製および同定
アクチン−ｒｔＴＡ−ポリ（Ａ）およびＴＲＥＧＡＬ４ＤＢＤ２ＸＦ６−ｈＧｈ−ｐｏｌｙ（Ａ）ＤＮＡ構築物を、各ベクターから切り出し、マウス受精卵に微量注入する。卵を２細胞期にし、偽妊娠代理マウスの卵管に再移植する。得られた同腹子を、アクチン−ｒｔＴＡ−ポリ（Ａ）およびＴＲＥＧＡＬ４ＤＢＤ２ＸＦ６−ｈＧｈ−ｐｏｌｙ（Ａ）導入遺伝子の同時組み込みについてテールＤＮＡ　ＰＣＲによってスクリーニングする。２つのＤＮＡカセットが同一または類似の宿主ゲノム位置に組み込まれているかどうかを調査するために、創始者をＣ５７ＢＬ６マウスと交配し、導入遺伝子伝達について子孫をスクリーニングする。上記のＰＣＲを使用したＤＮＡスクリーニング後、両構築物についてポジティブなトランスジェニック同腹子を、さらなる特徴づけのために選択する。各組み込み導入遺伝子のＤＮＡ配列の完全性を、テール核内転写制御性ＤＮＡのサザンブロット分析および各導入遺伝子の５’または３’末端に相同なプローブに対するハイブリッド形成によって確認する。
【０２１７】
マウスにおける導入遺伝子発現の特徴づけ
同定したトランスジェニック動物（Ｔｅｔ−Ｆ６という）を、Ｄｏｘに応答するＦ６ペプチド発現にスイッチングする能力について特徴づけを行う。文献に記載のように（Ｒａｙ，Ｐ．ら、１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００、２５０１〜２５１１）、２匹のトランスジェニック同腹子を、通常の水または０．５ｍｇ／ｍｌ　Ｄｐｏｘを補足した水で種々の期間維持する。このアプローチは、Ｆ６ペプチドの発現を誘導するために必要なＤｏｘ処理マウスの最低必要時間を評価する。マウスを、Ｄｏｘの添加前、添加から２、４、６日間後に屠殺し、組織を採取する。全ｍＲＮＡを、頭蓋冠、大腿骨、椎骨、子宮、乳腺、および多数の柔組織（肝臓、肺、腎臓、脾臓、脳など）から抽出し、ノーザンブロット分析を使用してＦ６発現を評価する。その後同一のアプローチを行って、２匹のトランスジェニック動物の飲料水からのＤｏｘの除去により、ペプチド産生が停止されることを確認する。
【０２１８】
ペプチドのエストロゲン誘導性転写を遮断する能力の評価
２匹のトランスジェニックマウスを、ＥＲＥ−ｌａｃＺトランスジェニックマウスと交配させる。３匹のトランスジェニック同腹子が成体に達した場合、飲料水にＤｏｘを添加し、ペプチド発現を少なくとも４８時間誘導および維持する。ＥＲ媒介転写が遮断されたことを確認するために、２０ｎｇ／ｇ体重のＥ２で２４時間処理した後に動物を屠殺し、子宮、乳腺、大腿骨、および椎骨のＬａｃＺ活性を測定した。一旦ＥＲＥ−ｌａｃＺトランスジェニックマウスでのペプチド発現およびＥＲ転写の遮断が確認されると、ＷＴマウスおよび擬給食または卵巣摘出マウスのいずれかにおいて成体期に少なくとも２８日間Ｆ６発現を誘導するＴｅｔ−Ｆ６マウスを使用して、遮断を直接確認する。手術後、全ての群を、２０ｎｇ／ｇ体重のＥ２で２８日間治療する。処理から２８日後、マウスを屠殺し、子宮および乳腺を単離した。これらの組織から全ＲＮＡを抽出し、ラクトフェリン（古典的ＥＲＥ結合を介してエストロゲンによって転写調節されている遺伝子）発現についてスクリーニングする。ＷＴマウスでは、ラクトフェリンｍＲＮＡは、これらの同一の実験条件下で、子宮にて約５倍増加することが既知である。ＥＲペプチドアンタゴニストの機能効率を、Ｔｅｔ−Ｆ６動物ではラクトフェリン発現が欠損するが、エストラジオールを投与された卵巣摘出ＷＴコントロールでは欠損しないことで直接確立した。
【０２１９】
骨表現型分析
Ｅ２（２０ｎｇ／ｇ体重）、ＤＨＴ（２０ｎｇ／ｇ体重）、または賦形剤のいずれかで治療した４月齢の雌Ｔｅｔ−Ｆ６マウスにおいて導入遺伝子を、４から６週間オンにする。賦形剤またはステロイド治療Ｔｅｔ−Ｆ６マウスの骨表現型を、４月齢で卵巣摘出し、卵巣摘出後さらに４〜６週間Ｅ２またはＤＨＴ治療を行うか行わないで維持した野生型動物の表現型と比較する。Ｔｅｔ−Ｆ６および野生型動物を、導入遺伝子のオンまたは卵巣摘出から１週間間隔でインビボＤＥＸＡ分析によって骨量を評価する。４から６週間後、両動物群を屠殺し、以下の同定を行うａ）全身ならびに子宮および乳腺の重量、ｂ）長骨の長さおよび骨膜と骨内膜との間の骨の幅、ｃ）骨髄細胞のエクスビボ培養における骨芽細胞形成および破骨細胞形成、ｄ）椎骨切片における骨芽細胞／骨細胞および破骨細胞アポトーシスの罹患率、ｅ）動的組織形態計測による骨形成および骨吸収の速度、ｆ）椎骨の圧縮強度。動的組織形態計測のために動物を屠殺する８日前および２日前に腹腔内注射で３０ｎｇ／ｇ体重の塩酸オキシテトラサイクリンを投与した。ＴＥＴ　ＯＮ系は、ドキシサイクリンよりもテトラサイクリンに対して感度が１／１００から１／１０００であるに留意することが重要である。さらに、ドキシサイクリン（０．５ｍｇ／ｍｌ飲料水）の投与は骨再構成に影響を与えず、０．５ｍｇのテトラサイクリンの注射（ｓ．ｃ．）後の海綿質に形成されたテトラサイクリン標識の視覚化を干渉しないことが確立されている。したがって、この操作は、導入遺伝子の発現に影響を与えず、この段階でドキシサイクリンがオンになった。
【０２２０】
実施例８
αＩＩおよび２９３導入遺伝子を使用したトランスジェニック動物
２つのＥＲペプチドアンタゴニストαＩＩ＋２Ｘ２９３（ここから先はＴｅｔ−ペプチドという）をコードするテトラサイクリン誘導導入遺伝子を保有するトランスジェニックマウスを、類似の方法を使用して作製することができる。導入遺伝子としてαＩＩ＋２Ｘ２９３を使用して、ＥＲαによる核内転写制御を介さない活性を保持することができるが、ＥＲαおよびＥＲβの両方による転写活性およびＥＲβの核内転写制御を介さないを遮断することができる。２９３ペプチドは、ＥＲβの転写活性および核内転写制御を介さない活性を遮断するが、ＥＲαの転写活性または核内転写制御を介さない活性のいずれかに対する効果はない。
【０２２１】
２つの構築物を構築し、ペプチドのＤｏｘ誘導性発現のために同一のマウスに同時移入する（図８）。第１の構築物では、ｒｔＴＡ（ｒＴｅｔＲおよびＶ１６活性化ドメインから構成される）をコードする遺伝子を、遍在発現のためにアクチンプロモータの調節下に置く。核局在化シグナル（ＮＬＳ）およびポリアデニル化部位（ｐｏｌｙＡ）を含むヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の第１のイントロン領域を、アクチンｒｔＴＡ構築物の下流にクローン化して、転写物を安定化し、最適なタンパク質発現レベルを付与する。第２の構築物では、ｔｅｔＯ配列および最小プロモータを保有するテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）を、ＧＡＬ４ＤＢＤαＩＩ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ２Ｘ２９３−ｈＧｈ−ｐｏｌｙ（Ａ）カセットの上流に入れる。このカセットでは、ＧＡＬ４　ＤＮＡ結合ドメイン−αＩＩペプチド融合を、内部リボゾーム侵入部位（ＩＲＥＳ、１つのｍＲＮＡ由来の２つの読み取り枠を転写する）と共に緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＧＦＰ）に融合する２９３ペプチドの２つのコピーに連結させる。
【０２２２】
２９３ペプチドの２つのコピーを使用する理由は、予備試験でＥＲβの転写および抗アポトーシス活性の両方の抑制において１コピーのみよりも有効であることを示したからである。αＩＩおよび２Ｘ２９３ペプチドをそれぞれ同一のＧＡＬ４ＤＢＤの代わりに異なるタンパク質を融合して、２つの同一のＧＡＬ４ＤＢＤ領域間で起こる組換えの可能性を回避する。さらに、ＧＡＬ４ＤＢＤαＩＩ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ２Ｘ２９３−ｈＧｈ−ｐｏｌｙ（Ａ）カセットにＧＦＰを組み込んで、ペプチド発現の容易なスクリーニング手段を得る。同時組み込み構築物を保有するトランスジェニックマウスを成体まで成長させて、飲料水に混合したＤｏｘで治療した。Ｄｏｘの非存在下では、第１の構築物でのトランスアクチベーターは、ｔｅｔＯ配列への結合が遮断される。一旦Ｄｏｘが添加されると、トランスアクチベータはＴＲＥ中のその標的ｔｅｔＯ配列を認識し、アクチンプロモータの調節下で、プロモータはペプチド配列の転写活性化を駆動する。
【０２２３】
微量注入用のＤＮＡ構築物の作製
アクチン−ｒｔＴＡ−ポリ（Ａ）およびＴＲＥ−ＧＡＬ４ＤＢＤαＩＩ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ２Ｘ２９３−ｈＧｈ−ｐｏｌｙ（Ａ）ＤＮＡ構築物を、標準的なサブクローニング技術にしたがって作製する。最終構築物の完全性を配列分析によって評価し、機能をＥＲαおよびＥＲβ両方の転写活性ならびにＥＲβの抗アポトーシス活性の遮断能力のモニタリングによってＨｅＬａ細胞の一過性タランスファクタントで確立する。
【０２２４】
トランスジェニックマウスの作製および同定
アクチン−ｒｔＴＡ−ポリ（Ａ）およびＴＲＥ−ＧＡＬ４ＤＢＤαＩＩ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ２Ｘ２９３−ｈＧｈ−ｐｏｌｙ（Ａ）ＤＮＡ構築物を、各ベクターから切り出し、マウス受精卵に微量注入する。卵を２細胞期にし、偽妊娠代理マウスの卵管に再移植する。テールＤＮＡを、アクチン−ｒｔＴＡ−ポリ（Ａ）およびＴＲＥ−ＧＡＬ４ＤＢＤαＩＩ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ２Ｘ２９３−ｈＧｈ−ｐｏｌｙ（Ａ）導入遺伝子の同時組み込みについてスクリーニングする。２つのＤＮＡカセットが同一または類似の宿主ゲノム位置に組み込まれているかどうかを調査するために、創始者をＣ５７ＢＬ６マウスと交配し、導入遺伝子伝達について子孫をスクリーニングする。上記のＰＣＲを使用したＤＮＡスクリーニング後、両構築物についてポジティブなトランスジェニック同腹子を、さらなる特徴づけについて選択する。各組み込み導入遺伝子のＤＮＡ配列の完全性を、テール核内転写制御性ＤＮＡのサザンブロット分析および各導入遺伝子の５’または３’末端に相同なプローブに対するハイブリッド形成によって確認する。
【０２２５】
マウスにおける導入遺伝子発現の特徴づけ
同定したトランスジェニック動物を、Ｄｏｘに応答するαＩＩおよび２９３ペプチド発現にスイッチングする能力について特徴づけを行う。２匹のトランスジェニック同腹子を、通常の水または０．５ｍｇ／ｍｌ　Ｄｐｏｘを補足した水で種々の期間維持する。このアプローチは、αＩＩおよび２９３ペプチドの発現を誘導するために必要なＤｏｘ処理マウスの最低必要時間を評価する。マウスを、Ｄｏｘの添加前、添加から２、４、６日間後に屠殺し、組織を採取する。全ｍＲＮＡを、頭蓋冠、大腿骨、椎骨、子宮、乳腺、および多数の柔組織（肝臓、肺、腎臓、脾臓、脳など）から抽出し、ノーザンブロット分析を使用してαＩＩおよび２９３ペプチド発現を評価する。その後同一のアプローチを行って、２匹のトランスジェニック動物の飲料水からのＤｏｘの除去により、ペプチド産生が停止されることを確認する。
【０２２６】
ペプチドのエストロゲン誘導性転写を遮断する能力の評価
Ｔｅｔペプチド動物のエストロゲン転写活性の選択的阻害を同定するために、２つのアプローチを行った。第１に、２匹のトランスジェニックマウスを、ＥＲＥ−ｌａｃＺトランスジェニックマウスと交配する。３匹のトランスジェニック同腹子が成体に達した場合、飲料水にＤｏｘを添加し、ペプチド発現を少なくとも４８時間誘導および維持する。ＥＲ媒介転写が遮断されたことを確認するために、２０ｎｇ／ｇ体重のＥ２で２４時間処理した後に動物を屠殺し、子宮、乳腺、大腿骨、および椎骨のＬａｃＺ活性を測定した。ＥＲ媒介転写の遮断の直接確認のために、ＷＴマウスおよび成体期に少なくとも２８日間ペプチド発現を誘導するＴｅｔペプチドマウスを擬給食を与えるか卵巣摘出する。手術後、全ての群を、２０ｎｇ／ｇ体重のＥ２で２８日間治療する。処理から２８日後、マウスを屠殺し、子宮および乳腺を単離した。これらの組織から全ＲＮＡを抽出し、ラクトフェリン（古典的ＥＲＥ結合を介してエストロゲンによって転写調節されている遺伝子）発現についてスクリーニングする。Ｔｅｔ−ペプチド動物ではラクトフェリン発現が欠損するが、エストラジオールを投与した卵巣摘出ＷＴコントロールでは欠損しないことにより、ＥＲペプチドアンタゴニストの機能的効率を直接確立される。
【０２２７】
骨表現型分析
上記のように一旦Ｔｅｔ−ペプチドマウスが確立され、特徴付けられると、雌を４月齢まで成長させる。この時点で、導入遺伝子を４から６週間オンにし、骨表現型を、４月齢で卵巣提出し、卵巣摘出後さらに４から６週間維持した野生型動物と比較する。導入遺伝子のオンまたは野生型動物の卵巣摘出後１週間間隔で、両動物をインビボＤＥＸＡ分析によって骨量を評価する。脊髄ＢＭＤの変化％が卵巣摘出野生型群では少なくとも３％が変化するか６週間後のいずれか早いほうで、動物を屠殺する。この相違には、群あたり８０％を超える８匹の動物が必要である。４から６週間後、両動物群を屠殺し、以下の同定を行うａ）全身ならびに子宮および乳腺の重量、ｂ）長骨の長さおよび骨膜と骨内膜との間の骨の幅、ｃ）骨髄細胞のエクスビボ培養における骨芽細胞形成および破骨細胞形成、ｄ）椎骨切片における骨芽細胞／骨細胞および破骨細胞アポトーシスの罹患率、ｅ）動的組織形態計測による骨形成および骨吸収の速度、ｆ）椎骨の圧縮強度。動的組織形態計測のために動物を屠殺する８日前および２日前に腹腔内注射で３０μｇ／ｇ体重の塩酸オキシテトラサイクリンを投与した。ＴＥＴ　ＯＮ系は、Ｄｏｘよりもテトラサイクリンに対して感度が１／１００から１／１０００であるに留意することが重要である。さらに、Ｄｏｘ（０．５ｍｇ／ｍｌ飲料水）の投与は骨再構成に影響を与えず、０．５ｍｇのテトラサイクリンの注射（ｓ．ｃ．）後の海綿質に形成されたテトラサイクリン標識の視覚化を干渉しない。
【０２２８】
実施例９
不活化誘導性ステロイド受容体を有するトランスジェニック動物
閉経後または精巣摘出後の正確且つ有益なモデルは、性ステロイド受容体のそれぞれ１つの欠失、細胞特異的様式（骨芽細胞、破骨細胞、および両方）および遍在の両方が必要である。バクテリオファージＰの１時間のＣｒｅ／ｌｏｘＰ二成分（ｂｉｎａｒｙ）組換え系は、ＥＳ細胞（Ｚｏｕ，Ｙ．Ｒ．ら、１９９４、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．、４、１０９９〜１１０３；Ｇｕ，Ｈ．ら、１９９３、Ｃｅｌｌ、７３、１１５５〜１１６４）およびトランスジェニックマウス（Ｌａｋｓｏ，Ｍ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９、６２３２〜６２３６；Ｏｒｂａｎ，Ｐ．Ｃ．ら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９、６８６１〜６８６５）の両方でのｌｏｘＰ部位特異的組換えを有効に媒介することが示されている。
【０２２９】
微量注入用ＤＮＡ構築物の作製
逆テトラサイクリンリプレッサー（ｒＴｅｔＲまたはＴＥＴ−ＯＮ）系を使用して、条件的発現を行う。第１の構築物では、破骨細胞特異的発現のためにｒｔＴＡをコードする遺伝子をオステオカルシン（ＯＧ−２）プロモータの調節下に置いた。核局在化シグナル（ＮＬＳ）およびポリアデニル化部位（ｐｏｌｙ（Ａ））を含むヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の第１のイントロン領域を、ＯＧ−２−ｒｔＴＡ構築物の下流にクローン化して、転写物を安定化し、最適なタンパク質発現レベルを付与する。第２の構築物では、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）を、Ｃｒｅ−ｈＧｈ−ｐｏｌｙ（ａ）カセットの上流に入れる。２つの構築物のうちの１つはそれぞれ複数のクローニング工程を必要とする（図９Ａ）。各工程を、適切な制限酵素消化およびＰＣＲ反応でチェックし、最終構築物を配列決定した。さらに、Ｄｏｘ誘導Ｃｒｅ発現の特異性および有効性を、Ｏｂ−６骨芽細胞株を使用したインビトロ系で確認する。これらの細胞を、特徴づけ、オステオカルシンならびにＥＲαおよびＥＲβの両方を発現することが見出された。Ｏｂ−６細胞を、ＯＧ−２−ｒｔＴＡ−ｐｏｌｙ（Ａ）およびＴＲＥ−Ｃｒｅ−ｈＧｈ−ｐｏｌｙ（Ａ）構築物または空のベクターのいずれかで一過性にトランスフェクトし、これらを１．５μｇ／ｍｌのＤｏｘまたは賦形剤で４８時時間処理した。細胞を回収し、全ＲＮＡの抽出に使用した。Ｃｒｅ特異的プライマーを使用した半定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により、Ｄｏｘで処理した細胞集団のみでＣｒｅの特異的発現が認められた（図９Ｂ）。
【０２３０】
トランスジェニックマウスの作製および同定
ＯＧ−２−ｒｔＴＡ−ｐｏｌｙ（Ａ）およびＴＲＥ−Ｃｒｅ−ｈＧｈ−ｐｏｌｙ（Ａ）ＤＮＡ構築物を、適切な制限エンドヌクレアーゼで各ベクターから切り出し、受精Ｃ５７Ｂ１／６マウスの卵の前核に微量注入した。卵を２細胞期にし、偽妊娠代理マウスの卵管に再移植する。創始者を、ＯＧ−２−ｒｔＴＡおよびＴＲＥ−Ｃｒｅ導入遺伝子の同時組み込みについてのスクリーニングによって同定する。ＯＧ−２−ｒｔＴＡおよびＴＲＥ−Ｃｒｅ構築物（以後Ｔｅｔ−ＯＧ２−Ｃｒｅという）の両方にトランスジェニックなマウスを、それぞれＯＧ−２−ｒｔＴＡおよびＣｒｅ　ＤＮＡ配列の一部を増幅するようにデザインされている２組のプライマーを使用するテールＤＮＡのＰＣＲ分析によって同定する。２つのＤＮＡカセットがマウスゲノムの同一の部位に組み込まれているかを調査するために、創始者をＣ５７ＢＬ６マウスと交配し、導入遺伝子伝達について子孫をスクリーニングする。上記のＰＣＲを使用したＤＮＡスクリーニング後、両構築物についてポジティブなトランスジェニック同腹子を、さらなる特徴づけのために選択する。各組み込み導入遺伝子のＤＮＡ配列の完全性を、テール核内転写制御性ＤＮＡのサザンブロット分析および各導入遺伝子の５’または３’末端に相同なプローブに対するハイブリッド形成によって確認する。
【０２３１】
導入遺伝子の機能的特徴づけ
同定したトランスジェニック動物を、Ｄｏｘに応答するＣｒｅ発現にスイッチングする能力について特徴づけを行う。文献に報告のように（Ｒａｙ，Ｐ．ら、１９９７、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１００、２５０１〜２５１１）、２匹のトランスジェニック同腹子を、通常の水または０．５ｍｇ／ｍｌ　Ｄｐｏｘを補足した水で種々の期間維持する。このアプローチは、Ｄｏｘ処理マウスの最低必要時間を評価する。Ｃｒｅの発現を誘導するために、Ｄｏｘの添加前、添加から２、４、６日間後に屠殺し、組織を採取する。全ｍＲＮＡを、頭蓋冠、大腿骨、椎骨、子宮、乳腺、および多数の柔組織（肝臓、肺、腎臓、脾臓、脳など）から抽出し、ノーザンブロット分析を使用してＣｒｅ発現を評価する。その後同一のアプローチを行って、２匹のトランスジェニック動物の飲料水からのＤｏｘの除去により、Ｃｒｅ産生が停止されることを確認する。
【０２３２】
Ｃｒｅ媒介組換えをモニターするために、Ｔｅｔ−ＯＧ２−Ｃｒｅマウスを、現在Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｗから利用可能なＲＯＳＡ２６受容体マウス（Ｍａｏ，Ｘ．ら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９６、５０３７〜５０４２）と交配させる。これらのマウスでは、フロックス化（ｆｌｏｘｅｄ）ストッパーフラグメントおよびβ−ガラクトシダーゼ−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合遺伝子（βｇｅｏ）を、ＲＯＳＡ２６遺伝子座に組み込んだ。ストッパーフラグメントのＣｒｅ媒介切り出し後、βｇｅｏの発現を、ＲＯＳＡ２６対立遺伝子のエクソン１で駆動させ、これは胚発生期および成体期で遍在している。機能的Ｔｅｔ−ＯＧ２−Ｃｒｅトランスジェニック株とＲＯＳＡ２６マウスの交配により、骨芽細胞でβガラクトシダーゼが発現する。頭蓋冠、大腿骨、および椎骨などの組織を、βガラクトシダーゼ発現について染色する。類似のアプローチを使用して、Ｔ細胞特異的発現を評価した（Ｍａｏ，Ｘ．ら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、９６、５０３７〜５０４２）。
【０２３３】
ＥＲαのフロックス化エクソン３を保有するマウス変異株
第２のマウス株（Ｉｎｄ−ＥＲＫＯ）は、それぞれＣｒｅ組換えによって認識される一連の３４ｂｐの縦列反復からなる２つのｌｏｘＰ部位に隣接する９６ｋｂの０．２４９ＫｂのマウスＥＲαＤＮＡ結合ドメイン（７４０〜９８９ｂｐ）（Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．ら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１、７３５〜７４４）を含むエクソン３（６５３〜８４５ｂｐ）を保有する。２つのｌｏｘＰ部位（フロックス化）に隣接した同方向の任意のＤＮＡ領域を、Ｃｒｅ組換え作用後に切り出した。エクソン３に含まれるＤＮＡ結合配列および弱い二量体形成ドメインの欠失によるＥＲαの不活化により、受容体の転写活性を破壊する。さらに、エクソン３は、エクソン３の上流領域が除去された場合に選択的スプライシングが行われ得るいくつかの潜在的な受容体配列を含む。最後に、エクソン３のＣｒｅ媒介欠失は、ＥＲαＤＮＡ下流の読み取り枠を破壊し、抗アポトーシスまたは二量体形成を必要とする任意の残存する活性、および／またはリガンド結合ドメインを不活化する。
【０２３４】
ＥＲα変異マウスの作製
Ｃ５７Ｂ１／６マウス遺伝子ライブラリーから単離し、ＢＡＣベクターにサブクローン化されたマウスＥＲα遺伝子のエクソン３および４を含む８６Ｋｂの核内転写制御性遺伝子座（図１０）を、Ｋｅｎ　Ｋｏｒａｃｈ博士（ＮＩＨ）から入手した。この核内転写制御を介する遺伝子座を制限マッピングおよび配列分析に関して特徴づけ、５ｋｂの左アームおよび３ｋｂの右アームに隣接するエクソン３（０．２Ｋｂ）を含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをサブクローン化した。標的構築物を、ｐＥａｓｙ−Ｆｌｏｘベクター（３つのｌｏｘＰ部位（そのうちの２つがサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータの調節下でネオマイシン耐性（ｎｅｏ−１）遺伝子に隣接している）およびＨＳＶ−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）カセットを含む）に構築する。インビトロでのＥＳ細胞中のフロックス化エクソン３を作製し局在化させるための２工程戦略を図１０に示した。第１の工程では、左アームの上流のフロックス化ＨＳＶ−ｎｅｏ１選択マーカー、フロックス化エクソン３、右アーム、およびその後のＨＳＶ−ｔｋカセットを含む標的構築物をＣ５７Ｂ１／６ＥＳ細胞（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｂｅｌｇｕｉｍから獲得し、生殖系列伝達についての二倍体凝集および三倍体凝集による試験でポジティブ）にエレクトロポレーションし、相同組換えによって標的核内転写制御を介する遺伝子座の隣接領域に移入する。
【０２３５】
トランスフェクトＥＳ細胞を、マイトマイシンＣおよびＬＩＦ処理したＳｗｉｓｓ／１２９／Ｂａｌｂ／ｃマウス由来ｎｅｏ耐性マウス胚線維芽細胞（これもＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃから入手）の単層上で増殖させる。エレクトロポレーションおよびＧ４１８およびガンシクロビルを使用したポジティブＥＳクローンの選択を、確立されたプロトコールにしたがって行った（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ、３２３、４４５〜４４８）。標的化構築物のＧ４１８ポジティブクローンへの相同組換えを、核内転写制御性ＤＮＡのサザンブロット分析を使用して確認する。相同組換え頻度は二剤耐性コロニーにおいて１８個のうち１個（Ｇｕ，Ｈ．，Ｊｅｔら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５、１０３〜１０６）および５０個のうち１個（Ｐａｓｐａｒａｋｉｓ，Ｍ．ら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８４、１３９７〜１４１１）で変動することが報告されている。第２の工程では、ＣＭＶプロモータの調節下でＣｒｅを保有するプラスミドを、遺伝子改変ＥＳ細胞にエレクトロポレーションする。Ｃｒｅの発現は一過性であるので、３つのｌｏｘＰ部位のうち２つが１回だけ相同組換えして、３つの型の欠失が得られる可能性がある。Ｉ型欠失により、ＥＳゲノムからエクソン３−ｌｏｘＰ−ＨＳＶ−ｎｅｏ１選択マーカーが完全に欠失し、対応するＥＳ細胞由来の動物は生殖系列中にフロックス化エクソン３を保有する。サザンブロット分析を使用して、ＩＩＩ型欠失を同定する。このアプローチは説明されており、ＤＮＡポリメラーゼβ遺伝子セグメントのＴ細胞特異的欠失に首尾よく使用されている（Ｇｕ，Ｈ．Ｊｅｔら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５、１０３〜１０６）。標的化ＥＳ細胞を、ＢＡＬＢ／Ｃ胚盤胞に微量注入する。雄キメラを、Ｃ５７Ｂ１／６雌と交配させる。子孫での生殖系列伝達を、サザンブロット分析によって確認する。最後に、フロックス化遺伝子の機能の完全性を、古典的な受容体結合研究および卵巣および子宮などの古典的標的組織から単離した細胞を使用した転写アッセイを使用して同定する。
【０２３６】
骨芽細胞または破骨細胞特異的ＥＲα不活化のために、Ｉｎｄ−αＥＲＫＯマウスをＴｅｔ−ＯＧ２−ＣｒｅトランスジェニックマウスまたはＴＲＡＰ−Ｃｒｅトランスジェニックマウスと交配させた。得られた子孫を成体まで成長させ、Ｔｅｔ−ＯＧ２−Ｃｒｅの場合、所定の時間Ｄｏｘで処理し、Ｃｒｅ発現を最大にする。次いで、マウスを屠殺し、頭蓋冠、大腿骨、椎骨、子宮、乳腺、肺、肝臓、腎臓、および脳を含む組織を採取し、核内ＤＮＡを抽出する。エクソン３欠失に特異的なＣｒｅ媒介細胞の有効性を、異なる組織から抽出した核内転写制御性ＤＮＡのサザンブロット分析によって評価する。ＥＲαの骨芽細胞特異的不活化を、ＥＲαノックアウトマウスから単離した頭蓋冠細胞の複数のＥＲＥ−ルシフェラーゼ構築物でのトランスフェクションによって証明した。他の細胞ではなく骨芽細胞におけるＥＲα不活化の特異性を、頭蓋骨芽細胞の代わりに同一のマウス由来の乳房または子宮細胞を使用した同一の研究によって確立する。このアプローチをＥｒｎｓｔおよび共同研究者は以前に首尾よく使用して、骨芽細胞における低レベルの機能的内因性ＥＲの存在を証明した（Ｅｒｎｓｔ，Ｍ．、Ｍ．Ｇ．Ｐａｒｋｅｒ，ａｎｄ　Ｇ．Ａ．Ｒｏｄａｎ、１９９１、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．、１１、１５９７〜１６０６）。これらの実験では、ＥＲβを介したＥＲＥ転写に対する潜在的効果を、１７β−Ｅ２の代わりにＥＲα特異的リガンドであるプロピルピラゾールトリオール（Ｊｏｈｎ　Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ博士、イリノイ大学、Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｉｇｎが開発した合成化合物）の使用によって取り除く。プロピルピラゾールトリオールは、Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎグループによって報告されている化合物群に関連する種々の構造のＥＲリガンドである（Ｓｕｎ，Ｊ．ら、１９９９、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１４０、８００〜８０４）。この化合物は、明らかなＥＲα選択性結合親和性を有し（１７β−Ｅ２に対するＲＢＡはＥＲαでは６３、ＥＲβでは０．０９５）、および一過性トランスフェクトヒト子宮内膜癌（ＨＥＣ−１）細胞において高いＥＲα転写潜在性を示すが、高い治療濃度でさえＥＲβ媒介転写活性を示さない（私信）。ノックアウトマウスにおける骨芽細胞特異的様式でのＥＲα不活化を証明するためのさらなるアプローチとして、ノックアウトマウスをＥＲＥ−ｌａｃＺレポーターマウスと交配させる。得られた同腹子および野生型動物の卵巣を摘出して内因性エストロゲンを除去する。卵巣摘出から１週間後、いずれかの型のマウスを、プロピルピラゾールトリオールで２４時間処理する。２４時間の治療後、マウスを屠殺し、ＥＲαまたはこれを欠く転写活性を、子宮、乳房、および骨切片のβガラクトシダーゼ染色でアッセイする。
【０２３７】
骨芽細胞および破骨細胞のみにＥＲα不活化が標的化されたマウスの作製に加えて、ＥＲαがこの遺伝子を発現する全ての細胞型で不活化された異なるマウスを、Ｉｎｄ−αＥＲＫＯマウスのＭｘ−Ｃｒｅ導入遺伝子を保有する既存のトランスジェニックマウスとの交配によって作製する（Ｋｕｈｎ，Ｒら、１９９５、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６９、１４２７〜１４２９）。このマウスでは、Ｃｒｅリコンビナーゼは、Ｍｘ１遺伝子プロモータの調節下にある。この遺伝子は健常なマウスではサイレントであるが、ウイルス感染時にオンになる。実験的に、ＩＦＮ−α若しくはβまたは合成二本鎖ＲＮＡポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ｐＩ−ｐＣ）（これ自体がマウスのＩＦＮインデューサーである）の投与によってＭｘ１プロモータ活性を非常に高いレベルに刺激することができる。フロックス化ＥＲαおよびＭｘ−Ｃｒｅの両方を保有するマウスは、ＩＦＮまたはｐＩ−ｐＣでの処理時にＥＲαの不活性に変異する。
【０２３８】
実施例１０
核内転写制御を介さないエストロゲン様シグナル伝達のスクリーニング法
転写活性を欠く核内転写制御を介さないエストロゲン様シグナル伝達のアクチベータを、ＳＲＥ−ＳＥＡＰ検出系（ポジティブ読み出し）およびＣ３（補体３）転写（ネガティブ読み出し）を使用してＥＲＫ活性化が同時に検出されるハイ・スループット・コンビネーションスクリーニングで同定する。このために、ＨｅＬａ細胞を、レトロウイルスを使用してｈＥＲαおよび／またはｈＡＲ、ＳＲＥ−ＳＥＡＰならびにＣ３−Ｌｕｃプラスミドで安定にトランスフェクトする。本発明の別の態様は、ｈＥＲαまたはｈＡＲ遺伝子がＴＥＴ−ＯＦＦ（テトラサイクリン−ＯＦＦ）系の調節下で条件的に発現する安定なトランスフェクタントである。
【０２３９】
ＳＲＥ−ＳＥＡＰアッセイは、分泌アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）発現を駆動する単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）プロモータの上流に存在する血清応答エレメント（ＳＲＥ）の転写因子（Ｅｌｋ−１／ＳＲＦ）誘導活性化のアッセイによってＭＡＰＫ／ＪＮＫシグナル伝達経路の活性化を検出する。このアッセイは市販されている。ＭＥＫ１またはＭＥＫＫ１キナーゼのインビボアッセイ用キットもまた市販されている。一般に、トランスフェクションから２４時間後、血清含有培地を、約０．２％血清を含む培地と置換する。細胞を約０．２％の血清中で２４時間培養し、その後アッセイする。コントロールサンプルを、賦形剤のみで処理する。
【０２４０】
一般に、ＨｅＬａ細胞を、４〜５×１０４／ウェルの濃度で４８ウェルプレートに分注し、１０％活性炭処理ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）、およびグルタミンを含む無フェノールレッドＭＥＭ培地中で一晩培養する。培地を除去し、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、トランスフェクション混合物（リポフェクタミン、リポフェクタミンプラス、０．６ｍｇまでのトランスフェクトされる全量ＤＮＡ）を含む無血清無抗生物質培地を重層する。細胞をトランスフェクション混合物と２から３時間インキュベートする。トランスフェクション混合物を除去し、１０％活性炭処理ＦＢＳ、抗生物質、およびグルタミンを含む新鮮な無フェノールレッドＭＥＭ培地と置換し、細胞を放置して２４時間後に回収する。１０％ＦＢＳ含有培地を、０．２％活性炭処理ＦＢＳ、抗生物質、およびグルタミンを含む新鮮な無フェノールレッドＭＥＭ培地と置換する。細胞を０．２％ＦＢＳ含有培地中で２４時間培養する。細胞を所望の濃度のステロイドで２４時間処理する。市販のキットを使用し、製造者の指示にしたがって、５０ｍｌの０．２％ＦＢＳ含有細胞培養培地中でＳＲＥ−ＳＥＡＰ活性を測定する。一過性トランスフェクションの場合、細胞溶解物におけるＲｅｎｉｌｌａ−ルシフェラーゼ活性のアッセイによってトランスフェクション効率についてデータを修正する。
【０２４１】
１７β−エストラジオールは、ＥＲＫ活性化およびＣ３転写のポジティブコントロール化合物である。ＥＲＫ活性化のネガティブコントロールとしてピラゾールを、Ｃ３転写のネガティブコントロールとしてエストレンを使用することができる。１７β−エストラジオールと比較して強力なＳＲＥ−ＳＥＡＰ活性を有するがＣ３−Ｌｕｃ活性が低いか存在しない化合物を選択する。選択基準には、Ｃ３転写に対するＥＲＫ活性化の比に基づいた目的の化合物の分類を含み得る。目的の化合物を、骨芽細胞／骨細胞抗アポトーシス活性についてさらにスクリーニングする。
【０２４２】
さらに、ＥＲの結合ポケットのコンビナトリアル・ケミストリーおよび三次元モデリングを使用して、新規のリガンドを合成することができる。
【０２４３】
本発明は目的を実行し、且つ記載の目標および利益ならびに本発明本来の目的、目標、および利益が得られるように十分に適用されることが当業者に容易に認識される。本発明の実施例は、本明細書中に記載の方法、手順、処理、分子、および特定の化合物と同様に現在の代表的な好ましい実施形態の例示であり、本発明の範囲の制限を意図しない。当業者はこれらを変更して他の用途で使用し、これらは特許請求の範囲によって規定された本発明の精神の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
インビボおよびインビトロでの性ステロイドによる骨芽細胞および骨細胞のアポトーシスの調節を示す一連のグラフである。Ａ．マウスの卵巣摘出および精巣摘出後の骨芽細胞および骨細胞アポトーシスの罹患率。バーは、群あたり４〜５匹の動物の平均±ＳＤを意味する。＊ｐ＜０．０５。Ｂ．頭蓋冠骨芽細胞を、１０−１１Ｍ〜１０−６ＭのＥ２またはＤＨＴで１時間処理後、プロアポトーシス薬エトポシド（５０μＭ）で６時間処理した。死細胞率を、トリパンブルー染色によって定量した。ステロイドの非存在下でのエトポシド誘導性アポトーシスを１００％とした。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを示す（Ｅ２またはＤＨＴ処理培養対各処理について異なる一元配置分散分析を使用した賦形剤について＊ｐ＜０．０５）。ＣおよびＤ。頭蓋冠由来の骨芽細胞またはＭＬＯ−Ｙ４骨細胞を１０−８ＭのＥ２またはＤＨＴで処理し、エトポシド、デキサメタゾン（１０−７）、またはＴＮＦα（１ｎＭ）の添加によってアポトーシスを誘導した。死細胞率をＢに記載のように定量した。結果を、二元配置分散分析によって分析した。各薬剤群および各薬剤対賦形剤内の前処理と所与の前処理と比較した場合、＊ｐ＜０．０５。Ｅ．コラーゲンゲルに組み込まれたＯＢ−６骨芽細胞を、異なる濃度のＥ２またはＤＨＴで２４時間処理した。無作為に選択した全部で２００個の細胞を評価した。賦形剤コントロールでは、３２．３±２．５％の細胞がアポトーシスであった。各処理について異なる一元配置分散分析を使用したＥ２またはＤＨＴ処理培地対賦形剤は＊ｐ＜０．０５。
【図２】
Ｅ２またはＤＨＴの抗アポトーシス効果がＥＲまたはＡＲアンタゴニストの両方で阻害され、これはＥＲ（αまたはβ）またはＡＲのいずれかを介して媒介され得ることを示す一連のグラフである。頭蓋冠骨芽細胞をＥＲアンタゴニストＩＣＩ　１８２，７８０（１０−７Ｍ）またはＡＲアンタゴニストフルタミド（１０−７Ｍ）で３０分間前処理後、１０−８ＭのＥ２またはＤＨＴと１時間インキュベートした。その後、エトポシドを添加し、６時間後にアポトーシス細胞を図１Ｂに記載のように定量した。結果を、ステロイドの非存在下（１００％）でのエトポシド誘導性アポトーシスの百分率として示す。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを示す（ＡＮＯＶＡによって賦形剤に対して＊ｐ＜０．０５）。Ｂ．ＨｅＬａ細胞を、Ｎｕｃ−ＥＧＦＰ発現ベクターと共に、ＥＲα、ＥＲβ、ＡＲ，ＶＤＲ、またはＲＸＲ発現ベクターまたは空のベクター（ｅｖ）のいずれかで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションから１６時間後、細胞を表示の濃度のＥ２、ＤＨＴ、または１，２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３（１，２５Ｄ３）で１時間処理後、エトポシドで６時間処理した。２００から５００個のトランスフェクトした（蛍光）細胞の核の形態学の実験によってアポトーシス細胞を同定した。ステロイドの非存在下（−）で培養した細胞のエトポシド誘導性アポトーシスを１００％ととした。結果を、エトポシド誘導性アポトーシスの百分率として示した（平均±ＳＤ）。ＡＮＯＶＡによるステロイドの非存在下でエトポシドで処理した細胞に対して＊ｐ＜０．０５。
【図３Ａ】
Ｅ（リガンド結合）ドメインへのＥＲαの抗アポトーシス活性の局在化および核標的化による除去を示す図である。Ａ．ＨｅＬａ細胞を、Ｎｕｃ−ＥＧＦＰおよび種々のＥＲα変異体の発現ベクターで同時トランスフェクトし、次いで１０−８ＭのＥ２で１時間処理後、エトポシドで６時間処理した。Ｂ．全長ＥＲαを、非標的化ＥＣＦＰに融合した（ＥＲα−ＥＣＦＰ）。ＥＲαのＥドメインを、非標的化ＥＣＦＰ（Ｅ−ＥＣＦＰ）、膜標的化ＥＣＦＰ（Ｅ−Ｍｅｍ−ＥＣＦＰ）、または核標的化ＥＣＦＰ（Ｅ−Ｎｕｃ−ＥＣＦＰ）のいずれかに融合した。これらの各融合タンパク質を、ＨｅＬａ細胞中で核標的化赤色蛍光タンパク質（Ｎｕｃ−ＥＲＦＰ）と共に発現し、その細胞内分布を落射蛍光顕微鏡で分析した。左および中央のパネルは、シアンまたは赤色フィルターセットを使用して得た同一の細胞の顕微鏡写真を示す。バー＝１５μｍ。その除去がシアン融合タンパク質の除去と容易に区別することができるので、本実験でＮｕｃ−ＥＲＦＰを使用してアポトーシスを定量した。トランスフェクト細胞を、１０−８のＥ２または賦形剤で１時間処理後、エトポシドで６時間処理した。３Ａおよび３Ｂのアポトーシスを、図２に記載のように定量した。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを示す。ＡＮＯＶＡによるエトポシドで処理されていない細胞に対して＊ｐ＜０．０５。
【図３Ｂ】
Ｅ（リガンド結合）ドメインへのＥＲαの抗アポトーシス活性の局在化および核標的化による除去を示す図である。Ａ．ＨｅＬａ細胞を、Ｎｕｃ−ＥＧＦＰおよび種々のＥＲα変異体の発現ベクターで同時トランスフェクトし、次いで１０−８ＭのＥ２で１時間処理後、エトポシドで６時間処理した。Ｂ．全長ＥＲαを、非標的化ＥＣＦＰに融合した（ＥＲα−ＥＣＦＰ）。ＥＲαのＥドメインを、非標的化ＥＣＦＰ（Ｅ−ＥＣＦＰ）、膜標的化ＥＣＦＰ（Ｅ−Ｍｅｍ−ＥＣＦＰ）、または核標的化ＥＣＦＰ（Ｅ−Ｎｕｃ−ＥＣＦＰ）のいずれかに融合した。これらの各融合タンパク質を、ＨｅＬａ細胞中で核標的化赤色蛍光タンパク質（Ｎｕｃ−ＥＲＦＰ）と共に発現し、その細胞内分布を落射蛍光顕微鏡で分析した。左および中央のパネルは、シアンまたは赤色フィルターセットを使用して得た同一の細胞の顕微鏡写真を示す。バー＝１５μｍ。その除去がシアン融合タンパク質の除去と容易に区別することができるので、本実験でＮｕｃ−ＥＲＦＰを使用してアポトーシスを定量した。トランスフェクト細胞を、１０−８のＥ２または賦形剤で１時間処理後、エトポシドで６時間処理した。３Ａおよび３Ｂのアポトーシスを、図２に記載のように定量した。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを示す。ＡＮＯＶＡによるエトポシドで処理されていない細胞に対して＊ｐ＜０．０５。
【図４Ａ】
ＥＲおよびＡＲの抗アポトーシス活性がＳｒｃ／Ｓｈｃ／ＥＲＫシグナル伝達経路を介して媒介されることを示す図である。Ａ．ＭＬＯ−Ｙ４細胞を、Ｅ２またはＤＨＴと２、５、または１５分間、またはＰＤ９８０５９（５０μＭ）またはＰＰ１（１０μＭ）と２５分間インキュベート後、Ｅ２またはＤＨＴで５分間インキュベートした。細胞溶解物を得、タンパク質を抗ＥＲＫ１／２または抗ホスホＥＲＫ１／２（ｐ−ＥＲＫ１／２）抗体を使用したウェスタンブロット分析によって分析した。アポトーシスの同定のために、細胞を賦形剤、ＰＤ９８０５９、またはＰＰ１で３０分間インキュベート後、Ｅ２またはＤＨＴを添加した。３０分後、エトポシドを添加し、図１Ｂに記載のように６時間後にアポトーシスをアッセイした。Ｂ．図１Ｂに記載のように、Ｓｒｃ＋／＋対Ｓｒｃ−／−マウス由来の胚線維芽細胞においてアポトーシスに対するＥ２またはＤＨＴの効果を比較した。実験手順に記載のように、ＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｃ〜Ｅ．ＨｅＬａ細胞を、Ｎｕｃ−ＥＧＦＰおよび全長ＥＲαまたはそのＥドメインをコードする発現ベクター、またはＡＲのみ（Ｃ、左のパネル）またはｄｎ　ＭＥＫ（Ｃ、右のパネル）；キナーゼ活性を欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　Ｋ−）、ＳＨ２ドメインを欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　ΔＳＨ２）、またはＳＨ３ドメインを欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　ΔＳＨ３）（Ｄ）；またはＥＲαとともにｗｔ　Ｓｈｃ、ｄｎ　Ｓｈｃ変異体Ｙ２３９Ｆ／Ｙ２４０Ｆ／Ｙ３１７Ｆ（Ｓｈｃ　ＦＦＦ）、Ｙ３１７Ｆ（Ｓｈｃ　ＹＹＦ）、またはＹ２３８Ｆ／Ｙ２４０Ｆ（Ｓｈｃ　ＦＦＹ）（Ｅ）でトランスフェクトした。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを意味する。ＡＮＯＶＡによる、ステロイドを使用しないで培養した細胞に対して＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｂ】
ＥＲおよびＡＲの抗アポトーシス活性がＳｒｃ／Ｓｈｃ／ＥＲＫシグナル伝達経路を介して媒介されることを示す図である。Ａ．ＭＬＯ−Ｙ４細胞を、Ｅ２またはＤＨＴと２、５、または１５分間、またはＰＤ９８０５９（５０μＭ）またはＰＰ１（１０μＭ）と２５分間インキュベート後、Ｅ２またはＤＨＴで５分間インキュベートした。細胞溶解物を得、タンパク質を抗ＥＲＫ１／２または抗ホスホＥＲＫ１／２（ｐ−ＥＲＫ１／２）抗体を使用したウェスタンブロット分析によって分析した。アポトーシスの同定のために、細胞を賦形剤、ＰＤ９８０５９、またはＰＰ１で３０分間インキュベート後、Ｅ２またはＤＨＴを添加した。３０分後、エトポシドを添加し、図１Ｂに記載のように６時間後にアポトーシスをアッセイした。Ｂ．図１Ｂに記載のように、Ｓｒｃ＋／＋対Ｓｒｃ−／−マウス由来の胚線維芽細胞においてアポトーシスに対するＥ２またはＤＨＴの効果を比較した。実験手順に記載のように、ＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｃ〜Ｅ．ＨｅＬａ細胞を、Ｎｕｃ−ＥＧＦＰおよび全長ＥＲαまたはそのＥドメインをコードする発現ベクター、またはＡＲのみ（Ｃ、左のパネル）またはｄｎ　ＭＥＫ（Ｃ、右のパネル）；キナーゼ活性を欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　Ｋ−）、ＳＨ２ドメインを欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　ΔＳＨ２）、またはＳＨ３ドメインを欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　ΔＳＨ３）（Ｄ）；またはＥＲαとともにｗｔ　Ｓｈｃ、ｄｎ　Ｓｈｃ変異体Ｙ２３９Ｆ／Ｙ２４０Ｆ／Ｙ３１７Ｆ（Ｓｈｃ　ＦＦＦ）、Ｙ３１７Ｆ（Ｓｈｃ　ＹＹＦ）、またはＹ２３８Ｆ／Ｙ２４０Ｆ（Ｓｈｃ　ＦＦＹ）（Ｅ）でトランスフェクトした。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを意味する。ＡＮＯＶＡによる、ステロイドを使用しないで培養した細胞に対して＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｃ】
ＥＲおよびＡＲの抗アポトーシス活性がＳｒｃ／Ｓｈｃ／ＥＲＫシグナル伝達経路を介して媒介されることを示す図である。Ａ．ＭＬＯ−Ｙ４細胞を、Ｅ２またはＤＨＴと２、５、または１５分間、またはＰＤ９８０５９（５０μＭ）またはＰＰ１（１０μＭ）と２５分間インキュベート後、Ｅ２またはＤＨＴで５分間インキュベートした。細胞溶解物を得、タンパク質を抗ＥＲＫ１／２または抗ホスホＥＲＫ１／２（ｐ−ＥＲＫ１／２）抗体を使用したウェスタンブロット分析によって分析した。アポトーシスの同定のために、細胞を賦形剤、ＰＤ９８０５９、またはＰＰ１で３０分間インキュベート後、Ｅ２またはＤＨＴを添加した。３０分後、エトポシドを添加し、図１Ｂに記載のように６時間後にアポトーシスをアッセイした。Ｂ．図１Ｂに記載のように、Ｓｒｃ＋／＋対Ｓｒｃ−／−マウス由来の胚線維芽細胞においてアポトーシスに対するＥ２またはＤＨＴの効果を比較した。実験手順に記載のように、ＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｃ〜Ｅ．ＨｅＬａ細胞を、Ｎｕｃ−ＥＧＦＰおよび全長ＥＲαまたはそのＥドメインをコードする発現ベクター、またはＡＲのみ（Ｃ、左のパネル）またはｄｎ　ＭＥＫ（Ｃ、右のパネル）；キナーゼ活性を欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　Ｋ−）、ＳＨ２ドメインを欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　ΔＳＨ２）、またはＳＨ３ドメインを欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　ΔＳＨ３）（Ｄ）；またはＥＲαとともにｗｔ　Ｓｈｃ、ｄｎ　Ｓｈｃ変異体Ｙ２３９Ｆ／Ｙ２４０Ｆ／Ｙ３１７Ｆ（Ｓｈｃ　ＦＦＦ）、Ｙ３１７Ｆ（Ｓｈｃ　ＹＹＦ）、またはＹ２３８Ｆ／Ｙ２４０Ｆ（Ｓｈｃ　ＦＦＹ）（Ｅ）でトランスフェクトした。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを意味する。ＡＮＯＶＡによる、ステロイドを使用しないで培養した細胞に対して＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｄ】
ＥＲおよびＡＲの抗アポトーシス活性がＳｒｃ／Ｓｈｃ／ＥＲＫシグナル伝達経路を介して媒介されることを示す図である。Ａ．ＭＬＯ−Ｙ４細胞を、Ｅ２またはＤＨＴと２、５、または１５分間、またはＰＤ９８０５９（５０μＭ）またはＰＰ１（１０μＭ）と２５分間インキュベート後、Ｅ２またはＤＨＴで５分間インキュベートした。細胞溶解物を得、タンパク質を抗ＥＲＫ１／２または抗ホスホＥＲＫ１／２（ｐ−ＥＲＫ１／２）抗体を使用したウェスタンブロット分析によって分析した。アポトーシスの同定のために、細胞を賦形剤、ＰＤ９８０５９、またはＰＰ１で３０分間インキュベート後、Ｅ２またはＤＨＴを添加した。３０分後、エトポシドを添加し、図１Ｂに記載のように６時間後にアポトーシスをアッセイした。Ｂ．図１Ｂに記載のように、Ｓｒｃ＋／＋対Ｓｒｃ−／−マウス由来の胚線維芽細胞においてアポトーシスに対するＥ２またはＤＨＴの効果を比較した。実験手順に記載のように、ＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｃ〜Ｅ．ＨｅＬａ細胞を、Ｎｕｃ−ＥＧＦＰおよび全長ＥＲαまたはそのＥドメインをコードする発現ベクター、またはＡＲのみ（Ｃ、左のパネル）またはｄｎ　ＭＥＫ（Ｃ、右のパネル）；キナーゼ活性を欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　Ｋ−）、ＳＨ２ドメインを欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　ΔＳＨ２）、またはＳＨ３ドメインを欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　ΔＳＨ３）（Ｄ）；またはＥＲαとともにｗｔ　Ｓｈｃ、ｄｎ　Ｓｈｃ変異体Ｙ２３９Ｆ／Ｙ２４０Ｆ／Ｙ３１７Ｆ（Ｓｈｃ　ＦＦＦ）、Ｙ３１７Ｆ（Ｓｈｃ　ＹＹＦ）、またはＹ２３８Ｆ／Ｙ２４０Ｆ（Ｓｈｃ　ＦＦＹ）（Ｅ）でトランスフェクトした。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを意味する。ＡＮＯＶＡによる、ステロイドを使用しないで培養した細胞に対して＊ｐ＜０．０５。
【図４Ｅ】
ＥＲおよびＡＲの抗アポトーシス活性がＳｒｃ／Ｓｈｃ／ＥＲＫシグナル伝達経路を介して媒介されることを示す図である。Ａ．ＭＬＯ−Ｙ４細胞を、Ｅ２またはＤＨＴと２、５、または１５分間、またはＰＤ９８０５９（５０μＭ）またはＰＰ１（１０μＭ）と２５分間インキュベート後、Ｅ２またはＤＨＴで５分間インキュベートした。細胞溶解物を得、タンパク質を抗ＥＲＫ１／２または抗ホスホＥＲＫ１／２（ｐ−ＥＲＫ１／２）抗体を使用したウェスタンブロット分析によって分析した。アポトーシスの同定のために、細胞を賦形剤、ＰＤ９８０５９、またはＰＰ１で３０分間インキュベート後、Ｅ２またはＤＨＴを添加した。３０分後、エトポシドを添加し、図１Ｂに記載のように６時間後にアポトーシスをアッセイした。Ｂ．図１Ｂに記載のように、Ｓｒｃ＋／＋対Ｓｒｃ−／−マウス由来の胚線維芽細胞においてアポトーシスに対するＥ２またはＤＨＴの効果を比較した。実験手順に記載のように、ＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｃ〜Ｅ．ＨｅＬａ細胞を、Ｎｕｃ−ＥＧＦＰおよび全長ＥＲαまたはそのＥドメインをコードする発現ベクター、またはＡＲのみ（Ｃ、左のパネル）またはｄｎ　ＭＥＫ（Ｃ、右のパネル）；キナーゼ活性を欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　Ｋ−）、ＳＨ２ドメインを欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　ΔＳＨ２）、またはＳＨ３ドメインを欠くＳｒｃ変異体（Ｓｒｃ　ΔＳＨ３）（Ｄ）；またはＥＲαとともにｗｔ　Ｓｈｃ、ｄｎ　Ｓｈｃ変異体Ｙ２３９Ｆ／Ｙ２４０Ｆ／Ｙ３１７Ｆ（Ｓｈｃ　ＦＦＦ）、Ｙ３１７Ｆ（Ｓｈｃ　ＹＹＦ）、またはＹ２３８Ｆ／Ｙ２４０Ｆ（Ｓｈｃ　ＦＦＹ）（Ｅ）でトランスフェクトした。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを意味する。ＡＮＯＶＡによる、ステロイドを使用しないで培養した細胞に対して＊ｐ＜０．０５。
【図５】
ペプチドを使用したＥＲα媒介転写作用対抗アポトーシス作用およびＥＲα媒介対ＥＲβ媒介効果の分離を示す図である。Ａ．ＨｅＬａ細胞を、ＥＲα発現ベクターのみまたはα−ＩＩペプチドのＳＶ４０プロモータによって駆動するＧＡＬ４　ＤＮＡ結合ドメインとの融合物を保有するベクターと共に一過性にトランスフェクトした。さらに、転写研究のために、細胞をＥＲＥ−ｌｕｃまたはＩＬ−６−ｌｕｃとトランスフェクトしアポトーシス研究のためにＥＧＦＰ−ｎｕｃでトランスフェクトした。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを示し、ＥＲＥ−ｌｕｃ刺激倍率またはＩＬ−６−ｌｕｃの阻害倍率、または賦形剤（Ｅ２−）または１０−８ＭのＥ２（Ｅ２＋）におけるアポトーシスを示すトランスフェクト細胞の％を示す。ＡＮＯＶＡによる賦形剤処理細胞にたいして＊ｐ＜０．０５。Ｂ．ＨｅＬａ細胞を、ＥＲαもしくはＥＲβのみまたは２Ｘ２９３もしくは２ＸＦ６ペプチドを保有する発現ベクターとともにトランスフェクトした。バーは、表示の受容体およびペプチドでトランスフェクトした細胞対受容体のみでトランスフェクトした細胞におけるＥ２（１０−８Ｍ）に応答する活性の三連の同定（ＥＲＥ−ｌｕｃ、ＩＬ−６−ｌｕｃ、または抗アポトーシス）の平均±ＳＤを示す。受容体を保有するがペプチドを保有しない細胞におけるＥ２誘導活性を、１００％とした。ＡＮＯＶＡによる受容体のみでトランスフェクトした細胞に対して＊ｐ＜０．０５。Ｃ．ＨｅＬａ細胞を、ＧＲＩＰペプチドのみまたはＥＲαを共に保有するベクターでトランスフェクトした。バーは、三連の同定の平均±ＳＤを示す。ＡＮＯＶＡによる賦形剤処理細胞に対して＊ｐ＜０．０５。
【図６】
合成リガンドを用いたＥＲの核内転写制御を介する活性から核内転写制御を介さない活性の分離を示す図である。Ａ．Ｃ３媒介転写のために、ＨｅＬａ細胞を、Ｃ３−ｌｕｃおよびＥＲαでトランスフェクトし、表示の濃度のエストレンまたはピラゾールで処理した。バーは、β−ガラクトシダーゼ活性を基準とした相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）の平均±ＳＤを示す。ＡＮＯＶＡによる空のベクター（ｅｖ）でトランスフェクトした細胞に対して＊ｐ＜０．０５。図１Ｂに記載のように、エストレンおよびピラゾールの抗アポトーシス活性を、頭蓋冠由来の骨芽細胞において評価した。ＡＮＯＶＡによるエトポシドで処理されていない細胞に対して＊ｐ＜０．０５。Ｂ．図４Ａに記載のように、ＭＬＯ−Ｙ４細胞を、表示濃度の異なるリガンドと５分間インキュベートし、ＥＲＫリン酸化を評価した。
【図７】
性ステロイド受容体の古典的核内転写制御を介する活性からの抗アポトーシス活性のリガンド誘導分離についての提案モデルを示す図である。３つの絵は、核内転写制御を介する応答または抗アポトーシス応答のいずれかを示すために必要な、リガンドとの相互作用前後の受容体タンパク質の高次構造の状態を示す。不活性非ライゲーション受容体を、中央に灰色で示す。転写活性を優先的に誘発するリガンド（例えば、図６のピラゾール）との相互作用によって誘導された高次構造の変化を、右に青色で示す。受容体の抗アポトーシス活性を優先的に誘発するリガンド（例えば、図６のエストレン）との相互作用によって誘導された高次構造の変化を、右に赤色で示す。緑色の円および緑色の菱形は、２つのリガンドを示す；結合ポケット内の完全および不完全な適合を留意のこと。受容体に対する２つの異なる型のリガンドの会合（ｋａ）および解離（ｋｄ）速度を、異なる幅および長さの矢印で示す。Ｅ２などのリガンドは、もちろん両方の高次構造を誘導する。抗アポトーシスモデルにおいて、受容体とＳｒｃとの間の直接的接触が認められるにもかかわらず、アダプタータンパク質が２つの分子間の相互作用に架橋することができる。不活性非ライゲーション状態における対応する受容体タンパク質のエネルギーレベル（破線）、核内転写制御を介する高次構造（青色の線）または抗アポトーシス高次構造（赤色の線）のいずれかへの進行を下部に示す。エネルギー線図中の不連続な縦軸は、２つの活性間のエネルギー要件における尺度の相違が大きいことを示す。
【図８】
αＩＩおよび２９３ペプチドのＤｏｘ誘導性発現についての同一のマウスに同時移入した２つの導入遺伝子構築物の図である。
【図９】
図９Ａは、Ｃｒｅリコンビナーゼの骨芽細胞特異的発現についてのＤｏｘ誘導系の作製および機能的特徴づけを示す図である。ＯＧ−２の調節下でのＣｒｅによるＲＯＳＡ２６遺伝子座の活性化。「ＳＡ」は、元のＲＯＳＡ２６遺伝子座のスプライス受容体部位を示す。図９Ｂは、インビトロでのＣｒｅ発現のＤｏｘ誘導活性化を示すゲルである。Ｏｂ−６細胞を、Ｔｅｔ――ＯＧ２−Ｃｒｅ構築物で一過性にトランスフェクトし、次いで０．５ｍｇ／ｍｌ　Ｄｏｘまたは賦形剤で２４時間処理した。細胞を回収し、ＲＴ−ＰＣＲ分析によってＣｒｅ発現を評価した。レーン１はサイズマーカーを含む。レーン２は、空の賦形剤＋Ｄｏｘで処理した細胞を示す。レーン３は、Ｄｏｘを使用しないＯＧ−２−ｒｔＡ−Ｃｒｅを含む細胞を示す。レーン４は、Ｄｏｘを使用したＯＧ−２−ｒｔＡ−Ｃｒｅを含む細胞を示す。レーン４は、Ｄｏｘを使用して誘導したＯＧ−２−ｒｔＡ−Ｃｒｅプラスミドを含む。
【図１０】
マウスＥＲα遺伝子のエクソン３および４を含む８６Ｋｂの核内転写制御を介する遺伝子座へのフロックス化（ｆｌｏｘｅｄ）エクソン３の標的を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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