(57)【要約】本発明は治療剤の修飾条件を決定する方法に関し、方法は以下を含む：（１）第１の修飾型治療剤を被験体に投与した後、該第１の修飾型治療剤の生物学的活性をアッセイする；（２）少なくとも１回の第１の修飾型治療剤の追加免疫投与を該被験体に行った後、第１の修飾型治療剤の生物学的活性をアッセイする；（３）第１の修飾型治療剤と異なる修飾を行った更なる修飾型治療剤を用いて（１）および（２）を実施する；そして（４）第１の修飾型治療剤の生物学的活性を更なる修飾型治療剤の生物学的活性と比較する。本発明はまた、修飾型治療剤にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホストが介在する治療剤の不活性化を予防するために該治療剤の修飾条件を決定する方法であって、以下：
（１）第１の修飾型治療剤を被験体に投与した後に該第１の修飾型治療剤の生物学的活性をアッセイし；
（２）少なくとも１回の該第１の修飾型治療剤の追加免疫投与を該被験体に行った後に該第１の修飾型治療剤の生物学的活性をアッセイし；
（３）該第１の修飾型治療剤とは異なる修飾を施与した更なる修飾型治療剤を用いて（１）および（２）を実施し；そして
（４）該第１の修飾型治療剤の生物学的活性を該更なる修飾型治療剤の生物学的活性と比較する
を含む、上記方法。
【請求項２】
該更なる修飾型治療剤が該第１の修飾型治療剤と同じ修飾剤で修飾される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該修飾剤がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
該ＰＥＧがモノメトキシスクシンイミジルブタノエート（ＳＢＡ）−ＰＥＧ、スクシンイミジルカーボネート（ＳＣ）−ＰＥＧ、アルデヒド（ＡＬＤ）−ＰＥＧ、およびスクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）−ＰＥＧから成る群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該更なる修飾型治療剤が該第１の修飾型治療剤と同じ程度まで修飾される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該更なる修飾型治療剤および第１の修飾型治療剤が異なる修飾剤で修飾される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
該治療剤がポリペプチドである、請求項１記載の方法。
【請求項８】
該ポリペプチドを使用して、その治療を必要とする患者においてウィルス感染を治療する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該ポリペプチドを使用して、その治療を必要とする患者において癌を治療する、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
該ポリペプチドが約３００ダルトンから約３００，０００ダルトンの単量体分子量を有する、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
該ポリペプチドを使用して被験体におけるグルタミンレベルを低下させる、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
該ポリペプチドを使用して被験体におけるアスパラギンレベルを低下させる、請求項７記載の方法。
【請求項１３】
該ポリペプチドを使用して被験体におけるアスパラギンおよびグルタミンレベルを低下させる、請求項７記載の方法。
【請求項１４】
該治療剤が核酸である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
該核酸を使用して、その治療を必要とする患者においてウィルス感染を治療する、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該核酸を使用して、その治療を必要とする患者において癌を治療する、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
ホストが介在する不活性化を予防する医薬組成物の調製法であって、請求項１記載の方法によって治療剤の修飾条件を確認し、該修飾条件に従って該治療剤を修飾することを含む、上記方法。
【請求項１８】
該医薬組成物が添加剤を更に含有する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該添加剤が凍結乾燥の際に該治療剤を保護する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
該治療剤がグルタミナーゼ−アスパラギナーゼを含有する、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
該治療剤がシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）グルタミナーゼ−アスパラギナーゼである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該シュードモナス  グルタミナーゼ−アスパラギナーゼがポリエチレングリコールで修飾される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該医薬組成物がスクシンイミジルカーボネートポリエチレングリコール５０００（ＳＣ−ＰＥＧ５０００）で修飾されたグルタミナーゼ−アスパラギナーゼを含有し、該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼがＳＣ−ＰＥＧ５０００で約２１％から約４９％の程度まで修飾され、そして該組成物がホストが介在する不活性化を予防する、請求項１７記載の方法によって調製される医薬組成物。
【請求項２４】
該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼがＳＣ−ＰＥＧ５０００で約２６％から約３６％まで修飾されている、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼがＳＣ−ＰＥＧ５０００で約３１％修飾されている、請求項２４記載の組成物。
【請求項２６】
該医薬組成物がモノメトキシスクシンイミジルブタノエートポリエチレングリコール５０００（ＳＢＡ−ＰＥＧ５０００）で修飾されたグルタミナーゼ−アスパラギナーゼを含有し、該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼがＳＢＡ−ＰＥＧ５０００で約２５％から約５８％まで修飾され、そして該組成物がホストが介在する不活性化を予防する、請求項１７記載の方法によって調製される医薬組成物。
【請求項２７】
該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼがＳＢＡ−ＰＥＧ５０００で約３０％から約４０％まで修飾されている、請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼがＳＢＡ−ＰＥＧ５０００で約３５％修飾されている、請求項２７記載の組成物。
【請求項２９】
該医薬組成物がアルデヒドポリエチレングリコール２０００（ＡＬＤ−ＰＥＧ２０００）で修飾されたグルタミナーゼ−アスパラギナーゼを含有し、該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼがＡＬＤ−ＰＥＧ２０００で約４５％から約６５％まで修飾され、そして該組成物がホストが介在する不活性化を予防する、請求項１７記載の方法によって調製される医薬組成物。
【請求項３０】
該医薬組成物がスクシンイミジルプロピオネートポリエチレングリコール５０００（ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００）で修飾されたグルタミナーゼ−アスパラギナーゼを含有し、該修飾されたグルタミナーゼ−アスパラギナーゼがＳＰＡ−ＰＥＧ５０００で約２５％から約６５％まで修飾され、そして該組成物がホストが介在する不活性化を予防する、請求項１７記載の方法によって調製される医薬組成物。
【請求項３１】
該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼがＳＰＡ−ＰＥＧ５０００で約４０％から約５５％まで修飾されている、請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
グルタミナーゼ−アスパラギナーゼを含有する組成物であって、該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼがスクシンイミジルカーボネートポリエチレングリコール５０００（ＳＣ−ＰＥＧ５０００）で約２１％から約４９％の間の程度まで修飾された、上記組成物。
【請求項３３】
該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼが約２６％から約３６％の間の程度まで修飾された、請求項３２記載の修飾型治療組成物。
【請求項３４】
該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼが約３１％の程度まで修飾された、請求項３３記載の修飾型治療組成物。
【請求項３５】
グルタミナーゼ−アスパラギナーゼを含有する組成物であって、該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼがスクシンイミジルブタノエートポリエチレングリコール５０００（ＳＢＡ−ＰＥＧ５０００）で約２５％から約５８％の間の程度まで修飾された、上記組成物。
【請求項３６】
該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼが約３０％から約４０％の間の程度まで修飾された、請求項３５記載の修飾型治療組成物。
【請求項３７】
該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼが約３５％の程度まで修飾された、請求項３６記載の修飾型治療組成物。
【請求項３８】
グルタミナーゼ−アスパラギナーゼを含有する組成物であって、該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼがアルデヒドポリエチレングリコール２０００（ＡＬＤ−ＰＥＧ２０００）で約４５％から約６５％の間の程度まで修飾された、上記組成物。
【請求項３９】
グルタミナーゼ−アスパラギナーゼを含有する組成物であって、該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼがスクシンイミジルプロピオネートポリエチレングリコール５０００（ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００）で約２５％から約６５％の間の程度まで修飾された、上記組成物。
【請求項４０】
該グルタミナーゼ−アスパラギナーゼが約４０％から約５５％の間の程度まで修飾された、請求項３９記載の修飾型治療組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ホストが介在する不活性化から治療組成物を保護するような修飾条件を決定する方法に関する。本発明はまた、ホストが介在する不活性化から防護される修飾型治療剤にも関する。
【０００２】
（技術背景）
ホストがその循環において外来物質に遭遇すると、ホストの免疫系が免疫応答を開始しうる。この応答には物質を不活性化する抗体の産生があり、これによって細網内皮組織系による循環からの物質の除去も可能となる。従って、投与された非ヒト物質の治療有効期間は、多くの場合ホストの免疫系によって制限される。更に、ホストが介在する防御の問題によって、一般に循環中に見られない、または異種の系で組換えＤＮＡ法を使用して生成されたヒトタンパク質の有用性が制限される（Ｎｕｃｃｉ， ＭＬ， Ｓｈｏｒｔ， ＲおよびＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ， Ａ．， １９９１． Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ６：１３３−１５１）。
【０００３】
これらの物質を保護するための戦略の１つは、それらを炭水化物または生体適合性を有するポリマー、例えばポリエチレングリコール（“ＰＥＧ”）のような物質との共有結合で修飾することである。例えばタンパク質の“ＰＥＧ化”はそれらのタンパク質を免疫系から防護するために使用されてきた（Ｎｕｃｃｉ， ＭＬ， Ｓｈｏｒｔ， ＲおよびＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ， Ａ．， １９９１． Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ６：１３３−１５１；Ｚａｌｉｐｓｋｙ， Ｓ． １９９５． Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， １６：１５７−１８２）。ＰＥＧ化によってタンパク質の安定性が向上し（Ｎｕｃｃｉ， ＭＬ， Ｓｈｏｒｔ， ＲおよびＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ， Ａ．， １９９１． Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ６：１３３−１５１）、またｉｎ ｖｉｔｒｏでの免疫学的方法による測定で、それらの抗原性（ＰＥＧ化したタンパク質に対する、未修飾タンパク質に対して産生された抗体の反応の程度によって測定）および免疫原性（処理動物においてＰＥＧ化したタンパク質に対する抗体産生の程度によって測定）が著しく低下する（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ， Ａ．， Ｖａｎ， Ｅｓ， Ｔ．， Ｐａｌｃｚｕｋ， ＮＣおよびＤａｖｉｄｓ， ＦＦ．， １９７７． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １１：３５７８−３５８１）。
【０００４】
しかしながら、ＰＥＧ化によるタンパク質の修飾の１つの欠点は、多くの場合ＰＥＧ化によって物質の生物学的活性が低下することである。低下の程度は使用する活性化型ＰＥＧのタイプおよび物質に結合させるポリエチレングリコール部分の数によって変化する。生物学的活性は、物質を特定のＰＥＧでどの程度まで修飾するかによっても影響される。
【０００５】
現在、使用する活性化型ＰＥＧの選択およびＰＥＧ化の程度は以下の２つの主な基準に基づく：許容される治療活性の喪失（Ｆｒａｎｃｉｓ， ＧＥ， Ｄｅｌｇａｒｄｏ， Ｃ， Ｆｉｓｈｅｒ， Ｄ， Ｍａｌｉｋ， ＦおよびＡｇｒａｗａｌ， ＡＫ．， １９９６． Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ， ３：３２１−３４０）および物質の抗原性および免疫原性の低下。しかしながら、これらの基準に従った所定の物質のＰＥＧ修飾の評価は、多くの場合、独断的な結果となる。そのような独断的な例では、ＳＣ−ＰＥＧ５０００を使用してシュードモナス７Ａグルタミナーゼ−アスパラギナーゼ（ＰＧＡ）を７４％まで修飾すると、２０％未満の活性の喪失が起こる（米国特許第５，８０８，０９６号；５，６１２，４６０号；５，３２４，８４４号；５，１２２，６１４号）。
【０００６】
使用する活性化型ＰＥＧおよびＰＥＧ化の程度を決定するための既存の基準（抗原性、免疫原性、および許容される生物活性の喪失）は、例えば物質を長期間にわたって患者に投与する場合、それらの物質の修飾を確認するのには不十分である。上記の基準はいずれも、ＰＥＧ化した物質をホストに投与した後の物質の生物学的活性に対するホストの応答の影響を考慮に入れていないため、これは事実である。結果として、前述の基準だけに依存すると、ホストの免疫系または他のｉｎ ｓｉｔｕの不活性化から最適に保護されていない物質が生成される。
【０００７】
従って、当業者が長期の治療期間中に患者に投与される所定の物質に関するＰＥＧ化の程度を決定できるような戦略が、現在非常に必要とされている。本発明者らは、新規の生理学的に適切な最適化のスキームを適用し、修飾剤がポリエチレングリコールである場合に、これらの修飾（“ＰＥＧ化”）の範囲は、治療活性、抗原性、および免疫原性の喪失をモニタリングするｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して決定される最も好適なＰＥＧ化の範囲と同程度ではないことを発見した。現在、好適なＰＥＧ化の範囲を決定するこれらのｉｎ ｖｉｔｒｏ法は、当業界で報告されている唯一存在する方法である。本発明者らの発見は、物質の過剰ＰＥＧ化、並びに任意の修飾剤での物質の過剰修飾によって物質の２次および／または３次構造が崩壊し、それによって新たな抗原決定基が免疫系に暴露されうることを示唆している。理解されるようにこの観察は、治療剤の有効循環半減期を向上するために使用される他の生体適合性を有するポリマーまたは物質にも同様に適用される。
【０００８】
（発明の概要）
本発明は、ホストが介在する治療剤の不活性化を予防するために該治療剤の修飾条件を決定する方法に関し、方法は以下を含む：（１）第１の修飾型治療剤を被験体に投与した後、該第１の修飾型治療剤の生物学的活性をアッセイする；（２）少なくとも１回の第１の修飾型治療剤の追加免疫投与を該被験体に行った後、第１の修飾型治療剤の生物学的活性をアッセイする；（３）第１の修飾型治療剤と異なる修飾を行った更なる修飾型治療剤を用いて（１）および（２）を実施する；そして（４）第１の修飾型治療剤の生物学的活性を更なる修飾型治療剤の生物学的活性と比較する。
【０００９】
本発明は、長期間にわたる被験体への治療的投与に好適なグルタミナーゼ−アスパラギナーゼ（ＧＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する修飾型治療組成物で、ＧＡが約２１％から４９％の間でＰＥＧ化され、ＰＥＧがＳＣ−ＰＥＧ５０００であるものに関する。
【００１０】
本発明はまた、長期間にわたる被験体への治療的投与に好適なＧＡおよびＰＥＧを含有する修飾型治療組成物で、ＧＡが約２５％から５８％の間でＰＥＧ化され、ＰＥＧがＳＢＡ−ＰＥＧ５０００であるものに関する。
【００１１】
本発明は更に、長期間にわたる被験体への治療的投与に好適なＧＡおよびＰＥＧを含有する修飾型治療組成物で、ＧＡが約４５％から６５％の間でＰＥＧ化され、ＰＥＧがＡＬＤ−ＰＥＧ２０００であるものに関する。
【００１２】
本発明は更に、長期間にわたる被験体への治療的投与に好適なＧＡおよびＰＥＧを含有する修飾型治療組成物で、ＧＡが約２５％から６５％の間でＰＥＧ化され、ＰＥＧがＳＰＡ−ＰＥＧ５０００であるものに関する。
【００１３】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、ホストが介在する治療剤の不活性化を予防するために該治療剤の修飾条件を決定する方法に関し、方法は以下を含む：（１）第１の修飾型治療剤を被験体に投与した後、第１の修飾型治療剤の生物学的活性をアッセイする；（２）少なくとも１回の第１の修飾型治療剤の追加免疫投与を被験体に行った後、第１の修飾型治療剤の生物学的活性をアッセイする；（３）第１の修飾型治療剤と異なる修飾を行った更なる修飾型治療剤を用いて（１）および（２）を実施する；そして（４）第１の修飾型治療剤の生物学的活性を更なる修飾型治療剤の生物学的活性と比較する。
【００１４】
ここで使用する、ホストが介在する不活性化の予防とは、治療剤に対する被験体の正常な自己防衛反応またはその効果が低減することを言う。自己防衛反応には、物質を不活性化する抗体の産生（これによって細網内皮組織系による循環からの物質の除去が可能となる）、並びに解毒機構の誘導（治療剤を治療的に不活性な化合物に変換する作用をする）が含まれうる。ホストの自己防衛機構のために、多くの場合、投与される非ヒト物質の治療有効期間は制限される。従って本発明は、物質がホストの自己防衛機構を回避し、その結果としてホストにおける治療剤の治療有効期間が延長されるような治療剤の修飾条件を確認する直接的なｉｎ ｖｉｖｏの機能的方法を提供する。予防とは、修飾型治療剤に対するホストの正常な不活性化機構の有効性が完全に、または部分的に低下し、それによって物質の治療有効期間が未修飾の、または既に修飾された治療剤より増加されることを意味しうる。
【００１５】
本発明の方法では、第１の治療剤および更なる治療剤は同一の活性成分または構造的に関係する類似体であるが、少なくとも１つの態様ではそれらは異なって修飾されている。ある実施形態では、治療剤は同一であり、修飾剤は同一であるが、治療剤に結合する修飾剤の量または程度が異なる。別の実施形態では、治療剤は同一であるが、修飾剤は異なる。ここで使用する“更なる”とは１つ以上を意味し、従ってここで記載する方法は１つ以上の修飾型治療剤を第１の修飾型治療剤と比較することを含む。
【００１６】
修飾条件とは、治療剤に結合または連結する修飾剤のタイプ並びに修飾の程度および条件を言う。本発明の面で理解されるように、治療剤の修飾の程度もしくは度合い、または量は、修飾剤で修飾された治療剤のアミノ酸残基の数を修飾可能なアミノ酸の総数で割って、パーセントで表したものを意味するのに使用される。例えば２０％“ＰＥＧ化された”物質（これは物質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）をそれに結合させることによって修飾されていることを意味する）とは、ＰＥＧが治療剤のリジン残基の２０％に連結または結合していることを意味する。修飾条件の他のパラメーターには、それに限定される訳ではないが以下がある：使用される修飾剤のタイプ（例えば生体適合性ポリマー）、修飾を行う際のバッファー、ｐＨ、圧力、および温度、治療剤のコンフォメーション状態、使用される治療剤のタイプ（例えば構造的に関連する類似体のいずれかに対する親化合物）、および修飾剤または治療剤の物理的状態（限定される訳ではないが、液体、固体、および気体状態、マトリクスに結合した状態、製品（ｐｒｏｄｕｃｔ）の基質に結合した状態、凍結乾燥した固体、凍結した液体、または凝縮した気体）。
【００１７】
例えばポリペプチドの修飾パーセントは種々の従来技術の一つによって測定できる。ある実施形態によれば、修飾したポリペプチドをポリペプチドの特定の遊離アミノ酸を検出するアッセイを使用してアッセイし、ここで遊離アミノ酸は選択した修飾剤と反応するアミノ酸のタイプを表す。例えば、フルオレスカミンは未修飾のリジン基と反応して蛍光誘導体を生成する。フルオレスカミンを含むアッセイは、例えば興味のポリペプチドをリジンに対する親和性を有する修飾剤と反応させるような条件下で使用するのに好適なアッセイである。修飾されていないポリペプチドと修飾されたポリペプチド間の蛍光誘導体の生成の偏差を比較することによって、当業者は特定のポリペプチドに関係する修飾の程度を確認することができる。
【００１８】
メルカプトまたはスルフヒドリル基特異的ＰＥＧのＰＥＧ化の程度は分光光度法によって決定できる。代表的な方法は利用可能なシステインスルフヒドリル基を定量し、これらの官能基を２，２’−ジピリジルジスルフィドと反応させ、２−チオピリドンを生成させて表す。ｐＨ７．２で、２−チオピリドンは３４３ｎｍで吸収し（ａｄｓｏｒｂｓ）、ｅ＝７０６０である。別の有効な方法では、エルマン試薬［５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）］を２，２’−ジピリジルジスルフィドの代わりに使用する。別の実施形態では、ポリペプチドの修飾の程度はマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ−ｌａｓｅｒ−ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＭＡＬＤＩ）によって測定できる。ＭＡＬＤＩによって約１００，０００ダルトンまでの高分子のフラグメント化していない単荷電（ｓｉｎｇｌｙ−ｃｈａｒｇｅｄ）分子イオンの質量が得られ、それためＰＥＧコンジュゲート（例えばＰＥＧ化したポリペプチド）の分子イオンの質量の測定の大きな助けとなる。更に、異なる数のＰＥＧを含有するＰＥＧ化反応産物の組成物（例えば“一量体（ｏｎｅ−ｍｅｒ）”、“二量体（ｔｗｏ−ｍｅｒ）”など）を、ＭＡＬＤＩ技術を使用して確立することができる。従って、本発明は物質が修飾される程度またはパーセントを推測するための種々の技術を企図する。
【００１９】
出発物質としての特定の物質または他の好適な治療組成物の修飾のパーセントは本発明の範囲から逸脱することなく変化しうる。例えば、まず物質を約２５％から約７５％間での間で修飾し、次いでここに開示する方法に従って被験体に投与することができる。
【００２０】
本発明のある実施形態によれば、一度特定の治療剤または組成物を選択すれば、この物質または組成物に修飾手順（例えばＰＥＧ化）を施与し、被験体に投与するための物質または組成物の修飾条件を決定してもよい。もちろん、所定の物質または治療組成物に関する修飾条件は、使用する修飾剤のタイプおよび物質または組成物の特性によって変化する。ある実施形態では、選択した修飾剤を特定の物質と反応させた後、修飾された物質を被験体に投与する。好ましい実施形態では、まず物質または治療組成物を精製し、液体（例えば標準的なバッファー溶液）の懸濁液に溶解し（ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｉｎ ａ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｉｌｄ）、その後修飾剤と反応させる。最終的に物質または組成物の分離した画分を得る。その後、当業者が同修飾剤の修飾の度合いの確認を試みるなら、例えば選択したＰＥＧの濃度を各画分に添加するが、修飾剤の濃度はそれぞれの画分で変化させる。物質または組成物と修飾剤の反応は、修飾剤または組成物の濃度の一部が物質に共有結合して物質または組成物を修飾するように行う。従って、各画分は、修飾された物質または組成物の他の画分に関連する修飾パーセンテージとは異なるパーセンテージで修飾された物質または組成物を含有する。治療剤または組成物が核酸を含有するベクターの場合、修飾剤を、例えば表面抗原決定基のリジンアミノ基または他の官能基（単数または複数）に結合させてもよい。
【００２１】
本発明によれば、好適な治療剤には、限定される訳ではないが、アミノ酸、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、または小分子（例えば薬剤）がある。更に、治療剤は被験体または患者に治療的利益を与える能力のある物質である。物質または化合物（ｃｏｍｐｏｕｎｄ）という用語は、ここでは互換性を持って使用する。本発明の企図としては、“治療的利益”という用語は、状態または疾病の治療を必要とする患者において状態または疾病の症状を緩和、低減、および除去する物質への生理学的または細胞応答を意味することを意図する。また治療的利益は、患者が“治癒する”、または、患者が罹患している状態の原因物質もしくは因子が除去、破壊、もしくは矯正されるような物質に対する生理学的または細胞応答も意味する。ある実施形態では、本発明は治療剤としてのポリペプチドの使用を企図する。更なる実施形態では、このポリペプチドは約３００から約３００，０００ダルトンの単量体分子量を含む。
【００２２】
ある実施形態では、治療剤または組成物を使用してそれらの治療を必要とする被験体において癌を治療することができる。本発明に従って治療できる多くのタイプの癌があり、それらには例えば前立腺癌、卵巣癌、およびグリア芽腫がある。治療しうる他のタイプの癌には以下がある：慢性および急性白血病、骨、脳、胸部軟骨、子宮頚（ｃｅｒｖｉｘ）、食道、腎臓、喉頭、肝臓、肺、膵臓、および子宮の癌。更に、本発明の物質または組成物をホジキン病、リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、結腸直腸癌、および睾丸癌の治療（ｃｏｍｂａｔ）に使用してもよい。
【００２３】
別の実施形態では、治療剤または組成物を使用してそれらの治療を必要とする被験体におけるウィルス感染を治療することができる。従って、本発明の修飾された物質または組成物はこれらの３つの主な群のウィルスに対して有効であり得る。本発明に従って治療できる特定のウィルスには、限定される訳ではないがヒト呼吸系発疹ウィルス（ＲＳＶ）、単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ）、およびヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）がある。
【００２４】
他の治療可能なウィルスには以下の密接に関係するウィルスがある。呼吸系発疹ウィルスはパラミクソウィルス科に属する。他のヒトに感染しうる、パラミクソウィルス科に属するウィルスには以下がある：パラインフルエンザウィルス１、２、３、４（上気道疾患、気管支炎／細気管支炎、肺炎を誘引する）、流行性耳下腺炎ウイルス、および麻疹ウィルス。パラミクソウィルス科はラブドウィルス科およびフィロウィルス科と非常に近い関係にあるが、これはそれらの科に属するウィルスがセグメント化されていない、膜に封入された（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）１本鎖ＲＮＡ（ネガティブセンス）ゲノムを含有するためである。ラブドウィルス科に属するヒト感染性ウィルスは水疱性口内炎インディア、ニュージャージー、球菌ウィルス、チャンディプラウィルス、ピリウィルス、Ｉｓｆａｈａｎウィルス、狂犬病ウィルス、Ｍｏｋｏｌａウィルス、およびＤｕｖｅｎｈａｇｅウィルスである。フィロウィルス科に属するヒト感染性ウィルスにはマールブルグウィルスおよびエボラウィルスがある。より広範には、呼吸系発疹ウィルスはＲＮＡウィルスである。
【００２５】
ヒト感染症の原因となる他のＲＮＡウィルスには以下がある：ポリオウィルス１、２、および３；コクサッキーウィルスＢ１−Ｂ６；ヒト・エコーウィルス１−９、１１−２７、および２９−３４；ヒト・エンテロウィルス１−１１３；ノーウォークウィルスおよびヒトにおいて胃腸炎を誘引するカリチウィルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓｅｓ）科に属する同様のウィルス；東部ウマ脳炎ウィルス；西部ウマ脳炎ウィルス；ベネズエラウマ脳炎ウィルス；チクングニヤウィルス；オニョンニョンウィルス；ロスリバーウィルス；マヤロウィルス；風疹ウィルス；黄熱病ウィルス；デング熱ウィルス；西部ナイルウィルス；セントルイス脳炎ウィルス；日本脳炎ウィルス；マーレーバレー脳炎ウィルス；Ｒｏｃｉｏウィルス；ダニ媒介性脳炎ウィルス；ヒト・コロナウィルス２２９−ＥおよびＯＣ４３；上気道感染症、おそらくは肺炎、ことによると胃腸炎；インフルエンザＡ、Ｂ、およびＣウィルス；ブンヤムウェラウィルス；ブワンバウィルス；オリボカウィルス；オロポーシェウィルス；グワマ（Ｇｗａｍａ）ウィルス；カリフォルニア脳炎ウィルス；ラクロスウィルス；タヒナウィルス；ネパール砂バエ熱ウィルス；クリミアコンゴ出血熱ウィルス；Ｈａｎｔａａｎウィルス（韓国出血熱、腎症候性出血熱、流行性ネフロパシー（ｎｅｐｈｒｏｐａｌｔｈｉａ ｅｐｉｄｅｍｉｃａ））；リンパ球性脈絡髄膜炎（ＬＣＭ）ウィルス；ラッサウィルス；Ｍａｃｈｕｐａウィルス（ボリビア出血熱）；フニンウィルス（アルゼンチン出血熱）；レオウィルス１、２、および３；Ｏｒｕｎｇｏウィルス（ナイジェリアおよびウガンダにおける熱性疾患）；ケメロボウィルス（ロシアおよびエジプトにおける熱性疾患）；ヒト・ロタウィルス、コロラドダニ熱ウィルス。
【００２６】
マウス・ラウシャー白血病ウィルスはレトロウィルス・ファミリーに属する。このファミリーに属するウィルスは１本鎖（ポジティブセンス）のセグメント化されていない、膜に封入されたゲノムを有するが、それらは複製においてＤＮＡ段階を伴う。このファミリーに属するヒト感染性ウィルスにはＣ型腫瘍ウィルス、例えばヒトＴリンパ球好性（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ウィルス１（ＨＴＬＶ−Ｉ、成人Ｔ細胞白血病）およびヒトＴリンパ球好性（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ）ウィルス２（ＨＴＬＶ−ＩＩ、おそらくヘアリーセル白血病と関係する）、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因となるヒト免疫不全ウィルス１および２（ＨＩＶ１およびＨＩＶ２）、そしてＡＩＤＳ様疾患の原因となるＨＩＶ１およびＨＩＶ２に関連する他のウィルスがある。
【００２７】
単純疱疹ウィルスはヘルペスウィルス科に属する。ヘルペスウィルス科に属するウィルスは２本鎖の膜に封入されたゲノムを有し、ポックスウィルス科およびイリドウィルス科に属するウィルスと共有する特性を有する。ヘルペスウィルス科に属するヒト感染性ウィルスには以下がある：単純疱疹ウィルス１および２、セルコピルテシン（ｃｅｒｃｏｐｉｌｔｈｅｃｉｎｅ）、ヘルペスウィルス１（Ｂ−ウィルス）、水痘・帯状疱疹ウィルス、ヒト・サイトメガロウィルス、ＥＢウィルス、およびヒト・ヘルペスウィルス６。ポックスウィルス科に属するヒト感染性ウィルスには痘瘡ウィルス（天然痘、アラストリム）、ワクシニアウィルス、サル痘ウィルス、牛痘ウィルス、羊鵞口瘡ウィルス（感染性膿疱性皮膚炎）、偽牛痘（搾乳者小結節）ウィルス、ヤナ痘ウィルス、タナ痘ウィルス、および伝染性軟肬腫ウィルスがある。より広範には、単純疱疹ウィルスはＤＮＡウィルスであり、このカテゴリーの他のヒト感染性ウィルスは以下である：Ｂ型肝炎ウィルス；ヒト・パルボウィルスＢ−１９、パルボウィルスＲＡ−１、および胃腸炎の原因となる他のパルボウィルス；ヒト乳頭腫ウィルス（ＨＰＶ）１−４８；ポリオーマウィルス（例えばＪＣ、ＳＶ４０、およびＢＫ）；およびアデノウィルス（例えばマストアデノウィルスｈ１−ｈ４９）。
【００２８】
前記のように、治療剤はポリペプチドでもよい。“タンパク質”、“ペプチド”、および“ポリペプチド”という用語は互換性を持って使用する。好適なポリペプチドの例には、それらに限定される訳ではないが以下がある：酸化還元酵素、例えば酸素酸化還元酵素（１．７．３．３；“ウリカーゼ”）、過酸化水素酸化還元酵素（１．１１．１．６；“カタラーゼ”）、および酸素酸化還元酵素（２０−ベータ−水酸化）（１．１４．１．９；“コレステロール２０−ヒドロキシラーゼ”）；転移酵素、例えばグルクロニルトランスフェラーゼ（２．４．１．１７；“ＵＤＰグルクロニルトランスフェラーゼ”）、およびα−Ｄ−ガラクトース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ（２．７．７．１２）；加水分解酵素、例えばムコペプチドＮ−アセチルムラミルヒドロラーゼ（３．２．１．１７；リゾチーム）、トリプシン（３．４．４．４）、およびＬ−アスパラギン・アミノヒドロラーゼ（３．５．１．１；“アスパラギナーゼ”）；リアーゼ、例えばフルクトース−１，６−ジホスフェートＤ−グリセルアルデヒド−３−ホスフェート−リアーゼ（４．１．２．１２；“アルドラーゼ”）；イソメラーゼ、例えばＤ−キシロースケトール・イソメラーゼ（５．３．１．５、キシロースイソメラーゼ）；およびリガーゼ、例えばＬ−アスパラギン酸リガーゼ（ＡＭＰ）（６．３．４．５）。いくつかのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、および酵素は治療活性を有することが明らかになっている。
【００２９】
他のポリペプチドの中でも、本発明においては以下のような治療的に有用な酵素（天然および組換え）が企図される：炭水化物特異的酵素、タンパク分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、およびリガーゼ。治療的酵素の例には、限定される訳ではないが以下がある：アスパラギナーゼ、グルタミナーゼ−アスパラギナーゼ、例えばシュードモナス７Ａグルタミナーゼ−アスパラギナーゼ（“ＰＧＡ”）、アルギナーゼ、アルギニンデイミナーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、リジンデカルボキシラーゼ、ヒスチジンアンモニアリアーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＤＮアーゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルコウロニダーゼ、血栓溶解剤アクチバーゼ（Ａｃｔｉｖａｓｅ）、（アルテプラーゼ）、ストレプターゼ（ストレプトキナーゼ）、アボキナーゼ（ウロキナーゼ）、およびエミナーゼ（アニストレプラーゼ）、凝固因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、およびＩＸ、血液凝固剤レフルダン、アンチトロンビン、およびインテグリリン、α−アンチトリプシン、ウリエートオキシダーゼ、インドリル−３−アルケンα−ヒドロキシラーゼ（ＩＡＨ）、メチオニナーゼ、ノイラミニダーゼ、フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）アンモニアリアーゼ、およびリパーゼ。
【００３０】
他のポリペプチドには、限定される訳ではないが以下がある：ホルモンおよび成長因子、例えばインスリン、エリスロポエチンおよびエリスロポエチン様の活性を有するホルモン、成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、インスリン様成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）、トランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）、組織成長因子αおよびβ、上皮成長因子、線維芽細胞成長ホルモン、ケラチン細胞成長ホルモン、レプチン（ｌｅｐｔｉｎ）、神経成長因子、骨形態形成因子、幹細胞因子、稔性ホルモン、ヒト副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性性腺刺激ホルモン、卵胞刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、血管内皮成長因子、アムリン（ａｍｌｉｎ）、インスリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、グルカゴン、エンドスタチン（ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、アンギオスタチン（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ソマトメジン、色素ホルモン；酵素、例えばアスパラギナーゼ、グルタミナーゼ−アスパラギナーゼ；サイトカイン、例えばインターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、腫瘍壊死因子受容体、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子、インターロイキン１から１５、骨髄性ｐｒｏｇｉｎａｔｏｒ阻害因子１、インターロイキン受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ＴＮＦ受容体融合タンパク質、Ｔ細胞阻害タンパク質、ヘモグロビン、血清タンパク質、例えばＶＩＩ、ＶＩＩＩ、およびＩＸ因子、免疫グロブリン（ヒトまたは他の哺乳動物）、例えばＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびそれらのフラグメント（ＦａｂおよびｓｃＦｖを含む）、および植物タンパク質（例えばレクチンおよびリシン）。
【００３１】
本発明はまた、ある実施形態では、抗微生物活性（例えば抗真菌活性および抗細菌活性）を示す物質の使用も企図する。本発明によれば、親抗微生物性ポリペプチドの例には以下がある：真菌属クルブラリア由来の殺真菌活性ポリペプチド（例えばＷＯ９４／０１４５９号に記載される）；抗細菌性ポリペプチド（例えばヨーロッパ特許第４０３．４５８号に記載される）；Ｍｉｒａｂｉｌｉｓの種子から単離された抗微生物性タンパク質（例えばＷＯ９２／１５６９１号に記載される）；ブタ小腸の抽出物から単離された抗細菌性ポリペプチド（ＷＯ９２／２２５７８号に記載される）；ハンゼヌラ種の酵母に蓄積されるような酵母致死作用を有するポリペプチド（例えば日本特許出願公開第６０−１３０５９９号に記載される）；抗菌物質として使用できるＰｈｙｔｏｌａｃｃａ ｉｎｓｕｌａｒｉｓ抗ウィルスタンパク質（米国特許第５，３４８，８６５号に記載される）；ノカルジオプシス・ダッソンビレィ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）由来の溶菌酵素標品（例えば米国特許第５，３５４，６８１号に記載される）。本発明で企図される他の抗微生物性ポリペプチドの更なる例には以下がある：マガニニン（ｍａｇａｎｉｎｉｎ）、プロテグリン（ｐｒｏｔｅｇｒｉｎ）、デフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）、シュードマイシン（ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｉｎ）、ムタノリシン（ｍｕｔａｎｏｌｙｓｉｎ）、およびＮ−アセチルノイラミダーゼ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｎｅｕｒａｍｉｄａｓｅ）。
【００３２】
本発明は更に、天然から入手できるポリペプチド、並びに組換えＤＮＡ技術を使用して生成されるポリペプチドの使用を企図する。それらのポリペプチドには非グリコシル化ポリペプチドおよび翻訳後修飾（例えばリン酸化、グリコシル化など）によって修飾されていないポリペプチドがある。本発明はまた、生体活性を有する部分ペプチド、並びに２つ以上の官能基を結合させた融合タンパク質を企図する。
【００３３】
別の実施形態では、本発明は更なる治療剤、例えば核酸の使用を含む。核酸を被験体に直接投与するか、またはプラスミドまたはウィルスベクターの一部として投与することができる。被験体へのそれらの投与はここに記載する方法に従って行うべきである。本発明によれば、好適なベクターにはレトロウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、レンチウィルス、または遺伝子治療に有用な他のウィルスがある。ベクターがホスト細胞に遺伝子を運搬する能力があれば、このベクターは遺伝子治療に“有用”である。ある実施形態によれば、ベクターはある核酸配列を含有し、後にその配列から興味のポリペプチドが転写される。別の実施形態では、核酸を使用して、それらの治療を必要とする被験体においてウィルス感染、例えばヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）の治療を行う。更なる実施形態では、核酸を使用して、それらの治療を必要とする被験体において癌を利用する。
【００３４】
本発明において提供する方法は、治療剤の修飾条件の決定を、動物または被験者への投与後に修飾された物質の生物学的活性を評価することによって行う。“生物学的活性”とは、その物質が直接的または間接的に誘引する細胞または生理学的応答または反応を意味する。生物学的活性はｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ ｓｉｔｕで評価することができる。生物学的活性の例には、限定される訳ではないが反応を触媒する酵素、受容体または抗体に結合する分子、受容体介在型反応（例えばイオンの内向き流束／外向き流束または第２メッセンジャーの生成）の仲介、受容体介在型反応の拮抗または阻害、アポトーシスの誘導、および神経伝達物質またはホルモンの放出または取り込みがある。生物学的活性は薬剤が被験体に施与する治療的利点と同一の活性である必要はない。例えば、当業者はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｓｉｔｕで修飾型治療剤の受容体への結合能力を測定し、治療剤が治療的利点に寄与していることを証明することができた。しかしながら、使用するアッセイのタイプは投与される治療剤のタイプに従って変化する。好適なアッセイは治療剤の生物学的活性を検出することができるいずれかのアッセイである。例えば、投与される物質がグルタミナーゼ活性を有するなら、この場合に好適なアッセイはそれらのグルタミナーゼ活性を検出できるものである（Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｊ．， １９７６． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２５１：２１１９−２１２３）。投与される治療剤が（例えば生物学的活性を有するポリペプチドを転写する能力のある）核酸配列を含有するベクターである場合、好適なアッセイは転写されたポリペプチドの生物学的活性を検出できるアッセイである。投与された治療剤が血清中での生物学的活性を測定するための簡易なアッセイを有さない場合、免疫学的アッセイを使用して血清中の治療組成物の量を定量することができる。
【００３５】
この初期投与量のアッセイに続いて、修飾型治療剤を被験体に１以上の追加免疫投与量で投与する。ここで使用する“追加免疫投与量”は慣例的な治療的投与量計画に従って被験体に投与される治療剤の量を擬態する傾向のある投与量である。追加免疫投与量は上記のような初期投与量以上、未満、またはそれと同量であることが可能である。好ましい実施形態では、追加免疫投与量は初期投与量より低い濃度である。“治療的投与計画”とは、治療的利点を被験体にもたらすのに十分な治療剤の量を言う。
【００３６】
ここで使用する被験体、患者、および動物という用語は互換性を持って使用する。本発明によれば、好適な被験体には哺乳動物、特に齧歯動物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、非ヒト霊長類、およびヒトがある。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【００３７】
ここで使用する“修飾型治療剤”とは、修飾剤を治療剤に結合または連結させた治療剤を意味する。修飾剤とは、治療剤に対する被験体の免疫原性または抗原性応答を、修飾されていない同治療剤に対する被験体の免疫原性または抗原性応答に比較して低下させる物質または化合物を意味する。修飾剤の例には、限定される訳ではないが生体適合性ポリマーがある。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなポリマーを薬剤またはポリペプチドに付加することができ、これによって、被験体への利点は与えられたまま、ポリペプチドに対する被験体の免疫応答が低下する。付加されたＰＥＧが存在しなければ、薬剤またはポリペプチドは被験体の免疫系によって中和され、薬剤またはポリペプチドが被験体に施与する生物学的活性の一部または全部が喪失しうる。
【００３８】
本発明によれば、好適な生体適合性ポリマーには以下がある：モノアルキルでキャップされたポリアルキレンオキシドのホモポリマー、コポリマー、およびブロック・コポリマー（それぞれ直鎖または分枝鎖であってもよい）。本発明によれば、モノアルキルでキャップされたポリアルキレンオキシドにはポリエチレングリコール（“ＰＥＧ”）ホモポリマーおよびポリプロピレングリコールホモポリマーがある。本発明によれば、使用に好適な他の生体適合性ポリマーはデキストラン、ポリビニルピロピドン、およびＤＬアミノ酸である。好ましい実施形態では、生体適合性ポリマーの一端を末端キャッピングして交差誘導体化（ｃｒｏｓｓ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）の防止を補助する。好適な“キャッピング”基には直鎖または分枝鎖の低級アルコキシ基；好ましくはモノメトキシ基がある。
【００３９】
ある実施形態では、生体適合性ポリマーを活性化した後にカップリング反応を行い、共有結合の形成を可能にする。この実施形態によれば、活性化に好適な水酸基を、物質に面する生体適合性ポリマーの末端に結合させる。本発明は共有結合のために選択されるアミノ酸によって、生体適合性ポリマーを活性化するいくつかの方法を提供する。
【００４０】
好ましい実施形態では、生体適合性ポリマーはＰＥＧホモポリマーである。ＰＥＧの分子量は約３００から約６０，０００ダルトンまでの範囲であることが可能であり、より好ましくは１，０００から２０，０００の間である。特定のＰＥＧの分子量の選択は、ＰＥＧで修飾する特定の物質の性質を考慮して行うことができる。特に考慮すべき事柄には、修飾に利用できるような、物質のアミノ基または他の官能基の数がある。本発明の特に好ましいＰＥＧホモポリマーはモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）およびその誘導体である。
【００４１】
特定の実施形態では、選択されるＰＥＧは以下であることが可能である：モノメトキシスクシンイミジルブタノエート（ＳＢＡ）−ＰＥＧ、スクシンイミジルカーボネート（ＳＣ）−ＰＥＧ、アルデヒド（ＡＬＤ）−ＰＥＧ、ｍＰＥＧスクシンイミジルスクシネート、ｍＰＥＧスクシンイミジルスクシンアミド、ｍＰＥＧスクシンイミジルプロピオネートＳＰＡ−（ＳＰＡ−ＰＥＧ）、スクシンイミジルブタノエート、ｍＰＥＧのスクシンイミジルカーボネート、カルボキシメチル化したｍＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ｍＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール、ｍＰＥＧニトロフェニルカーボネート、ｍＰＥＧトリクロロフェニルカーボネート、ｍＰＥＧトレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、ｍＰＥＧ無水マレイン酸およびｍＰＥＧメチルマレイン酸無水物、ｍＰＥＧスクシネートの混合無水物、ｍＰＥＧ酢酸またはｍＰＥＧプロピオン酸、ｍＰＥＧアルデヒド、ｍＰＥＧマレイミド、ｍＰＥＧビニルスルホンおよびｍＰＥＧ−オルトピリジルジスルフィド、そしてフェニルグリオキサールのｍＰＥＧ誘導体。
【００４２】
本発明はまた、米国特許第５，６１２，４６０号、５，８０８，０９６号、５，６４３，５７５号、５，６７２，６６２号、５，９９０，２３７号（全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＰＥＧの使用を提供する。
【００４３】
本発明のある態様では、以下の式に相当するＰＥＧポリマーを提供する：
Ｐｎ−Ｌ−Ａ
式中、（Ｐ）はＰＥＧであり；（ｎ）は少なくとも１、２、または３であり；（Ｌ）は各（Ｐ）に共有結合する結合部分であり；そして（Ａ）は求核置換されることが可能な活性官能基を表す。（Ａ）は、例えば結合能力のある生物学的に活性な求核試薬または部分と結合する能力のある基であることが可能である。このポリマーは他のタイプの物質の中でも、ポリペプチドと結合する能力がある。
【００４４】
ポリペプチドへのポリマーの結合位置は、例えば官能基（Ａ）に依存する。例えば、（Ａ）はリジンのイプシロンアミノ基と反応するスクシンイミジルスクシネートまたはカーボネートであることが可能である。慣例的な化学を使用してＰＥＧポリマーを活性化し、生物学的に活性な物質上に見られる第１級もしくは第２級アミノ基、チオール基、カルボン酸基、または反応性カルボニル基と結合させることもできる。他の活性化基には当業者に明らかなものがある。
【００４５】
また本発明は、物質にＰＥＧを結合させる種々の結合部分の使用も企図する。ある実施形態では、結合部分は１８個まで、より好ましくは１−１０個の炭素原子鎖を含有する脂肪族基である。ヘテロ原子、例えば窒素、酸素、または硫黄をアルキル鎖内に含んでもよい。アルキル鎖は炭素または窒素原子で分枝していてもよい。本発明の別の態様では、（Ｌ）は１個の窒素原子である。より詳細には、好適な脂肪族には置換されたアルキルジアミンおよびトリアミン、リジンエステル、およびマロン酸エステル誘導体がある。本発明によれば、結合部分は好ましくは非平面であり、ポリマー鎖は堅く固定されていない。また、結合部分（Ｌ）は複数のＰＥＧ、または“分枝”を（Ａ）に結合させるための手段である。
【００４６】
結合部分（Ｌ）および各（Ｐ）は好ましくは（Ｐ）および（Ｌ）の両方の求核官能基間の反応によって結合する。各（Ｐ）を機能化して求核置換を行い、（Ｌ）と結合させてもよい。この機能化の工程は慣例的な技術に従って容易に実施することができる。
【００４７】
広範な結合が（Ｐ）および（Ｌ）間で企図される。Ｌａｒｗｏｏｄら（Ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．， ２１：６０３−６１４（１９８４））の報告によれば、ウレタン結合は種々の生理学的条件下で非常に安定であるため、ウレタン（カーバメート）結合は好ましい。（Ｐ）および（Ｌ）間のカーバメート結合は、例えばアミノ基（例えば１，３−ジアミノ−２−プロパノール）をメトキシポリエチレングリコールスクシンイミジルカーボネートと反応させることによって生成することができ、これは米国特許第５，１２２，６１４号に記載されている（本開示は参照により本明細書に組み入れられる）。アミド結合も（Ｐ）および（Ｌ）間の結合として企図され、これはａｍｉｎｏ−ｔｅｒｍｉｎａｔｅｄ非抗原性ポリマー（例えばメトキシポリエチレングリコールアミン（ｍＰＥＧアミン）を塩化アシル官能基と反応させて生成することができる。
【００４８】
（Ｐ）および（Ｌ）間の他の結合の例にはエーテル、アミン、尿素、そしてそれらのチオおよびチオール類似体、並びに上記のウレタンおよびアミド結合のチオおよびチオール類似体がある。これらの結合は当業者に十分理解される方法によって生成する。更なる好適な結合、並びにその生成は、米国特許第４，１７９，３３７号（参照により本明細書に組み入れる）を参照して決定することができる。
【００４９】
部分（Ａ）は、ここに記載するＰＥＧポリマーを“活性化し”、これらのポリマーと１つ以上の生物学的に活性な物質（例えば薬剤または治療組成物）とのコンジュゲートを提供する基を示す。従って、（Ａ）は以下から選択される部分であることが可能である：
Ｉ．アミノ基と反応する能力のある官能基。例えば：
ａ）カーボネート、例えばｐ−ニトロフェニル、もしくはスクシンイミジル；ｂ）カルボニルイミダゾール；ｃ）アズラクトン；ｄ）環状イミドチオン；またはｅ）イソシアネートもしくはイソチオシアネート；
ＩＩ．カルボン酸基および反応性カルボニル基と反応する能力のある官能基。例えば：
ａ）第１級アミン；およびｂ）ヒドラジンおよびヒドラジド官能基、例えばアシルヒドラジド、カーバゼート（ｃａｒｂａｚａｔｅｓ）、セミカーバメート、チオカーバゼート（ｔｈｉｏｃａｒｂａｚａｔｅｓ）；
ＩＩＩ．メルカプトまたはスルフヒドリル基と反応する能力のある官能基。例えば：
フェニルグリオキサール。この種類の官能基は例えば米国特許第５，０９３，５３１号に開示されており、この開示は参照により本明細書に組み入れられる；または
ＩＶ．求電子中心と反応する能力を有する他の求核試薬。限定される訳ではないがヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、チオール基、および活性メチレンがある。
【００５０】
（Ａ）部分は脂肪族結合部分（Ｌ）に近接する位置に“スペーサー”を含むことができる。スペーサー部分は、例えば１８個までの炭素原子を含むヘテロアルキル、アルコキシ、アルキル、または更なるポリマー鎖であってもよい。これらのスペーサー部分は慣例的な合成技術を使用して付加することができる。当然、（Ａ）部分は生物学的に活性な求核試薬以外の他の部分と反応することもできる。
【００５１】
ある実施形態では、本発明は医薬組成物の調製法を提供し、組成物における活性な治療剤の修飾の度合いまたは程度をここに提供する方法によって確認するする。
【００５２】
修飾された治療剤を既知の方法に従って生成し、それらの物質またはその機能的誘導体を製薬上許容される担体賦形剤（ｃａｒｒｉｅｒ ｖｅｈｉｃｌｅ）と混合する、医薬的に有用な組成物を調製することができる。好適な添加剤およびその生成（ヒト・タンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含む）は、例えばレミントンの薬学（第１６版、Ｏｓｏｌ， Ａ．， 編， Ｍａｃｋ， Ｅａｓｔｏｎ ＰＡ （１９８０））に記載されている。有効な投与に好適な製薬上許容されるを調製するために、同組成物は有効量の本発明の１つ以上の薬剤を好適な量の担体賦形剤と共に含有する。
【００５３】
本発明に従って使用するための医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体または添加剤を使用して慣例的な方法で調製してもよい。従って、化合物および生理学的に許容されるその塩および溶媒和化合物は吸入もしくは通気（口または鼻を通して）、または経口、口腔内（ｂｕｃｃａｌ）、非経口、もしくは直腸投与による投与のために調製してもよい。ある実施形態では、選択される添加剤は、凍結乾燥の際、治療組成物（すなわち医薬品）を保護する能力を有する。添加剤は、例えばＣａＣｌ２、グルタミン酸ナトリウム、またはスクロース、アルギニン、もしくはマンニトールであることができる。
【００５４】
経口投与には、医薬組成物は例えば慣例的な方法によって医薬上許容される以下のような添加剤と共に調製される錠剤またはカプセル剤の形態であってもよい：結合剤（例えばα化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸エステルナトリウム）；または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）。錠剤は当該分野で周知の方法によってコーティングしてもよい。経口投与のための液体製剤は、例えば液体、シロップ、もしくは懸濁液の形態であってもよく、または、乾燥粉末であって使用前に水もしくは他の好適な媒質と共に調合してもよい。それらの液体製剤は慣例的な方法によって、例えば以下のような製薬上許容される添加剤と共に調製してもよい：懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または水素化食用脂）；乳化剤（例えばレシチンまたはアカシア）；非水性媒質（例えば扁桃油、油性エステル、エチルアルコール、または精製（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｅｄ）植物油）；および保存剤（例えばｐ−オキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、またはソルビン酸）。製剤は必要によりバッファー塩、着香剤、着色剤、および甘味剤を含有してもよい。
【００５５】
経口投与のための製剤は、活性化合物を制御放出するのに好適に調製してもよい。口腔（ｂｕｃｃａｌ）投与では、組成物は慣例的な方法で調製した錠剤またはトローチ剤の形態であってもよい。
【００５６】
吸入による投与では、本発明に従って使用する化合物を、好適な噴霧剤（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、または他の好適な気体）を使用して、加圧パック（ｐｒｅｓｓｕｒｉｚｅｄ ｐａｃｋｓ）または噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で慣例的に運搬してもよい。加圧エアロゾルの場合、測定された量を運搬するためのバルブを提供して投与単位を決定してもよい。吸入器または注入器で使用するための（例えばゼラチンの）カプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えばラクトースまたはデンプン）の粉末混合物を含有して調製してもよい。
【００５７】
化合物を、例えば大量注射または持続注入（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）による注射による非経口投与のために調製してもよい。注射用製剤は、保存剤を添加して（例えばアンプルまたは多投与（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ）容器中の）単位投与量の形態であってもよい。組成物は油性または水性媒体中の懸濁液、溶液、または乳濁液の形態であってもよく、また懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤のような調合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ）を含有してもよい。あるいはまた、活性成分は粉末の形態であって、使用前に好適な媒体（例えば発熱性物質を含有しない無菌水）と共に調合してもよい。
【００５８】
化合物はまた、（例えば慣例的な座薬基剤（例えばココア脂または他のグリセリド）を含有する）座薬または停留浣腸のような直腸用組成物として調製してもよい。
【００５９】
前記の製剤に加え、化合物をデポ製剤として調製してもよい。それらの長時間作用性製剤を（例えば皮下または筋肉内の）インプランテーションまたは筋肉内注射によって投与してもよい。従って、例えば化合物を好適なポリマー物質もしくは疎水性物質（例えば許容される油中の乳濁液として）もしくはイオン交換樹脂と共に、または僅かに可溶な誘導体（例えば僅かに可溶な塩）として調製してもよい。
【００６０】
組成物は、必要により、活性成分を含有する１つ以上の単位投与形態を含有するパックまたはディスペンサー装置であってもよい。例えばパックは、ブリスターパックのように金属またはビニール性のホイル（例えば）を含んでよい。パックまたはディスペンサー装置に投与のための説明書を添付してもよい。
【００６１】
従って、本発明はグルタミナーゼ−アスパラギナーゼ（ＧＡ）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する被験体への長期間にわたる治療投与に好適な医薬組成物を提供し、ここでＧＡは約２１％から４９％の間でＰＥＧ化され、ＰＥＧはＳＣ−ＰＥＧ５０００である。ある実施形態では、ＧＡはＳＣ−ＰＥＧ５０００で約２６％から３６％ＰＥＧ化される。好ましい実施形態では、ＧＡはＳＣ−ＰＥＧ５０００で約３１％ＰＥＧ化される。ＰＥＧ化の程度は本発明の方法によって確認する。
【００６２】
本発明はまた、ＧＡおよびＰＥＧを含有する被験体への長期間にわたる治療投与に好適な医薬組成物を提供し、ここでＧＡは約２５％から５８％ＰＥＧ化され、ＰＥＧはＳＢＡ−ＰＥＧ５０００である。ある実施形態では、ＧＡはＳＢＡ−ＰＥＧ５０００で約３０％から４０％ＰＥＧ化される。好ましい実施形態では、ＧＡはＳＢＡ−ＰＥＧ５０００で約３５％ＰＥＧ化される。ＰＥＧ化の程度は本発明の方法で確認する。
【００６３】
本発明はまた、ＧＡおよびＰＥＧを含有する被験体への長期間にわたる治療投与に好適な医薬組成物を提供し、ここでＧＡは約４５％から６５％ＰＥＧ化され、ＰＥＧはＡＬＤ−ＰＥＧ２０００である。ＰＥＧ化の程度は本発明の方法で確認する。
【００６４】
本発明はまた、ＧＡおよびＰＥＧを含有する被験体への長期間にわたる治療投与に好適な医薬組成物を提供し、ここでＧＡは約２５％から６５％ＰＥＧ化され、ＰＥＧはＳＰＡ−ＰＥＧ５０００である。ある実施形態では、ＧＡはＳＰＡ−ＰＥＧ５０００で約４０％から５５％ＰＥＧ化される。ＰＥＧ化の程度は本発明の方法で確認する。
【００６５】
（基本的方法論）
本発明の基本方法は修飾された治療剤または組成物を被験体へ投与することを伴う。次に、被験体の血液を治療剤の生物学的活性についてアッセイする。次いで被験体を、治療的に有用なレベルである修飾された物質または組成物の１回以上の投与で治療する。被験体の血液を、治療剤または組成物の生物学的活性について再びアッセイする。最初の測定とその後の測定からの活性の低下を確認する。上記を複数回反復してもよい。また、修飾の程度が異なる別のロットの治療剤を用いて方法を反復してもよい。修飾の理想的なレベルは、投与間で生物学的活性の低下が最も低くなるものである。
【００６６】
被験体に投与される修飾型物質または組成物の量、並びに投与方法は、本発明の範囲から逸脱することなく変化しうる。一般に、投与される修飾型物質の最初の量は、好適なアッセイによって物質または組成物の生物学的活性を検出するのに十分な量である。好ましくは、治療剤は修飾型治療剤の投与後、約１２から４８時間で検出可能である。
【００６７】
最初の治療の後、血液、血清、または他の体液において、投与された修飾型治療剤の生物学的活性をアッセイする。当業者は修飾型治療剤の投与および投与された修飾型治療剤の生物学的活性のアッセイの好適な期間を確認することができる。ある実施形態では、投与の約３０分後および約１０日後に生物学的活性をアッセイする；しかしながら、治療剤の投与とその生物学的活性に関するアッセイの間の期間は本発明の範囲から逸脱することなく変化しうる。生物学的活性が検出される場合、１回以上の追加免疫投与を、ここに記載する方法論に従って被験体に行ってもよい。この追加免疫投与の治療計画を行った後、被験体に修飾型物質の３回目の投与を、投与された治療剤の生物学的活性をアッセイするのに十分な量となる濃度で、一般にはこの用量の投与の少なくとも約３０分後から１０日後に行ってもよい。その後、投与された治療剤の生物学的活性を好適なアッセイで測定する。この投与計画は（１）被験体に修飾型治療剤または組成物の追加免疫投与を１回以上行い、（２）好適なアッセイによって物質または組成物の生物学的活性を検出するのに十分な濃度の修飾型物質を投与し、その後（３）投与された物質または組成物の生物学的活性をアッセイすることを含むが、これを更に反復することができる。
【００６８】
有意義な比較データを得るために、本発明は同治療剤を使用する上記の方法論の反復を企図するが、ここで治療剤は異なるレベルで修飾される。投与計画、すなわち被験体への（１）１回以上の修飾型物質の追加免疫投与、それに次ぐ（２）好適なアッセイによって物質または組成物の生物学的活性を検出するのに十分な濃度の修飾型物質の投与、その後の（３）投与された物質の生物学的活性のアッセイにより、この物質の生物学的活性がこの修飾型物質を投与した被験体において検出可能なままである期間が明らかとなる。当然、本発明はこの過程の反復を提供するが、興味の物質は既知の、しかし異なるパーセンテージで修飾する。
【００６９】
別の実施形態では、本発明は同治療剤を２ロット以上使用する上記の方法論の反復を企図するが、ここで治療剤は各ロットで同一の、または実質的に同様のレベルまで修飾される。本質的に上記のような投与／アッセイ方法論の反復により、被験体に投与される治療剤の生物学的活性を延長するのに最も有益である修飾剤が明らかになる。特定の修飾剤の選択後、本発明は上記の投与／アッセイ投与計画のように、選択した修飾剤を使用して同治療剤の理想的な修飾の程度を決定するための投与計画を提供する。
【００７０】
所定の物質に関する修飾条件を決定する工程は多くの場合、一群の物質の中での特定のパーセンテージまたはその範囲の選択を必要とし、そのそれぞれは既知の、しかし互いに異なるパーセンテージまで修飾されたものである。異なる、しかし既知のパーセンテージまで修飾されているこれらの物質間のデータを比較することによって、当業者は特定の物質に関する理想的なレベルを推測することができる。一般に、本発明の方法により本発明の物質または組成物の循環レベルが増加し、それによって循環半減期が増加する。
【００７１】
治療的有効量の決定は十分に臨床医の範囲内であり、物質または組成物の正確な同一性、修飾剤、および患者の特徴に大きく依存する。一般的な手引きは、例えばＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎの文献に見られる。それらの決定は、特に本発明の化合物の毒性および有効性の概要に依存する。
【００７２】
最初の臨床試験では、治療を必要とする患者または健康なボランティアに修飾型物質または組成物を特定の用量（通常は低用量）で、一定期間にわたって特定の感覚で投与する。臨床医による確認で有害反応がなければ、この処置を物質または組成物の用量を連続的に増加させて反復してもよい。このように、可能性のある有毒な副作用およびパラメーター（たとえば生物学的利用能）を、当該分野で容易に知れる方法を使用して確認してもよい。モニターされる一般的な前臨床または臨床パラメーターのいくつかはレミントンの第２７章および２８章（４８４−５２８ページ）に見られる。
【００７３】
企図する毒性学的研究の結果を用いて、有効性に関する臨床試験を行ってもよい。例えば、医薬品で治療される患者に修飾型物質または組成物を投与する。周知の方法によって医薬品または組成物の循環レベルを測定できる。この循環レベルを試験投与量の関数（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）として分析することにより、臨床医はいずれかの医薬品または組成物に関連して修飾型治療剤または組成物の有効で非毒性の投与量を容易に決定できる。
【００７４】
上の詳しい記述および以下の実施例は本発明の代表的な好ましい実施形態を明らかにするものであるが、限定的な実施形態として意図するものではない。提示される（ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）物質の観点から、通常の技術を有する当業者は本発明の範囲内に含まれる更なる実施形態を認識するであろう。
【００７５】
以下の実施例は本発明を例証するために提供するものであり、いかなる様にも本発明を制限するものと解釈するべきではない
（実施例）
実施例１：フルオレスカミン（Ｆｌｕｏｒｅｓｃａｍｉｎｅ）アッセイを使用するＰＥＧ化の程度の決定
フルオレスカミン・アッセイによってシュードモナス７Ａグルタミナーゼ−アスパラギナーゼ（ＰＧＡ）のＰＥＧ化の程度を決定する。フルオレスカミンは未修飾のリジン基と反応して蛍光誘導体を生成する。アッセイを行うために、タンパク質サンプル（未修飾のＰＧＡまたはＰＥＧ修飾されたもの）を希釈して２００μｇ／ｍｌの溶液（約２ｍｌの溶液）を調製した。５本の試験管のセットに溶液を一部ずつ（ｉｎ ｐｏｒｔｉｏｎ）添加した：１番目には０．１ｍｌ、２番目には０．２ｍｌなど。各試験管を０．１Ｍ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）で２．０ｍｌまで希釈した。２．０ｍｌのバッファーのみを含有する第６の試験管をブランクとして含めた。フルオレスカミン溶液（０．３ｍｇ／ｍｌアセトン）の１ｍｌを、激しく撹拌しながらサンプルに添加した。５分後、蛍光分光光度計で励起波長を３９０ｎｍ、蛍光波長を４７５ｎｍにセットしてサンプルをアッセイした。
【００７６】
実施例２：ＰＥＧ化したシュードモナス７Ａグルタミナーゼ−アスパラギナーゼ（ＰＧＡ）に対する不活性化抗体産生を検出するためのアッセイ
治療の状態に非常に類似したモデルを使用して、我々はタンパク質、シュードモナス７Ａグルタミナーゼ−アスパラギナーゼ（ＰＧＡ）の有効なＰＥＧ化の方法を開発した。ＰＥＧ化によって治療酵素は免疫系、およびそれによって不活性化から保護または保護される。ＰＥＧ化の程度は重要である。少なすぎればタンパク質はカバーされず、抗体を介する不活性化がまだ起こりうる。ＰＥＧ化しすぎればタンパク質の３次構造が崩壊し、それによって免疫系に対する新たな抗原決定基が暴露されうる。以下に我々がＰＧＡの有効なＰＥＧ化を試験するために使用した方法を記載する。
【００７７】
マウスに初期投与量のＰＧＡを注射し、１８時間後に後眼窩放血（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ）の方法によって放血させた。ＰＥＧ化したＰＧＡの１回目の注射後の血清についてグルタミナーゼアッセイを実施し、血清から回収されたＰＧＡの活性を測定した。初期注射に次いで、有意により低い投与量の追加注射を１日おきに行った。各週の後にグルタミナーゼアッセイを実施するのに好適な用量で別の注射をし、１８時間後にマウスを出血させて血清を回収し、上記のようにアッセイを反復した。血清中に活性が検出されない場合は実験を終了した。ＰＥＧ化しない場合はＰＧＡに対する抗体が８日間以内に産生され、ＰＧＡは、ネガティブマウスでの半減期が４８時間を越えるのに対して、数時間で血中で不活性化される。
【００７８】
実施例３：酵素結合免疫吸着剤アッセイ
抗体産生の程度を測定する他の方法は、長期治療の際の治療タンパク質の保護におけるＰＥＧ化の有効性を予測できないことが証明されている。酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施して血清中に存在する抗シュードモナス７Ａグルタミナーゼ−アスパラギナーゼ（ＰＧＡ）抗体の程度を測定した。プレートをＰＧＡの１０μｇ／ｍｌ溶液で被覆した。処置の２週間後の種々のＰＥＧ化された形態のＰＧＡの注射の１８時間後に出血させたマウスから単離された血清をウェルに添加した。アルカリホスファターゼにコンジュゲートさせた抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭを２次抗体として添加した。その後、比色分析を行って処理マウスの血清中の抗ＰＧＡ抗体のレベルを測定した。ＥＬＩＳＡの結果は、血清中の抗体の検出可能レベルに関わらず、ＰＥＧ−ＰＧＡのある標品（ＳＢＡ−ＰＧＡ）は通常の半減期レベルで血清中に酵素活性を保持することができることを示した。しかしながら以下の表に示すように、ＡＬＤ−ＰＧＡ標品のいくつかは、酵素は血清からうまく除去されたが、ＥＬＩＳＡで検出可能な抗体の産生が示されなかった。
【００７９】
【表１】
2004533598.tif 000002
従って、ＥＬＩＳＡでは活性の消失を予測することはできず、種々のＰＥＧ化方法の成功を確認するために、血清についてグルタミナーゼアッセイ（または他の物質についての関係する生物学的活性）を行わなければならない。
【００８０】
実施例４：スクシンイミジルスクシネート（ＳＳ）ＰＥＧを使用するＰＥＧ化の最適化
ＰＥＧスクシネートのＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（またはＮＨＳ）活性エステル（ＳＳ−ＰＥＧ）はＰＥＧをタンパク質またはペプチドに結合させるのに一般的に使用される。この誘導体は温和な条件下で短時間内に（約３０分、ｐＨ８．５）タンパク質上のアミノ基と反応して広範に修飾され、しかし活性を有するコンジュゲートを生成する。この誘導体で起こりうる問題は骨格のエステル結合が加水分解による開裂を受けやすいことである。ＳＳ−ＰＥＧは以下の構造を有する：
【化１】
2004533598.tif 000003
ＳＳ−ＰＥＧによるＰＥＧ化を行うために、精製したＰＧＡタンパク質を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．０）に溶解して８．０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。ＳＳ−ＰＥＧの２つの標品は以下のように生成した：標品１：１０ｍｇのＳＳ−ＰＥＧ５０００を２００μｌの８．０ｍｇ／ｍｌ  ＰＧＡ溶液に添加。標品２：２０ｍｇ／２００μｌ。これらの標品を未修飾のＰＧＡと共に、実施例２の方法に従ってマウスにおいて長期治療の際の安定性について評価した。治療の６日後、未修飾ＰＧＡ並びに標品１および２で処理した動物からＰＧＡ活性が回収された。治療の２週間後、未修飾ＰＧＡまたは標品２で処理した動物からは活性が回収されなかった。治療の３週間後には、いずれの標品で処理した動物の血清にも活性は残存しなかった。結果を図１に要約する。これらの知見は上記のＳＳ−ＰＥＧ骨格の加水分解による開裂による可能性が最も高い。
【００８１】
実施例５：ベンゾトリアゾールカーボネート（ＢＴＣ）ＰＥＧ５０００を使用するＰＥＧ化の最適化
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）活性エステルのいくつかと同程度の反応性はないが、ＢＴＣ−ＰＥＧはペプチドおよびタンパク質のアミノ基の有効な調節剤である。ＢＴＣ−ＰＥＧは温和な条件下で短時間内に広範な修飾型ＰＥＧタンパク質を生成するのに十分な反応性を有する。ＢＴＣ−ＰＥＧは以下の構造を有する：
【化２】
2004533598.tif 000004
ＢＴＣ−ＰＥＧによるＰＥＧ化を行うために、精製したＰＧＡタンパク質を５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーに溶解して８．０ｍｇ／ｍｌの濃度とした。ｐＨ６．５およびｐＨ８．０のリン酸ナトリウムバッファーを使用してＰＥＧ化を実施したところ、同様の結果を得た。ＰＥＧを２．５ｍｇ／２００μｌ  ＰＧＡ溶液から２０ｍｇ／２００μｌの範囲の量で添加した。反応混液を室温で６０分間撹拌してＰＥＧ化反応を行った。未結合のＰＥＧを除去するために、５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．５）に対して透析した。ＢＴＣ−ＰＥＧを用いてＰＥＧ化したＰＧＡは５ｍｇ／２００μｌ  ＰＧＡ溶液で１６．５％のＰＥＧ化となり、１０ｍｇ／２００μｌでは２６％のＰＥＧ化となった。１５および２０ｍｇ／２００μｌでのＰＥＧ化では、それぞれ５７％および６５％のＰＥＧ化となった。しかしながら、より高濃度でのＰＥＧ化は約７５％の酵素活性が喪失した。
【００８２】
ＢＴＣ−ＰＥＧは血清におけるＰＧＡの半減期を延長した。ホストによるＰＧＡに対する不活性化抗体の産生の遅延は見られなかった（図２）。試験した全てのＰＥＧ濃度において、両ＰＥＧ化ｐＨ値（６．５、８．０）で、処理のわずか２週間後に不活性化抗体の産生が起こった。
【００８３】
実施例６：アルデヒド（ＡＬＤ）ＰＥＧを使用するＰＥＧ化の最適化
アルデヒド基を有するＰＥＧは、ナトリウムシアノボロハイドライドの存在下で第１級アミンとの還元的アミノ化反応を受ける。他の求電子的に活性化された基とは異なり、アルデヒドはアミンとしか反応しない。このように修飾したタンパク質はアミン基および溶液中での関係する電荷を保持し、このことはタンパク質のコンフォメーションおよび活性を維持するのに重要でありうる。更に、抗原性部位として作用する、あるいは損傷の際に毒性を引き起こすようなＰＥＧおよびタンパク質間のリンカーが存在しない。このＰＥＧはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ 社から販売されており、以下の構造を有する：
【化３】
2004533598.tif 000005
ＡＬＤ−ＰＥＧを使用するＰＥＧ化は、精製／凍結乾燥したＰＧＡを５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）に溶解して８．０ｍｇ／ｍｌの濃度として行った。次いでＡＬＤ−ＰＥＧ２０００を以下の濃度で添加した：標品１：２．５ｍｇ／２００μｌ；標品２：７．５ｍｇ／２００μｌ；標品３：１０ｍｇ／２００μｌ；そして標品４：１２．５ｍｇ／２００μｌ。その後ナトリウムシアノボロハイドライド（３１．５ｍｇ／ｍｌ）を１ｍｌ当たり５０μｌで添加した。ＰＥＧを溶解し、溶液を室温で１８から２４時間撹拌した。標品１は３１％、標品２は５１％、標品３は６６％、そして標品４は７４％ＰＥＧ化された。ＡＬＤ−ＰＥＧ標品のいずれも、酵素活性を有意に喪失しなかった。
【００８４】
標品２および３は長期治療に最も適していることが確認された。１ヶ月の治療後、標品３を投与した５検体のマウスの全て、および標品２を投与した５検体のマウス中４検体は、注射の１８時間後に酵素活性を保持していた。結果は、ＡＬＤ−ＰＥＧ２０００を使用する場合、ＰＧＡのＰＥＧ化のパーセントは４５−６５％の範囲内とする必要があることを示している。これらの結果を図３に示す。それぞれ標品１および４でのような、より低い、またはより高い量のＰＥＧ化では長期治療の経過中に血清中の酵素が不活性化した。アルデヒドＰＥＧを使用するＰＥＧ化は他の活性化したＰＥＧを使用するＰＥＧ化より優れており、これは活性の喪失がより少なく、広範なＰＥＧ化範囲にわたって有効であり、リジン基のみが修飾されるためである。
【００８５】
実施例７：スクシンイミジルカーボネート（ＳＣ）ＰＥＧを使用するＰＥＧ化の最適化
シュードモナス７Ａグルタミナーゼ・アスパラギナーゼ（ＰＧＡ）のＰＥＧ化についての広範な実験を、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ社から販売されているＳＣ−ＰＥＧ、並びにＭｉｒｏｎおよびＷｉｌｃｈｅｋ（Ｍｉｒｏｎ， ＴおよびＭ． Ｗｉｌｃｈｅｋ．， １９９３． Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４：５６８−５６９）に記載される方法に従って製造したＳＣ−ＰＥＧを使用して行った。このＰＥＧは相対的に反応性がないが、それでもタンパク質の有効な修飾物質である。それらのコンジュゲートの生物学的活性は、一般に十分保存されている。ＳＣ−ＰＥＧおよびアミノ含有分子間の反応によってウレタン結合が生成され、これは加水分解に対して安定である。ＳＣ−ＰＥＧは以下の構造を有する：
【化４】
2004533598.tif 000006
ＰＥＧ化の手順は、精製したタンパク質を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ８．８）に溶解して約８．０ｍｇ／ｍｌの濃度とすることから成るものであった。ＳＣ−ＰＧＡの４つの標品を以下の方法で生成した。２００μｌの８．０ｍｇ／ｍｌ溶液にＳＣ−ＰＥＧを以下の量で添加した：標品１は２．５ｍｇ、標品２は５ｍｇ、標品３は７．５ｍｇ、そして標品４は１０ｍｇ。標品１は３１％のＰＥＧ化で酵素失活は３０％となった。標品２は４９％のＰＥＧ化で４１％の失活となった。標品３は５５％のＰＥＧ化で４４％の失活であった。標品４は６１％のＰＥＧ化で５６％の失活となった。標品１のＳＣ−ＰＥＧを投与したマウスは全て、３週間後の注射の１８時間後で循環ＰＧＡ活性を保持しており、５検体中４検体のマウスは１０週間の治療後でも、注射の１８時間後に循環ＰＧＡ活性を維持していた。ＰＥＧ化のパーセンテージが高いにも関わらず、標品２、３、および４は３週間の治療で数検体のマウスにおいて、注射後１８時間の循環酵素活性を維持するのに有効ではなかった。これらの結果を図４に示す。従って、ＳＣ−ＰＥＧ５０００を使用して、３１％が最適なＰＧＡの修飾程度である。
【００８６】
実施例８：モノメトキシスクシンイミジルブタノエートポリ（エチレングリコール）（ＳＢＡ−ＰＥＧ５０００）を使用するシュードモナス７Ａグルタミナーゼ−アスパラギナーゼ（ＰＧＡ）に対する不活性化抗体産生の阻害
我々はモノメトキシポリ（エチレングリコール）ブタン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＭＷ５０００、ＳＢＡ−ＰＥＧ５０００）を使用してシュードモナス７Ａグルタミナーゼ−アスパラギナーゼ（ＰＧＡ）を修飾した。ＳＢＡ−ＰＥＧは以下の構造を有する：
【化５】
2004533598.tif 000007
リジン、末端アミン、および活性エステル間の反応によって安定なアミド結合が生成される。ＰＥＧの骨格にエステル結合が存在しないことによって、より安定となる。このＰＥＧはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ 社から販売されている。ＰＧＡをいくつかの比率でＳＢＡでＰＥＧ化し、理想的な比率を確認した。ＰＥＧ化の手順は、精製したタンパク質を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ９．５）に溶解して約８．０ｍｇ／ｍｌの濃度とすることから成るものであった。ＳＢＡ−ＰＥＧを以下の量で添加した：標品１：３ｍｇ／２００μｌ；標品２：５ｍｇ／２００μｌ；そして標品３：１０ｍｇ／２００μｌ。版の右近液を室温で９０分間撹拌した。次いで、ＰＥＧ化されたＰＧＡを５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）に対して透析した。他のＰＥＧを使用する場合は有意な活性の喪失がしばしば観察されるが、使用した最も高い比率のＰＥＧの場合でも、ＰＥＧ化によって酵素活性の喪失はほとんど起こらなかった。実施例１に記載したフルオレスカミンアッセイに従って、標品１は３５％、標品２は５８％、そして標品３は７１％のＰＥＧ化という結果を得た。グルタミナーゼは実施例２に従って処理した動物の血清では、標品２および３を使用した場合、２週間の治療で不活性化されなかった；しかしながら、標品１を使用した場合、血清グルタミナーゼ活性は、８週間の治療後でも高かった。従ってｍＳＢＡ−ＰＥＧ５０００を使用してＰＧＡを３５％ＰＥＧ化するのが、長期治療の際にタンパク質を保護するのに最適である。結果を図５に要約する。
【００８７】
実施例９：スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）ＰＥＧを使用するＰＥＧ化の最適化
ＳＢＡ−ＰＥＧと同様に、ＳＰＡ−ＰＥＧはＰＥＧの骨格にエステル結合が存在しないことから、非常に安定である。２つの化合物のタンパク質に対する反応性は非常に類似しており、ＳＰＡのほうがわずかに反応性が高い。ＳＰＡ−ＰＥＧは以下に示す構造を有する：
【化６】
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ＳＰＡ−ＰＥＧを使用するＰＥＧ化はＳＢＡ−ＰＥＧと同様に、精製したタンパク質を５０ｍＭ炭酸水素ナトリウムバッファー（ｐＨ９．５）に溶解して約１０ｍｇ／ｍｌの濃度として行った。次いでＳＰＡ−ＰＥＧを以下の量で添加した：標品１：２ｍｇ／２００μｌ；標品２：３ｍｇ／２００μｌ；そして標品３：４ｍｇ／２００μｌ。反応混液を室温で６０分間撹拌した。その後、ＰＥＧされたＰＧＡを５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）に対して透析した。標品１は約４０％、標品２は約５０％、そして標品３は約５５％までＰＥＧ化された。標品３は、長期の治療後でも、注射１８時間後の循環ＰＧＡ活性を保持するのに有効であった。標品３のマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析法（Ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ−ｌａｓｅｒ−ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ−ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ；ＭＡＬＤＩ）での分析により、標品３はＰＥＧ化されたＰＧＡの分子量が単量体あたり７０，０００から１１０，０００ダルトンの間であることが明らかになった（図６）。標品３は、５検体中４検体の動物で６０日間の治療後でも高い循環酵素活性を保持するＰＥＧ化であることが観察された（図７）。
【００８８】
実施例１０：ＰＥＧ化されたＰＧＡの調製
ＰＥＧ化されたＰＧＡの凍結乾燥は酵素活性に有意に作用し、不活性化抗体産生を阻害するＰＥＧ化の能力を損なうことが明らかとなった。種々の化合物を試験し、いずれの化合物が加熱の影響に対してＰＧＡに更なる安定性を与えうるかを観察した。その後、最も好結果であった化合物（ＣａＣｌ２、グルタミン酸ナトリウム、およびスクロース）を、凍結乾燥の際のＰＥＧ化ＰＧＡの保護物質として作用するその能力について試験した。以前は、凍結乾燥は活性を約５０％低下させ、不活性化抗体産生を阻害するＰＥＧ化の能力を低下させることが見いだされた。ＳＢＡ−ＰＧＡ１：３を５ｍＭ  リン酸カリウムバッファー中、１０ｍＭ  スクロース、１０ｍＭ  グルタミン酸ナトリウム、そして１０ｍＭの両化合物の組み合わせを使用して凍結乾燥した。活性の有意な低下は見られなかった。５ｍＭ  リン酸カリウムの単独、または１０ｍＭ  スクロースとの組み合わせでの存在下で凍結乾燥したＳＢＡ−ＰＧＡで２週間処理した動物では、注射１８時間後に酵素活性は回収されなかった。しかしながら、１０ｍＭのグルタメートは凍結乾燥の際にＳＢＡ−ＰＧＡを保護する効果を有し、１０週間の治療後でも注射後１８時間後に良好な循環ＰＧＡ活性を有した（図８）。
【００８９】
更なる実験を行って、ＳＰＡ−ＰＥＧ５０００でＰＥＧ化したＰＧＡを凍結乾燥時に最も保護する添加剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）を確認した。以下の添加剤を試験した：（ｉ）１０ｍＭ  ＭＳＧ単独、（ｉｉ）１０ｍＭ  ＭＳＧ＋５ｍＭ  ＣａＣｌ２、（ｉｉｉ）１０ｍＭ  ＭＳＧ＋１０％スクロース、（ｉｖ）１０ｍＭ  ＭＳＧ＋５ｍＭ  ＣａＣｌ２＋１０％スクロース。上記の添加剤を含有するＰＥＧ−ＰＧＡを以下のように凍結乾燥した：段階１  −２０℃で２時間、凍結（ｓｈｅｌｆ ｆｒｅｅｚｅ）した；段階２  −２０℃で４時間、１次乾燥した；段階３  ４℃で１２時間、２次乾燥した；そして段階４  ２０℃で３時間、３次乾燥した。凍結乾燥したタンパク質を更なる使用まで、デシケーター中で、４℃で保存した。４標品を動物で試験し、添加剤によって凍結乾燥の際にＳＰＡ−ＰＥＧ５０００でＰＥＧ化したＰＧＡに施与される保護について研究したが、これは実施例２に記載される方法に従って行った。図９に見られるように、１０ｍＭ  ＭＳＧ＋５ｍＭ  ＣａＣｌ２は凍結乾燥の際のＳＰＡ−ＰＥＧ５０００でＰＥＧ化したＰＧＡの安定化に最も良好な添加剤の組み合わせであった。これらの添加剤を使用して我々のスケールアップした研究、および動物での毒性実験およびヒトの臨床試験のためのＰＥＧ−ＰＧＡの製造を行った。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＳＳ−ＰＥＧで修飾したＰＧＡを用いた動物実験を表すグラフである。
【図２】
図２は、ＢＴＣ−ＰＥＧで修飾したＰＧＡを用いた動物実験を表すグラフである。
【図３】
図３は、ＡＬＤ−ＰＥＧで修飾したＰＧＡを用いた動物実験を表すグラフである。
【図４】
図４は、ＳＣ−ＰＥＧで修飾したＰＧＡを用いた動物実験を表すグラフである。
【図５】
図５は、ＳＢＡ−ＰＥＧで修飾したＰＧＡを用いた動物実験を表すグラフである。
【図６】
図６は、ＳＰＡ−ＰＥＧで修飾したＰＧＡのＭＡＬＤＩ分析を表すグラフである。
【図７】
図７は、ＳＰＡ−ＰＥＧで修飾したＰＧＡを用いた動物実験を表すグラフである。
【図８】
図８は、ＰＧＡ凍結乾燥の際の化合物の保護能力を表すグラフである。
【図９】
図９は、ＳＰＡ−ＰＥＧで修飾したＰＧＡを用いた製剤開発の動物実験を表すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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