(57)【要約】本発明の目的は、免疫学的応答を調節する能力をもつ抗原以外の物質の免疫調節特性を改善するための方法において、イオンリガンドを支持するか又はしない、場合によって両親媒性化合物層で被覆された親水性粒子と前記物質を混合する段階を含むことを特徴とする方法にある。本発明は同様に、かくして得られた薬学組成物及び癌、ウイルス疾患及び感染性疾患の治療及び／又は予防のためのその利用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌及び／又はウイルス性疾患の治療を目的とした１つの医薬品の調製を目的とした、液体でない親水性核を有するタイプのベクターの利用において、前記ベクターが該医薬品中で、免疫応答を調節する能力をもつ抗原以外の少なくとも１つの物質と結びつけられている利用。
【請求項２】
ベクターが、非液体親水性核並びに疎水性相互作用及び／又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのものであることを特徴とする請求項１に記載の利用。
【請求項３】
非液体親水性核が、イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成されていることを特徴とする請求項１〜２のいずれか１項に記載の利用。
【請求項４】
イオンリガンドが正の電荷をもつことを特徴とする請求項３に記載の利用。
【請求項５】
正の電荷をもつイオンリガンドが第４アンモニウムであることを特徴とする請求項４に記載の利用。
【請求項６】
外部層が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ）及びコレステロールで形成されていることを特徴とする請求項２〜５のいずれか１項に記載のベクターの利用。
【請求項７】
ＤＰＰＣとコレステロールの質量比が７０／３０であることを特徴とする請求項６に記載の利用。
【請求項８】
物質とベクターの重量比が約１％〜２０％、好ましくは約５％〜１０％の間に含まれていることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の利用。
【請求項９】
免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質が、免疫系の機能において１つの役割を果たす治療上有利なタンパク質、アジュバント又は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを修飾する能力をもつ物質、又はこれらの混合物であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の利用。
【請求項１０】
治療上有利なタンパク質が、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、ＴＮＦ、ＴＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＲＡＮＴＥＳ又はこれらの混合物を含むグループの中から選択されるサイトカイン又はケモカインであることを特徴とする請求項９に記載の利用。
【請求項１１】
治療上有利なタンパク質がインタロイキン２であることを特徴とする請求項１０に記載の利用。
【請求項１２】
アジュバントが、細菌腸毒素、リポ糖類誘導体、オリゴヌクレオチド、サポニン誘導体、アンモニウム塩及びその誘導体、ＤＴ又はＴＴタイプのタンパク質又はそれらの混合物を含むグループの中から選択されることを特徴とする請求項９に記載の利用。
【請求項１３】
治療対象の癌が、免疫原性でない又は免疫原性の低いタイプのものであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載のベクターの利用。
【請求項１４】
医薬品が、経鼻又は経口投与を目的とするものであることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の利用。
【請求項１５】
（ａ）正の電荷又は負の電荷のイオンリガンドが上にグラフト化されている、自然に又は化学的に網状化された多糖類又はオリゴ糖基質で構成された非液体親水性核、及び
（ｂ）疎水性相互反応及び／又はイオン結合によって核に結びつけられた両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成された外部層、
を含み
（ｃ）ＩＬ−２を取込んでいる、
ベクターの、アルブミンの不在下において注入可能な形でＩＬ−２を投与するための医薬品の調製を目的とした利用。
【請求項１６】
免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質の免疫調節特性を改善するための方法において、非液体親水性核を有するタイプのベクターと前記物質の混合物を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１７】
ベクターが、非液体親水性核並びに疎水性相互作用及び／又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのものであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
非液体親水性核が、イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成されていることを特徴とする請求項１６又は１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
イオンリガンドが正の電荷をもつことを特徴とする請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
正の電荷をもつイオンリガンドが第４アンモニウムであることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
外部層が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ）及びコレステロールで形成されていることを特徴とする請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ＤＰＰＣとコレステロールの質量比が７０／３０であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
物質とベクターの重量比が約１％〜２０％、好ましくは約５％〜１０％の間に含まれていることを特徴とする請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質が、免疫系の機能において１つの役割を果たす治療上有利なタンパク質であることを特徴とする請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
治療上有利なタンパク質が、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、ＴＮＦ、ＴＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＲＡＮＴＥＳ又はこれらの混合物を含むグループの中から選択されるサイトカイン又はケモカインであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質がアジュバントであることを特徴とする請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
アジュバントが、細菌腸毒素、リポ糖類誘導体、オリゴヌクレオチド、サポニン、アンモニウム塩及びその誘導体、ＤＴ又はＴＴタイプのタンパク質又はそれらの混合物を含むグループの中から選択されることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質が、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを修飾する能力をもつ物質であることを特徴とする請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質が、免疫抑制剤であることを特徴とする請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
−　イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成された非液体親水性核そして場合によっては、疎水性相互作用及び／又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのベクター、及び
−　少なくとも１つの治療上の有利なタンパク質、及び／又はアジュバント及び／又はＴｈ１／Ｔｈ２バランスを修飾する能力をもつ物質、
を含むことを特徴とする薬学組成物。
【請求項３１】
外部層が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ）及びコレステロールで形成されていることを特徴とする請求項３０に記載の薬学組成物。
【請求項３２】
物質とベクターの重量比が約１％〜２０％、好ましくは約５％〜１０％の間に含まれていることを特徴とする請求項３０又は３１のいずれか１項に記載の薬学組成物。
【請求項３３】
治療上有利なタンパク質が、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、ＴＮＦ、ＴＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＲＡＮＴＥＳ又はこれらの混合物を含むグループの中から選択されるサイトカイン又はケモカインであることを特徴とする請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の薬学組成物。
【請求項３４】
治療上有利なタンパク質がインタロイキン２であることを特徴とする請求項３３に記載の薬学組成物。
【請求項３５】
アジュバントが、細菌腸毒素、リポ糖類誘導体、オリゴヌクレオチド、サポニン誘導体、アンモニウム塩及びその誘導体、ＤＴ又はＴＴタイプのタンパク質又はそれらの混合物を含むグループの中から選択されることを特徴とする請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の薬学組成物。
【請求項３６】
ワクチン組成物の調製を目的とした、液体でない親水性核を有するタイプのベクターの利用において、前記ベクターが該組成物の中で、少なくとも１つの抗原及び該抗原に対する免疫学的応答を調節する能力をもつ少なくとも１つの物質と混合されている、利用。
【請求項３７】
ベクターが、非液体親水性核並びに疎水性相互作用及び／又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのものであることを特徴とする請求項３６に記載の利用。
【請求項３８】
非液体親水性核が、イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成されていることを特徴とする請求項３６又は３７のいずれか１項に記載の利用。
【請求項３９】
イオンリガンドが正の電荷をもつことを特徴とする請求項３８に記載の利用。
【請求項４０】
正の電荷をもつイオンリガンドが第４アンモニウムであることを特徴とする請求項３９に記載の利用。
【請求項４１】
外部層が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ）及びコレステロールで形成されていることを特徴とする請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の利用。
【請求項４２】
物質とベクターの重量比が約１％〜２０％、好ましくは約５％〜１０％の間に含まれていることを特徴とする請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の利用。
【請求項４３】
抗原の免疫学的応答を調節する能力をもつ物質が、アジュバント及び／又は、治療上有利なタンパク質及び／又は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを修飾する能力をもつ物質であることを特徴とする請求項３６〜４２のいずれか１項に記載の利用。
【請求項４４】
アジュバントが、細菌腸毒素、サポニン誘導体、アンモニウム塩及びその誘導体、ＤＴ又はＴＴタイプのタンパク質サイトカイン、オリゴヌクレオチド又はそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする請求項４３に記載の利用。
【請求項４５】
治療上有利なタンパク質が、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、ＴＮＦ、ＴＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＲＡＮＴＥＳ又はこれらの混合物を含むグループの中から選択されるサイトカイン又はケモカインであることを特徴とする請求項４３に記載の利用。
【請求項４６】
ウイルス疾患特にエイズ及び慢性肝炎又は癌の治療及び／又は予防のためのワクチン組成物の調製を目的とする、請求項３６〜４５のいずれか１項に記載の利用。
【請求項４７】
−　抗原又は抗原混合物、
−　イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成された非液体親水性核そして場合によっては、疎水性相互作用及び／又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのベクター、及び
−　前記抗原に対する免疫学的応答を調節する能力をもつ少なくとも１つの物質、
を含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項４８】
外部層が、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ）及びコレステロールで形成されていることを特徴とする請求項４７のいずれか１項に記載の薬学組成物。
【請求項４９】
抗原の免疫学的応答を調節する能力をもつ物質が、アジュバントおよび／又は、治療上有利なタンパク質及び／又は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを修飾する能力をもつ物質、又はこれらの混合物であることを特徴とする請求項４７又は４８のいずれか１項に記載のワクチン組成物。
【請求項５０】
アジュバントが、細菌腸毒素、サポニン誘導体、アンモニウム塩及びその誘導体、ＤＴ又はＴＴタイプのタンパク質サイトカイン、オリゴヌクレオチド又はそれらの混合物の中から選択されることを特徴とする請求項４９に記載のワクチン組成物。
【請求項５１】
治療上有利なタンパク質が、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、ＴＮＦ、ＴＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＲＡＮＴＥＳ又はこれらの混合物を含むグループの中から選択されるサイトカイン又はケモカインであることを特徴とする請求項４９に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、免疫学的応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質の免疫調節特性を改善するための方法において、イオンリガンドを支持するか又は支持せず場合によって両親媒性化合物層で被覆された親水性粒子と前記物質を混合させることから成る方法を目的としている。
【０００２】
本発明は特に、治療用組成物特にワクチン組成物及びその調製方法に関する。
【０００３】
本発明は、特に、癌の治療を目的とする医薬品の調製のためのインタロイキン２を取込んだ特定のベクターの利用を目的としている。
【０００４】
【従来の技術】
癌は、免疫系の監視を逃れる或る種の細胞の無制御増殖を特徴とする疾病である。実際、免疫系の役割は、人間の体内に侵入しうる病原性の異物（ウイルス、細菌、寄生虫…）を拒否するだけでなく、異常な特徴を呈する細胞を除去することにもある。癌性細胞が、例えば腫瘍に特異的な或る種の抗原又は免疫系による認識に関わる分子（主要組織適合性複合体タンパク質）の発現を減少させることにより、免疫系の警戒から逃れることも時として可能である。その他のケースでは、腫瘍はきわめて免疫原性ではあるものの、癌性集積の近くではリンパ球がアネルギー状態にあることから、免疫系がこれを抑えこむことはできない。
【０００５】
近年開発された新しい戦略は、免疫系の調整において１つの役割をもつ治療上有利なタンパク質を注入することにより免疫系を刺激することから成るものである。これらのタンパク質に入るものとしては、当然サイトカインのみならず、ケモカインといったようなその他の作用物質も挙げることができる。特に、インタロイキン、インタフェロン、ＴＮＦ（腫瘍壊死誘発因子）、ＴＧＦ（成長形質転換因子）、Ｍ−ＣＳＦ及びＧＭ−ＣＳＦといったような造血成長因子だけでなく、ＭＩＦ又はＲＡＮＴＥＳといったような免疫細胞誘引因子も指摘することができる。
【０００６】
免疫系の刺激において特に有利なサイトカインは、インタロイキン２（ＩＬ−２）である。これは、適切な細胞により提示される抗原による刺激に応答して、Ｉ型ヘルパーＴリンパ球（Ｔｈ１）により大部分が合成される。これは、数多くの細胞（Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ＮＫ天然キラー細胞）と相互作用して、それらを活性化しそれらの分化及び／又は増殖を誘発するという点で、特異的及び非特異的免疫応答の発達に関与する。かくして、ＩＬ−２は、異なる中実腫瘍、黒色腫、白血病又はリンパ腫などの退行を誘発することができるという点で抗腫瘍特性を有している。
【０００７】
しかしながら、化学療法におけるＩＬ−２の利用には、数多くの問題が立ちはだかっている。求める効果を得るためには、往々にして大用量のタンパク質を投与する必要があり、これは、わずらわしい副作用（発熱、紅斑、浮腫）をひき起す可能性がある。一方、このタンパク質は精製がむずかしく、一般に遺伝子工学によって産生されているためにコストが高い。又、サイトカインは、４℃という温度であっても、溶解状態で不安定であることが多く、そのため保存の問題がでてくる。その上、ＩＬ−２を含む溶液の調製方法は、往々にしてアルブミンである安定化タンパク質の添加段階を含み、このことは、アルブミンの利用によりもたらされるリスクのため、規制機関にとって受諾し難いことである。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、通常の製剤に比べさらに高い活性特に抗腫瘍活性をもつ溶液を得ることを可能にするＩＬ−２含有組成物の新しい処方方法を利用することによって、これらの異なる問題を解決することを提案している。この新しい製剤は同様に、ＩＬ−２の安定性を増大させることをも可能にする。その上、本発明は、有効成分の送達システムが、前述のシステムに比べきわめて大幅な改善を示すことから鼻腔内又は経口投与できる医薬品の製造のために利用することができる。要するに、本発明に従った製剤は、注入可能な形で投与することを目的とする、ＩＬ−２含有組成物中のアルブミンの存在から解放されることを可能にする。
【０００９】
出願人は、以下「ＢＶＳＭＴＭ」とも呼ばれる特定の合成ベクターの調製においてその専門知識を開発した。
【００１０】
第１のタイプのＢＶＳＭ及びその調製方法は、欧州特許第３４４，０４０号の中で記述されていた。これは、内側から外側へ向かって以下のものを含む粒子である：
−　さまざまなイオン基によって修飾され得る、自然に又は化学的に網状化された多糖類又はオリゴ糖マトリックスから成る、非液体親水性中心核；
−　核に対し、共有結合によりグラフト化された脂肪酸層；
−　特にリン脂質から成る単数又は複数の脂質層。
【００１１】
この第一世代のＢＶＳＭの開発により、出願人は、特に輸送される有効成分に応じて改善された特性をもつ新しいＢＶＳＭを設計し調製するに至った。
【００１２】
ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ９６／０６６３８及びＥＰ７８２８５１という番号で公示された特許出願は、これらのＢＶＳＭ、その製造、さまざまな有効成分に対するその会合、及び薬学組成物の調製のためのその利用について記述している。
【００１３】
かくして、親水性核は、すでに記述した異なる方法（例えば特許ＥＰ３４４０４０号、ＷＯ９２／２１３２９号、ＷＯ９４／２００７８号）によって得ることができ、網状化方法は、当業者にとって既知のものであり、多糖類は、重合体を構成する糖に対するカチオン又はアニオンのイオン基のグラフト化により正又は負に帯電している可能性がある。これらの基は、第４アンモニウム又はカルボキシメチル官能基の中から選択され得る。方法は、ＷＯ９２／２１３２９及び上述の特許の中で記述されていた。本発明に従った組成物のベクターの多糖類コアの電荷は、一般に好ましくは、正の電荷である。しかしながら、コアに負の電荷を含むベクターが時として、特に注入可能な形で利用するための組成物において好適でありうる。
【００１４】
前述の特許は、同様に、当業者が脂質外部層の取込みのために利用できるプロトコルについても記述している。この外部層は、好ましくは、「ＤＰＰＣ様のもの」つまりＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）又はこの生成物と同じ物性をもちその中にコレステロールが添加されるその他のあらゆる化合物から成る。ただし、特に例えば生体膜の構成成分といったその他の成分を付加できるリン脂質又はセラミドといったその他の脂質化合物も利用することができる。好ましくは、ＤＰＰＣとコレステロールの質量比は７０／３０である。
【００１５】
ＢＶＳＭの調製について自ら今日保有しているノウハウにより、出願人は、広範なタイプのＢＶＳＭを入手することができる。これらのＢＶＳＭは、ナノ粒子ゲルの形の網状化された親水性重合体、好ましくは多糖類で形成され、これらのＢＶＳＭはＰＳＣ（フランス語ではＮＰＳ）タイプと呼ばれている。
【００１６】
上述のように、この重合体は場合によって、正のイオンリガンド、いわゆるカチオンＢＶＳＭ又は、負のイオンリガンドすなわちアニオンＢＶＳＭを担持することができる。この荷電又は非荷電重合体は、任意には両親媒性化合物層、好ましくはリン脂質、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９４／２００７８号の中で記述されているＬｉｇｈｔ タイプと呼ばれるＢＶＳＭで被覆されている。
【００１７】
ＢＶＳＭのサイズは、２０〜２００ｎｍ、好ましくは５０〜１００ｎｍ、より好ましくは６０〜８０ｎｍの間に含まれる。
【００１８】
ＢＶＳＭは、ろ過により滅菌可能であり、有効成分に対するその会合は、完全に製造されたＢＶＳＭ上で行なわれる（Ｍａｊｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ（１９９７）、１３２７、３２−４０）。こうして、最適な条件下で特に脆い生体分子に働きかけることが可能となっている。
【００１９】
ＢＶＳＭは、分解から生体分子を保護する。（Ｐｒｉｅｕｒ Ｒ．ｅｔ ａｌ． Ｖａｃｃｉｎｓ（１９９６）、第１４巻、Ｎｏ．６．ｐ５１１〜５２０、８０ｎｍのカチオンバイオベクターとｈＣＭＶ組換え型ＩＥ１タンパク質の組合せ；タンパク質分解からの保護及びＣＤ４に対する提示の増強作用）。
【００２０】
同様に、それらが、酵素、抗原などといったようなペプチド及びタンパク質の生物活性を増大させることも示された。
【００２１】
ＢＶＳＭは、例えばペプチド、抗原又はオリゴヌクレオチドといったような活性物質の運搬体として利用されるものとして知られている。この利用においては、ＢＶＳＭのカチオン核とアニオンオリゴヌクレオチドの間のイオン相互作用として、ＢＶＳＭと活性物質間の真の複合体の形成が存在する。従って生物学的環境内で安定したイオン接合体の形成が存在する。このタイプの調製においては、オリゴヌクレオチド／ＢＶＳＭの比は、５〜１０％であり、測定上の会合効率は９０％を上回る。
【００２２】
ＷＯ９６／０６６３８という番号で公示されたＰＣＴ特許出願は、抗原／ＢＶＳＭの単純な混合物によって得られた抗原の免疫原性の増大に関するものである。抗原はここでも又、疎水性及び／又はイオン結合により特定のベクターに会合されている。この結果を得るためには、例えば１０ｍｇのＢＶＳＭについてタンパク質ＧＳＴ〜ｅ４ １ｍｇをインキュベートし、これにより、利用されるＢＶＳＭタイプの如何に関わらず９０％の平均会合率を得ることが可能となる（Ｐｒｉｅｕｒ Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｖａｃｃｉｎｓ（１９９６）第１４巻、Ｎ°６ｐ５１１〜５２０）。
【００２３】
出願人は、今ＢＶＳＭが、免疫学的応答を調節する能力をもつ抗原以外の物質の免疫調節特性を改善できるようにするということを発見した。これらの物質は、より特定的には以下のようなものである。
−　免疫応答を増幅、調整又は修飾する能力をもつアジュバント、
−　免疫系細胞の活性を修飾するという固有の特性をもつサイトカイン及びケモカイン、
−　アレルギー及び／又は移植片拒絶の治療におけるその利用を理由として、免疫抑制剤、
−　Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを修飾する能力をもつ物質。
【００２４】
免疫応答はリンパ球性細胞特にＢ細胞及びＴリンパ球により引継がれるということを喚起しておく。これらの細胞は、表面抗原ＣＤ４及びＣＤ８の発現に基づき２つの亜型に分類できる。ＣＤ４＋細胞は一般に「ヘルパー」機能に関与している。特に、これらは、その他のリンパ球性細胞の増殖及び成熟を誘発するサイトカインを分泌する。かくして、ヘルパーＴリンパ球のもつ次のような２つのプロフィールを定義づけすることができる：すなわち、
−　一方では、サイトカイン特にＩＬ２、ＩＬ７及びガンマインタフェロンの誘発、ＣＴＬの刺激及びＩｇＧ２ａタイプの抗体の誘発を伴う、細胞媒介応答を特徴づけるＴｈ１プロフィール、そして
−　他方では、サイトカイン、特にＩＬ４、ＩＬ５及びＩＬ１０の誘発及びＩｇＧ１及びＩｇＥタイプの抗体の存在を伴う、体液媒介応答を特徴づけるＴｈ２プロフィール。
【００２５】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるその提示が大部分クラスＩＩのＣＭＨによって行なわれるタンパク質抗原は、Ｔｈ２に方向づけされた応答を誘発する。逆に、トランスフェクションの後クラスＩのＣＭＨ上で直接抗原を提示できるようにするＡＤＮは、免疫応答をＴｈ１に向かって方向づけする。
【００２６】
応答を大部分Ｔｈ１又はＴｈ２へと方向づけするためのいくつかのアジュバントが知られている。例えば、ＩｇＧ１タイプの血清応答を誘発するアルミニウム塩は、Ｔｈ２とみなされる。アジュバントとは逆に、ＩｇＧ２ａ及びＣＴＬ応答を誘発する脂質Ａの誘導体（ＭＰＬ）又はＱｕｉｌＡの誘導体はＴｈ１とみなされる。従って、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスに作用できるようにする手段を手に入れることが有用と思われ、これこそまさに本発明が実現すべく提供するものである。
【００２７】
本発明の枠内で出願人により実施された研究作業は、ＢＶＳＭが単独では免疫系の活性化を誘発しないことからアジュバントとして作用せず、提示細胞に対する抗原のより良い侵入及び／又はより良い提示を可能にする「キャリヤ」として作用することを示している。かくして、得られた結果は、ＣＴＢ、ＭＰＬ及びＯＤＮのアジュバント能に対するＢＶＳＭ寄与を示していた。驚くべきことに、アジュバント能は、次のものに対して異なる形で視覚化される：
−　血清ＩｇＧ応答については、ＣＴＢの場合強い相乗作用又はＯＤＮ ＣｐＧの場合応答の加算が得られた。
−　ＩｇＡ応答については、ＭＰＬに関して相乗作用が明確に立証された。
−　Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスについては、数量的に等価の応答（ＩＬ２）の場合でさえ、特に細胞応答における差異を反映するＩｇ１／ＩｇＧ２ａバランスにおいて応答の質的差異が観察される。
【００２８】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明はまず第１に、癌及び／又はウイルス性疾患の治療を目的とした１つの医薬品の調製を目的とした、液体でない親水性核を有するタイプのベクターの利用において、前記ベクターが該医薬品中で、免疫応答を調節する能力をもつ抗原以外の少なくとも１つの物質と結びつけられている利用を目的としている。
【００２９】
ベクターは有利には、非液体親水性核並びに疎水性相互作用及び／又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのものである。外部層はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ）およびコレステロールで形成されている。
【００３０】
非液体親水性核は、イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成されている。
【００３１】
イオンリガンドは、第４アンモニウムといったように正の電荷をもつ。
【００３２】
非液体親水性核及び両親媒性化合物から成る外部層を有する粒子状ベクターについては、すでに、特に特許出願ＷＯ９４／２００７８号において記述されていた。
【００３３】
親水性核は、すでに記述した異なる方法（例えば特許ＥＰ３４４０４０号、ＷＯ９２／２１３２９号、ＷＯ９４／２００７８号）によって得ることができ、網状化方法は、当業者にとって既知のものであり、多糖類は、重合体を構成する糖に対するカチオン又はアニオンのイオン基のグラフト化により正又は負に帯電している可能性がある。これらの基は、第４アンモニウム又はカルボキシメチル官能基の中から選択され得る。方法は、ＷＯ９２／２１３２９及び上述の特許の中で記述されていた。本発明に従った組成物のベクターの多糖類コアの電荷は、一般に好ましくは、正の電荷である。しかしながら、コアに負の電荷を含むベクターが時として、特に注入可能な形で利用するための組成物において好適でありうる。
【００３４】
前述の特許は、同様に、当業者が脂質外部層の取込みのために利用できるプロトコルについても記述している。この外部層は、好ましくは、「ＤＰＰＣ様のもの」つまりＤＰＰＣ（ジパルミトイルホスファチジルコリン）又はこの生成物と同じ物性をもちその中にコレステロールが添加されるその他のあらゆる化合物から成る。ただし、特に例えば生体膜の構成成分といったその他の成分を付加できるリン脂質又はセラミドといったその他の脂質化合物も利用することができる。好ましくは、ＤＰＰＣとコレステロールの質量比は７０／３０である。
【００３５】
本発明の利用においては、物質と粒子の重量比は約１％〜２０％、好ましくは約５％〜１０％の間に含まれている。有利には、（物質）／（核＋外部層）の重量比は１対１０である。
【００３６】
免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の第１のクラスの物質には、免疫系の機能において１つの役割を果たす治療上有利なタンパク質が含まれる。すなわちこれには特に、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、ＴＮＦ、ＴＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＲＡＮＴＥＳ又はこれらの混合物を含むグループの中から選択されたサイトカイン又はケモカインである。
【００３７】
前述のものを部分的にカバーする、免疫応答を調節する能力をもつ抗原以外の第２のクラスの物質には、アジュバントが含まれる。アジュバントというのは、１つの抗原の特異的免疫応答を増幅、調整又は方向づけできるようにする分子のことである。かくして、抗原以外の物質の免疫調節能に対するＢＶＳＭの特性を評価する目的で、細菌産物（内毒素、壁の成分）、サイトカイン、オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ）といったような主要なカテゴリのアジュバントに属するさまざまな分子が、本発明の枠内でテストされた。その中でもより特定的に以下のものを挙げることができる：
−　ＣＴ、ＣＴＢ、ＬＴといったような細菌腸毒素、
−　ＭＰＬ及び脂質Ａの誘導体といったようなリポ糖類誘導体；
−　ＱＳ２１タイプのサポニンの誘導体；
−　ミョウバンといったようなアンモニウム塩及びその誘導体；
−　ＤＴ又はＴＴタイプのタンパク質、
又はこれらの混合物。
【００３８】
免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の基板は、好ましくは以下のもの中から選択される：
−　免疫応答を増幅、調整又は修飾する能力をもつアジュバント、
−　免疫系の細胞の活性を修飾するという固有の特性をもつサイトカイン及びケモカイン、
−　アレルギー及び／又は移植片拒絶の治療におけるその利用を理由として免疫抑制剤、
−　Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを修飾する能力をもつ物質。
【００３９】
この中でも、本発明では、より特定的に、免疫調節特性を改善することが望まれる物質として、免疫細胞の活性を刺激するサイトカイン、なかでもＩＬ２、ＩＬ１１及びＧＭ−ＣＳＦが考慮されている。実際、サイトカインは、免疫細胞の活性を刺激又は阻害する。
【００４０】
本発明のきわめて好ましい実施形態は、
（ａ）正の電荷又は負の電荷のイオンリガンドが上にグラフト化されている、自然に又は化学的に網状化された多糖類又はオリゴ糖マトリックスで構成された非液体親水性核、及び
（ｂ）疎水性相互反応及び／又はイオン結合によって核に結びつけられた両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成された外部層、
を含み
（ｃ）インタロイキン２を取込んでいる、
ベクターの、癌の治療を目的とする医薬品の調製のための利用に関する。
【００４１】
（ａ）イオンリガンドが上にグラフト化されている、自然に又は化学的に網状化された多糖類又はオリゴ糖基質で構成された非液体親水性核、及び
（ｂ）疎水性相互反応及び／又はイオン結合によって核に結びつけられた両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成された外部層、
を含み
（ｃ）インタロイキン２を取込んでいる、
ベクターを含む、このような薬学組成物も同様に本発明の一部を成している。
【００４２】
この利用においては、本発明は、免疫原性でない又は免疫原性の低いタイプの癌の治療および／又は、免疫応答を活性化するための治療的処置を補うものとして免疫調節剤が提案されたエイズ又は慢性肝炎といった特にウイルス性の感染の治療に関係する。この利用を実施するための組成物は、イオンリガンドを担持するか又はしない、そして場合によっては上述のような治療上有利なタンパク質又はアジュバントが取込まれた両親媒性化合物の層で被覆された親水性粒子を含んで成る。かかる組成物は、抗原を含まない。
【００４３】
発明に基づく組成物によって治療可能な癌は、あらゆる種類のものであり得る。特に、ＯＲＬ球、食道、膵臓、乳房、子宮頸部又は子宮体部、卵巣、腎臓、膀胱、骨又は甲状腺の癌が挙げられる。同じく気管支肺癌、悪性黒色腫、脳腫瘍、リンパ腫（ホジキン又は非ホジキン）、白血病（骨髄性又はリンパ性）、初期位置不明の癌も加えられる。これらの癌は、原発性である場合も転移性である場合もある。又これらの癌は、肉腫、腺腫、癌腫、腺癌、リンパ腫、骨髄腫、膠腫、芽腫、グリア芽腫タイプのものであり得る。本発明に従った組成物により治療され得る癌は、免疫原性であってもなくてもよい。出願人は、本発明に従った組成物が、ほとんど又は全く免疫原性でない癌の治療及び制御において特に有効であるということを示した。
【００４４】
本発明に従った組成物及び医薬品は、さまざまな形、特に非経口で投与することができる。かくして、本発明に従った組成物を、静脈内、皮下、筋内又は皮内投与することができる。投与は、経口又は鼻腔内でも行なうことができる（これが発明の大きな利点である）。経口投与を可能にする組成物は、錠剤、ゼラチン嚢、粉末、顆粒又は経口用懸濁液又は溶液でありうる。これらの組成物には、舌下又は口腔投与形態も含まれる。
【００４５】
本発明に従った医薬品組成物に対し、或る種の賦形剤を付加することも場合によって可能である。かくして、あらゆる種類の結合剤、界面活性剤、コーティング剤、分散剤又は給湿剤を利用することができる。
【００４６】
出願人は、これらのベクターがきわめて効果的な形でＩＬ−２を固定する能力をもつこと、タンパク質がその生物活性を保持すること、そして、予想外にもこの活性が、処方されていないタンパク質に比べ増大させられていることを立証した。
【００４７】
出願人は同様に、本発明に従った処方が、アルブミンの存在下と同様の形で溶液状態のタンパク質を安定化することを可能にするものである、ということも立証した。かくして、
（ａ）正の電荷又は負の電荷のイオンリガンドが上にグラフト化されている、自然に又は化学的に網状化された多糖類又はオリゴ糖マトリックスで構成された非液体親水性核、及び
（ｂ）疎水性相互反応及び／又はイオン結合によって核に結びつけられた両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成された外部層、
を含み、
（ｃ）ＩＬ−２を取込んでいる、
ベクターの、アルブミンの不在下での前記タンパク質ＩＬ−２の注入可能な形での投与のための医薬品の調製を目的とした利用も同様に本発明の一部を成している。
【００４８】
その上、出願人は、ベクター／タンパク質の会合が（数カ月の保管後の活性の維持によって測定された場合に）安定した状態にとどまることを示しており、このことは、ＩＬ−２の治療用調製物を保存することができず、そのためコストをなお一層増大させることになる先行技術に比べて１つの改善である。
【００４９】
最後に、出願人は、驚くべきことに、本発明に従って処方され鼻腔内経由で投与されたＩＬ−２が、皮下といったようなより古典的な経路で投与されるＩＬ−２と類似した又はそれを上回る活性を有することを示した。
【００５０】
従って、本発明に従ったベクターの利用は、ＩＬ−２の利用の際に従来提起されてきた異なる全ての問題から解放されることを可能にする。
【００５１】
従って、本発明に従ったベクターは、免疫応答の増強が求められる癌治療のために利用可能である。
【００５２】
本発明は同様に、免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質の免疫調節特性を改善するための方法において、非液体親水性核を有するタイプのベクターと前記物質の混合物を含むことを特徴とする、方法をもその目的としている。有利にも、ベクターは、非液体親水性核並びに疎水性相互作用及び／又はイオン結合によって核に会合された、少なくとも部分的に両親媒性化合物で構成された外部層を有するタイプのものである。前述のように、非液体親水性核は、特に第４アンモニウムといったような、正の電荷を持つイオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成されている。外部層は、例えばジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＤＰＣ）及びコレステロールで、特に７０／３０というＤＰＰＣとコレステロールの質量比で形成されている方法。好ましくは、物質とベクターの重量比は、約１％〜２０％、好ましくは約５％〜１０％の間に含まれている。
【００５３】
前述のように、免疫応答を調節する能力をもつ、抗原以外の物質は、好ましくはインタロイキン、インタフェロン、ＴＮＦ、ＴＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＦ、ＲＡＮＴＥＳ又はこれらの混合物を含むグループの中から選択された、サイトキン又はケモカインといったような、免疫系の機能において１つの役割を果たす治療上有利なタンパク質、
−　特に細菌腸毒素、リポ糖類誘導体、オリゴヌクレオチド、サポニン、アンモニウム塩及びその誘導体、ＤＴ又はＴＴタイプのタンパク質又はそれらの混合物を含むグループの中から選択されたアジュバント、
−　Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを修飾する能力をもつ物質、
−　免疫抑制剤
の中から選ばれる。
【００５４】
本発明は同様に、イオンリガンドが上にグラフト化された自然に又は化学的に網状化したオリゴ糖又は多糖類マトリクスで構成された非液体親水性核そして、疎水性相互作用及び／又はイオン結合により核に結びつけられ両親媒性化合物で少なくとも部分的に構成されている外部層を含むタイプのベクター、及び
−　少なくとも１つの治療上の有利なタンパク質、及び／又はアジュバント又はそれらの混合物、
を含むことを特徴とする薬学組成物にも関する。
【００５５】
ベクター、治療上有利なタンパク質及びアジュバントは、前述のように定義される。
【００５６】
本発明はさらに、特に治療又は予防用ワクチン組成物の調製のための前述の通りのベクターの利用において、前記粒子が前記抗原に対する免疫学的応答を調節する能力をもつ少なくとも１つの物質及び少なくとも１つの抗原と該組成物中で混合されている利用にも関する。治療上の利用の場合には、本発明は特に、ウイルス疾患、特にエイズ及び慢性肝炎のみならず免疫原性をもつ癌の治療及び／又は予防に関係する。
【００５７】
従って、本発明は、特に、上述のとおりのベクター、及び抗原又は抗原混合物そして前記抗原の免疫学的応答を調節する能力をもつ少なくとも１つの物質を含むことを特徴とするワクチン組成物に関する。
【００５８】
本発明の組成物中に存在する抗原に対する免疫学的応答を調節する能力をもつ物質は、好ましくはアジュバントである。これらのうち、本発明では、細菌産物（内毒素、壁の成分）、サイトカイン、オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ）が考慮されている。より特定的に言うと、これらのうち、次のものを挙げることができる：
−　ＣＴ、ＣＴＢ、ＬＴといったような細菌腸毒素、
−　ＭＰＬ及び脂質Ａの誘導体といったようなリポ糖類誘導体；
−　ＱＳ２１タイプのサポニンの誘導体；
−　ミョウバンといったようなアンモニウム塩及びその誘導体；
−　ＤＴ又はＴＴタイプのタンパク質、
又はこれらの混合物。
【００５９】
前述のように、物質／粒子の重量比は、約１％〜２０％、好ましくは約５％〜１０％の間に含まれている。
【００６０】
本発明は、特に鼻腔内といった粘膜投与のための組成物の調製に特に適しているが、例えば非経口といったような他のあらゆる投与様式も考慮することができる。
【００６１】
本発明の特徴及び利点は、次のものに関する例から明らかになることだろう。
実施例１： ＢＶＳＭ−ＩＬ２の調製及び生物活性
実施例２： （ｉｉ）異なるアジュバントのものに対する三価のインフルエンザスプリットの免疫原性に対するＢＶＳＭの、マウスにおける効果及び、（ｉｉｉ）三価のインフルエンザスプリットの免疫原性に対する製剤及び異なるアジュバントの同時投与の、マウスにおける効果。
【００６２】
以下の例は、本発明を例示することを目的とするものであるが、制限的意味はもたない。特に、示された値は、一例として与えられているにすぎず、本発明の実施に際して最適化され得るものである。
【００６３】
【実施例１】
ＢＶＳＭ−ＩＬ２の調製及び生物活性
（１）ＩＬ−２がロードされた粒子の特徴づけ
Ａ．ＩＬ−２がロードされたベクターの調製
この例で利用されているベクター（ＢＶＳＭ）については前述された。これは、ＤＰＰＣ−コレステロールの脂質層を有するカチオンベクターである。
【００６４】
利用されるインタロイキン２（ＩＬ−２）は、Ｃｈｉｒｏｎ社製である。これは、１８・１０６ＵＩ＝１．１ｍｇの凍結乾燥タンパク質といったような、凍結乾燥された組換え型ＩＬ−２の形を呈している。
【００６５】
本発明に従った組成物は、１０／１の重量比で緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中に２つの化合物を単に混合することによって、ＢＶＳＭ−ＩＬ２結合によって得られる。
【００６６】
Ｂ．最適なＢＶＳＭ−ＩＬ２比の決定
タンパク質との関係におけるＢＶＳＭの最適な質量比は、当業者にとって周知の方法に従って、ＥＬＩＳＡを用いた分析により決定される。
【００６７】
簡単に言うと、抗−ＩＬ２抗体でウェルをカバーし、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）で飽和させる。テストすべきＩＬ−２調製物を添加し、次に、ビオチニル化された第２の抗ＩＬ−２抗体を添加する。ペルオキシダーゼに結合させたストレプトアビジンの添加とそれに続く前記ペルオキシダーゼの基質の付加により、比色計を用いて溶液中に存在するＩＬ−２の量を決定することが可能となる。得られた値は、任意単位で表現され、値は、テスト対象溶液中に存在するＩＬ−２に比例して高くなる。
【００６８】
テスト対象調製物は、タンパク質の安定剤としてのＢＳＡを伴って又は伴わずに、さまざまな割合でベクターが存在する中で又はその不在下で、同量のＩＬ−２が導入された調製物である。
【００６９】
結果は、図１に表わされている。ＢＳＡを含有する複数の調製物中に利用可能なＩＬ−２がほぼ同じ割合で得られるか、又はＢＶＳＭ／ＩＬ−２の質量比が１０／１となるような特定のベクターの割合が得られるということがわかる。ＩＬ−２がＰＢＳ中に単独で存在しているか又は質量比が比較的低い場合、溶液状態で利用可能なＩＬ−２は比較的少なくなる。
【００７０】
従って、これらの結果は、ベクターが、ＩＬ−２を安定化させるため及び有効濃度の低下を妨げるためにアルブミンと同じ位効果的であることを示している。
【００７１】
Ｃ．ＢＶＳＭに対するＩＬ−２の会合率の決定
メーカーの指示事項に従って、ＢｉａｃｏｒｅＸ装置内のプラズモンの表面共鳴技術によりベクターに対するＩＬ−２の会合率を決定する。この方法から、単色偏光での照明により、検出用チップと接触状態にある溶液の表面層の屈折率の差を検出することが可能になる。
【００７２】
作業プロトコルは、以下の通りである：
−　検出用チップの表面上にＢＶＳＭ（０．０５ｇ／ｌ）を吸着させる；
−　注入したタンパク質の濃度の関数である標準曲線（共鳴単位ＲＵとして表わされている）を決定するべく遊離ＩＬ−２（１〜６ｍｇ／ｍｌ）を注入する；
−　再生後、ＢＶＳＭ−ＩＬ２ならびに遊離ＩＬ−２が中に存在する、実施例１．Ａで調製されたような調製物を注入する。この遊離ＩＬ−２のみが検出用チップの表面に固定されたＢＶＳＭに会合することができる。
【００７３】
このプロトコルは、実施例１．Ａの製剤中の遊離ＩＬ−２濃度を決定し、ＢＶＳＭの会合率を推定できるようにする。
【００７４】
図２のデータから、前記会合率が８５％であることを計算することができる。
【００７５】
（２）異なるベクターに会合したＩＬ−２の生物活性の分析
この例は、ＩＬ−２の生物活性に対するベクターの層及び核の組成の重要性を示している。
【００７６】
次のような４つの異なるタイプのベクターが利用される：
ａ．ホスホリポン／コレステロール（ＰＰＬｐｏｎ／Ｃｈｏｌ）混合物、又は、
ｂ．ＤＰＰＣ／コレステロール（Ｐ　ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ又はＰＹ）混合物、
を含有する脂質層と共にアニオンコアを有する２つのベクター、
ｃ．ホスホリポン／コレステロール（ＱＡＥ　ＰＬｐｏｎ／Ｃｈｏｌ）混合物又は、
ｄ．ＤＰＰＣ／コレステロール（ＱＡＥ　ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ又はＫＹ）混合物、を含有する膜及びカチオンコアを有する２つのベクター。
【００７７】
ＩＬ−２は１／１０という質量比で、ＢＶＳＭに添加される。
【００７８】
３Ｈでマーキングされたチミジンの取込みによって計算される血中単核細胞の増殖を測定することにより、異なるＢＶＳＭに会合したＩＬ−２の生物活性を評価する。これらの細胞は、ＩＬ−２に対する強い親和性を有するレセプタＣＤ２５の発現を誘発する化合物（ＰＨＡ）によって、予め刺激されている。
【００７９】
全てのＢＶＳＭによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは処方されていない対照ＩＬ−２と同等の活性を得ることが可能であり、ＢＶＳＭ ＱＡＥ ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ はこの生物活性を改善しさえする、ということがわかる（図３）。
【００８０】
（３）ＩＬ−２調製物の安定性の研究
溶解状態のＩＬ−２調製物は一般に、４℃の溶解状態ではＩＬ−２がその生物活性を失なうことから安定していない。
【００８１】
マウスＣＴＬＬ−２細胞中の３Ｈでマーキングされたチミジンの取込みによって測定されるように、新鮮なＩＬ−２の９５％の生物活性が維持されることから、４℃で２ヵ月間の保管後、ＢＶＳＭ−ＩＬ２（ＱＡＥ／ＤＰＰＣ／Ｃｈｏｌ）調製物は安定した状態にとどまる。
【００８２】
（４）ｉｎ ｖｉｖｏ テスト、ＴＳ／Ａ腫瘍
ＴＳ／Ａ腫瘍（非免疫原性で未分化の乳腺癌）モデル、腫瘍移植拒絶モデル又は予め移植された腫瘍の治療モデルにおける、ＢＶＳＭ−ＩＬ２の活性（ＫＹ／ＩＬ２、質量比１０／１）をテストした。
【００８３】
Ａ．腫瘍移植の拒絶
Ａ．１．同じ脇腹内への同時投与
図４に示されたＩＬ−２濃度に対応するＢＶＳＭ−ＩＬ２（ＫＹ／ＩＬ−２）と共に、皮下（ｓ．ｃ．）経由で雌のマウスＢＡＬＢ／ｃに対し５・１０４個の腫瘍細胞を同時投与する。対照として、単独のベクター又は処方されていないＩＬ−２、又は単純なＰＢＳも投与する。腫瘍の移植及びそのサイズの推移を測定する。
【００８４】
図４は、腫瘍細胞の移植及びベクター単独又はＩＬ−２単独の投与後に腫瘍の成長が存在する一方で、ベクターＫＹと共に処方されたＩＬ−２は腫瘍成長を遅延させることができるということを、明確に示している。
【００８５】
Ａ．２．対側投与
対側脇腹内に、図５に示されたＩＬ−２濃度に対応するＫＹ／ＩＬ−２と共に、ｓ．ｃ．経由でＢＡＬＢ／ｃマウスに対し５・１０４個のＴＳ／Ａ腫瘍細胞を投与する。対照としてＰＢＳ又は処方されていないＩＬ−２を投与する。
【００８６】
図５は、ベクターに複合されたＩＬ−２の対側投与が腫瘍成長の減少を可能にすることを示しており、これは、たとえ１００倍多い用量で利用されても処方されていないＩＬ−２の場合には観察できない結果である。
【００８７】
Ｂ．移植された腫瘍に対する治療及び保護効果：皮下投与
Ｂ．１．治療効果
１グループにつき１０匹のマウスに対し５・１０４個のＴＳ／Ａ細胞をｓ．ｃ．投与してから６日後に、対側脇腹内にｓ．ｃ．経由でＫＹ／ＩＬ−２を投与する。１つの部位（５・１０３単位のＩＬ−２）又は、注入用量を一部位につき１・１０３単位として５カ所の全く異なる部位への投与を行う。
【００８８】
かかるモデルにおいては、腫瘍は移植されたものであり、手で触れることができる（約４０ｍｍの表面）。腫瘍のサイズの増大を評価する。図６Ａは、ベクターに複合されたＩＬ−２が、ＩＬ−２単独よりも大幅に腫瘍成長を減速させることができるということを示している。なお、多数の部位への少用量注入の方が、唯一の部位へ大用量注入よりも効果が高いと思われる。
【００８９】
唯一の部位にＫＹ／ＩＬ−２の投与を受けた１０匹のマウスのうち３匹は、３０日後に検出可能な腫瘍を示さず、一方、５カ所の部位でＫＹ／ＩＬ−２の投与を受けた１０匹のうち６匹のマウスも同じく、検出可能な腫瘍を示していない。これら９匹の動物は、その後腫瘍を再発することもない。
【００９０】
Ｂ．２．保護効果
ＩＬ−２の投与から４６日後に腫瘍を示さなくなった前述の９匹のマウスに対し、再び２５・１０４個のＴＳ／Ａ細胞を注入する。対照としてナイーブマウスを利用する。
【００９１】
図６Ｂは、ＫＹ／ＩＬ−２の予備投与により、新しい抗原投与から部分的に動物を保護することができるということを示している。実際、９匹のうち４匹のマウスが腫瘍を発生せず、その他の動物においては、ナイーブ動物に比べ腫瘍発生が減速する。
【００９２】
Ｃ．移植された腫瘍に対する治療及び保護効果： 鼻腔内投与
Ｃ．１．治療効果
５・１０４個のＴＳ／Ａ細胞を１グループにつき１０匹のマウスにｓ．ｃ．投与してから６日目に開始して、５日間、鼻腔内経路でＫＹ／ＩＬ−２を投与する。１日あたり１回又は２回の投与を行なう。利用された対照は、ＩＬ−２単独（１日２回投与）、ベクター単独又はＰＢＳである。
【００９３】
かかるモデルにおいては、腫瘍は移植されたものであり、手で触れることができる（約４０ｍｍの表面）。腫瘍のサイズの増大を評価する。図７Ａは、ベクターに複合されたＩＬ−２が、ＩＬ−２単独よりも大幅に腫瘍成長を減速させることができるということを示している。なお、投与回数が観察結果に差異をもたらすとは思われない。
【００９４】
１日１回鼻腔内でＫＹ／ＩＬ−２の投与を受けた１０匹のマウスのうち４匹は、３５日後に検出可能な腫瘍を示さず、一方、１日２回ＫＹ／ＩＬ−２の投与を受けた１０匹のうち６匹のマウスも同じく、検出可能な腫瘍を示していない。これら１０匹の動物は、その後腫瘍を再発することもない。
【００９５】
Ｃ．２．保護効果
ＩＬ−２の投与から４８日後に腫瘍を示さなくなった前述の１０匹のマウスに対し、再び２５・１０４個のＴＳ／Ａ細胞を注入する。対照としてナイーブマウスを利用する。
【００９６】
図７Ｂは、ＫＹ／ＩＬ−２の予備投与により、新しい抗原投与から部分的に動物を保護することができるということを示している。実際、１０匹のうち４匹のマウスが腫瘍を発生せず、その他の動物においては、ナイーブ動物に比べ腫瘍発生が減速する。
【００９７】
（５）ＣＴＬの誘発
移植された腫瘍を拒絶しより大用量での新たな抗原投与の後に腫瘍を再発しなかった、皮下（７５日後）又は鼻腔内（７９日後）経由で処置された４匹のマウスの脾臓を分離する（第４．Ｂ及び４．Ｃ項）。
【００９８】
６日間ＴＳ／Ａ細胞を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで脾臓を刺激し、ＴＳ／Ａ細胞に対するＣＴＬ活性を研究する。
【００９９】
皮下でＫＹ／ＩＬ−２の投与を受けたマウスは、同系細胞ＷＥＨＩ１６４及び細胞ＹＡＣが溶解されていないことから、ＴＳ／Ａの特異的ＣＴＬ活性を発現しない（図８Ａ）ということがわかる。
【０１００】
同様に、鼻腔内でＫＹ／ＩＬ−２の投与を受けたマウスでも、特異的ＣＴＬ活性が見られる。
【０１０１】
【実施例２】
異なるアジュバントのものに対する三価のインフルエンザスプリットの免疫原性に対するＢＶＳＭのマウスにおける効果及び三価のインフルエンザスプリットの免疫原性に対する製剤及び異なるアジュバントの同時投与の、マウスにおける効果
Ｉ．材料と方法
（１）材料
利用された動物は、Ｊａｎｖｉｅｒ飼育センタ（Ｒｏｕｔｅ ｄｅ Ｃｈｅｎｅｓ−Ｓｅｃ−Ｂ．Ｐ．５−Ｌｅ Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓａｉｎｔ−Ｉｓｌｅ）から入手した（研究当初、生後１０週であった）雌のＢＡＬＢ／ｃＪ／Ｒｊマウスであり、研究を始める前に１かごあたり６匹の割合で７日間順化させる。
【０１０２】
（２）製品
ａ．ＢＶＳＭＴＭ
利用されるＢＶＳＭＴＭはＫＹ：ＱＡＥ＝２ｍＥｑ−ＤＰＰＣ／コレステロールタイプのものである。これは、グリシジルトリメチルアンモニウムによってグラフト化されＤＰＰＣ／コレステロール層でとり囲まれた多糖核に対応する。このタイプのベクターは、ＥＰ６８７ １７３に記述されている。
【０１０３】
ｂ．アジュバント
以下の４つのアジュバントが利用された：
−　コレラ毒素のサブユニットＢ（ＣＴＢ）（品番Ｃ９９０３、Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ Ｑｕｅｎｔｉｎ Ｆａｌｌａｖｉｅｒ， フランス）、
−　モノホスフォリル、脂質Ａ（ＭＰＬ）（品番Ｒ−３５０、Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ミズーリ州）、
−　組換え型ＩＬ−２、プロロイキン活性１６．３・１０６Ｕ／ｍｇ（Ｃｈｉｒｏｎ Ｆｒａｎｃｅ， Ｓｕｒｅｓｎｅｓ， フランス）
−　オリゴヌクレオチドＯＤＮ；５ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣ′（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ， Ｂｒｕｘｅｌｌｅｓ， ベルギー）
【０１０４】
ｃ．３価インフルエンザスプリット
３価インフルエンザスプリット１ｍｌあたり２５０μｇのＨＡ（８３．３μｇ／菌株）溶液を、次の３つのＢｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａ（カナダ）の一価の卵スプリットを用いて調製する。
−　Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ７／９４菌株から産生された１価の卵スプリット、
−　Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ ８２／９６菌株から産生された１価の卵スプリット、
−　Ａ／Ｎａｎｃｈａｎｇ９３３／９５菌株から産生された１価の卵スプリット。
【０１０５】
これらのスプリットは、ウイルスタンパク質特にヘマグルチニン（ＨＡ）及び／イラミニダーゼの混合物で構成されている。
【０１０６】
ｄ．製剤
−　抗原＋ＢＶＳＭＴＭ製剤
３価のインフルエンザスプリット１ｍｌあたり２５０μｇのＨＡの製剤（８３．３μｇ／菌株）を、１／８９に等しいＨＡ／ＢＶＳＭ比 すなわち三価ＨＡ２５０μｇ／ＢＶＳＭ２２．２５ｍｇ／ｍｌを得るべく上述の３つの１価卵スプリットを用いて調製する。
【０１０７】
この製剤は、各々の１価のスプリット１ｍｌあたりＨＡ２５０μｇ／ＢＶＳＭＴＭ２２．２５ｍｇの３つの製剤を等体積で混合することによって得られる。
【０１０８】
−　抗原＋ＢＶＳＭＴＭ＋アジュバント製剤
抗原＋ＢＶＳＭＴＭの製剤から、アジュバントを伴うその他４つの製剤を調製した。これらの製剤は、アジュバントの存在下で及びアジュバントを添加することにより２５０μｇのＨＡ／ｍｌで３価の製剤を希釈することによって得られる。希釈によって、免疫１回マウス１匹あたりの１価のＨＡの用量を１．２μｇ、つまり１ｍｌあたり１価のＨＡが６０μｇに調整することができ、かつ希釈のために利用された体積中にアジュバントを追加することができる。
【０１０９】
ｅ．対照
次の３つのタイプの対照を調整した：
−　１価の各スプリット１ｍｌあたりＨＡ２５０μｇの３つの溶液を等体積で混合することにより調製された以下ＡＳ及びＡＮと呼称される３価のスプリットの対照、
−　３価のスプリット＋アジュバントの対照、
−　ナイーブ対照（ＰＢＳ ０．２２Ｘ）。
【０１１０】
皮下（ＡＳ）又は鼻腔内（ＡＮ）投与経路に応じて、３価スプリット溶液をそれぞれリン酸緩衝液又は精製水で調製する。
【０１１１】
（３）方法
以下のスキーマに従って０日目と２１日目に異なる処方（アジュバント±ＢＶＳＭ±Ａｇ）を投与する：
2004508290.tif 000002
【０１１２】
免疫原性は、３５日目の追加免疫の後に評価される：
−　血清レベルでは、各１価スプリットの特異的ＩｇＧのＥＬＩＳＡによる検出、
−　粘度レべルでは、鼻腔分泌物及び／又は膣分泌物中の各１価スプリットの特異的ＩｇＡのＥＬＩＳＡによる検出。
【０１１３】
ａ．マウスの免疫化
−　投与
処方（ＢＶＳＭ±Ａｄｊ±Ａｇ）の投与は、麻酔せずにつまり以下の経路で実施される：
・　皮下：対照について、背中のレベルで１ｍｌ入り注射器を用いて１００μｌ、
・　鼻腔：テスト対象の標本及び対照については、１０μｌのマイクロピペットを用いて２０μｌ（１０μｌ／鼻孔）
【０１１４】
各グループについて、免疫化には、同じ様式に従って実施される０日目及び２１日目の２回の投与が含まれる。
【０１１５】
−　採血
０日目（対照）と３５日目に、眼窩後静脈で約０．３ｍｌの採血を行なう。
【０１１６】
血塊の形成及び遠心分離の後、利用するまで血清を−２０℃に凍結させる。
【０１１７】
・　鼻腔分泌物の採取
鼻腔洗浄は、鼻腔タービンの方向で気管内に導入されたリン酸緩衝液−ＢＳＡ １％ ５００μｌを用いて実施される。かくして、作業は同じＰＢＳ−ＢＳＡ １％を用いて３度くり返される。鼻腔採取物は−２０℃でエッペンドルフ管の中に保存される。鼻腔分泌物を３５日目に回収する。
【０１１８】
ｂ．採取物の分析
血清及び鼻腔分泌物の分析は、ＥＬＩＳＡテストによって実施される。簡単に言うと、マイクロプレート（Ｎｕｎｃ， Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ ｍａｘｉｓｏｒｂ， ｐｏｌｙｌａｂｏ）をインフルエンザのワクチン（炭酸塩緩衝液ｐＨ９．６中でウェルあたりＨＡ１００ｎｇ、２時間３７℃）でコーティングする。洗浄（ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ 緩衝液ｐＨ７．６で３回）及びウェルあたり２５０μｌのＰＢＳ−ＢＳＡ３％溶液による飽和（１時間３７℃）の後、一連の血清又は鼻腔分泌物を３７℃で一時間インキュベートし、ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ ｐＨ７．６溶液で新たに洗い流す。洗浄（３回）の後、ペルオキシダーゼにカップリングされたマウス抗ＩｇＧ（品番Ａ４４１６ Ｓｉｇｍａ）又はマウス抗ＩｇＡ（品番Ａ４７８９ Ｓｉｇｍａ）によって検出する。最後の洗浄段階（５回）の後、ＯＰＤ基質を添加する（品番Ｐ８２８７、Ｓｉｇｍａ， ５ｍｌの顕示用緩衝液＋５０μｌのＨ２Ｏ２中糖衣錠１個、１００μｌ／ウェル）。３７℃で３０分のインキュベーション後、塩酸１Ｎ（品番３００２４−２９０、Ｐｒｏｌａｂｏ）を添加し（５０μｌ／ウェル）、４９０ｎｍでの吸光度を測定する。０．１のＤＯを得ることのできる希釈度の逆数として力価が定義づけられる。
【０１１９】
ＩＩ．ＢＶＳＭＴＭ／アジュバント／インフルエンザ製剤の調製様式の影響
ＢＶＳＭ／アジュバント／インフルエンザ製剤の最も優れた調製様式を評価するべく、表面プラズモン共鳴（ＲＰＳ）ＢｉａｃｏｒｅＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ Ｉｎｃ．）を利用することにより、アジュバント（ＣＴＢ又はＭＰＬ）の存在下で、ＢＶＳＭ上のインフルエンザスプリットの会合を研究する。この研究では、ＢＶＳＭの懸濁液（０．３倍のＰＢＳ １ｍｌあたり５０μｇ）２０μｌを疎水性センサーチップ（ＨＰＡ、Ｂｉａｃｏｒｅ， ＢＲ−１０００−３０）上に毎分５μｌで導入する。
【０１２０】
図９は、ＣＴＢの濃度｛ＰＢＳ４５ｍＭ中　１）２．５μｇ／ｍｌ；　２）２５μｇ／ｍｌ；　３）２５０μｇ／ｍｌ｝（これは０．３倍に対応する）に応じたＨＰＡセンサーチップ上に固定化されたＢＶＳＭ及びＣＴＢの会合によって得られるセンサーグラムを示す。
【０１２１】
図１０は、ＭＰＬの濃度｛ＰＢＳ４５ｍＭ中、　１）１．５６μｇ／ｍｌ；　２）３．１２５μｇ／ｍｌ；　３）６．２５μｇ／ｍｌ；　４）１２．５μｇ／ｍｌ；　５）２５μｇ／ｍｌ；　６）５０μｇ／ｍｌ｝に応じたＨＰＡセンサーチップ上に固定化されたＢＶＳＭ及びＭＰＬの会合によって得られるセンサーグラムを示す。
【０１２２】
ＣＴＢ及びＭＰＬの両方のケースにおいて、得られたセンサーグラムは、ＢＶＳＭ及びアジュバントの会合能力を確認するものである。
【０１２３】
このとき、ＢＶＳＭ／アジュバント／インフルエンザスプリットの製剤の調製様式を検討する。以下の２つの方法が利用される。
【０１２４】
第１の方法では、インフルエンザスプリットの添加前に、アジュバント溶液が導入される。
【０１２５】
第２の方法では、インフルエンザスプリットは、アジュバントの添加前に導入される。
【０１２６】
図１１は、Ｂ　Ｈａｒｂｉｎスプリットの場合における結果をまとめたものである。可変量のＣＴＢが、固定化されたＢＶＳＭ上に導入される｛ＰＢＳ４５ｍＭ中ｌ、１）ＣＴＢ無し；　２）２．５Ｍｇ／ｍｌ；　３）２５μｇ／ｍｌ；　４）２５０μｇ／ｍｌ｝。次に、２５μｇ／ｍｌのＢ　Ｈａｒｂｉｎ １価スプリットが、アジュバントの加わったＢＶＳＭ上に被着させられる。ＣＴＢがスプリットの前に添加された場合、ＢＶＳＭ上のスプリットの会合が阻害されるということが明確にわかる。
【０１２７】
同様にして、図１２は、ＭＰＬ及び Ｂ　Ｈａｒｂｉｎ スプリットの場合に得られた結果をまとめている。可変量のＭＰＬが、固定化されたＢＶＳＭ上に導入される｛ＰＢＳ４５ｍＭ中、　１）１．５６μｇ／ｍｌ；　２）３．１２μｇ／ｍｌ；　３）６．２５μｇ／ｍｌ；　４）１２．５μｇ／ｍｌ；　５）２５μｇ／ｍｌ；　６）５０μｇ／ｍｌ｝。次に、２５μｇ／ｍｌのスプリットが、アジュバントの加わったＢＶＳＭ上に被着させられる。ＣＴＢの場合と同様に、ＭＰＬの量に比例してアジュバントがスプリットの前に添加された場合、ＢＶＳＭ上のスプリットの会合の阻害が存在する。
【０１２８】
図１３は、ＣＴＢの場合の２つの調製様式を比較することによって得られたセンサーグラムを表わしている。Ａでは、固定化されたＢＶＳＭ上にＣＴＢが添加され、次に１価のスプリットが導入される。
【０１２９】
Ｂでは、１価のスプリットは、固定化されたＢＶＳＭ上に添加され、その後ＣＴＢが導入される。
【０１３０】
抗原がＣＴＢの前に添加された場合、ＢＶＳＭ上のスプリットのこの会合の低下が存在するということがわかる。逆に、ＣＴＢがスプリットの後に添加された場合、ＢＶＳＭは、ＣＴＢに対応する補足的量の材料の会合を可能にする。かくして、「キャリヤ抗原」としてのＢＶＳＭの役割を保つためには、ＢＶＳＭ／スプリット製剤上にＣＴＢを添加する調製様式を維持することが重要である。
【０１３１】
同様にして、図１４は、ＭＰＬの場合の２つの調製様式を比較することによって得られるセンサーグラムを表わしている。
【０１３２】
Ａでは、ＭＰＬはスプリットの前に添加されている。Ｂではそれが逆になっている。
【０１３３】
抗原がＭＰＬの前に添加される場合、スプリット／ＢＶＳＭ会合の有意な修飾は存在しないが、ＢＶＳＭは、ＭＰＬに対応する補足的量の材料を会合できるようにする。
【０１３４】
従って、
−　アジュバントがＢＶＳＭ／抗原製剤上に添加される、
−　「キャリヤ抗原」としてのＢＶＳＭの役割が保たれる、
ようなアジュバント追加された製剤の調製様式を規定することが可能であると思われる。
【０１３５】
ＩＩＩ．ＢＶＳＭ／インフルエンザ製剤の免疫学的応答に対するＣＴＢの効果　（１）プロトコル
「材料及び方法」の部分で言及された通りに抗原製剤＋ＢＶＳＭＴＭを調製する。
【０１３６】
２５０μｇのＨＡ（８３μｇ／菌株）／ｍｌで三価のＳｐｌｉｔ をもたらすＢＶＳＭＴＭの不在下の同一条件下で、対照を実現する。
【０１３７】
アジュバントを含む製剤及び対応する対照を得るべく、これらの調製物の各々に対し、ＣＴＢ溶液を添加する。
【０１３８】
３６匹の雌ＢＡＬＢ／ｃＪ／Ｒｊマウス（研究当初で生後１０週間）を、１グループあたり６匹のマウスの割合で６つのグループに分割する。各グループについて、前述のように処置を施する。下表１は、各グループの処置をまとめたものである。
【０１３９】
【表１】
2004508290.tif 000003
【０１４０】
各グループについて、「材料と方法」の部分で指示されている通り採血及び鼻腔分泌物の採取及びそれらの分析を実施する。
【０１４１】
（２）結果
図１５は、マウスの血清（ＩｇＧ）及び鼻腔分泌物（ＩｇＡ）のプールのスプリットＢ／Ｈａｒｂｉｎ特異的滴定で得られた結果をまとめたものである。この図は、異なる対照に対しＣＴＢ（Ｆ−ＣＴＢ）を含有する三価の製剤の結果を比較できるようにしている。これらの対照は、抗原単独の対照、又はＣＴＢに会合された抗原の対照、又は基準製剤（ＨＡ／ＢＶＳＭ比；１／８９）である。これらの結果は、スプリットＢ／Ｈａｒｂｉｎ及びＡ／Ｎａｎｃｈａｎｇに対する個々の応答の分析によって確認された。
【０１４２】
予期した通り、基準製剤（ＦＡ）は、皮下投与（ＡＳ）された単独の抗原対照と等価のＧタイプの抗体率及び鼻腔内投与（ＡＮ）（２２．４倍）された単独の対照より高いＩｇＧ率を誘発する。
【０１４３】
鼻腔投与されたＣＴＢに会合された抗原（ＡＣＴＢ）の対照は、同じ経路により投与された遊離抗原よりもはるかに高いＩｇＧを誘発する（２２．４倍の増大）。同時にこれらの製剤（Ａｇ＋ＣＴＢ）（ＡＣＴＢ）は、強い粘膜免疫を誘発する。
【０１４４】
アジュバントＣＴＢ（ＦＣＴＢ）に会合した製剤は、基準製剤（ＦＡ）及びその基準対照（ＡＣＴＢ）よりもはるかに高い特異的ＩｇＧ応答を誘発する。このアジュバントについては、ＣＴＢとＢＶＳＭＴＭの間に大きな相乗効果が存在し、かくして得られた血清ＩｇＧ率は、基準製剤ＦＡに比べ３．７倍となる。逆に、ＣＴＢの重大な粘膜アジュバント活性の存在下では、確実に生物学的応答の飽和作用を伴って、この段階でこのタイプのアジュバント及びＢＶＳＭＴＭについてのＩｇＡ応答の相乗作用の潜在性を定義することは困難である。
【０１４５】
ＩＶ．ＢＶＳＭＴＭ／インフルエンザ製剤の免疫学的応答についてのＭＰＬの効果
（１）プロトコル
インフルエンザスプリット１ｍｌにつき２５０μｇのＨＡ／ｍｌ（８３．３μｇ／菌株）で、三価の製剤及び対応する対照を調製する。
【０１４６】
アジュバントを含む製剤及び対応する対照を得るべく、これらの調製物の各々に対し、ＭＰＬ溶液を添加する。
【０１４７】
３６匹の雌ＢＡＬＢ／ｃＪ／Ｒｊマウス（研究当初で生後１０週間）を、１グループあたり６匹のマウスの割合で６つのグループに分割する。各グループについて、「材料及び方法」の部分に記述されている通りに処置を施す。下表２は、各グループの処置をまとめたものである。
【０１４８】
【表２】
2004508290.tif 000004
【０１４９】
各グループについて、方法の部分で記述されている通り採血及び鼻腔分泌物の採取を実施する。
【０１５０】
ＥＬＩＳＡテストにより、血清及び鼻腔分泌物の分析を実施する。
【０１５１】
（２）結果
図１６は、ＭＰＬによりアジュバント付加された製剤が投与されたマウスの血清（ＩｇＧ）及びマウスの鼻腔分泌物（ＩｇＡ）のプールのスプリットＢ／Ｈａｒｂｉｎ特異的滴定で得られた結果をまとめたものである。これらの結果は、スプリットＢ／Ｈａｒｂｉｎ及びＡ／Ｎａｎｃｈａｎｇに対する個々の応答の分析によって確認された。
【０１５２】
ＭＰＬ又はＢＶＳＭＴＭに会合されたインフルエンザウイルススプリットは、同じ経路により投与された遊離抗原よりもはるかに高い血清ＩｇＧを誘発する（それぞれ２２．４倍及び７．３倍の増大）。同時にこれらの製剤は、強い粘膜免疫を誘発する。
【０１５３】
アジュバントＭＰＬに会合した製剤は、基準製剤（ＦＡ）に類似した特異的ＩｇＧ応答を誘発する。逆にこのアジュバントについては、ＭＰＬとＢＶＳＭＴＭの間に大きな相乗効果が存在する。かくして、得られたＩｇＡ率は、基準製剤（Ａｇ／ＢＶＳＭ）に比べて２．７倍となる。かくして、ＩｇＧ応答とは逆に、粘膜応答についてＭＰＬとＢＶＳＭＴＭにの間に強い相乗作用潜在性を実証することができる。
【０１５４】
Ｖ．ＢＶＳＭ／インフルエンザ製剤の免疫学的応答についてのオリゴヌクレオチドの効果
（１）プロトコル
インフルエンザスプリット１ｍｌにつき２５０μｇのＨＡ／ｍｌ（８３．３μｇ／菌株）で、三価の製剤及び対応する対照を調製する。
【０１５５】
アジュバントを含む製剤及び対応する対照を得るべく、これらの調製物の各々に対し、オリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）溶液を添加する。
【０１５６】
４２匹の雌ＢＡＬＢ／ｃＪ／Ｒｊマウス（研究当初で生後１０週間）を、１グループあたり６匹のマウスの割合で７つのグループに分割する。各グループについて、「材料及び方法」の部分に記述されている通りに処置を施す。下表３は、各グループの処置をまとめたものである。
【０１５７】
【表３】
2004508290.tif 000005
【０１５８】
各グループについて、方法の部分で指示されている通り採血及び鼻腔分泌物の採取を実施する。
【０１５９】
ＥＬＩＳＡテストにより、結成及び鼻腔分泌物の分析を実施する。
【０１６０】
（２）結果
図１７は、オリゴヌクレオチドによりアジュバント付加された製剤が投与されたマウスの血清（ＩｇＧ）及びマウスの鼻腔分泌物（ＩｇＡ）のプールのスプリットＢ／Ｈａｒｂｉｎ特異的滴定で得られた結果をまとめたものである。これらの結果は、スプリットＢ／Ｈａｒｂｉｎ及びＡ／Ｎａｎｃｈａｎｇに対する個々の応答の分析によって確認された。
【０１６１】
鼻腔投与されたＯＤＮ又はＢＶＳＭＴＭに会合されたインフルエンザウイルススプリットは、同じ経路により投与された遊離抗原よりもはるかに高い血清ＩｇＧを誘発する（それぞれ２２．４倍及び７．３倍の増大）。同時にこれらの製剤は、強い粘膜免疫を誘発する。
【０１６２】
アジュバントＯＤＮに会合した製剤は、基準製剤（ＦＡ）及びその基準対照（Ａｇ＋ＯＤＮ）よりも高いＩｇＧ応答を誘発する。このアジュバントについては、製剤について得られたＩｇＧ力価が、抗原＋ＯＤＮ１（ＡＯＤＮ１）について及び基準製剤（Ａｇ＋ＢＶＳＭＴＭ）（ＦＡ）について得られた応答の合計に等しいことから、応答の相加性が存在すると思われる。
【０１６３】
ＶＩ．ＢＶＳＭ／インフルエンザ製剤のアジュバント添加によるＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１バランスの修飾
（１）プロトコル
インフルエンザスプリット１ｍｌにつき２５０μｇのＨＡ／ｍｌ（８３．３μｇ／菌株）で、三価の製剤及び対応する対照を調製する。３価の製剤から、以下の３つのアジュバント入り製剤を得る：
−　ＢＶＳＭＴＭ／Ａｇ／ＣＴＢ：ＣＴＢ溶液を３価の製剤上に添加することによる、
−　ＢＶＳＭＴＭ／Ａｇ／ＩＬ２：組換え型ＩＬ−２溶液を３価の製剤上に添加することによる、
−　ＢＶＳＭＴＭ／Ａｇ／ＭＰＬ：ＭＰＬ溶液を３価の製剤上に添加することによる。
【０１６４】
５４匹の雌ＢＡＬＢ／ｃＪ／Ｒｊマウス（研究当初で生後１０週間）を、１グループあたり６匹のマウスの割合で９つのグループに分割する。各グループについて、「材料及び方法」の部分に記述されている通りに処置及び採取を行う。
【０１６５】
下表４は、これらの処置をまとめたものである。
【０１６６】
【表４】
2004508290.tif 000006
【０１６７】
マウス抗ＩｇＧ２ａ又はマウス抗ＩｇＧ１を利用して、前述の通りにＥＬＩＳＡテストにより血清の分析を実施する。
【０１６８】
（２）結果
下表５は、鼻腔内投与後のアジュバント付与された異なる製剤ＢＶＳＭＴＭ／インフルエンザ及び対応する対照のガンマグロブリン亜型（ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１）に関して得られた結果をまとめている。皮下投与された遊離抗原に比べ、鼻腔投与された製剤ＢＶＳＭＴＭ／インフルエンザは、特異的ＩｇＧ２ａ産生のわずかな増大しか誘発しない。
【０１６９】
これに比較して、製剤Ａｇ／ＢＶＳＭＴＭに対してＣＴＢを付加すると、Ｉｇ２ａ産生の著しい増加が誘発される（Ａｇ　ｓ．ｃに対してＩｇ２ａ／ＩｇＧ１指数が５．４倍）。なお、抗原に対するＣＴＢの会合によって得られた結果から、このＴｈ１／Ｔｈ２バランスの修飾を予想することはできないという点に留意することが重要である。実際、この対照グループでは、Ｉｇ２ａ／ＩｇＧ１指数の低下が存在する。
【０１７０】
【表５】
2004508290.tif 000007
【０１７１】
逆に、インフルエンザスプリットに会合された場合にＩｇＧ２ａ産生に有利に作用する（指数がＡｇ　ｓ．ｃについての６．７に対し４７．６の）ＭＰＬは、製剤Ａｇ／ＢＶＳＭＴＭとの会合後、Ｔｈ１／Ｔｈ２のわずかな修飾しかひき起こさない。
【０１７２】
最終的に、ＩｇＧ２ａ／Ｉｇ１指数の低下に基づいて視覚化可能であるように、製剤Ａｇ／ＢＶＳＭＴＭに対するＩＬ２の会合は、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスを修飾することを可能にする。
【０１７３】
かくして、免疫学的応答の量的修飾が不在である場合でも抗原／ＢＶＳＭＴＭ製剤に対するアジュバントの会合は、免疫学的応答の質的修飾を誘発できるようにする。この会合は、利用されるアジュバントの正しい選択により、提案されたワクチン戦略にＴｈ１／Ｔｈ２バランスを適合させることを可能にするはずである。
【図面の簡単な説明】
−　実施例１で参照指示されている図：
【図１】
特に有利なタンパク質とベクターの間の最適な質量比を計算することを可能にするＢＶＳＭ−ＩＬ２相互作用のＥＬＩＳＡ分析。値は、任意単位（ＵＡ）で与えられている。
【図２】
Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）装置上でのＢＶＳＭ−ＩＬ２の分析。遊離ＩＬ−２組成物とＢＶＳＭ−ＩＬ２組成物の間の屈折の比較。値は、屈折単位（ＲＵ）で与えられる。
【図３】
ＰＨＡ及びさまざまな組成のＢＶＳＭ−ＩＬ２によって予め刺激された末梢単核細胞の増殖。増殖は、３Ｈによりマーキングされたチミジンの取込みによって測定され、読取られた毎分ストローク数（ｃｐｍ）に正比例する。
【図４】
同時投与後のＴＳ／Ａモデル内の腫瘍の移植及び成長に対する異なるＩＬ−２製剤の効果。記号は、以下のものを表わしている：　ＰＢＳ、食塩水緩衝液；　ＩＬ−２、処方されていないインタロイキン２；　ＫＹ−カチオンコア及びＤＰＰＣ／コレステロール層をもつベクター；　ＫＹ／ＩＬ−２、ＩＬ−２を伴って処方されたＫＹベクター
【図５】
ＢＡＬＢ／ｃマウスの対側脇腹内への投与の後の、ＴＳ／Ａモデル内の腫瘍の移植及び成長に対する、異なるＩＬ−２製剤の効果。記号は、前述のものと同じであり、指示された数値は、ＩＬ−２のＵＩ値に対応する。
【図６】
Ａ．移植後６日目の１つ又は５つの部位におけるＢＡＬＢ／ｃマウスの対側脇腹内のＫＹ／ＩＬ−２の皮下投与による移植ＴＳ／Ａ腫瘍の拒絶特性。記号は、前述のものと同じであり、指示された数値は、ＩＬ−２の値ＵＩに対応する。Ｂ．腫瘍細胞ＴＳ／Ａの再注入後の治癒したマウスの防御。２つの図において、腫瘍を呈するマウスの数がカッコ内に指示されている。
【図７】
Ａ．移植から６日後に５日間、１日に１〜２回ＢＡＬＢ／ｃマウスの対側脇腹内にＫＹ／ＩＬ−２の鼻腔内投与による移植ＴＳ／Ａ腫瘍の拒絶特性。記号は、前述のものと同じであり指示された数値は、ＩＬ−２のＵＩ値に対応している。Ｂ．腫瘍細胞ＴＳ／Ａの再注入後の治癒したマウスの防御。２つの図において、腫瘍を呈するマウスの数がカッコ内に指示されている。
【図８】
ＫＹ／ＩＬ−２の投与後の、ＴＳ／Ａ細胞を拒絶したマウスにおける抗腫瘍ＣＴＬ活性。Ａ．皮下投与を受けたマウス、Ｂ．鼻腔内投与を受けたマウス。
−　実施例２で参照指示されている図：
【図９】
ＣＴＢ濃度に応じたＢＶＳＭＴＭとＣＴＢの会合のＢｉａｃｏｒｅでの分析（表面プラズモン共鳴）。
【図１０】
ＭＰＬ濃度に応じたＢＶＳＭＴＭとＭＰＬの会合のＢｉａｃｏｒｅでの分析。
【図１１】
増大した量のＣＴＢの存在下でのＢＶＳＭ上のＢ Ｈａｒｂｉｎスプリットの会合の阻害。
【図１２】
増大した量のＭＰＬの存在下でのＢＶＳＭ上のＢ Ｈａｒｂｉｎスプリットの会合の阻害。
【図１３】
センサーチップＨＰＡ上に固定化されたＢＶＳＭ上のインフルエンザ抗原及びＣＴＢの２つの調製様式を比較することによって得られたセンサーグラム。当初はＣＴＢそして次に抗原が連続してＢＶＳＭ上に（曲線Ａ）、及び逆順序で（曲線Ｂ）被着される。
【図１４】
センサーチップＨＰＡ上に固定化されたＢＶＳＭ上のインフルエンザ抗原及びＭＰＬの２つの調製様式を比較することによって得られたセンサーグラム。当初はＭＰＬそして次に抗原が連続してＢＶＳＭ上に（曲線Ａ）、及び逆順序で（曲線Ｂ）被着される。
【図１５】
ＣＴＢに会合された又はされていない抗原対照及び３価の製剤による投与を受けたマウスの血清（ＩｇＧ）及び鼻腔分泌物（ＩｇＡ）のＢ／Ｈａｒｂｉｎスプリットの特異的滴定。
【図１６】
ＭＰＬに会合された又はされていない抗原対照及び３価の製剤による投与を受けたマウスの血清（ＩｇＧ）及び鼻腔分泌物（ＩｇＡ）のＢ／Ｈａｒｂｉｎスプリットの特異的滴定。
【図１７】
オリゴヌクレオチドに会合された又はされていない抗原対照及び３価の製剤による投与を受けたマウスの血清（ＩｇＧ）及び鼻腔分泌物（ＩｇＡ）のＢ／Ｈａｒｂｉｎスプリットの特異的滴定。
【図１】
2004508290.tif 000008
【図２】
2004508290.tif 000009
【図３】
2004508290.tif 000010
【図４】
2004508290.tif 000011
【図５】
2004508290.tif 000012
【図６】
2004508290.tif 000013
【図７】
2004508290.tif 000014
【図８】
2004508290.tif 000015
【図９】
2004508290.tif 000016
【図１０】
2004508290.tif 000017
【図１１】
2004508290.tif 000018
【図１２】
2004508290.tif 000019
【図１３】
2004508290.tif 000020
【図１４】
2004508290.tif 000021
【図１５】
2004508290.tif 000022
【図１６】
2004508290.tif 000023
【図１７】
2004508290.tif 000024
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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