(57)【要約】本発明は、投薬された被験体の血液中のインバリアント鎖（Ｉｉ）の中間分解産物、とりわけｐ１０　Ｉｉフラグメントの蓄積を測定することによる、カテプシンＳインヒビターのインビボ投与の影響のモニタリング方法に関する。
2004508553.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）治療される被験体の血液サンプルを採取すること；
ｂ）前記血液サンプル中のインバリアント鎖（Ｉｉ）の中間分解産物の蓄積を測定すること
を含んで成る、カテプシンＳインヒビターのインビボ投与の影響のモニタリング方法。
【請求項２】
ａ）治療される被験体の血液サンプルを採取すること；
ｂ）前記サンプルから白血球を精製すること；
ｃ）精製された白血球の全細胞ライセートを作成すること；
ｄ）適するアッセイ方法により、インバリアント鎖（Ｉｉ）の中間分解産物の存在についてライセートを分析すること
の段階を含んで成る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
段階（ｄ）の適するアッセイ方法がウェスタンブロッティングもしくはＥＬＩＳＡである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
インバリアント鎖（Ｉｉ）の中間分解産物がｐ１０Ｉｉフラグメントである、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の交差引用）
本出願は、２０００年９月６日出願の米国仮出願番号第６０／２３０，４８４号明細書の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、投薬された被験体の血液中のインバリアント鎖（Ｉｉ）の中間分解産物、とりわけｐ１０　Ｉｉフラグメントの蓄積を測定することによる、カテプシンＳインヒビターのインビボ投与の影響のモニタリング方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
ＣＤ４＋　Ｔ細胞による抗原提示ＭＨＣクラスＩＩ分子の認識は免疫学的応答の決定的に重要な構成要素である。クラスＩＩ分子は、他の膜貫通タンパク質と同様、合成後に小胞体に転位され、そこでそれらは第三のタンパク質、インバリアント鎖（Ｉｉ）と会合する。この分子は、小胞体からのクラスＩＩ−Ｉｉ複合体の退出（ｅｘｉｔ）を促進しかつクラスＩＩ分子を小胞体および分泌経路中の結合ペプチドおよびフォールディングされないタンパク質から保護する、クラスＩＩ特異的シャペロンとしてはたらくタイプＩＩの膜貫通タンパク質である。
【０００４】
Ｉｉの細胞質尾部中のターゲッティングモチーフは、該複合体を分泌経路からエンドソーム系に向ける。ＭＨＣクラスＩＩ分子が抗原を提示することができる前に、Ｉｉは除去されなければならない。これはＩｉを小ペプチドに解体する一連のプロテアーゼにより達成される。しかしながら、クラスＩＩ分子のペプチド結合溝を占有するクラスＩＩに会合されるインバリアント鎖ペプチド（ＣＬＩＰ）と呼ばれるＩｉフラグメントは、大部分の場合に自発的に遊離されない。ＣＬＩＰフラグメントは、細胞内輸送の間およびエンドソーム系中でのＩｉの分解後の双方に、クラスＩＩ結合ポケットを崩壊すること（ｃｏｌｌａｐｓｉｎｇ）から保護する置換ペプチドとしてはたらく。エンドサイトーシスされたタンパク質から生成される抗原ペプチドの結合は、空の、さらに開放の結合部位を必要とし、そして従ってＣＬＩＰは遊離されなければならない一方、該開放の結合部位は他のペプチドの結合を可能にするよう安定化される必要がある。ヒト白血球抗原ＤＭ（「ＨＬＡ−ＤＭ」）は、これらの機能の双方を媒介し従って抗原ペプチドの結合を促進することが十分に報告されている。ペプチドを獲得した後に、クラスＩＩ分子は、ほとんど未知である経路を介して細胞表面に輸送される。
【０００５】
抗原の提示の封鎖は免疫応答の有望な一阻害方法である。これは、取り込み、タンパク質分解的プロセシングもしくはＭＨＣクラスＩＩ分子への結合を混乱させることによりなすことができる。取り込みを封鎖することは、多くの異なる細胞型がこの機能を必要とするために問題が多いかもしれない。特定の抗原のタンパク質分解的プロセシングの阻害は、異なるプロテアーゼが異なる抗原の切断に関与するかもしれないために有用であるかもしれないが、しかしながら、これらのプロテアーゼは特異的でなく、そして他の副作用につながるかもしれない。ＭＨＣクラスＩＩへの抗原への結合を特異的に封鎖するための一方法は、インバリアント鎖のタンパク質分解を阻害することである。これが除去されない場合には、ＭＨＣクラスＩＩ分子はペプチドを入れることができず、これゆえに、Ｉｉの分解を封鎖することは、ＣＤ４＋　Ｔ細胞への抗原提示を減少させかつ正常な免疫応答を混乱させるとみられる。
【０００６】
カテプシンＳ（ＣａｔＳ）はリンパ組織中で発現されるシステインプロテアーゼである。それは、ＭＨＣクラスＩＩのペプチドを入れる必要条件であるインバリアント鎖のタンパク質分解において主要な役割を演じるとして同定されている（Ｒｉｅｓｅら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　４：３５７）。それはカテプシンＬおよびＫとの５０〜６０％の同一性を有するが、しかし、それがアルカリ性のｐＨにわたる広範なｐＨの至適を有することにおいて異なる。阻害剤は、動物モデルにおいて抗原提示を調節することが示され、また、喘息モデルにおいて有効である（Ｒｉｅｓｅら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９９８）１０１：２３５１）。カテプシンＳが欠乏したマウスは、専門の抗原提示細胞による外因性タンパク質を提示する損なわれた能力を有する（Ｎａｋａｇａｗａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）１０：２０７；Ｓｈｉら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（１９９９）１０：１９７）。
【０００７】
ヒトカテプシンＳのタンパク質分解活性を阻害する化合物は、限定されるものでないが、狼瘡、慢性関節リウマチおよび喘息を挙げることができる慢性自己免疫疾患の治療において有用性を見出し；また、組織移植に対する免疫応答の調節において潜在的有用性を有すると期待される。
【０００８】
カテプシンＳ活性、例えばＩｉ鎖のタンパク質分解を調節する作用物質を用いる自己免疫の調節方法、ならびに自己免疫障害を有する被験体の治療方法、免疫応答を調節するその能力についての治療の評価方法は、第ＷＯ　９９／５８１５３号明細書に記述される。
【０００９】
（発明の要約）
本発明は：
ａ）治療される被験体の血液サンプルを採取すること；
ｂ）前記血液サンプル中のインバリアント鎖（Ｉｉ）の中間分解産物の蓄積を測定すること
を含んで成る、カテプシンＳインヒビターのインビボ投与の影響のモニタリング方法もしくはそのためのアッセイに関する。
【００１０】
より具体的には、前記方法は、
ａ）治療される被験体の血液サンプルを採取すること；
ｂ）前記サンプルから白血球を精製すること；
ｃ）精製された白血球の全細胞ライセートを作成すること；
ｄ）適するアッセイ方法により、インバリアント鎖（Ｉｉ）の中間分解産物の存在についてライセートを分析すること
を含んで成る。
【００１１】
適するアッセイ方法は例えばウェスタンブロットアッセイもしくはＥＬＩＳＡアッセイ方法を含んで成る。インバリアント鎖（Ｉｉ）の特定の一中間分解産物はｐ１０Ｉｉである。さらなる一局面において、本発明は上の方法もしくはアッセイを実施するのに適する材料を含んで成る試験キットに関する。
【００１２】
（詳細な記述）
従って、本発明は、投薬された被験体の血液中のインバリアント鎖（Ｉｉ）の中間分解産物、とりわけｐ１０Ｉｉフラグメントの蓄積を測定することによる、カテプシンＳインヒビターのインビボ投与の影響のモニター方法を提供する。
【００１３】
本発明の前記アッセイは臨床試験の設定でとりわけ有用である。しかしながら、それは、限定されるものでないがサル、イヌ、ブタ、ウサギ、モルモットおよびげっ歯類を挙げることができる動物試験におけるインビボのカテプシンＳインヒビターの影響をモニターするのにもまた適用することができる。
【００１４】
臨床試験の設定におけるカテプシンＳインヒビターのインビボ投与の影響は、投薬された被験体の血液中のインバリアント鎖（Ｉｉ）の中間分解産物、すなわちｐ１０Ｉｉフラグメントの蓄積を測定することによりモニターすることができる。
【００１５】
簡潔には、時間のある期間の間、好ましくは１６〜３０時間のカテプシンインヒビターの投与後に、血液を引き抜き、そして白血球を例えば赤血球の溶解もしくはフィコール（ＦＩＣＯＬＬ）勾配遠心分離のいずれかにより精製する。ＷＢＣの全細胞ライセートをその後作成し、そしてその後ウェスタンブロットアッセイもしくはＥＬＩＳＡアッセイのいずれかにより分析する。ウェスタンアッセイのためには、細胞ライセートを最初にＰＡＧＥゲル上で分離する。ニトロセルロースメンブレンに転写した後、Ｉｉ、およびｐ１０Ｉｉを包含するその中間分解産物をその後、Ｉｉに対するマウスｍＡｂ例えばＰｉｎ１．１、またはＩｉ全体もしくは一ペプチドフラグメントに対するウサギポリクローナル抗体を使用して検出することができる。ＥＬＩＳＡアッセイのためには、Ｐｉｎ１．１を包含するＩｉに対する一対の抗体、およびｐ１０ＩｉのＣ末端に対するウサギポリクローナル抗体を使用することができる。
【００１６】
前記アッセイは、限定されるものでないがサル、イヌ、ブタ、ウサギ、モルモットおよびげっ歯類を挙げることができる動物試験においてインビボのカテプシンＳインヒビターの影響をモニターするのにもまた適用することができる。
【００１７】
本発明の利点は、該方法が単純かつカテプシンインヒビター化合物のインビボの効力の測定においてより信頼できると考えられることである。
【００１８】
該方法は、実験的スクリーニングもしくは臨床の設定においてカテプシン阻害化合物の効力をアッセイするのに使用することができるのみでない。それは、カテプシンインヒビターで治療されている患者をモニターして、それらの治療の効力を確認しかつ必要な場合は投与を調節するのにもまた有用である。これは、処方医もしくは監督医が、所望のカテプシンＳ阻害薬物のレジメンをより正確かつ効果的に投与することを可能にすることができる。
【００１９】
実施例１
ヒト血液中のカテプシンＳ阻害のモニタリング
臨床試験の設定におけるカテプシンＳインヒビターのインビボ投与の影響は、投薬された被験体の血液中のインバリアント鎖（Ｉｉ）の中間分解産物、とりわけｐ１０Ｉｉフラグメントの蓄積を測定することによりモニターすることができる。簡潔には、時間のある期間の間、好ましくは１６〜３０時間のカテプシンインヒビターの投与後に、血液を引き抜き、そして白血球を例えば赤血球の溶解もしくはフィコール（ＦＩＣＯＬＬ）勾配遠心分離のいずれかにより精製する。ＷＢＣの全細胞ライセートをその後作成し、そしてウェスタンブロットアッセイもしくはＥＬＩＳＡアッセイのいずれかにより分析する。ウェスタンアッセイのためには、細胞ライセートを最初にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離する。ニトロセルロースメンブレンに転写した後、Ｉｉ、およびｐ１０Ｉｉを包含するその中間分解産物をその後、Ｉｉに対するマウスｍＡｂ例えばＰｉｎ１．１、もしくはｐ１０ＩｉフラグメントのＣ末端に特異的なウサギポリクローナル抗体を使用して検出することができる。ＥＬＩＳＡアッセイのためには、Ｐｉｎ１．１を包含するＩｉに対する一対の抗体、およびｐ１０ＩｉのＣ末端に対するウサギポリクローナル抗体を使用することができる。同一のアッセイを、例えばサル、イヌ、ブタ、ウサギ、モルモットおよびげっ歯類での動物試験においてインビボでのカテプシンＳインヒビターの影響をモニターするのにもまた適用することができる。
【００２０】
本実施例において、ヒト血液からの精製された末梢血単核細胞を、カテプシンＳインヒビターＬＨＶＳ（モルホリン尿素−ロイシン−ホモフェニルアラニン−ビニルスルホンフェニル、４−モルホリンカルボキサミド、Ｎ−［（１Ｓ）−３−メチル−１−［［［（１Ｓ，２Ｅ）−１−（２−フェニルエチル）−３−（フェニルスルホニル）−２−プロペニル］アミノ］カルボニル］ブチル］−（９Ｃｌ）ともまた称される）とともにインキュベートした。この化合物は米国特許第５，９７６，８５８号明細書、ならびにＰａｌｍｅｒら（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３８：３１９３およびＲｉｅｓｅら（１９９６）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　４：３５７に記述されている。２４時間のインキュベーション後に、サンプルを標準的ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロトコルを使用して泳動し、ニトロセルロースメンブレンに転写し、そしてｐ１０Ｉｉフラグメントを包含するインバリアント鎖を認識する抗体でプロービングした。ＬＨＶＳの存在下で、ｐ１０Ｉｉフラグメントは容易に見ることができる（図１）。これはカテプシンＳの阻害によるＩｉの分解における封鎖を表す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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