(57)【要約】組織培養物において細胞の遺伝的改変物を入手するための方法が記載されている。改変は、組織培養物を望ましい遺伝子用の送達ビヒクルと接触させる前にその組織培養物をコラゲナーゼで処理することにより補助される。毛包及び他の組織をこの方法で改変し、その後で無傷のレシピエントに移植することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物被験体に核酸分子を導入する方法であって、前記核酸分子を含むようにイクスビボで改変された少なくとも一個の毛包を前記被験者の皮膚に移植する工程を含む方法。
【請求項２】
前記毛包が、組織培養物中でイクスビボで改変されている請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記組織培養物が、前記毛包を改変する前にコラゲナーゼを用いて処理されている請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記毛包が成長中である請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記包が、前記核酸を用いて形質導入することによって、またはリポフェクションによって前記核酸分子を含むように改変された請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記包が、ウイルスベクターを用いて処理することによって前記核酸分子を含むように改変された請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスベクターがウイルスパッケージング細胞の上清を含み、及び／または前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターを含み、及び／または前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターを含む請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物がマウスまたはヒトである請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記核酸が免疫原をコードするか、または前記核酸がホルモンをコードするか、または前記核酸が毛髪の成長もしくは質に影響を与える産生物をコードする請求項１記載の方法。
【請求項１０】
異種の核酸分子を含むように改変された成長期にある組織培養中の毛包。
【請求項１１】
哺乳動物被験者に核酸分子を導入する方法であって、前記核酸分子を含むようにイクスビボで改変された組織培養された無傷の組織を前記哺乳動物の対応する組織に移植することを含む方法。
【請求項１２】
前記組織培養物が、その組織を前記核酸を用いて改変する前にコラゲナーゼで処理される請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
核酸を用いる前記改変がリポソーム組成物を用いて前記組織を処理することを含むか、または前記改変が前記核酸を用いて前記組織の細胞を形質導入することを含むか、または前記改変がウイルスベクターを用いて前記組織を処理することを含む請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記無傷の組織が皮膚であるか、または前記組織がリンパ組織である請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
毛包に核酸を供給する方法であって、組織培養物中に前記毛包を維持させ、前記組織培養物を核酸を用いて処理することを含む方法。
【請求項１６】
核酸を用いる前記処理の前に、コラゲナーゼで前記組織培養物を処理する工程が行われる請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
無傷の組織に核酸を送達する方法であって、前記核酸を用いて前記無傷の組織の組織培養物を処理することを含む方法。
【請求項１８】
核酸を用いる前記処理の前に、コラゲナーゼで前記組織培養物を処理する工程が行われる請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸が皮膚またはリンパである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
異種の核酸を含むように改変された組織培養物。
【請求項２１】
皮膚またはリンパ節の無傷の断片である請求項２０記載の組織培養物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願との相互参照
この出願は、その内容が参照文献としてこの明細書に組み入れられる１９９９年１２月１０日に提出された仮出願第６０／１７０，１６６号から３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１９９（ｅ）に基づく優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、異種遺伝子を含むように哺乳動物被験体を改変することに関する。更に特定すると本発明は、毛包を含む組織培養された組織をイクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で処理し、レシピエントに組織または毛包を再移植することを含む。
【０００３】
背景技術
ヒトを含む哺乳動物被験体を遺伝的に補足するという体細胞性改変は、さまざまな技術を用いて試みられてきた。例えば、所望の遺伝子を含むアデノウイルスベクターは、組織及び器官をインサイチューで直接的に感染させるために用いることができる。より一般的には、おそらく、細胞培養物または細胞の上清がイクスビボで改変され、その後で血流を介して無傷の被験体に戻される。例えば、マウスのチロシナーゼ遺伝子中のアルビノ点突然変異を修正するように設計されたＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＲＤＯ）は、培養されたアルビノメラニン細胞においてこの状態を修正することができた（Ａｌｅｘｅｅｄ， Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（１９９８） １６： １３４３−１３４６）。この研究は、同じグループによって報告されているように、リポソームに入れてＲＤＯを供給することによって、または皮内注入することによって同じ欠陥のインビボでの修正に拡張された（Ａｌｅｘｅｅｄ， Ｄ．らのＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９９） １６： １３４３−１３４６。早期の研究は、リポソーム−トラップｌａｃＺを用いた毛包の選択的遺伝子治療について記載していた（Ｌｉ， Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ （１９９５） １： ７０５−７０６）。リポソーム組成物の好ましいレシピエントは、成長期にある内因性の毛包であった（Ｄｏｍａｓｈｅｎｋｏ， Ａ．ら、Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ （１９９９） １１２：５５２）。
【０００４】
このように、培養物中で個別に毛包細胞を改変すること、およびインビボで無傷の毛包を改変することが可能となっている。また、ラメラ状魚鱗癬を持っている患者から得られた培養された突然変異性皮膚ケラチン細胞をインビトロで遺伝的に安全に改変し、続いて正常の表皮が得られるようにヌードマウスに移植するとよいこともわかっている（Ｃｈｏａｔｅ， Ｋ． Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ （１９９６） ２： １２６３−１２６７）。同様に、インビトロで個々に培養したケラチン細胞を遺伝的に改変し、その後でヌードマウスに移植することによって再−形成組織が得られるようにしてもよい（Ｄｅｎｇ， Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９７） １５： １３８８−１３９１）。毛包が、別の個体の頭皮から採取される毛包皮膚鞘細胞から形成できることもわかった（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ， Ｊ．ら、Ｎａｔｕｒｅ （１９９９） ４０２： ３３−３４）。
【０００５】
要約すると、個々の細胞を遺伝的に改変してから無傷の生物に移植できること、また移植が行われた場合に個々の細胞が適当な条件下で構造化組織を形成できることが判明した。
【０００６】
ヒトの皮膚に遺伝子を、即ち一般的にはＤＮＡを直接的に適用すると、コードされた抗原に関して免疫化された期間は少なくとも効果的であることがわかっている。このことは、Ｔａｎｇ， Ｄ−ＣらのＮａｔｕｒｅ （１９９７） ３８８： ７２９−７３０、Ｙｕ， Ｗ−ＨらのＪ． Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ （１９９９） １１２： ３７０−３７５、Ｆａｌｏ， Ｌ． Ｄ． Ｊｒ．のＰｒｏｃ Ａｓｓｏｃ Ａｍ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ （１９８９） １１１： ２１１−２１９、Ｓｈｉ， Ｚ．らのＶａｃｃｉｎｅ （１９９９） １７： ２１３６−２１４１、及びＴｕｔｉｎｇ． Ｐ．らのＪ． Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ （１９９８） １１１： １８３−１８８といった、多くのグループによって報告されている。Ｆａｎ， Ｈ．らのＮａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ （１９９９） １７： ８７０−８７２はさらに、Ｂ型肝炎表面抗原に対する応答を誘導するために、毛包を含む正常の皮膚に適用する場合にはこの抗原をコードする遺伝子が効果的であることを示した。しかしながら毛包がなくなっている皮膚は、ワクチン接種に対する適当な標的ではなかった。
【０００７】
本発明の開示
本発明は、毛包を含む組織などの組織培養された組織がイクスビボで遺伝子的にうまく改変され、続いて無傷の哺乳動物被験体に首尾よく移植できるという発見に属している。その改変の首尾は、遺伝子的に改変する前にコラゲナーゼを用いて組織培養された組織を処理することによって良くなる。
【０００８】
このように一態様における本発明は、組織に核酸を送達する方法であり、その方法は、前記組織の組織培養物を前記核酸で処理する工程を含んでおり、任意でその工程の前にはコラゲナーゼで前記の組織を処理する工程が行われる。好適な組織は毛包を含む組織である。
【０００９】
別の態様での本発明は、哺乳動物被験体に核酸分子を導入するための方法であり、その核酸分子を含有するようにイクスビボで改変された少なくとも一個の毛包を前記被験体の皮膚に移植し、またはその核酸分子を含むようにイクスビボで改変された組織培養中の組織をその被験体の対応する組織に移植する工程が含まれる。どちらの場合でも、望ましい核酸を用いて改変する工程の前に組織培養物がコラゲナーゼを用いて処理される。
【００１０】
さらに別の態様における本発明は、異種の核酸を含むように改変された組織培養された組織に向けられる。
【００１１】
発明の実施の形態
遺伝的改変のための基質として組織培養された組織を用いると、直接的にインビボで適用した場合を越えるいくつかの利点、また、引き続いてインビボで移植するために個別に培養された細胞をイクスビボで改変した場合を越えるいくつかの利点がある。この組織は三次元の保全性を維持しており、したがってレシピエントに移植された場合にはより容易に再構成される。組織をイクスビボで操作することによって遺伝的改変のレベルを調節でき、被験体の侵襲性の処理を行う前に結果が評価できる。異種の核酸を受け入れる組織の能力を高めるためにコラゲナーゼを用いてその培養組織を処理することは有利であるが、その処理は三次元配列の保全性を完全に破壊するほど苛酷ではない。
【００１２】
三次元の組織培養物は、皮膚、特に毛包を含む皮膚、リンパ組織、または腫瘍組織といった任意の組織から集めることができる。組織の選択は、計画した処理の特徴に依存する。組織培養物は、無傷の断片として与えられる組織サンプルの構造を維持している。「無傷の」とは、その組織の三次元構造が、異種の核酸を含むように細胞を改変する前と後のどちらにおいてもその組織培養物に保存されていることを意味する。下記のように組織培養物は、適当な核酸−含有ベクターまたはその核酸を含む配合物を提供する前に、コラゲナーゼを用いて処理できる。しかしながらコラゲナーゼを用いた処理は、構造の必須の要素を保存できるように充分に緩和でなくてはならない。したがって「無傷の」組織、または「無傷の」断片とは、本発明の方法に従いコラゲナーゼを用いて処理を行う前と後の双方における、ドナーである被験体から入手した組織の断片を意味する。
【００１３】
例えば毛包は、毛髪の成長または質に影響を与えることを意図する遺伝子の有用な受容体であり、それだけでなく免疫原や、採用した生物体に全体として有用でありうる他の産物を産生する能力もある。したがって毛包を形質転換することは、生物体全体に向けられる遺伝子治療の際の中間工程として容易に利用できる。例えば必要な抗原を産生するために毛包を改変する工程を経た免疫化では、毛包を含む皮膚のみが、抗原に対する免疫応答を誘導できるＤＮＡを受け入れることができ、これに対して毛包が全くない皮膚ではそれが起こる可能性がないという上記で報告された観察結果と一致している。
【００１４】
こうして毛包または毛包を含む皮膚は、治療すべき被験体の重要でない領域から採取され、インビトロで培養される。好ましくは毛包を含む皮膚は、組織培養する。それからその組織培養された皮膚は、異種の核酸を取り込む毛包の能力を高めるのに充分な量と時間でコラゲナーゼを用いて処理されるが、ただしその処理は、結果的に組織培養物の壊変が生じないように調節される。続いて培養物中、または組織培養物中の無傷の毛包は、目的の核酸を送達できる適当なベクターを用いて処理される。このようなベクターには、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターのようなウイルスベクター、またはパッケージング細胞由来の上澄が含まれる。
【００１５】
概して言うと一態様において本発明は、遺伝子発現ベクターのため、またはむき出しのままのＤＮＡのための送達システムとして毛包を利用することに関する。本発明を実施するためには、毛包を採集して処理を行う適当な方法を用いるべきである。即ちさまざまな手段が毛包を改変するために利用可能であり、その毛包はその後レシピエントに再移植できる。
【００１６】
毛包を採集するためには、好ましくはその包を含む皮膚が小さな片として適当なドナーから採取される。包が既に成長期にある場合には、それらは直接組織培養できる。しかし提供者が成長期ではない毛包を有しているのであれば、例えばワックス法を用いて皮膚を脱毛し、その後成長が確立されたら適当な時点で毛包を含有する皮膚片を採取することによって、再同調させることが可能である。一般にこれは、マウスの被験体では３−１０日後、より好ましくは５−７日後、そして最も好ましくは６日後であり、他の哺乳動物被験体では成長性が再び確立されるための期間はさまざまである。最適の待機期間はたやすく決定できる。その後、成長期にある毛包を含む皮膚は、一般的にはコラーゲンをベースとする三次元マトリックスに埋め込まれる。その組織培養物がコラゲナーゼまたは感染もしくは形質導入を促す他の適当な溶菌酵素を用いて処理されると、続いて行われる所望の異種遺伝子を用いた改変が改良されることが本発明者らによって見出されている。
【００１７】
コラゲナーゼを用いた処理は、続いて行われる遺伝的改変を高めるのに十分であるが、組織培養物の保全性を破壊するほど過酷でないべきである。コラゲナーゼによる分解の程度は、コラゲナーゼの濃度、インキュベーションの温度、及びインキュベーションの時間を調節することによって調整できる。これらは相互依存するファクターであり、最適レベルは経験的により容易に決定できる。一般に適する条件は、約２ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ溶液、３７℃で１−２時間である。
【００１８】
支持マトリックスを「開放」した後、その組織培養物は遺伝子の改変を受け入れるための適当な条件下に置かれる。この工程で考慮すべきファクターは、改変方法の特徴、即ち、用いるベクター系または方法論、及び挿入すべき遺伝子の性質である。
【００１９】
遺伝的改変は、典型的には、市販されている系を含む、リポソームを基本的に用いる系、または一般にはリポフェクションを用いて処理することによって成し遂げられる。アデノウイルスベクターやレトロウイルスベクターのようなウイルスベクター、また一般的にウイルスベクターの場合では、このようなベクターにのパッケージング細胞から得られる上澄である。裸のままのＤＮＡを用いて適した条件下で形質導入を行うこともできる。
【００２０】
図１は、一般的な毛包の図である。ここに示すように、毛管は、脂を分泌する皮脂腺に結合している。一般に組成物の毛包への選択的送達は、リポソーム組成物を用いて行うことができることが本発明者らによって見出された。例えば参照としてこの明細書に組み入れられる米国特許第５，９１４，１２６号を参照されたい。このように、場合によってコラゲナーゼで処理された組織培養サンプルにおいて、毛包への特異的な作用を意図した核酸の毛包への選択的な送達が成し遂げられる。
【００２１】
本発明の別法では、特に局所送達を全身化する、即ち核酸分子を全身的に送達することが望まれる場合、被験体の皮膚または他の組織を組織培養したサンプルを用いることができる。この例では選択的な送達は必要ではない。一般にサンプルを組織培養するための適切な技術は周知であり、例えば参照としてここに組み入れられる米国特許第５，８４９，５７９号及び米国特許第５，７２６，００９号に開示されている技術が好ましい。
【００２２】
挿入すべき遺伝子は、それら自体のコントロール配列に機能的に結合させて用いることができるし、また毛包細胞にある内因性のプロモーターを利用するむき出しのままのＤＮＡを供給してもよい。このコントロール配列には通常、構成的または誘導的な、哺乳動物の細胞と適合できるプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターとしては、限定するわけではないが、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶプロモーター、アデノウイルス由来のＬＴＲ、及びメタロチオニンプロモーターが挙げられる。
【００２３】
適切なヌクレオチドのオープンリーディングフレームは、免疫応答を誘起したり、毛髪の成長を調節したり、毛髪の色を変化させたりするタンパク質、またはホルモンや治療用化合物であるタンパク質をコードするものを含む。ヌクレオチド配列の選択は、状況や目的とする結果に応じて異なる。したがって例えば、レシピエントに色や密度についてある特徴を持つ髪を提供することが、望まれる最終的な結果であるならば、メラニンの生成に関与するチロシナーゼのようなタンパク質をコードするヌクレオチドオープンリーディングフレームが含まれているとよいし、また、毛髪の成長を刺激するタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれていてもよい。この場合の好適な方法には、レシピエントの皮膚に本発明の方法によって改変した毛包を移植することが含まれるであろう。目的が原虫、細菌、またはウイルスのような病原体に対する個体の免疫感作に影響を与えることにあるならば、Ｂ型肝炎の表面抗原、ウイルスの皮膜タンパク質、細菌や原虫の表面抗原ペプチドサブユニット、または他のペプチドをベースとする免疫原のような適当な免疫原がヌクレオチド配列によってコードされているとよい。この例では、本発明の方法によって改変された毛包、あるいは組織培養した組織サンプルのいずれかの移植を用いることが可能である。上記したように組織培養されたサンプルには、皮膚以外にリンパ組織または腫瘍組織が含まれる。さらに、ＦＳＨ、ＬＨ、ヒト成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、オキシトシン、カルシトニン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、エリスロポエチン、インターロイキンのような種々のサイトカインなどのホルモンまたは治療薬を、それらをコードするヌクレオチド配列を与えることによって投与し、実質的に被験体の代謝を改変することも本発明の範囲に含まれる。局所作用と全身作用のどちらもが得られるであろう。一般に、改変した毛包の移植、または組織培養された一部の移植のいずれかを用いることができる。
【００２４】
上述したように、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列をむき出しのままのＤＮＡとして用いることもできるが、発現させるためのコントロール配列を有する構築物の形態でこれらのヌクレオチド配列を提供する方が好ましい。この構築物はさらに、標的細胞に形質導入するためのウイルスベクターまたは別の手段によって達成されるような感染法によって、毛包や組織サンプルに含まれる細胞の形質導入機構をもたらすことができる。例えばリポフェクション、リポソームの利用、エレクトロポレーション、及び他の同種の方法を用いることもできる。
【００２５】
毛包または組織が上記の遺伝子構築物を含むように改変されると、それらは適当なレシピエントに移植される。レシピエントへの毛包の移植技術、また、毛包を含む組織などの組織の移植技術はこの技術分野では周知である。組織培養された毛包または組織は、無傷で構造の整った移植片として与えられる。
【００２６】
移植片のレシピエントである被験体は、哺乳動物被験体である。移植された組織の拒絶反応を抑えるために、レシピエントは毛包または培養組織の提供者と同系であること、またレシピエントが免疫無防備状態にあることが好ましい。ヒトの同種移植の設定で毛包を移植することは周知である。同様にヒト被験体では、例えば被験体に再移植するのに先だって遺伝的改変するために、その同一の個体自身の皮膚組織を用いることが明らかに好ましい選択である。しかしながら何らかの理由で同一の個体の皮膚を用いることができない場合には、従来から行われているように、免疫抑制剤の投与を伴って、別の提供者から入手した組織の移植がなされる。
【００２７】
同様の考え方は、免疫原、ホルモンまたは治療用化合物を産生する核酸構築物を投与する場合の獣医学での利用に関してもあてはまる。
【００２８】
実験室の環境で用いる場合にはこの移植技術は、この遺伝子治療法によって導入されたタンパク質の効果が評価できるように、改変された被験体を形成する点で有用である。要するにこの技術は、そのモデル系に他の物質を投与したことによる効果を評価するための実験モデルとして用いることができる、トランスジェニック被験体を産生する。この状況では、改変された組織を同一又は同系の被験体から誘導してもよいし、あるいはＳＣＩＤマウスやヌードマウスのような免疫無防備状態のレシピエントを、任意の起源から誘導された組織に対するレシピエントとして利用することもできる。これらの免疫無防備状態のマウス被験体以外に他の哺乳動物を、例えばＨｏｄｇｉｎ， Ｅ． Ｃ．らのＭ． Ｊ． Ｖｅｔ． Ｒｅｓ． （１９７８） ３９： １１６１−１１６７、Ｐｅｒｒｙｍａｎ， Ｌ． Ｅ．らのＴｈｙｍｕｓ （１９８４） ６： ２６３−２７２によるウマ、Ｒｏｔｈ， Ａ．らのＭ． Ｊ． Ｖｅｔ． Ｒｅｓ． （１９８４） ４５： １１５１−１１５５によるイヌ、及びＢａｓｋｉｎ， Ｇ． Ｂ．のＡｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． （１９８７） １２９： ３４５−３５２によるサルで記載されているように放射線照射または免疫抑制剤によって免疫無防備状態にすることができる。
【００２９】
このように任意の哺乳動物被験体は、改変されて構造の整った組織または毛包が移植されるレシピエントとして適当である。被験体には、ウサギ、マウス及びラットのような実験動物はもちろん、ヒト以外に、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、及びネコのような獣医学上の被験体も含まれる。
【００３０】
レシピエントの一部に十分な免疫無防備状態を確実に起こさせるために所与の工程を行ったレシピエントに移植する際には、任意の起源から得られる組織を用いることが可能であるが、本発明の利点の一つは、遺伝子構築物を送達するためのビヒクルとして皮膚組織及び／または毛包を用いることによって、同種移植片の利用がかなり可能になることである。これによって、さもなければ免疫抑制状態において苦労が伴うであろう合併症が回避される。
【００３１】
実施例
以下の実施例は本発明を例示することを意図しており、本発明を限定するものではない。
【００３２】
ＧＦＰを形質導入した毛包及び毛幹を評価する方法
毛包とＧＦＰ陽性毛包の数を、自然光視野の顕微鏡及び蛍光視野の顕微鏡の下で測定した。０．５８１ｍｍ２の視野（２００×倍率の１視野）をカバーする５カ所の無作為に選択した顕微鏡視野から得られる毛髪の平均数に基づいて計算を行った。１つの群あたり少なくとも５００本の毛髪を、ＧＦＰ陽性毛包のパーセントを得るためにカウントした。毛球または毛幹のどこかでＧＦＰが明視化されている毛包をＧＦＰ陽性として数えた。
【００３３】
５０Ｗ水銀ランプのパワー電源を装着したニコン（Ｎｉｋｏｎ）（Ｔｏｋｙｏ， Ｊａｐａｎ）の蛍光顕微鏡及びレイカ（Ｌｅｉｃａ）の蛍光立体顕微鏡モデルＬＺ１２（Ｌｅｉｃａ Ｉｎｃ．， Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ， ＩＬ）を用いた。放射された蛍光は、ハママツ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）Ｃ５８１０ ３−チップ冷却カラーＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ， ＮＪ）に装着した長波−透過フィルターＧＧ４７５（Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ， ＶＴ）を通過させて集めた。
【００３４】
ウイルスのＧＦＰを形質導入した後、組織学的研究を行うべく数回の時点で皮膚片を採取し、ＧＦＰ発現の局在化を検出した。組織培養された皮膚片または皮膚移植片は、培養培地に入れた２ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼ溶液中で２時間、３７℃にてインキュベートし、毛包を遊離させるために培養培地ですすいだ。また組織学的研究では、組織培養された皮膚片または皮膚移植片は−８０℃で保存した。凍結させた試験片はクリオスタット（Ｈａｃｋｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ．， Ｆａｉｒｆｉｅｌｄ， ＮＪ）上で薄片に切断し、スライドガラス（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）の上に収集した。
【００３５】
さらに、ＲＴ−ＰＣＲにかけた組織培養した皮膚または移植された皮膚からＲＮＡを単離した。皮膚サンプル（１００ｍｇ）は、１ｍｌのＴＲＩ ＲＥＡＧＥＮＴ（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）中で均質化することでＲＮＡ（１３，１４）を抽出した。ＲＴ−ＰＣＲでは約１０μｇのＲＮＡが第１ｃＤＮＡ鎖に逆転写された。逆転写は２０μｌの第１鎖緩衝液、５００μＭの各ｄＮＴＰ、及び２０ユニットのＡＭＶ逆転写酵素（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）中で行った。第１鎖のプライマーはｐＧＦＰアンチセンスであった。インキュベーションは４２℃で５０分間行った。それから逆転写の生成物をＰＣＲによって増幅した。マウスβ−アクチンのｍＲＮＡを標準物質として用いた。比較参照としてマウスβ−アクチン（５１４ｂｐ）を、ＧＦＰ陽性およびＧＦＰ陰性である皮膚の両方から抽出したＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。ＧＦＰ上流のプライマーの配列は、５’−ＡＴＧ ＧＣＴ ＡＧＣ ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＡＡ ＧＡＡ ＣＴ−３’であった。下流側のプライマーは、５’−ＴＣＡ ＧＴＴ ＧＴＡ ＣＡＧＴＴＣ ＡＴＣ ＡＣＴ Ｇ−３’であった。ＧＦＰとβ−アクチンの両方のＰＣＲ条件は以下のとおりである。即ち、９７℃で３０秒間の変性；５５℃で３０秒間のアニール化；そして７２℃で４５秒間の伸張；続いて７２℃で１０分間の最終的な伸張である。
【００３６】
実施例１
組織培養された皮膚の毛包の遺伝的改変
Ｃ５７ＢＬ／１０とアルビノのマウスをこの研究では用いた。修飾される場合の毛包は成長期にあった。この研究で使用した６日齢のマウスの毛包は、天然には成長期にあった。この研究で使用した８週齢のマウスは、ピンク色を示すことから休止期にあることが判断される。これらのマウスに麻酔をかけ、３×５ｃｍの背部領域をワックスを用いて脱毛することによって、毛包が同期した成長期となるように処理した。これはつまり、８週齢のマウスの毛包は天然には休止期であったが、背部領域から脱毛を行った６日後に、成長期に切り替わったということである。
【００３７】
各マウスについて、皮下組織を取り出して１ｍｍ×２ｍｍの切片とした。その皮膚片を組織培養した。組織培養した試料のいくつかを、３７℃で１〜２時間、２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ溶液を含む培養培地（ＲＰＭＩ １６４０、１０％のＦＢＳ）中でインキュベートすることによって、コラゲナーゼ処理した。コラゲナーゼで処理された組織培養物を、続いてＰＢＳですすいだ。
【００３８】
より詳細には、動物を脱毛後６日目に頚椎脱臼によって殺した。背部の皮膚を皮下組織の深さまで切開した。皮下組織を取り出し、その皮膚をカルシウム及びマグネシウム不含リン酸緩衝化生理食塩水（ＣＭＦ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４）ですすいだ。その皮膚サンプルを小片（１ｍｍ×１ｍｍ〜２ｃｍ×２ｃｍ）に切断した。試料の断片は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０中で培養して非処理のコントロールとして直接用いた。その試料の残りは、２ｍｇ／ｍｌのＩ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）溶液を含む培地中、３７℃で４５分〜３時間４５分、インキュベートし、ＣＭＦ−ＰＢＳにてすすいだ。
【００３９】
処理していない培養物も処理された培養物も、加湿された５％のＣＯ２／９５％空気中、３７℃でインキュベートし、その後ｐＱＢＩ−ＡｄＣＭＶ５ＧＦＰ（Ｑｕａｎｔｕｍ， Ｍｏｎｔｒｅａｌ， Ｑｕｅｂｅｃ）を用いて、培養培地１ｍｌあたり２．４×１０６個から５．０×１０９個のプラーク形成単位（ＰＦＵ）で９０分間にわたり感染させ、続いて新しいＲＰＭＩ １６４０（１０％のＦＢＳ）中、３７℃で１〜６時間インキュベートした。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現をその後数日の間観察した。結果が表１に示されている。遺伝子修飾はコラゲナーゼを用いた場合でも用いなかった場合でも首尾よく達成されているが、この効果はコラゲナーゼを用いて処理すると改善されることがわかる。
【００４０】
【表１】
2004500809.tif 000002
同様の実験では、コラゲナーゼ処理を行った皮膚と処理を行わなかった皮膚の組織培養物の両方を、２．４×１０６から５．０×１０９ｐｆｕ／ｍｌの範囲のアデノウイルスＧＦＰを用いて３７℃で２．５時間処理した。ＧＦＰを形質導入した３日後には、コラゲナーゼ処置した組織培養物に含まれるＧＦＰ−ポジティブな毛包の数は、ウイルス力価が高くなるにつれて８０％まで増加した。非処理の組織培養物ではＧＦＰポジティブな毛包の数は非常に少なく、力価が高まるにつれてほんのわずかに増加するにすぎず、コラゲナーゼ処理した組織培養物の４分の１以下であった。これらの結果は図２Ａに示されており、それはウイルス力価に依存することを示している。
【００４１】
さらに同様の実験では、コラゲナーゼ処理を行った組織培養物と処理を行わなかった組織培養物の両方を、３．４×１０８ｐｆｕ／ｍｌのアデノウイルスＧＦＰとともに３７℃で１時間〜６時間インキュベートした。コラゲナーゼ処置した組織培養物に含まれるＧＦＰ−ポジティブな毛包の数が、ウイルスとのインキュベーションの時間が最大で４時間に達するまでに８０％まで増加した。４時間を過ぎるとそれ以上の増加は観察されなかった。非処理の組織培養物ではＧＦＰポジティブな毛包の数は非常に少なく、時間が経過してもほんのわずかに増加したにすぎなかった。これらの結果は図２Ｂに示されている。
【００４２】
ＧＦＰ陽性毛包の数は、皮膚の組織培養物をコラゲナーゼ処理した時間が最大で１時間３０分に達するまでは増加したが、それを過ぎると時間の経過につれてその数は減少した。
【００４３】
これらの実験では、アデノウイルス−ＧＦＰ処理を行った１日後には組織培養された皮膚の毛髪マトリックス細胞においてＧＦＰが可視化された。アデノウイルス−ＧＦＰ処理をした３日後に組織培養された皮膚から毛包を単離し、ＧＦＰ蛍光の局在を調べた。ＧＦＰは、毛球及び真皮乳頭にある細胞の大部分で広範囲に可視化された。アデノウイルスＧＦＰ処理の７日後には、組織培養した皮膚の毛幹でＧＦＰが可視化された。図３Ａ参照。ＧＦＰ陽性毛幹、ＧＦＰ陰性毛幹、および部分的にＧＦＰ陽性である毛幹は、イクスビボでアデノウイルス−ＧＦＰ遺伝子治療を行った３日後には特異的なＧＦＰ蛍光によって明瞭に識別され、ＧＦＰ蛍光はコラゲナーゼ処理を行って組織培養された皮膚に存在する毛包の７９％で可視化された。対照的に、処理を行わなかった組織培養された皮膚においては、わずか１２％の毛包しかＧＦＰ蛍光を有しなかった。図３Ａを参照のこと。組織培養物においては少なくとも３５日間にわたり、高いＧＦＰ蛍光が毛包において維持されていた。
【００４４】
異なる時点での毛包におけるＧＦＰ遺伝子の発現を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いて、３日目、６日目、９日目、１２日目、１５日目、及び１７日目においてアデノウイルス−ＧＦＰ遺伝子を形質導入した組織培養皮膚に存在するＧＦＰ−特異的ｍＲＮＡを検出した。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、ＧＦＰのｃＤＮＡが上記の時点で全ＲＮＡから特異的に増幅されたことを示していた。電気泳動分析は、アデノウイルス−ＧＦＰ−形質導入された組織培養皮膚から増幅された産物の推定サイズが７２０ｂｐであることを示した。非感染組織培養皮膚から抽出した全ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲでは、この配列は増幅されなかった。
【００４５】
どの場合においても、組織培養された皮膚の毛包、毛球、及び真皮乳頭においてＧＦＰの発現が示されることが可視的な観察によって示された。
【００４６】
実施例２
レシピエントへの改変された組織培養物の移植
毛包が休止期にある８週齢のメスのＣ５７ＢＬ／１０マウスを、ドナーとして用いた。その背部領域をワックスにより脱毛することによって、脱毛後６日で起こる成長を誘導した。組織を背部領域から採取し、小片に切断してから、培養、コラゲナーゼを用いた処理、及びＧＦＰを含むアデノウイルスを用いた感染を実施例１に記載されたように行った。それからその皮膚片を７週齢／３日齢のメスのヌードマウスの背部領域に移植した。移植後の移植皮膚を観察すると、毛包においてＧＦＰが広範囲に発現すること、およびその発現はコラゲナーゼで前処理することにより増強されることが示された。
【００４７】
より詳細には、インビボでトランスジーンの発現を可視化するために、ウイルスＧＦＰを形質導入した後、組織培養した皮膚をヌードマウスまたはＣ５７ＢＬ／１０マウスに移植した。組織培養された試料は、採集した２４時間以内に移植した。移植外科術は、滅菌法を用いて層流フード内で行った。マウスはケタミンを用いて麻酔した。１×１ｃｍの皮膚片を、筋膜の下にあるレシピエントマウスの皮膚をとり除いて準備した同じ大きさの埋め込み部に移植した。皮膚移植片は、６〜０の非吸収性の単繊維縫合糸を用いて適切に固定した。
【００４８】
移植後のコラゲナーゼ処理した組織培養皮膚においては、毛包のより広範囲のＧＦＰ蛍光が可視化され、この蛍光は非処理の皮膚におけるよりも広範囲であった。移植の８日後には、皮膚移植片における最大蛍光の領域において毛包の７５％でＧＦＰが可視化されていた。移植後、コラゲナーゼ−処理された皮膚においてＧＦＰ蛍光を有する毛包のパーセントは、非処理の皮膚の毛包における該パーセントの５．７倍大きかった。図３Ｂを参照するとよい。上記に記載した免疫応答性を有するＣ５７ＢＬ１０マウスに移植したＧＦＰ−アデノウイルス処理を行った皮膚においては、免疫不全のヌードマウスに移植した皮膚と同様の期間、同様の効率で、ＧＦＰが可視化された。
【００４９】
ＧＦＰ−形質導入した移植皮膚について、６日目、８日目、そして１０日目にＲＴ−ＰＣＲを行った。ＧＦＰ−特異的ｍＲＮＡがそれぞれの時点で同様に増幅された。これらのデータからは、組織培養を行う少なくとも１７日間にわたって、およびマウスへの皮膚の移植後少なくとも１０日間にわたって、ＧＦＰ遺伝子が発現することが確認された。
【００５０】
実施例３
ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）チロシナーゼ遺伝子、上流ＯＲＦ−４３８、および内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）のクローニング
ストレプトマイセス・アンチビオティカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）のチロシナーゼ遺伝子およびＯＲＦ−４３８をエンコードする配列を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）より入手したプラスミドｐＩＪ７０２ （ＡＴＣＣ ＃３５２８７） からＰＣＲによって増幅した。Ｋａｔｚ， Ｅ．らのＪ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． （１９８３） １２９： ２７０３−２７１４。
【００５１】
ＰＣＲ増幅するためのオリゴマーは、Ｓ． アンチビオティカス（Ｓ． ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）チロシナーゼ遺伝子とＯＲＦ−４３８のｃＤＮＡの配列に従って設計した。Ｂｅｒｎａｎ， Ｖ．らのＧｅｎｅ， （１９８５） ３７： １０１−１１０。哺乳動物細胞において上記細菌遺伝子の発現を増強するために、ＯＲＦ−４３８およびチロシナーゼ遺伝子のＴＧＡ終止コドンをＴＡＡに変更した。翻訳効率を向上させるために、それぞれの場合にＡＴＧ開始コドンのすぐ前に、コザック共通配列であるＧＣＣＧＣＣＡＣＣを上流側に付加した。
【００５２】
コザック共通配列を含むＯＲＦ−４３８上流側プライマーの配列は、５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＧＧＡＡＣＴＣＡＣＣＣＧＴＣ−３’であった。下流側プライマーの配列は、５’−ＧＧＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＧＴＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧＡＧＣ−３’であった。コザック共通配列を含むチロシナーゼの上流側プライマーの配列は、５’−ＣＴＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＡＣＣＧＴＣＣＧＣＡＡＧＡＡＣＣＡ−３’であった。
【００５３】
下流側プライマー配列は、５’−ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＣＧＴＣＧＡＡＧＧＴＧＴＡＧＴＧＣ−３’であった。ＯＲＦ−４３８とチロシナーゼの両方について、ＰＣＲ反応条件は以下のとおりであった。即ち、９７℃で１０分間の変性；次に９７℃で３０秒間の変性、６６℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で４５秒間の伸長を１０サイクル；それから７２℃で１０分間の最後の伸長。
【００５４】
ＰＣＲオリゴマーは、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）から入手したレトロウイルスベクターｐＬＩＳＮに含まれる内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）の配列に従って設計した。上流側プライマーの配列は、５’−ＧＧＣＴＧＡＴＣＡＴＴＣＧＣＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣＣＣ−３’であった。下流側プライマーの配列は、５’−ＡＧＣＧＧＣＣＡＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧＧ−３’であった。
【００５５】
ＩＲＥＳ遺伝子は、鋳型としてのｐＬＸＩＮからＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲの反応条件は以下のとおりであった。即ち、まず９６℃で１０分間の変性；次に９４℃で３０秒間の変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で４５秒間の伸長を３０サイクル；それから７２℃で１０分間の最後の伸長。
【００５６】
電気泳動分析は、増幅された産物の推定サイズが、ＯＲＦ−４３８、チロシナーゼ及びＩＲＥＳに対してそれぞれ４３８ｂｐ、８００ｂｐ及び５８０ｂｐであることを示した。
【００５７】
実施例４
レトロウイルスベクターｐＬｍｅｌＳＮの構築およびパッケージング
ｐＬｍｅｌＳＮの構築を記述する。レトロウイルスベクターｐＬＸＳＮ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）は、二つのプロモーター、即ち、挿入遺伝子を調節する５’−長末端反復配列（５’−ＬＴＲ）と、ネオマイシンリン酸転移酵素（ｎｅｏＲ）を調節するＳＶ４０プロモーター、とを含むマウス白血病ウイルス系ベクターである。８００−ｂｐのチロシナーゼＰＣＲ産物をＸｈｏｌによって切断し、ｐＬＸＳＮのＨａｐＩ／ＸｈｏＩクローニング部位に挿入することによってｐＬｔｙｒＳＮが得られた。ＯＲＦ−４３８とＩＲＥＳ ＰＣＲ産物をＢｃｌ Ｉ部位で連結し、その後ｐＬｔｙｒＳＮのＥｃｏＲＩ／Ｘｈｏｌクローニング部位に挿入することによって、ｐＬｍｅｌＳＮが得られた。ＯＲＦ−４３８とチロシナーゼ遺伝子はどちらも、ｐＬｍｅｌＳＮ中のモロニーマウス白血病ウイルスの５’−ＬＴＲによって駆動される。５’−ＬＴＲプロモーターの制御下にあるＯＲＦ−４３８、ＩＲＥＳ及びチロシナーゼ遺伝子を含む二シストロン配列がそのベクター中に存在している。
【００５８】
ｐＬｍｅｌＳＮを、ｌｉｐｏＴＡＸＩ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いてＰＴ６７パッケージング細胞系にトランスフェクトした。そのトランスフェクトされたＰＴ６７細胞系は、０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭ培地にて選択した。Ｇ４１８−耐性細胞をクローン化し増殖させた。Ｇ４１８を用いて２週間の選択的培養を行った後、陽性であるトランスフェクトされた細胞であるＰＴ６７−ｍｅｌが得られた。
【００５９】
実施例５
ＰＴ６７−ｍｅｒ細胞における発現
ＯＲＦ−４３８遺伝子とチロシナーゼ遺伝子の両方の発現を確認するために、ＲＴ−ＰＣＲ分析を用いてトランスフェクトされたパッケージング細胞において各ｍＲＮＡを検出した。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、Ｓ． ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ由来のチロシナーゼ遺伝子とＯＲＦ−４３８遺伝子がｐＬｍｅｌＳＮ形質導入したＰＴ７−細胞の全ＲＮＡから特異的に増幅された産物であることを示していた。比較対照として、ＰＴ６７−ｍｅｌとＰＴ６７細胞の両方から得られるマウスのβ−アクチンをＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。電気泳動分析は、ＲＴ６７−ｍｅｌ細胞から得られる増幅産物の予測サイズが、チロシナーゼとＯＲＦ−４３８に対してそれぞれ８００ｂｐと４３８ｂｐであることを示した。感染を行わなかったＰＴ６７細胞から得られる全ＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲ反応では、これらの断片は増幅しなかった。
【００６０】
より詳細に述べると、ＰＴ６７−ｍｅｌ細胞をトリプシンを用いて消化し、そして遠心分離によってペレット化した。全ＲＮＡはグアニジンチオシアナート法（ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ， Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）によって抽出した。ＲＮＡは、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量した。約１０μｇの全ＲＮＡを第１ｃＤＮＡ鎖へと逆転写した。逆転写は２０μｌの第１鎖緩衝液、５００μＭの各ｄＮＴＰ、及び２０ユニットのＡＭＶ逆転写酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で行った。第１鎖に対するＰＣＲプライマーは、ｐＯＲＦ−４３８アンチセンスとｐＴｙｒアンチセンスであった。サンプルを４２℃で５０分間インキュベートした、逆転写の産物をＰＣＲ反応によって増幅した。マウスβ−アクチンを標準として用いてＲＮＡの品質を調節した（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。
【００６１】
実施例６
チロシナーゼ活性アッセイ
トランスフェクトしたパッケージング細胞を、Ｇ４１８−耐性パッケージング細胞のクローンの溶解物に含まれるチロシナーゼ活性を測定することによって、活性を有するチロシナーゼタンパク質の発現についてスクリーニングした。チロシナーゼ活性は、ＮａｋａｊｉｍａらのＰｉｇｍｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ （１９９８） １１： １２−１７によって記載された方法で評価した。ｐＬｍｅｌＳＮ感染したＰＴ６７パッケージング細胞を、９６ウェルプレートに２，０００細胞／ウェルの密度で植え付けた。培養を２４時間行った後、そのパッケージング細胞をＰＢＳを用いて洗浄し、１％のトリトン−１００（４５μ／ウェル）を用いて溶解した。振とうしてその溶解物を混合した後、５μｌの１０ｍＭ Ｌ−ＤＯＰＡをそれぞれのウェルに添加した。その培養物を３７℃で３０分間インキュベートしてから、４９０ｎｍでの吸光度を分光光度測定法で測定した。
【００６２】
またＤＯＰＡ−オキシダーゼ反応も、無傷のトランスフェクトしたＰＴ６７細胞におけるメラニンの産生を検出するために利用した。その細胞を、１ｍｇ／ｍｌのＤＯＰＡと２ｍｇ／ｍｌのチロシンとを含むＰＢＳ（ｐＨ ７．４）とともに３７℃で１２時間、先に記載したようにインキュベートした。Ｋｕｇｅｌｍａｎ， Ｔ．らのＪ． Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ （１９６１） ３７： ６６−７３参照。
【００６３】
同じ条件を用いて細胞上清のメラニン含有量について４９０ｎｍで測定した。図３は、ＰＴ６７クローン１−４が比較対照のＰＴ６７よりも多いメラニンを生成することを示している。チロシナーゼ陽性細胞は、自然光視野の顕微鏡を用いて観察される茶色のメラニン顆粒を産生することによって同定した。茶色に着色した顆粒は、ｐＬｍｅｌＳＮ−トランスフェクトした細胞でのみ観察された。
【００６４】
実施例７
アルビノマウスの成長期の毛包の培養
メスのアルビノマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−チロシナーゼ（ｃ−２Ｊ）（８週齢）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。全ての毛包が毛髪サイクルの休止期（テロゲン期）に入っている背部の皮膚に、毛髪サイクルの成長期（組織再生期）を誘導した。全身麻酔を行った後、温かいワックス／ロジン混合液を適用してから皮膚を剥離し、全ての休止期の毛幹を脱毛し、それによって成長期に入るように毛包を誘導した。Ｓｃｈｉｌｌｉ Ｊ Ｉｎｖｅｓｔ Ｄｅｒｍａｔｏｌ （１９９８） １１１： ５９８−６０４参照。
【００６５】
脱毛後６日目に全ての毛包が成長期に入った時点でそのマウスを殺し、その背部の皮膚を採集した。マウスの皮膚の小片（２×５×２ｍｍ）をハサミで切断し、ＨＢＳＳで３度洗浄した。採集した皮膚を抗生物質（１ｍｌあたり１００μｇのゲンタマイシン、１ｍｌあたり１０μｇのシプロフロキサシン、１ｍｌあたり２．５μｇのアンホテリシン−Ｂ、１ｍｌあたり１００ＩＵ−１００μｇのペニシリン−ストレプトマイシン）を含むＭＥＭ中で３０分間、３７℃でインキュベートした（Ｓｉｇｍａ）。その皮膚をＨＢＳＳ培地を用いて３回洗浄することによって残っている抗生物質を除去し、１０％のウシ胎児血清とゲンタマイシンを補充したイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）において組織培養するため、コラーゲンを含むゲルに入れた。培養は５％のＣＯ２を含むガス封入インキュベーター中で、３７℃に維持した。
【００６６】
実施例８
培養したアルビノマウスの毛包の感染
実施例７の組織培養したアルビノマウスの皮膚を、ＰＴ６７−ｍｅｌ細胞とともに以下のとおりに共培養した。
【００６７】
最も多く産生したクローンから得られるＰＴ６７−ｍｅｌ細胞を計数し、２４−ウェルのプレートに植え付けてから８０％のコンフルエントに達するまで３７℃で増殖させ、２４−ウェルのプレートにおいて組織培養されたアルビノ皮膚とともに、１２時間、２４時間及び７２時間共培養した。その後組織培養された皮膚を、新しいＭＥＭ培地を用いて２４ウェルのプレートで単独培養し、更に４〜６日間インキュベートした。ウイルス感染させた皮膚の小片を無作為にサンプリングした。新しい凍結切片を標準法によって調製した。
【００６８】
メラニンは、レトロウイルス感染の４日後の組織培養物の毛球の深部にある毛マトリックスにおいて観察された。またメラニンは毛包の上部にも見られ、感染の６日後には毛マトリックスと毛幹の両方で観察することができた。
【００６９】
共培養した組織培養アルビノマウスの皮膚をＰＴ６７−ｍｅｌ細胞とともに２４時間共培養する工程が含まれる最初の実験では、皮膚組織培養物のほぼ２．５−１５％がメラニン産生性の毛包を含んでいた。ＰＴ６７−ｍｅｌと共培養しなかった組織培養したアルビノマウスの皮膚ではメラニンは観察されなかった。
【００７０】
次に、アルビノ皮膚とＰＴ６７−ｍｅｌの共培養物のインキュベーション時間が長くなるほどチロシナーゼ感染の効率が良くなるかどうかを調べるために、経時的実験を行った。組織培養皮膚の感染効率は、共培養した時間につれて有意に向上した。１２時間の共培養を行った後では、皮膚の７％（３０片のうちの２片）がメラニンを産生し、また毛包の１５％（６０片のうち４０片）がメラニンを産生した。共培養を２４時間行った後では皮膚片の２５％（２０片のうち５片）がメラニンを産生し、毛包の３５％（８０片のうち２８片）がメラニンを産生した。共培養を７２時間行った後では、皮膚片の６０％（２０片のうち１２片）がメラニンを産生し、毛包の５３％（８０片のうち４２片）がメラニンを産生した。
【００７１】
これらの結果は、ウイルス力価とウイルスに曝露された時間が形質導入の頻度に影響をあたえ得ることを示唆している。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、一般的な毛包の図である。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、コラゲナーゼを用いた処理を行った場合と行わなかった場合の組織培養された皮膚におけるアデノウイルス−供給ＧＦＰについて、ウイルス力価及びウイルスインキュベート時間のそれぞれに対する関数として示したグラフ表示である。
【図３】図３Ａ及び３Ｂはそれぞれ、組織培養物及び移植された皮膚におけるＧＦＰの持続性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500809.tif 000032
【国際調査報告】
2004500809.tif 000033
2004500809.tif 000034
2004500809.tif 000035