(57)【要約】本発明は、皮膚糸状菌のワクチン接種株を含有するワクチン、皮膚糸状菌症の免疫防御および治療のための前記ワクチンの使用、並びに前記ワクチンを産生する適切な方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のワクチン接種株
ａ１）トリコフィトン・ベルコスム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）ＣＣＭ  Ｆ−７６５
ａ２）トリコフィトン・ベルコスムＣＣＭ  ８１６６
ａ３）トリコフィトン・メンタグロフィテス（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）ＣＣＭ  ８２９０
および
ａ４）トリコフィトン・ルブルム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｒｕｂｒｕｍ）ＣＣＭ  ８２９１
の少なくとも１つを含有するワクチン。
【請求項２】
最終産物中の個々のワクチン接種株ａ１：ａ２：ａ３：ａ４の比が、０または２〜１０：０または１〜５：０または５〜３０：０または２〜１０である、請求項１記載のワクチン。
【請求項３】
最終産物中の個々のワクチン接種株ａ１：ａ２：ａ３：ａ４の比が、０または１〜１０：０または１〜２：０または３〜３０：０または１〜３である、請求項１記載のワクチン。
【請求項４】
最終産物中のワクチン接種株ａ１：ａ２：ａ３の比が、２：１：５または１０：１：３０である、請求項１、２または３記載のワクチン。
【請求項５】
最終産物中のワクチン接種株ａ１：ａ３：ａ４の比が、１：３：１である、請求項１、２または３記載のワクチン。
【請求項６】
最終産物中のワクチン接種株ａ２：ａ４の比が、１：２である、請求項１、２または３記載のワクチン。
【請求項７】
最終産物中のワクチン接種株ａ１：ａ２：ａ３：ａ４の比が、４：２：１０：３または１０：１：３０：２である、請求項１、２または３記載のワクチン。
【請求項８】
すべてのワクチン接種株の増殖（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ）型の総量が、ワクチン１ｍｌあたり少なくとも１００万（１ｍｉｏ）であることで特徴付けられる、先行する請求項いずれか１項記載のワクチン。
【請求項９】
すべてのワクチン接種株の増殖型の総量が、ワクチン１ｍｌあたり少なくとも５００万であることで特徴付けられる、先行する請求項いずれか１項記載のワクチン。
【請求項１０】
すべてのワクチン接種株の増殖型の総量が、ワクチン１ｍｌあたり少なくとも１０００万であることで特徴付けられる、先行する請求項いずれか１項記載のワクチン。
【請求項１１】
最終産物のｐＨが３．０〜１０．０の範囲であることで特徴付けられる、先行する請求項いずれか１項記載のワクチン。
【請求項１２】
最終産物のｐＨが６．０〜８．０の範囲であることで特徴付けられる、先行する請求項いずれか１項記載のワクチン。
【請求項１３】
０．０５％未満のホルムアルデヒドを含有する、先行する請求項いずれか１項記載のワクチン。
【請求項１４】
０．０２％未満のホルムアルデヒドを含有する、先行する請求項いずれか１項記載のワクチン。
【請求項１５】
皮膚上（ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用のための、先行する請求項いずれか１項記載のワクチン。
【請求項１６】
ヒト医学において使用するための、先行する請求項いずれか１項記載のワクチン。
【請求項１７】
獣医学において使用するための、先行する請求項いずれか１項記載のワクチン。
【請求項１８】
ヒトまたは動物における皮膚糸状菌症の免疫防御または治療のため、ワクチンを調製するためのワクチン接種株
ａ１）トリコフィトン・ベルコスムＣＣＭ  Ｆ−７６５
ａ２）トリコフィトン・ベルコスムＣＣＭ  ８１６６
ａ３）トリコフィトン・メンタグロフィテスＣＣＭ  ８２９０
および
ａ４）トリコフィトン・ルブルムＣＣＭ  ８２９１
の少なくとも１つの使用。
【請求項１９】
少なくとも２つのワクチン接種株の、請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
少なくとも３つのワクチン接種株の、請求項１８記載の使用。
【請求項２１】
ワクチン接種株の比が、請求項２〜７のいずれか１項に請求されるとおりである、請求項１８〜２０のいずれか１項記載の使用。
【請求項２２】
ワクチンを皮膚上適用する、請求項１８〜２１のいずれか１項記載の使用。
【請求項２３】
皮膚糸状菌症に対するワクチンの産生法であって：
ａ）増殖型が最適に形成されるまで、糖類または有機結合窒素を含有する、培地として適した組成の寒天培地上、併用しようとするワクチン接種株を、場合によってｐＨを中間調整した後、２５〜２９℃の範囲の温度で、１０〜３０日間、無菌条件下で個々に培養し、
ｂ）続いて、水性０．１％ホルムアルデヒド溶液中でホモジナイズし、ここで胞子の大部分は、表面構造が破壊されることなく、菌糸体から分離される、
ｃ）少なくとも２４〜３６時間、１８〜２６℃の温度で、形成される懸濁物中の株を不活化し、
ｄ）ワクチン接種株間の比を調整し、
ｅ）ワクチン接種株数を、最終調製１ｍｌ中、少なくとも１００万に調製し、
ｆ）ｐＨを３．０〜１０．０の範囲に調整し、そして
ｇ）ホルムアルデヒドの残存含量を調整し、場合によって続いてホルムアルデヒドを置換する
ことを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚糸状菌のワクチン接種株を含有する新規ワクチン、皮膚糸状菌症の免疫防御および治療のための該ワクチンの使用とともに、該ワクチンの調製法に関する。本発明のワクチンは、獣医学およびヒト医学両方に使用可能である。
【背景技術】
【０００２】
現在、獣医学において、皮膚糸状菌症の予防および治療両方に、いくつかのワクチンが用いられている。これらは、生ワクチンおよび不活化ワクチン両方であり、とりわけ、ＣＳ  １６０３２４、ＰＬ  １５６８４４、ＳＵ  １７３４７６２、ＧＢ  ２０２５２２２、ＳＵ  ９５５５７０、ＳＵ  ９５５５７１、ＳＵ  ５４８９４７、ＳＵ  ８３５４４６、ＲＵ  ２０１３４４４、ＲＵ  ２０１３４４５、ＥＰ  ３９３３７１、ＤＥ９２１８９２１  Ｕ１、ＰＬ  １００９５８、ＵＳ  ４，２２９，４３４、ＵＳ  ５，２７７，９０４、ＵＳ  ５，２８４，６５２、ＣＳ  ２０１４８１、ＣＳ  ２４６７９１、ＣＳ  ２６１４６０、ＣＺ  ２７９２７８およびＣＺ  ２７９９８２に記載される。これらの刊行物に記載されるワクチンはすべて、共通の非経口適用を有する。大部分の場合、これらは、筋内適用され、稀に皮下適用される。非経口適用は、ワクチン接種された生物において、アナフィラキシー反応およびアナフィラキシー様反応を引き起こす危険を伴う可能性があるため（Ｇｕｄｄｉｎｇ  Ｒ．およびＮａｅｓｓ  Ｂ．，  Ａｍｅｒ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．  ４７，１９８６，  ２４１５−２４１７，  “Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔｔｌｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｉｎｇｗｏｒｍ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ”）、これまで産生されたワクチンの適用は、もちろん、ヒト医学では除外されてきた。その結果、何よりも、ヒト医学においても使用可能なワクチンが、緊急に必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の詳細な説明
最初に、本発明は、皮膚糸状菌のワクチン接種株を含有する新規ワクチン、皮膚糸状菌症の免疫防御および治療のための該ワクチンの使用に関する。
【０００４】
本発明のワクチンは、ヒト医学および獣医学両方に適用される。本発明にしたがって治療すべき、獣医学における温血動物には、特に、家畜および生産的家畜が含まれる。
本発明にしたがって、皮膚糸状菌症は、皮膚糸状菌に引き起こされる、皮膚および皮膚付属器の疾患であることが理解される。
【０００５】
本発明は、少なくとも１つの皮膚糸状菌ワクチン接種株を含有するワクチンに関する。
本発明において、皮膚糸状菌には、とりわけ、白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属、小胞子菌（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）属、表皮糸状菌（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）属、アースロダーマ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ）属およびナニジア（Ｎａｎｎｉｚｚｉａ）属の真菌が含まれる。特に好ましいワクチン接種株は白癬菌属に属し、特に、株は、トリコフィトン・ベルコスム（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ）ＣＣＭ  Ｆ−７６５（ａ１）、トリコフィトン・ベルコスムＣＣＭ  ８１８６（ａ２）、トリコフィトン・メンタグロフィテスＣＣＭ  ８２９０（ａ３）およびトリコフィトン・ルブルムＣＣＭ  ８２９１（ａ４）であることが好ましい。上述の株、トリコフィトン・ベルコスムＣＣＭ  Ｆ−７６５（ａ１）およびトリコフィトン・ベルコスムＣＣＭ  ８１８６（ａ２）の培養物は、出願者らによって、チェコ微生物コレクション（ＣＣＭ）、マサリク大学、Ｔｖｒｄｅｈｏ  １４，  ６０２  ００  Ｂｒｎｏに、それぞれ寄託番号ＣＣＭ  Ｆ−７６５およびＣＣＭ  ８１６６で、元来、それぞれ１９８４年１１月５日および１９９３年２月２３日に寄託された。それぞれ１９９２年１２月１４日および２００２年７月２２日に、これらの寄託は、ブダペスト条約にしたがった寄託に変更された。上述の株、トリコフィトン・メンタグロフィテスＣＣＭ  ８２９０（ａ３）およびトリコフィトン・ルブルムＣＣＭ  ８２９１（ａ４）の培養物は、ブダペスト条約にしたがって、２００１年７月２３日に、それぞれ寄託番号ＣＣＭ  ８２９０およびＣＣＭ  ８２９１で該コレクションに寄託された。
【０００６】
白癬菌属の上述のワクチン接種株の少なくとも２つを組み合わせて含有するワクチンが、別の好ましい態様である。上述のワクチン接種株４つのうち３つの組み合わせが特に好ましい。
【０００７】
この場合、０または２〜１０：０または１〜５：０または５〜３０：０または２〜１０、あるいは、０または１〜１０：０または１〜２：０または３〜３０：０または１〜３、あるいは０または１〜１０：０または１〜５：０または３〜３０：０または１〜１０である、最終産物中の個々のワクチン接種株ａ１：ａ２：ａ３：ａ４の比が、特に好ましい。
【０００８】
獣医学において使用するには、２：１：５または１０：１：３０である比ａ１：ａ２：ａ３の態様、あるいはａ１（トリコフィトン・ベルコスムＣＣＭ  Ｆ−７６５）単独の使用が特に好ましい。
【０００９】
ヒト医学において使用するには、４：２：１０：３または１０：１：３０：２である比ａ１：ａ２：ａ３：ａ４とともに、１：３：１である比ａ１：ａ３：ａ４、および１：２である比ａ２：ａ４の態様、あるいはａ４（トリコフィトン・ルブルムＣＣＭ  ８２９１）単独の使用が特に好ましい。
【００１０】
さらに、最終産物中のワクチン接種株の増殖（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ）型の総量が、１ｍｌあたり少なくとも１００万（１ｍｉｏ）であることが好ましい。１ｍｌあたり少なくとも５００万である総量が、より好ましく、１ｍｌあたり少なくとも１０００万である総量が、最も好ましい。
【００１１】
最終産物のｐＨ範囲は３．０〜１０．０である。この場合、例えばアセテートまたはカーボネート緩衝系などの、当業者が一般的に精通している適切な緩衝系、あるいはクエン酸、酢酸または塩酸などの薬学的に許容しうる有機酸または無機酸を用いる。
【００１２】
好ましいｐＨ範囲は６．０〜８．０である。この場合、当業者が精通している多様な組成のリン酸緩衝系を用いる。
ヒト医学において使用するため、ホルムアルデヒドの総含量は、０．０２％以下であり、そして獣医学において使用するため、該含量は、０．０５％以下である。
【００１３】
不活化後に残存するこの量は、生理的に問題がなく、そして法律によって許容されうる。これはさらに、殺菌剤としての機能を有し、そして予防および療法効果を支持する機能を有する。ホルムアルデヒドは、必要であれば、これに他の物質を補うか、または他の物質をこれに代用することが可能である。特に適切なホルムアルデヒドとは別に、例えばベータ−プロピオノラクトン（ｐｒｏｐｉｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ）、エチレンイミン二元化合物および酢酸などの、化学的手段または物理的適用が使用可能である。
【００１４】
０．０２％または０．０５％未満のホルムアルデヒド総含量が、特に好ましい。
本発明のワクチンは、非経口適用、例えば筋内適用または皮下適用または皮膚上（ｅｐｉｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用可能である。ヒト医学において使用するには、皮膚上適用、すなわち皮膚上の適用および分配が、特に好ましい。特に、ヒトの体の他の部分の皮膚真菌症の主な供給源である、足指間の領域における皮膚上適用が好ましい。上にすでに説明したように、生命を脅かす可能性があるアナフィラキシー反応またはアナフィラキシー様反応のリスクは、皮膚上適用によって最小化可能である。
【００１５】
さらに、ワクチンの非経口適用の場合、通常必要であろうような注射が必要でないため、皮膚上経路の適用にはさらなる利点が伴う。したがって、患者がいかなる痛みにも苦しまず、またより恐れを抱かないため、コンプライアンスが増進する。もちろん、治療を実施する人が、動物の恐れまたは痛みによる危険な反応を予期しないで済むため、同じことが獣医学にもあてはまる。
【００１６】
本発明の別の側面は、皮膚糸状菌症に対する、本発明記載のワクチンを産生する方法を提供し、該方法を以下に記載する：
場合によって増殖型が形成されるまで、糖類および有機結合窒素を含有する、適切な組成の培地としての寒天培地上、ワクチン接種株を、場合によってｐＨを中間調整した後、２５〜２９℃の範囲の温度で、１０〜３０日間、無菌条件下で個々に増殖させる。その後、水性０．１％ホルムアルデヒド溶液中で株をホモジナイズし、そして少なくとも２４〜３６時間、１８〜２６℃の温度で、得た懸濁物を不活化する。ホモジナイズ過程は、胞子の大部分の表面構造が破壊されることなく、菌糸体から分離されるような方式で行う。増殖型の数を測定した後、すべてのワクチン接種株の増殖型の総量が、１ｍｌあたり少なくとも１００万であり、好ましくはワクチン１ｍｌあたり少なくとも５００万であり、ｐＨが３〜１０の間、好ましくは６．０〜８．０の間であり、そして不活化後に存在するホルムアルデヒドの含量が、ヒト医学における適用では０．０２％以下であり、そして獣医学における適用では０．０５％以下であるような方式で、個々の株を場合によって互いに混合し、そしてリン酸緩衝生理食塩水、場合によって、別の方式で緩衝した生理食塩水を補う。
【００１７】
この場合、最終産物中の株ａ１：ａ２：ａ３：ａ４の混合物が、０または２〜１０：０または１〜５：０または５〜３０：０または２〜１０に対応することが好ましく、ここで、上述の混合物比および個々の株が、特に好ましい。
【００１８】
本発明のワクチンの抗原性組成は非常に広いため、相同な属に対する免疫反応、および例えばイヌ小胞子菌（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ）またはウマ白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｅｑｕｉｎｕｍ）などの他の皮膚糸状菌属類との交差反応が検出されている。
【００１９】
以下に、本発明の特に好ましい態様を記載する。これはしかし、本発明を例示するためにのみ働き、本発明を制限するためのものではない。
【実施例】
【００２０】
調製および適用の実施例
（実施例１）
獣医学用のワクチンの調製および該ワクチンの適用
白癬菌属のワクチン接種株を増やし／増殖させるため、１．２％寒天、５．０％糖類および０．３％有機結合窒素を含有する培地を用いた。
【００２１】
蒸気オートクレーブ中、８０〜１００ｋＰａの超過気圧下で、培地を２０〜３０分間滅菌した。ｐＨを６．０〜７．０の値に調整した後、フラスコの底を培地で覆い、そして上述の条件下で滅菌を繰り返した。寒天を固形化し、そして無菌性を管理した後、培地を含む培養フラスコに、ワクチン接種株の懸濁物を個々に接種した。接種には、ワクチン接種株（ＣＣＭ  Ｆ−７６５、ＣＣＭ  ８１６６およびＣＣＭ８２９０）の凍結乾燥培養物またはその場で調製した接種培養物を用いた。接種培養物はすべて、１ｍｌあたり少なくとも５０万の生存ＣＦＵを含有した。ワクチン接種株の接種培養物を、培地表面に分配した。増殖型の最適な形成を達成するため、２５〜２９℃の温度で、１０〜３０日間、培養を行った。真菌抗原の生産性が高いときに、培地表面から培養物を取り除き、そして水性０．１％ホルムアルデヒド溶液中にホモジナイズした。胞子の大部分の表面構造が破壊されることなく、菌糸体から分離されるような方式で、ホモジナイザーを用いたホモジナイズを行った。形成された、均質な懸濁物のアリコットを、個々に保存容器に満たし、そして１８〜２６℃の温度で、２４時間、ワクチン接種株を不活化するために保存した。その後、ビュルケル細胞計数チャンバー中で、個々のワクチン接種株に関して増殖型の数を測定した。この総数は、ワクチン１ｍｌあたり４１００万であった。最終ワクチン調製において、トリコフィトン・ベルコスムＣＣＭ  Ｆ−７６５：トリコフィトン・ベルコスムＣＣＭ  ８１６６：トリコフィトン・メンタグロフィテスＣＣＭ  ８２９０の比が、２：１：５であるような方式で、個々のワクチン接種株を混合した。
【００２２】
ホルムアルデヒドの含量は０．０５％であった。
リン酸緩衝生理食塩水を添加することによって、調製のｐＨを６．０に調整した。
この方式で調製したワクチンを無菌性および増殖型の数に関して試験し、そして白癬症に感染させたウシにワクチン接種するのに用いた。各５ｍｌの用量で２回、筋内ワクチン接種した後、２系統のウシで、再ワクチン接種の１４日後以内に、疾患が治癒した。
【００２３】
通例、療法が１〜３ヶ月かかるような、これまでに用いられた免疫生物学的調製で達成された結果を考慮すると、成功は非常に驚くべきことであった。
（実施例２）
獣医学用のワクチンの調製および該ワクチンの適用
ワクチン接種株を培養するため、１．３％の割合の寒天、１０．０％の糖類含量および０．５％の有機結合窒素含量を有する培地を用いた。蒸気オートクレーブ中、各１２０ｋＰａの超過気圧下で、培地を２回、各３０分間滅菌した。培地のｐＨ値は６．６であった。この培地に、トリコフィトン・ベルコスムＣＣＭ  Ｆ−７６５株の懸濁物を接種し、培養温度を２５〜２６℃に維持した。１５日間培養した後、培養物を０．１％ホルムアルデヒド溶液中でホモジナイズした。２２℃の温度で３６時間不活化した後、リン酸緩衝生理食塩水を添加した。最終ワクチン溶液中のホルムアルデヒド含量は０．０４％であり、ｐＨは７．３であり、そしてワクチン接種株の増殖型の数は、１ｍｌ中２２００万であった。
【００２４】
試験のため、ウシにおいて、該ワクチン溶液を用い、そしてその防御効果は優れていた。
（実施例３）
獣医学用のワクチンの調製および該ワクチンの適用
実施例１に似た方式で、調製を行った。Ｔ．ベルコスムＣＣＭ  Ｆ−７６５株、Ｔ．ベルコスムＣＣＭ  ８１６６株およびＴ．メンタグロフィテスＣＣＭ８２９０株の比は、１０：１：３０であった。ホルムアルデヒド含量は０．０４％であり、ｐＨを８．０に調整し、すべてのワクチン接種株の増殖型の総数は、ワクチン１ｍｌ中８０００万であった。
【００２５】
１ヶ月齢の子ウシにおけるその耐容性に関して、ワクチン溶液を試験した。５頭の子ウシの尻の筋肉に、１０ｍｌのワクチン溶液を筋内投与した。ワクチン接種２４時間前、ワクチン接種時、ワクチン接種４時間後、およびそれに続く４日間、子ウシの体温を直腸測定した。ワクチンは耐容性であり、すべての動物の体温は、生理的値の範囲内に留まった。ワクチン接種した子ウシにおいて、望ましくない局所反応または他の後遺症は観察不能であった。
【００２６】
（実施例４）
ヒト医学用のワクチンの調製および該ワクチンの適用
ワクチン接種株を、１．５％寒天、１５．０％糖類および１．０％有機結合窒素を含有する培地中で増殖させた。
【００２７】
蒸気オートクレーブ中、８０〜１００ｋＰａの超過気圧下で、培地を２回、各２５分間滅菌した。接種、ワクチン接種株の培養、ホモジナイズ、不活化および増殖型の数の測定は、実施例１に上述するのと同じ方式で行った。ワクチン接種株、トリコフィトン・ベルコスムＣＣＭ  Ｆ−７６５、トリコフィトン・ルブルムＣＣＭ  ８２９１、トリコフィトン・メンタグロフィテスＣＣＭ  ８２９０を、１：１：３の比で混合した。
【００２８】
残存ホルムアルデヒドの含量が結果として０．０２％になり、そして最終産物に含有される増殖型の総量が１０００万になるように、適切な量のリン酸緩衝生理食塩水と、得た懸濁物を混合した。緩衝溶液の組成に応じて、ｐＨを６．０〜８．０の間の値に調整した。
【００２９】
増殖型の数、ホルムアルデヒド含量およびｐＨを測定した後、ヒトにおける無菌性および無害性に関して、志願候補でワクチンを試験した。この目的のため、下肢の足指の間の皮膚上にこすりつけることによって、１０ｍｌの量で、週３回、ワクチンを適用した。
【００３０】
ヒトに対して、有害な副作用は検出不能であった。
さらに、実験上の目的のため、白癬症に感染させたウシに対して、ワクチンを２回、皮膚上適用した。非ワクチン接種動物に比較して、治癒の成功が約１週間早く観察可能であったが、これによって、この方式で調製した本発明のワクチンの療法的有効性が立証される。
【００３１】
（実施例５）
ヒト医学に適用するためのワクチンの調製
実施例２にしたがった組成を持つ培地中、２６〜２８℃の温度で、１８日間、ワクチン接種株トリコフィトン・ルブルムＣＣＭ  ８２９１を培養した。２６℃の温度で、０．１％ホルムアルデヒド溶液中、ホモジナイズした培養物を不活化するのには２４時間かかった。不活化懸濁物をリン酸緩衝生理食塩水と混合した後、ｐＨは６．８であり、ホルムアルデヒド含量は０．０１５％であり、そしてワクチン接種株の増殖型の総数は、１ｍｌ中１１００万に達した。
【００３２】
ワクチン溶液を用いて、子ウシにおいて、曝露試験を行った。２回、皮膚上ワクチン接種した子ウシは、ワクチンで処理しなかった対照動物に比較した際、実験的白癬症感染に対して、十分に防御された。
【００３３】
（実施例６）
ヒト医学に適用するためのワクチンの調製
異なる量の２つの皮膚糸状菌株、トリコフィトン・ベルコスムＣＣＭ  Ｆ−７６５およびトリコフィトン・メンタグロフィテスＣＣＭ  ８２９０からワクチン溶液を調製した。これらを培養するため、８．０％糖類および０．８％ペプトンとともに１．５％寒天を含有する培地を用いた。１２０ｋＰａの超過気圧下、蒸気滅菌装置中で、２回、各３０分間、培養物を滅菌した。１ｍｌ接種物あたり１００万の含量を有する、言及したワクチン接種株の懸濁物を、培地に個々に接種した。接種後、２５〜２７℃で１０日間置いた後、０．１％ホルムアルデヒド溶液中、分あたり１０，０００回転で２〜３分間、培養物をホモジナイズした。続いて、ワクチン接種株を不活化するため、１８℃の温度で７２時間、懸濁物を暗所に維持した。培地上のインキュベーション試験によって、不活化を検出した。ホルムアルデヒドの含量が０．０１８％であり、ｐＨが７．１７であり、そしてワクチン接種株の増殖型の数が、１ｍｌ中１５８０万であるような方式で、不活化懸濁物をリン酸緩衝生理食塩水で希釈した。
【００３４】
無害性に関して、ウサギにおいてワクチンを試験した。３ｍｌワクチン溶液を骨盤筋に筋内注射した後、望ましくない局所反応または全身状態における変化は、いずれのウサギにも観察不能であった。
【００３５】
（実施例７）
ヒト医学に適用するためのワクチンの調製
１．２％寒天、１０．０％糖類および０．５％ペプトンの組成を持つ培地上で、ワクチン接種株Ｔ．ベルコスムＣＣＭ  ８１６６およびＴ．ルブルムＣＣＭ  ８２９１を培養した。実施例６と同一条件下で、水中、オートクレーブにおいて、これらの物質を滅菌した。２８〜２９℃での培養を３０日後に終了し、採取した培養物を０．１％ホルムアルデヒド溶液中でホモジナイズし、そして２４℃で２４時間不活化した。ワクチンに存在するＴ．ベルコスムＣＣＭ  ８１６６株およびＴ．ルブルムＣＣＭ  ８２９１株の比は１：２であった。
【００３６】
異なるリン酸水素ナトリウム含量を有するリン酸緩衝生理食塩水を添加することによって、ｐＨを６．０〜８．０の間に調整した。増殖型の数は、ワクチン溶液１ｍｌ中５００万であった。
【００３７】
３頭の子ウシの皮膚の１０ｘ１０ｃｍの領域上をはさみで切り、そして表面に傷をつけて、ワクチン溶液を動物あたり体積５ｍｌで、連続３日間、皮膚上適用した。動物において、局所反応または他のワクチン接種後反応のいずれも観察不能であった。
【００３８】
（実施例８）
ヒト医学用のワクチンの調製および該ワクチンの適用
実施例２にしたがって、培地を調製した。接種、培養および培養物のホモジナイズは、実施例１と同様に行った。ワクチンを調製するため、４つのワクチン接種株を以下の比で用いた：Ｔ．ベルコスムＣＣＭ  Ｆ−７６５：Ｔ．ベルコスムＣＣＭ  ８１６６：Ｔ．メンタグロフィテスＣＣＭ  ８２９０：Ｔ．ルブルムＣＣＭ  ８２９１＝４：２：１０：３。
【００３９】
ワクチン接種株の増殖型の総量は、１ｍｌ中７５００万であり、ホルムアルデヒド含量は０．０１５％であった。
異なる割合のリン酸水素ナトリウムを有するリン酸緩衝生理食塩水溶液を添加することによって、ｐＨを６．０〜８．０の間に調整した。
【００４０】
２人の志願候補において、足指間の領域中、体積２ｍｌで、皮膚上、連続３日間、ワクチン溶液を試験した。ワクチンは無害であり、そして局所でも、また全身状態に関しても、いかなる望ましくない臨床的変化も引き起こさなかった。
【００４１】
（実施例９）
ヒト医学用のワクチンの調製および該ワクチンの適用
株ａ１：ａ２：ａ３：ａ４の比が１０：１：３０：２であり、そして溶液のｐＨが６．９であったことを除いて、実施例８におけるようにワクチン溶液を調製した。
【００４２】
療法のため、足指間の感染領域とともに、真菌症を示す臨床的変化を持つ左足の親指にワクチン溶液を適用した；病原体を単離するのは不可能だった。ワクチン溶液の体積２ｍｌを連続３日間、１日１回、感染皮膚中にこすりつけることによって、３回目の適用７日後に、皮膚変化の治癒が観察可能であった。
【００４３】
上述の説明および実施例から疑う余地なく理解可能であるように、本発明はしたがって、獣医学およびヒト医学において、皮膚糸状菌症の免疫防御および治療のため、非常に有効で、そしてさらに容易に適用可能なワクチンである。獣医学では、本発明のワクチンは、非経口適用、特に筋内適用および皮下適用、並びに皮膚上適用がいずれも可能である。さらに、ヒト医学では、本発明のワクチンは、適切な適用によって、例えば無菌スプレーアンプルでヒト皮膚上にスプレーすることによって、皮膚上適用することが特に好ましい。
【００４４】
したがって、皮膚糸状菌症に対する皮膚上適用のためのワクチンが、初めて、ヒト医学において使用するために提供される。皮膚上適用によって、生命を脅かす可能性があるアナフィラキシー反応またはアナフィラキシー様反応のリスクが排除される。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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