(57)【要約】本発明は、色素形成化合物、並びにカルボキシペプチダーゼＮおよびカルボキシペプチダーゼＵファミリーの酵素を測定するためのその使用に関する。より具体的には、上記本発明は、Ａ＝(1), (2), (3), (4)または(5)であり、R1, R2＝H, -CH3, -CH(CH3)2, -OCH3, -Cl, -CF3, -OCF3, -SCH3であり、R3＝カルボキシペプチダーゼＡにより加水分解され得るアミノ基であり、R4＝塩基性アミノ基である、式(I)の化合物である。
2004533489.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式(I)で示される化合物：
【化１】
2004533489.tif 000106
ここで
【化２】
2004533489.tif 000107
* R1, R2 = H, -CH3, -CH(CH3)2, -OCH3, -Cl, -CF3, -OCF3, -SCH3;
* R3 = カルボキシペプチダーゼＡにより加水分解可能なアミノ酸ラジカル;
* R4 = 塩基性アミノ酸ラジカル。
【請求項２】
以下の式(I)で示される請求項１に記載の化合物：
【化３】
2004533489.tif 000108
ここで
【化４】
2004533489.tif 000109
* R1, R2 = H, -CH3, -CH(CH3)2, -OCH3, -Cl, -CF3, -OCF3, -SCH3;
* R3 = 疎水性アミノ酸ラジカル;
* R4 = アルギニンまたはリシンラジカル。
【請求項３】
R1 = H であり、R2 = -S-CH3 であることを特徴とする、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
R3 が、以下のアミノ酸から選択されることを特徴とする、請求項１または３に記載の化合物：
* チロシン;
* フェニルアラニン;
* アラニン;
* バリン;
* ロイシン;
* イソロイシン;
* フェニルグリシン。
【請求項５】
R3 がフェニルアラニンであることを特徴とする、請求項１または３に記載の化合物。
【請求項６】
R3 がフェニルアラニンまたはチロシンであり、R4 がアルギニンまたはリシンであることを特徴とする、請求項１または３に記載の化合物。
【請求項７】
R3 がチロシンであることを特徴とする、請求項１または３に記載の化合物。
【請求項８】
R1 が -H および -CH3 から選択され、R2 が CH3, O-CH3 および -S-CH3 から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
A が
【化５】
2004533489.tif 000110
であることを特徴とする、請求項１〜８の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
式(I)で示される請求項１に記載の化合物であって、
【化６】
2004533489.tif 000111
であり、R1, R2, R3, R4 が以下に示す化合物により構成される基から選択される化合物：
【化７】
2004533489.tif 000112
（括弧内の数字は、フェニルラジカル上のメチル基の位置を決める）。
【請求項１１】
4-MTPAFYR (4-メチルチオフェニルアゾホルミルチロシンアルギニン) であることを特徴とする、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
生物学的サンプルにおけるカルボキシペプチダーゼＮまたはカルボキシペプチダーゼＵの活性を分析する方法であって、
* 前記サンプルを、該サンプルの加水分解を許容する条件下で、請求項１〜１１の何れか１項に記載の式(I)で示される化合物およびカルボキシペプチダーゼＡと接触させ；
* 式(I)で示される基質およびカルボキシペプチダーゼＡを含有する前記サンプルの着色低下を、該サンプルのＣＰＮまたはＣＰＵによる、並びにＣＰＡによる、式(I)で示される基質の二重加水分解に起因して測定する
方法。
【請求項１３】
R1 = H であり、R2 = -S-CH3 であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
R4 がアルギニンまたはリシンラジカルであることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記基質が、R3 が以下のアミノ酸ラジカルから選択される式(I)で示される化合物であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の方法：
* チロシン;
* フェニルアラニン;
* アラニン;
* バリン;
* ロイシン;
* イソロイシン;
* フェニルグリシン。
【請求項１６】
R3 がチロシンであることを特徴とする、請求項１２〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記基質が、R3 がフェニルアラニンである式(I)で示される化合物であることを特徴とする、請求項１２〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記基質が、R3 がフェニルアラニンであり、R4 がアルギニンまたはリシンである式(I)で示される化合物であることを特徴とする、請求項１２〜１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記基質が、R1 が -H および -CH3 から選択され、R2 が CH3, O-CH3 および -S-CH3 から選択される式(I)で示される化合物であることを特徴とする、請求項２１〜１８の何れか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記基質が、式(I)で示される化合物であって、
【化８】
2004533489.tif 000113
* R1, R2 = H, -CH3, -CH(CH3)2, -OCH3, -Cl, -CF3, -OCF3, -SCH3;
* R3 = カルボキシペプチダーゼＡにより加水分解可能なアミノ酸ラジカル;
* R4 = 塩基性アミノ酸ラジカル
であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記基質が、式(I)で示される化合物であって、
【化９】
2004533489.tif 000114
であり、R1, R2, R3, R4 が以下に示す化合物により構成される基から選択される化合物：
【化１０】
2004533489.tif 000115
（括弧内の数字は、フェニルラジカル上のメチル基の位置を決める）であることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
式(I)で示される前記化合物が、4-MTPAFYR (4-メチルチオフェニルアゾホルミルチロシンアルギニン) である、請求項１２、１３、１５、２０および２１の何れか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記混合物の光学密度を、ＣＰＡを添加しないで測定し、その後ＣＰＡを添加して測定することを特徴とする、請求項１２〜２２の何れか１項に記載の方法。
【請求項２４】
測定される着色の前記低下を、検量線上の値と比較することを特徴とする、請求項１２〜２３の何れか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記サンプルが血液サンプルであることを特徴とする、請求項１２〜２４の何れか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記サンプルが血漿であることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＣＰＡが膵臓ＣＰＡであることを特徴とする、請求項１２〜２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
活性を測定したいカルボキシペプチダーゼＵを活性化するのに必要な時間、前記試験サンプルを、活性化剤バッファーの存在下に導入し、その後セリンプロテアーゼインヒビターの存在下に導入することを特徴とする、請求項１２〜２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
式(I)で示される前記基質を、前記活性化剤バッファーと同時に、または前記セリンプロテアーゼインヒビターと同時もしくはその直後に添加することを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
トロンビン/トロンボモジュリン複合体ルートを用いて活性化を行うことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
サンプルの構成的ＣＰＮまたはＣＰＵの活性および同サンプルの活性化可能なＣＰＮまたはＣＰＵの活性を分析する方法であって、
必要であれば活性を測定したいカルボキシペプチダーゼＵを活性化するのに必要な時間、前記サンプルを活性化剤バッファーの存在下に導入し、その後セリンプロテアーゼインヒビターの存在下に導入した後に観察される、式(I)で示される基質に対する前記サンプルの加水分解活性を、請求項２１に従って活性化剤バッファーの非存在下で分析される、式(I)で示される基質に対する前記サンプルの加水分解活性と比較することを特徴とする方法。
【請求項３２】
前記カルボキシペプチダーゼがＣＰＵであることを特徴とする、請求項２１〜２８の何れか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＣＰＵがＴＡＦＩであることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記サンプルを特異的ＴＡＦＩインヒビターの存在下および非存在下で処理することを特徴とする、請求項２８〜３３の何れか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記特異的ＴＡＦＩインヒビターがＣＰＩであることを特徴とする、請求項２８〜３４の何れか１項に記載の方法。
【請求項３６】
血液サンプル中の活性化されたＴＡＦＩを分析する方法であって、以下の工程を含む方法：
ａ）前記サンプルの第一の部分を特異的ＴＡＦＩインヒビターと接触させ、それを請求項２８に記載の方法を用いて処理する工程；
ｂ）前記サンプルの第二の部分を請求項２８に記載の方法を用いて特異的ＴＡＦＩインヒビターの非存在下で処理する工程；
ｃ）前記サンプル中の活性化されたＴＡＦＩの活性を表す、前記第一の部分と第二の部分との間のΔＯＤを測定する工程。
【請求項３７】
構成的ＴＡＦＩの活性と同サンプル中の活性化可能なＴＡＦＩの活性とを識別するための請求項３６に記載の方法であって、前記サンプルの第三の部分の加水分解活性を、活性化剤バッファーの非存在下で、式(I)で示される基質について測定することを特徴とする方法。
【請求項３８】
サンプル中のカルボキシペプチダーゼＮまたはＵの酵素活性を分析するための、請求項１〜１１の何れか１項に記載の式(I)で示される化合物の使用。
【請求項３９】
前記カルボキシペプチダーゼがＴＡＦＩであることを特徴とする、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
サンプル中のＣＰＮまたはＣＰＵの活性を分析するためのキットであって、請求項１〜１１の何れか１項に記載の化合物により構成される色素形成基質を含むキット。
【請求項４１】
生物学的サンプル中のＴＡＦＩの活性を分析するためのキットであって、以下のものを含むキット：
* ＴＡＦＩ活性化剤バッファー;
* カルボキシペプチダーゼＡ;
* 請求項１〜１１の何れか１項に記載の式(I)で示される基質;
* ＴＡＦＩインヒビター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、色素形成化合物、並びにカルボキシペプチダーゼＮおよびカルボキシペプチダーゼＵファミリー由来の酵素を分析する際の前記化合物の使用に関する。より具体的には、本発明は、血液サンプル中のＴＡＦＩ（Thrombin Activatable Fibrinolysis inhibitor：トロンビン活性化可能なフィブリン溶解インヒビター）の活性を分析する際の前記化合物の使用、並びに対応の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
カルボキシペプチダーゼ (CP) は、エキソペプチダーゼファミリーにおいて酵素の一グループを構成する。カルボキシペプチダーゼは、ポリペプチド鎖におけるアミド結合を最後のＣＯＯＨ末端のアミノ酸で切断する酵素である。カルボキシペプチダーゼは、セリンカルボキシペプチダーゼ、システインカルボキシペプチダーゼおよびメタロカルボキシペプチダーゼを含む。
【０００３】
多くのカルボキシペプチダーゼが、細菌、酵母および植物で単離、配列決定されている。また、これら酵素は、哺乳類において広く種々の組織に存在する。
カルボキシペプチダーゼは、膵臓および多くの細胞から単離されている。血漿中を循環する他のカルボキシペプチダーゼが、クローニング、単離、配列決定されている。
【０００４】
これら酵素はすべて、それらの存在位置および物理的特性の両方に依存して生体内での役割を果たす。よって、カルボキシペプチダーゼは、基質特異性に従って別々に分類される。カルボキシペプチダーゼＡは、比較的広い範囲を有する：カルボキシペプチダーゼＡは、最後のアミノ酸が疎水性(Phe, Leu, Val, Ala)である場合、最後のアミノ酸のＣ末端ペプチド結合を優先的に加水分解する。カルボキシペプチダーゼＡは、２つのカルボキシル基を有するアミノ酸(Asp, Glu)をゆっくりと加水分解し、またグリシン(Gly)をゆっくりと分解し、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン(Arg)、リシン(Lys)、ヒスチジン(His)、またはリシンの低級相同体であるオルニチン(Orn)を加水分解せず、また第二のアミノ酸、例えばプロリン(Pro)またはヒドロキシプロリン(Hyp)を加水分解しない。
【０００５】
カルボキシペプチダーゼＢは、最後の塩基性Ｃ末端アミノ酸、例えばArg、Lysを特異的に加水分解する。このクラスの酵素は、カルボキシペプチダーゼＨ（エンレファリンコンバターゼ（enlephalin convertase）またはカルボキシペプチダーゼＥとしても公知である）、Ｍ、ＮおよびＵにより構成されるサブクラスに更に分けられる。
【０００６】
カルボキシペプチダーゼＥは、ランゲルハンス島、腎上体および下垂体の分泌顆粒、並びに脳に位置している。カルボキシペプチダーゼＭは、多くの培養組織および細胞に存在する膜酵素である。
【０００７】
カルボキシペプチダーゼＮ（これ以降ＣＰＮと称する）は、血漿中を循環する酵素である。この酵素は、循環の際に遊離した塩基性Ｃ末端アミノ酸（好ましくはリシン）を含有するペプチドの血管作用性および炎症性効果に対して生物を保護する。この酵素は、血液中で活性型で存在する。この酵素は、その天然基質、すなわちブラジキニン、キニンおよびアナフィラトキシンのためにキニナーゼとも称される。
【０００８】
最後に、Ｕ（unstable；不安定な）カルボキシペプチダーゼ（これ以降ＣＰＵと称する）は、塩基性Ｃ末端アミノ酸をアルギニンを優先して加水分解するが、カルボキシペプチダーゼＮとは対照的に、活性型であるときに非常に不安定である酵素である。
【０００９】
カルボキシペプチダーゼファミリー由来の酵素に関する最近の総論は、BOUMA et al (1)により記載されている。
ＴＡＦＩは、塩基性亜鉛メタロカルボキシペプチダーゼである(1-4)。より明確には、これは、カルボキシペプチダーゼＵであり、その活性は３７℃で不安定である。この酵素は、ヒトにおけるそのｃＤＮＡおよび対応するアミノ酸配列を含めて、例えば米国特許US 5,206,161に記述され、フィブリン溶解を調節する際の当該酵素の役割については、活性化されたＴＡＦＩの存在下で凝血塊の溶解が遅延することがin vitroで観察されたことにより、初めて予測された。
【００１０】
活性化されたＴＡＦＩは、フィブリンのＣＯＯＨ末端の位置に露出したアルギニンおよびリシン残基を切断する。この加水分解により、フィブリン凝血塊の表面にあるプラスミノゲンおよびｔＰＡ結合部位の数が減少し、これにより、ｔＰＡによるプラスミノゲンのプラスミンへの変換が減少する。
【００１１】
ＴＡＦＩは、アルギニン残基に対するカルボキシペプチダーゼ活性のために、プロカルボキシペプチダーゼＢ（プロＰＣＰＢ）と同定され、その後、不安定なプロカルボキシペプチダーゼ（プロＣＰＵ：Unstable ProCarboxypeptidase）およびプロカルボキシペプチダーゼＲ（ＣＰＲ）と連続して同定された。酵素原の形態は、肝臓で合成され血漿中を循環する、60 kDaの単一鎖の糖タンパク質である。
【００１２】
酵素原は、トロンビンによりarg 92部位においてまず切断される。このタンパク分解により、幾つかのグリコシル化部位を含有する92アミノ酸Ｎ末端ペプチドが遊離する。ＴＡＦＩに対するトロンビンの触媒作用は、二価イオンの存在下でトロンボモジュリンによりかなり増大する。トロンビンにより触媒されるＴＡＦＩの活性化の割合は、トロンボモジュリンとの三重複合系を形成するため、1000倍以上増大する。
【００１３】
活性化されたＴＡＦＩ（ＴＡＦＩａ）は、酵素原のＣ末端触媒領域により構成され、309アミノ酸を含む。
フィブリン溶解プロセスを調節するメカニズムにおいて、活性化されたＴＡＦＩが重要な役割を有するため、種々の病的状況において血漿に存在する構成的な活性化されたＴＡＦＩおよび活性化可能なＴＡＦＩの量を測定可能であることが有用であると速やかに確認される。
【００１４】
特異的な基質を用いて種々のカルボキシペプチダーゼ活性を分析する幾つかの方法が、先行技術において記載されている。
WOLFF et al.(5)は、クロマトグラフィーにより精製された膵臓Ｂカルボキシペプチダーゼに対する合成基質 Hip-Arg, Hip-Lys, Hip-Ormの挙動を、ＵＶ吸収の差異を測定することにより比較した。
【００１５】
1970年に、S. SUZUKI et al.(6)は、試薬ＴＴ（2,4,6-トリクロロ-5-トリアジン）により遊離したベンゾイルグリシンの誘導体化（derivatisating）により、加水分解産物の検出を改良した。この誘導体化（derivation）は、αにおけるグリシンのＣＨ2に対して、、単一の遊離酸官能基へと特異的に作用した。この誘導体は、鮮やかな黄色になった（382 nmでの最大波長）。
【００１６】
ヒプリル(Hippuryl)残基に黄色を発色するこの方法は、その後数人の著者によって広く利用された。
1972年に、K. LORENTZ et al.(7)は、アルギニン着色反応を利用して、試薬としてp-ベンゾキノンを用いてHip-Arg基質に対してＢカルボキシペプチダーゼを作用させることにより、この時間が自由になった。このようにして着色された誘導体は、480 nmに最大波長を有していた。
【００１７】
1980年に、Th. H. Plummer et al.(8)は、合成基質：フリルアクリロイル-Ala-Lysを用いて、カルボキシペプチダーゼＮを定量し、324 nm（近ＵＶであり可視光でない）で読取った。
1985年に、G. H. Fischer et al.(9)は、分析すべきカルボキシペプチダーゼの特定のペプチドのＮ末端ダンシル化により蛍光基質を用いた。このアッセイは、読取りに先立って化学種をうまく分離するため、加水分解産物を抽出する工程が必須である。
【００１８】
1986年に、H. SARUTA et al.は、カルボキシペプチダーゼＡの活性を比色定量法により測定した(10)。彼らは、特定の酵素：“ヒプリカーゼ”を利用して、ＣＰＡを用いたヒドロキシル−ヒプリシル−Phg基質の加水分解により得られたヒプリシル誘導体自体を加水分解した。この反応は、505 nmで吸収するキノンイミド着色剤を与える4-アミノアンチピリンにより最終的に明らかにされた。
【００１９】
1998年に、NAM JOO HONG et al.は、アルギニン類似体であるチアアルギニンと合成基質を用いてＣＰＢsを分析した(11)。
しかし、上述の比色定量法は、ＣＰＮまたはＣＰＵ、とりわけＴＡＦＩの酵素活性を特異的に分析するために使用できないか、あるいは比色定量法による当該タイプの酵素の単純かつ効果的なアッセイ試験と適合しないという欠点がある。
【００２０】
実際、ケースに依存して、
* 着色された生成物を生じる誘導体化（derivatisation）反応は何れも、加水分解の間に遊離される化学種に対して特異的でない；
* あるいは、誘導体化試薬の毒性が高く、工業的規模で使用することができない；
* あるいは、着色の発色方法に時間がかかり、制限的であり、容易に自動化することができない。
【００２１】
1996年に、W. L. Mock et al.は、酵素の加水分解作用の下で脱色する合成基質を用いて、細菌に由来する細胞外亜鉛エンドプロテアーゼ、サーモリシンを分析する方法を記載した(12)。この目的のために、著者らは、アミン官能基にグラフトされたN-(4-メトキシフェニルアゾホルミル)を有するロイシン残基および中性アミノ酸(Leu, Ala, PheまたはGly)により構成されるジペプチド化合物を合成した。
【００２２】
アラゾホルミル基を組込むと、強く着色された化合物が生じる。サーモリシンの存在下で、着色剤分子は、(12-13)に記載されるメカニズムに従って化学的加水分解反応の間に転位し、非着色生成物(アニソールフラグメント, N2, CO2およびアミノ酸)を生じる。従って、培質の脱色速度を利用して酵素速度を求めることは容易である。
【００２３】
同著者は、カルボキシペプチダーゼＡ(13)およびブタの膵臓カルボキシペプチダーゼＢ(14)に対するのと同じ従前の原理に基づいて分光測光法により分析する反応速度論的（kinetic）方法を記載している。
このケースにおいて、使用される化合物は、Ｎ−アラゾホルミル基を有する、カルボキシペプチダーゼＡ(Phe, Leu)またはカルボキシペプチダーゼＢ(Lys)により切断されることが公知の単一のアミノ酸により構成される。これら化合物が非着色生成物へと酵素により切断されたことは、培質の着色低下を測定することにより求められる。
【発明の開示】
【００２４】
この情報から出発して、本発明者らは、カルボキシペプチダーゼＮまたはカルボキシペプチダーゼＵの活性、より詳細にはＴＡＦＩの活性を比色定量法により分析するための着色された新規化合物を合成した。
第一の側面において、本発明は、カルボキシペプチダーゼＮまたはＵのための基質、より詳細には活性化されたＴＡＦＩの基質を構成する新規化合物に関する。これら化合物は色素形成基質である。
【００２５】
本発明の化合物は、以下の一般式(I)で示されるアラゾホルミル化合物であることを特徴とする：
【化１１】
2004533489.tif 000003
ここで
【化１２】
2004533489.tif 000004
* R1, R2 = H, -CH3, -CH(CH3)2, -OCH3, -Cl, -CF3, -OCF3, -SCH3;
* R3 = カルボキシペプチダーゼＡにより加水分解可能なアミノ酸ラジカル;
* R4 = 塩基性アミノ酸ラジカル。
【００２６】
より詳細には、R3は、例えば以下の疎水性アミノ酸ラジカルから選択される：
* チロシン:
【化１３】
2004533489.tif 000005
* フェニルアラニン:
【化１４】
2004533489.tif 000006
* アラニン: R3 = -CH3;
* バリン: R3 = -CH-(CH3)2;
* ロイシン: R3 = -CH2-CH-(CH3)2;
* イソロイシン:
【化１５−１】
2004533489.tif 000007
* フェニルグリシン:
【化１５−２】
2004533489.tif 000008
【００２７】
より明確には、R4は、例えば以下のアミノ酸ラジカルから選択される：
* アルギニン:
【化１６】
2004533489.tif 000009
* リシン: R4 = -(CH2)4-NH2;
* オルニチン: R4 = (CH2)3-NH2。
【００２８】
好ましくは、R3は、芳香族アミノ酸残基、とりわけフェニルアラニンまたはチロシンを表し、R4は、アルギニンまたはリシンを表す。
【００２９】
好ましくは、R1は、
* -H および -CH3
から選択され;
R2は好ましくは、
* -CH3, -O-CH3 および -S-CH3
から選択される。
【００３０】
本発明の化合物の好ましいファミリーは、以下の一般式により表される：
【化１７】
2004533489.tif 000010
ここで
* A =
【化１８】
2004533489.tif 000011
* R1, R2 = -H, -CH3, (CH3)2CH-, CH3-O-, Cl-, -CF3;
* R3 = カルボキシペプチダーゼＡにより加水分解可能なアミノ酸ラジカル;
* R4 = 塩基性アミノ酸ラジカル。
【００３１】
好ましくは、R3は、フェニルアラニンまたはチロシンを表し;
R4 は好ましくは、アルギニンまたはリシンを表す。
【００３２】
好ましくは、R1は、
* -H and -CH3
から選択され;
R2は好ましくは、
* -CH3, -O-CH3 and -S-CH3
から選択される。
【００３３】
本発明で規定されるファミリー由来の特に好ましい化合物は、式(I)で示される化合物であって、
* A =
【化１９】
2004533489.tif 000012
であり、R1, R2, R3, R4 が以下に示す化合物により構成される基から選択される化合物である：
【化２０】
2004533489.tif 000013
（括弧内の数字は、フェニルラジカル上のメチル基の位置を決める）。
【００３４】
とりわけ、上記規定の状況内において、本発明は、A, R1, R2, R3 および R4（その好ましい規定は上述のとおりである）の可能な組み合わせから得られる、式(I)で示される全ての化合物に関する。
【００３５】
以下の記載において、上記規定の化合物は、同様に、「式(I)で示される化合物」または「式(I)で示される基質」と称される。
【００３６】
第二の側面において、本発明は、生物学的サンプルにおけるカルボキシペプチダーゼＮの活性、好ましくはＣＰＵの活性を比色定量分析する方法であって、
* 前記サンプルを、該サンプルの加水分解が可能な条件下で、上述の式(I)で示される色素形成化合物およびカルボキシペプチダーゼＡファミリー由来の酵素と接触させ;
* 該サンプルのＣＰＮまたはＣＰＵによる式(I)で示される前記化合物の加水分解を、前記化合物の吸収スペクトルから選択される波長において（吸収低下に対応する）着色低下を測定することにより決定する
方法に関する。
【００３７】
一方、着色低下は、サンプルのカルボキシペプチダーゼＮまたはＵ、およびカルボキシペプチダーゼＡによる、式(I)で示される基質の二重加水分解に起因する。
【００３８】
本発明の方法は、疎水性アミノ酸がフェニルアラニン、好ましくはチロシンであり、塩基性アミノ酸がアルギニンまたはリシンである式(I)で示される化合物を用いて好ましくは行われる。
【００３９】
本発明の方法は、R1が -Hおよび -CH3から選択され、R2が -CH3, -O-CH3および -S-CH3から選択される式(I)で示される化合物を用いて好ましくは実行される。好適には、式(I)で示される化合物においてR1が Hであるとき、R2は S-CH3である。
【００４０】
本発明の方法は、
【化２１】
2004533489.tif 000014
R1およびR2は、上記意味の何れかであり、R2は、好ましくは-S-CH3である式(I)で示される化合物のファミリーを用いて好適には実行される。
【００４１】
より詳細には、式(I)で示される化合物は、
【化２２】
2004533489.tif 000015
であり、R1, R2, R3, R4 が以下に示す化合物により構成される基から選択される、フェニルアゾホルミル化合物である：
【化２３】
2004533489.tif 000016
（括弧内の数字は、フェニルラジカル上のメチル基の位置を決める）。
【００４２】
使用されるカルボキシペプチダーゼＡは、例えば膵臓または多くの細胞等の種々の供給源から得ることができる。カルボキシペプチダーゼＡは、ヒトまたは動物由来であってもよい。
好ましくは、ウシ由来の膵臓カルボキシペプチダーゼＡは、本発明の状況において使用される。
【００４３】
本発明の方法の原理は、媒質に添加したカルボキシペプチダーゼＡの作用と、分析サンプル中に存在するかもしれないカルボキシペプチダーゼＮまたはカルボキシペプチダーゼＵの作用による、上述の式(I)で示される着色された基質の加水分解に基づくものである。この特異的な加水分解は、出発化合物の着色の消光につながり、これは分光光度計を用いて追跡することができる。
【００４４】
より明確には、上述のカルボキシペプチダーゼＮまたはＵおよびＡの加水分解の特異性、並びに上述の式(I)で示される化合物の構造的特徴に依存するが、カルボキシペプチダーゼＡおよび活性化されたカルボキシペプチダーゼＮまたはＵが前記化合物と接触することにより、カルボキシペプチダーゼＮまたはＵの作用のために、前記化合物の第一のアミノ酸と第二のアミノ酸との間の結合が切断され、その後ほぼ同時に、カルボキシペプチダーゼＡの作用のためにアゾホルミル基と第一のアミノ酸との間の結合が切断される。
【００４５】
二つの反応結果、反応スタート時の媒質は脱色される。従って、着色剤［式(I)で示される化合物］の吸収波長において、好ましくは最大（ピーク）吸収に対応する波長において観察することにより、この着色低下を追跡することは容易である。
【００４６】
この低下は、加水分解の反応速度（kinetic）を表す。サンプル中に最初に存在する活性なカルボキシペプチダーゼＮまたはＵの量は、測定される光学密度を、例えば精製された活性なカルボキシペプチダーゼＮまたはＵの溶液中の濃度範囲から確立することができる検量線の光学密度と比較することにより計算される。
【００４７】
対照的に、サンプルがカルボキシペプチダーゼＮまたはＵを含有していないか、あるいは当該酵素が不活性である場合、式(I)で示される化合物の第一のアミノ酸と第二のアミノ酸との間の切断は起こらず、そのためカルボキシペプチダーゼＡが、第一のアミノ酸上の着色基の結合に作用することができない。よって、反応スタート時の溶液の着色の低下は観察されない。
【００４８】
より詳細には、本発明は、生物学的サンプル、とりわけ全血または純粋な血漿もしくは希釈した血漿等の血液サンプルにおけるＣＰＮまたはＣＰＵの活性を分析する方法、好ましくは血液サンプル、とりわけ純粋な血漿もしくは希釈した血漿におけるＴＡＦＩの活性を分析する方法を提供する。
【００４９】
このケースでは、バッファー溶液、必要であれば活性を測定するカルボキシペプチダーゼの活性化剤を含むバッファー溶液（これ以降活性化剤バッファーと称する溶液）の存在下に、まず試験サンプルを導入し、調査されるカルボキシペプチダーゼを活性化するのに必要な時間インキュベートする。好ましくは、インキュベーションは、周囲温度で５〜２０分間、好適には８〜１２分間、好ましくは１０分間行う。
【００５０】
本発明の好ましい実施において、カルボキシペプチダーゼ活性化剤は、カルボキシペプチダーゼＵ、とりわけＴＡＦＩを活性化するために作用することが可能な活性化剤、とりわけ凝固因子とすることができる。
【００５１】
このケースでは、その後、当該混合物にセリンプロテアーゼインヒビターを添加して、凝固プロセスに妨害を引き起こす。セリンプロテアーゼインヒビターは、例えば、PPACK (H-D-Phe-Pro-Arg-クロロメチルケトン-Bachem - Ref. No. 1065)であり、これは、最終濃度範囲 1 〜 50 μM、好ましくは 30 μMで使用され、初期濃度 10 〜 250 μM、好ましくは 150 μMに相当する。また、0.1 mMの濃度で優先的に使用される、Pefabloc [4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフルオライドヒポクロライド - Penthapharm - Ref. 399.01] 等の他の化合物も適切である。
【００５２】
インヒビターを添加するのと同時もしくは直後に、本発明の式(I)で示される化合物の一つを水溶液で添加する。この化合物は、最終濃度範囲 0.25 〜 10 mM、好ましくは 0.25 〜 2.5 mM、好適には 0.25 〜 1 mMで一般に使用される。この化合物は、好ましくは0.4 mMの濃度で使用される。
【００５３】
好ましくは周囲温度での新たなインキュベーション期間（この間に、式(I)で示される基質が、活性を調査したいサンプルのＣＰＮまたはＣＰＵにより、その第二のアミノ酸で切断される）の後、ＨＣｌの添加により加水分解を停止し、その直後に塩基を添加してｐＨを７〜８の範囲の値に再調整することができる。
【００５４】
その後、得られた混合物の光学密度の一回目の測定を、媒質にＣＰＡを添加することなく行う。その後ＣＰＡを媒質に添加して、ＯＤを再度測定する。この低下は、分光光度計を用いて求めることができる。これは、サンプルのＣＰＵまたはＮおよびＣＰＡの共同作用による、式(I)で示される基質の加水分解を表す。
【００５５】
測定されたデルタＯＤ (ΔＯＤ) を、例えば調査されるＣＰＮまたはＣＰＵを欠損したサンプルであって、精製されたＣＰＮまたはＣＰＵでオーバーロードされたサンプルから得ることができる検量線上の値と比較する。
【００５６】
上述のプロトコールは、本発明の好ましい実施を構成する。しかし、種々の化合物を添加する順序および前記化合物の種類に関しては、幾つかのバリエーションを予測することができる。また、幾つかの変化は、本発明の規定に包含される。
【００５７】
従って、例えば、本方法の開始から、凝固活性化剤バッファーと同時に、式(I)で示される基質を組込むことが可能である。
同様に、同じ反応媒質の二つの部分を用いて、その一つのみをＣＰＡで処理して、アッセイを行うこともできる。その後、これら二つの部分の間のΔＯＤを測定する。
【００５８】
活性化剤バッファーが凝固を活性化する場合、当業者に公知であり、凝固試験で慣例的に使用される種々のルートを用いて活性化を行うことができる。
【００５９】
これら活性化ルートは、詳細には以下のとおりである：
* トロンビン/トロンボモジュリン複合体による活性化ルート。この第一の可能性は、本発明の好ましい実施を構成する；
* 活性化因子XIの活性化ルート。この場合、活性化因子XIが、活性化剤バッファー中のトロンビンに取って代わる。反応を促進するため、媒質にトロンボモジュリンを添加することが好適である；
* とりわけヘビの毒物である毒物の活性化ルート。プロトロンビンおよび/またはトロンボモジュリンの媒質への添加も可能である。好ましい毒物は、「トロンビン様」毒物ファミリーに由来する毒物、例えばArkistrodon rhodostomaまたはBathrops atroxの毒物、およびプロトロンビン活性化剤毒物、例えばNotechis scutatusまたはEchis carinatus由来の毒物である(15-18)；
* リン脂質およびカルシウムの存在下での組織因子の活性化ルート（クイックタイム原理(Quick time principle)を用いた外因性ルートの活性化）；
* 接触相（contact phase）の活性化ルート；
* プラスミンの活性化ルート。
【００６０】
好適には、本発明の方法は、同一のサンプルについて、サンプル中に存在する「構成的な(constitutional)」ＣＰＮおよび/またはＣＰＵの活性、すなわち「天然に」活性な形態で存在するＣＰＮおよび/またはＣＰＵの活性（すなわち、活性化剤バッファーにより活性化を誘導しない）を最初に測定し、次に、活性化可能なＣＰＮおよび/またはＣＰＵの活性、すなわち不活性な形態でサンプル中に存在するＣＰＮおよび/またはＣＰＵの活性（この活性は、活性化剤バッファーにリンクした活性化プロセスの間に誘導され生じる）を測定することができる。
【００６１】
この目的のために、式(I)で示される基質に対するサンプルの加水分解活性を、上述の方法を利用して、活性化剤バッファーの存在下にあるサンプル（サンプル中のＣＰＮまたはＣＰＵの全活性の検出）または活性化剤を含まない生理学的バッファーの存在下にあるサンプル（構成的なＣＰＮおよび/またはＣＰＵの活性の検出）を用いて比較する。
二つの測定の間の差（ΔＯＤ）は、サンプル中に存在する、活性化可能なＣＰＮまたはＣＰＵの活性を示す。
【００６２】
好ましいバリエーションにおいて、本発明は、生物学的サンプル、とりわけ血液サンプル中の活性化されたＴＡＦＩを分析する方法であって、上述の式(I)で示される化合物または基質の一つを用いた方法に関する。
構成的なＴＡＦＩおよび/または活性化可能なＴＡＦＩの活性は、特異的なＴＡＦＩインヒビターの存在下および非存在下で、規定したとおりサンプルを処理することにより測定される。
【００６３】
好ましいインヒビターは、ＣＰＩ (ポテト塊茎のカルボキシペプチダーゼインヒビター)であり、ＴＡＦＩの機能に関するインビトロおよびインビボ研究におけるＣＰＩの利用は、文献（参考文献１）に広く記載されている。今日、ＣＰＩが、他の血漿ＣＰの活性を変化させることなくＴＡＦＩを特異的に阻害することは当業者に周知である。本発明の方法の状況内において、ＣＰＩは、0.10 〜 0.50 mM (初期濃度) の濃度範囲、すなわち最終濃度で表現すると 2 〜 10 μMの濃度範囲で使用することができる。ＣＰＩは、7 μM (最終濃度)、すなわち0.38 mM (初期濃度)で好ましくは使用される。
【００６４】
この好ましいバリエーションの原理に従って、サンプルは、ＴＡＦＩ活性化バッファー、例えばトロンビン/トロンボモジュリン複合体による凝固のための活性化バッファーにより活性化され、上述の方法を用いて、ＴＡＦＩインヒビターの存在下または非存在下で処理される。
よって、ＴＡＦＩインヒビターを含む媒質と含まない媒質の着色の差により、サンプル中の活性化されたＴＡＦＩ(ＴＡＦＩａ)の酵素活性を測定することが可能である。
【００６５】
より明確には、本発明の方法は、以下のプロトコールを用いて行うことができる：サンプル中に含有されるＴＡＦＩの全活性を測定したいか、あるいは構成的なＴＡＦＩの活性と活性化可能なＴＡＦＩの活性との間の差を測定したいかに依って、試験サンプルを２つの部分、必要であればそれ以上の部分に分ける。
* ＴＡＦＩインヒビターを含有する第一の部分を、上述の方法を用いて活性化し、処理する。これは、媒質の僅かな脱色を生じるのみであり、サンプル中に存在する他のカルボキシペプチダーゼによる、式(I)で示される基質の副次的な加水分解から生じたものである；
* 第二の部分を、同じ方法であるがＴＡＦＩの非存在下で処理する。これは、サンプル中の活性化されたＴＡＦＩによる、式(I)で示される基質の加水分解にリンクした、媒質の激しい脱色に至る；
* 第一の部分と第二の部分との間の着色の差 (ΔＯＤ) を測定する。これは、サンプル中の活性化されたＴＡＦＩの特異的活性を表す。
【００６６】
活性化可能なＴＡＦＩの特異的な活性と構成的なＴＡＦＩの活性とを区別したい場合、
同サンプルの第三の部分を使用して、第三の部分の加水分解活性を、活性化剤バッファーを媒質に添加しないことにより活性化を触発しないで、式(I)で示される基質について測定する。
これら異なる部分の間のΔＯＤは、サンプルの全ＴＡＦＩ活性または構成的なＴＡＦＩのみの活性の何れかを示し、これにより、活性化可能なＴＡＦＩの活性を推論することができる。
【００６７】
第三の側面において、本発明は、ＣＰＮまたはＣＰＵを分析するための診断キットであって、上記規定の式(I)で示される基質を含む診断キットに関する。
好ましくは、本発明の診断キットは、血液サンプル中のＴＡＦＩ活性を測定するためのキットである。
【００６８】
前記診断キットは、
* ＴＡＦＩ活性化剤、とりわけＴＡＦＩ活性化剤バッファー;
* カルボキシペプチダーゼＡ;
* 式(I)で示される基質;
* ＴＡＦＩインヒビター。
を含む。
【００６９】
また、このキットは、セリンプロテアーゼインヒビターを任意に含む。
これら構成成分の各々は、好ましくは粉の形態またはフリーズドライされた形態である。
【実施例】
【００７０】
以下の実施例および図面により本発明を説明する。
【００７１】
例１：
本発明に従ったアゾールホルミル化合物群の合成
下記表１に、本発明の式(I)で示される化合物のうち８つの好ましい化合物の化学式を示す。ＵＶ-可視分光光度計(UVIKON-KONTRON)を用いて測定されたこれらの吸収スペクトルを図１に示す。これらの１つである化合物４(MxPAFFR)の合成を以下に詳述する。
この化合物について以下に記載する工程は、その他の各化合物と同一であるが、例外として化合物５(MxPAFFK)では、リシンを脱保護するための追加の工程が必要であった（後述の反応スキームおよび説明を参照されたい）。
【００７２】
表１
【表１−１】
2004533489.tif 000017
【００７３】
【表１−２】
2004533489.tif 000018
【００７４】
【表１−３】
2004533489.tif 000019
【００７５】
Ａ/ 4-メトキシフェニルアゾホルミルフェニルアラニルアルギニン（化合物４）の合成：
序論：以下に記す全ての工程は、各着色剤について同一であった。各工程は、高速液体クロマトグラフィーを用いて、フェニルアラニンおよびアルギニンのカップリングについてはアミノ酸分析を用いてモニターされた。
【００７６】
第１工程：グリニャール試薬
反応スキーム：
【化２４】
2004533489.tif 000020
【００７７】
オペレーティング・モード：１当量の4-ブロモアニソールおよび１当量のマグネシウムを調製した。マグネシウムおよび20重量％の4-ブロモアニソールを、３つ口フラスコ内に導入し、無水テトラヒドロフラン(2 mL/mmol）中に溶解し、堆積物(assembly)を窒素下に置いた。３つ口フラスコをガスバーナー(blow torch)を用いて一点で加熱することにより反応を開始し；反応混合物は茶色に変化した。反応が開始したら（マグネシウム表面に気泡）、90℃の還流下に置き、次いで、無水THF（2 mL/mmol）中に溶解した残留する4-ブロモアニソールをゆっくりと添加した。還流を１時間後に停止させた。4-メトキシフェニルマグネシウムブロマイドを、次の工程の合成に用いた（茶色）。
【００７８】
ＮＢ：ガラス容器とマグネシウムとを初めに120℃でオーブン乾燥させ、他の生成物をデシケーター内で乾燥させた。
保持時間：グリニャール試薬が非常に不安定で水感受性の化合物であるため、HPLC分析の間に形成された分解産物について３つの特徴的な保持時間が得られた：
保持時間１：2.68分；
保持時間２：3.32分；
保持時間３：5.38分。
【００７９】
第２工程：ジ-t-ブチルアゾジカルボキシレートとのカップリング
反応スキーム
【化２５】
2004533489.tif 000021
【００８０】
オペレーティング・モード：１当量のジ-t-ブチルアゾジカルボキシレートおよび１当量の4-メトキシフェニルマグネシウムブロマイド（グリニャール試薬）を無水THF（2 mL/mmol)中に溶解した。各々を０〜５℃の間で冷却した。グリニャール試薬をジ-t-ブチルアゾジカルボキシレートに添加した。これを10分間撹拌し、1.02当量の酢酸を添加し、次いで周囲温度にまで戻した。水／エーテル抽出を行った。エーテル相を乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。黄色の油状物を得た。
保持時間：7.85分。
【００８１】
第３工程：脱保護
反応スキーム
【化２６】
2004533489.tif 000022
【００８２】
オペレーティング・モード：１当量のN,N’-ビス-(t-ブトキシカルボニル)-4-(メトキシ)フェニルヒドラジンをイソプロパノール（10.2 mL/mmol）中に溶解し、次いでジオキサン（2 mL/mmol）中のHCl 4.8 Mを添加した。これを加熱して還流させた（80℃）。15分後、冷却し、エーテルを添加した（5 mL/mmol）。4-メトキシフェニルヒドラジンヒドロクロライドが沈殿した。これを濾過し、乾燥させた。粉末を水中に溶解し、次いでpHを７にした。水／ジクロロメタン抽出を行い、ジクロロメタンを蒸発させて乾燥させた。4-メトキシフェニルヒドラジン（黄色の粉末）を得、乾燥させた。
保持時間：2.20分。
【００８３】
第４工程：ジフェニルカーボネートとのカップリング
反応スキーム：
【化２７】
2004533489.tif 000023
【００８４】
オペレーティング・モード：1.4当量のジフェニルカーボネートをベンゼン（0.25 mL/mmol）中に溶解し、120℃で加熱して還流させた。ベンゼン（0.7 mL/mmol）中に溶解した１当量の4-メトキシフェニルヒドラジンをゆっくりと添加した。６時間後還流を停止させた。反応媒質(reaction medium)を濃縮し、次いでヘキサン／ベンゼン結晶化を行った（4/1）。白色がかった結晶を濾過し、デシケーター内で乾燥させた。
保持時間：6.74分。
【００８５】
第５工程：フェニルアラニンとのカップリング
反応スキーム
【化２８】
2004533489.tif 000024
【００８６】
オペレーティング・モード：ジメチルホルムアミド（3.33 mL/mmol）中に溶解した1.2当量のフェニルアラニントリエチルアンモニウム塩を加熱して還流させた（95℃）。ジメチルホルムアミド（2 mL/mmol）中に溶解した１当量の4-メトキシフェニルヒドラゾホルメートをゆっくりと添加した。１時間30分後に還流を停止させ、周囲温度にまで冷却し、濃縮した。これを酸性にした（pH＝２）。クロマトグラフィにより精製した（白色がかった結晶）。
保持時間：6.12分。
【００８７】
第６工程：酸化；「ヒドラゾ」型から「アゾ」型への変化
反応スキーム
【化２９】
2004533489.tif 000025
【００８８】
オペレーティング・モード：１当量のN-(4-メトキシフェニルヒドラゾホルミル)-L-フェニルアラニンを、１当量の水酸化ナトリウムおよび１当量の酢酸アンモニウムを含んだ超純水（20.8 mL/mmol）中に溶解した。超純水（4.2 mL/mol）中に溶解した１当量のメタ過ヨウ素酸ナトリウムを添加した。20分後、反応媒質を酸性にし（pH＝２）、次いでクロマトグラフィにより精製した（橙色の結晶）。
保持時間：6.86分。
【００８９】
第７工程：アルギニンとのカップリング
反応スキーム
【化３０】
2004533489.tif 000026
【００９０】
オペレーティング・モード：１当量のアルギニンメチルエステルヒドロクロライドをジメチルホルムアミド（3 mL/mmol)中に溶解した。1.１当量のDIAE（ジイソプロピルエチルアミン）、１当量のN-(4-メトキシフェニルアゾホルミル)-L-フェニルアラニン、次いで1.１当量のTBTU（O-ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート）を添加した。必要量のDIAEを添加して、pHを７〜８とした。５分後、これを蒸発させて乾燥させ、クロマトグラフィにより精製した（橙色の結晶）。
保持時間：6.06分。
【００９１】
第８工程：鹸化
反応スキーム
【化３１】
2004533489.tif 000027
【００９２】
オペレーティング・モード：１当量のN-(4-メトキシフェニルアゾホルミル)-L-フェニルアラニンアルギニンメチルエステルを水／メタノール混合物（比：1/2；3 mL/mmol)中に溶解した。３当量の1N 水酸化ナトリウムを添加した。１時間後、反応媒質を酸性にし、濃縮し、次いで水／ジクロロメタンを用いて抽出した。ジクロロメタン相を蒸発させ、次いで乾燥させた。N-(4-メトキシフェニルアゾホルミル)-L-フェニルアラニルアルギニンを橙色の粉末として得た。
保持時間：5.5分。
【００９３】
最終生成物のアミノ酸分析を酸加水分解後に行い、配列の同質性(sequence homogeneity)を検査した。この分析の結果を図２のクロマトグラムに示す。
分析条件：
・HPLC AAA ライン：PITC（フェニルイソシアネート）プレカラム誘導化（derivatization）；
・C18カラム；100A；5μ；250 x 4.6mm；
・254nmで検出；流速＝1mL/分；
・溶出剤：
Ａ：pH 5.74 酢酸緩衝液；
Ｂ：70％ CH3CN，30％ AcONa 緩衝液；32mM；pH＝6.10；
Ｃ：CH3CN。
【００９４】
他の化合物のための合成プロトコールは上述したものと同様の工程に基づく。これらを下記の反応スキームにまとめる。
上記化合物の合成の各工程で得られた保持時間を下記表IIに示す：
【００９５】
表II：合成された他の着色剤の各工程においてHPLCを用いて得られた保持時間
【表２】
2004533489.tif 000028
【００９６】
分析条件：
・C18カラム；5μ；100 x 4.6mm；
・254nmで検出；流速＝1mL/分；
・勾配：0’→10％Ｂ；10’→90％Ｂ
・Ａ：１％トリフルオロ酢酸を含んだ水
Ｂ：0.1％トリフルオロ酢酸を含んだアセトニトリルを用いる。
【００９７】
Ｂ/ 2,3-ジメチルフェニルアゾホルミルフェニルアラニルアルギニン（化合物１）の合成：
第１工程：グリニャール試薬
【化３２】
2004533489.tif 000029
【００９８】
第２工程：ジ-t-ブチルアゾジカルボキシレートとのカップリング
【化３３】
2004533489.tif 000030
【００９９】
第３工程：脱保護
【化３４】
2004533489.tif 000031
【０１００】
第４工程：ジフェニルカーボネートとのカップリング
【化３５】
2004533489.tif 000032
【０１０１】
第５工程：フェニルアラニンとのカップリング
【化３６】
2004533489.tif 000033
【０１０２】
第６工程：酸化；「ヒドラゾ」型から「アゾ」型への変化
【化３７】
2004533489.tif 000034
【０１０３】
第７工程：アルギニンとのカップリング
【化３８】
2004533489.tif 000035
【０１０４】
第８工程：鹸化
【化３９】
2004533489.tif 000036
【０１０５】
Ｃ/ 2,4-ジメチルフェニルアゾホルミルフェニルアラニルアルギニン（化合物２）の合成：
第１工程：グリニャール試薬
【化４０】
2004533489.tif 000037
【０１０６】
第２工程：ジ-t-ブチルアゾジカルボキシレートとのカップリング
【化４１】
2004533489.tif 000038
【０１０７】
第３工程：脱保護
【化４２】
2004533489.tif 000039
【０１０８】
第４工程：ジフェニルカーボネートとのカップリング
【化４３】
2004533489.tif 000040
【０１０９】
第５工程：フェニルアラニンとのカップリング
【化４４】
2004533489.tif 000041
【０１１０】
第６工程：酸化：「ヒドラゾ」型から「アゾ」型への変化
【化４５】
2004533489.tif 000042
【０１１１】
第７工程：アルギニンとのカップリング
【化４６】
2004533489.tif 000043
【０１１２】
第８工程：鹸化
【化４７】
2004533489.tif 000044
【０１１３】
Ｄ/ 2,5-ジメチルフェニルアゾホルミルフェニルアラニルアルギニン（化合物３）の合成：
第１工程：グリニャール試薬
【化４８】
2004533489.tif 000045
【０１１４】
第２工程：ジ-t-ブチルアゾジカルボキシレートとのカップリング
【化４９】
2004533489.tif 000046
【０１１５】
第３工程：脱保護
【化５０】
2004533489.tif 000047
【０１１６】
第４工程：ジフェニルカーボネートとのカップリング
【化５１】
2004533489.tif 000048
【０１１７】
第５工程：フェニルアラニンとのカップリング
【化５２】
2004533489.tif 000049
【０１１８】
第６工程：酸化；「ヒドラゾ」型から「アゾ」型への変化
【化５３】
2004533489.tif 000050
【０１１９】
第７工程：アルギニンとのカップリング
【化５４】
2004533489.tif 000051
【０１２０】
第８工程：鹸化
【化５５】
2004533489.tif 000052
【０１２１】
Ｅ/ 4-メトキシフェニルアゾホルミルフェニルアラニルリシンの合成：
第１工程：グリニャール試薬
【化５６】
2004533489.tif 000053
【０１２２】
第２工程：ジ-t-ブチルアゾジカルボキシレートとのカップリング
【化５７】
2004533489.tif 000054
【０１２３】
第３工程：脱保護
【化５８】
2004533489.tif 000055
【０１２４】
第４工程：ジフェニルカーボネートとのカップリング
【化５９】
2004533489.tif 000056
【０１２５】
第５工程：フェニルアラニンとのカップリング
【化６０】
2004533489.tif 000057
【０１２６】
第６工程：酸化；「ヒドラゾ」型から「アゾ」型への変化
【化６１】
2004533489.tif 000058
【０１２７】
第７工程：リシンとのカップリング
【化６２】
2004533489.tif 000059
【０１２８】
第８工程：鹸化
【化６３】
2004533489.tif 000060
【０１２９】
第９工程：脱保護
この特定の化合物は、リシン側鎖（ε-boc：N-ε-tertioブトキシカルボニル）を脱保護するために、追加の工程を必要とした。
【化６４】
2004533489.tif 000061
【０１３０】
オペレーティング・モード：１当量のN-(4-メトキシフェニルアゾホルミル)-L-フェニルアラニル-L-リシン（ε-Boc）をフラスコ内のジクロロメタン（3 mL/mmol）中に溶解した。撹拌を開始した。トリフルオロ酢酸（3 mL/mmol）を含んだ滴下漏斗(dropping funnel)を連結した。これをゆっくり添加した（滴下）。15分後、反応媒質を濃縮し、高速液体クロマトグラフィにより精製した。最後に橙色の粉末を得た。
【０１３１】
Ｆ/ 3-クロロ-p-トリルアゾホルミルフェニルアラニルアルギニン（化合物６）の合成：
第１工程：グリニャール試薬
反応スキーム
【化６５】
2004533489.tif 000062
【０１３２】
第２工程：ジ-t-ブチルアゾジカルボキシレートとのカップリング
反応スキーム
【化６６】
2004533489.tif 000063
【０１３３】
第３工程：脱保護
反応スキーム
【化６７】
2004533489.tif 000064
【０１３４】
第４工程：ジフェニルカーボネートとのカップリング
反応スキーム
【化６８】
2004533489.tif 000065
【０１３５】
第５工程：フェニルアラニンとのカップリング
反応スキーム
【化６９】
2004533489.tif 000066
【０１３６】
第６工程：酸化；「ヒドラゾ」型から「アゾ」型への変化
反応スキーム
【化７０】
2004533489.tif 000067
【０１３７】
第７工程：アルギニンとのカップリング
反応スキーム
【化７１】
2004533489.tif 000068
【０１３８】
第８工程：鹸化
反応スキーム
【化７２】
2004533489.tif 000069
【０１３９】
Ｇ/ 3-クロロ-p-トリルアゾホルミルフェニルアラニルアルギニン（化合物７）の合成：
第１工程：グリニャール試薬
反応スキーム
【化７３】
2004533489.tif 000070
【０１４０】
第２工程：ジ-t-ブチルアゾジカルボキシレートとのカップリング
反応スキーム
【化７４】
2004533489.tif 000071
【０１４１】
第３工程：脱保護
反応スキーム
【化７５】
2004533489.tif 000072
【０１４２】
第４工程：ジフェニルカーボネートとのカップリング
反応スキーム
【化７６】
2004533489.tif 000073
【０１４３】
第５工程：フェニルアラニンとのカップリング
反応スキーム
【化７７】
2004533489.tif 000074
【０１４４】
第６工程：酸化；「ヒドラゾ」型から「アゾ」型への変化
反応スキーム
【化７８】
2004533489.tif 000075
【０１４５】
第７工程：アルギニンとのカップリング
反応スキーム
【化７９】
2004533489.tif 000076
【０１４６】
第８工程：鹸化
反応スキーム
【化８０】
2004533489.tif 000077
【０１４７】
Ｈ/ 4-メチルチオフェニルアゾホルミルフェニルアラニルアルギニン（化合物８）の合成：
第１工程：グリニャール試薬
【化８１】
2004533489.tif 000078
【０１４８】
第２工程：ジ-t-ブチルアゾジカルボキシレートとのカップリング
【化８２】
2004533489.tif 000079
【０１４９】
第３工程：脱保護
【化８３】
2004533489.tif 000080
【０１５０】
第４工程：ジフェニルカーボネートとのカップリング
【化８４】
2004533489.tif 000081
【０１５１】
第５工程：フェニルアラニンとのカップリング
【化８５】
2004533489.tif 000082
【０１５２】
第６工程：酸化；「ヒドラゾ」型から「アゾ」型への変化
反応スキーム
【化８６】
2004533489.tif 000083
【０１５３】
第７工程：アルギニンとのカップリング
【化８７】
2004533489.tif 000084
【０１５４】
第８工程：鹸化
【化８８】
2004533489.tif 000085
【０１５５】
Ｉ/ 4-メチルチオフェニルアゾホルミルチロシルアルギニン（化合物９）の合成：
第１工程：グリニャール試薬
【化８９】
2004533489.tif 000086
【０１５６】
第２工程：ジ-t-ブチルアゾジカルボキシレートとのカップリング
【化９０】
2004533489.tif 000087
【０１５７】
第３工程：脱保護
【化９１】
2004533489.tif 000088
【０１５８】
第４工程：ジフェニルカーボネートとのカップリング
【化９２】
2004533489.tif 000089
【０１５９】
第５工程：チロシンとのカップリング
【化９３】
2004533489.tif 000090
【０１６０】
第６工程：酸化；「ヒドラゾ」型から「アゾ」型への変化
【化９４】
2004533489.tif 000091
【０１６１】
第７工程：アルギニンとのカップリング
【化９５】
2004533489.tif 000092
【０１６２】
第８工程：鹸化
【化９６】
2004533489.tif 000093
【０１６３】
例２：
１ - アッセイの原理および使用した主な試薬
ＴＡＦＩａ酵素活性の原理
【化９７】
2004533489.tif 000094
【０１６４】
２．本発明の方法に従ってＴＡＦＩの活性を分析するためのプロトコールの例
a) 第一オペレーティング・モード：トロンビン - トロンボモジュリン方法
試験用血漿サンプルを２つの部分に分け、一つにはPIC (Calbiochem - ref 217359)を補充し、もう一つはHepesバッファーを補充した。
【０１６５】
その後、２つの部分を以下の原理に従って同一の方法で処理した：
ＴＡＦＩの活性化
Hepesバッファーで1/20希釈された150 μlの血漿 (精製されたTAFI, Hepesバッファー中に13 μg/ml);
10 μlのPIC または H2O;
周囲温度で５分;
150 μlの凝固活性化剤バッファー;
周囲温度で10分;
100 μl PPACK + 100 μl MxPAFFR (基質) (5 mM)。
【０１６６】
ＴＡＦＩ活性試験
周囲温度で30分;
100 μl HCl 1M + 100 μl NaOH 1M;
発色：
Hepesバッファーで1/3に希釈;
382 nmで OD を読取る;
25 μl カルボキシペプチダーゼＡ;
382 nmで１分間 OD を読取る。
【０１６７】
第一オペレーティングモードの可能なバリエーション：
* アッセイは、37℃の温度で行うことができる;
* 基質は、活性化剤バッファーと同時に、はじめから(ab initio)取り込むことができる;
* 読取りは、HPLCにより行うことができる。
【０１６８】
種々の生成物についての好ましい最終濃度：
* PPACK: H-D-Phe-Pro-Arg-クロロメチルケトン, MW = 451  30 μM (Bachem - ref n° 1065);
* Pefabloc: PPACKの代わりに使用することができる: 0.1 mM (Pentapharm - ref 399.01);
* 基質 (MxPAFFR): 1 mM;
* カルボキシペプチダーゼＡ: ウシ膵臓由来 (Sigma - ref C 0386)。
5000 ユニットを有する5.1 mlフラスコ、21 mg prot/ml, 47 units/mg タンパク質。
CPAを、プレフィルター、5 μm フィルターおよび0.45 μm フィルターで濾過し、それにmlのH2Oを添加した。
* PIC: 7 μMで使用
【０１６９】
1 mg のPCI は、製造者 (Calbiochem)により示されるとおり、約8 mg の TAFI (50 U/mg)を 50% 阻害することができる。
30 μM PPACKの濃度は、150 μMの初期濃度に相当する。1 mM の基質の最終濃度は、5 mMの初期濃度に相当する。7 μM CPIの最終濃度は、0.38 mMの初期濃度に相当する。
本発明者らは、上記濃度をモニターして4 μMに低下したPPACKの最終濃度および低下した基質の最終濃度を使用することができることを観察した。
【０１７０】
活性化剤バッファー：
* 本発明において凝固を活性化する好ましいルートは、トロンビン/トロンボモジュリン複合体による活性化ルートである。このケースにおいて、使用する活性化剤バッファーは、以下の構成成分を含む：
0 〜 80 nM、好ましくは10 nMのトロンボモジュリン37 μl (ウサギ肺トロンボモジュリン - American Diagnostica - ref 237);
0.2 〜 10 NIH/ml、好ましくは0.8 NIH/mlのトロンビン6 μl (Diagnostica Stago- リサーチ・プロダクト);
0 〜 80 nm、好ましくは40 nMの塩化カルシウム750 μl;
705 μl のHepesバッファー, 9.4 mM, pH = 7.6。
【０１７１】
濃度は、最終体積1498 μlの活性化剤バッファーについて示す。
NB: Hepesバッファーは以下のものを含む: 20 mM Hepes, 4 mM KCl および 1% BSA。他の試験は、20 mM Hepesおよび150 mM NaClを用いて行った。
* 本説明において記載したとおり、他の活性化ルート、とりわけ因子XIaによる活性化ルートが可能である。
このケースにおいて、活性化剤バッファーの一例は、以下の構成成分を含有する：
5 μl のトロンボモジュリン, 30 U/ml;
30 μl の 純粋な因子XIa (Calbiochem - ref 233483);
88 μl Hepesバッファー, pH = 7.4 (Hepes 20 mMおよびNaCl 150 mM)。
濃度は一例として示し、当業者により再調整することができる。
【０１７２】
b) 第二オペレーティング・モード: トロンビン生成方法
凝固の別の活性化ルートは、トロンビンを含み、接触相に対する活性化剤の実行（implementation）を必要とする。
【０１７３】
【表Ａ】
2004533489.tif 000095
【０１７４】
例３：
トロンビン/トロンボモジュリン方法における検量線の確立
以下の図３は、0 〜 26 μg/mlのＴＡＦＩ濃度の範囲を得るために、精製ＴＡＦＩでオーバーロードしたＴＡＦＩを含まない血漿から確立した検量線を示す。
使用した式Ｉで示される化合物は、5 mMの濃度のMxPAAFRであった。
本発明の方法に従って測定されたΔＯＤを以下の表IIIに示す：
【０１７５】
【表３】
2004533489.tif 000096
【０１７６】
図３に示すとおり、検量線は、調査された濃度範囲において直線的である。これは、正常の区域を広くカバーし、ＴＡＦＩは、5 〜 15 μg/mlの濃度で生物に存在する。
よって、本発明の方法は、ＴＡＦＩの欠損および異常に高いレベルの両方を検出することができる。
【０１７７】
例４：
種々の血漿タイプで得られた結果
本発明の方法を、例２に記載のプロトコールを用いて種々の血漿タイプに適用した。
フレッシュな血漿、凍結した血漿：
フレッシュな血漿または凍結した血漿についてアッセイを行うことができるが、ＯＤの低下が、これら２つの間で観察される。これは、解凍の間のＴＡＦＩの僅かな分解により生じる（当該タンパク質が分解する）。
2004533489.tif 000097
【０１７８】
凍結された血漿、凍結乾燥された血漿：
ＴＡＦＩアッセイは、凍結乾燥された血漿について可能であり、凍結された血漿と同様である。
2004533489.tif 000098
【０１７９】
種々の由来の凍結された血漿：
2004533489.tif 000099
【０１８０】
例５：
本発明の種々の基質を用いて行ったアッセイ
本発明の方法を、例１に記載の種々の化合物とともに、精製されたＴＡＦＩを含有する溶液に適用した。
試験は、Hepesバッファー中に6.5 μg/ml の精製ＴＡＦＩを含有する溶液に対して行った。その結果を以下の表IVに示す。
【０１８１】
【表４】
2004533489.tif 000100
【０１８２】
例６：
本発明に従った式(I)で示される化合物に対するＴＡＦＩａの特異性：
以下の例は、他の基本的なカルボキシペプチダーゼと比較して、ＣＰＮまたはＣＰＵ、とりわけＴＡＦＩの活性を特異的に分析するために、本発明の方法および式(I)で示される化合物を用いる必要性を実証することを目的とする。
【０１８３】
1/ このケースにおいて、アッセイは、Mock (14)により記載される化合物のファミリーに由来する基質を用いて行った。この基質は、アニジルアゾホルミル発色ラジカル (CH3OC6H4-N=N-CO- 部分) を有する単一のアミノ酸により構成されていた。選択されるアミノ酸は、アルギニン、カルボキシペプチダーゼＢにより正常に加水分解される塩基性アミノ酸であった(1)。
【０１８４】
これ以降、この基質をAAFR (アニジルアゾホルミルアルギニン) または MxAFR (4-メトキシフェニルアゾホルミルアルギニン)と称する。
この基質 (0.25 mM)を、血漿ＴＡＦＩのサンプルまたはブタ膵臓カルボキシペプチダーゼＢ (Sigma, Reference: C9584), 5.2 mol/l の溶液の何れかの存在に導入した。
【０１８５】
２つのサンプルの各々の着色低下を、分光光度計を用いて追跡した。各サンプルを以下のプロトコールを用いて処理した：
a) 出発サンプル:
* 血漿ＴＡＦＩ (正常な血漿プールに存在する - 1/20に希釈); または
* ブタ膵臓カルボキシペプチダーゼＢ, 5.2 mol/l (Hepesバッファー中);
b) トロンビン-トロンボモジュリン-CaCl2 複合体 (例２参照) による、血漿ＴＡＦＩサンプルの活性化;
c) 5 mM AAFRの添加;
d) 382 nmでＯＤを読取る。
【０１８６】
結果：
【表５】
2004533489.tif 000101
結論：
活性化されたＴＡＦＩは、膵臓ＣＰＢとは対照的にAAFRを加水分解しない。
【０１８７】
2/ 次いで、ＴＡＦＩａが、それにもかかわらず式(I)で示される化合物を加水分解することを証明するために、本発明の方法を、式(I)で示される基質 (MxPAFFK) または MxAFR の何れかとともに、精製ＴＡＦＩの溶液に適用した。凝固の活性化を、トロンビン-トロンボモジュリン-CaCl2 複合体により誘発した (例２のプロトコール参照)。
【０１８８】
２つのサンプルの各々の着色低下を、分光光度計を用いて追跡した。
a) 出発サンプル: 精製されたＴＡＦＩ溶液, 18 μg/ml (Hepesバッファーで希釈);
b) 凝固を活性化する;
c) 27 mM MxAFR または MxPAFFK (コントロール), MxAFFKのコンセントレーションを添加する;
d) MxPAFFKを含有するサンプルにＣＰＡを添加する;
e) 382 nmでＯＤを読取る。
【０１８９】
結果：
【表６】
2004533489.tif 000102
結論：
活性化されたＴＡＦＩは、MxAFRを加水分解しないが、MxPAFFKに対して活性である。
【０１９０】
例７: トロンビン生成方法論
例２、オペレーティング・モード b)に記載されるとおり、血漿プールを希釈することにより、ある範囲(range)が作成された(図４)。
【０１９１】
【表７】
2004533489.tif 000103
この方法論により、トロンビンを生成する能力の機能(function)として、血漿を区別することができる。この方法論は、患者の凝固能亢進状態をよりよく反映していた。
【参考文献】
【０１９２】
2004533489.tif 000104
2004533489.tif 000105
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１Ａ】ＵＶ可視分光光度計を用いて測定した、式(I)で示される種々の合成化合物の吸収スペクトル。
【図１Ｂ】ＵＶ可視分光光度計を用いて測定した、式(I)で示される種々の合成化合物の吸収スペクトル。
【図１Ｃ】ＵＶ可視分光光度計を用いて測定した、式(I)で示される種々の合成化合物の吸収スペクトル。
【図２】酸加水分解により行われたAAFFR分析。
【図３】精製されたTAFIでオーバーロードして0 〜 26 μg/mlの濃度範囲を得た、TAFI欠損血漿から確立された検量線。
【図４】血漿プールから得た濃度範囲についての検量線。検量線は、トロンビン生成方法を用いて作成した。比色定量分析は、色素形成基質 4-MTPAFYRを用いて行った。
【図１Ａ】
2004533489.tif 000116
【図１Ｂ】
2004533489.tif 000117
【図１Ｃ】
2004533489.tif 000118
【図２】
2004533489.tif 000119
【図３】
2004533489.tif 000120
【図４】
2004533489.tif 000121
【国際公開パンフレット】
2004533489.tif 000122
2004533489.tif 000123
2004533489.tif 000124
2004533489.tif 000125
2004533489.tif 000126
2004533489.tif 000127
2004533489.tif 000128
2004533489.tif 000129
2004533489.tif 000130
2004533489.tif 000131
2004533489.tif 000132
2004533489.tif 000133
2004533489.tif 000134
2004533489.tif 000135
2004533489.tif 000136
2004533489.tif 000137
2004533489.tif 000138
2004533489.tif 000139
2004533489.tif 000140
2004533489.tif 000141
2004533489.tif 000142
2004533489.tif 000143
2004533489.tif 000144
2004533489.tif 000145
2004533489.tif 000146
2004533489.tif 000147
2004533489.tif 000148
2004533489.tif 000149
2004533489.tif 000150
2004533489.tif 000151
2004533489.tif 000152
2004533489.tif 000153
2004533489.tif 000154
2004533489.tif 000155
2004533489.tif 000156
2004533489.tif 000157
2004533489.tif 000158
2004533489.tif 000159
2004533489.tif 000160
2004533489.tif 000161
2004533489.tif 000162
2004533489.tif 000163
2004533489.tif 000164
2004533489.tif 000165
2004533489.tif 000166
2004533489.tif 000167
2004533489.tif 000168
2004533489.tif 000169
2004533489.tif 000170
2004533489.tif 000171
2004533489.tif 000172
2004533489.tif 000173
2004533489.tif 000174
2004533489.tif 000175
2004533489.tif 000176
2004533489.tif 000177
2004533489.tif 000178
2004533489.tif 000179
2004533489.tif 000180
2004533489.tif 000181
2004533489.tif 000182
2004533489.tif 000183
2004533489.tif 000184
2004533489.tif 000185
2004533489.tif 000186
2004533489.tif 000187
2004533489.tif 000188
2004533489.tif 000189
2004533489.tif 000190
2004533489.tif 000191
2004533489.tif 000192
2004533489.tif 000193
2004533489.tif 000194
2004533489.tif 000195
2004533489.tif 000196
2004533489.tif 000197
2004533489.tif 000198
2004533489.tif 000199
2004533489.tif 000200
2004533489.tif 000201
2004533489.tif 000202
2004533489.tif 000203
2004533489.tif 000204
2004533489.tif 000205
2004533489.tif 000206
2004533489.tif 000207
2004533489.tif 000208
2004533489.tif 000209
2004533489.tif 000210
2004533489.tif 000211
2004533489.tif 000212
2004533489.tif 000213
2004533489.tif 000214
2004533489.tif 000215
2004533489.tif 000216
2004533489.tif 000217
【国際調査報告】
2004533489.tif 000218
2004533489.tif 000219
2004533489.tif 000220
2004533489.tif 000221