(57)【要約】本発明は活性成分として少なくとも１種のカルパイン阻害物質と少なくとも１種の反応性酸素種（ＲＯＳ）捕捉物質とを含有し且つ場合によっては製薬上許容しうる担体を含有してなる医薬組成物に関する。本発明はまた少なくとも１種のカルパイン阻害物質と少なくとも１種の反応性酸素種（ＲＯＳ）を捕捉する物質とを選択的に含有してなる生成物に関するか又は選択的でなく活性成分が別個である組合せ生成物としての生成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分として少なくとも１種のカルパイン阻害物質と少なくとも１種の反応性酸素種捕捉物質とを含有し且つ場合によっては製薬上許容し得る担体を含有してなる医薬組成物。
【請求項２】
活性成分として１種のカルパイン阻害物質と１種の反応性酸素種捕捉物質とを含有し且つ場合によっては製薬上許容しうる担体を含有してなる請求項１記載の組成物。
【請求項３】
カルパイン阻害剤は次式（ＩＢ）
Ｔ−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｙ  （ＩＢ）
〔式中Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は個々に水素原子を表わすかあるいは１個又はそれ以上の置換基即ちヒドロキシ基、低級アルコキシ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、カルボキシ基、アミノカルボニル基、（低級アルキル）アミノカルボニル基、ジ（低級アルキル）アミノカルボニル基、アミノ基、グアニジノ基、随意に置換したアリール基又は随意に置換したヘテロアリール基から選んだ置換基によって随意に置換された低級アルキル基を表わし、前記アリール及びヘテロアリール基の１個又はそれ以上の置換基はハロ、ヒドロキシ、低級アルキル又は低級アルコキシ基から選ばれ；
Ｙは水素原子又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｙ又はＣ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ’ｙ基を表わし、但しＲｙは低級アルキル基又は−Ｎ（Ｒｙ１）（Ｒｙ２）基を表わし；
Ｒ’ｙは水素原子又は低級アルキル基又は低級アラルキル基を表わし；
Ｒｙ１及びＲｙ２は個々に水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アラルキル基、低級ヘテロアラルキル基、シクロアルキル−アルキル基、ヘテロシクロアルキル基を表わし；これらの基は１個又はそれ以上の同一又は相異なる置換基即ちハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、アリールオキシ基、アリールアルコキシ基から選んだ置換基によって置換されうるものであり；
ｎは０又は１を表わし；
Ｔは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｔ１又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｔ２の基を表わし、但しＲｔ１は低級アルキル基又は低級アラルキル基を表わし；
Ｒｔ２は低級アルキル基、低級アラルキル基、アリールオキシ低級アルキル基又はヘテロアリール基を表わす〕に相当する請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
カルパイン阻害剤は次式（ＩＢ）
Ｔ−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｙ    （ＩＢ）
〔式中Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は個々に１個又はそれ以上の置換基即ちヒドロキシ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、カルボキシ基、アミノカルボニル基、アミノ基、グアニジノ基又は随意に置換したフェニル、インドール又はイミダゾール基から選んだ置換基によって随意に置換されたアルキル基を表わし、前記のフェニル、インドール及びイミダゾール基の１個又はそれ以上の置換基はハロ基、ヒドロキシ基、低級アルキル基又は低級アルコキシ基から選ばれ；
Ｙは水素原子又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｙ又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ’ｙ基を表わし、但しＲｙは低級アルキル基又は−Ｎ（Ｒｙ１）（Ｒｙ２）基を表わし；
Ｒ’ｙは低級アルキル基又はベンジル基を表わし；
Ｒｙ１は水素原子を表わし、Ｒｙ２は個々に水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アラルキル基、低級ヘテロアラルキル基、シクロアルキル−アルキル基、ヘテロシクロアルキル基を表わし、これらの基は１個又はそれ以上の同一又は相異なる置換基即ちハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、アリールオキシ基、アリールアルコキシ基から選んだ置換基によって置換されうるものであり；
ｎは０又は１を表わし；
Ｔは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｔ１又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｔ２の基を表わし、但しＲｔ１は低級アルキル基、ベンジル基、フェネチル基を表わし；
Ｒｔ２は低級アルキル基、低級アラルキル基、アリールオキシ低級アルキル基又はヘテロアリール基を表わす〕に相当する請求項１〜３の何れかに記載の組成物。
【請求項５】
カルパイン阻害剤は次式（ＩＢ）
Ｔ−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｙ    （ＩＢ）
〔式中Ｒ１及びＲ２は個々にフェニル基によって随意に置換されたアルキル基を表わし、該フェニル基自体、ハロ基、ヒドロキシ基によって随意に置換されており；
Ｙは水素原子を表わし；
Ｔは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｔ１（但しＲｔ１は低級アルキル基又はベンジル基を表わす）の基を表わし、ｎは０である〕に相当する請求項１〜４の何れかに記載の組成物。
【請求項６】
カルパイン阻害剤は３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−２−プロペン酸である請求項１又は２記載の組成物。
【請求項７】
反応性酸素種捕捉剤はアスコルビン酸、エトキシキン、Ｎ−アセチル−システイン、β−カロテン、２，２，５，５−テトラメチル−３−ピロリン−１−オキシル−３−カルボン酸、Ｑ１０補酵素、キャプトディチブ（ｃａｐｔｏｄａｔｉｖｅ）化合物、ニトロン、フェノール化合物、インドール誘導体、インドリン、イミダゾール、フェノチアジン、フェノキサジン、フェナジン、ジフェニルアミン又はカルバゾール類から選択される請求項１〜６の何れかに記載の組成物。
【請求項８】
反応性酸素種捕捉剤はアスコルビン酸、エトキシキン、テンポール、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−α−フェニル−ニトロン、Ｎ−アセチル−システイン、β−カロテン、２，２，５，５−テトラメチル−３−ピロリン−１−オキシル−３−カルボン酸、Ｑ１０補酵素、キャプトディチブ化合物、プロブコール、ＮＤＧＡ、α−，β−，γ−，ε−，τ−又はδ−トコフェロール、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸、２，３，６−トリメチル−２−ヘキシルオキシフェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール、トロロックス、ｎ−プロピルガレート、エウゲノール、カフェイン酸、シナピン酸、没食子酸、プロポホール、メラトニン、５−ヒドロキシ−トリプタミン、５−ヒドロキシ−インドール−２−カルボン酸、５−アミノ−インドリン、Ｎ−メチル−インドリン、イミダゾール、シメチジン、４−ヒドロキシ−カルバゾール、カルベジルオール、２−メトキシ−１０Ｈ−フェノチアジン、４−ヒドロキシジフェニルアミン、４−アミノジフェニルアミン、４−メトキシ−Ｎ−（４−メトキシフェニル）アニリン又は９−［２−（４−モルホリニル）エチル］−２，４−ジ−１−ピロリジニル−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドールから選ばれる請求項１〜７の何れかに記載の組成物。
【請求項９】
反応性酸素種捕捉剤はフェノール化合物、フェノチアジン及びジフェニルアミン類から選択される請求項１〜６の何れかに記載の組成物。
【請求項１０】
反応性酸素種捕捉剤は３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸（ＢＨＴ）、２−メトキシ−１０Ｈ−フェノチアジン及び４−ヒドロキシジフェニルアミンから選択され；しかも
カルパインを阻害する化合物はベンジル（１Ｓ）−１−（｛［（１Ｓ）−１−ホルミル−３−メチルブチル］アミノ｝カルボニル）−３−メチルブチルカルバメート、ベンジル（１Ｓ）−１−｛［（１−ベンジル−２−オキソエチル）アミノ］カルボニル｝−３−メチルブチルカルバメート、１−｛［（１−ホルミルペンチル）アミノ］カルボニル｝−３−メチルブチル  カルアバミン酸のベンジルエステル（カルペプチン）及び３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−２−プロペン酸から選択される請求項１又は２記載の組成物。
【請求項１１】
カルパイン及び反応性酸素種が関与する病状の処置に、病状例えば炎症性及び免疫性及び免疫系の疾病、心臓血管性及び脳血管性の疾病、中枢神経系の疾病、骨粗鬆症、筋ジストロフィー、悪液質、難聴、増殖性疾病、白内障、器官の移植、自己免疫性及びウィルス性の疾病、ガン及びＲＯＳの過度の生産及び／又はカルパインの賦活化を特徴とする全ての疾病の処置に、同時又は順次に用いるため個々分離した形で、組合せ生成物としてカルパインを阻害する少なくとも１種の物質と少なくとも１種の反応性酸素種捕捉物質とを含有してなる生成物。
【請求項１２】
中枢又は末梢神経系の疾病、筋ジストロフィー、悪液質、難聴、白内障の処置に用いる請求項１１記載の生成物。
【請求項１３】
カルパイン阻害剤は次式（ＩＢ）
Ｔ−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｙ    （ＩＢ）
〔式中Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は個々に水素原子を表わすか又は１個又はそれ以上の置換基即ちヒドロキシ基、低級アルコキシ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、カルボキシ基、アミノカルボニル基、（低級アルキル）アミノカルボニル基、ジ（低級アルキル）アミノカルボニル基、アミノ基、グアニジノ基、随意に置換したアリール基又は随意に置換したヘテロアリール基から選んだ置換基によって随意に置換された低級アルキル基を表わし、前記のアリール基及びヘテロアリール基の１個又はそれ以上の置換基はハロ基、ヒドロキシ基、低級アルキル基又は低級アルコキシ基から選ばれ；
Ｙは水素原子又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｙ又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ’ｙ基を表わし、但しＲｙは低級アルキル基又は−Ｎ（Ｒｙ１）（Ｒｙ２）基を表わし；
Ｒ’ｙは水素原子又は低級アルキル基又は低級アラルキル基を表わし；
Ｒｙ１及びＲｙ２は個々に水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アラルキル基、低級ヘテロアラルキル基、シクロアルキル−アルキル基、ヘテロシクロアルキル基を表わし、これらの基はハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、アリールオキシ基、アリールアルコキシ基から選んだ１個又はそれ以上の同一又は相異なる置換基によって置換されうるものであり；
ｎは０又は１を表わし；
Ｔは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｔ１又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｔ２の基を表わし、但し
Ｒｔ１は低級アルキル基又は低級アラルキル基を表わし；
Ｒｔ２は低級アルキル基、低級アラルキル基、アリールオキシ低級アルキル基又はヘテロアリール基を表わす〕に相当する請求項１１又は１２記載の生成物。
【請求項１４】
カルパイン阻害剤は次式（ＩＢ）
Ｔ−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｙ    （ＩＢ）
〔式中Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は個々に１個又はそれ以上の置換基即ちヒドロキシ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、カルボキシ基、アミノカルボニル基、グアニジノ基、又は随意に置換したフェニル、インドール又はイミダゾール基から選んだ置換基によって随意に置換されたアルキル基を表わし、
前記フェニル、インドール及びイミダゾール基の１個又はそれ以上の置換基はハロ基、ヒドロキシ基、低級アルキル基又は低級アルコキシ基から選ばれるものであり；
Ｙは水素原子又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｙ又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ’ｙ基を表わし、但しＲｙは低級アルキル基又は−Ｎ（Ｒｙ１）（Ｒｙ２）基を表わし；
Ｒ’ｙは低級アルキル又はベンジル基を表わし；
Ｒｙ１は水素原子を表わし、Ｒｙ２は個々に水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アラルキル基、低級ヘテロアラルキル基、シクロアルキル−アルキル基、ヘテロシクロアルキル基を表わし、これらの基はハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、アリールオキシ基、アリールアルコキシ基から選んだ１個又はそれ以上の同一又は相異なる置換基によって置換されうるものであり；
ｎは０又は１を表わし；
Ｔは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｔ１又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｔ２の基を表わし、但し
Ｒｔ１は低級アルキル基、ベンジル基又はフェネチル基を表わし；
Ｒｔ２は低級アルキル基、低級アラルキル基、アリールオキシ低級アルキル基又はヘテロアリール基を表わす〕に相当する請求項１１〜１３の何れかに記載の生成物。
【請求項１５】
カルパイン阻害剤は次式（ＩＢ）
Ｔ−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｙ    （ＩＢ）
〔式中Ｒ１及びＲ２は個々にフェニル基によって随意に置換されたアルキル基を表わし、該フェニル基それ自体はハロ基又はヒドロキシ基によって随意に置換されており；
Ｙは水素原子を表わし；
Ｔは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｔ１の基を表わし、但し
Ｒｔ１は低級アルキル基又はベンジル基を表わし、ｎは０である〕に相当する請求項１１〜１４の何れかに記載の生成物。
【請求項１６】
カルパイン阻害剤は３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−２−プロペン酸である請求項１１又は１２記載の生成物。
【請求項１７】
反応性酸素種捕捉剤はアスコルビン酸、エトキシキン、Ｎ−アセチル−システイン、β−カロテン、２，２，５，５−テトラメチル−３−ピロリン−１−オキシル−３−カルボン酸、Ｑ１０補酵素、キャプトディチブ化合物、ニトロン、フェノール化合物、インドール誘導体、インドリン、イミダゾール、フェノチアジン、フェノキサジン、フェナジン、ジフェニルアミン又はカルバゾール類から選択される請求項１１〜１６の何れかに記載の生成物。
【請求項１８】
反応性酸素種捕捉剤はアスコルビン酸、エトキシキン、テンポール、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−α−フェニルニトロン、Ｎ−アセチル−システイン、β−カロテン、２，２，５，５−テトラメチル−３−ピロリン−１−オキシル−３−カルボン酸、Ｑ１０補酵素、キャプトディチブ化合物、プロブコール、ＮＤＧＡ、α−，β−，γ−，ε−，τ−又はδ−トコフェロール、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸、２，３，６−トリメチル−２−ヘキシルオキシフェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール、トロロックス、ｎ−プロピルガレート、エウゲノール、カフェイン酸、シナピン酸、没食子酸、プロポホール、メラトニン、５−ヒドロキシ−トリプタミン、５−ヒドロキシ−インドール−２−カルボン酸、５−アミノ−インドリン、Ｎ−メチル−インドリン、イミダゾール、シメチジン、４−ヒドロキシ−カルバゾール、カルベジオール、２−メトキシ−１０Ｈ−フェノチアジン、４−ヒドロキシジフェニルアミン、４−アミノジフェニルアミン、４−メトキシ−Ｎ−（４−メトキシフェニル）アニリン又は９−［２−（４−モルホリニル）エチル］−２，４−ジ−１−ピロリジニル−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドールから選択される請求項１１〜１７の何れかに記載の生成物。
【請求項１９】
反応性酸素種捕捉剤はフェノール化合物、フェノチアジン及びジフェニルアミン類から選択される請求項１１〜１６の何れかに記載の生成物。
【請求項２０】
反応性酸素種捕捉剤は３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸（ＢＨＴ）、２−メトキシ−１０Ｈ−フェノチアジン及び４−ヒドロキシジフェニルアミンから選択され；しかも
カルパインを阻害する化合物はベンジル（１Ｓ）−１−（｛［（１Ｓ）−１−ホルミル−３−メチルブチル］アミノ｝カルボニル）−３−メチルブチルカルバメート、ベンジル（１Ｓ）−１−｛［（１−ベンジル−２−オキソエチル）アミノ］カルボニル｝−３−メチルブチルカルバメート、（１−｛［（１−ホルミルペンチル）アミノ］カルボニル｝−３−メチルブチル）カルバミン酸のベンジルエステル（カルペプチン）及び３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−２−プロペン酸から選択される請求項１１又は１２記載の組成物。
【請求項２１】
筋ジストロフィーの処置に意図した医薬を製造するためにカルパインを阻害する物質と反応性酸素種捕捉剤との使用。
【請求項２２】
悪液質の処置に意図した医薬を製造するためにカルパインを阻害する物質と反応性酸素種捕捉剤との使用。
【請求項２３】
難聴の処置に意図した医薬を製造するためにカルパインを阻害する物質と反応性酸素種捕捉剤との使用。
【請求項２４】
白内障の処置に意図した医薬を製造するためにカルパインを阻害する物質と反応性酸素種捕捉剤との使用。
【請求項２５】
中枢神経系の疾病の処置に意図した医薬を製造するためにカルパインを阻害する物質と反応性酸素種捕捉剤との使用。
【請求項２６】
カルパインを阻害する物質は３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−２−プロペン酸（ＰＤ １５０６０６）であるか又は請求項３に定義した式ＩＢに相当する請求項２１〜２５の何れかに記載の使用。
【請求項２７】
反応性酸素種捕捉剤はフェノール化合物、フェノチアジン及びジフェニルアミン類から選択される請求項２１〜２５の何れかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は活性成分としてカルパインを阻害する少なくとも１種の物質と反応性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）（ＲＯＳ）を捕捉する少なくとも１種の物質とを含有してなりしかも場合によっては製薬上許容しうる担体をも含有してなる医薬組成物に関する。本発明はまたカルパインを阻害する少なくとも１種の物質と反応性酸素種を捕捉する少なくとも１種の物質とを選択的に又は非選択的に含有してなる生成物であって、これらの活性成分の組合せ生成物として、個々分離した形での生成物に関する。
【０００２】
（背景技術）
生理病理学において、カルパインの重要な役割及びＲＯＳの重要な役割が与えられれば、本発明の組成物はこれらの酵素及び／又はこれらのラジカル種（ｒａｄｉｃｕｌａｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）が関与する病状の処置に有益な又は好都合な作用を生じることができ、特に次の疾病：
（イ）  炎症性及び免疫系の疾病例えばリウマチ様関節炎、膵臓炎、多発性硬化症、胃腸系の炎症（潰瘍性又は非潰瘍性大腸炎、クローン病）、
（ロ）  例えば動脈高血圧症、敗血性ショック、阻血又は出血起源の心臓梗塞又は脳梗塞、阻血症並びに血小板凝集に関連する疾病を含めて心臓血管性及び脳血管性の疾病、
（ハ）  中枢又は末梢神経系の疾病例えば特に脳又は脊髄の損傷、クモ膜下出血、てんかん、老化、アルツハイマー病を含めての老人性痴呆、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、末梢神経障害を挙げ得る神経変性の疾病、
（ニ）  骨粗鬆症、
（ホ）  筋ジストロフィー、悪液質、
（ヘ）  増殖性疾病例えばアテローマ性動脈硬化症又は狭窄症の再発、
（ト）  難聴、
（チ）  白内障、
（リ）  器官の移植、
（ヌ）  自己免疫性及びウィルス性の疾病例えば狼瘡、ＡＩＤＳ、寄生虫及びウィルスの感染、糖尿病及びその合併症、多発性硬化症、
（ル）  ガン、
（オ）  ＲＯＳの過剰生産及び／又はカルパインの賦活化を特徴とする全ての疾病
の処置に有益な作用を生じ得る。
【０００３】
全てのこれらの病状において、ＲＯＳの関与を証明する実験的証拠〔Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． （１９９６） ２０， ６７５〜７０５；Ａｎｔｉｏｘｉｄ． Ｈｅａｌｔｈ． Ｄｉｓ． （１９９７） ４（合成抗酸化剤の教本Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔｓ）１〜５２〕並びにカルパインの関与を証明する実験的証拠〔Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． （１９９４） １５，４１２４１９；Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ （１９９９） １２，７３〜８２〕がある。１例として、脳梗塞に伴なう脳の病変又は実験的な頭蓋外傷性全身障害に伴なう脳の病変は抗酸化剤によって低減され〔Ａｃｔａ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｓｃａｎｄ． （１９９４） １５２，３４９〜３５０；Ｊ． Ｃｅｒｅｂ． Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂｏｌ． （１９９５） １５，９４８〜９５２；Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ． （１９９７） ２，８９５〜９０４〕並びにカルパイン阻害剤によって低減される〔Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ （１９９６） ９３，３４２８〜３３；Ｓｔｒｏｋｅ（１９９８）２９，１５２〜１５８；Ｓｔｒｏｋｅ（１９９４）２５，２２６５〜２２７０〕。これらの２種の活性成分即ちカルパインを阻害する物質と反応性酸素種を捕捉する物質とを治療目的で組合せることは文献に記載されていなかった。更に、これらの２種の活性成分は相乗作用がある。
【０００４】
（発明の開示）
それ故本発明の目的は、活性成分としてカルパインを阻害する少なくとも１種の物質と反応性酸素種を捕捉する少なくとも１種の物質とを含有してなり、しかも場合によっては製薬上許容しうる担体をも含有してなる医薬組成物を提供する。本明細書において、用語「カルパインを阻害する少なくとも１種の物質と反応性酸素種を捕捉する少なくとも１種の物質」は少なくとも２種の相異なる部分の組合せ体を意味し、１方がカルパイン阻害剤であって他方がフリーラジカル捕捉剤である組合せ体を意味する。
【０００５】
本発明のより特定の要旨は活性成分としてカルパインを阻害する１種の物質と反応性酸素種を捕捉する１種の物質とを含有してなりしかも場合によっては製薬上許容しうる担体を含有してなる医薬組成物である。
【０００６】
用語「反応性酸素種捕捉剤」とは、Ｏ２−、ＯＨ、ＲＯ２・、ＲＯ・、ＯＮ２・、ＮＯ・、ＮＯ２・又はＨ２Ｏ２の如き反応性酸素種又はそれの１種に抵抗するか又はこれを捕捉しうる何れかの化学物質又は酵素物質と理解すべきである（Ｈａｌｌｉｗｅｌｌ Ｂ．， Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ ＪＭＣ．， 生物学及び医薬におけるフリーラジカル、２版、オックスフォード、クラレンドンプレス社１９８９）。これらの物質は天然又は合成物質であることができ、しかも抗酸化特性を有する（Ｓａｎｔｒｕｃｅｋ及びＫｒｅｐｅｌｋａ、抗酸化剤−重要な化学療法剤、薬剤の未来１３、９７５〜９９６、１９８８；Ｊａｃｋｓｏｎらの抗酸化剤；アテローマ性動脈硬化症を防止するための生体防御機構、Ｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｒｅｖｉｅｗｓ １３、１６１〜１８２（１９９３）；Ａｒｕｏｍａ、抗酸化予防薬として医薬の特徴付け、Ｆｒｅｅ Ｒａｄ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ２０，６７５〜７０５（１９９６））。化学物質の抗酸化活性は本願の実験部分に例示した如き標本の製薬試験によって測定できる。かかる抗酸化物質はかくして脂質過酸化（実験部分の試験参照）について１００μＭ以下のＩＣ５０、好ましくは１０μＭ以下のＩＣ５０を示し得る。
【０００７】
カルパインはプロテアーゼ  システイン科に属するタンパク質分解性細胞質基質の酵素である。カルパインの賦活化は厳密にはカルシウムに依存する〔スズキ等のカルパイン：新規な科のメンバー、賦活化、及び生理機能（１９９５）Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ， ３７６，５２３〜５２９〕。通常の生理条件下では、これらの酵素は賦活化されないか又はわずかに賦活化される。これに反して、或る生理病理学的な現象で見られる細胞内カルシウムの過度の増大はカルパインの強力な賦活化を誘発する。この賦活化は選択的な開裂を生じ、従って細胞骨格タンパク質、膜受容体又は転写因子の機能の減損を生じ、かくして細胞の死滅及び組織の分解をもたらす。カルパインの賦活化は例えば神経変性の疾病、脳の阻血又は筋ジストロフィーの如き若干の病状に主要な且つ有害な役割を演じると思われ、該賦活化は場合によてはこれらの酵素の阻害剤を抑制してしまう〔Ｗａｎｋ Ｋ等のカルパイン抑制：その治療能力の所見（１９９４）薬理科学における傾向１５、４１２〜４１９〕。カルパインに対する化学物質の阻害活性は本願の実験部分に例示した如き標準の製薬試験によって決定し得る。カルパインを阻害するかかる物質はかくしてカルパインの阻害に関して（本願の実験部分の試験参照）１０μＭ以下のＩＣ５０を有し得る。
【０００８】
本発明の要旨はまた、カルパイン及び反応性酸素種が関与する病状の処置に、炎症性及び免疫疾病、心臓血管及び脳血管の疾病、中枢神経系の疾病、骨粗鬆症、筋ジストロフィー、悪液質、難聴、増殖性の疾病、白内障、器官の移植、自己免疫及びウィルス性の疾病、ガンの如き病状及びＲＯＳの過剰生産及び／又はカルパインの賦活化を特徴とする全ての病状の如き疾病の処置に、好ましくは中枢又は末梢神経系の疾病、筋ジストロフィー、悪液質、難聴及び白内障の処置に同時に又は順次に用いるため、組合せ生成物として個々分離した形で、カルパインを阻害する少なくとも１種の物質と反応性酸素種を捕捉する少なくとも１種の物質とを含有してなる生成物に関する。
【０００９】
本発明の医薬組成物又は生成物において、カルパイン阻害剤及び反応性酸素種捕捉剤は同一又は相異なり得る投与量で呈示し得る。投与量は適当な希釈剤または賦形剤と組合せた化合物類の関数として選択される。
【００１０】
カルパイン阻害剤及び反応性酸素種捕捉剤は同じ投与方式により又は相異なる投与方式により同時に又は順次に投与できる。投与方式は経口、非経口又は局所投与であるのが好ましい。
【００１１】
反応性酸素種捕捉剤は例えばアスコルビン酸、エトキシキン、Ｎ−アセチル−システイン、カロテン誘導体即ちα−，β−，γ−又はδ−カロテンしかも詳細に言えばβ−カロテン（Ｈａｏ Ｃｈｅｎ等のフリーラジカル生物学及び医薬１８（５）、９４９〜９５３（１９９５）、２，２，５，５−テトラメチル−３−ピロリン−１−オキシル−３−カルボン酸、ユビキノン例えばＱ１０補酵素（Ｓ． Ｔｅｒｅａｏ等のＪ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．  ４４，８６８（１９９７））又はキャプトディチブ化合物（本願に参考のため組入れたＨ．Ｇ． Ｖｉｅｈｅ等のＡｃｃ． Ｒｅｓ． １８，１４８〜１５４（１９８５））から選択し得る。反応性酸素種捕捉剤はまた例えばニトロン、フェノール化合物、インドール誘導体、インドリン、イミダゾール、フェノチアジン、フェノキサジン、フェナジン、ジフェニルアミン又はカルバゾール類からも選択でき、あるいはまた反応性酸素種それ自体又はそれらの１種を中和し得る酵素例えばスーパーオキシド  ジスムターゼ、カタラーゼ又はグルタチオン  パーオキシダーゼ及びそれらの模造品からも選択できる。
【００１２】
反応性酸素種捕捉剤ニトロンの例としては、国際特許出願公開ＷＯ ９６／１５１１０号、ＷＯ８８／０５０４４号及び米国特許第５３１０９１６号（参考のため本願に組入れた）に定義した化合物のみならずテンポール及びＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−α−フェニル−ニトロンもまた挙げ得る。
【００１３】
反応性酸素種を捕捉するフェノール化合物の例としては、プロブコール、ＮＤＧＡ、トコフェロール誘導体即ちα−，β−，γ−，ε−，τ−又はδ−トコフェロール又はフェノール性フラボノイド（参考のため本願に組入れた、Ｒ．Ａ．等の植物化学２７（４）、９６９〜９７８（１９８８））を挙げ得る。反応性酸素種を捕捉するフェノール化合物は次式ＩＡ又はＩＩＡ
2004533987.tif 000002
（式中Ｒ’１は水素原子、ヒドロキシ基、ハロ基、カルボキシ基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アルケニル基又はアルコキシカルボニル基から選んだ１つ又はそれ以上の置換基を表わし、該アルキル、アルコキシ及びアルケニ基は随意にヒドロキシ基、ハロ基、カルボキシ基又はアミノ基によって置換されており；Ｒ’２は水素原子あるいは随意に置換された低級アルキル基、低級アルコキシ基、ヒドロキシ基、ハロ基、アミノ基又はカルボキシ基から選んだ１つ又はそれ以上の置換基を表わす）の化合物から選択し得る。一般式ＩＡ又はＩＩＡの化合物は３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸、２，３，６−トリメチル−２−ヘキシルオキシ−フェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシ−フェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチル−フェノール、トロロックス、ｎ−プロピル  ガレート、エウゲノール、カフェイン酸、シナピン酸、没食子酸及びプロポホールであるのが好ましい。
【００１４】
反応性酸素種捕捉用インドール誘導体は国際出願公開ＷＯ ９６／２６９４１号に定義した如き化合物であり得る。これは一般式ＩＩＩＡ
2004533987.tif 000003
（式中Ｒ’３は水素原子、ヒドロキシ基、ハロ基、低級アルキル基又は低級アルコキシ基から選んだ１つ又はそれ以上の置換基を表わし；Ｒ’４は水素原子、ハロ基、ヒドロキシ基、アミノ基、カルボキシ基又はアルキルカルボニルアミノアルキル基から選んだ１つ又はそれ以上の置換基を表わす）の化合物であり得る。式ＩＩＩＡの化合物はメラトニン、５−ヒドロキシ−トリプタミン、５−ヒドロキシ−インドール−２−カルボン酸であるのが好ましい。
【００１５】
反応性酸素種捕捉用インドリン誘導体としては、５−アミノ−インドリン及びＮ−アルキル−インドリンを挙げることができ、詳細に言えばＮ−メチル−インドリンを挙げ得る。
【００１６】
反応性酸素種捕捉用イミダゾールとしては、イミダゾールそれ自体又はシメチジンを挙げ得る。
【００１７】
反応性酸素種阻害剤としては、次式ＩＶＡ又はＶＡ
2004533987.tif 000004
〔式中Ｒ’５、Ｒ’６、Ｒ’７、Ｒ’８、Ｒ’９は個々に水素原子、アルキル基、アルコキシ基、シアノ基、ハロ基、ヒドロキシ基、ニトロ基又は−ＮＲ’１１Ｒ’１２基を表わし、
Ｒ’１１及びＲ’１２は個々に水素原子、アルキル基又は−ＣＯＲ’１３基を表わすかあるいはＲ’１１及びＲ’１２はこれらが結合している窒素原子と一緒になって随意に置換された複素環を形成し、
Ｒ’１３は水素原子、アルキル基、アルコキシ基又は−ＮＲ’１４Ｒ’１５基を表わし、
Ｒ’１４及びＲ’１５は個々に水素原子又はアルキル基を表わすかあるいはＲ’１４及びＲ’１５はこれらが結合している窒素原子と一緒になって随意に置換された複素環を形成し、
Ｒ’１０は水素原子、アルキル基又は−ＣＯＲ’１６基を表わし、
Ｒ’１６は水素原子、アルキル基、アルコキシ基又は−ＮＲ’１７Ｒ’１８基を表わし、
Ｒ’１７及びＲ’１８は個々に水素原子又はアルキル基を表わすかあるいはＲ’１７及びＲ’１８はこれらが結合している窒素原子と一緒になって随意に置換された複素環を形成し、
Ｗは結合手、Ｏ又はＳを表わすかあるいは−Ｎ（Ｒ’１９）−基（但しＲ’１９は水素原子又はアルキル基を表わす）を表わす〕の化合物をも挙げ得る。
【００１８】
カルバゾール類の例としては、カルベジルオール又は式ＩＶＡの化合物及び詳しく言えば４−ヒドロキシカルバゾールを挙げ得る。式ＩＶＡの化合物の別例としては、フェノチアジン、詳しく言えば２−メトキシフェノチアジン、フェノキサジン及びフェナジンをも挙げ得る。式ＶＡの化合物の例としては、ジフェニルアミン例えば４−ヒドロキシジフェニルアミン、４−アミノジフェニルアミン又は４−メトキシ−Ｎ−（４−メトキシフェニル）アニリンを挙げ得る。
【００１９】
本発明のより特定の要旨はカルパイン阻害剤が３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−２−プロペン酸（ＰＤ１５０６０６）である前述した組成物又は生成物に関する。
【００２０】
本発明のより特定の要旨はカルパイン阻害剤が式ＩＢ
Ｔ−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｙ    （ＩＢ）
〔式中Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は個々に水素原子を表わすかあるいは１個又はそれ以上の置換基即ちヒドロキシ基、低級アルコキシ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、カルボキシ基、アミノカルボニル基、（低級アルキル）アミノカルボニル基、ジ（低級アルキル）アミノカルボニル基、アミノ基、グアニジノ基、随意に置換したアリール基又は随意に置換したヘテロアリール基から選んだ置換基によって随意に置換された低級アルキル基を表わし、
該アリール及びヘテロアリール基の１個又はそれ以上の置換基はハロ基、ヒドロキシ基、低級アルキル又は低級アルコキシ基から選ばれ；
Ｙは水素原子又は−（Ｃ（Ｏ）−Ｒｙ又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ’ｙ基を表わし、
Ｒｙは低級アルキル基又は−Ｎ（Ｒｙ１）（Ｒｙ２）基を表わし；
Ｒ’ｙは水素原子又は低級アルキル基又は低級アラルキル基を表わし；
Ｒｙ１及びＲｙ２は個々に水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アラルキル基、低級ヘテロアラルキル基、シクロアルキル−アルキル基、ヘテロシクロアルキル基を表わし、これらの基はハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、アリールオキシ基、アリールアルコキシ基から選んだ１個又はそれ以上の同一又は相異なる置換基によって置換され得るものであり；
ｎは０又は１を表わし；
Ｔは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｔ１又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｔ２の基を表わし、；
Ｒｔ１は低級アルキル基又は低級アラルキル基を表わし；
Ｒｔ２は低級アルキル基、低級アラルキル基、アリールオキシ低級アルキル基又はヘテロアリール基を表わす〕に相当する前述した組成物又は生成物である。
【００２１】
前述した定義において、「ハロ」なる表現はフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード基、好ましくはクロロ、フルオロ又はブロモ基を表わす。但し書きがなければアルキル基又は低級アルキル基とは１〜６個の炭素原子を含有する直鎖又は分枝鎖アルキル基を意味し、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル及びｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ネオペンチル、イソペンチル、ヘキシル、イソヘキシル基の如きアルキル基を意味する。但し書きがなければアルコキシ基又は低級アルコキシ基は前述したアルキル基に対応でき例えばメトキシ、エトキシ、プロピルオキシ又はイソプロピルオキシ基のみならず第２級又は第３級ブトキシの如きアルコキシ基である。用語低級アルキルチオ基は、アルキル基が前述の如き基である基例えばメチルチオ、エチルチオ基の如き基を表わすのが好ましい。
【００２２】
但し書きがなければアルケニル基又は低級アルケニル基とは２〜６個の炭素原子を含有し且つ少なくとも１個の不飽和結合（１個又はそれ以上の二重結合）を有する直鎖又は分枝鎖アルキル基を意味する。例えば、ビニル、アリル、プロペニル、イソプロペニル、ペンテニル、ブテニル、ヘキサニル、プロペニル及びブタジエニル基を挙げ得る。用語シクロアルキル基はシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル又はシクロヘキシル環を表わすのが好ましい。
【００２３】
用語アリール基は、例えばフェニル基又はナフチル基の如き１個又はそれ以上の縮合環によって構成される芳香族基を表わす。用語アリールオキシ基はアリール基が前述の如くである基例えばフェノキシ基であるのが好ましい。用語ヘテロアリール基は、少なくとも１個の縮合環が硫黄、窒素又は酸素から選んだ１個又はそれ以上の同一又は相異なる異原子を含有しながら１個又はそれ以上の縮合環によって構成された芳香族基を表わす。ヘテロアリール基の例としては、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、チアゾリル、イソキサゾリル、オキサゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジル、キノリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフリル及びインドリル基を挙げ得る。
【００２４】
用語ヘテロシクロアルキル基はＯ、Ｓ、Ｎから選んだ１個又はそれ以上の異原子を含有する飽和単環式又は二環式複素環を表わすのが好ましい。例えば、テトラヒドロフラン、テトラヒドロピラン、オキセタン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロチオピラン、チエタン、ピロリジン、ピペリジン、アゼチジン、１，３−ジオキサン、１，３−ジオキソラン、１，３−ジチオラン、１，３−ジチアン、１，３−オキサチオラン、１，３−オキサゾリジン、１，３−イミダゾリジン又は１，３−チアゾリジンを挙げ得る。
【００２５】
用語アリールアルキル（即ちアラルキル）基はアリール基及びアルキル基がそれぞれ前述した如くである基例えばベンジル、フェネチル又はナフチルメチル基を表わす。アルコキシカルボニル基、（アルキル）アミノカルボニル基及び（ジアルキル）アミノカルボニル基は、アルキル基及びアルコキシ基がそれぞれ前述した意義を有する基を表わす。用語アルキルカルボニルアミノアルキル、アリールオキシアルキル、アリールアルコキシ、ヘテロアリールアルキル、シクロアルキルアルキル基はアルキル、アリールオキシ、アリール、ヘテロアリール及びシクロアルキル基が前述した如くである基を表わす。
【００２６】
式−ＮＲｉＲｊ（但しＲｉ及びＲｊはこれらが結合した窒素原子と一緒になって随意に置換した複素環を形成する）の基の場合には、該複素環は好ましくは飽和しており、４〜７個の構成原子と既に存在する窒素原子を含めて１〜３個の異原子を含有しており、追加の該異原子はＯ、Ｎ及びＳ原子によって構成される群から個々に選ばれる。該複素環は例えばアゼチジン、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン又はチオモルホリン環であり得る。該複素環はアルキル、アルコキシ、アリール、アラルキル、ヒドロキシ又はハロ基から選んだ１個又はそれ以上の同一又は相異なる置換基によって置換し得る。
【００２７】
種々の基の定義によると、前述の如き式ＩＢの化合物は１個又はそれ以上の非対称炭素を有し得る。本発明は前述の如き式ＩＢの化合物であって、ラセミ形、鏡像体形又は偏左右異性体形で見出し得る化合物に関する。
【００２８】
好ましくは、本発明の要旨は、カルパイン阻害剤が前述の如き式（ＩＢ）
Ｔ−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｙ  （ＩＢ）
〔式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は個々に、１個又はそれ以上の置換基即ちヒドロキシ、メルカプト、低級アルキルチオ、カルボキシ、アミノカルボニル、アミノ、グアニジノ又は随意に置換したフェニル、インドール又はイミダゾール基から選んだ置換基によって随意に置換されたアルキルを表わし、
該フェニル、インドール及びイミダゾール基の１個又はそれ以上の置換基はハロ、ヒドロキシ、低級アルキル又は低級アルコキシ基から選ばれ；
Ｙは水素原子又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｙ又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ’ｙの基を表わし、但し
Ｒｙは低級アルキル基又は−Ｎ（Ｒｙ１）（Ｒｙ２）基を表わし；
Ｒ’ｙは低級アルキル基又はベンジル基を表わし；
Ｒｙ１は水素原子を表わし、Ｒｙ２は個々に水素原子、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アラルキル、低級ヘテロアラルキル、シクロアルキル−アルキル、ヘテロシクロアルキル基を表わし、これらの基はハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、低級アルキル、低級アルコキシ、アミノ、（低級アルキル）アミノ、ジ（低級アルキル）アミノ、アリールオキシ、アリールアルコキシ基から選んだ１個又はそれ以上の同一又は相異なる置換基によって置換し得るものであり；
ｎは０又は１を表わし；
Ｔは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｔ１又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｔ２の基を表わし、但し
Ｒｔ１は低級アルキル基、ベンジル基又はフェネチル基を表わし；
Ｒｔ２は低級アルキル基、低級アラルキル基、低級アリールオキシアルキル基又はヘテロアリール基を表わす〕に相当することを特徴とする、前述の如き組成物又は生成物である。
【００２９】
全く好ましくは、本発明の要旨はカルパイン阻害剤が前述の如き式（ＩＢ）
Ｔ−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｙ  （ＩＢ）
（式中、Ｒ１及びＲ２は個々にハロ、ヒドロキシ基によって随意に置換されたフェニル基それ自体によって随意に置換されたアルキル基を表わし；
Ｙは水素原子を表わし；
Ｔは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｔ１（但しＲｔ１は低級アルキル基又はベンジル基を表わす）の基を表わし、ｎは０である）に相当することを特徴とする、前述の如き組成物又は生成物である。
【００３０】
本発明のより特定の要旨は、反応性酸素種捕捉剤がアスコルビン酸、エトキシキン、Ｎ−アセチルシステイン、β−カロテン、２，２，５，５−テトラメチル−３−ピロリン−１−オキシル−３−カルボン酸、Ｑ１０補酵素、キャプトディチブ化合物、ニトロン、フェノール化合物、インドール誘導体、インドリン、イミダゾール、フェノチアジン、フェノキサジン、フェナジン、ジフェニルアミン又はカルバゾール類から選ばれることを特徴とする、前述の如き組成物又は生成物である。
【００３１】
好ましくは、本発明の要旨は、反応性酸素種捕捉剤がアスコルビン酸、エトキシキン、テンポール、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−α−フェニルニトロン、Ｎ−アセチルシステイン、β−カロテン、２，２，５，５−テトラメチル−３−ピロリン−１−オキシル−３−カルボン酸、Ｑ１０補酵素、キャプトディチブ化合物、プロブコール、ＮＤＧＡ、α−，β−，γ−，ε−，τ−又はδ−トコフェロール、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸、２，３，６−トリメチル−２−ヘキシルオキシフェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メトキシフェノール、２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール、トロロックス、ｎ−プロピルガレート、エウゲノール、カフェイン酸、シナピン酸、没食子酸、プロポホール、メラトニン、５−ヒドロキシ−トリプタミン、５−ヒドロキシインドール−２−カルボン酸、５−アミノ−インドリン、Ｎ−メチル−インドリン、イミダゾール、シメチジン、４−ヒドロキシ−カルバゾール、カルベジルオ−ル、２−メトキシ−１０Ｈ−フェノチアジン、４−ヒドロキシジフェニルアミン、４−アミノジフェニルアミン、４−メトキシ−Ｎ−（４−メトキシフェニル）アニリン又は９−［２−（４−モルホリニル）エチル］−２，４−ジ−１−ピロリジニル−９Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドールから選ばれる、前述の如き組成物又は生成物である。
【００３２】
本発明のより特定の要旨は、反応性酸素種捕捉剤がフェノール化合物、フェノチアジン及びジフェニルアミンから選ばれることを特徴とする前述の如き組成物又は生成物である。好ましくは、反応性酸素種捕捉剤は前述の式ＩＡのフェノール化合物、前述の式ＩＶＡのフェノチアジン及び前述の式ＶＡのジフェニルアミンから選ばれる。
【００３３】
また詳しく言えば、本発明の要旨は、反応性酸素種捕捉剤が、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸（ＢＨＴ）、２−メトキシ−１０Ｈ−フェノチアジン及び４−ヒドロキシジフェニルアミンから選ばれ；
カルパインを阻害する化合物がベンジル（１Ｓ）−１−（｛［（１Ｓ）−１−ホルミル−３−メチルブチル］アミノ｝カルボニル）−３−メチルカルバメート（即ちＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈ）、ベンジル（１Ｓ）−１−｛［（１−ベンジル−２−オキソエチル）アミノ］カルボニル｝−３−メチルブチルカルバメート（即ちＺ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｈ）、（１−｛［（１−ホルミルペンチル）アミノ］カルボニル｝−３−メチルブチル）カルバミン酸のベンジルエステル（カルペプチン）及び３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−２−プロペン酸（ＰＤ１５０６０６）から選ばれる、前述の如き組成物又は生成物である。
【００３４】
最後に、本発明の要旨は、中枢又は末梢神経系の疾病、筋ジストロフィー、悪液質、難聴及び白内障を処置するのに意図した医薬を製造するために、カルパインを阻害する物質と反応性酸素種を捕捉する物質との使用である。好ましくは、カルパインを阻害する物質は３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−２−プロペン酸（ＰＤ１５０６０６）であるか又は前述の式ＩＢに相当する。また好ましくは、反応性酸素種捕捉剤はフェノール化合物、フェノチアジン及びジフェニルアミンから選択され、しかも詳しく言えば反応性酸素種捕捉剤は前述の如き式ＩＡのフェノール化合物、前述の如き式ＩＶＡのフェノチアジン及び前述の如き式ＶＡのジフェニルアミン類から選択される。
【００３５】
カルパインを阻害する化合物及び反応性酸素種捕捉剤は工業製品であるかあるいは当業者に既知の方法により（又は該方法と類似の方法により）製造できる（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７巻、２９１８〜２９２９（１９９４）；ＴＩＰＳ １１巻、１３９〜１４２（１９９０）；ＴＩＢＳ １６巻、１５０〜１５３（１９９１）；Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １１０巻、３６９〜３７７（１９９３））。
【００３６】
本明細書で用いた技術用語及び科学用語の全ては当業者に知られた意味を有する。更には、全ての特許（又は特許出願）並びに別の参考文献は参考のためにここに組入れてある。
【００３７】
実験部分
前記の手法を例示するために次の実施例を呈示するが、これらは本発明の範囲を限定するものと何ら考えるべきでない。
【００３８】
Ａは反応性酸素種捕捉剤とさせ、Ｂはカルパイン阻害剤とさせる。
【００３９】
実施例１
化合物ＡＢ：酸素のフリーラジカルを捕捉する抗酸化剤である
化合物Ａ：３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸（ＢＨＴ）とカルパイン阻害剤である化合物Ｂ：Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈとの組合せ体。
【００４０】
実施例２
化合物ＡＢ：酸素のフリーラジカルを捕捉する抗酸化剤である
化合物Ａ：２−メトキシ−１０Ｈ−フェノチアジンとカルパイン阻害剤である化合物Ｂ：Ｚ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｈとの組合せ体。
【００４１】
実施例３
化合物ＡＢ：酸素のフリーラジカルを捕捉する抗酸化剤である
化合物Ａ：３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸（ＢＨＴ）とカルパイン阻害剤である化合物Ｂ：カルペプチンとの組合せ体。
【００４２】
実施例４
化合物ＡＢ：酸素のフリーラジカルを捕捉する抗酸化剤である
化合物Ａ：３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸（ＢＨＴ）とカルパイン阻害剤である化合物Ｂ：３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−２−プロペン酸（ＰＤ１５０６０６）との組合せ体。
【００４３】
実施例５
化合物ＡＢ：酸素のフリーラジカルを捕捉する抗酸化剤である
化合物Ａ：４−ヒドロキシジフェニルアミンとカルパイン阻害剤である化合物Ｂ：３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−２−プロペン酸（ＰＤ１５０６０６）との組合せ体。
【００４４】
実施例６
化合物ＡＢ：酸素のフリーラジカルを捕捉する抗酸化剤である
化合物Ａ：４−ヒドロキシジフェニルアミンとカルパイン阻害剤である化合物Ｂ：Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈとの組合せ体。
【００４５】
実施例７
化合物ＡＢ：酸素のフリーラジカルを捕捉する抗酸化剤である
化合物Ａ：２−メトキシ−１０Ｈ−フェノチアジンとカルパイン阻害剤である化合物Ｂ：カルペプチンとの組合せ体。
【００４６】
薬理研究
本発明の化合物を生体外で若干の生物学的試験にかけて、カルパインを阻止し且つフリーラジカルを捕捉するそれらの活性を証明した。それらの活性は酵素試験において且つ細胞死滅から保護するモデルについて評価した。このモデルにおいては、壊死による細胞死滅はマイトトキシンにより誘発した（神経化学雑誌  Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  １９９９，７２（５）；１８５３〜１８６３  Ｍｃ Ｇｉｎｎｉｓ等）。マイトトキシンはカルシウムチャンネルを賦活化する海洋毒素である（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９０、３９：１６３３〜１６３９、Ｇｕｓｏｖｓｋｙ等）。かくしてラットのグリア細胞Ｃ６において細胞内カルシウムの１０〜２０倍の増大が得られる（Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． １９９９；１２；９９３〜１００１、Ｋｏｎｏｋｉ等）。ＳＨＳＹ５Ｙヒトの神経芽細胞腫をマイトトキシンで処置すると細胞内カルシウムの増大を介してカルパイン活性の賦活化を誘発する（生化学及び生物理学の文庫、３３１（２）；２０８〜２１４、Ｗａｎｇ等）。カルパインは賦活化されるためにはカルシウムを絶対的に必要とする細胞質基質のプロテアーゼ  システインである。カルパインの２種のイソ型が組織中に偏在しており；即ちカルパインＩ即ち”μ”とカルパインＩＩ即ち”ｍ”とが偏在しており、これらは賦活化されるためにはμＭ濃度又はｍＭ濃度のカルシウムをそれぞれ必要とする。
【００４７】
マイトトキシンによって誘発される壊死の現場でのモデルでは、カルパインの刺激と反応性酸素種の生産とが生起する。カルパイン阻害剤又は反応性酸素種捕捉剤の壊死における部分的保護作用を証明する。組合せ体の作用は、カルパイン阻害剤又は反応性酸素種捕捉剤単独での処理によって生じた作用と比較した。カルパイン阻害剤と反応性酸素種捕捉剤との組合せ体は、別個に採用されしかも用いた投与量でのカルパイン阻害剤又は反応性酸素種捕捉剤の作用と比較するとマイトトキシンによって誘発される壊死に有意な程の保護作用を示す。これはカルパイン阻害剤と反応性酸素種捕捉剤との間の相乗効果を証明する。
【００４８】
１）  ヒトのカルパインＩにおける作用の研究
該試験は酵素（ヒトの赤血球から精製した酵素）の活性を測定することからなり、該酵素は蛍光色素（アミノメチルクマリン、ＡＭＣ）及びカルシウムと組合わせたペプチド基質の存在下に緩衝剤中で培養（インキュベート）した。カルシウムによって賦活化した該酵素は基質をタンパク分解し、ＡＭＣフラグメントを放出する。放出したＡＭＣは３８０ｎｍでの励起下に４６０ｎｍで蛍光する。それ故該酵素の活性は、蛍光の量即ち遊離ＡＭＣフラグメントの量に比例する。蛍光（３８０／４６０ｎｍ）はマルチウェル（凹み）の蛍光光度計（ビクター２、Ｗａｌｌａｃ）を用いて測定した。
【００４９】
検定は、透明な底部と黒色の壁面とを有する９６個の凹みの微小板（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅｓ）で行ない、該微小板中に、１個の凹み当りＤＭＳＯ １０％中の１０μｌの供試物質と、緩衝剤（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １１０ｍＭ；ＮａＣｌ  １１０ｍＭ；ＥＤＴＡ  ２．２ｍＭ；ＥＧＴＡ  ２．２ｍＭ；メルカプトエタノール  １．１ｍＭ）に入れた２．２Ｕ／ｍｌのヒトのカルパインＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、参照番号；２０８７１３）、１．１ｍＭのＳｕｃ Ｌｅｕ Ｔｙｒ−ＡＭＣ基質（Ｂａｃｈｅｍ．参照番号：Ｉ−１３５５）を含有する反応混合物４５μｌを分布させた。反応は４５μｌのＣａＣｌ２  ２２ｍＭを添加することにより開始した。バックグラウンドノイズを測定するために、カルシウムなしの対照凹みを微小板に追加した（１０μｌのＤＭＳＯ  １０％＋４５μｌの酵素及び基質入り緩衝剤＋４５μｌの水）。酵素の全活性を測定するために、生成物を含有しない対照凹みを微小板に追加した（１０μｌのＤＭＳＯ  １０％＋４５μｌの酵素及び基質入り緩衝剤＋４５μｌのＣａＣｌ２  ２２ｍＭ）。生成物の各々の濃度（０．１ｎＭ〜１０μＭ）を２回試験した。微小板を振盪し、培養は２５℃で１時間暗所で行なった。蛍光はビクターを用いて３８０／４６０ｎｍで読み取った。
【００５０】
結果はＩＣ５０値として表わされ、以下の表１に要約した。
【００５１】
２）  ヒトの神経芽細胞腫（ＳＨＳＹ５Ｙ）及びラットのグリア細胞（Ｃ６）におけるカルパイン活性の現場での作用
ヒトの神経芽細胞腫ＳＨＳＹ５Ｙ及びラットのグリア細胞Ｃ６を、ＤＭＥＭ  １０％ＦＢＳに入れた９６個の凹みの微小板で１個の凹み当りそれぞれ５０，０００個の細胞及び２５，０００個の細胞の割合で播種した。次の日に、板に付着した細胞を血清なしのＤＭＥＭ培地及び４０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ中で３回洗浄した。１００マイクロリットルの生成物Ｂを凹みに配置した。５％ＣＯ２の雰囲気下に３７℃で１時間培養した後に、カルパインの蛍光基質（Ｓｕｃ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＡＭＣ）及びマイトトキシン（シグマ社、参照番号：Ｍ−９１５９）を含有する１０μｌを、それぞれ１００μＭ及び１ｎＭの最終濃度を凹み中で得るために添加した。
【００５２】
細胞酵素の全活性を測定するために、生成物を含有しない凹みを微小板に追加した（１００μｌのＤＭＳＯ  １００ｔｈ＋１０μｌのＭＴＸ及び基質）。バックグラウンドのノイズはＭＴＸを有しない対照凹みを追加することにより測定した。生成物の各々の濃度（ＳＨＳＹ５Ｙ細胞については０．３μＭ〜２００μＭ及びＣ６細胞については０．０１μＭ〜１００μＭ）を３連制で試験した。微小板を振盪し、蛍光はＴゼロでビクターを用いて３８０／４６０ｎｍで読み取った。培養は３０℃で暗所でＳＨＳＹ５Ｙ細胞については４時間、Ｃ６細胞については１時間３０分行なった。
【００５３】
結果をＩＣ５０値として表わし、以下の表１に要約した。
【００５４】
表１：化合物Ａ及びＢの酵素阻害活性
2004533987.tif 000005
（ロイペプチン並びに実施例３〜７は無細胞のヒトのカラピンＩの阻止についてのみ試験した）。
【００５５】
３）  脂質の脂質過酸化（ｌｉｐｏｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ）における生体外作用
該試験は鉄及びアスコルベートの存在下にフェントン反応により脂質過酸化を誘発することからなる。脂質過酸化の程度はマロンアルデヒド（ＭＤＡ）の濃度により決定する。不飽和脂肪酸の脂質過酸化により生じたＭＤＡは脂質過酸化の良好な尺度である（Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ等のＭｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８６；４０１〜４２１（１９９０））。この比色試験について、ＭＤＡの１分子と色素試薬Ｒ（Ｎ−メチル−２−フェニルインドール）の２分子とが縮合すると安定な発色団を生じ、その最大吸光度波長は５８６ｎＭに等しい。
【００５６】
体重２００〜２５０ｇの雄のスプラグ  ダウレイ  ラットの皮質から細胞膜を調製した。ラットを断頭により屠殺し、脳を直ちに取出し、冷却Ｔｒｉｓ ＨＣｌ  ２０ｍＭ（ｐＨ ７．４）でゆすいだ。解剖及び白色物質の除去後に、皮質を４℃でＴｒｉｓ ＨＣｌ緩衝剤２０ｍＭ（ｐＨ ７．４）中でトーマス  ポッターで次いで粉砕した。得られた均等質を低速で遠心分離して大きな汚物を除去した（４℃で１５分間、５１５ｇ）。次いで上澄み液をポリカーボネート遠心管に分布させ、４℃で２５分間５１５００ｇで遠心分離した。膜のペレットを−８０℃で保存した。
【００５７】
実験の当日に、Ｔｒｉｓ ＨＣｌ緩衝剤２０ｍＭ（ｐＨ ７．４）の５ｍｌ当り０．５当量ｇの皮質の濃度で凍結した膜を再懸濁し、コンビチップス（ｃｏｍｂｉｔｉｐｓ）を用いて均質化した。円錐基部を有する、９６個の凹みの「深凹み」１ｍｌポリプロピレン板中で、１個の凹み当り５μｌの供試生成物又は溶剤をラットの脳皮質均等質の４０μｌと遠心（８００ｒｐｍ）により混合した。該板を粘着性のアルミニウムシートで被覆し、３７℃で１５分間攪拌下に培養した。脂質過酸化反応は１個の凹み当り１ｍＭのＥＤＴＡと４ｍＭのアスコルビン酸と１ｍＭのＦｅＣｌ２とを含有する過酸化混合物の添加によりウエントン反応により開始してＭＤＡを形成した。該板を短時間に遠心し（８００ｒｐｍ）、粘着性のアルミニウムシートで被覆した。攪拌下に３７℃で３０分間培養した後に、３容量の色素原試薬Ｒと１容量のメタノールとを含有する発現混合物を１個の凹み当り添加した。１０秒間攪拌した後に、４０μｌの３７％ＨＣｌを１個の凹み当り添加した。生成したＭＤＡの発現は４５℃で４５分間の培養後に得られた。
【００５８】
該膜及び上澄み液はマルチスクリーン濾過基剤ＮＡ（ミリポア、参照番号：ＭＡＮＡＮＬＹ５０）を用いて９６個の凹みの板上で真空濾過により分離した。９６個の凹みの板で回収した上澄み液の吸光度は光度計を用いて読み取った。
【００５９】
結果はＩＣ５０値として表わし、以下の表２に要約した。
【００６０】
４）  イソプロスタン濃度（８−イソＰＧ１Ｆ２α）への現場での作用
８−イソＰＧ１Ｆ２αは或る化合物のファミリーの一部であり、その第１の合成段階（アラキドン酸の過酸化）はフリーラジカルの存在下に無酵素要領で行なう（Ｍｏｒｒｏｗ及びｃｏｌｌ、１９９０）。８−イソＰＧ１Ｆ２α濃度の測定は酸化ストレスの信頼しうるマーカーと考えられる。
【００６１】
ラットのグリア細胞Ｃ６はＤＭＥＭ  １０％ＦＢＳ中での９６個の凹みの板で１個の凹み当り２５，０００個の細胞で播種された。次の日に、１００μｌの生成物Ａを凹みに配置した。５％ＣＯ２の雰囲気下に３７℃で１時間培養した後に、マイトトキシン含有１０μｌを添加して凹みに１ｍＭの最終濃度を得た。３時間培養した後に上澄み液を取出し、−２０℃で凍結した。８−イソＰＧ１Ｆ２α濃度は特異なＥＩＡ投薬キット（カイマン  ケミカル社、参照番号：５１６３５１）を用いて測定した。
【００６２】
結果をＩＣ５０（μＭ）値として表わし、以下の表２に要約した。
【００６３】
表２  化合物Ａ及びＢの酵素阻害活性
2004533987.tif 000006
（ロイペプチン並びに実施例３〜７はヒトの無細胞カラピンＩの阻害についてのみ試験した）。
【００６４】
５）  マイトトキシンによって誘発される壊死についての生体外作用
ヒトの神経芽細胞種ＳＨＳＹ５Ｙ及びラットのグリア細胞Ｃ６を、２４時間ＤＭＥＭ  １０％ＦＢＳに入れた９６個の凹みの板中で１個の凹み当り２５，０００個の細胞で播種した。Ｌ６ラットの筋原細胞はゼラチン  ０．５％ＰＢＳで前もって被覆した９６個の凹み微小板上でＤＭＥＭ  １０％ＦＢＳ中で１個の凹み当り１，０００個の細胞で播種した。３日間培養した後に、培地を取出し、分別培地（ＤＭＥＭ＋１０μｇ／ｍｌのインスリン＋１００μｇ／ｍｌのトランスフェリン）を補充した。５０μｌの生成物Ａと５０μｌの溶剤又は５０μｌの生成物Ｂを凹みに配置した。５％ＣＯ２の雰囲気下に３７℃で１時間培養した後に、１０μｌのマイトトキシンを添加して０．１ｎＭ〜１ｎＭ（細胞の型式に応じて）の最終濃度を得た。５％ＣＯ２の雰囲気下に３７℃で３時間培養した後に、細胞の生存能力は１０μｌのテトラゾリウム塩（ｗｓｔ−１、ロッシェ社、参考番号：１６４４８０７）を添加することにより測定した。テトラゾリウム塩はミトコンドリアの脱水素酵素によりホルマザン分子に開裂された。生成したホルマザンの量は培養物中の代謝活性細胞の個数と直接相関する。ホルマザンの吸光度の測定は６２０ｎｍ対照波長に対して４２０ｎｍの波長で多重凹み（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ）光度計を用いて行なう。結果は０．１ｎＭマイトトキシン（ＭＴＸ）によって誘発される壊死に対して保護百分率（％）として表わし、以下の表４及び５に要約する。
【００６５】
理論的な作用は生成物Ａの存在下での死滅細胞の百分率に生成物Ｂの存在下での死滅細胞の百分率をかけることにより得られた（表３）。ＭＴＸにより誘発される細胞死滅に対する保護百分率は１種又はそれ以上の生成物の存在下に生存し続けた細胞の百分率である。
【００６６】
表３  化合物Ａ及びＢの相互作用の測定
2004533987.tif 000007
第１の一連の実験においては、実施例１において生成物Ａの濃度を固定し（１００μＭ）、生成物Ｂは零から１００μＭまで変化する濃度で添加した（表４Ａ）。第２の一連の実験においては、実施例１の生成物Ｂを１００μＭに固定し、生成物Ａは零から１００μＭにまで変化する濃度で添加した（表４Ｂ）。ＭＴＸにより誘発される壊死からＳＨＳＹ５Ｙ細胞を保護するのに生成物Ａと生成物Ｂとの間で最大の相乗作用を示すのは両生成物の各々の１００μＭでの組合せ体である。
【００６７】
表４：  ヒトの神経芽細胞種ＳＨＳＹ５Ｙ（ｎ＝２）への０．１ｎＭマイトトキシンにより誘発される壊死からの保護
表４Ａ：種々濃度の化合物Ｂ（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈ）の存在下に化合物Ａ（ＢＨＴ）（１００μＭで固定した濃度）の相互作用
2004533987.tif 000008
表４Ｂ：種々濃度の化合物Ａ（ＢＨＴ）の存在下に固定した（１００μＭ）化合物Ｂ（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈ）の相互作用
2004533987.tif 000009
前述の結果から見て、両生成物の１００μＭの割合で生成物Ａと生成物Ｂとを有する実施例１の組合せ体は、ヒトの神経芽細胞種（ＳＨＳＹ５Ｙ；表５Ａ）について実施され、しかも大多数の場合２５μＭの生成物Ａと５０μＭの生成物Ｂとを有してグリア細胞（Ｃ６；表５Ｂ）について実施された。
【００６８】
表５：壊死からの保護における化合物Ａ及びＢの相乗的な相互作用
表５Ａ：
2004533987.tif 000010
表５Ａ、実施例１の結果が示す処によれば、１００μＭの濃度で用いたＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈカルパイン阻害剤はマイトトキシンによって誘発される壊死からヒトの神経芽細胞種（ＳＨＳＹ５Ｙ）を有効に保護する程には活性でない。同様に、１００μＭの投与量で反応性酸素種捕捉剤として用いた３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸は活性が弱い（２０％以下）。他方、２種の化合物の組合せ体は、別個に試験した２種の化合物と比較すると有意な程の保護を与える。この作用は相乗作用である。何故ならば２種の化合物を組合わせることにより得られた保護百分率は、算出される理論作用よりも大きいからである（表３及び５Ａ、実施例１）。
【００６９】
表５Ｂ：
2004533987.tif 000011
（（ａ）  実施例１及び３〜７についてはｎ＝１、実施例２についてはｎ＝３）
表５Ａについてと同様に、表５Ｂ、実施例１の結果が示す処によれば５０μＭの濃度で用いたＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈカルパイン阻害剤はマイトトキシンによって誘発される壊死からラットのグリア細胞（Ｃ６）を有効に保護する程には活性でない。同様に、２５μＭの投与量で反応性酸素種捕捉剤として用いた３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸は活性が弱い（２０％の程度）。他方、２種の化合物の組合せ体は別個に試験した２種の化合物と比較すると有意な保護（４３％）を与える。この作用は相乗作用である。何故ならば、２種の化合物の組合せ体によって得られた保護百分率は算出した理論作用よりも大きいからである（表３及び５Ｂ、実施例１）。
【００７０】
ＭＴＸによって誘発される壊死からの保護に抗−ＲＯＳ及び抗−カルパインの相乗作用は、別の抗酸化剤及び別のカルパイン阻害剤に対してグリア細胞で証明された（実施例２、表５Ｂ）。
【００７１】
同様に、反応性酸素種を捕捉する抗酸化剤である２−メトキシ−１０Ｈ−フェノチアジン及びカルパイン阻害剤であるＺ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｈはマイトトキシンによって誘発される壊死からラットのグリア細胞（Ｃ６）を保護するのに５０μＭの投与量では不活性である。他方、２−メトキシ−１０Ｈ−フェノチアジンとＺ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｈとの組合せ体（表５、実施例２）は別個に試験した２種の化合物並びに理論的な組合せ体と比較すると高度に有意な保護を示す。この作用は有意な程に相乗作用である。何故ならば、２種の化合物の組合せ体によって得られた保護百分率は算出した理論作用よりも有意な程に大きいからである（表３及び５Ｂ）。
【００７２】
他の抗酸化剤と他のカルパイン阻害剤との相乗作用もグリア細胞について試験した（実施例３〜７；表５Ｂ）。実施例７は別の細胞系について特にラットの骨格筋細胞（筋管に分化した筋原細胞；表５Ｃ）について再現した。これらの実施例において、生成物Ａ及びＢはマイトトキシンによって誘発される壊死に対してそれら自体殆んど保護を与えないが、他方、２種の化合物の組合せ体は、別個に試験した２種の化合物と比較すると保護を与える。これらの保護作用は相乗作用である。何故ならば、２種の化合物の組合せ体によって得られた保護百分率は算出した理論作用よりもずっと大きいからである（表３、実施例３〜７及び５Ｃ、実施例７）。
【００７３】
表５Ｃ：
2004533987.tif 000012
【国際公開パンフレット】
2004533987.tif 000013
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533987.tif 000047
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533987.tif 000048
【手続補正書】
【提出日】平成15年3月31日(2003.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分として少なくとも１種のカルパイン阻害物質と少なくとも１種の反応性酸素種捕捉物質とを含有し且つ場合によっては製薬上許容し得る担体を含有してなる医薬組成物において反応性酸素種捕捉剤はフェノール化合物、フェノチアジン及びジフェニルアミン類から選ばれることを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
活性成分として１種のカルパイン阻害物質と１種の反応性酸素種捕捉物質とを含有し且つ場合によっては製薬上許容しうる担体を含有してなる請求項１記載の組成物。
【請求項３】
カルパイン阻害剤は次式（ＩＢ）
Ｔ−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｙ  （ＩＢ）
〔式中Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は個々に水素原子を表わすかあるいは１個又はそれ以上の置換基即ちヒドロキシ基、低級アルコキシ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、カルボキシ基、アミノカルボニル基、（低級アルキル）アミノカルボニル基、ジ（低級アルキル）アミノカルボニル基、アミノ基、グアニジノ基、随意に置換したアリール基又は随意に置換したヘテロアリール基から選んだ置換基によって随意に置換された低級アルキル基を表わし、前記アリール及びヘテロアリール基の１個又はそれ以上の置換基はハロ、ヒドロキシ、低級アルキル又は低級アルコキシ基から選ばれ；
Ｙは水素原子又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｙ又はＣ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ’ｙ基を表わし、但しＲｙは低級アルキル基又は−Ｎ（Ｒｙ１）（Ｒｙ２）基を表わし；
Ｒ’ｙは水素原子又は低級アルキル基又は低級アラルキル基を表わし；
Ｒｙ１及びＲｙ２は個々に水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アラルキル基、低級ヘテロアラルキル基、シクロアルキル−アルキル基、ヘテロシクロアルキル基を表わし；これらの基は１個又はそれ以上の同一又は相異なる置換基即ちハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、アリールオキシ基、アリールアルコキシ基から選んだ置換基によって置換されうるものであり；
ｎは０又は１を表わし；
Ｔは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｔ１又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｔ２の基を表わし、但しＲｔ１は低級アルキル基又は低級アラルキル基を表わし；
Ｒｔ２は低級アルキル基、低級アラルキル基、アリールオキシ低級アルキル基又はヘテロアリール基を表わす〕に相当する請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
カルパイン阻害剤は次式（ＩＢ）
Ｔ−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｙ    （ＩＢ）
〔式中Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は個々に１個又はそれ以上の置換基即ちヒドロキシ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、カルボキシ基、アミノカルボニル基、アミノ基、グアニジノ基又は随意に置換したフェニル、インドール又はイミダゾール基から選んだ置換基によって随意に置換されたアルキル基を表わし、前記のフェニル、インドール及びイミダゾール基の１個又はそれ以上の置換基はハロ基、ヒドロキシ基、低級アルキル基又は低級アルコキシ基から選ばれ；
Ｙは水素原子又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｙ又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ’ｙ基を表わし、但しＲｙは低級アルキル基又は−Ｎ（Ｒｙ１）（Ｒｙ２）基を表わし；
Ｒ’ｙは低級アルキル基又はベンジル基を表わし；
Ｒｙ１は水素原子を表わし、Ｒｙ２は個々に水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アラルキル基、低級ヘテロアラルキル基、シクロアルキル−アルキル基、ヘテロシクロアルキル基を表わし、これらの基は１個又はそれ以上の同一又は相異なる置換基即ちハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、アリールオキシ基、アリールアルコキシ基から選んだ置換基によって置換されうるものであり；
ｎは０又は１を表わし；
Ｔは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｔ１又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｔ２の基を表わし、但しＲｔ１は低級アルキル基、ベンジル基、フェネチル基を表わし；
Ｒｔ２は低級アルキル基、低級アラルキル基、アリールオキシ低級アルキル基又はヘテロアリール基を表わす〕に相当する請求項１〜３の何れかに記載の組成物。
【請求項５】
カルパイン阻害剤は次式（ＩＢ）
Ｔ−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｙ    （ＩＢ）
〔式中Ｒ１及びＲ２は個々にフェニル基によって随意に置換されたアルキル基を表わし、該フェニル基自体、ハロ基、ヒドロキシ基によって随意に置換されており；
Ｙは水素原子を表わし；
Ｔは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｔ１（但しＲｔ１は低級アルキル基又はベンジル基を表わす）の基を表わし、ｎは０である〕に相当する請求項１〜４の何れかに記載の組成物。
【請求項６】
カルパイン阻害剤は３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−２−プロペン酸である請求項１又は２記載の組成物。
【請求項７】
反応性酸素種捕捉剤は３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸（ＢＨＴ）、２−メトキシ−１０Ｈ−フェノチアジン及び４−ヒドロキシジフェニルアミンから選択され；しかも
カルパインを阻害する化合物はベンジル（１Ｓ）−１−（｛［（１Ｓ）−１−ホルミル−３−メチルブチル］アミノ｝カルボニル）−３−メチルブチルカルバメート、ベンジル（１Ｓ）−１−｛［（１−ベンジル−２−オキソエチル）アミノ］カルボニル｝−３−メチルブチルカルバメート、１−｛［（１−ホルミルペンチル）アミノ］カルボニル｝−３−メチルブチル  カルアバミン酸のベンジルエステル（カルペプチン）及び３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−２−プロペン酸から選択される請求項１又は２記載の組成物。
【請求項８】
カルパイン及び反応性酸素種が関与する病状の処置に、病状例えば炎症性及び免疫性及び免疫系の疾病、心臓血管性及び脳血管性の疾病、中枢神経系の疾病、骨粗鬆症、筋ジストロフィー、悪液質、難聴、増殖性疾病、白内障、器官の移植、自己免疫性及びウィルス性の疾病、ガン及びＲＯＳの過度の生産及び／又はカルパインの賦活化を特徴とする全ての疾病の処置に、同時又は順次に用いるため個々分離した形で、組合せ生成物としてカルパインを阻害する少なくとも１種の物質と少なくとも１種の反応性酸素種捕捉物質とを含有してなる生成物において反応性酸素種捕捉剤がフェノール化合物、フェノチアジン及びジフェニルアミン類から選ばれることを特徴とする医薬生成物。
【請求項９】
中枢又は末梢神経系の疾病、筋ジストロフィー、悪液質、難聴、白内障の処置に用いる請求項８記載の生成物。
【請求項１０】
カルパイン阻害剤は次式（ＩＢ）
Ｔ−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｙ    （ＩＢ）
〔式中Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は個々に水素原子を表わすか又は１個又はそれ以上の置換基即ちヒドロキシ基、低級アルコキシ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、カルボキシ基、アミノカルボニル基、（低級アルキル）アミノカルボニル基、ジ（低級アルキル）アミノカルボニル基、アミノ基、グアニジノ基、随意に置換したアリール基又は随意に置換したヘテロアリール基から選んだ置換基によって随意に置換された低級アルキル基を表わし、前記のアリール基及びヘテロアリール基の１個又はそれ以上の置換基はハロ基、ヒドロキシ基、低級アルキル基又は低級アルコキシ基から選ばれ；
Ｙは水素原子又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｙ又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ’ｙ基を表わし、但しＲｙは低級アルキル基又は−Ｎ（Ｒｙ１）（Ｒｙ２）基を表わし；
Ｒ’ｙは水素原子又は低級アルキル基又は低級アラルキル基を表わし；
Ｒｙ１及びＲｙ２は個々に水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アラルキル基、低級ヘテロアラルキル基、シクロアルキル−アルキル基、ヘテロシクロアルキル基を表わし、これらの基は、ハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、アリールオキシ基、アリールアルコキシ基から選んだ１個又はそれ以上の同一又は相異なる置換基によって置換されうるものであり；
ｎは０又は１を表わし；
Ｔは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｔ１又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｔ２の基を表わし、但し
Ｒｔ１は低級アルキル基又は低級アラルキル基を表わし；
Ｒｔ２は低級アルキル基、低級アラルキル基、アリールオキシ低級アルキル基又はヘテロアリール基を表わす〕に相当する請求項８又は９記載の生成物。
【請求項１１】
カルパイン阻害剤は次式（ＩＢ）
Ｔ−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｙ    （ＩＢ）
〔式中Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は個々に１個又はそれ以上の置換基即ちヒドロキシ基、メルカプト基、低級アルキルチオ基、カルボキシ基、アミノカルボニル基、アミノ基、グアニジノ基、又は随意に置換したフェニル、インドール又はイミダゾール基から選んだ置換基によって随意に置換されたアルキル基を表わし、
前記フェニル、インドール及びイミダゾール基の１個又はそれ以上の置換基はハロ基、ヒドロキシ基、低級アルキル基又は低級アルコキシ基から選ばれるものであり；
Ｙは水素原子又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｙ又は−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ’ｙ基を表わし、但しＲｙは低級アルキル基又は−Ｎ（Ｒｙ１）（Ｒｙ２）基を表わし；
Ｒ’ｙは低級アルキル基又はベンジル基を表わし；
Ｒｙ１は水素原子を表わし、Ｒｙ２は個々に水素原子、低級アルキル基、低級アルコキシ基、低級アラルキル基、低級ヘテロアラルキル基、シクロアルキル−アルキル基、ヘテロシクロアルキル基を表わし、これらの基はハロ基、ヒドロキシ基、トリフルオロメチル基、低級アルキル基、低級アルコキシ基、アミノ基、（低級アルキル）アミノ基、ジ（低級アルキル）アミノ基、アリールオキシ基、アリールアルコキシ基から選んだ１個又はそれ以上の同一又は相異なる置換基によって置換されうるものであり；
ｎは０又は１を表わし；
Ｔは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｔ１又は−Ｃ（Ｏ）−Ｒｔ２の基を表わし、但し
Ｒｔ１は低級アルキル基、ベンジル基又はフェネチル基を表わし；
Ｒｔ２は低級アルキル基、低級アラルキル基、アリールオキシ低級アルキル基又はヘテロアリール基を表わす〕に相当する請求項８〜１０の何れかに記載の生成物。
【請求項１２】
カルパイン阻害剤は次式（ＩＢ）
Ｔ−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ１）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ（Ｒ２）−Ｃ（Ｏ）−［ＮＨ−ＣＨ（Ｒ３）−Ｃ（Ｏ）］ｎ−Ｙ    （ＩＢ）
〔式中Ｒ１及びＲ２は個々にフェニル基によって随意に置換されたアルキル基を表わし、該フェニル基それ自体はハロ基又はヒドロキシ基によって随意に置換されており；
Ｙは水素原子を表わし；
Ｔは式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒｔ１の基を表わし、但しＲｔ１は低級アルキル基又はベンジル基を表わし、ｎは０である〕に相当する請求項８〜１１の何れかに記載の生成物。
【請求項１３】
カルパイン阻害剤は３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−２−プロペン酸である請求項８又は９記載の生成物。
【請求項１４】
反応性酸素種捕捉剤は３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ安息香酸（ＢＨＴ）、２−メトキシ−１０Ｈ−フェノチアジン及び４−ヒドロキシジフェニルアミンから選択され；しかも
カルパインを阻害する化合物はベンジル（１Ｓ）−１−（｛［（１Ｓ）−１−ホルミル−３−メチルブチル］アミノ｝カルボニル）−３−メチルブチルカルバメート、ベンジル（１Ｓ）−１−｛［（１−ベンジル−２−オキソエチル）アミノ］カルボニル｝−３−メチルブチルカルバメート、（１−｛［（１−ホルミルペンチル）アミノ］カルボニル｝−３−メチルブチル）カルバミン酸のベンジルエステル（カルペプチン）及び３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−２−プロペン酸から選択される請求項１１又は１２記載の生成物。
【請求項１５】
筋ジストロフィーの処置に意図した医薬を製造するためにカルパインを阻害する物質と、フェノール化合物、フェノチアジン及びジフェニルアミン類から選んだ反応性酸素種捕捉剤との使用。
【請求項１６】
悪液質の処置に意図した医薬を製造するためにカルパインを阻害する物質と、フェノール化合物、フェノチアジン及びジフェニルアミン類から選んだ反応性酸素種捕捉剤との使用。
【請求項１７】
難聴の処置に意図した医薬を製造するためにカルパインを阻害する物質と、フェノール化合物、フェノチアジン及びジフェニルアミン類から選んだ反応性酸素種捕捉剤との使用。
【請求項１８】
白内障の処置に意図した医薬を製造するためにカルパインを阻害する物質と、フェノール化合物、フェノチアジン及びジフェニルアミン類から選んだ反応性酸素種捕捉剤との使用。
【請求項１９】
中枢神経系の疾病の処置に意図した医薬を製造するためにカルパインを阻害する物質と、フェノール化合物、フェノチアジン及びジフェニルアミン類から選んだ反応性酸素種捕捉剤との使用。
【請求項２０】
カルパインを阻害する物質は３−（４−ヨードフェニル）−２−メルカプト−２−プロペン酸（ＰＤ １５０６０６）であるか又は請求項３に定義した式ＩＢに相当する請求項１５〜１９の何れかに記載の使用。
【国際調査報告】
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