(57)【要約】本発明は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドおよび核酸、ならびにそのようなポリペプチドおよび核酸の用途に関する。デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）は、種々の疾患に関連した広く分布しているマダニである。本発明の好ましい用途は、マダニのインフェステーションを予防または治療する化合物の入手である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
連続した少なくとも９アミノ酸長である配列番号１、配列番号２または配列番号３の特有アミノ酸領域を含んでなる精製されたポリペプチドであって、該特有領域が配列番号７中には存在しないことを特徴とする精製されたポリペプチド。
【請求項２】
該特有領域が、
ＱＩＬＮＡＦＦＴＲＧ（配列番号９）、
ＭＴＶＧＡＥＶＡＥＲＩＷＶＰ（配列番号１０）、
ＲＷＳＤＧＤＴＳＶＲＩＡＫ（配列番号１１）、
ＴＡＬＬＥＹＡＡＶＧＹＬＧ（配列番号１２）、
ＲＣＡＡＡＳＳＮＥＰＳＳＥＰＬＬＡＳＰＥＶＳＩＶＫＴ（配列番号１３）、
ＱＰＲＥＡＰＰＴＧＦＴ（配列番号１４）、
ＭＧＲＲＧＡＤＱＣＣＰＧＬＱＧＳＣＱＶＣ（配列番号１５）、
ＭＥＶＲＬＫＭＶＤＰＫＧＦＳＫＳＳ（配列番号１６）、
ＨＩＳＤＶＬＰＤＤＶＧＤＤ（配列番号１７）および
ＨＶＳＤＶＬＰＤＤＶＧＤＤ（配列番号１８）よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
該ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２および配列番号３よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
該ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２および配列番号３よりなる群から選ばれるアミノ酸配列よりなる、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
該ポリペプチドが、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列よりなる、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる精製された核酸。
【請求項７】
請求項５記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる精製された核酸。
【請求項８】
連続的な少なくとも１８ヌクレオチド長である配列番号４、配列番号５、配列番号６またはその相補体の特有ヌクレオチド配列領域を含んでなる精製された核酸であって、該特有領域が配列番号８またはその相補体中には存在しないことを特徴とする核酸。
【請求項９】
該特有領域が、
ＣＡＡＡＣＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＣＡＡ（配列番号２０）、
ＧＡＧＣＧＡＣＴＣＴＣＧＴＴＣＣＡＧ（配列番号２１）、
ＡＴＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧ（配列番号２２）、
ＡＡＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＣＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡ（配列番号２３）、
ＣＴＣＧＧＣＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＣＣ（配列番号２４）、
ＧＧＴＴＣＣＴＧＴＣＡＡＧＴＴＴＧＴ（配列番号２５）、
ＧＧＴＴＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＧＴ（配列番号２６）および
ＣＣＡＡＣＣＧＧＡＴＴＴＡＣＣＡＴＧ（配列番号２７）よりなる群から選ばれる配列を含む、請求項８記載の精製された核酸。
【請求項１０】
該核酸が、配列番号４、配列番号５および配列番号６のヌクレオチド配列よりなる群から選ばれる配列を含む、請求項８記載の精製された核酸。
【請求項１１】
該核酸が、配列番号４、配列番号５および配列番号６のヌクレオチド配列よりなる群から選ばれる配列よりなる、請求項１０記載の精製された核酸。
【請求項１２】
連続的な少なくとも９アミノ酸長である配列番号１、配列番号２または配列番号３の特有アミノ酸領域をコードする組換えヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターであって、該特有領域が配列番号７中には存在しないことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１３】
該組換えヌクレオチド配列が、配列番号１、配列番号２および配列番号３よりなる群から選ばれる配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１２記載の発現ベクター。
【請求項１４】
請求項１２記載の発現ベクターを含んでなる組換え細胞であって、組換えヌクレオチド配列が、該細胞により認識されるプロモーターに機能的に共役していることを特徴とする組換え細胞。
【請求項１５】
請求項１３記載の発現ベクターを含んでなる組換え細胞であって、組換えヌクレオチド配列が、該細胞により認識されるプロモーターに機能的に共役していることを特徴とする組換え細胞。
【請求項１６】
請求項１２記載の発現ベクターを細胞内に導入する工程を含む製造方法により製造された組換え細胞であって、組換えヌクレオチド配列が、該細胞により認識されるプロモーターに機能的に共役していることを特徴とする組換え細胞。
【請求項１７】
配列番号１、配列番号２および配列番号３よりなる群から選ばれるポリペプチドに結合する抗体を含んでなる精製された抗体調製物。
【請求項１８】
該ポリペプチドが、配列番号１９（ＬＧＫＲＩＴＭＲＫＴＲＣＱＱＬＡＫＬＡＥＱＨＲＱＲ）のアミノ酸配列よりなる、請求項１７記載の抗体。
【請求項１９】
ＧＡＢＡ依存性塩素イオンポリペプチドの製造方法であって、連続した少なくとも９アミノ酸長である配列番号１、配列番号２または配列番号３の特有アミノ酸領域（該特有領域は配列番号７中には存在しない）をコードする組換えヌクレオチド配列を含む細胞を、該ポリペプチドが発現される条件下でインキュベートする工程を含んでなる製造方法。
【請求項２０】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルへの化合物の結合をアッセイするための方法であって、
ａ）連続した少なくとも９アミノ酸長である配列番号１、配列番号２または配列番号３の特有アミノ酸領域（該特有領域は配列番号７中には存在しない）を含むポリペプチドを組換え核酸から発現させ、
ｂ）１以上の試験化合物を含む試験調製物を該ポリペプチドに与え、
ｃ）該ポリペプチドへの該試験調製物の結合能を測定する工程を含んでなる方法。
【請求項２１】
該ポリペプチドが、配列番号１、２または３に示される連続した９アミノ酸から完全長までの配列よりなる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該工程（ｂ）および（ｃ）をインビトロで行う、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を、全細胞を使用して行う、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
該ポリペプチドを発現ベクターから発現させる、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
該ポリペプチドが、配列番号１、配列番号２および配列番号３よりなる群から選ばれる配列よりなる、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性の測定方法であって、
ａ）連続した少なくとも９アミノ酸長である配列番号１、配列番号２または配列番号３の特有アミノ酸領域（ただし、該特有領域は配列番号７中には存在しない）を含む機能的ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを発現する組換えヌクレオチド配列を含む組換え細胞を化合物と接触させ、
ｂ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性を測定する工程を含んでなる方法。
【請求項２７】
該機能的ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルが、配列番号１に対して少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該機能的ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルが、配列番号１、配列番号２および配列番号３よりなる群から選ばれる配列を含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２９】
該機能的ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルが、配列番号１、配列番号２および配列番号３よりなる群から選ばれる配列よりなる、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
マダニのインフェステーションを軽減または予防する方法であって、
ａ）デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性をモジュレーションする化合物を同定し、
ｂ）該化合物を使用してマダニのインフェステーションを軽減または予防する工程を含んでなる方法。
【請求項３１】
（ｉ）連続した少なくとも９アミノ酸長である配列番号１、配列番号２または配列番号３の特有アミノ酸領域（ただし、該特有領域は配列番号７中には存在しない）を含む機能的ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを発現する組換えヌクレオチド配列を含む組換え細胞を化合物と接触させ、（ｉｉ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性を測定することにより、該工程（ａ）を行う、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
該機能的ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルが、配列番号１、配列番号２および配列番号３よりなる群から選ばれる配列を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
該機能的ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルが、配列番号１、配列番号２および配列番号３よりなる群から選ばれる配列よりなる、請求項３２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本明細書中に引用されている参考文献は本発明の先行技術であると認められるものではない。
【０００２】
γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）は、昆虫および脊椎動物に存在する主要な抑制性神経伝達物質である。脊椎動物中枢神経系ＧＡＢＡ受容体は、サブタイプＧＡＢＡＡおよびサブタイプＧＡＢＡＢに分類されている。ＧＡＢＡＡ受容体はＧＡＢＡ依存性Ｃｌ−電流を生成し、ベンゾジアゼピン、バルビツール酸誘導体およびステロイドに関するモジュレーション部位を含有する。ＧＡＢＡＢ受容体は、Ｇタンパク質との相互作用を介してＫ＋およびＣａ２＋コンダクタンスに対するＧＡＢＡの効果を媒介する（Ｒａｕｈら，ＴｉＰＳ　１１：３２５−３２９，１９９０）。
【０００３】
ＧＡＢＡ受容体をコードする核酸が、脊椎動物および昆虫を含む種々の起源からクローニングされている。いくつかの脊椎動物ＧＡＢＡ受容体の具体例が、Ｏｌｓｅｎら，ＦＡＳＥＢ　Ｊ．４：４６９−１４８０，１９９０に考察されている。昆虫ＧＡＢＡ受容体の具体例が、Ｓｏｄｅｒｌｕｎｄら，米国特許第５，４８７，９７６号、Ｔｏｍａｌｓｋｉら，米国特許第５，８５４，００２号、Ｗｉｎｇａｔｅら，米国特許第５，７６７，２６２号およびＲｏｕｓｈら，国際公開番号ＷＯ　９３／０７１６１に記載されている。
【０００４】
昆虫から得られたＧＡＢＡ受容体の一例として、ディエルドリン耐性ＧＡＢＡ受容体（Ｒｄｌ）が挙げられる。Ｒｄｌをコードする核酸がショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）からクローニングされている（Ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：７２０９−７２１３，１９９１およびＲｏｕｓｈら，国際公開番号ＷＯ　９３／０７１６１）。ｒｄｌ遺伝子中にＡ３０２Ｓ突然変異を含有する昆虫は、シクロジエン、ピクロトキシニンおよびフィブロニルを含む種々のＧＡＢＡアンタゴニストに耐性である（Ｆｆｒｅｎｃｈ−Ｃｏｎｓｔａｎｔら，Ｎａｔｕｒｅ　３６３：４４９−４５１，１９９３；Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍら，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１８１：１３７−１４０，１９９４；およびＨｏｓｉｅら，Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　１１５：９０９−９１２，１９９５）。
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドおよび核酸、ならびにそのようなポリペプチドおよび核酸の用途に関する。デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）は、種々の疾患に関連した広く分布しているマダニである。本発明の好ましい用途は、マダニのインフェステーション（寄生、侵入）を予防または治療する化合物の入手である。
【０００６】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドは、配列番号１、２または３中に存在する連続した少なくとも９アミノ酸の領域を含有する。配列番号１、２および３は同一遺伝子に由来する。これらの配列間の相違は、ｍＲＮＡ編集および株変異によるものである。
【０００７】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドをコードする又は配列番号４、５、６もしくはそれらの相補体中に存在する少なくとも１８個の連続した核酸を含有する領域を含有する。また、ｍＲＮＡ編集および株変異の効果は、配列番号４、５および６のコード化核酸中の相違をもたらす。
【０００８】
したがって、本発明の第１の態様は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルの特有（ユニーク）アミノ酸領域を含む精製されたポリペプチドを記載する。該特有領域は少なくとも９アミノ酸長である。
【０００９】
「特有アミノ酸領域」は、配列番号１、２または３には存在し配列番号７には存在しない連続的なアミノ酸の領域である。配列番号７はキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｒｄｌ配列である。配列番号１、２または３中に存在する特有領域に対する言及は、配列番号１、２および３の任意の組合せ中に存在する特有領域を含む。該特有領域は、示されている特有領域サイズより小さな配列番号７中に存在する連続的なアミノ酸のセグメントを含有しうる。
【００１０】
「精製（された）ポリペプチド」は、サンプルまたは調製物中に存在する全タンパク質の少なくとも約１０％に相当する。好ましい実施形態においては、該精製ポリペプチドは、サンプルまたは調製物中の全タンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％または少なくとも約９５％に相当する。「精製（された）ポリペプチド」に対する言及は、該ポリペプチドがいずれかの精製を受けていることを要するものではなく、例えば、精製されていない化学合成されたポリペプチドを含みうる。
【００１１】
本発明のもう１つの態様は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルの特有アミノ酸領域をコードするヌクレオチド配列またはその相補体を含む精製された核酸を記載する。該コード領域は少なくとも９アミノ酸長である。
【００１２】
「精製（された）核酸」は、サンプルまたは調製物中に存在する全核酸の少なくとも約１０％に相当し、一本鎖核酸および二本鎖核酸の両方を含む。好ましい実施形態においては、該精製核酸は、サンプルまたは調製物中の全核酸の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％または少なくとも約９５％に相当する。「精製（された）核酸」に対する言及は、該核酸がいずれかの精製を受けていることを要するものではなく、例えば、精製されていない化学合成された核酸を含みうる。
【００１３】
本発明のもう１つの態様は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸の特有ヌクレオチド配列領域またはその相補体を含む精製された核酸を記載する。該特有ヌクレオチド配列領域は少なくとも１８ヌクレオチド長である。
【００１４】
「特有ヌクレオチド配列領域」は、配列番号８またはその相補体中には存在しない配列番号４、５、６またはそれらの相補体の少なくとも１８個の連続的なヌクレオチドを含む領域である。配列番号８は、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｒｄｌ配列をコードするヌクレオチド配列である。配列番号４、５、６またはそれらの相補体中に存在する特有領域に対する言及は、配列番号４、５および６またはそれらの相補体の任意の組合せ中に存在する特有領域を含む。該特有領域は、示されている特有領域サイズより小さな配列番号８中に存在する連続的なヌクレオチドのセグメントを含有しうる。
【００１５】
本発明のもう１つの態様は、発現ベクターを記載する。該発現ベクターは、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルの特有アミノ酸領域をコードする組換えヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
「組換えヌクレオチド配列」は、天然では付随しない１以上の核酸領域を含有する核酸上に存在する配列である。存在しうる核酸領域の具体例には、該配列に天然では付随しない１以上の調節要素、ウイルス要素および選択マーカーが含まれる。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルをコードする発現ベクターを含む組換え細胞を記載する。該発現ベクターは、該細胞内に存在するＲＮＡポリメラーゼにより認識される、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルの特有領域をコードする核酸に機能的に共役したプロモーターを含有する。
【００１８】
本発明のもう１つの態様は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルの特有アミノ酸領域をコードする発現ベクターを細胞内に導入することにより製造された組換え細胞を記載する。該発現ベクター内に存在するＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸は宿主ゲノム内に挿入されることが可能であり、あるいは宿主ゲノムから独立して存在することが可能である。
【００１９】
本発明のもう１つの態様は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルに結合する抗体を含む精製された抗体調製物に関する。「精製（された）抗体調製物」は、存在する抗体の少なくとも約１０％がデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルに結合する調製物である。好ましい実施形態においては、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルに結合する抗体が、存在する全抗体の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％または少なくとも約９５％に相当する。「精製（された）抗体調製物」は、該調製物中の抗体がいずれかの精製を受けていることを要さない。
【００２０】
本発明のもう１つの態様は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドの製造方法を記載する。該方法は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドをコードする組換えヌクレオチド配列を含有する細胞を、該ポリペプチドが発現される条件下でインキュベートする工程を含む。
【００２１】
本発明のもう１つの態様は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルへの化合物の結合をアッセイするための方法を記載する。該アッセイは、（ａ）特有デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルアミノ酸配列領域を含むポリペプチドを組換えヌクレオチド配列から発現させ、（ｂ）１以上の試験化合物を含む試験調製物を該ポリペプチドに与え、（ｃ）該試験調製物が該ポリペプチドに結合する能力を測定することを含む。
【００２２】
本発明のもう１つの態様は、ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性の測定方法を記載する。該方法は、機能的ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを組換えヌクレオチド配列から発現する組換え細胞内のＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性に対する化合物の効果を測定する。
【００２３】
本発明のもう１つの態様は、マダニのインフェステーションを軽減または予防する方法を記載する。該方法は、（ａ）デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性をモジュレーションする化合物を同定し、（ｂ）マダニのインフェステーションを軽減または予防するために該化合物を使用することを含む。
【００２４】
本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例を含む本明細書に記載の更なる説明から明らかである。記載されている実施例は、本発明の実施に有用な種々の成分および方法を例示するものである。該実施例は本発明を限定するものではない。本開示に従い、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を同定し使用することが可能である。
【００２５】
（図面の簡単な記載）
図１は、配列番号１（クローン（ｃｌｏｎｅ）８）、２（クローン９）および３（クローン５）のデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドとキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｒｄｌ（配列番号７）との比較を示す。
【００２６】
図２Ａ〜２Ｃは、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルをコードする核酸（配列番号５）と、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｒｄｌをコードする核酸（配列番号８）との比較を示す。
【００２７】
図３Ａおよび３Ｂは、配列番号４、５および６の配列比較を示す。
【００２８】
図４は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性を示す。配列番号１のデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを使用して、活性を測定した。
【００２９】
図５は、フィブロニル（ｆｉｂｒｏｎｉｌ）に対するデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルの感受性を示す。配列番号２のデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを使用して、活性を測定した。
【００３０】
（発明の詳細な記載）
本出願は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルのアミノ酸および核酸配列を同定するものである。そのような同定は、例えばデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）を同定するために及びデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）のインフェステーションを治療または予防するのに有用な化合物を得るために使用されうる標的を与える。
【００３１】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）は、その生活環の全体にわたり、種々の宿主の血液を餌とし、疾患のキャリアーとなりうる。その血液摂食行動の結果として、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）は、ロッキー山紅斑熱、バベジア症、ダニ性麻痺、アナプラズマ症、ツラレミアおよびシタウクスズーン症を含む多種多様な疾患に関連づけられている。デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）の宿主には、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、シカならびに他の野生および家畜動物が含まれる（例えば、Ｃｕｐｐ，Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｔｉｃｋｓ．Ｉｎ　Ｈｏｓｋｉｎｓ（編）：Ｔｉｃｋ−Ｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｄ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９１，ｐ．１−２６を参照されたい）。
【００３２】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）の同定は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸またはポリペプチドを他の生物の核酸またはポリペプチドから識別する核酸配列および抗体を使用して達成されうる。デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）の存在の判定を用いて、該寄生生物の広がりを追跡することができる。
【００３３】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）のインフェステーションの治療または予防に有用な化合物は、許容し得ない毒性効果を環境またはヒトおよび他の哺乳動物に及ぼすことなく該寄生生物に対して毒性効果を発揮する。デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルは、そのような効果を達成する化合物を得るための魅力的な標的を提供する。有用な化合物に関してスクリーニングするためにデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを使用する利点には、マダニで見出されるＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルと哺乳動物で見出されるＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルとの相違、およびデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）における毒性効果を達成するために標的化されうる部位の同定が含まれる。
【００３４】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性化合物は、例えば、アゴニスト、アンタゴニストまたはアロステリックモジュレーターとして作用することにより、チャンネルの活性をモジュレーションする。デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性を調節することが確認された化合物は更に、それらがデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）に対して毒性効果を発揮する能力を判定するために試験されうる。そのような化合物は、ヒトまたは他の哺乳動物に対して望ましくない効果を及ぼす可能性がより高い化合物を同定するためにヒトまたは哺乳動物ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルに対して容易にカウンター（ｃｏｕｎｔｅｒ）スクリーニングされうる。
【００３５】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルにおいて活性な化合物は、他のマダニまたは関連寄生生物（例えば、ダニ）に対しても毒性効果を発揮する可能性があり、そのような寄生生物に関連した疾患の広がりの予防に有用でありうる。また、本発明を指針として用いて、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルに関連したＧＡＢＡ受容体を他の生物から得ることができる。関連生物からのＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルは、より広く活性な化合物のスクリーニングを促進するために、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルと共に使用することができる。
【００３６】
デルマセンター・ヴァリァビリスＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチド
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドは、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルアミノ酸領域を含有する。そのようなポリペプチドは、配列番号１、２または３中に存在する又は存在しない追加的領域を含有しうる。
【００３７】
特有デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルアミノ酸領域は、本明細書に記載のデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル配列とキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｒｄｌ配列との比較に基づいて、容易に同定することができる。図１は、配列番号１、２、３および７の配列比較を提供する。
【００３８】
別の実施形態においては、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドは、特有アミノ酸領域を含む又はそれよりなる。特有領域の具体例には以下のものが含まれる：
ＱＩＬＮＡＦＦＴＲＧ（配列番号９）、
ＭＴＶＧＡＥＶＡＥＲＩＷＶＰ（配列番号１０）、
ＲＷＳＤＧＤＴＳＶＲＩＡＫ（配列番号１１）、
ＴＡＬＬＥＹＡＡＶＧＹＬＧ（配列番号１２）、
ＲＣＡＡＡＳＳＮＥＰＳＳＥＰＬＬＡＳＰＥＶＳＩＶＫＴ（配列番号１３）、
ＱＰＲＥＡＰＰＴＧＦＴ（配列番号１４）、
ＭＧＲＲＧＡＤＱＣＣＰＧＬＱＧＳＣＱＶＣ（配列番号１５）、
ＭＥＶＲＬＫＭＶＤＰＫＧＦＳＫＳＳ（配列番号１６）、
ＨＩＳＤＶＬＰＤＤＶＧＤＤ（配列番号１７）および
ＨＶＳＤＶＬＰＤＤＶＧＤＤ（配列番号１８）。
【００３９】
特有アミノ酸領域の定義は、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｒｄｌ配列に関するものである。したがって、例えば、特有アミノ酸領域は、１以上のデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル中、およびキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）以外の１以上の生物からのポリペプチド中に存在しうる。特有デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルアミノ酸領域が存在しうる他の生物の具体例には、他のマダニおよび／または他のクモ形類動物のような関連生物が含まれる。
【００４０】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドは、機能的チャンネルへの成分の付与、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルに結合する抗体を製造するための抗原としての使用、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルに結合する化合物を同定するための標的としての使用、および／またはデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性に影響を及ぼす化合物の能力を測定するためのアッセイにおける使用のような種々の用途を有する。
【００４１】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル由来の１以上の領域とデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル由来ではない１以上の領域とを含有するキメラポリペプチドを、本明細書に記載の開示に基づいて製造することができる。デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル由来の領域は、例えば、特定の目的を達成するために、またはデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルもしくはその断片の代わりに使用されうるポリペプチドを製造するために使用することができる。キメラデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチド中に存在する追加的領域により達成されうる特定の目的には、単離用のマーカーの付与、異なるチャンネル領域の機能解析の促進、および免疫応答の増強が含まれる。
【００４２】
別の実施形態においては、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドは、少なくとも１８、少なくとも２７または少なくとも５４アミノ酸長の特有アミノ酸領域を含む又はそれよりなる。好ましくは、該デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル関連ポリペプチドは、配列番号１、２または３のアミノ酸配列を含む又はそれよりなる。
【００４３】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドはまた、配列番号１に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％の配列類似性を有する機能的デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを含む。ポリペプチドに関する配列類似性は、ギャップウェイト８、長さウェイト２でＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ　Ｂｅｓｔｆｉｔ　Ａｌｇｏｒｉｔｈｍのような方法を用いて、およびＢＬＡＳＴ（参照により本明細書に組み入れるＡｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２）により測定することができる。１つの実施形態においては、配列類似性は、ｔＢＬＡＳＴｎ検索プログラムを以下のパラメーターと共に使用して測定する：ＭＡＴＲＩＸ：ＢＬＯＳＵＭ６２，ＰＥＲ　ＲＥＳＩＤＵＥ　ＧＡＰ　ＣＯＳＴ：１１、およびＬａｍｂｄａ比：１。
【００４４】
ポリペプチドは、化学合成を伴う方法および生化学的合成を伴う方法を含む標準的な技術を用いて製造することができる。ポリペプチドの化学合成のための技術は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ，ｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｄｅｋｋｅｒ，１９９０を参照されたい）。
【００４５】
ポリペプチドの生化学的合成技術も当技術分野でよく知られている。そのような技術は、ポリペプチド合成のために核酸鋳型を使用するものである。特定のアミノ酸をコードする核酸トリプレットの配列を与える遺伝暗号は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｌｅｗｉｎ　ＧＥＮＥＳ　ＩＶ，ｐ．１１９，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照されたい）。細胞内に核酸を導入し該核酸を発現させてタンパク質を得るための技術の具体例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９のような参考書に記載されている。
【００４６】
機能的デルマセンター・ヴァリァビリスＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルのアミノ酸および核酸配列の同定は、他のマダニおよびダニのような他の起源からのデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルに関連した機能的チャンネルを得るための手段を提供する。そのような同定はまた、配列番号１、２または３の機能的誘導体を得るための出発点を与える。
【００４７】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルからのアミノ酸および核酸配列情報は、種々の技術を用いてデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドおよび関連ペプチドを同定し得るのを助けるのに用いることができる。例えば、配列番号１は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル関連ポリペプチドをコードする核酸を同定しクローニングするための縮重核酸プローブまたはプライマーを設計するために使用することが可能であり、配列番号４またはその断片は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル関連ポリペプチドをコードする核酸を同定しクローニングするために中等度のストリンジェンシーの条件下で使用することが可能である。
【００４８】
クローニングのための縮重プローブおよび中等度のストリンジェンシー条件の使用は、当技術分野でよく知られている。そのような技術の具体例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８およびＳａｍｂｒｏｏｋら，ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。
【００４９】
特定の起源から得られたデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルから出発して、機能的活性を有する誘導体を得ることができる。そのような誘導体は、アミノ酸の置換、付加および欠失を有するポリペプチドを含む。適当な置換のいくつかの具体例は、配列番号１、２および３の比較から得られる。ポリペプチドがデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性を有する能力は、ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性の測定技術のような技術を用いて確認することができる。
【００５０】
天然に存在するアミノ酸における相違は、異なるＲ基によるものである。Ｒ基は、異なるアミノ酸特性（例えば、物理的サイズ、電荷および疎水性）をもたらす。アミノ酸は、以下のとおり、異なるグループに分類されうる：中性で疎水性（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニンおよびメチオニン）；中性で極性（グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギンおよびグルタミン）；塩基性（リシン、アルギニンおよびヒスチジン）；および酸性（アスパラギン酸およびグルタミン酸）。
【００５１】
一般に、異なるアミノ酸を置換する際には、類似した特性を有するアミノ酸を交換することが好ましい。特定のグループ内の異なるアミノ酸の置換、例えば、ロイシンからバリン、リシンからアルギニン、およびグルタミンからアスパラギンへの置換は、ポリペプチドの機能の変化を引き起こさないための良好な候補である。
【００５２】
異なるアミノ酸グループの範囲外での変化も施すことができる。好ましくは、そのような変化は、該ポリペプチド内の置換すべきアミノ酸の位置を考慮して施す。例えば、アルギニンは、グルタミン酸より自由に、ポリペプチドの内部の無極性アミノ酸の代用となりうる。なぜなら、それは、長い脂肪族側鎖を有するからである（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　３３　Ａｐｐｅｎｄｉｘ　１Ｃを参照されたい）。
【００５３】
デルマセンター・ヴァリァビリスＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル抗体
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル抗体を認識する抗体は、配列番号１、２、３またはそれらの断片を含有するポリペプチドを免疫原として使用して製造することができる。好ましくは、抗原として使用するポリペプチドは、少なくとも９アミノ酸長の配列番号１、２もしくは３またはそれらの断片のポリペプチドよりなる。本発明の１つの実施形態においては、該ポリペプチドは、配列番号１９（ＬＧＫＲＩＴＭＲＫＴＲＣＱＱＬＡＫＬＡＥＱＨＲＱＲ）アミノ酸配列よりなる。
【００５４】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルに対する抗体は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルの存在を確認するための及びデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドを単離するための使用のような種々の用途を有する。デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルの存在の確認は、例えば、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを産生する細胞を同定するために及びそのような細胞を他の生物の細胞から識別するために利用することができる。
【００５５】
抗体を製造し使用するための技術の具体例は当技術分野でよく知られている。そのような技術の具体例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８、およびＫｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７，１９７５に記載されている。
【００５６】
結合アッセイ
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルまたはその断片は、該チャンネルに結合する化合物を同定するための研究において使用することができる。そのような研究は、競合および非競合形式を含む種々の形式を用いて行うことができる。競合研究は、該チャンネルに結合することが知られている化合物を使用して又は該チャンネルに結合する化合物を同定した後で行うことができる。デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルに結合する化合物の具体例には、ＧＡＢＡおよびフィブロニル（ｆｉｂｒｏｎｉｌ）が含まれる。
【００５７】
本明細書に記載の開示に基づき、他の生物由来のＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルへの結合を測定する方法を、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドでの使用に応用することができる。ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルへの結合を測定する方法の一例は、Ｍｉｌｌａｒら，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．２５８：３０７−３１４，１９９４に記載されている。
【００５８】
リガンド結合に関与する特定のデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル配列は、該チャンネルの一部に結合する標識化合物を使用することにより容易に同定することができる。該結合領域を絞り込むために被検断片を選択するためには、種々の方法を用いることができる。そのような方法の一例には、Ｎ末端から始まる約１５アミノ酸長の連続的断片の試験、およびより長い断片の試験が含まれる。より長い断片を試験する場合には、該結合領域を更に詳しく位置づけるために、化合物に結合する断片を細分することができる。結合研究に使用する断片は、組換え核酸技術を用いて作製することができる。
【００５９】
好ましくは、結合研究は、組換え核酸から発現したデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを使用して行う。より好ましくは、組換え的に発現したデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルは、配列番号１、２または３のアミノ酸配列よりなる。
【００６０】
結合アッセイは、個々の化合物を使用して又は種々の数の化合物を含有する調製物を使用して行うことができる。デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルに結合する能力を有する種々の数の化合物を含有する調製物は、該チャンネルに結合する化合物を同定するために試験されうる、より小さな化合物群に分けることができる。本発明の１つの実施形態においては、少なくとも１０個の化合物を含有する試験調製物を結合アッセイにおいて使用する。
【００６１】
結合アッセイにおいて使用する組換え的に製造したデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルは、種々の環境中に存在しうる。そのような環境には、例えば、組換え核酸から発現されたデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを含有する細胞抽出物および精製された細胞抽出物が含まれ、また、例えば、異なる環境中に導入された組換え手段により産生された精製されたデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドの使用も含まれる。
【００６２】
機能的アッセイ
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル機能的アッセイは、全体的または部分的にデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルから構成される１以上のリガンド依存性塩素イオンチャンネル活性を測定する。本明細書に記載のチャンネルを単独で又は１以上の追加的リガンド依存性塩素イオンチャンネルサブユニット（好ましくは、１以上のＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルサブユニット）と組合されたサブユニット（ここで、それらのサブユニットは一緒になって機能的チャンネル活性を与える）として使用して、ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性を測定することができる。
【００６３】
ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性を測定するアッセイは、３６Ｃｌを使用する機能的スクリーニング、パッチクランプ電気生理学を用いる機能的スクリーニング、および蛍光色素を使用する機能的スクリーニングを含む。そのようなアッセイを行うための技術は、一般に当技術分野でよく知られている（例えば、Ｓｍｉｔｈら，Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　１５９：２６１−２６９，１９９８，ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＴｓｉｅｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｙ　４：２６９−２７７，１９９７；Ｍｉｌｌｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ．２５８：３０７−３１４，１９９４；Ｒａｕｈら，ＴｉＰＳ　１１：３２５−３２９，１９９０；およびＴｓｉｅｎら，米国特許第５，６６１，０３５号を参照されたい）。
【００６４】
結合アッセイは、個々の化合物を使用して又は種々の化合物を含有する調製物を使用して行うことができる。１以上の化合物がデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性に影響を及ぼす種々の化合物を含有する調製物は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性に影響を及ぼす化合物を同定するために、より小さな化合物群に分けることができる。本発明の１つの実施形態においては、少なくとも１０個の化合物を含有する試験調製物を機能的アッセイにおいて使用する。
【００６５】
種々の環境中に存在する組換え的に製造したデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを、機能的アッセイにおいて使用することができる。適当な環境には、組換え核酸から発現されたデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを含有する生きた細胞および精製された細胞抽出物ならびに活性のための適当な膜が含まれ、また、ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性の測定に適した異なる環境中に導入された組換え手段により産生された精製されたデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルの使用も含まれる。
【００６６】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル誘導体を使用して、該チャンネルにおいて活性な化合物に関してアッセイし、該チャンネルの種々の領域に関する情報を得ることができる。例えば、天然チャンネル中のアミノ酸領域が改変されたＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル誘導体を産生させることが可能であり、チャンネルの活性に対する該改変の効果を測定して種々のチャンネル領域に関する情報を得ることができる。
【００６７】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドをコードする領域、または配列番号４、５、６もしくはそれらの相補体中に存在する少なくとも１８個の連続的ヌクレオチドを含有する領域を含有する。そのような核酸は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルをコードする核酸中または配列番号４、５、６もしくはそれらの相補体中に存在する又は存在しない追加的領域を含有しうる。
【００６８】
特有核酸領域は、配列番号４、５および６の核酸配列を配列番号８の核酸配列と比較することにより、容易に同定することができる。図２Ａ〜２Ｃは、配列番号８との配列番号５の核酸配列の比較を示す。図２Ａ〜２Ｃに示す比較は、配列番号４および６を考慮するよう容易に拡張されうる。図３Ａおよび３Ｂに示すとおり、配列番号４、５および６は非常に類似している。
【００６９】
別の実施形態においては、核酸は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルからの特有ヌクレオチド配列領域を含む又はそれよりなる。特有領域の具体例には以下のものが含まれる：
ＣＡＡＡＣＧＣＡＡＣＧＴＧＧＡＣＡＡ（配列番号２０）、
ＧＡＧＣＧＡＣＴＣＴＣＧＴＴＣＣＡＧ（配列番号２１）、
ＡＴＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＡＧ（配列番号２２）、
ＡＡＧＧＴＣＣＴＣＧＧＴＣＡＣＧＴＣＣＡＡＡＡＡ（配列番号２３）、
ＣＴＣＧＧＣＡＡＧＡＧＡＡＴＣＡＣＣ（配列番号２４）、
ＧＧＴＴＣＣＴＧＴＣＡＡＧＴＴＴＧＴ（配列番号２５）、
ＧＧＴＴＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＴＴＧＴ（配列番号２６）および
ＣＣＡＡＣＣＧＧＡＴＴＴＡＣＣＡＴＧ（配列番号２７）。
【００７０】
特有ヌクレオチド配列領域の定義は、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ｒｄｌ核酸に関するものである。したがって、例えば、特有ヌクレオチド配列領域は、１以上のデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルをコードする及びキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）以外の１以上の生物からのポリペプチドをコードする核酸中に存在しうる。特有デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルヌクレオチド配列領域が存在しうる他の生物の具体例には、他のマダニのような関連生物が含まれる。
【００７１】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸は種々の用途を有し、そのような用途としては、例えば、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸の存在を同定するためのハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとしての使用、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルに関連したＧＡＢＡ受容体をコードする核酸を同定するためのハイブリダイゼーションプローブまたはＰＣＲプライマーとしての使用、および／またはデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドの組換え発現のための使用が挙げられる。
【００７２】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルセグメントをコードしない又は配列番号４、５、６もしくはそれらの相補体中に見出されない領域が、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸中に存在しうる。そのような領域は、存在するならば、好ましくは、特定の目的を達成するように選択される。特定の目的を達成するために使用しうる追加的領域の具体例には、サンドイッチアッセイの一部として使用しうる捕捉領域、該核酸の存在を示すためにプローブされうるレポーター遺伝子、発現ベクター領域、および他のポリペプチドをコードする領域が含まれる。
【００７３】
別の実施形態においては、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸は、配列番号１、２または３中の少なくとも９個の連続的なアミノ酸、少なくとも１８個の連続的なアミノ酸、少なくとも２７個の連続的なアミノ酸または少なくとも５４アミノ個の連続的なアミノ酸の特有領域をコードする配列を含む又はそれよりなるか、あるいは配列番号４、５、６またはそれらの相補体中に存在する少なくとも１８個の連続的なヌクレオチド、少なくとも３６個の連続的なヌクレオチドまたは少なくとも７２個の連続的なヌクレオチドを含む又はそれよりなる。好ましくは、該デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸は、配列番号４、５または６のヌクレオチド配列を含む又はそれよりなる。
【００７４】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸はまた、配列番号１に対して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％の配列類似性を有するポリペプチドをコードする核酸、および配列番号４に対して少なくとも約８５％、好ましくは９０％の配列類似性を有する核酸を含む。核酸に関する配列類似性は、ギャップウェイト８、長さウェイト２でＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ　Ｂｅｓｔｆｉｔ　Ａｌｇｏｒｉｔｈｍのような方法を用いて、およびＦＡＳＴＡ（参照により本明細書に組み入れるＰｅａｒｓｏｎ　１９９０．Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８３，６３−９８）により測定することができる。１つの実施形態においては、配列類似性は、ＦＡＳＴＡ検索プログラムを以下のパラメーターと共に使用して測定する：ＭＡＴＲＩＸ：ＢＬＯＳＵＭ５０，ＰＥＲ　ＰＥＮＡＬＴＩＥＳ：オープン（ｏｐｅｎ）＝−１２；残基＝−２。
【００７５】
本出願に記載している指針を用いて、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルをコードする核酸配列を得たり、別の起源からの関連チャンネルをコードする核酸配列を得たり、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性を有するチャンネルを構築することができる。デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルに関連した異なる起源由来のチャンネルをコードする核酸の入手は、縮重プローブおよびプライマーのセットを使用することにより及びハイブリダイゼーション条件の適切な選択により促進される。縮重プローブおよびプライマーのセットは、遺伝暗号の縮重を考慮して製造する。ハイブリダイゼーション条件の調節は、類似配列を有する核酸に対するハイブリダイゼーションを可能にするプローブまたはプライマーの特異性を制御するのに有用である。
【００７６】
ハイブリダイゼーション検出およびＰＣＲクローニングに用いる技術は当技術分野でよく知られている。核酸検出技術は、例えば、Ｓａｍｂｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。ＰＣＲクローニング技術は、例えば、Ｗｈｉｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｖｏｌｕｍｅ　６７，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されている。
【００７７】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルのプローブおよびプライマーは、例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを含有する核酸ライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。そのようなライブラリーは商業的に入手可能であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８に記載されているような技術を用いて製造することができる。
【００７８】
特定のデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルアミノ酸配列および遺伝暗号の公知縮重から、多数の異なるコード化核酸配列を得ることができる。遺伝暗号の縮重は、ほとんどすべてのアミノ酸が、異なる組合せのヌクレオチドトリプレット、すなわち「コドン」によりコードされるために生じる。特定のアミノ酸への特定のコドンの翻訳は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｌｅｗｉｎ　ＧＥＮＥＳ　ＩＶ，ｐ．１１９，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照されたい）。アミノ酸は、以下のとおりにコドンによりコードされる。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ
【００７９】
化学的および生化学的技術を用いて、所望の配列を有する核酸を合成することができる。化学的技術の具体例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。
【００８０】
生化学的合成技術は、核酸鋳型、ならびに適当な酵素、例えばＤＮＡおよび／またはＲＮＡポリメラーゼの使用を含む。そのような技術の具体例には、インビトロ増幅技術、例えばＰＣＲおよび転写に基づく増幅、およびインビボ核酸複製が含まれる。適当な技術の具体例は、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９、およびＫａｃｉａｎら，米国特許第５，４８０，７８４号に記載されている。
【００８１】
デルマセンター・ヴァリァビリスＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルプローブ
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸に対するプローブは、適当なハイブリダイゼーション条件下でデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル標的核酸に特異的にハイブリダイズすることが可能であり、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸を非標的核酸から識別しうる。デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸に対するプローブは、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸に相補的ではない核酸を含有しうる。
【００８２】
好ましくは、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル核酸プローブ中に存在する非相補的核酸は、レポーター配列となる又は捕捉配列となるというような特定の目的を有する。しかし、該プローブが標的核酸と非標的核酸とを識別するのを追加的核酸が妨げない限り、追加的核酸は特定の目的を有する必要はない。
【００８３】
ハイブリダイゼーションは相補的ヌクレオチド塩基を介して生じる。２つの分子または領域が安定なハイブリッドの形成のために十分に強力な相互作用を有するかどうかは、ハイブリダイゼーション条件によって決まる。
【００８４】
互いにハイブリダイズする２つの分子間の相互作用の程度は、生じたハイブリッドのＴｍにより表される。Ｔｍが高ければ高いほど、その相互作用は強力であり、そのハイブリッドは安定である。Ｔｍは、当技術分野でよく知られた種々のの要因、例えば、相補性の程度、存在する相補的塩基のタイプ（例えば、Ａ−ＴハイブリダイゼーションなのかＧ−Ｃハイブリダイゼーションなのか）、修飾核酸の存在、および溶液成分に影響される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。
【００８５】
特定の組合せのハイブリダイゼーションアッセイ条件下で用いる温度よりハイブリッドのＴｍのほうが高い場合に、安定なハイブリッドが形成される。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件を調節することにより、プローブの特異性の程度を変化させることができる。プローブハイブリダイゼーションの検出は、検出可能な標識の使用により促進される。検出可能な標識の具体例には、発光、酵素および放射能標識が含まれる。
【００８６】
ストリンジェンシー条件の具体例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。高いストリンジェンシー条件の一例は以下のとおりである。ＤＮＡを含有するフィルターのプレハイブリダイゼーションを、６×ＳＳＣ、５×デンハルト液および１００μｇ／ｍｌ　変性サケ精子ＤＮＡを含むバッファー中、６５℃で２時間〜一晩行なう。１００μｇ／ｍｌ　変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリダイゼーション混合物中、フィルターを６５℃で１２〜４８時間ハイブリダイズさせる。２×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳを含有する溶液中、３７℃で１時間、フィルターの洗浄を行なう。この後、０．１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳ中、５０℃で４５分間の洗浄を行なう。高いストリンジェンシーの条件を用いる他の方法は、例えば、５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、５０％　ホルムアミド中、４２℃で１２〜４８時間行なうハイブリダイゼーション工程、または０．２×ＳＳＰＥ、０．２％　ＳＤＳ中、６５℃で３０〜６０分間行なう洗浄工程を含む。
【００８７】
プローブは、核酸またはその誘導体、例えば修飾核酸およびペプチド核酸から構成される。修飾核酸には、１以上の改変基、改変ヌクレオチド間連結および／または改変ヌクレオチドプリンもしくはピリミジン塩基を有する核酸が含まれる。修飾核酸を記載する参照文献には、ＷＯ　９８／０２５８２、米国特許第５，８５９，２２１号および米国特許第５，８５２，１８８号（それらのそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）が含まれる。
【００８８】
組換え発現
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドは、適当な宿主内で又は翻訳系を使用して試験管内で、組換え核酸から発現させることができる。組換え的に発現されたデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドは、好ましくは、該チャンネルに結合し該チャンネルの活性をモジュレーションする化合物に関してスクリーニングするためのアッセイで使用する。
【００８９】
好ましくは、発現は、発現ベクターを使用して宿主細胞内で達成される。発現ベクターは、適切な転写およびプロセシングのための調節要素と共に所望のポリペプチドをコードする組換え核酸を含有する。存在しうる調節要素には、該組換え核酸に天然で付随する調節要素、および該組換え核酸に天然で付随しない外在性調節要素が含まれる。該外在性プロモーターのような外在性調節要素は、特定の宿主内での組換え核酸の発現に有用でありうる。
【００９０】
一般に、発現ベクター中に存在する調節要素には、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、および所望により存在しうるオペレーターが含まれる。もう１つの好ましい要素は、真核細胞内でのプロセシングをもたらすポリアデニル化シグナルである。他の好ましい要素には、宿主細胞内での自律複製のための複製起点、選択マーカー、一定数の有用な制限酵素部位、および高いコピー数の潜在性を含有する。発現ベクターの具体例としては、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドおよびウイルスが挙げられる。
【００９１】
種々の宿主内で適当なレベルのポリペプチド発現を得るために使用しうる発現ベクターが、当技術分野でよく知られている。当技術分野でよく知られた哺乳類発現ベクターには、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ　３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ　３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ　３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ　３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ　３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ　３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ　３７４６０）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびラムダＺＤ３５（ＡＴＣＣ　３７５６５）が含まれる。当技術分野でよく知られた細菌発現ベクターには、ｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ラムダｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれる。当技術分野でよく知られた真菌細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびピチア（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。当技術分野でよく知られた昆虫細胞発現ベクターには、Ｂｌｕｅ　Ｂａｃ　ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。
【００９２】
組換え宿主細胞は原核性または真核性でありうる。組換え宿主細胞の具体例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌；酵母などの真菌細胞；ヒト、ウシ、ブタ、サルおよびげっ歯類などの哺乳類細胞；およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）およびカイコに由来する細胞系などの昆虫細胞が含まれる。商業的に入手可能な哺乳類細胞系には、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ．ｓｕｐ−）（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１．２）、２９３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　２６）およびＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　１７１）が含まれる。
【００９３】
特定の宿主内での発現を増強するためには、該宿主のコドン使用頻度を考慮するよう、配列番号４、５または６に示す配列を修飾することが有用でありうる。種々の生物のコドン使用が当技術分野でよく知られている（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　３３，Ａｐｐｅｎｄｉｘ　１Ｃを参照されたい）。
【００９４】
発現ベクターは、標準的な技術を用いて宿主細胞内に導入することができる。そのような技術の具体例には、形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合およびエレクトロポレーションが含まれる。
【００９５】
ポリペプチドをコードする核酸は、発現ベクターを使用することなく、例えば合成ｍＲＮＡまたは天然ｍＲＮＡを使用して、細胞内で発現させることができる。また、ｍＲＮＡは、コムギ胚抽出物、網状赤血球抽出物などの種々の無細胞系内で、または細胞に基づく系（例えば、カエル卵母細胞）内で発現されうる。細胞に基づく系内へのｍＲＮＡの導入は、例えば、マイクロインジェクションにより達成されうる。
【００９６】
抗寄生生物用途
本出願を指針として用いて、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルをモジュレーションしうる化合物を得、それを使用してデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）のインフェステーションを治療または予防することができる。そのような化合物はまた、他の寄生生物のインフェステーションの治療または予防に有用でありうる。
【００９７】
抗寄生生物剤として有用なデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを調節しうる化合物を患者に投与したり、あるいは寄生生物を排除するために特定の領域を治療し又は寄生生物の侵入を予防するために使用することが可能である。
【００９８】
患者は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）のインフェステーションの排除または予防のために治療される哺乳動物を意味する。治療は、内的投与または局所投与を含む種々の手段を用いて行うことができる。
【００９９】
内的投与は、経口経路を含む種々の経路によるもの、または患者への注射によるものでありうる。マダニは、血液摂取中に、内的に投与された化合物にさらされうる。一般的な医薬投与のための指針は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９０、およびＭｏｄｅｒｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ　第２版，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０（それらの両方を参照により本明細書に組み入れることとする）。
【０１００】
適当な官能基を有するデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性化合物は、酸性または塩基塩として製造することができる。医薬上許容される塩（水溶性、油溶性または分散性産物の形態）には、例えば無機または有機酸または塩から形成される通常の無毒性塩または第四級アンモニウム塩が含まれる。そのような塩の具体例には、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミスルファート、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩（ｐａｍｏａｔｅ）、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩およびウンデカン酸塩のような酸付加塩；およびアンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えばナトリウムおよびカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばカルシウムおよびマグネシウム塩）、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンのような有機塩基との塩およびアミノ酸（例えばアルギニンおよびリシン）との塩のような塩基塩が含まれる。
【０１０１】
懸濁剤として経口投与する有効成分は、医薬製剤の分野でよく知られた技術に従い製造することが可能であり、かさ高さを付与するための微晶質セルロース、懸濁化剤としてのアルギン酸またはアルギン酸ナトリウム、増粘剤としてのメチルセルロース、および甘味剤／香味剤を含有しうる。即時放出錠剤としては、これらの組成物は、微晶質セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよびラクトース、および／または他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤および滑沢剤を含有しうる。
【０１０２】
また、該組成物は、静脈内（ボーラスおよび注入の両方）、腹腔内、皮下、局所（閉鎖（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）の存在下または不存在下）または筋肉内形態により患者に投与することが可能であり、すべて、薬学分野の当業者によく知られた形態を用いて行うことができる。注射により投与する場合には、注射溶液または懸濁剤は、適当な無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶剤、例えばマンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル液または等張塩化ナトリウム溶液、あるいは適当な分散または湿潤および懸濁化剤、例えば無菌無刺激性不揮発性油、例えば合成モノまたはジグリセリド、および脂肪酸、例えばオレイン酸を使用して製剤化することができる。
【０１０３】
本発明の抗寄生生物用途のための投与計画は、患者として治療する哺乳動物のタイプ、患者の年齢、医学的状態；投与経路；患者の腎および肝機能；および使用する個々の化合物を含む当技術分野でよく知られた因子を考慮して選択される。毒性を伴うことなく効力を与える範囲内の薬物濃度を最適に正確に得るためには、標的部位に対する薬物のアベイラビリティーの速度論に基づく計画が必要である。これは、薬物の分布、平衡および消失の考慮を含む。
【０１０４】
抗寄生生物化合物の局所適用は、水溶液、分散液または懸濁液としての活性化合物含有液体ドレンチまたはシャンプーの使用により達成されうる。これらの製剤は、一般には、ベントナイトのような懸濁化剤、湿潤剤など、賦形剤を含有し、通常、消泡剤も含有する。本発明の種々の実施形態においては、製剤は、０．００１〜１重量％の該有効（活性）成分を含有するか、あるいは０．０１〜１重量％の該活性化合物を含有する。
【０１０５】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルをモジュレーションする化合物は、キット中に提供されうる。そのようなキットは、典型的には、使用する剤形中に活性化合物を含有する。剤形は、１日以上にわたり１日に１〜６回というような規則的な間隔で使用した場合に有益な効果が得られうるよう十分な量の活性化合物を含有する。好ましくは、キットは、一定の期間にわたり使用する剤形の量およびマダニのインフェステーションを治療または予防するための該剤形の使用を示す説明書を含有する。
【０１０６】
（実施例）
本発明の種々の特徴および利点を更に例示するために、以下に実施例を記載する。また、実施例は、本発明の実施のための有用な方法を例示する。これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【０１０７】
実施例１：デルマセンター・ヴァリァビリスＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルのクローニング
リピセファルス・サングイネウス（褐色犬ダニ）（Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ）ＧｌｕＣｌ遺伝子コード化セグメントをプローブ（配列番号２８）として使用し、マダニ　デルマセンター（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ）ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルをクローニングした。クローン化デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを使用して、インビトロ転写キャップ化ＲＮＡを合成した。
【０１０８】
５’ＥｃｏＲＩ−３’ＸｈｏＩインサートとしてクローニングされたオリゴ（ｄＴ）プライムドＺＡＰ　ｃＤＮＡライブラリーを作製するために、全デルマセンター（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ）マダニから精製したポリＡ＋ＲＮＡ使用して、マダニ　デルマセンター（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ）ｃＤＮＡライブラリーを製造した。該ライブラリーは、増幅前には約１．８×１０６個の独立したクローンよりなるものであった。ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ＫｉｔおよびＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）ｃＤＮＡ　ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ　Ｇｏｌｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ＫｉｔをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入し、該製造業者の指示に従い使用した。
【０１０９】
配列番号２８の核酸プローブでハイブリダイゼーションを検出することにより、該マダニ　デルマセンター（Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ）ｃＤＮＡライブラリーをプローブした。ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＰＥ、０．１％　ＳＤＳ、１０×デンハルト液、サケ精子ＤＮＡ（２００μｇ／ｍｌ）および４５％　ホルムアミド中、４２℃で行った。ついで該メンブレンを、ｉ）２×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ中、室温で１５分間、およびｉｉ）０．２×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ中、４２℃で３０分間の２回の洗浄を行い、ついで０．２×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ中、５５℃で３０分間の１回の洗浄を行った。Ｄｖ５、Ｄｖ８およびＤｖ９を含む９個の陽性クローンが、最初のスクリーニングにおいて同定された。
【０１１０】
該Ｄｖ５、Ｄｖ８およびＤｖ９インサートを該ファージから切り出し、製造業者のプロトコール（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いてｐＢＫ−ＣＭＶファジミドベクターに変換し、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ（商標）３７７ＤＮＡ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）上で配列決定した。Ｄｖ８、Ｄｖ９およびＤｖ５のオープンリーディングフレームを配列番号４、５および６に示す。
【０１１１】
インビトロ転写キャップ化ＲＮＡの合成
ＰＣＲ法を用いて、クローンＤｖ５、Ｄｖ８およびＤｖ９のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の開始メチオニン（ＡＴＧ）の上流にＴ７プロモーターを、および終結コドン（ＴＡＧ）の後にポリＡ＋尾部を付加した。フランキングＴ７プロモーターおよびポリＡ＋尾部を含有する増幅されたＯＲＦを、インビトロ転写反応（ｍＭｅｓｓａｇｅ　ｍＭａｃｈｉｎｅ（商標），Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）において、直接、鋳型として使用した。
【０１１２】
ＤＮＡ鋳型の除去後、ヌクレアーゼを含有しない水で該容積を１００μｌに調節し、Ｇ−５０　Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用してＲＮＡを精製した。該溶出液を等容積のフェノール／クロロホルムで抽出し、ついでもう一度クロロホルム抽出し、イソプロピルアルコールで沈殿させ、ヌクレアーゼを含有しない水に再懸濁させて、保存濃度を１μｇ／μｌとした。
【０１１３】
【化１】
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【０１１４】
実施例２：配列番号１〜６
配列番号１〜６は、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルのアミノ酸および核酸配列を示す。前記のとおり、配列番号１〜３のアミノ酸配列間の相違および配列番号４〜６間の相違は、ｍＲＮＡ編集および株変異によるものである。
【０１１５】
【化２】
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【０１１６】
実施例３：機能的発現
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞内に注入した配列番号１、２および３のポリペプチドをコードするｍＲＮＡを使用して、デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルの機能的発現を観察した。実施例１に記載のとおりにＤｖ８、Ｄｖ９およびＤｖ５を使用して、配列番号１、２および３をコードするｍＲＮＡを得た。
【０１１７】
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞を調製し、既に記載されている標準的な方法を用いて注入を行った（Ａｒｅｎａら，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏ．４０：３６８−３７４，１９９１；およびＡｒｅｎａら，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．１５：３３９−３４８，１９９２）。成体雌アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ　ｌａｅｖｉｓ）を０．１７％　トリカインメタンスルホナートで麻酔し、卵巣を外科的に摘出し、ＮａＣｌ　８２．５、ＫＣｌ　２、ＭｇＣｌ２　１、ＨＥＰＥＳ　５、ピルビン酸Ｎａ　２．５、ペニシリンＧ　１００，０００単位／Ｌ、硫酸ストレプトマイシン　１０００ｍｇ／Ｌ、ｐＨ７．５（Ｍｏｄ．ＯＲ−２）（ｍＭ）よりなる溶液中に配置した。
【０１１８】
卵巣葉を破って開き、Ｍｏｄ．ＯＲ−２中で数回リンスし、穏やかに振とうしながらＭｏｄ．ＯＲ−２中の０．２％　コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｔｙｐｅ１）中、室温でインキュベートした。１時間後、該コラゲナーゼ溶液を新しくし、該卵母細胞の約５０％が卵巣から遊離されるまで、該卵母細胞を更に３０〜９０分間インキュベートした。Ｖ期およびＶＩ期の卵母細胞を選択し、ＮａＣｌ　９６、ＫＣｌ　２、ＭｇＣｌ２　１、ＣａＣｌ２　１８、ＨＥＰＥＳ　５、ピルビン酸Ｎａ　２．５、テオフィリン　０．５、ゲンタマイシン　５０ｇ／ｍｌ、ｐＨ７．５（ＮＤ−９６）（ｍＭ）を含有する媒体中に、注入前の１６〜２４時間にわたり配置した。卵母細胞に、５０ｎｌのＤｖ８、Ｄｖ９およびＤｖ５を０．２ｍｇ／ｍｌの濃度で注入した。記録前に、卵母細胞を、ＮＤ−９６中、１８℃で１〜６日間インキュベートした。
【０１１９】
記録は、ＮａＣｌ　９６、ＭｇＣｌ２　１、ＣａＣｌ２　０．１、ＢａＣｌ２　３．５、ＨＥＰＥＳ　５、ｐＨ７．５（ｍＭ）よりなる修飾ＮＤ−９６中、室温で行った。Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ　７１００／８０コンピューターにインターフェースされたＤａｇａｎ　ＣＡ１二微小電極増幅器（Ｄａｇａｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用して、卵母細胞を電圧固定した。電流通過電極を０．７Ｍ　ＫＣｌ、１．７Ｍ　クエン酸Ｋで満たし、電圧記録電極を１Ｍ　ＫＣｌで満たした。該実験の全体にわたり、卵母細胞を修飾ＮＤ−９６（対照溶液）で、または潜在的チャンネルアクチベーターおよびブロッカーを含有するＮＤ−９６で、約３ｍｌ／分の速度で灌流した。データを１００Ｈｚで収集し、ＨＥＫＡ　Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ（Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からのＰｕｌｓｅソフトウェアを使用して３３．３Ｈｚで濾過した。すべての記録は、０または−３０ｍＶの保持電圧から行った。
【０１２０】
Ｄｖ８およびＤｖ９を発現する卵母細胞は、１ｍＭ　ＧＡＢＡの適用に応答した急速活性化電流を示した（図４および５）。ＧＡＢＡの６０秒間の適用中、該電流の約５０％が脱感作し、残りの電流はＧＡＢＡの洗浄後に急速に脱活性化された。１ｍＭ　ＧＡＢＡの反復適用は同様の応答を惹起した。これに対して、１ｍＭ　グルタマートは電流を活性化しなかった。該ＧＡＢＡ活性化電流は、５μＭ　フィプロニル（図５）および１０μＭ　ピクロトキシニンにより完全に遮断された（データは示していない）。Ｄｖ５　ｍＲＮＡを注入した卵母細胞は、Ｄｖ８およびＤｖ９　ｍＲＮＡを注入した卵母細胞と同様に応答した（データは示していない）。
【０１２１】
特許請求の範囲の範囲内には他の実施形態が含まれる。いくつかの実施形態を示し記載してきたが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾を施すことが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
配列番号１（クローン（ｃｌｏｎｅ）８）、２（クローン９）および３（クローン５）のデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルポリペプチドとキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｒｄｌ（配列番号７）との比較を示す。
【図２Ａ】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルをコードする核酸（配列番号５）と、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｒｄｌをコードする核酸（配列番号８）との比較を示す。
【図２Ｂ】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルをコードする核酸（配列番号５）と、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｒｄｌをコードする核酸（配列番号８）との比較を示す。
【図２Ｃ】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルをコードする核酸（配列番号５）と、キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）Ｒｄｌをコードする核酸（配列番号８）との比較を示す。
【図３Ａ】
配列番号４、５および６の配列比較を示す。
【図３Ｂ】
配列番号４、５および６の配列比較を示す。
【図４】
デルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネル活性を示す。配列番号１のデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを使用して、活性を測定した。
【図５】
フィブロニル（ｆｉｂｒｏｎｉｌ）に対するデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルの感受性を示す。配列番号２のデルマセンター・ヴァリァビリス（Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）ＧＡＢＡ依存性塩素イオンチャンネルを使用して、活性を測定した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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