(57)【要約】化学の研究もしくは生化学の研究においてとくに好ましく使用される試料キャリアを製造する方法は、キャリアベースの少なくとも一表面に、プラスチック層を設け、プラスチック層は、キャリアベースに固着しないように熱的および／または化学的に処理されて、キャリアベースに面するプラスチックの面の表面粗さを低減し、そこでプラスチックをキャリベースから除去し、この除去により、キャリア表面を形成するプラスチック表面を相対的に円滑にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学の研究もしくは生化学の研究においてとくに好ましく使用される試料キャリアを製造する方法は、キャリアベースの少なくとも一表面に、プラスチック層を設け、
プラスチック層は、キャリアベースに固着しないように熱的および／または化学的に処理されて、キャリアベースに面するプラスチックの面の表面粗さを低減し、
そこでプラスチックをキャリベースから除去し、この除去により、キャリア表面を形成するプラスチック表面を相対的に円滑にする。
【請求項２】
請求項１の方法において、
少なくとも部分的に前記プラスチックを溶融して、キャリアベースの少なくとも一方の面の全域にプラスチックを設ける。
【請求項３】
請求項１または２の方法において、
前記プラスチックは、試料に対する少なくとも一つの活性基、とくに、−ＣＯＯＨ基または−ＣＯＯ−メチル基のようなアミノ基を形成するために使用される基を有するモノマープラスチックまたは高分子プラスチックである。
【請求項４】
請求項１または２の方法において、
キャリア表面は、試料に対する少なくとも一つの活性基、とくに、−ＣＯＯＨ基または−ＣＯＯ−メチル基のようなアミノ基を形成するために使用される基をキャリア表面に少なくとも備えるように処理される。
【請求項５】
請求項４の方法において、
キャリア表面は、とくにモノマーまたはポリマー、好ましくはアクリル酸もしくはアクリル酸メチルでグラフトされる。
【請求項６】
請求項４または５の方法において、
キャリア表面の中に、または少なくともキャリア表面の上に、−ＮＨ２基を導入することによって、その表面粗さを低減する。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれかの方法において、
少なくともキャリア表面上の少なくともプラスチック層は、モノマー溶液と接触し、ここで、プラスチックおよび溶液は、少なくともモノマーの一部分の重合がキャリア表面で生じるように処理され、この目的のために、好ましくは、プラスチックは溶液とともに照射処理される。
【請求項８】
請求項７の方法において、
キャリア表面には、重合された比較的薄い接着層が設けられ、この接着層は、好ましくは、小数の原子に相当する厚さ、もしくは比較的フラットな連鎖の厚さを持つ。
【請求項９】
請求項３〜８のいずれかの方法において、
前記活性基は、リンカーによってアミノ基に変換される。
【請求項１０】
請求項３〜１０のいずれかの方法において、
情報伝達ポリマーは、適宜のリンカーの媒介によって、少なくとも複数の活性基に任意に結合され、または合成される。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかの方法において、
キャリベースは、少なくともプラスチックが設けられる面の表面粗さがとくに低くされ、好ましくは、原子粗さの大きさのオーダ−、またはそれよりもやや上のオーダーの表面粗さにされる。
【請求項１２】
請求項１１の方法において、
ベースキャリアは、少なくともその表面が雲母、ガラス、あるいは表面粗さ、硬さ、多孔性の観点からそれらと同等の材料で作られ、好ましくはガラスから作られる。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法において、
キャリア表面は、少なくとも一つのほぼ球面体で形成されるか、もしくは少なくとも一つのほぼ球面体を備え、球面体の直径は、キャリアに向う面において、少なくとも一つ、好ましくはマトリクス状のウェルを設け、そのウェルの容積は、３μｌ未満、好ましくは１μｌ未満、とくには０．１μｌ未満である。
【請求項１４】
試料、とくに生化学試料の検査に使用される試料キャリアは、プラスチックで製造されたキャリア表面を有し、前記キャリア表面は、前記キャリア表面に付着された生化学試料要素のマーカーが知覚でき、そして、前記キャリア表面に前記マーカーが留まり、前記キャリア表面は少なくとも試料が共有的に結合するのに適している。
【請求項１５】
請求項１４の試料キャリアにおいて、
前記キャリア表面は、前記キャリア表面の表面粗さとほぼ等しいか、それ未満の表面粗さを有するキャリアベースの上で、部分的にプラスチックを溶融して形成される。
【請求項１６】
請求項１４または１５の試料キャリアにおいて、
前記プラスチックはポリマー、とくにポリエチレン、またはポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｅｎｅ）である。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかの試料キャリアにおいて、
キャリア表面は、モノマーまたはポリマー、好ましくはアクリル酸またはアクリル酸メチルでグラフトされている。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれかの試料キャリアにおいて、
前記キャリア表面は少なくとも−ＣＯＯＨ基または−ＣＯＯ−メチル基を有する。
【請求項１９】
請求項１４〜１８のいずれかの試料キャリアにおいて、
前記キャリア表面は、比較的大きな密度で、好ましくは、活性基が比較的規則的に分布している。
【請求項２０】
生化学研究の顕微鏡観察および／または顕微鏡撮影の使用において、試料キャリアには、好ましくは請求項１４〜１９のいずれか一つのプラスチックキャリア表面が設けられ、
ペプチド、有機分子、またはその一部などの要素が前記キャリア表面に結合され、
少なくとも結合要素にはマーカーが設けられ、
マーカーの存在および位置が、試料キャリアの処理の後、顕微鏡観察および／または顕微鏡撮影により確定される。
【請求項２１】
請求項１４〜１９のいずれかの試料キャリア、検査試料、または液体、溶液および／またはそれらのために使用される結合に応用されるプリンタの使用において、
とくに、インクジェットプリンタ、もしくはバブルジェットプリンタなどのドロップオンデマンド方式のプリンタを使用する。
【請求項２２】
請求項２１のプリンタとともに使用するのに適した、マトリクス状のウェルを有する試料キャリアにおいて、前記ウェルの容積は、３μｌ未満、とくには１μｌ未満、好ましくは０〜０．１μｌである。
【請求項２３】
請求項２２の試料キャリアにおいて、
前記ウェルは、中間材料の表面粗さよりも低い粗さを持つ内表面を有する。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、試料（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）キャリアの製造方法、特に、化学および生化学における研究調査での使用に適した試料キャリアの製造方法に関する。
【０００２】
生化学分野での研究調査において、例えばマイクロプレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）におけるいわゆるミニウェル（ｍｉｎｉｗｅｌｌｓ）が一般的に使用される。このミニウェルに分析の対象となる少量の試料が投入され、処理され、観察される。マーカーにより、該当ミニウェルにおいて特有の結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）が生じたか否かを確認することが可能であり、検査対象試料の特性を特定することが可能である。
【０００３】
このような方法では、試料の均一な配分が可能であるという利点があり、その結果、異なる分析を同一試料において同時に行うことができ、また、同一の分析を異なる試料において行うことができる。しかしながら、この方法は、ミニウェルの最小容量が、例えば３μｌ程度と、比較的大きいという欠点を有する。これは、異なる分析を行うためには比較的多くの試料を必要とし、さらに、所定の面には限られた数のマイクロウェルしか設けられないことを意味する。また、この方法は試料キャリア上で多くのスペースを必要とする。
【０００４】
また、分析対象の試料をピン上に供給して使用する方法が知られている。ピンは、分析対象の試料と異なるウェルの液体との間での結合が生じるあるいは生じないように、連続してマイクロプレートのウェルに注入された液体に浸すことが可能である。この方法も、検査対象の試料部分が比較的少数であるため、比較的大きな面を有した試料キャリアが必要となるという欠点を有する。
【０００５】
上記方法で使用されるマイクロプレートおよびピンは、例えば、ポリエチレンなどのプラスチック（樹脂）で製造することが可能であり、そのプラスチックは、特定の結合のみが可能なように、反応性物質を有するかあるいは有しないものとされる。使用されるプラスチックは比較的平坦性が小さい。局所的な平坦性は、例えばガラス面やマイカ面の局所的平坦性よりかなり小さい。ここでいう「局所的平坦性」とは、例えばμｍ平方オーダーの比較的小さな面の平坦性のことを言うものとする。このことは、マーカーを有し、プラスチック面に結合された試料からエレメント（構成物質）を知覚することは比較的困難であることを意味する。というのは、特に、分析に使用する顕微鏡や撮影装置をその面に適切に焦点を合わせることができないからである。確かに、エレメントが結合している表面の粗さが比較的大きいため、該当面に対して直角方向に見た場合に、これらのエレメントはお互いにふらついた状態に見え、それ故焦点を合わせることを困難にしている。このことは、十分な弁別を可能とするために分析対象の各ウェル（溜め）あるいはピンの面が比較的大きなものである必要があることを意味する。これは、さらにコンパクト化を阻害する要因である。
【０００６】
本発明の目的は、プレアンブル部で述べたタイプの方法の提供にあり、その方法は、公知の方法による欠点を回避し、長所を維持するものである。このため、本発明の方法はクレーム１の特徴を有することを特徴とする。
【０００７】
特にフラットなプラスチックキャリアの表面を有し、試料の所望のエレメントの結合に適した試料キャリアを提供することによって得られる効果は、特にお互いに接近した検出対象のエレメントの結合を可能とし、それにもかかわらず、例えば顕微鏡やＣＣＤカメラやその他の装置によって、お互いに区別して識別が可能となることである。
【０００８】
原則、プラスチックは試料キャリアの製造に好適な材料であり、処理が比較的単純で比較的強度があり、特に、ウイルス、抗原、ペプチドなどの生化学試料などの異なる試料のプラスチックへの適切な結合を可能とするものである。
【０００９】
驚くべきことには、本発明の方法によると、検査における試料のためのキャリア面として実に好適であるように、あるいは、少なくともより好適であるようにスムーズなプラスチック表面を得ることができることが判明した。確かに、好適な粗さの表面を有するキャリアベースの表面に対して、熱的あるいは化学的に処理をして、プラスチック層を形成することにより、キャリアベースに接する面の粗さがかなり低減される。このようにして、例えば表面の粗さの低減が５−２０のファクターであるいはそれ以上で実現できる。このことは、キャリア面に結合された試料のエレメントは特に小さな寸法でよく、しかも、例えば、それに結合したマーカーに基づいて、その存在を最も望ましく確認することができる。本発明の方法によって得られる小さなキャリア面では、多くの異なるあるいは同一のエレメントが近接した状態で識別することが可能である。この近接した状態は、例えば、０．２５−０．５ｎｌの液粒をその表面に当てることによって実現することが可能である。実施の形態では、これらの液粒はプリンタによって当てられる。特に、インクジェットあるいはバブルジェットタイプなどのプリンタであり、好ましくは圧電気によって制御されるプリンタである。これらのプリンタは公知である。これらを（生）化学試料の製造に使用することは、精細な位置決めと試料の投与を高速にしかも再現性良く得ることが可能となるという特別な効果を有する。
【００１０】
さらに、特に小さなウェル（溜め）に、例えば０−３μｌオーダ程度、さらには、０−０．１μｌオーダ程度で充填することが可能となる。本発明の方法において、このようなウェルは前述した粗さが低減された表面を有するのが好ましいが、例えば蛍光マーカーなどを使用した分析では、ウェルの内部表面は例えばＰＥの通常の粗さのデザインであってもよい。
【００１１】
特に効果のある態様として、本発明の方法はクレーム２の特徴を有することを特徴とする。
【００１２】
キャリアベースの一表面に対してプラスチックを少なくとも部分的に溶融させることによって、プラスチックの理想的な分布が特に単純な方法で実現できる。さらに、そのような場合、例えばプラスチックフィルムやプラスチックシートを容易に得ることができる。しかし、キャリア表面に例えばプラスチック層の重合を生じさせること、あるいは、キャリアベースの表面に対して潮解（ｄｅｌｉｑｕｅｓｃｅｎｃｅ）が生じるようにプラスチックを化学的に処理することも可能となる。
【００１３】
理論的にはともかくとして、得られたキャリア表面の特別なスムーズさは、少なくとも部分的には、特にスムーズなキャリアベースの使用とキャリアベースに対して接着されていないことの結果生じたものであると考えられる。それゆえ、本発明の方法は、最適なスムーズさを有しプラスチックとキャリアベース間を接着させないこととするキャリアベースを使用することによって最も効果的に実現される。しかしながら、２次的な最適条件により、十分にスムーズなキャリア表面をすでに得ることができているということである。
【００１４】
第１の実施の形態では、本発明の方法は、さらにクレーム３の特徴を有することを特徴とする。
【００１５】
対象試料に対する少なくとも一つの活性基を有するプラスチックを使用することは、所望の結合基（ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ）を直接得ることが出来るという効果を有する。キャリア表面に結合（ｃｏｕｐｌｅ）されるアミノ基を生成するのに適した基は、このような試料キャリアが特に生化学分野での使用、より具体的にはアミノ酸の結合により適しているという効果を有する。
【００１６】
変形例として、本発明の方法は、クレーム４の特徴を有することを特徴とする。
【００１７】
使用されるプラスチックが直接的にあるいは少なくとも十分に対象試料の結合に適していないとき、あるいは、少なくともリンカーによって転移（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）することができないときには、キャリア表面は次のような処理をするのが好ましい。すなわち、キャリア表面上あるいは少なくともキャリア表面において対象試料に対する１以上の活性基が供給される。特に、例えば−ＣＯＯＨあるいは−ＣＯＯ−メチル基などのリンカーによってアミノ基を生成するのに使用される基が供給される。このようにすることにより次のような効果を得る。キャリア表面のプラスチックとして、特に適した特性を有する材料、例えばポリエチレンなどを使用することができ、しかも、キャリア表面の処理によりアミノ基の生成が効果的になされる。この点で、例えばマイカやガラスなどと比べて、プラスチックはそのような処理がきわめて単純に効果的に行うことができ、結合すべき試料に応じて最適な処理を選択することができるという効果を有する。特に、−ＣＯＯＨ基は、実際に直接的間接的に例えばウイルスなどの結合を可能とする一方、また、例えば−ＮＨ２基などの他の活性基も供給される。
【００１８】
さらに、本方法はクレーム５の特徴を有することを特徴とするのが好ましい。
【００１９】
プラスチックによってキャリア表面をグラフトすることにより、それ自体不十分に結合しているキャリア表面を所望の活性を得るために処理することがとにかく容易にできるようになる。特に、アクリル酸あるいはアクリル酸メチルの使用がきわめて適している。
【００２０】
さらに効果のある態様として、本発明の方法はクレーム６の特徴を有することを特徴とする。
【００２１】
驚くべきことには、キャリア表面の粗さは、該キャリア表面にあるいは少なくともその表面上に−ＮＨ２基を導入することによりさらに低減できることが判明した。このようにして、例えば、アクリル酸あるいはアクリル酸メチルで処理されたポリエチレンの表面の粗さは、所望の使用に最適あるいは少なくともより適するように低減される。
【００２２】
さらに、本発明の方法はクレーム７の特徴、好ましくはクレーム７とクレーム８の特徴を有することを特徴とする。
【００２３】
好適なモノマー溶液にキャリア表面を接触させ、引き続きプラスチックおよびその溶液を処理することにより、モノマーの少なくとも一部の重合が生じ、薄いいわゆる接着層がキャリア表面上に特に単純な方法で提供される。この接着層は、所望の結合を適切に可能とする。適切な照射によって、特に効果的な方法でこの重合は実現されまた確認される。
【００２４】
特にキャリアベースとして最適なのは、例えばマイカあるいはガラス、あるいは同様な表面の粗さ、硬さ、多孔性を有する材料によって形成された表面を有するものである。特に、ガラスは極めて好適であることが確認されている。
【００２５】
好ましくは、本発明の試料キャリアの使用中、数多くの分離したスポット（点）を有するその表面に液体が当てられる。各スポットは所定の面領域を有する。各スポットにおいて、一つのあるいはそれ以上の分析が行われる。接着層の薄さを調整することにより、各スポットのサイズを決定することができる。驚くべきことには、所定量の液体で比較的薄い接着層の方が、同量の液体でより厚い接着層よりより小さいスポットが得られることが判明した。理論的にはともかくとして、少なくとも液体の潮解による接着層の吸着作用が比較的厚い接着層の方が大きいということから生じるもの思われる。実例として、１スポットあたり０．２５ｎｌの液量で、１から数アトムの薄さを有する接着層で、スポットは例えば０．１ｍｍ以下の断面を有し、一方、かなり厚い接着層では、スポットは例えば０．５ｍｍ以上の断面を有する。上記の量および寸法は特に本発明を限定して解釈するために使用してはならない。
【００２６】
本発明の方法では、所望の粗さの表面にウェルを設けることも可能である。そのウェルは、例えば、丸い先端を有するガラス棒あるいはマイカ棒を使用し、その丸い先端を熱が加えられた例えばＰＥなどの材料の表面に押しつけるようにして設ける。ボールやピンなどがマトリックス状に配列されているものが好ましい。その結果、各ウェルは前記したように局所的に低減された粗さを有する内部面を有することとなる。このような方法では、例えば、３μｌ以下、さらに特別には１μｌ以下、例えば０．１μｌ以下の容量を有するウェルを得ることが可能であり、これらのウェルにきわめて少量の液粒をジェットプリンタなどの技術を使用して投入することが可能となる。
【００２７】
さらに、本発明の方法は、クレーム１０の特徴を有することを特徴とする。
【００２８】
情報伝達ポリマーをキャリア表面に結合させることは、情報伝達ポリマーを無意識に解放してしまうことなしに表面の後処理がきわめて容易におこなうことができ、前記処理後これらのポリマーをすぐに容易に検査することが可能になるという効果を有する。必要なら、ポリマーの結合にリンカーを使用することが可能であり、これにより結合が単純化され、さらに、所望の結合のみを実現するあるいは残すという選択性が増す。
【００２９】
本発明は、クレーム１４の特徴を有することを特徴とする試料キャリアに関する。
【００３０】
厳密に言うと、プラスチックにより製造され、接着された生化学エレメントのマーカーの認識および配置が可能であるような表面粗さのキャリア表面を有する試料キャリアは、次のような効果を有する。この試料キャリアは、きわめて単純に検査対象の試料を製造し調整することができ、さらに、そのような試料キャリアは、特に比較的丈夫であるので、極めて単純な方法で使用することができる。キャリア表面は試料の特定の結合に適しているため、使用中、試料の非結合エレメントを容易に洗浄しあるいはそれに対して他の処理が可能であり、例えばＥＬＩＳＡなど、あらゆる種類の公知な分析をその試料に対して施すことが可能であるという効果を有する。厳密に言うと、試料からのエレメントをキャリア表面の特定の活性基に結合させるという特定の結合ができるので、上記の分析が可能となる。キャリア表面の特別な平坦性は、特に高密度な情報を得ることができるという効果を有する。検査対象の試料のエレメントは、識別性を失うことなくお互いに非常に近接して配置されることが可能である。
【００３１】
さらに、本発明の試料キャリアは、クレーム１８の特徴を有することを特徴とする。
【００３２】
表面にあるいは少なくとも表面上にある−ＣＯＯＨ基や−ＣＯＯ−メチル基は、キャリア表面にリンカー手段によって容易にアミノ基を生成することが可能であり、それらの基は表面にアミノ酸を結合させるのに特に適している。これは、単純な方法で、任意に前合成された、完全なあるいは不完全なペプチド、ＰＮＡの断片、ＤＮＡの断片、糖類、他の有機分子、蛋白質、ウイルス、バクテリア、細胞などをその表面に、−ＣＯＯＨ基に、−ＣＯＯ−メチル基あるいは生成されたアミノ基に結合することができるという効果を有する。さらには、他の活性基も同様に使用することが可能である。このようにして、例えばブロム酢酸の合成がキャリア表面上で可能となり、その後ペプチドが当該ペプチドのＳＨ−基を介してそれに結合することが可能となる。
【００３３】
本発明の試料キャリアは、エレメントのキャリア表面へのさまざまな化学結合を可能とするので、その結果、本試料キャリアはあらゆるものに応用することができる。
【００３４】
本発明は、さらに、クレーム２０の特徴を有することを特徴とする、生化学分野の調査研究用顕微鏡観察や写真撮影の使用に関する。
【００３５】
厳密には、顕微鏡や撮影装置とともに本発明の試料キャリアを使用することは、試料キャリアのキャリア表面が特にフラットであり、それぞれの場合において適切な焦点合わせが可能となるため、特に小さな色領域や他のタイプのマーカーを容易に検出し、お互いに区別して識別することができるという効果を有する。従って、公知の方法と違って、きわめて多数のマーカーを比較的小さな面上で識別することが可能となる。また、共焦点顕微鏡スキャナーや顕微鏡などにおいて使用されることも好ましい。
【００３６】
本発明は、さらに、クレーム２１の特徴を有することを特徴とする、検査対象の試料を本発明の試料キャリアに導入するプリンタの使用に関する。
【００３７】
特に、インクジェットタイプ、バブルジェットタイプのプリンタ、あるいは同様のプリンタ、ドロップオンデマンド技術で動作する、例えば、液体を圧電素子手段による壁面の変形により非常に小さな「液粒（ｄｒｏｐｓ）」にして噴射するガラス毛細管を備えたプリンタなどは、比較的迅速に、高精度に、再現性のあるように、特に少量の液体試料をキャリア面の特に近接した異なる位置に投入することができるという効果を有する。必要なら、結合させる物質（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を追加することもまた可能である。このようにして、試料キャリアは単純にしかも迅速に検査の準備をすることができ、しかも、特に多くの情報を比較的小さな試料キャリアに付与することが可能である。このことは、試料キャリア上の情報に対する処理および分析をきわめて単純な方法で可能とする。
【００３８】
本発明は、さらに、クレーム２２の特徴を有することを特徴とする、マトリックス状にウェルを有するマイクロプレートあるいは試料キャリアなどに関する。
【００３９】
この試料キャリアは、クレーム２０に記載するプリンタの使用に特に適したものである。これにより、ウェルに導入される液体の表面張力を急速にしかも確実に各ウェルに導入して、空気が混入するおそれを防ぐことができるという効果を呈する。したがって、例えば１０分の数μｌあるいは１０分の数ｎｌあるいはそれ以下の液粒の使用が可能となる。その結果、より少ない試料、より小さい表面で済むことになる。必ずしも必要ではないが、ウェルは、クレーム１−１３のいずれかの方法によって得られる比較的低い平滑度を有するのが好ましい。
【００４０】
そのような試料キャリアは、２．５×７．５ｃｍの外形サイズを有し、標準的な検出装置に搭載が可能で、顕微鏡のスライドとして適したものであるのが好ましい。
【００４１】
本発明の方法および試料キャリアの他の態様はサブクレームによって与えられる。
【００４２】
本発明をより明確にするために、本発明の方法および試料キャリアの実施の形態を図を参照しながら以下に説明する。
【００４３】
本明細書中、同一部分、すなわち対応する部分には同一の符号を用いる。さらに、本明細書中では一例として、他で示さない限り、キャリア表面上にアミノ基を形成するのに適している試料用キャリアは、処理されたポリエチレンかポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｅｎｅ）をガラスに溶融させることにより製造される。しかし、他のプラスチックや別のキャリアベースが同様に使われており、例えば、雲母のキャリアベースや、ポリ酢酸エステル、アクリル酸やアクリル酸メチルが試料用キャリアとして適しているも、理解されるであろう。特に、前述のプラスチックでは、−ＣＯＯＨ基やＣＯＯ−メチル基を直接その上に用いることができるという利点がある。ポリエチレンやポリプロピレンは、比較的不活性である。しかし、これらは、比較的硬くて強く、砕けることがないという利点がある。さらに、他のプラスチックは、その上に簡単にグラフトすることができる。
【００４４】
本明細書では、各々の場合において、比較平面測定法が用いられる。公称基準面上にある突起の最大高さ（Ｚ軸）は、走査面の水平測定値（Ｘ軸）の１つに対する割合で示される。本明細書では、この水平方向の測定値は、２０００―４５００ナノメーターのオーダーである。平面度Ｖの測定値は、次式にて算出される。
（Ｚ軸／Ｘ軸）×１００％
【００４５】
素材の平面度の例
・雲母：Ｖ＝０．１％　（図６ｂ）
・ガラス：Ｖ＝０．３％　（図６ｄ）
・高分子ポリエチレン：Ｖ＝１０％　（図６ａ）
・ポリエチレンフィルム：Ｖ＝３％　（図６ｂ）
・本発明によって形成されたポリエチレン面：Ｖ＝０．６％　（図６ｃ）
・ポリエチレンのピン表面：Ｖ≒２８％
【００４６】
これらの寸法や値は、あくまで一例として示したものであり、特に本発明を限定して解釈するために使用してはならない。
【００４７】
図中の凡例
□＝ −ＣＯＯＨまたは−ＣＯＯ−メチル
◯＝ −ＮＨ２
【外１】
2004508532.tif 000002
【外２】
2004508532.tif 000003
∩＝ マーカー
【００４８】
図１は、キャリアベース２の側面断面図である。キャリアベース２は、雲母から形成され、平面度Ｖが約０．１％である上面４を備える。従って、表面４上には、公称面Ｎ上で計測されるＺ方向の最大高さである突起が存在し、その突起は、せいぜい数ナノメーターであり、例えば４−５ナノメーターであるということを意味している。従って、雲母の表面４は、著しく平らである。表面４は、例えば方形であり、外寸は２５×２５ミリメーターである。ベースキャリア２は、例えば０．５ミリメーターの厚さである。
【００４９】
図２に示す状態では、プラスチック層６は、ベースキャリア２のなめらかな上面４を備える。図示される実施形態では、これは、約３％である固有のなめらかさを持つポリエチレンフィルムである。フィルム層は、例えば、０．０３５ミリメーターの厚さである。
【００５０】
フィルム層６および／またはベースキャリア２は、少なくともプラスチック層６の表面４に向かい合う側が表面４上で溶融するように熱せられ、その後、全体が冷やされる。ガラスのベースキャリアとプラスチック層６とを付着させることは意図しておらず、プラスチック層６は、ベースキャリア２から再度、簡単に取り外すことができる。驚いたことに、ベースキャリア２と向かい合うプラスチック層６の面８は、ポリエチレンフィルムが使用された時の平面度Ｖよりも、相当良い平面度Ｖが得られることが分かった。さらなる特定の計測が行われない時には、キャリア面８の平面度は、例えば、約０．６％である。さらに観察されたところによれば、ベースキャリア２と向かい合うプラスチック層６の少なくとも一部が溶融する効果もある。すなわち、化学反応によって少なくとも部分的な効果が得られる。
【００５１】
図３（Ａ）は、本発明によって形成された試料用キャリア１を示すものであり、キャリア表面８は、上方を向いている。実施形態において示されるように、プラスチックとして、例えば、ポリエチレンかポリプロピレンが使用され、それらは比較的、不活性のものである。この結果、生化学的要素をそこに結合させることは、実際不可能になる。図３（Ｂ）は、変形例であり、プラスチック層１０６として、ロッドの上に置かれた丸によって抽象的に表現されている活性基１１２を含むプラスチックが使用されている。そのようなプラスチックは、例えば、ポリ炭酸エステル、アクリル酸、アクリル酸メチルを用いることができ、そこには、例えば、−ＣＯＯＨ基や−ＣＯＯ−メチル基が活性基１１２として存在している。それらの活性基は、図でロッド上の四角や丸にて抽象的に表現されている。
【００５２】
図４は、プラスチック層１０を持つ試料用キャリア１を示す。プラスチック層１０には、例えば、アクリル酸やアクリル酸メチルの重合層がグラフトされている。そのような層１０は、以下で述べるポリエチレンのプラスチックキャリア層６や他のプラスチックに適用することができる。
【００５３】
プラスチック部分６は、そのなめらかなキャリア表面８が、特定の濃度であるモノマーの溶液に浸される。その後、プラスチックを含む溶液は、特定の強さを持つ放射性のある放射線にさらされ、少なくともキャリア表面８には、当該モノマーの重合がおこる。
【００５４】
好ましいモノマー溶液は、例えば、０．６％から６％のアクリル酸（ＡＣ）モノマー溶液、もしくは、０．６％から６％のアクリル酸メチル（ＭＡ）モノマー溶液である。例えば、これらの溶液は、例えば２から１２キログレイ（ｋＧｙ）のγ放射線にさらされる。照射時間を適切に選択することにより、キャリア面８上やその一部に、所望の厚さの当該重合層を得ることができる。そのような付着層は、例えば、数個の分子や鎖の厚さを持つので、キャリア面８の平面度はできる限り保存され、もしくはさらに向上する。
【００５５】
図７と図８は、図４の試料用キャリアを８つ示す。それらは、異なる濃度と異なる照射量のモノマーアクリル酸メチル（図７）やモノマーアクリル酸（図８）の溶液を、それぞれグラフトしたものである。図７から分かるように、特に図７ｃ、７ｄ、７ｈに示す表面は、著しく平らであり、それ故に、試料の試験には、非常に最適である。キャリアプラスチック（ＰＥ）、溶液の濃度（％）、放射量（ｋＧｙ）、グラフトされたプラスチック（ＡＣまたはＭＡ）のように、符号を継続して用いる。もちろん、他の組み合わせも可能であり、例えば、より多いか少ないモノマーや他のモノマー、他の放射線量、他の重合方法、他のキャリアプラスチックである。それらの中から、適切な選択をすることは、当業者にとって明白なことであり、さらなる発明をしなくても決定することができる。
【００５６】
本発明により製造される試料用キャリアは、以下のように利用される。
ＥＤＣ（１エチル３（３ジメチルアミノプロピル）カルボジアミド：１−ｅｔｙｌ−３− （３−ｄｉｍｅｔｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ） ｃａｒｂｏｄｉａｍｉｄｅ））により、ペプチドＡＣ−ＳＤＳＳＦＦＳＹＧＥＩＰＦＧＫは、キャリア表面に付加され、活性基１２と結合される。次に、分裂緩衝の分裂前後において、その上にモノクローナル抗体（ｍａｂ）５９．７（１／１００００）を用いて、ＥＬＩＳＡが行われる。この目的のために、キャリア表面は、硫酸ナトリウムジデシル（ＳＤＳ：ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）とベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ：ｂｅｔａ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）のもとで、７０度の超音波洗浄が行われる。このＥＬＩＳＡの結果を表１に示す。
【表１】
2004508532.tif 000004
明確に示されているように、プラスチック（アクリル酸）でグラフトされたキャリア表面上には、ペプチドが結合され、分裂前は、まだモノクローナル抗体を結合することができるが、分裂後は、露出したキャリア表面８ではもはや結合することはできない。特に、グラフトされたプラスチック（０．６／１２Ａｃ）と（０．６／２Ａｃ）は、申し分のない効果をもたらす。
【００５７】
予め合成された完全ペプチドは、ＰＮＡ断片、ＤＮＡ断片、糖類、完全複素有機分子（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｒｇａｎｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、タンパク質、ウイルス、バクテリア、細胞と同様に、本発明による試料用キャリアのキャリア表面に結合される。原則として、これらは、キャリア表面に結合されるのであるが、キャリア表面に形成されたアミノ基に結合されるのと同じように、鎖により−ＣＯＯＨ基や−ＣＯＯ−メチル基に結合される。また、例えば、ブロム基を得るために、ブロム酢酸が−ＮＨ２基に結合される。このブロム基に対しては、ペプチドは、ＳＨ基を介して結合することができる。これは、価格の観点から有利である。このようにして形成され、処理される試料用キャリアは、例えば、共焦点顕微鏡スキャナー（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｓｃａｎｎｅｒ）で観察することができる。これにより、例えば、デジタル方式で保存された比較物と比べて、比較的大きい表面の良好な観察をすることができる。
【００５８】
本発明による試料用キャリアの他の応用例では、ウイルスや抗体が活性基１２と鎖で直接、もしくは鎖を介して、キャリア表面８上か、少なくともキャリア表面８中に結合される。
【００５９】
結合されるウイルスや抗体は、活性基、例えば、−ＣＯＯＨ基および／または、−ＮＨ２基とを含んでおり、キャリア表面８，１０上か、少なくともキャリア表面８，１０中の活性基１２と鎖で直接、もしくは鎖を介して結合される。従って、例えば、ウイルスの−ＮＨ２基は、キャリア表面８，１０の−ＣＯＯＨ基や−ＮＨ２基と結合することができ、一方、ウイルスの−ＣＯＯＨ基は、キャリア表面８，１０の−ＮＨ２基と結合することができる。鎖として、種々の化学物質を使用することができ、例えば、ＨＭＤＡ（ヘキサメチレンジアミン）やＥＤＡ（エチレンジアミン）を使用することができる。従って、例えば、−ＮＨ２基がキャリア表面８，１０の上か中に活性基として導入され、キャリア表面８，１０は、活性基１２としては、例えば−ＣＯＯＨ基のみ、すなわち、実質上−ＣＯＯＨ基から構成される。ＨＭＤＡは、Ｂｏｃ ＨＭＤＡ（ブチルオキシカルボニルヘキサメチレンジアミン）を、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）を介して、−ＣＯＯＨ基と結合することにより使用され、それにより、Ｂｏｃ脱保護（Ｂｏｃ−ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）の後、−ＮＨ２基は、抗原との結合のために利用される。ＥＤＡが使われる時は、アクリル酸メチルで処理される表面８，１０は、その後、活性−ＮＨ２基が利用できるようにするため、例えば、４０℃で７２時間、前述したＥＤＡで処理される。最初のキャリア表面は、例えば、ＰＥ（０．６／２Ａｃ）−ＨｍｄａとＰＥ（０．６／１２Ａｃ）−Ｈｍｄａであり、一方、２番目のタイプの表面は、例えば、ＰＥ（０．６／２ＭＡ）−ＥＤＡである。
【００６０】
図７，図８に示される他の表面は、あまり平らではない。例えば、上述した方法によって、−ＮＨ２基をこれらの表面に導入することにより、これらの表面の平面度Ｖは、驚くほど改善される。このことは、前述した−ＮＨ２基を導入することにより、これらの表面が、少なくとも有形試験のための試料用キャリアとして用いるのに、さらに適したものとなることを意味している。
【００６１】
試料用キャリアを用いたさらなる試験を、一例として以下に包括的に述べるが、特に本発明を限定して解釈するために使用してはならない。
【００６２】
図９は、ペップスキャン（ｐｅｐｓｃａｎ）試験の概要図であり、ＨＩＶ１のＧＰ１２０の主要アミノ配酸列、ＨＩＶ１の主要糖タンパク質を含んでいる。それぞれの円は、アミノ酸を表している。アミノ酸として、一文字の符号が用いられている（Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リジン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリネン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシン）。
【００６３】
ＨＩＶ１のＧＰ１２０の主要アミノ酸配列は、図に示されているように、複合ペプチド（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）に分けられている。ペプチド１は、アミノ酸１から始まり、アミノ酸９で終わるペプチドである。ペプチド２は、アミノ酸２から始まり、アミノ酸１０まで続いているペプチド、等である。ペプチドは、図９の下部に示されるように、キャリア表面上に合成される。ペプチドは、それぞれ三角形で示されている。続いて、総キャリア表面は、
【外３】
2004508532.tif 000005
で示される同じ抗体と接触される。いくつかのペプチドが、この抗体と結合する。抗体の溶液がキャリア表面から洗い流された後、キャリア表面にまだ残されていて、ペプチドと結合している抗体が、対抗体結合物によって、明示される。従って、抗体と結合しているペプチド配列が、直接決定しうる。マーカー、好ましくは蛍光マーカーを備えてもよく、さらに他のマーカーを適用してもよい。例えば、放射性マーカー、金のような貴金属、カラーマーカー等である。図９から分かるように、個々のペプチドは、著しく接近している。キャリア表面は著しく平らであるので、これらのペプチドは、少なくともマーカーが付着しており、共焦点顕微鏡スキャナーでそれぞれ検知することができる。これは、さらに、区別されるべきペプチド、結合物、抗体、対抗体結合物などの、検査に必要な種々の要素が、ほとんど必要でないことを意味している。
【００６４】
望ましいペプチド配列や各当該ペプチドが形成された後、抗体は、ペプチドから取り除かれ、ペプチドは再利用される。本発明による試料用キャリアを用いることにより、非常に多くの異なったペプチドを、比較的短時間に合成することができる。
【００６５】
インクジェットプリンタや、バブルジェットプリンタ、ドロップオンデマンド技術に基づくようなプリンタによって、ペプチドをキャリア表面につけるのが好ましい。これは、簡単かつ迅速な方法で、精度が高く、再現性よくキャリア表面に当該ペプチドを凝縮することができるからである。例えば、０．２５から０．５ナノメーターの液粒（ｄｒｏｐｓ）が、１から２キロヘルツで噴射される。キャリアプラスチックは、適度にペプチド化学に抵抗しうるという利点があり、もしガラスがキャリアとして使用されるなら、無謀のように思われる。本発明による方法では、ペップスキャンを超小型化することができる。結合されているペプチドなどのある表面をスキャンするためには、共焦点顕微鏡を用いるのが好ましい。そのような顕微鏡を用いることにより、表面の著しいなめらかさが大きな利点となるのである。
【００６６】
表２は、図７と図８に示す８つの表面に対して、モノクローナル抗体と当該キャリア表面に合成されている結合ペプチドのＥＬＩＳＡ値を示す。ここには、使用される全てのグラフトされた表面で合成が可能であり、その厚さには関係ないことが明示されている。従って、ペプチド、ＤＮＡ、ＰＮＡや情報伝達モノマーのようなものを、表面上にて合成することができる。
【表２】
2004508532.tif 000006
【００６７】
本発明による試料キャリアは、従来技術に対して重要な利点を有している。すなわち、非常に簡易な方法により、種々の活性基を、少なくとも上述した−ＣＯＯＨ基および−ＮＨ２基のようなキャリア表面に、もしくはキャリア表面内に設けることができる。所望の応用例や所望の結合に応じて、キャリア表面は必要に応じて適宜の方法で処理される。さらに、活性基を非常に接近させて、試料から検出される要素の密度が高くなるように、たとえば、１平方センチメートル当たり９９９のペプチドが存在するように、活性基を設けることができる。したがって、使用される検出技術の解像度が非常に向上する。あるいは少なくともより最適な方法で使用可能となる。
【００６８】
キャリア表面８の平坦度は、適宜の技術を使用してより向上させることが可能となる。それはたとえば、キャリベース２上にプラスチック層６を置いて溶融させるための真空技術である。あるいは、少なくとも、キャリアベース２上でそれを溶解させるための真空技術である。これにより、平坦性を損なう原因となる可能性のあるガスの含有を抑制する。
【００６９】
図１０は、上面２０４を有するキャリアベース２０２の断面図である。キャリアベース２０２の上面２０４には、突起２０４が設けられている。突起２０４はほぼ球状、たとえば半球状である。その凸側はキャリアベース２０２から離れる方向に向いている。プラスチック層２０６はベースキャリア２０２および突起２０４の全面に設けられている。たとえば、図１および図２で説明したようにである。その結果、プラスチック層２０６に複数のキャビティ２１６が形成される。その複数のキャビティは突起２１４の外表面に対応する内面を有し、また、複数のキャビティはそれに相当する表面粗さを有する。突起２１４は、ベースキャリア２０２の中にほぼ半分だけ押し込まれたボールのようなガラス部品あるいは雲母部品により形成することができる。それらは、その部分に一体に形成してもよい。こうして、内表面の表面粗さがとりわけて低くされたウェル（溜め）２１６が得られる。表面粗さは、たとえば図１〜９で説明したような大きさのオーダーである。複数のウェルは好ましくは、既知のマイクロプレートに相当するＮ×Ｍマトリクス状に配置されて。
【００７０】
ウェル２１６は、既知のマイクロプレートのウェルに相当する容積を持つことができる。換言すると、たとえば、約３μｌのオーダーの容積である。しかしながら、それらをかなり小さく設計することも可能である。たとえば、３μｌ以下のかなり少ない容積、たとえば、１μｌもしくは０．１μｌ以下のウェル２１６が得られるような、直径を有するように設計することもできる。これらのウェルは、かなずしも必要ではないが、好ましくは、とくに円滑な外表面を有する突起２１４によって形成される。非常に細かいウェル２１６を有するキャリア２０６により次のような利点が得られる。すなわち、非常に微量な試料が必要となり、非常に多くのウェル２１６を比較的小さな表面上に設けることができる。そのような試料キャリア２０１は、インクジェットプリンタやバブルジェットプリンタなどのようなドロップオンデマンド方式のプリンタの使用に対してとくに好ましい。したがって、ウェルの中へ空気の混入を起こすことなく、とくに小さい容積の試料を導入することができる。一方、導入される試料液の表面張力は比較的簡単に克服できる。
【００７１】
他の実施の形態においては、図示はしないが、突起に代えて、複数のピンを用いることができる。ピンは突起２１４に相当する端部を有している。これらのピンは、プラスチック層２０６に対して移動して所望のキャビティを形成する。また、このようにして、規則的パターン、あるいは他のパターンにより、所望の容積のウェル２１６を得ることができる。比較的小さな容積のウェル２１６（３μｌ未満、とくには１μｌ未満、好ましくは０．１μｌ未満）は、ウェルに含まれる試料を分析する際にとりわけ適している。このような分析は、ＨＦＭ顕微鏡を用いることなく検出できるような、たとえば、発光マーカー、あるいは蛍光マーカーもしくは同等のマーカーを用いることにより行うものである。
【００７２】
本発明は、図面や明細書に示された具体的な実施例に何ら限定されない。添付された請求の範囲によって概説された発明の範囲内において多くの変形例が可能である。
【００７３】
たとえば、他のプラスチックを使用してキャリア表面を形成したり、その上に層１０をグラフトすることができる。好ましいプラスチックは、たとえば、所望の活性基と、所望の硬さや柔軟性と、キャリアプラスチックとグラフトプラスチックとの所望の結合性と、そして、たとえば、化学薬剤（製品）、あるいは照射、露光などに対する耐性（抵抗力）とに基づいて選択される。そのような選択は、本発明の当業者によって簡単に理解できる。
【００７４】
さらに、本発明による試料キャリアは、他の検査のために使用することもできる。特定要素（構成物質）の存在を確定するマーカー、たとえば、蛍光マーカー、カラーリングマーカーおよび光放射マーカーの使用を含む検査にも使用できる。具体的な複数の実施例では、いずれの場合にも、プラスチック層はベースキャリア上に設けられている。その上、プラスチック層を、十分に円滑なベースキャリアの表面で処理することももちろん可能である。ベースキャリアは、プラスチック層の表面、たとえばガラスや雲母のベースキャリアの表面に対して、またはその表面に沿って移動する。所望の円滑性（平坦性）を持ったベースキャリア上でプラスチックを重合させることも可能である。あるいは、その表面上に好ましい特性を持ったプラスチックを他の方法で生成することも可能である。キャリアは型の一部としてもよい。もちろん、種々のすべての試料を、本発明による試料キャリア上に結合できる。上述したウイルスだけを一例として説明した。これら多くの類似する変形例は、特許請求の範囲によって概説された発明の枠内で理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
キャリアベースを示す。
【図２】
プラスチック層が形成されたキャリアベースを示す。
【図３】
（Ａ）は、キャリアベースからはがされたプラスチック層を示し、（Ｂ）は、他のプラスチックの変形例による図３（Ａ）のプラスチック層を示す。
【図４】
キャリア表面にグラフトされた接着層を有するプラスチック層を示す。
【図５】
キャリア表面に固着されたペプチドを有する試料キャリアの概略図を示す。
【図６】
通常使用するピンの表面、マイカの表面、ポリエチレンにより製造された本発明のキャリア面の表面、ガラスの表面のそれぞれの拡大図である。
【図７】
アクリル酸メチル層をグラフトしたキャリア面を有する本発明による４つの面を示す。
【図８】
ポリアクリレートをグラフトした本発明による４つの面を示す。
【図９】
キャリア表面のペプスキャンの概略図を示す。
【図１０】
ウェルをマトリクス状に有するマイクロプレートを形成するための図２と同様のプラスチック層が形成されたキャリアベースを示す。
【図１】
2004508532.tif 000007
【図２】
2004508532.tif 000008
【図３】
2004508532.tif 000009
【図４】
2004508532.tif 000010
【図５】
2004508532.tif 000011
【図６】
2004508532.tif 000012
【図７】
2004508532.tif 000013
【図８】
2004508532.tif 000014
【図９】
2004508532.tif 000015
【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成12年6月27日(2000.6.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
化学の研究もしくは生化学の研究においてとくに好ましく使用される試料キャリアを製造する方法は、キャリアベースの少なくとも一表面に、プラスチック層を設け、
プラスチック層は、キャリアベースに固着しないように熱的および／または化学的に処理されて、キャリアベースに面するプラスチックの面の表面粗さを低減し、
そこでプラスチックをキャリベースから除去し、この除去により、キャリア表面を形成するプラスチック表面を相対的に円滑にする。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項２】
請求項１の方法において、
少なくとも部分的に前記プラスチックを溶融して、キャリアベースの少なくとも一方の面の全域にプラスチックを設ける。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３】
請求項１または２の方法において、
前記プラスチックは、試料に対する少なくとも一つの活性基、とくに、−ＣＯＯＨ基または−ＣＯＯ−メチル基のようなアミノ基を形成するために使用される基を有するモノマープラスチックまたは高分子プラスチックである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項４】
請求項１または２の方法において、
キャリア表面は、試料に対する少なくとも一つの活性基、とくに、−ＣＯＯＨ基または−ＣＯＯ−メチル基のようなアミノ基を形成するために使用される基をキャリア表面に少なくとも備えるように処理される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項５】
請求項４の方法において、
キャリア表面は、とくにモノマーまたはポリマー、好ましくはアクリル酸もしくはアクリル酸メチルでグラフトされる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項６】
請求項４または５の方法において、
キャリア表面の中に、または少なくともキャリア表面の上に、−ＮＨ２基を導入することによって、その表面粗さを低減する。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項７】
請求項４〜６のいずれかの方法において、
少なくともキャリア表面上の少なくともプラスチック層は、モノマー溶液と接触し、ここで、プラスチックおよび溶液は、少なくともモノマーの一部分の重合がキャリア表面で生じるように処理され、この目的のために、好ましくは、プラスチックは溶液とともに照射処理される。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項８】
請求項７の方法において、
キャリア表面には、重合された比較的薄い接着層が設けられ、この接着層は、好ましくは、小数の原子に相当する厚さ、もしくは比較的フラットな連鎖の厚さを持つ。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項９】
請求項３〜８のいずれかの方法において、
前記活性基は、リンカーによってアミノ基に変換される。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１０】
請求項３〜１０のいずれかの方法において、
情報伝達ポリマーは、適宜のリンカーの媒介によって、少なくとも複数の活性基に任意に結合され、または合成される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかの方法において、
キャリベースは、少なくともプラスチックが設けられる面の表面粗さがとくに低くされ、好ましくは、原子粗さの大きさのオーダ−、またはそれよりもやや上のオーダーの表面粗さにされる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１２】
請求項１１の方法において、
ベースキャリアは、少なくともその表面が雲母、ガラス、あるいは表面粗さ、硬さ、多孔性の観点からそれらと同等の材料で作られ、好ましくはガラスから作られる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法において、
キャリア表面は、少なくとも一つのほぼ球面体で形成されるか、もしくは少なくとも一つのほぼ球面体を備え、球面体の直径は、キャリアに向う面において、少なくとも一つ、好ましくはマトリクス状のウェルを設け、そのウェルの容積は、３μｌ未満、好ましくは１μｌ未満、とくには０．１μｌ未満である。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、試料（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）キャリアの製造方法、特に、化学および生化学における研究調査での使用に適した試料キャリアの製造方法に関する。
【０００２】
生化学分野での研究調査において、例えばマイクロプレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）におけるいわゆるミニウェル（ｍｉｎｉｗｅｌｌｓ）が一般的に使用される。このミニウェルに分析の対象となる少量の試料が投入され、処理され、観察される。マーカーにより、該当ミニウェルにおいて特有の結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）が生じたか否かを確認することが可能であり、検査対象試料の特性を特定することが可能である。
【０００３】
このような方法では、試料の均一な配分が可能であるという利点があり、その結果、異なる分析を同一試料において同時に行うことができ、また、同一の分析を異なる試料において行うことができる。しかしながら、この方法は、ミニウェルの最小容量が、例えば３μｌ程度と、比較的大きいという欠点を有する。これは、異なる分析を行うためには比較的多くの試料を必要とし、さらに、所定の面には限られた数のマイクロウェルしか設けられないことを意味する。また、この方法は試料キャリア上で多くのスペースを必要とする。
【０００４】
また、分析対象の試料をピン上に供給して使用する方法が知られている。ピンは、分析対象の試料と異なるウェルの液体との間での結合が生じるあるいは生じないように、連続してマイクロプレートのウェルに注入された液体に浸すことが可能である。この方法も、検査対象の試料部分が比較的少数であるため、比較的大きな面を有した試料キャリアが必要となるという欠点を有する。
【０００５】
上記方法で使用されるマイクロプレートおよびピンは、例えば、ポリエチレンなどのプラスチック（樹脂）で製造することが可能であり、そのプラスチックは、特定の結合のみが可能なように、反応性物質を有するかあるいは有しないものとされる。使用されるプラスチックは比較的平坦性が小さい。局所的な平坦性は、例えばガラス面やマイカ面の局所的平坦性よりかなり小さい。ここでいう「局所的平坦性」とは、例えばμｍ平方オーダーの比較的小さな面の平坦性のことを言うものとする。このことは、マーカーを有し、プラスチック面に結合された試料からエレメント（構成物質）を知覚することは比較的困難であることを意味する。というのは、特に、分析に使用する顕微鏡や撮影装置をその面に適切に焦点を合わせることができないからである。確かに、エレメントが結合している表面の粗さが比較的大きいため、該当面に対して直角方向に見た場合に、これらのエレメントはお互いにふらついた状態に見え、それ故焦点を合わせることを困難にしている。このことは、十分な弁別を可能とするために分析対象の各ウェル（溜め）あるいはピンの面が比較的大きなものである必要があることを意味する。これは、さらにコンパクト化を阻害する要因である。
ワング他の「ラテックスフィルム生成の原子間力顕微鏡観察の研究」は、ラテックス分散液を２〜３滴新たに固着したマイカ表面に注ぎ、フィルムを３６℃で４時間乾燥させることによるフィルムの生成について開示する。そして、前記ラテックスフィルム表面の原子間力顕微鏡イメージが報告されている。これらのフィルムは、高度に整然とした表面構造を有する。
研究対象のラテックスフィルムはマイカ表面に十分に接触し、前記フィルムの他の面は長期間研究の対象となる。この刊行物による方法において、ラテックスフィルムの通常の表面構造とその変更が研究の主題である。しかしながら、ワング他に開示されている表面の粗さは１０％以上のレベル（Ｚ軸／Ｘ軸×１００％）で、通常使用されるポリエチレンフィルムに相当するものである。
ＵＳ５，６２７，０７９は、フッ素化あるいはフッ素を含む表面の生成を開示する。それは、例えば酵素、抗体、ペプチドの結合のために、例えば前記表面を再機能化するためのものであり、生物学分野におけるセンサーの組立に有効なものである。すべての異なる種類の材料から出発し、そのようなフッ素化された表面を生成するためのいくつかの方法が開示されている。この刊行物による本質的な成果は前記した（オキシ）フッ素化表面である。表面のスムーズさや平坦性については何も教示はない。
ＧＢ４７１８８２は、スムーズな表面を有する人工ガラス成果物の製造方法を開示し、それはモールドによる製造および前記表面の高重合によってなされる。
【０００６】
本発明の目的は、プレアンブル部で述べたタイプの方法の提供にあり、その方法は、公知の方法による欠点を回避し、長所を維持するものである。このため、本発明の方法はクレーム１の特徴を有することを特徴とする。
【０００７】
特にフラットなプラスチックキャリアの表面を有し、試料の所望のエレメントの結合に適した試料キャリアを提供することによって得られる効果は、特にお互いに接近した検出対象のエレメントの結合を可能とし、それにもかかわらず、例えば顕微鏡やＣＣＤカメラやその他の装置によって、お互いに区別して識別が可能となることである。
【０００８】
原則、プラスチックは試料キャリアの製造に好適な材料であり、処理が比較的単純で比較的強度があり、特に、ウイルス、抗原、ペプチドなどの生化学試料などの異なる試料のプラスチックへの適切な結合を可能とするものである。
【０００９】
驚くべきことには、本発明の方法によると、検査における試料のためのキャリア面として実に好適であるように、あるいは、少なくともより好適であるようにスムーズなプラスチック表面を得ることができることが判明した。確かに、好適な粗さの表面を有するキャリアベースの表面に対して、熱的あるいは化学的に処理をして、プラスチック層を形成することにより、キャリアベースに接する面の粗さがかなり低減される。このようにして、例えば表面の粗さの低減が５−２０のファクターであるいはそれ以上で実現できる。このことは、キャリア面に結合された試料のエレメントは特に小さな寸法でよく、しかも、例えば、それに結合したマーカーに基づいて、その存在を最も望ましく確認することができる。本発明の方法によって得られる小さなキャリア面では、多くの異なるあるいは同一のエレメントが近接した状態で識別することが可能である。この近接した状態は、例えば、０．２５−０．５ｎｌの液粒をその表面に当てることによって実現することが可能である。実施の形態では、これらの液粒はプリンタによって当てられる。特に、インクジェットあるいはバブルジェットタイプなどのプリンタであり、好ましくは圧電気によって制御されるプリンタである。これらのプリンタは公知である。これらを（生）化学試料の製造に使用することは、精細な位置決めと試料の投与を高速にしかも再現性良く得ることが可能となるという特別な効果を有する。
【００１０】
さらに、特に小さなウェル（溜め）に、例えば０−３μｌオーダ程度、さらには、０−０．１μｌオーダ程度で充填することが可能となる。本発明の方法において、このようなウェルは前述した粗さが低減された表面を有するのが好ましいが、例えば蛍光マーカーなどを使用した分析では、ウェルの内部表面は例えばＰＥの通常の粗さのデザインであってもよい。
【００１１】
特に効果のある態様として、本発明の方法はクレーム２の特徴を有することを特徴とする。
【００１２】
キャリアベースの一表面に対してプラスチックを少なくとも部分的に溶融させることによって、プラスチックの理想的な分布が特に単純な方法で実現できる。さらに、そのような場合、例えばプラスチックフィルムやプラスチックシートを容易に得ることができる。しかし、キャリア表面に例えばプラスチック層の重合を生じさせること、あるいは、キャリアベースの表面に対して潮解（ｄｅｌｉｑｕｅｓｃｅｎｃｅ）が生じるようにプラスチックを化学的に処理することも可能となる。
【００１３】
理論的にはともかくとして、得られたキャリア表面の特別なスムーズさは、少なくとも部分的には、特にスムーズなキャリアベースの使用とキャリアベースに対して接着されていないことの結果生じたものであると考えられる。それゆえ、本発明の方法は、最適なスムーズさを有しプラスチックとキャリアベース間を接着させないこととするキャリアベースを使用することによって最も効果的に実現される。しかしながら、２次的な最適条件により、十分にスムーズなキャリア表面をすでに得ることができているということである。
【００１４】
第１の実施の形態では、本発明の方法は、さらにクレーム３の特徴を有することを特徴とする。
【００１５】
対象試料に対する少なくとも一つの活性基を有するプラスチックを使用することは、所望の結合基（ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｒｏｕｐｓ）を直接得ることが出来るという効果を有する。キャリア表面に結合（ｃｏｕｐｌｅ）されるアミノ基を生成するのに適した基は、このような試料キャリアが特に生化学分野での使用、より具体的にはアミノ酸の結合により適しているという効果を有する。
【００１６】
変形例として、本発明の方法は、クレーム４の特徴を有することを特徴とする。
【００１７】
使用されるプラスチックが直接的にあるいは少なくとも十分に対象試料の結合に適していないとき、あるいは、少なくともリンカーによって転移（ｔｒａｎｓｆｏｒｍ）することができないときには、キャリア表面は次のような処理をするのが好ましい。すなわち、キャリア表面上あるいは少なくともキャリア表面において対象試料に対する１以上の活性基が供給される。特に、例えば−ＣＯＯＨあるいは−ＣＯＯ−メチル基などのリンカーによってアミノ基を生成するのに使用される基が供給される。このようにすることにより次のような効果を得る。キャリア表面のプラスチックとして、特に適した特性を有する材料、例えばポリエチレンなどを使用することができ、しかも、キャリア表面の処理によりアミノ基の生成が効果的になされる。この点で、例えばマイカやガラスなどと比べて、プラスチックはそのような処理がきわめて単純に効果的に行うことができ、結合すべき試料に応じて最適な処理を選択することができるという効果を有する。特に、−ＣＯＯＨ基は、実際に直接的間接的に例えばウイルスなどの結合を可能とする一方、また、例えば−ＮＨ２基などの他の活性基も供給される。
【００１８】
さらに、本方法はクレーム５の特徴を有することを特徴とするのが好ましい。
【００１９】
プラスチックによってキャリア表面をグラフトすることにより、それ自体不十分に結合しているキャリア表面を所望の活性を得るために処理することがとにかく容易にできるようになる。特に、アクリル酸あるいはアクリル酸メチルの使用がきわめて適している。
【００２０】
さらに効果のある態様として、本発明の方法はクレーム６の特徴を有することを特徴とする。
【００２１】
驚くべきことには、キャリア表面の粗さは、該キャリア表面にあるいは少なくともその表面上に−ＮＨ２基を導入することによりさらに低減できることが判明した。このようにして、例えば、アクリル酸あるいはアクリル酸メチルで処理されたポリエチレンの表面の粗さは、所望の使用に最適あるいは少なくともより適するように低減される。
【００２２】
さらに、本発明の方法はクレーム７の特徴、好ましくはクレーム７とクレーム８の特徴を有することを特徴とする。
【００２３】
好適なモノマー溶液にキャリア表面を接触させ、引き続きプラスチックおよびその溶液を処理することにより、モノマーの少なくとも一部の重合が生じ、薄いいわゆる接着層がキャリア表面上に特に単純な方法で提供される。この接着層は、所望の結合を適切に可能とする。適切な照射によって、特に効果的な方法でこの重合は実現されまた確認される。
【００２４】
特にキャリアベースとして最適なのは、例えばマイカあるいはガラス、あるいは同様な表面の粗さ、硬さ、多孔性を有する材料によって形成された表面を有するものである。特に、ガラスは極めて好適であることが確認されている。
【００２５】
好ましくは、本発明の試料キャリアの使用中、数多くの分離したスポット（点）を有するその表面に液体が当てられる。各スポットは所定の面領域を有する。各スポットにおいて、一つのあるいはそれ以上の分析が行われる。接着層の薄さを調整することにより、各スポットのサイズを決定することができる。驚くべきことには、所定量の液体で比較的薄い接着層の方が、同量の液体でより厚い接着層よりより小さいスポットが得られることが判明した。理論的にはともかくとして、少なくとも液体の潮解による接着層の吸着作用が比較的厚い接着層の方が大きいということから生じるもの思われる。実例として、１スポットあたり０．２５ｎｌの液量で、１から数アトムの薄さを有する接着層で、スポットは例えば０．１ｍｍ以下の断面を有し、一方、かなり厚い接着層では、スポットは例えば０．５ｍｍ以上の断面を有する。上記の量および寸法は特に本発明を限定して解釈するために使用してはならない。
【００２６】
本発明の方法では、所望の粗さの表面にウェルを設けることも可能である。そのウェルは、例えば、丸い先端を有するガラス棒あるいはマイカ棒を使用し、その丸い先端を熱が加えられた例えばＰＥなどの材料の表面に押しつけるようにして設ける。ボールやピンなどがマトリックス状に配列されているものが好ましい。その結果、各ウェルは前記したように局所的に低減された粗さを有する内部面を有することとなる。このような方法では、例えば、３μｌ以下、さらに特別には１μｌ以下、例えば０．１μｌ以下の容量を有するウェルを得ることが可能であり、これらのウェルにきわめて少量の液粒をジェットプリンタなどの技術を使用して投入することが可能となる。
【００２７】
さらに、本発明の方法は、クレーム１０の特徴を有することを特徴とする。
【００２８】
情報伝達ポリマーをキャリア表面に結合させることは、情報伝達ポリマーを無意識に解放してしまうことなしに表面の後処理がきわめて容易におこなうことができ、前記処理後これらのポリマーをすぐに容易に検査することが可能になるという効果を有する。必要なら、ポリマーの結合にリンカーを使用することが可能であり、これにより結合が単純化され、さらに、所望の結合のみを実現するあるいは残すという選択性が増す。
【００２９】
本発明は、クレーム１４の特徴を有することを特徴とする試料キャリアに関する。
【００３０】
厳密に言うと、プラスチックにより製造され、接着された生化学エレメントのマーカーの認識および配置が可能であるような表面粗さのキャリア表面を有する試料キャリアは、次のような効果を有する。この試料キャリアは、きわめて単純に検査対象の試料を製造し調整することができ、さらに、そのような試料キャリアは、特に比較的丈夫であるので、極めて単純な方法で使用することができる。キャリア表面は試料の特定の結合に適しているため、使用中、試料の非結合エレメントを容易に洗浄しあるいはそれに対して他の処理が可能であり、例えばＥＬＩＳＡなど、あらゆる種類の公知な分析をその試料に対して施すことが可能であるという効果を有する。厳密に言うと、試料からのエレメントをキャリア表面の特定の活性基に結合させるという特定の結合ができるので、上記の分析が可能となる。キャリア表面の特別な平坦性は、特に高密度な情報を得ることができるという効果を有する。検査対象の試料のエレメントは、識別性を失うことなくお互いに非常に近接して配置されることが可能である。
【００３１】
さらに、本発明の試料キャリアは、クレーム７の特徴を有することを特徴とする。
【００３２】
表面にあるいは少なくとも表面上にある−ＣＯＯＨ基や−ＣＯＯ−メチル基は、キャリア表面にリンカー手段によって容易にアミノ基を生成することが可能であり、それらの基は表面にアミノ酸を結合させるのに特に適している。これは、単純な方法で、任意に前合成された、完全なあるいは不完全なペプチド、ＰＮＡの断片、ＤＮＡの断片、糖類、他の有機分子、蛋白質、ウイルス、バクテリア、細胞などをその表面に、−ＣＯＯＨ基に、−ＣＯＯ−メチル基あるいは生成されたアミノ基に結合することができるという効果を有する。さらには、他の活性基も同様に使用することが可能である。このようにして、例えばブロム酢酸の合成がキャリア表面上で可能となり、その後ペプチドが当該ペプチドのＳＨ−基を介してそれに結合することが可能となる。
【００３３】
本発明の試料キャリアは、エレメントのキャリア表面へのさまざまな化学結合を可能とするので、その結果、本試料キャリアはあらゆるものに応用することができる。
【００３４】
本発明は、さらに、クレーム１９の特徴を有することを特徴とする、生化学分野の調査研究用顕微鏡観察や写真撮影の使用に関する。
【００３５】
厳密には、顕微鏡や撮影装置とともに本発明の試料キャリアを使用することは、試料キャリアのキャリア表面が特にフラットであり、それぞれの場合において適切な焦点合わせが可能となるため、特に小さな色領域や他のタイプのマーカーを容易に検出し、お互いに区別して識別することができるという効果を有する。従って、公知の方法と違って、きわめて多数のマーカーを比較的小さな面上で識別することが可能となる。また、共焦点顕微鏡スキャナーや顕微鏡などにおいて使用されることも好ましい。
【００３６】
特に、インクジェットタイプ、バブルジェットタイプのプリンタ、あるいは同様のプリンタ、ドロップオンデマンド技術で動作する、例えば、液体を圧電素子手段による壁面の変形により非常に小さな「液粒（ｄｒｏｐｓ）」にして噴射するガラス毛細管を備えたプリンタなどは、比較的迅速に、高精度に、再現性のあるように、特に少量の液体試料をキャリア面の特に近接した異なる位置に投入することができるという効果を有する。必要なら、結合させる物質（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を追加することもまた可能である。このようにして、試料キャリアは単純にしかも迅速に検査の準備をすることができ、しかも、特に多くの情報を比較的小さな試料キャリアに付与することが可能である。このことは、試料キャリア上の情報に対する処理および分析をきわめて単純な方法で可能とする。
【００３７】
本発明は、さらに、クレーム２１の特徴を有することを特徴とする、マトリックス状にウェルを有するマイクロプレートあるいは試料キャリアなどに関する。
【００３８】
この試料キャリアは、クレーム１９に記載するプリンタの使用に特に適したものである。これにより、ウェルに導入される液体の表面張力を急速にしかも確実に各ウェルに導入して、空気が混入するおそれを防ぐことができるという効果を呈する。したがって、例えば１０分の数μｌあるいは１０分の数ｎｌあるいはそれ以下の液粒の使用が可能となる。その結果、より少ない試料、より小さい表面で済むことになる。必ずしも必要ではないが、ウェルは、クレーム１−１３のいずれかの方法によって得られる比較的低い平滑度を有するのが好ましい。
【００３９】
そのような試料キャリアは、２．５×７．５ｃｍの外形サイズを有し、標準的な検出装置に搭載が可能で、顕微鏡のスライドとして適したものであるのが好ましい。
【００４０】
本発明の方法および試料キャリアの他の態様はサブクレームによって与えられる。
【００４１】
本発明をより明確にするために、本発明の方法および試料キャリアの実施の形態を図を参照しながら以下に説明する。
【００４２】
本明細書中、同一部分、すなわち対応する部分には同一の符号を用いる。さらに、本明細書中では一例として、他で示さない限り、キャリア表面上にアミノ基を形成するのに適している試料用キャリアは、処理されたポリエチレンかポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｅｎｅ）をガラスに溶融させることにより製造される。しかし、他のプラスチックや別のキャリアベースが同様に使われており、例えば、雲母のキャリアベースや、ポリ酢酸エステル、アクリル酸やアクリル酸メチルが試料用キャリアとして適しているも、理解されるであろう。特に、前述のプラスチックでは、−ＣＯＯＨ基やＣＯＯ−メチル基を直接その上に用いることができるという利点がある。ポリエチレンやポリプロピレンは、比較的不活性である。しかし、これらは、比較的硬くて強く、砕けることがないという利点がある。さらに、他のプラスチックは、その上に簡単にグラフトすることができる。
【００４３】
本明細書では、各々の場合において、比較平面測定法が用いられる。公称基準面上にある突起の最大高さ（Ｚ軸）は、走査面の水平測定値（Ｘ軸）の１つに対する割合で示される。本明細書では、この水平方向の測定値は、２０００―４５００ナノメーターのオーダーである。平面度Ｖの測定値は、次式にて算出される。
（Ｚ軸／Ｘ軸）×１００％
【００４４】
素材の平面度の例
・雲母：Ｖ＝０．１％　（図６ｂ）
・ガラス：Ｖ＝０．３％　（図６ｄ）
・高分子ポリエチレン：Ｖ＝１０％　（図６ａ）
・ポリエチレンフィルム：Ｖ＝３％　（図６ｂ）
・本発明によって形成されたポリエチレン面：Ｖ＝０．６％　（図６ｃ）
・ポリエチレンのピン表面：Ｖ≒２８％
【００４５】
これらの寸法や値は、あくまで一例として示したものであり、特に本発明を限定して解釈するために使用してはならない。
【００４６】
図中の凡例
□＝ −ＣＯＯＨまたは−ＣＯＯ−メチル
◯＝ −ＮＨ２
【外１】
2004508532.tif 000060
【外２】
2004508532.tif 000061
∩＝ マーカー
【００４７】
図１は、キャリアベース２の側面断面図である。キャリアベース２は、雲母から形成され、平面度Ｖが約０．１％である上面４を備える。従って、表面４上には、公称面Ｎ上で計測されるＺ方向の最大高さである突起が存在し、その突起は、せいぜい数ナノメーターであり、例えば４−５ナノメーターであるということを意味している。従って、雲母の表面４は、著しく平らである。表面４は、例えば方形であり、外寸は２５×２５ミリメーターである。ベースキャリア２は、例えば０．５ミリメーターの厚さである。
【００４８】
図２に示す状態では、プラスチック層６は、ベースキャリア２のなめらかな上面４を備える。図示される実施形態では、これは、約３％である固有のなめらかさを持つポリエチレンフィルムである。フィルム層は、例えば、０．０３５ミリメーターの厚さである。
【００４９】
フィルム層６および／またはベースキャリア２は、少なくともプラスチック層６の表面４に向かい合う側が表面４上で溶融するように熱せられ、その後、全体が冷やされる。ガラスのベースキャリアとプラスチック層６とを付着させることは意図しておらず、プラスチック層６は、ベースキャリア２から再度、簡単に取り外すことができる。驚いたことに、ベースキャリア２と向かい合うプラスチック層６の面８は、ポリエチレンフィルムが使用された時の平面度Ｖよりも、相当良い平面度Ｖが得られることが分かった。さらなる特定の計測が行われない時には、キャリア面８の平面度は、例えば、約０．６％である。さらに観察されたところによれば、ベースキャリア２と向かい合うプラスチック層６の少なくとも一部が溶融する効果もある。すなわち、化学反応によって少なくとも部分的な効果が得られる。
【００５０】
図３（Ａ）は、本発明によって形成された試料用キャリア１を示すものであり、キャリア表面８は、上方を向いている。実施形態において示されるように、プラスチックとして、例えば、ポリエチレンかポリプロピレンが使用され、それらは比較的、不活性のものである。この結果、生化学的要素をそこに結合させることは、実際不可能になる。図３（Ｂ）は、変形例であり、プラスチック層１０６として、ロッドの上に置かれた丸によって抽象的に表現されている活性基１１２を含むプラスチックが使用されている。そのようなプラスチックは、例えば、ポリ炭酸エステル、アクリル酸、アクリル酸メチルを用いることができ、そこには、例えば、−ＣＯＯＨ基や−ＣＯＯ−メチル基が活性基１１２として存在している。それらの活性基は、図でロッド上の四角や丸にて抽象的に表現されている。
【００５１】
図４は、プラスチック層１０を持つ試料用キャリア１を示す。プラスチック層１０には、例えば、アクリル酸やアクリル酸メチルの重合層がグラフトされている。そのような層１０は、以下で述べるポリエチレンのプラスチックキャリア層６や他のプラスチックに適用することができる。
【００５２】
プラスチック部分６は、そのなめらかなキャリア表面８が、特定の濃度であるモノマーの溶液に浸される。その後、プラスチックを含む溶液は、特定の強さを持つ放射性のある放射線にさらされ、少なくともキャリア表面８には、当該モノマーの重合がおこる。
【００５３】
好ましいモノマー溶液は、例えば、０．６％から６％のアクリル酸（ＡＣ）モノマー溶液、もしくは、０．６％から６％のアクリル酸メチル（ＭＡ）モノマー溶液である。例えば、これらの溶液は、例えば２から１２キログレイ（ｋＧｙ）のγ放射線にさらされる。照射時間を適切に選択することにより、キャリア面８上やその一部に、所望の厚さの当該重合層を得ることができる。そのような付着層は、例えば、数個の分子や鎖の厚さを持つので、キャリア面８の平面度はできる限り保存され、もしくはさらに向上する。
【００５４】
図７と図８は、図４の試料用キャリアを８つ示す。それらは、異なる濃度と異なる照射量のモノマーアクリル酸メチル（図７）やモノマーアクリル酸（図８）の溶液を、それぞれグラフトしたものである。図７から分かるように、特に図７ｃ、７ｄ、７ｈに示す表面は、著しく平らであり、それ故に、試料の試験には、非常に最適である。キャリアプラスチック（ＰＥ）、溶液の濃度（％）、放射量（ｋＧｙ）、グラフトされたプラスチック（ＡＣまたはＭＡ）のように、符号を継続して用いる。もちろん、他の組み合わせも可能であり、例えば、より多いか少ないモノマーや他のモノマー、他の放射線量、他の重合方法、他のキャリアプラスチックである。それらの中から、適切な選択をすることは、当業者にとって明白なことであり、さらなる発明をしなくても決定することができる。
【００５５】
本発明により製造される試料用キャリアは、以下のように利用される。
ＥＤＣ（１エチル３（３ジメチルアミノプロピル）カルボジアミド：１−ｅｔｙｌ−３− （３−ｄｉｍｅｔｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ） ｃａｒｂｏｄｉａｍｉｄｅ））により、ペプチドＡＣ−ＳＤＳＳＦＦＳＹＧＥＩＰＦＧＫは、キャリア表面に付加され、活性基１２と結合される。次に、分裂緩衝の分裂前後において、その上にモノクローナル抗体（ｍａｂ）５９．７（１／１００００）を用いて、ＥＬＩＳＡが行われる。この目的のために、キャリア表面は、硫酸ナトリウムジデシル（ＳＤＳ：ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）とベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ：ｂｅｔａ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）のもとで、７０度の超音波洗浄が行われる。このＥＬＩＳＡの結果を表１に示す。
【表１】
2004508532.tif 000062
明確に示されているように、プラスチック（アクリル酸）でグラフトされたキャリア表面上には、ペプチドが結合され、分裂前は、まだモノクローナル抗体を結合することができるが、分裂後は、露出したキャリア表面８ではもはや結合することはできない。特に、グラフトされたプラスチック（０．６／１２Ａｃ）と（０．６／２Ａｃ）は、申し分のない効果をもたらす。
【００５６】
予め合成された完全ペプチドは、ＰＮＡ断片、ＤＮＡ断片、糖類、完全複素有機分子（ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｒｇａｎｉｃ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）、タンパク質、ウイルス、バクテリア、細胞と同様に、本発明による試料用キャリアのキャリア表面に結合される。原則として、これらは、キャリア表面に結合されるのであるが、キャリア表面に形成されたアミノ基に結合されるのと同じように、鎖により−ＣＯＯＨ基や−ＣＯＯ−メチル基に結合される。また、例えば、ブロム基を得るために、ブロム酢酸が−ＮＨ２基に結合される。このブロム基に対しては、ペプチドは、ＳＨ基を介して結合することができる。これは、価格の観点から有利である。このようにして形成され、処理される試料用キャリアは、例えば、共焦点顕微鏡スキャナー（ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｓｃａｎｎｅｒ）で観察することができる。これにより、例えば、デジタル方式で保存された比較物と比べて、比較的大きい表面の良好な観察をすることができる。
【００５７】
本発明による試料用キャリアの他の応用例では、ウイルスや抗体が活性基１２と鎖で直接、もしくは鎖を介して、キャリア表面８上か、少なくともキャリア表面８中に結合される。
【００５８】
結合されるウイルスや抗体は、活性基、例えば、−ＣＯＯＨ基および／または、−ＮＨ２基とを含んでおり、キャリア表面８，１０上か、少なくともキャリア表面８，１０中の活性基１２と鎖で直接、もしくは鎖を介して結合される。従って、例えば、ウイルスの−ＮＨ２基は、キャリア表面８，１０の−ＣＯＯＨ基や−ＮＨ２基と結合することができ、一方、ウイルスの−ＣＯＯＨ基は、キャリア表面８，１０の−ＮＨ２基と結合することができる。鎖として、種々の化学物質を使用することができ、例えば、ＨＭＤＡ（ヘキサメチレンジアミン）やＥＤＡ（エチレンジアミン）を使用することができる。従って、例えば、−ＮＨ２基がキャリア表面８，１０の上か中に活性基として導入され、キャリア表面８，１０は、活性基１２としては、例えば−ＣＯＯＨ基のみ、すなわち、実質上−ＣＯＯＨ基から構成される。ＨＭＤＡは、Ｂｏｃ ＨＭＤＡ（ブチルオキシカルボニルヘキサメチレンジアミン）を、ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）を介して、−ＣＯＯＨ基と結合することにより使用され、それにより、Ｂｏｃ脱保護（Ｂｏｃ−ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）の後、−ＮＨ２基は、抗原との結合のために利用される。ＥＤＡが使われる時は、アクリル酸メチルで処理される表面８，１０は、その後、活性−ＮＨ２基が利用できるようにするため、例えば、４０℃で７２時間、前述したＥＤＡで処理される。最初のキャリア表面は、例えば、ＰＥ（０．６／２Ａｃ）−ＨｍｄａとＰＥ（０．６／１２Ａｃ）−Ｈｍｄａであり、一方、２番目のタイプの表面は、例えば、ＰＥ（０．６／２ＭＡ）−ＥＤＡである。
【００５９】
図７，図８に示される他の表面は、あまり平らではない。例えば、上述した方法によって、−ＮＨ２基をこれらの表面に導入することにより、これらの表面の平面度Ｖは、驚くほど改善される。このことは、前述した−ＮＨ２基を導入することにより、これらの表面が、少なくとも有形試験のための試料用キャリアとして用いるのに、さらに適したものとなることを意味している。
【００６０】
試料用キャリアを用いたさらなる試験を、一例として以下に包括的に述べるが、特に本発明を限定して解釈するために使用してはならない。
【００６１】
図９は、ペップスキャン（ｐｅｐｓｃａｎ）試験の概要図であり、ＨＩＶ１のＧＰ１２０の主要アミノ配酸列、ＨＩＶ１の主要糖タンパク質を含んでいる。それぞれの円は、アミノ酸を表している。アミノ酸として、一文字の符号が用いられている（Ａ＝アラニン、Ｃ＝システイン、Ｄ＝アスラギン酸、Ｅ＝グルタミン酸、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｋ＝リジン、Ｌ＝ロイシン、Ｍ＝メチオニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｐ＝プロリン、Ｑ＝グルタミン、Ｒ＝アルギニン、Ｓ＝セリネン、Ｔ＝トレオニン、Ｖ＝バリン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシン）。
【００６２】
ＨＩＶ１のＧＰ１２０の主要アミノ酸配列は、図に示されているように、複合ペプチド（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）に分けられている。ペプチド１は、アミノ酸１から始まり、アミノ酸９で終わるペプチドである。ペプチド２は、アミノ酸２から始まり、アミノ酸１０まで続いているペプチド、等である。ペプチドは、図９の下部に示されるように、キャリア表面上に合成される。ペプチドは、それぞれ三角形で示されている。続いて、総キャリア表面は、
【外３】
2004508532.tif 000063
で示される同じ抗体と接触される。いくつかのペプチドが、この抗体と結合する。抗体の溶液がキャリア表面から洗い流された後、キャリア表面にまだ残されていて、ペプチドと結合している抗体が、対抗体結合物によって、明示される。従って、抗体と結合しているペプチド配列が、直接決定しうる。マーカー、好ましくは蛍光マーカーを備えてもよく、さらに他のマーカーを適用してもよい。例えば、放射性マーカー、金のような貴金属、カラーマーカー等である。図９から分かるように、個々のペプチドは、著しく接近している。キャリア表面は著しく平らであるので、これらのペプチドは、少なくともマーカーが付着しており、共焦点顕微鏡スキャナーでそれぞれ検知することができる。これは、さらに、区別されるべきペプチド、結合物、抗体、対抗体結合物などの、検査に必要な種々の要素が、ほとんど必要でないことを意味している。
【００６３】
望ましいペプチド配列や各当該ペプチドが形成された後、抗体は、ペプチドから取り除かれ、ペプチドは再利用される。本発明による試料用キャリアを用いることにより、非常に多くの異なったペプチドを、比較的短時間に合成することができる。
【００６４】
インクジェットプリンタや、バブルジェットプリンタ、ドロップオンデマンド技術に基づくようなプリンタによって、ペプチドをキャリア表面につけるのが好ましい。これは、簡単かつ迅速な方法で、精度が高く、再現性よくキャリア表面に当該ペプチドを凝縮することができるからである。例えば、０．２５から０．５ナノメーターの液粒（ｄｒｏｐｓ）が、１から２キロヘルツで噴射される。キャリアプラスチックは、適度にペプチド化学に抵抗しうるという利点があり、もしガラスがキャリアとして使用されるなら、無謀のように思われる。本発明による方法では、ペップスキャンを超小型化することができる。結合されているペプチドなどのある表面をスキャンするためには、共焦点顕微鏡を用いるのが好ましい。そのような顕微鏡を用いることにより、表面の著しいなめらかさが大きな利点となるのである。
【００６５】
表２は、図７と図８に示す８つの表面に対して、モノクローナル抗体と当該キャリア表面に合成されている結合ペプチドのＥＬＩＳＡ値を示す。ここには、使用される全てのグラフトされた表面で合成が可能であり、その厚さには関係ないことが明示されている。従って、ペプチド、ＤＮＡ、ＰＮＡや情報伝達モノマーのようなものを、表面上にて合成することができる。
【表２】
2004508532.tif 000064
【００６６】
本発明による試料キャリアは、従来技術に対して重要な利点を有している。すなわち、非常に簡易な方法により、種々の活性基を、少なくとも上述した−ＣＯＯＨ基および−ＮＨ２基のようなキャリア表面に、もしくはキャリア表面内に設けることができる。所望の応用例や所望の結合に応じて、キャリア表面は必要に応じて適宜の方法で処理される。さらに、活性基を非常に接近させて、試料から検出される要素の密度が高くなるように、たとえば、１平方センチメートル当たり９９９のペプチドが存在するように、活性基を設けることができる。したがって、使用される検出技術の解像度が非常に向上する。あるいは少なくともより最適な方法で使用可能となる。
【００６７】
キャリア表面８の平坦度は、適宜の技術を使用してより向上させることが可能となる。それはたとえば、キャリベース２上にプラスチック層６を置いて溶融させるための真空技術である。あるいは、少なくとも、キャリアベース２上でそれを溶解させるための真空技術である。これにより、平坦性を損なう原因となる可能性のあるガスの含有を抑制する。
【００６８】
図１０は、上面２０４を有するキャリアベース２０２の断面図である。キャリアベース２０２の上面２０４には、突起２０４が設けられている。突起２０４はほぼ球状、たとえば半球状である。その凸側はキャリアベース２０２から離れる方向に向いている。プラスチック層２０６はベースキャリア２０２および突起２０４の全面に設けられている。たとえば、図１および図２で説明したようにである。その結果、プラスチック層２０６に複数のキャビティ２１６が形成される。その複数のキャビティは突起２１４の外表面に対応する内面を有し、また、複数のキャビティはそれに相当する表面粗さを有する。突起２１４は、ベースキャリア２０２の中にほぼ半分だけ押し込まれたボールのようなガラス部品あるいは雲母部品により形成することができる。それらは、その部分に一体に形成してもよい。こうして、内表面の表面粗さがとりわけて低くされたウェル（溜め）２１６が得られる。表面粗さは、たとえば図１〜９で説明したような大きさのオーダーである。複数のウェルは好ましくは、既知のマイクロプレートに相当するＮ×Ｍマトリクス状に配置されて。
【００６９】
ウェル２１６は、既知のマイクロプレートのウェルに相当する容積を持つことができる。換言すると、たとえば、約３μｌのオーダーの容積である。しかしながら、それらをかなり小さく設計することも可能である。たとえば、３μｌ以下のかなり少ない容積、たとえば、１μｌもしくは０．１μｌ以下のウェル２１６が得られるような、直径を有するように設計することもできる。これらのウェルは、かなずしも必要ではないが、好ましくは、とくに円滑な外表面を有する突起２１４によって形成される。非常に細かいウェル２１６を有するキャリア２０６により次のような利点が得られる。すなわち、非常に微量な試料が必要となり、非常に多くのウェル２１６を比較的小さな表面上に設けることができる。そのような試料キャリア２０１は、インクジェットプリンタやバブルジェットプリンタなどのようなドロップオンデマンド方式のプリンタの使用に対してとくに好ましい。したがって、ウェルの中へ空気の混入を起こすことなく、とくに小さい容積の試料を導入することができる。一方、導入される試料液の表面張力は比較的簡単に克服できる。
【００７０】
他の実施の形態においては、図示はしないが、突起に代えて、複数のピンを用いることができる。ピンは突起２１４に相当する端部を有している。これらのピンは、プラスチック層２０６に対して移動して所望のキャビティを形成する。また、このようにして、規則的パターン、あるいは他のパターンにより、所望の容積のウェル２１６を得ることができる。比較的小さな容積のウェル２１６（３μｌ未満、とくには１μｌ未満、好ましくは０．１μｌ未満）は、ウェルに含まれる試料を分析する際にとりわけ適している。このような分析は、ＨＦＭ顕微鏡を用いることなく検出できるような、たとえば、発光マーカー、あるいは蛍光マーカーもしくは同等のマーカーを用いることにより行うものである。
【００７１】
本発明は、図面や明細書に示された具体的な実施例に何ら限定されない。添付された請求の範囲によって概説された発明の範囲内において多くの変形例が可能である。
【００７２】
たとえば、他のプラスチックを使用してキャリア表面を形成したり、その上に層１０をグラフトすることができる。好ましいプラスチックは、たとえば、所望の活性基と、所望の硬さや柔軟性と、キャリアプラスチックとグラフトプラスチックとの所望の結合性と、そして、たとえば、化学薬剤（製品）、あるいは照射、露光などに対する耐性（抵抗力）とに基づいて選択される。そのような選択は、本発明の当業者によって簡単に理解できる。
【００７３】
さらに、本発明による試料キャリアは、他の検査のために使用することもできる。特定要素（構成物質）の存在を確定するマーカー、たとえば、蛍光マーカー、カラーリングマーカーおよび光放射マーカーの使用を含む検査にも使用できる。具体的な複数の実施例では、いずれの場合にも、プラスチック層はベースキャリア上に設けられている。その上、プラスチック層を、十分に円滑なベースキャリアの表面で処理することももちろん可能である。ベースキャリアは、プラスチック層の表面、たとえばガラスや雲母のベースキャリアの表面に対して、またはその表面に沿って移動する。所望の円滑性（平坦性）を持ったベースキャリア上でプラスチックを重合させることも可能である。あるいは、その表面上に好ましい特性を持ったプラスチックを他の方法で生成することも可能である。キャリアは型の一部としてもよい。もちろん、種々のすべての試料を、本発明による試料キャリア上に結合できる。上述したウイルスだけを一例として説明した。これら多くの類似する変形例は、特許請求の範囲によって概説された発明の枠内で理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
キャリアベースを示す。
【図２】
プラスチック層が形成されたキャリアベースを示す。
【図３】
（Ａ）は、キャリアベースからはがされたプラスチック層を示し、（Ｂ）は、他のプラスチックの変形例による図３（Ａ）のプラスチック層を示す。
【図４】
キャリア表面にグラフトされた接着層を有するプラスチック層を示す。
【図５】
キャリア表面に固着されたペプチドを有する試料キャリアの概略図を示す。
【図６】
通常使用するピンの表面、マイカの表面、ポリエチレンにより製造された本発明のキャリア面の表面、ガラスの表面のそれぞれの拡大図である。
【図７】
アクリル酸メチル層をグラフトしたキャリア面を有する本発明による４つの面を示す。
【図８】
ポリアクリレートをグラフトした本発明による４つの面を示す。
【図９】
キャリア表面のペプスキャンの概略図を示す。
【図１０】
ウェルをマトリクス状に有するマイクロプレートを形成するための図２と同様のプラスチック層が形成されたキャリアベースを示す。




【手続補正書】
【提出日】平成12年10月25日(2000.10.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学の研究もしくは生化学の研究においてとくに好ましく使用される試料キャリアを製造する方法は、キャリアベースの少なくとも一表面に、プラスチック層を設け、
プラスチック層は、キャリアベースに固着しないように熱的および／または化学的に処理されて、キャリアベースに面するプラスチックの面の表面粗さを低減し、
そこでプラスチックをキャリベースから除去し、この除去により、キャリア表面を形成するプラスチック表面を相対的に円滑にする。
【請求項２】
請求項１の方法において、
少なくとも部分的に前記プラスチックを溶融して、キャリアベースの少なくとも一方の面の全域にプラスチックを設ける。
【請求項３】
請求項１または２の方法において、
前記プラスチックは、試料に対する少なくとも一つの活性基、とくに、−ＣＯＯＨ基または−ＣＯＯ−メチル基のようなアミノ基を形成するために使用される基を有するモノマープラスチックまたは高分子プラスチックである。
【請求項４】
請求項１または２の方法において、
キャリア表面は、試料に対する少なくとも一つの活性基、とくに、−ＣＯＯＨ基または−ＣＯＯ−メチル基のようなアミノ基を形成するために使用される基をキャリア表面に少なくとも備えるように処理される。
【請求項５】
請求項４の方法において、
キャリア表面は、とくにモノマーまたはポリマー、好ましくはアクリル酸もしくはアクリル酸メチルでグラフトされる。
【請求項６】
請求項４または５の方法において、
キャリア表面の中に、または少なくともキャリア表面の上に、−ＮＨ２基を導入することによって、その表面粗さを低減する。
【請求項７】
請求項４〜６のいずれかの方法において、
少なくともキャリア表面上の少なくともプラスチック層は、モノマー溶液と接触し、ここで、プラスチックおよび溶液は、少なくともモノマーの一部分の重合がキャリア表面で生じるように処理され、この目的のために、好ましくは、プラスチックは溶液とともに照射処理される。
【請求項８】
請求項７の方法において、
キャリア表面には、重合された比較的薄い接着層が設けられ、この接着層は、好ましくは、小数の原子に相当する厚さ、もしくは比較的フラットな連鎖の厚さを持つ。
【請求項９】
請求項３〜８のいずれかの方法において、
前記活性基は、リンカーによってアミノ基に変換される。
【請求項１０】
請求項３〜１０のいずれかの方法において、
情報伝達ポリマーは、適宜のリンカーの媒介によって、少なくとも複数の活性基に任意に結合され、または合成される。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかの方法において、
キャリベースは、少なくともプラスチックが設けられる面の表面粗さがとくに低くされ、好ましくは、原子粗さの大きさのオーダ−、またはそれよりもやや上のオーダーの表面粗さにされる。
【請求項１２】
請求項１１の方法において、
ベースキャリアは、少なくともその表面が雲母、ガラス、あるいは表面粗さ、硬さ、多孔性の観点からそれらと同等の材料で作られ、好ましくはガラスから作られる。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の方法において、
キャリア表面は、少なくとも一つのほぼ球面体で形成されるか、もしくは少なくとも一つのほぼ球面体を備え、球面体の直径は、キャリアに向う面において、少なくとも一つ、好ましくはマトリクス状のウェルを設け、そのウェルの容積は、３μｌ未満、好ましくは１μｌ未満、とくには０．１μｌ未満である。
【請求項１４】
試料、とくに生化学試料の検査に使用される試料キャリアであって、プラスチックで製造されたキャリア表面を有し、前記キャリア表面は、前記キャリア表面に付着された生化学試料要素のマーカーが知覚でき、そして、前記キャリア表面に前記マーカーが留まる試料キャリアにおいて、
前記キャリア表面は、前記キャリア表面の表面粗さとほぼ等しいか、それ未満の表面粗さを有するキャリアベースの上で、部分的にプラスチックを溶融して形成され、
前記キャリア表面は少なくとも試料が共有的に結合するのに適している。
【請求項１５】
請求項１４の試料キャリアにおいて、
前記プラスチックはポリマー、とくにポリエチレン、またはポリプロピレン（ｐｏｌｙｐｒｏｐｅｎｅ）である。
【請求項１６】
請求項１４〜１５のいずれかの試料キャリアにおいて、
キャリア表面は、モノマーまたはポリマー、好ましくはアクリル酸またはアクリル酸メチルでグラフトされている。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれかの試料キャリアにおいて、
前記キャリア表面は少なくとも−ＣＯＯＨ基または−ＣＯＯ−メチル基を有する。
【請求項１８】
請求項１４〜１７のいずれかの試料キャリアにおいて、
前記キャリア表面は、比較的大きな密度で、好ましくは、活性基が比較的規則的に分布している。
【請求項１９】
生化学研究の顕微鏡観察および／または顕微鏡撮影の使用において、試料キャリアには、好ましくは請求項１４〜１８のいずれか一つのプラスチックキャリア表面が設けられ、
ペプチド、有機分子、またはその一部などの要素が前記キャリア表面に結合され、
少なくとも結合要素にはマーカーが設けられ、
マーカーの存在および位置が、試料キャリアの処理の後、顕微鏡観察および／または顕微鏡撮影により確定される。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれかの方法で製作される試料キャリアは、
プリンタを用いた使用にとりわけ好ましいように、マトリクス状のウェルを備え、
前記ウェルの容積は、３μｌ未満、とくには０と１μｌの間、好ましくは０と０．１μｌとの間である。
【請求項２１】
請求項２０の試料キャリアにおいて、
前記ウェルは、中間材料の表面粗さよりも低い粗さを持つ内表面を有する。
【国際調査報告】
2004508532.tif 000065
2004508532.tif 000066
2004508532.tif 000067
2004508532.tif 000068
2004508532.tif 000069