(57)【要約】本発明は、式Ｚ−Ｂｍ−（ＡＸＡ）ｘ−Ｂｎ−（ＡＸＡ）ｙ−Ｂｏ−（ＡＸＡ）ｚ−Ｂｐの抗ヘパリン活性を示す化合物、それを含む診断試薬および抗ヘパリン活性用医薬のインビトロ診断試験への該化合物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１の抗ヘパリン活性を示す化合物。
【化１】
2004506651.tif 000008
［式中、
＊Ｚは以下の一般式を有し：
【化２】
2004506651.tif 000009
（式中、Ｃｙ＝−共有結合
−ＣＨ２−
−ＣＯ−
−ＣＯ−Ｓ−
−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−
（式中、１≦ｎ≦２およびＸ＝Ｏ−、Ｓ−、
【化３】
2004506651.tif 000010
）であり、
Ｃｘ＝−共有結合
−（ＣＨ２）ｎ−、１≦ｎ≦５
または
【化４】
2004506651.tif 000011
（式中、Ｒ１＝−ＯＨ、−ＮＨ２）である）、
＊Ｂは塩基性アミノ酸を示し、
ｍ、ｎ、ｏおよびｐは、互いに独立して２〜４の整数を示す。
＊ＡＸＡは式：−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−に対応する炭化水素に基づく鎖を示し、ｎは２〜６の整数であり、ｘ、ｙおよびｚは、互いに独立して１〜６の整数を示す。］
【請求項２】
Ｚが以下の化合物から選ばれる、請求項１記載の化合物。
４−アミノピロリジン−２−カルボン酸
アゼチジン−２−カルボン酸
２−カルボキシモルホリン酸
１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソインドールカルボン酸
４−ヒドロキシピロリジン−２−カルボン酸
インドリン−２−カルボン酸
イソニペコチン酸
ピログルタミン酸
ピペコリン−２−カルボン酸
ピロリジン−２−カルボン酸
２−オキソチアゾリジン−４−カルボン酸
チアゾリジンカルボン酸
テトラヒドロイソキノリン−２−カルボン酸
【請求項３】
Ｚが式：
【化５】
2004506651.tif 000012
のピログルタミン酸（ＰＧｌｕ）である、請求項１および２のいずれかに記載の化合物。
【請求項４】
Ｂが、リジン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジン、ホモリジンおよびホモアルギニンから選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｂがリジンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
ｍ、ｎおよびｏが４に等しく、ｐが２に等しい、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
ＡＸＡが式ＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−（アミノヘキサン酸）に対応する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
ｘが２に等しく、ｙおよびｚが１に等しい、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
式：ＰＧｌｕ−Ｋ４−（ＡＨＡ）２−Ｋ４−ＡＨＡ−Ｋ４−ＡＨＡ−Ｋ２に対応する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
凝血試験において、ヘパリン化血漿と非ヘパリン化血漿との間のΔ相対凝血時間によって決定される、１０％未満、好ましくは５％未満の抗ヘパリン力を示す、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物を含む、インビトロ診断用試薬。
【請求項１２】
血液サンプル中のヘパリンの存在または不存在に関係なく、当該血液サンプルの凝血時間を計算するための請求項１１記載の試薬。
【請求項１３】
血液サンプル中のヘパリンの存在または不存在に関係なく、凝固カスケードの種々の要素を検出またはアッセイするための請求項１１記載の試薬。
【請求項１４】
ＰＴ試薬である、請求項１１記載の試薬。
【請求項１５】
式：ＰＧｌｕ−Ｋ４−（ＡＨＡ）２−Ｋ４−ＡＨＡ−Ｋ４−ＡＨＡ−Ｋ２の化合物を含む、請求項１１記載の試薬。
【請求項１６】
ＯＤによって６３０ｎｍで測定される、０．５未満、好ましくは０．１未満の濁度を示す、請求項１１記載の試薬。
【請求項１７】
一般式１の化合物を最終濃度２〜１０μｇ／ｍｌで含む、請求項１１記載の試薬。
【請求項１８】
試薬中の化合物の最終濃度が５μｇ／ｍｌである、請求項１１記載の試薬。
【請求項１９】
血液サンプル中のヘパリンの存在または不存在に関係なく、血液サンプルの凝血時間を計算するための、または血液サンプル中における凝固カスケードの種々の要素を検出もしくはアッセイするための、インビトロ診断用試薬中での請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項２０】
医薬品の製造のための、抗ヘパリン薬としての請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、式Ｚ−Ｂｍ−（ＡＸＡ）ｘ−Ｂｎ−（ＡＸＡ）ｙ−Ｂｏ−（ＡＸＡ）ｚ−Ｂｐの抗ヘパリン活性を示す化合物、それを含む診断試薬およびインビトロ診断試験または抗ヘパリン目的の医薬品の製造への該化合物の使用に関する。
【０００２】
未分画ヘパリン（ＵＦＨ）は、グリコサミノグリカンファミリーの天然の硫酸化多糖類である。これは、ブタまたはウシの腸管粘膜から主に抽出される。
【０００３】
これは、その糖単位の組成のために不均一な製品であり、その結果として分子のイオン電荷もまた不均一である。すなわち、グルコサミン硫酸単位の硫酸化度が異なり、イズロン酸およびグルクロン酸単位中のカルボキシル基の数が異なる［１，２］。
【０００４】
ヘパリンの本質的な物理的特性は、そのポリアニオン性およびその高電荷密度である。特に、それぞれの二糖は３〜４の陰電荷（硫酸塩およびカルボン酸塩）をもつ。
【０００５】
ヘパリンの種々の単位の特別の配列は、配列の全長を通して、五糖を再現可能に形成する。
この五糖は、ヘパリンの抗トロンビンＩＩＩ認識部位として知られており、これらの２つの物質の間に高い親和性をもたらし、その結果、高い抗凝血活性をもたらす［３］。
五糖を含まない鎖は、事実上抗凝血活性を有しない（ヘパリン分子の１／３だけしかこのＡＴＩＩＩへの親和性を示さない）［４］。
未分画ヘパリン（ＵＦＨ）は多分散高分子であり、市販のＵＦＨに基づく製剤は１２０００〜１８０００Ｄａの分子量を有する。
これらの製剤は、主に、血栓症に対する予防または治療作用の目的で使用される。
【０００６】
ＵＦＨは、（化学処理後に）大きさによって分画することが可能であり、これによりＬＭＷＨ（低分子量ヘパリン）のファミリーが製造される［５］。
ＵＦＨは因子ＩＩａおよびＸａに同等の活性を有する。他方で、ＬＭＷＨは高い抗Ｘａ活性と、ＬＭＷＨ分子の大きさに伴って減少する抗ＩＩａ活性とを保持する。
高い抗ＩＩａ活性は出血性の副作用を有することがあるので、ＬＭＷＨをＵＦＨの代わりに抗凝血剤として有利に使用することができる。
【０００７】
しかしながら、治療におけるＵＦＨまたはＬＭＷＨヘパリンの使用は、特に、例えば体外循環のような循環系における介入の終わりにそれらの抗凝血効果を中和する化合物の投与を必要とすることがある。さらに、インビトロにおける特定の診断試験では、サンプル中のヘパリンの存在は、結果の間違った解釈をもたらす場合がある。それゆえ、診断には抗ヘパリン特性をもつ化合物もまた有することが必要であることは明らかである。
【０００８】
硫酸プロタミンは、インビボでヘパリンの抗凝血効果を中和することができる唯一の公知化合物である。プロタミンはアルギニン残基が豊富な塩基性タンパク質のファミリーに属し、サケ精子から精製され［６−７］、その正電荷によってヘパリンを中和する［８−１０］。
【０００９】
しかしながら、プロタミンは低血圧症、徐脈、血小板減少症および白血球減少症のような血行力学的および血液学的副作用を引き起こす［１１−１５］。特に、プロタミン上の正電荷はヘパリンの有効性および中和に直接比例するが、分子の毒性にも比例することが実証された［１６］。
【００１０】
ポリ（Ｌ）−リジンおよびポリブレンは、ヘパリンを中和することが知られている他の化合物である。しかしながら、これらのポリカチオンもまた、臨床使用では毒性が強すぎるようである。
【００１１】
Ｗａｋｅｆｉｅｌｄら（ＷＯ９５／１３０８３）は、毒性が低いと考えられるプロタミン改変体を開示する。これらは＋１４〜＋１８の正電荷をもち、２０〜４０アミノ酸配列を有するペプチドであり、これらの構造は中性アミノ酸を点在させた正残基のクラスターに相当する。Ｈａｒｒｉｓら（ＥＰ９９９２１９）は、一連のアルギニンおよびアラニンクラスターを含む直鎖状または分枝状の抗ヘパリンペプチドを開示する。
【００１２】
しかしながら、上述の文献には、診断において抗ヘパリン剤を有する必要性に関する教示は全く含まれない。
【００１３】
本発明の目的は、ヘパリン中和剤として有用な新規合成分子である。
【００１４】
本発明の分子の特性は、インビトロ診断用試薬においてさらに詳細に研究されてきた。
試験する血液サンプル中におそらく存在するヘパリンの効果に無感応であるというそれらの能力に加えて、これらの診断試薬のいくつかについては低い濁度を示すことも必要であるかもしれない。この特性は、特に光学検出器を備えた自動装置でクィックタイムを測定するためのトロンボプラスチンを含む試薬の場合に特に重要である。
【００１５】
以下で説明する一般式Ｉを有する化合物によって、これら２つの基準を満たすことが可能である。それゆえ、それらが診断および治療の両方の目的で、ヘパリンの存在と関連する起こり得る妨害の中和に特に有用であることが明らかである。
【００１６】
従って、本発明は、下記一般式Ｉで示される、抗ヘパリン活性を有する化合物に関する：
【００１７】
【化６】
2004506651.tif 000002
【００１８】
［式中、
＊Ｚは一般式：
【００１９】
【化７】
2004506651.tif 000003
【００２０】
（式中、Ｃｙ＝−共有結合
−ＣＨ２−
−ＣＯ−
−ＣＯ−Ｓ−
−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−
（式中、１≦ｎ≦２およびＸ＝Ｏ−、Ｓ−、
【００２１】
【化８】
2004506651.tif 000004
【００２２】
）であり、
Ｃｘ＝−共有結合
−（ＣＨ２）ｎ−、１≦ｎ≦５
または
【００２３】
【化９】
2004506651.tif 000005
【００２４】
（式中、Ｒ１＝−ＯＨ、−ＮＨ２）である）を有し、
＊Ｂは塩基性アミノ酸を示し、リジン、アルギニン、オルニチン、ヒスチジン、ホモリジンおよびホモアルギニンから有利に選択することができ；
ｍ、ｎ、ｏおよびｐは、互いに独立して２〜４の整数を示す。］
【００２５】
本発明の好ましい化合物の中で、ｍ、ｎおよびｏが４に等しく、ｐが２に等しい化合物がさらに詳細に言及される。
【００２６】
＊ＡＸＡは式：−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−に対応する炭化水素に基づく鎖を示し、ｎは２〜６の整数であり、ｘ、ｙおよびｚは、互いに独立して１〜６の整数を示す。
【００２７】
有利には、Ｚは以下の化合物から選ばれる。
【００２８】
【表１】
2004506651.tif 000006
【００２９】
好ましくは、Ｚはピログルタミン酸（ＰＧｌｕ）である。
【００３０】
本発明の好ましい化合物の中で、ＡＨＡがＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−、すなわち、ｘが２に等しく、ｙおよびｚが１に等しいアミノヘキサン酸に対応する化合物をさらに詳細に言及する。
有利には、本発明は、以下の式：
ＰＧｌｕ−Ｋ４−（ＡＨＡ）２−Ｋ４−ＡＨＡ−Ｋ４−ＡＨＡ−Ｋ２に対応する化合物に関する。
【００３１】
上述の化合物は、ヘパリン化血漿と非ヘパリン化血漿との間のΔ相対凝血時間によって決定される、１０％未満、好ましくは５％未満の抗ヘパリン力を示す。
【００３２】
それゆえ、本発明の目的はまた、上述の式１に対応する化合物の、インビトロ診断用試薬への使用、特に、血液サンプル中のヘパリンの存在または不存在に関係なく、血液サンプルの凝血時間を計算するための、または凝固カスケードの種々の要素を検出もしくはアッセイするための試薬への使用である。
【００３３】
該試薬、特にＰＴ（プロトロンビン時間）型の試薬は、有利にはＯＤによって６３０ｎｍで測定される、０．５未満、好ましくは０．１未満の濁度を示す。
【００３４】
別の態様によれば、本発明は、上記一般式１により定義される化合物、特にＡＸＡがＮＨ−（ＣＨ２）５−ＣＯ−、すなわち、ｘが２に等しく、ｙおよびｚが１に等しいアミノヘキサン酸に対応する化合物、さらに好ましくは下記式：
ＰＧｌｕ−Ｋ４−（ＡＨＡ）２−Ｋ４−ＡＨＡ−Ｋ４−ＡＨＡ−Ｋ２の化合物を含む、インビトロ診断用試薬に関する。
【００３５】
それゆえに、かかる診断試薬によって、血液サンプル中のヘパリンの存在または不存在に関係なく、当該血液サンプル中で試験またはアッセイを行うことが可能になる。
【００３６】
本発明の試薬は、有利には、従来の凝血試験、すなわち、血液サンプルの凝血時間を決定する試験、または凝固カスケードの種々の要素を検出またはアッセイする（例えば、因子ＶＩＩａ、フィブリノーゲン、ならびにタンパク質ＣおよびＳをアッセイする）試験、ＰＴ試験に対応する。これらの試験は当業者によって普通に使用される。
【００３７】
本発明の好ましいインビトロ診断用試薬は、ＰＴ（プロトロンビン時間またはクィックタイム）試験を実施するためのトロンボプラスチンを含む試薬である。
【００３８】
かかる試薬における先に定義された本発明の化合物の最終濃度は、有利には２〜１０μｇ／ｍｌである。
好ましくは、この濃度は５μｇ／ｍｌである。
【００３９】
本発明はまた、先に定義した一般式１の化合物を、抗ヘパリン薬として、医薬品の製造に使用することに関する。
【００４０】
【実施例】
実施例１：本発明の好ましい化合物を合成するためのプロトコル
図１の一覧表は、合成の種々の工程を総括する。
【００４１】
好適な自動装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３３Ａ）を用い、固相支持体化学によって構造鎖を合成する。
【００４２】
合成収率を上げるために、疎水性スペーサーアーム（ＡＸＡ）を二重カップリングによって加えた。
樹脂からの切断後に中性アミドＣ末端構造を回収するために使用する樹脂はＭＢＨＡ（メチルベンズヒドリルアミン）樹脂である。
本明細書で使用する化学は、各工程で脱保護にピペリジンを使用するＦｍｏｃ化学である。
側鎖はＢｏｃ基で保護される。
合成機の合成規模は０．１ｎｍｏｌｅであり、約１００ｍｇの粗生成物を製造する。生成物を樹脂から切断し、ＴＦＡ（５５％トリフルオロ酢酸）で処理して側鎖を脱保護する。切断溶液を体積の２／３まで濃縮した後、生成物をエーテルから沈殿させる。
続いて粗生成物を凍結乾燥し、次いで、５μｍ　Ｋｒｏｍａｓｉｌ　Ｃ１８カラム（２０ｍｍ×２５０ｍｍ）を用い、水／アセトニトリル０．１％のＴＦＡ（１５ｍｌ／分で３０分間に０から６０％のアセトニトリル）の勾配で逆相ＨＰＬＣによって精製する。
検出は２１４ｎｍで行い、画分を手動で採取する。
回収された精製生成物の量は５０ｍｇである。
【００４３】
最終生成物の構造は、１２０℃で２４時間、６Ｎ　ＨＣｌで加水分解した後の配列を分析することによって確認する。ＰＩＴＣ（フェニルチオイソシアネート）で誘導体化した後、次いで加水分解物を逆相ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ　Ｃ１８カラム、５μｍ、２５０ｍｍ×４．６ｍｍ）によって分析する。
【００４４】
実施例２：ＰＴ試験における本発明の抗ヘパリン剤の試験
目的は、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ　Ｓｔａｇｏトロンボプラスチン試薬に取り入れられた抗ヘパリン剤の性能（抗ヘパリン力および濁度）を分析することである。
【００４５】
抗ヘパリン力の分析：これは、抗ヘパリン剤が、試薬を血液サンプル中に含まれるヘパリンに無感応にする能力である。
【００４６】
ヘパリンで過負荷をかけてもよいしかけなくてもよい正常な血漿（１ＩＵ／ｍｌのＵＦＨでヘパリン化した血漿（Ｃａｌｃｉｐａｒｉｎｅ　２５０００ＩＵ／ｍｌ，Ｓａｎｏｆｉ））のプールから試験サンプルを調製する。
【００４７】
コメント：ネガティブコントロールとして作用する試薬、すなわち抗ヘパリン剤を含まない試薬は、血漿のヘパリン化を立証するために有用である。
【００４８】
クィックタイムを決定するために、自動装置（ＳＴＡ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ　Ｓｔａｇｏ−特許ＥＰ０３２５８７４）は５０μｌのサンプル血漿を取り出し、ビーズを含む容器中において３７℃で２４０秒間それをインキュベートし、次いでその容器を測定エリアに移し、１００μｌのトロンボプラスチン試薬をサンプルに加える。
【００４９】
凝血時間を以下の方法によって決定した。一定粘度では容器中のビーズの振動（電磁場を用いて維持した振動）の振幅は一定である。粘度が増すと（凝血現象）、ビーズの振動の振幅は減少する。
【００５０】
凝血時間を決定するために、アルゴリズムはこの振幅の変動を使用する。
【００５１】
抗ヘパリン力を以下の方法で計算する：ヘパリン化血漿と非ヘパリン化血漿の間の相対時間Δの決定、すなわち：
【００５２】
［｛ＣＴ（ヘパリン化血漿）−ＣＴ（非ヘパリン化血漿）｝／ＴＣ（非ヘパリン化血漿）×１００］
（式中、ＣＴ＝凝血時間）
本発明の化合物の抗ヘパリン力は、このΔ時間が１０％未満であるときに顕著であると判断される。
【００５３】
濁度の分析：
濁度は診断、さらに詳細にはトロンボプラスチン試験（ＰＴ）に適用できるほど低くなければならない。
【００５４】
分光光度計（Ｕｖｉｋｏｎ　９４０，Ｋｏｎｔｒｏｎ）で６３０ｎｍでＯＤを測定することによって、この濁度を決定する。
【００５５】
コメント：ネガティブコントロールとして作用する試薬、すなわち抗ヘパリン剤を含まない試薬は、この抗ヘパリン剤の試薬の濁度への影響を測定するために有用である。
【００５６】
実施例３：トロンボプラスチン型試薬に導入した本発明の種々の抗ヘパリン剤の性能（抗ヘパリン力および濁度）の分析（抗ヘパリン剤を含まないコントロール（Ｃ）と比較した結果）：
【００５７】
【表２】
2004506651.tif 000007
【００５８】
ここで、ＡＰＡは式−（ＣＨ２）２−ＣＯ−のアミノプロパン酸に対応する。
【００５９】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の化合物の合成の種々の工程を総括した一覧表である。
【図１】
2004506651.tif 000013
【国際公開パンフレット】
2004506651.tif 000014
2004506651.tif 000015
2004506651.tif 000016
2004506651.tif 000017
2004506651.tif 000018
2004506651.tif 000019
2004506651.tif 000020
2004506651.tif 000021
2004506651.tif 000022
2004506651.tif 000023
2004506651.tif 000024
2004506651.tif 000025
2004506651.tif 000026
2004506651.tif 000027
2004506651.tif 000028
2004506651.tif 000029
2004506651.tif 000030
2004506651.tif 000031
2004506651.tif 000032
【国際調査報告】
2004506651.tif 000033
2004506651.tif 000034
2004506651.tif 000035
2004506651.tif 000036