(57)【要約】培養された繊維芽細胞および培養された角化細胞の隔てられた層から構成される凍結保存された複合生体構築物（ＣＣＬＣ）、ならびに、対応する解凍および洗浄されたＣＣＬＣであって、該ＣＣＬＣの成長可能な細胞の割合（すなわち、細胞生存性）が少なくとも約７０％であるＣＣＬＣを製造するための方法が記載される。ＣＣＬＣにおける生存可能な細胞の密度は、凍結保存前の密度の少なくとも約５０％である。ＣＣＬＣの貯蔵安定性は少なくとも約１２ヶ月である。さらに、解凍および洗浄されたＣＣＬＣの代謝活性は凍結保存前の複合生体構築物（ＣＬＣ）の少なくとも約５０％である。ＣＣＬＣの構造的一体性は凍結保存前のＣＬＣと実質的に同じである。ＣＣＬＣを製造するための方法は、コラーゲンスポンジ層と、細胞に対して非多孔性である半透過性コラーゲン層とから構成されるコラーゲン基質を供するステップと、コラーゲンスポンジ層の表面および内部に繊維芽細胞を、細胞に対して非多孔性である半透過性コラーゲン層の表面に角化細胞を、細胞増殖培地の存在下に、播種、培養し、それによりＣＬＣを供するステップと、ＣＬＣを、規定された平衡化プログラムに従って、少なくともコンドロイチン硫酸およびジメチルスルホキシドを含む凍結保護液と平衡化させるステップと、温度をプログラムされた割合で約９０℃に低下させるステップと、ＣＣＬＣを約１５０℃以下で貯蔵するステップとを含む。ヒトおよび動物における創傷を処置するためのＣＣＬＣを調製するための方法はさらに、プログラムされた解凍ならびに凍結保護剤を実質的に除くための洗浄系列を含む。
2004520828.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維芽細胞および角化細胞を保持するマトリックス内に存在する該繊維芽細胞および該角化細胞を凍結保存するための方法であって、細胞非浸透成分および細胞浸透成分を含む溶液が凍結保護液として使用され、該細胞が該溶液と平衡化され、該凍結保護液で平衡化された細胞が凍結温度に曝され、さらに、
ａ）温度を周囲の温度から約４℃に低下させるステップと、
ｂ）温度を約４℃から約−２０℃に約１℃／分の割合で低下させ、温度を約−２０℃で約１５分間保持するステップと、
ｃ）温度を約−２０℃から約−２５℃に約０．５℃／分の割合で低下させ、温度を約−２５℃で約１５分間保持するステップと、
ｄ）温度を約−２５℃から約−７０℃に約１℃／分の割合で低下させるステップと、
ｅ）温度を約−７０℃から約−９０℃に約５℃／分の割合で低下させるステップと、
ｆ）約−１５０℃以下の温度で貯蔵するステップと
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記細胞非浸透成分が、多糖類およびグリコサミノグリカンからなる群から選択され、前記細胞浸透成分が、グリセロールおよびジメチルスルホキシドからなる群から選択され、前記平衡化が周囲の温度付近で行われ、さらには、平衡化の最初のステップが、前記細胞非浸透成分を含有する第１の溶液を前記細胞に加え、該細胞を該溶液と平衡化させ、その後、前記細胞浸透成分と前記細胞非浸透成分とを含む第２の溶液を該細胞に加え、該細胞を該溶液と平衡化させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞非浸透成分がコンドロイチン硫酸またはデキストランであり、前記細胞浸透成分がジメチルスルホキシドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の凍結保護液がコンドロイチン硫酸を約２％〜３％の基礎濃度で含み、前記第２の凍結保護液が、
前記第１の溶液とジメチルスルホキシドとのおよそ４：１の比率の混合物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
約−７０℃から約−９０℃にチャンバーの温度を低下させるステップの後、前記マトリックス表面の温度が約−８５℃〜−９０℃になるまで、凍結チャンバーの温度を約−９０℃で保持し、その後、ＣＣＬＣを約−１５０℃以下の温度で貯蔵することを含むさらなるステップが行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＣＬＣが約−１７０℃〜−１９０℃で貯蔵される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の凍結保護液が約２％〜３％のコンドロイチン硫酸を含み、室温において該第１の凍結保護液と平衡化した後、約２０％のＤＭＳＯおよび２％〜３％のコンドロイチン硫酸を含有する二次凍結保護液の等量が系に導入され、平衡化が行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
温度低下プログラムが液体窒素の気相を使用することで達成される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ＣＬＣ構造物が、培養されたヒト繊維芽細胞を含有するコラーゲンスポンジ層と、生物学的細胞に対して半透過性かつ非多孔性であり、ガスおよび非細胞成分に対して透過性であるコラーゲン層であって、ヒト角化細胞の培養された層がその表面に存在するコラーゲン層とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＣＬＣが、
ａ）架橋されたコラーゲンスポンジを含むスポンジ状の第１の層であって、上部表面と下部表面とを有し、培養された繊維芽細胞をその中に含有する第１の層と、
ｂ）外因性のグリコサミノグリカンを本質的に含まない高純度のコラーゲンを含む非多孔性の第２の層であって、上部表面と下部表面とを有し、その下部表面が前記第１の層の上部表面と接している層と、
ｃ）前記非多孔性コラーゲンの第２の層の上部表面と接している培養された角化細胞を含む層と
を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
繊維芽細胞および角化細胞を含む非凍結保存マトリックスから調製される凍結保存された複合生体マトリックスであって、前記凍結保存マトリックスが、培養された繊維芽細胞および培養された角化細胞の別個の層を含み、前記細胞は、成長可能な培養された繊維芽細胞および角化細胞の総数の百分率として表される細胞生存性が、非凍結保存マトリックス内に最初に存在する成長可能な細胞の最初の数の少なくとも約７０％であり、全ての繊維芽細胞および角化細胞の総数が、非凍結保存マトリックス内に最初に存在する繊維芽細胞および角化細胞の最初の数の少なくとも約５０％であり、成長可能な細胞の代謝活性が、非凍結保存マトリックスに最初に存在する成長可能な細胞の最初の代謝活性の少なくとも５０％マトリックスであり、凍結保存前の元のマトリックスの構造的一体性と実質的に類似する構造的一体性を有し、貯蔵安定性がおよそ少なくとも１２ヶ月である、凍結保存された複合生体マトリックス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、培養された繊維芽細胞および培養された角化細胞の別個の層から構成される凍結保存された複合生体構築物（ＣＣＬＣ：cryopreserved Composite Living Construct）、およびＣＣＬＣの製造方法に関する。本発明にかかるＣＣＬＣは、凍結保護液と平衡化し、凍結し、極低温で貯蔵することによって複合生体構築物（ＣＬＣ：composite living construct）から調製される。使用に先立って、ＣＣＬＣは解凍および洗浄され、凍結保護剤が実質的に除かれる。
【背景技術】
【０００２】
［背景］
ＣＬＣは、通常はマトリックス表面および／またはその内部に繊維芽細胞真皮層および角化細胞表皮層の両方を含むことがある創傷手当て物として有用である生物学的に活性な複合生体構築物である。ＣＬＣは、肉芽化する創傷などの皮膚から露出する創傷において、擦過傷、切り傷、火傷および栄養障害型表皮水疱症で見出される傷害などの傷害において、ならびに、床ずれ、糖尿病および静脈鬱血潰瘍に罹っている個体で見られる皮膚などの虚血性皮膚において、組織を再生させるために用いることができ、組織の再生を助けることができる。
【０００３】
ＣＬＣの生存性は、皮膚等価物、移植片、血管、臓器などの他の細胞構築物の生存性と同様に、そのような構築物が凍結保存されない限り、短寿命である。貯蔵された細胞および構築物の安定性は、それらが、凍結保存などのいくつかの手段によって劣化から保護されない限り、典型的には約２４時間〜１２０時間に制限される。凍結保存の主要な目的の１つは、生存性（viability）および代謝活性を実質的に損なうことなくＣＬＣの貯蔵安定性を延ばすこと、ならびに、解凍および洗浄を行ったとき、ＣＬＣがそのような生存性を維持し、代謝活性を回復することを可能にすることである。「貯蔵安定性」は、解凍および洗浄を行ったときの生存性および代謝活性の低下を最小限にしながらＣＣＬＣが貯蔵され得る総時間である。長い貯蔵安定性は、移植物またはインプラントが実用的かつ商業的に有用であるために、輸送計画および貯蔵計画に順応させるために、および、持続可能な在庫を維持するために重要である。凍結保存によって達成されるＣＣＬＣの性状を評価する際に有用な測定項目は、「構築物の細胞密度」、すなわち、単位面積あたりの成長可能な（viable）細胞総数；「細胞生存性」、すなわち、成長可能な細胞総数の割合；および「代謝活性」、すなわち、栄養物を代謝し、他の細胞維持機能を行う能力についての成長可能な細胞の全体的な活力の尺度である。本発明に適用され得るさらなる測定項目は、構築物内および構築物表面上の細胞の存在、形態および分布についてのＣＣＬＣ構造物の組織学的検査、ならびに、増殖因子およびサイトカインなどの創傷治癒促進因子および組織再生促進因子を発現する細胞および構築物の能力である。
【０００４】
凍結保存では、多糖類およびグリコサミノグリカンなどの細胞非浸透成分（non-cell-penetrating component）（例えば、デキストランおよびコンドロイチン硫酸）と、細胞浸透成分（cell-penetrating component）（例えば、グリセロールおよびジメチルスルホキシド）とを含有する緩衝液を含む凍結保護液が典型的には使用される。細胞浸透成分の役割は、細胞を破壊する氷結晶の形成を制限すること、および細胞内液の破壊的な脱水を制限することであり、細胞非浸透成分の役割は、ＣＬＣの物理的な一体性および構造を維持することを助けることであると考えられている。
【０００５】
凍結プロセスおよびその後の解凍プロセスはまさに、ある量の細胞損失ならびに細胞生存性および代謝活性の低下を必然的に生じさせることに留意しなければならない。これは、部分的には凍結保護剤の濃度および毒性のため、ならびに、凍結および解凍を行っているときに受ける熱ショックおよび物理的損傷のためである。従って、解凍および洗浄された製造物の生存性および代謝活性を、凍結保存される前に存在する製造物にできる限り近い状態で持続することが重要である。
【０００６】
凍結保護剤の最適な配合、凍結保存のための最適な条件、ならびに、解凍および洗浄のための最適な条件は、凍結保存しようとするＣＬＣによって決定される。同じ凍結保存法をすべてのＣＬＣに適用することはできない。配合物およびプロセス条件は、細胞タイプ、構築物の形態、大きさ、密度、透過性および厚さのような様々な要因に依存する。そのような配合物および条件には、凍結保存および長期間の貯蔵については、凍結保護液の組成、その添加および撹拌のプログラム、凍結プログラム、ならびに、貯蔵温度が含まれる。ヒトおよび動物における使用のための調製には、解凍プログラム、洗浄液の組成および洗浄プロセスなどの要件がさらに含まれる。
【発明の開示】
【０００７】
［発明の要約］
本発明は、例えば、ヒトおよび動物において創傷を処置するために使用することができるＣＣＬＣを得るために、そのようなＣＬＣを凍結保存するための方法、ならびに、そのような構築物を貯蔵し、解凍および洗浄するための方法を記載する。本発明の方法において用いられるＣＬＣは、好ましくは、コラーゲンスポンジ層の表面および内部におけるヒト繊維芽細胞と、生物学的細胞（biological cell）に対して非多孔性であり、かつガスおよび非細胞成分に対して透過性であるという点で半透過性であるコラーゲン層の表面におけるヒト角化細胞との隔てられた培養層から構成される。そのようなＣＬＣは、Eisenbergの米国特許第5,282,859号および米国再発行特許第35,399号および米国特許第6,039,859号に記載される（これらの開示はすべて、参考として本明細書中に組み込まれる）。そのようなＣＬＣは、例えば、急性および慢性の皮膚創傷を処置するための生物学的に活性な手当て物として使用される。前記の米国再発行特許に記載されるＣＬＣで、本発明において出発用ＣＬＣとして有用であるＣＬＣは、
ａ）架橋されたコラーゲンスポンジを含む多孔性スポンジ状の第１の層であって、上部表面と下部表面とを有し、培養された繊維芽細胞をその中に含有する第１の層と、
ｂ）外因性のグリコサミノグリカンを本質的に含まない高純度のコラーゲンを含み、細胞に対して非多孔性である半透過性の第２の層（これはゲル形態であってもよく、またはゲル形態でなくてもよい）であって、上部表面と下部表面とを有し、その下部表面が前記第１の層の上部表面と接している第２の層と、
ｃ）前記非多孔性コラーゲンの第２の層の上部表面と接している培養された角化細胞を含む層と
を含む複合物である。
【０００８】
繊維芽細胞および角化細胞に対する構造物として有用なコラーゲン複合マトリックスは、米国特許第6,039,760号の請求項１には下記のように記載される。
水平面に対して、
ａ）上部表面および下部表面を有するコラーゲンマトリックスを含む第１の層であって、該マトリックスが、その中に繊維芽細胞を増殖させることができ、本質的に非収縮性である第１の層と、
ｂ）外因性のグリコサミノグリカンを本質的に含まず、細胞に対して非多孔性である半透過性の第２の層であって、上部表面と下部表面とを有する非多孔性のコラーゲン層を含み、その下部表面が前記第１の層の上部表面と接触し、該非多孔性コラーゲン層が、角化細胞を、前記コラーゲンマトリックス内への該細胞の実質的な侵入を伴うことなく、その表面に維持することができるように十分に非多孔性である第２の層と
を含む複合物。
【０００９】
他のＣＬＣもまた、本発明の凍結保存方法における出発材料として使用することができる。本発明の方法は、任意の生体適合性の吸収性の多孔性材料の表面および内部における繊維芽細胞、および任意の生体適合性の吸収性材料の表面における角化細胞に対して適している。コラーゲン／ＧＡＧ、架橋ゼラチン、アルギン酸塩、合成された吸収性ポリマー（ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン共重合体など）などのような材料を使用することができる。
【００１０】
本発明の目的の１つは、凍結保存前の対応するＣＬＣの貯蔵安定性と比較して、許容され得る細胞生存性、代謝活性および構造的一体性（structural integrity）だけでなく、長期間の貯蔵安定性を有するＣＣＬＣを作製する方法を提供することである。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、凍結保存前の対応するＣＬＣの場合と比較した場合、ヒトおよび動物における創傷を処置する際に有用であるために、許容され得る細胞生存性、代謝活性および構造的一体性を有する解凍および洗浄されたＣＣＬＣを製造する方法を提供することである。
【００１２】
本発明のさらにさらなる目的は、上記の方法から得られるＣＣＬＣ、ならびに、上記の方法から得られる解凍および洗浄されたＣＣＬＣを提供することである。
【００１３】
従って、本発明の実施形態には、前記の目的を満たす方法、およびそのような方法から得られる製造物の両方が包含される。
【００１４】
本発明の１つの好ましい実施形態は、培養された繊維芽細胞および角化細胞の隔てられた層から構成されるＣＣＬＣであって、ＣＣＬＣは、細胞生存性（すなわち、成長可能な培養された繊維芽細胞および角化細胞の総数の百分率）が最初の数の少なくとも約７０％であり、ＣＣＬＣは、少なくとも約６ヶ月〜１２ヶ月の貯蔵安定性を有するＣＣＬＣを製造するための方法を提供する。
【００１５】
本発明の方法によって製造されるＣＣＬＣは、凍結保存前のＣＬＣの特徴と比較したとき、下記のさらなる特徴を含む。繊維芽細胞および角化細胞の総数が最初の総数の少なくとも約５０％であること、成長可能な細胞の代謝活性が最初の細胞の少なくとも５０％であること、および、マトリックスの構造的一体性が保持されていること。
【００１６】
本発明の方法は、ＣＬＣを供するステップと、少なくとも細胞非浸透成分（多糖類またはグリコサミノグリカンなど、例えば、デキストランまたはコンドロイチン硫酸、好ましくはコンドロイチン硫酸）および細胞浸透成分（グリセロールまたはジメチルスルホキシドなど、好ましくはジメチルスルホキシド）を含む凍結保護液とＣＬＣとを平衡化プログラムに従って平衡化させるステップと、温度をプログラムに従って周囲の温度付近から約−９０℃に低下させるステップと、ＣＣＬＣを約−１５０℃以下で貯蔵するステップとを含む。本発明の凍結保存方法に供される出発ＣＬＣは、凍結保存されることになる細胞をマトリックスと一緒に含有するならば、任意の様々な方法で製造され、任意の組成を有する任意のＣＬＣであり得る。本発明者らは、ＣＬＣ出発材料として、Eisenbergの米国特許第5,282,859号における記載に従って調製された複合物を使用することを好む。そのような場合、本発明では、コラーゲンスポンジ層と、細胞に対して非多孔性である半透過性コラーゲン層とから好ましくは構成されるコラーゲンマトリックスを供し、コラーゲンスポンジの表面および内部に繊維芽細胞を、細胞に対して非多孔性である半透過性のコラーゲン層の表面に角化細胞を、細胞増殖培地の存在下に播種、培養し、それによりＣＬＣを提供することが意図される。一辺が約６ｃｍ〜７ｃｍ、厚さが１ｍｍ〜３ｍｍのＣＬＣにより、好適な結果が得られる。
【００１７】
本発明において、ＣＬＣは、通常、周囲の温度付近で凍結保護液と平衡化させられ、その後、その細胞代謝活性を遅くする、または停止させるのに、および、付随して生じる氷結晶の形成を最小限に抑えながら脱水からの保護を達成するのに、ＣＬＣにとって最適な割合で、温度が下げられる。温度は、長期間の貯蔵のために代謝活性を本質的には停止させるために、約−１５０℃よりも低い温度にさらに下げられる。解凍（通常的には周囲の温度への解凍）の後、ＣＣＬＣは、凍結保護剤のレベルを実質的に減少させるために洗浄される。
【００１８】
平衡化プログラムは、最初の平衡化されたＣＬＣを形成するために、細胞非浸透成分（好ましくは、コンドロイチン硫酸）を基礎濃度（basal concentration）（好適には、２％〜３％）で含有する第１の溶液をＣＬＣに加えるステップと、最後の平衡化されたＣＬＣを形成するために、細胞浸透成分（好ましくは、ジメチルスルホキシド）を約２０％（好適には１８％〜２２％の間）の最初のジメチルスルホキシド濃度で含有し、かつコンドロイチン硫酸を第１の溶液の場合と同じ基礎濃度で含有する第２の溶液を最初の平衡化されたＣＬＣに加えるステップであって、コンドロイチン硫酸が最初のコンドロイチン硫酸濃度で維持され、ジメチルスルホキシドが、最終的なジメチルスルホキシド濃度、好ましくは約１０％（好適には９％〜１１％の間）にされるステップとを含む。
【００１９】
本発明の別の好ましい実施形態によると、ヒトおよび動物において創傷を処置するために使用され得る解凍および洗浄されたＣＣＬＣを製造するための方法が提供される。解凍および洗浄されたＣＣＬＣを製造するための方法は、ＣＣＬＣを製造するために示されたステップに加えて、ＣＣＬＣを室温において放置することによって、ＣＣＬＣを低温の貯蔵温度から約−１００℃の第１の高い温度に温めるステップと、室温の生理的食塩水または水において温めることによって、ＣＣＬＣを、約０℃を越える第２の高い温度（４℃〜室温が好適である）に温めるステップと、その後の、凍結保護剤を実質的に含まないようにＣＣＬＣを洗浄するステップとを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
［発明の詳細な説明］
本発明の様々な実施形態および利点は、下記の図面を参照して、本発明の詳細な説明から容易に明らかになる。
【００２１】
本発明の方法によって凍結保存される好ましいＣＬＣを製造するための方法が、方法の流れ図（図１）を参照して本明細書中に簡単に記載される。この方法は、Eisenbergの米国特許第5,282,859号および米国再発行特許第35,399号および米国特許第6,039,859号に詳細に記載されている（これらは全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。前記特許においてさらに詳しく記載されている、本発明において使用されるＣＬＣを製造するための方法は、皮膚サンプルを酵素的に処理して、表皮を真皮から分離するステップと、表皮を好ましくはトリプシンで酵素的に処理して、角化細胞を遊離させるステップと、表皮を好ましくはコラゲナーゼで酵素的に処理して、繊維芽細胞を遊離させるステップとを含む。架橋されたコラーゲンスポンジの１つの表面には、層状のコラーゲン基質を形成するために、細胞に対して非多孔性である半透過性の高純度コラーゲンの層がコーティングされ；多孔性の架橋されたコラーゲンスポンジに、繊維芽細胞が播種（すなわち、接種）され；コラーゲンスポンジの表面および内部において繊維芽細胞の増殖を可能にする増殖培地の存在下で、播種されたコラーゲンスポンジが培養（すなわち、インキュベーション）され；コラーゲンスポンジのコーティング面に角化細胞が播種され；増殖培地の存在下で培養が行われ、繊維芽細胞および角化細胞を伴うコラーゲンマトリックスを含むＣＬＣが得られる。
【００２２】
様々な培地が、様々な操作のために、例えば、皮膚由来の繊維芽細胞および角化細胞を培養すること、コラーゲン基質のコラーゲンスポンジと、細胞に対して非多孔性である半透過性の層とにそれぞれ繊維芽細胞および角化細胞を播種、培養すること、および、凍結保存のために使用できる時点まで構築物をさらに培養することなどのために本発明において使用される。そのような培地は、当業者には十分に知られているダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ならびに増殖因子および他の栄養成分などの補充物を含む。本発明において使用されるＣＬＣを培養するための好ましい増殖培地は、ＤＭＥＭに加えて、ウシ胎児血清、組換えヒト表皮増殖因子、ヒドロコルチゾン、Ｌ−グルタミン、コレラトキシン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ＨＥＰＥＳ（緩衝剤）およびグルコース（好ましくは約４ｇ／Ｌの濃度で）などの成分を含有する「完全ＤＭＥＭ」（ｃＤＭＥＭ）（溶液Ａを参照のこと）である。培養期間中、使用後の増殖培地（馴化培地または使用済み培地）は定期的に除かれ、新しい増殖培地が加えられる。培養終了時における洗浄のための好ましい培地は、ＤＭＥＭ＋２（溶液Ｂを参照のこと）、すなわち、ＤＭＥＭ＋Ｌ−グルタミン＋非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）である。
【００２３】
本発明のＣＣＬＣを製造するための方法は、前記されたように少なくともコンドロイチン硫酸およびジメチルスルホキシドを含む凍結保護液とＣＬＣとを平衡化プログラムに従って平衡化させるステップと、温度を、温度低下プログラムに従って周囲の温度付近から少なくとも約−９０℃に低下させるステップと、約−１５０℃よりも低い温度で貯蔵するステップとを含む。下記の議論で示される細部は、一般的な態様および好ましい態様において、当該方法の様々なステップがどのように行われるかの例として使用され、そのような方法から得られる製造物の例を記載するためのものであり、本発明を実施し得る当業者によって論理的に使用され得る代わりの方法、およびそのような方法から得られる製造物を排除するためのものではないことに留意しなければならない。すぐ下記の議論は、本発明のＣＣＬＣを製造するための方法の流れ図である図２を参照して行われる。
【００２４】
〔ＣＣＬＣの調製〕
（溶液）
【表１】
2004520828.tif 000003
【００２５】
【表２】
2004520828.tif 000004
【００２６】
【表３】
2004520828.tif 000005
【００２７】
【表４】
2004520828.tif 000006
【００２８】
（１．タンパク質含有増殖培地の除去）
上記ＣＬＣは、調整された培地を除くためにタンパク質非含有ＤＭＥＭ＋２（溶液Ｂ）で洗浄、撹拌され、一定期間（例えば、約３０分間）インキュベーションされる。その後、ＣＬＣと接触しているＤＭＥＭ＋２は新しいＤＭＥＭ＋２によって置換され、撹拌される。この手順が、好ましくは少なくとも約２回以上繰り返される。その後、ＣＬＣは、凍結保存に先立って一次パッケージに入れることができるまで、好ましくは８時間までの期間、ＤＭＥＭ＋２においてインキュベーションされる。
【００２９】
（２．一次パーケージング）
洗浄されたＣＬＣはインキュベーションから取り出され、医療規格の非接着性ポリエチレン網または医療規格のガーゼの層の間の液体透過性トレーに入れられる。ＣＬＣは、その支持体に入れられたまま、極低温に適合し得るパッケージの中に入れられる。この場合、パッケージには流体の導入用および除去用の手段が取り付けられている。ＣＬＣを支持体内に含有している、この第１の極低温適合性のパッケージは、熱などの手段によってシールされる。
【００３０】
（３．凍結保護液とのＣＬＣの平衡化）
２つの溶液が、ＤＭＥＭ、葉酸、Ｌ−グルタミン、重炭酸ナトリウム、ＮａＯＨおよびＨＥＰＥＳを含む低重炭酸塩ＤＭＥＭ（ＬＢ−ＤＭＥＭ）において調製される。第１の溶液（溶液Ｃ）は、コンドロイチン硫酸を約２．５％の基礎濃度（好適な範囲は約２％〜３％である）で含む一次凍結保護液である。第２の凍結保護液（溶液Ｄ）は、一次溶液とジメチルスルホキシドとの約４：１の混合物を含む。これらの溶液は、調製時に生成する溶解熱の分散を助けるために、室温よりも低い温度で好ましくは調製され、その後、貯蔵される。調製されると、これらの凍結保護液は、好ましくは室温で使用される。
【００３１】
最初の平衡化されたＣＬＣを形成するために、パッケージが振とう台などの手段によって撹拌されながら、一次凍結保護液が、流体導入用手段を介して、好ましくはポンプ手段によってパッケージに入れられる。ぜん動ポンプなどの非汚染性のポンプ手段はどれも使用することができる。一次凍結保護液の温度は、５℃〜２０℃の間で、好ましくは室温でパッケージ内に導入される。
【００３２】
その後、二次凍結保護液（溶液Ｄ）が、最後の平衡化されたＣＬＣを形成させるために、一次凍結保護液について使用された手段と類似する手段で、撹拌されながら、流体導入手段を介してパッケージに入れられる。この場合、ＣＬＣは、コンドロイチン硫酸の濃度が約２．５％であり、ジメチルスルホキシドの濃度が約１０％である。パッケージに入れられた二次凍結保護液は５℃〜２０℃の間であり、好ましくは室温である。
【００３３】
残留する空気および過剰な凍結保護液が、ポンプ手段によって、好ましくはぜん動ポンプによってパッケージから引き抜かれる。その後、すべての流体導入用手段が閉じられ、またはそうでなければ、例えば、熱シールによってシールされ、除かれる。
【００３４】
（４．凍結平衡化されたＣＬＣ（ＣｅＣＬＣ：cryo-equilibrated CLC）の凍結および貯蔵）
ＣｅＣＬＣを含有するパッケージは、例えば、熱的手段または超音波的手段によってシールされ、極低温に適合し得る上包の中に入れられ、二重にパッケージされたＣＬＣにされる。これは、その後、熱伝導性のキャニスター（例えば、金属製キャニスター、好ましくはアルミニウム製キャニスター）に入れられる。その後、二重にパッケージされたＣＬＣの温度が、好ましくは、温度低下プログラムに従って液体窒素の気相を使用して下げられる。温度低下プログラムは、マイクロプロセッサーにより制御される凍結チャンバーによって実施することができる。温度プローブが、凍結チャンバーの温度をモニターするために用いられ、別のプローブにより、ＣＬＣの表面がモニターされる。実際には、ＣＬＣ自体の温度とは対照的に、液体窒素の気相を伴うＣＬＣの周りの空間における温度をモニターすることが好ましい。従って、凍結プログラムにおいて示される温度は、本明細書中では、別途述べられない限り、凍結チャンバー内の温度である。
【００３５】
好ましい温度低下プログラムは、温度を周囲の温度から約４℃に低下させるステップと、温度を約４℃から約−２０℃に約１℃／分の割合で低下させ、温度を約−２０℃で約１５分間保持するステップと、温度を約−２０℃から約−２５℃に約０．５℃／分の割合で低下させ、温度を約−２５℃で約１５分間保持するステップと、温度を約−２５℃から約−７０℃に約１℃／分の割合で低下させるステップと、温度を約−７０℃から約−９０℃に約５℃／分の割合で低下させるステップとを含む。この時点で、凍結チャンバーの温度は、ＣＬＣ表面が約−８５℃〜−９０℃の間になるまで−９０℃で保つことが好ましい。その後、ＣＣＬＣは、約−１５０℃よりも低い温度で、好ましくは約−１７０℃〜−１９０℃で液体窒素の気相中に貯蔵される。
【００３６】
（５．ＣＣＬＣの解凍および洗浄）
図３には、本発明のＣＣＬＣを解凍および洗浄するための方法の流れ図が示される。この方法は２つのステップを含む。その第１のステップは、凍結されたＣＣＬＣを、室温で放置することによって約−１００℃にまで加温することである。第２のステップは、凍結されたＣＣＬＣを、室温の生理的食塩水または水において加温することによって凍結状態よりも高い温度に解凍し、その後、ＣＣＬＣを、凍結保護剤を実質的に含まないように洗浄することを含む。
【００３７】
実際には、二重にパッケージされたＣＣＬＣが金属製キャニスター内の気相−液体窒素貯蔵から取り出され、周囲の温度付近で約４分間加温され、第１の高い温度に、通常的には約−１００℃にされる。二重にパッケージされたＣＣＬＣはさらに、周囲の温度付近の水または生理的食塩水において約５分間加温され、約４℃〜周囲の温度付近の範囲内にある第２の高い温度にされる。
【００３８】
ＣＣＬＣがその外側のパッケージから取り出され、無菌または清浄な場所に移される。その後、ＣＣＬＣは、その液体透過性支持体に入れられたまま一次パッケージから取り出され、ほぼ周囲の温度の規定食塩水に撹拌しながら約１０分間入れられ、それによりＣＣＬＣが洗浄され、凍結保護剤が実質的に除かれる。あるいは、洗浄ステップは、生理的食塩水の洗浄液を５分程度の撹拌の後に除き、洗浄液を新しい生理的食塩水で置き換え、撹拌を５分間またはそれ以下でもう一度繰り返すことによる２つ以上のステップで行うことができる。
【００３９】
〔インビトロ機能のアッセイ〕
下記のインビトロアッセイが、ＣＣＬＣに対する凍結保存、解凍および洗浄の各プロセスの直後の影響および長期の影響を評価するために使用される。アッセイには、凍結保護剤の残留量、細胞数、細胞生存率、代謝活性、組織学的検査およびサイトカイン発現が含まれる。ＣＣＬＣをアッセイするためのサンプルは、ＣＣＬＣデバイスから無作為に選択された、適切なサイズの直径を有する生検穿刺物を使用して採取される。
【００４０】
（細胞数および細胞生存性）
ＣＬＣまたはＣＣＬＣから採取された生検穿刺サンプルを酵素的に消化し、繊維芽細胞および角化細胞をコラーゲンマトリックスから遊離させる。その後、細胞生存率および細胞数が、生細胞を死細胞から区別するためにトリパンブルー色素排除を使用して血球計によって測定される。
【００４１】
（代謝活性）
代謝活性は、成長可能な細胞の全体的な生理学的状態の尺度である。ＣＬＣまたはＣＣＬＣから採取された生検穿刺サンプルをアラマーブルー色素とともにインキュベーションする。このアッセイでは、ミトコンドリアの活性が、細胞ミトコンドリア内に拡散し、酸化還元反応を受けて、蛍光分光光度計によって読み取られる蛍光性生成物をもたらす細胞非傷害性のアラマーブルー色素を使用して測定される。
【００４２】
（組織学）
組織学により、ＣＬＣおよびＣＣＬＣの両方の構造および形態の以下の視覚評価が得られる。１．コラーゲン基質のマトリックスの内部および表面における繊維芽細胞および角化細胞の存在および分布。２．マトリックス自体の形態、例えば、細胞に対して非多孔性である半透過性コラーゲン層の表面における角化細胞の接着および分布、ならびに、コラーゲンスポンジ層の表面および内部における繊維芽細胞の接着および分布に対する、凍結保存または解凍の影響など。３．ＣＣＬＣ支持体の構造的一体性および形態。
【００４３】
（サイトカイン）
サイトカインの発現は、創傷治癒および組織再生を刺激するＣＣＬＣの潜在的能力の尺度である。サイトカイン発現データは、凍結保存前、ならびに、解凍、洗浄、およびＣＤＭＧＭ−ｈＧにおける約４８時間のインキュベーションの後におけるＣＬＣの使用済み培養培地を分析することによって得られる。使用済み培地は、適切な利用可能なＥＬＩＳＡキットを使用して様々なサイトカインについてアッセイされる。
【００４４】
表１では、本発明の目的および特許請求の範囲を裏づける、細胞数、細胞生存性および代謝活性について得られた値に関して、ＣＣＬＣおよび凍結保存前のＣＬＣのインビトロ機能が比較される。
【００４５】
表２では、凍結保存前のＣＬＣおよびＣＣＬＣによる様々なサイトカインの発現が約４８時間のインキュベーション後のそれらのインキュベーション培地において比較される。
【００４６】
【表５】
2004520828.tif 000007
【００４７】
【表６】
2004520828.tif 000008
【００４８】
（組織学的研究）
図４ａおよび図４ｂは、本発明において使用されたＣＬＣ１０の凍結保存前の組織学的断面図の概略図、およびＣＬＣ１０から得られた凍結保存後のＣＣＬＣ１００の組織学的断面図の概略図である。これらの２つの図は、本発明による凍結保存の前後における関連領域を示している。図４ａのＣＬＣは、図の上から下に、正常なヒト角化細胞１２を半透過性コラーゲン層１４の表面に有する、細胞に対して非多孔性である半透過性コラーゲン層１４と、空間２０がスポンジ層の空隙空間であり、その一部が正常なヒト繊維芽細胞１８を空間２０内に含有するコラーゲンスポンジ層１６とを有する。境界線２２はコラーゲンスポンジ層１６のコラーゲン構造部であるが、より薄い境界線２４はコラーゲン構造部のより厚い領域を取り囲んでいる。
【００４９】
凍結保存後のＣＣＬＣ１００（図４ｂ）は、図４ａに示されるのと同じ層配列および細胞配列を上から下に有している。
【００５０】
すべての場合において、ＣＬＣおよびＣＣＬＣの様々な構成成分間の比較（すなわち、凍結保存の前後における比較）により、コラーゲンスポンジ層１６および半透過性コラーゲン層１４の形態、角化細胞１２、コラーゲンスポンジ１６のマトリックスの内部における繊維芽細胞１８の存在および分布、細胞に対して非多孔性である半透過性コラーゲン層１４の表面における角化細胞１２の接着および分布、ならびに、ＣＣＬＣ１００およびＣＬＣ１０の境界（２２および２４）の構造的一体性においてほとんど差がないことが示される。
【実施例】
【００５１】
下記の実施例により、本発明の具体的な実施形態が例示される。
【００５２】
〔実施例１〕
下記の手順が、無菌下、別途記されない限り、周囲の温度のもとで行われた。
【００５３】
約６ｃｍ×６ｃｍ×２〜３ｍｍの大きさのＣＬＣを、以下のことを除いて、Eisenbergの米国特許第6,039,760号および同第5,282,859号および米国再発行特許第35,399号に記載されるように製造した。（１ｇ／Ｌの代わりに）約４ｇ／Ｌのグルコースを含有する高グルコース培養培地が、上記特許に記載される１４日間の代わりに所望する場合には１１日〜１３日までの期間にわたって２〜３日毎に使用済み培地を新しい培地と交換する培養計画に従って使用された。培養の最後の３日間（成熟化期間）のとき、市販の利用可能なＥＬＩＳＡアッセイを使用して様々なサイトカインの発現について試験するために、使用済み培地サンプルが集められ、小分けにして凍結され、保持された。培養の最後の３日間の１日において、ＣＬＣをタンパク質非含有血清非含有培地で洗浄し、１つを除くすべてを以下の凍結保存ステップに供した。１個の除かれたユニットは、細胞数および細胞生存性、代謝活性、ならびに組織学的試験のために試験され、以下で調製されたＣＣＬＣに対する同じパラメーターと比較された。
【００５４】
洗浄されたＣＬＣはそれぞれ、ＣＬＣの６×６ｃｍの表面が凍結保護液によるその後の処理のために利用できるような方法で、非接着性の医療規格ガーゼの２枚の向き合うシートの間の液体透過性トレーに入れられた。その後、トレーは、ルアーロックコネクターを有する極低温用のバッグに入れられ、その中で熱シールされた。その後、極低温用バッグを、ルアーロックコネクターを介してぜん動ポンプに接続し、ポンプを作動させて、空気をバッグから除いた。その後、２．５％のコンドロイチン硫酸を含有する室温以下の７５ｃｃ量の一次凍結保護液（溶液Ｃ）を、バッグが連続的に撹拌されるように、ポンプを使用して導入した。撹拌下で凍結保護液Ｃと室温で９分間〜１１分間平衡化させた後、２０％のＤＭＳＯおよび２．５％のコンドロイチン硫酸を含有する室温以下の二次凍結保護液（溶液Ｄ）の７５ｃｃを、一定の撹拌を行いながら、ポンプを使用して導入した。合計で１２分〜１３分の後、ポンプを逆転させ、最初に余分な空気を除き、次いで１００ｃｃの溶液を除いた。その後、溶液導入口を熱シールして、余分なチューブを切り取った。その後、それぞれのシールされたパッケージを別の極低温用の上包パッケージの中に入れ、上包パッケージを真空熱シールした。その後、二重にパッケージされたユニットをアルミニウム製キャニスターに入れて、マイクロプロセッサーで制御された速度の凍結チャンバーの中に入れた。ユニットは、液体窒素の気相を使用して、マイクロプロセッサーにより制御された計画に従って凍結され、その後、使用されるまで、−１５０℃よりも低い温度で液体窒素の気相中に貯蔵される。温度低下プログラムは、チャンバー温度を周囲の温度から約４℃に低下させるステップと、チャンバー温度を約４℃から約−２０℃に約１℃／分の割合で低下させ、チャンバー温度を約−２０℃で約１５分間保持するステップと、チャンバー温度を約−２０℃から約−２５℃に約０．５℃／分の割合で低下させ、チャンバー温度を約−２５℃で約１５分間保持するステップと、チャンバー温度を約−２５℃から約−７０℃に約１℃／分の割合で低下させるステップと、チャンバー温度を約−７０℃から約−９０℃に約５℃／分の割合で低下させるステップと、ＣＬＣの表面が−８５℃〜−９０℃に達するまでＣＬＣを凍結チャンバー内に保持するステップと、ＣＣＬＣを約−１５０℃よりも低い温度で貯蔵するステップとを含んでいた。
【００５５】
上記の調製された凍結保存（ＣＣＬＣ）ユニットは、以下の手順を凍結保存ユニットに行った後、患者への移植または他の研究のいずれにも好適である。最初に、ＣＣＬＣは室温で約４分間加温される。この加温時間が終了したとき、上包に入れられているパッケージされたＣＣＬＣは、第２段階における解凍のために、約４分間〜７分間、定期的に手で撹拌しながら、４リットルの室温の無菌水（または無菌の生理的食塩水）浴に入れられる。上包を切り開き、内部のパッケージを取り出して切り開き、ＣＣＬＣを含有するトレーを取り出す。トレー内のＣＣＬＣは、凍結保護液を除くために、３リットルの無菌の生理的食塩水に入れて約１０分間撹拌することによって洗浄されるか、あるいは５分間撹拌し、その後、生理的食塩水を除き、別の３リットルの生理的食塩水と置き換えて、もう一度５分間撹拌することによって洗浄される。その時間が終了したとき、ＣＣＬＣはトレーから取り出され、患者に適用することができ、またはインビトロ研究のために使用することができる。
【００５６】
インビトロ研究の場合、ＣＣＬＣを高グルコース培養培地に戻し、インキュベーションし、市販の利用可能なＥＬＩＳＡキットを使用してサイトカイン発現についてアッセイすることができる。ＣＣＬＣはまた、凍結保存ステップにおいて行われたように、すなわち、細胞数、生存性、代謝活性および組織学について試験されたように、試験のために直ちに使用することができ、凍結保存前の材料と比較するための試験のために直ちに使用することができる。
【００５７】
〔実施例２〕
（ＳＣＩＤマウスへの移植）
インビボ移植研究が、実施例１のＣＣＬＣが移植された重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスにおける全厚皮膚創傷の治癒特性を比較するために行われた。これは、実施例１において参照されたEisenbergの米国特許に従って調製され、凍結保存および／または凍結が行われることなく使用された新鮮なＣＬＣと比較された。本研究は、約２４時間ずれて開始された、それぞれが１２匹の動物からなる２回の試験として行われた。全層創傷（１．７ｃｍの直径）を、同じサイズおよび形状のＣＬＣ移植片またはＣＣＬＣ移植片を創傷部に適用する直前に、外科用はさみを使用してそれぞれのマウスの背に作った。それぞれの試験において６匹のマウスは新しいＣＬＣ移植片を受け、６匹のマウスはＣＣＬＣ移植片を受けた。４つの群のそれぞれに由来するＣＬＣおよびＣＣＬＣのサンプルを、細胞収率、細胞生存性、および創傷治癒に関連するいくつかのサイトカインおよび増殖因子を分泌する能力についてインビトロでアッセイした。移植片を施した後、創傷部を、１層のポリエチレンネットで、次に２層のパラフィンガーゼで覆い、包帯で各マウスの胴体の周りを３回覆って、移植片を固定した。
【００５８】
マウスは、毎日、観察され、体重が測定された。移植した８日後および１４日後に、包帯を除き、創傷部を肉眼検査し、写真撮影した。創傷の収縮度を８日目および１４日目に計算した。１４日目にマウスを屠殺し、創傷部を組織学的な調製および評価のために切り出した。すべての生検サンプルを固定液に入れ、８ｕｍの切片を作製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、および／またはトリクロムおよび／もしくはオルセインおよびメチレンブルーで染色した。上皮化の程度、真皮および表皮の平均厚さ、ならびに真皮の細胞性を計算した。他の組織学的特徴がコメントとして記された。
【００５９】
この研究期間中、著しい有害作用は認められなかった。１４日までに、移植片のほとんどが、治癒プロセス、ＣＬＣおよびＣＣＬＳのコラーゲンマトリックスの再吸収のために見えなくなっていた。新しいＣＬＣ移植片およびＣＣＬＣ移植片は、肉眼観察による創傷外見および収縮に関して類似する結果をもたらした。顕微鏡観察したとき、新しいＣＬＣ移植片またはＣＣＬＣ移植片で処置された創傷の治癒性において、著しい差は認められなかった。１４日までに、新ＣＬＣ群およびＣＣＬＣ群において、それぞれ、創傷の８／１２および７／１２が完全な上皮化を受けていた。上皮化における差は、新しいＣＬＣ移植片とＣＣＬＣ移植片との間で認められなかった。本研究の結果から、本発明のＣＣＬＣ移植片と新しいＣＬＣとは、ＳＣＩＤマウスでの全層創傷治癒モデルにおいて比較したとき、実質的な差はなく、創傷の治癒パラメーターに対する類似した作用を有すると結論された。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】本発明において使用されるＣＬＣを製造するための流れ図である。
【図２】本発明のＣＣＬＣを製造するための流れ図である。
【図３】本発明の解凍および洗浄されたＣＣＬＣを製造するための流れ図である。
【図４】本発明において使用される新しく製造されたＣＬＣの組織学的断面（４ａ）および本発明のＣＣＬＣの組織学的断面（４ｂ）を示す。これらはそれぞれが、本発明において使用された凍結保存直前のＣＬＣの正常なヒト角化細胞層（４ａ）を、凍結保存後の本発明のＣＣＬＣの角化細胞（４ｂ）と一緒に、本発明において使用された凍結保存直前のＣＬＣの正常なヒト繊維芽細胞層（４ａ）を、凍結保存後の本発明のＣＣＬＣの繊維芽細胞層（４ｂ）と一緒に示している。
【図１】
2004520828.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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2004520828.tif 000014
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2004520828.tif 000041
2004520828.tif 000042
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520828.tif 000043
2004520828.tif 000044
【国際調査報告】
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