(57)【要約】本発明は、発育速度、テロメア長および寿命に関与する細胞生理学的レベルでの機能を有するｃｌｋ−２遺伝子に関し、該ｃｌｋ−２突然変異は野生型と比較してより長い寿命、細胞代謝の変化およびテロメア長の変化を引き起こす。本発明は、図３３に記載されるヌクレオチド配列を持つｃｅｘ−７遺伝子から成り、図３４に記載されるアミノ酸配列を持つＣＥＸ−７タンパク質をコードするｃｌｋ−２共発現遺伝子を提供し、該遺伝子はｃｌｋ−２オペロンに位置し、ｃｅｘ−７遺伝子は同一オペロンに存在するｃｌｋ−２遺伝子と転写的に共発現される。本発明はまた、図３６に記載されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、発育速度および寿命に関与する細胞生理学的レベルでの機能を持つｃｏｑ−４遺伝子に関し、該ｃｏｑ−４の突然変異型は野生型と比較して細胞代謝および生理的な変化を生じる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
発育速度、テロメア長および寿命に関与する細胞生理学的レベルでの機能を有する、配列番号１に記載のヌクレオチド配列により特定されるｃｌｋ−２遺伝子であって、該ｃｌｋ−２の突然変異体は、野生型に比べて寿命の延長、細胞代謝および／またはテロメア長の変化をもたらし、ｃｌｋ−２の過剰発現はテロメアの短縮をもたらすことを特徴とする、上記遺伝子。
【請求項２】
発育速度、テロメア長および寿命に関与する細胞生理学的レベルで機能する、配列番号１、４、５、６、７、１５、１６、２０、２１、２２、２３もしくは２４に記載のヌクレオチド配列により特定されるか、または配列番号２、３、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１もしくは３２に記載のタンパク質配列をコードするものであるｃｌｋ−２遺伝子の使用であって、該ｃｌｋ−２の突然変異体は、野生型に比べて寿命の延長、細胞代謝および／またはテロメア長の変化をもたらし、ｃｌｋ−２の過剰発現はテロメアの短縮をもたらすことを特徴とする、上記遺伝子の使用。
【請求項３】
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＣＬＫ−２タンパク質をコードする、請求項１記載のｃｌｋ−２遺伝子。
【請求項４】
発育速度、テロメア長および寿命に関与する細胞生理学的レベルでの機能を改変する、配列番号３２に示す配列を有するタンパク質をコードするｃｌｋ−２遺伝子の使用であって、該ｃｌｋ−２の突然変異体は、野生型に比べて寿命の延長、細胞代謝および／またはテロメア長の変化をもたらし、ｃｌｋ−２の過剰発現はテロメアの短縮をもたらすことを特徴とする、上記遺伝子の使用。
【請求項５】
請求項１記載の遺伝子によりコードされる、発育速度、テロメア長および寿命に関与する細胞生理学的レベルでの機能を有するＣＬＫ−２タンパク質。
【請求項６】
発育速度、テロメア長および寿命に関与する細胞生理学的レベルでの機能を改変する、請求項２に記載の遺伝子によりコードされるＣＬＫ−２タンパク質の使用であって、ｃｌｋ−２の過剰発現はテロメアの短縮をもたらすことを特徴とする、上記タンパク質の使用。
【請求項７】
配列番号３１に示すアミノ酸配列を有する突然変異型ＣＬＫ−２タンパク質。
【請求項８】
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＣＬＫ−２タンパク質。
【請求項９】
発育速度、テロメア長および寿命に関与する細胞生理学的レベルでの機能を改変する、配列番号２、３、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、１９、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１もしくは３２に記載のアミノ酸配列を有するＣＬＫ−２タンパク質。
【請求項１０】
配列番号１に記載のヌクレオチド配列を有するｃｌｋ−２遺伝子。
【請求項１１】
請求項２に記載のｃｌｋ−２遺伝子の相同体であるマウスｃｌｋ−２遺伝子の遺伝子ノックアウトを含むマウス。
【請求項１２】
テロメアの機能を変化させること、および／またはテロメア長を調節することを含む多細胞生物の寿命を長期化させる方法。
【請求項１３】
多細胞生物が後生生物である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
サブテロメアのサイレンシングの機構を改変することおよび／またはテロメア長を調節することを含む、多細胞生物の寿命を長期化させる方法。
【請求項１５】
多細胞生物が後生生物である、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
生理学的速度および／またはテロメア生物学を操作して生物の寿命を改変するための、請求項１、３または１０に記載のｃｌｋ−２遺伝子およびその相同体の使用。
【請求項１７】
多細胞生物の寿命を短期化または長期化する薬剤をスクリーニングするための、請求項１、３もしくは１０に記載のｃｌｋ−２遺伝子または請求項５、７もしくは８に記載のＣＬＫ−２タンパク質あるいはその相同体の使用。
【請求項１８】
薬剤がｃｌｋ−２遺伝子発現またはＣＬＫ−２タンパク質もしくはその相同体の活性を増大または抑制するものである、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
請求項５、７または８のＣＬＫ−２タンパク質もしくはその相同体の活性を干渉する化合物の、宿主の組織、器官および／または生物全体の生理学的速度を増加または減少するための薬剤を製造するための使用。
【請求項２０】
ｃｌｋ−２活性の組織および／または器官特異的な減少または増加を誘導する化合物の、個体における組織および／または器官の生理学的速度の増加をもたらす生理的状態を治療するための薬剤を製造するための使用。
【請求項２１】
ｃｌｋ−２活性の組織および／または器官特異的な減少または増加を誘導する化合物の、個体における組織および／または器官の生理学的速度の減少をもたらす生理的状態を治療するための薬剤を製造するための使用。
【請求項２２】
ｃｌｋ−２オペロン内に存在し、該オペロン内に存在するｃｌｋ−２遺伝子と共に翻訳において共発現される、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を有するＣＥＸ−７タンパク質をコードする配列番号３３に記載のヌクレオチド配列を有するｃｅｘ−７遺伝子を含む、ｃｌｋ−２と共発現された遺伝子。
【請求項２３】
配列番号３５に記載の配列を有するタンパク質をコードする、請求項２２記載のｃｅｘ−７遺伝子のヒト相同体。
【請求項２４】
配列番号３５に記載の配列を有するタンパク質をコードする請求項２２記載のｃｅｘ−７遺伝子のヒト相同体およびその相同体の、発育速度、テロメア長および寿命に関与する細胞生理学的レベルでの機能を改変するための使用。
【請求項２５】
配列番号３５に記載のヒト遺伝子のｃｅｘ−７遺伝子マウス相同体の遺伝子ノックアウトを含むマウス。
【請求項２６】
請求項２２もしくは２３記載のＣＥＸ−７またはその相同体の活性を干渉する化合物の、個体の組織および／または器官の生理学的速度を増加および／または減少させるための薬剤を製造するための使用。
【請求項２７】
ｃｅｘ−７活性の組織および／もしくは器官特異的な減少または増加を誘導し、請求項２２もしくは２３記載のＣＥＸ−７またはその相同体の活性を干渉する化合物の、個体の組織および／または器官の生理学的速度を増加させる生理的状態を治療するための薬剤を製造するための使用。
【請求項２８】
ｃｅｘ−７活性の組織および／もしくは器官特異的な減少または増加を誘導し、請求項２２もしくは２３記載のＣＥＸ−７またはその相同体の活性を干渉する化合物の、個体の組織および／または器官の生理学的速度を減少させる生理的状態を治療するための薬剤を製造するための使用。
【請求項２９】
配列番号３６に記載のヌクレオチド配列により特定される、発育の速度および寿命に関与する細胞生理学的レベルでの機能を有するｃｏｑ−４遺伝子であって、該ｃｏｑ−４の突然変異体は、野生型に比べて細胞代謝の変化および生理的変化をもたらすことを特徴とする、上記遺伝子。
【請求項３０】
配列番号３６に記載のヌクレオチド配列により特定され、かつ配列番号３７に記載の配列を有するタンパク質をコードする、発育の速度および寿命に関与する細胞生理学的レベルでの機能を有するｃｏｑ−４遺伝子であって、該ｃｏｑ−４の突然変異体は、野生型に比べて細胞代謝の変化および生理的変化をもたらすことを特徴とする、上記遺伝子。
【請求項３１】
配列番号４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１または５２に記載の配列を有するタンパク質をコードする、発育速度の制御に関与する細胞生理学的レベルでの機能を改変するｃｏｑ−４遺伝子であって、該ｃｏｑ−４の突然変異は、野生型に比べて細胞代謝の変化および生理的変化をもたらすことを特徴とする上記遺伝子の使用。
【請求項３２】
請求項２９に記載の遺伝子によりコードされる、発育速度および寿命の調節に関与する細胞生理学的レベルでの機能を有するＣＯＱ−４タンパク質。
【請求項３３】
配列番号４５に記載のマウスｃｏｑ−４遺伝子の遺伝子ノックアウトを含むマウス。
【請求項３４】
請求項３２に記載のＣＯＱ−４タンパク質またはその相同体の活性を干渉する化合物の、宿主の組織、器官および／または生物全体の生理学的速度を増加および／または減少させるための薬剤を製造するための使用。
【請求項３５】
ｃｏｑ−４活性の組織および／または器官特異的な減少または増加を誘導する、請求項３２に記載のＣＯＱ−４タンパク質またはその相同体の活性を干渉する化合物の、個体の組織および／または器官の生理学的速度の増大をもたらす生理的状態を治療するための薬剤薬剤を製造するための使用。
【請求項３６】
ｃｏｑ−４活性の組織および／または器官特異的な減少または増加を誘導する、請求項３２に記載のＣＯＱ−４タンパク質またはその相同体の活性を干渉する化合物の、個体の組織および／または器官の生理学的速度の減少をもたらす生理的状態を治療するための薬剤薬剤を製造するための使用。
【請求項３７】
ｃｌｋ−２活性の組織および／または器官特異的な減少または増加を誘導する、請求項５、７または８記載のＣＬＫ−２タンパク質またはその相同体の活性を干渉する化合物の、個体の組織および／または器官におけるテロメア長の変化に起因する生理的状態を治療するための薬剤を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
（ａ）発明の分野
本発明は３つの遺伝子、すなわち、ｃｌｋ−２遺伝子、ｃｌｋ−２と同一オペロンに位置するｃｅｘ−７遺伝子、およびｃｏｑ−４遺伝子の同定に関する。本発明は、これらの遺伝子が発育および行動の時期を制御し、寿命を決定すること、あるいは、ｃｌｋ−２がテロメア長を制御することを示す。
【０００２】
（ｂ）先行技術の説明
その活性は線虫がどれくらいの早さで生命を終えるかを制御する、ｃｌｋ（’ｃｌｏｃｋ’「時計」）遺伝子という遺伝子のクラスが、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）で同定された。これらの遺伝子における突然変異は、動物の寿命の増長だけでなく、動物の胚発生および胚生期後の発育の変更、ならびに周期的な行動の平均的な速度低下を含む、発育および行動の時期の変更を生じる。更に、これらの遺伝子における突然変異は母性効果を示す、すなわち、ヘテロ接合の母親（ｃｌｋ／＋）に由来するホモ接合突然変異体（ｃｌｋ／ｃｌｋ）は表現型としては野生型のように見える。
【０００３】
本発明者らは、線虫での生存能力のある母性効果突然変異のためのスクリーニングにおいて、遺伝子ｃｌｋ−１、ｃｌｋ−２、ｃｌｋ−３の所定の突然変異を単離した（Ｈｅｋｉｍｉ， Ｓ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４１， １３５１（１９９５））。ｇｒｏ−１は、本来、野生型単離株から最近確立された系統から単離された、自然発生的突然変異により同定された（Ｈｏｄｇｋｉｎ， Ｊ．およびＤｏｎｉａｃｈ， Ｔ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４６， １４９（１９９７））。この突然変異についての本発明者らが後に再評価したところ、それがｃｌｋ遺伝子の特徴を共有することを示した（ｗｏｎｇ， Ａ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １３９， １２４７（１９９５））。
【０００４】
本発明らはこれらの遺伝子のうちの２つ、ｃｌｋ−１およびｇｒｏ−１を分子同定した。ｃｌｋ−１は、プロテオバクテリアからヒトまで高度に保存されている、構造的に酵母の代謝調節因子Ｃａｔ５ｐ／Ｃｏｑ７ｑに類似したタンパク質をコードする（Ｅｗｂａｎｋ， Ｊ． Ｊ． ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５， ９８０（１９９７）； ＷＯ９８／１７８２３）。ｇｒｏ−１は、高度に保存された細胞内の酵素、ジメチルアリルトランスフェラーゼ：ｔＲＮＡジメチルアリルトランスフェラーゼ（ＷＯ９９／１０４８２）をコードする。
【０００５】
現在までのところ、ｃｌｋ−１は最も詳細に特性解析された遺伝子である。表現型および分子の特性に加えて、ｃｌｋ−１は線虫の体に普遍的に発現することが見いだされ、それはミトコンドリア、細胞のエネルギー生成細胞小器官に局在する（Ｆｅｌｋａｉ， Ｓ．ら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １８， １７８３（１９９９））。従って、ｃｌｋ−１は生理的速度を調節することによって時期を制御する（Ｂｒａｎｉｃｋｙ Ｒ， Ｃ． Ｂｅｎａｒｄ， Ｓ． Ｈｅｋｉｍｉ， Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２２， ４８（２０００））。
【０００６】
遺伝子ｃｌｋ−２は、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）での生存能力のある母性効果突然変異のためのスクリーニングにおいて単離された１つの対立遺伝子によって規定される（Ｈｅｋｉｍｉ， Ｓ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４１， １３５１（１９９５））。遺伝子ｃｌｋ−２における突然変異は、発育および行動のいくつかの事象の時期の改変を生じ（Ｈｅｋｉｍｉ， Ｓ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４１， １３５１（１９９５））、ｃｌｋ−２遺伝子の活性は線虫がどれくらいの速度で生きてどれくらいすぐに死ぬかを制御することが示された（Ｌａｋｏｗｓｋｉ， Ｂ．およびＨｅｋｉｍｉ， Ｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２， １０１０（１９９６））。本発明者らはまた、ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）対立遺伝子の温度感受性等のｃｌｋ−２突然変異体の他の表現型にも注目した。概して、これらの表現型は、３つのｃｌｋ遺伝子における突然変異のそれらと類似している（Ｈｅｋｉｍｉ， Ｓ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４１， １３５１（１９９５））。
【０００７】
現在までの結果は、老化の速度に対するｃｌｋ遺伝子の影響は、生存の速度に対する影響に起因することを示唆する。第一に、ｃｌｋ−１活性の減少を引き起こすｃｌｋ−１突然変異は、発育および行動の速度低下、ならびに寿命の増加を生じる。これに対して、トランスジェニック動物でのｃｌｋ−１の過剰発現は、加齢に伴う特徴的な行動の速度低下の欠如によって示されるように、生存の速度を加速する。第二に、異なるｃｌｋ遺伝子の効果は相加的である。本発明者らは、ｃｌｋの二重突然変異体が単一のｃｌｋ突然変異体より遅く発育し、より長く生きることを示した。第三に、ｃｌｋ遺伝子は、ストレス抵抗性に関与し、また寿命をも延長するｄａｕｅｒ形成遺伝子（ｄａｆ遺伝子）とは異なる。ｄａｆ遺伝子は、ｃｌｋのそれとは別の機構を経て寿命に影響を及ぼす。実際、ｃｌｋ突然変異体はｄａｕｅｒ構成的でもｄａｕｅｒ欠損でもなく、ｄａｆ−１６突然変異はｃｌｋ−１、−２、−３突然変異体の長い寿命を抑制することができない。
【０００８】
両遺伝子はともに酵母における正常なユビキノン生合成のために必要であり、両遺伝子はともにＥ． ｃｏｌｉでの相同体を持たないという点で、ｃｏｑ−４遺伝子は遺伝子ｃｌｋ−１と類似している。後述されるｃｅｘ−７遺伝子は、ヒトにおいてＸＥ７と名付けられた偽常染色体の遺伝子であることが発見された。
【０００９】
動物においてｃｏｑ−４遺伝子の特徴だけでなく、ｃｌｋ−２遺伝子の詳細な表現型および分子的特徴も共に提供されることは非常に望ましいであろう。
【００１０】
発明の概要
本発明の目的の１つは、ｃｌｋ−２遺伝子が図１に記載のヌクレオチド配列を有することを特徴とする、ｃｌｋ−２突然変異が野生型と比較してより長い寿命、細胞代謝の変化およびテロメア長の変化を引き起こす、発育速度、テロメア長および寿命に関与する細胞生理学的レベルでの機能を有するｃｌｋ−２遺伝子を提供することである。
【００１１】
本発明により、ｃｌｋ−２遺伝子が図１、４〜７、１５、１６および２０〜２４に記載のヌクレオチド配列を有することを特徴とするか、または遺伝子が図１、４〜７、１５、１６、２０〜２４から推定されるような図２、３、８〜１４、１７〜１９および２５〜３２に記載されるタンパク質配列をコードするｃｌｋ−２突然変異が、野生型と比較して、寿命の増長、細胞代謝および生理的な速度の変化ならびにテロメア長の変化を引き起こす、発育速度、テロメア長および寿命の調節に関与する細胞生理学的レベルでの機能を変化させるためのｃｌｋ−２遺伝子の使用が提供される。
【００１２】
また、本発明によって、遺伝子が図３２に記載の配列を有するタンパク質をコードする、ｃｌｋ−２突然変異が野生型と比較して、寿命の増長、細胞代謝および生理的な速度の変化ならびにテロメア長の変化を引き起こす、発育速度、テロメア長および寿命の調節に関与する細胞生理学的レベルでの機能を変化させるためのｃｌｋ−２遺伝子の使用も提供される。
【００１３】
本発明に従って、発育速度、テロメア長および寿命の調節に関与する細胞生理学的レベルでの機能を有するＣＬＫ−２タンパク質が提供される。
【００１４】
本発明はまた、図３１に記載されるアミノ酸配列を有する突然変異ＣＬＫ−２タンパク質、ならびに、ＣＬＫ−２タンパク質が図２、３、８〜１４、１７〜１９および２５〜３２に記載されるアミノ酸配列を有する、発育速度、テロメア長および寿命の調節に関与する細胞生理学的レベルでの機能を変化させるためのＣＬＫ−２タンパク質の使用も提供する。
【００１５】
本発明に従って、図１に記載されるヌクレオチド配列を有するｃｌｋ−２遺伝子、ならびに、それによって生物の寿命が改変される、生理的速度および／またはテロメア生物学を操作するためのｃｌｋ−２遺伝子およびその相同体の使用が提供される。
【００１６】
ｃｌｋ−２遺伝子に対するマウスｃｌｋ−２遺伝子相同体の遺伝子ノックアウトを包含するマウスもまた提供される。
【００１７】
本発明によって、多細胞生物および後生生物の寿命を増加させるための、テロメアの機能およびサブテロメアサイレンシングの機構の改変を含む方法が提供される。
【００１８】
本発明はまた、ｃｌｋ−２遺伝子の発現またはＣＬＫ−２タンパク質およびその相同体の活性を促進もしくは抑制する、多細胞生物の寿命を減少または増加させる薬剤のスクリーニングのための、ｃｌｋ−２遺伝子、ＣＬＫ−２タンパク質およびその相同体の使用をも提供する。
【００１９】
本発明によって、宿主の組織、器官および／または生物全体の生理的速度を増加および／または減少させるための薬剤を製造するための、ＣＬＫ−２タンパク質およびその相同体の活性を阻害する化合物の使用が提供される。
【００２０】
また、組織および／または器官特異的なｃｌｋ−２活性の減少もしくは増加を促進する、ＣＬＫ−２タンパク質およびその相同体の活性を阻害する化合物の、個体の組織および／または器官の生理的速度の増加もしくは減少を起こす病的な状態の治療のための薬剤を製造するための使用も提供される。
【００２１】
本発明によって、図３３に記載されるヌクレオチド配列を有するｃｅｘ−７遺伝子から成り、図３４に記載されるアミノ酸配列を有するＣＥＸ−７タンパク質をコードするｃｌｋ−２共発現遺伝子が提供され、遺伝子はｃｌｋ−２オペロンに位置し、ｃｅｘ−７遺伝子は同一オペロンに存在するｃｌｋ−２遺伝子と転写的に共発現される。
【００２２】
本発明によって、遺伝子が図３５に記載されるような配列を有するタンパク質をコードするｃｅｘ−７遺伝子のヒト相同体もまた提供される。
【００２３】
本発明によって、遺伝子が図３５に記載されるような配列を有するタンパク質をコードする、発育速度および寿命の調節に関与する、細胞レベルの生理学のレベルでの機能を変化させるためのｃｅｘ−７遺伝子のヒト相同体およびその相同体の使用が提供される。
【００２４】
本発明は、図３５に記載されるヒト遺伝子のマウスｃｅｘ−７遺伝子相同体の遺伝子ノックアウトを含むマウスを提供する。
【００２５】
また、本発明によって、ＣＥＸ−７およびその相同体の活性を阻害する化合物の、宿主の組織、器官および／または生物全体の生理的速度を増加および／または減少させるための薬剤を製造するための使用も提供される。
【００２６】
本発明のもう１つの目的は、個体の組織および／または器官の生理的速度の増加もしくは減少を起こす病的な状態の治療のための薬剤を製造するために、組織および／または器官特異的なｃｅｘ−７活性の減少もしくは増加を促進する、ＣＥＸ−７およびその相同体の活性を阻害する化合物の使用を提供することである。
【００２７】
本発明によって、ｃｏｑ−４遺伝子が図３６に記載されるヌクレオチド配列を有することを特徴とする、発育速度および寿命に関与する細胞生理学的レベルでの機能を有するｃｏｑ−４遺伝子が提供され、ここでｃｏｑ−４の突然変異型は野生型と比較して細胞代謝および生理的な変化を生じる。
【００２８】
本発明によって提供されるｃｏｑ−４遺伝子は、図３６に記載されるヌクレオチド配列を有することを特徴とし、図３７に記載される配列を有するタンパク質をコードし、発育速度および寿命に関与する細胞生理学的レベルでの機能を有するが、ｃｏｑ−４の突然変異型は野生型と比較して細胞代謝および生理的な変化をもたらす。
【００２９】
本発明により、遺伝子が図４３〜５４に記載される配列を有するタンパク質およびその相同体をコードするｃｏｑ−４遺伝子の、発育速度の調節に関与する細胞生理学的レベルでの機能を変化させるための使用が提供される。該ｃｏｑ−４の突然変異型は野生型と比較して異なる細胞代謝および生理的速度を生じる。
【００３０】
本発明によって、図４７に記載されるマウスｃｏｑ−４遺伝子の遺伝子ノックアウトを含むマウスもまた提供される。
【００３１】
また、本発明によって、宿主の組織、器官および／または生物全体の生理的速度を増加および／または減少させるための薬剤を製造するために、ＣＯＱ−４およびその相同体の活性を干渉する化合物の使用も提供される。
【００３２】
本発明によって、個体の組織および／または器官の生理的速度の増加もしくは減少を起こす病的な状態の治療のための薬剤を製造するために、組織および／または器官特異的なｃｏｑ−４活性の減少もしくは増加を誘導する、ＣＯＱ−４およびその相同体の活性を干渉する化合物が提供される。
【００３３】
ｃｌｋ遺伝子を有することは、発育速度、細胞周期、行動速度および老化速度の操作に利用できる。別の見方をすれば、医療および工業目的において生理的速度の制御に役立てられるということである。退化速度を低下させるために個体の器官または組織の老化速度を低下させることは１つの医療上の例であり、家畜または作物の成長の促進は工業利用の例である。
【００３４】
本明細書において、本発明者らは、ｃｌｋ−２およびｃｅｘ−７の分子特性解析、ならびにヒトを含むいくつかの種における相同体の同定を含む、本発明者らのｃｌｋ−２およびｃｅｘ−７の解析、ならびにこの解析から導かれる本発明を記載する。本発明者らはまた、新規ｃｌｋ遺伝子、ｃｏｑ−４の同定をも記載する。本発明者らは、線虫のｃｏｑ−４遺伝子座における突然変異体を得て、その突然変異型動物がｃｌｋ突然変異の最も重要な特徴のいくつかを示すことを明らかにした。
【００３５】
本発明によって初めて、テロメアの生物学の調節によって寿命を増加させる新しい方法が提供される。
【００３６】
ｃｌｋ−２ 突然変異体のｃｌｋ表現型
本発明者らは以前に、ｃｌｋ−２突然変異体が、母性救出（ｍａｔｅｒｎａｌｙ ｒｅｓｃｕｅ）効果、それらの遅い発育および行動、ならびにそれらの寿命の増長を含む、ｃｌｋ−１突然変異体のそれと類似した表現型を有することを示した（Ｈｅｋｉｍｉ，ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４１， １３５１ （１９９５）； Ｌａｋｏｗｓｋｉ， ＢおよびＨｅｋｉｍｉ， Ｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２， １０１０ （１９９６））。本発明者らは更に詳細にｃｌｋ−２突然変異体の欠陥を特性解析し、以下にその結果を示した。１５〜２０℃においては、ｃｌｋ−２突然変異体の表現型はｃｌｋ−１ 突然変異体のそれと同様である。表１に要約されたように、野生型の表現型よりも、発育、繁殖および行動の平均速度は劇的に遅く、平均および最長寿命はより長くなる。詳細には、ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）突然変異体の胚発生は２０℃で１７．０±１．５時間持続する（ｎ＝９７）一方、野生型では１３．２±０．７時間続く（ｎ＝８０）。ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）突然変異体の胚生期後の発育もまたより遅く、２０℃で９５．７±１．３時間持続する（ｎ＝７３）一方、野生型の線虫では５３．６±８．７時間しか掛からない（ｎ＝１８４）。
【００３７】
同様に排泄周期も遅くなり、ｃｌｋ−２突然変異体では２０℃で１０５．７±１５．２秒毎に（ｎ＝１０）、野生型では５４．９±０．６秒毎に（ｎ＝７０）起こる。拍動速度は遅くなり、ｃｌｋ−２突然変異体では２０℃で１分間あたり１８０．９±２４．８回の拍動（ｎ＝２５）、野生型では１分間あたり２６５．３±６４．４回の拍動（ｎ＝２５）が起こる。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
更に、本発明者らはまた２０℃での自家産卵数も調べ、野生型では３０２．４±３０．５（ｎ＝２０）であるのに対して、ｃｌｋ−２突然変異体では８３．４（ｎ＝１０）と減少することを見いだした。最高産卵速度は、ｃｌｋ−２突然変異体では２０℃で１．３（ｎ＝１０）、野生型では５．３（ｎ＝１０）である。本発明者らはまた、寿命も調べた。ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）突然変異体は野生型より長く生存し、野生型Ｎ２の線虫の平均寿命１９．３±５．３日（ｎ＝１００）および最長寿命３２日より長く、２０℃において平均２２．４±７．４日（ｎ＝１００）生存し、４０日の最長寿命を有する。
【００４０】
発育および行動の表現型は完全に母性救出される、すなわちｃｌｋ−２（ｑｍ３７）／＋ヘテロ接合の母親に由来するホモ接合ｃｌｋ−２／ｃｌｋ−２突然変異体は野生型の表現型を示す。実際、２０℃ではヘテロ接合体の母親に由来するホモ接合突然変異体の胚発育は１３．３±１．６時間（ｎ＝４０）しか掛からず、それらの胚生期後の発育は５３．９±１２．４時間（ｎ＝９８）しか続かなかった。また、２０℃において６０．３±９．１秒毎に起こる排泄（ｎ＝８）および２０℃で１分間あたり２４５．２±２４．６の拍動速度で起こる拍動の両方とも母性救出される。しかし、繁殖に関する表現型は、母親の遺伝子ｃｌｋ−２の野生型コピーによって、部分的にしか救出されない。自家産卵数は２０℃で１１３．９±３０．３（ｎ＝２４）であり、最高産卵速度は３．６±０．９（ｎ＝２４）である。このことは、母親の野生型ｃｌｋ−２遺伝子が１世代の間だけ続くエピジェネティックな状態を誘導することを示す。生殖細胞系列でのエピジェネティックな状態の消失は、動物が野生型の繁殖速度を有することを妨げる。更に、母性救出されたホモ接合突然変異体の寿命は、突然変異体および野生型の寿命の両方に対して劇的に短くなる。実際、ヘテロ接合の母親に由来するホモ接合突然変異体は、２０℃で平均１４．９±４．１日（ｎ＝１０６）しか生きず、最長寿命２７日である。興味深いことに、母性救出されたｃｌｋ−２野生型の兄弟は野生型Ｎ２の線虫よりわずかに短く、１７．３±４．１日（ｎ＝２０６）生きる。この観察は、母親のエピジェネティックな背景によってもたらされる野生型の生理的速度は、環境条件に応じてその生理的速度を調節することが部分的にできない動物にとって有害であることを示す。
【００４１】
【表２】
2004500878.tif 000003
【００４２】
本発明者らは、表２に要約されたように、ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）によって生じる寿命の増長を他の加齢遺伝子によって生じるそれと比較することにより解析した。線虫において寿命に影響を及ぼす他の遺伝子のうち、最もよく理解されているものはｄａｆ遺伝子である。ｅａｔ遺伝子における突然変異は、脊椎動物においても寿命を延長する過程である、動物の摂食量の減少によるカロリー制限を介して寿命を延長する。ｄａｆ遺伝子における突然変異は、ｄａｕｅｒ形成経路の部分的な活性化によって寿命を延長する。ｄａｕｅｒ期は、有害な環境条件によって誘導される、休眠状態の、長く生きられる、代替的な発育段階である。調べられたすべてのｄａｕｅｒ形成突然変異体の寿命の増加は、ｄａｆ−１６における機能突然変異を失うことによって抑制される。
【００４３】
実際、本発明者らは、ｄａｆ−１６（ｍ２６）が平均１８．１±２．６日、２５日の最長寿命で生きる一方、二重突然変異体ｄａｆ−１６（ｍ２６）ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）は平均２１．７±５．８日、４１日の最長寿命で生きることを発見した。更に、２つの長く生きられるｄａｕｅｒ形成突然変異による二重突然変異体は構成要素の突然変異を１つだけしか持たない突然変異体より長く生きないが、ｄａｆ−２（ｅ１３７０）ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）二重突然変異体は大幅にｄａｆ−２より長く生き、野生型よりほぼ３倍長く生きる。本発明者らは、ｄａｆ−２（ｅ１３７０）が平均２９．３±１０．３日、５１日の最長寿命で生きる一方、二重突然変異体ｄａｆ−２（ｅ１３７０）ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）は５４．５±２１．４日の平均寿命、１０１日の最長寿命で生きることを示した。これらの観察とは対照的に、ｃｌｋ−２およびｅａｔ−２の効果は相加的でない。実際、二重突然変異体はｅａｔ−２突然変異体より若干短く生存する。本発明者らは、ｅａｔ−２（ａｄ４６５）が平均３０．０±７．０日、４２日の最長寿命で生き、二重突然変異体ｄａｆ−２（ｅ１３７０）ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）は平均２６．６±６．３日、４５日の最長寿命で生きることを示した。これらの観察はまた、ｄａｆ−２ ｅａｔ−２二重突然変異体が、ｄａｆ−２またはｅａｔ−２突然変異体単独でよりも長く生きるという発見とも一致している（Ｌａｋｏｗｓｋｉ， Ｂ．およびＨｅｋｉｍｉ， Ｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２， １０１０（１９９６））。同時にこれらの結果は、ｄａｆ−２およびｃｌｋ−２が異なる機構によって寿命を延長するが、ｃｌｋ−２はカロリー制限と類似した方法で働くことを示す。
【００４４】
ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）突然変異の厳密な母性効果
ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）突然変異体によって示されるＣｌｋ表現型に加えて、それらは２５℃で温度感受性の胚性致死および不妊の表現型を示す。本発明者らはｑｍ３７が温度感受性突然変異であり、それらが２５℃に移された場合、その突然変異体は死胚を産むことを知った（Ｈｅｋｉｍｉ， Ｓ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４１， １３５１ （１９９５））。これらの発見はさらに進展し、異なる発育段階において許容温度から制限温度へ、あるいはその逆での多数の温度シフト実験後の、２５℃でのｃｌｋ−２突然変異体の表現型が検討されている。
【００４５】
許容温度（１５から２０℃）では、ｃｌｋ−２胚はすべて正常に発生し、成長して長く生きられる成体となる。しかし、許容温度で発生した両性個体が産卵を開始する前に２５℃に移された場合、それらは発生の様々な段階で胚発生の間に死ぬ子孫しか産出しない。２５℃で死んだ胚を産出していたこれらの両性個体が１８℃に戻された場合、それらは最初は死んだ卵しか産まないが、１８℃で５〜６時間後には成体へと発生する生きた卵を産み始める。１８℃に保持され生きた卵のみを産む両性個体が２５℃に移された場合もまた、それらが死んだ卵のみを産む前に５〜６時間掛かる。動物の完全な胚性期後の発育が単一の（許容もしくは非許容）温度で行われた場合でも、（生きた、または死んだ子孫を産む）両者の状態は温度シフトによって完全に可逆的である。更に、許容温度で発生した幼虫が２５℃に移された場合、いくらかは発育が止まるが、他は不妊および不健全な成虫期に達する。これらの表現型は同様に完全に可逆的である。最終的に、２５℃でのｃｌｋ−２（ｑｍ３７）突然変異体によって示されるこれらの致死性および不妊表現型はすべて、完全に母性救出されることができる、すなわち、ヘテロ接合の動物は任意の温度で生存する子孫しか生じない。
【００４６】
本発明者らはまた、２５℃での胚性致死が厳密な母性表現型であることも発見した。すなわち、ｑｍ３７は劣性突然変異として振る舞うにも関わらず、もし母親がｃｌｋ−２／ ｃｌｋ−２ホモ接合突然変異体であったならば、胚のゲノムにおける野生型対立遺伝子は生存にとって十分ではない。ｃｌｋ−２両性個体が２５℃において野生型のオスと交配された場合、それにも関わらず、それらは死んだ胚しか産まない。交配後の様々な時点で１８℃に移した場合、それらは生きているオスを生じ、交配が成功したことを示す。ｃｌｋ−２の厳密な母性致死作用は接合体ゲノムの活性化の前の非常に早期の作用を示す。
【００４７】
線虫の発育の間どれくらい早期にｃｌｋ−２が作用するかを確認するために、本発明者らは、許容（２０℃）もしくは非許容（２５℃）温度のいずれかに保った、あるいは他の温度に移した（または対照として移さない）野生型Ｎ２およびｃｌｋ−２突然変異の両性個体からの２−４細胞期の胚を解剖した。表３に要約されたように、本発明者らは、２−４細胞期までの発生が許容温度で進行した場合、２０℃において｛分析されたＮ２卵の１００％（ｎ＝３５）が孵化し、分析されたｃｌｋ−２卵の８７％が孵化した（ｎ＝９１）｝または２５℃において｛分析されたＮ２卵の９７％（ｎ＝３６）が孵化し、分析されたｃｌｋ−２卵の９１％が孵化した（ｎ＝９３）｝、ほとんどすべての卵が孵化し、更なる胚発生および胚性期後の発育を行うことを発見した。対照的に、卵が２５℃で２−４細胞期まで発生し、その後２０℃に移された場合、非常にわずかなｃｌｋ−２卵しか孵化および２０℃での完全な発生が成功しなかった｛分析されたｃｌｋ−２卵の１２％が孵化した（ｎ＝１３６）｝。対照として、Ｎ２卵が２５℃で２−４細胞期まで発生し、その後２０℃に移された場合、２０℃｛９８％、ｎ＝４５｝または２５℃｛９６％、ｎ＝４５｝において、ほとんどすべてが孵化し、発生を完了することに成功した。これらの結果は、生存能力のためにｃｌｋ−２が２−４細胞期の前に必要とされることを示す。ｃｌｋ−２はまさに卵形成の終末と胚発生の開始との間の狭い時間帯において必要とされる。
【００４８】
【表３】
2004500878.tif 000004
【００４９】
実際、成体期の２６時間を２５℃で過ごしたｃｌｋ−２両性個体は、許容温度へ移された場合、子宮の中に平均９．９（ｎ＝１２５）の発生する卵を持つが、平均１０．７の死んだ卵（ｎ＝１３３）を産出する。この観察は、致死温度からの移動によって、既に卵殻を形成したものに加えて平均１つの卵母細胞または胚だけが死ぬことを示す。これは受精、卵母細胞の減数分裂、前核形成および卵殻形成が起こる時間に対応する。本発明者らは、ＤＩＣ顕微鏡を用いて初期の胚発生を観察したが、受精に続く事象において明らかな異常は何も検出されなかった。初期胚は、正常な大きさと形の核および細胞を持ち、常に正常あるいは健全に見える。本発明者らはまた、卵母細胞および初期胚でＤａｐｉを用いてＤＮＡを視覚化し、染色体分離の異常なパターンまたは他の何らかの欠陥も検出しなかった。最後に、ｃｌｋ−２ホモ接合のオスは、野生型の両性個体と交配した場合、２５℃において多数の交雑子孫を生じさせることができるので、減数分裂それ自体は影響を受けていない。
【００５０】
ｃｌｋ−２のポジショナルクローニング、遺伝子構造およびオペロン
本発明者らは、ポジショナルクローニングによって遺伝子ｃｌｋ−２を分子的に同定した。その遺伝子は、遺伝子地図上でＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｃａｎｓの連鎖群ＩＩＩの左のクラスター上の、遺伝マーカーｓｍａ−４およびｍａｂ−５間の０．８４ｃＭの間隔内に限定された（Ｈｅｋｉｍｉ， Ｓ．ら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４１、１３５１（１９９５））。本発明者らは、遺伝マーカーｓｍａ−３、ｕｎｃ−３６、ｌｉｎ−１３およびｌｉｎ−３９を用いた多点および二点交叉による更なる一連のマッピング実験によって、この遺伝子の位置を正確にした。以下の多点結果が得られた（子孫が得られた遺伝子型は括弧内に与えられる）。すなわち、ｄｐｙ−１７ １４ ｃｌｋ−２ １８ ｕｎｃ−３２ （ｃｌｋ−２／ｄｐｙ−１７ ｕｎｃ−３２）； ｌｏｎ−１ ４７ ｃｌｋ−２ ２３ ｕｎｃ−３６ （ｃｌｋ−２／ｌｏｎ−１ ｕｎｃ−３６）； ｓｍａ−４ ３５ ｃｌｋ−２ ３ ｍａｂ−５ １４ ｕｎｃ−３６ （ｃｌｋ−２／ ｓｍａ−４ ｍａｂ−５ ｕｎｃ−３６）； ｓｍａ−３ １８ ｃｌｋ−２ ０ ｌｉｎ−１３ １０ ｕｎｃ−３６ （ｓｍａ−３ ｃｌｋ−２ ｕｎｃ−３６／ｌｉｎ−１３）； ｃｌｋ−２ ３ ｌｉｎ−１３ ４９ ｕｎｃ−３２ （ｌｉｎ−１３／ ｃｌｋ−２ ｕｎｃ−３２）； ｓｍａ−３ ４０ ｌｉｎ−３９ ０ ｃｌｋ−２ ３３ ｕｎｃ−３６ （ｓｍａ−３ ｃｌｋ−２ ｕｎｃ−３６／ｌｉｎ−３９）。更に、二点交叉（ｃｌｋ−２ ｕｎｃ−３６／＋ ＋）を行い、５／６３０Ｕｎｃｓが迅速に発育することを発見した（ｐ＝０．４ｃＭ）。本発明者らはまた、ｎＤｆ２０欠失がｃｌｋ−２の欠失を引き起こさず、重複ｑＤｐ３がｃｌｋ−２を含むことを発見した。従って本発明者らは、遺伝子ｃｌｋ−２をｓｍａ−３（ＬＧＩＩＩ上の−０．９ｃＭ）およびｌｉｎ−１３（ＬＧＩＩＩ上の−０．６ｃＭ）の間、ｌｉｎ−３９遺伝子（−０．６５ｃＭ）の非常に近くに位置している、０．３ｃＭの間隔内に位置付けた。
【００５１】
遺伝子地図および物理的地図をアライメントさせることによって、本発明者らはおそらくｃｌｋ−２遺伝子を含むであろう物理的な領域を予測した。この領域からのコスミドのグループは、ＤＮＡマイクロインジェクションによってｃｌｋ−２突然変異体を救出するそれらの能力を検査した。ｃｌｋ−２は、４つのコスミドプール（Ｈ１４Ａ１２、Ｋ０７Ｄ８、Ｃ３４Ａ５、Ｃ０７Ｈ６）によって救出された。コスミドＣ０７Ｈ６およびＣ３４Ａ５の個別注入もまたｃｌｋ−２表現型を救出し、ｃｌｋ−２の物理的位置は約１５ｋｂ内に狭められた。その後、コスミドＣ０７Ｈ６の断片（コスミドＣ０７Ｈ６［Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＣ００６６０５］の３１，５２８塩基対から３６，５４５塩基対の制限消化によって得られる）が救出について調べられ、約５ｋｂの短い領域が表現型を完全に救出することが示され、この５ｋｂの断片がｃｌｋ−２遺伝子を含むことを示した。
【００５２】
遺伝子の同定は、完全にこの遺伝子の機能を廃するために対象の遺伝子のコードｍＲＮＡ配列に対応する二本鎖ＲＮＡの注入するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）実験を用いて、ｃｌｋ−２表現型を表現型模写することによって、更に確認された。二本鎖ＲＮＡは、この領域に位置するｃＤＮＡ（ＥＳＴ ４４７ｂ４、Ｙ． Ｋｏｈａｒａより贈与された）からｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写によって産生され、ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）線虫と同様に野生型に注入された。ｃｌｋ−２ ｄｓＲＮＡを注入されたすべての野生型およびｃｌｋ−２動物は、まず発育の遅れ、遅い排泄および不妊を示す、ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）に表現型が類似している線虫へと孵化し発生する胚を生じた。２４時間後、注入された動物は死んだ卵のみを産出し始めた。これらの結果はｃｌｋ−２の同定を確実にした。ＲＮＡｉ処理された母親が死んだ卵、すなわち通常ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）株で現れる弱い胚性致死より厳しい表現型を生じるという観察は、ｑｍ３７が２５℃だけで全欠失表現型を示す部分的な機能喪失突然変異であることを示した。本発明者らは更に、ｃｌｋ−２突然変異の根底にある分子の損傷の特徴を記述することによって遺伝子の同定を確認した。ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）株からのゲノムＤＮＡが分離され、ｃｌｋ−２領域のヌクレオチド配列が決定された。ｑｍ３７突然変異は、ｃＤＮＡの２３２１塩基でのＧ→Ａ転位である。
【００５３】
遺伝子の構造は、ＥＳＴ ｙｋ４４７ｂ４ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を決定することによって実験的に確認され、このようにして、ｉｎ ｖｉｖｏにおける実際のイントロン／エキソン境界を定義し、コードされたタンパク質の予測を可能にした。遺伝子ｃｌｋ−２は、トランススプライスされるＳＬ２である。本発明者らは更に、ＲＴ−ＰＣＲ実験によって遺伝子構造を確認し、そしてそれはｃｌｋ−２がトランススプライスされるＳＬ２であることを示すだけでなく、ｃｌｋ−２のすぐ上流にある本発明者らがｃｅｘ−７と呼ぶ遺伝子が発現され、トランススプライスされるＳＬ１あることを示した。上流に位置する遺伝子のＳＬ１による、および下流の遺伝子のＳＬ２によるトランススプライシングは、１つのオペロン内にあり転写的に共発現する遺伝子の特質を構成する。その結果、ｃｌｋ−２およびｃｅｘ−７は転写的に共発現し、従って、機能的に関連した役割を果たす。ｃｅｘ−７に対応するｃＤＮＡ（ｙｋ２１５ｆ６）もまた、配列決定された。遺伝子ｃｅｘ−７は、５５０アミノ酸のヒトポリペプチド（図３５）に類似する、長さ４８１アミノ酸残基の予測タンパク質（図３４）をコードする。
【００５４】
ｃｌｋ−２は８７７アミノ酸の予測タンパク質をコードし、ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）突然変異は予測タンパク質の７７２残基にシステインからチロシンへの置換がある。本発明者らは、異なる温度において突然変異体および野生型の線虫から抽出されたタンパク質のウェスタンブロット解析によって、発現されたタンパク質を検出することができた。ＣＬＫ−２は、ヒト（図３）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（図１３）、コメ（図１９）、ダイズ（図２６〜３０）および酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｅｌ２Ｐ（図３２）あるいは他の種（図７〜１２、１４、１７〜１９）において固有の予測タンパク質に類似している。これらのタンパク質間の構造の保存性は、図３８、３９、４０および４１において提示されたアライメントに図解される。複数の配列をアライメントすることが相同性を示すために必要であるため、Ｔｅｌ２ｐの相同体は以前は認識されていなかった。Ｔｅｌ２ｐは、配列特異的な方式で酵母テロメアＤＮＡに結合すること（Ｋｏｔａ， Ｒ．Ｓ． Ｒｕｎｇｅ， Ｋ．Ｗ． Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ １０８， ２７８ （１９９９）； Ｋｏｔａ， Ｒ．Ｓ．， Ｒｕｎｇｅ， Ｋ．Ｗ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２６， １５２８ （１９９８））、およびテロメア長に影響を及ぼすことが示されてきた。
【００５５】
ｃｌｋ−２の発現パターン
本発明者らは、転写およびタンパク質レベル（図５５）の分析によって、ならびにリポーター融合を有するトランスジェニック線虫の調査によって、遺伝子ｃｌｋ−２の空間的および時間的発現パターンを決定した。図５５のパネルＡは、すべての発生段階におけるｃｌｋ−２のノーザンおよびウェスタン（３７）解析を示す。ｃｌｋ−２ ｍＲＮＡのレベルは、前成虫発生を通して一様に見られる（Ｅ、胚； Ｌ１−Ｌ４、幼虫期； Ａ、成虫； ｇｌｐ−４、２５℃での成虫ｇｌｐ−４（ｂｎ２ｔｓ）突然変異体）。Ｌ４幼虫および２５℃で生殖細胞系列を欠くｇｌｐ−４突然変異体での低いレベルのｃｌｋ−２発現は、成虫でのほとんどのｃｌｋ−２ ＲＮＡが配偶子に局在することを示唆する。ｍＲＮＡでの発見に対比して、ＣＬＫ−２タンパク質のレベルは、成虫を含むすべての段階で類似している（Ａの下段パネル）。図５５のパネルＢ、突然変異体（２５℃において精子のみを産生するｇｌｐ−４ （ｂｎ２ｔ２）、ｆｅｍ−３ （ｑ２０ｔｓ）、および、２５℃において卵母細胞のみを産生するｆｅｍ−２（ｂ２４５ｔｓ））におけるｃｌｋ−２ ｍＲＮＡおよびタンパク質レベル（下段パネル）。ｃｌｋ−２発現のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルは、ｆｅｍ−３では野生型に類似し、ｆｅｍ−２突然変異体では増加する。ｇｌｐ−４突然変異体は、野生型のタンパク質レベルを有するが、ｍＲＮＡレベルを減少させた。ｃｌｋ−２ ｍＲＮＡは、ｃｌｋ−２突然変異体で強く増加したように見られる。図５５のパネルＣ、３つの温度での野生型およびｃｌｋ−２突然変異体におけるＣＬＫ−２タンパク質レベル。ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）は、ミスセンス（Ｃ７７２Ｙ）および温度感受性突然変異である。ＣＬＫ−２のレベルは、突然変異体において大きく減少するが、野生型または突然変異体での温度の作用としては変わらない。線虫は別に指定された場合を除き２０℃で育った。
【００５６】
本発明者らは、異なる発生段階で同調させた線虫の個体群を飼育し、それらから全ＲＮＡまたはｐｏｌｙＡ＋選別ＲＮＡを抽出した。最も高いレベルのｃｌｋ−２ ｍＲＮＡは、若い成虫において検出される。本発明者らは、若い成虫における転写レベルの起源を決定するためにいくつかの突然変異体を用いた。非許容温度で生殖細胞系列を生じないｇｌｐ−４（ｂｎ２ｔｓ）突然変異体でのｃｌｋ−２ ｍＲＮＡレベルは大きく減少するので、野生型の若い成虫に存在するほとんどのＲＮＡは生殖細胞系列にある。既に多量の生殖細胞系列を持っているがわずかな雄性配偶子しか持たないＬ４幼虫においてＲＮＡの低量を生じるので、野生型成虫におけるほとんどのｃｌｋ−２ ｍＲＮＡは、減数分裂した配偶子、特に卵母細胞に限定される。
【００５７】
本発明者らは、異なる遺伝的背景および異なる温度で成長した線虫においてＣＬＫ−２タンパク質レベルを分析した。本発明者らは、２つの異なるポリクローナル抗体、ＭＧ１９およびＭＧ２０を用いることによって、ウェスタンブロットでＣＬＫ−２タンパク質を免疫検出した。本発明者らは、細菌で発現させたＨｉｓ１０−ＣＬＫ−２タンパク質をウサギを注射することによってこれらの抗体を得た。本発明者らは、ＣＬＫ−２タンパク質の含有量が野生型およびｃｌｋ−２動物での発生段階全体にわたって一様であることを見いだした。更に、生殖細胞系列を持たないｇｌｐ−４突然変異体においても、また、それぞれ精子および卵母細胞のみを有するｆｅｍ−３およびｆｅｍ−２突然変異体においても、ＣＬＫ−２の濃度は野生型と異ならない。これらの結果を併せて考えると、おそらく胚によって使われるための貯蔵として、配偶子が特に高レベルのｃｌｋ−２ ｍＲＮＡを蓄積することを示す。最後に、本発明者らは、ｑｍ３７突然変異体においてｃｌｋ−２ ｍＲＮＡのレベルがわずかに増加する一方、ＣＬＫ−２タンパク質のレベルは大いに減少することを観察した。
【００５８】
本発明者らは、異なる上流のプロモーター領域、および／または、緑色蛍光タンパク質に融合されたｃｌｋ−２遺伝子のコード領域を包含した、ｃｌｋ−２遺伝子の３つのリポーター構築物を作成した。構築物のうち２つは転写融合であり、１つは、コスミドＣ０７Ｈ６［ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＣ００６６０５ ］の塩基３６９３２から３７３１９を含み、他方は塩基３６９３２から４００１０までを含む。３番目のリポーター構築物（ｐＭＱ２５１）は、遺伝子ｃｅｘ−７の部分である塩基３５０７８から３６５４５を除く、塩基３０５０１から３７３１９までを含む翻訳融合である。本発明者らは、野生型およびｃｌｋ−２（ｑｍ３７）突然変異体の線虫にこれらのリポーター遺伝子をマイクロインジェクションし、これらのリポーターを有するいくつかのトランスジェニック系統から多数の線虫を分析した。本発明者らは、ｃｌｋ−２のプロモーター領域が、下皮、筋肉、ニューロン、排泄器官、腸、咽頭、身体の生殖腺、外陰およびおそらくすべての細胞を含むすべての身体組織において発現を誘導することを観察した。標準および複合配列混合物の両方の使用にも関わらず、発現は生殖細胞系列では見られなかった。これは、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓでのトランスジーンにとっては一般的な事例であり、生殖細胞系列組織における発現の欠如を示さない。２５℃における発生、行動および生存能力について突然変異体表現型を補完するＣＬＫ−２およびＧＦＰ間の全長融合タンパク質（構築物ｐＭＱ２５１によってコードされる）は、専ら細胞質のみに局在し、それは予測タンパク質における明白な核局在化シグナルの欠如と一致している。非常に少ないトランスジーン濃度が複合配列に使用されたので、観察されたパターンは過剰発現の結果ではない（Ｋｅｌｌｙら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４６：２２７−２３８、１９９７）。核は蛍光画像では暗く見えるが、しかし、それでもなお非常に少量の融合タンパク質を含むかもしれない。この発現解析は、抗ＣＬＫ−２抗体を用いた全Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ抽出物のウェスタン解析によって示されたように、ＣＬＫ−２タンパク質が実際に線虫において産生されることを示す。
【００５９】
酵母Ｔｅ１２ｐは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでテロメア反復に結合することが発見され、従って、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて核に存在することが予想される。しかし、ＣＬＫ−２：：ＧＦＰは核から排除されることが発見された。サブテロメアのサイレンシングおよびテロメア長の調節はまた、細胞質ゾルにおける事象によっても影響を受け得る。例えば、Ｈｓｔ２ｐ、すなわちＳｉｒ２ｐに相同な細胞質ゾルのＮＡＤ＋依存性脱アセチル化酵素は、酵母において核小体およびテロメアのサイレンシングを調節することができ（Ｐｅｒｒｏｄら、ＥＭＢＯ Ｊ．， ２０ （Ｎｏｓ １＆２）、１９７−２０９、２００１）、ナンセンス介在的ｍＲＮＡ分解経路はテロメアのサイレンシングおよびテロメア長調節の両方に影響を及ぼすと思われる（Ｌｅｗら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， １８（１０）：６１２１−６１３０， １９９８）。タンキラーゼ（Ｓｍｉｔｈ， Ｓ．およびＤｅ Ｌａｎｇｅ， Ｔｉｔｉａ， Ｊ． ｏｆ ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １１２：３６４９−３６５６、１９９９）のようにテロメア長に影響を及ぼす他のタンパク質は、大部分は核外にあり（Ｃｈｉ， Ｎ．−Ｗ．およびＬｏｄｉｓｈ， Ｈ．Ｆ．， Ｊ． ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ２７５（４９）：３８４３７−３８４４４， ２０００）、テロメアに局在化される非常に少量のタンパク質を伴う（Ｓｍｉｔｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１４８４−１４８７， １９９８）。
【００６０】
ｃｌｋ−２の役割
テロメア機能は、酵母および脊椎動物細胞における複製の寿命に影響を及ぼすことが発見されている。それはまた、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓでの生殖細胞系列の不死性にも影響を及ぼすことが示されている。しかし、多細胞生物の寿命の決定におけるテロメア機能の関与は、この研究以前には確立されていなかった。ここで本発明者らは、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓの母性効果ｃｌｋ−２遺伝子が、テロメア長を調節し、ｄａｕｅｒ形成の調節とは異なるがカロリー制限と類似した機構によって寿命を延長させ、酵母テロメア結合タンパク質Ｔｅｌ２ｐに類似しているタンパク質をコードすることを示した。
【００６１】
ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）の致死的作用の時期は、卵母細胞減数分裂、前核形成および細胞核融合を含む、受精に続いて直ちに起こる事象の間のｃｌｋ−２の機能を示し、これは減数分裂におけるテロメアの既知の重要性と一致するであろう。しかし、本発明者らの卵母細胞および初期胚における染色体の形態学の調査は、何の異常も示さなかった。同様に、線虫においても、テロメア機能は二本鎖破損修復および染色体安定性に関連すると思われるが、ｃｌｋ−２突然変異体は、適度に電離放射線感受性と思われるだけで、染色体不安定性の兆候を示さない。実際、本発明者らはガンマ放射線に対するｃｌｋ−２（ｑｍ３７）突然変異体の反応を調べ、照射を受けた動物の子孫のうちの死んだ卵および幼虫の割合は、照射を受けた野生型動物の子孫においてより約１０倍高いことをを発見した。酵母でも、電離放射線に対する反応におけるＴｅｌ２ｐの機能についての報告はない。
【００６２】
ｔｅｌ２の全欠失表現型は致死であるが、ｔｅｌ２の低形質突然変異は短いテロメアおよび遅い成長を引き起こす（Ｒｕｎｇｅ， Ｋ．Ｗ．およびＺａｋｉａｎ， Ｖ．Ａ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６， ３０９４（１９９６））。Ｔｅｌ２ｐはテロメア位置効果（ＴＰＥ）に関与することが示され、従って、サブテロメア領域のサイレンシングに寄与する（Ｒｕｎｇｅ， Ｋ．Ｗ．およびＺａｋｉａｎ， Ｖ．Ａ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １６， ３０９４ （１９９６））、エピジェネシスについて最も研究された例の１つである。同様にテロメアの短縮を引き起こすｔｅｌ１のような他の遺伝子は異常なＴＰＥを起こさず、ｔｅｌ２突然変異体におけるＴＰＥの欠陥は短いテロメアの単純な結果ではないことを示す。更に、Ｔｅｌ２ｐを完全に欠失している細胞の急速な死および異常な細胞形態は、Ｔｅｌ２ｐが、Ｒａｐ１ｐおよびＳｉｒタンパク質のように非テロメア部位でも機能することを示唆する（Ｚａｋｉａｎ， Ｖ．Ａ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． ３０， １４１（１９９６））。これを考慮すると、胚形成における母性ｃｌｋ−２の絶対的な必要性は、線虫の生活環の一部の間必要であるが初期発生の間に発現した場合有害であるサイレンシング遺伝子における、ＣＬＫ−２の機能を示唆する。線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）における生殖細胞系列の指定のために必要であり、母性効果の不妊表現型を与えることができるｍｅｓ遺伝子の研究は、サイレンシングの機構が線虫の正常な発生の一部であることを示している。実際に、いくつかのｍｅｓ遺伝子は、ポリコームグループタンパク質に類似したタンパク質をコードしていることが発見されており、一般的にクロマチン構造の調節に関与すると思われる。
【００６３】
許容温度におけるｃｌｋ−１およびｃｌｋ−２（ｑｍ３７）突然変異は、類似したＣＬＫ表現型、特に同等の寿命の増加を与え（Ｌａｋｏｗｓｋｉ， Ｂ．およびＨｅｋｉｍｉ， Ｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２， １０１０（１９９６））、他の加齢遺伝子との相互作用の類似したパターンを示す（Ｌａｋｏｗｓｋｉ， Ｂ． Ｈｅｋｉｍｉ， Ｓ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳ ９５， １３０９１（１９９８））。ＣＬＫ−１は未知の機能をもつミトコンドリアのタンパク質である（Ｆｅｌｋａｉ， Ｓ．ら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １８， １７８３（１９９９））。母性効果を含む、ｃｌｋ−１表現型の多くの不可解な特徴を説明するために、本発明者らは、ＣＬＫ−１の作用が間接的であるが明確に核の遺伝子発現を調節することであると示唆した（Ｂｒａｎｉｃｋｙ Ｒ， Ｃ． Ｂｅｎａｒｄ， Ｓ． Ｈｅｋｉｍｉ， Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２２：４８， ２０００）。１つの可能性は、ＣＬＫ−２がＣＬＫ−１活性の変化に応答した遺伝子発現の変更を行う分子の１つであるかもしれないことである。ｃｌｋ−１ ｃｌｋ−２二重突然変異体は、いずれか単独の突然変異体より深刻な表現型を有する（Ｌａｋｏｗｓｋｉ， Ｂ．およびＨｅｋｉｍｉ， Ｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２， １０１０（１９９６））。しかし、ｃｌｋ−１（ｑｍ３０）との二重突然変異体がｃｌｋ−１（ｅ２５１９）とのそれよりずっと深刻であるｃｌｋ−３の状況とは対照的に、全欠失対立遺伝子ｃｌｋ−１（ｑｍ３０）を含む二重突然変異体の表現型は、ずっと弱い対立遺伝子ｃｌｋ−１（ｅ２５１９）を含む二重突然変異体より深刻ではない（Ｌａｋｏｗｓｋｉ， Ｂ．およびＨｅｋｉｍｉ， Ｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２， １０１０（１９９６））。これらの観察は、ｃｌｋ−１の活性の少なくとも一部はｃｌｋ−２を必要とすることを示す。更に、ｃｌｋ−１ ｃｌｋ−２二重突然変異体の胚は、胚の細胞周期の中間期は減速するが有糸分裂は変化しないように見えるという点でｃｌｋ−１突然変異体と類似している。これは、ｃｌｋ−１と同様にｃｌｋ−２が細胞増殖速度の決定に関与し、従って、規制を解除された場合、癌を引き起こすことが知られている機構に影響を及ぼすことを示す。
【００６４】
テロメア機能はまた酵母の複製の寿命にも関与し、そこではＳｉｒタンパク質がテロメアおよびＨＭ遺伝子座でのサイレンシングを仲介する。突然変異またはテロメアＤＮＡの不足によってテロメアから移動させられた場合、Ｓｉｒ複合体の一部は核小体へ移動することができ、その作用が複製の寿命を延長すると思われる。これらおよび他の研究は、テロメアがサイレンシング因子のための予備の区画であり、ゲノムの他の部分でのサイレンシングの調節に関係することを示す。ヒト細胞培養におけるテロメラーゼ発現の細胞老化に対する効果は、染色体浸食の防止によるというよりむしろ、サイレンシングに対する効果によって仲介されるかもしれないということが示唆されてきた。従って、ｃｌｋ−２は脊椎動物を含む細胞老化の決定に関与し、このようにして、加齢、および癌などの細胞老化に関連した疾患に影響するに違いない。
【００６５】
前述のように、ＣＬＫ−２は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｔｅｌ２ｐだけでなく脊椎動物および植物での予測タンパク質に類似している。Ｔｅｌ２ｐは、配列特異的な方式で酵母テロメアＤＮＡに結合し、テロメア長に影響を及ぼすことが示されている。本発明者らは、ｃｌｋ−２もまた線虫においてテロメア長に影響を及ぼすことを発見した（図５６）。線虫では、ＨｉｎｆＩによる制限消化後のゲノムＤＮＡのテロメアプローブに対するハイブリダイゼーションは、分離したバンドとして現れる染色体内部テロメア反復領域を有する断片と同様に、スメアとして現れるテロメアを有する染色体の末端断片を示す。テロメアのスメアが最も大きい領域は点線で示される。各遺伝子型および各温度のために２本のレーンが示される。
【００６６】
野生型およびｃｌｋ−２突然変異体におけるテロメア長は、致死温度を含む３つの温度でサザンブロッティングによって調べられた。１８および２０℃については、線虫はＤＮＡ抽出の前に多数の世代の間、各温度で育てられた。ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）は２５℃で致死であるため、２０℃からの様々な段階の線虫が２５℃に移され３−４日間育てられた。ゲノムＤＮＡが調製され、ＨｉｎｆＩ消化され、０．６％アガロースゲルによって１．２Ｖｃｍ−１で分離された。サザンブロットは、γ３２Ｐ ｄＡＴＰ末端ラベルされたＴＴＡＧＧＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＧＧオリゴヌクレオチドでハイブリダイズされた。プライマーＴ７およびＳＨＰ１６１７（ＧＡＡＴＡＡＴＧＡＧＡＡＴＴＴＴＣＡＧＧＣ）によるプラスミドｃＴｅｌ５５Ｘからのテロメア反復のＰＣＲ増幅の間にα３２Ｐ ｄＡＴＰの直接の取り込みによって作られた、第二の種類のプローブの使用は同一の結果を与えた。ＭＱ６９１ ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）； ｑｍＥｘ１５９における染色体外配列（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｒｒａｙ）は、オペロンのプロモーターだけでなくｃｌｋ−２の完全なコード配列を有するが、ｃｕｘ−７を除外したクローン（塩基３６５４４から３５０７７を除いたコスミドＣ０７Ｈ６の塩基３７３１９から３１５２８）を含み、ｃｌｋ−２突然変異体の表現型を救出する。ｃｌｋ−２突然変異体では、テロメアは野生型より平均２から３倍長い（図５６）。しかし、ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）染色体で野生型ＣＬＫ−２を発現する染色体外配置を有するＭＱ６９１株では、染色体は野生型の長さであり（図５６）、ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）突然変異体のテロメア長の変化は、実際にこれらの突然変異体におけるｃｌｋ−２の異常な機能に起因することを示す。
【００６７】
ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）染色体の２５℃での発生および行動を救出する、機能的野生型ＣＬＫ−２を含む染色体外配列（ｑｍＥｘ１５９）を持った、ＭＱ６９１株の動物における末端テロメア断片長を、更に分析した。ｑｍ３７突然変異を含む同様のクローンは、Ｃｌｋ−２表現型を救出することができない。ＭＱ６９１動物では、末端テロメア断片長は野生型に非常に類似し、より短くさえ考えられ、ｑｍ３７突然変異体の延長されたテロメア表現型は、ｃｌｋ−２（＋）の発現によって救出されることを示す。染色体外配列を喪失し、それによって再びｃｌｋ−２（＋）を欠如した、ＭＱ６９１に由来するＭＱ９３１株の非トランスジェニック動物のテロメア長を、更に調べた。この株における末端テロメア反復は再び長くなる。従って、ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）の延長されたテロメア表現型は、ｃｌｋ−２（＋）によって救出されることができ、トランスジーンの喪失後、突然変異体の長さに逆戻りする。
【００６８】
線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）では、多数のＴＴＡＧＧＣテロメア反復の連続が６つの染色体末端に存在する（Ｗｉｃｋｙ Ｃ．，ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３：８９８３−８９８８， １９９６）。更に、多数の完全なおよび変性したテロメア反復の介在性領域が、染色体のより内部に位置する（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ ＩＩ． Ｒｉｄｄｅｌ Ｄら編集、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ出版、Ｎ．Ｙ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）、ｐｐ ５６−５９、第３章）。テロメア反復内で切断しない頻出する部位に対する制限酵素（ＨｉｎｆＩ）を用いた制限消化、電気泳動およびテロメアプローブとのハイブリダイゼーション後のゲノムＤＮＡの分析は、テロメアを有する染色体の末端断片を示す（Ｗｉｃｋｙ Ｃ．，ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３：８９８３−８９８８， １９９６）。テロメア、従ってそれらを含む制限断片は、不均一な大きさであり、スメアとして現れる。他方、内部テロメア反復領域を持っている制限断片は固定された大きさであり、０．５−３ｋｂ範囲の分離したバンドとして現れる（Ａｈｍｅｄ Ｓ， Ｈｏｄｇｋｉｎ Ｊ． Ｎａｔｕｒｅ， ４０３（６７６６）：１５９−６４， ２０００；およびＷｉｃｋｙ Ｃ．， ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３：８９８３−８９８８， １９９６）。テロメア反復を検出するハイブリダイゼーションプローブによる線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）でのテロメア長の視覚化の優良性は、それもまたプローブにハイブリダイズする、多数の内部反復によって損なわれる。特に、それらは小さいＨｉｎｆＩ末端テロメア断片を有する染色体のテロメアの検出を遮蔽する可能性がある。ｃｌｋ−２（ｑｍ３７）突然変異体のテロメア表現型を更に記述するために、個別のテロメアの長さを解析した。末端テロメア反復にちょうど隣接したサブテロメア領域は、染色体間で配列の相同性を共有しない（Ｗｉｃｋｙ Ｃ．，ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３：８９８３−８９８８， １９９６）。この配列の多様性を利用して、特定のテロメアに特異的なプローブを設計した。所与のＨｉｎｆＩ末端断片の大きさは、染色体の最も外側のＨｉｎｆＩ部位とテロメア反復の始点との間の固定された距離に関連し、数の異なる末端テロメア反復に依存する。ＨｉｎｆＩによるゲノムＤＮＡ消化および特定のテロメアに特異的なプローブによるサザンブロッティングによって、不均一な大きさである末端断片は再びスメアとして現れる。２つの個別のテロメアについて得られた詳細な結果は図５６で図解される。
【００６９】
染色体Ｘの左側テロメアの末端断片長は、ｑｍ３７において野生型より約１ｋｂ長く、それぞれ２．４から４．２ｋｂおよび１．７から２．８ｋｂに及ぶ。このテロメアは、救出トランスジーンを有するＭＱ６９１では野生型長であり、救出されないＭＱ９３１株では再びｃｌｋ−２（ｑｍ３７）の値まで延長される。別の末端断片（染色体ＩＶの左側テロメア）の長さもまた、ｑｍ３７において野生型より約１ｋｂ長く、それぞれ２．２から３．９ｋｂおよび１．８から２．８ｋｂに及ぶ。このテロメアはＭＱ６９１では野生型より短くなり、１．３から２ｋｂにしか及ばない。このテロメアはＭＱ９３１におけるトランスジーンの喪失後、再び突然変異体の長さを獲得する。従って、ｃｌｋ−２の過剰発現はテロメア反復の連続を短縮することができるが、すべてのテロメアにおいてそうではない。
【００７０】
遺伝子ｃｏｑ−４およびｃｏｑ−４（ｑｍ１４３）突然変異体の同定
酵母Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの遺伝子ＣＯＱ７／ＣＡＴ５は、ｃｌｋ−１と相同の遺伝子である（Ｅｗｂａｎｋ， Ｊ． Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７５， ９８０（１９９７）； ＰＣＴ／ＣＡ９７／００７６８）。Ｃｏｑ７ｐは構造的に酵素に類似していないが、それは酵母におけるユビキノン生合成のために必要である。また、酵母におけるユビキノン生合成のために必要な第二の遺伝子、ＣＯＱ４（Ｍａｒｂｏｉｓ， Ｂ． Ｎ．およびＣｌａｒｋ， Ｃ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２７１， ２９９５（１９９６）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＮＰ＿０１０４９０）は、酵素をコードせず、ＣＯＱ７と同様に細菌における相同体を持たない。遺伝子ｃｏｑ−４の役割、ならびに本発明者らが同定、ｃｏｑ−４と記述したｃｌｋ遺伝子（ｃｌｋ−１、ｃｌｋ−２およびｇｒｏ−１を含む）との機能的な関係を説明するために、本発明者らは、欠失突然変異体線虫を作成した。
【００７１】
線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）における遺伝子ｃｏｑ−４は、ほぼコスミドＴ０３Ｆ１の予測される遺伝子Ｔ０３Ｆ１．２（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｕ８８１６９）に対応する。それはＬＧＩ上のｕｎｃ−７３とｎｕｃ−１１との間に局在する。ｃｏｑ−４は、特徴付けられた遺伝子ｕｎｃ−７３から１００ｋｂ未満離れ、他の特徴付けられた遺伝子ｕｎｃ−１１から４０ｋｂ未満離れている。ｃｏｑ−４は、長さ８４３ｂｐであり、４つのエキソンを有する。本発明者らは、ｃＤＮＡクローンｙｋ１４０ａ２を配列決定することによって実験的に遺伝子ｃｏｑ−４の構造を確立した。ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）に非常に類似した第二の遺伝子、Ｔ０３Ｆ１．３は、本発明者らが示したように、ｃｏｑ−４の２６４ｂｐ上流にあり、ｃｏｑ−４とともにオペロンを形成し、従って転写的に共発現される。本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲによってｃｏｑ−４はＴ０３Ｆ１．３と同一オペロンにあり、ｃｏｑ−４はトランススプライスされるＳＬ２であり、Ｔ０３Ｆ１．３はトランススプライスされるＳＬ１であることを示した。
【００７２】
本発明者らは、大規模な野生型線虫のＥＭＳ突然変異誘発に続いて、ＰＣＲに基づく突然変異体スクリーニングを行うことにより、ｃｏｑ−４（ｑｍ１４３）欠失突然変異体を作成した。ｃｏｑ−４（ｑｍ１４３）は、Ｔ０３Ｆ１．３の４４ｂｐ下流から始まりｃｏｑ−４の４０６ｂｐ下流で終わる１４６９ｂｐの欠失を有する。下流の予測される遺伝子は、ｃｏｑ−４から１５２１ｂｐ離れ、欠失から１１１５ｂｐ離れている。従って、ｃｏｑ−４（ｑｍ１４３）は全欠失突然変異体であり、それはｃｏｑ−４以外のいずれの遺伝子のコード配列にも影響を及ぼさない。
【００７３】
ｃｏｑ−４突然変異体の表現型
ｃｏｑ−４（ｑｍ１４３）は、厳密ではない母性効果の致死突然変異である。ホモ接合ｃｏｑ−４両性個体からのほとんどの子孫は胚形成の間に死亡する。ごく少数の卵しか孵化せず、孵化したものは発生を完了させることができず、若い幼虫のうちに死亡する。本発明者らはまた、ホモ接合ｃｏｑ−４にとって、成虫期まで正常に発生するために母性ｃｏｑ−４産物が十分であることを示した。しかし、ヘテロ接合の両性個体（ｃｏｑ−４／＋）からのホモ接合ｃｏｑ−４成虫は、麻痺性で産卵に欠陥がある。更に、ｃｏｑ−４ホモ接合突然変異体はＮ２のオスと交配され、子孫を生じることができ、それは正常に成長する。総合すると、これらの結果は、母性または接合体のいずれかのｃｏｑ−４産物は、ｃｏｑ−４突然変異体が胚発生および胚性期後の発育を行うために十分であることを示す。ｃｏｑ−４欠失（ｑｍ１４３）は、安定した系統、ｃｏｑ−４（ｑｍ１４３）／ｕｎｃ−７３（ｅ９３６）として維持される。
【００７４】
本発明者らは、ｃｏｑ−４突然変異体の表現型、特に不妊は、染色体外のｃｏｑ−４ ＤＮＡ断片の野生型コピーによって救出され得ることを実証した。
【００７５】
ｃｏｑ−４の発現パターン
ｃｏｑ−４の空間的発現パターンは、２．２ｋｂの上流プロモーター領域を含む、緑色蛍光タンパク質との翻訳リポーター融合を用いることによって決定された。これらの構築物はＮ２およびヘテロ接合ｃｏｑ−４（ｃｏｑ−４／ｕｎｃ−７３）の両方に注入され、いくつかのトランスジェニック株の動物が調べられた。本発明者らは、機能的なｃｏｑ−４：：ｇｆｐが下皮、筋肉、腸、排泄管および胚で発現されることを発見した。更に、本発明者らは、リポーター融合が、特に筋肉細胞において、ミトコンドリアに局在することを検出した。
【００７６】
本発明はその特異的な実施形態と関連して記載されたが、更なる改良が可能であり、この出願は以下の本発明の任意の変化、使用、または適合を網羅する意図にあることが理解されるであろう。すなわち、一般に本発明の原理、あるいは、本発明が属する当技術分野内の既知のまたは慣習的な方法の範囲に入るような、および、前述の基本的な特徴に適用されうるような、および、特許請求の範囲における開示からの発展を包含する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａおよび１Ｂは、線虫ｃｌｋ−２ ｃＤＮＡ配列を示す。
【図２】
図２は線虫ＣＬＫ−２タンパク質配列を示す。
【図３】
図３はヒト ＣＬＫ−２タンパク質配列（クローンＫＩＡＡ０６８３に由来する）を示す。
【図４】
図４Ａおよび４Ｂはヒト ｃｌｋ−２相同体ヌクレオチド配列（ＡＬ０８０１２６に由来する）を示す。
【図５】
図５はマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ） ｃｌｋ−２ ｃＤＮＡ配列の一部（ＡＡ６７１９０５ ｖｌ１１ｂ１０．ｒ１に由来する）を示す。
【図６】
図６はマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ） ｃｌｋ−２ ｃＤＮＡ配列の一部（ＡＡ０３１１０８ ｍｉ４０ｆ０３．ｒ１に由来する）を示す。
【図７】
図７はマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ） ｃｌｋ−２ ｃＤＮＡ配列の一部（ＡＡ２３０９９４ ｍｗ３０ｈ１１．ｒ１に由来する）を示す。
【図８】
図８はマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ） ＣＬＫ−２タンパク質配列の一部（ｇｂ｜ＡＡ６７１９０５．１｜ＡＡ６７１９０５．に由来する）を示す。
【図９】
図９はマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ） ＣＬＫ−２タンパク質配列の一部（ｇｂ｜ＡＡ２３０９９４．１｜ＡＡ２３０９９４に由来する）を示す。
【図１０】
図１０はマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ） ＣＬＫ−２タンパク質配列の一部（ｇｂ｜ＡＡ０３１１０８．１｜ＡＡ０３１１０８に由来する）を示す。
【図１１】
図１１はマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）複合ＣＬＫ−２タンパク質配列を示す。
【図１２】
図１２はＳｕｓ ｓｃｒｏｆａ ＣＬＫ−２タンパク質配列の一部（ｇｂ｜ＡＷ４２９６１１．１｜ＡＷ４２９６１１に由来する）を示す。
【図１３】
図１３はショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＣＬＫ−２タンパク質配列を示す。
【図１４】
図１４はシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＣＬＫ−２推定タンパク質配列（７６３００３４｜ｅｍｂ｜ＣＡＢ８８３２８．１｜に由来する）を示す。
【図１５】
図１５はイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ） ｃｌｋ−２ ｃＤＮＡ配列の一部（ＡＵ０３１８１１に由来する）を示す。
【図１６】
図１６はイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ） ｃＤＮＡ配列の一部（Ｄ２４２３８に由来する）を示す。
【図１７】
図１７はイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ） ＣＬＫ−２タンパク質配列の一部（ｄｂｊ｜Ｄ２４４２２．１｜Ｄ２４４２２に由来する）を示す。
【図１８】
図１８はイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ） ＣＬＫ−２タンパク質配列の一部（ｄｂｊ｜ＡＵ０３１８１１．１｜ＡＵ０３１８１１に由来する）を示す。
【図１９】
図１９はイネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）複合ＣＬＫ−２タンパク質を示す。
【図２０】
図２０はダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ｃｌｋ−２ ｃＤＮＡ配列の一部（ＡＩ４６１２０１ ｓａ７６ｄ０７．ｙ１ Ｇｍ−ｃ１００４に由来する）を示す。
【図２１】
図２１はダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ｃｌｋ−２ ｃＤＮＡ配列の一部（ＡＷ１８５０２９ ｓｅ８５ｇ０６．ｙ１ Ｇｍ−ｃ１０２３に由来する）を示す。
【図２２】
図２２はダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ｃｌｋ−２ ｃＤＮＡ配列の一部（ＡＷ３５０１６６ ＧＭ２１０００７Ａ１０Ｆ４Ｒ Ｇｍ−ｒ１０２１に由来する）を示す。
【図２３】
図２３はダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ｃｌｋ−２ ｃＤＮＡ配列の一部（ＡＷ３９７８２６ ｓｇ６８ｇ１２．ｙ１ Ｇｍ−ｃ１００７に由来する）を示す。
【図２４】
図２４はダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ｃｌｋ−２ ｃＤＮＡ配列の一部（ＡＷ５６７７１３ ｓｉ５４ａ０１．ｙ１ Ｇｍ−ｒ１０３０に由来する）を示す。
【図２５】
図２５はダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ＣＬＫ−２タンパク質配列の一部（ｇｂ｜ＡＷ３５０１６６．１｜ＡＷ３５０１６６に由来する）を示す。
【図２６】
図２６はダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ＣＬＫ−２タンパク質配列の一部（ｇｂ｜ＡＩ４６１２０１．１｜ＡＩ４６１２０１に由来する）を示す。
【図２７】
図２７はダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ＣＬＫ−２タンパク質配列の一部（ｇｂ｜ＡＷ１８５０２９．１｜ＡＷ１８５０２９に由来する）を示す。
【図２８】
図２８はダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ＣＬＫ−２タンパク質配列の一部（ｇｂ｜ＡＷ５６７７１３．１｜ＡＷ５６７７１３に由来する）を示す。
【図２９】
図２９はダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ＣＬＫ−２タンパク質配列の一部（ｇｂ｜ＡＷ３９７８２６．１｜ＡＷ３９７８２６に由来する）を示す。
【図３０】
図３０はダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）ＣＬＫ−２複合タンパク質配列を示す。
【図３１】
図３１は、７７２の位置にＣからＹへの置換を伴う線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ） ＣＬＫ−２（ＱＭ３７）突然変異タンパク質を示す。
【図３２】
図３２は、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＣＬＫ−２タンパク質、Ｔｅｌ２ｐを示す。
【図３３】
図３３は、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ） ｃｅｘ−７ ｃＤＮＡ配列を示す。
【図３４】
図３４は、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ） ＣＥＸ−７タンパク質配列を示す。
【図３５】
図３５は、ヒト ＣＥＸ−７タンパク質配列（ＸＥ７）を示す。
【図３６】
図３６は、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ） ｃｏｑ−４ ｃＤＮＡ配列を示す。
【図３７】
図３７は、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ） ＣＯＱ−４タンパク質配列を示す。
【図３８】
図３８Ａおよび３８Ｂは、ＣＬＫ−２の真核生物の相同体の比較を示す（ｈＣＬＫ−２： ヒト ＣＬＫ−２： 線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ） Ｔｅｌ２ｐ： 酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） ＡｔＣＬＫ−２： Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）。
【図３９】
図３９は、ＣＬＫ−２の動物の相同体の比較を示す（Ｄ．ｍ．： ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）， Ｈ．ｓ．： ヒト Ｃ．ｅ．： 線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ））。
【図４０】
図４０は、ＣＬＫ−２の脊椎動物相同体の比較を示す（Ｈ．ｓ．： ヒト Ｍ．ｍ．： マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）Ｓ．ｓ．： Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）。
【図４１】
図４１は、ＣＬＫ−２の植物相同体の比較を示す（Ａ．ｔ．： シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ） Ｇ．ｍ．： ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ） Ｏ．ｓ．： イネ（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ））。
【図４２】
図４２は、ＣＯＱ−４相同体タンパク質の比較を示す。
【図４３】
図４３は、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ） ＣＯＱ−４タンパク質（ｇｉ｜７２９３９８７｜ｇｂ｜ＡＡＦ４９３４４．１に由来する）を示す。
【図４４】
図４４は、ヒト ＣＯＱ−４タンパク質（ｇｉ｜７７０５８０８｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿０５７１１９．１｜ＣＧＩ−９２に由来する）を示す。
【図４５】
図４５は、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ） ＣＯＱ−４タンパク質（ｇｉ｜７４９３１３０｜ｐｉｒ｜｜Ｔ３７７５５に由来する）を示す。
【図４６】
図４６は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ＣＯＱ−４タンパク質（ｇｉ｜４４０６７６１｜ｇｂ｜ＡＡＤ２００７２．１｜に由来する）を示す。
【図４７】
図４７Ａはマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ） ＣＯＱ−４タンパク質の一部（ｇｂ｜ＡＡ２７４６８３．１｜ＡＡ２７４６８３に由来する）を、図４７Ｂはマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ） ＣＯＱ−４タンパク質の一部（ｄｂｊ｜ＡＵ０５１６３２．１｜ＡＵ０５１６３２に由来する）を、図４７Ｃはマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ） ＣＯＱ−４タンパク質の一部（ｇｂ｜ＡＩ１５７５３１．１｜ＡＩ１５７５３１に由来する）を、図４７Ｄはマウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ） ＣＯＱ−４コンセンサスタンパク質を示す。
【図４８】
図４８は、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ） ＣＯＱ−４タンパク質（ｇｂ｜ＡＷ２０１１５７．１｜ＡＷ２０１１５７に由来する）を示す。
【図４９】
図４９は、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＣＯＱ−４タンパク質（ｇｂ｜ＡＷ６６０７７１．１｜ＡＷ６６０７７１に由来する）を示す。
【図５０】
図５０は、Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｔｒｕｎｃａｔｕｌａ ＣＯＱ−４タンパク質（ｇｂ｜ＡＷ６９６０２５．１｜ＡＷ６９６０２５に由来する）を示す。
【図５１】
図５１は、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｃａｎｉｕｍ ＣＯＱ−４タンパク質（ｇｂ｜ＡＷ８７０５３７．１｜ＡＷ８７０５３７に由来する）を示す。
【図５２】
図５２は、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉ ＣＯＱ−４タンパク質（ｇｂ｜ＡＷ３３００４３．１｜ＡＷ３３００４３に由来する）を示す。
【図５３】
図５３は、Ｒａｔｔｕｓ ｒａｔｔｕｓ ＣＯＱ−４タンパク質（ｇｂ｜ＡＡ８０００４６．１｜ＡＡ８０００４６に由来する）を示す。
【図５４】
図５４は、Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ ＣＯＱ−４タンパク質（ｇｂ｜ＡＩ７３１０９７．１｜ＡＩ７３１０９７に由来する）を示す。
【図５５】
図５５Ａ−Ｃは、ｃｌｋ−２の発現パターンを示す。
【図５６】
図５６Ａ−Ｅは、異なる温度でのｃｌｋ−２（ｑｍ３７）突然変異体のテロメア延長表現型を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004500878.tif 000189
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