(57)【要約】本発明は、植物のミトコンドリアにおけるＡＴＰ生産を不能にする未編集のｎａｄ９遺伝子を発現するＲＮＡ編集により作製される細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）トランスジェニック植物、および該植物を作製する方法に関する。前記方法は、ミトコンドリアＤＮＡ由来のＰＣＲ産物を制限酵素処理することにより未編集のｎａｄ９遺伝子をクローニングし、ｐＮＧ３を得ること；ユビキチンプロモーター、ＮＯＳターミネーター下のターゲティング配列を有する未編集のｎａｄ９遺伝子で作物をクローニングし、ｐＮＧ１１を得ること；本明細書に記載の方法でｐＮＧ１１構築物を、ハイグロマイシン遺伝子（ｐＬＡＵ６　ｈｐｈ構築物）と共に遺伝子導入（ｃｏ−ｂｏｍｂａｒｄ）し、未編集のｎａｄ９遺伝子を含有する植物をつくること；編集されたｎａｄ９遺伝子、ｐＮＧ１０を有するコントロール植物を用いて、未編集のｎａｄ９（ｐＮＧ１１）構築物を分析し、ｎａｄ９遺伝子の存在を決定することを含む。【選択図】なし
2004500094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物のミトコンドリアにおけるＡＴＰ生産を不能にする未編集のｎａｄ９遺伝子を発現するＲＮＡ編集により作製される、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）トランスジェニック植物。
【請求項２】
前記植物が、Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（イネ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トウモロコシ（Ｚｅａ ｍａｙｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）等から成る群より選択される、請求項１に記載の細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）トランスジェニック植物。
【請求項３】
前記植物がＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ（イネ）である、請求項１に記載の細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）トランスジェニック植物。
【請求項４】
植物のミトコンドリアにおけるＡＴＰ生産を不能にする未編集のｎａｄ９遺伝子を発現するＲＮＡ編集により細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）トランスジェニック植物を作製する方法であって、以下の工程を含む方法：
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ｃＤＮＡ（Ａｔ−ｍＲＢＰ１ａ）由来のミトコンドリアターゲティングペプチドをｐＢＳＫベクターにクローニングし、ｐＮＧ１を得ること、
ミトコンドリアＤＮＡ由来のＰＣＲ産物を制限酵素処理することにより未編集のｎａｄ９遺伝子をクローニングし、ｐＮＧ３を得ること、
ユビキチンプロモーター、ＮＯＳターミネーター下のターゲティング配列を有する未編集のｎａｄ９遺伝子で作物をクローニングし、ｐＮＧ１１を得ること、
本明細書に記載の方法でｐＮＧ１１構築物を、ハイグロマイシン遺伝子（ｐＬＡＵ６　ｈｐｈ構築物）と共に遺伝子導入（ｃｏ−ｂｏｍｂａｒｄ）し、未編集のｎａｄ９遺伝子を含有する植物をつくること、
編集されたｎａｄ９遺伝子、ｐＮＧ１０を有するコントロール植物を用いて、未編集のｎａｄ９（ｐＮＧ１１）構築物を分析し、ｎａｄ９遺伝子の存在を決定すること。
【請求項５】
以下の工程を含む請求項４に記載の方法：
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ｃＤＮＡ（Ａｔ−ｍＲＢＰ１ａ）由来のミトコンドリアターゲティングペプチドを、ｐＢＳＫベクターにクローニングし、ｐＮＧ１を得ること、
ミトコンドリアＤＮＡ由来のＰＣＲ産物を制限酵素処理することにより未編集のｎａｄ９遺伝子をクローニングし、ｐＮＧ３を得ること、
ユビキチンプロモーター、ＮＯＳターミネーター下のターゲティング配列を有する未編集のｎａｄ９遺伝子でイネをクローニングし、ｐＮＧ１１を得ること、
本明細書に記載の方法でｐＮＧ１１構築物を、ハイグロマイシン遺伝子（ｐＬＡＵ６　ｈｐｈ構築物）と共に遺伝子導入（ｃｏ−ｂｏｍｂａｒｄ）し、未編集のｎａｄ９遺伝子を含有するイネ植物をつくること、
編集されたｎａｄ９遺伝子、ｐＮＧ１０を有するコントロールのイネを用いて、未編集のｎａｄ９（ｐＮＧ１１）構築物を分析し、ｎａｄ９遺伝子の存在を決定すること。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）のトランスジェニック植物、およびＲＮＡ編集を分子ツールに用いてこれを製造する方法に関する。本発明は特に、ＲＮＡ編集を用いることによるイネのハイブリッド（ＣＭＳ）の開発に関する。
【０００２】
【発明の背景】
ＣＭＳは、小胞子生成の際に、減数分裂後の花粉粒子の発育停止をもたらす植物ミトコンドリアにおける母系遺伝形質である。ＣＭＳの興味が高いのは、ハイブリッド種子の生産における損経済的重要性によるものである。その混合受粉から誘導される植物は、花粉親の核ゲノムが核雄性繁殖力修復因子（ＭＦＲ）対立遺伝子を有していない限り、雄性のままである（１）。組替えミトコンドリアゲノムを含む株を製造する能力は、ＣＭＳを研究するために著しい価値を有している。もう一つの勝ちある遺伝的資源は、ＣＭＳ形質を反転させるＲｆと称する単一の優勢な核遺伝子である。繁殖力を回復した植物と、不稔性細胞質を有する不稔性植物との間の比較によって、ある重要な情報がもたらされた。これは、ｍｔＤＮＡ（２，３）配列の間での組替え事象から生じるキメラ遺伝子の存在によって、幾つかの事例では遺伝子レベルで関連することができ、またＡＴＰ賛成の顕著な減少によって生化学的に証明される。
【０００３】
第二のグリーン革命は、農作物植物（特にイネ）に対する分子生物学の応用における主要な進歩に依存している。現代の分子生物学は宿主の技術を開発してきており、これは作物ゲノムの分析、および高収穫高、増大した病害耐性および極端な環境に対する寛容性に適した方法でこれらを改変することを可能にするであろう。イネは二番目に大きな一年生穀物作物であり、小麦とは違って小さな占有土地で生育し、手で収穫される。栽培されたＯｒｙｚａ ｓａｔｉｖａは長い葉を持った一年生穀物作物であり、種子または穀物を産生する花を備えた小穂で構成される花序（円錐花序）を有する。それは略２５種を含み、インドでは略紀元前３０００年に栽培が始められ、その後に中国、インドシナ、インドネシアおよび日本列島に広がった。中国およびインドは世界生産量の殆ど６０％を閉めており、その生産高は略２億トンである。イネの収量は地形学的な位置、天候条件、および栽培方法に依存する。イネは、年間３０億ドル近くを消費する世界最も大きな単一の農薬市場であり、それによってバイオテクノロジーの主要な機会を提供する。インドでは、１９３０年〜１９８０年の間にイネの生産は２倍以上になり、現在では３億５千エーカーに亘って４億２千トンが栽培されている。この増大は、改良種および改良された栽培法の利用によるものであった。
【０００４】
ハイブリッドイネの栽培は、間接的に細胞質均一性を促進した。新規なハイブリッドの開発においては、細胞質雄性不稔（ＣＭＳ）株の開発に著しい時間が費やされる。望ましい核バックグラウンドを持った株を、ハイブリッド種子の製造に使用できる雄性不稔株に変換するためには、５〜６回の戻し交配世代を必要とする。新規な細胞質源を発生させるために、分子ツールを使用して迅速なアプローチを決定および設計する必要が急務である。
【０００５】
ＲＮＡ編集は、植物ミトコンドリアにおいて、ＣがＵに変更されたＲＮＡを生じる転写後プロセスである。ＲＮＡ編集は、ＲＮＡ分子のヌクレオチド配列を、それをコードするＤＮＡテンプレートの配列から変化させることにより、分子生物学の中心命題に挑戦する（４，５）。この転写後プロセスは、ＣからＵへの変化、およびそれほど頻繁ではないがＴからＣへの変化によって、変更されたＲＮＡをもたらす（６，７）。コドンにおける重要なヌクレオチドが編集されて、殆どの場合はアミノ酸の変化を導き、また時には以前には存在しなかった開始コドンおよび停止コドンを生じて、最終的には機能的遺伝子を組み立てる。ＲＮＡ編集の後では、対応するタンパク質の配列は、未編集の遺伝子的に予測されたタンパク質とは異なる。複雑な呼吸連鎖に関与するタンパク質の修飾は、それがミトコンドリア呼吸連鎖の複合体Ｉの機能に影響するので、屡々、雄性不稔発現型の原因であることが示されている。編集事象は時には種特異的であり（８）、また幾つかの場合には無変化、部分的、またはＯｅｎｏｔｈｅｒａおよび小麦、トウモロコシもしくはエンドウにおける保存された領域と同一である（９）。また、編集は小麦およびＯｅｎｏｔｈｅｒａにおけるスプライス部位の創製においても観察されている（１０，１１）。
【０００６】
維管束植物のミトコンドリア（ｍｔ）ゲノムは、多くの異なる特徴的構造によって特徴付けられる。これらのゲノムは非植物性ミトコンドリアゲノムよりも大きく、またそれらの物理的構造は、活性なＤＮＡ再構成の原因である繰り返しのために不均一である。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（非売、１９９７＃２５６２）のミトコンドリアゲノムの完全な配列決定によって、より高分子量の植物ミトコンドリアＤＮＡの大きなポピュレーションは非コード性であるが、５０以上のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がゲノム中に存在し、これには動物のｍｔゲノムに存在する正常な遺伝子の組だけでなく、リボゾームタンパク質遺伝子、チトクロムｃ生合成に関与するバクテリア遺伝子に類似した新規遺伝子（Ｇｏｎｚａｌｅｓｚ， １９９３＃１８７４； Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， １９９４＃２１９４； Ｂｏｎｎａｒｄ， １９９５＃２３３１； Ｇｒｕｓｋａ， １９９５＃２３４０）、およびｏｒｆＢおよびｏｒｆ２５様の機能未知の遺伝子が含まれている。ミトコンドリアに幾つかの機能的ｔＲＮＡ遺伝子を供給する葉緑体ＤＮＡ挿入物の存在が、多くの異なる種において報告されている（Ｍａｒｅｃｈａｌ， １９８７＃８１０）。これらの挿入物は、イントロンおよび頻繁な繰り返し配列と共に、高分子量ｍｔゲノムの大きなサイズに寄与する。
【０００７】
この遺伝子の独特さは、その発現に必要なメカニズムによっても説明され、これにはｃｉｓ−スプライシングおよびｔｒａｎｓ−スプライシング、並びにＲＮＡ編集が含まれる。殆どの場合に、ｍＲＮＡ編集は、以前には存在していない開始コドンおよび停止コドンの創製を含むアミノ酸の変化を導く。タンパク質をコードする全ての遺伝子の略全ての転写物が編集されて、最も頻繁には種間のタンパク質配列の類似性増大をもたらす。類似したＣからＵへのｍＲＮＡの編集活性もまた、高等植物（Ｍａｉｅｒ， １９９６＃２５６０）の葉緑体において見出されている。イントロンおよびｔＲＮＡのような構造化されたＲＮＡもまた、幾つかの種のミトコンドリア内で編集されることが認められた（Ｗｉｓｓｉｎｇｅｒ， １９９１＃１６０８； Ｍａｒｅｃｈａｌ−Ｄｒｏｕａｒｄ， １９９３＃１９９１）。高等植物のミトコンドリアイントロンは、ｃｏｘ２遺伝子において最初に検出された（Ｆｏｘ， １９８１＃３６７）。それらは、それらの構造（Ｍｉｃｈｅｌ， １９８３＃１７６４； Ｍｉｃｈｅｌ， １９８９＃８２０）およびそれらの除去のために用いられるメカニズム（Ｃｅｃｈ， １９９０＃１７６４５）によって特徴付けられるグループＩＩイントロンに属する。植物ミトコンドリアにおいて、このグループＩＩイントロンの幾つかは組換えによって開裂され、異なるゲノム位置においてエキソンを抑制する。従って、分離された転写物は、ｔｒａｎｓ−スプライシングによって連結される必要がある。核遺伝子において最初に既述された（Ｂｏｒｓｔ， １９８６＃１７７８）この現象もまた、葉緑体ｒｐｓ１２遺伝子（Ｋｏｌｌｅｒ， １９８７＃２２５）およびｐｓａＡ遺伝子（Ｇｏｌｄｓｃｈｍｉｄｔ−Ｃｌｅｒｍｏｎｔ， １９９１＃１３９４）の発現のために必要とされる。
【０００８】
ＮＡＤＨ／ユビキノン酸化還元酵素（複合体Ｉ）は、２５以上のタンパク質サブユニットからなっている。これは最も大きな呼吸系複合体であり、ミトコンドリア内膜に位置している（Ｈｅｒｚ， １９９４＃２０８０）。この酵素は、ＮＡＤＨの酸化を触媒し、電子をユビキノンへと運ぶ。現在まで、これらの遺伝子は、高等植物ミトコンドリアで同定されている９個のミトコンドリア的にコードされたサブユニットであった。
【０００９】
ｎａｄ１、ｎａｄ２、ｎａｄ３、ｎａｄ４、ｎａｄ４Ｌ、ｎａｄ５およびｎａｄ６遺伝子（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ， １９９４＃２１９５）は、哺乳類ミトコンドリアにおける対応部分を有しており、これとは対照的に、核ゲノムの中にコードされるｎａｄ７（Ｂｏｎｅｎ， １９９４＃２１２３）およびｎａｄ９（Ｌａｍａｔｔｉｎａ， １９９３＃１４９１）は哺乳類である（Ｗａｌｋｅｒ， １９９２＃１８３４）。ｎａｄ遺伝子類の発現は、高等植物のｍｔゲノム中に認め得る種々の範囲の複雑さの良好な説明を与える。ｎａｄ３、ｎａｄ４Ｌ、ｎａｄ６およびｎａｄ９は連続的な遺伝子であるのに対して、ｎａｄ４（Ｌａｍａｔｔｉｎａ， １９９１＃１０８０）およびｎａｄ７（Ｂｏｎｅｎ， １９９４＃２１２３）は幾つかのｃｉｓ−スプライシングイントロンによって中断されている。ｎａｄ１（Ｗｉｓｓｉｎｇｅｒ， １９９１＃１１２４； Ｃｈａｐｄｅｌａｉｎｅ， １９９１＃１０９７）、ｎａｄ２（Ｂｉｎｄｅｒ， １９９２＃１４４１６）およびｎａｄ５（Ｋｎｏｏｐ， １９９１＃１２５０； Ｐｅｒｅｉｒａ ｄｅ Ｓｏｕｚａ， １９９１＃１１２８）は、最も複雑な発現パターンを示す種々の植物種においてｃｉｓ−スプライスおよびｔｒａｎｓ−スプライスされる。
【００１０】
小麦ｎａｄ２の構造および発現、その発現が維管束植物ミトコンドリアゲノムの幾つかの特徴を例示するＮＡＤＨ／ユビキノンレダクターゼのサブユニット２をコードするミトコンドリア遺伝子（これら遺伝子の正しい発現のためには、ｃｉｓ−スプライシングおよびｔｒａｎｓ−スプライシング、並びにｍＲＮＡ編集が必要である）が研究されている。小麦ミトコンドリアにおいて、ＮＡＤＨ／ユビキノン酸化還元酵素のサブユニット２をコードする遺伝子（ｎａｄ２）は、二つの異なるゲノム領域に位置する五つのエキソンに分割される。これら遺伝子の最初の二つのエキソン、即ちａおよびｂは、同じＤＮＡ鎖からのエキソンｃ、ｄおよびｅの２２ ｋｂ下流に転写される。ｎａｄ２の全てのイントロンはグループＩＩのものである。二つの独立に転写されたコード配列を一緒にするためには、エキソンｂおよびｃのｔｒａｎｓ−スプライシングが仮定されなければならない。中断されたドメインＩＶの幹におけるｔｒａｎｓ−スプライシング事象は、二つの前駆体ＲＮＡの塩基対形成を含んでいるので、ドメインＩＶループを用いたＤＮＡ再構成は、この遺伝子組織化の原因であると思われる。ｔＲＮＡ Ｔｙｒをコードする遺伝子は、エキソンｃの上流に位置し、エキソンｃ〜ｅと同時転写される可能性がある。スプライシングプロセスに加えて、ｍＲＮＡ編集はｎａｄ２の正しい発現のためにも必要とされる。この成熟ｍＲＮＡは３６位において編集され、その五つのエキソンに亘ってランダムに分布されて、２８のコドン修飾を生じる。編集は、タンパク質の疎水性および保存性を増大させる。
【００１１】
非常に狭い細胞質ベースは、病害、害虫発生および劣悪な環境条件に対して作物を弱くする可能性がある。今日のハイブリッドの殆どは「ＷＡ」細胞質のような非常に狭い細胞質ベースを有しており、病害および害虫の攻撃、並びに劣悪な環境条件に対して作物を弱くする。
【００１２】
【発明の概要】
したがって、ＣＭＳを与える細胞質の新規な源を同定、および開発することが、本発明の主要な目的である。
【００１３】
さらに、本発明のもう一つの目的は、ＣＭＳを作製するために、翻訳されていないバージョンを遺伝子操作して過剰発現する使用、および核の稔性を回復させるために、アンチセンスバージョンを遺伝子操作して過剰発現する使用を最適化することである。
【００１４】
また、本発明の目的は、正確な転写物のプロセシングにおけるＲＮＡ編集の基本的な重要性と、もっと応用したアプローチで、作物植物の、特にイネのＣＭＳ株の作製を併用することである。
【００１５】
さらに、本発明の目的は、本発明の目的は、正確な転写物のプロセシングにおけるＲＮＡ編集の基本的な重要性と、もっと応用したアプローチで、作物植物の、特にイネのＣＭＳ株の作製を併用することである。
【００１６】
さらに、本発明のもう一つの目的は、雄性不稔の出現と、未編集バージョンの遺伝子の発現が相関することである。雄性不稔表現型は、ミトコンドリア機能異常を生じ、正常なその他の発生に影響を与え、かつ花粉粒の形成を減少する。
【００１７】
前記目的を達成するために、本発明は、細胞質雄性不稔トランスジェニック植物であって、未編集のｎａｄ９遺伝子を発現して植物のミトコンドリアにおいてＡＴＰを産生不能にするために、ＲＮＡ編集によって作製された細胞質雄性不稔トランスジェニック植物に関する。
【００１８】
前記細胞質雄性不稔トランスジェニック植物は、イネ（コメ）、コムギ（コムギＴｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、トウモロコシ（トウモロコシＺｅａ ｍａｙｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）などのグループから選択される。
【００１９】
前記細胞質雄性不稔トランスジェニック植物は、イネ（コメ）である。
【００２０】
さらに、本発明は、未編集のｎａｄ９遺伝子を発現して植物のミトコンドリアにおいてＡＴＰを産生不能にするために、ＲＮＡ編集することによって作製された細胞質雄性不稔トランスジェニック植物の作製方法であって、以下の工程を含む方法を提供する：
−シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ｃＤＮＡ（Ａｔ−ｍＲＢＰ１ａ）から、ＰＣＲによってミトコンドリアターゲッティング配列をクローン化すること、
−前記ＰＣＲ産物のＳａｃＩおよびＸｂａＩ部位を、ＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化して、ｐＢＳＫへのクローン化を容易にして、ｐＮＧ１と呼ばれる構築物を得ること、
−クローン化して、前記ＰＣＲ産物を消化することによって、種々の作物に由来するミトコンドリアＤＮＡからｐＮＧ１内に未編集のｎａｄ９遺伝子を得ること、
−未編集のｎａｄ９遺伝子を有するクローン化した産物を消化して、ｐＮＧ３を得ること、
−ユビキチンプロモーター、およびＮＯＳターミネーター下にある前記ターゲッティング配列で、未編集のｎａｄ９を有する作物をクローニングして、ｐＮＧ１１を得ること、
−ハイグロマイシン遺伝子（ｐＬＡＵ６ ｈｐｈ構築物）とｐＮＧ１１構築物を共に衝撃させて（ｃｏ−ｂｏｍｂａｒｄｉｎｇ）、未編集のｎａｄ９植物を作製して得ること。
【００２１】
【発明の詳細な記述】
本発明の目的は、同じ遺伝子の二種の形態を使用することによって、ミトコンドリア内膜の４種のプロトンポンピング多タンパク質複合体（ＮＡＤＨ−レダクダーゼ、シトクロムＣレダクターゼ、およびシトクロムＣオキシダーゼ、またはＡＴＰシンターゼ複合体）の一種以上の機能を変化させ、細胞内エネルギーレベルを減少させることである。前記遺伝子の一つの形態は、天然に存在する機能的に編集された転写物であり、もう一つは、未編集の転写物であり、異なったＲＮＡおよび推定タンパク質を生じることにより、サブユニットアラインメントが損なわれて前記複合体の機能を失うであろう。
【００２２】
複合体Ｉ（Ｃｏｍｐｌｅｘ Ｉ）（ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシド−レダクターゼ複合体）のサブユニット９（ｎａｄ９）は、呼吸鎖の第一複合体であり、ミトコンドリア内膜において、ユビキノンの還元、電子移動を引き起こす。該複合体Ｉは、その構築を乱す電子流動＆変異において、戦略的に重要な位置を占めており、これが雄性不稔を誘導することが示されている。このサブユニット（ｎａｄ９）は、哺乳類複合体Ｉの３０ｋｄａのタンパク質と一致する。複合体Ｉにおいて、ｎａｄ９は、鉄硫黄細画分に位置し、ミトコンドリアマトリックスに面している。この推定アミノ酸組成は、このタンパク質が疎水性タンパク質であることを示している。このタンパク質は、小さな転写物なので、ｎａｄ９は、前記目的の最適な候補となり、コムギでは１４位において編集されて、１１アミノ酸に修飾を引き起こし、すべての場合でよく保存されたタンパク質を生じるであろう。
【００２３】
特に、前記方法は以下の工程を含む：
工程１
ミトコンドリアターゲッティング配列のクローニング（図１）：前記ミトコンドリアターゲッティング配列は、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）ｃＤＮＡ（Ａｔ−ｍＲＢＰ１ａ）からＰＣＲすることによってクローン化した。
【００２４】
オリゴ：
フォワードプライマー：ａａｇａｇｃＴｃｃｃ ＡＴＧ ＧＴＣ ＴＴＣ ＴＧＴ ＡＡＣ ＡＡＡ ＣＴＣ Ｇ
リバースプライマー：Ａａ ｔｃｔ Ａｇａ ＣＴＴ ＧＧＴ ＡＧＡ ＣＡＴ ＣＡＡ ＣＣＧ Ｇ
ｐＢＳ（ＳＫ）へのクローニングを容易にするために、フォワードプライマーは、ＳａｃＩ部位を有し、かつリバースプライマーは、ＸｂａＩ部位を有する。
【００２５】
前記ミトコンドリアターゲッティング配列をクローニングするためのＰＣＲ条件は以下の通りである：
５０ｎｇ　Ａｔ−ｍＲＢＰ１ａ ｃＤＮＡを含むベクター
１０μｌ　１０×Ｐｆｕクローンバッファー
２μｌ　１０ｍＭ ｄＮＴＰ’ｓ
１μｌ　オリゴ　フォワード（５０ｐｍｏｌｅｓ）
１μｌ　オリゴ　リバース（５０ｐｍｏｌｅｓ）
１μｌ　ｐｆｕポリメラーゼ
水で最終体積１００μｌとする。
【００２６】
９２℃　３分
９２℃　４５秒
４０℃　１分（５サイクル）
７２℃　１分
９２℃　４５秒
４７℃　１分（３０サイクル）
７２℃　１分
７２℃　１０分
該ＰＣＲ産物をＳａｃＩおよびＸｂａＩで消化して、ｐＢＳ（ＳＫ）にクローン化した。この構築物をｐＮＧ１と呼ぶ。
【００２７】
工程２
イネの編集されたｎａｄ９のクローニング：
編集ｎａｄ９をイネのトータルＲＮＡからＲＴＰＣＲにより取得した。インディカイネ（ＩＲ６４）種子を暗下２５０ｃでの湿潤バーミキュライトで発芽させ、その後３週間成長させた３週齢の実生をトータルＲＮＡ抽出およびミトコンドリア分離に使用した。
【００２８】
トータルＲＮＡの抽出
・液体窒素中で３ｇｍの組織を磨り潰し、ファルコンチュウブに移す。
・９ｍＬの抽出緩衝液を添加して、ボルテックスする、
・０．６ｍＬの３Ｍ　酢酸ナトリウムｐＨ４．８、　３．０ｍＬの水飽和フェノールおよび１．８ｍＬのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を添加して、ボルテックスする、
・１５分間氷上でインキュベートする、
・ＪＡ２５．５０ローター、１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する、
・界面が透明になるまでフェノール：クロロホルムで抽出する、
・水層に等容量のイソプロパノールを添加する、
・−２０℃で１時間保存する、
・１５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離する、
・７０％アルコールで洗浄する、
・ペレットを乾燥する、
・水に溶解する。
【００２９】
抽出緩衝液
４Ｍ　グアニジン　チオシアネート
２５ｍＭ　クエン酸ナトリウムｐＨ７．０
０．５％　サルコシル
０．１ｍＭ　／３−メルカプトエタノール
３Ｍ　酢酸ナトリウムｐＨ４．８
水で平衡化したフェノール
クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）
イソプロパノール及び７０％アルコール
ＲＴ−ＰＣＲ
逆転写
ＲＮＡがエタノール中に存在するのであれば、１／１０容量の３Ｍ　酢酸ナトリウムを添加し、−２０℃で１時間ＲＮＡを沈殿させる、１２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、７０％エタノールでペレットを洗浄し、ミリＱ水に溶解する。
【００３０】
更に５００ｎｇのランダムヘキサマーを添加し、６５℃で５分間インキュベートして氷上に静置する。更に以下を添加する。
【００３１】
―　　　１０μＬの５Ｘ　ＲＴ緩衝液
―　　　５μＬのＤＴＴ（０．１Ｍ）
―　　　１０μＬのｄＮＴＰｓ（２ｍＭ）
―　　　１μＬのリバーストランスクリプターゼＭ−ＭＬＶ（＝２００ユニット）
そして、更に３７℃で２時間インキュベーションする、
５μＬの１０ｍＭ　ＡＴＰ、１μＬのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０ユニット）を添加する
３７℃で１５分間インキュベートする
２μＬのＴ４　ＤＮＡリガーゼ（２ユニット）を添加する
３７℃で４５分間インキュベートする。
【００３２】
オリゴ：
フォワード：ａａ Ｔｃｔ ａｇａ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＡＣ ＣＡＡ ＴＴＣ ＡＴＴ ＴＴＣ ＣＡＡ
リバース　：ａａｇ ｇＡｔ ｃＣＧ ＧＡＡ ＴＴＡ ＴＣＣ ＧＴＣ ＧＣＴ ＡＣＧ
ミトコンドリアのターゲッティング配列に近接する編集ｎａｄ９遺伝子のクローニングのためにフォワードプライマーはＸｂａＩサイトを有し、リバースプライマーはＢａｍＨＩを有する。標準的条件によりＰＣＲを実行した。ＰＣＲ産物をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化して、ｐＮＧ１にクローン化してｐＮＧ２と命名した。このｐＮＧ２より編集ｎａｄ９遺伝子をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、図２に示されるようにユビキチンプロモーターにクローン化して、ｐＮＧ１０と命名した。
【００３３】
工程３
未編集のイネｎａｄ９のクローニング
ミトコンドリアの分離を標準的プロトコールを用いて行った。
抽出緩衝液
０．４Ｍ　スクロース
５０．０ｍＭ　ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　ｐＨ７．５
３．０ｍＭ　ＥＤＴＡ
０．１％　ＢＳＡ
４．０ｍＭ　ｂ−／３−メルカプトエタノール
２ｍＭ　ＤＴＴ
洗浄緩衝液―ＢＳＡ及びＤＴＴを含まない抽出緩衝液
２Ｘ　グラジエント緩衝液
０．５Ｍ　スクロース
１００ｍＭ　ｔｒｉｓ　ＨＣｌ　ｐＨ７．５
６．０ｍＭ　ＥＤＴＡ
２ｘグラジエント緩衝液中に調製したパーコールグラジエント
ミトコンドリアＤＮＡを取得するためのミトコンドリアのリシス：
イネのミトコンドリア約７５μｇを再懸濁緩衝液に再懸濁した。再懸濁したミトコンドリアに１／４容量のリシス緩衝液を添加した。チュウブを転倒混和し、すぐにフェノールを添加し、その後にクロロホルムを添加した。そして３度のフェノールクロロホルム抽出を実行し、その後クロロホルム抽出を行った。水層に２．５容量エタノールおよび１／１０容量の３．０Ｍ　Ｎａ　アセテートを添加した。−２０℃で３０分間保存し、１３０００ｒｐｍで２０分間スピンし、７０％エタノールで洗浄し、乾燥させ水に溶解した。
【００３４】
オリゴ
フォワード：ａａ Ｔｃｔ ａｇａ ＡＴＧ ＧＡＴ ＡＡＣ ＣＡＡ ＴＣＣ ＡＴＴ ＴＴＣ ＣＡＡ
リバース　：ａａｇ ｇＡｔ ｃＣＧ ＧＧＡ ＴＴＡ ＴＣＣ ＧＴＣ ＧＣＴ ＡＣＧ
ミトコンドリアのターゲッティング配列に近接する未編集のｎａｄ９遺伝子のクローニングのために、フォワードプライマーはＸｂａＩサイトを有し、リバースプライマーはＢａｍＨ１を有する。
【００３５】
ＰＣＲ
１μＬの１：１０希釈ミトコンドリアＤＮＡをＰＣＲに使用した
１０μＬの１０ｘＰｆｕクローン緩衝液
２μＬの１０ｍＭ　ｄＮＴＰｓ
１μＬのオリゴ　フォワード（５０ｐｍｏｌ）
１μＬのオリゴ　リバース　（５０ｐｍｏｌ）
１μＬのｐｆｕポリメラーゼ
最終容量の１００μＬまで水を添加する。
【００３６】
９２℃　３分間
９２℃　４５秒間
４２℃　１分間（５サイクル）
７２℃　１分間
９２℃　４５秒間
４９℃　１分間（３０サイクル）
７２℃　１分間
７２℃　１０分間
ＰＣＲ産物をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化して、ｐＮＧ１にクローン化してｐＮＧ３と命名した。
このｐＮＧ３より未編集のｎａｄ９遺伝子をＸｂａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、図３に示されるようにユビキチンプロモーターにクローン化してｐＮＧ１１と命名した。
【００３７】
工程４
編集されたｎａｄ９（ｐＮＧ１０）及び未編集のｎａｄ９（ｐＮＧ１１）をバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）形質転換に使用した。形質転換の方法は共照射法（ｃｏ−ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）であり、従ってバイオリスティック形質転換の構築物は１つのプラスミド（ユビキチンプロモーター及びＮｏｓターミネーターを有するｐＡＨＣ２７、並びにｐＬＡＵ６（ＣｖＭＶプロモーター及びＮＯＳターミネーターを有するＩＬＴＡＢより））上に目的遺伝子、及び別のプラスミド上に選択マーカーを有する。
【００３８】
【実施例】
例
植物材料の収集：バスマチ ３７０（Ｂａｓｍａｔｈｉ ３７０）とスワーナ（ｓｗａｒｎａ）の種子は、ディレクトレート・オブ・ライス・リサーチ（Ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ Ｏｆ Ｒｉｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ；ＤＲＲ， Ｈｙｄｅｒａｂａｄ， Ｉｎｄｉａ）から提供された。
【００３９】
培地：ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ ｓｋｏｏｇ， １９６２）はＭｓ塩類（ＭＳ−多量養素、ＭＳ−微量栄養素）、ＦｅＥＤＴＡ、０．５ｍｇ／Ｌのピロドキシン、１．０ｍｇ／Ｌのチアミン、０．５ｍｇ／Ｌのニコチン酸、３０ｇ／Ｌのサッカロース、２．６ｇ／Ｌのフィタゲル（ｐｈｙｔａｇｅｌ）から構成される。
【００４０】
ＭＳＯ培地は、３０ｇ／Ｌのマンニトールと３０ｇ／Ｌのソルビトールを補充したＭＳ培地である。
【００４１】
第１の選択のためのＲＣ培地には、３０ｍｇ／Ｌのヒグロマイシン（ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）を含む。
【００４２】
第２の選択のためのＣＣ培地は、５０ｍｇ／Ｌのヒグロマイシン、３００ｍｇ／Ｌのカゼイン加水分解物、５００ｇｍ／Ｌのプロリンを含む。
【００４３】
前再生培地は、３０ｇ／Ｌのマルトース、５０ｍｇ／Ｌのヒグロマイシン、２ｍｇ／Ｌのキネチン、１ｍｇ／Ｌのナフチレン酢酸、５ｍｇ／Ｌのアブシジン酸を含む。
【００４４】
再生培地は、３０ｇ／Ｌのマルトース、５０ｍｇ／Ｌのヒグロマイシン、２．５ｍｇ／Ｌのキネチン、０．１ｍｇ／Ｌのナフチレン酢酸を含む。
【００４５】
発根のための１／Ｓ ＭＳ培地は、１／２ ＭＳ 塩類、１／２ Ｂ５ ビタミン類、１０ｍｇ／Ｌのサッカロースを含む。
【００４６】
カルス誘導および再生可能なカルスの選択：脱殻した成熟した種子を、７０％のエタノール中で２分間、続いて５０％の市販の漂白剤中で３０分間、表面について消毒をした。この種子を、次に、滅菌水で濯いだ。当該種子を、次に、ＭＳ培地を含むペトリ皿におき、２５℃で１４日間、暗所でインキュベートした。胚盤領域から誘導された初代カルスを取り、新鮮なＭＳ培地上で１週間に亘って同様な条件でサブカルチャーした。当該サブカルチャーの後で、多くのルーズに（ｌｏｏｓｅｌｙ）付いた小さな球状のカルスが、夫々のコンパクトな初代カルスの先端に出現した。これを丁寧に取り外し、新鮮なＭＳ培地上においた。直径１−３ｍｍのカルスを形質転換に使用した。
【００４７】
サブカルチャーしたカルスの砲撃（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）のための準備：約６０の直径２−３ｍｍの胚形成カルスを、浸透培地を含むペトリ皿の中央においた。この培地上での４時間のインキュベーションの後、当該カルスを、直ちに、粒子加速装置、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅを使用する微小発射体砲撃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）に供した。
【００４８】
微小発射体を介した形質転換：使用したバイオリスティックガン（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｇｕｎ）は、ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ銃（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｄ， ＵＳＡ）である。使用した金の大きさは、１．５−３．０μの間である。破裂板圧（ｒｕｐｔｕｒｅ ｄｉｓｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ）は１１００ｐｓｉであり、このとき、ヘリウム圧は１２００ｐｓｉであるべきであった。２５ｍｇ／Ｈｇの真空は、当該銃のチャンバーにおいて作り出された。使用されたＤＮＡの濃度は５μｇ／μＬであった。
【００４９】
金懸濁液の調製：６ｍｇの金粒子を量り取り、これに対して１００μＬの１００％のエタノールを添加し、１分間、ボルテックスに掛けた。これを１０秒間、１００００ｒｐｍで遠心分離した。その上清をピペットで吸い出し、そのペレットに１００μＬの滅菌蒸留水を添加した。これをボルテックスに掛け、遠心分離し、同様の手順を繰り返した。５０μＬの最終金懸濁液を当該砲撃に使用した。
【００５０】
粒子のコーティングプロトコール：５０μＬの金懸濁液に対して、５μｇのＤＮＡを添加し、十分に混合した。これに対して、２０μＬの０．１Ｍのスペルミジン（Ｓｉｇｍａ， Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、ボルテックス上で低速で混合した。５０μＬの２．５ＭのＣａＣｌ２を添加し、十分に混合した。この混合物を室温に１０分間放置した。それを１０秒間、１００００ｒｐｍで遠心分離し、その上清をピペットで捨て、そのペレットに対して５０μＬの１００％エタノールを加えた。そのサンプルの１０μＬを使用し、マクロキャリアをコートし、その膜を乾燥させ、形質転換に使用した。当該形質転換の後、当該細胞はその同じ皿に維持し、１６時間暗所でインキュベートした。
【００５１】
砲撃された細胞の成長および選択：１６時間後、当該カルスを選択のためのＲＣ３０培地に移し、２５℃、暗所で、２１日間インキュベートした。耐性カルスをＣＣ５０培地に移し、暗所で１８日間インキュベートした。耐性カルスのみを前再生培地に１週間移した。増殖中のカルスを再生培地に、１６時間明および８時間暗の光期間で、２５℃で維持した。植物が再生されたときに、それらは１／２ ＭＳ培地を含む試験管に移された。
【００５２】
形質転換の解析には、多種多様な手段があるだろう：
１．導入遺伝子の存在をサザンハイブリッドにより、適切なプローブ（ｃＤＮＡクローン類、オリゴヌクレオチド類）を用いて試験し得る。ＲＮＡへの当該遺伝子の発現は、ノーザンブロットにより解析され、当該ｍＲＮＡの配列は、ＲＴ−ＰＣＲ法の後に続いて得られ得る。
【００５３】
２．当該タンパク質の移入に続く、単一特異性であるｎａｄ９に対する抗血清の使用があるだろう。
【００５４】
３．コンプレックスＩにおけるタンパク質の統合と、推定されるミスアッセンブリにより引き起こされる損傷の判断は、免疫親和性の新しい技術を用いて評価でき得る。
【００５５】
４．葯の組織学的解析は、トルイデンブルーを用いて超微細構造分析で実施され得る。
【００５６】
５．収穫を評価するためのひこばえ（ｔｉｌｌｅｒ）、種子の数、植物の丈における基本的な育種試験が実施され得る。
【００５７】
６．異種交配が、編集されたおよび未編集のｎａｄ９形質転換イネ植物の間で行われ、稔性回復が評価され得る。
【００５８】
７．花粉生存能力は、指定された培地における花粉の成長能力によって評価される。
【００５９】
【参考文献】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
ミトコンドリアの標的配列のクローニングを示す図である。
【図２】
編集されたｎａｄ９プラスミドを示す図である。
【図３】
編集されないｎａｄ９プラスミドを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004500094.tif 000031
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500094.tif 000032
2004500094.tif 000033
【国際調査報告】
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2004500094.tif 000035