(57)【要約】老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａをコードする遺伝子もしくは遺伝子断片もしくはその両方をアンチセンス方向で植物のゲノム中へと組み込むことによって、植物における老化等のプログラム細胞死の発現の調節が達成される。老化により誘導されるデオキシプシンシンターゼ及び老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａをコードする植物遺伝子が同定され、そして各ヌクレオチド配列が単一又は組み合わせて用いられトランスジェニック植物の老化に変化を与える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物において生理疾患に対する耐性を高める方法であって、前記方法は、
（１）  植物のゲノム中にベクターを組み込み；
（２）  前記植物を生長させる；
ことを含んで成り、前記ベクターは、
（Ａ）  アンチセンスヌクレオチド配列、
（Ｂ）  前記アンチセンスヌクレオチド配列が発現されるように、当該アンチセンスヌクレオチド配列に対して作用可能式に連結された調節配列、
を含んで成り、前記アンチセンスヌクレオチド配列は、
（ｉ）  老化により誘導される内生のデオキシヒプシンシンターゼの３´末端をコードするＤＮＡ分子の一本鎖の対応する部分（ここで、前記老化により誘導される内生のデオキシヒプシンシンターゼをコードするＤＮＡ分子が配列番号：３１とハイブリダイズする）、
（ｉｉ）  老化により誘導される内生のデオキシヒプシンシンターゼ遺伝子の３´末端によってコードされるＲＮＡ配列の少なくとも一部分、
（ｉｉｉ）  老化により誘導される内生のｅｌＦ−５Ａ遺伝子をコードするＤＮＡ分子の一本鎖の対応する部分（ここで、前記老化により誘導される内生のｅｌＦ−５Ａ遺伝子をコードするＤＮＡ分子が配列番号：１１、配列番号：１３及び／又は配列番号：１５とハイブリダイズする）、
（ｉｖ）  老化により誘導される内生のｅｌＦ−５Ａ遺伝子によりコードされるＲＮＡ配列の対応する部分、又は、
（ｖ）  （ｉ）もしくは（ｉｉ）と、（ｉｉｉ）もしくは（ｉｖ）との組み合わせ、
に対して実質上相補的であり、これによって、前記アンチセンスヌクレオチド配列が転写され、そして前記ＲＮＡ配列に結合し、これにより前記老化により誘導されるデオキシヒプシンシンターゼ遺伝子、老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子、又はその両方の発現が阻害される、
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記疾患が尻腐れ（ｂｌｏｓｓｏｍ ｅｎｄ ｒｏｔ ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
植物及びその子孫であって、ここで前記植物は、老化により誘導されるデオキシヒプシンシンターゼ、老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ、又はその両方の発現が阻害又は減少している細胞に由来し、ここで前記細胞は、
（１）  細胞のゲノム中にベクターを組み込み；
（２）  前記細胞を増殖させる；
ことによって生産され、前記ベクターは、
（Ａ）  アンチセンスヌクレオチド配列、
（Ｂ）  前記アンチセンスヌクレオチド配列が発現されるように、当該アンチセンスヌクレオチド配列に対して作用可能式に連結された調節配列、
を含んで成り、前記アンチセンスヌクレオチド配列は、
（ｉ）  老化により誘導される内生のデオキシヒプシンシンターゼの３´末端をコードするＤＮＡ分子の一本鎖の対応する部分（ここで、前記老化により誘導される内生のデオキシヒプシンシンターゼをコードするＤＮＡ分子が配列番号：３１とハイブリダイズする）、
（ｉｉ）  老化により誘導される内生のデオキシヒプシンシンターゼ遺伝子の３´末端によってコードされるＲＮＡ配列の対応する部分、
（ｉｉｉ）  老化により誘導される内生のｅｌＦ−５Ａ遺伝子をコードするＤＮＡ分子の一本鎖の対応する部分（ここで、前記老化により誘導される内生のｅｌＦ−５Ａ遺伝子をコードするＤＮＡ分子が配列番号：１１、配列番号：１３及び／又は配列番号：１５とハイブリダイズする）、
（ｉｖ）  老化により誘導される内生のｅｌＦ−５Ａ遺伝子によりコードされるＲＮＡ配列の対応する部分、又は、
（ｖ）  （ｉ）もしくは（ｉｉ）と、（ｉｉｉ）もしくは（ｉｖ）との組み合わせ、
に対して実質上相補的であり、これによって、前記アンチセンスヌクレオチド配列が転写され、そして前記ＲＮＡ配列に結合し、これにより前記老化により誘導されるデオキシヒプシンシンターゼ遺伝子、老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子、又はその両方の発現が阻害される、
ことによって生産される細胞由来の植物及びその子孫。
【請求項４】
前記植物がトマトである、請求項３に記載の植物及び子孫。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、老化により誘導される発現（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ）を示す植物ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関連する。本発明は、アンチセンス方向において前記ポリヌクレオチドを含有するトランスジェニック植物、及び老化等の、植物におけるプログラム細胞死を抑制する方法にも関連する。更に詳細に、本発明は、それらの発現が老化等のプログラム細胞死の開始により誘発される老化により誘導される植物デオキシヒプシンシンターゼ遺伝子、及び老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子に関連し、並びにデオキシヒプシンシンターゼ遺伝子及びｅｌＦ−５Ａ遺伝子を単独又は組み合わせて使用して、植物におけるプログラム細胞死及び老化を抑制することに関連する。
【０００２】
従来技術の説明
老化は植物の生命における生物学的分化の最終段階である。それは死の前兆となり、そして生物組織、例えば、植物全体、器官、花及び果実、組織及び各細胞の様々なレベルで生ずる。
【０００３】
老化の開始は内的及び外的な様々な因子によって誘導される。老化は、植物体又は植物組織、例えば果実、花及び葉の寿命における、複雑な、非常に調節がなされた生長段階である。老化は、細胞膜及びマクロ分子の全体的な破壊（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ）をもたらし、そしてその後の植物体の他の部分への代謝産物の流動化につながる。
【０００４】
通常の植物生長の間に起こるプログラムされた老化に加えて、外部の、環境因子に対する組織的応答（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）として細胞及び組織の死、並びにそれに続く代謝産物の再流動化が生ずる。ネクローシス又はアポトーシスともいわれる老化の未成熟開始（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）を誘導する外部因子としては、温度、日照、光又は栄養供給の不足、並びに病原菌による攻撃のような環境ストレスが挙げられる。環境ストレスにさらされる植物組織は、エチレンをも生産する。それは一般にストレスエチレンとして知られている（Ｂｕｃｈａｎｅｎ−Ｗｏｌｌａｓｔｏｎ， Ｖ． １９９７， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｏｔａｎｙ． ４８ ： １８１−１９９ ； Ｗｒｉｇｈｔ， Ｍ， １９７４， Ｐｌａｎｔ， １２０ ： ６３−６９ ）。ある植物ではエチレンにより老化が生ずることが知られている。
【０００５】
老化は、受動的な作用ではなく、正確に言えば、むしろ積極的な調節がなされる作用であって特定の遺伝子の組織的な発現に伴って生ずる。老化の間、総ＲＮＡのレベルが低下して多くの遺伝子の発現がスイッチ・オフになる（Ｂａｔｅら、１９９１， Ｊ． Ｅｘｐｅｒ． Ｂｏｔａｎｙ， ４２， ８０１−１１ ； Ｈｅｎｓｅｌ ら、１９９３， Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， ５， ５５３−６４）。しかし、老化作用が核遺伝子のｄｅ ｎｏｖｏ転写に依存する更なる証拠がある。例えば、ｍＲＮＡ及びタンパク質合成の阻害物質及び核の摘出により老化が遮断される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写実験の為の老化している葉及び生きいきした葉由来のｍＲＮＡを用いる分子研究により、老化している葉では葉のタンパク質産物のパターンが変化していることが示された（Ｔｈｏｍａｓら、１９９２， Ｊ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｎ．， １３９， ４０３−１２）。ディファレンシャルスクリーニング及び消去式ハイブリダイゼーション法を利用することにより、老化により誘導される遺伝子を示す多くのｃＤＮＡクローンが様々な異なる単子葉及び双子葉等の植物から同定された。植物の例としては、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ）、ナタネ、キュウリ、アスパラガス、トマト、コメ及びジャガイモが挙げられる。老化の間に有意に発現する遺伝子を同定することは、老化が進む為にはｄｅ  ｎｏｖｏ転写が必要であることの確かな証拠である。
【０００６】
老化の間に起こる事象とは、ネクローシス及び死が起こる前に細胞成分を最大に使用する為の非常に組織的な事象のようだ。遺伝子発現の特異的シグナルの認知及びカスケードの誘導に伴う複合反応が生じてこの作用の調節が生ずるに違いない。老化に関係するタンパク質をコードする遺伝子の発現は、共通のアクチベータータンパク質によりおそらく調節されている。そのアクチベータータンパク質は、ホルモンシグナルにより直接又は間接的に順番に活性化される。前記作用の初期シグナリング又はその後の協調の機構についてはほとんど分かっていない。
【０００７】
開始因子等の転写及び翻訳に伴う因子が、協調遺伝子発現（ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ）には必要である。植物等、様々な生物において翻訳開始因子の遺伝子が同定及び特性決定されて来た。真核生物の翻訳開始因子５Ａ（ｅｌＦ−５Ａ）は、大きさ約１７ｋＤａ の必須タンパク質因子であり、真核細胞のタンパク質合成の開始に関わる。ｅｌＦ−５Ａが特徴とするのはそれにのみ存在することが知られている。固有の修飾アミノ酸、ヒプシン〔Ｎ−（４−アミノ−２−ヒドロキシブチル）リジン〕の存在である。ｅｌＦ−５Ａ中のあるリジン残基のアミノ基側鎖に対してポリアミン、スペルミジン由来のブチルアミノ基を転移及びヒドロキシル化することにより、翻訳後にヒプシンが形成される。ｅｌＦ−５Ａの活性化には、スペルミジンのブチルアミン残基をｅｌＦ−５Ａのリジンに移し、ヒプシンを形成してｅｌＦ−５Ａを活性化する必要がある。真核生物では、デオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＳ）は、ｅｌＦ−５Ａにおけるヒプシンの翻訳後合成を仲介する。植物において対応するＤＨＳ遺伝子が同定されて来たが、しかし、植物のｅｌＦ−５Ａがヒプシンを含むことは公知である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｅｌＦ−５Ａ−活性にはヒプシンの修飾が不可欠であることがメチオニルピューロマイシンアッセイを用いて示されて来た。
【０００８】
ヒプシンはｅｌＦ−５Ａ中に固有に存在し、そして真正細菌以外、全ての真核生物、（真核生物に関係するような）ある古細菌中で見出される。更に、ｅｌＦ−５Ａのアミノ酸配列はヒプシン残基周辺の領域では特に非常に保存されており、これは、ｅｌＦ−５Ａ及びその活性化タンパク質、デオキシヒプシンシンターゼが真核細胞生理学において基本的に重要な段階を行うことを示唆している（Ｊｏｅ ら、ＪＢＣ， ２７０ ： ２２３８６−２２３９２， １９９５）。ヒト、アルファルファ、粘菌変形菌、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ）、タバコ及び酵母からｅｌＦ−５Ａがクローン化されて来た。ｅｌＦ−５Ａはその分離性に基づき、ウサギ、網状赤血球溶解物のリボソームから最初通常の翻訳開始因子として同定され、メチオニン−ピューロマイシン合成を刺激するそのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性が同定された。しかし、更に最近のデータによると、ｅｌＦ−５Ａは広範囲なタンパク質合成の為の翻訳開始因子ではなく、むしろある一部のｍＲＮＡ集団の翻訳を促すのに働くことが示されている。例えば、ｅｌＦ−５Ａの１又は複数のイソ型は、細胞増殖に関連するある一部のｍＲＮＡの翻訳を仲介する重要な役割を果たすという動物系細胞及び酵母による実験からの有力な証拠がある。酵母においては２つのイソ型があり、そしてもし両方の遺伝子がサイレントであるならば、細胞は分裂できないだろう（Ｐａｒｋら、Ｂｉｏｌ． Ｓｉｇｎａｌｓ， ６ ： １１５−１２３， １９９７）。類似して、酵母のｅｌＦ−５Ａを活性化するデオキシヒプシンシンターゼの発現のサイレンシングにより細胞分裂は遮断される。実際に、デオキシヒプシンシンターゼの阻害物質が開発されて来た。それらは増殖過剰（ｈｙｐｅｒｐｒｏ／ｉｔｅｒａｔｉｖｅ）症状の治療における重要性を持つようだ（Ｗｏｌｆｆ ら、ＪＢＣ， ２７２ ： １５８６５−１５８７１， １９９７）。他の研究により示されたことは、ｅｌＦ−５Ａの他のイソ型が、ＨＩＶ−Ｉ複製のＲｅｖ機能又はＨＴＬＶＶ複製のＲｅｘ機能に不可欠であることだ（Ｐａｒｋら、Ｂｉｏｌ． Ｓｉｇｎａｌｓ， ６ ： １１５−１２３， １９９７）。タバコにおいてはｅｌＦ−５Ａ遺伝子が２つ以上発現している。試験した全組織中でそれらは共に発現しているが、各遺伝子は、独特の発現パターンを有し、おそらくある転写産物の翻訳を調節していることが、遺伝子特異的プローブにより示される（Ｃｈａｗｒｏｔら、Ｎａｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ， ２０ ： ６２５−６６９， １９９２）。
【０００９】
ラット精巣、ＨｅＬａ細胞、アカパンカビ及び酵母からデオキシヒプシンシンターゼが精製されて来た。デオキシヒプシンシンターゼのアミノ酸配列は非常に保存されており、そして様々な種に由来する酵素は類似する生理的及び酵素的特性を共有し、そしてヘテロｅｌＦ−５Ａ前駆体による異種反応性を示す（Ｐａｒｋら、６ Ｂｉｏｌ． Ｓｉｇｎａｌｓ， ６ ： １１５−１２３， １９９７）。
【００１０】
花芽誘導、胚形成、病原耐性、細胞増殖、分化及び分裂等幅広い様々な生理作用に植物ポリアミンは関係している（Ｅｖａｎｓら、１９８９， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４０， ２３５−２６９；及び Ｇａｌｓｔｏｎら、１９９０， Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ９４， ４０６−１０）。ポリアミンがその作用を発揮する場合、ｅｌＦ−５Ａが介在することが示唆されて来た（Ｃｈａｍｏｔ ら、１９９２， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０（４）， ６６５−６９）。
【００１１】
タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ）由来のｅｌＦ−５Ａのイソ型をコードする２つの遺伝子（ＮｅｌＦ−５Ａ１及びＮｅｌＦ−５Ａ２）が同定されて来た（Ｃｈａｍｏｔら、１９９２， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０（４）， ６６５−６９）。前記遺伝子同士は非常に類似しているようだった。しかし、それらは異なる発現パターンを示す。ｍＲＮＡレベルに応じて常時発現しているような遺伝子もあれば、光合成活性の有無と関連する発現パターンのものもある。遺伝子構造及びゲノムサザンマッピングに基づき示唆されて来たことは、タバコにおいてはＮｅｌＦ−５Ａ遺伝子の多遺伝子ファミリーがあることだ。一部の老化／ネクローシス特異的ｍＲＮＡ転写産物の翻訳を調節するｅｌＦ−５Ａイソ型があるようだ。
【００１２】
内部の又は環境ストレス等の外部因子によって生ずるプログラム細胞死（老化等）の開始を抑制する為に幅広く適用できる方法が現在はない。故に、課題は、全ての種類の植物に対して適用可能であり且つ老化につながる事象の最も初期のカスケードで有効である、老化調節技術を開発することである。
【００１３】
発明の概要
本発明は、トマト老化により誘導されるデオキシヒプシンシンターゼ（ＤＨＳ）をコードする完全長ｃＤＮＡクローン、並びにシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ）の葉及びカーネーションの花弁に由来する老化により誘導されるＤＨＳの完全長ｃＤＮＡクローンの発見及びクローニングに基づく。本明細書中にヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が開示されている。
【００１４】
本発明は、幾分、トマト、シロイヌナズナ及びカーネーションに由来する老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子をコードする完全長ｃＤＮＡクローンの発見及びクローニングに基づく。本明細書中にｅｌＦ−５ＡｃＤＮＡクローンの各ヌクレオチド配列及び対応するアミノ酸配列が開示されている。
【００１５】
本発明は、植物の遺伝子を改変して、老化、年齢に関係する老化又は環境ストレスにより誘導される老化、の開始を抑制する方法を供する。本発明の老化により誘導されるＤＨＳヌクレオチド配列、その断片、又はかかる断片の組み合わせ、が逆向きに植物細胞中へと導入されて老化により誘導される内生のＤＨＳ遺伝子の発現が抑制される。それによって内生の老化により誘導されるＤＨＳタンパク質のレベルが下がり、そしてｅｌＦ−５Ａの活性化及びそれに続く老化を仲介する遺伝子の発現が抑制及び／又は妨害される。
【００１６】
本発明の他の観点において、本発明の老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａのヌクレオチド配列、その断片、又はかかる断片の組み合わせが逆向きに植物細胞中に導入され内生の老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子の発現が阻害される。それによって老化により誘導される内生のｅｌＦ−５Ａタンパク質のレベルが下がり、そしてそれに続く老化に関わる遺伝子の発現が抑制及び／又は妨害される。代わりに、ＤＨＳ配列及びｅｌＦ−５Ａ配列が両方一緒に用いられて内生のＤＨＳタンパク質及び内生のｅｌＦ−５Ａタンパク質のレベルが下げられる。
【００１７】
更に他の観点では、本発明は植物遺伝子の改変を行い、老化、年齢に関連する老化又は環境ストレスによる老化、の開始を抑制する方法に関する。その方法とは、本発明の老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａヌクレオチド配列及び本発明の老化により誘導されるＤＨＳヌクレオチド配列の組み合わせを逆向きに植物細胞中に導入して内生の、老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子及び老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の発現を阻害することによって、老化により誘導される内生のＤＨＳタンパク質のレベルを下げ、そしてｅｌＦ−５Ａの活性化及びそれに続く老化に関わる遺伝子の発現を低下及び／又は妨害することによる。
【００１８】
更に他の観点において、本発明は、植物の遺伝子の改変をし（限定ではないが、尻腐れ等）生理疾患に対する耐性を高める方法に関する。その方法とは、本発明の老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａヌクレオチド配列及び／もしくは本発明の老化により誘導されるＤＨＳヌクレオチド配列の組み合わせを逆向きに植物細胞中に導入して、老化により誘導される内生のｅｌＦ−５Ａ遺伝子及び／もしくは老化により誘導される内生のＤＨＳ遺伝子の発現を阻害する。それによって、老化により誘導される内生のＤＨＳタンパク質のレベルを下げ、そして／又はｅｌＦ−５Ａの活性化及びそれに続く老化を仲介する遺伝子の発現を抑制及び／もしくは妨害することによる。特に好適な観点では、老化により誘導される内生のＤＨＳの３′末端が逆向きに導入されている。
【００１９】
本発明の方法を用いることで、トランスジェニック植物が生成されて、生長、分化及び天然又は早期に誘導される老化についてのモニタリングがなされる。老化により誘導されるＤＨＳ、老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ又はその両方のレベルが減少することにより（例えば、花の寿命が伸びたこと、果実もしくは野菜の損傷が減ったこと、バイオマスの増加、種子の収量の増加（尻腐れ等）生理疾患に対する耐性の高まり、種子の加齢化の抑制及び／もしくは葉の黄変の抑制等）寿命又は棚寿命の延びを示す（挿し木、花、野菜、果実、種子又は葉等の）植物又は植物の切り離した部分は、葉の黄変化の抑制、花弁の器官脱離の抑制、輸送及び保存の間の果実及び野菜の損傷の減少等の向上した特性を有する所望の生産物として選択される。これらの優れた植物が普及している。類似して、環境ストレスに対する耐性の高まりを示す植物が優れた植物が高品質な生産物として選択される。それは例えば、低温（凍結）、干ばつ、感染症等に対する感受性を低くした植物、並びに／又は病原菌及び／もしくは生理疾患に対する耐性を高めたような植物である。
【００２０】
ある観点において、本発明は、老化により誘導されるＤＨＳをコードする単離されたＤＮＡ分子に関する。ここで、前記ＤＮＡ分子は配列番号：１とハイブリダイズする。又は本発明は、配列番号：１とハイブリダイズする前記単離ＤＮＡの機能的誘導体に関する。本発明のこのような観点のある実施態様において、前記単離されたＤＮＡ分子は、配列番号：１のヌクレオチド配列を有する。即ち、配列番号：１と１００％の相補性（配列の同一性）を有するということである。
【００２１】
本発明は、老化により誘導されるＤＨＳをコードする単離されたＤＮＡ分子に関する。ここで、前記ＤＮＡ分子は配列番号：９とハイブリダイズする。又は本発明は、配列番号：９とハイブリダイズする前記単離されたＤＮＡの機能的誘導体に関する。本発明のこのような観点のある実施態様において、単離されたＤＮＡ分子は、配列番号：９のヌクレオチド配列を有する。即ち、配列番号：９に対して１００％相補性（配列の同一性）を有する。
【００２２】
本発明は、老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａをコードする単離されたＤＮＡ分子に関する。ここで、前記ＤＮＡ分子は配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５とハイブリダイズする。又は本発明は、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５とハイブリダイズする前記単離されたＤＮＡの機能的誘導体に関する。本発明のこのような観点のある実施態様において、単離されたＤＮＡ分子は、配列番号：１１、配列番号：１３又は配列番号：１５のヌクレオチド配列を有する。即ち、配列番号：１１、配列番号：１３、又は配列番号：１５に対して１００％相補性（配列の同一性）を有する。
【００２３】
本発明の他の実施態様では、本明細書で先に記載のＤＮＡ分子によりコードされる単離されるタンパク質、又はその機能的な誘導体が提供される。好適なタンパク質は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質、又はその機能的な誘導体である。他の好ましいタンパク質は、配列番号：１０のアミノ酸配列を有するタンパク質、又はその機能的な誘導体である。本発明の他の好ましいタンパク質は、配列番号：１２、配列番号：１４又は配列番号：１６のアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【００２４】
本明細書中では、本明細書中で先に記載のＤＮＡ分子のＲＮＡ転写産物の対応する部分に対して相補的なＲＮＡ分子をコードするアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドも提供される。この部分で前記オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドがＲＮＡ転写産物とハイブリダイズすることにより、老化により誘導される内生のＤＨＳの発現が変化する。本発明のこの観点の他の実施態様では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドはＲＮＡ分子であり、それが、本明細書中で先に記載のＤＮＡ分子のＲＮＡ転写産物の対応する部分とハイブリダイズすることにより、老化により誘導される内生のｅｌＦ−５Ａの発現が変化する。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドは完全長もしくは約６〜約１００ヌクレオチドであって良い。
【００２５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドは、老化により誘導されるＤＨＳをコードするＤＮＡ分子の、一本鎖の対応する部分（ここで老化により誘導されるＤＨＳをコードする前記ＤＮＡ分子は、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：９又はこの組み合わせとハイブリダイズする）、に対して実質上相補的であって良く、又は老化により誘導されるＤＨＳをコードするＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ配列の少なくとも対応する部分に対して実質上相補的であって良い。本発明のある実施態様において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドは、一本鎖のヌクレオチド配列、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：９もしくはこの組み合わせ、又は配列番号：１、配列番号：５、配列番号：９もしくはこの組み合わせから転写されるＲＮＡ転写産物に対して実質上相補的である。他の実施態様において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、老化により誘導されるＤＨＳをコードするＤＮＡ分子の一本鎖の５′非コーディング部分もしくは３′部分の対応する部分（ここで前記ＤＮＡ分子は、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：９又はこの組み合わせとハイブリダイズする）に対して実質上相補的である。
【００２６】
代わって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドは、老化により誘導されるｅｌＦ−５ＡをコードするＤＮＡ分子の一本鎖の対応する部分（ここで老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａをコードする前記ＤＮＡ分子は配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、もしくはこの任意の組み合わせとハイブリダイズする）に対して実質上相補的であって良く、又は番号：１１、配列番号：１３、番号：１５から転写されたＲＮＡ配列の少なくとも対応する部分に対して実質上相補的であって良い。本発明のある実施態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドは、一本鎖のヌクレオチド配列、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５もしくはこの組み合わせの対応する部分に対して実質上相補的であるか、又はコードされるＲＮＡ転写産物は、老化により誘導されるｅｌＦ−５ＡをコードするＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ配列の対応する部分に対して実質上相補的である。他の実施態様において、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、老化により誘導されるｅｌＦ−５ＡをコードするＤＮＡ分子の一本鎖の５′非コーディング領域もしくは３′領域の対応する部分（ここで前記ＤＮＡ分子は配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５又はこの組み合わせとハイブリダイズする）に対して実質上相補的である。
【００２７】
本発明は更に、植物細胞を形質転換させる為のベクターに関する。そのベクターは、
（ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドであって、（１）老化により誘導されるＤＨＳをコードするＤＮＡ分子の一本鎖の対応する部分（ここで、老化により誘導されるＤＨＳをコードする前記ＤＮＡ分子が、配列番号：１、配列番号：５、又は配列番号：９とハイブリダイズする）に対して、又は（２）老化により誘導されるＤＨＳをコードする前記ＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ配列の対応する部分に対して、実質上相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチド；並びに
（ｂ）調節配列であって、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドに対して作用可能式に連結され、それによって植物細胞中で当該アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドが発現され、植物細胞が形質転換する調節配列、
を含んで成る。
【００２８】
本発明は更に、植物細胞を形質転換させる為のベクターに関する。そのベクターは、
（ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドであって、それは（１）老化により誘導されるｅｌＦ−５ＡをコードするＤＮＡ分子の一本鎖の対応する部分（ここで老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａをコードする前記ＤＮＡ分子が、配列番号：１１、配列番号：１３、又は配列番号１５とハイブリダイズする）に対して、又は（２）老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａをコードする前記ＤＮＡ分子によりコードされるＲＮＡ配列の対応する部分に対して、実質上相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチド；並びに
（ｂ）調節配列であって、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドに対して作用可能式に連結され、それによって植物細胞中で当該アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドが発現され、植物細胞が形質転換する調節配列、
を含んで成る。
【００２９】
調節配列には形質転換された植物細胞において機能的なプロモーターが含まれ、そのプロモーターは誘導性又は構造性であって良い。任意的に、調節配列にはポリアデニル化シグナルが含まれる。
【００３０】
本発明は、上記ベクターもしくはベクターの組み合わせにより形質転換した植物細胞、かかる細胞から生じた苗木もしくは成熟植物、もしくはかかる苗木もしくは植物の植物部分をも提供する。
【００３１】
本発明は更に、未改変の植物に比べて、老化により誘導されるＤＨＳ、老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ又はその両方のレベルが低い植物を生産する方法に関する。その方法は：
（１）上記ベクター又はベクターの組み合わせにより植物を形質転換し；
（２）苗木状態以上へと植物を生長させ；
（３）老化により誘導されるＤＨＳ活性及び／もしくはｅｌＦ−５Ａ活性の変化、並びに／又は老化の変化及び／もしくは環境ストレスにより誘導される老化の変化、及び／もしくは病原体により誘導される老化、及び／もしくはエチレンにより誘導される老化の変化について、形質転換した植物もしくは苗木をアッセイし；そして
（４）非形質転換植物に比べて、老化により誘導されるＤＨＳの活性の変化及び／もしくはｅｌＦ−５Ａ抑制、並びに／又は老化の変化、及び／もしくは環境ストレス誘導による老化の変化及び／もしくは病原体が誘導する老化の変化、及び／もしくはエチレンが誘導する老化の変化を有する植物を選択して生長させること：
を含んで成る。
【００３２】
老化により誘導されるＤＨＳ発現の減少、老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ活性の減少、もしくはその両方並びに老化の遅延及び／もしくはストレスにより誘導される老化及び／もしくは病原体により誘導される老化及び／もしくはエチレン誘導老化の遅延を、上記のようにして生産した植物、もしくはその子孫、ハイブリッド植物、クローン植物もしくは植物の部分が示すことが好ましい。
【００３３】
本発明は更に、植物において老化により誘導されるＤＨＳの発現を阻害する方法に関する。前記方法は：
（１） 植物のゲノムにベクターを組み込み；
（２） 前記植物を生長させる；
ことを含んで成り、そのベクターが含んで成るのは、
（Ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチド、
（Ｂ）前記アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドが発現されるように当該アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドに作用可能式に連結された調節配列、であり、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドは、（ｉ）老化により誘導される内生のＤＨＳをコードするＤＮＡ分子の一本鎖の少なくとも一部分（ここで老化により誘導されるＤＨＳをコードする前記ＤＮＡ分子が配列番号：１、配列番号：５及び／又は配列番号：９又はこれらの組み合わせとハイブリダイズする）、又は
（ｉｉ）老化により誘導される内生のＤＨＳ遺伝子によりコードされるＲＮＡ配列の少なくとも一部分、
に対して相補的であり、これによって前記アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが転写及び翻訳され、前記内生のＲＮＡに連結し、これにより前記老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の発現が阻害される方法である。
【００３４】
本発明は更に、植物において老化により誘導される内生のｅｌＦ−５Ａの発現を阻害する方法に関する。前記方法は：
（１）植物のゲノムにベクターを組み；
（２）前記植物を生長させる；
ことを含んで成り、そのベクターが含んで成るのは、
（Ａ）アンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチド、
（Ｂ） 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドが発現されるように当該アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドに作用可能式に連結された調節配列、
であり、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはアンチセンスポリヌクレオチドは、（ｉ）老化により誘導される内生のｅｌＦ−５ＡをコードするＤＮＡ分子の一本鎖の対応する部分（ここで老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａをコードする前記ＤＮＡ分子が配列番号：１１、配列番号：１５及び／又は配列番号：１７又はこれらの組み合わせとハイブリダイズする）、又は
（ｉｉ）老化により誘導される内生のｅｌＦ−５Ａ遺伝子によりコードされるＲＮＡ配列の少なくとも一部分、
に対して相補的であり、これによって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドが転写及び翻訳され、前記内生のＲＮＡに連結し、これにより前記老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子の発現が阻害される方法である。
【００３５】
発明の詳細の説明
植物細胞中で老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子、老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子又はその両方の発現を変化させる方法及び組成物が提供される。植物中で、老化により誘導されるＤＨＳ及び老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａの発現を単独もしくは組み合わせにおいて変化させることにより老化開始の遅れ並びに環境ストレス及び病原体に対する耐性の向上がもたらされ、よって植物の棚寿命及び／もしくは生長期間が延びる。
【００３６】
逆転写酵素介在ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、老化により誘導される発現を示すトマトＤＨＳ遺伝子をコードする完全長ｃＤＮＡ配列が単離されて来た。ＲＴ−ＰＣＲでは、冷害を受けたトマトの葉から単離されたＲＮＡを鋳型として用い、そしてそのＲＴ−ＰＣＲ産物を用いて冷害を受けた、ソルビトール処理されたトマト葉のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングをする。環境ストレス（凍結）を受けたトマトの葉、（デヒドロ）ソルビトール処理されたトマトの葉、成熟したトマトの果実及び老化したトマトの花において、単離されたトマト葉ｃＤＮＡ配列の選択される領域に対応するポリヌクレオチドプローブ並びに完全長トマト葉ｃＤＮＡを用い、ＤＨＳ遺伝子をコードするｍＲＮＡの存在を特定する。
【００３７】
シロイヌナズナＤＨＳゲノムクローンから設計されたプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物を生成する。鋳型として老化シロイヌナズナ葉ｃＤＮＡライブラリーを用いる。シロイヌナズナヌクレオチド配列は、７３％のヌクレオチド配列の同一性及び８１％のアミノ酸配列の同一性を老化により誘導されるトマトＤＨＳの対応する配列に対して持つ。
【００３８】
ＲＴ−ＰＣＲを用いることによって本発明の老化により誘導されるトマトＤＨＳ遺伝子が単離された。トマトＤＨＳ遺伝子を単離するのに用いた上流プライマーは、２４ヌクレオチドプライマー：５’ ＡＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＡＧＧ ＴＧＣ ＴＣＧ ＴＣＣ ＴＧＡ Ｔ ３’（配列番号：３）であり；下流プライマーは、３４個のヌクレオチドを有する：５’ Ｇ ＡＣＴ ＧＣＡ ＧＴＣ ＧＡＣ ＡＴＣ ＧＡＴ （Ｔ）１５ ３’ （配列番号：４）である。１００ｐｍｏｌの下流プライマーを用いる標準ＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡの第１鎖が単離された。次いで上流及び下流プライマーの両方を用いるＲＴ−ＰＣＲにおいて、第１鎖は鋳型として用いられた。アガロースゲル上でのＲＴ−ＰＣＲ産物の分離により、大きさ約１．５ｋｂ〜６００ｂｐの３つの異なるバンドの存在が明らかになった。各々上流及び下流プライマー中に在るＸｂａｌＩ及びＳａｌＩクローニングサイトを用いてこれら３つの断片をプラスミドベクター、ｐＢｌｕ  ｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＬａＪｏｌｌａ， ＣＡ ）中でサブクローニングされた。そして配列決定された。Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋデータベース中に在る配列と前記断片の配列を比較及び位置合わせをした（ａｌｉｇｎｅｄ ）。１．５ｋｂ及び１ｋｂの断片はトマトＤＨＳ配列であることが結果により分かった。６００ｂｐの断片のヒト、酵母及びニューロスポラＤＨＳ配列との位置合わせもした。
【００３９】
６００ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ断片を用いてトマトＣＶ、マッチＦ１雑種ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングをした。そのｃＤＮＡライブラリーは、２Ｍのソルビトールで６時間に渡り処理して脱水させたトマトの葉から得たＲＮＡから作製された。λＺａｐ（登録商標）ｃＤＮＡライブラリーキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＬａＪｏｌｌａ ＣＡ）を用いて前記ｃＤＮＡライブラリーが作製された。老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子に対応する３つの同じ陽性完全長ｃＤＮＡクローンが得られて配列決定された。老化により誘導されるＤＨＳ ｃＤＮＡのクローンのヌクレオチド配列は配列番号：１に示されている。前記ｃＤＮＡクローンは、分子量４２．１ｋＤａ と計算された３８１アミノ酸ポリペプチド（配列番号：２）をコードする。
【００４０】
老化に関連する分化中、及びストレスを受けたトマトの花、果実及び葉における遺伝子の発現パターンに基礎を置く。
【００４１】
シロイヌナズナゲノムバンク（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）において位置合わせをされたトマトＤＨＳ ｃＤＮＡ配列は未確認のゲノム配列だった。結果として未確認のシロイヌナズナゲノム配列（ＡＢ１０７０６０）を有するアライメントが示された。アライメント情報を用いてシロイヌナズナ配列中のオープンリーディングフレームを同定してそれにより予測されるアミノ酸配列がそれより生成された。位置合わせをされたシロイヌナズナＤＨＳ遺伝子の生成されたヌクレオチド及びアミノ酸配列をそれぞれ、配列番号：５（図２Ａ）及び配列番号：６と命名している。
【００４２】
同定されたシロイヌナズナＤＨＳ配列の短い領域に基づく２つのプライマー：プライマー１、５’ ＧＧＴＧＧＴＧＴＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＣ ３’（配列番号：７）；及びプライマー２、５’ ＧＧＧＴＧＣＡＣＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣ ３’（配列番号：８）が生成された。標準ＰＣＲにおいて、２つのプライマーに対する鋳型としてシロイヌナズナ老化葉ｃＤＮＡライブラリーが用いられた。６００ｂｐのＰＣＲ産物が単離及び配列決定されてゲノムＤＨＳ配列の対応する断片の配列と同一であることが示された。
【００４３】
完全長の老化により誘導されるトマトＤＨＳ ｃＤＮＡクローンが用いられて老化により誘導されるシロイヌナズナ及びカーネーションＤＨＳの完全長ｃＤＮＡクローンも単離された。完全長トマトＤＨＳ ｃＤＮＡクローンをプローブとして用いる、シロイヌナズナ葉ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング及び老化カーネーション花弁ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによりシロイヌナズナ及びカーネーションＤＨＳ ｃＤＮＡクローンがそれぞれ単離された。次いでｃＤＮＡライブラリーから得たｃＤＮＡクローンの配列決定がされた。この方法で単離したシロイヌナズナ完全長ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は、トマトｃＤＮＡ配列とのアラインメントによりシロイヌナズナＤＨＳをコードするとして単離されたシロイヌナズナゲノム配列のコーディング領域と同じ配列を持つ（図２Ａ、配列番号：５）。カーネーション花弁の老化により誘導されるＤＨＳ完全長クローンのヌクレオチド配列及び誘導されたアミノ酸配列は図１０に示されている（それぞれ配列番号：９及び配列番号：１０）。
【００４４】
従って、トマト、カーネーション及びシロイヌナズナ由来のＤＨＳをコードする本発明のｃＤＮＡ配列を類似の方法においてプローブとして用い、他の植物由来のＤＨＳ遺伝子を単離することができ、次いで、それはトランスジェニック植物において老化を変化させるのに用いることができる。
【００４５】
老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子はＤＨＳ遺伝子ファミリーのメンバーのようである。ハイブリッド植物から抽出されたゲノムＤＮＡを用いてトマト葉ＤＮＡのゲノムサザンブロット解析が行われた。前記ＤＮＡは様々な制限酵素により切断された。その制限酵素は、ＤＨＳ遺伝子のコーディング領域内の単一部位を認識するか又はＤＨＳ遺伝子のオープンリーディングフレーム内の全ての部位を認識しない。トマトＤＨＳに関する制限地図を図４に示している。
【００４６】
トマトの葉のゲノムＤＮＡを消化した制限酵素は３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識完全長トマトＤＨＳ  ｃＤＮＡで標識された。ＤＮＡサンプルを消化した各制限酵素による２〜３個の制限断片に対する完全長ｃＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションが高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションにより明らかになった。特に注目すべきことは、制限部位をＤＨＳのオープンリーディングフレーム内に持つＸｂａｌ及びＥｃｏＲＩ（図４）によりトマトの葉のゲノムＤＮＡが消化された場合、サザンブロットにおいて検出できる制限断片は２つを超える（図５）。雑種系統のｃｖマッチＦ１、及び同型系統ＵＣＴ５由来のゲノムＤＮＡは同じパターンの制限断片を生じた。これらの結果により、トマト植物においてＤＨＳ遺伝子のイソ型が２つ以上あることが示された。図３に示されるように、ＤＨＳ遺伝子は種間で非常に保存されており、それ故に、全ての種のイソ型の間で有為な量の保存があることが予測されるだろう。
【００４７】
トマトの花において、老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の発現は有意に誘導を受けているが、つぼみでは殆どその発現を検出できないことが、完全長トマトｃＤＮＡで標識されたトマト花総ＲＮＡのノーザンブロットにより示された（図６）。トマト果実の分化の様々な段階でのＤＨＳ発現のノーザンブロット解析により示されたことは、ブレーカー（ｂｒｅａｋｅｒ ）及びピンクの果実でのＤＨＳ遺伝子の発現は低レベルである一方；赤色（成熟した）トマト果実でのＤＨＳ発現は有意に高まっていたことである（図７）。
【００４８】
脱水（図８）及び凍結（図９）等の環境ストレス条件によって老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子が誘導されることもノーザンブロット解析により示された。脱水を誘導する為に２Ｍのソルビトールにより処理されたトマトの葉により、ＤＨＳ発現は未処理の葉に比べて脱水された葉において誘導されることも証明された。凍結温度にさらされて、そして穏和な温度に戻された植物は、冷害による症状（漏出等）の進行と同時に老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の発現を誘導した（図９）。トマト植物及び葉、果実及び花等の様々な植物組織における遺伝子発現の全体的なパターンにより示されたことは、これらの植物及び植物組織における老化の開始に本発明のＤＨＳ遺伝子が関わっていることである。
【００４９】
シロイヌナズナの葉の老化及びカーネーションの花弁の老化の開始について、ＤＨＳ遺伝子発現に関する類似の結果が観察された。様々な年齢のシロイヌナズナ植物から単離されたシロイヌナズナ葉総ＲＮＡのノーザンブロット解析により示されたことは、老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の発現が若い植物（５週齢植物）では明らかではないが、約６週で始まることである。ＤＨＳ遺伝子の発現は７週で有意に誘導される。シロイヌナズナＤＨＳ遺伝子は植物の年齢により有意に増強されることがノーザン解析により示される（図１１）。
【００５０】
カーネーション等の顕花植物においても、ＤＨＳ遺伝子は類似に調節されていることがノーザンブロット解析により示される（図１２）。様々な年齢のカーネーションの花の花弁から単離した総ＲＮＡのノーザンブロット解析により示されたことは、老化による最初の形態的な徴候である花弁の巻き込み（ｐｅｔａｌ ｉｎｒｏｌｌｉｎｇ ）のような年齢により誘発される症状を有する花由来の花弁においてカーネーションＤＨＳの発現は有意に誘導されているが、固いつぼみの花ではその発現がかなり低いことである。固いつぼみの段階にある花に比べて、開花し始めているカーネーションの花由来の花弁には有意なＤＨＳの発現があり、そして完全に開化した花に由来する花弁もＤＨＳの発現の増強を示す。
【００５１】
従って、植物組織中での老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の発現を実質的に抑制又は改変することによって、劣化及び腐敗を遅らせることができ、傷みやすい果実、花及び植物体の棚寿命を伸ばすことができること、並びにそれらの組織を一層ストレス寛容性及び病原体耐性にすることができると予測されている。このようなことは、トランスジェニック植物を生産することによって達成できる。この植物は、果実、葉及び野菜中で、ＤＨＳ ｃＤＮＡ又はそのオリゴヌクレオチド断片が、好ましくは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター等の構造プロモーターを用いて又は組織特異的もしくは、老化／ストレス誘導プロモーターを用いることでアンチセンス配置において発現させられる。
【００５２】
植物の形態変化に関連する老化の誘導に関わる他の遺伝子、ｅｌＦ−５ＡもＤＨＳ同様本明細書中で単離及び配列決定されており、植物における老化に変化を与える為及び老化に関連する作用を変化させる為に、好ましくはアンチセンス方向で植物中に導入されて利用される。成熟したトマトの果実、老化したシロイヌナズナの葉及び老化したカーネーションの花の各ｃＤＮＡライブラリーから老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａの完全長ｃＤＮＡクローンが単離された。各完全長クローンのヌクレオチド配列及び生成されるアミノ酸配列が、図１３（トマト誘導ｅｌＦ−５Ａ）、図１４（カーネーション配列誘導ｅｌＦ−５Ａ）及び図５（シロイヌナズナ老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ）に示されている。これら各ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列は、配列番号：１１（トマト）（図１３）、配列番号：１３（カーネーション）（図１４）及び配列番号：１５（シロイヌナズナ）（図１５）として示されている。各遺伝子の誘導アミノ酸配列は、配列番号：１２（図１３）、配列番号：１４（図１４）及び配列番号：１６（図１５）としてそれぞれ示されている。
【００５３】
本明細書中に記載されたＤＨＳ遺伝子配列の場合のように、本発明のｅｌＦ−５Ａ配列を用いて他の植物からｅｌＦ−５Ａ遺伝子を単離できる。その単離されたｅｌＦ−５Ａ配列を用いて、植物の老化及び老化に関連する作用に変化を与えることができる。種間での約７０％以上の配列の類似性に基づき、公知の方法を用いて植物からｅｌＦ−５Ａ配列の単離を達成できる。
【００５４】
植物におけるｅｌＦ−５Ａ及びＤＨＳの平行誘導は老化の間に生ずる。天然の老化及びストレスにより誘導された老化の両方の始まりにおいて、ｅｌＦ−５ＡとＤＨＳは平行して調節を受けていることがノーザンブロット解析により示される（図１６〜２０）。例えば、様々な年齢のシロイヌナズナ植物の葉から単離した総ＲＮＡのノーザンブロット解析により示されたことは、植物において、葉の老化が明かになる時からｅｌＦ−５Ａの発現が誘導されており、そしてその発現は、老化作用が進むにつれて有意に増強されていることである。トマト等の結果植物では、果実の軟化及び損傷の始まりと時を同じくして赤く柔かい果実中でｅｌＦ−５Ａ及びＤＨＳが平行して調節を受ける（図１７）。
【００５５】
干ばつ（図１８）及び冷害（図２０）のような環境ストレスに応じて、植物中ではｅｌＦ−５Ａ及びＤＨＳが平行して調節されていることもノーザンブロット解析により示された。それに類似して、顕花植物では、開いている花ではｅｌＦ−５Ａ及びＤＨＳが平行して調節を受け、そして開花のより後期段階を通じて両遺伝子の発現の増強が続く。
【００５６】
イチジクイボモザイクウィルス３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウィルスＣａＭＶ３５Ｓ、２重３５Ｓプロモーター又はＭＡＳプロモーター等、構造プロモーターの制御下で、クローン化された老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子、その断片もしくはクローン化された老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子もしくはその断片、又はｅｌＦ−５Ａ配列とＤＨＳ配列の組み合わせが逆向き（アンチセンス）に導入された場合、植物を遺伝的に改変するのに用いることができ、そして改変された植物の老化に変化を与えることができる。トマト、シロイヌナズナ又はカーネーションの老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子又は老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子との十分な配列の同一性を共有する、他の植物由来の選択されたアンチセンス配列を用いて類似の遺伝子改変をすることができる。内生の翻訳可能な老化により誘導されるＤＨＳコーディングｍＲＮＡ、ｅｌＦ−５ＡコーディングｍＲＮＡ又は両方の量が減少したことがこのような遺伝子改変による１つの結果である。その結果、植物細胞中では老化により誘導されるＤＨＳ及び／又は老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａの量が減少することによって、活性化ｅｌＦ−５Ａの量が減少する。そして次には、老化により誘導されるタンパク質、例えば老化により誘導されるリパーゼ、老化により誘導されるプロテアーゼ及び老化により誘導されるヌクレオチドの翻訳が低下する。従って老化が阻害又は遅延されることになる。何故なら老化の開始にはｄｅ  ｎｏｖｏタンパク質合成が必要であるからだ。
【００５７】
例えば、２重３５Ｓプロモーターによる調節下でシロイヌナズナの老化により誘導される完全長ＤＨＳ遺伝子又はその３′領域（配列番号：２６）（図３８）のどちらかをアンチセンス方向で発現するベクターにより形質転換されるシロイヌナズナ植物は、図２１〜２４に示すようにコントロールの植物に比べてバイオマスの増加、例えば、葉の大きさの肥大化及び生長の全段階を通じてのより大きな植物生長及び葉の老化の遅延を示す。
【００５８】
トランスジェニックシロイヌナズナ植物中でシロイヌナズナの老化により誘導されるＤＨＳ完全長遺伝子又はその３′領域がアンチセンス方向で発現することによりもたらされた老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の発現低下の作用は、形質転換植物の種子の収量の増加としても確認される。シロイヌナズナ老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子のアンチセンス３′非コーディング領域を発現するシロイヌナズナ植物系統は、野生型植物に比べて最大６倍超の種子を産む（図２５）。
【００５９】
アンチセンス方向且つ２重３５Ｓプロモーターの調節下にあるトマトの老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の３′末端（配列番号：２７）で形質転換されたトマト植物により得た結果は類似している。アンチセンス方向にある遺伝子の３′末端により形質転換された植物は、（形質転換されていない）コントロールのトマト植物に比べて葉の大きさ及び植物体の大きさが増加した（図２６及び２７）。
【００６０】
アンチセンス方向にあるトマトの老化により誘導される完全長ＤＨＳにより形質転換されたトマト植物は、野生型の植物に比べて軟化及び損傷するのが遅い果実を生産する（図２８〜３５）。従って、本発明の方法及び配列を用いて、果実が軟化及び損傷するのを遅らせること、並びに植物バイオマス及び種子の収量を増加させること、及び一般に、植物における老化を遅らせることができる。
【００６１】
２重３５Ｓプロモーターの調節の下、アンチセンス方向において、トマトの老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の３′領域（配列番号：３１）（図３７）を発現するウィルスベクターにより形質転換されたトマト植物のトマト果実は、図４０に見られるように、コントロール植物に比べて生理疾患の尻腐れに対する耐性の高まりを示す。
【００６２】
本発明の単離された核酸配列を用いて、他の植物又もしくは生物から実質的に相補的なＤＨＳ及び／もしくはｅｌＦ−５Ａヌクレオチド配列を単離できる。次いで、これらの配列を用いて植物を形質転換させて、本明細書中に示される単離されたヌクレオチド配列の使用に示されるのと同じ方法で、形質転換植物の老化を変化させることができる。
【００６３】
ＤＨＳ、ｅｌＦ−５Ａ、その断片もしくはその組み合わせを有する植物を形質転換することで得られる遺伝子改変により、老化により誘導されるＤＨＳ、ｅｌＦ−５Ａもしくはその両方のレベルでの恒久的な変化を植物において促すことができ、そして自殖もしくは他の繁殖方法により子孫を繁殖させることができる。遺伝子的な変更が加えられた植物を用いて新たなる変種又は系統の植物を生産することができる。この場合、その変化は世代を通じて安定して伝えられる。本発明では、幅広い様々な植物における老化に安定な遺伝的変化を加えるのに用いられて良い適切なＤＮＡ配列を最初に提供する。
【００６４】
老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子及び老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子の同定及び単離に関して、当業界で常用される方法を用いて一般に行われたことは、プラスミドＤＮＡの調製、制限酵素による消化、ＤＮＡのアガロースゲル電気泳動、タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンブロット、ノーザンブロット、ＤＮＡのライゲーション及び細菌の形質転換であった。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版、ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９８９． Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｒｅ ｄｉｓｃｌｏｓｅｄ ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ （Ｓｕｐｒａ）． を参照のこと。
【００６５】
本明細書中で用いた場合、用語「植物」とは、植物全体、植物の一部、植物細胞又は植物細胞の群を言及する。本発明の方法において用いられる植物の種類には、限定ではないが、例えば、エチレン感受性及びエチレン非感受性植物；結果植物、例えばアンズ、リンゴ、オレンジ、バナナ、グレープフルーツ、西洋ナシ、トマト、イチゴ、アボカド等；野菜、例えば、ニンジン、エンドウ、レタス、キャベツ、カブ、ジャガイモ、ブロッコリー、アスパラガス等；花、例えば、カーネーション、バラ、キク等；作物学的な作物植物及び樹木種、例えば、トウモロコシ、米、大豆、アルファルファ等；が挙げられ、そして一般には、本発明のＤＮＡ分子を獲得及び発現する全ての植物である。それには、様々な倍数性レベル、例えば、半数体、二倍体、三倍体及び倍数体の植物が含まれて良い。植物は単子葉植物又は双子葉であって良い。
【００６６】
本明細書中で植物として定義されているトランスジェニック植物は、ある方法で遺伝子が組換えられており、限定されないが、その植物には、相同もしくは異種の老化により誘導されるＤＨＳ ＤＮＡもしくは組換えＤＮＡ又は異種の老化により誘導されるＤＨＳ ＤＮＡもしくは相同の老化により誘導されるＤＨＳ ＤＮＡのある部分がそのゲノム中へと導入されている植物が挙げられる。代わって、本発明のトランスジェニック植物は、異種もしくは相同の老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ ＤＮＡもしくは組換えＤＮＡ又は異種の老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ ＤＮＡもしくは相同の老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ ＤＮＡのある部分をそのゲノム中へと導入されて植物である。本発明のトランスジェニック植物は、異種もしくは相同の老化により誘導されるＤＨＳ及びｅｌＦ−５Ａ ＤＮＡもしくは組換えＤＮＡ又は異種の老化により誘導されるＤＨＳ及びｅｌＦ−５Ａ ＤＮＡもしくは相同の老化により誘導されるＤＨＳ ＤＮＡもしくは異種及び相同ＤＨＳ及びｅｌＦ−５Ａ配列の組み合わせをそのゲノム中に組み込まれていて良い。改変された遺伝物質は、タンパク質をコードし、調節及びコントロール配列を含んで成って良く、又はアンチセンス配列であるか、もしくはアンチセンス配列を含んで良く又はアンチセンスＲＮＡをコードしうる。アンチセンスＲＮＡは、植物の老化により誘導される内生のＤＨＳもしくはｅｌＦ−５Ａ ＤＮＡもしくはｍＲＮＡ配列、又はその部分に対してアンチセンスである。「導入遺伝子」もしくは「トランスジェニック遺伝子」とは、トランスジェニック植物中に組み込まれている外来遺伝子もしくは部分配列として定義されている。
【００６７】
本明細書中で用いられる場合に用語、「ハイブリダイゼーション」とは、一般に当業者にとってはすぐ分かるように、プローブ配列及び標的配列の性質に依存する、適切なストリンジェンシー条件での核酸のハイブリダイゼーションを示すのに用いられる。ハイブリダイゼーション及び洗いの条件は当業者に周知であり、条件の調節は、インキュベーション時間、溶液の温度及び／又はイオン強度を変化させることによって所望のストリンジェンシーにすることに依り容易に遂行される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．ら．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９． を参照のこと。ハイブリダイズする配列の長さ、詳しくは、プローブ配列の長さ、核酸の相対ＧＣ含量及び許容されるミスマッチの量によって条件の選択が決定される。鎖間でのより低い程度の相補性が望まれる部分的ハイブリダイゼーションの場合は低ストリンジェンシー条件が好適である。完全又はほぼ完全な相補性が望まれる場合、高ストリンジェンシー条件が好ましい。典型的な高ストリンジェンシー条件について、ハイブリダイゼーション溶液が含むのは、６×Ｓ．Ｓ．Ｃ、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液及び０．５％ＳＤＳである。ハイブリダイゼーションは、約６８℃でクローン化したＤＮＡの断片については約３〜４時間及び総真核ＤＮＡについては約１２〜約１６時間行われる。低ストリンジェンシーについて、ハイブリダイゼーションの温度は二本鎖の融解温度（ＴＭ ）より約４２℃低く下げられる。ＴＭ はＧ−Ｃ含量及び二本鎖長並びに溶液のイオン強度の関数であることが知られている。
【００６８】
本明細書中で用いられる場合、用語、「実質的な配列の同一性」又は「実質的相同性」とは、他のヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列と実質上の構造的もしくは機能的な同等性を示すヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列を示すのに用いられる。実質的な配列の同一性もしくは実質的な相同性を有する配列間での任意の構造的もしくは機能的な違いは僅少である。即ち、所望の用途において示されたような機能をする配列の能力に対してそれらは影響ないだろうことである。違いとは、例えば異なる種間でコドンを利用する場合の先来のばらつきによるものでありうる。配列が構造もしくは長さにおいて異っていたとしても、もし２つ以上の異なる配列間で有意な量配列の重複もしくは類似性があるのならば、又は異なる配列が類似の物理特性を示すのならば、構造的な差は僅少であると考えられる。かかる特性には例えば、規定の条件下でハイブリダイズする能力、又はタンパク質の場合には、免疫交差反応性、類似酵素活性等が挙げられる。これら特性の各々は当業者によって容易に決定される。
【００６９】
更に、もし２つの配列が約７０％以上、好ましくは８０％以上そして最も好ましくは約９０％以上、配列間での類似性を有するのならば、それらは「実質上相補的」である。ポリペプチドの活性部位でもし５０％以上、好ましくは７０％以上の類似性があるなら、２つのアミノ酸配列は実質上相同的である。
【００７０】
本明細書中で用いられる場合、用語、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の「対応する部分に対してハイブリダイズする」とは、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、又は（センスもしくはアンチセンス方向にある）任意のヌクレオチド配列等のハイブリダイズする分子が、他の核酸分子中の配列を認識してハイブリダイズすることをいう。その核酸分子中の配列は、おおよそ同サイズであり、そして適切な条件下でそれに対してハイブリダイゼーションをするのに十分な配列の類似性を持つものである。例えば、トマトＤＨＳの３′コーディング領域もしくは非コーディング領域に由来する１００ヌクレオチドの長さのアンチセンス分子は３′コーディングもしくは非コーディング領域内のヌクレオチド配列の約１００ヌクレオチドの部分を認識してハイブリダイズし、それぞれカーネーションＤＨＳ遺伝子又は他の植物のＤＨＳ遺伝子に関しては２つの配列の間で約７０％超の配列の類似性がある。「対応する部分」のサイズとは、ハイブリダイゼーションにおけるいくつかのミスマッチが許される大きさであり、従って、前記「対応する部分」とは、それにハイブリダイズする分子よりも小さい又は大きくて良いことが理解されるべきだ。例えば、それより２０〜３０％大きいか又は小さく、約１２〜１５％を超えずに大きいもしくは小さいのが好ましい。
【００７１】
本明細書中で用いられる場合、用語、核酸（もしくはポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド）の「機能的誘導体」とは老化により誘導されるＤＨＳもしくは老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａをコードする遺伝子又はヌクレオチド配列の断片、変異体、相同体又は類似体をいう。機能的誘導体は、本発明に従い、老化により誘導されるＤＨＳ又はｅｌＦ−５Ａの使用を可能にするそれをコードするＤＮＡの機能の少なくとも一部を保持して良い。かかる機能に含まれて良いのは、低ストリンジェンシー条件下で、天然トマト、シロイヌナズナもしくはカーネーションの老化により誘導されるＤＨＳもしくはｅｌＦ−５Ａ又はＤＨＳもしくはｅｌＦ−５Ａをコードする他の植物由来の実質上相同なＤＮＡとハイブリダイズする能力、又はアンチセンス方向においてそのｍＲＮＡ転写物とハイブリダイズして植物の老化により誘導されるＤＨＳｍＲＮＡもしくはｅｌＦ−５Ａ  ｍＲＮＡの転写及び／もしくは翻訳を阻害する能力等が挙げられる。
【００７２】
遺伝子又はＤＮＡ配列の「断片」とは、より短かいポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド等、分子の任意の一部をいう。「変異体」とは、遺伝子全体又はその断片に実質的に類似する分子をいう。例えば、１又は複数のヌクレオチドが置換されているが、特定の遺伝子とハイブリダイズする能力又は天然ＤＮＡとハイブリダイズするｍＲＮＡをコードする能力を維持しているヌクレオチド置換変異体が挙げられる。「相同体」とは、様々な植物の属又は種に由来する断片又は変異配列をいう。「類似体」とは、分子全体、変異体又はその断片に対して実質上類似する又は機能する非天然分子をいう。
【００７３】
老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子もしくは老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子等の遺伝子の「発現の改変」もしくは「発現の修飾」とは、例えば修飾されていない結実、開花又は他の植物において生ずる遺伝子発現が、ある方法によって変えられたことによる任意の作用又は結果をいう。本明細書中で意図する場合、遺伝子発現の改変とは、老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子もしくは老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子もしくはその両方の発現の完全なもしくは部分的減少であるが、発現のタイミングの変化、又は未改変の植物体もしくは品種において最も天然に起こるだろうとは異なって老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子もしくは老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子もしくはその両方の発現することによる他の状態を含んで良い。好ましい改変とは未修飾の植物に比べて老化により誘導されるＤＨＳ生産、老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ生産又はその両方の生産の減少をもたらすものである。
【００７４】
本発明に従い遺伝的に改変された植物を生産するにあたり、所望の形質によって、一般に、老化により誘導されるＤＨＳの発現もしくは生産の減少もしくは老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａの発現の減少又はその両方によって、各々の苗木もしくは植物を選択することが好ましい。トランスジェニック植物における老化の遅延又は減少を確認すること等により、老化により誘導されるＤＨＳ及び老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａの発現が特定できる。公知のアッセイを用いることで、コントロール（正常、非トランスジェニック）植物との比較においてトランスジェニック植物中でのＤＨＳ及び／又はｅｌＦ−５Ａの活性を定量することも可能である。
【００７５】
新たに挿入された遺伝子又はＤＮＡ配列が発現して、それがコードするタンパク質の生産がもたらされる為に、又はアンチセンスＤＮＡの場合、転写されてアンチセンスＲＮＡ分子がもたらされる為に、前記遺伝子又はＤＮＡ配列に対して適切な位置及び方向で適切な調節エレメントが存在するべきである。調節領域は、プロモーター、５′−非翻訳リーダー配列及び３′−ポリアデニル化配列並びにエンハンサー及び他の調節領域を含んで良い。
【００７６】
老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子との組み合わせにおいて有用であり、遺伝子のセンスもしくはアンチセンス転写物を生ずるプロモーター調節エレメントには、一般に、任意の植物プロモーター、そして更に詳細には、構造性のプロモーターを含む。そのプロモーターには例えば、イチジクイボモザイクウィルス３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウィルスプロモーター、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、又はＭＡＳプロモーター、又は組織特異的もしくは老化により誘導されるプロモーター、例えば、カーネーション花弁ＧＳＴ１プロモーターもしくはシロイヌナズナＳＡＧ１２プロモーターである。（本明細書中に参考文献として組み込まれている、例えば、Ｊ．Ｃ． Ｐａｌａｑｕｉら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １１２ ： １４４７−１４５６ （１９９６） ； Ｍｏｒｔｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， １ ： １２３−１３２ （１９９５） ； Ｆｏｂｅｒｔら、Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ， ６ ： ５６７−５７７ （１９９４） ； 及びＧｅｎら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．， １１３ ： ３１３ （１９９７） 、を参照のこと）本発明において用いられるプロモーターは、構造性のプロモーターであるのが好ましく、２重３５Ｓプロモーターが用いられるのが最も好ましい。
【００７７】
本発明の為に有用なプロモーターによる発現レベルは、例えば、プロモーター／レポーター遺伝子が導入されているトランスジェニック植物の葉、花、又は他の組織の抽出物中のタンパク質もしくはｍＲＮＡ等、レポーター遺伝子産物のレベルを測定すること等によって常用の発現糸を用いることでテストできる。
【００７８】
本発明は、トマトの老化により誘導されるＤＨＳ、カーネーションの老化により誘導されるＤＨＳ、シロイヌナズナの老化により誘導されるＤＨＳをコードする遺伝子に対して相補的又は他の植物由来の遺伝子もしくは遺伝子断片に対して相補的であり、トマト、カーネーションもしくはシロイヌナズナの老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子と低〜高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。本発明は、トマトの老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ、カーネーションの老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ、シロイヌナズナの老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａをコードする遺伝子に対して相補的又は他の植物由来の遺伝子もしくは遺伝子断片に対して相補的であり、トマト、カーネーションもしくはシロイヌナズナの老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子と低〜高ストリンジェント条件下でハイブリダイズするアンチセンスオリゴヌクレオチド及びアンチセンスポリヌクレオチドを提供する。かかるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、６ヌクレオチド以上の長さであり、ハイブリダイゼーションの最小限の特異性を提供すべきであり、老化により誘導される遺伝子をコードする一本鎖ＤＮＡもしくはｍＲＮＡ又はその一部に対して相補的、又は老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子又はｅｌＦ−５Ａ遺伝子発現の調節に関わるゲノムＤＮＡ中のフランキング配列に対して相補的であって良い。アンチセンスオリゴヌクレオチドは１００ヌクレオチド超の大きさであって良く、アンチセンスである全コーディング配列の長さを超えうる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡもしくはキメラ混合物又はその誘導体もしくは修飾型である。
【００７９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用は、細胞中での老化により誘導されるＤＨＳ発現、老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ発現又はその両方の改変、一次阻害をもたらしうる。アンチセンスの一般的な論議については、Ａｌｂｅｒｔｓ ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第２版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９（特に本明細書中に参考文献として組み込まれた、ｐｐ． １９５−１９６）を参照のこと。
【００８０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、老化により誘導されるＤＨＳ又はｅｌＦ−５Ａ遺伝子の任意の対応する部分に対して相補的であって良い。ある実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは６〜１００ヌクレオチドの長さであって良く、例えば、老化により誘導されるＤＨＳもしくはｅｌＦ−５Ａ配列の５′非コーディングもしくは３′末端内の配列に対して相補的であって良い。主として５′非コーディング配列に対して相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、転写因子をコードする遺伝子の発現を阻害する有効な阻害物質であることが知られている。Ｂｒａｎｃｈ， Ｍ．Ａ．， Ｍｏｌｅ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １３ ： ４２８４−４２９０ （１９９３） 。
【００８１】
好的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、老化により誘導されるＤＨＳ又は老化により誘導されるｅｌＦ−５ＡをコードするｍＲＮＡの一部に対して実質上相補的であり、当該ｍＲＮＡの部分はアンチセンスオリゴヌクレオチドとほぼ同サイズである。例えば、老化により誘導されるＤＨＳ又はｅｌＦ−５Ａをコードする完全長ｃＤＮＡクローンを植物体中へとアンチセンス方向において導入することにより期待されていることは、老化により誘導されるＤＨＳ及び／又はｅｌＦ−５Ａ遺伝子発現の成功裡な改変がもたらされることである。更に、図２１〜３５中に表したように、老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子もしくは老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子もしくはその両方の特異的な部分を標的とした、部分配列の導入も同様に有効である。
【００８２】
本発明の定める最小量の相同性とは、特異的標的ＤＮＡもしくはＲＮＡの認識を担うに足りる十分な相補正をもたらして、他のＲＮＡ又はＤＮＡ分子の機能及び他の遺伝子の発現に影響を与えることなく、その翻訳もしくは機能を阻害もしくは減少をさせるのに十分な量である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子又は老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子のＲＮＡ転写産物の対応する部分に対して相補的な配列を含んで成る一方で、完全な相補性は好ましいが必要とされてはいない。ハイブリダイズする能力は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さと相補性の程度に依存しうる。一般に、ハイブリダイズする核酸がより長くなれば、老化により誘導されるＤＨＳ標的配列との一層の塩基のミスマッチが含まれそしてそのまま二本鎖が形成される。当業者は、例えばハイブリッド複合体の融解温度を決定する為等の標準手段を用いることで、許容できるミスマッチの程度を確認できる。
【００８３】
外生的に導入された核酸配列からの転写によって、アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドが細胞内で生成されて良い。プラスミド又はウィルス等のベクターによる形質転換もしくはトランスフェクションもしくは感染によってアンチセンス分子が細胞へと供給されて良い。そのベクター中には、プロモーター等の適切な調節エレメントに作用可能式に結合する老化により誘導されるＤＨＳのアンチセンス配列をコードするＤＮＡが導入されている。細胞内で外生ＤＮＡ配列が発現され、老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子のアンチセンスＲＮＡが生産される。
【００８４】
好ましくはベクターは、プラスミドベクターであって良く、又は植物細胞もしくは細菌細胞中で、そこにコードされている遺伝子を複製及び発現する当業界で公知のウィルスもしくは他のベクターであって良い。ベクターはそれが転写され所望の老化により誘導されるＤＨＳのアンチセンスのＲＮＡを生産できるように染色体に組み込まれるようになる。当業界で標準的なＤＮＡ組み換え技術による方法によって、かかるプラスミド又はウィルスベクターが構築できる。例えば、ベクターは、原核生物宿主中で機能的な複製系及び本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドを含むプラスミドベクターであって良い。代わりに、ベクターは、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ）中で機能的な複製系及び本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセンスポリヌクレオチドを含有するプラスミドであって良い。アグロバクテリウム中で複製できるプラスミドは当業界で周知である。Ｍｉｋｉら、Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｆｏｒｅｉｇｎ ＤＮＡ Ｉｎｔｏ Ｐｌａｎｔｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．， Ｅｄｓ． Ｂ．Ｒ． Ｇｌｉｃｋ ａｎｄ Ｊ．Ｅ． Ｔｈｏｍｐｓｏｎ． ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （１９９３）， ＰＰ． ６７〜８３ を参照のこと。
【００８５】
トマトＤＨＳ遺伝子は、以下の方法に従い、プラスミドベクター中にアンチセンス方向にてクローン化される。ｐＵＣ１８骨格から構築されて、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）由来の３５Ｓプロモーター、それに続くマルチクローニングサイト及びオクタピンシンターゼ終結配列を含むｐＣＤプラスミドが、トマトＤＨＳ遺伝子をクローニングする為に用いられた。ＸｈｏＩ及びＳａｃＩ制限部位を用いて完全長トマトＤＨＳ遺伝子をアンチセンス方向でｐＣＤプラスミド中にサブクローニングすることによってｐＣｄ−ＤＨＳ（アンチセンス）プラスミドが構築された。
【００８６】
約６〜約１００ヌクレオチドの長さであり且つ老化により誘導されるＤＨＳもしくは老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子の標的配列に相補的であるのが好ましいオリゴヌクレオチドは、例えば、ヌクレオチド組み換え技術によって調製されて良い又はモノヌクレオチドもしくはより短かいオリゴヌクレオチドから合成されて良い。本発明のオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを化学的に合成するのに自動合成装置が適用できる。本発明に従い組み換えヌクレオチド分子を構築する為の手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｉｎ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． （１９８９） に記載されており、それはそのまま本明細書中に参考文献として組み込まれている。老化により誘導されるデオキシプシンシンターゼ配列に対して相補的なアンチセンスＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドは、当業界で周知の手順を用いて調製できる。Ｍａｎｉａｔｉｓ， Ｔら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ｅｄｓ．， Ｎｉｅｒｌｉｃｈら、ｅｄｓ．， Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９７６） に、かかる手順に関する詳細が供されている。
【００８７】
本発明の他の実施態様では、植物の、内生の老化により誘導されるＤＨＳ、老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａもしくはその両方の発現の阻害は、植物細胞中に導入された外生の老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子もしくは老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子もしくは遺伝子断片又はその両方の過剰な発現による共抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）の結果である。本発明のこの実施態様では、アンチセンス分子について本明細書中で記載したのと同じ方法で、センス方向で老化により誘導されるＤＨＳ及び老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ又はその両方をコードするベクターが細胞中に導入されている。老化により誘導されるＤＨＳ又は老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａが、例えば、イチジクイボモザイクウィルスプロモーターもしくはＣａＭＶ３５Ｓもしくは２重３５Ｓプロモーター等の強力な構造性プロモーターに対して作用可能式に結合するのが好ましい。
【００８８】
本発明の他の実施態様では、リボザイムの利用により植物の内生の、老化により誘導されるＤＨＳ、老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａもしくはその両方の発現が阻害される。リボザイムは、配列特異的エンドリボヌクレアーゼ活性を示すＲＮＡ分子である。例にはハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）リボザイムが挙げられ、それは、標的ＲＮＡ中のＵＨ（ここでＨはＡ、Ｃ又はＵ残基である）認識部位での解裂を起こし、そして基質ＲＮＡの標的部位に対してリボザイムの触媒ドメインを向ける塩基対領域を含む。リボザイムは標的特異性が非常に高く、そして多遺伝子ファミリーの１つのメンバー又は標的となった前記ｍＲＮＡの保存領域を不活性化するように設計できる（Ｍｅｒｌｏら、Ｔｈｅ Ｂｌａｎｔ Ｃｅｌｌ， １０ ： １６０３−１６２１， １９８８ を参照のこと）。プラスミド又はウィルス等のベクターによる形質転換もしくはトランスフェクションもしくは感染によってリボザイム分子が細胞へと供給されて良い。そのベクター中には、プロモーター等の適切な調節エレメントに作用可能式に結合するリボザイムが導入されている。かかるリボザイム構築体は塩基対の腕を含み、それは、老化により誘導されるＤＨＳ ｍＲＮＡもしくは老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ ｍＲＮＡ内の開裂部位にリボザイムを向けて、ＤＨＳもしくはｅｌＦ−５Ａ  ｍＲＮＡの開裂及び老化により誘導されるＤＨＳ及び／又はｅｌＦ−５Ａの発現の阻害をもたらすものである。
【００８９】
本発明により作製されたトランスジェニック植物は、当業界で周知の、植物を形質転換する任意の方法を用いてＤＮＡを形質転換させることにより調製されて良い。植物を形質転換する方法には、例えば、アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｃｅ）との植物体、組織もしくは細胞の直接共培養又は直接感染（Ｍｉｋｉら、Ｍｅｔｈ． ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， （１９９３）， ｐ６７−８８）；プロトプラストへの直接遺伝子転移又はプロトプラストによる取り込み（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉら、ＥＭＢＯ Ｊ．， １２ ： ２７１７ （１９８４））；エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍｍら、Ｎａｔｕｒｅ， ３１９ ： ７１９ （１９８６））；粒子爆弾（Ｋｌｅｉｎら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６ ： ｐｐ． ５５９−５６３ （１９８８））；種子及び植物の分裂組織への注射（Ｄｅ ＬａＰｅｎａら、Ｎａｔｕｒｅ， ３２５ ： ２７４−２７６ （１９８７））； 培養細胞及び組織のプロトプラストへの注射（Ｒｅｉｃｈら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ４ ： ｐｐ． １００１−１００４ （１９８６））が挙げられる。
【００９０】
一般に、形質転換方法より完全な植物を得ることができる。植物は、プロトプラスト、カルス、組織部分又は外植片等から生成される。老化により誘導されるＤＨＳ、老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ又はその両方の発現が改変されている再生植物から得た植物の部分には、例えば、葉、花、果実、種子、等が挙げられ、本明細書中で用いられるように定義「植物」に含まれている。再生植物の子孫、変異体及び突然変異体も定義「植物」に含まれている。
【００９１】
トマト、カーネーション、シロイヌナズナの老化により誘導されるＤＨＳタンパク質もしくはその機能的誘導体、及びトマト、カーネーションもしくはシロイヌナズナの老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａタンパク質もしくはその機能的誘導体は、任意的に化学合成法と組合わせて組換え技術により生産されるのが好ましい。本発明のある実施態様において、老化により誘導されるＤＨＳは融合タンパク質として発現されており、マルトース結合タンパク質と融合した老化により誘導されるＤＨＳを構成するのが好ましい。
【００９２】
本明細書中で記載した老化により誘導されるＤＨＳタンパク質もしくは老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａタンパク質の「機能的誘導体」とは、それぞれ、老化により誘導されるＤＨＳもしくは老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａの断片、変異体、類似体、もしくは化学的な誘導体であり、それらは、それぞれ老化により誘導されるＤＨＳもしくはｅｌＦ−５Ａ活性又は老化により誘導されるＤＨＳもしくは老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａに対して特異的な抗体による免疫学的な交差反応性を少なくとも一部維持する。老化により誘導されるＤＨＳ又は老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａタンパク質の断片とは任意の分子の一部のことをいう。変異ペプチドは当業界で周知の方法を用いる直接化学合成等によって作製されて良い。老化により誘導されるＤＨＳもしくは老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａの類似体とは、完全なタンパク質又はその断片に実質上類似する非天然のタンパク質を言及する。老化により誘導されるＤＨＳ又は老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａの化学的誘導体は、通常、ペプチド又はペプチド断片ではない更なる化学成分を含む。ペプチドの標的アミノ酸残基と有機誘導化剤（ｏｒｇａｎｉｃ ｄｅｒｉｖａｔｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）とを反応させることによって、修飾体がペプチド又はその断片中に組み込まれて良い。その有機誘導化剤は、選択された鎖又は末端の残基と反応することができる。
【００９３】
本発明の老化により誘導されるＤＨＳもしくは老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａのタンパク質もしくはペプチドは、本発明の（センス方向にある）ヌクレオチド配列により形質転換された細胞を培養することによって生産されて良い。その方法は、細胞にタンパク質を合成させて次いで、用いたクローニングプロトコルによって培養培地から又は細胞抽出物から、当該タンパク質を遊離タンパク質又は融合タンパク質として単離する。もう１つの方法として、前記タンパク質は無細胞系において生産できる。Ｒａｎｕら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ， ６０ ： ｐｐ． ４５９−４８４ （１９７９））。
【００９４】
これまで本発明を大まかに説明して来た。以下の例を参考にすることで本発明はより容易に理解されるだろう。以下の例は説明の手段として供されており、本発明を限定することを意図してはいない。
【００９５】
実施例１
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の単離
様々な生長段階にあるトマトの花及びトマト果実及び葉（凍結後未処理又はソルビート処理した）から総ＲＮＡを単離した。組織（５ｇ）を液体窒素中で手速く、粉砕した。その粉砕粉末を３０ｍｌのグアニジニウム緩衝液（４Ｍのグアニジニウムイソチオシアネート、２．５ｍＭのＮａＯＡｃ  ｐＨ８．５、０．８％のβ−メルカプトエタノール）と混合した。混合物を４層のチーズクロスによるろ過をして４℃、１０，０００ｇで３０分に渡る遠心に掛けた。次いで、その上清を２６，０００ｇで２０時間に渡る塩化セシウム濃度勾配遠心に委ねた。ペレット化したＲＮＡを７５％エタノールですすぎ、６００μｌのＤＥＰＣ処理水中で再懸濁して、０．７５ｍｌの９５％エタノール及び３０μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃにより−７０℃で前記ＲＮＡを沈澱させた。１．２％変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で１０ｍｇのＲＮＡを分画化してナイロンメンブレン上に移した。ランダムプライム３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識完全長ＤＨＳ  ｃＤＮＡ（配列番号：１）を用いて、４２℃で一晩メンブレンを標識した。次いで、そのメンブレンを、室温で１５分に渡り０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中で一回洗い、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中６５℃で１５分ごと３回洗った。メンブレンを−７０℃で一晩Ｘ線フィルムにさらした。
【００９６】
Ｐｒｏｍｅｇａ から入手できるポリＡ＋ 領域ｍＲＮＡ単離システムを用いてポリＡ＋ ｍＲＮＡを総ＲＮＡから単離した。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａｌｉｆ．）から入手可能なＺＥＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）合成システムを用いてｃＤＮＡを合成する為の鋳型としてポリＡ＋ ｍＲＮＡを用いた。
【００９７】
トマト葉ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
６時間に渡り２Ｍのソルビトールに暴露したマッチＦ１雑種トマトの葉から単離したｍＲＮＡを用いて作製したｃＤＮＡライブラリーを希釈して、約５×１０６ＰＦＵ／ｍｌにした。３２Ｐで標識した６００ｂｐのＲＴ−ＰＣＲ断片を用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。３つの陽性ｃＤＮＡクローンを切り出して、そして使用説明書中の方法を用いてｐＢＫ−ＣＭＶ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に再び挿入した。完全長ｃＤＮＡをｐＢＫ−ＣＭＶベクター中に挿入した。
【００９８】
プラスミドＤＮＡの単離、ＤＮＡ配列決定
Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら（Ｓｕｐｒａ）により記載されたアルカリ溶解の方法を用いて、プラスミドＤＮＡを単離した。ジデオキシ配列決定法、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７４ ： ｐｐ． ５４６３−５４６７を用いて完全長陽性ｃＤＮＡクローンの配列を決定した。オープンリーディングフレームは込み入っており、そしてＢＬＡＳＴサーチ（ＧｅｎＢａｎｋ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ ）を用いて解析して、ＢＣＭ  Ｓｅｒｃｈ  Ｌａｕｎｃｈｅｒ：多数配列アライメントパターン誘導多数アライメント法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ Ｐａｔｔｅｒｎ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ）（Ｆ． Ｃｏｒｐｅｔ， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６ ： ｐｐ １０８８１〜１０８９０ （１９８７） を参照のこと）を用いることで、コード遺伝子の誘導アミノ酸配列を有する最も相同的な５つのタンパク質のアライメントを得た。誘導生成アミノ酸配列中に存在する機能モチーフをＭｕｌｔｉ Ｆｉｎｄｅｒによって同定した。
【００９９】
トマトＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション
様々な段階（つぼみ及び花及び大きく開いた又は乾燥していた老化花弁）のトマトの花、トマトの葉、及び成熟の様々な段階（ブレーカー、即ち、緑の果実が赤色の１０％未満、ピンク、即ち、柔らかいか又は引き締まった、果実全体がオレンジ又はピンク、及び赤）のトマトの果実から単離した１０ｇの総ＲＮＡを１％変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分離してナイロンメンブレン上に固定化した。ランダムプライマーキット（Ｂｏｅｈｉｎｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した完全長トマトｃＤＮＡを用いてフィルターを標識（ｐｒｏｂｅ ）した（７×１０７ｃｐｍ）。フィルターを室温で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより１回、及び０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより６５℃で３回洗った。フィルターを乾燥させて−７０℃で一晩Ｘ線フィルムにさらした。その結果を図６、７、８及び９に示している。
【０１００】
シロイヌナズナＲＮＡのノーザンブロットハイブリダイゼーション
５週齢（レーン１）、６週齢（レーン２）及び７週齢（レーン３）でのシロイヌナズナ植物の葉に由来する総ＲＮＡを上記のようにして単離し、１％変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分離してナイロンメンブレン上で固定化した。ランダムプライマーキット（Ｂｏｅｈｉｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識完全長シロイヌナズナ老化により誘導されるＤＨＳ  ｃＤＮＡを用いてフィルターを標識した（７×１０７ｃｐｍ）。フィルターを室温で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより１回、及び０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより６５℃で３回洗った。フィルターを乾燥させて−７０℃で一晩Ｘ線フィルムにさらした。その結果を図１１に示している。
【０１０１】
カーネーションＲＮＡのノーザンハイブリダイゼーション
様々な分化段階、即ち、固いつぼみの花（レーン１）及び開き始め（レーン２）、完全に広いた（レーン３）、又は巻き込んだ（ｉｎｒｏｌｌ）花弁（レーン４）のカーネーション植物の花弁から上記のように総ＲＮＡを単離し、１％変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で分離し、ナイロンメンブレン上で固定化した。ランダムプライマーキット（Ｂｏｅｈｉｎｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識完全長カーネーション老化により誘導されるＤＨＳｃＤＮＡを用いてフィルターを標識した（７×１０７ｃｐｍ）。フィルターを室温で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより一回、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより６５℃で３回洗った。フィルターを乾燥させて−７０℃で一晩Ｘ線フィルムにさらした。その結果を図１２に示している。
【０１０２】
実施例２
トマト老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子のソルビトール誘導
密閉チャンバー（ｓｅａｌｅｄ ｃｈａｍｂｅｒ）中でトマトの葉を６時間に渡り２Ｍのソルビトールで処理した。以下のとおりにソルビトール処理した葉からＲＮＡを抽出した。
【０１０３】
葉（５ｇ）を液体窒素中で粉砕した。粉砕粉を３０ｍｌのグアニジウム緩衝液（４Ｍのグニアジウムイソチアネート、２．５ｍＭのＮａＯＡｃ  ｐＨ８．５、０．８％β−メルカプトエタノール）と混合した。前記混合物を４層のチーズクロスによるろ過をして４℃、１０，０００ｇで３０分に渡り遠心した。次いで、上清を２６，０００ｇで２０時間に渡る塩化セシウム密度勾配遠心に委ねた。ペレット化したＲＮＡを７５％エタノールですすぎ、６００μｌのＤＥＰＣ処理水中で再懸濁して０．７５ｍｌの９５％エタノール及び３０μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃにより−７０℃で前記ＲＮＡを沈澱させた。１．２％変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で１０μｇのＲＮＡを分画化してナイロンメンブレン上に移した。ランダムプライム３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識完全長ＤＨＳ ｃＤＮＡ（配列番号：１）を用いて４２℃で一晩メンブレンを標識した。次いで、そのメンブレンを室温で１５分に渡り０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中で１回洗い、そして０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中６５℃で１５分ごと３回洗った。−７０℃で一晩Ｘ線フィルムにメンブレンをさらした。
【０１０４】
結果を図８に示してある。見て分かるとおり、ＤＨＳの転写はソルビトールによって誘導されている。
【０１０５】
実施例３
老化している葉におけるトマトＤＨＳ遺伝子の誘導
トマト植物の固い花のつぼみ及び開いた、老化した花を収穫して、ＲＮＡを実施例２のように単離した。１．２％変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で１０μｇのＲＮＡを分画化してナイロンメンブレン上に移した。ランダムプライム３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識完全長ＤＨＳ ｃＤＮＡ（配列番号：１）を用いて４２℃で一晩メンブレンを標識した。次いで、そのメンブレンを室温で１５分に渡り０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中で１回洗い、そして０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中６５℃で１５分ごと３回洗った。−７０℃で一晩Ｘ線フィルムにメンブレンをさらした。
【０１０６】
結果を図６に示してある。見て分かるとおり、ＤＨＳの転写は老化している花で誘導されている。
【０１０７】
実施例４
成熟している果実におけるトマトＤＨＳ遺伝子の誘導
ブレーカー、ピンク及び成熟した果実からＲＮＡを実施例２のように単離した。１．２％変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で１０μｇのＲＮＡを分画化してナイロンメンブレン上に移した。ランダムプライム３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識完全長ＤＨＳ  ｃＤＮＡ（配列番号：１）を用いて４２℃で一晩メンブレンを標識した。次いで、そのメンブレンを室温で１５分に渡り０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中で１回洗い、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中６５℃で１５分ごと３回洗った。Ｘ線フィルムにメンブレンを−７０℃で一晩さらした。
【０１０８】
結果を図７に示してある。見て分かるとおり、ＤＨＳの転写は腐敗につながる老化が開始される寸前の成熟した赤い果実で最も強力である。
【０１０９】
実施例５
凍結によるトマトの老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の誘導
針にあるトマト植物（７〜８週齢）を生長チャンバー（ｇｒｏｗｔｈ ｃｈａｍｂｅｒ）中で２日、３日、６日に渡り６℃にさらした。暗期８時間及び明期１６時間の光周期にした。植物を温室に移して再加温した。生長チャンバーから取り除いた後、再加温しなかった植物はすぐに収穫した。
【０１１０】
葉（５ｇ）を液体窒素中で粉砕した。粉砕粉を３０ｍｌのグアニジウム緩衝液（４Ｍのグニアジウムイソチアネート、２．５ｍＭのＮａＯＡｃ  ｐＨ８．５、０．８％β−メルカプトエタノール）と混合した。前記混合物を４層のチーズクロスによるろ過をして４℃、１０，０００ｇで３０分に渡り遠心した。次いで、上清を２６，０００ｇで２０時間に渡る塩化セシウム密度勾配遠心に委ねた。ペレット化したＲＮＡを７５％エタノールですすぎ、６００μｌのＤＥＰＣ処理水中で再懸濁して０．７５ｍｌの９５％エタノール及び３０μｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃにより−７０℃で前記ＲＮＡを沈澱させた。１．２％変性ホルムアルデヒドアガロースゲル上で１０μｇのＲＮＡを分画化してナイロンメンブレン上に移した。ランダムプライム３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識完全長ＤＨＳ  ｃＤＮＡ（配列番号：１）を用いて４２℃で一晩メンブレンを標識した。次いで、そのメンブレンを室温で１５分に渡り０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＣ中で１回洗い、そして０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中６５℃で１５分ごと３回洗った。−７０℃で一晩Ｘ線フィルムにメンブレンをさらした。
【０１１１】
結果を図９に示してある。見て分かるとおり、凍結温度にさらされて次いで再加温されることによって葉におけるＤＨＳの転写が誘導される。そしてメンブレン漏出（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｅａｋｉｎｅｓｓ）として測定された凍結障害に関連する翻訳が増加する。
【０１１２】
実施例６
未だ同定されていないシロイヌナズナのゲノム配列に基づくプライマーを用いてのシロイヌナズナＰＣＲ産物の生成
シロイヌナズナのゲノム配列から設計されたオリゴヌクレオチドプライマーのペアを用いるＰＣＲによってシロイヌナズナｃＤＮＡ鋳型から部分長（ｐａｒｔｉａｌ ｌｅｎｇｔｈ）の老化により誘導されるＤＨＳ配列を生成した。配列、５’−ＧＧＴＧＧＴＧＴ５ＴＧＡＧＧＡＡＧＡＴＣ（配列番号：７）を有する１９マーが５′プライマーであり；配列、ＧＧＴＧＣＡＣＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＣ−３’（配列番号：８） を有する２０マーが３′プライマーである。最高忠実度（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＰＣＲ系（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ ）及び鋳型としてシロイヌナズナ老化葉ｃＤＮＡライブラリーを用いたポリメラーゼ連鎖反応を以下のとおりに行った。
反応成分：
ｃＤＮＡ                                        １μｌ（５×１０７ｐｆｕ）
ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ）                            １μｌ
ＭｇＣｌ２ （５ｍＭ）＋１０×緩衝液                ５μｌ
プライマー１及び２（各１００μＭ）              ２μｌ
最高忠実度（Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）
ＤＮＡポリメラーゼ                              １．７５Ｕ
反応体積                                      ５０μｌ
反応パラメータ：
９４℃で３分
９４℃／１分、５８℃／１分、７２℃／２分、で４５サイクル
７２℃で１５分。
【０１１３】
実施例７
ゲノムＤＮＡの単離及びサザン解析
液体窒素中でトマトの葉の組織（１０ｇ）を粉砕して微粉にすることによってゲノムＤＮＡをトマトの葉から抽出した。予め６０℃に温めた２５ｍｌのホモジネーション緩衝液〔１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１００ｍＭのＥＤＴＡ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１％サルコシル、１％２−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ及び１２．５ｍｌのフェノール〕を含有する３７．５ｍｌの混合物を粉砕組織に添加した。混合物を１５分に渡り振とうした。更なる１２．５ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を前記混合物に添加して、更に１５分に渡り振とうした。前記混合物を遠心して、２５ｍｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２４：１）及びクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）により水相を再抽出した。１５ｍｌのイソプロパノールによる室温での沈澱によって核酸を回収した。１ｍｌの水中で沈澱を再懸濁した。
【０１１４】
以下のように、ゲノムＤＮＡを制限酵素による消化に委ねた。１０μｇのゲノムＤＮＡ、４０μｌの１０×反応緩衝液及び１００Ｕの制限酵素（ＸｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ又はＨｉｎＤＩＩＩ ）を総反応体積４００μｌ中で、５〜６時間に渡り反応させた。次いで、混合物のフェノール抽出及びエタノール沈澱をした。消化されたＤＮＡを、０．８％アガロースゲル上１５Ｖで約１５分に渡るアガロースゲル電気泳動に委ねた。前記ゲルを変性緩衝液〔ＮａＣｌ  ８７．６６ｇ及びＮａＯＨ  ２０ｇ／Ｌ〕中に沈めて３０分に渡り穏やかに動揺し、蒸留水ですすぎ、そして中性緩衝液〔ＮａＣｌ  ８７．６６ｇ及びトリスＨＣｌ  ６０．５５ｇ、ｐＨ７．５／Ｌ〕中に沈めて３０分に渡り穏やかに動揺した。キャピラリーブロッティングにより、ＤＮＡをＨｙｂｏｎｄ−Ｈ＋ メンブレン上に移した。
【０１１５】
１×１０６ｃｐｍ／ｍｌの３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した完全長ＤＨＳ  ｃＤＮＡ、又はＤＨＳ  ｃＤＮＡクローンの３′非コーディング領域を用いて４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液、０．１％ＳＤＳ及び１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む緩衝液中でプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを行った。メンブレンのプレハイブリダイゼーションを２時間〜４時間に渡り行った。ハイブリダイゼーションは一晩行った。
【０１１６】
ハイブリダイゼーション完了後、室温で、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中でのメンブレンのすすぎを行い、次いで、２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で１５分並びに０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中で１５分に渡る洗いを行った。−８０℃で一晩メンブレンをＸ線フィルムにさらした。結果を図５に示してある。
【０１１７】
実施例８
シロイヌナズナからの老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子の単離
シロイヌナズナの老化している葉ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いるＰＣＲによって、シロイヌナズナの葉において発現する老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子の完全長ｃＤＮＡクローンを得た。最初、ベクターＴ７プライマー〈ＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ〉（配列番号：１８）と対になる上流変性プライマー（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ ）〈ＡＡＡＲＲＹＣＧＭＣＣＹＴＧＣＡＡＧＧＴ〉（配列番号：１７）、及びベクターＴ３プライマー〈ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧ〉（配列番号：２０）と対になる下流変性プライマー〈ＴＣＹＴＴＮＣＣＹＴＣＭＫＣＴＡＡＨＣＣ〉（配列番号：１９）を用いて遺伝子の５′及び３′末端に対応するＰＣＲ産物を作製した。配列決定をする為にＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローン化した。次いで、３′−特異的プライマー〈ＡＧＡＡＧＡＡＧＴＡＴＡＡＡＡＡＣＣＡＴＣ〉（配列番号：２２）と対になる５′−特異的プライマー〈ＣＴＧＴＴＡＣＣＡＡＡＡＡＡＴＣＴＧＴＡＣＣ〉（配列番号：２１）を用いて完全長ｃＤＮＡクローンを得、そして配列決定をする為にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローン化した。
【０１１８】
実施例９
トマトの果実からの老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子の単離
トマト果実ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いるＰＣＲによって、トマトの果実中で発現する老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子の完全長ｃＤＮＡクローンを得た。最初、ベクターＴ７プライマー（配列番号：１８）と対になる上流変性プライマー（配列番号：１７）、及びベクターＴ３プライマー（配列番号：２０）と対になる下流変性プライマー（配列番号：１９）を用いて遺伝子の５′及び３′末端に対応するＰＣＲ産物を作製した。配列決定をする為にＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローン化した。次いで、Ｔ７プライマー （配列番号：１８）と対になる５′−特異的プライマー〈ＡＡＡＧＡＡＴＣＣＴＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＧＧ〉（配列番号：２３）を用いて完全長ｃＤＮＡクローンを得て、配列決定をする為にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローン化した。
【０１１９】
実施例１０
カーネーションからの老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子の単離
カーネーションの老化している花ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として用いるＰＣＲによって、カーネーションの花において発現する老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子の完全長ｃＤＮＡクローンを得た。最初、ベクターＴ７プライマー（配列番号：１８）と対になる上流変性プライマー（配列番号：１７）、及びベクターＴ３プライマー（配列番号：２０）と対になる下流変性プライマー（配列番号：１９）を用いて遺伝子の５′及び３′末端に対応するＰＣＲ産物を作製した。配列決定をする為にＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローン化した。次いで、３′−特異的プライマー〈ＡＣＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＧＴＴＡＴＡＡＣＴＣＣ〉（配列番号：２５）と対になる５′−特異的プライマー〈ＴＴＴＴＡＣＡＴＣＡＡＴＣＧＡＡＡＡ〉（配列番号：２４）を用いて完全長ｃＤＮＡクローンを得、そして配列決定をする為にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローン化した。
【０１２０】
実施例１１
シロイヌナズナからの老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の単離
シロイヌナズナの老化している葉のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってシロイヌナズナの葉で発現する、老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の完全長ｃＤＮＡクローンを得た。スクリーニングの為に用いたプローブの配列（配列番号：２６）を図３８中に示している。鋳型として、老化葉ｃＤＮＡライブラリー及びＧｅｎ  Ｂａｎｋにおいて未同定ゲノム配列（ＡＢ０１７０６０）から設計されたプライマー（図３８の下の領域として示されている）を用いるＰＣＲによって、前記プローブを得た。配列決定をする為にＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローン化した。
【０１２１】
実施例１２
カーネーションからの老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の単離
カーネーションの老化している花弁のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによってカーネーションの花弁で発現する、老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の完全長ｃＤＮＡクローンを得た。スクリーニングの為に用いたプローブの配列（配列番号：２７）を図３９中に示している。鋳型として、老化花弁ｃＤＮＡライブラリー及び変性プライマー、（上流：５’ ＴＴＧ ＡＲＧ ＡＡＧ ＡＴＹ ＣＡＴ ＭＡＡ ＲＴＧ ＣＣＴ ３’）（配列番号：２８）；下流：５’ ＣＣＡ ＴＣＡ ＡＡＹ ＴＣＹ ＴＧＫ ＧＣＲ ＧＴＧ ＴＴ ３’（配列番号：２９））を用いるＰＣＲによって、前記プローブを得た。配列決定をする為にＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にサブクローン化した。
【０１２２】
実施例１３
アンチセンス方向にあるシロイヌナズナＤＨＳの完全長又は３′領域によるシロイヌナズナの形質転換
２重３５Ｓプロモーターによる調節の下で、アンチセンス方向において共に発現する完全長老化により誘導されるシロイヌナズナＤＨＳ  ｃＤＮＡ配列又はＤＨＳ遺伝子の３′末端（配列番号：３０）（図３６）を含有する、バイナリーベクター、ｐＫＹＬＸ７１によりアグロバクテリアを形質転換させた。シロイヌナズナ植物を、真空浸透（ｖａｃｕｕｍ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）法によって前記アグロバクテリアで形質転換させ、そしてＴ０ 植物から生じた形質転換種子をアンピシリン上で選択した。
【０１２３】
図２１〜２４は形質転換シロイヌナズナ植物の写真であり、形質転換植物中でアンチセンス方向におけるＤＨＳ遺伝子又は３′末端の発現により、葉の肥大化及び植物サイズの増加等のバイオマス増加が見られる。形質転換植物では種子の収率が増加したことを図２５に示す。
【０１２４】
実施例１４
アンチセンス方向にあるトマトＤＨＳの完全長又は３′領域によるトマト植物の形質転換
２重３５Ｓプロモーターによる調節の下で、アンチセンス方向において共に発現する完全長老化により誘導されるトマトＤＨＳ  ｃＤＮＡ配列又はＤＨＳ遺伝子の３′末端（配列番号：３１）（図３７）を含有する、バイナリーベクター、ｐＫＹＬＸ７１によりアグロバクテリアを形質転換させた。トマトの葉の移植片はこれらアグロバクテリアにより形成されて、形質転換したカルス及び苗木が生じて、標準組織培養法により選択した。温室条件下で形質転換苗木が生長し、成熟果実を生産するＴ１植物になった。
【０１２５】
図２６〜３５は形質転換植物において老化により誘導されるトマトＤＨＳ遺伝子の発現が減少した結果、形質転換シロイヌナズナ植物に見られるような葉の大きさの肥大化及び植物がより大きくなること等のバイオマスの増加並びにトマト果実が軟化及び腐るのが遅延したことを示す写真である。
【０１２６】
実施例１５
アンチセンス方向にあるトマトＤＨＳの３′領域によるトマト植物の形質転換  ２重３５Ｓプロモーターによる調節の下で、アンチセンス方向において発現するＤＨＳ遺伝子の３′末端（図３７）を含有する、バイナリーベクター、ｐＫＹＬＸ７１によりアグロバクテリアを形質転換させた。トマトの葉の移植片はアグロバクテリアで形質転換されて、形質転換したカルス及び苗木が生じて、標準組織培養法により選択した。温室条件下で形質転換苗木が生長し成熟果実を生産するＴ１ 植物になった。
【０１２７】
コントロールの植物に由来する果実の３３％が尻腐れを進行した条件下で、ＤＨＳ発現が低下したこれら形質転換植物に由来する果実は完全に尻腐れを伴わなかった。尻腐れは栄養ストレスに起因する生理疾患であり、果実の（底部）で発生して老化及び腐敗を引き起こす。尻腐れを示しているコントロールの植物及び尻腐れを伴わないトランスジェニック植物を表しているのが図４０（ａ）及び４０（ｂ）である。
【０１２８】
生理疾患により生ずる組織及び細胞の死の始まりはＤＨＳの発現が低下することによって、予防されることを結果が示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
トマト葉ｃＤＮＡライブラリーから得た老化により誘導されるトマト葉ＤＨＳｃＤＮＡ配列（配列番号：１）及び誘導アミノ酸配列（配列番号：２）が描いてある。
【図２】
図２Ａはシロイヌナズナのジーンバンク（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ−ｗｗｗ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ／）中では未だ同定されていないゲノム配列とトマトＤＨＳ配列のアライメントをすることによって得たシロイヌナズナＤＨＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：５）を描いてある。アミノ酸配列の間のすき間は予測されるイントロンである。
図２Ｂには誘導シロイヌナズナＤＨＳアミノ酸配列（配列番号：６）が描いている。
図２ＣにはＰＣＲによって得られた６００ｂｐの老化により誘導されるシロイヌナズナＤＨＳ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列が描いてある。
図２Ｄには老化により誘導されるシロイヌナズナＤＨＳ ｃＤＮＡ断片の誘導アミノ酸配列が描いてある。
【図３】
誘導される完全長の、トマト葉の老化により誘導されるＤＨＳアミノ酸配列（配列番号：２）及び誘導される完全長の、シロイヌナズナの老化により誘導されるＤＨＳアミノ酸配列とヒト、酵母、真菌及び古細菌のＤＨＳタンパク質の配列とのアライメントである。３〜４の一致するアミノ酸に囲みをつけた。
【図４】
トマトＤＨＳｃＤＮＡの制限地図である。
【図５】
トマト葉から単離して３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したトマトの老化により誘導されるＤＨＳ完全長ｃＤＮＡで標識したゲノムＤＮＡのサザンブロットである。
【図６】
様々な分化の段階にあるトマトの花から単離したＲＮＡのノーザンブロットである。図６Ａはエチジウムブロマイド染色した総ＲＮＡのゲルである。各レーンには１０μｇのＲＮＡが含まれる。図６Ｂは３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したトマトの老化により誘導されるＤＨＳ完全長ｃＤＮＡで標識したノーザンブロットのオートラジオグラフである。
【図７】
様々な成熟の段階にあるトマト果実から単離して３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したトマトの老化により誘導されるＤＨＳ完全長ｃＤＮＡで標識した、ＲＮＡのノーザンブロットである。各レーンは１０μｇのＲＮＡが含まれる。
【図８】
２Ｍのソルビトールで６時間に渡り処理することによって渇水ストレスを掛られたトマトの葉から単離したＲＮＡのノーザンブロットである。各レーンには１０μｇのＲＮＡが含まれる。３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したトマトの老化により誘導されるＤＨＳ完全長ｃＤＮＡでブロットを標識した。
【図９】
凍結温度にさらされたトマトの葉から単離したＲＮＡのノーザンブロットである。図９Ａはエチジウムブロマイドで染色した総ＲＮＡのゲルである。各レーンには１０μｇのＲＮＡが含まれる。図９Ｂは、３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したトマトの老化により誘導されるＤＨＳ完全長ｃＤＮＡで標識したノーザンブロットのオートラジオグラフである。図９Ｃには葉分散体の電導度として測定した対応する関連データを示す。
【図１０】
ポリＡ尾部及び５′末端の非コーディング領域を含まないカーネーションＤＨＳ完全長（１３８４塩基対）ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列である。誘導アミノ酸は以下のヌクレオチド配列（３７３個のアミノ酸）（配列番号：１０）に示されている。
【図１１】
３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したシロイヌナズナの老化により誘導されるＤＨＳ完全長ｃＤＮＡで標識した、老化しているシロイヌナズナの葉由来の総ＲＮＡのノーザンブロットである。オートラジオグラフが上であり、エチジウム染色ゲルが下である。
【図１２】
様々な段階にあるカーネーションの花弁から単離した総ＲＮＡのノーザンブロットである。３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したカーネーションの老化により誘導されるＤＨＳ完全長ｃＤＮＡでブロットを標識した。オートラジオグラフが上であり、エチジウム染色したゲルは下である。
【図１３】
トマト果実の老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子のヌクレオチド配列（上）（配列番号：１１）及び誘導アミノ酸配列（下）（配列番号：１２）である。
【図１４】
カーネーションの老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子のヌクレオチド配列（上）（配列番号：１３）及び誘導アミノ酸配列（下）（配列番号：１４）である。
【図１５】
シロイヌナズナの老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ遺伝子のヌクレオチド配列（上）（配列番号：１５）及び誘導アミノ酸配列（下）（配列番号：１６）である。
【図１６】
様々な段階にあるシロイヌナズナ植物の葉から単離した総ＲＮＡのノーザンブロットである。３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識したシロイヌナズナの老化により誘導されるＤＨＳ完全長ｃＤＮＡ及び完全長老化により誘導されたｅｌＦ−５ＡｃＤＮＡでブロットを標識した。オートラジオグラフが上であり、エチジウム染色したゲルは下である。
【図１７】
ブレーカー（ＢＫ）、赤く固い（ＲＦ）及び赤く柔かい（ＲＳ）分化段階にあるトマト果実から単離した総ＲＮＡのノーザンブロットである。３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した老化により誘導されるＤＨＳ完全長ｃＤＮＡ及び老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ完全長ｃＤＮＡでプローブを標識した。果実が成熟するのと時を同じくして、赤く柔かい果実において、ＤＨＳ及びｅｌＦ−５Ａは同時に調節されている。オートラジオグラフが上であり、エチジウム染色したゲルは下である。
【図１８】
渇水ストレスを誘導する為にソルビトールで処理したトマトの葉から単離した総ＲＮＡのノーザンブロットである。Ｃはコントロール；Ｓはソルビトール処理したものである。３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した老化により誘導されるＤＨＳ完全長ｃＤＮＡ及び老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ完全長ｃＤＮＡでブロットを標識した。ｅｌＦ−５Ａ及びＤＨＳの両方が渇水ストレスに応答して調節されている。オートラジオグラフが上であり、エチジウム染色したゲルは下である。
【図１９】
トマト植物の花のつぼみ及び開いた老化している花から単離した総ＲＮＡのノーザンブロットである。３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した老化により誘導されるＤＨＳ完全長ｃＤＮＡ及び老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ完全長ｃＤＮＡでブロットを標識した。開いている／老化している花においてｅｌＦ−５Ａ及びＤＨＳの両方が調節を受けている。オートラジオグラフが上であり、エチジウム染色したゲルは下である。
【図２０】
冷害を受けたトマトの葉から単離した総ＲＮＡのノーザンブロットである。３２Ｐ−ｄＣＴＰで標識した老化により誘導されるＤＨＳ完全長ｃＤＮＡ及び老化により誘導されるｅｌＦ−５Ａ完全長ｃＤＮＡでブロットを標識した。ｅｌＦ−５Ａ及びＤＨＳの両方が再加温する間の冷害の進行に伴い調節を受けている。オートラジオグラフが上であり、エチジウム染色したゲルは下である。
【図２１】
３．１週齢の野生型シロイヌナズナ（左）及びトランスジェニック植物の写真である。トランスジェニック植物は、アンチセンス方向において老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の３′末端（図３６に配列を示す）を発現し、トランスジェニック植物における葉の肥大化を示す。
【図２２】
４．６週齢の野生型シロイヌナズナ（左）及びトランスジェニック植物の写真である。トランスジェニック植物は、アンチセンス方向において老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の３′末端（図３６に配列を示す）を発現し、トランスジェニック植物における葉の肥大化を示す。
【図２３】
５．６週齢の野生型シロイヌナズナ（左）及びトランスジェニック植物の写真である。トランスジェニック植物は、アンチセンス方向において老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の３′末端（図３６に配列を示す）を発現し、トランスジェニック植物における葉の肥大化を示す。
【図２４】
６．１週齢の野生型シロイヌナズナ（左）及びトランスジェニック植物の写真である。トランスジェニック植物は、アンチセンス方向において老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の３′末端（図３６に配列を示す）を発現し、トランスジェニック植物における葉の肥大化を示す。
【図２５】
アンチセンス方向において老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子を発現する３つのＴ１ トランスジェニックシロイヌナズナ植物系統による種子の収量の増加を示すグラフである。種子の収量を種子の体積として表した。標準誤差（ＳＥ）ｎ＝３０を野生型植物について示す。
【図２６】
野生型シロイヌナズナ（右）及びアンチセンス方向において老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の３′末端（図３６に配列を示す）を発現するトランスジェニックトマト植物（左）の写真である。トランスジェニック植物における葉のサイズの増加及び植物サイズの増加を示している。苗木を土に移植した１８日後にこの写真はとられた。
【図２７】
野生型シロイヌナズナ（左）及びアンチセンス方向において老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の３′末端（図３６に配列を示す）を発現するトランスジェニックトマト植物（左）の写真である。トランスジェニック植物における葉のサイズの増加及び植物サイズの増加を示している。苗木を土に移植した３２日後にこの写真はとられた。
【図２８〜３５】
野生型（上のパネル）及びアンチセンス方向において完全長老化ＤＨＳ遺伝子を発現するトランスジェニック植物（下のパネル）由来のトマトの果実の写真である。生長チャンバーにおいて、分化のはじめ及び成熟した段階で果実を収穫した。収穫後の日数を各パネルの左上角に示している。
【図３６】
植物を形質転換させるのにアンチセンス方向において用いたシロイヌナズナの老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：３０）（上）及び誘導アミノ酸配列（下）である。
【図３７】
植物を形質転換させるのにアンチセンス方向において用いたトマトの老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号：３１）（上）及び誘導アミノ酸配列（下）である。
【図３８】
完全長シロイヌナズナ遺伝子を単離するのに用いた６００ｂｐのシロイヌナズナ老化により誘導されるＤＨＳプローブのヌクレオチド配列（配列番号：２６）（上）及び誘導アミノ酸配列（下）である。
【図３９】
完全長カーネーション遺伝子を単離するのに用いた４８３ｂｐのカーネーションの老化により誘導されるＤＨＳプローブのヌクレオチド配列（配列番号：２７）（上）及び誘導アミノ酸配列（下）である。
【図４０】
（ａ）及び（ｂ）は、アンチセンス方向において老化により誘導されるＤＨＳ遺伝子の３′末端（図３７に配列を示してある）を発現しているトランスジェニックトマト植物由来のトマトの果実（右）及び野生型の植物由来のトマトの果実（左）の写真である。野生型果実が尻腐れを示す一方、トランスジェニック植物はそれを示さない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【国際調査報告】
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