(57)【要約】本発明は、ターゲティングペプチドの同定及び使用に関連した組成物及び方法に関する。そのようなターゲティングペプチドは、インビボにおいて特異的な臓器又は組織へと選択的に回帰する。本明細書において開示される新規なターゲティング配列は、標的化臓器又は組織への、様々な治療剤の標的化送達に有用である。特定の態様において、本発明は、遺伝子治療ベクター又はその他の治療剤と結合する、Ｆａｂ断片のような分子に付着した臓器ターゲティングペプチドを含む、二重特異性ターゲティング試薬に関する。別の態様において、臓器ターゲティング部分および、遺伝子治療又は治療的物質ターゲティング部分を含む二重特異性ターゲティングペプチドが得られ、標的化送達に使用することもできる。その他の態様は、抗原又はその他の分子のリンパ節への標的化送達を介した、宿主免疫系機能の調整に関する。アデノウイルス又はリンパ節組織に対するターゲティングペプチド配列の多数の例が、本発明において開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫系応答を調整するための方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）リンパ節ターゲティングペプチドを得る段階；
ｂ）ターゲティングペプチドを免疫原に付着させる段階；ならびに
ｃ）ターゲティングペプチド及び免疫原を個体へ投与する段階。
【請求項２】
免疫原が、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、脂質、炭水化物、核酸、プリオン、ウイルス、細菌、ファージ、胞子、カビ、酵母、藻類、アメーバ、ジアルジア、渦鞭毛藻類、単細胞生物、病原体、細胞、又は感染物質である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ターゲティングペプチドが、免疫原の表面タンパク質の一部として発現する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ターゲティングペプチドが、免疫原と結合するＦａｂ断片に付着する、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ターゲティングペプチドが二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
ターゲティングペプチドが、免疫原と結合する部分を含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ターゲティングペプチドが、アミノ酸配列ＣＡＹ（システイン−アラニン−チロシン）又はＳＣＡＲ（セリン−システイン−アラニン−アルギニン）を含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ターゲティングペプチドが、配列番号：７又は配列番号：８を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
投与段階が、ターゲティングペプチドの非存在下での免疫応答と比較して、免疫原に対する個体の免疫応答を増加させるのに有効である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
免疫原に対して個体を予防接種する段階をさらに含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
免疫原が癌細胞である、請求項９記載の方法。
【請求項１２】
免疫原がＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）である、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
第二の部分に付着したアミノ酸配列ＣＡＹ又はＳＣＡＲを含む、二重特異性化合物。
【請求項１４】
第二の部分が抗体又は抗体断片である、請求項１３記載の化合物。
【請求項１５】
抗体又は抗体断片が免疫原と結合する、請求項１４記載の化合物。
【請求項１６】
第二の部分が免疫原と結合するペプチドである、請求項１３記載の化合物。
【請求項１７】
ベクター結合部分に付着したターゲティングペプチドを含む、二重特異性化合物。
【請求項１８】
ベクターがアデノウイルス又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項１７記載の化合物。
【請求項１９】
ベクター結合部分が抗体又は抗体のＦａｂ断片を含む、請求項１７記載の化合物。
【請求項２０】
抗体がＩＣ５ＩＩＥ１１又は３Ｂ２ＩＤ１０である、請求項１９記載の化合物。
【請求項２１】
ターゲティングペプチドが配列番号：５を含む、請求項１７記載の化合物。
【請求項２２】
配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：２３、又は配列番号：２４を含む、請求項１７記載の化合物。
【請求項２３】
アミノ酸配列ＥＬＲ（グルタミン酸−ロイシン−アルギニン）を含む、請求項１７記載の化合物。
【請求項２４】
アミノ酸配列ＧＲ（グリシン−アルギニン）を含む、請求項１７記載の化合物。
【請求項２５】
ベクターを臓器又は組織へとターゲティングする方法であって、以下の段階を含む方法：
ａ）臓器又は組織に対するターゲティングペプチドを得る段階；
ｂ）ベクターに対する結合部分を得る段階；
ｃ）ターゲティングペプチドを結合部分に付着させ、複合体を形成させる段階；並びに
ｄ）複合体及びベクターを被験者へ投与する段階。
【請求項２６】
ベクターがアデノウイルス又はＡＡＶである、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
結合部分が抗体又は抗体のＦａｂ断片である、請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
抗体がＩＣ５ＩＩＥ１１又は３Ｂ２ＩＤ１０である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ターゲティングペプチド及び結合部分が、二重特異性化合物の一部である、請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
二重特異性化合物が単一ペプチドである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
個体が哺乳類である、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
個体がマウス又はヒトである、請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本出願は、２０００年９月８日に提出された米国特許仮出願第６０／２３１，２６６号および２００１年１月１７日に提出された米国特許出願第０９／７６５，１０１号からの優先権を主張する。本発明は、米国陸軍の助成金ＤＡＭＤ １７−９８−１−８０４１および１７−９８−１−８５８１ならびに米国国立衛生研究所の助成金１Ｒ０１ＣＡ７８５１２−０１Ａ１、１Ｒ１ＣＡ９０８１０−０１、および１Ｒ０１ＣＡ８２９７６−０１により政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権利を保有する。
【０００２】
１． 発明の分野
本発明は、分子薬品および治療剤の標的化送達の分野に関する。より具体的には、本発明は、二重特異性ターゲティング試薬を用いた、治療用ベクター、特にアデノウイルスベクターのターゲティングのための組成物および方法、ならびに、リンパ節ターゲティングペプチドを用いた免疫系応答の調整に関する。
【０００３】
２． 関連技術の説明
多くのヒト疾患状態の治療的治療は、用いる治療剤の全身毒性のために制限される。癌治療剤は、特に非常に低い治療指数を示し、皮膚および骨髄のような急速に増殖する正常組織は、腫瘍細胞を殺すために用いる濃度ほど高くない薬剤の濃度で影響を受ける。癌および他の臓器または組織限定疾患の治療は、所望の臓器または組織への治療剤の標的化送達のための組成物および方法を開発することによって大きく促進されるであろう。
【０００４】
最近、マウスモデル系において臓器または組織ターゲティングペプチドを同定するためのファージディスプレイライブラリを用いるインビボ選択系が開発された。バクテリオファージの表面上にトランスジェニックペプチドを発現するファージディスプレイライブラリは、当初、免疫グロブリンのエピトープ結合部位をマッピングするために開発された（Ｓｍｉｔｈ、１９８５；ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、１９８５、１９９３）。そのようなライブラリは、ファージの表面タンパク質をコードするｃＤＮＡにランダムオリゴヌクレオチドを挿入すること、独自のペプチドを１０９個もの順列で示すファージ粒子のコレクションを作製することによって作製することができる（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ａｒａｐら、１９９８ｂ）。
【０００５】
ファージディスプレイライブラリをマウスに静脈内投与した後に、個々の臓器からのファージの回収を行った（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）。ファージの外部表面上に発現された特異的ターゲティングペプチド配列に基づいて、異なるマウス臓器または組織の血管床に選択的に回帰することができるファージを回収した（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）。多様な臓器および腫瘍回帰ペプチドがこの方法によって同定されている（Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８、１９９９；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９；Ｂｕｒｇら、１９９９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９）。それらのターゲティングペプチドはそれぞれ、マウス標的組織の血管上に選択的に発現される異なる受容体に結合した（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、２０００ｂ；Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９５；Ｆｏｌｋｍａｎ、１９９７）。腫瘍回帰ペプチドはマウスの腫瘍新生血管において上方制御されている受容体に結合した（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、２０００ｂ）。臓器または組織に対して選択的な個々のターゲティングペプチドを同定する他に、（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９）、このシステムは、インビボでマウスに発現される内皮細胞表面マーカーを同定するために用いられている（ＲａｊｏｔｔｅおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９）。
【０００６】
ターゲティングペプチドに治療剤が結合すれば、マウスモデル系において、作用物質は所望の臓器、組織、または細胞型へと選択的に送達された。化学療法剤およびアポトーシス促進ペプチドを、腫瘍新生血管に存在する受容体に標的送達すると、担癌マウスモデルにおいて治療有効性の著しい増加および全身毒性の減少が起こる（Ａｒａｐら、１９９８ａ、１９９８ｂ；Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９９）。
【０００７】
遺伝子治療ベクターの送達を特定の臓器または組織にターゲティングする試みが行われている。そのようなベクターを関心対象の部位に向ければ、治療効果を増強し、有害な全身免疫反応を減少させるであろう。アデノウイルス５型（Ａｄ５）に基づくベクターは、遺伝子移入研究に一般的に用いられている（Ｗｅｉｔｚｍａｎら、１９９７；Ｚｈａｎｇ、１９９９）。標的細胞に対するＡｄ５の結合は、カプシド繊維のこぶ領域によって媒介され、これは、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を含む細胞表面受容体と、そしておそらくＭＨＣクラスＩと相互作用する（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎら、１９９７；Ｈｏｎｇら、１９９７）。インビボで全身投与すると、ＣＡＲに対するウイルスの結合によって、標的ではないがＣＡＲを発現する組織においてベクターの意図していない濃縮が起こりうる。逆に、ＣＡＲをほとんどまたは全く発現しない標的細胞の形質導入は効率が悪い。より選択的な遺伝子治療の送達を行うためには、Ａｄ５ベクターを再ターゲティングする必要がある。
【０００８】
アデノウイルスの再ターゲティングを達成するための従来の努力においては、二重特異性接合体又は遺伝学的に修飾されたカプシドが使用されてきた。二重特異性接合体は、腫瘍発生又は炎症の際に上方制御される増殖因子受容体へとＡｄ５をターゲティングするために使用された（Ｄｏｕｇｌａｓら、１９９６；Ｇｏｌｄｍａｎら、１９９７；Ｗａｔｋｉｎｓら、１９９７；Ｍｉｌｌｅｒら、１９９８）。ＣＤ３、αｖインテグリン、又はヘパラン硫酸受容体に対するリガンドを使用したＡｄ５再ターゲティングも、試みられた（Ｗｉｃｋｈａｍら、１９９５；１９９６ａ、１９９６ｂ；１９９７ａ、１９９７ｂ；Ｖｉｇｎｅら、１９９９）。他の試みにおいては、アデノウイルスを再ターゲティングすることを試み、異種リガンドがファイバーノブのＨＩループに取り込まれた（Ｄｍｉｔｒｉｅｖら、１９９８；Ｋｒａｓｎｙｋｈら、１９９８）。異種リガンドを、レトロウイルスのエンベロープ、又はアデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスのカプシドへと取り込ませ、それにより、これらのベクターを、インテグリン（Ｄｍｉｔｒｉｅｖら、１９９８；Ｖｉｇｎｅら、１９９９；Ｇｉｒｏｄら、１９９９）、Ｔ細胞受容体（Ｅｎｇｅｌｓｔａｄｔｅｒら、２０００）、又は黒色腫関連抗原（Ｍａｒｔｉｎら、１９９９）へとターゲティングすることも行われている。これらの手法には、二つの主要な限界がある。（１）ターゲティングされた受容体が特異的組織に限定されていなかった；又は（２）ターゲティングされた受容体が、静脈投与療法にとっての要件である、血管を裏打ちしている内皮細胞の内腔表面上に選択的に発現されていなかった。目的の臓器又は組織への選択的な静脈送達を可能にするために有効な、アデノウイルスベクター及びその他の遺伝子治療ベクターの再ターゲティング手段が、当技術分野においては必要とされている。
【０００９】
免疫系応答を調整するため、脾臓及びリンパ節のような宿主免疫系の一部への免疫原性剤の標的化送達が、試みられている。そのような手法は、リンパ節又は脾臓への抗原の直接接種（Ｓｉｇｅｌら、１９８３；Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９８７）、並びに樹状細胞及びその他の抗原提示細胞の上に位置している受容体のターゲティング（Ｗａｎｇら、２０００；Ｈｅｉｊｎｅｎら、１９９６）を含んでいた。現在までの結果は、ごくわずかにしか成功していない。免疫原性剤の免疫系ターゲティングの効率的かつ効果的な方法が、必要とされている。
【００１０】
発明の概要
本発明は、インビボにおける特異的な臓器又は組織への、遺伝子治療ベクター（アデノウイルスベクターを含むが、これに限定されるわけではない）の選択的送達のための組成物及び方法を提供することにより、当技術分野における長年にわたる需要を満たす。他の態様において、組成物及び方法は、様々な抗原の送達のためリンパ節組織をターゲティングし、それにより、抗原に対する宿主の免疫系応答を調整することを可能にする。当業者であれば、特許請求の範囲に記載された使用法の範囲が、ターゲティングされうる抗原の型に関して制限されず、単一の精製された分子から、ウイルス、細菌、又は罹患宿主細胞のような病原性因子にまで及ぶ任意の免疫原性化合物を含むことを理解するであろう。さらなる態様において、リンパ節へとターゲティングされる化合物は、１個以上の免疫系機能の制御分子（サイトカイン又はケモカインを含むが、これらに限定されるわけではない）を含みうる。いくつかの態様において、治療を受ける罹患細胞又は病原性生物は、ターゲティングされた臓器又は組織から遠位の体内部位に位置していてもよい。そのような使用法の非限定的な例は、腫瘍関連抗原に対する全身性体液性免疫応答を惹起し、腫瘍に対する宿主免疫応答を増幅することによる転移性癌の治療であろう。
【００１１】
本発明のいくつかの態様は、所望の臓器又は組織に対するターゲティングペプチドを選択する段階、ターゲティングペプチドを、分子、高分子複合体、又は遺伝子治療ベクターに付着させる段階、及び、分子、複合体、又はベクターに付着したペプチドを被験者へと供給する段階を含む、標的化送達の方法に関する。いくつかの好ましい態様において、臓器又は組織はリンパ節である。リンパ節ターゲティングペプチドの好ましい例は、下記の実施例２に開示される。
【００１２】
本発明のもう一つの態様は、標的化遺伝子治療のための分子アダプターに関する。好ましい態様において、分子アダプターは、所望の臓器又は組織への選択的ターゲティングを提供するターゲティングペプチド配列に、共有結合により付着した、遺伝子治療ベクターに特異的な抗体のＦａｂ断片を含む。より好ましい態様において、遺伝子治療ベクターは、アデノウイルス、特に５型アデノウイルスである。当業者であれば、本発明がアデノウイルスベクターに限定されず、当技術分野において既知の任意の遺伝子治療ベクターを含みうることを認識するであろう。同様に、分子アダプターのベクター結合部分は、抗体のＦａｂ断片に限定されず、ターゲティングペプチドを遺伝子治療ベクターに付着させるために使用されうる他の分子を含みうる。唯一の要件は、遺伝子治療ベクターが、分子アダプターの存在下で、所望の臓器又は組織へと選択的にターゲティングされることである。そのようなＦａｂ断片及びアデノウイルスターゲティングペプチドの好ましい例は、下記の実施例１に提供される。
【００１３】
さらなる態様は、抗原をリンパ節へとターゲティングすることによる体液性免疫応答の調整のための組成物及び方法に関する。リンパ節ターゲティングペプチドは、抗原に付着し、被験者へと投与されうる。ターゲティングペプチドの存在は、抗原のリンパ節への選択的送達を提供し、抗原は、リンパ節で、被験者の体液性免疫応答を調整する。好ましい態様において、ターゲティングペプチドは、共有結合により抗原に付着している。本発明の範囲に含まれる抗原には、これらに限定されるわけではないが、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、ウイルス、細菌、病原性微生物、及び罹患細胞を含む、被験者における体液性免疫応答を惹起することができる任意の分子又は高分子集合体が含まれうる。
【００１４】
添付の図面は、本明細書の一部であり、本発明の特定の局面をさらに示すために含まれる。本発明は、本明細書に示す特定の態様の詳細説明と共にこれらの図面の一つまたは複数を参照することによってよりよく理解されるであろう。
【００１５】
例示的態様の説明
本明細書において用いられるように、「一つ（ａ）」、または「一つ（ａｎ）」とは、一つまたは複数を意味してもよい。本明細書の特許請求の範囲において用いられるように、「含む」という用語と組み合わせて用いる場合、「一つ（ａ）」または「一つ（ａｎ）」とは、一つまたは複数を意味してもよい。本明細書において用いられるように、「もう一つ」とは、項目の少なくとも二番目またはそれ以上を意味してもよい。
【００１６】
「ターゲティングペプチド」とは、連続するアミノ酸配列を含むペプチドであり、臓器または組織への選択的局在を特徴とする。選択的局在は例えば、推定のターゲティングペプチド配列が、ファージの外表面上に表示されるタンパク質に組み入れられる、下記に開示する方法によって決定してもよい。異なるアミノ酸配列のそのようなターゲティングペプチドを多数発現するよう遺伝学的に改変されたそのようなファージのライブラリを、被験者へと投与した後、被験者から１個以上の臓器又は組織を収集し、その臓器又は組織に見出されるファージを同定する。ターゲティングペプチド配列を発現しているファージは、対照の組織又は臓器と比較して、より多い結合を、その組織又は臓器において示す場合、その組織又は臓器に選択的に移行するものと見なされる。又は、選択的移行を示すターゲティングペプチド配列を発現しているファージは、標的臓器から回収されたファージを、次回のスクリーニングのため第二の宿主へと再注射した場合に、対照臓器と比較して増加した濃縮を標的臓器において示すはずである。３回目のスクリーニングの後には、さらなる濃縮が示されうる。選択的局在を決定するもう一つの手段は、推定の標的ペプチドを発現するファージが、非特異的ペプチドを発現する、または任意の推定の標的ペプチドを発現するように遺伝子操作されていない対照ファージと比較して、標的臓器において少なくとも２倍、より好ましくは少なくとも３倍の濃縮を示すことである。選択的局在を決定するもう一つの方法は、標的ペプチドを発現するファージの標的臓器への局在が、標的ペプチド配列を含む合成ペプチドの同時投与によって少なくとも部分的に阻害されることである。「ターゲティングペプチド」および「回帰ペプチド」とは、本明細書において同義に用いられる。
【００１７】
「ファージディスプレイライブラリ」とは、その外表面上に推定のターゲティングペプチドの組を発現するように遺伝子操作されているファージのコレクションを意味する。好ましい態様において、推定のターゲティングペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ファージ被膜タンパク質をコードする遺伝子にフレームが合うように挿入される。他の好ましい態様において、推定のターゲティングペプチド配列は、一部が２０個全てのアミノ酸のランダム混合物であり、一部が非ランダム混合物である。特定の好ましい態様において、ファージディスプレイライブラリの推定のターゲティングペプチドは、ターゲティングペプチド配列内の固定位置で一つまたは複数のシステイン残基を示す。
【００１８】
「高分子複合体」とは、その配列がランダム、規則正しい、または部分的に規則正しくてもよい分子のコレクションを意味する。この用語は、バクテリオファージ、ウイルス、細菌、単細胞病原性生物、多細胞病原性生物、および原核または真核細胞のような生物を含む。この用語はまた、リポソーム、微小カプセル、微粒子、磁気ビーズのような非生存分子群を含む。唯一の要件は、複合体が一つ以上の分子を含むことである。分子は同一であっても、または互いに異なっていてもよい。
【００１９】
ターゲティングペプチドのための「受容体」には、ターゲティングペプチドに結合する任意の分子または分子の複合体が含まれるがこれらに限定されない。受容体の非限定的な例には、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、エピトープ、脂質、糖質、多分子構造、一つまたは複数の分子の特異的コンフォメーションおよび形態解剖学的実体が含まれる。好ましい態様において、「受容体」とは、標的臓器または組織内の血管を裏打ちする（ｌｉｎｅ）内皮細胞の管腔表面上に存在する天然に存在する分子または分子の複合体である。
【００２０】
ファージディスプレイ
ターゲティングペプチドを同定するための本明細書に記載の方法は、ファージディスプレイライブラリのインビトロ投与を含む。ファージディスプレイの様々な方法およびペプチドの多様な集団を作製する方法は当技術分野で周知である。例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，２２３，４０９号、第５，６２２，６９９号、および第６，０６８，８２９号は、ファージライブラリを調製する方法を開示する。ファージディスプレイ技術は、小さいペプチドがその表面上に発現されうるようにバクテリオファージを遺伝子操作することを含む（Ｓｍｉｔｈ、１９８５；ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、１９８５、１９９３）。この技術を適用できる可能性がある範囲はかなり広く、過去１０年の間に、ファージによって表示されたペプチドライブラリの構築、およびライブラリを用いてペプチドリガンドを単離するスクリーニング方法の開発にはかなりの進歩が認められている。例えば、ペプチドライブラリを用いることによって、相互作用部位、および炎症反応に関与する抗体または細胞接着を媒介するインテグリンのような多くのタンパク質における受容体−リガンド結合モチーフの特徴を調べることが可能となった。この方法は同様に、ペプチド模倣薬または造影剤を開発するためのリードとして役立つ新規ペプチドリガンドを同定するためにも用いられている（Ａｒａｐら、１９９８ａ）。ペプチドの他に、一本鎖抗体のようなより大きいタンパク質ドメインもまた、ファージ粒子の表面上に表示されうる（Ａｒａｐら、１９９８ａ）。
【００２１】
ある臓器又は組織をターゲティングするための最も効率的なアミノ酸配列は、「バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）」により単離されうる（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９）。簡単に説明すると、推定ターゲティングペプチドを含むファージのライブラリを被験者へと投与し、ファージを含む臓器又は組織の試料を回収する。繊維状ファージを利用した好ましい態様においては、バイオパニングとバイオパニングの間に、線毛陽性細菌においてインビトロでファージを繁殖させることができる。この細菌は、ファージによって溶解せず、特定の挿入物を表示するファージを、多コピー、分泌する。標的分子と結合するファージは、標的の臓器又は組織から溶出させ、次いで宿主細菌において増殖させることにより増幅することができる。所望により、増幅されたファージを宿主へと投与し、臓器又は組織の試料を再び収集してもよい。選択的バインダーの集団が得られるまで、複数回のバイオパニングを実施することができる。ペプチドのアミノ酸配列は、ファージゲノムにおけるターゲティングペプチド挿入物に対応するＤＮＡを配列決定することによって決定される。次に、同定されたターゲティングペプチドを標準的なタンパク質化学技術によって合成ペプチドとして産生することができる（Ａｒａｐら、１９９８ａ；ＳｍｉｔｈおよびＳｃｏｔｔ、１９８５）。このアプローチによって、その標的の特性に関して如何なる概念も予め抱くことなく、循環中のターゲティングペプチドを偏りのない機能的アッセイにおいて検出することができる。候補標的がターゲティングペプチドの受容体として同定されると、これを、標準的な生化学的方法を用いて単離、精製、およびクローニングすることができる（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９；ＲａｊｏｔｔｅおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９）。
【００２２】
ファージディスプレイ系の選択
マウスにおいて行われたこれまでのインビボ選択研究は、ｆＵＳＥ５ベクターにおけるＩＩＩ遺伝子被膜タンパク質との融合タンパク質として発現されたランダムペプチドのライブラリを好んで用いた（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６）。所定のライブラリに存在する個々のクローンの数および多様性は、インビボ選択の成否にとって重要な要因である。欠損ファージクローンの過剰発現を有する可能性が低い第一のライブラリを用いることが好ましい（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９）。ライブラリの調製は、１０８〜１０９形質導入単位（Ｔ．Ｕ．）／ｍｌのあいだで最適化しなければならない。特定の態様において、各選択ラウンドの間にバルク増幅戦略を適用する。
【００２３】
直鎖、環状、または二環ペプチドを示すファージライブラリを、本発明の範囲内で用いてもよい。しかし、単環ペプチドは直鎖ペプチドより標的臓器に対して高い親和性を有する傾向があることから、環状挿入物（ＣＸ３−１０Ｃ）において３〜１０個のランダム残基を表示するファージライブラリが好ましい。二環ペプチドを示すライブラリ（ＣＸ３Ｃ Ｘ３Ｃ Ｘ３Ｃなど；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８）も首尾よく用いられている。しかし、同源の合成ペプチドの産生は、可能ではあるが、異なるジスルフィド架橋配列を有する多数の配座異性体のために複雑となりうる。
【００２４】
マウスにおけるインビボファージディスプレイによる回帰ペプチドおよび受容体の同定
マウスに投与されたファージディスプレイペプチドライブラリ由来のペプチドのインビボ選択を用いて、正常なマウス脳、腎臓、肺、皮膚、膵臓、網膜、腸、小腸、子宮、前立腺、および副腎に関して選択的なターゲティングペプチドを同定した（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８）。これらの結果は、正常な臓器の血管内皮が、ペプチドプローブによる異なるターゲティングを可能にするために十分に不均一であることを示している（ＰａｓｑｕａｌｉｎｉおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９６；Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８）。腫瘍の新生血管に回帰するペプチドを同定する手段は、下記のように考案されている。ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の血管を標的とするペプチドモチーフのパネルが構築されている（Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９９により概説）。これらのモチーフには、配列ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ（配列番号：２５）（ＲＧＤ−４Ｃと名付ける）、ＮＧＲ、およびＧＳＬが含まれる。ＲＧＤ−４Ｃペプチドはこれまで、選択的に結合するαｖインテグリンとして同定されており、ヌードマウスにおける腫瘍異種移植片の血管に回帰することが示されている（Ａｒａｐら、１９９８ａ、１９９８ｂ；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、１９９７）。
【００２５】
腫瘍回帰ＲＧＤ４Ｃターゲティングペプチドの受容体は、αｖインテグリンとして同定されている（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９７）。αｖインテグリンは、血管新生において重要な役割を果たす。αｖβ３およびαｖβ５インテグリンは、正常な内皮細胞には存在しないか、または発現されても低レベルであるが、腫瘍の新生血管では誘導される（Ｂｒｏｏｋｓら、１９９４ａ、１９９４ｂ；Ｈａｍｍｅｓら、１９９６）。アミノペプチダーゼＮ／ＣＤ１３は最近、ＮＧＲモチーフの血管新生受容体であると同定されている（Ｂｕｒｇら、１９９９）。アミノペプチダーゼＮ／ＣＤ１３は、マウス前立腺癌の新生血管だけでなく、正常前立腺内皮組織においても強く発現されている。表１は、マウスにおけるインビボファージディスプレイによる、腫瘍ターゲティングのための代表的なリガンド−受容体対を示す。
【００２６】
細胞表面受容体、及びインビボファージディスプレイにより単離された回帰モチーフ
【表１】
2004536020.tif 000002
ＨＭＷＭＡＡ、高分子量黒色腫関連抗原；ＭＭＰ、マトリックスメタロプロテイナーゼ；ＥＣ、内皮細胞；Ｎ／Ｄ、未決定；Ｒ、アルギニン；Ｇ、グリシン；Ｃ、システイン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｓ、セリン；Ｌ、ロイシン；Ｔ、トレオニン、Ｈ、ヒスチジン；Ｗ、トリプトファン、Ｆ、フェニルアラニン；ＭＤＰ、メンブレンジペプチダーゼ（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｉｐｅｐｔｉｄａｓｅ）
【００２７】
腫瘍回帰ファージは、腫瘍の新生血管においてその受容体と同時局在するが、正常組織の非新生血管には存在しない（Ａｒａｐら、１９９８ｂ）。免疫組織化学的証拠から、血管ターゲティングファージが、組織切片においてヒト腫瘍血管に結合するが（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、２０００ｂ）、正常血管には結合しないことが示されている。挿入物を有さない陰性対照ファージ（ｆｄファージ）は、正常または腫瘍組織切片に結合しなかった。血管新生受容体の発現を、細胞株、非増殖血管、および腫瘍の活性化血管、ならびに黄体のような他の血管新生組織において評価した。血管新生受容体は、正常臓器の血管において検出されなかった。
【００２８】
これらの受容体の分布を、腫瘍細胞、腫瘍血管、および正常血管において免疫組織化学によって分析した。αｖインテグリン、ＣＤ１３、アミノペプチダーゼＡ、ＮＧ２、および腫瘍血管における既知の受容体であるＭＭＰ−２／ＭＭＰ−９は、新生血管の内皮細胞および周皮細胞において特異的に発現される。新生血管は、非増殖性の内皮細胞では非常に低レベルで発現されるか、または全く発現されないマーカーを発現する（示していない）。
【００２９】
新生血管内皮のマーカーには、ＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ受容体の特異的サブタイプ、ならびに中でもαｖインテグリンのような血管増殖因子の受容体が含まれる（ＭｕｓｔｏｎｅｎおよびＡｌｉｔａｌｏ、１９９５）。これまで、新生血管の特徴である新規分子の同定および単離は、主に内皮細胞を培養で増殖させると表現型が劇的に変化するために遅れている（Ｗａｔｓｏｎら、１９９５）。
【００３０】
これらの腫瘍血管マーカーの多くはプロテアーゼであり、マーカーのいくつかは、ウイルス受容体として作用する。αｖインテグリンは、アデノウイルスの受容体であり（Ｗｉｃｋｈａｍら、１９９７ｃ）、ＣＤ１３はコロナウイルスの受容体である（Ｌｏｏｋら、１９８９）。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９は、エコーウイルスの受容体である（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９９）。アミノペプチダーゼＡも同様にウイルス受容体であると考えられる。バクテリオファージは真核細胞ウイルスと同じ細胞受容体を利用する可能性がある。これらの知見は、インビボファージディスプレイによって単離された受容体が、同定されたペプチドモチーフを標的遺伝子治療担体として利用するための重要な特徴である、細胞内部移行（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）能を有することを示唆している。
【００３１】
標的化送達
腫瘍血管に回帰するペプチドを細胞障害薬またはアポトーシス促進ペプチドにカップリングさせると、腫瘍異種移植片を有する実験的マウスモデルにおいて親化合物より有効でより毒性の低い化合物が得られている（Ａｒａｐら、１９９８ａ；Ｅｌｌｅｒｂｙら、１９９９）。下記に示すように、ＲＧＤ−４Ｃペプチドをアデノウイルスの表面タンパク質に挿入すると、腫瘍標的化遺伝子治療のために用いてもよいアデノウイルスベクターが得られる（Ａｒａｐら、１９９８ｂ）。他の態様において、様々な治療用のタンパク質又はペプチドと連結されたターゲティングペプチドを含む融合タンパク質又はキメラタンパク質を作製し、本発明の方法により投与することもできる。開示された方法による送達のためターゲティングされうる治療用のタンパク質又はペプチドの非限定的な例を、以下に挙げる。
【００３２】
プログラム細胞死の制御因子
アポトーシス又はプログラム細胞死は、正常な胚発生、成体組織におけるホメオスタシスの維持、及び発癌の抑制にとって不可欠の過程である（Ｋｅｒｒら、１９７２）。タンパク質のＢｃｌ−２ファミリー及びＩＣＥ様プロテアーゼは、他の系においてアポトーシスの重要な制御因子及びエフェクターであることが証明されている。ろ胞性リンパ腫に関連して発見されたＢｃｌ−２タンパク質は、多様なアポトーシス刺激に対する応答の際、アポトーシスの調節及び細胞生存の増強において顕著な役割を果たしている（ＣｌｅａｒｙおよびＳｋｌａｒ、１９８５；Ｃｌｅａｒｙら、１９８６；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏら、１９８５；ＴｓｕｊｉｍｏｔｏおよびＣｒｏｃｅ、１９８６）。進化上保存されてきたＢｃｌ−２タンパク質は、現在では、細胞死アゴニスト（ｄｅａｔｈ ａｇｏｎｉｓｔｓ）又は細胞死アンタゴニスト（ｄｅａｔｈ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ）として分類されうる関連タンパク質のファミリーのメンバーであることが認識されている。
【００３３】
その発見に続き、Ｂｃｌ−２は多様な刺激により誘発される細胞死を抑制するよう作用することが示された。また、現在では、構造上及び配列上の相同性を共有しているＢｃｌ−２細胞死制御タンパク質のファミリーが存在することが明らかである。これらの種々のファミリーメンバーは、Ｂｃｌ−２と類似の機能を保有しているか（例えば、ＢｃｌＸＬ、ＢｃｌＷ、ＢｃｌＳ、Ｍｃｌ−１、Ａ１、Ｂｆｌ−１）、又はＢｃｌ−２機能に対抗し、細胞死を促進するか（例えば、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ）のいずれかであることが示されている。
【００３４】
本発明の範囲内で意図されるアポトーシス促進剤の非限定的な例には、グラミシジン、マガイニン、メリチン、デフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）、セクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）、（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（配列番号：１）、（ＫＬＡＫＫＬＡ）２（配列番号：２）、（ＫＡＡＫＫＡＡ）２（配列番号：３）、又は（ＫＬＧＫＫＬＧ）３（配列番号：４）が含まれる。
【００３５】
血管新生阻害剤
いくつかの態様において、本発明は、アンジオテンシン、ラミニンペプチド、フィブロネクチンペプチド、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、組織メタロプロテイナーゼ阻害剤、インターフェロン、インターロイキン１２、血小板因子４、ＩＰ−１０、Ｇｒｏ−β、トロンボスポンジン、２−メトキシエストラジオール、プロリフェリン（ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ）関連タンパク質、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、マリマスタット（Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）、ペントサンポリ硫酸（ｐｅｎｔｏｓａｎ ｐｏｌｙｓｕｌｐｈａｔｅ）、アンジオポエチン２（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、インターフェロンα、ハービマイシン（ｈｅｒｂｉｍｙｃｉｎ）Ａ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノマイド、サリドマイド、ペントキシフィリン（ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎｅ）、ゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）、ＴＮＰ−４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アキュチン（ａｃｃｕｔｉｎ）、アンジオスタチン、シドフォビル（ｃｉｄｏｆｏｖｉｒ）、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４、又はミノサイクリン（ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ）のような抗血管新生剤に付着したターゲティングペプチドの投与に関しうる。
【００３６】
タンパク質とペプチド
特定の態様において、本発明は、少なくとも一つのタンパク質またはペプチドを含む新規組成物に関する。本明細書において用いられるように、タンパク質またはペプチドは一般的に、アミノ酸２００個以上で遺伝子から翻訳された完全長の配列までのタンパク質；アミノ酸１００個以上のポリペプチド；および／またはアミノ酸約３〜約１００個のペプチドを意味するがこれらに限定されない。便宜上、「タンパク質」、「ポリペプチド、および「ペプチド」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。
【００３７】
特定の態様において、少なくとも一つのタンパク質またはペプチドの大きさは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、約２５００個のアミノ酸残基またはそれ以上を含んでもよいがこれらに限定されない。
【００３８】
本明細書において用いられるように、「アミノ酸残基」とは、当技術分野で既知の任意の天然のアミノ酸、任意のアミノ酸誘導体、または任意のアミノ酸模倣体を意味する。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基は連続的であって、アミノ酸残基の配列を中断する任意の非アミノ酸は存在しない。他の態様において、配列は一つまたは複数の非アミノ酸部分を含んでもよい。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基の配列は、一つまたは複数のアミノ酸部分によって中断されてもよい。特定の態様において、タンパク質またはペプチドの残基配列は、一つまたは複数のアミノ酸部分によって中断されてもよい。
【００３９】
したがって、「タンパク質またはペプチド」という用語は、天然に存在するタンパク質において認められる一般的なアミノ酸２０個の少なくとも一つ、または下記の表２に示すアミノ酸を含むがこれらに限定しない少なくとも一つの改変もしくはまれな（ｕｎｕｓｕａｌ）アミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。
【００４０】
改変アミノ酸およびまれなアミノ酸
【表２】
2004536020.tif 000003
【００４１】
タンパク質またはペプチドは、標準的な分子生物学的技術を用いたタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの発現、タンパク質もしくはペプチドの天然資源からの単離、またはタンパク質もしくはペプチドの化学合成を含む、当業者に既知の任意の技術によって作製してもよい。様々な遺伝子に対応するヌクレオチドならびにタンパク質、ポリペプチド、およびペプチド配列がこれまでに開示されており、当業者に既知のコンピューターデータベースにおいて認められるであろう。そのような一つのデータベースは、国立バイオテクノロジー情報センターのＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＰｅｐｔデータベースである（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。既知の遺伝子のコード領域は、本明細書に開示の技術を用いて、または当業者に既知であるように増幅および／または発現してもよい。または、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの様々な市販の調製物が、当業者に既知である。
【００４２】
ペプチド模倣体
本発明に従ってポリペプチドを調製するためのもう一つの態様は、ペプチド模倣体を用いることである。模倣体は、タンパク質の二次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。例えば、参照として本明細書に組み入れられる、「バイオテクノロジーと薬学（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、ペズット（Ｐｅｚｚｕｔｏ）ら編、Ｃｈａｐｍａｎ ａｎｄ Ｈａｌｌ、ニューヨーク（１９９３）内、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、「ペプチド折り返し模倣体（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｕｒｎ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」を参照のこと。ペプチド模倣体を用いる背景の基礎となる根本的理由は、タンパク質のペプチド骨格が、抗体と抗原の相互作用のような分子間相互作用を促進するようにアミノ酸側鎖を主に向けるように存在する点である。ペプチド模倣体は、天然の分子と類似の分子間相互作用を可能にすると予想される。これらの原理を用いて、本明細書に開示のターゲティングペプチドの天然の特性の多くを有するが、改変および改善すらされた特徴を有する第二世代の分子を操作してもよい。
【００４３】
融合タンパク質
本発明の他の態様は、融合タンパク質に関する。これらの分子は一般的に、ターゲティングペプチドの全てまたは実質的な部分が、Ｎ末端またはＣ末端で第二のポリペプチドまたはタンパク質の全てまたは実質的な部分に結合している。例えば、融合体は、異種宿主においてタンパク質の組み換え型を発現させるように他の種からのリーダー配列を用いてもよい。もう一つの有用な融合には、融合タンパク質の精製を促進するために、抗体のエピトープのような免疫学的に活性なドメインを付加することが含まれる。融合部またはその近傍に切断部位を含めると、精製後のさらなるポリペプチドの除去が促進されるであろう。他の有用な融合には、酵素からの活性部位、グリコシル化ドメイン、細胞ターゲティングシグナル、または膜貫通領域のような機能的ドメインの連結が含まれる。好ましい態様において、本発明の融合タンパク質は、治療タンパク質またはペプチドに結合したターゲティングペプチドを含む。融合タンパク質に組み入れてもよいタンパク質またはペプチドの例には、細胞抑制タンパク質、殺細胞タンパク質、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、ペプチド薬、抗体、Ｆａｂ断片抗体、抗原、受容体タンパク質、酵素、レクチン、ＭＨＣタンパク質、細胞接着タンパク質、および結合タンパク質が含まれる。これらの例は、制限することを意味しておらず、実質的に本発明の範囲内において、タンパク質またはペプチドはターゲティングペプチドを含む融合タンパク質に組み入れることができることを意図している。融合タンパク質を作製する方法は、当業者に周知である。そのようなタンパク質は、例えば二官能架橋剤を用いる化学的結合によって、完全な融合タンパク質の新規合成によって、またはターゲティングペプチドをコードするＤＮＡ配列を第二のペプチドまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合させた後、無傷の融合タンパク質を発現させることによって、産生することができる。
【００４４】
タンパク質の精製
特定の態様において、タンパク質またはペプチドは単離または精製してもよい。タンパク質精製技術は当業者に周知である。これらの技術は、一つのレベルで細胞、組織、または臓器のポリペプチドおよび非ポリペプチド画分へのホモジナイゼーションならびに粗分画化を含む。関心対象のタンパク質またはポリペプチドは、部分的または完全な精製を得るために（または均一になるまで精製）、クロマトグラフィーおよび電気泳動技術を用いてさらに精製してもよい。純粋なペプチドの調製に特に適した分析法は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル排除クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、アフィニティクロマトグラフィー、免疫アフィニティクロマトグラフィー、および等電点電気泳動である。アフィニティクロマトグラフィーによる受容体タンパク質精製の例は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，２０６，３４７号に開示されている。ペプチドを精製する特に効率のよい方法は、速いタンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）またはＨＰＬＣである。
【００４５】
精製タンパク質またはペプチドは、タンパク質またはペプチドが、その天然に得られる状態と比較して任意の程度にも精製されている、他の成分から単離可能な組成物を意味すると解釈される。したがって、単離または精製タンパク質またはペプチドも同様に、天然に存在する可能性がある環境を含まないタンパク質またはペプチドを意味する。一般的に、「精製された」とは、様々な他の成分を除去するために分画化が行われている、および組成物がその発現された生物活性を実質的に保持しているタンパク質またはペプチド組成物を意味するであろう。「実質的に精製された」という用語を用いる場合、この用語は、タンパク質またはペプチドが、組成物におけるタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、またはそれ以上を構成するような、組成物の主成分を形成する組成物を意味する。
【００４６】
タンパク質またはペプチドの精製の程度を定量する様々な方法が、本開示に照らして当業者に既知である。これらには、例えば、活性な画分の比活性を決定する、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析によって画分内でのポリペプチドの量を評価することが含まれる。画分の純度を評価する好ましい方法は、画分の比活性を計算すること、それを最初の抽出物の比活性と比較すること、およびこのように、「〜精製倍率」によって評価して、その純度を計算することである。活性の量を示すために用いられる実際の単位は、当然、精製を行うために選択される特定のアッセイ技術、および発現されたタンパク質またはペプチドが検出可能な活性を示すか否かに依存するであろう。
【００４７】
タンパク質精製に用いるために適した様々な技術は、当業者に周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体等による沈殿、または熱変性の後に遠心；イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシアパタイト、およびアフィニティクロマトグラフィーのようなクロマトグラフィー段階；等電点電気泳動；ゲル電気泳動；ならびにこれらおよび他の技術の組み合わせが含まれる。当技術分野で一般的に既知であるように、様々な精製段階を行う順序は、変更してもよく、または特定の段階を省略してもよいと考えられ、なおも実質的に精製されたタンパク質またはペプチドを調製するための適した方法が得られる。
【００４８】
タンパク質またはペプチドは常にその最も精製された状態で提供すべきであるという一般要件はない。実際に、実質的にあまり精製されていない産物は、特定の態様において有用であると考えられる。部分精製は、より少ない精製段階を組み合わせて用いて、または同じ一般的精製スキームの異なる型を用いて行ってもよい。例えば、ＨＰＬＣ装置を用いて行われる陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般的に低圧クロマトグラフィーシステムを用いる同じ技術より大きい精製「倍率」が得られるであろうと認識される。相対的なより低い程度の精製を示す方法は、タンパク質産物の全体的な回収、または発現されたタンパク質の活性を維持するために長所を有する可能性がある。
【００４９】
アフィニティクロマトグラフィーは、単離される物質と、それが特異的に結合する分子との特異的親和性に依存するクロマトグラフィー技法である。これは、受容体−リガンドタイプの相互作用である。カラム材料は、結合パートナーの一つを不溶性のマトリクスに共有カップリングさせることによって合成される。次に、カラム材料は溶液から物質を特異的に吸収することができる。条件を結合が起こらない条件に変更すると（例えば、ｐＨ、イオン強度、温度等の変化）、溶出が起こる。マトリクスは、如何なる有意な程度にもそれ自身が分子を吸収せず、しかも広い範囲の化学、物理、および熱安定性を有する物質でなければならない。リガンドはその結合特性に影響を及ぼさないようにカップリングしなければならない。リガンドは、比較的堅固な結合を提供しなければならない。そして、試料またはリガンドを破壊することなく、物質を溶出することができなければならない。
【００５０】
合成ペプチド
本発明のターゲティングペプチドは、その大きさが比較的小さいために、従来の技術に従って溶液または固体支持体上で合成することができる。様々な自動シンセサイザーが市販されており、既知のプロトコールに従って用いることができる。例えば、そのそれぞれが参照として本明細書に組み入れられる、スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）、１９８４；タム（Ｔａｍ）ら、１９８３；メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、１９８６；およびバラニー（Ｂａｒａｎｙ）およびメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）、１９７９を参照のこと。通常、アミノ酸約６個から約３５〜５０個までの短いペプチド配列は、そのような方法によって容易に合成することができる。または、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列が発現ベクターに挿入され、適当な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされ、発現に適した条件で培養される組み換え型ＤＮＡ技術を用いてもよい。
【００５１】
抗体
特定の態様において、同定されたターゲティングペプチドまたはその受容体に対する抗体を作製することが望ましいかもしれない。適当なターゲティングペプチドまたは受容体、またはその一部をリンカー、ポリリンカー、または誘導体化アミノ酸によって一つまたは複数の物質にカップリング、結合（ｂｏｎｄｅｄ）、結合（ｂｏｕｎｄ）、共役、または化学的に結合させてもよい。これは、双特異的、または多価組成物またはワクチンが産生されるように行ってもよい。これらの組成物の調製において用いられる方法は、当業者に周知であり、ヒトに投与するために適していなければならない、すなわち薬学的に許容されなければならないとさらに想像される。好ましい物質は、担体であり、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。
【００５２】
「抗体」という用語は、抗原決定領域を有する任意の抗体様分子を意味するために用いられ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖ドメイン抗体（ＤＡＢｓ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（一本鎖Ｆｖ）等のような抗体断片が含まれる。様々な抗体に基づく構築物および断片を調製および用いる技術は、当技術分野で周知である。抗体を調製および特徴付けする手段も同様に、当技術分野で周知である（例えば、「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８を参照のこと；参照として本明細書に組み入れられる）。
【００５３】
サイトカインとケモカイン
特定の態様において、臓器、組織、または細胞型に標的化送達するために、特異的生物活性物質を一つまたは複数のターゲティングペプチドにカップリングさせることが望ましいかもしれない。そのような物質には、サイトカイン、ケモカイン、アポトーシス促進因子、および抗血管新生因子が含まれるがこれらに限定されない。「サイトカイン」という用語は、細胞間メディエータとしてもう一つの細胞に作用する、一つの細胞集団によって放出されたタンパク質の総称である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、増殖因子、および従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニル成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）のような糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；プロスタグランジン、線維芽細胞増殖因子、プロラクチン；胎盤ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；ムレリアン阻害物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βのような神経生長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βのようなトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；インスリン様増殖因子−Ｉおよびインスリン様増殖因子−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、−β、および−γのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８のようなインターロイキン（ＩＬ）、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、キット−リガンドまたはＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、腫瘍壊死因子ならびにＬＴが含まれる。本明細書において用いられるように、サイトカインという用語には、天然起源からのタンパク質または組み換え型細胞培養からのタンパク質、および本来の配列サイトカインの生物活性同等物が含まれる。
【００５４】
ケモカインは、一般的に、ケモカイン発現部位に免疫エフェクター細胞を動員するための化学誘引物質として作用する。例えば、他の免疫系成分の治療部位への動員を増強するために、サイトカイン遺伝子と併用して特定のケモカイン遺伝子を発現することが有利であろう。ケモカインには、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＡＦ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ１−β、およびＩＰ−１０が含まれるが、これらに限定されない。当業者は、特定のサイトカインも同様に化学誘引作用を有することが知られており、それらも同様にケモカインという用語の下に分類されうることを認識するであろう。
【００５５】
架橋剤（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）
二官能架橋試薬は、アフィニティマトリクスの調製、多様な構造の改変および安定化、リガンドおよび受容体結合部位の同定、ならびに構造研究を含む多様な目的のために広く用いられている。二つの同一の官能基を有するホモ二官能試薬は、同一および異なる高分子または高分子サブユニット間の架橋を誘導するために、ならびにペプチドリガンドをその特異的結合部位に結合させるために非常に効率がよいことが判明した。ヘテロ二官能試薬は、異なる二つの官能基を含む。異なる二つの官能基の異なる反応性を利用することによって、架橋は、選択的および連続的に制御することができる。二官能架橋試薬はその官能基の特異性に従って、例えばアミノ、スルフヒドリル、グアニジノ、インドール、カルボキシル特異的置換基に分類することができる。これらの中で、遊離のアミノ基に対する試薬は、それらが市販されているため、合成が容易であるため、およびそれらを適用できる緩和な反応条件のために特に一般的となった。ヘテロ二官能架橋試薬の大部分は、一級アミン反応基とチオール反応基とを含む。
【００５６】
リガンドをリポソームに架橋させる例示的方法は、それぞれが特に参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，６０３，８７２号、および米国特許第５，４０１，５１１号に記載されている。様々なリガンドをアミン残基の架橋によってリポソーム表面に共有結合させることができる。リポソーム、特に、それぞれがホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含む微小乳化リポソーム（ＭＥＬ）および大きい単層リポソーム（ＬＵＶＥＴ）のような多層小胞（ＭＬＶ）または単層小胞は、確立された技法によって調製されている。リポソームにＰＥを含めこと、架橋目的のためにリポソーム表面上に活性な官能残基、１級アミンを提供する。上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）のようなリガンドは、ＰＥ−リポソームに首尾よく結合されている。リガンドは、リポソーム表面上の明確な部位に共有結合している。これらの部位の数および表面密度は、リポソーム製剤およびリポソームタイプによって決まる。リポソーム表面はまた、非共有結合部位を有してもよい。リガンドとリポソームとの共有結合体を形成するために、架橋試薬を有効性および生体適合性に関して調べられている。架橋試薬には、グルタルアルデヒド（ＧＡＤ）、二官能オキシラン（ＯＸＲ）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ＥＧＤＥ）、および水溶性カルボジイミド、好ましくは１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が含まれる。架橋の複合体化学によって、認識物質のアミン残基とリポソームとの結合が確立される。
【００５７】
もう一つの例において、ヘテロ二官能架橋試薬および架橋試薬を用いる方法を記載する（その全文が参照として本明細書に組み入れられる、米国特許第５，８８９，１５５号）。架橋試薬は、求核性のヒドラジド残基を求電子性のマレイミド残基と組み合わせて、それによって一つの例においてアルデヒドを遊離のチオールにカップリングさせることができる。架橋試薬は、様々な官能基を架橋するように改変することができる。
【００５８】
核酸
本発明による核酸は、ターゲティングペプチド、受容体タンパク質、または融合タンパク質をコードしてもよい。核酸は、ゲノムＤＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、または合成ＤＮＡに由来してもよい。発現ベクターに組み入れることが望ましい場合、核酸はまた、天然のイントロンまたはもう一つの遺伝子に由来するイントロンを含んでもよい。そのような操作された分子は時に、「ミニ遺伝子」と呼ばれる。
【００５９】
本明細書において用いられる「核酸」には、一本鎖および二本鎖分子と共に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、化学改変核酸および核酸類似体が含まれる。本発明の範囲内の核酸は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、約１１０、約１２０、約１３０、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０、約２２０、約２３０、約２４０、約２５０、約２７５、約３００、約３２５、約３５０、約３７５、約４００、約４２５、約４５０、約４７５、約５００、約５２５、約５５０、約５７５、約６００、約６２５、約６５０、約６７５、約７００、約７２５、約７５０、約７７５、約８００、約８２５、約８５０、約８７５、約９００、約９２５、約９５０、約９７５、約１０００、約１１００、約１２００、約１３００、約１４００、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、約２５００個のヌクレオチド残基またはそれ以上の長さであってもよいと考えられる。
【００６０】
ターゲティングペプチド、融合タンパク質、および受容体は、適当なアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列によってコードされうると考えられる。所望のアミノ酸配列をコードする核酸の設計および産生は、標準化コドン表を用いて当業者に周知である（下記の表３を参照のこと）。好ましい態様において、それぞれのアミノ酸をコードするために選択されたコドンは、関心対象の宿主細胞において核酸の発現を最適にするように改変してもよい。宿主細胞の様々な種のコドン選択性は当技術分野で周知である。
【００６１】
【表３】
2004536020.tif 000004
【００６２】
所望のターゲティングペプチド、融合タンパク質または受容体アミノ酸配列をコードする核酸の他に、本発明は、そのようなコードする核酸配列と高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする相補的核酸を含む。核酸ハイブリダイゼーションのための高ストリンジェンシー条件は当技術分野で周知である。例えば、条件は、温度約５０℃〜約７０℃で約０．０２ Ｍ〜約０．１５ Ｍ ＮａＣｌによって提供される条件のように、低い塩および／または高い温度条件を含んでもよい。所望のストリンジェンシーの温度およびイオン強度は特定の核酸、標的配列の長さおよびヌクレオチド含有量、核酸の荷電組成物、およびハイブリダイゼーション混合物中のホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウム、または他の溶媒の存在または濃度によって部分的に決定される。
【００６３】
クローニング、遺伝子移入、および発現のためのベクター
特定の態様において、発現ベクターを用いてターゲティングペプチドまたは融合タンパク質を発現して、次にこれを精製および用いることができる。他の態様において、発現ベクターは、遺伝子治療において用いられる。発現は、適当なシグナルがベクターにおいて提供される必要があり、宿主細胞において関心対象の遺伝子の発現を促進するウイルスおよび哺乳類起源の双方からのエンハンサー／プロモーターのような様々な調節要素が含まれる。宿主細胞においてメッセンジャーＲＮＡ安定性および翻訳可能性を最適にするように設計した要素も同様に既知である。
【００６４】
調節要素
「発現構築物」または「発現ベクター」という用語は、核酸コード配列の一部または全てが転写されることが可能である遺伝子産物をコードする核酸を含む任意の種類の遺伝子構築物が含まれることを意味する。好ましい態様において、遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターの転写制御下である。「プロモーター」とは、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識され、遺伝子の特異的転写を開始するために必要なＤＮＡ配列を意味する。「転写制御下」という用語は、プロモーターが、ＲＮＡポリメラーゼの開始および遺伝子の発現を制御するために、核酸に対して正しい位置および方向に存在することを意味する。関心対象の核酸配列の発現を制御するために用いられる特定のプロモーターは、標的細胞において核酸の発現を指示することができる限り、重要ではないと考えられている。
【００６５】
様々な態様において、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターを用いて、関心対象のコード配列の高レベル発現を得ることができる。関心対象のコード配列の発現を得るために、当技術分野で周知である他のウイルスもしくは哺乳類の細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターを用いることも同様に、発現レベルが所定の目的にとって十分である限り考慮される。
【００６６】
ｃＤＮＡ挿入物を用いる場合、典型的にこれは遺伝子転写物の適切なポリアデニル化を行うためにポリアデニル化シグナルを含むであろう。ポリアデニル化シグナルの特性は、本発明の実践の成功にとって重要ではないと考えられ、成長ホルモン、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルのようなそのような任意の配列を用いてもよい。同様に、ターミネータも発現構築物の要素として同様に考慮される。これらの要素は、メッセージレベルを増強して構築物からの他の配列への読み過ごしを最小限にするように作用しうる。
【００６７】
選択マーカー
本発明の特定の態様において、本発明の核酸構築物を含む細胞は、発現構築物にマーカーを含めることによってインビトロまたはインビボで同定してもよい。そのようなマーカーは、細胞に対して同定可能な変化を付与して、発現構築物を含む細胞を容易に同定できるようにするであろう。通常、薬物選択マーカーを含めると、形質転換体のクローニングおよび選択に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン、およびヒスチジノールに対して抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。または、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）のような酵素、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）のような酵素を用いてもよい。免疫学的マーカーも同様に用いることができる。用いられる選択マーカーは、それが遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現されることができる限り、重要ではないと考えられる。選択マーカーのさらなる例は当業者に周知である。
【００６８】
発現ベクターの送達
発現ベクターを細胞に導入する多くの方法がある。本発明の特定の態様において、発現構築物は、ウイルス、またはウイルスゲノムに由来する操作された構築物を含む。特定のウイルスは受容体媒介エンドサイトーシスによって細胞内に入ることができること、宿主細胞ゲノムに組み入れられうること、およびウイルス遺伝子を安定かつ効率よく発現できることによって、それらは、哺乳類細胞に外来遺伝子を移入するための魅力的な候補物質となる（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｔｅｍｉｎ、１９８６）。一般的に、好ましい遺伝子治療ベクターはウイルスベクターである。
【００６９】
外来の遺伝子材料を許容することができるいくつかのウイルスは、それらが順応することができるヌクレオチドの数およびそれらが感染する細胞の範囲が制限されるが、これらのウイルスは遺伝子発現を首尾よく行うことができることが証明されている。しかし、アデノウイルスは、宿主ゲノムにその遺伝子材料を組み入れず、したがって、遺伝子発現のために宿主複製を必要とせず、そのためそれらは迅速で、効率のよい、異種遺伝子発現にとって理想的に適している。治療用ウイルスを調製する技術は当技術分野で周知である。
【００７０】
ウイルス送達系を用いる場合、それがベクター構築物を受け入れる細胞、組織、または無傷の臓器において望ましくない反応を引き起こさないように、欠損干渉ウイルス粒子またはエンドトキシンおよび他の発熱物質のような望ましくない混入物を本質的に含まないようにするために十分にビリオンを精製することが望ましいであろう。ベクターを精製する好ましい手段は、塩化セシウム勾配遠心のような懸濁密度勾配を用いることを含む。
【００７１】
遺伝子ベクターとして用いられるウイルスはＤＮＡウイルスであり、パポバウイルス（例えば、シミアンウイルス４０、ウシ乳頭腫ウイルス、およびポリオーマ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６）およびアデノウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６）を含みうる。
【００７２】
インビボ送達のための好ましい方法の一つは、アデノウイルス発現ベクターを用いることを含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡに対する組み込み能が低いことが知られているが、この特徴は、これらのベクターによって得られる遺伝子移入効率が高いことによって相殺される。「アデノウイルス発現ベクター」とは、（ａ）構築物のパッケージングを支持するため、および（ｂ）その中にクローニングされているアンチセンスポリヌクレオチドを発現するために十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。
【００７３】
発現ベクターは、アデノウイルスの遺伝子操作型を含む。アデノウイルスの遺伝子構築が、３６ ｋｂの直線状の二本鎖ＤＮＡウイルスであることを理解すれば、アデノウイルスＤＮＡの大きい断片を７ｋｂまでの外来配列に置換することが可能である（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２）。レトロウイルス感染症とは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染症は、アデノウイルスＤＮＡがエピソームにおいて複製できることから、染色体組み込みが起こらず、可能性がある遺伝子毒性を示さない。同様に、アデノウイルスは構造的に安定であり、十分に増幅させた後もゲノム再編成は検出されていない。アデノウイルスは、その細胞周期段階によらず、実質的に全ての上皮細胞に感染することができる。
【００７４】
アデノウイルスは、そのゲノムの大きさが中等度であること、操作が容易であること、高力価、広い細胞範囲、および高い感染性のために、遺伝子移入ベクターとして用いるために特に適している。ウイルスゲノムの両端は１００塩基対〜２００塩基対の逆方向反復配列（ＩＴＲ）を含み、これはウイルスＤＮＡ複製およびパッケージングにとって必要なシス要素である。ゲノムの初期（Ｅ）および後期（Ｌ）領域は、ウイルスＤＮＡ複製の開始によって分割される異なる転写単位を含む。Ｅ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写の調節に関与するタンパク質をコードする。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）の発現によって、ウイルスＤＮＡ複製のためのタンパク質の合成が起こる。これらのタンパク質は、ＤＮＡ複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞の遮断（Ｒｅｎａｎ、１９９０）に関係している。ウイルスカプシドタンパク質の大多数を含む後期遺伝子の産物は、主要な後期プロモーター（ＭＬＰ）によって生じた単一の主転写物の有意なプロセシングの後に限って発現される。ＭＬＰ（１６．８ ｍ．ｕ．に存在）は、感染の後期段階において特に効率的であり、このプロモーターに由来する全てのｍＲＮＡは、５’−３連（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー（ＴＰＬ）配列を有し、それによってそれらは翻訳にとって好ましいｍＲＮＡとなる。
【００７５】
現在用いられている系において、組み換え型アデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの相同的組み換えによって生じる。二つのプロウイルスベクターのあいだの可能性がある組み換えにより、野生型アデノウイルスがこのプロセスから生じる可能性がある。したがって、個々のプラークからウイルスの単一のクローンを単離して、そのゲノム構造を調べることが重要である。
【００７６】
複製欠損であるアデノウイルスベクターの作製および増殖は、Ａｄ５ ＤＮＡ断片によってヒト胎児腎細胞から形質転換され、Ｅ１タンパク質を構成的に発現する２９３と呼ばれる独自のヘルパー細胞株に依存する（Ｇｒａｈａｍら、１９７７）。Ｅ３領域は、アデノウイルスゲノムにとって重要ではないため（ＪｏｎｅｓおよびＳｈｅｎｋ、１９７８）、現在のアデノウイルスベクターは、２９３細胞の助けを借りて、Ｅ１、Ｅ３、または双方の領域のいずれかに外来ＤＮＡを有する（ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃら、１９９１）。本質的に、アデノウイルスは、野生型ゲノムの約１０５％をパッケージングすることができ（Ｇｈｏｓｈ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙら、１９８７）、約２ｋｂの余分のＤＮＡの容量を提供する。Ｅ１領域およびＥ３領域において置換可能な約５．５ ｋｂのＤＮＡと組み合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大容量は７．５ ｋｂ以下、またはベクターの全長の約１５％である。アデノウイルスウイルスゲノムの８０％以上がベクター骨格に残っており、ベクター媒介細胞障害性の原因となる。同様に、Ｅ１欠失ウイルスの複製欠損も不完全である。例えば、ウイルス遺伝子発現の漏出は、現在利用可能なベクターについて高い感染多重度（ＭＯＩ）で認められる（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、１９９３）。
【００７７】
レイチャー（Ｒａｃｈｅｒ）ら（１９９５）は、２９３細胞を培養して、アデノウイルスを増殖させる改善された方法を開示した。一つの形式において、個々の細胞を培地１００ ｍｌ〜２００ ｍｌを含む１Ｌのシリコン処理スピナーフラスコ（Ｔｅｃｈｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）に接種して天然の細胞凝集体を増殖させる。４０ ｒｐｍで攪拌した後、細胞生存率をトリパンブルーによって推定する。もう一つの形式において、フィブラ−セル微小担体（５ ｇ／ｌ）（Ｂｉｂｂｙ Ｓｔａｒｌｉｎ、Ｓｔｏｎｅ、ＵＫ）を以下のように用いる。培地５ｍｌに再懸濁させた細胞接種物を２５０ ｍｌアーレンマイヤーフラスコ中の担体（５０ ｍｌ）に加えて、時折攪拌しながら１時間〜４時間静置した。次に、培地を新鮮な培地５０ ｍｌに交換して振とうを開始する。ウイルスを産生するために、細胞を約８０％コンフルエントまで増殖させて、その後培地を交換して（最終容積の２５％）、アデノウイルスをＭＯＩ ０．０５で加える。培養物を一晩静置して、その後容積を１００％まで増加させて、振とうをさらに７２時間行う。
【００７８】
アデノウイルスベクターが複製欠損である、または少なくとも条件的に欠損であるという要件以外に、アデノウイルスベクターの特性は、本発明の実施の成功にとって重要ではないと考えられる。アデノウイルスは、既知の異なる血清型４２個またはサブグループＡ〜Ｆのいずれかであってもよい。サブグループＣのアデノウイルス５型は、本発明において用いられる条件的複製欠損アデノウイルスベクターを得るために好ましい開始材料である。これは、５型アデノウイルスが、それに関する膨大な生化学および遺伝子情報が既知であるヒトアデノウイルスであるためであり、このためこのアデノウイルスは、歴史的にアデノウイルスをベクターとして用いるほとんどの構築物について用いられている。
【００７９】
本発明を実践するために適用可能な典型的なベクターは、複製欠損であり、アデノウイルスＥ１領域を有さないであろう。このように、Ｅ１コード配列が除去されている位置で遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが最も簡便である。しかし、アデノウイルス配列内の構築物の挿入位置は重要ではない。関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドも同様に、カールソン（Ｋａｒｌｓｓｏｎ）ら、１９８６によって記載されるようにＥ３置換ベクターにおいて欠失されたＥ３領域の代わりに、またはヘルパー細胞株もしくはヘルパーウイルスがＥ４欠損を補う場合にはＥ４領域の代わりに挿入してもよい。
【００８０】
アデノウイルスは、増殖および操作が容易で、インビトロおよびインビボで広い宿主範囲を示す。このグループのウイルスは、高い力価、例えば、１０９〜１０１１プラーク形成単位／ｍｌで得ることができ、それらは非常に感染性である。アデノウイルスの生活環は宿主細胞ゲノムに組み入れられる必要はない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子は、エピソームであり、したがって、宿主細胞に対する遺伝子毒性は低い。野生型アデノウイルスをワクチン接種した研究では副作用は報告されておらず（Ｃｏｕｃｈ、１９６３；Ｔｏｐら、１９７１）、インビボ遺伝子移入ベクターとしてのその安全性および治療能を証明する。
【００８１】
アデノウイルスベクターは、真核細胞遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏら、１９９１；Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘら、１９９２）およびワクチン開発（ＧｒｕｎｈａｕｓおよびＨｏｒｗｉｔｚ、１９９２；ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃ、１９９１）に用いられている。動物試験から、組み換え型アデノウイルスが遺伝子治療に用いられ得ることが示唆された（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔおよびＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ、１９９１；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９０；Ｒｉｃｈら、１９９３）。異なる組織に組み換え型アデノウイルスを投与する研究には、気管注入（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９１；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉注射（Ｒａｇｏｔら、１９９３）、末梢静脈注射（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、１９９３）、および脳への定位注射（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅら、１９９３）が含まれる。
【００８２】
他の遺伝子移入ベクターは、レトロウイルスから構築してもよい。レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染細胞においてそのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換できることを特徴とする一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次に、得られたＤＮＡは、プロウイルスとして細胞の染色体に安定に組み入れられ、ウイルスタンパク質の合成を指示する。組み込みによって、レシピエント細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列が保持される。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含む。ｇａｇ遺伝子から上流に認められる配列は、ゲノムをビリオンにパッケージングするためのシグナルを含む。二つの長末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは、強いプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、同様に、宿主細胞ゲノムへの組み込みにとって必要である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。
【００８３】
レトロウイルスベクターを構築するために、関心対象のタンパク質をコードする核酸を、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製欠損であるウイルスを作製する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築する（Ｍａｎｎら、１９８３）。レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と共にｃＤＮＡを含む組み換え型プラスミドをこの細胞株に導入する場合（例えば、リン酸カルシウムによって）、パッケージング配列によって、組み換え型プラスミドのＲＮＡ転写物をウイルス粒子にパッケージングすることが可能となり、次に、これを培養培地に分泌する（ＮｉｃｏｌａｓおよびＲｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、１９８８；Ｔｅｍｉｎ、１９８６；Ｍａｎｎら、１９８３）。次に、組み換え型レトロウイルスを含む培地を回収して、選択的に濃縮し、遺伝子移入のために用いる。レトロウイルスベクターは広く多様な細胞型に感染することができる。しかし、組み込みおよび安定な発現には宿主細胞の分割を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄら、１９７５）。
【００８４】
レトロウイルスベクターを用いることには特定の制限がある。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノムにおけるランダムな部位に組み入れられる。このため、宿主遺伝子の中断によって、または隣接遺伝子の機能を妨害することができるウイルス調節配列の挿入によって挿入変異誘発が起こりうる（Ｖａｒｍｕｓら、１９８１）。欠損レトロウイルスベクターを用いる場合のもう一つの懸念は、パッケージング細胞において野生型複製コンピテントウイルスが出現する可能性である。これは、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ配列から上流の組み換え型ウイルス挿入物からの無傷の配列が宿主細胞ゲノムに組み入れられる組み換え事象が原因である可能性がある。しかし、パッケージング細胞株を利用することができ、それらは組み換えの可能性を大きく減少させるはずである（Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら、１９８８；Ｈｅｒｓｄｏｒｆｆｅｒら、１９９０）。
【００８５】
他のウイルスベクターを発現構築物として用いてもよい。ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）（Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｓｋａ、１９８４）、およびヘルペスウイルスのようなウイルスに由来するベクターを用いてもよい。それらは様々な哺乳類細胞にとっていくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９８９；Ｒｉｄｇｅｗａｙ、１９８８；ＢａｉｃｈｗａｌおよびＳｕｇｄｅｎ、１９８６；Ｃｏｕｐａｒら、１９８８；Ｈｏｒｗｉｃｈら、１９９０）。
【００８６】
発現構築物を培養哺乳類細胞に移入するためのいくつかの非ウイルス法もまた、本発明によって考慮される。これらには、リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）、ＤＥＡＥデキストラン（Ｇｏｐａｌ、１９８５）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）、直接マイクロインジェクション、ＤＮＡ負荷リポソーム、およびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞の超音波処理、高速微小弾丸を用いた遺伝子衝突、および受容体媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ、１９８７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８）が含まれる。これらの技術のいくつかは、インビボまたはエクスビボでの使用に首尾よく適合させてもよい。
【００８７】
本発明のさらなる態様において、発現構築物はリポソームに封入してもよい。リポソームはリン脂質二重膜と内側の水性媒体とを特徴とする小胞構造である。多層リポソームは水性媒体で分かれた多数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰量の水溶液に懸濁されると自然に形成する。脂質成分は閉鎖構造を形成する前に自己再配列を受けて、脂質二重層の間に水と溶存溶質とを捕獲する。同様に、リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体も考慮される。
【００８８】
リポソーム媒介核酸送達および外来ＤＮＡのインビトロでの発現は非常に成功している。ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、（１９８０）は、培養ニワトリ胚、ＨｅＬａ、および肝腫細胞において外来ＤＮＡのリポソーム媒介送達および発現の実現可能性を証明した。ニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）ら、（１９８７）は、静脈内注射後のラットにおいてリポソーム媒介遺伝子移入に成功した。
【００８９】
形質転換細胞を同定又は選択するために、ｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、またはａｐａｒｔ細胞においてそれぞれ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含むがこれらに限定されない多くの選択系を用いてもよい。同様に、抗代謝物抵抗性を、メソトレキセートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ、ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ、アミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ、およびハイグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏを選択するための基礎として用いることができる。
【００９０】
薬学的組成物
臨床応用を考慮する場合、薬学的組成物発現ベクター、ウイルス保存液、タンパク質、抗体、および薬剤を意図する適用にとって適当な形で調製する必要があるかもしれない。一般的にこれは、被験者に対して有害となりうる不純物を本質的に含まない組成物を調製することを含むであろう。
【００９１】
一般的に、送達ベクターを安定にして、標的細胞によって取り込まれることができるように、適当な塩および緩衝液を用いることが望まれるであろう。組み換え型細胞を患者に導入する場合には緩衝液も同様に用いる。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性培地に溶解または分散させたタンパク質またはペプチドの有効量を含む。そのような組成物も同様に、接種物と呼ばれる。「薬学的または薬理学的に許容される」という用語は、被験者に投与した場合に有害、アレルギー、またはその他の望ましくない反応を引き起こさない分子実体および組成物を意味する。本明細書において用いられるように、「薬学的に許容される担体」には、任意のおよび全ての溶媒、分散培地、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等が含まれる。そのような培地および物質を薬学的活性物質のために用いることは当技術分野で周知である。従来の培地または物質が本発明のタンパク質またはペプチドと不適合である場合を除き、治療的組成物において用いることが考慮される。補助活性成分も同様に組成物に組み入れることができる。
【００９２】
本発明の活性組成物には、古典的な薬学的調製物が含まれてもよい。これらの組成物は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、任意の一般的な経路によって投与されうる。これには、経口、鼻腔内、口腔内、直腸内、膣内、または局所投与が含まれる。または、投与は、正所性、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射であってもよい。そのような組成物は通常、上記の薬学的に許容される組成物として投与されるであろう。
【００９３】
注射によって用いるために適した薬学的剤形は、滅菌水溶液または分散液、および注射可能滅菌溶液または分散液の即時調合製剤のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、製剤は滅菌でなければならず、容易なシリンジ操作性が存在する程度に流動性でなければならない。これは、製造および保存条件で安定でなければならず、細菌および真菌のような微生物の混入作用に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、その適した混合物、および植物油を含む溶媒または分散培地となりうる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散剤の場合には必要な粒子径を維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって得ることができる。多くの場合、等張剤、例えば糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の持続的な吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物において用いることによって得ることができる。
【００９４】
注射可能滅菌溶液は、必要な量の活性化合物を、先に列挙した様々な他の成分と共に適当な溶媒において組み入れて、必要であれば濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散剤は、様々な滅菌活性成分を滅菌媒体に組み入れることによって調製される。注射可能滅菌溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分および先に濾過滅菌したその溶液からの任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
【００９５】
用量
当業者は、「レミントンの薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１５版、第３３章、特に６２４頁〜６５２頁に従う。治療すべき被験者の状態に応じて用量の何らかの変更が必然的に起こるであろう。投与の責任者は、いずれにせよ、個々の被験者にとって適当な用量を決定するであろう。その上、ヒトでの投与に関して、調製物は、ＦＤＡの生物医薬品標準局によって必要とされる滅菌性、発熱性、および全身的安全性および純度標準を満たさなければならない。
【００９６】
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を示すために含められる。以下の実施例に開示した技術は、本発明の実践において十分に機能するように本発明者らによって発見された技術を表し、このように、その実践のために好ましい様式を構成すると見なされうると、当業者によって認識されなければならない。しかし、当業者は、開示の特定の態様に多くの変更を行うことができ、それらも本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果をなおも得ることができることを、本開示に照らして認識すべきである。
【００９７】
実施例１：二機能性接合体を使用した遺伝子治療ベクターの再ターゲティング
この実施例は、いくつかの臓器の内皮に特異的に発現している受容体へ、アデノウイルスベクター又はその他のベクターをターゲティングするために、臓器回帰ペプチドを使用することが可能であることを証明する。Ａｄ５ファージと結合する部分と、特異的な臓器又は組織に選択的なターゲティングペプチドである部分とからなる二重特異性接合体を設計した。回帰ペプチドのウイルスカプシドへの直接的な化学的接合によって、Ａｄ５ベクターの感染性が減弱したため（データは示していない）、二重特異性アダプターを選択した。さらに、ターゲティングペプチドのカプシドゲノムへのクローニングは、ペプチド構造のコンフォメーション変化により、リガンドの特異性を変化させる可能性があった。さらに、ウイルスカプシドを遺伝学的に修飾する以前の試みは、ＣＡＲ相互作用を媒介するファイバーノブタンパク質のアミノ酸配列を欠失又は変異させることができないため、天然の向性を減弱させなかった（Ｍｉｃｈａｅｌら、１９９５；Ｗｉｃｋｈａｍら、１９９５；Ｗｉｃｋｈａｍら、１９９７Ｂ；Ｄｍｉｔｒｉｅｖら、１９９８；Ｖｉｇｎｅら、１９９９）。
【００９８】
この実施例において、ＧＦＥ−１肺回帰ペプチド（Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８；ＲａｊｏｔｔｅおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９）と接合体された抗Ａｄ５抗体のＦａｂ断片が、Ａｄ５ベクターを良好に再ターゲティングするために使用されうることが証明された。通常はＡｄ５感染に対して感受性でないが、ＧＦＥ−１ペプチドの受容体を発現している細胞型が、二重特異性アダプター接合体の存在下では、効率的に形質導入された。これは、機能性Ｆａｂ−ターゲティングペプチド接合体の最初の証明であった。そのような分子アダプターは、腫瘍組織のようなある種の臓器又は組織の血管系に特異的に発現している受容体への、Ａｄ５遺伝子治療ベクターの全身送達に有用であり得る。本実施例において開示された好ましい態様は、アデノウイルスベクターを利用したが、当業者であれば、開示された方法が、事実上任意の遺伝子治療ベクターを用いて使用されうることを理解するであろう。
【００９９】
材料及び方法
免疫蛍光又は免疫沈降のためのウイルスの作製及び感染
ＨｅＬａ子宮頸癌細胞及び２９３胎児腎細胞を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）より得、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及びペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の中で増殖させた。野生型Ａｄ５、及びマーカー遺伝子としてエクオレア・ビクトリア（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）緑色蛍光タンパク質（Ａｄ５−ＧＦＰ）又は大腸菌ＬａｃＺ遺伝子（Ａｄ５−ＬａｃＺ）をＣＭＶプロモーターの調節下で発現しているＥ１欠失組換えウイルスを、２９３細胞において繁殖させた。細胞ペレットからウイルスを採集し、当技術分野において既知の標準的なプロトコルに従い、連続的なＣｓＣｌ勾配超遠心分離により収集した。ウイルス濃度を、Ａ２６０における吸光度（１吸光度単位は約１０１２ビリオンに相当する）を測定することにより推定し、感染力価をプラークアッセイにより決定した。免疫蛍光又は免疫沈降の前の感染のため、２％ＦＢＳを含むＤＭＥＭの中で、ＭＯＩ １０ＰＦＵ／細胞又は５０ＰＦＵ／細胞において、細胞をＡｄ５と共にインキュベートした。５時間後、新鮮なＦＢＳを１０％添加し、感染を２４時間進行させた。
【０１００】
モノクローナル抗体の作製
雌２ヶ月齢Ｂａｌｂ／Ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）に、２ヶ月間、２週間間隔で、１０９粒子の野生型Ａｄ５を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。３回目及び４回目の免疫の後、免疫された各マウスの血清を、ＥＬＩＳＡにより分析した。最も高い抗Ａｄ５抗体力価を有するマウスから脾臓を摘出し、脾細胞を単離し、１：５という比率で、Ｓｐ２０ＡＧ１４マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ）と融合させた。融合した細胞を、フィーダー層細胞を含まない９６ウェルプレートに播いた。ハイブリドーマクローンを選択し、増大させ、１０％ＣＰＳＲ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、１×ＨＡＴ、１０％Ｈｙｂｒｉｍａｘハイブリドーマ培地補助剤、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（全て、Ｓｉｇｍａ製）の中でサブクローニングした。限界希釈により、単一クローンを得た。抗体産生は、ハイブリドーマ上清を使用したＡｄ５抗原に対するＥＬＩＳＡ技術によりモニタリングした。
【０１０１】
より大量の抗体を得るため、雌３ヶ月齢Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）を、腹水作製のためプリスタンで初回刺激し、１匹当たり２×１０６個のハイブリドーマ細胞を腹腔内注射した（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、この全文が参照として本明細書に完全に組入れられる）。１４日〜２９日後、腹水を採集した。製造業者の指示に従い、プロテインＧ−セファロース（ＧａｍｍａＢｉｎｄ、ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ）を用いて腹水から抗体を精製した。この実施例に記載されたモノクローナル抗体は、二つの別々の免疫及び融合の実験より得られた。
【０１０２】
ＥＬＩＳＡ
野生型Ａｄ５ビリオン、又は組換えファイバーノブタンパク質（Ｋｒａｓｎｙｋｈら、１９９６）を、ＰＢＳ内、Ｈｉｇｈ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ａｓｓａｙ Ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔａｒ）上に固定化した（１０９粒子又は５μｇ／ウェル）。対照ウェルは、２ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳにより４℃で一晩コーティングされた。次いで、一次抗体又は対照マウスＩｇＧポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ）を室温で１時間一定濃度範囲でインキュベートした。二次抗体（抗マウスＦａｂアルカリホスファターゼ接合体、Ｓｉｇｍａ、３％ＢＳＡ中１：３０００）を添加し、１時間インキュベートした。ＥＬＩＳＡをｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍａ）で発色させ、１時間〜４時間後、４０５ｎｍで読み取りを行った（Ｒｅａｄｅｒ ５２０、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ）。
【０１０３】
免疫蛍光染色
カバーグラス上で増殖させたＨｅＬａ細胞に、ＭＯＩ ５０ＰＦＵ／細胞において感染させた。感染から２４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、３．７％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳで透過処理し、再びＰＢＳで洗浄し、３％ＢＳＡを含むＰＢＳで２０分間ブロッキングした。マウスモノクローナル抗体を含む３％ＢＳＡを、１０μｇ／ｍｌ、室温で１時間スライドガラスに添加し、ウサギ抗Ａｄ５ポリクローナル抗体（Ｋｏｚａｒｓｋｙら、１９９６）を１：１０００の希釈率で使用した。細胞を洗浄し、フルオレセイン結合二次抗体（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共に１時間インキュベートした。試料をＰＢＳで洗浄し、１μｇ／ｍｌの４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含むＰＢＳの中で５分間インキュベートした。Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を用いてカバーグラスを取り付け、ＣＣＤカメラ（Ｃｏｏｋｅ Ｓｅｎｓｉｃａｍ）につながれたＮｉｋｏｎ顕微鏡を使用してエピフルオレセンスにより染色を可視化した。画像を二重励起モードで得て、ＳｌｉｄｅＢｏｏｋ及びＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて加工した。
【０１０４】
免疫沈降及びウェスタンブロット分析
プロテアーゼ阻害剤の存在下で、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．６、１％ＮＰ−４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１ｍＭ ＺｎＯＡｃの中で、細胞を溶解させた。タンパク質濃度をローリー（Ｌｏｗｒｙ）法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により決定した。プロテインＧ−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及び５μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体を用いて、１ｍｇの細胞抽出物からタンパク質を免疫沈降させた。又は、３μｇのＣｓＣｌ精製Ａｄ５を使用することにより、精製されたウイルスストックから免疫沈降を実施した。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロース膜へ転写し、ウサギポリ抗Ａｄ５クローナル抗体（Ｋｏｚａｒｓｋｙら、１９９６）及び抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてブロッティングし、増強化学発光（Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ、ＮＥＮ）により可視化した。
【０１０５】
Ａｄ５中和アッセイ
ＨｅＬａ細胞を、使用する２４時間前に、９６ウェルプレートに２０，０００個／ウェルの細胞密度で播いた。抗体をＤＭＥＭで希釈し、２×１０７ＰＦＵ／ｍｌの濃度のＡｄ５−ＬａｃＺと共に３７℃で１時間インキュベートした。続いて、抗体−Ａｄ５−ＬａｃＺ複合体を、ＭＯＩ ５０ＰＦＵ／細胞においてＨｅＬａ細胞上で９０分間インキュベートした後、１．８容量の１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭを添加した。２４時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、β−ガラクトシダーゼ発現に関して染色した（インサイチューβ−ガラクトシダーゼ染色キット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。１ウェル当たり少なくとも１５０個の細胞を計数し、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞の割合を計算するために使用した。
【０１０６】
細胞へのファージ結合アッセイ
ＲＤヒト横紋筋肉腫細胞（ＡＴＣＣ）及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌細胞（Ｐｒｉｃｅら、１９９０）を、１０％ＦＢＳ及び１％ストレプトマイシン／ペニシリンを含むＤＭＥＭの中で、標準的な手法に従い増殖させた。配列ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ（配列番号：５）を表示するｆＵＳＥ５に基づくファージクローンであるＧＦＥ−１ファージを用いてファージ結合アッセイを実施した。挿入物を含まないｆｄ−ｔｅｔファージを対照として使用した。ＲＤ細胞又はＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を２４ウェルプレートで３００，０００個／ウェルの密度にまで増殖させた。培地を除去し、２×１０８形質導入単位のＧＦＥ−１ファージ又はｆｄ−ｔｅｔファージのいずれかを含む完全培地と交換した。細胞をファージ粒子と共に４℃で３時間インキュベートし、次いで１ｍｌの１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで４回洗浄した。結合したファージを、１ｍｌのＫ９１ Ｋａｎテリフィックブロス（ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ）培養物を添加することによりレスキューした。この培養物の複数の希釈物を、２０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天プレートに播き、３７℃で１６時間増殖させた後、コロニー（形質導入単位）を計数した。
【０１０７】
抗体ペプチド接合体の作製
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むパパイン消化緩衝液（どちらもＰｉｅｒｃｅ製）中で、固定化パパインを用いて９時間、精製された１Ｃ５ＩＩＥ１１抗Ａｄ５ ＩｇＧを消化した。次いで、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むホウ砂緩衝液で平衡化されたＧａｍｍａＢｉｎｄプロテインＧカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に消化混合物を通した。カラム素通り物（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を５ｍｇ／ｍｌにまで徐々に濃縮した（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎチューブ、Ａｍｉｃｏｎ、分子量カットオフ値１０，０００）。得られたＦａｂ断片の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色により確認した。
【０１０８】
ＧＦＥ−１ペプチド（ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ、配列番号：５）及び環状対照ペプチド（ＣＡＲＡＣ、配列番号：６）は、アナスペック（Ａｎａｓｐｅｃ）により合成され、精製された。精製されたＦａｂを、２０倍過剰モルのいずれかのペプチド及びホモ二機能性架橋剤であるビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ｂｉｓ（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ）ｓｕｂｅｒａｔｅ）（ＢＳ３、Ｐｉｅｒｃｅ）へと添加した。室温での２時間のインキュベーションの後、架橋反応の生成物を、１０００容量の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ホウ砂緩衝液ｐＨ８．５に対する透析により精製した。溶液から界面活性剤を完全に除去すると、試料の沈降及び濃度減少が起こった。数回の試みにも関わらず、この反応は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析による接合体の質量の測定を妨害した。その代わり、接合の成功は、４％〜２０％勾配Ｔｒｉｓ−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色により決定された。Ｆａｂ及びその接合体の抗原結合活性は、前述のＥＬＩＳＡにより確認した。
【０１０９】
メンブレンジペプチダーゼアッセイ
Ｆａｂ−ＧＦＥアダプターの存在下及び非存在下で、細胞溶解物中のＤ−Ｐｈｅの蛍光検出によりメンブレンジペプチダーゼ活性の評価を実施した。プロテアーゼ阻害剤を含まない１００μｌのＴＢＳ／１００ｍＭオクチルグリコシドの中で１０６個のＲＤ細胞を溶解させた。溶解物のタンパク質濃度を、ローリー法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により決定した。１０μｇタンパク質に対し規準化された溶解物を、まず、それぞれ、一定濃度範囲のＦａｂ−ＧＦＥアダプター又は媒体を含む０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８の中で３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、開示（ＨｅｙｗｏｏｄおよびＨｏｏｐｅｒ、１９９５）のように、酵素活性を検出した。簡単に説明すると、試料を３通り調製し、１ｍＭのＭＤＰ基質Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅと共に３７℃で３時間インキュベートした。次いで、放出されたＤ−Ｐｈｅを、それをＤ−アミノ酸オキシダーゼ及びペルオキシダーゼ（全て、Ｓｉｇｍａ製）の存在下で蛍光色素６，６’−ジヒドロキシ−（ｌ，ｌ’−ビフェニル）３，３’−二酢酸へと変換することにより、間接的に検出した。励起波長３１７ｎｍ、放出波長４１４ｎｍ、スリット幅＝５ｎｍ、積分時間＝１秒を使用して、ｆｍａｘ蛍光マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＣＡ）を使用して蛍光を検出した。
【０１１０】
Ａｄ５再ターゲティングアッセイ
感染の２４時間前に、ＲＤ細胞又はＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を２０，０００個／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播いた。Ｆａｂ断片又はＦａｂペプチド接合体をＤＭＥＭで希釈し、６×１０７粒子／ｍｌのＡｄ５−ＬａｃＺと共に３７℃で１時間インキュベートした。次いで、Ｆａｂ−Ａｄ５−ＬａｃＺ複合体をＭＯＩ １５０ＰＦＵ／細胞においてＨｅＬａ細胞と共に９０分間インキュベートした。９０分後、上清を除去し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭと交換した。２４時間後、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、β−ガラクトシダーゼ発現に関して染色した（インサイチューβ−ガラクトシダーゼ染色キット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）。１ウェル当たり少なくとも１５０個の細胞を計数し、β−ガラクトシダーゼ陽性細胞の割合を計算するために使用した。Ａｄ５−ＧＦＰベクターのターゲティングの手法は、ＧＦＰ発現細胞を、染色ではなく、ＳＰＯＴイメージングシステム（Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）とつながれたＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＴＥ３００顕微鏡を用いたエピフルオレセンスにより可視化したことを除き、Ａｄ５−ＬａｃＺベクターの場合と同様であった。さらに、２４ウェルプレート上のＡｄ５−ＧＦＰ感染細胞を、感染から２４時間後に２．５ｍＭ ＥＤＴＡを用いて脱離させ、蛍光細胞をＦＡＣＳＯＲＴフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で計数した。データは、Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔを用いて分析した。
【０１１１】
結果
抗Ａｄ５モノクローナル抗体の生成及び特徴決定
抗Ａｄ５モノクローナル抗体を、マウス脾細胞より生成させた。まず、抗Ａｄ５モノクローナルＩｇＧを安定的に発現しているハイブリドーマクローンを、完全Ａｄ５ウイルス粒子を使用したＥＬＩＳＡにより特徴決定した（データは示していない）。Ａｄ５感染細胞の間接免疫蛍光により、抗体がアデノウイルスタンパク質を認識したことが確認された。従って、感染多重度（ＭＯＩ）５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）／細胞においてＨｅＬａ細胞にＡｄ５を感染させ、６個のモノクローナル抗体を染色に使用した。Ａｄ５に対するウサギポリクローナル抗体血清が、対照として使用され、感染細胞に関する強いシグナルを生じさせた（示していない）。１Ｃ５ＩＩＥ１１抗体及び３Ｂ２ＩＤ１０抗体は、感染細胞の核内に類似の蛍光シグナルを生じさせた。未感染細胞又は二次抗体単独ではシグナルが検出されなかった。
【０１１２】
感染２９３細胞からアデノウイルスタンパク質を沈降させる能力に関しても、抗体を試験した。未感染細胞抽出物に由来する免疫沈降物は陰性であった。感染細胞において、約６０ｋＤａの最も顕著なバンドは、ファイバータンパク質を表していた。約７０ｋＤａのもう一つの顕著なバンドは、ペントンベース（ｂａｓｅ）を表していた。１個の抗体は、ウイルスヘキソンタンパク質に相当する１２０ｋＤａの第三のバンドも沈降させた（データは示していない）。これら３個のタンパク質は、Ａｄ５感染２９３細胞由来の抽出物のウェスタンブロットにおいて対照ポリクローナル抗体によっても検出された（データは示していない）。精製されたＡｄ５粒子に由来する免疫沈降物は、類似の結果を示し（データは示していない）、このことから、抗体が、完全に集合した精製されたアデノウイルスカプシドを認識することが確認された。
【０１１３】
Ａｄ５カプシド中の３個の主要タンパク質（即ち、ヘキソン、ペントンベース、及びシャフトとノブとから構成されるファイバー）のうち、ファイバーノブ領域は、ウイルスの標的細胞への付着を媒介するため（Ｈｅｎｒｙら、１９９４；Ｌｏｕｉｓら、１９９４）、その領域は、再ターゲティングアダプターの適当な結合部位である。従って、ファイバーノブと結合したアダプターは、Ａｄ５に基づくベクターの内因性の向性も中和するかもしれない。固定化された組換えファイバーノブタンパク質のＥＬＩＳＡは、抗体クローンのうちの２個、３Ｂ２ＩＤ１０及び１Ｃ５ＩＩＥ１１が、Ａｄ５カプシドのファイバーノブタンパク質と結合することを示した。
【０１１４】
Ａｄ５感染の中和
ウイルスの天然の向性の消失は、再ターゲティング戦略にとって望ましいため、抗Ａｄ５抗体及びＡｄ５結合性ペプチドの、組換えＡｄ５感染を中和する能力を試験した。抗体の存在下及び非存在下で、ＨｅＬａ細胞に、組換えＡｄ５−ＬａｃＺベクターを感染させた。１Ｃ５ＩＩＥ１１及び３Ｂ２ＩＤ１０抗体は、有意な中和活性を示し、他の４個の抗体は、弱いが再現性のあるＡｄ５感染の中和を示した（図１）。
【０１１５】
Ａｄ５形質導入の再ターゲティングに適した細胞系の特徴決定
インビトロのベクターターゲティングの適当なモデルを決定するため、二つのパラメータに基づき細胞系を特徴決定した。（１）Ａｄ５感染に対する許容性の欠如；及び（２）ＧＦＥ−１ターゲティングペプチドの受容体の発現。２個の細胞系、ＲＤ及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５を、２５、５０、１００、及び２ＭＯＩ ５０ＰＦＵ／細胞において、組換えＡｄ５−ＬａｃＺと共にインキュベートすることにより、Ａｄ５感受性に関して試験し、β−ガラクトシダーゼ発現を感染から２４時間後に決定した。いずれの細胞系も、ＭＯＩ １００以下ではこのマーカーを発現しなかった。ＭＯＩ ２００では、細胞のごく一部（ＲＤについては２％〜６％、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５については０％〜３％）が、青色染色を示した（データは示していない）。
【０１１６】
次に、これらの細胞が、肺ターゲティングペプチドＧＦＥ−１の受容体であるメンブレンジペプチダーゼ（ＭＤＰ）（Ｒａｊｏｔｔｅら、１９９８；ＲａｊｏｔｔｅおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９）を発現しているか否かを決定した。ヒトＭＤＰに対する抗体は入手されていないため、ＧＦＥ−１を表示するファージクローンの細胞結合を、野生型の挿入物を含まないｆｄ−ｔｅｔファージの結合と比較した。ＧＦＥ−１ファージは、ｆｄ−ｔｅｔファージよりも２０倍強く両細胞系と結合した（図２）。これらの所見は、ＲＤ細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞が、ＧＦＥ−１受容体を発現しており、ターゲティング部分としてＧＦＥ−１を含むアダプターを用いたＡｄ５の再ターゲティングに適していることを示唆している。
【０１１７】
ＧＦＥに基づく分子アダプターの生成
Ａｄ５感染を中和することができたモノクローナル抗体のうちの１個を、ＧＦＥ受容体を介したＡｄ５送達のための分子アダプターを生成させるために使用した。前記の６個の抗Ａｄ５抗体のうち、１Ｃ５ＩＩＥ１１が、最も高い結合強度及び特異性を示したため、最も適当と見なした。
【０１１８】
ヘテロ二機能性架橋剤ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル［ピリジルジチオ］プロピオネート）又はカルボジイミド誘導体を用いたもののような、二重特異性接合体を生成させるための標準的な技術は、それが、ペプチド内のジスルフィド架橋を破壊するであろう化学的還元を必要とするため、又は架橋剤が、比較的小さい機能性部分をＦａｂ断片と連結させるために必要なスペーサーアームを提供しないため、環状ペプチドをＦａｂ断片と連結させるためには適していない。環状オリゴペプチドをマウスモノクローナル抗体のＦａｂ断片と連結させるために適当であることが立証されたホモ二機能性架橋剤であるビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（ＢＳ３）を含む接合プロトコルを確立した。
【０１１９】
パパイン消化により１Ｃ５ＩＩＥ１１抗体のＦａｂ断片を生成させ、ＧＦＥ−１ペプチド又は対照ペプチド（ＣＡＲＡＣ、配列番号：６）のいずれかと架橋した。接合反応の生成物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクーマシーブルー染色により分析した。接合していないＦａｂは、約５０ｋＤａの明瞭なバンドを示し、接合体（Ｆａｂ−ＧＦＥ及びＦａｂ−ＣＡＲＡＣ）は５０ｋＤａ〜６５ｋＤａの「スメア」を示し、このことから、多コピー（約５〜１０）のペプチドが各Ｆａｂ断片に接合したことが示唆された（データは示していない）。
【０１２０】
二重特異性Ｆａｂ−ＧＦＥ接合体の２個の結合部分の機能性を調査した。ＥＬＩＳＡによって、接合していないＦａｂ及びＦａｂペプチドアダプターが、同等に、Ａｄ５と結合したことが確認された（データは示していない）。完全１Ｃ５ＩＩＥ１１抗体、１Ｃ５ＩＩＥ１１由来のＦａｂ、及びＦａｂ−ＧＦＥを使用した中和アッセイにより、消化及び接合は、抗体の中和能に影響を与えないことが立証された（図３）。
【０１２１】
機能性ＧＦＥ−１ペプチドがメンブレンジペプチダーゼ（ＭＤＰ）機能を阻害する観察に基づき（ＲａｊｏｔｔｅおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９）、アダプターのＧＦＥペプチド部分の特性を評価した。Ｆａｂ−ＧＦＥアダプターは、ＭＤＰの酵素活性を用量依存的に特異的に阻害し（図４）、このことから、Ｆａｂ−ＧＦＥアダプターがＧＦＥ−１ペプチドの受容体であるＭＤＰと結合することが示された。
【０１２２】
ＦＡＢ−ＧＦＥターゲティングアダプターによるＲＤ細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のＡｄ５感染への感作
生成した接合体の、Ａｄ５に基づくベクターをＧＦＥ−１受容体へとターゲティングする能力を、評価した。Ａｄ５−ＬａｃＺを添加し、ベクター単独、又はベクター＋アダプター（１Ｃ５ＩＩＥ１１のＦａｂ断片（Ｆａｂ）、ＣＡＲＡＣ（配列番号：６）と接合したその断片（Ｆａｂ−ＣＡＲＡＣ）、もしくはＧＦＥ−１ペプチドと接合したその断片（Ｆａｂ−ＧＦＥ）のいずれか）による感染から２４時間後に、β−ガラクトシダーゼ染色陽性細胞を計数した。単独の、又はＦａｂもしくはＦａｂ−ＣＡＲＡＣと組み合わされたＡｄ５−ＬａｃＺのＲＤ細胞への感染は、０．２％〜３．３％の陽性染色細胞を与えた。しかしながら、Ｆａｂ−ＧＦＥ接合体の感染は、β−ガラクトシダーゼ陽性ＲＤ細胞を濃度依存的に増加させ、ＭＯＩ １５０ＰＦＵ／細胞においてＦａｂ−ＧＦＥアダプターの推定ＥＣ５０値は、６μｇ／ｍｌであった（図５）。飽和には５０μｇ／ｍｌで達し、そのとき、９５％〜９８％の陽性細胞が生じた。類似の結果がＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞でも得られたが、この細胞系における形質導入効率はやや低かった（最大約８０％の陽性細胞、推定ＥＣ５０値は１０μｇ／ｍｌ；図５）。
【０１２３】
異なるレポーター遺伝子、緑色蛍光タンパク質を保持しているＡｄ５ベクター（Ａｄ５−ＧＦＰ）を使用して、Ｆａｂ−ＧＦＥアダプターを評価した。結果は、Ａｄ５−ＬａｃＺで得られたものと量的に類似していた（示していない）。分子アダプターを添加した場合、及び添加しない場合の、Ａｄ５−ＧＦＰ感染細胞の数のフローサイトメトリーによる測定は、蛍光顕微鏡及びβ−ガラクトシダーゼ染色で得られたものと類似していた（データは示していない）。
【０１２４】
考察
Ａｄ５に基づくベクターは、インビトロ及びインビボの遺伝子移入の極めて効率的な手段である。アデノウイルスベクター及びその他の遺伝子治療ベクターの主要な限界は、目的の細胞、組織、又は臓器に特異的に形質導入することができない点である。本実施例は、Ａｄ５に基づく遺伝子移入ベクターが、Ａｄ５ファイバータンパク質特異的部分に付着したターゲティングペプチド部分を含む二重特異性アダプターを使用することにより、ＣＡＲ非依存性の経路を介して、特異的細胞表面受容体へと再ターゲティングされうることを示している。マウス抗Ａｄ５モノクローナル抗体のＦａｂ断片とＧＦＥ−１肺回帰ペプチドとからなるアダプターを生成させるため、新規な接合プロトコルを使用した。このアダプターは、アデノウイルスをＧＦＥ−１ペプチド受容体陽性細胞へと再ターゲティングした。この効果は、抗Ａｄ５ Ｆａｂ単独、又は対照ペプチドと接合したＦａｂでは観察されなかった。
【０１２５】
従来の遺伝子治療ターゲティング戦略とは対照的に、本発明の方法は、二重特異性接合体のターゲティング部分として臓器回帰ペプチドを利用した。ペプチドに基づくアデノウイルスの再ターゲティングは、最近、報告されたが（Ｈｏｎｇら、１９９９；Ｒｏｍａｎｃｚｕｋら、１９９９）、本発明の手法は二つの点で新規である。（１）初めて、受容体特異的ターゲティングペプチドを、Ｆａｂ抗体断片と接合体させた。（２）ターゲティングペプチドを、インビボファージディスプレイにより選択した。
【０１２６】
インビボスクリーニングにより単離されたペプチドによりターゲティングされる受容体は、特定の臓器の血管系に特異的であるのみならず、循環血中リガンドへの到達可能性に関しても選択された。これらの特徴は、全身投与される化合物のターゲティングにとって不可欠である。本実施例は、これらの受容体が、Ａｄ５に基づく遺伝子治療ベクターの向性を再方向付けするための標的として機能しうることを示している。当業者であれば理解するであろうように、本発明の方法は、ベクターと結合するＦａｂ抗体断片又はその他の結合部分が、適切なターゲティングペプチドと連結されうるのであれば、事実上任意の遺伝子治療ベクターで利用されうる。当結果は、標的化インビボ遺伝子治療にとって有用であり得る。
【０１２７】
ＧＦＥ−１ペプチドのメンブレンジペプチダーゼ（ＭＤＰ）受容体（ＲａｊｏｔｔｅおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９）をターゲティングした。ＭＤＰは、肺血管内皮細胞上に発現している。ＧＦＥファージを使用したインビボ回帰及び抗ＭＤＰ抗体を用いた免疫染色に基づく広範な研究により、この血管プロテアーゼは他の臓器内の循環血中リガンドには到達不可能であることが明白に証明されている（ＲａｊｏｔｔｅおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９に概説されている）。しかしながら、ＭＤＰは、ある種の腫瘍細胞系の表面上に発現していた（ＲａｊｏｔｔｅおよびＲｕｏｓｌａｈｔｉ、１９９９）。従って、本発明の方法は、ＧＦＥに基づくアダプターを使用した腫瘍細胞のターゲティング、及び選択的ターゲティングペプチドが同定されている他の組織又は臓器の標的化治療を可能にするはずである。
【０１２８】
実施例２． アデノウイルスターゲティングモチーフ
アデノウイルス結合性ペプチド内に、いくつかの新規モチーフが同定された。Ａｄ５アデノウイルスと結合するターゲティングペプチドを、前記の方法により、ＣＸ８Ｃファージディスプレイライブラリより調製した。以下のアデノウイルスターゲティングペプチドが同定された。明らかな保存モチーフには下線が施されている。
2004536020.tif 000005
【０１２９】
同定されたアデノウイルスターゲティングペプチドを保持しているファージは、図６に示されるように、実質的に増加したＡｄ５との結合を示した。５２−７ファージが、最も低い親和性でＡｄと結合した。５２−１、５２−３１、及び５２−４０ファージは、はるかに高いＡｄ５結合親和性を示した。当業者であれば、本明細書に開示されたアデノウイルスターゲティングペプチドが、アデノウイルス遺伝子治療ベクターの所望の臓器又は組織への選択的送達のための、臓器又は組織に対するターゲティングペプチドと併せて使用されうる実施例１に開示されたようなキメラアダプターの調製にとって有用であろうことを理解するであろう。
【０１３０】
実施例３． アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及び腫瘍に対する二重特異性ターゲティングペプチドの構築
実施例１は、二重特異性アダプターが、アデノウイルスを、肺のような特異的な臓器又は組織へとターゲティングするために使用されうることを証明した。その例においては、二重特異性アダプターは、肺ターゲティングペプチドと連結された抗アデノウイルス抗体のＦａｂ断片より構成されていた。遺伝子治療ベクターのような治療剤へと方向付けられたペプチドの部分と、特異的な臓器又は組織へとターゲティングされた部分とを含む二重特異性ターゲティングペプチドを開発することも可能である。二重の特異性を有するアダプターペプチド（腫瘍血管系回帰部分とアデノウイルス又はＡＡＶと結合する部分とを含有するキメラペプチド）を単離するため、ファージが、ランダム化された６アミノ酸挿入物と連結されたＣＮＧＲＣ腫瘍血管系回帰ペプチドを表示するキメラランダムライブラリを設計し、スクリーニングした。ライブラリ構造は、ＣＮＧＲＣＸ６（式中、Ｃはシステインであり、Ｘは任意のアミノ酸である）として表されうる。これらのライブラリにおいては、血管新生性血管系回帰配列が、複数の折り畳み配置を可能にする、種々の環境で表示されうるランダムペプチド挿入物と共に表されている。環状ペプチドでは、より高い結合親和性が達成されるため、ライブラリは腫瘍回帰ペプチドを環状型で呈示していた（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９５；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９５）。
【０１３１】
２．５×１０１２形質導入単位（ＴＵ）を含むライブラリのアリコートを、１回目のパニングにおいて使用した。スクリーニングは、マイクロタイタープレート上にコーティングされたアデノウイルス粒子を用いて実施された。ファージの濃縮のため、３回のパニングが行われた。アデノウイルスと結合したファージをレスキューするため、ウェルに直接細菌を感染させた。記載されたようにして（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９５；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９５）、３回のパニングの後、ランダムに選択されたクローンから回収されたファージを配列決定した。アデノウイルスと相互作用するいくつかの別個なＣＮＧＲＣ含有配列が回収された（表４）。
【０１３２】
アデノウイルスに対し選択されたＣＮＧＲＣ含有ペプチドのうちの２個、ＣＮＧＲＣＲＬＡＳＳＡ（配列番号：９）及びＣＮＧＲＣＴＭＧＶＲＡ（配列番号：１２）は、スクリーニング中に分析されたクローンの中に比較的高頻度に出現したため、特に興味深い。あるクローンの優勢は、その特異性を示している場合が多い。
【０１３３】
ＣＮＧＲＣ−Ｘ６ライブラリより選択されたアデノウイルスと結合するファージにより表示された配列
【表４】
2004536020.tif 000006
【０１３４】
ＣＮＧＲＣペプチドが、ウイルス結合性ペプチドと共に表示された場合にも腫瘍へと回帰しうることを証明するため、最も有望なＣＮＧＲＣ−アデノウイルス結合性ペプチドアダプターを、腫瘍保持マウスへと注射した。ＣＮＧＲＣＲＬＡＳＳＡ（配列番号：９）ファージ及び腫瘍スクリーニングにおいて回収された最初のＣＮＧＲＣ含有ファージを用いて得られた腫瘍回帰率には、検出可能な減少は存在しなかった（示していない）。
【０１３５】
これらの結果は、アデノウイルスベクター又はその他の遺伝子治療ベクターのような治療剤と結合する部分と、臓器又は組織に局在している受容体と結合する部分とを含む二重特異性回帰ペプチドを得ることが可能であることを証明している。これは、単一のターゲティングペプチドを使用した、特異的な臓器又は組織への治療剤の標的化送達を可能にする。この手法は、治療剤へとターゲティングされるＦａｂ断片又はその他の分子を分離する必要、及びＦａｂ断片を臓器ターゲティングペプチドと架橋させる必要が排除されるため、有利である。当業者であれば、この手法が、アデノウイルス、又はさらには遺伝子治療ベクター一般の標的化送達に限定されず、臓器、組織、又は細胞型への送達が望まれる任意の治療剤に利用されうることを理解するであろう。
【０１３６】
実施例４． アデノウイルス（Ａｄ５）におけるランダムファージディスプレイペプチドライブラリのパニング
アデノウイルス送達ベクター又はＡＡＶ送達ベクターとの結合において有用なさらなるターゲティングペプチドを単離した。下記表５に列挙されるような多様なファージライブラリを、固定化されたウイルス粒子を用いてスクリーニングした。固定化されたＢＳＡ、カゼイン、又はγグロブリンを、陰性対照として使用した。３回のパニングの後、アデノウイルス又はＡＡＶと優先的に結合するファージを、対照タンパク質に対する著しい濃縮（約２０倍）に基づき、ライブラリより選択した。３回の選択の後、アデノウイルスにおいて選択された個々のファージに由来する挿入物を配列決定することにより、多数のペプチドモチーフが明らかとなった。
【０１３７】
記載されたようにして（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９５；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９５）、３回のパニングの後、ランダムに選択されたクローンからファージを配列決定した。アデノウイルスと特異的に相互作用するペプチドを表示するファージが、多数のライブラリより単離された（表５）。各ファージの特異性を、個々に増幅されたファージを使用した結合アッセイにおいて査定した（Ｋｏｉｖｕｎｅｎら、１９９５）。簡単に説明すると、マイクロタイタープレートに、１０１０ｐｆｕのアデノウイルス（血清型５＝Ａｄ５）、又は１．５ｍｇのカゼイン（対照タンパク質）をコーティングした。ファージを１時間結合させた後、充分に洗浄した。次いで、結合したファージを、Ｋ９１ ｋａｎ細菌と共に１時間直接インキュベートすることによりレスキューした。様々な濃度で感染細菌をｔｅｔプレートに播き、一晩の増殖の後、コロニーを計数することにより、濃縮を査定した。
【０１３８】
アデノウイルスと結合するファージにより表示された配列
【表５】
2004536020.tif 000007
【０１３９】
上で同定されたアデノウイルスターゲティングペプチドは、治療用アデノウイルスを特異的な臓器又は組織へとターゲティングすることができる二重特異性分子を生成させるために使用されうる。前記実施例４に記された方法を使用して、例えば、ランダムペプチド挿入物と組み合わされたウイルス結合性ペプチドを含むキメラライブラリを、腫瘍保持マウスへのインビボの結合に関してスクリーニングすることが可能である。腫瘍より単離されたファージは、腫瘍ターゲティング特性及びアデノウイルス結合特性の両方を有するペプチド挿入物を含むはずである。又は、標準的な架橋法を使用して、ウイルス結合性配列、及び任意の臓器又は組織に対する既知のターゲティングペプチドの両方を含む二重特異性ターゲティングペプチドを構築することが可能である。
【０１４０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）におけるランダムファージディスプレイペプチドライブラリのパニング
ＡＡＶを使用したスクリーニングにおいて単離されたファージの特異性を決定するため、類似の戦略を使用した。マイクロタイタープレートに、５×１０９単位のＡＡＶ又は１．５ｍｇの対照タンパク質（１回目はＢＳＡ、２回目はカゼイン、３回目はγグロブリン、４回目はＢＳＡ、５回目はカゼイン）をコーティングした。ライブラリを１時間結合させ、続いて充分に洗浄した。次いで、タンパク質と結合したファージを、Ｋ９１ ｋａｎ細菌と１時間直接インキュベートすることによりレスキューした。様々な濃度でファージ感染細菌をｔｅｔプレートに播き、一晩の増殖の後、コロニーを計数することにより、濃縮を査定した。レスキューされたファージを一晩バルク増幅し、精製した。その後の選択は、コーティングされたマイクロタイタープレート１枚当たり１０９形質導入単位を使用して実施した。この手法は、ＡＡＶと選択的に結合するターゲティングペプチドを単離するために良好に使用された。
【０１４１】
実施例５：リンパ節ターゲティングによる体液性免疫応答の調整
免疫原性ウイルスに対する免疫系応答の調整を、宿主生物のリンパ節へとウイルスを方向付けるターゲティングペプチドを使用して実施した。
【０１４２】
材料及び方法
インビボファージディスプレイ
マウスのリンパ節の血管内皮へと回帰するターゲティングペプチドを選択するため、インビボファージディスプレイを使用した。全部で１０７形質導入単位の、一般的なペプチド挿入物Ｘ２ＣＸ４ＣＸ（Ｃ＝システイン、Ｘ＝任意の残基）を有するランダムファージディスプレイライブラリを、深い麻酔下の２ヶ月齢Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの尾静脈へと注射した。注射から５分後に、５ｍｌのＤＭＥＭを心臓に還流することにより、マウスを安楽死させた。
【０１４３】
結合したファージを回収するため、腋窩リンパ節及び対照臓器（脳及び膵臓）を外科的に摘出し、計量し、１ｍｌのＤＭＥＭ＋プロテアーゼ阻害剤（１ｍＭ ＰＭＳＦ、２０μｇ／ｍｌアプロチニン、１μｇ／ｍｏｌロイペプチン）の中で、ガラス製のダウンス（Ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザーにより磨砕した。１ｍｌの氷冷洗浄培地（ＤＭＥＭ−ＰＩ＋１％ＢＳＡ）で３回組織を洗浄した。３回の洗浄の後、組織を１ｍｌの飢餓状態コンピテント大腸菌Ｋ９１ｋａｎと共にインキュベートし、細菌培養物の段階希釈物を、４０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン及び１００μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートへと拡げた。標準的なファージの増幅、精製、及び個々のクローンの選択を実施した（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、２０００ａ）。簡単に説明すると、１回目の選択より得られた１０３個の個々のコロニーをプールして、３回の選択を実施した。単一のコロニーを、４０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含むＮＺＹ培地５ｍｌの中で、１２時間、別々に増殖させた。細菌培養物をプールし、ファージ調製物を精製し、１０９Ｔ．Ｕ．をマウスへと再注射した。
【０１４４】
リンパ節ターゲティングの確認
連続的な選択において複数回単離されたモチーフ及び／又はペプチドを表示するファージを、リンパ節に対する選択性を決定するためのさらなる分析に使用した。リンパ節より回収された選択された配列を保持しているファージの数Ｔ．Ｕ．を、対照臓器である脳及び膵臓より回収されたファージの数Ｔ．Ｕ．と比較した（質量により規準化）。リンパ節回帰ファージＴ．Ｕ．値を、挿入物を含まない対照ファージ又は未選択のＸ２ＣＸ４ＣＸファージライブラリのいずれかとも比較した。
【０１４５】
ペプチドＰＴＣＡＹＧＷＣＡ（配列番号：７）及びＷＳＣＡＲＰＬＣＧ（配列番号：８）を表示する２個のファージクローンが、最も高いリンパ節／対照比を与えた。モチーフＣＡＹ及びＳＣＡＲを含むペプチドを表示するその他のファージ（データは示していない）も、複数回のインビボ選択においてリンパ節より回収された。
【０１４６】
配列ＰＴＣＡＹＧＷＣＡ（配列番号：７）及びＷＳＣＡＲＰＬＣＧ（配列番号：８）を表示するファージクローンを、陰性対照としての未選択ファージライブラリ又は挿入物を含まないファージと、リンパ節回帰に関して比較した。個々のファージクローンを、前記のようにして、雌２ヶ月齢Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスへと静脈注射し、ファージを回収した。特異性を確認し、表示されたペプチドがリンパ節への回帰を媒介したことを確認するため、同族の可溶性ペプチドＰＴＣＡＹＧＷＣＡ（配列番号：７）及びＷＳＣＡＲＰＬＣＧ（配列番号：８）を合成し、精製し、環化し（Ａｎａｓｐｅｃ、ＣＡ）、ファージ回帰を阻害する能力に関して試験した。インビボでの同族ペプチドによるファージ回帰の競合は、１回の実験につき１ｍｇの各合成ペプチドを共投与することにより実施した。
【０１４７】
リンパ節ターゲティングペプチドを使用した免疫原応答の調整
リンパ節回帰ペプチドＰＴＣＡＹＧＷＣＡ（配列番号：７）又はＷＳＣＡＲＰＬＣＧ（配列番号：８）を表示するファージに対する宿主免疫応答を、挿入物を含まない対照ファージ（ｆｄ−ｔｅｔファージ）に応答して生じるものと比較した。ファージ（１０６Ｔ．Ｕ．〜１０８Ｔ．Ｕ．）を雌２ヶ月齢Ｂａｌｂ／ｃイムノコンピテントマウスの尾静脈へと注射した。同時にファージバッチを調製し、予防接種の前に調製物から内毒素を除去した。各実験を、リンパ節回帰ファージクローン及び陰性対照ファージ（ｆｄ−ｔｅｔ）の独立の各調製物を使用して実施した。ファージ試料１個当たり２匹のマウスに注射し、２週間の間隔で、追加接種をおこなった。免疫応答を査定するため、最初の予防接種の６日後、並びに２回目及び３回目の予防接種の３日目に、マウスから採血した。３つの独立したコホート（ｃｏｈｏｒｔ）で、７８匹のＢａｌｂ／ｃマウスに全部で２３４回の予防接種を実施した。抗ファージ抗体血清の力価を、固定化ファージ粒子（ｆｄ−ｔｅｔ、９６ウェルプレート１枚当たり１０５Ｔ．Ｕ．）を使用することによりＥＬＩＳＡにより決定した。血清の希釈率は１：５００であり、プレートのコーティングは４℃で一晩行った。データは、２回の免疫後のｐ−ニトロフェニルリン酸基質の光学密度値（ＯＤ４５０）を表している。ＰＴＣＡＹＧＷＣＡ（配列番号：７）ファージ又はＷＳＣＡＲＰＬＣＧ（配列番号：８）ファージのいずれかを予防接種されたマウスのさらなるセットには、ファージ予防接種の前に１ｍｇの同族ペプチドを注射した。
【０１４８】
結果
全身投与時にファージのリンパ節への回帰を媒介する２個のペプチドが、単離された。これらのペプチドの配列は、ＰＴＣＡＹＧＷＣＡ（配列番号：７）及びＷＳＣＡＲＰＬＣＧ（配列番号：８）であり、リンパ節組織をターゲティングするその他のファージクローンには、ＣＡＹ及びＳＣＡＲを表すモチーフも存在した。ペプチド挿入物を欠いたファージ（ｆｄ−ｔｅｔファージ）とは対照的に、ペプチドＰＴＣＡＹＧＷＣＡ（配列番号：７）及びＷＳＣＡＲＰＬＣＧ（配列番号：８）を表示するファージは、対照臓器として使用された脳と比較して、リンパ節への優先的な回帰を示した（データは示していない）。
【０１４９】
リンパ節ターゲティングペプチドＰＴＣＡＹＧＷＣＡ（配列番号：７）又はＷＳＣＡＲＰＬＣＧ（配列番号：８）を表示するファージの免疫原性を、挿入物を含まないファージ（ｆｄ−ｔｅｔファージ）のものと比較した。リンパ節回帰ファージで免疫されたマウスは、ｆｄ−ｔｅｔファージで免疫されたマウスよりも顕著に高力価の抗ファージ抗体を示した（図７）。リンパ節回帰ファージで免疫されたマウスに、同族合成ペプチド（ＰＴＣＡＹＧＷＣＡ、配列番号：７；ＷＳＣＡＲＰＬＣＧ、配列番号：８；又は対照としての媒体）を前注射した。リンパ節回帰ファージ単独で予防接種されたマウスにおける抗ファージ抗体血清の力価は、この場合にも、ｆｄ−ｔｅｔファージで予防接種されたマウスで見られたものよりも高かった。しかしながら、同族合成ペプチドで前処理され、次いでリンパ節回帰ファージで予防接種されたマウスは、ｆｄ−ｔｅｔ免疫マウスと類似の力価を有していた（図８）。この実施例の結果は、この効果が、受容体により媒介された回帰による、リンパ節へのファージの蓄積により媒介されていることを示している。
【０１５０】
リンパ節の内皮へとターゲティングされた抗原は、予防接種後、体液性免疫応答を増強した。当業者であれば、抗原のリンパ節ターゲティングペプチドへの付着による、この新規な体液性免疫応答の調整法が、多様な病原性因子又は罹患細胞に対するワクチンの効率を増強するために一般的に利用可能でありうることを理解するであろう。例えば、リンパ節ターゲティングペプチドの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）への付着は、ヒト腫瘍に対する全身性体液性応答を増強するために使用されうる。細菌、ウイルス、レトロウイルス、ＨＩＶ、単細胞生物、又は多細胞病原性生物のような極めて多様な不活化病原体への、リンパ節ターゲティングペプチドの付着は、病原性攻撃に対する免疫系応答を増強するために有用でありうる。この手法は、さらに、単独の、又は特異的抗原の標的化送達と組み合わされた、サイトカイン又はケモカインのような免疫系制御分子のリンパ節への標的化送達により修飾されうる。最近、ファージカプシド内にウイルスペプチドエピトープを表示することにより、ＨＩＶ−１に対する驚くべき細胞溶解応答が観察された（Ｄｅ Ｂｅｒａｒｄｉｎｉｓら、２０００）。この手法を免疫系調整と組み合わせることにより、ワクチンの効力、並びに感染性疾患及び悪性疾患の宿主に対する免疫療法が改善されうる。
【０１５１】
本明細書において開示および主張される組成物、方法、および装置は全て、本開示に照らして不適当な実験を行うことなく作製され、実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して説明してきたが、組成物、方法、および装置、ならびに本明細書に開示の段階、または段階の順序に変更を行ってもよく、それらも本発明の概念、精神、および範囲に含まれることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的および生理的に関連する特定の物質は、同じまたは類似の結果が得られれば、本明細書に記載の物質に置換してもよいことは明らかである。当業者に明らかであるそのような類似の置換基および改変は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であると考えられる。
【０１５２】
参照
以下の参照は、これらが、例示的手法又は本明細書に記載されたもののその他の詳細を提供するという程度まで、本明細書において特に参照として組み入れられる。
2004536020.tif 000008
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【図面の簡単な説明】
【図１】モノクローナル抗体は、ＨｅＬａ細胞のＡｄ５感染を中和した。Ａｄ５感染中和アッセイを、ＨｅＬａ細胞において実施した。Ａｄ５−ＬａｃＺ単独を感染させたウェル（抗体なし）において観察された陽性細胞の数を、１００％に設定した。データは、２回のの独立した実験における４つの異なるデータセットの平均値である。標準偏差は、平均値の１０％未満であった。
【図２】ＧＦＥ−１ペプチドを表示するファージは、ＲＤ細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞と結合した。ＲＤ細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を増殖させ、等量のＧＦＥ−１ファージ又は挿入物を含まないｆｄ−ｔｅｔファージと共にインキュベートした。細菌感染によりファージを回収し、形質導入単位（ＴＵ）の数を、コロニー計数により決定した。
【図３】Ｆａｂ−ＧＦＥアダプター接合体の特徴決定。Ｆａｂ−ＧＦＥアダプターは、ＨｅＬａ細胞のＡｄ５感染を中和した。Ａｄ５感染中和アッセイを、ＨｅＬａ細胞において実施した。Ａｄ５−ＬａｃＺ単独を感染させたウェル（抗体なし）において観察された陽性細胞の数を、１００％に設定した。データポイントは、２個の独立した実験の平均値である。
【図４】Ｆａｂ−ＧＦＥアダプター接合体は、メンブレンジペプチダーゼ機能を阻害した。ＲＤ細胞を増殖させ、溶解させた。１０μｇのタンパク質と等価な細胞溶解物を、Ｆａｂ−ＧＦＥアダプターと共に１５分間インキュベートした後、ＭＤＰ基質Ｇｌｙ−Ｄ−Ｐｈｅを添加した。発色剤の添加後の様々な時点で、蛍光測定により酵素活性を検出した。データポイントは、１回の代表的な実験の３通りの平均値を示す。
【図５】１Ｃ５ＩＩＥ１１に基づくＦａｂ−ＧＦＥアダプターを用いた、Ａｄ５ベクターのＲＤ細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞へのターゲティング。１Ｃ５ＩＩＥ１１に基づくＦａｂ単独、Ｆａｂ−ＧＦＥ接合体、又はＦａｂ−ＣＡＲＡＣ接合体の存在下又は非存在下で、ＲＤ細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に、Ａｄ５−ＬａｃＺ又はＡｄ５−ＧＦＰを１ＭＯＩ ５０ＰＦＵ／細胞において感染させた。アダプター又はＦａｂの濃度は１２．５μｇ／ｍｌであった。ＲＤ細胞又はＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に対するＦａｂ−ＧＦＥアダプターのＥＣ５０を推定するため、一定濃度範囲のＦａｂに基づくアダプターの存在下又は非存在下で、細胞をＡｄ５−ＬａｃＺと共にインキュベートした。２４時間後、β−ガラクトシダーゼ発現に関して細胞を染色し、顕微鏡観察により陽性細胞を計数した。データポイントは、類似の結果を示す４回のうちの１回の独立した実験からの２通りの平均値である。
【図６】アデノウイルスターゲティングペプチドを表示するファージのＡｄ５との結合の効率。
【図７】ＰＴＣＡＹＧＷＣＡ（配列番号：７）ペプチド又はＷＳＣＡＲＰＬＣＧ（配列番号：８）ペプチドを表示するファージは、非標的化（挿入物を含まない）ｆｄ−ｔｅｔ対照ファージよりも強い免疫応答を誘発した。ファージを、雌２ヶ月齢Ｂａｌｂ／Ｃマウスへ静脈注射し（注射するファージ１種類当たり２匹のマウスを使用した）、予防接種後３日目に、血清収集、及び固定化ｆｄ−ｔｅｔファージに対するＥＬＩＳＡにより、抗ファージ抗体力価を決定した。データは、２回の免疫後のＥＬＩＳＡにおけるｐ−ニトロフェニルリン酸基質の４０５ｎｍにおける光学密度値（ＯＤ）を表している。血清希釈率は１：５００であった。
【図８】リンパ節ターゲティングによる体液性免疫応答の増強は特異的であり、同族合成ペプチドにより阻止されうる。マウスに、ＰＴＣＡＹＧＷＣＡ（配列番号：７）ファージ、ＷＳＣＡＲＰＬＣＧ（配列番号：８）ファージ、又は挿入物を含まないｆｄ−ｔｅｔ対照ファージを予防接種した。ＰＴＣＡＹＧＷＣＡ（配列番号：７）ファージ又はＷＳＣＡＲＰＬＣＧ（配列番号：８）ファージのいずれかを予防接種されたマウスのさらなるセットには、予防接種の５分前に１ｍｇの同族ペプチド（Ａｎａｓｐｅｃ，Ｉｎｃ．、ＣＡにより合成）を注射した。抗ファージ抗体力価を決定した。ＯＤ値は、３回の予防接種の後、５匹のマウスに由来する血清を用いて実施されたＥＬＩＳＡにおける３通りの平均値＋ＳＥＭを表している。血清希釈率は１：５００であり、免疫前対照マウス血清（ＮＭＳ）を対照とした。＊ｐ＝０．００４；＊＊ｐ＝０．００１（スチューデントｔ検定）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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