(57)【要約】広いスペクトルで研究すべき材料をラベルすることができ、蛍光技術により同定できるオキサジン誘導体【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）を有するオキサジン誘導体またはその塩：
【化１】
2004508448.tif 000023
ここで、
（ａ）基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０ は相互に独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルケンオキシ、アリール、アリールジアゾ、アルキルアリール、アリールアルコキシル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、カルボニル、アシル、アシルオキシ、カルボキシル、カルボンアミド、ハロゲンカルボンアミド、スルホニル、ハロゲン化スルホニル、酸エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物、イミド、イミジルエステル、イソチオシアネート、ホスホロアミダイト、アジド、ジチオニコチン誘導体またはアミンを意味し、必要に応じて置換される；
（ｂ）Ｒ１とＲ２ および／または Ｒ９とＲ１０ は、必要に応じて置換される飽和または不飽和のＣ３もしくはＣ４ブリッジを形成する；
（ｂ）前記置換基は、相互に独立に、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルケンオキシ、アリール、アリールジアゾ、アルキルアリール、アリールアルコキシル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、カルボニル、アシル、アシルオキシ、カルボキシル、カルボンアミド、ハロゲン カルボンアミド、スルホニル、ハロゲン化スルホニル、酸エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物、イミド、イミジルエステル、イソチオシアネート、ホスホロアミダイト、アジド、ジチオニコチン誘導体またはアミンを意味することができ；
（ｄ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも一つは、調査すべき物質に結合するための少なくとも一つの反応性基を含み、または更に少なくとも一つの追加の反応性基を含む。
【請求項２】
請求項１に記載のオキサジン誘導体であって、Ｒ１とＲ２および／またはＲ９とＲ１０が飽和もしくは不飽和のＣ４ブリッジを形成することを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項３】
請求項２に記載のオキサジン誘導体であって、Ｒ１とＲ２、またはＲ９とＲ１０が飽和もしくは不飽和のＣ４ブリッジを形成することを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載のオキサジン誘導体であって、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ７またはＲ８が反応性基を含有または保持することを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載のオキサジン誘導体であって、前記反応性基が酸エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物、イミド、イミジルエステル、カルボキシル、カルボンアミド、ハロゲン カルボンアミド、ハロゲン化スルホニル、イソチオシアネート、ホスホロアミダイト、アミン、アジド、アリールジアゾ、アルデヒド、ケトンまたはジチオニコチン誘導体であることを特徴とするオキサジン誘導体。．
【請求項６】
請求項５に記載のオキサジン誘導体であって、前記反応性基が酸エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物、イミド、イミジルエステル、カルボキシル、カルボンアミド、ハロゲン カルボンアミド、ハロゲン化スルホニル、イソチオシアネート、ホスホロアミダイト、アミン、アジド、アリールジアゾ、またはジチオニコチン誘導体であることを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項７】
請求項６に記載のオキサジン誘導体であって、前記反応性基が、必要に応じて置換されるＮ−スクシンイミジルエステル、マレイミド、カルボキシル、ハロゲン、アセタミド、イソチオシアネート、ホスホロアミダイト、アリールジアゾ、アジド、塩化スルホニル、スルホ−テトラフルオロフェノールエステルまたは一級もしくは二級アミンであることを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項８】
請求項７に記載のオキサジン誘導体であって、前記Ｎ−スクシンイミジルエステルがスルホン酸基で置換されることを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載のオキサジン誘導体であって、前記リンカー化合物は、前記反応性基と非ブリッジ形成基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９またはＲ１０との間に挿入されることを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項１０】
請求項９に記載のオキサジン誘導体であって、前記リンカー化合物は、必要に応じて置換され得るポリオキシアルキルユニット、脂肪族、脂環式もしくは芳香族ユニットであることを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項１１】
請求項１に記載のオキサジン誘導体であって、前記塩は、ハロゲン陰イオン、ＢＦ４−イオン、またはテトラフェニルホウ酸陰イオンから選択される対イオンを含むことを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項１２】
請求項１１に記載のオキサジン誘導体であって、前記対イオンは塩素陰イオン、臭素陰イオン、またはテトラフェニルホウ酸塩であることを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項１３】
次式（ＩＩ）を有する請求項１に記載のオキサジン誘導体またはその塩：
【化２】
2004508448.tif 000024
ここで、Ｘは必要に応じて置換されるＯＨ、ホスホロアミダイトまたはＮ−スクシンイミジルエステル基を意味する。
【請求項１４】
次式（ＩＩＩ）を有する請求項１に記載のオキサジン誘導体またはその塩：
【化３】
2004508448.tif 000025
ここで、Ｘは必要に応じて置換されるＯＨ、ホスホロアミダイトまたはＮ−スクシンイミジルエステル基を意味する。
【請求項１５】
次式（ＩＶ）を有する請求項１に記載のオキサジン誘導体またはその塩：
【化４】
2004508448.tif 000026
ここで、Ｘは必要に応じて置換されるＯＨ、ホスホロアミダイトまたはＮ−スクシンイミジルエステル基を意味する。
【請求項１６】
次式（Ｖ）を有する請求項１に記載のオキサジン誘導体またはその塩：
【化５】
2004508448.tif 000027
ここで、Ｘは必要に応じて置換されるＯＨ、ホスホロアミダイトまたはＮ−スクシンイミジルエステル基を意味する。
【請求項１７】
請求項１３〜１６の何れか１項に記載のオキサジン誘導体であって、その塩がハロゲン陰イオン、ＢＦ４−イオン、またはテトラフェニルホウ酸陰イオンから選択される対イオンを含むことを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項１８】
請求項１７に記載のオキサジン誘導体であって、前記対イオンは塩素陰イオン、臭素陰イオンまたはテトラフェニルホウ酸陰イオンであることを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項１９】
請求項１〜１８の何れか１項に記載のオキサジン誘導体であって、前記誘導体は少なくとも一つの親和性マーカーを有することを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項２０】
請求項１９に記載のオキサジン誘導体であって、該誘導体は一つの親和性マーカーだけを有することを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項２１】
請求項１９〜２０の何れか１項に記載のオキサジン誘導体であって、前記親和性マーカーはビオチン、ヘキサ−ヒス（ｈｅｘａ−ｈｉｓ）またはハプテンであることを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項２２】
請求項１〜２１の何れか１項に記載のオキサジン誘導体であって、前記反応性基が研究すべき物質に結合されることを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項２３】
請求項１〜２２の何れか１項に記載のオキサジン誘導体であって、前記研究すべき物質は ｉ）生物学的材料、ｉｉ）化学的化合物、特に生物学的に活性な物質および／または薬学的に活性な成分、ｉｉｉ）合成または生物学的な微小粒子、または ｉｖ）それらの組合せであることを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項２４】
請求項２３に記載のオキサジン誘導体であって、前記合成の微小粒子は、可溶性または懸濁可能なキャリア材料であることを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項２５】
請求項２３に記載のオキサジン誘導体であって、前記生物学的微小粒子は、小胞体またはウイルス様粒子であることを特徴とするオキサジン誘導体。
【請求項２６】
請求項２３に記載のオキサジン誘導体であって、前記生物学的材料はヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖、脂質、膜、細胞、細胞構成成分、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、抗体、ハプテンまたは抗原を含んでなるオキサジン誘導体。
【請求項２７】
研究すべき物質をラベルするためのキットであって、請求項１〜２６の何れか１項に記載のオキサジン誘導体を含んでなるキット。
【請求項２８】
請求項２７に記載のキットであって、それが請求項１３〜１８の何れか１項に記載のオキサジン誘導体を含んでなることを特徴とするキット。
【請求項２９】
化学技術またはバイオ技術の適用における、請求項２７または２８に記載のキットまたは請求項１〜２６の何れか１項に記載のオキサジン誘導体の使用。
【請求項３０】
請求項２９に記載の使用であって、前記キットまたはオキサジン誘導体は、ｉ）生物学的材料または化学的化合物を同定および特徴付けするために、ｉｉ）生物学的活性物質および／または薬学的活性物質を検索するために、ｉｉｉ）診断法および／または治療法におけるアナライトを同定するために、ｉｖ）ゲノム分析のために、またはｖ）物質の精製および濃縮のために使用されることを特徴とする使用。
【請求項３１】
請求項１〜２６の何れか１項に記載のオキサジン誘導体の製造方法であって：
式ＶＩを有する化合物
【化６】
2004508448.tif 000028
を、酸性媒質中で温和に加熱しながら１０分〜５時間、次式ＶＩＩを有する化合物と反応させる方法
【化７】
2004508448.tif 000029
ここで、Ｒ１〜Ｒ１０ は請求項１で特定した意味を有する。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって、下記のアミノ化合物およびニトロソ化合物が出発化合物として使用される方法。
【化８】
2004508448.tif 000030
【請求項３３】
請求項３１または３２に記載の方法であって、前記オキサジン誘導体は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドおよび ジイソプロピルカルボジイミドの存在下で、Ｎ−スクシンイミドと反応させることにより活性化されることを特徴とする方法。
【請求項３４】
研究すべき物質を標的ラベリングする方法であって：
ａ）研究すべき材料を含有するサンプルを調製する工程と；
ｂ）研究すべき材料を、請求項１９〜２１の何れか１項に記載の親和性マーカーを含むオキサジン誘導体と反応させて、ラベルされないオキサジン誘導体および１もしくは数個のオキサジン誘導体でラベルされた研究すべき材料の、ラベルされた混合物を形成する工程と；
ｃ）アフィニティークロマトグラフィーにより、研究すべき材料を、ラベルされていない画分、一つだけラベルされた画分または複数ラベルされた画分に分離する工程とを具備する方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって、親和性マーカーとしてビオチン、ヘキサ−ヒス、またはハプテンが使用されることを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載の方法であって、前記一つだけラベルされた画分が、前記材料のその後の調査のために使用されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はオキサジン誘導体、これを製造する方法、並びに生物学的および非生物学的材料をラベルするための赤色スペクトル領域の蛍光色素としての適用に関する。
【０００２】
オキサジンに基づく色素は広く使用されている。それらは、種々の染料について織物産業に頻繁に見られる。ＥＰ−Ｂ−０ ６０３ １２９は、夫々が置換され得るエキソアミノ基（ｅｘｏ−ａｍｉｎｏ ｇｒｏｕｐｓ）をベンゼン環に有するオキサジン色素を記載している。これら塩基性オキサジン色素の僅かに可溶性の塩は、天然繊維または完全な合成繊維を染色またはプリントするために適している。
【０００３】
ＵＳ−Ａ−５６５６７５９は、これも置換され得る二つのエキソアミノ基を有する陽イオン性オキサジン色素を開示している。無機陰イオンの置換によって疎水性とすることができるこれらのオキサジン色素は、特に熱転写印刷のためのインクリボンのインク層に使用される。
【０００４】
ＥＰ−Ａ−０ ７４７ ４４７は、生物学的分子に関連して蛍光マーカーとして使用されるオキサジン色素を開示している。これら共役系の吸収範囲は、６４５〜７００ ｎｍに位地しており、赤色スペクトル範囲に対応している。連結可能なオキサジン誘導体は、少なくとも四環系であり、二つのエキソ環窒素の少なくとも一方が、環構造の中に組込まれている。しかし、この複雑な多環基本構造の結果として、これら色素を合成するための費用は非常に高い。
【０００５】
特に、共焦点蛍光分光計を使用した高スループットのスクリーニングのために、高い蛍光量子収率、有機溶媒中での高い水溶性、高い化学的安定性、高い光安定性、並びに生物学的および非生物学的材料または分子に結合する能力を有する色素が必要とされている。
【０００６】
赤色レーザー発光光源、およびエネルギーに富む励起波長と比較して赤色で励起された生物学的材料の低バックグラウンド蛍光（自己蛍光）への安価なアクセスの結果として、赤色光で励起可能な蛍光色素（就中オキサジン色素を含む）の使用は、益々重要になっている。
【０００７】
例えば、蛍光検出マーカーを使用した従来のラベリング技術、特にタンパク質ラベリング技術の結果として、これら分子の複数の反応性基は、ラベリング反応が統計的ラベリングを生じるように、即ち、幾つかのタンパク質はラベルをもたず、他のタンパク質は一または二以上のラベルを有するようにターゲッティングされる。高感受性の分析技術では、不均一なアナライト混合物は望ましくない不均一な信号分布を生じ、これは測定結果を誤らせ、または全く使用不能にする。加えて、例えば複数ラベルされたタンパク質における個々のラベル間の相互作用の結果として、信号が弱くなる。
【０００８】
本発明の目的は、既知の蛍光色素における上記欠点を回避し、積極的な特性を示す蛍光色素を提供することである。また、本発明の更なる目的は、これら蛍光色素を製造する方法、およびこれら色素を使用して材料または分子をラベリングする方法を提供することである。この目的は、特に、水に易溶性で、光化学的特性を保持した赤励起性蛍光色素を提供することにある。更に、この色素は、ラベルすべき材料または分子との如何なる否定的な相互作用も伴わないで、生物学的および非生物学的材料または分子に連結可能になるように活性化されるべきである。
【０００９】
上記目的は、請求項１、３１または３４の特徴を有する材料および方法により、本発明に従って達成される。
【００１０】
本発明の主題は、特に、下記一般式Ｉを有するオキサジン誘導体またはその塩を含んでなるものである。
【００１１】
【化９】
2004508448.tif 000002
ここで、
（ａ）基 Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９ および Ｒ１０ は相互に独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルケンオキシ、アリール、アリールジアゾ、アルキルアリール、アリールアルコキシル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、カルボニル、アシル、アシルオキシ、カルボキシル、カルボンアミド、ハロゲン カルボンアミド、スルホニル、ハロゲン化スルホニル、酸エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物、イミド、イミジルエステル、イソチオシアネート、ホスホロアミダイト、アジド、ジチオニコチン誘導体またはアミンを意味し、必要に応じて置換される；
（ｂ）Ｒ１とＲ２ および／または Ｒ９とＲ１０ は、必要に応じて置換される飽和または不飽和のＣ３もしくはＣ４ブリッジを形成する；
（ｂ）前記置換基は、相互に独立に、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルケンオキシ、アリール、アリールジアゾ、アルキルアリール、アリールアルコキシル、アルコキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、カルボニル、アシル、アシルオキシ、カルボキシル、カルボンアミド、ハロゲン カルボンアミド、スルホニル、ハロゲン化スルホニル、酸エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物、イミド、イミジルエステル、イソチオシアネート、ホスホロアミダイト、アジド、ジチオニコチン誘導体またはアミンを意味することができ；
（ｄ）Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０の少なくとも一つは、調査すべき物質に結合するための少なくとも一つの反応性基を含み、または更に少なくとも一つの追加の反応性基を含む。
【００１２】
上記オキサジン誘導体の好ましい実施例に関する従属請求項は、本発明による製造方法およびラベリング方法に関する。
【００１３】
本発明に従う意味において、基Ｒ１ ｔｏ Ｒ１０ は反応性基を含むことができる。即ち、例えばこれら反応性基を表し、および／またはこれを含むことができる。例えば、置換基は当該反応性基を表すことができる。加えて、これら反応性基を含まないときには、当該オキサジン誘導体が反応性基を有することができる。この反応性基は、非反応性置換基に結合することができる。
【００１４】
本発明によるオキサジン誘導体は、三または四／五環系であることができる。好ましい実施例において、Ｒ１とＲ２ および／または Ｒ９とＲ１０は、飽和または不飽和のＣ４ブリッジを形成する。特に、Ｒ１とＲ２ 、またはＲ９とＲ１０ が飽和または不飽和のＣ４ ブリッジを形成し、それによって当該３員環に、必要に応じて置換される更なる６員環が出現する。特に好ましくは、Ｒ１とＲ２は不飽和のＣ４ブリッジを形成する。
【００１５】
当該反応性基は、当該色素を活性化するように働く。即ち、研究すべき材料に対する結合を生じさせる部位を提供する。本発明の意味における反応性基は、活性化可能なおよび活性化された基を含んでいる。研究すべき材料への結合は、共有結合的または非共融結合的であることができるが、共有結合が好ましい。色素分子当り、唯一の反応性基が存在するのが好ましい。この活性化は、例えば光によって生じることができる（光活性化）。
【００１６】
反応性基は、研究すべき材料に結合できる如何なる基であってもよい。例えば、研究すべき材料がタンパク質であれば、色素に結合するために種々の基が利用可能である。例えば、リジン基由来のアミン、または遊離シスチン基もしくはシステイン基由来のチオールである。オリゴヌクレオチドを合成する際に、本発明によるオキサジン誘導体を用いてオリゴヌクレオチドをラベリングするためには、反応性基としてホスホロアミダイト基をもった本発明によるオキサジン誘導体を使用するのが好ましい。これらオキサジン誘導体の特に高い基本的安定性は、それらを、このような合成反応において簡易かつ迅速に使用することを可能にする。
【００１７】
好ましい反応性基のリストの一例には、酸エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物、イミド、イミジルエステル、カルボキシル、カルボンアミド、ハロゲン カルボンアミド、ハロゲン化スルホニル、イソチオシアネート、ホスホロアミダイト、アミン、アリールジアゾ、アジド、アリールジアゾ、アルデヒド、ケトン またはジチオニコチン誘導体のような基が含まれる。
【００１８】
特に好ましい反応性基は、酸エステル、酸無水物、酸ハロゲン化物、イミド、イミジルエステル、カルボキシル、カルボンアミド、ハロゲン カルボンアミド、ハロゲン化スルホニル、イソチオシアネート、ホスホロアミダイト、アミン、アジド、アリールジアゾ、またはジチオニコチン誘導体である。
【００１９】
全く特に好ましい反応性基は、必要に応じて置換されるＮ−スクシンイミジルエステル、マレイミド、カルボキシル、ハロゲン アセタミド、イソチオシアネート、ホスホロアミダイト、アリールジアゾ、アジド、塩化スルホニル、スルホ−テトラフルオロフェノール エステル、または一級もしくは二級 アミンである。
【００２０】
Ｎ−スクシンイミジルエステル が置換される場合には、好ましい置換基はスルホン酸基である。
【００２１】
本発明によれば、当該オキサジン誘導体はリンカー化合物を含んでいてもよいことが分っている。このリンカー化合物は、反応性基と非ブリッジ形成基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９ またはＲ１０との間に挿入される。好ましくは、非ブリッジ形成基の反応性基は、このリンカー化合物と結合する。好ましくは、この結合の後に、少なくとも一つの反応性基が更に当該リンカー化合物に結合される。反応性基を簡単に修飾する必要性、即ち、官能性を変化させる必要性があるときに、当該リンカー化合物が導入される。例えば、カルボン酸またはＮ−スクシンイミジルエステルは、リンカー化合物によってアミンに変換することができる。他方、リンカー化合物は、色素と研究すべき物質との間の距離を変化させることを可能にする。当該オキサジン誘導体の溶解度は、リンカー化合物によって夫々の溶媒に容易に適合させることができる。
【００２２】
適切なリンカー化合物には、例えば、ポリオキシアルキルユニット、脂肪族ユニット、脂環式ユニット、または芳香族ユニットが含まれる。それらは分岐したものでも非分岐のものでもよく、また必要に応じて不飽和ユニットおよびヘテロ原子（例えば窒素）を含むことができる。
【００２３】
前記ポリオキシアルキル ユニットは、酸素ブリッジを介して相互に連結されるポリマーもしくはオリゴマーの有機基である。それには、例えばポリエーテル、ポリオール、可能性炭水化物、それらの誘導体、または水溶性ポリマーが含まれる。
【００２４】
一例として、リンカー化合物は次のように表すことができる（Ｙは下記の例における「反応性基」を意味する）：
【化１０】
2004508448.tif 000003
（並びにオルト−およびメタ−置換）
基および置換基のアルキル、シクロアルキル、アルケニル、アルケンオキシ、アルキルアリール、アリールアルコキシ、アルコキシ、ハロゲン カルボンアミド、およびアルコキシカルボニルは、一般には１〜１０、好ましくは１〜７の炭素原子を有し、また直鎖もしくは分岐鎖であることができる。１〜４の炭素原子が特に好ましい。アリールの場合は、好ましくはベンゼン環が存在する。
【００２５】
必要に応じて置換され、且つ反応性基を含むＲ３、Ｒ４、Ｒ７およびＲ８アルキル基が好ましい。また、種々の実施例においては、他の電子吸引性基もまた好ましい。これらの誘導体は、特に高い蛍光量子収率を有する。
【００２６】
可能なハロゲンは、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素である。
【００２７】
電荷の中和に適し、且つ化合物全体の水溶性またはＤＭＳＯ、ＤＭＦ もしくはアルコールのような他の溶媒中での溶解度を低下させないような、陽イオン性の基本構造に適合した如何なる陰イオンも、対イオンとして使用することができる。好ましいのは、ハロゲン陰イオン、ＢＦ４− またはテトラフェニルホウ酸陰イオンである。特に好ましいのは、塩素陰イオン、臭素陰イオン、またはテトラフェニルホウ酸陰イオンである。
【００２８】
特に好ましいオキサジン誘導体は、次式ＩＩ〜Ｖおよび次式ＶＩＩＩからＩＸによって表される特定の実施例である。
【００２９】
【化１１】
2004508448.tif 000004
【化１２】
2004508448.tif 000005
ここで、ＸはＯＨ、ホスホロアミダイト、または必要に応じて置換されるＮ−スクシンイミジルエステル基であり、それらの塩も含まれる。
【００３０】
クマリン、またはフルオレセインおよびローダミンのような青色もしくは緑色の光で励起される色素のようなＵＶ色素と比較したときの、本発明によるオキサジン色素の利点は次の通りである。
【００３１】
・アミンに対する反応性が高く、研究すべき広範な物質を簡易な方法で共有結合的にラベルすることができる。
【００３２】
・水溶性が高く、最小の吸収および最小の非特異的結合を導く。
【００３３】
・例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦまたはアルコールのような有機溶媒中での溶解度が高い。
【００３４】
・安価なレーザーダイオードまたはＨｅ−Ｎｅレーザーによる６３０〜６５０ ｎｍでの励起。
【００３５】
・通常のフィルター装置を使用できる最大６７０ ｎｍ領域での発光。
【００３６】
・鮮明且つ明瞭な蛍光信号を生じる高い蛍光量子収率。
【００３７】
・非常に多くの応用に適適した溶媒安定性およびｐＨ安定性（ｐＨ １〜１０）。
【００３８】
・全体の電荷が中性であり、ラベルされた分子に対する静電的影響がない。
【００３９】
・化学的に安定で、有機化学（溶液相および固相）に著しく適する。
【００４０】
・ＮＩＲで励起可能あり、研究すべき物質の非常に低いバックグラウンド蛍光（自己蛍光）を導く。
【００４１】
本発明によるオキサジン誘導体、特に誘導体ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶの高い対称性は、特に高い蛍光量子収率、高い光吸収、および鮮鋭な吸収帯を生じる。
【００４２】
本発明による色素の更なる決定的な利点は、後述するタンパク質のラベリングの実施例を用いて示されるであろう。従来のラベリング方法、特に、活性化されたカルボン酸とタンパク質のリジン残基との反応、またはマレイミドとタンパク質の遊離チオール基との反応のようなタンパク質のラベリング方法によれば、益々多くのこれらタンパク質の基がターゲッティングされ、このラベリング反応によって該タンパク質上におけるラベリングの統計的分布がもたらされるように、即ち、幾つかのタンパク質分子にはラベリングがなく、他のタンパク質は１、２、３またはそれ以上のラベリングを有するようになる。例えば、ＦＣＳ（蛍光相関分光法）およびＦＩＤＡ（蛍光強度分布分析）のような高感度蛍光技術において、この不均一なアナライト混合物は、データの評価を困難にする不均一な信号分布を導く。加えて、二つ、三つまたはそれ以上のラベルを有するタンパク質において、これは蛍光信号を劇的に弱くする色素／色素相互作用を生じる。
【００４３】
しかし、本発明によるオキサジン誘導体では、分析のために、一つだけラベルされた研究すべき材料を与えることが可能である。それによって、不均一な信号分布および色素／色素相互作用が生じないことが保証される。これは、測定結果に有意な改善を導く。
【００４４】
原理的には、例えば放射性検出マーカー等のような、如何なる測定可能な検出マーカーでも使用することができる。好ましく使用されるのは色素マーカー、特に蛍光マーカーである。特に好ましく使用されるのは、本発明によるオキサジン誘導体である。研究すべき材料の単一にラベルされた画分の代りに、例えば、二重、三重等にラベルされた画分を単離することも好ましいかもしれない。
【００４５】
本発明によるオキサジン誘導体はまた、アフィニティークロマトグラフィーによる簡単な精製を可能にする少なくとも一つの親和性マーカーを有することができる。この親和性マーカーは、例えば、前記リンカー化合物に結合させることができる。
【００４６】
好ましい実施例において、当該オキサジン誘導体は唯一の親和性マーカーを有する。原理的には、以下のアフィニティークロマトグラフィーにおいて、鮮明な分離を行うのに適した如何なる親和性マーカーを使用することも可能である。この点における例としては、ビオチン、ヘキサ−ヒス、またはハプテンを挙げることができる。
【００４７】
親和性ラベルされたオキサジン誘導体を使用することにより、研究すべき材料を標的ラベリングする方法は、次のようにして実施することができる：
ａ）研究すべき材料を含有するサンプルを調製し；
ｂ）研究すべき材料を、上記親和性マーカーを含むオキサジン誘導体と反応させて、ラベルされないオキサジン誘導体および１もしくは数個のオキサジン誘導体でラベルされた、研究すべき物質のラベルされた混合物を形成し；
ｃ）アフィニティークロマトグラフィーにより、研究すべき材料を、ラベルされていない画分、一つだけラベルされた画分、または複数ラベルされた画分に分離する。
【００４８】
親和性ラベルされたオキサジン誘導体を使用することにより、研究すべき材料を標的ラベリングする方法は、次のようにして実施することができる：
ａ）研究すべき材料を含有するサンプルを調製し；
ｂ）研究すべき材料を、上記親和性マーカーを含む検出マーカーと反応させて、ラベルされないオキサジン誘導体および１もしくは数個のオキサジン誘導体でラベルされた、研究すべき物質のラベルされた混合物を形成し；
ｃ）アフィニティークロマトグラフィーにより、研究すべき材料を、ラベルされていない画分、一つだけラベルされた画分、または複数ラベルされた画分に分離すること。
【００４９】
ビオチン／アビジン系（親和性マーカー／キャリア材料）と共に本発明によるオキサジン誘導体を用いたこのようなアフィニティー精製が、後述の実施例において提示される。
【００５０】
以下に提示する本発明による親和性ラベルされた色素反応性分子を使用することにより、上記で述べた既知のラベリング技術の欠点を回避することができる。ここで、ビオチンユニットは何れかの親和性マーカーを表し、オキサジン誘導体ＩＩＩは何れかの色素マーカー、特に本発明による色素を表し、Ｎ−スクシンイミジルエステルは何れかの反応性基を表す。このような分子は、従来のラベリング方法と同様にしてタンパク質と反応し、これは上記で述べたように不均一な混合物を生じる。以下の適切なキャリア材料（この場合はアビジンモノマー）上でのアフィニティー精製によって、ラベルされていないタンパク質がサンプルから除去される。その後の注意深い溶出によって、単一にラベルされたタンパク質を溶出させる一方、二重に、またはより高度にラベルされたタンパク質は、キャリア材料への協働的に強い結合の結果として結合させたまま残すことができる。こうして、タンパク質１分子当り、正確に一つの本発明によるオキサジン誘導体を有する均一なアナライトを得ることができる。
【００５１】
【化１３】
2004508448.tif 000006
研究すべき材料は、共有結合的または非共有結合的にオキサジン誘導体に結合させることができるが、共有結合的に結合させるのが好ましい。研究すべき材料は、好ましくは生物学的材料、化学的化合物、特に生物学的に活性な物質および／または薬学的に活性な成分、合成もしくは生物学的微小粒子、またはこれらの組合せである。
【００５２】
化学的化合物は、単一分子または凝集体として、例えば、小有機化合物またはオリゴマーもしくはポリマーとして存在する全合成の化合物からなることができる。この化学的化合物は、好ましくは生物学的活性物質および／または薬学的活性成分からなる。
【００５３】
合成微小粒子、即ち、特に可溶性および懸濁性キャリア材料は、液体、特に水溶液中に溶解または懸濁され得る何れかのタイプの合成微小粒子を意味する。該微小粒子の直径は１μｍ以下であり、好ましくは １ ｎｍ≦ｄ≦１μｍ、特に好ましくは １０ ｎｍ≦ｄ≦５００ ｎｍ、最も好ましくは ５０ ｎｍ≦ｄ≦３００ ｎｍである。合成微小粒子の例には、有機ポリマー粒子が含まれる。例えば、デンドリマー系ポリエチレングリコールを使用することができる。しかし、実験条件下で可溶性または懸濁可能な全ての合成微小粒子、特に定義された孔サイズを有するガラス粒子、セルロース、シリカゲル、および他のタイプのポリスチレン粒子を使用することが可能である。後者は、必要であればジビニルベンゼンで架橋され、および／またはポリエチレングリコールをグラフトされ、および／またはアミノ、ヒドロキシ、カルボキシルもしくはハロゲンで官能化される。可能な合成微小粒子の更なる例は、グラフト共重合体、ポリアクリルアミド、ラテックス、必要に応じてＮ，Ｎ’−ビス−アクリロイルエチレンジアミンをグラフトされたジメチルアクリルアミド粒子、およびポリマーコーティングされたガラス粒子が含まれる。生物学的微小粒子は、好ましくは小胞体粒子またはウイルス様粒子である。
【００５４】
生物学的材料は、例えば、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、糖、脂質、膜、細胞、細胞構成成分、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、タンパク質、抗体、ハプテン、または抗原であることができる。
【００５５】
研究すべき材料、特に生物学的材料は、液相で、および固相と組合わせてラベルすることができる。この場合、活性化されたオキサジン誘導体および活性化可能なオキサジン誘導体の両者を使用することができる。例えば、活性化可能なオキサジン誘導体、例えばカルボキシ誘導体の活性化は、例えばベンゾイル−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＢ）のような活性化剤を使用してインサイチューで行われる。このような活性化は、好ましくは固相反応で行われる。
【００５６】
また、本発明は、上記で述べたような研究すべき材料をラベリングするためのキットに関する。通常の構成成分に加えて、このキットは、一般式（Ｉ）のオキサジン誘導体を含んでいる。通常の構成成分は、例えば、緩衝液、分析容器、および研究を実施するための指示書である。好ましい実施例において、このキットは、式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩＩまたはＩＸのオキサジン誘導体、特に、必要に応じて置換し得るＮ−スクシンイミジルエステルの形態である。式ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶを有するオキサジン誘導体を有するキットが特に好ましい。
【００５７】
研究すべき材料は、好ましくは生物学的材料、化学的化合物、特に生物学的活性物質および／または薬学的活性成分、合成もしくは生物学的な微小粒子、またはそれらの組合せである。個々の材料については既に上記述べた通りである。
【００５８】
本発明によるオキサジン誘導体は、化学技術またはバイオ技術の研究に特に適している。これら研究には、生物学的材料または化学的化合物の同定および特徴付け、生物学的活性物質および／または薬学的活性成分の探索、診断法および／または治療法におけるアナライトの同定、ゲノム分析（例えばＳＮＰ分析）または物質の生成および濃縮が含まれる。
【００５９】
前記研究は、好ましくはレーザー光分析および蛍光検出を使用して行われる。この場合に使用される測定方法には、オキサジン誘導体を測定できる殆どの方法が含まれる。これらの方法には、分光分析、複数光子励起（特に二光子励起）、レーザー走査顕微鏡、近視野分光分析（ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、光子分布分析（特にＦＩＤＡおよび２−Ｄ−ＦＩＤＡ）、蛍光寿命分析、および蛍光偏光分析が含まれる。特に好ましくは、共焦点顕微鏡または他の共焦点光学系を使用して測定が行われる。
【００６０】
データは、好ましくは自己相関分析（ａｕｔｏｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）および／または交差相関分析（ｃｒｏｓｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって最終的に評価される。
【００６１】
２−Ｄ−ＦＩＤＡおよび交差相関分析においては、測定容積のサンプルに二つの波長を同時に照射し、緑色励起性蛍光色素と組合わせた本発明によるオキサジン誘導体のような二つの色素種の、時間一致分析（ｔｉｍｅ ｃｏｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）によって情報が得られる。
【００６２】
同様に、蛍光共鳴エネルギー移動実験（ＦＲＥＴ）における使用は、本発明によるオキサジン誘導体が、エネルギー移動のための対として一連の既知のキサンテンと共に使用される場合に、非常に有益である。また、本発明によるオキサジン誘導体は、ＦＩＳＨ（蛍光インサイチューハイブリダイゼーション）またはＰＣＲ法（ポリメラーゼ連鎖反応）において非常に効果的に使用することができる。
【００６３】
本発明によるオキサジン色素は、合成により容易に入手可能であり、また製造が実質的により困難な従来技術の化合物とは異なっている。本発明による色素、特に誘導体ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶまたはＶは全て、非常にコンパクトな分子構造を有しており、研究すべき材料との相互作用が極めて小さくなるようになっている。特に、生物学的材料の生物学的特性は変更されない。一般的に中性の全体的変化は、色素とラベルされた成分との間の静電的相互作用を最小化する。本発明による蛍光色素は、研究すべき材料（特にアミン）に対する高い反応性、高い蛍光量子収率、高い溶媒耐性およびｐＨ耐性、高い化学的安定性およびＮＩＲ励起性を有する。本発明による色素は低い励起エネルギーを特徴とし、従って低い光破壊を特徴とする。本発明による色素の特定の励起波長および発光波長は、商業的に入手可能なフィルターシステムを使用することを可能にする。エネルギーに富む励起波長に比較して、赤色光で励起される化学的および生物学的材料の低いバックグラウンド蛍光（自己蛍光）も有利である。従って、本発明による色素は、赤色スペクトル範囲において非常に有効に使用することができる。固相合成の条件下において、高い化学的安定性は特に重要である。本発明による色素は低い吸収または非特異的結合傾向を示し、また水に対して非常に可溶性である。従って、それらは水溶液、ＤＭＳＯ、ＤＭＦまたはアルコール中での化学技術およびバイオ技術の研究のために理想的に使用することができる。
【００６４】
本発明によるオキサジン誘導体は、例えば、以下の方法で製造することができる：
次式ＶＩを有する３−アミノフェノールを、酸性媒質中において、温和に加熱しながら１０分〜５時間、次式ＶＩＩを有するニトロソフェニル化合物と反応させる。
【００６５】
【化１４】
2004508448.tif 000007
【化１５】
2004508448.tif 000008
ここで、基Ｒ１〜Ｒ１０は上記で既に特定した意味を有する。
【００６６】
この反応は、５０〜７０℃、好ましくは５５〜６５℃の温度で行われることが分っている。この目的のために、３−アミノフェノール化合物は、例えば氷酢酸中に溶解され、その後、１０分〜５時間に亘ってニトロソ化合物を添加する。一般的に、深い青色の溶液が形成された後に反応は終了する。次いで、普通はカラムクロマトグラフィーにより精製を行う。
【００６７】
また、次のような合成の可能性も含まれ、ここでは出発化合物が以下に示す構造を有する。
【００６８】
【化１６】
2004508448.tif 000009
以下の実施例は、本発明を説明するために用いられるものである。
【００６９】
実施例
例１
【化１７】
2004508448.tif 000010
０．１ｍｏｌの３−ジエチルアミノフェノールを２０ｍＬの氷酢酸中に溶解させ、６０℃にまで加熱した。この溶液に３０分以内に、１０ｍＬの氷酢酸中の０．１ｍｏｌの３−（Ｎ−メチル−Ｎ−（４−ニトロソフェニル）−アミノ）プロピオン酸を添加した。鮮やかな青色になった溶液を２時間還流にまで加熱した。氷酢酸を蒸留して除去した後、残渣をカラムクロマトグラフィ（溶出剤：エタノール／Ｈ２Ｏ：５：１；担体：ＳｉＯ２）により精製した。青銅色の生成物［（２−カルボキシ−エチル）−メチルアミノ］−ジエチルアミノフェノキサジン−５−イリウムを水中に溶解させ、テトラフェニルホウ酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｔｅｔｒａｐｈｅｎｙｌ ｂｏｒａｔｅ）を用いて沈澱させた。
【００７０】
例２
【化１８】
2004508448.tif 000011
０．１ｍｏｌのＮ（−３−ヒドロキシフェニル）−Ｎ−メチルアミノ−プロピオン酸メチルエステルを５０ｍＬの氷酢酸中に溶解させ、６０℃にまで加熱した。この溶液に１時間以内に、０．１ｍｏｌの３−（Ｎ−エチル−Ｎ−（４−ニトロソ−３−ヒドロキシフェニル）−アミノ）プロパンスルホン酸を数回に分けて添加した。短時間の後、暗い青色の溶液が形成された。３時間の反応後、溶液を濃縮し、カラムクロマトグラフィにより精製した（溶出剤：エタノール；担体：ＳｉＯ２）。次いで得られた生成物を１Ｎ ＮａＯＨ 溶液中に取り出し、沸騰熱（ｂｏｉｌｉｎｇ ｈｅａｔ）で数時間処理した。次いでこの溶液を乾燥するまで蒸発させ、粗成物をカラムクロマトグラフィにより分離した（溶出剤：エタノール／Ｈ２Ｏ：１０：１；担体：ＳｉＯ２）。メタノールからの再結晶後、青銅色の結晶の［（２−カルボキシ−エチル）−メチル−アミノ）］−［エチル−（３−スルフォ−プロピル）−アミノ］−フェノキサジン−５−イリウムを得た。
【００７１】
例３
【化１９】
2004508448.tif 000012
０．１ｍｏｌの３−（７−スルフォ−ナフチルアミノ）−プロピオン酸および０．１ｍｏｌの５−（ジエチルアミノ）−２−ニトロソ−フェノールをともに２０ｍＬの氷酢酸中で３０分、還流にまで加熱した。反応溶液が冷却された後、緑色の結晶の（２−カルボキシ−エチルアミノ）−ジエチルアミノ−スルフォベンゾ［α］フェノキサジン−７−イリウムが沈澱した。溶剤を除去し、粗成物をカラムクロマトグラフィにより精製した（溶出剤：エタノール／水：２０：１；担体：ＳｉＯ２）。氷酢酸からの再結晶化を行った。
【００７２】
例４
【化２０】
2004508448.tif 000013
０．１ｍｏｌのＮ−（４−ニトロソナフチル）−アミノプロパンスルホン酸および０．１ｍｏｌのＮ−（３−ヒドロキシフェニル）−Ｎ−メチルアミノプロピオン酸メチルエステルをともに２０ｍＬの氷酢酸中で、３０分還流にまで加熱した。この反応溶液を冷却した後、溶液を乾燥するまで蒸発させ、残渣をアセトンから再結晶化させた。得られた生成物を、１０ｍＬの水および１０ｍＬのアセトンの混合物中に溶解させ、１ｍＬの１Ｎ ＨＣｌ 溶液と混合し、８時間還流にまで加熱した。次いで溶媒混合物を流し、粗成物をカラムクロマトグラフィにより分離した（溶出剤：エタノール／Ｈ２Ｏ：１０／１；担体 ＳｉＯ２）。メタノールからの再結晶後、青銅色の結晶の（２−カルボキシ−エチルアミノ）−エチル−（３−スルフォ−プロピル）−アミノ−ベンゾ［α］フェノキサジン−７−イリウムを得た。収率：１０％。
【００７３】
例５
【化２１】
2004508448.tif 000014
２μｍｏｌの［（２−カルボキシ−エチル）−メチル−アミノ］−［エチル−（３−スルフォ−プロピル）−アミノ］−フェノキサジン−５−イリウムを、２００μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解させ、１００μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の１０μｍｏｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミドの溶液および２．４μｍｏｌのジイソプロピルカルボジイミドを添加する。この溶液を３時間室温で振とうし、次いで乾燥するまで濃縮する。［（２−カルボキシ−エチル）−メチル−アミノ］−［エチル−（３−スルフォ−プロピル）−アミノ］−フェノキサジン−５−イリウム−スクシンイミジルエステルへの変換は＞９０％であり、よってさらなる精製は不要である。
【００７４】
例６
【化２２】
2004508448.tif 000015
１μｍｏｌの５−カルボキシアミドトリプタミン（５−ＣＴ）を５０μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解させ、２００μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の１．５μｍｏｌの［（２−カルボキシ−エチル）−メチル−アミノ］−［エチル−（３−スルフォ−プロピル）−アミノ］−フェノキサジン−５−イリウム−スクシンイミジルエステルの溶液に添加する。この溶液に、２５０μＬの０．１５Ｍ ｐＨ８．６ ホウ酸緩衝液（ｂｏｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）を添加し、反応溶液を３時間室温で振とうする。次いでこの溶液を乾燥するまで濃縮し、粗成物をカラムクロマトグラフィにより精製する（溶出剤：メタノール／水；勾配：３０分で０％メタノール乃至１００％メタノール；担体：逆相Ｃ１８）。
【００７５】
例７
【化２３】
2004508448.tif 000016
１０ｎｍｏｌのウシＩｇＧ を１５０μＬの水中に溶解させる。この溶液を、１５μＬの１Ｍ ｐＨ９．３ 炭酸ナトリウム溶液、および３３１．４μＬの０．１Ｍ ｐＨ９．３ 炭酸ナトリウム溶液ならびに３．６μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の５０ｎｍｏｌの［（２−カルボキシ−エチル）−メチル−アミノ］−［エチル−（３−スルフォ−プロピル）−アミノ］−フェノキサジン−５−イリウム−スクシンイミジルエステルの溶液と混合し、反応溶液を１時間室温で振とうする。次いで、５０μＬの１．５Ｍ ヒドロキシアミン溶液を添加することにより反応を停止させる。次いで粗成物を排除クロマトグラフィ（溶出剤：ＰＢＳ ｐＨ７．４）により精製する。
【００７６】
例８　オキサジン誘導体（ＩＩＩ）におけるリンカーの導入
【化２４】
2004508448.tif 000017
2004508448.tif 000018
２．ＤＣＭ中の２０％ＴＦＡ
２μｍｏｌの［（２−カルボキシ−エチル）−メチル−アミノ］−［エチル−（３−スルフォ−プロピル）−アミノ］−フェノキサジン−５−イリウム（オキサジン誘導体ＩＩＩ）を、２００μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解させ、５０μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の４μｍｏｌのモノ−ｔ−ブトキシカルボニル−１，５−ジアミノペンタン（Ｂｏｃ−カダベリン）の溶液、５０μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の４μｍｏｌ ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−ｔｒｉｓ−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＰｙＢＯＰ）の溶液、１０μｍｏｌのＮ−エチル−ジイソプロピル−アミン（ＤＩＰＥＡ）を添加する。この溶液を１６時間室温で振とうし、次いで乾燥するまで濃縮する。残渣を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の２０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の３００μＬの溶液と混合し、３０分室温で振とうする。溶液を乾燥するまで濃縮し、粗成物を、ＨＰＬＣを用いるカラムクロマトグラフィにより精製する。
【００７７】
例９　オキサジン誘導体（ＩＩＩ）におけるリンカーの導入
【化２５】
2004508448.tif 000019
2004508448.tif 000020
２．ＤＣＭ中の２０％ＴＦＡ。
【００７８】
２μｍｏｌの［（２−カルボキシ−エチル）−メチル−アミノ］−［エチル−（３−スルフォ−プロピル）−アミノ］−フェノキサジン−５−イリウム（オキサジン誘導体ＩＩＩ）を２００μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解させ、５０μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の４μｍｏｌのモノ−ｔ−ブトキシカルボニル−ｔｒａｎｓ−１，４−ジアミノシクロヘキサン（Ｂｏｃ−ＣＨＡ）溶液、５０μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２μｍｏｌベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−ｔｒｉｓ−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＰｙＢＯＰ）の溶液、および８μｍｏｌのＮ−エチル−ジイソプロピル−アミン（ＤＩＰＥＡ）を添加する。この溶液を１６時間室温で振とうし、次いで乾燥するまで濃縮した。残渣を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の２０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の３００μＬの溶液と混合する。３０分室温で振とうする。この溶液を乾燥するまで濃縮し、粗成物を、ＨＰＬＣを用いるカラムクロマトグラフィにより精製する。
【００７９】
例１０　親和性マーキング
１ｍｍｏｌのＮ−ε−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−アミノヘキサン酸を、１２００μＬのジクロロメタンおよび３００μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＡ）中に溶解させ、０℃にまで冷却した。５００μＬのＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドを８０μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解させ、アミノ酸溶液中に添加した。反応溶液を０℃で３０分静置し、次いでジクロロメタンを真空下で除去した。残渣を１０００μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に取り出し、ここで透明な溶液を得た。この溶液を、フリットを備えた５ｍＬシリンジ中で１００μＬのＷａｎｇ 樹脂に添加した。この懸濁液に、２５μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の１０μｍｏｌのジメチルアミノピリジンを添加し、この混合物を一晩静置した。
【００８０】
次いで、上記樹脂を、２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いて６回、２ｍＬのジクロロメタンを用いて３回、および２ｍＬのｔ−ブチルメチルエーテルを用いて６回洗浄し、乾燥させ、負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）を測定するために重さを計った。樹脂の特異的な負荷は０．８ｍｍｏｌ／ｇ 樹脂であった。さらに負荷を加えるために、９−フルオレニルメトキシカルボニル保護基（ＦＭＯＣ）を、初めに、５分および１５分だけ、それぞれＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジン溶液を用いた二重処理（ｔｗｏｆｏｌｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）により処理した。次いで、この樹脂を２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いて６回洗浄した。１２０μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解した１ｍｍｏｌのＮ−α−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）−ε−（４−メチルトリチル）−Ｌ−リシン、および１２０μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中に溶解した１ｍｍｏｌの１−［ビス（ジメチルアミノ）メチリウミル（ｍｅｔｈｙｌｉｕｍｙｌ）］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジン−３−オキシドヘキサフルオロリン酸塩を、２ｍｍｏｌのＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンとともに樹脂に添加した。この反応溶液を３０分後に流し、上記負荷工程を同一の条件下で再び繰り返した。２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを毎回用いて樹脂を６回洗浄した後、９−フルオレニルメトキシカルボニル保護基を、５分および１５分それぞれＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンの溶液を用いた二重処理により分離した。次いで樹脂を再び、２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いて６回洗浄した。続いて３００μＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２５０ｍＬのビオチノイルアミノヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステルを用いて反応させた。１０時間の反応後、反応溶液を流し、樹脂を２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いて６回、２ｍＬのジクロロメタンを用いて３回、および２ｍＬのｔ−ブチルメチルエーテルを用いて６回洗浄して、乾燥させた。
【００８１】
蛍光色素を負荷するために、１０μｍｏｌの樹脂を除去し、５ｍＬシリンジに移した。樹脂を２ｍＬのジクロロメタン中に予め浸漬（ｐｒｅ−ｓｏａｋｅｄ）したのち、４−メチルトリチル保護基（ＭＴＴ）を、ジクロロメタン中の２ｍＬの３０％ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）を毎回用いた３分間の処理を５回行うことにより分離した。次いで樹脂を、２ｍＬのジクロロメタンを用いて６回、および２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いて３回洗浄した。次いで、３００ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２５μｍｏｌの［（２−カルボキシ−エチル）−メチル−アミノ］−エチル−（３−スルフォ−プロピル）−アミノ］−フェノキシン−５−イリウム−スクシンイミジルエステルとの反応を３時間室温で行った。反応が行われた後、樹脂を２ｍＬのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドを用いて６回、２ｍＬのジクロロメタンを用いて６回、２ｍＬのメタノールを用いて６回、および２ｍＬのｔ−ブチルメチルエーテルを用いて６回洗浄し、乾燥させた。９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％水および２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）の混合物を用い、樹脂から生成物を分離した。２時間の反応後、溶液を樹脂から濾過除去し、真空下で濃縮した。次いで残渣として残った粗成物をメタノール中に取り出し、クロマトグラフィにより精製した。
【００８２】
【化２６】
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【化２７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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