(57)【要約】黒鉛化炭素マトリクスを使用したサンプル処理方法は、ポリハロゲン化二環芳香族炭化水素（ＰＨＤＨ類）の混合物中のポリハロゲン化ビフェニル類（ＰＨＢ類）、ポリハロゲン化ジベンゾフラン類（ＰＨＤＦ類）、およびポリハロゲン化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類（ＰＨＤＤ類）の相対量を決定するのに有用である。本発明の方法は、ＰＨＤＨ化合物の毒性を決定するための細胞に基づく分析法と共に使用するとき、特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリハロゲン化ビフェニル化合物（ＰＨＢ類）、ポリハロゲン化ジベンゾフラン類（ＰＨＤＦ類）およびポリハロゲン化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類（ＰＨＤＤ類）を、複数のポリハロゲン化二環芳香族炭化水素の混合物から分離する方法であって、
サンプルを有機溶剤で抽出して、複数のポリハロゲン化二環芳香族炭化水素を含む初回抽出サンプルを作るステップと、
前記初回抽出サンプルを、活性炭および珪藻土を含む吸着マトリクスと接触させるステップであって、ＰＨＢ化合物類、ＰＨＤＤ化合物類およびＰＨＤＦ化合物類を前記マトリクスに吸着させることを特徴とするステップと、
前記ＰＨＢ化合物類を、前記マトリクスから溶離して、ＰＨＢ分画を作るステップと、
ＰＨＤＤ化合物類およびＰＨＤＦ化合物類を前記マトリクスから溶離してＰＨＤＤ／ＰＨＤＦ分画を作るステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記複数のポリハロゲン化二環芳香族炭化水素の混合物が、ポリ塩化二環芳香族炭化水素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数のポリハロゲン化二環芳香族炭化水素の混合物が、ポリ臭化二環芳香族炭化水素を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のポリハロゲン化二環芳香族炭化水素の混合物が、二環芳香族炭化水素の臭素化物と塩素化物と臭素化塩素化物の混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＰＨＢ分画が、ポリ臭化ビフェニル化合物類（ＰＢＢ類）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＨＢ分画が、ポリ塩化ビフェニル化合物類（ＰＣＢ類）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＨＤＤ／ＰＨＤＦ分画が、ポリ臭化ジベンゾフラン類（ＰＢＤＦ類）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＨＤＤ／ＰＨＤＦ分画が、ポリ塩化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類（ＰＣＤＦ類）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＨＤＤ／ＰＨＤＦ分画が、ポリ臭化ジベンゾフラン類（ＰＢＤＦ類）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＰＨＤＤ／ＰＨＤＦ分画が、ポリ塩化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類（ＰＣＤＦ類）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記初回抽出サンプルが、硫酸ナトリウムを含むマトリクスで前記サンプルを分離することによって精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記初回抽出サンプルが、シリカゲルを含むカラムで該初回抽出サンプルを分離することによってさらに精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記初回抽出サンプルを精製する前に、シリカゲルを含む前記カラムが硫酸で処理される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記活性炭が黒鉛化炭素である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記活性炭が、前記初回抽出サンプルと接触する前に加熱される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＨＤＤ／ＰＨＤＦ分画が、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾダイオキシン、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン、およびそれらの異性体からなる群から選択される１以上の化合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが液体サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記サンプルが固体サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルがガス状サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルが、土壌サンプルおよび灰サンプルからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰＨＢ分画の毒性を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記毒性が細胞に基づく分析法で決定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞に基づく分析法が、前記ＰＨＢ分画中のＰＨＢ濃度に応答した、細胞系ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１２２８６におけるルシフェラーゼの発現を測定するステップを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＨＤＤ／ＰＨＤＦ分画の毒性を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記毒性が、細胞に基づく分析法で決定される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞に基づく分析法が、前記ＰＨＤＤ／ＰＨＤＦ分画中の、ＰＨＤＤ／ＰＨＤＦ化合物の濃度に応答した、細胞系ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１２２８６におけるルシフェラーゼの発現を測定するステップを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ポリ塩化ビフェニル化合物類（ＰＣＢ類）、ポリ塩化ジベンゾフラン類（ＰＣＤＦ類）およびポリ塩化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類（ＰＣＤＤ類）を、複数のポリ塩化二環芳香族炭化水素の混合物から分離する方法であって、
サンプルを有機溶剤で抽出して、複数のポリ塩化二環芳香族炭化水素を含む初回抽出サンプルを作るステップと、
前記初回抽出サンプルを、活性炭および珪藻土を含む吸着マトリクスと接触させるステップであって、ＰＣＢ化合物類、ＰＣＤＤ化合物類およびＰＣＤＦ化合物類を前記マトリクスに吸着させることを特徴とするステップと、
前記ＰＣＢ化合物類を、前記マトリクスから溶離して、ＰＣＢ分画を作るステップと、
前記ＰＣＤＤ化合物類およびＰＣＤＦ化合物類を前記マトリクスから溶離してＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ分画を作るステップと
を含む方法。
【請求項２８】
前記初回抽出サンプルが、硫酸ナトリウムを含むマトリクスで前記サンプルを分離することによって精製される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記初回抽出サンプルが、シリカゲルを含むカラムで該初回抽出サンプルを分離することによってさらに精製される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記初回抽出サンプルを精製する前に、前記シリカゲルを含むカラムが硫酸で処理される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記活性炭が黒鉛化炭素である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記活性炭が、前記初回抽出サンプルと接触する前に加熱される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ分画が、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾダイオキシン、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン、およびそれらの異性体からなる群から選択される１以上の化合物を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３４】
前記サンプルが液体サンプルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記サンプルが固体サンプルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記サンプルがガス状サンプルである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記サンプルが、土壌サンプルおよび灰サンプルからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＣＢ分画の毒性を決定するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記毒性が細胞に基づく分析法で決定される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞に基づく分析法が、前記ＰＣＢ分画中のＰＣＢ濃度に応答した、細胞系ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１２２８６におけるルシフェラーゼの発現を測定するステップを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ分画の毒性を決定するステップをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項４２】
前記毒性が、細胞に基づく分析法で決定される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞に基づく分析法が、前記ＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ分画中のＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ化合物の濃度に応答した、細胞系ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１２２８６におけるルシフェラーゼの発現を測定するステップを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
複数のポリ塩化二環芳香族炭化水素の混合物を含むサンプル中の、ＰＣＤＤ類およびＰＣＤＦ類の量に対するＰＣＢ類の量を比較する方法であって、
サンプルを有機溶剤で抽出して、複数のポリ塩化二環芳香族炭化水素類を含む初回抽出サンプルを作るステップと、
前記初回抽出サンプルを、活性炭および珪藻土を含む吸着マトリクスと接触させるステップであって、ＰＣＢ類、ＰＣＤＤ類およびＰＣＤＦ類を前記マトリクスに吸着させることを特徴とするステップと、
前記ＰＣＢ類を、前記マトリクスから溶離して、ＰＣＢ分画を作るステップと、
前記ＰＣＢ分画中に存在するＰＣＢ類の量を決定するステップと、
前記ＰＣＤＤ類およびＰＣＤＦ類を前記マトリクスから溶離してＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ分画を作るステップと、
前記ＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ分画中に存在するＰＣＤＤ類およびＰＣＤＦ類の量を決定するステップと、
次いで、前記ＰＣＢ分画中のＰＣＢ類の量を、前記ＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ分画中に存在するＰＣＤＤ類およびＰＣＤＦ類の量と比較するステップと
を含む方法。
【請求項４５】
前記サンプルの抽出が、該サンプルを、硫酸ナトリウムを含むマトリクス上で分離することによって行われる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記サンプルを、シリカゲルを含むカラムで分離することによって、前記初回抽出サンプルを精製するステップをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記カラムが硫酸で処理される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記活性炭が黒鉛化炭素である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記活性炭が、前記初回抽出サンプルと接触する前に加熱される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記サンプルが液体サンプルである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記サンプルが固体サンプルである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記サンプルがガス状サンプルである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記サンプルが、土壌サンプルおよび灰サンプルからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ分画が、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾダイオキシン、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン、およびそれらの異性体からなる群から選択される１以上の化合物を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＰＣＢ分画中に存在する前記ＰＣＢ類の量が、高分解能ガスクロマトグラフィ質量分析法で決定される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ分画中に存在する前記ＰＣＤＤおよびＰＣＤＦ化合物類の量が、高分解能ガスクロマトグラフィ質量分析法で決定される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５７】
ポリ塩化ビフェニル化合物類（ＰＣＢ類）、ポリ塩化ジベンゾフラン類（ＰＣＤＦ類）およびポリ塩化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類（ＰＣＤＤ類）を、複数のポリ塩化二環芳香族炭化水素類の混合物から分離する方法であって、
サンプルを有機溶剤で抽出して、複数のポリ塩化二環芳香族炭化水素を含む初回抽出サンプルを作るステップと、
前記初回抽出サンプルを、硫酸ナトリウムを含むマトリクス上で分離することによって、該初回抽出サンプルを精製するステップと、
前記初回抽出サンプルを、シリカゲルを含むカラムで分離して精製された初回抽出サンプルを作ることによって、前記初回抽出サンプルをさらに精製するステップであって、該初回抽出サンプルを精製する前に、シリカゲルを含む前記カラムを、硫酸で処理することを特徴とするステップと、
前記精製された初回抽出サンプルを、活性化された黒鉛化炭素および珪藻土を含む吸着マトリクスと接触させて、ＰＣＢ化合物類、ＰＣＤＤ化合物類およびＰＣＤＦ化合物類を前記マトリクスに吸着させるステップと、
前記ＰＣＢ化合物類を、前記マトリクスから溶離させて、ＰＣＢ分画を作るステップと、
前記ＰＣＤＤ化合物類およびＰＣＤＦ化合物類を、前記マトリクスから溶離させてＰＣＤＤ／ＰＣＤＦ分画を作るステップと
を含む方法。
【請求項５８】
前記活性炭がＡＸ−２１である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＡＸ−２１が、初回抽出サンプルと接触する前に加熱される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記活性炭が、ＧＲＡＦＯＩＬ（登録商標）の等級ＴＧ−４０７可撓性グラファイト粉末である、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［関連出願］
本出願は、２０００年６月２日提出の米国特許仮出願第６０／２０８，８９８号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）の利益を請求する。
【０００２】
［合衆国政府の支援に関する記述］
本発明は、米国国立衛生研究所（中小企業主導調査（Ｓｍａｌｌ　Ｂｕｓｉｎｅｓｓ　Ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ））から、ＥＳ０８３７２−０３の助成金番号で、政府支援を受けて行われた。合衆国政府は、本発明に対して、ある一定の権利を有する。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は、概して、ポリハロゲン化二環芳香族炭化水素類を分離および検出するための分析システムに関する。
【０００４】
［発明の背景］
ポリハロゲン化二環芳香族炭化水素（ＰＨＤＨ類）は、ポリ塩化ビフェニル類（ＰＣＢ類）、ポリ塩化ジベンゾフラン類（ＰＣＤＦ類）、ポリ塩化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類（ＰＣＤＤ類）、ポリ臭化ビフェニル類（ＰＢＢ類）、ポリ臭化ジベンゾフラン類（ＰＢＤＦ類）、ポリ臭化ジベンゾ−ｐ−ダイオキシン類（ＰＢＤＤ）、およびＰＨＤＨのその他のサブクラスを含む、広範囲に及ぶ環境汚染物質の様々な集団である。たとえば、Ｇｉｅｓｙら、９章、２４９〜３０７ページ，Ｄｉｏｘｉｎｓ　ａｎｄ　Ｈｅａｌｔｈ（Ａ．Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９４）を参照されたい。ＰＨＤＨ類の中で、塩素化化合物類、すなわちポリ塩化二環芳香族炭化水素類（ＰＣＤＨ類）が最も広く研究されてきた。しかし、その他のＰＨＤＨ化合物類、たとえば、ポリ臭化二環芳香族炭化水素類、および二環芳香族炭化水素の臭素化物と塩素化物と臭素化塩素化物との混合物類（ｍｉｘｅｄ ｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ／ｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ ｄｉａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ）の、環境および健康に対する影響が次第に認識されてきた。
【０００５】
多くのＰＨＤＨ類は親油性で分解に強く、土壌、堆積物、および水の中で検出されている。さらに、多くのＰＨＤＨ類は、濃縮される。従って、食物連鎖で、その作用が増幅されることが確認されている。たとえば、Ｇｉｅｓｙ　ｅｔ　ａｌ．（１９９４ａ），上掲；Ｔａｎａｂｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ　４７，１４７−１６３（１９８７）；Ｇｉｅｓｙ　ｅｔ　ａｌ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２８，１２８Ａ−１３５Ａ（１９９４ｂ）；Ｗｅｂｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，１章、１〜６ページ、Ｄｉｏｘｉｎｓ　ａｎｄ　Ｈｅａｌｔｈ（Ａ．Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ編、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９４）を参照されたい。ＰＨＤＨ類への曝露およびＰＨＤＨ類の生体内蓄積によって、腫瘍助長、先天性欠損症、肝毒性、免疫毒性、皮膚毒性、内分泌ホメオスタシスの変化、望ましくない多数の酵素の誘導（シトクロムＰ４５０　１Ａ１を含む）、および死亡を含む、様々な有害な種特異的作用および組織特異的作用が引き起こされることが確認されている。たとえば、Ｇｉｅｓｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９９４ｂ，上掲，Ｐｏｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２２，５１７−５４２（１９８２）；Ｓａｆｅ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　２４，８７　１４９（１９９４）；ＤｅＶｉｔｏ　＆　Ｂｉｒｎｂａｕｍ，Ｄｉｏｘｉｎｓ　ａｎｄ　Ｈｅａｌｔｈ，１３９〜１６２ページ（Ａ．Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ編，Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９４）を参照されたい。
【０００６】
ＰＨＤＨ類を検出および定量化するための既知の技術は、一般に、高価で且つ多くの時間を要する伝統的な機器分析法、たとえば、ガスクロマトグラフィ分離（ＧＣ）および質量分析法（ＭＳ）を含む。こうした方法は、一般に、定量化および分析の前に、大量のサンプル処理を含む。たとえば、Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　Ａｇｅｎｃｙ（ＥＰＡ）Ｍｅｔｈｏｄ　１６１３（４０Ｃ．Ｆ．Ｒ．Ｐａｒｔ　１３６）およびＥＰＯ　Ｍｅｔｈｏｄ　８２９０（４０Ｃ．Ｆ．Ｒ．Ｐａｒｔ　２６１）を参照されたい。高分解能ガスクロマトグラフィ／高分解能質量分析（ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ）処理は、一般に、分析すべきサンプルの抽出、次いで、結果として得られた抽出物の酸性化合物および塩基性化合物による処理、続いて、たとえば、硫酸、中性アルミナ、シリカゲルおよび活性炭を含浸したシリカゲルカラムを用いた逐次的分離（通常は、クロマトグラフィ技術による）を必要とする。このように、サンプル抽出物を多段処理することにより、通常、ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ検出を使用して、全部ではないが、多くの有毒なＰＨＤＨ類のコンジナー（ｃｏｎｇｅｎｅｒ）に特異的な定量化をするのに十分な程度に、妨害化合物を含まない抽出物が得られる。
【０００７】
ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ技術の重大な不都合は、一般に、ポリ塩化化合物（たとえば、ＰＣＤＨ類）しか、この方法で定量化できないことである。たとえば、ポリ臭化化合物および臭素化物と塩素化物とが混じった化合物類（ｍｉｘｅｄ ｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ／ｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）を検出／定量化するための分析技術は、一般に非常に高価であり、またそれらの標準は十分に確立されていない。残念ながら、現在、ポリ臭化化合物、またはポリ臭化化合物とポリ塩化化合物とが混じった化合物類（ｍｉｘｅｄ ｐｏｌｙｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ／ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）は有毒である、または対応する塩素化異性以上に有毒であると考えられている。従って、ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ方法では検出されない有毒化合物、たとえば、有毒なポリ臭化二環芳香族炭化水素、または臭素化と塩素化とが混じった二環芳香族炭化水素類を決定および定量化することができるシステムおよび方法が依然として必要である。
【０００８】
さらに、ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ分析を用いて、既知のＰＣＤＨ異性体およびコンジナーの混合物を検出および定量化することができるが、この方法は、一般に、これらの複合混合物（ｃｏｍｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅ）の生物学的作用または毒物学的作用あるいはそれらの両方に関する情報を与えない。これらの混合物は、ある一定の環境条件で、理論的に、２１０までの、または２１０以上の、異なるＰＣＢ異性体およびコンジナー、１３５の異なるＰＣＤＦ異性体およびコンジナー、および７５の異なるＰＣＤＤ異性体およびコンジナーを含む可能性があり、そのそれぞれが、大いに異なる化学的、物理的、および毒物学的特性を有する。Ｓａｆｅ，１９９４，上掲、およびＳａｆｅ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　２１，５１−８８（１９９０）を参照されたい。
【０００９】
従って、ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳを使用して、ＰＣＤＨの複合混合物の生物／中毒活性を正確に予測することは困難である。その結果として、ＰＣＤＨ化学物質の複合混合物の毒物学的効力は、一般に、毒性換算係数（Ｔｏｘｉｃ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ ｆａｃｔｏｒ：ＴＥＦ）によるアプローチで評価される。これは、ＰＣＤＨ混合物中に存在する個々の化合物の濃度に、それらの比ＴＥＦを乗じ、その値の和を毒性当量（ＴＥＱ）として表すものである。Ｓａｆｅ，１９９４，上掲；Ｓａｆｅ，１９９０，上掲；およびＡｈｌｂｏｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊ．ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　２２８，１７９−１９９（１９９２）を参照されたい。
【００１０】
ＰＨＤＤ、ＰＨＤＦ、およびダイオキシン様ＰＨＢの多くの作用は、これらの化合物を高い親和性で結合するサイトゾルタンパク質であるアリール炭化水素受容体（ＡｈＲ）の作用を介して進行すると、一般に考えられている（Ｓａｆｅ　１９９０，上掲；Ｓ．Ｓａｆｅ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．１００，２５９−２６８（１９９２）；Ｓａｆｅ　１９９４，上掲；Ｌ．Ｓ．Ｂｉｒｎｂａｕｍ，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ　　Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．１０２，Ｓｕｐｐｌ．９，１５７−１６７（１９９４）；Ｍ．Ｓ．Ｄｅｎｉｓｏｎ　ａｎｄ　Ｓ．Ｈｅａｔｈ−Ｐａｇｌｉｕｓｏ，Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　ｏｆ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ　６１，５５７−５６８（１９９８）；Ｄｅｎｉｓｏｎ，Ｍ．Ｓ．，Ｈｅｌｆｅｒｉｃｈ（編）、生体異物、受容体および遺伝子発現（Ｘｅｎｏｂｉｏｔｉｃｓ，ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（Ｔａｙｌｏｒ　ａｎｄ　Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，３〜３３ページ，１９９８ａ）のＭ．Ｓ．Ｄｅｎｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，「Ａｈシグナル伝達経路」）。この共通の機序の存在によって、ＴＥＦコンセプトの使用の継続が支持される。
【００１１】
２位、３位、７位、および８位に塩素置換を含むＰＣＤＤ類およびＰＣＤＦ類は、ＡｈＲに対する最高の親和性結合および最強の毒作用を示し、塩素化が増すと、一般に毒性（ｔｏｘｉｃ ｐｏｔｅｎｃｉｅｓ）が低減する。最も有毒なダイオキシンである、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン（２，３，７，８−ＴＣＤＤ）を基準にした、異なるコンジナーの毒性は、それらの対応する毒性変換係数（ＴＥＦ）で示される。過去１０年間にわたって、多数の異なるＴＥＦ案が提出されてきた。たとえば、Ｕ．Ｇ．Ａｈｌｂｏｒｇ，Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ　２８，１０４９−１０６７（１９９４）；Ｍ．Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．１０３，７７５−７９２（１９９８）；Ｓ．Ｓａｆｅ，Ｔｅｒａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ　ａｎｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　１７，２８５−３０４（１９９７−９８）を参照されたい。ヒト、魚類、および野生生物危険性評価に関する最新の合意したＴＥＦは、１９９７年６月１５〜１８日に、スウェーデンのストックホルムで開催されたＷＨＯ／ＩＰＣＳ（Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ／Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ　ｏｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓａｆｅｔｙ）会議で得られた。Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，上掲，およびＭ．Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇ，Ｆｏｏｄ　Ａｄｄ．Ｃｏｎｔａｍ．１７，３４７−３５８（２０００）を参照されたい。ＴＥＦは、７種のＰＣＤＤ類、１０種のＰＣＤＦ類および１２種のＰＣＢに、毒性の顕著な変化性を表す０．００００１〜１の範囲が割当てられている。
【００１２】
監督官庁が実行した、化学物質の害毒および危険性評価は、主として個々の化合物の毒性を検討しているが、ヒトおよび野生生物は、有毒化合物の複合混合物に曝露される（Ｓａｆｅ，１９９８，上掲）。ＰＣＤＤ類、ＰＣＤＦ類、およびダイオキシン様ＰＣＢのほかにも、多数の他の化合物が、ＡｈＲ作動薬活性を発揮する。１９９８年に、国際ＷＨＯ委員会は、他のハロゲン化化学物質が、ＴＥＦコンセプトに包括するための基準を満たすという合意に達したが、これらの化合物のＴＥＦ値を確定するのに十分な環境データおよび毒物学的データが得られないと主張した（Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８，上掲）。これらの化合物のいくつかの例は、以下にさらに詳述するが、ＰＣＤＤ類、ＰＣＤＦ類およびＰＣＢの臭素化類縁体類、およびクロロ置換類縁体とブロモ置換類縁体とが混じった類縁体類（ｍｉｘｅｄ ｃｈｌｏｒｏ／ｂｒｏｍｏ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ａｎａｌｏｇｕｅｓ）、ハロゲン化ナフタレン類、ハロゲン化ジフェニルエーテル類、ハロゲン化アゾベンゼン類、ハロゲン化アゾキシベンゼン類および多環芳香族炭化水素類（ＰＡＨ）である。たとえば、Ｇ．Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ　１５，２１０５−２１０７１９８６；Ｂｉｒｎｂａｕｍ，１９９４，上掲；Ｄｅｎｉｓｏｎ　ａｎｄ　Ｈｅａｔｈ−Ｐａｇｌｉｕｓｏ，１９９８，上掲；およびＤｅｎｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８ｂ，上掲、を参照されたい。
【００１３】
ＰＣＤＨ類汚染環境サンプルの特異性の分析法を改善するために、細胞に基づくバイオアッセイを、抽出技術および酸シリカゲルカラムクロマトグラフィと組み合わせてきた。たとえば、既知の一方法論では、ＰＣＤＨ類の比含量の決定と、伝統的ＨＲＧＳ／ＨＲＭＳ技術との相関関係は約０．７１であった。しかし、この方法論および他の方法論には、混合物中のダイオキシン／フランのクラスのＰＣＤＨ類の含量に比したＰＣＢ類の含量を定量化できないことを含む、ある種の不都合がある。Ｊ．Ｍ．Ａａｒｔｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｏｒｇａｎｏｈａｌｏｇｅｎ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ　２７，２８５２８９（１９９６）を参照されたい。
【００１４】
ある一定のＰＣＤＨ類の毒性の濃度特異的な発現に基づいて、ＴＥＱ活性を直接定量化するために、細胞バイオアッセイシステムが開発された。Ｄｅｎｉｓｏｎらに付与された米国特許第５，８５４，０１０号（以下、「’０１０」特許と呼び、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）には、レポーター化合物ルシフェラーゼを発現することにより、ある特定の多環芳香族炭化水素に応答する、新規な組換え細胞系を基にした検出システムが記載されている。Ｐ．Ｍ．Ｇａｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ　ａｌ．，Ｆｕｎｄａｍ．Ａｐｐｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３０，１９４−２０３（１９９６）を参照されたい。換言すれば、’０１０特許のバイオアッセイシステム（および以下、互換可能にＣＡＬＵＸ（登録商標）とも呼ぶ）は、定量化することができ、また、最終的に、サンプル中に存在する多環芳香族炭化水素の量と精確に相関するルミネセンスによって、ある特定の多環芳香族炭化水素の存在に応答する。
【００１５】
’０１０特許に記載されているシステムは、これまでの多環芳香族炭化水素定量化法にまさる利点を有するにも関らず、一般に規制目的で使用されるＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ方法（すなわち、ＥＰＡ　Ｍｅｔｈｏｄ　８２９０および１６１３）による異性体に特異的な検出法を用いて得られる結果と確実に相関関係がある結果を提供するために、多くの時間を要するサンプル処理方法を、やはり必要とする。従って、定量化および分析用に、ＰＨＤＨ化合物類の個々の種類（たとえば、ＰＣＤＨ化合物類およびＰＢＤＨ化合物類）を分離するための、信頼でき且つ便利なサンプル処理技術が依然として必要である。さらに、ポリ臭化化合物類および臭素化物と塩素化物とが混じった化合物類（ｍｉｘｅｄ ｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ／ｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ）を含む、広範囲の有毒なポリハロゲン化化合物類の存在および毒性を決定するための、サンプル処理技術および評価技術が必要である。
【００１６】
［発明の概要］
本発明者は、ポリハロゲン化ビフェニル類（たとえば、ＰＣＢ類およびＰＢＢ類）、および／またはＰＨＤＨクラスの化合物のダイオキシン類および／またはフラン類が寄与する、ＴＥＱを定量化するための、迅速で、比較的安価な方法論を発見した。１つの実施形態では、本発明は、ポリ塩化二環芳香族炭化水素（ＰＣＤＨ）ファミリーから、２，３，７，８−テトラクロロジベノ−ｐ−ダイオキシンおよび関連の有毒なコンジナーを単離し、特異的に検出するためのサンプルを提供するのに有用な分離方法について説明する。本方法を使用して、ＰＨＤＨファミリーの化合物のうち、特定の有毒化合物を定量化することができる。また、本発明の方法を使用して、ポリハロゲン化ビフェニル類、特にポリ塩化ビフェニル類によって助長される各フラン類の毒性に比した、ポリハロゲン化ジベンゾダイオキシン類、特に、ポリ塩化ジベンゾダイオキシン類およびそれぞれのフラン類に起因する毒性を正確に決定することができる。
【００１７】
従って、本発明は、ある特定の多環芳香族炭化水素類（および特に、ポリハロゲン化二環芳香族炭化水素類）を定量分析するためのサンプル処理方法を提供する。本方法の一つの実施形態は、サンプルから多環芳香族炭化水素混合物類を分離するステップと、サンプル中の多環芳香族炭化水素類の総量および多環芳香族炭化水素類の特定のファミリーの量の両者を決定するステップとを含む。
【００１８】
ある特定の実施形態では、本方法は、複合混合物中の多環芳香族炭化水素化合物類のファミリーを定量化する既知の方法と併せて使用することが可能である。このような定量化方法としては、ポリハロゲン化二環芳香族炭化水素類を試験するための組換えバイオアッセイシステム、および、ポリ塩化二環芳香族炭化水素類の場合には、ガスクロマトグラフィと電子捕獲検出法（ＧＣ／ＥＣＤ）による伝統的な化学分析および高分解能ガスクロマトグラフィ高分解能質量分析法（ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ）を用いた分析などがあるが、その限りではない。
【００１９】
好ましい実施形態では、定量化方法は、ＣＲＬ−１２２８６の受託番号でＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託された、組換え細胞系（「マウスＨ１Ｌ１．１細胞系」としても知られ、また本明細書で互換可能に呼ばれる）を使用する、米国特許第５，８５４，０１０号（引用することにより、本明細書の一部をなすものとする）に記載の、ＣＡＬＵＸ（登録商標）システムとして知られるバイオアッセイシステムである。
【００２０】
本発明の方法を使用すれば、サンプル中に存在する多環芳香族炭化水素類の含量を多回測定できるように、サンプルを都合よく調製することが可能である。本発明の、ある特定の実施形態では、サンプル中に存在する全ての多環芳香族炭化水素類を個々に定量化することができる。本発明のさらなる態様は、ＰＨＤＨ類である化合物のクラスのものではない、ある種の化学物質を除去することが可能である。
【００２１】
本明細書に記載の創意に富む方法を使用すれば、本明細書に記載のアフィニティマトリクスに吸着させることにより、ＰＨＤＨ類、特に、ＰＣＤＨ類を定量化することができる。これらの方法は、任意に、サンプル中の、平面状のポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ類）として知られる化合物群に属する化合物の量、ならびに、サンプル中の、ポリ塩化ジベンゾ−パラ−ダイオキシン類（ＰＣＤＤ類）およびポリ塩化ジベンゾフラン類（ＰＣＤＦ類）を含む群に属する化合物の量を測定／定量化することが可能である。これらの方法は、任意に、サンプル中の、平面状のポリ臭化ビフェニル（ＰＢＢ類）として知られる化合物群に属する化合物の量、ならびに、サンプル中の、ポリ臭化ジベンゾ−パラ−ダイオキシン類（ＰＢＤＤ）およびポリ臭化ジベンゾフラン類（ＰＢＤＦ類）を含む群に属する化合物の量を測定／定量化することが可能である。さらに他の代替実施形態では、これらの方法は、サンプル中の、平面状の、ポリ臭化ビフェニルとポリ塩化ビフェニルとが混じったビフェニル類（ｍｉｘｅｄ ｐｏｌｙｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ／ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ ｂｉｐｈｅｎｙｌｓ）である化合物群に属する化合物の量、ならびに、サンプル中の、ポリ臭化ジベンゾ−パラ−ダイオキシンとポリ塩化ジベンゾ−パラ−ダイオキシンが混じったジベンゾ−パラ−ダイオキシン類（ｍｉｘｅｄ ｐｏｌｙｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ／ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ ｄｉｂｅｎｚｏ−ｐａｒａ−ｄｉｏｘｉｎｓ）、およびポリ臭化ジベンゾフランとポリ塩化ジベンゾフランとが混じったジベンゾフラン類（ｍｉｘｅｄ ｐｏｌｙｂｒｏｍｉｎａｔｅｄ／ｐｏｌｙｃｈｌｏｒｉｎａｔｅｄ ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｓ）を含む群に属する化合物の量を測定し、または定量化することが可能である。
【００２２】
本発明の前述の態様および他の態様を、以下に記載の明細書に、詳細に説明する。
【００２３】
［発明の詳細な説明］
次に、本発明の好ましい実施形態を示す、添付の図面および明細書を参照しながら、以下に、本発明をさらに詳しく説明する。しかし、本発明は、異なる形態で具象化することが可能であり、本明細書に記載の実施形態に限定されるものと考えてはならない。むしろ、これらの実施形態は、この開示内容が周到で完全になるように、また、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるために提供するものである。
【００２４】
特に記載がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野において通常に熟練した者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書で、本発明の説明に使用される専門用語は、個々の実施形態を説明するために限られ、本発明を限定する意図はない。本発明の説明および添付のクレームで使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、前後関係から、そうではないことが明白に示されない限り、複数形も含むことを意図する。本明細書に記載の、全ての出版物、特許出願、特許、および他の参考文献を、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００２５】
［略語および頭文字］
利便性および明瞭性のため、本明細書を通して、以下の略語および頭文字を使用する。
【００２６】
【表１】
2004508539.tif 000002
【００２７】
【表１（つづき）】
2004508539.tif 000003
【００２８】
本発明は、ＰＨＤＨ類（たとえば、ＰＣＤＨ類、ＰＢＤＨ類）を吸収し、また、環境サンプルからＰＣＢ、ダイオキシンおよびフラン類を特異的に吸収する、創意に富む吸収マトリクスの作製を含む。
【００２９】
本明細書で使用される用語「サンプル」および「環境サンプル」は、天然および非天然の、固体、液体およびガス状サンプルを含む。単なる例として、本発明で分析することが可能なサンプルとしては、堆積物サンプル、土壌サンプル、および灰サンプル、水サンプル（すなわち、地下水サンプル、飲料水サンプル、廃水または廃液サンプル）、他の液体サンプル、ミルク、肉、果物、包装食品、非包装食品、および保存食品または非保存食品を含む、固体および液体食物サンプル（またはその抽出物）などがある。ガス状サンプルとしては、自動車または産業排ガスなどがあるが、その限りではない。用語「サンプル」は、体液、血液、組織、死亡、生検、細胞、葉、根、および種子サンプルを含む、ヒト、非ヒト動物、または植物対象からの生物サンプルも含む。
【００３０】
本発明の方法で検出可能なポリハロゲン化二環芳香族炭化水素としては、類似した作用機序により毒性を引き起こす、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾダイオキシン、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾフラン、およびそれらの異性体、ならびに同一平面上のポリ塩化ビフェニル類（ＰＣＢ類）およびポリ臭化ビフェニル類（ＰＢＢ類）等の、有毒化合物などがあるが、その限りではない。本発明で検出することが可能な多環芳香族炭化水素に、ポリ塩化ジベンゾ−パラ−ダイオキシン類（たとえば、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−パラ−ダイオキシン）およびＴＣＤＤ様化合物（たとえば、ＴＣＤＤ様縮合環多環芳香族炭化水素化合物（ＴＣＤＤ−ｌｉｋｅ ｆｕｓｅｄ−ｒｉｎｇ ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）およびＴＣＤＤ様ポリ塩化二環芳香族炭化水素化合物）が含まれることが好ましい。また、また好ましくは、本発明で検出することが可能なＴＣＤＤ様ポリ塩化二環芳香族炭化水素化合物に、ポリ塩化ジベンゾフラン類および同一平面上のポリ塩化ビフェニル類、およびポリ臭化ジベンゾフラン類および同一平面上のポリ臭化ビフェニル類等の化合物が含まれることが好ましい。
【００３１】
図１は、本発明の一実施形態を示し、また、本発明に従って、サンプルを抽出および処理する方法の全般的概略図である。本方法の１つの態様は、「初回抽出サンプル」を得るための、サンプル中に含まれるポリ塩化二環芳香族炭化水素（ＰＣＤＨ類、たとえば、ＰＣＢ類、ダイオキシン類およびフラン類）の抽出である。サンプル中のＰＣＤＨ化合物を抽出することにより、サンプル中に含まれるその化合物の濃縮および処理が容易になる。ＰＣＤＨ化合物類の抽出は、抽出物中に含まれるＰＣＤＨ化合物類の処理および定量化を潜在的に妨害する可能性がある、粒状物質の除去を容易にするクロマトグラフィマトリクスまたはカラムを使用することが好ましい。従って、初回抽出サンプルは、サンプル中のＰＣＤＨ化合物の全量を含むことが好ましい。必要に応じて、当業者は、当技術分野で周知の方法を使用して、サンプル中の全ＰＣＤＨ化合物類の定量的または定性的測定を行うことが可能である。
【００３２】
初回抽出サンプルを作るためのＰＣＤＨ化合物類の抽出は、有機相に分配することが可能な有機溶剤の混合物を用いて、サンプルを超音波処理することによって行うことが可能である。好ましい実施形態では、溶剤混合物は、メタノールおよびトルエンの混合物であり、さらに好ましくは、メタノールが、混合物の約１５〜２５％、さらに好ましくは混合物の約２０％を構成し、トルエンが、混合物の約６０〜９０％、好ましくは混合物の約８０％を構成するメタノールおよびトルエンの混合物である。残留水性成分（たとえば、水）を除去するために、有機相を、クロマトグラフィで分離することが好ましい。好ましい実施形態では、残留水相を除去するために、有機相を、硫酸ナトリウムカラムで分離する。分離後、好ましくは、真空遠心分離で有機相を濃縮する。
【００３３】
図１に示す通り、本方法で望み通り検出されるＰＣＢ類、ダイオキシン類およびフラン類ほど有毒ではない多環芳香族炭化水素類（すなわち、持続性および毒性が低いため、検出または定量化する必要がない且つ／または政府の規制を受けない多環芳香族炭化水素類）等の汚染物質を除去するために、初回抽出サンプルに対して任意の精製ステップを実行することが可能である。「精製された初回抽出サンプル」を得るために、第２のクロマトグラフィマトリクスまたはカラムを使用することによって、任意の精製ステップが好ましく実行される。１つの実施形態では、精製された初回抽出サンプルを作るために、約３０％の硫酸で処理したシリカゲルカラム（すなわち、酸−シリカカラム）で初回抽出サンプルを分離し、ヘキサン等の有機溶剤で溶離する。
【００３４】
次いで、初回抽出サンプル（任意に、また好ましくは、酸−シリカカラムから溶離された精製初回抽出サンプル）を、別のクロマトグラフィマトリクスまたは活性炭および珪藻土を含むカラム（本明細書では「ＸＣＡＲＢカラム」と呼ぶ）に適用する。やはり、図１に表示されているこの処理ステップは、独特の特異性、およびサンプル中に存在する化合物のうち、ＰＣＤＨクラスのダイオキシン類およびフラン類の量に比して（すなわち、それらの量に対して、またはそれらの量と比較して）、それぞれのＰＣＢを個々に定量化することができる能力を提供する活性炭アフィニティマトリクスを使用する。
【００３５】
多くのタイプの珪藻土が当技術分野で知られており、また、市販されているが、好ましい実施形態では、珪藻土は、Ｓｉｇｍａ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入できる、市販のＣｅｌｉｔｅ（登録商標）である。
【００３６】
ＸＣＡＲＢカラムの活性炭は、黒鉛化炭素であることが好ましい。好ましい実施形態では、活性炭は、炭素分子篩である。金属含有触媒の調製に適した炭素分子篩は、当技術分野で周知であり、一般に、個々の分子の臨界寸法に似た平均孔寸法を有する非晶質材料である。これらの炭素系吸着材は、超微小孔性炭素とも呼ばれ、主として分子寸法の孔で、比較的大きい比孔体積を含む。これらの炭素は、一般に、石炭、ココナッツの殻、ピッチ、フェノールホルムアルデヒド樹脂、スチレンビニルベンゼンスルホン酸樹脂、ポリフルフリルアルコール、ポリアクリロニトリル、およびポリ塩化ビニリデンを含む、天然および合成の前駆体の制御された熱分解によって得られる。適する前駆体は、架橋していてもよく、陽イオン、陰イオン、強塩基、弱塩基、スルホン酸、カルボン酸、ハロゲン、またはアルキルアミン官能基を含んでもよい。このような材料の化学は、たとえば、Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｅｖｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｌａｎｋ　ｅｔ　ａｌ．，（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｓｏｃｉｅｔｙ，３３５〜３６０ページ（１９８８））の中のＦｏｌｅｙ，「Ｃａｒｂｏｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｅｖｅｓ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ」、Ｃａｒｂｏｎ，　２９（６），　７４３−７４５　（１９９１）の中のＳｃｈｍｉｔｔ、「Ｃａｒｂｏｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｅｖｅｓ　ａｓ　Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｃａｔａｌｙｓｔ　Ｓｕｐｐｏｒｔｓ−１　０　Ｙｅａｒｓ　Ｌａｔｅｒ」およびＣａｒｂｏｎ，２８（２／３），２６１−２７９（１９９０）の中の、Ｗａｌｋｅｒ、「Ｃａｒｂｏｎ−Ａｎ　Ｏｌｄ　Ｂｕｔ　Ｎｅｗ　Ｍａｔｅｒｉａｌ　Ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ」で再検討されている。好ましい実施形態では、活性炭カラムで使用される炭素は、たとえば、ファン・デル・ワールス力によって、平面状の分子が炭素上に吸収されるように、分子レベルで、平面状のシートを形成する。
【００３７】
ある種の炭素分子篩は、市販されており、本発明で使用することも可能である。有用な炭素分子篩としては、たとえば、Ｒｏｈｍ　ａｎｄ　Ｈａａｓ　Ｃｏｍｐａｎｙにより提供されるＡｍｂｅｒｓｏｒｂシリーズの吸着媒（たとえば、「Ａｍｂｅｒｓｏｒｂ　５６３」、「Ａｍｂｅｒｓｏｒｂ　５６４」、「Ａｍｂｅｒｓｏｒｂ　５７２」、「Ａｍｂｅｒｓｏｒｂ　５７５」、「Ａｍｂｅｒｓｏｒｂ　３４８Ｆ」）、ならびに、Ａｍｏｃｏ（「ＰＸ−２１」）、Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ（「ＡＸ−２１」および「Ｓｕｐｅｒ　ＡＸ−２１」）、Ｃａｌｇｏｎ　Ｃａｒｂｏｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（「ＣａｌｇｏｎＭＳＣ−Ｖ」）、Ａｌｌｔｅｃｈ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（「Ｃａｒｂｏｓｐｈｅｒｅ」）、Ｔａｋｅｄａ（「５Ａ　Ｃａｒｂｏｎ」）、およびＴｏｋａｉ　Ｃａｒｂｏｎ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ（「ＴＯＫＡＢＬＡＣＫ」）から入手可能な炭素分子篩材などがある。本発明で有用な炭素分子篩を作製する方法を記載した参考文献としては、数ある中でも、Ｌａｆｙａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３０，８６５−８７３（１９９１）、日本特許公開公報第６１−１９１，５１０号（Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔ１０５：２２９２６４ｙに抄録）、Ｗｅｎｎｅｒｂｅｒｇらに付与された米国特許第４，０８２，６９４号、Ｍａｒｏｌｄｏらに付与された米国特許第４，８３９，３３１号、Ｎｅｅｌｙに付与された米国特許第４，０４０，９９０号、およびＳｕｆｔに付与された米国特許第４，５２８，２８１号などが挙げられ、これらの出版物の教示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００３８】
黒鉛化した活性炭を、任意に、また好ましくは、カラムで使用する前に加熱する。炭素を加熱する温度および時間の長さは、使用する具体的な材料によって異なるが、約１００℃、または約２００℃、または約２５０℃、または約３００℃、または約４００℃、または約５００℃、または約６００℃、または約７００℃、または約８００℃、または、当業者が決定できる、さらに高温であってもよい。この炭素は、約２００℃、または約２５０℃で処理することが好ましい。活性炭を１時間以上、または１日以上（たとえば、約１〜約１４日間、または約２１日間、または約３０日間）、または１週間以上（たとえば、約１週間、または約２週間、または約３週間、または約４週間）、または１カ月以上（たとえば、１カ月、または２カ月、または３カ月）または、当業者が決定できる、さらに長期間、加熱してもよい。好ましい実施形態では、炭素を約３０日間処理する。
【００３９】
１つの好ましい実施形態では、活性炭分子篩は、Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ（Ａｄｒｉａｎ，ＭＩ）から市販されている、活性炭ＡＸ−２１であり、使用前に、活性炭を約２００℃で約３０日間加熱することにより、処理する。別の好ましい実施形態では、活性炭分子篩は、ＵＣＡＲ　Ｃａｒｂｏｎ　Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，Ｏｈｉｏ）から市販されているＧＲＡＦＯＩＬ（登録商標）の等級ＴＧ−４０７可撓性グラファイト粉末である。この実施形態では、ＧＲＡＦＯＩＬ（登録商標）の粒子サイズは、約２０〜約４０μｍであることが好ましい。本発明で有用な他の炭素材料の場合と同様、ＧＲＡＦＯＩＬ（登録商標）は、使用前に加熱してもよく、加熱しなくてもよい。
【００４０】
ＸＣＡＲＢカラムは、平面状であり且つＴＥＱ活性であるＰＣＤＨ化合物を特異的に保持する。サンプルをカラムと接触させた後、カラムを有機溶剤（たとえば、ヘキサン）で洗浄することが好ましい。１つの実施形態では、「ダイオキシン／フラン分画」を得るために、少量の有機溶剤、たとえば、トルエンで、ダイオキシンおよびフランＰＣＤＨ化合物類（たとえば、ＰＣＤＤ類およびＰＣＤＦ類）をカラムから溶離させる。「ＰＣＢ分画」を得るために、別の有機溶剤、たとえば、ヘキサン中２５％のトルエンの溶液で、または、好ましくは、１０％のトルエン／１０％の酢酸エチル／８０％のヘキサンの溶液で溶離することにより、ＰＣＢ化合物をカラムから溶離することが可能である。ダイオキシン／フラン分画および／またはＰＣＢ分画は、さらなる分析のために、任意に乾燥させてもよい。
【００４１】
ＸＣＡＲＢカラムから溶離されたＰＣＢ分画およびダイオキシン／フラン分画は、当技術分野で既知の幾つかの方法のいずれか１つで、任意に、さらに精製、分離または濃縮してもよい。たとえば、ＥＰＡ　Ｍｅｔｈｏｄ　８２９０［高分解能ガスクロマトグラフィ／高分解能質量分析法（ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ）によるＰＣＤＤ類およびＰＣＤＦ類の分析］に記載されているアルミナ精製技術を使用して、ＸＣＡＲＢカラムから溶離された分画を精製することが可能である。
【００４２】
ＸＣＡＲＢカラムから溶離された（任意に、さらに精製した）分画を濃縮乾固し、ヘキサン等の有機溶剤に溶解してもよい。ある実施形態では、分画を濃縮乾固する前に、適量のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を試験管に加える。
【００４３】
次いで、複合混合物内のＰＨＤＨ型化合物を定量化するための幾つかの既知の方法の１つで、乾燥した分画を定量化することが可能である。このような定量化方法としては、ポリハロゲン化二環芳香族炭化水素をテストするための組換えバイオアッセイシステム、および、ポリ塩化二環芳香族炭化水素の場合には、ガスクロマトグラフィと電子捕獲検出法（ＧＣ／ＥＣＤ）による伝統的化学分析および高分解能ガスクロマトグラフィと高分解能質量分析法（ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ）による分析などがあるが、その限りではない。
【００４４】
好ましい実施形態では、定量化方法は、米国特許第５，８５４，０１０号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に記載の、ＣＡＬＵＸ（登録商標）システムとして知られるｉｎ　ｖｉｔｒｏバイオアッセイシステムであり、この方法は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにＣＲＬ−１２２８６の受託番号で寄託された組換え細胞系（「マウスＨ１Ｌ１．１細胞系」または「マウス肝癌Ｈ１Ｌ１．１細胞系」としても知られ、また、互換可能に呼ばれる）を使用する。本発明の好ましい実施形態では、発光酵素ホタル・ルシフェラーゼに関する遺伝子（またはそのコード領域）を含む、言い換えれば、アリール炭化水素受容体（Ａｈ受容体またはＡｈＲ）の転写促進（転写）の調節下にある、ベクター（たとえば、ｐＧｕｄＬｕｃ１．１ベクター）を、マウスＨ１Ｌ．１細胞系にしっかりトランスフェクトする。この組換え細胞系は、ポリハロゲン化二環芳香族炭化水素への曝露に対して、ルシフェラーゼの誘導で応答し、その基質の存在下で、細胞の応答に比例して、ルミネセンスシグナルを誘発する。所与のサンプルの応答を、（一例として）２，３，７，８−ＴＣＤＤ用量応答曲線（たとえば、Ｇａｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６，上掲；Ｍ．Ｈ．Ｚｉｃｃａｒｄｉ，ＴｏｘｉｃｏＬ　Ｓｃｉ．５４，１８３−１９３（２０００）参照）で得られるものと直接比較することによって、測定されたルミネセンスを、ＴＥＱ値に変換する。都合のよいことに、ＣＡＬＵＸ（登録商標）ｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞バイオアッセイは、たとえば、ポリ臭化化合物類および臭素化と塩素化とが混じった化合物等類の、ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳで容易に定量化されない化合物を含む、ＡｈＲおよびＡｈＲ依存性遺伝子発現を活性化することができる全ての化合物（すなわち、ＡｈＲ作動物質）を検出する。
【００４５】
要約すると、本発明は、環境サンプルから、ＰＨＤＨ類、さらに詳細には、ＰＣＤＨ類、なおいっそう詳細には、ＰＣＢ類、ダイオキシン類およびフラン類を吸収するのに有用である、特異的な、新規な吸収マトリクスの作製を含む。環境サンプルからの、ＰＨＤＨ類、詳細には、ＰＣＤＨ類、なおいっそう詳細には、ＰＣＢ類、ダイオキシン類およびフラン類のＴＥＱ活性の定量化を可能にする新規な吸収マトリクスを用いて、サンプル抽出物を調製するのに有用な方法論も記載する。
【００４６】
以下の実施例は、本発明を説明するために提供するものであって、本発明を制限するものと考えてはならない。以下の実施例において、ＰＣＢ類、ダイオキシン類およびフラン類の混合物は、Ａｃｃｕｓｔａｎｄａｒｄ（Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）から購入し、また、以下の化学化合物を含む。Ａ＝２，３，７，８−ＴＣＤＤ、Ｂ＝１，２，３，７，８−ＰｅＣＤＤ、Ｃ＝１，２，３，４，７，８ＨｘＣＤＤ、Ｄ＝１，２，３，６，７，８−ＨｘＣＤＤ、Ｅ＝１，２，３，７，８，９−ＨｘＣＤＤ、Ｆ＝１，２，３，４，６，７，８−ＨｐＣＤＤ、Ｇ＝１，２，３，４，６，７，８，９−ＯＣＤＤ、Ｈ＝２，３，７，８−ＴＣＤＦ、Ｉ＝１，２，３，７，８−ＰｅＣＤＦ、Ｊ＝２，３，４，７，８−ＰｅＣＤＦ、Ｋ＝１，２，３，４，７，８−ＨｘＣＤＦ、Ｌ＝１，２，３，６，７，８−ＨｘＣＤＦ、Ｍ＝１，２，３，７，８，９−ＨｘＣＤＦ、Ｎ＝２，３，４，６，７，８−ＨｘＤＣＦ、Ｏ＝１，２，３，４，６，７，８−ＨｐＣＤＦ、Ｐ＝１，２，３，４，７，８，９−ＨｐＣＤＦ、Ｑ＝１，２，３，４，６，７，８，９−ＯＣＤＦ。ＰＣＢ標準は、１＝３，３′，３，４′テトラクロロビフェニル、２＝２，３，４，４′，５ペンタクロロビフェニル、３＝２，３′，４，４′，５ペンタクロロビフェニル、４＝２，３，４，４′，５ペンタクロロビフェニル、５＝２，３，３′，４，４′ペンタクロロビフェニル、６＝３，３′，４，４′５ペンタクロロビフェニル、７＝２，３′，４，４′，５，５′ヘキサクロロビフェニル、８＝２，３，３′，４，４′，５ヘキサクロロビフェニル、９＝２，３，３′，４，４′，５′ヘキサクロロビフェニル、１１＝３，３′，４，４′，５，５′ヘキサクロロビフェニル、１３＝２，３，３′，４，４′，５，５′ヘプタクロロビフェニルを含んでいた。未知のサンプルおよびＧＣ／ＭＳデータは、Ｈｉｙｏｓｈｉ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（日本）により供給された。
【００４７】
［実施例１］
＜ＰＣＤＨ類単離用ＸＣＡＲＢアフィニティマトリクスカラムの作製＞
炭素ＡＸ−２１を、炉内で２００℃にて３０日間加熱することにより、吸着マトリクスを作製した。結果として得られた材料は、ＰＣＢ類、ポリハロゲン化ダイオキシン類およびフラン類を含む、ＰＣＤＨ類を特異的に吸着する。処理したＡＸ−２１を、１：９９の比率で、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）と混合して、本明細書で、「ＸＣＡＲＢ」と呼ぶ、特異的結合マトリクスまたはアフィニティマトリクスを作る。アフィニティカラムは、ガラスウールの栓を、カラムの端から７インチの位置まで、長さが１６インチあるガラスカラムに入れて詰めることにより、作製する。硫酸ナトリウム０．３ｃｃをカラムに加え、このカラムを静かにたたく。次いで、ＸＣＡＲＢ　０．７ｃｃをカラムに加え、このカラムを静かにたたく。さらに０．３ｃｃの硫酸ナトリウムをカラムに加え、炭素を静かにたたく。最後に、パッキング材料をカラム内に保持するガラスウールの栓を、パッキング材料に抗して静かに押す。次いで、ＸＣＡＲＢカラムを、アセトン５ｍｌ、トルエン２０ｍｌ、およびヘキサン１０ｍｌで順次洗浄する。
【００４８】
［実施例２］
＜ＰＣＤＨ類のＴＥＱを定量化するための、固体サンプルの調製＞
固体サンプルの塊をガラスバイアルに計り分ける。このサンプルの塊は、汚染性ＰＣＤＨ類の予想濃度によって異なるが、通常は、１〜５ｇのサンプルである。このサンプルに、トルエン中２０％のメタノール１０ｍｌを加える。このサンプルを、水浴中で５分間、超音波処理する。
【００４９】
回収目的で、サンプル抽出物を通過させるための、乾燥用カラムを作製する。この乾燥用カラムは、パッキング材料を保持するためにガラスウール栓を加えておいた２５ｍｌガラスカラムからなる。乾燥用カラムに加える第１のパッキング材料は、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）１ｃｃに続く、硫酸ナトリウム４．３ｃｃからなる。乾燥用カラムは、サンプル抽出物を回収する前に、ヘキサン３０ｍｌで洗浄する。
【００５０】
初回サンプル抽出物を、乾燥用カラムを通過させ、５０ｍｌ培養管または他の適当な回収容器内に回収する。このサンプルに、トルエン１０ｍｌをさらに加え、このサンプルを、水浴中で５分間、超音波処理する。第２回抽出混合物を乾燥用カラムに加え、初回抽出物と同じ容器内に回収する。
【００５１】
トルエン１０ｍｌでサンプルの第３回抽出を行い、水浴中で５分間、超音波処理し、この抽出物の上澄を、乾燥用カラムを通してクロマトグラフで分離し、最初の２抽出サンプルに加える。回収されたサンプル抽出物を、真空遠心分離で濃縮乾固し、ヘキサンに再溶解する。
【００５２】
［実施例３］
＜ＰＣＤＨ類のＴＥＱを定量化するための液体サンプルの調製＞
サンプル１〜５ｇを、５０ｍｌ遠沈管内に計り分ける。ＸＣＡＲＢ濾過したギ酸１ｍｌを加え、この溶液をかき混ぜ、次いで、１５分間静置させる。アセトン３０ｍｌをサンプルに加え、このサンプルをかき混ぜ、２分間静める。ヘキサン１０ｍｌをサンプルに加え、このサンプルをかき混ぜ、次いで、有機相と水相に分離させる（約１０分）。
【００５３】
回収目的で、サンプル抽出物を通過させるための、乾燥用カラムを作製する。この乾燥用カラムは、パッキング材料を保持するために、ガラスウール栓を加えておいた２５ｍｌガラスカラムからなる。乾燥用カラムに加える第１のパッキング材料は、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）１ｃｃに続く、硫酸ナトリウム４．３ｃｃからなる。乾燥用カラムは、サンプル抽出物を回収する前に、ヘキサン３０ｍｌで洗浄する。
【００５４】
上相を乾燥用カラムおよびに移し、乾燥用カラムを通過させ、５０ｍｌ遠沈管または他の適当な回収容器内に回収する。このサンプルに、トルエン１０ｍｌをさらに加え、振盪手順および抽出手順を繰返す。分離させた後、上相を除去し、乾燥用カラムを通過させる。ヘキサン１０ｍｌで、第３回用抽出手順を繰返し、乾燥用カラムを通過させるクロマトグラフィ後、最初の２抽出物と一緒にプールする。
【００５５】
［実施例４］
＜酸−シリカクロマトグラフィ＞
使用前に、濃硫酸を、１：２または３３重量％の比率で活性シリカゲルに加え、２４時間静置させることにより、酸被覆シリカゲルを調製する。この方式で調製した酸被覆シリカゲルは、一般に、３０日間有用である。酸被覆シリカゲルカラムは、１０ｍｌガラス乾燥用カラムに、ガラスウールの栓を入れ、硫酸ナトリウム１ｃｃを加え、この上に、酸被覆シリカゲル４．３３ｃｃ、および最後に、硫酸ナトリウム１ｃｃを載せる。カラムをヘキサン３０ｍｌで洗浄し、廃棄する。
【００５６】
実施例２および３に上述した方法で抽出されたサンプルを、ヘキサンに再溶解した後、勢いよく渦巻攪拌する。溶解したサンプルを酸シリカカラムに適用し、管をヘキサン２ｍｌで２回すすぎ、これもカラムに適用する。カラムから溶離される全材料を、５０ｍｌガラス遠沈管内に回収する。カラムを、ヘキサン１０ｍｌで２回溶離し、最初のカラム溶離物と一緒にプールする。このサンプルを、真空濃縮装置内で乾固し、以下の炭素カラム手順に使用するために保存する。
【００５７】
［実施例５］
＜ＸＣＡＲＢカラム手順＞
ヘキサン２ｍｌを加え、実施例４の酸被覆シリカゲルクロマトグラフィからのサンプル濃縮物と共に勢いよく渦巻攪拌する。このサンプルを、実施例１に記載の通りに作製したＸＣＡＲＢカラムに適用する。サンプル容器を、ヘキサン１ｍｌですすぎ、ヘキサン２ｍｌでさらに２回すすいで、カラムに適用する。次いで、このカラムを、最初にヘキサン５ｍｌで洗浄し、続いて、さらに５ｍｌのヘキサンで洗浄する。これらの洗浄液は、廃棄する。回収管（１６ｍｍガラス管）をカラムの下に置いて、ＰＣＢ類を含む分画を回収する。１０％のトルエン／１０％の酢酸エチル／８０％のヘキサンを含む溶液１５ｍｌでカラムをを溶離することより、ＰＣＢ類を溶離させる。ＰＣＢ分画を濃縮乾固して、ＣＡＬＵＸ（登録商標）分析用に調製した。別の回収管（５０ｍｌガラス管）をカラムの下に置いて、ダイオキシン／フラン材料を回収する。トルエン２０ｍｌで、ダイオキシン／フラン分画を溶離させる。サンプルを濃縮乾固して、ＣＡＬＵＸ（登録商標）分析およびルシフェラーゼ活性の誘導用に調製する。
【００５８】
［実施例６］
＜ＣＡＬＵＸ（登録商標）分析用サンプル濃縮物の調製＞
ＣＡＬＵＸ（登録商標）分析は、概して、以下の通りに実行される：上述の通り、細胞系マウス肝癌Ｈ１Ｌ．１に、アリール炭化水素受容体の転写促進調節下にある、ホタル・ルシフェラーゼに関する遺伝子を含むベクターをしっかりトランスフェクトする。Ｐ．Ｍ．Ｇａｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ　ａｌ，Ｆｕｎｄａｍ．Ａｐｐｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３０，１９４−２０３（１９９６）；Ｄｅｎｉｓｏｎらに付与された米国特許第５，８５４，０１０号（引用することにより、本明細書の一部をなすものとする）を参照されたい。関心のある化合物の段階希釈を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で作成する。細胞を投与する前に、ＤＭＳＯ溶液を、細胞培地中に懸濁し、この培地を、９６ウェル培養プレートで成長させた細胞の単層に加える。
【００５９】
サンプルのほかにも、ＴＣＤＤの標準曲線も分析する（１．５５×１０−９Ｍ　ＴＣＤＤで始まる２倍希釈シリーズ）。最適ルシフェラーゼ遺伝子発現を可能にするため、プレートを、一般に、加湿したＣ０２インキュベーター内で、３７℃にて約２０時間、インキュベートする。インキュベーション後、培地を除き、生存能力について、細胞を検鏡する。Ｐｒｏｍｅｇａ社（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのルシフェラーゼアッセイキットを使用して、ルシフェラーゼ活性の誘導を定量化する。
【００６０】
データ解析に関して、最大応答に達した各化合物の各濃度に関する応答は、一般に、少なくとも３回解析する。ベストフィットモデルである最小二乗法を使用して、用量応答シリーズに関するデータを、Ｈｉｌｌの式によって描かれるシグモイド曲線に当てはめる。
【００６１】
各化合物について、最大応答の値および最大応答の２０〜８０％（ＥＣ２０〜８０）と関連した濃度を、Ｈｉｌｌの式から決定する。両側ｓｔｕｄｅｎｔ　ｔ検定法とα＝０．０５を使用して、化合物のそれぞれの最大応答を、標準ＴＣＤＤの最大応答と比較する。
【００６２】
前述の一般的プロトコール、サンプル濃縮物または実施例５で作ったサンプル濃縮物の希釈物を、ヘキサン１ｍｌに溶解し、４ｍｌのＤＭＳＯを管に加える。真空遠心分離を使用して、サンプルを濃縮乾固する。ＲＰＭｌ　１６４０、８％のウシ胎仔血清を含む細胞培地０．４ｍｌを管に加える。サンプルを勢いよく渦巻攪拌し、我々の特許を得た組換え細胞の単層に適用する。この細胞を、２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンの標準曲線希釈物およびサンプルと共にインキュベートし、しっかりトランスフェクトされたレポーター遺伝子構築物から最高濃度のルシフェラーゼを誘導するようにインキュベートする。インキュベーション後、細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定する。標準２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシンで誘導されるルシフェラーゼ活性と比較することによって、処理サンプル中に含まれるＴＥＱ活性を定量化する。
【００６３】
［実施例７］
＜結果の解析＞
図２は、ガスクロマトグラフィおよび電子捕獲検出で得られた、ＰＣＢ類およびダイオキシン類およびフラン類の代表的な混合物のクロマトグラムプロフィールを示す図である。この全混合物は、世界保健機構（ＷＨＯ）により毒性変換係数（ＴＥＦ）が指定されているＰＣＤＨ類の大部分を含む。これに対して、図３は、ガスクロマトグラフィおよび電子捕獲検出を使用した、混合物中のダイオキシン類およびフラン類のクロマトグラムプロフィールを示す図である。図３から欠けているピークは、ＰＣＢ類の混合物への寄与を表す。対照的に、図４は、ガスクロマトグラフィおよび電子捕獲検出を使用した、混合物中のＰＣＢ類のクロマトグラムプロフィールを示す図であり、このクロマトグラムから、ダイオキシン類およびフラン類に特有のピークが欠けている。
【００６４】
本発明の効果を示すために、上述の実施例に従って、ＰＣＤＨ類の代表的な混合物を、本発明のＸＣＡＲＢマトリクスを用いたクロマトグラフィで分離した。
【００６５】
図５は、吸着媒上に保持されなかった異性体のクロマトグラムである。クロマトグラム上のこれらのピークは、ＴＥＦ値を持たないＰＣＢ１７０および１８０を示す。図７は、ＸＣＡＲＢアフィニティカラムからのＰＣＢ類の選択的溶離のクロマトグラムであり、図４（ＰＣＢ類のクロマトグラム）とぴったり合う。しかし、ＸＣＡＲＢマトリクスで保持されなかったＰＣＢ１７０および１８０に関するピークが欠けている。
【００６６】
図６は、ＸＣＡＲＢマトリクスから溶離されたＰＣＢ類、ダイオキシン類およびフラン類を含む、ＰＣＤＨ類のクロマトグラムである。これらのデータから、ＸＣＡＲＢマトリクスは、ＰＣＤＨ類を保持することができ、また、本発明の方法は、このマトリクスから、これらのＰＣＤＨ異性体を定量的に回収できることが分かる。この材料および方法を、′０１０特許（ＣＡＬＵＸ（登録商標）システム）に記載の組換えバイオアッセイ手順と連結させて、環境マトリクス中のＰＣＤＨ類を検出するための高感度分析システムを実現することができる。
【００６７】
図８は、ＣＡＬＵＸ（登録商標）バイオアッセイと本発明の処理システムとを使用して定量化した土壌サンプルおよび灰サンプルのＴＥＱ活性と、高分解能ガスクロマトグラフィ／高分解能質量分析法を使用した定量化との相関関係を示す図である。結果は非常によく一致し、その相関係数は０．９４である。
【００６８】
図９は、ＣＡＬＵＸ（登録商標）バイオアッセイと本発明の処理システムとを使用して定量化した灰サンプルのＴＥＱ活性と、高分解能ガスクロマトグラフィ／高分解能質量分析法を使用した定量化との相関関係を示す図である。
【００６９】
図１０は、ＣＡＬＵＸ（登録商標）バイオアッセイと本発明の処理システムとを使用して定量化した灰サンプルのＴＥＱ活性と、高分解能ガスクロマトグラフィ／高分解能質量分析法を使用した定量化との相関関係を示す図である。
【００７０】
図１１は、ＣＡＬＵＸ（登録商標）バイオアッセイと本発明の処理システムとを使用して定量化した排ガスサンプルのＴＥＱ活性と、高分解能ガスクロマトグラフィ／高分解能質量分析法を使用した定量化との相関関係を示す図である。以上のデータから、ＣＡＬＵＸ（登録商標）バイオアッセイと本発明の方法との組合せは、環境およびヒトの健康を守るために、危険性評価目的で、サンプルのＴＥＱ汚染に関するデータを提供するのに有用なことがわかる。
【００７１】
上述のものは、本発明を説明するものであって、本発明を制限するものと考えてはならない。本発明は、クレームと、中に含まれるべきクレームの均等物によって規定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
サンプル中に含まれる全多環芳香族炭化水素類／ＰＣＤＨ類を決定するためのサンプルを処理する総合手順、およびサンプル中の全ＰＣＤＨ類、ＰＣＢ類、およびダイオキシン類およびフラン類の個々の量を決定するための分離手順を示す概略図である。
【図２】
ガスクロマトグラフィおよび電子捕獲検出で測定した、ポリ塩化ビフェニルおよびポリ塩化ジベンゾダイオキシン類／フラン類の１つの被験混合物のクロマトグラフである。
【図３】
本発明の方法で処理する前に、図２における全混合物を作るのに使用された、ポリ塩化ジベンゾダイオキシン類の、ガスクロマトグラフィおよび電子捕獲検出法で測定したクロマトグラフである。
【図４】
本発明の方法で処理する前に、図２における全混合物を作るのに使用された、ポリ塩化ビフェニル類の、ガスクロマトグラフィおよび電子捕獲検出法で測定したクロマトグラフである。
【図５】
本発明のＸＣＡＲＢカラム吸着マトリクスで保持されなかったポリ塩化ビフェニル類の、ガスクロマトグラフィおよび電子捕獲検出法で測定したクロマトグラフである。
【図６】
全ＰＣＤＨを単離するために、本発明のＸＣＡＲＢカラム吸着マトリクスで保持し、溶離した、ポリ塩化ビフェニル類およびポリ塩化ジベンゾダイオキシン類／フラン類の、ガスクロマトグラフィおよび電子捕獲検出法で測定したクロマトグラフである。
【図７】
ＰＣＢに関して、本発明のＸＣＡＲＢカラム吸着マトリクスで選択的に保持し、続いて選択的に溶離した、ポリ塩化ビフェニル類の混合物の、ガスクロマトグラフィおよび電子捕獲検出法で測定したクロマトグラフである。
【図８】
土壌サンプルおよび灰サンプルに関して、ＴＥＱ活性の、ＣＡＬＵＸ（登録商標）ＴＥＱ測定と、ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ測定とを比較する相関データの、グラフによる表現である。
【図９】
灰サンプルに関して、ＴＥＱ活性の、ＣＡＬＵＸ（登録商標）ＴＥＱ測定と、ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ測定とを比較する相関データの、グラフによる表現である。
【図１０】
土壌サンプルに関して、ＴＥＱ活性の、ＣＡＬＵＸ（登録商標）ＴＥＱ測定と、ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ測定とを比較する相関データの、グラフによる表現である。
【図１１】
排ガスサンプルに関して、ＴＥＱ活性の、ＣＡＬＵＸ（登録商標）ＴＥＱ測定と、ＨＲＧＣ／ＨＲＭＳ測定とを比較する相関データの、グラフによる表現である。
【図１】
2004508539.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2004508539.tif 000012
【図１０】
2004508539.tif 000013
【図１１】
2004508539.tif 000014
【国際公開パンフレット】
2004508539.tif 000015
2004508539.tif 000016
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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