(57)【要約】本発明は、シンチレーション近接アッセイでの使用のための粒子に関する。特に、本発明は、サンプルの一酸化窒素シンターゼ活性を検出するためのシンチレーション近接アッセイでの使用のための粒子に関する。本発明はまた、シンチレーション近接アッセイでのこれらの粒子を使用する、サンプル中の一酸化窒素シンターゼ活性を測定する方法に関する。本発明はさらに、これらの粒子を使用して一酸化窒素シンターゼ活性のモジュレーターの存在を検出する方法に関する。
2004533820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シンチレーション近接アッセイでの使用のためのビーズであって、当該ビーズがシリカナノ粒子の被覆を有することを特徴とする、ビーズ。
【請求項２】
当該ビーズがリン光体粒子である、請求項１のビーズ。
【請求項３】
当該ビーズがセリウムイオンでドープされたイットリウム珪酸塩／エステル粒子またはユーロピウムでドープされたイットリウム酸化物である、請求項２のビーズ。
【請求項４】
当該ビーズが、標識されたアルギニンを、シトルリンに対して優先的に結合する、請求項１ないし３のいずれかのビーズ。
【請求項５】
サンプル中のＮＯシンターゼ活性を決定するための方法であって、
ａ）流体媒体中で混合物を形成すること、当該混合物は、試験すべきサンプル、および
ＮＯシンターゼの放射性標識された基質、を含む、
ｂ）当該混合物を、ＮＯシンターゼ活性を促進する条件下でインキュベートすること、
ｃ）当該混合物を、シリカナノ粒子で被覆された固相の存在下、放射性標識された基質の少なくとも一部が該固相と会合するようになるを生じる条件下でインキュベートすること、ここで当該固相はシンチラントを含む、および
ｄ）放射性標識された基質の、該固体表面への結合の量を検出すること、ここでＮＯシンターゼ酵素を欠くコントロールと比較したときの結合の減少は、ＮＯシンターゼ活性を指摘する、の工程を含む方法。
【請求項６】
該固相が請求項１ないし４のいずれかのビーズである、請求項５の方法。
【請求項７】
サンプル中のＮＯシンターゼ活性の阻害剤または増強剤を検出する方法であって
ａ）流体媒体中の混合物を形成すること、当該混合物は、
ＮＯシンターゼの阻害または活性化について試験すべき化合物、
ＮＯシンターゼの放射性標識された基質、および
ＮＯシンターゼ酵素を含む、
ｂ）当該混合物を、ＮＯシンターゼ活性を促進する条件下でインキュベートすること、
ｃ）当該混合物を、シリカナノ粒子で被覆された固相の存在下で、放射性標識された基質の少なくとも一部が該固相と会合するようになるのを生じる条件下でインキュベートすること、ここで当該固相はシンチラントを含む、および
ｄ）該放射性標識された基質の、該固体表面への結合の量を検出し、そして該結合の量を、該化合物を欠くコントロールと比較することの工程を含む方法。
【請求項８】
シリカナノ粒子の被覆を有するＳＰＡ粒子を含む、サンプル中のＮＯシンターゼ活性を決定するための試験キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シンチレーション近接アッセイにおける使用のための粒子に関する。特に、本発明は、サンプル中のＮＯシンターゼ活性を検出するためのシンチレーション近接アッセイにおける使用のための粒子、およびＮＯシンターゼ活性を決定するためまたはサンプル中のＮＯシンターゼ活性の阻害剤または増強剤の存在を検出するための方法に関する。
【０００２】
一酸化窒素は、細胞内で作用する、または細胞膜を貫通し隣接細胞に影響することによって、神経および免疫系での主要なシグナル伝達分子である（Cell 1994, 78, 919）。それは重要な治療的標的を形成し、なぜならそれは種々の生理学的プロセスに関係するからである。結果として、多くの科学的分野に関係する、強いおよび広範の調査を刺激した。ＮＯの阻害剤は、ショック、炎症、発作、および糖尿病を駆除するため調査中であり、一方ＮＯ供与体または前駆体（例えばＬ−アルギニン）は、血管疾患、高血圧、血管攣縮性疾患、ＧＩおよび尿生殖器的問題、肺高血圧および気管支喘息の処置のため有用であることがわかる（Ariggard E. Lance. 1994;343:1199-1206）。ＮＯはまた、パーキンソン（Nat Med 1996:2(9);1017-21）およびアルツハイマー病（Soc Neurosci Abstr 1995; 21:1010）関係した。
【０００３】
ＮＯは、酵素一酸化窒素シンターゼ（ＮＯシンターゼ）によって触媒される反応において、シトルリンおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を形成する、中間体、Ｌ−ＮＧ−ヒドロキシアルギニンを介するアルギニンの酸化によって形成される。該反応は、いくつかの共因子、例えばフラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（還元型）（ＮＡＤＰＨ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）およびビオプテリンを要する（Reutov et al., Biochemistry(Moscow)1998:63,(7);874-1029）。ＮＯの重要性の観点から、ＮＯシンターゼは、可能な薬物標的として長く認識された。
【０００４】
ＮＯシンターゼ活性を測定するための現行の方法は、クロマトグラフィー的技法、例えばカチオン交換ＨＰＬＣ／Ｄｏｗｅｘカラム（Knowles and Salter, Methods in Molecular Biology, Vol 100, Nitric acid protocols, ed M.A.Titheradge）、またはセルロースまたはシリカゲルを使用する薄層クロマトグラフィーを使用して基質と生成物を分離し、そしてこれらの相対量を測定することに関係する。利用可能な他の方法は、放射性標識したアルギニンに基づき、そして使用するアッセイであるが、これらのアッセイはまた分離工程に関係する。
【０００５】
代替的技法は、ＮＯを間接的に測定する。例えば、生理学的条件下、ＮＯを亜硝酸塩／エステルおよび硝酸塩／エステルに酸化する。亜硝酸塩／エステルの形成を、比色分析で検出でき、これらはＧｒｉｅｓｓ試薬と反応し、５３８ｎｍの吸光度によって監視できる紫色アゾ誘導体を形成するからである（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987,84,9265）。同様に、硝酸塩／エステルの形成を、Ｇｒｉｅｓｓ試薬での反応に先立ち硝酸塩／エステルレダクターゼを使用する亜硝酸塩／エステルへの還元によって定量し得る。
【０００６】
ゲノミクスおよびコンビナトリアル化学の最近の発展は、多数の新しい薬物標的および新しい化合物を生じた。結果において、薬物発見の前進は、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）技法および小型化に焦点があった。これらの技法は、多数（典型的には、製薬会社はそれぞれ、２０００００と２百万の間の化学物質を使用して年あたり近似的に２０ハイスループットスクリーニングを実施する）の候補薬物標的または新しい化合物のいずれかを、短時間に新しいリードを取り出すためにスクリーニングすることを目的とする（High-throughput screening for drug discovery, James R. Broach and Jeremy Thormer, Nature Vol. 384, Supp, 7 November 1996, 14-16）。そのようなＨＴＳ技法の成功のために重要なのは、小型化形式に適合できる、かつエラーを減少し自動化スクリーニングプロセスを容易化するため最小数の工程のみを有するアッセイの開発である。
【０００７】
ＮＯシンターゼ活性を測定するための現行の多重工程手法、特にクロマトグラフィーカラムに関係するものは、自動化するのが困難で、かつ多数のサンプルについて同時的に実施するのが不便である。よって、現在まで、ＮＯシンターゼ活性についての、またはこの活性の増強剤または阻害剤として作用し得る化合物についてのスクリーニングのため利用可能なＨＴＳ技法は作成されていない。
【０００８】
最近、均質(homogeneous)技法に基づくアッセイが開発され、そしてこれらはＨＴＳに容易に適合可能である。これらは、固相結合工程を介する検出に関係できる。１例は、均質放射性免疫アッセイ技法であって、注目すべきは米国特許４５６８６４９によって包含されるシンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）の技法の導入であった。シンチレーション近接アッセイは、近年広い受容を得た放射性同位体的アッセイ技法であり、そして放射−リガンド結合アッセイ、タンパク質結合アッセイおよび酵素アッセイに適用可能である。該技法は、放射性同位体から放射されるβ−粒子が、エネルギーが消散する前に、水性環境中を限定された距離のみ移動するという観察（チタニウムβ−粒子の場合、これは近似的に１．５μｍである）に基づく。ＳＰＡは、例えばレセプター結合アッセイに適用され、ここで該シンチラント粒子、すなわちポリスチレンＰＶＴを含有する有機シンチラント材料またはリン光体粒子が、捕捉部分例えばレセプタータンパク質または結合タンパク質例えばプロテインＡで被覆されている。試験すべき化合物を含むまたは含むと疑われるサンプルを、ある量の放射性標識されたリガンドといっしょに、シンチラント粒子の存在下インキュベートする。そのリガンドの、そのレセプターへの結合は、放射性同位体的に標識された分子を、ミクロスフェアとの緊密な近接をもたらし、シンチラントヘ効率的に送達されるべきβ−粒子エネルギーを生じ、それによって光の放射を生じる。溶液中遊離のままである標識された分子は検出されず、なぜならこれらは固相からあまりに遠いからである。該アッセイはしたがって、分離工程を要せず、そして該プロトコルは、慣行の、すなわち分離に基づくアッセイと比較してより少ないピペッティング工程を有する。
【０００９】
ＳＰＡに基づくアッセイにおいて、伝統的な分離に基づくアッセイと比較してアッセイ正確性および再現性の増加がしばしばあることが示された。もうひとつの有利性は、増加したサンプルスループットのための潜在性および自動化のための許容性にある（Cook, N. D., Drug Discovery Today (1996), 1, 287-294）。ＳＰＡの適用は、特定の検体に、または分子の型に限定されず、そして原則として該技法を、伝統的な分離に基づくアッセイに適用できる。ＳＰＡ結果を、標準的マイクロプレートシンチレーションカウンターを使用して９６および３８４ウェルプレートで、またはＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ（登録商標）（Amersham Pharmacia Biotech）Homogeneous Imaging System, Imagging Systemを使用して３８４またはより高いウェル密度プレートで読むことができる(Imaging Proximity Assay-The LEADseeker(登録商標)Homogeneous Imaging System, Imaging System,Fowler, A. et al.,Genetic Engineering News, Volume 18, Number 21, November 21, November 15, 1998)。ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ（登録商標）システムは、単一通過で高密度ミクロプレートの画像化を可能とするＣＣＤカメラを特徴とする。
【００１０】
本発明は、ＮＯシンターゼ活性の決定のためのＳＰＡに基づく技法のため特に適する新型のビーズを提供する。これらのビーズおよびそのようなアッセイでのこれらの使用は、分離段階を要しない均質システムを提供し、こうしてＮＯ代謝のための治療的標的についての１次的スクリーニングにおけるＮＯシンターゼの阻害剤または活性剤についての化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニングを可能とする。「ヒット」のためのスクリーニングに加えて、動力学的分析をまた実施し得る。
【００１１】
本発明はよって、第１側面で、シンチレーション近接アッセイでの使用のためのビーズを提供し、当該ビーズはシリカナノ粒子の被覆を有することを特徴とする。
【００１２】
好適には、当該ビーズは、リン光体粒子、特にイットリウム珪酸塩／エステル粒子であって、セリウムイオンでドープされたもの、またはユーロピウムでドープされたあるイットリウム酸化物粒子である。他の好適な粒子は、ＰＣＴ出願ＷＯ９９／０９４１５に記載されるような画像化適用のため有用なものを含む。リン光体は好ましくは、範囲５００ｎｍないし９００ｎｍの放射最大を有し、そして一般に、活性化剤でドープされた無機宿主材料からなる。宿主材料の例は、イットリウム珪酸塩／エステル、イットリウム酸化物、イットリウムオキシ硫化物、イットリウムアルミニウムガリウム酸化物（ＹＡＧ）、イットリウムアルミニウムガーネット、ナトリウムイットリウムフッ化物（ＮａＹＦ４）ランタンフッ化物、ランタンオキシ硫化物、イットリウムフッ化物（ＹＦ３）、イットリウム没食子酸塩／エステル、ガドリウムフッ化物（ＧｄＦ３）、バリウムイットリウムフッ化物（ＢａＹＦ５）またはＢａＹ２Ｆ８）、ガドリニウムオキシ硫化物、珪酸亜鉛、硫化亜鉛、およびイットリウムパナジウム酸塩／エステルを含む。活性剤は一般に、ランタニドまたはアクチニド部分であり、そして好ましくはテルビウム、ユーロピウム、エルビウム、ツリウム、ホルミウム、ジスプロシウム、サマリウム、イッテルビウム、ルテシウム、ガドリニウム、ウラニウムおよびウラニルＵＯ２であって、一般に＋２または＋３イオンの形態であるものである。他の好適なリン光体は、カンタニドまたはアクチニド遷移金属の有機キレート化合物、例えばＥＰ５５６００５に開示のようなイミドホスホランである。
【００１３】
１実施態様では、当該ビーズを、被覆物質で被覆し得、そしてシリカナノ粒子のさらなる被覆を有する。好適な被覆物質は、タンパク質例えばストレプトアビジンまたはオリゴ糖類例えばデキストランまたはアガロースを含むポリマー性種を含む。
好ましい実施態様では、当該ビーズは、標識されたアルギニンを、シトルリンと比べて優先的に結合させる。
【００１４】
本発明の第２側面では、サンプル中のＮＯシンターゼ活性を決定するための方法であって、
ａ）流体媒体中で混合物を形成すること、当該混合物は、
試験すべきサンプル、および
ＮＯシンターゼの放射性標識された基質、を含む、
ｂ）当該混合物を、ＮＯシンターゼ活性を促進する条件下でインキュベートすること、
ｃ）当該混合物を、シリカナノ粒子で被覆された固相の存在下、放射性標識された基質の少なくとも一部が該固相と会合することになるのを生じる条件下でインキュベートすること、ここで当該固相はシンチラントを含む、
ｄ）該放射性標識された基質の、該固体表面ヘの結合の量を検出すること、ここで該ＮＯシンターゼ酵素を欠くコントロールと比較したときの結合の減少は、ＮＯシンターゼ活性を指摘する、の工程を含む方法を提供する。
【００１５】
好ましくは、該固相は、シンチレーション近接アッセイでの使用のためのビーズであって、当該ビーズが本発明の第１側面にしたがうシリカナノ粒子の被覆を有することを特徴とする。１実施態様では、該ビーズは、シンチラントを含むビーズまたは粒子である。特に好ましい実施態様では、該ビーズは、リン光体粒子である。
【００１６】
代替的実施態様では、固相は表面の形態をとりえ、ここで該シンチラント、例えばリン光体は、予め形成された表面上に適用される被覆として存在し、またはビーズまたは表面の一部に分散し、または構成しまたは形成し得る。この実施態様では、該固相は好適には、有機ポリマー、例えばプラスチックまたはポリマー性材料、例えばポリスチレン、ポリビニルトルエンおよびポリアクリルアミドを含み、そして該シンチラント、例えばリン光体を固相の該表面上に被覆し、またはマトリクスに組みこみ得る。該固相は比較的大きくてよい、例えばアッセイ容器の表面、例えばマイクロウェルプレート、好ましくはＣｙｔｏｓｔａｒ（登録商標）(Amersham Pharmacia Biotech)プレートまたはＦｌａｓｈｐｌａｔｅ（登録商標）（ＮＥＮ）のウェルの基材または壁。
【００１７】
本発明の第３側面では、サンプル中のＮＯシンターゼ活性の阻害剤または増強剤を検出するための方法であって、
ａ）流体媒体中で混合物を形成すること、当該混合物は、
ＮＯシンターゼの阻害または活性化について試験すべき化合物
ＮＯシンターゼの放射性標識された基質、および
ＮＯシンターゼ酵素、を含む
ｂ）当該混合物を、ＮＯシンターゼ活性を促進する条件下でインキュベートすること、
ｃ）当該混合物を、シリカナノ粒子で被覆された固相の存在下、放射性標識された基質の少なくとも一部が該固相と会合するようになるのを引き起こす条件下でインキュベートすること、ここで当該固相はシンチラントを含む、および
ｄ）該放射性標識された基質の、該固体表面への結合の量を検出し、そして該化合物を欠くコントロールに対する結合の量を比較すること、の工程を含む方法を提供する。
もし化合物が阻害剤として作用するならば、酵素のみを含むサンプルと比較して、該放射性標識された基質の結合のより高いレベルが検出される。
【００１８】
本発明の第２または第３側面に従うアッセイ方法は好ましくは、多重ウェルプレート、例えば２４、９６、３８４またはより高密度のウェル、たとえば８６４または１５３６ウェルを有するマイクロプレートのウェル中で実施する。典型的なアッセイでは、該酵素（および、可能なら試験化合物）を含むサンプルを、流体媒体において、放射性標識された基質およびシンチラント粒子と混合する。この混合物を次いで、該放射性標識された基質の変換を生じるＮＯシンターゼ活性を促進する条件下でインキュベートする。ＮＯシンターゼ活性の生成物へ変換されない放射性標識された基質は、該ビーズに結合しそして、こうして放射性標識された基質によって放射される放射活性エネルギーをもたらすシンチラント表面ヘの、十分に近接して接近し、該シンチラントを活性化し、そして該シンチラントに光を放射させる。
【００１９】
該固体表面は、放射性標識された基質は、該生成物と比べて優先的に結合するから、結合した放射性標識された基質の量は、ＮＯシンターゼ活性の程度に依存する。生産された光の強度は、放射性標識された、結合されたリガンドの量に直接的に関連し、そしてしたがってＮＯシンターゼ活性の量に反比例的である。
【００２０】
放射性標識された基質は好ましくは、放射性標識されたアルギニンである。ＮＯシンターゼ活性は、アルギニンをシトルリンに変換する。好適には、放射性標識は、β粒子または、水性媒体中で１５０μｍまでの平均自由経路（free path）を有するＡｕｇｅｒ電子を放射するものである。これらは生化学的および分子生物学的適量での共通に使用される同位体、例えば３Ｈ、１４Ｃおよび１２５Ｉを含む。
【００２１】
アッセイ試験サンプルは一般に、水性液体例えばバッファー溶液中である。本発明のでの使用のための好適なバッファーは、５０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．４、そして他の生理学的食塩水溶液例えばＫｒｅｂｓ−Ｒｉｎｇｅｒ、ＨａｎｋｓまたはＤｕｌｂｅｃｃｏ培地を含む。
【００２２】
好適な検出技法は、シンチラント粒子の性質に依存する；ビーズ例えばＹＳｉ粒子を使用するとき、検出工程は、カウンティング技法によって実施し得る（例えば液体シンチレーションカウンター、またはルミノメーター）。リン光体ビーズ例えばＹｏｘ粒子を、電荷結合素子（ＣＣＤ）イメージャー（スキャニングイメージャーまたはエリアイメージャーのような）の手段によって検出し、多重ウェルプレートのウェルのすべてを画像化する。ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ（登録商標）システムは、単一通過での高密度マイクロプレートのが増加を可能とするＣＣＤカメラを特徴とする。これを放射性活性、蛍光性かつ発光性形式でのアッセイを読むことのために使用できる。画像化は、定量的かつ急速であり、そして画像化適用のため好適な装置はいま、多重ウェルプレートの全体を同時的に画像化できる。
【００２３】
本発明の第４側面では、サンプル中のＮＯシンターゼ活性の決定のための試験キットを提供し、該キットは、シリカナノ粒子の被覆を有するＳＰＡビーズを含む。
【００２４】
１実施態様では、キットは追加的に、放射性標識された基質、例えば放射性標識されたアルギニン（例えば３Ｈ  Ａｒｇまたは１４Ｃ  Ａｒｇ）を含み得る。もう１つの実施態様では、キットはさらに、ＮＯシンターゼ活性に好適なバッファーを含み得る。
明確のために、本発明のある種の実施態様をここで、以下の図を参照で例の目的によって記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、種々の源由来のｉＮＯＳ酵素の活性を示す。
【図２】図２は、インキュベーション時間の、ｉＮＯＳ活性に及ぼす影響を示す。
【図３】図３は、温度の、ｉＮＯＳ活性に及ぼす影響を示す。
【図４】図４は、非標識アルギニン濃度の、１０００００ｃｐｍでのｉＮＯＳ活性に及ぼす影響を示す。
【図５】図５は、非標識アルギニン濃度の、２０００００ｃｐｍでのｉＮＯＳ活性へ及ぼす影響を示す。
【図６】図６は、ビーズ濃度の、ｉＮＯＳ活性へ及ぼす影響を示す。
【図７】図７は、非標識アルギニン濃度の、ＳＭＴへのｉＮＯＳ応答に及ぼす影響を示す。
【図８】図８は、ＮＯＳ阻害剤アミノグアニジンを使用するＳＰＡ競合データを示す。
【図９】図９は、ＮＯＳ阻害剤２−エチル−２−チオ偽尿素ヒドロブロミド（Ｓｅｉｔｕ）を使用するＳＰＡ競合データを示す。
【図１０】図１０は、ｉＮＯＳシンチレーション近接アッセイを使用するＫｍ分析を示す。
【図１１】図１１は、Ｄｏｗｅｘイオン交換法を使用するＫｍ分析を示す。
【図１２】図１２は、ｉＮＯＳ  ＳＰＡを使用するＬＯＰＡＣライブラリースクリーニング結果を示す。
【図１３】図１３は、Ｄｏｗｅｘ分離を使用するＬＯＰＡＣスクリーニング結果を示す。
【００２６】
実施例１
シリカ表面での粒子の被覆
１０ｇのＹｏｘ（酸化イットリウム；赤色光を放射するＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ（登録商標）近接粒子）またはＹＳｉ（セリウムでドープしたイットリウム珪酸塩／エステル；青色光を放射するＳＰＡ粒子）を、５０ｍｌ管中で２９．４ｍｌのエタノール＋０．６ｍｌのＨ２Ｏ中で混合した。０．４ｍｌのアンモニア（Ｈ２Ｏ中３５％ｗｔ）、次いで１ｍｌのテトラエチルオルトシリケートを添加した。管をパラフィルムでシールし、そして環境温度で５時間転がす。さらなる０．２ｍｌのＨ２Ｏと１ｍｌのテトラエチルオルトシリケートをそれぞれの管に添加し、そして混合物を終夜室温で転がしてインキュベートした。
【００２７】
ビーズを４８００ｘｇで５分間遠心分離によってペレット化し、そして上清を廃棄した。Ｈ２Ｏでの３回洗浄を、ビーズの、５０ｍｌのＨ２Ｏ中の最終再懸濁に先立ち実施し、そして＋４℃で貯蔵した。
【００２８】
実施例２
１４Ｃ標識アルギニンの、１４Ｃ標識シトルリンの存在下での選択的捕捉
１４Ｃ標識したアルギニンおよび１４Ｃシトルリンの捕捉を、５０μｌの総体積の３８４ウェルプレートを使用して決定した。水中で作成された、５００００ｃｐｍの１４Ｃアルギニン（APBiotech, CFB63, 300mCi/mMol ストック溶液）またはシトルリン（MEN, NEC214, 57.8mCi/mmol)を、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１．０ｍＭのＮＡＤＰＨ、２．９ｍＭのＤＴＴ，３．８μＭのＦＭＮ、ＦＡＤ、およびビオプテロンを含む反応バッファーに添加した。「停止」試薬、ＥＤＴＡ／アミノグアニジンを、それぞれ４ｍＭおよび８９μＭの最終濃度に添加した。ビーズ（水中１００ｍｇ／ｍｌ）を添加し０．１ｍｇ／ウェルを与えた。プレートを室温でインキュベートした。プレートを、使用したリン光体粒子に依存して、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（登録商標）(Packard)(ＹＳｉ−ＳＰＡビーズ）またはＬＡＥＤｓｅｅｋｅｒ（登録商標）Generation II装置（Yoxビーズ）を使用してカウントした。
【００２９】
ＳＰＡ結果
プレートを室温の終夜インキュベーション後ＴｏｐＣｏｕｎｔを使用してカウントした。結果を表１に示す。
【表１】2004533820.tif 000003
【００３０】
ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ（登録商標）結果
プレートを、同時平均化しつつ、２分間画像化した。同時平均化は、データからの重大なノイズ事象を排除するための方法であり、そして同じ曝露を使用して獲得した画像のある数を使用する。他の曝露での対応するピクセルから決定された値によって異なるピクセルは無視する。
【００３１】
同時平均化は、重大なノイズを除去するため同じ曝露を使用する画像のある数を使用する一方、ある程度の同時平均化(Q-coincident)は、非同等曝露時間であって、実際のデータ画像よりも短いものを使用し、重大なノイズを同定しそして除去する。より短い曝露は通常、画像曝露時間の１０分の１であり、アルゴリズムは次いで、減少された曝露時間について補正する。
【００３２】
３ｘ３ビンニング（binning）を使用した。ビンイングは、ＣＣＤ（荷電結合素子）読み出し中に隣接ピクセルからの荷電バケットを合わせるプロセスである。３ｘ３ビンニングを一般に、３８４ウェルプレートと使用し、そして９ピクセルのアレイの組み合わせである。
プレートを、終夜インキュベーション後画像化した。結果を表２に示す。これらは、両方の調製された新しい粒子が、シトルリンについて選択的にアルギニンを捕捉することを示す。
【００３３】
実施例３
酵素アッセイ−種々の源からのｉＮＯＳの活性
実験を実施し、Oxis Research(Catalogue Number27513)およびCayman Chemical Company(Catalogue Number 60864 and 60862)によって供給された種々のｉＮＯＳ酵素の間の変異を決定した。反応を、反応バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓｐＨ７．５であって、１．０ｍＭのＮＡＤＰＨ、３．８μＭのＦＭＮ、３．８μＭのＦＡＤ、３．８μＭのビオプテリン、２．９ｍＭのジチオスレイトールを含む）、２μＭのＬ−アルギニン、および１０００００ｃｐｍの３Ｈアルギニン（反応バッファー中で希釈された）中の、０．０３８単位／ウェルに均等な１０μｌのそれぞれの酵素を使用して実施した。プレート（Costar3705)を、室温で４０分間インキュベートし、そして反応を、「停止」バッファー（５０ｍＭのＮａＯＨ）中の２０μｌのアルギニン結合ビーズ（５０ｍｇ／ｍｌ）の添加によって種々の時間間隔で終結させた。結果をＴｏｐＣｏｕｎｔ（ウェルあたり１分）を使用して読んだ。
図１は、この実験の結果を示し、それからそれぞれの酵素の活性の間にいくつかの変異があることを見ることができる。
【００３４】
実施例４
酵素アッセイ−ｐＨおよび時間従属関係
開発作業を実行し、時間およびｐＨの、酵素反応の効率に及ぼす影響を確認した。反応条件およびデータ測定を、０．０３８単位／ウェルに同等な、１０μＬのｉＮＯＳ（Cayman Chemical Company, Catalogue Number 60864)酵素を使用し、前記実施例３の通りであった。
図２は、該アッセイの、酵素インキュベーションの期間への線形応答を示す。
酵素の最適ｐＨは、ｐＨ７．５であるものと見出された（結果示さず）。
【００３５】
実施例５
酵素アッセイ−温度の影響
実験を実施し、酵素アッセイを実施するための最適温度を決定した。アッセイ条件およびデータ収集を、実施例４に記載のとおりであり、該アッセイを、１０℃、２０℃、３０℃、３７℃および４５℃で実施した。
結果を図３に示し、それから温度は、２０−４５℃の範囲の温度で酵素活性には顕著な効果を有しないことを見出すことができる。
【００３６】
実施例６
酵素アッセイ−標識濃度の影響
実験を実施し、標識濃度の、非標識アルギニン濃度（０、２、４、８、１６μＭ）の範囲の酵素活性に及ぼす影響を決定した。アッセイ条件およびデータ収集を、実施例４に本質的に記載のとおりであり、アッセイを１０００００ｃｐｍおよび２０００００ｃｐｍ３Ｈを使用して実施した。
これらの実験の結果を、図４と５に見出すことができる。よい感度が、１０００００ｃｐｍ３Ｈおよび２μＭの非標識アルギニンを使用して見出された。
【００３７】
実施例７
酵素アッセイ−ビーズ濃度の影響
ビーズ濃度の影響を決定するための研究を、１ｍｇビーズ／ウェルまたは１．５ｍｇビーズ／ウェルを使用して実施した（その他のアッセイ条件は、前記実施例４の通りである）。既知のＮＯＳ阻害剤ＬＮＭＭＡ（ＮＧ−メチル−Ｌ−アルギニン（Sigma Aldrich Inc., Catalogue Number M-7033)の影響を、前記実施例４に記載のアッセイ条件を使用して調査した。
結果は、より多いビーズを添加することは、得られるｃｐｍを増加させるが、阻害曲線の形状は本質的に変化しないままであることを指摘する（図６）。
【００３８】
実施例８
酵素アッセイ−アッセイ体積
５０μｌまでのアッセイ体積を、実施例６に記載の方法を使用して調査した。結果は示さないが、データは変化可能であった。同様に、２０μｌより少ないまたはより多い停止堆積での結果はよくなく；最適結果は５０ｍＭのＮａＯＨの２０μｌで取得された。
【００３９】
実施例９
酵素アッセイ−溶媒の影響
試験阻害剤化合物を溶解するための、種々の溶媒を使用する影響を、前記実施例４に記載のアッセイ条件を使用して試験した。これらの実験からのデータを、表３ａ−ｃに示す。みられるように、阻害剤を溶解するために使用した溶媒の性質および濃度の両方は、アッセイの結果に影響できる。適当な「実験コントロール」をしたがってすべての実験で使用すべきである。
【００４０】
【表２】2004533820.tif 000004
【表３】2004533820.tif 000005
【００４１】
実施例１０
酵素アッセイ−プレート型の影響
いくつかの種々の３８４ウェルプレートを、アッセイへのそれらの影響について試験した。アッセイを実施例４に記載のとおり、種々のプレート型を使用して実施した。試験したプレートは：Costar3704(組織培養処理された、固体底)；Costar3705（非処理、固体底）；Costar3706（非処理、透明底）；Greiner781075（非処理、固体底）およびMatrix（利用可能なカタログナンバーなし、非処理、固体底）だった。
顕著な相違は、該アッセイから取得された結果においてこれらの種々のプレート型を使用したときに見出されなかった。
【００４２】
実施例１１
酵素アッセイ−非標識アルギニンの濃度
非標識アルギニンの濃度は、比較的低い（１００ｎＭ）ので、非標識アルギニンの種々の濃度の影響を、実施例４に記載のような、かつ０−８０μＭの濃度の範囲のＮＯＳ阻害剤ＳＭＴ（Ｓ−メチルイソチオ尿素、Siguma Aldrich Inc. M-3127）を含むアッセイ条件を使用して調査した。
図７に見られるように、２μＭをこえる非標識アルギニンの濃度は、アッセイの感度を変えた。
【００４３】
実施例１２
酵素アッセイ−競合実験Ｉ
シトルリンと比較されるアルギニンの優先的な捕捉は、シグナル減少アッセイで利用できる。該アッセイは、3074Costar384ウェルプレートで実施する。酵素（ｉＮＯＳマウスマクロファージ、組換え。カタログナンバー60864,112単位／ｍｌ）を、アッセイバッファー（５０ｍＭのＴＲＩＳｐＨ７．５中の１．２ｍＭのＮＡＤＰＨ、３．６ｍＭのＤＴＴ、４．８μＭのＦＡＤ、４．８μＭのＦＭＮ、４．８μＭのビオプテリン）中１０倍希釈する。希釈した酵素を（１０μｌ）、１０μｌ１４Ｃアルギニントレーサー（APBiotech, CFB63, １０μｌ中１０００００−１５００００ｃｐｍにアッセイバッファー中希釈した300mCi/mMolストック溶液）とともに１００％ＤＭＳＯ中に溶解した１．５μｌの阻害剤／アゴニストと室温で１時間インキュベートし、光から保護する。「停止」溶液（３６０μＭのアミノグアニジン、２０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８）中に１００ｍｇ／ｍｌに（すなわち１０μｌ＝１ｍｇ／ウェル）懸濁された１０μｌのＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒビーズを添加し、そして混合物を室温で少なくとも２時間インキュベートする。コントロール反応物を、阻害剤を、１．５μｌ水で置換することによって実施した。結果を、ＬＥＡＤｓｅｅｋｅｒ（登録商標）（2x2,Q coincidenceでbinnigおよび５分間画像化する）においてカウントすることによって読む。
【００４４】
図８は、用量応答曲線を示し、そしてアミノグアニジンによる酵素活性の阻害を実証する。図８は、アミノグアニジンについてのＩＣ５０値（酵素の５０％阻害によって表される）を約５００μＭとして示す。ベースラインを、１．５μｌの１ｍＭのアミノグアニジン（最終濃度７０μＭ）を使用して決定され、および１．５μｌの３０ｍＭのアミノグアニジン（最終濃度）を使用して最大応答。
【００４５】
実施例１３
酵素アッセイ−競合実験ＩＩ
実験を実施して、既知のＮＯＳ阻害剤ＳＥＩＴＵ（２−エチル−２−チオ偽尿素（thiopseudourea）ヒドロブロミド）の効果を調査した。アッセイ条件は、ある範囲の阻害剤濃度を使用する前記実施例４の記載のとおりであった。
３２ｎＭ（９５％信頼限界）のＩＣ５０値を、図９に示すグラフに基づいてＳＥＩＴＵについて取得した。
【００４６】
実施例１４
酵素アッセイ−Ｋｍ−決定
Ｋｍ分析を、前記実施例４に記載の標準的アッセイ条件を使用するアッセイで実施した。Ｋｍ分析をまた、Ｄｏｗｅｘ  ＡＧ−５０Ｘイオン交換クロマトグラフィー（Knowles and Salter, Methods in Molecular Biology, Vol 100, Nitric Acid Protocols, ed M. A. Titheradge）にしたがって実施した。
これらの実験の結果を、図１０および１１に示す。
【００４７】
実施例１５
酵素アッセイ−シグナル安定性
ＳＰＡシグナルの安定性を、１９０時間の期間にわたり評価した。プレートを、停止溶液の添加の２時間後読むことができる。その後、停止溶液の添加１６時間後まで、シグナルのわずかな増加がある。しかし、添加１６時間ないし１９０時間後、シグナルはかなり一定のままである。さらに、グラフの形状は、停止溶液の添加２時間ないし１９０時間後変化しない。
【００４８】
実施例１６
酵素アッセイ−スクリーニング研究
Sigma Aldrich Inc.(Product code SC001)からのＬＯＰＡＣライブラリーを、阻害剤活性についてスクリーニングした。該ライブラリーは、いくつかの既知のＮＯＳ阻害剤を含む、６４０種の種々の化合物からなる。
【００４９】
８プレートＬＯＰＡＣライブラリー（Sigma, Product Code SC001）を当初に、８個の９６ウェルミクロプレートないし２個の３８４ミクロプレートから再形成した。ストック化合物をＤＭＳＯで４ｍｇ／ｍｌに希釈した。３８４ウェル形式中で合わせ、これらをさらに、別のＤＭＳＯの添加によって、０．４ｍｇ／ｍｌに希釈した。
スクリーニング実験のために、１μｌアリコートのそれぞれの化合物を、２個のアッセイプレートのそれぞれに移動した。標準的ＮＯＳアッセイ成分を次いで、Beckman Multimek 96（０．０３８Ｕ／ウェルＮＯＳ酵素、〜１０００００ｃｐｍ[３Ｈ]Ｌ−アルギニン、バッファー中）を使用して添加した。反応物を、２０分間室温でインキュベートし、ついで、「停止」バッファー（５０ｍＭのＮａＯＨ中に懸濁された５０ｍｇ／ｍｌのＹＳｉビーズ）の添加によって終結させた。プレートをカウント（１分／ウェル、Wallac MicroBeta Trilux）前に室温で終夜インキュベートした。
【００５０】
結果を、Activity Baseデータプログラムで分析した。ヒットを、コントロールアッセイウェルで生成したｃｐｍレベルに基づいて恣意的なカットオフ数を取ることによって同定した。
これから、全部で２２個の「ヒット」を、プレート一から、およびプレート二から４２個同定した。
【００５１】
上１３個の化合物（最高のシグナルを与えるもの）を、この当初シグナル点スクリーニングから、前記概説基準によって定義のような潜在的ヒットとして同定した。該１３個の化合物をＳＰＡ形式を使用して３反復で、そして再び、シグナルを生成するためのＳＰＡビーズよりむしろＤｏｗｅｘ樹脂（Bio-Rad, 731-6213）分離を使用して２反復再試験した。アッセイ条件を、両方の二次的な試験実験（前記概説のような）で同定した。樹脂を、１ＭのＮａＯＨで洗浄することによってそのナトリウム形態に変換し、次いで水で中和した。これらの条件下で、アルギニンは樹脂に結合するが、アッセイ産物シトルリンは結合せず、こうしてｉＮＯＳの阻害は、この型のシグナル報告で減少されたカウントを生成する。
【００５２】
スクリーニングで同定された１３個のヒットのうち、８個はＬＯＰＡＣライブラリー中の既知阻害剤であった。
結果を図１２および１３に示す。
ＮＯＳ阻害剤として同定された化合物を表４に列挙する。
表４
【表４】2004533820.tif 000006
【図１】
2004533820.tif 000007
【図２】
2004533820.tif 000008
【図３】
2004533820.tif 000009
【図４】
2004533820.tif 000010
【図５】
2004533820.tif 000011
【図６】
2004533820.tif 000012
【図７】
2004533820.tif 000013
【図８】
2004533820.tif 000014
【図９】
2004533820.tif 000015
【図１０】
2004533820.tif 000016
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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2004533820.tif 000051
2004533820.tif 000052
2004533820.tif 000053
2004533820.tif 000054
【手続補正書】
【提出日】平成15年2月17日(2003.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトルリンと比べて優先的に、標識されたアルギニンを結合するための、シンチレーション近接アッセイでの使用のためのビーズであって、活性化剤でドープされた無機宿主材料を含むリン光体を含み、かつ当該ビーズがシリカナノ粒子の被覆を有することを特徴とする、ビーズ。
【請求項２】
当該リン光体がセリウムイオンでドープされたイットリウム珪酸塩／エステルまたはユーロピウムでドープされたイットリウム酸化物を含む、請求項１のビーズ。
【請求項３】
サンプル中のＮＯシンターゼ活性を決定するための方法であって、
ａ）流体媒体中で混合物を形成すること、当該混合物は、
試験すべきサンプル、および
ＮＯシンターゼの放射性標識された基質、を含む、
ｂ）当該混合物を、ＮＯシンターゼ活性を促進する条件下でインキュベートすること、
ｃ）当該混合物を、シリカナノ粒子で被覆された固相の存在下、放射性標識された基質の少なくとも一部が該固相と会合するようになるのを引き起こす条件下でインキュベートすること、ここで当該固相はシンチラントを含む、および
ｄ）放射性標識された基質の、該固体表面への結合の量を検出すること、ここでＮＯシンターゼ酵素を欠くコントロールと比較したときの結合の減少は、ＮＯシンターゼ活性を指摘する、の工程を含む方法。
【請求項４】
該固相が請求項１または２のいずれかのビーズである、請求項３の方法。
【請求項５】
サンプル中のＮＯシンターゼ活性の阻害剤または増強剤を検出する方法であって
ａ）流体媒体中で混合物を形成すること、当該混合物は、
ＮＯシンターゼの阻害または活性化について試験すべき化合物、
ＮＯシンターゼの放射性標識された基質、および
ＮＯシンターゼ酵素を含む、
ｂ）当該混合物を、ＮＯシンターゼ活性を促進する条件下でインキュベートすること、
ｃ）当該混合物を、シリカナノ粒子で被覆された固相の存在下で、放射性標識された基質の少なくとも一部が該固相と会合するようになるのを引き起こす条件下でインキュベートすること、ここで当該固相はシンチラントを含む、および
ｄ）該放射性標識された基質の、該固体表面への結合の量を検出し、そして該結合の量を、該化合物を欠くコントロールと比較することの工程を含む方法。
【請求項６】
該固相が、請求項１または２のいずれかのビーズである、請求項５の方法。
【請求項７】
請求項１または２のいずれかのＳＰＡビーズを含む、サンプルのＮＯシンターゼ活性を決定するための試験キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
本発明はよって、第１側面で、シトルリンと比べて優先的に、標識されたアルギニンを結合するためのシンチレーション近接アッセイであって、リン光体が活性化剤でドープされた無機宿主材料を含むリン光体を含む、アッセイでの使用のためのビーズを提供し、当該ビーズはシリカナノ粒子の被覆を有することを特徴とする。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
好適には、当該リン光体は特にイットリウム珪酸塩／エステルであって、セリウムイオンでドープされたもの、またはユーロピウムでドープされたイットリウム酸化物である。他の好適な粒子は、ＰＣＴ出願ＷＯ９９／０９４１５に記載されるような画像化適用のため有用なものを含む。リン光体は好ましくは、範囲５００ｎｍないし９００ｎｍの放射最大を有し、そして一般に、活性剤でドープされた無機宿主材料からなる。宿主材料の例は、イットリウム珪酸塩／エステル、イットリウム酸化物、イットリウムオキシ硫化物、イットリウムアルミニウムガリウム酸化物（ＹＡＧ）、イットリウムアルミニウムガーネット、ナトリウムイットリウムフッ化物（ＮａＹＦ４）ランタンフッ化物、ランタンオキシ硫化物、イットリウムフッ化物（ＹＦ３）、イットリウム没食子酸塩／エステル、ガドオリウムフッ化物（ＧｄＦ３）、バリウムイットリウムフッ化物（ＢａＹＦ５またはＢａＹ２Ｆ８）、ガドリニウムオキシ硫化物、珪酸亜鉛、硫化亜鉛、およびイットリウムパナジウム酸塩／エステルを含む。活性化剤は一般に、ランタニドまたはアクチニド部分であり、そして好ましくはテルビウム、ユーロピウム、エルビウム、ツリウム、ホルミウム、ジスプロシウム、サマリウム、イッテルビウム、ルテシウム、ガドリニウム、ウラニウムおよびウラニルＵＯ２であって、一般に＋２または＋３イオンの形態であるものである。他の好適なリン光体は、ランタニドまたはアクチニド遷移金属の有機キレート化合物、例えばＥＰ５５６００５に開示のようなイミドホスホランである。
ＵＳ６１０７３３７９は、ＳＰＡでの利用性を有するミクロスフェアの調製のための方法を開示する。該方法は、ポリマー性材料のミクロスフェアを被覆することに関係し、これは、シリカナノ粒子の１または２以上の層でその表面上に吸着された１または２以上の界面活性剤を有する。得られたミクロスフェアをさらに、それらの磁性特性を増強するため、そして種々の生物学的適用での使用のため修飾できる。
ＵＳ４２７８６５１は、リガンド結合アッセイでの使用のためのレセプター分子を支持するための固体支持体を記載する。該固体支持体は、レセプターとの連結のための少なくとも１つの官能基を含む水不溶性ポリマーを含む。該ポリマーを、外部多孔性被覆を形成するシリカ、アルミナまたはトリアミクロスフェアの層で覆われている非多孔性核（例えばガラス）からなる好適な基質に連結し得る。
一酸化窒素シンターゼ活性を測定するためのシンチレーション近接アッセイの例は、文献で既知である。これらのアッセイは、これらは結合パートナーの１つの表面固定化、例えばレセプタータンパク質を要する点で、ＳＰＡ技法での共通の問題に苦しむ。こうしてAlderton and Lowe（Biochem J., 1998, 332, 195-201）は、基質結合のための、付着された、中性一酸化窒素シンターゼのヘムを結合するドメインを有するＳＰＡビーズの使用を記載する。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
１実施態様では、当該ビーズは、被覆物質で被覆し得、そしてシリカナノ粒子のさらなる被覆を有する。好適な被覆物質は、タンパク質、例えばストレプトアビジンまたはオリゴ糖類、例えばデキストランまたはアガロースを含むポリマー性種を含む。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明の第４側面では、サンプル中のＮＯシンターゼ活性の決定のための試験キットを提供し、該キットは、本発明の第１側面のＳＰＡビーズを含む。




【国際調査報告】
2004533820.tif 000055
2004533820.tif 000056
2004533820.tif 000057
2004533820.tif 000058