(57)【要約】本発明は、ムチン合成を調節する方法、および疾患（例えば、喘息、慢性気管支炎、炎症性肺疾患、嚢胞性線維症および急性または慢性の呼吸器感染疾患ならびに慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））に関連するムチン過剰産生を制御する際の化合物の治療適用に関する。詳細には、本発明は、ムチンの産生によって特徴付けられる疾患を有する被験体の処置方法であって、該被験体におけるムチンの合成またはレベルを減少させる少なくとも１つの化合物を含む組成物の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法に関する。
2004507444.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムチンの産生によって特徴付けられる疾患を有する被験体の処置方法であって、該被験体におけるムチンの合成またはレベルを減少させる少なくとも１つの化合物を含む組成物の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記ムチン合成が、塩素イオンチャネル依存性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記化合物が、ＩＣＡＣＣ塩素イオンチャネルを発現する細胞におけるムチンの合成を減少させる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、アントラニル酸のアナログおよび誘導体、２−アミノ−ニコチン酸のアナログおよび誘導体、２−アミノ−フェニル酢酸のアナログおよび誘導体、ベンドロフルメチアジド、アミノキノリンのアナログおよび誘導体、それらの塩およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物が、タルニフルマート、フルフェナム酸、ニフルム酸、メフェナム酸、ベンドロフルメチアジド、Ｎ−（３−フルオロベンジル）−３−アミノキノリン、それらの塩、それらの誘導体およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物が、タルニフルマート、タルニフルマート誘導体、それらの塩またはそれらのプロドラッグを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物が、吸入によって投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物が、液体の形態である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、粉末の形態である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記液体が、エアゾール化されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、少なくとも１つの去痰薬、粘液溶解剤、抗生物質または鬱血除去剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記去痰薬が、グアイフェネシンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、少なくとも１つの安定剤、吸収増強剤または矯味矯臭剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記安定剤がシクロデキストランである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記吸収増強剤がキトサンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記疾患が、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性肺疾患、嚢胞性線維症および急性または慢性の感染性疾患からなる群より選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、吸入によって投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、吸入によって肺または鼻の通路へと投与される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＣＯＰＤが、気腫、慢性気管支炎および喘息からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
肺への吸入送達のために処方された治療組成物であって、タルニフルマート、フルフェナム酸、ニフルム酸、メフェナム酸、Ｎ−（３−フルオロベンジル）−３−アミノキノリン、それらの塩、それらの誘導体およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される少なくとも１つの化合物をムチンの産生またはレベルを減少させるのに有効な量で含む、治療組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、タルニフルマート、タルニフルマート誘導体、それらの塩またはそれらのプロドラッグを含む、請求項２０に記載の治療組成物。
【請求項２２】
前記組成物が、液体の形態である、請求項２０に記載の治療組成物。
【請求項２３】
前記組成物が、粉末の形態である、請求項２０に記載の治療組成物。
【請求項２４】
前記組成物が、少なくとも１つの去痰薬、粘液溶解剤、抗生物質または鬱血除去剤をさらに含む、請求項２０に記載の治療組成物。
【請求項２５】
前記去痰薬が、グアイフェネシンである、請求項２４に記載の治療組成物。
【請求項２６】
前記組成物が、少なくとも１つの安定剤、吸収増強剤または矯味矯臭剤をさらに含む、請求項２０に記載の治療組成物。
【請求項２７】
前記安定剤が、シクロデキストランである、請求項２６に記載の治療組成物。
【請求項２８】
前記吸収増強剤が、キトサンである、請求項２６に記載の治療組成物。
【請求項２９】
請求項２０〜２８のいずれか１項に記載の治療組成物を含む、吸入デバイス。
【請求項３０】
前記化合物が、タルニフルマートである、請求項５に記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物が、Ｎ−（３−フルオロベンジル）−３−アミノキノリン、その塩、その誘導体およびそのプロドラッグからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項３２】
前記化合物が、経口投与される、請求項４に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物が、経口投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ムチンの産生によって特徴付けられる疾患を有する被験体を処置する方法であって、該被験体におけるムチンの合成またはレベルを減少させ、そしてシクロオキシゲナーゼ酵素を阻害する少なくとも１つの化合物を含む組成物の有効量を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３５】
前記化合物が、シクロオキシゲナーゼ２を特異的に阻害する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記化合物が、アントラニル酸のアナログおよび誘導体、２−アミノ−ニコチン酸のアナログおよび誘導体、２−アミノ−フェニル酢酸のアナログおよび誘導体、ベンドロフルメチアジド、アミノキノリンのアナログおよび誘導体、それらの塩およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記化合物が、タルニフルマート、フルフェナム酸、ニフルム酸、メフェナム酸、ベンドロフルメチアジド、Ｎ−（３−フルオロベンジル）−３−アミノキノリン、それらの塩、それらの誘導体およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物が、タルニフルマート、タルニフルマート誘導体、それらの塩またはそれらのプロドラッグを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記組成物が、Ｎ−（３−フルオロベンジル）−３−アミノキノリン、その塩、その誘導体およびそのプロドラッグを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物が、肺への吸入送達のために処方されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物が、経口送達のために処方されている、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２０００年１月３１日に出願された米国仮出願第６０／１７９，１２７号、２０００年３月３０日に出願した米国仮出願第６０／１９３，１１１号、２０００年９月７日に出願した米国仮出願第６０／２３０，７８３号、２０００年１０月２３日に出願した米国仮出願第６０／　　　号および２０００年１１月２０日に出願した米国仮出願第６０／　　　号の利益を主張する。これらの出願は全て、その全体が本明細書中に参考として援用される。上記に引用した出願の全ては、「ムチン合成インヒビター」と題され、そして発明者は、Ｙｕｈｏｎｇ　Ｚｈｏｕ、Ｒｏｙ　Ｃ．Ｌｅｖｉｔｔ、Ｎｉｃｈｏｌａｓ　Ｃ．Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ、Ｓｔｅｖｅ　Ｊｏｎｅｓ、およびＭｉｋｅ　Ｍｃｌａｎｅである。
【０００２】
本発明はまた、１９９６年８月２３日に出願され、２０００年３月１４日に米国特許第６，０３７，１４９号として発行された米国特許出願第０８／７０２，１１０号の主題に関し、そして１９９９年６月９日に出願された米国特許出願第０９／３２５，５７１号および１９９９年６月１日に発行された米国特許第５，９０８，８３９号に関する。これらは全て、その全体が本明細書中に参考として援用される。さらに、本出願は、その全体が本明細書中に参考として援用される、１９９７年１２月１日に出願した米国特許出願第０８／９８０，８７２号に関する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、ムチン合成を調節する方法、および疾患（例えば、喘息、慢性気管支炎、炎症性肺疾患、嚢胞性線維症および急性または慢性の呼吸器感染疾患ならびに慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ））に関連するムチン過剰産生を制御する際の化合物の治療適用に関する。
【０００４】
（発明の背景）
気道上皮は、粘膜線毛（ｍｕｃｏｃｉｌｉａｒｙ）系および機械的障壁を通して、気道防御機構において肝要な役割を果たすことが公知である。近年の研究は、気道上皮細胞（ＡＥＣ）が活性化されて、複数の気道障害の病因において重要な生物学的メディエーターを産生および放出し得ることを示す（ＰｏｌｉｔｏおよびＰｒｏｕｄ、１９９８；Ｔａｋｉｚａｗａ、１９９８）。上皮が、慢性気道障害（例えば、喘息、慢性気管支炎、気腫および嚢胞性線維症）において基本的に障害を受けているという証拠が示された（Ｈｏｌｇａｔｅら、１９９９；Ｊｅｆｆｅｒｙ　ＰＫ、１９９１；Ｓａｌｖａｔｏ、１９６８；ＧｌｙｎｎおよびＭｉｃｈａｅｌｓ、１９６０）。これらの気道障害の特徴の１つは、ＡＥＣによる粘液の過剰産生である。粘液の主要な高分子成分は、ムチンとして公知の大きな糖タンパク質である。近年、少なくとも７つのヒトムチンの分子構造が決定された。公知のムチン転写産物は、不均質であり、これらの遺伝子間に配列相同性はない（ＶｏｙｎｏｗおよびＲｏｓｅ、１９９４）が、これらはその全体的な繰り返し構造が類似している。
【０００５】
有害な刺激は、ＡＥＣを活性化することが公知である。これらの刺激は、慢性閉塞性肺疾患の形態に関連した薬物または環境汚染物質、タバコの煙および感染性因子に対するアレルギー性疾患において抗原によって変化し得る。ＡＥＣの活性化は、イオン輸送の変化、毛様体の拍動の変化、ならびにムチンの産生および分泌の増加をもたらし、粘液の増加をもたらす。ＡＥＣ活性化に応答して産生されるメディエーターとしては、炎症細胞の流入を促進するケモカインが挙げられる（Ｔａｋｉｚａｗａ、１９９８）。これらの炎症細胞は次いで、ＡＥＣを損傷し得るメディエーターを産生し得る。ＡＥＣの損傷は、前炎症（ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）産物（肺の破壊および機能喪失をもたらし得る、気道壁再造形を駆動する、プロテアーゼおよび増殖因子を含む）の拡大しかつ連続した供給源をもたらす、細胞増殖を刺激する（杯細胞および粘膜下腺細胞過形成）（Ｈｏｌｇａｔｅら、１９９９）。
【０００６】
粘液の過剰産生およびその生理化学的特徴の変化は、肺の病因に多くの方法で寄与し得る。ムチンの過剰産生による生理学的粘膜線毛クリアランスの破壊は、粘液のつまり、空気の捕捉、およびしばしば感染を併発する無気肺をもたらし得る。
【０００７】
喘息は、有病率および重篤度が増加しているようである慢性の閉塞性肺障害である（ＧｅｒｇｅｎおよびＷｅｉｓｓ、１９９２）。人口の３０〜４０％がアトピー性アレルギーに罹患しており、そして人口のうち小児の１５％および成人の５％が喘息に罹患していると見積もられている（ＧｅｒｇｅｎおよびＷｅｉｓｓ、１９９２）。
【０００８】
喘息では、抗原による免疫系の活性化が、アレルギー性炎症をもたらす。この型の免疫活性化が生じた場合、これは、肺の炎症、気管支反応性亢進（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ　ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）、杯細胞および粘膜下腺過形成、ならびにムチンの過剰産生および過剰分泌を併発する（Ｂａｓｌｅら、１９８９）（Ｐａｉｌｌａｓｓｅ、１９８９）（Ｂｏｓｑｕｅら、１９９０）。杯細胞および粘膜下腺細胞過形成に関連した粘液の過剰産生およびつまりは、喘息の病因の重要な部分であり、そして軽度の喘息および喘息発作重積状態で死亡した個体の両方の気道の検査について記載されている（Ｅａｒｌｅ、１９５３）（ＣａｒｄｅｌｌおよびＰｅａｒｓｏｎ、１９５９）（Ｄｕｎｎｉｌｌ、１９６０）（Ｄｕｎｎｉｌｌら、１９６９）（Ａｉｋａｗａら、１９９２）（Ｃｕｔｚら、１９７８）。特定の炎症細胞は、この反応において重要である。このような炎症細胞としては、Ｔ細胞、抗原提示細胞、ＩｇＥを産生するＢ細胞、ＩｇＥを結合する好塩基球、および好酸球が挙げられる。これらの炎症細胞は、アレルギー性炎症の部位に蓄積し、そしてこれらが放出する毒性産物は、ＡＥＣおよびこれらの障害に関連する他の組織の破壊に寄与する。
【０００９】
上記に述べた関連の特許出願では、出願人は、インターロイキン−９（ＩＬ９）、そのレセプターおよびＩＬ９によってもたらされる活性が、アトピー性アレルギー、喘息および関連の障害において治療介入の適切な標的であることを実証した。アレルゲンによって肥満細胞から放出されるメディエーターは、アレルギーにおける重要な開始事象であると考えられてきた。ＩＬ９は元々、肥満細胞増殖因子として同定され、そしてＩＬ９が肥満細胞プロテアーゼ（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−４を含む）（Ｅｋｌｕｎｄら、１９９３）およびグランザイムＢ（Ｌｏｕａｈｅｄら、１９９５）の発現をアップレギュレートすることが実証された。従って、ＩＬ９は、肥満細胞の増殖およびまたは分化において役割を果たすようである。さらに、ＩＬ９は、高親和性ＩｇＥレセプターのα鎖の発現をアップレギュレートする（Ｄｕｇａｓら、１９９３）。さらに、インビトロおよびインビボの両方での研究は、刺激されたＢ細胞からのＩｇＥの放出をＩＬ９が増強することを示した（Ｐｅｔｉｔ−Ｆｒｅｒｅら、１９９３）。
【００１０】
近年、ＩＬ９は、ムチン合成を刺激することが示された。そしてＩＬ９は、アレルギー性気道疾患における肺の流体のムチン刺激活性のうちの５０〜６０％程度を占め得る（Ｌｏｎｇｐｒｅら、１９９９）。バックグラウンド系統由来のマウスと比較したムチン合成および粘液過剰産生の正味のアップレギュレーションは、ＩＬ９トランスジェニックマウスにおいて生じる。ＩＬ９は、ＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣの遺伝子およびタンパク質をインビトロおよびインビボで特異的にアップレギュレートする（Ｌｏｕａｈｅｄら、２０００）。さらに、ＩＬ９中和抗体は、喘息の動物モデルにおける抗原チャレンジに応答したムチンのアップレギュレーションを完全に阻害する（ＭｃＬａｎｅら、２０００）。
【００１１】
現行の喘息処置は、多数の欠点がある。主な治療剤であるβ−レセプターアゴニストは、症状を減少させ、それによって肺の機能を一時的に改善させるが、基礎をなす炎症には影響を与えず、かつムチン産生を抑制もしない。さらに、β−レセプターアゴニストの不断の使用は、脱感作を生じ、これにより、その効力および安全性が低下する（Ｍｏｌｉｎｏｆｆら、１９９５）。基礎をなす炎症を減少させ得、それによってムチン産生を減少させ得る薬剤（例えば、抗炎症ステロイド）は、免疫抑制から骨損失までの範囲にわたる、それ自体の欠点のリストを有する（Ｍｏｌｉｎｏｆｆら、１９９５）。
【００１２】
慢性気管支炎は、別の形態の慢性閉塞性肺障害である。成人のうちのほぼ５％がこの肺障害に罹患している。慢性気管支炎は、痰の慢性過剰産生として定義される。粘液過剰産生は一般に、誘導気道の炎症に関連している。好中球およびマクロファージを含む、炎症細胞のメディエーターは、この障害におけるムチン遺伝子発現増加に関連し得る（Ｖｏｙｎｏｗら、１９９９；Ｂｏｒｃｈｅｒｓら、１９９９）。粘液産生増加は、気道閉塞に関連しており、気道閉塞は、この肺障害の主な特徴のうちの一つである。治療は主に症候性であり、そして感染を制御することおよび肺機能のさらなる欠損を防ぐことに集中する。気管支炎の症状を処置するためにしばしば用いられる、鬱血除去薬、去痰薬およびこれらの薬剤の組み合わせは、ムチン産生を変化させるとは考えられない。粘液溶解は、気道分泌物の粘度および／または弾性を減少させることによって粘膜線毛クリアランスを促進し得、そして症状の軽減を提供し得るが、ムチンの合成も粘液過剰産生をも阻害しない（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９８）。
【００１３】
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、肺に変化をもたらし、そして濃い分泌物に関連するなお別の疾患であり、気道閉塞および吸入された病原性微生物によるその後の集落形成（ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）および感染をもたらす（Ｅｎｇら、１９９６）。ＤＮＡレベルは、ＣＦ肺において顕著に増加し、そして痰の粘度を上昇させ得る。エアゾール化された組換えＤＮａｓｅはこれらの患者において有益なものであるが、病原性の粘液過剰産生について有効な処置は存在しない。従って、当該分野には、ＣＦにおける気道上皮細胞によるムチン過剰産生を阻害し得る薬剤の同定についての特異的な、まだ対処されていない必要性がある。ムチン分泌物によって引き起こされる気道閉塞に加えて、ＣＦ患者はまた、消化管への消化酵素の送達を妨げる、膵管での粘液つまりを罹患する。この結果は、吸収不良症候群、脂肪便および下痢である。
【００１４】
粘液過剰産生は多くの慢性閉塞性肺障害の特徴のうちの１つであるが、当該分野には、これらの肺障害に関連したムチンの合成または過剰産生をブロックする方法はない。従って、当該分野には、ムチンの過剰産生を阻害し、そしてこれらの患者の分泌物を薄めて粘膜線毛クリアランスを促進し、そして肺の機能を保つという、特定の必要性が存在する。
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、ムチン糖タンパク質の合成および過剰産生を阻害する薬剤の発見、ならびに慢性閉塞性肺障害および他の疾患における粘液の病理的な過剰産生を処置するためのこれらの分子を使用する方法に関する。
【００１６】
１つの局面では、本発明は、ムチンの産生によって特徴付けられる呼吸器疾患を有する被験体を処置する方法を提供し、この方法は、肺または胃腸管におけるムチンの合成またはレベルを減少させる少なくとも１つの化合物を含む組成物の有効量をこの被験体に投与する工程を包含する。いくつかの実施形態では、ムチン合成は、塩素イオンチャネル依存性であり得る。いくつかの実施形態では、この化合物は、ＩＣＡＣＣ塩素イオンチャネルを発現する細胞におけるムチン合成を減少させる。いくつかの実施形態では、この化合物は、アントラニル酸のアナログおよび誘導体、２−アミノ−ニコチン酸のアナログおよび誘導体、２−アミノ−フェニル酢酸のアナログおよび誘導体、ベンドロフルメチアジド、それらの塩およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態では、この化合物は、タルニフルマート、フルフェナム酸、ニフルム酸、メフェナム酸、それらの塩、それらの誘導体およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される。いくつかの好ましい実施形態では、本発明の組成物は、タルニフルマート、タルニフルマート誘導体、それらの塩またはそれらのプロドラッグを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、肺または胃腸管におけるムチンの合成またはレベルを減少させる少なくとも１つの化合物を含み得、ここで、この化合物は、キノリンまたはキノリン誘導体である。いくつかの実施形態では、この化合物は、アミン基を用いて、好ましくはキノリンの２位または３位で改変されたキノリンであり得る。好ましい実施形態では、この化合物は、環外窒素が１以上の部分を用いて改変された３−アミノ−キノリンであり得る。いくつかの実施形態では、この環外アミン基は、芳香族部分を用いて改変され得る。この芳香族部分は、改変されていても改変されていなくてもよい。好ましい実施形態では、この芳香族基は、１以上の置換基を用いて改変され得るベンジル基である。適切な置換基としては、ハロゲンが挙げられるがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、この化合物は、Ｎ−（フルオロベンジル）−３−アミノ−キノリン（図１９）であり、好ましくは、このフッ素はメタ位に存在する。
【００１８】
本発明の別の局面では、ムチン合成を減少させる化合物はまた、酵素シクロオキシゲナーゼのインヒビター（例えば、タルニフルマート）である。より好ましい実施形態では、この化合物は、酵素シクロオキシゲナーゼ−２の特異的インヒビターである。
【００１９】
別の実施形態では、本発明は、吸入によって本発明の組成物を投与することによって、ムチンの産生によって特徴付けられる呼吸器疾患を有する被験体を処置する方法を提供する。いくつかの実施形態では、この組成物は、液体の形態または粉末の形態である。いくつかの実施形態では、この組成物は、エアゾール化されている。他の実施形態では、この組成物はさらに、少なくとも１つの去痰薬、抗ヒスタミン薬、粘液溶解剤、抗生物質または鬱血除去剤を含む。いくつかの実施形態では、この去痰薬は、グアイフェネシンである。本発明の組成物は、少なくとも１つの安定剤、吸収増強剤または矯味矯臭剤を含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、この安定剤はシクロデキストランであり、そして／またはこの吸収増強剤はキトサンである。
【００２０】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の組成物および方法は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性肺疾患、嚢胞性線維症および急性または慢性の感染性疾患からなる群より選択される呼吸器疾患を処置するために用いられ得る。これらの疾患のうちのいずれか１つの処置は、１以上の本発明の組成物を吸入によって投与することによって行われ得る。いくつかの実施形態では、この組成物は、吸入によって肺へと投与される。好ましい実施形態では、本発明は、気腫、慢性気管支炎および喘息からなる群より選択されるＣＯＰＤを処置するための方法および材料を提供する。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、本発明の組成物および方法は、嚢胞性線維症の胃腸合併症（例えば、吸収不良症候群、脂肪便および下痢）を処置するために用いられ得る。この疾患の処置は、本発明の１以上の組成物を経口投与することによって行われ得る。
【００２２】
別の実施形態では、本発明は、吸入送達のために処方された治療組成物を提供し、この組成物は、タルニフルマート、フルフェナム酸、ニフルム酸、メフェナム酸、それらの塩、それらの誘導体およびそれらのプロドラッグからなる群より選択される少なくとも１つの化合物を、ムチンの産生またはレベルを減少させるのに有効な量で含む。いくつかの好ましい実施形態では、この組成物は、タルニフルマート、タルニフルマート誘導体、それらの塩またはそれらのプロドラッグを含む。いくつかの実施形態では、この組成物は、液体の形態または粉末の形態である。いくつかの実施形態では、この組成物は、少なくとも１つの去痰薬、粘液溶解剤、抗生物質、抗ヒスタミン薬または鬱血除去剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、この去痰薬は、グアイフェネシンである。
【００２３】
上記の薬剤に加えて、吸入のために処方された本発明の薬学的組成物は、少なくとも１つの安定剤、吸収増強剤または矯味矯臭剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、この安定剤はシクロデキストランであり、そして／またはこの吸収増強剤はキトサンである。
【００２４】
本発明はまた、上記のような治療組成物を含む吸入デバイスを提供する。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本発明は部分的に、肺の非線毛性上皮細胞の活性化からもたらされる粘液過剰産生が、ＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣを含むムチン遺伝子の誘導によって引き起こされるという知見から誘導される。従って、本発明の１つの局面は、上皮細胞活性化の阻害である。ＡＥＣ活性化のこの阻害は、ケモカイン産生、気管支応答性およびムチン遺伝子発現をダウンレギュレートする。それゆえ、ムチンの合成またはレベルを減少させる分子は、本発明の一部である。
【００２６】
（ムチンの合成またはレベルを減少させる薬剤）
本明細書中に記載する場合、本発明の処方物および組成物は、ムチンの合成もしくはレベルを減少させるか、または何らかの方法でムチンの過剰産生を減少させる薬剤を含む。本明細書中で使用する場合、「減少させる」は、ムチンのレベル、活性化、機能、安定性または合成のダウンレギュレーションと定義される。好ましい薬剤は、ムチンの塩素イオンチャネル依存性のレベル、活性化、機能、安定性または合成を減少させる。本明細書中で使用される場合、「塩素イオンチャネル」とは、ＩＣＡＣＣ塩素イオンチャネルおよびＷＯ　９９／４４６２０（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）において言及された関連するチャネルをいうがこれらに限定されない。これらの定義に入る薬剤は、実施例に記載のアッセイにおけるスクリーニングによってそれらの活性が同定され得るかまたは確認され得る。例えば、実施例７および８に記載されるインビトロおよびインビボでのアッセイを用いて、薬剤の活性をスクリーニング、同定または確認し得る。
【００２７】
ムチンの合成またはレベルを減少させる分子としては、アントラニル酸（２−アミノ安息香酸）のアナログおよび誘導体が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、この分子は、Ｎ−誘導体化アントラニル酸であり得る。いくつかの実施形態では、アントラニル酸のアミノ基は、１以上の基で改変され得る。いくつかの実施形態では、この基は、芳香族基であり得る。好ましい実施形態では、この基は、トリフルオロメチル−フェニル基（好ましくは３−トリフルオロメチル−フェニル基）であり得、そしてムチンの合成またはレベルを減少させる分子はフルフェナム酸である。別の好ましい実施形態では、このアミノ基は、２，３−ジメチル−フェニル基で誘導体化され得、そしてムチンの合成またはレベルを減少させる分子はメフェナム酸である。当業者は、アントラニル酸の他のフェニル誘導体が本発明において用いられ得ることを認識する。他の好ましい実施形態では、安息香酸の環は、１以上の置換基を含み得る。好ましい実施形態では、安息香酸の環およびアミノ基の両方が改変され得る。他の好ましい実施形態は、安息香酸の環上の置換基および芳香族基がアミノ基に結合した分子を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ムチンの合成を減少させる分子は、２−アミノ−ニコチン酸のアナログおよび誘導体を含む。いくつかの実施形態では、環外アミノ基は、１以上の基を含むように改変され得る。いくつかの好ましい実施形態では、この環外アミン基は、全ての芳香族基で改変され得る。適切な芳香族基としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：フェニル基、改変されたフェニル基、ベンジル基、改変されたベンジル基など。好ましい実施形態では、この芳香族基は３−トリフルオロメチル−フェニル基であり得、そして２−アミノ−ニコチン酸の誘導体はニフルム酸である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ムチンの合成を減少させる分子は、２−アミノ−フェニル酢酸のアナログまたは誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、このアミノ基は、１以上の基を含むように改変され得る。いくつかの実施形態では、このアミノ基は、芳香族基で改変され得る。適切な芳香族基としては以下が挙げられるがこれらに限定されない：フェニル基、改変されたフェニル基、ベンジル基、改変されたベンジル基など。好ましい実施形態では、２−アミノ−フェニル酢酸は２，６−ジクロロフェニル基でＮ−改変され、そしてムチンの合成またはレベルを減少させる分子はタルニフルマートである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ムチンの合成またはレベルを減少させる分子はベンドロフルメチアジドであり得る。
【００３１】
本発明はまた、上記の、ムチンの合成またはレベルを減少させる分子の１以上のプロドラッグの使用を意図する。本明細書中で定義するように、プロドラッグは、上記の形態以外の形態で投与され、そして被験体の身体中で、記載された形態へと変換される分子である。好ましいプロドラッグとしては、フェナメートのプロドラッグが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの好ましいプロドラッグは、ムチンの合成またはレベルを減少させる酸の形態の分子のエステルである。好ましいエステルとしては、ＮＦＡのエステル（例えば、β−モルホリノエチルエステル、モルニフルメート（ｍｏｒｎｉｆｌｕｍａｔｅ）およびフタリジルエステル、タルニフルマート）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３２】
（ムチンの産生を調節する薬剤についての用途）
実施例に提供するように、ムチンの発現を調節、減少またはダウンレギュレートさせる薬剤を用いて、ムチン産生に関連した、生物学的プロセスおよび病理プロセスを改変し得る。
【００３３】
出願人は、ＩＬ９がムチン遺伝子産物の発現を選択的に誘導することを観察した。従って、ＩＬ９（これは、多数の抗原誘発性応答に対して重要である）についての多面的役割は部分的に、ＡＥＣにおけるムチンのアップレギュレーションに依存する。ＩＬ９の機能が中和抗体処置によってダウンレギュレートされる場合、動物は、肺における抗原誘発性応答から完全に防御され得る。これらの応答としては、以下が挙げられる：気管支反応性亢進、気管支洗浄液における好酸球増加および細胞数上昇、血清ＩｇＥの上昇、炎症に関連した、肺における組織学的変化、ならびに粘液の過剰産生に関連した杯細胞および粘膜下腺細胞過形成。ＩＬ９のダウンレギュレーションおよび喘息様応答は、ムチンのダウンレギュレートされた発現に関連する（図１０）。従って、喘息の病因の基礎となり、そしてムチン産生をダウンレギュレーションすることによって、この障害に関連したアレルギー性炎症を特徴付ける、このような応答の処置は、本発明の範囲内にある。
【００３４】
ＩＬ９トランスジェニックマウス気道の組織学的分析は、非線毛化上皮細胞におけるムチン過剰産生を示した（Ｔｅｍａｎｎら、１９９８；Ｌｏｕａｈｅｄら、２０００）。ＩＬ９トランスジェニックマウスの肺におけるムチンの誘導は、ＩＬ９がこれらの細胞による粘液産生を促進することを示唆する（図８を参照のこと）。ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＢおよびＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡを発現する、活性化されたＣａｃｏ２細胞が産生され、そしてムチン産生のインヒビターについての試験のために用いられた。これらの細胞は、過ヨウ素酸シッフ染色（ＰＡＳ）を用いてムチンについて染色され得る。図１Ａに示すように、処理されていない活性化されたＣａｃｏ２細胞は、ＰＡＳ陽性ムチン糖結合体について強く染まる。コントロールの細胞および活性化された細胞は、ニフルム酸（ＮＦＡ）または４，４’−ジイソチオシアノスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（ＤＩＤＳ）の存在下で培養された。インヒビターで処理した活性化された細胞のＰＡＳ染色は、未処理細胞と比較して有意に少ない陽性染色糖結合体を示した（図１Ｂと比較して図１Ｄ）。
【００３５】
ムチンダウンレギュレーションについての治療の可能性が、喘息において同定された一方で、出願人はまた、嚢胞性線維症におけるムチンのダウンレギュレーションについての治療の可能性を認めた。嚢胞性線維症を有する患者は、濃い分泌物によって特徴付けられる肺疾患によって障害を受けている。これは、気道閉塞および吸入された病原性微生物によるその後の集落形成および感染を引き起こす（Ｅｎｇら、１９９６）。それゆえ、出願人は、肺におけるムチン産生をダウンレギュレートすることによって嚢胞性線維症を処置するための方法を提供する。
【００３６】
嚢胞性線維症におけるムチンの過剰産生はまた、消化酵素を消化管へと送達する膵管に存在して、吸収不良症候群、脂肪便および下痢をもたらす。それゆえ、出願人はまた、膵臓におけるムチン産生をダウンレギュレートすることによって嚢胞性線維症を処置するための方法を提供する。
【００３７】
出願人はまた、慢性気管支炎および気腫におけるムチンダウンレギュレーションについての治療の可能性を同定した。慢性気管支炎および気腫を有する患者は、濃い分泌物によって特徴付けられる肺疾患によって妨げられている。これは、気道閉塞および吸入された病原性微生物によるその後の集落形成および感染を引き起こす（Ｅｎｇら、１９９６）。それゆえ、出願人は、肺におけるムチン産生をダウンレギュレートすることによって慢性気管支炎および気腫を処置するための方法を提供する。
【００３８】
本明細書中で使用する場合、哺乳動物がムチン産生によって媒介される病理プロセスまたは生物学的プロセスの調節を必要とする限り、被験体は、任意の哺乳動物であり得る。用語「哺乳動物」は、哺乳綱に属する個体を意味する。本発明はヒト被験体の処置において特に有用である。
【００３９】
病理プロセスとは、有害な効果を生ずる生物学的プロセスのカテゴリーをいう。例えば、本発明のムチンの過剰産生は、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、炎症性肺疾患、嚢胞性線維症ならびに急性または慢性の感染性疾患を含む、呼吸器疾患に関連し得る。ＣＯＰＤとしては、気管支炎、喘息および気腫が挙げられるがこれらに限定されない。ムチンの過剰産生はまた、嚢胞性線維症において存在する胃腸管疾患（例えば、吸収不良症候群、脂肪便および下痢）に関連し得る。
【００４０】
本明細書中で使用される場合、薬剤が、病理プロセスの程度または重篤度を減少させる場合、その薬剤は、病理プロセスを調節すると言われる。例えば、気道閉塞は、ムチンの合成、レベルおよび／または過剰産生を何らかの方法で減少させるかまたは調節する薬剤の投与によって、予防され得るか、または疾患の進行が調節され得る。
【００４１】
（治療組成物）
本発明の薬剤は、単独で提供され得るか、または特定の病理プロセスを調節する他の薬剤と組み合わせて提供され得る。例えば、本発明の薬剤は、抗喘息剤と組み合わせて投与され得る。別の実施形態では、薬剤は、去痰薬、粘液溶解剤、抗生物質、抗ヒスタミン薬または鬱血除去薬と組み合わせて投与され得る。なお別の実施形態では、薬剤は、界面活性剤、安定剤、吸収増強剤、βアドレナリン作用性レセプターもしくはプリンレセプターのアゴニストまたは矯味矯臭剤または組成物の嗜好性を増加させる他の薬剤とともに投与され得る。一例として、本発明の組成物は、活性薬剤に加えて、去痰薬（例えば、グアイフェネシン）、安定剤（例えば、シクロデキストラン）および／または吸収増強剤（例えば、キトサン）を含み得る。任意のこのような薬剤は、本発明の組成物において使用され得る。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、２以上の薬剤は、これらの薬剤が同時に投与されるかまたはこのような薬剤が同時に作用するような様式で独立して投与される場合、組み合わせて投与されるといわれる。
【００４３】
本発明の薬剤は、非経口経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、経皮経路、局所経路または頬内経路を通して投与され得る。あるいは、または同時に、投与は、経口経路もしくは鼻腔内経路によって行われ得るか、または肺へと直接的に行われ得る。好ましい実施形態では、本発明の化合物は、吸入によって投与され得る。吸入治療のためには、この化合物は、液体エアゾール、計量用量吸入器による投与に有用な溶液、または乾燥粉末吸入器に適切な形態であり得る。投与される投薬量（ｄｏｓａｇｅ）は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、同時に行われる処置の種類（存在する場合）、処置の頻度、および所望される効果の性質に依存する。
【００４４】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明の薬剤は、エアゾールとして処方され得る。薬学的エアゾールの処方は、当業者には慣用である。例えば、Ｓｃｉａｒｒａ，Ｊ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ　第１９版、第９５章、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡを参照のこと。この薬剤は、乾燥粉末、エマルジョンまたは半固体調製物の溶液のエアゾール、分散物または懸濁物のエアゾールとして処方され得る。このエアゾールは、当業者に公知の任意のプロペラント系を用いて送達され得る。このエアゾールは、例えば、鼻腔内吸入により、上気道に、または下気道に、あるいはその両方に適用され得る。
【００４５】
本発明の処置方法において用いられる化合物は、処置されるべき条件、部位特異的処置の必要性、投与されるべき薬物の量および同様の考慮すべき事柄のような考慮すべき事柄に依存して、全身的または局所的に投与され得る。
【００４６】
任意の一般的な局所的処方物（例えば、溶液、懸濁物、ゲル、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）もしくは軟膏（ｓａｌｖｅ）など）が用いられ得る。このような局所処方物の調製は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって例示されるように、薬学的処方物の分野において充分に記載されている。局所適用のためには、これらの化合物はまた、粉末またはスプレーとして、特にエアゾール形態で投与され得る。その活性成分は、全身投与に適合させた薬学的組成物中で投与され得る。公知のとおり、薬物が全身投与される場合には、薬物は、経口投与のための散剤、丸剤、錠剤などとして、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤として、調製され得る。静脈内、腹腔内または病巣内（ｉｎｔｒａ−ｌｅｓｉｏｎａｌ）投与のためには、この化合物は、注射により投与され得る溶液または懸濁物として調製される。特定の場合には、これらの化合物を坐剤形態で、または皮膚下貯蔵（ｄｅｐｏｓｉｔ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｓｋｉｎ）のための長期放出処方物または筋肉内注射として処方することが有用であり得る。
【００４７】
これらに含まれる組成物または薬剤の有効量は、ムチンの活性化、機能、安定性または合成を減少、低下またはダウンレギュレートする量である。好ましい組成物または薬剤は、ＩＣＡＣＣ塩素イオンチャネル依存性のムチンの活性化、機能、安定性または合成を含む、塩素イオンチャネル依存性のムチンの活性化、機能、安定性または合成を減少、低下、もしくはダウンレギュレートする。所定の有効量は、状態によって変化し、そして特定の場合では、処置される状態の重篤度および患者の処置への感受性により変化し得る。従って、所定の有効量は、慣用的な実験によりその時点および場所について最良に決定される。しかし、本発明による慢性閉塞性肺障害の処置において、０．００１重量パーセントと５重量パーセントとの間、好ましくは約０．０１〜１％を含む処方物が、通常、治療有効量を構成することが予想される。全身投与される場合、大部分の場合、１日あたり体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇと１００ｍｇとの間の量、しかし好ましくは約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ／日が、治療結果を達成する。
【００４８】
吸入により投与される場合、大部分の場合、１日あたり体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇと１００ｍｇとの間の量、しかし好ましくは約０．１０〜１０ｍｇ／ｋｇ／日が、治療結果を達成する。いくつかの例では、計量用量エアゾール単位は、約０．８ｍｇの本発明の化合物（例えば、タルニフルマート）を含む。この処方では、成体のための維持用量は、約２回の吸入（約１．６ｍｇ）を１日２回（約３．２ｍｇ）である。
【００４９】
本発明はまた、本発明の化合物を薬学的に受容可能なキャリアとともに含む薬学的組成物を含む。薬学的に受容可能なキャリアは、無菌の溶液（例えば、水および油）であり得る。このような油としては、石油、動物、植物または合成の起源の油（例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など）が挙げられる。水は、薬学的組成物が静脈内にまたは吸入によって投与される場合、好ましいキャリアである。生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水はまた、キャリアとして特にエアゾールによる吸入のために用いられ得る。乳酸加生理食塩水溶液ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液もまた、液体キャリアとして、特に注射可能溶液のために用いられ得る。適切な薬学的キャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５に記載される。
【００５０】
薬理学的に活性な薬剤に加えて、本発明の組成物は、作用部位への送達のために薬学的に用いられ得る調製物への活性化合物の加工を促進する賦形剤および補助物質を含む、適切な薬学的に受容可能なキャリアを含み得る。非経口投与のために適切な処方物としては、水溶性形態（例えば、水溶性塩）の活性化合物の水溶液が挙げられる。さらに、適切な油状注射懸濁物としての活性化合物の懸濁物が投与され得る。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油）または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリド）が挙げられる。水性注射懸濁物は、懸濁物の粘度を増加させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランが挙げられる）を含み得る。必要に応じて、懸濁物はまた、上記の通りの安定剤を含み得る。リポソームもまた、細胞への送達のために薬剤をカプセル化するために用いられ得る。
【００５１】
本発明による、全身投与のための薬学的処方物は、腸内、非経口または局所での投与のために処方され得る。実際、３つ全ての型の処方物は、同時に用いて、活性成分の全身投与を達成し得る。
【００５２】
経口投与のために適切な処方物としては、硬質または軟質のカプセル剤、丸剤、錠剤（コーティングされた錠剤を含む）、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤または吸入剤およびそれらの制御放出形態が挙げられる。経口吸入または鼻腔内吸入のために適切な処方物としては、当該分野で周知の賦形剤を含むかまたは含まない、水溶液が挙げられる。
【００５３】
本発明の治療的または薬学的な組成物または処方物は、この組成物または処方物が、気管支分泌物が濃くなること、刺激された気道膜が粘液の流れの増加を通して滑らかになることならびに／または粘着性の濃縮した粘液の産生の減少およびその除去を促進することによって、下気道排液を促進する能力について扱う説明書またはラベルを伴って、容器、バイアル、吸入デバイスなどの中に充填され得る。このラベルまたは説明書はまた、指標および使用法（例えば、本明細書中に記載されるような種々の状態の症状の軽減の維持）を扱い得る。このような状態としては、中程度から重度の喘息、慢性気管支炎、嚢胞性線維症、上気道および下気道の感染および気道または身体の他の場所における粘着性の粘液の存続を伴う他の状態が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５４】
本発明のデバイスは、１以上の治療組成物を上気道および／または下気道へと導入することに適応させた任意のデバイスであり得る。いくつかの好ましい実施形態では、本発明のデバイスは、計量用量吸入器であり得る。このデバイスは、本発明の治療組成物を、細かく分散された霧状の液体、発泡物または粉末の形態で送達するために適合され得る。このデバイスは、ポンプ、液化ガス、圧縮ガスなどを含むがこれらに限定されない、当業者に公知の任意のプロペラント系を用い得る。本発明のデバイスは代表的に、治療組成物の流れが移動する１以上のバルブおよびこの流れを制御するためのアクチュエータを備える容器を含む。本発明における使用のために適切なデバイスは、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、第９５章、１６７６−１６９２頁、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ　ＰＡ　１９９５において見出され得る。
【００５５】
本発明の実施では、当業者の通常の技術範囲内である、分子生物学、薬理学、免疫学および生化学の従来の用語および技術を用い得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、１９８５を参照のこと。
【００５６】
さらに説明することなしに、当業者は、前述の記載および以下の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を作製および利用し得、そして本願方法を実施し得ると考えられる。それゆえ、以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を具体的に指摘する。そして、以下の実施例は、残りの部分の開示を制限するとは決して解釈されるべきでない。
【００５７】
（実施例）
（実施例１：ＮＦＡは、ムチンを過剰産生するように活性化されたＣａｃｏ２細胞によるムチン産生を阻害する）
ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＢおよびＭＵＣ５ＡＣのｍＲＮＡを発現する活性化されたＣａｃｏ２細胞を作製し、そしてこれを用いてムチン産生のインヒビターについて試験した。これらの細胞は、ムチンについて過ヨウ素酸シッフ染色（ＰＡＳ）を用いて染色され得る。図１に示すように、Ｃａｃｏ２コントロール細胞は、いくつかの小さな糖結合体小胞が散在した基本的なＰＡＳ染色を提示した（パネルＡ）とはいえ、Ｃａｃｏ２細胞の活性化は、ＰＡＳ陽性ムチン糖結合体の数および強度を劇的に増加させた（パネルＢ）。この活性化されたＣａｃｏ２細胞を、ニフルム酸（ＮＦＡ）または４，４’−ジイソチオシアノスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（ＤＩＤＳ）の存在下で培養した。示した濃度（ＮＦＡについては１００μｍ、そしてＤＩＤＳについては３００μｍ）、インヒビターで処理された活性化されたＣａｃｏ２細胞のＰＡＳ染色は、未処理の細胞と比較して有意に少ない陽性染色ムチン糖結合体を示した（図１Ｂと比較して図１Ｄ）。さらに、コントロール細胞において見られたわずかな染色もまた阻害された（図１Ａと比較して図１Ｃ）。活性化されたＣａｃｏ２細胞によるムチン産生もまた、フルフェナメート（ＦＦＡ）、トルフェナメート（ＴＦＬＡ）のような他のフェナメートによって阻害され得、そしてメフェナメート（ＭＦＡ）およびメクロフェナメート（ＭＬＦＡ）によって部分的に阻害され得た（図２）。関連する化合物であるナプロキセン（ＭＭＮＡ）およびスリンダクは無効であった。ＮＦＡ処理細胞におけるこの減少したムチン産生は、この細胞の生理学的条件の劇的な変化には起因しなかった。なぜなら、これらの細胞の生存率は、さらに高い濃度のＮＦＡによって影響されなかったからである（図３）。総合すると、この結果は、これらの薬物が上皮の活性化を阻害することと一致する。さらに、この結果は、複数の慢性閉塞性肺障害の特徴である粘液の過剰産生に対するＮＦＡおよびそのアナログ（図１１に示すフェニルアントラニル酸誘導体）、ＤＩＤＳおよびＳＩＤＳの直接的な効果を明らかに実証する。
【００５８】
（実施例２：ＮＦＡは、ムチンを過剰産生するように活性化されたＣａｃｏ２細胞によるエオタキシン産生を阻害する）
エオタキシンを発現および分泌する活性化されたＬＨＬ４細胞が産生され、そしてこの細胞を用いて、エオタキシン産生のインヒビターについて試験した。これらの細胞を、当該分野で周知のＥＬＩＳＡ技術（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってエオタキシンについてインビトロでアッセイした。図４に示すように、活性化されたＬＨＬ４細胞を、ニフルム酸（ＮＦＡ）の非存在下（コントロール）または漸増濃度のニフルム酸の存在下で培養した。エオタキシン産生の顕著な阻害が、漸増濃度のＮＦＡについて注目された。同様の阻害は、同一の実験においてＤＩＤＳおよびＳＩＤＳについて見られた。Ｍａｄ／Ｃ３細胞は、ＮＦＡ、ＤＩＤＳおよびＳＩＤＳによるエオタキシン産生の類似の阻害を示す。まとめると、これらの結果は明らかに、エオタキシン産生に対するＮＦＡの直接的な効果を実証する。
【００５９】
（実施例３：ＮＦＡによる、喘息のマウスモデルにおけるムチン過剰産生の阻害）
以下の系統（ＤＢＡ、Ｃ５７Ｂ６およびＢ６Ｄ２Ｆ１）の保証されたウイルスフリーの雄性および雌性のマウスを、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　ＩｎｓｔｉｔｕｔｅまたはＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ　ＭＥ）から購入した。ＩＬ−９トランスジェニックマウス（Ｔｇ５）およびそれらの親系統（ＦＶＢ）を、Ｌｕｄｗｉｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）から入手した。動物を、高い効率の粒子濾過空気施設で飼育し、そして実験操作の前に３日間〜７日間にわたって食物および水を自由に摂らせた。この動物施設を２２℃に維持し、そして明暗周期を自動的に制御した（１０時間：１４時間の明：暗）。
【００６０】
（表現型分類および前処理の効力）
動物は、気管支反応性亢進、気管支肺胞洗浄液の組成、ムチン産生および血清ＩｇＥに対する前処理の効果を評価するために、前処理を受けなかったかまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ抗原の鼻腔内呼吸によって感作されたかのいずれかであった。マウスに、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたは生理食塩水を鼻腔内抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）し（０日目、７日目、１４日目、２１日目および２２日目）、そして最後の用量の２４時間後に表現型分類（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）した。感作したマウスを、０〜２１日目にＰＢＳまたは１００μｇのＮＦＡのいずれかで、気管内点滴注入（ＩＴ）によって処置した。肺における粘液産生およびムチン発現の阻害を用いて、ＮＦＡの処置効果を評価したか、またはこれを用いて、他の薬物候補の処置効果を評価し得る。気管支収縮応答を決定するために、薬物への曝露の前および曝露の間に呼吸器系の圧力を気管で測定し、そして記録した。以前に記載されたように、マウスに麻酔をし、そして器具を取り付けた（Ｌｅｖｉｔｔら、１９８８；ＬｅｖｉｔｔおよびＭｉｔｚｎｅｒ、１９８９；Ｋｌｅｅｂｅｒｇｅｒら、１９９０；Ｌｅｖｉｔｔ、１９９１；ＬｅｖｉｔｔおよびＥｗａｒｔ、１９９５；Ｅｗａｒｔら、１９９５）。気道応答性を、以下のうちの１以上について測定する：５−ヒドロキシトリプタミン、アセチルコリン、アトラクリウムまたはサブスタンスＰアナログ。気管支収縮抗原投与後のピーク吸息圧における変化の単純かつ反復可能な測定を用いた。これを、気道圧力時間指数（Ａｉｒｗａｙ　Ｐｒｅｓｓｕｒｅ　Ｔｉｍｅ　Ｉｎｄｅｘ；ＡＰＴＩ）（Ｌｅｖｉｔｔら、１９８８；ＬｅｖｉｔｔおよびＭｉｔｚｎｅｒ、１９８９）と呼んだ。ＡＰＴＩを、注射時点から、ピーク圧力がベースラインまたはプラトーに戻るまで積算されたピーク吸息圧における変化によって評価した。ＡＰＴＩは、気道抵抗に匹敵した。しかし、ＡＰＴＩは、気管支収縮からの回復に関連するさらなる成分を含む。
【００６１】
屠殺の前に、全血を、麻酔した動物の下大静脈の針穿刺によって血清ＩｇＥ測定のために収集した。サンプルを遠心分離して細胞を分離し、そして血清を収集し、この血清を用いて総ＩｇＥレベルを測定した。すぐに測定しないサンプルを、−２０℃にて凍結させた。
【００６２】
全てのＩｇＥ血清サンプルを、ＥＬＩＳＡ抗体サンドイッチアッセイを用いて測定した。マイクロタイタープレートを、アジ化ナトリウムを含む炭酸ナトリウム−重炭酸ナトリウムのコーティング緩衝液中２．５μｇ／ｍｌの濃度のラット抗マウスＩｇＥ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で１ウェルあたり５０μｌでコーティングした。プレートを、プラスチックラップで覆い、そして４℃にて１６時間インキュベートした。このプレートを、１回の洗浄につき５分間インキュベートして、リン酸緩衝化生理食塩水中０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０の洗浄緩衝液で３回洗浄した。非特異的結合部位のブロッキングを、リン酸緩衝化生理食塩水中５％ウシ血清アルブミンを１ウェルあたり２００μｌ添加し、プラスチックラップで覆い、そして３７℃にて２時間インキュベートすることによって達成した。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、２連の５０μｌの試験サンプルを各ウェルに添加した。試験サンプルを、洗浄緩衝液中の５％ウシ血清アルブミンで１：１０、１：５０および１：１００に希釈した後でアッセイした。試験サンプルに加えて、洗浄緩衝液中の５％ウシ血清アルブミン中の０．８ｎｇ／ｍｌ〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩｇＥ標準（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）のセットをアッセイして、標準曲線を作成した。サンプルも標準もないブランクを用いて、プレートリーダーを０にした（バックグラウンド）。サンプルおよび標準を加えた後、プレートをプラスチックラップで覆い、そして室温にて２時間インキュベートした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、５０μｌの二次抗体ラット抗マウスＩｇＥ−西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体を、洗浄緩衝液中の５％ウシ血清アルブミン中２５０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。このプレートをプラスチックラップで覆い、そして室温にて２時間インキュベートした。洗浄緩衝液で３回洗浄した後、０．１Ｍクエン酸緩衝液中の基質０．５ｍｇ／ｍｌ　ｏ−フェニレンジアミン１００μｌを全てのウェルに添加した。５〜１０分後、この反応を５０μｌの１２．５％硫酸で停止させ、そして吸光度をＭＲ５０００プレートリーダー（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）で４９０ｎｍにて測定した。標準曲線を、Ｘ軸を抗原濃度（対数目盛）およびＹ軸を吸光度（一様目盛）にして標準ＩｇＥ濃度から作成した。サンプル中のＩｇＥの濃度を、標準曲線から外挿した。
【００６３】
気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）および細胞分析を、以前に記載された（Ｋｌｅｅｂｅｒｇｅｒら、１９９０）ように行った。肺の組織学を、肺にインサイチュで固定液を満たし、そしてホルマリンを入れた後、または、抽出し、そして液体窒素中で直ちに凍結した後のいずれかの後に行った。先の器具使用がアーチファクトを導入し得ることから、別々の動物をこれらの研究に用いた。従って、小さな群の動物を、これらの動物を気管支応答性試験以外の他の試験に用いないこと以外は種々の前処置を受けたコホートと正確に同じに並行して処置した。気管支応答性試験の後、肺を取り出し、そして上記の通りに液体窒素に浸漬した。凍結切片化、染色および組織学的検査を、当業者に明らかな様式で実施した。
【００６４】
ＮＦＡは、上皮細胞活性化をブロックし、そしてインビトロでのムチンおよびエオタキシンの産生をダウンレギュレートする。ＮＦＡを治療的に用いて、抗原誘発性ムチン産生、気管支応答性、血清ＩｇＥおよびマウスにおいてＢＡＬによって評価した場合の気道炎症に対するインビボでの上皮細胞活性化の重要性を評価した。ビヒクル処置をした一致するコントロールと比較した、気道応答性、ＢＡＬ、粘液産生および血清ＩｇＥレベルに対するＮＦＡ処置の効果を決定した。図５および図６は、ＮＦＡが、気道反応性亢進およびＢＡＬ肺好酸球増加をそれぞれ抑制し得るが、血清ＩｇＥレベルに対しては何の効果もないことを示す。さらに、ＮＦＡはまた、抗原に対する曝露によって引き起こされる肺における粘液の過剰産生を抑制し得る（図７）。
【００６５】
（実施例４：トランスジェニックマウスにおけるＩＬ９による上皮活性化は、粘液過剰産生およびムチン遺伝子のアップレギュレーションを生じる。薬物スクリーニングについてのモデル）
５〜６週齢の保証されたウイルスフリーの雄性および雌性のＩＬ９トランスジェニックマウス（ＩＬ９ＴＧ５−ＦＶＢ／Ｎ）を、本発明者らの研究室で交配させた。５〜６週齢の雄性および雌性のＦＶＢ／Ｎマウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ　ＭＥ）から購入した。動物を、高い効率の粒子濾過空気施設で飼育し、そして実験操作の前に３日間〜７日間にわたって食物および水を自由に摂らせた。この動物施設を２２℃に維持し、そして明暗周期を自動的に制御した（１０時間：１４時間の明：暗）。
【００６６】
（表現型分類および処置の効力）
動物を、未刺激、または気管内（ＩＴ）偽（ビヒクル）処置を受けてから２４時間後、同一に処置したコントロールで用いたビヒクルと同じビヒクル中での薬物を受けてから２４時間後に表現型分類した。マウスを、ＩＴで一日１回、３日間にわたって処置した。ＮＦＡ（１００μｇ）またはＩＬ−９に対する抗体を、ＰＢＳ中でＩＴで投与した。処置応答を、組織学的検査（処置肺およびコントロール肺の全体についての１０を超える切片のＰＡＳ染色または同じ肺からのＭＵＣ１、ＭＵＣ２およびＭＵＣ３の発現のウェスタンブロット）によるムチン阻害の評価によって測定した。図８は、ＩＬ−９トランスジェニックマウスが、コントロールのＦＶＢマウスと比較してムチンを構成的に過剰産生することを示す。喘息性ＩＬ９トランスジェニックにおいて生じる高レベルの構成性ムチン産生（図８）（未刺激およびビヒクルコントロール）から、ＦＶＢ／Ｎ肺（正常な陽性コントロール）において見出されるずっと低いベースラインのムチン産生に匹敵するレベルへの減少を、任意の薬物について有意であるとみなした。ＩＬ９トランスジェニックにおける粘液産生のアップレギュレーションは、ＲＴ−ＰＣＲによって示されるようなＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣの増加した定常ｍＲＮＡレベルに特異的に関連する（図９）。
【００６７】
中和ＩＬ−９抗体は、ＩＬ９トランスジェニック肺においてムチン産生の有意な減少を生じることが示された（図１０）。ＮＦＡはまた、このモデルにおけるムチン産生を減少させた。
【００６８】
（実施例５：タルニフルマートによる喘息のマウスモデルにおけるムチン過剰産生の阻害）
５〜６週齢の保証されたウイルスフリーの雄性のＢ６Ｄ２Ｆ１マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ　ＭＥ）から購入した。動物を、高い効率の粒子濾過空気施設で飼育し、そして実験操作の前に５日間〜７日間にわたって食物および水を自由に摂らせた。この動物施設を２２℃に維持し、そして明暗周期を自動的に制御した（１２時間：１２時間の明：暗）。
【００６９】
（表現型分類および処置の効力）
動物に、タルニフルマートを含むマウス用餌または通常のマウス用餌のいずれかを自由に給餌した。動物は、気管支反応性亢進、気管支肺胞洗浄液の組成、ムチン産生および血清ＩｇＥに対する前処置の効果を評価するために、感作を受けなかったかまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ抗原の鼻腔内吸入によって感作されたかのいずれかであった。マウスに、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓを鼻腔内抗原投与し（０日目、７日目、１６日目および１７日目）、そして最後の用量の２４時間後に表現型を決定した。肺における粘液産生の阻害を用いて、タルニフルマートの処置効果を評価したか、またはこの阻害を用いて、他の薬物候補の処置効果を評価し得る。気管支収縮応答を決定するために、薬物への曝露の前および曝露の間に呼吸器系の圧力を気管で測定し、そして記録した。以前に記載されたように、マウスに麻酔をし、そして器具を取り付けた（Ｌｅｖｉｔｔら、１９８８；ＬｅｖｉｔｔおよびＭｉｔｚｎｅｒ、１９８９；Ｋｌｅｅｂｅｒｇｅｒら、１９９０；Ｌｅｖｉｔｔ、１９９１；ＬｅｖｉｔｔおよびＥｗａｒｔ、１９９５；Ｅｗａｒｔら、１９９５）。気道応答性を、以下のうちの１以上について測定する：５−ヒドロキシトリプタミン、アセチルコリン、アトラクリウムまたはサブスタンスＰアナログ。気管支収縮抗原投与後のピーク吸息圧における変化の単純かつ反復可能な測定を用いた。これを、気道圧力時間指数（ＡＰＴＩ）（Ｌｅｖｉｔｔら、１９８８；ＬｅｖｉｔｔおよびＭｉｔｚｎｅｒ、１９８９）と呼んだ。ＡＰＴＩを、注射時点から、ピーク圧力がベースラインまたはプラトーに戻るまで積算されたピーク吸息圧における変化によって評価した。ＡＰＴＩは、気道抵抗に匹敵した。しかし、ＡＰＴＩは、気管支収縮からの回復に関連するさらなる成分を含む。気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）および細胞分析を、以前に記載された（Ｋｉｅｅｂｅｒｇｅｒら、１９９０）通りに行った。肺の組織学を、肺を採取し、そして液体窒素中で直ちに凍結した後に実施した。気管支応答性試験の後、肺を取り出し、そして上記の通りに液体窒素に浸漬した。凍結切片化、染色および組織学的検査を、当業者に明らかな様式で実施した。
【００７０】
処置応答を、組織学的検査（処置肺およびコントロール肺のＰＡＳ染色）によるムチン阻害の評価によって測定した。
【００７１】
タルニフルマートでの経口処置は、ムチン染色を減少させた。図１５Ａは、通常のマウス用餌を給餌したＡｓｐ−ｓｅｎｓマウスから得られたマウス肺におけるＰＡＳ染色を示す。図１５Ｂは、タルニフルマートを含む餌を給餌したＡｓｐ−ｓｅｎｓマウスから得られた結果を示す。図１６は、タルニフルマートでコーティングされたマウス用餌を給餌した結果を、気管支肺胞洗浄によって決定した肺好酸球増加について示す。タルニフルマートは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓに感作させたマウスから得られる好酸球細胞の数を、標準的なマウス用餌を給餌した感作したマウスと比較して減少させた。
【００７２】
（実施例６：上皮細胞株におけるＩＣＡＣＣ−１の過剰発現は、ムチン産生を増強する）
ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（ヒト肺粘液性類表皮癌細胞株）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ　ＶＡ）から購入し、そして１０％　ＦＢＳおよび１％　ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。加湿し、５％　ＣＯ２を補充した空気含有インキュベーター中で３７℃にてこの細胞を増殖させた。ｈＩＣＡＣＣ−Ｉを過剰発現する安定なＮＣＩ−Ｈ２９２細胞株を、製造業者の指示書（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）に従ってＦｕｊｉｎ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎキットを用いたｐｃＤＮＡ３−ｈＩＣＡＣＣ−１のトランスフェクションによって樹立した。同じ手順を用いたＮＣＩ−Ｈ２９２細胞株へのｐｃＤＮＡ３（ｃｔｌ）のトランスフェクションによってコントロール細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２／ｃｔｌを産生した。ｈＩＣＡＣＣ−１遺伝子の発現は、ノーザン分析によってｐｃＤＮＡ３−ｈＩＣＡＣＣ−１トランスフェクタントについて確認された。
【００７３】
ｓ−ＥＬＬＡ（特異的酵素結合レクチンアッセイ）のために、細胞を２４ウェル組織培養プレートにプレーティングし、そして７２時間インキュベートしてコンフルエントにした。上清を、１μｇ／ｍｌの抗ＭＵＣ５Ａ／Ｃ抗体（Ｎｅｗ　ｍａｒｋｅｒ、Ｆｒｅｍｏｎｔ　ＣＡ）で予めコーティングしかつ１％　ＢＳＡでブロックした９６ウェルプレート中に移した。次いで、抗体が結合したＭＵＣ５Ａ／Ｃを、ＨＲＰ−レクチン（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出した。
【００７４】
ＲＴ−ＰＣＲのために、総ＲＮＡを、製造業者のプロトコルに従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いて細胞株から単離した。ＲＴ−ＰＣＲを、１μｇの総ＲＮＡを逆転写し、そして適切なプライマーを用いてＰＣＲによってｃＤＮＡを増幅することによって行った。産物を、２％アガロースゲルでの電気泳動によって分離し、そして臭化エチジウム染色によって可視化した。ヒトＩＣＡＣＣ−１メッセージを作製するために用いたプライマー対は以下の通りであった：センス５’−ＧＧＣＡＣＡＧＡＴＣＴＴＴＴＣＡＴＴＧＣＴＡ−３’およびアンチセンス５’−ＧＴＧＡＡＴＧＣＣＡＧＧＡＡＴＧＧＴＧＣＴ−３’（これらは、１８２ｂｐの産物を産生する）。ムチンのメッセージを作成するために用いられたプライマー対を表１に列挙する。
【００７５】
【表１】
2004507444.tif 000003
ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞はＭＵＣ１を構成的に発現し、一方、ＭＵＣ２およびＭＵＣ５Ａ／Ｃ　ｍＲＮＡ発現は、ベースラインでは検出レベル未満である。図１２Ａは、ｐｃＤＮＡ３−ｈＩＣＡＣＣ−１でトランスフェクトされた細胞のノーザンブロット分析の結果を示し、これは、ＩＣＡＣＣ　ｍＲＮＡについての発現レベルの増加を示す。ＩＣＡＣＣ−１を過剰発現するクローンからの細胞全体の溶解産物のウェスタンブロット分析は、ＭＵＣ２タンパク質産生の増強を示した（図１２Ｂ）。ＭＵＣ５Ａ／Ｃ発現は、ＩＣＡＣＣ−１を過剰発現する細胞において有意に増加し、一方、ＭＵＣ１は、ＲＴ−ＰＣＲ分析において変化しなかった（図１２Ｃ）。特異的ＥＬＬＡ分析はまた、トランスフェクトしていないＮＣＩ−Ｈ２９２細胞または空のベクターでトランスフェクトした細胞と比較して、ＩＣＡＣＣ−Ｉを発現するクローンにおいてＭＵＣ５Ａ／Ｃタンパク質の過剰産生を示した（図１２Ｄ）。
【００７６】
（実施例７：ｈＩＣＡＣＣ−１を過剰発現するＮＣＩ−Ｈ２９２細胞における粘液過剰産生およびＭＵＣ　５Ａ／Ｃ発現の阻害）
粘液糖結合体産生の決定のために、ＮＣＩ−Ｈ２９２／ｃｔｌおよびＮＣＩ−Ｈ２９２／ｈＩＣＡＣＣ−１（ＡＡＦ　１５）細胞を、２４ウェルプレート中で３日間にわたって培養した。次いで、細胞をホルマリンで固定し、そして粘液糖結合体をＡＢ／ＰＡＳ染色（Ｓｉｇｍａ）によって可視化した。ＮＣＩ−Ｈ２９２コントロール細胞は、いくつかの散在した顆粒を伴って基本的ＰＡＳ染色を提示した（図１３Ａ）が、ＩＣＡＣＣ−１の過剰発現は、ＰＡＳ陽性粘液糖結合体の数および強度を劇的に増加させた（図１３Ｂ）。塩素イオンチャネル遮断研究のために、細胞を、１００μＭ濃度のニフルム酸（ＮＦＡ）（Ｓｉｇｍａ）、１２５μＭもしくは２５０μＭのメフェナム酸（ＭＦＡ）または１２．５μＭ、２５μＭもしくは５０μＭのタルニフルマートの存在下で、または培地単独で培養した。ＮＦＡ、ＭＦＡまたはタルニフルマートで処理した細胞のＰＡＳ染色は、未処理の細胞と比較して有意に少ない陽性染色粘液糖結合体を示した（図１３Ｃおよび図１３Ｄならびに図１４の挿入図）。インヒビターで処理したコントロール細胞のＰＡＳ染色は、未処理の細胞との相違を実質的に全く示さなかった（図１３Ａおよび図１３Ｃ）。
【００７７】
タルニフルマート（図１４）、ニメスリド（図１７）およびＭＳＩ−２０７９（図１８、ＭＳＩ−２０７９の構造を図１９に示す）についてのＩＣ５０値を、ｈＣＬＣＡ１を発現するＨ２９２細胞におけるＭＵＣ５Ａ／Ｃ分泌の阻害に基づいて決定した。コンフルエントな細胞を、このインヒビターで、ＯＰＴＩ　ＭＥＭ中で０μＭ〜２５０μＭの濃度で処理した。分泌されたＭＵＣ５Ａ／Ｃは、実施例５に記載される通りのＥＬＬＡアッセイによってこのインヒビターの添加の４８時間後に検出された。ＩＣ５０値を、データ分析ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍを用いて決定した。図１４の挿入図は、ＰＡＳ染色によって検出された、タルニフルマート処理に応答した細胞内ムチンレベルを示す。
【００７８】
本発明を種々の特定の材料、手順および例を参照して本明細書中に記載および例示してきたが、本発明は、その目的のために選択された材料および手順の特定の組み合わせに制限されないことが理解される。このような詳細の多数のバリエーションは、当業者に認識されるように示され得る。本出願を通して引用される全ての特許、特許出願および他の参考文献は、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００７９】
（参考文献）
以下の参考文献は、本出願において言及された全ての参考文献、特許または特許出願と同様に、その全体が本明細書中に参考として援用される。
【００８０】
【表２】
2004507444.tif 000004
2004507444.tif 000005
2004507444.tif 000006
2004507444.tif 000007
2004507444.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ムチン産生に対するＮＦＡの効果を示す顕微鏡写真である。ＮＦＡインヒビターは、インビトロでのムチン過剰産生をブロックする。
【図２】
図２は、ＮＦＡおよび種々の化合物の、活性化されたＣａｃｏ２細胞によるムチンの過剰産生を抑制する能力を示す顕微鏡写真である。この図は、フェナメートによる、活性化されたＣａｃｏ２細胞におけるムチン産生の阻害を示す。
【図３】
図３は、活性化されたＣａｃｏ２細胞株の、ＮＦＡでの処理が、そのＣａｃｏ２細胞株の生存率に影響を有さないことを示すグラフである。この図は、ＮＦＡが上皮細胞増殖に影響を有さないことを示す。
【図４】
図４は、ケモカインであるエオタキシンの上皮細胞による産生の阻害を示すグラフである。この図は、ＮＦＡが、ケモカイン産生を含む上皮活性化をブロックすることを示す。
【図５】
図５は、ＮＦＡの気管内投与が、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）と比較して、抗原誘発性気道反応性亢進（Ａｆ＋ＮＦＡ）を抑制することを示すグラフである。この図は、ＮＦＡが、気道反応性亢進を含む上皮抗原応答をブロックすることを示す。
【図６】
図６は、ＮＦＡの気管内投与の結果を示すグラフである。この図は、ＮＦＡが抗原誘発性肺好酸球増加をインビボで減少させることを示す。これは、ＮＦＡの存在下でＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（Ａｆ＋ＮＦＡ）を用いた活性化後の好酸球増加を、ＮＦＡが存在しないリン酸緩衝化生理食塩水（Ａｆ＋ＰＢＳ）での活性化後の好酸球増加と比較することにより見られる。
【図７】
図７は、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）と比較した、粘液（ムチン糖結合体）における抗原誘発性増加に対するＮＦＡの気管内投与（Ａｆ＋ＮＦＡ）の結果を示す顕微鏡写真である。この図は、曝露したマウスの肺における抗原に起因して、ＮＦＡがムチン発現の増加をブロックすることを示す。
【図８】
図８は、コントロールのＦＶＢマウスとは対照的に、ＩＬ９トランスジェニックマウスが、気道においてムチンを構成的に過剰産生することを示す顕微鏡写真である。
【図９】
図９は、ＩＬ９トランスジェニックマウスの肺におけるムチンの構成的過剰産生が、バックグラウンドの系統（ＦＶＢ／ＮＪ）のマウスと比較して、ＭＵＣ２およびＭＵＣ５ＡＣの定常状態の転写物の特異的アップレギュレーションに関連することを示す顕微鏡写真である。この図は、特異的ムチン遺伝子が、ＩＬ−９トランスジェニックマウスの肺においてアップレギュレートされることを示す。
【図１０】
図１０は、抗原に曝露されたマウスの肺におけるムチン過剰産生に対する抗ＩＬ−９抗体の効果を示す顕微鏡写真である。この図は、中和ＩＬ−９抗体が、抗原に曝露したマウスにおけるムチン過剰産生を妨げることを示す。
【図１１】
図１１は、ムチン産生をブロックするフェニルアントラニル酸アナログの一般式を示す化学式であり、ここで、
Ｘ１〜Ｘ９＝各々他とは独立して、Ｃ、Ｓ、ＯまたはＮであり得、
Ｒ１〜Ｒ１１＝各々他とは独立して、水素、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリール、ハロゲン、ハロゲン置換アルキル、ハロゲン置換アリール、環を形成するアルキル、環を形成するアリール、環を形成する置換アルキル、環を形成する置換アリール、ヒドロキシル、アルキルエーテル、アリールエーテル、アミン、アルキルアミン、アリールアミン、アルキルエステル、アリールエステル、アルキルスルホンアミド、アリールスルホンアミド、チオール、アルキルチオエーテル、アリールチオエーテル、アルキルスルホン、アリールスルホン、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルスルホンアミドまたはアリールスルホンアミドであり得、
Ｙ＝カルボキシレート、アルキルカルボキシレート、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、ホスホネート、カルボン酸のアミド、カルボン酸のエステル、リン酸のアミド、リン酸のエステル、スルホン酸のアミド、スルホン酸のエステル、ホスホン酸のアミド、ホスホン酸のエステル、スルホンアミド、ホスホンアミド（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｍｉｄｅ）、テトラゾール、ヒドロキサム酸または他の酸の同配体、
Ｚ＝Ｏ、ＮＲ１０、Ｓ、ＣＲ１０Ｒ１１、スルホキシドまたはスルホン、
ｍ＝０または１、
ｎ＝１または２である。
【図１２】
図１２は、ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞においてｈＩＣＡＣＣ−１によって誘導されたムチン発現を示すノーザンブロットである。
【図１３】
図１３は、ｈＩＣＡＣＣ−１を過剰発現するＮＣＩ−Ｈ２９２細胞における粘液過剰産生を示す顕微鏡写真である。
【図１４】
図１４は、タルニフルマートによるムチン産生の阻害を示すグラフである。
【図１５Ａ】
図１５Ａは、マウスにおけるタルニフルマートの経口投与によるムチン過剰産生の阻害を示す顕微鏡写真である。図１５Ａは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓに対して感作し、そして通常のマウス用の餌を採らせたマウス由来の肺（Ｈ＆Ｅで染色した）の切片を示す。
【図１５Ｂ】
図１５Ｂは、マウスにおけるタルニフルマートの経口投与によるムチン過剰産生の阻害を示す顕微鏡写真である。図１５Ｂは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓに対して感作し、そしてタルニフルマートを含有するマウス用の餌を採らせたマウス由来の肺（Ｈ＆Ｅで染色した）の切片を示す。
【図１６】
図１６は、マウスにおけるタルニフルマートの経口投与による肺好酸球増加の阻害を示すグラフである。この図は、ＡＨＲ３７３：Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓで感作したＢ６Ｄ２Ｆ１／Ｊ雄性マウスのＢＡＬに対するタルニフルマートマウス用餌の効果を示す。
【図１７】
図１７は、ニメスリドによるＭＵＣ５Ａ／Ｃ分泌の阻害を示すグラフである。
【図１８】
図１８は、ＭＳＩ−２０７９によるＭＵＣ５Ａ／Ｃ分泌の阻害を示すグラフである。
【図１９】
図１９は、ＭＳＩ−２０７９の構造を示す化学式である。
【図１】
2004507444.tif 000009
【図２】
2004507444.tif 000010
【図３】
2004507444.tif 000011
【図４】
2004507444.tif 000012
【図５】
2004507444.tif 000013
【図６】
2004507444.tif 000014
【図７】
2004507444.tif 000015
【図８】
2004507444.tif 000016
【図９】
2004507444.tif 000017
【図１０】
2004507444.tif 000018
【図１２】
2004507444.tif 000019
【図１３】
2004507444.tif 000020
【図１４】
2004507444.tif 000021
【図１６】
2004507444.tif 000022
【図１７】
2004507444.tif 000023
【図１８】
2004507444.tif 000024
【国際公開パンフレット】
2004507444.tif 000025
2004507444.tif 000026
2004507444.tif 000027
2004507444.tif 000028
2004507444.tif 000029
2004507444.tif 000030
2004507444.tif 000031
2004507444.tif 000032
2004507444.tif 000033
2004507444.tif 000034
2004507444.tif 000035
2004507444.tif 000036
2004507444.tif 000037
2004507444.tif 000038
2004507444.tif 000039
2004507444.tif 000040
2004507444.tif 000041
2004507444.tif 000042
2004507444.tif 000043
2004507444.tif 000044
2004507444.tif 000045
2004507444.tif 000046
2004507444.tif 000047
2004507444.tif 000048
2004507444.tif 000049
2004507444.tif 000050
2004507444.tif 000051
2004507444.tif 000052
2004507444.tif 000053
2004507444.tif 000054
2004507444.tif 000055
2004507444.tif 000056
2004507444.tif 000057
2004507444.tif 000058
2004507444.tif 000059
2004507444.tif 000060
2004507444.tif 000061
2004507444.tif 000062
2004507444.tif 000063
2004507444.tif 000064
2004507444.tif 000065
2004507444.tif 000066
2004507444.tif 000067
2004507444.tif 000068
2004507444.tif 000069
2004507444.tif 000070
2004507444.tif 000071
2004507444.tif 000072
2004507444.tif 000073
2004507444.tif 000074
2004507444.tif 000075
2004507444.tif 000076
2004507444.tif 000077
2004507444.tif 000078
2004507444.tif 000079
2004507444.tif 000080
2004507444.tif 000081
2004507444.tif 000082
【国際調査報告】
2004507444.tif 000083