(57)【要約】ウイルス感染を阻害する、酸性アミノ酸および芳香族アミノ酸の特定のパターンを有するペプチドが記載される。このペプチドは、１５〜１８アミノ酸を含み、そしてそれ自体として、さらなる抗ウイルス剤と組み合わせて、および／またはこれらをコードするヌクレオチド配列の形態で投与され得る。１つの実施形態において、本発明の化合物は、単離された形態で、配列ＡＬＥＡＫＩＣＨＱＩＥＹＹＦＧＤＦ、ＡＡＬＥＡＫＩＣＨＱＩＥＹＹＦＧＤＦ、ＬＤＬＤＴＫＩＣＥＱＩＥＹＹＦＧＤＦ、ＡＡＬＥＡＫＩＣＨＱＩＥＥＹＹＦＧＤＦ、ＤＤＡＤＱＲＩＩＫＱＬＥＹＹＦＧＮＩ、ＶＳＫＬＥＡＳＴＩＲＱＥＹＹＦＧＤＡまたはＱＥＲＡＩＩＲＱＶＥＹＹＦＧＤＦを含み、ただし、全てのアミノ酸がＬ体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ａ１ｎＡ２ｎＡ３ｎＡ４Ａ５Ａ６Ａ７Ａ８Ａ９Ａ１０Ａ１１Ａ１２Ａ１３Ａ１４Ａ１５Ａ１６Ａ１７Ａ１８（１）の化合物ならびに該化合物のアシル化形態および／またはアミド化形態であって、
ここで、各々のｎは、独立して０または１であり；
Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、各々独立して、任意のアミノ酸であり；
Ａ４、Ａ１２、およびＡ１７は、独立して、酸性アミノ酸であり；
Ａ１３、Ａ１４、Ａ１５およびＡ１８は、独立して、芳香族アミノ酸であり；
Ａ５、Ａ７、Ａ８、Ａ１１、およびＡ１６は、任意のアミノ酸を表し；
Ａ６、Ａ９、およびＡ１０は、独立して、塩基性アミノ酸または極性中性アミノ酸を表し；
ここで各々のアミノ酸は、Ｌ体、ラセミ形態、またはＤ体であり得、ただし
全てのアミノ酸がＬ体である場合、該式（１）の化合物は、ＡＡＬＥＡＫＩＣＨＱＩＥＹＹＦＧＤＦ以外であり、そして
全てのアミノ酸がＬ体でありかつ式（１）が、配列ＡＬＥＡＫＩＣＨＱＩＥＹＹＦＧＤＦ、ＡＡＬＥＡＫＩＣＨＱＩＥＹＹＦＧＤＦ、ＬＤＬＤＴＫＩＣＥＱＩＥＹＹＦＧＤＦ、ＡＡＬＥＡＫＩＣＨＱＩＥＥＹＹＦＧＤＦ、ＤＤＡＤＱＲＩＩＫＱＬＥＹＹＦＧＮＩ、ＶＳＫＬＥＡＳＴＩＲＱＥＹＹＦＧＤＡまたはＱＥＲＡＩＩＲＱＶＥＹＹＦＧＤＦである場合、該式（１）の化合物は、単離された形態でなくてはならない、化合物。
【請求項２】
全てのアミノ酸が遺伝子にコードされている、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ａｉサブユニット間の全ての結合が、アミド結合である、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
全てのＡｉがＤ体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
全てのＡｉがＬ体である、請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
Ａ４、Ａ１２、およびＡ１７の各々が、独立してアスパラギン酸またはグルタミン酸である、請求項１に記載の化合物。
【請求項７】
Ａ１３、Ａ１４、Ａ１５およびＡ１８の各々が、独立して、フェニルアラニンまたはチロシンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
Ａ８がシステインである、請求項１に記載の化合物。
【請求項９】
Ａ６、Ａ９、およびＡ１０の各々が、独立して、リジン、ヒスチジン、アルギニン、グルタミン、またはアスパラギンである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
ＡＡＬＥＡＱＩＣＱＱＩＥＹＹＦＧＤＦ、ＡＡＬＱＡＫＩＣＨＱＩＱＹＹＦＧＱＦ、ＱＱＱＥＡＫＩＣＨＱＩＥＹＹＦＧＤＦおよびＡＡＬＥＡＫＩＣＨＱＩＥＹＱＦＧＤＦからなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
請求項１に記載の化合物であって、該化合物は、単離または精製された形態であり、そしてＡＬＥＡＫＩＣＨＱＩＥＹＹＦＧＤＦ、ＡＡＬＥＡＫＩＣＨＱＩＥＹＹＦＧＤＦ、ＬＤＬＤＴＫＩＣＥＱＩＥＹＹＦＧＤＦ、ＡＡＬＥＡＫＩＣＨＱＩＥＥＹＹＦＧＤＦ、ＤＤＡＤＱＲＩＩＫＱＬＥＹＹＦＧＮＩ、ＶＳＫＬＥＡＳＴＩＲＱＥＹＹＦＧＤＡおよびＱＥＲＡＩＩＲＱＶＥＹＹＦＧＤＦからなる群より選択される、化合物。
【請求項１２】
適切な賦形剤と共に請求項１に記載の組成物を含む、薬学的組成物、獣医学的組成物、または農学的／園芸学的組成物。
【請求項１３】
請求項２に記載の化合物をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項１４】
請求項２に記載の化合物をコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現系であって、該ヌクレオチドは、該ヌクレオチドの発現に有効な制御配列に作動可能に連結されている、組み換え発現系。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現系を含むように改変された組み換え宿主細胞。
【請求項１６】
前記発現系が前記宿主細胞のゲノム中に組み込まれている、請求項１５に記載の組み換え宿主細胞。
【請求項１７】
請求項２に記載の化合物を作製するための方法であって、請求項１４に記載の発現系から該化合物の発現をもたらす工程を包含する、方法。
【請求項１８】
ウイルスベクター中に含められる、請求項１４に記載の発現系。
【請求項１９】
アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項１８に記載のウイルスベクター。
【請求項２０】
植物被検体または動物被検体におけるウイルス感染を処置するための方法であって、該方法は、該被検体に、抗ウイルス有効量の請求項１の化合物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
前記方法が、少なくとも１種のさらなる抗ウイルス剤を投与する工程をさらに包含する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物および前記少なくとも１種のさらなる抗ウイルス剤を投与する工程が、実質的に同時である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１に記載の化合物および前記少なくとも１種のさらなる抗ウイルス化合物を投与する工程が、連続的である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記さらなる抗ウイルス化合物が、Ｉ−ＲＮＡである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
植物被検体または動物被検体におけるウイルス感染を処置するための方法であって、該方法は、該被検体に、抗ウイルス有効量の請求項２に記載の化合物をコードするヌクレオチド配列を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記ヌクレオチド配列が、前記被検体の細胞と適合性の発現系に含まれる、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記方法が、少なくとも１種のさらなる抗ウイルス剤を投与する工程をさらに包含する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物および前記少なくとも１種のさらなる抗ウイルス剤を投与する工程が、実質的に同時である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１に記載の化合物および前記少なくとも１種のさらなる抗ウイルス化合物を投与する工程が、連続的である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記さらなる抗ウイルス化合物が、Ｉ−ＲＮＡである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
化合物を肝臓に選択的に送達するための方法であって、該方法は、肝臓を含有する被検体に、請求項１に記載の化合物に結合した所望の化合物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３２】
請求項１の化合物に特異的に免疫反応性な抗体。
【請求項３３】
免疫特異的フラグメントである、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３４】
モノクローナル抗体である、請求項３３に記載の抗体。
【請求項３５】
請求項１に記載の化合物を精製するための方法であって、該方法は、該化合物を含むサンプルと、該化合物に特異的に免疫反応性な抗体とを接触させる工程を包含し、該抗体が、固体支持体に結合されている、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、内部リボソーム進入部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）（ＩＲＥＳ）で開始される翻訳を利用する感染性ウイルスの複製を阻害するために有効なペプチド、および／またはそれらの生活環の任意の段階においてＬａタンパク質を利用するウイルスを阻害するために関する。これらのペプチドは、Ｌａタンパク質と競合し、そして増殖性ウイルス生活環に必要とされるＬａタンパク質の種々の生化学的機能および生理学的機能の利用を阻害する。より詳細には、本発明は、そのような阻害に有利な特性を有する天然に存在しないペプチドを含む。
【背景技術】
【０００２】
（背景技術）
ＰＣＴ公開公報ＷＯ９６／１１２１１（その内容は、本明細書中に参考として援用される）は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）でのメッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害するための方法であって、そのような翻訳に必要とされるタンパク質に結合するオリゴヌクレオチドに基づく方法を記載する。ＰＣＴ公開広報に記載されるように、「Ｉ−ＲＮＡ」と称されるオリゴヌクレオチドは、所望される阻害特性を示す酵母由来の６０ヌクレオチドのＲＮＡの同定に基づく。しかし、そこにさらに記載されるように、Ｉ−ＲＮＡはまた、この酵母ＲＮＡの関連する部分の種々の模倣物の形態をとり得る（例えば、ポリオウイルスのヌクレオチド１８６−２２０の配列またはポリオウイルスのヌクレオチド５７８−６１８の配列、および種々の他の配列）。この阻害性オリゴヌクレオチド（Ｉ−ＲＮＡ）の重大な局面は、ヌクレオチド配列自体、および内因性タンパク質に結合するその能力である。Ｉ−ＲＮＡが結合する内因性タンパク質（ヒトＬａ自己抗原と称される）は、阻害性オリゴヌクレオチドに結合され、従って、抗原が要求するｍＲＮＡへの結合を防ぎ、そしてＩＲＥＳがリボソームと相互作用することを阻害する。野生型Ｌａ自己抗原の１１〜２８位にわたるこのタンパク質の１８アミノ酸部分は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９９／６１６１３（これもまた本明細書中に参考として援用される）に記載されるようにウイルス複製を阻害することが示されている。Ｌａ自己抗原全体のアミノ酸配列は、以前に、Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｊ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２５３：１８０４３−１８０６１（これもまた本明細書中に参考として援用される）により記載されている。Ｌａ抗原（ＬＡＰ）の１８アミノ酸の結合領域および以前に記載されたオリゴヌクレオチドが、ウイルスＲＮＡの翻訳を阻害する機構は、上に引用されたＷＯ９９／６１６１３に記載されている。
【０００３】
以前に記載されているように、多数のウイルス（ピコルナウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスなどを含む）は、翻訳を開始するためにＩＲＥＳ機構を利用する。上述のオリゴヌクレオチドおよびＬＡＰがこの翻訳を阻害するので、これらはまた、ウイルス複製および他の必須のウイルス機能を阻害する。これらの公開広報で実証されるように、ＬＡＰは、容易に細胞内に進入し得、従って、この阻害をもたらす位置に存在する。
【０００４】
現在、ＬＡＰに関連するが、ＬＡＰを除くペプチドのファミリーが、ＩＲＥＳで開始される翻訳を阻害すること、およびそれによりウイルス複製を阻害することにおいて有用性を有することが見出されている。従って、これらのペプチドは、ウイルス感染の処置およびウイルス感染の機構の研究に有用である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の開示）
本発明は、抗ウイルス剤およびウイルス感染の機構を解明するための調査ツールとして有用なペプチドのファミリーに関する。これらのペプチドは、ＩＲＥＳで開始されるＲＮＡ翻訳を阻害する。
【０００６】
従って、１つの局面において、本発明は、式Ａ１ｎＡ２ｎＡ３ｎＡ４Ａ５Ａ６Ａ７Ａ８Ａ９Ａ１０Ａ１１Ａ１２Ａ１３Ａ１４Ａ１５Ａ１６Ａ１７Ａ１８（１）のペプチドならびにそのアシル化形態および／またはアミド化形態に関し、
ここで、各々のｎは、独立して０または１であり；
Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、各々独立して、任意のアミノ酸であり；
Ａ４、Ａ１２、およびＡ１７は、独立して、酸性アミノ酸であり；
Ａ１３、Ａ１４、Ａ１５およびＡ１８は、独立して、芳香族アミノ酸であり；
Ａ５、Ａ７、Ａ８、Ａ１１、およびＡ１６は、任意のアミノ酸を表し；
Ａ６、Ａ９、およびＡ１０は、独立して、塩基性アミノ酸または極性中性アミノ酸を表し；
ここで各々のアミノ酸は、Ｌ体、ラセミ形態、またはＤ体であり得、ただし、これらのペプチドは、単離された形態または精製された形態以外では、他の種において存在するようなＬＡＰのホモログを含まない。
【０００７】
アミノ酸Ａ５、Ａ７、Ａ８、Ａ１１、およびＡ１６は、好ましくは独立して、中性の非芳香族アミノ酸を表し、より好ましくは疎水性で中性の非芳香族アミノ酸を表す。
【０００８】
Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、好ましくは中性であり、好ましくは非芳香族アミノ酸であり、好ましくは疎水性である。
【０００９】
さらなる局面において、本発明は、ＩＲＥＳで開始される翻訳を利用するウイルスに感染した無細胞系または生きた細胞系に本発明のペプチドを添加することによって、ＩＲＥＳで開始される翻訳および／または他のウイルス性機能を阻害する方法に関する。本発明はまた、本発明のペプチドまたはその薬学的組成物もしくは獣医学的組成物を用いてウイルス複製を阻害するための方法およびウイルス感染を処置するための方法に関し、そして本発明はまた、これらの薬学的組成物もしくは獣医学的組成物に関する。植物のウイルス感染もまた、本発明のペプチドにより阻害され得、従ってこれらのペプチドおよびそれらをコードするヌクレオチド配列は、農学および園芸学の文脈においても同様に有用である。これらのペプチドは、それ自体添加されても、インサイチュでヌクレオチド配列から作製されてもよい。
【００１０】
ＩＲＥＳ媒介翻訳を利用し、従って本発明のペプチドの適切な標的であるウイルスとしては、ポリオウイルス、リノウイルス、脳心筋炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、古典的ブタコレラウイルス、ウシウイルス性下痢性ウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、モロニーマウス白血病ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２を含むＨＩＶおよびＨＩＶ−２）、Ｐｌａｕｔｉａ  ｓｔａｌｉ腸ウイルス、Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ  ｐａｄｉウイルス、クリケット麻痺ウイルス、カポジ肉腫関連疱疹ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、インフルエンザウイルスＨＡＶ、Ｅｃｈｏウイルス、コクサッキーウイルス、豚コレラウイルス、ブタ水痘性ウイルス、ペストウイルス、およびＰｏｔｙウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
ペプチドおよび／またはそれらをコードするポリヌクレオチドは、他の抗ウイルス剤と組み合わせて添加され得る。詳細には、ＷＯ９６／１１２１１に記載されるＩ−ＲＮＡを有する本発明のペプチドまたはそれらのコードヌクレオチド配列は、特に有用である。しかし、他の抗ウイルス剤が、本発明のペプチドまたはＩ−ＲＮＡと組み合わせた本発明のペプチドと共に投与され得る。
【００１２】
別の局面において、本発明は、本発明のペプチドに特異的に免疫反応性である抗体に関する。これらの抗体（その免疫反応性のフラグメントを含む）は、本発明の阻害性タンパク質を生成するため、ならびに種々の薬学的組成物、獣医学的組成物、および農学的組成物中のそのレベルの評価において有用である。
【００１３】
さらに、本発明のペプチドは、特定の組織（特に肝臓）に優先的に会合する特徴を有する。従って、これらのペプチドは、本発明のペプチドと、特異的な送達が所望される物質とを融合させるかまたはそうでなければ会合させることによって、他の化合物および組成物に特異的な送達系として使用され得る。
【００１４】
（本発明の実施の様式）
本発明のペプチドは、上記の式（１）のペプチドであり、ここで各々のアミノ酸は、上で規定されるように特徴付けられる。示されるように、１位、２位および３位の３つのアミノ酸残基の各々は、独立して、存在しても存在していなくてもよい。最も好ましくは、これらのアミノ酸は、疎水性であるが、一般的には、任意の中性アミノ酸が、置換され得、実際、これらの位置におけるアミノ酸は、活性に重要ではなく、従って、任意のアミノ酸が使用され得る。好ましくは、Ａ１、Ａ２およびＡ３が、このペプチドから欠失される。
【００１５】
１つの例外（Ａ１４はまた、特定の実施形態において中性／極性であり得る）を除いて、このペプチドは、Ａ４、Ａ１２およびＡ１７に酸性アミノ酸を有することが必要とされ、そしてＡ１３、Ａ１４、Ａ１５、およびＡ１８に芳香族アミノ酸を有することが必要とされる。残りの部分は、あまり重要ではない。
【００１６】
保存的置換が、分子の特性を変更することなくなされ得るように、アミノ酸の一般的特徴に従いアミノ酸を分類することは、慣用的である。最も単純なカテゴリーは、酸性アミノ酸および塩基性アミノ酸である。酸性アミノ酸は、生理学的ｐＨで陰性の電荷を有し、そして天然に存在するアミノ酸においてグルタミン酸（ｇｌｕまたはＥ）およびアスパラギン酸（ａｓｐまたはＤ）により表される。
【００１７】
同様に、塩基性アミノ酸は、生理学的ｐＨで陽性の電荷を有し、天然に存在するアミノ酸においてリジン（ｌｙｓまたはＫ）、アルギニン（ａｒｇまたはＲ）およびより低い程度であるがヒスチジン（ｈｉｓまたはＨ）により表される。残りのアミノ酸は、中性であるが、これらの中性アミノ酸は、さらに、下位分類され得る。詳細には、芳香族系を含有するアミノ酸は、「芳香族」アミノ酸の群に配置され得、そして天然に存在するアミノ酸においてトリプトファン（ｔｒｐまたはＷ）、フェニルアラニン（ｐｈｅまたはＦ）およびチロシン（ｔｙｒまたはＹ）により代表される。
【００１８】
天然のアミノ酸の別の下位群は、極性のアミノ酸であり、天然のアミノ酸においてグルタミン（ｇｌｎまたはＱ）およびアスパラギン（ａｓｎまたはＮ）により代表される。しばしば、セリン（ｓｅｒまたはＳ）およびトレオニン（ｔｈｒまたはＴ）もまた、ＯＨの存在に起因して、このカテゴリーに同様にして分類される。
【００１９】
中性アミノ酸の別のサブカテゴリーは、明白に疎水性であるアミノ酸である。天然に存在するアミノ酸の中で、それらのアミノ酸としては、バリン（ｖａｌまたはＶ）、ロイシン（ｌｅｕまたはＬ）、メチオニン（ｍｅｔまたはＭ）およびイソロイシン（ｉｌｅまたはＩ）が挙げられる。しばしば、システイン（ｃｙｓまたはＣ）およびアラニン（ａｌａまたはＡ）、およびグリシン（ｇｌｙまたはＧ）さえもこのカテゴリーに含まれ得る。しかし、これらのアミノ酸の小さいサイズに起因して、これらは、イソロイシン、バリン、およびロイシンほど疎水性ではない。
【００２０】
唯一の残りの遺伝子によりコードされるアミノ酸であるプロリン（ｐｒｏまたはＰ）は、分類するのが困難であるが、明らかに中性である。
【００２１】
本発明のペプチドが、合成で作製され得、そしてヌクレオチド配列から翻訳され得るので、これらのアミノ酸残基を、遺伝子にコードされるアミノ酸に限定する必要性はない。従って、これらのペプチドは、β−アラニン（β−ａｌａ）、３−アミノプロピオン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸（２，３−ｄｉａｐ）、４−アミノ酪酸（４−ａｂａ）、α−アミノ酸イソ酪酸（ａｉｂ）、サルコシン（ｓａｒ）、オルニチン（ｏｒｎ）、シトロリン（ｃｉｔ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ｂｕａ）等のような非天然のアミノ酸を含み得る。これらのアミノ酸は、それらの構造に従って酸性もしくは塩基性に分類され得るか、または中性であり得る。中性形態は、中性／極性または中性／疎水性または中性／芳香族に分類され得る。さらなるカテゴリーは、中性／低分子であり、これは、４個以下の炭素原子を含むアミノ酸を記載する。
【００２２】
一方、これらのペプチドは合成により作製され得るので、天然のペプチド結合は、等配電子の結合（例えば、代表的な例として、ＣＨ２ＮＨ、ＣＨ２Ｓ、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ＝ＣＨ（シスおよびトランス）、ＣＯＣＨ２、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２、およびＣＨ２ＳＯ）により置換され得る。これらの等配電子の置換を用いてペプチド様分子を合成するための手段は、当該分野において周知である。
【００２３】
同様に、本発明の化合物の合成のための合成方法が利用可能であるので、天然に存在するアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸の両方のＤ体ならびにそれらのラセミ混合物が、使用され得る。式（１）の化合物の特に好ましい実施形態は、全ての残基がＤ配置であるアミノ酸を含む。そのような化合物は、生分解に対して耐性であり、従って、特に有効である。
【００２４】
式（１）の化合物により記載される種類は、当該分野において公知であるＬａ抗原結合領域（ＬＡＰ）により表されるペプチドを特異的に排除する。このペプチドは、以下の表１における式で表示されたＬＡＰを有する。表１はまた、番号が割り当てられた天然のＬＡＰの特定のムテインを示す。それはまた、ヒトＬＡＰのホモログにおけるＬＡＰアミノ酸配列を示す。好ましくは、これらのホモログはまた、これらのペプチドが、精製形態もしくは単離形態で提供されるか、または獣医学的組成物、薬学的組成物もしくは農学的／園芸学的組成物の文脈で提供される場合を除いて、本発明の種類から除かれる。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「単離された」とは、「単離された」物質がその天然の環境から取り出された状態をいう。単離される場合、それは、精製されていても精製されていなくてもよいが、天然で会合していた成分の少なくとも幾分かは、除去または置換されている。
【００２６】
【表１】
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式（１）により記載される本発明の化合物において、Ａ４、Ａ１２、およびＡ１７が酸性アミノ酸であることが必須である。これらのアミノ酸の好ましい実施形態は、アスパラギン酸およびグルタミン酸であり、好ましくは、Ａ４およびＡ１２が、グルタミン酸であり、そしてＡ１７がアスパラギン酸である。光学的に単一の形態（ＤまたはＬのいずれか）が、それらの位置に存在していることが好ましい。
【００２７】
Ａ１４が中性／極性であり得ることを除き、Ａ１３、Ａ１４、Ａ１５およびＡ１８が芳香族アミノ酸であることも必須である。好ましい芳香族アミノ酸は、フェニルアラニンおよびチロシンである。好ましいＡ１３およびＡ１４は、チロシンであり、そしてＡ１５およびＡ１８は、フェニルアラニンである。しかし、これらの残基は、例えば、Ａ１３および／もしくはＡ１４がフェニルアラニンでありそしてＡ１５および／もしくはＡ１８がチロシンであるように再構成され得るか、そのような全ての残基がチロシンであり得るか、または全てフェニルアラニンであり得る。
【００２８】
式（１）の化合物中の残りのアミノ酸は、上記のアミノ酸に比べて重要ではない。しかし、特に、Ａ６および／またはＡ９の残基が塩基性アミノ酸または中性の極性アミノ酸であることが好ましい。中性の極性アミノ酸は、好ましくはＡ１０にあるが、塩基性アミノ酸はまた、置換され得る。より好ましくないが、これらの位置のいずれかが、アスパラギンで置換され得る。本発明の範囲に入っているが、グリシン、アラニン、トレオニンまたはセリンによるこれらの位置の置換は、なおより好ましくない。
【００２９】
Ａ７およびＡ３は、存在する場合、好ましくは疎水性アミノ酸であり、最も好ましくは、ロイシン、イソロイシン、バリンまたはメチオニンであり、最も好ましくは、ロイシン、イソロイシンまたはバリンである。Ａ１およびＡ２、ならびに存在する場合、Ａ５は、好ましくは、疎水性であるが、低分子であり、そして例えば、アラニン、システイン、またはグリシンであり、好ましくは、アラニンである。Ａ１６は、好ましくは、グリシンであるが、また低分子アミノ酸（例えば、アラニンまたはセリンまたはトレオニン）でもあり得る。好ましくは、Ａ８は、システインであるが、類似のアミノ酸（例えば、セリン、トレオニン、アラニン、またはグリシン）もまた置換され得る。
【００３０】
式（１）の化合物の特に好ましい実施形態は、ペプチド７０２、ペプチド７６１、およびペプチド６３３である。
【００３１】
ペプチド７０１もまた、好ましい。
【００３２】
上記のような、本発明のペプチドは、当該分野において理解されるような、溶液もしくは固相に基づく標準的な合成技術を用いて作製され得るか、または遺伝子にコードされるアミン酸のＬ異性体からなる場合、組換え産生され得る。これらのペプチドの組換え産生は、市販の器具を用いて容易に合成される合成ポリヌクレオチドを使用し得る。次いで、分泌をもたらすリーダー配列を必要に応じて添加されたコード領域は、発現をもたらす制御配列に予め作動可能に連結されているかまたはこの目的のための外因性制御配列を用いて、宿主細胞において発現され得る。このペプチドは、種々の細胞（原核生物細胞および真核生物細胞（例えば、酵母細胞および哺乳動物細胞）が挙げられる）において産生され得る。これらのペプチドは、所望される場合、動物または植物においてトランスジェニックに産生され得る。
【００３３】
しかし、産生される本発明のペプチドは、Ｎ末端がアシル化（例えば、アセチル化）され、かつ／またはＣ末端が、アミド化（例えば、カルボンキサミドとしてかもしくはカルボン酸残基とアルキルアミドまたはジアルキルアミドとの反応により得られるアミドとして）された形態で提供され得る。そのようなアルキルアミンまたはジアルキルアミンは、好ましくは、６個以下の炭素を有する。
【００３４】
このペプチドの側鎖上のＮ末端もしくはＣ末端、または他の反応基を誘導体化することに加えて、ペプチド自体のアミド結合が、等配電子体（例えば、ＣＨ２ＮＨまたはＣＨ２Ｏ、ＣＨ２ＣＯなど）により置換され得る。そのような偽ペプチドを合成するための方法もまた、当該分野において、十分に理解されている。
【００３５】
本発明のペプチドはまた、それらの薬学的に受容可能な塩として添加されてもよく、また脂質化されていてもグリコシル化されていてもよい。
【００３６】
本発明のペプチド（そのアシル化形態および／またはアミド化形態を含む）は、抗ウイルス治療に使用するための薬学的組成物または獣医学的処方物に処方され得る。ペプチドについてのそのような適切な組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（本明細書中に参考として援用される）に見出される。これらの化合物は、経口、経皮、経粘膜、もしくは他の経路のために処方されても、注射されてもよい。標準的な組成物としては錠剤、カプセル剤、溶液、粉末剤、シロップ剤、ローションなどが挙げられることが当該分野において理解される。そのような処方物に含有される賦形剤としては、リポソームおよび界面活性剤を含む種々のキャリアが挙げられる。ペプチドの投与のための適切な処方および経路は、当業者により理解される。１つの特に適切な処方物としては、このペプチドと標的化薬剤または薬剤（例えば、細胞への組み合わせたペプチドの進入を容易にし得るｔａｔタンパク質）との組み合わせが挙げられる。投与量レベルは、被検体の状態、ウイルス感染の重篤度、および主治医の判断により変化する。処方および投与量の最適化は、場合により医師または獣医の通常の技術の範囲である。
【００３７】
本発明のペプチドについては、可能性のある多くの薬学的／獣医学的組成物の中には、活性成分を所定の速度で放出するための、分解し得るかもしくはし得ないポリマー、または、このペプチドの一定の供給を提供するための他のマトリクスに基づく種々の徐放性系がある。
【００３８】
農学的用途に関して、感染しているかまたは感染している可能性のある植物にこのペプチドを提供するのに適する処方物が使用される。そのような組成物としては、土壌調整組成物、スプレー剤、が挙げられ得るか、または個々の植物に対するより正確な適用が使用され得る。
【００３９】
動物被検体または植物におけるウイルス感染を処置するための本発明の組成物の使用に加えて、ペプチドは、実験室の状態におけるウイルスの感染および複製の機構を研究するために使用され得る。従って、例えば、ウイルス性ｍＲＮＡの種々の改変形態に対するこれらの効果は、無細胞系または細胞培養において評価され得る。これらの状態においてそのようなペプチドを用いるための手段は、周知である。
【００４０】
上記の全ての状態において、処置のために意図される処方物はまた、裸のＤＮＡとしてか、または発現系に含まれてのいずれかとして投与されるコード核酸を用いて、投与され得る。広範な種々の宿主細胞についての発現系の構築は、当該分野において十分に理解されている；発現において重要な機能を果たす適切なプロモーター、エンハンサー、終結シグナルなどが開発されており、これらは、種々の哺乳動物細胞、鳥類細胞、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞などに適する。プロモーターは、構成的でも誘導可能でもよい。従って、発現系は、処置される被検体のために設計される。例えば、哺乳動物被検体のための適切なプロモーターとしては、メタラチオニンプロモーター、種々のウイルス誘導性プロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター）などが挙げられ得る。発現系としては、哺乳動物被検体への投与のために特に簡便なウイルスベクターが挙げられる。特に好ましい実施形態としては、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたは当該分野において理解されているような他のウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター））が挙げられる。これらのベクターは、ウイルスで感染した細胞においてのみベクター自体が複製し、かつタンパク質を産生するように、条件付きで複製するように作製され得る。
【００４１】
ベクターは、ウイルス感染に応答するか、または他の外部化学物質もしくは物理的誘導シグナルに応答して複製および発現するように設計される。これらのベクターはまた、宿主細胞ゲノムに適切な発現系を組み込むための相同配列を含み得るか、またはそうでなければその細胞が分裂するときに複製しそして娘細胞に継代するように設計され得る。多数の適切なベクターが当該分野において公知であり、例えば、ＣＤ３４（＋）細胞の形質導入のために適合した自己不活性化レンチウイルスベクター、およびアデノウイルスベクターと野生型アデノウイルスとの混合物が挙げられる。
【００４２】
上記のように、ペプチドは、他の抗ウイルス剤（ＰＣＴ公報ＷＯ９６／１１２１１に記載されるＩ−ＲＮＡを含む）と組み合わせて投与され得る。「Ｉ−ＲＮＡ」は、本明細書中に記載される内因性の酵母阻害性ＲＮＡの阻害効果を模倣する任意のヌクレオチド配列を意味する。そのような模倣物を含む多数のヌクレオチド配列がＰＣＴ公報に記載される。Ｉ−ＲＮＡの阻害効果は、本質的にヌクレオチド配列の機能であり、従って、このＩ−ＲＮＡは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、または当該分野において周知の代わりの核酸骨格（例えば、ペプチド核酸）として投与され得ることが強調されるべきである。従って、「Ｉ−ＲＮＡ」は、任意の支持骨格に沿って組み合わせられたヌクレオチド配列を含む。実際、ヌクレオチド配列を形成する塩基は、天然に存在するＡ、Ｔ（Ｕ）、Ｇ、Ｃである必要はなく、ネイティブなヌクレオチドの必須の相補的特性を維持するこれらの塩基の改変形態を含み得る。
【００４３】
ウイルス感染を制御するための本発明の方法に有用な多数の組み合わせ組成物が処方され得る。これらは、本発明のペプチドと上で規定されるＩ−ＲＮＡとの組み合わせを含む。Ｉ−ＲＮＡと組み合わせた本発明のペプチドについての発現系の組み合わせ、異なる抗ウイルス剤（例えば、アシクロビル）と組み合わせた本発明のペプチドもしくはその発現系、アンチセンス抗ウイルス配列もしくはその発現系、ウイルス性ＲＮＡを標的化するリボザイムもしくはその発現系、または任意の他の抗ウイルス剤もしくは抗ウイルス剤の組み合わせ。これらの抗ウイルス剤はまた、Ｉ−ＲＮＡと本発明のペプチドとの組み合わせと組み合わせて使用され得る。
【００４４】
なお別の局面において、本発明は、本発明のペプチドに特異的に免疫反応性である抗体に関する。上記のように、これらの抗体は、処方物中のペプチドの濃度を評価するため、および投与後の本発明のペプチドのレベルをモニタリングするために有用である。本明細書中で規定されるように、「抗体」または「免疫グロブリン」とは、例えば、完全な抗体の免疫特異性を保持するＦａｂ、Ｆａｂ’などを含み、そしてこの抗体の組み換え形態（Ｆｖ形態のような単鎖形態）を含む。本発明のペプチドに対する抗体を産生するための方法は、当該分野において周知である；免疫特異性は、本発明のタンパク質に類似するが異なるペプチドと比較した本発明のタンパク質との結合アッセイの結果により確認され得る。１０倍、好ましく１００倍、より好ましくは１，０００倍の結合の差分が、そのような特異性を示す。
【００４５】
本発明の免疫特異的な抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよく、そして組み換え体でも免疫により産生されてもよい。これらは、当該分野において公知の方法を用いて種特異的に改変され得る。従って、所望の場合、例えば、これらの抗体は、ヒト化され得る。
【００４６】
上で規定される本発明のペプチドに特異的な免疫グロブリンは、固体支持体に結合され得、そして本発明のペプチドを精製するために使用され得る。
【００４７】
本発明のペプチドは、特定の組織（特に肝臓）に進むようであるが、これらの自体は、特定の器官または組織に特異的であるさらなるタンパク質または他の組成物にそれらのペプチドを結合することにより所望の位置に標的化され得る。従って、これらのペプチドは、所望の標的受容体に結合するリガンドまたは例えば、細胞表面タンパク質もしくは腫瘍関連抗原と反応性である化合物に結合され得る。
【００４８】
それにも関らず、本発明のペプチドが肝臓組織に進む場合、それらのペプチド自体は、これらの位置に他の組成物を輸送するための送達系として使用され得る。従って、本発明の別の局面は、さらなる化合物の送達系としての本発明のペプチドの使用である。
【実施例】
【００４９】
以下の実施例は、本発明を例示することが意図されるが、それを限定することは意図されない。
【００５０】
（調製Ａ）
（試験化合物の調製）
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅの  ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅＴＭ部位特異的変異誘発キット（番号２００５１８）を用いて、Ｌａの野生型ｃＤＮＡクローン（Ｄｒ．Ｊａｃｋ  Ｋｅｅｎｅ、Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａの好意により提供される）にアミノ酸変化を導入した（Ｃｈａｍｂｅｒｓ、Ｊ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８５）８２：２１１５−２１１９）。組換えタンパク質を、０．４ｍＭのＩＰＴＧを用いて４時間にわたり誘導することによりＥ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ）中で発現させた。これらの細胞を、超音波破砕により溶解し、そしてその溶解物を、４℃で３０分間、遠心分離（１２，０００×ｇ）した。上清を、硫酸ストレプトマイシン（３％最終濃度）で処理し、そして上記のように遠心分離した。上清を、緩衝液Ａ（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ）に対して４℃で一晩透析し、次いで、緩衝液Ａで平衡化したＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｃｅｌカラム上に充填した。フロースルー（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）を、回収し、そしてヘパリンアガロースカラムおよび０〜１ＭのＮａＣｌ勾配を用いるＦＰＬＣを用いて分離した。精製されたＬａまたはＬａ変異体を含むフラクションを、プールし、そして緩衝液Ａに対して透析した。
【００５１】
このペプチドが細胞に進入する能力を試験する実験のために、ペプチドを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＰｒｏｂｅのＦｌｕｏＲｅｐｏｒｔｅｒ（登録商標）ＦＩＴＣタンパク質標識キット（Ｆ−６４３４）を製造者の指示書を若干修正して従い使用してＦＩＴＣ標識した。これらのペプチドの全てを、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｓｙｎ．ｃｏｍ）により合成しそして＞９５％の均一性まで精製した。これらのペプチドを、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に５ｍｇ／ｍｌで溶解し、次いで翻訳アッセイにおいて次で用いられるヌクレアーゼを含まない水を用いて１ｍｇ／ｍｌまで希釈した。ＦＩＦＣ標識のために、これらのペプチドを、ＰＢＳ、ｐＨ８．０に溶解した。
【００５２】
（実施例１）
（インビトロでの翻訳に対する種々のペプチドの効果）
これらの実験において、ｐ２ＣＡＴ（Ｃｏｗａｒｄ，Ｐら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ（１９９２）６６：２８６−２８５）プラスミドＤＮＡを、ＢａｍＨＩを用いて直線状にし、そしてＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロで転写した。転写したｍＲＮＡを、フェノール：クロロホルム抽出およびＥｔＯＨ沈殿を用いて精製した。ＰＶ  ５’ＵＴＲ（ポリオウイルスの５’ＵＴＲのクローン）（Ｄａｓ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８：７２００−７２１１）を、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて直線状にし、そしてα−３２Ｐ  ＵＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）の存在下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写した。放射標識したＲＮＡを、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  ＲＮＡカラム（Ｒｏｃｈｅ）を用いて精製した。
【００５３】
ＨｅＬａ細胞を、１０％の胎仔ウシ血清を添加した最小必須培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）中の単層中で増殖させた。ＨｅＬａ細胞溶解物を、以前に記載されたように調製した（Ｃｏｗａｒｄら、前出；Ｒｏｓｅ，Ｊ．Ｋ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：２７３２−２７３６）。ＨｅＬａ細胞抽出物を用いたｐ２ＣＡＴのインビトロでの翻訳を、他の場所（Ｒｏｓｅら、前出）に実質的に記載される通りに実施した。１μｇのインビトロ転写されたｐ２ＣＡＴ  ＲＮＡを、２５μＣｉの３５Ｓメチオニンおよび４０ＵのＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の存在下で、２５μｌの反応混合物中の８０μｇのＨｅＬａ細胞抽出物において翻訳させた。ペプチドを、反応１回当たり２０μＭ、４０μＭ、および６０μＭの濃度で添加した。陰性コントロールとして、３μｌの希釈した（１：５）１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０もまた試験した。
【００５４】
表１に示されるペプチドについての結果は、以下の通りである：ペプチド７０２（ここでＡ６のリジンおよびＡ９のヒスチジンが、中性の極性アミノ酸グルタミンで置換されている）は、４０μＭおよび６０μＭの濃度でＣＡＴレポータータンパク質の翻訳を阻害するのに効果的であった；しかし、ペプチド７０１（ここで酸性残基部分Ａ４、Ａ１２、およびＡ１７は、全て中性の極性アミノ酸グルタミンにより置換されている）は、これらの濃度で翻訳を阻害する能力を欠損していた。
【００５５】
ペプチド７６１（ここでＡ１、Ａ２、およびＡ３は、極性の中性アミノ酸グルタミンにより置換されている）は、６０μＭで阻害性であり、そして４０μＭでわずかに阻害性であった。しかし、このＡ１〜Ａ３でのこの置換に加えて、Ａ５のアラニンおよびＡ７のイソロイシンがグルタミンにより置換されている場合、このペプチドが翻訳を阻害する能力を欠損していた。
【００５６】
類似の実験において、ペプチド７０３、ペプチド７７１およびペプチド７７２を用いて、Ａ１３位の芳香族アミノ酸以下のうちの１つ以上がグルタミンにより置換された場合、阻害活性はまた欠損していた。従って、これらの実験において、Ａ１３、Ａ１４、Ａ１５およびＡ１８のうちの少なくとも２つの芳香族残基が、置換されていた。
【００５７】
ペプチド６３１、ペプチド６３２、ペプチド７４１およびペプチド６３３におけるように、１つの置換のみがなされた場合も再び、翻訳を阻害する能力が減少した。しかし、より高いレベルの濃度のペプチド６３３およびペプチド６３１はなお、阻害し得た。実際、ペプチド６３１は、４０μＭおよび６０μＭの濃度で阻害し、そしてペプチド６３３は、６０μＭで阻害した。ペプチド６３１において、Ａ１８のみが、グルタミンにより置換されており；従ってペプチド６３３において、Ａ１４が置換されたいた。
【００５８】
従って、Ａ１３、Ａ１４、Ａ１５およびＡ１８は、一般的に、芳香族アミノ酸残基として必須であり、Ａ１４またはＡ１８が中性アミノ酸、好ましくは低分子の中性アミノ酸以外により置換されている場合の実施形態は、本発明の範囲内に含まれる。
【００５９】
（実施例２）
（ｍＲＮＡ自体が結合する能力）
この分析について、３２Ｐ標識されたＰＶ  ５’ＵＴＲ  ＲＮＡ（１×１０６ｃｐｍ）プローブを、組み換え野生型Ｌａまたはその変異体と共に、３０℃で、１０分間インキュベートした。結合の後、この反応は、Ｃａｎｎ（編）、ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（２０００）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ中の（Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｒ．ら）「Ｉｎ−ｖｉｔｒｏ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓｅｓ」、ｐ．１５８−１６４に記載されるように完了した。
【００６０】
標識されたＰＶ５’ＵＴＲ  ＲＮＡを、５００ｎｇ、１μｇまたは１．５μｇの野生型Ｌａ抗原または２つのペプチド７７１もしくはペプチド７７２にＵＶ架橋した。ＲＮａｓｅ消化の後、タンパク質ヌクレオチド複合体をＳＤＳポリアクリルアミド上で分析した。これらの結果は、両方のペプチドの劇的に減少した結合を示した。
【００６１】
類似の実験において、類似の結果が、ペプチド７４１（ここでＡ１３は、チロシンからグルタミンに変更されている）について得られた。Ａ２５がフェニルアラニンからグルタミンに変化した場合およびＡ２４のチロシンがグルタミンに変化した場合、わずかに減少した結合のみが観察された。
【００６２】
（実施例３）
（細胞進入および保持）
これらの実験において、ＦＩＴＣ標識したペプチドを用いた。このペプチドの標識は、上記の調製Ａに記載されている。標識後、これらのペプチドを、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  ＲＮＡカラム（Ｒｏｃｈｅ）を用いて精製した。スライドチャンバー中で増殖したＨｅＬａ細胞またはＨｕｈ−７細胞を、５μＭの各々のペプチドと共に１晩インキュベートした。（肝細胞癌細胞（Ｈｕｈ−７）を、１０％の胎仔ウシ血清を添加したＲＰＭＩ培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）中で増殖させた。）次にこれらの細胞膜を、作用する濃度の１ｍｇ／ｍｌでの１：２００希釈のＤｉＩＣ１８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて２０分間染色し、次いでＰＢＳで３回洗浄した。これらの細胞に、２５μｌのＧｅｌｖａｔｏｌを重ね、そしてカバーガラスでカバーした。これらの細胞を、１００倍の浸油レンズを用いるＬｅｉｔｚ共焦点レーザー走査顕微鏡システムで分析した。
【００６３】
一般的に、これらの結果は、これらのペプチドが細胞に進入しそして保持される能力が、これらのペプチドが翻訳を阻害する能力に比例したことを示した。試験した種々のペプチドについてのこれらの結果の要約を、表２に示す。
【００６４】
【表２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004533823.tif 000024
2004533823.tif 000025