(57)【要約】【課題】韓国産ケンポナシの低級アルコール−不溶性抽出物、それから分離した多糖体、およびそれを含有する抗−肝毒性組成物を提供すること。【解決手段】本発明は、肝保護活性を有する韓国産ケンポナシ（Hovenia dulcis var. koreana NAKAI）の低級アルコール−不溶性抽出物またはそれから分離した多糖体を含む医薬組成物および健康食品を提供する。
2004520384.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥した韓国産ケンポナシの低級アルコール−不溶性分画。
【請求項２】
低級アルコールが、メタノール、エタノールおよびブタノールからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１記載の低級アルコール−不溶性分画。
【請求項３】
低級アルコールがメタノールであることを特徴とする請求項２記載の低級アルコール−不溶性分画。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の低級アルコール−不溶性分画から分離された多糖体。
【請求項５】
乾燥した韓国産ケンポナシの熱水抽出物を得る工程、および得られた熱水抽出物を低級アルコールで抽出して低級アルコール−不溶性分画を得る工程を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の低級アルコール−不溶性分画の製造方法。
【請求項６】
乾燥した韓国産ケンポナシの熱水抽出物を得る工程；得られた熱水抽出物を低級アルコールで抽出して低級アルコール−不溶性分画を得る工程；および得られた低級アルコール−不溶性分画をイオン交換カラムクロマトグラフィーで分離して多糖体を得る工程を含む、請求項４記載の多糖体の製造方法。
【請求項７】
低級アルコールがメタノール、エタノールおよびブタノールからなる群から選ばれることを特徴とする請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
低級アルコールがメタノールであることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
イオン交換カラムクロマトグラフィーが、陽イオン交換樹脂または陰イオン交換樹脂を用いて行われることを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１０】
イオン交換カラムクロマトグラフィーがセファロースＣＬ、バイオゲルＡセファロース型樹脂、フラクトゲルおよびトヨパール樹脂からなる群から選ばれる改良されたビーズ型イオン交換樹脂を用いて行われることを特徴とする請求項９記載の方法。
【請求項１１】
イオン交換カラムクロマトグラフィーがトヨパール樹脂を用いて行われることを特徴とする請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の低級アルコール−不溶性分画または請求項４記載の多糖体、および薬剤学的に許容可能な担体を含む、アルコールジヒドロゲナーゼ阻害用組成物。
【請求項１３】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の低級アルコール−不溶性分画または請求項４記載の多糖体、および薬剤学的に許容可能な担体を含む、肝疾患の予防および治療用の医薬組成物。
【請求項１４】
肝疾患が肝炎または肝硬化であることを特徴とする請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の低級アルコール−不溶性分画または請求項４記載の多糖体、および食品学的に許容可能な添加剤を含む健康食品。
【請求項１６】
前記食品が飲料形態であることを特徴とする請求項１５記載の健康食品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝保護活性を有する韓国産ケンポナシ（Hovenia dulcis var. koreana NAKAI）の低級アルコール−不溶性抽出物およびそれから分離した多糖体を含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
罹病率が増加している肝炎は特効薬がなく、一般的に慢性肝炎、肝硬変または肝癌に発展することになる。患者が、たとえば、ストレス、飲み過ぎ、および／または肝毒性物質にさらされる場合、様々な形態の肝炎に発展することになる。
【０００３】
肝毒性物質としては、四塩化炭素、Ｄ−ガラクトサミン、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ブロモベンゼン、およびアルコールの代謝過程の中間体であるアセトアルデヒドのようなアルデヒドなどを挙げることができる。したがって、前記肝毒性物質から肝を保護し、肝毒性物質によって損傷された肝機能を復元できる新規な薬物を発見するために多くの研究が行われてきた。
【０００４】
たとえば、ケンポナシ（Hovenia dulcis Thunb）の種と実から分離したトリテルペン配糖体成分はヒスタミンの放出および体内でのアルコールの吸収を抑制すると知られており（例えば、非特許文献１参照。）；ケンポナシの実は四塩化炭素またはＤ−ガラクトサミン／リポポリサッカライドによって発生する肝の損傷を抑制すると明らかになった（例えば、非特許文献２参照。）。前記およびその他の従来文献には日本産ケンポナシ（Hovenia dulcis Thunb. var. tomentella Makino）および中国産ケンポナシ（Hovenia dulcis Thunb）の実や種の抽出物の薬効は記述されているが、新規な医薬的活性剤（active agent）の供給源として韓国産ケンポナシ（Hovenia dulcis Thunb. var. Koreana NAKAI）を使用した例は報告されていない。
【０００５】
韓国産ケンポナシは、クロウメモドキ科に属する落葉高木であり、韓国だけの特産種であって、江原道以南地域に分布している。中国産および日本産は花弁が軟緑色であるのに対し、韓国産は花弁が白色であり、果梗（fruit-peduncle）の大きさおよび種の形態が異なることから、韓国産ケンポナシは中国産および日本産のケンポナシと区別される。したがって、韓国産ケンポナシは異なる種に分類されており（例えば、非特許文献３参照。）、それの実や種は口渇および嘔吐治療に使用されてきた（例えば、非特許文献４参照）。
【非特許文献１】Yoshikawa著、1995年発行、Chem. Pharm. Bull. Tokyo, 43(3), pp532-534
【非特許文献２】Hase著、1997年発行、Chem. Pharm. Bull. Tokyo, 20(4), pp381-385
【非特許文献３】Uehara著、1960年発行、JUMOKUDAITSUSETSU, Yumei出版社第２版、pp1072-1074
【非特許文献４】Chung著、1998年発行、DOHAEHYANGYAKDAISAJEON (Plant part)、Youngrim出版社、pp291-292
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明の目的は、韓国産ケンポナシから抽出した医薬的活性物質を提供することである。
本発明の他の目的は、韓国産ケンポナシから前記物質を分離する方法を提供することである。
本発明のまた他の目的は、薬剤学的に許容可能な担体および韓国産ケンポナシから分離した前記物質を含む、アルコールジヒドロゲナーゼおよび乳酸ジヒドロゲナーゼ阻害用医薬組成物を提供することである。
本発明のまた他の目的は、薬剤学的に許容可能な担体および韓国産ケンポナシから分離した多糖体を含む、肝疾患の予防または抑制用医薬組成物を提供することである。
本発明のまた他の目的は、前記物質および／または韓国産ケンポナシから誘導された多糖体を含む健康食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一実施態様によって、本発明では乾燥した韓国産ケンポナシ（Hovenia dulcis  Thunb var. Koreana NAKAI）の熱水抽出物を低級アルコールで処理して得られた低級アルコール−不溶性分画が提供される。
また、本発明では前記低級アルコール−不溶性分画から分離した、肝保護活性効能を有する多糖体が提供される。
ここで、「低級アルコール」とはＣ１〜Ｃ４アルコールを意味し、低級アルコールの例としてはメタノール、エタノール、ブタノールなどを挙げることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の韓国産ケンポナシ抽出物の低級アルコール−不溶性分画は
（１）高圧抽出工程を用いて乾燥した韓国産ケンポナシの熱水抽出物を得る第１工程、および（２）１工程で得られた熱水抽出物を低級アルコールで処理して低級アルコール−不溶性分画を得る第２工程を含む方法によって製造できる。
【０００９】
第１工程では、たとえば、韓国産ケンポナシの果梗を細かく切り、日陰で乾燥した後、適当量の水を加え、これを１１０〜１５０℃、好ましくは１２０〜１２５℃範囲の温度および１〜３気圧、好ましくは１．５気圧に該当する圧力で１５分〜４８時間、好ましくは３０分〜１２時間放置する。次いで、これを室温に冷却し、濾過し、濾液を通常の凍結乾燥方法に従って凍結乾燥して熱水抽出物を得る。
【００１０】
第２工程では、前記から得られた熱水抽出物を室温でさらに乾燥し、減圧（例：１．５気圧）濃縮した後、この濃縮物を低級アルコール、たとえば、メタノール、エタノールまたはブタノール、好ましくは１００％メタノールで抽出して低級アルコール−可溶性成分を除去することにより、目的とする低級アルコール−不溶性分画を得る。
【００１１】
前記で得られた低級アルコール−不溶性分画はゲルパーミエーションクロマトグラフィー法（ＧＰＣ）による平均分子量が１，３３０，０００、１４２，８００、７０，５４０および１０２，４００ピークから構成され、ＩＲ（ＫＢｒ，ｎｍ）スペクトル上でエーテル、フェノール、スルホキシド、ビニル基（１０００−１３００ｎｍ）に該当する吸収ピークを、ＵＶスペクトル上でサイクリック環の吸収ピーク（２００−３００ｎｍ）を有する特性を有する。
【００１２】
前記低級アルコール−不溶性分画は優れた肝保護活性を有する多糖体を含有しており、これは下記のような工程によって分離され得る。
【００１３】
低級アルコール−不溶性分画を蒸留水に溶かした後イオン交換カラムに入れ、０〜５Ｍ塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）水溶液で濃度段階別に順次に溶出させた後、透析、濃縮および凍結乾燥を順次に行う（図１参照）。この際、イオン交換樹脂は陽イオン交換樹脂または陰イオン交換樹脂を使用してもよい。使用され得る交換樹脂としては強酸性陽イオン交換樹脂、たとえば、ＡＧ５０Ｗ−ｘ８、アンバーライト（Amberlite）ＩＲ−１２０およびドウェツクス（Dowex）５０Ｗ−ｘ８；弱酸性陽イオン交換樹脂、たとえば、アンバーライトＩＲＣ−５０、バイオ−レックス（Bio-Rex）７０およびデュオライト（Duolite）−４３６；弱塩基性陽イオン交換樹脂、たとえば、アンバーライトＩＲＡ−６７およびドウェックス３−ｘ４Ａ；強塩基性陽イオン交換樹脂、たとえば、ＡＧ２×８、アンバーライトＩＲＡ−４００およびドウェックス２−ｘ８；改良されたセルロース陽イオン交換樹脂、たとえば、ＣＭ−セルロースおよびＳＥ−セルロース；改良されたセルロース陰イオン交換樹脂、たとえば、ＤＥＡＥセルロース；陽イオンセファデックス型樹脂、たとえば、Ｇ−２５およびＧ−５０ビーズ型架橋結合されたデキストラン樹脂；およびアガロースで製造された改良されたビーズ型イオン交換樹脂、たとえば、セファロースＣＬ、バイオゲルＡセファロース型樹脂、フラクトゲル（Fractogels）およびトヨパール（Toyopearl）などを例として挙げることができる。このうち、トヨパールＤＥＡＥ型交換樹脂が好ましく、トヨパールＤＥＡＥ−６５０Ｃ型交換樹脂がさらに好ましい。
【００１４】
いくつかの多糖体分画は前記のような分離工程を通じて得られ、このうち、０．２Ｍ塩化ナトリウム溶液で溶出された多糖体が最も優れた肝保護活性を示す。この多糖体は、マンノース（１％）を基準とした相対的な糖含量がグルコース２．５１％、ガラクトース１２．５３％、ラマノース１８７％およびアラビノース１３．４３％であり、絶対分子量が１１４，５００であり、ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）スペクトル上では３５５０−３４５０（broad, OH）、１６６０−１６００（Ｃ＝Ｃ）、１２９０−１４２０（＝ＣＨ−ＯＨ）のピークが現われ、１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）スペクトル上では４．４〜４．８ｐｐｍ（糖ピーク）のピークが現われる特性を有する。
【００１５】
様々な実験を通じて、低級アルコール−不溶性分画およびそれから分離した多糖体は優れた肝毒性解消活性を有し、肝疾患の予防および治療に有効であることが明白に分かる。
【００１６】
したがって、本発明の低級アルコール−不溶性分画および多糖体は、肝炎、脂肪肝、肝硬化症のような肝疾患だけでなく、肝毒性などの予防または治療用薬剤として使用され得る。
【００１７】
これにより、本発明は韓国産ケンポナシの低級アルコール−不溶性分画およびそれから分離した多糖体を有効成分とし、薬剤学的に許容可能な賦形剤、担体または稀釈剤を含む、アルコールジヒドロゲナーゼおよび乳酸ジヒドロゲナーゼ阻害用医薬組成物を提供する。また、本発明は前記抽出物および／または多糖体を含む健康食品を提供する。
【００１８】
本発明の医薬剤形は、通常の方法に従って製造することができる。剤形の製造において、活性成分を担体とともに混合または希釈するか、カプセル、におい袋（sachet）またはその他容器形態の担体に封入することが好ましい。担体が希釈剤として働く場合には、活性成分に対するビヒクル、賦形剤または媒質として作用する固体、半固体または液状物質であり得る。したがって、剤形は、錠剤、丸剤、粉末、におい袋、エリキシル、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エーロゾル、軟質または硬質ゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末などの形態であり得る。
【００１９】
適切な担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、スターチ、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラル油などを挙げることができる。剤形は、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。本発明の組成物は、患者に投与された後、活性成分の迅速、遅速または遅延放出を提供するために当業界で公知の方法を用いて剤形化することができる。
【００２０】
さらに、本発明の医薬剤形は、経口、経皮、皮下、静脈または筋肉内投与を含む種々の経路を通じて投与され得る。ヒトの場合、前記韓国産ケンポナシから分離した分画または多糖体の通常の１日投与量は０．０１〜１０ｇ／ｋｇ体重であり、好ましくは１〜５ｇ／ｋｇ体重の範囲であり、１回または数回に分けて投与し得る。しかし、活性成分の実際投与量は治療する疾患、選択された投与経路、患者の年齢、性別および体重、および患者の症状を含む色々な関連因子を考慮して決定され、したがって、前記投与量は本発明の範囲を制限しない。
【００２１】
前述の低級アルコール−不溶性分画およびそれから分離した多糖体は各種の肝疾患および二日酔い予防などの目的に食品または飲料に添加されてもよい。この際、肝疾患の予防を目的に食品または飲料中に添加される前記分画および／または多糖体の量は一般的に健康食品の場合、全食品重量の０．１〜１５重量％、好ましくは１〜１０重量％で添加してもよく、健康飲料の場合、１００ｍｌを基準として１〜３０ｇ、好ましくは、３〜１０ｇの量で添加してもよい。
【００２２】
本発明の健康飲料は通常の飲料のようにその他の成分、たとえば、種々の香味剤、天然炭水化物などを含んでもよい。前記天然炭水化物としては、単糖類、たとえば、ブドウ糖、果糖など；二糖類、たとえば、マルトース、スクロースなど；および多糖類、たとえば、デキストリン、シクロデキストリンなど；および糖アルコール、たとえば、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどを挙げることができる。香味剤としては、天然香味剤、たとえば、タウマチン、レバウジオシドＡ、グリチルリチンなど、および合成香味剤、たとえば、サッカリン、アスパルテームなどを使用してもよい。前記天然炭水化物は一般的に健康飲料の場合、１００ｍｌを基準として１〜２０ｇ、好ましくは５〜１２ｇ範囲の量で添加する。
【００２３】
前記成分の以外に、本発明の食品または飲料組成物は種々の栄養剤、ビタミン、鉱物、合成香料、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸化剤、果汁、野菜汁などを含有してもよい。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を下記参照例、試験例および製造例によってさらに詳細に説明する。ただし、これらは本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【００２５】
参照例１：ゲルパーミエーションクロマトグラフィーによる絶対分子量の測定
ポンプ（Spectra system p2000モデル）、ガードカラム（TSK PWH, Tosoh社）、ＲＩ−感知機（Shodex SE71モデル）、サイズ排除クロマトグラフィー（Size Exclusion Chromatography; SEC）カラム（ＴＳＫゲル３０００ｐｗ、４０００ｐｗ、５０００ｐｗ（７．８×３００ｍｍ、Tosoh社））および、ＭＡＬＬＳ（多角レーザー光散乱、Ｄａｗｎ  ＤＳＰ−Ｆ、Wyatt Technology社））検出器付きのＧＰＣ機器を用い、展開溶媒として０．０２％アジ化ナトリウムに０．１５ＭのＮａＮＯ３を含む溶液を０．５ｍｌ／分の流速で流してＧＰＣを行うことにより分子量を測定した。
【００２６】
参照例２：試薬および材料
乳酸ジヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の量は３４０−ＵＶ分光計（シグマ社）を用いて測定した。肝毒性物質によって損傷された肝の回復能力を有するタンパク質の合成量の測定に用いられる同位元素である３Ｈ−ロイシン（５μＣｉ／plate）、およびＲＮＡの合成量の測定に用いられる同位元素である３Ｈ−ウリジンはシグマ社製のものを用いた。アルコールジヒドロゲナーゼ活性度の測定のための吸光度実験に用いたガスクロマトグラフィーヘッドスペース（Gas chromatography head space）分析法は、ＦＩＤ（Flame Ionization Detector）を取り付けたＨＰ５８９０ガスクロマトグラフィー（米国のヒューレットパッカード社製）で行った。
【００２７】
［実施例１］韓国産ケンポナシの低級アルコール−不溶性分画の製造
京畿道抱川郡ソホル面ジクドン里の国立樹木院で採取して日陰で乾燥した韓国産ケンポナシの果梗１．５ｋｇを１２０℃で３時間高圧（１．５気圧）下で熱水抽出を行った。抽出液をワットマンペーパーで濾過して得られた抽出物（２１８．５ｇ）を凍結乾燥した後、ＨＰＬＣ用純粋メタノール３ｌで１時間ずつ３回環流抽出した。この抽出液を集めて４，０００ｒｐｍで１０〜２０分間遠心分離し、メタノル−可溶性分画１５２．２９ｇ（収率：１０．２７％）およびメタノール−不溶性分画６５．７１ｇ（収率：４．３％）を得た。
【００２８】
［実施例２］韓国産ケンポナシのメタノール−不溶性分画の分析
実施例１で得られたメタノール−不溶性分画の特性を次のように分析した。
【００２９】
（１）溶融温度および溶融エンタルピー測定
溶融温度および溶融エンタルピーを示差走査熱量機（Seiko Instruments Inc. DSC 6100）を用いて測定した。アルミニウム皿にメタノール−不溶性分画試料を入れ、密封して１０℃／分の速度で２０℃から２００℃まで加熱して溶融吸熱曲線を得、溶融温度および試料の結晶性を測定した。
【００３０】
その結果、１６４．９℃で主要なピークの溶融が開始され、１８５．３℃で頂点を示した。このことから、メタノール−不溶性分画はいくつかの成分から構成され、これらはいくつかの炭水化物（溶融温度６０〜１００℃）と微量のタンパク質（溶融温度６０〜１００℃）であると判断される（図２）。
【００３１】
（２）糖鎖分析
前記主要なピーク成分の糖鎖を確認するために、ハコモリ（Hakomori et al）法（J. Biochem. Tokyo, 55, pp205-209. 1964）とウエーゲー（Waeghe, T. J et al.）法（Carbohydrate Research, 123, pp281-304. 1983）に従ってメチル化分析を行った。
【００３２】
すなわち、試料５００μｇをメチル化した後、エタノールを吸着させたＣ１８８×１０カートリッジカラム（セップパック）を用いてメチル化された試料を回収した。メチル化多糖のうち酸性糖残基はＴＨＦに溶解しているＬｉＢ（Ｃ２Ｈ５）３Ｄ（スーパーデュープライド、１ｍｌ、アルドリッチ社）で還元した後、これをさらにＣ１８８×１０カートリッジカラム（セップパック）で回収した。次いで、これを１．０Ｍ  ＴＦＡで１２１℃で２時間加水分解した後ＮａＢＤ４で還元してアセチル化反応を行った。部分的にメチル化されたアルジトールアセテートはＧＬＣとＧＣ−ＥＩＭＳで分析し、ピーク面積はＦＩＤ（Flame ionization detector）で測定した。
【００３３】
（３）ＧＰＣによる分子量測定
参照例１に記載されたようにＧＰＣを行った結果、図３および表１のようにメタノール不溶性分画は４つのピークを有する成分からなることが確認された。
【表１】
2004520384.tif 000003
（４）ＩＲスペクトル（図４）
試料をＩＲ分光計（ベクター２２、Bruker analytische messtechnik GMBH）を用いて分析した（解像度：４．０、ソース：球形、速度：６、１０．０Ｋｈｚ、捕獲モード：二重壁／前方−後方条件）。
ＩＲ（ＫＢｒ，ｎｍ）：エーテル、フェノール、スルホキシド、ビニル基ピーク（１０００−１３００ｎｍ、主要ピーク：１０３９ｎｍ）、芳香環ピーク（６６５、９３９、１３１３、１６６３）、ヒドロキシ基ピーク（３４３５ｎｍ）。
【００３４】
（５）ＵＶスペクトル（図５）
ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計（ＨＰ８４５３モデル、ヒューレットパッカード社）を用いて試料を分析した結果、２００〜３００ｎｍでサイクリック環を示す最大吸収ピークが現われた。
【００３５】
［実施例３］肝保護活性を有する多糖体の分離
実施例１で得られたメタノール−不溶性分画から肝保護活性成分を分離するために、前記メタノール−不溶性分画２００ｍｇを蒸留水に溶かしてトヨパール（Toyo pearl（登録商標））ＤＥＡＥ−６５０Ｃカラム（４．０×３０ｃｍ）に入れた後、０、０．１、０．２、０．３および３Ｍ  ＮａＣｌ溶液で順次に溶出させた。この溶出分画を分子量１０００以下の物質を透過させる透析膜で透析した後、濃縮および凍結乾燥して精製された分画をそれぞれ３８ｍｇ、６４ｍｇ、７３ｍｇ、５ｍｇ、４ｍｇずつ得た。
【００３６】
［実施例４］分離した分画の特性分析
実施例３で得られた０、０．１、０．２、０．３、３Ｍ  ＮａＣｌ溶出によって分離された分画をそれぞれ順次分画１〜５と命名し、これらの総糖類およびポリフェノール成分の含量をフェノール−硫酸法（Dubois, M. et al.; Anal. Chem. 28, pp350〜356, 1956）によって測定し、表２のような結果を得た。
【表２】
2004520384.tif 000004
前記各分画の糖成分を分析するために、ＧＣ分析［Varian CP-3800モデル使用、使用条件−検出器：ＦＩＤ、カラム：ＳＰ−２３８０（３０ｍ×０．２５ｍｍ×０．２μｍ）、カラム温度：２３０℃、注入器温度：２５０℃、検出器温度：２５０℃、移動相：窒素ガス（１．０ｍｌ／分）］を行って各分画に存在するマンノース、グルコース、ガラクトース、ラマノース、アラビノースおよびキシロースの相対的な量を測定した。その結果を表３に示す。
【表３】
2004520384.tif 000005
前記分画のうち、特に分画３が最も優れた肝保護活性を示したが、分画３の追加的な特性は下記の通りである。
【００３７】
分画３の特性分析
参照例１に記載された方法で測定した分画３の絶対分子量は１１４，５００であった（図７）。ＩＲ（ＫＢｒ，ｃｍ−１）分析結果、３５５０−３４５０（ｂｒｏａｄ，ＯＨ）、１６６０−１６００（Ｃ＝Ｃ）、１２９０−１４２０（＝ＣＨ−ＯＨ）のピークが現われた（図８）。１Ｈ−ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）スペクトル上では４．４−４．８ｐｐｍ（糖ピーク）が現われた（図９）。
【００３８】
試験例１：韓国産ケンポナシのメタノール−不溶性分画の肝保護活性
（１）四塩化炭素によって損傷された肝保護活性
５週齢のスプラグダウリー（ＳＤ）ラットから肝を切取った後、組織切断機（ブレンデル／ビトロン社（Brendel/Vitron社）、米国）を用いて直径約０．８ｍｍ、厚さ２００μｍ（湿式重量：１８〜２２ｍｇ）を有するディスク状の切片を製造した。前記切片を４つの群に分け、そのうち、２つの群に実施例１で製造したメタノール−不溶性分画およびメタノール−可溶性分画を２００μｇ／ｍｌの濃度で各々処理した（群３および群４）。次いで、雰囲気をＯ２／ＣＯ２（９５％／５％）に保持しながら、力動力学的器官組織培養機（三洋社、日本）を用いて表面培養した。１時間後、群３、群４および残っている２つの群のうち一群の肝切片に四塩化炭素を４ｍＭの濃度で各々加えた。残りの一群（群１１）には四塩化炭素の代わりに蒸留水を処理して対照群とした。
【００３９】
その後、ボニーら（Bonney et al）の方法（「Some characteristics and function of adult rat liver primary culture, in Gene Expression and Carcinogenesis in Cultured Liver」(1975) Gerschenson, E and Thompson, E. B.(Eds), Academic Press, New York, pp. 24-45）に従ってタンパク質合成量を測定して韓国産ケンポナシ抽出分画の肝毒性解消効能を評価した。その結果、図１０に示すように、メタノール不溶性分画がメタノール可溶性分画より活性が優れていると確認された。
【００４０】
（２）Ｄ−ガラクトサミン／ＬＰＳによって損傷された肝機能復元活性
Ｄ−ガラクトサミンはバクテリアのリポポリサッカライド（ＬＰＳ）とともに投与した場合、生化学的および組織学的にヒトの肝炎と類似する肝損傷を誘発すると知られており、下記のような方法で韓国産ケンポナシメタノール−不溶性分画の肝毒性解消効果を確認した。
【００４１】
四塩化炭素の代わりに、Ｄ−ガラクトサミン５００μＭおよびＬＰＳ１μｇ／ｍｌを用いたことを除いては、前記試験例１と同様な方法で行った。その結果、図１１に示すように、メタノール−不溶性およびメタノール−可溶性分画の両方とも有意義な復元活性を示した。
【００４２】
（３）ブロモベンゼンによって損傷された肝の回復
四塩化炭素の代わりに、１ｍＭブロモベンゼンを用いたことを除いては、前記試験例１と同様な方法を行って韓国産ケンポナシ抽出物の肝毒性解消効能を評価した。その結果、図１２に示すように、メタノール−不溶性分画がメタノール−可溶性分画よりも損傷した肝機能復元効能が優れていると確認された。
【００４３】
また、培養液から流出されるＬＤＨ（乳酸ジヒドロゲナーゼ）の量をシグマキット（Sigma kit）３４０−ＵＶを用いて測定した結果、図１３に示すように、メタノール−不溶性分画がメタノール−可溶性分画よりもブロモベンゼンによって誘導されたＬＤＨ放出に対してより優れた効能を示した。
【００４４】
試験例２：韓国産ケンポナシのメタノール−不溶性分画から分離した多糖体の肝保護活性
５週齢のスプラグダウリー（ＳＤ）ラットから肝を切取った後、組織切断機（ブレンデル／ビトロン社（Brendel/Vitron社）、米国）を用いて直径約０．８ｍｍ、厚さ２００μｍ（湿式重量：１８〜２２ｍｇ）を有するディスク状の切片を製造した。前記切片を７つの群に分け、そのうち、５つの群に実施例４で製造した多糖体を２００μｇ／ｍｌの濃度で各々処理した（群１〜群５）。次いで、雰囲気をＯ２／ＣＯ２（９５％／５％）に保持しながら、力動力学的器官組織培養機（三洋社、日本）を用いて表面培養した。１時間後、群１〜群５および残っている２つの群のうち一群（群６）の肝切片にブロモベンゼンを４ｍＭの濃度で各々加えた。残りの一群（群７）には四塩化炭素の代わりに蒸留水を処理して対照群とした。
【００４５】
その後、ボニーら（Bonney et al）の方法に従ってタンパク質合成量を測定して韓国産ケンポナシの各多糖体分画の肝毒性解消効能を評価した。その結果、図１４に示すように、分核の多糖体が最も優れた活性を有することが確認された。
【００４６】
本発明の低級アルコール−不溶性分画およびそれから分離した多糖体は下記に示すように通常の方法に従って薬剤学的に許容可能な散剤、錠剤、カプセル剤、注射剤および液剤などのような精製形態に製剤化して使用してもよい。
【００４７】
［製剤例１］
実施例１で得られた乾燥抽出物２ｇを乳糖１ｇと混合し、気密パッケージに充填して散剤を製造した。
【００４８】
［製剤例２］
実施例１で得られた乾燥抽出物１００ｍｇ、トウモロコシ澱粉１００ｍｇ、乳糖１００ｍｇおよびステアリン酸マグネシウム２ｍｇを混合した後打錠して錠剤を製造した。
【００４９】
［製剤例３］
実施例１で得られた乾燥抽出物１００ｍｇ、トウモロコシ澱粉１００ｍｇ、乳糖１００ｍｇおよびステアリン酸マグネシウム２ｍｇを混合した後、ゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【００５０】
［製剤例４］
通常の注射剤の製造方法に従い、実施例１で得られた乾燥抽出物１００ｍｇおよびｐＨ調節剤を適量注射用蒸留水に溶解して２ｍｌ容量のアンプルに充填し、滅菌して注射剤を製造した。
なお、下記のような方法で健康食品を製造した。
【００５１】
［健康食品の製造］
玄米、麦、もち米、鳩麦の混合物を日干しし、粉砕して粒度６０メッシュ以下の粉末に作った。黒豆、黒ゴマおよび荏ゴマの混合物を蒸かして日干しし、粉砕して粒度６０メッシュ以下の粉末に作った。
【００５２】
実施例１で得られた韓国産ケンポナシのメタノール−不溶性分画乾燥物を粉砕して粒度６０メッシュ以下の粉末を得、これを前記で製造した穀物類および種実類乾燥粉末と次の比率で配合して顆粒型健康食品を製造した。
【００５３】
穀物類：玄米３０重量％、鳩麦１５重量％、麦２０重量％、
種実類：荏ゴマ７重量％、黒豆８重量％、黒ゴマ７重量％、
韓国産ケンポナシ乾燥粉末：３重量％、
霊芝０．５重量％、地黄０．５重量％
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】韓国産ケンポナシの果梗抽出物のメタノール−不溶性分画を製造する概略的な工程図。
【図２】メタノール−不溶性分画の融点および溶融エンタルピースペクトル。
【図３】メタノール−不溶性分画のＭＡＬＬＳスペクトル。
【図４】メタノール−不溶性分画のＩＲスペクトル。
【図５】メタノール−不溶性分画のＵＶスペクトル。
【図６】メタノール−不溶性分画のＧＣスペクトル。
【図７】メタノール−不溶性多糖体のＭＡＬＬＳスペクトル。
【図８】メタノール−不溶性分画のＩＲスペクトル。
【図９】メタノール−不溶性分画のＮＭＲスペクトル。
【図１０】メタノール−不溶性分画の四塩化炭素で誘導された肝切片におけるインビトロタンパク質合成活性を示すグラフ。
【図１１】メタノール−不溶性分画のガラクトサミン／ＬＰＳで誘導された肝切片におけるインビトロタンパク質合成活性を示すグラフ。
【図１２】メタノール−不溶性分画のブロモベンゼンで誘導された肝切片におけるインビトロタンパク質合成活性を示すグラフ。
【図１３】メタノール−不溶性分画のブロモベンゼンで誘導された肝切片におけるＬＤＨ放出抑制活性を示すグラフ。
【図１４】図７に示す多糖体のブロモベンゼンで誘導された肝切片におけるインビトロタンパク質合成活性を示すグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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