(57)【要約】ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素δサブユニットをコードする遺伝子及びアミノ酸配列及び細菌由来の構造遺伝子が提供される。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット分子を同定するのに有用な抗体及び他の試薬も提供される。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブ有用分子を同定する方法も提供される。候補の抗生物質を同定するためのアッセイにおけるＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニットの使用法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの完全に配列決定されたゲノム由来の細菌のＤＮＡポリメラーゼホロ酵素のδサブユニットを同定する方法であって、
ａ）多数の異なる生物に関する配列情報のデータベースを提供し；
ｂ）必要な反復の数を最小にするのに十分なレベルに包含の閾値（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を設定し；
ｃ）検索される生物を選択するが、その際選択された生物が候補生物であり；
ｄ）基準生物からのδサブユニット蛋白質のアミノ酸配列を提供し；
ｅ）候補生物の配列と基準生物の配列を比較し；
ｆ）公知のＤｎａＸ蛋白質及び公知のδ’蛋白質を後続の工程から除外し；
ｇ）３００から４００のアミノ酸を含む蛋白質を選択し；
ｈ）候補生物からデルタ候補を選択するが、候補生物からのもっとも低いＥスコアを用いて配列を選択することからなり；そして
ｉ）任意に工程ｅ）−ｇ）を繰り返えすことを含むが、その際、候補生物の配列は工程ｈにおいて選択された配列であり、但し、細菌のＤＮＡポリメラーゼホロ酵素のδサブユニット蛋白質を同定してよい、方法。
【請求項２】
包含閾値が０．００１である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
包含閾値が０．００２である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法により同定された細菌のＤＮＡポリメラーゼホロ酵素のδサブユニット蛋白質。
【請求項５】
工程ｃ）の選択が、完全に配列決定されていない、検索データベース中の全ての生物を選択することを含む、請求項１記載の方法によりδ蛋白質を同定することを含む、少なくとも一部配列決定されているゲノムからのδ蛋白質の同定方法。
【請求項６】
少なくとも一つの完全に配列決定されたゲノム由来の細菌のＤＮＡポリメラーゼホロ酵素のδサブユニットを同定する方法であって、
ａ）多数の異なる生物に関する配列情報のデータベースを提供し；
ｂ）必要な反復の数を最小にするのに十分なレベルに包含の閾値を設定し；
ｃ）検索される生物を選択するが、その際選択された生物が候補生物であり；
ｄ）基準生物からのδサブユニット蛋白質のアミノ酸配列を提供し；
ｅ）候補生物の配列と基準生物の配列を比較し；
ｆ）公知のＤｎａＸ蛋白質及び公知のδ’蛋白質を後続の工程から除外し；
ｇ）以下の６つの特性：
ａ．保存された領域１７――（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｙ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＧＸ（Ｄ／Ｅ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――３８からの１０の保存された残基のうちの少なくとも５つを有する；
ｂ．保存された領域６４――（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸ（Ａ／Ｓ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｆ（Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――８２からの１１の保存された残基のうちの少なくとも５つを有する；
ｃ．保存された領域９７――（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸＸ（Ｄ／Ｅ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＫ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――１１７からの１０の残基のうちの少なくとも５つを有する；
ｄ．保存された領域１５４――（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｄ／Ｅ）Ｘ（Ｄ／Ｅ）（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸＸＸＮ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｄ／Ｅ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｒ／Ｋ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――１９１からの１８の保存された残基のうちの少なくとも９つを有する；
ｅ．保存された領域２１５――ＦＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｄ／Ｅ）（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＧ（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＧＸ（Ｄ／Ｅ）Ｐ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――２６０からの２３の保存された残基のうちの少なくとも１１を有する；及び
ｆ．保存された領域２９８――（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸ（Ｄ／Ｅ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸＸＸ（Ｄ／Ｅ）ＸＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｄ／Ｅ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）―３３１からの１２の保存された残基のうちの少なくとも６つを有する；
のうちの少なくとも３つを含む蛋白質を選択し；そして
ｈ）上記閾値を上回る配列を残すが、残された配列がデルタ候補配列であり；そして
ｊ）任意に工程ｅ）−ｇ）を繰り返えすが、但し、候補生物の配列がデルタ候補配列であり、それによりδ蛋白質を同定してよい，方法。
【請求項７】
多数の異なる生物が進化上離れた多数の生物である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
包含閾値が０．００１であり、請求項６記載の方法。
【請求項９】
包含閾値が０．００２であり、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
請求項６記載の方法により同定された細菌のＤＮＡポリメラーゼホロ酵素のδサブユニット蛋白質。
【請求項１１】
工程ｃ）の選択が、完全に配列決定されていない、検索データベース中の全ての生物を選択することを含む、請求項６記載の方法によりδ蛋白質を同定することを含む、少なくとも一部配列決定されているゲノムからのδ蛋白質の同定方法。
【請求項１２】
進化上離れた生物からδ蛋白質を同定し、そして標的生物の配列内で類似の配列の検索を実施することを含む、少なくとも一つの標的生物からδ蛋白質を同定する方法。
【請求項１３】
Ｅ．ｃｏｌｉのδサブユニット蛋白質、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのδサブユニット蛋白質、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓのδサブユニット蛋白質からなる群のメンバーではない、単離された細菌のＤＮＡポリメラーゼδサブユニット蛋白質。
【請求項１４】
プロテオバクテリアのガンマ門のδサブユニット蛋白質及びプロテオバクテリアのベータ門のδサブユニット蛋白質からなる群のメンバーではない、単離された細菌のＤＮＡポリメラーゼδサブユニット蛋白質。
【請求項１５】
グラム陽性細菌のδサブユニット蛋白質である、単離された細菌のＤＮＡポリメラーゼδサブユニット蛋白質。
【請求項１６】
Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ門のδサブユニット蛋白質である、単離された細菌のＤＮＡポリメラーゼδサブユニット蛋白質。
【請求項１７】
Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのδサブユニット蛋白質、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのδサブユニット蛋白質、及びＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのδサブユニット蛋白質からなる群のメンバーである、請求項１５記載の単離された細菌のＤＮＡポリメラーゼδサブユニット蛋白質。
【請求項１８】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ、及びＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのδサブユニット蛋白質からなる群から選択される、単離された細菌のＤＮＡポリメラーゼδサブユニット蛋白質。
【請求項１９】
ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５３，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５６からなる群から選択されるアミノ酸配列；及び
ｂ）ａ）のアミノ酸配列に少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１８記載の単離された細菌のＤＮＡポリメラーゼδサブユニット蛋白質。
【請求項２０】
請求項１８記載のアミノ酸配列によりコードされる蛋白質上の少なくとも一つの抗原決定基に対して特異的に結合することができる抗体。
【請求項２１】
抗体の種類がポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ断片、及びＦａｂ発現ライブラリーからなる群から選択される、請求項２０記載の抗体。
【請求項２２】
免疫コンピテント細胞を、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのδサブユニットの少なくとも一つの抗原部分に暴露することを含む、抗−ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット抗体の生産方法。
【請求項２３】
抗体を回収することをさらに含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ハイブリドーマが生産されるような条件下で免疫コンピテント細胞を不死細胞系と融合させることをさらに含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質を検出する方法であって、
ａ）何れかのオーダーにおいて、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩを含む疑いのあるサンプル、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質の少なくとも一部に特異的に結合できる抗体を提供し；
ｂ）上記サンプルと上記抗体を、抗体がＤＮＡポリメラーゼＩＩＩに結合できる条件下で混合し；そして
ｃ）結合を検出すること
を含む方法。
【請求項２６】
ａ）ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５３，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５６；及び
ｉｉ）ｉ）のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有する蛋白質からなる群から選択される蛋白質；及び
ｂ）ａ）に記載された何れかの核酸分子に完全に相補な単離された核酸分子
からなる群から選択される、単離された核酸分子。
【請求項２７】
核酸分子が、Ａｑｕｉｆｅｘ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｂｕｃｈｎｅｒａ，Ｂｏｒｒｅｌｉａ，Ｃａｍｐｙｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ，Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ，Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ，Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ，Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ，Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ，Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ，Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ，Ｖｉｂｒｉｏ，Ｘｙｌｅｌｌａ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ，Ｙｅｒｓｉｓｎａ，Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｂｏｒｄｅｔｅａｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ，Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ，Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｃｙｔｏｐａｈａｇａ，Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ，Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ，及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａの核酸分子からなる群から選択される、請求項２６記載の核酸分子。
【請求項２８】
核酸分子が、Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂｕｃｈｎｅｒａ，Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ，Ｃａｍｐｙｒｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ，Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｍｕｒｉｄａｒｕｍ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ，Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　２６６９５，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　Ｊ９９，Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｐｒａｅ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｏｔｉ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　ＭＣ５８，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　Ｚ２４９１，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ，Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ，Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ，Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ，Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ　ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ，Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ，Ｘｙｌｅｌｌａ　ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｕｌｍｏｎｉｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｙｅｒｓｉｓｎａ　ｐｅｓｔｉｓ，Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ，Ｂｏｒｄｅｔｅａｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ，Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ　ｔｅｐｉｄｕｍ，Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｕｒａｎｔｉｃｕｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ，Ｃｙｔｏｐａｈａｇａ　ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ，Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ　ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ，Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｒｉｎｕｓ，及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉの核酸分子からなる群から選択される、請求項２７記載の核酸分子。
【請求項２９】
核酸分子が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１００，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４からなる群から選択される、請求項２６記載の核酸分子。
【請求項３０】
請求項２６、２７、２８又は２９記載の細菌のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのｈｏｌＡ核酸分子の少なくとも一部を含む、組換え分子。
【請求項３１】
請求項２６、２７、２８又は２９記載の細菌のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのｈｏｌＡ核酸分子の少なくとも一部を含む、組換え細胞。
【請求項３２】
生物学上のサンプルの中のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニットの少なくとも一部をコードする核酸分子の検出のための方法であって、工程：
ａ）ｈｏｌＡ核酸分子の少なくとも一部を、生物学上のサンプルの核酸物質にハイブリダイゼズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ、そして
ｂ）ハイブリダイゼーション複合体を検出するが、但し、複合体の存在が生物学上のサンプル中のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニットの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドの存在に相関すること、
を含む方法。
【請求項３３】
ｈｏｌＡ核酸分子が請求項２６、２７、２８又は２９記載のｈｏｌＡ核酸分子である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
修飾されたか又は変異されたＤＮＡ；ＩＩＩδサブユニット蛋白質又は遺伝子配列の発現を含む、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニットの発現を検出する方法であって、工程：
ａ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質を含む疑いのある試験サンプルを適宜提供し；そして
ｂ）試験ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニットを、対照中の定量されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニットと比較することにより、サンプル中の試験ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニットの相対濃度を測定すること
を含む方法。
【請求項３５】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物に関してスクリーンする方法であって、
ａ）レプリカーゼ活性に関して許容される条件下で少なくとも一つの試験化合物に、単離されたレプリカーゼを接触させ；
ｂ）試験化合物の存在下でレプリカーゼの活性を評価し；そして
ｃ）試験化合物存在下でのレプリカーゼの活性を、試験化合物不在下でのレプリカーゼの活性と比較するが、その際、試験化合物存在下でのレプリカーゼの活性における変化がレプリカーゼの活性を変調する化合物の指標であること、
を含み、但し上記レプリカーゼが単離されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質を含む、
上記方法。
【請求項３６】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質が、
ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１００，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４；及び
ｂ）ａ）の蛋白質の相同体を含む蛋白質であって、但し、当該相同体は一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換、又は挿入を含む蛋白質をコードし、そして上記蛋白質は細菌複製アッセイにおいて天然δサブユニット蛋白質の機能を遂行する；及び
ｃ）ａ）の何れかの核酸分子に完全に相補な、単離された細菌核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によりコードされる、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
請求項３５又は３６記載の方法により同定されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物。
【請求項３８】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物を同定する方法であって、
ａ）プライムされたＤＮＡ分子、ＤＮＡポリメラーゼαサブユニット、候補化合物、ｄＮＴＰ，及び任意に、βサブユニット、τ複合体、及びβサブユニットとτ複合体の両方からなる群から選択されるメンバーを含む反応混合物を作成することによりレプリカーゼを作成し；
ｂ）候補化合物の不在下で核酸の重合を達成するのに有効な条件に上記反応混合物を供し；そして
ｃ）試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性を、試験化合物不在下でのレプリカーゼの活性と比較するが、その際、試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性の変化がレプリカーゼの活性を変調する化合物の指標であること
を含み、但し、ＤｎａＸ複合体は本発明のδサブユニット蛋白質を含む、
方法。
【請求項３９】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質が、
ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１００，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４；及び
ｂ）ａ）の蛋白質の相同体を含む蛋白質であって、但し、当該相同体は一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換、又は挿入を含む蛋白質をコードし、そして上記蛋白質は細菌複製アッセイにおいて天然δサブユニット蛋白質の機能を遂行する；及び
ｃ）ａ）の何れかの核酸分子に完全に相補な、単離された細菌核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によりコードされる、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
請求項３８又は３９記載の方法により同定されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物。
【請求項４１】
ＤＮＡポリメラーゼを刺激することにおいてＤｎａＸ複合体とβサブユニットの活性を変調する候補薬剤を同定する方法であって、
ａ）プライムされたＤＮＡ（ＳＳＢでコートされていてよい）を、ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼ、βサブユニット、及びτ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）と、候補薬剤、及びｄＮＴＰｓ（又は修飾されたｄＮＴＰｓ）の存在下で接触させることにより反応混合物を形成し；
ｂ）反応混合物を、候補薬剤の不在下で核酸の重合を作用させる条件に供し；そして
ｃ）試験化合物の存在下での核酸の重合を、試験化合物の不在下での核酸の重合と比較するが、その際、試験化合物の存在下での核酸の重合の変化がＤｎａＸ複合体とβサブユニットの活性を変調する化合物の指標であること
を含み、但し、ＤｎａＸ複合体は、本発明のδサブユニットを含む、
方法。
【請求項４２】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質が、
ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１００，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４；及び
ｂ）ａ）の蛋白質の相同体を含む蛋白質であって、但し、当該相同体は一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換、又は挿入を含む蛋白質をコードし、そして上記蛋白質は細菌複製アッセイにおいて天然δサブユニット蛋白質の機能を遂行する；及び
ｃ）ａ）の何れかの核酸分子に完全に相補な、単離された細菌核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によりコードされる、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
請求項４１又は４２記載の方法により同定されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物。
【請求項４４】
βサブユニットとＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）が相互作用する能力を変調する化合物を同定する方法であって、
ａ）βサブユニットを、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）と、上記化合物の存在下で接触させることにより反応混合物を形成させ
ｂ）反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）とβサブユニットが上記化合物の不在下で相互作用するはずの条件下に供し；そして
ｃ）試験化合物存在下での相互作用の程度を、試験化合物不在下での相互作用の程度と比較するが、その際、βサブユニットとＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）の間の相互作用の変化が相互作用を変調する化合物の指標であること
を含み、但し、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）は、本発明のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニットを含む、
方法。
【請求項４５】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質が、
ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１００，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４；及び
ｂ）ａ）の蛋白質の相同体を含む蛋白質であって、但し、当該相同体は一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換、又は挿入を含む蛋白質をコードし、そして上記蛋白質は細菌複製アッセイにおいて天然δサブユニット蛋白質の機能を遂行する；及び
ｃ）ａ）の何れかの核酸分子に完全に相補な、単離された細菌核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によりコードされる、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
請求項４４又は４５記載の方法により同定されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物。
【請求項４７】
ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）がＤＮＡ分子上にβサブユニットを集合させる能力を変調する化合物を同定する方法であって、
ａ）環状のプライムされたＤＮＡ分子（ＳＳＢでコートされていてよい）を、ＤｎａＸ複合体（又はそのサブアッセンブリー）及びβサブユニットと、上記化合物、及びＡＴＰ又はｄＡＴＰの存在下で接触させることにより反応混合物を形成し
ｂ）反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（又はサブアッセンブリー）が候補薬剤の不在下でＤｎａＸ分子上にβサブユニットを集合させる条件に供し；そして
ｃ）試験化合物の存在下でのアッセンブリーの程度を試験化合物の不在下でのアッセンブリーの程度と比較するが、その際、ＤｎａＸ分子上のβサブユニットの量の変化が、ＤｎａＸ文上にβサブユニットを集合させるＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブアッセンブリー）の能力の指標であること
を含み、但し、ＤｎａＸ複合体は本発明のデルタ蛋白質を含む、
方法。
【請求項４８】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質が、
ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１００，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４；及び
ｂ）ａ）の蛋白質の相同体を含む蛋白質であって、但し、当該相同体は一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換、又は挿入を含む蛋白質をコードし、そして上記蛋白質は細菌複製アッセイにおいて天然δサブユニット蛋白質の機能を遂行する；及び
ｃ）ａ）の何れかの核酸分子に完全に相補な、単離された細菌核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によりコードされる、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
請求項４７又は４８記載の方法により同定されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物。
【請求項５０】
ＤｎａＸ分子からβサブユニットを取り外すＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体の一つ又は複数のサブユニット）の能力を変調させる化合物を同定する方法であって、
ａ）上記化合物の存在下でβサブユニットが集合したＤＮＡ分子を接触させることにより反応混合物を形成し；
ｂ）反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸの一つ又は複数のサブユニット又はサブアッセンブリー）が候補薬剤不在下でＤＮＡ分子からβサブユニットを取り外す条件に供し；そして
ｃ）試験化合物の存在下でのアッセンブリーの程度を試験化合物の不在下でのアッセンブリーの程度と比較するが、その際、ＤＮＡ分子上のβサブユニットの量の変化が、ＤＮＡ分子上でβサブユニットを取り外すＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブアッセンブリー）の能力を変調する化合物の指標であることを含み、但し、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブアッセンブリー）がＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニットを含む、方法。
【請求項５１】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質が、
ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１００，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４；及び
ｂ）ａ）の蛋白質の相同体を含む蛋白質であって、但し、当該相同体は一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換、又は挿入を含む蛋白質をコードし、そして上記蛋白質は細菌複製アッセイにおいて天然δサブユニット蛋白質の機能を遂行する；及び
ｃ）ａ）の何れかの核酸分子に完全に相補な、単離された細菌核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によりコードされる、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
請求項５０又は５１記載の方法により同定されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物。
【請求項５３】
ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、τサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合活性を変調する化合物を同定する方法であって、
ａ）ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体サブユニット）を、ＤＮＡ分子の存在下又は不在下の何れかでｄＡＴＰ／ＡＴＰと接触させるか、及び／又は候補薬剤の存在下でβサブユニットと接触させることにより反応混合物を形成させ；そして
ｂ）反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット）が候補薬剤の存在下でｄＡＴＰ／ＡＴＰと相互作用する条件に供し；そして
ｃ）試験化合物の存在下での結合の程度を試験化合物の不在下での結合の程度と比較するが、その際、ｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合の変化が、ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、τサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合活性を変調する化合物の指標であること
を含む方法であり、但し、ＤｎａＸ複合体は本発明のデルタ蛋白質を含む、
方法。
【請求項５４】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質が、
ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１００，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４；及び
ｂ）ａ）の蛋白質の相同体を含む蛋白質であって、但し、当該相同体は一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換、又は挿入を含む蛋白質をコードし、そして上記蛋白質は細菌複製アッセイにおいて天然δサブユニット蛋白質の機能を遂行する；及び
ｃ）ａ）の何れかの核酸分子に完全に相補な、単離された細菌核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によりコードされる、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
請求項５３又は５４記載の方法により同定されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物。
【請求項５６】
ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、τサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合活性を変調する化合物を同定する方法であって、
ａ）ＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、ＤｎａＸ複合体サブユニット）を、ＤＮＡ分子の存在又は不在下でｄＡＴＰ／ＡＴＰと接触させるか、及び／又は候補薬剤の存在下でβサブユニットと接触させることにより反応混合物を形成させ；
ｂ）反応混合物を、ＤＮＡサブユニット（又は複合体）が候補薬剤の存在下でｄＡＴＰ／ＡＴＰを加水分解する条件下に供し：そして
ｃ）試験化合物の存在下での加水分解の程度を試験化合物の不在下での加水分解の程度と比較するが、その際、加水分解されたｄＡＴＰ／ＡＴＰの量の変化がＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、τサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰａｓｅ活性を変調する化合物の指標であること
を含む方法であり、但し、ＤｎａＸ複合体（又はサブユニット）がＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質を含む、方法。
【請求項５７】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質が、
ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１００，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４；及び
ｂ）ａ）の蛋白質の相同体を含む蛋白質であって、但し、当該相同体は一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換、又は挿入を含む蛋白質をコードし、そして上記蛋白質は細菌複製アッセイにおいて天然δサブユニット蛋白質の機能を遂行する；及び
ｃ）ａ）の何れかの核酸分子に完全に相補な、単離された細菌核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によりコードされる、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
請求項５６又は５７記載の方法により同定されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物。
【請求項５９】
ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼの活性を変調する化合物を同定する方法であって、
ａ）任意にＳＳＢによりコートされていてよい環状のプライムされたＤＮＡ分子を、ＤｎａＸ複合体、βサブユニット及びαサブユニットと、上記化合物、及びｄＮＴＰｓ（又は修飾されたｄＮＴＰｓ）の存在下で接触させることにより反応混合物を形成させ；
ｂ）反応混合物を、候補薬剤の不在下で核酸の重合に影響する条件に供し；そして
ｃ）試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性を、試験化合物の不在下でのレプリカーゼの活性と比較するが、その際、試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性の変化が、レプリカーゼの活性を変調する化合物の指標であること
を含む方法であり、但し、ＤｎａＸ複合体がＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質を含む、方法。
【請求項６０】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質が、
ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１００，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４；及び
ｂ）ａ）の蛋白質の相同体を含む蛋白質であって、但し、当該相同体は一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換、又は挿入を含む蛋白質をコードし、そして上記蛋白質は細菌複製アッセイにおいて天然δサブユニット蛋白質の機能を遂行する；及び
ｃ）ａ）の何れかの核酸分子に完全に相補な、単離された細菌核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によりコードされる、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
請求項５９又は６０記載の方法により同定されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物。
【請求項６２】
δサブユニットとδ’及び／又はＤｎａＸサブユニットが相互作用する能力を変調する化合物を同定する方法であって、
ａ）δサブユニットと、δ’サブユニット及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットを、上記化合物の存在下で接触させることにより反応混合物を形成させ；
ｂ）反応混合物を、候補薬剤不在下でδサブユニットとδ’サブユニット及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットが相互作用するはずの条件に供し、
ｃ）試験化合物の存在下での相互作用の程度を試験化合物の不在下での相互作用の程度と比較するが、その際、δサブユニットとδ’サブユニット及び／又はＤｎａＸサブユニットの間の相互作用の変化が相互作用を変調する化合物の指標であること
を含む方法であり、但し、ＤｎａＸ複合体がＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質を含む、方法。
【請求項６３】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質が、
ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１００，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４；及び
ｂ）ａ）の蛋白質の相同体を含む蛋白質であって、但し、当該相同体は一つ又は複数のアミノ酸の欠失、置換、又は挿入を含む蛋白質をコードし、そして上記蛋白質は細菌複製アッセイにおいて天然δサブユニット蛋白質の機能を遂行する；及び
ｃ）ａ）の何れかの核酸分子に完全に相補な、単離された細菌核酸分子
からなる群から選択される核酸分子によりコードされる、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
請求項６２又は６３記載の方法により同定されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物。
【請求項６５】
ＤＮＡ分子を合成する方法であって、
ａ）プライマーを第１のＤＮＡ分子にハイブリダイズさせ；そして
ｂ）上記ＤＮＡ分子を高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼ及び一つ又は複数のｄＮＴＰｓ存在下で上記第１ＤＮＡ分子の全部又は一部に相補な第２のＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件下でインキュベートすること
を含む方法であり、但し、上記高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼはＡｑｕｉｆｅｘ，Ｔｈｅｒｍｕｓ及びＴｈｅｒｍａｔｏｇａのδサブユニット蛋白質からなる群から選択されるδサブユニット蛋白質を含む、方法。
【請求項６６】
上記高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼが、Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、及びＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのδサブユニット蛋白質からなる群から選択される、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
上記高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼが、
ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８１，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０８からなる群から選択される蛋白質；及び；
ｉｉ）ｉ）のアミノ酸配列に９５％の配列相同性を有する蛋白質からなる群から選択される蛋白質
からなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼδサブユニット蛋白質を含む、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
二本鎖ＤＮＡ分子を増幅する方法であって、
ａ）第１及び第２のプライマーを提供するが、但し、第１プライマーは上記ＤＮＡ分子の第１の鎖の３’末端の配列又は近傍の配列に相補性であり、そして第２プライマーは上記ＤＮＡ分子の第２の鎖の３’末端の配列又は近傍の配列に相補性であり；
ｂ）上記プライマーを上記第１の鎖にハイブリダイズさせ、そして上記第２プライマーを上記第２鎖にハイブリダイズさせるが、高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼ存在下で、上記第１鎖に相補な第３のＤＮＡ分子及び上記第２鎖に相補な第４のＤＮＡ分子が合成されるような条件下であり；
ｃ）第１鎖と第３鎖、及び第２鎖と第４鎖を変性させ；そして
ｄ）工程ａ）からｃ）を１回又は複数回繰り返えすこと
を含む方法であり；但し、上記高温安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ａｑｕｉｆｅｘ，Ｔｈｅｒｍｕｓ及びＴｈｅｒｍａｔｏｇａのδサブユニット蛋白質からなる群から選択される、方法。
【請求項６９】
上記高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼが、Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、及びＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのδサブユニット蛋白質からなる群から選択される、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
上記高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼが、
ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８１，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０８からなる群から選択される蛋白質；及び；
ｉｉ）ｉ）のアミノ酸配列に９５％の配列相同性を有する蛋白質からなる群から選択される蛋白質
からなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼδサブユニット蛋白質を含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
核酸配列を増幅する方法であって、
ａ）ローリングサークル複製プライマーを一つ又は複数の増幅標的サークルと混合することにより、プライマー−増幅標的サークル混合物を生成し、そして当該プライマー−増幅標的サークル混合物を、プライマー−増幅標的サークル混合物中の増幅標的サークルとローリングサークル複製プライマーの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベートするが、但し、増幅標的サークルは各々プライマー相補部分を含む一本鎖の環状ＤＮＡ分子を含み、そして当該プライマー相補部分はローリングサークル複製プライマーに相補であり；そして
ｂ）高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼをプライマー−増幅標的サークル混合物と混合することにより、レプリカーゼ−増幅標的サークル混合物を生成し、そしてレプリカーゼ−増幅標的サークル混合物を、増幅標的サークルの複製を促進する条件下でインキュベートするが、但し、増幅標的サークルの複製がタンデム配列のＤＮＡの形成をもたらし、そして上記高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼがＡｑｕｉｆｅｘ，Ｔｈｅｒｍｕｓ及びＴｈｅｒｍａｔｏｇａのδサブユニット蛋白質からなる群から選択される
ことを含む、方法。
【請求項７２】
上記高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼが、Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、及びＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのδサブユニット蛋白質からなる群から選択される、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
上記高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼが、
ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８１，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０８からなる群から選択される蛋白質；及び；
ｉｉ）ｉ）のアミノ酸配列に９５％の配列相同性を有する蛋白質からなる群から選択される蛋白質
からなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼδサブユニット蛋白質を含む、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼがＥ．ｃｏｌｉのＤｎａＢヘリカーゼの相同体を含む、請求項７１記載の方法。
【請求項７５】
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５３，及びＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５６からなる群からのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む一つ又は複数のポリペプチドを利用することを含む、ＤＮＡ合成方法。
【請求項７６】
鋳型及びヌクレオチドを含む成分を含む反応混合物を何れかの順序で提供し、そしてＤＮＡ合成が得られるのに十分な長さの時間及び温度において反応混合物をインキュベートすることをさらに含む、請求項７５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細菌由来のＤＮＡポリメラーゼホロ酵素δサブユニット及び構造遺伝子をコードする遺伝子の配列及びアミノ酸配列に関する。本発明は、ＤＮＡポリメラーゼδサブユニット分子を同定するために有用な抗体及び他の試薬も提供する。本発明は、δサブユニットの様々な用途のための方法も提供し、ＤＮＡ複製において及びＤＮＡ複製の変調剤の同定におけるそれらの用途を含む。本発明は、ＤＮＡ合成及び増幅における使用のための好熱性生物のδ蛋白質も提供する。
【０００２】
発明の背景
マクロ分子合成の多くの他の複雑な機構のように、ＤＮＡ複製の基本的な機構は生物を通して保存されている。合成の化学及び方向、ＲＮＡプライマーに関する要求性、ラギング鎖上のオカザキフラグメントによる半不連続複製の機構及びよく定義されたオリジンに関する要求を共にする（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．ａｎｄ　Ｂａｋｅｒ，Ｔ．Ａ．ＤＮＡ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ＷＨ　Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９２））。複製装置の基本的な特性も共にする。全てのレプリカーゼは、主として、残りの複製装置との特異的な蛋白質−蛋白質相互作用に参加するその能力によりその他とは区別される複製ポリメラーゼからなる。全ての原核細胞は３つのポリメラーゼを有する；真核生物は少なくとも５つ有する。しかし、これらのポリメラーゼのサブユニットのみがレプリカーゼ触媒サブユニットとして機能できる（表１）。真核生物においては、δポリメラーゼがリーディング鎖のポリメラーゼであり、そしてεがラギングであると提案されているが（Ｂｕｒｇｅｒｓ，Ｐ．Ｍ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２２６９８−２２７０６（１９９１）；Ｎｅｔｈａｎｅｌ，Ｔ．ａｎｄ　Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｇ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：５９１２−５９１８（１９９０））、Ｅ．ｃｏｌｉにおいては、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのαサブユニットが唯一のポリメラリゼーションサブユニットとして機能する。鍵となる別のレプリカーゼ成分はいわゆるβスライディングクランプであり、レプリカーゼ上での高いプロセッシビティーを授与する。プロセッシビティーは、鋳型結合−触媒−解離事象あたりで挿入されるヌクレオチドの数として定義される。βはＤＮＡの周囲を締める（ｃｌａｍｐ）ブレスレット形の分子からなることにより、ＤＮＡを迅速にスライドダウンすることを許容するが、解離することを許容しない。クランプは蛋白質−蛋白質相互作用によりポリメラーゼに接触して、鋳型から離れて落ちることを妨害し、高いプロセッシビティーを保証する。２つの代表的な原核及び真核のスライディングクランプは、それぞれβとＰＣＮＡである。酵母のＰＣＮＡとＥ．ｃｏｌｉのβの結晶構造は、ほぼ重ね合わせが可能である（Ｋｏｎｇ，Ｘ．Ｐ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　７９：１２３３−１２４３（１９９４）；Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｔ．Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ　７９：１２３３−１２４３（１９９４））。細菌及び真核生物の両方において、５つの蛋白質の複合体がＡＴＰ依存性反応におけるプライマー末端上へのスライディングクランプの移動に必須である（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｈ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：５９４−６０２（１９９１）；Ｂｕｎｚ，Ｆ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：１１０１４−１１０１８（１９９３））。サブユニットのいくつかは、真核生物間及びグラム陰性及び陽性原核生物の両方の間で認識可能な配列相同性を呈し、そして類似の機構により作用すると予測されるはずである（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：３８１２−３８２２（１９９３）；Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ���　Ｒｅｓ．２１：１−３（１９９３））。
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素は染色体の大多数の合成に必須の、Ｅ．ｃｏｌｉの複製用ポリメラーゼである（総説として、Ｋｅｌｍａｎ，Ｚ．ａｎｄ　Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６４：１７１−２００（１９９５）を参照）。当該酵素の複製における役割は、生化学及び遺伝学の両方の基準により確立されてきた。ホロ酵素は生化学上定義されており、天然染色体アッセイを用いて精製された。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのホロ酵素形態のみが、他の公知の複製用蛋白質の存在下でインビトロにおいて一本鎖バクテリオファージを有効に複製する（Ｗｉｃｋｎｅｒ，Ｗ．ａｎｄ　Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７０：３６７９−３６８３（１９７３）；Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．ａｎｄ　Ｗｉｃｋｎｅｒ，Ｓ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７１：６−１０（１９７４）；ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄ　Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２：６４７８−６４８４（１９７７））。ホロ酵素のみがバクテリオファージλプラスミド及びＥ．ｃｏｌｉ複製オリジンｏｒｉＣを含む分子の複製において機能する。ホロ酵素は、分子量がそれぞれ１２９，９００，７１，０００，４７，４００，４０，６００，３８，７００，３６，９００，２６，９００，１６，６００，１５，０００及び８，８００の、１０のサブユニット：α、τ、γ、β、δ、δ’、ε，ψ、χ及びθを含む。
【０００４】
【表１】
2004508018.tif 000002
【０００５】
遺伝学の研究は、ｐｏｌ　ＩＩＩホロ酵素に対する主要な複製における役割の割り当ても指示する。α触媒サブユニットの構造遺伝子であるｄｎａＥの温度感受性変異体は、条件致死性である（Ｇｅｆｔｅｒ，Ｍ．Ｌ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．６８：３１５０−３１５３（１９７１））。同様に、温度感受性の条件致死性の変異体が、βプロセッシビティー因子、ＤｎａＸ蛋白質及びε校正エキソヌクレアーゼを各々コードするｄｎａＮ，ｄｎａＸ及びｄｎａＱ遺伝子に関して単離された（Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，Ｙ．ａｎｄ　Ｍｉｚｕｋａｍｉ，Ｔ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１７８：５４１−５５３（１９８０）；Ｃｈｕ，Ｈ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３２：１５１−１５８（１９９７）；Ｈｅｎｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　９２：１０４１−１０５９（１９７９）；Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｔ．ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６３：２７７−２８３（１９７８））。最後のホロ酵素サブユニットの構造遺伝子は逆転遺伝学のアプローチにより同定された（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．，（１９９３），同じ箇所；Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：７０１３−７０２５（１９９２）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４１：３９９−４０８（１９９３）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：３２８１−３２８６（１９９３）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５：５６０４−５６１０（１９９３）；Ｄｏｎｇ，Ｚ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１７５８−１１７６５（１９９３）；Ｘｉａｏ，Ｈ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１１７７３−１１７７８（１９９３））。これらは、それぞれ、δ、δ’、χ、ψ及びθ遺伝子に関して、ｈｏｌＡ，ｈｏｌＢ，ｈｏｌＣ，ｈｏｌＤ，及びｈｏｌＥと命名した。
【０００６】
エキソヌクレアーゼには少なくとも３つの異なるポリメラーゼが存在するが、ｐｏｌ　ＩＩＩホロ酵素のみが主要な複製の役割を担うと考えられる。複製においてその唯一の役割を授与するｐｏｌ　ＩＩＩホロ酵素の特別な特徴とは何であろうか？これまでの仕事は、素早い複製速度、高いプロセッシビティー、塩の生理レベルに対する耐性及び複製装置の他の蛋白質特徴とは相互作用する能力が、全てその唯一の機能に必須であることを示唆する。対照的に、他の非複製ポリメラーゼ、例えばＤＮＡポリメラーゼＩはインビトロにおいてもインビボにおいてもレプリカーゼを有効に置き換えることはできない（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，ａｎｄ　Ｂａｋｅｒ，同じ箇所）。これは、それらの低いプロセッシビティー、それらのゆっくりとした反応速度、及びそれらが他の複製蛋白質と相互作用できないために複製フォークにおける同調した反応の触媒が不可能なためである。
【０００７】
複数のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの形態−ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素は一連の連続した単純な形態に生化学上分解することができる。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのコアは、ε（校正サブユニット）とθに強固に結合したα触媒サブユニットを含む。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ’はコア＋τ（ＤｎａＸ）を含む。ＤｎａＸ蛋白質はＥ．ｃｏｌｉにおいて２つの関連する蛋白質γ（４７．４ｋＤａ）及びτ（７１ｋＤａ）として出現する（Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ，Ｚ．ａｎｄ　Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７７９０−１７７９５（１９８９））。γはτのアミノ末端の５／７を表す。上記２つの蛋白質は、この明細書においては、ほとんどの目的に関してほぼ機能上交換可能であり、そしてほとんどの目的に関して識別できない。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ＊はｐｏｌ　ＩＩＩ’＋γ，δ−δ’，χ−ψを含む。ホロ酵素はｐｏｌ　ＩＩＩ＊＋βからなる。
【０００８】
プロセッシビティー−複数のポリメラーゼＩＩＩ形態のプロセッシビティーの研究は、サブユニットの個々の寄与を解明した（Ｆａｙ，Ｐ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：９７６−９８３（１９８１）；Ｆａｙ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：５６９２−５６９９（１９８２））。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの複数の形態が厳密に異なるプロセッシビティーを呈する。コアのｐｏｌ　ＩＩＩは低イオン強度において低いプロセッシビティー（計算値．１０塩基）を有し、より生理的な条件下では完全に分配的に低下する（プロセッシビティー＝１）。プロセッシビティーは、τＤｎａＸサブユニットの添加により増強されて、ｐｏｌ　ＩＩＩ’を形成する。ｐｏｌ　ＩＩＩ’はコアのｐｏｌ　ＩＩＩを阻害する試薬であるスペルミジンの生理濃度の存在下で最大のプロセッシビティーを達成する。γ、δδ’及びχψのｐｏｌ　ＩＩＩ’への添加によりｐｏｌ　ＩＩＩ’を形成することが、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ＳＳＢ）の存在下においてプロセッシビティーをさらに増加させる。上記ホロ酵素はそのサブアッセンブリーの何れよりも桁違いに大きなプロセッシビティーを呈する。一本鎖ファージを用いた、注意深く制御された実験において、完全な鋳型（８０００ヌクレオチドまで）を単一進行事象において１５秒下で３０℃において合成させる（Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｏ．ａｎｄ　ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，（１９８２）同じ箇所）（２２℃において１分（Ｆａｙ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，（１９８１），同じ箇所））。ホロ酵素がプライモソーム成分と作用する、カップリングされた複製フォーク系においては、１５０−５００ｋｂのプロセッシビティーが直接観察された（Ｗｕ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：４０６４−４０７３（１９９２））。これらの生成物は５００−７００ヌクレオチド／秒の速度で合成されることから、計算上は３分で１００，０００塩基の合成を可能にする。即ち、対応する酵素形態の構造上の複雑性に匹敵するプロセッシビティーの進歩が観察される。比較目的のため、細菌のＤＮＡポリメラーゼＩクラスの「修復タイプ」のポリメラーゼのプロセッシビティーは典型的には１５−５０塩基である（Ｂａｍｂａｒａ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：４１３−４２３（１９７８））。
【０００９】
イニシエーション複合体形成−高いプロセッシビティーを達成するため、ホロ酵素はＡＴＰとプライムされたＤＮＡを必要とすることにより安定なイニシエーション複合体を形成する（Ｆａｙ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，（１９８１）同じ箇所）。イニシエーション複合体はゲル濾過により単離することができ、そしてｄＮＴＰｓの添加に際して、たえず解離しなくても１０−１５秒で完全なＲＦＩＩを形成する（Ｗｉｃｋｎｅｒ，Ｗ．ａｎｄ　Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，同じ箇所；Ｈｕｒｗｉｔｚ，Ｊ．ａｎｄ　Ｗｉｃｋｎｅｒ，Ｓ．，同じ箇所；Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｏ．ａｎｄ　ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０９８４−１０９９０（１９８０））。イニシエーション複合体形成は、複製活性の抗βＩｇＧ耐性への変換として実験上監視できる（Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｏ．ａｎｄ　ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，（１９８２）同じ箇所；Ｊｏｈａｎｓｏｎ，Ｋ．Ｏ．ａｎｄ　Ｍｃｈｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，（１９８０）同じ箇所）。βは伸長合成に参加する；抗体耐性は複合体中のβの侵入により生じることから、抗体結合を立体上排除する。この観察に一致して、Ｍ．Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌの研究室は、βのカルボキシル末端に融合させたキナーゼ認識ペプチドが溶液中において迅速にリン酸化されるがイニシエーション複合体中ではされないことを見いだした（Ｓｔｕｋｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｔ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　７８：８７７−８８７（１９９４））。
【００１０】
βスライディングクランプの構造−Ｋｕｒｉｙａｎ，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ及び共同研究者（Ｋｏｎｇ，Ｘ．Ｐ．，ｅｔ　ａｌ．，（１９９４）同じ箇所）により解明されたβのＸ線結晶構造は、その機能に関しての単純で精密な説明を提供する。βのダイマーはブレスレット様構造を形成するが、おそらくは中心の穴にＤＮＡを通し、それでＤＮＡを素早くスライドダウンさせるが、容易に解離することを妨害する。βと他の複製複合体成分の間の蛋白質−蛋白質の接触は、ポリメラーゼをＤＮＡにつなぎ止め、それによりプロセッシビティーを増加させる。強固に締められたブレスレットは、容易にはＤＮＡと結合するとは予測されないはずである。これは、プライマー末端を認識してＤＮＡの周囲でβブレスレットを開いたり閉じたりするための、エネルギー依存性クランプセッティング複合体、ＤｎａＸ複合体に関する要求を説明する。
【００１１】
ＤｎａＸ複合体：プライムされたＤＮＡ上でβスライディングクランプをセットする装置−ＤｎａＸ蛋白質はその末端近傍にコンセンサスＡＴＰ結合部位を含み（Ｙｉｎ，Ｋ．Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１４：６５４１−６５４９（１９８６））、δ−δ’及びχ−ψと協調してＡＴＰに結合して加水分解するために使用されて、プライマー末端上のβのプロセッシビティークランプをセットする。ＤｎａＸは計算上２μＭの解離定数によりＡＴＰを結合し（Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ，Ｚ．ａｎｄ　Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．（１９８９）同じ箇所）、ＤＮＡ依存性ＡＴＰａｓｅである（同じ箇所；Ｌｅｅ，Ｓ．Ｈ．ａｎｄ　Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：２７１３−２７１７（１９８７））。プライマー末端はＡＴＰａｓｅのもっとも活性なエフェクターであるらしい（Ｏｎｒｕｓｔ，Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２１６８１−２１６８６（１９９１））。ＤｎａＸ（τ）は、αサブユニットＤＮＡポリメラーゼＩＩＩコアを結合し、そしてそれをダイマーにさせ、ダイマーの足場を形成して、他の付随蛋白質が集合することによりダイマー複製複合体を形成できる。インビトロにおいては、τＤｎａＸサブユニットが、プライムされたＤＮＡ上にβを負荷するように機能する「τ−複合体」（τ−ψ−χ−δ−δ’）を容易に形成できる（Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｈ．Ｇ．ａｎｄ　ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９５６３−２９５６９（１９９５）；Ｏｎｒｕｓｔ，Ｒ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３３４８−１３３５７（１９９５）；Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９５５５−２９５６２（１９９５））。ＤｎａＸの化学量論は複雑であり（ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）、そして３コピーのＤｎａＸ蛋白質と各１つの付属サブユニットを有することがわかった（ＤｎａＸ３δ１δ’１χ１ψ１）（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ａ．，Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｇ．，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｂ．ａｎｄ　ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．（２０００）ＥＭＢＯ　Ｊ１９：６５３６−６５４５）。
【００１２】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の構造−図１はホロ構造サブユニット−サブユニット相互作用に関する現在の作業仮説を示す。αとεは、混合により分離可能な複合体を形成する（Ｍａｋｉ，Ｈ．ａｎｄ　Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４３８９−４３９２（１９８７））。εの構造遺伝子内の変異は、ｄｎａＥ（α）変異を抑圧することも見いだされた（Ｍａｕｒｅｒ，Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１０８：２５−３８（１９８４））。抑圧性変異は、おそらく、抑圧された変異遺伝子産物と直接相互作用するサブユニットの修飾を通して生じる。ｐｏｌ　ＩＩＩコア（αεθ）は分離可能である（ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄ　Ｃｒｏｗ，Ｗ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：１７４８−１７５３（１９７９））。ＤｎａＸ（τはｐｏｌ　ＩＩＩコアとの複合体中で単離可能である（ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２６５７−２６６３（１９８２））。抑圧因子のデータはＤｎａＸとβの間の相互作用を示唆するが（Ｅｎｇｓｔｒｏｍ，Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１１３：４９９−５１６（１９８６））、直接の相互作用はいまだ生化学上は証明されていない。δ及びδ’の存在下でのＤｎａＸはβをプライムされたＤＮＡに輸送することにより、前イニシエーション複合体を形成させる（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．ａｎｄ　Ｓｔｕｄｗｅｌｌ，Ｐ．Ｓ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１７９−１１８７）。抑圧因子のデータは、βとαの間の相互作用（Ｋｕｗａｂａｒａ，Ｎ．ａｎｄ　Ｕｃｈｉｄａ，Ｈ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：５７６４−５７６７（１９８１））、βがコアｐｏｌ　ＩＩＩと相互作用してコアｐｏｌ　ＩＩＩのプロセッシビティーを増加させる能力により支持される概念（Ｌａｄｕｃａ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：７５５０−７５５７（１９８６））及びα触媒サブユニットのカルボキシル末端ドメインとβとの相互作用の観察（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ　ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０６９９−２０７０４（１９９６））を示す。α−α相互作用に関して及びｐｏｌ　ＩＩＩホロ酵素のダイマーの性質に関しての遺伝学上の証拠は、ｄｎａＥ１０２６及びｄｎａＥ４８６又はｄｎａＥ５１１の間の対立遺伝子間の相補性を通して得られた（Ｂｒｙａｎ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，”ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ＩＩＩ　ｉｓ　Ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”ＤＮＡ　Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｍｏｓｅｓ，Ｒ．＆　Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｗ．編纂、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣの中）−この相互作用が起これば、それは弱いに違いなく、他のサブユニットの存在を必要とするが、それはα−α相互作用がインビトロにおいて観察されるからである。χとψはＤｎａＸとの複合体の中で単離された（Ｏｌｓｏｎ，Ｍ．Ｗ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９５７０−２９５７７（１９９５）；Ｏ’Ｄｏ��ｎｅｌｌ，Ｍ．ａｎｄ　Ｓｔｕｄｗｅｌｌ，Ｐ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１７９−１１８７（１９９０））。δとδ’はそれら自身は溶液中で弱く相互作用することができ、そして共にＤｎａＸと相互作用できる（Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｈ．Ｇ．ａｎｄ　ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２９５６３−２９５６９（１９９３））。ψとδ’はＤｎａＸに直接相互作用するサブユニットであることが明白である（Ｏｎｒｕｓｔ，Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３３４８−１３３５７（１９９５））。直接のδ−β相互作用は検出されている（Ｎａｋｔｉｎｉｓ，Ｖ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３３５８−１３３６５（１９９５））。ホロ酵素中には３コピーのＤｎａＸ蛋白質が存在する（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，（２０００）同じ箇所）。
【００１３】
ポリメラーゼ鎖反応−ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）は分子生物学に多大な貢献をもたらした。それは、複合したゲノム調製物からの直接のＤＮＡ増幅のため、直接配列決定分析のため、変異の検出又は診断のため、病原体の診断上及び法廷における分析のため、そして分子生物学の研究において使用される様々な操作のために有用である（Ａｒｎｈｅｉｍ，Ｎ．ａｎｄ　Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：１３１−１５６（１９９２））。そのもっとも単純な形態において、反応は３つの工程を含む：（１）標的ＤＮＡを熱により変性して一本鎖にする。（２）増幅される配列の周囲のオリゴヌクレオチドをアニールさせる。計算上２０ヌクレオチドの配列が通常は特定の遺伝子の増幅のために要求される特異性を提供する。ゲノム配列が公知なら、特異性を増加させ且つゲノム上のどこかの相補性の部分的な領域を避けるために、配列を選択することができる。溶液の条件もストリンジェンシーに影響するように変更することができる。（３）好熱性ＤＮＡポリメラーゼは、第２のプライマー結合部位をすぎて複製が起こるまでプライマーを伸長合成する。第３工程は、生成物が単離及び分析を許容するのに十分豊富になるまで繰り返され、典型的には２５−３０サイクルである。
【００１４】
上記方法の主要な制限は、プライマーを分離するＤＮＡの全長を越えて複製が起こらなければならないという要求である。これは、１０ｋｂを越える範囲で天然配列のＤＮＡにより、そして実用上の目的のためしばしば短い領域にわたり、重大な制限を導入する。革新は、うまくセットアップされた研究室により３０−４０ｋｂまでＰＣＲ増幅を可能にさせた。多数の溶液条件が増幅された各配列に関して最適化されなければならないが、主な寄与は、好熱性ポリメラーゼ混合物中の厚生ポリメラーゼの包含による（Ｂａｒｎｅｓ，Ｗ．Ｍ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：２２１６−２２２０（１９９４）；Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：５６９５−５６９９（１９９４））。おそらく、３’→５’校正エキソヌクレアーゼはほとんどのＤＮＡポリメラーゼにより伸長合成されない誤って取り込まれた塩基を除去する。多くの研究室はこの方法が実用に適合させる困難を見いだし（Ｈｅｎｇｅｎ，Ｐ．Ｎ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１９：３４１−３４２（１９９４））、エキスパート研究室においてさえ、２０ｋｂを越える全ての配列を増幅できなかった（Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１）５６９５−５６９９（１９９４））。これらの系において使用される好熱性ユーバクテリアのＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼクラスＩのものであり（Ｌａｗｙｅｒ，Ｆ．Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：６４２７−６４３７（１９８９））極めて長い配列の増幅のための限定されたプロセッシビティーと限定された有効性を有すると予測される。始原細菌のＤＮＡポリメラーゼはよく定義されていない。しかしながら、使用されたポリメラーゼは細胞内でもっとも豊富であり、そして真核生物系及び原核生物系の両方に対する類似性により、限定されたプロセッシビティーの豊富な修復クラスのポリメラーゼであると予測される。強固なプロセッシブな好熱性ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素は高い分子量のＤＮＡの増幅のための実用的な応用を開発させ得るべきである。
【００１５】
好熱性生物由来のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素
好熱性ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のサブアッセンブリーが単離されたことから、長い間単離の試みを回避してきた好熱性レプリカーゼが一般的に細菌のＤＮＡの複製に使用されて、中温性の生物に限定されないことが示された（ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７２：１７８−１８９（１９９７））。単離されたレプリカーゼから得た蛋白質の配列を用いて、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中のγ及びγ様蛋白質の同定を直接証明した（ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，（１９９７）同じ箇所）。平行したアプローチにおいて、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌの研究室は、ＰＣＲ及び保存された領域に相当するオリゴヌクレオチドを用いて、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの染色体ＤＮＡから直接ｄｎａＸ遺伝子を単離した（Ｙｕｒｉｅｖａ，Ｏ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２７１３１−２７１３９（１９９７））。Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＸのＥ．ｃｏｌｉにおける発現は、γ及びγ様の蛋白質の合成を導く（Ｙｕｒｉｅｖａ，Ｏ．，ｅｔ　ａｌ．，同じ箇所；ＰＣＴ　ＷＯ９９／１３０６０；ＰＣＴ　ＷＯ９９５３０７４）が、転写スリップ機構によることは明らかである（Ｌａｒｓｅｎ，Ｂ．ｅｔ　ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：１６８３−１６８８（２０００））。単離されたＴ，ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαサブユニットからの部分的な蛋白質配列は構造遺伝子の同定を導き（ＰＣＴ　ＷＯ９９／１３０６０；ＰＣＴ　ＷＯ９９５３０７４）、そして活性な天然の及び標識されたＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのαサブユニットの発現を導いた（ＰＣＴ　ＷＯ９９／１３０６０）。染色体のイニシエーション蛋白質ｄｎａＡとスライディングクランププロセッシビティー因子β（ｄｎａＮ）の間の密接な遺伝子連鎖を利用して、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのｄｎａＮ遺伝子が単離されて、配列決定されて、そして活性なＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　βの合成及び続く生成を指示するのに情報が使用された（ＰＣＴ　ＷＯ９９／１３０６０；ＰＣＴ　ＷＯ９９５３０７４）。Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　ＤｎａＸ複合体のサブユニットδとδ’も活性な形態で発現されて、活性なＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素を再校正するのに使用された（米国、実用特許出願番号０９／８１８，７８０）。
【００１６】
Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓとＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのゲノムの配列から、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素がこれらの生物にも存在することが明らかである（Ｄｅｃｋｅｒｔ，Ｇ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３９２：３５３−３５８（１９９８）；Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｐ．ａｎｄ　Ｉｔｏ，Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２６：５３００−５３０９（１９９８）；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｋ．Ｅ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３９９：３２３−３２９（１９９９））。Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓの配列に公表の時に注釈を付け、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩコアのα（ｄｎａＥ）及びε（ｄｎａＱ）成分、ＤｎａＸ複合体のβスライディングクランププロセッシビティー因子（ｄｎａＮ）、一本鎖ＤＮＡ結合蛋白質（ｓｓｂ）及び中心ＤｎａＸ蛋白質の相同体を明らかにした（Ｄｅｃｋｅｒｔ，Ｇ．，ｅｔ　ａｌ．，（１９９８）同じ箇所）（図２Ａ−Ｄ）。しかしながら、δ、δ’、χ及びψのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの類似体は不在であった。
【００１７】
Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａにおいて、２つの異なるＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ様触媒サブユニットの配列が公表され（Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｐ．ａｎｄ　Ｉｔｏ．，（１９９８）同じ箇所）、グラム陽性（ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ門）中温性細菌と平行する状況であった（Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．，ａｎｄ　Ｂｏｒｋ，Ｐ／．Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：１２８−１２９（１９９６））。一つのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩは同じポリペプチドの一部として３’→５’エキソヌクレアーゼを含んだが、第２のαサブユニット及びεサブユニットはそれぞれＥ．ｃｏｌｉ様のｄｎａＥ及びｄｎａＱ遺伝子によりコードされていることが明らかである。ｄｎａＮ，ｓｓｂ，ｄｎａＸに関する相同体に注釈を付けた（図３Ａ−Ｆ）。追加の「γ−様」遺伝子（ＴＭ０７７１）に注釈を付けたがｈｏｌＢであるらしい；しかしながら、配列の保存度が低いため、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素δ、χ及びψサブユニットの相同体の構造遺伝子は明らかでない。δサブユニットの構造遺伝子の欠如は特に問題であり、何故ならばＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓとＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来のプロセッシブなＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の再構成のためのその予測された必須性のためである。
【００１８】
グラム陽性（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ門）生物における複製
ＤＮＡ複製はグラム陽性（ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ門）生物に関するプロトタイプ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいては、Ｅ．ｃｏｌｉほど広範囲に研究されていない。伸長合成成分のうち、基本的なＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ触媒サブユニットのみが精製された（Ｌｏｗ，Ｒ．Ｌ．，Ｒａｓｈｂａｕｍ　Ｓ．Ａ．，ａｎｄ　Ｃｏｚｚａｒｅｌｌｉ　Ｎ．Ｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５１：１３１１−１３２５（１９７６）；Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｒ．Ａ．，Ｂａｒｎｅｓ，Ｍ．Ｈ．，Ｍａｃｋ，Ｓ．Ｌ．，Ｍｉｔｃｈｅｎｅｒ，Ｊ．Ａ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｎ．Ｃ．，Ｇｅｎｅ　９８：２９−３６（１９９１））。この酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩに類似の配列を示すが、同じポリペプチド鎖の中に３’→５’校正活性を含むことにおいて異なる。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのｐｏｌ　ＩＩＩの配列の検証は、アミノ末端近傍に挿入されたＥ．ｃｏｌｉのε校正サブユニットとの密接な類似性を伴う配列を明らかにする（Ｂａｒｎｅｓ，Ｍ．，Ｈａｍｍｏｎｄ，Ｒ．，Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｃ．，Ｍａｃｋ，Ｓ．ａｎｄ　Ｂｒｏｗｎ，Ｎ．Ｃ．，Ｇｅｎｅ　１１１：４３−４９（１９９２））。グラム陽性生物由来のいくつかのゲノムの配列の完成と共に、第２のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのαサブユニットがＥ．ｃｏｌｉ様の酵素により密接な類似した配列をもって存在することが明らかになった（Ｋｏｏｎｉｎ，Ｅ．Ｖ．，ａｎｄ　Ｂｏｒｋ，Ｐ．，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：１２８−１２９（１９９６））。最近、類似の状況が、より異なるＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａにおいて観察された（Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｐ．＆　Ｉｔｏ，Ｊ（１９９８）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２６：５３００−５３０９（１９９８））。Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ａ．＆ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８６：１０６７−１０８０（１９０９）及びＩｔｏ（Ｈｕａｎｇ，Ｙ．Ｐ．，ａｎｄ　Ｉｔｏ，Ｊ．（１９９８）同じ箇所）が、プロトタイプのＥ．ｃｏｌｉ様及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ様ポリメラーゼのそれぞれタイプＩ及びＩＩに言及し、この出願において集合がフォローされる。タイプＩＩのｐｏｌ　ＩＩＩが存在する場合、それはいつも第２のｐｏｌ　ＩＩＩ様酵素として存在する。これは、各ポリメラーゼの機構上の寄与に関する重要な疑問を生じさせる；これらの提案された研究が解明されるべきかの問題である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓにおいては、プロトタイプのグラム陽性のタイプＩＩのｐｏｌ　ＩＩＩが細胞の生存に必須なことが明らかである。ヒドロキシフェニルアゾピリミジンはこの酵素を阻害し、薬剤耐性はタイプＩＩ酵素の構造遺伝子にマップされる（Ｌｏｖｅ，Ｅ．，Ｄａｍｂｒｏｓｉｏ，Ｊ．，Ｂｒｏｗｎ，Ｎ．，ａｎｄ　Ｄｕｂｎａｕ，Ｄ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１４４：３１３−３２１（１９７６））。しかしながら、Ｄ．Ｅｈｒｌｉｃｈと同僚たちは、タイプＩのｐｏｌ　ＩＩＩも細胞の生存に必須であることを最近示した（私信）。密接に近縁の生物Ｓ．ピオゲネスにおいては、伸長合成の装置の最小の成分（タイプＩＩのｐｏｌ　ＩＩＩ，β、τ、δ及びδ’）が最近発現されて、最小のレプリカーゼを再構成するのに使用された（Ｂｒｕｃｋ，Ｉ．ａｎｄ　Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２８９７１−２８９８３（２０００）；Ｋｌｅｍｐｅｒｅｒ，Ｎ，Ｚｈａｎｇ，Ｄ，Ｓｋａｎｇａｌｉｓ，Ｍ　ａｎｄ　Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｍ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２６１３６−２６１４３（２０００）；ＰＣＴ　ＷＯ　０１／０９１６４）。
【００１９】
【表２】
2004508018.tif 000003
【００２０】
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びその他の関連した生物のゲノミック配列は、高度に保存されていないθ、χ及びψを除いて、きわめて密接に近縁の細菌の間でさえ、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の補助サブユニットの有望な構造遺伝子を明らかにした。ｄｎａＸ，ｈｏｌＢ（δ’）及びｄｎａＮ（β）及びｓｓｂのＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの相同体も明らかであり、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓゲノムプロジェクトウエブサイトに記録された（パスツール研究所、パリのＳｕｂＬｉｓｔウエブサイトにて利用可能）。プライマーゼ及びＳＳＢ蛋白質は配列の検証から明らかであり、そしてＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及び他の生物のゲノムにおいて記録された。
【００２１】
ＤＮＡ複製装置の細胞学−技術において最近開発された改良は、細菌において複製装置の可視化を可能にした（Ｌｅｍｏｎ，Ｋ．ａｎｄ　Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ａ．（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：１５１６−１５１９；Ｇｏｒｄｏｎ，Ｇ．Ｓ．，Ｓｉｔｎｉｋｏｖ，Ｄ．，Ｗｅｂｂ，Ｃ．Ｄ．，Ｔｅｌｅｍａｎ，Ａ．，Ｓｔｒａｉｇｈｔ，Ａ．，Ｌｏｓｉｃｋ，Ｒ．，Ｍｕｒｒａｙ　Ａ．Ｗ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．，Ｃｅｌｌ　９０：１１１３−１１２１（１９９７）；Ｎｅｗｍａｎ，Ｇ．ａｎｄ　Ｃｒｏｏｋｅ，Ｅ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：２６０４−２６１０（２０００））。Ｃ末端標識されたＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＰｏｌ　Ｃ（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩタイプＩＩ）、ＤｎａＸ（τ）及びＨｏｌＢ（δ’）を用いて、Ｇｒｏｓｓｍａｎとその同僚たちは、複製装置が細胞の中心部分に固定されていること、及び染色体が複製の間その中を通り過ぎることを証明した（Ｌｅｍｏｎ，Ｋ．ａｎｄ　Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８２：１５１６−１５１９（１９９８）；Ｌｅｍｏｎ，Ｋ．ａｎｄ　Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ａ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ　６：１３２１−１３３０（２０００））。しかしながら、複製起点は複製されるにつれて、細胞の極に進行するらしい。染色体の複製の開始に関連しているらしい２つの遺伝子産物（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのＤｎａＢ蛋白質とＤｎａＩ蛋白質）が複製の開始の間に核様体のエッジに優位に結合した座として共に存在することが可視化された（Ｉｍａｉ，Ｙ，Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｎ，Ｉｓｈｉｇｏ−Ｏｋａ　Ｄ，Ｋａｄｏｙａ　Ｒ，Ｄａｉｔｏ　Ｔ，Ｍｏｒｉｙａ　Ｓ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３６：１０３７−４８（２０００））。
【００２２】
細菌及び抗菌薬剤。細菌感染は、主要な全世界の健康上の危険を代表し続けている（Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｒｅｐｏｒｔ　ｏｎ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＷＨＯ／ＣＤＳ／２０００．２）（２０００））。感染とは、相対的に無害の、例えば皮膚の発疹及び幼児に共通の耳の感染から、免疫上危険にさらされた患者における極めて重度の致死の可能性のある感染にわたる。薬剤耐性の病院での後天性の団体感染が増加している。莫大で、臨床上重要で、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｙ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを含む薬剤１４耐性細菌の最近の緊急性により、緊急性が明白になった。
【００２３】
抗菌剤のクラス及び耐性の機構。抗菌剤は、生存に必須の細胞機能の主要なプロセスを干渉することにより細菌を殺傷する。βラクタム類（ペニシリンとセファロスポリン）及びグリコペプチド類（バンコマイシンとテイコプラニン）は、細胞壁の合成を阻害する。マクロライド類（エリスロマイシン、クラリスロマイシン、及びアジスロマイシン）、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、アミノグリシド類（ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、及びアミカシン）及びテトラサイクリンは、蛋白質合成を阻害する。蛋白質合成の阻害は、是認される抗菌剤の新規なクラス（リンゾリド）であり、合成オキサゾリジノン類である。リファンピンはＲＮＡ合成を阻害し、フルオロキノロン類（例えば、シプロフロキサシン）はＤＮＡのトポロジー状態を保持する酵素を阻害することにより間接的にＤＮＡ合成を阻害する。トリメソプリン及びスルフォナミド類は必要なヌクレオチドの一つのプールを枯渇させることにより、葉酸生合成を直接阻害して、ＤＮＡ合成を間接に阻害する（Ｃｈａｍｂｅｒｓ，Ｈ．Ｆ．ａｎｄ　Ｓａｎｄｅ，Ｍ．Ａ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ．Ｇｏｏｄｍａｎ　＆　Ｇｉｌｍａｎ’ｓ　Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９６））。
【００２４】
抗菌剤に対する耐性は、薬剤の標的が変異することにより、まだ機能できるが薬剤によりもはやブロックされないか又は流出ポンプの変異又は修飾により酵素が新しい薬剤に対してそれらの特異性を広くする場合に、起こり得る。成長の利点のため、これは耐性細胞及びその子孫に抗生物質の存在下で付与し、耐性生物は素早く細菌集団を乗っ取る。一つの細胞において発生した耐性は集団中の別の細胞に移ることができるが、細菌が遺伝物質を直接効果する機構を有するためである。最近の議会の報告において、会計検査院（ＧＡＯ）は、薬剤耐性細菌によりもたらされる現在及び未来の公共の健康の負担を要約した（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌｓ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．会計検査院、ＧＡＯ／ＲＣＥＤ−９９−１３２（１９９９））。この報告によると、薬剤耐性細菌による感染のための病院の設定において処置される患者の数は１９９４から１９９６年で倍加して、１９９６から１９９７年で再びほぼ倍加する。耐性株は、環境下、例えばかなり多数の免疫上抑圧された患者を有する病院又は第３の介護施設において容易に広がり得る。同じＧＡＯの報告は、以前は感受性であった細菌がますます耐性を増加させ、世界中で広がるという明確な証拠も提供する。さらに、細菌集団内の耐性細菌の比率が上昇中である。特にこわがらせる進展は、全ての是認された耐性物質に耐性の細菌株の出現である。薬剤耐性細菌の劇的な増加を認識することにより、食品医薬品局は、最近、医師に対して、抗生物質は思慮分別をもって臨床上必要なときにのみ使用することを促す忠告を発した（ＦＤＡ　Ａｄｖｉｓｏｒｙ．Ｆｅｄｅｒａｌ　Ｒｅｇｉｓｔｅｒ　６５（１８２），５６５１１−５６５１８（２０００））。
【００２５】
最近まで、薬剤の開発者は、存在する抗生物質を単純に修飾することにより、新生の薬剤耐性細菌株に対応する傾向があった。事実、ほとんどの抗生物質は、後期段階の開発において臨床用途において既に薬剤の類似体である。この戦略は、有効性が低くなっているが、抗生物質のクラスに対する耐性に関する基本的な機構が自然界において既に広がっているからである。同じクラスの新規な抗生物質に対して耐性を授与するための耐性標的のさらなる変異は、標的に関する遺伝子内の１塩基変化によりしばしば起こり得る。即ち、開発パイプラインにおける目下の抗生物質の利用性は有限であることが予測され、そしてヘルスケア工業は、現在、存在する薬剤とは機構上異なる新規な抗生物質の重要な要求下にある。したがって、細菌の健康上の危険と格闘するため、細菌の中心的なＤＮＡ複製装置を阻害する新規な治療用薬剤を開発する染色体複製系に関する要求が残されている。
【００２６】
発明の概要
本発明は、細菌の遺伝子及び核酸分子由来のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素δサブユニットをコードする遺伝子及びアミノ酸配列に関し、そのような蛋白質をコードするものを含み、そしてそのような蛋白質に対して生じさせた抗体にも関する。本発明は、そのような蛋白質、核酸分子及び抗体を得るための方法にも関する。
【００２７】
本発明は、少なくとも一つの完全に配列決定されたゲノム由来の細菌ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素δサブユニットを同定する方法を提供するが、多数の異なる生物に関する配列情報のデータベースを提供し、必要な反復の数を最小にするのに十分なレベルに包含の閾値を設定し、検索される生物を選択するが、その際選択された生物が候補生物であり、基準生物からのδサブユニット蛋白質のアミノ酸配列を提供し、候補生物の配列と基準生物の配列を比較し、公知のＤｎａＸ蛋白質及び公知のδ’蛋白質を後続の工程から除外し、３００から４００のアミノ酸を含む蛋白質を選択し、候補生物からデルタ候補を選択するが、候補生物からのもっとも低いＥスコアを用いて配列を選択することからなり、そして任意に前記の工程を繰り返えすことを含むが、その際、候補生物の配列は候補生物からのもっとも低いＥスコアを用いて配列決定し、但し、細菌のＤＮＡポリメラーゼホロ酵素のδサブユニット蛋白質を同定してよい。
【００２８】
本発明は、上記方法により同定された細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素δサブユニットを提供する。上記方法は、部分的に配列決定されたゲノムのみを用いて生物からδサブユニット蛋白質を得るように修飾することができる。
【００２９】
本発明は、多数の異なる生物に関する配列情報のデータベースを提供し、必要な反復の数を最小にするのに十分なレベルに包含の閾値を設定し、検索される生物を選択するが、その際選択された生物が候補生物であり、基準生物からのδサブユニット蛋白質のアミノ酸配列を提供し、候補生物の配列と基準生物の配列を比較し、公知のＤｎａＸ蛋白質及び公知のδ’蛋白質を後続の工程から除外し、以下の６つの特性の少なくとも３つを含む蛋白質を選択することを含む、少なくとも一つの完全に配列決定されたゲノム由来の細菌ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素δサブユニットを同定する方法も提供する：
ａ．保存された領域１７――（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｙ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＧＸ（Ｄ／Ｅ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――３８からの１０の保存された残基のうちの少なくとも５つを有する；
ｂ．保存された領域６４――（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸ（Ａ／Ｓ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｆ（Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――８２からの１１の保存された残基のうちの少なくとも５つを有する；
ｃ．保存された領域９７――（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸＸ（Ｄ／Ｅ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＫ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――１１７からの１０の残基のうちの少なくとも５つを有する；
ｄ．保存された領域１５４――（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｄ／Ｅ）Ｘ（Ｄ／Ｅ）（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸＸＸＮ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｄ／Ｅ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｒ／Ｋ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――１９１からの１８の保存された残基のうちの少なくとも９つを有する；
ｅ．保存された領域２１５――ＦＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｄ／Ｅ）（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＧ（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＧＸ（Ｄ／Ｅ）Ｐ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――２６０からの２３の保存された残基のうちの少なくとも１１を有する；
ｆ．保存された領域２９８――（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸ（Ｄ／Ｅ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸＸＸ（Ｄ／Ｅ）ＸＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｄ／Ｅ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）―３３１からの１２の保存された残基のうちの少なくとも６つを有する；そして
上記閾値を上回る配列を残すが、残された配列がデルタ候補配列である；そして任意に前記の３工程を繰り返えすが、但し、候補生物の配列がデルタ候補配列であり、それによりδ蛋白質を同定してよい。
【００３０】
本発明は、上記方法により同定された細菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素であるサブユニットを提供する。上記方法は、部分的に配列決定されたゲノムのみを用いて生物からδサブユニット蛋白質を得るように修飾することができる。
【００３１】
本発明は、少なくとも一つの標的生物からδ蛋白質を同定する方法も提供し、進化上近縁な生物からδ蛋白質を同定し、そして標的生物の配列内で類似の配列に関する検索を実施することを含む。
【００３２】
本発明は、さらに、単離された細菌ＤＮＡポリメラーゼδサブユニット蛋白質を提供するが、但し、当該δサブユニット蛋白質は、Ｅ．ｃｏｌｉのδサブユニット蛋白質、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのδサブユニット蛋白質、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ　Ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓのδサブユニット蛋白質からなる群のメンバーではない。
【００３３】
本発明は、さらに、単離された細菌ＤＮＡポリメラーゼδサブユニット蛋白質を提供するが、但し、当該δサブユニット蛋白質は、プロテオバクテリアδサブユニットのガンマ門（ｄｉｖｉｓｉｏｎ）及びプロテオバクテリアδサブユニット蛋白質のβ部分からなる群のメンバーではない。
【００３４】
本発明は、さらに、単離された細菌ＤＮＡポリメラーゼδサブユニット蛋白質を提供するが、但し、当該δサブユニット蛋白質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ，δサブユニット蛋白質、Ｓ．ａｕｒｅｕｓδサブユニット蛋白質、及びＳ．ｎｅｕｍｏｎｉａｅのδサブユニット蛋白質を含む、グラム陽性（ｆｉｒｍｉｃｕｔｅ門）細菌のδサブユニットではない。
【００３５】
本発明は、さらに、好熱性生物由来の単離された細菌ＤＮＡポリメラーゼδサブユニット蛋白質を提供するが、但し、当該δサブユニット蛋白質は、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ，及びＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのδサブユニット蛋白質からなる群から選択される。
【００３６】
本発明は、本発明のδサブユニット蛋白質に対する抗体を提供するが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、Ｆａｂ断片又はＦａｂ発現ライブラリーであってよく、そしてＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニットの少なくとも抗原性部分を含む免疫原に、免疫コンピテント細胞を有する動物を暴露することを含む、抗−ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット抗体の生産方法を提供する。
【００３７】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質を検出する方法を提供するが、何れかのオーダーにおいて、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩを含む疑いのあるサンプル、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質の少なくとも一部に特異的に結合できる抗体を提供し、上記サンプルと上記抗体を、抗体がＤＮＡポリメラーゼＩＩＩに結合できる条件下で混合すること；及び結合を検出することを含む。
【００３８】
本発明は、本発明のδサブユニット蛋白質をコードする単離された核酸分子及びそれらの相補体も提供する。
本発明は、本発明による細菌のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ核酸分子の少なくとも一部を含む組換え分子及び組換え細胞も提供する。
【００３９】
さらに、本発明は、生物学上のサンプルの中のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニットの少なくとも一部をコードする核酸分子の検出のための方法を提供するが、ｈｏｌＡ核酸分子の少なくとも一部を、生物学上のサンプルの核酸物質にハイブリダイゼズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成させ、そしてハイブリダイゼーション複合体を検出するが、但し、複合体の存在が生物学上のサンプル中のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニットの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドの存在に相関する、工程を含む。
【００４０】
本発明は、修飾されたか又は変異されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質又は遺伝子配列の発現を含む、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニットの発現を検出する方法も提供し、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質を含む疑いのある試験サンプルを適宜提供し；そして試験ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニットを、対照中の定量されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニットと比較することにより、サンプル中の試験ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニットの相対濃度を測定する工程を含む。
【００４１】
さらに、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物に関してスクリーンする方法を提供し、レプリカーゼ活性に関して許容される条件下で少なくとも一つの試験化合物に、単離されたレプリカーゼを接触させ、試験化合物の存在下でレプリカーゼの活性を評価し；そして試験化合物存在下でのレプリカーゼの活性を、試験化合物不在下でのレプリカーゼの活性と比較するが、その際、試験化合物存在下でのレプリカーゼの活性における変化がレプリカーゼの活性を変調する化合物の指標であり、そして上記レプリカーゼが単離されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質を含む。
【００４２】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物を同定する方法を記載する。この方法は、プライムされたＤＮＡ分子、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼ、候補化合物、ｄＮＴＰ又は４までの異なるｄＮＴＰｓ，ＡＴＰ、及び任意にβサブユニット、ＤｎａＸ複合体の何れか、又はβサブユニットとＤｎａＸ複合体の両方を含む反応混合物を作成し；候補化合物の不在下で核酸の重合を達成するのに有効な条件に上記反応混合物を供し；核酸重合伸長生成物の存在又は不在に関して反応混合物を分析し、そして試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性を、試験活性を不在下でのレプリカーゼの活性と比較することにより実施する。試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性の変化がレプリカーゼの活性を変調する化合物の指標である。ＤｎａＸ複合体は本発明ののδサブユニット蛋白質を含む。
【００４３】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼを刺激することにおいてＤｎａＸ複合体とβサブユニットの活性を変調する候補薬剤を同定する方法を記載する。上記の方法は、プライムされたＤＮＡ（ＳＳＢでコートされていてよい）を、ＤＮＡポリメラーゼ、βサブユニット、及びＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）と、候補薬剤、及びｄＮＴＰｓ（又は修飾されたｄＮＴＰｓ）の存在下で接触させることにより反応混合物を形成することを含む。反応混合物は候補薬剤の不在下で核酸の重合を作用させるはずの条件に供され、そして反応混合物中での伸長産物の存在又は不在を分析する。試験化合物の存在下での核酸の重合を、試験化合物の不在下での核酸の重合と比較する。試験化合物の存在下での核酸の重合の変化がＤｎａＸ複合体とβサブユニットの活性を変調する化合物の指標である。ＤｎａＸ複合体は、本発明のδサブユニットを含む。
【００４４】
本発明は、βサブユニットとＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）が相互作用する能力を変調する化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、βサブユニットを、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）と、ＡＴＰ（又は適切なＡＴＰ類似体、例えばＡＴＰγＳ，ＡＴＰの加水分解不可能な類似体、βのＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）との相互作用を可能にする、及び候補薬剤の存在下で接触させることにより反応混合物を形成させることを含む。反応混合物は、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）とβサブユニットが候補薬剤の不在下で相互作用するはずの条件下に供する。次に、反応混合物をβサブユニットとＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）の間の相互作用に関して分析する。βサブユニットとＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）の間の相互作用の変化が、相互作用を変調する化合物の指標である。ＤｎａＸ複合体は本発明のδ蛋白質を含む。
【００４５】
本発明は、δサブユニットとδ’及び／又はＤｎａＸサブユニットが相互作用する能力を変調する化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、δサブユニットと、δ’サブユニット及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットを、候補化合物の存在下で接触させることにより反応混合物を形成させることを含む。反応混合物は、候補薬剤不在下でδサブユニットとδ’サブユニット及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットが相互作用するはずの条件に供する。試験化合物の存在下での相互作用の程度を試験化合物の不在下での相互作用の程度と比較する。δサブユニットとδ’サブユニット及び／又はＤｎａＸサブユニットの間の相互作用の変化が相互作用を変調する化合物の指標である。
【００４６】
本発明は、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）がＤＮＡ分子上にβサブユニットを集合させる能力を変調する化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、環状のプライムされたＤＮＡ分子（ＳＳＢでコートされていてよい）を、ＤｎａＸ複合体（又はそのサブアッセンブリー）及びβサブユニットと、候補薬剤、及びＡＴＰ又はｄＡＴＰの存在下で接触させることにより反応混合物を形成させることを含む。反応混合物は、ＤｎａＸ複合体（又はサブアッセンブリー）が候補薬剤の不在下でＤＮＡ分子上にβサブユニットを集合させる条件に供する。反応混合物中でのＤＮＡ分子上のβサブユニットの存在又は不在を分析する。試験化合物の存在下でのアッセンブリーの程度を試験化合物の不在下でのアッセンブリーの程度と比較する。ＤＮＡ分子上のβサブユニットの量の変化が、ＤｎａＸ分子上にβサブユニットを集合させるＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブアッセンブリー）の能力の指標である。ＤｎａＸ複合体は本発明のデルタ蛋白質を含む。
【００４７】
本発明は、ＤＮＡ分子からβサブユニットを取り外すＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体の一つ又は複数のサブユニット）の能力を変調させる化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、候補薬剤の存在下でβサブユニットが集合したＤＮＡ分子を接触させることにより反応混合物を形成することを含む。反応混合物は、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸの一つ又は複数のサブユニット又はサブアッセンブリー）が候補薬剤不在下でＤＮＡ分子からβサブユニットを取り外す条件に供する。反応混合物中でのＤＮＡ分子上のβサブユニットの存在又は不在を分析する。試験化合物の存在下でのアッセンブリーの程度を試験化合物の不在下でのアッセンブリーの程度と比較する。ＤＮＡ分子上のβサブユニットの量の変化が、ＤＮＡ分子上でβサブユニットを取り外すＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブアッセンブリー）の能力を変調する化合物の指標である。
【００４８】
本発明は、ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、ＤｎａＸサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合活性を変調する化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、ＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体サブユニット）を、ＤＮＡ分子の存在下又は不在下の何れかでｄＡＴＰ／ＡＴＰと接触させるか、及び／又は候補薬剤の存在下でβサブユニットと接触させることにより反応混合物を形成させることを含む。反応混合物は、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット）が候補薬剤の存在下でｄＡＴＰ／ＡＴＰと相互作用する条件に供される。候補薬剤の存在下でｄＡＴＰ／ＡＴＰがＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット）に結合するか否かを測定するのに反応を分析する。試験化合物の存在下での結合の程度を試験化合物の不在下での結合の程度と比較する。ｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合の変化が、ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、ＤｎａＸサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合活性を変調する化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット）を、ＤＮＡ分子の存在又は不在下でｄＡＴＰ／ＡＴＰと接触させるか、及び／又は候補薬剤の存在下でβサブユニットと接触させることにより反応混合物を形成させることを含む。反応混合物は、ＤｎａＸサブユニット（複合体）が候補薬剤の存在下でｄＡＴＰ／ＡＴＰを加水分解する条件下に供する。ｄＡＴＰ／ＡＴＰが加水分解されたか否かを測定するために反応を分析する。試験化合物の存在下での加水分解の程度を試験化合物の不在下での加水分解の程度と比較する。加水分解されたｄＡＴＰ／ＡＴＰの量の変化がＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、ＤｎａＸサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰａｓｅ活性を変調する化合物の指標である。ＤｎａＸ複合体は本発明のδ蛋白質を含む。
【００４９】
発明は、環状のプライムされたＤＮＡ分子（ＳＳＢによりコートされていてよい）を、ＤｎａＸ複合体、βサブユニット及びαサブユニットと、候補薬剤、及びｄＮＴＰｓ（又は修飾されたｄＮＴＰｓ）の存在下で接触させることにより反応混合物を形成させることを含む。反応混合物は、候補薬剤の不在下で核酸の重合に影響する条件に供され、そして反応混合物中の伸長産物の存在又は不在を分析する。試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性を、試験化合物の不在下でのレプリカーゼの活性と比較する。試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性の変化が、レプリカーゼの活性を変調する化合物の指標である。ＤｎａＸ複合体は本発明のδ蛋白質を含む。
【００５０】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼ活性を変調することができる化合物を同定する試験キットも含む。そのようなキットは、単離されたδサブユニット蛋白質、及び推定される阻害化合物の存在下で（即ち、その作用により）ＤＮＡ複製活性の変調の程度を測定する手段を含む。
【００５１】
本発明は、そのような方法により単離された変調剤及び阻害剤、及び／又は試験キット、及びそのような阻害剤に対して感受性のδサブユニットを含むあらゆるレプリカーゼを阻害するためのそれらの用途も含む。細菌のＤＮＡ複製の変調剤はそのような化合物が処置される種に対して有害ではない限り、細菌の感染を有する疑いのある動物、植物及びヒトを直接処置するためにも使用することができる。同様に、限定ではないが抗体及び小分子を含む、δサブユニットを含むあらゆるレプリカーゼに結合する分子も、感染部位に対して細胞障害性実在物、治療用実在物、又はイメージング実在物を標的化するために使用することができる。
【００５２】
本発明は、ＤＮＡ分子を合成する方法も含み、プライマーを第１のＤＮＡ分子にハイブリダイズさせ；そして上記ＤＮＡ分子を高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼ及び一つ又は複数のｄＮＴＰｓ存在下で上記第１ＤＮＡ分子の全部又は一部に相補な第２のＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件下でインキュベートすることを含み、但し、上記高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼはＡｑｕｉｆｅｘ，Ｔｈｅｒｍｕｓ及びＴｈｅｒｍａｔｏｇａのδサブユニット蛋白質からなる群から選択されるδサブユニット蛋白質を含む。
【００５３】
本発明は、二本鎖ＤＮＡ分子を増幅する方法も提供し、第１及び第２のプライマーを提供するが、但し、第１プライマーは上記ＤＮＡ分子の第１の鎖の３’末端の配列又は近傍の配列に相補性であり、そして第２プライマーは上記ＤＮＡ分子の第２の鎖の３’末端の配列又は近傍の配列に相補性であり、上記プライマーを上記第１の鎖にハイブリダイズさせ、そして上記第２プライマーを上記第２鎖にハイブリダイズさせるが、高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼ存在下で、上記第１鎖に相補な第３のＤＮＡ分子及び上記第２鎖に相補な第４のＤＮＡ分子が合成されるような条件下であり、第１鎖と第３鎖、及び第２鎖と第４鎖を変性させ；そして上記工程を１回又は複数回繰り返えすが；上記高温安定性ＤＮＡポリメラーゼは、Ａｑｕｉｆｅｘ，Ｔｈｅｒｍｕｓ及びＴｈｅｒｍａｔｏｇａのδサブユニット蛋白質からなる群から選択される。
【００５４】
本発明は、核酸配列を増幅する方法も提供し、当該方法はローリングサークル複製プライマーを一つ又は複数の増幅標的サークルと混合することにより、プライマー−増幅標的サークル混合物を生成し、そして当該プライマー−増幅標的サークル混合物を、プライマー−増幅標的サークル混合物中の増幅標的サークルとローリングサークル複製プライマーの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下でインキュベートするが、但し、増幅標的サークルは各々プライマー相補部分を含む一本鎖の環状ＤＮＡ分子を含み、そして当該プライマー相補部分はローリングサークル複製プライマーに相補性であり；そして高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼをプライマー−増幅標的サークル混合物と混合することにより、レプリカーゼ−増幅標的サークル混合物を生成し、そしてレプリカーゼ−増幅標的サークル混合物を、増幅標的サークルの複製を促進する条件下でインキュベートするが、但し、増幅標的サークルの複製がタンデム配列のＤＮＡの形成をもたらし、そして上記高温安定性ＤＮＡポリメラーゼレプリカーゼがＡｑｕｉｆｅｘ，Ｔｈｅｒｍｕｓ及びＴｈｅｒｍａｔｏｇａのδサブユニット蛋白質からなる群から選択されることを含む。
【００５５】
本発明は、一つ又は複数のポリペプチドを利用することを含むＤＮＡ合成方法をさらに提供するが、上記一つ又は複数のポリペプチドは本発明のδサブユニット蛋白質に少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００５６】
好ましい態様の説明
本発明は、様々な細菌からのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のδサブユニットをコードする構造遺伝子及びアミノ酸配列に関する。本明細書にて使用されるとおり、用語「遺伝子」は、ポリペプチド又は前駆体の生産に必要なコーディング配列を含む核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を意味する（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素又はホロ酵素サブユニット、適宜）。ポリペプチドは、完全長のコーディング配列によるか又は完全長又は断片の所望の活性又は機能特性（例えば、酵素活性、リガンド結合、別のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの結合、プロセッシビティー、等）が保持される限り、コーディング配列のあらゆる部分によりコードされ得る。当該用語は、構造遺伝子のコーディング領域と、遺伝子が完全長ｍＲＮＡの長さに相当するようにその何れかの末端上で約１ｋｂの距離について両５’及び３’末端上でコーディング領域に隣接して位置する包含配列も包含する。用語「遺伝子」は、遺伝子のｃＤＮＡ形態及びゲノミック形態の両方を含む。ゲノミック形態又は遺伝子のクローンは、「介在領域」又は「介在配列」と呼ばれる非コーディング配列で遮断されるコーディング領域を含む。ｍＲＮＡは転写の間は隣接するポリペプチド内でアミノ酸の配列又は順番を特定するように機能する。
【００５７】
本明細書にて使用されるとおり、用語「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素」は、全ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの完全性を意味するが（即ち、ポリメラーゼサブユニットの全て、並びに染色体又はゲノムのプロセッシブな複製に必要な他の付随するアクセサリー蛋白質）、「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ」はタイプＩのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩｓ（ｄｎａＥによりコードされる）のまさにコア［α、ε、θ］であるか又はタイプＩＩのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩｓ（ｐｏｌＣによりコードされる）のα触媒サブユニットであり、同じポリペプチド鎖内のエプシロン様配列を含む。「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニット」は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素を含むサブユニットの完全性の何れかに関して使用される。即ち、用語「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ」は、「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素」及び「ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット」を包含する。サブユニットは、限定ではないが、ＤｎａＸ又はτ（及び同じ生物由来のγ、限定ではないが多くのプロテオバクテリア及びＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ＨｏｌＡ又はδ、ＨｏｌＢ又はδ’蛋白質、ＤｎａＮ又はβ蛋白質、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ――タイプＩのＤｎａＥ又はαサブユニット、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ――タイプＩＩのＰｏｌＣ又はαサブユニット及びＤｎａＱ又はε蛋白質を含む。本明細書にて使用されるとおり、「レプリカーゼ」はＤｎａＱ、ポリヌクレオチド配列を倍加させる酵素を意味する。
【００５８】
「アミノ酸配列」は本明細書において天然に生じる蛋白質分子のアミノ酸配列を意味するように記載されるが、「アミノ酸配列」等、例えば「ポリペプチド」又は「蛋白質」は、記載された蛋白質に関連する完全な天然のアミノ酸配列にアミノ酸配列を限定すること意味しない。用語「ａ」又は「ａｎ」その完全性の一つ又は複数を意味することに注意するべきである；例えば、ａ　ｐｒｏｔｅｉｎは一つ又は複数の蛋白質又は少なくとも一つの蛋白質を意味する。そのようにして、「ａ」又は「ａｎ」は「一つ又は複数」及び「少なくとも一つ」が本明細書中で交換可能に使用できることを意味する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は交換可能に使用できることにも注意するべきである。さらに、「からなる群から選択される」化合物は、続くリストの中の化合物一つ又は複数を意味し、化合物２つ又は複数の混合物（即ち、組み合わせ）を含む。
【００５９】
本発明のδサブユニット蛋白質及び核酸分子を同定する方法
本発明の一つの態様は、単離されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットδ蛋白質である。本発明によれば、単離されたか、又は生物学上純粋な蛋白質は、その自然環境から取り出された蛋白質である。そのようにして、「単離された」及び「生物学上純粋な」は、蛋白質が精製される程度を必ずしも反映はしない。本発明の単離されたδサブユニット蛋白質は、天然源から得ることができるか、組換えＤＮＡ技術を用いて生産できるか又は化学合成により生産できる。本明細書において使用されるとおり、単離されたδサブユニット蛋白質は、完全長の蛋白質又はそのような蛋白質のあらゆる相同体であり得る。
【００６０】
本発明の蛋白質相同体の最小サイズは、対応する天然蛋白質をコードする核酸分子の相補配列と安定なハイブリッドを形成することができる核酸分子によりコードされるのに十分なサイズである。そのように、そのような相同体をコードする核酸分子のサイズは、当該核酸分子と相補配列の間の核酸組成とパーセント相同性に依存し、並びにハイブリダイゼーション条件自体（例えば、温度、塩濃度、及びホルムアルデヒド濃度）に依存する。そのような核酸分子の最小サイズは、典型的には、核酸分子がＧＣ−リッチならば少なくとも１２から約１５ヌクレオチドの長さであり、そして核酸分子がＡＴ−リッチならば少なくとも約１５から約１７塩基の長さである。そのように、本発明の蛋白質相同体をコードするのに使用される核酸分子の最小サイズは、約１２から約１８ヌクレオチドの長さである。核酸分子が遺伝子の位置部、全遺伝子、又は複数の遺伝子あるいはその一部を含むことができることにおいて、そのような核酸分子の最大サイズには制限がない。同様に、本発明のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩサブユニット蛋白質相同体の最小サイズは約４から約６ヌクレオチドの長さであり、好ましいサイズはそのような蛋白質の完全長、多価（即ち、機能を有する各々の一つのドメインよりも長い融合蛋白質）又は機能部分が望まれるか否かに依存する。本発明のポリメラーゼ蛋白質相同体は天然サブユニットに相当する活性を有することが好ましく、例えば結合アッセイ又はＤＮＡ複製アッセイの活性を達成可能なことである。
【００６１】
ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットδ蛋白質相同体は、天然の対立遺伝子のバリエーション又は天然の変異の結果であり得る。本発明の蛋白質相同体は当業界公知の技術を用いて生産することもでき、限定ではないが、蛋白質に対する直接の修飾又は当該蛋白質をコードする遺伝子に対する修飾を含み、例えば、ランダムか又は標的化された変異導入を作用させるために古典技術又は組換えＤＮＡ技術を用いる。
【００６２】
本発明の方法によると、δサブユニット蛋白質は如何なる細菌から同定してもよい。δサブユニット蛋白質のそのような同定は、δ配列の限定され配列の相関（ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）のために、以前は不可能であった。本発明の前には、δ蛋白質はＥ．ｃｏｌｉ、及び２つの関連するプロテオバクテリアのデルタ−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅとＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓにおいてのみ公知であった。公知のＥ．ｃｏｌｉ配列に基づくδ蛋白質のＮＣＢＩデータベースの単純なＢＬＡＳＴ検索は、少数の密接に近縁な生物のみ：ガンマプロテオバクテリア門からの、Ｖｉｂｒｉｏ　Ｃｈｏｌｅｒａｅ，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｂｕｃｈｎｅｒａ種ＡＰＳ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｘｙｌｅｌｌａ　ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ、及びプロテオバクテリアのベータ門からのＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓに関する結果を生む。プロテオバクテリアのアルファ、デルタ又はエプシロン門からの配列は何も引き出されない。本発明は、以下に詳細に説明されて実施例のセクションに記載される、全ての公知の門からの細菌からのδサブユニットの同定を可能にさせる方法も提供する。
【００６３】
本発明は、上記の方法により同定されるδサブユニット蛋白質も提供する。一つの態様において、本発明は、配列決定されたゲノムから細菌δ蛋白質を同定する方法を提供する。
【００６４】
好ましい態様において、少なくとも一つの完全に配列決定されたゲノムから細菌ＤＮＡポリメラーゼホロ酵素δサブユニットを同定する上記方法は、多数の異なる生物に関する配列情報のデータベースを提供し、必要な繰り返えしの数を最小にするのに十分なレベルに包含の閾値（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を設定し、上記生物が検索されることを選択し、基準生物からのδサブユニット蛋白質のアミノ酸配列を提供し、選択された生物と基準生物の配列を比較し、公知のＤｎａＸ蛋白質と公知のδ’蛋白質を次の工程から除外し、そして同定されたδ配列の類似性のパターンを用いて約３００から約４００アミノ酸の間の蛋白質を選択して細菌の追加の複数のδの同定を許容するサイクルを次の工程において繰り返えすが、その際、細菌のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素δサブユニット蛋白質を選択してよいことを含む。
【００６５】
本明細書にて使用されるとおり、包含閾値を、必要な繰り返しの数を最小にするのに十分なレベルに設定することは、無理のない時間と努力により検索物が発見されることを可能にする閾値を意味する。繰り返しは、公知のＤｎａＸ蛋白質と公知のδ’蛋白質を次の工程から除外し、そして約３００から約４００アミノ酸の間の蛋白質を選択する工程の繰り返しである。無理のない数の繰り返しは、他の因子の中で、とりわけ、検索されるデータベースの複雑度、標的化された生物からのδ配列の配列の関連性に依存することになる。本発明において使用される条件下では、約２０回未満の繰り返しが無理のない数である。好ましい態様においては、約１５回未満の繰り返しが無理のない数である。より好ましい態様においては、約１０回未満の繰り返しが無理のない数である。別の好ましい態様においては、約５回未満の繰り返しが無理のない数である。
【００６６】
本明細書にて使用されるとおり、包含の閾値はＥ又は「エクスペクト（Ｅｘｐｅｃｔ）」値限界とも呼ばれる。包含閾値よりも高いＥ値を有する強力な（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）「ヒット」を除外する。一つの好ましい態様において、包含閾値は０．００２である。別の好ましい態様において、閾値は０．００１である。（閾値を０．００１に設定した場合、基準の推計学のもモデルに基づくと１０００のうち１の不適切なヒットがある。）
【００６７】
保存された領域は、多数の生物からの同定されたデルタの整列化に基づく。この方法を用いて多数の候補のデルタを発見した後に、それらをＣｌｕｓｔａｌ　Ｗを用いて整列化し（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．，ａｎｄ　Ｇｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４））、そして保存された領域を当業界公知の方法を用いて同定した。保存された領域内の保存されたアミノ酸を太字で示す。
【００６８】
これらの保存された領域は：
１．）１７――
（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｙ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＧＸ（Ｄ／Ｅ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――３８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９４）
２．）６４――
（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸ（Ａ／Ｓ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｆ（Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――８２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９５）
３．）９７――
（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸＸ（Ｄ／Ｅ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＫ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――１１７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９６）
４．）１５４――
（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｄ／Ｅ）Ｘ（Ｄ／Ｅ）（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸＸＸＮ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｄ／Ｅ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｒ／Ｋ）
（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――１９１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９７）
５．）２１５――ＦＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｄ／Ｅ）（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＧ（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＧＸ（Ｄ／Ｅ）Ｐ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）
（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――２６０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９８）
６．）２９８――
（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸ（Ｄ／Ｅ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸＸＸ（Ｄ／Ｅ）ＸＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｄ／Ｅ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）―３３１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９９）
である。
【００６９】
本発明は、少なくとも一つの部分的に配列決定されたゲノムからδ蛋白質を同定する方法も提供する。生物を選択する工程は、ほんの部分的に配列決定されたデータベース内の生物を選択することを含む。
【００７０】
本発明は、少なくとも一つの標的生物からδ蛋白質を同定する方法も提供し、進化上近縁な生物からδ蛋白質を同定するための方法を使用し、そして標的生物の配列内の類似配列に関して検索を実施することを含む。
【００７１】
別の態様において、上記方法は、異なる生物の配列情報のデータベースを提供し、必要な繰り返しの数を最小にするのに十分なレベルに包含閾値を設定し、比較のために基準生物からのδサブユニット蛋白質のアミノ酸配列を入力し、選択された生物と基準生物の配列を比較し、公知のＤｎａＸ蛋白質と公知のδ’蛋白質を次の工程から除外し、ｉ）以下の６つの特徴：
ａ．保存された領域１７――（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｙ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＧＸ（Ｄ／Ｅ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――３８からの１０の保存された残基のうちの少なくとも５つを有する；（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９４）
ｂ．保存された領域６４――（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸ（Ａ／Ｓ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｆ（Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――８２からの１１の保存された残基のうちの少なくとも５つを有する；（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９５）
ｃ．保存された領域９７――（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸＸ（Ｄ／Ｅ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＫ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――１１７からの１０の残基のうちの少なくとも５つを有する；（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９６）
ｄ．保存された領域１５４――（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）
（Ｄ／Ｅ）Ｘ（Ｄ／Ｅ）（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸＸＸＮ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｄ／Ｅ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｒ／Ｋ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――１９１からの１８の保存された残基のうちの少なくとも９つを有する；（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９７）
ｅ．保存された領域２１５――ＦＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｄ／Ｅ）（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）
ＸＧ（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＧＸ（Ｄ／Ｅ）Ｐ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――２６０からの２３の保存された残基のうちの少なくとも１１を有する；（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９８）
ｆ．保存された領域２９８――（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸ（Ｄ／Ｅ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸＸＸ（Ｄ／Ｅ）ＸＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｄ／Ｅ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）―３３１からの１２の保存された残基のうちの少なくとも６つを有する（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９９）
のうちの少なくとも３つを含む蛋白質を選択し；そして閾値を上回る配列を残すことを含む。残された配列がδサブユニット配列であると同定される。
【００７２】
繰り返しは、公知のＤｎａＸ蛋白質と公知のδ’蛋白質を次の工程から除外し、そして６つの保存された領域のうちの３つを有する蛋白質を選択する工程の繰り返しである。
【００７３】
本発明は、完全には配列決定されていないが部分的に配列決定されているゲノムからδサブユニット蛋白質を同定する方法も提供する。これは、検索される一つ又は複数の生物を選択する工程を、部分的に配列決定されているデータベース中の生物の選択で置き換えることにより、上記の方法の中で達成される。ほんの部分的にしか配列決定されていないゲノムの検索を可能にしないデータベースにおいては、部分的に配列決定されている生物と完全に配列決定されている生物、又は他の適切な生物のサブセットを含む全ての細菌を検索することを許容する。完全に配列決定されている生物から既に同定されている配列は特別に除外することができるか、或いは、同定された新規なδ配列を正しく見つけることができる。
【００７４】
本発明は、上記の方法によりまだ同定されていないδ蛋白質を同定する方法も提供する。これらの方法は、既に配列決定されているか又は部分的に配列決定されているがδ蛋白質が発見されていないゲノムからδを同定するため、及びこれらの生物の配列が利用可能になるにつれて生物からδを同定するために有用な方法も提供する。上記方法は、細菌の間の系統発生上の関係に基づく。δ蛋白質が発見されていない細菌の種からδを同定するため、検索は、標的生物に対して進化上近縁な生物（即ち、同じ綱／門のメンバー）からのδアミノ酸配列に対して新規な生物に関しての配列を検索することを含む。即ち、進化上近縁な生物からのδ蛋白質を基準配列又は質問（ｑｕｅｒｙ）配列として用いる。基準δ配列は本発明の方法の何れによっても得ることができる。最初の検索がヒットを生まなかったなら、次に標的配列とは徐々により進化上離れた質問配列としてδアミノ酸配列を用いて、δが同定されるまで又は全ての公知の門からのδ配列を枯渇するまで、検索を続けるべきである。これらの方法の使用の例示の例は実施例のセクションに記載される。
【００７５】
δサブユニット蛋白質
本発明の一つの態様は、単離されたＡｑｕｉｆｅｘ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｂｕｃｈｎｅｒａ，Ｂｏｒｒｅｌｉａ，Ｃａｍｐｙｒｏｂａｃｔｅｒ，Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ，Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ，Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ，Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ，Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ，Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ，Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ，Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ，Ｖｉｂｒｉｏ，Ｘｙｌｅｌｌａ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ，Ｙｅｒｓｉｓｎａ，Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｂｏｒｄｅｔｅａｌｌａ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ，Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ，Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｃｙｔｏｐａｈａｇａ，Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ，Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ，及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素δサブユニット蛋白質を含む。
【００７６】
本発明の一つの態様は、単離されたＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｈａｌｏｄｕｒａｎｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｂｕｃｈｎｅｒａ，Ｂｏｒｒｅｌｉａ　ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ，Ｃａｍｐｙｒｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ，Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｍｕｒｉｄａｒｕｍ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａ　ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａ，Ｄｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　２６６９５，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ　ｐｙｌｏｒｉ　Ｊ９９，Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｌａｃｔｉｓ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌａｐｒａｅ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｌｏｔｉ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　ＭＣ５８，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　Ｚ２４９１，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ　ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ，Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ，Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ，Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍ，Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ　ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ，Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ，Ｘｙｌｅｌｌａ　ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｕｌｍｏｎｉｓ，Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｙｅｒｓｉｓｎａ　ｐｅｓｔｉｓ，Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ，Ｂｏｒｄｅｔｅａｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ，Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ　ｔｅｐｉｄｕｍ，Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｕｒａｎｔｉｃｕｓ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ，Ｃｙｔｏｐａｈａｇａ　ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ，Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｏｉｄｅｓ　ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ，Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｒｉｎｕｓ，及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素δサブユニット蛋白質を含む。
【００７７】
また、好ましいのは、アミノ酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５６に、少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、そしてより好ましくは少なくとも約９８％同一なアミノ酸配列を含むデルタ蛋白質、又はこれらの配列の何れかを含む蛋白質をコードする核酸分子の対立遺伝子バリアントによりコードされる蛋白質である。アミノ酸配列間及び核酸配列間のパーセント同一性を決定する方法は、当業者に知られている。配列間のパーセント同一性を決定するための好ましい方法は、コンピュータープログラム、例えばＧＣＧプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃ．より利用可能）、ＭａｃＶｅｃｔｏｒｓプログラム（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，Ｃｏｎｎ．より利用可能）、ＤＮＡｓｉｓ（登録商標）プログラム（Ｈｉｔａｃｈｉ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ　Ｂｒｕｎ，Ｃａｌｉｆ．より利用可能）、Ｖｅｃｔｏｒ　ＮＴＩ　Ｓｕｉｔｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｇｒａｍｓ（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｉｎｃ．，Ｎｏｒｔｈ　Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤより利用可能）又はＮＣＢＩウエブサイトから利用可能なＢＬＡＳＴソフトウエアを含む。
【００７８】
一つの態様において、好ましいδサブユニット蛋白質は、少なくとも約５アミノ酸、好ましくは少なくとも約５０アミノ酸、好ましくは少なくとも約１００アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２００アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２７５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約３００アミノ酸、より好ましくは少なくとも約３５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約３７５アミノ酸又は完全長のδ蛋白質の何れか短いアミノ酸配列である。別の態様において、好ましいδサブユニット蛋白質は完全長の蛋白質、即ち、完全長のコーディング領域によりコードされた蛋白質、又はその翻訳後に修飾された蛋白質、例えば、最初のメチオニン及び／又はシグナル配列又は「ｐｒｏ」配列が除去された成熟蛋白質を含む。
【００７９】
本発明のδサブユニット蛋白質の断片は、好ましくは、少なくとも約５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約１５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約３５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約４０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約４５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約５０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約５５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約６０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約６５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約７０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約７５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約８５アミノ酸、より好ましくは少なくとも約９０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約９５アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも約１００アミノ酸の長さを含む。
【００８０】
一つの態様において、本発明の好ましい単離されたδサブユニット蛋白質は、核酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１００，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４を有する核酸分子によりコードされるか；又はこれらの配列の何れかを有する核酸分子の対立遺伝子バリアントによりコードされる蛋白質である。
【００８１】
本発明の一つの態様は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でδサブユニット遺伝子又はｈｏｌＡ遺伝子とハイブリダイズする核酸分子によりコードされる非天然δサブユニット蛋白質を含む。本明細書にて使用されるとおり、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、オリゴヌクレオチドを含む核酸分子を用いて類似の核酸配列を有する分子を同定する標準ハイブリダイゼーション条件を意味する。そのような標準条件は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｓ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に開示されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，同じ箇所は、その全体を引用により本明細書に編入する。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、典型的には、ハイブリダイゼーション反応において釣り上げる（ｐｒｏｂｅ）ために使用される核酸分子と少なくとも約７０％核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にする。ヌクレオチドの３０％又はそれ未満のミスマッチを可能にするハイブリダイゼーションを達成するための適切なハイブリダイゼーション及び洗浄条件を計算する式は、例えば、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７−２８４（１９８４）に開示されている；Ｍｅｉｎｋｏｔｈ，Ｊ．ｅｔ　ａｌ．，同じ箇所は引用によりその全体を本明細書に編入する。好ましい態様において、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げる為に使用される核酸分子と少なくとも約８０％配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にすることになる。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約９０％配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にすることになる。より好ましい態様において、ハイブリダイゼーション条件は、釣り上げるために使用される核酸分子と少なくとも約９５％配列同一性を有する核酸分子の単離を可能にすることになる。
【００８２】
好ましいδサブユニット蛋白質は、少なくとも約５０ヌクレオチドの核酸分子であり、且つ、好ましくは約２０％塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは約１５％塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは約１０％塩基対ミスマッチを許容する条件下で、より好ましくは約５％塩基対ミスマッチを許容する条件下で、そしてより好ましくは約２％塩基対ミスマッチを許容する条件下で、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１００，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４からなる群から選択される核酸分子、又はこれらの核酸分子の何れかの相補体とハイブリダイズする核酸分子によりコードされる蛋白質を含む。
【００８３】
本明細書にて使用されるとおり、ｈｏｌＡ遺伝子は、その遺伝子によりコードされるδサブユニット蛋白質の生産を制御する制御領域のような天然ｈｏｌＡ遺伝子に関係する全ての核酸配列（例えば、限定ではないが、転写、翻訳又は翻訳後制御領域）並びにそのコーディング領域を含む。一つの態様において、ｈｏｌＡ遺伝子は、核酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１を含む。核酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１は本明細書ではｎＡｅｏｄと記した核酸分子の推定アミノ酸を表し、その推定は実施例に開示される。核酸配列決定技術は完全にエラーを含まないことがないからＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１（並びに本明細書に示された他の配列）は、せいぜい、本発明のＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのδサブユニット蛋白質をコードする核酸分子の見かけ上の（ａｐｐａｒｅｎｔ）核酸配列を表す。
【００８４】
別の態様において、ｈｏｌＡ遺伝子はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に類似であるが同一でない配列を含む対立遺伝子バリアントであり得る。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１を含むｈｏｌＡ遺伝子の対立遺伝子バリアントはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１を含む遺伝子と本質的には同じゲノム内の座において生じる遺伝子であるが、例えば変異又は組換えにより生じる天然バリエーションのために類似であるが同一でない配列を有する。対立遺伝子バリアントは、典型的には、それらが比較される遺伝子によりコードされる蛋白質と類似の活性を有する蛋白質をコードする。対立遺伝子バリアントは上記遺伝子の５’又は３’の非翻訳領域（例えば、制御領域）の変化も含み得る。対立遺伝子バリアントは当業者にはよく知られており、与えられた細菌中に見いだされることが推定されるはずであるが、ゲノムが二倍体であり、及び／又は集団間で２つ又は複数の細菌を含むからである。例えば、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ２６６９５のδサブユニットの核酸分子ｎＨｐｙｌ２ｄは、核酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７を有して以下により詳細に説明されるが、核酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０を有する、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ　Ｊ９９のδサブユニット核酸分子の対立遺伝子バリアントを表す。
【００８５】
同様に、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓのｈｏｌＡは、天然のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓのｈｏｌＡ遺伝子に関係する全ての核酸配列、例えばその遺伝子によりコードされるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓのδサブユニット蛋白質の生産を制御する制御領域並びにそのコーディング領域を含む。一つの態様において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓのｈｏｌＡ遺伝子は核酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３を含む。核酸配列ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３は本明細書中でｎＳｐｙｏｄと記されるＤＮＡ核酸分子の推定配列を表し、その生産は実施例に開示される。別の態様において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓのｈｏｌＡ遺伝子はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３に類似であるが同一ではない対立遺伝子バリアントであり得る。
【００８６】
同様に、本明細書に記載される他の全てのｈｏｌＡ遺伝子は、その遺伝子によりコードされるδサブユニットの生産を制御する制御領域のような天然ｈｏｌＡ遺伝子に関係した全ての核酸配列並びにそのコーディング領域を含む。
【００８７】
本発明の単離されたδサブユニット蛋白質は、その天然源から得ることができるか、組換えＤＮＡ技術を用いて生産することができるか、又は化学合成により生産することができる。本明細書にて使用されるとおり、単離されたδサブユニット蛋白質は、完全長蛋白質又はそのような蛋白質の何れかの相同体であり得る。δサブユニット相同体の例は、アミノ酸が推定されたか（例えば、蛋白質の末端削除バージョン、例えば、ペプチド、又はインテインが除去されたか又は２つのエクステインが連結された場合の蛋白質スプライシング反応による）、挿入されたか、逆転されたか、置換されたか、そして／又は誘導された（例えば、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、メチル化、ミリスチル化、プレニル化、パルミトイル化、アミド化によるか及び／又はグリセロホスファチジルイノシトールの添加による）δ蛋白質であり、そのような相同体はδ蛋白質に対する免疫応答を導き出すことができる少なくとも一つのエピトープを含む。即ち、当業者に知られている公知の技術を用いて相同体が動物に対して免疫原として投与される場合、動物はδ蛋白質の少なくとも一つのエピトープに対して体液性及び／又は細胞性の免疫応答を生じることになる。δ相同体は免疫血清に選択的に結合するそれらの能力により選択することもできる。そのような活性を測定する方法は、本明細書に開示される。δ相同体は、機能アッセイにおいて天然δ蛋白質の機能を遂行可能な蛋白質も含む。
【００８８】
本発明のδサブユニット蛋白質は、機能アッセイにおいてδサブユニットの機能を遂行するその能力により同定してよい。「機能アッセイにおいて機能を遂行することができる」なる句は、機能アッセイにおいて天然蛋白質サブユニットの活性の少なくとも約１０％を上記蛋白質が有することを意味する。別の好ましい態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約２０％を有する。別の好ましい態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約３０％を有する。別の好ましい態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約４０％を有する。別の好ましい態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約５０％を有する。別の好ましい態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約６０％を有する。より好ましい態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約７０％を有する。より態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約８０％を有する。より態様において、機能アッセイにおいて天然蛋白質の活性の少なくとも約９０％を有する。
【００８９】
機能アッセイの例は、「本発明の蛋白質の用途」と題されるセクションにおいて以下において詳細に説明され、そして限定ではないが、ＤＮＡ複製アッセイ、βクランプ負荷又は非負荷アッセイ、ＡＴＰ結合及び加水分解アッセイ、蛋白質結合アッセイ等を含む。
【００９０】
本発明の単離された蛋白質は様々な様式において生産することができ、細菌からそのような蛋白質を回収してそのような蛋白質を組換え生産することを含む。本発明の一つの態様は、組換えＤＮＡ技術を用いて本発明の単離された蛋白質を生産する方法である。そのような方法は、（ａ）本発明の蛋白質をコードする核酸分子を含む組換え細胞を培養することにより蛋白質を生産させ、そして（ｂ）それから蛋白質を回収する工程を含む。組換え細胞を生産してそれを培養することの詳細は、以下に示される。「蛋白質を回収する」なる句は、蛋白質を含む全発酵培地を単純に回収することを意味し、分離又は精製の追加の工程を包含する必要はない。本発明の蛋白質は、様々な標準蛋白質精製技術を用いて精製することができる。
【００９１】
本発明の単離された蛋白質は、「実質上純粋な」形態で回収されることが好ましい。本明細書にて使用されるとおり、「実質上純粋な」は、ＤＮＡ複製アッセイにおいて蛋白質の有効な使用を可能にさせる純度を意味する。
【００９２】
δサブユニット核酸分子又はｈｏｌＡ遺伝子
本発明の別の態様は、ストリンジェトな条件下でδサブユニット蛋白質をコードする遺伝子とハイブリダイズできる単離された核酸分子である。そのような核酸分子は本明細書においてδサブユニット核酸分子又はｈｏｌＡ核酸分子とも呼ばれる。特に好ましいのは、ストリンジェントな条件下でｈｏｌＡ遺伝子とハイブリダイズする単離された核酸分子である。本発明によると、単離された核酸分子は、その天然の環境から取り出された核酸分子である（即ち、ヒトの操作に供された）。それだけでは、「単離された」は、核酸分子が精製された程度を反映しない。単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡあるいはＲＮＡの何れかの誘導体を含み得る。
【００９３】
上記のとおり、ｈｏｌＡ遺伝子は、その遺伝子によりコードされるδサブユニットの生産を制御する制御領域のような天然ｈｏｌＡ遺伝子に関係した全ての核酸配列（例えば、転写、翻訳又は翻訳後制御領域）並びにそのコーディング領域を含む。本発明の核酸分子は、単離されたｈｏｌＡ核酸分子又はその相同体であり得る。本発明の核酸分子は、一つ又は複数の制御領域、完全長又は一部のコーディング領域またはそれらの組み合わせを含み得る。本発明のｈｏｌＡ核酸分子の最小サイズは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で相当する天然遺伝子と安定なハイブリッドを形成できる最小サイズである。ｈｏｌＡ核酸分子は、ハイブリッド蛋白質、融合蛋白質、多価蛋白質又は末端削除断片をコードする核酸分子でもあり得る。
【００９４】
本発明の単離された核酸分子は、その天然源から、全体の（即ち、完全な）遺伝子又はその遺伝子と安定なハイブリッドを形成できるその一部として得ることができる。本明細書にて使用されるとおり、全体の「少なくとも一部」なる句は、その全体の機能上の側面を有するのに少なくとも十分なかなりの量の全体（ａｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｅｎｔｉｔｙ）を意味する。例えば、本明細書にて使用される、核酸配列の少なくとも一部は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で相当する遺伝子と安定なハイブリッドを形成できるかなりの量の（ａｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ）核酸配列である。
【００９５】
本発明の単離された核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローン化、等）又は化学合成を用いて生産することもできる。単離されたｈｏｌＡ核酸分子は、天然の核酸分子及びその相同体を含み、限定ではないが、天然の対立遺伝子バリアント、及び核酸分子が本発明のδサブユニット蛋白質をコードする能力又は天然核酸分子単離物とストリンジェント条件下で安定なハイブリッドを形成する能力をそのような修飾が実質上干渉しないような様式にて、ヌクレオチドが挿入されたか、欠失されたか、置換されたか及び／又は逆転された修飾核酸分子を含む。
【００９６】
ｈｏｌＡ核酸分子相同体は当業者に知られている多数の方法を用いて生産することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，同じ箇所、を参照）。例えば、核酸分子は様々な技術を用いて修飾することができ、限定ではないが、古典的な変異導入技術及び組換えＤＮＡ技術、例えば部位特異的変異導入、核酸分子の化学処理による変異誘導、核酸断片の制限酵素分割、核酸断片の連結、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は核酸配列の選択された領域の変異導入、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び核酸分子の混合物を「構築する（ｂｕｉｌｄ）」ための混合物群の連結およびそれらの組み合わせを含む。核酸分子の相同体は、核酸によりコードされる蛋白質の機能のスクリーニングにより修飾核酸の混合物から選択することができる（例えば、δサブユニット蛋白質に対する免疫応答を誘導すること及び／又はＤＮＡ複製アッセイにおいて機能することにおける相同体の能力、又は他の機能アッセイ、及び／又は単離されたδサブユニットコーディング核酸とのストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーション。
【００９７】
本発明の単離されたδサブユニット核酸分子は、本発明の少なくとも一つのδサブユニット蛋白質をコードする核酸分子を含むことができ、そのような蛋白質の例が本明細書に開示される。「核酸分子」なる句は主に物質的な核酸分子を意味し、そして「核酸配列」なる句は主に核酸分子上の核酸配列を意味し、２つの句は交換可能に使用することができ、特に核酸分子、又は核酸配列に関しては、δサブユニット蛋白質をコードすることができる。
【００９８】
本発明の一つの態様は、δサブユニット又はその相同体の少なくとも一部をコードする核酸鎖又はそのような核酸の相補体に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる、本発明のｈｏｌＡ核酸分子である。本発明の何れかの核酸鎖の核酸配列相補体は、配列が引用される鎖に相補である（即ち、完全な二重ヘリックスを形成できる）。ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯで表される、一つの鎖に関して核酸配列が決定された本発明の二重鎖核酸分子は、そのＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯの相補体の配列を有する相補鎖も含むことに注意されたい。それとして、本発明の核酸分子は、二本鎖又は一本鎖の何れかであり得て、本明細書に表示された所定のＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯの何れかか又はそのＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯの相補体とストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で安定なハイブリッドを形成する核酸分子を含み、本明細書において表示されてもされなくてもよい。好ましいのは、δサブユニット蛋白質の少なくとも一部をコードする核酸配列の相当する領域に対して、少なくとも約６５パーセント、好ましくは少なくとも約７０パーセント、より好ましくは少なくとも約７５パーセント、より好ましくは少なくとも約８０パーセント、より好ましくは少なくとも約８５パーセント、より好ましくは少なくとも約９０パーセント、そしてさらにより好ましくは少なくとも約９５パーセント相同性を有する核酸配列を含むｈｏｌＡ核酸分子である。特に好ましいのは、天然に細菌中に存在するδサブユニット蛋白質の少なくとも一部をコードし得るδサブユニット核酸分子である。
【００９９】
好ましいｈｏｌＡ核酸分子は、以下の配列：
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：７９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１００，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２４，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２７，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３０，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３６，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３９，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４２，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４５，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１４８，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５１，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５４の少なくとも一つを含む。また、好ましいのは、そのような核酸分子の対立遺伝子バリアントである。
【０１００】
本発明のδサブユニット蛋白質の核酸分子を知ることは、当業者が、その核酸分子のコピーを作成すること、並びにδサブユニットコーディング遺伝子の追加部分を含む核酸分子（例えば、翻訳開始部位及び／又は転写及び／又は翻訳制御領域を含む核酸分子）及び／又はδサブユニット核酸分子相同体を得ることを可能にさせる。本発明のδサブユニット蛋白質のアミノ酸配列の一部を知ることは、当業者がそのようなδサブユニット蛋白質をコードする核酸配列をクローン化することを可能にさせる。さらに、所望のδサブユニット核酸分子を様々な様式により得ることができ、本発明のδサブユニット蛋白質に結合する抗体による適当な発現ライブラリーのスクリーニング；適当なライブラリー又はＤＮＡをスクリーニングするための本発明のオリゴヌクレオチドプローブを用いた伝統的クローン化技術；及び本発明のオリゴヌクレオチドプライマーを用いた適当なライブラリー、又はＲＮＡ又はＤＮＡのＰＣＲ増幅を含む（ゲノム及び／又はｃＤＮＡライブラリーが使用できる）。例示の実施例は実施例のセクションに提供される。
【０１０１】
本発明は、ストリンジェントな条件下で、他の相補領域とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドである核酸分子も含み、好ましくは、δサブユニット蛋白質の少なくとも一部をコードする本発明の、より長い核酸分子である。本発明のオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又は何れかの誘導体であり得る。そのようなオリゴヌクレオチドの最小サイズは、与えられたオリゴヌクレオチドと、本発明の別の核酸分子上の相補配列との間で安定なハイブリッドを形成するのに必要なサイズである。オリゴヌクレオチドのサイズは、本発明によればオリゴヌクレオチドの使用のために十分でもなければならない。本発明のオリゴヌクレオチドは様々な応用において使用することができ、限定ではないが、追加の核酸分子を同定するためのプローブとして、核酸分子を増幅するか又は伸長合成するためのプライマーとして、又はδサブユニット生産を阻害する治療上の適用において使用することができる。そのような治療上の適用は、そのようなオリゴヌクレオチド、例えばアンチセンス−、三重鎖形成−、リボザイム−、及び／又はＲＮＡ薬剤−に基づく技術の使用を含む。本発明は、よって、そのようなオリゴヌクレオチド及び一つ又は複数のそのような技術の使用によるδサブユニット蛋白質の生産を干渉する方法を含む。
【０１０２】
天然の野生型細菌細胞及び組換え分子及び細胞
本発明は組換えベクターも含み、宿主細胞内に核酸分子を送達できるあらゆるベクターに挿入された本発明のｈｏｌＡ核酸分子を含む。そのようなベクターは異種核酸配列を含み、本発明のｈｏｌＡ核酸分子に隣接した天然では見いだされない核酸配列である。ベクターはＲＮＡ又はＤＮＡの何れか、原核又は真核の何れかであり得て、そして典型的にはウイルス又はプラスミドである。組換えベクターは本発明のｈｏｌＡ核酸分子のクローン化、配列決定、及び／又は別の操作において使用することができる。本明細書中の組換えベクターの一つの種類は、組換え分子と呼ばれて、以下に詳細に説明され、本発明の核酸分子の発現において使用することができる。好ましい組換えベクターは形質転換細胞中で複製することができる。本発明の組換えベクターにおいて含む好ましい核酸分子は、本明細書に開示される。
【０１０３】
これまで開示されたとおり、本発明の一つの態様は、蛋白質を生産するのに有効な条件下で蛋白質を発現できる細胞を培養し、そして蛋白質を回収することによる、本発明のδサブユニット蛋白質を生産する方法である。
【０１０４】
好ましい態様において、培養する細胞は天然の細菌細胞であり、そしてデルタは溶解と再構成のアプローチによりこれらの細胞から単離されるが、その際、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の必要な成分の全てを溶解して、一つの蛋白質に関してのアッセイを作成する。その一つの蛋白質は、限定量にて存在するなら、他の蛋白質の飽和レベルの存在下において、添加された限定蛋白質の量に比例したレベルにおいて進行する単一のプライマーを含む、長い環状ＤＮＡ鋳型上のＤＮＡ複製を許容する。そのようなアッセイは、精製手法の間に蛋白質を確認して（ｌｏｃａｔｅ）その純度を評価するために使用することができる（活性／蛋白質の比＝比活性）。溶解と再構成の例は当業者に知られており、Ｓｃｈｅｋｍａｎ，Ｒ．，Ｗｅｉｎｅｒ，Ａ．，ａｎｄ　Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　１８６：９８７−９９３（１９７４）及びＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．ａｎｄ　Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ　２５２：６４７８−６４８４（１９７７）に提供される。
【０１０５】
別の態様において、培養するのに好ましい細胞は、δサブユニット蛋白質を発現できる組換え細胞であり、当該組換え細胞は本発明の一つ又は複数の核酸分子で宿主細胞を形質転換することにより生産される。核酸分子による細胞の形質転換は、核酸分子が細胞に挿入できるあらゆる方法により達成することができる。形質転換技術は、限定ではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクチン、吸着、及びプロトプラスト融合を含む。組換え細胞は単細胞のままでよく、あるいは組織、器官又は多細胞生物に生育させてよい。本発明の形質転換された核酸分子は、染色体外のままであり得るか、又はそれらの発現される能力が保持されるように、形質転換された（組換え）細胞の染色体内の一つ又は複数の部位に組み込まれ得る。宿主細胞を形質転換する好ましい核酸分子は、本明細書に開示される。
【０１０６】
形質転換される適切な宿主細胞は、形質転換でき且つ導入されたδサブユニット蛋白質を発現できるあらゆる細胞を含む。そのような細胞は、従って、本発明の少なくとも一つの核酸分子で形質転換された後に、本発明のδサブユニット蛋白質を生産できる。宿主細胞は、まだ形質転換されない細胞か少なくとも一つの核酸分子により既に形質転換された細胞の何れかであり得る。本発明の適当な宿主細胞は、細菌、真菌（酵母を含む）、昆虫、動物及び植物細胞を含み得る。好ましい宿主細胞は細菌細胞であり、Ｅ．ｃｏｌｉとＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞が特に好ましい。別の好ましい宿主細胞は、同じ起源のδサブユニット蛋白質を生産する未形質転換の（野生型）細菌細胞であり、病原性の低下した弱毒株を適宜含む。
【０１０７】
組換え体細胞は、一つ又は複数の組換え体分子で細胞を形質転換することにより生産することが好ましく、各々が、一つ又は複数の転写制御配列を含む発現ベクターに作動可能なように連結した本発明の一つ又は複数の核酸分子を含む。作動可能なように連結したという句は、宿主細胞を形質転換する際に上記分子が発現され得る様式における、核酸分子の発現ベクターへの挿入を意味する。本明細書にて使用されるとおり、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換できて且つ特定の核酸分子の発現を作用させることが可能なＤＮＡ又はＲＮＡのベクターである。好ましくは、発現ベクターは宿主細胞内で複製することもできる。発現ベクターは、原核又は真核のいずれかであり得て、典型的にはウイルス又はプラスミドである。本発明の発現ベクターは、本発明の組換え体細胞中で機能するあらゆるベクターを含み（即ち、直接の遺伝子発現）、細菌、真菌、昆虫、動物及び／又は植物の細胞を含む。そのように、本発明の核酸分子は、制御配列、例えばプロモーター、オペレーター、エンハンサー、停止配列、複製オリジン、及び組換え体細胞内で適合可能であって且つ本発明の核酸分子の発現を制御する他の制御配列を含む発現ベクターに、作動可能なように連結させることができる。本明細書にて使用されるとおり、転写制御配列は、イニシエーション、伸長合成、及び転写終結を制御できる配列を含む。特に重要な転写制御配列は、転写の開始を制御するものであり、例えばプロモーター、エンハンサー、オペレーター及びリプレッサー配列である。適当な転写制御配列は、本発明の組換え体細胞の少なくとも一つにおいて機能し得るあらゆる転写制御配列を含む。そのような転写制御配列の様々なものが当業界公知である。好ましい転写制御配列は、細菌、酵母及び哺乳類の細胞において機能する配列であり、限定ではないが、ｔａｃ，ｌａｃ，ｐＡ１（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ　ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０６９０−２０６９８（１９９６））ｔｚｐ，ｔｒｃ，ｏｘｙ−ｐｒｏ，ｏｍｐ／ｌｐｐ，ｒｒｎＢ、バクテリオファージラムダ（．ｌａｍｂｄａ．）（例えば、．ｌａｍｂｄａ．ｐ．ｓｕｂ．Ｌ及び．ｌａｍｂｄａ．ｐ．ｓｕｂ．Ｒ及びそのようなプロモーターを含む融合体）、バクテリオファージＴ７，Ｔ７ｌａｃ，バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６，バクテリオファージＳＰ０１，メタロチオネイン、アルファ交配因子、ピキアアルコールオキシダーゼ、アルファウイルスサブゲノミックプロモーター（例えば、シンドビスウイルスサブゲノミックプロモーター）、バキュロウイルス、ヘリオディス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ）トウモロコシ昆虫ウイルス、ワクシニアウイルスヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０、レトロウイルスアクチン、レトロウイルスロングターミナルリピート、ラウスザルコーマウイルス、熱ショック、リン酸塩及び硝酸塩転写制御配列並びに原核又は真核細胞において遺伝子発現を制御できる他の配列である。さらなる適当な転写制御配列は、組織特異性プロモーター及びエンハンサー並びにオカイン−誘導可能性プロモーター（例えば、インターフェロン又はインターロイキンにより誘導可能なプロモーター）を含む。本発明の転写制御配列は、δサブユニット蛋白質をコードするＤＮＡ配列に天然において付随する天然の転写制御配列を含むこともできる。
【０１０８】
本発明の発現ベクターは分泌シグナル（即ち、シグナルセグメントの核酸配列）を含むことにより、当該蛋白質を生産する細胞から発現されたδサブユニット蛋白質が発現されることを可能にしてもよい。適当なシグナルセグメントは、δサブユニット蛋白質シグナルセグメント、又は本発明の、融合蛋白質を含むδサブユニット蛋白質の分泌を指示することができるあらゆる異種シグナルセグメントを含む。好ましいシグナルセグメントは、限定ではないが、δサブユニット、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、インターフェロン、インターロイキン、成長因子、組織適合性及びウイルスのエンベロープの糖蛋白質シグナルセグメントを含む。
【０１０９】
本発明の発現ベクターは、融合蛋白質として本発明の挿入された核酸分子の発現を導く融合配列を含んでもよい。本発明のｈｏｌＡ核酸分子の一部としての融合配列の包含は、核酸分子によりコードされる蛋白質の生産、保存及び／又は使用の間の安定性を増強することができる。さらに、融合セグメントはδサユニット蛋白質の精製を単純化する手段、例えば結果として生じる融合蛋白質の親和性クロマトグラフィーを用いた精製を可能にする手段として機能し得る。適当な融合セグメントは所望の機能を有するあらゆるサイズのドメインであり得る（例えば、増加した安定性及び／又は精製手段）。一つ又は複数の融合セグメントを使用することは本発明の範囲内である。融合セグメントは、δサブユニット蛋白質のアミノ及び／又はカルボキシル末端に連結することができる。融合セグメントとδサブユニット蛋白質の間の結合は、δサブユニット蛋白質の直接の回収を可能にする分割に感受性であるように構築することができる。融合蛋白質は、δサブユニット蛋白質のアミノ及び／又はカルボキシル末端の何れかに結合させた融合セグメントを含む蛋白質をコードする融合核酸配列で形質転換された組換え体細胞を培養することにより生産することが好ましい。
【０１１０】
本発明の組換え体分子は、形質転換される細胞内で核酸分子の発現を有効に制御できるあらゆる少なくとも一つの転写制御配列に作動可能なように連結した、今まで記載されたあらゆる核酸分子少なくとも一つを含み得る。好ましい組換え体分子は本発明の一つ又は複数の核酸分子を含み、一つ又は複数のδサブユニット蛋白質をコードするものが特に好ましい。本発明の好ましい組換え体分子及びそれらの生産は、実施例のセクションに記載される。
【０１１１】
当業者には認識されるとおり、組換えＤＮＡ技術の使用は形質転換された核酸分子の発現を改良でき、例えば、核酸分子の宿主細胞内でのコピー数、それらの核酸分子が転写される効率、結果の転写物が翻訳される効率、及び翻訳後の修飾の効率を操作することによる。本発明の核酸分子の発現を増加させるのに有用な組換え技術は、限定ではないが、高コピー数のプラスミドへの核酸分子の作動可能な連結、一つ又は複数の宿主細胞染色体への核酸分子の組み込み、ベクター安定性配列のプラスミドへの添加、転写制御シグナルの置換又は修飾（例えば、プロモーター、オペレーター、エンハンサー）、転写制御シグナルの置換又は修飾（例えば、リボソーム結合部位、シャイン−ダルガノ配列）、宿主細胞のコドン使用頻度に対応させるための本発明の核酸分子の修飾、転写物を脱安定化するための配列の欠失、及び発酵の間の組換え蛋白質生産から組換え体細胞成長を一時分離する制御シグナルの使用を含む。本発明の発現された組換え体蛋白質の活性は、結果の蛋白質を断片化、修飾又は誘導することにより、改良してよい。
【０１１２】
本発明によれば、組換え体細胞は、そのような細胞を生産するのに有効な条件下でそのような細胞を培養し、そして蛋白質を回収することにより、本発明のδサブユニット蛋白質を生産することができる。蛋白質を生産するための有効な条件は、限定ではないが、適切な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ及び蛋白質生産を可能にする酸素条件を含む。適切か又は有効な培地は、培養した時に、本発明の細胞がδサブユニット蛋白質を生産できるようなあらゆる培地を意味する。そのような培地は、同化できる糖質、窒素及びリン酸源、並びに適切な塩、ミネラル、金属及び他の栄養物質、例えばビタミンを含む水性培地が典型である。上記培地は、複合体、栄養を含んでよく、あるいは規定された最小培地であってよい。
【０１１３】
本発明の細胞は慣用の発酵バイオリアクター内で培養することができ、限定ではないが、バッチ、給餌バッチ、細胞リサイクル、及び連続発酵機を含む。培養は、振盪フラスコ、試験管、マイクロタイター皿、及びペトリ皿内で実施することもできる。培養は、組換え体細胞に適した温度、ｐＨ及び酸素含有量にて実施する。そのような培養条件は、当業者の一人の専門技術の範囲内である。
【０１１４】
生産のために使用されるベクター及び宿主系に依存して、結果のδサブユニット蛋白質は組換え体細胞内に残ったままであるか；発酵培地中に分泌するか；２つの細胞膜、例えばＥ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間の間に分泌するか；又は細胞又はウイルスの膜の外表面に保持するかのいずれかであってよい。そのような蛋白質を精製する方法は実施例のセクションに開示される。
【０１１５】
抗体
本発明は、単離された抗δサブユニット抗体及びそれらの使用も含む。抗δサブユニット抗体は、δサブユニットに選択的に結合できる抗体である。単離された抗体はそれらの天然環境から取り出された抗体である。用語「単離された」は、そのような抗体の精製度の程度を意味しない。そのようにして、単離された抗体は、そのような抗体を含む抗血清、又は精製される程度を変更した抗体を含み得る。本明細書にて使用されるとおり、用語「選択的に結合する」は、抗体を生じさせたプロテアーゼに選択的に結合する、そのような抗体の能力を意味する（即ち、混合物中の関係ない成分からプロテアーゼを識別することが可能）。平衡結合定数として通常は表現される結合親和性は、典型的には、約１０３Ｍ−１から約１０１２Ｍ−１の範囲である。結合は、当業者に知られている様々な方法を用いて測定することができ、免疫ブロットアッセイ、免疫沈殿アッセイ、放射線免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光抗体アッセイ及び免疫電子顕微鏡を含み、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，同じ箇所を参照。
【０１１６】
本発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナル抗体の何れかであり得る。本発明の抗体は、抗体を得るために使用された蛋白質のエピトープの少なくとも一つに選択的に結合することができる、単鎖抗体を含む抗体断片又は遺伝学上操作された抗体のような機能性均等物を含む。本発明の抗体は、一つよりも多いエピトープに結合することができるキメラ抗体も含む。好ましい抗体は、本発明のδサブユニット核酸分子により少なくとも一部コードされた蛋白質に応答して生じさせる。
【０１１７】
本発明の抗δサブユニット抗体は、δサブユニットを投与された動物において生じさせた抗体を含む。本発明の抗δサブユニットは、当業者に知られた技術を用いて細胞から後に回収される、本発明の一つ又は複数のδサブユニット蛋白質に対して動物において生じさせた抗体も含む。さらに、本発明の追加の抗体は、本発明のδサブユニット蛋白質に関してこれまで開示された技術を用いて組換え生産される。規定された蛋白質に対して生じさせた抗体は有利であるが、何故ならば、そのような抗体は、他の点で、診断アッセイにおいて干渉を引き起こすか又は治療用組成物中で使用されるなら副作用を引き起こし得るかもしれない他の物質に対する抗体により実質上汚染されないからである。
【０１１８】
本発明の抗δサブユニット抗体は本発明の範囲内の様々な用途を有する。例えば、そのような抗体は、細菌感染から動物を防御するために、動物を受動的に免疫させるため、本発明の組成物中で使用することができる。抗δサブユニット抗体は、発現ライブラリーをスクリーニングし、及び／又は蛋白質と他の汚染物の混合物から本発明の所望の蛋白質を回収するための手段として使用することもできる。さらに、本発明の抗体は、細菌を殺傷するか、治療剤を送達するか又はイメージング剤を細菌感染した器官又は組織に局在化させるために、細胞障害性か、治療用か又はイメージング用の薬剤を細菌又は細菌感染器官又は組織を標的化するのに使用できる。標的化は、当業界公知の技術を用いて、そのような抗体を、細胞障害性か、治療用か又はイメージング用の薬剤に配合する（即ち、安定に連結させる）ことにより達成できる。
【０１１９】
本発明の好ましい抗δサブユニット抗体は、選択的に結合し、そしてδサブユニット蛋白質を含むレプリカーゼのＤＮＡ複製活性を優先的に低下させることができる。
【０１２０】
本発明の蛋白質の用途
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素（α、β、ＤｎａＸ、δ、及びδ’サブユニットを含む）の再構成アッセイにおける本発明のδサブユニット蛋白質の使用のための方法を提供する。そのような方法は、全体を引用により本明細書に編入する、２０００年１０発２７日に出願された米国仮出願連続番号６０／２４４，０２３及び２００１年５発１４日に出願された米国仮出願連続番号６０／２９０，７２５において詳細に説明される。
【０１２１】
本発明は、ＤＮＡ増幅のための好熱性細菌由来の本発明のδサブユニットの使用方法も提供し、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）及び恒温増幅を含み、限定ではないが、研究目的のため（クローン化及び分析）及び診断目的のための、回転循環増幅を含む。そのような方法は、ＷＯ９９／１３０６０において詳細に記載される。そのようなδサブユニット蛋白質は、限定ではないが、Ａｑｕｉｆｅｘ，Ｔｈｅｒｍｕｓ及びＴｈｅｒｍａｔｏｇａ属由来のものを含む。特定の例は、Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ由来（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３，ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２６）、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０８）、及びＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒａｔｉｍａ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８１）由来のδサブユニット蛋白質である。
【０１２２】
一つの態様において、好熱性ポリメラーゼは、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭグルタミン酸カリウム、２０％グリセロール及び１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液中で７０℃において５分間インキュベーションに際してその活性の少なくとも５０％を保持するものである。別の態様において、好熱性ポリメラーゼは、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭグルタミン酸カリウム、２０％グリセロール及び１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液中で６０℃において５分間インキュベーションに際してその活性の少なくとも５０％を保持するものである。好ましい態様において、好熱性ポリメラーゼは、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭグルタミン酸カリウム、２０％グリセロール及び１ｍＭジチオスレイトールを含む溶液中で６０℃において１０分間インキュベーションに際してその活性の少なくとも５０％を保持するものである。
【０１２３】
本発明は、動物、植物、ヒト及び環境の細菌感染を低下させるための、δサブユニットを含むＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの複製活性を低下させる細菌ＤＮＡ複製の変調剤の使用も含む。本明細書にて使用されるとおり、細菌のＤＮＡ複製の変調剤は、レプリカーゼに相互作用することにより、レプリカーゼがＤＮＡを複製する能力を変化させる化合物である。
【０１２４】
細菌のレプリカーゼの必須サブユニットの最小のアッセンブリーは、長いストレッチのＤＮＡの迅速かつプロセッシブな合成を可能にするべきである。これまで研究された全ての細菌のレプリカーゼにおいて、最小の機能性ホロ酵素は３つの成分からなる：１）ポリメラーゼコア、２）βプロセッシビティー因子負荷（又はクランプ負荷）複合体及び３）スライディングクランププロセッシビティー因子β。Ｅ．ｃｏｌｉにおいては、最小ホロ酵素は、αサブユニット、ＤｎａＸ−δδ’クランプ負荷複合体及びβサブユニットからなる。同じ成分は、グラム陽性Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓとＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の機能性ＤＮＡ　Ｐｏｌ　ＩＩＩホロ酵素に関して最小限必要である。関連性の遠い生物間におけるこの要求の一般性を仮定すれば、α、β、ＤｎａＸ、δ及びδ’がほとんどの生物のためのレプリカーゼのアッセンブリーに十分になることを予測する。本明細書にて使用されるとおり、ＤｎａＸ複合体はＤｎａＸ、デルタ及びデルタ’のアッセンブリーを記載するのに使用される用語である。
【０１２５】
標的指示（ｔａｒｇｅｔ ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ）は、細胞成長を阻止するか又は細胞死を誘導することによりもたらされる動物研究における細菌感染からの回収を含んでよい。様々な活性に関するアッセイ及び結合剤が提供され、ＤＮＡ合成、ＡＴＰａｓｅ、ＤＮＡ上へのクランプ負荷、蛋白質−蛋白質結合アッセイ、免疫アッセイ、細胞に基づくアッセイ等を含む。薬剤を同定するために使用される複製蛋白質組成物は、単離されたか、一部純粋な形態か又は純粋な形態であり、そして典型的には必須ではないが組換えにより生産される。複製蛋白質は、別のペプチド又はポリペプチドとの融合産物の一部であってよい（例えば、蛋白質−蛋白質結合、アッセイ条件下での安定性等を提供するか又は増強することができるポリペプチド（例えば、検出又はアンカー化の標識））。アッセイ混合物は、天然の細胞内複製蛋白質−結合標的、例えばＤＮＡ、別の蛋白質、ＮＴＰ，又はｄＮＴＰを含む。結合アッセイに関しては、天然の結合標的を使用して良いが、その一部がアッセイにおいて便利に測定可能な主題の複製蛋白質に対して結合親和性及び親和力を提供する限り、その一部（例えば、ペプチド、核酸断片）を使用することがしばしば好ましい。アッセイ混合物は候補の薬剤も含む。通常、多数のアッセイ混合物を平行して異なる薬剤濃度で稼働させることにより、様々な濃度における異なる応答を得る。典型的には、これらの濃度の一つが陰性対照として作用する（即ち、ゼロ濃度又はアッセイ検出の限界以下）。追加の対照がしばしば存在し、例えば陽性対照、用量応答曲線、公知の阻害剤の使用、対照の異種蛋白質の使用等である。候補の薬剤は莫大な化学クラスを包含するが、典型的にはそれらは有機化合物である；好ましくは、それらは小さな有機化合物であり、そして様々な源から得られ、合成又は天然の化合物のライブラリーを含む。様々な他の試薬も混合物に含ませてよい。これらは、塩、バッファー、中性蛋白質（例えばアルブミン、界面活性剤等）を含み、最適な結合を促進させるか及び／又は非特異的相互作用又はバックグラウンド相互作用等を減じるために使用してよい。また、アッセイの効率を他に改良する試薬（例えば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等）を使用してよい。
【０１２６】
発明は、複製蛋白質特異的アッセイ及び天然細胞内結合剤、例えば他の複製蛋白質を含む結合剤等、及びそのような剤を同定及び作成する方法、及びそれらの様々な診断及び治療の応用における使用、特に疾患が過剰な細胞成長に関係する場合、を提供する。新規な複製蛋白質−特異的抗体及び他の天然細胞内結合剤は、アッセイ、例えば１ハイブリッド及び２ハイブリッドスクリーンにより同定され、非天然細胞内結合剤は化学物質ライブラリー等のスクリーンにより同定される。
【０１２７】
通常、結合剤の複製蛋白質特異性は、平衡定数又は反応を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０）のような平衡定数に近い値により示される。そのような剤は、複製蛋白質を選択的に結合することができる（即ち、少なくとも約１０７Ｍ−１、好ましくは少なくとも約１０８Ｍ−１、より好ましくは少なくとも約１０９Ｍ−１）。様々な細胞に基づくアッセイ及び細胞を含まないアッセイを使用することにより、複製蛋白質特異的活性、結合、ゲルシフトアッセイ、免疫アッセイ等を立証してよい。
【０１２８】
その結果の混合物は、候補薬剤の存在を別にすれば、複製蛋白質が細胞結合標的、部分又は類似体に選択的に結合する条件下でインキュベートする。成分の混合物は、必須の結合に関して提供される何れかの順番で加えることができる。
【０１２９】
インキュベーションは、最適な結合を促進させる如何なる温度で実施しても良く、典型的には４℃と４０℃の間であり、より一般的には１５℃から３７℃の間である。インキュベーション期間は、同様に、最適な結合のために選択されるが、迅速かつ高処理能力のスクリーニングを促進するように最小化されて、典型的には０．１時間から１０時間の間、好ましくは５時間未満、より好ましくは１時間未満である。
【０１３０】
インキュベーション後に、活性の存在又は不在又は複製蛋白質と一つ又は複数の結合標的の間の特異的結合の存在又は不在を何れかの便利な方法により検出する。細胞を含まないアッセイ及び結合種類のアッセイに関しては、分離工程を用いることにより、未結合成分から活性産物又は結合成分を分離してよい。
【０１３１】
分離は、沈殿（例えば、核酸生成物の免疫遅延又は酸沈殿）、固定化（例えば、固相指示体上、例えばマイクロタイタープレート上）等により、洗浄後に行ってよい。分離を必要としない多くのアッセイも使用可能であり、例えば、近接アッセイにおけるユーロピウムの配合の使用、二本鎖ＤＮＡ内へのインターカレートに際して蛍光を増加させる染料の存在下での二本鎖ＤＮＡ合成上の蛍光の増加、シンチレーション近接アッセイ又は反応産物又は基質の損失に依存した検出系である。
【０１３２】
検出は、如何なる便利な方法において作用させてもよい。細胞を含まない活性及び結合アッセイに関しては、成分の一つが通常標識を含むかまたはカップリングされる。
【０１３３】
様々な標識を用いてよく、本質的には、ＤＮＡ産物の検出、ＤＮＡ基質の損失、ヌクレオチド基質の変換のために提供されるあらゆる標識であるか、又は結合蛋白質が有用である。標識は、直接検出、例えば放射活性、蛍光、発光、光学密度又は電子密度等、又は間接検出、例えばエピトープ標識、酵素等に関して提供してよい。標識は、蛋白質に付録として着けるか（例えば、リンの放射活性アイソトープを含むリン酸基）、ＤＮＡ基質に取り込ませるか又は蛋白質構造に取り込ませてよい（例えば、イオウの放射活性アイソトープを含むメチオニン残基）。様々な方法を使用することにより、標識及び他のアッセイ成分の性質に依存して標識を検出してよい。例えば、標識は、固相指示体に結合させて検出して良く、あるいは標識を含む結合複合体の一部を固相指示体から分離してよく、そしてその後に標識を検出する。標識は、光学密度又は電子密度、放射活性放出、非放射性エネルギー転移、蛍光放出等により直接検出して良く、あるいは抗体配合体等を用いて間接に検出してよい。例えば、放射活性標識の場合、放出は直接に（例えば、粒子カウンターによ）又は間接に（例えば、シンチレーションカクテル及びカウンターにより）検出してよい。
【０１３４】
本発明は、細菌からの複製蛋白質を使用して新規の薬剤を発見することによる方法を提供する。複製蛋白質の機能は、異なる化学試験化合物の存在下で定量する。上記機能を阻害する化学化合物は候補の抗生物質である。
【０１３５】
いくつかの態様においては、単一の生物に由来する複製蛋白質サブユニットを用いることが好ましい。他の態様においては、様々なサブユニットが一つ又は複数の生物に由来してよい。グラム陽性細菌及びグラム陰性細菌由来の複製蛋白質は特定の態様において互いに交換可能であり得る。よって、それらは混合物として機能し得る。適当なＥ．ｃｏｌｉ複製蛋白質はそのＰｏｌ　ＩＩＩホロ酵素のサブユニットであり、引用により本明細書に編入される、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌに対する米国特許第５，５８３，０２６号及び第５，６６８，００４号に記載される。
【０１３６】
本発明において有用ないくつかの他の複製サブユニット蛋白質は表３；「完全に配列決定されたゲノムのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索により同定されたＤｎａＸ蛋白質」；表４、「ＮＣＢＩにおいてすべて終了した配列のＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索により同定されたδ’」；表５、「Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＤｎａＸ蛋白質」；表６、「Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のδ’蛋白質」；表７、「ＮＣＢＩにおいて終了していない細菌ゲノムのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索により同定されたδ蛋白質」；表８、「ＮＣＢＩにおいて終了していないゲノムのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索により同定されたδ蛋白質に対応するＤｎａＸ蛋白質」；表９、「ＮＣＢＩにおいて終了していないゲノムのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索により同定されたδ蛋白質に対応するδ’蛋白質」；表１０、「系統学上関連した生物のＢＬＡＳＴ検索により同定されたδ蛋白質に対応するＤｎａＸ蛋白質」；表１１、「系統学上関連した生物のＢＬＡＳＴ検索により同定されたδ蛋白質に対応するδ’蛋白質」；表１２、「ＮＣＢＩにおいて終了したゲノムのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索により同定されたδ蛋白質に対応するＤｎａＥ蛋白質」；表１３、「Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＤｎａＥ及びＰｏｌＣ蛋白質」；表１４、「一部配列決定されたゲノムのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索により同定された追加のδ蛋白質に対応するＤｎａＥ及びＰｏｌＣ蛋白質」；表１５、「系統学上関連した生物のＢＬＡＳＴ検索により同定されたδ蛋白質に対応するＤｎａＥ及びＰｏｌＣ蛋白質」；表１６、「完全に配列決定されたゲノムのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索により同定されたδに対応するβ蛋白質」；表１７、「Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のβ蛋白質」；及び表１８、「系統学上関連した生物のＢＬＡＳＴ検索により同定されたδ蛋白質に対応するβ蛋白質」、表２１、「一部配列決定されたゲノムのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索により同定された追加のδ蛋白質に対応するβ蛋白質」に記載される。上記の表に表されない生物に関しては、ゲノムの関連領域がまだ配列決定されていないというのが有力な理由である。配列決定されれば、蛋白質は本明細書に概要を述べた方法を用いて発見できる。上記の表の各々において、ＮＣＢＩはＮＣＢＩ　ｎｒデータベースを意味し、非重複配列のコンパイルである。報告されたアクセス番号はＮＣＢＩのデータベースのアクセション番号それ自体ではないが、上記配列をコンパイルしたデータベースを参照する。
【０１３７】
表３−１８及び２１に詳細な情報のいくつかは当業界公知である。この情報のいくつかは、実施例のセクション、特に実施例１−３及び５において本明細書にて詳細な方法を用いて得られた。本発明において有用な他のサブユニット蛋白質は図面に詳細である。またその他のサブユニット蛋白質は当業界公知である。
【０１３８】
本発明は、一つの態様において、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物又は化学物質をスクリーニングする方法を提供し、ａ）単離されたレプリカーゼをレプリカーゼ活性に許容性の条件下で少なくとも一つの試験化合物に接触させ；ｂ）試験化合物の存在下でレプリカーゼの活性を評価し；そして、ｃ）試験化合物の存在下でのレプリカーゼ活性を、試験化合物の不在下でのレプリカーゼ活性と比較することを含むが、その際、試験化合物の存在下でのレプリカーゼ活性の変化がレプリカーゼ活性を変調する化合物の指標であり、上記レプリカーゼが本発明の単離されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩδサブユニット蛋白質を含む。
【０１３９】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼの活性を変調する化合物を同定する方法を記載する。この方法は、プライムされたＤＮＡ分子、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼ、候補化合物、ｄＮＴＰ又は４つまでの異なるｄＮＴＰｓ，ＡＴＰ，及び任意にβサブユニット、ＤｎａＸ複合体の何れか、又はβサブユニットとＤｎａＸ複合体の両方を含む反応混合物を形成し；反応混合物を、候補化合物の不在下で核酸重合を達成するのに十分な条件下に供し；核酸重合伸長産物の存在又は不在に関して反応混合物を分析し、そして試験化合物の存在下でのレプリカーゼ活性を、試験化合物の不在下でのレプリカーゼ活性と比較することを含む。試験化合物の存在下でのレプリカーゼ活性の変化がレプリカーゼ活性を変調する化合物の指標である。ＤｎａＸ複合体は、本発明のδサブユニット蛋白質を含む。
【０１４０】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼを刺激することにおいてＤｎａＸ複合体とβサブユニットの活性を変調する候補薬剤を同定する方法を記載する。当該方法は、プライムされたＤＮＡ分子（ＳＳＢによりコートされていてよい）、ＤＮＡポリメラーゼ、βサブユニット、及びＤｎａＸ複合体（ＤｎａＸ複合体のサブユニット又はアッセンブリー）を、候補薬剤、及びｄＮＴＰｓ（修飾されたｄＮＴＰｓ）の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成する。反応混合物を、候補薬剤の不在下で核酸重合を達成するのに十分な条件下に供し、そして反応混合物仲の伸長産物の存在又は不在を分析する。試験化合物の存在下での核酸重合を、試験化合物の不在下での核酸重合と比較する。試験化合物の存在下での核酸重合の変化が、ＤｎａＸ複合体とβサブユニットの活性を変調する化合物の指標である。ＤｎａＸ複合体は、本発明のδサブユニットを含む。
【０１４１】
本発明は、βサブユニットとＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又はアッセンブリー）が相互作用する能力を変調する化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、βサブユニットを、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又はアッセンブリー）と、ＡＴＰ（又は適当なＡＴＰ類似体、例えば、ＡＴＰγＳ、ＡＴＰの加水分解不可能な類似体であって、βとＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又はアッセンブリー）の相互作用を可能にするもの）、候補薬剤の存在下で接触させることにより反応混合物を形成することを含む。反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又はアッセンブリー）とβサブユニットが候補薬剤の不在下で相互作用するはずの条件に供する。反応混合物は、次に、βサブユニットとＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又はアッセンブリー）の間の相互作用に関して分析する。試験化合物存在下での相互作用の程度を、試験化合物不在下での相互作用の程度と比較する。βサブユニットとＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又はアッセンブリー）の間の相互作用の変化が、相互作用を変調する化合物の指標である。ＤｎａＸ複合体は本発明のδ蛋白質を含む。
【０１４２】
本発明は、δサブユニットとδ’及び／又はＤｎａＸサブユニットが相互作用する能力を変調する化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、δサブユニットを、δ’及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットと、候補薬剤の存在下で接触させることにより、反応混合物を形成することを含む。反応混合物は、δサブユニットと、δ’及び／又はδ’プラスＤｎａＸサブユニットが候補薬剤の不在下で相互作用するはずの条件に供する。反応混合物は、次に、δサブユニットとδ’及び／又はＤｎａＸサブユニットの間の相互作用に関して分析する。試験化合物存在下での相互作用の程度を、試験化合物不在下での相互作用の程度と比較する。δサブユニットとδ’及び／又はＤｎａＸサブユニットの間の相互作用の変化が、相互作用を変調する化合物の指標である。
【０１４３】
本発明は、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又はアッセンブリー）がＤＮＡ分子上でβサブユニットとアッセンブリーを形成する能力を変調する化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、環状のプライムされたＤＮＡ分子（ＳＳＢによりコートされていてよい）を、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又はアッセンブリー）及びβサブユニット（又はそのサブアッセンブリー）と、候補薬剤、及びＡＴＰ又はｄＡＴＰの存在下で接触させることにより反応混合物を形成することを含む。反応混合物は、ＤｎａＸ複合体（又はサブアッセンブリー）が候補薬剤の不在下でＤＮＡ分子上においてβサブユニットと集合する条件に供する。反応混合物中でのＤＮＡ分子上のβサブユニットの存在又は不在を分析する。試験化合物の存在下でのβサブユニットの集合の程度を、試験化合物の不在下でのβサブユニットの集合の程度と比較する。ＤＮＡ分子上のβサブユニットの量の変化が、ＤＮＡ分子上へβサブユニットを集合させるＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）の能力を変調する化合物の指標である。ＤｎａＸ複合体は本発明のデルタ蛋白質を含む。
【０１４４】
本発明は、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット）がＤＮＡ分子上からβサブユニットを取り外す能力を変調する化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、βサブユニットが集合していたＤＮＡ分子を候補薬剤の存在下で接触させることにより反応混合物を形成することを含む。反応混合物は、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット又はサブアッセンブリー）がβサブユニットをＤＮＡ分子から取り外す条件に候補薬剤の不在下で供する。反応混合物中のＤＮＡ分子の存在又は不在を分析する。試験化合物の存在下のアッセンブリーの程度を試験化合物の不在下のアッセンブリーの程度と比較する。ＤＮＡ分子上のβサブユニットの量の変化が、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブアッセンブリー）のＤＮＡ分子からβサブユニットを取り外す能力を変調する化合物の指標である。ＤｎａＸ複合体は本発明のδサブユニットを含む。
【０１４５】
本発明は、ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、ＤｎａＸサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合特性を変調する化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体サブユニット）を、ＤＮＡ分子の存在又は不在下でｄＡＴＰ／ＡＴＰと接触させるか、及び／又は候補薬剤の存在下でβサブユニットと接触させることにより、反応物を形成することを含む。反応混合物を、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット）がｄＡＴＰ／ＡＴＰと候補薬剤の存在下で相互作用する条件に供する。ｄＡＴＰ／ＡＴＰがＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体のサブユニット）に結合するか否かを測定するために、反応物を分析する。試験化合物の存在下での結合の程度を試験化合物の不在下での結合の程度と比較する。ｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合の変化が、ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えばＤｎａＸサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰ結合活性を変調する化合物の指標である。ＤｎａＸ複合体は本発明のδサブユニットを含む。
【０１４６】
本発明は、ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、ＤｎａＸサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰａｓｅ活性を変調する化学物質を同定する方法を記載する。この方法は、ＤＮＡ分子及び又はβサブユニットの存在又は不在下の何れかにおいて、候補薬剤の存在下で、ＤｎａＸ複合体（又はＤｎａＸ複合体サブユニット）をｄＡＴＰ／ＡＴＰと接触させることにより反応混合物を形成させることを含む。上記反応混合物を、ＤｎａＸサブユニット（又は複合体）が候補薬剤の不在下でｄＡＴＰ／ＡＴＰを加水分解する条件に供する。上記反応は、ｄＡＴＰ／ＡＴＰが加水分解されたか否かを測定するために分析される。試験化合物の存在下での加水分解の程度を、試験化合物の不在下での加水分解の程度と比較する。加水分解されたｄＡＴＰ／ＡＴＰの量の変化が、ＤｎａＸ複合体又はＤｎａＸ複合体サブユニット（例えば、ＤｎａＸサブユニット）のｄＡＴＰ／ＡＴＰ活性を変調する化合物の指標である。ＤｎａＸ複合体は本発明のδ蛋白質を含む。
【０１４７】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼの活性を変調する化学物質を同定する別の方法を提供し、環状のプライムされたＤＮＡ分子（ＳＳＢによりコートされていてよい）を、ＤｎａＸ複合体、βサブユニット及びαサブユニットと、候補薬剤、及びｄＮＴＰｓ（又は修飾されたｄＮＴＰｓ）存在下で接触させることにより反応混合物を形成することを含む。反応混合物は、候補薬剤の不在下で核酸重合に影響する条件に供し、そして反応混合物中の伸長産物の存在又は不在を分析する。試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性を、試験化合物不在下でのレプリカーゼの活性と比較する。試験化合物の存在下でのレプリカーゼの活性の変化が、レプリカーゼの活性を変調する化合物の指標である。ＤｎａＸ複合体は本発明のδ蛋白質を含む。
【０１４８】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩレプリカーゼ活性を変調する化合物を同定するためのキットも含む。そのようなキットは、単離されたδサブユニット蛋白質と、仮想の阻害化合物の存在下で（例えば、作用により）ＤＮＡ複製活性の変調の程度を測定するための手段を含む。
【０１４９】
本発明は、そのような方法により単離された変調剤及び阻害剤、及び／又は試験キット、及びそのような阻害剤に感受性のδサブユニットを含むあらゆるレプリカーゼを阻害するためのそれらの用途も含む。細菌のＤＮＡ複製の変調剤は、そのような化合物が処置される種に対して有害でない限り、細菌の感染を有する疑いのある動物、植物及びヒトを直接処置するために使用することもできる。同様に、限定ではないが抗体及び小分子を含む、δサブユニットを含むあらゆるレプリカーゼに結合する分子も、感染部位への障害性、治療用又はイメージング実在物を標的化するのに使用することができる。
【０１５０】
再構成のアプローチにより精製された必須ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の利用可能性と共に、発明の複製方法は、提供された新規な標的に対する高処理量のスクリーンに基づいて分析できる。これは、それがほとんど制限しないことにより変調が小分子ライブラリーの中の活性化合物との相互作用に際して観察されるまで、各成分を力価測定することにより実施することができる。バッファー条件は、マルチプレートスクリーニングプロセスの間、別々の冷却したコンテナーに保存された、酵素混合物の安定性を保証するように最適化されることになる。上記アッセイの時間と温度は、安定な直線応答を保証するように再度最適化もされる。同様に、上記アッセイの統べての関連成分の濃度は、試験化合物による不安の原因に対してアッセイの高い感度を保証するように最適化されることになる。
【０１５１】
上記方法は、リード化合物に関する化学物質ライブラリーの自動化されて費用面で有効な高処理量スクリーニングに基づいて分析できる。同定された試薬は、動物及びヒトの試験に関する薬学産業並びに植物病原体に関する農業関連産業における用途を見いだす；例えば、上記試薬は、誘導され、そしてインビボ及びインビトロアッセイにおいて再スクリーンされることにより、薬剤製品、動物のケアの製品及び農業製品の開発のために活性を最適にして毒性を最小にするかもしれない。
【０１５２】
実施例
実施例１．一般的戦略
そのゲノムが完全に配列決定されてナショナルセンターフォーバイオテクノロジーインフォメーション（ＮＣＢＩ）に寄託された生物からの、細菌のＤｎａＸ蛋白質サブユニット（ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のＤｎａＸ、δ’及びδ）の関連するファミリーのメンバーの同定は、コンピュータープログラムＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（位置特異的反復ＢＬＡＳＴ）を用いて可能である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２（１９９７））。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（又はψ−ＢＬＡＳＴ）は、プロファイル（又は位置特異的スコアリングマトリックス、ＰＳＳＭ）を初期ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメントサーチツール）検索においてもっとも高いスコアリングヒットの複数の整列化から構築するプログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））。ＢＬＡＳＴは、質問が蛋白質かＤＮＡに拘わらず、利用可能な配列データベースの全てを調査するようにデザインされた類似性検索プログラムのセットである。
【０１５３】
ＢＬＡＳＴ検索由来のψ−ＢＬＡＳＴプロファイル構築物は、第２の（及び連続の）検索を実施するために使用され、そしてプロファイルをさらに精密にするために各「繰り返し」の結果が使用される。ＢＬＡＳＴとＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは、マイクロソフトエクスプローラー、ネットスケープ又は他の適当なウエブブラウザーによりアクセス可能なＮＣＢＩウエブサイトニオイテアクセスできる。規則又は基準が、細菌のＤｎａＸ、δ’及びδの同定を可能にさせるために存在する。
【０１５４】
標的にされた生物からのＤｎａＸ蛋白質を最初に同定する。次に、それらの生物からδ’サブユニットを同定する。δ’サブユニットはＤｎａＸと配列類似性を呈するが、ＤｎａＸ蛋白質にのみ見いだされる特定の保存されたモチーフを欠く。最後に、上記生物からのδ’サブユニットを同定する。δサブユニットは、あまり保存されていないが、それらの疑わしくない同定を可能にさせる２つの手法が開発された。
【０１５５】
実施例２．完全に配列決定されたゲノムからのＤｎａＸ配列の同定
ＤｎａＸ蛋白質の同定：初期ＢＬＡＳＴ検索及び次の繰り返しの感度は、検索ウインドウの「オプション」及び「フォーマット」の部分に見いだされるセッティングにより操作してよい。セッティングは以下に掲載される工程に記載され、そしてＤｎａＸ、δ’及びδに関する検索において使用された。
【０１５６】
工程１：検索の基準はこれらのセッティングに対する「フォーマット」中に設定されるべきである：
−包含閾値（Ｅ又はエクスペクト値）を０．００１から０．００２に設定する
検索基準はこれらのセッティングに対する「オプション」中に設定されるべきである：
−マトリックスをＢｌｏｓｕｍ６２に設定する
−ギャップコストを存在に設定する：１１エクステンション：１
−エクスペクトを１０に設定する。
【０１５７】
インプットパラメーターに関する情報は、ＮＣＢＩを通してＢＬＡＳＴウエブページから入手可能である。次の繰り返しにおいてＰＳＳＭを創製するための、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴにより使用されたモデルにおいて配列を含むための統計上有意な閾値。
【０１５８】
例えば、異なる置換マトリックスを、程度を変えることにより分かれる配列の間の類似性を検出するためにあつらえる。単一のマトリックスは、にもかかわらず、相対的に広い範囲の進化上の変化を超えて、ほどよく有効であってよい。ＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックスはもっとも弱い蛋白質類似性を検出するためにとりわけ最良であることを、実験が示してきた。ギャップが入った整列化のための詳細な統計理論はまだ開発されておらず、そして与えられた置換マトリックスを用いて使用するための最良のギャップコストは経験上決定される；しかしながら、初期検索は、イグジステンス：１０，エクステンション：１にて開始することが示唆される。
【０１５９】
「エクスペクト」は、「Ｅ値」とも呼ばれるか、あるいはこの出願における「Ｅ」はデータベース配列に対する適合を報告するための統計上有意な閾値である。エクスペクトを１０に設定する場合、Ｋａｒｌｉｎ　ａｎｄ　Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）の推計モデルによれば、１０の適合は単に偶然見いだされることが予測される。エクスペクトを０．００１に設定すると、引用された推計モデルに基づくと、不適切なヒットに関して１０００の偶然のうちの１である。適合に帰する統計上の有意性はエクスペクト値よりも大きく、適合は報告されない。低いエクスペクト値はよりストリンジェントであり、少数の偶然の適合は報告されなくなることを導く。分数の値は許容される。
【０１６０】
工程２：特定の生物のゲノムに検索を制限するために、検索ウインドウの「オプション」部分内の設定もある。「エントレッツ質問による制限」と標識されたウインドウにおいては、あなたがあなたの検索を制限する生物の名前をタイプするか又は貼り込まなければ（ｐａｓｔｅｄ）ならない。エントレッツはいくつかのリンクしたデータベースを検索するための回帰システムであり、特定の生物を入力することにより、本明細書においては特定の生物からのみの質問配列に類似の蛋白質配列を検索することに検索を限定する。当該検索は、ゲノミックのＤＮＡを完全に配列決定した生物にのみ限定され、そしてナショナルセンターフォーバイオテクノロジーインフォメーションにおいて利用可能である。これらの生物のリストはＮＣＢＩウエブサイトにおいて見いだすことができる。この出願において記載された例における蛋白質の検索は、以下にリストされる３４の生物に限定した。
【０１６１】
【表３】
2004508018.tif 000004
【０１６２】
生物を入力するためのフォーマットは示された通りでなければならない。生物の完全な名前を略さずに書かなければならない。名前の略語を使用すること（即ち、Ｅ．ｃｏｌｉ）は許されない。上記の名前は株の名称へと続く（即ち、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ　Ｚ２４９１）が、全種に関する名称には続かない（即ち、Ｂｕｃｈｎｅｒａであるが、Ｂｕｃｈｎｅｒａ種ではない）。また、名前は括弧により囲まれた分類に続き（［Ｏｒｇａｎｉｓｍ］又は［ｏｒｇｎ］）、括弧から名前を分離するスペースはない。
【０１６３】
工程３：質問蛋白質のアミノ酸配列を検索ボックスに入力しなければならない。初期ＢＬＡＳＴ検索はこの初期アミノ酸質問配列に対してであった。質問配列を特定するために、当該初期検索ウインドウ内にはウインドウ（検索）がある。この検索においては、Ｅ．ｃｏｌｉのＤｎａＸ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２００）のアミノ酸配列を用いた（以下に示す）。
【０１６４】
【表４】
2004508018.tif 000005
【０１６５】
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索は１４３のヒットを返した。ヒットは、類似性をＥ．ｃｏｌｉの質問配列へ下げることにおいて示され、そして典型的にはＥ．ｃｏｌｉ質問配列に類似の蛋白質が中でも第１のヒットである。
【０１６６】
工程４：ＤｎａＸ蛋白質であるヒットを選択するために使用される基準
ＡＴＰ結合蛋白質は、ヌクレオチド結合及び加水分解に必要な局所類似性を分かち、ウオーカーＡ及びウオーカーＢモチーフと呼ばれる。ウオーカーＡヌクレオチド結合フォールドコンセンサス配列は、Ｇ（Ｘ）４ＧＫ（Ｔ／Ｓ）（Ｘ）６（Ｉ／Ｖ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０１）（式中、Ｘは何れかのアミノ酸）であり、そしてウオーカーＢヌクレオチド結合フォールドモチーフ配列は、（Ｒ／Ｋ）（Ｘ）３Ｌ（疎水性）４Ｄ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０２）であり、Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．１：９４５−９５１（１９８２）に記載されるとおりである。２つのアミノ酸が／のマークにより分離されて括弧内に示される場合、何れかのアミノ酸がその位置に出現してよいことを示す。ＡＴＰ結合性蛋白質のこの群のＤｎａＸ蛋白質は、ウオーカーＡモチーフの定義された保存残基を含む。しかしながら、ウオーカーＡモチーフを超えてＤｎａＸに関して広がるＤｎａＸの証明のために使用される追加の保存された残基があり、そしてこの完全な領域は「ＤｎａＸウオーカーＡ」配列と呼ばれる。ウオーカーＢモチーフを包含するＤｎａＸ蛋白質中の保存された残基も、同定と証明の目的のために広げられており、「ＤｎａＸウオーカーＢ」と呼ばれる。これらの残基の保存は、ＤｎａＸ蛋白質の選択のために使用された基準である。
【０１６７】
ｉ．以下にリストされるパラメーターからＤｎａＸのために示された要求される厳格に保存された残基を含む蛋白質を選択する。有り得るＤｎａＸ、δ’及びδは、対応するＥ．ｃｏｌｉの蛋白質と（対の整列化）、ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０（１９９４））を用いて整列化されなければならない。これらの検索において、ＣＬＵＳＴＡＬ　ＷはベクターＮＴＩｖ．５．２．１．３の一部として使用された。「スローな対合整列化のアルゴリズム」は、「ブロサム（Ｂｌｏｓｕｍ）」に設定された残基置換マトリックス、１０に設定されたギャップオープニングペナルティ、及び０．１に設定されたギャップ伸長ペナルティと共に使用した。数字は、Ｅ．ｃｏｌｉのナンバリングにおけるＮ−及びＣ−末端残基を示す。括弧内に一つより多い残基があり且つスラッシュにより分離されている場合、これらの残基の何れかが保存された残基に対応してよい。スコアされるため、ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗプログラムにより最適な整列化のための規定された位置の間にギャップが挿入されるかもしれないとしても（Ｅ．ｃｏｌｉ配列又は標的配列中）、残基はＥ．ｃｏｌｉナンバリングに厳格に従った位置において保存されたＥ．ｃｏｌｉ残基と整列化されなければならない。Ｘとして示された残基は何れのアミノ酸でもあり得て、Ｘ’ｓは規定された保存残基間のアミノ酸の下図を示す（Ｅ．ｃｏｌｉナンバリングシステム中）。
【０１６８】
ａ．ＤｎａＸウオーカーＡＴＰモチーフを包含する保存された残基（太字で示された）。１１の保存された残基のうちの６つが存在しなければならない。これらの６つの保存された残基は５１及び５２位においてＫ（Ｔ／Ｓ）残基を含む：３９−ＨＡＹＬＦＳＧＸＸＧＸＧＫ（Ｔ／Ｓ）−５２　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０３）
ｂ．ＤｎａＸウオーカーＡとＢモチーフの間の保存された残基。１０の保存された残基のうちの７つが存在しなければならない：８８−（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｄ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｅ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｄ（Ａ／Ｇ）ＡＳ−９７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０４）
ｃ．ＤｎａＸウオーカーＢモチーフを包含する保存された残基。１１の保存された残基のうちの９つが存在しなければならない。これらの９つの保存された残基は１２６位においてＤ残基を含まなければならない：１２１−（Ｋ／Ｒ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｙ／Ｆ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＤＥＸＨＭ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｓ／Ｔ）−１３２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０５）
これらの保存されたＤｎａＸ残基のいくつかは科学文献に報告された（Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：６１０６−６１１３（２０００）；Ｎｅｕｗａｌｄ，Ａ．Ｆ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．９：２７−４３（１９９９））。
【０１６９】
初期の検索（繰り返し）は９０の上部閾値及び５３の下部閾値を用いて、１４３のヒットを提供した。検索された全てのゲノムからのＤｎａＸが最初の４０ヒット内に含まれた。トップ４０の中の残りのヒットは重複配列を含んだ。同定されたＤｎａＸ蛋白質の配列に関するアクセション番号及びＧＩ番号を表３に示す。
【０１７０】
工程５．全ての標的生物が同定されなかった場合に追加の繰り返しを実施する。
ｉ．工程４においてＤｎａＸ蛋白質として選択された閾値及び配列より大きなＥ値により、配列に対するさらなる検索（繰り返し）のためにヒットを限定する。追加の繰り返しにおいて同定されたＤｎａＸ蛋白質は４ｉに概説された基準に合わなければならない。
【０１７１】
実施例３．完全に配列決定されたゲノムからのδ’蛋白質の同定
δ’に関する検索をＤｎａＸ蛋白質に関する検索のようにＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて実施した。ＤｎａＸとδ’は類似性の同じ領域を有する；よって、ＤｎａＸ検索において同定されたＤｎａＸ蛋白質を除外した。
【０１７２】
工程１．ＤｎａＸ検索の工程１において規定されたＰＳＩ−ＢＬＡＳＴにおいて検索基準を設定する（実施例２）。
工程２．完全に配列決定されたゲノミックＤＮＡを有してナショナルセンターフォーバイオテクノロジーインフォメーションにおいて利用可能である生物のみに、エントレッツ質問による検索を限定する。起こり得るヒットとしてＤｎａＸ蛋白質を除外するため、生物のリストに続くジェンバンク同定（ＧＩ）番号をリストすることにより、ウインドウ標識された「エントレッツ質問による制限」内でそれらが除外されなければならない。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ整列化において示された異なるＧＩ番号をもつ全ての重複蛋白質も除外されなければならない。蛋白質検索は以下にリストされる生物に限定し、以下に示すとおりＧＩによりＤｎａＸ蛋白質が除外された。
【０１７３】
【表５】
2004508018.tif 000006
【０１７４】
生物をリストするためのフォーマットはＤｎａＸ蛋白質に関して記載されたとおりである。除外されるべき蛋白質は、スペースなしで用語「ｇｉ」を含む括弧がＧＩに続くことによりリストされる。
【０１７５】
工程３．質問蛋白質のアミノ酸配列が検索ボックスに入力されなければならない。この検索において、Ｅ．ｃｏｌｉのδ’に関するアミノ酸配列を用いた（以下に示す）。
【０１７６】
【表６】
2004508018.tif 000007
【０１７７】
Ｐｓｉ−ＢＬａｓｔは類似性を低下させてリストされた４２ヒットを返し、３２ヒットが閾値を超えるＥ−値を有した。
【０１７８】
工程４．δ’であるヒットを選択するのに使用された基準。
ｉ．以下のａ．及びｂ．にリストされるパラメーターから、δ’に関する保存された残基を含む蛋白質のみを選択する。数字は、Ｅ．のδ’ナンバリング中のＮ−及びＣ−末端の残基を示す。スコアされるため、ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗプログラムにより最適な整列化のための規定された位置の間にギャップが挿入されるかもしれないとしても（Ｅ．ｃｏｌｉ配列又は標的配列中）、残基はＥ．ｃｏｌｉナンバリングに厳格に従った位置において保存されたＥ．ｃｏｌｉ残基と整列化されなければならない。Ｘとして示された残基は何れのアミノ酸でもあり得る。
【０１７９】
ａ．δ’分子は、保存された領域
１２４−（Ａ／Ｓ）ＡＮ（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｅ（Ｅ／Ｄ）ＰＰ−１３６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０７）
の中の１２の保存された残基のうち８つを含まなければならない。
【０１８０】
ｂ．δ’分子は
１５１−（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＴ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＳＲ−１５８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０８）
の中の６の保存された残基のうち４つを含まなければならない。
【０１８１】
ｉｉ．初期検索において（繰り返し）、δ’は検索された生物の２９に関して同定された（１つのヒットが重複していた）。４つの残りの生物に関してのδ’サブユニットは閾値よりも低いＥ−値を有するものとして記録された（全部で３３のδ’が同定された）。
【０１８２】
これらの保存された残基のいくつかが報告された（Ｎｅｕｗａｌｄ，Ａ．Ｆ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．９：２７−４３（１９９９））。
【０１８３】
工程５．全ての標的生物からδ’が同定されないなら追加の繰り返しを実施する。
ｉ．工程４においてδ’蛋白質として選択された閾値及び配列より大きなＥ値により、配列に対するさらなる検索（繰り返し）のためにヒットを限定する。
ｉｉ．追加の繰り返しにおいて同定されたδ’蛋白質はδ’の同定に関して工程４ｉに概説された基準に合わなければならない。
【０１８４】
ｉｉｉ．全ての特定された生物からδ’が同定されるまで工程５を繰り返す。
第２の繰り返しは全部で３１７のヒットを与え、そして閾値未満のＥ−値を有する４つの生物からのδ’サブユニットが、今、閾値を超えるＥ−値を含んだ。最後の（３４番目）種からのδ’は、閾値を超える値としても同定された。これらの配列のアクセション番号及びＧＩ番号を表４に示す。
【０１８５】
実施例４．完全に配列決定されたゲノムからのδ蛋白質の同定
上に示すとおり、δ蛋白質はあまり保存されておらず、即ち標準技術を通してでは検索できない。例えば、公知のＥ．ｃｏｌｉの配列を基にしたδ蛋白質に関するＮＣＢＩデータベースの単純なＢＬＡＳＴ検索は、ほんの少数の生物に関する結果しか返さない：ガンマプロテオバクテリア門からＶｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｂｕｃｈｎｅｒａ種ＡＰＳ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｘｙｌｅｌｌａ　ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ、及びプロテオバクテリアのβ門からＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ　Ｚ２４９１。プロテオバクテリアのアルファ又はエプシロン門からは配列が引き出せない。
【０１８６】
２つの関連する方法を用いて、Ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔを用いることにより、デルタ配列を同定した。２０００年７月１４日に出願した我々の仮出願に記載された最初（方法Ａ）は、Ｅ．ｃｏｌｉのδ配列により始まるψ−ＢＬａｓｔを用いる（アクセション番号Ｐ２８６３０；ＧＩ番号ＧＩ１２３４５２）。候補の同定されている配列は、ＤｎａＸ配列及びδ’配列の除外により制限され、候補δ配列が３００から４００アミノ酸の長さの間である要求、及びそれらがＤｎａＸ及びδ’配列の除外後の生物からの「最良の」ヒット（もっと低いＥスコア）であり、そして３００アミノ酸未満又は４００を超えるアミノ酸の蛋白質である要求による。第２の方法（方法Ｂ）において、方法Ａにより同定された配列を用いて全てのδ配列中に存在する特定の保存された残基の同定を可能にさせる整列化を実施した。これらの保存された残基は下記のとおりδ同定の基準に含まれた。これは長さの基準を排除することを可能にし、３００−４００アミノ酸の長さの範囲外又はそれらの報告された配列の中に誤りを有した遺伝子からの蛋白質のδ配列が同定されるのを可能にし、不正確に記録された予測蛋白質配列が、３００アミノ酸よりも短いか又は４００アミノ酸よりも長いものとさせる。
【０１８７】
方法Ａ
工程１．ＮＣＢＩウエブサイト及びＮＣＢＩ　ｎｒデータベースを用いたψ−ｂｌａｓｔ検索を実施するが、「Ｅ値」の閾値を０．００１に設定する。Ｖｉｂｒｉｏ　Ｃｈｏｌｅｒａｅ，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ　ｍｕｌｔｏｃｉｄａ，Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｂｕｃｈｎｅｒａ種ＡＰＳ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｘｙｌｅｌｌａ　ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ、及びＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓからのδ配列を、閾値の値よりも低いＥ値を用いて同定した。０．００１の代わりにＥ値を０．００２に設定しても、同じ７つの生物からのデルタサブユニット蛋白質は、なお同定された。
【０１８８】
工程２．ヒットを検査し、そしてＤｎａＸ蛋白質に関するヒット（通常は、それらの各々のデータベースにおいてＤｎａＸ蛋白質、τ及び／又はγ蛋白質等と注釈を付けられ、良好な適合を提供することがわかった（Ｅ．ｃｏｌｉのＤｎａＸ配列に対して検索した場合にδ配列よりも低いＥ値））及びδ’（通常は、それらの各々のデータベースにおいてｈｏｌＢ遺伝子産物、デルタ’又はＤｎａＸ様蛋白質、τ／γ−様蛋白質等と注釈を付けられ、良好な適合を提供することがわかった（Ｅ．ｃｏｌｉのδ’配列に対して検索した場合にδ配列よりも低いＥ値））に関するヒットを除外した。これらの方法は細菌のδ配列及びそれらと同じ起源のレプリカーゼを扱うから、細菌以外の生物由来の配列は無視される。
【０１８９】
工程３．コードされた候補δ蛋白質の長さを検査して、３００から４００アミノ酸のもののみをさらに考慮に入れた。
工程４．与えられた候補生物からの最良のヒットのみが含まれた（あらゆる追加のＤｎａＸとＨｏｌＢ配列を除外した）。それらのゲノムが完全に配列決定された生物から、図４に示すデルタ配列のリストを発見した。
工程２−４を、標的生物からデルタが同定されるまで同じ設定において追加の繰り返しと共に繰り返すことができる。
【０１９０】
工程５．現在配列が完全に決定されており且つＮＣＢＩ　ｎｒデータベースに存在するゲノムからのデルタ配列の同定は疑わしくないが、追加の基準（２０００年７月１４日の仮出願に概説）は、疑念が存在するならば、δ配列を確認するために適用できる。これらは、ｉ）同じ生物のｈｏｌＢ遺伝子によりコードされるδ’を結合する能力、ｉｉ）同じ生物からのｄｎａＮ遺伝子によりコードされるβを結合する能力及びｉｉｉ）同じ生物からのこれらの蛋白質に関する対応する構造遺伝子から発現されたＤｎａＸ複合体のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ，βプロセッシビティー因子及びＤｎａＸ及びデルタ’成分と混合した場合に、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素機能を再構成する能力を含む。また、候補デルタ配列は、２０００年７月１４日の出願において実施されたとおりに、保存された残基の全パターンがほとんど正確であることを保証するための可視検査を用いて、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗプログラムを用いて他の同定されたデルタ配列と整列化することができる。
【０１９１】
δ配列のこのより多様な群を有することは、Ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔ又はＮＣＢＩデータベースによりアクセス可能でない追加の生物からの配列の同定を可能にさせた（しかし、局所データベースを検索する局所稼働性Ｐｓｉ−Ｂｌａｓｔ上で同じ方法を用いて接近可能であった）。「進行中」と報告された単純なＢＬＡＳＴ検索又は他の遠隔のデータベースをｔＢＬＡＳＴｎを用いて実行して、そしてδ遺伝子のコーディング配列を同定した。これらのｔｂｌａｓｔｎ　ＢＬＡＳＴ（Ｇｉｓｈ，Ｗ．＆　Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３））検索において使用された設定は、以下に記載されたとおりであった。このプログラムは、全６つのリーディングフレームにおいて翻訳されたヌクレオチドデータベースに対して蛋白質質問配列を比較する。欠損パラメーターを各々の場合に使用した。例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのδ蛋白質配列に対してＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの配列のザユニバーシティオブオクラホマアドバンスドセンターゲノムテクノロジーのデータベースを検索することにより、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのデルタをコードする配列の同定が可能になった（図５）。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのδ蛋白質配列に対してＴＩＧＲ，ゲノミックリサーチ研究所のデータベースを検索することにより、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのδの配列の同定が可能になった（図５）。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓのδ蛋白質配列に対してサンガーセンターのデータベースを検索することにより、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓのδの配列の同定が可能になった（図５）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ及びＳ．ａｕｒｅｕｓからのＤｎａＸ及びデルタ’蛋白質の対応する遺伝子を表６に示す。
【０１９２】
方法Ｂ．δに関する検索をＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いてＤｎａＸ及びδ’に関する検索のように実施した。ＤｎａＸとδ’はδと類似な領域を有してよく、よって、ＤｎａＸ及びδ’検索において同定されたＤｎａＸ及びδ’蛋白質は起こり得るヒットとして除外した。
【０１９３】
工程１．ＤｎａＸ検索の工程において定義されたとおりにＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ内で検索基準を設定する（実施例２）。
工程２．完全に配列決定されてＮＣＢＩにおいて利用可能なゲノミックＤＮＡを有する生物のみに、エントレッツ質問による検索を限定する。起こり得るヒットとしてＤｎａＸ及びδ’を除外するため、それらは生物のリストに従いＧＩメンバーをリストすることにより「エントレッツ質問による限定」と標識されたウインドウ内で除外されなければならず、検索は以下に示すとおりに限定される。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ整列化に示される異なるＧＩ番号の全ての重複したＤｎａＸ及びδ’蛋白質も除外されなければならない。蛋白質の検索を、以下にリストされる生物に限定し、ＧＩ番号により除外されたＤｎａＸとδ’蛋白質は以下に示すとおりである。
【０１９４】
【表７】
2004508018.tif 000008
【０１９５】
工程３．Ｅ．ｃｏｌｉのδアミノ酸配列に対して示されたゲノムの検索する（以下に示す）。Ｅ．ｃｏｌｉのδのこのアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２０９）が、初期検索ウインドウの検索ボックスに入力されなければならない。
【０１９６】
【表８】
2004508018.tif 000009
【０１９７】
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索は低下した類似性においてリストされた１３のヒットを返し、１０のヒットが閾値より大きなＥ−値を含み、そして３つのヒットが閾値よりも小さなＥ−値を有した。
【０１９８】
工程４．δ蛋白質であるヒットを選択する基準。方法Ａにおいて同定されたδ蛋白質を用いることにより、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのδ配列（特許出願番号０９／８１８，７８０）及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｏ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来のδサブユニット配列（図５）、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗを用いた整列化は高度に保存されたアミノ酸を含む６つのエリアを示した。これらの６つの領域中の保存された残基は、δ蛋白質の確認のための追加の配列に基づく基準を提供する。選択された配列は整列化されたデルタ中の１７アミノ酸より多いもっとも保存されたストレッチを表した（図６）。
【０１９９】
ｉ．ＤｎａＸ及びδ’検索において同定されたＤｎａＸとδ’を除外する。
ｉｉ．同定されたδサブユニットは以下に示す６つの保存された領域の少なくとも３つにおいて以下の基準に合致しなければならない。保存された領域＃１−６において、保存された残基の示された数が観察されなければならない：＃１，起こり得る１０のうち１、＃２，起こり得る１１の保存された残基のうち３、＃３，起こり得る１０の保存された残基のうち５、＃４，起こり得る１８の保存された残基のうち９、＃５，起こり得る２３の保存された残基のうち１１、＃６，起こり得る１２の保存された残基のうち６。対の整列化及び選択は実施例２の工程４ｉに記載されたとおりに実施されなければならない。
【０２００】
１．）１７――
（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｙ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＧＸ（Ｄ／Ｅ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――３８（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９４）
２．）６４――
（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸ（Ａ／Ｓ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｆ（Ａ／Ｓ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――８２（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９５）
３．）９７――
（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸＸ（Ｄ／Ｅ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＫ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――１１７（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９６）
４．）１５４――
（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｄ／Ｅ）Ｘ（Ｄ／Ｅ）（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＸＸＸＮ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｄ／Ｅ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｒ／Ｋ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――１９１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９７）
５．）２１５――ＦＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｄ／Ｅ）（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＧ（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸ（Ａ／Ｓ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸＧＸ（Ｄ／Ｅ）Ｐ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）――２６０（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９８）
６．）２９８――（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）ＸＸＸ（Ｄ／Ｅ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｒ／Ｋ）ＸＸＸＸＸ（Ｄ／Ｅ）ＸＸＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｄ／Ｅ）ＸＸ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）（Ｌ／Ｉ／Ｖ）Ｘ（Ｌ／Ｉ／Ｖ）―３３１（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９９）
閾値を超えるＥ−値を有する全てのヒット（１０）がδ蛋白質であるらしい配列を有した。これらのヒットを第２の繰り返しのために記録した。
【０２０１】
工程５．全ての標的生物からのδが同定されなければ追加の繰り返し；即ち、全ての標的生物からのδが同定されるまで工程４を繰り返す。
ｉ．閾値より大きなＥ−値を有する配列及び工程４においてδとして選択された配列によりさらなる検索のためにヒットを限定する（繰り返し）。
【０２０２】
ｉｉ．追加の繰り返しにおいて同定された可能性のあるδ蛋白質は上に示すδ検索の工程４において概説された基準に合致しなければならない。
ｉｉｉ．全ての特定された生物からδが同定されるまで工程５を繰り返す。
【０２０３】
第２の繰り返しは３３のヒットを返し、閾値を超えるＥ−値を有する２０のヒットを伴った。新たな９つのヒットがδ蛋白質として同定された。これらのヒットは上記のとおりに選択されて、第３の繰り返しのために記録された。第３の繰り返しは５０のヒットを返し、標的生物の１つを除く全てにδを含んだ。第４の繰り返しは６４のヒットを含み、最後のδを含んだ。各δに関しての保存された領域の中の保存された残基を表１９に示す。
【０２０４】
実施例５：ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いた部分配列決定されたゲノムからのＤｎａＸ、δ’及びδの同定
全部配列決定されたゲノムからではないが一部配列決定されたゲノムからの蛋白質として同定されたいくつかの蛋白質配列も、ＮＣＢＩにファイルされてきた。これらの一部配列決定されたゲノムからのＤｎａＸ、δ’及びδは、それらが完全に配列決定されたゲノムからＤｎａＸ、δ’及びδを同定するための上記基準を用いることによりＮＣＢＩに寄託されているなら、同定することができる。上記検索モデルの唯一の例外は、検索は完全に配列決定されたゲノムのみに対するエントレッツ質問により限定されないで、代わりに全ての細菌に対するエントレッツ質問により限定されることである。
【０２０５】
ＤｎａＸ蛋白質に関する検索のため、初期検索ウインドウにおいて「エントレッツ質問による限定」と標識されたウインドウに用語細菌を入力するべきあり、続いて以下に示す完全に配列決定されたゲノムからＤｎａＸ及びδ’に関する検索において同定されたＤｎａＸ及びδ’蛋白質を除外する。
【０２０６】
【表９】
2004508018.tif 000010
【０２０７】
ＤｎａＸとして識別されるために、蛋白質は完全に配列決定されたゲノムからＤｎａＸを検索する工程４において上で概説された基準に合致しなければならない（実施例２）。３つの追加のＤｎａＸ蛋白質が１回の繰り返しの後に同定された。ＤｎａＸ蛋白質が同定された生物であって、類似の様式（以下参照）において同定されたデルタサブユニット蛋白質に対応するのは、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｕｌｍｏｎｉｓ及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒであった（表８）。
【０２０８】
この同じ手法を用いて、一部配列決定されたゲノムからＮＣＢＩに寄託されているδ’を同定する。δ’蛋白質に関する検索のため、初期検索ウインドウにおいて「エントレッツ質問による限定」と標識されたウインドウに用語細菌を入力するべきあり、続いて以下に示す完全に配列決定されたゲノムからＤｎａＸ及びδ’に関する検索において同定されたＤｎａＸ及びδ’蛋白質を除外する。完全に配列決定されたゲノム及び完全には配列決定されていないゲノムからの配列において同定されたδ’蛋白質を以下に示すとおりに入力するべきである。
【０２０９】
【表１０】
2004508018.tif 000011
【０２１０】
δ’として識別されるためには、完全に配列決定されたゲノムからのδ’に関する検索の工程４において上で概説された基準に合致しなければならない。
３回の繰り返しの後に、５つの追加のδ’蛋白質が、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｕｌｍｏｎｉｓ，Ｐｌｅｃｔｏｎｅｍａ　ｂｏｒｙａｎｕｍ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒから同定された。
【０２１１】
この同じ手法を用いて、一部配列決定されたゲノムからＮＣＢＩに寄託されているδを同定する。δ蛋白質に関する検索のため、初期検索ウインドウにおいて「エントレッツ質問による限定」と標識されたウインドウに用語細菌を入力するべきあり、続いて以下に示す完全に配列決定されたゲノムからＤｎａＸに関する検索及びδ’に関する検索において同定されたＤｎａＸ及びδ’蛋白質を除外する。完全に配列決定されたゲノム及び完全には配列決定されていないゲノムからの配列において同定されたδ’蛋白質を以下に示すとおりに入力するべきである。完全に配列決定されたゲノム及び完全に配列決定されていないゲノムの両方からの検索において同定されたδ’蛋白質を以下に示すとおりに入力するべきである。
【０２１２】
【表１１】
2004508018.tif 000012
【０２１３】
δとして識別されるために、蛋白質は完全に配列決定されたゲノムからのδに関する検索の工程４において上で概説された基準に合致しなければならない。
４回の繰り返しの後に、４つの追加のδ’蛋白質が、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｕｌｍｏｎｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｇａｌａｃｔｉａｅ及びＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒから同定された。これらのδ蛋白質の配列を図７に示す。Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　ｐｕｌｍｏｎｉｓとＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒからの対応するＤｎａＸ及びδ’の遺伝子の位置を表８及び９にそれぞれ示す。
【０２１４】
実施例６：系統上関連する生物からのデルタ配列を用いて開始したＢＬＡＳＴ検索を用いた追加のδ−コーディング配列の同定
この実施例においては、広いグループのデルタ配列が、系統上の関係を用いてあらゆる生物からのデルタ配列の同定を表「ＢＬＡＳＴ」プログラムを用いて可能にするための前のセクション（実施例４及び５）において生じた。この方法は、デルタ配列がよく保存されていないため、ほんの僅かな公知のデルタ配列を用いて、当初は不可能であったはずである。しかし、今、細菌の系統樹の全ての主要なブランチの代表が同定されてきており、近縁の生物からデルタ配列を検索することにより新たに配列決定された生物からデルタが同定できる。
【０２１５】
系統モデルは、それらのｒＲＮＡ配列により決定されたそれらの進化上の関係により近縁の生物を存在させ（「Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ　Ｏｕｔｌｉｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｉｃ　Ｇｅｎｅｒａ」、組織細菌学のバージェイズマニュアル（登録商標）、第２版、リリース１．０、２００１年４月１日）、そして図８に示される。この系統モデルは、２３の異なる門及びこれらの門の中のクラスをリリースの時に利用可能なデータに基づいて示す。門は、細菌のクラス（第２の分類レベル）がそれらのｒＲＮＡ配列の関係により評価される第１の分類レベルである。系統モデルを用いることにより、近縁の生物を決定して、それにより、新たなデルタ配列がｂｌａｓｔ検索により同定できる。実施例４及び５におけるｐｓｉ−ｂｌａｓｔの使用の後に、デルタ配列はいくつかの門において未同定のままであったが、何故ならばＰｓｉ　Ｂｌａｓｔ検索のために使用されたＮＣＢＩｎｒデータベースにおいてそれらの門の代表がなかったからである。系統モデルの他の門を代表する生物からδ蛋白質を同定するため、追加の検索を実施した。他の生物を同定するための補助として、ミシガン州立大学及びリボソームデータベースプロジェクトにより示されたＡＳＭ２０００ポスターの２０００のポスターバックボーン樹の追加も使用した。この図は採用されて、本明細書では図９として現れる。この系統樹は、進化上近縁の生物が、新規のδ蛋白質の検索においての使用のために同定されることを可能にさせる。
【０２１６】
データベースは、サンガーセンター（Ｔｈｅ　Ｓａｎｇｅｒ　Ｃｅｎｔｒｅ）、ＴＩＧＲ，ゲノミックリサーチ研究所（ｔｈｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、オクラホマ大学ゲノムテクノロジーアドバンスドセンター（Ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｏｋｌａｈｏｍａ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＤＯＥ−ジョイントゲノム研究所（ＤＯＥ−Ｊｏｉｎｔ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）において受けた配列決定プロジェクトから検索した。検索はｔｂｌａｓｔｎ　ＢＬＡＳＴ検索を用いて実施した。これらのｔｂｌａｓｔｎ　ＢＬＡＳＴ（Ｇｉｓｈ，Ｗ．ａｎｄ　Ｓｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３））検索において使用した設定は、以下に記載されたとおりであった。このプログラムは、全部で６つのリーディングフレームにおいて翻訳されたヌクレオチドデータベースに対して蛋白質質問配列を比較する。検索パラメーターは欠損において呈されるべきであり、これらの検索における検索パラメーターは：
−エクスペクトを１０に設定
−マトリックスをＢＬＯＳＵＭ　６２に設定
−ＨＳＰスコアを「ＳＵＭＰ」に設定
−フィルタータイプを「ｓｅｇ」に設定
−フィルター低複雑領域
−ｐ値による分類結果
−遺伝子コードを標準に設定
であった。
【０２１７】
δとして指名されるためには、蛋白質（ヒット）が実施例４、方法Ｂにおいて上で記載されたＰＳＩ−ＢＬＡＳＴのδ検索の工程４の要求に合致していなければならない。新規な細菌種からδを同定するためには、標的生物に進化上近縁の（即ち、同じクラス／門のメンバー）である生物からδアミノ酸配列に対して検索することにより最初に検索を開始するべきである。初期の検索がヒットを生じなかったなら、次に、δが同定されるか、又は全ての公知の門由来のδ配列が枯渇するまで、図９をガイドとして用いて（標的生物に対して最も少数のブランチによりリンクした生物を拾う）標的生物からより進化上徐々に離れた質問配列としてδアミノ酸配列を用い続けるべきである。そのδアミノ酸配列を使用して標的のデータベースを検索することにより新規のδ蛋白質を同定した生物を表２０に示す。
【０２１８】
１４の追加のδ蛋白質（図１０）が様々な門由来の生物を代表して同定された。Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓ，Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ，Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ　Ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ，Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ　ｔｅｐｉｄｕｍ，Ｃｌｏｓｔｒｉｄｕｍ　Ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ，Ｃｙｔｏｐｈａｇａ　ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎｉｉ，Ｄｅｈａｌｏｃｏｃｃｉｄｅｓ　ｅｔｈｅｎｏｇｅｎｅｓ，Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｒｉｎｕｓ，Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ，Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓ，Ｙｅｒｓｅｎｉａ　ｐｅｓｔｉｓ及びＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ。Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓのデータベースの検索は、上記のＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ検索の工程４の要求に合致する蛋白質をもたらしたが、しかしながら、この蛋白質をコードするＤＮＡはコンティグの５’末端に位置し、よって、このδ配列のＮ−末端における６０アミノ酸ほどが存在しないのかもしれない。同定された１４の追加のδ蛋白質を含むこれらの生物は、図８において二重に下線を引いて示された系統分類に加えられた。このモデルは新規なδ蛋白質の同定においてガイドとして用いてよい。
【０２１９】
これらの結果は、上記概説された手法を用いて、δをコードする遺伝子を包含するゲノムの領域が配列決定されたあらゆる生物からδが同定できることを示す。
【０２２０】
δが同定された同じ１４の生物からのゲノミックＤＮＡ配列を含むデータベースは、次に、δを同定するためのｔｂｌａｓｔｎ検索のために上で記載されたとおりにｔｂｌａｓｔｎを用いて進化上近縁なＤｎａＸ及びδ’に対して検索した。ＤｎａＸ及びδ’の遺伝子座及び蛋白質の注釈を（表１０）及び（表１１）に示す。
【０２２１】
インターネットを用いて実施例１−６において記載された検索を実施するための別法として、配列データベースを局所インストールしてよく、そしてＰｓｉ−Ｂｌａｓｔ及びＢｌａｓｔを用いて検索を実施してよい。ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは局所稼働させることができ、そして局所データベースに対して検索を実施するのに使用される。ＢＬＡＳＴバイナリーは、マッキントッシュ、ウイン３２（ＰＣ），ＬＩＮＵＸ，ソラリス、ＳＧＩ，及びＨＰ　ＵＸシステムに関して提供される。独立型のＢＬＡＳＴ実行可能性は、ＮＣＢＩ特色のないＦＴＰサーバーアンダー上に見いだされてよい。さらなる情報に関してはこのディレクトリーにおいてＲＥＡＤＭＥを読む。独立型のＢＬＡＳＴをセットアップするための情報も、ナショナルヒューマンゲノムリサーチ研究所ウエブサイトに見いだすことができる。
【０２２２】
実施例７：配列決定された好熱性生物、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ及びＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓからのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素（ｈｏｌＡ）のδサブユニットの構造遺伝子の同定
記載されたψ−ＢＬＡＳＴ手法を用いて、第１及び次の繰り返しにおける包含に関する０．００１のエクスペクト値で開始し、Ｅ．ｃｏｌｉに近縁なｈｏｌＡ遺伝子のみを同定した（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ又はＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）。これらの３つの配列は第２の繰り返しに含まれ、３つのδのファミリー間に共通の要素のみによる検索を可能にした。これは、Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓからの候補（仮想蛋白質ＡＱ　１１０４；長さ＝３５０ａａ；スコアｅ＝９ｘ１０−７）及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びＤｅｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｒａｄｉｏｄｕｒａｎｓ由来の候補の同定をもたらした。この手法は、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａの候補が同定されるまでの３回の繰り返しを通して繰り返された（ＴＭ０１８１；長さ＝３２４アミノ酸；スコアｅ＝２ｘ１０−７）。
【０２２３】
ゲノミックリサーチ研究所（ＴＩＧＲ）のウエブサイトから、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａの蛋白質ＴＭ０１８１に関する以下の配列がダウンロードされた。
【０２２４】
【表１２】
2004508018.tif 000013
【０２２５】
配列決定され、同じウエブサイトから得られた配列は：
【０２２６】
【表１３】
2004508018.tif 000014
【０２２７】
であった。
配列データベース中の特定された停止コドン（ｔａａ）及び開始（ａｔｇ）は下のケースにあり、下線を引く。
【０２２８】
同定された遺伝子及び周辺配列を、ＮＣＢＩのｏｒｆファインダープログラム（ＮＣＢＩウエブサイト）を用いたオープンリーディングフレーム分析に供することで、上にリストされた配列内で大文字で下線を引かれた５つコドン上流の、別のインフレームの可能な開始（ＡＴＧ）を明らかにした。この別の開始は、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ蛋白質のＴＭ０１８１からのデータベースリスティングのアミノ末端のエンド上にペンタペプチド配列ＭＲＧＤＣを有する蛋白質をコードするはずである。他のｏｒｆファインダープログラムは広く利用可能であって当業界においてよく知られたものを用いることにより、オープンリーディングフレーム、即ち、ベクターＮＴＩ　Ｖ．５．２．１．０，インフォマックス社を同定することができる（１９９８年１２月９日）。
【０２２９】
ＮＣＢＩエントレッツウエブサイトから、仮説の蛋白質のＡＱ　１１０４（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：）の構造遺伝子をダウンロードして、対応の蛋白質配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：）を確かめた：
【０２３０】
【表１４】
2004508018.tif 000015
【０２３１】
ｇｔｇ開始コドンとｔａａ停止コドンを太字で下線を引いた活字で示す。
【０２３２】
【表１５】
2004508018.tif 000016
【０２３３】
新たに同定されたδ’と、Ｅ．ｃｏｌｉとＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの候補（仮説蛋白質ＹＱＥＮ）との整列化を，ベイラーカレッジオブメディスンサーチラウンチャーのウエブサイトにおけるＣｌｕｓｔａｌＷ　１．８を用いたところ（Ａｉｙａｒ，Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：２２１−２４１（２０００）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５（２４）：４８７６−４８８２（１９９７））、図６に示す整列化をもたらした。
【０２３４】
ベイラーカレッジオブメディスンサーチラウンチャーは、分子生物学関連検索を組織化するための進行中のプロジェクトであり、そして関連する検索に関して単一ポイントの入力（ａ ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｅｎｔｒｙ）を提供することにより機能上ＷＷＷ上で利用可能な分析サービスである（例えば、標準パラメーターを用いた蛋白質配列検索に着手するための単一のページ）。２つの新たに同定されたＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ及びＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａの候補δは他のδ配列と同じ類似残基のパターンを共有することが注目できる。Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのｈｏｌＡ遺伝子の正確な開始における曖昧さは、整列化により解析されなかった。
【０２３５】
実施例８：Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのｈｏｌＡの発現
Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのｈｏｌＡを発現させることにより、天然のｇｔｇ開始に代えてＡＴＧ開始及び天然の停止コドンを伴う天然のＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのδ蛋白質を生産し、そしてＥ．ｃｏｌｉにおいてビオチン化されたペプチド配列とｈｅｘａＨｉｓ配列を伴うアミノ末端伸長を伴う蛋白質として生産することになる。このペプチド（ＭＡＧＣＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＨＨＨＨＨＬＶＰＲＧＳＧＧＧＧ．．．．）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１４）及びそれに融合させた蛋白質を発現するためのベクターが記載される（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ　ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，同じ箇所；ＰＣＴ　ＷＯ９９／１３０６０）。標識された蛋白質は、（ｉ）ビオチンブロットにおいてコンジュゲートされたストレプトアビジン試薬を用いて標識化δの発現を監視及び定量する容易さのため（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ　ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，同じ箇所）、及び（ｉｉ）Ｎｉ＋＋−ＮＴＡ及びモノマーアビジンカラム上の親和性クロマトグラフィーにより補助された次の精製の容易さのため、アミノ末端ビオチン−ｈｅｘａＨｉｓ伸長により最初に発現させる。精製された標識蛋白質は、再構成アッセイのための初期の試み（実施例１６参照）及び必要であれば機能アッセイの不在下で天然Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのδの精製を監視するために使用できるウサギポリクローナル抗体の産生のための抗原のために使用される。ポリクローナル及びモノクローナル抗体は古くて当業界公知の方法により作成される。全蛋白質のレベルは、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４（１９７６））又はこの実施例及び他の実施例における他の適当な方法により測定される。
【０２３６】
標識されたＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのδを発現させるため、ビオチン／ｈｅｘａＨｉｓ標識をコードする配列をＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのｈｏｌＡの第２コドンと融合させる。これはＰＣＲにより達成され、ＡｑｕｉｆｅｘのｈｏｌＡ遺伝子（ＡＱ　１１０４）を増幅するのに使用される。ＰｓｔＩ部位が上記遺伝子の５’末端に付加されて、ＨｉｎｄＩＩＩ部位が遺伝子の３’末端に付加されるように、プライマーがデザインされる。
【０２３７】
フォワードプライマーは：
【０２３８】
【化１】
2004508018.tif 000017
【０２３９】
になる。
このプライマーの相補部分を大文字として示し、そしてコドン＃２から始まる（ＡｑｕｉｆｅｘのｈｏｌＡ遺伝子のＡＴＧ開始コドンは除外される）。ＰｓｔＩ部位をイタリックで示し下線を引く。これは、Ｎ−末端融合ペプチドとインフレームにてＡｑｕｉｆｅｘのｈｏｌＡ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を配置させる。プライマーの５’末端上に４塩基の付加部分が存在することにより、ＰｓｔＩによる有効な消化を可能にさせる。
【０２４０】
リバースプライマーは、
【０２４１】
【化２】
2004508018.tif 000018
【０２４２】
になる。
プライマーの相補部分を大文字として示す。ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位はイタリックであり、そして下線を引き、そしてプライマーの５’末端上に４塩基の付加部分が存在することにより、ＨｉｎｄＩＩＩによる有効な消化を可能にさせる。非相補部分は追加の開始コドン（ｔｔａ）を含むことにより翻訳の停止を増強する。ＰＣＲ産物の図解描写を図１１に示す。ＰＣＲ産物は、ＰｓｔＩとＨｉｎｄＩＩＩにより消化されて、同じ制限酵素で消化されたベクターｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩに挿入する。ＰＣＲ産物が挿入されるｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩの領域を図１２に示す。この結果のプラスミド（ｐＡ１−ＮＢ−ＡＱＤ）によりＥ．ｃｏｌｉ　ＤＨ５αを形質転換する。陽性の単離物をアンピシリン耐性に関して選択して、陽性単離物から単離されたプラスミドを、挿入物を含む領域にわたって配列決定する。発現の証明は、ＯＤ　０．５までの細胞成長及び１ｍＭのＩＰＴＧの３時間の添加により達成される。細胞の抽出物をＳＤＳゲル上の電気泳動に供し、膜に移し、そしてストレプトアビジンコンジュゲートされた試薬により検出するが、その開示が引用により本明細書に編入される、２０００年７月１４日出願のＰＣＴ　ＷＯ　９９／１３０６０及び米国仮出願番号６０／１９２，７３６に教示されたとおりである。
【０２４３】
上記の手法及び以下の実施例において、以下の通常のクローン化の手法を持ちいる：全ての中間体プラスミドでＥ．ｃｏｌｉのＤＨ５αを形質転換する。ＡｍｐＲコロニーを選択して、適当な制限部位の増加又は損失に関してプラスミドをスクリーニングする。挿入されたＤＮＡの配列をＤＮＡ配列決定により確認する。ライゲーションはＴ４　ＤＮＡライゲース及びＡＴＰの存在下で実施する。蛋白質の発現は、プラスミドによるＥ．ｃｏｌｉ　ＭＧＣ１０３０（ｍｃｒＡ，ｍｃｒＢ，ｌａｍＢＤＡ（−），（ＲＲＮＤ−ＲＲＮＥ）１，ｌｅｘＡ３）及びＡＰ１．Ｌ１　Ｅ．ｃｏｌｉ細菌の形質転換により確認する。ＡＰ１．Ｌ１細菌株に対する親はＢＬＲ細菌株［Ｆ−，ｏｍｐＴ　ｈｓｄＳＢ（ｒＢ−ｍＢ−）ｇａｌ　ｄｃｍ（ｓｒｌ−ｒｅｃＡ）３０６：：Ｔｎ１０（ｎｏｖａｇｅｎ）］であった。Ｔ１ファージ耐性バージョンのこのＢＬＲ株をＡＰ１．Ｌ１と称する。アンピシリン耐性に関して選択された形質転換細胞の単一のコロニー（各形質転換体から３コロニー）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ｍｌの２ｘＹＴ培養培地に接種し、そして振盪インキュベーター上で一晩３７℃において生育させる。朝に、一晩生育からの濁った培養液０．５ｍｌを１．５ｍｌのフレッシュな２ｘＹＴ培養培地に接種する。培養液を１時間３７℃において振盪しながら生育させ、発現を最終濃度１ｍＭまでのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加により誘導する。細胞を誘導後３時間に遠心分離することにより回収する。細胞沈殿をすぐに１／１０の培養容量の２ｘレムリサンプルバッファー（２ｘ溶液：１２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），２０％グリセロール、４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ），５％β−メルカプトエタノール、及び０．００５％ブロムフェノールブルーｗ／ｖ）に溶解し、そして音波処理することにより、細胞を完全に溶解して、ＤＮＡを剪断する。サンプルを１０分間９０−１００℃に加熱して、遠心分離することにより、不溶性残渣を除去する。各上清のアリコート（３μｌ）を４−２０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ，ＥＣ６０２５５；１ｍｍ厚、１５ウエル／ゲル）にて２５ｍＭＴｒｉｓ塩基、１９２ｍＭグリシン、及び０．１％ＳＤＳ中で電気泳動する。結果のゲルをクマジーブリリアントブルーにより染色することにより、蛋白質のバンドを可視化させる。
【０２４４】
標識された蛋白質として発現された蛋白質は誘導時に最終濃度１０μＭにｄ−ビオチンを受ける。対照の培養は、ｄ−ビオチンのみを受け、そしてＩＰＴＧにより誘導しない。発現された蛋白質はビオチンブロットを用いて分析する。各溶解物中の全蛋白質をポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜にＮｏｖｅｘ移動装置を３０Ｖの定圧にて１２ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩基、９６ｍＭグリシン、０．０１％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、及び２０％メタノール（ｖ／ｖ）中で６０分間室温にて移動させる（ブロットする）。膜は、５％ノンファットドライミルク（ｗ／ｖ）を含む０．２％　Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）−ＴＢＳ（ＴＢＳＴ）（ｔｒｉｓ−緩衝塩溶液；８ｇ／Ｌ　ＮａＣｌ，０．２ｇ／Ｌ　ＫＣｌ，３ｇ／Ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４））中で１時間室温においてブロックする。ブロットされた膜を次にＴＢＳＴを用いて洗浄し、そして次にＴＢＳＴ中の２μｇ／ｍｌのアルカリホスファターゼーコンジュゲートされたストレプトアビジン（ピアスケミカル社）中で１時間室温においてインキュベートする。ＴＢＳＴによる大規模な洗浄の後に、ブロットをＢＣＩＰ／ＮＢＴ（ＫＰＬ　＃５０−８１−０７；１成分系）により発色させる。内因性Ｅ．ｃｏｌｉビオチン−カルボキシル担体蛋白質（ビオチン−ＣＣＰ，計算上２０ｋＤａ）が誘導サンプル及び非誘導サンプルの両方において検出可能である。Ｎ−末端標識蛋白質として発現された標的蛋白質は誘導サンプルのみで可視化される。
【０２４５】
Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのδは天然蛋白質として発現される。遺伝子（ＡＱ　１１０４）は、当該遺伝子が天然形態にて発現可能なベクターへの遺伝子の挿入を可能にさせるようにデザインされたプラスミドを用いてＡｑｕｉｆｅｘのゲノミックＤＮＡから増幅される。
【０２４６】
フォワードプライマーは、開始「ＡＴＧ」コドンがＮｄｅＩ制限部位に取り込まれるようにデザインされる。フォワードプライマーを以下に示す。
【０２４７】
【化３】
2004508018.tif 000019
【０２４８】
このプライマーの相補部分を太字により示し、そしてＮｄｅＩ部位をイタリックにして下線を引く。プライマーの５’末端上に４塩基の付加部分が存在することにより、ＮｄｅＩによる有効な消化を可能にさせる。
【０２４９】
リバースプライマーは、ＫｐｎＩ部位を含み、そして以下に示される。
【０２５０】
【化４】
2004508018.tif 000020
【０２５１】
当該プライマーの相補部分を太字で示す。ＫｐｎＩ制限部位をイタリックにして下線を引き、そして４塩基の付加部分が存在することにより、ＫｐｎＩによる有効な消化を可能にさせる。非相補部分は、追加の停止コドン（ｔｔａ）も含むことにより、翻訳の停止を増強する。ＰＣＲ産物の図解描写を図１３に示す。
【０２５２】
ＰＣＲ産物はＮｄｅＩ及びＫｐｎＩにより消化されて、同じ制限酵素により消化したベクターｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩ（７４）に挿入される。ＰＣＲ産物が挿入されることになるｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩの領域を図１４に示す。ＫｐｎＩ部位の下流、即ち挿入されたＡｑｕｉｆｅｘ　ｈｏｌＡ遺伝子８ＡＱ１１０４）の停止コドンの下流に位置するＣ−末端ビオチン／ｈｅｘａＨｉｓ融合ペプチドをコードする配列が存在し、発現されない。これらのプライマーの配列を上記のとおりに証明して、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ１内で発現させる。
【０２５３】
発現の証明は、予測された分子量のバンドのＩＰＴＧ−発現のための候補細胞の抽出物からクマジー−染色されたＳＤＳゲルの検査により達成される。その手法で失敗すれば、ポリクローナル抗体を、精製された標識Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ　δに対して生じさせて、発現された蛋白質をウエスタンブロットにより検出する。発現は、実施例１６に記載された機能アッセイを用いることにより証明及び定量もする。
【０２５４】
実施例９．Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのδの精製
標識されたＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのδは、硫酸アンモニウム画分化、Ｎｉ＋＋−ＮＴＡクロマトグラフィー、及び必要であればモノマーアビジンクロマトグラフィーにより精製される。抽出物は、スフェロプラストの形成及びスペルミジン存在下で徐々に加熱して誘導した溶解により調製される（ＰＣＴ　ＷＯ９９／１３０６０）。硫酸アンモニウム画分（３０、４０、５０、６０、７０％飽和）を作成して、全蛋白質に対して沈殿させた標識δの量を直線応答範囲内でのビオチンブロットにより測定する。標識δの８０％の沈殿をもたらす硫酸アンモニウムの濃度を次の精製に使用する。最適化された画分化手法によりもたらされた硫酸アンモニウム沈殿物は、記載されたのと（ＰＣＴ　ＷＯ９９／１３０６０）類似の手法により、適当なバッファーに溶解されて、そしてＮｉ＋＋−ＮＴＡカラム上でクロマトグラフィーされる。標識δの溶出位置を染色ＳＤＳゲル及びビオチンブロットにより測定する。蛋白質が純粋であれば、それを透析して、抗体生産及び予備的機能アッセイをサポートするために使用される。必要であれば、標識δを最初にモノマーアビジンクロマトグラフィーによりさらに精製する（ＰＣＴ　ＷＯ９９／１３０６０）。
【０２５５】
天然のＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのδを硫酸アンモニウム画分化及び標準クロマトグラフィー手法により精製する。精製は、精製された標識化Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ　ｐｏｌＩＩＩホロ酵素サブユニットα、β、δ、δ’、ε及びＤｎａＸを用いた再構成反応のアッセンブリーを待つ（実施例１６参照）。機能アッセイは、反応効率を損なうか又は蛋白質−蛋白質相互作用を一部弱めるかもしれない標識を含まない完全に活性なサブユニットの最適な生産のために重要である。機能アッセイのみにより、手法が蛋白質不活性化を導く場合が見えてくる。機能アッセイは汚染物の存在下でカラム画分内の所望の蛋白質の存在を監視するのにも有用である。活性は各クロマトグラフィー工程の前と後に定量されて、汚染蛋白質の損失と共に有意な（通常＞５０％）活性を保持をもたらす手法のみが最終精製処置に含まれる。
【０２５６】
精製の開発は経験的なプロセスである。溶解物からの硫酸アンモニウム画分化を最適化することが第１の工程になり、上記の標識化蛋白質に関して多く記載されたとおりであるが、δが機能アッセイにより定量されることを除く。次に、様々な、カチオン交換、アニオン交換、ヒドロキシアパタイト及び疎水性相互作用クロマトグラフィー樹脂を用いることにより、δ活性の結合及び溶出に必要なバッファー条件を決定する。もっとも高い収量を提供する樹脂に関しては、勾配溶出条件を最適化して、高い回収率に一致する汚染物からのδの最適な分離を与える。δがほぼ均質になるまで連続クロマトグラフィーの処置を展開する。最終精製工程はゲル濾過が有望であるが、何故ならば如何なる凝集蛋白質も除去し、且つ最適な保存バッファー中に精製蛋白質を入れるための有効な方法を提供するためである。最後に回収された蛋白質を等分化して、最適な条件下で保存するが、液体窒素中への投げ込みによる素早い凍結及び必要なときまでの−８０℃における保存が有望である。
【０２５７】
実施例１０．Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ　ｈｏｌＡの発現
ＴＭ０１８１は融合蛋白質として発現され、そのＮ−末端を標識され、実施例８においてＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのｈｏｌＡに関して多く記載された。開始部位に曖昧さが存在するから、より上流の部位を用いることにより、全てのコーディング配列が含まれることを保証する。特定すれば、ＰＣＲを用いることにより、Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａのｈｏｌＡ遺伝子を増幅する（ＴＭ０１８１）。ＫｐｎＩ部位が当該遺伝子の５’末端上流に付加されてＳｐｅＩ部位が遺伝子の３’末端に付加されるように、プライマーをデザインする。この問題を克服するため、発現ベクターｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩは一部ＰｓｔＩ部位とオーバーラップするＫｐｎＩ制限部位を含む。この制限部位の使用は、Ｎ−末端ビオチン／ｈｅｘａＨｉｓ融合ペプチドとＴ．ｍａｒｉｔｉｍａのｈｏｌＡ遺伝子の間に最終の蛋白質において加えられる追加の２アミノ酸をもたらす。
【０２５８】
フォワードプライマーは、
【０２５９】
【化５】
2004508018.tif 000021
【０２６０】
である。
このプライマーの相補部分を太字で示し、コドン＃２から始まり（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａのｈｏｌＡ遺伝子のＡＴＧ開始コドンは除外する）、ＫｐｎＩ部位をイタリックにして下線を引く。４塩基の付加部分が当該プライマーの５’末端上に存在することにより、ＫｐｎＩによる有効な消化を可能にさせる。当該プライマーの非相補部分に追加のヌクレオチド「ｃ」を含むことにより、ビオチン／ｈｅｘａＨｉｓ融合ペプチドとＴ．ｍａｒｉｔｉｍａのｈｏｌＡ遺伝子間のＯＲＦを保持する。
【０２６１】
リバースプライマーは、
【０２６２】
【化６】
2004508018.tif 000022
【０２６３】
である。
このプライマーの相補部分を太字で示す。ＳｐｅＩ制限部位をイタリックにして下線を引きそして４塩基の付加部分が存在することにより、ＳｐｅＩによる有効な消化を可能にさせる。非相補部分は、追加の停止コドン（ｔｔａ）を含むことにより、翻訳の停止を増強させる。ＰＣＲ産物の図解描写を図１５に示す。
【０２６４】
ＰＣＲ産物はＫｐｎＩ及びＳｐｅＩにより消化されて、同じ制限酵素により消化したベクターｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩに挿入される。ＰＣＲ産物が挿入されることになるｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩの領域を図１２に示す。これらのプライマー（ｐＡ１−ＮＢ−ＴＭＤ）によりＤＨ５αを形質転換して、単離されたプラスミドの配列を上記のとおりに証明して、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ１内で発現させる。発現された細胞を実施例８に記載されたとおりに証明する。
【０２６５】
標識化Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ　δ（実施例８に記載された手法により得られた）に対する抗体を用いることにより、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａの抽出物からδを免疫沈殿させる。沈殿した蛋白質をさらにＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製して、膜に移し、そしてそのアミノ末端を決定することにより、２つの別々の開始部位の何れが使用されるかを決定する。この手法が失敗すれば、可能性のある両方のδ蛋白質を発現することにより、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素を最良に再構成するように働くことを測定する。
【０２６６】
遺伝子が天然形態で発現され得るベクターに遺伝子を挿入することを可能にさせるようにデザインされたプラスミドを用いて、天然（非標識）のＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのδをＴ．ｍａｒｉｔｉｍａのゲノミックＤＮＡから遺伝子（ＴＭ０１８１）の増幅により発現させる。
【０２６７】
フォワードプライマーは、開始「ＡＴＧ」コドンがＮｄｅＩ制限部位に取り込まれるようにデザインされる。フォワードプライマーを以下に示す。
【０２６８】
【化７】
2004508018.tif 000023
【０２６９】
このプライマーの相補部分を太字で示す。ＮｄｅＩ制限部位をイタリックにして下線を引きそして４塩基の付加部分が存在することにより、ＮｄｅＩによる有効な消化を可能にさせる。
【０２７０】
リバースプライマーはｐＡ１−ＮＢ−ＴＭＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：）との構築において使用されたのと同じリバースプライマーであり、ＳｐｅＩ制限部位と、天然の停止コドンに隣接した追加の停止コドンを含む。
【０２７１】
ＰＣＲ産物の図解描写を図１６に示す。ＰＣＲ産物はＮｄｅＩ及びＳｐｅＩにより消化されて、同じ制限酵素により消化したベクターｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩに挿入される。ＰＣＲ産物が挿入されることになるｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩの領域を図１４に示す。これらのプライマー（ｐＡ１−ＴＭＤ）によりＤＨ５αを形質転換して、単離されたプラスミドの配列を上記のとおりに証明して、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ１内で発現させる。発現は実施例８に記載されたとおりに証明する。第２の可能な開始コドンから始まるこの遺伝子の短いバージョンを発現ベクターに挿入することもできる。これは、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのδ遺伝子の長いバージョンをコードする遺伝子の標識形態及び非標識形態の両方をクローン化するのに使用したのと同じ戦略を用いて達成される。
【０２７２】
実施例１１．Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのδの精製
標識された天然のＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのδを実施例９に記載されたのと類似の戦略により精製する。標識された蛋白質に対する抗体を実施例８に記載されたとおりに調製する。
【０２７３】
実施例１２．配列決定された好熱性生物、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ及びＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のδ’サブユニット（ｈｏｌＢ）の構造遺伝子の同定
全ての配列決定された細菌は、細菌ｄｎａＸに顕著に相同な２つの遺伝子を含む。相同性の低い２つの蛋白質の短い方は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．，（１９９３）同じ箇所）及びＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓにおいてδ’である。この原理はＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ及びＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓにおいてδ’（ｈｏｌＢ）の構造遺伝子を検出するために活用した。ｂｌａｓｔ研削をＥ．ｃｏｌｉのｄｎａＸ及びＢＬＡＳＴの欠損パラメーターを用いて実施したが、但し２５０適合までを示すオプションが示された。Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのｄｎａＸ遺伝子を配置し（ｅ＝１ｘ１０−６５）、そして第２の遺伝子を配置させることにより（ａｑ　１５２６；３１２アミノ酸；ｅ＝５ｘ１０−１４）、候補のＡｑｕｉｆｅｘ　ｈｏｌＢを提供した。Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓの仮想蛋白質ａｑ　１５２６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１５）の以下の蛋白質配列をＮＣＢＩエントレッツウエブサイトからダウンロードした：
【０２７４】
【表１６】
2004508018.tif 000024
【０２７５】
ａｑ　１５２６（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２１６）をコードする以下のＤＮＡ配列をダウンロードして、ＮＣＢＩのｏｒｆファインダープログラムを用いて証明した（開始コドン及び停止コドンに下線を引く）：
【０２７６】
【表１７】
2004508018.tif 000025
【０２７７】
Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａに関しては、一次（ｐｒｉｍａｒｙ）相同性が注釈を着けられたｄｎａＸに対して再び発見された（ＴＭ０６８６；４７８アミノ酸；ｅ＝２ｘ１０−６４）；しかしながら、二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）相同性の２つの蛋白質が同定された。ＴＭ０５０８（５９９残基；ｅ＝１ｘ１０−４）及びＴＭ０７７１（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのＴＩＧＲデータベース中の関連があるγサブユニットとして証明された）（３１２残基；ｅ＝６ｘ１０−４）。一つの細菌の中の３つのｄｎａＸ−様遺伝子の発見は前例がない。証明されたδ’配列は３００−４００アミノ酸の範囲に入ることから、ＴＭ０７７１はおそらくＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのｈｏｌＢ候補であることが示唆される。以下の蛋白質及びＤＮＡ配列をＮＣＢＩウエブサイトからダウンロードした；各々のｏｒｆの開始コドン及び停止コドン（以下に下線を引く）を証明して、対応する開始コドン及び停止コドンを当該ＤＮＡ配列中にて下線を引いた。
【０２７８】
【表１８】
2004508018.tif 000026
【０２７９】
【表１９】
2004508018.tif 000027
【０２８０】
【表２０】
2004508018.tif 000028
【０２８１】
【表２１】
2004508018.tif 000029
【０２８２】
相同性スコアに全く依存するよりも、３つのｄｎａＸ様Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ蛋白質をＣｌｕｓｔａｌを持て整列化することにより、それらの類似性及び相異を図１７に示すとおりにより厳密に細かく調べることができる。
【０２８３】
ＴＭ０６８６とＴＭ０５０８は配列によると機能性ＡＴＰａｓｅであるらしい。両者は、全ての機能性ＤｎａＸ分子に見いだされるがδ’からは欠如しているウオーカーＡモチーフ（ＧＸＧＫＴ（Ｔ／Ｓ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２１））と完全に一致した。両者は機能性ＤｎａＸにおいて見いだされる種類の機能性「ＤＥＡＤ」ボックスを有し（ＤＥｈＨ，但し、ｈは巨大な疎水性残基）、そして両者はＳＲＣ配列を有する。ＴＭ０７７１は機能性ＡＴＰａｓｅを欠き、そして「ＤＥＡＤ」相同性が低下しており、特性はδ’配列と共通である。ＴＭ０７７１とＴＭ０６８６は、他のＤｎａＸとδ’蛋白質により共有される未知の機能の１１残基のストレッチを通して顕著な類似性を共有する。ＴＭ０６８６は、Ｅ．ｃｏｌｉのＤｎａＸとδ’の両方に見いだされたＮＡＬＬＫＴＬＥＥＰＰ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２２２）配列に対して完全なマッチを呈する。ＴＭ０６８６及びＴＭ０５０８において見いだされた保存されたＳＲＣに代わり、ＳＲＶがＴＭ０７７１において見いだされた。これらのデータは、これら３つのＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ蛋白質がβプロセッシビティー因子アッセンブリー装置の一部であること、及びＴＭ０７７１が最良のｈｏｌＢ候補であることを強く示唆する。ＴＭ０６８６（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのγ及びτサブユニットであるとＴＩＧＲデータベースにおいて注釈を付けられた）及びＴＭ０５０８（仮説の蛋白質であると注釈を付けられた）は、共に、おそらくＤｎａＸ複合体中の機能性ＡＴＰａｓｅである。おそらく、ＴＭ０６８６はγ−相同体をコードし、そしてより長いＴＭ０５０８はＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａにおけるτ−相同体である。あるいは、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ中の２つの異なるＤｎａＸポリメラーゼＩＩＩ分子について、ＴＭ０５０８とＴＭ０６８６は異なるＤｎａＸポリメラーゼＩＩＩを供給するかもしれない。全ての候補を発現させて、それらをＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのプロセッシブなＤｎａＸポリメラーゼＩＩＩホロ酵素を再構成するのに用いる。
【０２８４】
実施例１３．Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのｈｏｌＢの発現
ＰＣＲを用いることにより、ＡｑｕｉｆｅｘのｈｏｌＢ遺伝子（ＡＱ　１５２６）を増幅する。ＰｓｔＩ部位が遺伝子の５’末端に付加されて、ＫｐｎＩ部位が遺伝子の３’末端に付加されるように、プライマーをデザインする。
【０２８５】
フォワードプライマーは：
【０２８６】
【化８】
2004508018.tif 000030
【０２８７】
である。
このプライマーの相補部分を太字で示し、そしてコドン＃２（ＡｑｕｉｆｅｘのｈｏｌＢ遺伝子のＡＴＧ開始コドンは除外する）から始まる。ＰｓｔＩ部位をイタリックで示して下線を引く。これは、ＡｑｕｉｆｅｘのｈｏｌＢ遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＮ−末端融合ペプチドに対してインフレームに配置させることになる。ＰｓｔＩによる有効な消化を可能にさせるために、当該プライマーの５’末端上に４塩基の追加部分が存在する。
【０２８８】
リバースプライマーは
【０２８９】
【化９】
2004508018.tif 000031
【０２９０】
である。
当該プライマーの相補部分を太字で示す。ＫｐｎＩ制限部位をイタリックで示して下線を引き、そしてＫｐｎＩによる有効な消化を可能にさせるための４塩基の追加部分が存在する。非相補部分は翻訳の停止を増強するための追加の停止コドン（ｔｔａ）も含む。ＰＣＲ産物の図解描写を図１８に示す。
【０２９１】
ＰＣＲ産物をＰｓｔＩとＫｐｎＩで消化して、同じ制限酵素により消化したベクターｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ２（７４）に挿入する。ＰＣＲ産物が挿入されることになるｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ２を図１９に示す。
【０２９２】
これらのプラスミド（ｐＡ１−ＮＢ−ＡＱＤ’）によりＤＨ５α細菌を形質転換して、アンピシリン耐性に関してスクリーニングして、陽性単離物から単離し、そして単離されたプラスミドの配列を上記のとおりに証明して、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ１内で発現させる。
【０２９３】
非標識形態にてＡｑｕｉｆｅｘのδ’サブユニットを発現させるため、遺伝子が天然形態にて発現され得るベクター内に遺伝子が挿入されることを可能にさせるようにデザインされたプラスミドを用いて、ＡｑｕｉｆｅｘのゲノミックＤＮＡから遺伝子（ＡＱ　１５２６）を増幅する。
【０２９４】
開始「ＡＴＧ」がＮｄｅＩ制限部位に取り込まれるように、フォワードプライマーをデザインする。フォワードプライマーを以下に示す。
【０２９５】
【化１０】
2004508018.tif 000032
【０２９６】
プライマーの相補部分を太字で示す。ＮｄｅＩ制限部位をイタリックで示して下線を引き、そしてＮｄｅＩによる有効な消化を可能にさせるために４塩基の追加部分が存在する。
【０２９７】
リバースプライマーは、ｐＡ１−ＮＢ−ＡＱＤ’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６５）の構築において使用されたのと同じリバースプライマーであり、そして天然の停止コドンに追加の停止コドンが隣接する。ＰＣＲ産物の図解描写を図２０に示す。
【０２９８】
ＰＣＲ産物をＮｄｅＩとＫｐｎＩで消化して、同じ制限酵素により消化したベクターｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩに挿入する。ＰＣＲ産物が挿入されることになるｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩを図１４に示す。これらのプラスミド（ｐＡ１−ＡＱＤ’）によりＤＨ５αを形質転換して、アンピシリン耐性に関してスクリーニングして、陽性単離物から単離し、そして単離されたプラスミドの配列を上記のとおりに証明して、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ１内で発現させる。
【０２９９】
実施例１４．Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのδ’の精製
Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのδ’の標識形態及び天然（非標識）形態を実施例９に概説したアプローチ及び戦略を用いて精製する。
【０３００】
実施例１５．Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ複製蛋白質：α、ε、β、ＤｎａＸ及びＳＳＢの発現と精製
前の実施例及び引用文献（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ　ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，同じ箇所；Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｈ．Ｇ．ａｎｄ　ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７０：２９５６３−２９５６９（１９９５）；Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７０：２９５５５−２９５６２（１９９５）；ＰＣＴ　ＷＯ９９／１３０６０）に記載された一般的戦略を用いて、天然及び標識されたＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのα、ε、β、ＤｎａＸ及びＳＳＢを発現させて精製する。αは、その存在、収量及び比活性を監視するために、ヌクレアーゼ−活性化ＤｎａＸ上でのギャップフィリングアッセイを用いて精製する。εはその精製を監視するためにαの存在下及び不在下においてその固有のヌクレアーゼ活性を用いて精製する（Ｍａｋｉ　ａｎｄ　Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，（１９８７），同じ箇所；Ｇｒｉｅｐ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９：９００６−９０１４（１９９０）；Ｒｅｅｍｓ，Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．２６６：４８７８−４８８２（１９９１））。β及びＤｎａＸは標識された蛋白質として精製されて、再構成アッセイが開発されたなら、それらを天然形態で精製する。ＳＳＢは天然形態で発現されて、確立された手法により精製される（Ｇｒｉｅｐ，Ｍ．ａｎｄ　ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．２６４：１１２９４−１１３０１（１９８９）；Ｌｏｈｍａｎ，Ｔ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２５：２１（１９８６））。
【０３０１】
実施例１６．Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのＤｎａＸポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のサブユニットに関する再構成アッセイの開発
Ｅ．ｃｏｌｉとＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの両者に関して、α、ＤｎａＸ、β、δ及びδ’のサブユニットの組み合わせが、長い一本鎖鋳型、例えばプライムされたＭ１３ＧｏｒｉのＤｎａＸを複製できる最小限プロセッシブなレプリカーゼの再構成をもたらす（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，ａｎｄ　Ｂａｋｅｒ，同じ箇所；ＰＣＴ　ＷＯ９９／１３０６０）。Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩコアのεサブユニットはαサブユニットの重合活性を安定化させて刺激する；即ち、それも予想された複製反応に適宜含ませる。Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓの複製サブユニットが標識された形態で利用可能になれば、それらを共に、アニールされたＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーでプライムされたか又はＥ．ｃｏｌｉのＳＳＢ及びＥ．ｃｏｌｉのＤｎａＧプライマーゼの作用により別反応においてプライムされた、プライムされたＭ１３ＧｏｒｉのＤＮＡと混合する。ｄＮＴＰｓ，ＡＴＰ及びＭｇ＋＋を実験上決定された最適な濃度にて含ませる（最初が１ｍＭ　ＡＴＰ，１０ｍＭ　Ｍｇ＋＋，１５０μＭ　ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＧＴＰ及び５０μＭ［３Ｈ］ＴＴＰ（計算上４００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ））。反応は、実験上決定された最適な温度において実施し（６５℃にて開始）、ＤＮＡ合成量が時間に比例する間、実施する（初期の５分間）。反応を対照としてのＴｔｈ蛋白質と比較する。大まかに同じレベルの合成が標識されたＴｔｈ対照蛋白質としてのＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ蛋白質を用いて観察されたなら、反応の最適化が続くことになる。
【０３０２】
貧困な合成がＴｔｈ対照反応において使用されたのとほぼ同じレベルの標識Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ蛋白質を用いて観察されたなら、個々の標識蛋白質（又は蛋白質の群）のレベルを、合成を最適化する試みにおいて増加させる。紛失した（ｍｉｓｓｉｎｇ）蛋白質が複合体の機能最適化に必要であるか、又は標識が必須の蛋白質−蛋白質相互作用を干渉するなら、高いレベルの一つ又は複数の蛋白質を必要とするかもしれない。標識された蛋白質のレベルの増加が有効な反応物の再構成をもたらさなければ、対応する標識化蛋白質に関する個々のサブユニット（又はサブユニットのグループ）に関する硫酸アンモニウムカットを交換することにより、標識化形態において蛋白質が欠損していることを決定することになる。不必要な汚染物の含有なしに蛋白質の回収のために最適化された沈殿物を生じるのに必要な硫酸アンモニウム濃度は、機能アッセイの利用可能性に先立って定量性ウエスタンブロットのために抗体を用いて測定される。未標識蛋白質の硫酸アンモニウム画分が標識された精製蛋白質よりも活性であることがわかったとすれば、それは再構成反応において標識蛋白質の代わりに用いられることになる。問題が残るとすれば、個々のＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓの蛋白質が低下した温度（１５℃）又は高い温度（４３℃）において、様々な時間又は共に過剰生産されるシャペロン（ＧｒｏＥＬ．ＧｒｏＥＳ）及び／又は（ＤｎａＫ／ＤｎａＩ／ＧｒｐＥ）を発現させることにより、正確に折り畳まれた活性蛋白質の相対レベルを増加させるように試みることになる。
【０３０３】
最適な反応が再構成されたなら、個々の限定するサブユニットの存在下で、最少のバックグラウンドの最適反応を提供するのに必要な他のサブユニットのレベルを測定することになる。個々の反応において選られた合成が加えられた限定する蛋白質のレベルに比例するか否かを決定する。この直線の応答は、限定する蛋白質のレベルを定量するための手段としてアッセイを使用するのに必要である。
【０３０４】
Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓの再構成反応が定量手段として確立されたなら、個々の天然の未標識Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ複製蛋白質の精製を監視及び定量するために使用することができる。未知レベルの特定のＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓサブユニットを含む蛋白質画分の量を変えて、他のサブユニットの最適レベルを含む反応に加える。少なくとも２つのレベルの蛋白質が比例応答を生じる場合に得られた値は、定量に使用されることになる。最適な条件下で１分に１ｐｍｏｌｅのＤＮＡ合成（取り込まれた全部のヌクレオチド）を提供するのに必要な既知の蛋白質のレベルを１ユニットとして表現する。個々の未標識蛋白質が純粋な形態で利用可能になるにつれて、それらは再構成アッセイにおいて未標識蛋白質の代わりに用いられることになる。これは、加えられた未標識蛋白質のレベルに関してアッセイの再度の最適化を必要とする。未標識の蛋白質がその標識された相当物よりも他の成分に対して強固に結合するなら、最適な合成を達成するためには低いレベルが必要なのかもしれない。
【０３０５】
実施例１７．Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ　δ及びδ’の相互作用の試験
必要な成分の存在下でＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのレプリカーゼを再構成するための候補のＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ　δ’及びδに関する要求に加えて、これらの蛋白質が互いに又はＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのレプリカーゼの他の成分と相互作用することを示すことにより、再構成された複製反応における機能及び示唆された利用性を証明できることが期待される。
【０３０６】
発現されて精製されたＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのδ及びδ’が互いに相互作用することが期待される。相互作用の証明は、個々が適切に同定されてかつ機能性蛋白質が発現されるという条件で、同じ機能性サブユニットに個々が参加することを証明することになる。１０倍希釈にて検出に十分なδ及びδ’のレベルを交ぜて、セファロース１２カラム上のゲル濾過に供される。個々の溶出した画分のＳＤＳポリアクリルアミドゲルのクマジー染色か、又は膜にブロットされたゲルのウエスタンブロットの何れかにより、検出されることになる。個々のδ及びδ’は同一の条件下でゲル濾過に供される。δ及びδ’の両者の溶出位置から溶出画分におけるおおよその化学量論的結合の比率で存在する両蛋白質の高い分子量の位置への変化により相互作用が示唆される。相互作用が観察されなかったら、δとδ’の濃度を１０μＭまで上げる。
【０３０７】
相互作用が観察されなかったら。それは、強固な複合体を形成するためのＤｎａＸに関する要求によるかもしれない。δとδ’の単独の間で相互作用が観察されなかったら、ゲル濾過に供された混合物にＤｎａＸを加え、そしてδとδ’が高い分子量にシフトしてＤｎａＸと共に溶出するか否かを観察するためにゲルを分析する。
【０３０８】
Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのδがＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのβと相互作用することも予測される。δとβを混合して、このセクションにおいてδとδ’に関して上で記載されたとおりにゲル濾過に供する。相互作用が観察されなかったら、Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのβをδ−δ’及びＤｎａＸと、ＡＴＰ存在下で混合することにより、相互作用を試験する。これは、プライムされたＤＮＡ上でのβのアッセンブリー中での機能であると予測される複合体である（Ｎａｋｔｉｎｉｓ，Ｖ．，ｅｔ　ａｌ，同じ箇所）。
【０３０９】
実施例１８．Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の再構成
全てのＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓの複製蛋白質が精製形態にて利用可能になったら、それらを混合して、（ｉ）高温（６０℃又はそれ以上の温度）におけるＤＮＡ合成、（ｉｉ）単一の温度又は熱循環の何れかを必要とする応用における高分子量ＤＮＡの合成、（ｉｉｉ）高分子量ＤＮＡのプロセッシブな合成（プロセッシブは、結合−と伸長合成−ポリメラーゼ解離の事象あたり１０００を超えるヌクレオチドの取り込みを示す）、（ｉｖ）２００ヌクレオチド／秒より大きな速度の高速ＤＮＡ合成、（ｖ）εサブユニットの判官によりもたらされる高い精度のＤＮＡ合成、及び（ｖｉ）発現されたＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのＳＳＢ又はＥ．ｃｏｌｉのＳＳＢの存在下でのプロセッシブな反応のために使用される。
【０３１０】
実施例１９．Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ蛋白質ＴＭ０５０８（仮想上の第２のＤｎａＸ蛋白質）の発現
ＰＣＲを使用してＴ．ｍａｒｉｔｉｍａ遺伝子（ＴＭ０５０８）を増幅する。当該遺伝子の５’末端にＰｓｔＩ部位を、そして当該遺伝子の３’末端にＫｐｎＩ部位を付加するように、プライマーをデザインする。
【０３１１】
フォワードプライマーは：
【０３１２】
【化１１】
2004508018.tif 000033
【０３１３】
である。
このプライマーの相補部分は太字で示され、コドン＃２から始まる（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ遺伝子（ＴＭ０５０８）のＡＴＧ（ＴＴＧ）開始コドンは除去する。）。ＰｓｔＩ部位をイタリックで示して下線を引く。これは、Ｎ−末端融合ペプチドとインフレームにてＴ．ｍａｒｉｔｉｍａ遺伝子（ＴＭ０５０８）のオープンリーディングフレームを配置させることになる。ＰｓｔＩによる有効な消化を可能にするために、上記プライマーの５’末端上に４塩基の付加部分が存在する。
【０３１４】
リバースプライマーは：
【０３１５】
【化１２】
2004508018.tif 000034
【０３１６】
である。
このプライマーの相補部分は太字で示される。ＫｐｎＩ制限部位をイタリックで示して下線を引き、そしてＫｐｎＩによる有効な消化を可能にするために、４塩基の付加部分が存在する。非相補部分は翻訳の停止を増強するための追加の停止コドン（ｔｔａ）も含む。ＰＣＲ産物の図解描写を図２１に示す。
【０３１７】
ＰＣＲ産物をＰｓｔＩとＫｐｎＩにより消化して、同じ制限酵素により消化したベクターｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ２（７４）に挿入する。ＰＣＲ産物が挿入されるｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ２の領域を図１９に示す。これらのプラスミド（ｐＡ１−ＮＢ−ＴＭ［０５０８］）によりＤＨ５α細菌を形質転換して、アンピシリン耐性に関してスクリーニングして、陽性単離物から単離し、そして単離されたプラスミドの配列を上記のとおりに証明して、そしてＥ．ｃｏｌｉ　ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ１において発現させる。
【０３１８】
未標識形態のＴ．ｍａｒｉｔｉｍａサブユニット［ＴＭ０５０８］を発現させるため、当該遺伝子が天然形態で発現できるベクターへの当該遺伝子の挿入を可能にさせるようにデザインされたプライマーを用いてＴ．ｍａｒｉｔｉｍａのゲノミックＤＮＡから当該遺伝子（ＴＭ０５０８）を増幅する。ＴＭ０５０８遺伝子は内部にＮｄｅＩ部位を含み、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩ発現ベクターの使用を可能にさせない。この問題は、ＮｄｅＩ制限部位に代えてＮｃｏＩ制限部位を含んだ発現ベクター（ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ）を用いることにより回避された。ＮｄｅＩ制限部位は、制限部位の末端に開始コドンとして使用される「ＡＴＧ」を含んだ（ｃａｔａｔｇ）。ＮｃｏＩ制限部位は、しかしながら、内部に「ＡＴＧ」（ｃ／ｃａｔｇｇ）を含む。ＴＭ０５０８遺伝子の最初の２つのコドンは「ａｔｇａｇｔ」であり、ＭｅｔとＳｅｒをコードする。即ち、この制限部位はフォワードプライマーの一部として使用することができず、ｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩのＮｃｏＩ制限部位への両方の挿入を可能にして、Ｍｅｔ及びＳｅｒをコードする両方のコドンを残す。この問題は、ＲｃａＩ制限部位（ｔ／ｃａｔｇａ）をフォワードプライマーに付加することにより解決した。この制限部位は、ＲｃａＩにより分割されたＰＣＲ産物が、ＮｃｏＩにより分割されたｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩにスプライスされることを可能にする。これは両方の制限部位を破壊するが、ＴＭ０５０８遺伝子がｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ発現ベクターに挿入されることを可能にする。フォワードプライマーを以下に示す。
【０３１９】
【化１３】
2004508018.tif 000035
【０３２０】
このプライマーの相補部分は太字で示さる。ＲｃａＩ制限部位をイタリックで示して下線を引き、そしてＲｃａＩによる有効な消化を可能にするために、４塩基の付加部分が存在する。
【０３２１】
リバースプライマーは、ｐＡ１−ＮＢ−ＴＭ［０５０８］（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６８）の構築において使用されたのと同じリバースプライマーであり、そしてＫｐｎＩ制限部位及び天然の停止コドンに隣接して追加の停止コドンを含む。ＰＣＲ産物の図解描写を図２２に示す。
【０３２２】
ＰＣＲ産物をＲｃａＩとＫｐｎＩにより消化して、同じ制限酵素により消化したベクターｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩに挿入する。ＰＣＲ産物が挿入されることになるｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩの領域を図２３に示す。
【０３２３】
前の段落で記載したとおり、ＲｃａＩ／ＫｐｎＩにより消化したＰＣＲ産物のＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ消化したｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩ（７４）への挿入は、プラスミドｐＡ１−ＴＭ［０５０８］をもたらした。ＲｃａＩ消化した制限部位をｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩのＮｃｏＩ制限部位にスプライスした部位を含むｐＡ１−ＴＭ［０５０８］の領域を図２４に示す。
【０３２４】
ｐＡ１−ＴＭ［０５０８］の中のＴＭ０５０８遺伝子の最初の２つのコドンを図２４において太字の下線で示す。もはやＮｃｏＩ及びＲｃａＩの制限はこのプラスミドに存在しない。これらのプラスミド（ｐＡ１−ＴＭ［０５０８］）でＤＨ５α細菌を形質転換して、アンピシリン耐性に関してスクリーニングして、陽性単離物から単離し、そして単離したプラスミドの配列を上記のとおりに証明して、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ１において発現させる。
【０３２５】
注釈：Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来のこの「第２の」ＤｎａＸ様蛋白質は、この明細書において特定されたようなＤｎａＸ蛋白質に関する完全なコンセンサス配列の基準には合わないが、それを発現し、そして現在まで他の細菌レプリカーゼにおいて発見されていない、追加の必要な蛋白質又は付属の蛋白質を構成するか否かを試験するために記載された、再構成Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素反応において試験するには十分なＤｎａＸ様である。
【０３２６】
実施例２０．Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ蛋白質ＴＭ０７７１（仮説上のＨｏｌＢ（δ’））の発現
当該遺伝子の５’末端にＰｓｔＩ部位が付加されて、当該遺伝子の３’末端にＫｐｎＩ部位が付加されるうに、プライマーをデザインする。
【０３２７】
フォワードプライマーは：
【０３２８】
【化１４】
2004508018.tif 000036
【０３２９】
である。
このプライマーの相補部分は太字で示され、コドン＃２から始まる（Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａ遺伝子（ＴＭ０７７１）のＡＴＧ開始コドンは除去する。）。ＰｓｔＩ部位をイタリックで示して下線を引く。これは、Ｎ−末端融合ペプチドとインフレームにてＴ．ｍａｒｉｔｉｍａ遺伝子（ＴＭ０７７１）のオープンリーディングフレームを配置させることになる。ＰｓｔＩによる有効な消化を可能にするために、上記プライマーの５’末端上に４塩基の付加部分が存在する。
【０３３０】
リバースプライマーは：
【０３３１】
【化１５】
2004508018.tif 000037
【０３３２】
である。
プライマーの相補部分は太字で示される。ＫｐｎＩ制限部位をイタリックで示して下線を引き、そしてＫｐｎＩによる有効な消化を可能にするために、４塩基の付加部分が存在する。非相補部分は翻訳の停止を増強するための追加の停止コドン（ｔｔａ）も含む。ＰＣＲ産物の図解描写を図２５に示す。
【０３３３】
ＰＣＲ産物をＰｓｔＩとＫｐｎＩにより消化して、同じ制限酵素により消化したベクターｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ２に挿入する。ＰＣＲ産物が挿入されるｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ２の領域を図１９に示す。これらのプラスミド（ｐＡ１−ＮＢ−ＴＭＤ’［０７７１］）によりＤＨ５α細菌を形質転換して、アンピシリン耐性に関してスクリーニングして、陽性単離物から単離し、そして単離されたプラスミドの配列を上記のとおりに証明して、そしてＥ．ｃｏｌｉ　ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ１において発現させる。
【０３３４】
未標識形態のＴ．ｍａｒｉｔｉｍａのδ’サブユニット［ＴＭ０７７１］を発現させるため、当該遺伝子が天然形態で発現できるベクターへの当該遺伝子の挿入を可能にさせるようにデザインされたプライマーを用いてＴ．ｍａｒｉｔｉｍａのゲノミックＤＮＡから当該遺伝子（ＴＭ０７７１）を増幅する。
【０３３５】
開始「ＡＴＧ」コドンをＮｄｅＩ制限部位に取り込むようにフォワードプライマーをデザインする。フォワードプライマーを以下に示す。
【０３３６】
【化１６】
2004508018.tif 000038
【０３３７】
プライマーの相補部分は太字で示される。ＮｄｅＩ制限部位をイタリックで示して下線を引き、そしてＮｄｅＩによる有効な消化を可能にするために、４塩基の付加部分が存在する。
【０３３８】
リバースプライマーはｐＡ１−ＮＢ−ＴＭＤ’［０７７１］（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７１）の構築において使用されたのと同じリバースプライマーであり、そしてＫｐｎＩ制限部位及び天然の停止コドンに隣接して追加の停止コドンを含む。ＰＣＲ産物の図解描写を図２６に示す。
【０３３９】
ＰＣＲ産物をＮｄｅＩとＫｐｎＩにより消化して、同じ制限酵素により消化したベクターｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩに挿入する。ＰＣＲ産物が挿入されるｐＡ１−ＣＢ−ＮｄｅＩの領域を図１４に示す。これらのプラスミド（ｐＡ１−ＴＭＤ’［０７７１］）によりＤＨ５α細菌を形質転換して、アンピシリン耐性に関してスクリーニングして、陽性単離物から単離し、そして単離されたプラスミドの配列を上記のとおりに証明して、そしてＥ．ｃｏｌｉ　ＭＧＣ１０３０及びＡＰ１．Ｌ１において発現させる。
【０３４０】
実施例２１．Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａの蛋白質ＴＭ０５０８（仮想上の第２のＤｎａＸ蛋白質）の精製
Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのＴＭ０５０８を標識形態及び天然（非標識）形態の両方で、実施例９に概説されたアプローチ及び戦略を用いて精製する。天然の蛋白質の精製を監視できることは、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのレプリカーゼの再構成のためのその要求に依存する。
【０３４１】
実施例２２．Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａの蛋白質ＴＭ０５０８（仮想上の第２のＤｎａＸ蛋白質）の精製
Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのδ’を標識形態及び天然（非標識）形態の両方で、実施例９に概説されたアプローチ及び戦略を用いて精製するが、但し実施例１８に記載された再構成アッセイを用いる。
【０３４２】
実施例２３．Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の成分の発現：ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩタイプＩのαサブユニット、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩタイプＩＩのαサブユニット、ε、β、ＤｎａＸ及びＳＳＢ
天然及び標識されたＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのαのタイプＩ及びタイプＩＩの両方（ＴＭ０４６１及びＴＭ０５７６）、ε（ＴＭ０４９６），β（ＴＭ０２６２），ＤｎａＸ（ＴＭ０６８６）及びＳＳＢ（ＴＭ０６０４）を前の実施例に記載された一般的戦略並びに文献（Ｋｉｍ，Ｄ．Ｒ．ａｎｄ　ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，同じ箇所；Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｈ．Ｇ．ａｎｄ　ＭｃＨｅｎｒｙ，Ｃ．Ｓ．，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７０：２９５６３−２９５６９（１９９５）；Ｄａｌｌｍａｎｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　２７０：２９５５５−２９５６２（１９９５）；ＰＣＴ　ＷＯ９９／１３０６０；ＰＣＴ　ＷＯ９９５３０７４）を用いて発現及び精製する。両サブユニット（タイプＩ及びタイプＩＩのＤｎａＸポリメラーゼＩＩＩ由来の）をヌクレアーゼ活性化ＤＮＡ上のギャップフィリングアッセイを用いて精製することにより、その存在、収量及び比活性を監視する。εは、α（タイプＩのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ由来）の存在下及び不在下でその固有のヌクレアーゼ活性を用いて精製することにより、その精製を監視する（Ｍａｋｉ　ａｎｄ　Ｋｏｒｎｂｅｒｇ（１９８７）同じ箇所；Ｇｒｉｅｐ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，（１９９０）同じ箇所；Ｒｅｅｎｓ，Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，同じ箇所）。βとＤｎａＸは最初に標識蛋白質として精製し、そして再構成アッセイを開発したら、天然形態で精製する。ＳＳＢは、天然形態で発現して、確立された手法により精製する（一般的なＳＳＢの文献）。
【０３４３】
実施例２４．Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のサブユニットに関する再構成アッセイの開発
Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのレプリカーゼの成分の再構成アッセイを、実施例１６のＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓに関して記載された一般的手法及び戦略を用いて開発するが、但し、全ての試験をタイプＩのαサブユニット（適切な場合はプラスε）又はタイプＩＩのα又は両方のαサブユニットを混合して行う。注釈を付けられたＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのＤｎａＸ（ＴＭ０６８６）又は仮想の第２のＤｎａＸ（ＴＭ０５０８）を単独においてか又は混合しても、実験を実施する。
【０３４４】
実施例２５．Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのδ及びδ’サブユニットの相互作用の試験
精製されたＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのδ及びδ’の同定及び機能を試験するための実験は実施例１７に記載されたとおりに実施するが、但し、ＤｎａＸ、ＴＭ０６８６又は第２の仮想ＤｎａＸ（ＴＭ０５０８）の何れかを含む実験を単独においてか又は組み合わせて含ませる。
【０３４５】
実施例２６．Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのＤｎａＸポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の再構成
Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのＤｎａＸポリメラーゼＩＩＩホロ酵素を、前の実施例にて同定された成分を用いて、Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素に関する実施例１８に記載の目的のために強制的か又は刺激により再構成する。
【０３４６】
実施例２７．実施例１−２６に報告された手法の他の全ての細菌からのＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のサブユニットの検出への拡張
序章及び前の実施例に記載された一般的手法は、配列決定された如何なる細菌にも一般的に適用可能であるべきである。特に、δ成分、δ’成分及び追加のＤｎａＸ様成分を発見するための我々の手法は、これらの成分が同定されて配列決定されることを可能にするべきである。これらの成分は、より容易に同定されたα、ε、β及びＤｎａＸ蛋白質と共に、実施例１８に記載されたＤＮＡの合成における用途及びＤＮＡの合成及びそのプロセスの阻害剤を発見することを含むあらゆる追加の応用のために、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素を再構成する。
【０３４７】
明細書において上で言及された全ての刊行物及び特許は引用により本明細書に編入される。発明の記載された方法及び系の様々な修飾及び変更は発明の犯意及び精神から逸脱することなく当業者に明らかとなる。発明は特定の好ましい態様に関連して記載されたが、特許請求の範囲に記載され発明がそのような特定の態様に不当に限定されるべきでないことは理解されるべきである。事実、関連技術分野の当業者には明らかな発明を実施するための記載された様式の様々な変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【０３４８】
実施例２８．あらゆる門からの細菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素サブユニットの発現、精製、ホロ酵素の再構成及び機能の試験
この出願において同定されたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素のサブユニット又はこの出願において記載されたアプローチを用いて将来配列決定される細菌から同定されたホロ酵素サブユニットを発現させ、精製し、そしてこの出願におけるＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ及びＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ及びＹｅｒｉｎｉａ　ｐｅｓｔｉｓ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ及び引用された文献及び特許出願の中の他の生物に関して記載された方法によりそしてアッセイを用いて活性なＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素を再構成するために使用される。この出願の同定されたδサブユニットの真生性は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素活性を再構成することによるか及び／又は祖先の同じ生物又は他の細菌からのβサブユニット及びδ’サブユニットとのそれらの相互作用により、さらに証明することができる。ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の再構成アッセイは祖先の同じ生物又は異なる生物由来のサブユニットを用いて生じさせることができる。
【０３４９】
【表２２】
2004508018.tif 000039
【０３５０】
【表２３】
2004508018.tif 000040
【０３５１】
【表２４】
2004508018.tif 000041
【０３５２】
【表２５】
2004508018.tif 000042
【０３５３】
【表２６】
2004508018.tif 000043
【０３５４】
【表２７】
2004508018.tif 000044
【０３５５】
【表２８】
2004508018.tif 000045
【０３５６】
【表２９】
2004508018.tif 000046
【０３５７】
【表３０】
2004508018.tif 000047
【０３５８】
【表３１】
2004508018.tif 000048
【０３５９】
【表３２】
2004508018.tif 000049
【０３６０】
【表３３】
2004508018.tif 000050
【０３６１】
【表３４】
2004508018.tif 000051
【０３６２】
【表３５】
2004508018.tif 000052
【０３６３】
【表３６】
2004508018.tif 000053
【０３６４】
【表３７】
2004508018.tif 000054
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素の構造上の特徴を示す。
【図２】
図２Ａは、Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ由来の注釈を付けられたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素アルファサブユニット遺伝子を示す。
図２Ｂは、Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ由来の注釈を付けられたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素βサブユニット遺伝子を示す。
図２Ｃは、Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ由来の注釈を付けられたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素イプシロンサブユニット遺伝子を示す。
図２Ｄは、Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ由来の注釈を付けられたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素ガンマ（ＤｎａＸ）サブユニット遺伝子を示す。
図２Ｅは、Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓ由来の注釈を付けられたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素ＳＳＢ遺伝子を示す。
【図３】
図３Ａは、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来の注釈を付けられたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素ガンマ／τ（ＤｎａＸ）遺伝子を示す。
図３Ｂは、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来の注釈を付けられたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素β遺伝子を示す。
図３Ｃは、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来の注釈を付けられたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素イプシロン遺伝子を示す。
図３Ｄは、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＤｎａＸポリメラーゼＩＩＩ，タイプＩＩの注釈を付けられたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素アルファ遺伝子を示す。
図３Ｅは、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＤｎａＸポリメラーゼＩＩＩ，タイプＩの注釈を付けられたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩホロ酵素アルファ遺伝子を示す。
図３Ｆは、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来の注釈を付けられたＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのＳＳＢ遺伝子を示す。
【図４】
図４Ａ−ＨＨＨは、完全に配列決定されたゲノムを有する生物から発見されたデルタ配列及びそれらの構造遺伝子のＤＮＡ配列（ｈｏｌＡ）を示す。
【図５】
図５Ａ−Ｇは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓ．ａｕｒｅｕｓのデルタ蛋白質及びＤＮＡ配列を示す。
【図６】
図６は、図４及び５に示す新たに同定されたデルタ蛋白質と、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの確立されたδ蛋白質配列とのアミノ酸整列化、並びにＣｌｕｓｔａｌＷ　１．８を用いて実施された整列化を示す。
【図７】
図７Ａ−Ｆは、部分的に配列決定されたゲノムから同定されたδ蛋白質及び遺伝子配列を示す。
【図８】
図８は、認識された細菌の門の全て及び各門の亜綱（ｓｕｂｃｌａｓｓ）の第１レベルのリスト、並びにデルタ配列が同定された細菌のリストを示す。
【図９】
図９は、それらのＲＮＡ配列により決定されたそれらの進化上の関係により生物を関連させることにより構築された、新規なδ蛋白質を検索する用とのために進化上関連した生物が同定されるのを可能にさせる、系統樹を示す。
【図１０】
図１０Ａ−ＢＢは、系統の研究を用いて同定された追加のδ蛋白質及びそれらの構造（ｈｏｌＡ）遺伝子を示す。
【図１１】
図１１は、標識されたＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのｈｏｌＡ遺伝子を発現するために使用される、ＰＣＲ産物「ＰＣＲ　Ａｑｕｉｆｅｘ　ＮＢデルタ」の図解描写を示す。
【図１２】
図１２は、ＰＣＲ産物「ＰＣＲ　Ａｑｕｉｆｅｘ　ＮＢデルタ」が適切な制限酵素による消化後に挿入されるｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩの領域を示す。
【図１３】
図１３は、天然のＡｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓのｈｏｌＡ遺伝子を発現させるのに使用される、ＰＣＲ産物「ＰＣＲ　Ａｑｕｉｆｅｘ天然デルタ」の図解描写を示す。
【図１４】
図１４は、ＰＣＲ産物「ＰＣＲ　Ａｑｕｉｆｅｘ天然デルタ」が適切な制限酵素による消化後に挿入されるｐＡ１−ＮＢ−ＫｐｎＩの領域を示す。
【図１５】
図１５は、標識されたＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのｈｏｌＡ遺伝子を発現するために使用される、ＰＣＲ産物「ＰＣＲ　ＮＢ　Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　Ｄ」の図解描写を示す。
【図１６】
図１６は、標識されたＴｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａのｈｏｌＡ遺伝子を発現するために使用される、ＰＣＲ産物「ＰＣＲ天然Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　Ｄ」の図解描写を示す。
【図１７】
図１７は、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて整列化した３つのｄｎａＸ様Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａを示す。
【図１８】
図１８は、標識されたＡｑｕｉｆｅｘのｈｏｌＢ遺伝子を発現するために使用されるＰＣＲ産物「ＰＣＲ　ＡＱ　ＮＢデルタ」の図解描写を示す。
【図１９】
図１９は、適切な制限酵素による続く消化にＰＣＲ産物「ＰＣＲ　ＡＱ　ＮＢデルタ」が挿入されるｐＡ１−ＮＢ−Ａｖｒ２の領域を示す。
【図２０】
図２０は、未標識形態にてＡｑｕｉｆｅｘのδ’サブユニットを発現するのに使用される、ＰＣＲ産物「天然Ａｑｕｉｆｅｘ　のＰＣＲ」の図解描写を示す。
【図２１】
図２１は、標識されたＴ．ｍａｒｉｔｉｍａのＴＭ０５０８遺伝子を発現するために使用されるＰＣＲ産物「ＰＣＲ　ＴＭ　ＮＢ　Ｄ’（０５０８）」の図解描写を示す。
【図２２】
図２２は、天然のＴ．ｍａｒｉｔｉｍａのＴＭ０５０８遺伝子を発現するために使用されるＰＣＲ産物「ＰＣＲ　ＴＭ天然Ｄ’（０５０８）」の図解描写を示す。
【図２３】
図２３は、適切な制限酵素による続く消化に「ＰＣＲ　ＴＭ天然Ｄ’（０５０８）」が挿入されるｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩの領域を示す。
【図２４】
図２４は、ＲＣａＩ消化された制限部位をｐＡ１−ＣＢ−ＮｃｏＩのＮｃｏＩ制限部位にスプライスした部位を含むｐＡ１−ＴＭ［０５０８］の領域を示す。
【図２５】
図２５は、標識されたＴ．ｍａｒｉｔｉｍａの蛋白質ＴＭ０７７１の発現のために使用されるＰＣＲ産物「ＰＣＲ　ＴＭ　ＮＢ　Ｄ’０７７１」の図解描写をを示す。
【図２６】
図２６は、天然Ｔ．ｍａｒｉｔｉｍａの蛋白質ＴＭ０７７１の発現のために使用されるＰＣＲ産物「ＰＣＲ　ＴＭ天然Ｄ’（０７７１）」の図解描写をを示す。
【図２】
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【図３】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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