(57)【要約】本発明は、変化した生物学的持続性を有する改変神経毒を開示する。１つの態様において、改変神経毒は、ボツリヌス菌毒素から誘導される。このような改変神経毒は、種々の状態（筋肉障害、多汗症および痛みを含むが、これらに限定はされない）の治療に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造改変を含む神経毒からなる改変神経毒であって、該構造改変が、構造改変を含まない同一の神経毒と比較して、改変神経毒の生物学的持続性を変化させるのに効果的なものであり、該改変神経毒が、天然の神経毒とは構造的に異なるものである改変神経毒。
【請求項２】
構造改変が、既に天然に存在する部位に加えて、１またはそれ以上の二次改変部位の存在を含む請求項１に記載の改変神経毒。
【請求項３】
二次改変部位が、Ｎ−グリコシル化、カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ−２）ホスホリル化、Ｎ−末端ミリスチル化、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ホスホリル化およびチロシンホスホリル化部位からなる群から選択される一員である請求項２に記載の改変神経毒。
【請求項４】
構造改変が、１またはそれ以上の二次改変部位の不存在を含む請求項１に記載の改変神経毒。
【請求項５】
二次改変部位が、Ｎ−グリコシル化、カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ−２）ホスホリル化、Ｎ−末端ミリスチル化、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ホスホリル化およびチロシンホスホリル化部位からなる群から選択される一員である請求項４に記載の改変神経毒。
【請求項６】
構造改変が、構造改変を含まない同一の神経毒と比較して、改変神経毒の生物学的持続性を増加させるのに効果的なものである請求項１に記載の改変神経毒。
【請求項７】
構造改変が、構造改変を含まない同一の神経毒と比較して、改変神経毒の生物学的持続性を減少させるのに効果的なものである請求項１に記載の改変神経毒。
【請求項８】
改変神経毒の製造方法であって、構造改変を含む神経毒の暗号を有するオリゴヌクレオチドからポリペプチドを製造する工程を含んでなり、該構造改変が、構造改変を含まない同一の神経毒と比較して、改変神経毒の生物学的持続性を変化させるのに効果的なものであり、該改変神経毒が、天然の神経毒とは構造的に異なるものである方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、改変神経毒、特に改変クロストリジウム神経毒、ならびに、神経筋障害、自律神経系障害および痛みを含む種々の障害を治療するための該神経毒の使用に関する。
【０００２】
（背景技術）
ボツリヌス毒素血清型Ａ（以下において「ＢｏＮＴ／Ａ」と称する；クロストリジウム神経毒の血清型）の臨床使用は、最新医学において最も劇的に役割逆転したものの１つである。即ち、強力な生物学的毒素が治療剤に転換されている。ＢｏＮＴ／Ａは、筋肉機能亢進、自律神経系機能亢進および／または痛みを特徴とする多種多様の障害および状態の治療において、多用途の手段となっている。
【０００３】
ボツリヌス毒素
嫌気性のグラム陽性細菌であるボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）は、強力なポリペプチド神経毒（ボツリヌス毒素）を産生し、該毒素は、ヒトおよび動物において、ボツリヌス中毒と称される神経麻痺性疾患の原因となる。ボツリヌス菌の胞子は、土壌中に見い出され、原産地の缶詰工場で適切に滅菌されずに密閉された食品容器において増殖することができ、多くのボツリヌス中毒の原因となる。通常、ボツリヌス中毒の作用は、ボツリヌス菌の培養物または胞子に感染した食品を食べて１８〜３６時間後に現れる。ボツリヌス毒素は、弱毒化せずに腸管を通過し、末梢運動神経を攻撃しうると考えられる。ボツリヌス毒素中毒の症状は、歩行困難、嚥下困難および会話困難から、呼吸筋の麻痺および死へと進行することができる。
【０００４】
ＢｏＮＴ／Ａは、ヒトに対して知られている最も致死性の高い天然生物剤である。約５０ピコグラム（ｐｇ）のボツリヌス毒素（精製された神経毒複合体）血清型Ａが、マウスにおけるＬＤ５０である。ボツリヌス毒素の１単位（Ｕ）は、それぞれ体重１８〜２０ｇの雌性Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒマウスに腹腔内注射したときのＬＤ５０と定義される。７種類の免疫学的に異なるボツリヌス神経毒が特性化されている。これらは、それぞれボツリヌス神経毒の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧであり、これらのそれぞれは血清型特異的な抗体による中和によって識別される。ボツリヌス毒素の種々の血清型は、それらが作用する動物種において、ならびに、それらが誘発する麻痺の重度および期間において異なる。例えば、ＢｏＮＴ／Ａは、ラットにおいて生じる麻痺の等級によって評価したときに、ボツリヌス毒素血清型Ｂ（ＢｏＮＴ／Ｂ）よりも５００倍強力である。さらに、ＢｏＮＴ／Ｂは、ＢｏＮＴ／Ａの霊長類ＬＤ５０の約１２倍の４８０Ｕ／ｋｇの投与量において、霊長類に非毒性であることが測定されている。ボツリヌス毒素は、高親和力でコリン作動性運動ニューロンと結合し、ニューロンに転位し、アセチルコリンの放出をブロックすると考えられる。
【０００５】
ボツリヌス毒素は、機能亢進骨格筋を特徴とする神経筋障害の治療の臨床設定（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｅｔｔｉｎｇｓ）において使用されている。ＢｏＮＴ／Ａは、眼瞼痙攣、斜視および片側顔面痙攣の治療に関して、米国食品医薬局（Ｕ．Ｓ． Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって承認されている。血清型Ａではないボツリヌス毒素血清型は、ＢｏＮＴ／Ａと比較して、より低い効力および／またはより短い活性期間を有すると考えられる。末梢筋肉内ＢｏＮＴ／Ａの臨床作用は、通常、注射の１週間以内に見られる。ＢｏＮＴ／Ａの１回の筋肉内注射による症状軽減の通常の期間は、平均で約３ヶ月である。
【０００６】
全てのボツリヌス毒素血清型が、神経筋連結点における神経伝達物質アセチルコリンの放出を抑制すると考えられるが、これらは、異なる神経分泌タンパク質に影響を及ぼすことによって、および／または、これらのタンパク質を異なる部位において切断することによって、そのように抑制する。例えば、ボツリヌス血清型ＡおよびＥの両方は、２５キロダルトン（ｋＤ）のシナプトソーム関連タンパク質（ＳＮＡＰ−２５）を切断するが、これらは該タンパク質中の異なるアミノ酸配列を標的とする。ＢｏＮＴ／Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧは、小胞関連タンパク質（ＶＡＭＰ、シナプトブレビンとも称される）に作用するが、それぞれの血清型は該タンパク質を異なる部位において切断する。最後に、ボツリヌス毒素血清型Ｃ１（ＢｏＮＴ／Ｃ１）は、シンタキシン（ｓｙｎｔａｘｉｎ）およびＳＮＡＰ−２５の両方を切断することが知られている。これらの作用メカニズムの相違は、種々のボツリヌス毒素血清型の相対効力および／または作用期間に影響を与えることができる。
【０００７】
血清型に関係なく、毒素中毒の分子メカニズムは類似しており、少なくとも３つの工程または段階を含むと考えられる。過程の第１工程において、毒素は、標的ニューロンのシナプス前膜に、Ｈ鎖と細胞表面受容体との特異的相互作用によって結合する。受容体は、ボツリヌス毒素の各血清型および破傷風毒素で異なると考えられる。Ｈ鎖のカルボキシル末端セグメント（ＨＣ）は、毒素を細胞表面に指向させるのに重要であると考えられる。
【０００８】
第２工程において、毒素は、毒を与えられた細胞の形質膜を横切る。毒素は、初めに、受容体媒介エンドサイトーシスにより細胞によって呑み込まれ、毒素を含有するエンドソームが形成される。次に、毒素は、エンドソームから出て、細胞形質に入る。この工程は、約５．５またはそれ以下のｐＨに反応して毒素のコンフォメーション変化を誘発するＨ鎖のアミノ末端セグメント（ＨＮ）によって媒介されると考えられる。エンドソームは、エンドソーム内ｐＨを低下させるプロトンポンプを有することが既知である。コンフォメーションのシフトは、毒素中の疎水性残基を露出させ、これが、毒素のエンドソーム膜中への埋込みを可能にする。次に、毒素は、エンドソーム膜を通って細胞質中に転位する。
【０００９】
ボツリヌス毒素活性のメカニズムの最終工程は、Ｈ鎖およびＬ鎖を結合するジスルフィド結合の減少を含むと考えられる。ボツリヌス毒素および破傷風毒素の全体の毒素活性は、ホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）のＬ鎖に含まれる。このＬ鎖は亜鉛（Ｚｎ＋＋）エンドペプチダーゼであり、これは、神経伝達物質を含有する小胞の認識および形質膜の細胞質表面とのドッキング、ならびに、小胞と形質膜との融合に必須であるタンパク質を選択的に切断する。破傷風神経毒、ボツリヌス毒素Ｂ、Ｄ、ＦおよびＧ型は、シナプトソーム膜タンパク質であるシナプトブレビン［小胞関連膜タンパク質（ＶＡＭＰ）とも称される］の分解を引き起こす。シナプス小胞の細胞質表面に存在する大部分のＶＡＭＰは、これらの切断現象のいずれかの結果として除去される。それぞれの毒素は、異なる結合を特異的に切断する。
【００１０】
ボツリヌス毒素タンパク質分子の分子量は、７種類の全ての既知ボツリヌス毒素血清型について、約１５０ｋＤである。興味深いことに、ボツリヌス毒素は、１５０ｋＤのボツリヌス毒素タンパク質分子を関連の非毒素タンパク質と共に含んでなる複合体として、クロストリジウム属細菌により放出される。即ち、ＢｏＮＴ／Ａ複合体は、９００ｋＤ、５００ｋＤおよび３００ｋＤの形態で、クロストリジウム属細菌によって産生される。ＢｏＮＴ／ＢおよびＣ１は、５００ｋＤ複合体としてのみ産生されるようである。ＢｏＮＴ／Ｄは、３００ｋＤおよび５００ｋＤ複合体として産生される。最後に、ＢｏＮＴ／ＥおよびＦは、約３００ｋＤ複合体としてのみ産生される。複合体（即ち、約１５０ｋＤより大きい分子量）は、非毒素の血球凝集素タンパク質ならびに非毒素および非毒性の非血球凝集素タンパク質を含有すると考えられる。これら２つの非毒素タンパク質（ボツリヌス毒素分子と共に、関連の神経毒複合体を構成する）は、変性に対する安定性をボツリヌス毒素分子に与え、毒素が摂取されたときに消化酸（ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ ａｃｉｄ）に対する保護を与えるように作用しうる。さらに、大きい（約１５０ｋＤ分子量より大きい）ボツリヌス毒素複合体は、ボツリヌス毒素複合体の筋肉内注射部位からの、ボツリヌス毒素の比較的遅い拡散速度を与えることができる。
【００１１】
インビトロ試験は、ボツリヌス毒素が、脳幹組織の一次細胞培養物からのアセチルコリンおよびノルエピネフリンの両方の、カリウム陽イオン誘発放出を抑制することを示した。さらに、ボツリヌス毒素が、脊髄ニューロンの一次培養物におけるグリシンおよびグルタメートの両方の誘発放出を抑制すること、ならびに、脳シナプトソーム調製物において、ボツリヌス毒素が、神経伝達物質アセチルコリン、ドパミン、ノルエピネフリン、ＣＧＲＰおよびグルタメートのそれぞれの放出を抑制することも報告されている。
【００１２】
ＢｏＮＴ／Ａは、既知の方法に従って、発酵槽においてボツリヌス菌の培養物を樹立および増殖させ、次に、発酵混合物を収穫および精製することによって得られる。全てのボツリヌス毒素血清型は、初めに、不活性な一本鎖タンパク質として合成され、これがプロテアーゼによって切断されるかまたはニックが入って神経活性になる。ボツリヌス毒素の血清型ＡおよびＧを産生する細菌株は内因性プロテアーゼを有しており、従って、血清型ＡおよびＧは、主にその活性形態で細菌培養物から回収することができる。これに対して、ボツリヌス毒素の血清型Ｃ１、ＤおよびＥは、非タンパク質分解菌株によって合成され、従って、培養物から回収したときには活性化されていないのが普通である。血清型ＢおよびＦは、タンパク質分解菌株および非タンパク質分解菌株の両方によって産生され、従って、活性または不活性のどちらかの形態で回収することができる。しかし、例えばＢｏＮＴ／Ｂ血清型を産生するタンパク質分解菌株であっても、該菌株は、産生された毒素の一部を切断するにすぎない。ニック入り分子と非ニック入り分子の正確な比率は、培養時間および培養温度に依存する。従って、例えばＢｏＮＴ／Ｂ毒素のいずれかの調製物のある一定割合は不活性である可能性があり、これが、ＢｏＮＴ／Ａと比較したときのＢｏＮＴ／Ｂの既知の有意に低い効力を説明すると考えられる。臨床調製物における不活性ボツリヌス毒素分子の存在は、臨床効果に寄与せずに、調製物の全体のタンパク質負荷に寄与し、抗原性の増加につながる。さらに、ＢｏＮＴ／Ｂは、筋肉内注射したときに、同じ用量レベルのＢｏＮＴ／Ａより短い活性期間を有し、低い有効性であることも知られている。
【００１３】
ＢｏＮＴ／Ａは、下記の臨床設定において使用されることが報告されている：
（１）頸部ジストニーの治療のために、筋肉内注射（複数筋肉）あたり、約７５〜１２５単位のＢＯＴＯＸＲ（この登録商標のもとで、Ａｌｌｅｒｇａｎ，Ｉｎｃ．，Ｉｒｖｉｎｅ，カリフォルニアから市販されている）；
（２）眉間線（前頭溝）の治療のために、筋肉内注射あたり、５〜１０単位のＢＯＴＯＸＲ（５単位を鼻根筋に注射し、１０単位を各皺眉筋に注射する）；
（３）恥骨直腸筋の括約筋内注射による便秘の治療のために、約３０〜８０単位のＢＯＴＯＸＲ；
（４）上眼瞼の外側瞼板前部の眼輪筋および下眼瞼の外側瞼板前部の眼輪筋への注射による眼瞼痙攣の治療のために、筋肉あたり約１〜５単位のＢＯＴＯＸＲの筋肉内注射；
（５）斜視の治療のために、約１〜５単位のＢＯＴＯＸＲを外眼筋に注射する：注射される量は、注射される筋肉の大きさおよび所望の筋肉麻痺の程度（即ち、所望のジオプトリ矯正量）に依存して変化する；
（６）脳卒中後の上肢痙性の治療のために、下記の５種類の異なる上肢屈筋にＢＯＴＯＸＲを筋肉内注射する：
（ａ）深指屈筋：７．５〜３０Ｕ
（ｂ）浅指屈筋：７．５〜３０Ｕ
（ｃ）尺側手根屈筋：１０〜４０Ｕ
（ｄ）橈側手根屈筋：１５〜６０Ｕ
（ｅ）上腕二頭筋：５０〜２００Ｕ
上記の５種類の筋肉のそれぞれに同じ治療期間において注射し、それにより、各治療期間において９０〜３６０Ｕの上肢屈筋ＢＯＴＯＸＲを患者に筋肉内注射投与する。
【００１４】
種々の臨床状態の治療におけるＢｏＮＴ／Ａの成功は、他のボツリヌス毒素血清型への関心を高めた。市販されている２種類のＢｏＮＴ／Ａ調製物［ＢＯＴＯＸＲおよびＤｙｓｐｏｒｔＲ］、ならびに、ＢｏＮＴ／ＢおよびＦの調製物（両方とも和光化学、日本から得られる）について試験を行って、局所筋肉虚弱化効力、安全性および抗原潜在性を評価した。ボツリヌス毒素調製物を右腓腹筋の上部に注射し（０．５〜２００．０単位／ｋｇ）、筋肉虚弱を、マウス指外転評価アッセイ（ＤＡＳ）を使用して評価した。ＥＤ５０値を用量反応曲線から計算した。別のマウスに筋肉内注射を行って、ＬＤ５０用量を測定した。治療指数を、ＬＤ５０／ＥＤ５０として計算した。マウスの別のグループに、ＢＯＴＯＸＲ（５．０〜１０．０単位／ｋｇ）またはＢｏＮＴ／Ｂ（５０．０〜４００．０単位／ｋｇ）を後脚に注射し、筋肉虚弱および水消費の増加について試験した（この後者は乾燥した口の推定モデルである）。１ヶ月に１回ウサギに筋肉内注射することによって（１．５または６．５ｎｇ／ｋｇのＢｏＮＴ／Ｂまたは０．１５ｎｇ／ｋｇのＢＯＴＯＸＲ）、抗原潜在性を評価した。ピーク筋肉虚弱および期間は、全ての血清型において用量に相関していた。ＤＡＳ ＥＤ５０値（単位／ｋｇ）は次の通りであった：ＢＯＴＯＸＲ：６．７、ＤｙｓｐｏｒｔＲ：２４．７、ＢｏＮＴ／Ｂ：２７．０〜２４４．０、ＢｏＮＴ／Ｆ：４．３。ＢＯＴＯＸＲは、ＢｏＮＴ／ＢまたはＢｏＮＴ／Ｆより長い作用期間を有していた。治療指数値は以下の通りであった：ＢＯＴＯＸＲ：１０．５、ＤｙｓｐｏｒｔＲ：６．３、ＢｏＮＴ／Ｂ：３．２。水消費は、ＢｏＮＴ／Ｂを注射したマウスは、ＢＯＴＯＸＲを注射したマウスより多かったが、ＢｏＮＴ／Ｂは、筋肉の虚弱化において低い有効性であった。注射から４ヶ月後に、４匹中２匹のウサギ（１．５ｎｇ／ｋｇで処置）および４匹中４匹のウサギ（６．５ｎｇ／ｋｇで処置）は、ＢｏＮＴ／Ｂに対して抗体を発生させた。別の試験において、ＢＯＴＯＸＲで処理したウサギの９匹中０匹が、ＢｏＮＴ／Ａに対して抗体を示した。ＤＡＳの結果は、ＢｏＮＴ／Ａの相対ピーク効力は、ＢｏＮＴ／Ｆに等しく、ＢｏＮＴ／Ｆは、ＢｏＮＴ／Ｂより高いことを示している。作用期間については、ＢｏＮＴ／ＡはＢｏＮＴ／Ｂより長く、ＢｏＮＴ／Ｂの作用期間はＢｏＮＴ／Ｆより長かった。治療指数値によって示されるように、ＢｏＮＴ／Ａの２種類の市販調製物（ＢＯＴＯＸＲおよびＤｙｓｐｏｒｔＲ）は異なっている。ＢｏＮＴ／Ｂの後脚注射後に観察される水消費挙動の増加は、臨床的に有意な量のこの血清型がマウスの全身循環に入ったことを示している。また、この結果は、ＢｏＮＴ／Ａと同等の有効性を得るためには、試験した他の血清型の用量を増加させる必要があることをも示している。用量増加は、安全性を損なうことがある。さらに、ウサギにおいて血清型ＢはＢＯＴＯＸＲより抗原性が高いが、その理由は、ＢｏＮＴ／Ｂの有効用量を得るために、より高いタンパク質負荷量が注射されたためと考えられる。
【００１５】
破傷風神経毒は、主に中枢神経系において作用するが、ボツリヌス神経毒は神経筋連結点において作用する。両方の神経毒は、影響を受けたニューロンの軸索からシナプスへのアセチルコリン放出を抑制することによって作用し、麻痺を導く。影響を受けたニューロンにおける中毒作用は長く続き、最近まで不可逆性であると考えられていた。破傷風神経毒は、１つの免疫学的に異なる血清型中に存在することが知られている。
【００１６】
アセチルコリン
一般に、単一型の小分子神経伝達物質だけが、各型のニューロンにより、哺乳動物神経系に放出される。神経伝達物質アセチルコリンは、脳の多くの領域のニューロンによって分泌されるが、特に、運動皮質の大錐体細胞、脳幹神経節の数種類の異なるニューロン、骨格筋を神経支配する運動ニューロン、自律神経系（交感神経および副交感神経の両方）の節前ニューロン、副交感神経系の節後ニューロン、ならびに、交感神経系の一部の節後ニューロンによって分泌される。本質的に、汗腺、立毛筋および少数の血管への節後交感神経線維だけがコリン作動性であり、交感神経系の大部分の節後ニューロンは、神経伝達物質ノルエピネフィンを分泌する。ほとんどの場合に、アセチルコリンは興奮作用を有する。しかし、アセチルコリンは、一部の末梢副交感神経終末において、迷走神経による心拍数の抑制のような抑制作用を有することが知られている。
【００１７】
自律神経系の遠心性信号は、交感神経系または副交感神経系によって身体に伝達される。交感神経系の節前ニューロンは、脊髄の中間外側角に位置する節前交感神経ニューロン細胞体から伸びる。細胞体から伸びる節前交感神経線維は、脊椎傍交感神経節または脊椎前神経節に位置する節後ニューロンとシナプス形成する。交感神経系および副交感神経系の両方の節前ニューロンは、コリン作動性であるので、神経節へのアセチルコリンの適用は、交感神経および副交感神経の節後ニューロンの両方を興奮させる。
【００１８】
アセチルコリンは、２種類の受容体、即ちムスカリン性およびニコチン性受容体を活性化させる。ムスカリン性受容体は、副交換神経系の節後ニューロンによって刺激される全ての効果細胞、ならびに、交感神経系の節後コリン作動性ニューロンによって刺激される効果細胞において見い出される。ニコチン性受容体は、交感神経系および副交感神経系の両方の節前ニューロンと節後ニューロンの間のシナプスにおいて見い出される。ニコチン性受容体は、神経筋連結点における骨格筋線維の多くの膜にも存在する。
【００１９】
アセチルコリンは、小さい透明な細胞内小胞が、シナプス前ニューロン細胞膜と融合したときに、コリン作動性ニューロンから放出される。多種多様の非ニューロン分泌細胞、例えば、副腎随質（ならびにＰＣ１２セルライン）およびランゲルハンス島細胞は、それぞれカテコールアミンおよびインスリンを、大きい濃染芯小胞（ｌａｒｇｅ ｄｅｎｓｅ−ｃｏｒｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）から放出する。ＰＣ１２セルラインは、交感神経副腎発生の研究用の組織培養モデルとして広く使用されているラット褐色細胞腫細胞のクローンである。ボツリヌス毒素は、インビトロで、脱神経細胞への毒素の直接注射によって、または透過性化（エレクトロポレーションによるなど）した両種類の細胞からの両種類の化合物の放出を抑制する。ボツリヌス毒素は、皮質シナプトソーム細胞培養物からの神経伝達物質グルタメートの放出をブロックすることも知られている。
【００２０】
Ｓａｎｄｅｒｓら（米国特許Ｎｏ．５，７６６，６０５）は、ＢｏＮＴ／Ａを用いて、自律神経系の障害、例えば、鼻漏、中耳炎、過剰唾液分泌、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、過剰胃酸分泌、痙性大腸炎および過剰発汗を治療しうることを開示している。
【００２１】
また、Ｂｉｎｄｅｒ（米国特許Ｎｏ．５，７１４，４６８）は、ＢｏＮＴ／Ａを用いて、筋痙攣、血管障害、神経痛および神経障害に付随する片頭痛を治療しうることを開示している。さらに、Ｋｅｉら（米国特許Ｎｏ．６，１１３，９１５）は、ＢｏＮＴ（例えばＢｏＮＴ／Ａ）を用いて、痛み（例えば、神経障害性または炎症性の痛み）を治療しうることを開示している。Ｓａｎｄｅｒｓら、ＢｉｎｄｅｒおよびＫｅｉらの開示は、その全体が本明細書の一部を構成する。
【００２２】
臨床使用のために、ＢｏＮＴ／Ａが他の血清型（例えば、血清型Ｂ、Ｃ１、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ）以上に選択される理由の１つは、ＢｏＮＴ／Ａが相当に長く持続する治療効果を有していることである。換言すると、ＢｏＮＴ／Ａの抑制作用は、比較的持続性が高い。即ち、ボツリヌス毒素の他の血清型は、それらの生物学的持続性を高めることができたときに、臨床環境において有効に使用される可能性がある。例えば、耳下腺性の唾液腺腫瘤は、患者が過剰唾液分泌を有している状態である。Ｓａｎｄｅｒｓらは、その特許において、血清型Ｄが過剰唾液分泌を低下させるのに極めて有効でありうることを開示している。しかし、血清型Ｄボツリヌス毒素の生物学的持続性は、比較的短く、従って臨床使用のためには実際的ではない。血清型Ｄの生物学的持続性を高めることができたなら、それを、例えば耳下腺性の唾液腺腫瘤を治療するために、臨床環境において有効に使用することができる。
【００２３】
ＢｏＮＴ／Ａが臨床使用に好ましい神経毒である別の理由は、上記のように、弛緩性麻痺により筋肉を動かなくするこの神経毒の優れた能力である。例えば、腱手術後に筋肉を動かなくし、肢の動きを妨げるために、ＢｏＮＴ／Ａを好ましく使用して、回復を容易にする。しかし、一部の少数の腱手術においては、治癒時間は比較的短い。このような状況下で使用するためには、患者が手術からの回復とほぼ同時に移動性を回復しうるように、長い持続性を持たないＢｏＮＴ／Ａを持っておくのが有利であろう。
【００２４】
現在のところ、種々のボツリヌス毒素の間の持続性の相違の基礎はわかっていない。しかし、これら毒素の持続性の相違を説明する２つの主な理論が存在する。作用メカニズムまたはオペレーションのいずれの理論にも拘束されることを望むものではないが、これらの理論を、以下において簡単に説明する。第１の理論は、毒素の持続性が、どの標的タンパク質を毒素が攻撃するか、ならびに、該標的タンパク質のどこを毒素が攻撃するかに依存することを提案するものである［Ｒａｃｉｂｏｒｓｋａら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍｃｏｌ． ７７： ６７９−６８８ （１９９９）］。例えば、ＳＮＡＰ−２５およびＶＡＭＰは、小胞のドッキング（小胞のエキソサイトーシスに必要な工程）に必要なタンパク質である。ＢｏＮＴ／Ａは標的タンパク質ＳＮＡＰ−２５を切断し、ＢｏＮＴ／Ｂは標的タンパク質ＶＡＭＰを切断する。それぞれの効果は、各タンパク質の切断が、エキソサイトーシスにより神経伝達物質を放出するニューロンの能力を損なうという点では類似している。しかし、損傷したＶＡＭＰは、損傷したＳＮＡＰ−２５よりも容易に新しいものに置換される（例えば、置換合成による）。即ち、細胞が新しいＳＮＡＰ−２５タンパク質を合成して、損傷したものと置換するのにより長い時間を要するので、ＢｏＮＴ／Ａの方が長い持続性を有する（同文献の第６８５頁）。
【００２５】
さらに、毒素によって切断される部位が、損傷した標的タンパク質をいかに迅速に置換しうるかを指令する。例えば、ＢｏＮＴ／ＡおよびＥの両方はＳＮＡＰ−２５を切断する。しかし、これらは異なる部位において切断し、ＢｏＮＴ／Ｅは、ＢｏＮＴ／Ａと比較して、より短い持続性の麻痺を患者に引き起こす（同文献の第６８５−６頁）。
【００２６】
第２の理論は、毒素の特定の持続性が、その特定の細胞内半減期または安定性に依存する（即ち、毒素の細胞内での利用が長くなるほど、その作用が長くなる）ことを提案するものである［Ｋｅｌｌｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４５６： １３７−４２ （１９９９）］。多くの因子が毒素の細胞内安定性に寄与するが、基本的には、毒素を分解する細胞内プロテアーゼの代謝作用に耐えることができればできるほど、毒素がより安定になる［Ｅｒｄａｌら、Ｎａｕｎｙｎｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３５１： ６７−７８ （１９９５）］。
【００２７】
一般的に、細胞内プロテアーゼの代謝作用に耐える分子の能力は、その構造に依存するであろう。例えば、分子の一次構造には、特有の一次配列が含まれ、これが、分子のプロテアーゼによる分解しやすさまたは分解しにくさの原因となるであろう。例えば、Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ Ａ．は、ある種のアミノ酸を末端とするポリペプチドが、分解性プロテアーゼの影響をより受けやすいと記載している［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３： １２１４２−１２１４９ （１９９６）］。
【００２８】
さらに、細胞内酵素が、分子（例えばポリペプチド）を、例えばＮ−グリコシル化、ホスホリル化などによって改変することが知られており、この種の改変を、本明細書においては「二次改変」と称する。「二次改変」は、内因性分子（例えばポリペプチド）がＲＮＡから翻訳された後の該分子の改変を指すことが多い。しかし、本明細書中で使用するときには、「二次改変」は、外因性分子を改変する酵素（例えば細胞内酵素）の能力をも指すであろう。例えば、患者に外因性分子（例えば薬物）を投与した後に、これらの分子は、患者の酵素（例えば細胞内酵素）の作用によって二次改変を受けるであろう。
【００２９】
分子（例えばポリペプチド）のある種の二次改変は、分解性プロテアーゼの作用を妨げるかまたは促進するであろう。これらの二次改変は、特に、（１）分子に直接的に作用する分解性プロテアーゼの能力に影響を及ぼし、そして／または、（２）これらの分解性プロテアーゼから保護されるように小胞中に隔離される分子の能力に影響を及ぼすであろう。
【００３０】
種々のボツリヌス毒素血清型の効力を有するが、変化した生物学的持続性を有する改変神経毒、ならびに、該毒素の製造方法が必要とされていた。
【００３１】
（発明の開示）
本発明は、上記の必要性を満たすものであり、変化した生物学的持続性を有する改変神経毒ならびに該毒素の製造方法を提供するものである。
【００３２】
いずれかの作用理論または作用メカニズムに限定されることを望むものではないが、ボツリヌス毒素は、その生物学的持続性を決定するであろう二次改変部位を有すると考えられる。本明細書において使用する「二次改変部位」とは、部位の改変（例えば、ホスホリル化、グリコシル化など）に影響を及ぼすように、酵素（例えば細胞内酵素）によって標的とされる、分子（例えば、特定のフラグメントまたはポリペプチド）上の位置を意味する。この二次改変（例えばホスホリル化）は、毒素に対する分解性プロテアーゼの作用を妨げるかまたは促進するように働き、次いでこれが毒素の持続性または安定性をそれぞれ増加または減少させる。また、これらの二次改変部位は、毒素が、分解性プロテアーゼから保護されるように小胞中に輸送されるのを妨げるかまたは促進するであろうと考えられる。さらに、この二次改変の役割の１つは、例えば分子と分解性プロテアーゼの間または分子と小胞トランスポーターの間のタンパク質相互作用に必要な３次元的および／または化学的要件を付加または除去することであると考えられる。
【００３３】
従って、構造改変を含む改変神経毒は、構造改変を含まない同一の神経毒と比較して、変化した持続性を有するであろう。構造改変には、少なくとも１つの改変部位の部分的または完全な欠失または突然変異が含まれるであろう。また、構造改変には、ある種の改変部位の付加が含まれるであろう。１つの態様においては、変化した持続性は、生物学的持続性の増強である。別の態様においては、変化した持続性は、生物学的持続性の減少である。好ましくは、変化した持続性は、改変神経毒の安定性の変化によって影響を受ける。
【００３４】
例えば、ＢｏＮＴ／Ａの軽鎖は、種々の二次改変部位（以下においては、「改変部位」と称する）のためのアミノ酸フラグメントを有する。これら部位には、Ｎ−グリコシル化、カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ−２）ホスホリル化、Ｎ−末端ミリスチル化、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）ホスホリル化およびチロシンホスホリル化部位が含まれるが、これらに限定はされない。ＢｏＮＴ／Ｅも、これら種々の二次改変部位を有する。構造改変には、１またはそれ以上のこれら二次改変部位の欠失または突然変異が含まれる。また、構造改変には、神経毒に１またはそれ以上の改変部位を付加して改変神経毒を形成させることが含まれる。
【００３５】
また、本発明は、改変神経毒の製造方法を提供するものである。さらに、本発明は、生物学的障害を治療するために改変神経毒を使用する方法を提供するものである。
【００３６】
（発明を実施するための最良の形態）
定義
本発明の説明を進める前に、以下に定義を挙げ、これを本明細書において適用する。
【００３７】
「重鎖」は、クロストリジウム神経毒の重鎖を意味する。これは、好ましくは約１００ｋＤの分子量を持ち、本明細書においては、これをＨ鎖またはＨと称することもある。
【００３８】
「ＨＮ」は、Ｈ鎖のアミノ末端セグメントにほぼ等しいクロストリジウム神経毒Ｈ鎖由来のフラグメント（好ましくは約５０ｋＤの分子量を有する）、または無傷のＨ鎖中の該フラグメントに相当する部分を意味する。これは、天然または野生型クロストリジウム神経毒のうち、細胞内エンドソーム膜を横切って起こるＬ鎖のトランスロケーションに関与する部分を含むと考えられる。
【００３９】
「ＨＣ」は、Ｈ鎖のカルボキシル末端セグメントにほぼ等しいクロストリジウム神経毒Ｈ鎖由来のフラグメント（約５０ｋＤ）、または無傷のＨ鎖中の該フラグメントに相当する部分を意味する。これは、免疫原性であると考えられ、また、天然または野生型クロストリジウム神経毒のうち、運動ニューロンへの高親和性のシナプス前結合に関与する部分を含むと考えられる。
【００４０】
「軽鎖」は、クロストリジウム神経毒の軽鎖を意味する。これは、好ましくは約５０ｋＤの分子量を持ち、Ｌ鎖、Ｌ、またはクロストリジウム神経毒のタンパク質分解ドメイン（アミノ酸配列）と称することもある。軽鎖は、それが標的細胞の細胞質中に放出されたときには、神経伝達物質放出の阻害剤として有効であると考えられる。
【００４１】
「神経毒」は、ニューロンの機能に干渉しうる分子を意味する。「神経毒」は天然物または人工物であってよい。
【００４２】
「改変神経毒」は、構造改変を含む神経毒を意味する。換言すると、「改変神経毒」は、構造改変によって改変されている神経毒である。構造改変は、改変神経毒が調製される元の神経毒と比較して、改変神経毒の生物学的持続性（好ましくは生物学的半減期）を変化させる。改変神経毒は、天然の神経毒とは構造的に異なる。
【００４３】
「構造改変」は、神経毒に対する物理的変化を意味し、これは、例えば神経毒に１またはそれ以上のアミノ酸を共有融合させることにより行うことができる。また、「構造改変」は、神経毒からの１またはそれ以上のアミノ酸の欠失を意味する。さらに、「構造改変」は、構造改変を含まない同一の神経毒とは物理的または化学的に異なるようにする、神経毒に対するあらゆる変化を意味することもある。
【００４４】
「生物学的持続性」は、神経毒または改変神経毒がニューロン機能への干渉を引き起こす時間、例えば、神経毒または改変神経毒が神経末端からのアセチルコリンの放出の実質的な抑制を引き起こす時間を意味する。
【００４５】
「生物学的半減期」は、神経毒または改変神経毒、好ましくは神経毒または改変神経毒の活性部分、例えばボツリヌス毒素の軽鎖の濃度が、哺乳動物において、好ましくは哺乳動物ニューロンにおいて、元の濃度の半分に減少する時間を意味する。
【００４６】
「改変部位」は、二次改変が起こりうる特定のアミノ酸またはアミノ酸フラグメントを意味する。また、「改変部位」は、ある種の二次改変が起こるのに必要な特定のアミノ酸または特定のアミノ酸フラグメントを意味することもある。
【００４７】
本発明は、部分的には、神経毒の生物学的持続性を、神経毒の構造改変によって変化させうるという発見に基づいている。換言すると、変化した生物学的持続性を有する改変神経毒を、構造改変を含むかまたは含有する神経毒から形成させることができる。好ましくは、構造改変の包含は、改変神経毒の生物学的半減期を変化させることができる。変化した生物学的持続性（好ましくは、変化した生物学的半減期）とは、改変神経毒の生物学的持続性（または生物学的半減期）が、構造改変を含まない同一の神経毒のものとは異なることを意味する。さらに、生物学的持続性（好ましくは生物学的半減期）を、より長くまたはより短く変化させることもできる。
【００４８】
１つの態様において、構造改変には、神経毒の改変部位の部分的または完全な欠失または突然変異を行って、改変神経毒を得ることが含まれる。この改変部位の包含は、改変神経毒の生物学的持続性を増大させることができる。好ましくは、改変部位の部分的または完全な欠失または突然変異は、改変神経毒の生物学的半減期を増大させる。より好ましくは、改変神経毒の生物学的半減期を約１０％増大させる。さらに好ましくは、改変神経毒の生物学的半減期を、約１００％増大させる。一般に、改変神経毒は、構造改変を含まない同一の神経毒よりも約２０〜３００％高い生物学的持続性を有する。即ち、例えば改変された改変部位を含む改変神経毒は、改変されていない神経毒よりも約２０〜３００％長い、神経末端からのアセチルコリン放出の実質的な抑制を引き起こすことができる。
【００４９】
１つの態様において、構造改変には、神経毒の改変部位の部分的または完全な欠失または突然変異を行って、改変神経毒を得ることが含まれる。この改変部位の包含は、改変神経毒の生物学的持続性を減少させることができる。好ましくは、改変部位の部分的または完全な欠失または突然変異は、改変神経毒の生物学的半減期を減少させる。より好ましくは、改変神経毒の生物学的半減期を約１０％減少させる。さらに好ましくは、改変神経毒の生物学的半減期を、約９９％減少させる。一般に、改変神経毒は、構造改変を含まない同一の神経毒よりも約２０〜３００％低い生物学的持続性を有する。即ち、例えば改変された改変部位を含む改変神経毒は、改変されていない神経毒よりも約２０〜３００％短い、神経末端からのアセチルコリン放出の実質的な抑制を引き起こすことができる。
【００５０】
例えば、ＢｏＮＴ／ＡおよびＢｏＮＴ／Ｅは、それぞれ以下の表１および表２に示すように、次のような潜在的な二次改変部位を有する。
【表１】
2004536778.tif 000002
【００５１】
【表２】
2004536778.tif 000003
【００５２】
１つの好ましい態様において、ＢｏＮＴ／Ａの１またはそれ以上の改変部位（例えばＮ−グリコシル化部位）を、部分的に欠失、完全に欠失、または突然変異させて、変化した生物学的持続性（好ましくは、変化した生物学的半減期）を有する改変神経毒を得る。１つの態様において、改変神経毒を、より長い生物学的持続性（好ましくは、より長い生物学的半減期）を有するように変化させる。別の態様においては、改変神経毒を、より短い生物学的持続性（好ましくは、より短い生物学的半減期）を有するように変化させる。
【００５３】
１つの好ましい態様において、ＢｏＮＴ／Ｅの１またはそれ以上の改変部位（例えばＮ−グリコシル化部位）を、部分的に欠失、完全に欠失、または突然変異させて、変化した生物学的持続性（好ましくは、変化した生物学的半減期）を有する改変神経毒を得る。１つの態様において、改変神経毒を、より長い生物学的持続性（好ましくは、より長い生物学的半減期）を有するように変化させる。別の態様においては、改変神経毒を、構造改変を含まない同一の神経毒と比較して、より短い生物学的持続性（好ましくは、より短い生物学的半減期）を有するように変化させる。
【００５４】
１つの広い態様において、改変神経毒は、改変神経毒を形成するように神経毒に融合させた追加の改変部位を含むことができる。この改変部位は、当分野で既知の任意の改変部位（表１および表２に挙げた部位を含む）であってよい。１つの態様において、このような改変部位の包含は、改変神経毒の生物学的持続性を増大させることができる。好ましくは、この改変部位は、改変神経毒の生物学的半減期を増大させる。より好ましくは、改変神経毒の生物学的半減期を約１０％増大させる。さらに好ましくは、改変神経毒の生物学的半減期を、約１００％増大させる。一般に、改変神経毒は、構造改変を含まない同一の神経毒よりも約２０〜３００％高い生物学的持続性を有する。即ち、例えば改変部位を含む改変神経毒は、改変されていない神経毒よりも約２０〜３００％長い、神経末端からのアセチルコリン放出の実質的な抑制を引き起こすことができる。追加の改変部位を有する改変神経毒の非限定的な例は、その一次構造に融合させた、カゼインキナーゼＩＩホスホリル化部位（好ましくは、ＴＤＮＥ）を有するＢｏ／Ｅである。より好ましくは、このＴＤＮＥを、ＢｏＮＴ／Ｅの７９位に、またはＢｏＮＴ／Ａの７９位に実質的に対応するＢｏＮＴ／Ｅ上の位置に融合させる。
【００５５】
１つの広い態様において、改変神経毒は、改変神経毒を形成するように神経毒に融合させた追加の改変部位を含むことができる。この改変部位は、当分野で既知の任意の改変部位（表１および表２に挙げた部位を含む）であってよい。１つの態様において、このような改変部位の包含は、改変神経毒の生物学的持続性を減少させることができる。好ましくは、この改変部位は、改変神経毒の生物学的半減期を減少させる。より好ましくは、改変神経毒の生物学的半減期を約１０％減少させる。さらに好ましくは、改変神経毒の生物学的半減期を、約９９％減少させる。一般に、改変神経毒は、構造改変を含まない同一の神経毒よりも約２０〜３００％低い生物学的持続性を有する。即ち、例えば改変部位を含む改変神経毒は、改変されていない神経毒よりも約２０〜３００％短い、神経末端からのアセチルコリン放出の実質的な抑制を引き起こすことができる。追加の改変部位を有する改変神経毒の非限定的な例は、その一次構造に融合させた、カゼインキナーゼＩＩホスホリル化部位（好ましくは、ＳＤＥＥ）を有するＢｏ／Ａである。より好ましくは、このＳＤＥＥを、ＢｏＮＴ／Ａの７６位に、またはＢｏＮＴ／Ｅの７６位に実質的に対応するＢｏＮＴ／Ａ上の位置に融合させる。
【００５６】
１つの態様において、構造改変は、改変部位の追加ならびに部分的または完全な欠失または突然変異を含むことができる。例えば、改変神経毒は、１５位のＧＶＤＩＡＹが削除され、タンパク質キナーゼＣホスホリル化のためのＳＬＫフラグメントを含むＢｏＮＴ／Ａであってよい。このＳＬＫフラグメントは、好ましくは、ＢｏＮＴ／Ａの６０位に、またはＢｏＮＴ／Ｅの６０位に実質的に対応するＢｏＮＴ／Ａ上の位置に融合させる。この態様に従う改変神経毒は、変化した生物学的持続性を有することができる。１つの態様においては、生物学的持続性が増大している。別の態様においては、生物学的持続性が減少している。好ましくは、この態様に従う改変神経毒は、変化した生物学的半減期を有することができる。１つの態様においては、生物学的半減期が増大している。別の態様においては、生物学的半減期が減少している。
【００５７】
本発明の１つの広い態様においては、改変神経毒を用いて生物学的障害を治療するための方法が提供される。この治療法は、神経筋障害、自律神経系障害および痛みの治療を包含することができる。
【００５８】
改変神経毒を用いて治療することができる神経筋の障害および状態には、例えば、斜視、眼瞼痙攣、痙性斜頸（頸部ジストニー）、口下顎ジストニーおよび痙性発声困難（喉頭ジストニー）が含まれる。
【００５９】
例えば、Ｂｏｒｏｄｉｃ（米国特許Ｎｏ．５，０５３，００５）は、ＢｏＮＴ／Ａを用いて若年性脊柱彎曲（即ち、脊柱側弯症）を治療する方法を開示している。Ｂｏｒｏｄｉｃの開示は、その全体が本明細書の一部を構成する。１つの態様において、Ｂｏｒｏｄｉｃが開示した方法と実質的に同し方法を用いて、改変神経毒を哺乳動物（好ましくはヒト）に投与して、脊柱彎曲を治療する。好ましい態様においては、Ｎ−末端ミリスチル化部位と融合させたＢｏＮＴ／Ｅを含んでなる改変神経毒を投与する。さらに好ましくは、Ｎ−末端ミリスチル化部位を、ＢｏＮＴ／Ｅの軽鎖の１５位に、またはＢｏＮＴ／Ａの軽鎖の１５位に実質的に対応する位置に融合させたＢｏＮＴ／Ｅを含んでなる改変神経毒を、哺乳動物（好ましくはヒト）に投与して、脊柱彎曲を治療する。ＢｏＮＴ／Ａを用いて普通に行われている周知の方法を用いて、改変神経毒を投与することにより、他の神経筋障害を治療することができる。
【００６０】
自律神経系障害を、改変神経毒を用いて治療することもできる。例えば、腺機能不全は自律神経系障害である。腺機能不全には、過剰発汗および過剰唾液分泌が含まれる。呼吸機能不全は、自律神経系障害の別の例である。呼吸機能不全には、慢性閉塞性肺疾患および喘息が含まれる。Ｓａｎｄｅｒｓらは、天然のボツリヌス毒素を用いて、自律神経系障害（例えば、過剰発汗、過剰唾液分泌、喘息など）を治療する方法を開示している。Ｓａｎｄｅｒらの開示は、その全体が本明細書の一部を構成する。１つの態様において、改変神経毒を使用することを除き、Ｓａｎｄｅｒｓらの方法と実質的に同じ方法を用いて、上記のような自律神経系障害を治療することができる。例えば、改変神経毒を、鼻腔における粘液分泌を制御する自律神経系のコリン作動性ニューロンを変性させるのに十分な量で、哺乳動物の鼻腔に局所適用することができる。
【００６１】
改変神経毒によって治療することができる痛みには、筋緊張または筋痙攣に起因する痛み、または筋痙攣とは関連しない痛みが含まれる。例えば、Ｂｉｎｄｅｒは、米国特許Ｎｏ．５，７１４，４６８において、血管障害、筋緊張、神経痛および神経障害に起因する頭痛を、天然のボツリヌス毒素（例えばＢｏＮＴ／Ａ）により治療しうることを開示している。Ｂｉｎｄｅｒの開示は、その全体が本明細書の一部を構成する。１つの態様において、改変神経毒を使用することを除き、Ｂｉｎｄｅｒの方法と実質的に同じ方法を用いて、頭痛（特に、血管障害、筋緊張、神経痛および神経障害に起因する頭痛）を治療することができる。筋痙攣に起因する痛みも、改変神経毒の投与によって治療することができる。例えば、Ｎ−末端ミリスチル化部位を、ＢｏＮＴ／Ｅの軽鎖の１５位に、またはＢｏＮＴ／Ａの軽鎖の１５位に実質的に対応する位置に融合させたＢｏＮＴ／Ｅを含んでなる改変神経毒を、痛み／痙攣部位に筋肉内投与して、痛みを軽減することができる。
【００６２】
さらに、改変神経毒を哺乳動物に投与して、筋肉障害（痙攣など）に関連しない痛みを治療することもできる。１つの広い態様において、痙攣に関連しない痛みを治療するための本発明の方法は、改変神経毒の中枢投与または末梢投与を包含する。
【００６３】
例えば、Ｆｏｓｔｅｒらは、米国特許Ｎｏ．５，９８９，５４５において、標的化部分とコンジュゲート化したボツリヌス毒素を中枢（鞘内）投与して、痛みを軽減しうることを開示している。Ｆｏｓｔｅｒらの開示は、その全体が本明細書の一部を構成する。１つの態様において、本発明の改変神経毒を使用することを除き、Ｆｏｓｔｅｒらの方法と実質的に同じ方法を用いて、痛みを治療することができる。治療される痛みは、急性痛みまたは好ましくは慢性痛みであることができる。
【００６４】
筋痙攣に関連しない急性または慢性の痛みを、哺乳動物上の実際の痛み部位または痛みを感じている部位への改変神経毒の局所末梢投与によって軽減することもできる。１つの態様において、改変神経毒を、痛み部位またはその近傍（例えば、切傷部位またはその近傍）に皮下投与する。別の態様において、改変神経毒を、痛み部位またはその近傍（例えば、哺乳動物上の挫傷部位またはその近傍）に筋肉内投与する。別の態様において、改変神経毒を、関節炎状態に起因する痛みを治療または軽減するために、哺乳動物の関節中に直接注射する。また、末梢痛み部位への改変神経毒の頻繁な反復注射または注入も、本発明の範囲内に包含される。しかし、長時間持続する本発明の治療効果を考えると、神経毒の頻繁な注射または注入は必要ないはずである。例えば、本発明の実施により、１回の注射につき、ヒトにおいて２ヶ月以上、例えば２７ヶ月にわたる鎮痛効果を得ることができる。
【００６５】
本発明をいずれかの作用機序または作用理論に限定することを望むものではないが、改変神経毒を末梢部位に局所投与すると、改変神経毒は、末梢一次感覚終末からの神経物質（例えばサブスタンスＰ）の放出を抑制すると考えられる。末梢一次感覚終末によるサブスタンスＰの放出は、痛み伝達過程を誘発するか、または少なくとも増幅することができるので、末梢一次感覚終末におけるその放出を抑制すると、痛みシグナルの伝達が抑制されて脳に到達しなくなるであろう。
【００６６】
末梢部位において薬理作用を有することに加えて、本発明の改変神経毒は、中枢神経系において抑制作用を有することもできる。恐らくは、逆行性輸送は、一次求心性神経を経由する。この仮説は、ＢｏＮＴ／Ａが末梢注射されたときに、この神経毒が後角に逆行性輸送されることを示す我々の実験データによって裏付けられる。さらに、Ｗｅｉｇａｎｄら［Ｎａｕｎｙ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９７６：２９２，１６１−１６５］、およびＨａｂｅｒｍａｎｎ［Ｎａｕｎｙ−Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇ’ｓ Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９７４：２８１，４７−５６］の研究は、ボツリヌス毒素が逆行性輸送によって脊髄領域に上行できることを示した。従って、末梢部位に注射（例えば筋肉内注射）された改変神経毒（例えば、ロイシンベースモチーフから１またはそれ以上のアミノ酸を欠失させたＢｏＮＴ／Ａ）は、末梢一次感覚終末から中枢一次感覚終末に逆行性輸送されうる。
【００６７】
改変神経毒の投与量は、治療される特定の障害、その重症度、ならびに、他の種々の患者の変数、例えば大きさ、体重、年齢、および治療に対する応答性などによって大きく変動することができる。一般に、投与される改変神経毒の用量は、治療される哺乳動物（好ましくはヒト）の年齢、存在する症状および体重によって変動するであろう。改変神経毒の効力も考慮されるであろう。
【００６８】
効力がヒト患者においてＬＤ５０＝２，７３０Ｕに実質的に等しく、平均的な人が７５ｋｇであると仮定すると、改変神経毒の致死用量は約３６Ｕ／ｋｇであろう。従って、このようなＬＤ５０を有する改変神経毒を投与する場合、３６Ｕ／ｋｇ未満の改変神経毒をヒト対象に投与するのが適切であろう。好ましくは、約０．０１〜３０Ｕ／ｋｇの改変神経毒を投与する。より好ましくは、約１〜１５Ｕ／ｋｇの改変神経毒を投与する。さらに好ましくは、約５〜１０Ｕ／ｋｇの改変神経毒を投与する。一般に、改変神経毒は、約２．５ｃｃ／１００Ｕの割合に相当する投与量で、組成物として投与されるであろう。これより高いかまたは低い効力の神経毒について、これらの投与量を調節する方法は、当業者であれば知っているか、または容易に確かめることができる。
【００６９】
投与経路および投与量の例を記載したが、適切な投与経路および投与量は、一般に主治医が症例毎に決定する。このような決定は、当業者にとっては常法である［例えば、”Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ” （１９９８）、Ａｎｔｈｏｎｙ Ｆａｕｃｉら編、第１４版、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ版を参照］。例えば、本発明に従う改変神経毒の投与経路および投与量は、選択した改変神経毒の溶解特性ならびに治療される障害の種類などの基準に基づいて選択することができる。
【００７０】
改変神経毒は、当分野で周知の通常の化学的方法を用いて、神経毒に改変部位を化学結合させることによって製造することができる。神経毒は、神経毒の収穫によって得ることができる。例えば、ＢｏＮＴ／Ｅは、既知の方法に従って、発酵槽においてボツリヌス菌の培養物を樹立および増殖させ、次に、発酵混合物を収穫および精製することによって得ることができる。全てのボツリヌス毒素血清型は、初めに、不活性な一本鎖タンパク質として合成され、これがプロテアーゼによって切断されるかまたはニックが入って神経活性になる。ボツリヌス毒素の血清型ＡおよびＧを産生する細菌株は内因性プロテアーゼを有しており、従って、血清型ＡおよびＧは、主にその活性形態で細菌培養物から回収することができる。これに対して、ボツリヌス毒素の血清型Ｃ１、ＤおよびＥは、非タンパク質分解菌株によって合成され、従って、培養物から回収したときには活性化されていないのが普通である。血清型ＢおよびＦは、タンパク質分解菌株および非タンパク質分解菌株の両方によって産生され、従って、活性または不活性のどちらかの形態で回収することができる。しかし、例えばＢｏＮＴ／Ｂ血清型を産生するタンパク質分解菌株であっても、該菌株は、産生された毒素の一部を切断するにすぎない。ニック入り分子と非ニック入り分子の正確な比率は、培養時間および培養温度に依存する。従って、例えばＢｏＮＴ／Ｂ毒素のいずれかの調製物のある一定割合は不活性である可能性があり、これが、ＢｏＮＴ／Ａと比較したときのＢｏＮＴ／Ｂの既知の有意に低い効力を説明すると考えられる。臨床調製物における不活性ボツリヌス毒素分子の存在は、臨床効果に寄与せずに、調製物の全体のタンパク質負荷に寄与し、抗原性の増加につながる。さらに、ＢｏＮＴ／Ｂは、筋肉内注射したときに、同じ用量レベルのＢｏＮＴ／Ａより短い活性期間を有し、低い有効性であることも知られている。
【００７１】
改変神経毒は、組換え技術によって製造することもできる。クロストリジウム属の異なる種に由来するアミノ酸配列領域を有する神経毒、または改変されたアミノ酸配列領域を有する神経毒を製造するためには、組換え技術が好ましい。また、改変（欠失または突然変異）されたかまたは付加された改変部位を有するＢｏＮＴ／Ａを製造する場合にも、組換え技術が好ましい。この技術には、ニューロン結合部分、神経毒またはその一部を移行させるのに有効なアミノ酸配列、ならびに、標的細胞（好ましくはニューロン）の細胞質中に放出されたときに治療活性を有するアミノ酸配列の暗号を有する遺伝物質を、天然供給源または合成供給源から取得する工程が含まれる。好ましい態様において、この遺伝物質は、クロストリジウム神経毒の生物学的持続性増強成分、好ましくはロイシンベースモチーフ、ＨＣ、ＨＮおよびＬ鎖ならびにそのフラグメントの暗号を有する。初めに、遺伝子構築物をクローニングベクター（例えばファージまたはプラスミド）と融合させることによって、遺伝子構築物を増幅のために宿主細胞に導入する。次に、このクローニングベクターを、宿主、好ましくは大腸菌宿主中に挿入する。宿主細胞における組換え遺伝子の発現に続いて、得られたタンパク質を通常の方法を用いて単離することができる。
【００７２】
これら改変神経毒の組換え法による製造には多くの利点がある。例えば、改変神経毒を得るためには、改変用フラグメントを神経毒に結合させるか、または挿入しなければならない。嫌気性クロストリジウム培養からの神経毒の製造は、面倒で時間のかかる方法であり、これには、数工程のタンパク質沈降および長時間を要する反復される毒素の結晶化または数段階のカラムクロマトグラフィーを必要とする多段階の精製プロトコールが含まれる。重要なことは、生成物の毒性が高いために、操作を厳格な封じ込め（ＢＬ−３）のもとで行わなければならないことである。発酵過程中に、折り畳まれた一本鎖神経毒は、内因性クロストリジウムプロテアーゼにより、ニッキングと称される過程によって活性化されて、二鎖（ｄｉｃｈａｉｎ）が創製される。ときには、ニッキング過程に伴って一本鎖から約１０アミノ酸残基が除去され、２本の鎖が鎖内ジスルフィド結合によって共有結合された状態を保っている二鎖形態が創製される。
【００７３】
ニックの入った神経毒は、ニックが入っていない形態よりも、はるかに活性が高い。ニッキングの量および正確な位置は、毒素を産生する細菌の血清型によって変化する。一本鎖神経毒活性化の相違、従って、ニック入り毒素の収量の相違は、血清型およびある菌株が産生するタンパク質分解活性の量の変動によって起こる。例えば、ボツリヌス菌血清型Ａの一本鎖神経毒の９９％以上は、ボツリヌス菌Ｈａｌｌ Ａ株によって活性されるが、血清型ＢおよびＥの菌株は、活性化の量が少ない毒素を産生する（発酵時間に依存して０〜７５％）。即ち、高い毒性の成熟神経毒は、治療薬としての神経毒の商業的製造において重要な役割を果たす。
【００７４】
即ち、操作されたクロストリジウム毒素の活性化の程度は、これら物質の製造にとって重要な考慮事項である。ボツリヌス毒素や破傷風毒素などの神経毒を、安全で単離しやすく、完全活性型への変換が容易な、比較的非毒性の一本鎖（あるいは毒活性が低下した一本鎖）として、迅速に増殖する細菌（例えば、異種の大腸菌細胞）において高収率で組換え発現させることができれば、非常に有利であろう。
【００７５】
安全性が最も重要であるため、過去の研究は、破傷風毒素およびボツリヌス毒素のＨ鎖とＬ鎖を個別に大腸菌で発現させて精製することに集中していた。これらの単離された鎖は、それら自体では無毒である［Ｌｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：７０１４−７０２０ （１９９４）およびＺｈｏｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１５１７５−１５１８１ （１９９５）を参照；これら文献の開示は本明細書の一部を構成する］。これらのペプチド鎖を個別に製造した後、厳密に制御された条件下で、Ｈ鎖とＬ鎖を酸化的ジスルフィド結合によって組み合わせて、神経麻痺性の二鎖（ジポリペプチド）を形成させることができる。好ましくは、これらポリペプチドの一方はクロストリジウム神経毒の重鎖であり、他方はクロストリジウム神経毒の軽鎖である。ニューロン結合部分は、好ましくは重鎖の一部である。
【００７６】
（実施例）
以下の非限定的な実施例により、当業者に、本発明の範囲内に包含される非痙攣関連の痛みを治療するための好ましい方法を具体的に示すが、これら実施例は本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００７７】
実施例１：筋肉障害に伴う痛みの治療
ある３６歳の不運な女性は、１５年に及ぶ顎関節疾患ならびに咬筋および側頭筋に沿った慢性痛の病歴を有している。評価を受ける１５年前に、彼女は、顎の開閉に関して痛みを伴う顎の不動性が増していること、および顔の両側に沿って圧痛があることに気付いた。最初は左側の方が右側より悪いと判断される。彼女は、関節の亜脱臼を伴う顎関節（ＴＭＪ）機能不全と診断され、外科的矯正半月切除および顆切除術による治療を受ける。
【００７８】
手術後も顎を開閉しにくい状態が続くので、数年後に、両側の人工関節置換術を行なう。この手術後に、顎の痙攣および偏位が漸進的に起こるようになる。人工関節のゆるみを修正するために、関節の最初の手術に続いて、さらなる外科的修正も行なわれる。これらの手術後も顎はかなりの痛みと不動を呈し続ける。ＴＭＪおよび筋そのものは、相変わらず、触れると痛みを感じた。圧痛点は顎関節の全面にわたって存在し、筋肉全体に緊張の増加が認められる。彼女は術後筋膜疼痛症候群と診断され、咬筋および側頭筋への約８〜１５Ｕ／ｋｇの改変神経毒の注射を受ける。この改変神経毒は、好ましくは、Ｎ−末端ミリスチル化部位（例えば、ＧＶＤＩＡＹ）を、ＢｏＮＴ／Ｅの軽鎖の１５位に、またはＢｏＮＴ／Ａの軽鎖の１５位に実質的に対応する位置に融合させたＢｏＮＴ／Ｅを含んでなる改変神経毒である。
【００７９】
注射の数日後に、彼女は、痛みが大きく改善したことに気付き、顎が自由になった感じがすると報告する。これは２〜３週間かけて徐々に改善し、この間に彼女は顎が開けやすくなり、痛みも減少していることに気付く。彼女は、痛みはこの４年間のどの時期よりも良好であると明言する。改善された状態は、改変神経毒の最初の注射後、２７ヶ月まで持続する。
【００８０】
実施例２：脊髄傷害後の痛みの治療
脊髄傷害後の痛みを感じている３９歳の患者を、約０．１〜１０Ｕ／ｋｇの改変神経毒の髄腔内投与、例えば脊椎穿刺または脊髄へのカテーテル挿入（注入用）によって治療する。この改変神経毒は、好ましくは、Ｎ−末端ミリスチル化部位（例えば、ＧＶＤＩＡＹ）を、ＢｏＮＴ／Ｅの軽鎖の１５位に、またはＢｏＮＴ／Ａの軽鎖の１５位に実質的に対応する位置に融合させたＢｏＮＴ／Ｅを含んでなる改変神経毒である。上記のように、具体的な毒素の投与量と注射部位、ならびに、毒素の投与頻度は、治療医の技量の範囲内で種々の因子に依存する。改変神経毒の投与後の約１〜７日以内に、患者の痛みは大きく減少する。痛みの軽減は２７ヶ月まで持続する。
【００８１】
実施例３：改変神経毒の末梢投与による「肩手症候群」の治療
肩、腕および手の痛みは、筋萎縮症、骨粗鬆症および関節の固着に伴って発症しうる。冠不全後が最も一般的であるが、この症候群は、頸部関節症または限局性肩疾患でも起こり、また、患者に臥床状態を強いる長期間の病気後にも起こりうる。
【００８２】
ある４６歳の女性は、肩手症候群型の痛みを呈している。痛みは三角筋領域に特に局在している。この患者を、肩への約０．０５〜２Ｕ／ｋｇの改変神経毒の皮下ボーラス注射によって治療する。この改変神経毒は、好ましくは、Ｎ−末端ミリスチル化部位（例えば、ＧＶＤＩＡＹ）を、ＢｏＮＴ／Ｅの軽鎖の１５位に、またはＢｏＮＴ／Ａの軽鎖の１５位に実質的に対応する位置に融合させたＢｏＮＴ／Ｅを含んでなる改変神経毒である。上記のように、具体的な投与量ならびに投与頻度は、治療医の技量の範囲内で種々の因子に依存する。改変神経毒の投与後の１〜７日以内に、患者の痛みは大きく軽減する。痛み軽減の持続期間は、約７〜２７ヶ月である。
【００８３】
実施例４：改変神経毒の末梢投与による帯状疱疹後神経痛の治療
帯状疱疹後神経痛は、難治性が最も高い慢性痛の１つである。この耐え難い痛みを伴う経過に苦しむ患者は、多くの場合、高齢であり、消耗性疾患を持ち、大きな介入操作には適さない。診断は、疱疹の病巣跡の存在および患者の病歴によって容易に下される。痛みは強く、情動的に苦しい。帯状疱疹後神経痛は、どこにでも起こりうるが、胸部に起こることが最も多い。
【００８４】
ある７６歳の男性は、帯状疱疹後型の痛みを呈している。痛みは腹部領域に局在している。この患者を、腹部への約０．０５〜２Ｕ／ｋｇの改変神経毒の皮内ボーラス注射によって治療する。この改変神経毒は、好ましくは、Ｎ−末端ミリスチル化部位（例えば、ＧＶＤＩＡＹ）を、ＢｏＮＴ／Ｅの軽鎖の１５位に、またはＢｏＮＴ／Ａの軽鎖の１５位に実質的に対応する位置に融合させたＢｏＮＴ／Ｅを含んでなる改変神経毒である。上記のように、具体的な投与量ならびに投与頻度は、治療医の技量の範囲内で種々の因子に依存する。改変神経毒の投与後の１〜７日以内に、患者の痛みは大きく軽減する。痛み軽減の持続期間は、約７〜２７ヶ月である。
【００８５】
実施例５：改変神経毒の末梢投与による鼻咽頭腫瘍痛の治療
これらの腫瘍は、多くの場合、扁平上皮癌であり、通常はローゼンミュラー窩にあり、頭蓋底を冒しうる。顔面の痛みがよく起こる。この痛みの性質は、絶え間なく続く鈍痛である。
【００８６】
ある３５歳の男性は、鼻咽頭腫瘍型の痛みを呈している。痛みは左下頬に認められる。この患者を、頬への約０．０５〜２Ｕ／ｋｇの改変神経毒の筋肉内ボーラス注射によって治療する。この改変神経毒は、好ましくは、Ｎ−末端ミリスチル化部位（例えば、ＧＶＤＩＡＹ）を、ＢｏＮＴ／Ｅの軽鎖の１５位に、またはＢｏＮＴ／Ａの軽鎖の１５位に実質的に対応する位置に融合させたＢｏＮＴ／Ｅを含んでなる改変神経毒である。具体的な投与量ならびに投与頻度は、治療医の技量の範囲内で種々の因子に依存する。改変神経毒の投与後の１〜７日以内に、患者の痛みは大きく軽減する。痛み軽減の持続期間は、約７〜２７ヶ月である。
【００８７】
実施例６：改変神経毒の末梢投与による炎症痛の治療
ある４５歳の患者は、胸部に炎症痛を呈している。この患者を、胸部への約０．０５〜２Ｕ／ｋｇの改変神経毒の筋肉内ボーラス注射によって治療する。この改変神経毒は、好ましくは、Ｎ−末端ミリスチル化部位（例えば、ＧＶＤＩＡＹ）を、ＢｏＮＴ／Ｅの軽鎖の１５位に、またはＢｏＮＴ／Ａの軽鎖の１５位に実質的に対応する位置に融合させたＢｏＮＴ／Ｅを含んでなる改変神経毒である。上記のように、具体的な投与量ならびに投与頻度は、治療医の技量の範囲内で種々の因子に依存する。改変神経毒の投与後の１〜７日以内に、患者の痛みは大きく軽減する。痛み軽減の持続期間は、約７〜２７ヶ月である。
【００８８】
実施例７：過剰発汗の治療
片側性過剰発汗を示す６５歳の男性を、所望の効果の程度に依存して、約０．０５〜２Ｕ／ｋｇの改変神経毒の投与によって治療する。この改変神経毒は、好ましくは、Ｎ−末端ミリスチル化部位（例えば、ＧＶＤＩＡＹ）を、ＢｏＮＴ／Ｅの軽鎖の１５位に、またはＢｏＮＴ／Ａの軽鎖の１５位に実質的に対応する位置に融合させたＢｏＮＴ／Ｅを含んでなる改変神経毒である。投与は、腺神経叢、神経節、脊髄または中枢神経系への投与である。具体的な投与部位は、標的とする腺および分泌細胞の解剖学および生理学に関する医師の知識に基づいて決定される。さらに、適当な脊髄レベルまたは脳領域に毒素を注射することもできる。改変神経毒治療の後の過剰発汗の停止は２７ヶ月に及ぶ。
【００８９】
実施例８：術後治療
ある２２歳の女性は、肩腱断裂を呈し、腱を修復するために整形外科手術を受ける。手術後に、患者の肩に、約０．０５〜２Ｕ／ｋｇの改変神経毒を筋肉内投与する。この改変神経毒は、好ましくは、Ｎ−末端ミリスチル化部位（例えば、２５４位のＧＬＥＶＳＦ）が削除されたＢｏＮＴ／Ａを含んでなる改変神経毒である。具体的な投与部位は、筋肉の解剖学および生理学に関する医師の知識に基づいて決定される。投与された改変神経毒は、腕の動きを抑制して、手術からの回復を促進する。改変神経毒の作用期間は約５週間である。
【００９０】
実施例９：痙性発声困難の治療
ある４５歳の男性は、声帯ひだの痙攣により明瞭に話すことができない。この男性を、約０．１〜２Ｕ／ｋｇの本発明の改変神経毒の声帯ひだ注射によって治療する。３〜７日後に、患者は明瞭に話すことができる。この患者の状態は、約７〜２７ヶ月にわたり軽減される。
【００９１】
実施例１０：痙性斜頸の治療
ある４５歳の男性は、頸筋系の痙攣性または緊張性の収縮によって示され、頭部の立体的な異常偏位を生じ、顎が側面に回転しており、頭部が回転している側面に向かって肩が上昇している痙性斜頸を呈する。この男性を、約８〜１５Ｕ／ｋｇの本発明の神経毒の注射によって治療する。３〜７日後に、症状が大きく軽減する。即ち、患者は、頭部および肩を正常位置に保持することができる。この軽減は、約７〜２７ヶ月にわたり持続する。
【００９２】
実施例１１：特発性振せんの治療
ある４５歳の男性は、頭部または手筋肉のリズミカルな振動によって示され、姿勢または運動の維持によって誘発される特発性振せんを呈する。この男性を、約８〜１５Ｕ／ｋｇの本発明の改変神経毒の注射によって治療する。２〜８週間後に、症状が大きく軽減する。即ち、患者の頭部または手は振動を停止する。症状は、約５〜２７ヶ月にわたり軽減される。
【００９３】
実施例１２：変化した生物学的持続性を有する改変神経毒の製造
本発明の改変神経毒を、組換え技術によって製造することができる。組換え技術の例は、本発明の改変神経毒の暗号を有するオリゴヌクレオチド配列から遺伝物質を得る工程を含むものである。初めに、遺伝子構築物をクローニングベクター（例えばファージまたはプラスミド）と融合させることによって、遺伝子構築物を増幅のために宿主細胞に導入する。次に、このクローニングベクターを、宿主、好ましくは大腸菌宿主中に挿入する。宿主細胞における組換え遺伝子の発現に続いて、得られたタンパク質を通常の方法を用いて単離することができる。国際特許出願公開ＷＯ９５／３２７３８をも参照（この出願の開示は、その全体が本明細書の一部を構成する）。
【００９４】
この例に従って製造した改変神経毒は、変化した生物学的持続性を有する。好ましくは、この生物学的持続性は増強されており、より好ましくは、ロイシンベースモチーフを含まない同一の神経毒と比較して、約２０〜３００％増強されている。
【００９５】
本発明を、ある種の好ましい方法に関連して詳しく説明したが、本発明の範囲内にある他の態様、変形および変更も可能である。例えば、多種多様の改変神経毒を、クロストリジウム神経毒に代えて、本発明の方法において効果的に使用することができる。また、改変神経毒に対応する遺伝暗号（即ち、ＤＮＡ配列）も、本発明の一部であると考えられる。さらに、本発明は、２またはそれ以上の改変神経毒（例えば、改変部位と融合させたＢｏＮＴ／Ｅおよび改変部位と融合させたＢｏＮＴ／Ｂ）を、同時にまたは連続して投与する末梢投与法を包含する。さらに、「標的化成分」を、本発明の改変神経毒に付加するかまたは置換することもできる。この「標的化成分」は、特定の受容体に選択的に結合する小さい分子またはポリペプチドであってよい。このようにして、標的化成分を含む本発明の改変神経毒を、特定の標的受容体に特異的に指向させることができる。Ｆｏｓｔｅｒらの米国特許Ｎｏ．５，９８９，５４５およびＤｏｎｏｖａｎの米国特許出願Ｎｏ．０９／４８９，６６７を参照（これら特許文献の開示は、本明細書の一部を構成する）。
【００９６】
本発明を、種々の具体例および態様に関連して説明したが、本発明がこれらに限定されるものではなく、特許請求の範囲の記載の範囲内で様々に実施しうることを理解すべきである。
【国際公開パンフレット】
2004536778.tif 000004
2004536778.tif 000005
2004536778.tif 000006
2004536778.tif 000007
2004536778.tif 000008
2004536778.tif 000009
2004536778.tif 000010
2004536778.tif 000011
2004536778.tif 000012
2004536778.tif 000013
2004536778.tif 000014
2004536778.tif 000015
2004536778.tif 000016
2004536778.tif 000017
2004536778.tif 000018
2004536778.tif 000019
2004536778.tif 000020
2004536778.tif 000021
2004536778.tif 000022
2004536778.tif 000023
2004536778.tif 000024
2004536778.tif 000025
2004536778.tif 000026
2004536778.tif 000027
2004536778.tif 000028
2004536778.tif 000029
2004536778.tif 000030
2004536778.tif 000031
2004536778.tif 000032
2004536778.tif 000033
2004536778.tif 000034
2004536778.tif 000035
2004536778.tif 000036
2004536778.tif 000037
2004536778.tif 000038
2004536778.tif 000039
2004536778.tif 000040
2004536778.tif 000041
2004536778.tif 000042
2004536778.tif 000043
2004536778.tif 000044
2004536778.tif 000045
2004536778.tif 000046
2004536778.tif 000047
2004536778.tif 000048
2004536778.tif 000049
2004536778.tif 000050
2004536778.tif 000051
2004536778.tif 000052
2004536778.tif 000053
2004536778.tif 000054
2004536778.tif 000055
2004536778.tif 000056
2004536778.tif 000057
2004536778.tif 000058
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004536778.tif 000059
【国際調査報告】
2004536778.tif 000060
2004536778.tif 000061
2004536778.tif 000062
2004536778.tif 000063
2004536778.tif 000064