(57)【要約】Ｇαサブユニットタンパク質をコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含むトランスジェニックラットであって、前記Ｇαタンパク質サブユニットがＧタンパク質シグナル伝達の調節因子（ＲＧＳ）タンパク質による調節から脱共役し、Ｇｘサブユニットタンパク質が結局はＧｘ９の優性ネガティブなＧ１８８Ｓ変異型であり、前記ヌクレオチド配列がニューロン特異的な発現制御配列と作用的に会合し、Ｇαサブユニットタンパク質により媒介されるＧタンパク質共役型受容体の広範囲のシグナル伝達を生じさせるＧαサブユニットタンパク質を神経細胞において発現するトランスジェニックラット。
2004500843.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇαサブユニットタンパク質をコードするヌクレオチド配列をそのゲノムに含むトランスジェニックラットであって、前記Ｇαタンパク質サブユニットがＧタンパク質シグナル伝達の調節因子（ＲＧＳ）タンパク質による調節から脱共役し、かつ前記ヌクレオチド配列がニューロン特異的な発現制御配列と作用的に会合し、Ｇαサブユニットタンパク質により媒介されるＧタンパク質共役型受容体の広範囲のシグナル伝達を生じさせるＧαタンパク質サブユニットを神経細胞において発現するトランスジェニックラット。
【請求項２】
広範囲のシグナル伝達を示すＧタンパク質共役型受容体が、ムスカリン性受容体、５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＴ）２Ａ受容体、５−ＨＴ２Ｃ受容体、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体およびドーパミン（ＤＡ）受容体からなる群から選択される請求項１記載のトランスジェニックラット。
【請求項３】
全般的な行動評価により評価される震え、オープンフィールド試験により評価される中心復帰時間の増大、状況的恐怖条件付けの低下、食物摂取の低下、体重の低下、５−ＨＴ２Ａアゴニストおよび５−ＨＴ２Ｃアゴニストに対する感受性の増大、ムスカリン性アゴニストに対する応答におけるコリン作動性徴候の増大、プレパルス阻害の低下、ＮＭＤＡアンタゴニストに対する応答における多動性の増大およびＤＡアゴニストに対する応答における多動性の低下からなる群から選択される表現型を示す請求項１記載のトランスジェニックラット。
【請求項４】
変異型Ｇαサブユニットタンパク質が、優性ネガティブ変異を有するＧαｑサブユニットタンパク質である請求項１記載のトランスジェニックラット。
【請求項５】
ＧαｑがマウスＧαｑである請求項４記載のトランスジェニックラット。
【請求項６】
マウスＧαｑサブユニットが、セリンで置換されたグリシン１８８（Ｇ１８８Ｓ）を有する請求項５記載のトランスジェニックラット。
【請求項７】
変異型ＧαｑサブユニットがＲＧＳと相互作用しない請求項６記載のトランスジェニックラット。
【請求項８】
ニューロン特異的プロモータがＴｈｙ１．２プロモータである請求項１記載のトランスジェニックラット。
【請求項９】
ＧＴＰのＧα加水分解のＲＧＳ変調を変調する（モジュレート）化合物を同定する方法であって、試験化合物が投与された試験野性型ラットの表現型を、請求項１記載のトランスジェニックラットの表現型と比較することを含み、試験ラットの表現型がトランスジェニックラットの表現型と類似しているとき、試験化合物により、ＧＴＰのＧα加水分解のＲＧＳ調節が調節される前記方法。
【請求項１０】
表現型が、全体的な行動評価により評価される震え、オープンフィールド試験により評価される中心復帰時間の増大、状況的恐怖条件付けの低下、食物摂取の低下、体重の低下、５−ＨＴ２Ａアゴニストおよび５−ＨＴ２Ｃアゴニストに対する感受性の増大、ムスカリン性アゴニストに対する応答におけるコリン作動性徴候の増大、プレパルス阻害の低下、ＮＭＤＡアンタゴニストに対する応答における多動性の増大およびＤＡアゴニストに対する応答における多動性の低下からなる群から選択される請求項９記載の方法。
【請求項１１】
変異型Ｇαサブユニットタンパク質が、優性ネガティブ変異を有するサブユニットタンパク質である請求項９記載の方法。
【請求項１２】
ＧαｑがマウスＧαｑである請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
マウスＧαｑサブユニットが、セリンで置換されたグリシン１８８（Ｇ１８８Ｓ）を有する請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
変異型ＧαｑサブユニットがＲＧＳと相互作用しない請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
化合物が、双極性障害を処置するためのリード物質である請求項９記載の方法。
【請求項１６】
ＧαがＲＧＳから脱共役している動物に対する化合物の作用を同定する方法であって、試験化合物が投与された請求項１記載のトランスジェニックラットの表現型を評価することを含み、前記試験化合物が投与されていないコントロールのトランスジェニックラットに対する表現型の変化により、ＧαがＲＧＳから脱共役している動物における化合物の作用が示される前記方法。
【請求項１７】
化合物が５−ＨＴ２Ｃアゴニストであり、表現型が食物摂取の阻害である請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
化合物が５−ＨＴ２Ａアゴニストであり、表現型が、頭振りの誘導、腹這いになった身体姿勢、痙攣および死からなる群から選択される請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
化合物がムスカリン性アゴニストであり、表現型が、コリン作動性徴候の増大、痙攣および死からなる群から選択される請求項１６記載の方法。
【請求項２０】
化合物がＮＭＤＡアンタゴニストであり、表現型が多動性の増大である請求項１６記載の方法。
【請求項２１】
化合物がＤＡアゴニストであり、表現型が多動性の低下である請求項１６記載の方法。
【請求項２２】
広範囲のＧＰＣＲシグナル伝達を有するトランスジェニックラットを作製する方法であって、ＲＧＳタンパク質による調節から脱共役しているＧαサブユニットタンパク質をコードし、かつニューロン特異的な発現制御配列と作用的に会合しているヌクレオチド配列をラットのゲノムに導入し、それにより、トランスジェニックラットに広範囲のＧＰＣＲシグナル伝達を生じさせるＧαサブユニットタンパク質を神経細胞において発現させることを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本出願は、米国特許法１１９条に基づいて米国仮特許出願第６０／１９９，２０９号および同第６０／２４５，４７３号（それぞれ、２０００年４月２４日出願および２０００年１１月３日出願）の優先権を主張する。これらはそれぞれがその全体において参照して本明細書中に組み込まれる。
本発明は、一般にはトランスジェニック動物（ラットおよびマウス）およびヒト疾患の動物モデルに関する。本発明は、特に、Ｇタンパク質のシグナル伝達を調節するタンパク質によって調製されるヒトの疾患および状態の動物モデルとして役立ち得るトランスジェニック動物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＲＧＳ（Ｇタンパク質シグナル伝達の調節因子）タンパク質は、活性化されたＧαサブユニットの内因性ＧＴＰａｓｅ活性を促進することによって、Ｇタンパク質により媒介されるシグナル伝達を脱感作するように作用する。ＲＧＳタンパク質は、ＧαサブユニットのＧαｏサブタイプ、Ｇαｉサブタイプ、ＧαｚサブタイプおよびＧαｑサブタイプに対するＧＡＰ（ＧＴＰａｓｅ促進タンパク質）として機能することが示されている（Ｇｒａｆｓｔｅｉｎ−Ｄｕｎｎ他、Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．２００１、８８：１１３〜１２３；総説については、Ｈｅｐｌｅｒ、Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉ．１９９９、２０：３７６〜３８２を参照のこと）。従って、ＲＧＳタンパク質はＧタンパク質共役型受容体ＧＰＣＲのシグナル伝達の停止を促進する。ＲＧＳタンパク質は、ＣＮＳ内の多くの臨床的に関連するＧＰＣＲのシグナル伝達を調節していることが考えられる。Ｇｏｌｄ他（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９７、１７（２０）：８０２４〜３７）によるインサイチュー（ｉｎ　ｓｉｔｕ）分析は脳に特異的なＲＧＳのｍＲＮＡ発現を示した。追加のインサイチュー評価は、ＲＧＳ４、ＲＧＳ７およびＧαｑに対するｍＲＮＡ発現が重なることを示した（Ｓｈｕｅｙ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９８、７０：１９６４〜１９７２）。
【０００３】
ＲＧＳタンパク質ファミリーの最初のメンバー（ＳＳＴ２ｐ）が、フェロモン応答経路のリガンドに対して過敏性の遺伝子的に特徴付けられた変異型酵母株（ｓｓｔ）を使用して酵母で同定された（Ｄｏｈｌｍａｎ他、Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１９９６、（９）：５１９４〜２０９）。この経路の受容体は、Ｇタンパク質に共役した７回膜貫通型受容体（ＧＰＣＲ）である。この酵母経路の構成成分は、哺乳動物のＧＰＣＲシグナル伝達における構成成分と類似している。その結果として、優性変異が、酵母のＲＧＳ（ＳＳＴ２ｐ）を欠失させた酵母株の表現型を模倣する酵母で同定された。その変異はまた、細胞周期停止を生じさせる酵母のフェロモン応答経路を刺激するＧＰＣＲリガンドのアルファ因子に対する過敏性をもたらした。この優性変異は、酵母における遺伝子研究および分子生物学を使用して同定され（Ｄｏｈｌｍａｎ他、上記）、（ＲＧＳ）ＳＳＴ２による調節に対して無感応にする酵母Ｇタンパク質（Ｇｐａ１）内のＧ３０２Ｓ変異のためであった。Ｇｐａ１は、哺乳動物のＧαｉタンパク質に対して相同的である。そのグリシン残基は哺乳動物Ｇαサブユニットにおいて保存され、Ｇαタンパク質では最初のスイッチ領域内に含有される。結晶学的研究は、Ｇαｉのスイッチ領域はＲＧＳ４と相互作用することを示している（Ｔｅｓｍｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７、２７８（５３４５）：１９０７〜１６）。酵母で同定されたＧαタンパク質におけるＧ３０２Ｓ変異から生じる優性な表現型（ＲＧＳ無感応）は哺乳動物のＧαｑタンパク質に移すことができる（Ｓｈｕｅｙ他、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９８、７０：１９６４〜１９７２）。この研究は、酵母タンパク質のＧｐａ１のＲＧＳ無感応表現型を哺乳動物のＧαｐタンパク質（Ｇ１８８Ｓ）に拡大した。ＧからＳへの変異を有する哺乳動物Ｇαタンパク質は、グアニンヌクレオチドに結合することができるが、ＲＧＳタンパク質のＧＡＰ活性に対して抵抗性がある。
【０００４】
ＲＧＳタンパク質ファミリーの最初のメンバー（酵母タンパク質のＳＳＴ２）が１９９６年に同定されて以来、ＲＧＳタンパク質の影響および生物学が明らかにされることが残されている。領域特異的な発現によって示唆されるように、ＲＧＳタンパク質が脳の機能において役割を果たしていることが示されている。
【０００５】
特に、いくつかのＧＰＣＲはＧαｑを介して共役し、ＰＬＣ、ホスホチジルイノシトール、ジアシルグリセロール、ＰＫＣおよびカルシウムなどの二次メッセンジャー系を活性化する（Ｆｏｒｓｅ、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ．２０００、３２：５２４〜３０；Ｇｕｄｅｒｍａｎｎ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９７、２０：３９９〜４２７）。さらに、これらのメッセンジャーはＭＡＰキナーゼ経路内に結合して、細胞応答をさらに調節することができる。Ｇαｑ共役型受容体には、α１アドレナリン作動性受容体、ムスカリン性受容体（ｍ１、ｍ３、ｍ５）、アドレナリン受容体、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体、ヒスタミン受容体、セロトニン受容体、Ｐ２Ｙおよび代謝型グルタミン酸受容体が含まれる。しかし、これらに限定されない。これらの受容体の多くは脳において異なる発現パターンを示す。Ｇαｑ共役型セロトニン受容体（５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｂ、５−ＨＴ２Ｃ）は、この神経伝達物質系がいくつかの抗うつ治療薬によって標的化されているので特に注目されている。
【０００６】
抗うつ治療薬の中で、リチウムは、双極性情動障害に対する最も一般的に使用されている処置である（Ｊｏｐｅ、Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１９９９、４：２１〜２５および１１７〜２８）。その数年の使用にもかかわらず、リチウムの治療的作用機構は明確には解明されていない。リチウムは、広範囲の行動的および神経化学的な作用をもたらし、その作用機構が１つ以上のシグナル伝達経路（Ｇタンパク質、ＩＰ３、ｃＡＭＰ、ｗｎｔ、β−カテニン、ＧＳＫ３ｂなど）に対するその作用に関連しているという推定に導く（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＨａｒｗｏｏｄ、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉ．２０００、２１：６１〜６４；Ｈｅｄｇｅｐａｔｈ他、Ｂａｓｉｃ　Ｒｅｓ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９７、９２：３８５〜９０）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
双極性障害を処置するためのリチウムなどの治療薬の作用機構を解明することを目指した相当の努力にもかかわらず、そのような化合物がどのように作用しているかということは明瞭には描かれていない。リチウムなどの化合物がその作用をどのように発揮するかということを理解することにより、有害な副作用を潜在的に避けながら、所望する治療効果をもたらす新規な治療薬の設計および試験が可能になる。Ｇタンパク質のシグナル伝達は、追加の情報が、特定の機構を解明することに役立ち得る領域を形成する。従って、ＲＧＳ遮断薬の作用機構を同定するために、そして受容体機能におけるＧαｑ媒介の活性またはＧタンパク質混信の識別に対するモデルとして使用するために使用することができるモデル動物システムの必要がある。トランスジェニック動物の樹立は、分子標的について、生物学的関連性への洞察をもたらし、そして潜在的な治療的適用をもたらし得る。
【０００８】
この目的のために、ＲＧＳ無感応なＧαｑ変異型（Ｇ１８８Ｓ）をニューロン組織で発現するトランスジェニック動物が樹立された。これらの動物は、神経学的に重要なＧαｑ媒介ＧＰＣＲのＲＧＳ制御を示すトランスジーン（導入遺伝子）の発現および挙動について評価された。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、優性ネガティブ変異として機能するトランスジーンを有するトランスジェニック動物、すなわち、その発現が正常な細胞プロセスを阻害する動物を提供する。記載のタイプのトランスジェニック動物は、変異していない内因性の遺伝子が動物において正常な機能を調節するか、または動物において正常な機能で調節される任意の状況で有用である。優性ネガティブなトランスジーンを導入することにより、トランスジーンが内因的な系の調節機能を様々な程度で無効にするので、トランスジーンの発現レベルに依存して異なった動物系統における活動の変化を評価することが可能になる。この方法は、内因性遺伝子のノックアウトが致死的である場合に、または内因性遺伝子が、類似する機能もしくは重複する機能をコードする遺伝子群のメンバーである場合には有用である。後者の場合、関連する遺伝子は、単純なノックアウト体の表現型作用が遺伝子機能の有用な情報または正確な情報をもたらすことができないような階層的な様式または代償的な様式で相互作用し得る。そのような関連した遺伝子の一例が、細胞外のホルモンおよび神経伝達物質などのようなリガンドの存在に対する細胞内の応答を制御するＧタンパク質シグナル伝達経路のタンパク質をコードする遺伝子によってもたらされる。本明細書中に記載されているように、ＲＧＳタンパク質は、Ｇタンパク質シグナル伝達の構成成分であり、特にシグナルを終了させるか、またはシグナルを弱めることによって、中枢神経系における神経伝達物質に対するニューロン応答などのリガンドと結合したときのＧＰＣＲシグナル伝達を調節するように機能する。本発明において例示されるトランスジェニック動物は、Ｇタンパク質のシグナル伝達において機能的であるが、ＲＧＳタンパク質に対して無感応であるトランスジーンの変化体タンパク質を発現する。具体的な実施形態において、変異型Ｇαタンパク質の発現により、変異型Ｇαタンパク質がＲＧＳ調節から脱共役する。あるいは、Ｇαタンパク質の過剰発現はＲＧＳ活性を競合的に阻害し、またＧタンパク質のシグナル伝達を脱共役させる。
【００１０】
本発明はさらに、トランスジェニック動物を作製するための方法を包含する。この方法は、優性ネガティブ機能を制御する変化コード配列を同定する工程、およびその変化コード配列を動物細胞に導入して、トランスジェニック動物をもたらすように複製するトランスジェニック動物細胞を作製する工程を含む。この方法はまた、優性ネガティブな機能の発現がトランスジェニック動物の脳などの所望する組織タイプに限定されるように、変化コード領域に作用的に結合される組織特異的な発現制御因子を提供する工程を含むことができる。この方法により、同じトランスジーンを有するが、トランスジーンの発現レベルが異なる多くの動物系統を作製することができる。そのような系統の変化した表現型を比較することにより、優性ネガティブなトランスジーンの定量的な影響を分析することが可能になる。
【００１１】
本発明はまた、例示されているように、本明細書中に詳しく記載されている優性ネガティブなＧタンパク質、具体的にはＧαｑ変異型タンパク質を有するトランスジェニックラット系統を提供する。変異型Ｇαｑのコード配列は、ニューロン特異的なプロモータのＴｈｙ１．２、すなわち既知の汎ニューロン組織特異的プロモータと組み合わせられる。種々のラット系統における発現レベルの差は、ゲノム内の組込み座が異なることによる。トランスジーンはまた、免疫検出によってトランスジーンの発現レベルを同定および定量するために使用することができる容易に同定可能なエピトープと組み合わせられる。様々な精神運動作用および薬物応答作用が、下記に記載されるようにトランスジェニックラットにおいて同定されている。予想外にも、正常な（ｗｔ）ラットに対して非毒性である５ＨＴ２Ａアゴニストの用量が本発明のトランスジェニックラットに対しては致死的であった。本発明のトランスジェニックラットは、５ＨＴ２Ｃにより誘導される食物摂取応答に対する増大した感受性を示した。これらの観測結果および他の観測結果により、５ＨＴ２により媒介される応答がトランスジェニックラットでは変化していることが示された。さらに、トランスジェニックラットは、ムスカリン性アゴニストのピロカルピンに対する増大した感受性を示した。本発明のトランスジェニックラットは、精神活性薬物の薬理学的作用の範囲を分析するために有用であり、神経細胞および脳の機能の調整および調節におけるＧタンパク質の活性および相互作用を測定するための研究道具として有用である。そのような理解は、うつ病、不安、強迫性障害、多動性、睡眠障害、精神病、精神分裂病、認知障害、痛み、気分障害、摂食障害、自閉症、注意欠陥障害、双極性情動などの、これらに限定されないが、神経障害および脳障害を処置するための薬理学的薬剤の設計および試験には不可欠である。
【００１２】
【発明の実施の形態】
ＲＧＳタンパク質のファミリーには、約２０のメンバーが含まれる（ＲｏｓｓおよびＷｉｌｋｉｅ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００、６９：７９５〜８２７、特に７９６〜８０３）。それぞれの個々のＲＧＳサブタイプを組織的に欠失させることは非常に大きい企てである。さらに、異なるＲＧＳタンパク質が様々な脳領域で共に発現しており、その結果、特定のＲＧＳタンパク質が欠失していることの影響が異なるＲＧＳの共発現によって遮蔽される。さらに、タンパク質が、欠失したタンパク質、すなわち、ノックアウトにより人為的に誘導される役割を機能的に補う。ＲＧＳタンパク質の機能に対しより全般的な洞察を得るために、ＲＧＳタンパク質のＧＡＰ活性に対して抵抗性のあるＧαｑ変異型を発現するトランスジェニックラットが作製された。Ｇαｑは、ＧαｏサブタイプまたはＧαｉサブタイプと比較して脳ではより低いレベルで発現しており、従ってトランスジーンの影響を観測する機会をより多く提供する。この目的のために、マウスのＴｈｙ１．２−Ｇ１８８Ｓ型Ｇαｑトランスジーン（図２）を発現するラットが作製された。
【００１３】
リチウムの行動的作用および薬理学的作用の多く（ＫｏｆｍａｎおよびＰｅｔｉｓｈｉ、Ｅｕｒ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９９、９：３８５〜９７）が本発明のトランスジェニックラットによって示されることが発見された。本発明のトランスジェニックラットは、ＲＧＳタンパク質によって調節されないＧαｑの変異型形態を過剰に発現しており、従ってＲＧＳ遮断のモデルになる。Ｇαｑ変異型遺伝子導入体と同様に、リチウムで処置された野生型ラットは、軽度の振せんまたは震えを有し、低下した食物摂取および体重を有し、そしてプレパルス阻害の欠落を有する。さらに、短期または長期のいずれかのリチウムは、間接的なドーパミンアゴニストであるアンフェタミンの運動活性化作用を弱め、５−ＨＴ２ＡアゴニストのＤＯＩ、５−ＨＴ２ＣアゴニストのＲＯ６０−０１７５、ムスカリン性アゴニストのピロカルピン、および非競合的なＮＭＤＡアンタゴニストのＰＣＰに対する応答を強めている。すなわち、Ｇαｑが変異している動物はリチウム処置動物の表現型を示す。
【００１４】
Ｇαｑ変異型トランスジェニックラットとリチウム処置ラットとの間で観察される類似点は、Ｇαｑ変異型トランスジェニックラットが双極性情動障害の処置されたモデルを表すことを示している。Ｇαｑ変異型トランスジェニック動物はＲＧＳ遮断の作用を模倣するので、これらの類似点は、ＲＧＳ遮断剤が双極性情動障害の処置において有用であることを示している。さらに、トランスジェニック動物は、リチウム処置よりも正確なＲＧＳ遮断モデルを表しており、従って他の薬物の作用またはＲＧＳ遮断動物を研究するために有用である。
【００１５】
下記の開示では、本発明は、トランスジェニックラットに関して説明されている。本発明は、下記の実施例３に示されるようなトランスジェニックマウスを含み、一般には遺伝子導入された齧歯類（例えば、ラットおよびマウスに加えて、ウサギ、ハムスター、アレチネズミおよびモルモット）、ならびに優性ネガティブとして機能するトランスジーンを有する他の動物をも包含することは明らかであるはずである。本発明のトランスジェニック動物は、少なくとも１つの外来遺伝子がゲノムに挿入されている遺伝子的に改変された動物である。このような動物は、何らかの他の試験系では達成することができない系統的な様式および特定の様式で細胞レベルでの調節プロセスを調べ、影響させることができる。記載のタイプのトランスジェニック動物は、変異していない内因性遺伝子が動物における阻害機能を制御している任意の状況で有用である。特に、本発明のトランスジェニック動物は、精神活性薬物の薬理学的作用の範囲を分析するために有用であり、神経細胞および脳の機能の調整および調節におけるＧタンパク質の活性および相互作用、ならびに他の組織における機能を測定するための研究道具として有用である。トランスジェニック動物は、ＧＰＣＲのシグナル伝達をＲＧＳタンパク質の調節から脱共役することに関連して、化合物、すなわち、ＧＰＣＲの潜在的リガンドまたは実際のリガンドの作用を評価するための優れたモデルとして役立つ。そのような理解は、うつ病、不安、強迫性障害、多動性、睡眠障害、精神病、精神分裂病、認知障害、痛み、気分障害、摂食障害、自閉症、注意欠陥障害などを含む、これらに限定されないが、神経障害および脳障害を処置する薬理学的薬剤の設計および試験には不可欠である。
【００１６】
優性ネガティブなトランスジーンを導入することは、トランスジーンが内因性遺伝子の機能を様々な程度で無効にするので、トランスジーンの発現レベルに依存して異なった動物系統における活動の変化を評価することが可能になる。この方法は、内因性遺伝子のノックアウトが致死的である場合に、または内因性遺伝子が、類似する機能もしくは重複する機能をコードする遺伝子群のメンバーである場合に有用である。後者の場合、関連する遺伝子は、単純なノックアウト体の表現型作用が遺伝子機能の有用な情報または正確な情報をもたらすことができないような階層的な様式または代償的な様式で相互作用し得る。そのような関連した遺伝子の一例が、細胞外のホルモンおよび神経伝達物質などの存在に対する細胞内の応答を制御するＧタンパク質シグナル伝達経路のタンパク質をコードする遺伝子によってもたらされる。本明細書中に記載されているように、ＲＧＳタンパク質はＧタンパク質シグナル伝達の構成成分であり、中枢（および末梢）神経系における神経伝達物質に対するニューロン応答を調節するように機能している。本発明において例示されるトランスジェニック動物は、Ｇタンパク質のシグナル伝達において機能的であるが、ＲＧＳに対して無感応であるトランスジーンの変化体タンパク質を有する。
【００１７】
分子生物学
本発明に従って、この分野の技術内において従来的な分子生物学、微生物学および組換えＤＮＡの技術を用いることができる。そのような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版（１９８９）、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（本明細書中では「Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）」）；ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、（１９８４）］；Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、（１９８６）］；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｉｅｄ　Ｃｅｌｌｓ　Ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　Ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ他（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照のこと。
【００１８】
分子生物学−定義
本明細書におけるトランスジーンは、プロモータ、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）および他のリボソーム結合部位配列、エンハンサー、応答因子、サプレッサー、シグナル配列、ポリアデニル化配列、イントロン、５’および３’非コード化領域などを含む、天然の調節（発現制御）配列が隣接しているか、または異種の配列と結合しているＧαサブユニットタンパク質のコード配列（例えば、ｃＤＮＡ、合成コード配列またはゲノムＤＮＡ）を含む。コード配列はまた、当業界で既知の多くの手段によって修飾することができる。そのような修飾の非限定的な例には、メチル化、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１つ以上をアナローグで置換すること、ならびに例えば、非荷電型結合を有する修飾（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、カルバメートなど）および荷電型結合を有する修飾（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）などのヌクレオチド間修飾が含まれる。ポリヌクレオチドは、１つ以上のさらなる共有結合した部分を含有することができ、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリＬ−リシンなど）、インターカレーター（挿入剤）（例えば、アクリジン、プソラレンなど）、キレート化剤（例えば、金属、放射活性金属、鉄、酸化性金属など）およびアルキル化剤などを含有することができる。ポリヌクレオチドは、メチルホスホトリエステル結合またはエチルホスホトリエステル結合またはアルキルホスホルアミデート結合を形成させることによって誘導体化することができる。さらに、本明細書中のポリヌクレオチドは、また、直接的または間接的のいずれかで検出可能なシグナルをもたらし得る標識で修飾することができる。例示的な標識として、放射性同位体、蛍光性分子、ビオチンなどが挙げられる。
【００１９】
「コード配列」またはＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素などの発現生成物を「コードする」配列は、発現したときに、そのＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産生をもたらすヌクレオチド配列である。すなわち、ヌクレオチド配列は、そのポリペプチド、タンパク質または酵素に対するアミノ酸配列をコードする。タンパク質に対するコード配列は開始コドン（通常の場合にはＡＴＧ）および停止コドンを含んでもよい。
【００２０】
用語「遺伝子」は、「構造遺伝子」とも呼ばれるが、１つ以上のタンパク質または酵素の全体または一部分を含むアミノ酸の特定の配列をコードするか、そのようなアミノ酸の特定の配列に対応するＤＮＡ配列を意味し、イントロン、および例えば、遺伝子が発現する条件に影響を及ぼす、プロモータ配列、５’非翻訳領域または３’非翻訳領域などの調節ＤＮＡ配列を含んでもよく、または含まなくてもよい。構造遺伝子ではない一部の遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡに転写され得るが、アミノ酸配列には翻訳されない。他の遺伝子は、構造遺伝子の調節因子として、またはＤＮＡ転写の調節因子として機能する。
【００２１】
「プロモータ配列」は、細胞内でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を規定するために、プロモータ配列は、転写開始部位によりその３’末端に結合し、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始させるために必要な最小数の塩基または因子を含むように上流（５’方向）に広がっている。プロモータ配列内には、転写開始部位（これは、例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いたマッピングによって都合よく定義される）が、ＲＮＡポリメラーゼの結合に関わるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）と共に見出される。プロモータは、エンハンサー配列およびリプレッサー配列を含む他の発現制御配列と作用的に会合させる（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）ことができる。
【００２２】
遺伝子発現を制御するために使用され得るプロモータには、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ（米国特許第５，３８５，８３９号および同第５，１６８，０６２号）、ＳＶ４０初期プロモータ領域（ＢｅｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９８１、２９０：３０４〜３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモータ（Ｙａｍａｍｏｔｏ他、Ｃｅｌｌ、１９８０、２２：７８７〜７９７）、ヘルペスのチミジンキナーゼプロモータ（Ｗａｇｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８１、７８：１４４１〜１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、１９８２、２９６：３９〜４２）；Ｇａｌ  ４プロモータ、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモータ、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモータ、アルカルホスファターゼプロモータなどの酵母または他の菌類に由来するプロモータ因子；ならびに視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子の制御領域などのニューロンまたは脳に特異的な発現を示す転写制御領域（Ｍａｓｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８６、２３４：１３７２〜１３７８）、ニューロンにおいて活性なＴｈｙ１．２「汎ニューロン」プロモータおよびシナプシンＩプロモータ（Ｈｏｗｌａｎｄ  Ｄ．、Ｓａｖａｇｅ  Ｍ．、Ｈｕｎｔｒｅｓｓ  Ｆ．、Ｗａｌｌａｃｅ  Ｒ．、Ｓｃｈｗａｔｚ  Ｄ．、Ｌｏｈ  Ｔ．、Ｍｅｌｌｏｎｉ  Ｒ．、ＤｅＧｅｎｎａｒｏ  Ｌ．、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  Ｂ．、Ｓｉｍａｎ  Ｒ．、Ｓｗａｎｓｏｎ  Ｍ．およびＳｃｏｔｔ  Ｒ．、１９９５、トランスジェニックマウスの脳における変異型および天然型のヒトＢ−アミロイド前駆体タンパク質、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ、１６：６８５〜６９９）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、次いでそのｍＲＮＡが（イントロンを含有する場合には）トランスＲＮＡスプライシングされ、そしてｍＲＮＡの場合にはコード配列によりコードされるタンパク質に翻訳されるとき、細胞内において転写制御配列および翻訳制御配列の「制御下」にあるか、または細胞内において転写制御配列および翻訳制御配列と「作用的に会合」している。
【００２４】
用語「発現する」および用語「発現」は、遺伝子またはＤＮＡ配列の情報が明らかになることを可能にするか、または生じさせることを意味し、例えば、対応する遺伝子またはＤＮＡ配列の転写および翻訳に関与する細胞機能を活性化することによってタンパク質を産生させることを意味する。さらに、本発明に関連して、発現には、ＧＰＣＲのシグナル伝達をＲＧＳタンパク質から脱共役することの顕示が含まれる。ＤＮＡ配列は細胞内または細胞によって発現され、タンパク質などの「発現生成物」を形成する。生じたタンパク質などの発現生成物自身は、また、「発現さ」れたと言うことができる。発現生成物は、細胞内、細胞外または分泌型として特徴付けることができる。用語「細胞内」は、細胞の内部に存在するものを意味する。用語「細胞外」は、細胞の外部に存在するものを意味する。物質は、その物質が細胞表面または細胞内部のどこかから細胞の外側に有効な量で出現するならば、細胞によって「分泌」されている。
【００２５】
用語「トランスフェクション」は、外来の核酸を細胞内に導入することを意味する。用語「形質転換」は、「外来」（すなわち、外因性または細胞外）の遺伝子、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をＥＳ細胞または前核に導入し、その結果、トランスジェニック動物において、細胞が、導入された遺伝子または配列を発現して、所望する物質を産生することを意味する。
【００２６】
用語「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列（例えば、外来の遺伝子）を宿主細胞（例えば、ＥＳ細胞または前核）に導入することができ、その結果、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進させるようにするビヒクルを意味する。
【００２７】
用語「異種」は、天然に存在しない因子の組み合わせをいう。例えば、異種のＤＮＡは、細胞内または細胞の染色体部位において天然には存在しないＤＮＡをいう。好ましくは、異種のＤＮＡは、細胞にとって外来の遺伝子を含む。異種の発現調節因子は、自然界で作用的に会合している因子とは異なる遺伝子と作用的に会合しているそのような因子である。
【００２８】
本発明における用語「変異型」および「変異」は、Ｇαサブユニットタンパク質をコードする遺伝物質、例えば、ＤＮＡにおける任意の検出可能な変化、あるいはＧαサブユニットをＲＧＳタンパク質から部分的または完全に脱共役することを伴うそのような変化の任意のプロセス、機構または結果を意味する。これには、遺伝子の構造（例えば、ＤＮＡ配列）が変化している遺伝子の変異、何らかの変異プロセスから生じる任意の遺伝子またはＤＮＡ、および修飾された遺伝子またはＤＮＡ配列によって発現される任意の発現生成物（例えば、タンパク質または酵素）が含まれる。用語「変化体」も、また、修飾されたか、または変化した遺伝子、ＤＮＡ配列、酵素、細胞など、すなわち、任意の種類の変異型を示すために使用される。そのような変異の具体的な例として、マウスＧαｑタンパク質の１８８位におけるグリシンからセリンへの置換に対応する変異、および３０２位におけるグリシンからセリンへの置換を生じさせる酵母Ｇｐａ１における変異に対応するＧαｉ変異が挙げられる。
【００２９】
本明細書中で使用されているように、すべてのその文法的形態および綴り変化形における用語「相同的」は、スーパーファミリー（例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー）に由来するタンパク質および異なる種に由来する相同的なタンパク質（例えば、ミオシン軽鎖など）を含む、「共通した進化的起源」を有するタンパク質間の関係をいう（Ｒｅｅｃｋ他、Ｃｅｌｌ、５０：６６７、１９８７）。そのようなタンパク質（およびそのコード遺伝子）は、保存された位置におけるパーセント類似性または特定の残基またはモチーフの存在の点から、それらの配列類似性によって反映されるように、配列相同性を有する。特に、Ｇαサブユニットタンパク質は相同的であり、特にＧαｑファミリーおよびＧαｉファミリーは相同的である。同様に、ＲＧＳタンパク質は、特にＲＧＳドメインに関して相同的である（ＲｏｓｓおよびＷｉｌｋｉｅ、上記）。
【００３０】
Ｇαサブユニットタンパク質およびＲＧＳタンパク質
本発明は、変異型Ｇαサブユニットタンパク質の発現または正常なＧαサブユニットタンパク質の過剰発現を提供し、その結果、ＧαによるＧＴＰの結合を変化させることなく、またはＧＰＣＲにリガンドが結合したときのそのシグナル伝達能を変化させることなく、Ｇタンパク質により媒介されるシグナルがＲＧＳタンパク質による調節から脱共役されるようになる。これは、Ｇαタンパク質における変異が、１つ以上のＲＧＳタンパク質と相互作用するその能力を低下させるか、または除去されている場合に生じる。これは、また、Ｇαサブユニットが過剰発現しているときも生じ、その結果、Ｇタンパク質複合体と会合していない一部のＧαが１つ以上のＲＧＳタンパク質と結合し、その複合体によりシグナル伝達を調節することが妨げられる。
【００３１】
具体的な実施形態において、変異型Ｇαタンパク質は、ネズミＧαｑのアミノ酸残基１８８または酵母Ｇｐａ１のアミノ酸残基３０２に対して相同的な位置におけるグリシンからセリンへの置換を含有する。変異型の他の例には、例えば、２０５位のグルタミンがロイシンで置換されているＧαｚが挙げられる（Ｑ２０５Ｌ）。
【００３２】
Ｇタンパク質複合体において機能することに加えて、本発明のＧα変異型は、低下した親和性または全く親和性なしでＲＧＳタンパク質のＲＧＳドメインを結合する。従って、ＲＧＳタンパク質はＧα活性を調節しない。すなわち、ＲＧＳタンパク質は、Ｇαサブユニットタンパク質に結合したＧＴＰの加水分解速度の増大を媒介しない。ＲＧＳタンパク質は、上記に、そしてＲｏｓｓおよびＷｉｌｋｉｅ（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００、６９：７９５〜２７）およびＺｈｅｎｇ（ＴＩＢＳ、１９９９、２４：４１１〜１４）に記載されている。ＲＧＳタンパク質の特に好ましいサブファミリーには、ＲＺ、Ｒ４、Ｒ７およびＲ１２のファミリーが挙げられる。従って、本発明のトランスジェニック動物において使用されるＧαの変異型変化体は、シグナル機能を阻害することなく１つ以上のＲＧＳタンパク質に対する結合の低下または除去によって容易に同定することができる。
【００３３】
トランスジェニック動物の調製
トランスジェニック動物は、当業者に既知のいくつかの方法で作製することができる。１つの方法は、受精した卵母細胞をメスの動物から採取することを含む。その後、所望する外来ＤＮＡまたはトランスジーンを卵母細胞に入れることができる。トランスジーンを卵母細胞に入れることは、適切なレトロウイルスベクターを介することなどのいくつかの方法によって、またはマイクロインジェクションによって達成することができる。
【００３４】
上記に記したように、任意のトランスジェニック動物を使用することができる。特に行動応答について十分に研究されているので、ラット（または任意の種、これには、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｌａｂｓ）、Ｌｏｎｇ  Ｅｖａｎｓ（Ｔａｃｏｎｉｃ）、Ｆｉｓｃｈｅｒ３４４（Ｔａｃｏｎｉｃ）およびＷｉｓｔｅｒ（Ｔａｃｏｎｉｃ）が含まれる）が好ましい。それらの近い進化的関係のために、マウスもまた有用である。マウスの系統には、ＢＡＬＢ／Ｃ、ＢＬ−６、ＤＢＡ／２などが挙げられるが、これらに限定されない。Ｔａｃｏｎｉｃに加えて、好適なラット、マウスおよび他の動物が、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、および認定された動物管理施設におけるコロニーから入手することができる。
【００３５】
トランスジェニック動物、特に、マウスまたはラットを作出する技術は十分に知られている（Ｇｏｒｄｏｎ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｌｏｇｙ、１９８９、１１５：１７１〜２２９）。トランスジーンを導入する様々な方法を利用することができ、１９７３年に開発された細胞内への核酸のマイクロインジェクション（この技術において、１９８０年現在、遺伝子移入頻度は５％〜２０％の範囲である）、レトロウイルスベクター法、および胚性幹（ＥＳ）細胞への遺伝子移入が含まれる。特に、ＥＳ技術は培養状態にある細胞の操作を可能にした（ＢｒａｎｄｌｅｙおよびＬｉｕ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９６、１４：１２１）もまた参照のこと）。例えば、Ｃａｐｅｃｃｈｉは、胚、胎児または成体の多能性幹細胞にトランスジーンを取り込ませることができる方法を開発した（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１９９１、１２８８〜１２９２）。Ｃａｐｅｃｃｈｉの方法では、胚性幹細胞が、インビトロ（生体外）で培養されている胚盤胞から単離されている。この胚性幹細胞は、分化することなく多数の細胞世代にわたって培養状態で安定に保つことができる。その後、トランスジーンをエレクトロポレーション（電気穿孔法）または他の形質転換方法によって胚性幹細胞に取り込ませることができる。トランスジーンを担持する幹細胞が選択され、胚盤胞の内部細胞塊に注入された。その後、胚盤胞が偽妊娠のメスに移植された。胚盤胞の内部細胞塊の細胞は必ずしもすべてがトランスジーンを担持するわけではないので、動物はトランスジーンに関してキメラである。このキメラな動物を交雑することにより、トランスジーンを担持する動物の作製が可能になる。このプロセスの概略がＣａｐｅｃｃｈｉ（Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９８９、５：７０〜７６）によって示されている。
【００３６】
遺伝子発現の制御は、当業界で既知の様々な手段により達成される。トランスジーンの発現は、典型的には、与えられた条件設定に対して、例えば、与えられた化合物の存在、または規定された物質、または組織タイプもしくは温度などの環境条件の変化に対して応答し得るプロモータを選ぶことによって既知の手段により誘導的または抑制的であるように構成的であり得るか、または調節することができる。本明細書中に記載される例では、変異型Ｇαｑのコード配列は、ニューロン特異的なプロモータであるＴｈｙ１．２、つまり既知の汎ニューロン組織特異的プロモータと組み合わせられる。用語「誘導的発現」は、遺伝子発現を規定された条件のもとで生じさせるための任意の手段にまで拡張される。手段および条件の選択は、都合良さおよび宿主生物の適切性に基づいて選ばれる。
【００３７】
形質転換は、生物に依存し、生物細胞およびその生物学の特性に依存して、様々な既知の技術によって行うことができる。安定した形質転換は細胞内および細胞核内へのＤＮＡエントリーを伴う。単一の細胞から再生させることができる生物の場合（いくつかの哺乳動物が含まれる）、形質転換はインビトロ培養で行うことができ、続いて、形質転換体の選択および形質転換体の再生が行われる。ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞内に移すためによく使用される方法には、マイクロインジェクション、パーティクルガン撃ち込み、カチオン性脂質またはリポソームまたは他の担体物質とのＤＮＡ複合体またはＲＮＡ複合体の形成、エレクトロポレーション、および形質転換するＤＮＡまたはＲＮＡをウイルスベクターに入れることが挙げられる。他の技術が当業界では知られている。形質転換の最新技術の総説については、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、これらはすべてＡｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｎ．Ｙ．）によって発行されている、などの標準的な参考書籍を参照のこと。細胞核内へのＤＮＡ移入は細胞プロセスによって生じ、細胞内のトランスポゼースまたはリコンビナーゼにより作用し得る組込み部位配列を含ませることによって、適切なベクターを選ぶことにより促進され得る場合がある（例えば、［Ｃｒａｉｇ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９８８、２２：７７；Ｃｏｘ、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ（Ｒ．ＫｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉおよびＧ．Ｒ．Ｓｍｉｔｈ編）、１９８８、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、４２９頁〜４９３頁；Ｈｏｅｓｓ、Ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．ＥｃｋｓｔｅｉｎおよびＤ．Ｍ．Ｊ．Ｌｉｌｌｅｙ編）、第４巻、１９９０、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、９９頁〜１０９頁を参照のこと］。多細胞生物の直接的な形質転換は、多くの場合、生物の胚段階で行うことができる。例えば、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ならびに他の昆虫では、一部が生殖系列の細胞の核になる多数の核にＤＮＡが組み込まれる多核段階の胚にＤＮＡをマイクロインジェクションすることができる。形質転換するＤＮＡの成分としてマーカーを組み入れることによって、最初の形質転換体個体のキメラでない子孫の昆虫を同定し、飼育することができる。卵細胞または胚細胞へのＤＮＡの直接的なマイクロインジェクションもまた、多くの種を形質転換するために効果的に用いられている。マウスでは、インビトロで培養することができる多能性胚性幹（ＥＳ）細胞の存在が、形質転換マウスを作製するために利用されている。ＥＳ細胞は培養状態で形質転換することができ、次いでマウスの胚盤胞にマイクロインジェクションすることができ、胚盤胞において、ＥＳ細胞は発達中の胚に一体化し、最終的には生殖系列のキメラを生成する（例えば、Ｈａｒｅｎ他、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９９、５３：２４５〜２８１；Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．��ｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９９、２６６（３）：７２９〜７３４；Ｉｖｉｃｓ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｄ．１９９９、６０：９９〜１３１；Ｈａｌｌ他、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１９９７、Ｓｅｐ：２１（２）：１５７〜１７８；Ｃｒａｉｇ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９７、６６：４３７〜４７４；Ｂｅａｌｌ他、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１９９７、１１（１６）：２１３７〜２１５１を参照のこと）。同じ親からのヘテロ接合の子を相互に交配することによって、所望する遺伝子を担持するホモ接合動物を得ることができる。
【００３８】
一般に、本発明のトランスジェニック動物には、ヒトを除く任意の形質転換可能な種が含まれる。特に注目されるものは、マウス、ラット、ヒツジおよびブタその他などの既知の形質転換可能な種を含む哺乳動物であり、形質転換方法が開発されているので、ウシおよびヒト以外の霊長類、ならびにＣ．ｅｌｅｇａｎｓ、ゼブラ・フィッシュおよび酵母（Ｓ，ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）などのモデル生物が含まれる。
【００３９】
表現型
本明細書中で使用されているように、用語「表現型」は、広範囲のＧＰＣＲシグナル伝達などの生化学的特徴、すなわち、ＧＰＣＲシグナル伝達のＲＧＳタンパク質調節の脱共役による生化学的特徴、様々な化合物およびＧＰＣＲに対する増大した感受性のような動物におけるそのような脱共役の物理的顕示による生化学的特徴、動物における行動変化を包含する。本明細書中で使用されているように、用語「脱共役」は、Ｇα変異型の作用によってまたはＧαの過剰発現によって、Ｇαタンパク質とのＲＧＳタンパク質相互作用の阻害または遮断を意味する。
【００４０】
トランスジェニック動物を特徴付けるために使用することができ、トランスジェニック動物および本発明の方法において使用される動物の治療的症状を測定するために使用することができる様々な行動試験が当業者には知られている。そのような行動試験には、オープンフィールド、全般的な評価、体重、食物摂取、驚愕およびプレパルス阻害、状況的恐怖条件付けおよび聴覚刺激条件付け、ショックに対する応答性、薬理学的応答ならびに運動活動が含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明のトランスジェニック動物の使用
本発明のトランスジェニック動物は、ＲＧＳ機能を遮断する化合物または組成物、あるいはＧαのシグナル伝達を活性化または延ばす化合物または組成物を同定するために使用することができる。これは本明細書中において「調節活性」と定義される。特に、本発明のトランスジェニック動物は、精神活性薬物の薬理学的作用の範囲を分析するために有用であり、神経細胞および脳の機能の調整および調節におけるＧタンパク質の活性および相互作用を測定するための研究道具として有用である。そのような理解は、うつ病、不安、強迫性障害、多動性、睡眠障害、精神病、精神分裂病、認知障害、痛み、気分障害、摂食障害、自閉症、注意欠陥障害、双極性情動障害などを含む、これらに限定されないが、神経障害および脳障害を処置する薬理学的薬剤の設計および試験には不可欠である。
【００４２】
ＲＧＳ無感応なトランスジェニックラットの表現型を模倣する薬剤
本出願において示される結果は、ＲＧＳ無感応性のＧαｑ変異型トランスジェニックラットと野生型ラットのリチウム処置との間で認められる類似点を裏付けている。これにより、ＲＧＳ機能を調節すること（すなわち、遮断すること）ができる薬剤（例えば、小分子、ペプチド、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド）が、双極性情動障害などの、リチウムによって処置される疾患を処置するために使用されることを示している。
【００４３】
本明細書中に記載されている動物の比較使用は、新規な治療薬を同定するために使用することができる。例えば、未知の薬剤（化合物またはペプチドなど）を、処置されていない正常なラット、リチウムにさらされた正常なラット、および処置されていないトランスジェニックラットに（様々な濃度を使用して）投与することができる。動物は、薬剤の効果について、本明細書中に記載されているように、行動分析（これに限定されない）に類似する多数の試験で評価される。
【００４４】
リチウム表現型に対する重要な試験は、そのすべてがＧｑにより媒介される受容体シグナルにつながっているＲＯ食物摂取、ＤＯＩ頭振りおよびピロカルピンコリン作動性徴候を含むＩＰ３経路に特異的に関連する試験である。これらは、リチウムの作用に対するつながりを確立するための好ましい最小限の試験である。
【００４５】
１つの実施形態において、処置されていないコントロールのラットには試験化合物またはビヒクルが投与され、一方、トランスジェニックラットにはビヒクルのみが投与される。本明細書中に記載される試験などの試験の１つ以上の行動表現型または他の表現型の特徴付けを使用してこれらの３つの群（野生型＋ビヒクル、野生型＋化合物、トランスジェニックラット＋ビヒクル）を比較することによって、行動の違いをスコア化することができる。トランスジェニックラット＋ビヒクルと類似するスコアをもたらした潜在的な薬剤が投与された野生型動物により、トランスジェニックラットで観察される機構と類似する機構を介して機能する薬剤が同定される。トランスジェニック動物におけるこれらの試験の結果が、処置群で得られる結果と実質的に同じである場合、その薬物は、ＲＧＳ経路において相互作用するように相互作用し、例えば、双極性障害を処置するために使用することができる。本明細書中で使用されているように、用語「実質的に同じ」は、同じ定性的変化（表現型の変化）または定量的変化（効力の変化）を意味する。例えば、トランスジェニックラットおよびリチウム処置ラットはともに、ＤＯＩに対する増大した感受性（定性的変化）を有し、そしてＲＯおよびピロカルピンの効力における類似する変化（定量的変化）を有する。
【００４６】
【実施例】
下記の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態の例示として示され、本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
実施例１：トランスジーンのクローニング
ＧαｑのＧ１８８ＳトランスジーンのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅およびクローニング
プラスミドｐｃＤＮＡａｍｐＧｑｓｓｔ（ＤｉＢｅｌｌｏ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８、２７３：５７８０〜５７８４）をテンプレートとして使用して、マウスＧαｑのｃＤＮＡの１．１ｋｂフラグメントをＰＣＲ増幅した。Ｇｑｓｓｔは、アミノ酸残基１８８におけるグリシン残基をセリンへの変換させる（Ｇ１８８Ｓ）ヌクレオチド位５７３におけるＧからＡへの変換と、ヌクレオチド位５７５におけるＧからＣへの変換とを含有する（図１を参照のこと）。さらに、数個のヌクレオチド変化がこの変異の５’側に組み込まれ、内因性のＧαｑアミノ酸配列部分を、抗ＥＥ抗血清を使用して変異型Ｇαｑタンパク質の検出を可能にするＥＥエピトープ標識のアミノ酸配列部分に変換させた（図１）。「ＥＥ」は、市販のマウスモノクローナル抗体Ｇｌｕ−Ｇｌｕ（Ｂａｂｃｏ、Ｂｅｒｋｌｅｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）によって認識されるエピトープの一部分である２つのグルタミン酸からなる配列をいう。この抗体は、配列ＣＥＥＥＥＹＭＰＥに対して惹起された（ｗａｓ  ｒａｉｓｅｄ）が、６アミノ酸の配列ＥＹＭＰＭＥまたは配列ＥＦＭＰＭＥのどちらに対しても特異的である。ＥＥエピトープは、機能を変化させることなく多くのＧタンパク質内に挿入可能であることが知られている。プライマー（表１にまとめられている）のＤＨ１、ＤＨ２、ＤＨ３およびＤＨ４を、１．１ｋｂの変異型ＧαｑのＤＮＡをＰＣＲ増幅するために、エロンガーゼポリメラーゼ（ＢＲＬ）を用いた重複ＰＣＲにおいて使用した。プライマーＤＨ１は、ＧαｑのｃＤＮＡの５’末端内に組み込まれたコンセンサスＫｏｚａｋ配列（ＣＣＡＣＣＡＴＧ）のすぐ上流にＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ配列を含有する。プライマーＤＨ４は、ＴＡＡ停止コドンと重なり、またＸｈｏＩ制限部位を含有し、１．１ｋｂのＰＣＲ生成物をＸｈｏＩ制限フラグメントとしてクローン化することができる。最初のＰＣＲにおいて、ＤＨ１およびＤＨ２のプライマーを使用して、９２６ｂｐの位置におけるＴがＣに変換され、内因性のＸｈｏＩ制限部位が破壊されたヌクレオチド０．９ｋｂのＤＮＡフラグメントを作製した。ＤＨ３およびＤＨ４のプライマーを使用して、破壊されたＸｈｏＩ部位においてＤＨ１／ＤＨ２生成物と部分的な重なりを有するＧαｑ  ＤＮＡの３’末端の０．２ｋｂを作製した。第２のＰＣＲ工程を、ＤＨ１／ＤＨ２生成物およびＤＨ３／ＤＨ４生成物ならびに外側プライマーのＤＨ１およびＤＨ４を使用して行い、ＸｈｏＩ制限部位が両側に位置する最終的な１．１ｋｂの変異型ＧαｑのｃＤＮＡを作製した。この１．１ｋｂのＸｈｏＩフラグメントを、１％アガロースゲルを使用して電気泳動し、Ｇｅｎｅ−Ｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ−１０１）によって溶出して、ベクターｐＧｅｍＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）にサブクローン化した。ＤＮＡ配列分析により、１．１ｋｂのＧαｑのｃＤＮＡが本物であり、１８８位におけるグリシンからセリンへの変化（Ｇ１８８Ｓ）変異について予想されたヌクレオチド変化、ならびに組み込まれたＥＥエピトープ標識および修飾されたＫｏｚａｋコンセンサス配列を含有することが確認された。
【００４８】
【表１】
2004500843.tif 000003
【００４９】
実施例２：組織特異的なトランスジーン発現構築物の構築
Ｔｈｙ１．２−Ｇαｑ（Ｇ１８８Ｓ）のクローニング
プラスミドＧαｑ（Ｇ１８８Ｓ）−ＧｅｍＴをＸｈｏＩで切断し、１．１ｋｂのＧαｑのｃＤＮＡを１％アガロースゲルから切り出し、製造者のプロトコルに従ってＧｅｎｅ−Ｃｌｅａｎ（Ｂｉｏ−１０１）によって溶出した。ｐＵＣ１９にクローン化されている６．７ｋｂのＮｏｔＩ−ＰｖｕＩのマウスＴｈｙ１．２ミニ遺伝子を含有するプラスミドＴｈｙ１．２は以前に記載された。１．１ｋｂのＧαｑのＤＮＡを、ＸｈｏＩで切断され、５’端のリン酸基末端を除くために子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理されたＴｈｙ１．２ベクターＤＮＡに連結した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９８２）。Ｔｈｙ１．２発現カセットのＸｈｏＩクローニング部位において正しい配向で１．１ｋｂの変異型ＧαｑのｃＤＮＡを含有するクローンＴｈｙ１．２−Ｇαｑ（Ｇ１８８Ｓ）を制限マッピングならびにＤＮＡ配列分析によって確認した（図２参照）。
【００５０】
実施例３：トランスジェニックラットの調製
ＤＮＡマイクロインジェクション用トランスジーンの調製
構築物Ｔｈｙ１．２−ＧαｑＧ１８８ＳのＤＮＡ（１００マイクログラム）をＮｏｔＩおよびＰｖｕＩの制限酵素で３７℃において一晩切断した。ＤＮＡを１％低融点アガロースゲル（ＢＲＬ）で電気泳動し、７．８ｋｂのＴｈｙ１．２−ＧαｑＧ１８８ＳトランスジーンＤＮＡを、ｐＵＣ１９ベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｂｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）骨格の制限から生じたそれよりも小さいサイズの２ｋｂおよび１ｋｂのフラグメントから分離した。７．８ｋｂのフラグメントをＬＭＰゲルから切り出し、７０℃に加熱して、アガロースを融解した。液状化したら、等容量のフェノールを使用して、ゲル混合物を抽出した。水性部分を、フェノール−クロロホルム混合物を使用して抽出し、次いでクロロホルムを使用して抽出した。その後、水性画分を、２容量の９５％エタノールを使用して沈殿させ、続いて７０％エタノールで洗浄した。ＤＮＡペレットを２．５ｍｌのＴＥ緩衝液に再懸濁した。１グラムの塩化セシウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をＤＮＡ−ＴＥ混合物の１ｍｌ毎に加え、穏やかに溶解した。臭化エチジウム（１０ｍｇ／ｍｌ）を０．７４ｍｇ／ｍｌの最終濃度に加えて、サンプルを３．９ｍｌのヒートシール可能な超遠心分離チューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ）に充填し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｏｐｔｉｍａｘ卓上型超遠心分離機で１００，０００ｒｐｍにおいて２５℃で４時間遠心分離した。線状のＴｈｙ１．２−ＧαｑＧ１８８ＳをＣｓＣｌグラジエント（勾配）から溶出し、そして臭化エチジウムを除くためにイソプロパノールで５回抽出した。その後、ＤＮＡをマイクロインジェクション緩衝液（５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ）に対して一晩透析した。透析したＤＮＡをマイクロインジェクションのために２ｍｇ／ｍｌに希釈した。
【００５１】
トランスジェニックラットの作製
トランスジェニックラットを、（Ｈｏｇａｎ他、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；１９８６）により記載された手法の改変法を使用して作製した。マイクロインジェクション用のガラス製ニードルを、マイクロピペット引張り機およびマイクロ加熱炉を使用して調製した。Ｈｏｆｆｍａｎ変調位相差光学系を有し、かつＮａｒａｓｈｉｇｉマイクロマニピュレーターおよびＮ２により駆動されるピコインジェクター（Ｎａｒａｓｈｉｇｉ）を有するＮｉｋｏｎ顕微鏡を使用して注入を行った。
【００５２】
受精したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット胚を、過剰排卵処理されたメスラットの卵管から手術によって取り出し、Ｍ２培地に入れた。丘細胞を、ヒアルロニダーゼを３００μｇ／ｍｌで用いて胚から除いた。その後、胚を新鮮なＭ２培地で洗浄し、注入前に３７℃で貯蔵するためにＭ１６培地に移した。ＤＮＡ溶液を雄性前核に注入した後、胚を、精管切除したオスと交尾させることによって偽妊娠させたアバルチン麻酔のＳＤ被移植体メスに移植した。胚を出産まで発達させて、新生児ラットを、下記に記載されているように、トランスジーンの存在について分析した。
【００５３】
始祖体の同定
トランスジーンに特異的なポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、始祖体のトランスジェニックラットをスクリーニングするために開発した。ＰＣＲ分析用のサンプルを得るために、ラットの尾の生検を生後６日目〜８日目に行い、生検物を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＳＤＳ、１．６ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含有するプロテイナーゼＫ緩衝液中において５６℃で一晩消化した。その後、抽出物を１４，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、残渣を除いた。ＰＣＲを準備するために、プロテイナーゼＫ消化サンプルを水で１：２００に希釈し、その後、９５℃で１５分間加熱した。その後、希釈された熱不活化サンプルの１μｌをＰＣＲ反応において使用した。ＤＨ１６プライマー配列は、Ｔｈｙ１．２−Ｇαｑトランスジーンの第２エキソン内のＡＴＧ翻訳開始コドンの約１００ｂｐ上流に位置する。プライマーＤＨ１４は、Ｇαｑコード配列内のＡＴＧ開始の３’側の３１８ｂｐに位置する。ＰＣＲ増幅を、ＰＣＲスーパーミックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、２２ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．４、５５ｍＭのＫＣｌ、１．６５ｍＭのＭｇＣｌ２、２２０μＭの各ヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ）、２２ユニットの組換えＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、および１μｌのＤＮＡサンプルを使用して行った。ＰＣＲは、下記の工程条件を使用して行われた。ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ２０００サーモサイクラーを使用して、９４℃で５分間の１サイクル、その後、９４℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間の３０サイクル、その後、７２℃で７分間、そして４℃で浸し保存。４２０ｂｐのＰＣＲ生成物を２％Ｎｕｓｉｅｖｅアガロース−１％Ｓｅａｋｅｍアガロースゲル（ＦＭＣ）で分離した。
【００５４】
合計で１１匹の始祖体ラットが、トランスジーン特異的ＰＣＲを使用して同定された。これらのうちの１０匹が、組み込まれたトランスジーンＤＮＡを含有することが、サザンブロット分析（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、１９７８）によって確認された。始祖体番号８０は遺伝子導入体でないことが後に明らかにされた。２匹の始祖体（＃３７、＃６７）は、性的な成熟に達する前に死亡した。しかしながら、残る８匹の始祖体はすべて、野生型と交配したときに、遺伝子導入されたｆ１子孫をもたらした。
【００５５】
実施例４：トランスジェニックマウスの調製
トランスジーンの調製およびＤＮＡのマイクロインジェクション
上記の実施例３に記載されるように、構築物Ｔｈｙ１．２−ＧαｑＧ１８８ＳのＤＮＡ（１００マイクログラム）を得て、処理した。この構築物は、ネズミの配列であるので、トランスジェニックマウスを作製するために、トランスジェニックラットを作製するための上記の実施例３に記載されているのと同じように使用される。
【００５６】
トランスジェニックマウスは、（Ｈｏｇａｎ他、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；１９８６）により記載された手法の改変法を使用して作製される。マイクロインジェクション用のガラス製ニードルが、マイクロピペット引張り機およびマイクロ加熱炉を使用して調製される。注入は、Ｈｏｆｆｍａｎ変調位相差光学系を有し、かつＮａｒａｓｈｉｇｉマイクロマニピュレーターおよびＮ２により駆動されるピコインジェクター（Ｎａｒａｓｈｉｇｉ）を有するＮｉｋｏｎ顕微鏡を使用して行われる。
【００５７】
受精したマウス胚を、過剰排卵処理されたメスマウスの卵管から手術によって取り出して、Ｍ２培地に入れる。丘細胞を、ヒアルロニダーゼを３００μｇ／ｍｌで用いて胚から除く。その後、胚を新鮮なＭ２培地で洗浄して、注入前に３７℃で貯蔵するためにＭ１６培地に移す。ＤＮＡ溶液を雄性前核に注入した後、胚は、精管切除したオスと交尾させることによって偽妊娠させたアバルチン麻酔のＳＤ被移植体メスに移植される。胚を出産まで発達させ、新生児マウスを、下記に記載されているようにトランスジーンの存在について分析する。
【００５８】
実施例５：トランスジーン発現の分析
Ｔｈｙ１．２−Ｇαｑ遺伝子導入系統の発現分析
ラットにおける変異型Ｇαｑトランスジーンの発現レベルおよび発現部位を測定するために、トランスジーンに由来するＧαｑと内因性のラットＧαｑとの両方を検出することができるＲＮａｓｅ保護アッセイを、Ｔｈｙ１．２−Ｇαｑ遺伝子導入系統のそれぞれに対して、脳、ならびに肝臓、腎臓、脾臓および心臓を含む末梢組織について行った。マウスＧαｑのｃＤＮＡの２２１ｂｐフラグメントを、Ｇ１８８Ｓ変異と共にＧαｑのＥＥエピトープ標識を包含するプライマーのＤＨ１０およびＤＨ１５を使用するＰＣＲによって増幅した。２２１ｂｐ生成物を、プラスミド１０１５／ＧｅｍＴを得るためにｐＧｅｍＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローン化することによって、ＤＮＡ配列分析により確認した。プラスミド１０１５／ＧｅｍＴを、ｐＧｅｍＴベクターのポリリンカー内の挿入物の５’末端におけるＮｃｏＩで線状化し、リボプローブ合成用のテンプレート（鋳型）として使用した。リボプローブを、インビトロ転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）および販売者により記載されているプロトコルを使用して合成した。３１９塩基のリボプローブ（２２１塩基のＧαｑ＋９８塩基のポリリンカー配列）を、１０ｍＭのＤＴＴ、それぞれが０．０５ｍＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、１０μＭの３２Ｐ標識ＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ；６００Ｃｉ／ｍｍｏｌの活性）、１μｇのＮｃｏＩ線状化１０１５／ＧｅｍＴ、および５ユニットのＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを含有する１×転写緩衝液において３７℃で１時間合成し、その後、ＲＱ１  ＤＮＡｓｅを用いて３７℃で３０分間処理した。標識されたＲＮＡをＧ５０スピンカラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で分離して、溶出液を液体シンチレーションによって数えられた。
【００５９】
ＲＮＡｓｅ保護アッセイを、ＲＮＡｓｅ  Ａ／Ｔ１ミックスを使用して、以前に記載（Ｈｏｗｌａｎｄ他、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ａｇｉｎｇ、１９９５、１６：６８５〜６９９）したように行った。総ＲＮＡを、以前の記載（Ｈｏｗｌａｎｄ他、上記）したように、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、全脳または心臓、肝臓、腎臓、胸腺から単離した。ＲＰＡの生成物を５％ポリアクリルアミド／８Ｍ尿素ゲルで電気泳動し、その後、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に一晩感光させた。トランスジーンＧαｑバンドおよび内因性Ｇα××ｑバンドの定量を、Ｓｔｏｒｍホスホイメージャー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して行った。比較のために、ニューロン特異的なラットのシナプシンＩプロモータ（Ｈｏｗｌａｎｄ他、上記）によって駆動される変異型ＧαｑのｃＤＮＡを有するトランスジェニックラットもまたＲＰＡアッセイにおいて分析された。
【００６０】
ＲＮＡｓｅ保護を使用することにより、トランスジーンに由来するＧαｑのｍＲＮＡを表す予想される２２１塩基の保護された生成物が、すべてのＴｈｙ１．２−Ｇαｑ遺伝子導入体の脳サンプルで明らかになった。８０塩基〜１２０塩基のより小さい分子量の生成物は、内因性のマウスＧαｑのｍＲＮＡが保護されていることを表している。比較のために、ニューロン特異的なラットのシナプシンＩプロモータ（Ｈｏｗｌａｎｄ他、上記）によって駆動される変異型ＧαｑのｃＤＮＡを有するトランスジェニックラットもまたＲＰＡアッセイにおいて分析された。それぞれの場合において、マウスＴｈｙ１．２プロモータから駆動される変異型ＧαｑのＲＮＡの発現は、Ｓｙｎ−Ｇαｑ遺伝子導入系統のいずれかから見られる発現よりも強固であった。２２１塩基の保護されたＧαｑトランスジーンＲＮＡ生成物は、脳以外の調べられた組織のいずれにおいても明らかではなく、Ｔｈｙ１．２ミニ遺伝子カセットの発現がＣＮＳおよびＰＮＳに限定されていることが確認される（Ｃａｒｏｎｉ，Ｐ．１９９７、成体のトランスジェニックマウスのニューロンにおける成長関連タンパク質の過剰発現、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、７１（１）：３〜９）。脳におけるＧαｑトランスジーン発現の定量は、６７、７６および７７の系統が、脳における内因性のラットＧαｑのｍＲＮＡよりも高いレベルで発現していることを示している。５８および７５の系統は匹敵するレベルで発現しているが、１１および７０の系統は、脳における内因性のＧαｑに対して、より低いレベルのトランスジーンＧαｑのｍＲＮＡを発現している。
【００６１】
Ｇαｑタンパク質発現の免疫ブロット
ラットをＣＯ２で安楽死させ、断頭した。その後、脳を取り出し、ドライアイスで直接凍結した。ウエスタンブロット分析のために、動物あたり半分の脳を５ｍｌの１×ＲＩＰＡ溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、１％のトリトンＸ−１００（ｘ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）、０．２５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのベンゾアミジン（Ｓｉｇｍａ）、０．０５ｍＭのロイペプチン（Ｓｉｇｍａ）、０．０２ｍＭのペプスタチンＡ（Ｓｉｇｍａ））においてホモジネートした。抽出物を１４，０００×ｇで遠心分離して、上清を取り出して、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７６、７２：２４８〜２５４）によって総タンパク質濃度をアッセイした。５０ｍｇの総タンパク質を８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して、ニトロセルロースにブロッティング（吸着）した（Ｈｏｗｌａｎｄ他、上記）。フィルターを、５％の脱脂乳を含有するＴＢＳ中で一晩ブロッキング（遮断）し、その後、１：１０００のウサギ抗Ｇαｑ／Ｇ１１抗体または１：５００のマウス抗ＥＥ抗体（Ｂｅｒｋｌｅｙ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏ．）のいずれかで室温において４時間処理した。０．０５％のツィーン２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート）を含有するＴＢＳで連続的に洗浄した後、ブロットを、西洋ワサビペルオキシダーゼに接合させた（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）ヤギ抗ウサギＩｇＧまたはヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢｉｏＲａｄ、１：２０００）のいずれかと１時間インキュベーションした。ＴＢＳ／０．０５％ツィーン２０で連続的に洗浄した後、フィルターをＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で処理して、Ｘ線フィルムに感光させ、バンドを可視化した。
【００６２】
トランスジーンのタンパク質生成物の検出を、遺伝子導入体の脳サンプルのそれぞれからの強い免疫反応シグナルを検出するために抗ＥＥ抗血清を使用して測定した。ＧαｑおよびＧ１１の両方をウエスタンブロットによって認識するポリクローナル抗体を使用して、Ｔｈｙ１．２−Ｇαｑトランスジェニックラットの脳における変異型Ｇαｑの発現もまた検出された。Ｔｈｙ１．２−Ｇαｑ遺伝子導入体からの脳抽出物は、非遺伝子導入体（ＳＤ）の脳サンプルと比較したとき、Ｇαｑタンパク質が過剰発現していることを示している。非常に高いレベルの変異型Ｇαｑタンパク質が、Ｔｈｙ１．２−Ｇαｑ系統の５、６７および７６からの脳において検出された。これは、ＲＮａｓｅ保護アッセイによって測定された高いｍＲＮＡレベルと一致している。これらのデータは、Ｔｈｙ１．２プロモータから駆動されるＧαｑが、脳におけるＧαｑの正常な内因性レベルを上回って過剰発現し得ることを示している。
【００６３】
インサイチュー分析
ラット脳のサブ領域におけるトランスジーンＧαｑのＲＮＡ発現を突き止めるために、インサイチューハイブリダイゼーション分析を、Ｔｈｙ１．２−ＧαｑＧ１８８Ｓの１１、５８、６７、７５および７６の系統を使用して行った。動物をＣＯ２で安楽死させ、その後、断頭して、脳を取り出し、ドライアイスで凍結して、−７０℃で保存した。脳の切片をＢｒｉｇｈｔのＯＴＦ型クライオスタットにおいて冠状面で切断した。インサイチューハイブリダイゼーションを本質的には以前に記載（Ｌｅｗｉｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１９９３、１９６：５５３〜６０）されているように行った。固定された（ｍｏｕｎｔｅｄ）切片をパラホルムアルデヒドで２５℃で１時間処理した。切片を２×ＳＳＣで５回洗浄し、その後、０．５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫにおいて３７℃で１時間インキュベーションした。水で１分間洗浄した後、切片を、０．１Ｍトリエタノールアミン中の０．２５％無水酢酸で１０分間アセチル化し、その後、水で５分間洗浄した。次いで、切片を段階的なアルコールで脱水した。１０１５／ＧｅｍＴリボプローブを、上記のように、３３Ｐ−ＵＴＰ（＞１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ、ＮＥＮ）を使用して標識し、スライドあたり１５，０００，０００ｃｐｍを加えて、５０％ホルムアミドのハイブリダイゼーション緩衝液において５２℃で一晩ハイブリダイゼーションした。翌日、カバーガラスを２×ＳＳＣ中で除き、５回洗浄した。スライドをＲＮＡｓｅＡ（Ａｍｂｉｏｎ）中で３７℃で３０分間インキュベーションし、その後、２×ＳＳＣで洗浄した。１×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよび０．１×ＳＳＣにおいて室温で洗浄した後、スライドを０．１×ＳＳＣにおいて７０℃で１時間洗浄した。その後、スライドを０．１×ＳＳＣにおいて室温で５分間洗浄し、続いて水で５分間洗浄した。段階的なアルコールで脱水した後、スライドを空気乾燥して、Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａｋ）に感光させた。
【００６４】
ラット脳のサブ領域におけるトランスジーンＧαｑのｍＲＮＡ発現をさらに突き止めるために、インサイチューハイブリダイゼーション分析を、Ｔｈｙ１．２−ＧαｑＧ１８８Ｓラット系統を使用して行った。これらの系統（１１、５８、６７、７５および７６）は、ＲＮＡｓｅ保護分析により示されるように、脳におけるｍＲＮＡ発現レベルの範囲を示した。Ｔｈｙ１．２トランスジーンの組込み部位は脳におけるトランスジーンの発現パターンに影響を及ぼし得ることが以前に報告されている（Ｃａｒｏｎｉ、７１（１）：３〜９）。これらの報告されたデータは、特定の脳領域（すなわち、海馬、皮質および扁桃）がすべての系統にわたってＴｈｙ１．２トランスジーンの発現を一貫して表していることを示している。しかしながら、線条体および視床下部を含む他の領域は、Ｔｈｙ１．２発現カセットを担持する遺伝子導入体系統にわたって発現の変動を示している。Ｔｈｙ１．２−Ｇαｑ遺伝子導入体の脳に関するインサイチューハイブリダイゼーション研究により、発現パターンの違いに関するＣａｒｏｎｉ（１９９７）の知見が確認された。Ｔｈｙ１．２−Ｇαｑ系統の１１および７６は類似した発現パターンを示していた。これらの２つの系統は、分析された系統のすべてのなかで最も大きい汎ニューロン性の発現パターンを示していた。特に、これらの系統におけるトランスジーンの発現は、線条体と共に視床下部においても明らかであった。発現パターンが５８および６７の系統間では類似していた。これらの２つの系統は、トランスジーンの発現が視床下部および線条体にはないことを示している。しかしながら、これらの２つの領域を除いて、トランスジーンｍＲＮＡ分布は、１１および７６の系統について観察された分布と類似していた。Ｔｈｙ１．２−Ｇαｑの系統７５は、系統１１、７６および系統５８、６７に対してより中間的である発現パターンを示した。非常に低いレベルのトランスジーンｍＲＮＡがこの系統の線条体および視床下部で検出可能であったにすぎなかった。Ｔｈｙ１．２−Ｇαｑの１１、５８、６７、７５および７６の系統における変異型Ｇαｑの発現プロファイルのまとめを表２に示す。
【００６５】
【表２】
2004500843.tif 000004
【００６６】
実施例６：動物行動の特徴付け
行動試験法の概略
ＲＧＳ無感応性Ｇ１８８ＳのＧαｑ変異型トランスジーンの行動に対する影響を評価するために、下記の評価を下記の順で行った：
【００６７】
オープンフィールド
全般的な評価
体重
摂取研究
驚愕およびプレパルス阻害＊
状況的恐怖／聴覚刺激の条件付け
ショックに対する応答性
運動活動＊
５−ＨＴ２Ａによる頭振り
ピロカルピンによるコリン作動性徴候＊＊
【００６８】
・プレパルス阻害は系統５８および系統７５の別のコホートで再評価し、続いて運動活動の評価を行った。
・＊＊ピロカルピンによるコリン作動性徴候は、系統６７、系統７６および系統１１からのメスのみで行った。
【００６９】
動物−全般
一般に、各系統のオス１０匹およびメス１０匹のヘテロ接合体を同じような数の野生型同腹子コントロールと比較した。試験を７週齢〜８週齢のときに開始した。被検体を、１２時間の明暗サイクルの下で、餌および水を自由に摂取させながら引掛け式の金属製メッシュケージに１匹ずつ収容した。７６、６７および１１の系統については、被検体を、研究期間中、粉末にした齧歯類用の餌で飼育した。５８および７５の系統からの被検体は給餌研究のために粉末餌に順応させ、その後、残りの研究についてその餌で飼育された。被検体は、約１２週間の期間にわたって下記に概略される一連の試験で評価された。
【００７０】
短期リチウム研究の場合、オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０ｇ〜３００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）を使用した。ラットは、下記に記載される方法による行動評価または薬理学的評価の２０時間前〜２４時間前にＬｉＣｌ（３〜１０ｍＥｑ／ｋｇのｉ．ｐ．）またはビヒクル（生理的食塩水）で短期的に処置が行われた。動物は、運動およびプレパルス阻害の研究では群毎に収容され、オープンフィールド行動、給餌、およびＤＯＩまたはピロカルピンにより誘導される行動を調べる研究の場合には１匹ずつ収容された。
【００７１】
長期リチウム研究の場合、オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（到着時で２３日齢、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ）を使用した。１週間慣らした後、これらの被検体を５匹からなる群で収容して、穀粒に基づく標準的な齧歯類用の餌、またはＬｉＣｌ含有餌（１．７ｇ／ｋｇ）を２９日齢目から与えた。餌および水を自由に摂取させ、体重を少なくとも２回毎週測定した。４５日齢目に、通常餌の群を半分に分けた。一方の半分は自由摂食（ａｄ−ｌｉｂ）の通常餌で続けたが、もう一方の半分は制限量の通常餌を毎日与えて、体重をリチウム摂食群（ペア摂食）に等しいレベルにまで低下させた。被検体を４７日齢のときに１匹ずつ収容した。行動試験を（４週間のリチウム餌の後）約８週齢のときにこれらの被検体で開始し、通常餌（ａｄ−ｌｉｂまたはペア摂食）またはリチウム餌のいずれかで飼育し続けながら、トランスジェニックラットに類似する試験計画（下記参照）に従った。行動試験を運動研究の後で中断した。１７週齢のとき（１３週間の１．７ｇ／ｋｇのＬｉ餌）、ＬｉＣｌの濃度を２．２ｋｇ／ｋｇに増大し、生理的食塩水（０．９％）を与えた。ＤＯＩ頭振り研究およびピロカルピン研究を２０週齢〜２４週齢の間で行った。別のオスラット群（若い成体、２００ｇ〜２５０ｇ）にＬｉＣｌ餌（４．３ｇ／ｋｇ）を供した。プレパルス阻害研究および運動活動研究を６週間〜８週間の該餌を供した期間で行った。
【００７２】
全般的な行動の評価
行動研究の計画は、野生型の同腹子コントロールに対するヘテロ接合体の表現型を測定するために準備された。これらの試験は、動物を多数の行動について評価し、トランスジーンの発現による何らかの視覚的／明白な作用を評価した。
【００７３】
被検体は体重測定され、１０匹の群で、それらのホームケージから金属製の引掛け式ケージのラックに移された。その後、ラックを観察室に移し、被検体には順応期間が与えられた。被検体の遺伝的正体を知らない観察者が、それぞれの被検体を、順応期間後、１時間にわたり１５分毎に１回評価した。行動、反射および自発的徴候のチェックリスト（まとめについては表３を参照のこと）がそれぞれの徴候の存在についてマーク（ｍａｒｋ）された（Ｃｒａｗｌｅｙ他（１９９８）を参照のこと）。
【００７４】
「振せん」のみが、遺伝子導入陽性ラットの大部分またはすべてにおいて一貫して現れた。この行動は、手で扱ったときの「震え」として、動物が胴の周りをつかまれ、下肢をぶら下げたときの下肢の非自発的な運動の増大として、観測者によって記述された（図３、ＡおよびＢ）。
【００７５】
ラットの観察は１．７ｇ／ｋｇのリチウム餌で約４週間後に行われた。「振せん」のみが、ラットの大部分で一貫して現れた。観察者は、この行動を、取り扱い時および拘束時の「震え」として記述した（表３）。
【００７６】
【表３】
2004500843.tif 000005
【００７７】
体重
測定値が多数の時点および行動アッセイの期間中に記録された。体重は、トークリップで（６日目、系統６７、７６および１１）、離乳時（２１日目、系統６７および７６）、全般的な評価（６週〜８週、すべての系統）、食物摂取研究（９週〜１０週、すべての系統）およびプレパルス阻害研究（１１週〜１２週、すべての系統）のときに測定された。最少二乗を使用する反復測定によるＡＮＯＶＡ（分散分析）および事後比較により、統計学的有意性を決定した。
【００７８】
一般に、トランスジーンを発現するラットは、同腹子コントロールよりも若干小さいことが観察された。このことをより正確に評価するために、体重測定値を、前記に記されているように様々な時点で得た。５８および７５のラット系統の場合（系統５８のオスを除く）、体重差は、測定された最も早い時点（６週〜７週）で統計学的に有意であった（Ｐ＜０．０５）。ラット系統５８のオスの場合、体重の有意差が８週〜９週の間において後で観察された。６７および７６のラット系統の場合、６７および７６の両方の系統からの遺伝子導入が陰性であるオスは、類似した成長曲線を示した。系統６７および系統７６のオスの＋／−ラットは、−／−ラットよりも著しく少ない体重を有していたが、系統７６の方が明らかにより大きな影響があった。６日目、差はなかったが、２１日目まではグループ間の差は統計学的に有意であった（データ示さず）。類似した影響が系統６７、７６および１１のメスで生じ、７週〜８週までは有意差が生じていた（図４）。成長曲線のすべてにおいて生じるプラトー部は、動物が２週間の期間にわたって３回、２４時間絶食させられ、そして５−ＨＴ２Ｃ受容体アゴニストで処置された食物摂取研究と一致している。
【００７９】
ラットは、リチウム（ＬｉＣｌ）餌（１．７ｇ／ｋｇ）で２９日齢目から飼育された。長期リチウム餌で飼育されたラットは、体重が、穀粒に基づく餌で飼育されたラットよりも２０％〜３０％少なかった（図５）。
【００８０】
食物摂取
野生型ラットよびトランスジェニックラットはそれらのホームケージにおいて粉末餌で飼育された。ラットは、食物摂取を評価する前の２４時間絶食させられた。食物摂取は、ビヒクルまたは１ｍｇ／ｋｇもしくは１．７ｍｇ／ｋｇのＲＯ６０−０１７５をｉｐ（腹腔内）注射した後、２時間、４時間および２４時間の時点で測定された。実験は、一般には火曜日および金曜日に行われたが、２４時間の絶食が月曜日および木曜日に開始された。最少二乗を使用する反復測定によるＡＮＯＶＡおよび事後比較により、統計学的有意性を決定した。５−ＨＴ２Ｃアゴニストは、Ｇαｑにより調節される経路を介して食物摂取を低下させた。選択的５−ＨＴ２ＣアゴニストであるＲＯ６０−０１７５を使用する研究を、５−ＨＴ２Ｃアゴニスト活性がトランスジェニックラットにおいて変化しているかどうかを明らかにするために行った。その結果が図６および図７にまとめられている。食物摂取は、食物摂取の差（図６に示される２時間の時点；他のデータは示さず）を示さなかった系統７５のメスを除くすべての系統のオスおよびメスの遺伝子導入ヘテロ接合体において、ビヒクル投与後の１つ以上の時点で低下していた。
【００８１】
野生型ラットとトランスジェニックラットとの食物摂取の基礎的な差を説明するために、ＲＯ６０−０１７５の影響をビヒクル食物摂取の百分率として計算した。１．７ｍｇ／ｋｇのＲＯ６０−０１７５の影響は、７５および６７の系統については遺伝子導入ヘテロ接合体のオスとメスとの両方でより大きかった（図７）。１．０ｍｇ／ｋｇのＲＯ６０−０１７５の影響も同様に、系統６７のオスでより大きかった（データ示さず）。しかし、系統７５のメスでは、１．０ｍｇ／ｋｇのＲＯ６０−０１７５の影響は、野生型ラットの方がトランスジェニックラットよりも大きかった（データ示さず）。５８、７６または１１の系統からのラットにおけるＲＯ６０−０１７５の影響には変化はなかった。これらのデータは、Ｇαｑを介して媒介される５−ＨＴ２Ｃアゴニストの作用が、ＲＧＳタンパク質により調節されないＧαｑ変異型の存在下において強められることを示している。
【００８２】
２時間の食物摂取は、別のラット群における短期リチウム投与後に顕著に低下した。５−ＨＴ２Ｃアゴニストは、Ｇαｑにより調節される経路を介して食物摂取を低下させた。選択的５−ＨＴ２ＣアゴニストであるＲＯ６０−０１７５を使用する研究を、５−ＨＴ２Ｃアゴニスト活性がリチウムによって変化しているかどうかを明らかにするために行った。リチウムによってもたらされる食物摂取の顕著な低下のために、５−ＨＴ２Ｃアゴニストにより誘導される食物摂取の低下は解釈が困難である。それにもかかわらず、基礎的な摂取の割合として、ＲＯ６０−０１７５はリチウム処置動物において食物摂取のより大きい低下をもたらした（図８）。
【００８３】
２時間の食物摂取は、長期リチウム餌で飼育された動物では影響を受けなかった（図９）。５−ＨＴ２Ｃアゴニストは、Ｇαｑにより調節される経路を介して食物摂取を低下させる。選択的５−ＨＴ２ＣアゴニストであるＲＯ６０−０１７５を使用する研究を、５−ＨＴ２Ｃアゴニスト活性がリチウムによって変化しているかどうかを明らかにするために行った。食物摂取に対するＲＯ６０−０１７５の作用は、リチウム餌で飼育された動物で強められた（図４）。
【００８４】
プレパルス阻害および驚愕
被検体を体重測定して、そのホームケージから研究室の試験室に移した。音響驚愕の習慣化を午前中に評価し、プレパルス阻害を午後に評価した。試験と試験との間、被検体はそのホームケージに戻された。音響驚愕を習慣化させるために、それぞれの被検体を、驚愕試験チャンバー（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）内の台に取り付けられた拘束器の中に入れた。被検体の動きを、デジタイザーおよびコンピューターに接続された変換器によって検出した。６４ｄＢのバックグラウンドのノイズレベルで５分間順応させた後、突発のホワイトノイズ（１２０ｄＢ、２０ｍｓ）を、不規則な間隔で１５秒間、ラットの上方３０．４８センチ（１２インチ）に取り付けられたスピーカーから流した。それぞれの驚愕刺激に応答した被検体の動きを、突発ノイズ開始後、１００ｍｓの期間にわたってデジタル化し、任意設定の驚愕ユニットで表した。データを、１つの反復測定（試験）を用いて２元ＡＮＯＶＡ（トランスジーン×試験）に従ってＬＳＤ（最小有効差異）により分析し、有意性をｐ＜０．０５として決定した。
【００８５】
プレパルス阻害試験については、被検体を、６４ｄＢのバックグラウンドのノイズレベルで５分間順応させるために驚愕試験チャンバーの中にある拘束器に再び入れた。順応期間後、それぞれの被検体を４タイプの音響刺激にさらした。驚愕刺激（２０ｍｓの継続期間、１２０ｄＢ）および３つの異なる強度のプレパルス刺激（２０ｍｓの期間中、驚愕刺激の前に１００ｍｓ（開始から開始まで）与えられた６９ｄＢ、７４ｄＢおよび７９ｄＢ）。試験は、最初の驚愕刺激、その後、一定した６４ｄＢのホワイトノイズのバックグラウンドに対して擬似乱数的順序で与えられる１５回の４つの刺激タイプからなっていた。試験間の間隔は平均して１５秒であった。平均驚愕の大きさを、刺激の開始から取得された１００回の１ｍｓ読み取り値を平均化することによって測定された。ＰＰＩを、それぞれのプレパルス強度について、１００−（［プレパルス試験における驚愕の大きさ／驚愕単独の試験での驚愕の大きさ］×１００）として定義した（Ｓｗｅｒｄｌｏｗ他、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９９、８７７：２０２〜２１６）。データを、５８および７５の系統については１つの反復測定（プレパルス強度）を用いて３元ＡＮＯＶＡ（トランスジーン×性別×プレパルス強度）に従って、または１つの反復測定（プレパルス強度）を用いて２元ＡＮＯＶＡ（トランスジーン×プレパルス強度）に従ってＬＳＤにより分析して、有意性をｐ＜０．０５で決定した。
【００８６】
音響驚愕の習慣化を、感覚運動ゲーティング（音響的驚愕のプレパルス阻害）の評価と共にラット系統で評価した。驚愕の習慣化は、（ＳＳＲＩおよびＬＳＤにより損なわれ；５−ＨＴ２Ａアンタゴニストにより促進される）セロトニンの神経伝達の変化によって影響を受ける。音響的驚愕応答のプレパルス阻害（ＰＰＩ）は、驚愕を生じさせる刺激の直前に弱い刺激を与えることにより、運動性の驚愕反射応答の阻止が生じる非学習行動である。ＰＰＩは、精神分裂病、ハンチントン病、おそらくはＯＣＤなどのいくつかの疾患状態において乱れている（ｄｉｓｒｕｐｔｅｄ）（Ｓｗｅｒｄｌｏｗ他、上記）。ＰＰＩはいくつかの種でモデル化することができ、そして脳幹神経節の回路構成に依存し、辺縁皮質入力によって制御される。５−ＨＴ２ＡアゴニストのＤＯＩはＰＰＩを乱し、この作用は腹側淡蒼球における５−ＨＴ２ａ受容体によって媒介される。
【００８７】
図１０には、プレパルス阻害について、それぞれの系統のヘテロ接合体と野生型同腹子コントロールとの差がまとめられている。系統５８の遺伝子導入体のメスではなく、そのオスが、驚愕の習慣化において著しい低下（ｐ＜０．０５）を示した（データ示さず）。系統６７では、遺伝子導入体のメスが著しい低下（ｐ＜０．０５）を示し、一方、低下傾向が、驚愕の習慣化に関して系統６７の遺伝子導入体のオスについて認められた（データ示さず）。７５、７６または１１の系統については、驚愕の習慣化における差は観察されなかった（データ示さず）。しかしながら、すべての系統で、プレパルス阻害に対するトランスジーンの作用が示され、すべての系統において現れる他の表現型（体重の低下、「震え」）との何らかの共通性を示唆している（図１０）。プレパルス阻害における欠陥は、ある種の神経精神的疾患状態における注意欠陥と関連している。これらのデータは、変異型トランスジーンの発現により誘導される注意欠陥を反映している。該系統は、脳幹神経節構造におけるトランスジーンの発現パターンが異なっている。従って、この表現型がそのような脳領域に関連している可能性は低い。
【００８８】
短期リチウムがもたらす欠陥は音響的驚愕に影響を及ぼさなかった。リチウムは、すべての刺激強度においてＰＰＩの欠陥をもたらした（図１１）。
【００８９】
高濃度ＬｉＣｌ餌（４．３ｍｇ／ｋｇ）を１週間供することにより、プレパルス阻害の低下が生じた（図１２）。
【００９０】
状況的恐怖条件付けおよび聴覚刺激条件付け
被検体を直方体のオペラントチャンバーに入れて、２分間慣れさせ、その後、音を２０秒間与えた。音を与えた直後に、１ｍＡのスクランブル化ショックを、格子状の床を介して２秒間与えた。ショックが終了した３０秒後に、動物をチャンバーから取り出し、そのホームケージに戻した。約１５時間後、動物を最初の試験チャンバーに戻し（状況）、そして１０秒間の間隔でこわばり（ｆｒｅｅｚｉｎｇ）の発生率を５分間記録した（最大応答＝３０）。５分間の試験期間が終わったとき、動物をそのホームケージに戻した。約６０分後に、動物を新しい環境（新しい部屋、四角型チャンバー、プラスチック床、赤色光）に置き、こわばりを５分間記録した（新規）。５分間の期間が終わったとき、聴覚的音を与えて、こわばり行動を５分間記録した（ＲｕｄｙおよびＯ’Ｒｅｉｌｌｙ、Ｂｅｈａｖｉｏｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９９、１１３：８６７〜８８０；Ｐｕｇｈ他、Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９７、１１１：５０３〜１１；Ａｕａｇｎｏｓｔａｒａｓ他、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１９９９、２１：７３１〜４４を参照のこと）。
【００９１】
連合学習に対するＲＧＳ無感応なＧαｑ変異型トランスジーンの作用を明らかにするために、状況的恐怖条件付け（海馬依存、扁桃依存）および聴覚刺激条件付け（海馬非依存、扁桃依存）をラット系統で評価した。すべての被検体は、新しい環境の場合と比較して、状況において、そして聴覚的刺激の存在下でこわばりが増大しているという証拠を示した。図１３（Ａ〜Ｆ）には、試験の各条件のもとで、それぞれの系統の野生型同腹子コントロールに対してヘテロ接合体において観察されたこわばり行動の差がまとめられている。系統７６のメスでは、試験の各条件における著しい低下が示された（図１３Ｄ〜Ｆ）。系統７６のオスは状況的恐怖条件付けの低下を示しただけであった（図１３Ａ）。系統６７のオスもまた状況的恐怖条件付けの低下を示した（図１３Ａ）が、系統６７のメスはすべての測定において応答低下の傾向を示した（図１３Ｄ〜Ｆ）。５８および７５の系統は著しい影響を示さず、系統１１のオスがすべての条件でこわばりの増大を示した（図１３Ｂ）。６７および７６の系統はトランスジーンの海馬における発現がより大きいことを示しているので、これらのデータは、これらの系統では海馬の機能が変化していることを示している。
リチウム餌が投与されたラットでは、著しい影響は観察されなかった（データ示さず）。
【００９２】
ショックに対する応答
電気ショックが、連合学習を調べるために使用されたので、能動的回避手法を使用してこの刺激に対する感受性を評価する試みを使用した。電気ショックから逃れるように被検体が最初に訓練されるる手法が設計された。続いて、ショックのレベルを試験中に低下および増大させた。被検体がショックから逃れた試験の割合を、加えたショック電流の関数としてプロットした。
【００９３】
動物を直方体チャンバーに入れて、４分間慣れさせた。順応が終わったとき、実験の学習期を開始した。学習期および試験期の両方のときに、ショックを、動物が最大で１０秒間静止しているか、または動物がチャンバーの反対側に動くまで（ショックが与えられていない場合、すなわち、逃げるまで）静止している格子状床の１／２に与えた。回避行動割合および平均回避潜伏時間を５回の試験の各組全体で計算した。学習期は、０．５ｍＡのショック強度での５回の試験からなっていた。学習期のすぐ後に、試験期を、ショック強度が０．５ｍＡに達するまで（０．１ｍＡから開始し、０．１ｍＡずつ増大して）ショック強度を増大させながら、５回の試験からなる５組を与えることによって開始した。その後、動物を試験チャンバーから取り出し、そのホームケージに戻した。データを、１つの反復測定（条件）を用いて２元ＡＮＯＶＡ（トランスジーン×条件）に従ってペアードｔテスト（ｐａｉｒｅｄ  ｔ  ｔｅｓｔ）を使用して分析して、有意性をｐ＜０．０５で決定した。
【００９４】
図１４には、アッセイの学習期および試験期についてヘテロ接合体と野生型同腹子コントロールとの差がまとめられている。すべての系統が、ショックを回避することを学習した。系統６７の場合、獲得基準（５０％を越える回避した試験）を満たさない被検体が１匹存在したので、このデータは、ショックに対する感受性のその後の評価には含めなかった。系統５８のオスおよびメスは、応答電流曲線が左側に移動することによって明らかであるように、より大きいショック感受性を示した（図１４Ａ）。ショック感受性の差を示す別の系統は系統７６であった。この場合、メスもまた、ショックに対してより大きい感受性を有するようであったが、オスは、感受性が一層小さいようであった（図１４Ａ）。系統１１のオスもまた、一層小さいショック感受性を有するようであったが、状況的恐怖条件付け研究では増大したこわばり行動を示した。系統５８は状況的恐怖条件付けでは差を示さず、系統７６のオスは状況的恐怖条件付けの低下を示したので、ショックに対する感受性の変化は、学習の変化が変異型ラットで観察されるときには学習の変化において役割を果たしていないと考えられる。
リチウム餌にさらされたラットでは、一貫した影響は観察されなかった（データ示さず）。
【００９５】
自発的および刺激誘導による運動活動
オープンフィールド試験を使用して得られる運動活動の観測結果を補足するために、ヘテロ接合体および野生型同腹子コントロールを、自動データ収集システムおよびより長期間の試験期間を使用して自発的な運動活動について評価した。この試験におけるデータは、試験期間にわたる多数の時間ビン（ｂｉｎ）で収集され、新しい環境での探検的な活動レベルおよびその環境に対する順応速度の両方をある程度評価することが可能になった。被検体を慣れさせた後、刺激を与えて、尺度としての運動活動を使用して刺激に対するこれらの被検体の応答性を測定した。この研究において、本発明者らは、間接的に作用するドーパミンアゴニストのｄ−アンフェタミンと、ＮＭＤＡ興奮性アミノ酸アンタゴニストのフェンシクリジンとを使用して、運動を誘導させた。運動活動を増大させるｄ−アンフェタミンの能力は、線条体（特に、中隔側坐核）におけるドーパミン作動性の神経伝達に依存しているが、他の神経伝達物質によって影響される。運動活動を誘導するフェンシクリジンの能力は、ドーパミンおよびグルタミン酸の両方の神経伝達における変化に依存している（ＡｄａｍｓおよびＭｏｇｈａｄｄａｍ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９８、１８：５５４５〜５４）。野生型同腹子コントロールに対するヘテロ接合体における自発的条件および刺激誘導条件のもとで観察された運動活動の差が図１５および図１６にまとめられている。
【００９６】
被検体を、水平軸（フィールド内で１６×１６）および垂直軸の両方で運動を検出するために赤外線ビームを備えた活動モニター（モデルＲＸＹＺＣＭ１６、Ｏｍｎｉｔｅｃｈ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）に入れた。試験室にはホワイトノイズが施された。活動が自発的な運動活動の差についてモニターされる６０分間の順応期間の後、それぞれの被検体を１ｍｇ／ｋｇのｄ−アンフェタミンｉｐの用量で処置して、活動モニターに戻した。ｄ−アンフェタミンにより誘導される活動を２時間にわたってモニターした。別の場合には、これらの同じ被検体を活動モニターに入れて、６０分間慣れさせた。この再順応の後、それぞれの被検体を１０ｍｇ／ｋｇのフェンシクリジンｉｐで処置して、活動についてさらに４時間モニターした。ｄ−アンフェタミンおよびフェンシクリジンのこれらの用量は、正常なラットにおいて多動性状態を誘導する用量として、他の研究に基づいて選択された（ＡｄａｍｓおよびＭｏｇｈａｄｄａｍ、上記；Ｋｒｅｂｓ−Ｔｈｏｍｓｏｎ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８、３４３：１３５〜４３を参照のこと）。データを、１つの反復測定（時間）を用いて２元ＡＮＯＶＡ（トランスジーン×時間）を使用し、続いてＬＳＤを使用して分析した。結果は、ｐ＜０．０５で有意と決定された。
【００９７】
自発的な運動活動における著しい変化は、系統７６のメスを除いてどの系統でも検出されなかった。この場合、野生型と比較してヘテロ接合体で観察された活動の低下は最小限であったが、試験期間の大部分にわたって一貫していた。系統７６のオスを除いて、５８、７５、６７および１１の系統のオス、ならびに６７、７６および１１の系統のメスは、アンフェタミンにより誘導される運動活動の低下を示した。５８および７５の系統のメスは試験しなかった。５８および６７の系統は、中隔側坐核においてトランスジーンが発現しているという証拠を示さないので、投与した用量におけるアンフェタミンに対する応答性の低下は、他の脳領域および／または他の神経伝達物質とドーパミンとの相互作用に基づいているに違いない。
【００９８】
フェンシクリジンによる運動活動は系統６７のオスで低下した（図１６）。系統７６のオスでは、フェンシクリジンにより誘導される活動における類似した低下に対する傾向はわずかであった（ｐ＝０．０７）。対照的に、系統５８のオスは、開始が遅れた、フェンシクリジンにより誘導される運動活動の増大を示し、そしてフェンシクリジンのより高用量に伴う運動活動のパターンに似ていた（顕著な運動失調および鎮静、その後、強い運動活動）。同じ遅れた多動性が、系統７６のメスで、そして系統１１のオスおよびメスで、そしてより小さい程度で系統６７のメスにおいて観察された。５８および７５の系統のメスは試験しなかった。トランスジーンの発現パターンに関連した一貫した表現型はなかった。５−ＨＴ２Ａアゴニストはフェンシクリジン誘導の運動活動に影響を及ぼすことが報告されているので（Ｋｒｅｂｓ−Ｔｈｏｍｓｏｎ他、１９９８）、これらの結果は、変化したセロトニン作動性神経伝達システムの相互作用を表しているかもしれない（ＤＯＩによる頭振りに関して下記に報告されている結果を参照のこと）。
【００９９】
短期リチウムは、順応期間中の自発的な運動活動を低下させた（図１７および図１８、順応期間）。リチウムは、ｄ−アンフェタミン（１ｍｇ／ｋｇ）によってもたらされる運動活動の増大を弱め（図１７）、そしてＰＣＰ（１０ｍｇ／ｋｇ）の運動活性化作用を高めた（図１８）。
【０１００】
高濃度のリチウム餌（４．３ｇ／ｋｇ）に１週間さらされたオスのラットは、自発的な運動活動またはｄ−アンフェタミンにより刺激される運動活動においてコントロールとの差を何ら示さなかった（図１９）。しかし、これらのラットは、フェンシクリジンにより刺激される活動の増強を示した（図２０）。
【０１０１】
オープンフィールド
動物の一般的な「不安」行動に対する影響を評価するために、オープンフィールド試験パラダイムが使用される。オープンフィールドモデルにより、２つの主要な尺度が評価される。中心部の正方形に戻るまでの潜伏時間は、「不安緩解」作用（減少した潜伏時間）または「不安生成」作用（増大した潜伏時間）を示す。線横断および後ろ足立ちの回数は運動活動の変化を示す。
【０１０２】
典型的には、３’×３’の正方形フィールドの中心内に置かれたラットは（壁に沿って）外側の正方形の方に移動する。中心部の正方形への復帰は、「不安なし」行動または「不安がより少ない」行動を示すものである。中心部の正方形に戻るために記録される時間は、「不安緩解」活動または「不安生成」活動に対する指標として役立つ。例えば、（中心部の正方形への）復帰時間が長くなることは、より不安な表現型（不安生成的）と関係付けられる。
【０１０３】
実験を３’×３’の黒色プレキシガラスのオープンフィールドで行った。オープンフィールドにおける壁の高さは４５．７２センチ（１８インチ）であった。フィールドの床には、フィールドを９個の正方形に分割する白色の線がある。野生型ラットおよびトランスジェニックラットをオープンフィールドの中心部の正方形に１匹ずつ入れた。ラットが中心部の正方形から出るまでの時間（中心退去時間）を記録した。ラットが中心部の正方形に戻るまでの時間（中心復帰時間）を記録した。さらに、線横断の回数および後ろ足立ちの回数を記録した。すべての実験は、継続時間が１５分間であり、暗く照明された部屋（２〜４ｌｕｘ）で行われた。野生型ラットおよびトランスジェニックラットは、これらの実験が行われたときには約７週齢であった。統計学的有意性をＡＮＯＶＡによって決定し、ｐ＜０．０５に設定した。
【０１０４】
系統５８からのオスの遺伝子導入ヘテロ接合体ラット、および系統７６からのオスとメスとの両方は、オープンフィールドの中心部に戻るまでの潜伏時間の増大を示した。これは、おそらくはこれらの動物に対する「不安生成」プロファイルを示唆している（図２１）。６７および７６の系統にからのオスの遺伝子導入ヘテロ接合体ラットは、線横断の回数の減少とともに、減少した活動プロファイルを示した（図２２）。トランスジェニックラット系統におけるこの結果パターンは、これらの行動が二重に解離されることを明らかにしている。すなわち、「不安生成」作用は、運動活動の減少の存在下（系統７６のオス）または非存在下（系統５８のオス、系統７６のメス）において生じる。さらに、運動活動の減少は、「不安生成」作用の存在下（系統７６のオス）または非存在下（系統６７のオス）において生じる。短期リチウム処置に供された動物に対するオープンフィールド試験の結果が図２３に示されている。リチウム餌で飼育された動物はコントロール動物とは異なっていなかった（データ示さず）。
【０１０５】
ＤＯＩにより誘導される頭振り
野生型ラットおよびトランスジェニックラットにビヒクルまたはＤＯＩ（０．００１、０．０１、０．１、１．０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかをｉｐ注射し、その後、ラットを観察研究のために透明なプレキシガラスチャンバー（１０”×１８”×８”）に１匹ずつ収容した。訓練された観察者が、頭振りの回数を２回の観察期間（０分〜３０分、４５分〜７５分）において各ラットについて数えた。
【０１０６】
トランスジェニックラットにおいてＧαｑを介してＩＰ３経路に共役した受容体に対するＲＧＳ無感応なＧαｑ変異型トランスジーンの作用を評価することは興味深いことであった。５−ＨＴ２Ａアゴニストは、この経路を介してラットにおける頭振りの大きな増大をもたらす。ＤＯＩ（−１［２，５−ジメトキシ−４−ヨードフェニル］−２−アミノプロパン）は、ラットにおける頭振りを増大させる５−ＨＴ２Ａ受容体アゴニストであり、この経路を調べるために使用されている（Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ他、１９９９）。ＤＯＩの投与が、本明細書中では、５−ＨＴ２Ａアゴニスト活性がトランスジェニックラットにおいて変化しているかどうかを明らかにするために使用された。結果は図２７に示されている。
【０１０７】
驚くべきことに、１ｍｇ／ｋｇのＤＯＩが投与された、５８、７５、６７および７６の系統からのトランスジェニックラットは、投与後２４時間以内に死亡することが見出された。より高い用量のＤＯＩ（３〜１０ｍｇ／ｋｇ）が、系統１１において類似した作用を生じさせるために必要であった（データ示さず）。別の実験において、３０ｍｇ／ｋｇもの高い用量のＤＯＩは、正常なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットでは致死にはならなかった。より低い用量のＤＯＩ（０．１ｍｇ／ｋｇ）は、系統７５のオスのトランスジェニックヘテロ接合体ラットにおける頭振りの回数を増大させ、系統６７のオスのトランスジェニックヘテロ接合体ラットにおける頭振りを増大させる傾向を示した（データ示さず）。これらのデータは、Ｇαｑにより媒介される５−ＨＴ２Ａアゴニストの作用が、ＲＧＳタンパク質によって調節されないＧαｑ変異型の存在下で強められることを明らかにしている。
【０１０８】
選択的５−ＨＴ２ＡアゴニストのＤＯＩを使用する研究を、５−ＨＴ２Ａアゴニスト活性が短期または長期のリチウムによって変化するかどうかを明らかにするために行った（図２５〜図２７）。短期リチウムは、１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇのＤＯＩによってもたらされる頭振りの増大を弱めた（図２５）。さらに、リチウムの前処理（５．６〜１０ｍＥｑ／ｋｇ）は、８ｍｇ／ｋｇのＤＯＩで処置されたラットにおいて痙攣および致死性を生じさせた（図２６）。１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇのＤＯＩによってもたらされるＤＯＩによる頭振りはまた、リチウム餌（２．２ｇ／ｋｇ）にさらされたラットでは低下した（図２７）。さらに、痙攣および致死性が３ｍｇ／ｋｇのＤＯＩの後で観察された。
【０１０９】
ピロカルピンにより誘導されるコリン作動性の徴候および痙攣
ムスカリン性コリン作動性アゴニストは、Ｇαｑにより調節される経路を介して高用量で一連のコリン作動性徴候（血涙症、流涎、下痢、低活動性、振せん、泡吹き、痙攣および死）を生じさせる。研究を、ムスカリン性アゴニスト活性がトランスジェニックラットにおいて変化しているかどうかを明らかにするために、ムスカリン性アゴニストのピロカルピンを用いて行った（図２８）。研究を、ムスカリン性アゴニスト活性が短期リチウム（図２９）または長期リチウム（図３０）によって変化しているかどうかを明らかにするために、ムスカリン性アゴニストのピロカルピンを用いて行った。短期リチウムおよび長期リチウムの両方ともに、ピロカルピンによってもたらされるコリン作動性の徴候を強めた。
【０１１０】
リチウム（１０ｍＥｑ／ｋｇ、２０時間〜２４時間の前処置）による短期処置と、長期リチウム餌（１．７ｇ／ｋｇ〜４．３ｇ／ｋｇ）と、Ｇαｑ変異型トランスジェニックラットとの類似性が下記の表５にまとめられている。Ｇαｑ変異型トランスジェニックラットにおいて観察されるすべての表現型作用が、リチウムによる短期処置または長期処置のいずれかの後で観測される。観測された表現型作用は、非薬理学的に誘導される行動および薬理学的に誘導される行動で生じている。例えば、リチウム処置ラットおよびＧαｑ変異型トランスジェニックラットは、震え、オープンフィールド行動、食物摂取、体重およびプレパルス阻害に関して、類似した行動作用を示している。さらに、リチウム処置ラットおよびＧαｑ変異型トランスジェニックラットは、Ｇαｑに共役した受容体（５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ２Ａ、ムスカリン性）の刺激により誘導される行動作用の類似した強化を示している。さらに、それらはまた、間接的なドーパミンアゴニストの作用の類似した変化（弱化）およびＮＭＤＡアンタゴニストの作用の類似した変化（強化）を示している。
【０１１１】
Ｇαｑ変異型トランスジェニックラットとリチウム処置との間で認められる類似点は、Ｇαｑ変異型トランスジェニックラットが、リチウムで処置される双極性情動障害のモデルを表すことを示している。Ｇαｑ変異型トランスジェニック動物はＲＧＳ遮断の作用を模倣するので、これらの類似点は、ＲＧＳ遮断薬が双極性情動障害の処置において有用であることを示唆している。さらに、トランスジェニックラットは、ＲＧＳが遮断された動物における化合物の作用を研究するために有用であり、薬物の相互作用および不一致を評価するためには重要である。
【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
本発明は、本明細書中に記載されている特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。実際、本発明の様々な改変が、本明細書中に記載されている実施形態に加えて、上記の説明および添付された図から当業者には明らかになるであろう。そのような改変は、添付された請求項の範囲に含まれるものとする。
【０１１４】
すべての値はおおよその値であり、かつ説明のために示されていることをさらに理解しなければならない。
【０１１５】
特許、特許出願明細書、刊行物、製品説明書およびプロトコルが本明細書中で引用されているが、それらの開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書中に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、マウスのＧ１８８Ｓ型Ｇαｑのヌクレオチド配列（配列番号１）およびアミノ酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図２】
図２は、変異型マウスＧαｑトランスジーンの概略図である。
【図３】
図３（ＡおよびＢ）は、オス（Ａ）およびメス（Ｂ）のＧｑトランスジェニックラットにおける全般的な行動評価を示す図である。
【図４】
図４（ＡおよびＢ）は、オス（Ａ）およびメス（Ｂ）のＧｑトランスジェニックラットにおける体重の影響を示す図である。
【図５】
図５（ＡおよびＢ）は、ＬｉＣｌ餌で処置されたラットにおける体重に対する影響の結果を示す図である。
【図６】
図６（ＡおよびＢ）は、ビヒクルで処置されたオス（Ａ）およびメス（Ｂ）のＧｑトランスジェニックラットにおける食物摂取に対する影響を示す図である。
【図７】
図７（ＡおよびＢ）は、５−ＨＴ２Ｃアゴニストで処置されたオス（Ａ）およびメス（Ｂ）のＧｑトランスジェニックラットにおける食物摂取に対する影響を示す図である。
【図８】
図８（ＡおよびＢ）は、グラム（Ａ）またはパーセントコントロール（Ｂ）の量に基づく、ビヒクルおよび５−ＨＴ２Ｃアゴニストで処置されたラットにおける食物摂取に対する短期リチウムの影響を示す図である。
【図９】
図９（ＡおよびＢ）は、ＬｉＣｌ餌で処置されたラットにおける食物摂取に対するビヒクルまたは５−ＨＴ２Ｃアゴニストの影響を示す図である。
【図１０】
図１０（ＡおよびＢ）は、オス（Ａ）およびメス（Ｂ）のＧｑトランスジェニックラットにおけるプレパルス阻害および音響驚愕研究を示す図である。
【図１１】
図１１（ＡおよびＢ）は、短期リチウムで処置されたラットにおけるプレパルス阻害研究（Ａ）および音響驚愕研究（Ｂ）を示す図である。
【図１２】
図１２（ＡおよびＢ）は、ＬｉＣｌ餌で飼育されたラットにおけるプレパルス阻害研究（Ａ）および音響驚愕研究（Ｂ）を示す図である。
【図１３】
図１３（Ａ〜Ｆ）は、オス（Ａ〜Ｃ）およびメス（Ｄ〜Ｆ）のＧｑトランスジェニックラットにおける状況的恐怖条件付けおよび聴覚刺激条件付けを示す図である。
【図１４】
図１４（Ａ〜Ｅ）はＧｑトランスジェニックラットにおけるショック回避行動を示す図である。
【図１５】
図１５（Ａ〜Ｈ）は、オス（Ａ〜Ｅ）およびメス（Ｆ〜Ｈ）のＧｑトランスジェニックラットにおける運動活動に対するｄ−アンフェタミンの影響を示す図である。
【図１６】
図１６（Ａ〜Ｈ）は、オス（Ａ〜Ｅ）およびメス（Ｆ〜Ｈ）のＧｑトランスジェニックラットにおける運動活動に対するフェンシクリジンの影響を示す図である。
【図１７】
図１７は、短期リチウム処置後の運動活動に対するｄ−アンフェタミンの影響を示す図である。
【図１８】
図１８は、短期リチウム処置後の運動活動に対するフェンシクリジンの影響を示す図である。
【図１９】
図１９は、塩化リチウム餌で飼育されたラットにおける運動活動に対するｄ−アンフェタミンの影響を示す図である。
【図２０】
図２０は、塩化リチウム餌で飼育されたラットにおける運動活動に対するフェンシクリジンの影響を示す図である。
【図２１】
図２１（ＡおよびＢ）は、オス（Ａ）およびメス（Ｂ）のＧｑトランスジェニックラットにおけるオープンフィールド行動（中心復帰時間）を示す図である。
【図２２】
図２２（ＡおよびＢ）は、Ｇｑトランスジェニックラットにおけるオープンフィールド行動（線横断）を示す図である。
【図２３】
図２３（ＡおよびＢ）は、１５分の期間における４回目の発生に基づく短期リチウム処置後のオープンフィールド行動（Ａ）、中心退去時間（Ｂ）、中心復帰時間（Ｃ）、消費時間（Ｄ）を示す図である。
【図２４】
図２４（ＡおよびＢ）は、Ｇｑトランスジェニックラットにおける頭振り（Ａ）および痙攣（Ｂ）に対する５−ＨＴ２Ａアゴニストの影響を示す図である。
【図２５】
図２５は、短期リチウム処置後の頭振りに対する５−ＨＴ２Ａアゴニストの影響を示す図である。
【図２６】
図２６は、短期リチウム処置後の痙攣に対する５−ＨＴ２Ａアゴニストの影響を示す図である。
【図２７】
図２７（ＡおよびＢ）は、長期リチウム餌で飼育されたラットにおける頭振り（Ａ）および致死性（Ｂ）に対する５−ＨＴ２Ａアゴニストの影響を示す図である。
【図２８】
図２８（Ａ〜Ｃ）は、Ｇｑトランスジェニックラットにおける振せん（Ａ）、痙攣（Ｂ）または死（Ｃ）を誘導することにおけるムスカリン性アゴニストの影響を示す図である。
【図２９】
図２９（Ａ〜Ｃ）は、短期リチウム処置後のムスカリン性アゴニストの影響を示す図である。
【図３０】
図３０（Ａ〜Ｃ）は、ＬｉＣｌ餌で飼育されたラットに対する振せん（Ａ）、痙攣（Ｂ）および死（Ｃ）を誘導することにおけるムスカリン性アゴニストの影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004500843.tif 000198
2004500843.tif 000199
2004500843.tif 000200