(57)【要約】成熟β−カテニン／ＡＰＣ経路を有する腫瘍における腫瘍選択的遺伝子発現を得るために有用な、ＤＮＡエレメントおよび構築物が開示される。特に、直腸結腸癌細胞における治療タンパク質をコードする遺伝子を発現するための、これらの構築物の使用が記載される。この構築物は、プロモーターに作動可能に連結したＴＣＦ結合エレメントの複数の反復を含む。このような構築物によって、ニトロレダクターゼのようなプロドラッグ転換酵素の腫瘍細胞特異的発現が達成される。ＣＢ１９５４のような適切なプロドラッグの全身的投与と関連して、このような腫瘍細胞の選択的殺傷が実証され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸構築物であって、該構築物は、ＴＣＦ応答性エレメントおよび該ＴＣＦ応答性エレメントに作動可能に連結した発現可能な治療遺伝子を含み、該ＴＣＦ応答性エレメントは、以下：
配列ＣＴＴＴＧＮＮを有する少なくとも１つのＴＣＦ結合エレメントであって、ここでＮはＡまたはＴである、エレメント；および
プロモーター、
を含み、ここで、該ＴＣＦ応答性エレメントは、作動可能に連結した該治療遺伝子の誘導性発現を可能にする、核酸構築物。
【請求項２】
前記治療遺伝子が、毒素またはプロドラッグ活性化酵素をコードする、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記治療遺伝子が、ＣＢ１９５４を活性化し得るニトロレダクターゼをコードする、請求項１または２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記プロモータが、ＳＶ４０プロモーター、Ｅ１Ｂプロモーター、およびｃ−Ｆｏｓプロモーターからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記プロモーターが、Ｅ１Ｂプロモーターである、請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記ＴＣＦ応答性エレメントが、５と１５との間のＴＣＦ結合エレメントを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記ＴＣＦ応答性エレメントが、５と１０との間のＴＣＦ結合エレメントを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記ＴＣＦ応答性エレメントが、５のＴＣＦ結合エレメントを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記ＴＣＦ結合エレメントが、３と２０との間のヌクレオチドによって互いに分離されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
前記ＴＣＦ結合エレメントが、３と１２との間のヌクレオチドによって互いに分離されている、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記ＴＣＦ結合エレメントが、１０と１２との間のヌクレオチドによって互いに分離されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
前記ＴＣＦ結合エレメントが、３と４との間のヌクレオチドによって互いに分離されている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
前記プロモーターに最も近い前記ＴＣＦ結合エレメントが、該プロモーターのＴＡＴＡボックスから１４０ヌクレオチドと１０ヌクレオチドとの間にある、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１４】
前記プロモーターに最も近い前記ＴＣＦ結合エレメントが、該プロモーターのＴＡＴＡボックスから１００ヌクレオチドと１０ヌクレオチドとの間にある、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１５】
前記プロモーターに最も近い前記ＴＣＦ結合エレメントが、該プロモーターのＴＡＴＡボックスから５０ヌクレオチドと１０ヌクレオチドとの間にある、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
前記プロモーターに最も近い前記ＴＣＦ結合エレメントが、該プロモーターのＴＡＴＡボックスから３０ヌクレオチドと１５ヌクレオチドとの間にある、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
前記ＴＣＦ結合エレメントが、３または４の間のヌクレオチドによって互いに分離され、ここで前記プロモーターに最も近い該ＴＣＦ結合エレメントが、該プロモーターのＴＡＴＡボックスから２５ヌクレオチドである、請求項１〜１０または１２〜１６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
前記ＴＣＦ結合エレメントが、ヌクレオチド配列ＣＴＴＴＧＡＴを有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
ＴＣＦ応答性エレメントであって、以下：
５と１５との間のＴＣＦ結合エレメント；および
プロモーター配列、
を含み、ここで、該ＴＣＦ結合エレメントは、３と２０との間のヌクレオチドによって互いに分離され、そして該プロモーターに最も近い該ＴＣＦ結合エレメントは、該プロモーターのＴＡＴＡボックスから５０ヌクレオチドと１０ヌクレオチドとの間にあり、そしてここで、該ＴＣＦ応答性エレメントは、発現可能な遺伝子に作動可能に連結される場合、該作動可能に連結された遺伝子の誘導性発現を与える、ＴＣＦ応答性エレメント。
【請求項２０】
前記ＴＣＦ結合エレメントが、１０と１２との間のヌクレオチドによって分離される、請求項１９に記載のＴＣＦ応答性エレメント。
【請求項２１】
前記ＴＣＦ結合エレメントが、３または４のヌクレオチドによって分離される、請求項１９に記載のＴＣＦ応答性エレメント。
【請求項２２】
前記プロモーターに最も近い前記ＴＣＦ結合エレメントが、該プロモーターのＴＡＴＡボックスから３０ヌクレオチドと１５ヌクレオチドとの間にある、請求項１９〜２１のいずれかに記載のＴＣＦ応答性エレメント。
【請求項２３】
レポーター遺伝子に作動可能に連結した請求項１９〜２２のいずれかに記載のＴＣＦ応答性エレメントを含む、ＴＣＦレポーター構築物。
【請求項２４】
Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節解除に関連する癌の処置における使用のための候補薬物の同定方法における、請求項２３に記載のＴＣＦレポーター構築物の使用であって、該方法は、以下の工程：
該レポーター遺伝子が転写される条件下で、該ＴＣＦレポーター構築物を試験化合物と接触させる工程；および
該レポーター遺伝子の転写を測定する工程；
を包含し、ここで、該レポーター遺伝子の転写を阻害する試験化合物が、癌の処置についての候補薬物である、使用。
【請求項２５】
請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸構築物、または発現可能な遺伝子に作動可能に連結した請求項１９〜２２のいずれかに記載のＴＣＦ応答性エレメント、または請求項２３に記載のＴＣＦレポーター構築物を含む、ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターでトランスフェクトした、宿主細胞。
【請求項２７】
治療において使用するための、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸構築物、請求項２５に記載のベクター、または請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
癌の処置において使用するための組成物の製造における、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸構築物、請求項２５に記載のベクター、または請求項２６に記載の宿主細胞の使用。
【請求項２９】
処置方法であって、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸構築物、請求項２５に記載のベクター、または請求項２６に記載の宿主細胞の有効用量を、このような処置を必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３０】
薬学的に受容可能な賦形剤と組合せて、請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸構築物、請求項２５に記載のベクター、または請求項２６に記載の宿主細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項３１】
請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸構築物、発現可能な遺伝子に作動可能に連結した請求項１９〜２２のいずれかのに記載のＴＣＦ応答性エレメント、または請求項２３に記載のＴＣＦレポーター構築物を細胞に送達するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、Ｔ細胞因子（ＴＣＦ）反応性エレメント、遺伝子、およびこのＴＣＦ反応性エレメントまたは核酸の構築物の、アッセイにおける使用、ＴＣＦ反応性エレメントおよび治療剤を包含する核酸の構築物ならびに治療に関する。
【０００２】
ＴＣＦは、ＤＮＡ結合タンパク質の高可動性群（ＨＭＧ）の中の転写因子のファミリーである（Ｌｏｖｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３７６，７９１−７９５，１９９５）。そのファミリーは、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅｔｅｒｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ．（ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０、１２３−１３２，１９９１）、ＥＰ−Ａ−０  ９３９  １２２およびＫｏｒｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，１７８４−１７８７，１９９７）に記述されるＴＣＦ−１、ＴＣＦ−３およびＴＣＦ−４を包含する。ＴＣＦ−４は、Ｗｎｔ／Ｗｉｎｇｌｅｓｓシグナル伝達に関連した腫瘍形成に関与されることが示されている。ＴＣＦおよびＬＥＦ−１（リンパ球エンハンサー因子−１）は、βカテニンと相互作用することによってＷｎｔシグナルへの核応答を媒介すると考えられる。βカテニンの安定性を増加するＷｎｔシグナル伝達および他の細胞現象は、βカテニンと会合してＬＥＦ−１およびＴＣＦのタンパク質によって、遺伝子の転写活性化を生じると考えられる。Ｗｎｔシグナル伝達の非存在下において、ＬＥＦ−１／ＴＣＦタンパク質は、ＧｒｏｕｃｈｏおよびＣＢＰ（ＣＲＥＢ結合タンパク質）と会合して転写を抑制する。
【０００３】
Ｗｎｔシグナル伝達の非存在下において、βカテニンは２つの異なる多重タンパク質の複合体で見出される。細胞膜に位置する一方の複合体は、アクチン細胞骨格とともにカドヘリン（カルシウム依存性接着分子）に結合する。他方、他方の複合体（以下のタンパク質：腺腫性結腸ポリポーシス症タンパク質（ＡＰＣ）、アキシン（ａｘｉｎ）およびグリコーゲン合成キナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を含む）は分解のためにβカテニンを標的とする。Ｗｎｔシグナル伝達はＡＰＣ−アキシン−ＧＳＫ３βにアンタゴナイズし、遊離の細胞質βカテニンのプールの増加を生じる。この遊離の細胞質βカテニンは核にトランスロケーションし得、そこでＬＥＦ−１／ＴＣＰ因子に結合し、そしてＷｎｔ標的遺伝子を活性化する。Ｗｎｔおよび他のシグナルによるＬＥＦ−１／ＴＣＰ転写因子の調節は、Ｅａｓｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１１，２３３−２４０，１９９９）において考察されている。
【０００４】
ＡＰＣ遺伝子は、ほとんどの結腸直腸癌において不活性化される腫瘍サプレッサー遺伝子である。ＡＰＣの変異は、遊離のβカテニンの蓄積を引き起こすと考えられ、次いで、この遊離のβカテニンはＴＣＦに結合し、細胞増殖にとって重要な遺伝子（例えば、サイクリンＤ１（Ｔｅｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３９８，４２２−４２６，１９９９、および  Ｓｈｔｕｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９６，５５２２−５５２７，１９９９）およびｃ−ｍｙｃ（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１，１５０９−１５１２，１９９８））を包含する遺伝子の増加された転写活性化を引き起こす。癌の発達における、このＡＰＣの関与は、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（前出）において考察されている。
【０００５】
ＴＣＦは、ヌクレオチド配列ＣＴＴＴＧＮＮを有するＴＣＦ結合エレメントを認識および結合することが公知であり、ここで、ＮはＡまたはＴを示す（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ，前出）。
【０００６】
ＴＣＦレポーター遺伝子は構築されており、そしてＫｏｒｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５，１７８４−１７８７，１９９７）、Ｍｏｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５、１７８７−１７９０，１９９７）、ＥＰ−Ａ−０  ９３９  １２２およびＷＯ９８／４１６３１において記載されている。ＴＣＦレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼの発現を駆動する最小のｃ−Ｆｏｓプロモーター、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼの発現を駆動する最小のヘルパーウイルスチミジンキナーゼのプロモーターのどちらかの上流の３つのＴＣＦ結合エレメントを包含するといわれる。Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（前出）は、ｐＢＶ−Ｌｕｃに挿入された４つのＴＣＦ結合エレメントを包含するＴＣＦレポーター遺伝子の構築物を開示する。
【０００７】
Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節解除に関連する癌の有効な処置に対する必要性がある。そのような癌は、ほとんどの結腸直腸癌、黒色腫の約３０％、ならびにいくつかの胸部、前立腺および肝細胞の癌を包含する。
【０００８】
また、発現可能な遺伝子に結合されるときに改善されたレベルの発現および特異性を与えるＴＣＦ応答エレメントに対する必要性がある。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、以下：
ＴＣＦ応答エレメントであって、以下：
配列ＣＴＴＴＧＮＮを有する少なくとも１つのＴＣＦ結合エレメントであって、ＮはＡまたはＴである、ＴＣＦ結合エレメント；および
プロモーター、
を含む、ＴＣＦ応答エレメント、ならびにＴＣＦ応答エレメントに作動可能に連結される発現可能な治療遺伝子を包含する核酸の構築物であって、ここでこのＴＣＦ応答エレメントは、この作動可能に連結される治療遺伝子の誘導性発現を可能にする、核酸の構築物を提供する。
【００１０】
本明細書中で使用される「誘導性発現」という用語は、１以上のＴＣＦ／βカテニンのヘテロダイマーが１以上のＴＣＦ結合エレメントに結合するとき、ＴＣＦ応答エレメントを使用して獲得されるレベルの発現が誘導される（つまり増加される）ことを意味する。好ましくは、発現のレベルは少なくとも１５倍、さらに好ましくは、少なくとも２５倍、および最も好ましくは、少なくとも３０倍増加する。
【００１１】
本明細書中で使用される「作動可能に連結され」という用語は、ＴＣＦ応答エレメントの制御下での発現の対象となる遺伝子におけるｃｉｓ結合をいう。
【００１２】
発現可能な遺伝子は、ＴＣＦ応答エレメントに作動可能に連結されるときに、遺伝子の発現を可能にする必須のエレメント、例えば、スプライスのアクセプター配列、内在性リボソーム侵入部位配列（ＩＲＥＳ）および転写停止部位、を包含する。そのようなエレメントは当業者に周知である。
【００１３】
本発明の核酸の構築物を用いることによって、作動可能に連結される治療遺伝子の発現はＴＣＦ／βカテニンのへテロダイマーが存在し、そして転写を活性化することが可能なときにのみ誘導されることが見出された。Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節解除に起因して癌になっている細胞が、転写を活性化するＴＣＦ／βカテニンのへテロダイマーを有するとき、治療遺伝子の発現が誘導される。従って、本発明の核酸の構築物は腫瘍の選択的プロモーターとして働く。
【００１４】
本発明の核酸の構築物は、ＴＣＦ／βカテニンのへテロダイマーの非存在下において、バックグラウンドのレベルを超えて作動可能に連結される遺伝子、または機能的に等価の転写活性化因子の発現の誘導を与えないことにおいて、高い選択的な発現を示す。
【００１５】
治療遺伝子は、発現すると治療の恩恵を与える任意の遺伝子であり得る。好ましい治療遺伝子は、リシンおよびジフテリアの毒素のような毒素をコードする遺伝子、ならびにＣＢ１９５４を活性化するニトロレダクターゼ、５−フルオロシトシンを活性化するシトシンデアミナーゼ、シクロホスファミドおよびパラセタモールを活性化するシトクロムＰ−４５０、およびガンシクロビルを活性化するチミジンキナーゼのようなプロドラッグ活性化酵素を包含する。好ましくは、治療遺伝子はニトロレダクターゼをコードする。適切なニトロレダクターゼは、ＥＰ−Ａ−０６３８１２３およびＷａｔａｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．において記載されている（ＮＡＲ、１８，１０５９，１９９０）。他の好ましい治療遺伝子は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭＣＳＦ，Ｂ７−１およびＢ７−２共刺激分子のような免疫調節性の因子をコードする遺伝子；ＲＢ、ｐ５３およびｐ１６のような腫瘍サプレッサーをコードする遺伝子；Ｂａｘ、ＦａｓＬおよびカスパーゼのようなアポトーシス遺伝子をコードする遺伝子を包含する。
【００１６】
プロモーターは、作動可能に連結される遺伝子の所望のレベルの発現を与える任意のプロモーターであり得る。適切なプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、Ｅ１Ｂプロモーターおよびｃ−Ｆｏｓプロモーターを包含する。好ましくは、プロモーターはＥ１Ｂプロモーターの基礎のＴＡＴＡボックスである。
【００１７】
好ましくは、ＴＣＦ応答エレメントは少なくとも３つ、およびより好ましくは、少なくとも５つのＴＣＦ結合エレメントを包含する。少なくとも３つ、およびより好ましくは少なくとも５つのＴＣＦ結合エレメントを使用することによって、より少ない結合エレメントを包含するＴＣＦ応答エレメントと比較して発現における予想外の増加が獲得され得ることが見出された。発現におけるこの増加は、コードされた産物の治療的に有効な量の生成に関して望ましい。
【００１８】
好ましくは、ＴＣＦ反応エレメントは５と１５との間のＴＣＦ結合エレメント、さらに好ましくは５と１０との間のＴＣＦ結合エレメント、および最も好ましくは５のＴＣＦ結合エレメントを包含する。
【００１９】
ＴＣＦ結合エレメントは、好ましくは３ヌクレオチドと２０ヌクレオチドとの間、さらに好ましくは３ヌクレオチドと１４ヌクレオチドとの間、および最も好ましくはヌクレオチド１０とヌクレオチド１２との間で互いに離れている。
【００２０】
ＴＣＦ結合エレメントは、特にプロモーターがＥ１Ｂプロモーターであるときに、ＤＮＡらせんの周りに半径方向に均等に分布されるように互いに間隔をあけられることがさらになお好ましい。
【００２１】
プロモーターに最も近接したＴＣＦ結合エレメントは、プロモーターのＴＡＴＡボックスから１４０ヌクレオチドと１０ヌクレオチドとの間であることが好ましい。プロモーターに最も近接したＴＣＦ結合エレメントは、プロモーターのＴＡＴＡボックスから１００ヌクレオチドと１０ヌクレオチドとの間、さらに好ましくはヌクレオチド５０とヌクレオチド１０との間、および最も好ましくは３０ヌクレオチドと１５ヌクレオチドとの間であることがさらになお好ましい。
【００２２】
１つの好ましい実施形態において、ＴＣＦ結合エレメントは３ヌクレオチドまたは４ヌクレオチドとの間で互いに離れており、およびプロモーターに近接したＴＣＦ結合エレメントはプロモーターのＴＡＴＡボックスから２５ヌクレオチドである。
【００２３】
好ましくは、このＴＣＦ結合エレメントはヌクレオチド配列ＣＴＴＴＧＡＴを有する。
【００２４】
このＴＣＦ結合エレメントは、プロモーターに対してどちらの方向（つまり５’から３’または３’から５’）においても存在し得る。
【００２５】
本発明はまた、本明細書中で５マーのＴＣＦ−Ｅ１ＢＴＡＴＡと称する核酸の構築物を提供し、それは図６において図解的に示され、そして材料および方法の節の以下において記載される。
【００２６】
本発明はまた、以下：
少なくとも５つのＴＣＦ結合エレメント；および
プロモーター配列、
を包含するＴＣＦ応答エレメントであって、ここで、このＴＣＦ応答エレメントは、発現可能な遺伝子に作動可能に連結されるとき、この作動可能に連結される遺伝子の誘導性発現を与える、ＴＣＦ応答エレメントを提供する。
【００２７】
少なくとも５つのＴＣＦ結合エレメントを包含するこのＴＣＦ応答エレメントを使用して、レポーター遺伝子または治療遺伝子のような任意の作動可能に連結された遺伝子の誘導性発現を獲得し得る。適切なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられる。
【００２８】
少なくとも５つのＴＣＦ結合エレメントを包含するこのＴＣＦ応答エレメントは、５未満のＴＣＦ結合エレメントを包含するＴＣＦ応答エレメントと比較して、作動可能に連結される遺伝子の改善された（つまり、増加された）レベルの発現を与えることが見出された。
【００２９】
ＴＣＦ結合エレメントおよび少なくとも５つのＴＣＦ結合エレメントを包含するＴＣＦ応答反応のプロモーターは上記のように定義される。
【００３０】
本発明はまた、レポーター遺伝子に作動可能に連結された少なくとも５つのＴＣＦ結合エレメントを有するＴＣＦ応答エレメントを含有するＴＣＦのレポーターの構築物を提供する。
【００３１】
本発明はまた、以下の工程を包含する、Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節解除に関連する癌の処置において使用するための候補薬物を同定する方法における、本発明のＴＣＦのレポーターの構築物の使用を提供する：
レポーター遺伝子が転写される条件下で、このＴＣＦのレポーターの構築物に試験合成物を接触させる工程；および
レポーター遺伝子の転写を測定する工程；
ここで、このレポーター遺伝子の転写を阻害するこの試験合成物は、癌の処置のための候補薬物である。
【００３２】
好ましくは、ＴＣＦのレポーターの構築物と接触するこのステップは、調節解除されたＷｎｔシグナル伝達経路をともなう細胞からの溶解物の存在中で実行される。
【００３３】
本発明はまた、本発明の核酸の構築物、または発現可能な遺伝子に作動可能に結合される本発明の少なくとも５つのＴＣＦ結合エレメントを有するＴＣＦ応答エレメントを含有するベクターを提供する。
【００３４】
このベクターは、ＤＮＡを細胞に移入し得る任意のベクターであり得る。好ましくは、このベクターは組込みベクターまたはエピソームベクターである。
【００３５】
好ましい組込みベクターとしては、組換えレトロウイルスベクターが挙げられる。組換えレトロウイルスベクターは、標的細胞に感染可能であるレトロウイルスゲノムの少なくとも１つの部分のＤＮＡを包含する。「感染」という用語は、ウイルスが遺伝物質をその宿主または標的細胞に移入するプロセスを意味するために使用される。好ましくは、本発明のベクターの構築物において使用されるレトロウイルスはまた、複製欠損として標的細胞のウイルス複製の効果を取り除く。そのような場合において、複製欠損のウイルスゲノムは、従来の技術に従ってヘルパーウイルスによってパッケージングされ得る。概して、感染および機能的な遺伝子の移入の能力の上記の判定基準を満たす任意のレトロウイルスは、本発明の実行において利用され得る。
【００３６】
適切なレトロウイルスベクターとしては、ｐＬＪ、ｐＺｉｐ、ｐＷｅおよびｐＥＭが挙げられるが、これらに限定されず、当業者には周知である。複製欠損のレトロウイルスに関する適切なパッケージングウイルスの株としては、例えば、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡｍが挙げられる。
【００３７】
本発明において有用な他のベクターは、アデノウイルス、アデノ随判ウイルス、ＳＶ４０ウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶおよびポックウイルスベクターを包含する。好ましいベクターはアデノウイルスである。アデノウイルスベクターは当業者に周知であり、ならびに遺伝子を気道上皮、胸骨筋、肝臓、脳および皮膚を包含する、無数の細胞の種類に運搬するために使用される（Ｈｉｔｔ、ＭＭ、Ａｄｄｉｓｏｎ  ＣＬ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ，ＦＬ（１９９７）遺伝子を哺乳動物細胞に移入するためのヒトアデノウイルスベクター。Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４０：１３７−２０６；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ  ＷＦ（１９９８）ヒトの遺伝子治療。Ｎａｔｕｒｅ，３９２：（６６７９  ｓｕｐｐｌ）：２５−３０）。
【００３８】
さらなる好ましいベクターはアデノ随判（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターは、当業者に周知であり、および遺伝子治療の適用のためのヒトＴリンパ球、繊維芽細胞、鼻ポリープ、骨格筋、脳、赤血球および造血幹細胞を安定的に形質導入するために使用されている（Ｐｈｉｌｉｐ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４，２４１１−２４１８；Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９１，８９１５−８９１９；Ｆｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９０，１０６１３−１０６１７；Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８９，７２５７−７２６１；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９１，１０１８３−１０１８７；Ｅｍｅｒｓｏｎ，１９９６，Ｂｌｏｏｄ，８７，３０８２−３０８８）。国際特許出願ＷＯ９１／１８０８８は具体的なＡＡＶベースのベクターについて記載する。
【００３９】
好ましいエピソームベクターとしては、一過的な非複製エピソームベクター、および例えば、ＥＢＶ，ヒトパポバウイルス（ＢＫ）およびＢＰＶ−１のウイルスの複製起点に由来する機能をともなう自己複製エピソームベクターが挙げられる。そのような組込みベクター、およびエピソームベクターは当業者に周知であり、そして当業者に周知である文献の本文において充分に記載されている。特に、適切なエピソームベクターはＷＯ９８／０７８７６において記載されている。
【００４０】
哺乳動物の人工的な染色体もまた、本発明においてベクターとして使用され得る。哺乳動物の人工的な染色体の使用は、Ｃａｌｏｓによって考察されている（１９９６，ＴＩＧ，１２，４６３−４６６）。
【００４１】
好ましい実施形態において、本発明のベクターはプラスミドである。このプラスミドは非複製で非組込みなプラスミドであり得る。
【００４２】
本明細書中で使用される「プラスミド」という用語は、発現可能な遺伝子をコードする任意の核酸をいい、そして直鎖状または環状の核酸および二本鎖または一本鎖の核酸を包含する。この核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、そして改変されたヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを包含し得、そしてメチル化のような手段または保護基またはキャプもしくはテイルの構造の包含により化学的に改変され得る。
【００４３】
非複製、非組込みなプラスミドは、宿主細胞にトランスフェクトされたとき、複製せず、そして宿主細胞のゲノムに特異的に組込まない核酸である（つまり、高い頻度および特定の部位で組込まない）。
【００４４】
複製プラスミドは、Ｕｓｔａｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０，４４９−４５７，１９９１の標準的な複製アッセイを包含する標準的なアッセイを使用して同定され得る。
【００４５】
本発明はまた、本発明のベクターでトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。宿主細胞は任意の哺乳動物細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞はげっ歯類または哺乳動物細胞である。
【００４６】
本明細書中に記載されるベクターを細胞に送達するための多数の技術は、公知であり、そして本発明に従って有用である。そのような技術としては、核酸濃縮剤の使用、エレクトロポレーション、アスベスト、ポリブレン、ＤＥＡＥセルロース、デキストラン、リポソーム、カチオンリポソーム、リポポリアミン、ポリオルチニンとの複合体化、パーティクルボンバートメントならびに直接マイクロインジェクションの使用を包含することに有用である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ａｎｄ  Ｓｋｏｕｌｔｃｈｉ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６：３４９−３７９（１９８４）；Ｋｅｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：５２７（１９９０）において概説される）。
【００４７】
本発明のベクターは、ウイルスもしくは非ウイルスの送達手段を介して、宿主細胞に非特異的または特異的に（つまり、宿主細胞の部分集合を称したものに）送達され得る。ウイルスの起源の好ましい送達方法は、ウイルスのパッケージングシグナルが操作された本発明のベクター、例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびパポバウイルスのためのトランスフェクションレシピエントとしてウイルスの粒子生成するパッケージング細胞株を包含する。好ましい非ウイルスベースの遺伝子送達手段および方法もまた、本発明において使用され、そして直接的な裸の核酸の注入、ペプチドおよび非ペプチドを濃縮する核酸、カチオン性リポソームおよびリポソームにおけるカプセル化を包含し得る。
【００４８】
組織へのベクターのこの直接的な送達は記載されており、およびいくつかの短期の遺伝子発現は達成されている。筋肉（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１４６５−１４６８，１９９０）甲状腺（Ｓｙｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，５，８３７−８４４，１９９４）黒色腫（Ｖｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３，９６２−９６７，１９９３）、皮膚（Ｈｅｎｇｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ，１０，１６１−１６６，１９９５）、肝臓（Ｈｉｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，５，１４７７−１４８３，１９９４）および露出後の気道上皮（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２，４５０−４６０，１９９５）へのベクターの直接的な送達は、明確に従来技術において記載されている。
【００４９】
ウイルスのエンペロープタンパク質のアミノ酸配列に由来する多様なペプチドは、ポリリジンＤＮＡ複合体（Ｐｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２９１８−１２９２４（１９９４）；．Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｄｏｎｊｉｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：３２３−３２７（１９９２）；ＷＯ９１／１７７３；ＷＯ９２／１９２８７；およびＭａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３０７８；１３８−１４３（１９９４））と共投与される場合、遺伝子の移入において使用されており、カチオン脂質と共ポリリジン結合体の共濃縮が、遺伝子の移入の効率において向上をもたらし得ることを示唆する。国際特許出願ＷＯ９５／０２６９８は、カチオン脂質遺伝子の移入の効率の増加を試みるためのウイルス成分の使用を開示する。
【００５０】
本発明における有用な核酸濃縮剤としては、スペルミン、スペルミン誘導体、ヒストン、カチオンペプチド、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のようなカチオン非ペプチド、およびポリリジンが挙げられる。「スペルミン誘導体」とは、スペルミンの類似体および誘導体をいい、そして国際特許出願ＷＯ９３／１８７５９（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ３０，１９９３に公開）に記載の化合物を包含する。
【００５１】
ジスルフィド結合は、送達ベシクルのペプチド成分に結合するために使用されている（Ｃｏｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４（１９９２））；または、Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（前出）を参照のこと
ＤＮＡの構築物を細胞に送達するための送達ベシクルは、当該分野において公知であり、および細胞の表面のレセプターにとって特異的なＤＮＡ／ポリカチオン複合体を包含し、例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１４６２１（１９８８）；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３−９６７（１９９２）；および米国特許第５，１６６，３２０号において記載されている。
【００５２】
本発明に記載のベクターの送達は、核酸凝集ペプチドを用いて考慮される。核酸凝集ペプチドは、ベクターの凝集およびベクターの細胞への送達に特に有用であり、国際特許出願ＷＯ９６／４１６０６に記載される。ＷＯ９６／４１６０６に記載のように本発明に従うベクター送達に有用なペプチドに官能基を結合し得る。これらの官能基は、特定の細胞型を標的にするリガンド（例えば、モノクローナル抗体、インスリン、トランスフェリン、アシアログリコプロテイン、または糖）を含み得る。したがってこのリガンドは、非特異的な様式または細胞型に関して限定される特異的な様式で細胞を標的し得る。
【００５３】
官能基はまた、脂質（例えば、パルミトイル、オレイル、ステアロイル）、中性親水性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリビニルピロリドン）、フソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ペプチド（例えば、インフルエンザウイルスのＨＡペプチド）、またはリコンビナーゼ、またはインテグラーゼを含み得る。官能基はまた、細胞内輸送タンパク質（例えば、核局在化配列（ＮＬＳ））、エンドソーム回避シグナル（例えば、膜破壊ペプチド）、または細胞質に直接指向するシグナル指向タンパク質を含み得る。
【００５４】
本発明はまた、治療に用いるための本発明の核酸構築物、ベクター、または宿主細胞を提供する。
【００５５】
好ましくは、この核酸構築物、ベクター、または宿主細胞を癌の処置に使用する。
【００５６】
本発明はまた、癌の処置に使用するための組成物の製造における、本発明の核酸構築物、ベクター、または宿主細胞の使用を提供する。
【００５７】
本発明はまた、処置の必要な患者に本発明の核酸構築物、ベクター、または宿主細胞の有効量を投与する工程を含む処置方法を提供する。好ましくは、この患者は癌に罹患している。
【００５８】
好ましくは、癌は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の調節解除に関する任意の癌（例えば、結腸直腸の癌、メラノサイト、乳癌、前立腺癌、および肝細胞癌）である。
【００５９】
本発明はまた、本発明の核酸構築物、ベクター、または宿主細胞を含む薬学的組成物を、薬学的に受容可能なレシピエントとの組み合せにおいて提供する。
【００６０】
本発明の薬学的組成物は、本発明の核酸構築物、ベクター、または宿主細胞を、必要な場合、疾患を処置する治療のための薬学的に受容可能なキャリア、または希釈剤との混合で含み得る。
【００６１】
本発明の核酸構築物、ベクター、もしくは宿主細胞、または薬学的組成物は、全身経路、筋肉内経路、皮下経路、皮内経路、静脈内経路、エアロゾル経路、経口（固体または液体形態）、局所経路、眼の経路、座薬のような経路、腹腔内経路および／またはくも膜下腔内経路、および局所での直接の注入を含む経路を経て投与され得る。
【００６２】
当然、正確な投与レジメンは、個々の患者について個々の医師によって決定される必要があり、同様に、治療的遺伝子によって発現されるタンパク質の正確な性質および処置の標的とされる組織の型によって調節される。
【００６３】
投与量はまた、疾患の指標および投与経路に依存する。
【００６４】
本発明に従う有効な処置のために送達される核酸構築物またはベクターの量は、好ましくは約５０ｎｇ〜１０００μｇベクターＤＮＡ／ｋｇ体重の範囲；そしてさらに好ましくは約１〜１００μｇベクターＤＮＡ／ｋｇの範囲である。
【００６５】
インビボ細胞取り込みのために、本発明に従い核酸構築物、ベクター、または宿主細胞が哺乳動物に投与されることは好ましいが、細胞が動物から取り出され、核酸構築物またはベクターが形質導入され、次いで動物に再移植されるエキソビボアプローチが利用され得る。例えば、肝臓は、動物から肝細胞をとりだし、インビトロで肝細胞に形質導入し、そして形質導入された肝細胞を動物に再移植することによるエキソビボアプローチによってアクセスされ得る（例えば、ウサギについては、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１８０２〜１８０５、１９９１に記載される、ヒトについては、Ｗｉｌｓｏｎ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１７９〜２２２、１９９２に記載される）。このような方法はまた、循環器系またはリンパ系の種々の細胞集団（例えば、赤血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および造血幹細胞）への送達に有効であり得る。
【００６６】
本発明はまた、本発明の核酸構築物、または発現可能な遺伝子に作動可能に結合した少なくとも５つの本発明のＴＣＦ結合エレメントを含むＴＣＦ応答エレメントの細胞への送達のための組成物を提供する。
【００６７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、以下の実施例の使用によって詳細に記載される。これらは、単に例示する方法に過ぎず、限定されるべきものではない。
【００６８】
（実施例）
（材料および方法）
（細胞培養物）
ＨｅｐＧ２（ヒト肝臓癌；変異βカテニン）細胞株，ＳＷ４８０（ヒト結腸癌，変異ＡＰＣ）細胞株およびＨｅＬａ（ヒト子宮頸部癌）細胞株をＡＴＣＣから入手し、そして供給者の推奨にしたがって維持した。ＰＥＲ．Ｃ６（ヒト胚性網膜芽細胞株）細胞株をＩｎｔｒｏＧｅｎｅから入手し（Ｆａｌｌａｕｘら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、９：１９０９−１９１７、１９９８）、そしてＤＭＥＭ（１０％  ＦＣＳ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２および抗生物質（１５０μｇ／ｍｌペニシリン、２５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン）を補充した）中で培養した。
【００６９】
初代ヒト皮膚線維芽細胞を健康なボランティア由来のパンチ生検サンプルから単離し、そして上記のように維持した。ＨＵＶＥＣ細胞をＰｒｏｍｏｃｅｌｌ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し、そしてＥｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｐｌｕｓ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　Ｍｉｘ（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）中で維持した。初代肝細胞を抗生物質、グルタミン、インスリン、およびヒドロコルチゾンを添加したＷｉｌｌｉａｍｓ培地中で維持した。
【００７０】
（プラスミド構築）
ｐＧＬ３ｐｒｏ／５マーＴｃｆ−ＳＶ４０（ＣＴＬ５０１）をクローニングするために、オリゴヌクレオチド１と２、３と４の部分的に相補した対をアニールすることによって、部分的に２重鎖になった２つのフラグメントを生成した。
【００７１】
オリゴ１：ＰＣＴ　ＡＧＣ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＣＴ　ＡＧＴ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＧ　ＡＧＴ　ＣＣＴ　ＡＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＴＣ　ＴＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＣ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣ
オリゴ２：ＰＡＣ　ＴＧＡ　ＡＴＴ　ＣＣＴ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＡＧＧ　ＡＣＴ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＡＣＴ　ＡＧＴ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　Ｇ
オリゴ３：ＰＡＡ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＡＧ　ＴＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＧＡＧ　ＴＣＣ　ＴＡＣ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣＴ　ＣＴＡ　ＡＡＴ　ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　Ａ
オリゴ４：ＰＧＡ　ＴＣＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＴＧＣ　ＡＴＴ　ＴＡＧ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＣＴＣ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧ
（ここでＰは、リン酸修飾を示す）
これらのフラグメントは、それぞれ３つのＴＣＦ結合部位（コンセンサスなＣＣＴＴＴＧＡＴＣ）を含む。これらの２重鎖フラグメントを連結し、そして生じた６つのＴＣＦ部位を含むフラグメント（約１３０ｂｐ）をそれらのＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩ部位を用いて、ＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩで消化したｐＧＬ３プロモータープラスミド（ｐＧＬ３ｐｒｏ；Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、ｐＧＬ３ｐｒｏ／５マーＴｃｆ−ＳＶ４０クローン１０を生成した。しかし、配列決定によりほとんどの３’ＴＣＦ結合部位が１つのＧヌクレオチドの欠損を含み、非活性部位（ＣＣＴＴＴＡＴＣ）を産生することが明らかになった（図１を参照のこと）。
【００７２】
ＣｌｏｎｔｅｃｈプラスミドｐＧ５ＣＡＴ由来のｐＧＬ３ベーシック／５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ（ＣＴＬ５０２）８４ｂｐを産生するために、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのオーバーハングを含むオリゴを用いて、アデノウイルスＥ１ＢＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡＴＡＡＴ）の上流２１ｂｐおよび下流５５ｂｐにかけてをＰＣＲで増幅した。次いで、このフラグメント（Ａｄ５Ｅ１Ｂプロモーター（ＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＣＧＣＣ）の１６ｂｐを含む）をＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＧＬ３ベーシックにクローニングし、ｐＧＬ３ベーシック／Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン２を産生した（図６ｃを参照）。次いで、ｐＧＬ３ベーシック／５マーＴｃｆ−ＳＶ４０（ＣＴＬ５０１）クローン１０由来の５マーのＴＣＦ部位をＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩ消化により切りだし、そしてＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＧＬ３ベーシック／Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン２にクローニングし、ｐＧＬ３ベーシック／５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１を生成した。配列決定によって予期される構築物を確認した。
【００７３】
ｐＧＬ３ｐｒｏ／ＴｃｆＡ−ＳＶ４０クローン４，ｐＧＬ３ｐｒｏ／ＴｃｆＢ−ＳＶ４０クローン３１，ｐＧＬ３ｐｒｏ／ＴｃｆＣ−ＳＶ４０クローン３，ｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＡ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン２８，ｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＢ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１０およびｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１を産生するために、オリゴヌクレオチド５、７、および９（それぞれは、５つの活性なＴＣＦ結合部位（ＣＣＴＴＴＧＡＴＣ）および内包的な変異部位（一貫性に、ＣＣＴＴＴＡＴＣ）を含む）を、これらのそれぞれのアンチセンスオリゴヌクレオチド６、８、および１０に対してアニールした。
【００７４】
オリゴ５：ＣＴＡ　ＧＣＡ　ＡＧＣ　ＴＴＡ　ＣＴＡ　ＧＴＣ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＡＧＡ　ＧＴＴ　ＴＣＣ　ＴＡＣ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣＴ　ＣＴＡ　ＡＡＴ　ＴＧＣ　ＡＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＡＧ　ＴＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＧＡＧ　ＴＡＡ　ＣＣＴ　ＡＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＴＣ　ＴＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＣ　ＣＴＴ　ＴＡＴ　ＣＡ
オリゴ６：ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＡ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＡＧＧ　ＴＴＡ　ＣＴＣ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＣＴＧ　ＡＡＴ　ＴＣＣ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　ＴＡＧ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＡＡＣ　ＴＣＴ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＣ　ＴＡＧ　ＴＡＡ　ＧＣＴ　ＴＧ
オリゴ７：ＣＴＡ　ＧＣＡ　ＡＧＣ　ＴＴＡ　ＣＴＡ　ＧＴＣ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＡＧＣ　ＴＡＣ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣＴ　ＣＴＡ　ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＧ　ＡＧＴ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＡＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＴＣ　ＴＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＣ　ＣＴＴ　ＴＡＴ　ＣＡ
オリゴ８：ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＡ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＡＧＧ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＡＣＴ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＴＧＣ　ＴＡＧ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＴＡ　ＧＣＴ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＣ　ＴＡＧ　ＴＡＡ　ＧＣＴ　ＴＧ
オリゴ９：ＣＴＡ　ＧＣＡ　ＡＧＣ　ＴＴＡ　ＣＴＡ　ＧＴＣ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＡＴＡ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＴＣＡ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＧ　ＴＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＴ　ＡＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＴＣ　ＴＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＣ　ＣＴＴ　ＴＡＴ　ＣＡ
オリゴ１０：ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＡ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＴＧＡ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＴＡＴ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＣ　ＴＡＧ　ＴＡＡ　ＧＣＴ　ＴＧ
（すべての６つのオリゴヌクレオチドは、５’リン酸で修飾された）。
【００７５】
ＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩのオーバーハングを含む得られたフラグメントを、ＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩ消化したｐＧＬ３プロモーターまたはＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩ消化されたｐＧＬ３ベーシック／Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン２にクローニングして、上述の構築物を産生した。この配列が予期されたようであることを確認した。
【００７６】
構築物ｐＧＬ３ベーシック／２マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン９、ｐＧＬ３ベーシック／３マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン２、ｐＧＬ３ベーシック／３マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１３、ｐＧＬ３ベーシック／４マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１５、およびｐＧＬ３ベーシック／４マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン３４を同様にクローニングしたが、これらの構築物は、最も恐らくはアニーリングの間のループ形成および続く形質転換後のＥ．ｃｏｌｉ中でのループ切除に起因して１つ以上のＴｃｆ部位を欠損している。ＴＣＦ部位およびこれらの構築物の確認された配列の間の間隔については、図９ａおよびｃを参照。
【００７７】
ｐＧＬ３ベーシック／８８−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン８およびｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＣ−８８−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン２（ＴＡＴＡボックスとの距離：ｄ＝１４０）を、ヒトβグロブリン遺伝子イントロンＩＩ由来のＰＣＲで増幅した８８ｂｐフラグメント（５’オリゴ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧ、３’オリゴ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣ）ＢｇｌＩＩオーバーハングを用いて、ＢｇｌＩＩ消化したｐＧＬ３ベーシック／Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン２またはＢｇｌＩＩ消化したｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１にそれぞれクローニングすることによって構築した。ｐＧＬ３ベーシック／４４７−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１およびｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＣ−４４７−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン６（ＴＡＴＡボックスとの距離：ｄ＝４９９）を、ヒトβグロブリン遺伝子イントロンＩＩ由来のＰＣＲで増幅した４４７ｂｐフラグメント（５’オリゴ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧ、３’オリゴ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴＧＧＴＣＡＡＴＡＴＧＴＧＴＡＣＡＣ）ＢｇｌＩＩオーバーハングを用いて、ＢｇｌＩＩ消化したｐＧＬ３ベーシック／Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン２またはＢｇｌＩＩ消化したｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１にそれぞれ挿入することによってクローニングした。この配列を確認した。
【００７８】
ｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＣ−２５−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン６（ＴＡＴＡボックスへの距離：ｄ＝２５）を作製するために、ＴｃｆＣフラグメントを、ｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１からＨｉｎｄＩＩＩ／Ｂｇ／ＩＩ消化によって切出して、次いでマングビーンヌクレアーゼ（ＮＥＢ）を用いて鈍化した（ｂｌｕｎｔ）。鈍化したフラグメントを、部分的にＸｂａＩで消化したマングビーンヌクレアーゼ−鈍化ｐＧＬ３ベーシック／Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン２の中にクローン化して、中間構築物ｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＣ−２５−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１９を作製した。ここから、本発明者らは、ＴｃｆＣ２５−Ｅ１ＢＴＡＴＡプロモーターフラグメントを、ｐＧＬ３ベーシック中へ再クローン化する必要があった。なぜならこのプロモーターのすぐ上流のプラスミド骨格が、未知の理由によりクローン１９中で変化されたからである。従って、このＴｃｆＣ−２５−Ｅ１ＢＴＡＴＡプロモーターを、ＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化によりｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＣ−２５−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１９から切りだし、次いでＫｌｅｎｏｗ酵素を用いて鈍化した。最後に、鈍化したＴｃｆＣ−２５−Ｅ１ＢＴＡＴＡフラグメントを、正しいプラスミド骨格を有するｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＣ−２５−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン６（ｄ＝２５）を生成するためにＨｉｎｄＩＩＩ消化してＫｌｅｎｏｗ鈍化したｐＧＬ３ベーシック中にクローン化した。鈍化プロセスが誤りがちであるので、この配列を決定した（図１０ｃ）。
【００７９】
（遷移（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ）
ＨｅｐＧ２、ＳＷ４８０およびＨｅＬａを、トランスフェクションの前日に、それぞれの６ウェルあたり２．５×１０５、１．５×１０５および６．０×１０４の細胞の密度で、播種した。次の日に、ＣＬ２２ペプチド（ＫＫＫＫＫＫＧＧＦＬＧＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲＳＡＹＥＲＭＣＮＩＬＫＧＫ（国際特許出願ＷＯ　９８／３５９８４に記載される））とプラスミドＤＮＡとの混合物（２：１比率、μｇ：μｇ）を、ＨＢＳ（１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ　７．４，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ；Ｓｉｇｍａ）中で最終容量１００μｌとして調製して、そして室温において、０．９ｍｌの「ＲＡＣ」溶液（ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）中の０．１％ヒトアルブミン（ＢＰＬ、ＵＫ）、１２０μＭのクロロキン（Ｓｉｇｍａ））の添加前に３０〜４５分間インキュベーションした。次いで、このトランスフェクション溶液を、ＰＢＳで１回洗浄した後の細胞に加えて、これらの細胞と４〜５時間インキュベーションした。その後、２ｍｌの新鮮な完全培地で置きかえた。２日後、細胞を、ＰＢＳの使用により１度洗浄し、次いで、１０分間、室温で２００μｌ溶解緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．８、８ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００および１５％グリセロール）中でインキュベーションした。遠心分離後、この上清のアリコートを、照度計（Ｌｕｍａｔ　ＬＢ　９５０１，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してルシフェラーゼアッセイ緩衝液（溶解緩衝液中の０．１ｍＭルシフェリン，０．４４ｍＭ　ＡＴＰ）と共に、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。活性を各サンプル中のこのタンパク質の含有量（ＢＣＡ，Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて正規化した。
【００８０】
（ＮＴＲを発現する複製欠損アデノウイルスの構築）
この移入ベクターを使用して、この組換えアデノウイルスベクターｃ１／ＣＴＬ５０１、ｃ１３およびＣＴＬ５０２を構築した。すなわちｐＰＳ１１２８／５マーＴｃｆ−ＳＶ４０（クローン１および１３）およびｐＰＳ１１２８／５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ（クローン１０）のそれぞれを、２段階で構築した。第１に、ｐＧＬ３ｐｒｏ／５マーＴｃｆ−ＳＶ４０クローン１０からの５マーＴｃｆ−ＳＶ４０プロモーターおよびｐＧＬ３ベーシック／５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１からの５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡプロモーターを、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてＨｉｎｄＩＩＩ消化されたｐＴＸ０３７４の中にクローン化し、これは、それぞれのＴｃｆプロモーターとＣＭＶエンハンサー／プロモーターを置換して「ｐＴＸ０３７４／５マーＴｃｆ−ＳＶ４０クローン８」および「ｐＴＸ０３７４／５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１」を作製する。ｐＴＸ０３７４は、転写安定化のためのヒトβ−グロビンイントロンＩＩおよび終止のための相補的２遺伝子ポリ（Ａ）シグナルならびに骨格としてのプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋を伴うＣＭＶ−ＮＴＲ−ＩＶＳＩＩ−ｐ（Ａ）（ＮＴＲ：ゲノムＤＮＡから増幅されたＥ．ｃｏｌｉ　Ｂ／ｒ　ニトロレダクターゼ（ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ）遺伝子）発現カセットを含む。第２の段階において、ｐＴＸ０３７４／５マーＴｃｆ　ＳＶ４０クローン８由来のこの完全な発現カセットおよびｐＴＸ０３７４／５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１を、ＳｐｅＩ消化したｐＰＳ１１２８の中へ再クローン化し、「ｐＰＳ１１２８／５マーＴｃｆ−ＳＶ４０クローン１および１３」（クローン１：Ｅ１において左から右への方向；クローン１３：Ｅ１において右から左への方向）および「ｐＰＳ１１２８／５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１０」（Ｅ１において左から右への方向）を作製した。ｐＰＳ１１２８は、Ｐ．Ｓｅａｒｌｅ博士（ＣＲＣ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｔｕｄｉｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）の厚意により提供された。ｐＰＳ１１２８は、左手側ＩＴＲ〜ヌクレオチド３５９およびヌクレオチド３５２５〜１０，５８９のアデノウイルス配列を含み、従って、これはＥｌ−欠失ベクターである。
【００８１】
ＣＴＬ１０２を生成するために使用される移入ベクターであるｐＴＸ０３７５を、発現カセット（ＣＭＴ−ＮＴＲ−ＩＶＳＩＩ−ｐ（Ａ））全体にわたるｐＴＸ０３７４由来のＳｐｅＩフラグメントを、ＳｐｅＩ消化ｐＰＳ１１２８の中へクローニングおよび左から右方向でカセットを含むクローンの同定によって構築した。
【００８２】
アデノウイルス「骨格」ベクターｐＰＳ１１６０を、ｐＰＳ１１２８のＰａｃＩ線形化、ＸｂａＩ部位含むＰａｃＩ−適合性アダプター（オリゴ１：５’ＴＡＣＡＴＣＴＡＧＡＴＡＡＴ−３’，オリゴ２：５’−ＴＴＡＴＣＴＡＧＡＴＧＴＡ−３’）を用いたライゲーション、その後のＡｄ５配列３５２４〜１０５８９を含む約７ｋｂのＸｂａＩフラグメントを放出するＸｂａＩ消化によって構築した。次いで、これを、ＸｂａＩ線形化したｐＰＳ１０２２（Ｐｅｔｅｒ　Ｓｅａｒｉｅ博士）すなわちヌクレオチドの２８，５９２〜３０，４７０（Ｅ３領域）を欠いたヌクレオチド１０，５８９〜右手側ＩＴＲのＡｄ５配列を含むｐＵＣ１８−ベースのプラスミドの中へクローン化した。
【００８３】
組換えウイルスＣＴＬ５０１、ＣＴＬ５０２およびＣＴＬ１０２を、相同性組換えによってＰｅｒ．Ｃ６細胞中に構築した。これらを、ｐＰＳ１　１２８／５マーＴｃｆ−ＳＶ４０（クローン１またはクローン１３）、ｐＰＳ１１２８／５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ（クローン１０）またはｐＴＸ０３７５のそれぞれ、およびｐＰＳ１１６０の等モル混合物を用いて９０％融合性のＰＥＲ．Ｃ６細胞の中へ同時トランスフェクトした。組換えウイルスを、感染培地（ＤＭＥＭ，１％ＦＣＳ，２ｍＭ　ＭｇＣｌ２）中での３回の凍結融解サイクルによって約７日後に回収した。反復感染／収集サイクルにより、ウイルスを巨大なスケールまで増殖し、次いで標準的なＣｓＣｌ密度遠心分離により精製し、貯蔵緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７．４，１４０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＫＣｌ、０．６ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４、０．９ｍＭ　ＣａＣｌ２，０．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２および５％スクロース）の過剰量に対して透析し、そして最後に液体窒素で急速冷凍（ｓｎａｐ−ｆｒｏｚｅｎ）し、そして−８０℃で貯蔵した。粒子濃度を、ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて決定した。感染力価（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｔｉｔｒｅｓ）を、１００粒子中の１粒子が感染性のであるとする仮定に基づいて推定したか、または規定された内部のウイルス標準に対する限界希釈の標準的方法で決定した。アデノウイルスＤＮＡを、制限消化およびテンプレートとしてウイルスＤＮＡを使用する直接的な配列決定（開始ＮＴＲ読み枠までのプロモーター領域を、配列決定した）により特徴づけた。
【００８４】
ｐＴＸ０３７４を、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｎｔｒ遺伝子に結合したＣＭＶプロモーターを含む１．６ｋｂ　Ｂｇ／ＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＳＷ１０７中へクローニングすることにより構築した。このプラスミドを、ヒト相補Ｃ２遺伝子のｐｏｌｙＡ付加および転写終止シグナルを含む２４０ｂｐ　ＨｉｎｃＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに結合したヒトβ−グロビン遺伝子（エキソン２のＢａｍＨＩ部位〜エキソン３のＥｃｏＲＩ部位）の９１７ｂｐフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローニングすることによって構築した。ｐＴＸ０３７５を、ｐＴＸ０３７４由来の２．５ｋｂ　ＳｐｅＩフラグメントをＳｐｅＩ消化ｐＰＳ１１２８中にクローニングすることにより構築した。このプラスミドを、２段階で構築した。第１に、ｐＰＳ９７１（Ｗｅｅｄｏｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、印刷中）の左手側ＥｃｏＲＩ部位をＳｗａＩ部位に変換してｐＰＳ１１５を生成した。第２に、ｐＰＳ１１５の３５０ｂｐのＳｐｅ１−Ａｆ／ＩＩフラグメントを、以下の２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって調製したリンカーで置換した：
５’−ＣＴＡＧＴＡＴＣＧＡＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＧＣＧＴＧＧＣＣ−３’および
５’−ＴＴＡＡＧＧＣＣＡＣＧＣＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＣＧＡＴＡ−３’。
ｐＰＳ１０２２を、ＳｗａＩ部位への右手側ＥｃｏＲＩ部位の変換によってｐＰＳ９７２から構築した。
【００８５】
当業者は、任意の適切なベクターを本発明のＴｃｆ応答エレメントの構築において使用し得ることを理解する。特に、任意の適切なアデノウイルスベースのベクターを、本発明のＴｃｆ応答エレメントの構築において使用し得ることを理解する。
【００８６】
（アデノウイルスＤＮＡの調製）
ウイルスＤＮＡを、ＣｓＣｌでバンド形成した約１０１１個のウイルス粒子から、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ　ｐＨ７．５，５ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０，０．１％ＳＤＳの中の１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫとともに、３〜４時間、３７℃でインキュベーションすることによって調製した。次いで、粗ＤＮＡ調製物を、等容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を用いて２回、クロロホルムのみを用いて１回抽出して、次いでドライアイス／エタノール浴中で、１／１０体積の３．０Ｍ酢酸ナトリウムおよび２倍体積の１００％エタノールで、１０分間沈澱させた。遠心分離後、（１０分間、１３Ｋ、室温で）得られたＤＮＡペレットを、７０％エタノールで洗浄して、空気乾燥し、次いで水中に再懸濁した。ウイルスＤＮＡを、制限消化で分析した。ＣＴＬ５０１およびＣＴＬ５０２のプロモーター領域を、ＤＮＡ配列決定（Ｓｅｑｌａｂ　ＧｍｂＨ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）で分析した。
【００８７】
（ウイルス形質転換した細胞により発現されたＮＴＲのアッセイ（ＥＬＩＳＡ））
６ウェル細胞培養プレート当たり１〜１．５×１０４細胞を、９０分間、３７℃、５％Ｃ０２雰囲気において感染培地（ＤＭＥＭ／１％ＦＣＳ）中のウイルスとともにインキュベーションし、その後の２日間の完全培地中でのインキュベーションにより形質導入した。次いで、細胞質抽出物を、低張溶解により調製した。細胞をＰＢＳで洗浄し、その後氷温（ｉｃｅ−ｃｏｌｄ）低張溶解緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７．５）を４５分間氷上で用いることにより溶解した。抽出物を、１３Ｋ、２分間の遠心分離で透明化した。９６ウェル（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ　Ｐｌａａｔｅ　Ｍａｘｉｓｏｒｐ　Ａｓｓａｙ　Ｐｌａｔｅ）を、５０μｌ抽出物の３連で一晩コートした。ウェルを、ＰＢＳ／０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０を用いて３回洗浄して、次いでヒツジ抗ＮＴＲポリクローナル抗体（ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ２０中で１：２，０００希釈したものを１００μｌ）とともに、３０分間、室温でインキュベートした。ＰＢＳ／０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０を用いた３回の洗浄によって過剰な一次抗血清の除去した後、この抽出物を、ロバ抗ヒツジＨＲＰ結合体（ＰＢＳ／０．５％　Ｔｗｅｅｎ２０による１：５，０００希釈物を１００μｌ）とともに、３０分間、室温でインキュベートした。ＰＢＳでの３回洗浄後、ウェルを１ｍｌのＴＭＢ（ＤＭＳＯ中１ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）と９ｍｌの０．０５Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（Ｓｉｇｍａ）および２μｌの３０％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ２とを混合することにより調製した１００μｌの溶液とともにインキュベートした。ウェルを、１５分間、室温でインキュベートし、この反応を２５μｌの２Ｍ　Ｈ２ＳＯ４で停止した。ＯＤ４５０ｎｍを、９６ウェルプレート読取り機（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ　Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ　ＭＳ）を用いて読取った。
【００８８】
（ウイルス注入された異種移植片のＮＴＲ免疫染色）
ＳＷ４８０腫瘍を、２０μｌのＣＴＬ１０２またはＣＴＬ５０１のいずれかで注入して、そして４８時間後に安楽死させ切り取った。次いで、この腫瘍を、２０〜２４時間、４℃で４％ホルマリン／ＰＢＳ中に固定し、その後パラフィンワックス（Ｃｉｔａｄｅｌ　２０００）中に組込んだ。３−４μｍのワックス切片を切り、そしてＡＰＥＳ処理したガラススライド上に回収した。切片を、脱ワックスし、再水和し、ＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０中で２回洗浄して（５分）、次いで０．２５％Ｈ２Ｏ２／ＰＢＳに、３０分間、室温で浸した。次いで、切片をＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０中で３回洗浄し（５分間）、次いで氷温度（ｉｃｅ　ｃｏｌｄ）０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を５分間、室温で用いて透過性を上げ、その後ＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いた５分間の洗浄を２回行った。次いで、切片をＰＢＳ中の５％正常ウサギ血清を用いて、６０分間、室温で遮断し、その後ポリクローナルヒツジ抗ＮＴＲ（ＰＢＳ中で１：２，０００希釈）を用いてインキュベーションを、６０分間、室温で行った。過剰な一次抗体を、ＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いた洗浄（５分間）を３回行うことにより除去し、その後、ビオチン化した抗ヒツジＩｇＧ／ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰ溶液（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ　ＡＢＣキット、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＰＫ−６１０６、ＰＢＳ中１：２００希釈）を用いてインキュベーションを、３０分間、室温で行った。
【００８９】
切片を、ＰＢＳ／０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて５分間で３回洗浄して、次いで、新たに調製したＡＥＣ試薬（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ，Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いてインキュベーションした。反応を、１０分後に水で洗浄することにより停止し、そして最後に、切片を水性マウンタント（ｍｏｕｎｔａｎｔ）中で標本にした。染色を標準化した面積内で陽性染色された細胞を計数することにより、分析した。
【００９０】
（ヌードマウスの皮下腫瘍異種移植片の生成）
腫瘍異種移植片を、雄性Ｂａｌｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕマウス（６〜８週齢，Ｈａｒｌａｎ　ＵＫ）の側面へ、指数関数的に増殖する培養された腫瘍細胞の１００μｌの懸濁液を皮下注射することにより生成し、洗浄し、そして無菌生理的食塩水溶液中に再懸濁した。細胞生存率を、少なくとも９０％であった。ＨｅｐＧ２に対して、５×１０６細胞の接種材料（ｉｎｎｏｃｕｌｕｍ）を使用した。ＳＷ４８０に対して、これは僅かに低く、２×１０６細胞であった。注入後、マウスを滅菌した環境に維持し、そして腫瘍異種移植片の外観に対して定期的に検査した。
【００９１】
（ＣＴＬ１０２およびＣＴＬ５０１の腫瘍内注入）
固定した２７ゲージ針をはめ込んだＵ−１００インスリン注射器（ＴＥＲＵＭＯ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して、２０μｌのウイルス懸濁液またはビヒクルのみ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ中の５％スクロース，ｐＨ７．４）を腫瘍の中へ直接的に皮膚を通して注入した。ウイルス漏出を避けるために、注入を、連続的なゆっくりとした動きで実施して、そしてこの針を、注入完了後約１５秒間その場で保持した。
【００９２】
（ＣＢ１９５４処置スケジュールおよび腫瘍サイズ測定）
ＤＭＳＯ中に新たに溶解し、そしてＮＳＳを用いて、５倍に希釈したＣＢ１９５４を、腹腔内注入によって投与した。マウスは、１日当たり２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量を５回連続受けた。ビヒクルのみで処理したマウスに、２０％ＤＭＳＯ／生理的食塩水（５．０μｌ／ｋｇ体重）を注射した。腫瘍増殖を、皮膚を通して、カリパー（ｃａｌｌｉｐｅｒ）を使用して２つの直交する寸法次元（長さおよび幅）で腫瘍直径を測定することによりモニタリングし、そして表面積（長さ×幅＝ｍｍ２）として表現した。過度の苦痛を防止するために、腫瘍が１４０ｍｍ２に達していたときに強制的な屠殺を実行した。体重の損失および動物の挙動における変化（苦痛の徴候）をまた、記録した。
【００９３】
（ヌードマウスにおけるＣＴＬ５０１／ＣＴＬ１０２およびＣＢ１９５４投与の静脈注射）
固定された２７ゲージの針を装着したシリンジを、ヌードマウスの尾静脈に１００μｌのウイルス懸濁液を投与するために使用した。４８時間後、ＣＢ１９５４を、上記のように投与した。マウスを、毎日モニタしそして体重を測定した。動物に対する過度の苦痛を防止するために、マウスの体重が、２０％以上まで減少するかまたは重篤な苦痛の任意の兆候を発した場合、人道的な屠殺を実施した。
【００９４】
（新たに切除された結腸直腸の腫瘍サンプルのエキソビボ形質導入）
新しく切除された腫瘍組織を、１０％　ＦＣＳ、１５０μｇ／ｍｌ　ペニシリン、２５０μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌ　テトラサイクリン、１００μｇ／ｍｌ　アミカシン、１５０ｇ／ｍｌ　クロラムフェニコールおよび１００μｇ／ｍｌ　ゲンタマイシンを含む２０ｍｌのＥａｒｌ’ｓ　ＭＥＮで無菌条件下において大規模に洗浄し（少なくとも１０分間）そして１０％　ＦＣＳを含む培地で４℃で一晩保存した。脂肪およびひどくそして疑われる壊死組織を除去した後、２〜３ｍｍ３のサンプルを調製し、そして９６−ウェルプレートのウェルに個別に配置した。サンプル（４組）を、ＣＯ２恒温器内で、１５０μｌの無血清培地（１．０×１０１０ウイルス粒子を含む）または培地単独中で４時間インキュベーションした。次いで、この培地を、１０％　ＦＣＳを含むＥＭＥＭ培地と交換し、そしてサンプルを、さらに４４時間インキュベーションして、遺伝子発現を起こすのを可能にした。β−ガラクトシダーゼ発現を、４℃で２時間、２％　パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ中での腫瘍サンプルの固定そしてＰＢＳで洗浄後、３７℃でＸ−ｇａｌ染色溶液中で一晩インキュベーションすることによって視覚化した。
【００９５】
（β−カテニン免疫組織化学染色）
パラフィン包埋された切片を、ウサギポリクローナル抗血清（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ）およびベクターＡＥＣキットを使用してβ−カテニンに対して染色した。
【００９６】
（ＣＴＬ５０３、Ａｄ．ＣＴＰ−１ｎＬａｃＺおよびＡｄ．ＣＴＰ３．ｎＬａｃＺの構築）
ＣＴＬ５０３のトランスファーベクターを、ｐＴＸ０３７４からＣＭＶプロモーターを除去するために、ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＴＸ０３７４におけるＮＴＲ遺伝子の上流にＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてＴＣＦＣｄ＝２５−Ｅ１ＢＴＡＴＡプロモーターをクローニングすることによって構築した。新しい発現カセットを、ＳｐｅＩフラグメントとしてｐＰＳ１１２８にクローニングして、ｐＰＳ１１２８／ＴＣＦＣｄ＝２５−Ｅ１ＢＴＡＴＡを作製した。
【００９７】
Ａｄ．ＣＴＰ１−ｎＬａｃＺに関するトランスファーベクターを、Ｘｍａｌ／ＳｐｅＩ消化かつ平滑化されたｐＴＸ０３７４に、Ｘｂａｌフラグメントとして、マウスプロタミンポリアデニル化シグナルに融合された核標的化ＬａｃＺ遺伝子を含む発現カセットをクローニングすることによって構築した。ＣＴＰ１プロモーターを、ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてｎＬａｃＺ遺伝子の上流にクローニングした。次いで、ＣＴＰ１−ｎＬａｃＺ発現カセットをＳｐｅＩ平滑化されたｐＰＳ１１２８に、平滑化されたＳｐｅＩ／ＮｏｔＩフラグメントという、ｐＰＳ１１２８に向かって左から右方向にクローニングして、ｐＰＳ１１２８／ＣＴＰ１−ｎＬａｃＺを作製した。
【００９８】
Ａｄ．ＣＴＰ３−ｎＬａｃＺに関するトランスファーベクターを構築するために、第１の工程において、ＣＴＰ３プロモーターを、平滑化ＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとしてＨｉｎｄＩＩＩ消化かつ平滑化ｐＴＸ０３７４にクローニングして、ＣＭＶプロモーターをＣＴＰ３に置換した。このクローニングは、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を再生した。第２の工程において、得られたプラスミドを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＰａｃＩで消化し、次いで平滑化して、ＮＴＲ遺伝子およびＩＶＳＩＩイントロン／ポリアデニル化シグナルを遊離した。ｎＬａｃＺ−ポリ（Ａ）カセット（ＣＴＰ１−ｎＬａｃＺの構築に関して記載される詳細を参照のこと）を、平滑化ＸｂａＩフラグメントとしてＣＴＰ３の下流にクローニングした。最後に完全発現カセットを、特定のＳｐｅＩ部位をＰｍｅｌ部位によって置き換えたｐＰＳ１１２８誘導体（ｐＴＸ０３９８）のＰｍｅｌ部位への平滑化したＳｐｅＩ／ＮｏｔＩフラグメントとして左から右方向にｐＰＳ１１２８にクローニングして、ｐＴＸ０３９８／ＣＴＰ３−ｎＬａｃＺを作製した。
【００９９】
ウイルスを、上記（複製欠損アデノウイルス発現ＮＴＲの構築）されるようにＰｅｒＣ６細胞においてｐＰＳ１１６と上記のトランスファーベクターの相同組換えによってレスキューした。
【０１００】
（組織学のための細胞のＸ−ｇａｌ染色）
ＰＢＳで細胞を洗浄後、細胞をＰＢＳ中の０．０５％のグルタルアルデヒドにおいて室温で１０分間固定した。ＰＢＳでさらに洗浄後、細胞を、以下の溶液でインキュベーションし、そして３７℃でインキュベーションした。Ｘ−ｇａｌ溶液：ＤＭＦ中の４００μｌの５００ｍＭ　Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６、４００μｌの５００ｍＭ　Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、１００μｌの２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２５０μｌの４０ｍｇ／ｍｌ　Ｘ−Ｇａｌおよび８．８５ｍｌのＰＢＳ。
【０１０１】
（β−ガラクトシダーゼ発現の定量化）
β−ガラクトシダーゼの発現を、Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔシステム（Ｔｒｏｐｉｘ　Ｉｎｃ，Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）によって定量的なグラフ表示のために測定した。
【０１０２】
（実施例）
（実施例１）
（５マーＴｃｆ−ＳＶ４０−ルシフェラーゼ構築物は、調節解除されたβ−カテニン活性を有する腫瘍細胞株において特異的に活性化される）
調節解除されたβ−カテニン活性を有する細胞において高レベル遺伝子発現を特異的に検出するβ−カテニン／Ｔｃｆ結合エレメントの能力を評価するために、発明者らは、基礎ＳＶ４０プロモーターの上流５Ｔｃｆ部位を含む人工プロモーターを含むルシフェラーゼレポータープラスミドを構築した。ＨｅＬａ細胞において（β−カテニンは調節解除されていない）、５マーＴｃｆ−ＳＶ４０は、ＳＶ４０プロモーター単独よりも活性ではなかった。対称的に、調節解除されたβ−カテニンを有する細胞株において、５マーＴｃｆ−ＳＶ４０プロモーターは、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターの約８０％の活性を発現し（ＳＷ４８０細胞）そしてＣＭＶよりもなお活性があった（ＨｅｐＧ２）。５マーＴｃｆ−ＳＶ４０に対する誘導比は、１８（ＨｅｐＧ２）および４４．２（ＳＷ４８０）であった。これらのデータは、Ｔｃｆ部位が、核β−カテニンの存在下のみで活性であることを示す。いくつかの実験において、ＨｅＬａ細胞における５マーＴｃｆ−ＳＶ４０プロモーターの活性は、ＳＶ４０単独の活性よりもなお低かった（データは示していない）。これは、β−カテニンが、β−カテニン／Ｔｃｆヘテロダイマーを産生するために存在しない場合、Ｔｃｆ因子が、通常、転写を（例えば、転写性補因子ＣＢＰ（ｃＡＭＰ結合タンパク質）との相互作用によって）抑制しているという事実と一致した。
【０１０３】
（実施例２）
（５マーＴｃｆ−ＳＶ４０人工プロモーターの活性および特異性は、複製欠損アデノウイルスベクターにおいて保持される）
調節解除されたβ−カテニンを有する細胞を含む腫瘍（例えば、結腸直腸起源の腫瘍）において治療的遺伝子の高レベルの発現を選択的に、駆動する５マーＴｃｆ−ＳＶ４０プロモーターの有用性を評価するために、発明者らは、５マーＴｃｆＳＶ−４０プロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ　Ｂ　ニトロレダクターゼ遺伝子（ＮＴＲ）を発現する複製欠損アデノウイルスベクターを構築した。ＮＴＲ遺伝子は、プロドラッグＣ１９５４を分裂細胞と非分裂細胞の両方を殺し得る強力なＤＮＡ架橋薬剤へ変換し得る酵素をコードする。クローン１（ＣＴＬ５０１）および１３は、示される方向においてカセットを含む（図２ａ）。ＣＴＬ１０２において、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターは、ＮＴＲ発現を調節する。ＣｓＣｌ縞状ウイルスを、調製し、そしてＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２およびＳＷ４８０細胞を、示される感染効率で感染した（図２ｂ）。この場合、クローン１の左から右方向は、示されるように、発現のわずかに高い特異性を提供することが見出され、そしてこれは採用された標準方向になった（ＣＴＬ５０１）。予想どおり、ＣＴＬ１０２は、細胞株のβ−カテニン状態に関係なく３つ全ての細胞株においてＮＴＲ発現を示した。対称的に、ＣＴＬ５０１は、ＨｅｐＧ２細胞およびＳＷ４８０細胞においてのみ高い活性を有した。５倍高い感染効率のＮＴＲ発現でさえ、ＨｅＬａ細胞においてほとんど検出可能でなかった。ＨｅｐＧ２細胞およびＳＷ４８０細胞におけるＣＴＬ５０１程に活性なクローン１３はまた、ＨｅＬａにおいて発現するが、前者と比較して相対的に低いレベルでなお発現する。
【０１０４】
（実施例３）
（Ｔｃｆ応答性アデノウイルスＣＴＬ５０１は、インビボにおいて抗腫瘍活性を示す）
ＣＴＬ５０１が、インビトロにおいて許容性細胞において高いレベルのＮＴＲを発現し得ること確立し、本発明者らは、ウイルスを用いるＨｅｐＧ２異種移植片の腫瘍内注射が、ＣＢ１９５４に対する腫瘍を感作するのに十分な酵素の発現を生じるか、そして腫瘍退行を含む測定可能な抗腫瘍効果を起こすかどうかを試験した。実験において、５つの腫瘍のうち４つが、明らかな退行を起こした（図３）。５６日後、４つのレスポンダーのうち２つが、完全な退行として分類され得、そして２つの動物が、休止した、非常に小さな腫瘍を有した。ビヒクルのみ注射された腫瘍およびＣＢ１９５４で処理された腫瘍が、予想どおり増殖した。興味深いことにウイルス注射単独では、腫瘍増殖の明白な遅れを生じた。本発明者らは、処置に対する可変な応答を腫瘍内注射技術の固有の変性に起因される。
【０１０５】
（実施例４）
（ＳＷ４８０異種移植片を注射されたＣＴＬ−５０１におけるＮＴＲの高いレベルの発現）
ＣＴＬ５０１が、インビトロにおけるＳＷ４８０結腸直腸癌細胞において高い活性であることを実証して、本発明者らは、高いレベルのＮＴＲ発現を、ヌードマウスにおける皮下のＳＷ４８０異種移植片の腫瘍内注射によって得ることができた。４つの腫瘍を、ＣＴＬ１０２かまたはＣＴＬ５０１かのいずれかで注射し、４８時間後、人道的な屠殺した後に、切除し、固定し、切片にし、そしてＮＴＲ発現に対して免疫染色した。この結果を、図４に要約した。これらは、ＣＴＬ５０１が、ＣＴＬ１０２と少なくとも匹敵するレベルにおいてＮＴＲを発現する証拠をさらに提供する。本発明者らは、ＮＴＲ陽性である細胞のパーセントおける有意な変動を腫瘍内注射技術の固有の可変性に起因させて。
【０１０６】
（実施例５）
（アデノウイルスの全身投与に続くＣＢ１９５４処置：ＣＴＬ５０１は、ＣＴＬ１０２よりも非常に毒性が低い（ＣＭＶ−ＮＴＲ））
本発明者らは、ＣＴＬ５０１の腫瘍内注射が、高いレベルのＮＴＲ発現を生じることについて示す。しかし、腫瘍細胞に対する治療的遺伝子の特異的な送達を得る方法に関連するのが、特に、肝臓への血流を介するウイルス播種の危険である。上記に示されるインビトロ特異性のデータに基づいて、発明者らは、ＣＴＬ１０２でのヌードマウスの静脈内注射が、肝臓においてＮＴＲの高いレベルの発現を生じ、そして結果としてＣＢ１９５４に有意な毒性を生じるが、ＣＴＬ５０１の注射が、ＮＴＲの肝臓発現を非常にわずかかまたは発現しないので相対的に非常に許容的であることを予想した。図５に示される結果は、これをサポートする。ＣＴＬ５０１＋ＣＢ１９５４処置の１０９個の粒子の用量が、実質的に無毒性であり、ＣＴＬ１０２の１０倍少ない用量が、１００％の死亡率を生じる。本発明者らは、ＣＴＬ５０１が、特に肝臓組織における、正常細胞において、ＮＴＲを発現しないかまたはわずかな量のＮＴＲを発現すると結論づけた。
【０１０７】
（実施例６）
（β−カテニン活性を欠く細胞における完全に不活性である改良されたＴｃｆ基礎プロモーターの構築）
いくつかの適用のために、５マーＴｃｆ基礎化人工プロモーターの特異性を増大することさらに治療的アデノウイルスの複製を制御することが、例えば、所望される。従って、本発明者らは、アデノウイルス（Ａｄ５）Ｅ１Ｂ遺伝子ＴＡＴＡボックス（５マーＴｃＦ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ−Ｌｕｃ（ＣＴＬ５０２）、図６ａ）と上記される５マーＴｃｆエレメントの組み合わせを評価した。上記さされるように、ＨｅＬａおよびＳＷ４８０における一時的なトランスフェクションにおいて、５マーＴｃｆ−ＳＶ４０プロモーターは、ここで、ＣＭＶに匹敵して、ＳＷ４８０において高い活性があるが、ＳＶ４０プロモーターの基礎的な活性のせに起因してＨｅＬａ細胞においてバックグランド活性を示す。反対に、ＳＷ４８０において少ない活性であるが（５マーＴｃｆ−ＳＶ４０の６０％活性）、５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ−ｌｕｃ構築物は、ＨｅＬａにおいて完全に不活性であった（β−カテニンを調節解除していない）。別の方法で発現すると、Ｅ１ＢＴＡＴＡエレメントでのＳＶ４０最小プロモーターの置換は、ＨｅＬａと比較してＳＷ４８０において５マーＴｃｆ−ＳＶ４０に対する約３０〜６０倍から５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡに対する６００〜２，０００倍（すなわち、２０倍の改良）の誘導能を増大した。
【０１０８】
（実施例７）
（５マーＴｃｆ−ＳＶ４０および５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡプロモーター構築物の活性は、Ｔｃｆ部位の相対的な位置決めに依存する）
ＤＮＡへリックスに沿った部位の配列の変更が、５マーＴｃｆ−基礎プロモーター構築物の活性に影響するか否かを決定するために、本発明者らは、Ｓｖ４０最小プロモーターかまたはＥ１ＢＴＡＴＡのいずれかとの組み合わせにおいて「ＴｃｆＡ」、「ＴｃｆＢ」および「ＴｃｆＣ」（図７）を構築し、そしてそれぞれの起源の５マーＴｃｆ基礎化プロモーター（すなわち、＋ＳＶ４０または＋Ｅ１ＢＴＡＴＡ）とそれぞれの活性を比較した。一過性にトランスフェクションされたＳＷ４８０細胞において、レポーター遺伝子の発現の最も高いレベルは、ＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡプロモーターエレメントを使用して得た（図８ａ）。最も低いレベルの発現は、ＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡの約半分の活性であるＥ１ＢＴＡＴＡ−ＴｃｆＢの組み合わせを使用して得た。ＳＶ４０の組み合わせに関して、発現においてより少ない変動が見られた（図８ｂ）。さらに、Ｅ１ＢＴＡＴＡでの結果と顕著に対称的に、ＴｃｆＣ−ＳＶ４０プロモーターは、最小の活性であり、そしてＴｃｆＢ−ＳＶ４０は、最大の活性であった。これらの結果は、Ｔｃｆ部位の最適な間隔は、Ｔｃｆエレメントとの組み合わせである基礎プロモーターに依存する。さらに、β−カテニン調節解除された細胞における発現のレベルの決定においてＴｃｆ部位の間隔における決定的な役割に関する証拠を、図９に提供する。これは、５Ｔｃｆ部位よりも少数（２、３または４）を含むＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ−ｌｕｃ構築物でのＳＷ４８０の一過性トランスフェクションの結果を示す。部位の増大する数と共に発現は、一般に増大し、この結果はまた、３部位の適切な間隔よって、４部位の代替の配列と比較してより高いレベルの発現を得たことを示す。
【０１０９】
上記の構築物のいずれも、もとの５マーＴｃｆベースのプロモーターと比較して、Ｈｅｌａにおける増大したバックグラウンドの発現レベルを示さなかった。すなわち、Ｔｃｆ部位のスペーシングの変更は、本発明者らが上記した優れた特異性の喪失を生じない。
【０１１０】
（実施例８）
（ＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡプロモーター要素の活性を、Ｔｃｆ結合部位とＥ１ＢＴＡＴＡボックスとの間の距離によって決定する。）
本発明者らはまた、発現に対するＴｃｆ結合部位とＴＡＴＡボックスとの間の距離の変化の効果を、決定した（図１０）。ＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡに基づく４つの構築物を、構築し、そして比較した（図１０ａ−ならびに材料および方法の節を参照のこと）。図１０ｂに示すように、逆の関係が、ＴｃｆのＴＡＴＡへの分離と、トランスフェクトされたＳＷ４８０細胞におけるルシフェラーゼの発現レベルとの間に発見された。発現を、分離を減少させることによってさらに改善し得るが、２５ｂｐが、さらに、最小の分離に近づいているようである。以下のように、開始複合体およびＴｃｆ／β−カテニンは、そのそれぞれの結合部位への接近を立体的に妨害すると予測される。本明細書中で試験される新規構築物は、もとの５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ人工プロモーターの特異性を保持した（データは示さない）。
【０１１１】
（実施例９）
（５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡプロモーターの活性および特異性はまた、複製欠損アデノウイルスにおいて保持される。）
５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ（ＣＴＬ５０２）プロモーターがまた、アデノウイルスに関してその活性および特異性を保持することを確認するため、本発明者らは、ＣＴＬ１０２、ＣＴＬ５０１およびＣＴＬ５０２で、ＨｅＬａおよびＳＷ４８０細胞を感染させ、そしてＮＴＲ発現をＥＬＩＳＡによってアッセイした（図１１）。予測されたように、ＣＴＬ１０２は、ＨｅＬａおよびＳＷ４８０の両方において高度に活性であった。上に示した一過性のトランスフェクション研究と一致して、ＣＴＬ５０１およびＣＴＬ５０２の両方は、ＳＷ４８０において高度に活性であったが、ＨｅＬａにおいては非常に弱い活性にすぎなかった。さらに、ＣＴＬ５０２は、明らかにＨｅＬａにおけるＣＴＬ５０１よりも活性が弱かった。ＣＴＬ５０１が、高い感染効率（１５０００ｐｆｕ／細胞）で明確に検出可能なレベルのＮＴＲを発現したが、これはＣＴＬ５０２では検出されなかった。従って、β−カテニン／Ｔｃｆ応答性要素の、アデノウイルス（Ａｄ５）Ｅ１ＢＴＡＴＡボックスとの組み合わせは、低レベルでさえ非癌性細胞を有意に損傷し得る非常に強力な治療剤をコードする遺伝子の発現に適切であるような、非常に高いレベルの腫瘍選択性を提供する。
【０１１２】
（実施例１０）
（ＣＴＬ５０１およびＣＴＬ１０２の正常マウスへの静脈内注射：ＣＴＬ５０１での肝臓発現の欠如）
本発明者らは、正常マウスへのＣＴＬ５０１の全身投与（尾部静脈注射）、続くＣＢ１９５４処置が、非常に良好に許容されたことを上（実施例５）で示す。対照的に、ＣＴＬ１０２（ＣＭＶ．ＮＴＲ）／ＣＢ１９５４の１０分の１の用量とＣＢ１９５４との組み合わせの注射は、全ての場合において致死であった。本発明者らは、この結果から、ＣＴＬ５０１においてＮＴＲ遺伝子を駆動するβ−カテニン／Ｔｃｆ応答性プロモーターが、ウイルスによって感染された正常マウスの組織、特に肝臓において不活性であるかまたは非常に弱く活性であると結論付けた。これについての直接の証拠を提供するために、マウスに、ＣＴＬ５０１またはＣＴＬ１０２を注射し、そして肝臓の発現を、注射後４８時間で免疫染色することによって決定した。図１２において、本発明者らは、ＮＴＲ発現について染色された代表的な肝臓切片を示す。ＣＴＬ５０１の注射は、散発的な低レベルのＮＴＲ発現を生じたが、ＣＴＬ１０２の１０分の１の用量は、細胞の大多数において高レベルの発現を生成した。本発明者らは、この結果および実施例５に記載された結果を解釈して、β−カテニン／Ｔｃｆ−４複合体が、正常マウスの肝細胞の核において存在しないかまたはプロモーターを活性化するには低すぎるレベルで存在するかのいずれかであることを示した。これらのデータが、プロモーターを活性化するマウスのβ−カテニン／Ｔｃｆ−４の不能を反映することは、あまりありそうにない：なぜなら、（ｉ）Ｗｎｔ経路は、ハエから上で進化的に高度に保存され、そして（ｉｉ）Ｗｎｔシグナル伝達（ｃｄｘ）によって活性化される少なくとも１つのマウス遺伝子のプロモーターは、本発明者らがこのプロモーターの構築に使用したコンセンサスヒトＴｃｆ−４結合部位に適合するＴｃｆ結合部位を含むからである（Ｌｉｃｋｅｒｔら、（２０００）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２７：３８０５−３８１３）。
【０１１３】
（実施例１１）
（結腸直腸癌の異種移植片モデルにおけるＣＴＬ５０１／ＣＢ１９５４抗腫瘍効果）
本発明者らは、上記の実施例３において、ＣＴＬ５０１の単一の用量でのＨｅｐＧ２（肝臓癌）異種移植片の腫瘍内注射が、このβ−カテニン調節解除（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｄ）腫瘍モデルをプロドラッグＣＢ１９５４に対して強く敏感にさせ、大多数の場合において腫瘍の後退を生じることを示す。本発明者らは、ＣＴＬ５０１／ＣＢ１９５４治療が、β−カテニン調節解除結腸直腸癌（ＳＷ４８０）の異種移植片モデルにおいて非常に有効であることを、本明細書で示す。２つの大きさの無作為化した腫瘍群に、ＣＴＬ５０１の粒子１０９個および１０１０個をそれぞれ注射し、そしてＣＢ１９５４を開始４８時間後に宿主マウスに投与した。ＣＭＶプロモーターからＮＴＲが発現された場合に、達成可能である効力と観察された効力を比較し得るように、２つのさらなる腫瘍群に、等用量のＣＴＬ１０２を注射した。図１３に示したように、ＣＴＬ５０１およびＣＴＬ１０２注射は、類似のレベルの抗腫瘍効力を生じた。非ウイルス注射されたコントロール腫瘍（ビヒクル注射＋全身ＣＢ１９５４処置）は、強く増殖した。
【０１１４】
（実施例１２）
（結腸直腸癌の異種移植片モデルにおけるＣＴＬ５０３／ＣＢ１９５４抗腫瘍効力）
本発明者らは、ＳＶ４０最小プロモーターフラグメントをＡｄ５　Ｅ１ＢＴＡＴＡで置換することによって、そしてＴｃｆ結合部位の間およびＥ１ＢＴＡＴＡとプロモーター近位のＴｃｆ−４結合部位との間の間隔を変更することによって、β−カテニン／Ｔｃｆ−４に対する増大した依存性を有する（従って、調節解除されたβ−カテニンで腫瘍に対する特異性を改善された）β−カテニン／Ｔｃｆ−４応答性プロモーターを構築することが可能であることを、上（実施例６〜８）において示す。一過性のトランスフェクション実験を使用して観察される、許容性細胞における高レベルの発現が、アデノウイルスのバックボーンに関して保持されるか否かを決定するために、組換え体ウイルス（「ＣＴＬ５０３」）を、ＮＴＲを駆動するこの改変されたプロモーターを含んで構築した。図１４において、本発明者らは、ＣＴＬ５０３によるＳＷ４８０異種移植片の腫瘍内注射および続くＣＢ１９５４投与が、ＣＴＬ１０２＋ＣＢ１９５４処置から得られる結果と類似の強度の抗腫瘍応答を生じたことを示す。従って、これらのインビボの効力データは、一過性のトランスフェクション実験によって検出されるＣＴＰ３の改善された腫瘍特異性が、調節解除されたβ−カテニン／Ｔｃｆ−４を有する腫瘍細胞における高レベルの活性の保持と共に得られたという強い証拠を提供する。
【０１１５】
（実施例１３）
（β−カテニン／Ｔｃｆ依存性プロモーターは、培養された初代ヒト肝細胞、真皮繊維芽細胞および内皮細胞において非常に低レベルで発現する。）
本発明者らは、特許請求されたプロモーターが、正常なβ−カテニン調節を保持する腫瘍細胞株において非常に低レベルで発現することを上で示す。このことから、本発明者らは、これらのプロモーターが正常ヒト細胞（すなわち、本発明者らがモデル正常細胞として使用した腫瘍細胞）において不活性／弱く発現されることを推測する。このための直接の証拠を提供するため、本発明者らは、培養した初代ヒト細胞（肝細胞、内皮細胞および真皮繊維芽細胞）のパネルにおいてこれら２つのプロモーターの活性を決定した。培養された初代ヒト組織（以下の実施例１５および１６を参照のこと）を含むこれらの研究および続く研究を容易にするために、本発明者らは、特許請求されたプロモーターの２つ（「Ａｄ．ＣＴＰ１−ｎＬａｃＺ」および「Ａｄ．ＣＴＰ３−ｎＬａｃＺ」）の制御下でβ−ガラクトシダーゼを発現する、組換えアデノウイルスを構築した（明確さの目的で、本発明者らは、現在これらのプロモーターについて体系的な命名法を使用する：ＣＴＬ５０１中に存在する元のプロモーターを、「ＣＴＰ１」と改名する；ＣＴＬ５０３中に存在する最適化されたプロモーターを、「ＣＴＰ３」と改名する）。
【０１１６】
図１５は、ＣＭＶプロモーターが、試験された３つ全ての細胞型において強く発現し、一方でＣＴＰ１およびＣＴＰ３が、これらの細胞における非常に低レベルのβ−ガラクトシダーゼ発現を導いたことを示す。しかし、３つ全てのプロモーターは、ＳＷ４８０結腸癌細胞においては強く活性であった（図１５ｄ）。
【０１１７】
（実施例１４）
（ＣＴＰ１およびＣＴＰ３は、２９３細胞株およびＰｅｒＣ６ヘルパー細胞株におけるＥ１欠失アデノウイルスの増殖の間、非常に低レベルの導入遺伝子の発現を導く）
Ｅ１発現Ａｄヘルパー細胞において活性なプロモーターによって駆動される細胞傷害性遺伝子をコードするＥ１欠失ウイルスを増殖させる試みは、毒性の遺伝子産物の発現が、細胞が効果的なウイルス増殖を支持するのを妨げるため、一般的に成功しない。
【０１１８】
ウイルス生成の間のＣＴＰ１およびＣＴＰ３プロモーターの発現レベルを決定するために、本発明者らは、Ａｄ．ＣＭＶ−ｎＬａｃＺ、Ａｄ．ＣＴＰ１−ｎＬａｃＺおよびＡｄ．ＣＴＰ３−ｎＬａｃＺウイルスを２９３細胞およびＰｅｒＣ６細胞に感染させ、感染後３０時間でＬａｃＺの発現レベルを決定した。
【０１１９】
図１６において、本発明者らは、ＣＴＰ１およびＣＴＰ３によって駆動されるＬａｃＺの発現が、両方のＡｄヘルパー株におけるＣＭＶプロモーターによって駆動される発現よりも有意に低かったことを示す。しかし、他の非許容性細胞株全てにおいて観察されるように、ＣＴＰ３は明らかに、ＣＴＰ１より活性が低かった（約１０分の１）。両方のプロモーターは、２９３細胞においてよりもＰｅｒＣ６細胞において約３倍活性であった。これらのデータは、両方の細胞株、特に２９３細胞が、毒性の導入遺伝子をコードする、ＣＴＰ３プロモーター制御下のアデノウイルスベクターの最初の生成の、効率的な複製を支持することを示唆する。
【０１２０】
（実施例１５）
（ＣＴＰ１およびＣＴＰ３プロモーターは、新たに切除された転移性結腸直腸癌組織においては高度に活性であるが、関連する肝臓組織においては不活性である。）
樹立された腫瘍細胞株は、癌における遺伝子発現パターンを研究するために、有用なモデル系である。しかし、これらの株は、遺伝的に異なる細胞および遺伝的に不安定な細胞のポリクローナル集団である初代癌からクローン化される。これらはまた、一般的に長期間連続して培養され、エクスビボ培養に良好に適用されるが、これらが由来する癌のまさに代表ではない細胞の選択についてのさらなる目的を提供する。これらの理由のために、新たに外植された初代および二次結腸直腸癌のサンプルにおけるＣＴＰ１およびＣＴＰ３の活性を決定した。材料および方法の節に記載のように、サンプルを調製し、そしてＡｄ．ＣＭＶ−ｎＬａｃＺ、Ａｄ．ＣＴＰ１−ｎＬａｃＺおよびＡｄ．ＣＴＰ３−ｎＬａｃＺウイルスで感染させ、そして核のβ−ガラクトシダーゼ発現について分析した。Ａｄ．ＣＭＶ−ｎＬａｃＺを、各サンプルの生存率およびアデノウイルス感染への感受性を決定し、そしてＣＭＶプロモーターおよびＣＴＰ１／３プロモーターの相対的な活性の比較を可能にするために使用した。図１７は、この肝臓から単離された二次癌によって得られた結果を示す。各ウイルス処置について、肝臓の縁に付着した腫瘍を、ウイルス懸濁液中でインキュベートした。他の全ての腫瘍検体で観察されるように、この組織は、内在性のβ−ガラクトシダーゼ活性を有しなかった（モック感染させたサンプルは、Ｘ−Ｇａｌによって染色されなかった）。Ａｄ．ＣＭＶ−ｎＬａｃＺとのインキュベーションは、腫瘍および付着した肝臓の両方の強い染色を生じた。腫瘍特異性の顕著な実証を、Ａｄ．ＣＴＰ１−ｎＬａｃＺおよびＡｄ．ＣＴＰ３−ｎＬａｃＺウイルスでの同等のサンプルの感染によって提供した：両方の場合において、肝臓および腫瘍組織の曝露は、ＣＭＶと等価だが腫瘍組織に限定されない発現レベルを生じた。これまでに、試験された５つ全ての結腸直腸転移は、高レベルのＣＴＰ１およびＣＴＰ３発現について許容性であった。１０の初代のうち３は、プロモーター活性について弱く許容性であるかまたは非許容性であることが見出された。注目すべきことに、二次腫瘍を生じたこの初代腫瘍は各々の場合において許容性であった。
【０１２１】
（実施例１６）
（高レベルのＣＴＰ媒介発現は、β−カテニンの高レベルな、非膜性の発現に相関する。）
実施例１５において、本発明者らは、ＣＴＰ１およびＣＴＰ３が、隣接する健康な肝臓組織中への導入遺伝子の同時の導入にもかかわらず、二次結腸直腸癌組織において、選択的な高レベルの遺伝子発現を提供し得ることを実証した。これまでに時折、これらのプロモーターが、全ての二次ＣＲＣ寄託物において活性であり、低レベルまたは検出不能な発現が、１０の初代のうち３において観察された。β−カテニンについてのこれらの非許容性腫瘍の分析は、タンパク質の全体的レベルと細胞成分分布との間の相関を明らかにした。図１８は、代表的な許容性腫瘍サンプルおよび非許容性腫瘍サンプルについての結果を示す。腫瘍Ａ（非許容性）は、細胞表面に広く限定されたβ−カテニンの染色で比較的良好に区別され、Ｅ−カドヘリンに関して一致する。対照的に、腫瘍Ｂ（許容性）は、有意により高いレベルの細胞質／核のβ−カテニン染色で不完全に区別される。この知見は、β−カテニン調節解除に対するＣＴＰプロモーターの依存性についてのさらなる証拠を提供する。これは、β−カテニン／Ｔｃｆに応答性の遺伝子の構成的活性化を生じるβ−カテニン調節解除が開始事象である、結腸発癌の単純なモデルと矛盾する。この知見の実際の適用は、これが、ＣＴＰプロモーターに対して許容性の、従って、治療的遺伝子がＣＴＰプロモーターの制御下にある場合、遺伝子治療アプローチによって潜在的に処置可能である腫瘍を有する患者の前選択のための基礎を提供し得ることである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞およびＳＷ４８０細胞の、Ｔｃｆ応答性ルシフェラーゼレポーター構築物「５マーＴｃｆ−ＳＶ４０−Ｌｕｃ」（ＣＴＬ５０１）（図１ａ）を用いる一過性のトランスフェクションの結果を示す。数は、Ｔｃｆ部位間の塩基対の数を示す。５マーＴＣＦ−ＳＶ４０アンチセンス鎖のヌクレオチド配列は、図１ｃに示される。下線を引かれかつイタリック体の配列は、活性ＴＣＦ部位である。単に下線を引かれた配列は、変異ＴＣＦ部位である。太字の配列は、ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅｌおよびＫｐｎＩ認識部位である。細胞を、図１ｂにおいて示されるように、等モル量（各々約１μｇ）のＴｃｆ応答性ルシフェラーゼレポーター構築物およびコントロールルシフェラーゼレポーター構築物で、トランスフェクトした。「ＳＶ４０ｐ」は、ＳＶ４０プロモーターのみを含む；「ＳＶ４０　ｅ／ｐ」は、ＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサーの両方を含む；「ＣＭＶ」は、サイトメガロウイルスエンハンサー／プロモーターを含む。データは、１に設定されたＳＶ４０プロモーターの活性に対する活性化の倍数として示される。２つの独立したトランスフェクションからの平均値およびＳＤが示される。この結果は、３つの独立した実験の代表である。
【図２】
図２は、ＣＴＬ１０２またはＣＴＬ５０１を用いて感染させたＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞およびＳＷ４８０細胞によって発現されたニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）の定量を示す。細胞を、ＣＴＬ１０２（これは、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターからＮＴＲを発現する）、ｃ１（ＣＴＬ５０１）（これは、左から右の向きで５マーＴｃｆ−ＳＶ４０−ＮＴＲカセットを含む）、またはｃ１３（これは、右から左の向きであるが同じカセットを含む）のいずれかでの示された感染効率（ｍｏｉ、ｐｆｕ／細胞）で、感染させた。細胞質抽出物を２日後に調製し、そして、ＥＬＩＳＡによるＮＴＲ発現についてアッセイした（材料および方法を参照のこと）。感染を２連で行なった。代表的な実験からの平均ＮＴＲ発現レベルを示す。
【図３】
図３は、ヌードマウスにおけるＨｅｐＧ２異種移植片腫瘍に対するＣＴＬ５０１／ＣＢ１９５４の抗腫瘍効力を示す。２０〜８０ｍｍ２の大きさの断面積で変化する６つの腫瘍の群を、単回注射として、約１０１０個のウイルス粒子で注射した。プロドラッグ投与および腫瘍測定は、材料および方法において記載される。
【図４】
図４は、ＣＴＬ５０１またはＣＴＬ１０２（５％スクロース、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４の２０μｌ中に１．５×１０１０個の粒子）の単回注射後の、ヌードマウスにおける皮下ＳＷ４８０異種移植片のＮＴＲ免疫染色の結果を要約する。材料および方法の節において記載されるように、腫瘍を４８間後に切除し、そしてＮＴＲ発現についてモニターした。３つの連続する切片由来のＮＴＲポジティブ細胞の平均割合を解剖された各腫瘍について示す。
【図５】
図５は、全身的投与およびプロドラッグ処置後に、ＣＴＬ１０２と比較したＣＴＬ−５０１のインビボ毒性の比較を示す。ヌードマウスを、示された数のウイルス注射で、静脈内（尾の静脈）注射した。４８時間後、ＣＢ１９５４を、２０ｍｇ／ｋｇ体重で、５日継続して腹腔内に与えた。図面は、各動物群（１群当り４匹の動物）についてのモニタリング期間（１〜１５日目）の間の最大平均重量減少（％）および１５日後の各処置群についての生存動物の割合を示す。
【図６】
図６は、ＨｅＬａ細胞およびＳＷ４８０細胞の、Ｔｃｆ応答性ルシフェラーゼレポーター構築物５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ−Ｌｕｃ（ＣＴＬ５０２）（図６ａ）を用いる一過性のトランスフェクションの結果を示す。Ｅ１ＢＴＡＴＡアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を、図６ｃに示す。下線を引かれかつイタリック体の配列が、Ｅ１Ｂ　ＴＡＴＡボックスである。太字の配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩ認識部位である。細胞を、図６ｂに示されるように、等モル（各約１μｇ）量のいくつかのルシフェラーゼレポーター構築物で、トランスフェクトした。ｐＧＬ３ベーシックは、プロモーターなしのｌｕｃｃＤＮＡを含む；「Ｅ１Ｂ」は、ｌｕｃ　ｃＤＮＡの上流にＡｄ５　Ｅ１Ｂ　ＴＡＴＡボックスを含む；５マーＴｃｆ−ＳＶ４０（ＣＴＬ５０１）は、図１ａに記載される。データは、１に設定したｐＧＬ３ベーシックの活性と比較した活性化の倍数として表される。２連のトランスフェクションの平均値およびＳＤを示す。データは、３つの独立した実験の代表である。
【図７】
図７は、この明細書中に記載される作業において評価された５　Ｔｃｆ結合エレメントの４つの異なる配列を概略図で示す。各構築物について、結合部位間の塩基対の数、ならびに１０．４ｂｐがヘリックスの完全なターンに対応するという仮定に基づくＤＮＡへリックスに沿った部位の二次元配列が示される。
【図８】
図８は、示されたＴｃｆ応答性ルシフェラーゼレセプター構築物を使用する、ＳＷ４８０細胞の一過性のトランスフェクションの結果を示す。ＴｃｆＡ、ＴｃｆＢおよびＴｃｆＣは、最小のアデノウイルスＥ１ＢＴＡＴＡボックス、またはＳＶ４０基礎プロモーターのいずれかと組み合わせた（ＴｃｆＡ、ＴｃｆＢおよびＴｃｆＣの記載については図７を参照のこと）。Ｅ１Ｂ、５マーＴｃｆ−ＳＶ４０（ＣＴＬ５０１）、５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ（ＣＴＬ５０２）およびＣＭＶレポータープラスミドは、図６に対する説明文に記載される。細胞を、等モル量（各約０．５μｇ）の各ルシフェラーゼレポーター構築物でトランスフェクトした。データは、それぞれ（ａ）５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ（ＣＴＬ５０２）または（ｂ）５マーＴｃｆ−ＳＶ４０（ＣＴＬ５０１）の活性の割合として表す。３連のトランスフェクションの平均値およびＳＤを示す。これらのデータは、３つの独立した実験の代表である。
【図９ａ】
図９ａは、異なる数および配置のＴｃｆ結合部位を有するＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡルシフェラーゼレポーター構築物を使用する、ＳＷ４８０細胞の一過的なトランスフェクションの結果を示す。図９ａは、Ｔｃｆ部位数およびそれらの間のスペーシングを示す。図９ｃは、Ｔｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ構築物のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を示す。下線を引かれかつイタリック体の配列は、活性Ｔｃｆ部位である。太字の配列は、ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩ認識部位である。４マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ構築物において、ＢｇｌＩＩ部位は、欠損している。細胞を、０．５μｇの各ルシフェラーゼレポーター構築物を用いてトランスフェクトした。データは、５マーＴｃｆ−ＥＩＢＴＡＴＡ（ＣＴＬ５０２）の活性の割合として発現される（図９ｂ）。３連のトランスフェクションの平均値およびＳＤが示される。この結果は、３つの独立した実験の代表である。
【図９ｂ】
図９ｂは、異なる数および配置のＴｃｆ結合部位を有するＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡルシフェラーゼレポーター構築物を使用する、ＳＷ４８０細胞の一過的なトランスフェクションの結果を示す。図９ａは、Ｔｃｆ部位数およびそれらの間のスペーシングを示す。図９ｃは、Ｔｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ構築物のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を示す。下線を引かれかつイタリック体の配列は、活性Ｔｃｆ部位である。太字の配列は、ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩ認識部位である。４マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ構築物において、ＢｇｌＩＩ部位は、欠損している。細胞を、０．５μｇの各ルシフェラーゼレポーター構築物を用いてトランスフェクトした。データは、５マーＴｃｆ−ＥＩＢＴＡＴＡ（ＣＴＬ５０２）の活性の割合として発現される（図９ｂ）。３連のトランスフェクションの平均値およびＳＤが示される。この結果は、３つの独立した実験の代表である。
【図９ｃ】
図９ｃは、異なる数および配置のＴｃｆ結合部位を有するＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡルシフェラーゼレポーター構築物を使用する、ＳＷ４８０細胞の一過的なトランスフェクションの結果を示す。図９ａは、Ｔｃｆ部位数およびそれらの間のスペーシングを示す。図９ｃは、Ｔｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ構築物のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を示す。下線を引かれかつイタリック体の配列は、活性Ｔｃｆ部位である。太字の配列は、ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩ認識部位である。４マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ構築物において、ＢｇｌＩＩ部位は、欠損している。細胞を、０．５μｇの各ルシフェラーゼレポーター構築物を用いてトランスフェクトした。データは、５マーＴｃｆ−ＥＩＢＴＡＴＡ（ＣＴＬ５０２）の活性の割合として発現される（図９ｂ）。３連のトランスフェクションの平均値およびＳＤが示される。この結果は、３つの独立した実験の代表である。
【図１０】
図１０は、近位のＴｃｆ部位とＴＡＴＡボックス（２５−４９９ｂｐ）との間の変化するスペーシングを有するＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ−ｌｕｃ構築物を用いるＳＷ４８０細胞の一過的なトランスフェクションの結果を示す。ＴｃｆＣエレメントの構造は、図７に記載される。図１０ａは、このアッセイに使用されたＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡレポーター構築物の構造を示す。「ｄ」は、近位のＴｃｆ結合部位最後のヌクレオチドからＴＡＴＡ配列の最初のＴまでの塩基対の数を示す。８８ｂｐおよび４４７ｂｐのスペーサーフラグメントをヒトβ−グロブリン遺伝子イントロンＩＩからＰＣＲによって誘導した。細胞を、０．５μｇの各ルシフェラーゼレポーター構築物でトランスフェクトした。データを、ＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ　ｄ＝２５構築物の活性の割合として表す（ｂ）。３連のトランスフェクションの平均値およびＳＤを示す。結果は、３つの独立した実験の代表である。ｄ＝２５である場合のＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を図１０ｃに示す。下線部を引かれかつイタリック体の配列は、活性なＴｃｆ部位である。太字の配列は、Ｅ１Ｂ　ＴＡＴＡボックス、ならびにＳｍａＩおよびＫｐｎＩ認識部位である。
【図１１】
図１１は、ＣＴＬ１０２、ＣＴＬ５０１およびＣＴＬ５０２を用いて感染させたＨｅＬａおよびＳＷ４８０細胞によって発現されるＮＴＰのＥＬＩＳＡによる定量を示す。細胞を、ある範囲のｍｏｉ（１、５、２０、１００、５００および１５００ｐｆｕ／細胞）で感染させた。細胞質抽出物を、２日後に調製し、そして、ＥＬＩＳＡによってＮＴＲについてアッセイした（材料および方法）。２連の感染の平均値が示される。
【図１２】
図１２は、ＣＴＬ１０２およびＣＴＬ５０１を用いて静脈内注射した後、正常のマウスの肝臓における組換えアデノウイルス指向ＮＴＲ発現のレベルの比較を示す。マウスを、示された量のＣＴＬ１０２またはＣＴＬ５０１を用いて尾の静脈に注射し、４８時間後に屠殺し、そして腫瘍切片について、材料および方法において記載されるように、ＮＴＲについて肝臓を染色した。
【図１３】
図１３は、結腸癌の異種移植片モデルにおけるＣＴＬ５０１／ＣＢ１９５４とＣＴＬ１０２／ＣＢ１９５４との抗腫瘍効力のレベルの比較を示す。２０〜８０ｍｍ２の横断面積の大きさで変化するＳＷ４８０腫瘍（ｎ＝５）の群を、ＣＴＬ１０２またはＣＴＬ５０１のいずれかの単回用量（１０９個または１０１０個の粒子）で注射した。プロドラッグ処置および腫瘍測定を、材料および方法に記載されるように行なった。
【図１４】
図１４は、結腸癌の異種移植片におけるＣＴＬ５０３／ＣＢ１９５４とＣＴＬ１０２／ＣＢ１９５４との抗腫瘍効力のレベルの比較を示す。２０〜８０ｍｍ２の横断面積の大きさで変化するＳＷ４８０腫瘍（ｎ＝５）の群を、ＣＴＬ１０２またはＣＴＬ５０３のいずれかの単回用量（１０１０個の粒子）で注射した。プロドラッグ処置および腫瘍測定を、材料および方法に記載されるように行なった。
【図１５ａ】
図１５ａは、ＣＴＰ１およびＣＴＰ３が、正常なヒト内皮細胞、真皮の線維芽細胞および肝細胞において、非常に低いレベルで発現することを示す。細胞を、材料および方法において記載されるように、Ａｄ．ＣＭＶ−ｎＬａｃＺ、Ａｄ．ＣＴＰ１−ｎＬａｃＺおよびＡｄ．ＣＴＰ３−ｎＬａｃＺを用いて感染させ、そして、４８時間後に分析した。図１５ａおよびｂにおいて示されるデータについて、示されたＭＯＩ（ｐｆｕ／細胞）で感染した細胞から抽出物を調製し、供給業者によって説明されるようなＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔアッセイ系を使用して、β−ガラクトシダーゼをアッセイした。誤差バーは、標準偏差を示す。代表的な実験を、各場合において示す。図１５ｃにおいて、細胞を１０００ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで感染し、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現細胞を、Ｘ−Ｇａｌ染色によって可視化した。Ａｄ．ＣＭＶ−ｎＬａｃＺで感染された線維芽細胞のみが、検出可能な酵素を発現した。図１５ｄは、３つ全てのウイルスが、感染したＷＶ４８０結腸癌細胞における高レベルのβガラクトシダーゼ発現を指向したことを示す。
【図１５ｂ】
図１５ｂは、ＣＴＰ１およびＣＴＰ３が、正常なヒト内皮細胞、真皮の線維芽細胞および肝細胞において、非常に低いレベルで発現することを示す。細胞を、材料および方法において記載されるように、Ａｄ．ＣＭＶ−ｎＬａｃＺ、Ａｄ．ＣＴＰ１−ｎＬａｃＺおよびＡｄ．ＣＴＰ３−ｎＬａｃＺを用いて感染させ、そして、４８時間後に分析した。図１５ａおよびｂにおいて示されるデータについて、示されたＭＯＩ（ｐｆｕ／細胞）で感染した細胞から抽出物を調製し、供給業者によって説明されるようなＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔアッセイ系を使用して、β−ガラクトシダーゼをアッセイした。誤差バーは、標準偏差を示す。代表的な実験を、各場合において示す。図１５ｃにおいて、細胞を１０００ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで感染し、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現細胞を、Ｘ−Ｇａｌ染色によって可視化した。Ａｄ．ＣＭＶ−ｎＬａｃＺで感染された線維芽細胞のみが、検出可能な酵素を発現した。図１５ｄは、３つ全てのウイルスが、感染したＷＶ４８０結腸癌細胞における高レベルのβガラクトシダーゼ発現を指向したことを示す。
【図１５ｃ】
図１５ｃは、ＣＴＰ１およびＣＴＰ３が、正常なヒト内皮細胞、真皮の線維芽細胞および肝細胞において、非常に低いレベルで発現することを示す。細胞を、材料および方法において記載されるように、Ａｄ．ＣＭＶ−ｎＬａｃＺ、Ａｄ．ＣＴＰ１−ｎＬａｃＺおよびＡｄ．ＣＴＰ３−ｎＬａｃＺを用いて感染させ、そして、４８時間後に分析した。図１５ａおよびｂにおいて示されるデータについて、示されたＭＯＩ（ｐｆｕ／細胞）で感染した細胞から抽出物を調製し、供給業者によって説明されるようなＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔアッセイ系を使用して、β−ガラクトシダーゼをアッセイした。誤差バーは、標準偏差を示す。代表的な実験を、各場合において示す。図１５ｃにおいて、細胞を１０００ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで感染し、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現細胞を、Ｘ−Ｇａｌ染色によって可視化した。Ａｄ．ＣＭＶ−ｎＬａｃＺで感染された線維芽細胞のみが、検出可能な酵素を発現した。図１５ｄは、３つ全てのウイルスが、感染したＷＶ４８０結腸癌細胞における高レベルのβガラクトシダーゼ発現を指向したことを示す。
【図１５ｄ】
図１５ｄは、ＣＴＰ１およびＣＴＰ３が、正常なヒト内皮細胞、真皮の線維芽細胞および肝細胞において、非常に低いレベルで発現することを示す。細胞を、材料および方法において記載されるように、Ａｄ．ＣＭＶ−ｎＬａｃＺ、Ａｄ．ＣＴＰ１−ｎＬａｃＺおよびＡｄ．ＣＴＰ３−ｎＬａｃＺを用いて感染させ、そして、４８時間後に分析した。図１５ａおよびｂにおいて示されるデータについて、示されたＭＯＩ（ｐｆｕ／細胞）で感染した細胞から抽出物を調製し、供給業者によって説明されるようなＧａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔアッセイ系を使用して、β−ガラクトシダーゼをアッセイした。誤差バーは、標準偏差を示す。代表的な実験を、各場合において示す。図１５ｃにおいて、細胞を１０００ｐｆｕ／細胞のＭＯＩで感染し、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現細胞を、Ｘ−Ｇａｌ染色によって可視化した。Ａｄ．ＣＭＶ−ｎＬａｃＺで感染された線維芽細胞のみが、検出可能な酵素を発現した。図１５ｄは、３つ全てのウイルスが、感染したＷＶ４８０結腸癌細胞における高レベルのβガラクトシダーゼ発現を指向したことを示す。
【図１６】
図１６は、ＣＴＰ１およびＣＴＰ３が、アデノウイルスヘルパー細胞株（ＰｅｒＣ６および２９３）における複製条件下で、非常に低いレベルで発現することを示す。ＰｅｒＣ６および２９３細胞を、１００のＭＯＩで感染させ、そして、３０時間後に収集した。次いで、材料および方法において記載されるように、細胞抽出物を調製し、そしてβ−ガラククトシダーゼについてアッセイした。誤差バーは、標準偏差を示す。代表的な実験を示す。図１６ａは対数スケール、そして１６ｂは、線形スケールである。
【図１７】
図１７は、ＣＴＰ１およびＣＴＰ３が、続発性結腸直腸癌組織において高いレベルで発現するが、付着した肝臓組織では発現しないことを示す。新しく切除された、付着した肝臓縁組織を有する続発性結腸直腸癌（肝臓）の２〜３ｍｍ３の切片を、材料および方法において記載されるように、示されたウイルス中でインキュベートし、４８時間後に固定し、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現について染色した。「Ｔ」は、腫瘍組織を示し、「Ｌ」は、付着した肝臓組織を示す。
【図１８】
図１８は、原発性結腸直腸癌試料における高レベルのＣＴＰ１およびＣＴＰ３発現が、β−カテニンの高レベルの非膜性発現と相関することを示す。新しく切除した原発性結腸直腸癌の２〜３ｍｍ３の切片を、材料および方法において記載されるように、示されたウイルスを用いて形質導入し、そしてβ−ガラクトシダーゼ発現について染色した。材料および方法に記載されるように、各腫瘍のサンプルを切片にし、β−カテニンについて染色した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１５ｄ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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2004500097.tif 000092
【手続補正書】
【提出日】平成14年6月17日(2002.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
オリゴ１：ＰＣＴ　ＡＧＣ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　ＡＣＴ　ＡＧＴ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＧ　ＡＧＴ　ＣＣＴ　ＡＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＴＣ　ＴＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＣ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣ（配列番号９）
オリゴ２：ＰＡＣ　ＴＧＡ　ＡＴＴ　ＣＣＴ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＡＧＧ　ＡＣＴ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＡＣＴ　ＡＧＴ　ＡＡＧ　ＣＴＴ　Ｇ（配列番号１０）
オリゴ３：ＰＡＡ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＡＧ　ＴＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＧＡＧ　ＴＣＣ　ＴＡＣ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣＴ　ＣＴＡ　ＡＡＴ　ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　Ａ（配列番号１１）
オリゴ４：ＰＧＡ　ＴＣＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＴＧＣ　ＡＴＴ　ＴＡＧ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＣＴＣ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧ（配列番号１２）
（ここでＰは、リン酸修飾を示す）
これらのフラグメントは、それぞれ３つのＴＣＦ結合部位（コンセンサスなＣＣＴＴＴＧＡＴＣ）を含む。これらの２重鎖フラグメントを連結し、そして生じた６つのＴＣＦ部位を含むフラグメント（約１３０ｂｐ）をそれらのＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩ部位を用いて、ＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩで消化したｐＧＬ３プロモータープラスミド（ｐＧＬ３ｐｒｏ；Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし、ｐＧＬ３ｐｒｏ／５マーＴｃｆ−ＳＶ４０クローン１０を生成した。しかし、配列決定によりほとんどの３’ＴＣＦ結合部位が１つのＧヌクレオチドの欠損を含み、非活性部位（ＣＣＴＴＴＡＴＣ）を産生することが明らかになった（図１を参照のこと）。


【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
ＣｌｏｎｔｅｃｈプラスミドｐＧ５ＣＡＴ由来のｐＧＬ３ベーシック／５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ（ＣＴＬ５０２）８４ｂｐを産生するために、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩのオーバーハングを含むオリゴを用いて、アデノウイルスＥ１ＢＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡＴＡＡＴ）の上流２１ｂｐおよび下流５５ｂｐにかけてをＰＣＲで増幅した。次いで、このフラグメント（Ａｄ５Ｅ１Ｂプロモーター（ＧＧＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧＣＧＣＣ）（配列番号１３）の１６ｂｐを含む）をＢｇｌＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化したｐＧＬ３ベーシックにクローニングし、ｐＧＬ３ベーシック／Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン２を産生した（図６ｃを参照）。次いで、ｐＧＬ３ベーシック／５マーＴｃｆ−ＳＶ４０（ＣＴＬ５０１）クローン１０由来の５マーのＴＣＦ部位をＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩ消化により切りだし、そしてＮｈｅＩ／ＢｇｌＩＩで消化されたｐＧＬ３ベーシック／Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン２にクローニングし、ｐＧＬ３ベーシック／５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１を生成した。配列決定によって予期される構築物を確認した。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
オリゴ５：ＣＴＡ　ＧＣＡ　ＡＧＣ　ＴＴＡ　ＣＴＡ　ＧＴＣ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＡＧＡ　ＧＴＴ　ＴＣＣ　ＴＡＣ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣＴ　ＣＴＡ　ＡＡＴ　ＴＧＣ　ＡＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＧＧＡ　ＡＴＴ　ＣＡＧ　ＴＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＧＡＧ　ＴＡＡ　ＣＣＴ　ＡＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＴＣ　ＴＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＣ　ＣＴＴ　ＴＡＴ　ＣＡ（配列番号１４）
オリゴ６：ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＡ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＡＧＧ　ＴＴＡ　ＣＴＣ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＣＴＧ　ＡＡＴ　ＴＣＣ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＧＣＡ　ＡＴＴ　ＴＡＧ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＴＡ　ＧＧＡ　ＡＡＣ　ＴＣＴ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＣ　ＴＡＧ　ＴＡＡ　ＧＣＴ　ＴＧ（配列番号１５）
オリゴ７：ＣＴＡ　ＧＣＡ　ＡＧＣ　ＴＴＡ　ＣＴＡ　ＧＴＣ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＡＧＣ　ＴＡＣ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣＴ　ＣＴＡ　ＧＣＡ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＧ　ＡＧＴ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＧ　ＣＣＴ　ＡＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＴＣ　ＴＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＣ　ＣＴＴ　ＴＡＴ　ＣＡ（配列番号１６）
オリゴ８：ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＡ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＡＧＧ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＡＣＴ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＴＧＣ　ＴＡＧ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＴＡ　ＧＣＴ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＣ　ＴＡＧ　ＴＡＡ　ＧＣＴ　ＴＧ（配列番号１７）
オリゴ９：ＣＴＡ　ＧＣＡ　ＡＧＣ　ＴＴＡ　ＣＴＡ　ＧＴＣ　ＣＴＴ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＡＴＡ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＴＣＡ　ＣＣＴ　ＴＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＧ　ＴＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＴ　ＡＣＣ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＣＴＣ　ＴＡＡ　ＡＴＧ　ＣＡＣ　ＣＴＴ　ＴＡＴ　ＣＡ（配列番号１８）
オリゴ１０：ＧＡＴ　ＣＴＧ　ＡＴＡ　ＡＡＧ　ＧＴＧ　ＣＡＴ　ＴＴＡ　ＧＡＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ＡＴＣ　ＡＡＡ　ＧＧＡ　ＣＴＴ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＴＧＡ　ＧＡＴ　ＣＡＡ　ＡＧＧ　ＴＡＴ　ＴＧＡ　ＴＣＡ　ＡＡＧ　ＧＡＣ　ＴＡＧ　ＴＡＡ　ＧＣＴ　ＴＧ（配列番号１９）
（すべての６つのオリゴヌクレオチドは、５’リン酸で修飾された）。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
ｐＧＬ３ベーシック／８８−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン８およびｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＣ−８８−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン２（ＴＡＴＡボックスとの距離：ｄ＝１４０）を、ヒトβグロブリン遺伝子イントロンＩＩ由来のＰＣＲで増幅した８８ｂｐフラグメント（５’オリゴ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧ（配列番号２０）、３’オリゴ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＴＣＡＴＴＣＧＴＣＴＧＴＴＴＣＣＣ（配列番号２１））ＢｇｌＩＩオーバーハングを用いて、ＢｇｌＩＩ消化したｐＧＬ３ベーシック／Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン２またはＢｇｌＩＩ消化したｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１にそれぞれクローニングすることによって構築した。ｐＧＬ３ベーシック／４４７−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１およびｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＣ−４４７−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン６（ＴＡＴＡボックスとの距離：ｄ＝４９９）を、ヒトβグロブリン遺伝子イントロンＩＩ由来のＰＣＲで増幅した４４７ｂｐフラグメント（５’オリゴ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＣＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴＡＴＧＧＴＴＡＡＧ（配列番号２２）、３’オリゴ：ＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＴＴＴＧＧＴＣＡＡＴＡＴＧＴＧＴＡＣＡＣ（配列番号２３））ＢｇｌＩＩオーバーハングを用いて、ＢｇｌＩＩ消化したｐＧＬ３ベーシック／Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン２またはＢｇｌＩＩ消化したｐＧＬ３ベーシック／ＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡクローン１にそれぞれ挿入することによってクローニングした。この配列を確認した。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
（遷移（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイ）
ＨｅｐＧ２、ＳＷ４８０およびＨｅＬａを、トランスフェクションの前日に、それぞれの６ウェルあたり２．５×１０５、１．５×１０５および６．０×１０４の細胞の密度で、播種した。次の日に、ＣＬ２２ペプチド（ＫＫＫＫＫＫＧＧＦＬＧＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲＳＡＹＥＲＭＣＮＩＬＫＧＫ（配列番号２４）（国際特許出願ＷＯ　９８／３５９８４に記載される））とプラスミドＤＮＡとの混合物（２：１比率、μｇ：μｇ）を、ＨＢＳ（１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ　７．４，１５０ｍＭ　ＮａＣｌ；Ｓｉｇｍａ）中で最終容量１００μｌとして調製して、そして室温において、０．９ｍｌの「ＲＡＣ」溶液（ＲＰＭＩ培地（Ｓｉｇｍａ）中の０．１％ヒトアルブミン（ＢＰＬ、ＵＫ）、１２０μＭのクロロキン（Ｓｉｇｍａ））の添加前に３０〜４５分間インキュベーションした。次いで、このトランスフェクション溶液を、ＰＢＳで１回洗浄した後の細胞に加えて、これらの細胞と４〜５時間インキュベーションした。その後、２ｍｌの新鮮な完全培地で置きかえた。２日後、細胞を、ＰＢＳの使用により１度洗浄し、次いで、１０分間、室温で２００μｌ溶解緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．８、８ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０、１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００および１５％グリセロール）中でインキュベーションした。遠心分離後、この上清のアリコートを、照度計（Ｌｕｍａｔ　ＬＢ　９５０１，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してルシフェラーゼアッセイ緩衝液（溶解緩衝液中の０．１ｍＭルシフェリン，０．４４ｍＭ　ＡＴＰ）と共に、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。活性を各サンプル中のこのタンパク質の含有量（ＢＣＡ，Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて正規化した。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８２】
アデノウイルス「骨格」ベクターｐＰＳ１１６０を、ｐＰＳ１１２８のＰａｃＩ線形化、ＸｂａＩ部位含むＰａｃＩ−適合性アダプター（オリゴ１：５’ＴＡＣＡＴＣＴＡＧＡＴＡＡＴ−３’（配列番号２５）、オリゴ２：５’−ＴＴＡＴＣＴＡＧＡＴＧＴＡ−３’（配列番号２６））を用いたライゲーション、その後のＡｄ５配列３５２４〜１０５８９を含む約７ｋｂのＸｂａＩフラグメントを放出するＸｂａＩ消化によって構築した。次いで、これを、ＸｂａＩ線形化したｐＰＳ１０２２（Ｐｅｔｅｒ　Ｓｅａｒｉｅ博士）すなわちヌクレオチドの２８，５９２〜３０，４７０（Ｅ３領域）を欠いたヌクレオチド１０，５８９〜右手側ＩＴＲのＡｄ５配列を含むｐＵＣ１８−ベースのプラスミドの中へクローン化した。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
ｐＴＸ０３７４を、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｎｔｒ遺伝子に結合したＣＭＶプロモーターを含む１．６ｋｂ　Ｂｇ／ＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＳＷ１０７中へクローニングすることにより構築した。このプラスミドを、ヒト相補Ｃ２遺伝子のｐｏｌｙＡ付加および転写終止シグナルを含む２４０ｂｐ　ＨｉｎｃＩＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに結合したヒトβ−グロビン遺伝子（エキソン２のＢａｍＨＩ部位〜エキソン３のＥｃｏＲＩ部位）の９１７ｂｐフラグメントを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にクローニングすることによって構築した。ｐＴＸ０３７５を、ｐＴＸ０３７４由来の２．５ｋｂ　ＳｐｅＩフラグメントをＳｐｅＩ消化ｐＰＳ１１２８中にクローニングすることにより構築した。このプラスミドを、２段階で構築した。第１に、ｐＰＳ９７１（Ｗｅｅｄｏｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、印刷中）の左手側ＥｃｏＲＩ部位をＳｗａＩ部位に変換してｐＰＳ１１５を生成した。第２に、ｐＰＳ１１５の３５０ｂｐのＳｐｅ１−Ａｆ／ＩＩフラグメントを、以下の２つのオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって調製したリンカーで置換した：
５’−ＣＴＡＧＴＡＴＣＧＡＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＧＣＧＴＧＧＣＣ−３’（配列番号２７）および
５’−ＴＴＡＡＧＧＣＣＡＣＧＣＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＴＣＧＡＴＡ−３’（配列番号２８）。
ｐＰＳ１０２２を、ＳｗａＩ部位への右手側ＥｃｏＲＩ部位の変換によってｐＰＳ９７２から構築した。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
図１は、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞およびＳＷ４８０細胞の、Ｔｃｆ応答性ルシフェラーゼレポーター構築物「５マーＴｃｆ−ＳＶ４０−Ｌｕｃ」（ＣＴＬ５０１）（図１ａ）を用いる一過性のトランスフェクションの結果を示す。数は、Ｔｃｆ部位間の塩基対の数を示す。５マーＴＣＦ−ＳＶ４０アンチセンス鎖のヌクレオチド配列（配列番号１）は、図１ｃに示される。下線を引かれかつイタリック体の配列は、活性ＴＣＦ部位である。単に下線を引かれた配列は、変異ＴＣＦ部位である。太字の配列は、ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅｌおよびＫｐｎＩ認識部位である。細胞を、図１ｂにおいて示されるように、等モル量（各々約１μｇ）のＴｃｆ応答性ルシフェラーゼレポーター構築物およびコントロールルシフェラーゼレポーター構築物で、トランスフェクトした。「ＳＶ４０ｐ」は、ＳＶ４０プロモーターのみを含む；「ＳＶ４０　ｅ／ｐ」は、ＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサーの両方を含む；「ＣＭＶ」は、サイトメガロウイルスエンハンサー／プロモーターを含む。データは、１に設定されたＳＶ４０プロモーターの活性に対する活性化の倍数として示される。２つの独立したトランスフェクションからの平均値およびＳＤが示される。この結果は、３つの独立した実験の代表である。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
図６は、ＨｅＬａ細胞およびＳＷ４８０細胞の、Ｔｃｆ応答性ルシフェラーゼレポーター構築物５マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ−Ｌｕｃ（ＣＴＬ５０２）（図６ａ）を用いる一過性のトランスフェクションの結果を示す。Ｅ１ＢＴＡＴＡアンチセンス鎖のヌクレオチド配列（配列番号２）を、図６ｃに示す。下線を引かれかつイタリック体の配列が、Ｅ１Ｂ　ＴＡＴＡボックスである。太字の配列は、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩ認識部位である。細胞を、図６ｂに示されるように、等モル（各約１μｇ）量のいくつかのルシフェラーゼレポーター構築物で、トランスフェクトした。ｐＧＬ３ベーシックは、プロモーターなしのｌｕｃｃＤＮＡを含む；「Ｅ１Ｂ」は、ｌｕｃ　ｃＤＮＡの上流にＡｄ５　Ｅ１Ｂ　ＴＡＴＡボックスを含む；５マーＴｃｆ−ＳＶ４０（ＣＴＬ５０１）は、図１ａに記載される。データは、１に設定したｐＧＬ３ベーシックの活性と比較した活性化の倍数として表される。２連のトランスフェクションの平均値およびＳＤを示す。データは、３つの独立した実験の代表である。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図９ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９ａ】
図９ａは、異なる数および配置のＴｃｆ結合部位を有するＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡルシフェラーゼレポーター構築物を使用する、ＳＷ４８０細胞の一過的なトランスフェクションの結果を示す。図９ａは、Ｔｃｆ部位数およびそれらの間のスペーシングを示す。図９ｃは、Ｔｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ構築物のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列（配列番号３〜７）を示す。下線を引かれかつイタリック体の配列は、活性Ｔｃｆ部位である。太字の配列は、ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩ認識部位である。４マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ構築物において、ＢｇｌＩＩ部位は、欠損している。細胞を、０．５μｇの各ルシフェラーゼレポーター構築物を用いてトランスフェクトした。データは、５マーＴｃｆ−ＥＩＢＴＡＴＡ（ＣＴＬ５０２）の活性の割合として発現される（図９ｂ）。３連のトランスフェクションの平均値およびＳＤが示される。この結果は、３つの独立した実験の代表である。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図９ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９ｂ】
図９ｂは、異なる数および配置のＴｃｆ結合部位を有するＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡルシフェラーゼレポーター構築物を使用する、ＳＷ４８０細胞の一過的なトランスフェクションの結果を示す。図９ａは、Ｔｃｆ部位数およびそれらの間のスペーシングを示す。図９ｃは、Ｔｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ構築物のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列を示す（配列番号３〜７）。下線を引かれかつイタリック体の配列は、活性Ｔｃｆ部位である。太字の配列は、ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩ認識部位である。４マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ構築物において、ＢｇｌＩＩ部位は、欠損している。細胞を、０．５μｇの各ルシフェラーゼレポーター構築物を用いてトランスフェクトした。データは、５マーＴｃｆ−ＥＩＢＴＡＴＡ（ＣＴＬ５０２）の活性の割合として発現される（図９ｂ）。３連のトランスフェクションの平均値およびＳＤが示される。この結果は、３つの独立した実験の代表である。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図９ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９ｃ】
図９ｃは、異なる数および配置のＴｃｆ結合部位を有するＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡルシフェラーゼレポーター構築物を使用する、ＳＷ４８０細胞の一過的なトランスフェクションの結果を示す。図９ａは、Ｔｃｆ部位数およびそれらの間のスペーシングを示す。図９ｃは、Ｔｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ構築物のアンチセンス鎖のヌクレオチド配列（配列番号３〜７）を示す。下線を引かれかつイタリック体の配列は、活性Ｔｃｆ部位である。太字の配列は、ＢｇｌＩＩ、ＮｈｅＩおよびＫｐｎＩ認識部位である。４マーＴｃｆ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ構築物において、ＢｇｌＩＩ部位は、欠損している。細胞を、０．５μｇの各ルシフェラーゼレポーター構築物を用いてトランスフェクトした。データは、５マーＴｃｆ−ＥＩＢＴＡＴＡ（ＣＴＬ５０２）の活性の割合として発現される（図９ｂ）。３連のトランスフェクションの平均値およびＳＤが示される。この結果は、３つの独立した実験の代表である。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
図１０は、近位のＴｃｆ部位とＴＡＴＡボックス（２５−４９９ｂｐ）との間の変化するスペーシングを有するＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ−ｌｕｃ構築物を用いるＳＷ４８０細胞の一過的なトランスフェクションの結果を示す。ＴｃｆＣエレメントの構造は、図７に記載される。図１０ａは、このアッセイに使用されたＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡレポーター構築物の構造を示す。「ｄ」は、近位のＴｃｆ結合部位最後のヌクレオチドからＴＡＴＡ配列の最初のＴまでの塩基対の数を示す。８８ｂｐおよび４４７ｂｐのスペーサーフラグメントをヒトβ−グロブリン遺伝子イントロンＩＩからＰＣＲによって誘導した。細胞を、０．５μｇの各ルシフェラーゼレポーター構築物でトランスフェクトした。データを、ＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡ　ｄ＝２５構築物の活性の割合として表す（ｂ）。３連のトランスフェクションの平均値およびＳＤを示す。結果は、３つの独立した実験の代表である。ｄ＝２５である場合のＴｃｆＣ−Ｅ１ＢＴＡＴＡのアンチセンス鎖のヌクレオチド配列（配列番号８）を図１０ｃに示す。下線部を引かれかつイタリック体の配列は、活性なＴｃｆ部位である。太字の配列は、Ｅ１Ｂ　ＴＡＴＡボックス、ならびにＳｍａＩおよびＫｐｎＩ認識部位である。




【国際調査報告】
2004500097.tif 000093
2004500097.tif 000094
2004500097.tif 000095
2004500097.tif 000096
2004500097.tif 000097