(57)【要約】本発明はGENSETポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。かかるGENSET産物は法医学的分析用の試薬として、染色体マーカーとして、組織/細胞/細胞小器官に特異的なマーカーとして、発現ベクターの作製において使用することができる。加えて、それらは異常なGENSET発現および／または生物活性についてのスクリーニングおよび診断アッセイに、また、GENSET関連疾患の治療に用いられる化合物のスクリーニングに使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
i)  配列番号305で示されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、
ii)  配列番号170〜304、306〜338、456〜560、785〜918で示されるアミノ酸配列のいずれか1つを含んでなるポリペプチド、または
iii)  前記ポリペプチドのいずれかの生物学的に活性な断片、
をコードする核酸配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドがシグナルペプチドを含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが成熟タンパク質である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号1〜169、339〜455、または561〜784で示される核酸配列のいずれか1つを含んでなる、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
プロモーターに機能し得る形で連結されている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター。
【請求項７】
請求項１に記載のポリヌクレオチドについての宿主細胞組換え体。
【請求項８】
請求項７に記載の宿主細胞を含んでなる非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項９】
請求項１に記載のポリヌクレオチド、および製薬上許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項１０】
GENSETポリペプチドの生産方法であって、
a)  請求項５に記載のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞の集団を準備し、
b)  該宿主細胞の集団を、該宿主細胞内での該ポリペプチドの生産を助長する条件下で培養する、
ことを含んでなる方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞の集団から前記ポリペプチドを精製することをさらに含んでなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号1〜169、339〜455、または561〜784で示される核酸配列のいずれか1つを含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドによってコードされる生物学的に活性なポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号170〜338、456〜560、または785〜918で示されるアミノ酸配列のいずれか1つを含んでなる、単離されたポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片。
【請求項１５】
シグナルペプチドを含んでなる、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
成熟タンパク質である、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１４に記載のポリペプチドと特異的に結合する抗体。
【請求項１８】
請求項１４に記載のポリペプチド、および製薬上許容される担体を含有する医薬組成物。
【請求項１９】
GENSETポリペプチドの生産方法であって、
a)  プロモーターに機能し得る形で連結されている、請求項１４に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞の集団を準備し、
b)  該細胞の集団を、該細胞内での該ポリペプチドの生産を助長する条件下で培養し、
c)  該細胞の集団から該ポリペプチドを精製する、
ことを含んでなる方法。
【請求項２０】
GENSET遺伝子が哺乳動物の体内で発現されるかどうかを調べる方法であって、
a)  哺乳動物由来の生物学的サンプルを準備し、
b)  該生物学的サンプルを、
i)  ストリンジェントな条件下で請求項１に記載のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド、または
ii)  請求項１４に記載のポリペプチドと特異的に結合するポリペプチド、
のいずれかと接触させ、
c)  該ポリヌクレオチドと該サンプル内のRNA種とのハイブリダイゼーションの有無、または該ポリペプチドと該サンプル内のタンパク質との結合の有無を検出する、
ステップを含んでなり、その際、前記ハイブリダイゼーションまたは結合が検出されれば、GENSET遺伝子が該哺乳動物の体内で発現されていることを示す、前記方法。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチドがプライマーであり、かつ、前記ハイブリダイゼーションがプライマーの配列を含む増幅産物の存在を検出することによって検出される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物におけるGENSET遺伝子の発現レベルが上昇しているか低下しているかを調べる方法であって、
a)  哺乳動物由来の生物学的サンプルを準備し、
b)  該生物学的サンプル内の請求項１４に記載のポリペプチドの量または該ポリペプチドをコードするRNA種の量を、対照サンプルで検出されるかまたは対照サンプルから予想されるレベルと比較する、
ステップを含んでなり、その際、生物学的サンプル内の該ポリペプチドまたはRNA種の量が、対照サンプルで検出されたまたは対照サンプルから予想されたレベルと比較して増加していれば、該哺乳動物におけるGENSET遺伝子の発現レベルが上昇していることを示し、生物学的サンプル内の該ポリペプチドまたはRNA種の量が、対照サンプルで検出されたまたは対照サンプルから予想されたレベルと比較して減少していれば、該哺乳動物におけるGENSET遺伝子の発現レベルが低下していることを示す、前記方法。
【請求項２４】
GENSETポリペプチドの候補モジュレーターの同定方法であって、
a)  請求項１４に記載のポリペプチドを試験化合物と接触させ、
b)  該化合物が該ポリペプチドと特異的に結合するかどうかを調べる、
ことを含んでなり、その際、該化合物が該ポリペプチドと特異的に結合することが検出されれば、該化合物がGENSETポリペプチドの候補モジュレーターであることを示す、前記方法。
【請求項２５】
前記候補モジュレーターの存在下でGENSETポリペプチドの生物活性を調べることをさらに含んでなり、その際、前記化合物の存在下でのGENSETポリペプチドの生物活性が該化合物の不在下での該活性と比較して変化していれば、該化合物がGENSETポリペプチドのモジュレーターであることを示す、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
医薬組成物の製造方法であって、
a)  請求項２４に記載の方法を用いてGENSETポリペプチドのモジュレーターを同定し、
b)  該モジュレーターを製薬上許容される担体と組み合わせる、
ことを含んでなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はGENSETポリペプチド、その断片、および該ポリペプチドをコードする遺伝子の5'および3'末端に位置する調節領域に向けられる。本発明はまた、GENSET遺伝子によってコードされるポリペプチドおよびその断片に関する。本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含む組換えベクター、特にGENSET遺伝子調節領域またはGENSETポリペプチドをコードする配列を含む組換えベクター、および本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞、ならびにかかるベクターおよび宿主細胞の作製方法に関する。本発明はさらに、本発明のポリペプチドの生産におけるこれらの組換えベクターおよび宿主細胞の使用に関する。本発明はさらに、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体、ならびにかかる抗体およびそのフラグメントの作製方法に関する。本発明はまた、サンプル中の本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの存在を検出する方法、異常なGENSETポリペプチド発現および／または生物活性を診断およびスクリーニングする方法、GENSETポリペプチドの活性または発現を調節する能力について化合物をスクリーニングする方法、ならびにかかる化合物の使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト染色体に散在する推定30,000〜12,000個の遺伝子は、ヒト疾病の理解、診断および治療に対してとてつもなく大きい可能性を提供する。さらに、ヒトゲノム全体に分布する遺伝子座と特異的にハイブリダイズできるプローブは、高分解能の染色体地図の作成および個体の確認において使用される。
【０００３】
かつては、単一のヒト遺伝子を特徴づけることでさえ、何年もの努力を必要とする骨の折れるプロセスであった。クローニングベクター、DNA配列決定およびコンピュータ技術の領域における最近の進展により、ヒト遺伝子を単離し、配列決定し、マッピングし、特性決定できる速度がかなり速くなってきた。
【０００４】
現在では、ヒトゲノムに分布する遺伝子を同定し特性決定するために2つの異なるアプローチが進められている。一方のアプローチでは、ゲノムDNAの大きな断片を単離し、クローニングして配列決定する。これらのゲノム配列中の潜在的オープンリーディングフレームをバイオインフォマティクス・ソフトウェアを用いて同定する。しかしながら、このアプローチは、ゲノム中に散在するタンパク質コード配列を見つけ出すために、タンパク質をコードしない大きなストレッチのヒトDNAを配列決定する必要がある。広範囲の配列決定を必要とする上に、バイオインフォマティクス・ソフトウェアは得られたゲノム配列を誤って特性決定することがあり、すなわち、非コードDNAをコードDNAと、また、その逆に分類することがある。
【０００５】
もう1つのアプローチはヒト遺伝子を同定および特性決定するためにより直接的な経路をとる。このアプローチでは、ヒトタンパク質をコードする単離したメッセンジャーRNA（mRNA）から相補DNA（cDNA）を合成する。このアプローチを用いれば、配列決定はゲノムのうちのタンパク質をコードする断片に由来するDNAに対してのみ実施される。多くの場合、短いストレッチのcDNAだけを配列決定して発現配列タグ(EST)と呼ばれる配列を得る。次いで、ESTを用いてEST配列に隣接する配列を含むcDNAを単離または精製すればよい。cDNAはそれを得るために用いたEST配列のすべてを含む場合もあるし、それを得るために用いたEST配列の断片のみしか含まない場合もある。さらに、cDNAはESTが由来する遺伝子の全コード配列を含む場合もあるし、あるいは、cDNAはESTが由来する遺伝子のコード配列の断片しか含まない場合もある。選択的スプライシングまたは別のプロモーター活性の結果として該EST配列を含むcDNAがいくつか存在し得ることが理解されよう。
【０００６】
かつては、これらの短いEST配列はオリゴdTプライムド(primed)cDNAライブラリーから得ることが多かった。従って、それらは主にmRNAの3'非翻訳領域に対応していた。mRNAの3'末端に由来するEST配列の普及は、一部には、cDNAを取得するための典型的な技法がmRNAの5'末端に由来するcDNA配列を単離するのにあまり適していないという事実の結果である(Adamsら, Nature 377:3-174, 1996, Hillier ら, Genome Res. 6:807-828, 1996)。さらに、より長いcDNA配列が得られた報告例では、報告された配列は一般的にコード配列に対応し、cDNAが誘導されるmRNAの全5'非翻訳領域(5'UTR)を含まない。実際、5'UTRはmRNAの安定性または翻訳のいずれかに影響を及ぼすことが分かっている。従って、例えば、分裂促進的に活性化された細胞におけるメタロプロテアーゼmRNAの組織阻害剤の翻訳の場合に示されるように、遺伝子発現の調節が別の5'UTRの使用によって達成される可能性がある(Waterhouseら, J Biol Chem. 265:5585-9. 1990)。さらに、突然変異、挿入または転座の事象による5'UTRの改変が病気の発生に関係することさえある。例えば、遺伝性の精神遅滞の最も一般的な原因である脆弱X症候群は、一部には、リボソームの失速によるタンパク質合成の阻害をもたらす、脆弱X mRNAの5'UTRへの複数のCGGトリヌクレオチドの挿入によるものである(Feng ら, Science 268:731-4, 1995)。プロトオンコジーンc-mycの翻訳を阻害することが知られている5'UTRの領域における異常な突然変異は、多発性骨髄腫患者に由来する細胞においてc-mycタンパク質レベルのアップレギュレーションをもたらすことが明らかにされた(Willisら,Curr Top Microbiol Immunol 224:269-76, 1997)。さらに、オリゴdTプライムドcDNAライブラリーを使用しても完全な5'UTRは単離できないが、それは、この方法によって得られた不完全な配列がmRNAの最初のエキソンを（特に最初のエキソンが短い場合には）含まない可能性があるからである。さらに、それらはスプライシング部位の上流に位置するいくつかのエキソン（多くは短いもの）を含まない場合もある。従って、mRNAの5'末端に由来する配列を取得する必要性が存在する。
【０００７】
さらに、大規模な配列決定プロジェクトがもたらした大量のESTデータにもかかわらず(Adamsら, Nature 377:174, 1996; Hillierら, Genome Res. 6:807-828, 1996)、得られたcDNAに対応するmRNAの生物学的機能に関する情報は限られていることが分かった。実際、mRNAの生物学的機能を調べるためには完全なコード配列についての知識が絶対に必要であるが、ESTは部分的なコード配列しかもたらさない。これまでのところ、大規模な全長cDNAのクローニングは、全長cDNAライブラリーの構築方法の効率が低いために、限られた成功を収めているにすぎない。実際、かかる方法は、大量のmRNA (Ederlyら, 1995)を必要とする（それゆえ、少量の組織しか入手できない場合には、代表的ではない全長ライブラリーをもたらす）か、あるいは、適切な数のクローンを得るためにPCR増幅(Maruyamaら, 1994; CLONTECHniques, 1996)を必要とする（それゆえ、稀な、長いcDNAが失われている極めて偏ったcDNAライブラリーをもたらす）かのいずれかである。従って、全長cDNA、すなわち、対応するmRNAの全コード配列を含むcDNAを取得する必要がある。
【０００８】
ヒト染色体由来の多数の配列は実際的な用途があるが、タンパク質産物をコードする染色体配列の同定および特性決定に基づくアプローチは特に診断および治療上の用途と関連がある。30,000〜120,000のタンパク質コード遺伝子のうち、タンパク質を合成する細胞から分泌されるタンパク質をコードする遺伝子、ならびに分泌されたタンパク質それ自身は潜在的な治療薬として特に価値がある。かかるタンパク質は、しばしば細胞間連絡に関与しており、その標的細胞において臨床的に関連のある応答をもたらす原因となりうる。実際、組織プラスミノーゲンアクチベーター、G-CSF、GM-CSF、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、インスリン、インターフェロン-α、インターフェロン-β、インターフェロン-γおよびインターロイキン-2を含めて、いくつかの分泌タンパク質が現在臨床使用中である。これらのタンパク質は急性心筋梗塞、急性虚血発作、貧血、糖尿病、成長ホルモン欠乏症、肝炎、腎臓癌、化学療法誘導性好中球減少および多発性硬化症を含む広範囲の症状を治療するために使用されている。こうした理由のために、分泌タンパク質またはその断片をコードするcDNAは特に価値のある治療薬の供給源に当たる。従って、分泌タンパク質およびそれらをコードする核酸を同定および特性決定する必要がある。
【０００９】
分泌タンパク質は、それら自身が治療上有用であることに加えて、そのアミノ末端に、その分泌を指令するシグナルペプチドと呼ばれる短いペプチドを含んでいる。これらのシグナルペプチドは分泌タンパク質をコードする遺伝子のコード配列の5'末端に位置するシグナル配列によってコードされている。これらのシグナルペプチドは機能的に連結されたタンパク質の細胞外分泌を指令するので、シグナル配列は、分泌が望まれるタンパク質をコードする遺伝子にシグナル配列を機能的に連結させることによって、どのようなタンパク質でも効率的な分泌を指令すべく利用することができる。さらに、膜移動配列と呼ばれるシグナルペプチドの断片を、目的のペプチドまたはタンパク質の細胞内移入を指令するために用いてもよい。これは特定の遺伝子産物をその産生細胞以外の細胞に送達することが望まれる遺伝子治療ストラテジーにおいて有用でありうる。シグナルペプチドをコードするシグナル配列はまた、タンパク質精製技法を簡略化する際にも使用される。かかる用途では、所望のタンパク質の細胞外分泌により、望まないタンパク質（それらから所望のタンパク質を選択しなければならない）の数を減らすことで精製が大いに促進される。従って、シグナルペプチドをコードする分泌タンパク質の遺伝子の5'断片を同定および特性決定する必要性が存在する。
【００１０】
分泌タンパク質をコードする配列はまた、治療薬または診断薬として使用することもできる。特に、かかる配列を用いて、分泌タンパク質のコード配列の突然変異の結果として個体が疾病などの検出可能な表現型を発現する可能性があるかどうかを調べることができる。個体がかかるコード配列における突然変異の結果として疾病またはその他の望ましくない表現型を患う危険がある場合には、遺伝子治療を用いて正常なコード配列を導入することで望ましくない表現型を修正しうる。あるいはまた、望ましくない表現型がコード配列によってコードされるタンパク質の過剰発現に起因する場合には、アンチセンスまたは三重らせんに基づくストラテジーを用いて、そのタンパク質の発現を低下させることもできる。
【００１１】
コード配列によってコードされる分泌ヒトポリペプチドはまた、そのポリペプチドをコードする配列の突然変異が原因となる疾病などの症状を有する個体に直接それらを投与することによって、治療薬として使用することができる。このような場合には、個体にポリペプチドを投与することによってその症状を治癒または改善することができる。
【００１２】
さらに、分泌ヒトポリペプチドまたはその断片は、生物学的サンプルの組織型または起源種を調べるのに有用な抗体を生成するために使用することもできる。抗体を用いて、分泌ヒトポリペプチドの細胞局在または該ヒトポリペプチドに融合されたポリペプチドの細胞局在を調べることも可能である。さらに、この抗体を免疫アフィニティークロマトグラフィー技術に用いて、ヒトポリペプチドまたはヒトポリペプチドに融合された標的ポリペプチドを単離、精製または濃縮することが可能である。
【００１３】
プロモーターおよび上流の調節領域が同定および特性決定されているヒト遺伝子の数に関する一般に入手可能な情報は極めて限られている。一つには、これはそのような調節配列を単離することの難しさによる。転写因子結合部位などの上流調節配列は、一般的に短すぎて、ヒトゲノムライブラリーからプロモーターを単離するためのプローブとして利用できない。最近では、ヒトプロモーターを単離するためのアプローチがいくつか開発されている。それらのうちの一つはCpGアイランドライブラリーを作製することからなる(Crossら, Nature Genetics 6: 236-244, 1994)。二つめは、SpeI結合タンパク質を用いることによりSpeI結合部位を含むヒトゲノムDNA配列を単離することからなる(Mortlockら, Genome Res. 6:327-335, 1996)。これらのアプローチは両方とも特異性および包括性の欠如のために限界がある。従って、遺伝子の5'断片を同定し、さらに系統的に特性決定する必要性が存在する。
【００１４】
対応するmRNAの5'末端を含むcDNAは、タンパク質合成の場所、進行段階、速度および量ならびにmRNAの安定性を制御する5'UTRおよび上流調節領域を効率よく同定して単離するために使用することができる(Theilら, BioFactors 4:87-93, (1993)。ひとたび同定および特性決定されれば、これらの調節領域を遺伝子治療またはタンパク質精製スキームに利用して、タンパク質合成の所望の量および場所を得たり、あるいは、望ましくない遺伝子産物の合成を阻害し、減少させ、または妨げることができる。
【００１５】
さらに、分泌タンパク質遺伝子の5'末端を含むcDNAは染色体地図作成および個体の確認のためのプローブとして有用な配列を含みうる。従って、分泌タンパク質をコードする遺伝子の5'コード配列の上流にある配列を同定および特性決定する必要がある。
【発明の開示】
【００１６】
本発明は、(a)配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列；(b)寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列；(c)配列番号1〜169、339〜455、561〜784のコード配列；(d)寄託されたクローンプールのクローンインサートのコード配列；(e)配列番号170〜338、456〜560、785〜918のポリペプチドのうちの1つをコードする配列；(f)寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドのうちの1つをコードする配列；(g)GENSETポリペプチドをコードするゲノム配列；(h)GENSET遺伝子の5'転写調節領域；(i)GENSET遺伝子の3'転写調節領域；(j)(g)〜(i)の任意の組合せのヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；(k)(a)〜(j)のいずれかのポリヌクレオチドの変異ポリヌクレオチド；(l)(a)〜(k)のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド(ここで、該ポリヌクレオチドは一本鎖、二本鎖、またはある部分が一本鎖で、ある部分が二本鎖である)；(m)(l)の一本鎖ポリヌクレオチドのいずれかに相補的なヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド；からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる(comprising)、からなる(consisting of)、または本質的にからなる(consisting essentially of)、精製または単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明はさらに前記の(a)〜(m)の核酸分子の断片を提供する。
本発明のさらなる実施形態は、前記の(a)〜(m)のヌクレオチド配列のいずれかに対して、例えば、少なくとも約25、50、100、150、250、 500、1000個またはそれ以上連続したヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも70％同一の、より好ましくは少なくとも75％、さらにより好ましくは少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一のヌクレオチド配列を含んでなる、からなる、または本質的にからなる、精製または単離されたポリヌクレオチド、あるいはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記の(a)〜(m)のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む。
【００１７】
本発明はまた、本発明の精製または単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および本発明のポリヌクレオチドについての宿主細胞組換え体、ならびに前記ベクターおよび宿主細胞の作製方法に関する。本発明はさらにGENSETポリペプチドの生産におけるこれらの組換えベクターおよび組換え宿主細胞の使用に関する。
【００１８】
本発明はさらに、(a)配列番号170〜338、456〜560、785〜918のポリペプチド；(b)寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチド；(c)配列番号170〜338、456〜560、785〜918のポリペプチドのエピトープ含有断片；(d)寄託されたクローンプールに含まれるクローンインサートによってコードされるポリペプチドのエピトープ含有断片；(e)配列番号170〜338、456〜560、785〜918のポリペプチドのドメイン；(f)寄託されたクローンプールに含まれるクローンインサートによってコードされるポリペプチドのドメイン；および(g) (a)〜(f)のポリペプチドのいずれかの対立遺伝子変異ポリペプチド；からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、からなる、または本質的にからなる、精製または単離されたポリペプチドを提供する。本発明は生物活性を有するもの、または生物学的に機能的なドメインを含んでなるものなどの前記(a)〜(g)のポリペプチドの断片をさらに提供する。
【００１９】
本発明は、(a)〜(g)に記載のポリペプチドに対して、例えば、少なくとも約25、50、100、150、250、500、1000個、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、少なくとも70%の類似性、より好ましくは少なくとも75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%の類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに(a)〜(g)に記載のポリペプチドに対して少なくとも70%同一の、より好ましくは少なくとも75%同一の、さらにより好ましくは80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをさらに含む。本発明はさらに、本発明のポリペプチドの製造方法に関する。
【００２０】
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドについてトランスジェニックであり、かつ、本発明のポリペプチドを発現するトランスジェニック植物または動物に関する。
【００２１】
本発明はさらに、本発明のGENSETポリペプチドおよびその断片と特異的に結合する抗体、ならびにかかる抗体およびそのフラグメントの作製方法に関する。
【００２２】
本発明はまた、生物学的サンプルにおいてGEMSET遺伝子の発現および／または生物活性を検出するキット、使用および方法を提供する。かかる方法の１つは、GENSETポリヌクレオチドを増幅および検出するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)またはGENSETゲノムDNA、cDNAまたはmRNAを検出するためのサザンおよびノーザンブロットハイブリダイゼーションを用いて、生物学的サンプルにおけるGENSETポリヌクレオチドの発現をアッセイすることを含む。あるいは、試験サンプルにおけるGENSET遺伝子発現を検出する方法は、本発明のGENSETポリペプチドまたはGENSETポリペプチドの一部と結合する化合物を用いて達成してもよい。
【００２３】
本発明はまた、GENSET遺伝子産物レベルが上昇または低下しており、それぞれGENSET遺伝子発現を抑制または増強する治療の恩恵を受ける可能性がある個体または非ヒト動物を同定するための診断法、ならびにGENSETポリヌクレオチドおよびポリペプチドの使用に関し、また、GENSETポリペプチドの発現または生物活性と関連のある特定の疾病／障害に罹患する危険の高い、または現在罹患している個体または非ヒト動物の同定方法に関する。
【００２４】
本発明はまた、GENSET遺伝子調節配列と相互作用する化合物およびGENSETポリペプチドと直接または間接的に相互作用する化合物を含めて、化合物をGENSETポリペプチドの活性または発現を調節する(例えば、増加または抑制する)その能力についてスクリーニングするキット、使用および方法に関する。かかる化合物の使用もまた本発明の範囲内にある。
【００２５】
本発明はまた、本発明の活性物質、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは抗体、および典型的には製薬上許容される担体、を含んでなる製薬上または生理学上許容される組成物に関する。
【００２６】
本発明はまた、本発明の配列のcDNAコードおよびポリペプチドコードを含むコンピューターシステム、ならびに本発明のGENSETポリペプチドまたはGENSETポリヌクレオチド配列を用いて配列を比較し、ホモロジーまたは特徴を同定するコンピューター関連方法に関する。
【００２７】
もう1つの態様では、本発明は、i)配列番号170〜338、456〜560、785〜918で示される配列のいずれか1つまたは寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドの配列のいずれか1つに対して少なくとも約80％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド；あるいはそのポリペプチドの生物学的に活性な断片をコードする核酸配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
【００２８】
ある実施形態では、前記ポリペプチドは配列番号170〜338、456〜560、785〜918で示される配列のいずれか1つまたは寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチド配列のいずれか1つを含んでなる。もう1つの実施形態では、前記ポリペプチドはシグナルペプチドを含んでなる。もう1つの実施形態では、前記ポリペプチドは成熟タンパク質である。もう1つの実施形態では、核酸配列は、少なくとも約100個の連続するヌクレオチドにわたって、配列番号1〜169、339〜455、561〜784で示される配列のいずれか1つまたは寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列のいずれか1つに対して少なくとも約80％の同一性を有する。もう1つの実施形態では、ポリヌクレオチドはストリンジェントな条件下で配列番号1〜169、339〜455、561〜784で示される配列のいずれか1つまたは寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列のいずれか1つを含んでなるポリヌクレオチドとハイブリダイズする。もう1つの実施形態では、核酸配列は配列番号1〜169、339〜455、561〜784で示される配列のいずれか1つまたは寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列のいずれか1つを含んでなる。もう1つの実施形態では、ポリヌクレオチドはプロモーターと機能し得る形で連結されている。
【００２９】
もう1つの態様では、本発明は、プロモーターと機能し得る形で連結されている本明細書に記載のいずれかのポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを提供する。もう1つの態様では、本発明は、本明細書に記載のいずれかのポリヌクレオチドについての宿主細胞組換え体を提供する。もう1つの態様では、本発明は、前記宿主細胞を含んでなる非ヒトトランスジェニック動物を提供する。
【００３０】
もう1つの態様では、本発明は、GENSETポリペプチドの作製方法を提供し、この方法は、a)本明細書に記載のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞集団を準備し、次いでb)その宿主細胞集団を宿主細胞内のポリペプチドの産生を助長する条件下で培養することを含んでなる。
【００３１】
ある実施形態では、前記方法は、宿主細胞集団からポリペプチドを精製することをさらに含んでなる。
【００３２】
もう1つの態様では、本発明はGENSETポリペプチドの作製方法を提供し、この方法は、a)本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる細胞集団を準備し、b)その細胞集団を細胞内のポリペプチドの産生を助長する条件下で培養し、さらにc)その細胞集団からポリペプチドを精製することを含んでなる。
【００３３】
もう1つの態様では、本発明は、少なくとも約100個の連続するヌクレオチドにわたって、配列番号1〜169、339〜455、561〜784で示される配列のいずれか1つまたは寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列のいずれか1つに対して少なくとも約80％の同一性を有する核酸配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドを提供する。ある実施形態では、前記ポリヌクレオチドはストリンジェントな条件下で配列番号1〜169、339〜455、561〜784で示される配列のいずれか1つまたは寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列のいずれか1つを含んでなるポリヌクレオチドとハイブリダイズする。もう1つの実施形態では、前記ポリヌクレオチドは配列番号1〜169、339〜455、561〜784で示される配列のいずれか1つまたは寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列のいずれか1つを含んでなる。
【００３４】
もう1つの態様では、本発明は本明細書に記載のいずれかのポリヌクレオチドによってコードされる生物学的に活性なポリペプチドを提供する。
【００３５】
もう1つの態様では、本発明は、配列番号170〜338、456〜560、785〜918で示される配列のいずれか1つまたは寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチド配列に対して少なくとも約80％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を提供する。
【００３６】
ある実施形態では、前記ポリペプチドは、抗原性ポリペプチドまたはその抗原性フラグメントに対する抗体によって選択的に認識され、この抗原性ポリペプチドは配列番号170〜338、456〜560、785〜918で示される配列のいずれか1つまたは寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチド配列のいずれか1つを含んでなる。もう1つの実施形態では、前記ポリペプチドは配列番号170〜338、456〜560、785〜918で示される配列のいずれか1つまたは寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドの配列のいずれか1つを含んでなる。もう1つの実施形態では、前記ポリペプチドはシグナルペプチドを含んでなる。もう1つの実施形態では、前記ポリペプチドは成熟タンパク質である。
【００３７】
もう1つの態様では、本発明は本明細書に記載のいずれかのポリペプチドと特異的に結合する抗体を提供する。
【００３８】
もう1つの態様では、本発明はGENSET遺伝子が哺乳動物内で発現されるかどうかを調べる方法を提供し、この方法はa)哺乳動物から生物学的サンプルを準備し、b)生物学的サンプルをi)ストリンジェントな条件下で本明細書に記載のいずれかのポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはii)本明細書に記載のいずれかのポリペプチドと特異的に結合するポリペプチドのいずれかと接触させ、さらにc)該ポリヌクレオチドとサンプル内のRNA種とのハイブリダイゼーションの有無、または該ポリペプチドとサンプル内のタンパク質との結合の有無を検出するステップを含んでなり、その際、ハイブリダイゼーションまたは結合が検出されれば、GENSET遺伝子が哺乳動物内で発現されていることが示される。
【００３９】
ある実施形態では、前記ポリヌクレオチドはプライマーであり、かつ、ハイブリダイゼーションはプライマーの配列を含んでなる増幅産物の存在を検出することによって検出される。もう1つの実施形態では、前記ポリペプチドは抗体である。
【００４０】
もう1つの態様では、本発明は、哺乳動物のGENSET遺伝子の発現レベルが上昇しているか低下しているかを調べる方法を提供し、この方法はa)哺乳動物から生物学的サンプルを準備し、さらに、b)生物学的サンプル内の本明細書に記載のいずれかのポリペプチドの量またはポリペプチドをコードするRNA種の量を、対照サンプルで検出されるかまたは予想されるレベルと比較するステップを含んでなり、その際、対照サンプルで検出されるかまたは予想されるレベルと比較して、生物学的サンプル内のポリペプチドまたはRNA種の量が増加していれば、哺乳動物のGENSET遺伝子の発現レベルが上がっていることを示し、対照サンプルで検出されるかまたは予想されるレベルと比較して、生物学的サンプル内のポリペプチドまたはRNA種の量が減少していれば、哺乳動物のGENSET遺伝子の発現レベルが下がっていることを示す。
【００４１】
もう1つの態様では、本発明はGENSETポリペプチドの候補モジュレーターの同定方法を提供し、この方法はa)本明細書に記載のいずれかのポリペプチドを試験化合物と接触させ、さらに、b)該化合物が該ポリペプチドと特異的に結合するかどうかを調べることを含んでなり、その際、該化合物が該ポリペプチドと特異的に結合することが検出されれば、該化合物がGENSETポリペプチドの候補モジュレーターであることを示す。
【００４２】
ある実施形態では、前記方法はさらに候補モジュレーターの存在下でGENSETポリペプチドの生物活性を調べることを含んでなり、その際、該化合物の不在下でのGENSETポリペプチドの生物活性と比較して該化合物の存在下での活性が変化していれば、該化合物がGENSETポリペプチドのモジュレーターであることを示す。
【００４３】
もう1つの態様では、本発明は医薬組成物の製造方法を提供し、この方法はa)本明細書に記載のいずれかの方法を用いてGENSETポリペプチドのモジュレーターを同定し、さらに、b)モジュレーターと製薬上許容される担体とを組み合わせることを含んでなる。
【００４４】
表の簡単な説明
表Ｉは、優先権主張出願第60/197,873号中の配列番号に対応する本出願の配列番号(核酸配列に対応する配列番号は「NUC」が先行し、コードされたポリペプチド配列に対応する配列番号は「PRT」が先行する)を示す。各配列番号(SEQ ID)に対応する本出願人の内部識別番号(クローンID)も示されている。
【００４５】
表IIは、本発明のポリヌクレオチドの推定される染色体位置を記載する。各ポリヌクレオチドに記載される配列番号は優先権主張出願第60/197,873号由来のものであり；本出願の配列の対応する配列番号は表Ｉを参照することで調べることができる。
【００４６】
表IIIは、本発明のポリヌクレオチドについての組織および細胞型のGenset ｃDNAライブラリーにおけるヒット数を示す。各細胞または組織型を示すために以下の略語を用いる：A=脳；B=胎児脳；C=胎児腎臓；D=胎児肝臓；E=脳下垂体；F=肝臓；G=胎盤；H=前立腺；I=唾液腺；J=胃／腸；およびK=精巣。各ポリヌクレオチドに記載される配列番号は優先権主張出願第60/197,873号由来のものであり；本出願中の配列の対応する配列番号は表Ｉを参照することで調べることができる。
【００４７】
表IVは、本発明のポリヌクレオチドについての組織および細胞型の公的に入手可能なライブラリーにおけるヒット数を示す。各ポリヌクレオチドに記載される配列番号は優先権主張出願第60/197,873号由来のものであり；本出願中の各配列の対応する配列番号は表Ｉを参照することで調べることができる。
【００４８】
表Ｖは、本発明のポリヌクレオチド配列が過剰に現れるか、または過小に現れる組織および細胞型を示す。各ポリヌクレオチドに記載される配列番号は優先権主張出願第60/197,873号由来のものであり；本出願中の各配列の対応する配列番号は表Ｉを参照することで調べることができる。
【００４９】
配列表の簡単な説明
配列番号1〜169、339〜455、561〜784はcDNAのヌクレオチド配列であり、オープン・リーディング・フレームが特徴(CDS)として示される。適宜に、潜在的なポリアデニル化部位およびポリアデニル化シグナルの位置も示されている
配列番号170〜338、456〜560、785〜918は配列番号1〜169、339〜455、561〜784のcDNAによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号1〜85、339〜400、406〜407、413〜415、561〜594および634〜651は分泌型でありうるタンパク質をコードするcDNAのヌクレオチド配列である。ORFおよびシグナルペプチドをコードする配列の位置が添付の配列表に示される。さらに、以下に記載するようにコンピューターによって計算されたシグナルペプチドのvon Heijneスコアが添付の配列表中に「スコア」として示される。シグナルペプチドの配列は添付の配列表中に「seq」として示される。シグナルペプチド配列中の「／」は、シグナルペプチドのタンパク質分解切断が起きて成熟タンパク質が生じる位置を示す。適宜に、コード配列の最初と最後のヌクレオチドの位置、ひいては、ポリAの最初と最後のヌクレオチドの位置およびポリA部位の最初と最後のヌクレオチドの位置を示す。
【００５１】
配列番号86〜169、401〜405、408〜412、416〜455、595〜633、652〜784は、現在までのところシグナルペプチドをコードする配列が同定されていないcDNAのヌクレオチド配列である。しかしながら、今後の解析によって、これらの核酸中にシグナルペプチドをコードする配列が同定される可能性は残っている。ORFの位置を添付の配列表に示す。適宜に、コード配列の最初と最後のヌクレオチドの位置、ひいては、ポリAの最初と最後のヌクレオチドの位置およびポリA部位の最初と最後のヌクレオチドの位置を示す。
【００５２】
配列番号170〜254、456〜517、520〜521、527〜529、785〜818および858〜875は、シグナルペプチドを含むポリペプチドのアミノ酸配列である。これらのポリペプチドは配列番号1〜85、339〜400、406〜407、413〜415、561〜594および634〜651のcDNAによってコードされる。シグナルペプチドの位置を添付の配列表に示す。
【００５３】
配列番号255〜338、517〜519、522〜526、530〜560、819〜857、876〜918は、現在までのところシグナルペプチドが同定されていないポリペプチドのアミノ酸配列である。しかしながら、今後の解析によって、これらのポリペプチド中にシグナルペプチドが同定される可能性は残っている。これらのポリペプチドは配列番号86〜169、401〜405、408〜412、416〜455、595〜633、652〜784の核酸によってコードされている。
【００５４】
配列表に関する規則に従って、配列表では以下のコードを用いてヌクレオチド配列を記載した。配列中のコード「r」は、グアニンまたはアデニンであり得るヌクレオチドを示す。配列中のコード「y」は、チミジンまたはシトシンであり得るヌクレオチドを示す。配列中のコード「m」は、アデニンまたはシトシンであり得るヌクレオチドを示す。配列中のコード「k」は、グアニンまたはチミジンであり得るヌクレオチドを示す。配列中のコード「s」は、グアニンまたはシトシンであり得るヌクレオチドを示す。配列中のコード「w」は、アデニンまたはチミジンであり得るヌクレオチドを示す。さらに、核酸配列中の記号「n」のすべての例は、そのヌクレオチドがアデニン、グアニン、シトシンまたはチミジンであり得ることを意味する。
【００５５】
いくつかの場合には、配列表中のポリペプチド配列が記号「Xaa」を含む。これらの「Xaa」記号は、(1)ヌクレオチド配列多義性のために同定できない残基、または(2) (その配列がより正確に決定された場合には)本出願人が存在すべきでないと考える場合の決定された配列中の停止コドン、のいずれかを示す。ある場合には、この遺伝コードによって、未知のアミノ酸のいくつかの可能性のある正体が示唆される。
【００５６】
分泌型のタンパク質の場合には、配列表を支配する規則に従って、添付の配列表では、コードされるタンパク質(すなわち、シグナルペプチドと成熟タンパク質またはその一部を含むタンパク質)は負の番号のアミノ酸残基から正の番号のアミノ酸残基までに及ぶことに注意すべきである。従って、シグナルペプチドの切断によってもたらされる成熟タンパク質の最初のアミノ酸がアミノ酸番号1と指定され、シグナルペプチドの最初のアミノ酸は適宜に負の番号で示される。
【００５７】
本発明および好適な実施形態の詳細な説明
定義
本発明をより詳細に説明する前に、本明細書において本発明を説明するために用いられる用語の意味および範囲を例示および規定するために以下の定義を行うこととする。
【００５８】
本明細書において「GENSET遺伝子」とは、5'および3'非翻訳領域を含むGENSETポリペプチドをコードするゲノム、mRNAおよびcDNA配列を包含する。
【００５９】
「GENSETポリペプチド生物活性」または「GENSET生物活性」とは、本発明のGENSETポリペプチドの活性と必ずしも同一ではないが、何らかの類似の活性を示すポリペプチドを表す。所定のポリペプチドのGENSETポリペプチド生物活性は、どのような好適な生物学的アッセイを用いても評価することができ、そのいくつかは当業者には公知である。対照的に、「生物活性」とは、任意のポリペプチドが持ち得る任意の活性を指す。
【００６０】
「対応するmRNA」とは、本発明のcDNAを作製するためのcDNA合成の鋳型であったか、または鋳型となり得るmRNAを指す。
【００６１】
「対応するゲノムDNA」とは、例えば、本発明のcDNAに対応する目的のmRNAをコードするゲノムDNAを指し、このゲノムDNAはゲノムDNA(またはcDNA)の配列中のチミジン残基がmRNAではウラシル残基で置換されているmRNA鎖の一方の配列を含む。
【００６２】
本明細書において「寄託されたクローンプール」とは、2000年9月27日にATCCに寄託されcDNA-8-2000と称されたクローンのプール、または2000年11月27日にATCCに寄託されcDNA-11-2000と称されたクローンのプール、または本明細書に記載の配列のいずれかに対応するクローンを含むいずれかのその他の寄託されたクローンプールを指す。
【００６３】
本明細書において「異種」とは、本発明のGENSETポリヌクレオチドまたはGENSETポリペプチド以外のいずれかのポリヌクレオチドまたはポリペプチドをそれぞれ示すものとする。
【００６４】
生物学的サンプル、細胞集団などに関する「準備する」とは、サンプル、細胞集団などがある方法または手順において何らかの形で用いられることを示す。重要なことには、生物学的サンプルまたは細胞集団を「準備する」ことは、サンプルまたは細胞を本発明の目的のために特別に単離したり、または取得したりすることを必要とせず、その代わりに、例えば、別の個体によって別の目的のために取得された生物学的サンプルを使用することを指すこともある。
【００６５】
「増幅産物」とは、いずれかの増幅反応、例えば、PCR、RT-PCR、LCRなどの産物を指す。
【００６６】
タンパク質またはその他の化合物の「モジュレーター」とは、タンパク質との物理的結合、タンパク質発現の量または質の変化、タンパク質の測定可能または検出可能な活性、特性、または挙動の変更を含めて、タンパク質に対して機能的な影響を有するか、あるいは該タンパク質または化合物と何らかの方法で相互作用する、あらゆる物質を指す。
【００６７】
「試験化合物」とは、タンパク質またはその他の化合物を調節するその能力について評価されるどのような分子であってもよい。
【００６８】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドと特異的に結合する抗体またはその他の化合物は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを「選択的に認識する」とも言われる。
【００６９】
分子に関して「単離された」とは、その分子がもとの環境(例えば、天然のものである場合には天然環境)から取り出されている必要がある。例えば、生存動物中に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されていないが、天然の系において共存する一部または全部の物質から分離された同ポリヌクレオチドもしくはDNAまたはポリペプチドは単離されている。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよく、かつ／またはかかるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、ベクターまたは組成物は天然環境の一部ではないという点でやはり単離されたものである。例えば、生存動物中に存在する天然のポリヌクレオチドは単離されていないが、天然の系において共存する一部または全部の物質から分離された同ポリヌクレオチドは単離されている。天然の染色体(染色体の広がりなど)、in vitro核酸調製物として、またはトランスフェクト／形質転換された宿主細胞調製物(ここで、宿主細胞はin vitro異種調製物であるか、または単一コロニーの異種集団としてプレーティングされている)として存在する、人工染色体ライブラリー、ゲノムライブラリーおよびcDNAライブラリーは、「単離された」という定義から特に除外される。また、特定のポリヌクレオチドがベクター分子中の核酸インサートの数の5％未満を構成する前記ライブラリーも特に除外される。さらに、全細胞ゲノムDNAまたは全細胞RNA調製物(機械的に剪断されたか、または酵素的に消化された全細胞調製物を含む)も特に除外される。さらに、本発明のポリヌクレオチドが電気泳動媒質中の異種ポリヌクレオチドからそれ以上分離されていない(例えば、アガロースゲルまたはナイロンブロットで異種バンド集団から単一のバンドを切り出すことによりさらに分離する)、電気泳動によって分離された異種混合物(そのブロットトランスファーを含む)またはin vitro調製物のいずれかとしての前記全細胞調製物も特に除外される。
【００７０】
「精製された」とは、完全な精製を必要とするものではなく、むしろ相対的な定義である。出発物質または天然物質の少なくとも1桁分高い精製、好ましくは2または3桁分、より好ましくは4または5桁分高い精製が特に考慮される。例として、0.1％濃度から10％濃度への精製は2桁分高い精製である。例えば、cDNAライブラリーから単離された個々のcDNAクローンは通常、電気泳動的に均一になるまで精製されている。これらのクローンから得られた配列は、ライブラリーからも全ヒトDNAからも直接得ることはできないであろう。cDNAクローンはそれ自体天然のものではなく、むしろ部分精製した天然物質(mRNA)の操作によって得られるものである。mRNAのcDNAライブラリーへの変換は合成物質(cDNA)の作製を含み、純粋な個々のcDNAクローンは合成ライブラリーからクローン選択によって単離できる。従って、メッセンジャーRNAからのcDNAライブラリーの作製とそれに次ぐライブラリーからの個々のクローンの単離は、天然メッセージの約104〜106倍の精製をもたらす。
【００７１】
さらに、本明細書において「精製された」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、炭水化物、脂質などを含むがこれらに限らない他の化合物から分離されている本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを記載するためにも用いられる。「精製された」は、本発明の単量体ポリペプチドがホモまたはヘテロ二量体、三量体などのオリゴマー形態から分離されていることを明記するために用いてもよい。「精製された」はまた、共有結合で閉環された(すなわち、環状の)ポリヌクレオチドが線状ポリヌクレオチドから分離されていることを明記するのに用いてもよい。ポリヌクレオチドはサンプルの少なくとも約50%、好ましくは60〜75%が単一のポリヌクレオチド配列およびコンホメーション(線状対共有結合閉環)を示す場合に実質的に純粋である。実質的に純粋なポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、典型的には約50%、好ましくは60〜90重量／重量%のポリペプチドまたはポリヌクレオチドサンプルをそれぞれ含んでなり、より一般的には約95%、好ましくは約99%以上の純度である。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの純度つまり均一性は、サンプルのアガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動と、それに次いでゲルを染色した際の単一バンドの可視化など、当業者に周知のいくつかの手段によって示される。特定の目的のためには、HPLCまたは当技術分野で周知のその他の手段を用いることで、より高い分離能も提供され得る。別の実施形態として、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの精製は、異種ポリペプチドおよびポリヌクレオチド(DNA、RNAまたは双方)に対する「少なくとも」パーセント純度として表してもよい。好ましい実施形態として、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、それぞれ異種ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに対して少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、96%、98%、99%または100%の純度である。さらに好ましい実施形態として、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、それぞれ異種ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、任意の数字から小数点以下第3位まで、90%〜100%の範囲の純度(例えば、少なくとも99.995%の純度のポリペプチドまたはポリヌクレオチド)、または担体中に存在するもの以外のすべての化合物および分子に対する重量／重量比としての純度を有する。小数点以下第3位までのパーセント純度を表す各数字は、個々の種の純度であると言うことができる。
【００７２】
本明細書において相互交換可能に用いられる「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」には、RNAもしくはDNA(一本鎖もしくは二本鎖、コーディング、相補的、またはアンチセンス)、または一本鎖もしくは二本鎖形態のいずれかの2以上のヌクレオチドからなるRNA/DNAハイブリッド配列が含まれる(しかし、上記種の各々を特に特定することができる)。本明細書において「ヌクレオチド」とは、一本鎖または二本鎖形態の任意の長さのRNA、DNAまたはRNA/DNAハイブリッド配列を含んでなる分子を記載するために形容詞として用いられる。より正確には、「ヌクレオチド配列」という表現は核酸物質それ自体を包含し、従って、特定のDNAまたはRNA分子を生化学的に特徴付ける配列情報(すなわち、4種の塩基文字から選択された文字の連続物)に限定されない。本明細書において「ヌクレオチド」はまた、個々のヌクレオチドまたは多種のヌクレオチドを指す名詞としても用いられ、プリンもしくはピリミジンと、リボースもしくはデオキシリボース糖部分と、リン酸基を含み、またはオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド内のヌクレオチドの場合にはホスホジエステル結合を含む、分子またはより大きな核酸分子中の個々の単位を意味する。本明細書において「ヌクレオチド」はまた、(a)別の結合基、(b)プリンの類似形態、(c)ピリミジンの類似形態、または(d)類似した糖などの少なくとも1つの修飾を含んでなる「修飾ヌクレオチド」を包含する。類似した結合基、プリン、ピリミジンおよび糖の例については、例えばPCT公開第WO 95/04064号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）を参照されたい。本発明の好ましい修飾物としては、限定されるものではないが、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、4-アセチルシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルケオシン、5'-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸(v)ワイブトキソシン(ybutoxosine)、シュードウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル)ウラシル、および2,6-ジアミノプリンが挙げられる。本発明のポリヌクレオチド配列は合成、組換え、ex vivo作製またはそれらの組合せ、ならびに当技術分野で公知のいずれかの精製法の利用をはじめとするいずれかの既知の方法で調製すればよい。メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシドならびに混合バックボーン化合物は、米国特許第5,378,825号、同第5,386,023号、同第5,489,677号、同第5,602,240号および同第5,610,289号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のように調製することができる。ホルムアセタールおよびチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第5,264,562号および同第5,264,564号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のように調製することができる。エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許第5,223,618号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のように調製すればよい。ホスフィネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,508,270号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のように調製すればよい。アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第4,469,863号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のように調製すればよい。3'-デオキシ-3'-メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,610,289号または同第5,625,050号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のように調製することができる。ホスホルアミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,256,775号または同第5,366,878号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のようにして調製することができる。アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、PCT公開第WO94/17093号および同第WO94/02499号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のようにして調製すればよい。3'-デオキシ-3'-アミノホスホルアミデートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,476,925号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のようにして調製することができる。ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,023,243号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のようにして調製することができる。ボラノホスフェートオリゴヌクレオチドは、米国特許第5,130,302号および同第5,177,198号（全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）に記載のようにして調製すればよい。
【００７３】
本明細書において「上流」とは、特定の基準点からポリヌクレオチドの5'末端の方に向かう位置を指す。
【００７４】
本明細書において「塩基対合」および「ワトソン＆クリック塩基対合」は、相互交換可能に用いられ、2個の水素結合によってアデニン残基と結合したチミジンまたはウラシル残基ならびに3個の水素結合によって結合したシトシンおよびグアニン残基を含む二重らせんDNAに存在するものと同様に、その配列自体によって互いに水素結合され得るヌクレオチドを指す(Stryer, 1995を参照のこと；全開示内容を参照により本明細書に組み入れる)。
【００７５】
本明細書において「相補的な」または「その相補体」とは、もう1つの特定のポリヌクレオチドと相補領域全体を通してワトソン＆クリック塩基対を形成し得るポリヌクレオチド配列を指す。本発明の目的のためには、第1のポリヌクレオチド中の各塩基がその相補的な塩基と対合する場合に、第1のポリヌクレオチドは第2のポリヌクレオチドに相補的であると認められる。相補的な塩基とは、一般にAとT(もしくはAとU)またはCとGである。本明細書において「相補体」は、「相補的ポリヌクレオチド」、「相補的核酸」および「相補的ヌクレオチド配列」からの同義語として用いられる。これらの用語は、単にその配列だけに基づくポリヌクレオチドの対に適用され、2つのポリヌクレオチドが実際に結合するであろう特定のセットの条件には適用されない。特に断らない限り、すべての相補的ポリヌクレオチドは考慮されるポリヌクレオチドの全長に対して完全に相補的である。
【００７６】
本明細書において相互交換可能に用いられる「ポリペプチド」および「タンパク質」は重合体の長さに関わらずアミノ酸の重合体を指し、従って、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質がポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、本発明のポリペプチドの化学的修飾または発現後修飾を特定したり排除したりしないが、これらのポリペプチドの化学的または発現後修飾は特定の実施形態として含めて除外してもよい。従って、例えば、グリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基などの共有結合を含むポリペプチドの修飾もポリペプチドという用語に明らかに包含される。さらに、これらの修飾を含むポリペプチドは、本発明に含まれるまたは本発明から除外される個々の種として特定され得る。上記の例に挙げたものなどの天然または他の化学的修飾は、ペプチドのバックボーン、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシル末端を含むポリペプチド中のどこに存在してもよい。同じタイプの修飾が所定のポリペプチド中のいくつかの部位に同程度または様々な程度に存在しうることが理解されよう。また、所定のポリペプチドは多くのタイプの修飾を含んでいてもよい。ポリペプチドは例えば、ユビキチン化の結果として分岐していてもよく、また、分岐したまたはしてない環状であってもよい。修飾としては、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合による結合、ヘム部分の共有結合による結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合による結合、脂質または脂質誘導体の共有結合による結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合による結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、共有結合による架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニン化などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファーRNA媒介性付加、およびユビキチン化が挙げられる(例えば、Creighton (1993); Seifterら, (1990); Rattanら, (1992)参照)。また、1個以上のアミノ酸類似体（例えば、非天然アミノ酸、無関係の生物系においてのみ天然に存在するアミノ酸、哺乳動物系からの修飾アミノ酸など）を含むポリペプチド、置換された結合を含むポリペプチド、ならびに天然および非天然双方の当技術分野で公知の他の修飾物も定義内に含まれる。
【００７７】
本明細書において「組換えポリヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド構築物」は、相互交換可能に用いられ、その最初の天然環境では連続したヌクレオチド配列として存在しない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含んでなる、人工的に設計された、直鎖状または環状の、精製または単離されたポリヌクレオチドを指す。特に、これらの用語は、ポリヌクレオチドまたはcDNAがその天然環境では隣接していない「バックボーン」核酸に隣接していることを意味する。さらに、cDNAが「富化される」とは、核酸バックボーン分子の集団中の核酸インサートの数が5%以上であることを表す。本発明のバックボーン分子としては、発現ベクター、自己複製核酸、ウイルス、組込み用の核酸、および目的の核酸インサートを維持または操作するために用いられるその他のベクターまたは核酸などの核酸が挙げられる。好ましくは、富化されたcDNAは組換えバックボーン分子の集団中の核酸インサート数が15%以上に相当する。富化されたcDNAは、組換えバックボーン分子の集団中の核酸インサート数が50%以上に相当することがさらに好ましい。非常に好ましい実施形態では、富化されたcDNAは、組換えバックボーン分子の集団中の核酸インサート数が90%以上(90〜100％の間の少数点以下第3位までの任意の数字を含み、例えば99.5％)に相当する。
【００７８】
本明細書において「組換えポリペプチド」とは、その最初の天然環境では連続したポリペプチド配列として存在しない少なくとも2つのポリペプチド配列を含んでなる、人工的に設計されたポリペプチドを指すか、または組換えポリヌクレオチドから発現されたポリペプチドを指す。
【００７９】
本明細書において「機能し得る形で連結された」とは、機能的な関係でのポリヌクレオチド要素の連結を指す。プロモーターなどの調節配列に「機能し得る形で連結された」配列とは、その調節エレメントが核酸との関係において正しい位置および方向にあって、RNAポリメラーゼの開始および目的の核酸の発現を制御することを意味する。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合にはコード配列に機能し得る形で連結されている。
【００８０】
本明細書において「非ヒト動物」とは、昆虫、鳥類、げっ歯類、より一般的には哺乳類を含めて、ヒト以外のあらゆる動物を指す。好ましい非ヒト動物としては霊長類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ウサギなどの家畜、ならびにげっ歯類、好ましくはラットまたはマウスが挙げられる。本明細書において「動物」とは、動物界中のいずれかの種、好ましくは鳥類、魚類、より好ましくは哺乳類を含めた脊椎動物を指す。「動物」と「哺乳類」の双方は、「非ヒト」が前にない限りはヒト被験者を特に包含する。
【００８１】
「ドメイン」は特定の生物学的特性を有するアミノ酸断片を指す。この用語はすべての既知の構造および直鎖状の生物学的モチーフを包含する。かかるモチーフの例としては、限定されるものではないが、ロイシンジッパー、へリックス−ターン−へリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、αへリックスおよびβシート、タンパク質の分泌を指令するシグナルペプチド、翻訳後修飾の部位、酵素の活性部位、基質結合部位および酵素切断部位が挙げられる。
【００８２】
「含んでなる」、「からなる」および「本質的にからなる」は、各々明確に区別される意味を有するが、本願を通じて相互に交換してもよい。「有する」は「含んでなる」と同じ意味であり、「からなる」または「本質的にからなる」のいずれかと置き換えることもできる。
【００８３】
特に断らない限り、本願において、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドのそれぞれヌクレオチドおよびアミノ酸は連続しており、異種配列によって中断されていない。
【００８４】
核酸またはポリペプチド間の同一性
「配列同一性％」および「ホモロジー％」は本明細書において相互交換可能に用いられ、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド間の比較を指し、2つの最適にアラインメントさせた配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって決定される。2つの配列の最適なアラインメントについて参照配列(付加または欠失を含まない)と比較した場合に、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は付加または欠失(すなわちギャップ)を含んでいてもよい。パーセントは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列中に存在する位置の数を求めることでマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で割り、その結果に100をかけて配列同一性％を得ることにより算出する。ホモロジーは当技術分野で公知の種々の配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれかを用いて評価する。かかるアルゴリズムおよびプログラムとしては、限定されるものではないが、TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA、CLUSTALW、FASTDB (PearsonおよびLipman, 1988; Altschulら, 1990; Thompsonら, 1994; Higginsら, 1996; Altschulら, 1990; Altschulら, 1993; Brutlagら, 1990)が挙げられ、これらの全開示内容を参照により本明細書に組み入れるものとする。
【００８５】
特に好ましい実施形態では、タンパク質および核酸配列ホモロジーは当技術分野で周知のザ・ベーシック・ローカル・アラインメント・サーチ・ツール(the Basic Local Alignment Search Tool)(「BLAST」)を用いて評価する(例えば、KarlinおよびAltschul, 1990; Altschulら, 1990, 1993, 1997参照；これらの開示内容を参照により本明細書に組み入れる)。特に、5つの特定のBLASTプログラムを用いて以下のタスクを実施する：
(1)  BLASTPおよびBLAST3はアミノ酸クエリー配列をタンパク質配列データベースに対して比較する；
(2)  BLASTNはヌクレオチドクエリー配列をヌクレオチド配列データベースに対して比較する；
(3)  BLASTXはクエリーヌクレオチド配列(両鎖)の6フレーム概念の翻訳産物をタンパク質配列データベースに対して比較する；
(4)  TBLASTNはクエリータンパク質配列をすべての6リーディング・フレームで翻訳されるヌクレオチド配列データベース(両鎖)に対して比較する；
(5)  TBLASTXはヌクレオチドクエリー配列の6フレーム翻訳をヌクレオチド配列データベースの6フレーム翻訳に対して比較する。
【００８６】
BLASTプログラムは、クエリーアミノ酸または核酸配列と試験配列（好ましくはタンパク質または核酸配列データベースから得られる）間で、「ハイスコアリングセグメントペア」（高いスコアを与える断片対）と呼ばれる類似セグメントを同定することによって、相同配列を同定する。ハイスコアリングセグメントペアはスコアリング・マトリックスを用いて同定(すなわち、アラインメント)することが好ましく、その多くは当技術分野で公知である。好ましくは、用いるスコアリング・マトリックスはBLOSUM62マトリックスである(Gonnetら, 1992; HenikoffおよびHenikoff, 1993；その開示内容を参照により本明細書に組み入れる)。あまり好ましくないが、PAMまたはPAM250マトリックスも用いることができる(例えば、SchwartzおよびDayhoff編, 1978参照；その開示内容を参照により本明細書に組み入れる)。BLASTプログラムは同定されたすべてのハイスコアリングセグメントペアの統計的有意性を評価し、好ましくは、ユーザーが特定したホモロジー％などの有意性のユーザー特定閾値を満たすセグメントを選択する。ハイスコアリングセグメントペアの統計的有意性は、統計的有意性に関するカーリン(Karlin)の式を用いて評価することが好ましい(例えば、KarlinおよびAltschul, 1990参照；その開示内容を参照により本明細書に組み入れる)。BLASTプログラムはデフォルトパラメーターを用いて使用してもよいし、ユーザーによって提供される改変パラメーターを用いて使用してもよい。
【００８７】
クエリーヌクレオチド配列(本発明の配列)とサブジェクト配列間で最良の全体的なマッチを決定するためのもう1つの好ましい方法は、グローバル配列アラインメントとも呼ばれており、Brutlagら(1990) (全開示内容を参照により本明細書に組み入れる)のアルゴリズムに基づいたFASTDBコンピュータープログラムを用いて求めることができる。配列アラインメントでは、クエリーおよびサブジェクト配列は双方ともDNA配列である。RNA配列はまずUをTに変換して比較すればよい。このグローバル配列アラインメントの結果は同一性％として得られる。同一性％を算出するためにDNA配列のFASTDBアラインメントで用いるのに好ましいパラメーターは次のとおりである：マトリックス=Unitary、k-tuple=4、ミスマッチペナルティー=1、ジョイニングペナルティー=30、ランダム化グループ長=0、カットオフスコア=1、ギャップペナルティー=5、ギャップサイズペナルティー=0.05、ウィンドウサイズ=500またはサブジェクトヌクレオチド配列の長さのどちらか短い方。サブジェクト配列が、内部欠失のためではなく5'または3'欠失のためにクエリー配列よりも短い場合には、結果に手修正を施さなければならない。これはFASTDBプログラムが同一性％を計算する際にサブジェクト配列の5'および3'末端切断を計上しないからである。クエリー配列に比べて5'または3'末端が切断されているサブジェクト配列については、マッチ／アラインメントしないサブジェクト配列の5'および3'側にあるクエリー配列の塩基数を、クエリー配列の全塩基に対する％として算出することで、同一性％を修正する。ヌクレオチドがマッチ／アラインメントするかどうかはFASTDB配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、この％値を10の特定のパラメーターを用いて前記FASTDBプログラムから算出された同一性％から差し引くことで最終的な同一性％スコアを得る。この修正されたスコアが本発明において用いられるものである。同一性％スコアを手作業で調整するために、FASTDBアラインメントによって表示されたサブジェクト配列の5'および3'ヌクレオチドの外側のヌクレオチド（クエリー配列とマッチ／アラインメントしない）のみを算出する。例えば、90ヌクレオチドのサブジェクト配列を100ヌクレオチドのクエリー配列に対してアラインメントして同一性％を求める。欠失がサブジェクト配列の5'末端に存在し、ゆえにFASTDBアラインメントは5'末端の最初の10ヌクレオチドのマッチ／アラインメントを示さない。この10個の不対合ヌクレオチドは当該配列の10％(マッチしない5'および3'末端のヌクレオチド数／クエリー配列中の全ヌクレオチド数)に相当するので、10％をFASTDBプログラムによって算出された同一性％スコアから差し引く。残りの90ヌクレオチドが完全にマッチする場合には、最終的な同一性％は90％となる。もう1つの例では、90ヌクレオチドのサブジェクト配列を100ヌクレオチドのクエリー配列と比較する。今回は、欠失が内部欠失であり、従って、クエリーとマッチ／アラインメントしないヌクレオチドはサブジェクト配列の5'または3'側にはない。この場合にはFASTDBによって算出される同一性％に手修正を施さない。ここで再び、クエリー配列とマッチ／アラインメントされないサブジェクト配列の5'および3'側のヌクレオチドのみを手修正する。本発明の目的のた��には他の手修正は加えない。
【００８８】
クエリーアミノ酸配列(本発明の配列)とサブジェクト配列間で最良の全体的なマッチを決定するためのもう1つの好ましい方法は、グローバル配列アラインメントとも呼ばれるもので、Brutlagら(1990)のアルゴリズムに基づいたFASTDBコンピュータープログラムを用いて求めることができる。配列アラインメントでは、クエリーおよびサブジェクト配列は双方ともアミノ酸配列である。このグローバル配列アラインメントの結果は同一性％で得られる。FASTDBアミノ酸アラインメントで用いるのに好ましいパラメーターは次のとおりである：マトリックス=PAM、k-tuple=2、ミスマッチペナルティー=1、ジョイニングペナルティー=20、ランダム化グループ長=0、カットオフスコア=1、ウィンドウサイズ=配列の長さ、ギャップペナルティー=5、ギャップサイズペナルティー=0.05、ウィンドウサイズ=500またはサブジェクトアミノ酸配列の長さのどちらか短い方。内部欠失のためではなくNまたはC末端欠失のためにサブジェクト配列がクエリー配列よりも短い場合には、同一性％で表される結果を手修正しなければならない。これはFASTDBプログラムがグローバルな同一性％を計算する際にサブジェクト配列のNおよびC末端切断を計上しないからである。クエリー配列と比べてNおよびC末端が切断されているサブジェクト配列については、対応するサブジェクト残基とマッチ／アラインメントしないサブジェクト配列のNおよびC末端側にあるクエリー配列の残基数を、クエリー配列の全残基に対する％として算出することで、同一性％を修正する。残基がマッチ／アラインメントするかどうかはFASTDB配列アラインメントの結果によって決定される。次いで、この％値を、特定のパラメーターを用いて前記FASTDBプログラムによって算出した同一性％から差し引いて、最終的な同一性％スコアを得る。この最終同一性％スコアが本発明において用いられるものである。クエリー配列とマッチ／アラインメントしないサブジェクト配列のNおよびC末端側の残基のみが、同一性％スコアを手作業で調整するために考慮される。これはサブジェクト配列の最も遠いNおよびC末端残基の外側にあるクエリーアミノ酸残基のみである。例えば、90アミノ酸残基のサブジェクト配列を100残基のクエリー配列とアラインメントして同一性％を求める。欠失がサブジェクト配列のN末端に存在し、ゆえに、FASTDBアラインメントはN末端の最初の10残基とのマッチ／アラインメントを示さない。10個の不対残基はこの配列の10％(マッチしないNおよびC末端の残基数／クエリー配列の全残基数)に相当し、そのために10％をFASTDBプログラムによって算出された同一性％スコアから差し引く。残りの90残基が完全にマッチする場合には、最終同一性％は90％となる。もう1つの例では、90残基のサブジェクト配列を100残基のクエリー配列と比較する。今回は欠失が内部にあり、そのためクエリーとマッチ／アラインメントしない残基はサブジェクト配列のNまたはC末端側にはない。この場合にはFASTDBによって算出される同一性％を手修正しない。ここで再び、クエリー配列とマッチ／アラインメントしないFASTDBアラインメントで表示されたサブジェクト配列のNおよびC末端の外側の残基位置のみを手修正する。本発明の目的のためには他の手修正は加えない。
【００８９】
「配列類似性％」とはポリペプチド配列間の比較を指し、2つの最適にアラインメントされた配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって求める。ここで、比較ウィンドウ中のポリペプチド配列の部分は、2つの配列の最適なアラインメントのために参照配列(付加または欠失を含んでいない)に対して付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含んでいてもよい。配列類似性％を算出するには、両配列中に同一または同等のアミノ酸残基が存在する位置の数を求めることで一致した位置の数を得、この一致した位置の数を比較ウィンドウ中の全位置数で割り、この結果に100を掛けて配列類似性％とする。類似性は本節で上記したものを含めて当技術分野で公知の種々の配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれかを用いて評価する。同等なアミノ酸残基は本明細書において「変異ポリペプチド」の節で規定される。
【００９０】
本発明のポリヌクレオチド
本発明はGENSETゲノムおよびcDNA配列に関する。本発明はGENSET遺伝子、GENSETゲノムおよびcDNA配列を含んでなるポリヌクレオチド、ならびにその断片および変異体を包含する。これらのポリヌクレオチドは単離・精製されたものでも、組換え体であってもよい。
【００９１】
また本発明はGENSET遺伝子の対立遺伝子変異体、オルソログ、スプライス変異体および／または種相同体も包含する。当技術分野で公知の手順により、本明細書に開示される配列またはATCCもしくはその他の寄託機関に寄託されたクローンプールからの情報を用いて、配列番号1〜169、339〜455、561〜784および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対応する遺伝子およびcDNAの全長遺伝子、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、全長コード部分、オルソログおよび／または種相同体を得ることができる。例えば、対立遺伝子変異体、オルソログおよび／または種相同体は、本明細書に示される配列から好適なプローブまたはプライマーを作製し、「類似配列を検出するために」と題される節に記載されるものを含めて当業者に公知のいずれかの技術を用いて対立遺伝子変異体および／または所望の相同体について好適な核酸源をスクリーニングすることによって、単離および同定することができる。
【００９２】
特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは少なくとも15、30、50、100、125、500または1000個の連続するヌクレオチドである。もう1つの実施形態では、ポリヌクレオチドの長さは300kb以下、200kb、100kb、50kb、10kb、7.5kb、5kb、2.5kb、2kb、1.5kbまたは1kbである。さらなる実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは本明細書に開示されるコード配列の一部を含んでなるが、任意のイントロンの全部または一部を含まないものである。もう1つの実施形態では、コード配列を含んでなるポリヌクレオチドはゲノムフランキング遺伝子のコード配列(すなわち、ゲノム中の対象とする遺伝子の5'または3'側の配列)を含まない。その他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは1000、500、250、100、75、50、25、20、15、10、5、4、3、2または1個より多い天然のゲノムフランキング遺伝子のコード配列を含まない。
【００９３】
本発明の寄託されたクローンプール
GENSET遺伝子の発現はGENSET遺伝子あたり少なくとも1つのｍRNA種の産生をもたらすことが明らかにされており、そのcDNA配列は添付の配列表に配列番号1〜169、339〜455、561〜784として示されている。これらのGENSET mRNA種に対応するcDNA(配列番号1〜169、339〜455、561〜784)をベクターpBluescriptII SK- (Stratagene) またはpPTと呼ばれるベクターのいずれかにクローニングした。クローニングされた本発明のcDNAを含む細胞はGenset,S.A. (24 Rue Royale, 75008 Paris, France)の本発明者らによって永久寄託されて維持されている。各cDNAはNotI PstI二重消化を実施することによってそれを含有するBluescriptベクターから、またはMunI HindIII二重消化を実施することによってpPTベクターから取り出して、各クローンにつき適当な断片を得ることができる。ただし、このcDNA配列はその配列内に対応する制限部位を含まないことを条件とする。あるいは、製造業者によって指示されるようにベクターのマルチクローニング部位のその他の制限酵素を用いて所望のインサートを回収してもよい。
【００９４】
本発明の特定のcDNAを含む細胞のプール（これらから特定のポリヌクレオチドを含有する細胞を得ることができる）はまた、American Tissue Culture Collection (ATCC) (10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, United States)に寄託されている。これらのcDNAクローンはこれらの複合寄託物のための個別の細菌細胞(大腸菌)にトランスフェクトされている。
【００９５】
特定のクローンを含有する細菌細胞はこの複合寄託物から以下のようにして得ることができる：
オリゴヌクレオチドプローブまたはプローブ類はその特定のクローンについて知られている配列に対して設計すべきである。この配列は本明細書に示される配列から、またはそれらの配列の組合せから誘導することができる。好ましくは、オリゴヌクレオチドプローブの設計はこれらのパラメーターに従うようにすべきである：
(a)多義性の塩基(「N」)は、存在するとしても、最少しか含まない配列の領域に対して設計すべきである；
(b)好ましくは、プローブは (AまたはT各々について2度およびGまたはC各々について4度と仮定して) 約80℃のTmをもつように設計する。しかしながら、特異性が失われないという条件で、融解温度が40℃〜80℃の間であるプローブを用いてもよい。
【００９６】
オリゴヌクレオチドは好ましくは、オリゴヌクレオチドを標識するための慣用技法により、γ[32P]ATP(比活性6000Ci/mmole)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いて標識すべきである。その他の標識技法を用いてもよい。組み込まれない標識は好ましくはゲル濾過クロマトグラフィーまたはその他の確立された方法によって除去すべきである。プローブに組み込まれた放射能の量はシンチレーションカウンターでの測定によって定量すべきである。好ましくは、得られたプローブの比活性は約4x106dpm/pmoleとすべきである。
【００９７】
全長クローンのプールを含有する細菌培養物は好ましくは、解凍した後、ストック100μｌを用いて100μg/mlのアンピシリンを含有する滅菌Lブロス25mlを入れた滅菌培地フラスコに播種する。この培養物を37℃で飽和状態になるまで増殖させ、飽和培養物は新鮮なLブロスで希釈するのが好ましい。これらの希釈物のアリコートをプレーティングして、150mmペトリ皿に100μg/mlのアンピシリンおよび1.5％の糖を含有するLブロスを含有する固体細菌学的培地で37℃にて一晩増殖させた場合に、約5000個の明確に区別される十分に分離したコロニーを生じる希釈率および容量を決定すべきである。明確に区別される十分に分離したコロニーを得るために、その他の既知の方法を用いてもよい。
【００９８】
次いで、標準的なコロニーハイブリダイゼーション法を用いてコロニーをニトロセルロースフィルターに移し、それらを溶解し、変性させ、焼きつける。
【００９９】
次いで、好ましくはこのフィルターを65℃で1時間、0.5%のSDS、100pg/mlの酵母RNAおよび10mMのEDTAを含有する6×SSC（20Xストックは175.3gのNaC1/リットル、88.2gのクエン酸Na/リットルをNaOHでpH7.0に調整したものである）中でゆっくりと振盪しながらインキュベートする(150mmフィルターあたり約10ml)。好ましくは、次いで、ハイブリダイゼーション混合液に1x106dpm/ml以上の濃度でプローブを加える。次いで、好ましくはこのフィルターを65℃でゆっくりと振盪しながら一晩インキュベートする。次いで、好ましくは、このフィルターを室温にて500mlの2X SSC/0.1% SDS中でゆっくりと振盪しながら15分間洗浄する。所望により、65℃にて0.1X SSC/0.5% SDS中で30分〜1時間3回目の洗浄をする。次いで、好ましくは、このフィルターを乾燥させて、X線フィルム上で陽性のものを可視化するのに十分な時間オートラジオグラフィーに付す。その他の公知のハイブリダイゼーション法を用いてもよい。
【０１００】
陽性コロニーを選び取り、培養して増殖させ、標準的な手順を用いてプラスミドDNAを単離する。次いで、制限分析、ハイブリダイゼーション分析またはDNA配列決定によってクローンを確認する。次いで、これらの手順を用いて得られたプラスミドDNAを当業者によく知られている標準的なクローニング技術を用いて操作する。
【０１０１】
あるいは、細菌のプールからcDNAインサートを回収するために、標準的な手順およびcDNA挿入の両端で設計したプライマー（ベクターのマルチクローニング部位で設計したプライマーを含む）を用いて、単離したプラスミドDNAに対してPCRを実施することができる。目的とする特定のcDNAを回収するには、添付の配列表から得られる配列情報を用いてこのcDNAの5'末端および3'末端に特異的となるようにプライマーを設計すればよい。次いで、目的のcDNAに相当するPCR産物を当業者によく知られている標準的なクローニング技術を用いて操作する。
【０１０２】
従って、本発明の目的は、寄託されたクローンプールのcDNAインサートからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる単離された、精製された、または組換えポリヌクレオチドである。さらに、本発明の好ましいポリヌクレオチドとしては、寄託されたクローンプールのcDNAインサートからなる群から選択されるヌクレオチド配列からなる、本質的にからなる、または含んでなる精製された、単離された、または組換えGENSET cDNAが挙げられる。
【０１０３】
本発明のcDNA配列
本発明のもう1つの目的は配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列、それに相補的な配列、およびその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる精製された、単離された、または組換えポリヌクレオチドである。さらに、本発明の好ましいポリヌクレオチドとしては、配列番号1〜169、339〜455、561〜784からなる群から選択された配列からなる、本質的にからなる、または含んでなる精製された、単離された、または組換えGENSET cDNAが挙げられる。
【０１０４】
従って、本発明の各cDNAのコード配列(CDS)またはオープン・リーディング・フレーム(ORF)は、開始コドンの最初のヌクレオチドで始まり、停止コドンの最後のヌクレオチドで終わるヌクレオチド配列を指す。同様に、本発明の各cDNAの5'非翻訳領域(すなわち、5'UTR)は、ヌクレオチド1で始まり、開始コドンの最初のヌクレオチドのすぐ5'側のヌクレオチドで終わるヌクレオチド配列を指す。本発明の各cDNAの3'非翻訳領域(すなわち、3'UTR)は、停止コドンの最後のヌクレオチドのすぐ3'側のヌクレオチドで始まり、cDNAの最後のヌクレオチドで終わるヌクレオチド配列を指す。
【０１０５】
非翻訳領域
さらに、本発明は配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列、それらに相補的な配列、ならびにその対立遺伝子変異体の5'UTRからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる、精製された、単離された、および組換え核酸に関する。また、本発明は配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列、それらに相補的な配列、ならびにその対立遺伝子変異体の3'UTRからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなる精製された、単離された、および／または組換え核酸に関する。
【０１０６】
これらのポリヌクレオチドを用いて、当業者に周知のハイブリダイゼーションまたはRT-PCR技術のいずれかにより、生物学的サンプル中のGENSET mRNA種の存在を検出することができる。
【０１０７】
さらに、これらのポリヌクレオチドは、それらを含む任意のポリヌクレオチド(GENSETポリヌクレオチドまたは異種ポリヌクレオチドのいずれか)のプロセシングおよび成熟化、好ましくはそれらを含むそのポリヌクレオチドの局在、安定性および／または翻訳に影響を及ぼし得る調節分子として使用することができる(UTRに関しては、DeckerおよびParker, 1995、Derrigoら, 2000を参照のこと)。特に、Makrides ((1999) Protein Expr Purif 1999 Nov; 17(2): 183-202)、米国特許第5,925,564号;同第5,807,707号および同第5,756,264号; 全開示内容を参照により本明細書に組み入れる）を含めて当業者に公知のいずれかの方法を用いて、組換えベクター中の異種mRNAの安定性を制御するために3'UTRを用いてもよい。
【０１０８】
コード配列
本発明のもう1つの目的は、配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列、寄託されたクローンプールのクローンインサート、およびそれらの変異体からなる群から選択される配列のコード配列を含んでなる、単離された、精製された、または組換えポリヌクレオチドである。
【０１０９】
本発明のさらなる目的は、配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列およびその対立遺伝子変異体からなる群から選択される配列を含んでなるポリペプチドをコードする単離された、精製された、または組換えポリヌクレオチドである。本発明のもう1つの目的は寄託されたクローンプールのcDNAインサートおよびその対立遺伝子変異体によってコードされるポリペプチドからなる群から選択される配列を含んでなるポリペプチドをコードする、単離された、精製された、または組換えポリヌクレオチドである。
【０１１０】
たとえコード配列の範囲が、配列決定エラー、逆転写または増幅エラー、mRNAスプライシング、コードされたタンパク質の翻訳後修飾、コードされたタンパク質の酵素的切断、またはその他の生物学的要因の結果として添付の配列表に示されるものと異なるとしても、当業者は配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列中のコード配列の範囲を容易に同定できることが理解されよう。従って、配列番号1〜169、339〜455、561〜784のうちの1つのコード配列を含む核酸に関する請求項の範囲は、添付の配列表に記載されるコード配列から容易に同定可能な変異体またはその同等物を除外するものとして解釈されるべきでない。同等物としては、そのヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドにおいて、アミノ酸の変更をもたらさないまたは保存的アミノ酸置換（以下に定義する）をもたらすヌクレオチドコード配列の変化が含まれる。同様に、たとえポリペプチドの範囲が前記の要因のいずれかの結果として添付の配列表に示されるものと異なるとしても、配列番号170〜338、456〜560、785〜918のポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに関する請求項の範囲は、添付の配列表に記載される配列から容易に同定可能な変異体またはその同等物を除外するものとして解釈されるべきでない。
【０１１１】
GENSET遺伝子のコード配列を含む上記ポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドが好適な発現シグナルの制御下に置かれた場合に、所望の宿主細胞または所望の宿主生物において発現可能である。発現シグナルは本発明のGENSET遺伝子の調節領域に含まれる発現シグナルであってもよいし、対照的に該シグナルは外来の調節ヌクレオチド配列であってもよい。好適な発現シグナル下に置かれた場合の該ポリヌクレオチドは、その発現および／または増幅用のベクターに挿入することもできる。
【０１１２】
さらに、異種アミノ酸配列のコード配列にインフレームで融合された本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。追加の非コード配列（限定するものではないが、5'および3'非コード配列、ベクター配列、精製、プロービング、プライミングに用いる配列を含む）と一緒の本発明のポリペプチドをコードする核酸も本発明に含まれる。例えば、異種配列としては、転写およびmRNAプロセシング（例えば、mRNAのリボソーム結合および安定性）において何らかの役割を果たし得る、転写されるが翻訳されない配列が挙げられる。あるいは、異種配列はさらなる機能性を提供する追加のコード配列を含んでいてもよい。従って、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、融合ポリペプチドの精製または検出を容易にするペプチドをコードする配列などのタグ配列に融合させることができる。本発明のこの態様の好ましい実施形態では、タグアミノ酸配列はヘキサヒスチジンペプチドであり、例えば、pQEベクター(QIAGEN)またはいくつかのさらなる市販のベクターのいずれか中に提供されるタグである。例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の簡便な精製を提供する(Gentzら, 1989, Proc Natl Acad Sci U S A Feb; 86(3): 821-4参照; 全開示内容を参照により本明細書に組み入れる)。「HA」タグは精製に有用なもう1つのペプチドであり、これはインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに相当する(Wilsonら, 1984, Cell Jul; 37(3): 767-78参照; 全開示内容を参照により本明細書に組み入れる)。以下で述べるように、その他のかかる融合タンパク質としては、NまたはC末端でFcに融合されたGENSETポリペプチドが挙げられる。
【０１１３】
本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドを含む好適な組換えベクターは本明細書の他の箇所に開示される。GENSETポリペプチドまたはその断片をコードする発現ベクターは、「ポリペプチドの調製」と題する文節に記載される。
【０１１４】
本発明の調節配列
上記のように、GENSET遺伝子のゲノム配列はこれらの遺伝子のエキソンを含むGENSETポリペプチドコード領域に隣接する非コード5'フランキング領域に、また、おそらくは非コード3'フランキング領域に調節配列を含んでいる。
【０１１５】
GENSETポリヌクレオチド5'および3'調節領域由来のポリヌクレオチドは、試験サンプル中のGENSET遺伝子のゲノムヌクレオチド配列またはその断片の少なくとも1コピーの存在を検出するのに有用である。
【０１１６】
好ましい調節配列
GENSETポリペプチドコード領域の5'末端および3'末端に位置する調節エレメントを担うポリヌクレオチドは、例えば、目的の異種ポリヌクレオチドの転写および翻訳活性を制御するために、有利に使用することができる。
【０１１７】
従って、本発明はまた、5'および3'GENSETポリヌクレオチド調節領域、それらに相補的な配列、その調節活性断片および変異体からなる群から選択されるポリヌクレオチドを含んでなる、精製または単離された核酸に関する。本発明はまた、GENSETポリヌクレオチド5'および3'調節領域からなる群から選択されるポリヌクレオチドに対して少なくとも95％のヌクレオチド同一性、有利にはGENSETポリヌクレオチド5'および3'調節領域、それらに相補的な配列、その変異体および調節活性断片からなる群から選択されるポリヌクレオチドに対して99％のヌクレオチド同一性、好ましくは99.5％のヌクレオチド同一性、最も好ましくは99.8％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなる、精製または単離された核酸に関する。
【０１１８】
本発明のもう1つの目的は、本明細書に定義されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、GENSETポリヌクレオチド5'および3'調節領域のヌクレオチド配列、それらに相補的な配列、その変異体および調節活性断片からなる群から選択されるポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなる、精製された、単離された、または組換え核酸からなる。
【０１１９】
5'調節領域の好ましい断片は約1500または1000ヌクレオチドの長さを有し、好ましくは約500ヌクレオチド、より好ましくは約400ヌクレオチド、さらにより好ましくは300ヌクレオチド、最も好ましくは約200ヌクレオチドの長さを有する。
【０１２０】
3'調節領域の好ましい断片は少なくとも20、50、100、150、200、300または400塩基長である。
【０１２１】
5'または3'調節領域の「調節活性」ポリヌクレオチド誘導体とは、組換え細胞宿主における組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドの発現に対して調節領域として機能的である前記ポリヌクレオチドの断片を含んでなる、あるいは、からなるポリヌクレオチドである。それはエンハンサーまたはリプレッサーのいずれかとして作用し得る。本発明の目的のためには、調節ポリヌクレオチドが転写および翻訳調節情報を含むヌクレオチド配列を含み、かつそのような配列が所望のポリヌクレオチドまたは所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に「機能し得る形で連結」されている場合に、その核酸またはポリヌクレオチドは組換えポリペプチドまたは組換えポリヌクレオチドの発現のための調節領域として「機能的」である。
【０１２２】
本発明の調節ポリヌクレオチドはGENSETゲノムまたはcDNA配列のヌクレオチド配列から、例えば、好適な制限酵素を用いる切断によって、またはPCRによって調製することができる。調節ポリヌクレオチドはまた、Bal31 (Wabikoら, DNA 5(4): 305-14 (1986); 全開示内容を参照により本明細書に組み入れる)などのエキソヌクレアーゼ酵素によるGENSET遺伝子含有ゲノムクローンの消化によって調製することもできる。これらの調節ポリヌクレオチドはまた、本明細書に記載されるように核酸の化学合成によって調製してもよい。
【０１２３】
本発明の調節ポリヌクレオチドは所望の宿主細胞または宿主生物においてコード配列を発現させるのに使用できる組換え発現ベクターの一部であってもよい。本発明の組換え発現ベクターは本明細書の他の箇所に記載される。
【０１２４】
本発明の好ましい5'調節ポリヌクレオチドとしては、GENSET cDNAの5'-UTR、またはその調節活性断片もしくは変異体が挙げられる。本発明のより好ましい5'調節ポリヌクレオチドとしては、配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列の5'-UTR、寄託されたクローンプールのクローンインサートの5'-UTR、その調節活性断片および変異体からなる群から選択される配列が挙げられる。
【０１２５】
本発明の好ましい3'調節ポリヌクレオチドとしては、GENSET cDNAの3'-UTR、またはその調節活性断片もしくは変異体が挙げられる。本発明のより好ましい3'調節ポリヌクレオチドとしては、配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列の3'-UTR、寄託されたクローンプールのクローンインサートの3'-UTR、その調節活性断片および変異体からなる群から選択される配列が挙げられる。
【０１２６】
本発明のさらなる目的は、
a)  (i)GENSETポリヌクレオチド5'調節領域のポリヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列；
(ii)GENSETポリヌクレオチド5'調節領域のヌクレオチド配列に対して少なくとも95％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列；
(iii)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でGENSETポリヌクレオチド5'調節領域のヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド配列；および
(iv) (i)、(ii)および(iii)のポリヌクレオチドの調節活性断片または変異体；
からなる群から選択される5'調節ヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド、
b)  (a)で定義されるポリヌクレオチドに機能し得る形で連結された、所望のポリペプチドをコードする核酸分子または目的の核酸分子、および
c)  所望により、3'調節ポリヌクレオチド、好ましくはGENSET遺伝子の3'調節ポリヌクレオチド、を含んでなるポリヌクレオチド、
を含んでなる精製または単離された核酸からなる。
【０１２７】
特定の実施形態では、先に定義した核酸にはGENSET cDNAの5'-UTR、またはその調節活性断片もしくは変異体が含まれる。
【０１２８】
第2の特定の実施形態では、先に定義した核酸にはGENSET cDNAの3'-UTR、またはその調節活性断片もしくは変異体が含まれる。
【０１２９】
5'調節領域の調節ポリヌクレオチド、またはその調節活性断片もしくは変異体は、所望のポリペプチドをコードする核酸分子または目的の核酸分子の5'末端に機能し得る形で連結される。
【０１３０】
3'調節領域の調節ポリヌクレオチド、またはその調節活性断片もしくは変異体は、所望のポリペプチドをコードする核酸分子または目的の核酸分子の3'末端に機能し得る形で連結されることが有利である。
【０１３１】
上記核酸によってコードされる所望のポリペプチドは種々の由来または起源のものであってよく、原核生物ウイルスまたは真核生物起源のタンパク質を包含する。GENSETポリヌクレオチド調節領域の制御下で発現されるポリペプチドの中には、細菌、真菌またはウイルスの抗原がある。真核生物のタンパク質、例えば、「ハウスキーピング」タンパク質などの細胞内タンパク質、ミトコンドリアの膜結合タンパク質および細胞表面受容体などの膜結合タンパク質、およびサイトカインなどの内在性メディエーターのような分泌タンパク質も包含される。所望のポリペプチドは異種ポリペプチドまたはGENSETポリペプチド、特に、配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質、その断片および変異体であってもよい。
【０１３２】
上記ポリヌクレオチドによってコードされる所望の核酸（通常はRNA分子）は、所望のコードポリヌクレオチド、例えば、GENSETコード配列に相補的であり、それゆえアンチセンスポリヌクレオチドとして有用であり得る。かかるポリヌクレオチドは、宿主細胞または宿主生物において所望のポリペプチドまたは所望の核酸を発現させるために、組換え発現ベクター内に含まれていてもよい。本明細書に記載されるようなポリヌクレオチドを含む好適な組換えベクターは本明細書の他の箇所に開示される。
【０１３３】
ポリヌクレオチド変異体
本発明はまた本明細書に記載のポリヌクレオチドの変異体およびその断片に関する。本明細書において使用するポリヌクレオチドの「変異体」とは、参照ポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドである。一般に、相違は参照および変異体のヌクレオチド配列が全体的に酷似しており、かつ、多くの領域で同一であるよう限定される。本発明は対立遺伝子変異体および縮重変異体の双方を包含する。
【０１３４】
本発明のポリヌクレオチドの変異体配列の例は添付の配列表に示されている。特に、表Iは複数の密接に関連した配列、例えば、変異体が示される配列を含んでいる。
【０１３５】
対立遺伝子変異体
ポリヌクレオチドの変異体は天然の対立遺伝子変異体などの天然の変異体であってもよく、または天然に生じるとは知られていない変異体であってもよい。「対立遺伝子変異体」とは生物の染色体上の所与の遺伝子座を占めるいくつかの代替型遺伝子の1つを表す(全開示内容が参照により組み入れられる、Lewin,1990参照)。二倍体生物は対立遺伝子型についてホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。ポリヌクレオチドの非天然の変異体はポリヌクレオチド、細胞または生物に適用するものをはじめとする当技術分野で公知の突然変異誘発技術によって作製すればよい。例えば、複数の密接に関連する配列、例えば、単一遺伝子の対立遺伝子変異体が示される配列を含む表Iを参照。
【０１３６】
縮重変異体
本発明の単離されたポリヌクレオチドおよびその断片に加え、本発明はさらに前記のものとは実質的に異なるが、遺伝コードの縮重のために依然として本発明のGENSETポリペプチドをコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチド変異体は本願を通じて「縮重変異体」と呼ぶ。すなわち、本発明のGENSETポリペプチドをコードするすべての可能性あるポリヌクレオチド配列が考慮される。これは当技術分野で公知の遺伝コードおよび種特異的コドン優先を含む。従って、例えば、コドン発現を特定の宿主のために最適化するために前記の縮重変異体を作製すること(例えばヒトmRNAのコドンのその他の哺乳類または細菌宿主細胞にとって好ましいものへの変更)は当業者には慣例であろう。
【０１３７】
変異体ポリヌクレオチドに存在するヌクレオチド変更はサイレントであってもよく、これはそのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を変更しないことを意味する。しかしながら、ヌクレオチド変更はまた参照配列によってコードされるポリペプチド中のアミノ酸置換、付加、欠失、融合および末端切断をもたらしてもよい。置換、欠失または付加は1個以上のヌクレオチドに関するものであってもよい。変異体はコードもしくは非コード領域または両方で変更されていてもよい。コード領域における変更は保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失または付加を生じ得る。本発明の背景において、好ましい実施形態はポリヌクレオチド変異体がGENSETタンパク質と実質的に同一の生物学的特性または活性を保持するポリペプチドをコードするものである。より好ましいポリヌクレオチド変異体は保存的置換を含むものである。
【０１３８】
類似ポリヌクレオチド
本発明のその他の実施形態は配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートからなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一の、精製された、単離されたまたは組換えポリヌクレオチドを提供する。前記のポリヌクレオチドはそれらがGENSET生物活性を有するポリペプチドをコードするかどうかに関わらず含まれる。これは特定の核酸分子が活性を有するポリペプチドをコードしない場合であっても、当業者ならばその核酸分子の、例えばハイブリダイゼーションプローブまたはプライマーとしての使用方法を知っているであろうからである。GENSET活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分子の用途としては、特に、DNAライブラリーからのGENSET遺伝子またはその対立遺伝子変異体の単離、および、例えばノーザンブロットまたはPCR解析によるGENSETmRNAまたはDNAを含むと思われる生物学的サンプルにおけるGENSETmRNA発現の検出が挙げられる。
【０１３９】
本発明はさらに配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートからなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一の配列を有するポリヌクレオチド(このポリヌクレオチドは実際にGENSET生物活性を有するポリペプチドをコードする)に向けられる。もちろん、当業者ならば、遺伝コードの縮重のために配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートからなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一の多数のポリヌクレオチドが生物活性を有するポリペプチドをコードすることが直ちに分かるであろう。実際、これらのヌクレオチド配列の縮重変異体すべてが同一のポリペプチドをコードするので、このことは前記の比較アッセイを実施しなくとも当業者には明白であろう。さらに、縮重変異体でないかかる核酸分子については妥当な数が生物活性を有するポリペプチドをコードするということも当技術分野では認識されるであろう。これは、以下にさらに記載されるように、当業者がタンパク質機能に重大な影響をあまり及ぼさない、または及ぼさないと考えられるアミノ酸置換のいずれをも(例えば、ある脂肪族アミノ酸の第2の脂肪族アミノ酸での置換)十分に認識しているからである。本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば95%「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチド配列がGENSETポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各100個のヌクレオチド当たり5個までの点突然変異を含み得るという点以外はポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であるということを表す。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列のヌクレオチドの5%までは欠失、挿入されていてもよく、または他のヌクレオチドで置換されていてもよい。クエリー配列は配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列からなる群から選択される全配列、または前記の群から選択されるポリヌクレオチド配列のORF(オープン・リーディング・フレーム)または本明細書に記載されるように特定されるいずれかの断片であってもよい。
【０１４０】
ハイブリダイズするポリヌクレオチド
もう1つの態様では、 本発明は本明細書、特に「類似配列を見出すために」の節に開示されるものをはじめとする当業者に公知のいずれかの方法を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明のいずれかのポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを含んでなる、単離または精製された核酸分子を提供する。また、より低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件で、好ましくは本明細書に定義される中程度または低いストリンジェンシー条件で本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズする核酸分子も考慮される。かかるハイブリダイズするポリヌクレオチドは少なくとも15、18、20、23、25、28、30、35、40、50、75、100、200、300、500または1000個のヌクレオチド長のものであってよい。
【０１４１】
特に注目されるものは本発明のいずれかのポリヌクレオチドとハイブリダイズし、かつ、GENSETポリペプチド、特にGENSET生物活性を示すGENSETポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
もちろん、ポリA+配列(配列表に示されるいずれかのcDNAの3'末端ポリA+領域(tract)など)と、またはT(またはU)残基の5'の相補的なストレッチとのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは「ポリヌクレオチド」の定義に含まれないが、かかるポリヌクレオチドがポリ(A)のストレッチまたはその相補体を含むいずれの核酸分子(例えば、実際にはオリゴdTをプライマーとして用いて作製したいずれかの二本鎖cDNAクローン)ともハイブリダイズするだろうからである。
【０１４２】
相補ポリヌクレオチド
本発明はさらに本発明のポリヌクレオチドのいずれかと十分に相補的なヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子を提供する。本発明は配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列、寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列およびその断片からなる群から選択される配列と相補的なヌクレオチド配列を有する、精製された、単離された、または組換えポリヌクレオチドを包含する。かかる単離された分子、特にDNA分子は遺伝子マッピングのためのおよび例えば、PCRまたはノーザンブロット解析によって生物学的サンプルにおいてGENSETmRNAを同定するためのプローブとして有用である。
【０１４３】
ポリヌクレオチド断片
本発明はさらに本明細書に記載されるヌクレオチド配列の一部または断片をコードするポリヌクレオチドに向けられる。本発明のポリヌクレオチド断片の用途としてはプローブ、プライマー、分子量マーカーおよび本発明のポリペプチド断片の発現に関するものが挙げられる。断片はa)配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列、b)ゲノムGENSET配列、c)配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、d)寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列およびe)寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択されるポリヌクレオチドの一部を含む。本発明は特に本発明のポリヌクレオチドの少なくとも8個の連続する塩基を含んでなる精製されたまたは単離されたポリヌクレオチドを含む。この実施形態のある態様では、ポリヌクレオチドは本発明のポリヌクレオチドのうち少なくとも10、12、15、18、20、25、28、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500、800、1000、1500または2000個の連続するヌクレオチドを含んでなる。
【０１４４】
前記の好ましいポリヌクレオチドの長さに加え、さらに好ましいポリヌクレオチドの亜属は少なくとも8個のヌクレオチドを含んでなり、「少なくとも8個」は8と配列表または本明細書の他のどこかに示される最も3'のヌクレオチド位を表す整数の間のいずれかの整数と定義される。本発明の好ましいポリヌクレオチドとして5'および3'位という用語でさらに特定される前記の少なくとも8個のヌクレオチドの長さのポリヌクレオチド断片がさらに含まれる。5'および3'位は添付の配列表に示される位置数によって表される。対立遺伝子、縮重およびその他の変異体については、位置1はORFの最も5'のヌクレオチド、すなわち、開始コドンのヌクレオチド「A」と定義され、残りのヌクレオチドには連続して番号が付けられる。従って、少なくとも8個の連続するヌクレオチドの長さの本発明のポリヌクレオチド断片が本発明のポリヌクレオチドで占めることができる5'および3'ヌクレオチド位置のどの組合せも個別の種として本発明に含まれる。5'および3'位で特定されるポリヌクレオチド断片はすぐに思い描くことができ、従って、明細書を不必要に長くしないというためだけに個々には記載しない。
【０１４５】
本発明のポリヌクレオチド断片の前記の種は式「a〜b」(ここで、「a」はポリヌクレオチドの最も5'のヌクレオチド位であり、かつ、「b」はポリヌクレオチドの最も3'のヌクレオチド位に等しく、さらに、「a」は1と本発明のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数マイナス8の間の整数に等しく、かつ、「b」は9と本発明のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数の間の整数に等しく、「a」は「b」よりも少なくとも8は小さい整数である)によって代替的に記載されうることが示される。
【０１４６】
従って、本発明は配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列およびそれに完全に相補的な配列からなる群から選択される配列の少なくとも8、10、12、15、18、20、25、28、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500、1000または2000個のヌクレオチドの連続するスパンからなる、から本質的になるまたは含んでなる、単離された、精製された、または組換えポリヌクレオチドを包含する。
【０１４７】
本発明のその他の好ましい断片にはポリペプチドのドメインをコードするポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドがある。かかる断片を用いて、ハイブリダイゼーションまたはRT-PCR技術を用いて類似のドメインを有するポリペプチドをコードするその他のポリヌクレオチドを得てもよい。あるいは、これらの断片を用いて特定の生物学的特性を有し得るポリペプチドドメインを発現させてもよい。従って、本発明のもう1つの目的は配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列からなる群から選択される配列の少なくとも5、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100、150または200個の連続するアミノ酸の連続するスパンからなり、から本質的になりまたは含んでなり(これらの長さの連続するスパンが選択された配列の長さに一致する範囲で)、その連続するスパンが選択された配列の少なくとも1、2、3、5または10のアミノ酸位のドメインを含んでなるポリペプチドをコードする、単離された、精製されたまたは組換えポリヌクレオチドである。本発明はまた、配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列からなる群から選択される配列の少なくとも5、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100、150または200個の連続するアミノ酸の連続するスパンを含んでなり(これらの長さの連続するスパンが選択された配列の長さに一致する範囲で)、その連続するスパンが選択された配列のドメインであるポリペプチドをコードする、単離された、精製されたまたは組換えポリヌクレオチドを包含する。本発明はまた、配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列からなる群から選択される配列のドメインを含んでなるポリペプチドをコードする、単離された、精製されたまたは組換えポリヌクレオチドを包含する。
【０１４８】
本発明はさらにこの節に記載されるポリヌクレオチド断片のいずれの組合せも包含する。
【０１４９】
オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ
本発明はまたプライマーおよびプローブとして用いられるGENSETポリヌクレオチドの断片を包含する。GENSETゲノムおよびcDNA配列由来のポリヌクレオチドは試験サンプルにおいて少なくとも1コピーのGENSETポリヌクレオチドまたはその断片、相補体もしくは変異体の存在を検出するために有用である。
【０１５０】
構造の定義
本発明のいずれのポリヌクレオチドもプライマーまたはプローブとして用いてもよい。本発明の特に好ましいプローブおよびプライマーとしては、GENSETゲノム配列、cDNA配列およびそれに十分に相補的な配列からなる群から選択される配列の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000個のヌクレオチドの連続するスパンを含んでなる、単離された、精製されたまたは組換えポリヌクレオチドが挙げられる。本発明のもう1つの目的は配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列、寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列、それに十分に相補的な配列、その対立遺伝子変異体、およびその断片からなる群から選択される配列のヌクレオチド配列を含んでなる、精製された、単離されたまたは組換えポリヌクレオチドである。
【０１５１】
さらに、本発明の好ましいプローブおよびプライマーとしては配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列からなる、から本質的になるまたは含んでなる、精製された、単離されたまたは組換えGENSETcDNAが挙げられる。本発明の特に好ましいプローブおよびプライマーとしては、配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列およびそれに十分に相補的な配列からなる群から選択される配列の少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、500または1000個のヌクレオチドの連続するスパンを含んでなる、単離された、精製されたまたは組換え ポリヌクレオチドが挙げられる。
【０１５２】
プライマーおよびプローブの設計
本発明のプローブまたはプライマーは8個〜1000個の間のヌクレオチドの長さを有するか、または少なくとも12、15、18、20、25、35、40、50、60、70、80、100、250、500または1000個のヌクレオチドの長さであると特定される。より詳しくは、これらのプローブおよびプライマーの長さは8、10、15、20または30〜100個のヌクレオチド、好ましくは10〜50個、より好ましくは15〜30個のヌクレオチドで変動し得る。より短いプローブおよびプライマーは標的核酸配列に対する特異性を失いやすく、一般には鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度を必要とする。より長いプローブおよびプライマーは作製するのに費用がかかり自己ハイブリダイズしてヘアピン構造を形成する場合もある。特定のセットのアッセイ条件下でのプライマーおよびプローブにとっての適当な長さは当業者ならば経験的に決定できる。安定なハイブリッドの形成はそのDNAの融解温度(Tm)に依存する。Tmはプライマーまたはプローブの長さ、溶液のイオン強度およびG+C含量に依存する。プライマーまたはプローブのG+C含量が高いほど、融解温度も高いが、これはG:C対が3つのH結合によって保持されるのに対し、A:T対は2つしか有さないためである。本発明のプローブ中のGC含量は通常10と75％の間、好ましくは35と60％の間、より好ましくは40と55％の間にわたる。
【０１５３】
増幅目的には、ほぼ同じTmのプライマー対が好ましい。プライマーはオリゴヌクレオチドのGC含量および融解温度に基づいてOSPソフトウェア(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、HillierおよびGreen, 1991)を用いて、または8量体頻度相異法(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Griffaisら, 1991)に基づいてPC-Rare(http:// bioinformatics.weizmann.ac.il/software/PC-Rare/doc/manuel.html) を用いて設計してもよい。DNA増幅技術は当業者には周知である。本発明の背景において使用できる増幅技術としては、限定されるものではないが、EP-A-320 308、WO9320227およびEP-A-439 182に記載されるリガーゼ連鎖反応(LCR)、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR、RT-PCR)およびGuatelliら(1990)およびCompton (1991)に記載される核酸配列を基にした増幅(NASBA)などの技術、欧州特許出願第4544610号に記載されるQβ増幅、 Walkerら(1996)およびEP A 684 315に記載される鎖置換増幅およびPCT国際公開WO9322461に記載される標的媒介性増幅が挙げられる(なお、これらの全開示内容は参照により組み入れられる)。
【０１５４】
LCRおよびGapLCRは指数関数的増幅技術であり、双方ともDNA分子にアニーリングされる隣接するプライマーを結合させるのにDNAリガーゼに依存する。リガーゼ連鎖反応(LCR)では、2種の一次(第1および第2)および2種の二次(第3および第4)プローブを含むプローブ対を用い、そのすべては標的に対してモル過剰で用いる。最初のプローブは標的鎖の第1のセグメントとハイブリダイズし、かつ、第2のプローブは標的鎖の第2のセグメントとハイブリダイズし、第1および第2のセグメントは連続しており、その結果一次プローブは5'ホスフェート-3'ヒドロキシル関係で互いに接しており、その結果リガーゼが共有結合によって2つのプローブを融合産物に融合または連結させることができる。さらに、第3の(二次)プローブは第1のプローブの一部とハイブリダイズでき、かつ、第4の(二次)プローブは第2のプローブの一部とハイブリダイズでき、同様に接する。もちろん、標的が最初に二本鎖である場合には、二次プローブは最初の時に標的相補体ともハイブリダイズするだろう。ひと度、一次プローブの連結された鎖が標的鎖から離れれば、第3および第4のプローブとハイブリダイズし、これが連結して相補的な二次連結産物を形成することができる。連結産物が標的またはその相補体のいずれかと機能的に同等であるということを理解することが重要である。ハイブリダイゼーションおよび連結反応のサイクルを反復することにより、標的配列の増幅が達成される。またマルチプレックスLCR法は記載されている(全開示内容が参照により組み入れられるWO9320227)。GapLCR(GLCR)はLCRの変法であり、これではプローブは隣接しておらず2〜3塩基離れている。
【０１５５】
mRNAの増幅について、mRNAをcDNAに逆転写すること、それに次ぐポリメラーゼ連鎖反応、または米国特許第5,322,770号に記載されるように両ステップに単一の酵素を用いること、または Marshallら(1994)によって記載されるように非対称GapLCR(RT-AGLCR)を用いることは本発明の範囲内であり、なおこれらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。AGLCRは、RNAの増幅を可能にするGLCRの改変である。
【０１５６】
PCR技術は本発明に用いられる好ましい増幅技術である。PCR技術の変法は当業者にはよく知られている。PCR技術の総説については、全開示内容が参照により組み入れられる、White (1997)、Erlich (1992)および「PCR Methods and Applications」 ((1991) Cold Spring Harbor Laboratory Press)を題された出版物を参照。これらのPCR手順の各々では、好適に調製した核酸サンプルに、増幅される核酸配列の両側上のPCRプライマーをdNTPおよびTaqポリメラーゼ、Pfuポリメラーゼ、TthポリメラーゼまたはVentポリメラーゼなどの熱安定性ポリメラーゼとともに加える。サンプル中の核酸は変性されており、PCRプライマーはサンプル中の相補的な核酸配列と特異的にハイブリダイズする。ハイブリダイズしたプライマーが伸長される。その後、変性、ハイブリダイゼーション、および伸長というもう1つのサイクルを開始する。このサイクルを複数回反復するとプライマー部位の間の核酸配列を含む増幅断片が得られる。PCRは米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号および同第4,965,188号をはじめとするいくつかの特許においてさらに記載されている(なお、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
【０１５７】
プライマーおよびプローブの調製
プライマーおよびプローブは、例えば、Narangら(1979)のホスホジエステル法、Brownら(1979)のホスホジエステル法、Beaucageら(1981)のジエチルホスホルアミダイト(diethylphosphoramidite)法およびEP 0 707 592に記載される固相支持体法などの方法によるクローニングおよび適当な配列の制限および直接化学合成をはじめとするいずれの好適な方法によって調製してもよい(なお、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
【０１５８】
一般に、検出プローブは核酸配列または、例えば、国際特許出願WO92/20702に開示されるペプチド核酸、米国特許第5,185,444号、同第5,034,506号および同第5,142,047号に記載されるモルホリノ類似体などの無荷電核酸類似体である(なお、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。プローブはさらなるdNTPをプローブに付加できないという「伸長可能でない」とされなければならない場合もある。類似体はそれ自体もともと通常は伸長可能でなく、核酸プローブはプローブの3'末端をヒドロキシル基がもはや伸長に加わることができなくなるように改変することによって伸長可能でないようにできる。例えば、プローブの3'末端は捕捉または検出標識を用いて機能を持たせ、それによってヒドロキシル基を消費またはブロックしてもよい。あるいは、3'ヒドロキシル基を単に切断、置換または改変してもよく、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、1993年4月19日に出願された米国特許出願第07/049,061号はプローブを伸長可能でなくするために使用できる修飾を記載している。
【０１５９】
プローブの標識
本発明のいずれのポリヌクレオチドも、所望する場合、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出可能であるように当技術分野で公知のいずれかの標識を組み込むことによって標識してもよい。例えば、有用な標識としては放射活性物質(32P、35S、3H、125Iをはじめとする)、蛍光色素(5-ブロモデオキシウリジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニンをはじめとする)またはビオチンが挙げられる。好ましくは、ポリヌクレオチドはその3'および5'末端で標識する。核酸断片の非放射活性標識の例は仏国特許第FR-7810975号またはUrdeaら(1988)またはSanchez-Pescadorら(1988)に記載されており、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる。さらに、本発明のプローブはシグナル増幅を可能にするような構造特性を有していてもよく、かかる構造特性には、例えば、1991のUrdeaらまたは欧州特許EP 0 225 807(Chiron)に記載されるような分岐DNAプローブがある(なお、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
【０１６０】
検出可能プローブは一本鎖であってもまたは二本鎖であってもよく、in vitro転写、ニックトランスレーションまたはキナーゼ反応をはじめとする当技術分野で公知の技術を用いて作製すればよい。標識されたプローブとハイブリダイズ可能な配列を含む核酸サンプルを標識されたプローブと接触させる。サンプル中の核酸が二本鎖である場合には、プローブを接触させる前に変性させてもよい。いくつかの適用では、核酸サンプルをニトロセルロースまたはナイロンメンブレンなどの表面に固定化してもよい。核酸サンプルはゲノムDNA、cDNAライブラリー、RNAまたは組織サンプルをはじめとする種々の供給源から得た核酸を含んでなってもよい。
【０１６１】
検出可能なプローブとハイブリダイズ可能な核酸の存在を検出するのに用いられる手順としてはサザンブロッティング、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、コロニーハイブリダイゼーションおよびプラークハイブリダイゼーションなどの周知の技術が挙げられる。いくつかの適用では、サンプル中のハイブリダイズする核酸の特性決定および発現を容易にするために、標識されたプローブとハイブリダイズ可能な核酸を発現ベクター、配列決定ベクターまたはin vitro転写ベクターなどのベクターにクローニングしてもよい。例えば、かかる技術をゲノムライブラリーまたはcDNAライブラリーにおいて用い、本明細書に記載される検出可能なプローブとハイブリダイズ可能な配列を単離およびクローニングしてもよい。
【０１６２】
プローブの固定
また、標識はプライマーまたは増幅されたDNAなどのプライマー伸長産物のいずれかの固相支持体に対する固定を容易にするためにプライマーを捕捉するために用いてもよい。捕捉標識はプライマーまたはプローブにつけられ、固相試薬の特異的結合部分と結合対を形成する特異的結合メンバーであり得る(例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン)。従って、ポリヌクレオチドまたはプローブによって保持される標識の種類によって、標的DNAを捕捉するために用いてもよいし、または検出するために用いてもよい。さらに、本明細書において示されるポリヌクレオチド、プライマーまたはプローブはそれ自身を捕捉標識として用いてもよいということが分かるであろう。例えば、固相試薬の結合メンバーが核酸配列である場合には、プライマーまたはプローブの相補的な部分と結合し、それによってプライマーまたはプローブを固相に固定するよう選択してもよい。ポリヌクレオチドプローブ自身が結合メンバーとして働く場合には、当業者ならばプローブは標的と相補的でない配列または「テール」を含むだろうということが分かるであろう。ポリヌクレオチドプライマー自身が捕捉標識として役立つ場合には、プライマーの少なくとも一部は固相上で核酸とハイブリダイズするために遊離しているだろう。DNA標識技術は当業者には周知である。
【０１６３】
本発明のプローブは多数の目的にとって有用である。特に、それらはゲノムDNAのサザンハイブリダイゼーションに使用できる。プローブはまたPCR増幅産物を検出するためにも使用できる。また、それらを用いその他の技術を用いてGENSET遺伝子またはmRNAにおけるミスマッチを検出してもよい。それらはまたin situハイブリダイゼーションに用いてもよい。
【０１６４】
便宜には、本発明のポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブのいずれも固相支持体に固定すればよい。固相支持体は決定的なものではなく、当業者が選択することができる。従って、ラテックス粒子、微粒子、磁気ビーズ、非磁気ビーズ(ポリスチレンビーズをはじめとする)、膜(ニトロセルロースストリップをはじめとする)、プラスチック管、マイクロタイターウェルの壁、ガラス製またはシリコン製チップ、ヒツジ(またはその他の好適な動物の)赤血球細胞およびデュラサイト(duracytes)はすべて好適な例として挙げられる。核酸を固相に固定するための好適な方法としてはイオン性、疎水性、共有結合性相互作用などが挙げられる。本明細書において使用する固相支持体とは、不溶性であるか、またはその後の反応によって不溶性になり得るいずれかの物質を指す。固相支持体は捕捉試薬を引きつけ固定化するその固有の能力について選択すればよい。あるいは、固相は捕捉試薬を引きつけ固定化する能力を有するさらなる受容体を保持してもよい。さらなる受容体としては捕捉試薬自身または捕捉試薬と結合した荷電物質に対して反対に荷電した荷電物質が挙げられうる。さらにもう1つの別法として、受容体分子は固相支持体に固定化されており(付着しており)、かつ、特異的結合反応を介して捕捉試薬を固定化する能力を有するいずれかの特異的結合メンバーであってもよい。受容体分子はアッセイを実施する前にまたはアッセイを実施する間、捕捉試薬の固相支持体物質との間接的結合を可能にする。従って、固相はプラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、試験管のガラスまたはシリコン面、マイクロタイターウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ(またはその他の好適な動物)赤血球、デュラサイト(登録商標)および当業者に公知のその他の形状であってもよい。本発明のポリヌクレオチドは個別に、または少なくとも2、5、8、10、12、15、20または25個の個別の本発明のポリヌクレオチドからなる群で固相支持体に付着させるか、または固定化すればよい。さらに、本発明のもの以外のポリヌクレオチドを1つ以上の本発明のポリヌクレオチドと同じ固相支持体に付着させてもよい。
【０１６５】
オリゴヌクレオチドアレイ
本発明の複数のオリゴヌクレオチド プライマーまたはプローブを含んでなる基質をGENSET遺伝子における標的配列の検出または増幅のいずれかのために用いてもよく、GENSET遺伝子のコードまたは非コード配列における突然変異の検出に用いてもよく、また本願において別の場所で記載されるように、種々の組織において、プロセス(胚発達、疾病治療)の種々段階で、患者対健常な個人においてといった種々の背景でGENSET遺伝子発現を測定するために用いてもよい。
【０１６６】
本明細書において使用する「アレイ」という用語は、遺伝子発現の特異的検出ができる十分な長さの核酸の一次元、二次元または複数次元の配置を意味する。例えば、アレイはその発現レベルが評価される遺伝子由来の複数のの核酸を含んでもよい。アレイはGENSETゲノムDNA、GENSETcDNA、それに相補的な配列またはその断片を含んでもよい。好ましくは、断片は少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40または50個のヌクレオチド長である。より好ましくは、断片は少なくとも100個のヌクレオチド長である。さらにより好ましくは、断片は100個のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、断片が500個のヌクレオチド長よりも長いものであってよい。
【０１６７】
本明細書に示されるいずれのポリヌクレオチドも固相支持体上の重複する領域にまたは無作為な位置に付着させてよい。あるいは、本発明のポリヌクレオチドは各ポリヌクレオチドがいずれかのその他のポリヌクレオチドの付着部位と重複しない固相支持体の個別の領域に付着されている整理されたアレイに付着させてもよい。ポリヌクレオチドのかかる整理されたアレイは、個別の位置を記録し、アッセイ手順の一部として評価できる「アドレス可能」であるよう設計されるのが好ましい。アドレス可能ポリヌクレオチドアレイは典型的には種々の既知の位置の基質の表面に結合された複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含んでなる。各ポリヌクレオチド位置の正確な位置を知ることでこれらの「アドレス可能」アレイがハイブリダイゼーションアッセイにおいて特に有用なものとなる。当技術分野で公知のいずれのアドレス可能アレイ技術を本発明のポリヌクレオチドに関して用いてもよい。これらのポリヌクレオチドアレイのある特定の実施形態はジーンチップ(商標名)として知られており、米国特許第5,143,854号、PCT国際出願WO90/15070および92/10092に広く記載されている(なお、これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。これらのアレイは一般に機械的合成法またはフォトリソグラフィック法と固相オリゴヌクレオチド合成の組合せを取り入れる光指向性合成法(Fodorら, 1991)を用いて作製すればよい(なお、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。固相支持体へのオリゴヌクレオチドのアレイの固定は一般に「Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis」(VLSIPS(商標名))として識別される技術の開発によって可能となったが、これでは典型的には、プローブは高密度アレイでチップの固相表面に固定されている。VLSIPS(商標名)技術の例はその全開示内容を参照により本明細書に組み入れる、米国特許第5,143,854号および同第5,412,087号およびPCT国際出願WO90/15070、WO92/10092およびWO95/11995に示されており、これらは光指向性合成技術などの技術を介してオリゴヌクレオチドアレイを形成する方法を記載している。固相支持体に固定化されたヌクレオチドのアレイを提供することを目的とした戦略を立てる中で、ハイブリダイゼーションパターンおよび配列情報を最大化しようとしてチップ上でオリゴヌクレオチドアレイを整理し、表示するためのさらなる提示戦略が開発された。かかる提示戦略の例はPCT国際公開WO94/12305、同WO94/11530、同WO97/29212および同WO97/31256に開示されており、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０１６８】
従って、本発明は少なくとも1つの本発明のポリヌクレオチド、特に、本明細書に記載されるプローブまたはプライマーを含んでなる核酸分子のアレイに関する。好ましくは、本発明は少なくとも2つの本発明のポリヌクレオチド、特に、本明細書に記載されるプローブまたはプライマーを含んでなる核酸のアレイに関する。好ましくは、本発明は少なくとも5つの本発明のポリヌクレオチド、特に、本明細書に記載されるプローブまたはプライマーを含んでなる核酸のアレイに関する。
【０１６９】
本発明の好ましい実施形態は配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列、それに完全に相補的な配列、およびその断片からなる群から選択される少なくとも1、2、5、10、15、20、35、50または100個の配列を含む、少なくとも12、15、18、20、25、30、35、40、50、100または500個のヌクレオチド長のポリヌクレオチドのアレイである。
【０１７０】
本発明のポリヌクレオチドの作製方法
本発明はまた配列番号1〜169、339〜455、561〜784のポリヌクレオチド、それから得られるゲノムDNAまたはその断片をはじめとする本発明のポリヌクレオチドの作製方法を含んでなる。これらの方法はヌクレオチドを順次連結して前記の配列を有する核酸を得ることを含んでなる。本発明のポリヌクレオチドは本明細書に記載される増幅またはハイブリダイゼーションを基にした方法をはじめとする当業者に周知の技術を用いて、酵素的にか、または化学的にのいずれかで合成すればよい。
【０１７１】
核酸を合成するための種々の化学的な方法は当業者には公知である。これらの方法の多くでは、合成は固相支持体上で実施する。これらとしては、所望のオリゴヌクレオチドの3'末端塩基を不溶性担体に固定化する3'ホスホルアミダイト法が挙げられる。付加されるヌクレオチド塩基は5'ヒドロキシでブロックされ、固定化されたヌクレオチド塩基との共役を引き起こすよう3'ヒドロキシルで活性化される。新しく固定されたヌクレオチド化合物のブロック解除およびサイクルの反復により所望のポリヌクレオチドが得られるだろう。あるいは、ポリヌクレオチドは全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,049,656号に記載のように調製してもよい。いくつかの実施形態では、前記のように調製したいくつかのポリヌクレオチドを連結して所望の配列を有するより長いポリヌクレオチドを作製する。
【０１７２】
本発明のポリペプチド
本明細書において「GENSETポリペプチド」という用語は、本発明のすべてのタンパク質およびポリペプチドを包含するように使用される。本発明は配列番号170〜338、456〜560、785〜918および寄託されたクローンに含まれるヒトcDNAによってコードされるポリペプチドからなる群から選択される配列からなる、から本質的になるまたは含んでなる、組換え、単離または精製されたGENSETポリペプチドをはじめとするGENSETポリペプチドを包含する。本発明のその他の目的は本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドならびにかかるポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドである。
【０１７３】
ポリペプチド変異体
本発明はさらに対立遺伝子およびスプライシング変異体、オルソログおよび／または種相同体によってコードされるGENSETポリペプチドを提供する。配列番号170〜338、456〜560、785〜918からなる群のポリペプチドおよび寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体、スプライス変異体、オルソログおよび／または種相同体は当技術分野で公知の手順を用い、本明細書に開示される配列またはATCCに寄託されたクローンからの情報を用いて得ればよい。
【０１７４】
本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるものからなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも50%同一、より好ましくは少なくとも60%同一、さらにより好ましくは70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。本発明のクエリーアミノ酸配列と少なくとも、例えば、95%「同一」のアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、対象のポリペプチド配列がクエリーアミノ酸配列の各100個のアミノ酸あたり5個までのアミノ酸変更を含み得るという点以外は、対象のポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列と同一であるということを意味する。言い換えると、クエリーアミノ酸配列と少なくとも95%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るには、対象の配列中に5%まで(100個のうちの5個)のアミノ酸残基が別のアミノ酸で置換、欠失(インデル)または挿入されていてもよい。
【０１７５】
本発明のさらなるポリペプチドとしては前記のものと少なくとも90%類似性、より好ましくは少なくとも95%類似性、さらにより好ましくは少なくとも96%、97%、98%または99%類似性を有するポリペプチドが挙げられる。本発明のクエリーアミノ酸配列と少なくとも、例えば、95%「類似の」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、対象のポリペプチド配列がクエリーアミノ酸配列の各100個のアミノ酸当たり5個までのアミノ酸変更を含み得るという点以外は、対象のポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列と類似である(すなわち、同一または同等のアミノ酸残基を含む)ということを意味する。言い換えると、クエリーアミノ酸配列と少なくとも95%類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るには、対象の配列中に5%まで(100個のうちの5個)のアミノ酸残基が別の同等でないアミノ酸で置換、欠失(インデル)または挿入されていてもよい。
【０１７６】
参照配列のこれらの変更は参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置またはそれらの末端位置の間のいずれで生じてもよく、参照配列の残基の間で個々に、または参照配列内の1個以上の連続する群のいずれかに散在する。クエリー配列は配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるものからなる群から選択される全アミノ酸配列であってもよいし、または本明細書に記載のように特定されるいずれかの断片であってもよい。
【０１７７】
本明細書に記載される変異体ポリペプチドはそれらがその正常な生物活性を有するかどうかに関わらず本発明に含まれる。これは特定のポリペプチド分子が生物活性を有さない場合であっても、当業者ならば、例えば、ワクチンとしてまたは抗体を作製するためのこのポリペプチドの使用法が分かるであろう。GENSET生物活性を有さない本発明のポリペプチドのその他の用途としては、特に、当業者に公知の方法を用いるエピトープマッピングにおけるエピトープタグとして、およびSDS-PAGEゲルでのまたは分子篩ゲル濾過カラムでの分子量マーカーとしての用途が挙げられる。以下に記載されるように、本発明のポリペプチドはまたGENSETタンパク質発現を検出するためのアッセイにおいて有用である、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製するために、またはGENSETタンパク質機能を増強または阻害し得るアゴニストおよびアンタゴニストとして用いてもよい。さらに、かかるポリペプチドは酵母ツーハイブリッド系において、これもまた本発明の候補アゴニストおよびアンタゴニストであるGENSETタンパク質結合タンパク質を「捕捉する」ために用いてもよい(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Fieldsら、1989参照)。
【０１７８】
本発明のポリペプチドの調製
本発明のポリペプチドはいずれの好適な方法で調製してもよい。かかるポリペプチドとしては単離された天然ポリペプチド、組換えによって得られるポリペプチド、合成によって得られるポリペプチドまたはこれらの方法の組合せによって得られるポリペプチドが挙げられる。本発明のポリペプチドは単離型で提供されるのが好ましく、部分的にまたは好ましくは実質的に精製されていてもよい。
【０１７９】
従って、本発明はまた本発明のポリペプチド、特に、配列番号1〜169、339〜455、561〜784のcDNAによって、または寄託されたクローンプールのクローンインサート、それから得られるゲノムDNAまたはその断片によってコードされるポリペプチドの作製方法、および配列番号170〜338、456〜560、785〜918のポリペプチドまたはその断片の作製方法を含んでなる。本方法はアミノ酸を順次連結して前記の配列を有する核酸ポリペプチドを得ることを含んでなる。いくつかの実施形態において、これらの方法によって作製されたポリペプチドが150個以下のアミノ酸長である。その他の実施形態では、これらの方法によって作製されるポリペプチドは120個以下のアミノ酸長である。
【０１８０】
単離
天然の供給源から
本発明のGENSETタンパク質はヒトまたは非ヒト動物の、直接単離されたかまたは培養された細胞にかかわらず、体液、組織および細胞をはじめとする天然の供給源から単離すればよい。天然タンパク質の抽出および精製方法は当技術分野では公知であり、粒子を破壊するための界面活性剤またはカオトロピック剤の使用とそれに次ぐイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、密度による沈降およびゲル電気泳動によるポリペプチドの分別抽出および分離を含む。例えば、種々のタンパク質の精製法については、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、「Methods in Enzymology, Academic Press, 1993」参照。本発明のポリペプチドはまた、天然の供給源から、タンパク質精製の技術分野で周知の方法において本明細書に記載されるものなどの本発明のポリペプチドに向けられる抗体を用いて精製してもよい。
【０１８１】
組換え供給源から
本発明のGENSETポリペプチドは当技術分野で公知の慣例の発現法を用いて組換えによって得られるのが好ましい。所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをいずれかの便宜な宿主に好適な発現ベクター中のプロモーターに機能し得る形で連結させる。真核生物および原核生物双方の宿主系を組換えポリペプチド形成に用いる。次いで、溶解した細胞からまたは培養培地からポリペプチドを単離してその目的とする使用のために必要な程度まで精製する。
【０１８２】
配列番号1〜169、339〜455、561〜784に記載されるもの、寄託されたクローンプールのクローンインサートのものおよびその対立遺伝子変異体をはじめとするいずれのGENSETポリヌクレオチドを用いてGENSETポリペプチドを発現させてもよい。発現されるGENSETポリペプチドをコードする核酸は従来のクローニング技術を用いて発現ベクター中のプロモーターに機能し得る形で連結させる。発現ベクター中のGENSETインサートはGENSETタンパク質の全コード配列またはその一部を含んでなってもよい。例えば、GENSET由来のインサートは配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドからなる群から選択されるGENSETタンパク質の少なくとも6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100、150または200個の連続したアミノ酸を含んでなるポリペプチドをコードしていてもよい。
【０１８３】
従って、本発明のさらなる実施形態は配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドからなる群から選択されるタンパク質を含んでなるポリペプチドの作製方法であって、この方法は
a)i)配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列、ii)寄託されたクローンプールの1つのクローンインサートの配列、iii)配列番号170〜338、456〜560、785〜918のポリペプチドの1つをコードする配列およびiv)寄託されたクローンプールのクローンインサートの1つによってコードされるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列からなる群から選択される配列を含んでなるcDNAを得て；
b)そのcDNAをcDNAがプロモーターに機能し得る形で連結されるように発現ベクターに挿入し；そして
c)その発現ベクターを宿主細胞に導入し、それにより宿主細胞がそのポリペプチドを産生する、
ステップを含んでなる。
【０１８４】
この実施形態のある態様では、本方法はポリペプチドを単離するというステップをさらに含んでなる。本発明のもう1つの実施形態は前記の段落に記載される方法によって得られるポリペプチドである。
【０１８５】
発現ベクターは当技術分野で公知の哺乳類、酵母、昆虫または細菌発現系のいずれかである。市販のベクターおよび発現系はGenetics Institute(Cambridge, MA)、Stratagene(La Jolla, California)、Promega(Madison, Wisconsin)およびInvitrogen(San Diego, California)をはじめとする種々の供給業者から入手できる。所望の場合、発現を増強し、また適切なタンパク質の折りたたみを容易にするために、配列のコドン背景およびコドン対形成を、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,082,767号に説明されるように、発現ベクターが導入される特定の発現生物に最適化する。
【０１８６】
ある実施形態では、GENSETcDNAの全コード配列およびcDNAのポリAシグナルを介して3'UTRを発現ベクター中のプロモーターに機能し得る形で連結する。あるいは、GENSETタンパク質の一部をコードする核酸が開始部位として役立つメチオニンを欠いている場合には、従来技術を用いて開始メチオニンを核酸の第1のコドンの隣りに導入してもよい。同様に、GENSETcDNA由来のインサートがポリAシグナルを欠いている場合には、例えば、BglIおよびSalI制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いてpSG5(Stratagene)からポリAシグナルをスプライスアウトし、それを哺乳類発現ベクターpXT1(Stratagene)に組み込むすることによってこの配列を構築物に付加してもよい。pXT1はLTRおよびモロニーマウス白血病ウイルス由来のgag遺伝子の一部を含む。構築物中のLTRの位置により効率的で安定なトランスフェクションが可能となる。ベクターは単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイシン遺伝子を含む。GENSETタンパク質またはその一部をコードする核酸は配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートからなる群から選択されるGENSETcDNAを含むベクターから、GENSETcDNAまたはその一部に相補的であり、かつ、5'プライマーに組み込まれたPstIおよび対応するcDNA3'プライマーの5'末端にBglIIの制限エンドヌクレアーゼ配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用い、確実にGENSETタンパク質またはその一部をコードする配列がポリAシグナルに関して適切な位置となるように注意しながらPCRによって得る。生じたPCR反応物から得られ精製した断片をPstIで消化し、エキソヌクレアーゼで平滑末端とし、BglIIで消化し、精製してpXT1に連結し、ここでポリAシグナルを含み、さらにBglIIで消化する。
【０１８７】
もう1つの実施形態では、組換えポリヌクレオチドに分泌またはリーダー配列、プロ配列、複数のヒスチジン残基などの精製に役立つ配列をコードするさらなるヌクレオチド配列、または組換え生産の際の安定性のためのさらなる配列を付加することが有利であることが多い。
【０１８８】
対照として、cDNAインサートを欠く発現ベクターを宿主細胞または生物に導入する。
【０１８９】
GENSET発現ベクターのマウスNTH3T3細胞へのトランスフェクションはしかしながら、宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入のある実施形態である。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの宿主細胞への導入はリン酸カルシウムトランスフェクション、DEAEデキストラン媒介性トランスフェクション、カチオン脂質媒介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染またはその他の方法によって達成すればよい。かかる方法はDavisら(1986)などの多数の標準的な実験マニュアルに記載されている(なお、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。本発明のポリペプチドが組換えベクターを欠く宿主細胞によって実際に発現され得るということは特に考慮する。
【０１９０】
次いで、組換え細胞抽出物、または発現されたポリペプチドが分泌される場合には培養培地からのタンパク質を調製し、ゲル電気泳動によってタンパク質を分離する。所望の場合、タンパク質は電気泳動の前に硫酸アンモニウム沈殿させてもよいし、または大きさもしくは荷電を基に分離されていていもよい。存在するタンパク質はクマシーもしくは銀染色などの技術または目的のGENSET cDNAによってコードされるタンパク質に対する抗体を用いて検出する。クマシーおよび銀染色技術は当業者にはよく知られている。
【０１９１】
GENSET cDNAまたはその断片を含む発現ベクターを含む宿主細胞または生物由来のタンパク質を対照細胞または生物由来のものと比較する。対照細胞には存在しない、発現ベクターを含む細胞由来のバンドの存在によりGENSET cDNAが発現されているということが示される。一般に、GENSETcDNAによってコードされるタンパク質に相当するバンドはcDNAのオープン・リーディング・フレーム中のアミノ酸数を基に予想されるものに近い移動度を有するだろう。しかしながら、バンドはグリコシル化、ユビキチン化または酵素による切断などの修飾の結果、予想されるものとは異なる移動度を有する場合もある。
【０１９２】
あるいは、発現されるGENSETポリペプチドはトランスジェニック動物の生産物、すなわち、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む体細胞または生殖細胞を特徴とする、トランスジェニックウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジのミルクの成分などであってもよい。
【０１９３】
本発明のポリペプチドは分別抽出、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーをはじめとする周知の方法によって組換え細胞培養物から回収および精製すればよい。例えば、種々のタンパク質の精製法については前記の「Methods in Enzymology」参照。精製には高性能液体クロマトグラフィー(「HPLC」)を用いるのが最も好ましい。GENSETポリペプチドの組換えにより得られるバージョンは本明細書に記載の技術または例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるSmithおよびJohnson(1988)に記載される一段階法などの別の当技術分野で公知の技術を用いて実質的に精製してもよい。本発明のポリペプチドはまた組換え供給源からタンパク質精製の技術分野で周知の方法で本明細書に記載されるものなどの本発明のポリペプチドに向けられた抗体を用いて精製してもよい。
【０１９４】
好ましくは、組換えにより発現されるGENSETポリペプチドは「イムノアフィニティークロマトグラフィー」と題される節に記載されるものなどのなどの標準的なイムノクロマトグラフィー技術を用いて精製する。かかる手順では、培養培地または細胞抽出液などの目的のタンパク質を含有する溶液を、クロマトグラフィーマトリックスにそのタンパク質に対する抗体が付着しているカラムに適用する。組換えタンパク質はイムノクロマトグラフィーカラムに結合できる。従って、カラムを洗浄して非特異的に結合したタンパク質を除去する。次いで、特異的に結合した分泌タンパク質を標準的な技術を用いてカラムから遊離させて回収する。
【０１９５】
抗体作製が不可能な場合には、GENSET cDNA配列またはその断片をキメラポリペプチドを用いる精製スキームにおける使用のために設計される発現ベクターに組み込んでもよい。かかる戦略では、GENSET cDNAまたはその断片のコード配列をキメラの他の半分をコードする遺伝子とともにインフレームで挿入する。キメラの他の半分はβグロビンまたはニッケル結合ポリペプチドをコードする配列であってもよい。次いで、βグロビンに対する抗体を有するか、またはそれにニッケルを付着させたクロマトグラフィーマトリックスを用いてキメラタンパク質を精製する。プロテアーゼ切断部位をβグロビン遺伝子またはニッケル結合ポリペプチドとGENSET cDNAまたはその断片の間に設計すればよい。このようにして、キメラの2つのポリペプチドをプロテアーゼ消化によって互いに分離すればよい。
【０１９６】
βグロビンキメラを作製するためのある有用な発現ベクターにはpSG5(Stratagene)があり、これはウサギβグロビンをコードしている。ウサギβグロビン遺伝子のイントロンIIは発現される転写産物のスプライシングを容易にし、構築物に組み込まれるポリアデニル化シグナルによって発現レベルが高まる。記載されるこれらの技術は分子生物学の当業者には周知である。標準的な方法はDavisら(1986)などの方法教本に公開されており、方法の多くはStratagene, Life Technologies, Inc.またはPromegaから入手できる。ポリペプチドはさらに構築物からin vitro Express(商標名)翻訳キット(Stratagene)などのin vitro翻訳系を用いて得てもよい。
【０１９７】
組換え生産手順に用いる宿主によって、本発明のポリペプチドはグリコシル化されていてもよいし、またはグリコシル化されていなくてもよい。さらに、本発明のポリペプチドはまた、宿主媒介性プロセスの結果として最初の改変メチオニン残基を含む場合もある。従って、一般に、翻訳開始コドンによってコードされるN末端メチオニンはすべての真核細胞で翻訳後にいずれのタンパク質からも高効率で除去されるということは当技術分野では周知である。ほとんどの原核生物でもほとんどのタンパク質のN末端メチオニンはまた効率的に除去されるが、あるタンパク質については、N末端メチオニンが共有結合しているアミノ酸の性質次第ではこの原核生物の除去プロセスは非効率的である。
【０１９８】
化学合成から
さらに、本発明のポリペプチド、特に短いタンパク質断片は当技術分野で公知の技術を用いて化学合成してもよい(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Creighton,1983およびHunkapillerら,1984参照)。例えば、本発明のポリペプチド配列の断片に相当するポリペプチドはペプチドシンセサイザーを用いて合成してもよい。ポリペプチドを作製する種々の方法は当業者には公知であるが、カルボキシ末端アミノ酸をポリビニルベンゼンまたは別の好適な樹脂に結合させる方法が挙げられる。加えられるアミノ酸がアミノ部分の基およびいずれの側鎖反応基もブロッキング基を有し、その結果カルボキシル部分のみが反応し得る。カルボキシル基はカルボジイミドまたは別の活性化剤で活性化されて固定化されたアミノ酸と結合できる。ブロッキング基を除去した後、サイクルを反復して所望の配列を有するポリペプチドを作製する。あるいは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,049,656号に記載される方法を用いてもよい。
【０１９９】
さらに、所望の場合、非古典的なアミノ酸または化学アミノ酸類似体を置換または付加としてポリペプチド配列に導入してもよい。非古典的なアミノ酸としては、限定されるものではないが、通常のアミノ酸のD異性体、2,4-ジアミノ酪酸、a-アミノイソ酪酸、4-アミノ酪酸、Abu、2-アミノ酪酸、g-Abu、e-Ahx、6-アミノヘキサン酸、Aib、2-アミノイソ酪酸、3-アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、b-アラニン、フルオロアミノ酸、b-メチルアミノ酸、Ca-メチルアミノ酸、Na-メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸および一般的なアミノ酸類似体が挙げられる。さらに、アミノ酸はD(右旋性)またはL(左旋性)であってもよい。
【０２００】
修飾
本発明は翻訳の間またはその後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護／ブロッキング基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体分子またはその他の細胞性リガンドへの連結などによって、異なった形で修飾されているポリペプチドを包含する。多数の化学的修飾のいずれも、限定されるものではないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、V8プロテアーゼ、NaBH4による特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在化での代謝合成などをはじめとする公知の技術で実施すればよい。
【０２０１】
本発明に包含されるさらなる翻訳後修飾としては、例えば、N結合型またはO結合型糖鎖、N末端またはC末端のプロセシング、アミノ酸主鎖への化学部分の付加、N結合型またはO結合型糖鎖への化学修飾および原核生物の宿主細胞発現の結果としてのN末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。ポリペプチドはまたタンパク質の検出および単離を可能にする酵素、蛍光、同位体またはアフィニティー標識などの検出可能な標識で修飾されていてもよい。
【０２０２】
ポリペプチドの可溶性、安定性および循環時間の増大または免疫原性の低下などのさらなる利点を提供し得る、本発明のポリペプチドの化学的に修飾された誘導体も本発明によって提供される。米国特許第4,179,337号参照。誘導体化のための化学部分は米国特許第4,179,337号を参照して選択すればよく、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる。誘導体化のための化学部分はポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどといった水溶性ポリマーから選択すればよい。ポリペプチドは分子内のランダムな位置で、または分子内の所定の位置で修飾されていてもよく、1、2、3またはそれより多くの付着された化学部分を含んでもよい。
【０２０３】
ポリマーはいずれの分子量のものであってもよく、分枝していてもまたは分枝していなくともよい。ポリエチレングリコールについては、取り扱いおよび製造の容易さのために、好ましい分子量は約1kDaと約100kDaの間である(「約」という用語はポリエチレングリコールの調製においては、規定の分子量よりも重い分子もあり、軽い分子もあるであろうということを指す)。所望の治療プロフィールによっては(例えば、所望の徐放期間、あるとすれば生物活性に対する作用、取り扱いの容易さ、抗原性度またはその欠如およびポリエチレングリコールの治療タンパク質または類似体へのその他の既知の作用)その他の大きさを用いてもよい。
【０２０４】
ポリエチレングリコール分子(またはその他の化学部分)はタンパク質の機能性または抗原性ドメインに対する作用を考慮してタンパク質に付着されるべきである。当業者が利用できる多数の付着法があり、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、EP0 401 384,(G-CSFへPEGを結合させる)およびMalikら(1992)(塩化トレシルを用いるGM-CSFのペグ化(pegylation)を報告している)がある。例えば、ポリエチレングリコールは遊離アミノまたはカルボキシル基などの反応基を介してアミノ酸残基によって共有結合され得る。反応基とはそれに活性化されたポリエチレングリコール分子が結合され得るものである。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基としてはリジン残基およびN末端アミノ酸残基が挙げられ、遊離カルボキシル基を有するのものとしてはアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびC末端アミノ酸残基が挙げられうる。スルフヒドリル基もポリエチレングリコール分子を付着するための反応基として用いてもよい。治療目的に好ましいのはN末端またはリジン基での付着などのアミノ基での付着である。
【０２０５】
N末端で化学修飾されたタンパク質を特に所望してもよい。本組成物の例示としてポリエチレングリコールを用いるならば、種々のポリエチレングリコール分子から(分子量、分枝などによって)、反応混合物中のポリエチレングリコール分子とタンパク質(ポリペプチド)との割合、実施されるペグ化反応の種類および選択されたN末端ペグ化されたタンパク質を得る方法を選択すればよく、N末端ペグ化された調製物を得る(すなわち、必要に応じてこの部分をその他のモノペグ化された部分から分離する)方法はペグ化されたタンパク質分子集団からのN末端ペグ化された物質の精製によってであり得る。N末端修飾で化学修飾される選択的タンパク質は特定のタンパク質の誘導体化に利用できる異なる種類の主要なアミノ基(リジン対N末端)の異なる反応性を利用する還元アルキル化によって達成され得る。適当な反応条件下で、カルボニル基を含むポリマーを用いるタンパク質のN末端での実質的に選択的な誘導体化が達成される。
【０２０６】
多量体化
本発明のポリペプチドは単量体または多量体(すなわち、二量体、三量体、四量体およびより高次の多量体)であってもよい。従って、本発明は本発明のポリペプチドの単量体および多量体、その調製およびそれを含有する組成物に関する。特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは単量体、二量体、三量体または四量体である。さらなる実施形態では、本発明の多量体は少なくとも二量体、少なくとも三量体または少なくとも四量体である。
【０２０７】
本発明に包含される多量体はホモマーであってもヘテロマーであってもよい。本明細書において使用する「ホモマー」という用語は、配列番号170〜338、456〜560、785〜918の、または寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるアミノ酸配列に相当するポリペプチドのみ(本明細書に記載されるこれらのポリペプチドに相当する断片、変異体、スプライス変異体および融合タンパク質を含む)を含む多量体を指す。これらのホモマーは同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み得る。特定の実施形態では、本発明のホモマーは同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドのみを含む多量体である。もう1つの特定の実施形態では、本発明のホモマーは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む多量体である。特定の実施形態では、本発明の多量体はホモ二量体(例えば、同一のまたは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む)またはホモ三量体(例えば、同一のおよび／または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む)である。さらなる実施形態では、本発明のホモマーの多量体は少なくともホモ二量体、少なくともホモ三量体または少なくともホモ四量体である。
【０２０８】
本明細書において使用する「ヘテロマー」という用語は本発明のポリペプチドに加え、1種以上の異種ポリペプチド(すなわち、異なるタンパク質のポリペプチド)を含む多量体を指す。特定の実施形態では、本発明の多量体はヘテロ二量体、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体である。さらなる実施形態では、本発明のヘテロマーの多量体は少なくともヘテロ二量体、少なくともヘテロ三量体または少なくともヘテロ四量体である。
【０２０９】
本発明の多量体は疎水性、親水性、イオンおよび／または共有結合性の会合の結果であってもよく、および／または、例えば、リポソーム形成によって直接連結していてもよい。従って、ある実施形態では、例えば、ホモ二量体またはホモ三量体などの本発明の多量体は溶液中で本発明のポリペプチドを互いに接触させる際に形成される。もう1つの実施形態では、例えば、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体などの本発明のヘテロ多量体は溶液中で本発明のポリペプチドを本発明のポリペプチドに対する抗体(本発明の融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に対する抗体をはじめとする)と接触させる際に形成される。その他の実施形態では、本発明の多量体は本発明のポリペプチドとの、および／または本発明のポリペプチド間の共有結合性の会合によって形成される。かかる共有結合性の会合にはポリペプチド配列中に含まれる(例えば、配列表に列挙される、または寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドに含まれる)1個以上のアミノ酸残基が関与し得る。ある例では、共有結合性の会合はポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間の架橋であり、これは未変性(すなわり、天然の)ポリペプチドにおいても相互作用する。もう1つの例では、共有結合性の会合は化学的または組換え操作の結果である。あるいは、かかる共有結合性の会合には本発明の融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に含まれる1個以上のアミノ酸残基が関与し得る。
【０２１０】
ある例では、共有結合性の会合は本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列間にある(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,478,925号参照)。特定の実施例では、共有結合性の会合は(本明細書に記載される)本発明のFc融合タンパク質に含まれる異種配列間である。もう1つの特定の例では、本発明の融合タンパク質の共有結合性の会合は共有結合性に会合した多量体を形成し得る、例えば、オステオプロテジェリンなどの別のタンパク質由来の異種ポリペプチド配列間である(例えば、その全内容を参照により本明細書に組み入れる国際公開WO98/49305参照)。もう1つの実施形態では、2個の以上の本発明のポリペプチドをペプチドリンカーによって結合する。例としては、米国特許第5,073,627号(参照することにより本明細書に組み入れる)に記載されるペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーによって分離される複数の本発明のポリペプチドを含んでなるタンパク質は従来の組換えDNA技術を用いて得ればよい。
【０２１１】
本発明の多量体ポリペプチドのもう1つの調製方法はロイシンジッパーまたはイソロイシンジッパーポリペプチド配列と融合した本発明のポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパーおよびイソロイシンジッパードメインはそれらが見出されるタンパク質の多量体化を容易にするポリペプチドである。ロイシンジッパーは最初にいくつかのDNA結合タンパク質で同定され、その後種々の異なるタンパク質でも認められてきた(Landschulzら, 1988)。既知のロイシンジッパーの中には二量体化するか、または三量体化する天然のペプチドおよびその誘導体がある。本発明の可溶性多量体タンパク質を得るのに好適なロイシンジッパードメインの例としては、参照により本明細書に組み入れるPCT国際出願WO94/10308に記載されるものがある。溶液中で二量体化するか、または三量体化するポリペプチド配列と融合した本発明のポリペプチドを含んでなる組換え融合タンパク質を好適な宿主細胞において発現させ、得られる可溶性多量体融合タンパク質を当技術分野で公知の技術を用いて培養上清から回収する。
【０２１２】
本発明の三量体ポリペプチドは生物活性の増強という利点を提供し得る。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は三量体を優先的に形成するものである。ある例としてはHoppeら(1994)および米国特許出願第08/446,922号に記載される、肺界面活性タンパク質D(SPD)由来のロイシンジッパーがある(なお、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。天然の三量体タンパク質由来のその他のペプチドを本発明の三量体ポリペプチドの調製に用いてもよい。もう1つの例では、本発明のタンパク質はフラッグ(登録商標)ポリペプチド配列を含有する本発明の融合タンパク質に含まれるフラッグ(登録商標)ポリペプチド配列間の相互作用によって会合する。さらなる実施形態では、本発明の会合タンパク質は本発明のフラッグ(登録商標)融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチド配列と抗フラッグ(登録商標)抗体間の相互作用によって会合する。
【０２１３】
本発明の多量体は当技術分野で公知の化学技術を用いて作製してもよい。例えば、本発明の多量体中に含まれるよう望まれるポリペプチドを当技術分野で公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋してもよい(例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,478,925号参照)。さらに、本発明の多量体は多量体中に含まれるよう望まれるポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基間に1個以上の分子間架橋を形成するための当技術分野で公知の技術を用いて作製してもよい(例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,478,925号参照)。さらに、本発明のポリペプチドはポリペプチドのC末端またはN末端へのシステインまたはビオチンの付加によって慣例的に修飾してもよく、さらに当技術分野で公知の技術を適用して1個以上のこれらの修飾されたポリペプチドを含む多量体を作製してもよい(例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,478,925号参照)。さらに、当技術分野で公知のその他の技術を適用して本発明の多量体に含まれるよう望まれるポリペプチド成分を含有するリポソームを作製してもよい(例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,478,925号参照)。
【０２１４】
あるいは、本発明の多量体は当技術分野で公知の遺伝子操作技術を用いて作製してもよい。ある実施形態では、本発明の多量体に含まれるポリペプチドは本明細書に記載されるかあるいは当技術分野で公知の融合タンパク質技術を用いて組換えによって得られる(例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,478,925号参照)。特定の実施形態では、本発明のホモ二量体をコードするポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列をリンカーポリペプチドをコードする配列、次いでさらにポリペプチドの翻訳産物を本来のC末端からN末端とは逆向きにコードする合成ポリヌクレオチド(リーダー配列を欠いている)に連結することによって作製する(例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,478,925号参照)。もう1つの実施形態では、本明細書に記載されるか、あるいは当技術分野で公知の組換え技術を適用して膜貫通ドメイン(または疎水性もしくはシグナルペプチド)を含み、膜再構成技術によってリポソームに組み込まれ得る本発明の組換えポリペプチドを作製する(例えば、その全体を参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,478,925号参照)。
【０２１５】
突然変異ポリペプチド
本発明のGENSETポリペプチドの特性を改良または変更するために、タンパク質工学を用いてもよい。当業者に公知の組換えDNA技術を用いて単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加を含む新規突然変異体タンパク質もしくはムテインまたは融合タンパク質を創出してもよい。かかる改変ポリペプチドは、例えば、生物活性の増加／低下または安定性の増加／低下を示し得る。さらに、それらは少なくとも特定の精製および貯蔵条件下では、相当する天然ポリペプチドよりも高収率で精製されてもよく、またより高い可溶性を示し得る。さらに、本発明のポリペプチドは二量体、三量体および四量体をはじめとする多量体として得てもよい。多量体化はFc領域などの異種ポリペプチドを介してリンカーまたは組換えによって容易になり得る。
【０２１６】
NおよびC末端欠失
生物学的機能の実質的な損失を伴わずに1個以上のアミノ酸がN末端またはC末端から欠失し得るということは当技術分野では公知である。例えば、Ronら(1993)は、3、8、または27N末端アミノ酸残基が失われているがヘパリン結合活性を有する改変KGFタンパク質を報告した。従って、本発明は配列番号170〜338、456〜560、785〜918のポリペプチドまたは寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるもののアミノ末端から1個以上の残基が欠失しているポリペプチドを提供する。同様に、生物学的に機能的なC末端欠失突然変異体の多数の例も知られている。例えば、インターフェロンγはタンパク質のC末端から810個のアミノ酸残基を欠失させることによって10倍までより高い活性を示す(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Dobeliら1988参照)。従って、本発明は配列番号170〜338、456〜560、785〜918の示される、または寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドのカルボキシ末端から1個以上の残基が欠失しているポリペプチドを提供する。本発明はまた以下に記載されるようにアミノおよびカルボキシル末端の双方から1個以上のアミノ酸が欠失しているポリペプチドも提供する。
【０２１７】
その他の突然変異
前記で論じられたタンパク質のNおよびC末端欠失型に加え、その他の突然変異体も本発明に含まれる。当業者ならば本発明のGENSETポリペプチドのいくつかのアミノ酸配列はタンパク質の構造または機能の重大な作用を伴わずに変化し得るということも理解するであろう。配列のかかる相異を考慮する場合には、タンパク質には活性を決定する重要な領域があるであろうということを念頭におかなくてはならない。従って、本発明はさらに実質的なGENSETポリペプチド活性を示すGENSETポリペプチドの変異を含む。かかる突然変異体としては活性に対してわずかな作用しか有さないよう当技術分野で公知の通則に従って選択される欠失、挿入、逆位、反復および置換が挙げられる。例えば、表現型的にはサイレントなアミノ酸置換の作製方法に関する指針が提供されている。
【０２１８】
アミノ酸配列の変更に対する許容度を研究するためには2つの主なアプローチがある(その全開示内容を参照により本明細書に組み入れるBowieら1994,参照)。第1の方法は進化のプロセスに依存するものであり、これでは突然変異は自然選択によって受け入れられるか、または拒絶される。
【０２１９】
第2のアプローチはクローニングされた遺伝子の特定の位置にアミノ酸変更を導入するための遺伝子操作と機能を維持する配列を同定するための選択またはスクリーニングとを用いる。これらの研究によりタンパク質はアミノ酸置換に驚くほど許容性があるということが示されている。この研究はタンパク質の特定の位置でどのアミノ酸変更が許容的であると考えられるかを示している。例えば、最も埋もれたアミノ酸残基には非極性側鎖が必要であるが、一般に、表面側鎖の特徴はあまり保存されない。その他のかかる表現型的にはサイレントな置換はBowieら(前記)およびそれに記載されている参照文献に記載されている。
【０２２０】
保存的置換として典型的に認められるものには脂肪族アミノ酸、Ala、Val、LeuおよびPheの中での互いの置換;ヒドロキシル残基SerおよびThrの交換、酸性残基AspおよびGluの交換、アミド残基AsnおよびGln間の置換、塩基性残基LysおよびArgの交換および芳香族残基Phe、Tyr間の置換がある。従って、本発明のポリペプチドの断片、誘導体、類似体または相同体は、例えば、(i)1個以上のアミノ酸残基が、保存または非保存アミノ酸残基(好ましくは保存アミノ酸残基)で置換されているものであって、かかる置換されたアミノ酸残基は遺伝コードによってコードされるものであっても、またはそうでなくともよい:または(ii)1個以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの:または(iii)GENSETポリペプチドがそのポリペプチドの半減期を増加する化合物(例えば、ポリエチレングリコール)などの別の化合物と融合しているもの:または(iv)IgG Fc融合領域ペプチドまたはリーダーもしくは分泌配列または前記の形態のポリペプチドの精製に用いられる配列またはプロタンパク質配列などの、さらなるアミノ酸が前記の形態のポリペプチドと融合しているものであってもよい。かかる断片、誘導体および類似体は本明細書における教示から当業者の範囲内にあると考えられる。
【０２２１】
従って、本発明のGENSETポリペプチドは天然突然変異またはヒトによる操作のいずれかに由来する1個以上のアミノ酸置換、欠失または付加を含み得る。示したように、変更はタンパク質の折りたたみまたは活性に対して大きく影響を及ぼさない保存的アミノ酸置換などの小さな性質のものであるのが好ましい。一般に、以下の群のアミノ酸は同等な変更に相当する:(1)Ala、Pro、Gly、Glu、Asp、Gln、Asn、Ser、Thr;(2)Cys、Ser、Tyr、Thr;(3)Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe;(4)Lys、Arg、His;(5)Phe、Tyr、Trp、His。
【０２２２】
本発明の目的の改変GENSETペプチド分子の特定の実施形態としては、限定されるものではないが、タンパク質分解に耐性のある、-CONH-ペプチド結合が改変されており、(CH2NH)還元型結合、(NHCO)レトロインベルソ結合、(CH2-O)メチレン-オキシ結合、(CH2-S)チオメチレン結合、(CH2CH2)カルバ結合、(CO-CH2)セトメチレン結合、(CHOH-CH2)ヒドロキシエチレン結合、(N-N)結合、E-アルセン結合または-CH=CH-結合で置換されているペプチドである、ペプチド分子が挙げられる。本発明はまた少なくとも1つのペプチド結合が前記のように改変されているヒトGENSETポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を包含する。
【０２２３】
本発明のGENSETタンパク質中の機能に必須であるアミノ酸は部位特異的突然変異誘発またはアラニンスキャンニング突然変異誘発(例えば、全開示内容を参照により本明細書に組み入れられる、Cunninghamら 1989参照)などの当技術分野で公知の方法によって同定すればよい。後者の手順では単一のアラニン突然変異を分子中のいずれの残基にも導入する。次いで、得られた突然変異体分子を特定のタンパク質の機能を測定するのに適当なアッセイを用いて生物活性について調べる。特に注目されるのは荷電アミノ酸のその他の荷電または中性アミノ酸での置換であり、これによりあまり凝集しないなどの極めて望ましい改良された特性を有するタンパク質が生じ得る。医薬製剤を製造する場合には、凝集は活性を低下させるだけでなく、凝集物が免疫原性であり得るために問題となる場合がある(例えば、 Pinckardら,1967;Robbinsら,1987およびClelandら,1993参照)。
【０２２４】
本発明のさらなる実施形態は少なくとも1つの保存的アミノ酸置換であるが50以下の保存的アミノ酸置換、40以下の保存的アミノ酸置換、30以下の保存的アミノ酸置換、20以下の保存的アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するGENSETポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドに関する。また、少なくとも1つであるが10、9、8、7、6、5、4、3、2または1以下の保存的アミノ酸置換を有するGENSETポリペプチドのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドも提供する。
【０２２５】
ポリペプチド断片
構造の定義
本発明はさらに配列番号170〜338、456〜560、785〜918のポリペプチドまたは寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるものなどの本明細書に記載されるアミノ酸配列の断片に向けられる。より詳しくは、本発明は配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列、寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドおよび本発明のその他のポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドの少なくとも6個、好ましくは少なくとも8〜10個、より好ましくは12、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100、125、150、175、200、225、250、275または300個の連続するアミノ酸を含んでなる精製された、単離されたおよび組換えポリペプチドを具現化する。
【０２２６】
前記のポリペプチド断片に加え、さらに好ましいポリペプチドの亜属は少なくとも6個のアミノ酸を含んでなり、ここで、「少なくとも6個」とは6と以下の配列表のポリペプチド配列をはじめとする本発明のポリペプチドのC末端アミノ酸に相当する数の間のいずれかの整数と定義される。N末端およびC末端位置という形でさらに特定される、前記のような少なくとも6アミノ酸の長さのポリペプチド断片種もさらに含まれる。本発明には前記のような少なくとも6アミノ酸の長さのすべてのポリペプチド断片が個々の種として含まれるが、特にN末端およびC末端位置によって特定され得る。すなわち、配列表のまたは本発明のいずれかの所定のアミノ酸配列上の、少なくとも6個の連続するアミノ酸残基の長さの断片が占め得るN末端およびC末端位置のどの組合せも本発明に含まれる。
【０２２７】
本発明はまた前記のようにアミノ酸残基の大きさによって特定されるいずれかの断片亜属のN末端およびC末端位置によって特定されるいずれの断片種も排除することを提供する。前記のように、N末端およびC末端位置またはアミノ酸残基の大きさによって特定されるいずれかの数の断片は個々の種として排除され得る。
【０２２８】
前記の本発明のポリペプチド断片は前の記載を用いてすぐに予想することができ、従って、単に明細書を不必要に長くしないために個々には列記しない。さらに、GENSET生物活性を有するポリペプチドが本発明の好ましい実施形態であるとしても、前記の断片はこれらの活性を持つ必要はないが、これはそれらが例えば、イムノアッセイにおいて、エピトープマッピング、エピトープタギングにおいて、ワクチンとしておよび分子量マーカーとして有用であろうためである。前記の断片はポリペプチドの特定の部分に対する抗体を作製するために用いてもよい。次いで、これらの抗体を当技術分野で周知のイムノアッセイに用いてヒトおよび非ヒト細胞および組織間を区別してもよいし、または生物学的サンプル中の細胞または組織が本発明のポリペプチドを発現する同一種のものであるかどうかを調べてもよい。
【０２２９】
本発明のポリペプチド断片の前記の種は、あるいは式「a〜b」(ここで「a」はポリヌクレオチドの最もN末端のアミノ酸の位置に等しく、かつ、「b」はポリヌクレオチドの最もC末端のアミノ酸の位置に等しく、さらに「a」は1と本発明のポリペプチド配列のアミノ酸数マイナス6の間の整数に等しく、かつ、「b」は7と本発明のポリペプチオド配列のアミノ酸数の間の整数に等しく、かつ、「a」は「b」より少なくとも6小さい整数である)で記載してもよいということを注記する。
【０２３０】
本発明はまた前記のように5'および3'位によって特定される本発明のポリペプチド断片のいずれかの種またはアミノ酸の大きさによって特定されるポリペプチドの亜属を排除することを提供する。前記のように5'および3'位によってまたはアミノ酸の大きさによって特定されるいずれの数の断片も排除され得る。
【０２３１】
機能の定義
ドメイン
本発明の好ましいポリヌクレオチド断片は本発明のポリペプチドのドメインである。かかるドメインは結局は、限定されるものではないが、ロイシンジッパー、へリックス・ターン・へリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位などの翻訳後修飾部位、αへリックスおよびβシート、コードされるタンパク質の分泌に向けるシグナルペプチドをコードするシグナル配列、ホメオボックス、酸性ストレッチ、酵素の活性部位、基質結合部位および酵素の切断部位などの転写調節と関係する配列をはじめとする直線状または構造モチーフおよびシグネチャーを含んでなり得る。かかるドメインはDNAまたはRNA結合、タンパク質の分泌、転写調節、酵素活性、基質結合活性等といった特定の生物活性を示し得る。
【０２３２】
一般にドメインは3個〜1000個の間のアミノ酸を含む大きさを有する。好ましい実施形態では、ドメインは6個〜200個の間のいずれかの整数である多数のアミノ酸を含んでなる。ドメインは本明細書に、特に「本発明のポリペプチド調製」と題される節において開示されるものをはじめとする当業者に公知のいずれかの方法を用いて合成してもよい。特定の生物活性を有するドメインを構成するアミノ酸を決定する方法としては突然変異誘発研究および調べられる生物活性を測定するアッセイが挙げられる。
【０２３３】
あるいは、本発明のポリペプチドは当業者に公知のいずれかのコンピューターによる方法を用いてデータベースにおいてモチーフ、ドメインおよび／またはシグネチャーについて調査してもよい。検索可能なデータベースとしてはProsite(Hofmannら,1999;BucherおよびBairoch 1994)、Pfam(Sonnhammerら,1997;Henikoffら, 2000;Batemanら,2000)、Blocks(Henikoffら,2000)、Print(Attwoodら,1996)、Prodom(SonnhammerおよびKahn,1994;Corpetら2000)、Sbase (Pongorら,1993;Murvaiら,2000)、Smart(Schultzら,1998)、Dali/FSSP(HolmおよびSander,1996, 1997および1999)、HSSP(SanderおよびSchneider 1991)、CATH(Orengoら, 1997;Pearlら,2000)、SCOP(Murzinら,1995;Lo Conteら,2000)、COG(Tatusovら,1997および2000)、特定のファミリーのデータベースおよびその誘導体(Nevill-Manningら, 1998;Yonaら, 1999;Attwoodら, 2000)が挙げられ、それらの全開示内容は各々参照により本明細書に組み入れられる。利用できるデータベースの概説については、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Nucleic Acid Research(2000)の28巻1号参照。
【０２３４】
本発明のドメインは好ましくは本発明のポリペプチドの6個〜200個のアミノ酸(すなわち、6〜200までの間のいずれかの整数)を含んでなる。また、整数6〜配列表の全長GENSET配列の間のドメイン断片も本発明に含まれる。整数6〜GENSETポリペプチドの全長配列の間の配列のすべての組合せが含まれる。ドメイン断片は本発明のポリペプチド断片について前記のように連続するアミノ酸残基数(亜属として)によってか、または特定のN末端およびC末端位置のいずれかによって(種として)特定され得る。本発明のいずれの数のドメイン断片も同様に排除され得る。
【０２３５】
エピトープおよび抗体融合物:
本発明の好ましい実施形態はエピトープ担持ポリペプチドおよびエピトープ担持ポリペプチド断片に向けられる。これらのエピトープは「抗原性エピトープ」であってもよいし、または「抗原性エピトープ」および「免疫原性エピトープ」の双方であってもよい。「免疫原性エピトープ」とは、ポリペプチドが免疫原である場合にin vivoで抗体応答を誘発するタンパク質の一部と定義する。他方、抗体が結合するポリペプチドの領域は「抗原決定基」または「抗原性エピトープ」と定義する。一般に、タンパク質の免疫原性エピトープ数は抗原性エピトープ数よりも少ない(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Geysenら,1984参照)。特定のエピトープは免疫原性ではない場合があるが、それにもかかわらず、抗体は免疫原性および抗原性エピトープの双方に対して作製できるので有用であるということを特に注記する。
【０２３６】
エピトープは空間的な立体配座においてエピトープに特有のわずか3個のアミノ酸を含んでなる場合もある。一般に、エピトープは少なくとも6個のかかるアミノ酸からなり、少なくとも8〜10個のかかるアミノ酸からなることのほうが多い。好ましい実施形態では、抗原性エピトープは3〜50の間のいずれかの整数である多数のアミノ酸を含んでなる。エピトープとして機能する断片はいずれかの従来の(例えば、Houghten,1985参照)、またさらに、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,631,21号に記載される手段によって作製すればよい。エピトープを構成するアミノ酸を決定する方法としてはX線結晶解析、二次元核磁気共鳴およびエピトープマッピング、例えばGeysenら(1984);PCT国際公開WO84/03564;およびPCT国際公開WO84/03506によって記載されるPepscan法が挙げられる(なお、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。もう1つの例としてはJamesonおよびWolf,(1988)のアルゴリズムがある(なお、かかる参考文献は参照によりその全体が組み入れられる)。Jameson-Wolf抗原性解析は、例えば、コンピュータープログラムPROTEANを用い、デフォルトパラメーター(バージョン4.0 Windows, DNASTAR, Inc., 1228 South Park Street Madison, WI)を用いて実施すればよい。
【０２３７】
本発明のエピトープ担持断片は本発明のポリペプチドの6〜50個のアミノ酸(すなわち、6から50までの間のいずれかの整数)を含んでなることが好ましい。また、整数6〜配列表の全長GENSET配列の間の抗原性断片も本発明に含まれる。整数6〜GENSETポリペプチドの全長配列の間の配列のすべての組合せが含まれる。エピトープ担持断片は本発明のポリペプチド断片について前記のように連続するアミノ酸残基の数によって(亜属として)または特定のN末端およびC末端位置によって(種として)のいずれかによって特定され得る。同様に、本発明のいずれの数のエピトープ担持断片も排除され得る。
【０２３８】
抗原性エピトープは例えば、エピトープと特異的に結合するモノクローナル抗体をはじめとする抗体作製するために有用である(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Wilsonら,1984およびSutcliffeら,1983参照)。次いで、抗体を本明細書に記載されるような診断および組織／細胞同定技術などの種々の技術に、ならびにイムノアフィニティークロマトグラフィーなどの精製方法に用いる。
【０２３９】
同様に、免疫原性エピトープは当技術分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために用いてもよい(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Sutcliffeら,前記;Wilsonら,前記;Chowら(1985);およびBittleら,(1985)参照)。好ましい免疫原性エピトープとしては天然GENSETタンパク質が挙げられる。免疫原性エピトープはアルブミンなどの担体タンパク質とともに動物系(ウサギまたはマウスなど)に対して提示してもよいし、または十分に長ければ(少なくとも約25個のアミノ酸)担体なしでもよい。しかしながら、わずか8〜10個のアミノ酸を含んでなる免疫原性エピトープが、最低限でも、変性したポリペプチド中の直線状エピトープと結合し得る(例えば、ウェスタンブロッティングにおいて)抗体を作製するのに十分であるということが示されている。
【０２４０】
本発明のエピトープ担持ポリペプチドは、限定されるものではないが、in vivo免疫化、in vitro免疫化およびファージディスプレイ法をはじめとする当技術分野で周知の方法に従って抗体を誘導するために用いる(例えば、Sutcliffeら,前記;Wilsonら,前記およびBittleら,前記参照)。in vivo免疫化を用いる場合には、動物を遊離ペプチドで免疫化すればよいが、ペプチドをスカシガイ(keyhole limpet)ヘモシアニン(KLH)または破傷風トキソイドなどの高分子担体と結合させることで抗ペプチド抗体力価をブーストしてもよい。例えば、システイン残基を含むペプチドは-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)などのリンカーを用いて担体と結合させればよく、他方、他のペプチドはグルタルアルデヒドなどのより一般的な架橋剤を用いて担体と結合させればよい。ウサギ、ラットおよびマウスなどの動物は遊離または担体結合型ペプチドのいずれかで、例えば、約100μgのペプチドまたは担体タンパク質およびフロイントのアジュバントを含有するエマルションの腹腔内および／または皮内注射によって免疫化する。例えば、固相表面に吸着させた遊離ペプチドを用いるELISAアッセイによって検出され得る、有用な力価の抗ペプチド抗体を準備するには、例えば、約2週間の間隔で、数回のブースター注射が必要であり得る。免疫化された動物由来の血清中の抗ペプチド抗体の力価は、例えば、当技術分野で周知の方法に従って固相支持体上のペプチドへ吸着させ、選択された抗体を溶出することによる抗ペプチド抗体の選択によって高めてもよい。
【０２４１】
当業者ならば分かるであろうし、前記でも論じたが、免疫原性または抗原性エピトープを含んでなる本発明のポリペプチドは異種ポリペプチド配列と融合させてもよい。例えば、本発明のポリペプチドを免疫グロブリン(IgA、IgE、IgG、IgM)の定常ドメインまたはその一部(CH1、CH2、CH3、全ドメインとその一部の双方を含むそのいずれかの組合せ)と融合してキメラポリペプチドを得てもよい。これらの融合タンパク質により精製が容易になり、またin vivoでの半減期の増大を示す。このことは例えば、ヒトCD4ポリペプチドの最初の2つのドメインおよび哺乳類免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常領域の種々のドメインからなるキメラタンパク質について示されている(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、EPA0,394,827;およびTrauneckerら,1988参照)。IgG部分のためにジスルフィド結合した二量体構造を有する融合タンパク質はその他の分子の結合および中和において単量体のポリペプチドまたはその断片単独よりもより効率的であり得る(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Fountoulakisら,1995参照)。前記のエピトープをコードする核酸はまた発現されたポリペプチドの検出および精製に役立つようエピトープタグとして目的の遺伝子と再結合させてもよい。
【０２４２】
本発明のさらなる融合タンパク質は遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エキソンシャッフリングまたはコドンシャッフリング(総称して「DNAシャッフリング」と呼ぶ)という技術によって作製してもよい。DNAシャッフリングは本発明のポリペプチドの活性をモジュレートし、それによってポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを効率的に作製するために用いてもよい。例えば、米国特許第5,605,793号;同第5,811,238号;同第5,834,252号;同第5,837,458号;およびPattenら,(1997);Harayama,(1998);Hanssonら(1999);ならびにLorenzoおよびBlasco,(1998)参照(これらの文書の各々は参照により本明細書に組み入れる)。ある実施形態では、本発明のコードポリヌクレオチドの、1種以上の構成要素、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片など、またはそれによってコードされるポリペプチドを1種以上の異種分子の1種以上の構成要素、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと再結合させてもよい。
【０２４３】
本発明はさらに本節に列挙されるポリペプチド断片のいずれの組合せも包含する。
【０２４４】
抗体
定義
本発明はさらに、ポリペプチドと、より詳しくは、本発明のポリペプチドのエピトープと特異的に結合する抗体およびT細胞抗原受容体(TCR)に関する。本発明の抗体としてはIgG(IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4をはじめとする)、IgA(IgA1およびIgA2をはじめとする)、IgD、IgE、またはIgMおよびIgYが挙げられる。「抗体」(Ab)とは少なくとも1つの結合ドメインから構成されるポリペプチドまたはポリペプチド群を指し、ここで、該結合ドメインは抗原の抗原決定基の特徴に相補的な内部表面の形状および電荷分布を有する3次元結合空間を形成する抗体分子の可変ドメインの折りたたみから形成され、これにより抗原との免疫学的反応が可能となる。本明細書において「抗体」とは、一本鎖全抗体をはじめとする全抗体およびその抗原結合性断片を含む。好ましい実施形態では、抗体は本発明のヒト抗原結合性抗体断片であり、限定されるものではないが、Fab、Fab' F(ab)2およびF(ab')2、Fd、一本鎖Fvs(scFv)、一本鎖抗体、ジスルフィド結合したFvs(sdFv)およびVLまたはVHドメインのいずれかを含んでなる断片が挙げられる。抗体は鳥類および哺乳類をはじめとする動物起源であってもよい。好ましくは抗体はヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマまたはニワトリである。
【０２４５】
一本鎖抗体をはじめとする抗原結合性抗体断片は可変領域を単独で、または以下のヒンジ領域、CH1、CH2およびCH3ドメインの全体または一部と組み合わせて含んでもよい。また、可変領域と、ヒンジ領域、CH1、CH2およびCH3ドメインとのいずれの組合せも本発明に含まれる。本発明はさらに本発明のポリペプチドと特異的に結合するキメラ、ヒト化ならびにヒトモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。本発明はさらに本発明の抗体に対して抗イディオタイプである抗体を含む。
【０２４６】
本発明の抗体は単一特異性、二重特異性および三重特異性であってもよいし、またはそれ以上に多特異性を有していてもよい。多特異性抗体は本発明のポリペプチドの種々のエピトープに特異的であってもよいし、または本発明のポリペプチドと異種ポリペプチドまたは固相支持体物質などの異種組成物との双方に特異的であってもよい。例えば、WO93/17715、WO92/08802、WO91/00360、WO92/05793、Tuttら(1991)、米国特許第5,573,920号、同第4,474,893号、同第5,601,819号、同第4,714,681号、同第4,925,648号、Kostelnyら(1992)参照(なお、これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
【０２４７】
本発明の抗体は、抗体によって認識されるまたは特異的に結合される、本発明のポリペプチドのエピトープまたはエピトープ含有部分によって記載または特定してもよい。抗体は本発明の核酸またはその断片によってコードされる完全なタンパク質と特異的に結合し得る。従って、エピトープまたはエピトープ含有ポリペプチド部分は、例えば、N末端およびC末端部位によって、連続するアミノ酸残基の長さによって、または本明細書に記載されるその他の形式(配列表をはじめとする)によって、本明細書に記載されるように特定され得る。いずれかの本発明のエピトープまたはポリペプチドと特異的に結合する抗体はまた、個々の種として排除され得る。従って、本発明は本発明の特定のポリペプチドと特異的に結合する抗体を含み、かつ、その排除も考慮する。
【０２４８】
従って、本発明のもう1つの実施形態は配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列からなる群から選択される配列を含んでなるポリペプチドと特異的に結合し得る精製または単離された抗体である。この実施形態のある態様では、抗体は配列番号170〜338、456〜560、785〜918および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列からなる群から選択される配列の少なくとも6個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10個の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50または100個の連続するアミノ酸を含んでなるエピトープ含有ポリペプチドと結合し得る。
【０２４９】
本発明の抗体はまたその交差反応性により記載または特定してもよい。本発明のポリペプチドのその他の類似体、オルソログまたは相同体のいずれとも特異的に結合しない抗体も含まれる。本発明のポリペプチドに対して95％未満である、90％未満である、85％未満である、80％未満である、75％未満である、70％未満である、65％未満である、60％未満である、55％未満であるおよび50％未満である同一性(当技術分野で公知であり、かつ、本明細書に記載される方法を用いて、例えば、本明細書に示されるFASTDBおよびパラメーターセットを用いて算出される)を有するポリペプチドと結合しない抗体も本発明に含まれる。さらに、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件(本明細書に記載されるような)下で本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドとのみ結合する抗体も本発明に含まれる。本発明の抗体はまたその結合親和性により記載または特定してもよい。好ましい結合親和性としては解離定数すなわちKdが5X10-6M、10-6M、5X10-7M、10-7M、5X10-8M、10-8M、5X10-9M、10-9M、5X10-10M、10-10M、5X10-11M、10-11M、5X10-12M、10-12M、5X10-13M、10-13M、5X10-14M、10-14M、5X10-15Mおよび10-15M未満のものが挙げられる。
【０２５０】
本発明はまた変異GENSETタンパク質または変異GENSETタンパク質のエピトープを含んでなるその断片もしくは変異体と特異的に結合し得る精製または単離された抗体に関する。
【０２５１】
抗体の調製
本発明の抗体は当技術分野で公知のいずれかの好適な方法によって調製すればよい。これらの方法のいくつかは「GENSETタンパク質に対する抗体組成物の調製」と題される実施例においてより詳細に記載されている。例えば、「ポリクローナル抗体」を含有する血清の産生を誘導するために本発明のポリペプチドまたはその抗原性断片を動物に投与してもよい。本明細書において「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されるものではなく、むしろ真核細胞クローン、原核細胞クローンまたはファージクローンをはじめとする単一のクローン由来の抗体を指すのであってそれが産生される方法を指すのではない。モノクローナル抗体はハイブリドーマ、組換え体およびファージディスプレー技術の使用をはじめとする当技術分野で公知の様々な技術を用いて調製すればよい。
【０２５２】
ハイブリドーマ技術としては当技術分野で公知のものが挙げられる(例えば、Harlowら,1988;Hammerlingら,1981参照)(この参照文献はその全体を参照により組み入れる)。FavおよびF(ab)'2断片は、例えば、ハイブリドーマによって産生された抗体から、パパイン(Fab断片を生成するために)またはペプシン(F(ab)'2断片を生成するために)などの酵素を用いてタンパク質分解切断によって製造してもよい。
【０２５３】
あるいは、本発明の抗体は組換えDNA技術の適用によって、または当技術分野で公知の方法を用いる合成化学によって製造してもよい。例えば、本発明の抗体は当技術分野で公知の種々のファージディスプレー法を用いて調製してもよい。ファージディスプレー法では、機能的抗体ドメインが、それをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子表面に提示される。所望の結合特性を有するファージを、抗原、典型的には固相表面もしくはビーズに結合または捕捉された抗原を用いて直接的に選択することにより、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー(例えば、ヒトまたはマウス)から選択する。これらの方法に用いるファージは典型的にはFab、Fvまたはジスルフィド安定化Fv抗体ドメインがファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIタンパク質のいずれかに組換えによって融合されているfdおよびM13をはじめとする繊維状ファージである。本発明の抗体作製に使用できるファージディースプレー法の例としてはBrinkmanら(1995);Amesら(1995);Kettleboroughら(1994);Persicら(1997);Burtonら(1994);PCT/GB91/01134;WO90/02809;WO91/10737;WO92/01047;WO92/18619;WO93/11236;WO95/15982;WO95/20401および米国特許第5,698,426号、同第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,580,717号、同第5,427,908号、同第5,750,753号、同第5,821,047号、同第5,571,698号、同第5,427,908号、同第5,516,637号、同第5,780,225号、同第5,658,727号および同第5,733,743号に開示されるものが挙げられる(これらの参照文献はその全体が参照により組み入れられる)。
【０２５４】
前記の参照文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージから抗体コード領域を単離し、それを、ヒト抗体を含む全抗体またはその他の任意の所望の抗原結合性断片を生成するために用いて、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌をはじめとする任意の所望の宿主において発現させてもよい。例えば、WO92/22324;Mullinaxら(1992)およびSawaiら(1995)およびBetterら(1988)(これらの参照文献はその全体が参照により組み入れられる)に開示されるものなどの当技術分野で公知の方法を用いて、Fab、Fab’ F(ab)2およびF(ab')2断片を組換えにより産生する技術も用いることができる。
【０２５５】
一本鎖Fvsおよび抗体を製造するために使用できる技術の例としては米国特許第4,946,778号および同第5,258,498号;Hustonら(1991);Shuら(1993)およびSkerra(1988)（これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されるものが挙げられる。ヒトにおける抗体のin vivoでの使用およびin vitro検出アッセイをはじめとするいくつかの使用のためには、キメラ、ヒト化またはヒト抗体を用いることが好ましい場合もある。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野では公知である。例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Morrison(1985);Oiら(1986);Gilliesら(1989)および米国特許第5,807,715号参照。抗体は、CDRグラフティング(EP0 239 400;WO91/09967;米国特許第5,530,101号および同第5,585,089号)、化粧張り法(veneering)または表面加工法(resurfacing)(EP0 592 106;EP0 519 596;Padlan,1991;Studnickaら,1994;Roguskaら,1994)およびチェーン・シャッフリング法(chain shuffling)(米国特許第5,565,332号)をはじめとする種々の技術を用いてヒト化してもよい(なお、これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。ヒト抗体は前記のファージ・ディスプレー法をはじめとする当技術分野で公知の種々の方法によって作製すればよい。米国特許第4,444,887号、同第4,716,111号、同第5,545,806号および同第5,814,318号;WO98/46645;WO98/50433;WO98/24893;WO96/34096;WO96/33735およびWO91/10741も参照(これらの参照文献はその全体が参照により組み入れられる)。
【０２５６】
本発明のポリペプチドと組換えにより融合した、または化学的に結合した(共有および非共有結合の双方を含む)抗体も本発明にさらに含まれる。この抗体は本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であってもよい。例えば、本発明の抗体は、異種ポリペプチド、薬剤または毒素などの検出アッセイにおいて標識として有用な分子およびエフェクター分子と、組換えにより融合してもよいしまたは結合してもよい。例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、WO92/08495; WO91/14438; WO89/12624;米国特許第5,314,995号およびEP 0 396 387参照。融合した抗体はまた、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面受容体に特異的な抗体と融合または結合することによって、in vitroまたはin vivoのいずれかで本発明のポリペプチドを特定の細胞型へと標的化するために用いてもよい。本発明のポリペプチドと融合または結合された抗体はまた当技術分野で公知の方法を用いるin vitro免疫アッセイおよび精製法に用いてもよい(例えば、Harborら,前記;WO93/21232;EP0 439 095;Naramura, M.ら1994;米国特許第5,474,981号;Gilliesら,1992;Fellら,1991参照)(これらの参照文献はその全体が参照により組み入れられる)。
【０２５７】
本発明は可変領域以外の抗体ドメインと融合または結合した本発明のポリペプチドを含んでなる組成物をさらに含む。例えば、本発明のポリペプチドは抗体Fc領域またはその一部と融合または結合させてもよい。本発明のポリペプチドと融合される抗体部分はヒンジ領域、CH1ドメイン、CH2ドメインおよびCH3ドメイン、または全ドメインもしくはその一部のいずれかの組合せを含んでもよい。本発明のポリペプチドはポリペプチドのin vivo半減期を延長するために、または免疫アッセイに用いるために、当技術分野で公知の方法を用いて前記の抗体部分と融合または結合してもよい。本ポリペプチドはまた多量体を形成するために前記の抗体部分と融合または結合してもよい。例えば、本発明のポリペプチドに融合されたFc部分はFc部分間のジスルフィド結合を介して二量体を形成し得る。ポリペプチドをIgAおよびIgMの一部分と融合することでより高度の多量体型を作製してもよい。本発明のポリペプチドを抗体の一部分と融合または結合する方法は当技術分野では公知である。例えば、米国特許第5,336,603号、同第5,622,929号、同第5,359,046号、同第5,349,053号、同第5,447,851号、同第5,112,946号;EP0 307 434、EP0 367 166;WO96/04388、WO91/06570;Ashkenaziら(1991);Zhengら(1995)およびVilら(1992) 参照(これらの参照文献はその全体が参照により組み入れられる)。
【０２５８】
野生型であろうとトランスジェニックであろうと、抗体結合させることが望まれる対象とは異なる種のGENSETを発現する非ヒト動物または哺乳類、およびGENSETを発現しない動物(すなわち、本明細書に記載されるGENSETノックアウト動物)は抗体を製造するのに特に有用である。GENSETノックアウト動物はGENSETタンパク質の露出領域の全体またはほとんどを外来抗原として認識し、従って、より広範なGENSETエピトープを用いて抗体を産生する。さらに、10〜30個のアミノ酸のみを含むより小さなポリペプチドもGENSETタンパク質のいずれかの1種に対する特異的結合を得るのに有用であり得る。さらに、抗原性配列と類似するGENSET種を産生する動物の体液性免疫系は、好ましいことに、動物の天然のGENSET種とその抗原配列間の相異を認識して抗原配列中のそれらの独特の部位に対する抗体を産生する。かかる技術はGENSETタンパク質のいずれか1種と特異的に結合する抗体を得るのに特に有用である。
【０２５９】
本発明の抗体は、例えば、当技術分野で公知の放射性、蛍光または酵素標識のうちの任意のものによって標識してもよい。
【０２６０】
ポリヌクレオチドの使用
試薬としてのポリヌクレオチドの使用
本発明のポリヌクレオチド、特に「オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ」の節に記載のものは、単離方法、診断アッセイ、および法医学的方法における試薬として使用することができる。例えば、本発明のGENSETポリヌクレオチドの配列を、検出可能なように標識し、プローブとして使用してそれらとのハイブリダイズが可能なその他の配列を単離することができる。さらに、本発明のGENSETポリヌクレオチド由来の配列を使用して単離、診断、または法医学的方法において用いるPCRプライマーを設計することもできる。
【０２６１】
法医学的分析に関して
PCRプライマーは以下で記載するDNAフィンガープリント法などの法医学的分析において使用されうる。かかる分析では本発明のポリヌクレオチドの配列に基づく検出可能なプローブまたはプライマーを使用することができる。よって、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを法医学的分析に使用して個体を識別する方法であって、
a)個体から核酸材料を含む生体サンプルを取得し、
b)本発明のポリヌクレオチドを使用して、特にGENSETプライマーおよびプローブを使用して、この個体の識別パターンを得、
c)前記の識別パターンを参照識別パターンと比較し、そして
d)前記の識別パターンが前記の参照識別パターンと同一であるかどうかを判定する
ステップを含んでなる方法を包含する。
【０２６２】
本方法のある実施形態では、識別パターンは「DNA配列決定による法医学的マッチング」および「DNA配列決定による陽性識別法」と題した節で記述するように、GENSETプライマーを用いて得られるアンプリコンの配列に存在する。
【０２６３】
もう1つの実施形態では、識別パターンは「サザンブロット法医学的識別」、「ドットブロット識別手順」、および『代替的「フィンガープリント（指紋）」識別技術』と題した節に記載のいずれかの方法を用いて得られる固有のバンドまたはドットパターンに存在する。
【０２６４】
表Iでは本発明の一連の関連cDNA、例えば、単一配列の対立遺伝子変異を表す配列を示している。かかる変異体は本明細書に記載した法医学的分析用に特に有用であり、さらに、例えば、本明細書に記載のGENSET遺伝子と種々の疾病または疾病状態との間にある関連を調べる多型マーカーとしても有用である。
【０２６５】
DNA配列決定による法医学的マッチング
ある典型的な方法では、DNAサンプルを、例えば、毛髪、精液、血液または皮膚細胞である法医学的試料から従来の方法により単離する。次いで、本明細書に記載のものををはじめとする当業者に公知のいずれかの技術を用いて異なる本発明のポリヌクレオチドから設計された一群のPCRプライマーを使用して、法医学的試料から約100〜200塩基長のDNAを増幅させる。対応する配列を被験体から取得する。次いで、これらの鑑定用DNAの各々を標準技術を用いて配列決定し、単純なデータベース比較により被験体由来の配列とサンプル由来のものとの間に違いがあればその違いを決定する。被験体のDNA配列とサンプルDNA配列との間での統計学的有意差によって、同一でないことが決定的に立証される。このように同一でないことは、例えば、たった1つの配列により立証することができる。しかしながら、同一性は数多くの配列を用いて全て一致することにより、証明すべきである。 好ましくは、100塩基長の統計学的に同一である配列を、最低で50個の使用して、被疑体とサンプルとが同一であることの立証を行う。
【０２６６】
DNA配列決定による陽性識別法
また、本明細書に記載の「DNA配列決定による法医学的マッチング」技術をより大規模に使用して任意の個体の固有のフィンガープリント型による識別を提供し得る。この技術では、数多くの本発明のポリヌクレオチドからプライマーを作製する。好ましくは、20〜50個の異なるプライマーを使用する。これらのプライマーを使用して当該の個体から対応する数のPCRにより作製されたDNAセグメントを取得する。これらのDNAセグメントの各々を配列決定する。この手順により作製された配列のデータベースにより、その配列を提供した個体を一意的に識別する。そして、その後の任意の時点において、同じ一群のプライマーを使用して組織またはその他の生体サンプルとその個体とを完全に関連付けることができる。
【０２６７】
サザンブロット法医学的識別
本明細書に記載の「DNA配列決定による陽性識別法」手順を繰り返して、個体および試料から少なくとも10個の増幅配列の一群を取得する。好ましくは、その一群に少なくとも50個の増幅配列が含まれる。より好ましくは、その一群に100個の増幅配列が含まれる。いくつかの実施形態では、その一群に200個の増幅配列が含まれる。次いで、このPCRにより作製されたDNAを、好ましくは、4塩基特異的制限酵素の1種または組合せを用いて消化する。かかる酵素は商業的に入手可能であり、当業者には公知である。消化後、得られた遺伝子断片をアガロースゲルでの多重複製(multiple duplicate)ウェルでサイズ分離し、当業者に周知のサザンブロット法を用いてニトロセルロースに転写する。サザンブロット法の概説については、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるDavisら (1986)を参照。
【０２６８】
本発明のポリヌクレオチド、またはその少なくとも10塩基からなる断片の配列に基づくプローブの一群を、ニックトランスレーション法または末端標識などの当技術分野で公知の方法を用いて放射性標識または色素標識して、当技術分野で公知の技術を用いてサザンブロットとハイブリダイズさせる。好ましくは、プローブが本発明のポリヌクレオチド由来の少なくとも12、15、または17個連続したヌクレオチドを含んでなる。より好ましくは、プローブが本発明のポリヌクレオチド由来の少なくとも20〜30個連続したヌクレオチドを含んでなる。一部の実施形態では、プローブが本発明のポリヌクレオチド由来の30個を超えるヌクレオチドを含んでなる。他の実施形態では、プローブが本発明のポリヌクレオチド由来の少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも75個、少なくとも100個、少なくとも150個、または少なくとも200個連続したヌクレオチドを含んでなる。
【０２６９】
好ましくは、これらの標識されたプローブを少なくとも5〜10種使用して、より好ましくは少なくとも約20種または30種使用して、固有のパターンを得る。本発明のポリヌクレオチドの大量サンプルのハイブリダイゼーションの結果として現れるバンドは、固有の識別子である。制限酵素による切断は個体によって異なるため、サザンブロットでのバンドパターンもまた固有のものである。cDNAプローブ数を増やすと識別に使用される一連のバンド数が増えるため、識別における統計学的な信頼水準が高まる。
【０２７０】
ドットブロット識別手順
本明細書に開示したポリヌクレオチド配列を用いて個体を識別するためのもう1つの技術では、ドットブロットハイブリダイゼーション法を利用する。
【０２７１】
ゲノムDNAを、識別しようとする被験体の核から単離する。本発明のポリヌクレオチド由来の少なくとも10、好ましくは50の配列に対応する約30bpの長さを有するオリゴヌクレオチドプローブを合成する。プローブを使用して当業者に公知の条件によりゲノムDNAとハイブリダイズさせる。ポリヌクレオチドキナーゼ(Pharmacia)を用いてオリゴヌクレオチドを32Pで末端標識する。真空ドットブロットマニホールド(BioRad, Richmond California)を用いてゲノムDNAをニトロセルロースなどにスポットすることにより、ドットブロットを作製する。当技術分野で公知の技術を用いて、ゲノム配列を含むニトロセルロースフィルターを焼き付けるかまたはフィルターにUV固定し、プレハイブリダイズし、標識プローブとハイブリダイズさせる(Davisら 1986)。32P標識したDNA断片を引き続きストリンジェントな条件で連続してハイブリダイズして30bp配列とDNAとの間にある微小な差を検出する。塩化テトラメチルアンモニウムは少数のヌクレオチドミスマッチを含むクローンを同定するのに有用である(Woodら, 1985)。ドットの固有のパターンにより、ある個体と別の個体とを識別する。
【０２７２】
代替的「フィンガープリント（指紋）」識別技術
典型的な代替フィンガープリント法ではプローブをcDNAから誘導する。好ましくは、異なる遺伝子由来の配列を有する複数のプローブを以下のように使用する。これらの配列由来の少なくとも10個連続した塩基を有するポリヌクレオチドをプローブとして使用することができる。好ましくは、プローブが本発明のポリヌクレオチド由来の少なくとも12、15、または17個連続したヌクレオチドを含んでなる。より好ましくは、プローブが本発明のポリヌクレオチド由来の少なくとも20〜30個連続したヌクレオチドを含んでなる。一部の実施形態では、プローブが本発明のポリヌクレオチド由来の30個を超えるヌクレオチドを含んでなる。他の実施形態では、プローブが本発明のポリヌクレオチド由来の少なくとも40個、少なくとも50個、少なくとも75個、少なくとも100個、少なくとも150個、または少なくとも200個連続したヌクレオチドを含んでなる。
【０２７３】
オリゴヌクレオチド、一般に20量体はGenset(Paris, France)などの商業的に利用可能なオリゴヌクレオチドサービスを利用して多数の、例えば、50、100、または200種の本発明のポリヌクレオチドから作製する。被験体からの細胞サンプルは当業者に周知の技術を用いてDNA用に処理する。核酸をEcoRIおよびXbaIなどの制限酵素で消化する。消化に続き、サンプルを電気泳動用のウェルに適用する。当技術分野で公知の手順をポリアクリルアミド電気泳動に適合するよう改変してもよいが、この例では5μgのDNAを含むサンプルをウェルに負荷し、0.8%アガロースゲルで分離させる。ゲルは標準サザンブロット技術を用いてニトロセルロースに転写する。
【０２７４】
各オリゴヌクレオチドを10ngずつプールし、32Pで末端標識する。ニトロセルロースをブロッキング液とともにプレハイブリダイズし、次いで、標識プローブとともにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った後、ニトロセルロースフィルターをX-Omat AR X線フィルムに露光する。得られたハイブリダイゼーションパターンは各個体に固有のものであると考えられる。
【０２７５】
さらに、この例では、さらなる精度または明瞭性を目的として、使用するプローブ配列の数を変更することも意図される。
【０２７６】
対応するゲノムDNA配列の探索
また、本発明のGENSET cDNAを使用して、対応するゲノムDNAにおいて本発明のcDNAの上流に位置する配列をクローニングすることができる。かかる上流配列は遺伝子発現を調節することが可能であり、プロモーター配列、エンハンサー配列、および転写または翻訳レベルに影響を及ぼすその他の上流配列が含まれる。ひと度、同定してクローニングすれば、これらの上流調節配列は挿入された遺伝子の発現を所望の空間的、時間的、発生的、または定量的様式で指令するよう設計される発現ベクターにおいて使用できる。
【０２７７】
ゲノムDNAから上流配列をクローニングするためのcDNAまたはその断片の使用
本発明のポリヌクレオチドから得られる配列は染色体ウォーキング法を用いた対応する遺伝子のプロモーターの単離に用いることができる。Clontechから入手可能なGenomeWalker(商標)キットを使用する、ある染色体ウォーキング法では、5つの完全ゲノムDNAサンプルを各々、6塩基認識部位を有し、かつ平滑末端を生じる異なる制限酵素で消化する。消化後、オリゴヌクレオチドアダプターを得られたゲノムDNA断片の各末端に連結する。
【０２７８】
5つのゲノムDNAライブラリーの各々について、キットにて提供される外側アダプタープライマーおよび外側遺伝子特異的プライマーを用いて製造業者の説明書(参照により本明細書に組み入れられる)に従って第1のPCR反応を実施する。遺伝子特異的プライマーは目的の本発明のポリヌクレオチドに特異的となるよう選択すべきであり、かつ、PCR反応におけるその使用と合致する融解温度、長さ、および本発明のポリヌクレオチドにおける位置を有しているべきである。各々の第1のPCR反応は、全容量50μl中に、5ngのゲノムDNA、5μlの10X Tth反応バッファー、0.2mMの各dNTP、0.2μMの各外側アダプタープライマーおよび外側遺伝子特異的プライマー、1.1mMのMg(OAc)2、ならびに1μlのTthポリメラーゼ 50Xミックスを含む。第1のPCR反応の反応サイクルは以下のとおりである: 94℃で1分/94℃で2秒、72℃で3分(7サイクル)/94℃で2秒、67℃で3分(32サイクル)/67℃で5分。
【０２７９】
第1のPCR反応の産物を希釈し、第1のPCR反応により得られたアンプリコンの内部に位置するネステッド(nested)プライマー対を用いて製造業者の説明書に従って第2のPCR反応の鋳型として使用する。例えば、第1のPCR反応混合物の反応産物5μlを180倍に希釈する。ネステッドプライマーを使用すること以外、第1のPCR反応のものと同じ組成を有する50μl容量で反応させる。第1のネステッドプライマーはアダプターに特異的であり、GenomeWalker(商標)キットで提供される。第2のネステッドプライマーは、そのプロモーターをクローニングすべき本発明の特定のポリヌクレオチドに特異的であり、PCR反応におけるその使用と合致する融解温度、長さ、および本発明のポリヌクレオチドにおける位置を有しているべきである。第2のPCR反応の反応パラメーターは以下のとおりである: 94℃で1分/94℃で2秒、72℃で3分(6サイクル)/94℃で2秒、67℃で3分(25サイクル)/67℃で5分。
【０２８０】
第2のPCR反応の産物を精製し、クローニングし、次いで、標準技術を用いて配列決定する。あるいは、2つ以上のヒトゲノムDNAライブラリーを2種以上の制限酵素を使用することによって構築することができる。消化されたゲノムDNAは、一本鎖、環状、または直鎖DNAに変換されうるベクターにクローニングする。本発明のポリヌクレオチド配列由来の少なくとも15ヌクレオチドを含んでなるビオチン化オリゴヌクレオチドを一本鎖DNAとハイブリダイズさせる。ビオチン化オリゴヌクレオチドと本発明のポリヌクレオチド配列を含む一本鎖DNAとのハイブリッドを本明細書に記載のように単離する。その後、本発明のポリヌクレオチド配列を含む一本鎖DNAをビーズから解離させ、本発明のポリヌクレオチド配列に特異的なプライマーまたはクローニングベクターに含まれる配列に対応するプライマーを用いて二本鎖DNAに変換する。得られた二本鎖DNAを細菌中へ形質転換する。GENSETポリヌクレオチド配列を含むDNAをコロニーPCRまたはコロニーハイブリダイゼーションによって同定する。
【０２８１】
クローニングした上流配列内にあるプロモーターの同定
ひと度、前記のように上流ゲノム配列をクローニングし、配列決定すれば、上流配列内の推定プロモーターおよび転写開始部位が本発明のポリヌクレオチドの上流にある配列を既知の転写開始部位、転写因子結合部位、またはプロモーター配列を含むデータベースと比較することによって同定することができる。
さらに、上流配列内にあるプロモーターは、プロモーターリポーターベクターを用いて以下のようにして同定することができる。GENSET遺伝子の第1のエクソンの上流に位置するGENSETプロモーター領域の調節活性をもつポリヌクレオチド断片または変異体の制御下におかれている場合には、リポーター遺伝子の発現が検出される。GENSETプロモーター配列をクローニングし得る好適なプロモーターリポーターベクターとしては、Clontechから入手可能なpSEAP-Basic、pSEAP-Enhancer、pβgal-Basic、pβgal-Enhancer、またはpEGFP-1プロモーターリポーターベクター、またはPromegaのpGL2-basicまたはpGL3-basicプロモーターレスルシフェラーゼリポーター遺伝子ベクターが挙げられる。簡潔に説明すると、これらのプロモーターリポーターベクターは各々、分泌されるアルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、または緑色蛍光タンパク質などの容易にアッセイできるタンパク質をコードするリポーター遺伝子の上流に位置するマルチクローニング部位を含む。GENSETコード領域上流の配列はリポーター遺伝子の上流にあるクローニング部位に両方の方向性で挿入され、さらに好適な宿主細胞に導入される。リポータータンパク質のレベルをアッセイし、さらにクローニング部位にインサートを含まないベクターから得られたレベルと比較する。対照ベクターに関して、インサートを含むベクターに発現レベルの上昇が認められれば、インサート内にプロモーターが存在することが示される。必要であれば、上流配列を、弱いプロモーター配列からの転写レベルを高めるためのエンハンサーを含むベクター中にクローニングすることができる。インサートを含まないベクターで前記の発現が高レベルで観察されることにより、挿入した上流配列内にプロモーター配列が存在することが示される。
上流ゲノムDNA内のプロモーター配列は部位特異的突然変異誘発法、リンカースキャニング解析、または当業者に一般的なその他の技術によってさらに特徴付けることができる。例えば、エクソヌクレアーゼIIIまたは好適な制限エンドヌクレアーゼ消化などの従来の技術を用いて上流DNAにネステッド 5'および／または3'欠失を作製することによってプロモーターの境界をさらに調べてもよい。例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるColesら(1998)に記載のようにして、得られた欠失断片をプロモーターリポーターベクターに挿入して、その欠失によってプロモーター活性が上昇したか、低下したか、またははっきりしたかを調べることができる。このようにして、プロモーターの境界を規定することができる。望ましい場合には、プロモーター内の可能性のある個々の調節部位を部位特異的突然変異誘発法またはリンカースキャニング法を用いて同定し、プロモーター内の可能性のある転写因子結合部位を個々にまたは組み合わせて消失させてもよい。これらの突然変異による転写レベルへの影響はその突然変異をプロモーターリポーターベクター中のクローニング部位に挿入することによって調べることができる。この種のアッセイは当業者には周知のものであり、WO97/17359、米国特許第5,374,544号; EP 582 796; 米国特許第5,698,389号; 同第5,643,746号; 同第5,502,176号; および同第5,266,488号（これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【０２８２】
各GENSET遺伝子のプロモーターの強度および特異性は、異なる種類の細胞および組織におけるGENSETプロモーターに機能し得る形で連結された検出可能なポリヌクレオチドの発現レベルによって評価することができる。検出可能なポリヌクレオチドは所定のオリゴヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはGENSETポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を含む検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれかであり得る。この種のアッセイは当業者には周知のものであり、米国特許第5,502,176号; および同第5,266,488号（これらの全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。これらの方法のいくつかは本願の他の箇所でより詳細に説明している。
【０２８３】
本発明のポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーターおよびその他の調節配列は、挿入された遺伝子の発現を所望の空間的、時間的、発生的、または定量的様式で指令し得る発現ベクターを設計するのに使用することができる。所望の空間的、時間的、発生的、および定量的パターンを指令し得るプロモーターは本明細書に記載の発現解析の結果を用いて選択することができる。例えば、筋肉内で高レベルの発現を与えるプロモーターが望ましい場合、筋肉内で高レベルに発現されるmRNAから誘導した本発明のポリヌクレオチドの上流にあるプロモーター配列を発現ベクターに使用することができる。かかるベクターについては本願の他の箇所で詳細に説明している。
【０２８４】
好ましくは、挿入された遺伝子の発現をプロモーターが駆動し得るように、所望のプロモーターを多重制限部位近くに配置して所望のインサートを該プロモーターの下流へクローニングすることを容易にする。プロモーターを染色体外複製、宿主染色体への組込みまたは一時的発現のために設計された通常の核酸主鎖に挿入してもよい。本発現ベクター用の好適な主鎖としては、レトロウイルス主鎖、SV40またはウシ乳頭腫ウイルスなどの真核生物エピソーム由来の主鎖、細菌エピソーム由来の主鎖、または人工染色体が挙げられる。
【０２８５】
好ましくは、発現ベクターは、該発現ベクターに挿入された遺伝子から転写されたmRNAのポリアデニル化を指令する、多重制限部位の下流のポリA シグナルをさらに含む。
【０２８６】
類似配列の探索
本発明のポリヌクレオチドを使用し、それに類似した核酸を、本節で記載するハイブリダイゼーションまたは増幅に基づく技術をはじめとする当業者に周知のいずれかの方法を用いて単離および／または精製することができる。これらの方法を用いて、GENSET cDNAが誘導されるmRNAをコードするゲノムDNA、GENSET cDNAsに対応するmRNA、またはGENSET cDNAもしくはその断片と相同である、核酸（変異体、種相同体またはオルソログなど）が得られる。このように、GENSETポリヌクレオチドに類似した複数のcDNAはコードされるタンパク質のその後の評価のためにcDNAライブラリーとして提供してもよいし、または本明細書に記載の診断アッセイに使用してもよい。本明細書に記載のいずれかの方法によって作製されたcDNAはその後、サブクローニング、PCR、またはin vitro オリゴヌクレオチド合成などの従来の技術を用いて操作し、cDNAの所望の断片を含む核酸を取得することができる。例えば、当業者に公知の技術を用いて、コード配列のみを含む核酸を取得することができる。同様に、コードされるタンパク質に対するコード配列のその他の所望の断片を含む核酸を取得することができる。
【０２８７】
実際、本発明のcDNAまたはその断片を使用して、cDNAライブラリーまたはゲノムDNAライブラリーからcDNAに類似した核酸を単離し得る。かかるcDNAライブラリーまたはゲノムDNAライブラリーは商業的供給元から入手してもよいし、またはPCT公報WO00/37491（全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる）に記載のものなどの当業者に一般的な技術を用いて作製してもよい。GENSETポリヌクレオチドに類似した核酸を取得するための方法の例を以下に記載している。
【０２８８】
ハイブリダイゼーションに基づく方法
所定のプローブ配列とハイブリダイズするcDNAライブラリー中のcDNAクローンを同定するための技術については、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Sambrookら, (1989)ならびにHamesおよびHiggins (1985)に開示されている。その技術を用いてゲノムDNAを単離することができる。
【０２８９】
簡潔に説明すると、検出可能なプローブとハイブリダイズするcDNAまたはゲノムDNAクローンを同定し、それをさらなる操作に向けて以下のように単離する。本発明のポリヌクレオチド断片はいずれもプローブ、特に「オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ」の節で定義したものとして、使用することができる。GENSET cDNAまたはその断片由来の少なくとも10個連続したヌクレオチドを含むプローブを放射性同位元素または蛍光分子などの検出可能な標識で標識する。好ましくは、プローブがcDNAまたはその断片由来の少なくとも12、15、または17個連続したヌクレオチドを含んでなる。より好ましくは、プローブがcDNAまたはその断片由来の20〜30個連続したヌクレオチドを含んでなる。一部の実施形態では、プローブがcDNAまたはその断片由来の30個を超えるヌクレオチドを含んでなる。
【０２９０】
プローブを標識するための技術は周知であり、ポリヌクレオチドキナーゼによるリン酸化、ニックトランスレーション法、in vitro転写、および非放射性技術が挙げられる。ライブラリー中のcDNAまたはゲノムDNAをニトロセルロースまたはナイロンフィルターに転写して変性させる。フィルターを、非特異的部位をブロッキングした後、標識したプローブとともに、そのプローブとそれとハイブリダイズし得る配列を含むcDNAまたはゲノムDNAとが結合するのに十分な長さの時間にわたり、インキュベートする。
【０２９１】
検出可能なプローブとハイブリダイズするcDNAまたはゲノムDNAの同定に使用するハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを変えることによって、そのプローブと様々なレベルの同一性を有するcDNAまたはゲノムDNAを以下のように同定し、単離することができる。
【０２９２】
ストリンジェントな条件
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、あるプローブとの高レベルの同一性を有する核酸だけが前記のプローブとハイブリダイズできる条件として定義される。これらの条件は以下のようにして算出することができる。
【０２９３】
14〜70ヌクレオチド長のプローブについては、融解温度(Tm)は、以下の式:
Tm=81.5+16.6(log(Na+))+0.41(G+Cの割合)-(600/N)
(式中、Nはプローブの長さである)
を用いて算出される。
【０２９４】
ハイブリダイゼーションをホルムアミドを含有する溶液中で実施する場合、融解温度は以下の式:
Tm=81.5+16.6(log(Na+))+0.41(G+Cの割合)-(0.63%ホルムアミド)-(600/N)
(式中、Nはプローブの長さである)
を用いて算出することができる。
【０２９５】
プレハイブリダイゼーションは6X SSC、5X デンハルト試薬、0.5%SDS、100μg変性断片化サケ精子DNAまたは6X SSC、5X デンハルト試薬、0.5%SDS、100μg変性断片化サケ精子DNA、50%ホルムアミド中で実施することができる。SSCおよびデンハルト溶液の調製法についてはSambrookら, 1986に記載されている。
【０２９６】
ハイブリダイゼーションは前掲のプレハイブリダイゼーション溶液に、検出可能なプローブを添加して実施する。プローブが二本鎖DNAを含む場合、ハイブリダイゼーション溶液に添加する前にプローブを変性させる。フィルターを、プローブがそれと相補的なまたはそれと相同な配列を含む核酸とハイブリダイズするのに十分な時間にわたり、ハイブリダイゼーション溶液と接触させる。200ヌクレオチドを超える長さのプローブについては、ハイブリダイゼーションをTmより15〜25℃低い温度で実施することができる。オリゴヌクレオチドプローブなどの比較的短いプローブについては、ハイブリダイゼーションをTmより15〜25℃低い温度で実施することができる。好ましくは、6X SSC中でのハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーションを約68℃で実施する。好ましくは、50%ホルムアミド含有溶液中でのハイブリダイゼーションでは、ハイブリダイゼーションを約42℃で実施する。
ハイブリダイゼーション後に、フィルターを室温で15分間、2X SSC、0.1%SDS中で洗浄する。次いで、このフィルターを室温で30分〜1時間、0.1X SSC、0.5%SDSにより洗浄する。その後、溶液をハイブリダイゼーション温度で、0.1X SSC、0.5%SDS中で洗浄する。室温で、0.1X SSC中で最終洗浄を行う。
【０２９７】
プローブとハイブリダイズした核酸は、オートラジオグラフィーまたはその他の従来の技術により同定する。
【０２９８】
低度および中度の条件
ハイブリダイゼーションおよびシグナル検出のストリンジェンシーの変更は主としてホルムアミド濃度(ホルムアミドのパーセンテージが低いほど低ストリンジェンシーとなる); 塩条件、または温度を操作することによって果たされる。そのため、前記の手順を改変してプローブ配列との同一性レベルが順次低下した核酸を同定することができる。例えば、約1Mのナトリウム濃度を有するハイブリダイゼーションバッファー中でハイブリダイゼーション温度を68℃から42℃まで5℃刻みで下げてもよい。ハイブリダイゼーション後、フィルターをハイブリダイゼーション温度で2X SSC、0.5%SDSにより洗浄してもよい。これらの条件は50℃を超えると「中度」の条件、50℃より低いと「低度」の条件としてみなされる。あるいは、ハイブリダイゼーションをホルムアミドを含有する6X SSCなどのバッファー中、42℃の温度で実施してもよい。この場合、ハイブリダイゼーションバッファー中のホルムアミド濃度を50%から0%まで5%刻みで下げてプローブとの同一性レベルが順次低下したクローンを同定することができる。ハイブリダイゼーション後、フィルターを50℃で6X SSC、0.5%SDSにより洗浄してもよい。これらの条件は、ホルムアミドが25％を上回れば「中度」の条件、ホルムアミドが25％を下回れば「低度」の条件とみなされる。プローブとハイブリダイズしたcDNAまたはゲノムDNAは、オートラジオグラフィーまたはその他の従来の技術により同定する。
【０２９９】
前記の条件の変更は、ハイブリダイゼーション試験においてバックグラウンドの抑制に使用する代替ブロッキング試薬の含有および／または置換によって達成し得ることに留意すべきである。典型的なブロッキング試薬としては、デンハルト試薬、BLOTTO、ヘパリン、変性サケ精子DNA、および商業的に入手可能な専売製品が挙げられる。特定のブロッキング試薬を含めるには、適合性の問題により前記のハイブリダイゼーション条件の改変が必要となる。
【０３００】
よって、本発明は、本発明のポリヌクレオチドに類似した核酸を単離する方法であって、
a)cDNAまたはゲノムDNA分子のコレクションと、配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列、寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される配列の少なくとも12、15、18、20、23、25、28、30、35、40または50個連続したヌクレオチドを含んでなる検出可能なプローブとを、そのプローブが前記コレクション中の少なくとも1つのcDNAまたはゲノムDNA分子とハイブリダイズし得る中度または低度のストリンジェントな条件下で接触させ、
b)前記の検出可能なプローブとハイブリダイズした前記cDNAまたはゲノムDNA分子を同定し、さらに
c)前記のプローブとハイブリダイズした前記cDNAまたはゲノムDNA分子を単離する、
ステップを含んでなる方法、を含む。
【０３０１】
PCRに基づく方法
前記の方法に加えて、本発明のGENSET cDNAまたはその断片を用いて相同なcDNAを取得するためのその他のプロトコールが利用可能であり、以下のパラグラフで概略を示す。
【０３０２】
cDNAはポリA選択法または当業者に公知のその他の技術を利用したmRNA調製法を用いて目的の組織、細胞、または生物体からmRNAを得ることにより作製することができる。mRNAのポリAテールとハイブリダイズし得る第1のプライマーがmRNAとハイブリダイズし、逆転写反応が行われて第1のcDNA鎖が生成する。
【０３０３】
「mRNAのポリAテールとハイブリダイズし得る」とは、チミジン残基のストレッチを含む全てのプライマー、すなわち、真核生物のポリ(A)+ mRNAの3'末端とハイブリダイズして第1のcDNA鎖の合成をプライミングするオリゴ(dT)プライマーを指し、包含する。オリゴ(dT)プライマーを作製し、さらにそれらをmRNAとハイブリダイズさせて、続いて第1のcDNA鎖を作製するために前記のハイブリダイズしたmRNAの逆転写をプライミングするための技術は当業者には周知のものであり、Current Protocols in Molecular Biology, John WileyおよびSons, Inc. 1997ならびにSambrookら, 1989に記載されている。好ましくは、前記のオリゴ(dT)プライマーを大過剰に存在させて全てのmRNA 3'末端を少なくとも1つのオリゴ(dT)分子とハイブリダイゼーションさせる。プライミングおよび逆転写ステップは好ましくは使用する逆転写酵素のタイプに応じて37℃〜55℃間で行う。mRNAの逆転写をプライミングするための好ましいオリゴ(dT)プライマーはmRNAのポリAテールと特異的にハイブリダイズするのに十分な長さ、好ましくは12〜18個のチミジン残基長のチミジン残基のストレッチを含むオリゴヌクレオチドである。より好ましくは、かかるオリゴ(T)プライマーはポリ(dT)ストレッチの上流にさらなる配列を含み、それによりcDNAのその後の操作を容易にするために使用することができる所定の配列を全ての第1のcDNA鎖の5'末端へ付加することができる。好ましくは、この付加配列は8〜60残基長である。例えば、cDNAの5'に制限部位を付加することにより、得られたcDNAのサブクローニングが容易になる。あるいは、付加されたそのような5'末端を使用して目的のcDNAクローンを特異的に増幅するためのPCRのプライマーを設計してもよい。
【０３０４】
次いで、第1のcDNA鎖を第2のプライマーとハイブリダイズさせる。本発明のポリヌクレオチド断片、特に「オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブ」の節に記載のものを使用することができる。この第2のプライマーは本発明のポリヌクレオチドの少なくとも10個連続したヌクレオチドを含有する。好ましくは、前記プライマーが本発明のポリヌクレオチドの少なくとも10、12、15、17、18、20、23、25、または28個連続したヌクレオチドを含んでなる。いくつかの実施形態では、前記プライマーが本発明のポリヌクレオチドの30個を超えるヌクレオチドを含んでなる。真の翻訳開始部位を含む完全タンパク質コード配列を含むcDNAを取得したい場合、使用する第2のプライマーは翻訳開始部位の上流の位置に配列を含む。第2のプライマーを伸長させて第1のcDNA鎖に相補的な第2のcDNA鎖を作製する。あるいは、取得しようとするcDNAの両方の末端由来のプライマーを用いて前記のようにRT-PCRを実施してもよい。
【０３０５】
前記の方法を用いて作製された二本鎖cDNAを単離し、クローニングする。cDNAは好適な宿主細胞内で複製し得るプラスミドまたはウイルスベクターなどのベクター中にクローニングすることができる。例えば、宿主細胞は細菌細胞、哺乳類細胞、鳥類細胞、または昆虫細胞でありうる。
【０３０６】
mRNAを単離し、mRNAとハイブリダイズしたプライマーを逆転写して第1のcDNA鎖を作製し、プライマーを伸長させて第1のcDNA鎖と相補的な第2のcDNA鎖を作製し、二本鎖cDNAを単離し、さらに二本鎖cDNAをクローニングする技術は、当業者には周知のものであり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. 1997ならびにSambrookら, 1989に記載されている。
【０３０７】
よって、本発明はcDNAを作製する方法を包含する。第1の実施形態では、cDNAを作製する方法は、
a)ヒト細胞由来のmRNA分子のコレクションと、配列番号1〜169、339〜455、561〜784と相補的な配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートと相補的な配列からなる群から選択される配列の少なくとも12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、または50個連続したヌクレオチドを含んでなるプライマーとを接触させ、
b)前記のプライマーを前記のコレクション中のmRNAとハイブリダイズさせ、
c)前記のハイブリダイズしたプライマーを逆転写して前記のmRNAから第1のcDNA鎖を作製し、
d)前記の第1のcDNA鎖と相補的な第2のcDNA鎖を作製し、さらに
e)前記の第1のcDNA鎖と前記の第2のcDNA鎖を含んでなる得られたcDNAを単離する、
ステップを含んでなる。
【０３０８】
本発明のもう1つの実施形態は前のパラグラフの方法によって得られる精製cDNAである。この実施形態のある態様では、cDNAがヒトポリペプチドの少なくとも一部をコードする。
【０３０９】
第2の実施形態では、cDNAを作製する方法が、
a)ヒト細胞由来のmRNA分子のコレクションと、前記mRNAのポリAテールとハイブリダイズし得る第1のプライマーとを接触させ、
b)前記の第1のプライマーを前記のポリAテールとハイブリダイズさせ、
c)前記のmRNAを逆転写して第1のcDNA鎖を作製し、
d)配列番号1〜169、339〜455、561〜784および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列からなる群から選択される配列の少なくとも12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、または50個連続したヌクレオチドを含んでなる、少なくとも1つのプライマーを用いて前記の第1のcDNA鎖と相補的な第2のcDNA鎖を作製し、さらに
e)前記の第1のcDNA鎖と前記の第2のcDNA鎖を含んでなる得られたcDNAを単離する、
ステップを含んでなる。
【０３１０】
この方法のもう1つの態様では、第2のcDNA鎖を、
a)前記の第1のcDNA鎖と、配列番号1〜169、339〜455、561〜784および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列からなる群から選択される配列の少なくとも12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、または50個連続したヌクレオチドを含んでなる第2のプライマー、および前記の第1のプライマーの配列内に完全に含まれる配列からなる第3のプライマーとを接触させ、
b)前記の第2および第3のプライマーを用いて第1のポリメラーゼ連鎖反応を行って第1のPCR産物を作製し、
a)前記の第1のPCR産物と、配列番号1〜169、339〜455、561〜784および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列からなる群から選択される前記配列の少なくとも12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、または50個連続したヌクレオチドを含んでなる第4のプライマー、および前記の第3のプライマーの配列内に完全に含まれる配列からなる第5のプライマーとを接触させ、その際、その第4および第5のプライマーが前記の第1のPCR産物内の配列とハイブリダイズし、さらに
d)第2のポリメラーゼ連鎖反応を行うことによって第2のPCR産物を作製する、
ことによって作製する。
【０３１１】
あるいは、前記の第1のcDNA鎖と、配列番号1〜169、339〜455、561〜784および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列からなる群から選択される配列の少なくとも12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、または50個連続したヌクレオチドを含んでなる第2のプライマー、および前記の第1のプライマーの配列内に完全に含まれる配列からなる第3のプライマーとを接触させ、さらに前記の第2および第3のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応を行って前記の第2のcDNA鎖を作製することによって、第2のcDNA鎖を作製してもよい。
【０３１２】
あるいは、第2のcDNA鎖を、
a)前記の第1のcDNA鎖と、配列番号1〜169、339〜455、561〜784および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列からなる群から選択される配列の少なくとも12、15、18、20、23、25、28、30、35、40、または50個連続したヌクレオチドを含んでなる第2のプライマーとを接触させ、
b)前記の第2のプライマーを前記の第1のcDNA鎖とハイブリダイズさせ、さらに
c)ハイブリダイズした前記の第2のプライマーを伸長させて前記の第2のcDNA鎖を作製する、
ことによって作製してもよい。
【０３１３】
本発明のもう1つの実施形態は本発明のcDNAの作製方法によって得られる精製cDNAである。この実施形態のある態様では、前記のcDNAがヒトポリペプチドの少なくとも一部をコードする。
【０３１４】
その他のプロトコール
また、相同cDNAを取得するためにその他の手順を用いてもよい。あるアプローチでは、cDNAをmRNAから作製し、以下のように二本鎖ファージミドにクローニングする。次いで、二本鎖ファージミドのcDNAライブラリーを、ファージF1のGene II産物などのエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼでの処理により一本鎖にする(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Changら, 1993)。既知のGENSET cDNA、ゲノムDNAまたはその断片を含む断片の配列を含んでなるビオチン化オリゴヌクレオチドを一本鎖ファージミドとハイブリダイズさせる。好ましくは、断片が配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列からなる群から選択される配列の少なくとも10、12、15、17、18、20、23、25、または28個連続したヌクレオチドを含んでなる。
【０３１５】
ビオチン化オリゴヌクレオチドとファージミドとのハイブリッドを、ハイブリッドをストレプトアビジンコーティング常磁性ビーズとともにインキュベートし、マグネットでビーズを回収することにより単離する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Fryら, 1992)。その後、得られたファージミドをビーズから解離させ、ビオチン化オリゴヌクレオチドの設計に使用するGENSET cDNAまたは断片に特異的なプライマーを用いて二本鎖DNAに変換する。あるいは、Gene Trapper キット(Gibco BRL)などのプロトコール(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる)を使用してもよい。得られた二本鎖DNAを細菌中に形質転換する。GENSET cDNAまたはその断片配列と相同なcDNAを、コロニーPCRまたはコロニーハイブリダイゼーションにより同定する。
【０３１６】
染色体マーカーとして
本発明のcDNAの染色体上の局在を公共および企業データベースの情報を用いて決定した。表IIでは本発明のポリヌクレオチドの染色体上の推定位置を示している。最初の列には配列識別番号を、その対応する染色体上の位置を2列目に、記載している。このように、本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドの染色体上の位置を利用し、以下で開示されるものをはじめとする当業者に公知の任意の技術を用いてヒト高解像度マップを構築するまたはサンプル中の所定の染色体を同定するための方法および組成物に関する。
【０３１７】
GENSETポリヌクレオチドは、以下で記述する放射線ハイブリッド(RH)マッピング、PCRに基づくマッピングおよび蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)マッピングをはじめとする当業者に公知の任意の方法または技術を用いて、それらの染色体上の位置にマッピングすることができる。
【０３１８】
放射線ハイブリッドマッピング
放射線ハイブリッド(RH)マッピングはヒトゲノムの高解像度マッピングに使用できる体細胞遺伝的アプローチである。このアプローチでは、1つ以上のヒト染色体を含む細胞系に致死量照射し、各染色体を破壊して放射線量に応じた長さの断片にする。これらの断片を齧歯動物培養細胞との融合によって拾い上げ、ヒトゲノムの様々な断片を含むサブクローンを得る。この技術については、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Benhamら (1989)ならびにCoxら, (1990)に記載されている。そのサブクローンの性質がランダムでありかつ独立したものであることにより、ヒトゲノムマーカーの効率的なマッピングが可能である。80〜100の一群の細胞系から単離されたヒトDNAにより、GENSET cDNAまたはゲノムDNAを順序付けするためのマッピング試薬が提供される。このアプローチでは、マーカー間の切断頻度を利用して距離を測定し、それによって従来のESTを用いて行われていた微細な解像度のマップの構築を可能にする(Schulerら, 1996)(なお、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
【０３１９】
RHマッピングを用いて、成長ホルモン(GH)およびチミジンキナーゼ(TK)の遺伝子にわたるヒト染色体17q22-q25.3(Fosterら, 1996)、ゴーリン症候群遺伝子周辺の領域(Obermayrら, 1996)、12番染色体の短腕全体を含む60遺伝子座(Raeymaekersら, 1995)、神経線維腫症2型遺伝子座を含むヒト22番染色体の領域(Frazerら, 1992)および5番染色体の長腕上の13遺伝子座(Warringtonら, 1991)の高解像度全ゲノム放射線ハイブリッドマップが作製されている(なお、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
【０３２０】
PCR技術を用いたcDNAのヒト染色体へのマッピング
PCRに基づく手法を用いてGENSET cDNAおよびゲノムDNAをヒト染色体に割り当ててもよい。かかるアプローチでは、イントロンを挟んだ増幅の機会が最小限となるよう、cDNA配列からオリゴヌクレオチドプライマー対を設計する。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは18〜23bpの長さであり、PCR増幅用に設計される。既知の配列からのPCRプライマーの作製については当業者には周知である。PCR技術の概説については、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるErlich (1992)を参照。
【０３２１】
プライマーをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に使用して全ヒトゲノムDNA由来の鋳型を増幅する。PCR条件は以下のとおりである: 60ngのゲノムDNAをPCR用の鋳型として、80ngの各オリゴヌクレオチドプライマー、0.6単位のTaqポリメラーゼ、および1μCuの32P標識デオキシシチジン三リン酸とともに使用する。PCRをマイクロプレートサーモサイクラー(Techne)内で以下の条件下で実施する: 94℃、1.4分を30サイクル; 55℃、2分; および72℃、2分、さらに最終伸長を72℃で10分間。増幅産物を6%ポリアクリルアミドシークエンシングゲルで解析し、オートラジオグラフィーにより可視化する。得られたPCR産物の長さが、プライマーが誘導されたcDNA内のプライマー配列の末端間の距離と同一であれば、続いて、２群のヒト-齧歯動物体細胞ハイブリッド、すなわちBIOS PCRable DNA(BIOS Corporation)およびNIGMS ヒト-齧歯動物体細胞ハイブリッドマッピングパネル番号1(NIGMS, Camden, NJ)由来のDNA鋳型を用いて、PCR反応を繰り返す。
【０３２２】
PCRを使用して、所定のヒト染色体セットを含む一連の体細胞ハイブリッド細胞系を、所定のcDNAまたはゲノムDNAの存在についてスクリーニングする。DNAを体細胞ハイブリッドから単離し、GENSET cDNAまたはゲノムDNA由来のプライマー対を用いるPCR反応の開始鋳型として使用する。GENSET cDNAまたはゲノムDNAに対応するヒト遺伝子を含む染色体との体細胞ハイブリッドによってのみ、増幅された断片が得られる。GENSET cDNAまたはゲノムDNAは体細胞ハイブリッドDNA鋳型からのPCR産物の分離パターンの解析により染色体に割り当てられる。増幅断片をもたらす全ての細胞ハイブリッドに存在する単独のヒト染色体が、そのGENSET cDNAまたはゲノムDNAを含む染色体である。体細胞遺伝子マッピング試験の技術およびその結果の解析の概説については、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるLedbetterら, (1990)を参照。
【０３２３】
蛍光in situハイブリダイゼーションを用いたcDNAの染色体へのマッピング
蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)により、GENSET cDNAまたはゲノムDNAを所定の染色体上の特定の位置にマッピングすることができる。蛍光in situハイブリダイゼーション技術に用いる染色体は、細胞培養物、組織、または全血をはじめとする種々の供給源から取得することができる。
【０３２４】
好ましい実施形態では、GENSET cDNAまたはゲノムDNAの染色体上の局在が、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるCherifら(1990)に記載のFISHにより決定される。中期染色体をフィトヘマグルチニン(PHA)で刺激した血液細胞ドナーから調製する。健康な男性から取得したPHAで刺激したリンパ球を、RPMI-1640培地中で72時間培養する。同期化のため、メトトレキセート(10μM)を17時間添加し、続いて5-ブロモデオキシウリジン(5-BudR、0.1mM)を6時間添加する。細胞を回収する直前の15分間にコルセミド(1μg/ml)を添加する。細胞を回収し、RPMI中で洗浄し、KClの低張液(75mM)を加えて37℃で15分間インキュベートし、メタノール:酢酸(3:1)を3回交換して固定する。細胞懸濁物をスライドガラスに滴下し、風乾する。GENSET cDNAまたはゲノムDNAを製造業者の説明書(Bethesda Research Laboratories, Bethesda, MD)に従いニックトランスレーション法によりビオチン-16 dUTPで標識し、Sephadex G-50カラム(Pharmacia, Upssala, Sweden)を用いて精製し、沈殿させる。ハイブリダイゼーション直前にDNAペレットをハイブリダイゼーションバッファー(50%ホルムアミド、2X SSC、10%硫酸デキストラン、1mg/ml超音波処理サケ精子DNA、pH7)に溶解し、プローブを70℃で5〜10分間かけて変性させる。
【０３２５】
-20℃に維持したスライドガラスを37℃で1時間、RNアーゼ A(100μg/ml)で処理し、2X SSCで3回すすぎ、エタノール系で脱水する。染色体調製物を70℃で2分間、70%ホルムアミド、2X SSC中で変性させ、次いで、4℃で脱水する。このスライドを37℃で8分間、プロテイナーゼK(20mM Tris-HCl、2mM CaCl2中、10μg/100ml)で処理し、脱水する。プローブを含むハイブリダイゼーション混合物をスライドに載せ、カバースリップで覆い、ゴムセメントで密閉し、湿潤チャンバー内で37℃で一晩インキュベートする。ハイブリダイゼーションおよびポストハイブリダイゼーション洗浄後、ビオチン化プローブをアビジン-FITCにより検出し、ビオチン化ヤギ抗アビジンおよびアビジン-FITCのさらなる層とともに増幅させる。染色体上の位置決定のため、蛍光Rバンドを先に記載されているようにして(Cherifら, 1990)取得する。スライドをLEICA 蛍光顕微鏡(DMRXA)下で観察する。染色体をヨウ化プロピジウムで対比染色すると、プローブの蛍光シグナルが蛍光Rバンド染色体の両染色分体(赤色)上に2つの対称的な黄緑色スポットとして現れる。このようにして、特定のGENSET cDNAまたはゲノムDNAを、所定の染色体上の特定の細胞遺伝学的Rバンドに位置決定することができる。
【０３２６】
染色体マップを構築または拡充するためcDNAの使用
ひと度、当業者に公知のいずれかの技術、特に本明細書に記載のものを用いてGENSET cDNAまたはゲノムDNAを特定の染色体に割り当てれば、それらを利用してそれらが位置付けられる染色体の高解像度マップを構築するまたはサンプル中の染色体を同定することができる。
【０３２７】
染色体マッピングは、前記のように所定の固有の配列を特定の染色体に割り当てることを含む。ひと度、固有の配列を所定の染色体にマッピングすれば、それは同じ染色体上に位置する他の固有の配列と比較して順序付けされる。 染色体マッピングへの１つのアプローチでは、GENSET cDNAまたはゲノムDNAを得る由来となる生物の染色体から誘導された数千長ものインサートを有する一連の酵母人工染色体(YAC)を利用する。このアプローチについては、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるNagarajaら(1997)に記載されている。簡潔には、このアプローチでは各染色体を分断してYACベクターに挿入するための重複断片とする。YACインサートをPCRまたはその他の方法を用いてスクリーニングして、それらが、位置を決定すべきGENSET cDNAまたはゲノムDNAを含んでいるかどうかを調べる。ひと度、インサートがGENSET cDNAまたはゲノムDNAを含んでいることが分かれば、そのインサートをPCRまたはその他の方法を用いて解析して、染色体上、またはGENSET cDNAもしくはゲノムDNAが誘導されたその領域内に存在することが分かっているその他の配列を、インサートがさらに含んでいるかどうかを調べることもできる。YACライブラリー中の各インサートに対してこの方法を繰り返し、GENSET cDNAまたはゲノムDNAの各々について、相互の、かつその他の既知の染色体マーカーとの相対的な位置を調べることができる。このようにして、各生物の染色体に沿った多数の固有マーカーの分布に関する高解像度マップが得られる。
【０３２８】
遺伝性疾患または薬剤応答性と関連のある遺伝子の同定
この例ではGENSET cDNAまたはゲノムDNAの特定の表現型の特徴との関連付けに有用なアプローチを示す。この例では、特定のGENSET cDNAまたはゲノムDNAを試験プローブとして使用してそのGENSET cDNAまたはゲノムDNAを特定の表現型の特徴と関連付ける。
GENSET cDNAまたはゲノムDNAを本明細書に記載のものなどの技術または当技術分野で公知のその他の技術を用いてヒト染色体上の特定の位置にマッピングする。「ヒトにおけるメンデル遺伝(Mendelian Inheritance in Man)」(V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man; Johns Hopkins大学Welch医学図書館によってオンラインで提供されている)の検索によりいくつかの既知の遺伝子を含む極めて遺伝子の多い領域とされるGENSET cDNAまたはゲノムDNAを含むヒト染色体の領域や、関連する遺伝子がまだ同定されていないいくつかの疾病または表現型が示される。このように、このGENSET cDNAまたはゲノムDNAに対応する遺伝子はこれらの各遺伝性疾患の当面の候補となる。
【０３２９】
これらの疾病または表現型を有する患者の細胞を単離し、培養により増殖させる。GENSET cDNAまたはゲノムDNA由来のPCRプライマーを使用して患者から得たゲノムDNA、mRNAまたはcDNAをスクリーニングする。患者において増幅されないGENSET cDNAまたはゲノムDNAをさらなる解析により特定の疾病と正に関連付けることができる。また、サンプルが健康な個体由来のものではなく、サンプルが疾患と関連のある表現型を有する個体由来のものである場合、PCR解析によって異なる長さの断片を得ることにより、そのcDNAを含む遺伝子が遺伝性疾患の原因であることが示される。
【０３３０】
組換えベクターにおけるポリヌクレオチドの使用
本発明はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを含む組換えベクター、および前記のベクターなどの本発明のポリヌクレオチドについての宿主細胞組換え体、ならびにかかるベクターおよび宿主細胞の作製方法、さらに組換え技術によるGENSETポリペプチドの生産におけるこれらの使用に関する。
組換えベクター
本明細書において「ベクター」は、二本鎖または一本鎖のいずれかであり、さらに宿主細胞または単細胞もしくは多細胞宿主生物に導入しようとする少なくとも1つの目的ポリヌクレオチドを含んでなる環状もしくは直鎖DNAまたはRNA分子のいずれかを称するのに使用される。本発明はGENSETゲノム配列またはcDNA配列のいずれかから誘導される調節ポリヌクレオチドおよび／またはコーディングポリヌクレオチドを含む組換えベクターのファミリーを包含する。一般に、本発明の組換えベクターは調節配列、コード配列およびポリヌクレオチド構築物をはじめとする本明細書に記載のいずれかのポリヌクレオチド、ならびに本明細書で定義したいずれかのGENSETプライマーまたはプローブを含んでなり得る。
【０３３１】
第1の好ましい実施形態では、本発明の組換えベクターを使用して、GENSETゲノム配列またはGENSET cDNA、例えば、配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列、寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列、その変異体および断片からなる群から選択されるいずれかのcDNAから誘導された、挿入されたポリヌクレオチドを、好適な宿主細胞で増幅させる。このポリヌクレオチドは組換えベクターの複製が起こるたびに増幅される。
【０３３２】
本発明の組換えベクターの第2の好ましい実施形態は本発明の調節ポリヌクレオチドまたはコーディング核酸のいずれか、もしくはその両方を含む発現ベクターを含んでなる。特定の実施形態では、発現ベクターを使用してGENSETポリペプチドを発現させるが、次いでそれを精製して、例えば、リガンドスクリーニングアッセイにまたはGENSETタンパク質に対する特異的抗体を産生させる免疫原として使用することができる。その他の実施形態では、発現ベクターがトランスジェニック動物の構築に、さらには遺伝子治療にも使用される。発現には目的の遺伝子の宿主細胞内での発現を駆動するウイルスおよび哺乳類両起源由来のエンハンサー／プロモーターなどの種々の調節エレメントを含む好適なシグナルがベクター中に提供されることが必要である。産物を発現させる永続的な安定した細胞クローンを確立するための優性薬剤選択マーカーが、それらは薬剤選択マーカーの発現をポリペプチドの発現と結びつけるエレメントであることから、一般に本発明の発現ベクターに含められる。
【０３３３】
より詳しくは、本発明はGENSETタンパク質、好ましくは配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列、寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドの配列、その変異体および断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するGENSETタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターに関する。本発明のポリヌクレオチドを使用して宿主生物内でコードされるタンパク質を発現させ、有益な効果をもたらすことができる。かかる方法では、コードされるタンパク質が宿主生物内で一時的に発現されるか、または宿主生物内で安定して発現され得る。コードされるタンパク質は本明細書に記載の活性のいずれかを有し得る。コードされるタンパク質は宿主生物がもたないタンパク質であるか、あるいはコードされるタンパク質が宿主生物内でのそのタンパク質の存在レベルを高めるものであると考えられる。
【０３３４】
本発明のベクターに見ることができるいくつかのエレメントについては以下の節でさらに詳細に記載する。
【０３３５】
本発明の発現ベクターの一般的特徴
本発明の組換えベクターとしては、限定されるものではないが、YAC(酵母人工染色体)、BAC(細菌人工染色体)、ファージ、ファージミド、コスミド、プラスミドまたは染色体、非染色体、半合成および合成DNAを含む直鎖DNA分子が挙げられる。かかる組換えベクターは以下の構成要素を含んでなる転写単位を含み得る:
(1)遺伝子発現において調節的役割を有する１以上の遺伝的エレメント、例えば、プロモーターまたはエンハンサー。エンハンサーは、一般に、約10〜300bpの長さであり、プロモーターに作用して転写を増強する、DNAのシス作用性エレメントである。
(2)mRNAに転写されて最終的にポリペプチドに翻訳される、(1)に記載の調節エレメントに機能し得る形で連結された構造配列またはコード配列; ならびに
(3)好適な転写開始配列および終結配列。酵母または真核生物発現系にて使用することが意図される構造単位は、宿主細胞により翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。また、組換えタンパク質がリーダーまたは輸送配列がなくとも発現される場合には、それがN末端残基を含んでいてもよい。後に、発現された組換えタンパク質からこの残基が切除されてもまたはされなくても最終産物は得られる。
【０３３６】
一般に、組換え発現ベクターは、複製起点、宿主細胞の形質転換をもたらす選択マーカー、および下流にある構造配列の転写を指令する高発現遺伝子から誘導されたプロモーターを含む。異種構造配列は好適な時期に、翻訳開始配列および終結配列、ならびに好ましくは翻訳されたタンパク質の細胞膜周辺腔または細胞外媒質への分泌を指令し得るリーダー配列とともに、構築される。哺乳類宿主細胞内での所望の配列のトランスフェクトおよび発現用にベクターを適合させる特定の実施形態では、好ましいベクターは、所望の宿主における複製起点、好適なプロモーターおよびエンハンサー、さらにいずれかの必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、スプライスドナーおよびアセプター部位、転写終結配列、ならびに5'-フランキング非転写配列を含むであろう。SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えば、SV40起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスシグナルおよびポリアデニル化シグナルを使用して必要な非転写遺伝的エレメントを提供してもよい。
【０３３７】
本発明のGENSETポリペプチドのin vivo発現は、GENSETポリペプチド発現のレベルを高めることにより治療または予防できる疾病または疾病状態の治療または予防のための宿主生物内での生来の遺伝子の発現に関連するか、または生物学的に不活性なGENSETタンパク質の生産に関連する遺伝的欠損を是正するのに、有用と考えられる。よって、本発明はまた、治療しようとする生物または患者中に好適な遺伝物質を導入することによって本発明のGENSETポリペプチドをin vivo生産するよう主として設計された組換え発現ベクターを含む。この遺伝物質は予め生物から抽出したものであり、それを細胞にin vitroにおいて導入し、その改変された細胞は続いて前記の生物へと、好適な組織へとin vivoにおいて直接再導入することができる。
【０３３８】
調節エレメント
本発明の発現ベクターに使用する好適なプロモーター領域は、その内部で異種遺伝子を発現すべき宿主細胞を考慮して選択される。目的の核酸配列の発現を制御するのに使用されるプロモーターについては、それが標的とする細胞内での核酸の発現を指令し得る限りは、特定のものが有力であるとは考えられていない。そのため、ヒト細胞が標的とされる場合には、ヒト細胞内で発現され得るプロモーター、例えば、ヒトまたはウイルスプロモーターなどのプロモーターの近傍または制御下に、核酸コード領域を配置することが好ましい。
【０３３９】
好適なプロモーターは、それがその発現を制御する核酸に対して異種性であってもよいし、あるいは発現させるべきコード配列を含む天然ポリヌクレオチドに対して内在性であってもよい。さらに、プロモーターは、構築プロモーター／コード配列が挿入される組換えベクター配列に対して一般的には異種性である。
【０３４０】
プロモーター領域は、例えば、CAT(クロラムフェニコールトランスフェラーゼ)ベクター、より好ましくはpKK232-8およびpCM7ベクターを用いて、任意の所望の遺伝子から選択できる。
好ましい細菌プロモーターとしては、LacI、LacZ、T3もしくはT7バクテリオファージRNAポリメラーゼプロモーター、gpt、lambda PR、PLおよびtrpプロモーター(EP 0036776)、ポリヘドリンプロモーター、またはバキュロウイルス由来のp10タンパク質プロモーター(Kit Novagen)、(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Smithら, 1983; O’Reillyら, 1992)、lambda PRプロモーター、または、さらにtrcプロモーターがある。
【０３４１】
真核生物プロモーターとしては、CMV極初期、HSVチミジンキナーゼ、初期および後期SV40、レトロウイルスのLTR、およびマウスメタロチオネイン-Lが挙げられる。便宜なベクターおよびプロモーターの選択は当技術分野の技量レベルの範囲内に十分に入る。プロモーターの選択は遺伝子操作分野の専門家の技量の範囲内に十分に入る。例えば、Sambrookら, (1989)の書籍、または、さらに全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるFullerら, (1996)に記載の手順を参照することができる。
【０３４２】
その他の調節エレメント
cDNAインサートを使用する場合、典型的には、遺伝子転写物の正確なポリアデニル化をもたらすポリアデニル化シグナルを含めることが望ましい。ポリアデニル化シグナルの性質が本発明の実施を成功させるのに決定的なものとは考えられないので、ヒト成長ホルモンおよびSV40ポリアデニル化シグナルなどのそのような任意の配列を使用してもよい。発現カセットのエレメントとしてターミネーターもまた含める。これらのエレメントはメッセージレベルを高め、さらに当該カセットからその他の配列内への読み通し(read through)を最小限にするのに有用であり得る。
【０３４３】
選択マーカー
選択マーカーは細胞に識別可能な変化を与え、それにより発現構築物を含む細胞の同定を容易にする。形質転換された宿主細胞の選択のための選択マーカー遺伝子は、好ましくは、真核細胞培養物についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ耐性もしくはネオマイシン耐性、S.セレビシエ(S. cerevisiae)についてはTRP1、または大腸菌(E. coli)についてはテトラサイクリン、リファンピシンもしくはアンピシリン耐性、あるいはマイコバクテリアについてはレバンサッカラーゼである。この後者のマーカーは負の選択マーカーである。
【０３４４】
好ましいベクター
細菌ベクター
限定されるものではないが、典型的な例として、細菌での使用に有用な発現ベクターは、選択マーカーとpBR322(ATCC 37017)の遺伝的エレメントを含んでなる商業的に入手可能なプラスミドから誘導された細菌複製起点を含み得る。かかる市販のベクターとしては、例えば、pKK223-3(Pharmacia, Uppsala, Sweden)、およびpGEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA)が挙げられる。
当業者であればその他の多くの好適なベクターを知っており、以下の細菌ベクター: pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pbs、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A(Stratagene); ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia); pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene); pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia); pQE-30(QIAexpress)などが商業的に入手可能である。
【０３４５】
バクテリオファージベクター
P1バクテリオファージベクターは約80〜約100kbに及ぶ大きなインサートを含めることができる。p158またはp158/neo8などのP1バクテリオファージベクターの構築については特に、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるSternberg (1992、1994)に記載されている。GENSETヌクレオチド配列を含んでなる組換えP1クローンは、40kbを超える大きなポリヌクレオチドの挿入を目的として設計され得る(Lintonら, 1993を参照; その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。トランスジェニック試験用のP1 DNAを作製するために好ましいプロトコールは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるMcCormickら(1994)に記載のプロトコールである。簡潔に説明すると、P1プラスミドを保持する大腸菌(好ましくはNS3529株)を25μg/mlのカナマイシンを含有する好適なブロス培地で一晩増殖させる。Qiagen Plasmid Maxiキット(Qiagen, Chatsworth, CA, USA)を用いて製造業者の説明書に従ってP1 DNAを大腸菌からアルカリ溶解により調製する。キットに含まれる洗浄および溶出バッファーを用いて2本のQiagen-tip 500カラムで細菌溶解液からP1 DNAを精製する。次いで、フェノール／クロロホルム抽出を行い、その後、70%エタノールを用いてDNAを沈降させる。TE(10mM Tris-HCl、pH7.4、1mM EDTA)中にDNAを溶解した後、DNA濃度を分光測光法により評価する。
【０３４６】
トランスジェニック動物、典型的にはトランスジェニックマウスにおいてGENSETポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなるP1クローンを発現させることを目的とする場合は、例えば、P1 DNAをP1ポリリンカー内のレアカット部位(SfiI、NotIまたはSalI)で切断することにより、P1 DNA断片からベクター配列を除去することが望ましい。次いで、YACからのDNAの単離に関して最初に報告されたもの(例えば、Schedlら, 1993a; Petersonら, 1993を参照; 全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる)と同様の方法を用いてパルスフィールドアガロースゲル上でベクター配列からP1インサートを精製する。この段階において、必要であれば、得られた精製インサートDNAを、Milliporeウルトラフリー-MCフィルターユニット(Millipore, Bedford, MA, USA-30,000分子量限界)で濃縮した後に、100mM NaCl、30μMスペルミン、70μMスペルミジンを含有するマイクロインジェクションバッファー(10mM Tris-HCl、pH7.4; 250μM EDTA)に対して微小透析膜(タイプ VS、0.025μM Millipore製)により透析することができる。精製されたP1 DNAインサートの完全性を1%アガロース(Sea Kem GTG; FMC Bio-products)パルスフィールドゲルでの電気泳動および臭化エチジウム染色により評価する。
【０３４７】
ウイルスベクター
ある特定の実施形態では、ベクターをアデノウイルスから誘導する。本発明の好ましいアデノウイルスベクターは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、FeldmanおよびSteg(1996)、またはOhnoら, (1994)に記載のものである。本発明のこの特定の実施形態のもう1つの好ましい組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス2型または5型(Ad 2もしくはAd 5)あるいは動物起源のアデノウイルス(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる仏国特許出願第FR-93.05954号)である。
【０３４８】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは一般に、外因性ポリヌクレオチドの、特にヒトをはじめとする哺乳類へのin vivo導入用に選択される組換え遺伝子送達系であると考えられている。これらのベクターによって細胞への効率的な遺伝子送達がもたらされ、導入された核酸は宿主の染色体DNAに安定して組み込まれる。本発明のレトロウイルス系in vitroまたはin vitro遺伝子送達運搬体の作製または構築用に特に好ましいレトロウイルスとしては、ミンク細胞フォーカス誘導ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスが挙げられる。特に好ましいマウス白血病ウイルスとしては、4070Aおよび1504Aウイルス、Abelson(ATCC番号VR-999)、Friend (ATCC番号VR-245)、Gross(ATCC番号VR-590)、Rauscher(ATCC番号VR-998)ならびにモロニーマウス白血病ウイルス(ATCC番号VR-190; PCT出願番号WO94/24298)が挙げられる。特に好ましいラウス肉腫ウイルスとしては、Bryan high titer(ATCC番号VR-334、VR-657、VR-726、VR-659およびVR-728)が挙げられる。その他の好ましいレトロウイルスベクターには、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Rothら(1996)、PCT出願番号WO93/25234、同WO94/06920、Rouxら, (1989)、Julanら, (1992)、ならびにNedaら, (1991)に記載のものがある。
【０３４９】
本発明で意図されるさらにもう1つのウイルスベクター系にはアデノ随伴ウイルス(AAV)が含まれる。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および増殖ライフサイクルのためにヘルパーウイルスとしてアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを必要とする、天然に存在する欠損ウイルスである(Muzyczkaら, 1992; なお、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。これはそのDNAを非分裂細胞へと組み込み得る数少ないウイルスの1つでもあり、安定した高い組込み頻度を示す(Flotteら1992; Samulskiら, 1989; McLaughlinら, 1989; なお、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。AAVの1つの有利な特徴は、形質転換細胞と比較して一次細胞形質導入する効率の低さに基づいている。
【０３５０】
BACベクター
ゲノムDNAの大きな断片(100〜300kb)を大腸菌内に安定して維持するために、細菌人工染色体(BAC)クローニング系(Shizuyaら, 1992; 全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる)を作製した。好ましいBACベクターには、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるKimら(1996)に記載されたpBeloBAC11ベクターが含まれる。このベクターを使用し、ベクター内のBamHIまたはHindIII部位のいずれかへの連結を可能にする酵素を用いて部分的に消化したサイズ選別ゲノムDNAを用いてBACライブラリーを作製する。これらのクローニング部位には、RNA転写またはPCR法のいずれかによって末端プローブを作製するのに使用できるT7およびSP6 RNAポリメラーゼ転写開始部位がフランキングする。大腸菌におけるBACライブラリーを構築した後、BAC DNAをスーパーコイル環状DNAとして宿主細胞から精製する。サイズ決定およびBACのレシピエント細胞への導入はいずれもこれらの環状分子を直鎖形態へと変換した後に行う。クローニング部位には2つのNotI部位がフランキングしており、クローニングしたセグメントをNotI消化によってベクターから切り出すことができる。また、pBeloBAC11ベクター内に含まれるDNAインサートは、唯一のcosN部位での切断を誘導する商業的に入手可能な酵素λ-ターミナーゼによってBACベクターを処理することにより直鎖状にしてもよいが、この切断法では結果としてインサートDNAおよびBAC配列の両方を含む全長BACクローンが生じる。
【０３５１】
バキュロウイルス
もう1つの特定の好適な宿主ベクター系はスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)から誘導されるSF9細胞系(ATCC番号CRL 1711)をトランスフェクトするのに使用するpVL1392/1393バキュロウイルス導入ベクター(Pharmingen)である。本発明のGENSETポリペプチドをバキュロウイルス発現系において発現させるためのその他の好適なベクターとしては、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Chaiら, (1993)、Vlasakら, (1983)、およびLenhardら, (1996)に記載のものが挙げられる。
【０３５２】
組換えベクターの送達
本発明のポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド構築物の発現を達成するためには構築物を細胞内に送達させる必要がある。この送達は、細胞系を形質転換するための実験手順などにおけるin vitroで、または特定の病状の治療などにおけるin vivoもしくはex vivoで達成されうる。1つの機構が発現構築物が感染性ウイルス粒子内に封入されるウイルス感染である。
【０３５３】
ポリヌクレオチドを哺乳類培養細胞内へ導入するためのいくつかの非ウイルス的な方法もまた本発明に含まれ、限定されるものではないが、リン酸カルシウム沈降(Grahamら, 1973; Chenら, 1987);DEAE-デキストラン(Gopal, 1985);エレクトロポレーション(Tur-Kaspaら, 1986; Potterら, 1984);直接マイクロインジェクション(Harlandら, 1985);DNA負荷リポソーム(Nicolauら, 1982; Fraleyら, 1979);および受容体媒介性トランスフェクション(WuおよびWu, 1987, 1988)(なお、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)が挙げられる。これらの技術のいくつかはin vivoまたはex vivo使用にうまく適合すると考えられる。
【０３５４】
ひと度、発現ポリヌクレオチドを細胞に送達させれば、それはレシピエント細胞のゲノム内に安定して組み込まれ得る。この組込みは、相同組換えによって同起源の(cognate)位置および方向でなされ得る(遺伝子置換)か、またはランダムな、特定されない位置に組み込まれ得る(遺伝子増強)。いっそうさらなる実施形態では、核酸がDNAの独立したエピソームセグメントとして細胞内に安定して維持され得る。かかる核酸セグメントまたは「エピソーム」は宿主細胞周期とは無関係に、またはそれと同期して維持および複製させるのに十分な配列をコードする。
【０３５５】
タンパク質またはペプチドをin vivoにおいて脊椎動物の細胞内部に送達させる方法に関するある特定の実施形態は、生理学上許容される担体および目的のポリペプチドを機能し得る形でコードする裸のポリヌクレオチドを含んでなる調製物を細胞を含む組織の間質空間に導入するステップを含んでなり、それによって裸のポリヌクレオチドが細胞内部に取り込まれて生理学的作用を示すこととなる。これはin vitro導入に特に好適であるが、in vivoにおいても適合するであろう。
【０３５６】
in vitroおよびin vivoにおいて使用する「裸の」ポリヌクレオチドを含んでなる組成物は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるPCT出願WO90/11092(Vical Inc.)、さらにPCT出願WO95/11307(Institut Pasteur, INSERM, Universite d’Ottawa)、ならびにTasconら(1996)およびHuygenら(1996)の論文に記載されている。
【０３５７】
本発明のさらにもう1つの実施形態では、本発明のポリヌクレオチド構築物を含む本発明の裸のポリヌクレオチドの細胞内への導入を、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるKleinら(1987)に記載のように、粒子衝撃法(遺伝子銃)によって達成してもよく、ここでその粒子は高速度に加速されるDNAコーティングした微小弾(microprojectile)であり、これらは細胞膜を貫通して、細胞を死滅させることなく細胞に侵入することができる。
【０３５８】
さらなる実施形態では、本発明のポリヌクレオチドをリポソーム内に取り込ませることができる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、GhoshおよびBacchawat, 1991; Wongら, 1980; Nicolauら, 1987)。
【０３５９】
ある特定の実施形態では、本発明は本明細書に記載のGENSETポリペプチドをin vivo生産するための組成物を提供する。それはこのポリペプチドを機能し得る形でコードする裸のポリヌクレオチドであって、生理学上許容される担体中に溶解状態で含まれ、かつ組織の細胞について前記のタンパク質またはポリペプチドの発現を引き起こさせるために組織内へ導入する上で好適である裸のポリヌクレオチドを含んでなる。
【０３６０】
所望の宿主生物に注入すべきベクター量は注入部位によって異なる。指標となる量としては、動物体、好ましくは哺乳類の身体、例えば、マウス体内に0.1〜100μgのベクターを注入する。
【０３６１】
本発明のベクターのもう1つの実施形態では、それを、宿主細胞、好ましくは治療すべき動物から予め採取した宿主細胞、より好ましくは筋肉細胞などの体細胞にin vitro導入してもよい。後のステップにおいて、所望のGENSETポリペプチドまたは所望のその断片をコードするベクターで形質転換した細胞を動物体内に再導入して組換えタンパク質を局所的にまたは全身的に体内に送達させる。
【０３６２】
分泌ベクター
また、本発明のGENSET cDNAまたはゲノムDNAのいくつかを使用してベクターに挿入された遺伝子によってコードされるタンパク質の分泌を指令し得る分泌ベクターを構築してもよい。かかる分泌ベクターは、所望のタンパク質を精製または濃縮する際に取り除く必要のあるバックグラウンドタンパク質の数を減少させることによって、そこに挿入された遺伝子によりコードされるタンパク質の精製または濃縮を容易にし得る。典型的な分泌ベクターを以下に記載する。
【０３６３】
本発明の分泌ベクターは目的の宿主細胞、組織、または生物体内での遺伝子発現を指令し得るプロモーターを含む。かかるプロモーターとしては、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、SV40プロモーター、ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、および当業者に一般的なその他のプロモーターが挙げられる。
【０３６４】
本発明のポリヌクレオチドのシグナル配列、好ましくは配列番号1〜85、339〜400、406〜407、413〜415、561〜594、および634〜651のシグナル配列ならびに寄託されたクローンプールのクローンインサートのシグナル配列からなる群から選択されるシグナル配列は、プロモーターから転写されたmRNAがそのシグナルペプチドの翻訳を指令するようにそのプロモーターに機能し得る形で連結されている。宿主細胞、組織、または生物体はGENSET cDNAまたはゲノムDNA中のシグナル配列によってコードされるシグナルペプチドを認識する任意の細胞、組織、または生物体であり得る。好適な宿主としては、哺乳類の細胞、組織、もしくは生物体、鳥類の細胞、組織、もしくは生物体、昆虫の細胞、組織もしくは生物体、または酵母が挙げられる。
【０３６５】
さらに、分泌ベクターは分泌されるであろうタンパク質をコードする遺伝子を挿入するためのクローニング部位を含んでいる。このクローニング部位によって、シグナルペプチドと挿入された遺伝子によってコードされるタンパク質とが融合された融合タンパク質がプロモーターから転写されたmRNAより発現されるように、シグナル配列をインフレームで有するインサート遺伝子のクローニングが容易になる。シグナルペプチドは融合タンパク質の細胞外分泌を指令する。
【０３６６】
分泌ベクターはDNAまたはRNAであってよく、宿主の染色体に組み込まれるか、宿主内で染色体外レプリコンとして安定して維持されるか、人工染色体であるか、または宿主内に一時的に存在するものであってよい。好ましくは、分泌ベクターは各宿主細胞内で複数コピーとして維持される。本明細書において用いられる、複数コピーとは、細胞当たり少なくとも2、5、10、20、25、50または50を超える数以上のコピーを意味する。いくつかの実施形態では、複数コピーが染色体外で維持される。その他の実施形態では、複数コピーは染色体配列の増幅によってもたらされる。
【０３６７】
レトロウイルスベクター、SV40ベクター、ウシ乳頭腫ウイルスベクター、酵母組込みプラスミド、酵母エピソームプラスミド、酵母人工染色体、ヒト人工染色体、Pエレメントベクター、バキュロウイルスベクター、または細菌プラスミドをはじめとする、宿主内に一時的に導入できる分泌ベクターとしての使用に好適な数多くの核酸主鎖については、当業者には公知である。
【０３６８】
分泌ベクターは、ポリA シグナルが分泌ベクターに挿入された遺伝子の下流に配置されるようにポリA シグナルをさらに含んでいてもよい。
【０３６９】
分泌が望まれるタンパク質をコードする遺伝子を分泌ベクターに挿入した後に、その分泌ベクターを、リン酸カルシウム沈降、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクション、ウイルス粒子を利用して、または裸のDNAとして、宿主細胞、組織、または生物体に導入する。次いで、挿入された遺伝子によってコードされるタンパク質を、硫酸アンモニウム沈殿、免疫沈降、免疫クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、およびhplcなどの従来の技術を用いて上清から精製または濃縮する。また、分泌されたタンパク質は、宿主の上清または増殖培地においてさらなる濃縮を行うことなくその意図された目的に使用できる程度に十分に濃縮されたまたは精製された状態にあると考えられる。
【０３７０】
また、シグナル配列を遺伝子治療に向けて設計されたベクター中に挿入してもよい。かかるベクターでは、シグナル配列は、プロモーターから転写されたmRNAがシグナルペプチドをコードするようにプロモーターに機能し得る形で連結されている。クローニング部位は、分泌が望まれるタンパク質をコードする遺伝子が容易にベクター中に挿入されて、シグナル配列と融合させうるように、シグナル配列の下流に位置している。ベクターは好適な宿主細胞内に導入される。プロモーターより発現されたタンパク質は細胞外に分泌され、それによって、治療効果がもたらされる。
【０３７１】
宿主細胞
本発明のもう1つの目的は本明細書に記載のポリヌクレオチドの1つ、特にGENSETポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの調節配列またはGENSETポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのいずれかを含んでなるポリヌクレオチドによって形質転換またはトランスフェクトした宿主細胞を含む。また、前記のものの1つなどの組換えベクターで形質転換される(原核細胞)かまたはトランスフェクトされる(真核細胞)宿主細胞も含まれる。しかしながら、本発明の宿主細胞は本発明のポリヌクレオチドの任意のものを含んでいてよい。好ましい実施形態では、宿主細胞は配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列、寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列、その変異体および断片からなる群から選択される配列を含むポリヌクレオチド配列を含んでなる。本発明の発現ベクターに対するレシピエントとして使用される好ましい宿主細胞には以下のものがある:
a)原核宿主細胞: 大腸菌株(I.E.DH5-α株)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、ならびにシュードモナス属(Pseudomonas)、ストレプトミセス属(Streptomyces)およびブドウ球菌属(Staphylococcus)などの種の株。
【０３７２】
b)真核宿主細胞: HeLa細胞(ATCC番号CCL2; 同CCL2.1; 同CCL2.2)、Cv 1細胞(ATCC番号CCL70)、COS細胞(ATCC番号CRL1650; 同CRL1651)、Sf-9細胞(ATCC番号CRL1711)、C127細胞(ATCC番号CRL-1804)、3T3(ATCC番号CRL-6361)、CHO(ATCC番号CCL-61)、ヒト腎臓 293.(ATCC番号45504; 同CRL-1573)およびBHK(ECACC番号84100501; 同84111301)。
【０３７３】
c)その他の哺乳動物宿主細胞
本発明はまた、a)外因性(異種)ポリヌクレオチドを標的遺伝子の内因性染色体DNAに挿入する、b)内因性染色体DNAを欠失させる、および／またはc)内因性染色体DNAを外因性ポリヌクレオチドで置換するべく操作した脊椎動物起源、好ましくは哺乳動物起源、特にヒト起源の一次、二次、および不死化宿主細胞相同組換え体も含む。ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失、および／または置換は標的遺伝子のコード配列および／または標的遺伝子と機能し得る形で結合されたプロモーターおよびエンハンサー配列などの調節領域に対するものと考えられる。
【０３７４】
本明細書に記載のベクター構築物を含む宿主細胞を包含することに加えて、本発明はまた、操作することにより内因性遺伝物質(例えば、コード配列)を欠失させたもしくは置換した、ならびに／または本発明のポリヌクレオチドと機能し得る形で結合され、かつ、内因性ポリヌクレオチドを活性化する、改変する、および／もしくは増幅する遺伝物質(例えば、異種ポリヌクレオチド配列)を含めた脊椎動物起源、特に哺乳動物起源の一次、二次、および不死化宿主細胞も含む。例えば、当技術分野で公知の技術を用いて異種制御領域(例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー)と内因性ポリヌクレオチド配列を相同組換えによって機能し得る形で結合してもよい、例えば、1997年6月24日発行の米国特許第5,641,670号; 1996年9月26日公開の国際公開番号WO96/29411; 1994年8月4日公開の国際公開番号WO94/12650; Kollerら, (1989); およびZijlstraら(1989)(なお、それらの全開示内容は各々参照により本明細書に組み入れられる)を参照。
【０３７５】
本発明はさらに、in vitroまたはin vivoにおいて宿主細胞相同組換え体を作製する方法であって、細胞内で正常に発現されない標的遺伝子の発現を改変する方法に関する。好ましくは、その改変によって正常な増殖条件下または標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの生産に好適な条件下で標的遺伝子の発現が起こる。この方法は(a)in vitroまたはin vivoにおいて細胞を、(i)標的配列; (ii)調節配列および／またはコード配列; ならびに(iii)要すれば、不対スプライスドナー部位を含んでなるポリヌクレオチド構築物でトランスフェクトし、それによってトランスフェクト細胞を作製し、さらに(b)in vitroまたはin vivoにおいてトランスフェクト細胞を相同組換えに好適な条件下で維持するステップを含んでなる。
【０３７６】
本発明はさらに、細胞内で正常に発現されない標的遺伝子の細胞内での発現をin vitroまたはin vivoにおいて改変する方法であって、(a)in vitroまたはin vivoにおいて細胞を、(i)標的配列; (ii)調節配列および／またはコード配列; ならびに(iii)要すれば、不対スプライスドナー部位を含んでなるポリヌクレオチド構築物でトランスフェクトし、それによってトランスフェクト細胞を作製し、次いで(b)in vitroまたはin vivoにおいてトランスフェクト細胞を相同組換えに好適な条件下で維持し、それによって、相同組換え細胞を作製し、さらに(c)in vitroまたはin vivoにおいて相同組換え細胞を遺伝子の発現に好適な条件下で維持するステップを含んでなる方法に関する。
【０３７７】
本発明はさらに、細胞内で正常に発現されない標的内因性遺伝子の細胞内での発現をin vitroまたはin vivoにおいて改変することにより本発明のポリペプチドを作製する方法であって、(a)in vitroにおいて細胞を、(i)標的配列; (ii)調節配列および／またはコード配列; ならびに(iii)要すれば、不対スプライスドナー部位を含んでなるポリヌクレオチド構築物でトランスフェクトし、それによってトランスフェクト細胞を作製し、(b)in vitroまたはin vivoにおいてトランスフェクト細胞を相同組換えに好適な条件下で維持し、それによって、相同組換え細胞を作製し、さらに(c)in vitroまたはin vivoにおいて相同組換え細胞を遺伝子の発現に好適な条件下で維持し、それによってポリペプチドを作製するステップを含んでなる方法に関する。
【０３７８】
本発明はさらに、標的遺伝子の、その遺伝子が正常に発現されない細胞型内での発現を改変するポリヌクレオチド構築物に関する。これは、(a)標的配列; (b)調節配列および／またはコード配列; ならびに(c)要すれば、不対スプライスドナー部位を含んでなるポリヌクレオチド構築物が標的細胞の染色体DNAに挿入される場合に起こる。さらに、ポリペプチドをコードし、さらに染色体DNAとの相同組換え後に標的内因性遺伝子と同じフレーム内であるポリヌクレオチドをさらに含む前記のポリヌクレオチド構築物が含まれる。
【０３７９】
米国特許第6,054,288号;同第6,048,729号;同第6,048,724号;同第6,048,524号;同第5,994,127号;同第5,968,502号;同第5,965,125号;同第5,869,239号;同第5,817,789号;同第5,783,385号;同第5,733,761号;同第5,641,670号;同第5,580,734号;国際公開番号:WO96/29411、WO94/12650;およびKollerらによって記載(1994)された科学論文に記載のものなどの当技術分野で公知の技術によって組成物を作製し、さらに方法を実施してもよい(なお、それらの全開示内容は各々参照により本明細書に組み入れられる)。
【０３８０】
哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞におけるGENSET遺伝子発現は動物細胞のゲノム内の内因性GENSETポリペプチドをコードする遺伝子を本発明のGENSETポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと置換することによって欠損させるか、あるいは改変し得る。これらの遺伝的変化はこれまでに記載された特定のポリヌクレオチド構築物を用いる相同組換えによって起こし得る。
【０３８１】
ネズミ接合子などの哺乳動物接合子を宿主細胞として使用してもよい。例えば、ネズミ接合子に精製した目的のDNA分子、例えば、10mM Tris-HCl、pH7.4、100mM NaClを含有する250μM EDTA、30μMスペルミン、および70μMスペルミジン中1ng/ml(BACインサート)〜3ng/μl(P1バクテリオファージインサート)の範囲の濃度に予め調整した精製DNA分子のマイクロインジェクションを行ってもよい。マイクロインジェクトしようとするDNAのサイズが大きい場合には、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるSchedlら (1993b)に記載されたようにポリアミンおよび高塩濃度を使用してこのDNAの機械的切断を回避することができる。
【０３８２】
本明細書に記載のポリヌクレオチド構築物をはじめとする本発明のポリヌクレオチドのいずれか1つを胚幹(ES)細胞系、好ましくはマウスES細胞系に導入してもよい。ES細胞系は着床前胚盤胞内細胞塊の多能性分化未決定細胞から誘導される。好ましいES細胞系には以下のものがある: ES-E14TG2a(ATCC番号CRL-1821)、ES-D3(ATCC番号CRL1934およびCRL-11632)、YS001(ATCC番号CRL-11776)、36.5(ATCC番号CRL-11116)。好適なシグナルを提供してこの胚の表現型を維持し、さらにES細胞付着に関するマトリックスとしての機能を果たす増殖抑制した支持細胞の存在下での培養により、ES細胞は分化未決定状態で維持される。好ましい支持細胞は実質上すべてのマウス株の13〜14日胚の組織から確立される一次胚繊維芽細胞であり、これは、例えば、Abbondanzoら(1993)に記載されたように培養下で維持され、さらに例えば、Robertson (1987)に記載されたように放射線照射により、または例えば、PeaseおよびWilliams (1990)に記載されたように阻害濃度のLIFの存在により増殖抑制される(なお、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
【０３８３】
宿主細胞における構築物を従来の方法で使用して組換え配列によってコードされる遺伝子産物を作製することができる。
【０３８４】
好適な宿主を形質転換し、さらに宿主を好適な細胞密度へと増殖させた後に、選択されたプロモーターを温度変化または化学誘導などの好適な手段によって誘導し、さらに細胞をさらなる期間培養する。典型的には、細胞を遠心分離により回収し、物理的または化学的手段によって破壊し、さらに、得られた粗抽出物をさらなる精製に向けて保有する。タンパク質の発現において使用する微生物細胞は凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用をはじめとするいずれかの便宜な方法によって破壊できる。かかる方法は当業者には周知のものである。
【０３８５】
トランスジェニック動物
「トランスジェニック動物」または「宿主動物」とは、それらのゲノムが本発明の核酸の1つを含むように遺伝学的かつ人為的に操作した動物を称するために本明細書において使用する。好ましい動物は非ヒト哺乳動物であり、本発明の核酸の挿入によってそれらのゲノムが人為的かつ遺伝学的に改変されたMus(例えば、マウス)、Rattus(例えば、ラット)およびOryctogalus(例えば、ウサギ)から選択される属に属するものが含まれる。ある実施形態では、本発明は、非ヒト宿主哺乳動物および、本発明の組換えベクターまたはノックアウトベクターとの相同組換えによって破壊されたGENSET遺伝子を含んでなる動物を含む。
【０３８６】
本発明のトランスジェニック動物の全てが、それらの多くの細胞内にクローニングされた組換えまたは合成DNA配列、より詳しくは、例えば、本明細書に記載されるようなGENSETポリペプチドコード配列、GENSETポリヌクレオチド調節配列、ポリヌクレオチド構築物、またはアンチセンスポリヌクレオチドをコードするDNA配列を含んでなる精製または単離された核酸の1つを含んでいる。
【０３８７】
一般に、本発明のトランスジェニック動物は本発明において記載する全てのポリヌクレオチド、組換えベクターおよび宿主細胞を含んでなる。第1の好ましい実施形態では、これらのトランスジェニック動物が所定のGENSET遺伝子の発現の調節不全と関連のある多様な病因論を研究するための優れた試験モデルであり、特にトランスジェニック動物はそれらのゲノム内に天然GENSETポリペプチド、あるいはGENSETポリペプチド変異体をコードする挿入されたポリヌクレオチドの1個または複数個のコピーを含む。
【０３８８】
第2の好ましい実施形態では、これらのトランスジェニック動物はGENSET遺伝子の調節ポリヌクレオチドの制御下で目的とする所望のポリペプチドを発現し、それによってこの目的のタンパク質の合成が高収率で起こり、さらに最終的には目的のタンパク質の組織特異的発現がもたらされ得る。
【０３８９】
本発明のトランスジェニック動物の設計は当業者に周知の従来技術に従って行うことができる。トランスジェニック動物、特にトランスジェニックマウスの作製に関するより詳細な内容については、1989年10月10日発行の米国特許第4,873,191号; 1995年11月7日発行の同第5,464,764号; および1998年8月4日発行の第5,789,215号を参照されたい(なお、トランスジェニックマウスの作製方法を開示するこれらの文書が参照により本明細書に組み入れられる)。
【０３９０】
本発明のトランスジェニック動物は、結果として外因性遺伝物質を組み込んだゲノムを有する動物が得られる手順を適用することによって作製される。この手順には、例えば、本明細書に記載されるようにGENSETポリペプチドコード配列、GENSETポリヌクレオチド調節配列、またはGENSETポリヌクレオチドアンチセンス配列をコードするDNA配列、もしくはその一部のいずれかをコードする遺伝物質を得ることが含まれる。本発明の組換えポリヌクレオチドを胚またはES細胞系に挿入する。好ましくは、この挿入が、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるThomasら(1987)に記載されたようにエレクトロポレーションを用いてなされる。エレクトロポレーションに付した細胞をスクリーニングして(例えば、選択マーカーを介した選択による、PCRによる、またはサザンブロット解析による)外因性組換えポリヌクレオチドを、好ましくは相同組換え事象を介してそれらのゲノムに組み込んだ陽性細胞を見つける。本発明に従って使用し得る陽性-陰性選択手順の例は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるMansourら(1988)に記載されている。
【０３９１】
次いで、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるBradley (1987)に記載されるように、陽性細胞を単離し、クローニングし、さらにマウスの3.5日齢の胚盤胞に注入する。その後、胚盤胞を雌宿主動物に挿入し、一定期間増殖させる。あるいは、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Woodら(1993)、またはNagyら(1993)に記載されたように、陽性ES細胞を2.5日齢の8〜16細胞分裂の時期の胚(桑実胚)と接触させ、ES細胞を内部に取り込ませ、生殖細胞系を生じる細胞を含む胚盤胞を十分にコロニー形成させる。
【０３９２】
雌宿主の子孫を試験して動物がトランスジェニックであるかどうか、例えば、挿入された外因性DNA配列を含んでいるかどうか、あるいは野生型であるかどうかを調べる。
【０３９３】
よって、本発明はまた本発明の核酸、組換え発現ベクターまたは宿主細胞組換え体を含むトランスジェニック動物に関する。
【０３９４】
もう1つの実施形態では、トランスジェニック動物をポリヌクレオチドのマイクロインジェクション(受精卵母細胞にマイクロインジェクトされる)によって作製する。典型的には、受精卵母細胞を標準技術を用いてマイクロインジェクトし、その後、「着床前胚」が得られるまでin vitroにおいて培養する。かかる着床前胚は好ましくは約16〜150個の細胞を含む。受精卵母細胞を着床前段階まで培養する方法については、例えば、Gordonら((1984) Methods in Enzymology, 101, 414); Hoganら((1986) in Manipulating the mouse embryo. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y)(マウス胚に関する); Hammerら((1985) Nature, 315, 680)(ウサギおよびブタ胚に関する); Gandolfiら((1987) J. Reprod. Fert. 81, 23-28); Rexroadら((1988) J. Anim. Sci. 66, 947-953)(ヒツジ胚に関する); ならびにEyestoneら((1989) J. Reprod. Fert. 85, 715-720); Camousら((1984) J. Reprod. Fert. 72, 779-785); さらにHeymanら((1987) Theriogenology 27, 5968)(ウシ胚に関する)(なお、それらの全開示内容は各々参照により本明細書に組み入れられる)に記載されている。次いで、着床前胚を標準方法により好適な雌に移し、トランスジーンを導入する発生段階によってトランスジェニックまたはキメラ動物を誕生させる。
【０３９５】
トランスジーン取込み頻度が低いことが多いため、着床前胚におけるトランスジーン組込みの検出には本明細書に記載の方法のいずれかを使用することが望ましい場合が多い。多くの方法のうちいずれを用いて着床前胚におけるトランスジーンの存在を検出してもよい。例えば、1個以上の細胞を着床前胚から採取して、採取した細胞中のトランスジーンの存在もしくは不在をいずれかの標準方法、例えば、PCRを用いて検出してもよい。また、子宮内または分娩後に標準方法を用いてトランスジーンの存在を検出することができる。
【０３９６】
本発明の特に好ましい実施形態では、組換えGENSETポリペプチドをそれらの乳汁に分泌するトランスジェニック哺乳動物を作製する。乳腺はタンパク質生産性の高い器官であるため、かかる方法を使用してg/l範囲(多くの場合、著しく高い)のタンパク質濃度を生み出すことができる。好ましくは、乳腺での発現はGENSETポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを乳腺特異的プロモーターと、所望により、その他の調節エレメントに機能し得る形で連結することにより達成される。好適なプロモーターおよびその他のエレメントとしては、限定されるものではないが、哺乳動物ショートおよびロングWAP、 α、β、およびκ、カゼイン、αおよびβラクトグロブリン、β-CN 5’遺伝子由来のもの、ならびにマウス乳腺癌ウイルス(MMTV)プロモーターが挙げられる。かかるプロモーターおよびその他のエレメントは、限定されるものではないが、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウサギ、およびモルモットをはじめとする哺乳動物由来のものであってよい。プロモーターおよびその他の調節配列、ベクター、ならびにその他の関連した教示は、例えば、Clark (1998) J Mammary Gland Biol Neoplasia 3:337-50; Jostら(1999) Nat. Biotechnol 17:160-4;米国特許第5,994,616号;同第6,140,552号;同第6,013,857号; Sohnら(1999) DNA Cell Biol. 18:845-52; Kimら(1999) J. Biochem. (Japan) 126:320-5; Soulierら(1999) Euro. J. Biochem. 260:533-9; Zhangら(1997) Chin. J. Biotech. 13:271-6; Rijnkelsら(1998) Transgen. Res. 7:5-14; Korhonenら(1997) Euro. J. Biochem. 245:482-9; Uusi-Oukariら(1997) Transgen. Res. 6:75-84; Hitchinら(1996) Prot. Expr. Purif. 7:247-52; Platenburgら(1994) Transgen. Res. 3:99-108; Heng-Cherlら(1993) Animal Biotech. 4:89-107; およびChristaら(2000) Euro. J. Biochem. 267:1665-71(なお、それらの全開示内容は各々参照により本明細書に組み入れられる)により示されている。
【０３９７】
もう1つの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをin vivoにおいて乳腺の体細胞、例えば、乳腺分泌上皮細胞に導入することによりポリペプチドを乳汁に分泌させることができる。例えば、プラスミドDNAは乳頭管から、例えば、DEAE-デキストランを介して(例えば、Hensら(2000) Biochim. Biophys. Acta 1523:161-171を参照)、構築物の受容体媒介エンドサイトーシスを導き得るリガンドを介して(例えば、Sobolevら(1998) 273:7928-33を参照)、またはレトロウイルスベクター、例えば、テナガザル白血病ウイルスなどのウイルスベクターとして(例えば、Archerら(1994) PNAS 91:6840-6844を参照)注入することができる。これらの実施形態のいずれにおいても、ポリヌクレオチドが前記のように乳腺特異的プロモーター、あるいはCMVまたはMoMLV LTRなどのいずれかの強力な発現プロモーターに機能し得る形で連結されていてもよい。
【０３９８】
ベクター、プロモーター、調節エレメントなどの本発明での使用についての適合性は乳腺上皮細胞、例えば、MacT細胞(ウシ乳腺上皮細胞)またはGME細胞(ヤギ乳腺上皮細胞)などの細胞をin vitroにおいてトランスフェクトし、さらにトランスフェクションおよび細胞内でのトランスジーンの発現の効率を調べることによって事前に評価することができる。
【０３９９】
in vivo投与では、ポリヌクレオチドをいずれかの好適な製剤として、いずれの濃度範囲でも(例えば、1〜500μg/ml、好ましくは50〜100μg/ml)、いずれの用量でも(例えば、1〜100ml、好ましくは1〜20ml)投与することができるし、さらにいずれの服用回数でも(例えば、1、2、3、5、または10回)、いずれの頻度でも(例えば、1、2、3、5、10日おきに、またはいずれの日数を隔ててもよい)投与することができる。好適な濃度、回数、投与様式などはポリヌクレオチド、ベクター、動物などの性質によって異なり、当業者であれば容易に決定することができる。
【０４００】
好ましい実施形態では、Archerら((1994) PNAS 91:6840-6844)に記載されたようにテナガザル白血病ウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターを使用する。レトロウイルス感染は典型的には細胞分裂を必要とするため、ベクターの投与と同時に、例えば、安息香酸エストロジオール、プロゲステロン、レセルピン、またはデクサメタゾーンなどの因子を用いて乳腺における細胞分裂を刺激することができる。さらに、ポリブレンなどの補助的化合物を用いてレトロウイルスによる、さらにはその他の感染方法を容易にすることができる。
【０４０１】
乳汁からGENSETポリペプチドを得るための本明細書に記載のいずれの方法においても、得られる乳汁量、その結果として生じるGENSETポリペプチド量を、例えば、ヘクセストロール、エストロゲン、および／またはプロゲステロンを用いたいずれかの標準的乳汁分泌誘発方法を用いて高めることができる。
【０４０２】
かかる実施形態で使用するポリヌクレオチドは全長GENSETタンパク質またはGENSET断片のいずれかをコードすることができる。典型的には、コードされるポリペプチドはタンパク質の乳汁への分泌を確実にするシグナル配列を含んでいると考えられる。
【０４０３】
本発明のトランスジェニック動物から誘導される組換え細胞系:
本発明のさらなる目的は本明細書に記載のトランスジェニック動物から得られる宿主細胞組換え体を含む。ある実施形態では、本発明は非ヒト宿主哺乳動物および本発明の組換えベクターまたはノックアウトベクターとの相同組換えによって破壊されたGENSET遺伝子を含んでなる動物から誘導される細胞を含む。
【０４０４】
組換え細胞系は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Chou (1989)、およびShayら(1991)に記載されたように、本発明のトランスジェニック動物のいずれかの組織から得られた細胞から、例えば、SV40ラージT抗原などのonc-遺伝子を発現するベクターでの一次細胞培養物のトランスフェクションによってin vitroにおいて確立することができる。
【０４０５】
本発明のポリペプチドの使用
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは多くのin vitroおよびin vivo用途を含む多数の方法のいずれにおいても使用できる。以下、本明細書に記載の多数のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの特定の用途を詳細に記載する。
【０４０６】
配列番号255のタンパク質(内部識別番号500762786_255-24-5-0-A2-R_104)
クローン500762786_255-24-5-0-A2-R_104のcDNA(配列番号86)はヒトEDR4タンパク質LFPAPAPPPAPAFAPPPKVPSPERSAPRVPLPSPQPSYPFRPAASGGTPPPACLPPAQPCQGSPAMNLFRFLGDLSHLLAIILLLLKIWKSRSCAAHPQLPLSFCLSVCLSVSLSLSXSLSLSFSVSKKKKK(配列番号255)をコードする。本願を通して記載される配列番号86のポリヌクレオチドおよび配列番号355のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン500762786_255-24-5-0-A2-R_104のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドにも関係すると考えられる。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびそれをコードするポリヌクレオチドは本発明に含まれる。本発明に含まれる関連のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は配列番号406および520である。
【０４０７】
真核細胞の正常な機能には、新しく合成される総てのタンパク質が正確に折りたたまれ、修飾され、特定の内部および細胞外部位へ送達される必要がある。新しく合成される膜および分泌タンパク質は合成中または合成直後(同時翻訳的にまたは翻訳後に)細胞選別および分布ネットワークに入り、細胞内外の特定の場所に送られる。このプロセスの最初のコンパートメントが小胞体(ER)であり、ここでタンパク質はグリコシル化、ジスルフィド結合の形成およびオリゴマーの構築などの修飾を受ける。次にタンパク質はゴルジ体の種々の嚢を含むさらなる一連の膜結合コンパートメントを通して輸送され、ここでさらなる炭水化物修飾が起こる。コンパートメント間の輸送は特定の様式で出芽および融合する小胞によって起こり、分泌経路中、タンパク質は膜を経て細胞表面に達することはない。
【０４０８】
この系の複雑性は適当な酵素触媒を含む閉じられたコンパートメントでタンパク質の折りたたみおよび成熟を可能とすることから細胞にとって利点がある。しかし、それはこれらの酵素を正確に配置し、それらをその場所に維持する選別機構に依存している。
【０４０９】
この系の最初の細胞小器官であるERはタンパク質構造修飾に関与する多数の酵素を含む。この中にはタンパク質の正確な折りたたみを指示するBiP(結合タンパク質)、PDI(タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ)および90kDa熱ショックタンパク質のホモログがあり、後者はいずれもジスルフィド結合の形成および再配列を触媒する(Gething, M. J.およびSambrook, J. (1992) Nature 355:33-45)。これらの豊富な可溶性タンパク質はERに保持されていなければならず、すぐにゴルジ体へ輸送される新たに合成された分泌タンパク質とは区別されなければならない。哺乳動物細胞のERにおける保持のためのシグナルはタンパク質のカルボキシ末端にある4ペプチド配列KDELからなる。この配列はラットBiPおよびPDIの配列と比べた場合に最初に同定されたものであり、その後、いくつかの種の他の管腔ERタンパク質のカルボキシ末端で見出されている(Munro, S. (1986) Cell 46:291-300; Pelham, H. R. (1989) Ann. Rev. Cell. Biol. 5:1-23)。この配列を含むタンパク質はERを出ていくが、最初のゴルジ体コンパートメントからすぐに回収されてERに戻り、一方、このシグナルを持たないタンパク質は引き続き分布経路に留まる。
【０４１０】
まずS.セレビシエで2つの小胞体回収受容体が同定され、その後、このS.セレビシエ配列に基づく縮重PCRプライマーの使用によって2つのヒト小胞回収受容体が単離された(Hardwick, K. G. (1990) EMBO J. 9:623-630; Semenza, J. C. (1990) Cell 61:1349-1357; Lewis, M. J.およびPelham, H. R. (1990) Nature 348:162-163; Lewis, M. J.およびPelham, H. R. (1992) J. Mol. Biol. 226:913-916)。これらの配列を比較すると、それらが細胞質およびER管腔内に短いループだけを持つ保存された7開幕貫通ドメイン構造からなっていることが示される。これらの小胞回収受容体を用いた研究によれば、リガンド結合がこの受容体の移動を制御し、COS細胞で発現した場合にはこのヒト受容体は通常ゴルジ体で濃縮されるが、KDELタグを付けたニワトリリゾチームなどのリガンドと結合した場合にはERに移動することが示されている(Lewis, M. J.およびPelham, H. R. (1992) Cell 68:353-364)。
【０４１１】
これらの分子のER回収機能は、タンパク質構造修飾を行うのに必要な酵素プールをER内に保持し、新たに合成されたタンパク質を正確に修飾されるまでER内に維持し、かつ、ゴルジ体の構造を調節する働きをする。ER回収受容体(Erd2)を欠くサッカロミセス・セレビシエ細胞は欠陥のあるゴルジ体を有し、増殖できない。酵母Erd2変異体の解析では、それらの増殖にはER中に複数のタンパク質が保持されていることとゴルジ体から特定のタンパク質が選択的に除去されることの双方が必要であることを示している(Townsley, F. M. (1994) J. Cell Biol. 127:21-28)。COS細胞においてヒトER回収受容体が過剰発現すると、ゴルジ体からERへの活発な逆輸送が起こり、ゴルジ構造の欠如と分泌経路の崩壊に至る(Hsu V. W. (1992) Cell 69:625-635)。
【０４１２】
細胞の分泌経路の破壊はいくつかのヒト疾病と関連づけられている。家族性高コレステロール血症では、低密度リポタンパク質受容体が細胞表面に移動せずにERに留まる(Pathak, R. K. (1988) J. Cell Biol. 106:1831-1841)。ある形態の先天性甲状腺機能低下症は甲状腺プロホルモンであるチログロブリンの欠損によって起こる。この疾病ではチログロブリンが正確に折りたたまれないことからER内に留まる(Kim, P. S. (1996) J.Cell Biol. 133:517-527)。プロテオリピドタンパク質(PLP)の変異型は、髄鞘発育不全または髄鞘形成減少疾患の発症に役割を果たすことから調べられている。この場合、疾病を生じる突然変異はERおよび最初のゴルジ体でのPLPの輸送を抑える突然変異であり、その後のERでのPLPの蓄積は急速な乏突起神経膠細胞の死滅をもたらす(Gow, A. (1994) J. Neurosci. Res. 37:574-583)。
【０４１３】
ヒトER回収受容体の機能は特定の抗原のプロセシングおよびT細胞への提示に必要である。多くの抗原は、T細胞の抗原特異的受容体によって認識されるために、細胞表面で主要組織適合性複合体(MHC)分子と会合して提示され得るまで細胞内でプロセシングを受けなければならない。抗生物質ブレフェルジンAによりER回収受容体機能を崩壊させるとT細胞に対して特異的抗原複合体を提示する細胞の能力がなくなる。これらの抗原タンパク質は、次にMHC分子と結合して細胞表面での提示のために放出され得る小ペプチドに切断されるようERに留まっていなければならない(Kakiuchi, T. (1991) J. Immunol. 147:3289-3295)。
【０４１４】
新規なヒトKDEL受容体をコードするポリヌクレオチド、およびそれらの分子自体を発見すれば細胞のタンパク質分泌経路の調節をさらに調べる手段となる。新規なヒトKDEL受容体に関する分子を発見すれば、この経路の研究およびこの経路の機能不全を伴う疾病の研究の手段またはツールを提供することで当技術分野の必要が満たされる。
【０４１５】
本発明のある実施形態では、KDEL含有タンパク質、ならびに「HDEL」、「DDEL」、「ADEL」、「SDEL」、「RDEL」、「KEEL」、「QEDL」、「HIEL」、「HTEL」および「KQDL」などの同等のER保持シグナルを有するその他の相同タンパク質を精製するために本発明のERD4ポリペプチドを用いる。これは当技術分野で周知の方法(例えばアフィニティークロマトグラフィー、パンニングなど)を用いて本発明のEDR4ポリペプチドをカラムまたはその他の固相支持体に共有結合または非共有結合させることにより行えばよい。ERD4ポリペプチドと結合させたところで、夾雑物を除去するためにこの複合体を洗浄する。標的タンパク質はグラジェントまたは段階的精製のいずれかで塩濃度を上昇させて遊離させる。結合した標的タンパク質もまた、塩濃度を一段階引き上げることによりERD4ポリペプチドから遊離させることができる。
【０４１６】
本発明のもう1つの実施形態では、KDELまたはその他の相同配列をその配列と結合可能な条件下でEDR4ポリペプチドと接触させ、結合したEDR4の存在を検出するステップを含んでなる方法により、上記のようなKDEL含有タンパク質およびその他の相同配列を検出するために本発明のEDR4ポリペプチドを用いる。結合したEDR4の存在は直接または間接的にEDR4を標識するなど、当技術分野で公知の方法を用いて検出することができる。結合したEDR4は例えば、EDR4と特異的に結合する抗体または直接または間接的に検出可能な他のEDR4結合化合物を用いて検出することができる。
【０４１７】
上記のようなKDEL含有タンパク質およびその他の相同配列と結合するのに好ましいERD4ポリペプチドはアミノ酸配列-KIWK-または-MNLFRFLGDLSHLLAIILLLLKIWKSRSCA-を含んでなる。
【０４１８】
本発明はさらに、同時発現可能な状態で以下の発現ユニット:小胞体に局在し、かつ、そこに留まるためのシグナルを有するタンパク質と結合し得るERD4ポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ユニット;小胞体に局在する上記タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ユニット;および小胞体に局在する上記タンパク質の作用の対象となるポリペプチドをコードする外来遺伝子を含む発現ユニット；を含んでなる形質転換体、ならびに同時発現可能な状態でヒト血清アルブミンプレプロ配列をコードするDNA断片および有用なポリペプチドをコードする外来遺伝子からなる融合遺伝子を含んでなる形質転換体に関する。本発明はまた、ポリペプチドが形質転換細胞から優先的に分泌されるその形質転換体で上記遺伝子を同時発現させることにより上記ポリペプチドを生産する方法に関する。したがって、本発明は上記ポリペプチドの生産性を向上させるという利点を有する。
【０４１９】
より詳しくは、本発明は、同時発現可能な状態で酵母染色体に組み込まれた以下の発現ユニット:小胞体保持シグナルに対する受容体をコードする遺伝子を含む第1の発現ユニット(ここでこの受容体は「KDEL」、「HDEL」、「DDEL」、「ADEL」、「SDEL」、「RDEL」、「KEEL」、「QEDL」、「HIEL」、「HTEL」および「KQDL」からなる群から選択される保持シグナルに結合し得る受容体タンパク質EDR4またはその断片である)；ならびにタンパク質ジスルフィドイソメラーゼをコードする遺伝子を含む第2の発現ユニット(ここでこのイソメラーゼは小胞体保持シグナルを含んでなる)；または上記イソメラーゼのアミノ酸配列とヒト血清アルブミンプレプロ配列を含んでなる融合タンパク質をコードする遺伝子；を含んでなる形質転換酵母細胞に関する。これらの方法は当技術分野で公知であるか、または、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,578,466号に記載の方法を用いて行うことができる。
【０４２０】
配列番号193および194のタンパク質(内部識別番号585770_215-16-5-0-E8-Fおよび123996_140-002-5-0-B4-F)
クローン585770_215-16-5-0-E8-F(配列番号24)および123996_140-002-5-0-B4-F(配列番号25)のcDNAはそれぞれヒト平滑筋ペインエフェクター(SMPE)タンパク質: MRGATRVSIMLLLVTVSDCAVITGACERDVQCGAGTCCAISLWLRGLRMCTPLGRXGEECHPGSHKIPFFRKRKHHTCPCLPNLLCSRFPDGRYRCSMDLKNINF(配列番号193)およびMRGATRVSIMLLLVTVSDCAVITGACERDVQCGAGTCCAISLWLRGLRMCTPLGREGEECHPGSHKIPFFRKRKHHTCPCLPNLLCSRFPDGRYRCSMDLKNINF(配列番号194)をコードする。本願を通じて記載される配列番号24および25のポリヌクレオチド、ならびに配列番号193および194のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン585770_215-16-5-0-E8-Fおよび123996_140-002-5-0-B4-FのヒトcDNA、およびそれによりコードされるポリペプチドにも当てはまると考えられる。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびそれをコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。本発明に含まれる関連のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は配列番号360および447である。
【０４２１】
SMPEは縦走回腸筋および遠位結腸を収縮させ、近位結腸を弛緩させる。SMPEは回腸膜および脳膜の双方と高い親和性で結合する。従って、該細胞を収縮に有効な量のSMPEポリペプチドと接触させるステップを含んでなる、in vitroまたはin vivoにおいて胃腸管平滑筋細胞を収縮させる方法も本発明の実施形態として含まれる。好ましくはこの胃腸管平滑筋細胞は縦走回腸または遠位結腸の細胞である。本発明のさらなる実施形態は、該細胞を弛緩に有効な量のSMPEポリペプチドと接触させるステップを含んでなる、胃腸管平滑筋細胞を弛緩させる方法である。好ましくは、この胃腸管平滑筋細胞は遠位結腸細胞である。SMPEはまた同様に子宮細胞を収縮させるためにも使用できる。従って、該細胞を収縮に有効な量のSMPEポリペプチドと接触させることを含んでなる、子宮平滑筋を収縮させる方法が本発明に含まれる。さらに該細胞を収縮に有効な量のSMPEポリペプチドと接触させることを含んでなる、平滑筋細胞(例えば、膀胱、血管)を収縮させる方法も本発明に含まれる。さらに血管内皮細胞を血管形成阻害に有効な量のSMPEポリペプチドと接触させることを含んでなる、血管形成を阻害する方法も本発明に含まれる。SMPE抗血管形成作用は当技術分野で公知のアッセイを用いて測定することができる。例えば、in vivo抗血管形成作用は10日齢のニワトリ胚漿尿膜モデルを用いてアッセイすることができる。
【０４２２】
SMPEは回腸膜および脳膜の双方と高い親和性で結合する。従って、本発明のさらなる実施形態としては、回腸膜または脳膜にSMPEポリペプチドを結合させる方法がある。さらに回腸膜または脳膜を検出する方法としては、回腸膜または脳膜をこれらの膜に結合することができるような条件下でSMPEポリペプチドと接触させ、SMPEの存在を検出するステップを含んでなる方法も使用できる。SMPEの存在はSMPEを直接または間接的に標識することなどにより、当技術分野で公知の方法を用いて検出することができる。結合したSMPEは例えばSMPEと特異的に結合する抗体または直接または間接的に検出可能な別のSMPE結合化合物を用いて検出することができる。
【０４２３】
またSMPEは精母細胞でも発現する。従って、本発明のさらなる実施形態はSMPEポリペプチドまたは核酸を検出することにより精巣または精母細胞を検出する方法である。SMPEポリペプチドは抗SMPE抗体またはその他のSMPE結合化合物を用いて検出することができる。SMPEポリヌクレオチド(mRNAなど)はPCR(RT-PCR)、ハイブリダイゼーション(ノーザンブロット解析)など当技術分野で公知の方法を用いて検出することができる。
【０４２４】
SMPEは、CNS（例えば脳）と接触した際、痛覚過敏を誘発する。従って、本発明は、CNSを痛覚過敏に有効な量のSMPEポリペプチドと接触させることを含んでなる、痛覚過敏誘発法を含む。SMPEは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるPCT出願WO9906060に記載のものをはじめ、当技術分野で公知の方法を用いてCNSに送達することができる。WO9906060の方法を用い、TGF-α、または上皮増殖因子(EGF)受容体と結合するその他のポリペプチドを本発明のSMPEポリペプチドと置換する。
【０４２５】
さらにSMPEの阻害剤を用いて上記SMPE活性を阻害する方法も本発明に含まれる。SMPEの好ましい阻害剤は抗SMPE抗体である。このように本発明の1つの実施形態は、該細胞を収縮または痛みの抑制に有効な量の抗SMPE抗体またはその他のSMPE阻害剤と接触させるステップを含んでなる平滑筋(膀胱、胃腸管細胞、子宮)の収縮または痛みを抑制する方法である。
【０４２６】
本発明はさらに、SMPEポリペプチドを上記試験化合物と接触させ、その試験化合物が上記SMPEポリペプチドと結合するかどうかを検出または測定するステップを含んでなる、上記SMPEと結合するおよび／またはその活性を阻害する試験化合物のスクリーニング方法に関する。あるいは、この方法はSMPEポリペプチドを試験化合物の存在下でSMPEポリペプチドの結合標的(例えば、平滑筋細胞または脳細胞)と接触させ、その結合標的に対するSMPEポリペプチドの結合を検出または測定するステップを含んでなり、試験化合物の不在下での結合量に対して試験化合物の存在下での結合量の違いがその試験化合物がその結合標的に対する上記ポリペプチドの結合を調節、好ましくは阻害するということを示す。あるいはまたこの方法はSMPEポリペプチドを試験化合物の存在下で結合標的と接触させるステップを含んでなり、そのSMPEポリペプチドとその結合標的との結合が生物活性(例えば、上記の活性)を誘導するまたは生じさせ、これを検出または測定し、さらに試験化合物の不在下での生物活性の量に対して試験化合物の存在下での生物活性のレベルの違いがその試験化合物が上記SMPEポリペプチドの生物活性を調節、好ましくは阻害または活性化するということを示す。
【０４２７】
本明細書に記載の方法で用いるための好ましいSMPEポリペプチドとしては、配列番号193または194のアミノ酸配列AVITGACERDVQCGAGTCCAISLWLRGLRMCTPLGREGEECHPGSHKIPFFRKRKHH-または-TGACERDVQCGAGTCCAISLWLRGLRMCT-が挙げられる。
【０４２８】
配列番号305のタンパク質(内部識別番号500691428_255-2-5-0-D4-R_104)
ヒトcDNAクローン500691428_255-2-5-0-D4-R_104(配列番号136)はヒト小胞会合膜タンパク質10すなわちVAMP-10タンパク質: MSATAATAPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNRRLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGPSQFETSAAKLKRKYWWKNLKMMIILGVICAIILIIIIVYFST(配列番号305)をコードする。本願を通じて記載される配列番号136のポリヌクレオチドおよび配列番号305のポリペプチドの全ての特徴および用途はヒトcDNAクローン500691428_255-2-5-0-D4-R_104およびそれによりコードされるポリペプチドにも当てはまると考えられる。本明細書に記載の生物活性を有するポリペプチド断片およびそれをコードするポリヌクレオチドも本発明に含まれる。本発明に含まれる関連のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は配列番号432および546である。
【０４２９】
VAMP-10はある細胞の原形質膜からシナプスを経て受容ニューロンの原形質膜へ向かう小胞の移動に関与する内膜タンパク質である。この調節された小胞輸送経路およびエンドサイトーシスのプロセスはクロストリジウム破傷風毒素(TeTx)およびボツリヌス毒素(BoNT)、ならびにVAMPを切断することにより神経伝達物質の放出を妨げる他のメタロエンドプロテアーゼ神経毒の極めて特異的な作用によって遮断され得る。VAMP-10は膜輸送において重要である。VAMP-10は、発達中のエキソサイトーシスを介した軸索の伸張、神経伝達物質および調節ペプチドの放出、およびエンドサイトーシスに関与する。神経末端における厳格に調節されたシナプス小胞サイクルはシナプス小胞の形成、VAMP-10を含んでなる小胞とプレシナプス原形質膜との合体、これらの膜の融合およびその結果としての神経伝達物質の放出、空の小胞のエンドサイトーシス、ならびに新たな小胞の再生からなる。エンドサイトーシス的小胞輸送は核膜、小胞体、ゴルジ体、およびペルオキシソームまたはリソソームなどの種々の封入体の融合および分裂などの細胞内事象を含む。
【０４３０】
VAMP-10は他のVAMP同様、3つのドメイン構成を有する。これらのドメインにはプロリン豊富な可変N末端配列、高度に保存されたアミノ酸の親水性中央部分、および膜アンカーであると推測されるアミノ酸の疎水性配列が含まれる。
【０４３１】
ある実施態様では、本発明は第2の組成物、好ましくは核酸、ポリペプチド、または治療薬などの小分子をin vitroまたはin vivoで標的生体細胞へ送達するのに用いるためのVAMP-10ポリペプチド組成物を含む。この組成物は第1の分子および第2の分子としてVAMP-10ポリペプチドを含む。所望により第2の分子はVAMP-10ポリペプチドと共有結合もしくは非共有結合または融合させてもよい。VAMP-10ポリペプチド組成物はさらにリピソーム(lipisome)または脂質小胞によって第2の分子の送達を促進する人工脂質を含んでなってもよい。これらの方法においてVAMP-10ポリペプチドを用いるための方法は当技術分野で公知であり、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,074,844号、同第6,203,794号および同第6,099,857号が含まれる。好ましい実施形態では、培養細胞、好ましくは神経細胞、さらに好ましくはプレシナプス膜への第2の組成物の送達、例えばリピソーム媒介DNAトランスフェクションを促進するためにVAMP-10ポリペプチドが使用される。
【０４３２】
VAMP-10ポリペプチドはまたプレシナプス小胞とプレシナプス膜の合体および／または融合を妨げることにより神経伝達物質の放出を阻害する方法にも有用である。これらのポリペプチドは興奮分泌脱共役ペプチド(ESUP)と呼ばれることがある。この阻害活性を有するVAMP-10の断片は当技術分野で公知の方法を用いて同定することができる(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,090,631号および同第6,169,074号参照)。本発明のESUPは、神経伝達物質の分泌に先立って細胞原形質膜と合体する神経小胞にとって重要な三重タンパク質複合体(「合体複合体」)の構築のための結合ドメインとして働くペプチドに主要構造において対応する合成および精製VAMP-10ペプチド断片を含んでなる。好ましくは本発明のESUPの主要配列はまた、神経細胞におけるBoTxおよびTeTxタンパク質分解切断のVAMP-10ペプチド産物と配列が同じアミノ酸またはその断片(「タンパク質分解産物」)も含む。最適活性のためには、本発明のESUPは最小長約20アミノ酸、最大長約28アミノ酸を有するが、それより長くても短くてもよい。好ましくは、ESUPは合体複合体の結合ドメイン、最も好ましくはこのような結合ドメインの、天然型の合体複合体タンパク質の二重コイル構造の形成に関与する領域に主要構造が対応する。またESUPはターゲッティング様式で神経細胞へ目的物質を送達するために融合タンパク質の一部としての医薬担体として用いてもよい。神経伝達物質の放出を阻害するのに用いるための好ましいVAMP-10またはESUPポリペプチドとしては、配列番号305の-NRRLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGPSQFETSAAKLKRK-を含んでなるものが挙げられる。より好ましいESUPポリペプチドは、RVNVDKVLERDQKLSELDD; KVLERDQKLSELDDRA; VNVDKVLERDQKLSELDDRA; DIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADAL; DEVVDIMRVNVD; QAQVDEVVDIMRVNVD; LQQTQAQVDEVVDIMRVNVD; QQTQAQVDEVVD; NRRLQQTQAQVDEVVD;およびNLTSNRRLQQTQAQVDEVVDからなる群より選択される配列番号305のアミノ酸配列部分を含んでなる。
【０４３３】
上記ESUPは、A型BoTxを本発明のポリペプチドに置き換えることにより、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,113,915号または同第5,989,545号に従う痛みの抑制または治療のために用いることができる。
【０４３４】
VAMP-10は小胞の成分であるので、VAMP-10に対する抗体が小胞、好ましくは神経小胞輸送神経伝達物質の検出に有用である。VAMP-10は小胞の精製の際に小胞のマーカーとして使用することができ、あるいは免疫組織化学などのアッセイにおいてVAMP-10に対する抗体を用いて小胞を検出することができる。小胞のエキソサイトーシスの後、小胞内に挿入されたVAMP-10の一部が軸索の表面に見られることから、VAMP-10はシナプス小胞のエキソサイトーシスの検出およびモニタリングのために有用なものとなる。
【０４３５】
VAMP-10発現(mRNAまたはタンパク質)レベルまたは変異型VAMP-10の検出はさらに、ある個体が鬱病、双極性障害、精神分裂病などから選択される気分障害などの神経性疾患を発症するリスクがあるどうか、または有するかどうかを判定または診断するのに有利であり、ここでは神経性疾患を持たない個体と比較してVAMP-10、mRNAまたはタンパク質の発現レベルが低いことがその個体がその疾患を有している、または将来その疾患を有するリスクがあるということを示す。
【０４３６】
本発明はさらに新規な試薬を用いたクロストリジウム破傷風毒素(TeTx)およびボツリヌス毒素(BoNT)などの毒素に関する新規なアッセイ系を含む。好ましくは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,043,042号の方法を用いてアッセイを行うが、この場合、VAMP-10ポリペプチドは試験化合物によって切断される基質である。より具体的にはこのアッセイは以下のステップを含んでなる。
【０４３７】
本発明は
(a)試験化合物を基質および抗体と組み合わし(なおこの基質は毒素に対する切断部位を有し、毒素によって切断されると生成物を生じ、かつ、この抗体はその生成物と結合するが基質とは結合せず、かつ、この基質はVAMP-10ポリペプチドである);さらに
(b)その生成物と結合した抗体が存在するかどうかを調べる(なおこの生成物は固相アッセイ成分と結合している)
ステップを含んでなる、ボツリヌス毒素または破傷風毒素に関するアッセイに関する。
【０４３８】
好ましくは、本発明の実施では、VAMP-10ポリペプチドはこの毒素によって切断されてNおよびC末端を有する新たなペプチドを生じる。さらにペプチド基質がアッセイの固相成分と結合している。
【０４３９】
本発明のアッセイは、アッセイ成分(a)および(b):
(a)固相に結合されたペプチド（このペプチドは毒素によって切断可能であって切断産物を生じる）、
(b)切断産物と結合するが非切断ポリペプチドとは結合しない抗体、またはVAMP-10のN末端またはC末端部分のいずれかである切断産物と結合する抗体
を利用することができ、このアッセイは
(i)毒素を含む、または毒素からなり得る試験化合物を固相ペプチドと組み合わしてアッセイ混合物を形成し、
(ii)次にまたは同時にアッセイ混合物を抗体と組み合わし、さらに
(iii)次にまたは同時に抗体と切断産物との間でコンジュゲートが形成されているかどうかを調べる
ステップを含んでなるものであり得る。
【０４４０】
好ましくは、このアッセイのステップ(i)は亜鉛化合物およびVAMP-10ポリペプチドの存在下で行う。
【０４４１】
この実施形態では、アッセイは
(i)試験化合物を、VAMP-10ポリペプチドを含んでなる固相と組み合わし、
(ii)固相から試験化合物を洗い流し、
(iii)その固相を毒素により切断されたペプチドと選択的に結合するようにした抗体と組み合わし、さらに
(iv)抗体と切断されたペプチドとのコンジュゲートを検出する
ことを含んでなる。
【０４４２】
もう1つの実施形態では、アッセイは
(i)試験溶液を固定化ペプチド(ここでペプチドはVAMP-10ポリペプチドである)を含んでなるアッセイプレートに加え、
(ii)アッセイプレートをインキュベートし、
(iii)プレートをバッファーで洗浄し、
(iv)プレートに抗体溶液を加える(この溶液は(1)50C末端アミノ酸残基(配列番号305)、30C末端アミノ酸残基(配列番号305)、および20C末端アミノ酸残(基配列番号305)からなる群から選択されるペプチド(本発明のその他のVAMP-10ポリペプチドを選択してもよい)と選択的に結合するようにした抗体を含んでなる)
(2)そのN末端が(1)50N末端アミノ酸残基(配列番号305)、30N末端アミノ酸残基(配列番号305)、および25N末端アミノ酸残(基配列番号305)からなる群から選択されるペプチド(本発明のその他のVAMP-10ポリペプチドを選択してもよい)。
【０４４３】
(v)アッセイプレートをインキュベートし、
(vi)プレートをバッファーで洗浄し、さらに
(vii)アッセイプレート上の抗体の存在を測定する
ことを含んでなる。
【０４４４】
この実施形態では、抗体は酵素と結合させてもよく、プレート上の抗体の存在は酵素基質を加え、その基質の検出可能な産物への変換を測定することにより測定される。検出可能な産物は着色してもよいし、あるいは選択した波長における吸光度を測定してもよい。
【０４４５】
本発明の実施において試験化合物に存在する不活性毒素は活性毒素に変換し得る。これは試験化合物にプロテアーゼを添加することにより達成することができる。
【０４４６】
この抗体-ペプチドコンジュゲートは第1の抗体に特異的であって酵素に結合されているさらなる抗体を用いて検出することができる。
【０４４７】
配列番号171のタンパク質(内部識別クローン番号589115)および配列番号457の関連タンパク質
配列番号2および配列番号340のポリヌクレオチド、ならびに配列番号171および457のポリペプチドはアポリポタンパク質A1のC末端変異体(本明細書ではApoAI-CTVと呼ぶ)をコードする。本発明のある実施形態は、脂質輸送タンパク質のアポリポタンパク質ファミリーのこの新規な変異体をコードする配列番号2、340、171および457の組成を含む。具体的にはApoAI-CTVは循環からコレステロールを除去する働きをする高密度リポタンパク質の成分であることから、アテローム性動脈硬化症、冠状アテローム性動脈硬化病巣およびその後の微小血管および心血管疾患の発症に対する防御となる。
【０４４８】
本発明の好ましいポリヌクレオチドは配列-GCAGCTTTCTTAACTATCCTAACAAGCCTTGGACCAAATGGAAATAAAGCTTTTTGA-または-GAAGGCAGCTTTCTTAACTATCCTAACAAGCCTTGGACCAAATGGAAATAAAGCTTTTTGA-を含んでなる核酸をはじめとする配列番号2の塩基465〜521、または配列番号2および340の-AGCTCTACCGCCAGAAGGCAGCTTTCTTAACTATCCTAACAAGCCTTGGACCAAATGGAAATAAAGCTTTTTGATGAAAAAA-由来のcDNAの新規な部分の組成である。
【０４４９】
本発明の好ましいポリペプチドは配列番号171および配列番号457のアミノ酸配列-AAFLTILTSLGPNGNKAF、-MELYRQKAAFLTILTSLGPNGNKAF、または-QKKWQEEMELYRQKAAFLTILTSLGPNGNKAFを含んでなる新規なC末端部分の組成である。
【０４５０】
本発明のさらなる好ましいポリペプチドは配列番号171および457のアポリポタンパク質ドメインKAAVLTLAVLFLTGSQARHFWQQDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSAFSNLREQLGPVTQEXWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKAAFLTILTSLGPNGNKA、または配列番号171のアミノ酸残基位置-17〜+141を含んでなる組成を含む。
【０４５１】
本発明のある実施形態は、治療上有効量のapoAI-CTVもしくは変異体またはその混合物を個体に投与して治療前レベルの少なくとも5%総血漿コレステロールを低下させることを含んでなる、アテローム性動脈硬化症または心血管疾患の治療方法を含む。
【０４５２】
本発明のポリペプチドのさらなる有用性は当業者ならば他のアポリポタンパク質の生産および使用に関する方法によって、または全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5990081号のAgelandらによって記載されているようにしてさらに確認することができる。
【０４５３】
本願を通じて記載される配列番号2および配列番号340のポリヌクレオチド、ならびに配列番号171および457のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン589115のヒトcDNAについても当てはまると考えられる。
【０４５４】
配列番号302のタンパク質(内部識別クローン番号1000853793)および配列番号543の関連タンパク質
MRLFLSLPVLVVVLSIVLEGPAPAQGTPDVSSALDKLKEFGNTLEDKARELISRIKQSELSAKMREWFSETFQKVKDKLKIDS
配列番号133および配列番号429のポリヌクレオチドはそれぞれ配列番号302および配列番号543のヒトアポリポタンパク質CI(ApoCI)ポリペプチドをコードする。本発明のApoCIはGENPEP登録番号X00570、AF050154およびM20902のApoCIのグルタミン酸(E)がアスパラギン酸(配列番号302の77番のD)に置き換わったアミノ酸配列FQKVKDKLKIを含んでなり、1つのアミノ酸が異なっている。ApoCIは輸送コレステロールエステルに特異的に作用する脂質結合および輸送タンパク質のアポリポタンパク質ファミリーのメンバーである。
【０４５５】
本願を通じて記載される配列番号133および配列番号429のポリヌクレオチド、ならびに配列番号302および配列番号543のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン1000853793のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０４５６】
配列番号295のタンパク質(内部識別クローン番号642948)、配列番号296(内部識別クローン番号638743)、および配列番号539
MEASALTSSAVTSVAKVVRVASGSAVVLPLARIATVVIGGVVAMAAVPMVLSAMGFTAAGIASSSIAAKMMSAAAIANGGGVASGSLVATLQSLGATGLSGLTKFILGSIGSAIAAVIARFY
配列番号126、127および425のポリヌクレオチド、ならびに配列番号295、296および539のポリペプチドはそれぞれヒト膜貫通α-インターフェロン-誘導性ポリペプチドaINFIP-1、aINFIP-1、およびaINFIP-3をコードする。本発明の好ましいポリヌクレオチドおよびポリペプチドは配列番号126、127および425の核酸配列、ならびに配列番号295、296および539のアミノ酸配列を含んでなる。
【０４５７】
本明細書に記載の方法で用いるための配列番号295および配列番号539の好ましいポリペプチドとしては、-VLSAMGFTAAGIASSSIAAKMMSAAAIANGGGVASG-、-SSIAAKMMSAAAIANGGGVASGSLVATLQSLGAT-、または-VIGGVVAMAAVPMVLSAMGFTAAGIASSSIAAKMMSAAAIANGGGVASGSLVATLQSLGATGLSGLTK-を含んでなるアミノ酸配列が挙げられる。
本明細書に記載の方法で用いるための配列番号296の好ましいポリペプチドとしては、アミノ酸配列-AAAIANXGGVASGSLVATLQSLGATGLSGLTKF-または-LSAMGFTAAGIASSSIAAKMMSAAAIANXGGVASGSLVATLQSLGATGLS-が挙げられる。
【０４５８】
本願を通じて記載される配列番号126、127および425のポリヌクレオチド、ならびに配列番号295、296および539のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン番号642948およびクローン番号638743のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０４５９】
ポリペプチド内のグリシンミリスチル化部位はそのタンパク質の活性およびコンパートメント化を調節する働きをする(Resh, M. D. Biochim Biophys Acta 1451:1-16 (1999))。
【０４６０】
本発明の好ましいポリペプチドは、N-ミリスチル化部位を含んでなる断片を含む。配列番号295および配列番号539の中でのこのような部位の好ましいアミノ酸としては、GGVVAM(39〜44番)、GIASSS(60〜65番)、GGGVAS(79〜84番)、GSLVAT(85〜90番)、およびGSIGSX(108〜113番)が挙げられる。さらにこのようなアミノ酸配列の前に6残基内または後に6残基内のアミノ酸も好ましい。さらなる好ましいアミノ酸としては、配列番号296のポリペプチド内にN-ミリスチル化部位を含んでなる配列が挙げられる。配列番号296内のこのような部位の好ましいアミノ酸としては、IATVVIGGVVAMAAVPMV、MGFTAAGIASSSIAAKMM、AAIANXGGVASGSLVATL、NXGGVASGSLVATLQSLGA、およびLTKFILGSIGSAIAAVIARが挙げられる。
【０４６１】
インターフェロン(IFN)はサイトカインとして知られる細胞内メッセンジャータンパク質群の1つであり、ウイルスおよび腫瘍に対する身体の自然の防御の役割を果たす。I型IFN(αおよびβインターフェロン)は種々の細胞型で産生され、それらの生合成はウイルスその他の病原体により、また種々のサイトカインおよび増殖因子によって促進される。α-およびγ-IFNはいずれも免疫モジュレーターならびに抗炎症物質であって、マクロファージ、T-細胞およびナチュラルキラー細胞を活性化する(JonaschおよびHaluska, Oncologist 6(1):34 (2001)に総説)。ウイルスおよび腫瘍に対する身体の自然の防御の一環としてINFは免疫系の機能に作用し、病原体および腫瘍細胞に直接的な作用を持つ。IFNは本発明のポリペプチドaINFIP-1、aINFIP-1およびaINFIP-3をはじめとする細胞タンパク質の合成を誘導することによりこれら複数の作用を媒介する。
【０４６２】
aINFIPポリペプチドの抗ウイルス活性は常法に従ってアッセイされる(Toveyら, Proc. Soc. Exp. Biol. and Med., 1974 146: 809-815)。配列番号295、296および539の好ましいポリペプチドならびにその断片としては、単独またはインターフェロンαなどの既知の抗ウイルス治療薬と組み合わせて抗ウイルス活性を有する(好ましい抗ウイルス活性は単純ヘルペスウイルスおよびC型肝炎ウイルスに対するものである)ものが含まれる。
【０４６３】
本発明のaINFIPポリペプチドの抗腫瘍活性は、細胞をウイルスで処理するのではなく腫瘍細胞系を用いて抗ウイルス活性を試験するのに用いたものと同様の方法によって証明することができる。腫瘍細胞系の例としてはMCF-7(ヒト乳癌由来)、NOS-1(ヒト口腔扁平上皮細胞原発性癌腫由来)、およびMedB-1(ヒト縦隔ラージ原発性リンパ腫由来)が挙げられる。
【０４６４】
本発明のポリペプチドのさらなる用途は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるHardmanら, Pharmacological Basis of Therapeutics, McGraw-Hill, New York NY pp 1211-1214, 25 (1996)に記載の細胞浸透、脱殻、RNAおよびタンパク質合成、構築および放出などのウイルス機能の阻害におけるインターフェロン誘導性タンパク質に関する方法によってさらに確認することができる。
【０４６５】
本発明のもう1つの実施形態は細菌感染の悪影響を治療および／または予防するためのaINFIPポリペプチドまたはその断片の使用に関する。好ましい実施形態では、細菌内毒素リポ多糖(LPS)の作用を打ち消すために本発明のタンパク質を用いることができる。このような組成物を用いるための方法は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるDziegielewskaおよびAndersen, Biol. Neonate, 74:372-5 (1998)に記載されている。
【０４６６】
さらに、このaINFIP ポリペプチドまたはその断片はアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤などそれと結合する特異的分子を同定するために用いることもできる。本発明のもう1つの実施形態はaINFIPポリペプチドまたはその断片を用いてインターフェロンファミリーのサイトカインならびに本発明のaINFIPポリペプチドと相互作用し得るIL10および腫瘍抗原などの他のサイトカインを同定および／または定量する方法に関する。
【０４６７】
本発明のaINFIPポリペプチドまたはその断片は癌の治療、予防または緩和のための医薬製剤中に含まれる。本発明のもう1つの実施形態では、本発明のaINFIPポリペプチドまたはその断片はウイルスまたは細菌感染の治療、予防または緩和のための医薬製剤に含めて用いる。本発明のもう1つの実施形態では、本発明のaINFIPポリペプチドまたはその断片は、内在するサイトカインとそれらの天然受容体との結合を妨げ、それによりリガンド-受容体結合によって生じた細胞増殖または阻害シグナルを遮断することによりサイトカイン、およびIL-2、TNFα、CTLA4、CD28その他などの関連分子の作用を阻害および／または調節するために用いる。
【０４６８】
本発明のもう1つの実施形態では、本発明のaINFIPポリペプチドまたはその断片は、腹腔内、静脈内、皮下または罹患組織に直接タンパク質を注射することにより、自己免疫、炎症および腫瘍モデルなどのin vivo疾病モデルにおいて欠陥を直すのに有用である。
【０４６９】
配列番号126、127および425のポリヌクレオチドまたはその断片は、本発明のaINFIPポリペプチドの発現に関連するin vitroモデルまたは症状においてaINFIP-1、aINFIP-2またはaINFIP-3遺伝子発現の診断アッセイに有用である。この診断アッセイは遺伝子発現の有無および過剰を識別するため、また、治療的介入中に本発明の遺伝子レベルの調節をモニタリングするために有用である。このDNAはまた効果的な真核発現ベクターに組み込み、腫瘍をはじめとする上記症状を治療するため、および／または本発明のタンパク質を含む上記タンパク質のいずれかの疾病または遺伝子により誘導された欠陥を直すために遺伝子治療で用いるための特異的組織、器官または細胞集団へ直接ターゲッティングしてもよい。
【０４７０】
配列番号170のタンパク質(内部識別クローン番号502084)および配列番号456の関連タンパク質
配列番号339のポリヌクレオチドおよび配列番号456のポリペプチドは好中球刺激活性を有する新規な因子としてWO 9006321にすでに記載されている好中球刺激タンパク質2(GENPEP登録番号A01319)をコードする。配列番号1のポリヌクレオチドは配列番号170の+16の位置にグルタミン酸(E)ではなくアスパラギン酸(D)が位置する配列番号170のアミノ酸配列を含んでなる新規なポリペプチド変異体である好中球刺激タンパク質2vをコードする。本発明の好ましい組成としては配列番号170のポリペプチドが挙げられる。配列番号170のさらなる好ましいアミノ酸は配列LAKGKDESLDS、QXKRNLAKGKDESLDSDLYAE、またはSSTKGQXKRNLAKGKDESLDSDLYAELRCMCIKTTSGIHPKNIQSLEVIGKGTHCNQVEVIATLKDGRKICLDPDAPRIKKIVQKKLAGDESADを含んでなる。本願を通じて記載される配列番号1および配列番号339のポリヌクレオチド、ならびに配列番号170および配列番号456のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン502084のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０４７１】
本発明の好ましい実施形態は、創傷領域を有効量の配列番号170のポリペプチドと接触させることにより創傷治癒を刺激する方法における配列番号170の新規な好中球刺激タンパク質2vの使用、または全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,804,176号に記載のような使用を含む。さらなる好ましいものとしては、傷害部位を有効量の配列番号170のポリペプチドと接触させる、心筋梗塞後などの傷害後の再血管新生を目的とした血管形成の促進における好中球刺激タンパク質2vの使用、または全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,871,723号にさらに記載されているような使用を含む。好中球刺激タンパク質2vに対する抗体は、結合組織マトリックの沈着を妨げるまたは遮断することにより、配列番号170のポリペプチドを強皮症、肝硬変および骨髄繊維症などの繊維症組織と接触させることによる繊維性疾患の治療に有用である。
【０４７２】
本発明のある実施形態はこのサイトカインに機能を付与するドメインを含む配列番号170の断片を含む。好ましい断片としてはIL8ドメイン、DSDLYAELRCMCIKTTSGIHPKNIQSLEVIGKGTHCNQVEVIATLKDGRKICLDPDAPRIKKIVQKKLを含んでなるアミノ酸配列があげられる。さらなる好ましいアミノ酸としては、CMCIKTTSGIHPKNIQSLEVIGKGTHCNQVEVIATLKDGRKICLDを含んでなるアミノ酸配列の小サイトカイン(インタークリン/ケモカイン)C-x-Cサブファミリーサインが挙げられる。
【０４７３】
さらなる好ましいポリペプチドとしては、配列番号のアミノ酸残基2〜4、残基13〜15、残基36〜38および残基97〜99、すなわちSLR、SAR、STKおよびTLKを含んでなるアミノ酸配列を含むタンパク質キナーゼCリン酸化部位を含んでなる部分が挙げられる。さらなる好ましいポリペプチドとしては、アミノ酸残基97〜100、すなわちTLKDを含んでなるアミノ酸配列を含むカゼインキナーゼIIリン酸化部位を含んでなるアミノ酸配列部分が挙げられる。
【０４７４】
さらなる好ましいポリペプチドとしては、N-ミリスチル化部位、すなわちGTHCNQを含んでなるアミノ酸残基を含んでなるアミノ酸配列部分が挙げられる。
【０４７５】
さらなる好ましいポリペプチドとしては、CMCIKTTSGIHPKNIQSLEVIGKGTHCNQVEVIATLKDGRKICLDを含んでなるアミノ酸配列の小サイトカイン(インタークリン/ケモカイン)C-x-Cサブファミリーサインが挙げられる。
【０４７６】
配列番号227のタンパク質(内部識別クローン番号166601)および配列番号502の関連タンパク質
配列番号58および配列番号385のポリヌクレオチドはそれぞれ配列番号227および配列番号502のポリペプチドをコードし、アミノ酸配列MAAAAVPSLLLSLPPHQGLTFSNKIQPFGAQGVLHPEPGLRDWLLPTCSRQLRVALPEKGSEGSLCQTQLPATPCFLPSNTVRTを有する。本願を通じて記載される配列番号58および385のポリヌクレオチド、ならびに配列番号227および502のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン166601のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０４７７】
配列番号58および385のポリヌクレオチド、ならびに配列番号227および502のポリペプチドは転写調節タンパク質をコードする。本発明の好ましいポリヌクレオチドとしては、クローン166601を含んでなる核酸配列、配列番号58を含んでなるポリヌクレオチドおよび配列番号385を含んでなるポリヌクレオチドが挙げられる。本発明の好ましいポリペプチドとしては、クローン166601を含んでなる核酸配列に由来するアミノ酸配列、配列番号227のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド、および配列番号502のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが挙げられる。
【０４７８】
本発明のある実施形態では、好ましいポリペプチドとしては、タンパク質キナーゼCリン酸化部位、すなわち配列番号227および502のSNKまたはTVRを含んでなるアミノ酸配列を含んでなる部分が挙げられる。
【０４７９】
もう1つの実施形態では、本発明の好ましいポリペプチドとしては、ミリスチル化部位を含んでなるアミノ酸配列、すなわち配列番号227または502の配列GLTFSNまたはGSEGSLを含んでなるアミノ酸部分が挙げられる。
【０４８０】
配列番号268のタンパク質(内部識別クローン番号211056)および配列番号530の関連タンパク質
配列番号99および配列番号416のポリヌクレオチド、ならびに配列番号268および配列番号530のポリペプチドはそれぞれ以下nhTOHと呼ぶアミノ酸配列を含む新規なヒトトリプトファンヒドロキシラーゼをコードする。トリプトファンは能動輸送によってニューロンに取り込まれ、そこで5-ヒドロキシトリプトファン(5HTP)へとヒドロキシル化される。これは次に脱カルボキシル化されて、中枢神経系疾患、特に気分障害、睡眠障害および摂食障害に関与する神経伝達物質セロトニンとなる。本発明のポリペプチドの活性はセロトニンの生産レベルを高め、トリプトファンの代謝を高める。このように、本発明のポリペプチドはセロトニンのin vitro生産およびトリプトファンの代謝に有用である。例として配列番号99または配列番号416のポリヌクレオチドを含む発現ベクターをカルシウム沈殿法によるなど当技術分野で公知の方法によって細胞系へ導入することができ、トリプトファンを培地に供給し、細胞によって生産されたセロトニンを公知の方法により抽出することができる。
【０４８１】
本発明はさらにhnTOHポリペプチドを試験化合物と接触させ、試験化合物がhnTOHポリペプチドと結合するかどうかを検出または測定するステップを含んでなる、hnTOHと結合する試験化合物のスクリーニング方法に関する。本発明はさらにhnTOHポリペプチドを試験化合物と接触させ、試験化合物がhnTOHポリペプチドを活性化するかどうかを、例えばセロトニンの生産またはトリプトファンの枯渇を測定することによって検出または測定するステップを含んでなる、hnTOHポリペプチドを活性化する試験化合物のスクリーニング方法に関する。
【０４８２】
もう1つの実施形態は、スクリーニングにおいてセロトニンの生産を高めることが分かった試験化合物(アクチベーターと呼ばれる)の生理学上許容される組成物を含む。さらなる実施形態としては、in vivoで用いるための生理学上許容される製剤の調製における、クリーニングにおいて同定された、または当技術分野でこれまでに知られているアクチベーターを用いるための方法を含む。さらなる好ましいものとして、トリプトファンおよびセロトニンレベルが異常なCNS障害、特に鬱病、不安症、双極性障害および摂食障害の治療での生理学上許容される製剤においてアクチベーターを使用するための方法がある。
【０４８３】
本願を通じて記載される配列番号99および配列番号416のポリヌクレオチド、ならびに配列番号268および配列番号530のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン211056のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０４８４】
配列番号190のタンパク質(内部識別クローン番号147648)および配列番号474の関連タンパク質
配列番号21および配列番号357のポリヌクレオチド、ならびに配列番号190および配列番号474のポリペプチドは、転写因子基本ドメインサインbZIPとしても知られるロイシンジッパーパターン多量体化ドメイン（以下LZPと呼ぶ）を含む新規なDNA結合ポリペプチドをコードする(Haiら, Genes Dev. 3:2083(1989))。本発明のある実施形態は本発明の配列番号21、357、190および474の配列を含んでなるポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびその断片を含む。本発明の好ましいポリペプチドは、LAAGAVTLGIGFFALASALWFL、PKGFFNYLTYFLAAGAVTLGIG、またはFFALASALWFLICKRREIFQNSをはじめとする配列番号190および474のアミノ酸配列から選択されるロイシンジッパードメインを含んでなるアミノ酸配列に関する。本願を通じて記載される配列番号21および配列番号357のポリヌクレオチド、ならびに配列番号190および配列番号474のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン147648のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０４８５】
ロイシンジッパーは種々の細胞質ホルモン受容体および酵素の二量体化を可能とする(Formanら, Mol Endocrinol, 3, 1610-1626 (1989))。ロイシンジッパーはまた転写因子の共通の特徴であり、DNA鎖との強固な結合を生じるホモまたはヘテロ二量体化を可能とする(総説としてはAbelら, Nature 341, 24-25 (1989); Jonesら, Cell 61, 9-11 (1990); Lambら, Trends in Biochemical Sciences 16, 417-422 (1991)参照)。よって本発明の好ましいポリペプチドはバイオテクノロジーのいくつかの領域、特に、ホモ二量体化またはヘテロ二量体化を媒介するそれらの能力が、限定されるものではないが、免疫化学、抗体形成、可溶性オリゴマータンパク質の調製、相補性アッセイをはじめとするいくつかの適用が見出されているタンパク質工学において有用なツールとなる。本発明の有用性はさらに例えばBossletら(米国特許第5,643,731号)(in vitro診断のため、特に体液中のアナライトの免疫化学的検出および測定のためのロイシンジッパー対の使用)により;Tsoら(米国特許第5,932,448号)(二重特異性抗体ヘテロ二量体を形成するためのロイシンジッパーの使用);Conradら(米国特許第5,965,712号)、Ciardelliら(米国特許第5,837,816号)およびSpriggsら(WO9410308)（ロイシンジッパーを用いて可溶性オリゴマータンパク質を調製する方法が記載されている);およびPelletierら(WO9834120)（生体分子の相互作用を検出するためにタンパク質断片相補性アッセイにおいてロイシンジッパー形成配列を用いるための方法が記載されている)により記載されている方法(なお、全ての例で全開示内容は参照により本明細書に組み入れる)によってさらに確認することができる。
【０４８６】
ロイシンジッパードメインを含む本発明のポリペプチドの多量体化活性形成は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,942,433号に記載の円二色性スペクトルおよび熱融解分析をはじめとする当業者に公知のアッセイのいずれを用いてアッセイしてもよい。あるいは、当業者ならば、LZPのロイシンジッパーモチーフを、所定の生物の種々の組織または細胞型に由来するcDNAライブラリーからin vivoにてその相互作用タンパク質パートナーを同定するための十分確立された酵母二重ハイブリダイゼーション系において「ベイトタンパク質(bait protein)」として用いることもできる。あるいは、当業者ならば、哺乳動物細胞トランスフェクション実験においてLZPまたはその一部を用いることもできる。タンパク質発現ベクターにおいて[His]6タグなどの好適なペプチドタグと融合させ、培養細胞に導入すれば、この発現融合タンパク質は抗タグペプチド抗体を用いることでその可能性のある相互作用タンパク質を用いて免疫沈降させることができる。この方法は会合パートナーの同定または上述のものなどその他の方法によって得られた結果の確認のいずれかを目的に選択することができる。
【０４８７】
ある好ましい実施形態では、本発明は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる国際公開WO9410308に記載のものをはじめとする当業者に公知のいずれかの技術を用いて目的のタンパク質と融合させたロイシンジッパーを含む融合タンパク質の多量体からなる可溶性多量体タンパク質を調製するために配列番号および配列番号のLZPポリヌクレオチドおよびポリペプチドまたはその断片を用いた組成物および方法に関する。もう1つの好ましい実施形態では、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,932,448号に記載のような二重特異性抗体ヘテロ二量体を作製するためにLZPまたはその誘導体が使用される。要するに、ヘテロ二量体を形成し得るロイシンジッパーをそれぞれ異なる特異性を有するエピトープ結合成分に連結する。二重特異性抗体はロイシンジッパーの対をなす会合によって形成され、これにより2つの異なるエピトープ結合成分を連結するヘテロ二量体が形成される。さらにもう1つの好ましい実施形態では、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,643,731号に記載のような体液中のアナライトの検出および測定のためにLZPまたはその一部もしくはその誘導体が使用される。要するに、第1のロイシンジッパーを固相支持体に固定化し、第2のロイシンジッパーを体液中のアナライトの特異的結合パートナーに結合させる。次にこれら2つのペプチドを接触させ、それにより固相上にその結合パートナーを固定化する。次にこの生体サンプルを固定化した結合パートナーと接触させ、結合パートナーと結合したサンプル中のアナライト量を測定する。さらにもう1つの好ましい実施形態では、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,942,433号に記載のものをはじめとする当業者に公知のいずれかの遺伝子工学技術を用いて細胞増殖を阻害および／または制御するため、目的のタンパク質と多量体を形成し得る新規な核酸結合タンパク質を合成するためにLZPまたはその一部を使用してもよい。
【０４８８】
もう1つの実施形態では、本発明は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる国際公開WO9834120に記載のようにin vivoおよびin vitroにおいて生体分子の相互作用を検出することを目的とした、タンパク質断片相補性アッセイにおいてLZPまたはその一部もしくはその誘導体を用いた組成物および方法に関する。このようなアッセイは、未知のタンパク質を含む標的タンパク質と結合するcDNAライブラリーまたは有機小分子ライブラリーを生物活性に関してスクリーニングするため、タンパク質-タンパク質、タンパク質-核酸、タンパク質-炭水化物およびタンパク質-小分子間の相互作用をはじめとする分子の相互作用の平衡および動的態様を研究するのに用いることができる。
【０４８９】
本発明のさらにもう1つの目的は当業者に公知のタンパク質-タンパク質相互作用を検出するためのいずれかの技術を用いて新規なロイシンジッパードメインの同定のためのLPZまたはその一部の使用に関する。用い得る従来の方法としては、免疫共沈降、架橋、細胞溶解液のグラジェントまたはクロマトグラフィーカラムによる同時精製がある。LZPと相互作用するタンパク質として単離されれば、このような細胞内タンパク質を同定することができ(例えばそのアミノ酸配列を決定することができ)、次にそれと相互作用する他のタンパク質を同定するため標準的な技術と組み合わせて用いることができる。このようにして得られたアミノ酸配列はこのような細胞内タンパク質をコードする遺伝子配列のスクリーニングに使用できるオリゴヌクレオチド混合物を作製するための指標として用いることができる。スクリーニングは例えば標準的なハイブリダイゼーションまたはPCR技術によって達成し得る。オリゴヌクレオチド混合物の作製およびスクリーニングのための技術は周知のものである(例えば、Ausubelら編, Current Protocols in Molecular Biology, J.Wiley and Sons (New York, NY 1993)およびPR Protocols: A Guide to Methods and Applications, 1990, Innis, M.ら編, Academic Press, Inc., New York参照)。
【０４９０】
あるいは、当業者に公知のいずれかの技術を用いて、LZPまたはその一部と二量体化し得る細胞内タンパク質をコードする遺伝子を同時同定し得る方法も使用できる。これらの方法としては例えばLZPまたはその一部の標識された形態、あるいはマーカー(例えば酵素、蛍光物質、発光タンパク質または色素)と融合させたLZPまたはその一部などの融合タンパク質、あるいはIg-Fcドメインをプローブとして用いてλgt11ライブラリーの抗体プロービングに関する周知の技術と同様にしてcDNA発現ライブラリーをプロービングすることを含む(cDNA発現ライブラリーのスクリーニングに関する技術的詳細はAusubelら,上記を参照)。あるいはin vivoでタンパク質の相互作用を検出するための別法のツーハイブリッド系を用いてもよい。
【０４９１】
配列番号318のタンパク質(内部識別クローン番号124608)および配列番号556の関連タンパク質
配列番号149および配列番号442のポリヌクレオチド、ならびに配列番号318および配列番号556のポリペプチドはRNAプロセシングおよびタンパク質発現において機能するRNA結合タンパク質hgRBPをコードする。配列番号318および556の好ましい組成はMERPDKAALNALQPPEFRNESSLASTLKTLLFFTALMITVPIGLYFTTKSYIFEGALGMSNRDSYFYAAIVAVVAVHVVLALFVYVAWNEGSRQWREGKQDを含む。
【０４９２】
さらなる好ましいポリペプチドとしては、N-ミリスチル化部位すなわち43〜48番のアミノ酸配列を含んでなる、または細胞mRNAをタンパク質に翻訳する上でhgRBPを機能させるために小胞体の膜に対して該タンパク質をターゲッティングするアミノ酸配列GLYFTTを含んでなる配列番号318または配列番号556のものが挙げられる。
【０４９３】
本願を通じて記載される配列番号149および配列番号442のポリヌクレオチド、ならびに配列番号318および配列番号556のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン124608のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０４９４】
配列番号337のタンパク質(内部識別クローン番号113448)
配列番号168および関連の配列番号454のポリヌクレオチド、ならびに配列番号337のポリペプチドはクローン番号183902およびクローン番号635993に関連するRNAプロセシングおよびタンパク質発現に関与する新規なヒトRNA結合タンパク質をコードする。
【０４９５】
本願を通じて記載される配列番号168および関連の配列番号454のポリヌクレオチド、ならびに配列番号337のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン113448のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０４９６】
配列番号328のタンパク質(内部識別クローン番号183902)
配列番号159および関連の配列番号450のポリヌクレオチド、ならびに配列番号328のポリペプチドはクローン番号113448およびクローン番号635993に関連するRNAプロセシングおよびタンパク質発現に関与する新規なヒトRNA結合タンパク質をコードする。
【０４９７】
本願を通じて記載される配列番号159および関連の配列番号450のポリヌクレオチド、ならびに配列番号328のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン183902のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０４９８】
配列番号329のタンパク質(内部識別クローン番号635993)
配列番号160および関連の配列番号451のポリヌクレオチド、ならびに配列番号329のポリペプチドはクローン番号183902およびクローン番号113448に関連するRNAプロセシングおよびタンパク質発現に関与する新規なヒトRNA結合タンパク質をコードする。本願を通じて記載される配列番号160および関連の配列番号451のポリヌクレオチド、ならびに配列番号329のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン635993のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０４９９】
一本鎖RNAと結合する多くの真核生物タンパク質は約90アミノ酸の推定RNA結合ドメインの1以上のコピーを含む。これは真核生物RNA結合領域RNP-1サインまたはRNA認識モチーフ(RRM)として知られている(Bandziulisら, Genes Dev. 3:431 (1989); Swansonら, Trends Biochem. Sci. 13: 86-91 (1988))。RRMは、選択的スプライシングの調節に関連するタンパク質である異種核リボヌクレオタンパク質(hnRNP)および小核リボヌクレオタンパク質(snRNP)のタンパク質成分をはじめとする種々のRNA結合タンパク質で見られる。配列番号337、328および329のポリペプチドは、1コピーのRRMを含む新規なヒトRNA結合タンパク質(以下、ghRBPと呼ぶ)をコードする。核酸と結合するタンパク質ghRBPのさらなる特徴として、そのアミノ酸配列を含んでなるジンクフィンガーモチーフを含む。本発明の好ましいポリヌクレオチドとしては、配列番号159、160、168、450、451および454の核酸を含んでなるポリヌクレオチドが挙げられる。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号337、328および329のアミノ酸を含んでなるポリペプチドである。本願を通じて記載される配列番号159、160、168、450、451および454のポリヌクレオチドの全ての特徴および用途はクローン番号183902、クローン番号635993およびクローン番号113448のヒトcDNAについても当てはまると考えられる。
【０５００】
本発明の好ましいアミノ酸はRNA結合ドメインまたはその一部を含んでなる残基である。好ましいアミノ酸配列は以下、AFVRRXPWTAASSQLKEHFAQFGHVRRCILPFDKETGFHRGLGWVQFSSEEGLRNALQQENHIIDGVKVQV; SINQPVAFVRRXPWTAASSQLKEHFAQFGHVRRCILPFDKETGFHRGLGWVQFSSEEGLRNALQQENHIID; PWTAASSQLKEHFAQFGHVRRCILPFDKETGFHRGLGWVQFSSEEGLRNALQQENHIIDGVKVQVHTRRPをはじめとする配列セットから選択される。さらなる好ましい本発明のポリペプチドとしてはRNAと結合する配列番号のいずれかの断片が挙げられる。
【０５０１】
本発明のある実施形態は当技術分野で公知の技術によりin vitroにおいてRNA分子と結合させるために本発明のポリペプチドを用いる方法に関する。本発明のポリペプチドの好ましい使用としては、生体サンプル、化学試薬、細胞ホモジネートおよび組織ホモジネートからのRNAの抽出が挙げられる。本発明のポリペプチドまたはその一部のさらなる有用性は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるTrifillisら, RNA 5(8): 1071-82 (1999)および米国特許第6,107,029号に記載の方法を組み合わせることによってさらに確認することができる。
【０５０２】
配列番号248(内部識別クローン番号199782)、配列番号249(内部識別クローン番号821212)、配列番号250(内部識別クローン番号202863)のタンパク質および配列番号518の関連タンパク質
配列番号79、80、81および401のポリヌクレオチド、ならびに配列番号248、249、250および518のポリペプチドはスプライシング因子として働くヒトRNA会合ポリペプチドをコードする。本願を通じて記載される配列番号79、80、81および401のポリヌクレオチド、ならびに配列番号248、249、250および518のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン199782、821212および202863のヒトcDNAならびにそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０５０３】
遺伝情報のタンパク質への翻訳はRNAに依存し、このプロセスの最初のステップはDNAにコードされている遺伝情報を全て保持しつつDNAからRNAへ転写することである。このRNA転写物はスプライシングおよびポリアデニル化を含む種々のプロセシングステップを受ける。この成熟RNA転写物がリボソーム機構によりタンパク質へと翻訳される。初期RNA転写物は、イントロンの除去とエキソンの再連結を触媒するスプライセオソーム複合体により核内でスプライシングされる。少なくとも40のスプライシング因子が確認されており、これらの因子の相互作用は酵素的なイントロンの除去とエキソンの再連結に必要なコンホメーション変化において重要である。タンパク質およびRNA成分は両者ともスプライセオソームの構築およびスプライシング反応に関与する。異なるタンパク質およびRNA種とのRNAスプライシング反応に関与する2つの異なる触媒ステップが存在する。選択的スプライシング因子としては、それぞれパターン形成および性決定などの発達プロセスに重要な役割を果たす発達調節タンパク質が挙げられる(Hodgkin, J.ら (1994) Development 120:3681-3689)。選択的スプライシングはまた、構造タンパク質および酵素をはじめとするイソ型タンパク質の組織特異的発現にも関与している。
【０５０４】
本発明のある実施形態は、配列番号79、80、81および401のポリヌクレオチド、ならびに配列番号248、249、250および518のポリペプチドの組成物に関する。本発明の好ましいアミノ酸はジンクフィンガー領域またはその断片を含んでなり、以下、GACENCGAMTHKKKDCFE; NSIITKYRKGACENCGAM;またはTHKKKDCFERPRRVGAKFをはじめとする配列番号248、249、250および518由来のアミノ酸から選択される。
【０５０５】
配列番号248、249、250および518のポリペプチドはスプライセオソーム複合体に関与し、RNAプロセシングに機能を持つ。あるいは、本発明のポリペプチドはRNAプロセシングに関与し、従ってタンパク質発現に関与する。本発明の好ましい実施形態はin vitroにおいて配列番号79、80、81および401のポリヌクレオチドを用いる方法に関する。好ましい使用方法はトランスフェクションまたはマイクロインジェクションなど、当技術分野で公知の技術により細胞へ上記ポリペプチドまたはその断片を導入することに関する。さらなる好ましいものとして、所定の細胞においてタンパク質発現を変化させるために本発明のポリヌクレオチドを用いる方法がある。あるいは本発明のポリペプチドは無細胞発現系、哺乳動物発現系、昆虫発現系、または細菌発現系においてタンパク質発現を変化させるために当技術分野で公知の試薬と組み合わせて用いることができる。さらに本発明ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いてタンパク質発現を増強または低下させる方法が好ましい。本発明のポリペプチドまたはその一部の有用性は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6020164号、ならびにChuaおよびReed, Gene Devel 13:841-850 (1999)に記載の方法を用いてさらに確認することができる。
【０５０６】
もう1つの実施形態では、本発明のポリペプチドの阻害剤およびアクチベーターをスクリーニングするための方法が好ましい。もう1つの実施形態では、このようなスクリーニングで同定される分子または化合物がさらに好ましい。本発明のポリペプチドの活性を活性化または阻害する化合物がさらに好ましい。本発明のポリペプチドの活性はcAMPおよびcGMP依存性リン酸化部位(3〜6:55〜58;107〜110を含む)およびカゼインキナーゼIIリン酸化部位(33〜36:58〜61:126〜129を含む)におけるリン酸化によって修飾される。好ましいアクチベーターとしては限定されるものではないが、細胞内cAMPおよびcGMPの蓄積を促進する化合物が挙げられる。さらなる好ましいアクチベーターとしてはカゼインキナーゼIIを活性化する化合物が挙げられる。好ましい阻害剤としては細胞内のcAMPおよびcGMPの蓄積を阻害する化合物、またはcAMPおよびcGMPの分解を促進する化合物がある。さらなる好ましい阻害剤としては、カゼインキナーゼIIの脱活性化を促進する化合物が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドの阻害剤およびアクチベーターとしては当技術分野で公知の化合物ならびに本スクリーニング方法によって同定される化合物が挙げられる。さらに、リン酸化または脱リン酸化以外の手段により本発明のポリペプチドの活性を阻害または活性化する化合物も好ましい。
【０５０７】
もう1つの実施形態では、RNAプロセシングまたはタンパク質プロセシングの障害の治療、予防、緩和または診断において本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使用するための方法が好ましい。このような障害は限定されるものではないが、腺癌、白血病、肉腫、奇形癌腫などの癌、および細胞増殖および分化、胚形成、ならびにいずれかの組織、器官または系、例えば脳、副腎、または生殖系に関する形態形成に関連した障害を含む群から選択される。
【０５０８】
配列番号256のタンパク質(内部識別クローン番号822794)、配列番号257(内部識別クローン番号337572)および配列番号521の関連タンパク質
配列番号87、88および407のポリヌクレオチド、ならびに配列番号256、257および521のポリペプチドは、細胞分裂の調節に関与するシグナルトランスデューサー・転写アクチベーター(STAT)ファミリーのタンパク質の転写因子と相互作用するヒト核ポリペプチドをコードする。本願を通じて記載される配列番号87、88および407のポリヌクレオチド、ならびに配列番号256、257および521のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン822794および337572のヒトcDNA、ならびにそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０５０９】
STATは複数の細胞集団においてサイトカインにより刺激される遺伝子発現を媒介する多面的転写因子である(Levy, Cytokine Growth Factor Rev., 8:81 (1997))。STATタンパク質は全て、標的遺伝子発現の転写活性化に必要なDNA結合ドメイン、Srcホモロジー2(SH2)ドメイン、およびトランス活性化ドメインを含む。JAK1、JAK2、TykおよびJAK3をはじめとするヤヌスキナーゼ(JAK)は、SH2ドメイン付近の特定のチロシン残基でのチロシンリン酸化によって細胞質潜伏型のSTATタンパク質を活性化することにより、サイトカインにより誘発されるシグナル伝達の開始に中枢的役割を果たす細胞質タンパク質チロシンキナーゼ(PTK)である(Ihleら, Trends Genet., 11: 69 (1995); Darnell, Science 277(5332):1630 (1997); Johnstonら, Nature, 370: 1513 (1994))。チロシンリン酸化STATタンパク質は特異的相互的SH2ホスホチロシン相互作用によって二量体化し、細胞質から核へと転位し、そこでそれらはそれらのプロモーターの応答エレメントと結合することにより特定の標的遺伝子の転写を刺激する(Leonard, Nature Medicine, 2: 968 (1996); Zhongら, PNAS USA, 91:4806 (1994) Darnell, Science, 277:1630 (1997))。
【０５１０】
本発明のある実施形態では、それぞれ配列番号87、88および407、ならびに配列番号256、257および521のポリヌクレオチドおよびポリペプチドまたはそれらの断片の組成物が含まれる。活性化されたSTAT3と相互作用するが、STAT1、STAT2またはその他のSTATホモログとも相互作用し得る本発明のポリペプチドがさらに好ましい。本発明の好ましいポリペプチドはSTATの活性を阻害または低下する働きをする。配列番号256、257および521のさらなる好ましいアミノ酸として、SAPドメインVSSFRVSELQVLLGFAGRNKSGRKHDLLMRALHLLが挙げられる。それらの同族リガンドによるサイトカイン受容体の活性化はJAKを活性化し、次にこれがSTATSを活性化する。それゆえサイトカインおよびサイトカイン様受容体を介してシグナル伝達するその他のホルモンは本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドによって調節され得る。このように本発明によって調節され得るサイトカインおよびその他のホルモンとしては、限定されるものではないが、インターフェロン、インターロイキン、プロラクチンおよび成長ホルモンが挙げられる。本発明のポリペプチドまたはその一部の有用性は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるWIPO公報WO9928465に記載の方法を用いてさらに確認することができる。
【０５１１】
本発明のポリペプチドはin vitroで細胞中のSTATタンパク質の活性を阻害する方法において用いることができ、この方法は細胞内に核酸を導入することを含んでなる。ここで、この核酸は配列番号256、257および521のアミノ酸配列または1以上の保存的アミノ酸変異を有する配列番号256、257および521のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなり、かつ、この核酸は、上記アミノ酸配列がSTATタンパク質と特異的に結合し、またSTAT活性を低下させるのに十分な量で十分な時間上記アミノ酸配列を発現し、それにより細胞中のSTAT活性を低下させる。
【０５１２】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの好適な組成物は細胞周期の進行における欠陥から生じる疾病、症候群またはその他の望ましくない症状などの病態の治療方法として有用である。このような細胞周期欠陥は、活性化STATまたは活性化JNKもしくは活性化サイトカイン受容体などの上流因子の調節における欠陥に起因する可能性がある。あるいは、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、細胞周期の進行のSTAT調節の「下流」ステップにおける欠陥による細胞周期進行の欠陥に起因する病態を治療する方法において使用することもできる。好ましい実施形態では、限定されるものではないが、癌(例えば、白血病、リンパ腫、乳癌、大腸癌、前立腺癌、ウィルムス腫瘍)などの過増殖性疾患、環状動脈疾患、肺血管閉塞疾患、原発性または特徴的アイゼンメンガー症候群、および異常な細胞増殖に関するその他の疾患などの病態の治療において、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアゴニストが有用である。治療する細胞としては、限定されるものではないが、過増殖性細胞、癌細胞、血管平滑筋細胞、上皮細胞および生殖体が挙げられる。
【０５１３】
本発明のいくつかの実施形態では、最終的に分化した心筋細胞または組織、例えば横紋筋筋細胞の細胞再生などにおける細胞周期の進行を刺激、促進または助長するために本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドのアンタゴニストが用いられる。例えばこれにより心臓損傷、心筋梗塞、心筋炎、心筋症、外傷、心臓手術などの予後、損傷を受けた心筋の回復、または筋ジストロフィーにより消耗した横紋筋の充実が可能となる。
【０５１４】
さらなる実施形態では、これらの核酸によってコードされるポリペプチドの発現は宿主細胞の細胞周期欠陥を予防、緩和または軽減するか、あるいは宿主細胞の正常な細胞周期進行を回復させると予測される。核酸を介して提供した場合でも、細胞に直接ポリペプチドを送達する場合でも、本発明の治療製剤は、限定されるものではないが、化学療法および放射線療法をはじめとする他の形態の治療の補助として使用することもできる。
【０５１５】
配列番号330のタンパク質(内部識別クローン番号398703)および配列番号330の関連タンパク質
配列番号161および配列番号452のポリヌクレオチド、ならびに配列番号330のポリペプチドは新規なヒト脱ユビキチン化酵素(GNP:AF017306)をコードする。脱ユビキチン化酵素はいくつかの働きをする(Hochstrasser Cur Opin Cell Biol 4:1024 (1992); Rose, In: Ubiquitin, Plenum Press, New York (1988))。第一に、ユビキチンは生合成前駆体セットから切断されなければならず、これは一連のユビキチン単量体のヘッド-テール結合としてか、あるいはある種のリボソームタンパク質との融合としてかのいずれかで起こる(FinleyおよびChau, Annu Rev Cell Biol 7, 25-69 (1991))。第二に、ユビキチンは十分な遊離ユビキチンプールを維持するため、かつ、原則として少なくとも適切にターゲッティングされなかったタンパク質の修飾を逆転させるための双方の目的で、細胞内コンジュゲートから再利用されなければならない。最後に、脱ユビキチン化反応は、その厳密な組成および活性範囲はまだ十分に同定されていない複合体ATP依存性酵素26Sプロテオソームによるユビキチン化タンパク質の分解に必須であり得る(HershkoおよびCiechanover, Annu Rev Biochem 61, 761-807 (1992); Hadariら, J Biol Chem 267, 719-727 (1992); Murakamiら, Nature 360, 597-9 (1992); Rechsteiner, J. Biol. Chem. 268, 6065-6068 (1993))。
【０５１６】
本発明のある実施形態は、配列番号161のATGTGTACGACCTCATTGCCGTGTCCAATCATTATGGAGCCATGGGGGTTGGCCACTACTAAAGCAGCTTATGTGCTATTTTACCAACGTCGAGATGATGAATTTTATAAGACACCTTCACTTAGCAGTTCTGGTTCCTCTGATGGAGGGACACGACCAAGCAGCTCTCAGCAGGGCTTTGGGGATGATGAGGCTTGCAGCATGGACACCAACTAAによってコードされるアミノ酸配列MCTTSLPCPIIMEPWGLATTKAAYVLFYQRRDDEFYKTPSLSSSGSSDGGTRPSSSQQGFGDDEACSMDTNを含んでなるクローン番号398703の新規なN末端を有し、ユビキチン特異的プロテアーゼ活性を有する好ましいポリペプチドを含む。
【０５１７】
本発明の好ましいポリペプチドとしては、in vitroまたはin vivoにおいて細胞タンパク質のユビキチン化を妨げる、または逆転させるものがある。さらにまたin vitroまたはin vivoにおける細胞外タンパク質のユビキチン化を妨げる、または逆転させる本発明のポリペプチドも好ましい。
【０５１８】
配列番号161および配列番号452のポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、アミノ酸断片SARを含んでなるタンパク質キナーゼCリン酸化部位、およびアミノ酸断片GLNMSEを含んでなるN-ミリスチル化部位をはじめとするタンパク質ドメインまたはモチーフを含む配列番号330のポリペプチドをコードする。配列番号330のさらなる好ましいアミノ酸としては、ユビキチンカルボキシル末端ヒドロラーゼファミリー2サイン、すなわちアミノ酸配列YDLIAVSNHYGAMGVGHYが挙げられる。
【０５１９】
本願を通じて記載される配列番号161および配列番号452のポリヌクレオチド、ならびに配列番号330のポリペプチドはクローン398703のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０５２０】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドまたはその一部の有用性は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5391490号および同第5565352号に記載される脱ユビキチン化酵素の活性または作用を評価する方法を用いてさらに確認することができる。
【０５２１】
配列番号277のタンパク質(内部識別クローン番号653966)および配列番号535の関連タンパク質
配列番号108および配列番号421のポリヌクレオチド、ならびに配列番号277および配列番号535のポリペプチドは、配列番号277および535のアミノ酸配列を含んでなるヒト肝脂肪酸結合タンパク質(L-FABP)をコードする。配列番号277および535のアミノ酸配列はヒトL-FABP(Genbank登録番号GNP:M10617; Loweら, JBC 260:3413-17 (1985))と同一であり、ヒトFABP(Genbank登録番号GNP:M10050)と相同である。本発明のポリペプチドはFABP/P2/CRBP/CRABPファミリーの輸送体に属し、遊離脂肪酸およびその誘導体と機能的に結合する。L-FABPは通常肝細胞の細胞質で発現するが、好ましい実施形態は本発明のポリペプチドの細胞外ポリペプチドとしての使用を含む。さらなる好ましい実施形態では、血清または血漿ポリペプチドとしての本発明のポリペプチドの使用を含む。さらなる好ましい実施形態はin vitroで本発明のポリペプチドを用いる。なおさらなる好ましい実施形態はin vivoにおける本発明のポリペプチドの使用を含む。
【０５２２】
本発明の好ましいアミノ酸としては2〜127のリポカリンドメイン、すなわちアミノ酸配列SFSGKYQLQSQENFEAFMKAIGLPEELIQKGKDIKGVSEIVQNGKHFKFTITAGSKVIQNEFTVGEECELETMTGEKVKTVVQLEGDNKLVTTFKNIKSVTELNGDIITNTMTLGDIVFKRISKRIを含んでなるポリペプチドが挙げられる。配列番号277および配列番号535のポリペプチドは脂質、ステロイド、ホルモンおよびレチノイドなどの疎水性小分子と結合するポリペプチドの能力に作用するアミノ酸配列GKYQLQSQENFEAFMKAIを含んでなる細胞質脂肪酸結合タンパク質サインを含む。配列番号277および配列番号535の好ましいアミノ酸はGKYQLQSQENFEAFMKAI、MSFSGKYQLQSQENFEAFおよびLQSQENFEAFMKAIGLPEを含む。
【０５２３】
リン酸化状態はL-FABPの活性を調節する。本発明の好ましいポリペプチドは配列KRISを含んでなる配列番号277および535の残基を含むcAMPおよびcGMP依存性タンパク質キナーゼのリン酸化部位を含んでなるアミノ酸配列を含む。
【０５２４】
本発明のさらなる好ましいポリペプチドとしては、配列番号277および535の4〜6、94〜96および124〜126番の残基をはじめとするタンパク質キナーゼCリン酸化部位を含んでなるアミノ酸配列が挙げられる。配列番号277および535のさらに好ましいポリペプチドとしてはSGK、TFKおよびSKRを含んでなるアミノ酸配列が挙げられる。
【０５２５】
配列番号277および535のさらなる好ましいポリペプチドとしては、カゼインキナーゼIIリン酸化部位を含んでなるアミノ酸配列が挙げられる。配列番号277および535の好ましいアミノ酸としては64〜67、100〜103および114〜117番を含む。さらなる好ましいアミノ酸は配列TVGE、SVTEおよびTLGDを含んでなる。
【０５２６】
配列番号277および535の好ましいポリペプチドは、Nイソ型と呼ばれる105番の残基にアミノ酸アスパラギン(Asn)が位置するものである（以後、Nイソ型と称する）。さらなる好ましいものとして、105番の残基にアミノ酸アスパラギン酸(Asp)が位置する配列番号277および535のポリペプチドがある（以後、Dイソ型と称する）。本発明のヒトDイソ型のラットホモログは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるDiPietroおよびSantome, Biochim Biophys Acta 1478:186-200 (2000)によって記載された方法によって本発明のヒトNイソ型のラットホモログと比べた場合、リソリン脂質、プロスタグランジン、レチノイド、ビリルビン、および胆汁酸塩により高い親和性を有することが示されている。これらのラットホモログはヒトDおよびNイソ型と82%の同一性しか持たないので、このヒトDイソ型がリソリン脂質、プロスタグランジン、レチノイド、ビリルビン、胆汁酸塩および脂肪酸に対してヒトNイソ型に比べて同等または高い親和性を有することを見出せることは予測できない。
【０５２７】
本発明のさらなる好ましいポリペプチドとしては、脂肪酸、ならびに、限定されるものではないが、リソシンシ質、プロスタグランジン、レチノイド、ビリルビン、胆汁酸塩、ステロイドホルモン(テストステロンおよびエストラジオールなど)およびコレステロールからなる群から選択される脂肪親和性化合物に対してNイソ型に比べて同等または少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%または75%高い親和性を有するDイソ型ポリペプチドおよびその断片が挙げられる。
【０５２８】
本発明のもう1つの実施形態としては、血清または血漿中の、限定されるものではないが、遊離脂肪酸、リソリン脂質、プロスタグランジン、レチノイド、ビリルビン、胆汁酸塩、ステロイドホルモン(テストステロンおよびエストラジオールなど)およびコレステロールからなる群から選択される脂肪親和性化合物と結合する本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたはその断片が挙げられる。さらなる好ましいものとして、in vitroまたはin vivoで用いるための血清または血漿を精製するプロセスにおいて全血から分離される血清または血漿中の脂肪親和性化合物と結合する本発明のポリペプチドがある。さらなる好ましいものとして、血清または血漿中の脂肪親和性化合物とin vivoで結合する本発明のポリペプチドがある。
【０５２９】
さらなる実施形態では、生理学的に適切な製剤中の本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたはその断片が、脂肪親和性化合物が哺乳類、好ましくはヒトの血清において上昇している症状の予防、治療または緩和に有用である。このような症状は限定されるものではないが、肥満、高脂血症、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、I型糖尿病(IDDM)、II型糖尿病(NIDDM)、アテローム性動脈硬化症および高血圧症からなる群から選択される。
【０５３０】
乳房由来成長阻害剤（MDGI）および心脂肪酸結合タンパク質(FABP)(これはFABPファミリーに属す)は正常マウス乳房上皮細胞(MEC)の増殖を特異的に阻害し、形態分化を促進し、それ自体の発現を刺激し、乳汁タンパク質合成を促進する(1995年3月24日の米国特許第5977309号)。さらなる好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドとしては、局部的に増殖停止シグナルを伝達し、発達中の上皮の分化を刺激するものが挙げられる。本発明のさらなる好ましいポリペプチドはEGFファミリーメンバーの有糸分裂作用を抑制し、c-fos、c-mycおよびc-rasの発現を抑制する。
【０５３１】
本発明のさらなる態様では、本発明のヒト脂肪酸結合ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む組換え原核および／または真核宿主細胞を、そのタンパク質の発現を促進する条件下で培養し、次いでそのタンパク質を回収することを含んでなる組換え技術によるこのようなポリペプチドの生産方法が提供される。
【０５３２】
本発明のさらなる実施形態では、治療目的で、例えば細胞増殖阻害剤として、またin vitroにおいて種々の感応性の組織および細胞において分化刺激活性を生じさせるために本発明のこのようなポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いる方法が提供される。さらなる好ましいものとして、治療目的で、哺乳類、好ましくはヒトにおいて細胞増殖を阻害するため、または細胞分化を誘導するために好適な生理学的形態で本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いるための方法がある。
【０５３３】
本願を通じて記載される配列番号108および配列番号421のポリヌクレオチド、ならびに配列番号277および配列番号535のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン653966のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０５３４】
配列番号313のタンパク質(内部識別クローン番号633418)、配列番号314(内部識別クローン番号422878)および配列番号552の関連タンパク質
配列番号144、145および438のポリヌクレオチド、ならびに配列番号313、314および552のポリペプチドは、mRNAプロセシングおよびタンパク質発現において重要な切断刺激因子をコードする。タンパク質キナーゼCのリン酸化は該ポリペプチドの活性を増強し、好ましいアミノ酸としてはSEKおよびSGRが挙げられる。さらに、チロシンキナーゼリン酸化部位は該ポリペプチドの活性を増強し、配列番号314、552の好ましいアミノ酸としてはKKLEENPYが挙げられる。
【０５３５】
本願を通じて記載される配列番号144、145および438のポリヌクレオチド、ならびに配列番号313、314および552のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン633418および422878のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０５３６】
配列番号219のタンパク質(内部識別クローン番号589848)、配列番号220(内部識別クローン番号211883)、配列番号221(内部識別クローン番号642603)、配列番号222(内部識別クローン番号193316)、および配列番号497の関連タンパク質
配列番号50、51、52、53、380のポリヌクレオチド、ならびに配列番号219、220、221および497のポリペプチドはアミノ酸配列NEYQPSNIKRKNKHGWVRRLXTPAGXXXILRRMLKGRKSLSHまたはNEYQPSNIKRKNKHGWVRRLXTPAGVQVILRRMLKGRKSLSHを含んでなるリボゾームL34ドメインを有するRNA結合タンパク質をコードする。本願を通じて記載される配列番号50、51、52、53、380のポリヌクレオチド、ならびに配列番号219、220、221および497のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン589848、211883、642603および193316のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０５３７】
配列番号302のタンパク質(内部識別クローン番号1000891255)および配列番号543の関連タンパク質
配列番号133および429のポリヌクレオチド、ならびに配列番号302および543のポリペプチドは、ヒトリボゾームタンパク質hRIBPRTをコードする。本発明の実施形態としては、アミノ酸配列MVAAKKTKKSLESIKSRLQLVMKSGKYVLGYKQTLKMIRQGKAKLVILANNCPALRKSEIEYYAMLAKTGVHHYSGNNIELGTACGKYYRVCTLAIIDPXDSXIIRSMPEQTGEKを含んでなる配列番号302および543のポリペプチド、ならびにそれぞれヒトリボゾームタンパク質hRIBPRTをコードする配列番号133および429のポリヌクレオチドの組成物を含む。本発明のポリペプチドはリボゾームタンパク質L30e/L7Ae/S12e/Gadd4サイン(Koonin EV, J Mol Med 75:236-238 (1997)およびNakanishiら, Gene 35:289-96 (1985))を含む。
【０５３８】
本発明の好ましいポリペプチドとしては、KSLESIKSRLQLVMKSGKYVLGYKQTLKMIRQGKAKLVILANNCPALRKSEIEYYAMLAKTGVHHYSGNNIELGTACGKYYRVCTLAIIDPXDSXIIR; KSLESIKSRLQLVMKSGKYVLGYKQTLKMIRQGKAKLVILANNCPALRK;およびSEIEYYAMLAKTGVHHYSGNNIELGTACGKYYRVCTLAIIDPXDSXIIRを含んでなるアミノ酸配列が挙げられる。本発明のさらなる好ましいアミノ酸としては、TKK(7〜13番); SIK(13〜15番); SGK(24〜26番);およびTLK(34〜36番)を含む配列番号302および543のアミノ酸配列を含んでなるPKCリン酸化部位が挙げられる。本発明のさらなる好ましいアミノ酸はアミノ酸配列SEIE(58〜61番)およびSMPE(107-110番)を含んでなるカゼインキナーゼIIリン酸化部位が挙げられる。
【０５３９】
もう1つの実施形態では、配列番号302および543のタンパク質は核酸、好ましくはRNAと結合させるため、単独またはその他の物質と組み合わせて使用することができる。例えば本発明のタンパク質またはその一部は、RNAを含有するサンプルに結合に最適な条件で加えて、RNAと結合させることができる。このような好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部を、mRNAを単離するために、例えば特定の細胞型または特定の条件下で増殖させた細胞からRNAを特異的に単離するために用いてもよい。次にこのようなRNAを逆転写してクローニングし、相対的発現分析などで分析することができる。さらに、このような方法はサンプルから、例えばDNAの精製中にRNAを特異的に除去するために用いてもよい。これらの方法のうちいずれかを行うには、本発明のタンパク質またはその一部を単独で、またはその他のRNA結合タンパク質と組み合わせてクロマトグラフィー支持体に結合させ、アフィニティークロマトグラフィーカラムを作製してもよい。次に精製する核酸混合物を含むサンプルをこのカラムに流す。商業規模でこの方法を実施すべき実施形態には、本発明のタンパク質またはその一部を支持体に固定化させるのが特に有利である。このような固定化により、結合後に、樹脂に結合したタンパク質バッチからRNAを除去することが容易となり、その後のタンパク質の再利用が可能となる。本発明のタンパク質またはその一部の固定化は例えば当業者に公知の方法に従いタンパク質中にマトリックス結合ドメインを挿入することにより達成することができる。続いて、このようにして得られた、本発明のタンパク質またはその一部を含む融合産物を共有結合により、または他のいずれかの手段によりタンパク質、炭水化物またはマトリックス(金、「セファデックス」粒子、ポリマー表面)に結合させる。
【０５４０】
本発明のもう1つの実施形態は、真核細胞の細胞質にmRNAをさらに導入するためにリポソームの脂質二重層の内面に特異的なmRNAを結合させるために本発明のタンパク質またはその一部を用いる方法および組成物に関する。好ましくは、特異的なmRNAをまず本発明のタンパク質と会合させ、このようにして形成したRNA/タンパク質複合体を次に当業者に公知の方法に従ってリポソームと混合する。これらのリポソームを真核細胞のin vitro培養物に加える。in vivoにおいてこのような方法は癌などの遺伝子転写の脱調節に関連した疾患および異常な細胞分化、増殖または分解に関するその他の疾患を治療および／または予防し得る。
【０５４１】
リボゾーム機能の低下は細胞増殖の著しい阻害をもたらす。従って、もう1つの実施形態では、本発明のタンパク質および核酸はin vitroまたはin vivoにおける細胞増殖速度を調節するために使用できる。よって、本発明のタンパク質の発現または機能を阻害する化合物は細胞増殖速度を阻害するために使用でき、従って例えば癌または炎症症状などの過剰な細胞増殖を伴う疾病または症状の治療または予防に使用できる。このような化合物としては、限定されるものではないが、抗体、アンチセンス分子、本発明のタンパク質のドミナント・ネガティブ型、およびこれらタンパク質の発現または活性を阻害するいずれかの異種化合物が挙げられる。
【０５４２】
本願を通じて記載される配列番号133および429のポリヌクレオチド、ならびに配列番号302および543のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン1000891255のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０５４３】
配列番号271のタンパク質(内部識別クローン番号493328)、関連クローン153261、152042、599054および650872、ならびに配列番号533の関連タンパク質
配列番号102、103、104、105および106のポリヌクレオチド、ならびに配列番号271、272、273、274、275および533のポリペプチドはヒトGENSET結合タンパク質すなわちHGBP-1をコードする。好ましいポリペプチドはアミノ酸配列MKVKIKCWNGVATWLWVANDENCGICRMAFNGCCPDCKVPGDDCPLVWGQCSHCFHMHCILKWLHAQQVQQHCPMCRQEWKFKEを含んでなる。本願を通じて記載される配列番号102、103、104、105および106のポリヌクレオチド、ならびに配列番号271、272、273、274、275および533のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン493328、153261、152042、599054および650872のヒトcDNA、ならびにそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０５４４】
延長されたcDNA配列番号102によってコードされる配列番号271のタンパク質は肝細胞癌会合リングフィンガータンパク質(EMBL AF247565)およびショウジョウバエ(Drosophila)由来の後期プロモーター複合体(APC)(Embl登録番号AJ251510)との相同性を有するWO0100806のGensetタンパク質(Genpep登録番号AX061622)と同一である。さらにHGBP-1は33〜79番由来のpfam PHDジンクフィンガーサインを示す。
【０５４５】
C3HC4配列モチーフを含む亜鉛結合ドメインはRINGドメインとして知られている(Lovering, R.ら (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2112-2116)。ジンクフィンガードメインはタンパク質-タンパク質およびタンパク質-核酸相互作用に関与する多くの亜鉛結合タンパク質で見られる。これらはDNAの配列特異的認識を達成するためのモジュラー反復様式で用いられる独自に折りたたまれた亜鉛を含むミニドメインである(Klug 1993 Gene 135, 83-92)。このような亜鉛結合タンパク質は一般に遺伝子発現の調節に関与し、通常は転写に直接影響を及ぼすこと、またはコアクチベーターまたはコリプレッサーを動員することのいずれかによって転写因子として働く(米国特許第5,866,325号;同第6,013,453号および同第5,861,495号参照)。PHDフィンガーは約50〜80残基の、RINGフィンガーまたはLIMドメインとは異なるC4HC3ジンクフィンガーである。それらは大部分がDNAまたはRNA結合ドメインであると考えられるが、タンパク質-タンパク質相互作用にも関与する可能性がある(総説としてはAaslandら, Trends Biochem Sci 20:56-59 (1995)参照)。
【０５４６】
HGBP-1またはその一部は核酸、より好ましくは転写因子と結合し得る亜鉛結合タンパク質である。本発明の好ましいポリペプチドは配列番号271の33〜79番のアミノ酸を含んでなるポリペプチドである。本発明のその他の好ましいポリペプチドは本明細書に記載のいずれかの生物学的に活性な配列番号271の断片である。本発明のタンパク質またはその一部の核酸結合活性は米国特許第6,013,453号に記載のものをはじめ、当業者に公知のアッセイのいずれを用いてアッセイしてもよい。
【０５４７】
本発明は核酸、好ましくはDNAと単独または他の物質と組み合わせて結合させるための本発明のタンパク質またはその一部を用いる方法および組成物に関する。例えば本発明のタンパク質またはその一部を結合を可能とする条件で核酸を含むサンプルに加え、核酸と結合させる。ある好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部は制限断片などの核酸を精製するために使用してもよい。
【０５４８】
もう1つの好ましい実施形態では、ポリペプチドを適当な融合パートナーと連結させるか、あるいは抗体でプロービングすることで検出すれば、HGBPポリペプチドまたはその一部を用いて核酸を可視化することができる。このようにHGBPポリペプチドは診断に用いることができる。
【０５４９】
あるいは、当技術分野で周知の技術を用いて本発明のタンパク質またはその一部を単独または他のDNA結合タンパク質と組み合わせてクロマトグラフィーの支持体に結合させ、アフィニティークロマトグラフィーカラムを作製してもよい。精製する核酸を含むサンプルをこのカラムに流す。商業規模でこの方法を実施すべき実施形態には、本発明のタンパク質またはその一部を支持体に固定化させるのが特に有利である。このような固定化により生成物バッチからのタンパク質の除去およびその後のタンパク質の再利用が容易となる。本発明のタンパク質またはその一部の固定化は例えばタンパク質中にセルロース結合ドメインを挿入することにより達成することができる。当業者ならば、他の固定化法も使用でき、入手可能な文献に記載されていることが分かるであろう。
【０５５０】
もう1つの実施形態では、本発明は、標的細胞において目的遺伝子の発現を変化させるため、本発明のタンパク質またはその一部、特に亜鉛結合ドメインを用いた組成物および方法に関する。このような目的遺伝子は米国特許第5,861,495号;同第5,866,325号および同第6,013,453号に記載のものをはじめ、当業者に公知ないずれかの技術を用いた癌遺伝子、または細菌もしくはウイルスなどの病原体由来の外来遺伝子のような疾病関連遺伝子であり得る。
【０５５１】
さらなる実施形態では、癌などの遺伝子転写の脱調節に関連した疾患、ならびに高アルドステロン症、低コルチゾン症(アジソン病)、甲状腺機能亢進症(グレーブス病)、甲状腺機能低下症、直腸結腸ポリープ、胃炎、胃・十二指腸潰瘍、潰瘍性大腸炎およびクローン病をはじめとする異常な細胞分化、増殖または分解に関するその他の疾患を診断、治療および／または予防するために本発明のタンパク質またはその一部を用いることができる。本発明は、細胞を分裂可能とする遺伝子の発現を阻害するジンクフィンガーポリペプチドを患者に送達する、または患者内に存在させることを含んでなる、本明細書に記載の疾患の診断、治療および／または予防方法に関する。この標的は例えば癌細胞で過剰発現する癌遺伝子または正常遺伝子であり得る。
【０５５２】
ISPG鉄-硫黄クラスタータンパク質(クローン番号1000872335)
配列番号43および374のポリヌクレオチドは代謝反応における電子伝達を媒介する鉄-硫黄タンパク質(ISPGとも呼ばれる)であるそれぞれ配列番号212および491のアミノ酸配列をコードする。本願を通じて記載される配列番号43および374のポリヌクレオチド、ならびに配列番号212および491のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン1000872335のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０５５３】
ISPGは2Fe-2S型フェレドキシンの広範なファミリーに属する鉄-硫黄タンパク質である。2Fe-2S型フェレドキシンは単一の2Fe-2S鉄-硫黄クラスターと結合する100前後のアミノ酸残基タンパク質またはドメインであり、植物、動物および細菌で見られる。鉄-硫黄クラスタータンパク質は周知のクラスのタンパク質であり、電子の受容、供与、貯蔵およびシフトに関する理想的な手段として認識されている。当業者ならば、鉄-硫黄タンパク質の構造面が包括的に研究されており(Beinertら, Nature 1 Aug 1997, 277:653-659に総説)、電子伝達を媒介する生物学的機能、および可能性のあるタンパク質の安定化、および鉄またはスルフィド貯蔵作用を保持したまま、所望の用途にその特性を微調整するためISPGタンパク質の改変が可能なことが分かるであろう。配列番号491のISPGタンパク質は34番のアミノ酸にグリコサミノグリカン結合部位(SGSG)を；14番(SAR)、44番(TTR)、および86番(SGR)のアミノ酸にタンパク質キナーゼCリン酸化部位を；11番(GGVSAR)、24番(GTXWNR)、31番(GGTSGS)、39番(GVALGT)、106番(GACEAS)のアミノ酸にN-ミリスチル化部位を；114〜119番のアミノ酸にシトクロームcファミリーヘム結合部位を；また、108〜118番のアミノ酸に鉄-硫黄結合領域サインを含んでなる。
【０５５４】
電子伝達反応におけるその役割からして、ISPGは多様な代謝反応および代謝障害に関与していると考えられ、肥満など代謝障害の治療、毒性化合物の検出、薬物代謝に関連する症状または形質の予測、診断または治療、あるいは例えばステロイドホルモンの合成に関連する治療において有用であり得る。
【０５５５】
ある好ましい例では、ISPGタンパク質タンパク質の過剰発現または投与を、治療を必要とする被験体の代謝率を加速化することにより肥満の治療的処置として用いることができる。それが静止中の代謝率が低いためか、かつ／または物理的に不活性なためかに関わらず、低エネルギー出力の表現型が体重増および肥満の高いリスクとなるという仮説を支持する証拠が蓄積されている。低エネルギー出力表現型は食欲制御が損なわれていることに関連し、これはエネルギー出力が高まれば改善し、肥満管理の結果を向上させるためのツールとしてのエネルギー消費の薬理刺激の背景として役立つ。ISPGタンパク質およびそのアゴニストまたは刺激因子は、レプチン受容体、交感神経系およびその末梢βアドレナリン作動性受容体、選択的チロイドホルモン誘導体、ならびにミトコンドリア非結合タンパク質の刺激など一般に挙げられる標的と同じ目的で電子伝達ひいては個体の代謝率を高める手段として役立ち得る。
【０５５６】
さらに、ISPGなどの鉄-硫黄タンパク質は一般に、特異な鉄部位での基質の結合および活性化(アコニターゼおよび関連する酵素の触媒作用における)ならびにフリーラジカル経路によって起こる反応におけるラジカルの見かけの安定化などの酸化還元的性質のものではないいくつかの作用が可能であると認識されている。また、このような鉄-硫黄クラスターが電子伝達とプロトン輸送を関連づける働きをし得ることを示唆する証拠もある。ニトロゲナーゼのFeタンパク質においてみられるように、種々のサブユニット由来のCysリガンドと結合させることで鉄-硫黄クラスターは二量体形成を果たす。さらに、タンパク質構造エレメントを挟むこと(straddle)で鉄-硫黄クラスターは特定の機能(例えば大腸菌のエンドヌクレアーゼIII)に必要な構造を安定化させることができる。ISPGタンパク質種はまた細胞内プロテアーゼの攻撃からタンパク質を保護することも示されている。最後に、ISPGタンパク質種は鉄およびおそらくスルフィドの貯蔵手段として働き得ると思われる。
【０５５７】
このようにいくつかの例では、ISPGは、鉄過剰疾患の治療および／または診断のため、あるいはタンパク質生産またはタンパク質相互作用の媒介などを目的とする標的タンパク質の安定化を含む適用において鉄または金属のバイオセンサーとして使用できる。
【０５５８】
さらにまた、ISPGの構造面では、それがヒトもしくは動物における、または、ホルモンの大スケール生産のための操作された細胞培養系における、ステロイドホルモン合成を媒介し得ることが示唆されている。ISPGは、コレステロールの側鎖切断に関与する、アドレノドキシンレダクターゼからシトクロームP450sccに電子を伝達する脊椎動物ミトコンドリアタンパク質である副腎フェレドキシン(アドレノドキシンとして知られる)として働かせるために用いてもよい。NADPH依存性アドレノドキシンレダクターゼといくつかのシトクロームP450の間での可溶性電子担体としてのその主な機能により、脊椎動物の副腎ミトコンドリアでのステロイドホルモン生合成の不可欠な成分となっている。
【０５５９】
薬物代謝
これまでの研究では、シトクロームP-450アイソザイムが薬物代謝の一役を担い、P-450アイソザイムによる酸化が薬物の全般のクリアランスの一般的な態様であることが明らかとなっている。さらなる研究では、シトクロームP-450アイソザイムの遺伝子多型が薬物の酸化における基質特異性が幅広いことの理由であることが明らかとなっている。ある場合では、遺伝子の突然変異および／またはある重要なアイソザイム遺伝子の欠失が基質特異性に投影される表現型の顕著な変化をもたらす。CYP2D6は30を超える薬物を酸化することが報告されている(例えば、M. Eichelbaumら, Pharmacol. Ther., Vol. 46, pp. 377-, 1990)。多くの抗癌剤はシトクロームP450酵素により酸素化されて腫瘍細胞に対して細胞傷害性または細胞増殖抑制性である代謝産物を生じることが知られている。これらのものとして、シクロホスファミド(CPA)、その異性体イフォスファミド(IFA)、ダカルバジン、プロカルバジン、チオ-TEPA、エトポシド、2-アミノアントラセン、4-イポメアノールおよびタモキシフェンなど、一般に用いられるいくつかの癌化学療法薬が挙げられる(LeBlanc, G. A.およびWaxman, D. J., Drug Metab. Rev. 20:395-439 (1989); Ng, S. F.およびWaxman D. J., Intl. J. Oncology 2:731-738 (1993); Goeptar, A. R.ら, Cancer Res. 54:2411-2418 (1994); van Maanen, J. M.ら, Cancer Res. 47:4658-4662 (1987); Dehal, S. S.ら, Cancer Res. 57:3402-3406 (1997); Rainov, N. G.ら, Human Gene Therapy 9:1261-1273 (1998))。種々の抗癌薬に関する薬物の活性化をもたらす生体還元代謝もまたシトクロームP450酵素によって触媒される。このような薬物の例としてはアドリアマイシン、マイトマイシンCおよびテトラメチルベンゾキノン(Goeptar, A. R.ら, Crit. Rev. Toxicol. 25:25-65 (1995); Goeptar, A. R.ら, Mol. Pharmacol. 44:1267-1277 (1993))が挙げられる。この劣性遺伝子に同系接合性の変異を有する者がいわゆる「不全代謝者（PM）」であり、薬剤の不十分な代謝のために重篤な副作用を被る場合がある(例えば、M. Eichelbaumら, Pharmacol. Ther., Vol. 46, pp. 377-, 1990参照)。このような遺伝子変異は種々の人種集団の1〜30%の割合で生じる(例えば、L. M. Distlerathら, J. Biol. Chem., Vol. 260, pp. 9057-, 1985参照)。
【０５６０】
本発明のISPGタンパク質は利用可能な数種のシトクロームP450酵素の1以上を含む電子伝達系において可溶性電子担体として機能し得ると思われる。従ってISPGタンパク質はP450(およびISPG)遺伝子導入およびシトクロームP450により活性化される生体還元薬の使用を含む新生物細胞を死滅させる方法、ならびに特定のシトクロームP-450アイソザイム系に関してサンプル化合物の代謝の受けやすさを評価するための方法において有用であり得る。
【０５６１】
よって第1の態様では、P450により触媒されるモノオキシゲナーゼ反応によって活性化される癌の化学療法薬と組み合わせたシトクロームP450遺伝子(「CYP」または「P450」)を基にした薬物の活性化/遺伝子治療の方法論が開発されている(Chen, L.およびWaxman, D. J., Cancer Research 55:581-589 (1995); Wei, M. X.ら, Hum. Gene Ther. 5:969-978 (1994);1997年11月18日発行の米国特許第5,688,773号)。これまでに知られている薬物-酵素の組合せでは、癌治療で広く用いられている確立された化学療法薬が使用できる。化学感受性の増強を得る方法は、in vitroならびにin vivoにおける齧歯類皮下固形腫瘍モデルおよびヌードマウスで増殖させたヒト乳癌を用いた研究の双方で実証されており、これらの動物において実質的に肝臓と関連した薬物活性化能が存在するにもかかわらず、著しい効果がある(Chen, L.ら, Cancer Res. 55:581-589 (1995); Chen, L.ら, Cancer Res. 56:1331-1340 (1996))。このP450に基づくアプローチはまた、脳腫瘍の治療における遺伝子治療適用に関しても著しい有用性を示す(Wei, M. X.ら, Human Gene Ther. 5:969-978 (1994); Manome, Y.ら, Gene Therapy 3:513-520 (1996); Chase, M.ら, Nature Biotechnol. 16:444-448 (1998))。
【０５６２】
P450/薬物活性化系は数種の腫瘍種に対して高い有望性を示しているが、癌患者において臨床的に有効で持続的な応答を達成するにはこの系の活性のさらなる増強が必要である。この必要性はP450酵素系に固有の2つの特徴、すなわち(1)P450酵素は癌化学治療薬をはじめとする薬物またはその他の外的化学薬品を、典型的には1分あたりP450代謝回転数(生じた代謝産物のモル数/P450酵素のモル数)がわずか10〜30である低速度で代謝するということ、および(2)P450酵素は多くの化学治療薬を高いKm値、典型的にはミリモルの範囲で代謝するということ、により必要とされる。これはCPAおよびIFAなどの薬物をはじめとする多くの化学治療薬のわずかミリモル範囲といった血漿薬物濃度に匹敵する。このようにP450遺伝子治療に対する現在のアプローチは非常に低率で、薬物基質に関して不十分な条件でしか腫瘍内薬物活性化をもたらすことができない。さらに、P450は肝臓組織で極めて高レベルで発現することから、P450遺伝子治療に関して現在利用できる方法を用いた場合、腫瘍細胞のP450遺伝子産物によっては投与した化学療法薬のうちごく一部分しか代謝されない(Chen, L.およびWaxman, D. J., Cancer Res. 55:581-589 (1995))。米国特許第6,207,648号に記載のように、1つの増強法としてP450レダクターゼ(RED)遺伝子をシトクロームP450遺伝子(および従ってP450遺伝子産物)と組み合わせて新生物細胞に導入することを含み、P450によって活性化された化学療法薬の、その治療上活性な代謝産物への酵素的変換は腫瘍の細胞内の解剖学的場で著しく増強され、それにより新生物細胞を死滅させる選択性および効率ともに高める。
【０５６３】
ある好ましい実施形態では、既知のプロドラッグ-酵素戦略に対するさらなる増強は新生物細胞にISPG遺伝子を単独またはP450遺伝子および／またはP450レダクターゼ遺伝子と組み合わせて導入することにより達成することができる。これらISTGおよびP450遺伝子の導入および発現のための好適なベクターは当業者に公知である。ISPG遺伝子の導入およびその後のISPG遺伝子産物の発現は、P450により活性化された化学療法薬の、その治療上有効な代謝産物への酵素的変換を増強し得る。このように本発明は、(a)新生物細胞に、P450酵素による化学療法薬の酵素的変換を媒介し得るISPG遺伝子を含んでなる遺伝子送達ベクターを感染させ;(b)所望により新生物細胞に、シトクロームP450遺伝子および／またはREDをコードする遺伝子を含んでなる遺伝子送達ベクターを感染させ;(b)この新生物細胞を、シトクロームP450遺伝子産物により活性化されている化学療法薬で処理し;さらに(c)その新生物細胞を死滅させることを含んでなる、新生物細胞を死滅させる方法を含んでなる。
【０５６４】
本発明はまた、特定のシトクロームP-450アイソザイムによって薬物代謝を評価する上で用いるための、該特定のP-450を欠く肝ミクロソーム、特定のP-450アイソザイムおよび担体材料を含んでなる試薬組成物も提供する。この肝ミクロソームはCYP2D6、CYP2C19またはCYP2A6を欠くヒト起源のものであり得る。加えるCYP2D6アイソザイムCYP2C 19アイソザイムおよびCYP2A6アイソザイムは、組換えCYP2D6発現ミクロソーム、組換えCYP2C 19発現ミクロソーム、または組換えCYP2A6発現ミクロソームであり得る。この試薬組成物は1種以上のPMミクロソームを含んでなってもよい。
【０５６５】
本発明によれば、薬物代謝におけるCYP2D6、CYP2C 19およびCYP2A6などの特定のP-450アイソザイムの関与を正確に定量するための試薬組成物および方法を提供することができる。本発明は特定のシトクロームP-450アイソザイムに関してあるサンプル化合物の代謝の受けやすさを評価するための方法を提供する。該方法はサンプル化合物を、担体材料中、該特定のシトクロームP-450アイソザイムおよびISPGタンパク質を該特定のシトクロームP-450アイソザイムを欠く肝ミクロソームに加えることで調製した試薬組成物と接触させることを含んでなる。ISPGは薬物代謝におけるP-450アイソザイムの効力を増強し、それにより特定のP-450酵素の関与を検出するアッセイの能力を効果的に増幅するために有用である。もう1つの実施形態では、特定のP-450系の薬物代謝への関与はその特定のP-450系と会合している特定の鉄-硫黄タンパク質に着目することによりアッセイすることができる。この態様では、この方法は、サンプル化合物を、担体材料中、該特定のISPGタンパク質を該ISPGタンパク質を欠く肝ミクロソームに加えることで調製した試薬組成物と接触させることを含んでなる。この方法はさらに(a)サンプル化合物および試薬組成物の混合物をインキュベートし;(b)ステップ(a)で得られた反応混合物を抽出し;さらに(c)ステップ(b)で単離した反応生成物を分析することを含んでなる。このアッセイを定量する目的で、種々の量の特定のP-450アイソザイムまたはISPGタンパク質を有する複数の試薬組成物に対してそれぞれステップ(a)〜(c)を行えばよい。例えば、この方法で用いる特定のP-450アイソザイムはCYP2D6、CYP2C19、CYP2A6、CYPlA1およびCYP2E1から選択すればよい。
【０５６６】
鉄バイオセンサー
鉄-硫黄クラスターは鉄、ジオキシゲン、スパーオキシドイオン、およびおそらく一酸化窒素のセンサーとして働くことが見出されている。2つの主要なセンサー機構が記載されている。1つの例では、ジオキシゲンによる酸化[Fe2S2]1+ −−＞ [Fe2S2]2+は大腸菌のSoxRタンパク質で観察されるように、スーパーオキシドに対する防御機構の活性化のシグナルを与え、これにより細胞保護機構(例えば、虚血の治療などに有用)を提供し得る。もう1つの機構では、クラスターの酸化的解離または再会合が大腸菌のFNRタンパク質に関する制御シグナルを与える。
【０５６７】
さらに詳細な例では、本発明のISPGタンパク質はおそらく鉄バイオセンサーとして使用される。鉄バイオセンサーの例は米国特許第5,516,697号(Kruzelら)に示されている。要するに、ISPGをpH変化を測定する手段の付近に固定化し、鉄が結合した際の電位の変動を検出可能とすることができる。
【０５６８】
この鉄を隔離するプロセスでは、センサーエレメントであるISPGタンパク質は結合した鉄原子に直接比例関係にあるいくつかの水素プロトン(H+)を放出すると考えられる。ISPGによる鉄の結合の際のプロトンの放出はこのバイオセンサーによって測定される有用な特性となる。このプロトン放出はpH変化を引き起こし、これをイオン選択性電界効果トランジスタまたはpH感受紙により測定する。鉄含有サンプルをバッファー溶液、通常は水に入れる。このサンプルは1倍以上に希釈してもよい。本発明のセンサーのある実施形態では、プロトンの放出はイオン選択性電界効果トランジスタ(ISFET)の表面の電位変動として測定する(Biosensor Technology, Buckら編, Marcel Decker, Inc.刊行, 1990, タイトル "Solid State Potentiometric Sensors" by Jiri Janata, pp 17-34に総説)。本発明のもう1つの実施形態では、鉄の結合の際にISPGにより放出されたプロトンはpH感受紙を用いてpH変化により検出する。好ましくはこの鉄選択性エレメント(ISPG)はシグナルトランスデューサーに近接して組み込まれるか、シグナルトランスデューサーと統合され、無試薬の鉄センサー系となる。このシグナルは増幅可能であることから、鉄の検出には少量のISPGが必要とされるだけである。このISFETはISFETの表面にISPGを固定化するか、またはISFETの表面にISPGで修飾した膜を付着させることでISFETに近接させたISPGを固定化した取り外し可能な膜によって修飾される。次に、鉄含有サンプル、例えば哺乳類、特にヒト由来の体液などの生物学的サンプルをこのISPG修飾ISFETと接触させる。
【０５６９】
ISPG修飾ISFETを独立センサーとして作製するには、pH測定のために設計されたISFETを用いる既存の系を改変することができる。pH測定に現在ISFEを用いている系としてはIntegrated Sensor Technology, Federal Way, Wash.製のSentron 2001 pHシステム;Corning Incorporated, Corning N.Y.製のCorning 360i pHシステム;またはOrion Analytical Technology, Inc., Boston, Mass製のOrion 610 pHシステムがある。サンプル中の鉄の量を測定するのに必要な改変は、ISPGがサンプル中の鉄と結合した際にプロトンの放出を検出し、電位の変化を記録するようにこのようなシステムのISFET上にISPG層を固定化して置くこと、あるいはまた、既存のISFETに近接させるISPG修飾膜、すなわちISPGでコーティングした膜を提供することのいずれかである。
【０５７０】
鉄感受性バイオセンサー(ならびに鉄過剰疾患の治療)は極めて価値がある。30,000,000人のアメリカ人が、深刻な鉄欠乏症候群を相当な割合で含む種々のタイプの鉄関連疾患を患っているものと推計される。生物学的に利用可能な鉄の検出は、医師が鉄欠乏、鉄過剰、またはその他のタイプの免疫疾患かどうかの早期検出に使用できる最も重要な測定法の1つである。これまで鉄は鉄、および体内で鉄を輸送するタンパク質であるトランスフェリンの鉄結合能を検出する血液試験の組合せによって測定されている。この現行技術には非常に精巧な装置が含まれ、これがこの分析を極端に高いものとし、サンプルを分析する有資格者を必要とする場合が多い。従って簡便性と経済性を兼ね備えた直接的鉄アッセイが必要とされている。よってISPGはサンプル中の鉄量を検出するためのバイオセンサーの開発に有利に使用できる可能性がある。
【０５７１】
ステロイドバイオセンサー
上記で述べたように、ISPGは、コレステロール側鎖の切断に関与し、副腎ミトコンドリアにおけるステロイドホルモンの生合成の不可欠な成分であり、アドレノドキシンレダクターゼからシトクロームP450sccへ電子を伝達する脊椎動物ミトコンドリアタンパク質である副腎フェレドキシン(アドレノドキシン(ADX)として知られる)として用いることができる。
【０５７２】
治療的実施形態では、ISPGはステロイドホルモンの合成レベルの上昇が望まれる疾患の治療に特に重要性を有する。P450sccはコレステロールからプレグネノロンへの変換合成において決定的に重要な役割を持つことから、ISPGはステロイド合成のリミッターまたはエンハンサーとしても用いることができる。一例ではあるが、ヒト胎盤におけるシトクロームP450scc活性はP450sccへの電子の供給によって制限されるという証拠が示されている。また、Tuckeyら Eur. J. Biochem. 1999 Jul;263(2): 319-325は、p450scc活性がアドレノドキシンレダクターゼおよびアドレノドキシンを加えることで著しく増強され得ることを示している。このようにISPGはP450sccへの電子供給を増大させ、ひいてはプロゲステロン合成レベルを増強することで生殖障害の治療において有用である可能性がある。よって、もう1つの例では、ISPGは治療用途であれ研究用途であれステロイド合成を制限するために用いることができる。
【０５７３】
ISPGはまた、ステロイドホルモンの生産を目的とした生体ステロイド合成において用いることもできる。例えば、Duportら, Nat Biotechnol 1998 Feb;16(2):186-9は、サッカロミセス・セレビシエでステロイド合成経路の最初の2つのステップが再生産されるように操作された酵母においてプレグネノロンおよびプロゲステロンの自足的生合成系を報告している。Δ22-デサチュラーゼ遺伝子を破壊し、アラビドプシス・サリアナ(Arabidopsis thaliana)Δ7-レダクターゼ活性を導入し、ウシ側鎖切断性シトクロームP450、アドレノドキシンおよびアドレノドキシンレダクターゼを同時発現させることによるステロール生合成の操作により、単純な炭素源からプレグネノロンの生合成に至る。ISPGはアドレノドキシンタンパク質として機能し得ると考えられることから、ISPGはDuportらの系においてアドレノドキシンに代わる機能的代替物として使用できる。
【０５７４】
MTG(メタロチオネイン)(クローン番号654627)
配列番号96および413およびクローンFL11:654627_182-5-3-0-F10-Fは重金属と結合するメタロチオネインタンパク質であるそれぞれ配列番号265および527のポリペプチドをコードする。本発明のこのようなポリペプチドは本明細書ではMTGとも呼ぶ。本願を通じて記載される配列番号96および413のポリヌクレオチド、ならびに配列番号265および527のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン654627のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０５７５】
メタロチオネイン(MT)[1,2,3]はチオレート結合のクラスターを介して亜鉛、銅、カドミウム、ニッケルなどの重金属と結合する小タンパク質である。MTは動物界中に存在し、高等植物、真菌およびいくつかの原核生物でも見られ、金属の解毒作用または金属の代謝およびホメオスタシスに役割を果たしていると考えられる。構造的関係に基づきMTは3つのクラスに分けられている。クラスIは哺乳類MTならびに甲殻類および軟体動物由来のMTを含むが、明らかに関連のある一次構造を有する。クラスIIはクラスIのMTに対応しないか、極めて遠縁で対応するにすぎないウニ、真菌、昆虫およびシアノバクテリアなどの種々の種MTとともに分類されている。クラスIII MTはγ-グルタミルシステイニル単位を含む非定型（atypical）ポリペプチドである。
【０５７６】
本発明のMTGタンパク質などの脊椎動物クラスI MTは典型的には60〜68アミノ酸残基のタンパク質であり、このうち20残基は7つの二価金属イオンと結合するシステインである。サインパターンとして、発明者らは7つの金属結合システインを含む19残基にわたる領域を選択した。この領域はクラスI MTのN末端セクションに存在する。クラスI MTの共通パターンは以下の通りである:C-x-C-[GSTAP]-x(2)-C-x-C-x(2)-C-x-C-x(2)-C-x-K。
【０５７７】
配列番号527のMTGタンパク質は13〜31番アミノ酸にメタロチオネインドメイン(Prosite ref. PS00203);4番にN-グリコシル化部位(NCSC)；18番(SCK)、28番(SCK)および55番(SQR)のアミノ酸にタンパク質キナーゼCリン酸化部位;41番のアミノ酸にカゼインキナーゼIIリン酸化部位(TLVD);10番のアミノ酸にN-ミリスチル化部位(GVSCTC);および3番のアミノ酸に原核生物膜リポタンパク質脂質結合部位(PNCSCAAGVSC)を有する。
【０５７８】
治療薬
メタロチオネインに関する新たなタンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチドの発見は重金属毒性、癌、炎症性疾患および免疫疾患の診断および治療に有用な新規な診断または治療組成物を提供することで当技術分野の必要を満たす。
【０５７９】
鉛、砒素、水銀またはカドミウムなどの重金属に急性的または慢性的に曝されると神経筋、CNS、心血管および胃腸管作用を含む種々の疾病および疾患に至る。MTはこれらの症状の予防または緩和に役割を果たす可能性がある。さらに、MTは糖質コルチコイドによって転写調節を受けるが、このことはMTが、炎症性疾患、免疫疾患および癌を治療する糖質コルチコイドの作用に直接的な役割を持つことが示唆するものである。従ってMTGは炎症性疾患、免疫疾患および癌の治療、ならびに種々の治療適用における細胞保護に重要な用途を有するものと思われる。
【０５８０】
ある好ましい例では、MTG核酸およびタンパク質は、副作用が最小であって種々の様式で適用できる、サンバーン細胞の発生を抑えるための、メタロチオネインを誘導する方法、皮膚病の治療方法、および紫外線遮断の方法に用いることができ、さらには化粧組成物および紫外線遮断組成物にも関連する。
【０５８１】
従来、皮膚炎、日焼け、神経皮膚炎、湿疹および肛門性器掻痒症などの皮膚病を治療するためにはステロイドおよび酸化亜鉛製剤が薬剤として局所使用されてきた。しかしステロイドは強い副作用により大量に長期にわたって投与することは困難であった。酸化亜鉛製剤は局部的収斂作用を有し、それらは水に不溶であって通常内部投与できないことから医薬の製造という点で問題を伴う。
【０５８２】
亜鉛は生体において不可欠な微量金属の1つであり、生殖器官の発達、創傷治癒の促進に関与することが知られ、また、デヒドロゲナーゼのアクセレーターである金属酵素の成分であり、免疫系を活性化させるなど種々の機能を有することも知られている。さらに亜鉛は金属結合タンパク質メタロチオネイン(MT)の誘導因子であることも知られている。MTは炎症の開始時に生じるフリーラジカルのスカベンジャーとして働くことが報告されている["Dermatologica", Hanada, k.ら, 179 (suppl. 1) 143 (1989)]。
【０５８３】
米国特許第5,582,817号(Otsuら)において提示されているように、MTGはサンバーンなど外的な刺激性の刺激因子によって引き起こされた皮膚炎症の治療に有用である可能性があり、MTGは炎症部位に集まる白血球、特に顆粒球から放出されたフリーラジカルをクエンチする働きをし、それにより抗酸化作用を示し、特に正常なリンパ球に対する細胞損傷を少なくし、免疫系を活性化させ、さらに皮膚の加齢の加速化を妨げることができる。サンバーン細胞の発生は亜鉛を投与して上皮ケラチン層にMTGを存在させる、または増加させることにより抑制することができる。また、MTGの抗酸化作用はX線、α線、β線、γ線、中性子線および加速電子線による放射線療法に起因する皮膚の問題の治療にも有用である可能性がある。
【０５８４】
種々の亜鉛化合物がそれらの薬理活性に関してOtsuら(上記)によって研究されており、ある化合物の亜鉛塩または亜鉛錯体がメタロチオネイン(MT)を誘導し、紫外線によるサンバーン細胞(SBC)の発生を抑制する優れた作用を有し、それにより日焼けの緩和、日焼けの予防、皮膚病罹患の緩和、およびその他放射線により引き起こされる疾患の緩和を目的とした化粧組成物または薬剤の成分として有用であることが報告されており、この発明の完成に至った。
【０５８５】
日光により引き起こされる皮膚反応には2つの異なるタイプがあり、1つはサンバーンと呼ばれる皮膚の急性の炎症性変化であり、もう1つはサンタンと呼ばれるその後のメラニン色素の沈着である。UVBと呼ばれる320nm以下の範囲の波長を有する光はサンバーンを誘導し、紅斑性変化の一員となる。紫外線によって引き起こされるこの紅斑反応は日焼け傷害とは対照的に、日光に曝された直後に起こるのではなく、数時間経ってから起こる。サンバーンを受けた皮膚を組織病理学的に調べると、線量に応じて上皮および真皮に様々な程度の炎症性変化が見られる。このような変化のうち顕著なものとして、上皮におけるいわゆるサンバーン細胞(SBC)の発生である。組織学的に染色した組織サンプルは濃く染まる核を有する強く、好酸的に染まる細胞を呈する。この現象は上皮細胞の壊死を示す("Fragrance Journal", 9, 15-20 (1991))。サンバーンを防ぐためにはパラアミノ安息香酸誘導体、桂皮酸誘導体などの上述の紫外線吸収剤が用いられるが、それらの紫外線吸収作用は必ずしも満足のいくものではない。その上、使用上取り扱いが煩雑である、安定性が低い、その組成物の他の成分との適合性が十分でないという問題があり、また耐水性および耐油性の問題も解決されていない。
【０５８６】
皮膚病の治療用薬剤の分野では、副作用が最小であって、外的および内的双方の投与によって得られる新規な作用を有する薬剤の開発が望まれている。また、放射線障害の治療および予防の分野では、酸化反応によって引き起こされる障害を抑制および治癒させ得る薬剤が望まれている。最後に化粧品製造の分野では、使用上の取り扱いおよび組成物の安定性など上述の問題を克服する化粧品が望まれている。よって本発明はサンバーン細胞の発生を抑制するため、また、化粧組成物において用いるため、上記の特徴を有する皮膚病を治療する治療薬(これらの薬剤はMTGを誘導し得る)の提供を包含する。また、試験化合物を疾病の細胞、組織または動物モデルと接触させ、MTGの発現または機能の誘導を検出することを含んでなる皮膚病を治療するための薬剤のスクリーニング方法も包含される。
【０５８７】
遺伝子発現系
本発明のMTG核酸およびタンパク質はまた、生物医薬品としての組換えタンパク質の商業規模での生産において有利に使用できる。
【０５８８】
これまで遺伝子は哺乳類細胞系、特に、Urlaubら, PNAS U.S.A. 77, 4216-4220, 1980の方法によって考案されたようなジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子(dhfr)を欠損した突然変異チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞で大規模に発現させられてきた。種々の発現系が用いられている。従って、このような細胞において遺伝子を発現させるためには多くのベクターが利用できる。典型的には、発現ベクターで形質転換した細胞を単離するのに用いる選択法は、メトトレキセートを用いてdhfr遺伝子と標的遺伝子の両者が同時増幅される形質転換体を選択することによるものである。dhfr遺伝子は細胞をメトトレキセート抵抗性とすることができ、通常、発現が望まれる遺伝子とともにベクターに組み込む。次にメトトレキセートの濃度上昇下で細胞の選択を行う。コピー数の多い細胞ほどより高濃度のメトトレキセートに耐性となることから、これにより集団内の各細胞に存在するdhfr遺伝子の数の増幅につながる。dhfr遺伝子が増幅されると、目的遺伝子のコピー数がdhfr遺伝子のコピー数とともに増え、その結果、目的遺伝子の発現の増強が達成される。残念なことに、これらの増幅遺伝子は選択を継続しなければ、様々な不安定性を示すことが報告されている(Schimke, J. Biol. Chem. 263, 5989-5992, 1988)。この不安定性は従来利用可能なCHO dhfr-細胞発現系に固有のものである。長年の間、標的遺伝子の発現を駆動するために、SV40初期プロモーター、CMV初期プロモーターおよびSRαプロモーターなど、いくつかのプロモーターが使用されてきた。CMVおよびSRαプロモーターが最も強力であると主張されている(Wengerら, Anal. Biochem. 221, 416-418, 1994)。
【０５８９】
ある報告では、β-インターフェロンプロモーターもまた、突然変異CHO dhfr-細胞におけるβ-インターフェロン遺伝子の発現を駆動するために用いられてきた(米国特許第5,376,567号)。しかしこの系では、より高いレベルのβ-インターフェロン生産を達成するには、選択されたCHO dhfr-細胞はTanら(Tanら, PNAS U.S.A. 67, 464-471, 1970; Tanら, 米国特許第3,773,924号)の方法によってさらに誘導しなければならない。この系では、CHO dhfr-細胞によって生産された、さらなる誘導を受けたβ-インターフェロンのうちかなりのパーセンテージのものがグリコシル化されていなかった。マウスメタロチオネイン遺伝子(mMT1)プロモーターもまたCHO細胞、BHKおよびLTK-マウス細胞におけるβ-インターフェロン遺伝子の発現に用いられている(Reiserら 1987 Drug Res. 37, 4, 482-485)。しかし、このプロモーターによるβ-インターフェロンの発現はCHO細胞におけるSV40初期プロモーターほど良好なものではなかった。さらにmMT1プロモーターによって媒介されるこれらの細胞からのβ-インターフェロンの発現は重金属によって誘導可能であった。しかし重金属は細胞に極めて有毒であり、従ってこの系は棄却された。代わりにReiserらはCHO dhfr-発現系をSV40初期プロモーターとともに用い(Reiserら, Drug Res. 37,4, 482-485 (1987)およびEP-A-0529300)、Urlaubら(1980)の方法によって駆動されたようにCHO dhfr-細胞においてβ-インターフェロンを生産した。
【０５９０】
米国特許第6,207,146号(Tanら)に記載のように、β-インターフェロンはメタロチオネインに基づく系を用いて野生型CHO細胞で発現された。このようにMTGは組換えタンパク質の発現のための系を提供するものと同様の用途で用いることができる。Tanらはマウス肉腫ウイルスエンハンサーおよびマウスメタロチオネインプロモーター(MSV-mMT1)の制御下にβ-インターフェロン遺伝子、大腸菌および哺乳類細胞の双方でneo遺伝子の発現を駆動し得るプロモーターの制御下にneo遺伝子、およびそれ自身のプロモーターを有するヒトメタロチオネイン遺伝子を含んでなるベクターでトランスフェクトした野生型CHO細胞を示している。β-インターフェロンを発現し得るトランスフェクト細胞は、まず細胞をゲネチシン(抗生物質G418)に曝し、このようにしてneo遺伝子を欠いた細胞を除去し、次に生存細胞を濃度の上昇する重金属イオンに曝すことによって選択された。
【０５９１】
この重金属イオンはβ-インターフェロン遺伝子のMSV-mMT1プロモーターを増強し、従ってβ-インターフェロンの発現が増加した。重金属イオンはまたヒトメタロチオネイン遺伝子プロモーターも誘導し、ヒトメタロチオネインを発現させた。このヒトメタロチオネインは重金属イオンの有毒作用から細胞を保護した。重金属イオンの存在は、トランスフェクトベクターまたは少なくともβ-インターフェロン遺伝子およびヒトメタロチオネイン遺伝子およびそれら個々のプロモーターをゲノム中に組み込んで持った細胞の継続選択があったことを確信させた。
【０５９２】
トランスフェクションに成功した選択細胞はβ-インターフェロンを発現した。驚くことに発現は、細胞をZn2+の存在下で培養した際に向上した。このβ-インターフェロンは従来のβ-インターフェロンよりも向上した特性、特により高いバイオベラビリティーを有していた。
【０５９３】
これらの発見は全般的な適用可能性を有し、本発明のMTG遺伝子がしかるべく発現系で使用できることを示唆している。よって、本発明は、
(i)目的のタンパク質をコードし、かつ、重金属イオンの存在下で哺乳類細胞においてコード配列の発現を指示し得るプロモーターに機能し得る形で連結されたコード配列;(ii)本発明のMTG遺伝子を含んでなり、かつ、重金属イオンの存在下で哺乳類細胞においてMTG遺伝子の発現を指示し得るプロモーターに機能し得る形で連結された第1の選択マーカー配列;および所望により(iii)neo遺伝子を含んでなり、かつ、哺乳類細胞においてneo遺伝子の発現を指示し得るプロモーターに機能し得る形で連結された第2の選択マーカー配列、
を含んでなる核酸ベクターを提供する。
【０５９４】
CDPG(グリコシルホスファチジルイノシトール結合糖タンパク質)(クローン番号1000902917)
配列番号3および341ならびにクローンFL11:1000902917_223-52-4-0-G3-Fはそれぞれ、リンパ系細胞、骨髄性細胞および赤血球細胞で発現するシグナル伝達ポリペプチドであると考えられるグリコシルホスファチジルイノシトール結合糖タンパク質である配列番号172および458のポリペプチドをコードする。このポリペプチドはCD24シグナル伝達ドメインと本発明のGPI-アンカーとを含んでなり、本明細書ではCDPGとも呼ばれる。CDPGは高度にグリコシル化されていると考えられており、細胞型ごとおよび細胞の発達段階ごとにグリコシル化パターンの違いによってCDPGの分子量が異なり、治療標的としてのその用途にさらなる特性が与えられると期待される。本願を通じて記載される配列番号3および341のポリヌクレオチド、ならびに配列番号172および458のおよびポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン1000902917のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
CDPGは初期の胸腺細胞発達に果たす特定の役割を有することが示唆されている。CDPGタンパク質は広範囲にo-グリコシル化されていると考えられ、b細胞活性化応答を調節し得ると考えられる。いくつかの実施形態では、シグナル伝達トランスデューサーとしてのCDPGポリペプチドのシグナル伝達機能はレクチン様リガンドとCD24ドメイン炭水化物との結合およびシグナル伝達可能な第2のメッセンジャーの放出によって誘導される。このCDPGポリペプチドは、b細胞の抗原依存的増殖の特異的促進、および抗体形成細胞への最終的な分化の阻害をはじめ、リンパ系細胞、骨髄性細胞および赤血球細胞の分化および／または増殖を調節する上で重要な機能を有すると考えられる。
【０５９５】
さらに、CD24ドメイン機能を特徴づける、増えつつある証拠の実態を基に、CDPGは神経突起の伸び出しの有効な刺激因子としての役割を有し、従って、中枢神経系疾患の治療に有用であり得ることが提案される。
【０５９６】
またCDPGの断片、例えばGPI-アンカードメインもまた、可溶性T細胞受容体の開発(米国特許第6,080,840号)または目的タンパク質の可溶化の一時的制御が望まれるいずれかの好適な適用において有用である。例えば、目的タンパク質のcDNAの膜貫通ドメインをCDPGグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)結合を含んでなる配列で置換することによる可溶性分子の生産においては、CDPG GPI-アンカードメインを含んでなる断片を用いることができる。次にこれらのキメラcDNAを、強力なプロモーターと、遺伝子の高レベルの転写発現および増殖を可能とする変異型(例えばDHFR)遺伝子を含む発現ベクターへ導入する。次にこれらのキメラ遺伝子を、好ましくは目的の内在タンパク質を欠く選択された細胞型に同時トランスフェクトし、トランスフェクト体を選択し、目的のタンパク質に対する抗体を用いてスクリーニングすることもできる。次にこれらのGPIと結合した目的タンパク質を、酵素ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PI-PLC)で切断し、上清から(例えば、目的タンパク質に反応性のある抗体アフィニティーカラムを通すことで)精製/濃縮することにより可溶化することができる。
【０５９７】
治療薬
CDPGまたはCDPGの阻害剤は、B細胞の増殖または分化を調節することが望まれるいずれかの疾患の治療に用いることができる。CDPGまたはその阻害剤は疾病の攻撃性に関連するB細胞の種々の成熟状態を特徴とする異質な疾病群であるB細胞新生物の治療において有用であり得る。慢性リンパ球性白血病(CLL)はBリンパ球の増殖および蓄積を特徴とし、Bリンパ球性白血病(BLL)は形態的には成熟しているように見えるが生物学的には未成熟のBリンパ球の増殖および集積を特徴とする。この疾患は西洋諸国では白血病の30%を占める。この疾患は免疫グロブリンを生産できない生物学的に未成熟なリンパ球の増殖を特徴とし、リンパ節の肥大を引き起こす。B細胞の増殖および分化のレギュレーターとして、CDPGおよび／またはCDPGの阻害剤はCLL患者において白血病性B細胞の増殖を阻害するのに有用であり得る。
【０５９８】
CDPGはまたCNSの細胞増殖の調節に有用であり得る。CD24はニューロンで発現が高く、L1タンパク質との相互作用を介して大脳ニューロンの神経突起の伸び出しを促進しつつ、背根神経節ニューロンの神経突起の伸び出しを阻害することができると証明されている。
【０５９９】
選択細胞マーカー
ある態様では、CDPGポリペプチドは選択細胞マーカーとして、細胞を同定するために選択マーカーを用いる方法に対して使用することができる。組換えレトロウイルスなどのウイルスが、それらの高効率感染能と広範な細胞型にそれらのゲノムを無害で組み込むことができることに基づき、遺伝子導入のためのビヒクルとして使用されている。外来遺伝子の哺乳類細胞への導入は例えばin vivoにおいて欠損したまたは欠陥がある遺伝子産物の合成を介して遺伝性疾患または後天性疾患を修正する遺伝子治療で使用することができる。細胞内での外来遺伝子の発現は遺伝子レベルで遺伝性疾患を修正する体細胞遺伝子治療に有用であり得る。再生骨髄性細胞は単離が容易で、遺伝子導入によって修飾でき、免疫不全宿主へ移植して宿主造血系を再構築することができるので、特に造血幹細胞が体細胞遺伝子治療に適している。
【０６００】
組換え一次造血幹細胞の骨髄移植を含む遺伝子治療には幹細胞への効率的な遺伝子導入が必要である。非常に少数の一次幹細胞しか宿主造血系全体を再構築することができないので、導入遺伝子が導入された組換え幹細胞で効率的に発現することが重要である。再構築された宿主造血系への外来遺伝子の導入は、導入された遺伝子を効率的に発現する細胞の迅速かつ無害な選択を可能とする選択マーカーが利用できるかどうかによって制限されてきた。現在利用できる選択マーカーは、細胞の増殖能または生物学的特徴を変化させることがあるので一次造血幹細胞には好適なものとはいえない。再構築された宿主造血系への外来遺伝子の導入はまた、特にベクター内に1以上の転写ユニットが存在する場合、造血幹細胞で発現し得るウイルスベクターが利用できるかどうかによっても制限されてきた(Botrell, D. R. L.ら, 1987, Mol. Biol. Med. 4:229)。
【０６０１】
米国特許第5,804,177号(Humphriesら)は細胞表面タンパク質タンパク質CD24(またはM1/69-J11d熱安定抗原)が組換えウイルスベクターにおいて優性マーカーとして使用できることを実証している。組換えウイルスベクターにおいて細胞表面タンパク質CD24をコードするヌクレオチド配列を用いて造血幹細胞に感染させ、組換えウイルスベクターに感染した細胞がin vitroにて蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いるために迅速かつ無毒に選択され、プロウイルスのコピー数と選択マーカーの発現の間に良好な相関が示された。
【０６０２】
CD24は活性化シグナルに対するそれらの応答を調節し得るほとんどのヒトB細胞の表面に見られるシグナル伝達分子であり、構造的にはCDPGと密接な関連がある。CD24 cDNA(約300bp)がクローニングされているが(Kay, R.ら, 1991, J. Immunol. 147:1412)、これは広範囲にグリコシル化され、グリコシルホスファチジルイノシトール脂質アンカーによって血漿膜の外面に結合しているわずか31〜35アミノ酸の成熟ペプチドをコードしている。M1/69-J11d熱安定抗原は種々の造血細胞型で広く発現する相同なマウスペプチドと遺伝学的に類似している(Kay, R.ら, 1990, J. Immunol. 145:1952)。
【０６０３】
このように、組換えウイルスベクターを用いて原造血幹細胞にCDPG遺伝子を導入して、致死的照射を行ったレシピエントに最定着することができるように発現させることができるとされている。再定着動物での外来CDPG抗原の発現は再定着造血細胞の生物学的機能がCDPG抗原の発現によって影響されないように転写後も持続することが好ましい。その後、CDPGは顆粒球、マクロファージ、前赤血球、赤血球およびTおよびBリンパ球をはじめとする造血系のいずれか、または全てで発現することが見出されるであろう。よって、細胞表面タンパク質CDPGはin vivoにおいて再定着し得る造血幹細胞のマーカーとして、また、遺伝子治療における選択マーカーとして特に有用であり得る。また組換えウイルスベクターは、マーカーをコードするヌクレオチド配列が極めて小さく、外来遺伝子をコードするものなど目的の付加的遺伝子の挿入のための大きなスペースが残るという利点もある。
【０６０４】
本発明のある好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列を細胞へ導入するために組換えウイルスベクターを用いる。好ましくは、CDPGヌクレオチド配列を1以上の調節エレメントに機能し得る形で連結する。本発明の組換えウイルスベクターは宿主細胞で発現させる外来遺伝子のマーカーとして用いることもできる。本発明はさらに細胞およびその後代を同定する方法であって、細胞を準備し;細胞で細胞表面タンパク質CDPGが発現可能となる条件下で、その細胞を本発明の組換えウイルスベクターに感染させ;さらに細胞およびその後代での細胞表面タンパク質CDPGの発現を検出することによって細胞およびその後代を同定することを含んでなる方法を提供する。本発明の組換えウイルスベクターに感染し、かつ、その細胞表面タンパク質を発現する細胞を宿主に移植することができ、細胞およびその後代は、その宿主から生物学的サンプルを取り出し、細胞表面タンパク質を発現する細胞かどうかをアッセイすることで移植後に同定することができる。本発明の組換えウイルスベクターを宿主に直接導入してもよい。
【０６０５】
幹細胞組成物の濃縮
CDPGは初期胸腺細胞の発達に関与し、そのGPI-アンカーによって細胞表面に見られるとされていることから、本発明のCDPG核酸およびポリペプチドはまた、ヒト造血細胞を含む細胞調製物を調製するのに有用な新規な抗体組成物を得るために使用することもできる。
【０６０６】
幹細胞の精製技術の開発には継続的に関心が寄せられている。幹細胞の純粋な集団は造血の研究を助長するであろう。悪性、非悪性および遺伝疾患をはじめとする種々の疾患の治療のため、末梢血および／または骨髄由来の造血細胞の移植もまた、高用量化学療法および／または放射線療法と併用されることが増えている。このような移植物の中で長期の造血再構築が可能なのは極めて少数の細胞であるので、造血幹細胞の精製技術の開発へと強くせき立てられている。さらに、深刻な合併症および実際のところの移植手法の成功は、移植レシピエントに対してリスクがある移植において細胞を取り出すために用いる手法の有効性に大きく依存している。このような細胞としては、同種異系移植片における移植片対宿主病(GVHD)の一因であるTリンパ球、および悪性増殖の再発を起こし得る自己移植片の腫瘍細胞が挙げられる。
【０６０７】
造血細胞は密度などの物理的特徴に基づき、また、周期細胞を死滅させる特定の薬理剤に対する感受性に基づいて分離されてきた。細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体の出現は異なる細胞型を識別および分離できる可能性を大きく広げた。モノクローナル抗体を用いて骨髄および末梢血由来の細胞集団を分離するには2つの基本的アプローチがある。これらは抗体を用いて識別／標識するのが望む細胞か望まない細胞かによって異なる。ポジティブセレクション技術では、望む細胞を抗体で標識し、残りの非標識／望まない細胞から取り出す。ネガティブセレクションでは、望まない細胞を標識して除去する。抗体／補体処理および免疫毒の使用はネガティブセレクション技術であるが、FACS選別法および大部分はバッチ式の免疫吸着技術は、ポジティブおよびネガティブ両セレクションに採用することができる。免疫吸着技術では、モノクローナル抗体、好ましくは例えばビーズカラム、フラスコ、磁気粒子など残りの細胞から取り出せる表面に結合させたものを用いて細胞を選択する。免疫吸着技術は、FACS選別とは異なり、モノクローナル抗体によって標的細胞の高い特異性を維持すること、臨床的な採取において多数の細胞をそのまま扱えるようスケールアップ可能であること、また、免疫毒などの細胞傷害剤や補体を用いる危険性が避けられることから臨床および研究において極めて好ましい。
【０６０８】
造血幹細胞の精製のための現在のポジティブセレクション技術はCD34を発現する細胞を標的として単離するものである。しかし、ポジティブセレクション法には、CD34+細胞に上に抗体および／または磁気ビーズなどの物質が存在すること、およびこれらの物質の除去による細胞の損傷をはじめとする多くの欠点がある。
【０６０９】
ネガティブセレクションは臨床の移植片から少数派の細胞集団を除去するために用いられてきた。これらの細胞は、T細胞か、または移植レシピエントに対してリスクがある腫瘍細胞かのいずれかである。これらのパージの効率は技能により、また、用いる抗体の種類や数によって様々である。典型的には最終産物は腫瘍細胞またはT細胞が除かれている以外は出発時の懸濁液に極めて近いものである。
【０６１０】
米国特許第5,877,299号に記載のように、ThomasらはグリコホリンA、CD3、CD24、CD16、CD14および所望によりCD45RA、CD36、CD2、CD19、CD56、CD66aおよびCD66bに特異的な抗体を含む抗体組成物を用いたネガティブセレクション技術を開発し、ヒト造血および始原細胞が高度に濃縮された細胞集団が得られたと報告している。抗CD45Rおよび抗CD36を抗体組成物に含めた場合には、初期始原細胞および幹細胞(CD34+、CD38-細胞)の最大濃縮が認められた。しかし、CDPGは初期胸腺細胞の発達に作用するとされていることから、CDPGは造血幹細胞の選択のためにより有効な抗体組成物を開発するのに有利に使用できる可能性がある。よって、本発明は本発明のCDPGポリペプチドに特異的な抗体、ならびにCDPG、グリコホリンA、CD3、CD24、CD16、CD14および所望によりCD45RA、CD36、CD2、CD19、CD56、CD66aおよびCD66bに特異的な抗体を含んでなる、それらからなる、あるいは実質的にそれらからなる抗体組成物を包含する。
【０６１１】
造血幹細胞および始原細胞が濃縮された細胞集団を調製するため、ネガティブセレクション技術においてCDPGを含んでなる抗体組成物を使用すれば、従来の技術に優る著しい利益が得られる。この抗体組成物は末梢血、骨髄、臍帯血または冷凍骨髄のサンプルに対して、好ましくは始原細胞および幹細胞の損失または損傷につながる付加的な濃縮行程なく、一段階で適用される。
【０６１２】
PRSG(プロリンリッチカルシウム結合タンパク質)およびHSTG(塩基性ヒスチジンリッチ唾液腺ペプチド)(それぞれクローン番号338112および1000839315)
配列番号22および358ならびにクローンFL11:1000839315_220-26-1-0-F3-Fはそれぞれ、本明細書でHSTGと呼ばれ、強力な抗微生物性を有すると期待される、塩基性ヒスチジンリッチ唾液腺ペプチドである配列番号191および475のポリペプチドをコードする。好ましくはHSTGのアミノ酸配列(配列番号475)は40番のアミノ酸にチロシンを含んでなる。このHSTGタンパク質はまた51番のアミノ酸にパターン-DE:タンパク質キナーゼCリン酸化部位(SSK)も含んでなる。本願を通じて記載される配列番号22および358のポリヌクレオチド、ならびに配列番号191および475のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン1000839315のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０６１３】
配列番号8および345ならびにクローンFL11:338112_174-1-1-0-A11-Fはそれぞれ、本明細書でPRSGと呼ばれ、唾液の成分であって、強力な抗微生物性も有するカルシウム結合タンパク質であると考えられるプロリンリッチタンパク質である配列番号177および462のポリペプチドをコードする。好ましくはPRSG(配列番号462)のアミノ酸配列は96番のアミノ酸にプロリン残基、100番のアミノ酸にアルギニン残基、102番のアミノ酸にグルタミン残基、および／または103番のアミノ酸にグリシン残基を含んでなる。PRSGタンパク質はまた15番(SAQD)、24番(SQED)および59番(SAGD)のアミノ酸にカゼインキナーゼIIリン酸化部位、ならびに52番のアミノ酸にN-ミリスチル化部位(GGQQSQ)を含んでなる。本願を通じて記載される配列番号8および345のポリヌクレオチド、ならびに配列番号177および462のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン338112のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０６１４】
唾液およびその歯を保護する成分についての研究から、(1)緩衝力、(2)洗浄作用、(3)抗細菌作用、および(4)リン酸カルシウム過飽和状態の唾液の維持、の少なくとも4つの重要な唾液の機能が明らかである。数種の唾液成分はこれら機能のうち1以上の働きをする。研究から有機および無機分泌産物に関する重要な情報が得られた。また、独特な体液としての唾液はその全容において歯に対するその作用を十分説明できるよう考慮されなければならないことも明らかである。唾液はその部分部分の総和よりも秀でている。この理由の1つは、唾液の成分は機能の重複を示し、各々は1種以上の機能を有することが多いからである。しかし、この重複は機能的役割を共有するタンパク質が全て同じ程度で寄与することを意味するものではない。例えば、リン酸カルシウム沈殿を阻害するタンパク質を比べた場合、スタセリンおよび酸性プロリンリッチタンパク質が最も効力が高く、ヒスタチン、シスタチンおよびムチンはより弱い働きしかしないと思われる。タンパク質間の複雑な相互作用は唾液の機能に寄与するもう1つの主要な因子である。この点に関して、種々のタンパク質の異型複合体はヒドロキシアパタイト上で形成されることが示されている。プロリンリッチタンパク質、ヒスタチン、シスタチンおよびスタセリンをはじめとするその他の唾液タンパク質に対するムチンの結合はよく記載されている。歯の表面に吸着されているものであれ、唾液中のものであれ、これらの複合体は細菌の排除、歯の表面上での選択的な細菌凝集、ならびに無機化および脱無機化の制御に重要な意味を持つ。最後に、唾液のタンパク質分解活性は、その生物活性が元の化合物とは異なることが多い多くの生成物を生じる。唾液の歯の表面へのフッ化物送達能は一貫して、大抵は再無機化を促進して脱無機化を減らすことで唾液フッ化物を齲歯保護上重要な作用因子とする。唾液は齲歯からの保護によく適合している。唾液の緩衝能;唾液の歯表面の洗浄能、細菌洗浄能、ならびに脱無機化および無機化制御能;唾液の抗細菌活性;ならびにおそらくはその他機構は全て歯衛生上不可欠な役割に寄与する。唾液の保護機能は細菌の作用に圧倒されることがあるという事実はその他の感染性疾患の場合と同様に予防および治療の重要性を示す。唾液成分およびそれらの相互作用に関する知見により、改変した口腔内分子の治療薬としての使用が口腔衛生上重要な寄与因子となり得る。
【０６１５】
プロリンリッチタンパク質はヒトならびにその他の動物の耳下腺および顎下腺唾液の主成分である。それらは酸性、塩基性およびグリコシル化タンパク質に分類することができる。プロリンリッチタンパク質は明らかに唾液腺の腺房細胞で合成され、それらの表現型の発現は複雑な遺伝制御下にある。酸性プロリンリッチタンパク質は、それらが唾液中のカルシウムイオン濃度を維持する上で重要であることを示す強度でカルシウムと結合する。さらに、それらはヒドロキシアパタイトの形成を阻害することができ、これによりin vivoにおける歯の表面上でのヒドロキシアパタイト結晶の成長が避けられる。これらの両方の活性ならびにヒドロキシアパタイト結合部位はタンパク質のN末端の低プロリン部分に位置している。
【０６１６】
配列番号191および475のペプチドなどの塩基性ヒスチジンリッチ唾液腺ペプチドはヒスタチンとも呼ばれ、ヒト耳下腺および顎下腺分泌物中に見られる、抗細菌活性を有する電気泳動的に明確なヒスチジンリッチポリペプチドの一群である。ヒスタチン1、3および5は病原性酵母カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)を死滅させることが知られている、それぞれ38、32および24のアミノ酸残基からなる相同タンパク質である。もっと最近では、ヒスタチン2、4、6および7〜12が単離および同定されている(Troxler RFら, J Dent Res 1990 Jan;69(1):2-6)。ヒスタチン2はヒスタチン1のカルボキシル末端26残基と同一であることが分かっており;ヒスタチン4はヒスタチン3のカルボキシル末端20残基と同一であることが分かっており;また、ヒスタチン6は付加的なカルボキシル末端アルギニンを含む以外はヒスタチン5と同一であることが分かっている。ヒスタチン7〜12のアミノ酸配列は外見上ヒスタチン3のそれぞれ残基12〜24、13〜24、12〜25、13〜25、5〜11および5〜12に相当するが、ヒスタチン5または6からタンパク質分解により生じさせることもできる。Troxlerらはそれらの遺伝的起源、生合成および口腔内への分泌、ならびに抗カンジダ研究における試薬としての可能性に関して、ヒスタミンの構造要素および互いの関係についてのさらなる指針を示している。従ってHSTGポリペプチドおよびその断片は抗微生物剤としての適用、特に抗真菌剤としての適用での価値ある特性および用途を有するものと期待される。このような用途の支持は、MacKay BJら, Infect Immun. 1984 Jun;44(3):695-701, Growth-inhibitory andbactericidal effects of human parotid salivary histidine-rich polypeptides on Streptococcus mutants; MacKay BJら, Infect Immun. 1984 Jun;44(3):688-94, Isolation of milligram quantities of a group of histidine-rich polypeptides from human parotid saliva; Pollock JJら, Infect Immun. 1984 Jun;44(3):702-7, Fungistatic and fungicidal activity of human parotid salivary histidine-rich polypeptides on Candida albicans;およびXu Tら, Infect Immun. 1991 Aug;59(8):2549-54, Anticandidal activity of major human salivary histatinsをはじめとするかなりの証拠体系がある。さらに、ヒトおよびマカクのシスタチン、ヒスタチン、スタセリンおよびプロリンリッチ唾液タンパク質のRNAの組織分布がSabatiniら, J Dent Res 1989 Jul;68(7):1138-45にさらに考察されている。
【０６１７】
さらなる実施形態では、当業者ならば、PRSGおよびHSTGの断片および類似体が容易に作製および選択できることが分かるであろう。好ましい断片および類似体の選択は所望の抗微生物活性をアッセイすることにより行うことができる。例えば合成ヒスタチン類似体および幅広い抗微生物活性を有するこのような類似体を得る方法はHelmerhorst EJら, Biochem J 1997 Aug 15;326 ( Pt 1):39-45に記載されており、そこではヒスタチン類似体は、臨床単離物で見られる2番目に一般的な酵母トルロプシス・グラブラータ(Torulopsis glabrata)、プレボテラ・インテルメディア(Prevotella intermedia)およびストレプトコッカス・ムタンツ(Streptococcus mutantsies)などの口腔および非口腔病原体、ならびにメチシリン耐性黄色ブドウ球菌スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)の増殖を阻害した。
【０６１８】
このように好ましい実施形態では、PRSGおよび／またはHSTGポリペプチドまたはその断片を感染治療のために経口、注射、局所または可食組成物において用いてもよく、PRSGおよび／またはHSTG ポリペプチドはまた(例えば工業の場で)表面殺菌用の抗微生物／抗真菌組成物として用いてもよい。
【０６１９】
以下でさらに論じる好ましい例では、PRSGおよび／またはHSTGポリペプチドまたはその断片を、所望により抗齲歯作用を提供するさらなる唾液タンパク質を含有する経口、局所(例えば口中洗浄剤)または可食組成物において用いる。高レベルのフッ化物イオンに頼らずに齲歯を軽減する製品(例えばフッ素化水およびフッ化物練歯磨など)の開発および市場に関心が持たれているものの、成功を収めたこのようなアプローチの報告は多くはない。齲歯の治療に有用なある種のシステインリッチタンパク質が提案されているが(米国特許第5,688,766号, Revisら)、本発明はより優れた能力、効率ならびに感染防除および保護範囲を提供し得るPRSGおよびHSTGポリペプチドを提供する。
【０６２０】
PRSGおよびHSTGポリペプチド組成物は担体を含んでなる製剤に投与することができる。本発明の働きのために好ましい担体組成物は経口組成物である。このような組成物としては練歯磨、マウスリンス、液体歯磨剤、トローチ剤、チューインガムまたはその他口腔使用に好適なビヒクルが挙げられる。練歯磨およびマウスリンスが好ましい系である。本発明の練歯磨組成物において用いるために意図される研磨つや出し材は象牙質を過度にすり減らすことのないいずれの材料であってもよい。これらのものとしては、例えば、ゲルおよび沈殿物を含むシリカ、炭酸カルシウム、オルトリン酸二カルシウム二水和物、ピロリン酸カルシウム、リン酸三カルシウム、ポリメタリン酸カルシウム、不溶性ポリメタリン酸ナトリウム、水和アルミナ、ならびに尿素およびホルムアルデヒドの微粒子濃縮製品などの樹脂性研磨材、およびその他参照により本明細書に組み入れられるCooleyらが1962年12月25日の米国特許第3,070,510号で開示しているものが挙げられる。また、研磨剤の混合物も使用できる。種々のタイプのシリカ歯磨剤が歯のエナメル質および象牙質を過度にすり減らすことなく独特な優れた歯の洗浄およびつや出し性能の利益をもたらし得る。これらの理由からそれらは本明細書で用いるのに好ましい。練歯磨組成物には香味剤を加えることもできる。好適な香味剤としては冬緑油、ペパーミント油、スペアミント油、サッサフラス油、およびチョウジ油が挙げられる。使用できる甘味剤としてはアスパルテーム、アセスルフェーム、サッカリン、デキストロース、レブロース、およびシクラミン酸ナトリウムが挙げられる。香味剤および甘味剤は一般に練歯磨剤では約0.005%〜約2重量%のレベルで用いる。練歯磨組成物はまた乳化剤を含んでもよい。好適な乳化剤としては、非石鹸陰イオン、非イオン、陽イオン、両性イオンおよび両性有機合成界面活性剤をはじめとする、広いpH範囲にわたって合理的に安定で発泡性のものが挙げられる。本発明の練歯磨中には水も存在する。商業上好適な練歯磨の製造に用いられる水としては好ましくは脱イオン化して有機不純物を含まないものでなければならない。練歯磨の製造においては、望ましいコンシステンシーを与える増粘剤をいくらか加える必要がある。好ましい増粘剤としてはカルボキシビニルポリマー、カラギーナン、ヒドロキシエチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースおよびカルボキシメチルヒドロキシエチルセルロースナトリウムなどのセルロースエーテルの水溶性塩がある。カラヤガム、キサンタンガム、アラビアガムおよびトラガカントガムなどの天然ガムも使用できる。さらにテクスチャーを改良するために増粘剤の一部としてコロイド状ケイ酸マグネシウムアルミニウムを使用することができる。増粘剤は組成物全体の0.2%〜5.0重量%の量で使用することができる。また、硬化を防ぐため、練歯磨中に何らかの湿潤剤を含むことが望ましい。好適な湿潤剤としては、約15%〜約70%レベルのグリセリン、ソルビトールおよびその他の可食多価アルコールが挙げられる。
【０６２１】
本発明のもう1つの好ましい実施形態は口中洗浄組成物である。従来の口中洗浄剤組成物成分は本発明の薬剤の担体を含んでなり得る。口中洗浄剤は一般に約20:1〜約2:1の水／エチルアルコール溶液を含んでなるか、またはアルコール不含であり、好ましくは歯磨剤に関して上述したような香味剤、甘味剤、湿潤剤、および泡立剤などのその他の成分を含んでなる。グリセリンおよびソルビトールなどの湿潤剤は口中に潤い感を与える。一般に本発明の口中洗浄剤は重量ベースで0%〜60%(好ましくは5%〜20%)のエチルアルコール、0%〜20%(好ましくは5%〜20%)の湿潤剤、0%〜2%(好ましくは0.01%〜1.0%)の乳化剤、0%〜0.5%(好ましくは0.005%〜0.06%)の甘味剤(サッカリン、またはステブロシドなどの天然甘味剤など)、0%〜0.3%(好ましくは0.03%〜0.3%)の香味剤、および残部としての水を含んでなる。
【０６２２】
本組成物のpHおよび／または口中でのpHは口中の硬質および軟質組織に安全ないずれのpHであってもよい。このようはpHは一般に約3〜約10、好ましくは約4〜約8である。許容される他の口中カーダー(carder)としてはガム、トローチ、ならびに他の形態がある。このような好適な形態は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる、Grabenstetterらに対する1978年4月11日の米国特許第4,083,955号に記載されている。また、可食組成物も本明細書の担体組成物として用いるのに好適である。可食組成物としては多種の固体ならびに液体組成物がある。このような組成物としては、その他多数のものから例えば、清涼飲料、柑橘飲料、クッキー、ケーキ、パンが挙げられる。このような組成物は糖またはその他の甘味剤、水、小麦粉、ショートニング、他の繊維(小麦、トウモロコシ、大麦、ライ麦、オート麦、オオバコ、およびそれらの混合物など)を含んでもよい。
【０６２３】
HSDG(ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ)(クローン番号495917)
配列番号54および381ならびにクローンFL11:495917_160-22-4-0-D8-Fはそれぞれ、本明細書でHSDGと呼ばれるヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼである配列番号223および498のポリペプチドをコードする。HSDGポリペプチドはステロイドホルモン調節、好ましくは糖質コルチコイド代謝に関与することから、HSDGはステロイドホルモンレベルを増強または阻害するいずれの適用にも有用であり得る。HSDGはステロイドホルモンによって治療可能な疾病の治療に有用であり得る。また、HSDG阻害剤も、合成系路のエレメントを含んでなる操作細胞などにおいて、糖質コルチコイドなどのステロイドホルモンの自足的生合成系に有用であり得る。内在的HSDG活性のHSDG阻害剤は糖質コルチコイドおよび／またはその他これらの細胞系から合成されたステロイドホルモンをより多く回収できるようにする。
【０６２４】
本願を通じて記載される配列番号54および381のポリヌクレオチド、ならびに配列番号 223および498ポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン495917のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０６２５】
本発明のHSDGポリペプチドは配列番号498の58〜79番のアミノ酸にロイシンジッパーパターン(Prosite ref. PS00029)ならびに36番のアミノ酸にN-ミリスチル化部位(GANAGV)を含んでなる。ある例では、HSDGポリペプチドは糖質コルチコイドの生産および治療的調節に使用できる。当業者ならば、糖質コルチコイドを代謝できる好適なHSDGポリペプチドまたはその変異体もしくは断片はいずれもが容易に使用できることが分かるであろう。
【０６２６】
ある実施形態では、HSDG活性は糖質コルチコイドまたは代謝産物または糖質コルチコイドのレベルを検出することにより測定することができる。さらに11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼの構造面は当技術分野ですでに記載されており、好適なHSDG変異体および断片を開発するための指針として役立ち得る。本発明のHSDGポリペプチドは糖質コルチコイド活性の調節または糖質コルチコイドレベルもしくは活性を特異的に調節し得る化合物の同定(例えば薬物スクリーニング)を可能とし得る。HSDGはステロイドホルモン合成、または糖質コルチコイド合成の調節を組織特異的に行わせるに有用であり、それにより副作用のリスクを引き下げつつ疾病を治療する改良方法が得られる。
【０６２７】
コルチコステロイドは糖質コルチコイドとも呼ばれ、ステロイドホルモンであり、その最も一般的な形態はコルチゾールである。糖質コルチコイド活性の調節は広範囲の組織および器官の生理プロセスを調節する上で重要なものである。糖質コルチコイドは性腺内で働いてテストステロンの生産を直接抑制する(Monder, Cら, (1994) Steroids 59, 69-73)。また、糖質コルチコイドのレベルが高いと、腎臓に過剰な塩および水分が保持されることとなり、高血圧症を招く。
【０６２８】
糖質コルチコイド作用はこの分子と、以下鉱質コルチコイド受容体(MR)または糖質コルチコイド受容体(GR)いずれかであると定義される受容体との結合によって媒介される。Krozowski, Z. S.ら, ((1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 6056-6060)およびBeaumont, K.ら(1983) Endocrinology 113, 2043-2049)は、副腎摘出ラットのMRが鉱質コルチコイドアルドステロンおよび糖質コルチコイド、例えばコルチコステロンおよびコルチゾールに対して同等の親和性を有することを示している。ヒトMRで確証的な証拠が見つかっている(Arriza, J. Lら, (1988) Neuron 1, 887-900)。仮性鉱質コルチコイド受容体過剰(AME)の先天性症候群を患う患者では、コルチゾールレベルが上昇し、体内の塩と水のバランスを調節するステロイドであるアルドステロンによって通常占有されているMRと結合してそれを活性化させるとされている。塩および水はAME患者に保持され、重篤な高血圧症を招く。
【０６２９】
HSDG同様、酵素11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(11βHSD)も米国特許第5,965,372号(Funderら)で論じられており、糖質コルチコイドを、鉱質コルチコイド標的組織、例えば腎臓、膵臓、小腸、結腸、ならびに海馬、胎盤および性腺に存在するMRに結合することができない代謝産物へと変換する上で関与する可能性がある(Edwardsら, (1988) Lancet. 2: 986-9; Funderら, (1988) Science 242, 583,585)。例えばアルドステロン標的組織11βHSDは糖質コルチコイド分子を不活性化し、アルドステロンの循環レベルを著しく低くして腎のホメオスタシスを維持する。例えばAME患者で、あるいは甘草の成分であるグリシルレチン酸の投与後に11βHSD酵素が不活性化すると重篤な高血圧症を招く。さらに、胎盤11βHSD活性は、その後の生涯を高血圧症に傾かせる高循環レベルの糖質コルチコイドから胎児を保護し得る(Edwardsら, 1993)。活性の生化学的特性決定は、補因子要求および基質親和性が異なる少なくとも2種の11βHSDイソ酵素(11βHSD1および11βHSD2)の存在することを示している。11βHSD1酵素は補因子としてNADP+を好む低親和性酵素である(Agarwalら, 1989)。11βHSD2酵素は高親和性酵素(糖質コルチコイドに対するKm値=10nM)であり、好ましい補因子としてNADP+ではなくNAD+を要求し、以下、「NAD+依存性糖質コルチコイドデヒドロゲナーゼ」酵素と呼ばれる、糖質コルチコイドデヒドロゲナーゼ酵素の一クラスに属す。
【０６３０】
さらにヒト顆粒膜黄体細胞の11βHSD酵素とIVFの成功との間の逆相関が示されているが、このことはこの酵素の活性がIVF後の受精卵の着床および移植の成功に関係することを示唆している。あらゆる種における人工授精の結果の予後指標としての卵巣11βHSD酵素活性の測定は英国特許出願第9305984号の主題である。しかし、Michaelら((1993) Lancet 342, 711-712)および対応する英国特許出願第9305984号の開示は、どのイソ酵素が卵巣においてIVF受精卵移植の予測指標となるか、あるいはIVF受精卵移植の結果の予測において11βHSDのイソ酵素を識別する手段となるかについて明示も示唆もしていない。実際、この酵素アッセイ法は細胞における11βHSD活性の全てのイソ酵素を検出し得るものであって、その中にはこれまでにまだ同定されていないものもある。
【０６３１】
このようにヒトHSDGヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ酵素およびそれをコードする核酸は、遺伝子治療の発展、ならびに細胞におけるこのヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ酵素の内在活性を変化させるHSDGアクチベーターおよび阻害剤の同定のための新規な手段を提供する。本発明はまた、例えばとりわけ皮膚、結腸、腎臓、胎盤および性腺をはじめとする種々の組織または器官におけるNAD+依存性糖質コルチコイドデヒドロゲナーゼ酵素をコードする遺伝子の発現レベルを遺伝学的手段または免疫学的手段によってスクリーニングすることを可能とする。
【０６３２】
S100Gカルシウム結合タンパク質(クローン番号200895)
クローンFL11:200895_116-055-1-0-H11-Fならびに配列番号132および428のポリヌクレオチドは本明細書でS100Gと呼ばれるS100カルシウム結合タンパク質をコードする。配列番号301および542はそれぞれ配列番号132および428の核酸配列に対応するアミノ酸配列を示す。本願を通じて記載される配列番号132および428のポリヌクレオチド、ならびに配列番号301および542のポリペプチドの全ての特徴および用途は、クローン200895のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０６３３】
背景
ほとんど全ての真核細胞では、カルシウム(Ca2+)は、細胞増殖および分化、心液伝達物質分泌、グリコーゲン代謝、および骨格筋収縮をはじめとする多様な細胞プロセスにおいてシグナル伝達分子として機能する。休止細胞内では、細胞質のCa2+濃度は極めて低い(＜10-7M)。しかし、神経インパルスまたは増殖因子などの外部シグナルによって細胞が刺激されると、細胞質のCa2+濃度が約50倍高まる。このCa2+の内向きのフラックスは、原形質膜のCa2+チャネルの開放と小胞体などの細胞内貯蔵所からのCa2+の放出によって引き起こされる。Ca2+は、シグナル伝達経路の引き金を引くタンパク質キナーゼCなどの調節酵素を直接活性化する。
【０６３４】
配列番号301および542のタンパク質は典型的には心臓および筋肉に見られるカルシウム結合S100タンパク質である。S100タンパク質は細胞骨格/膜の相互作用、細胞分裂および分化などの種々の細胞プロセスに重要な役割を果たすと考えられている低分子量カルシウム結合タンパク質である。S100タンパク質の発現は種々の疾患において評価されてきた。例えば、S100タンパク質は潰瘍性大腸炎、クローン病をはじめとする炎症性疾患のマーカーとして、また、AIDSおよびマラリアをはじめとする感染性疾患患者および造血系疾患患者の血清マーカーとして評価されてきた。S100タンパク質が癌の細胞浸潤および転移速度を変化させる得ることを示す証拠が集まっている。例えばS100タンパク質は従来のヒト膀胱細胞癌の樹状細胞で発現し、これらの腫瘍の浸潤力はS100タンパク質発現細胞の存在と相関があることが見出されている。
【０６３５】
治療薬および診断薬
本明細書に開示されている配列番号301および542のS100Gタンパク質は癌、生殖障害、免疫疾患、神経疾患、小胞輸送障害および発達障害の診断、予防および治療に有用な新規なカルシウム結合S100タンパク質を提供する。
【０６３６】
CBPは種々の疾患に関連しており、いくつかのCBPは、それに対して小分子阻害剤が開発され得る有効な治療標的であることが分かっている。しかし、いくつかのCBPは広く用いられている治療処置の標的ではあるが、疾病に対してより選択性の高い治療処置の開発を可能とするさらなるCBPを提供することが有利である。ある例では、カルシニューリンは酵母から哺乳類に至るまであらゆる真核生物の細胞で見られる。カルシニューリンは免疫疾患に重要な免疫抑制剤シクロスポリンAおよびFK506による阻害のための標的である(Kissinger, C. R.ら (1995) Nature 378:641-644)。カルシニューリンはまた、Tリンパ球における転写調節および増殖制御に重要な役割を果たす(Wang, M. G.ら (1996) Cytogenet. Cell Genet. 72:236-241)。しかし、カルシニューリンホスファターゼ活性の阻害は免疫抑制の機構と非リンパ系細胞で見られるFK506の有害な副作用の双方に関連づけられており、このことはカルシニューリン阻害剤を媒介することができ、T細胞に対する発現に限定される新たなFK結合タンパク質(FKBP)を同定すれば、FKBPとの特異的相互作用によって作用部位にターゲッティングされる新たな免疫抑制薬を得ることができる(Baughman G,ら Mol Cell Biol 1995 Aug;15(8):4395-402)。別のCBP例では、CaMのレベルは腫瘍および各種タイプの癌の腫瘍由来細胞系では数倍高くなっている(Rasmussen, C. D.およびMeans, A. R. (1989) Trends in Neuroscience 12:433-438)。カルシウム結合S100βは種々の疾患に関与するCBPのもう1つの例である。本発明のS100Gタンパク質と同様、S100βはEF-ハンドモチーフを含む。S100βは神経系で豊富に発現する。S100βレベルは脳梗塞、一過性脳虚血発作、放血、頭部外傷およびダウン症候群に起因する神経損傷患者の血液および脳脊髄液で高くなっている。さらにまた、S100βおよびその他の神経特異的CBPはアルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン舞踏病などの神経変性疾患から防御し得る。S100βは中枢神経系および末梢神経系の神経膠細胞により生産および分泌される(Allore, R. J.ら (1990) J. Biol. Chem. 265:15537-15543)。成熟神経膠細胞におけるS100βの蓄積は微小管ネットワークに関連している。S100βは神経の分化および生存を促進するが、過剰発現すれば細胞に害を及ぼすことがある。この選択的過剰生産は、細胞分裂タンパク質キナーゼを伴い得るアルツハイマー病における神経病変の進行に関連づけられている(Marshak, D. R.およびPena, L. A. (1992) Prog. Clin. Biol. Res. 379:289-307)。成人性T細胞白血病(ATL)は1型Tリンパ親和性ウイルスによって引き起こされる成熟T細胞悪性疾患である。T細胞受容体αβ(TCRαβ+)複合体の表面発現の低下がATL細胞の特異的な特徴である。S100βはCD4+、TCRαβ+ATL細胞では検出できないが、4人のATL患者からのCD4-、CD8-、TCRαβ+白血病細胞では発現する。このことから、S100βのレベルがATLにおけるTCRαβ+複合体の表面発現の低下に関連する可能性があることが示唆された(Suzushima, H.ら (1994) Leuk. Lymphoma 13:257-262)。S100βの血清レベルの上昇は散在性悪性黒色腫転移症と関連しているが、このことは血清S100βが転移性黒色腫の進行の臨床マーカーとして価値があることを示唆している(Henze, G.ら (1997) Dermatology 194:208-212)。さらにもう1つの例では、正常な結腸直腸粘膜に比べて結腸直腸癌ではホスホリパーゼA2をコードするものとともにヒトカルジザリン(S100様タンパク質)をコードする���ッセンジャーRNAレベルが上昇している(Tanaka, M.ら (1995) Cancer Lett. 89:195-200)。最後に細胞内S100カルシウム結合タンパク質がラット腹膜から単離されている。このタンパク質MRP14は、関節炎罹患性ルイス/Nラットの腹膜マクロファージで発現する2つの移動阻害因子関連タンパク質のうちの1つである(Imamichi, T.ら (1993) Biochem. Biophys. Res. Comm. 194:819-825)。
【０６３７】
しかし、S100タンパク質およびその他のCBPを基にした多くの使用および治療薬があるにもかかわらず、疾病に関与し、かつ、標的細胞または組織内で特異的に見られるCBPを選択的にターゲッティングできることが有利となる。よって、第1の実施形態では、本発明のS100Gタンパク質はカルシウムシグナル伝達の選択的阻害剤、例えば好ましくは転写調節および細胞増殖制御の阻害剤の開発のために用いることができる。
【０６３８】
ある実施形態では、S100Gのアンタゴニストを、神経疾患を予防または治療するために患者に投与することができる。このような疾患としては、限定されるものではないが、静座不能、アルツハイマー病、記憶喪失、筋萎縮性側索硬化症、双極性障害、緊張病、脳腫瘍、痴呆、鬱病、ダウン症候群、晩発性運動障害、失調症、癲癇、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、神経繊維腫症、パーキンソン病、妄想型精神病、精神分裂病およびトゥーレット病が挙げられる。ある態様では、S100Gと特異的に結合する抗体をアンタゴニストとして直接用いてもよいし、あるいはS100Gを発現する細胞または組織へ薬剤を運ぶターゲッティングまたは送達機構として間接的に用いてもよい。
【０６３９】
ある実施形態では、S100Gのアンタゴニストを小胞輸送障害を予防または治療するために患者に投与することができる。このような疾患としては、限定されるものではないが、嚢胞性繊維症、グルコース-ガラクトース吸収不良症候群、高コレステロール血症、真性糖尿病、尿崩症、高・低血糖症、グレーブス病、甲状腺腫、クッシング病およびアジソン病;潰瘍性大腸炎、胃・十二指腸潰瘍などの胃腸管疾患;AIDSをはじめとする小胞輸送異常を伴うその他の症状;発熱、喘息および蕁麻疹をはじめとするアレルギー疾患;自己免疫性溶血性貧血;増殖性糸球体腎炎;炎症性腸疾患;多発性硬化症;重症筋無力症;慢性関節リウマチおよび骨関節炎;強皮症;チェディアック・東およびシェーグレン症候群;全身性紅斑性狼瘡;毒物ショック症候群;組織外傷;およびウイルス、細菌、真菌、蠕虫および原生動物感染症が挙げられる。ある態様では、S100Gと特異的に結合する抗体をアンタゴニストとして直接用いてもよいし、あるいはS100Gを発現する細胞または組織へ薬剤を運ぶターゲッティングまたは送達機構として間接的に用いてもよい。
【０６４０】
ある実施形態では、S100Gのアンタゴニストを免疫疾患を予防または治療するために患者に投与することができる。このような疾患としては、限定されるものではないが、AIDS、アジソン病、成人性呼吸窮迫症候群、アレルギー症、貧血症、喘息、アテローム性動脈硬化症、気管支炎、胆嚢炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、真性糖尿病、気腫、結節性紅斑、萎縮性胃炎、糸球体腎炎、痛風、グレーブス病、過好酸球増加症、過敏性腸症候群、紅斑性狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗鬆症、膵炎、多発性筋炎、慢性関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、ウェルナー症候群および自己免疫性甲状腺炎;癌、血液透析および対外循環の合併症;ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原生動物および蠕虫感染症;ならびに外傷が挙げられる。ある態様では、S100Gと特異的に結合する抗体をアンタゴニストとして直接用いてもよいし、あるいはS100Gを発現する細胞または組織へ薬剤を運ぶターゲッティングまたは送達機構として間接的に用いてもよい。
【０６４１】
ある実施形態では、S100Gのアンタゴニストを腫瘍性疾患を予防または治療するために患者に投与することができる。このような疾患としては、限定されるものではないが、腺癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、奇形癌、および特に副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頸、胆嚢、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺および子宮の癌が挙げられる。ある態様では、S100Gと特異的に結合する抗体をアンタゴニストとして直接用いてもよいし、あるいはS100Gを発現する細胞または組織へ薬剤を運ぶターゲッティングまたは送達機構として間接的に用いてもよい。
【０６４２】
さらに、本発明のS100G核酸およびポリペプチドは、身体のカルシウムホメオスタシスを崩す薬物などその他の医薬の投与による負の副作用を受けている患者の治療用組成物を同定するために用いることができる。医原的なカルシウム代謝不全に対処するにはこれらの組成物の同時投与が有用となろう。
【０６４３】
S100Gのアンタゴニストは当技術分野で一般に知られている方法を用いて作製すればよい。特に精製S100Gは抗体を作製するため、またはS100Gと特異的に結合するものを同定するための薬剤のライブラリーをスクリーニングするために使用できる。ある例では、Ca2+-シグナル伝達活性を特異的に阻害する薬剤のポジティブスクリーニングが、特定の表現型を有する酵母変異体における増殖促進作用に基づいて行われた(Shitamukai Aら, Biosci Biotechnol Biochem 2000 Sep;64(9):1942-6)。酵母でのシグナル伝達経路の不適切な活性化有害な生理作用を持つことが多く、増殖欠陥をはじめ種々の欠陥を引き起こす。サッカロミセス・セレビシエのある遺伝背景(deltazds1)では、Ca2+-シグナル伝達経路の過剰な活性化によりCaCl2を含む培地でのG2の細胞周期進行が特異的に遮断される。Shitamukaiらは過剰に活性化されたCa2+シグナル下にある細胞の増殖欠陥を無効にする能力に基づきCa2+-シグナル伝達活性を特異的に弱める有効化合物を検出すべく設計した薬物スクリーニング法の一例を提供している。スクリーニング条件はモデル化合物として既知のカルシニューリン阻害剤を用いてCa2+により誘導される増殖阻害を抑制する薬物を目的に確立されており、薬物感受性の増強した指標株はsyr1/erg3ヌル突然変異を用いて構築した。
【０６４４】
もう1つの実施形態では、S100Pをコードするポリヌクレオチドの相補物を発現するベクターを、限定されるものではないが上記のものをはじめとする神経疾患、免疫疾患、腫瘍性疾患または小胞輸送障害を治療または予防するために患者に投与することができる。その他の実施形態では、本発明のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、相補配列またはベクターはいずれも他の適当な治療薬と組み合わせて投与してもよい。組合せ療法において用いるための適当な薬剤の選択は当業者ならば従来の製薬原理に従って行うことができる。これら治療薬の組合せは上記の種々の疾患の治療または予防を達成すべく相乗作用し得る。このアプローチを用い、低用量の各薬剤で治療効果を達成し、従って、有害な副作用の潜在性を軽減することができる可能性がある。
【０６４５】
S100タンパク質の発現は黒色腫の血清マーカーとして(Henzeら, Dermatology 194:208-212; Buerら, 1997 Brit. J. Cancer 75: 1373-1376; Sherbertら 1998; Anticancer Res. 18:2415-2422)、また、より最近では、通常癌(特に乳癌、結腸癌および肺癌)の血清マーカーとして評価されており、血清中でのそれらの検出能は癌における予後および／または治療上の重要性を持ち得る。さらにS100タンパク質の対する自己抗体も癌患者で見つかっている(国際特許公報WO 00/26668)。よって、本発明のS100Gタンパク質は癌の診断および予防、癌に罹患しやすい被験者の特定、被験者の体液サンプル中のS100Gタンパク質のレベルの上昇に基づく、癌治療下の被験者のモニタリングに用いることができる。
【０６４６】
被験者における癌の診断および予後の方法は、
a)被験者から得た体液サンプルにおいてS100Gタンパク質を検出し、
b)被験者サンプルにおいて検出されたタンパク質レベルと対照サンプルにおいて検出されたタンパク質レベルを比較することを含んでなり、
その際、対照サンプルに比べて被験者サンプルで検出されたS100Gタンパク質のレベルが高いことが、癌のリスクが高い被験者の指標となる。
【０６４７】
本発明はまた、癌を有する被験者の診断および予後のための方法であって、
a)被験者から得た血清サンプルをS100Gタンパク質抗原を含有するサンプルと、特異的抗原抗体複合体結合が起こり得る条件下で接触させ、
b)被験者の血清サンプルに存在する自己抗体とS100Gタンパク質との免疫特異的結合の存在を検出することを含んでなり、
その際、自己抗体の免疫特異的結合の存在が癌の存在を示す、
上記方法も含んでなる。
【０６４８】
サンプル中のS100Gタンパク質の検出のためのアッセイは、S100G特異的抗体との相互作用によってS100Gタンパク質を検出する免疫アッセイをはじめとする任意の好適な方法によって達成してもよい。さらに例えばS100Gと特異的に結合するポリペプチドなど、抗体以外の試薬を用いてもよい。
【０６４９】
なおさらなる実施形態では、本発明のS100Gタンパク質はS100G以外の、S100タンパク質に特異的な特異的抗S100抗体の開発のために有用であり得る。いくつかのS100タンパク質が疾病と関連づけられていることから、例えば癌などの疾病を同定するためのS100特異的抗体のパネルを開発することが有利であり得る。よって、癌の種類を識別するためにはS100Gタンパク質およびそれに対する抗体が有利であり得る。S100Gタンパク質および抗体はまた、ある抗S100抗体の、その標的に対する選択性を調べ、S100Gタンパク質と交差反応性のある抗体を除去することによる、S100特異的抗体のスクリーニングにも有用であり得る。
【０６５０】
本発明のS100タンパク質の構造面
S100タンパク質とは、低分子量(約10〜12kDa)酸性Ca2+結合タンパク質の一群であり、100%飽和硫酸アンモニウム中で最初に単離されたタンパク質の溶解性からこのように称せられたものである。これらのタンパク質間の最も著しく保存されている特徴はEFハンドの存在である。S100タンパク質は2つのCa2+結合ドメインを有する。これらのドメインのうちの一方は塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスドメインであり、他方のドメインは酸性ヘリックス-ループ-ヘリックスEFハンドである(Kligman, D.およびHilt, D. C. (1988) Trends Biochem. Sci. 13:437-442)。EFハンドドメインはまた、S100タンパク質内に、Ca2+イオンに対して親和性の低いS100ファミリータンパク質のメンバーを特異的に識別するある領域部分を包含する(S100/ICaBP; PROSITE PS00303, SWISSPROT, PFAM PF01023)。EFハンドは互いに約90°の向きにある2つのαヘリックスによって挟まれた12のアミノ酸残基を含むループを特徴とする。この12のアミノ酸ループの境界には通常アスパラギン酸(D)およびグルタミン酸(E)残基が見られる。さらに、ほとんどのCa2+結合EFハンドドメインではループの中央部に保存的にグリシン残基が存在する。このドメインの酸素リガンドはCa2+イオンと配位結合している(Kretsinger, R. H.およびNockolds, C. E. (1973) J. Biol. Chem. 248:3313-3326)。また、当業者ならば、Ca(2+)結合カルシクリンの三次元構造およびそのS100によるCa(2+)-シグナル伝達の関与を記載しているSastry Mら, (Structure 1998;6:223-231)など、CBP構造とCa(2+)結合機構に関する包括的な知見を基にすればS100Gポリペプチドの修飾が容易に行えることも分かるであろう。
【０６５１】
最近、S100A13と呼ばれるタンパク質が発見され、本発明のS100Gポリペプチドと有意な一次構造の類似性を持つものものであるとの解析結果が得られた(Wickiら, (1996) BBRC 227:594-599)。
【０６５２】
カルシウムとの結合はS100タンパク質のコンホメーション変化をもたらし、これは次に第2のエフェクタータンパク質に作用し得る。このタンパク質-タンパク質相互作用様式および第2のエフェクタータンパク質の活性調節は、同様にEFハンドを含むカルモジュリンで見られるものと同様である。本発明のS100Gタンパク質は配列番号542のアミノ酸9〜52位にICaBP型カルシウム結合ドメインを、およびアミノ酸7位(TELE);34位(SVNE);および55位(SLDE)にカゼインキナーゼIIリン酸化部位モチーフを含んでいる。
【０６５３】
このように本発明のS100Gポリペプチドはまた、遊離カルシウムのレベルを調節、好ましくは低下させることが望ましいin vivoまたはin vitroのいずれかの状況下、あるいはカルシウム濃度変化の検出を含む適用において用いることができる。ある態様では、S100G核酸およびポリペプチドをカルシウムバイオセンサーの開発のため使用できる。カルシウムバイオセンサーは、細胞外液への流入または細胞外液からの流出が補償されなくなり、それぞれ高カルシウム血症および低カルシウム血症を招くカルシウム輸送の異常を検出する上で特に用途を持ち得る。このような血清カルシウム濃度異常は神経機能、胃腸管機能および腎機能に著しい影響を有する(Bushinsky DAら, Lancet 1998 Jul 25;352 (9124):306-11)。カルシウムバイオセンサーは、カルシウムと、S100GポリペプチドのEFハンドドメインとの結合によってもたらされるコンホメーション変化を検出するための当技術分野で公知のいずれの好適な技術を用いても開発できる。コンホメーション変化はS100Gタンパク質の、第2のエフェクタータンパク質との結合能の変化を検出ことによって検出するのが好ましい。
【０６５４】
特定のS100タンパク質の分布は細胞型によって異なることから、S100タンパク質は細胞型特異的な様式で細胞内カルシウムの上昇のシグナル伝達に関与し得る(Wu, T.ら (1997) J. Biol. Chem. 272:17145-17153)。
【０６５５】
CaMLP(カルシウム結合タンパク質)(クローン番号500742698)
カルシウムは細胞内の化学的・電気的シグナルに頼る「第2のメッセンジャー」の1つである。このシグナル伝達および、ひいては生物学的プロセスの調節はカルシウムイオンと高親和性カルシウム結合タンパク質(CBP)との相互作用を含む。本明細書において配列番号184および469で開示されるものは、それぞれ配列番号15および352の核酸配列およびクローンFL11:500742698_204-61-4-0-B2-Fによってコードされ、本明細書ではCaMLPとも呼ばれ、細胞増殖(例えば肝細胞、黒色腫細胞、白血病性リンパ球およびHUVEC(ヒト臍静脈内皮細胞)などのもの)および分化という多彩な方面に関与するCa2+感受・結合タンパク質として機能すると考えられる1つのタンパク質である。本願において記載される配列番号15および352のポリヌクレオチド、ならびに配列番号184および469のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン500742698のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。注目すべきは、CaMLPポリペプチドは配列番号469のアミノ酸81〜93位のにEFハンドカルシウム結合ドメイン(PROSITE PS00018)(CaMLP)を含むことである。
【０６５６】
細胞分裂および分化、神経伝達物質の分泌、グリコーゲンの代謝、および骨格筋の収縮をはじめ、Ca2+が細胞内シグナル伝達分子として働く細胞プロセスは多様である。休止細胞では、細胞質のCa2+濃度は極めて低い(＜10-7M)。しかし、神経パルスまたは増殖因子などの外部シグナルによって細胞が刺激されると、細胞質のCa2+濃度が約50倍高まる。このCa2+の流入は、原形質膜のCa2+チャネルの開放と小胞体などの細胞内貯蔵部位からのCa2+の放出によって引き起こされる。Ca2+は、シグナル伝達経路の引き金を引くタンパク質キナーゼCなどの調節酵素を直接活性化する。Ca2+はまた、次に酵素、膜輸送ポンプおよびイオンチャネルをはじめとする多重標的タンパク質を活性化するカルビンジン、トロポニンC、カルモジュリン、およびS-100タンパク質などの特定のCa2+結合タンパク質(CBP)とも結合する。カルモジュリン(CaM)は最も分布が広く、最も多いカルシウム作用のメディエーターであり、真核細胞におけるCa2+変化の主要なセンサーであると思われる。Ca2+とCaMの結合はタンパク質に顕著なコンホメーション変化をもたらし、100を超える異なるタンパク質との相互作用およびその調節を可能とする。CBP相互作用は、限定されるものではないが、遺伝子調節、DNA合成、細胞周期の進行、細胞分裂、細胞質分裂、細胞骨格の組織、筋肉収縮、シグナル伝達、イオンホメオスタシス、エキソサイトーシスおよび代謝調節をはじめとする多数の細胞プロセスに関与する(Celio, M. R.ら (1996) Guidebook to Calcium-binding Proteins, Oxford University Press, Oxford, UK, pp. 15-20)。
【０６５７】
治療薬
本明細書に開示される配列番号184および469のCaMLPタンパク質は癌、生殖障害、免疫疾患、神経障害および発達障害の診断、予防および治療に有用な新規なカルシウム結合タンパク質組成物を提供する。
【０６５８】
カルシウム結合タンパク質(CBP)は種々の疾患に関連しており、いくつかのCBPは、それに対して小分子阻害剤が開発され得る有効な治療標的であることが分かっている。しかし、いくつかのCBPは広く用いられている治療処置の標的ではあるが、疾病に対してより選択性の高い治療処置の開発を可能とするさらなるCBPを提供することが有利である。多数のCBPに関して細胞増殖性疾患への関与を示唆する証拠が集まっている。CaMLPは選択性と安全性が高められた(副作用プロフィールの軽減)特異的阻害剤およびアクチベーターの開発を可能とする組織特異的カルモジュリンホモログとして有用であり得るとされている。これまでにカルモジュリンアンタゴニストは数種の悪性腫瘍、特に中枢神経系ならびに肺腫瘍の治療に有用であることが報告されている。カルモジュリンアンタゴニストの抗腫瘍活性ならびにそれを用いた化学療法の成功が例えばScullerら Cancer Res., 50:1645-1649 (1990)およびHaitら Cancer Res., 50:6636-6640 (1990)に記載されている。米国特許第5,340,565号はさらに、化学療法薬または放射線治療の有効性を高める薬剤としてのカルモジュリンアンタゴニストまたは阻害剤の使用を記載している。特にそこでは放射線療法、またはシスプラチン(Platinol(登録商標))などの化学療法薬を用いた化学療法下にあるヒト患者において、カルモジュリン活性を阻害するカルモジュリン結合剤をさらに投与することにより腫瘍または癌細胞を阻害する、または死滅させる方法が記載されている。
【０６５９】
またカルモジュリンは、火傷および凍傷によって引き起こされた組織損傷、ならびに皮膚炎およびにケラチノサイトの過増殖を伴う他の症状において病理的役割を果たすと考えられている(Beitnerら, Gen. Pharmac. 20: 641-646, 1989)。本発明の方法は、カルモジュリン活性の拮抗作用が望まれる上記の症状、またその他の症状の治療に適用し得る。
【０６６０】
したがって、上記で論じたように、本発明のCaMLPタンパク質は偏在性細胞内受容体タンパク質カルモジュリンと構造的類似性を有するが、このことはCaMLPが選択的CaMLP阻害剤の開発に有用であることを示唆するものである。よって、本発明の核酸およびポリペプチドは、特に細胞増殖性疾患に対する新規な治療用標的を提供する。ある態様では、これらの核酸およびタンパク質は選択的カルモジュリンおよび本発明のポリペプチドを阻害しない他のカルシウム結合タンパク質アンタゴニストの開発のための薬物スクリーニングに用いることができる。もう1つの態様では、本発明の核酸およびポリペプチドは、カルモジュリンを阻害しないCaMLPの選択的モジュレーターを同定し、それにより望ましくない副作用を生じる可能性のより少ない化合物を同定するための薬物スクリーニングに用いることができる。さらにもう1つの態様では、本発明の核酸およびポリペプチドは、カルモジュリンおよびCaMLPの両者の選択的モジュレーターを同定し、それにより能力の高まった化合物を同定するための薬物スクリーニング法に用いることができる。
【０６６１】
カルシウムの結合により、CaMLPはカルシウム依存的にいくつかのタンパク質標的と相互作用し、それにより細胞の全体としての挙動に影響を及ぼし得るいくつかの複雑な生化学経路を変化させ得る。このカルシウム-カルモジュリン複合体は例えば真核生物の数種の酵素、イオン輸送体、受容体、運動タンパク質、転写因子および細胞骨格成分をはじめ、30種を超える異なるタンパク質の生物学的活性を制御する。
【０６６２】
米国特許第5,840,697号に記載のように、Blondelleらはカルモジュリンのペプチド阻害剤を有している。その他のカルモジュリン標的化合物もいくつか知られており、種々の治療適用で用いられている。例えば、例えば米国特許第2,645,640号に開示されているクロルプロマジン(Thorazine.RTM.)および関連のフェノチアジン誘導体は精神安定剤および鎮静剤として有用なカルモジュリンアンタゴニストである。また、Hidakaら ((1981), PNAS, 78:4354-4357)に開示されているように、ナフタレンスルホンアミドもカルモジュリンアンタゴニスト同様、細胞増殖を阻害することが知られており、抗腫瘍薬として有用である。さらに、米国特許第4,117,118号に開示されている環状ペプチドシクロスポリンA(Sandimmune(登録商標))もまた、リンパ細胞においてカルモジュリンが媒介する応答を阻害することにより働くと考えられる免疫抑制剤である。
【０６６３】
既存の多くのカルモジュリン阻害剤は、カルモジュリンを遮断するに十分な濃度で投与すると望ましくない生物学的作用を持つ。これらの望ましくない生物学的作用としては、例えばPolakら, ((1991), J. Neurosci. 11:534-542.)に記載のようなその他のタンパク質または受容体との非特異的結合が挙げられる。さらに、毒性などの負の副作用も起こり得る。具体例としてはシクロスポリンAに由来する有害な副作用がある。従って、カルモジュリン標的化合物、特に付加的な望ましない生物学的作用または副作用を有することなくカルモジュリンを阻害するカルモジュリンアンタゴニストの必要性がある。特に、カルモジュリン特異的阻害剤であり、かつ、有害な副作用を持たないものが必要である。
【０６６４】
さらに、本発明のCaMLP核酸およびポリペプチドは、身体のカルシウムホメオスタシスを崩す薬物など、他の医薬の投与による負の副作用を受けている被験者の治療のための化合物を同定するために用いることができる。医原的なカルシウム代謝不全に対処するにはこれらの組成物の同時投与が有用となろう。このような疾患としては、限定されるものではないが、臓器損傷、自己免疫疾患、精神病的疾患、腫瘍および医薬の投与後の、負の副作用など薬物誘導性の不全が挙げられる。例えば、臓器または組織移植は組織移植片(同種異系移植片)拒絶などの自己免疫疾患を招く可能性がある。
【０６６５】
アンタゴニストであるカルモジュリン標的化合物は免疫抑制剤として使用できることは周知である。さらに、上記のように、このような化合物は鎮静剤または抗精神病薬として広く使用されている。さらにまた、カルモジュリン(ならびにCaMLP)アンタゴニストはいくつかの悪性腫瘍、特に中枢神経系のものならびに肺腫瘍の治療に有用であるという証拠もある。カルモジュリンアンタゴニストの抗腫瘍活性、ならびにそれを用いた化学療法の成功が例えばScullerら Cancer Res., 50:1645-1649 (1990)およびHaitら Cancer Res., 50:6636-6640 (1990)(両者とも参照により本明細書に組み入れる)に記載されている。参照により本明細書に組み入れる米国特許第5,340,565号は、さらに化学療法薬または放射線治療の有効性を高める薬剤としてのカルモジュリンアンタゴニストまたは阻害剤の使用を記載している。特にそこでは、放射線療法、またはシスプラチン(Platinol)などの化学療法薬を用いた化学療法下にあるヒト患者において、カルモジュリン活性を阻害するカルモジュリン結合剤をさらに投与することにより腫瘍もしくは癌細胞を阻害する、または死滅させる方法が記載されている。
【０６６６】
また、細胞外カルモジュリンがTNFの放出を阻害し、かつ、エラスターゼの放出を促進することが分かっているが、このことからさらにCaMLP、CaMLP類似体およびCaMLP受容体アゴニストが炎症プロセスを調節するのに有用な薬剤であるという示唆が得られる。CaMLPアンタゴニストはCaMLP受容体アンタゴニストとCaMLP結合分子を含み、CaMLPと受容体との相互作用を遮断するために使用でき、よって、CaMLP、その類似体および受容体アゴニストから反対の作用が得られる。CaMLPは、原核生物(例えば細菌病原体)はCaMLPを含まないことから自己と非自己の認識を助けることにより自己決定的炎症の有効なモジュレーターとして働き得る。腫瘍壊死などのある状況では、細胞外CaMLPの放出は不適切な宿主応答および腫瘍細胞根絶のための免疫／炎症系の不全を招き得る。さらに、カルモジュリンおよびその他の物質によるTNF阻害についての患者の様々な状態を識別することができる診断試験が開発されている。この試験は有効な治療を決定するため、また、一方では細胞外CaMLP、CaMLP類似体またはCaMLP受容体アゴニスト、他方ではCaMLPアンタゴニストを用いた療法の効力を予測するために個々の患者をモニタリングする際に使用できる。また同様の用途でのエラスターゼに関する診断試験も開発されている。
【０６６７】
配列番号196のリゾチームCタンパク質(内部識別番号482181)および配列番号479の関連タンパク質
配列番号27および362のcDNAによってそれぞれコードされる配列番号196および配列番号479のポリペプチドは広く保存されているリゾチームC前駆体のファミリーに属す(全開示内容は参照により本明細書に組み入れられるPragerおよびJolles, Lysozymes: model enzymes in biochemistry and biology, ed. Jolles, 9-321 (1996), QasbaおよびKumar, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 32:255-306 (1997)))。配列番号196および479のタンパク質またはその一部は、おそらくはファミリー22のグリコシルヒドロラーゼとして、糖タンパク質および／またはペプチドグリカン代謝に役割を果たす。よって、本発明のタンパク質またはその一部は免疫および炎症応答に関与し、抗ウイルス作用、抗菌作用、抗炎症作用および／または抗ヒスタミン作用を有する。本発明の好ましいポリペプチドは配列番号196のアミノ酸19〜100位、または1〜100位のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドである。本発明のその他の好ましいポリペプチドは、本明細書に記載の生物学的活性のいずれかを有する配列番号196の断片である。本発明のタンパク質またはその一部の糖分解活性は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるGoldおよびSchweiger, M. Methods in Enzymology, Vol. XX, Part C pp. 537-542, Ed. Moldave, Academic Press,New YorkおよびLondon, 1971および米国特許第4,255,517号に記載のものをはじめ、当業者に公知のいずれのアッセイを用いてアッセイしてもよい。
【０６６８】
リゾチームはほとんどの体内分泌物中に見られる普遍的に存在するタンパク質であり、細菌のペプチドグリカンのN-アセチル-ムラミン酸のC-1とN-アセチルグルコサミンC-4の間のグリコシド結合を切断する1,4-β-N-アセチルムラミダーゼとして定義される。それらは抗ウイルス作用、抗菌作用、抗炎症作用および抗ヒスタミン作用などの種々の治療特性を有する。抗菌剤としてのリゾチームの活性はその直接的な細菌分解活性と多形核白血球およびマクロファージの食作用に関する刺激作用の双方を基にしていると思われる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるBiggarおよびSturgess, J. M. Infect Immunol. 16: 974-982 (1977); ThacoreおよびWillet, Am. Rev. Resp. Dis. 93: 786-790 (1966); KlockarsおよびRoberts, P. Acta Haematol 55: 289-292 (1976))。リゾチームは選択因子であるだけでなく、口腔の微生物に対して有効な作用であることが分かっている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるIacono et al, J. J. Infect. Immunol. 29: 623-632 (1980))。また、リゾチームは病原細胞を溶解する補体または抗体などのその他のタンパク質と相乗的に作用することにより病原体を死滅させることもできる。リゾチームはまた多形核白血球の走化性を阻害し、感染後の酸素のフリーラジカルの生成を制限する。これは炎症の程度を抑えると同時にこれらの細胞による食作用を増強する。その他仮定されるリゾチームの機能としては免疫刺激(Jolles, P. Biomedicine 25: 275-276 (1976) Ossermann, E. F. Adv. Pathobiol 4: 98-102 (1976))および腫瘍転換についての宿主膜の免疫学的また非免疫学的モニタリング(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるJolles, P. Biomedicine 25: 275-276 (1976); Ossermann, E. F. Adv. Pathobiol 4: 98-102 (1976))が挙げられる。このようにリゾチームは広い適用範囲で使用することができる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,618,712号参照)。血清および／または尿由来のリゾチームの判定は、種々の疾患の診断またはそれらの進展の指標として用いられる。急性リンパ球芽性白血病ではリゾチームの血清レベルは著しく低下しているが、慢性骨髄性白血病および急性単芽球性および骨髄単球性白血病では血清のリゾチーム濃度は著しく上昇している。治療上有効なリゾチームの使用は種々の細菌およびウイルス感染(帯状疱疹(Zona, Herpes zoster))、大腸炎、種々のタイプの痛み、アレルギー、炎症および小児科(リゾチームの添加による牛乳の乳児に適した形態への変換)の治療に可能性がある。
【０６６９】
本発明は1またはいくつかの基質を加水分解するための本発明のタンパク質またはその一部を単独で、または他の物質、好ましくは限定されるものではないが、免疫グロブリン、ラクトフェリン、ベータリジン、フィブロネクチンおよび補体成分をはじめとする抗ウイルス、抗真菌および／または抗菌物質と組み合わせて用いる方法および組成物に関する。このような基質としてはグリコシル化化合物、好ましくはβ-1-4-グリコシド結合を含むもの、より好ましくはn-アセチルムラミン酸とn-アセチルグルコサミンの間にβ-1-4-グリコシド結合を含むものが挙げられる。例えば、本発明のタンパク質またはその一部を加水分解が可能な条件で基質を含有するサンプルに加え、その基質の加水分解を触媒させる。ある好ましい実施形態では、この加水分解は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるGoldおよびSchweiger上記および米国特許第5,871,477号および同第4,255,517号に記載のものなどの標準的なアッセイを用いて行う。ある好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部は目的の組換えDNA、組換えタンパク質またはその双方を回収するために、例えば全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるSambrookら, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)に記載のアッセイのいずれかを用いて組換え細菌を溶解させるために用いることができる。
【０６７０】
ある実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部は、水性サンプル中、または材料、好ましくはガラスおよびプラスチック上で、混入基質、好ましくは細菌、真菌またはウイルス起源の外因性基質を加水分解するために用いることができる。特に本発明のタンパク質またはその一部は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,069,717号、同第4,355,022号および同第5,001,062号に記載のいずれかの方法および組成物を用いて歯の洗浄、水系の保護、または医療用の材料の調製において殺菌剤として用いることができる。ある好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,020,015号に記載のように、牛乳を乳児により好適な形態に変換する乳児用配合物において宿主耐性因子として使用される。もう1つの好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部は食品保存料として用いることができる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるHayashiら, Agric. Biol. Chem. (European Edition of Japanese Journal of Agriculture, BiochemistryおよびChemistry), Vol. 53, pp. 3173-3177, 1989参照)。さらに、本発明のタンパク質またはその一部は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,994,107号に記載の方法を用いて食品および化粧品工業用途のキサンタンガム発酵液を明澄化するために用いることができる。もう1つの好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部を含んでなる組成物を他の抗菌物質、好ましくは抗生物質または全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,458,876号および同第5,041,326号に記載のものなどの加水分解酵素との「カクテル」としてサンプルまたは材料に加え、サンプルのコンタミネーションをなくす。例えば、本発明のタンパク質またはその一部は、抗生物質の代わりに、あるいは抗生物質と組み合わせて細胞培養に用いることができる。加水分解酵素のカクテルを用いることの利点は、いかなる酵素にも特異性を有していることが知られていない広範な基質を加水分解できることである。また、加水分解酵素のカクテルを用いると、将来的にの多数のソースに由来する広範な未知の混入物からサンプルまたは材料を保護できる。例えば、本発明のタンパク質またはその一部を、基質、好ましくは細菌、真菌またはウイルス起源の外因性基質の混入が望ましくないサンプルにこれらの基質の加水分解を促進するに十分な量で加える。あるいは、本発明のタンパク質またはその一部を、当技術分野で周知の技術を用いて単独で、またはその他の加水分解酵素と組み合わせてクロマトグラフィー支持体に結合させてアフィニティークロマトグラフィーカラムを作製してもよい。望ましくない基質を含有するサンプルをこのカラムに流し、その基質を除去する。本発明のタンパク質またはその一部を支持体へ固定化することは特にこの方法を商業規模で実施する実施形態に有利である。この固定化により生成物のバッチからの酵素の除去およびその後の酵素の洗浄が容易となる。本発明のタンパク質またはその一部の固定化は、例えばタンパク質中にセルロース結合ドメインを挿入することによって達成することができる。当業者ならばその他の固定化方法も使用でき、入手可能な文献に記載されていることが分かるであろう。あるいは、同じ方法を用いて新たな基質を同定してもよい。
【０６７１】
さらにまた、本発明のタンパク質またはその一部は体液、食品、水、空気、溶液などにおける所定の基質を同定または定量するために有利であり得る。ある好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部は、細菌、真菌、植物、酵母、ウイルスまたは哺乳類細胞培養物の他、血液、リンパ液、唾液またはその他の組織サンプルをはじめとする体液中の外因性基質の同定および定量のためのアッセイおよび診断キットで用いられる。ある好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,935,804号に記載の試薬およびアッセイを用いて真性細菌を検出、同定および／または定量するために用いられる。要するに、本発明のタンパク質またはその一部は、変異体酵素、組換え酵素、または化学的不活性化酵素を製造するものをはじめ、当業者に公知のいずれかの方法を用いて、触媒的に不活性化され、すなわち、真性細菌においてNAc-ムラミン酸を含んでなるペプチドグリカンと結合できるが切断しない。次に本発明のこの触媒不活性タンパク質を、不活性酵素とペプチドグルカン基質との結合に好適な条件下で生物学的サンプルのアリコートとともにインキュベートする。次に、結合した酵素を、生物学的サンプル中の真性細胞の存在または量を評価するために検出する。
【０６７２】
もう1つの実施形態では、本発明の核酸またはその一部は、細菌、真菌および／またはウイルス感染に対する植物の病害耐性を増強するために用いることができる。本発明の核酸またはその一部を含有するポリヌクレオチドを、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,349,122号および同第5,850,025号に開示されているものをはじめ、当業者に公知のいずれかの方法を用い、トランスジェニックタンパク質の正確な発現を可能とする条件で植物ゲノムに導入する。
【０６７３】
もう1つの好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部は、限定されるものではないが、連鎖球菌(Streptococcus)、ベイヨネラ・アルカレッセンス(Veillonella alcalescens)、放線菌(Actinomyces)、単純ヘルペス(Herpes simplex)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、ミクロコッカス・リソデイクチカス(Micrococcus lysodeikticus)およびHIVをはじめとする種々の病原体によって引き起こされるヒトまたは動物の細菌、真菌およびウイルス感染を、このような微生物に含まれるグリコシル化化合物を加水分解することにより治療および／または予防するのに有用であり得る。さらなる好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部は、新生児または高齢者患者またはHIV感染患者などの完全に機能する免疫系を欠いた、あるいは嚢胞性繊維症などの呼吸管、あるいは潰瘍性大腸炎またはスプルーなどの胃腸管を侵す疾患を患う免疫無防備患者における細菌、真菌およびウイルス感染を予防および／または治療するのに用いる。
【０６７４】
さらにもう1つの実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,468,635号に教示される技術および方法を用いた、in vitro細胞培養、好ましくはT細胞およびT細胞株培養の、増殖因子として用いることができる。
【０６７５】
さらに、本発明のタンパク質またはその一部は、機械的および臨床的適用のための阻害剤を同定するために用いることもできる。次にこのような阻害剤は、サンプル中の本発明のタンパク質を同定または定量するため、また、限定されるものではないが、アミロイドーシス、大腸炎、リソソーム病、アレルギーおよび白血病をはじめとする炎症および免疫疾患をはじめ、患者の加水分解活性、免疫刺激活性および／または炎症活性が望ましくない、かつ／または有害であるいずれもの疾患を診断、治療または予防するために用いることができる。本発明のタンパク質はまた、宿主細胞膜の腫瘍転換に関するモニタリングのために用いることもできる。
【０６７６】
本願において記載される配列番号27および362のポリヌクレオチド、ならびに配列番号196および479のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン482181のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０６７７】
配列番号176のアンギオゲニンタンパク質(内部識別番号114180)および配列番号461の関連タンパク質
それぞれcDNA 配列番号7および配列番号344によりコードされる配列番号176および配列番号461のポリペプチドは膵臓リボヌクレアーゼファミリーに属するリボヌクレアーゼである(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるBeintema, (1998) Cell. Mol. Life Sci. 54:763-5; BeintemaおよびKleineidam, (1998) Cell. Mol. Life Sci. 54:825-32の総説を参照)。本願において記載される配列番号7および配列番号344のポリヌクレオチド、ならびに配列番号176および配列番号461のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン114180のヒトcDNAおよびそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。さらにまた、本発明のタンパク質はアンギオゲニン変異体タンパク質として血管形成の一役を果たす(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるBadet, (1999) Pathol. Biol. 74:345-51の総説を参照)。本発明の好ましいポリペプチドは、配列番号176の19〜75位、26〜75位、または63〜69位のアミノ酸を含んでなるポリペプチドである。本発明のその他の好ましいポリペプチドとしては、本明細書に記載の生物学的活性のいずれかを有する配列番号176の断片がある。本発明のタンパク質またはその一部のリボヌクレアーゼ活性は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,866,119号に記載のものをはじめ、当業者に公知のアッセイのいずれを用いてアッセイしてもよい。発明のタンパク質またはその一部の血管形成活性は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるFettら (1985) Biochem. 24, 5480-5486によって記載されているものをはじめ、当業者に公知のいずれのアッセイを用いてアッセイしてもよい。
【０６７８】
リボヌクレアーゼはRNA鎖のホスホジエステル結合の加水分解を触媒するタンパク質である。膵臓リボヌクレアーゼは哺乳類分類群の多くおよび数種の爬虫類の膵臓に多量に存在するピリミジン特異的リボヌクレアーゼである。RNAの加水分解におけるそれらの機能の他、リボヌクレアーゼはその他の種々の生理活性を助けるべく進化してきた。このような活性としては、抗寄生虫、抗菌、抗ウイルス、抗新生物活性、神経毒性および血管形成が挙げられる。例えば、ウシ精液リボヌクレアーゼは抗新生物性である(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるLaceettiら (1992) Cancer Res. 52: 4582-4586)。いくつかのカエルリボヌクレアーゼは抗ウイルス活性と抗新生物活性の両者を示す(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるYouleら (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 6012-6016; Mikulskiら (1990) J. Natl. Cancer Inst. 82: 151-152;およびWuら (1993) J. Biol. Chem. 268: 10686-10693)。好酸球由来神経毒(EDN)および好酸球陽イオンタンパク質(ECP)は神経毒性を有する関連のリボヌクレアーゼである(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるBeintemaら. (1988) Biochemistry 27: 4530-4538; Ackerman, (1993) In Makino,およびFukuda, Eosinophils: BiologicalおよびClinical Aspects. CRC Press, Boca Raton, Fla., pp 33-74)。さらに、ECPは細胞傷害活性、抗寄生虫活性および抗菌活性を示す。RNアーゼk6と呼ばれるEDN関連リボヌクレアーゼは正常ヒト単球および好中球で発現することが示されており、宿主防御におけるこのリボヌクレアーゼに関する役割を示唆している(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるRosenbergおよびDyer, (1996) Nuc. Acid. Res. 24: 3507-3513)。
【０６７９】
アンギオゲニンはエンドサイトーシスのため内皮細胞表面上のタンパク質パートナーと結合するtRNA特異的リボヌクレアーゼである。アンギオゲニンの可能性のあるパートナーとしては、ヘパリン、プラスミノーゲン、エラスターゼ、アンギオスタチン、アクチン、および内皮細胞の表面上の170kDa受容体が挙げられる(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるStrydom, (1998) Cell. Mol. Life Sci. 54, 811-824)。エンドサイトーシスされたアンギオゲニンは核に輸送され、そこで血管の形成に必要な内皮侵入を促進する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるMoroianu,およびRiordan, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 1217-1221)。
【０６８０】
最初、ヒト結腸癌細胞馴化培地から単離され(Fettら (1985), 前述)、次いで、その他数種の組織学的タイプのヒト腫瘍によっても産生されることが示されているが(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるRybakら (1987) Biochem. Biophys. Res, Commun. 146, 1240-1248; Olsonら, (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 442-446)、アンギオゲニンはまたヒト血漿の構成要素でもあり、通常250〜360ng/mlの濃度で循環している(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるShimoyamaら (1996) Cancer Res. 56, 2703-2706; Blaserら (1993) Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 31, 513-516)。また、再発胃癌患者が原発性胃癌患者よりもアンギオゲニンの血漿濃度がはるかに高いことも示されている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるShimoyamaおよびKaminishi, (2000) J. Cancer Res. Clin. Oncol. 126, 468-474)。
【０６８１】
アンギオゲニンは血管形成の可能性のあるインデューサーである(Fettら上記)。血管形成は、(i)血管形成刺激の作用による内皮細胞の活性化、(ii)活性化された内皮細胞の周辺組織への接着および浸潤、ならびに血管形成刺激の源への移動、そして(iii)新しい微小血管を形成するための内皮細胞の増殖と分化、を含む細胞レベルおよび生化学レベルでの独立ではなるが内部連関している数工程からなる血管を形成する複雑なプロセスである(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるFolkmanおよびShing, (1992) J. Biol. Chem. 267, 10931-10934; MoscatelliおよびRifkin, (1988) Biochim. Biophys. Acta 948, 67-85)。血管形成は通常の生理条件下では厳格に制御されたプロセスであるが、異常な血管形成は、関節炎、糖尿病性網膜炎および腫瘍増殖などの病態においてひどい結果をもたらし得る。今では、事実上全ての固形腫瘍の増殖が血管形成に依存しているということが、完全に確信されている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるFolkman, (1989) J. Natl. Cancer Inst. 82, 4-6)。血管形成はまた、もとの原発腫瘍から腫瘍細胞を伝播して離れた部位に定着する手段となることから転移の発症の不可欠なものである(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるMahadevanおよびHart, (1990) Rev. Oncol. 3, 97-103; Blood,およびZetter (1990) Biochim. Biophys. Acta 1032, 89-118)。従って、腫瘍誘導型の血管形成のプロセスの妨害は、原発癌および転移癌のいずれに対しても有効な療法となり得る。実際、いくつかの抗血管形成剤が製造されており、現在、臨床試験段階にある。
【０６８２】
本発明は、1または数種の基質、好ましくは核酸、より好ましくはRNAを加水分解するために本発明のタンパク質またはその一部を単独または他の物質と組み合わせて用いる方法および組成物に関する。例えば、本発明のタンパク質またはその一部は基質を含有するサンプルに、加水分解を可能とし、基質の加水分解を触媒し得る条件で加える。全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,866,119号に記載されているような加水分解条件が使用できる。
【０６８３】
ある好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部は、生物学的サンプル中に混入するRNAを除去するために、単独で、または他のヌクレアーゼと組み合わせて用いることができる。より好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部は、混入RNAからDNA調製物を精製するため、第2鎖の合成前およびin vitro転写産物の解析前にRNA鋳型を除去するために用いることができる。本発明のタンパク質またはその一部を含んでなる組成物は他のヌクレアーゼとともに「カクテル」として生物学的サンプルに加える。加水分解酵素のカクテルを用いることの利点は酵素の特異性が知られていない広範な基質を加水分解できることである。このようなヌクレアーゼカクテルは分子生物学的アッセイで、例えばRNアーゼ保護アッセイにおいて結合していないRNAを除去するためによく用いられる。また、加水分解酵素のカクテルをを用いると、将来の多数のソースからの広範な未知のRNA混入物からサンプルを保護できる。例えば本発明のタンパク質またはその一部を、混入基質が望ましくないサンプルに加える。あるいは、本発明のタンパク質またはその一部を、当技術分野で周知の技術を用いて単独またはその他の加水分解酵素と組み合わせてクロマトグラフィー支持体に結合させてアフィニティークロマトグラフィーカラムを作製してもよい。望ましくない基質を含有するサンプルをこのカラムに流し、その基質を除去する。本発明のタンパク質またはその一部を支持体へ固定化することは特にこの方法を商業規模で実施する実施形態に有利である。この固定化により生成物のバッチからの酵素の除去およびその後の酵素の洗浄が容易となる。本発明のタンパク質またはその一部の固定化は例えばタンパク質中にセルロース結合ドメインを挿入することによって達成することができる。当業者ならばその他の固定化方法も使用でき、入手可能な文献に記載されていることが分かるであろう。あるいは、同じ方法を用いて新たな基質を同定してもよい。
【０６８４】
もう1つの実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部は、Youleら(1994)上記; Mikulskiら(1990)上記, Wuら(1993)上記に記載されているものをはじめ、当業者に公知の方法のいずれかを用いて望ましくない寄生虫、細菌および／またはウイルスに感染したサンプルを除コンタミネーションまたは殺菌するために用いることができる。
【０６８５】
もう1つの実施形態では、本発明は細胞を選択的に死滅させるための、本発明のタンパク質またはその一部を用いる組成物および方法に関する。本発明のタンパク質またはその一部はレクチン、受容体または抗体など、選択された細胞に結合し得る認識部分に結合させ、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,955,073号に記載の方法および技術を用いて細胞傷害性試薬を作製する。
【０６８６】
さらにもう1つの実施形態では、本発明はin vitroおよびin vivoの双方で細胞増殖、特に内皮細胞の増殖を刺激するために本発明のタンパク質またはその一部を用いる組成物および方法に関する。例えば、可溶型の本発明のタンパク質またはその一部を細胞増殖を刺激するに有効な量で細胞培養培地に加えることができる。
【０６８７】
さらにもう1つの実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部は、腫瘍増殖、関節炎または糖尿病性網膜炎などの過剰な血管形成に関連する疾患の診断、予防および／または治療において用いることができる。
【０６８８】
ある好ましい実施形態では、本発明のタンパク質は、上述のように、体循環中のアンギオゲニンが正常者では腫瘍を有する患者よりも低いこと、また、再発腫瘍を有する患者に比べ原発癌を有する患者では低いことに基づき、ある被験者の腫瘍発生リスクを評価するため、腫瘍再発のリスクを評価するため、または癌の侵襲性の程度を評価するために診断マーカーとして用いることができる。従って、配列番号176のタンパク質または配列番号7のポリヌクレオチドようなタンパク質をコードするmRNAの異常なレベルを検出し、それにより腫瘍発生または腫瘍再発のリスクのある被験者を特定するために定量的免疫アッセイを用いることができる。本発明のタンパク質の異常なレベルの検出は本願の他所に記載されているものをはじめ、当業者に公知のいずれかの技術を用いて行うことができる。例えば、本発明のタンパク質またはその断片の有無をスクリーニングする通常の免疫アッセイでは本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体またはそのフラグメントが使用できる。あるいは、そのタンパク質の発現を検出および／または定量するためのハイブリダイゼーションアッセイでは本発明のタンパク質をコードする核酸またはその断片が使用できる。
【０６８９】
本発明のもう1つの態様は、配列番号276の生物学的活性または発現を阻害または低下させる分子を提供する。このような分子は血管新生、特に腫瘍の血管新生を妨げ、それにより腫瘍の増殖を制限するために患者に投与することができる。このようなアンタゴニストおよび／または阻害剤は本発明のタンパク質に特異的な抗体であってよく、これはアンタゴニストとして直接用いてもよいし、あるいは本発明のタンパク質を発現する細胞または組織へ薬剤を運ぶターゲッティングまたは送達機構として間接的に用いてもよい。治療用としては中和抗体(すなわち、タンパク質-タンパク質相互作用を阻害するもの)が特に好ましい。あるいは、このような分子は、本発明のタンパク質のパートナーと結合することができ、パートナーに関しては競合するが、その生物学的活性のいずれもを誘発することのない本発明のタンパク質の変異型または末端切断型であってもよい。本発明のタンパク質の発現を阻害するその他の方法としては、本明細書に記載のようなアンチセンスおよび三重らせんが挙げられる。本発明のタンパク質のその他のアンタゴニストまたは阻害剤は、本発明のタンパク質と特異的に結合するものを同定するための薬剤ライブラリーのスクリーニングをはじめ、当技術分野で一般に知られている方法を用いて製造することができる。本発明のタンパク質またはその一部、好ましくはその機能的または免疫原性断片、またはそれに関連するオリゴペプチドは、本明細書に記載のものをはじめ種々の薬物スクリーニング技術のいずれかで化合物ライブラリーをスクリーニングするために使用できる。
【０６９０】
配列番号181のプロテアーゼ阻害タンパク質(内部識別番号1000771934)および配列番号466の関連タンパク質
延長cDNA配列番号12および349によってコードされる配列番号181および466のタンパク質各々がWAPタイプのジスルフィドコアファミリーに属するプロテアーゼ阻害剤である。本願において記載される配列番号12および349のポリヌクレオチド、ならびに配列番号181および466のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン1000771934のヒトcDNAクローン、ならびにそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。本発明の好ましいポリペプチドは配列番号181の32〜73、49〜62、76〜122、97〜110またはそのいずれかの組合せのアミノ酸断片を含んでなるポリペプチドである。本発明のその他の好ましいポリペプチドは本明細書に記載の生物学的活性のいずれかを有する配列番号181の断片である。本発明のタンパク質またはその一部のプロテアーゼ阻害活性は当業者に公知のいずれかの技術を用いて評価することができる。本発明のタンパク質の可能性ある基質としては、限定されるものではないが、トリプシン、キモトリプシン、ロイコプロテイナーゼ、エラスターゼ、ズブチリシン、IV型コラゲナーゼおよびその他のセリンプロテアーゼが挙げられる。
【０６９１】
タンパク質を切断するプロテアーゼは主として、食品加工、醸造、およびアルコール製造関連産業で使用されている。プロテアーゼは洗濯洗剤およびその他の製品の重要な要素である。生物学的研究の範囲では、プロテアーゼは望まれないタンパク質を分解する精製ステップで使用される。多くの場合、低特異性のプロテアーゼまたはより特異性の高いプロテアーゼ混合物を使用して必要な分解度を得ることが望ましい。
【０６９２】
また、プロテアーゼは血液凝固および消化をはじめとする広範な生物学的経路の重要な要素でもある。例えば、プロテアーゼの不在または不全によって病的状態が起こり得、置換または強化療法による治療の可能性がある。かかる療法としては、凝固因子VIII、IX、およびVIIaによる血友病の治療が挙げられる。もう1つの適用法では、タンパク質分解酵素組織プラスミノゲンアクチベーター(t-PA)を使用して体内の血栓溶解機構を活性化することにより心筋梗塞によってもたらされた病的状態を緩和する。プロテアーゼトロンビンは、外科手術時にフィブリノーゲン系組織接着剤のクロッティングを開始させるのに使用される。好中球は数種の抗菌性セリンプロテアーゼを生成する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるGabay, Ciba Found. Symp. 186:237-247, 1994; Scocchiら, Eur. J. Biochem. 209:589-595, 1992)。また、プロテアーゼは同種の受容体のタンパク質分解による活性化によって受容体媒介性経路を介する細胞プロセスを制御する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるVuら, Cell 64:1057-1068, 1991; Blackhartら, J. Biol. Chem. 271:16466-16471, 1996)。
また、プロテアーゼの過剰生成または制御不全は病理学的な結果をもたらす可能性がある。異質粒子の存在に対して肺内で放出されるエラスターゼは、その活性が厳密に制御されないと肺組織に損傷を与える可能性がある。喫煙者の気腫は、エラスターゼとその阻害剤、α-1-アンチトリプシンとの間の不均衡が原因であると考えられている。この均衡は外因性α-1-アンチトリプシンの投与によって回復することができる。
【０６９３】
さらに、プロテアーゼ阻害剤が抗生物質耐性株をはじめとするA群連鎖球菌(streptococci)株などのヒト病原菌といった微生物の増殖を阻害することが分かってきた(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるMerigan, T. ら (1996) Ann Intern Med 124:1039-1050; Stoka, V. (1995) FEBS. Lett 370:101-104; Vonderfecht, S. ら (1988) J Clin Invest 82:2011-2016; Collins, A. ら (1991) Antimicrob Agents Chemother 35:2444-2446)。
【０６９４】
産業、研究、および医薬におけるプロテアーゼの拡大する用途において、当技術分野では新規酵素および新規酵素阻害剤に対する必要性が常に存在する。本発明はこの必要性に取り組んだものである。
【０６９５】
本発明はin vitroまたはin vivoのいずれにおいてもプロテアーゼを阻害するために本発明のタンパク質またはその一部を用いた組成物および方法に関する。プロテアーゼは事実上すべての生物の数多くの生物学的プロセスの制御において重要な役割を果たし、さらに疾病においても主要な役割を果たすことから、プロテアーゼの阻害剤が多種多様の用途に有用である。
【０６９６】
ある実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部は生物学的サンプル内の所定のプロテアーゼの量を定量するのに有用であり、それゆえ、体液またはその他の組織サンプル、ならびに細菌、真菌、植物、酵母、ウイルスまたは哺乳類細胞培養物内のプロテアーゼの定量を目的とするアッセイおよび診断キットに使用することができる。好ましい実施形態では、サンプルを標準プロテアーゼ基質を用いてアッセイする。既知濃度のプロテアーゼ阻害剤を添加して存在する特定のプロテアーゼと結合させる。次いで、プロテアーゼアッセイを再度実施し、当業者に周知の技術を用いて活性の喪失をプロテアーゼ阻害活性と相関させる。
【０６９７】
さらに、本発明のタンパク質またはその一部を使用してサンプル内に混在しているプロテアーゼを除去、同定または阻害してもよい。本発明のポリペプチドを含んでなる組成物はその他のプロテアーゼ阻害剤との「カクテル」として生物学的サンプルに添加してタンパク質サンプルの分解を防いでもよい。プロテアーゼ阻害剤カクテルを使用する利点はプロテアーゼの特異性が知られていない広範なプロテアーゼを阻害できることである。また、プロテアーゼ阻害剤カクテルを用いると、将来の多数のソースからのタンパク質サンプルを汚染するであろう広範な将来的未知のプロテアーゼからタンパク質サンプルが保護される。例えば、本発明のタンパク質またはその一部を、混在するプロテアーゼによるタンパク質分解が望ましくないサンプルに添加する。かかるプロテアーゼ阻害剤カクテル(例えば、Sigmaより販売される調合済カクテルを参照)を研究室アッセイにおいて幅広く使用してアッセイを実施しようとする目的タンパク質の分解が可能なプロテアーゼを阻害する。あるいは、本発明のタンパク質またはその一部を単独で、またはその他のプロテアーゼ阻害剤と組み合わせて、当技術分野では周知の技術を用いてクロマトグラフィー担体に結合させ、アフィニティークロマトグラフィーカラムを作製してもよい。望ましくないプロテアーゼを含有するサンプルをカラムに流してプロテアーゼを除去する。あるいは、同じ方法を用いて新規プロテアーゼを同定してもよい。
【０６９８】
好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部を使用して、限定されるものではないが、関節炎、筋ジストロフィー、炎症、腫瘍浸潤、糸球体腎炎、寄生虫媒介性感染、アルツハイマー病、歯周病、および癌転移といった組織破壊を特徴とする疾病などの細胞タンパク質分解が起こる数多くの疾病に関与するとされるプロテアーゼを阻害し得る。
【０６９９】
もう1つの好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部がin vivoおよびin vitroのいずれにおいても、限定されるものではないが、歯肉炎、マラリア、リーシュマニア症、フィラリア症、骨粗鬆症および骨関節炎、ならびにその他の細菌、および寄生虫媒介性またはウイルス感染といった数多くの感染病に関与するとされる外因性プロテアーゼを阻害するのに有用であり得る。特に、本発明のタンパク質またはその一部には一次ポリペプチド前駆体のタンパク質分解がウイルスの複製に不可欠であるHIVおよびHCVなどのウイルス病における用途が与えられよう。
【０７００】
もう1つの実施形態では、本発明のプロテアーゼ阻害剤を抗菌剤として使用してin vitroまたはin vivoのいずれかで特定の細菌の増殖を遅延または阻害し得る。特に、本発明のポリペプチドを使用して外科用器具、実験室のガラス器具およびプラスチック器具などの非生物材料での、さらには、生存している植物、真菌、および動物細胞の培養下でのA群連鎖球菌の増殖が阻害される。
【０７０１】
さらに、本発明のプロテアーゼ阻害剤には相乗効果的な適用において用途が見出せる。例えば、抗生物質または抗癌剤などの治療薬を内因性プロテアーゼによるタンパク質分解を通じて不活性化し、それによって投与された薬剤の効果を下げるまたは不活性にすることが可能である。従って、本発明のプロテアーゼ阻害剤を治療薬とともに患者に投与して薬剤の活性を増強または高めてもよい。この併用投与はプロテアーゼ阻害剤と薬剤との混合物などの同時投与、または個別に同時もしくは連続投与によって行うことができる。
【０７０２】
配列番号179のセルピンタンパク質(内部識別番号784093)および配列番号464の関連タンパク質
延長cDNA配列番号10および347によってコードされる配列番号179および464のタンパク質各々がセリンプロテアーゼ阻害剤である。本願において記載される配列番号10および347のポリヌクレオチド、ならびに配列番号179および464のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン784093のヒトcDNAクローン、ならびにそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。本発明の好ましいポリペプチドは配列番号179の47〜139位のアミノ酸断片を含んでなるポリペプチドである。本発明のその他の好ましいポリペプチドは本明細書に記載の生物学的活性のいずれかを有する配列番号179の断片である。本発明のタンパク質またはその一部のプロテアーゼ阻害活性は米国特許第5,955,284号に開示されたものをはじめとする当業者に公知のいずれかの技術を用いて評価することができる。本発明のタンパク質の可能性ある基質としては、限定されるものではないが、エラスターゼ、トリプシン、キモトリプシン、トロンビンIII、プラスミン、ヘパリン、補体II、プラスミノゲンアクチベーター、プロテインC、インターロイキン-1B変換酵素、好ましくはトリプシン、エラスターゼ、およびキモトリプシンなどのセリンプロテアーゼが挙げられる。
【０７０３】
プロテアーゼは血液凝固および消化をはじめとする広範な生物学的経路の重要な要素でもある。例えば、プロテアーゼの不在または不全によって病的状態が起こり得、置換または増強療法による治療の可能性がある。かかる療法としては、凝固因子VIII、IX、およびVIIaによる血友病の治療が挙げられる。もう1つの適用法では、タンパク質分解酵素組織プラスミノゲンアクチベーター(t-PA)を使用して体内の血栓溶解機構を活性化することにより心筋梗塞によってもたらされた病的状態を緩和する。プロテアーゼトロンビンは外科手術時にフィブリノーゲン系組織接着剤の凝固を開始させるのに使用される。好中球は数種の抗菌性セリンプロテアーゼを生成する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるGabay, Ciba Found. Symp. 186:237-247, 1994; Scocchiら, Eur. J. Biochem. 209:589-595, 1992)。また、プロテアーゼは同種の受容体のタンパク質分解による活性化によって受容体媒介性経路を介する細胞プロセスを制御する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるVuら, Cell 64:1057-1068, 1991; Blackhartら, J. Biol. Chem. 271:16466-16471, 1996)。
【０７０４】
また、プロテアーゼの過剰生成または制御不全は病理学的な結果をもたらす可能性がある。異質粒子の存在に対して肺内で放出されるエラスターゼは、その活性が厳密に制御されないと肺組織に損傷を与える可能性がある。喫煙者の気腫はエラスターゼとその阻害剤、α-1-アンチトリプシンとの間の不均衡が原因であると考えられている。この均衡は外因性α-1-アンチトリプシンの投与によって取り戻すことができる。
【０７０５】
セリンプロテアーゼ(SP)は消化酵素、トリプシンおよびキモトリプシン、補体カスケードおよび血液凝固カスケードの要素、ならびに細胞外マトリックスの巨大分子の分解およびターンオーバーを制御する酵素を含むタンパク質分解酵素の大型ファミリーである。SPはタンパク質切断の活性触媒部位にセリン残基が存在することからこのように名づけられている。これらはセリン、ヒスチジン、およびアスパラギン酸残基からなる触媒三残基を特徴とする。SPは広範な基質特異性を有しており、これらの特異性に基づいてサブファミリーに細分類できる。主要なサブファミリーがトリパーゼ(アルギニンまたはリジンの後ろで切断)、アスパーゼ(アスパラギン酸の後ろで切断)、キナーゼ(フェニルアラニンまたはロイシンの後ろで切断)、メターゼ(メチオニンの後ろで切断)、およびセラーゼ(セリンの後ろで切断)である。
【０７０６】
セリンプロテアーゼは多種多様な産業用途に使用される。例えば、セリンプロテアーゼズブチリシンは洗濯洗剤に使用されてタンパク質性の汚れの除去に役立っている(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるCrabb, ACS Symposium Series 460:82-94, 1991)。食品加工産業では、セリンプロテアーゼが魚類および家畜類からのタンパク質富化濃縮物の製造、ならびに乳製品の製造に使用されている(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるKidaら, Journal of Fermentation and Bioengineering 80:478-484, 1995; HaardおよびSimpson, in Martin, A. M., ed., Fisheries Processing: Biotechnological Applications, ChapmanおよびHall, London, 1994, 132-154; Bosら、欧州特許庁公報494 149 A1)。
【０７０７】
セルピンは基本的には細胞外にある不可逆性セリンプロテアーゼ阻害剤である。セルピンファミリーに属するタンパク質としては、以下のものが挙げられる: α-1プロテアーゼ阻害剤、α-1-アンチキモトリプシン、アンチトロンビンIII、α-2-アンチプラスミン、ヘパリン補助因子II、補体C1阻害剤、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤1および2、グリア由来ネキシン、プロテインC阻害剤、ラット肝細胞阻害剤、crmA(インターロイキン1-β切断酵素を阻害するウイルスセルピン)、腫瘍細胞に対する宿主免疫応答を調節し得るヒト扁平上皮細胞癌抗原、腫瘍サプレッサーとして作用すると思われるヒトマスピン、レピドプテラン(lepidopteran)プロテアーゼ阻害剤、白血球エラスターゼ阻害剤(唯一既知の細胞内セルピン)、ならびに3種類のオルトポックスウイルス属の生産物(これらの生産物は哺乳類宿主における血液凝固カスケードおよび／または補体カスケードの制御に関与すると考えられる)。
【０７０８】
産業、研究、および医薬におけるプロテアーゼの拡大する用途において、当技術分野では新規酵素および新規酵素阻害剤に対する必要性が常に存在する。本発明はこの必要性に取り組んだものである。
【０７０９】
ある実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部は生物学的サンプル内の所定のプロテアーゼの量を定量するのに有用であり、それゆえ、体液またはその他の組織サンプル、ならびに細菌、真菌、植物、酵母、ウイルスまたは哺乳類細胞培養物内のプロテアーゼの定量を目的とするアッセイおよび診断キットに使用することができる。好ましい実施形態では、サンプルを標準プロテアーゼ基質を用いてアッセイする。既知濃度のプロテアーゼ阻害剤を添加して存在する特定のプロテアーゼと結合させる。次いで、プロテアーゼアッセイを再度実施し、当業者に周知の技術を用いて活性の喪失をプロテアーゼ阻害活性と相関させる。この実施形態において好ましいプロテアーゼはセリンプロテアーゼ、より好ましくはエラスターゼ、トリプシンおよびキモトリプシンである。
【０７１０】
さらに、本発明のタンパク質またはその一部を使用してサンプル内に混在しているプロテアーゼを除去、同定または阻害してもよい。本発明のポリペプチドを含んでなる組成物はその他のプロテアーゼ阻害剤との「カクテル」として生物学的サンプルに添加してタンパク質サンプルの分解を防いでもよい。プロテアーゼ阻害剤カクテルを用いることの利点は特異性が不明の広範なプロテアーゼを阻害できることである。また、プロテアーゼ阻害剤カクテルの使用によって莫大な数の起源由来のタンパク質サンプルを汚染するであろう広範な将来的未知のプロテアーゼからタンパク質サンプルが保護される。例えば、本発明のタンパク質またはその一部を、混在するプロテアーゼによるタンパク質分解が望ましくないサンプルに添加する。かかるプロテアーゼ阻害剤カクテル(例えば、Sigmaより販売される調合済カクテルを参照)を研究室アッセイにおいて幅広く使用してアッセイを実施しようとする目的タンパク質の分解が可能なプロテアーゼを阻害する。あるいは、本発明のタンパク質またはその一部を単独で、またはその他のプロテアーゼ阻害剤と組み合わせて、当技術分野では周知の技術を用いてクロマトグラフィー担体に結合させ、アフィニティークロマトグラフィーカラムを作製してもよい。望ましくないプロテアーゼを含有するサンプルをカラムに流してプロテアーゼを除去する。あるいは、同じ方法を用いて新規プロテアーゼを同定してもよい。
【０７１１】
好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部を使用して、限定されるものではないが、関節炎、筋ジストロフィー、炎症、腫瘍浸潤、糸球体腎炎、寄生虫媒介性感染、アルツハイマー病、歯周病、および癌転移といった組織破壊を特徴とする疾病などの細胞タンパク質分解が起こる数多くの疾病に関与するとされるプロテアーゼを阻害し得る。
【０７１２】
より好ましい実施形態では、本発明は、限定されるものではないが、慢性肺気腫、肝硬変、肝不全、嚢胞性繊維症、動脈瘤または毒素性ショックなどのα1-アンチトリプシン欠損症関連疾患といった、トリプシン、キモトリプシンまたはエラスターゼが異常に高いレベルであることを特徴とする疾病において本発明のタンパク質またはその一部を用いた組成物および方法に関する。予防および／または治療用途では、本発明のタンパク質は本明細書に記載されているか、または当業者に公知の遺伝子治療方法のいずれかを用いて使用され得る。
【０７１３】
もう1つの好ましい実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部がin vivoおよびin vitroのいずれにおいても、限定されるものではないが、歯肉炎、マラリア、リーシュマニア症、フィラリア症、骨粗鬆症および骨関節炎、ならびにその他の細菌、および寄生虫媒介性またはウイルス感染といった多くの感染病に関与するとされる外因性プロテアーゼを阻害するのに有用であり得る。特に、本発明のタンパク質またはその一部には一次ポリペプチド前駆体のタンパク質分解がウイルスの複製に不可欠であるHIVおよびHCVなどのウイルス疾患における用途が与えられよう。
【０７１４】
もう1つの実施形態では、本発明のプロテアーゼ阻害剤を抗菌剤として使用してin vitroまたはin vivoのいずれかで特定の細菌の増殖を遅延または阻害し得る。特に、増殖を阻害するのに有効な量の本発明のポリペプチドを使用して外科用器具、実験室のガラス器具およびプラスチック器具などの非生物材料での、さらには、生存している植物、真菌、および動物細胞の培養下でのA群連鎖球菌の増殖が阻害されよう。
【０７１５】
さらに、本発明のプロテアーゼ阻害剤には相乗効果的な適用において用途が見いだされる。例えば、抗生物質または抗癌剤などの治療薬を内因性プロテアーゼによるタンパク質分解を通じて不活性化し、それによって投与された薬剤の効果を下げるまたは不活性にすることが可能である。従って、本発明のプロテアーゼ阻害剤を治療薬とともに患者に投与して薬剤の活性を増強または高めてもよい。この併用投与はプロテアーゼ阻害剤と薬剤との混合物などの同時投与、または個別に同時もしくは連続投与によって実施し得る。
【０７１６】
配列番号253のATPKfタンパク質配列(内部識別番号1000867870)
延長cDNA配列番号84および配列番号404の関連ポリヌクレオチドによってコードされる配列番号253のタンパク質はヒトミトコンドリアATPシンターゼfサブユニットまたはATPK(E.C. 3.6.1.34)の変異体であり、それ自体では細胞呼吸においてある役割を果たしている。本発明の好ましいポリペプチドは配列番号253の5〜88位のアミノ酸を含んでなるポリペプチドである。本発明のその他の好ましいポリペプチドは本明細書に記載の生物学的活性のいずれかを有する配列番号253の断片である。本願において記載される配列番号84および404のポリヌクレオチド、ならびに配列番号253のポリペプチドの全ての特徴および用途はクローン1000867870のヒトcDNAクローン、ならびにそれによりコードされるポリペプチドについても当てはまると考えられる。
【０７１７】
ミトコンドリア電子伝達(または呼吸)鎖はNADHから酸素への電子伝達、ならびにこの酸化とATPの合成との共役(酸化的リン酸化)を担うミトコンドリア膜にある一連の酵素複合体である。ATPはその後、細胞の数多くあるエネルギー要求反応を推進するための主要なエネルギー源として提供される。ATPシンターゼ(F0 F1 ATPアーゼ)はこの鎖の最後にある酵素複合体であり、ミトコンドリア膜を挟む電気化学的プロトン勾配のエネルギーをATPの合成または加水分解のいずれかに相互転換する可逆的結合要素として作用する。この勾配はNADHから酸素への電子伝達の過程にある呼吸鎖のその他の酵素によって生じる。細胞のエネルギー需要が高い場合には、NADHから酸素への電子伝達によりミトコンドリア膜にわたって電気化学的勾配をもたらす。膜の外側から内側へのプロトン転移によってATPの合成が推進される。低エネルギー要求条件下であり、かつ過剰のATPが存在する場合には、この電気化学的勾配を逆転させ、ATPシンターゼによりATPを加水分解する。この加水分解エネルギーを用いてミトコンドリアマトリックスからプロトンを大量に供給する。それゆえ、ATPシンターゼは二元複合体である(膜貫通プロトン担体またはポンプであるそのF0部分と、触媒部分であるATPを合成または加水分解するF1部分とを有する)。哺乳類ATPシンターゼ複合体は16の異なるポリペプチドで構成される(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるWalker, J. E.およびCollinson, T. R. (1994) FEBS Lett.346: 39-43)。これらのポリペプチドのうち6種(サブユニットα、β、γ、δ、ε、およびATPアーゼ阻害タンパク質 IF l)はミトコンドリア膜の外側に存在する複合体の球状触媒F l ATPアーゼ部分を含んでなる。残る10種のポリペプチド(サブユニットa、b、c、d、e、f、g、F6、OSCP、およびA6L)は複合体のプロトン転移、膜貫通F0部分を含んでなる。呼吸鎖のその他のメンバーのように、ATPシンターゼのポリペプチドサブユニットの2種を除く全てがミトコンドリアに輸送される核遺伝子産物である。哺乳類ATPシンターゼに類似した酵素複合体は全ての細胞型ならびに葉緑体および細菌膜で見つけられる。この普遍性によってこの酵素がATP代謝に対して中心的に重要な存在であることが示される。これらの核コード遺伝子の転写調節がATPシンターゼの生物発生を制御するための有力な手段であると思われる。細胞エネルギー産生、活性酸素種の生成およびアポトーシスの開始においてミトコンドリアの酸化的リン酸化の役割が不可欠であることから様々なミトコンドリア病が存在する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるWallace, Science, 283:1482-1488, 1999)。現在ではミトコンドリア病が心臓、筋肉および腎臓ならびに内分泌系などの高エネルギー要求のある組織に一般的に関連した臨床問題を総括して包含することが分かっている。過去11年間で、体の大部分における異常がミトコンドリアエネルギー産生経路、酸化的リン酸化、ミオパシーおよび心筋症をはじめとする種々の変性疾患に関与するとされる証拠が蓄積されてきた。ほとんどの種類の病原性ミトコンドリアDNA変異は骨格筋、中枢神経系(眼を含む)、内分泌系、および腎臓系を含み得る種々のその他の臨床症状を伴って心臓に作用する。ミトコンドリア疾患を引き起こす核変異についてはすでに記載されている。多くの場合、���れらは高度に保存されたサブユニットで認められる。核変異によるミトコンドリア疾患としては、ミオパシー(PEO、MNGIE、先天性筋ジストロフィー、カルニチン障害)、脳障害(リー脳症、小児脳症、ウィルソン病、難聴・失調症候群)、その他の全身性疾患ならびに心筋症が挙げられる。
【０７１８】
新規ATPシンターゼサブユニット、およびそれをコードするポリヌクレオチドを発見すれば、癌、ミオパシー、免疫疾患、および神経疾患の診断、予防、および治療に有用である新規組成物を提供することで当技術分野の必要が満たされる。
【０７１９】
本発明の目的は、本発明のタンパク質の断片を異種ポリペプチドまたはポリヌクレオチドとの組換えによりまたは化学的に融合することにより異種化合物、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのいずれかをミトコンドリアに向ける組成物および方法に関する。好ましい断片は、シグナルペプチド、両親媒性α-ヘリックスおよび／または本発明のタンパク質もしくはその一部のその他の断片であり、これには、限定されるものではないが、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるHerrmanおよびNeupert, Curr. Opinion Microbiol. 3:210-4 (2000); Bhagwatら J. Biol. Chem. 274:24014-22 (1999), Murphy Trends Biotechnol. 15:326-30 (1997); Glaserら Plant Mol Biol 38:311-38 (1998); Ciminaleら Oncogene 18:4505-14 (1999)、で定義されたマトリックス標的シグナルをはじめとするミトコンドリアへの標的シグナルが含まれ得る。かかる異種化合物を使用してミトコンドリアの活性を調節し得る。例えば、それらをミトコンドリアにより誘導されるアポトーシスまたは壊死を誘導および／または抑制するのに使用してもよい。さらに、異種ポリヌクレオチドをミトコンドリアの遺伝子治療に使用して欠損したミトコンドリア遺伝子を置換するおよび／またはミトコンドリア遺伝子の有害な発現を阻害してもよい。
【０７２０】
本発明はさらに、限定されるものではないが、ミトコンドリア細胞変性(mitochondriocytopathy)、壊死、老化、ミオパシー、癌およびアルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病、癲癇、ダウン症候群、痴呆、多発性硬化症、および筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患といったミトコンドリア呼吸電子伝達鎖が損なわれるいくつかの疾患を診断、予防および／または治療するために本発明のタンパク質またはその一部を用いた方法および組成物に関する。診断用途では、本発明のタンパク質の発現を本明細書に記載のノーザンブロット、RT-PCRまたは免疫ブロット法のいずれかを用いて調べ、対照個体の発現と比較することができる。予防および／または治療用途では、本発明のタンパク質は、電子伝達を促進してエネルギー送達を強化するために本明細書に記載されているか、または当業者に公知の遺伝子治療方法のいずれかを用いて使用され得る。
【０７２１】
もう1つの実施形態では、本発明はさらに、限定されるものではないが、シェーグレン症候群、アジソン病、気管支炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、糸球体腎炎、糖尿病、気腫、グレーブス病、萎縮性胃炎、紅斑性狼瘡、重症筋無力症、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、潰瘍性大腸炎、貧血、膵炎、強皮症、リウマチおよび骨関節炎、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、皮膚筋炎、多発性筋炎、ならびに痛風といったミトコンドリア呼吸電子伝達鎖を弱める必要があるいくつかの疾患を本明細書に記載のアンチセンスまたは三重らせん体形成法をはじめとする当業者に公知のいずれかの技術を用いて診断、予防および／または治療するために本発明のタンパク質またはその一部を用いた方法および組成物に関する。
【０７２２】
さらに、本発明のタンパク質またはその一部に対する抗体は当業者に公知のいずれかの技術を用いたミトコンドリア細胞小器官および／またはミトコンドリア膜の検出に使用することができる。
【０７２３】
配列番号310のオリゴマー形成タンパク質配列(内部識別番号D150568)
配列番号141および435のcDNAによってコードされる配列番号310のタンパク質はホモ-オリゴマーを形成することができる。本発明の好ましいポリペプチドは配列番号310の1〜109番のアミノ酸を含んでなるポリペプチドである。本発明のその他の好ましいポリペプチドは本明細書に記載の生物学的活性のいずれかを有する配列番号310の断片である。
【０７２４】
多価であることは抗体またはレクチンの特定の標的への結合、リガンド認識、受容体の活性化または阻害および細胞接着などの種々の巨大分子相互作用の必要条件である。そのため、タンパク質の二量体形成およびオリゴマー形成は細胞膜受容体、転写因子、小胞融合タンパク質、およびその他の種類の細胞内および細胞外タンパク質の活性化を助ける一般的な生物学的制御機構である。
【０７２５】
多量体形成ドメインについてはバイオテクノロジーのいくつかの分野で、特にタンパク質工学において有用なツールであることが示されてきた。例えば、Tsoらは二重特異性抗体ヘテロ二量体の形成にロイシンジッパーを使用した(米国特許第5,932,448号)/ロイシンジッパーを用いた可溶性オリゴマータンパク質の調製方法がConradら (米国特許第5,965,712号)、Ciardelliら (米国特許第5,837,816号)、Spriggsら (WO9410308)によって記載された/Pelletierらはタンパク質断片相補性アッセイにおいてロイシンジッパー形成配列を用いて生物学的分子の相互作用を検出した(WO9834120)(なお、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。バイオテクノロジーにおけるそれらの実用性から、新規多量体形成ドメインの単離には大いに興味が持たれる。
【０７２６】
本発明のタンパク質またはその一部の多量体形成活性は円二色性スペクトル、ゲル濾過クロマトグラフィーおよび熱融解解析をはじめとする当業者に公知のいずれかのアッセイを用いて評価することができる。
【０７２７】
ある実施形態では、本発明は全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる国際特許WO9410308に記載のものをはじめとする当業者に公知のいずれかの技術を用いて目的のタンパク質と融合される多量体形成ドメインを有する融合タンパク質多量体に存する可溶性多量体タンパク質を作製するために本発明のタンパク質またはその一部を用いた組成物および方法に関する。
【０７２８】
もう1つの実施形態では、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,643,731号の教示を用いた体液中の分析対象物の検出および測定のために本発明のタンパク質またはその一部もしくはその誘導体が使用される。要するに、第1の多量体形成ドメインを固体支持体上に固定化し、第2の多量体形成ドメインを体液中の分析対象物の特異的結合パートナーに結合させる。次に、これら2つのペプチドを接触させ、それにより固相上にその結合パートナーを固定化する。次に、この生物学的サンプルを固定化した結合パートナーと接触させ、結合パートナーと結合したサンプル中のアナライト量を測定する。
【０７２９】
さらにもう1つの実施形態では、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるWO0102440に記載されるように、多量体形成ドメインと融合される機能的ドメインを有するハイブリッド分子を含んでなる多量体形成手段を構築し、向上した薬物動態および薬理学的特性を有する多量体複合体を得るために本発明のタンパク質またはその一部を使用してもよい。好ましい実施形態では、酵素部分または細胞傷害性部分などの異なる機能的ドメインを有する異なる融合タンパク質を構築するために本発明のタンパク質またはその一部を使用してもよい。次いで、これらの異なるタンパク質をコードするベクターを多量体形成を可能にする条件において同じ宿主細胞でトランスフェクトして、多量体多官能複合体を得てもよい。
【０７３０】
配列番号303のシャペロンタンパク質(内部識別番号D637548)
配列番号134のcDNAによってコードされる配列番号303のタンパク質はシャペロニンである。従って、配列番号303のタンパク質はタンパク質合成/折りたたみ、細胞輸送、および細胞ストレス応答に関与する。さらに、配列番号303のタンパク質は免疫抑制活性および増殖因子特性を有する。これは遅延型過敏反応を抑えることができる。これは一次および腫瘍性細胞増殖の産物であり、これらの条件下では増殖因子として作用する。また、これは血小板活性化の産物でもあり、創傷治癒および皮膚修復に関与し得る。本発明の好ましいポリペプチドは配列番号303の9〜33番、または7〜101番のアミノ酸を含んでなるポリペプチドである。本発明のその他の好ましいポリペプチドは本明細書に記載の生物学的活性のいずれかを有する配列番号303の断片である。本発明のタンパク質またはその一部の異なる活性は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,117,421号に記載のいずれかのアッセイまたは米国特許第6,117,421号に引用されるいずれかのアッセイを用いて評価することができる。
【０７３１】
シャペロニンは幅広い種類の分子シャペロンに属しており、分子は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるEllisら, 1991, Annu. Rev. Biochem. 60 321-347で論述されているように、それ自体が最終的に構成される構造の一部を形成するものではないが、翻訳後の折りたたみ、ターゲティング、およびその他のタンパク質の構成に関与している。ほとんどの分子シャペロンは「熱ショック」または「ストレス」タンパク質(hsp)である、すなわち、種々の細胞損傷(代謝破壊、酸素ラジカル、炎症、感染および形質転換など)によってそれらの生産の誘導または増加が起こる。全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるLindquistら, 1988, Annu. Rev. Genet. 22 631-677により概説されるように、熱がより優れた研究ストレスの唯一のものある。特定タンパク質レベルのこれらの定量的変化に加え、ストレスは前記のLindquist参考文献で記載されるように構成的に生産されるストレスタンパク質の異なる細胞コンパートメントの移動を誘導することができる。熱ショック応答は最も高度に保存された公知の遺伝系の1つであり、種々の熱ショックタンパク質ファミリーは存在する最も進化的に安定なタンパク質に含まれる。大部分のストレスタンパク質はストレスを受けた細胞で非常に高いレベルまで蓄積されるが、ストレスを加えなかった細胞では低〜中度のレベルでしか生じない。これらのファミリーのメンバーは悪条件下でも細胞をうまく処理できる上に、正常細胞において不可欠な働きをする。
【０７３２】
また、シャペロンは数多くの疾患、特に1型糖尿病、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、および混合結合組織病などの自己免疫疾患にも関与している(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるFeigeら EXS 1996; 77:359-73; Feili-Haririら J Autoimmun 2000; 14:133-42)。また、シャペロンは結核およびハンセン病(Zugelら Clin Microbiol Rev 1999; 12:19-39)、アルツハイマー病およびパーキンソン病などの神経変性疾患(Yooら J Neural Transm Suppl 1999; 57:315-22)、ならびに悪性疾患(Csermelyら Pharmacol Ther 1998; 79:129-68)(なお、これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)をはじめとする様々な疾患にも関与している。
【０７３３】
ある実施形態では、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるMortonら, 1976, Proc. R. Soc. B. 193 413-41および米国特許第6,117,421 号の教示を用いて、妊娠の可能性を、好ましくは受精6〜24時間以内に検出するために本発明のタンパク質またはその一部を使用してもよい。本発明のタンパク質の発現または活性の検出は、本願の他の部分に記載されたものをはじめとする当業者に公知のいずれかの技術を用いて実施してもよい。
【０７３４】
もう1つの実施形態では、米国特許第6,117,421号に記載されたように妊娠中絶を誘導するために抗体、アンチセンスもしくは三重らせん体オリゴヌクレオチド、ドミナントネガティブ型のタンパク質、ポリペプチドまたはタンパク質の発現または活性に関する小分子阻害剤などの本発明のタンパク質の発現または活性を遮断することができる分子を使用してもよい。
【０７３５】
さらにもう1つの実施形態では、本発明のタンパク質またはその一部を、単純投与を用いて、または本願の他の場所で記載された遺伝子治療方法のいずれかおよび米国特許第6,117,421号の教示を用いて、不妊症および流産を治療および／または予防するために使用してもよい。
【０７３６】
もう1つの実施形態では、本発明はin vitroおよびin vivoにおいて特定の細胞型を同定するために本タンパク質を用いる方法を提供する。例えば、シャペロンタンパク質は細胞ストレスにより多くの場合アップレギュレートされるため、高レベルのタンパク質を発現する細胞を検出することによってストレス下で細胞を検出するツールが提供される。細胞ストレスは心血管疾患、神経変性疾患、および癌などの数多くの疾患に関与するとされていることから、かかるストレスが検出可能なことによりかかる病気の診断またはスクリーニングツールが提供される。
【０７３７】
さらに、本ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、様々なタイプの悪性疾患、および1型糖尿病、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、グレーブス病、多発性硬化症、および混合結合組織病をはじめとする自己免疫疾患などの配列番号303のタンパク質が異常なレベルまたは活性であることを特徴とする疾患についての診断およびスクリーニングアッセイを開発するために使用できる。かかるアッセイは血清または血漿などのいずれかの生物学的サンプルを用いて実施することができる。
【０７３８】
もう1つの実施形態では、配列番号303のタンパク質またはその一部、または核酸、抗体、もしくは化学物質などのタンパク質のレベルもしくは活性に作用し得るその他の化合物によって様々な疾患を治療、緩和、および／または予防することができる。好ましい実施形態では、本発明のタンパク質に対して向けられたタンパク質またはその他の化合物を使用して配列番号303のタンパク質の活性またはレベルが不安定である疾患を治療または予防することができる。かかる疾患としては、限定されるものではないが、感染病、アルツハイマー病およびパーキンソン病、統合失調症、脱毛症、老化、アテローム性動脈硬化症、様々なタイプの悪性疾患などの神経変性疾患、ならびに1型糖尿病、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、シェーグレン症候群、混合結合組織病、悪性疾患をはじめとする自己免疫疾患、自己免疫性およびその他の神経変性疾患が挙げられる。もう1つの実施形態では、配列番号303のタンパク質またはその一部は、限定されるものではないが、癌(Wangら Immunol Invest 2000;29:131-7)、結核(Silvaら Microbes Infect 1999;1:429-35)、糖尿病(Int Immunol 1999;11:957-66)、およびアテローム性動脈硬化症(Xuら Arterioscler Thromb 1992;12:789-99)(なお、これらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)をはじめとする様々な疾患に対するワクチンとして使用できる。
【０７３９】
本発明のある実施形態は、タンパク質分解を抑制する、組換えタンパク質の収量を高める、タンパク質の凝集を防ぐ、または変性したタンパク質を再生するために配列番号303のタンパク質またはその断片を安定助剤として用いた方法および組成物に関する。好ましい実施形態では、配列番号303のタンパク質またはその断片は、所望の結果を促す条件下で分解を抑制する、収量を高める、または変性したタンパク質を再生することが望ましいタンパク質を含んでなる組成物と混合される。例えば、分子生物学および生化学分野の技術者によって一般的に使用される市販の数多くのアッセイキットはそれらのタンパク質の安定性が低いことからin vitroでは非常に短命であり得るタンパク質(通常は酵素)の生物学的特性に依存している。光学的試験に使用される試験溶液の低固有安定性がシャペロンタンパク質の添加により高められ、その結果としてその試験の感度が高められるという例が、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる欧州特許DE4124286に記載されている。熱に不安定な逆転写酵素がシャペロンの存在下、高温レベルでcDNA合成を実施し得るというもう1つの例が、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,013,488号に示されている。
【０７４０】
また、配列番号303のタンパク質は組換えタンパク質、好ましくは分泌タンパク質の収量または活性を高めるために使用してもよい。組換えDNAテクノロジーにおいて、重要な未解決の問題は組換えによって宿主、特に細菌または酵母宿主内に過剰発現されるタンパク質の可溶性と生物学的活性である。多くの真核生物タンパク質、特に分泌タンパク質は大腸菌などの細菌宿主にはない、または高発現タンパク質であることから哺乳類／酵母細胞においては不十分となる特異な細胞機構である正確な折りたたみに必要である。配列番号303のタンパク質またはその断片の、組換えタンパク質の正確な折りたたみを確実に行う能力は以下のように使用することができる。配列番号303のタンパク質、またはその断片を、細菌または真核生物宿主において組換えタンパク質と同時に発現させて宿主に異種タンパク質またはポリペプチドを可溶性および／または生物学的活性が高められた形態で発現させることができる。例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,773,245号に記載の方法で配列番号303のタンパク質またはその断片を使用してもよい。よって、本発明はin vivoにおける単量体タンパク質の正確な折りたたみ、分解または凝集の予防のための方法であって、(a)(i)細胞内で凝集することができ、その結果として、生物学的活性のない多量体タンパク質またはその前駆体が生じる生物学的活性タンパク質またはその前駆体のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする第1のDNA、ならびに(ii)細胞に本発明のタンパク質またはその一部と前記のポリペプチドまたは前駆体とを同時発現させる第2のDNAでトランスフェクトした宿主細胞を構築し、(b)前記の宿主細胞を前記の第1のDNAおよび前記の第2のDNAが前記の生物学的に活性なタンパク質および前記の本発明のタンパク質の各々を発現する条件下で十分な時間増殖させ、さらに(c)生物学的に活性なタンパク質である単量体タンパク質を準備することを含んでなる方法に関する。あるいは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるPCT出願WO00/08135に記載されたように、配列番号303のタンパク質またはその断片を外的に細胞培養物に加えてもよい。
【０７４１】
さらに、配列番号303のタンパク質またはその断片は変性したタンパク質を再生するために使用してもよい。組換えによって発現される生物学的活性の乏しいタンパク質を、通常通り塩酸グアニジンなどの強力な変性剤で変性させ、その後、多量の希釈剤での希釈により変性剤の濃度を低下させて再び折りたたみを起こさせる。多くの場合、この方法では再び折りたたまれる割合が不十分であるが、これは全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる欧州特許EP0650975に記載されたものに類似した様式でシャペロンタンパク質カクテルを添加することによって大幅に高めてもよい。シャペロンタンパク質カクテルを使用する利点は異なるHspファミリーおよび各ファミリー内の異なるメンバーの結合特異性の違いに適応するということである。
【０７４２】
本発明のもう1つの実施形態では、組織修復を促進するおよび／または低酸素、酸化的ストレス、遺伝毒性物質およびより一般にはプログラム細胞死を誘導する有害な症状などのストレス条件下で細胞生存率を高めるために配列番号303のタンパク質を使用してもよい。これらの症状としては、限定されるものではないが、梗塞、心臓外科手術、卒中、神経変性疾患、癲癇、外傷、アテローム性動脈硬化症、血管形成術後の再狭窄、および神経損傷が挙げられる。
【０７４３】
さらに、本発明は米国特許第6,117,421号に記載のものをはじめとする当業者に公知のいずれかの技術を用いてin vitroおよびin vivoにおいて細胞増殖を促進するための組成物および方法に関する。例えば、可溶性の形態にある本発明のタンパク質またはその一部を細胞増殖を刺激するのに有効な量で細胞培養培地に添加する。あるいは、本明細書に記載のいずれかの遺伝子治療方法を用いて本発明のタンパク質またはその一部をin vivoにおいて過剰発現させてもよい。また、本発明のタンパク質またはその一部を前記被験体における細胞増殖を促進するのに有効な量で直接投与してもよい。これらの適用法は組織修復を促進すべき創傷または組織損傷を受けた個体、組織または皮膚移植片を受け入れた個体、炎症状態またはアレルギー性疾患に苦しむ個体において特に重要である。
【０７４４】
さらに、本発明は米国特許第6,117,421号に記載のものをはじめとする当業者に公知のいずれかの技術を用いて被験体における免疫抑制を強化するための組成物および方法に関する。例えば、本発明のタンパク質またはその一部を前記被験体における免疫抑制を達成するのに有効な量で直接投与してもよい。あるいは、本明細書に記載のいずれかの遺伝子治療方法を用いて本発明のタンパク質またはその一部をin vivoにおいて過剰発現させてもよい。これらの適用法は免疫抑制が望まれる、前記の疾患をはじめとする自己免疫疾患に苦しむ個体およびそれらが拒絶する可能性のある異種移植片を受け入れた個体などの場合に特に重要である。
【０７４５】
配列番号276のイオン輸送タンパク質(内部識別番号D538694)
配列番号107のcDNAによってコードされる配列番号276のタンパク質は小イオン輸送レギュレーターまたはチャンネルのFXDYファミリーに属する(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるSweadnerおよびRael(2000) Genomics 68:41-56)。配列番号276のタンパク質またはその一部はイオン輸送の制御に関与する。本発明の好ましいポリペプチドは配列番号276の9〜63番、または16〜29番のアミノ酸を含んでなるポリペプチドである。本発明のその他の好ましいポリペプチドは本明細書に記載の生物学的活性のいずれかを有する配列番号276の断片である。本発明のタンパク質またはその一部の活性は、すでに記載のものをはじめとする当業者に公知のいずれかのアッセイを用いて評価することができる。
【０７４６】
浸透圧調節はあらゆる生物において、生物環境によって異なる機構を通じて行われる。淡水生物は塩を保持する必要があるが、一方、海洋生物は水を保持する必要がある。陸生生物は水と塩の両方を保持する必要がある。生物はこれらの必要性と窒素系廃物などの代謝廃物を排除し、さらに消化のための唾液および体温調節のための汗などの分泌体液を生成すべき要件との平衡を保たねばならない。
【０７４７】
哺乳類では、汗腺、唾液腺、および腎臓は全て血液および細胞外液と実質的に等浸透圧性である一次分泌物を生成する。塩化ナトリウムおよび水は腺および腎臓の排出管を通過し、その一方でカリウムおよび重炭酸塩イオンが分泌されてそれらの大部分が再び吸収されるよう、この一次分泌物の改変が起こる。一次分泌物のこの改変は、高温環境で塩化ナトリウムを保持するために汗腺、および過剰量の唾液を使った場合に塩化ナトリウムを保持するために唾液腺において重要である。この改変は細胞外液において適切なナトリウムと水との平衡を維持するために腎臓において重大なことである。この平衡性によって動脈圧も調節される。導管細胞によるこの改変活性の喪失が原因となって多量のナトリウムおよび水が失われ、その結果として重症の脱水症および血液量の減少を招き、最終的には循環虚脱にまで及ぶ。
【０７４８】
腸、特に結腸におけるナトリウム吸収では、排泄物でのナトリウムの喪失を回避することが必要である。ナトリウム吸収ができないとさらに陰イオンおよび水までも吸収できなくなる。塩化ナトリウムおよび水が吸収されないと、その後、下痢が起こり、体内からさらなる塩化ナトリウムが失われることになる。その他の体液は前記の系に見られるものと同様の制御の下にあると考えられる。例えば、脳脊髄液は塩化物イオンおよび水を交代で取り込む、脈絡叢の上皮組織での毛細血管からのナトリウムイオン能動輸送によって産生される。カリウムおよび重炭酸塩イオンの逆流は脳脊髄液を出て毛細血管へと移る。浸透圧調節機能障害は低ナトリウム血症、腎不全および高ナトリウム血症をはじめとする重篤な病状と関わりがある(全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるStrange, K. (1992) J Am. Soc. Nephrol. 3:12-27)。
【０７４９】
ある実施形態では、本発明のタンパク質が、限定されるものではないが、尿崩症、下痢、腹膜炎、慢性腎不全、アジソン病、抗利尿ホルモン不適合分泌症候群(SIADH)、低アルドステロン症、低ナトリウム血症、副腎機能障害、甲状腺機能低下症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、バーター症候群、クッシング症候群、代謝性アシドーシス、代謝性アルカローシス、脳障害、浮腫、低血圧症、および高血圧症をはじめとする浸透圧調節疾患の診断、予防および／または治療において有用であり得る。例えば、本明細書に記載のいずれかの遺伝子治療方法を用いて本発明のタンパク質またはその一部をin vivoにおいて過剰発現させてもよい。あるいは、本発明のタンパク質またはその一部を前記被験体における細胞増殖を促進するのに有効な量で直接投与してもよい。診断用途では、本発明のタンパク質の発現を本明細書に記載のノーザンブロット、RT-PCRまたは免疫ブロット法のいずれかを用いて調べ、対照個体の発現と比較することができる。予防および／または治療用途では、本発明のタンパク質はイオン輸送を促進し、浸透圧調節疾患を予防または治療するために本明細書に記載のいずれかの遺伝子治療法を用いて使用することができる。
【０７５０】
抗体の用途
本発明の抗体には、限定されるものではないが、in vitroおよびin vivo両方における診断ならびに治療方法をはじめ、当技術分野で公知の本発明のポリペプチドの精製、検出およびターゲティング方法を含む用途がある。免疫アフィニティークロマトグラフィーを用いたかかる用途の例を以下に示している。本発明の抗体は、単独またはその他の組成物と組み合わせて使用してもよい。例えば、抗体には生物学的サンプル内の本発明のポリペプチドなどの抗原を有する物質のレベルを定性的および定量的に測定するイムノアッセイにおける用途がある(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるHarlowら, 1988を参照)。また、抗体はタンパク質を発現する細胞を死滅させるまたは体内のタンパク質のレベルを下げるための治療用組成物にも使用することができる。
【０７５１】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体に関する。例えば、本発明は本発明のポリペプチドによる受容体／リガンド相互作用を、部分的にまたは完全に遮断する抗体を含む。受容体特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。リガンド結合は妨げないが受容体活性化を妨げる受容体特異的抗体が含まれる。受容体活性化(すなわち、シグナル伝達)は、本明細書に記載されているか、または当業者に公知の技術によって測定し得る。また、リガンド結合と受容体活性化の両方を妨げる受容体特異的抗体も含まれる。同様に、リガンドに結合してリガンドの受容体への結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合することによって受容体活性化を妨げるがリガンドの受容体との結合は妨げない抗体も含まれる。さらに、受容体を活性化する抗体が含まれる。これらの抗体は、リガンド媒介による受容体活性化によって影響を受ける全てのまたはいくつかの生物学的活性のアゴニストとして作用し得る。これらの抗体を本明細書に開示される特定の活性を含んでなる生物学的活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして特定することもできる。前記の抗体アゴニストは当技術分野で公知の方法を用いて作製できる。例えば、WO96/40281; 米国特許第5,811,097号; Dengら (1998); Chenら (1998); Harropら (1998); Zhuら (1998); Yoonら (1998); Pratら (1998); Pitardら (1997); Liautardら (1997); Carlsonら (1997); Tarymanら (1995); Mullerら (1998); Bartunekら (1996) (これらの参考文献はその全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる)を参照。
【０７５２】
上述のように、本発明のポリペプチドの抗体を次々に使用して、当業者に周知の技術を用いて本発明のポリペプチドに「疑似的な」抗イディオタイプ抗体を作製することができる(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるGreenspanおよびBona (1989) ならびにNissinoff (1991)、を参照)。例えば、結合して競合的にポリペプチド多量体形成または本発明のポリペプチドのリガンドへの結合を阻害する抗体を使用してポリペプチド多量体形成または結合ドメインに疑似的な抗イディオタイプを作製し、結果として、ポリペプチドまたはそのリガンドと結合して中和することができる。かかる中和抗イディオタイプ抗体を使用して本発明のポリペプチドと結合するか、またはそのリガンド／受容体を結合することによって、その生物学的活性を遮断することができる。
【０７５３】
免疫アフィニティークロマトグラフィー
本明細書に記載のようにして作製された抗体を支持体に結合させる。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であるが、ポリクローナル抗体を使用してもよい。支持体はセファロースCL-4B(Pharmacia, Piscataway, NJ)、セファロースCL-2B(Pharmacia, Piscataway, NJ)、Affi-gel10(Biorad, Richmond, CA)、またはガラスビーズをはじめとする免疫アフィニティークロマトグラフィーにおいて典型的に使用されるもののいずれであってもよい。
【０７５４】
抗体は臭化シアンをはじめとする免疫アフィニティークロマトグラフィーにおいて典型的に使用されるいずれのカップリング試薬を用いても支持体に結合し得る。抗体を支持体に結合させた後、支持体を単離、精製または濃縮が望まれる標的ポリペプチドを含むサンプルと接触させる。標的ポリペプチドは配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列ならびに寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチド、その変異体および断片からなる群から選択されるポリペプチド、または前記の選択されたポリペプチドもしくはその断片を含んでなる融合タンパク質であってよい。
【０７５５】
好ましくは、サンプルを標的ポリペプチドの少なくとも50%が支持体に結合した抗体と特異的に結合し得るに十分な時間、さらに好適な条件下で支持体と接触させて置く。
【０７５６】
その後、支持体を好適な洗浄液で洗浄して支持体と非特異的に結合したポリペプチドを除去する。洗浄液はPBS、Tris-塩化リチウムバッファー(0.1Mリジン塩基および0.5M塩化リチウム、pH8.0)、Tris-塩酸バッファー(0.05M Tris-塩酸、pH8.0)、またはTris/Triton/NaClバッファー(50mM Tris-Cl、pH8.0または9.0、0.1%Triton X-100、および0.5M NaCl)をはじめとする免疫アフィニティークロマトグラフィーにおいて典型的に使用されるもののいずれでもよい。
【０７５７】
洗浄後、特異的に結合した標的ポリペプチドを免疫アフィニティークロマトグラフィーにおいて典型的に使用される高pHまたは低pH溶出液を用いてを支持体から溶出する。特に、溶出液がトリエタノールアミン、ジエチルアミン、塩化カルシウム、チオシアン酸ナトリウム、臭化カリウム、酢酸、またはグリシンなどの溶出剤を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、溶出液がTriton X-100またはオクチル-β-D-グルコシドなどの界面活性剤を含んでいてもよい。
【０７５８】
GENSET遺伝子産物の発現
本発明のGENSET遺伝子の空間的発現
本発明のcDNAの組織発現を調べた。表IIIおよびIVはGensetの組織および細胞型ライブラリー、ならびに公開データベースのcDNAにおけるヒット数の一覧である。ポリヌクレオチド発現について調べた組織および細胞型は表IIIでは: 脳;胎児脳; 胎児腎臓; 胎児肝臓; 下垂体; 肝臓; 胎盤; 前立腺; 唾液腺; 胃／腸; および精巣であった。優先権の基となる出願における対応する配列番号を引用して示す(本願中の対応する配列番号に関しては表Iを参照)各cDNAに関し、その名前で参照される特定組織内で発現された登録商標権を有する5'EST(すなわち、cDNA断片)数を括弧に入れて示している(第2列)。さらに、本発明のポリヌクレオチド配列の空間的分布における偏りを以下の統計的分析を用いてある組織の生物学的ポリヌクレオチドの相対的比率を比較することにより調べた。ある組織内のあるクラスターのポリヌクレオチドの発現について、それが不十分であるかまたは過剰であるかを二項分布の正規近似を用いて調べた。所定のコンセンサスでのある組織のポリヌクレオチドの観測比率がカイ二乗検定により任意に起こる見込み1%未満であった場合には頻度の偏り(frequency bias)を「好ましい」ものとして記した。この結果を下記の表Vに示している。第1列にあるその配列識別番号で示される組織分布において偏りを示す各ポリヌクレオチドに関し、ポリヌクレオチドが不十分とされる組織の一覧を「低発現」と題された第2列に挙げ、さらにポリヌクレオチドが過剰とされる組織の一覧を「高発現」と題された第3列に挙げている。
【０７５９】
GENSETポリペプチドをコードするmRNAの発現レベルおよびパターンの評価
GENSETポリペプチドをコードするmRNAの空間的および時間的発現パターン、ならびにそれらの発現レベルもまた以下のようにさらに調べることができる。
【０７６０】
GENSETポリペプチドをコードするmRNAの発現レベルおよびパターンは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる国際特許出願番号WO97/05277に記載されたように長いプローブを用いる溶液ハイブリダイゼーションによって解析してもよい。要するに、解析しようとするmRNAをコードする遺伝子に対応するGENSETポリヌクレオチド、またはその断片をバクテリオファージ(T3、T7またはSP6)RNAポリメラーゼプロモーターのすぐ下流にあるクローニング部位に挿入してアンチセンスRNAを作製する。好ましくは、GENSETポリヌクレオチドは少なくとも100ヌクレオチド長である。プラスミドを直鎖状にし、修飾リボヌクレオチド(すなわち、ビオチン-UTPおよびDIG-UTP)を含んでなるリボヌクレオチドの存在下で転写する。過剰のこの二重標識されたRNAを、対象の細胞または組織から単離されたmRNAと溶液中でハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションは標準ストリンジェント条件(80%ホルムアミド、0.4M NaClバッファー、pH 7〜8中40〜50℃で16時間)下で行う。ハイブリダイズしていないプローブは、一本鎖RNAに特異的なリボヌクレアーゼ(すなわち、RNアーゼCL3、T1、Phy M、U2またはA)による消化により除去する。ビオチン-UTP修飾物の存在によりストレプトアビジンでコーティングしたマイクロタイタープレート上でのハイブリッドの捕捉が可能になる。DIG改変物の存在によりハイブリッドの検出およびアルカリ性ホスファターゼと結合した抗DIG抗体を用いたELISAによる定量が可能になる。
【０７６１】
また、GENSETポリペプチドをコードするcDNAまたはその断片は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる英国特許出願番号2 305 241 Aで開示されたように、連続的遺伝子発現解析法(SAGE)のためにヌクレオチド配列をタグ付けしてもよい。この方法では、遺伝子発現パターンの決定が望まれる細胞、組織、生物体またはその他の核酸の供給源からcDNAを調製する。得られたcDNAを2つのプールに分ける。各プールのcDNAを、大部分のcDNAに少なくとも1箇所は存在するであろう認識部位を有する「アンカーリング酵素（anchoring enzyme）」と呼ばれる第1の制限エンドヌクレアーゼで切断する。切断されたcDNAの5'または3'側の大部分の領域を含む断片をストレプトアビジンコーティングビーズなどの捕捉材と結合させることによって単離する。増幅プライマーのハイブリダイゼーションのための第1の配列と「タギングエンドヌクレアーゼ（tagging endonuclease）」の内部制限部位とを有する第1のオリゴヌクレオチドリンカーを第1のプール内の消化されたcDNAに連結する。第2のエンドヌクレアーゼによる消化でcDNA由来の短い「タグ」断片が生成する。増幅プライマーのハイブリダイゼーション用の第2の配列と内部制限部位とを有する第2のオリゴヌクレオチドを第2のプール内の消化されたcDNAに連結する。第2のプール内のcDNA断片もまた「タギングエンドヌクレアーゼ」により消化して第2のプール内のcDNA断片由来の短い「タグ」断片が生成する。第1および第2のプールのアンカーリング酵素およびタギングエンドヌクレアーゼによる消化により得られた「タグ」を相互に連結して「ジタグ(ditag)」を作製する。いくつかの実施形態では、ジタグがコンカテマーとなり2〜200個のジタグを有するライゲーション産物が形成される。次いで、タグ配列を決定し、GENSETポリペプチドをコードするcDNAの配列と比較してどの遺伝子がタグが誘導された細胞、組織、生物体または核酸のその他の起源で発現されるかを判定する。このようにして、細胞、組織、生物体または核酸のその他の起源でのGENSETポリペプチドをコードする遺伝子の発現パターンが得られる。
【０７６２】
また、GENSET遺伝子発現の定量分析はアレイを用いて行ってもよい。例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるSchenaら(1995および1996)に記載されたように、遺伝子発現の定量分析をGENSETポリヌクレオチドまたはその断片を用いて相補的DNAマイクロアレイにより行ってもよい。GENSETポリペプチドをコードするcDNAまたはその断片をPCRにより増幅し、高速ロボットを用いて96ウェルマイクロタイタープレートからシリル化顕微鏡用スライド上にアレイ化する。プリントされたアレイをアレイの構成成分の再水和を可能にする湿潤チャンバー内でインキュベートし、0.2%SDSで1分間(1回)、水で1分間(2回)、さらに水素化ホウ素ナトリウム溶液で5分間(1回)洗浄する。アレイを95℃で2分間浸水し、0.2%SDSに1分間移し、水で2回すすぎ、風乾し、暗室内25℃で保存した。細胞または組織mRNAを単離するか、または商業的に入手し、1回限りの逆転写でプローブを作製する。プローブを14×14mmガラスカバースリップを用いて1cm2マイクロアレイに60℃で6〜12時間ハイブリダイズさせる。アレイを低ストリンジェンシー洗浄バッファー(1XSSC/0.2%SDS)で25℃で5分間、次いで、高ストリンジェンシー洗浄バッファー(0.1XSSC/0.2%SDS)で室温で10分間洗浄する。常用するフィルターの設定を備えた蛍光レーザースキャニング装置を用いて0.1XSSC内でアレイをスキャンする。2つの独立したハイブリダイゼーションの比率の平均を取ることにより、正確な発現差の測定が得られる。
【０７６３】
また、遺伝子発現の定量分析は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるPietuら(1996)に記載されたようにGENSETポリペプチドをコードするcDNAまたはその断片を用いて相補的DNAアレイにより行うことができる。本発明のGENSETポリヌクレオチドまたはその断片をPCR増幅し、メンブラン上にスポットする。次いで、種々の組織または細胞を起源とするmRNAを放射性ヌクレオチドで標識する。制御された条件下でハイブリダイゼーション、洗浄の後、ハイブリダイズしたmRNAをホスホイメージングまたはオートラジオグラフィーにより検出する。二重試験を行った後、発現差のあるmRNAの定量分析を行う。
【０７６４】
あるいは、GENSET遺伝子の発現解析は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるLockhartら(1996)およびSosnowskiら(1997)に記載されたように高密度ヌクレオチドアレイによって行うことができる。GENSETポリヌクレオチドまたはその断片の配列に対応する15〜50個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドをチップ上で直接合成する(Lockhartら, 前記)か、または合成した後、チップに移す(Sosnowskiら, 前記)。好ましくはオリゴヌクレオチドは約20個のヌクレオチドの長さである。ビオチン、ジゴキシゲニンまたは蛍光色素などの好適な化合物で標識したcDNAプローブを好適なmRNA集団から合成した後、平均サイズ50〜100個のヌクレオチドにランダムに断片化する。次いで、前記プローブをチップにハイブリダイズさせる。Lockhartら(前記)および異なる電気分野の出願(Sosnowskyら、前記)に記載されたように洗浄した後、色素または標識化合物を検出し、定量する。二重ハイブリダイゼーションを行う。異なるcDNAサンプルの同じ標的オリゴヌクレオチドでのcDNAプローブ由来シグナルの強度の比較分析によってGENSETポリペプチドをコードするmRNAの発現差が示される。
【０７６５】
GENSET遺伝子発現データの使用
当業者に公知のいずれかの技術、特に「GENSETポリペプチドをコードするmRNAの発現レベルおよびパターンの評価」と題した節で記載したものを用いて、または本開示を用いて、GENSETポリペプチドをコードするmRNAの発現レベルおよびパターンが一度決定されると、これらの情報を用いて、検出、同定、スクリーニングおよび診断用のGENSET遺伝子特異的マーカーを設計することができ、さらにはGENSET遺伝子発現パターンと類似した発現パターンを有するDNA構築物を設計することができる。
【０７６６】
GENSETポリペプチド発現および／または生物学的活性の検出
本発明はさらに、本明細書に記載のポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列を用いて生物学的サンプルのGENSETポリペプチド発現および／または生物学的活性を検出する方法に関する。かかる方法は、例えば、正常または異常なGENSETポリペプチド発現および／または生物学的活性のスクリーニングとして用いることが可能であることから、診断用に使用できる。本発明の方法に使用する生物学的サンプルとしては、例えば、哺乳類、特にヒト由来の好適なサンプルが挙げられる。例えば、サンプルを、例えば、表III、IV、またはVのデータ等によりそのポリペプチドがその発現されていることが分かっている組織または細胞系と同じ起源を有する組織または細胞系から得ることができる。
【０７６７】
GENSETポリペプチドの検出
本発明はさらに本明細書に記載の配列および当業者に公知のいずれかの技術を用いてサンプル内のGENSETポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを検出する方法に関する。例えば、GENSETポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの全てまたはその機能的部分のヌクレオチド配列を有する標識ポリヌクレオチドプローブをサンプル内のGENSETポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出する方法に使用することができる。ある実施形態では、サンプル内のポリヌクレオチドが、ポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに利用できるようにサンプルを処理する（これは、DNAまたはRNAであってよい）。得られた処理済みサンプルを相補的配列のハイブリダイゼーションが起こるのに好適な条件下でGENSETポリペプチドをコードするcDNAまたはゲノム配列の全てまたは一部のヌクレオチド配列を有する標識ポリヌクレオチドプローブと合わせる。サンプルのポリヌクレオチドと標識核酸プローブとのハイブリダイゼーションが検出することにより、サンプル中にGENSETポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの存在が判明する。GENSETポリペプチドをコードするmRNAの存在によりGENSETポリペプチドをコードする遺伝子の発現が示される。
【０７６８】
従って、本発明はサンプル中の、配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列、寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列、それに完全に相補的な配列、その断片および変異体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドの存在を検出する方法を含む。第1の実施形態では、上記方法は、
a)前記のサンプルと、前記の選択されたヌクレオチド配列とハイブリダイズする核酸プローブまたは複数の核酸プローブとを接触させ、そして、
b)前記プローブまたは前記複数プローブと前記ポリヌクレオチドとの間で形成されたハイブリッド複合体を検出する、
ステップを含んでなる。
【０７６９】
上記検出方法の好ましい実施形態では、前記核酸プローブまたは前記複数の核酸プローブが検出可能な分子で標識される。前記検出方法のもう1つの好ましい実施形態では、前記核酸プローブまたは前記複数の核酸プローブが基質に固定化されている。さらにもう1つの好ましい実施形態では、前記核酸プローブまたは前記複数の核酸プローブが前記の選択された配列に相補的な配列に含まれる配列を有している。
【０７７０】
第2の実施形態では、上記方法は、
a)前記のサンプルを増幅しようとする前記のヌクレオチド配列の領域の両側それぞれに位置する一対の増幅プライマーを含んでなる増幅反応試薬と接触させ、
b)増幅反応を行って前記の選択されたヌクレオチド配列の上記領域を含む増幅産物を合成し、そして、
c)該増幅産物を検出する、
ステップを含んでなる。
【０７７１】
上記検出方法の好ましい実施形態では、増幅しようとするポリヌクレオチドがRNA分子である場合、増幅しようとするDNA鋳型を提供するにはまず逆転写およびcDNA第2鎖の合成が必要である。上記検出方法のもう1つの好ましい実施形態では、増幅産物は増幅された領域に相補的である配列を有する標識プローブとのハイブリダイゼーションにより検出される。さらにもう1つの好ましい実施形態では、前記の増幅プライマーの少なくとも1つが前記の選択された配列または該配列に相補的な配列に含まれる配列を有している。
【０７７２】
あるいはまた、試験サンプル内のGENSETポリペプチドの発現を検出する方法は、本発明のGENSETポリペプチドまたはGENSETポリペプチドの一部と結合するいずれかの産物を用いて達成することができる。かかる産物がGENSETポリペプチドアゴニストおよびアンタゴニストをはじめとするGENSETポリペプチドまたはその断片と特異的に結合し得る、抗体、抗体の結合フラグメント、ポリペプチドであってよい。抗体との特異的結合が検出される(例えば、ELISA)ことでサンプル中にGENSETポリペプチドが存在するということが示される。
【０７７３】
従って、本発明はまた、生物学的サンプル中の本発明のGENSETポリペプチドの存在を特異的に検出する方法であって、
a)前記生物学的サンプルを本発明のポリペプチドまたはその断片と結合し得る産物と接触させ、
b)前記産物を前記ポリペプチドと結合させて複合体を形成させ、そして、
c)前記複合体を検出する、
ステップを含んでなる方法にも関する。
【０７７４】
前記検出方法の好ましい実施形態では、前記産物が抗体である。より好ましい実施形態では、前記抗体が検出可能な分子で標識される。前記検出方法のもう1つのより好ましい実施形態では、前記抗体が基質に固定化されている。
【０７７５】
さらに、本発明はまた、生物学的サンプル中のGENSET遺伝子産物(例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド)の有無であるかを調べる方法であって、
a)ヒトまたは非ヒト動物、好ましくは哺乳類由来の生物学的サンプルを準備し、
b)該生物学的サンプルを、本発明のGENSETポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドと結合し得る産物と接触させ、そして、
c)前記生物学的サンプル中の前記GENSETポリペプチドをコードする遺伝子産物の有無を調べる、
ステップを含んでなる方法に関する。
【０７７６】
本発明はまた、GENSETポリペプチドをコードする遺伝子発現産物の検出に使用できるキットに関する。キットには、GENSETポリペプチド(例えば、結合タンパク質、抗体またはその結合フラグメント(例えば、F(ab')2フラグメント))またはGENSETポリペプチドをコードするmRNA(例えば、相補的プローブまたはプライマー)を特異的に結合する化合物が、例えば、容器手段に配分されて含まれ得る。キットにはバッファーなどの補助試薬がさらに含まれ得る。
【０７７７】
GENSETポリペプチド生物学的活性の検出
本発明はさらに、GENSETポリペプチドの生物学的活性を特異的に検出し、GENSETポリペプチドの活性を調節し得る化合物を同定する方法を含む。GENSETポリペプチドの生物学的活性の評価は、本明細書に記載のものをはじめとする種々の技術を用いてGENSETポリペプチドと関連した何らかの細胞特性の変化の検出により行ってもよい。ポリペプチドのモジュレーターを同定するには対照を用いることが好ましい。例えば、対照サンプルには同じ試薬が全て含まれるが、評価される化合物または薬剤は含まれておらず、これを試験サンプルと同様に処理する。本明細書に記載のタンパク質の多くについての多数の潜在的にアッセイ可能な生物学的活性を標題「本発明のポリペプチドの使用」内、前記、に記載している。
【０７７８】
本発明はまたGENSETポリペプチド生物学的活性の検出に使用できるキットに関する。キットには、例えば、GENSETポリペプチドに対する基質、GENSETが結合する化合物、GENSETポリペプチドに対する抗体などが、例えば、容器手段に入った状態で、含まれ得る。キットにはバッファーなどの補助試薬がさらに含まれ得る。
【０７７９】
GENSETポリペプチドをコードする遺伝子発現の特定状況の同定
GENSETポリペプチドをコードするmRNAの発現パターンによってGENSETポリペプチドをコードする遺伝子がある状況下で特異的に発現されることが示される場合には、この遺伝子に特異的なプローブおよびプライマー、ならびにGENSETポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと結合する抗体をその特定の状況に対するマーカーとして使用し得る。特定の状況とは、例えば、ある組織／細胞または組織／細胞型における特異的発現(例えば、表III-Vを参照)、胚発生または疾病の発達などのプロセスのある発達段階における発現、あるいはある細胞小器官における特異的発現である。かかるプライマー、プローブ、および抗体は、例えば、in situ PCRまたは免疫化学をはじめとする当業者に公知のいずれかの技術を用いて、起源が不明の組織／細胞／細胞小器官、例えば、法医学的サンプル、体の異なる部位へ転移した分化腫瘍組織の同定、または組織断面にある異なる組織種の識別に商業的に有用である。
【０７８０】
例えば、配列表のcDNAおよびタンパク質、ならびにその断片を用いて、ヒト組織／細胞と非ヒト組織／細胞とを識別し、さらにcDNAを含んでなるポリヌクレオチドを発現するヒト組織／細胞／細胞小器官と発現しないものとを識別することができる。通常の試験によりまたは本明細書の開示内容を用いて、あるGENSETポリペプチドの発現パターンを判定することによって、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを未知の組織／細胞サンプル／細胞小器官の同一性を調べる方法に使用することも可能である。未知の組織／細胞サンプル／細胞小器官の同一性を調べる一環として、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを使用して何が未知の組織／細胞サンプルであり、さらに何が未知のサンプルではないのかを調べてもよい。例えば、cDNAが特定の組織／細胞型／細胞小器官内で発現され、未知の組織／細胞サンプル／細胞小器官においてはcDNAが発現されない場合には、未知の組織／細胞が、ヒトでないか、またはcDNAを発現するものと同じヒト組織／細胞型／細胞小器官ではないことが推察される。組織／細胞／細胞小器官の同一性を調べるこれらの方法は、当技術分野で周知の方法(例えば、ハイブリダイゼーション、PCRに基づく方法、免疫学的検定、免疫化学、ELISA)を用いて組織／細胞サンプル中のmRNA(または対応するcDNA)の存在または不在を検出する方法に基づいている。かかる技術の例については以下でさらに詳細に記載する。よって、本発明は本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの組織マーカーとしての使用を含む。好ましい実施形態では、表III-Vで示されるようにある組織で特異的に発現されるポリヌクレオチドおよびかかるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをこの目的に使用する。本発明はまた本発明のポリペプチドの細胞小器官マーカーとしての使用も含む。
従って、本発明は、組織／細胞型／細胞小器官の同定方法であって、
a)その身元（identity）をアッセイしようとする生物学的サンプルをGENSET遺伝子産物と結合し得る産物と接触させ、
b)前記生物学的サンプル内でGENSET遺伝子産物が発現されるかどうかを調べる、
ことを含む方法を包含する。
【０７８１】
GENSET遺伝子産物、すなわち、GENSETポリペプチドまたはGENSETポリペプチドをコードするmRNAと特異的に結合し得る産物としては、GENSETポリペプチド結合タンパク質、抗体またはその結合フラグメント(例えば、F(ab')2フラグメント)、ならびにGENSETポリヌクレオチド相補的プローブおよびプライマーが挙げられる。
【０７８２】
ステップb)は本明細書に記載のものをはじめとする当業者に公知の任意の検出方法、特に「GENSETポリペプチド発現および／または生物活性の検出」と題した節で記載したもの、を用いて行ってもよい。
【０７８３】
標識された組織特異的抗体による組織型または細胞型の同定
特定組織の同定は、直接(例えば、緑色蛍光タンパク質)または間接的に検出マーカーと結合した抗体調製物による組織特異的抗原の可視化によって達成される。選択された標識抗体種は、組織切片、細胞懸濁物、または組織サンプルからの可溶性タンパク質抽出物中のそれらの特異的抗原結合パートナーと結合し、定性的または半定性的解釈を得るためのパターンを提供する。
【０７８４】
これらの手順のための抗血清は、天然調製物の効力を上回る効力を有するものでなければならず、その理由で、抗体は、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは硫酸アンモニウム分画によるガンマグロブリン画分の単離によりmg/mlレベルに濃縮される。また、特異性の最も高い抗血清を得るためには、抗体をマーカーで標識する前に、例えば、一般タンパク質に対する望まれない抗体を、例えば、不溶性免疫吸着剤によってガンマグロブリン画分から除去する必要がある。モノクローナルまたは異種抗血清がいずれの手順にも好適である。
【０７８５】
A. 免疫組織化学法
前記のように作製した精製高力価抗体を、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるFudenberg, (1980)またはRoseら, (1980)に記載されたように検出マーカーと結合させる。
【０７８６】
蛍光マーカー、すなわちフルオレセインまたはローダミンのいずれかが好ましいが、抗体をセイヨウワサビペルオキシダーゼなどの基質との色素生成反応を手助けする酵素で標識することもできる。以下で記載するように、マーカーは第2ステップで組織結合抗体に添加することができる。あるいは、特異的抗組織抗体はフェリチンまたはその他の高電子密度粒子で標識することができ、フェリチン結合抗原-抗体複合体の位置確認を電子顕微鏡によって行うことができる。さらに別の手法では、抗体を、例えば125Iで放射性標識し、抗体処理調製物に写真乳剤を塗布することにより検出する。この手順を実施するための調製物は、組織型、例えば、脳組織に特異的であると特定される単一タンパク質またはペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含み得る。あるいは、数種の抗原的に異なる組織特異的抗原に対する抗体調製物をパネルで、単独で、または、必要であれば混合物として使用できる。免疫組織化学的試験用の組織切片および細胞懸濁物は一般的な組織学的技術により調製する。未知の組織および既知の対照の複数低温切片(約4um, 非固定)を載せ、各スライドを異なる希釈の抗体調製物で覆う。さらに、既知および未知の組織の切片を調製物で処理して正の対照、負の対照、例えば、免疫前血清、および非特異的染色の対照、例えば、バッファーも準備する必要がある。処理した切片を湿潤チャンバー内で室温で30分間インキュベートし、すすぎ、次いで、バッファーで30〜45分間洗浄する。過剰の液体を落として、マーカーを発色させる。第1のインキュベーションで組織特異的抗体が標識されなかった場合、第2の抗体-抗体反応の段階で、例えば、抗血清産生種の免疫グロブリンタイプに対するフルオレセインまたは酵素結合抗体、例えば、マウスIgGに対するフルオレセイン標識抗体を添加することにより標識することができる。かかる標識血清は商業的に入手可能である。前記の手順により組織で見つけられた抗原は、組織切片の色素または蛍光の強度を測定し、好適な標準を用いてそのシグナルを較正することによって定量できる。
【０７８７】
B. 組織特異的可溶性タンパク質の同定
組織特異的タンパク質の可視化およびその手順による未知の組織の同定は、免疫組織化学に関して記載されるように標識抗体試薬および検出手法を用いて行われる。しかしながら、サンプルは、検出を目的として組織から抽出されたタンパク質を分子量を基に規則正しく並べて分離する電気泳動法により調製される。組織サンプルをVirtis装置を用いてホモジェネートする。細胞懸濁物をDounceホモジナイゼーションまたは浸透溶解により破壊し、当技術分野では慣例であるように細胞膜を破壊する必要がある場合には界面活性剤を用いて破壊する。核、ミクロソーム、および膜断片などの不溶性細胞成分を超遠心分離により除去し、必要であれば可溶性タンパク質含有画分を濃縮して解析用に保存する。可溶性タンパク質溶液のサンプルは、例えば、Davisら, 第19-2節(1986)に記載の通常のSDSポリアクリルアミド電気泳動により、サンプルにおいて検出しようとするタンパク質の全分子量範囲を分離する一連のゲルに種々のポリアクリルアミド量を用いて個々のタンパク質種に分離する。構成タンパク質の分子量を推定するためにサイズマーカーを同時に流す。解析用のサンプルサイズは5〜55μlの扱いやすい量であり、約1〜100μgタンパク質を含有する。分離された各々のタンパク質のアリコートをニトロセルロースペーパーへのブロッティング、分離パターンを保持するプロセスにより転写する。複数のコピーを準備する。ウエスタンブロット解析として知られる手順についてはDavisら, (1986) 第19-3節で十分に記載されている。抗体結合タンパク質との比較のため、一連のニトロセルロースブロットをクーマシーブルー色素で染色し、一連のタンパク質全てを可視化する。次いで、残留するニトロセルロースフィルターを本明細書に記載のように作製された組織特異的タンパク質に対する1種以上の特異的抗血清の溶液と共にインキュベートする。前記手順Aの場合のように、この手順で好適な正および負のサンプル、ならびに試薬対照についても実施する。
手順AまたはBのいずれかにおいて、検出可能な標識を種々の手法およびその組合せによって一次組織抗原-一次抗体複合体に結合させることができる。直接的な手法では、一次特異的抗体を標識することができる。あるいは、非標識の複合体に標識された二次抗IgG抗体を結合させることもできる。別の手法では、一次または二次抗体のいずれかを後のステップでアビジン結合マーカーを結合できるビオチン分子に結合させる。さらにもう1つの手法によれば、いずれかのIgGとの結合特性を有する酵素標識または放射性プロテインAを最終ステップで一次または二次抗体のいずれかに結合させる。組織特異的抗原のcDNA配列から同定された遺伝子配列から作製される1種以上の組織特異的抗体との結合が、対照組織で見られるレベルよりも高いレベルで可視化されるため、起源が不明の組織、例えば、法医学的サンプル、または体の異なる部位へ転移した分化腫瘍組織が同定できる。
【０７８８】
異常なGENSETポリペプチド発現および／または生物活性のスクリーニングおよび診断
さらに、GENSETポリペプチド発現に特異的な抗体および／またはプライマーを使用して異常なGENSETポリペプチドの発現および／または生物活性を確認し、その後、異常なGENSETポリペプチド発現と関連のある疾患をスクリーニングおよび／または診断することができる。例えば、特定の疾病は、GENSETポリペプチドをコードするmRNAの発現欠如、過剰発現、または過小発現が原因となって起こると考えられる。健康個体から採取したサンプルと特定疾患にかかっている個体から採取したものとをそれらのmRNA発現パターンおよび量について比較することにより、この疾患の原因である遺伝子を同定しうる。さらに、このGENSETポリペプチドに特異的なプライマー、プローブおよび抗体を使用して、目的の遺伝子が特異的に発現される、またはその発現が特異的に脱調節される、すなわち、過小発現または過剰発現される疾患のスクリーニングおよび診断のキットを精巧に作製してもよい。
【０７８９】
特定疾患のスクリーニング
本発明はまた、GENSETポリペプチドのレベルが上昇しているかまたは低下している個体を同定するための方法およびGENSETポリペプチドの使用に関し、それによりその個体が各々、GENSETポリペプチドをコードする遺伝子発現を抑制または増強する治療法から恩恵を受けると思われる。かかる方法および使用の一例では
a)哺乳類から生物学的サンプルを準備し、
b)前記サンプル中のGENSETポリペプチドをコードする遺伝子産物(mRNAまたはタンパク質)の存在を検出し、
c)前記サンプル内に存在する前記GENSETポリペプチドをコードする遺伝子産物の量を対照サンプルのものと比較し、
d)前記ヒトまたは非ヒト哺乳類のGENSET遺伝子発現レベルが対照サンプルと比較して低下しているかまたは上昇しているかを調べる、
ことを含んでなる。
【０７９０】
GENSETポリペプチドと関連のあるいずれかの疾病または症状を患うまたは発症する危険性のある被験体由来の生物学的サンプルを正常集団(標準または対照)と比較して増加または低下レベルにあるGENSET遺伝子産物の存在についてスクリーニングすることができる。ここで、正常集団と比較して増加または低下レベルにあるGENSETポリペプチドは、疾病もしくは症状、または疾病もしくは症状と関連のあるいずれかの徴候に対する素因を示すかまたは現在徴候があることを示す。かかる個体は、治療法、例えば、GENSETポリペプチド、GENSETポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはGENSETポリペプチドの発現もしくは活性に作用する任意の他の化合物を含んでなる医薬組成物を用いた治療の候補であると考えられる。一般には、患者のGENSETポリペプチドレベルの上昇を確認することでGENSETポリペプチドの発現または活性を抑制する薬剤を用いた治療から恩恵を受けるであろう個体が示され、患者のGENSETポリペプチドレベルの低下を確認することでGENSETの発現または活性を誘導する薬剤を用いた治療から恩恵を受けるであろう個体が示される。
【０７９１】
この方法での使用に好適な生物学的サンプルとしては、限定されるものではないが、血液、唾液、乳汁、および尿をはじめとする任意の体液が挙げられる。本発明の方法ではGENSET遺伝子発現に関係のある任意の組織(例えば、表III-Vを参照)由来のサンプルをはじめとする組織サンプル(例えば、生検)もまた使用できる。例えば、組織生検由来の細胞培養物または細胞抽出物もまた使用できる。本発明の方法の検出ステップはタンパク質/mRNA検出のための標準プロトコールを用いて行うことができる。好適なプロトコールの例としては、ノーザンブロット解析、免疫学的検定(例えば、RIA、ウエスタンブロット、免疫組織化学法)、およびPCRが挙げられる。
【０７９２】
よって、本発明はさらに、異常なGENSETポリペプチドの発現または生物活性と関連した特定の疾病／疾患を発症する危険性が高いまたは現在その疾病／疾患にかかっている個体または非ヒト動物を同定するための方法およびGENSETポリペプチドの使用に関する。かかる方法および使用の一例では、
a)ヒトまたは非ヒト哺乳類から生物学的サンプルを準備し、
b)前記サンプル中のGENSET遺伝子産物(mRNAまたはタンパク質)の存在を検出し、
c)前記サンプル内に存在する前記GENSET遺伝子産物の量を対照サンプルのものと比較し、
d)前記ヒトまたは非ヒト哺乳類がある疾病または疾患を発症する危険性が高いかまたは現在その疾病または疾患にかかっているかを調べる、ことを含んでなる。
【０７９３】
好ましい実施形態では、生物学的サンプルがGENSET遺伝子産物と関連のある任意の疾病または症状に関連するいくつかの徴候を示している動物から採取される。この方法によれば、サンプル内の変化した(例えば、増加または低下した)レベルのGENSET産物の存在によって、被験体がその疾病または症状に対する素因があることが示される。この方法での使用に好適な生物学的サンプルとしては、限定されるものではないが、血液、唾液、乳汁、および尿をはじめとする体液が挙げられる。本発明の方法では表III-Vに記載の任意の組織由来のサンプルをはじめとする組織サンプル(例えば、生検)もまた使用できる。例えば、組織生検由来の細胞培養物または細胞抽出物もまた使用できる。
【０７９４】
本明細書に記載の診断手法はヒトおよび非ヒト哺乳類のいずれにも適用可能である。
【０７９５】
GENSET遺伝子突然変異の検出
本発明はまた、本発明のGENSETポリヌクレオチドにおける突然変異を検出するための方法およびGENSETポリヌクレオチドの使用を含む。かかる方法は、GENSET遺伝子、好ましくはそれらの調節領域に存在する変異を検出するのに有利に使用することができる。その突然変異がある疾病と関連があることが判明している場合には、かかる変異の検出をスクリーニングおよび診断目的で使用してもよい。
【０７９６】
本発明のオリゴヌクレオチドアレイの一実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブマトリックスが、GENSET遺伝子、好ましくはそれらの調節領域に存在する変異を検出するのに有利に使用することができる。この特定の用途では、プローブが、既知の変異(1個または数個のヌクレオチドの欠失、挿入または置換のいずれかによる)を有する遺伝子とのハイブリダイゼーションを可能にするヌクレオチド配列を有するように特別設計される。既知の変異とは、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるHuangら(1996)またはSamsonら(1996)によって使用された技術によって同定されたGENSET遺伝子における変異を意味する。
GENSET遺伝子における突然変異の検出に使用されるもう1つの技術は高密度DNAアレイの使用である。高密度DNAアレイの単位要素を構成している各オリゴヌクレオチドプローブはGENSETゲノムDNAまたはcDNAの特異的部分配列を適合させるよう設計される。従って、標的遺伝子配列の部分配列に相補的なオリゴヌクレオチドからなるアレイを使用して、野生型遺伝子配列を有する標的配列の同一性を調べ、その量を測定し、さらに標的配列とGENSET遺伝子の参照野生型遺伝子配列との差異を検出する。そのような設計の１つでは、いわゆる4Lタイルアレイ(tiled array)を、4つのプローブ(A、C、G、T)のセット、好ましくは15塩基のオリゴマーで準備する。4プローブのセット各々では、完全相補体が誤対合プローブよりも強くハイブリダイズする。そのため、長さLの核酸標的の変異が、4Lプローブ、すなわち、既知の野生型参照配列において起こり得る全ての変異を含有する全プローブセットを含むタイルアレイによりスキャンされる。15merプローブのセットのタイルアレイのハイブリダイゼーションシグナルは標的配列における単一塩基の変化により変動する。その結果として、変異位置と隣接するプローブではシグナルまたは「フットプリント」の特徴的な喪失がある。この技術は全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるCheeら 1996により記載されている。
【０７９７】
GENSET遺伝子発現パターンを有するDNA構築物の構築
さらに、GENSETポリペプチドをコードするmRNAの空間的および時間的発現パターンおよび発現レベルの特性決定は、以下で記載する所望の空間的または時間的様式で所望のレベルの遺伝子産物を産生し得る発現ベクターの構築にも有用である。
【０７９８】
組換え宿主細胞およびトランスジェニック動物における時間的および空間的GENSET遺伝子発現を指令するDNA構築物
GENSETポリペプチドの合成不足による生理学上および表現型における影響を細胞レベルおよび多細胞生物レベルで研究するために、本発明はまた、GENSETポリペプチドをコードするゲノム配列またはcDNAの特異的対立遺伝子、さらに配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列、またはその断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列に1個以上の塩基の置換、欠失、または付加を有する(これらの塩基置換、欠失または付加は、エクソン、イントロンもしくは調節配列内、好ましくは5'-調節配列内またはGENSETポリペプチドをコードするゲノム配列のエクソン内またはGENSETポリペプチドをコードするcDNA内のいずれかに位置している)このゲノム配列またはcDNAのコピー、の条件的な発現を可能にするDNA構築物および組換えベクターを含む。
【０７９９】
第1の好ましいDNA構築物は、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるGossenら(1992, 1995)およびFurthら(1994)に記載されたようにGENSET遺伝子発現を制御する大腸菌トランスポゾンTn10のテトラサイクリン耐性オペロンtetに基づいている。かかるDNA構築物は、最小のプロモーターまたはGENSET遺伝子の5'-調節配列のいずれか(前記最小プロモーターまたは前記GENSETポリヌクレオチド調節配列はセンスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはGENSETポリペプチドをはじめとするポリペプチド、もしくはそのペプチド断片のいずれかをコードする目的のポリヌクレオチドに機能し得る形で連結されている)と融合されるTn10 (tetop)に由来する7つのtetオペレーター配列を含む。このDNA構築物は、同じ細胞がHCMVIE1エンハンサー／プロモーターまたはMMTV-LTRなどのプロモーターの制御下におかれた、単純ヘルペスウイルスのウイルスタンパク質VP16の活性化ドメインと融合される野生型(tTA)または変異型(rTA)リプレッサーのいずれかをコードするヌクレオチド配列も含んでなる場合に、目的のヌクレオチド配列の条件的発現系として機能する。実際には、好ましい本発明のDNA構築物は、tetオペレーター配列を含むポリヌクレオチドとtTAまたはrTAリプレッサーをコードする配列を含むポリヌクレオチドとの両方を含んでなる。ある特定の実施形態では、条件的発現DNA構築物は、変異型テトラサイクリンリプレッサーrTAをコードする配列を含んでおり、目的のポリヌクレオチドの発現はテトラサイクリンの不在下ではサイレントであり、その存在下において誘導される。
【０８００】
相同組換えを可能にするDNA構築物: 置換ベクター
第2の好ましいDNA構築物は、5'末端から3'末端までに: (a)GENSETポリペプチドをコードするゲノム配列に見られる第1のヌクレオチド配列; (b)ネオマイシン耐性についてのマーカー(neo)などの正の選択マーカーを含んでなるヌクレオチド配列; および(c)GENSETポリペプチドをコードするゲノム配列に見られる、第1のGENSETポリペプチドをコードするヌクレオチド配列(a)の下流にあるゲノムに位置する第2のヌクレオチド配列、を含む。
好ましい実施形態では、このDNA構築物はまた、ヌクレオチド配列(a)の上流またはヌクレオチド配列(c)の下流に位置する負の選択マーカーも含んでなる。好ましくは、負の選択マーカーは、チミジンキナーゼ(tk)遺伝子(Thomasら, 1986)、ハイグロマイシンβ遺伝子(Te Rieleら, 1990)、hprt遺伝子(Van der Lugtら, 1991; Reidら, 1990)またはジフテリア毒素A断片(Dt-A)遺伝子(Nadaら, 1993; Yagiら1990)を含んでなる(なお、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。好ましくは、正の選択マーカーはGENSETエクソン配列内に位置しており、GENSETポリペプチドをコードする配列を分断している。これらの置換ベクターについては、例えば、Thomasら(1986; 1987)、Mansourら(1988)およびKollerら(1992)に記載されている。
第1および第2のヌクレオチド配列(a)および(c)は、独立してGENSETポリペプチドをコードする調節配列、イントロン配列、エクソン配列、または調節および／もしくはイントロンおよび／もしくはエクソン配列を含む配列内に存在してよい。ヌクレオチド配列(a)および(c)のサイズは1〜50kb、好ましくは1〜10kb、より好ましくは2〜6kbおよび最も好ましくは2〜4kbにおよぶ。
【０８０１】
相同組換えを可能にするDNA構築物: Cre-LoxP系
これらの新規DNA構築物はP1ファージの部位特異的組換え系を利用する。P1ファージは34塩基対のloxP部位と特異的に相互作用するCreと呼ばれるリコンビナーゼを有している。loxP部位は8bpの保存配列で隔てられた13bpの2つのパリンドローム配列で構成される(Hoessら, 1986)(なお、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。同じ配向を有する2つのloxP部位間でCre酵素により組換えが起こることによってDNA断片が欠失がする。
【０８０２】
相同組換え技術と組み合わせて使用されるCre-loxP系は最初に全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるGuら(1993, 1994)によって記載された。要するに、標的とするゲノム位置に挿入しようとする目的のヌクレオチド配列は同じ配向を有する少なくとも2つのloxP部位を有し、組換えゲノムから切除しようとするヌクレオチド配列の各々の末端に位置している。この切除事象には、宿主細胞組換え体の核内にリコンビナーゼ(Cre)酵素の存在が必要である。リコンビナーゼ酵素は、所望の時点において、(a)この酵素を含む培地で宿主細胞組換え体をインキュベートする、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるArakiら(1995)に記載されたように所望の細胞にCre酵素を直接注入する、または、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるBaubonisら(1993)に記載されたように細胞に酵素をリポフェクションする、(b)例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるGuら(1993)およびSauerら(1988)に記載されたように宿主細胞を宿主細胞組換え体内で機能を有するプロモーターに機能し得る形で連結されたCreコード配列を含んでなるベクターでトランスフェクトする(前記プロモーターは所望により誘導可能であり、かつ前記ベクターは宿主細胞組換え体に導入される)、(c)例えば、Guら(1994)に記載されたように宿主細胞のゲノムに宿主細胞組換え体内で機能を有するプロモーターに機能し得る形で連結されたCreコード配列を含んでなるポリヌクレオチドを導入する(前記プロモーターは所望により誘導可能であり、かつ前記ポリヌクレオチドはランダム挿入事象または相同組換え事象のいずれかにより宿主細胞のゲノムに挿入される)、のいずれかにより準備してもよい。
【０８０３】
ある特定の実施形態では、相同組換えによってGENSET遺伝子に挿入しようとする配列を含むベクターは同じ配向を有するloxP部位が選択マーカーの配列に隣接するように構築されるため、Cre酵素での処理により選択マーカーを除去し、相同組換え事象によって挿入された目的のGENSET配列を残すことが可能である。さらに、2つの選択マーカー、すなわち組換え事象を選択するための正の選択マーカーと相同組換え事象を選択するための負の選択マーカーが必要である。Cre-loxP系を用いたベクターおよび方法については全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるZouら(1994)に記載されている。
よって、第3の好ましい本発明のDNA構築物は、5'末端から3'末端までに: (a)GENSETゲノム配列に含まれる第1のヌクレオチド配列; (b)正の選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含んでなるヌクレオチド配列(このヌクレオチド配列はloxP部位などのリコンビナーゼによって認識される部位を明確にする同じ配向に置かれたさらなる2つの配列を含んでなる);ならびに(c)GENSETゲノム配列に含まれる、第1のGENSETヌクレオチド配列(a)の下流にあるゲノムに位置する第2のヌクレオチド配列、を含んでなる。
loxP部位などのリコンビナーゼによって認識される部位を明確にする配列は、好ましくは条件的切除が求められるヌクレオチド配列に隣接する好適な位置にあるヌクレオチド配列(b)内に位置している。ある特定の実施形態では、2つのloxP部位は正の選択マーカー配列の両側に位置しており、相同組換え事象が起こった後の所望の時点でのその切除が可能である。
【０８０４】
前記の第3のDNA構築物を用いた方法の好ましい実施形態では、例えば、Guら(1994)に記載されたように、プロモーター配列、好ましくは誘導プロモーター、より好ましくは組織特異的プロモーター配列、および最も好ましくは誘導的でも組織特異的でもあるプロモーター配列に機能し得る形で連結されたCre酵素をコードする配列が宿主細胞組換え体のゲノム内に存在するため、リコンビナーゼによって認識される2つの部位、好ましくは2つのloxP部位が隣接するポリヌクレオチド断片の切除は所望の時点で行われる。
【０８０５】
例えば、Guら(1994)に記載されたように、宿主細胞組換え体のゲノム内にCre酵素を存在させることは、2種類のトランスジェニック動物、すなわち前記のようなloxP部位を含有する目的のGENSET由来の配列を有する第1のトランスジェニック動物と好適なプロモーター配列に機能し得る形で連結されたCreコード配列を有する第2のトランスジェニック動物との交配の結果として果たされ得る。
【０８０６】
Cre酵素発現の時空間的制御は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるAntonおよびGraham(1995)ならびにKanegaeら(1995)に記載されたように、Cre酵素の送達を目的とした細胞の感染、または器官のin vivo感染を可能にするCre遺伝子を含むアデノウイルス系ベクターを用いても達成することができる。
【０８０７】
前記のDNA構築物を使用して本発明の所望のヌクレオチド配列、好ましくはGENSETゲノム配列またはGENSET cDNA配列、および最も好ましくはGENSETゲノムまたはcDNA配列の改変されたコピーを標的とするゲノムの所定の位置に導入して、標的とする遺伝子の改変されたコピーの作製(ノックアウト相同組換え)または標的とする遺伝子のコピーの相同組換え事象が起こり得るのに十分に相同な別のコピーとの置き換え(ノックイン相同組換え)のいずれかを誘導し得る。
【０８０８】
GENSETポリペプチド発現および／または生物活性の改変
内因性GENSET発現および／または生物活性の改変は明示的に本発明に含まれる。
GENSET発現および／または生物活性を調節する化合物についてのスクリーニング
本発明はさらにGENSET発現および／または生物活性を調節し得る化合物ならびにこれらの化合物を使用する方法に関する。かかる化合物はGENSET遺伝子の調節配列と相互作用するか、またはそれらがGENSETポリペプチドと直接または間接的に相互作用すると考えられる。
【０８０９】
GENSET調節配列と相互作用する化合物
本発明はまた、例えば、「クローニングされた上流配列でのプロモーターの同定」と題した節で記載したものをはじめとする当業者に公知の任意の技術を用いて決定されたゲノムDNAの非転写領域のプロモーターまたはエンハンサー配列などの、またはGENSET mRNAの非翻訳領域に位置する調節配列などのGENSET遺伝子の調節配列と相互作用し得る物質または分子をスクリーニングする方法に関する。
【０８１０】
本発明のポリヌクレオチドの非転写または非翻訳領域内の配列は、転写開始部位、転写因子結合部位、プロモーター配列、エンハンサー配列、5'UTRおよび3'UTRエレメントなどの既知の調節配列を有するデータベース(Pesoleら, 2000; http://igs-server.cnrs-mrs.fr/~gauthere/UTR/index.html)との比較により同定してもよい。あるいは、目的の調節配列を、例えば、「クローニングされた上流配列でのプロモーターの同定」と題した節で記載した技術を用いたリポータープラスミドの従来の突然変異または欠失解析によって同定してもよい。
【０８１１】
可能性あるGENSET調節配列の同定を受けて、これらの調節配列と相互作用するタンパク質を以下で記載するように同定してもよい。
【０８１２】
例えば、これらの公報の教示が参照により本明細書に組み入れられるFriedおよびCrothers(1981)、GarnerおよびRevzin(1981)ならびにDentおよびLatchman(1993)に記載されたように、GENSET遺伝子の調節配列と相互作用し得る候補分子をスクリーニングするためにゲル遅延アッセイを独立して行ってもよい。これらの技術はタンパク質と結合するDNAまたはmRNA断片が結合していない同じDNAまたはmRNA断片よりも移動が遅いという原理に基づいている。要するに、標的ヌクレオチド配列を標識する。次いで、標識した標的ヌクレオチド配列を調節因子を含む細胞由来の全核抽出物、または調べようとする異なる候補分子のいずれかと接触させる。GENSET遺伝子の標的調節配列と候補分子または調節因子との間の相互作用はゲルまたはキャピラリー電気泳動後に移動の遅延によって検出される。
GENSET遺伝子のプロモーター配列、より詳しくは5'および3'調節領域のポリヌクレオチドまたはその断片もしくは変異体からなる群から選択されるヌクレオチド配列と相互作用し得るタンパク質をコードする核酸は、ClontechのMatchmaker 1-ハイブリッド系キットに同封される小冊子(それらの技術的な教示が参照により本明細書に組み入れられるカタログ参照番号K1603-1)に記載されたものなどの1-ハイブリッド系を用いて同定してもよい。要するに、標的ヌクレオチド配列を選択可能なリポーター配列の上流にクローニングし、得られたポリヌクレオチド構築物を酵母ゲノム(サッカロミセス・セレビシエ)に組み込む。好ましくは、標的配列の複数コピーをリポータープラスミドに一列に並べて挿入する。次いで、ゲノムにリポーター配列を含む酵母細胞をGENSET遺伝子の調節配列に結合する候補タンパク質をコードするcDNAとGAL4などの酵母転写因子のアクチベータードメインをコードする配列との融合分子を含んでなるライブラリーで形質転換する。リポーター配列を発現する細胞を選抜するために酵母細胞組換え体を培養ブロスで培養する。このように選抜された酵母細胞組換え体はGENSET遺伝子の標的調節配列に結合し得る融合タンパク質を含んでいる。次いで、融合タンパク質をコードするcDNAを配列決定して、これらを発現または転写ベクターにin vitroクローニングしてもよい。コードされたポリペプチドのGENSET遺伝子の標的調節配列への結合はゲル遅延アッセイまたはDNAse保護アッセイなどの当業者に公知の技術により確認してもよい。
【０８１３】
GENSETポリペプチドと相互作用するリガンド
本発明の目的では、リガンドは、GENSETタンパク質、またはその断片もしくは変異体の1つ、と結合し得る、あるいはGENSETまたはその断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドの発現を調節する、タンパク質、ペプチド、抗体もしくは任意の合成化学化合物などの分子を意味する。
【０８１４】
本発明のリガンドスクリーニング方法では、GENSETタンパク質の推定リガンドとして調べようとする生物学的サンプルまたは定義された分子を対応する精製GENSETタンパク質、例えば、本明細書に記載の宿主細胞組換え体によって産生される対応する精製組換えGENSETタンパク質と接触させ、このタンパク質と調べようとする推定リガンド分子との間に複合体を形成させる。
【０８１５】
例として、配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドからなる群から選択される連続した少なくとも6個のアミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50、または100個のアミノ酸の長さのポリペプチドを含んでなるGENSETタンパク質またはその断片の、コンビナトリアルケミストリー手法により作製された分子などの薬剤または小分子との相互作用を調べるには、微量透析法をWangら(1997)に記載されたHPLC法またはBushら(1997)に記載されたアフィニティーキャピラリー電気泳動法と組み合わせて(なお、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)使用できる。
【０８１６】
さらなる方法では、配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドからなる群から選択される連続した少なくとも6個のアミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50、または100個のアミノ酸の長さのポリペプチドを含んでなるGENSETタンパク質またはその断片と相互作用するペプチド、薬剤、脂肪酸、リポタンパク質、または小分子を、以下のようなアッセイを用いて同定してもよい。結合について調べようとする分子を、蛍光、放射性、または酵素タグなどの検出可能な標識で標識し、特異的結合を起こさせる条件下で固定化されたGENSETタンパク質またはその断片と接触させて置く。特異的に結合していない分子を除去した後、結合分子を好適な手段を用いて検出する。
【０８１７】
種々の候補物質または分子をGENSETポリペプチドとの相互作用についてアッセイすることができる。これらの物質または分子としては、限定されるものではないが、ポリペプチドなどの生物起源の天然または合成有機化合物もしくは分子が挙げられる。候補物質または分子があるポリペプチドを含んでなる場合、このポリペプチドはファージに基づくランダムペプチドライブラリーに属するファージクローンの得られる発現産物であるか、あるいはこのポリペプチドはツーハイブリッドスクリーニングアッセイを実施するのに好適なベクターにクローニングされたcDNAライブラリーの得られる発現産物であると考えられる。
【０８１８】
A. ランダムペプチドライブラリーから得られる候補リガンド
スクリーニング方法の特定の実施形態では、推定リガンドはファージベクターに含まれるDNAインサートの発現産物である(ParmleyおよびSmith, 1988)。特に、ランダムペプチドファージライブラリーが使用される。ランダムDNAインサートは8〜20個のアミノ酸の長さのペプチドをコードする(Oldenburgら, 1992; Valadonら, 1996; Lucas, 1994; Westerink, 1995; Feliciら, 1991)(なお、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。この特定の実施形態によれば、固定化されたGENSETタンパク質と結合するタンパク質を発現する組換えファージが保持され、続いて、GENSETタンパク質と組換えファージとの間に形成された複合体をGENSETタンパク質に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体により免疫沈降してもよい。
【０８１９】
組換えファージのリガンドライブラリーを構築した後、ファージ集団を固定化されたGENSETタンパク質と接触させる。次いで、複合体の調製物を洗浄し、特異的に結合していない組換えファージを除去する。次いで、GENSETタンパク質に特異的に結合するファージをバッファー(酸pH)により溶出するか、またはハイブリドーマ抗GENSETにより産生されたモノクローナル抗体により免疫沈降し、続いて、このファージ集団を細菌の過剰感染(例えば、大腸菌)により増幅させる。選抜ステップを数回、好ましくは2〜4回繰り返してより特異性の高い組換えファージクローンを選抜してもよい。最終ステップは感染細菌における発現および単離により選抜された組換えファージクローンにより産生されるペプチドを特性決定するか、ファージインサートを別の宿主-ベクター系で発現させるか、または選抜された組換えファージに含まれるインサートを配列決定することを含んでなる。
【０８２０】
B. 競合試験により得られる候補リガンド
また、配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドからなる群から選択される連続した少なくとも6個のアミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50、または100個のアミノ酸の長さのポリペプチドを含んでなるGENSETタンパク質またはその断片と結合するペプチド、薬剤または分子を競合試験で同定してもよい。かかるアッセイでは、GENSETタンパク質またはその断片をプラスチックプレートなどの表面に固定化する。ペプチド、薬剤または小分子を、その量を増大させながら、検出可能に標識した既知のGENSETタンパク質リガンドの存在下で、固定化されたGENSETタンパク質、またはその断片と接触させる。例えば、GENSETリガンドを蛍光、放射性、または酵素タグで検出可能なように標識してもよい。試験分子がGENSETタンパク質またはその断片と結合する能力は試験分子の存在下で結合した検出可能に標識した既知のリガンドの量を測定することにより調べる。試験分子が存在する場合にGENSETタンパク質またはその断片と結合する既知のリガンド量が減少することから、その試験分子がGENSETタンパク質またはその断片と結合可能であることが示される。
【０８２１】
C. アフィニティークロマトグラフィーにより得られる候補リガンド
配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドからなる群から選択される連続した少なくとも6個のアミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50、または100個のアミノ酸の長さのポリペプチドを含んでなるGENSETタンパク質またはその断片と相互作用するタンパク質またはその他の分子は、GENSETタンパク質またはその断片を含むアフィニティーカラムを用いても見い出すことができる。GENSETタンパク質またはその断片を、アガロース、Affi Gel(登録商標)などの好適なカラムマトリックス、または当業者に一般的なその他のマトリックスとの化学結合をはじめとする従来の技術を用いてカラムに結合させてもよい。この方法のいくつかの実施形態では、アフィニティーカラムに、GENSETタンパク質またはその断片がグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)と融合されたキメラタンパク質が含まれる。前記のような細胞タンパク質混合物または発現タンパク質のプールをアフィニティーカラムにアプライする。次いで、カラムに結合したGENSETタンパク質またはその断片と相互作用するタンパク質またはその他の分子を、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるRamunsenら(1997)に記載されたように単離し、2-D電気泳動ゲルで解析することができる。あるいは、アフィニティーカラムに保持されたタンパク質を電気泳動に基づく方法により精製し、配列決定することができる。同じ方法を用いて、抗体を単離する、ファージディスプレイ産物をスクリーニングする、またはファージディスプレイヒト抗体をスクリーニングすることができる。
【０８２２】
D. 光学バイオセンサー法により得られる候補リガンド
配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドからなる群から選択される連続した少なくとも6個のアミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50、または100個のアミノ酸の長さのポリペプチドを含んでなるGENSETタンパク質またはその断片と相互作用するタンパク質はまた、それらの開示内容が参照により本明細書に組み入れられるEdwardsおよびLeatherbarrow(1997)ならびにSzaboら(1995)に記載されたように光学バイオセンサー（Optical Biosensor）を用いてスクリーニングすることができる。この技術は標識分子を必要とせず、リアルタイムでの分子間の相互作用の検出を可能にする。この技術は表面プラズモン共鳴(SPR)現象に基づいている。要するに、調べようとする候補リガンド分子を表面(カルボキシメチルデキストランマトリックスなど)に固定化する。調べようとするサンプルを含んでいない表面の側に光ビームを当てると、その表面により光ビームが反射する。SPR現象は角度と波長の固有の関係によって反射光強度の低下をもたらす。候補リガンド分子の結合により表面での屈折率の変化が起こり、この変化がSPRシグナルの変化として検出される。GENSETタンパク質またはその断片と相互作用し得る候補リガンド分子または物質のスクリーニングでは、GENSETタンパク質またはその断片を表面に固定化する。この表面はアッセイしようとする候補分子を流すセルの片側を含んでなる。GENSETタンパク質またはその断片への候補分子の結合がSPRシグナルの変化として検出される。調べる候補分子はコンビナトリアルケミストリーにより作製されたタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または小分子としうる。この技術はそれらの表面に内因性または組換え発現GENSETタンパク質を提示する真核もしくは原核細胞または脂質ビヒクルを固定化することによって行ってもよい。
【０８２３】
この方法の主な利点は、GENSETタンパク質とGENSETタンパク質と相互作用する分子との間の結合速度の測定が可能になることである。その結果として、GENSETタンパク質またはその断片と相互作用するリガンド分子を高いまたその逆でもある低い結合定数により特異的に選択することができる。
【０８２４】
E. ツーハイブリッドスクリーニングアッセイにより得られる候補リガンド
酵母ツーハイブリッド系はin vivoのタンパク質-タンパク質相互作用を調べるために設計されており(Fields and Song, 1989)(なお、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)、ベイトタンパク質（おとりタンパク質）の酵母Gal4タンパク質のDNA結合ドメインとの融合に依存する。この技術は米国特許第5,667,973号および同第5,283,173号にも記載されており、両特許の技術的な教示が参照により本明細書に組み入れられる。
【０８２５】
ツーハイブリッドアッセイによるライブラリースクリーニングの一般的な手順は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるHarperら(1993)またはChoら(1998)さらにまたはFromont-Racineら(1997)に記載されたように行ってもよい。
【０８２６】
ベイトタンパク質またはポリペプチドは、配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドからなる群から選択される連続した少なくとも6個のアミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50、または100個のアミノ酸の長さのポリペプチドを含んでなるGENSETポリペプチドまたはその断片を含んでなる、それから本質的になる、またはそれからなるものである。
【０８２７】
さらに正確には、GENSETポリペプチドまたはその断片もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列をGAL4タンパク質のDNA結合ドメインをコードするポリヌクレオチドと融合し、融合したヌクレオチド配列を好適な発現ベクター、例えば、pAS2またはpM3に挿入する。
【０８２８】
次いで、ヒトcDNAライブラリーを、ヒトcDNAインサートがGAL4タンパク質の転写ドメインをコードするベクターのヌクレオチド配列と融合されるように特別設計されたベクターで構築する。好ましくは、使用するベクターがpACTベクターである。ヒトcDNAライブラリーのヌクレオチドインサートによりコードされるポリペプチドは「プレイ(prey)」ポリペプチドと呼ばれる。
【０８２９】
第3のベクターは、転写活性化ドメインおよびDNA結合ドメインの両方を有する完全Gal4 タンパク質の結合に応答する調節配列の制御下におかれたβ-ガラクトシダーゼ遺伝子またはCAT遺伝子などの検出マーカー遺伝子を含む。例えば、ベクターpG5ECを使用しうる。
また、2種類の異なる酵母株も使用される。限定されるものではないが、例として、2種類の異なる酵母株は以下のものであってよい:
- Y190、この表現型は(MATa、Leu2-3、112 ura3-12、trp1-901、his3-D200、ade2-101、gal4Dgal180D URA3 GAL-LacZ、LYS GAL-HIS3、cyhr)である;
- Y187、この表現型は(MATa gal4 gal80 his3 trp1-901 ade2-101 ura3-52 leu2-3、-112 URA3 GAL-lacZmet-)であり、これはY190とは異なる接合型である。
【０８３０】
要するに、20μgのpAS2/GENSETと20μgのpACT-cDNAライブラリーを酵母株Y190に共形質転換する。ヒスチジン、ロイシンおよびトリプトファンを含有しないが、ヒスチジン合成阻害剤3-AT(50mM)を含有する最少培地での増殖により、形質転換体を選抜する。フィルターリフトアッセイにより陽性コロニーをβ-ガラクトシダーゼについてスクリーニングする。次いで、二重陽性コロニー(His+、β-gal+)を、ヒスチジン、ロイシンを含有しないが、トリプトファンおよびシクロヘキシミド(10mg/ml)を含有するプレートで増殖させ、pAS2/GENSETプラスミドを喪失しpACT-cDNAライブラリープラスミドを保持しているものについて選抜する。全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるHarperら(1993)およびBramら(1993)に記載されたように、得られたY190株をGENSETまたは無関係の対照タンパク質（シクロフィリンB、ラミンまたはSNF1など）をGal4融合物として発現するY187株と接合させ、フィルターリフトアッセイによりβ-ガラクトシダーゼについてスクリーニングする。対照Gal4融合物と接合させた後にβ-gal-である酵母クローンは偽陽性とみなされる。
【０８３１】
本発明のツーハイブリッド法のもう1つの実施形態では、GENSETまたはその断片もしくは変異体と細胞タンパク質との間の相互作用をMatchmaker ツーハイブリッド系2(カタログ番号K1604-1, Clontech)を用いて評価してもよい。その開示内容が参照により本明細書に組み入れられるキットに同封のマニュアルに記載されるように、GENSETタンパク質またはその一部をコードする核酸をそれらが酵母転写活性化因子GAL4のDNA結合ドメインをコードするDNAとフレームを合わせて発現ベクターに挿入する。所望のcDNA、好ましくはヒトcDNAをそれらがGAL4の活性化ドメインをコードするDNAとフレームを合わせて第2の発現ベクターに挿入する。2つの発現プラスミドを酵母に形質転換し、その酵母を各発現ベクターでの選択マーカーの発現ならびにHIS3遺伝子のGAL4依存的発現について選抜する選抜培地で培養する。ヒスチジン不含の培地で増殖可能な形質転換体をGAL4依存的lacZ発現についてスクリーニングする。ヒスチジン選抜およびlacZアッセイの両方で陽性である細胞はGENSETと最初に選択されたcDNAインサートによりコードされるタンパク質またはペプチドとの間に相互作用が見られる。
【０８３２】
GENSET生物活性を調節する化合物
GENSET発現および／または生物活性を調節する化合物のもう1つのスクリーニング方法は、試験化合物の特異的な生物活性、例えば、宿主細胞におけるGENSET生物活性への影響を測定することにより行う。ある実施形態では、本発明は、GENSET生物活性を変化させる薬剤を同定する方法であって、哺乳類GENSETポリペプチドをコードする核酸を含んでなる核酸構築物を宿主細胞に導入する方法に関する。得られた宿主細胞を、コードされる哺乳類GENSETポリペプチドの発現に好適な条件下で維持し、それによって核酸を発現させる。次いで、宿主細胞を評価しようとする化合物(「薬剤」または「試験薬剤」)と接触させ、細胞の特性を評価する。薬剤の存在下で何らかのGENSETポリペプチド関連特性の変化が検出されることでその薬剤がGENSET活性を変化させていることを示している。特定の実施形態では、本発明は、GENSET活性の活性剤である薬剤を同定する方法であって、薬剤の存在下での何らかのGENSETポリペプチド関連特性の増強の検出がその薬剤がGENSET活性を活性化していることを示す方法に関する。もう1つの特定の実施形態では、本発明は、GENSET活性の阻害剤である薬剤を同定する方法であって、薬剤の存在下での何らかのGENSETポリペプチド関連特性の低下の検出がその薬剤がGENSET活性を阻害していることを示す方法に関する。
【０８３３】
特定の実施形態では、ハイスループットスクリーニングを用いてGENSET活性を活性化する(増強する)または阻害する薬剤を同定することができる(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるPCT公報WO98/45438を参照)。例えば、GENSET活性を変化させる薬剤の同定方法を以下のように実施することができる。哺乳類GENSETポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる核酸構築物を宿主細胞に導入して宿主細胞組換え体を作製する。次いで、この宿主細胞組換え体を、コードされる哺乳類GENSETポリペプチドの発現に好適な条件下で維持し、それによって核酸を発現させる。評価しようとする化合物を宿主細胞組換え体に添加し、得られたコンビネーションを試験サンプルとする。検出可能な、細胞のGENSETポリペプチド関連特性を検出する。GENSET活性を変化させる薬剤の検出方法には対照を使用することができる。例えば、対照サンプルには同じ試薬を含めるが、評価される化合物または薬剤は含めない。これは試験サンプルと同様に処理される。
【０８３４】
GENSET発現および／または活性を調節する化合物についてのスクリーニング方法
本発明はまた、化合物をGENSETの活性または発現を調節する(例えば、増強するまたは阻害する)それらの能力についてスクリーニングする方法に関する。より詳しくは、本発明は、化合物をGENSETの発現または活性を増強するまたは低下させるそれらの能力について調べる方法に関する。このアッセイはin vitroまたはin vivoで行われる。
【０８３５】
in vitro法
in vitroにおいて、GENSETポリペプチドを発現する細胞を試験化合物の存在および不在下でインキュベートする。試験化合物の存在下でのGENSET発現のレベルまたは試験化合物の存在下でのGENSET活性のレベルを調べることによりGENSET発現または活性を抑制するまたは増強する化合物を同定することができる。また、リポーター遺伝子(例えば、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、LacZ、緑色蛍光タンパク質など)に機能し得る形で連結されたGENSET調節配列を含んでなる構築物を宿主細胞に導入して、試験化合物のリポーター遺伝子の発現に及ぼす影響を検出することができる。前記アッセイでの使用に好適な細胞としては、限定されるものではないが、表III、IV、またはVのデータによりポリペプチドが発現されることが分かっている組織または細胞系と同じ起源を有する細胞が挙げられる。
【０８３６】
よって、本発明はGENSET遺伝子の発現を調節する分子をスクリーニングする方法であって、
a)GENSETタンパク質またはその変異体もしくは断片をコードするヌクレオチド配列でトランスフェクトし、それ自身のプロモーターの制御下に置かれた原核または真核細胞を培養し、
b)前記培養細胞を調べようとする分子と接触させ、
c)前記分子の存在下での前記GENSETタンパク質またはその変異体もしくは断片の発現を定量する、
ことを含んでなる方法を含む。
【０８３７】
当業者に周知のDNA組換え技術を用いて、GENSETタンパク質をコードするDNA配列を、発現ベクターにそのプロモーター配列の下流において挿入する。例として、GENSET遺伝子のプロモーター配列はGENSETゲノムDNAの5'非転写領域に含まれる。
GENSETタンパク質の発現の定量は、mRNAレベル(例えば、ノーザンブロット、RT-PCR、好ましくは目的のGENSET mRNAに特異的なプライマーおよびプローブを用いる定量的RT-PCRを使用する)またはタンパク質レベル(ELISAもしくはRIAアッセイなどの免疫学的検定、ウエスタンブロット、または免疫化学においてポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を使用する)のいずれかで行うことができる。
【０８３８】
本発明はまたGENSET遺伝子の発現のレベルを増強し得る、またはそれとは逆に低下し得る物質または分子をスクリーニングする方法に関する。かかる方法によって当業者は、GENSET遺伝子の発現レベルに調節作用を有し、さらにGENSET産物の異常レベルと関連のある疾患にかかっている患者を治療する医薬組成物に含まれる有効成分として有用であり得る物質を選択することが可能になるであろう。
よって、本発明は別の部分において、GENSET遺伝子の発現を調節する候補分子をスクリーニングする方法であって、
a)検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能し得る形で連結されたGENSET 5'調節領域またはその調節活性断片もしくは変異体を含んでなる核酸を含む宿主細胞組換え体を準備し、
b)候補分子を入手し、
c)前記候補分子の、検出可能なタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドの発現レベルを調節する能力を調べる、
ことを含んでなる方法である。
【０８３９】
さらなる実施形態では、GENSET 5'調節領域またはその調節活性断片もしくは変異体を含んでなる前記核酸は、配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列、寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列、その調節活性断片および変異体の5'UTRからなる群から選択されるGENSET cDNAの5'UTR領域を含む。前記スクリーニング方法のより好ましい実施形態では、前記核酸がGENSET 5'UTR配列に関して内因性であるプロモーター配列を含む。前記スクリーニング方法のもう1つのより好ましい実施形態では、前記核酸が本明細書で定義したGENSET 5'UTR配列に関して外因性であるプロモーター配列を含む。
【０８４０】
検出可能なタンパク質をコードする好ましいポリヌクレオチドは、β-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質(GFP)およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)をコードするポリヌクレオチドである。
本発明はさらに、GENSET遺伝子の発現を調節する候補分子をスクリーニングし、さらに同定された分子と製薬上許容される担体とを混合する方法を含んでなる、医薬組成物の製造方法に関する。
【０８４１】
本発明はまた、GENSET遺伝子の発現を調節する候補物質をスクリーニングするキットに関する。好ましくは、かかるキットは、検出可能なタンパク質あるいはGENSETタンパク質またはその断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドに機能し得る形で連結されたGENSET 5'調節領域またはその調節活性断片もしくは変異体の発現を可能にする組換えベクターを含んでなる。より好ましくは、かかるキットは、検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能し得る形で連結された、配列番号1〜169、339〜455、561〜784の配列、寄託されたクローンプールのクローンインサートの配列、その調節活性断片および変異体の5'UTRを含む群から選択されるGENSET cDNAの5'UTR領域を含む核酸を含んでなる組換えベクターを含む。
上記のスクリーニング方法を実施するのに有用な好適な組換えベクターの設計に関しては、本発明の好ましい組換えベクターを詳述する本明細書の節を参照されたい。
【０８４２】
本発明のもう1つの目的は、GENSETポリペプチド、その断片または変異体と相互作用する候補物質をスクリーニングする方法およびキットを含む。これらの物質または分子は、それらのGENSETタンパク質、その断片または変異体と共有または非共有結合する能力により、in vitroおよびin vivoのいずれにおいても有利に使用することができる。
【０８４３】
in vitroでは、相互作用する前記分子を検出手段として使用して、サンプル、好ましくは生物学的サンプル中のGENSETタンパク質の存在を確認してもよい。
【０８４４】
GENSETポリペプチド、その断片または変異体と相互作用する候補物質をスクリーニングする方法であって、
a)配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドからなる群から選択される連続した少なくとも6個のアミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50、または100個のアミノ酸の長さのポリペプチドを含んでなるGENSETタンパク質、または断片を含んでなる、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチドを準備し、
b)候補物質を入手し、
c)前記ポリペプチドを前記候補物質と接触させ、
d)前記ポリペプチドと前記候補物質との間で形成された複合体を検出する、
ことを含んでなる方法。
本発明はさらに、GENSETポリペプチド、その断片または変異体と相互作用する候補物質をスクリーニングし、さらに同定された物質と製薬上許容される担体とを混合する方法を含んでなる、医薬組成物の製造方法に関する。
【０８４５】
本発明はさらに、GENSETポリペプチドと相互作用する候補物質をスクリーニングするキットであって、
a)配列番号170〜338、456〜560、785〜918の配列および寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチドからなる群から選択される連続した少なくとも6個のアミノ酸、好ましくは少なくとも8〜10個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも12、15、20、25、30、40、50、または100個のアミノ酸の長さのポリペプチドを含んでなるGENSETタンパク質またはその断片を含んでなる、それから本質的になる、またはそれからなるポリペプチド、および
b)所望により、前記ポリペプチドまたはその変異体と候補物質との間で形成された複合体を検出するのに有用な手段、
を含んでなるキットに関する。
【０８４６】
前記キットの好ましい実施形態では、検出手段が前記GENSETタンパク質またはその断片もしくは変異体と結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含んでなる。
【０８４７】
in vivo法
GENSET発現を抑制するまたは増強する化合物は、in vivoスクリーニングを用いても同定することができる。これらのアッセイでは、試験化合物を動物に、例えば、種々の投与量レベルで(例えば、IV、IP、IM、経口、または別の方法で)投与する。化合物のGENSET発現への影響は、例えば、表III、IV、またはVから得られるデータにより上記のようにノーザンブロット、免疫学的検定、PCRなどを用いて、目的の遺伝子を発現することが分かっている組織などにおけるGENSETレベルを比較して調べる。好適な試験動物としては、限定されるものではないが、齧歯動物(例えば、マウスおよびラット)、霊長類、およびウサギが挙げられる。内因性マウスタンパク質を除去し(ノックアウトし)て標準トランスジェニック手法により相同なヒトタンパク質を戻し入れたマウスであるヒト化マウスを試験動物として使用することもできる。かかるマウスはヒト型タンパク質のみ発現する。ヒトGENSETのみを発現するヒト化マウスを使用してGENSETタンパク質またはmRNAレベルを調節する有望な薬剤に対するin vivo応答性を調べることができる。例として、ヒトapoE4遺伝子を有するトランスジェニックマウスが作製されている。次いで、それらを内因性apoEを欠くマウス系と交配させ、アルツハイマー病を進行させ得るものと考えられるヒトタンパク質を有する動物モデルを作製した。かかるトランスジェニック動物は疾病の生化学的および生理学的段階の分析、さらに疾病介入に向けた治療の発展に有用である(Loring, ら, 1996)(なお、その全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。
【０８４８】
GENSET発現および／または生物活性を調節する化合物についての使用
in vivo(またはin vitro)系を用いて、副腎、骨髄、脳、小脳、結腸、胎児脳、胎児腎臓、胎児肝臓、心臓、前立腺肥大、腎臓、肝臓、肺、リンパ神経節、リンパ球、筋肉、卵巣、膵臓、下垂体、胎盤、前立腺、唾液腺、脊髄、脾臓、胃、腸、黒質、精巣、甲状腺、臍帯、および子宮などの目的の組織でのみ組織特異的効果を有する、例えば、GENSET発現または活性を増強する化合物を同定することが可能である。前記のものなどのスクリーニング手順は薬理学的介入計画において潜在的に使用しうる薬剤の同定にも有用である。よって、GENSET遺伝子発現を増強するまたはその活性を刺激する薬剤を使用して、GENSET遺伝子と関係のある任意の表現型を誘導してもよいし、あるいはGENSETポリペプチド活性または発現の不足によって起こる疾患を治療することができる。GENSETポリペプチド発現を抑制するまたはその活性を阻害する化合物を使用して、増大したまたは有害なGENSETポリペプチド活性または発現と関連のある疾病または症状を治療することができる。
【０８４９】
また、GENSET遺伝子またはポリペプチドと直接または間接的に相互作用し、さらにGENSETポリペプチド発現および／または機能を阻害するまたは増強する薬剤も本発明に含まれる。ある実施形態では、この薬剤は、GENSETポリペプチドを直接(例えば、GENSETポリペプチドと結合することにより)または間接的に(例えば、GENSETポリペプチドがGENSET生物活性を有する能力を遮断することにより)妨害する阻害剤である。特定の実施形態では、GENSETタンパク質の阻害剤が、GENSETタンパク質またはGENSETタンパク質の機能的部分に特異的な抗体である、すなわち、この抗体はGENSETポリペプチドと結合する。例えば、この抗体はヒトGENSET(配列番号1〜169、339〜455、561〜784)、哺乳類GENSET核酸、またはその一部の核酸配列の1つによってコードされるポリペプチドに特異的であり得る。また、阻害剤はGENSETポリペプチドと結合してその活性を遮断する抗体以外の薬剤(例えば、小有機分子、タンパク質またはペプチド)であり得る。例えば、この阻害剤は構造的にはGENSETポリペプチドに類似しているがその機能を有していない薬剤であり得る。あるいは、それがGENSETポリペプチドが通常結合するまたは相互作用する分子に結合するまたはそれと相互作用する薬剤であり得る。これによりGENSETポリペプチドの作用を妨げてそれが通常発揮すると考えられる作用を発揮させないようにする。
【０８５０】
もう1つの実施形態では、この薬剤は、GENSETポリペプチドの活性を増強する(ある量またはレベルのGENSETの作用を高める)、その有効時間の長さを延長する(その分解を妨げることにより、または別の、その活性時間を延長することにより)、あるいは直接または間接的にその両方を行う、GENSETポリペプチドの増強剤(活性剤)である。例えば、GENSETポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いて、GENSETポリペプチドのGENSET生物活性を誘導する能力を高めるまたは低下させる、GENSET生物活性と関連のある疾病または症状の治療または予防に有用である薬剤を同定することができる。
【０８５１】
本発明のGENSET配列を使用して、GENSET遺伝子を欠いたまたは遺伝子組換えによりGENSET遺伝子を過剰発現するマウスなどの非ヒト遺伝子ノックアウト動物を作製することもできる。例えば、かかるGENSET遺伝子ノックアウトマウスを作製し、使用して、GENSET遺伝子の機能をさらに理解し、さらにGENSET活性剤および阻害剤の特異性を評価することができる。また、トランスジェニックマウスでのGENSET遺伝子(例えば、ヒトGENSET遺伝子)の過剰発現は、GENSET活性剤および阻害剤(例えば、ヒトGENSETポリペプチドに対するもの)についての試験系を作製する手段としても使用できる。さらに、GENSET遺伝子を用いて、GENSETプロモーター／エンハンサーをクローニングしてGENSET遺伝子転写のレギュレーターを同定することができる。GENSET遺伝子ノックアウト動物としては、完全にまたは部分的にGENSET遺伝子および／またはGENSET活性もしくは機能を欠いた動物が挙げられる。よって、本発明は、哺乳類(例えば、ヒト)におけるGENSET生物活性を(部分的にまたは完全に)阻害する方法であって、哺乳類に有効量のGENSETポリペプチドまたはポリヌクレオチドの阻害剤を投与することを含んでなる方法に関する。本発明はまた、哺乳類におけるGENSET生物活性を増強する方法であって、哺乳類に有効量のGENSETポリペプチドまたはポリヌクレオチドの増強剤を投与することを含んでなる方法に関する。
【０８５２】
GENSET遺伝子発現の阻害
本発明の治療用組成物は、対応するGENSET遺伝子の発現を阻害するアンチセンスツールまたは三重らせんツールとして有利には1個または数個のGENSETオリゴヌクレオチド断片を含みうる。
【０８５３】
アンチセンス法
アンチセンス手法では、mRNAに相補的な核酸配列を細胞内でmRNAとハイブリダイズさせ、それによってmRNAによりコードされるタンパク質の発現を遮断する。遺伝子治療に使用しようとするアンチセンス核酸分子は、DNAまたはRNA配列のいずれであってもよい。本発明のアンチセンスポリヌクレオチドを用いる好ましい方法は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるSczakielら(1995)に記載された手順である。
【０８５４】
好ましくは、アンチセンスツールは、GENSET mRNAに、より好ましくはGENSET mRNAの5'末端に相補的なポリヌクレオチド(長さ15〜200bp)から選択される。別の実施形態では、所望の標的遺伝子の異なる部分に相補的な異なるアンチセンスポリヌクレオチドの組合せが使用される。
【０８５５】
本発明のその他の好ましいアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンATGを含んでなるGENSET mRNAの配列またはスプライシングドナーもしくはアセプター部位を含むGENSETゲノムDNAの配列のいずれかに相補的な配列である。
好ましくは、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、RNAポリメラーゼII転写物がそれらの3'末端にポリ(A)がなくても作製されるように自己切断型リボザイム配列で置き換えられた3'ポリアデニル化シグナルを有する。これらのアンチセンスポリヌクレオチドは、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるLiuら(1994)に記載されたように核から輸送されない。好ましい実施形態では、これらのGENSETアンチセンスポリヌクレオチドは、リボザイムカセット内に、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるEcknerら(1991)に記載された構造など、切断された転写物を3'-5'エキソヌクレアーゼ様分解（exonucleolytic degradation）に対して安定化させるヒストンステム-ループ構造も含んでなる。
【０８５６】
アンチセンス核酸は、二本鎖のGENSET mRNAの発現を阻害するのに十分な安定性を有する細胞内二本鎖の形成を可能にするのに十分な長さと融解温度を有する必要がある。遺伝子治療での使用に好適なアンチセンス核酸の設計については、それらの開示内容が参照により本明細書に組み入れられるGreenら,(1986)ならびにIzantおよびWeintraub,(1984)に開示されている。
【０８５７】
いくつかの手法では、アンチセンス分子はプロモーターに対してGENSETコード領域の配向を逆転させることによって得られ、通常細胞内で転写される対向する鎖を転写する。アンチセンス分子は、転写物を生成するためにT7またはSP6ポリメラーゼを使用する系などのin vitro転写系を用いて転写してもよい。もう1つの手法では、アンチセンス配列を含むDNAを好適な発現ベクター内のプロモーターに機能し得る形で連結することにより、GENSETアンチセンス核酸をin vivoで転写することを含む。
【０８５８】
あるいは、通常細胞内で転写される鎖に相補的なオリゴヌクレオチドをin vitroで合成してもよい。このように、アンチセンス核酸は、対応するmRNAに相補的であり、mRNAとハイブリダイズして二本鎖を合成することが可能である。いくつかの実施形態では、アンチセンス配列に修飾糖リン酸骨格を含めて安定性を高め、さらにそれらのRNase活性に対する感受性を低下させてもよい。アンチセンス手法での使用に好適な修飾物の例としては、2'O-メチルRNAオリゴヌクレオチドおよびタンパク質-核酸(PNA)オリゴヌクレオチドが挙げられる。さらなる例は、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるRossiら, (1991)に記載されている。
【０８５９】
GENSET cDNAまたはゲノムDNAの配列に相補的な種々のタイプのアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することができる。ある好ましい実施形態では、参照により本明細書に組み入れられる国際出願番号PCT WO94/23026に記載された安定および半安定アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する。これらの分子では、3'末端または3'および5'末端の両方が相補的塩基対間の分子内水素結合に使用される。これらの分子は従来のアンチセンスオリゴヌクレオチドと比べてエクソヌクレアーゼの攻撃によく耐え、高い安定性を示し得る。
【０８６０】
もう1つの好ましい実施形態では、参照により本明細書に組み入れられる国際出願番号WO95/04141に記載された単純ヘルペスウイルス1型および2型に対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドを使用する。
【０８６１】
さらにもう1つの好ましい実施形態では、参照により本明細書に組み入れられる国際出願番号WO96/31523に記載された共有結合により架橋したアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用する。これらの二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドは各々1つ以上のオリゴヌクレオチド間またはオリゴヌクレオチド内共有結合架橋を含んでなる。この結合は、一方の鎖の第1アミン基ともう一方の鎖または同じ鎖のカルボキシル基との間のアミド結合からそれぞれ構成され、その第1アミン基がその鎖のヌクレオチド単糖環の2'位で直接置換され、さらにそのカルボキシル基が別の鎖または同じ鎖のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体各々で置換された脂肪族スペーサー基によって運ばれる。
【０８６２】
参照により本明細書に組み入れられる国際出願番号WO92/18522で開示されたアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを使用してもよい。これらの分子は、分解に対して安定しており、結合してタンパク質を制御する少なくとも1つの転写制御認識配列を含み、それに対するデコイ(decoy)として有効である。これらの分子は、「ヘアピン」構造、「ダンベル」構造、「改変ダンベル」構造、「架橋」デコイ構造および「ループ」構造を有してもよい。
【０８６３】
もう1つの好ましい実施形態では、参照により本明細書に組み入れられる欧州特許出願番号0 572 287 A2に記載された環状二本鎖オリゴヌクレオチドを使用する。これらの連結されたオリゴヌクレオチド「ダンベル」は転写因子の結合部位を有しており、転写因子を分離することによりこの転写因子の制御下での遺伝子の発現を阻害する。
【０８６４】
参照により本明細書に組み入れられる国際出願番号WO92/19732で開示された閉環（closed）アンチセンスオリゴヌクレオチドの使用もまた含まれる。これらの分子は遊離末端を持たないため、エクソヌクレアーゼによる分解に対して従来のオリゴヌクレオチドよりも耐性がある。これらのオリゴヌクレオチドは多機能であり、標的mRNAに隣接していない複数の領域と相互作用すると考えられる。
【０８６５】
遺伝子発現の阻害に必要なアンチセンス核酸の好適なレベルをin vitro発現解析を用いて調べてもよい。アンチセンス分子は当技術分野で公知の手順を用いた拡散、注入、感染またはトランスフェクションにより細胞に導入してもよい。例えば、アンチセンス核酸を、裸の(bare or naked)オリゴヌクレオチド、脂質カプセルに封入したオリゴヌクレオチド、ウイルスタンパク質キャプシドで包まれたオリゴヌクレオチド配列、または発現ベクターに含まれるプロモーターに機能し得る形で連結されたオリゴヌクレオチドとして体内に導入することができる。発現ベクターは、レトロウイルスもしくはウイルスベクターをはじめとする当技術分野で公知の種々の任意の発現ベクター、染色体外複製が可能なベクターまたは組込み型ベクターであってよい。ベクターはDNAまたはRNAであってよい。
【０８６６】
アンチセンス分子を、いくるかの異なる濃度、好ましくは1×10-10M〜1×10-4M間で細胞サンプルに導入する。遺伝子発現を十分に制御できる最小濃度が特定された後、最適量がin vivoでの使用に好適な投与量に読み換えられる。 例えば、培養物中の阻害濃度1x10-7は投与量約0.6mg/体重kgに読み換えられる。約100mg/体重kgまたはそれを上回るオリゴヌクレオチドレベルについては、試験動物でのオリゴヌクレオチドの毒性試験後に使用可能となろう。さらに、脊椎動物由来の細胞を取り出し、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理し、さらに、脊椎動物に再導入するすることも意図される。
【０８６７】
本発明の好ましい適用では、遺伝子によりコードされるポリペプチドをまず同定するため、翻訳に対するアンチセンス阻害の有効性を、限定されるものではないが、RIAおよびELISA、機能アッセイ、または放射性標識法などの抗体媒介性試験をはじめとする技術を用いてモニターすることができる。
【０８６８】
本発明に従って使用するアンチセンス技術の代替法は、それらの相補的ポリヌクレオチドテールを介して標的配列に結合し、さらにその標的部位を加水分解することにより対応するRNAを切断すると考えられるリボザイム(すなわち、「ハンマーヘッド型リボザイム」)の使用を含んでなる。要するに、ハンマーヘッド型リボザイムの簡略化したサイクルでは、(1)相補的アンチセンス配列を介した標的RNAとの配列特異的結合; (2)標的鎖の切断可能なモチーフの部位特異的加水分解; および(3)もう1つの触媒的サイクルを引き起こす切断産物の放出、を含む。実際には、長いアンチセンスアームを有する長鎖アンチセンスポリヌクレオチド(少なくとも30塩基長)またはリボザイムの使用が有利である。アンチセンスリボザイムの好ましい送達系はこれらのアンチセンスリボザイムを親油性基に共有結合させる、または適当なベクターとしてリポソームを使用することにより達成される。本発明の好ましいアンチセンスリボザイムは、Rossiら, (1991)およびSczakielら(1995)に記載されたように作製される。なお、具体的な作製手順は参照により本明細書に組み入れられる前記論文で参照される。
【０８６９】
三重らせん法
GENSETゲノムDNAを使用し、細胞内三重らせん形成に基づきGENSET遺伝子の発現を抑制することも可能である。
三重らせんオリゴヌクレオチドを使用して、ゲノムからの転写を阻害する。これらは、細胞活性における変化が特定の遺伝子と関係がある場合には、その変化を調べるのに特に有用である。本発明のGENSET cDNAもしくはゲノムDNA、または、より好ましくはそれらの配列の断片を使用して、特定遺伝子の発現と関連のある疾病を有する個体における遺伝子発現を阻害することができる。同様に、GENSETゲノムDNAの一部を使用して、細胞内でのGENSET遺伝子転写を阻害する効果を調べることができる。伝統的には、ホモプリン配列が三重らせん手法に最も有用であると考えられていた。しかしながら、ホモピリミジン配列もまた遺伝子発現を阻害できる。かかるホモピリミジンオリゴヌクレオチドはホモプリン:ホモピリミジン配列で主溝（main groove）と結合する。よって、GENSETゲノムDNA由来の両タイプの配列は本発明の範囲内に含まれる。
三重らせん手法を用いた遺伝子治療計画を実践するため、GENSETゲノムDNAの配列を最初に調べて、GENSET発現を阻害する三重らせんに基づく手法において使用できる10量体〜20量体のホモピリミジンまたはホモプリンストレッチを同定する。候補ホモピリミジンまたはホモプリンストレッチの同定に続いて、GENSET発現を阻害するそれらの能力を、候補配列を含む種々の量のオリゴヌクレオチドをGENSET遺伝子を発現する組織培養細胞に導入することにより評価する。
オリゴヌクレオチドは、限定されるものではないが、リン酸カルシウム沈降、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介性トランスフェクションまたは自然取り込みをはじめとする当業者に公知の種々の方法を用いて細胞に導入することができる。
処理した細胞を、ノーザンブロット法、RNase保護アッセイ、またはPCRに基づく手法などの技術を用いて細胞機能変化またはGENSET発現の低下についてモニターし、オリゴヌクレオチドで処置した細胞におけるGENSET遺伝子の転写レベルを評価する。モニターしようとする細胞機能は、そのオリゴヌクレオチドを誘導したcDNAに対応する標的遺伝子の、特定機能と関係のある既知の遺伝子配列とのホモロジーに基づいて予測する。また、細胞機能は、特に、cDNAが特定の遺伝性疾病と関係がある場合、「遺伝性疾患または薬剤応答性と関連のある遺伝子の同定」と題した節で記載した技術を用いて、その遺伝性疾患を有する個体由来の細胞内での異常な生理機能の存在に基づいて予測できる。
【０８７０】
次いで、組織培養細胞における遺伝子発現の阻害に有効なオリゴヌクレオチドを「アンチセンス手法」と題した節で記載した技術およびin vitroでの結果に基づく算定投与量を用いてin vivoにおいて導入してもよい。
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド単位の天然(β-)アノマーをα-アノマーで置き換えてそのオリゴヌクレオチドにヌクレアーゼ耐性をさらに持たせることができる。さらに、臭化エチジウムなどの挿入剤をα-オリゴヌクレオチドの3'末端に結合させて三重らせんを安定させることができる。三重らせん形成に好適なオリゴヌクレオチドの作製に関する情報については参照により本明細書に組み入れられるGriffinら(1989)を参照されたい。
【０８７１】
GENSET遺伝子関連疾患の治療
本発明はさらに、GENSET遺伝子活性および／または発現を上昇させるかまたは低下させることによりGENSET遺伝子と関連のある疾病／疾患を治療するための方法、GENSETポリペプチドおよびポリヌクレオチドの使用、ならびにGENSETポリペプチドおよびポリヌクレオチドのモジュレーターの使用に関する。これらの手法は、本明細書に記載のものなどのスクリーニングプロトコールを用いて選択される化合物を使用しておよび／または当技術分野でまた本明細書に記載される遺伝子治療およびアンチセンス手法を用いることにより達成できる。遺伝子治療を用いて、任意の組織、例えば、治療しようとする疾病または症状と関連のある組織においてGENSET遺伝子の標的化した発現を行うことができる。GENSETのコード配列を好適な発現ベクターにクローニングし、特定の細胞型を標的にして有効な高レベル発現を達成することができる。GENSET コード配列の標的細胞への導入は、例えば、粒子媒介性DNA送達、(Haynes, 1996およびMaurer, 1999)、裸の DNAの直接注入、(Levyら, 1996; およびFelgner, 1996)、またはウイルスベクター媒介性輸送(Smithら, 1996、Stoneら, 2000; WuおよびAtai, 2000)を用いて達成することができる(なお、それらの全開示内容は各々参照により本明細書に組み入れられる)。例えば、組織特異的であるウイルスベクターを使用したウイルス媒介性輸送の場合、または組織特異的であるプロモーターの使用によって、組織特異的効果を得ることができる。例えば、任意の組織特異的プロモーター、例えば、アルブミンプロモーター(肝臓特異的; Pinkertら, 1987 Genes Dev. 1:268-277)、リンパ特異的プロモーター(Calameら, 1988 Adv. Immunol. 43:235-275)、T細胞受容体のプロモーター(Winotoら, 1989 EMBO J. 8:729-733)および免疫グロブリンのプロモーター(Banerjiら, 1983 Cell 33:729-740; QueenおよびBaltimore 1983 Cell 33:741-748)、ニューロン特異的プロモーター(例えば、神経フィラメントプロモーター; Byrneら, 1989 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477)、膵臓特異的プロモーター(Edlunchら, 1985 Science 230:912-916)または乳腺特異的プロモーター(乳清プロモーター、米国特許第4,873,316号および欧州出願公報第264, 166号)を使用して特異的発現を達成してもよい。また、マウスホメオボックスプロモーター(Kesselら, 1990 Science 249:374-379)またはα-フェトプロテインプロモーター(Campesら, 1989 Genes Dev. 3:537-546)などの発育制御プロモーターを使用することもできる。
【０８７２】
コンビナトリアル法を用いてGENSETコード配列を確実に標的組織で活性化することもできる(ButtおよびKarathanasis, 1995; MillerおよびWhelan, 1997)(なお、それらの全開示内容は参照により本明細書に組み入れられる)。GENSET mRNAに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して例えば、炎症部位においてタンパク質の発現を選択的に減少させるまたは除外することができる。より詳しくは、アンチセンス構築物またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して表Vの第3段に挙げたものなどの高発現細胞におけるGENSETの産生を阻害することができる。転写方向をアンチセンス方向に配向させたGENSET遺伝子配列またはその一部を有する発現ベクターを標的細胞にトランスフェクトすることによりアンチセンスmRNAを産生させることができる。好適なベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクターをはじめとするウイルスベクター、ならびに非ウイルスベクターが挙げられる。組織特異的プロモーターは前記のように使用できる。また、アンチセンスオリゴヌクレオチドを標的細胞に直接導入しても同じ目的が達成できる。(遺伝子治療と関連して本明細書に記載したその他の送達手法も参照)。高レベルの特異性を獲得するようにオリゴヌクレオチドを選択/設計することができる(Wagnerら, 1996)(なお、その全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる)。本明細書に記載の治療手法は、ヒトおよび非ヒト哺乳類(ネコおよびイヌなど)のいずれにも適用可能である。
【０８７３】
製薬上および生理学上許容される組成物
本発明はまた、有効物質として、本発明のポリペプチド、核酸または抗体を含んでなる製薬上または生理学上許容される組成物に関する。本発明はまた、有効物質として、前記のスクリーニングプロトコールを用いて選択される化合物を含んでなる組成物に関する。かかる組成物は、有効物質と製薬上または生理学上許容される担体とを組み合わせて含む。裸の DNAの場合、「担体」は金粒子であってよい。組成物中の有効物質量は、その物質、患者および求められている効果によって変更することができる。同様に、投与計画は、組成物および治療しようとする疾病／疾患によって変更することができる。
【０８７４】
よって、本発明は、本明細書に記載の任意のスクリーニング方法を用いて有効物質、化合物、物質または分子を選択し、さらに同定された有効物質、化合物、物質または分子と製薬上許容される担体とを混合する方法を含んでなる医薬組成物の製造方法に関する。
【０８７５】
本発明において使用する医薬組成物は、限定されるものではないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、クモ膜下、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、経鼻、経腸、局所、舌下、または直腸手段をはじめとするいくつもの経路により投与してよい。これらの医薬組成物には、有効成分のほか、有効な化合物の製薬上使用できる製剤への加工を助ける賦形剤および助剤を含んでなる好適な製薬上許容される担体を含めてよい。製造および投与に関する手法のさらなる詳細はRemington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co. Easton, Pa)の最新版で確認しうる。
【０８７６】
経口投与用の医薬組成物は、当技術分野では周知の製薬上許容される担体を経口投与に好適な量で用いて製剤化しうる。かかる担体により、患者による摂取のために医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などとして製剤化できる。
【０８７７】
経口用途用の医薬製剤は、有効化合物と固形賦形剤とを組み合わせることによって準備できるが、得られた混合物を所望により粉砕し、必要であれば好適な助剤を添加した後にさらに顆粒混合物を加工して錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。好適な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールをはじめとする糖類; トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、またはその他の植物由来のデンプン; メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル-セルロース、またはナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース; アラビアガムおよびトラガカントガムをはじめとするガム; ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物またはタンパク質増量剤である。必要であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）といった崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。
糖衣錠コアは、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコール、および／または 二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに好適な有機溶剤または溶剤混合物をさらに含んでいてもよい濃縮糖溶液などの好適なコーティング剤を併せて使用する。製品識別用に、または有効化合物の量、すなわち、投与量を確認するために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに加えてもよい。
【０８７８】
経口用に使用できる医薬製剤としては、プッシュフィット式ゼラチン製カプセル剤、ならびにゼラチンとグリセロールまたはソルビトールなどのコーティング剤とでできた密封軟カプセル剤が挙げられる。プッシュフィット式カプセル剤は、有効成分と、ラクトースまたはデンプンなどの増量剤もしくは結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤、さらに所望により安定剤とを混合して含めることができる。軟カプセル剤では、有効化合物を、脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体に安定剤を加えてまたは加えないで溶解または懸濁し得る。
【０８７９】
非経口投与に好適な医薬製剤は、水性溶液、好ましくはハンクス液、リンガー液、または生理的緩衝食塩水などの生理学的に適合するバッファー中で製造され得る。水性懸濁注射液に、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を含めてもよい。さらに、有効化合物の懸濁液を好適な油性懸濁注射液として製造してもよい。好適な親油性溶剤またはビヒクルとしては、ゴマ油などの脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル、またはリポソームが挙げられる。所望により、懸濁液に、好適な安定剤または化合物の可溶性を高めて高濃度溶液の製造を可能にする薬剤を含めてもよい。
【０８８０】
局所または経鼻投与では、製剤に浸透させようとする特定のバリアに好適な浸透剤を使用する。かかる浸透剤は当技術分野では一般的に公知である。
【０８８１】
本発明の医薬組成物は、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、内包または凍結乾燥ステップによる、当技術分野で公知の方法で製造してもよい。
【０８８２】
医薬組成物は塩として提供でき、さらにそれは、限定されるものではないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などをはじめとする数多くの酸によって生成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性またはその他のプロトン溶剤に対する溶解性が高い傾向にある。その他の場合、好ましい製剤は、使用前にバッファーと混合する凍結乾燥粉末であってよく、以下のもの: 1〜50mMヒスチジン、0.1%〜2%スクロース、および2〜7%マンニトールのいずれかまたは全てをpH範囲4.5〜5.5で含みうる。
【０８８３】
医薬組成物の製造後にはそれらを好適な容器に入れ、さらにラベルを貼って適応症に対する治療について記載することができる。GENSETポリペプチドの投与では、かかるラベル記載に投与の量、回数および方法を含めうる。
【０８８４】
本発明での使用に好適な医薬組成物としては、有効成分が本来の目的を達成する有効量で含まれる組成物が挙げられる。有効量の決定は当業者の裁量で十分に行うことができる。
【０８８５】
いずれの化合物でも、治療上有効な量は、細胞培養アッセイ(例えば、腫瘍性細胞)、または動物モデル（通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタ）のいずれかで最初に予測することができる。さらに、動物モデルを使用して投与の好適な濃度範囲および経路を調べてもよい。次いで、かかる情報を使用してヒトにおける投与に有用な投与量および経路を調べることができる。
【０８８６】
治療上有効な量とは、症状または病状を緩和する有効成分、例えば、GENSETポリペプチドもしくはその断片、GENSETポリペプチドに特異的な抗体、GENSETポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の量をいう。治療効果および毒性、例えば、ED50(集団の50%に治療上有効な量)およびLD50(集団の50%を死に至らせる量)は標準的な製薬手順によって細胞培養物または試験動物において決定しうる。治療効果および毒性作用との間の用量比が治療指数であり、これをLD50/ED50比で示すことができる。高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。ヒトでの使用に向けた投与量範囲の策定には細胞培養アッセイおよび動物試験で得られたデータを使用する。かかる組成物内の含有量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性のないED50を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、使用する投与剤形、患者の感受性、および投与経路によってこの範囲内で変わる。
【０８８７】
正確な量は治療を必要とする被験体に関連のある因子を考慮し、医師により決定される。投与量および投与は十分なレベルの有効成分を提供する、または所望の効果を維持するように調整される。考慮され得る因子としては、病状の重篤度、被験体の身体全体の健康、被験体の年齢、重量、および性別、食習慣、投与時間および回数、薬剤の組合せ、反応感受性、ならびに治療法に対する耐性/応答が挙げられる。持続性医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス速度によって3〜4日おきに、週に1回、または2週に1回投与する。
【０８８８】
平均的な投与量は、投与経路に応じて0.1〜100,000μg、全量最高約1gで変更してもよい。送達に関する詳細な用量および方法についての指針は文献で提供されており、一般に当技術分野の医師は入手可能である。当業者は、タンパク質またはそれらの阻害剤よりもヌクレオチドの種々の製剤を使用するだろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、細胞、症状、場所などによって固有のものであると考えられる。
【０８８９】
GENSET配列の使用:コンピュータ関連の実施形態
本明細書において用いられる用語「配列番号1〜169、339〜455、561〜784のcDNAコード」とは、配列番号1〜169、339〜455、561〜784および寄託されたクローンプールのクローンインサートのヌクレオチド配列、その断片、それに相同なヌクレオチド配列、ならびに前記配列の全てに相補的な配列を意味する。前記断片は、配列番号1〜169、339〜455、561〜784の少なくとも8、10、12、15、18、20、25、28、30、35、40、50、75、100、150、200、300、400、500、1000または2000個の連続するヌクレオチドを含んでなる配列番号1〜169、339〜455、561〜784の断片を含む。好ましくは、前記断片は、生物活性を有するポリペプチドをコードする本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む。配列番号1〜169、339〜455、561〜784の相同配列および断片とは、これらの配列と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、または75%の同一性を有する配列をいう。同一性は、デフォルトパラメーターまたは任意の変更パラメーターを用いるBLAST2Nをはじめとする本明細書に記載の任意のコンピュータプログラムとパラメーターを用いて決定しうる。相同配列には配列番号1〜169、339〜455、561〜784のcDNAコード内のチミジンをウリジンで置き換えたRNA配列も含む。相同配列は本明細書に記載のいずれかの手順を用いて準備してもよいし、または前記の配列決定エラーの補正によって得てもよい。配列番号1〜169、339〜455、561〜784のcDNAコードが従来の1文字表記(例えば、Stryer, 1995の裏表紙内側を参照)または配列内のヌクレオチドを識別して記録するその他の表記法により表すことができることが分かるであろう。
【０８９０】
本明細書において用いられる用語「配列番号170〜338、456〜560、785〜918のポリペプチドコード」とは、配列番号1〜169、339〜455、561〜784のcDNAによってコードされる配列番号170〜338、456〜560、785〜918 のポリペプチド配列、寄託されたクローンプールのクローンインサートによってコードされるポリペプチド配列、それに相同なポリペプチド配列、または前記配列のいずれかの断片を意味する。相同ポリペプチド配列とは、配列番号170〜338、456〜560、785〜918のポリペプチド配列の1つと少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、90%、85%、80%、75%の同一性を有するポリペプチド配列をいう。同一性は、デフォルトパラメーターまたは任意の変更パラメーターを用いるFASTAをはじめとする本明細書に記載の任意のコンピュータプログラムとパラメーターを用いて決定しうる。相同配列は、本明細書に記載の任意の手順を用いて準備してもよいし、または前記の配列決定エラーの補正によって得てもよい。ポリペプチド断片は、配列番号170〜338、456〜560、785〜918のポリペプチドの少なくとも5、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、50、60、75、100、150または200個の連続するアミノ酸を含んでなる。好ましくは、前記断片は、生物活性を有する本明細書に記載のポリペプチド、または生物活性を有する本明細書に記載のポリペプチドの少なくとも5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、または150個の連続するアミノ酸を含んでなる断片を含む。配列番号170〜338、456〜560、785〜918のポリペプチドコードが従来の1文字表記もしくは3文字表記(Stryer, 1995の裏表紙内側を参照)または配列内のポリペプチドの識別に関連するその他の表記法により表すことができることが分かるであろう。
【０８９１】
本発明の核酸コードおよび本発明のポリペプチドコードがコンピュータによる読み出しおよびアクセスが可能な任意の媒体で保存、記録、および 操作できることが当業者であれば分かるであろう。本明細書において用いられる用語「記録される」および「保存される」とは、コンピュータ媒体に情報を保存するプロセスをいう。当業者であればコンピュータ可読媒体に情報を記録するための現在知られる方法を容易に採用して1つ以上の本発明の核酸コード、または1つ以上の本発明のポリペプチドコードを含んでなる製造物を作製することができる。本発明のもう1つの態様は、少なくとも2、5、10、15、20、25、30、または50個の本発明の核酸コードを記録したコンピュータ可読媒体である。本発明のもう1つの態様は、少なくとも2、5、10、15、20、25、30、または50個の本発明のポリペプチドコードを記録したコンピュータ可読媒体である。
【０８９２】
コンピュータ可読媒体としては、磁気的可読媒体、光学的可読媒体、電子的可読媒体および磁気／光媒体が挙げられる。例えば、コンピュータ可読媒体は、ハードディスク、フロッピーディスク、磁気テープ、CD-ROM、デジタル多用途ディスク(DVD)、ランダムアクセスメモリ(RAM)、または読み取り専用メモリ(ROM)、ならびに当業者に公知のそれ以外のタイプの他の媒体であってよい。
【０８９３】
本発明の実施形態は、システム、特に本明細書に記載の配列情報を保存及び操作するコンピュータシステムを含む。コンピュータシステム100の一例を図1にブロック図で示している。本明細書において用いられる「コンピュータシステム」とは、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列の解析に使用するハードウェアコンポーネント、ソフトウェアコンポーネント、およびデータ保存コンポーネントをいう。ある実施形態では、コンピュータシステム100がサン・エンタープライズ1000サーバー(Sun Microsystems, Palo Alto, CA)である。コンピュータシステム100は、好ましくは配列データを処理、アクセスおよび操作するプロセッサを含む。プロセッサ105はインテル社製ペンティアムIII、またはサン、モトローラ、コンパックもしくはInternational Business Machines社製の類似プロセッサなどの周知のタイプの中央演算処理装置であり得る。
【０８９４】
好ましくは、コンピュータシステム100は、プロセッサ105およびデータを保存するための1つ以上の内部データ保存コンポーネント110、ならびにデータ保存コンポーネントに保存されたデータを読み出すための1つ以上のデータ読み出し装置を含んでなる汎用システムである。現在入手可能なコンピュータシステムのいずれか1つが好適であることは当業者には容易に理解できる。
【０８９５】
ある特定の実施形態では、コンピュータシステム100はメインメモリ115(好ましくは、RAMとして実行される)と接続されるバスと接続されたプロセッサ105、ならびにデータが記録されるハードドライブおよび／またはその他のコンピュータ可読媒体などの1つ以上の内部データ保存装置110を含む。いくつかの実施形態では、コンピュータシステム100は、内部データ保存装置110に保存されたデータを読み出すための1つ以上のデータ読み出し装置118 をさらに含む。
【０８９６】
データ読み出し装置118とは、例えば、フロッピーディスクドライブ、コンパクトディスクドライブ、磁気テープドライブなどである。いくつかの実施形態では、内部データ保存装置110が、フロッピーディスク、コンパクトディスク、磁気テープなどの制御論理および／または記録データの含まれる取り外し可能なコンピュータ可読媒体である。コンピュータシステム100は有利には、データ読み出し装置に挿入されているデータ保存コンポーネントから制御論理および／またはデータを読み出す好適なソフトウェアを含むまたはそれによってプログラム化されていてもよい。
【０８９７】
コンピュータシステム100はコンピュータユーザーに出力を表示するのに使用するディスプレイ120を含む。コンピュータシステム100とその他のコンピュータシステム125a-cとをネットワークまたは広域ネットワークで接続し、コンピュータシステム100への中央集中型アクセスを可能にすることができることにも注目すべきである。
【０８９８】
本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列にアクセスし、さらに処理するためのソフトウェア(検索ツール、比較ツール、およびモデリングツールなど)は実行時にはメインメモリ115に存在していてよい。
【０８９９】
いくつかの実施形態では、コンピュータシステム100が、コンピュータ可読媒体に保存された前記の本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードとコンピュータ可読媒体に保存された参照ヌクレオチドまたはポリペプチド配列とを比較するための配列比較プログラムをさらに含んでなる。「配列比較プログラム」とは、特定のヌクレオチドもしくはポリペプチド配列とその他のヌクレオチドもしくはポリペプチド配列および／または、限定されるものではないが、データ保存手段内に保存されたペプチド、ペプチド類似物、および化学物質をはじめとする化合物とを比較するためにコンピュータシステム100で実行される1つ以上のプログラムをいう。例えば、配列比較プログラムによりコンピュータ可読媒体に保存された本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列とコンピュータ可読媒体に保存された参照配列とを比較して、ホモロジー、生物学的機能に関連したモチーフ、または構造モチーフを確認してもよい。本特許明細書の他の場所で明記される種々の配列比較プログラムは特に本発明のこの態様で使用されると考えられる。
【０９００】
図2は、新規ヌクレオチドまたはタンパク質配列と配列のデータベースとを比較して新規配列とデータベースの配列間のホモロジーレベルを決定するためのプロセス200のある実施形態を例示するフロー図である。配列のデータベースは、コンピュータシステム100内に保存された非公開データベース、またはインターネットにより入手可能なGENBANK、PIR OR SWISSPROTなどの公開データベースであり得る。
【０９０１】
プロセス200はスタートステート201で開始し、次いで、比較対象の新規配列がコンピュータシステム100内のメモリに保存されるステート202に移る。前記のように、メモリはRAMまたは内部保存装置をはじめとするいずれのタイプのメモリであってもよい。
【０９０２】
次いで、プロセス200は解析および比較のために配列のデータベースがオープンとなるステート204に移る。その後、プロセス200はデータベースに保存された第1の配列がコンピュータのメモリに読み出されるステート206に移る。次いで、第1の配列が第2の配列と同一であるかどうかを調べるためにステート210で比較が実行される。このステップが新規配列とデータベースの第1の配列との正確な比較を実行することに限定されないことに留意することが重要である。2つのヌクレオチドまたはタンパク質配列が同一でない場合にそれらを比較するための十分に公知な方法は当業者には周知である。例えば、2つの試験配列間のホモロジーレベルを上げるために一方の配列にギャップを挿入することができる。比較中にギャップまたはその他の特徴を配列に挿入するかどうかを制御するパラメーターは通常コンピュータシステムのユーザーが入力する。
【０９０３】
ステート210で2つの配列の比較が実行されると、決定ステート210で2つの配列が同一であるかどうかの決定がなされる。もちろん、「同一」とは、完全に同一である配列に限定されるものではない。プロセス200ではユーザーによって入力されるホモロジーパラメーターの範囲内である配列が「同一」として示される。
【０９０４】
2つの配列が同一であるという決定がなされると、プロセス200はデータベースの配列名がユーザーに表示されるステート214に移る。このステートは、表示された名前の配列が入力されたホモロジーの制約条件を満たすことをユーザーに知らせる。保存された配列の名前がユーザーに表示されると、プロセス200はデータベース内にさらなる配列が存在するかどうかの決定がなされる決定ステート218に移る。データベース内にもはや配列が存在しない場合には、その後、プロセス200はエンドステート220にて終了する。しかしながら、さらに多くの配列がデータベース内に存在する場合には、その後、プロセス200は次の配列を新規配列と比較できるようにポインターをデータベース内のその配列に移動させるステート224に移る。このように、新規配列を整列させて、データベース内の各配列と比較する。
【０９０５】
決定ステート212で配列が相同でないという決定がなされた場合、その後、プロセス200は比較のためにデータベース内でその他の配列が入手可能かどうかを調べる決定ステート218に直ちに移ることに注目すべきである。
【０９０６】
よって、本発明のある態様は、プロセッサ、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードが保存されたデータ保存装置、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードと比較しようとする参照ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列が読み出し可能に保存されたデータ保存装置および比較を行うための配列比較プログラムを含んでなるコンピュータシステムである。配列比較プログラムでは、本発明の核酸コードおよび本発明のポリペプチドコードの生物学的機能に関連したモチーフおよび構造モチーフを比較または同定した配列間のホモロジーレベルを明示するかあるいはこれらの核酸コードおよびポリペプチドコードと比較した配列の構造モチーフを同定しうる。いくつかの実施形態では、データ保存装置に本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードの少なくとも2、5、10、15、20、25、30、もしくは50の配列が保存され得る。
【０９０７】
本発明のもう1つの態様は、本発明の核酸コードと参照ヌクレオチド配列間のホモロジーレベルを決定する方法であって、ホモロジーレベルを決定するコンピュータプログラムを使用して核酸コードおよび参照ヌクレオチド配列を読み出し、さらにそのコンピュータプログラムを使用して核酸コードと参照ヌクレオチド配列間のホモロジーレベルを決定するステップを含んでなる方法である。前記コンピュータプログラムは、デフォルトパラメーターまたは任意の変更パラメーターを用いるBLAST2Nをはじめとする本明細書で特記されたものなどの、ホモロジーレベルを調べるための数多くのコンピュータプログラムのうちのいずれかであってよい。この方法は前記のコンピュータシステムを使用して実施してもよい。また、この方法は、コンピュータプログラムを使用して本発明の前記核酸コードのうち2、5、10、15、20、25、30、または50のものを読み出し、さらに核酸コードと参照ヌクレオチド配列間のホモロジーを決定することにより行ってもよい。
【０９０８】
図3は、2つの配列が相同であるかどうかを調べるためのコンピュータのプロセス250の一実施形態を例示するフロー図である。プロセス250はスタートステート252で開始し、次いで、比較対象の第1の配列がメモリに保存されるステート254に移る。次いで、比較対象の第2の配列がステート256でメモリに保存される。その後、プロセス250は第1の配列の第1の文字が読み出されるステート260に移り、次いで、第2の配列の第1の文字が読み出されるステート262に移る。配列がヌクレオチド配列である場合には、通常、その文字がA、T、C、GまたはUのいずれかであることを理解されたい。配列がタンパク質配列である場合には、第1の配列が容易に比較できるようにそれが1文字表記のアミノ酸コードであるべきである。
【０９０９】
次いで、決定ステート264で2つの文字が同一であるかどうかの決定がなされる。それらが同一である場合には、その後、プロセス250は第1および第2の配列の次の文字が読み出されるステート268に移る。次いで、次の文字が同一であるかどうかの決定がなされる。それらが同一である場合には、その後、プロセス250は2つの文字が同一ではなくなるまでこのループを続ける。次の2つの文字が同一でないという決定がなされた場合、プロセス250は読み出すいずれかの配列にこれ以上の文字があるかどうかを調べる決定ステート274に移る。
【０９１０】
もはや読み出す文字が存在しない場合には、その後、プロセス250は第1および第2の配列間のホモロジーレベルがユーザーに表示されるステート276に移る。ホモロジーレベルは第1の配列の全配列数に対して同一であった配列間の文字の割合を算出することにより調べられる。このように、第1の100個のヌクレオチド配列の各文字が第2の配列の各文字と整列させることができると、ホモロジーレベルは100%となる。
【０９１１】
また、コンピュータプログラムは、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列を参照ヌクレオチド配列と比較して、本発明の核酸コードが参照核酸配列と1箇所以上の位置で相違があるかどうかを調べるコンピュータプログラムであってもよい。所望により、かかるプログラムは参照ポリヌクレオチドまたは本発明の核酸コードのいずれかの配列に関する挿入、欠失、または置換されたヌクレオチドの長さおよび識別を記録する。ある実施形態では、コンピュータプログラムは、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列に対して1つ以上の一塩基多型(SNP)を含んでいるかどうかを調べるプログラムであってよい。これらの一塩基多型は、各々一塩基置換、挿入、または欠失を含み得る。
【０９１２】
本発明のもう1つの態様は、本発明のポリペプチドコードと参照ポリペプチド配列間のホモロジーレベルを決定する方法であって、ホモロジーレベルを決定するコンピュータプログラムを使用して本発明のポリペプチドコードおよび参照ポリペプチド配列を読み出し、さらにそのコンピュータプログラムを使用してポリペプチドコードと参照ポリペプチド配列間のホモロジーを決定するというステップを含んでなる方法である。
【０９１３】
よって、本発明のもう1つの態様は、本発明の核酸コードが参照ヌクレオチド配列と1つ以上のヌクレオチドで異なっているかどうかを調べる方法であって、核酸配列間の相違を同定するコンピュータプログラムを使用して核酸コードおよび参照ヌクレオチド配列を読み出し、さらにそのコンピュータプログラムを使用して核酸コードと参照ヌクレオチド配列間の相違を同定するというステップを含んでなる方法である。いくつかの実施形態では、コンピュータプログラムは、一塩基多型を同定するプログラムである。この方法は、前記のコンピュータシステムで実行してもよく、その方法が図3に例示されている。また、この方法は、コンピュータプログラムを使用して少なくとも2、5、10、15、20、25、30、または50個の本発明の核酸コードおよび参照ヌクレオチド配列を読み出し、さらにそのコンピュータプログラムを使用して核酸コードと参照ヌクレオチド配列間の相違を同定することによっても実施してもよい。
【０９１４】
その他の実施形態では、コンピュータに基づくシステムは、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列内の特徴を同定するための同定プログラムをさらに含んでもよい。「同定プログラム」とは、前記の本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列内の特定の特徴を同定する1つ以上のプログラムをいう。ある実施形態では、同定プログラムは、本発明のcDNAsコード内のオープン・リーディング・フレームを同定するプログラムを含んでもよい。
【０９１５】
図4は、配列中の特徴の存在を検出するための同定プロセス300のある実施形態を例示するフロー図である。プロセス300は、スタートステート302で開始し、次いで、特徴について調べる対象の第1の配列がコンピュータシステム100内のメモリ115に保存されるステート304に移る。次いで、プロセス300は、配列特徴のデータベースがオープンとなるステート306に移る。かかるデータベースには、特徴名とともに各特徴の属性リストが含まれる。例えば、特徴名が「開始コドン」であると、属性は“ATG”である。もう1つの例では特徴名が「TAATAAボックス」であると、特徴属性は“TAATAA”である。かかるデータベースの例はウィスコンシン大学 Genetics Computer Group(www.gcg.com)により作成されている。
【０９１６】
ステート306で特徴のデータベースがオープンとなると、プロセス300は第1の特徴がデータベースから読み出されるステート308に移る。次いで、ステート310で第1の特徴属性の第1の配列との比較がなされる。その後、決定ステート316で特徴属性が第1の配列で発見されるかどうかの決定がなされる。その属性が発見されたら、次いで、プロセス300は発見された特徴の名前がユーザーに表示されるステート318に移る。
【０９１７】
次いで、プロセス300は、データベース内にさらなる特徴が存在するかどうかの決定がなされる決定ステート320に移る。もはや特徴が存在しない場合には、その後、プロセス300はエンドステート324にて終了する。しかしながら、さらに多くの特徴がデータベース内に存在する場合には、その後、プロセス300はステート326で次の配列特徴を読み取り、さらに、折り返して次の特徴属性が第1の配列と比較されるステート310に戻る。
【０９１８】
決定ステート316で第1の配列に特徴属性が発見されない場合、プロセス300はデータベース内にこれ以上の特徴が存在するかどうかを調べる決定ステート320に直ちに移ることに注目すべきである。
【０９１９】
もう1つの実施形態では、同定プログラムは、本発明のポリペプチドコードの三次元構造を決定する分子モデリングプログラムを含んでもよい。かかるプログラムは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるSternbergら, 1999に記載されたホモロジーモデリングに基づく方法、フォールド認識法およびab initio法をはじめとする当業者に公知の方法を使用しうる。いくつかの実施形態では、分子モデリングプログラムは、公知の三次元タンパク質構造に残基の構造的環境を示すプロフィールに最も適合する標的配列を同定する(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるEisenbergら、1995年7月25日取得の米国特許第5,436,850号を参照)。もう1つの技術では、所定のファミリー内のタンパク質の公知の三次元構造を重ね合わせてそのファミリーの構造的に保存された領域を特定する。また、このタンパク質モデリング技術では相同タンパク質の公知の三次元構造を使用して本発明のポリペプチドコードの構造に近づける(例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるSrinivasan,ら、1996年9月17日取得の米国特許第5,557,535号を参照)。従来のホモロジーモデリング技術は通常、プロテアーゼおよび抗体のモデルを構築するのに使用されている(Sowdhaminiら, (1997))。また、目的のタンパク質の鋳型タンパク質との配列同一性が乏しい場合には三次元タンパク質モデルの開発に比較手法を使用することができる。タンパク質の配列同一性が非常に低いにもかかわらず、そのタンパク質が類似の三次元構造に折りたたまれる場合もある。例えば、数多くのヘリックスサイトカインの三次元構造は配列ホモロジーが低いにもかかわらず、類似の三次元トポロジーで折りたたまれる。
最近のスレッディング法の開発により、現在では標的と鋳型間の構造上の類似性が配列レベルで検出できない数多くの状況で起こり得る折りたたみパターンの同定が可能である。ハイブリッド法では、マルチプルシーケンススレッディング(MST)を用いてフォールド認識を行い、ディスタンスジオメトリープログラム DRAGONを用いて構造的等価性をスレッディングアウトプットから推定して、低分解能モデルを構築し、QUANTAなどの分子モデリングパッケージを用いて全原子表示モデルを構築する。
この3ステップ法に従い、マルチプルアラインメントされた配列の1つ以上の3-D構造への同時スレッディングを行うことが可能な新規フォールド認識アルゴリズム MSTを用いて候補鋳型が最初に同定される。第2のステップでは、MSTアウトプットから得られた構造的等価を残基間ディスタンス制約条件に変換して、二次構造予測から得られた補助情報とともにディスタンスジオメトリープログラム DRAGONにかける。プログラムは無作為に制約条件を組み合わせて迅速に多数の低分解能モデルコンホメーションを作成する。第3のステップでは、これらの低分解能モデルコンホメーションを全原子モデルに変換し、さらに分子モデリングパッケージ QUANTAを用いてエネルギーの最小化を行う(例えば、Aszodiら, (1997)を参照)。
【０９２０】
後に、分子モデリング解析の結果を合理的薬剤設計技術に用いて本発明のポリペプチドコードの活性を調節する薬剤を同定してもよい。
【０９２１】
よって、本発明のもう1つの態様は、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコード内の特徴を同定する方法であって、その中の特徴を同定するコンピュータプログラムを使用して核酸コードまたはポリペプチドコードを読み出し、さらにそのコンピュータプログラムを使用して核酸コードまたはポリペプチドコード内の特徴を同定するステップを含んでなる方法である。ある実施形態では、コンピュータプログラムは、オープン・リーディング・フレームを同定するコンピュータプログラムを含んでなる。さらなる実施形態では、コンピュータプログラムによりポリペプチド配列の直線または構造モチーフを同定する。もう1つの実施形態では、コンピュータプログラムは分子モデリングプログラムを含んでなる。この方法は、コンピュータプログラムを使用して、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードの単一配列または少なくとも2、5、10、15、20、25、30、または50個を読み出し、さらにそのコンピュータプログラムを使用して核酸コードまたはポリペプチドコード内の特徴を同定することによって実施してもよい。
【０９２２】
本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードは、種々のデータ処理プログラムに種々の形式で保存し、操作してもよい。例えば、それらはMicrosoft WORDまたはWORDPERFECTなどのワードプロセッシングファイルのテキストとしてまたは当業者に一般的なDB2、SYBASEもしくはORACLEなどの種々のデータベースプログラムにASCIIファイルとして保存してよい。さらに、多くのコンピュータプログラムおよびデータベースを、配列比較プログラム、同定プログラム、あるいは本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードと比較しようとする参照ヌクレオチドまたはポリペプチド配列の情報源として使用してもよい。以下の一覧は本発明を限定するものではなく、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードに関して有用であるプログラムおよびデータベースに指針を与えることを意図するものである。使用することができるプログラムおよびデータベースとしては、限定されるものではないが: Mac Pattern (EMBL)、DiscoveryBase (Molecular Applications Group)、GeneMine (Molecular Applications Group)、Look (Molecular Applications Group)、MacLook (Molecular Applications Group)、BLASTおよびBLAST2 (NCBI)、BLASTNおよびBLASTX (Altschulら, 1990)、FASTA (PearsonおよびLipman, 1988)、FASTDB (Brutlagら, 1990)、Catalyst (Molecular Simulations Inc.)、Catalyst/SHAPE (Molecular Simulations Inc.)、Cerius2.DBAccess (Molecular Simulations Inc.)、HypoGen (Molecular Simulations Inc.)、Insight II (Molecular Simulations Inc.)、Discover (Molecular Simulations Inc.)、CHARMm (Molecular Simulations Inc.)、Felix (Molecular Simulations Inc.)、DelPhi (Molecular Simulations Inc.)、QuanteMM (Molecular Simulations Inc.)、Homology (Molecular Simulations Inc.)、Modeler (Molecular Simulations Inc.)、ISIS (Molecular Simulations Inc.)、Quanta/Protein Design (Molecular Simulations Inc.)、WebLab (Molecular Simulations Inc.)、WebLab Diversity Explorer (Molecular Simulations Inc.)、Gene Explorer (Molecular Simulations Inc.)、SeqFold (Molecular Simulations Inc.)、EMBL/Swissprotein database、MDL Available Chemicals Directory database、MDL Drug Data Report data base、Comprehensive Medicinal Chemistry database、Derwents's World Drug Index database、the BioByteMasterFile database、Genbank database、ならびにGenseqn databaseが挙げられる。本開示内容に記載の数多くのその他のプログラムおよびデータベースについては当業者であれば分かるであろう。
【０９２３】
前記のプログラムを使用して検出し得るモチーフとしては、ロイシンジッパー、ヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、α-ヘリックス、およびβ-シートをコードする配列、コードされるタンパク質の分泌を指示するシグナルペプチドをコードするシグナル配列、ホメオボックスなどの転写制御に関与する配列、酸性ストレッチ、酵素活性部位、基質結合部位、ならびに酵素切断部位が挙げられる。
【０９２４】
結論
前記のように、本発明のGENSETポリヌクレオチドおよびポリペプチドまたはその断片は種々の用途に使用できる。ポリヌクレオチドは、解析、特性決定または治療的使用に向けて組換えタンパク質を発現させるために; 対応するタンパク質が選択的に発現される(構成的にまたは組織分化もしくは発生の特定の段階でもしくは病気の状態で発現される)組織に対するマーカーとして; サザンゲルの分子量マーカーとして; 染色体を同定するまたは関連遺伝子の位置をマッピングするための染色体マーカーまたはタグとして(標識した場合); 生物学的サンプルにおけるGENSET発現のレベルを定量的に測定するよう設計されたアッセイでの試薬(標識試薬を含む)として; 患者の内因性DNA配列と比較して潜在的遺伝子障害を同定するために; ハイブリダイズにより新規の関連DNA配列を発見するためのプローブとして; 遺伝子フィンガープリンティング用のPCRプライマーを誘導するための情報源として; 発現パターン試験用などの「遺伝子チップ」またはその他の基板に結合させるオリゴマーを選択し、作製するために; DNA免疫化技術を用いて抗タンパク質抗体を産生させるために; ならびに抗DNA抗体を産生させるまたは別の免疫応答を誘導するための抗原として、使用できる。ポリヌクレオチドが別のタンパク質と結合するまたは結合する可能性があるタンパク質をコードする場合(例えば、受容体-リガンド相互作用においてなど)、このポリヌクレオチドは相互作用トラップアッセイ(例えば、Gyurisら, (1993)に記載のものなど)において、それとの結合が起こるその他のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを同定するかまたは結合相互作用の阻害剤を同定するためにも使用できる。
同様に、本発明により提供されるタンパク質またはポリペプチドは、ハイスループットスクリーニングのための複数のタンパク質のパネルをはじめとする生物活性を調べるアッセイで; 抗体を産生させるまたは別の免疫応答を誘導するために; 生物学的液体におけるタンパク質(またはその受容体)のレベルを定量的に測定するよう設計されたアッセイでの試薬(標識試薬を含む)として; 対応するタンパク質が選択的に発現される(構成的にまたは組織分化もしくは発生の特定の段階でもしくは病気の状態で)組織に対するマーカーとして; ならびに、もちろん、相関関係にある受容体またはリガンドを単離するためにも使用できる。タンパク質が別のタンパク質と結合するまたは結合する可能性がある場合(例えば、受容体-リガンド相互作用においてなど)、このタンパク質はそれとの結合が起こるその他のタンパク質を同定するまたは結合相互作用の阻害剤を同定するためにも使用できる。また、これらの結合相互作用に関連のあるタンパク質は、結合相互作用のペプチドもしくは小分子阻害剤またはアゴニストのスクリーニングに使用できる。
これらの研究による有用性のいずれかまたは全ては研究品としての製品化を目的に試薬用またはキット形式へと発展させることが可能である。
前記の使用を行うための方法は当業者には周知である。かかる方法を開示している参考文献としては、限定されるものではないが、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる"Molecular Cloning; A Laboratory Manual", 第二版, Cole Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J., E.F. FritschおよびT. Maniatis編, 1989、ならびに"Methods in Enzymology; Guide to Molecular Cloning Techniques", Academic Press, BergerおよびKimmel編, 1987が挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は栄養源または栄養補助剤としても使用できる。かかる使用としては、限定されるものではないが、タンパク質またはアミノ酸補助剤としての使用、炭素源としての使用、窒素源としての使用および炭水化物源としての使用が挙げられる。かかる場合では、本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドを特定の生物の食料に添加することができるし、また、散剤、丸剤、液剤、懸濁剤またはカプセル剤などの個別の固形または液体製剤として投与することもできる。微生物の場合、本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドを微生物がその中または上で培養される培地に添加することができる。
【０９２５】
本発明を特定の好ましい実施形態により記載してきたが、本発明の開示内容から当業者には理解できるであろうその他の実施形態もまた本発明の範囲に含まれる。よって、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲を参照することによってのみ特定されることが意図される。
【実施例】
【０９２６】
GENSETタンパク質に対する抗体組成物の作製
実質的に純粋なタンパク質またはポリペプチドを、GENSETタンパク質またはその一部をコードする発現ベクターを含むトランスフェクト細胞または形質転換細胞から単離する。最終調製物のタンパク質濃度は、例えば、Amiconフィルター装置により数μg/mlのレベルまで濃縮することにより調整する。次に、タンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を以下のように調製することができる。
【０９２７】
A. ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体の作製
GENSETタンパク質またはその一部のエピトープに対するモノクローナル抗体はKohlerおよびMilstein, (1975)の古典的な方法またはその誘導法によりマウスハイブリドーマから作製することができる。HarlowおよびLane. (1988)も参照されたい。
【０９２８】
具体的には、数μgのGENSETタンパク質またはその一部を数週間にわたって繰り返しマウスに接種する。次いで、マウスを犠牲にし、脾臓の抗体産生細胞を単離する。脾臓細胞をポリエチレングリコールによってマウス骨髄腫細胞と融合し、融合していない過剰の細胞をアミノプテリンを含有する選抜培地(HAT培地)でこの系を増殖させることによって破壊する。融合に成功した細胞を希釈し、アリコートの希釈物を培養物の増殖が続けられるマイクロタイタープレートのウェルに播種する。抗体産生クローンを、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる最初にEngvall, (1980)に記載されたELISAなどの免疫学的検定手法、およびその誘導法によってウェル上清液中の抗体を検出することにより同定する。選抜された陽性クローンを増殖させて、使用のためにそれらのモノクローナル抗体産物を回収することができる。モノクローナル抗体作製に関する詳細な手順はDavis,ら(1986) 第21-2節に記載されている。
【０９２９】
B. 免疫感作によるポリクローナル抗体の作製
GENSETタンパク質またはその一部の異種エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗血清は、好適な非ヒト動物を、改変しないでまたは免疫原性を高めるために改変することが可能なGENSETタンパク質またはその一部で免疫感作することにより作製することができる。好適な非ヒト動物は、好ましくは非ヒト哺乳類が選択され、一般的にはマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、またはウマである。また、GENSET濃度を高めた未精製の調製物も抗体作製に使用することができる。かかるタンパク質、断片または調製物を当技術分野では公知である好適なアジュバント(例えば、水酸化アルミニウム、RIBIなど)の存在下で非ヒト哺乳類に導入する。タンパク質の他、断片または調製物を抗原性を高めると考えられる薬剤で前処理することができる。かかる薬剤は当技術分野では公知であり、例えば、メチル化ウシ血清アルブミン(mBSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)、B型肝炎表面抗原、およびキーホールリンペット・ヘモシアニン(KLH)が挙げられる。公知の手順に従って、免疫化した動物から血清を採取し、処置し、試験する。血清に好ましくないエピトープに対するポリクローナル抗体が含まれている場合には、ポリクローナル抗体を免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
【０９３０】
有効なポリクローナル抗体の作製は抗原および宿主種の両方に関連する数多くの因子によって影響を受ける。また、宿主動物は接種部位および投与量に応じて異なり、不十分なまたは過剰な量の抗原からは低力価抗血清が生じる。少量(ngレベル)の抗原を複数の皮内部位に投与することが最も確実性が高いと思われる。ポリクローナル抗血清を作製および加工する技術については当技術分野では公知である。ウサギに対して有効な免疫化プロトコールは、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるVaitukaitisら(1971)に見ることができる。
【０９３１】
追加免疫注射を定期的に施与し、半定量的に、例えば、既知の濃度の抗原と対照する寒天内二重免疫拡散法によって調べられるその抗体力価が降下し始めたら時点で抗血清を採取することができる。例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるOuchterlonyら, (1973)を参照されたい。抗体のプラトー濃度は通常、0.1〜0.2mg/血清ml(約12uM)の範囲である。抗原に対する抗血清のアフィニティーは、例えば、全開示内容が参照により本明細書に組み入れられるFisher (1980)に記載されたように競合的結合曲線を作成することにより調べられる。
モノクローナルまたはポリクローナルプロトコールのいずれかによって作製した抗体調製物は、生物学的サンプル中の抗原を有する物質の濃度を調べる定量的免疫学的検定に有用である。また、これらは生物学的サンプル中の抗原の存在確認にも半定量的または定性的に使用される。この抗体はタンパク質を発現する細胞を死滅させるまたは体内のタンパク質レベルを下げるための治療用組成物にも使用することができる。
【０９３２】
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【図面の簡単な説明】
【０９３３】
【図１】例示的なコンピューターシステムのブロックダイヤグラムである。
【図２】新規ヌクレオチドまたはタンパク質配列をデータベースの配列と比較して新規配列とデータベースの配列間の同一性レベルを決定するためのプロセス200の一実施形態を例示するフローダイヤグラムである。
【図３】2つの配列が相同であるかどうかを調べるためのコンピューターでのプロセス250の一実施形態を例示するフローダイヤグラムである。
【図４】配列中の特徴の存在を検出するためのアイデンティファイアープロセス300の一実施形態を例示するフローダイヤグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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