(57)【要約】ＴＩＲＡＰポリペプチドおよびポリヌクレオチド、並びに組換え技術によって、こうしたポリペプチドを産生する方法を開示する。やはり開示するのは、療法、およびこのための診断アッセイにおいて、ＴＩＲＡＰポリペプチドおよびポリヌクレオチドを利用する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号３のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターであって、適合する宿主細胞に存在する、前記発現ベクター。
【請求項３】
組換え宿主細胞産生法であって、前記宿主細胞が、適切な培養条件下で、前記ポリペプチドを産生するように、請求項２の前記発現ベクターを宿主細胞に導入する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項４】
請求項３の方法によって産生される、組換え宿主細胞。
【請求項５】
細胞が前記ポリペプチドを発現する、請求項４の組換え宿主細胞の膜。
【請求項６】
ポリペプチド産生法であって、前記ポリペプチドの産生に十分な条件下で、請求項４の組換え宿主細胞を培養し、そして培養から前記ポリペプチドを回収することを含んでなる、前記方法。
【請求項７】
配列番号３のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項８】
配列番号３のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に完全に相補的なポリヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項９】
配列番号１のヌクレオチド配列に完全に相補的なポリヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
配列番号３に示すアミノ酸配列を含んでなる、単離ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項１０のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１０のポリペプチドに免疫特異的な抗体。
【請求項１３】
配列番号１の配列を含んでなるヌクレオチド配列を発現することによって得ることが可能なポリペプチド。
【請求項１４】
配列番号５のヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号９のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１６】
配列番号９に示すアミノ酸配列を含んでなる、単離ポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号２のヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターであって、適合する宿主細胞に存在する、前記発現ベクター。
【請求項１９】
組換え宿主細胞産生法であって、前記宿主細胞が、適切な培養条件下で、前記ポリペプチドを産生するように、請求項１８の前記発現ベクターを宿主細胞に導入する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項２０】
請求項１９の方法によって産生される、組換え宿主細胞。
【請求項２１】
細胞が前記ポリペプチドを発現する、請求項２０の組換え宿主細胞の膜。
【請求項２２】
ポリペプチド産生法であって、前記ポリペプチドの産生に十分な条件下で、請求項２０の組換え宿主細胞を培養し、そして培養から前記ポリペプチドを回収することを含んでなる、前記方法。
【請求項２３】
配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
配列番号４のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に完全に相補的なポリヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
配列番号２のヌクレオチド配列に完全に相補的なポリヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号４に示すアミノ酸配列を含んでなる、単離ポリペプチド。
【請求項２７】
配列番号４のアミノ酸配列からなる、請求項２６のポリペプチド。
【請求項２８】
請求項２６のポリペプチドに免疫特異的な抗体。
【請求項２９】
配列番号２の配列を含んでなるヌクレオチド配列を発現することによって得ることが可能なポリペプチド。
【請求項３０】
配列番号５のヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項３１】
配列番号９のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項３２】
配列番号９に示すアミノ酸配列を含んでなる、単離ポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号１１のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
配列番号１１に示すアミノ酸配列を含んでなる、単離ポリペプチド。
【請求項３５】
ａ．ＴＬＲ４の少なくともＴＩＲＡＰ結合ドメインを含んでなるポリペプチドを提供し；
ｂ．ＴＩＲＡＰポリペプチド、またはＴＬＲ４結合ドメインを含んでなる他のポリペプチドを提供し；
ｃ．候補化合物を提供し；
ｄ．候補化合物を、ＴＬＲ４のＴＩＲＡＰ結合ドメインを含んでなるポリペプチドおよびＴＩＲＡＰポリペプチドまたは他のポリペプチドと近接して配置し；そして
ｅ．候補化合物が、ＴＬＲ４のＴＩＲＡＰ結合ドメインを含んでなるポリペプチド、あるいはＴＩＲＡＰポリペプチドまたは他のポリペプチドいずれかの結合と競合するかどうかを決定する
工程を含んでなる、薬剤スクリーニング法。
【請求項３６】
ＴＬＲ４のＴＩＲＡＰ結合ドメインがＴＬＲ４を含んでなり、そしてＴＩＲＡＰポリペプチドまたは他のポリペプチドが配列番号９に示すポリペプチドを含んでなる、請求項３５の薬剤スクリーニング法。
【請求項３７】
ＴＬＲ４のＴＩＲＡＰ結合ドメインがＴＬＲ４を含んでなり、そしてＴＩＲＡＰポリペプチドまたは他のポリペプチドが配列番号１０に示すポリペプチドを含んでなる、請求項３５の薬剤スクリーニング法。
【請求項３８】
細胞において、ＴＩＲＡＰシグナル伝達を遮断する方法であって、前記細胞に阻害量のＴＩＲＡＰ阻害剤を投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項３９】
前記ＴＩＲＡＰ阻害剤がポリペプチドである、請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記ＴＩＲＡＰ阻害剤がペプチド模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃ）である、請求項３８の方法。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが配列番号９、１１および１２に示すアミノ酸配列群から選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項３９の方法。
【請求項４２】
融合タンパク質であって、ＴＩＲＡＰ阻害性ポリペプチド、および前記融合タンパク質を細胞に搬送するのに有用な第二のポリペプチドを含んでなる、前記融合タンパク質。
【請求項４３】
前記の第二のポリペプチドがアンテナペディアを含んでなる、請求項４２の融合タンパク質。
【請求項４４】
ＴＬＲ４のＭｙＤ８８独立シグナル伝達を阻害するペプチドまたは小分子に関してスクリーニングすることを含んでなる、ＴＩＲＡＰ活性アンタゴニストのスクリーニング方法。
【請求項４５】
ＴＩＲＡＰのＴＬＲ４への結合を阻害するペプチドまたは小分子に関してスクリーニングすることを含んでなる、ＴＩＲＡＰ活性アンタゴニストのスクリーニング方法。
【請求項４６】
ＴＬＲ４のＭｙＤ８８独立シグナル伝達を活性化するペプチドまたは小分子に関してスクリーニングすることを含んでなる、ＴＩＲＡＰ活性アゴニストのスクリーニング方法。
【請求項４７】
ＴＬＲ４のＴＩＲＡＰ結合部位に結合するペプチドまたは小分子に関してスクリーニングすることを含んでなる、ＴＩＲＡＰ活性アゴニストのスクリーニング方法。
【請求項４８】
候補ＴＩＲＡＰアンタゴニストと、ＴＬＲ４ポリペプチドまたはそのＴＩＲＡＰ結合ドメイン、およびＴＩＲＡＰまたはそのＴＬＲ４結合ドメインを、いずれかの順序で連続して、または同時に接触させ、そして候補アンタゴニストが、ＴＩＲＡＰまたはそのＴＬＲ４結合ドメインと、ＴＬＲ４ポリペプチドまたはそのＴＩＲＡＰ結合ドメインの結合を阻害するかどうかを決定することを含んでなる、請求項４４の方法。
【請求項４９】
突然変異体がＴＬＲ４に結合するが、ＴＬＲ４のＭｙＤ８８独立シグナル伝達を誘導しないように、ＴＬＲ４結合ドメインに少なくとも１つの突然変異を有するＴＩＲＡＰを含んでなる、ＴＩＲＡＰアンタゴニスト。
【請求項５０】
突然変異体がＴＩＲＡＰに結合し、そしてＴＩＲＡＰのＴＬＲ４への結合を妨げるが、ＴＬＲ４のＭｙＤ８８独立シグナル伝達を誘導しないように、ＴＬＲ４結合ドメインに少なくとも１つの突然変異を有するＴＩＲＡＰを含んでなる、ＴＩＲＡＰアンタゴニスト。
【請求項５１】
ヒトＴＩＲＡＰで判断された場合のアミノ酸１１８〜１３１の領域に少なくとも１つの突然変異を含んでなる、請求項４９のＴＩＲＡＰアンタゴニスト。
【請求項５２】
ＴＩＲＡＰの結合ドメインが、１２５位に、プロリンからヒスチジンへの突然変異を有する、請求項５１のＴＩＲＡＰアンタゴニスト。
【請求項５３】
ＴＩＲＡＰ発現と関連する疾患状態を治療する方法であって、ポリペプチドがＴＬＲ４に結合するが、ＴＬＲ４のＭｙＤ８８独立シグナル伝達を誘導しないように、ＴＬＲ４結合ドメインに突然変異を有するポリペプチドを、内部投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項５４】
ＴＩＲＡＰのＴＬＲ４への結合を阻害する小分子である、ＴＩＲＡＰアンタゴニスト。
【請求項５５】
ＴＩＲＡＰアンタゴニストを内部投与することを含んでなる、動物において、免疫応答を変調する方法。
【請求項５６】
ＴＩＲＡＰをコードするポリヌクレオチドにアンチセンスであるポリヌクレオチドを内部投与することを含んでなる、動物において、免疫応答を変調する方法。
【請求項５７】
内因性トル／インターロイキン−１受容体アダプタータンパク質遺伝子における破壊を含んでなる、トランスジェニック・ノックアウト非ヒトであって、ここにおいて、前記破壊は、ターゲティング構築物が前記非ヒトのゲノムに安定して組み込まれるように、胚性幹細胞において、ＤＮＡターゲティング構築物との相同組換えによってそのゲノムに導入されている、前記非ヒト。
【請求項５８】
非ヒトがマウスである、請求項５７のトランスジェニック・ノックアウト非ヒト。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
薬剤発見法は、「機能的ゲノミクス」、すなわちハイスループットのゲノムまたは遺伝子に基づく生物学を含むため、現在、抜本的な改革を経験しつつある。このアプローチは、ポジショナルクローニングに基づく、より初期のアプローチに迅速に取って代わっている。生物学的機能または遺伝子疾患である表現型が同定され、そしてこれはその後、遺伝子マップ位置に基づいて、関与する遺伝子にさかのぼられるであろう。
【０００２】
機能的ゲノミクスは、現在利用可能な多くの分子生物学データベースから、潜在的な目的の遺伝子配列を同定する、バイオインフォマティクスの多様なツールに非常に頼る。免疫応答に影響を及ぼす潜在能力を持つ薬剤発見のための標的として、さらなる遺伝子およびその関連ポリペプチド／タンパク質を同定し、そして性質決定する、継続した必要性がある。
【０００３】
生得的な免疫認識の戦略は、微生物代謝の恒常的な、そして保存される産物の検出に基づく。多くの代謝経路および個々の遺伝子産物は、微生物にユニークであり、そして宿主細胞には欠けている。認識のこれらの標的は、異なる種の微生物間で、絶対的には同一でないが、遺伝子産物は、共通の分子パターンの背景で見出すことが可能であり、これは、典型的には、既定のクラスの微生物間で非常に保存されており、そして不変である。生得的な免疫認識の標的は、保存された分子パターンであるため、これらは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる。
【０００４】
トル（Ｔｏｌｌ）様受容体（ＴＬＲ）ファミリーの最近の発見および性質決定は、生得免疫の分野に新たな関心を引き起こしてきている。ＴＬＲｓは、動物免疫において、ユニークでそして重要な機能を有する、パターン認識受容体である。ＴＬＲｓは、典型的には、細胞外ロイシンリッチ反復ドメインおよび細胞内ＴＩＲ（トル／インターロイキン−１受容体）ドメインによって特徴付けられる、膜貫通受容体である。ＴＩＲドメインは、保存されるタンパク質−タンパク質相互作用モジュールであり、そして宿主防御に役割を果たす。言い換えると、ＴＬＲは、微生物認識および獲得免疫応答の調節に重要な役割を果たす。
【０００５】
哺乳動物種には少なくとも１０のＴＬＲｓがあり、そして各々が、生得免疫認識において、別個の機能を有する。ＴＬＲｓは、主に、リガンド特異性、アクセサリー分子の使用、発現プロフィールおよびシグナル伝達経路の相違に関して、互いに異なる。
【０００６】
ヒトＴＬＲ４は、最初に同定され、そして機能的に性質決定された哺乳動物トルであった。ＴＬＲ４は、ＰＡＭＰリポ多糖（ＬＰＳ）、並びに、当業者に明らかな他のＰＡＭＰのシグナル伝達受容体として機能する。
【０００７】
ＴＬＲｓによるシグナル伝達経路の活性化は、炎症性サイトカイン、ケモカイン、ＭＨＣおよび同時刺激分子を含む、宿主防御において機能する、多様な遺伝子の誘導を導く。哺乳動物ＴＬＲｓはまた、誘導性一酸化窒素シンテターゼ、および微生物病原体を直接破壊可能な抗菌ペプチドなどの多数のエフェクター分子も誘導する。
【０００８】
トルおよびインターロイキン−１受容体（ＩＬ−１Ｒ）ファミリーのすべてのメンバーに共有されるようであるシグナル伝達経路には、４つの本質的な構成要素：アダプターＴＲＡＦ６、ＭｙＤ８８およびトーリップ（Ｔｏｌｌｉｐ）およびプロテインキナーゼＩＲＡＫが含まれる。ＭｙＤ８８は、２つのタンパク質相互作用ドメイン：Ｎ末端死ドメインおよびＣ末端ＴＩＲドメインを含有する。ＭｙＤ８８のＴＩＲドメインは、ＴＬＲおよびＩＬ−１ＲのＴＩＲドメインと関連し、一方、死ドメインは、ＩＲＡＫの死ドメインと相互作用する。
【０００９】
ＭｙＤ８８発現が抑制されている細胞では（すなわちＭｙＤ８８ノックアウトマウスでは）、マクロファージおよび樹状細胞は、それぞれ、ＴＬＲ４、ＴＬＲ２およびＴＬＲ９を通じてシグナル伝達するＬＰＳ、ＭＡＬＰ−２またはＣｐＧで刺激した際、サイトカインＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６およびＩＬ−１２を産生しない。その結果、ＭｙＤ８８ノックアウトマウスは、内毒素ショックに耐性である。さらに、正常な骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）をＬＰＳまたはＣｐＧで刺激した際、これらは、多量のＩＬ−１２を産生し、そしてＭＨＣおよび同時刺激分子の細胞表面発現を上方制御する。しかし、ＭｙＤ８８欠損ＢＭＤＣでは、ＬＰＳまたはＣｐＧでの刺激は、ＩＬ１２またはＩＬ−６を産生しない。
【００１０】
さらに、ＲＮＡ依存プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）欠損細胞は、ＬＰＳ刺激に応答して、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）およびｐ３８  ＭＡＰキナーゼ（ｐ３８）を活性化することができない。ＴＬＲ４はＬＰＳの下流のシグナルに必要であるため、これは、ＰＫＲがＴＬＲ４シグナル伝達経路の構成要素であることを示す。リン酸化ＰＫＲは、ＬＰＳで刺激した野生型マクロファージで検出可能であるが、リン酸化ＰＫＲはまた、ＬＰＳで刺激したＭｙＤ８８欠損マクロファージでも検出されてきている。興味深いことに、ＭｙＤ８８欠損マクロファージ由来のＰＫＲは、より遅い動力学で活性化された。
【００１１】
いくつかの細胞性応答が、ＭｙＤ８８欠損細胞で完全に無効にされているが、ＴＬＲ４はなお、ＮＦ−κＢおよびＭＡＰキナーゼを活性化可能であり、しかし、ＴＬＲ９またはＴＬＲ２はこれらを活性化可能でない。この相違は、ＴＬＲ４連結に応答して、ＭｙＤ８８独立シグナル伝達を仲介可能な、別のアダプタータンパク質が存在することを示す。
【００１２】
したがって、ＴＬＲ４機能に関連する疾患を治療する化合物を開発するには、ＴＬＲ４の下流のＭｙＤ８８独立シグナル伝達に関与するアダプタータンパク質の構造および機能を決定する必要がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
（発明の概要）
本発明は、トル（Ｔｏｌｌ）・インターロイキン−１受容体アダプタータンパク質（ＴＩＲＡＰｓ）に関し、そして特に、ＴＩＲＡＰポリペプチド群およびＴＩＲＡＰポリヌクレオチド群、組換え材料およびこれらの産生法に関する。さらなる側面において、本発明はＴＩＲＡＰ阻害剤に関する。別の側面において、本発明は、炎症を治療することおよび免疫応答を誘導するかまたは免疫応答に影響を及ぼすことを含む、こうしたポリペプチドおよびポリヌクレオチドを用いる方法に関する。さらなる側面において、本発明は、本発明に提供される材料を用いて、アゴニストおよびアンタゴニスト／阻害剤を同定する方法、並びに同定された化合物で、ＴＩＲＡＰ不均衡に関連する状態を治療する方法に関する。さらなる側面において、本発明は、ＴＩＲＡＰポリヌクレオチドを含んでなるトランスジェニック哺乳動物に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の説明）
上に簡潔に記載したように、いくつかの細胞性応答が、ＭｙＤ８８欠損細胞で完全に無効にされているが、ＴＬＲ４はなお、ＮＦ−κＢおよびＭＡＰキナーゼを活性化可能であり、しかし、ＴＬＲ９またはＴＬＲ２はこれらを活性化可能でない。具体的には、ＮＦ−κＢおよびＭＡＰシグナル伝達経路の詳細な解析によって、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）ＬＰＳが、ＭｙＤ８８欠損細胞において、ＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ｐ３８およびＥＲＫの活性化を誘導するが、ＣｐＧまたはＭＡＬＰ−２はこれらの活性化を誘導しないことが立証されている。これらのシグナル伝達経路の活性化は、遅延された動力学で起こり、そしてサイトカイン遺伝子発現の誘導には不十分であった。
【００１５】
さらに、ＬＰＳまたはＣｐＧで刺激されたＭｙＤ８８欠損ＢＭＤＣｓは、ＩＬ−１２またはＩＬ−６を産生しない。しかし、ＢＭＤＣｓは、ＬＰＳで処理した際、ＭＨＣおよび同時刺激分子（ＣＤ８０およびＣＤ８６など）の発現を上方制御するように誘導可能であるが、ＣｐＧで刺激した際は、誘導可能でない。この結果は、ＭｙＤ８８独立シグナル伝達経路が、樹状細胞成熟に十分であるが、サイトカインＩＬ−６およびＩＬ−１２の誘導には、ＭｙＤ８８依存シグナル伝達経路が必要であることを立証する。さらに、インターロイキン−１８の生物学的に活性な型へのカスパーゼ−１プロセシングは、ＭｙＤ８８と独立に、ＴＬＲ４によって誘導可能である。
【００１６】
これらの相違は、ＴＬＲ４連結に応答して、ＭｙＤ８８独立シグナル伝達を仲介可能な、別のアダプタータンパク質が存在することを示す。本明細書において、ＴＬＲ４連結に応答してＭｙＤ８８独立シグナル伝達を仲介するアダプタータンパク質は、「ＴＩＲＡＰ」（トル／インターロイキン−１受容体アダプタータンパク質）と称されるであろう。
【００１７】
特に、本発明のポリペプチドには、それぞれ、配列番号１および２に示す配列を含んでなる、ヒトおよびマウスポリヌクレオチドにコードされる単離ポリペプチドが含まれる。本発明のポリペプチドは、ＭｙＤ８８を含む、トル／インターロイキン−１受容体アダプタータンパク質ファミリーのメンバーであると考えられる。したがって、この遺伝子は、樹状細胞成熟と共に、細胞におけるＮＦ−κＢ、ＪＮＫ、ｐ３８およびＥＲＫ活性化を誘導するかまたは阻害する、別の機構を提示するため、興味深い。
【００１８】
当業者が理解するように、ＴＬＲ４は、感染および細胞損傷を含む、多くの生理学的応答に関与する。例えば、上に示すように、ＴＬＲ４はＰＡＭＰ  ＬＰＳを認識する。ＴＬＲ４はまた、炎症反応、そして特に、細胞壊死が誘導する炎症にも関連付けられてきている。したがって、ＴＬＲ４のシグナル伝達経路に影響を及ぼし、そして／または関与する分子の発見および性質決定は、上述の状態と共に、当業者に認識されるであろう他の状態の有効な治療の開発のために重要である。
【００１９】
一般的なＴＩＲＡＰおよびＴＩＲＡＰ阻害剤ポリヌクレオチドおよびポリペプチド
第一の側面において、本発明は、ＴＩＲＡＰポリヌクレオチドおよびＴＩＲＡＰポリペプチドに関する。具体的には、配列番号１および２に示すポリヌクレオチドは、それぞれ、本発明のトル・インターロイキン−１受容体アダプタータンパク質を含んでなる、配列番号３（ヒト）および４（マウス）に示すポリペプチドをコードする。ＴＩＲＡＰをコードするヒトおよびマウスポリヌクレオチドは、非常に相同である（図１を参照されたい）。具体的には、１つの態様において、ヒトおよびマウスＴＩＲＡＰポリヌクレオチドおよびポリペプチドの比較は、タンパク質レベルで少なくとも７３％の同一性、およびポリヌクレオチドレベルで８３％の同一性を示す。したがって、本開示に基づいて、ヒトおよびマウスＴＩＲＡＰポリヌクレオチド両方、並びにそれにコードされるポリペプチドは、本明細書に記載するように、同様の目的に使用可能であることが理解されるであろう。配列番号１〜４に示すポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、全長ＴＩＲＡＰ分子であり、そして以下、一般的に、ＴＩＲＡＰまたはＴＩＲＡＰポリヌクレオチド、ＴＩＲＡＰペプチドおよびＴＩＲＡＰポリペプチドと称される。別に明記しない限り、「ＴＩＲＡＰ」は、「ＴＩＲＡＰポリペプチド」と同義であり、そしてトル・インターロイキン−１受容体アダプタータンパク質、および同一の生物学的機能を有する、すなわちその活性化に応答してＭｙＤ８８独立シグナル伝達を変調する、他のポリペプチドを指すよう意味する。配列番号３および４に示すポリペプチドの特性はまた、以下、以下に説明するような「ＴＩＲＡＰ活性」または「ＴＩＲＡＰポリペプチド活性」または「ＴＩＲＡＰの生物学的活性」と称される。
【００２０】
以下に説明するように、ＴＩＲＡＰポリヌクレオチドおよびポリペプチドに相同性を有する、本発明の好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、ＴＩＲＡＰポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／特性を有すると予期される。具体的には、本発明の好ましいＴＩＲＡＰポリペプチドは、ＴＬＲ４のＴＩＲＡＰ結合ドメインに結合可能である点で、ＴＩＲＡＰ活性を有する。こうしたＴＩＲＡＰポリペプチドは、したがって、例えば以下に記載するように、薬剤スクリーニングに有用である。本発明のＴＩＲＡＰポリペプチドにはまた、ＴＬＲ４の活性化に際して、ＭｙＤ８８独立応答、例えばＮＦ−κＢおよびＭＡＰキナーゼ活性化をシグナル伝達するポリペプチドも含まれる。
【００２１】
ＴＩＲＡＰポリペプチドおよびＴＩＲＡＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの性質決定は、ＴＩＲＡＰポリペプチドが仲介するシグナル伝達を阻害することによって、ＴＬＲ４のＭｙＤ８８独立経路及びＭｙＤ８８依存経路の両方を阻害する化合物の発見を導いた。ＴＩＲＡＰ活性を阻害する、こうした化合物は、炎症および敗血症ショックを防止するかまたは減少させるのに、そして特に、少なくとも部分的に、細胞壊死が誘導する炎症のために生じる、移植片拒絶の防止を補助するのに、有用である。
【００２２】
したがって、第二の側面において、本発明は、ＴＩＲＡＰ阻害剤に関する。具体的には、配列番号９および１０に示すポリペプチドは、それぞれ、ヒトおよびマウスＴＩＲＡＰ阻害剤ポリペプチドである。これらのポリペプチドは、本明細書において、ＴＩＲＡＰ阻害剤またはＴＩＲＡＰ突然変異ペプチドまたはＴＩＲＡＰ阻害剤ポリペプチドと称される。各ＴＩＲＡＰ阻害剤の特性は、以下、「ＴＩＲＡＰ阻害剤活性」と称される。配列番号５（天然存在）および配列番号６（縮重）に示すポリヌクレオチドは、配列番号９に示すヒトＴＩＲＡＰ阻害剤ポリペプチドをコードし、そして配列番号７（天然存在）および配列番号８（縮重）に示すポリヌクレオチドは、配列番号１０に示すマウスＴＩＲＡＰ阻害剤ポリペプチドをコードする。配列番号５〜８は、ＴＩＲＡＰ阻害剤ポリヌクレオチドと称され、そして配列番号９および１０に示す配列は、ＴＩＲＡＰ阻害剤ポリペプチドと称される。
【００２３】
以下にさらに説明するように、ＴＩＲＡＰ阻害剤ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに相同性を有する、本発明の好ましい阻害剤ポリペプチドおよび阻害剤ポリヌクレオチドは、ＴＩＲＡＰ阻害剤ポリペプチドおよびポリヌクレオチドと同様の生物学的機能／特性を有すると予期される。本明細書において、本発明の好ましいＴＩＲＡＰ阻害剤ポリペプチドは、以下により詳細に記載するように、ＴＬＲ４の活性化にもかかわらず、ＴＬＲ４を発現している細胞において、ＭｙＤ独立応答、例えばＮＦ−κＢおよびＭＡＰキナーゼ活性化、並びにＭｙＤ依存応答両方を阻害することが可能であるという点で、ＴＩＲＡＰ阻害剤活性を有する。
【００２４】
最後に、配列番号１１は、アンテナペディアおよびＴＩＲＡＰ阻害剤ポリペプチドの融合タンパク質の機能する例である。具体的には、配列番号１１は、アンテナペディアおよび配列番号１０に示すＴＩＲＡＰ阻害剤の融合タンパク質である。配列番号１１に示すポリペプチドはまた、ＴＩＲＡＰ活性を阻害するため、ＴＩＲＡＰ阻害剤融合タンパク質の特性はまた、「ＴＩＲＡＰ阻害剤活性」と称することも可能である。この特別な態様は、表題「融合タンパク質」以下に、より詳細に記載される。
【００２５】
本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの構造
本発明のポリペプチドは、「成熟」タンパク質の形であることが可能であるし、または「融合タンパク質」以下に記載するように、融合タンパク質、例えば配列番号１１などのコンジュゲート化タンパク質の一部であることが可能である。分泌またはリーダー配列、プロ配列、多数ヒスチジン残基などの精製を補助する配列、または組換え産生中の安定性のためのさらなる配列を含有する、さらなるアミノ酸配列を含むことがしばしば好適である。
【００２６】
本発明にはまた、同様の特性を持つ別の残基によって置換される、保存的アミノ酸置換によって、参照ポリペプチドと異なるポリペプチドである、前述のポリペプチドの変異体も含まれる。典型的なこうした置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間；ＳｅｒおよびＴｈｒ間；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕ間；ＡｓｎおよびＧｌｎ間；並びに塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇ間；または芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間である。特に好ましいのは、いくつか、５〜１０、１〜５、１〜３、１〜２または１アミノ酸が、いずれかの組み合わせで、置換され、欠失され、または付加されている変異体である。
【００２７】
こうしたポリペプチドには、配列番号３、４、９、１０および１１の全長に渡って、配列番号３、４、９、１０および１１のものに、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９７〜９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離ポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドには、配列番号３、４、９、１０および１１に示すポリペプチドを含んでなるポリペプチドと共に、配列番号３、４、９、１０および１１に示すポリペプチドからなるポリペプチドが含まれる。
【００２８】
本発明はまた、式：
Ｘ――（Ｒ１）ｍ――（Ｒ２）――（Ｒ３）ｎ――Ｙ
（式中、アミノ末端で、Ｘは水素、金属または修飾ポリペプチドに関して本明細書に記載する他の部分いずれかであり、そしてカルボキシ末端で、Ｙは水素、金属または以下に記載する修飾を含む修飾ポリペプチドの他の部分いずれかであり、Ｒ１およびＲ３は、アミノ酸残基または修飾アミノ酸残基いずれかであり、ｍは１〜１０００の間の整数またはゼロであり、ｎは１〜１０００の間の整数またはゼロであり、そしてＲ２は上述のような本発明のアミノ酸配列またはその修飾型である）のポリペプチドからなるかまたは該ポリペプチドを含んでなる、ポリペプチドも含む。上記式において、Ｒ２は、そのアミノ末端アミノ酸残基が、その左側でＲ１に共有結合し、そしてそのカルボキシ末端アミノ酸残基が、その右側でＲ３に共有結合するように、配向される。Ｒ１またはＲ３いずれかに示すアミノ酸残基の伸展いずれかは、ｍおよび／またはｎが１より大きい場合、ヘテロポリマーまたはホモポリマーいずれかであることが可能であり、好ましくはヘテロポリマーである。ｍが１〜５０、１００または５００の間の整数であり、そしてｎが１〜５０、１００または５００の間の整数である、本発明の他の態様が提供される。
【００２９】
本発明のポリペプチドは、適切な方式いずれかで調製可能である。こうしたポリペプチドには、単離天然に生じたポリペプチド、組換え的に産生したポリペプチド、合成的に産生したポリペプチド、またはこれらの方法の組み合わせによって産生したポリペプチドが含まれる。こうしたポリペプチドを調製する手段は、当該技術分野によく理解されている。
【００３０】
本発明のポリヌクレオチドには、配列番号１、２、および５〜８の１つの全長に渡って、配列番号１および２に示すポリヌクレオチド、または配列番号５〜８に示すポリヌクレオチドに、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチドが含まれる。これに関連して、少なくとも９７％の同一性を有するポリヌクレオチドが非常に好ましく、一方、少なくとも９８〜９９％の同一性を有するものが、さらに非常に好ましく、そして少なくとも９９％の同一性を有するものが、最も非常に好ましい。こうしたポリヌクレオチドには、配列番号１および２に示すポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドと共に、配列番号１および２に示すポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチドが含まれる。こうしたポリヌクレオチドにはまた、配列番号５〜８に示すポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドと共に、配列番号５〜８に示すポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチドも含まれる。
【００３１】
上述のように、本発明はまた、ＴＩＲＡＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびＴＩＲＡＰ阻害剤をコードするポリヌクレオチド両方にも関する。当業者が理解するように、配列番号３、４、９、１０に示すポリペプチドの１つをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、配列番号１、２、５および７に示す配列をコードするポリペプチドと同一であることが可能であり、または遺伝暗号の重複（縮重）の結果として、やはり配列番号３、４、９、および１０のポリペプチドをコードする、配列番号１、２、５および７に示すもの以外の配列であることも可能である。
【００３２】
こうしたポリヌクレオチドには、配列番号３、４、９、１０および１１の全長に渡って、配列番号３、４、９、１０および１１のアミノ酸配列に、少なくとも７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも９０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離ポリヌクレオチドが含まれる。これに関連して、配列番号３、４、９、１０および１１に示すポリペプチドに、少なくとも９７％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが非常に好ましく、一方、配列番号３、４、９、１０および１１に示すポリペプチドに、少なくとも９８〜９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするものが、さらに非常に好ましく、そして配列番号３、４、９、１０および１１に示すポリペプチドに、少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドをコードするものが、最も非常に好ましい。
【００３３】
本発明はまた、式：
Ｘ――（Ｒ１）ｍ――（Ｒ２）――（Ｒ３）ｎ――Ｙ
（式中、分子の５’端で、Ｘは水素、金属または修飾ヌクレオチド残基であり、あるいはＹと共に共有結合を明示し、そして分子の３’端で、Ｙは水素、金属または修飾ヌクレオチド残基であり、あるいはＸと共に共有結合を明示し、Ｒ１およびＲ３の各発生は、独立に、核酸残基または修飾核酸残基いずれかであり、ｍは１〜３０００の間の整数またはゼロであり、ｎは１〜３０００の間の整数またはゼロであり、そしてＲ２は上述のような本発明の核酸配列または修飾核酸配列である）のポリヌクレオチドからなるかまたは該ポリヌクレオチドを含んでなる、ポリヌクレオチドも含む。上記のポリヌクレオチドの式において、Ｒ２は、その５’端核酸残基が、その左側でＲ１に結合し、そしてその３’端核酸残基が、その右側でＲ３に結合するように、配向される。Ｒ１および／またはＲ２いずれかに示される核酸残基の伸展いずれかは、ｍおよび／またはｎが１より大きい場合、ヘテロポリマーまたはホモポリマーいずれかであることが可能であり、好ましくはヘテロポリマーである。特定の態様において、ＸおよびＹが、共に共有結合を明示する場合、上記式のポリヌクレオチドは、閉じた、環状ポリヌクレオチドであり、これは、二本鎖ポリヌクレオチドであることが可能であり、この場合、式は第一の鎖を示し、これに対して第二の鎖が相補的である。別の態様において、ｍおよび／またはｎは、１〜１０００の間の整数である。ｍが１〜５０、１００または５００の間の整数であり、そしてｎが１〜５０、１００または５００の間の整数である、本発明の他の態様が提供される。
【００３４】
本発明はまた、上述のポリヌクレオチドすべてに相補的なポリヌクレオチドも提供する。
【００３５】
ＴＩＲＡＰ阻害剤
上述のように、配列番号９〜１１はＴＩＲＡＰ阻害剤である。配列番号９および１０に示すポリペプチドは、それぞれ、ＴＩＲＡＰポリペプチド、配列番号３および４に示すポリペプチドの結合ドメインの突然変異型である。
【００３６】
典型的なＴＩＲＡＰ阻害剤は、１）小分子模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃ）、または２）以下により詳細に示すような、それ自体が配列番号１および２の突然変異断片である、配列番号５〜８に示すポリヌクレオチドにコードされるポリペプチド、または３）上述のような、ＴＩＲＡＰ阻害剤活性を有する別のポリペプチドであることが可能である。
【００３７】
好ましくは、本発明の有効なＴＩＲＡＰ阻害剤ポリペプチドは、コードされる突然変異を持たないＴＩＲＡＰポリペプチドに比較して、コードされる、（図１に示す、マウスＴＩＲＡＰで判断された場合の）アミノ酸１４５位のヒスチジンからプロリンへの突然変異、または（やはり図１に示し、そして図中でＰ１２５Ｈと称する、ヒトＴＩＲＡＰで判断された場合の）アミノ酸１２５位のプロリンからヒスチジンへの突然変異を有する。突然変異は、当業者によく理解される技術を用いて、達成可能である。
【００３８】
適切な位でのヒスチジンからプロリンへの突然変異は、ＴＩＲＡＰ阻害剤が、ＴＬＲ４の細胞質ドメインに結合するのを可能にするが、それでもＴＬＲ４の下流シグナル伝達（ＭｙＤ８８依存およびＭｙＤ８８独立シグナル伝達両方）を阻害することが見出されている。
【００３９】
細胞受容体シグナル伝達の特定の理論に帰することなく、ＴＩＲＡＰ阻害剤、並びに、ＴＩＲＡＰ阻害剤活性を有する、ＴＩＲＡＰ阻害剤またはＴＩＲＡＰ阻害剤模倣体に十分に相同な他のポリペプチドが、ＴＬＲ４に結合すると考えられる。この結合を概念的に図７に例示する。ひとたび結合したら、ＴＩＲＡＰ阻害剤は、ＭｙＤ８８依存経路と共に、ＭｙＤ８８独立経路両方を通じて、ＴＬＲ４シグナル伝達を阻害する。
【００４０】
前の段落に示唆するように、ＴＩＲＡＰ阻害剤ポリペプチドに、適切な構造的類似性を有する、典型的には２ｋＤ未満の分子量を持つ有機化合物もまた、ＴＩＲＡＰ阻害剤として使用可能である。例えば、小分子模倣体が使用可能である。当業者が理解するように、小分子模倣体は、特定のタンパク質と適切に会合し、そして応答を引き出すのに必要な空間的コンホメーションを提供する、化学的に合成した化合物である。したがって、本発明はまた、ＴＩＲＡＰシグナル伝達を阻害するための、小分子模倣体の使用も含んでなる。
【００４１】
融合タンパク質
本発明のさらなる側面はまた、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにも関する。融合タンパク質技術の例は、国際特許出願第ＷＯ９４／２９４５８号および第ＷＯ９４／２２９１４号に見出すことが可能である。
【００４２】
本発明のこの特定の態様は、ＴＩＲＡＰ阻害剤ポリペプチド、またはその活性部分もしくは活性断片、およびアンテナペディアなどの細胞膜輸送タンパク質を含んでなる、融合タンパク質に関する。当業者が理解するように、療法的に有効になるように、細胞膜を渡ってタンパク質を搬送するのは、困難である可能性がある。ウイルスまたはウイルス断片を用いて、細胞にタンパク質を輸送することが可能であるが、この技術は、普遍的には認可されていない。ショウジョウバエＤｒｏｓｏｐｈｉｌａから得られるアンテナペディアは、該タンパク質のヒト型と実質的に同一であり、そしてしたがって、ヒトで使用する際、あるとしてもわずかしか抗原性応答がない。タンパク質は、アンテナペディアの一部（例えばＡｎｔｐ１６）を用いて輸送することが可能であるが、こうした方法は、典型的には、小さいタンパク質にしか適していない。
【００４３】
ＴＩＲＡＰ阻害剤活性を有する融合タンパク質の多くの態様が想定されるが、こうした態様の１つの機能する例が、配列番号１１に示され、該配列は、アンテナペディアおよび配列番号１０に示すＴＩＲＡＰ阻害剤の融合体に相当する。配列番号９および１０に示すＴＩＲＡＰ阻害剤が、アンテナペディアにコンジュゲート化し、そして細胞膜を渡って輸送されるのに適したサイズであることが見出されている。具体的には、ＴＩＲＡＰ阻害剤にひとたびコンジュゲート化されると、アンテナペディアは、ポリペプチドが細胞内で療法的に活性になり、そしてＴＩＲＡＰ阻害剤活性を示すように、細胞膜を渡るＴＩＲＡＰ阻害剤の輸送を促進する。
【００４４】
異常な状態を治療する方法
さらなる側面において、本発明は、ＴＩＲＡＰポリペプチド活性の過剰発現または過少発現いずれかに関する、例えば炎症などの異常な状態を治療する方法を提供する。好ましくは、本発明の実施は、ＴＩＲＡＰ活性をアンタゴナイズするかまたはアゴナイズして、炎症性反応を防止するかまたは治療することを含んでなるであろう。
【００４５】
ＴＩＲＡＰポリペプチドの活性が過剰である場合、いくつかのアプローチが利用可能である。１つのアプローチは、ＴＩＲＡＰの機能を阻害する必要がある被験者に、上述のようなＴＩＲＡＰ阻害剤またはＴＩＲＡＰ阻害剤模倣体（アンタゴニスト）を、所望により、薬学的に許容しうるキャリアーと組み合わせて、例えば１）阻害分子をＴＩＲＡＰ自体に結合させて、それによってＴＩＲＡＰ機能を阻害することによって、または２）ＴＩＲＡＰ阻害剤をＴＬＲ４に結合させることにより、ＴＬＲ４へのＴＩＲＡＰの結合を遮断して、そしてそれにより潜在的にＭｙＤ８８依存および独立シグナル伝達両方を阻害することによって、ポリペプチドの機能を阻害するのに有効な量で、投与することを含んでなる。
【００４６】
さらに別のアプローチにおいて、内因性ＴＩＲＡＰポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、発現遮断技術を用いて阻害可能である。既知の技術は、内部生成されるかまたは別個に投与されるかいずれかのアンチセンス配列の使用を伴う（例えばＯ’Ｃｏｎｎｅｒ，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ（１９９１）５６：５６０、Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  フロリダ州ボカレイトン（１９８８）を参照されたい）。あるいは、該遺伝子と三重らせんを形成するオリゴヌクレオチドを供給可能である（例えば、Ｌｅｅら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ（１９７９）６：３０７３；Ｃｏｏｎｅｙら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４１：４５６；Ｄｅｒｖａｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９１）２５１：１３６０を参照されたい）。これらのオリゴマーは、それ自体を投与することが可能であるし、また適切なオリゴマーをｉｎ  ｖｉｖｏで発現させることが可能である。
【００４７】
ＴＩＲＡＰおよびその活性の過少発現に関連する異常な状態を治療するため、やはりいくつかのアプローチが利用可能である。１つのアプローチは、被験者に、本発明のポリペプチドを活性化する化合物、すなわちアゴニストの療法的有効量を、薬学的に許容しうるキャリアー（次のセクションに、以下、記載される）と組み合わせて投与して、それによって異常な状態を緩和することを含んでなる。あるいは、遺伝子治療を使用して、被験者において、適切な細胞によるＴＩＲＡＰの内因性産生を達成することが可能である。例えば、上に論じるように、本発明のポリヌクレオチドを複製不全レトロウイルスベクターにおける発現用に操作することが可能である。その後、レトロウイルス発現構築物を単離し、そして本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有するレトロウイルスプラスミドベクターを形質導入したパッケージング細胞に、該レトロウイルス発現構築物を導入して、パッケージング細胞がここで、目的の遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生するようにすることが可能である。細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで操作し、そしてポリペプチドの発現をｉｎ  ｖｉｖｏで操作するため、これらの産生細胞を被験者に投与することが可能である。遺伝子治療の概説には、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｔ  ＳｔｒａｃｈａｎおよびＡ  Ｐ  Ｒｅａｄ，  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｌｔｄ（１９９６）中の第２０章、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃ−ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ（およびそこに引用される参考文献）を参照されたい。別のアプローチは、適切な薬学的キャリアーと組み合わせて、本発明のポリペプチドの療法量を投与することである。
【００４８】
薬学的適用
さらなる側面において、本発明は、本発明のポリペプチドの可溶性型などのポリペプチド、アゴニスト／アンタゴニスト、ペプチドまたは小分子化合物の療法的有効量を、薬学的に許容しうるキャリアーまたは賦形剤と組み合わせて含んでなる、薬剤組成物を提供する。こうしたキャリアーには、限定されるわけではないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが含まれる。本発明はさらに、本発明の前述の組成物の１以上の成分を充填した、１以上の容器を含んでなる、薬学的パックおよびキットに関する。本発明のポリペプチドおよび他の化合物は、単独で、または療法化合物などの他の化合物と組み合わせて、使用することが可能である。
【００４９】
組成物は、例えば、全身性または経口経路による投与経路に対して適応されるであろう。全身性投与の好ましい型には、典型的には静脈内注射による、注射が含まれる。皮下、筋内、または腹腔内などの他の注射経路が使用可能である。全身性投与の別の手段には、胆汁酸またはフシジン酸または他の界面活性剤などの浸透剤を用いた、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）および経皮投与が含まれる。さらに、本発明のポリペプチドまたは他の化合物を溶腸または被包処方で処方することが可能であるならば、経口投与もまた、可能でありうる。これらの化合物の投与はまた、軟膏、パスタ剤、ゲル等の形で、局所および／または局在性であることも可能である。
【００５０】
必要な投薬量範囲は、本発明のペプチドまたは他の化合物（小分子模倣体など）の選択、投与経路、処方の性質、被験者の状態の性質、および主治医の判断に応じる。しかし、適切な投薬量は、典型的には、０．１〜１００μｇ／ｋｇ被験者の範囲である。しかし、多様な化合物が入手可能であり、そして多様な経路の投与では効率が異なることを考慮すると、必要な投薬量には広い変動が予期されるはずである。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与より、より多い投薬量を必要とすると予期されるであろう。これらの投薬量レベルの変動は、当該技術分野によく理解されるように、最適化のための標準的な経験的ルーチンを用いて、調整可能である。
【００５１】
治療に用いるポリペプチドはまた、上述のように、「遺伝子治療」としばしば称される治療様式で、被験者において、内因性に生成可能である。したがって、例えば、被験者由来の細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏで、ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドで、そして例えばレトロウイルスプラスミドベクターの使用によって、操作することが可能である。その後、細胞を被験者に導入する。
【００５２】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、これを用いて、同様の相同性を持つさらなる配列を同定するのに有用な情報供給源を形作る。コンピュータ読み取り可能媒体に配列を保存し、そしてその後、保存したデータを用いて、ＧＣＣなどの公知の検索ツールを用い、配列データベースを検索して、最も容易にこれを行う。したがって、さらなる側面において、本発明は、配列番号１、２および５〜８の配列を含んでなるポリヌクレオチドを保存したコンピュータ読み取り可能媒体を提供する。
【００５３】
ポリペプチドおよびポリヌクレオチド産生法
本発明のポリヌクレオチドは、標準的クローニングおよびスクリーニング技術を用いて得ることが可能である。本発明のポリヌクレオチドはまた、ゲノムＤＮＡライブラリーなどの天然供給源からも得ることが可能であり、また公知で、そして商業的に入手可能な技術を用いて、合成することも可能である。本発明のポリペプチドはまた、公知で、そして商業的に入手可能な技術を用いて、合成することも可能である。
【００５４】
本発明のポリヌクレオチドを本発明のポリペプチドの組換え産生に用いる場合、ポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのためのコード配列を単独で含むことが可能であるし、またはリーダーまたは分泌配列、プレ、またはプロまたはプレプロタンパク質配列、あるいは他の融合ペプチド部分をコードするものなどの他のコード配列と、同じ読み枠で、成熟ポリペプチドのためのコード配列を含むことが可能である。例えば、融合ポリペプチドの精製を容易にするマーカー配列をコードすることが可能である。本発明のこの側面の特定の好ましい態様において、マーカー配列は、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．）に提供され、そしてＧｅｎｔｚら，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（１９８９）８６：８２１−８２４に提供されるような、ヘキサ−ヒスチジンペプチドであるか、またはＨＡタグである。ポリヌクレオチドはまた、転写される非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化する配列などの、非コード５’および３’配列も含有することが可能である。
【００５５】
本発明のさらなる態様には、配列番号３および４のアミノ酸配列を含んでなり、そしていずれかの組み合わせで、いくつかの、例えば５〜１０、１〜５、１〜３、１〜２、または１アミノ酸残基が置換されているか、欠失されているかまたは付加されている、ポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドが含まれる。
【００５６】
配列番号１、２および５〜８に含有されるヌクレオチド配列に同一であるか、または十分に同一であるポリヌクレオチドを、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーションプローブとして、または核酸増幅（ＰＣＲ）反応のプライマーとして使用して、本発明のポリペプチドをコードする全長ｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンを単離し、そして配列番号１、２および５〜８と高い配列類似性を有する、他の遺伝子（ヒト以外の種由来の相同体およびオルソログをコードする遺伝子を含む）のｃＤＮＡクローンおよびゲノムクローンを単離することが可能である。典型的には、これらのヌクレオチド配列は、対照の配列に７０％同一であり、好ましくは８０％同一であり、より好ましくは９０％同一であり、最も好ましくは９５％同一である。プローブまたはプライマーは、一般的に、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０ヌクレオチドを含んでなるであろうし、そして少なくとも５０ヌクレオチドを有することが可能である。特に好ましいプローブは、３０〜５０の間のヌクレオチドを有するであろう。
【００５７】
ヒト以外の種由来の相同体およびオルソログを含む、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１、２または５〜８あるいはその断片の配列を有する標識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、適切なライブラリー（一般的な当業者に理解されるとおり）をスクリーニングし；そして前記ポリヌクレオチド配列を含有する全長ｃＤＮＡおよびゲノムクローンを単離する工程を含んでなる方法によって、得ることが可能である。こうしたハイブリダイゼーション技術は当業者に公知である。好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０マイクログラム／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含んでなる溶液中、摂氏４２度で一晩インキュベーションし；その後、０．１ｘＳＳＣ中、約６５℃で、フィルターを洗浄することが含まれる。したがって、本発明はまた、配列番号１、２または５〜８あるいはその断片の配列を有する標識プローブを用いて、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、適切なライブラリーをスクリーニングすることによって得ることが可能なポリヌクレオチドも含む。
【００５８】
当業者は、多くの場合、ポリペプチドをコードする領域がｃＤＮＡの５’端で短く切断されている点で、単離ｃＤＮＡ配列が不完全であることを認識するであろう。これは、逆転写酵素のプロセッシビティー（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）（重合反応中、酵素がテンプレートに付着したままである能力の測定値）が本質的に低く、第一鎖ｃＤＮＡ合成中、ｍＲＮＡテンプレートのＤＮＡコピーを完成させるのに失敗する結果である。
【００５９】
全長ｃＤＮＡを得るか、または短いｃＤＮＡを伸長するのに利用可能であり、そして当業者に公知である、いくつかの方法があり、例えば、ｃＤＮＡ端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）法に基づくものがある（例えばＦｒｏｈｍａｎら，  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５，  ８９９８−９００２，  １９８８を参照されたい）。Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標）技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）に例示される技術の最近の修飾法は、例えば、より長いｃＤＮＡに関する検索を、有意に単純化してきている。Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標）技術では、選択した組織から抽出したｍＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、そして「アダプター」配列を各端に連結する。次いで、核酸増幅（ＰＣＲ）を行って、遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびアダプター特異的オリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを用いて、ｃＤＮＡの「欠失した」５’端を増幅する。その後、「入れ子（ｎｅｓｔｅｄ）」プライマー、すなわち増幅産物内にアニーリングするよう設計されたプライマー（典型的には、アダプター配列中のさらなる３’にアニーリングするアダプター特異的プライマー、および既知の遺伝子配列中のさらなる５’にアニーリングする遺伝子特異的プライマー）を用いて、ＰＣＲ反応を反復する。その後、ＤＮＡ配列決定によって、この反応の産物を解析し、そして存在するｃＤＮＡに産物を直接連結して完全な配列を生じるか、または５’プライマーを設計するために新規の配列情報を用いて、別個の全長ＰＣＲを行うことによって、全長ｃＤＮＡを構築することが可能である。
【００６０】
本発明の組換えポリペプチドは、当該技術分野に公知の方法によって、発現系を含んでなる遺伝子操作した宿主細胞から調製可能である。したがって、さらなる側面において、本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド類を含んでなる発現系、こうした発現系で遺伝子操作した宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産生に関する。無細胞翻訳系もまた使用し、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いて、こうしたタンパク質を産生することも可能である。
【００６１】
組換え産生のため、宿主細胞を遺伝子操作して、本発明のポリヌクレオチドの発現系またはその一部を取り込ませることが可能である。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入は、Ｄａｖｉｓら，  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）およびＳａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（１９８９）などの、多くの標準的実験室マニュアルに記載される方法によって、達成可能である。好ましいこうした方法には、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、トランスベクション、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質仲介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープ・ローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、弾道導入または感染が含まれる。
【００６２】
適切な宿主の代表的な例には、連鎖球菌、ブドウ球菌、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞などの細菌細胞；酵母細胞およびアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞などの真菌細胞；ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞などの動物細胞；並びに植物細胞が含まれる。
【００６３】
非常に多様な発現系、例えば染色体、エピソームおよびウイルス由来の系、例えば細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入要素由来、酵母染色体要素由来、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鳥類ポックスウイルス、偽狂犬病ウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス由来のベクター、並びにコスミドおよびファージミドなどの、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子要素に由来するものなど、これらの組み合わせに由来するベクターが使用可能である。発現系に、発現を制御すると共に生じさせる調節領域を含有させてもよい。一般的に、宿主において、ポリヌクレオチドを維持するか、増殖させるか、または発現させて、ポリペプチドを産生することが可能な系またはベクターいずれかが使用可能である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（上記）に示されるものなどの、多様な周知のそして日常的な技術いずれかによって、適切なヌクレオチド配列を発現系に挿入することが可能である。適切な分泌シグナルを望ましいポリペプチドに取り込んで、翻訳されたタンパク質を小胞体腔、細胞膜周辺空間または細胞外環境に分泌するのを可能にしうる。これらのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であることが可能であるし、またはこれらは異種シグナルであることが可能である。
【００６４】
本発明のポリペプチドをスクリーニングアッセイ（以下に記載する）で使用するために発現しようとするならば、ペプチドを細胞内で産生するか、または培地に分泌させることが可能である。細胞内で産生した場合、ポリペプチドを回収する前に、細胞をまず、溶解しなければならない。ペプチドは膜結合であることが可能であり、例えば、膜タンパク質の細胞質ドメインに融合させることが可能であり、またはペプチドを形質膜にターゲティングするであろうパルミトイル化などの脂質修飾を経るであろう、配列モチーフを含有することが可能である。ポリペプチドが培地に分泌される場合、ポリペプチドを回収し、そして精製するため、培地を回収することが可能である。
【００６５】
硫酸アンモニウム若しくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンおよび陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む、周知の方法によって、組換え細胞培養から、本発明のポリペプチドを回収し、そして精製することが可能である。最も好ましくは、精製には高性能液体クロマトグラフィーを使用する。単離およびまたは精製中に、ポリペプチドが変性している場合は、タンパク質を再フォールディングする公知の技術を使用して、活性コンホメーションを再生することが可能である。
【００６６】
ＴＩＲＡＰおよびＴＩＲＡＰ阻害剤に関するスクリーニング技術
上述のように、ＴＩＲＡＰは、多くの疾患状態、特に炎症、敗血症ショックおよび壊死が誘導する炎症を含む、多くの生物学的機能で役割を果たす。したがって、ＴＩＲＡＰポリペプチドの機能を刺激するかまたは阻害する化合物を同定するスクリーニング法を考案するのが望ましい。したがって、さらなる側面において、本発明は、ＴＩＲＡＰの機能を刺激するかまたは阻害する化合物を同定する化合物スクリーニング法を提供する。一般的に、アゴニストまたはアンタゴニストを療法および予防目的に使用可能である（上述）。多様な供給源、例えば細胞、無細胞調製、化学薬品ライブラリーおよび天然産物混合物から、適切な化合物を同定可能である。
【００６７】
スクリーニング法は、本発明のポリペプチドもしくは小分子模倣体への、または本発明のポリペプチドを所持する細胞もしくは膜への、またはその融合タンパク質への候補化合物の結合を、候補化合物に直接または間接的に会合させた標識によって、単純に測定することが可能である。あるいは、スクリーニング法は、標識競合剤との競合を伴うことが可能である。さらに、これらのスクリーニング法は、ポリペプチドを所持する細胞に適した検出系を用いて、候補化合物が、ポリペプチドの活性化または阻害によって生成されるシグナルを生じるかどうかを試験することが可能である。
【００６８】
活性化の阻害剤は、一般的に、既知のアゴニストの存在下でアッセイし、そしてアゴニストによる活性化に対する候補化合物の存在の影響を観察する。アゴニストまたは阻害剤の非存在下で、候補化合物がポリペプチドの活性化の阻害を生じるかどうかを試験することによって、逆アゴニストまたは阻害剤に関するスクリーニング方法において、恒常的に活性であるポリペプチドを使用することが可能である。さらに、スクリーニング方法は、単に、本発明のポリペプチドを含有する溶液と候補化合物を混合して混合物を形成し、混合物中のＴＩＲＡＰ活性を測定し、そして混合物のＴＩＲＡＰ活性を標準に比較する工程を、含んでなることが可能である。言い換えると、スクリーニング方法は、ＴＬＲ４の少なくともＴＩＲＡＰ結合ドメインを含んでなるポリペプチド、ＴＩＲＡＰポリペプチドまたはＴＬＲ４結合ドメインを含んでなる他のポリペプチド、および候補化合物を提供し、ＴＬＲ４のＴＩＲＡＰ結合ドメインを含んでなるポリペプチド、およびＴＩＲＡＰポリペプチド若しくは他のポリペプチドと、候補化合物を近接して配置し、そして候補化合物が、ＴＬＲ４のＴＩＲＡＰ結合ドメインを含んでなるポリペプチド、あるいはＴＩＲＡＰポリペプチドまたは他のポリペプチドのいずれかの結合と競合するかどうかを決定する工程を含んでなる。
【００６９】
当業者が理解するように、ポリペプチドのＦｃ部分およびＴＩＲＡＰポリペプチドから作成するものなどの融合タンパク質はまた、ハイスループットスクリーニングアッセイでも使用して、本発明のポリペプチドのアンタゴニストを同定することも可能である（Ｄ．  Ｂｅｎｎｅｔｔら，  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，  ８：５２−５８（１９９５）；およびＫ．  Ｊｏｈａｎｓｏｎら，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，  ２７０：９４５９−９４７１（１９９５）を参照されたい）。
【００７０】
潜在的なポリペプチドアンタゴニストの例には、抗体、またはいくつかの場合、場合によっては該ポリペプチドの、リガンド、基質、受容体、酵素などに緊密に関連するオリゴヌクレオチドまたはタンパク質、例えばリガンド、基質、受容体、酵素などの断片；あるいは本発明のポリペプチドに結合するが、ポリペプチドの活性が妨げられるように、応答を引き出さない小分子が含まれる。
【００７１】
本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび抗体はまた、細胞において、ｍＲＮＡおよびポリペプチドの産生に対して、添加された化合物の影響を検出するスクリーニング法を設定するのにも使用可能である。例えば、当該技術分野に知られる標準法によって、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を用いて、分泌されたまたは細胞に関連するレベルのポリペプチドを測定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを構築することが可能である。これを用いて、適切に操作された細胞または組織からのポリペプチドの産生を阻害するかまたは増進することが可能な剤を発見することが可能である。
【００７２】
したがって、別の側面において、本発明は、本発明のポリペプチドに対する、アゴニスト、アンタゴニスト、他のリガンドおよび受容体、基質、酵素など；あるいはこうしたポリペプチドの産生を減少させるかまたは増進する化合物を同定するためのスクリーニングキットであって：
（ａ）本発明のポリペプチド；
（ｂ）本発明のポリペプチドを発現する組換え細胞；
（ｃ）本発明のポリペプチドを発現する細胞膜；または
（ｄ）本発明のポリペプチドに対する抗体；
を含んでなり、該ポリペプチドが好ましくは配列番号３または４のものである、前記スクリーニングキットに関する。こうしたキットのいずれかにおいて、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）が実質的な構成要素を構成しうると認識されるであろう。
【００７３】
当業者には、本発明のポリペプチドがまた：
（ａ）まず、ポリペプチドの三次構造を決定し；
（ｂ）アゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤の、ありうる反応性部位（類）または結合部位（類）の三次元構造を推定し；
（ｃ）推定される結合部位または反応性部位と結合するかまたは反応すると予測される候補化合物を合成し；そして
（ｄ）候補化合物が、実際にアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤であるかどうかを試験する
ことによって、該ポリペプチドのアゴニスト、アンタゴニストまたは阻害剤を、構造に基づいて設計するための方法において、使用可能であることも容易に認識されるであろう。
【００７４】
さらに、これが、通常、反復過程であろうことも認識されるであろう。
【００７５】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの抗原性特性
本発明のポリペプチドまたはその断片もしくは類似体、またはそれらを発現する細胞はまた、本発明のポリペプチドに免疫特異的な抗体を産生する免疫原として使用することも可能である。用語「免疫特異的」は、抗体が、先行技術の他の関連するポリペプチドに対する親和性より、本発明のポリペプチドに実質的に高い親和性を有することを意味する。
【００７６】
本発明のポリペプチドに対して生成された抗体は、ポリペプチドまたはエピトープ所持断片、類似体または細胞を、動物、好ましくは非ヒト動物に、日常的なプロトコルを用いて投与することによって、得ることが可能である。モノクローナル抗体調製のため、連続する細胞株培養によって産生される抗体を提供するいかなる技術も使用可能である。例には、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ，  Ｇ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，  Ｃ．，  Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５−４９７）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３）４：７２）およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，  ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ  ＡＮＤ  ＣＡＮＣＥＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ，  ｐｐ．７７−９６，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８５）が含まれる。
【００７７】
米国特許第４，９４６，７７８号に記載されるものなどの、一本鎖抗体を産生するための技術を適応させて、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を産生することも可能である。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物を含む生物を用いて、ヒト化抗体を発現することも可能である。
【００７８】
上述の抗体を使用して、ポリペプチドを発現するクローンを単離するかまたは同定することが可能であり、あるいはアフィニティークロマトグラフィーによって、ポリペプチドを精製することが可能である。
【００７９】
さらなる側面において、本発明は、本発明のポリペプチド、またはその断片、および多様なサブクラスの免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）の重鎖または軽鎖の定常部の多様な部分を含んでなる、遺伝子操作した可溶性融合タンパク質に関する。免疫グロブリンとして好ましいのは、ヒトＩｇＧ、特にＩｇＧ１の重鎖の定常部であり、この場合、融合はヒンジ領域で行われる。特定の態様において、Ｆｃ部分は、単純に、血液凝固因子Ｘａで切断可能な切断配列の取り込みによって、除去可能である。さらに、本発明は、遺伝子操作によるこれらの融合タンパク質調製法に、そして例えば薬剤スクリーニングのためのその使用に関する。
【００８０】
トランスジェニック細胞および哺乳動物
本発明の核酸およびアミノ酸を用いて、ＴＩＲＡＰ機能研究のための有用なツールである、組換え細胞およびトランスジェニック非ヒト哺乳動物を産生することが可能である。すなわち、本発明の外因性核酸、または本明細書では導入遺伝子とも称するが、これを、細胞に導入し、そしてその後、該細胞を用いて、非ヒトトランスジェニック哺乳動物を生成する。導入遺伝子を導入する細胞は、好ましくは胚性幹（ＥＳ）細胞である。しかし、本発明は、本発明の導入遺伝子を含んでなるＥＳ細胞のみに限定されると解釈してはならないし、また、トランスジェニック動物を産生するのに用いる細胞のみに限定されると解釈してもならない。むしろ、本発明のトランスジェニック細胞には、限定されるわけではないが、導入遺伝子を含んでなるトランスジェニック動物由来の細胞、トランスジェニックＥＳ細胞由来のキメラ動物由来の導入遺伝子を含んでなる細胞、および非ヒトトランスジェニック哺乳動物を生成するのに使用可能であるか、または使用不能である、導入遺伝子を含んでなる他のものいずれかが含まれる。
【００８１】
さらに、導入遺伝子を含んでなる細胞、すなわち組換え細胞の目的は、トランスジェニック動物の生成に限定されると解釈してはならないことに注目することが重要である。むしろ、本発明は、ＴＩＲＡＰをコードする核酸が導入されたいかなる細胞種も含むと解釈すべきであり、こうした細胞種には、限定なしに、ＴＩＲＡＰをコードする単離核酸を含んでなる、原核細胞および真核細胞が含まれる。
【００８２】
細胞が真核細胞である場合、本発明の導入遺伝子が導入されており、そして望ましい遺伝子にコードされるタンパク質がもはやそこから発現されていない場合に利益が得られる、いかなる真核細胞であることも可能である。こうした利益には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実験室において、または細胞が存在する哺乳動物において、望ましい遺伝子の発現の欠如を研究することが可能な系、導入された遺伝子欠失を含んでなる細胞を研究、診断および療法ツールとして使用可能である系、並びに哺乳動物において、選択した疾患状態に対する新規診断および療法ツールの開発に有用な動物モデルを生成する系が提供されているという事実が含まれることが可能である。
【００８３】
あるいは、本発明は、本発明の導入遺伝子を導入し、そして該細胞において、以前には存在しなかったか、または発現されていなかった、あるいは現在、導入遺伝子が導入される前とは異なるレベルまたは状況下で、望ましい遺伝子にコードされるタンパク質が発現されている場合に利益が得られる、真核細胞を含む。こうした利益には、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実験室において、または細胞が存在する哺乳動物において、望ましい遺伝子の発現を研究することが可能な系、導入された遺伝子を含んでなる細胞を研究、診断および療法ツールとして使用可能である系、並びに哺乳動物において、選択した疾患状態に対する新規診断および療法ツールの開発に有用な動物モデルを生成する系が提供されているという事実が含まれることが可能である。
【００８４】
ＴＩＲＡＰをコードする単離核酸を発現している、こうした細胞を用いて、より高いレベルのＴＩＲＡＰが、低レベルのＴＩＲＡＰ発現および／または活性に関連する疾患、障害または状態を治療するかまたは緩和するのに有用である可能性がある、細胞、組織、または全動物にＴＩＲＡＰを提供することが可能である。こうした疾患、障害または状態には、限定されるわけではないが、腸腫瘍、家族性腺腫様ポリープ症、結腸癌、過敏性腸疾患、炎症性腸疾患、糖尿病、肥満、舌癌、乳癌、肺癌等が含まれることが可能である。したがって、本発明には、ＴＩＲＡＰ発現、翻訳、および／または活性を増加させるかまたは誘導する、ここで、ＴＩＲＡＰ発現、タンパク質レベル、および／または活性の増加が、疾患、障害または状態を治療するかまたは軽減するのに有用でありうる、ＴＩＲＡＰ発現細胞が含まれる。
【００８５】
一般の当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、本発明の「ノックイン」または「ノックアウト」ベクターが、それぞれ、置換されるかまたは欠失される、核酸の２つの部分に相同な、少なくとも２つの配列を含んでなることを認識するであろう。２つの配列は、遺伝子に隣接する配列に相同であり；すなわち、１つの配列は、ＴＩＲＡＰをコードする核酸のコード配列の５’部分の領域またはその近傍の領域と相同であり、そして他方の配列は、第一のものよりさらに下流である。当業者は、本明細書に提供する開示に基づいて、本発明が、いかなる特定の隣接核酸配列にも限定されないことを認識するであろう。その代わり、ターゲティングベクターは、それぞれ、哺乳動物ゲノムから、ＴＩＲＡＰまたはその断片をコードする核酸のいくつかまたはすべてを取り除く（すなわち「ノックアウト」ベクター）か、あるいは該ゲノムに、該核酸を挿入する（すなわち「ノックイン」ベクター）２つの配列を含んでなることが可能である。ターゲティングベクターの重大な特徴は、該ベクターが、ＴＩＲＡＰをコードする核酸のすべてまたは一部が哺乳動物染色体から欠失されるか、または該染色体のある位置に挿入されるように、相同組換えによる欠失／挿入が生じることを可能にするため、「ノックアウト」ベクターの場合、反対に向かって位置する、すなわちＴＩＲＡＰオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’端および３’端に位置する、２つの配列の十分な部分を含んでなることである。
【００８６】
導入遺伝子、並びにノックインおよびノックアウトターゲティングベクターの設計は、当該技術分野に周知であり、そしてＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ニューヨーク）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク）等の、標準的専門書に記載される。ターゲティングベクターで使用しようとするＴＩＲＡＰコード領域に隣接するかまたは該領域内部の上流および下流部分は、既知の方法に基づいて、そしてマウスおよびヒトＴＩＲＡＰ両方の核酸およびアミノ酸配列を含む、本明細書に提供する開示に基づき、本明細書に開示する解説にしたがって、容易に選択可能である。これらの配列があれば、一般の当業者は、本発明の導入遺伝子およびノックアウトベクターを構築可能であろう。
【００８７】
本発明は、例えばｎｅｏＲ遺伝子をコードし、それによって、細胞がＧ４１８の存在下で増殖する能力により、ＴＩＲＡＰをコードする核酸またはその一部が欠失していて、そしてネオマイシン耐性遺伝子で置換されている、トランスジェニック細胞の選択を可能にする核酸などの、選択可能マーカーをコードする核酸を含んでなる、ノックアウトターゲティングベクターをさらに含む。しかし、本発明は、選択可能マーカーとしてネオマイシン耐性に限定されると解釈してはならない。むしろ、当該技術分野に周知の他の選択可能マーカーをノックアウトターゲティングベクターで用いて、ＴＩＲＡＰ遺伝子が欠失しており、そして／または不活性化され、そして選択した選択可能マーカーをコードする核酸によって置換されている、組換え細胞の選択を可能にすることが可能である。選択可能マーカーを選択し、そしてベクターに組み込む方法は、当該技術分野に周知であり、そして例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ニューヨーク）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク）に記載される。
【００８８】
本明細書に記載するように、本発明には、ゲノムの望ましい部位に挿入され、それによって、望ましい内因性標的遺伝子のコード領域を欠失させる、外因性核酸を含んでなる、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、すなわちノックアウト・トランスジェニック哺乳動物が含まれる。さらに、本発明には、ゲノムの部位にＴＩＲＡＰをコードする外因性核酸が挿入されている、トランスジェニック非ヒト哺乳動物、すなわち「ノックイン」トランスジェニック哺乳動物が含まれる。挿入されるノックイン導入遺伝子は、例えば、タグポリペプチド、通常は細胞に存在しない、または典型的にはＴＩＲＡＰに機能可能であるように連結されていない、ＴＩＲＡＰをコードする核酸に機能可能であるように連結されているプロモーター／制御領域をコードする、多様な核酸を含んでなることが可能である。
【００８９】
本発明の非ヒトトランスジェニック哺乳動物の生成は、好ましくは、本明細書に記載する方法を用いて達成する。しかし、本発明は、いかなる点でも、この方法の使用のみに限定されると解釈してはならず、他の方法を用いて、望ましいノックアウト哺乳動物を生成することが可能である。
【００９０】
非ヒトトランスジェニック哺乳動物を生成する好ましい方法において、本発明の導入遺伝子を含んでなるＥＳ細胞を生成し、そしてその後、該細胞を用いて、本質的にＮａｇｙおよびＲｏｓｓａｎｔ（１９９３，  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ中，  ｐｐ．１４６−１７９，  Ｊｏｙｎｅｒ監修，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）に記載されるノックアウト動物を生成する。ＥＳ細胞は、宿主胚盤胞に注入するか、または分割球段階の胚と凝集させることによって、胚環境に戻したならば、正常な胚性細胞として振る舞う。このように戻した際、細胞は、胚のすべての細胞系譜に沿って発生する完全な潜在能力を有する。したがって、ＥＳ細胞を得て、望ましいＤＮＡを導入し、そしてその後、成熟哺乳動物細胞に発生させるために、該細胞を胚環境に戻すことが可能であり、ここで望ましいＤＮＡを発現させることが可能である。
【００９１】
トランスジェニックマウスを生成するための正確なプロトコルが、ＮａｇｙおよびＲｏｓｓａｎｔ（１９９３，  Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｊｏｙｎｅｒ監修  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ中，  ｐｐ．１４６−１７９）に開示され、そしてしたがって、本明細書には繰り返さない。望ましいＤＮＡを導入するためのＥＳ細胞のトランスフェクションまたは形質導入は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ニューヨーク）、およびＡｕｓｕｂｅｌら（１９９７，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク）に記載されるものなどの、標準的プロトコルを用いて達成される。好ましくは、Ｓｏｒｉａｎｏら（１９９１，  Ｃｅｌｌ  ６４：６９３−７０２）に記載されるように、本発明の導入遺伝子内に含有される望ましいＤＮＡをＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、そして細胞を増殖させる。
【００９２】
トランスジェニック技術におけるいずれかの数の標準的技術によって、哺乳動物受精卵への単離核酸の導入を達成する（Ｈｏｇａｎら，  １９８６，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ）。最も一般的には、マイクロインジェクションによって、核酸を胚に導入する。
【００９３】
ひとたび核酸を卵に導入したら、卵を短い期間インキュベーションして、そしてその後、Ｈｏｇａｎら（１９８６，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ）に記載されるように、卵を得たのと同一の種の偽妊娠哺乳動物に移す。典型的には、実験あたり、多くの卵に注入し、そして卵のおよそ３分の２がこの処置で生き残る。その後、約２０の生存卵を偽妊娠動物に移し、そして通常、こうして移した生存卵の４〜１０が生存仔に発生するであろう。
【００９４】
本明細書に記載する方法で、いかなる哺乳動物ＴＩＲＡＰ遺伝子を用いて、そのＴＩＲＡＰ遺伝子のすべてまたは一部の欠失を含んでなる導入遺伝子を宿する、トランスジェニック哺乳動物またはトランスジェニック細胞を産生することも可能である。好ましくは、ヒトＴＩＲＡＰ（配列番号１）またはマウスＴＩＲＡＰ（配列番号２）もまた用いる。
【００９５】
本発明のトランスジェニック哺乳動物は、哺乳動物のいかなる種であることも可能である。したがって、本発明は、キメラ核酸をコードするトランスジェニック哺乳動物であって、マウス、ハムスター、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジおよびウシを含む、前記哺乳動物の生成を含むと解釈すべきである。トランスジェニックマウスの生成に関して、本明細書に記載する方法は、いかなる哺乳動物種を用いても、同様に適用可能である。好ましくは、本発明のトランスジェニック哺乳動物はげっ歯類であり、そしてさらにより好ましくは、本発明のトランスジェニック哺乳動物はマウスである。例えば、Ｌｕｋｋａｒｉｎｅｎら（１９９７，  Ｓｔｒｏｋｅ  ２８：６３９−６４５）は、トランスジェニックマウスの生成を可能にする遺伝子構築物が、また、ラットを含む、他のトランスジェニックげっ歯類の生成も可能にすることを解説する。同様に、１つの種の動物の遺伝子座における無接合体（ｎｕｌｌｉｚｙｇｏｕｓ）突然変異は、第一の種に非常に相同な遺伝子座を有する別の種の動物において、反復可能である。
【００９６】
本発明のトランスジェニック哺乳動物を同定するため、サザンブロットハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、および／またはＲＴ−ＰＣＲなどの標準的技術を用いて、単離核酸の存在に関して、仔を調べる。本明細書に記載する通常の技術を用いて、哺乳動物の細胞および組織における核酸の発現もまた、評価する。さらに、本明細書に開示するように（例えばウェスタンブロット解析）、または当該技術分野に公知のタンパク質検出標準法を用いて、トランスジェニック動物の循環血液におけるＴＩＲＡＰの存在または非存在を測定することが可能である。
【００９７】
本明細書において用いる用語として、「トランスジェニック細胞」ともみなされる、本発明のトランスジェニック哺乳動物から得た細胞は、本明細書の別の箇所に記載するＴＩＲＡＰ（＋／−）および（−／−）トランスジェニック非ヒト哺乳動物から得られるものなどの細胞を含み、結腸癌、家族性腺腫様ポリープ症、過敏性腸疾患、炎症性腸疾患、腸腫瘍、乳癌、舌癌、糖尿病、および肥満などの、ＴＩＲＡＰ発現のレベル改変と関連すると考えられる哺乳動物の疾患および症状、並びに、ＴＩＲＡＰ発現のレベル改変と関連する他の疾患、障害または状態いずれかをモデリングするのに有用な系である。さらに、結腸癌、家族性腺腫様ポリープ症、過敏性腸疾患、炎症性腸疾患、腸腫瘍、乳癌、舌癌、糖尿病、および肥満などの、腫瘍増殖および他の腸異常と関連する経路（類）のマーカーとして、ＴＩＲＡＰ発現レベルはまた、こうした疾患、障害または状態の評価における有用な示標でもある。
【００９８】
特に適切なのは、本明細書に記載する非ヒトノックアウトまたはノックイン・トランスジェニック哺乳動物の組織由来の細胞であり、ここでＴＩＲＡＰ遺伝子を含んでなる導入遺伝子が発現されるか、または多様な組織におけるＴＩＲＡＰの発現を阻害する。例えば、こうした細胞が由来する細胞種には、（１）ＴＩＲＡＰ（＋／＋）、（＋／−）および（−／−）非ヒトトランスジェニック生産（ｌｉｖｅｂｏｒｎ）哺乳動物、（２）ＴＩＲＡＰ（＋／＋）、（−／−）または（＋／−）胎児動物、並びに（３）ＴＩＲＡＰ（＋／＋）、（−／−）および（＋／−）胎児および生産哺乳動物から得られる胎盤細胞株の線維芽細胞、内皮細胞、脂肪細胞、および筋芽細胞が含まれる。
【００９９】
本明細書に先に頻繁に用いられている特定の用語の理解を容易にするため、以下の定義を提供する。
「抗体」は、本明細書において、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、およびヒト化抗体と共にＦａｂ断片を含み、Ｆａｂまたは他の免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含む。
【０１００】
「単離された」は、天然状態から「ヒトの手によって」改変されることを意味する。「単離された」組成物または物質が天然に存在する場合、これは、その元来の環境から変化しているかまたは取り除かれているか、あるいは両方である。例えば、生存動物に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、天然状態の同時に存在する材料から分離された、同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、用語が本明細書で使用される際、「単離されて」いる。
【０１０１】
「ポリヌクレオチド」は、一般的に、未修飾ＲＮＡまたはＤＮＡあるいは修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであることが可能な、ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドいずれかを指す。「ポリヌクレオチド」には、限定なしに、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、並びに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖、あるいはより典型的には二本鎖であるか、または一本鎖および二本鎖領域の混合物であることが可能な、ＤＮＡおよびＲＮＡを含んでなるハイブリッド分子が含まれる。さらに、「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡあるいはＲＮＡおよびＤＮＡ両方を含んでなる、三本鎖領域を指す。用語「ポリヌクレオチド」はまた、１以上の修飾塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡ、および安定性のため、または他の理由のため修飾された主鎖を持つＤＮＡまたはＲＮＡも含む。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基およびイノシンなどの例外的な塩基が含まれる。多様な修飾をＤＮＡおよびＲＮＡに行うことが可能であるし；したがって、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に見られるような、ポリヌクレオチドの化学的、酵素的または代謝的修飾型と共に、ウイルスおよび細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学型を含む。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと称される、比較的短いポリヌクレオチドも含む。
【０１０２】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって互いに連結される、２以上のアミノ酸を含んでなる、ペプチドまたはタンパク質いずれか、すなわちペプチドアイソスターを指す。「ポリペプチド」は、一般的にペプチド、オリゴペプチドまたはオリゴマーと称される短い鎖、および一般的にタンパク質と称されるより長い鎖両方を指す。ポリペプチドは、遺伝子にコードされる２０のアミノ酸以外のアミノ酸を含有してもよい。ポリペプチドには、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによるか、または当該技術分野に公知の化学的修飾技術によるか、いずれかで修飾されたアミノ酸配列が含まれる。こうした修飾は、基本的な教科書に、そしてより詳細なモノグラフと共に、膨大な研究文献によく記載される。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノ末端またはカルボキシ末端を含む、ポリペプチドのどこで起こることも可能である。同じ種類の修飾が、既定のポリペプチドのいくつかの部位で、同じかまたは異なる度合いで存在することが可能であることが認識されるであろう。また、既定のポリペプチドは、多くの種類の修飾を含有することが可能である。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果、分岐していることが可能であり、そして分岐を伴いまたは伴わずに、環状であることが可能である。環状、分岐および分岐環状ポリペプチドは、翻訳後天然過程から生じることが可能であるし、または合成法によって作成可能である。修飾には、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環状化、ジスルフィド結合形成、ジメチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマ−カルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化などのアミノ酸のタンパク質へのトランスファーＲＮＡ仲介付加、およびユビキチン化が含まれる（例えばＰＲＯＴＥＩＮＳ−−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，  第２版，  Ｔ．Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ニューヨーク，  １９９３；Ｗｏｌｄ，  Ｆ．，  Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，  １−１２ページ，  ＰＯＳＴＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，  Ｂ．Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９８３中；Ｓｅｉｆｔｅｒら，  “Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｆａｃｔｏｒｓ”，  Ｍｅｔｈ  Ｅｎｚｙｍｏｌ（１９９０）１８２：６２６−６４６およびＲａｔｔａｎら，  “Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌ��ｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ”，  Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（１９９２）６６３：４８−６２を参照されたい）。
【０１０３】
「変異体」は、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチドと異なるが、本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、別の参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変する可能性もあるし、またはしない可能性もある。ヌクレオチド変化は、以下に論じるように、参照配列にコードされるポリペプチドにおいて、アミノ酸置換、付加、欠失、融合および一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）を生じることが可能である。ポリペプチドの典型的な変異体は、アミノ酸配列が、別の参照ポリペプチドと異なる。一般的に、参照ポリペプチドおよび変異体の配列が、全体で緊密に類似であり、そして多くの領域で同一であるように、相違が限定される。変異体および参照ポリペプチドは、いずれかの組み合わせの１以上の置換、付加、欠失によって、アミノ酸配列が異なることが可能である。置換または挿入アミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされるものである可能性も、またはない可能性もある。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体などの天然存在であることも可能であるし、または天然に存在することが知られていない変異体であることも可能である。ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの非天然存在変異体は、突然変異誘発技術によって、または直接合成によって、作成することが可能である。
【０１０４】
「同一性」は、当該技術分野に知られるように、場合によって、配列を比較することによって決定されるような、２以上のポリペプチド配列または２以上のポリヌクレオチド配列間の関係である。当該技術分野において、「同一性」はまた、場合によって、こうした配列のストリング間のマッチによって決定されてもよい、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の度合いも意味する。「同一性」は、限定されるわけではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｌｅｓｋ，  Ａ．Ｍ．監修，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．Ｗ．監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．Ｇ．監修，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ニュージャージー，  １９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８７；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，  Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．監修，  Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク，  １９９１；並びにＣａｒｉｌｌｏ，  ３０  Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，  Ｄ．，  ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，  ４８：１０７３（１９８８）に記載されるものを含む、既知の方法によって、容易に計算可能である。同一性を決定する方法は、試験する配列間の最大のマッチを生じるように設計される。さらに、同一性を決定する方法は、公共に利用可能なコンピュータプログラムにおいて、体系化されている。２つの配列間の同一性を決定するコンピュータプログラム法には、限定されるわけではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．ら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．ら，  Ｊ  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０（１９９０））が含まれる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給源から、公共に入手可能である（ＢＬＡＳＴＭａｎｕａｌ，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．ら，  ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．  ２０８９４，  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．ら，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０（１９９０））。公知のスミス・ウォーターマンアルゴリズムもまた、同一性を決定するのに使用可能である。
【０１０５】
ポリペプチド配列比較のためのパラメーターには以下が含まれる：
１）アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３（１９７０）
比較マトリックス：ＨｅｎｔｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｔｉｋｏｆｆ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．  ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）のＢＬＯＳＳＵＭ６２
ギャップペナルティ：１２
ギャップ長ペナルティ：４
これらのパラメーターを用いる、有用なプログラムは、遺伝学コンピュータグループ、ウィスコンシン州マディソンから、「ｇａｐ」プログラムとして公共に入手可能である。前述のパラメーターは、ペプチド比較のためのデフォルトパラメーターである（末端ギャップに対するペナルティなし、を伴う）。
【０１０６】
ポリヌクレオチド比較に関するパラメーターには、以下が含まれる：
１）アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３−４５３（１９７０）
比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０
ギャップペナルティ：５０
ギャップ長ペナルティ：３
遺伝学コンピュータグループ、ウィスコンシン州マディソンから、「ｇａｐ」プログラムとして入手可能。これらは、核酸比較のためのデフォルトパラメーターである。
【０１０７】
場合による、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する「同一性」の好ましい意味を以下の（１）および（２）に提供する。
（１）ポリヌクレオチド態様は、配列番号１または２の参照配列に少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７または１００％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含んでなる単離ポリヌクレオチドをさらに含み、前記ポリヌクレオチド配列は、配列番号１または２の参照配列と同一であるか、あるいは、参照配列に比較した際に、特定の整数までのヌクレオチド改変を含むことが可能であり、ここで、前記改変は少なくとも１つのヌクレオチド欠失、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入からなる群より選択され、そして前記改変は、参照ヌクレオチド配列の５’末端もしくは３’末端位で、または末端位の間のどこかで、参照配列中のヌクレオチドの間に個々に点在するか、または参照配列内の１以上の隣接基に生じることが可能であり、そして前記ヌクレオチド改変数は、配列番号１または２のヌクレオチド総数に、同一性パーセントを定義する整数を乗じて、１００で割り、そしてその後、配列番号１の前記ヌクレオチド総数からその積を減じることによって、あるいは：
Ｎｎ＝Ｘｎ−（Ｘｎ＊ｙ）
（式中、Ｎｎはヌクレオチド改変数であり、Ｘｎは配列番号１または２のヌクレオチド総数であり、ｙは５０％では０．５０、６０％では０．６０、７０％では０．７０、８０％では０．８０、８５％では０．８５、９０％では０．９０、９５％では０．９５、９７％では０．９７、または１００％では１．００であり、そして＊は、乗法演算子記号であり、そして式中、Ｘｎおよびｙの整数でないいかなる積も、これをＸｎから減じる前に、最も近い整数に四捨五入する）によって、決定可能である。配列番号３または４のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の改変は、このコード配列に、ナンセンス、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異を生成可能であり、そしてそれによって、こうした改変後に、ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドを改変可能である。
【０１０８】
例えば、本発明のポリヌクレオチド配列は、配列番号３または４の参照配列と同一であることが可能であり、すなわち１００％同一であることも可能であるし、または参照配列に比較した際、同一性パーセントが１００％未満の同一性であるように、アミノ酸改変の特定の整数までを含むことも可能である。こうした改変は、少なくとも１つの核酸欠失、トランジションおよびトランスバージョンを含む置換、または挿入からなる群より選択され、そして前記改変は、参照ポリヌクレオチド配列の５’末端もしくは３’末端位で、または末端位の間のどこかで、参照配列中の核酸の間に個々に点在するか、または参照配列内の１以上の隣接基に生じることが可能である。配列番号３または４のアミノ酸総数に、同一性パーセントを定義する整数を乗じて、１００で割り、そしてその後、配列番号３または４の前記アミノ酸総数からその積を減じることによって、あるいは：
Ｎｎ＝Ｘｎ−（Ｘｎ＊ｙ）
（式中、Ｎｎはアミノ酸改変数であり、Ｘｎは配列番号３または４のアミノ酸総数であり、ｙは、例えば７０％では０．７０、８０％では０．８０、８５％では０．８５などであり、＊は、乗法演算子記号であり、そして式中、Ｘｎおよびｙの整数でないいかなる積も、これをＸｎから減じる前に、最も近い整数に四捨五入する）によって、既定の同一性パーセントに対する核酸改変数を決定する。
【０１０９】
（２）ポリペプチド態様は、配列番号３または４のポリペプチド参照配列に少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９７または１００％の同一性を有するポリペプチドを含んでなる単離ポリヌクレオチドをさらに含み、前記ポリペプチド配列は、配列番号３または４の参照配列と同一であるか、あるいは、参照配列に比較した際に、特定の整数までのアミノ酸改変を含むことが可能であり、ここで、前記改変は少なくとも１つのアミノ酸欠失、保存的置換および非保存的置換を含む置換、または挿入からなる群より選択され、そして前記改変は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端位で、または末端位の間のどこかで、参照配列中のアミノ酸の間に個々に点在するか、または参照配列内の１以上の隣接基に生じることが可能であり、そして前記アミノ酸改変数は、配列番号３または４のアミノ酸総数に、同一性パーセントを定義する整数を乗じて、１００で割り、そしてその後、配列番号３または４の前記アミノ酸総数からその積を減じることによって、あるいは：
Ｎａ＝Ｘａ−（Ｘａ＊ｙ）
（式中、Ｎａはアミノ酸改変数であり、Ｘａは配列番号３または４のアミノ酸総数であり、ｙは５０％では０．５０、６０％では０．６０、７０％では０．７０、８０％では０．８０、８５％では０．８５、９０％では０．９０、９５％では０．９５、９７％では０．９７、または１００％では１．００であり、そして＊は、乗法演算子記号であり、そして式中、Ｘａおよびｙの整数でないいかなる積も、これをＸａから減じる前に、最も近い整数に四捨五入する）によって、決定可能である。
【０１１０】
例えば、本発明のポリペプチド配列は、配列番号３または４の参照配列と同一であることが可能であり、すなわち１００％同一であることも可能であるし、または同一性パーセントが１００％未満の同一性であるように、参照配列に比較した際、アミノ酸改変の特定の整数までを含むことも可能である。こうした改変は、少なくとも１つのアミノ酸欠失、保存的置換および非保存的置換を含む置換、または挿入からなる群より選択され、そして前記改変は、参照ポリペプチド配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端位で、または末端位の間のどこかで、参照配列中のアミノ酸の間に個々に点在するか、または参照配列内の１以上の隣接基に生じることが可能である。配列番号３または４のアミノ酸総数に、同一性パーセントを定義する整数を乗じて、１００で割り、そしてその後、配列番号３または４の前記アミノ酸総数からその積を減じることによって、あるいは：
Ｎａ＝Ｘａ−（Ｘａ＊ｙ）
（式中、Ｎａはアミノ酸改変数であり、Ｘａは配列番号３または４のアミノ酸総数であり、ｙは、例えば７０％では０．７０、８０％では０．８０、８５％では０．８５などであり、そして＊は、乗法演算子記号であり、そして式中、Ｘａおよびｙの整数でないいかなる積も、これをＸａから減じる前に、最も近い整数に四捨五入する）によって、既定の同一性％に対するアミノ酸改変数を決定する。
【０１１１】
「融合タンパク質」は、２つの、しばしば関連しない、融合遺伝子またはその断片にコードされるタンパク質を指す。１つの例において、ＥＰ−Ａ−０４６４は、免疫グロブリン分子の定常部の多様な部分を、別のヒトタンパク質またはその一部と共に含んでなる、融合タンパク質を開示する。多くの場合、融合タンパク質の一部として免疫グロブリンＦｃ領域を使用すると、療法および診断における使用に好適であり、例えば薬物動態特性改善を生じる（例えばＥＰ−Ａ  ０２３２  ２６２を参照されたい）。一方、いくつかの使用では、融合タンパク質を発現させ、検出し、そして精製した後、Ｆｃ部分を欠失可能であることが望ましいであろう。
【０１１２】
「小分子」または「小分子化合物」は、典型的には約２キロダルトン（ＫＤ）未満である合成有機化合物を指す。
用語「導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」は、本明細書において、哺乳動物細胞、特に生存動物の哺乳動物細胞のゲノムに人工的に挿入されているか、または挿入されようとしている遺伝子材料を記載するのに用いられる。導入遺伝子を用いて細胞を形質転換し、これは、外因性ＤＮＡの取り込みに続いて、永続的かまたは一過性の遺伝子変化、好ましくは永続的な遺伝子変化が、細胞において誘導されることを意味する。永続的な遺伝子変化は、一般的に、細胞ゲノムへのＤＮＡの導入によって達成される。安定な組込みのためのベクターには、プラスミド、レトロウイルスおよび他の動物ウイルス、ＹＡＣ等が含まれる。興味深いのは、トランスジェニック哺乳動物、例えばウシ、ブタ、ヤギ、ウマ等であり、そして特にげっ歯類、例えばラット、マウス等である。
【０１１３】
トランスジェニック動物には、その細胞、特に生殖細胞のすべてまたは一部に、染色体外要素として存在するか、または安定に組み込まれている、外因性核酸配列が含まれる。別に示さない限り、トランスジェニック動物には生殖系列配列に安定な変化が含まれると仮定されるであろう。動物の最初の構築中、「キメラ」または「キメラ動物」が生成され、その中で、細胞のサブセットのみが改変されたゲノムを有する。キメラは、主に、望ましいトランスジェニック動物を生成するため、交配目的のために用いられる。キメラの交配によってヘテロ接合体改変を有する動物が生成される。典型的には、オスおよびメスヘテロ接合体を交配して、ホモ接合体動物を生成する。
【０１１４】
本発明において、「ノックアウト」は、目的の内因性遺伝子の１つまたは両方の対立遺伝子において、部分的または完全な機能損失を有し、内因性遺伝子から改変された遺伝子配列および機能を持つ、導入された導入遺伝子を有する「ノックイン」とは対照的である。天然存在遺伝子を無効にして、そして改変型が導入されるように、この２つを組み合わせることが可能である。ノックアウトでは、好ましくは、標的遺伝子発現は、検出不能であるか、または重要でないようにされている。ＴＩＲＡＰ遺伝子のノックアウトは、発現が検出不能であるか、または重要でないレベルでしか存在しないように、ＴＩＲＡＰの機能が実質的に減少していることを意味する。これは、コード配列の破壊の導入、例えば１以上の停止コドンの挿入、ＤＮＡ断片の挿入など、コード配列の欠失、コード配列に対する停止コドンでの置換などを含む、多様な機構によって達成可能である。いくつかの場合では、外因性導入遺伝子配列は、最終的に、ゲノムから欠失され、天然配列に対する純粋な変化が残る。異なるアプローチを用いて、ノックアウトを達成することが可能である。非コード領域、特にプロモーター領域、３’制御配列、エンハンサーの欠失、または遺伝子発現を活性化する遺伝子の欠失を含む、天然遺伝子のすべてまたは一部の染色体欠失を誘導可能である。機能的ノックアウトはまた、天然遺伝子の発現を遮断するアンチセンス構築物の導入によっても達成可能である（例えばＬｉおよびＣｏｈｅｎ（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８５：３１９−３２９を参照されたい）。ノックアウトにはまた、コンディショナルノックアウト、例えば標的遺伝子改変を促進する物質に動物を曝露した際に、標的遺伝子改変が起こるもの、標的遺伝子部位で組換えを促進する酵素を導入するもの（例えばＣｒｅ−ｌｏｘ系におけるＣｒｅ）、または標的遺伝子改変を出生後に指示する他の方法が含まれる。
【０１１５】
本明細書に引用される、限定されるわけではないが特許および特許出願を含む、すべての刊行物は、個々の刊行物が各々、具体的に、そして個々に、完全に示されるかのように、本明細書に示されるように、本明細書に援用される。
【実施例】
【０１１６】
本発明は、以下の実験的実施例に言及して、さらに詳細に記載される。これらの実施例は、例示目的のためのみに提供され、そして別に明記しない限り、限定することを意図しない。したがって、本発明は、いかなる点でも、以下の実施例に限定されると解釈してはならず、むしろ、本明細書に提供する解説の結果明らかになる、変動いずれかおよびすべてを含むと解釈すべきである。
【０１１７】
（実施例１）
ＴＩＲＡＰは、ＴＬＲ４シグナル伝達経路の構成要素であるが、ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路の構成要素ではない。
【０１１８】
ＮＦ−κＢのプロモーター活性に対する多様なＴＩＲＡＰ構築物の影響を決定するため、２９３Ｔ細胞に、２．０μｇの示すＴＩＲＡＰ構築物および０．１μｇのＮＦ−κＢ依存ルシフェラーゼレポーター遺伝子を同時トランスフェクションした。ｐｃＤＮＡ３は、空のベクター対照であり；ＴＩＲＡＰは、全長ＴＩＲＡＰタンパク質をコードするベクターであり；ＴＩＲＡＰ  Ｎは、ＴＩＲＡＰのＮ末端ドメインをコードするベクターであり；ＴＩＲＡＰ  Ｃは、ＴＩＲＡＰのＣ末端ドメインをコードするベクターであり；そしてＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈは、アミノ酸１２５位にプロリンからヒスチジンへの突然変異を含有する、ＴＩＲＡＰ突然変異型をコードするベクターである。トランスフェクション２４時間後に細胞を採取し、そして標準的ルシフェラーゼレポーターアッセイにおける解析のため、溶解した。ルシフェラーゼ活性は、モックトランスフェクション細胞に比較した倍誘導として表す（図２Ａ）。ＴＩＲＡＰ構築物がＮＦ−κＢプロモーターの強い活性化を生じた（ルシフェラーゼ活性のおよそ８０倍の誘導）一方；ＴＩＲＡＰ  Ｎ、ＴＩＲＡＰ  Ｃ、またはＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈの存在下では、有意なプロモーター活性は観察されなかった。これらの結果に基づいて、全長ＴＩＲＡＰはＮＦ−κＢプロモーターを活性化するが、試験したＴＩＲＡＰの突然変異型は該プロモーターを活性化しない。これらの結果は、ＴＩＲＡＰがＴＬＲ４シグナル伝達経路の構成要素であることをさらに示唆する。
【０１１９】
ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈがドミナントネガティブとして機能するかどうか決定するため、２９３Ｔ細胞に、ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５ＨまたはＭｙＤ８８  ＤＮ（ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈと同じ位で、プロリンからヒスチジンへの突然変異を含有するＭｙＤ８８を発現するベクター）いずれかの増加する濃度（５０ｎｇ、２５０ｎｇ、１．０μｇ）を伴い、または伴わず、０．２５μｇのベクターのみ（ｐｃＤＮＡ）またはＣＤ４／ＴＬＲ４（ＴＬＲ４の恒常的活性型を発現するベクター）、並びにＮＦ−κＢ依存ルシフェラーゼレポーター遺伝子をトランスフェクションした。興味深いことに、ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈは、ＣＤ４／ＴＬＲ４によって仲介されるＮＦ−κＢの活性化を強く阻害した（図２Ｂ）。この阻害は、用量依存性であり、そしてＭｙＤ８８  ＤＮによるＣＤ４／ＴＬＲ４の阻害に匹敵した。これらの結果は、ＴＬＲ４が仲介するＮＦ−κＢ活性化をＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈが阻害することを示唆する。特に、同じ位でのＭｙＤ８８突然変異は、過剰発現されている際でも、なおＮＦ−κＢを活性化することが可能であり、ＴＩＲＡＰおよびＭｙＤ８８  ＴＩＲドメインの機能に相違がある可能性があることを示す。
【０１２０】
ＴＬＲ４と異なり、ＩＬ−１ＲまたはＴＬＲ９はいずれも、ＭｙＤ８８の非存在下ではＮＦ−κＢを誘導不能である（Ｋａｗａｉ  １９９９；Ｓｃｈｎａｒｅ  ２０００；Ａｄａｃｈｅ  １９９８）。ＭｙＤ８８独立シグナル伝達経路において、ＴＩＲＡＰが推定上のアダプターである可能性を評価するため、ＩＬ−１ＲおよびＴＬＲ９によって誘導されたＮＦ−κＢ活性を阻害する能力に関して、ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈを試験した。２９３Ｔ細胞に、増加する濃度（１０ｎｇ、５０ｎｇ、２００ｎｇ）のＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈプラスミドを伴い、または伴わず、ベクターのみ（ｐｃＤＮＡ３）、ＩＬ−１Ｒ（０．１μｇ）、およびＩＬ−１Ｒ  ＡｃＰ（０．１μｇ）［Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ博士：ＩＬ−１Ｒ  ＡｃＰ構築物がコードするものを示されたい］プラスミドｃＤＮＡ、並びにＮＦ−κＢ依存ルシフェラーゼレポーター遺伝子を同時トランスフェクションした。ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈは、同時トランスフェクションされたＩＬ−１ＲおよびＩＬ−１Ｒ  ＡｃＰ（図２Ｃ）によるか、またはＩＬ−１Ｂサイトカインによるか、いずれによって誘導されたＮＦ−κＢ活性も阻害しなかった。
【０１２１】
ＴＬＲ９は、過剰発現されている際には、ＮＦ−κＢ活性を誘導しないが、リガンドＣｐＧ  ＤＮＡを添加された際は、誘導する。ＴＩＲＡＰが、ＴＬＲ９トランスフェクション細胞のＣｐＧ刺激によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害するかどうかを決定するため、２９３Ｔ細胞に、増加する濃度（１００ｎｇ、２５０ｎｇ）のＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５ＨまたはＭｙＤ  ８８Ｎいずれかを伴い、または伴わず、ベクターのみ（ｐｃＤＮＡ３）、ＴＬＲ９（５０ｎｇ）をトランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後、ＴＬＲ９トランスフェクション試料に、最終濃度３μＭでＣｐＧオリゴヌクレオチドを添加し、そして採取前に、さらに１４時間インキュベーションした。ＣｐＧ  ＤＮＡがＭｙＤ８８欠損細胞において、ＮＦ−κＢを活性化する能力（Ｓｃｈｎａｒｅ  ２０００）と一致して、ＭｙＤ８８  ＤＮがＣｐＧシグナル伝達を阻害したが、ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈは、ＴＬＲ９トランスフェクション細胞のＣｐＧ刺激によって誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害しなかった（図２Ｄ）。したがって、ＴＩＲＡＰは、ＴＬＲ４の下流で機能するようであるが、ＩＬ−１ＲまたはＴＬＲ９の下流では機能しないようであり、そして、ＴＬＲ４下流のＭｙＤ８８独立経路のアダプターである可能性がある。
【０１２２】
（実施例２）
野生型ＴＩＲＡＰはＴＬＲ４と同時免疫沈降するが、ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５ＨはＴＬＲ４と同時免疫沈降しない。
【０１２３】
ＴＬＲ４シグナル伝達経路におけるＴＩＲＡＰの役割に関して、生化学的コンホメーションを得るため、同時免疫沈降実験を用いて、ＴＩＲＡＰ−ＴＬＲ４タンパク質相互作用を評価した。１．５μｇのＦｌａｇタグ化ＴＩＲＡＰ（Ｆｌａｇ  ＴＩＲＡＰ）またはＰ１２５Ｈ突然変異を含有するその突然変異誘導体（Ｆｌａｇ  ＴＩＲＡＰ  ＰＨ）の存在下または非存在下で、４．５μｇの、外部ドメインを欠く、Ｍｙｃタグ化ＴＬＲ４欠失構築物（Ｍｙｃ  ＴＬＲ４  ｗｔ）またはその突然変異誘導体（Ｍｙｃ  ＴＬＲ４  Ｐ７１４Ｈ）で、２９３Ｔ細胞を同時トランスフェクションした。トランスフェクション２４時間後に調製した溶解物を、抗Ｆｌａｇ  Ｍ２アガロースビーズと一晩インキュベーションして、Ｆｌａｇ  ＴＩＲＡＰまたはＦｌａｇ  ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈおよびいかなる関連タンパク質も免疫沈降した。免疫複合体を洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離し、そしてその後、同時免疫沈降したＴＬＲ４を探すために抗ｍｙｃ抗体で、あるいはＦｌａｇ  ＴＩＲＡＰまたはＦｌａｇ  ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈの免疫沈降を確認するために抗Ｆｌａｇ抗体で、免疫ブロットすることによって、解析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロットによって、総細胞溶解物（３５μｇ／試料）を同様に解析して、すべての試料に適切なタンパク質が同等に発現されていることを確認した。これらの実験によって、ＴＬＲ４が実際に、ＴＩＲＡＰと同時免疫沈降することが明らかになった（図３Ａ）。突然変異の結果としてシグナル伝達不能であり、そしてしたがって、ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウスをＬＰＳに非応答性にするＴＬＲ４突然変異体、ＴＬＲ４  Ｐ７１４Ｈもまた、ＴＬＲ４と同時免疫沈降する。対照的に、ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈは、ＴＬＲ４と同時免疫沈降できず、ＴＩＲドメインのこの保存される領域が、ＴＩＲＡＰとＴＬＲ４のＴＩＲドメインとの相互作用を仲介することが示唆される（図３Ａ）。
【０１２４】
同様に、ＴＩＲＡＰおよびＭｙＤ８８間の相互作用を調べた。１．５μｇのＨＡタグ化ＴＩＲＡＰ（ＨＡ  ＴＩＲＡＰ）のみを、あるいは１．５μｇのＦｌａｇタグ化ＭｙＤ８８（Ｆｌａｇ  ＭｙＤ８８）、Ｆｌａｇタグ化ＴＩＲＡＰ（Ｆｌａｇ−ＴＩＲＡＰ）、またはＦｌａｇタグ化ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈ（Ｆｌａｇ  ＴＩＲＡＰ  ＰＨ）いずれかと組み合わせて、２９３Ｔ細胞にトランスフェクションした。免疫沈降、および免疫複合体解析と共に総細胞溶解物の解析を、上述のように行った。ＴＩＲＡＰがＭｙＤ８８と相互作用しないことが立証され（図３）、これらのアッセイによって検出されるＴＩＲドメイン相互作用の特異性が立証された。ＴＩＲＡＰはまた、ＩＲＡＫ［Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ博士：これを詳述されたい］と会合できず、ＴＩＲＡＰがＭｙＤ８８依存シグナル伝達経路で、いかなる役割も持たない可能性があることが示唆された。しかし、ＴＩＲＡＰは、それ自体と同時免疫沈降可能であり（図３Ｂ）、ＴＩＲＡＰが、ＴＬＲ４およびＭｙＤ８８を含む、多くの他のＴＩＲドメイン含有タンパク質での場合のように、ホモ二量体化することが可能であることを示す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）プルダウンアッセイを用いて、ＴＩＲＡＰおよびＴＬＲ４のＴＩＲドメイン間の直接相互作用もまた、検出された。
【０１２５】
（実施例３）
ＰＫＲは、ＬＰＳおよびＣｐＧシグナル伝達経路の構成要素であり、そしてＴＩＲＡＰと同時免疫沈降する。
【０１２６】
インターフェロンに制御されるｄｓＲＮＡ結合プロテインキナーゼＰＫＲを欠く細胞が、ＬＰＳ刺激に応答してＪＮＫおよびｐ３８を活性化できないことが最近立証された（Ｇｏｈ  ２０００）。ＴＬＲ４はＬＰＳ下流のすべてのシグナルに必要であるため、この結果報告は、ＰＫＲがＴＬＲ４シグナル伝達経路の構成要素であることを示唆した。ＰＫＲがＭｙＤ８８依存経路または独立経路のどちらで機能するかを決定するため、野生型およびＭｙＤ８８欠損マクロファージにおいて、ＬＰＳ刺激後、ＰＫＲ活性化を評価した。この目的に向けて、野生型またはＭｙＤ８８欠損マウスいずれか由来の骨髄由来マクロファージを、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＣｐＧ（１０μＭ）いずれかで、示す時間、刺激して、その後、ＰＢＳで洗浄し、そしてＴＮＴ溶解緩衝液中で溶解した。ＰＫＲは、活性化に際して、スレオニン残基上でリン酸化されるため、リン酸化ＰＫＲを特異的に認識する抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離した溶解物（４０μｇ／試料）を免疫ブロットすることによって、ＰＫＲの活性化をアッセイした。ＬＰＳ刺激した野生型マクロファージにおいて、活性化され、リン酸化されたＰＫＲが検出可能であった（図４Ａ）。興味深いことに、リン酸化されたＰＫＲはまた、ＬＰＳで刺激したＭｙＤ８８欠損マクロファージでも検出されたが、これらの細胞では、有意に少ない割合のＰＫＲがリン酸化される。さらに、ＭｙＤ８８欠損細胞は、ＮＦ−κＢおよびＪＮＫ活性化の遅延した動力学と同様、ＰＫＲをより遅い動力学で活性化する。これらの観察は、ＬＰＳ刺激に応答して、ＰＫＲが、ＭｙＤ８８依存機構と共にＭｙＤ８８独立機構によって活性化されることを強く示唆する。ＭｙＤ８８依存経路が、ＬＰＳに応答してＰＫＲを活性化可能であるならば、ＰＫＲが他のＴＬＲによって活性化可能であることが想定可能である。したがって、ＣｐＧ刺激に応答したＰＫＲ活性化を試験した。実際、ＰＫＲは、ＣｐＧに応答してリン酸化され（図４Ａ）、ＰＫＲがＴＬＲ９経路と共にＴＬＲ４経路の構成要素であることが示された。
【０１２７】
ＰＫＲおよびＴＩＲＡＰが相互作用するかどうかを決定するため、３．５μｇのＨＡ  ＰＫＲキナーゼ死（ＫＤ）突然変異体または１．５μｇのＦｌａｇ  ＴＩＲＡＰいずれかをトランスフェクションした２９３Ｔ細胞由来の溶解物を、上述のような免疫沈降解析、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および示す抗体を用いた免疫ブロットに供した。ＰＫＲを過剰発現すると細胞死が誘導されるため、野生型ＰＫＲでなくＰＫＲ  ＫＤ突然変異体を用いた。ＰＫＲは実際、ＴＩＲＡＰと同時免疫沈降し（図４Ｂ）、上で確立された、ＰＫＲおよびＴＩＲＡＰの間の連関がさらに支持された。
【０１２８】
ＴＩＲＡＰが、ＰＫＲを直接制御しない可能性があるため、ＴＩＲＡＰおよび２つの他のタンパク質、ｐ５８およびＰＡＣＴ間の相互作用を解析した。ｐ５８は、ＰＫＲ活性を負に制御するテトラトリコペプチド反復含有タンパク質であり（Ｌｅｅ  １９９４）、そしてＰＡＣＴは、細胞ストレスに応答して、ＰＫＲを活性化する、ｄｓＲＮＡ結合ドメイン含有タンパク質である（Ｐａｔｅｌ  １９９８０）。ｐ５８コードベクター（３．５μｇ）またはＰＡＣＴ（３．５μｇ）いずれかおよびＦｌａｇ  ＴＩＲＡＰ（１．５μｇ）をトランスフェクションした２９３Ｔ細胞由来の溶解物を、免疫沈降解析、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および示す抗体を用いた免疫ブロッティングに供した。ＴＩＲＡＰは、ｐ５８およびＰＡＣＴ両方と免疫沈降することが示され（図４Ｃ）、ＰＫＲおよび／またはその制御因子ｐ５８およびＰＡＣＴが、ＴＩＲＡＰの下流標的である可能性があることが示された。
【０１２９】
（実施例４）
細胞透過性ＴＩＲＡＰ阻害性ペプチドは、ＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ活性化、ＰＫＲリン酸化、およびＪＮＫリン酸化を阻害するが、ＣｐＧが誘導するものは阻害しない。
【０１３０】
ＴＩＲＡＰ機能をさらに解明するため、ＴＩＲＡＰ阻害のするための別の方法を探求した。ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈ突然変異体が、ドミナントネガティブとして機能し、そしてもはやＴＬＲ４と相互作用不能であるという事実によって、この突然変異した残基が、上流受容体と相互作用する能力を含むＴＩＲＡＰ活性に重要であることが示された。したがって、野生型ＴＩＲＡＰのこの領域に対応するペプチドは、ＴＬＲ４との相互作用に関してＴＩＲＡＰと競合することによって、ＴＩＲＡＰの部位特異的阻害剤として作用可能である。この可能性を試験するため、細胞アッセイに有用な細胞透過性ペプチドをまず、構築した。ｍＴＩＲＡＰのこの領域に対応する合成ペプチドを、アンテナペディア由来のペプチドのＣ末端に連結した。アンテナペディアペプチドは、細胞培養に外因性に添加された際、細胞膜を横断することが可能であり、そして、細胞に融合ペプチドを搬送するビヒクルとして働くことが可能である（Ｄｅｒｏｓｓｉ  １９９８）。ＮＦ−κＢ依存ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ＲＡＷ  κＢ）を安定にトランスフェクションしたＲＡＷマクロファージ細胞株を、示す濃度のＴＩＲＡＰ阻害性ペプチドまたは５０μＭの対照ペプチドいずれかで、１時間、前処理し、その後、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で５時間刺激した後、レポーターアッセイのために採取した。試料は、２つ組で処理し、そして刺激した。ＴＩＲＡＰペプチドでのＲＡＷ  κＢ細胞株の前処理は、ＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ活性化を強力に阻害した（図５Ａ）。しかし、溶媒、ＤＭＳＯ、またはＴＩＲＡＰ配列が反転されている対照ペプチドでの前処理に際しては、ＮＦ−κＢ活性化に対していかなる影響も観察されなかった（図５Ａ）。
【０１３１】
ＩκＢ−α分解に対するＴＩＲＡＰの影響を決定するため、以下の実験を行った。未処理のＲＡＷ細胞、または４０μＭのＴＩＲＡＰペプチドで、１時間、前処理したＲＡＷ細胞いずれかを、示す時間、未刺激で放置するか、またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した後、ＴＮＴ溶解緩衝液中での溶解のため採取した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって溶解物（３０μｇ／試料）を分離し、その後、抗ＩκＢ−α分解を用いて免疫ブロットした。上に立証するＮＦ−κＢ活性化における遮断と一致して、ＬＰＳ刺激は、ＴＩＲＡＰペプチドで前処理したＲＡＷ細胞において、ＩκＢ−α分解を誘導しなかった（図５Ｂ）。
【０１３２】
ＴＩＲＡＰ突然変異ペプチドが、ＣｐＧが刺激するシグナル伝達を阻害するかどうかを決定するため、示す濃度のＴＩＲＡＰペプチドでＲＡＷ  κＢ細胞を前処理し、そしてＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＣｐＧ（１０μＭ）いずれかで５時間刺激した後、レポーターアッセイのために採取した。重要なことに、ＴＩＲＡＰペプチドでのＲＡＷ細胞の前処理は、ＣＰＧが誘導するＮＦ−κＢ活性化（図５Ｃ）またはＣｐＧが誘導するＩκＢ−α分解どちらも阻害せず、また該ペプチドは、２９３細胞において、ＩＬ−１Ｂサイトカインに仲介されるＮＦ−κＢ活性化も阻害しなかった。
【０１３３】
ＴＩＲＡＰ突然変異ペプチドが、ＬＰＳまたはＣｐＧに誘導されるＰＫＲおよびＪＮＫリン酸化を阻害するかどうか決定するため、未処理のＲＡＷ細胞、または４０μＭのＴＩＲＡＰペプチドで前処理したＲＡＷ細胞いずれかを、示す時間、未刺激で放置するか、あるいはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＣｐＧ（１０μＭ）いずれかで刺激した後、採取し、そして溶解した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後、リン酸化ＰＫＲおよびＪＮＫを特異的に認識する抗体での免疫ブロットによって、溶解物（３０μｇ／試料）を解析した。さらに、ＴＩＲＡＰペプチドはまた、ＲＡＷ細胞において、ＬＰＳによって誘導されるＰＫＲリン酸化も阻害したが、対照ペプチドはこれを阻害せず、ＴＩＲＡＰペプチドは、ＣｐＧに誘導されるものは阻害せず（図５Ｄ）、ＰＫＲがＴＩＲＡＰ下流で機能する可能性を支持した。
【０１３４】
これらのデータは、ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈドミナントネガティブ構築物を利用する一過性トランスフェクションアッセイの結果と一致し、そしてこれらは、ＴＩＲＡＰがＴＬＲ４の下流で機能するが、ＴＬＲ９またはＩＬ−１Ｒの下流で機能しないという仮説を強く支持する。さらに、ＴＩＲＡＰペプチドが、ＣｐＧが誘導する影響を阻害しないという事実は、ＴＩＲＡＰペプチドが、細胞傷害性を引き起こすことによって、または他の細胞過程と非特異的に干渉することによって、ＬＰＳシグナル伝達を阻害するという可能性を排除する。
【０１３５】
（実施例５）
ＴＩＲＡＰは樹状細胞成熟を調節する。
マクロファージにおけるＬＰＳ応答性を仲介する際のＴＩＲＡＰの重要な役割を考慮して、ＬＰＳが誘導するＤＣ成熟におけるＴＩＲＡＰの役割を調べた。ＭｙＤ８８欠損ＤＣが、ＬＰＳ刺激に応答して同時刺激分子を上方制御する能力を保持するため、ＴＩＲＡＰはこれらの事象において、重要である可能性がある（Ｋａｉｓｈｏ  ２００１）。同時刺激分子Ｂ７．１およびＢ７．２の発現に対するＴＩＲＡＰの影響を決定するため、野生型およびＭｙＤ８８−／−ＤＣに対してフローサイトメトリーを行った。ＤＣは、未刺激である（陰影）か、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＣｐＧ（１０μＭ）で刺激される（黒い線）か、あるいはＬＰＳまたはＣｐＧでの刺激前にＴＩＲＡＰペプチド（１０μＭ）で前処理される（点線）か、いずれかであった。実際、ＴＩＲＡＰペプチドは、野生型およびＭｙＤ８８欠損ＤＣ両方において、ＬＰＳが誘導するＢ７．１およびＢ７．２分子の上方制御を無効にした（図６Ａ）。しかし、該ペプチドは、ＣｐＧが誘導するＤＣ成熟には、まったく影響を及ぼさなかった（図６Ａ）。
【０１３６】
サイトカイン産生に対するＴＩＲＡＰペプチドの影響を決定するため、ＬＰＳまたはＣｐＧでの刺激前に、ＴＩＲＡＰペプチドを伴い、または伴わずに、ＤＣを処理し（上述のとおり）、そしてＩＬ−１２およびＩＬ−６の産生を測定した。ＴＩＲＡＰペプチドを添加すると、ＬＰＳでの刺激に応答したＩＬ−１２およびＩＬ−６サイトカインの産生が阻害されたが、ＣｐＧでの刺激に応答する産生は阻害されなかった（図６Ｂ）。
【０１３７】
最後に、Ｔ細胞増殖に対するＴＩＲＡＰペプチドの影響を評価した。ＬＰＳでの刺激前に、ＴＩＲＡＰペプチドを伴い、または伴わずに処理したＤＣによる、ＣＤ４  Ｔ細胞増殖の刺激を、多様な濃度のＥαペプチドの存在下で行った。１Ｈ３．１  ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞（Ｉ−Ａに結合しているＥαペプチドに特異的）とインキュベーションする前に、ＤＣを固定した。４８時間培養の最後の２４時間、３Ｈ−チミジン取り込みによって、増殖を測定した。野生型またはＭｙＤ８８欠損マウスいずれか由来の、ＴＩＲＡＰペプチドで処理したＤＣは、Ｔ細胞増殖を誘導不能であった（図６Ｃ）。これらのデータは、ＴＩＲＡＰがＤＣ成熟を誘導する経路を活性化可能であることを立証し、そしてＴＩＲＡＰが、ＭｙＤ８８欠損ＤＣにおいて、ＬＰＳが誘導する成熟に関与することを示唆する。これらの結果が示すように、ＤＣがＬＰＳ刺激に応答して、サイトカインを産生し、同時刺激分子を上方制御し、そして未処置（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞をプライミングする能力に対して、ＴＩＲＡＰが重要であるようである。
【０１３８】
（実施例６）
ＴＩＲＡＰノックアウトマウスの生成
ターゲティング構築物を作成するため、ＲＴ−ＰＣＲによって、７．４ｋｂのマウスＴＩＲＡＰ遺伝子をクローニングし、そしてｐＥａｓｙ  Ｆｌｏｘベクターにサブクローニングした。その後、当該技術分野において標準的な技術を用いて、ｐＥａｓｙ  Ｆｌｏｘベクター中で、７３０ｂｐコード配列の６１０ｂｐをコードする、マウスＴＩＲＡＰ遺伝子の第二のエクソンをネオマイシンで置換した。３．７ｋｂの５’隣接配列および３．１ｋｂの３’隣接配列が、マウスＴＩＲＡＰ遺伝子座での相同組換えを指示するというのが、我々の現在の理解である。
【０１３９】
その後、エレクトロポレーションによって、胚性幹細胞にターゲティング構築物をトランスフェクションし、そしてＧ４１８およびガンシクロビルを用いて選択した。相同組換えによってターゲティング構築物を組み込んだクローンを同定するため、サザン解析によってクローンをスクリーニングした。その後、偽妊娠母に注入するため、２つの陽性クローンを選択した。
【０１４０】
これらの注入クローンから、２つの非常にキメラであるオスマウスが発生し、これをメス同腹仔と交配した。その後、サザン解析のため、仔から尾のＤＮＡを得た。２匹のマウスから生殖系列伝達を得た。最後に、これらの２匹のＦ１マウスを交配して、ホモ接合体ＴＩＲＡＰノックアウトマウスを生成し、これは、期待されるメンデル頻度で生まれた。
【０１４１】
（実施例７）
ＴＬＲリガンドへのＴＩＲＡＰノックアウトマウス細胞の曝露
図８は、実施例６に記載する方式で産生した、ＴＩＲＡＰノックアウトマウス由来の細胞における、欠損Ｂ細胞増殖を図式的に示す。野生型およびＴＩＲＡＰノックアウトマウスから、脾臓細胞を採取し、計数し、そして約１００，０００細胞／１００ｍｌで、９６ウェルプレートに蒔いた。ＬＰＳ（２０μｇ／ｍｌ最終濃度から出発）およびＢＬＰ（３００ｎｇ／ｍｌ最終濃度から出発）の連続希釈を、脾臓細胞に添加した。３６時間後、放射性３Ｈチミジンを各ウェルに添加した。１２時間後、ベータ計測装置の使用によって、増殖中のＢ細胞への３Ｈチミジンの取り込みを評価した。図８に示す結果が示すように、細胞に取り込まれた３Ｈチミジン量、そしてしたがってＢ細胞の増殖は、野生型マウス脾臓細胞に比較した際、ＴＩＲＡＰノックアウトマウス脾臓細胞において、有意に減少した。
【０１４２】
図９は、実施例６に記載する方式で産生した、ＴＩＲＡＰノックアウトマウス由来の樹状細胞によるサイトカイン産生を図式的に示す。野生型およびＴＩＲＡＰノックアウトマウスから、骨髄由来細胞を採取し、そして２４ウェルプレート中、ＧＭ−ＣＳＦを補った完全ＲＰＭＩ中で、５日間培養した。第５日、細胞を計数し、そして約１００，０００細胞／ｍｌで２４ウェルプレートに再度蒔き、そしてＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはＢＬＰ（１００ｎｇ／ｍｌ）で一晩刺激した。刺激の２４時間後、ＥＬＩＳＡのために上清を採取した。
【０１４３】
ＥＬＩＳＡ解析のため、適切な捕捉抗体、すなわちＩＬ−６またはＴＮＦ−αでプレートをコーティングし、洗浄し、そしてその後、多様な試料由来の上清でコーティングした。一晩インキュベーションした後、上清を洗い流し、そして適切なビオチン・コンジュゲート化検出抗体を添加した。その後、ストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、その後、その基質を添加した。ＥＬＩＳＡプレート読み取り装置を用いて、比色変化を監視した。それぞれの組換えサイトカインを用いて作成した標準と比較することによって、上清中のサイトカイン濃度の定量化を行った。図９に示す結果が示すように、樹状細胞によるサイトカイン産生量は、野生型マウス樹状細胞に比較した際、ＴＩＲＡＰノックアウトマウス樹状細胞で、有意に減少した。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】図１は、ヒトおよびマウスＴＩＲＡＰの配列並列である。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｄを含んでなる図２は、ＴＩＲＡＰがＴＬＲ４シグナル伝達経路の構成要素であるが、ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路の構成要素でないことを立証する、一連のグラフである。ｙ軸上、ルシフェラーゼ活性を倍誘導または相対光単位（ＲＬＵ）として示す。ｘ軸は、トランスフェクション構築物を示す：ｐｃＤＮＡ３（対照ベクター）；ＴＩＲＡＰ（全長ＴＩＲＡＰをコードする）；ＴＩＲＡＰ  Ｎ（ＴＩＲＡＰのＮ末端ドメインをコードする）；ＴＩＲＡＰ  Ｃ（ＴＩＲＡＰのＣ末端ドメインをコードする）；ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈ（アミノ酸１２５に突然変異を含有するＴＩＲＡＰをコードする）；ＣＤ４／ＴＬＲ４（ＣＤ４の恒常的活性化型をコードする）；ＭｙＤ８８  ＤＮ（ＭｙＤ８８のドミナントネガティブ突然変異体をコードする）；ＩＬ−１Ｒ／ＡｃＰ（ＩＬ−１受容体および受容体アクセサリータンパク質をコードする）；ＴＬＲ９（全長ＴＬＲ９をコードする）。構築物の下の陰影つきの三角形は、増加する量のその構築物を添加したことを示す。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｄを含んでなる図２は、ＴＩＲＡＰがＴＬＲ４シグナル伝達経路の構成要素であるが、ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路の構成要素でないことを立証する、一連のグラフである。ｙ軸上、ルシフェラーゼ活性を倍誘導または相対光単位（ＲＬＵ）として示す。ｘ軸は、トランスフェクション構築物を示す：ｐｃＤＮＡ３（対照ベクター）；ＴＩＲＡＰ（全長ＴＩＲＡＰをコードする）；ＴＩＲＡＰ  Ｎ（ＴＩＲＡＰのＮ末端ドメインをコードする）；ＴＩＲＡＰ  Ｃ（ＴＩＲＡＰのＣ末端ドメインをコードする）；ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈ（アミノ酸１２５に突然変異を含有するＴＩＲＡＰをコードする）；ＣＤ４／ＴＬＲ４（ＣＤ４の恒常的活性化型をコードする）；ＭｙＤ８８  ＤＮ（ＭｙＤ８８のドミナントネガティブ突然変異体をコードする）；ＩＬ−１Ｒ／ＡｃＰ（ＩＬ−１受容体および受容体アクセサリータンパク質をコードする）；ＴＬＲ９（全長ＴＬＲ９をコードする）。構築物の下の陰影つきの三角形は、増加する量のその構築物を添加したことを示す。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｄを含んでなる図２は、ＴＩＲＡＰがＴＬＲ４シグナル伝達経路の構成要素であるが、ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路の構成要素でないことを立証する、一連のグラフである。ｙ軸上、ルシフェラーゼ活性を倍誘導または相対光単位（ＲＬＵ）として示す。ｘ軸は、トランスフェクション構築物を示す：ｐｃＤＮＡ３（対照ベクター）；ＴＩＲＡＰ（全長ＴＩＲＡＰをコードする）；ＴＩＲＡＰ  Ｎ（ＴＩＲＡＰのＮ末端ドメインをコードする）；ＴＩＲＡＰ  Ｃ（ＴＩＲＡＰのＣ末端ドメインをコードする）；ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈ（アミノ酸１２５に突然変異を含有するＴＩＲＡＰをコードする）；ＣＤ４／ＴＬＲ４（ＣＤ４の恒常的活性化型をコードする）；ＭｙＤ８８  ＤＮ（ＭｙＤ８８のドミナントネガティブ突然変異体をコードする）；ＩＬ−１Ｒ／ＡｃＰ（ＩＬ−１受容体および受容体アクセサリータンパク質をコードする）；ＴＬＲ９（全長ＴＬＲ９をコードする）。構築物の下の陰影つきの三角形は、増加する量のその構築物を添加したことを示す。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｄを含んでなる図２は、ＴＩＲＡＰがＴＬＲ４シグナル伝達経路の構成要素であるが、ＩＬ−１Ｒシグナル伝達経路の構成要素でないことを立証する、一連のグラフである。ｙ軸上、ルシフェラーゼ活性を倍誘導または相対光単位（ＲＬＵ）として示す。ｘ軸は、トランスフェクション構築物を示す：ｐｃＤＮＡ３（対照ベクター）；ＴＩＲＡＰ（全長ＴＩＲＡＰをコードする）；ＴＩＲＡＰ  Ｎ（ＴＩＲＡＰのＮ末端ドメインをコードする）；ＴＩＲＡＰ  Ｃ（ＴＩＲＡＰのＣ末端ドメインをコードする）；ＴＩＲＡＰ  Ｐ１２５Ｈ（アミノ酸１２５に突然変異を含有するＴＩＲＡＰをコードする）；ＣＤ４／ＴＬＲ４（ＣＤ４の恒常的活性化型をコードする）；ＭｙＤ８８  ＤＮ（ＭｙＤ８８のドミナントネガティブ突然変異体をコードする）；ＩＬ−１Ｒ／ＡｃＰ（ＩＬ−１受容体および受容体アクセサリータンパク質をコードする）；ＴＬＲ９（全長ＴＬＲ９をコードする）。構築物の下の陰影つきの三角形は、増加する量のその構築物を添加したことを示す。
【図３Ａ】図３Ａおよび３Ｂを含んでなる図３は、ＴＩＲＡＰとＴＬＲ４およびＭｙＤ８８の同時免疫沈降を立証する、一対の免疫ブロット画像である。示すように、各々、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ、または赤血球凝集素（ＨＡ）タグをさらにコードする、ＴＬＲ４の野生型部分（ＴＬＲ４  ｗｔ）、その突然変異誘導体（ＴＬＲ４  ｍｕｔ）、野生型ＴＩＲＡＰ（ＴＩＲＡＰ）、Ｐ１２５Ｈ突然変異を含有する突然変異ＴＩＲＡＰ（ＴＩＲＡＰ  ＰＨ）、または野生型ＭｙＤ８８（ＭｙＤ８８）をコードする構築物の存在下（＋）または非存在下（−）で、細胞にトランスフェクションした。免疫沈降（ＩＰ）または免疫ブロット（ＩＢ）に用いた抗体を、各ブロットの左に示す。
【図３Ｂ】図３Ａおよび３Ｂを含んでなる図３は、ＴＩＲＡＰとＴＬＲ４およびＭｙＤ８８の同時免疫沈降を立証する、一対の免疫ブロット画像である。示すように、各々、Ｍｙｃ、Ｆｌａｇ、または赤血球凝集素（ＨＡ）タグをさらにコードする、ＴＬＲ４の野生型部分（ＴＬＲ４  ｗｔ）、その突然変異誘導体（ＴＬＲ４  ｍｕｔ）、野生型ＴＩＲＡＰ（ＴＩＲＡＰ）、Ｐ１２５Ｈ突然変異を含有する突然変異ＴＩＲＡＰ（ＴＩＲＡＰ  ＰＨ）、または野生型ＭｙＤ８８（ＭｙＤ８８）をコードする構築物の存在下（＋）または非存在下（−）で、細胞にトランスフェクションした。免疫沈降（ＩＰ）または免疫ブロット（ＩＢ）に用いた抗体を、各ブロットの左に示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃを含んでなる図４は、ＰＫＲがＴＩＲＡＰと同時免疫沈降し、そしてＰＫＲがＬＰＳおよびＣｐＧシグナル伝達経路の構成要素であることを立証する、一連の免疫ブロット画像である。（Ａ）野生型（ＷＴ）またはＭｙＤ８８欠損（ＭｙＤ８８−／−）マウスいずれか由来の骨髄由来マクロファージを、ＬＰＳまたはＣｐＧいずれかで、示す時間（分）刺激し、そしてリン酸化ＰＫＲ（ＰＫＲ−Ｐ）を特異的に認識する抗体を用いて、免疫ブロットを行った。（ＢおよびＣ）示すように、Ｆｌａｇタグ化ＴＩＲＡＰをコードする構築物およびＰＫＲのＨＡタグ化キナーゼ死突然変異体（ＨＡ  ＰＫＲ  ＫＤ）またはｐ５８をコードする構築物いずれかを細胞にトランスフェクションした。免疫沈降（ＩＰ）または免疫ブロット（ＩＢ）に用いた抗体を、各ブロットの左に示し、そして右の矢印は、示すタンパク質の位置を示す。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｃを含んでなる図４は、ＰＫＲがＴＩＲＡＰと同時免疫沈降し、そしてＰＫＲがＬＰＳおよびＣｐＧシグナル伝達経路の構成要素であることを立証する、一連の免疫ブロット画像である。（Ａ）野生型（ＷＴ）またはＭｙＤ８８欠損（ＭｙＤ８８−／−）マウスいずれか由来の骨髄由来マクロファージを、ＬＰＳまたはＣｐＧいずれかで、示す時間（分）刺激し、そしてリン酸化ＰＫＲ（ＰＫＲ−Ｐ）を特異的に認識する抗体を用いて、免疫ブロットを行った。（ＢおよびＣ）示すように、Ｆｌａｇタグ化ＴＩＲＡＰをコードする構築物およびＰＫＲのＨＡタグ化キナーゼ死突然変異体（ＨＡ  ＰＫＲ  ＫＤ）またはｐ５８をコードする構築物いずれかを細胞にトランスフェクションした。免疫沈降（ＩＰ）または免疫ブロット（ＩＢ）に用いた抗体を、各ブロットの左に示し、そして右の矢印は、示すタンパク質の位置を示す。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃを含んでなる図４は、ＰＫＲがＴＩＲＡＰと同時免疫沈降し、そしてＰＫＲがＬＰＳおよびＣｐＧシグナル伝達経路の構成要素であることを立証する、一連の免疫ブロット画像である。（Ａ）野生型（ＷＴ）またはＭｙＤ８８欠損（ＭｙＤ８８−／−）マウスいずれか由来の骨髄由来マクロファージを、ＬＰＳまたはＣｐＧいずれかで、示す時間（分）刺激し、そしてリン酸化ＰＫＲ（ＰＫＲ−Ｐ）を特異的に認識する抗体を用いて、免疫ブロットを行った。（ＢおよびＣ）示すように、Ｆｌａｇタグ化ＴＩＲＡＰをコードする構築物およびＰＫＲのＨＡタグ化キナーゼ死突然変異体（ＨＡ  ＰＫＲ  ＫＤ）またはｐ５８をコードする構築物いずれかを細胞にトランスフェクションした。免疫沈降（ＩＰ）または免疫ブロット（ＩＢ）に用いた抗体を、各ブロットの左に示し、そして右の矢印は、示すタンパク質の位置を示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄを含んでなる図５は、ＴＩＲＡＰによって、ＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ活性化、ＰＫＲリン酸化、およびＪＮＫリン酸化の阻害が起こるが、ＣｐＧが誘導するものの阻害が起きないことを示す、一連のブロットである。（Ａ）ＴＩＲＡＰペプチドはＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ活性化を阻害したが、逆配列ペプチドは該活性化を阻害しなかった。ＴＩＲＡＰまたは対照ペプチドいずれかで、１時間、前処理したＲＡＷ  κＢ細胞を、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で５時間刺激した。試料は、２つ組で刺激した。（Ｂ）ＴＩＲＡＰペプチドでＲＡＷ細胞を前処理すると、ＬＰＳが誘導するＩκＢ−α分解が遮断される。示すように、ＴＩＲＡＰペプチドで前処理したＲＡＷ細胞を、示す時間、未刺激で放置するか、またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。溶解物（３０μｇ／試料）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、抗ＩκＢ−α抗体で免疫ブロットしてＩκＢ−α分解を評価した。（Ｃ）ＴＩＲＡＰペプチドは、ＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ活性を阻害したが、ＣｐＧが誘導する該活性は阻害しなかった。示すように、ＴＩＲＡＰペプチドで前処理したＲＡＷ  κＢ細胞を、ＬＰＳまたはＣｐＧいずれかで刺激し、そしてレポーターアッセイのため採取した。（Ｄ）ＴＩＲＡＰペプチドは、ＬＰＳによって誘導されるＰＫＲおよびＪＮＫリン酸化を阻害したが、ＣｐＧによって誘導されるものは阻害しなかった。示すように、未処理のＲＡＷ細胞、または４０μＭのＴＩＲＡＰペプチドで前処理したＲＡＷ細胞を、ＬＰＳまたはＣｐＧいずれかで刺激した。溶解物（３０μｇ／試料）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、その後、リン酸化ＰＫＲまたはリン酸化ＪＮＫを特異的に認識する抗体で免疫ブロットすることによって、解析した。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｄを含んでなる図５は、ＴＩＲＡＰによって、ＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ活性化、ＰＫＲリン酸化、およびＪＮＫリン酸化の阻害が起こるが、ＣｐＧが誘導するものの阻害が起きないことを示す、一連のブロットである。（Ａ）ＴＩＲＡＰペプチドはＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ活性化を阻害したが、逆配列ペプチドは該活性化を阻害しなかった。ＴＩＲＡＰまたは対照ペプチドいずれかで、１時間、前処理したＲＡＷ  κＢ細胞を、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で５時間刺激した。試料は、２つ組で刺激した。（Ｂ）ＴＩＲＡＰペプチドでＲＡＷ細胞を前処理すると、ＬＰＳが誘導するＩκＢ−α分解が遮断される。示すように、ＴＩＲＡＰペプチドで前処理したＲＡＷ細胞を、示す時間、未刺激で放置するか、またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。溶解物（３０μｇ／試料）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、抗ＩκＢ−α抗体で免疫ブロットしてＩκＢ−α分解を評価した。（Ｃ）ＴＩＲＡＰペプチドは、ＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ活性を阻害したが、ＣｐＧが誘導する該活性は阻害しなかった。示すように、ＴＩＲＡＰペプチドで前処理したＲＡＷ  κＢ細胞を、ＬＰＳまたはＣｐＧいずれかで刺激し、そしてレポーターアッセイのため採取した。（Ｄ）ＴＩＲＡＰペプチドは、ＬＰＳによって誘導されるＰＫＲおよびＪＮＫリン酸化を阻害したが、ＣｐＧによって誘導されるものは阻害しなかった。示すように、未処理のＲＡＷ細胞、または４０μＭのＴＩＲＡＰペプチドで前処理したＲＡＷ細胞を、ＬＰＳまたはＣｐＧいずれかで刺激した。溶解物（３０μｇ／試料）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、その後、リン酸化ＰＫＲまたはリン酸化ＪＮＫを特異的に認識する抗体で免疫ブロットすることによって、解析した。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｄを含んでなる図５は、ＴＩＲＡＰによって、ＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ活性化、ＰＫＲリン酸化、およびＪＮＫリン酸化の阻害が起こるが、ＣｐＧが誘導するものの阻害が起きないことを示す、一連のブロットである。（Ａ）ＴＩＲＡＰペプチドはＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ活性化を阻害したが、逆配列ペプチドは該活性化を阻害しなかった。ＴＩＲＡＰまたは対照ペプチドいずれかで、１時間、前処理したＲＡＷ  κＢ細胞を、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で５時間刺激した。試料は、２つ組で刺激した。（Ｂ）ＴＩＲＡＰペプチドでＲＡＷ細胞を前処理すると、ＬＰＳが誘導するＩκＢ−α分解が遮断される。示すように、ＴＩＲＡＰペプチドで前処理したＲＡＷ細胞を、示す時間、未刺激で放置するか、またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。溶解物（３０μｇ／試料）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、抗ＩκＢ−α抗体で免疫ブロットしてＩκＢ−α分解を評価した。（Ｃ）ＴＩＲＡＰペプチドは、ＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ活性を阻害したが、ＣｐＧが誘導する該活性は阻害しなかった。示すように、ＴＩＲＡＰペプチドで前処理したＲＡＷ  κＢ細胞を、ＬＰＳまたはＣｐＧいずれかで刺激し、そしてレポーターアッセイのため採取した。（Ｄ）ＴＩＲＡＰペプチドは、ＬＰＳによって誘導されるＰＫＲおよびＪＮＫリン酸化を阻害したが、ＣｐＧによって誘導されるものは阻害しなかった。示すように、未処理のＲＡＷ細胞、または４０μＭのＴＩＲＡＰペプチドで前処理したＲＡＷ細胞を、ＬＰＳまたはＣｐＧいずれかで刺激した。溶解物（３０μｇ／試料）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、その後、リン酸化ＰＫＲまたはリン酸化ＪＮＫを特異的に認識する抗体で免疫ブロットすることによって、解析した。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄを含んでなる図５は、ＴＩＲＡＰによって、ＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ活性化、ＰＫＲリン酸化、およびＪＮＫリン酸化の阻害が起こるが、ＣｐＧが誘導するものの阻害が起きないことを示す、一連のブロットである。（Ａ）ＴＩＲＡＰペプチドはＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ活性化を阻害したが、逆配列ペプチドは該活性化を阻害しなかった。ＴＩＲＡＰまたは対照ペプチドいずれかで、１時間、前処理したＲＡＷ  κＢ細胞を、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で５時間刺激した。試料は、２つ組で刺激した。（Ｂ）ＴＩＲＡＰペプチドでＲＡＷ細胞を前処理すると、ＬＰＳが誘導するＩκＢ−α分解が遮断される。示すように、ＴＩＲＡＰペプチドで前処理したＲＡＷ細胞を、示す時間、未刺激で放置するか、またはＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）で刺激した。溶解物（３０μｇ／試料）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、抗ＩκＢ−α抗体で免疫ブロットしてＩκＢ−α分解を評価した。（Ｃ）ＴＩＲＡＰペプチドは、ＬＰＳが誘導するＮＦ−κＢ活性を阻害したが、ＣｐＧが誘導する該活性は阻害しなかった。示すように、ＴＩＲＡＰペプチドで前処理したＲＡＷ  κＢ細胞を、ＬＰＳまたはＣｐＧいずれかで刺激し、そしてレポーターアッセイのため採取した。（Ｄ）ＴＩＲＡＰペプチドは、ＬＰＳによって誘導されるＰＫＲおよびＪＮＫリン酸化を阻害したが、ＣｐＧによって誘導されるものは阻害しなかった。示すように、未処理のＲＡＷ細胞、または４０μＭのＴＩＲＡＰペプチドで前処理したＲＡＷ細胞を、ＬＰＳまたはＣｐＧいずれかで刺激した。溶解物（３０μｇ／試料）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、その後、リン酸化ＰＫＲまたはリン酸化ＪＮＫを特異的に認識する抗体で免疫ブロットすることによって、解析した。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃを含んでなる図６は、ＴＩＲＡＰが樹状細胞成熟を誘導することを示す、一連のグラフである。（Ａ）野生型およびＭｙＤ８８−／−樹状細胞（ＤＣ）をＬＰＳまたはＣｐＧで誘導し、そしてフローサイトメトリーを用いて、同時刺激分子Ｂ７．１およびＢ７．１の発現に関して解析した。（Ｂ）ＴＩＲＡＰペプチドの存在下または非存在下で、未処理の細胞（なし）、またはＬＰＳもしくはＣｐＧで処理した細胞において、サイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６の産生を測定した。（Ｃ）未処理の野生型ＤＣ（なし）、ＬＰＳのみで処理したもの（ＬＰＳ）、または増加する量のＴＩＲＡＰペプチドの存在下、ＬＰＳで処理したもの（ＬＰＳ＋ＴＩＲＡＰペプチド）において、Ｔ細胞増殖を測定した。ｃｐｍｘ１０３として示す、細胞への３Ｈ−チミジンの取り込みによって、Ｔ細胞増殖を測定した。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃを含んでなる図６は、ＴＩＲＡＰが樹状細胞成熟を誘導することを示す、一連のグラフである。（Ａ）野生型およびＭｙＤ８８−／−樹状細胞（ＤＣ）をＬＰＳまたはＣｐＧで誘導し、そしてフローサイトメトリーを用いて、同時刺激分子Ｂ７．１およびＢ７．１の発現に関して解析した。（Ｂ）ＴＩＲＡＰペプチドの存在下または非存在下で、未処理の細胞（なし）、またはＬＰＳもしくはＣｐＧで処理した細胞において、サイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６の産生を測定した。（Ｃ）未処理の野生型ＤＣ（なし）、ＬＰＳのみで処理したもの（ＬＰＳ）、または増加する量のＴＩＲＡＰペプチドの存在下、ＬＰＳで処理したもの（ＬＰＳ＋ＴＩＲＡＰペプチド）において、Ｔ細胞増殖を測定した。ｃｐｍｘ１０３として示す、細胞への３Ｈ−チミジンの取り込みによって、Ｔ細胞増殖を測定した。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃを含んでなる図６は、ＴＩＲＡＰが樹状細胞成熟を誘導することを示す、一連のグラフである。（Ａ）野生型およびＭｙＤ８８−／−樹状細胞（ＤＣ）をＬＰＳまたはＣｐＧで誘導し、そしてフローサイトメトリーを用いて、同時刺激分子Ｂ７．１およびＢ７．１の発現に関して解析した。（Ｂ）ＴＩＲＡＰペプチドの存在下または非存在下で、未処理の細胞（なし）、またはＬＰＳもしくはＣｐＧで処理した細胞において、サイトカインＩＬ−１２およびＩＬ−６の産生を測定した。（Ｃ）未処理の野生型ＤＣ（なし）、ＬＰＳのみで処理したもの（ＬＰＳ）、または増加する量のＴＩＲＡＰペプチドの存在下、ＬＰＳで処理したもの（ＬＰＳ＋ＴＩＲＡＰペプチド）において、Ｔ細胞増殖を測定した。ｃｐｍｘ１０３として示す、細胞への３Ｈ−チミジンの取り込みによって、Ｔ細胞増殖を測定した。
【図７】図７は、ＴＩＲＡＰおよび阻害性ＴＩＲＡＰペプチドの機能に関する提唱される機構を示す図である。水平の黒線は、細胞外空間（線の上）を細胞内空間（線の下）と区別する。ＴＬＲ４、ＴＩＲＡＰ、ＭｙＤ８８、および阻害性ＴＩＲＡＰペプチドを図式的に示す。実線の矢印は、示すタンパク質（ＮＦ−κＢ、ＡＰ−１、およびｐ３８）の活性化を示し、一方、点線は、これらのタンパク質の活性化が阻害されることを示す。
【図８】図８は、３Ｈチミジンに曝露された、ＴＩＲＡＰノックアウトマウス由来の細胞における、不十分なＢ細胞増殖を図式的に示す。白抜き正方形および黒いひし形は、それぞれ、ＴＩＲＡＰノックアウトマウスＫ０１およびＫ０２からの結果を示し、そして白抜き三角形は、野生型（ＷＴ）対照を表す。Ｂ細胞増殖の測定値として、ベータ放射カウンターは、時間に渡る放射能放出数を計測することによって、Ｂ細胞に取り込まれた３Ｈチミジン量を測定した。
【図９】図９は、ＴＩＲＡＰノックアウトマウス由来の樹状細胞による不十分なサイトカイン産生を図式的に示す。黒いバーおよびストライプのバーは、それぞれ、ＴＩＲＡＰノックアウトマウスＫ０１およびＫ０２からの結果を示し、そして白抜きのバーは、野生型（ＷＴ）対照を表す。サイトカイン産生の測定値として、Ｂ細胞をＬＰＳおよびＢＬＰで刺激し、そしてＩＬ−６およびＴＮＦ−α捕捉抗体、並びに適切なビオチンコンジュゲート化検出抗体を用いたＥＬＩＳＡのため採取した。
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2004536585.tif 000008
【図５Ｂ】
2004536585.tif 000009
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2004536585.tif 000013
【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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