(57)【要約】本発明は、哺乳動物核酸分子及びその断片を提供する。本発明はまた、この哺乳動物核酸分子を用いた、情報伝達、免疫系、及び細胞増殖、特に結腸癌に関連する症状、疾患、及び障害の特徴付け・診断・評価・治療・予防方法を提供する。更に、本発明は、この哺乳動物核酸分子によってコードされるタンパク質を産生させるための発現ベクター及び宿主細胞を提供する。
2004500822.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列の生物学的に活性な部分、および
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列の免疫学的に活性な部分から選択されるＧＴＰアーゼ活性化タンパク質をコードする実質的に精製された哺乳動物核酸分子およびその断片、並びにその変異体およびその一部。
【請求項２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のアミノ酸配列をコードする請求項１に記載の哺乳動物核酸分子の変異体。
【請求項３】
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２９、
（ｂ）前記（ａ）の断片、および
（ｃ）前記（ａ）または前記（ｂ）の相補体から選択され、単離され精製された哺乳動物核酸分子。
【請求項４】
請求項３のポリヌクレオチドを含むプローブを含むプローブ。
【請求項５】
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８の６６２番目のヌクレオチドのＴからＡへの置換、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８の１０１３番目のヌクレオチドのＴからＣへの置換、および
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８の１０２０番目のヌクレオチドのＣからＧへの置換から選択された置換を含む一塩基多型（ＳＮＰ）。
【請求項６】
請求項３の核酸分子に機能的に結合したプロモーターを含む組換え核酸分子。
【請求項７】
請求項６の組換え核酸分子で形質転換された細胞。
【請求項８】
ポリペプチドを生産する方法であって、
（ａ）前記ポリペプチドが発現する条件下で、請求項７の細胞を培養するステップと、
（ｂ）発現した前記ポリペプチドを回収するステップとを含むことを特徴とするポリペプチド生産方法。
【請求項９】
サンプルにおいて哺乳動物核酸分子を検出するための方法であって、
（ａ）請求項４のプローブを前記サンプルとハイブリダイズさせて、ハイブリダイゼーション複合体を形成させるステップと、
（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出するステップとを含み、
前記ハイブリダイゼーション複合体の検出が、前記サンプルにおける前記哺乳動物核酸分子の存在を示すことを特徴とする哺乳動物核酸分子の検出方法。
【請求項１０】
前記ハイブリダイゼーションの前に、前記核酸分子またはその断片を増幅するステップを更に含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物核酸分子またはその断片を用いて分子のライブラリをスクリーニングし、前記哺乳動物核酸分子に特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定する方法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項３の哺乳動物核酸分子を前記分子のライブラリと結合させるステップと、
（ｂ）特異的な結合を検出して、前記哺乳動物核酸分子に特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含むことを特徴とするリガンド同定方法。
【請求項１２】
前記ライブラリが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ、ペプチド、およびタンパク質から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物核酸分子またはその断片を用いて、サンプルから前記哺乳動物核酸分子に特異的に結合するリガンドを精製する方法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項３の哺乳動物核酸分子またはその断片とサンプルとを結合させるステップと、
（ｂ）結合した前記哺乳動物核酸分子を回収するステップと、
（ｃ）前記リガンドから前記哺乳動物核酸分子を分離して、精製されたリガンドを得るステップとを含むことを特徴とするリガンド精製方法。
【請求項１４】
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列の生物学的に活性な部分、および
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列の免疫学的に活性な部分から選択されることを特徴とする実質的に精製されたタンパク質またはその一部。
【請求項１５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のアミノ酸配列を含む請求項１４のタンパク質の変異体。
【請求項１６】
タンパク質またはその一部を用いて分子のライブラリをスクリーニングし、前記タンパク質に特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定する方法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項１４のタンパク質またはその一部を前記分子のライブラリと結合させるステップと、
（ｂ）特異的な結合を検出して、前記タンパク質に特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含むことを特徴とするリガンド同定方法。
【請求項１７】
前記ライブラリが、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ、ペプチド、タンパク質、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、インヒビター、薬剤化合物、および医薬品から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質またはその一部を用いて、サンプルから前記タンパク質に特異的に結合するリガンドを精製する方法であって、
（ａ）特異的な結合が許容される条件下で、請求項１４のタンパク質またはその一部をサンプルと結合させるステップと、
（ｂ）結合した前記タンパク質を回収するステップと、
（ｃ）前記リガンドから前記タンパク質を分離して、精製したリガンドを得るステップとを含むことを特徴とするリガンド精製方法。
【請求項１９】
効果的な量の請求項１４のタンパク質および医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２０】
ＧＴＰＡＰの発現の変化に関連する疾患や症状を治療または防止する方法であって、そのような治療が必要な患者に請求項１９の医薬組成物を投与することを含むことを特徴とする治療方法。
【請求項２１】
前記疾患や症状が、シグナル伝達異常、免疫疾患、および癌を含む細胞増殖異常から選択されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌が結腸癌であることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、核酸分子およびその核酸分子にコードされたＧＴＰアーゼ活性化タンパク質、およびその変異体に関連し、また、これらの分子を用いたシグナル伝達異常、免疫疾患、および特に結腸癌である細胞増殖異常の特徴付け・診断・予防・治療に関連する。
【０００２】
（発明の背景）
グアニンヌクレオチド結合タンパク質（ＧＴＰ結合タンパク質）は全ての真核細胞に存在し、代謝、細胞成長、分化、シグナル伝達、細胞骨格形成、および細胞内の小胞輸送や分泌などのプロセスにおいて機能する。高等動物では、ＧＴＰ結合タンパク質は、免疫反応（Ａｕｓｓｅｌ ら （１９８８） Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４０ ： ２１５−２２０）、アポトーシス、分化、および発癌を含む細胞増殖（Ｄｈａｎａｓｅｋａｒａｎ ら （１９９８） Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １７ ： １３８３−１３９４）などのプロセスを調節するシグナル伝達に関与している。
【０００３】
ＧＴＰ結合タンパク質のスーパーファミリーは幾つかのファミリーから構成されており、翻訳因子と、膜貫通シグナル伝達プロセスに関係するヘテロ三量体ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質とも呼ぶ）と、発癌遺伝子Ｒａｓタンパク質と、ｒａｂ、ｒａｐ、ｒｈｏ、ｒａｃ、ｓｍｇ２１、ｓｍｇ２５、ＹＰＴ、ＳＥＣ４、およびＡＲＦなどの遺伝子の産物を含むその他の低分子量ＧＴＰ結合タンパク質と、チューブリンとに分類することができる（Ｋａｚｉｒｏ ら （１９９１） Ａｎｎ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６０ ： ３４９−４００）。
【０００４】
低分子量（ＬＭＷ）ＧＴＰ結合タンパク質は、２１〜３０ ｋＤａの小さなタンパク質のクラスである。これらのタンパク質は、細胞成長、細胞周期、タンパク質分泌、および細胞内の小胞体相互作用を調節する。特にＬＭＷ ＧＴＰ結合タンパク質は、受容体からの細胞外シグナルに応答して、様々な細胞機能に関係する分裂促進シグナルを伝達し、細胞タンパク質を活性化させる（Ｔａｖｉｔｉａｎ （１９９５） Ｃ Ｒ Ｓｅａｎｃｅｓ Ｓｏｃ Ｂｉｏｌ Ｆｉｌ １８９ ： ７−１２）。このプロセスの際、ＧＴＰの加水分解により、ＧＴＰ結合タンパク質が活性型（ＧＴＰ結合）から不活性型（ＧＤＰ結合）へ変換するだけではなく、エネルギーも供給される。
【０００５】
ＬＭＷ ＧＴＰ結合タンパク質のＲｈｏファミリー（Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ）には、アクチン細胞骨格再形成および細胞増殖に関連する様々な生体現象を調節するＲｈｏＡ、Ｒａｃ１、およびＣｄｃ４２が含まれる。Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼの主な調節分子群には、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）がある。Ｒｈｏ ＧＡＰは、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼのＧＴＰ結合型を選択的に認識し、内在性ＧＴＰアーゼ活性を刺激して結合ＧＴＰを加水分解してＧＤＰにする。従って、Ｒｈｏ ＧＡＰは、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼの活性なＧＴＰ結合型から不活性なＧＤＰ結合型への変換を刺激して、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼの負の調節因子すなわちリプレッサーとして機能する（Ｚｈａｎｇ． ら （１９９７） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２７２ ： ２１９９９−２２００７）。
【０００６】
Ｒｈｏ ＧＡＰタンパク質は、Ｒｈｏ ＧＡＰドメインと呼ばれる約１７０〜１９０のアミノ酸相同領域を共有している。この領域は、ＧＡＰ活性に必要な最小の構造ドメインを含むと思われる（Ｚｈｅｎｇ． ら （１９９３） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２４６２９−２４６３４）。Ｒｈｏ ＧＡＰタンパク質は、このドメインにおけるアミノ酸同一性が２０％〜２４％であるが、ある特定の残基が高度に保存されている。例えば、Ｒｈｏ ＧＡＰドメインのＮ末端に近接した一対のアルギニン残基は、Ｒｈｏ ＧＡＰタンパク質の間に高度に保存され、最大触媒作用に必要であると思われる（Ｌｅｏｎａｒｄ ら （１９９８） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７３ ： １６２１０−１６２１５）。更に、プロリンリッチのＳＨ３ドメイン結合部位は、これらのタンパク質のＮ末端領域にも見られる（Ｌｅｏｎａｒｄ、前出）。
【０００７】
癌に関連する遺伝子の同定および発癌に関係する遺伝メカニズムを理解することは、このような疾患の診断、予防、および治療に極めて重要である。特に結腸癌の場合、発癌遺伝子の活性化、癌抑制遺伝子の不活化、およびＤＮＡミスマッチ修復遺伝子の変異の組み合わせが、正常な粘膜から結腸癌への悪化に関係する（Ｆｅａｒｏｎ ら （１９９０） Ｃｅｌｌ ６１ ： ７５９−７６７ ； Ｃｈｕｎｇ （１９９５） Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １０９ ： １６８５−１６９９）。近年の研究により、正常な結腸粘膜に対する結腸腫瘍サンプルにおける染色体（遺伝子？）の対立遺伝子の喪失に基づいて、結腸癌に関連する第２２染色体の特定の領域が同定された（Ｃａｓｔｅｌｌｓ ら （１９９９） Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１７ ： ８３３１− ８３７）。対立遺伝子欠失の最小領域が、０．５７ｃＭの間隔をカバーするマーカーＤ２２Ｓ１１７１とＤ２２Ｓ９２８との間に存在し、遺伝子座位２２ｑ１３．３３に対応することが、第２２染色体のマイクロサテライトマーカーを用いて見出された。第２２染色体上の様々な遺伝子が、結腸直腸の発癌に関連する癌抑制遺伝子の候補と提示されたが、それらの遺伝子には如何なる突然変異も存在しなかった（Ｃａｓｔｅｌｌｓ他、前出）。
【０００８】
ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質をコードする核酸配列およびその変異体の発見により、癌、特に結腸癌を含む細胞増殖異常の特徴付け・診断・予防・治療に有用な組成物を提供する。
【０００９】
（発明の開示）
総称して「ＧＴＰＡＰ」、個別にはそれぞれ「ＧＴＰＡＰ−１」および「ＧＴＰＡＰ−２」と呼ぶＧＴＰアーゼ活性化タンパク質をコードする核酸分子の発見に基づき、シグナル伝達異常、免疫疾患、および特に結腸癌である細胞増殖異常などの症状の特徴付け・診断・予防・治療に有用な組成物を提供することで当分野の要望に応える。
【００１０】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列またはその一部と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０の生物学的に活性な部分と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０の免疫学的に活性な部分と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０の変異体とを含む本哺乳動物タンパク質をコードするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２９またはそれらの断片を含む単離され精製されたヒトおよびラット核酸分子を提供する。
【００１１】
本発明はまた、本哺乳動物核酸分子またはその断片とハイブリダイズするプローブを提供する。本発明はまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２９の核酸分子に相補的な単離され精製された核酸分子を提供する。一実施態様では、このプローブは、一本鎖の相補的なＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子である。
【００１２】
本発明は更に、サンプルにおいて核酸分子を検出する方法であって、プローブをそのサンプルの少なくとも１つの核酸分子とハイブリダイズするステップと、ハイブリダイゼーション複合体を形成するステップと、そのハイブリダイゼーション複合体を検出するステップとを含み、そのハイブリダイゼーション複合体の存在がそのサンプルに核酸分子存在することと相関する方法を提供する。一実施態様では、この方法は、ハイブリダイゼーションの前にその核酸分子を増幅するステップを更に含む。この核酸分子若しくはその断片を、マイクロアレイ上のエレメント若しくは標的として用いることができる。
【００１３】
本発明はまた、核酸配分子しくはその断片を用いて、その核酸分子と特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定するべく、分子のライブラリをスクリーニングする方法であって、特異的な結合が許容される条件下で、その核酸分子をその分子のライブラリと結合させるステップと、その特異的な結合を検出して、その核酸分子と特異的に結合するリガンドを同定するステップとを含むスクリーニング方法を提供する。このようなライブラリには、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子、ペプチド、ＰＮＡ、タンパク質等が含まれる。類似の方法で、核酸分子またはその断片を用いてリガンドを精製することができる。
【００１４】
本発明はまた、本核酸分子の少なくともある断片を含む発現ベクターを提供する。別の実施態様では、この発現ベクターは宿主細胞内に含まれている。本発明は更に、タンパク質が発現する条件下で宿主細胞を培養するステップと、そのタンパク質をその宿主細胞から回収するステップとを含むタンパク質生産方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、実質的に精製され哺乳動物ＧＴＰＡＰまたはその一部を提供する。更に、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０の生物学的に活性な部分と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０の免疫学的に活性な部分と、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１を含むＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０の変異体とを有する単離され精製されたタンパク質を提供する。本発明はまた、医薬用担体と共に実質的に精製された哺乳動物ＧＴＰＡＰタンパク質またはその一部を含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
本発明はまた、ＧＴＰＡＰの発現の変化に関連した疾患または症状を治療するための方法を提供する。この方法は、医薬用担体と共に実質的に精製された哺乳動物ＧＴＰＡＰタンパク質またはその一部を含む医薬組成物を好適な量、そのような治療が必要な患者に投与することを含む。本発明の一実施例では、そのような疾患は、細胞のシグナル伝達異常、免疫疾患、および特に結腸癌である細胞増殖異常から選択される。本発明の別の実施例では、癌は結腸癌である。
【００１７】
本発明は更に、その哺乳動物タンパク質の一部を用いて抗体を産生させる方法を提供する。本発明はまた、哺乳動物タンパク質若しくはその一部を用いて、そのタンパク質に特異的に結合する少なくとも１つのリガンドを同定するべく、分子のライブラリをスクリーニングする方法であって、特異的な結合が許容される条件下で、そのタンパク質を分子のライブラリと結合させるステップと、その特異的な結合を検出して、そのタンパク質と特異的に結合するリガンドを同定するスクリーニング方法を提供する。このようなライブラリには、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子、ペプチド、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、薬剤、医薬品、その他のリガンドが含まれる。一実施態様では、この方法で同定されたリガンドがその哺乳動物タンパク質の活性を調節する。類似の方法で、そのタンパク質若しくはその一部を用いてリガンドを精製する。本発明はまた、特異的な結合が許容される条件下で、その哺乳動物タンパク質またはその一部をサンプルと結合させて、そのタンパク質とリガンドとの特異的な結合を検出して、その結合したタンパク質を回収し、そのリガンドからそのタンパク質を分離して、精製されたリガンドを得る方法を提供する。
【００１８】
本発明はまた、哺乳動物のゲノムＤＮＡの中にマーカー遺伝子を挿入して、その天然の哺乳動物核酸分子の発現を阻害する方法を提供する。本発明はまた、その哺乳動物核酸分子を用いて哺乳動物モデル系を作製する方法であって、その哺乳動物核酸分子を含むベクターを作製するステップと、そのベクターを全能性哺乳動物胚性幹細胞の中に導入するステップと、ゲノムＤＮＡの中にそのベクターが組み込まれた胚性幹細胞を選択するステップと、この選択した細胞を哺乳動物胚盤胞の中に微量注入して、キメラ胚盤胞を形成するステップと、偽妊娠メスにキメラ胚盤胞を移植するステップと、このメスが、生殖細胞系の中に少なくとも１つの哺乳動物核酸分子の別の複製を含むキメラ哺乳動物を出産し、そのキメラ哺乳動物を交配して同型接合哺乳動物モデル系を作製するステップとを含む哺乳動物モデル系作製方法を提供する。
【００１９】
（本発明の実施方法について）
本発明は、ここに開示した特定の装置及び材料、方法に限定されず、その実施形態を変更できることを理解されたい。また、ここで用いられる用語は、特定の実施例のみを説明する目的で用いるものであり、後述の請求の範囲によってのみ限定され、本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい。本明細書及び請求の範囲において単数形を表す「或る」、「その（この等）」は、文脈で明確に示していない場合は複数形を含むことに注意されたい。従って、例えば「或る宿主細胞」は当業者には周知の複数の宿主細胞を含む。
【００２０】
本明細書で用いた全ての科学技術用語は、別の方法で定義されていない限り、本発明の属する技術分野の一般的な技術者が普通に解釈する意味と同じである。本明細書に記載の全ての文献は、本発明に関連して使用する可能性のある文献に記載された細胞系、プロトコル、試薬、ベクターを記述し開示するために引用した。従来の発明を引用したからと言って、本発明の新規性が損なわれると解釈されるものではない。
【００２１】
（定義）
「ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質」または「ＧＴＰＡＰ」は、天然、合成、半合成或いは組み換え体などの全ての種（マウス、ウシ、ヒツジ、ブタ、齧歯類、イヌ、サルを含むが好ましくはヒトである哺乳動物）から得られる、実質的に精製されたタンパク質を指す。「ＧＴＰＡＰｓ」は、２つ以上のＧＴＰＡＰを指す。
【００２２】
「遺伝子発現の変化」および「発現の変化」は、サンプルにおける遺伝子発現の増大および減少、並びに転写されたメッセンジャーＲＮＡ転写産物の存在または不在を指す。
【００２３】
「生物学的に活性」は、構造的または免疫学的、調節的、化学的な機能を有する、天然或いは組み換え、または合成分子であるタンパク質を指す。同様に、「免疫学的に活性」は、天然、組換え、または合成のＧＴＰＡＰ、或いはその任意のオリゴペプチドが、好適な動物または細胞において特定の免疫反応を誘導して特定の抗体に結合する能力を指す。
【００２４】
「相補的な」は、プリン塩基とピリミジン塩基との自然な水素結合による塩基対形成を指す。例えば、配列Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔは、その相補配列Ｔ−Ｇ−Ｃ−ＡまたはＵ−Ｇ−Ｃ−Ａと水素結合する。２つの一本鎖分子の相補性は、ヌクレオチドの幾つかのみが結合する部分的な相補性と、ヌクレオチドの殆ど全てが結合する完全な相補性とがある。核酸鎖間の相補性の程度は、ハイブリダイゼーション及び増幅反応の効率及び強度に影響する。
【００２５】
「誘導体」は、化学修飾された核酸分子やタンパク質配列を指す。化学修飾には、分子や配列の生物学的活性または寿命を維持或いは増大する、アルキル基またはアシル基、アミノ基による水素の置換や、グリコシル化、ポリエチレングリコール化、または類似の任意のプロセスが含まれる。
【００２６】
「断片」は、有用な機能的特性を維持する核酸分子の任意の一部またはインサイト社クローンを指す。有用な断片には、ハイブリダイゼーションや増幅技術、または複製や転写、翻訳の調節に有用なオリゴヌクレオチドを含む。
【００２７】
「ハイブリダイゼーション複合体」は、プリン塩基とピリミジン塩基との間の水素結合の形成による２つの核酸分子の複合体を指す。
【００２８】
「リガンド」は、核酸分子やタンパク質の相補部位に特異的に結合する任意の分子や物質、または化合物を指す。このようなリガンドは、核酸及びタンパク質、炭水化物、脂肪、脂質を含む無機及び有機物質の少なくとも１つからなり、本発明の核酸分子やタンパク質の活性を安定化させたり、調節したりする。
【００２９】
「調節する」は、分子と核酸分子かタンパク質の何れかとの特異的な結合によって、寿命や活性（生物学的または化学的、免疫学的）を変化させることを指す。
【００３０】
「非保存的なアミノ酸の置換」は、置換されると元のタンパク質の特性、すなわちタンパク質の構造、特にその機能に影響を与える可能性が最も高い置換を指す。例えば、酸性のアスパラギン酸や塩基性のアルギニンなどのアミノ酸の中性アミノ酸への置換は、非保存的置換である。同様に、「保存的なアミノ酸の置換」は、置換されても元のタンパク質の特性への影響が最小、すなわちタンパク質の構造、特にその機能が保存され、あまり変化しない置換を指す。バリンとアラニンとの置換などの中性のアミノ酸と中性のアミノ酸との置換は保存的な置換である。また、アスパラギン酸とグルタミン酸との置換などの酸性のアミノ酸と酸性のアミノ酸との置換も保存的な置換である。
【００３１】
「非保存的な核酸の置換」は、核酸分子におけるピリミジンヌクレオチドとプリンヌクレオチドとの置換を指す。同様に、「保存された核酸の置換」は、ＣとＴのピリミジンヌクレオチドと別のピリミジンヌクレオチドとの置換や、ＡとＧのプリンヌクレとチドと別のプリンヌクレオチドとの置換を指す。
【００３２】
「核酸分子」は、核酸、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはそれらの任意の断片を指す。また、「核酸分子」は、ゲノム若しくは合成起源の二本鎖若しくは一本鎖のＤＮＡ或いはＲＮＡであり、炭水化物または脂質、タンパク質、その他の物質と結合して、形質転換などの特殊な作用を起こしたり、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等の有用な成分を形成する。「オリゴヌクレオチド」は、アンプリマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）及びプライマー、オリゴマー、エレメント、標的、プローブと実質的に同一であり、好ましくは一本鎖である。核酸分子は別の核酸分子のスプライスバリアントであり得る。
【００３３】
「タンパク質」は、天然或いは合成のアミノ酸配列、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはそれらの一部を指す。
【００３４】
ここで用いる「一部」は、あらゆる目的に用いられるタンパク質の任意の一部を指すが、特に、その一部と特異的に結合する分子のライブラリのスクリーニングや抗体の生産に用いられる。「一部」の典型的な例は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６の初めの４０の連続するアミノ酸である。
【００３５】
ポリヌクレオチド配列に用いる「類似性」とは、標準的なアルゴリズムを用いてアラインメントされた少なくとも２つの配列間の一致する残基数から求められる。このようなプログラムは、２つの配列間のアラインメントを最適化するべく、標準的かつ再現性のある方法で比較する配列内にギャップを挿入可能なため、２つの配列間のより有意な比較を達成することが可能である。
【００３６】
広く用いられている無料の配列比較アルゴリズム一式が、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ）、（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）によって提供される。Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ） （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， ら （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０； Ａｌｔｓｃｈｕｌ （１９９３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３６： ２９０−３００）は、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）および幾つかのほかの情報源から入手可能である。このＢＬＡＳＴソフトウェア一式には、既知のポリヌクレオチド配列と様々なデータベースの別のポリヌクレオチド配列とのアラインメントに用いられる「ｂｌａｓｔｎ」を含む、様々な配列分析プログラムが含まれる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」と呼ばれるツールが入手可能であり、２つのヌクレオチド配列の対を直接比較するために用いられる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」は、ｈｔｔｐ：／／ＷＷＷ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｏｒｆ／ｂ１２．ｈｔｍｌにアクセスして、対話形式で利用ができる。「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールは、ｂｌａｓｔｎ 及び ｂｌａｓｔｐの両方に用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、一般的には、デフォルトを設定するギャップ及び他のパラメーターと共に用いられる。例えば、２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ある者は、デフォルトパラメータに設定された「ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールＶｅｒｓｉｏｎ ２．０．０９ （Ｍａｙ−０７−１９９９）でｂｌａｓｔｎを使用するであろう。そのようなデフォルトパラメータは、例えば、以下のようにする。
【００３７】
Ｍａｔｒｉｘ： ＢＬＯＳＵＭ６２
Ｒｅｗａｒｄ ｆｏｒ ｍａｔｃｈ： １
Ｐｅｎａｌｔｙ ｆｏｒ ｍｉｓｍａｔｃｈ： −２
Ｏｐｅｎ Ｇａｐ： ５ 及び Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｇａｐ： ２ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ
Ｇａｐ ｘ ｄｒｏｐ−ｏｆｆ： ５０
Ｅｘｐｅｃｔ： １０
Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ： １１
Ｆｉｌｔｅｒ： ｏｎ
類似性は、例えば、特定の配列番号で決められた、所定の配列の全長に対して測定してもよいし、それより短い長さに対して、例えば、ある大きな所定の配列から得られた断片、例えば、連続する少なくとも、２０または３０、４０、５０、７０、１００、２００のヌクレオチドの断片の長さに対して測定してもよい。このような長さは単なる例であり、配列表及び表、図面を含む明細書に記載の配列の任意の長さの断片を用いて、同一性のパーセントが測定される長さを示すことができる。
【００３８】
「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および抗体などを含むサンプルは、体液や、細胞が成長する細胞溶液、即ち培養液の可溶性画分や、細胞から単離或いは抽出した染色体、細胞小器官、または膜や、溶液中に存在する或いは基板に結合されたゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、ｃＤＮＡや、組織、細胞、組織プリント、またはフィンガープリント、皮膚、髪等を含み得る。
【００３９】
「特異的な結合」または「特異的に結合する」は、２つの分子間の相互作用を指す。ポリヌクレオチドの場合、特異的な結合には、センス鎖とアンチセンス鎖との間の水素結合、複製または転写に影響を与える一本鎖とタンパク質との間の水素結合、ＤＮＡ分子の主溝または副溝への分子または化合物の挿入、転写因子、エンハンサー、およびリプレッサー等として機能する少なくとも１つの分子との相互作用が含まれる。ポリペプチドの場合、特異的な結合には、上記したようなポリヌクレオチドとの相互作用、或いはアゴニスト、抗体、またはアンタゴニストなどの分子や化合物との相互作用が含まれる。特異的な結合は、分子間の好適な化学的相互作用または分子相互作用を許容する構造的特性の存在に左右される。
【００４０】
「一塩基多型」またはＳＮＰは、置換、挿入、または欠失により生じるポリヌクレオチドにおける１つのヌクレオチドの変化を指す。置換は上記したように保存的または非保存的であり、コードされるアミノ酸残基が変化する場合もあるし、変化しない場合もある。このような変化は、個人における特定の疾患や症状に対する素因となり得る。
【００４１】
「実質的に精製された」は、その自然環境から切り離されてから分離或いは単離された、自然環境では結合しているその他の成分が少なくとも約６０％、好適には約７５％、最も好適には、約９０％取り除かれた核酸分子またはタンパク質を指す。
【００４２】
「基板」は、核酸分子またはタンパク質が結合した任意の固体或いは半固体の支持物を指し、膜またはフィルター、チップ、スライド、ウエハ、ファイバー、磁気または非磁気ビーズ、ゲル、毛細管または他のチューブ、プレート、ポリマー、微小粒子が含まれる。この基板は、孔または溝、ピン、チャネル、細孔を含む様々な表面形態を有する。
【００４３】
「変異体」は、ＧＴＰＡＰをコードする核酸分子の変異体である核酸分子、またはそのような分子によってコードされるタンパク質を指す。このような変異体は、少なくとも１００、最も好ましくは４００以上のＢＬＡＳＴスコアから決定され得る。
【００４４】
（発明）
本発明は、ＧＴＰＡＰｓをコードする新規の哺乳動物核酸分子およびその核酸分子変異体の発見に基づき、シグナル伝達異常、免疫疾患、特に結腸癌である細胞増殖異常などの病態の特徴付け・診断・治療・予防においてその核酸分子やその断片、またはそのタンパク質やその一部を用いることに関連する。
【００４５】
本発明のＧＴＰＡＰ１をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメント用のコンピュータ検索を用いて子宮組織ライブラリ（ＵＴＲＳＮＯＲ０１）のインサイトクローン３０６８５３８Ｈ１において初めに同定された。コンセンサス配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８は、インサイトクローン９０８４６５Ｒ２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ （ＣＯＬＮＮＯＴ０９）、９５７１３０Ｒ６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ （ＫＩＤＮＮＯＴ０５）、１５８０６２８Ｈ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ （ＤＵＯＤＮＯＴ０１）、２６３１２４７Ｆ６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ （ＣＯＬＮＴＵＴ１５）、３０６８５３８Ｈ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ （ＵＴＲＳＮＯＲ０１）、３５３２２８６Ｔ６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ （ＫＩＤＮＮＯＴ２５）、および１３０１５２０Ｆ６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に由来する。
【００４６】
本発明のヒトＧＴＰアーゼ活性化タンパク質をコードする核酸分子、および核酸分子変異体は、本発明のＧＴＰＡＰ１およびＧＴＰＡＰ２をコードする核酸配列をＬＩＦＥＳＥＱデータベースおよびＺＯＯＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）における核酸配列と比較して初めに同定された。
【００４７】
一実施例では、本発明は、図１Ａ−図１Ｅに示されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。ＧＴＰＡＰ１はアミノ酸４３３個の長さであって、Ｎ３３８残基にける潜在的なＮ結合グリコシル化部位を有する。潜在的なカゼインキナーゼＩＩリン酸化部位が、Ｓ１６９、Ｔ２３９、Ｔ２９２、Ｓ３０９、およびＳ３８２に見られ、潜在的なプロテインキナーゼＣリン酸化部位が、Ｓ１２９、Ｔ２３９、およびＳ２９７に見られ、潜在的なチロシンキナーゼリン酸化部位が、Ｙ６０、Ｙ１０１、およびＹ３１５に見られる。ＢＬＩＭＰＳ＿ＰＦＡＭ分析により、Ｄ２６０からＰ２７６のアミノ酸残基におけるＲＨＧ５ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質シグネチャが同定された。ＢＬＩＭＰＳ＿ＰＲＯＤＯＭにより、Ｐ２１０からＡ２３５及びＬ３１０からＬ３５０における２つのタンパク質ＧＴＰアーゼ活性化ドメインが同定された。ＢＬＡＳＴ＿ＰＲＯＤＯＭ分析により、Ｌ８からＳ１６９における確率スコアｐ＝４．３−６０のＲＨＧ５ ＲｈｏＧＡＰタンパク質に対する相同性と、Ｔ１７５からＰ３８７における確率スコアｐ＝７．９−２９のＰ５０−ＲｈｏＧＡＰに対する相同性とが同定された。
【００４８】
別の実施例では、本発明は、図２Ａ−図２Ｅに示されているＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。ＧＴＰＡＰ２はまた、アミノ酸４３３個の長さであって、ＧＴＰＡＰ１と同じグリコシル化部位、リン酸化部位、モチーフ、およびシグネチャ配列を共有する。
【００４９】
図３Ａ−図３Ｄに示されているように、ＧＴＰＡＰ１は、ＧＴＰＡＰ２（インサイトＩＤ ４０４４２４．５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、ヒトＲｈｏＧＡＰタンパク質８（ＧＩ ６５７２１８５ ： ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）のアミノ酸配列の一部、およびヒトＲｈｏＧＡＰタンパク質ＧＩ ３１２２１２（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）と配列相同性を有する。具体的には、ＧＴＰＡＰ１とＧＴＰＡＰ２との同一性は９９．８％であって、異なる残基は唯１つである。すなわち、ＧＴＰＡＰ１の３０２位におけるグリシン残基がＧＴＰＡＰ２ではアルギニン残基に置換されている。この置換は、その位置のアミノ酸のコドンにおけるＳＮＰにより生じている（図４Ａおよび図４Ｂのポリヌクレオチドアラインメントを参照）。ＧＴＰＡＰ１は、そのＹ１０１からＬ４３３においてＧＩ ６５７２１８５と同一であるが、ＧＴＰＡＰ１は、そのタンパク質のアミノ末端に更に１００個のアミノ酸残基を含む。ＧＴＰＡＰ１はまた、ＧＩ ３１２２１２と４９．２％の同一性を有する。４つのタンパク質はそれぞれ、ＧＴＰＡＰ１の約Ｐ１７６からＰ１８９アミノ酸残基までのプロリンリッチ領域であるＳＨ３ドメイン結合部位を有する。４つのタンパク質はまた、Ｒｈｏ ＧＡＰドメインを含むＣ末端領域に実質的において相同である。具体的には、ＧＴＰＡＰ１の配列Ｆ２３１ＲＲＳに含まれているＧＡＰタンパク質の触媒活性に関連する２つのアルギニン残基は、４つ全てのタンパク質に保存されている。更に、ＧＴＰＡＰ１の３０２位におけるグリシン残基がＧＴＰＡＰ２ではアルギニン残基に置換されているが、この置換が非保存的な置換であってこのタンパク質のＲｈｏ ＧＡＰドメインで生じていることに注目されたい。
【００５０】
図４Ａおよび図４Ｂには、ＧＴＰＡＰ１（３０６８５３８：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）をコードするポリヌクレオチド、ＧＴＰＡＰ２（４０４４２４．５：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）をコードするポリヌクレオチド、およびこれらの配列が由来するインサイトｃＤＮＡクローンとの間のアラインメントが示されている。具体的には、このアラインメントには、２つの完全長のポリヌクレオチド間に見られる一塩基多型（ＳＮＰ）の領域が含まれる。図４Ａおよび図４Ｂでは、これらのＳＮＰはΔで示した。これらの領域を含むｃＤＮＡクローンおよび対応ライブラリは、９０８４６５Ｒ２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ （ＣＯＬＮＮＯＴ０９）、９５７１３０Ｒ６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ （ＫＩＤＮＮＯＴ０５）、１５８０６２８Ｈ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ （ＤＵＯＤＮＯＴ０１）、２６３１２４７Ｆ６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ （ＣＯＬＮＴＵＴ１５）、１３０１５２０Ｆ６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７ （ＢＲＳＴＮＯＴ０７）、２４６５４２２Ｆ６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ （ＴＨＹＲＮＯＴ０８）、９５７１３０Ｘ３１３Ｖ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ （ＫＩＤＮＮＯＴ０５）、１５８０５４５Ｈ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ （ＤＵＯＤＮＯＴ０１）、１８９１４５７Ｈ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ （ＢＬＡＤＴＵＴ０７）、４６４９６５７Ｈ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２ （ＰＲＯＳＴＵＴ０４）、４００２７５８Ｈ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３ （ＨＮＴ２ＡＺＳ０７）、９５７１３０Ｒ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４ （ＫＩＤＮＮＯＴ０５）、２６２４３６５Ｔ６．ｃｏｍｐ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５ （ＫＥＲＡＮＯＴ０２）、２０４４４４４Ｈ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６ （ＨＩＰＯＮＯＮ０２）、３４１６８８３Ｔ６；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７ （ＰＴＨＹＮＯＴ０４）、１３０１５２０Ｔ６．ｃｏｍｐ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８ （ＢＲＳＴＮＯＴ０７）、１３０１５２０Ｈ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９ （ＢＲＳＴＮＯＴ０７）、および１４２２６３５Ｘ３０５Ｄ１．ｃｏｍｐ；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０ （ＫＩＤＮＮＯＴ０９）である。図４Ａには、ＧＴＰＡＰ１における６６２位のヌクレオチドＴがＧＴＰＡＰ２ではＡに非保存的に置換されているのが示されている。この変化は、６つのクローンの内、２つがその位置にＴを含み、４つがその位置にＡを含むことにより支持されている。図４Ｂには、１０１３位および１０２０位におけるＳＮＰが示されている。１０１３位におけるＳＮＰは、Ｔ（ＧＴＰＡＰ１）からＣ（ＧＴＰＡＰ２）への保存的な置換であり、１２のクローンの内、２つがその位置にＣを含み、１０がその位置にＴを含むことにより支持されている。１０２０位におけるＳＮＰは、Ｇ（ＧＴＰＡＰ１）からＣ（ＧＴＰＡＰ２）への非保存的な置換であり、１２のクローンの内、２つがその位置にＣを含み、７つがその位置にＧを含むことにより支持されている。この領域を含む識別可能なクローンの２／１２すなわち１７％にのみ見られることから比較的稀であり、かつコードされるアミノ酸残基のコドンの５’位置、すなわち１０２０位におけるＳＮＰにより、ＧＴＰＡＰ２においてグリシンからアルギニンへの非保存的な置換が生じることから、１０１３位および１０２０位におけるＳＮＰは重要である。１０２０位における変化は、タンパク質のこの領域に位置するコードされるタンパク質の触媒活性に影響を与え得る。
【００５１】
ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ら （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５ ： ３３８９−３４０２）を用いて、ＺＯＯＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）において、ヒトＲｈｏ ＧＡＰタンパク質をコードする核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）に一致するラット、マウス、およびサルのクローンを検索して、本発明のヒトＧＡＰタンパク質をコードする核酸分子が更に同定された。図５Ａ−図５Ｅに、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８とラット由来のこの配列の非ヒト変異配列との間のアライメントが示されている。ヒト配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）に対してＢＬＡＳＴスコアが１００以上である、７０１２４４９２６Ｈ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１ （ＲＡＬＩＮＯＨ０２）、７００９５０１６９Ｈ２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２ （ＲＡＳＰＮＯＮ０２）、７０１５７５９７４Ｈ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３ （ＲＡＬＩＴＸＴ２５）、７０１２７４０３６Ｈ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４ （ＲＡＢＦＮＯＮ０２）， ７００４８０５２８Ｈ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５ （ＲＡＬＩＮＯＮ０３）、７００９３５７５３Ｈ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６ （ＲＡＬＩＮＯＮ０３）、および７００９３６０６１Ｈ１；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７ （ＲＡＬＩＮＯＮ０３）が同定された。
【００５２】
核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２９）をハイブリダイゼーションおよび増幅技術に用いて、サンプルにおけるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９、および類似分子間の同定および区別が可能である。これらの分子を用いて、遺伝子組換えによりヒトの症状、疾患、または障害を模した疾患動物モデルを作製したり、動物毒素研究、臨床検査、および被験動物／患者の治療プロファイルをモニタリングすることが可能である。
【００５３】
様々な組織においてＧＴＰＡＰが発現するが、ノーザン分析によりその少なくとも６８％が癌に関連し、３２％が炎症および免疫反応に関連し、１８％が細胞増殖の症状に関連することが示された。ＧＴＰＡＰが、結腸癌を含む胃腸組織（２３％）で発現することに注目されたい。
【００５４】
ＧＴＰＡＰをコードするポリヌクレオチドが、結腸癌に関連する遺伝子を含む第２２染色体の或る領域にマッピングされた。結腸癌に関連する第２２染色体の或る領域を画定するパブリックドメイン配列のＤ２２Ｓ１１７１およびＤＤ２２Ｓ９２を用いて、ＢＡＬＳＴ２によりＧＴＰＡＰをコードするポリヌクレオチド配列をこの領域内のゲノムＤＮＡとアラインメントさせ、その一致が少なくとも１００塩基対に亘って同一性が９８％以上であることが分かった。
【００５５】
Ｒｈｏ ＧＡＰタンパク質ＧＩ ６５７２１８５のアミノ酸配列の一部をコードするヒトＤＮＡ配列が、結腸癌に関連する遺伝子を含む第２２染色体の或る領域に位置することが近年になって分かった。Ｒｈｏ ＧＡＰタンパク質は、正常な細胞におけるＲｈｏ ＧＴＰアーゼ調節性シグナル伝達プロセスの負の調節因子すなわちサプレッサーとして作用することから癌抑制因子の可能性がある。
【００５６】
（本発明の特徴及び使用）
ｃＤＮＡライブラリ
ここに開示する特定の実施例では、当分野で周知の方法を用いて哺乳動物の細胞及び組織からｍＲＮＡを単離し、これを用いてｃＤＮＡライブラリを作製する。上記したインサイト社クローンは、哺乳動物ｃＤＮＡライブラリから単離された。本発明の代表的な少なくとも１つのライブラリの作製方法を以降に記載する実施例に示す。コンセンサス哺乳動物配列は、Ｐｈｒａｐ （Ｐ． Ｇｒｅｅｎ， 前出）及びＧＥＬＶＩＥＷ 断片構築システム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）、ＡＵＴＯＡＳＳＥＭＢＬＥＲアプリケーション（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ）などのコンピュータプログラムを用いて、インサイト社クローンを含む断片、伸長、及び／またはショットガン配列から化学的かつ／または電子的に構築した。クローン、伸長配列および／またはショットガン配列は、クラスターおよび／または主クラスターの中にに電子的に組み入れられた。
【００５７】
シークエンシング
核酸をシークエンシングする方法は当分野で周知であり、そのような方法を用いて本発明の任意の実施例を実施することができる。これらの方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩであるクレノウフラグメント、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよび熱耐性Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ （ＡＰＢ）， Ｐｉｃａｔａｗａｙ ＮＪ）、或いはＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ ＭＤ）に用いられるような校正エクソヌクレアーゼとポリメラーゼとの組み合わせを用いることができる。配列の準備は、ＨＹＤＲＡマイクロディスペンサー（Ｒｏｂｂｉｎｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ ＣＡ）、ＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ）、及びＤＮＡ ＥＮＧＩＮＥサーマルサイクラー（ＰＴＣ２００； ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ ＭＡ）などの装置を用いて自動的に行うのが望ましい。シークエンシングに用いる装置には、ＡＢＩ ３７００、３７７または３７３ＤＮＡシークエンシングシステム（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及びＭＥＧＡＢＡＣＥ １０００ ＤＮＡシークエンシングシステム（ＡＰＢ）等がある。当分野で周知の様々なアルゴリズムを用いて、シークエンシングした配列を解析することができる。これらのアルゴリズムは、Ａｕｓｕｂｅｌ（１９９７； Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｕｎｉｔ ７．７） 及びＭｅｙｅｒｓ（１９９５； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ ＶＣＨ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ， ｐｐ． ８５６−８５３）に記載されている。
【００５８】
ショットガンシークエンシングを用いて、様々に由来するクローニングしたインサートから更に配列を作り出す。ショットガンシークエンシング方法は当分野で周知であり、熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ類や非熱耐性ＤＮＡポリメラーゼ類、及び目的の核酸分子に隣接する代表的な領域から選択されたプライマーを用いる。当分野で周知のＣＯＮＳＥＤ（Ｇｏｒｄｏｎ （１９９８） Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ． ８：１９５−２０２）などの様々なアルゴリズムやプログラムを用いて、組み立てが不完全な配列を調べる。ベクターやキメラ配列、または欠失配列を含む汚染配列を除去して、組み立てが不完全な配列を完全な配列に組み立てる。
【００５９】
核酸配列の伸長
本発明の配列は、当分野で周知の様々なＰＣＲ法を用いた方法で伸長することができる。例えば、ＸＬ−ＰＣＲキット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及び入れ子プライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）、市販のｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリ用いてヌクレオチド配列を伸長することが可能である。全てのＰＣＲ系の方法に用いることができるように、プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６プライマー分析ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ ＭＮ）等の市販のソフトウェアを用いて、ヌクレオチドの長さが約２２〜３０個、ＧＣ含量が約５０％以上、約５５〜６８℃の温度で標的配列とアニールするように設計することが可能である。調節エレメントを復活させるために配列を伸長する場合は、ｃＤＮＡライブラリよりゲノムライブラリを用いる方が良い。
【００６０】
（本哺乳動物核酸分子の使用）
ハイブリダイゼーション
本哺乳動物核酸分子及びその断片は、様々な目的のための様々なハイブリダイゼーション技術に用いることができる。プローブは、５’調節領域やＧＴＰアーゼ活性化タンパク質グネチャなどの保存されたモチーフから作製可能であり、これらのプローブを、この哺乳動物タンパク質やアレル変位配列、または関連分子をコードする天然の分子を同定するためのプロトコルに用いることができる。通常は一本鎖であるＤＮＡ若しくはＲＮＡからなるこのプローブは、任意のこの核酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有することが望ましい。ハイブリダイゼーションプローブは、標識されたヌクレオチドの存在下でのＰＣＲ増幅、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、または末端標識化を利用して作製することができる。この核酸分子またはその断片を含むベクターを用いて、ＲＮＡポリメラーゼ及び標識したヌクレオチドを加えてｉｎ ｖｉｔｒｏでｍＲＮＡプローブを作製することができる。これらの方法はＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（ＡＰＢ）社が販売するキットを用いて行うことができる。
【００６１】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー（厳密性）は、プローブのＧＣ含量、塩濃度、及び温度によって決まる。特に、塩濃度を下げる、またはハイブリダイゼーションの温度を上げて、ストリンジェンシーを高めることができる。ある膜系のハイブリダイゼーション用の溶液にホルムアミドなどの有機溶媒を加えて、反応が低い温度で起こるようにすることができる。ハイブリダイゼーションは、低いストリンジェンシーの緩衝液（５×ＳＳＣ、１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））で、６０℃で行うことができるが、核酸配列間に不適正塩基対を含む複合体の形成を許容し得る。続く洗浄は、４５℃（中程度のストリンジェンシー）或いは６８℃（高いストリンジェンシー）の何れかの温度、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳなどの高いストリンジェンシーで行う。高いストリンジェンシーでは、ハイブリダイゼーション複合体は、完全に相補的な核酸分子部分のみが安定して保持される。ある膜系のハイブリダイゼーションにおいて、好ましくは３５％、最も好ましくは５０％のホルムアミドをハイブリダイゼーション溶液に加えて、ハイブリダイゼーションを行う温度を下げたり、または、ＳａｒｋｏｓｙｌやＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）などの界面活性剤及び変性したサケ精子ＤＮＡなどのブロッキング試薬を用いてバックグラウンドシグナルを低減することが可能である。ハイブリダイゼーションの条件や要素の選択については当分野で周知であり、Ａｕｓｕｂｅｌ（前出） 及びＳａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ ＮＹ．に記載されている。
【００６２】
当分野で周知の方法でマイクロアレイを準備して分析することができる。オリゴヌクレオチドをマイクロアレイのプローブや標的として用いることができる。マイクロアレイを用いて、同時に極めて多数の遺伝子の発現レベルをモニタリングし、遺伝子変異体、突然変異及びＳＮＰ（一塩基多型）を同定することができる。このようなデータを用いて、遺伝子機能の解明や、症状及び疾患、または障害における遺伝子原理の解明や、症状及び疾患、障害の診断または治療、治療薬の開発、並びにこれらの治療薬の活性のモニタリングが可能である（例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ他（１９９５） ＵＳＰＮ ５，４７４，７９６； Ｓｃｈｅｎａ他（１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３：１０６１４−１０６１９； Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒ他（１９９５） ＰＣＴ出願 ＷＯ９５／２５１１１６； Ｓｈａｌｏｎ他（１９９５） ＰＣＴ出願ＷＯ９５／３５５０５； Ｈｅｌｌｅｒ他（１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：２１５０−２１５５； ａｎｄ Ｈｅｌｌｅｒ他（１９９７） ＵＳＰＮ ５，６０５，６６２を参照）。
【００６３】
ハイブリダイゼーションプローブはまた、天然のゲノム配列のマッピングに有用である。このプローブは、（１）特定の染色体、（２）染色体の特定の領域、（３）ヒト人工染色体（ＨＡＣ）や酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、細菌Ｐ１作製物、または単一の染色体、（５）これらの試料の任意のものから作製されたＤＮＡライブラリなどの人工染色体作製物、にハイブリダイズすること可能である。
【００６４】
発現
ＧＴＰＡＰをコードする多数の核酸分子をベクターにクローニングして、このタンパク質若しくはその一部を宿主細胞で発現させることができる。この核酸配列を、ＤＮＡシャフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ ａｎｄ Ｃｒａｍｅｒｉ （１９９６） ＵＳＰＮ５，８３０，７２１）や部位特異的変異誘発などの方法によって、新規の制限部位を作り出したり、グリコシル化パターンを変えたり、優先コドンを変えて特定の宿主における発現を増大させたり、スプライスバリアントを作り出したり、半減期を延長する等の操作が可能である。この発現ベクターは、特定の宿主における各要素の効率に基づいて選択された様々なサンプルに由来する転写及び翻訳調節エレメント（プロモーター及びエンハンサー、特定の開始シグナル、ポリアデニル化３’配列）を含み得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏ組み換えＤＮＡ技術、合成技術及び／またはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子組み換え技術を組み合わせて、このベクターに核酸配列と調節エレメントをつなぐことができる。このような技術は、当分野で周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出、ｃｈ． ４， ８， １６ ａｎｄ １７）に記載されている。
【００６５】
様々な宿主系を発現ベクターで形質転換することができる。以下に限定するものではないが、これらの中には組み換えバクテリオファージやプラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌と、酵母発現ベクターで形質転換された酵母と、バキュロウイルス発現ベクターで形質転換された昆虫細胞系と、ウイルスエレメント及び／または細菌エレメントを含む発現ベクターで形質転換された植物細胞系や動物細胞系が含まれる（Ａｕｓｕｂｅｌ前出、ｕｎｉｔ １６）。例えば、アデノウイルス転写／翻訳複合体を哺乳動物細胞に用いることができる。配列をウイルスのゲノムのＥ１若しくはＥ３領域に結合させた後、この感染ウイルスを用いて形質転換させ、宿主細胞でタンパク質を発現させることができる。また、ラウス肉腫ウイルスエンハンサーやＳＶ４０、またはＥＢＶ系のベクターを用いてタンパク質を高発現させることができる。
【００６６】
核酸配列のルーチンのクローニング及びサブクローニング、増殖は、多機能ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて行うことができる。核酸配列をこれらのベクターの多数のクローニング部位に導入すると、ｌａｃＺ遺伝子が破壊され、形質転換された細菌を確認するための比色法によるスクリーニングが可能となる。更に、これらのベクターは、クローニングされた配列におけるｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写及びジデオキシ法によるシークエンシング、ヘルパーファージによる一本鎖の調整、入れ子状欠失の作製において有用である。
【００６７】
長期に渡って組み換えタンパク質を産生させるために、同一或いは別のベクター上の選択マーカー遺伝子或いは可視マーカー遺伝子と共にこのベクターを持続的に細胞株に形質転換することができる。形質転換後、細胞を強化培地で約１〜２日間増殖させてから選択培地に移す。選択マーカー、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性遺伝子は、関連する選択薬に対する抵抗性を与え、導入配列を確実に発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。アントシアニン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、βグルクロニダーゼ、ルシフェラーゼなどの可視マーカーの発現によって同定された、或いは選択培地に生存することによって同定された耐性クローンを、培養技術を用いて増殖することができる。また、可視マーカーを用いて、導入された遺伝子によって発現するタンパク質を定量することができる。宿主細胞が目的の哺乳動物核酸分子を含むか否かの決定は、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、或いはＰＣＲ増幅技術に基づいて行うことができる。
【００６８】
宿主細胞は、組み換えタンパク質を目的の形に修飾する能力に基づいて選択することができる。このような修飾には、アセチル化及びカルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化等が含まれる。「プレプロ」型を切断する翻訳後プロセシングを利用して、タンパク質のターゲッティング、折り畳み及び／または活性を特定することができる。翻訳後活性のための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有する異なった宿主細胞（Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）を選択して、組み換えタンパク質の正確な修飾及びプロセシングを確実にすることが可能である。
【００６９】
細胞培地からのタンパク質の回収
精製を容易にするために、ベクターに導入する異種部分は、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、６−Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ等を含む。ＧＳＴ及びＣＢＰ、６−Ｈｉｓはそれぞれ、グルタチオン及びカルモジュリン、金属キレート樹脂が結合した市販のアフィニティーマトリックスを用いて精製される。ＦＬＡＧ及びＭＹＣは、市販のモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を用いて精製される。目的のタンパク質配列と異種部分との間にタンパク分解切断部位を設けて、生成の後の分離が容易にすることができる。組み換えタンパク質の発現及び精製の方法はＡｕｓｕｂｅｌ（前出、ｕｎｉｔ １６）に記載され市販されている。
【００７０】
ペプチドの化学合成
タンパク質若しくはその一部は、組み換え方法以外の当分野で周知の化学的方法によって合成することもできる。固相技術を用いるペプチド合成は、バッチ式或いは連続的なフロープロセスによって行うことができる。連続的なフロープロセスでは、αアミノ保護及び側鎖保護アミノ酸残基をリンカーを介して不溶性の高分子支持物に連続的に追加する。メチルアミン誘導体化ポリエチレングリコールなどのリンカーを、ポリ（スチレン−ｃｏ−ジビニルベンゼン）に結合させて支持レジンを形成する。このアミノ酸残基は、酸不安定Ｂｏｃ（ｔ−ｂｕｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）法若しくは塩基不安定Ｆｍｏｃ（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）法によって保護されたＮ−α−である。保護されたアミノ酸のカルボキシル基をリンカーのアミンに結合して、この残基を固相支持レジンに結合させる。Ｂｏｃ若しくはＦｍｏｃを用いた場合、トリフルオロ酢酸若しくはピペリジンを用いて保護基を除去する。カップリング試薬若しくは予め活性化されたアミノ酸誘導体を用いて、追加する各アミノ酸を結合された残基に付加してから、レジンを洗浄する。完全長のペプチドは、連続的な保護の停止、即ち誘導体化アミノ酸を結合させて合成し、ジクロロメタン及び／またはＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドで洗浄する。このペプチドは、ペプチドカルボキシル末端とリンカーとの間で切断され、ペプチド酸またはペプチドアミドが作られる（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ １９９７／９８ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ ｐｐ． Ｓ１−Ｓ２０）。ＡＢＩ ４３１ Ａ ペプチドシンセサイザー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）などの装置を用いて、ペプチドを自動合成することができる。タンパク質またはその一部は調整用の高性能液体クロマトグラフィーによって実質的に精製し、その組成をアミノ酸解析またはシークエンシングによって確認することができる（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ （１９８４） Ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ）。
【００７１】
抗体の準備及びスクリーニング
ヤギ及びウサギ、ラット、マウス、ヒト等を含む様々な宿主は、ＧＴＰＡＰ若しくはその任意の一部を注入して免疫することができる。フロイントなどのアジュバント及びミネラルゲルと、リゾレシチン及びｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌ、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、ジニトロフェノールなどの表面活性物質とを用いて免疫反応を高めることができる。オリゴペプチドやペプチド、またはタンパク質の一部を用いて、少なくとも約５個のアミノ酸、より好ましくは１０個の天然のタンパク質の一部と同一のアミノ酸を含む抗体を誘発させる。キメラ分子に対する抗体を産生させるために、オリゴヌクレオチドをＫＬＨなどのタンパク質と融合させることができる。
【００７２】
モノクローナル抗体は、培地の連続細胞株によって抗体を産生させる任意の技術を用いて準備する。以下に限定するものではないが、このような技術には、ハイブリドーマ技術及びヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれる（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ他（１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７； Ｋｏｚｂｏｒ他（１９８５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ８１：３１−４２： Ｃｏｔｅ他（１９８３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８０：２０２６−２０３０； ａｎｄ Ｃｏｌｅ他（１９８４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ６２：１０９−１２０．を参照）。
【００７３】
別法では、当分野で周知の方法を用いる上記した一本鎖抗体を生産する技術で、エピトープ特異的一本鎖抗体を生産する。本哺乳動物タンパク質のエピトープに対して特異的に結合する部位を含む抗体断片を生産することが可能である。限定するものではないが、このような断片には、例えば、抗体分子のペプシン消化によって作製されたＦ（ａｂ’）２断片及びこのＦ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を減少させて作製したＦａｂ断片が含まれる。別法では、Ｆａｂ発現ライブラリを作製して、目的の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の高速かつ容易に同定できるようにする（例えば、Ｈｕｓｅ他（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１を参照）。
【００７４】
本哺乳動物タンパク質若しくはその一部を用いて、ファージミドまたはＢリンパ球免疫グロブリン・ライブラリをスクリーニングして、目的の特異性を有する抗体を同定する。確立された特異性を有するモノクローナル抗体或いはポリクローナル抗体のいずれか一方を用いる、競合的結合またはイムノアッセイの様々なプロトコルが当分野で周知である。このようなイムノアッセイは通常、このタンパク質とその特異的な抗体との複合体形成の測定を行う。２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合的結合によるアッセイを用いることもできる（Ｐｏｕｎｄ （１９９８） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ ＮＪ）。
【００７５】
アッセイのための分子の標識化
多様な標識化及び接合技術は当分野で周知であり、様々な核酸やアミノ酸、及び抗体のアッセイに用いることができる。標識した分子の合成は、３２Ｐ−ｄＣＴＰまたはＣｙ３−ｄＣＴＰ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰなどの標識したヌクレオチドや３５Ｓメチオニンなどのアミノ酸を組み込むためのＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＢｉｏｔｅｃｈキットまたはＰｒｏｍｅｇａ （Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて行うことができる。ヌクレオチド及びアミノ酸は、ＢＩＯＤＩＰＹまたはＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ ＯＲ）などの試薬を用いて分子中に存在するアミン及びチオール基または他の基に化学的に結合させることで、様々な物質（蛍光剤または化学発光剤、色素産生剤など）で直接標識することができる。
【００７６】
（診断）
本核酸分子、断片、オリゴヌクレオチド、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ分子、ＰＮＡを用いて、遺伝子発現の変化やｍＲＮＡの過剰な発現の不在／存在を検出及び定量、または治療期間中のｍＲＮＡレベルのモニタリングを行うことができる。発現の変化に関連する症状や疾患には、細胞増殖異常、免疫疾患、およびシグナル伝達異常が含まれ、細胞増殖異常の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には結腸癌が含まれ、免疫疾患の中には炎症及び日光性角化症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧血、喘息、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎、クローン病、糖尿病、肺気腫、痛風、グレーブス病、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、リウマチ様関節炎、強皮症、潰瘍性大腸炎が含まれ、シグナル伝達異常の中には原発脳腫瘍、腺腫、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、および頭部外傷による合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、先端巨大症、巨人症、および不適当な抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）を含む下垂体亢進に関連した疾患と、甲状腺腫、粘液水腫、および細菌感染性急性甲状腺炎を含む甲状腺機能低下症に関連した疾患と、Ｃｏｎｎ病（慢性高カルシウム症）を含む副甲状腺機能亢進症とが含まれる。診断アッセイにハイブリダイゼーションまたは増幅技術を用いて、遺伝子発現の変化を検出するべく、患者からの生体サンプルの遺伝子発現レベルを標準的なサンプルの値と比較する。質的または量的なこのような比較法は当分野で周知である。
【００７７】
例えば、本核酸分子またはプローブを標準的な方法で標識して、これをハイブリダイゼーション複合体の形成に好適な条件下で、患者からの生体サンプルに加える。インキュベーションの後、このサンプルを洗浄し、ハイブリダイゼーション複合体に関連する標識（シグナル）の量を定量して標準値と比較する。患者のサンプルにおける標識の量が標準値と著しく異なっている場合は、関連する症状や疾患、または異常症の存在が示唆される。
【００７８】
遺伝子発現に関連する症状や疾患、または異常症の診断のための基準を設けるために、正常或いは標準的な発現プロフィールを確立する。この発現プロフィールは、動物かヒトの正常な被験体から採取した生体サンプルを、ハイブリダイゼーションまたは増幅に好適な条件下で、プローブと結合させることによって確立することができる。標準的なハイブリダイゼーションは、正常な被験体から得た値と、実質的に精製された標的配列を所定量用いた実験値とを比較することによって定量することができる。このように求めた標準値を、特定の症状や疾患、または異常症を示す患者のサンプルから得た値と比較することができる。標準値と特定の症状に関連する値との偏差からその症状を診断する。
【００７９】
またこのようなアッセイを用いて、動物実験や臨床検査における特定の治療計画の効果を評価したり、患者個人の治療をモニタリングすることができる。病態が確認されると治療プロトコルを開始し、通常ベースで診断アッセイを繰り返して、被験者における発現のレベルが正常な患者に示される値に近づき始めたか否かを調べることが可能である。連続して行ったアッセイの結果から、数日から数ヶ月に渡る期間の治療効果を調べることができる。
【００８０】
免疫学的方法
特異的なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体の何れかを用いるタンパク質の検出及び定量は当分野で周知である。このような技術には、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化セルソーター法（ＦＡＣＳ）が含まれる。２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる２部位モノクローナル系イムノアッセイが好ましいが、競合的結合アッセイを用いることもできる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ 他 （１９９７） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ＮＹ； および Ｐｏｕｎｄ 前出）。
【００８１】
（治療）
ＧＴＰＡＰの所定の領域とＧＡＰタンパク質の所定の領域との間に、配列およびモチーフの文脈における化学的および構造的な類似性が存在する。更に、ＧＴＰＡＰの発現が、細胞増殖、特に結腸癌、および免疫反応に密接に関連する。従って、ＧＴＰＡＰは、細胞シグナル伝達異常、免疫疾患、および細胞増殖異常（特に結腸癌）にある役割を果たすと考えられる。発現または活性の上昇に関連する症状の治療においては、タンパク質の発現または活性を低下させることが望ましい。また、発現または活性の低下に関連する症状の治療においては、タンパク質の発現または活性を増大させることが望ましい。
【００８２】
一実施例において、本哺乳動物タンパク質の発現または活性の変化に関連する症状の治療または予防のために、本哺乳動物タンパク質、その一部、またはその誘導体を患者に投与することが可能である。限定するものではないがこのような疾患の例には、細胞増殖異常、免疫疾患、およびシグナル伝達異常が含まれ、細胞増殖異常の中には日光性角化症及びアテローム性動脈硬化、滑液包炎、硬変、肝炎、混合型結合組織病（ＭＣＴＤ）、乾癬、原発性血小板血症、並びに腺癌及び白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には結腸癌が含まれ、免疫疾患の中には炎症及び日光性角化症、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び副腎機能不全、成人呼吸窮迫症候群、アレルギー、貧血、喘息、自己免疫性甲状腺炎、気管支炎、滑液包炎、胆嚢炎、硬変、接触皮膚炎、クローン病、糖尿病、肺気腫、痛風、グレーブス病、肝炎、過好酸球増加症、過敏性大腸症候群、多発性硬化症、重症筋無力症、心筋または心膜炎症、骨関節炎、骨粗しょう症、膵炎、リウマチ様関節炎、強皮症、潰瘍性大腸炎が含まれ、シグナル伝達異常の中には原発脳腫瘍、腺腫、下垂体切除、動脈瘤、血管奇形、血栓症、および頭部外傷による合併症などの病変から起こる視床下部及び下垂体の障害と、先端巨大症、巨人症、および不適当な抗利尿ホルモン（ＡＤＨ）分泌症候群（ＳＩＡＤＨ）を含む下垂体亢進に関連した疾患と、甲状腺腫、粘液水腫、および細菌感染性急性甲状腺炎を含む甲状腺機能低下症に関連した疾患と、Ｃｏｎｎ病（慢性高カルシウム症）を含む副甲状腺機能亢進症とが含まれる。
【００８３】
別の実施例では、医薬用担体と共に実質的に精製された哺乳動物タンパク質を含む医薬組成物を患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこの内在性タンパク質の活性、または発現の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。
【００８４】
更なる実施例では、この哺乳動物タンパク質の活性を調節するリガンドを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこのタンパク質の寿命や発現、または活性の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。一実施態様では、この哺乳動物タンパク質に特異的に結合する抗体を、この哺乳動物タンパク質を発現する組織や細胞に薬剤を送達するためのターゲッティング或いは送達機構として用いることもできる。
【００８５】
更なる実施例では、この哺乳動物タンパク質またはその一部や誘導体を発現可能なベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこのタンパク質の寿命や発現、または活性の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。
【００８６】
更なる実施例では、この核酸分子やその断片の相補配列を発現するベクターを患者に投与して、限定するものではないが上記した疾患を含むこのタンパク質の寿命や発現、または活性の変化に関連する症状の治療または予防を行うことが可能である。
【００８７】
本核酸分子、またはそれに相補的な分子やその一部、そのタンパク質やその一部の内の任意のもの、これらの核酸分子やタンパク質を運ぶベクター、及びそれらのリガンドをその他の薬剤と共に投与することが可能である。併用療法に用いる薬剤の選択は、当業者が従来の薬学原理に従って行うことができる。薬剤を併用することによって、少量の各薬剤で特定の症状の予防または治療において相乗的な効果をあげることが可能である。
【００８８】
核酸を用いる遺伝子発現の調節
遺伝子の発現は、哺乳動物遺伝子の５’または３’調節領域、或いは他の調節領域に対して相補的或いはアンチセンス分子を設計することで調節することが可能である。転写開始部位に対して設計されたオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、ポリメラーゼ、転写因子、または調節分子の結合を阻止する三重螺旋塩基対合で遺伝子発現を阻止することができる（Ｇｅｅ 他 Ｉｎ： Ｈｕｂｅｒ ａｎｄ Ｃａｒｒ （１９９４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ， Ｆｕｔｕｒａ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ， Ｍｔ． Ｋｉｓｃｏ ＮＹ， ｐｐ． １６３−１７７）。また、リボソームとｍＲＮＡとの結合を阻止して翻訳が行われないように、相補的な分子を設計することも可能である。或るいは、核酸分子またはその断片のライブラリをスクリーニングして、翻訳されない調節配列に特異的に結合する核酸分子または断片を同定することも可能である。
【００８９】
また、酵素活性をもつＲＮＡ分子であるリボザイムを用いて、ＲＮＡの特異的な切断を触媒してもよい。リボザイム作用のメカニズムは、まずリボザイム分子と相補的な標的ＲＮＡとの配列特異的なハイブリダイゼーションが起こり、次にＧＵＡおよびＧＵＵ、ＧＵＣなどの部位においてヌクレオチド鎖が切断される。このような部位が一旦同定されたら、オリゴヌクレオチドを機能不全にしうる二次構造特性について、同じ配列を有するオリゴヌクレオチドを評価することができる。また、候補標的としての適合性は、ＲＮＡ分解酵素保護アッセイを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検査して評価することができる。
【００９０】
本発明の相補的な核酸およびリボザイムは、固相ホスホラミダイト化学合成法を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの組換え発現によって調製することが可能である。更に、ＲＮＡ分子は、その５’および／または３’末端に隣接配列を付加して、或いは分子のバックボーン内のホスホジエステル結合の代わりにホスホロチオネートまたは２’Ｏ−メチルを用いて、細胞内の安定性および半減期が増大するように改変することができる。この改変はＰＮＡの作製に固有であるが、他の核酸分子にも適用することができる。例えばイノシン、ｑｕｅｏｓｉｎｅ、ｗｙｂｕｔｏｓｉｎｅなどの伝統的でない塩基を含めて、またはアセチル基、メチル基、チオ基でウリジン、アデニン、シチジン、グアニン、およびチミンを修飾して、内在性エンドヌクレアーゼに対する分子の有効性を低くする。
【００９１】
スクリーニングアッセイ
本哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子を用いて、分子または化合物のライブラリをスクリーニングして特異的な結合親和性を調べることが可能である。このライブラリは、生物系の核酸分子の活性、複製、転写、または翻訳を調節するＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ、ペプチド、転写因子などのタンパク質、エンハンサー、リプレッサー、およびその他のリガンドを含み得る。このアッセイは、特異的な結合が許容される条件下で、哺乳動物核酸分子またはその断片を分子のライブラリと結合させるステップと、特異的な結合を検出して、その核酸分子と特異的に結合する少なくとも１つの分子を同定するステップとを含む。
【００９２】
同様に、本哺乳動物タンパク質またはその一部を用いて、任意の様々なスクリーニングアッセイで分子または化合物のライブラリをスクリーニングすることができる。このようなスクリーニングに用いるタンパク質の一部は、溶液中に遊離している、非生物的若しくは生物的な基板に固定されている、または細胞内に位置していてもよい。そのタンパク質と分子との特異的な結合を測定することが可能である。スクリーニングするライブラリの種類によって、アッセイでそのタンパク質に特異的に結合するＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ分子、アゴニスト、アンタゴニスト、抗体、免疫グロブリン、インヒビター、ペプチド、タンパク質、薬剤、または他の任意のリガンドを同定することが可能である。極めて少ないアッセイ容量および極少量の試験化合物を用いるハイスループットのスクリーニング方法が、米国特許第５，８７６，９４６号に記載されており、言及することを以って本明細書の一部とする。この方法は、酵素阻害または受容体結合を調べるために多数の分子をスクリーニングする。
【００９３】
リガンドの精製
本核酸分子またはその断片を用いてサンプルからリガンドを精製することが可能である。哺乳動物核酸分子またはその断片を用いてリガンドを精製する方法は、特異的な結合が許容される条件下でその核酸分子またはその断片とサンプルとを結合させるステップと、特異的結合を検出するステップと、結合した核酸分子を回収するステップと、好適な試薬を用いて精製されたリガンドから核酸分子を分離するステップとを含む。
【００９４】
同様に、本タンパク質またはその一部を用いてサンプルからリガンドを精製することが可能である。哺乳動物タンパク質またはその一部を用いてリガンドを精製する方法は、特異的な結合が許容される条件下でそのタンパク質またはその一部とサンプルとを結合させるステップと、そのタンパク質をリガンドとの間の特異的な結合を検出するステップと、結合したタンパク質を回収するステップと、好適なカオトロピック剤を用いて精製されたリガンドからタンパク質を分離するステップとを含む。
【００９５】
薬理学
医薬組成物とは、所望の目的を達成するのに効果的な量の活性成分を含んでいる物質である。効果的な薬用量の決定は、当分野の技術者の能力による部分が大きい。どんな化合物であっても、初めは細胞培養アッセイ或いは動物モデルの何れかによって治療効果のある薬用量を推定する。また、動物モデルを使って、好適な濃度範囲および投与経路を決定する。次に、このような情報を用いて、ヒトへの効果的な投与経路および薬用量を決定する。
【００９６】
治療効果のある薬用量とは、症状または病態を改善するタンパク質またはインヒビターの量である。このような薬剤の薬用効果および毒性は、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％に医薬的効果がある投与量）およびＬＤ５０（集団の５０％に致命的である投与量）などの細胞培養または実験動物における標準的な製薬方法によって決定することができる。或る投与量における毒性効果と治療効果との比率が治療指数となり、ＬＤ５０／ＥＤ５０と示すことができる。高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを用いて、ヒトへ適用する薬用量の範囲を決定する。
【００９７】
モデル系
動物モデルを用いて、ヒトに相当する暴露条件で動物モデルがヒトに類似の毒物反応を示すバイオアッセイを行うことができる。哺乳動物が最も一般的なモデルである。大抵の毒物研究は、低コストで入手が容易であり、かつ参照できる中毒学が豊富であることから、ラットやマウスなどの齧歯類を用いて行われる。齧歯類近交系は、目的の遺伝子の過剰或いは過少な発現の生理学的な原因を調査するのに有用なモデルであり、疾患の診断および治療方法の開発にも有用である。特定の遺伝子を大量に発現する（例えば、乳汁中に分泌される）同系哺乳動物は、その遺伝子によって発現されるタンパク質の便利な供給源となり得る。
【００９８】
中毒学
中毒学とは、生物系における物質の影響を研究する学問である。殆どの毒物研究はラットまたはマウスを用いて、物質がヒトの健康に与える影響を推定する。生理機能及び行動、恒常性プロセス、致死率における質的及び量的変化を観察して、毒性プロフィールを作成し、その物質に曝露された後のヒトの健康状態を評価する。
【００９９】
遺伝子毒物学は、物質が遺伝子の突然変異を引き起こす能力を同定し分析する。遺伝毒性物質は通常、核酸との相互作用を促進する共通の化学的或いは物理的特性を有し、突然変異した染色体が子孫に受け継がれるのが最大の害である。毒物研究によって、受胎前の両親のどちらか一方、または妊娠中の母、発生段階の生物に投与された場合の、子孫における構造的或いは機能的な異常の頻度を増加させる物質を同定することが可能である。マウス及びラットは生殖周期が短く、統計的必要性を満たす多数の子を出産する能力から、これらの試験にはマウス及びラットが用いられる場合が最も多い。
【０１００】
急性毒物の検査は、被験体への物質の一回の投与に基づき、その物質による症状または致死率を決定する。この検査では、（１）初めの投与量の範囲を決定する実験と、（２）有効な投与量の範囲を狭める実験と、（３）用量応答曲線を確立する実験の３つの実験が行われる。
【０１０１】
長期に渡る毒性検査では繰り返し物質を投与する。このような検査には、ラットやイヌが一般的に用いられ、分類学上異なった種からデータを収集する。物質を高い投与濃度で３〜４ヶ月間、毎日投与することで、発癌を除く、成体動物における殆どの毒性の種類が明らかになるという研究結果が多数報告されている。
【０１０２】
一年或いはそれ以上の長期に渡る慢性毒性検査は、物質に毒性がないこと、或いは物質の発癌の可能性の何れかを実証するために行われる。ラットで検査が行われる場合、少なくとも３つの検査グループと１つの対照グループが用いられ、最初から最後まである間隔で検査及びモニタリングが行われる。
【０１０３】
遺伝子組換え動物モデル
目的の遺伝子を過剰或いは過小に発現する遺伝子組換え齧歯類を同系交配し、それを用いてヒト疾患モデルを作製したり、治療薬検査や毒物検査を行う（例えば、米国特許第４，７３６，８６６号、同第５，１７５，３８３号、および同第５，７６７，３３７号を参照）。場合によっては、導入遺伝子が、胚発生中若しくは出生後の特定の時期に特定の種類の組織で活性化され得る。導入遺伝子の発現は、実験的薬剤治療を施す前、その最中、またはその後の、遺伝子組換え動物における表現型や組織特異的なｍＲＮＡの発現の分析からモニタリングすることができる。
【０１０４】
胚性幹細胞
齧歯類胚から単離された胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、胚を形成する可能性を維持している。ＥＳ細胞がキャリアとなる胚の中に導入されると、正常な発生が再開され、生まれる動物の全ての組織の一部を担うことになる。ＥＳ細胞は、実験用のノックアウトおよびノックイン齧歯類系を作製するのに好適な細胞である。マウス１２９／ＳｖＪ細胞株などのマウスＥＳ細胞は、マウスの初期胚から採取されてから当分野で周知の培養条件下で増殖されたものである。ノックアウト系に用いるベクターには、マーカー遺伝子配列を含むように破壊された疾患候補遺伝子が含まれる。このマーカー遺伝子配列は、ｉｎ ｖｉｖｏでその転写および／または翻訳を阻害する。このベクターを、当分野で周知の電気穿孔法およびリポソーム法、マイクロインジェクション等の形質転換方法によってＥＳ細胞に導入する。齧歯類の内在性遺伝子が、細胞分裂の際の相同組換えや組み込みによって、破壊された疾患遺伝子に置換される。形質転換されたＥＳ細胞を同定し、Ｃ５７ＢＬ／６マウス系などからのマウス細胞胚盤胞に微量注入するのが好ましい。この胚盤胞を複数の偽妊娠メスに外科的に導入すると、生まれるキメラ子孫がそれぞれ、その遺伝子型を有し、それらを交配してヘテロ接合系またはホモ接合系を作り出す。
【０１０５】
また、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの神経細胞および造血系、心筋細胞などの様々な細胞型や組織の分化の研究に、ＥＳ細胞が用いられている（Ｂａｉｎ 他 （１９９５） Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １６８：３４２−３５７； Ｗｉｌｅｓ ａｎｄ Ｋｅｌｌｅｒ （１９９１） Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １１１：２５９−２６７； ａｎｄ Ｋｌｕｇ 他 （１９９６） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９８：２１６−２２４）。近年の研究により、ヒト胚盤胞由来ＥＳ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで操作して、内胚葉および中胚葉、外胚葉性の細胞型を含む８つの別の細胞系譜に分化可能であることが実証された（Ｔｈｏｍｓｏｎら （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５−１１４７）。
【０１０６】
ノックアウト分析
遺伝子ノックアウト分析では、ヒト疾患遺伝子候補のある領域が、ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子などの非哺乳動物遺伝子を含むように酵素によって改変される（ｎｅｏ ； Ｃａｐｅｃｃｈｉ （１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１２８８−１２９２）。挿入されたコード配列は、標的遺伝子の転写および翻訳を阻害して疾患候補タンパク質の生化学的な合成を阻止する。この改変した遺伝子を培養胚性幹細胞（上記）に形質転換し、この形質転換細胞を齧歯類胞胚に注入し、この胞胚を偽妊娠メスに移植する。この遺伝子組換え子孫をクロス交配して、ホモ接合近交系を作り出す。
【０１０７】
ノックイン分析
胚発達の初期段階に現われる分化全能性ＥＳ細胞を用いてノックインヒト化動物（ブタ）または遺伝子組換えヒト疾患動物モデル（マウスまたはラット）を作り出すことができる。ノックイン技術を用いて、ヒト遺伝子のある領域を動物ＥＳ細胞に注入し、そのヒト配列が組換えによって動物細胞ゲノムの中に組み込まれるようにする。ヒト遺伝子が組み込まれた全能性ＥＳ細胞を上記したように操作する。ヒトの症状に類似の情報を収集するべく、この近交系動物の研究および処置を行う。これらの方法を用いて、幾つかのヒト疾患モデルを作り出す（例えば、Ｌｅｅ 他 （１９９８） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９５：１１３７１−１１３７６；Ｂａｕｄｏｉｎ 他 （１９９８） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １２：１２０２−１２１６； ａｎｄ Ｚｈｕａｎｇ 他 （１９９８） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １８：３３４０−３３４９）。
【０１０８】
非ヒト霊長類モデル
動物実験の分野は、生理学および遺伝学、化学、薬理学、統計学等の基本科学から得たデータおよび方法論を利用する。このようなデータは、非ヒト霊長類がヒトの健康に関連し得るため、非ヒト霊長類における治療薬の効果の評価に重要である。ヒトの代わりにサルをワクチンおよび薬剤の評価に用いる。サルの反応は、類似の条件下でのヒトへの暴露に相当する。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）、および一般的なマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ）は、このような実験に用いられる最も一般的な非ヒト霊長類（ＮＨＰ）である。ＮＨＰの群体作りおよび維持には多大な費用が掛かるため、初期の研究および毒物学的検査は、通常は齧歯類モデルで行われる。薬物嗜癖などの行動を調べる研究では、ＮＨＰは最良の実験動物である。更に、個々のＮＨＰおよびヒトは、多くの薬剤および毒物に対して異なった感受性を示すため、これらの物質を「高代謝型」および「低代謝型」に分類することができる。
【０１０９】
更なる実施例では、限定するものではないが、トリプレット遺伝子コードおよび特異的な塩基対相互作用などの特性を含む、現在知られている核酸配列の特性に新しい技術が依存する場合は、本哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子を、開発中のあらゆる分子生物学技術に用いることが可能である。
【０１１０】
【実施例】
本発明は、記載した特定の装置及び物質、方法に限定されるものではないことを理解されたい。特定の実施例について説明するが、同等の実施例を用いて本発明を具現することも可能である。本発明の範囲は、前記請求の範囲によってのみ限定されるものであって、記載した実施例によって限定されるものではない。また、以下に記載の実施例は、本発明を例示するためのものであって本発明を限定するものではない。例示目的で、ヒト子宮ｃＤＮＡライブラリＵＴＲＳＮＯＲ０１の作製方法を記載する。
【０１１１】
１　代表的なｃＤＮＡ配列の調整
ＵＴＲＳＮＯＲ０１ ｃＤＮＡライブラリは、２９歳の白人女性（標本＃０９０９Ａ）の膣式子宮摘出および膀胱ヘルニア修復術の際に採取した顕微鏡的に正常な子宮内膜から作製した。病理学的には、この子宮は１つの子宮内筋腫を示していた。子宮内膜は分泌期であって、子宮頚は、局所的な扁平化生を伴う軽度の慢性子宮頚炎を示していた。患者の病歴には、甲状腺機能低下症、骨盤底弛緩、自動車事故による不完全Ｔ−１２外傷性対麻痺、および自己導尿があった。家族歴には、良性高血圧症、ＩＩ型糖尿病、および高脂血症があった。
【０１１２】
凍結組織を、ＰＯＬＹＴＲＯＮホモジナイザー（ＰＴ−３０００；Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ， ＮＹ）を用いて、ＴＲＩＺＯＬ試薬（ＴＲＩＺＯＬ １０ｍｌ当たり１ｇの組織；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、即ち単相溶液フェノールおよびグアニジンイソチオシアネートの溶液においてホモジナイズし溶解した。氷上で短時間インキュベートした後、クロロホルム（１：５ ｖ／ｖ）を加え、溶解物を遠心分離した。上側のクロロホルム層を取り除いて新しい試験管に移し、イソプロパノールでＲＮＡを沈殿させ、ＤＥＰＣ処理した水に再懸濁し、３７℃で２５分間ＤＮアーゼＩで処理した。ｍＲＮＡを、酸性フェノールクロロホルム（ｐＨ４．７）で一回再抽出して、０．３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５倍量のエタノールで沈殿させた。次に、ｍＲＮＡをＯＬＩＧＯＴＥＸキット（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いて単離し、これをｃＤＮＡライブラリの作製に用いた。
【０１１３】
このｍＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成およびプラスミドクローニングのためにＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ プラスミドシステム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の推奨プロトコルに従って処理した。このｃＤＮＡを、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＣＬ４Ｂカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）上で分画化し、４００ｂｐを越える大きさのｃＤＮＡを、ｐＩＮＣＹ １プラスミド（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）に結合させた。次に組換えプラスミドを、ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。
【０１１４】
２　ｃＤＮＡの単離およびシークエンシング
プラスミドＤＮＡを細胞から遊離させ、ＲＥＡＬ Ｐｒｅｐ ９６ プラスミドキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。このキットにより、マルチチャネル試薬ディスペンサーを用いて９６穴プレートの中の９６のサンプルを同時に精製することが可能となる。以下の変更点を除いて推奨プロトコルに従った。その変更点は、（１）細菌を、２５ ｍｇ／Ｌのカルベニシリンと０．４％のグリセロールを含む１ ｍｌの滅菌ＴＥＲＲＩＦＩＣ ＢＲＯＴＨ （Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養し、（２）接種した後、１９時間インキュベートし、インキュベーションの最後に０．３ ｍｌの溶解緩衝液で溶解し、（３）イソプロパノール沈殿の後、プラスミドＤＮＡペレットを０．１ ｍｌの蒸留水に懸濁した。プロトコルのステップを終了した後、サンプルを９６穴プレートに移し４℃で保管した。
【０１１５】
このｃＤＮＡは、ＭＩＣＲＯＬＡＢ ２２００ （Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｒｅｎｏ ＮＶ） と共にＰｅｌｔｉｅｒ ＤＮＡ ＥＮＧＩＮＥサーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ， ＭＡ）を用いて調製した。ｃＤＮＡは、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７７ ＤＮＡシークエンシングシステム（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＳａｎｇｅｒおよびＣｏｕｌｓｏｎ （１９７５ ； Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ９４ ： ４４１ｆ）の方法によってシークエンシングし、リーディングフレームを決定した。
【０１１６】
３　同定及び伸長、構築、解析
コンセンサス配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）は、ヒトｃＤＮＡ配列のＺＯＯＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）のインサイトクローン番号：９０８４６５Ｒ２ （ＣＯＬＮＮＯＴ０９）、９５７１３０Ｒ６ （ＫＩＤＮＮＯＴ０５）、１３０１５２０Ｆ６ （ＢＲＳＴＮＯＴ０７）、１５８０６２８Ｈ１ （ＤＵＯＤＮＯＴ０１）、２６３１２４７Ｆ６ （ＣＯＬＮＴＵＴ１５）、３０６８５３８Ｈ１ （ＵＴＲＳＮＯＲ０１）、および３５３２２８６Ｔ６ （ＫＩＤＮＮＯＴ２５）から組み立て、これを用いて更なるＧＴＰＡＰ関連配列を同定するためにＬＩＦＥＳＥＱデータベースおよびＺＯＯＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を検索した。ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９の翻訳により、翻訳領域であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１を解明した。
【０１１７】
当分野で周知のアルゴリズムを用いるソフトウェアプログラムを組み合わせて用いて、ｃＤＮＡシークエンシングから得たポリヌクレオチド配列を構築および分析した。表１の列１には、用いたツール、プログラム、およびアルゴリズムが示されている。列２には、それらの簡単な説明が示されている。列３には、適当な問合せ先が示されている。これらに言及することを以って本明細書の一部とする。列４には、該当する場合にのみ、２つの配列間の一致の程度を評価するために用いたスコア、確率値、およびその他のパラメーターが示されている（スコアが高ければ高いほど２つの配列間の相同性が高い）。配列は、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）およびＬＡＳＥＲＧＥＮＥ ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて分析した。
【０１１８】
ポリヌクレオチド配列は、ＢＡＬＳＴ、動的アルゴリズム、およびジヌクレオチド分布による解析法に基づいたアルゴリズムおよびプログラムを用いて、ベクター、リンカー、ポリＡ配列を除去し、曖昧な塩基対をマスクして確認した。次に、これらの配列を、ＧｅｎＢａｎｋの霊長類、齧歯類、哺乳類、脊椎動物、および真核生物のデータベースや、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ、およびＰＦＡＭなどの適当なデータベースに問合せ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＢＬＩＭＰＳに基づいたプログラムを用いてアノテーションを取得した。これらの配列を、Ｐｈｒｅｄ、ＰＨＲＡＰ、およびＣｏｎｓｅｄに基づいたプログラムを用いて完全長のポリヌクレオチドに組み立て、ＧｅｎｅＭａｒｋ、ＢＬＡＳＴ、およびＦＡＳＴＡに基づいたプログラムを用いてオープンリーディングフレームを調べるためにスクリーニングした。完全長のポリヌクレオチドを翻訳して対応する完全長のアミノ酸配列を得、これらの完全長のアミノ酸配列を、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（上記）、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＢＬＯＣＫＳ、ＰＲＩＮＴＳ、ＤＯＭＯ、ＰＲＯＤＯＭ、Ｐｒｏｓｉｔｅ、およびＰＦＡＭなどの隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）ベースのタンパク質ファミリーデータベースなどのデータベースに問合せて分析した。ＨＭＭは、遺伝子ファミリーの共通の一次構造を分析する確率的アプローチである（Ｅｄｄｙ， Ｓ． Ｒ． （１９９６） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒ． Ｂｉｏｌ． ６ ： ３６１−３６５を参照）。
【０１１９】
完全長のポリヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を組立ておよび分析するための上記したプログラムを用いて、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９からポリヌクレオチド配列断片を同定した。ハイブリダイゼーションおよび増幅技術に有用な約２０〜４０００のヌクレオチドの断片を、本明細書の（発明）の部分に記載した。
【０１２０】
４　核酸変異体の同定
哺乳動物ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質をコードする核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８及び２９）の変異体である核酸分子をＢＬＡＳＴ若しくはＢＬＡＳＴ２ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ， 前出； デフォルトパラメータを備えたＮＣＩ−ＢＬＡＳＴＮ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．４）を用いて同定し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２８及び２９とアラインメントするクローンをＬＩＦＥＳＥＱデータベースまたはＺＯＯＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）において見出した。哺乳動物核酸分子変異体は、ＢＬＡＳＴスコアによって選択した。ＢＬＡＳＴスコアは、核酸高スコア対（ＨＳＰ）で一致する各塩基には＋５のスコアを与え、不一致の塩基には−４のスコアを与えて計算した。ＢＬＡＳＴアラインメントは視覚的に検査でき、ＢＬＡＳＴスコアが１００を超えるクローンは、Ｐｈｒａｐ （Ｇｒｅｅｎ， 前出）を用いて互いにアラインメントした。
【０１２１】
５　ノーザン分析
ノーザン分析は、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いる実験用技術であり、標識したプローブを特定の細胞型或いは組織から抽出したＲＮＡを固定した膜にハイブリダイズさせることが含まれる。
【０１２２】
ＢＬＡＳＴに用いられる類似性コンピュータ技術を用いて、ＬＩＦＥＳＥＱデータベースまたはＺＯＯＳＥＱデータベース（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）などのヌクレオチドデータベースにおいて、同一或いは関連する分子を検索する。この配列に基づいた解析は、多くの膜系ハイブリダイゼーションより非常に速度が速い。さらにコンピュータ検索の感度を調節して、任意の特定の一致を、同一または類似と分類することができる。ＢＬＡＳＴ検索の基準は、（％配列同一性×％最大ＢＬＡＳＴスコア）／１００と定義される積スコアである。積スコアは、２つの配列間の類似度及び配列一致の長さの両方を考慮する。例えば、積スコアが４０の場合、その一致は１〜２％誤差の範囲内で正確であり、７０以上であればその一致は正確であろう。類似する分子或いは関連する分子は通常、８〜４０の範囲の積スコアを示す分子を選択することにより同定される。
【０１２３】
ノーザン分析の結果は、この哺乳動物タンパク質をコードする転写物が発生したライブラリの分布割合（パーセント）として報告される。分析には、器官／組織及び疾患によるｃＤＮＡライブラリの分類も含まれる。器官／組織のカテゴリーには、心血管、皮膚、発生、内分泌、胃腸、造血／免疫、筋骨格、神経、生殖、泌尿器が含まれる。疾患のカテゴリーには、癌、炎症／外傷、細胞増殖、神経が含まれる。カテゴリー別に、目的の配列を発現するライブラリ数をカウントし、この数をこの哺乳動物タンパク質をコードする核酸分子の核酸分子変異体を含むと同定された全てのライブラリ数で除した。
【０１２４】
６　核酸分子の伸長
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９の組み立てに用いた核酸分子の少なくとも１つは、オリゴヌクレオチドプライマーを用いてインサイト社ｃＤＮＡクローンを伸長して作製した。一方のプライマーは既知の断片の５’の伸長を開始するために合成し、他方のプライマーは既知の断片の３’の伸長を開始するために合成した。開始プライマーは、ＯＬＩＧＯ ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、約２２〜約３０個のヌクレオチドの長さ、約５０％以上のＧＣ含量で、約５５〜６８℃の温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体が生じる断片は排除した。選択されたヒトｃＤＮＡライブラリを用いてこの分子を伸長した。２段階以上の伸長が必要な場合は、追加の或いは組みになった入れ子のプライマー（ｎｅｓｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒ）を設計する。
【０１２５】
ＤＮＡ ＥＮＧＩＮＥ サーマルサイクラー（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて９６ウェルプレートでＰＣＲ法を実施し、高い忠実度の増幅を達成した。反応混合液には、鋳型ＤＮＡ及び２００ ｎｍｏｌの各プライマー、反応緩衝液（Ｍｇ２＋、（ＮＨ４）２ＳＯ４、β−メルカプトエタノールを含む）、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＥＬＯＮＧＡＳＥ酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含まれている。プラスミドから選択したプライマーの組みに対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
別法では、プライマーの組、Ｔ７とＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に対して以下のパラメーターで増幅を行った。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　５７℃で１分間
ステップ４　　６８℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２０回繰り返す
ステップ６　　６８℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
【０１２６】
各ウェルのＤＮＡ濃度は、１× ＴＥ及び０．５μｌの希釈していないＰＣＲ産物に溶解した１００μｌのＰＩＣＯＧＲＥＥＮ定量試薬（０．２５％ （ｖ／ｖ）； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を不透明な蛍光光度計プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｃｏｒｎｉｎｇ ＮＹ）の各ウェルに分注して、ＤＮＡがその試薬と結合できるようにして測定する。このプレートをＦｌｕｏｒｏｓｋａｎ ＩＩ （Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ Ｏｙ， Ｈｅｌｓｉｎｋｉ， Ｆｉｎｌａｎｄ）でスキャンして、サンプルの蛍光を測定してＤＮＡの濃度を定量化する。反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを１％のアガロースミニゲル上で電気泳動させて解析し、何れの反応がより長い配列の伸長に成功したかを決定する。
【０１２７】
伸長した配列を脱塩及び濃縮してから３８４穴プレートに移し、ＣｖｉＪＩコレラウィルスエンドヌクレアーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）で消化し、ｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結する前に音波処理または切断した。ショットガンシークエンシングのために、消化した断片を０．６〜０．８％の濃度のアガロースゲル上に分離させ、ＵＶ光で視認できるように断片を切断し、寒天をＡＧＡＲＡＣＥ （Ｐｒｏｍｅｇａ）で消化／除去した。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ）を用いて伸長した断片をｐＵＣ １８ベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に再連結し、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で制限部位の延び出しを処理してから、コンピテント大腸菌細胞に形質転換した。形質転換細胞が抗生物質を含む培地で選択され、それぞれのコロニーを切りとって、ＬＢ／２Ｘカルベニシリン培養液の入った３８４ウェルプレートの中で、３７℃で一晩培養した。
【０１２８】
この細胞を溶解して、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて以下の手順でＤＮＡを増幅した。
ステップ１　　９４℃で３分間
ステップ２　　９４℃で１５秒
ステップ３　　６０℃で１分間
ステップ４　　７２℃で２分間
ステップ５　　ステップ２、３、及び４を２９回繰り返す
ステップ６　　７２℃で５分間
ステップ７　　４℃で保管。
上記したようにＰＩＣＯＧＲＥＥＮ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でＤＮＡを定量した。ＤＮＡ回収率の悪いサンプルは、上記した条件で再び増幅した。サンプルを２０％のジメチルサルホサイド（ｄｉｍｅｔｈｙｓｕｌｐｈｏｘｉｄｅ）（１：２， ｖ／ｖ）で希釈し、ＤＹＥＮＡＭＩＣエネルギー移動シークエンシングプライマー及びＤＹＥＮＡＭＩＣ ＤＩＲＥＣＴキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）またはＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ＢＩＧＤＹＥ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅａｄｙ ｒｅａｃｔｉｏｎキット（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてシークエンシングした。
【０１２９】
同様に上述の手順で、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２９のヌクレオチド配列を利用し、外側に伸長するように設計したオリゴヌクレオチドとゲノムＤＮＡライブラリを用いて調節配列を得た。
【０１３０】
７　ハイブリダイゼーション技術および分析
ポリヌクレオチドの基板への固定
ポリヌクレオチドを以下に示す方法で基板に固定する。ポリヌクレオチドの混合液をジェル電気泳動により分画後、毛細管輸送によってナイロン膜に移す。別法では、ポリヌクレオチドを個別にベクターに結合して、それを細菌宿主細胞に挿入してライブラリを形成する。次にポリヌクレオチドを以下の方法で基板に配列する。第１の方法では、個別のクローンを含む細菌細胞を機械的に摘み上げてナイロン膜に整列させる。このナイロン膜を、選択薬（用いるベクターによって異なるが、カルベンシリン、カナマイシン、アンピシリン、またはクロラムフェニコールなど）を含むＬＢ寒天培地に載置し、３７℃で１６時間インキュベートする。この膜を寒天培地から取り除き、次にこの膜をコロニー側を上にして１０％ＳＤＳ、変性溶液（１． ５ Ｍ ＮａＣｌ、０． ５ Ｍ ＮａＯＨ）、中和液（１． ５ Ｍ ＮａＣｌ、１ Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ８． ０）に入れ、２×ＳＳＣにおいて１０分間づつ２回インキュベートする。次にこの膜を、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でＵＶ照射する。
【０１３１】
第２の方法では、インサートに隣接したベクター配列に相補的なプライマーを用いて、ＰＣＲを３０サイクル行い細菌ベクターからポリヌクレオチドを増幅する。ＰＣＲ増幅により、拡散の濃度を開始時の１〜２ ｎｇから最終的に５μｇまで増大させる。約４００ ｂｐ〜約５０００ ｂｐの増幅した拡散をＳＥＰＨＡＣＲＹＬ−４００ビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製する。精製した拡散を、手動で或いはドット／スロットブロッティングマニフォールド及び吸入装置でナイロン膜に配列し、上記した変性、中和、及びＵＶ照射によって固定する。精製した拡散を、ＵＳＰＮ ５，８０７，５２２に開示された方法でポリマーコートスライドガラスに機械的に配列して固定する。ポリマーコートスライドガラスは、顕微鏡スライドガラス（Ｃｏｒｎｉｎｇ， Ａｃｔｏｎ ＭＡ）を０．１％ＳＤＳ及びアセトンで超音波洗浄した後、４％フッ化水素酸（ＶＷＲ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ ＰＡ）においてエッチングし、次に９５％エタノールにおいて０．０５％アミノプロピルシランでコーティングし、オーブンで１１０℃で硬化させて準備する。処理中及び処理後にこのスライドガラスを蒸留水で十分に洗浄する。次に、核酸分子をスライド上に配列し、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ ＵＶクロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてこの核酸分子のアレイをＵＶ照射してスライド上に固定する。次にこのアレイを、室温で０．２％ＳＤＳで洗浄し、蒸留水で３回すすぐ。非特異的な接合部位を、アレイをＰＢＳ（Ｔｒｏｐｉｘ， Ｂｅｄｆｏｒｄ ＭＡ）に於ける０．２％カゼインにおいて６０℃で３０分間インキュベートしてブロックし、次にこのアレイを０．２％ＳＤＳで洗浄し、前記したように蒸留水で洗い流す。
【０１３２】
メンブレンを用いるハイブリダイゼーションのためのプローブの準備
本配列表のポリヌクレオチドに由来するハイブリダイゼーションプローブは、メンブレンハイブリダイゼーションにおいてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡをスクリーニングするために用いられる。プローブを準備するために、ポリヌクレオチドを４５μｌ ＴＥバッファにおいて４０〜５０ ｎｇの濃度に希釈し、１００℃で５分間加熱して変性し、短時間遠心分離する。次に、変性したポリヌクレオチドをＲＥＤＩＰＲＩＭＥチューブ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に加え、青色が十分に拡散するまで軽く混合し、短時間遠心分離する。５μｌの［３２Ｐ］ ｄＣＴＰをチューブに加え、その内容物を３７℃で１０分間インキュベートする。この標識化反応を５μｌの０． ２Ｍ ＥＤＴＡを加えてストップし、ＰＲＯＢＥＱＵＡＮＴ Ｇ−５０マイクロカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてプローブを組み込まれなかったヌクレオチドから精製する。精製したプローブを１００℃で５分間加熱してから氷上で２分間冷却し、以下に記載するようにメンブレンハイブリダイゼーションに用いる。
【０１３３】
ポリマーコートスライドを用いるハイブリダイゼーションのためのプローブの準備
サンプルから単離したｍＲＮＡに由来するハイブリダイゼーションプローブを用いて、アレイハイブリダイゼーションにおいて本配列表のポリヌクレオチドをスクリーニングする。プローブは、ＧＥＭｂｒｉｇｈｔキット（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いて、ｍＲＮＡを９μｌ ＴＥバッファにおいて２００ ｎｇの濃度に希釈し、５μｌの５×バッファ、１μｌの０．１ Ｍ ＤＴＴ、３μｌのＣｙ３またはＣｙ５標識混合物、１μｌのＲＮアーゼインヒビター、１μｌの逆転写酵素、及び５μｌの１×酵母コントロールｍＲＮＡを加えて準備する。酵母コントロールｍＲＮＡは、非コード酵母ゲノムＤＮＡ（Ｗ． Ｌｅｉ， ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ）からｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって合成する。量的コントロールとして、０．００２ ｎｇ、０．０２ ｎｇ、０．２ ｎｇ、及び２ ｎｇのコントロールｍＲＮＡからなるセットを、サンプルｍＲＮＡに対してそれぞれ１：１００，０００、１：１０，０００、１：１０００、及び１：１００ （ｗ／ｗ）の比率で逆転写反応液に希釈する。ｍＲＮＡの異なった発現パターンを検査するために、第２のセットのコントロールｍＲＮＡを、１：３、３：１、１：１０、１０：１、１：２５、及び２５：１ （ｗ／ｗ）の比率で逆転写反応液に希釈する。反応液を混合し、３７℃で２時間インキュベートする。次に反応液を８５℃で２０分間インキュベートし、２つの連続したＣＨＲＯＭＡ ＳＰＩＮ＋ＴＥ ３０カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてプローブを精製する。精製したプローブを、ＤＥＰＣ処理水で９０μｌに希釈して、２μｌの１ｍｇ／ｍｌグリコーゲン、６０μｌの５Ｍ酢酸ナトリウム、３００μｌの１００％エタノールを加えてエタノール沈殿させる。このプローブを２０，８００×ｇにおいて２０分間遠心分離し、ペレットを１２μｌの再懸濁バッファに再懸濁させ、６５℃で５分間加熱し、完全に混合する。上記したようにプローブを加熱及び混合してから氷上で保管する。プローブを以下に記載するように高密度のアレイハイブリダイゼーションに用いる。
【０１３４】
メンブレンを用いるハイブリダイゼーション
膜を、１％Ｓａｒｋｏｓｙｌ及び１×高リン酸バッファ（０． ５Ｍ ＮａＣｌ、０．１ Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７）を含むハイブリダイゼーション溶液において５５℃で２時間プレハイブリダイゼーションする。１５ｍｌの新しいハイブリダイゼーション溶液に希釈したプローブを膜に加える。５５℃で１６時間、膜にプローブをハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、膜を１ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８． ０）、１％Ｓａｒｋｏｓｙｌにおいて２５℃で１５分間洗浄し、１ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ８． ０）において２５℃で１５分間づつ４回洗浄する。ハイブリダイゼーション複合体を検出するために、ＸＯＭＡＴ−ＡＲフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ， Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ ＮＹ）を膜に一晩−７０℃で露出し、現像して目で確認する。
【０１３５】
ポリマーコートスライドを用いるハイブリダイゼーション
プローブを６５℃で５分間加熱し、５４１５Ｃマイクロ遠心分離器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， Ｗｅｓｔｂｕｒｙ ＮＹ）を用いて毎分９４００回転で５分間遠心分離し、アレイの表面に１８μｌのアリコットを載せカバースリップで覆う。このアレイを、顕微鏡スライドより僅かに大きいキャビティを有する防水容器に移す。この容器の角から１４０μｌの５×ＳＳＣを加えてその内部を１００％の湿度に保つ。アレイを含む容器を６０℃で約６時間半インキュベートする。このアレイを、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて４５℃で１０分間洗浄し、０．１×ＳＳＣにおいて４５℃で１０分間づつ３回洗浄した後、乾燥させる。
【０１３６】
ハイブリダイゼーション反応を、絶対ハイブリダイゼーション（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）方式またはディファレンシャルハイブリダイゼーション方式で行う。絶対ハイブリダイゼーション方式の場合、１つのサンプルからのプローブをアレイの要素にハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体が形成された後にシグナルを検出する。シグナルの強度がサンプルにおけるプローブｍＲＮＡのレベルに相関する。ディファレンシャルハイブリダイゼーション方式の場合、２つの生体サンプルにおける遺伝子のセットの異なった発現を分析する。２つのサンプルからのプローブを準備し、異なった標識成分で標識する。２つの標識したプローブの混合物をアレイ要素にハイブリダイズさせ、２つの異なった標識からの蛍光シグナルをそれぞれ別に検出できる条件下でシグナルを検査する。アレイ上の要素に、２つの生体サンプルに由来するプローブのそれぞれが実質的に同数ハイブリダイズする場合、明瞭な複合蛍光が得られる（Ｓｈａｌｏｎ Ｗ０９５／３５５０５）。
【０１３７】
ハイブリダイゼーション複合体をＩｎｎｏｖａ ７０混合ガス１０Ｗレーザーを備えた顕微鏡（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ， Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ ＣＡ）で検出する。この顕微鏡は、Ｃｙ３を励起するために４８８ｎｍのスペクトル線を発生し、Ｃｙ５を励起するために６３２ｎｍのスペクトル線を発生することができる。励起レーザー光を２０倍の顕微鏡対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ， Ｍｅｌｖｉｌｌｅ ＮＹ）を用いてアレイに集束させる。アレイを含むスライドを顕微鏡上のコンピュータ制御されたＸＹステージ上に載せ、２０μｍの解像度で対物レンズを通してラスタースキャンする。ディファレンシャルハイブリダイゼーション方式の場合、２つの蛍光物質を順番にレーザーで励起する。波長に応じて放出された光を２つの蛍光物質に対応する２つの光電子増倍管検出器（ＰＭＴ Ｒ１４７７， Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ ＮＪ）に分割する。アレイと光電子増倍管との間に配置された好適なフィルターを用いてシグナルをフィルタリングする。用いられる蛍光物質の最大発光波長は、Ｃｙ３が５６５ｎｍであり、Ｃｙ５が６５０ｎｍである。スキャンの感度は、プローブ混合物に加えられた酵母コントロールｍＲＮＡによって生成されるシグナル強度を用いて較正する。アレイのある位置に相補的なＤＮＡ配列が含まれていると、その位置におけるシグナルの強度が、ハイブリダイズ種（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ｓｐｅｃｉｅｓ）の重量比で１：１００，０００の関係となり得る。
【０１３８】
光電子増倍管の出力をＩＢＭ互換性パーソナルコンピュータにインストールした１２ビットＲＴＩ−８３５Ｈ アナログ／デジタル変換ボードを用いてデジタル化する（Ａｎａｌｏｇ Ｄｅｖｉｃｅｓ， Ｎｏｒｗｏｏｄ ＭＡ）。このデジタル化したデータを、イメージとして表示する。この場合、シグナル強度を、２０色線形変換を用いて、青（弱いシグナル）から赤（強いシグナル）の疑似色スケールにマッピングする。データはまた量的にも分析する。２つの異なった蛍光物質が同時に励起されて測定された場合、データを、各蛍光物質の発光スペクトルを用いて蛍光物質間の光学クロストーク（発光スペクトルの重複による）をまず補正する。各スポットからのシグナルがグリッドの各要素の中心に来るように、蛍光物質シグナル強度の上にグリッドを重ね合わせる。各要素内の蛍光シグナルを統合して、シグナルの平均強度に対応する数値を求める。シグナル分析に用いるソフトウェアはＧＥＭＴＯＯＬＳプログラム（Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）である。
【０１３９】
８　相補的な核酸配列
本核酸分子に相補的な配列、或いはその断片を用いて、遺伝子の発現を検出したり、低下させたり、阻害することができる。約１５〜約３０個の塩基対からなるオリゴヌクレオチドの使用について記載するが、それより小さい或いは大きい配列の断片、またはその誘導体（ＰＮＡ）の場合でも同じ方法を用いることができる。オリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１−２９を用いて、Ｏｌｉｇｏ４．０６ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で設計する。プロモーターの結合を阻害して転写を阻止するために、相補的なヌクレオチドを、最も好ましくはオープンリーディングフレームの開始コドンの前の約１０個のヌクレオチドである最もユニークな５′配列に結合するように設計する。翻訳を阻害するために、相補的なオリゴヌクレオチドを、本哺乳動物タンパク質をコードするｍＲＮＡにリボソームが結合するのを阻害するように設計する。
【０１４０】
９　哺乳動物タンパク質の発現
本哺乳動物タンパク質の発現及び精製は、細菌若しくはウイルス系の発現系を用いて行うことができる。細菌で発現させるために、抗生物質耐性遺伝子とｃＤＮＡを高レベルで転写させる誘導性プロモーターとを含むベクターにｃＤＮＡをサブクローニングする。このようなプロモーターには、以下に限定するものではないが、ｌａｃオペレーター調節エレメントに関連するＴ５またはＴ７バクテリオファージプロモーター及びｔｒｐ−ｌａｃ（ｔａｃ）ハイブリッドプロモーターが含まれる。組み換えベクターを、例えばＢＬ２１（ＤＥ３）などの好適な細菌宿主に形質転換する。イソプロピルβ−Ｄチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導されると、抗生物質耐性細菌がこの哺乳動物タンパク質を発現する。真核細胞での発現は、Ａｕｔｏｇｒａｐｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多面性ウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）という組み換えバキュロウイスルスをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （Ｓｆ９）昆虫細胞に感染させて行う。バキュロウイルスのポリヘドリン遺伝子を、相同組み換え或いは転移プラスミド中間体が関係する細菌媒介遺伝子転移の何れかによって、この哺乳動物ｃＤＮＡと置換する。ウイルスの感染力は維持され、強力なポリヘドリンプロモータによって高いレベルでｃＤＮＡが転写される。
【０１４１】
大抵の発現系では、この哺乳動物タンパク質がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはペプチドエピトープタグ（ＦＬＡＧ）などとの融合タンパク質として合成されるため、未精製の細胞溶解物から親和性を用いた迅速な一段階の組み換え融合タンパク質の精製を行うことができる。ＧＳＴによって、タンパク質の活性及び抗原性を維持する条件下で、固定されたグルタチオンでの融合タンパク質の精製が可能となる（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）。精製の後、ＧＳＴ部分をこの哺乳動物タンパク質から蛋白分解的に遺伝子操作された特定部位で切断できる。アミノ酸８個のペプチドからなるＦＬＡＧによって、市販のモノクローナル及びポリクローナル抗ＦＬＡＧ抗体（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ）を用いたイムノアフィニティー精製が可能となる。６個の連続するヒスチジン残基のストレッチである６−Ｈｉｓによって、金属キレート樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）での精製が可能となる。タンパク質の発現及び精製の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ （１９９５，前出， ｃｈ １０， １６）に記載されている。これらの方法で精製したこの哺乳動物タンパク質を直接用いて以下のアッセイを行うことができる。
【０１４２】
１０　機能のアッセイ
ＧＴＰＡＰ活性のアッセイは、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼにおける内在性ＧＴＰアーゼ活性の刺激を測定する。ＧＴＰアーゼ活性は、ＲｈｏＡおよびＣｄｃ４２−ＧＴＰアーゼを用いて、文献（Ｌｉ ら （１９９７） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２ ： ３２８３０−３２８３５）に記載していあるように測定する。アッセイは、ＧＴＰＡＰを含めず、および様々な濃度のＧＴＰＡＰの存在下で実施する。ＧＴＰＡＰの存在下でのＧＴＰアーゼの活性量からＧＴＰＡＰが不在下での活性量を差引いた値が、サンプルにおけるＧＴＰＡＰの活性に比例する。
【０１４３】
別法では、タンパク質の機能は、哺乳動物細胞培養でＧＴＰＡＰをコードする配列を生理学的に高レベルで発現させてアッセイする。この核酸配列を、強力なサイトメガロウイルスプロモ刳ーターを含むＰＣＭＶ ＳＰＯＲＴベクター（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ．）にサブクローニングし、この組み換えベクター５〜１０μｇを、当分野で周知の形質転換法方によってヒトの内皮細胞株或いは造血細胞株に形質転換する。更に、蛍光マーカーとなるＣＤ６４−ＧＦＰ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ ＣＡ）をコードする配列を含むプラスミド１〜２μｇを同時に形質転換して、フローサイトメトリー（ＦＣＭ）で形質転換細胞を同定できるようにする。
【０１４４】
発現における導入された遺伝子の影響は、精製されたこれらの形質転換細胞集団を用いて評価することができる。形質転換細胞の表面で発現されるＣＤ６４−ＧＦＰが、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の保存された領域と結合するため、この形質転換細胞を、ヒトＩｇＧか抗ＣＤ６４抗体の何れかで被覆された磁気ビーズを用いて分離することができる（ＤＹＮＡＬ． Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ． ＮＹ）。ｍＲＮＡを細胞から単離して、ハイブリダイゼーション技術で分析することができる。
【０１４５】
１１　ＧＴＰＡＰに特異的な抗体の生産
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法でＧＴＰＡＰを精製し、これを用いてマウスやウサギを免疫する。以下の標準的なプロトコルを用いて抗体を生産する。別法では、ＧＴＰＡＰのアミノ酸配列をＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて解析し、免疫原性の高い領域を決定する。通常はＣ末端付近或いは親水性領域内に存在する免疫原性エピトープを選択して合成し、これを用いて抗体を増大させる。通常は１５残基程度の長さのエピトープを、Ｆｍｏｃ法でＡＢＩ ４３１Ａペプチドシンセサイザー（ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で合成し、これをＮ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルとの反応でＫＬＨ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に結合させて免疫原性を高める。
【０１４６】
エピトープ−ＫＬＨ複合体をフロイントの完全アジュバントと共に投与してウサギを免疫する。その後、間隔を置いてフロイントの不完全アジュバントで免疫化を繰り返す。マウスの場合は少なくとも７週間、ウサギの場合は少なくとも１２週間が経過した後、抗血清を採取して抗ペプチド活性を検査する。この検査には、このペプチドをプラスチックに結合し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキング処理し、ウサギ抗血清と反応させ、洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。当分野で周知の方法を用いて抗体力価及び形成された複合体の収量を測定する。
【０１４７】
１２　特異的な抗体を用いる天然タンパク質の精製
天然或いは組み換えの哺乳動物タンパク質を、このタンパク質に特異的な抗体を用いてイムノアフィニティークロマトグラフィで実質的に精製する。イムノアフィニティーカラムは、この抗体をＣＮＢｒ−活性化ＳＥＰＨＡＲＯＳＥレジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）に共有結合させて作製する。このタンパク質を含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、このタンパク質を優先的に吸着できるように、界面活性剤の存在下で高イオン強度緩衝液でそのカラムを洗浄する。結合後、緩衝液（ｐＨ ２〜３）或いは高濃度の尿素やチオシアネートイオンを用いてそのカラムからこのタンパク質を溶離させて抗体とこのタンパク質との結合を切断し、このタンパク質を回収する。
【０１４８】
１３　ポリヌクレオチドの第２２染色体の結腸癌領域へのマッピング
第２２染色体のパブリックドメインゲノムＤＮＡ配列データは、ＧｅｎＢａｎｋから入手でき、文献（Ｄｕｎｈａｍ， Ｉ． ら （１９９９） Ｎａｔｕｒｅ ４０２ ： ４８９−４９５）に記載されている。インサイトＩＤ Ｎｏ． ４４０４２４．５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）を含むインサイトテンプレートを、ＢＬＡＳＴ２を用いてパブリックドメインゲノム配列と整列させ、２つの配列間に１００塩基対以上に亘って９８％以上の同一性を有する配列を特定した。前出のＣａｓｔｅｌｌｓらによって同定された結腸癌に関連する第２２染色体の或る領域が、パブリックドメインのマーカーＤ２２Ｓ１１７１およびＤ２２Ｓ９２によって画定される。これらのマーカーを、ＢＡＬＳＴ２を用いて第２２染色体の配列をアラインメントし、この領域に関連するゲノムＤＮＡの座位を決定する。上記したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９に一致したゲノムＤＮＡ配列がこの領域内にマッピングされた。
【０１４９】
１４　本核酸分子若しくはタンパク質と特異的に結合する分子のスクリーニング
本核酸分子やその断片、或いは本タンパク質やその断片を、３２Ｐ−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、またはＢＩＯＤＩＰＹやＦＩＴＣ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）でそれぞれ標識する。予め基板上に配列した候補分子のライブラリを、標識した核酸分子またはタンパク質の存在下でインキュベートする。核酸分子或いはアミノ酸配列の何れかが存在する条件下でインキュベートした後、その基板を洗浄し、特異的な結合或いは複合体形成を示唆する標識が保持されている基板上の全ての部分をアッセイし、結合している分子を同定する。様々な濃度の核酸若しくはタンパク質で得られたデータを用いて、標識した核酸またはタンパク質と結合した分子との親和性を計算する。
【０１５０】
１５　ＧＴＰＡＰと相互作用する分子の同定
ＧＴＰＡＰ若しくは生物学的活性を有するその断片を、１２５Ｉ Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬（Ｂｏｌｔｏｎ 他 （１９７３） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １３３：５２９−５３９）で標識する。マルチウェルプレートのウェルにおいて、候補リガンド分子を標識したＧＴＰＡＰと共にインキュベートし、次に洗浄してから、標識した複合体を有する全てのウェルをアッセイする。様々な濃度のＧＴＰＡＰで得られたデータを用いて、ＧＴＰＡＰと結合した候補リガンド分子の関連性、数量、親和性を計算する。
【０１５１】
（表の簡単な説明）
表１は、ＧＴＰＡＰの分析に用いたツール、プログラム、およびアルゴリズム、並びに該当する説明、参照、および閾値パラメーターを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｂ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｃ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｄ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図１Ｅ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ＣＡ）を用いて作成した。
【図２Ａ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて作成した。
【図２Ｂ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて作成した。
【図２Ｃ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて作成した。
【図２Ｄ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて作成した。
【図２Ｅ】
本哺乳動物タンパク質のヒトアミノ酸配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）をコードするヒト核酸分子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）を示す。このアラインメントは、ＭＡＣＤＮＡＳＩＳ ＰＲＯソフトウェア（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を用いて作成した。
【図３Ａ】
ヒトＲｈｏＧＡＰタンパク質、ＧＴＰＡＰ２（クローンＩＤ ４０４４２４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、ＧＴＰＡＰ１（クローンＩＤ ３０６８５３８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質８（ＧＩ ６５７２１８５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、およびｒｈｏＧＡＰタンパク質（ＧＩ ３１２２１２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）との間の化学的および構造的類似性を実証する。このアラインメントは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて作成した。
【図３Ｂ】
ヒトＲｈｏＧＡＰタンパク質、ＧＴＰＡＰ２（クローンＩＤ ４０４４２４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、ＧＴＰＡＰ１（クローンＩＤ ３０６８５３８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質８（ＧＩ ６５７２１８５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、およびｒｈｏＧＡＰタンパク質（ＧＩ ３１２２１２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）との間の化学的および構造的類似性を実証する。このアラインメントは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて作成した。
【図３Ｃ】
ヒトＲｈｏＧＡＰタンパク質、ＧＴＰＡＰ２（クローンＩＤ ４０４４２４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、ＧＴＰＡＰ１（クローンＩＤ ３０６８５３８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質８（ＧＩ ６５７２１８５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、およびｒｈｏＧＡＰタンパク質（ＧＩ ３１２２１２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）との間の化学的および構造的類似性を実証する。このアラインメントは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて作成した。
【図３Ｄ】
ヒトＲｈｏＧＡＰタンパク質、ＧＴＰＡＰ２（クローンＩＤ ４０４４２４；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）、ＧＴＰＡＰ１（クローンＩＤ ３０６８５３８；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）、Ｒｈｏ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質８（ＧＩ ６５７２１８５；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）、およびｒｈｏＧＡＰタンパク質（ＧＩ ３１２２１２；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）との間の化学的および構造的類似性を実証する。このアラインメントは、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェアのＭＥＧＡＬＩＧＮプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）を用いて作成した。
【図４Ａ】
ヒトＧＴＰＡＰをコードする核酸分子間のアラインメント、並びに一塩基多型（ＳＮＰ）の領域を示す。ＳＮＰはΔで示されている。このアラインメントは、ＰＨＲＡＰソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成した。
【図４Ｂ】
ヒトＧＴＰＡＰをコードする核酸分子間のアラインメント、並びに一塩基多型（ＳＮＰ）の領域を示す。ＳＮＰはΔで示されている。このアラインメントは、ＰＨＲＡＰソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成した。
【図５Ａ】
ＰＨＲＡＰソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト３０６８５３８ＣＢ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）核酸配列、およびラット７０１２４４９２６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、７００９５０１６９Ｈ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２）、７０１５７５９７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、７０１２７４０３６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、７００４８０５２８ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、７００９３５７５３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、および７００９３６０６１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）核酸配列との間の化学的および構造的類似性を示す。
【図５Ｂ】
ＰＨＲＡＰソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト３０６８５３８ＣＢ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）核酸配列、およびラット７０１２４４９２６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、７００９５０１６９Ｈ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２）、７０１５７５９７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、７０１２７４０３６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、７００４８０５２８ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、７００９３５７５３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、および７００９３６０６１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）核酸配列との間の化学的および構造的類似性を示す。
【図５Ｃ】
ＰＨＲＡＰソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト３０６８５３８ＣＢ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）核酸配列、およびラット７０１２４４９２６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、７００９５０１６９Ｈ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２）、７０１５７５９７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、７０１２７４０３６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、７００４８０５２８ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、７００９３５７５３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、および７００９３６０６１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）核酸配列との間の化学的および構造的類似性を示す。
【図５Ｄ】
ＰＨＲＡＰソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト３０６８５３８ＣＢ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）核酸配列、およびラット７０１２４４９２６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、７００９５０１６９Ｈ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２）、７０１５７５９７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、７０１２７４０３６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、７００４８０５２８ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、７００９３５７５３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、および７００９３６０６１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）核酸配列との間の化学的および構造的類似性を示す。
【図５Ｅ】
ＰＨＲＡＰソフトウェア（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ ＷＡ）を用いて作成したアラインメントであって、ヒト３０６８５３８ＣＢ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）核酸配列、およびラット７０１２４４９２６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）、７００９５０１６９Ｈ２ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２）、７０１５７５９７Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）、７０１２７４０３６Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、７００４８０５２８ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、７００９３５７５３Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）、および７００９３６０６１Ｈ１ （ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）核酸配列との間の化学的および構造的類似性を示す。
【表１】2004500822.tif 000003
【表２】2004500822.tif 000004
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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