(57)【要約】本発明は、細胞あるいは無細胞翻訳系内で翻訳された新生タンパク質の検出及び分析を容易にする非放射性マーカーに関する。これらのマーカーを含有する新生タンパク質は、放射性試薬に関連する取り扱い及び廃棄の問題なく、迅速かつ効率的に検出、分離、かつ分析し得る。好ましいマーカーは、ジピロメテン二フッ化ホウ素（４，４‐ジフルオロ‐‐ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセン）色素である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ｔＲＮＡ分子とＢＯＤＩＰＹマーカーを供給すること、及び
ｂ）該ｔＲＮＡ分子を該ＢＯＤＩＰＹマーカーでアミノアシル化して、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを創造することを含む方法。
【請求項２】
該方法がさらに、
ｃ）該ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを、該マーカーが新生タンパク質中に取り込まれるような条件下で翻訳系中に導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該方法がさらに、
ｄ）該マーカーを含む該新生タンパク質を検出することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該方法がさらに、
ｅ）該検出された新生タンパク質を分離することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該検出される新生タンパク質が、組換え遺伝子産物、遺伝子融合産物、酵素、サイトカイン、炭水化物及び脂質結合タンパク質、核酸結合タンパク質、ホルモン、免疫原性タンパク質、ヒトタンパク質、ウィルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生虫タンパク質及びそれらのフラグメント及び組み合わせから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
該翻訳系が細胞または無細胞翻訳系を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
該細胞翻訳系が、組織培養細胞、初代細胞、インビボ細胞、分離された不死化細胞、ヒト細胞及びその組み合わせから成る群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
該無細胞翻訳系が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）溶解物、コムギ胚芽抽出物、昆虫細胞溶解物、ウサギ網状赤血球溶解物、カエル卵母細胞溶解物、イヌ膵臓溶解物、ヒト細胞溶解物、精製あるいは半精製翻訳因子の混合物及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
該無細胞翻訳系が、約２５℃〜約４５℃の温度でインキュベートされる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
該無細胞翻訳系が連続フローまたは透析系である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
該ｔＲＮＡが化学的または酵素的ミスアミノアシル化によってアミノアシル化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
２以上の異なるミスアシル化ｔＲＮＡが該翻訳系に導入される、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
該検出された新生タンパク質が機能的に活性である、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
該ｔＲＮＡ分子が開始ｔＲＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
該ｔＲＮＡ分子がサプレッサーｔＲＮＡ分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ａ）タンパク質合成系の少なくとも一つの成分を含む、第一包含手段、
ｂ）ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを含み、該ｔＲＮＡがＢＯＤＩＰＹマーカーでミスアミノアシル化されている、第二包含手段を含むキット。
【請求項１７】
該ミスアミノアシル・ｔＲＮＡが開始ｔＲＮＡを含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
該ミスアミノアシル・ｔＲＮＡがサプレッサーｔＲＮＡを含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
該タンパク質合成系の該成分がリボソームを含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項２０】
ＢＯＤＩＰＹマーカーでミスアミノアシル化されているｔＲＮＡ分子。
【請求項２１】
ａ）ｉ）タンパク質合成を開始するために働く第一ＡＵＧコドンのみを認識し、かつ第一マーカーを含むミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡ分子、及びｉｉ）アフィニティーマーカー及びＣ末端マーカーを含むタンパク質をコードする核酸鋳型を供給すること、
ｂ）該ミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡを、新生タンパク質が発生され、該タンパク質が該第一マーカー、該アフィニティーマーカー及び該Ｃ末端マーカーを含むような条件下で、該鋳型を含む翻訳系に導入すること、を含む方法。
【請求項２２】
発生する該新生タンパク質が、組換え遺伝子産物、遺伝子融合産物、酵素、サイトカイン、炭水化物及び脂質結合タンパク質、核酸結合タンパク質、ホルモン、免疫原性タンパク質、トランケート型タンパク質、突然変異型タンパク質、ヒトタンパク質、ウィルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生虫タンパク質及びそれらのフラグメント及び組み合わせから選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該翻訳系が細胞または無細胞翻訳系を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
該細胞翻訳系が、原核細胞、真核細胞、組織培養細胞、初代細胞、インビボ細胞、分離された不死化細胞、ヒト細胞及びその組み合わせから選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該無細胞翻訳系が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）溶解物、コムギ胚芽抽出物、昆虫細胞溶解物、ウサギ網状赤血球溶解物、カエル卵母細胞溶解物、イヌ膵臓溶解物、ヒト細胞溶解物、精製あるいは半精製翻訳因子の混合物及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
該無細胞翻訳系が、約２５℃〜約４５℃の温度でインキュベートされる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
該無細胞翻訳系が連続フローまたは透析系である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
該ｔＲＮＡが化学的または酵素的ミスアミノアシル化によってアミノアシル化される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
該新生タンパク質が機能的に活性である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
該第一マーカーが蛍光化合物を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
該蛍光化合物が、ジピロメテン二フッ化ホウ素（４，４‐ジフルオロ‐４‐ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセン）色素及び誘導体化クマリンから選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
該Ｃ末端がヒスチジンタグを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
ａ）ｉ）タンパク質合成を開始するために働く第一ＡＵＧコドンのみを認識し、かつ第一マーカーを含むミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡ分子、及びｉｉ）アフィニティーマーカー及びＣ末端マーカーを含むタンパク質をコードする核酸鋳型を供給すること、
ｂ）該ミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡを、新生タンパク質が発生され、該タンパク質が該タンパク質のＮ末端にある該第一マーカー、Ｃ末端マーカー及び該第一マーカーに隣接する該アフィニティーマーカーを含むような条件下で、該鋳型を含む翻訳系に導入することを含む方法。
【請求項３４】
該発生する新生タンパク質が、組換え遺伝子産物、遺伝子融合産物、酵素、サイトカイン、炭水化物及び脂質結合タンパク質、核酸結合タンパク質、ホルモン、免疫原性タンパク質、トランケート型タンパク質、突然変異型タンパク質、ヒトタンパク質、ウィルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生虫タンパク質及びそれらのフラグメント及び組み合わせから選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
該翻訳系が細胞または無細胞翻訳系を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
該細胞翻訳系が、原核細胞、真核細胞、組織培養細胞、初代細胞、インビボ細胞、分離された不死化細胞、ヒト細胞及びその組み合わせから選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
該無細胞翻訳系が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）溶解物、コムギ胚芽抽出物、昆虫細胞溶解物、ウサギ網状赤血球溶解物、カエル卵母細胞溶解物、イヌ膵臓溶解物、ヒト細胞溶解物、精製あるいは半精製翻訳因子の混合物及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
該無細胞翻訳系が、約２５℃〜約４５℃の温度でインキュベートされる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
該無細胞翻訳系が連続フローまたは透析系である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
該ｔＲＮＡが化学的または酵素的ミスアミノアシル化によってアミノアシル化される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
該新生タンパク質が機能的に活性である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
該第一マーカーが蛍光化合物を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
該蛍光化合物が、ジピロメテン二フッ化ホウ素（４，４‐ジフルオロ‐４‐ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセン）色素及び誘導体化クマリンから選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
該Ｃ末端がヒスチジンタグを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４５】
ａ）ｉ）タンパク質合成を開始するために働くようにデザインされた第一コドンのみを認識、かつ第一マーカーを含むミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡ分子、及びｉｉ）アフィニティーマーカー及びＣ末端マーカーを含むタンパク質をコードする核酸鋳型を供給すること、
ｂ）該ミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡを、新生タンパク質が発生され、該タンパク質が該第一マーカー、該アフィニティーマーカー及び該Ｃ末端マーカーを含むような条件下で、該鋳型を含む翻訳系に導入することを含む方法。
【請求項４６】
該発生する新生タンパク質が、組換え遺伝子産物、遺伝子融合産物、酵素、サイトカイン、炭水化物と脂質結合タンパク質、核酸結合タンパク質、ホルモン、免疫原性タンパク質、トランケート型タンパク質、突然変異型タンパク質、ヒトタンパク質、ウィルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生虫タンパク質及びそれらのフラグメント及び組み合わせから選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
該翻訳系が細胞または無細胞翻訳系を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
該細胞翻訳系が、原核細胞、真核細胞、組織培養細胞、初代細胞、インビボ細胞、分離された不死化細胞、ヒト細胞及びその組み合わせから選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
該無細胞翻訳系が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）溶解物、コムギ胚芽抽出物、昆虫細胞溶解物、ウサギ網状赤血球溶解物、カエル卵母細胞溶解物、イヌ膵臓溶解物、ヒト細胞溶解物、精製あるいは半精製翻訳因子の混合物及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
該無細胞翻訳系が、約２５℃〜約４５℃の温度でインキュベートされる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
該無細胞翻訳系が連続フローまたは透析系である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
該ｔＲＮＡが化学的または酵素的ミスアミノアシル化によってアミノアシル化される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
該新生タンパク質が機能的に活性である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５４】
該第一マーカーが蛍光化合物を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５５】
該蛍光化合物が、ジピロメテン二フッ化ホウ素（４，４‐ジフルオロ‐４‐ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセン）色素及び誘導体化クマリンから選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項５６】
該Ｃ末端がヒスチジンタグを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項５７】
ａ）ｉ） タンパク質合成を開始するために働くようにデザインされた第一コドンのみを認識し、かつ第一マーカーを含むミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡ分子、及びｉｉ）アフィニティーマーカー及びＣ末端マーカーを含むタンパク質をコードする核酸鋳型を供給すること、
ｂ）該ミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡを、新生タンパク質が発生され、該タンパク質が、該タンパク質のＮ末端にある該第一マーカー、Ｃ末端マーカー及び該第一マーカーに隣接する該アフィニティーマーカーを含むような条件下で該鋳型を含む翻訳系に導入することを含む方法。
【請求項５８】
該発生する新生タンパク質が、組換え遺伝子産物、遺伝子融合産物、酵素、サイトカイン、炭水化物と脂質結合タンパク質、核酸結合タンパク質、ホルモン、免疫原性タンパク質、トランケート型タンパク質、突然変異型タンパク質、ヒトタンパク質、ウィルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生虫タンパク質及びそれらのフラグメント及び組み合わせから選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
該翻訳系が細胞または無細胞翻訳系を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
該細胞翻訳系が、原核細胞、真核細胞、組織培養細胞、初代細胞、インビボ細胞、分離不死化細胞、ヒト細胞及びその組み合わせから選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
該無細胞翻訳系が、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）溶解物、コムギ胚芽抽出物、昆虫細胞溶解物、ウサギ網状赤血球溶解物、カエル卵母細胞溶解物、イヌ膵臓溶解物、ヒト細胞溶解物、精製あるいは半精製翻訳因子の混合物及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
該無細胞翻訳系が、約２５℃〜約４５℃の温度でインキュベートされる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
該無細胞翻訳系が連続フローまたは透析系である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
該ｔＲＮＡが化学的または酵素的ミスアミノアシル化によってアミノアシル化される、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
該新生タンパク質が機能的に活性である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６６】
該第一マーカーが蛍光化合物を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６７】
該蛍光化合物が、ジピロメテン二フッ化ホウ素（４，４‐ジフルオロ‐４‐ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセン）色素及び誘導体化クマリンから選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
該Ｃ末端がヒスチジンタグを含む、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞あるいは無細胞翻訳系内で翻訳された新生タンパク質の検出及び分析を容易にする非放射性マーカーに関する。これらのマーカーを含有する新生タンパク質は、放射性試薬に関連する取り扱い及び廃棄の問題なく、迅速かつ効率的に検出、分離、かつ分析し得る。
【０００２】
【従来の技術】
細胞は、オルガネラ（細胞小器官）、マクロ分子及び広く多様な小分子を含む。水分を除いては、ほとんど大多数の分子及びマクロ分子は、脂質、炭水化物、タンパク質または核酸に分類し得る。タンパク質は、最も豊富な細胞成分であり、多数の主要な細胞プロセスを促進する。これらは、酵素、抗体、ホルモン、輸送分子及び細胞の細胞骨格の成分を含む。
【０００３】
タンパク質は、線状ポリマーあるいはポリペプチド中に配列されたアミノ酸から構成される。生体系において、タンパク質は２０種類以上の一般アミノ酸を含む。これらの２０数種類のアミノ酸は、一般的には天然アミノ酸と称される。全てのアミノ酸の中心には、他分子と４つの結合または付着を形成するα炭素原子（Ｃα）がある（図１）。１つの結合はアミノ基（ＮＨ２）との共有結合で、他方はカルボキシル基（ＣＯＯＨ）との共有結合であり、どちらもポリペプチド形成に関与する。３番目の結合は、ほとんど常に水素原子と結合し、４番目の結合は、アミノ酸構造に可変性を分与する側鎖に結合する。例えば、側鎖がメチル基（−ＣＨ３）の場合はアラニン（Ａｌａ）が形成され、側鎖がイソプロピル基（−ＣＨ（ＣＨ３）２）の場合はバリン（Ｖａｌ）が形成される。さらに異なる側鎖を含むアミノ酸を化学的に合成することが可能であるが、細胞タンパク質合成系は、まれに例外はあるが、天然アミノ酸を利用する。他のアミノ酸及び構造的類似化合物は、非天然性と称され、ほとんどの生物体においては一般的には発見されない。
【０００４】
全ての生物系の主要な特徴は、アミノ酸からタンパク質を生成する能力である。根本的には、タンパク質は、図１Ｂに描写されるペンタペプチドのようなペプチド結合を介する、複数のアミノ酸の連結によって形成される。本工程に関与する主要な分子は、メッセンジャーＲＮＡ（伝令ＲＮＡ）（ｍＲＮＡ）分子、トランスファーＲＮＡ（転写ＲＮＡ）（ｔＲＮＡ）分子及びリボソーム（ｒＲＮＡ‐タンパク質複合体）である。タンパク質翻訳は通常では生細胞内で行われ、ある場合には、無細胞翻訳系と言及されるシステム内で細胞外で実施することも可能である。どちらのシステムにおいても、タンパク質合成の基本的工程は同一である。細胞外あるいは無細胞翻訳系は、細胞の細胞内内容物から調製された抽出物を含む。これらの調製物は、タンパク質翻訳をサポートするそれらの分子、また調製方法に応じて、グリコシル化及び切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）のような翻訳後イベントを含む。無細胞抽出物またはインビトロ抽出物が作製される典型的な細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）細胞、コムギ胚芽細胞、ウサギ網状赤血球、昆虫細胞及びカエル卵母細胞である。
【０００５】
インビボ及びインビトロ合成のどちらも、ｍＲＮＡ分子上にある塩基配列の読み取りを含む。ｍＲＮＡは、トリプレットコドンの形状で翻訳指令を含んでいる。遺伝暗号は、どのアミノ酸が各トリプレットコドンによってコードされるかを特定する。アミノ酸を特定する各コドンには、通常は正確なアミノ酸を新生ポリペプチド鎖上に転移するために機能する同族ｔＲＮＡ分子が存在する。アミノ酸チロシン（Ｔｙｒ）は、塩基配列ＵＡＵ及びＵＡＣによってコードされるが、システイン（Ｃｙｓ）はＵＧＵ及びＵＧＣによってコードされる。コドンの第３塩基に関連する変異はよくあることで、ゆらぎと称されている。
【０００６】
翻訳は、リボソームがｍＲＮＡに結合することにより開始する（図２）。開始因子、延長因子及び終了因子を含む多数のタンパク質因子が、翻訳の異なるフェーズ中にリボソームと連合（ｌｉｎｋａｇｅ）する。開始複合体の形成が翻訳の第１ステップである。開始因子は、塩基配列ＵＡＧを認識するｍＲＮＡと開始ｔＲＮＡ（ｆｍｅｔ及びｍｅｔ）と共に開始複合体に寄与する。延長は、電荷ｔＲＮＡのリボソームへの結合、翻訳及びペプチド鎖中へのアミノ酸積荷の輸送と放出と共に進行する。延長因子は、ｔＲＮＡの結合を補助し、ペプチジルトランスフェラーゼ（転移酵素）のような酵素によってポリペプチド鎖の延長を補助する。終了因子は、ポリペプチド合成を終了しさらにポリペプチド鎖とｍＲＮＡをリボソームから遊離するメッセージにおいて、塩基配列ＵＧＡのような終止シグナルを認識する。
【０００７】
ｔＲＮＡの構造は、しばしばクローバー葉モデルとして示される（図３Ａ）。典型的ｔＲＮＡの構造エレメントは、受容ステム、Ｄループ、アンチコドンループ、可変ループ及びＴΨＣループを含む。アミノアシル化あるいはｔＲＮＡの電荷は、その結果として、エステル結合を介する、アミノ酸のカルボキシル末端にある末端アデノシン塩基の２’−（または３’−）ヒドロキシル基への結合を生起する。このプロセスは、酵素的あるいは化学的方法のいずれかを使用することにより達成し得る。通常では、特定のｔＲＮＡは、１つの特定の天然アミノ酸によってのみ電荷される。ここでは酵素的アミノアシル化と称する、この選択的電荷は、アミノアシル・ｔＲＮＡシンテターゼ（合成酵素）によって達成される。チロシンＵＡＣコドンを認識することにより、チロシン残基を新生ポリペプチド鎖中に選択的に取り込むｔＲＮＡは、チロシン‐アミノアシル・ｔＲＮＡシンテターゼを有するチロシンによって電荷され、ＵＧＵコドンを読み取るようにデザインされたｔＲＮＡは、システイン‐アミノアシル・ｔＲＮＡシンテターゼによって電荷される。これらのシンテターゼは、ｔＲＮＡを正しいアミノ酸で電荷し、翻訳プロセスの適合度を維持することにおいて極めて正確であるように進化してきた。非天然アミノ酸がアミノ酸に構造的に極めて類似する特定の場合を除いては、ｔＲＮＡを電荷するために酵素的アミノアシル化以外の手段を使用することが必要である。
【０００８】
分子生物学者は、遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を、日常の仕事として研究している。研究における重要なステップは、これら遺伝子産物を、無傷細胞または無細胞抽出物のいずれかにおいて発現することである。伝統的には、分子生物学者は、新合成タンパク質または所謂新生タンパク質検出の手段として３５Ｓ−メチオニンのような放射性標識アミノ酸残基を使用する。これらの新生タンパク質は、通常では、まず標準技術であるゲル電気泳動によりタンパク質を分離し、さらにゲルに含まれるタンパク質が特定の放射性標識アミノ酸を含有するかどうかを測定することにより、細胞または無細胞抽出物中に存在する多数の他のタンパク質から識別され得る。この方法は単純で、ゲル電気泳動に基づき、広く利用可能かつ実用化されている方法である。本方法は、発現タンパク質に関して予め知識を必要とせず、さらに一般的にはタンパク質が特定の特性を有する必要がない。さらには、タンパク質が変性あるいはほぐれた形状（ｕｎｆｏｌｄ）であってもゲル電気泳動により検出し得る。その上、膜へのブロッティング及び共役酵素検定法のようなさらに特殊化したテクニックは必要とされない。放射性アッセイは、新生タンパク質の構造が変更されず、あるいは保存し得るという利点をさらに有するため、従ってタンパク質は次の生化学的及び生物物理学的試験のために機能性のある形状で分離し得る。
【０００９】
放射性方法には、放射性標識アミノ酸の利用に関する多数の欠点がある。実験室における放射性化合物の取り扱いは、常に健康へのリスクを含み、さらに実験室職員の特別な訓練と同様に、特別な実験室安全手順、施設、詳細な記録管理を必要とする。放射性廃棄物の処分はさらに、公共へのリスクの可能性及び放射性廃棄物処分場所の不足のために、懸念を増している。さらに、放射性標識の使用は時間を要し、ある場合では放射性標識検出に数日も必要とすることがある。そのような実験に長時間を要することは、主要な考慮点であり、さらに研究生産性の深刻な妨げとなり得る。放射能検出の迅速な方法は利用可能ではあるが、高価であり、しばしば複雑な画像エンハンスメント用装置を必要とする。
【００１０】
放射性標識アミノ酸の使用はまた、既存タンパク質から新生タンパク質を予め分離することなしには、無細胞抽出物中にある新生タンパク質の生産をモニタする単純かつ迅速な手段を可能としない。しかし、分離ステップは無細胞活性の最適化が可能ではない。イオン及び代謝物濃度、及びタンパク質合成の温度と時間を含む変数は調整できない。
【００１１】
放射性標識法はまた、新生タンパク質を将来利用可能である形状で分離する手段を供給しない。放射能の存在は、実験室及び動物におけるそれ以後の生化学的または生物物理学的手順のためのこの利用性を損なう。タンパク質が細胞に毒性である特性を有するために、インビボでタンパク質を容易に生産できない場合のインビトロ発現の場合において明らかである。機能性形状にある新生タンパク質の検出及び分離のための単純かつ便利な方法は、そのようなタンパク質が診断用あるいは治療用特性を有する場合に、生物医学分野において重要である。近年の研究はいくらかの成功を示すが、これらの方法は数々の欠点を有する。
【００１２】
放射性標識法はまた、これらのタンパク質またはこれらのタンパク質のフラグメントをコードするＤＮＡにおける突然変異を起因する可能性のある疾患の存在を指摘し得る新生タンパク質の配列における変化を検出する単純かつ迅速な手段を提供しない。タンパク質レベルにおける現在の分析方法は、ゲル電気泳動の使用、及び速度が遅く、ハイスループット分析や自動化に順応しない放射能検出に依存している。そのような突然変異はまた、特定のタンパク質またはタンパク質フラグメントをコードする遺伝子のＤＮＡ配列分析を実施することにより検出し得る。しかし、これにはＤＮＡの広い領域を配列することが必要であり、従って、時間を要しかつ高価である。突然変異を新生タンパク質レベルで検出することを可能とする一般的方法の開発は、生物医学分野において極めて重要である。
【００１３】
放射性標識法はまた、新生タンパク質と、薬物候補としての重要性を有する化合物を含む他の分子との相互作用を研究するための単純かつ迅速な手段を供給しない。そのようなアプローチが利用可能であれば、遺伝子やタンパク質の特性が解明されていない場合でも、特定の遺伝子によってコードされている新生タンパク質に対して多数の化合物をスクリーンするために極めて有用であり得る。可能性を有する薬物候補をスクリーンするためのアフィニティー電気泳動に基づく、現在のテクノロジーでは、天然試料及び合成ライブラリーのどちらも、第一に、タンパク質を特定のマーカーで均一に標識しなければならなず、これは、タンパク質の分離、さらに特定のリガンドマーカーのデザインまたはタンパク質工学を含む特殊な技術をしばしば必要とする。
【００１４】
サプレッサー特性を有するｔＲＮＡのような特定のｔＲＮＡ、サプレッサーｔＲＮＡは、部位特異的非天然アミノ酸置換（ＳＮＡＡＲ）プロセスに使用されてきた（Ｃ． Ｎｏｒｅｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１８２〜１８８、 １９８９）。ＳＮＡＡＲにおいては、ｍＲＮＡ及びサプレッサーｔＲＮＡ上にユニーク・コドンが必要であり、これはタンパク質合成期間にユニーク部位に非天然アミノ酸をターゲットするために作用する（ＰＣＴ　ＷＯ９０／０５７８５）。しかし、サプレッサーｔＲＮＡは、タンパク質翻訳系中に存在するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによって認識されてはならない（Ｂａｉｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：５４１１〜２１、 １９９１）。さらには、ナンセンスコドンを鋳型ＤＮＡまたはｍＲＮＡをコード領域への取り込むことが必要であるため、非天然アミノ酸の部位特異的取り込みは、一般的には細胞あるいは無細胞タンパク質合成系における新生タンパク質の検出には適切ではない。
【００１５】
タンパク質合成産物はまた、抗体ベースアッセイによっても検出し得る。この方法は、天然形状にフォールド（折り畳み）されたタンパク質、及び新生タンパク質または未知の新生タンパク質に融合されている既知タンパク質に対して予め産生された抗体が必要であるために、その用途に限定がある。そのような手順は、時間を要し、さらにその上タンパク質の同定とキャラクタリゼーションを必要とする。さらに、抗体の産生及びアミノ酸配列はどちらも純度の高いタンパク質を必要とする。
【００１６】
ある事例では、非天然アミノ酸は、天然アミノ酸を特異的に修飾するが、アミノアシル・ｔＲＮＡの機能的活性を実質的に変化しない化学反応を使用して、ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化後、形成され得る（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ Ｎｏ． １８２； ｔＲＮＡｎｓｃｅｎｄ（商標）：非放射性翻訳検出システム、１９９３年９月）。これらの反応は、アミノアシル化後修飾として言及されている。例えば、同族ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡＬＹＳ）に結合されたリジンのε‐アミノ基は、アミン特異性光親和性標識で修飾され得た（Ｕ．Ｃ． Ｋｒｉｅｇ ｅｔ ａｌ．、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：８６０４〜０８， １９８６）。アミノアシル化後修飾のこれらのタイプは、有用ではあるが、非天然アミノ酸を新生タンパク質中に取り込むための一般的手段を供給しない。不利な点は、正常アミノ酸の誘導体である非天然アミノ酸のみが取り込まれ、ほんの少数のアミノ酸残基のみが化学的修飾を受け得る側鎖を有することである。さらに頻繁に、アミノアシル化後修飾は、その結果としてｔＲＮＡに変質を生じ、さらにｔＲＮＡに結合するアミノ酸のα‐アミノ基の非特異性修飾（例えば、ε‐アミノ基の他に）を生じることがある。この因子は、ｔＲＮＡに結合する非天然アミノ酸の取り込みの効率を低下し得る。非特異的な、ｔＲＮＡ構造のアミノアシル化後修飾は、さらにタンパク質合成におけるその参与を損なう危険性を有する。アミノ酸のα‐アミノ基が修飾されると、さらに不完全鎖形成が生じることがある。
【００１７】
他のある事例では、新生タンパク質は、特異的酵素活性、吸光あるいは蛍光のような特異的かつユニークな特性に基づいて検出し得る。このアプローチは、ほとんどのタンパク質が容易に検出し得る特別の特性を有していないために、用途に限界がある。しかし、多くの事例においては、発現タンパク質は以前にキャラクタライズ、あるいは同定さえ行われていないことがあるため、従ってその特徴的性状は未知である。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
［発明の概要］
本発明は、現在のストラテジー及びデザインに関する問題や不利点を克服し、放射性アミノ酸や他の放射性標識を使用することなく、無細胞あるいは細胞翻訳系において生成される新生タンパク質の標識、検出、定量、分析及び分離の方法を供給する。本発明による１つの実施態様は、翻訳系において翻訳される新生タンパク質検出用方法を指示する。ｔＲＮＡ分子は、蛍光マーカーでアミノアシル化され、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを創造する。このミスアミノアシル化、あるいは電荷ｔＲＮＡは、化学的、酵素的、あるいは一部化学的かつ一部酵素的技術によって形成することが可能であり、該技術は蛍光マーカーをｔＲＮＡ分子上の位置に配置して、そこから蛍光マーカーを増殖ペプチド鎖中に転移し得る。マーカーは、蛍光部位を有する天然または非天然アミノ酸、蛍光部位を有するアミノ酸類似体または誘導体、検出性標識、共役因子、あるいは蛍光部位を有するこれら成分の組み合わせを含み得る。ミスアミノアシル・ｔＲＮＡは、無細胞抽出物のような翻訳系中に導入され、該システムはインキュベートされて、蛍光マーカーが新生タンパク質中に取り込まれる。
【００１９】
本発明を特定の蛍光部分の性質に限定することは意図されていない。（例えば、ＮＨＳで）誘導体化されて可溶性となる蛍光化合物（例えば、クマリンのＮＨＳ誘導体）を含む様々な蛍光化合物が考案されている。それでもなお、高量子効率を有する多数の他のフルオロフォアと比較して、ＢＯＤＩＰＹ化合物と試薬のいくつかは、ＵＶ及び可視励起蛍光検出のために高い効率で新生タンパク質中に取り込まれ得るという、さらに重要かつまれな特性を有することが実験に基づいて発見されている。蛍光部分を利用するこれらの方法は、組換え遺伝子産物、遺伝子融合産物、ヒト遺伝子における突然変異に起因するトランケート型タンパク質、酵素、サイトカイン、ホルモン、免疫原性タンパク質、ヒトタンパク質、炭水化物と脂質結合タンパク質、核酸結合タンパク質、ウィルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生虫タンパク質及びそれらのフラグメント及び組み合わせのような新生タンパク質を、検出、分離及び定量するために使用し得る。
【００２０】
本発明による他の実施態様は、アミノ末端において新生タンパク質を標識するための方法を指示する。メチオニン開始ｔＲＮＡまたはホルミルメチオニン開始ｔＲＮＡのような、開始ｔＲＮＡ分子は蛍光部分（例えば、ＢＯＤＩＰＹ部分）によりミスアミノアシル化されて、翻訳系に導入される。この系はインキュベートされ、マーカーが新生タンパク質のアミノ末端に取り込まれる。マーカーを含む新生タンパク質を検出、分離、かつ定量することができる。マーカーあるいはマーカーの一部は、実質的に未変性立体配置のままで機能的活性である新生タンパク質から切断され得る。
【００２１】
従って、本発明は組成物、方法及びシステム（系）を考案する。組成物については、本発明はＢＯＤＩＰＹマーカーでミスアミノアシル化されたｔＲＮＡ分子を特別に考案する。
一つの実施態様では、本発明は以下を含む方法を考案する：ａ）ｔＲＮＡ分子とＢＯＤＩＰＹマーカーを供給し；さらに、ｂ）該ｔＲＮＡ分子を該ＢＯＤＩＰＹマーカーでアミノアシル化して、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを創出する。ある実施態様による方法は、さらに、ｃ）該ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを該マーカーが新生タンパク質中に取り込まれるような条件下で、翻訳系に導入することを含む。さらに他の実施態様による方法は、さらに、ｄ）該マーカーを含む該新生タンパク質を検出することを含む。また他の実施態様による方法は、さらに、ｅ）該検出された新生タンパク質を分離することを含む。
【００２２】
本発明は、化学的あるいは酵素的ミスアミノアシル化によるｔＲＮＡ分子のアミノアシル化を考案する。本発明はさらに、２またはそれ以上の異なるミスアシル化ｔＲＮＡが翻訳系に導入される実施態様を考案する。好ましい実施態様においては、（取り込まれたマーカーによって）検出された新生タンパク質は機能的に活性である。
【００２３】
本発明が新生タンパク質の特定の性質に限定されることは意図されていない。一つの実施態様においては、本発明は、新生タンパク質の全体あるいは一部をコードするｍＲＮＡメッセージに抱合する新生タンパク質の検出用方法を考案する。一般的には、翻訳後修飾、タンパク質分解、ピューロマイシンリンカーを介するオリゴヌクレオチドのタンパク質Ｃ末端への付着、及び新生タンパク質と外因的に添加されたものを含む翻訳系の他の成分との相互作用を含む、新生タンパク質の様々な修飾が創案される。
【００２４】
本発明がｔＲＮＡ分子の特定の性質に限定されることは意図していない。一つの実施態様では、ｔＲＮＡ分子は開始ｔＲＮＡ分子である。他の実施態様では、ｔＲＮＡ分子はサプレッサーｔＲＮＡ分子である。
本発明はさらにキットも考案する。一つの実施態様では、キットは、ａ）タンパク質合成系の少なくとも１成分を含む第一容器手段（例：試験管、小瓶等）；さらに、ｂ）ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを含む第二容器手段、該ｔＲＮＡがＢＯＤＰＹマーカーによりミスアミノアシル化されている、を含む。そのようなキットは、開始ｔＲＮＡ及び／またはサプレッサーｔＲＮＡを含み得る。重要なことには、このキットは、該タンパク質合成系の特定の成分に限定はされず、様々な成分（例：リボソーム）が考案されている。
【００２５】
本発明の他の実施態様は、翻訳系において翻訳される新生タンパク質検出用方法を指示する。ｔＲＮＡ分子は二元マーカーシステムの１成分によりアミノアシル化されている。このミスアミノアシル化、あるいは電荷ｔＲＮＡは、化学的、酵素的、あるいは一部化学的かつ一部酵素的技術によって形成することが可能であり、該技術は二元マーカーシステムの成分をｔＲＮＡ分子上の位置に配置して、そこからマーカー成分を増殖ペプチド鎖中に転移し得る。二元マーカーシステムの成分は、天然または非天然アミノ酸、アミノ酸類似体または誘導体、検出性標識、共役因子あるいはこれら成分の組み合わせを含み得る。ミスアミノアシル・ｔＲＮＡは、無細胞抽出物のような翻訳系に導入され、この系はインキュベートされて、マーカーが新生タンパク質中に取り込まれる。二元マーカーシステムの第二成分が次に導入され、新生タンパク質中に取り込まれた第一成分を特異的に検出可能にする。これらの方法は、組換え遺伝子産物、遺伝子融合産物、酵素、サイトカイン、ホルモン、免疫原性タンパク質、ヒトタンパク質、炭水化物と脂質結合タンパク質、核酸結合タンパク質、ウィルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生虫タンパク質及びそれらのフラグメント及び組み合わせのような新生タンパク質を、検出、分離及び定量するために使用し得る。
【００２６】
本発明を特定の翻訳系に限定することは意図していない。一つの実施態様において、無細胞翻訳系は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ溶解物、コムギ胚芽抽出物、昆虫細胞溶解物、ウサギ網状赤血球溶解物、カエル卵母細胞溶解物、イヌ膵臓溶解物、ヒト細胞溶解物、精製あるいは半精製翻訳因子の混合物及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。また、本発明が使用する特定の反応条件に限定されることも意図されていない。しかし、典型的には無細胞翻訳系は、約２５℃〜約４５℃の温度でインキュベートされる。本発明は、連続フローシステムあるいは透析システムのどちらも考案する。
【００２７】
本発明による他の実施態様は、検出可能な電磁スペクトル特性を有する非放射性マーカーを使用する、細胞または無細胞翻訳系において翻訳された新生タンパク質検出用の方法を指示する。前述のように、非放射性マーカーはｔＲＮＡ分子にミスアミノアシル化され、このミスアミノアシル・ｔＲＮＡが翻訳系に添加される。マーカーを新生タンパク質中に取り込むために系はインキュベートされる。マーカーを含む新生タンパク質は、マーカーの特異的電磁スペクトル特性により検出され得る。新生タンパク質はさらに、これらのマーカーのユニークな特性を利用したり、電気泳動法、ゲル濾過法、高圧あるいは高速高圧液体クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ（親和力クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、化学的抽出法、磁性ビーズ分離法、沈降法あるいはこれら技術の組み合わせにより分離され得る。
【００２８】
本発明による他の実施態様は、レポーター特性を有するマーカーを含み、レポーターが第二因子と接触される際に、新生タンパク質の合成を指示する。レポーターマーカーは、ペプチドに取り込まれると検出可能な電磁スペクトル特性を有し、さらにそのスペクトル特性は取り込まれなかったマーカーやｔＲＮＡ分子に付着されたマーカーと識別可能である化学部分である。前述のように、ｔＲＮＡ分子は、今回はレポーターマーカーを使用して、ミスアミノアシル化される。ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを翻訳系に添加して、さらにペプチド中にマーカーを取り込むためにインキュベートする。レポーターマーカーは、タンパク質翻訳プロセスを調査し、タンパク質合成系の他の成分から予め分離することなしに、新生タンパク質を検出及び定量するために使用し得る。
【００２９】
本発明による他の実施態様は、細胞あるいは無細胞翻訳系において、マーカーの存在下で翻訳、分離さらに必要に応じて精製された新生タンパク質から成る組成物を指示する。組成物はさらに、薬学的受容性のあるキャリア（担体）を含み、ワクチンのような免疫学的活性組成物、あるいはヒト及び他の哺乳類に使用するための薬物のような薬学的活性組成物として利用され得る。
【００３０】
本発明による他の実施態様は、質量分析の使用による、翻訳系で翻訳される新生タンパク質検出用方法を指示する。質量が既知である非放射性マーカーが、ｔＲＮＡ分子にミスアミノアシル化され、このミスアミノアシル・ｔＲＮＡが翻訳系に添加される。質量マーカーを新生タンパク質中に取り込むために系をインキュベートする。翻訳系の質量スペクトルを次に測定する。新生タンパク質の存在は、未修飾タンパク質の質量と、新生タンパク質に加えてマーカーの質量を含む修飾アミノ酸の質量に対応する高質量位置にある第二バンドに対応する、タンパク質合成系の質量スペクトルのピークを識別することにより直接検出し得る。質量マーカーが光開裂性である場合は、質量マーカーを含む新生タンパク質に対する第二バンドの割り当ては、光線によりマーカーを除去することにより確証し得る。
【００３１】
本発明による他の実施態様は、翻訳系において翻訳される突然変異を有する新生タンパク質を検出する方法を指示する。起こり得る突然変異を含む可能性のあるタンパク質をコードするＲＮＡまたはＤＮＡを、翻訳系に添加する。新生タンパク質を合成するために系をインキュベートする。タンパク質のＮ末端またはその近隣に位置するアフィニティー（親和性）マーカーを使用して、新生タンパク質を次に翻訳系から分離する。タンパク質を次に、タンパク質のＮ末端またはその近隣に位置する検出マーカー（Ｎ末端マーカー）の存在下で分析する。タンパク質のＣ末端またはその近隣に位置する配列依存性検出マーカー（Ｃ末端マーカー）上で、別の測定を行う。次に、新生タンパク質におけるＮ末端とＣ末端マーカーの取り込み度の比較を行う。本発明をＮ及びＣ末端マーカーの性質、あるいは使用するアフィニティーマーカーのタイプによって限定することは意図していない。様々なマーカーが考案されている。一つの実施態様では、アフィニティーマーカーは、抗体または他の結合性分子により認識されるエピトープを含む。一つの実施態様では、Ｎ末端マーカーは蛍光マーカー（例：ＢＯＤＩＰＹマーカー）を含み、Ｃ末端マーカーは金属結合領域（例：Ｈｉｓタグ）を含む。
【００３２】
本発明は、３つのマーカー（例：Ｎ末端マーカー、Ｃ末端マーカー、アフィニティーマーカー）を新生タンパク質中に導入する様々な方法を考案する。一つの実施態様による方法は、ａ）ｉ）タンパク質合成を開始するために働く第一ＡＵＧコドンのみを認識し、かつ第一マーカーを含むミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡ分子、及びｉｉ）アフィニティーマーカー及びＣ末端マーカーを含むタンパク質をコードする核酸鋳型を供給すること；ｂ）該ミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡを、新生タンパク質が発生され、該タンパク質が該第一マーカー、該Ｃ末端マーカー及び（ある実施態様では）該アフィニティーマーカーを含むような条件下で、該鋳型を含む翻訳系に導入することを含む。一つの実施態様による方法は、ステップｂ）の後に、該新生タンパク質の分離をさらに含む。
【００３３】
他の実施態様による方法は、ａ）ｉ）タンパク質合成を開始するために働く第一ＡＵＧコドンのみを認識し、かつ第一マーカーを含むミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡ分子、及びｉｉ）アフィニティーマーカー及びＣ末端マーカーを含むタンパク質をコードする核酸鋳型を供給すること；ｂ）該ミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡを、新生タンパク質が発生され、該タンパク質が該タンパク質のＮ末端にある該第一マーカー、該Ｃ末端マーカー及び（ある実施態様では）該第一マーカーに隣接する該アフィニティーマーカーを含むような条件下で該鋳型を含む翻訳系に導入することを含む。一つの実施態様による方法は、ステップｂ）の後に、該新生タンパク質の分離をさらに含む。
【００３４】
さらに他の実施態様による方法は、ａ）ｉ）タンパク質合成を開始するために働くようにデザインされた第一コドンのみを認識、かつ第一マーカーを含むミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡ分子、及びｉｉ）アフィニティーマーカー及びＣ末端マーカーを含むタンパク質をコードする核酸鋳型を供給すること；ｂ）該ミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡを、新生タンパク質が発生され、該タンパク質が、該第一マーカー、該Ｃ末端マーカー及び（ある実施態様では）該アフィニティーマーカーを含むような条件下で該鋳型を含む翻訳系に導入することを含む。一つの実施態様による方法は、ステップｂ）の後に、該新生タンパク質の分離をさらに含む。
【００３５】
さらに他の実施態様による方法は、ａ）ｉ）タンパク質合成を開始するために働くようにデザインされた第一コドンのみを認識、かつ第一マーカーを含むミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡ分子、及びｉｉ）アフィニティーマーカー及びＣ末端マーカーを含むタンパク質をコードする核酸鋳型を供給すること；ｂ）該ミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡを、新生タンパク質が発生され、該タンパク質が、該タンパク質のＮ末端にある該第一マーカー、Ｃ末端マーカー及び（ある実施態様では）該第一マーカーに隣接する該アフィニティーマーカーを含むような条件下で該鋳型を含む翻訳系に導入することを含む。一つの実施態様による方法は、ステップｂ）の後に、該新生タンパク質の分離をさらに含む。
【００３６】
本発明はさらに、２つのマーカーのみが使用される（例えば、Ｎ末端マーカーとＣ末端マーカー）実施態様をも考案する。一つの実施態様では、新生タンパク質が、アフィニティーマーカによる特異的相互作用によるよりは、固体支持体（例：ビーズ、マイクロウェル、ストリップ等）に非特異的に結合されている。この文脈において、「非特異性」結合とは、結合が新生タンパク質配列の独自性によって行われないことを示すこと意味する。そのかわり、結合は電荷相互作用による。 一つの実施態様では、本発明は、固体支持体の表面上に新生タンパク質を捕獲するために、固体支持体が修飾されること（例えば、表面の電荷を変化させるために機能化する）を考案する。一つの実施態様では、固体支持体はポリ‐Ｌ‐リジンコートである。さらに他の実施態様では、固体支持体は、ニトロセルローズ（例：ストリップ、マイクロウェルを含むニトロセルローズ等）である。固体支持体の特定の性質に関わらず、本発明は、２つのマーカーを含む新生タンパク質が、マーカーの即時検出を許すような条件下で、捕獲されることを考案する。
【００３７】
前記に説明する２マーカー及び３マーカー実施態様のどちらにおいても、本発明は、１またはそれ以上のマーカーを、プライマー延長あるいはＰＣＲにより核酸鋳型中に導入することを考案する。一つの実施態様では、本発明は、（５’端上またはその付近に）プロモーターを含むプライマー、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、及び開始コドン（例：ＡＴＧ）を、鋳型に対する相補性領域と共に考案する。他の実施態様では、本発明は、（５’端上またはその付近に）プロモーター、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、開始コドン（例：ＡＴＧ）、アフィニティーマーカーコード領域、及び鋳型に対する相補性領域を考案する。本発明を相補性領域の長さによって限定することは意図していない；好ましくは、該領域は長さが８塩基以上であり、より好ましくは長さが１５塩基以上であり、長さが２０塩基以上であることがさらに好ましい。
【００３８】
本発明がリボソーム結合部位によってに限定されることは意図していない。一つの実施態様では、本発明は、翻訳前に存在し、真核細胞において転写かつ翻訳される大多数のｍＲＮＡで最初のＡＴＧを開始する、非ランダムヌクレオチドのストリングであるＫｏｚａｋ配列（共通配列：５’−ＧＣＣＡ／ＧＣＣＡＴＧＧ−３’）（配列番号１）を含むプライマーを考案する。Ｍ． Ｋｏｚａｋ、 Ｃｅｌｌ ４４：２８３〜２９２ （１９８６）を参照のこと。他の実施態様では、本発明は通常は、通常は、翻訳開始コドン：ｍＲＮＡ５’−ＵＡＡＧＧＡＧＧＵ − Ｎ５−１０ − ＡＵＧ． （配列番号３）のすぐ５’に発見され、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ （ＳＤ）配列として知られているポリプリンドメインＵＡＡＧＧＡＧＧＵ （配列番号２）の一部または全てを含む、原核細胞ｍＲＮＡリボソーム結合部位を含むプライマーを考案する。
【００３９】
ＰＣＲには、２プライマーが使用される。一つの実施態様では、本発明は、フォワードプライマーとして、（５’端上またはその付近に）プロモーターを含むプライマー、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、及び開始コドン（例：ＡＴＧ）を、鋳型に対する相補性領域と共に考案する。他の実施態様では、本発明は、フォワードプライマーとして、（５’端上またはその付近に）プロモーターを含むプライマー、リボソーム結合部位（「ＲＢＳ」）、開始コドン（例：ＡＴＧ）、アフィニティーマーカーコード領域、及び鋳型に対する相補性領域を考案する。本発明は、一つの実施態様では、（５’端上またはその付近に）１またはそれ以上の終止コドンと（ＨＩＳタグのような）Ｃ末端マーカーをコードする領域含むリバースプライマーを考案する。
【００４０】
本発明による他の実施態様は、電気泳動（例：毛管電気泳動）によって翻訳系において翻訳される新生タンパク質と分子の相互作用を検出するための方法を指示する。検出マーカーでミスアミノアシル化されたｔＲＮＡがタンパク質合成系に添加される。検出マーカーを新生タンパク質中に取り込むために系をインキュベートする。１またはそれ以上の特定分子を、次に新生タンパク質に（分離前あるいは分離後に）併合して、新生タンパク質／分子抱合体を含む混合物を形成する。この混合物のアリコートを次に毛管電気泳動にかける。新生タンパク質／分子抱合体は、取り込まれたマーカーを有する新生タンパク質の電気泳動の易動度の変化を検出することにより同定される。
【００４１】
本発明はさらに、前記に説明する方法と組成物を、薬物／プロテオームのスクリーニング用方法において使用することを考案する。例えば、本発明は、（薬物のような）リガンドと相互作用するタンパク質またはタンパク質の一部を同定する方法を考案し、該方法は、該所望するタンパク質を発現する細胞からｃＤＮＡライブラリーを調製するステップを含み；該ｃＤＮＡライブラリーを、発現ベクター中に挿入し、これによって、発現ｃＤＮＡライブラリーを形成し；該発現ライブラリーを細菌細胞中に形質転換して、さらに該細菌細胞を培養して個別の細菌コロニーを生産し；各コロニーが該発現ライブラリーの１メンバーを含み；既定数の該個別細菌コロニーから成るプールを収集し；細菌コロニーの該プールからｃＤＮＡを分離し；該ｃＤＮＡによりコードされるタンパク質（あるいはタンパク質の一部）を発現して；さらに所望するタンパク質（あるいはその一部）と所望する該タンパク質（またはその一部）をコードするｃＤＮＡを同定し；約５０個の個別細菌コロニーのプールを収集し（より好ましくは５０個以下、さらにより好ましくは４０個以下、さらには３０個以下、さらに最も好ましくは２５個以下であるが１０個以上）、各コロニーが発現ｃＤＮＡライブラリーの１メンバーを含み、これによりｃＤＮＡプールを形成し；さらに該ｃＤＮＡプールのｃＤＮＡでコードされるタンパク質（あるいはその一部）を、普通の反応混合物中にあるインビトロ転写／翻訳系において発現し、従って、該反応混合物から所望するタンパク質（またはその一部）を同定する。
【００４２】
本発明による他の実施態様及び利点は、一部は以下の説明において提示され、さらに一部は、本説明により明らかであるか、あるいは本発明の実施から習練され得る。
［定義］
本発明の理解を容易とするために、多数の術語を以下に定義する。
【００４３】
術語「遺伝子」は、ポリペプチドまたは前駆物質の生産のために必要な制御及びコード配列を含むＤＮＡ配列を言及する。ポリぺプチドは、全長コード配列、あるいは所望する酵素活性が保有されている限り、コード配列の一部によってコードされ得る。
術語「野生型」は、天然発生原料から分離された際にその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を言及する。野生型遺伝子は、集団内で最も頻繁に観察される遺伝子であり、従って、遺伝子の「正常」あるいは「野生型」形状が随意にデザインされている。対照的に、術語「修飾」または「突然変異体」とは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較すると、配列及び／または機能特性における修飾（すなわち、変更特徴）を呈示する遺伝子または遺伝子産物を言及する。天然発生突然変異体を分離することが可能であることが注目されており、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較する際に変更された特性を有する事実によりこれらは同定される。
【００４４】
術語「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用されるように、２またはそれ以上、好ましくは３以上、さらに通常では１０以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む分子として定義される。正確なサイズは、多数の因子に依存し、またこれはオリゴヌクレオチドの究極の機能または用途に基づく。オリゴヌクレオチドは、化学合成、ＤＮＡ複製、逆転写、あるいはそれらの組み合わせを含む、いずれの方法でも生成することが可能である。
【００４５】
モノヌクレオチドが反応して、一つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、一方向にリン酸ジエステル結合を介してそれに隣接する３’酸素に付着するような方式でオリゴヌクレオチドを作製し、５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に結合していない場合は、オリゴヌクレオチドの一端は「５’端」として言及され、さらにその３’酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸と結合していない場合は、「３’端」と言及される。本明細書に使用されるように、核酸配列は、それが分子内から大型オリゴヌクレオチドであっても、５’及び３’端を有し得る。
【００４６】
術語「プライマー」は、プライマー延長が開始されるような条件下に置かれる際に、合成開始のポイントとして作用することが可能であるオリゴヌクレオチドを言及する。オリゴヌクレオチド「プライマー」は、天然に、精製された制限消化として生じ、あるいは人工的に生産され得る。
プライマーは、３’端上に、鋳型の特定配列のストランド（鎖）と「実質的」に相補性である領域を有するように選択される。プライマー延長を生じるためには、プライマーは、鋳型ストランドとハイブリダイズするに十分なだけ相補性でなければならない。プライマー配列は、鋳型と全く同一配列である必要はない。例えば、プライマー配列の残り部分が実質的にストランドと相補性であれば、非相補性ヌクレオチドフラグメントが、プライマーの５’端に付着し得る。プライマー配列が、鋳型配列とハイブリダイズするために十分な相補性を有し、それによってプライマーの延長生成物の合成のための鋳型プライマー複合体を形成するならば、非相補性塩基あるいはより長い配列がプライマー中に散在してもよい。
【００４７】
本明細書中に使用されるように、術語「ハイブリダイズ」及び「ハイブリダイゼーション」は、ターゲット核酸に対して相補性配列をアニーリングすることを言及する。相補性配列を含む核酸の２ポリマーがお互いを見つけだして、塩基対合相互作用を通してアニールする能力は、既に認識されている現象である。Ｍａｒｍｕｒ 及び Ｌａｎｅ、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４６：４５３ （１９６０） 及び Ｄｏｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４６：４６１ （１９６０）。
【００４８】
術語「アニールされた」及び「ハイブリダイズされた」の使用は互換性があり、部分的相補性のみを有する領域の結合を含む、オリゴヌクレオチドとターゲット核酸間の特定かつ再現可能な相互作用を含むことが意図されている。
本明細書で使用される核酸配列の補体は、一つの配列の５’端が他の配列の３’端と対合されるように核酸配列と整列される際に、「アンチパラレル（逆平行）会合」状態にあるオリゴヌクレオチドを言及する。天然核酸には通常発見されない一定の塩基が、本発明による核酸に含まれることがあり、例えば、イノシン及び７‐デアザグアニンを含む。相補性は、完全である必要はなく、安定二重鎖がミスマッチ塩基対やマッチしない塩基を含んでもよい。核酸テクノロジー分野の当業者は、二重鎖の安定性を、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成及びオリゴヌクレオチドの配列、イオン強度及びミスマッチ塩基対のインシデンス（頻度）を含む、多数の変数を考慮して経験的に決定することができる。
【００４９】
核酸二重鎖の安定性は、融解温度、あるいは「Ｔｍ」により測定される。特定された条件下でのその核酸二重鎖のＴｍは、塩基対の平均半分が解離する温度である。
本明細書で使用される術語「プローブ」は、プローブ中の少なくとも一つの配列と他方の核酸中の配列との相補性または再現性のある誘引相互作用による他の手段ために、他の核酸配列中の配列との二重鎖構造または他の複合体を形成するオリゴヌクレオチドを言及する。
【００５０】
「遺伝子配列とマッチするまたは相補性のあるオリゴヌクレオチドプライマー」は、単鎖または二重鎖核酸の鋳型依存性合成を促進することが可能であるオリゴヌクレオチドプライマーを言及する。遺伝子配列にマッチするまたは相補性のあるオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲなどにおいて使用し得る。前記に記載のように、オリゴヌクレオチドプライマーは、ターゲットまたは鋳型配列と完全に相補性である必要はない。鋳型依存性合成による伸長が可能なように、プライマーは鋳型と十分な相互作用を有することのみを必要とする。
【００５１】
本明細書で使用されるように、術語「ポリヒスチジントラクト」または（ＨＩＳタグ）は、新生タンパク質のアミノまたはカルボキシル末端のいずれかに、２〜１０ヒスチジン残基が存在することを言及する。６〜１０残基から成るポリヒスチジントラクトが好ましい。ポリヒスチジントラクトは、所望するタンパク質に加えられ、結果生じるタンパク質のニッケル・キレートカラム上でのアフィニティー精製、または他の分子（例えば、ＨＩＳタグと反応性のある抗体）との相互作用を通してタンパク質末端の同定を可能とする、連続ヒスチジン残基数として機能的定義もされる。
【００５２】
［発明の説明］
本明細書に具体化及び説明するように、本発明は、新規または新生タンパク質合成による産物の非放射性標識及び検出方法、かつ細胞または無細胞翻訳系において既存するタンパク質からそれらの新生タンパク質の分離方法を含む。放射性標識が使用されないため、廃棄物処理のため遵守されるべき特定の規定はない。放射性標識を使用する際に生じる、翻訳産物のそれ以上の利用を阻止するような放射能の危険性やリスクがなく、従って結果生じるタンパク質産物を直接的あるいはさらに精製して使用し得る。さらに、例えば、ユニークなサプレッサーｔＲＮＡを含む、タンパク質配列または構造に関する既存の知識は必要ない。さらに、遺伝子またはｍＲＮＡの配列は決定される必要がない。その結果、ｍＲＮＡのコード領域におけるナンセンスコドンや特定コドンのいずれの存在も必要ではない。指定の標識についての特定のｔＲＮＡを含む、いずれのｔＲＮＡも使用することが可能であるが、そのような特異性は必要ではない。翻訳後標識とは異なり、新生タンパク質は、特異性により標識され、タンパク質構造や機能を影響する可能性がある翻訳後修飾を受けることがない。
【００５３】
本発明による１つの実施態様は、翻訳系において合成される新生タンパク質を標識するための方法を指示する。これらのタンパク質は、ペプチド鎖中に取り込まれる検出マーカーを伴って合成されることにより標識される。ｔＲＮＡ分子にアミノアシル化されるマーカーは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体または誘導体、または化学的部分を含み得る。これらのマーカーは、翻訳プロセス中に、その結果生じるミスアミノアシル・ｔＲＮＡから新生タンパク質中に導入される。アミノアシル化は、それによってｔＲＮＡが電荷されるプロセスである。本プロセスがインビボで起こる際は、天然アミノアシル化と言及され、その結果生じる産物は、天然アミノ酸で電荷されたアミノアシル・ｔＲＮＡである。本プロセスが人工的手段を介して生じる際は、ミスアミノアシル化と称され、天然アミノ酸以外で電荷されるｔＲＮＡはミスアミノアシル・ｔＲＮＡと言及される。
【００５４】
本方法に従って、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡは、細胞または無細胞タンパク質合成系、その翻訳系中に導入され、そこで、タンパク質合成の間に増殖ペプチド鎖中で天然アミノ酸の代わりに検出マーカーを取り込むように機能する。この翻訳系は、ＲＮＡ及び酵素、翻訳、開始及び延長因子、さらに化学的試薬を含むマクロ分子を含む。該系のＲＮＡは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）及びトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の３つの分子形であることを必要とする。ｍＲＮＡは、そのコドン配列内にコードされるペプチドを構築するための遺伝情報を担う。ｔＲＮＡは、ｍＲＮＡを解読する特定のアンチコドンを含み、増殖ペプチド鎖に沿う位置中に個別にアミノ酸を運ぶ。ｒＲＮＡとタンパク質の複合体である、リボソームは、トランスロケーションを含む、翻訳プロセスが進行する動的構造フレームワークを供給する。細胞内では、個別化されたアミノアシル・ｔＲＮＡシンテターゼが、特定のアミノ酸をマッチするアンチコドンを担うｔＲＮＡ分子に結合して、アミノアシル化プロセスにより、アミノアシル化あるいは電荷ｔＲＮＡを創出する。アミノアシル化または電荷ｔＲＮＡ分子を含む翻訳プロセスは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ（分子細胞生物学）（Ｊ． Ｄａｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．編集、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、 Ｎ．Ｙ．、 Ｎ．Ｙ． １９９１）に説明されており、本明細書に参考文献として特に編入されている。アミノアシル化は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体または誘導体、あるいは検出性化学物質または共役因子のような他の分子を利用する、天然または人工的手段であり得る。結果生じるミスアミノアシル・ｔＲＮＡは、化学的部分、非天然アミノ酸、アミノ酸誘導体または類似体、あるいは他の検出性化学物質と結合する天然アミノ酸を含む。これらのミスアミノアシル・ｔＲＮＡは、そのマーカーを翻訳中に増殖ペプチド鎖の中に取り込み、マーカーの存否によって検出及び分離し得る標識新生タンパク質を形成する。
【００５５】
細胞または無細胞翻訳系中での翻訳により発現され得るいずれのタンパク質も、新生タンパク質であり、従って、本発明による方法により標識、検出かつ分離され得る。そのようなタンパク質の実例は、タンパク質分解性タンパク質のような酵素、サイトカイン、ホルモン、免疫原性タンパク質、炭水化物または脂質結合タンパク質、核酸結合タンパク質、ヒトタンパク質、ウィルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生虫タンパク質及びフラグメントかつその組み合わせを含む。そのような遺伝子を担う組み換えベクターは一般的に、かなり高レベルでｍＲＮＡを転写する強力なプロモーターを担っているために、これらの方法は、組み換え型遺伝子産物及び遺伝子融合産物の検出によく応用される。これらのｍＲＮＡは、翻訳系において容易に翻訳される。
【００５６】
翻訳系は、細胞または無細胞であってもよく、まさらに原核性または真核性であってもよい。細胞翻訳系は、透過化細胞または細胞培養のような全細胞調製物を含み、そこで所望する核酸配列はｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡが翻訳され得る。
無細胞翻訳系は、市販されており、様々な異なるタイプ及びシステムがよく知られている。無細胞システムの実例は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）溶解物のような原核性溶解物、さらにコムギ胚芽抽出物、昆虫細胞溶解物、ウサギ網状赤血球、カエル卵母細胞溶解物及びヒト細胞溶解物のような真核性溶解物を含む。結果生じるタンパク質がグリコシル化、リン酸化または別な方法で修飾されている場合は、多数のそのような修飾は真核系でのみ可能であるために、真核性抽出物または溶解物が好ましいであろう。これらの抽出物及び溶解物のいくつかは、市販されており入手可能である（Ｐｒｏｍｅｇａ； Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ； Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ； Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ； Ａｍｅｒｓｈａｍ；Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ； ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ； Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）。ミクロソーム膜を含むイヌ膵臓溶解物のような、膜性抽出物もまた入手が可能であり、分泌型タンパク質の翻訳に有用である。精製翻訳因子の混合物もまた、溶解物、または開始因子‐１（ＩＦ−１）、ＩＦ−２、ＩＦ−３（α または β）、延長因子Ｔ（ＥＦ−Ｔｕ）、あるいは終止因子のような精製翻訳因子を補充した溶解物の組み合わせと同様に、タンパク質中にｍＲＮＡを翻訳する目的に使用され成功を収めている。
【００５７】
無細胞システムはまた転写／翻訳系と共役させることができ、そこでＤＮＡが系に導入され、ｍＲＮＡ中に転写され、さらにｍＲＮＡが、本明細書に特に参考文献として編入している、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （分子生物学における現代のプロトコル）（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ． 編集、 Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、 １９９３）に説明されているように、翻訳される。真核性転写系に転写されたＲＮＡは、ヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）または５’端キャップ（７‐メチルグアノシン）及び３’端ポリＡテール成熟ｍＲＮＡの形状のことがあり、これはある翻訳系では利点となり得る。例えば、ｍＲＮＡキャップは、網状赤血球溶解物系では高い効率で翻訳される。
【００５８】
マーカーによるミスアミノアシル化のために選択されるｔＲＮＡ分子は、タンパク質合成系中で機能する能力以外は特別の特性を有する必要はない。生体系におけるタンパク質翻訳系の普遍性のために、大量数のｔＲＮＡが、細胞及び無細胞反応混合物のどちらにも使用され得る。ナンセンスまたはアンバーコドン（ＵＡＧ）のようなユニークなコドンを認識する特定のｔＲＮＡ分子は、必要とされない。
【００５９】
非天然性類似体のタンパク質への翻訳中の部位特異性取り込みもまた必要ではない。マーカーの取り込みはポリペプチドのどこで生起されてもよく、また複数の位置で生起してもよい。これは翻訳されたｍＲＮＡの遺伝的配列に関する情報を予め得る必要性、またはこの遺伝的配列を修飾する必要性を排除する。
ある場合は、新生タンパク質の機能的特性を保存することが望ましいことがある。タンパク質機能または構造を妨害しない部位にマーカーを取り込むｔＲＮＡのサブセットを選択することが可能である。ポリペプチドのアミノまたはカルボキシル末端のアミノ酸は、機能や構造を実質的に変更しない。マーカーでミスアミノアシル化された際に、タンパク質翻訳開始のための万能コドン（ＡＵＧ）を認識するｔＲＮＡ分子は、アミノ末端にマーカーを配置する。原核性タンパク質合成系は、開始ｔＲＮＡｆＭｅｔ 分子を利用し、真核性系は、開始ｔＲＮＡＭｅｔ 分子を利用する。いずれの系においても、開始ｔＲＮＡ分子は、マーカー、レポーターまたはアフィニティー特性を有する非天然アミノ酸またはアミノ酸類似体または誘導体であり得るマーカーでアミノアシル化される。結果生じる新生タンパク質は、アミノ末端でのみ標識されるが、内部に配置されたマーカーはタンパク質の構造的または機能的状況を必ずしも破壊しない。例えば、ｔＲＮＡＬＹＳ は、タンパク質の機能や構造を妨害しないアミノ酸誘導体である、ダンシルリジンでミスアミノアシル化され得る。さらに、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを限定量使用することにより、極めて僅かな量のみがマーカーで標識された新生タンパク質を検出及び分離することが可能であり、これは大量のマーカーの影響が有害であったり、未知な場合のタンパク質分離に極めて有効である。
【００６０】
アミノアシル化に使用するｔＲＮＡ分子は、多数の製造元から市販されており、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌）、イースト、仔ウシ肝臓及びコムギ胚芽細胞を含む原料から既知の方法により調製され得る（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ； Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ； Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）。その分離と精製は、主として細胞分解、フェノール溶出、さらにＤＥＡＥ‐セルロース上のクロマトグラフィーを含む。アミノ酸特異的ｔＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡｆＭｅｔは、クローンされた遺伝子からの発現により分離され、ホスト細胞中で過剰発現され、さらに分離用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、次にバンド切除及び高収率かつ純度溶出のような技術により全ｔＲＮＡから分離される（Ｓｅｏｎｇ 及び ＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：３３４〜３３８、 １９８７）。ランオフ転写は、いずれのｔＲＮＡも高純度で生産することを可能とするが、翻訳後修飾を欠如するために、その適用には限りがある（Ｂｒｕｃｅ 及び Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：３９２１、 １９８２）。
【００６１】
ミスアミノアシル・ｔＲＮＡは、細胞あるいは無細胞タンパク質合成系中に導入される。無細胞タンパク質合成系においては、反応混合物は、リボソーム、ｔＲＮＡ、 ｒＲＮＡ、スパーミジン及び適切な濃度と適切なｐＨであるマグネシウム及びカリウムのような生理学的イオンを含む、タンパク質合成をサポートするために必要な全ての細胞成分を含む。反応混合物は、一般的には、コムギ胚芽、Ｅ． ｃｏｌｉ （Ｓ−３０）、赤血球（網状赤血球溶解物）及び卵母細胞を含む多数の様々な原料に由来し、いったん作製したものは、アリコートとして、約＋４０℃〜−７０℃の温度で保存し得る。そのような反応混合物調製の方法は、Ｊ．Ｍ． Ｐｒａｔｔ （Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（転写と翻訳）、 Ｂ．Ｄ． Ｈａｍｅｓ 及び Ｓ．Ｊ． Ｈｉｇｇｉｎｓ、編集、 ｐ． ２０９、 ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、 Ｏｘｆｏｒｄ、 １９８４）によって説明されており、参考文献として本明細書に編入されている。多数の異なる翻訳系が、多数の製造元から市販されている。
【００６２】
ミスアミノアシル・ｔＲＮＡは、容量と濃度を既定した溶液として、反応混合物中に直接に添加される。これは、反応混合物を−７０℃で保存する直前に行うことができ、その場合は、タンパク質合成開始前に総混合物が解凍される。あるいは、これはタンパク質合成開始前に行うことができる。新生タンパク質中へのマーカーの効率的な取り込みは、最終ｐＨ及びマグネシウムイオン濃度に感受性がある。反応混合物は、通常では約ｐＨ６．８で、約３ｍＭのマグネシウムイオン濃度を含む。これらの条件は、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡの塩基不安定性であるアミノアシル結合に安定性を分与する。アミノアシル・ｔＲＮＡは、翻訳抽出物から十分な量で得ることが可能である。マーカーで電荷されたミスアミノアシル・ｔＲＮＡは、約１．０μｇ ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約１０μｇ ／ｍｌ 〜約５００μｇ／ｍｌ、さらに好ましくは約１５０μｇ ／ｍｌの濃度で添加される。
【００６３】
タンパク質合成の開始は、一定量のｍＲＮＡまたはＤＮＡのミスアミノアシル・ｔＲＮＡを含む反応混合物中への添加時に起こる。ｍＲＮＡ分子は組み換え型原料から調製または獲得されるか、またはポリ‐ｄＴクロマトグラフィーのような手順により他の細胞から精製され得る。反応混合物成分の正しい比率を確実にするための一つの方法は、バイアル（小瓶）や標準マイクロ遠心分離用試験管のような便利な容器内に保存された既定容量を使用することである。例えば、新生タンパク質をコードするＤＮＡ及び／またはｍＲＮＡ及びミスアミノアシル・ｔＲＮＡ溶液を適切な量をプレミックスして、試験管内に分けて保存される。タンパク質合成を開始する必要のある際に、試験管（内容物）を混合する。
【００６４】
無細胞系における翻訳は、一般的には、成分をある一定の期間インキュベートする必要がある。インキュベーション時間は、約５分〜数時間にわたり、しかし好ましくは、約３０分〜約５時間、さらに好ましくは、約１〜３時間である。インキュベーションは、連続フローシステムを使用して、試薬が系中に流入し、さらに新生タンパク質が取り出されるかまたはそのまま蓄積するような連続的方法で実施され得る（Ａ．Ｓ． Ｓｐｉｒｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉ． ２４２：１１６２〜６４、１９８８）。本プロセスは、新生タンパク質の大規模生産のために望ましいであろう。インキュベーションは、透析膜によって翻訳系の多量成分から分離されている外側リザーバー中にある翻訳系のために、消耗性試薬が利用できる透析系を使用して実施することもできる［Ｋｉｍ， Ｄ．及び Ｃｈｏｉ， Ｃ． （１９９６） Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ １２、 ６４５〜６４９］。インキュベーション時間は、翻訳ミックスの量とインキュベーション時間に応じて大きく変化する。インキュベーション温度は、約４℃〜約６０℃、また好ましくは約１５℃〜約５０℃、さらに好ましくは約２５℃〜約４５℃、また約２５℃〜約３７℃であることがさらに好ましい。あるマーカーは、温度変化に感受性があり、そのような場合は、そのようなインキュベーションは非感受性温度領域で行うことが好ましい。翻訳ミックスは、典型的には、溶液のｐＨを約６〜８に、好ましくは約７に維持するために、トリス・塩酸、Ｈｅｐｅｓのような緩衝液、あるいは他の適切な緩衝剤を含む。さらに、あるマーカーは、ｐＨ感受性があり、そのような場合は、マーカーの感受性領域以外のｐＨでインキュベーションを行うことが好ましい。翻訳の効率は最適ではないかもしれないが、マーカーの利用度は向上されるだろう。翻訳系に含み得る他の試薬は、還元剤としてジチオトレイトール（ＤＴＴ）または２‐メルカプトエタノール、ＲＮＡ破壊を抑制するためにＲＮａｓｉｎ、さらに翻訳プロセスへの化学エネルギー供給のためのヌクレオシド三リン酸塩またはクレアチンリン酸塩及びクレアチンキナーゼを含む。
【００６５】
細胞タンパク質合成において、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡまたはマーカーを、無傷細胞、細胞オルガネラ、細胞エンベロープ及び無傷の生体膜によって結合されており、タンパク質合成システムを含んでいるその他の散在する容積中に導入する必要がある。これは、ｔＲＮＡ溶液をリポソームあるいは細胞との融合を誘導し得る特徴を有するベシクル内に封入するような既に確立されている様々な方法を介して達成し得る。融合はｔＲＮＡを含むリポソームやベシクル内部の溶液を細胞中に導入する。他方、ある細胞は、ファゴサイトーシス（食作用）によって、リポソームを内部細胞質中に能動的に取り込む。ｔＲＮＡ溶液はさらに、リポフェクションを仲介する陽イオン性洗浄剤によるプロセス（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：７４１３〜１７， １９８７）によって導入、または卵母細胞のような大型細胞中に注入され得る。注入は、マイクロピペットによる直接灌流、あるいは電気穿孔法による。
【００６６】
他方、低張媒体中にある低濃度の洗浄剤を含む溶液中で短時間インキュベートすることにより細胞を透過化し得る。有用な洗浄剤は、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ ４０ （ＮＰ４０）、 Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ （ＴＸ−１００）またはデオキシコール酸塩を、約０．０１ｎＭ 〜１．０ｍＭ、好ましくは約０．１μＭ〜約０．０１ｍＭ、さらにより好ましくは約１μＭの濃度で含む。透過化細胞は、マーカーを変質することなく細胞膜を通過させ、ホスト細胞酵素によって新生タンパク質中に取り込まれることを可能にする。そのような系は、細菌細胞、初代細胞、不死細胞株、ヒト細胞または混合細胞集団のような培養中の無傷細胞から形成され得る。これらの細胞は、例えば、強力かつある場合は調節プロモーターの制御下で、所望の遺伝子を含む適切なベクターによって形質移入され得る。メッセージはこれらのベクターから発現され、引き続いて細胞内で翻訳される。既に非放射性マーカーで電荷された無傷ミスアミノアシル・ｔＲＮＡ分子は、細胞中に導入され、また翻訳産物中に取り込まれ得る。
【００６７】
新生タンパク質検出のためのミスアミノアシル化用途の一つの実例の概略を、図４に提示する。ｔＲＮＡ分子は、ＵＶ（紫外線）照射によって励起されると強い蛍光性となるマーカーでミスアミノアシル化される。このミスアミノアシル・ｔＲＮＡは、次に無細胞タンパク質合成抽出物中に導入され、マーカー類似体を含む新生タンパク質が生産される。無細胞抽出物中のタンパク質は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって分離される。結果生じるゲルは、無細胞抽出物中に存在する全てのタンパク質に対応するバンドを含む。新生タンパク質は、ゲルのＵＶ照射時に、マーカーを含むタンパク質に対応するバンドからの蛍光の検出により同定される。検出は、目視観察、あるいは蛍光検出の他の従来の手段によって行うことができる。
【００６８】
ミスアミノアシル・ｔＲＮＡは、細胞酵素を使用する天然アミノアシル化、または化学的ミスアミノアシル化のようなミスアミノアシル化によって形成され得る。化学的ミスアミノアシル化の一つのタイプは、マーカーまたはマーカー前駆物質の付着を可能にするためのｔＲＮＡのトランケーションを含む。例えば、過ヨウ素塩＋リジン（ｐＨ８．０）、及びアルカリホスファターゼによる継続処理は、ｔＲＮＡ分子の３’末端残基を除去して、３’末端からのモノヌクレオチドまたはジヌクレオチドの欠落を有するｔＲＮＡ−ＯＨ−３’を生じる（Ｎｅｕ 及び Ｈｅｐｐｅｌ、 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３９：２９２７〜３４、１９６４）。他方、ｔＲＮＡ分子を遺伝的に操作して、ｔＲＮＡ遺伝子の特定部分を欠落させることもできる。結果生じる遺伝子は、転写されて、トランケート型ｔＲＮＡ分子を生産する（Ｓａｍｐｓｏｎ 及び Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：１０３３〜３７、 １９８８）。次に、ジヌクレオチドは、例えば、アシル化によって、修飾アミノ酸または他のマーカーに化学的に結合される。この手順を使用して、マーカーを合成し、高収率でジヌクレオチドにアシル化することができる（Ｈｕｄｓｏｎ、 Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５３：６１７〜６２４、１９８８： Ｈａｐｐ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５２：５３８７〜９１、 １９８７）。これらの修飾基は、共に結合され、ジヌクレオチドを介して、リガーゼ結合と言及されるプロセスにおいて、トランケート型ｔＲＮＡ分子に結合される（図３Ｂ）。
【００６９】
アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによるｔＲＮＡの活性化に含まれる結合（図３Ｂ、結合Ａ）以外の異なる結合がミスアミノアシル化には含まれている（図３Ｂ、結合Ｂ）。Ｔ４　ＴＮＡリガーゼはアシル置換基を認識しないために、ｔＲＮＡ分子は、化学的複雑化や副反応なく、容易にミスアミノアシル化され得る（結合Ｂ、図３Ｂ）（Ｔ．Ｇ． Ｈｅｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：１４６８〜７３、 １９８４；及び Ｔ．Ｇ． Ｈｅｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４０：８７〜９４、１９８４）。本プロセスは、付着アミノ酸の性質に非感受性であり、従って、様々な非天然アミノ酸を使用するミスアミノアシル化を可能とする。対照的に、完全な酵素的アミノアシル化（結合Ａ）は、基質ｔＲＮＡかつアミノ酸の構造に極めて感受性で、かつ特異的である。
【００７０】
マーカーは基本的には、翻訳プロセスの酵素により認識され、電荷ｔＲＮＡから増殖ペプチド鎖中に運搬される分子である。有効であるためには、マーカーは一定の物理的及び生理化学的特性を持たなければならない。従って、有用なマーカーを同定するために使用される複数の基準がある。第一に、マーカーは増殖ペプチド鎖中への取り込みに適切でなければならない。これは、ペプチド結合形成に関与する化学基の存在により決定され得る。第二に、マーカーはｔＲＮＡ分子に付着可能でなければならない。付着は、ｔＲＮＡ分子の３’末端とマーカーのカルボキシル基、またはマーカー付着する結合基及びトランケート型ｔＲＮＡ分子間の共有結合相互作用である。結合基は、ヌクレオチド、短オリゴヌクレオチドまたはその他の類似分子であってもよく、好ましくはジヌクレオチド、さらに好ましくはジヌクレオチドＣＡである。第三に、マーカーは、検出さらに望ましくは新生タンパク質の分離を容易にする１またはそれ以上の物理的特性を持たなければならない。有用な物理的特性は、発光または吸光、磁性、電子スピン共鳴、電気キャパシタンス（容量）、誘電率、あるいは導電率のような特徴的電磁スペクトル特性を含む。
【００７１】
有用なマーカーは、検出用標識、検出用非天然アミノ酸、検出用アミノ酸類似体、及び検出用アミノ酸誘導体と結合された天然アミノ酸である。標識及び他の検出性部分は、強磁性、常磁性、反磁性、ルミネッセント（発光性）、電気化学ルミネッセント、蛍光性、燐光性、染色性であるかあるいは特有の質量を有し得る。マーカーとして有用である蛍光部分は、デンシルフルオロフォア、クマリン、クマリン誘導体、蛍光性アクリジニウム部分及びベンゾピランベースのフルオロフォアを含む。好ましくは、蛍光マーカーは、天然アミノ酸と異なる波長において量子効率の高い蛍光を有し、さらに好ましくは、スペクトルのＵＶ及び可視部分で励起し得る量子効率の高い蛍光を有する。既定の波長で励起時に、このマーカーは、可視的あるいは従来の蛍光検出法を使用して、低濃度で検出が可能である。ルテニウムキレート化合物及びその誘導体、またはニトロオキシル酸化アミノ酸およびその誘導体のような電気化学ルミネッセントマーカーは、極めて高い感度を望む際には好ましい（Ｊ． ＤｉＣｅｓａｒｅ ｅｔ ａｌ．、 ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １５：１５２〜５９、 １９９３）。これらのマーカーは、フェムトメートル（ｆｅｒｍｉ）範囲及びそれ以下で検出可能である。
【００７２】
蛍光マーカーの他に、他の特異的物理特性を有する様々なマーカーを使用して、新生タンパク質生産を検出することができる。一般的に、これらの特性は、マーカーの電磁場及び光線に対する相互作用及び反応に基づき、ＵＶ、電磁スペクトルの可視及び赤外領域、ラマン活性である発色団の存在を含み、さらに共鳴ラマン・スペクトロスコピー（分光法）、電子スピン共鳴活性及び核磁気共鳴、また特定の分子質量を有するマーカーの存在検出のための質量スペクトロメーター（分光計）によって増強され得る。。これらの電磁スペクトル特性は、天然アミノ酸が所有していないもの、あるいは天然アミノ酸特性から容易に識別可能であることが好ましい。例えば、アミノ酸トリプトファンは、２９０ｎｍ近辺に吸光性があり、２９０ｎｍ近辺の光線で励起されると３４０ｎｍ近辺に蛍光発光を有する。従って、トリプトファンと十分に異なる吸光及び／または蛍光特性を有するトリプトファン類似体は、タンパク質中でその検出を容易にするために使用され得る。
【００７３】
マーカーとして使用できる多数の異なる修飾アミノ酸が市販されている（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ； Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ；Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）。そのようなマーカーの一つは、ｔＲＮＡ分子にデンシルフルオロフォアをミスアミノアシル化することによって創作されたＮε‐デンシルリジンである（図５、機構１）。Ｎε‐デンシルリジンのα‐アミノ基がまずＮＶＯＣ（オルソ‐ニトロベラトリルオキシカルボニル塩化物）よってブロックされ、さらにカルボキシル基がシアノメチルエステルにより活性化される。説明されるようにミスアミノアシル化が行われる。ミスアミノアシル・ｔＲＮＡ分子は次に、タンパク質合成系に導入され、そこでデンシルリジンが新規合成タンパク質中に直接に取り込まれる。
【００７４】
他のそのようなマーカーは、蛍光強度の高い分子クマリンに基づく、蛍光アミノ酸類似体である（図５；機構２）。このフルオロフォアは、塩化ダンシルよりもさらに高い蛍光量子効率を有し、より低レベルの新生タンパク質の検出を容易にし得る。さらに、このクマリン誘導体は、天然アミノ酸トリプトファンと類似の構造を有する。これらの構造的類似性は、新生タンパク質の本来の構造あるいは機能が重要な場合、またはこれを所望する場合に有用である。クマリンは、図５（機構２）に描写するように合成される。マロン酸アセトアミドは、ナトリウムエトキシドの存在において、僅かに過剰な４‐ブロモメチルクマリン（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ）でアルキル化され、その後酸加水分解される。塩酸塩としての対応するアミノ酸は、遊離アミノ酸類似体に転化され得る。
【００７５】
クマリン誘導体は、それが酵素的または化学的のいずれかの方法で、トリプトファン‐ｔＲＮＡをミスアミノアシル化する場合に、最も便利に使用できる。ミスアミノアシル化トリプトファン‐ｔＲＮＡの形状で導入される際、クマリンアミノ酸は、トリプトファン位置内にのみ取り込まれる。無細胞合成系中のミスアミノアシル・ｔＲＮＡまたは遊離クマリン誘導体の濃度を調節することにより、新生タンパク質中に取り込まれるクマリンアミノ酸の数をまた調節し得る。この手順は、新生タンパク質中にあるほとんど全てのマーカーの量を調節するために利用し得る。
【００７６】
マーカーは、天然アミノ酸及び通常ではアミノ酸として機能できないマーカー特性を有する分子から化学的に合成され得る。例えば、蛍光強度の高い分子を天然アミノ酸基に化学的に結合することができる。化学的修飾はアミノ酸側鎖上に生じ、カルボキシル及びアミノ官能性はそのまま残されており、ペプチド結合形成に関与し得る。蛍光強度の高い分子（例：塩化デンシル）は、リジン、アルギニン、チロシン、システイン、ヒスチジン等を含む様々なアミノ酸の親核性側鎖に結合され、主としてアミノ基のスルホンアミドまたは硫酸結合として、蛍光性誘導体を生じ得る。そのような誘導体形成は、ペプチド結合を無傷のまま形成する能力を残し、デンシルリジンのタンパク質中への正常な取り込みを可能とする。
【００７７】
多数の因子が、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを介して新生タンパク質中に取り込まれるマーカーの有効性を決定する。これらは、細胞または無細胞タンパク質合成系において、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡの使用を介して、タンパク質中にマーカー基を取り込む能力と、新生タンパク質中にいったん取り込まれた際のマーカー固有の検出性を含む。一般的には、優れた特性を有するマーカーは、短いインキュベーション時間、かつ少量の試料で新生タンパク質の正確な検出を可能とする。これらの因子は、説明される方法の有効性を直接的に影響する。新生タンパク質中への取り込みに使用される蛍光マーカーの場合、好ましい特性は、それに限定されるわけではないが、小型、量子効率の高い蛍光、及び長期にわたる露光に対する安定性（抗漂白性）であろう。
【００７８】
上記因子に関する知識をしても、特定の無細胞または細胞翻訳系を使用して、タンパク質中に特定のマーカーを取り込むための最適条件を先験的に予測することは、それがｔＲＮＡ、開始または延長因子及びリボソーム成分を含むタンパク質翻訳合成系の成分とマーカー基の詳細な相互作用に依存するために困難である。一般的には、小型のマーカーはリボソーム中により容易に収容されることが予測されているが、分子の正確な形状及びリボソーム結合部位におけるその特異的相互作用が最も重要な決定要素である。この理由で、いくつかの大型マーカーが、小型マーカーと比較して、より容易に新生タンパク質中に取り込まれることが可能である。例えば、そのような因子は、分子モデルに関する既知の方法を使用して予測することは極めて困難である。
【００７９】
いくつかの望ましい特性（タンパク質翻訳合成系の成分との望ましい相互作用を含む）を有するメンバーを持つフルオロフォアの一つの群は、ジピロメテン二フッ化ホウ素誘導体（ＢＯＤＩＰＹ）由来の群である（図１９）。高量子効率のような好都合な特性を有する様々なその他の通常使用されるフルオロフォアと比較して、いくつかのＢＯＤＩＰＹ化合物は、タンパク質合成系と高い両立性のあるさらに他の並はずれた特性を有する。全てのＢＯＤＩＰＹ フルオロフォアのコア構造は、４，４‐ジフルオロ‐−４−ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセン（４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ）である。米国特許第４，７７４，３３９号； ５，１８７，２８８号；５，２４８，７８２号； ５，２７４，１１３号；５，４３３，８９６号； ５，４５１，６６３号を参照のこと。この全てを本明細書に参考文献として編入している。中心的特徴は図１９に示すようにジフルオロボロンである。全てのＢＯＤＩＰＹフルオロフォアは、マーカーとしてのいくつかの望ましい特性を有し（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｃａｔａｌｏｇ（分子プローブカタログ、 ｐ．１３〜１８）、それらは高吸光係数、高蛍光量子効率、溶剤極性及びｐＨに非感受性であるスペクトル、フルオレセインのような他の色素と比較してより高いピーク強度を生じる狭い発光バンド幅、イオン電荷の不在、フルオレセインと比較して強化された光安定性を含む。基礎ＢＯＤＩＰＹ構造に置換基を加えることは、さらに抱合の追加を起因し、励起または発光波長を、検出の手段と両立可能な都合のよい波長にシフトするために使用され得る。
【００８０】
これらの色素は、Ｖｏｓ ｄｅ Ｗａａｌ ｅｔ ａｌ． （１９７７）によって最初に説明され、その蛍光特性はその後、Ｗｏｒｉｅｓにより説明された［Ｗｏｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．、”Ａ ｎｏｖｅｌ ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｏｆ ｔｈｅ ４−ｓｕｌｆｏｎａｔｏ−３，３’， ５’５−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２，２’−ｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎ−１，１’−ＢＦ．ｓｕｂ．２ ｃｏｍｐｌｅｘ，”（新水溶性蛍光プローブ合成、ルミネッセンス及び４‐スルフォナート‐３，３’，５，５’‐テトラメチル‐２，２’‐ピロメタン‐１，１’‐ＢＦ．ｓｕｂ２複合体の生物学的特性）Ｒｅｃｌ． Ｔｒａｖ． Ｃｈｉｍ． ＰＡＹＳＢＡＳ １０４， ２８８ （１９８５）を参照のこと］。ジピロメテン二フッ化ホウ素由来の色素は、新生タンパク質への取り込みに適切なそれ以上の特徴を有する。フルオロフォア　４，４‐ジフルオロ‐４‐ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセンの単純アルキル誘導体は、Ｔｒｅｉｂｓ 及び Ｋｒｅｕｚｅｒ、［Ｄｉｆｌｕｏｒｂｏｒｙｌ−ｋｏｍｐｌｅｘｅ ｖｏｎ ｄｉ− ｕｎｄ ｔｒｉｐｙｒｒｙｌｍｅｔｈｅｎｅｎ、 ＬＩＥＢＩＧＳ ＡＮＮＡＬＥＮ ＣＨＥＭ ７１８，２０８ （１９６８）］ 及び Ｗｏｒｒｉｅｓ、 Ｋｏｐｅｋ、 Ｌｏｄｄｅｒ、及び Ｌｕｇｔｅｎｂｕｒｇ， ［Ａ ｎｏｖｅｌ ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｂｅ： Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｏｆ ｔｈｅ ４−ｓｕｌｆｏｎａｔｏ−３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−２，２’−ｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎ−１，１’−ＢＦ．ｓｕｂ．２ ｃｏｍｐｌｅｘ， （新水溶性蛍光プローブ：４‐スルフォナート‐３，３’，５，５’‐テトラメチル‐２，２’‐ピロメタン‐１，１’‐ＢＦ．ｓｕｂ２複合体のナトリウム塩の合成、ルミネッセンス及び生物学的特性）、ＲＥＣＬ． ＴＲＡＶ． ＣＨＩＭ． ＰＡＹＳ−ＢＡＳ １０４， ２８８ （１９８５） ］により、約４９０ 〜 ５１０ ｎｍに最大吸光、及び約５００ 〜 ５３０ ｎｍに最大発光を有する、フルオレセインと類似のスペクトル特性を有する蛍光強度の極めて高いものとして説明されている。Ｈａｕｇｌａｎｄ ｅｔ ａｌ に対する（１９８８）米国特許第 ４，７７４，３３９号（’３３９特許）（本明細書に参考文献として編入されている）は、水素、ハロゲン、アルキル、シクロアルキル、アリル、アリルアルキル、アシル、及びバイオ分子との抱合に適切な反応基を含むスルホ置換誘導体を含み、光安定性が良好で、フルオレセイン様スペクトルを有する、４，４‐ジフルオロ‐４‐ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセン（ジピロメテン二フッ化ホウ素）色素を説明する。’３３９特許、及びＰａｖｌｏｐｏｕｌｏｓ， ｅｔ ａｌ．， ［Ｌａｓｅｒ ａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ａ ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ−ＢＦ．ｓｕｂ．２ ｃｏｍｐｌｅｘ（テトラメチルピロメタン‐ＢＦ．ｓｕｂ２複合体によるレー��ー作用）ＡＰＰ． ＯＰＴＩＣＳ ２７， ４９９８ （１９８８）］により説明されるように、４，４‐ジフルオロ‐４‐ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセン蛍光色素のアルキル誘導体の発光は、明らかにフルオレセインのそれとオーバーラップする。このオーバーラップは、励起源や光学フィルタを変更することなく、ジピロメテン二フッ化ホウ素のアルキル誘導体に、フルオレセインベース色素に使用する装置と同じ光学装置を使用することを可能とする。同様に、ジピロメテン二フッ化ホウ素中のアリル／ヘテロアリル置換基は、吸光／発光の最大値を高波長へとシフトする（本明細書に参考文献として編入する米国特許第５，４５１，６６３号を参照のこと）。
【００８１】
様々なＢＯＤＩＰＹ分子が、アミノアシル・ｔＲＮＡを誘導体化して、ＢＯＤＩＰＹマーカー部分を有するミスアミノアシル・ｔＲＮＡを生産するために使用し得るアミン反応体として市販されている。検出マーカーの新生タンパク質中への取り込みに優れた特性を呈示するこの系統の化合物の一つの実例は、４，４‐ジフルオロ‐５，７‐ジメチル‐４‐ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセン（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ）である。ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬのスルホン酸化Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）誘導体は、Ｅ． ｃｏｌｉ 開始ｔＲＮＡｆｍｅｔをミスアミノアシル化するために使用される場合、生産された新生タンパク質は、電気泳動後ポリアクリルアミドゲル上で、標準ＵＶトランスイルミネーター及び写真またはＣＣＤイメージングシステムを使用して、容易に検出され得る。これは、まずメチオニンでアミノアシル化して、次にＮ‐ヒドロキシスクシンイミドＢＯＤＩＰＹを使用して、メチオニンのα−アミノ基を特異的に修飾したｔＲＮＡｆｍｅｔ を使用して達成し得る。修飾反応前に、ｔＲＮＡｆｍｅｔ を、最大電荷（＞９０％）して、さらに３５Ｓ−メチオニン及び酸‐尿素ゲルを使用して確認する［Ｖａｒｓｈｎｅｙ， Ｕ．、 Ｌｅｅ， Ｃ． Ｐ．、 及び ＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ、 Ｕ． Ｌ． １９９１． Ｄｉｒｅｃｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｍｉｎｏａｃｙｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｔＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ． （インビトロにおけるｔＲＮＡのアミノアシル化度の直接分析）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２４７１２〜２４７１８］。
【００８２】
１０ ｎｍ以下の市販のＥ．ｃｏｌｉ　抽出物（Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｔ７翻訳システム、Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）が、１ ｎｇ以下の合成タンパク質に対応する分析に必要とされる。検出性タンパク質を生産するために必要とされるインキュベーション時間は、約１時間であるが、５分（またはそれ以下）のように短時間であってもよい。ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬはさらに、４８８ ｎｍ励起及び５２０ ｎｍ以上の発光測定力を備える市販の蛍光スキャナーを使用することにより、高感度で検出し得る。ＮＢＤ （７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール）及びピリン−ＰｙＭＰＯを含むその他の市販色素を使用する同様な試験は、およそ１次元の蛍光量低下を示し、ＵＶトランスイルミネーターや蛍光スキャナーのような標準実験室用装置を使用して検出することをさらに困難とする。３−Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジオゾール−４−ｙｌ）−２，３，−ジアミノプロピオン酸（ＮＢＤ−ＤＡＰ）のような蛍光マーカー及びクマリンを、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを使用してタンパク質中に取り込むことが可能であることが既に示されている。しかし、これらのマーカーを含む新生タンパク質の検出は、蛍光スペクトロメーターまたはマイクロスペクトルフルオロメーター（蛍光スペクトロメーター）のような高感度を有する器械を使用してのみ実証され、時として蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の使用のような間接的方法を必要とする　（Ｔｕｒｃａｔｔｉ， Ｇ．、 Ｎｅｍｅｔｈ， Ｋ．、 Ｅｄｇｅｒｔｏｎ， Ｍ． Ｄ．、 Ｍｅｓｅｔｈ， Ｕ．、 Ｔａｌａｂｏｔ， Ｆ．、 Ｐｅｉｔｓｃｈ， Ｍ．、 Ｋｎｏｗｌｅｓ， Ｊ．、 Ｖｏｇｅｌ， Ｈ．、 及びＣｈｏｌｌｅｔ， Ａ． （１９９６） Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１（３３）、 １９９９１〜８；　Ｋｕｄｌｉｃｋｉ， Ｗ．、 Ｏｄｏｍ， Ｏ． Ｗ．、 Ｋｒａｍｅｒ， Ｇ．、 及び Ｈａｒｄｅｓｔｙ， Ｂ． （１９９４） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４４（３）、 ３１９〜３１）。そのような器械は、分子生物学実験室においては一般的に常備されておらず、ゲル上の蛍光バンドの測定用には特定の適応のみが装備され得る。
【００８３】
ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬのマーカーとしてのそれ以上の利点は、該マーカーを含む新生タンパク質をアフィニティー精製するために使用し得るモノクローナル抗体が利用可能なことである。そのようなモノクローナル抗体の一例は、抗ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ抗体（カタログ番号Ａ−５７７０、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、 Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）である。ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを使用する他の市販マーカーと比較して、高い効率で新生タンパク質中にＢＯＤＩＰＹ−ＦＬを取り込む能力と組み合わされたこれ（抗体利用可能性）は、新生タンパク質のさらに効率的な分離を可能とする。ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬに対するこれらの抗体は、新生タンパク質中へのＢＯＤＩＰＹの取り込みの定量に使用され得る。
【００８４】
アミノアシル・ｔＲＮＡの機能的活性を実質的に変更することなく、マーカーを特異的に修飾する化学反応を使用することにより、ｔＲＮＡ分子をアミノアシル化またはミスアミノアシル化した後で、マーカーをさらに修飾することができる。アミノアシル化後修飾のこれらのタイプは、検出、分離または精製を容易とし、時には修飾によって新生タンパク質が未変性またはさらなる官能基配置を得ることが可能な場合に使用され得る。
【００８５】
蛍光及び他のマーカーは、スペクトロメーターにより検出され、かつ天然アミノ酸の電磁スペクトル特性から識別し得る検出可能な電磁スペクトル特性を有する。最も有用なスペクトロメーターは、蛍光、ラマン、吸光、電子スピン共鳴、可視、赤外及び紫外スペクトロメーター（分光計）を含む。顕著な電気的特性を有するマーカーのような他のマーカーは、電流計、電圧計または他のスペクトロメーターで検出することができる。マーカーと電磁場の顕著な相互作用に関係するマーカーの物理的特性は、蛍光、ラマン、吸光、電子スピン共鳴スペクトロメーターのような器械を使用して容易に検出できる。マーカーはさらに、外部力または電磁場のような作因またはその検出を可能とする反応体分子に反応して発色の変化のような、化学的、生化学的、電気化学的または光化学的反応も受けることがある。
【００８６】
本発明によって考案される蛍光マーカーの一つの部類は、結合時に検出可能である分子と特異的に結合できる小ペプチドから成る部類である。このアプローチの一例は、ＷＥＡＡＡＲＥＡＣＣＲＥＣＣＡＲＡ（配列番号４）から成る配列を有するペプチドである。この配列（４個のシステイン残基を含む）は、ペプチドが、非蛍光色素分子４’，５’‐ビス（１，３，２‐ジチオアルソラン‐２‐ｙｌ）フルオレセイン［４’， ５’−ｂｉｓ（１，３，２−ｄｉｔｈｉｏａｒｓｏｌａｎ−２−ｙｌ）］（ＦＬＡＳＨ、フルオレセイン砒素ヘリックス結合剤を意味する）に特異的に結合することを可能とする。この色素は、結合時に蛍光性となる興味深い特性を有する。言い換えれば、新生タンパク質中にこの特定のペプチド配列が存在するときのみに蛍光が観測される。従って、このペプチド配列をＮまたはＣ末端に置くことにより、合成されたタンパク質の量を容易にモニタし得る。このペプチド配列は、このペプチド配列をコードする領域を担うように、核酸プライマーをデザインすることにより導入され得る。
【００８７】
使用される蛍光化合物の部類に関わらず、検出は通常は、まず細胞または無細胞タンパク質合成系に存在するその他のバイオ分子から、新生タンパク質を物理的に分離することを含む。タンパク質分離は、例えば、ゲル電気泳動またはカラムクロマトグラフィーを使用して実施することができ、また受容体基に独自的に結合するアフィニティーマーカーによりさらに容易とされ得る。ゲル電気泳動によるフルオロフォアを含むマーカーの検出は、従来の蛍光検出法を使用して達成し得る。
【００８８】
無細胞系におけるタンパク質合成後、タンパク質合成に必要とされるバイオ分子の全てと新生タンパク質含む反応混合物を、ポリアクリルアミドまたはアガロースから成るゲル上に装填する（Ｒ．Ｃ． Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（タンパク質のゲル電気泳動及び集中電気泳動法） Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８４）。本混合物はさらに、非電荷ｔＲＮＡとミスアミノアシル・ｔＲＮＡも含む。反応混合物を装填した後、電圧をかけることによりゲル上のタンパク質を加えた電場方向に空間的に分離する。タンパク質は分離して、クーマシーブルー染色のようなゲル前後に染色法を使用して目視観察し得る分散、またはオーバーラップするバンドのセットとして出現する。ゲル上でのタンパク質バンドの移動は、タンパク質分子量と、減少分子量の関数である装填位置からの増加距離の関数である。新生タンパク質を含むゲル上のバンドは、適切な波長で励起されると、蛍光を呈する。これらのバンドは、可視、写真、または分光学的に検出が可能であり、さらに必要に応じて、新生タンパク質をゲル切片から精製し得る。
【００８９】
例えば、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬをマーカーとして使用する場合は、新生タンパク質は、ＵＶ照射によって励起すると、５１０ｎｍで蛍光を発する。この蛍光は、単に標準把持式ＵＶイルミネーターまたはトランスイルミネーターを使用することにより、可視的に検出され得る。約１０ナノグラム（ｎｇ）のタンパク質α‐ヘモリジンは、この方法を使用して検出できる。さらに、低温ＣＣＤイメージャーに基づく蛍光スキャナーのような、極めて低濃度のマーカーを迅速にスクリーンかつ同定し得る電子イメージング装置が有用である。この場合は、最低０．３ｎｇのタンパク質までが検出され得る。
【００９０】
新生タンパク質の分子量及び量は、蛍光標識された既定分子量を有するタンパク質のバンドのセットと、ゲル上のバンド位置の比較により決定し得る。例えば、分子量２５，０００である新生タンパク質は、既定量かつ既知分子量（ウシ血清アルブミン、６６ ｋＤ；ブタ心臓フマラーゼ、４８．５ｋＤ；カルボニックアンヒドラーゼ、２９ｋＤ；β−ラクトグロブリン、１８．４ｋＤ；α−ラクトグロブリン、１４．２ｋＤ； Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）の市販標準マーカータンパク質を含む較正ゲルに対するゲル上の相対的位置によって測定することができた。
【００９１】
較正タンパク質はまた、新生タンパク質を担うゲルと同様な方法を使用する検出に便利な類似したマーカーを含み得る。これは、多くの場合、較正タンパク質をマーカーと類似な分子と直接反応させることにより達成し得る。例えば、蛍光誘導体を得るように、較正タンパク質を塩化ダンシルで修飾し得る（Ｒ．Ｅ． Ｓｔｅｐｈｅｎｓ， Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６５， ３６９〜７９， １９７５）。他方、タンパク質をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ のＮＨＳ誘導体で標識することもできる。これらの蛍光タンパク質は、ＰＡＧＥを使用して分析し得る。蛍光較正タンパク質の検出を蛍光マーカー類似体を含む新生タンパク質の検出と組み合わせることにより、合成された新生タンパク質の分子量及び量のどちらも正確に測定できる。必要に応じて、正確に定量するために、較正タンパク質及び新生タンパク質それぞれに含まれるマーカーの量を決定し得る。新生タンパク質を担うゲルの定量のためには、既定レベルの蛍光マーカーを有するタンパク質の使用が好都合である。これは、較正タンパク質がシステインのような特定の反応残基を含み、従ってタンパク質当たり１つの蛍光色素のみが付着するように遺伝的操作を行うことにより達成され得た。
【００９２】
タンパク質分離のその他の方法はさらに、マーカーを含む新生タンパク質の検出、かつその後の分離と精製に便利である。例えば、タンパク質は、毛管電気泳動、集中電気泳動法、低圧クロマトグラフィー及び高速または高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ またはＦＰＬＣ）を使用して分離することができる。これらの場合は、個別のタンパク質は、マーカーの発光波長で、蛍光検出器によって個別に分析され得る分画に分離される。他方、オンライン蛍光検出法が、新生タンパク質がカラム分別システムから出てくる際に検出するために使用され得る。保持時間の関数としての蛍光グラフは、生産された新生タンパク質の量及び純度に関する情報を提供する。
【００９３】
本発明による他の実施態様は、前記に説明するように、切断可能なマーカーを含む新生タンパク質の標識、検出、さらに必要に応じて、分離と精製のための方法を指示する。切断可能なマーカーは、物理あるいは酵素処理、化学または温度処理、ガンマ線、Ｘ線、紫外線、可視光線、赤外線、マイクロウェーブ、ラジオ波または電場のような電磁放射のような外部効果に感受性のある化学構造を含む。マーカーは、前記のように従来の技術を使用して、ｔＲＮＡにアミノアシル化、またはミスアミノアシル化されて、翻訳系に加えられる。インキュベーション及び新生タンパク質の生産後、マーカーは特定の処理を加えることにより切断され、新生タンパク質が検出され得る。他方、新生タンパク質はまた、切断されたマーカーあるいはマーカーから取り除かれた化学的部分の存否によって、検出及び分離され得る。
【００９４】
切断可能なマーカーの一例は、２‐ニトロベンジル部分を含む化合物（図６Ａ）のような光開裂型マーカーである。照射時に、これらの芳香族ニトロ化合物は、内部酸化還元反応を受ける（Ｐｉｌｌａｉ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ １〜２６、 １９８０； Ｐａｔｃｈｏｒｎｉｋ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ９２：６３３３〜３５、 １９７０）。その結果、ニトロ基はニトロソ基に還元され、酸素がオルソ位置にあるベンジルＣ‐Ｈ結合中に挿入される。主要な光化学プロセスは、励起ニトロ基による分子内水素引抜反応である。これに、酸‐ニトロ型（ａｃｉ−ｎｉｔｒｏ ｆｏｒｍ）への電子リディストリビューションプロセスが引き続き、ニトロソ産物に再転位される。後続する温度反応は、ニトロベンジル結合（図６Ｂ）から基質の切断を誘導する。他の切断可能なマーカーの実例を図７に示す。
【００９５】
時には、基質と切断可能部分の間に距離を置くことが望ましいことがある。これを達成するために、クロスリンカーアームによって、切断可能部分を基質から分離し得る。クロスリンカーは、基質アクセスを増加し、化学的構造を安定化し、また例えば、長いアルキル鎖、またはアミド結合を介して結合されているカプロイル部分から成る複数反復ユニットを使用して作製し得る。
【００９６】
切断可能なマーカー合成には、異なるマーカーの数と同じほど多数の方法がある。ニトロベンジルアルコール基材の光開裂型ビオチン合成の一例は、４つの主要なステップを含む。光反応部分の前駆物質である２−ブロモ−２’−ニトロアセトフェノンは、まずα− またはω−アミノ酸様ε−アミノカプリン酸に転化される。結果生じる酸と光反応基であるアミノ官能基は、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使用して結合される。結果生じるアミドのベンゾイルカルボニル基は、水素化ホウ素ナトリウムを使用して還元される。その結果生じるニトロベンジルアルコール誘導体は、バイオ分子構造と反応できるような最終成分を得るために、例えば、塩化ギ酸官能基を誘導するために、ホスゲンガスによる反応により、誘導体化される。結果生じる化合物を、ＰＣＢのその他の誘導体と共に、図８Ａに描写する。アミノ酸への可能な結合は図８Ｂに描写する。
【００９７】
切断可能なマーカーは、新生タンパク質の分離を容易にする。例えば、切断可能なマーカーの一つのタイプは、アミノ酸と結合する光開裂型ビオチンである。このマーカーは、新生タンパク質中に取り込まれ、さらにこのタンパク質はビオチンとアビジンまたはストレプトアビジンとの特異的相互作用により精製され得る。分離とそれに引き続く精製に際して、ビオチンは、電磁放射を加えることにより除去され、付着するビオチン分子に起因する問題なく、新生タンパク質は有用な適用に利用された。切断可能なマーカーのその他の実例は、光開裂型クマリン、光開裂型ダンシル、光開裂型ジニトロフェニル及び光開裂型クマリン・ビオチンを含む。光開裂型マーカーは、ＵＶ光線のような電磁放射によって切断され、ペプチジルマーカーは酵素処理により切断され、さらにジスルフィド結合によって結合されているピレニルフルオロフォアはチオール試薬のような一定の化学処理を受けることにより切断される。
【００９８】
光開裂型マーカーによる切断は、光反応部分の構造及び照射に使用される電磁照射の波長に依存する。電磁放射の他の波長が、タンパク質や他の化学的部分を損傷してはならない。非置換２‐ニトロベンジル誘導体の場合は、光分解による収量及び基質の回収は、内部光フィルタとして作用し、さらに基質のアミノ基と反応可能である副産物の形成により顕著に低下する。典型的な照射時間は、１〜約２４時間と変化し、収量は１〜９５％である。線源は、基質タンパク質の約１０ ｃｍ以内に配置し、新生タンパク質中に出現する副反応があるとすれば、最少とするように低電力に設定する。α‐置換２‐ニトロベンジル誘導体（メチル、フェニルなど）の場合、光除去の比率と遊離基質の収量に相当な増加が観察される。光反応部分のフェニル環へのその他の電子ドナー基の導入は、基質収量を増加する。ＰＣＢの光分解の一般的反応を図９に描写する。
【００９９】
酵素的切断では、導入されたマーカーは、化学的物質から成る特有の酵素に対して感受性のある特定の結合を含む。タンパク質混合物中への酵素または化学物質の導入は、新生タンパク質からマーカーを切断する。マーカーが修飾アミノ酸である場合、これは天然タンパク質形状の生産を起因することになる。例えば、熱感受性のある化学的部分の熱処理は、同様な方法で行われる。マイクロウェーブまたは放射熱のような温度エネルギーの穏やかな適用は、新生タンパク質に顕著な損傷を生じることなく、タンパク質から感受性マーカーを切断する。
【０１００】
【発明の実施の形態】
Ａ．突然変異の検出
突然変異の検出は、ガンの診断及び／またはガンの素因を有する個人を含む、しかしこれに限定はされない、臨床診断において益々重要な領域となっている。タンパク質トランケーション試験（ＰＴＴ）は、トランケート型タンパク質産物の発生を誘導するナンセンス及びフレームシフト突然変異検出用手法である。デュシェンヌ筋ジストロフィ、腺腫性多発結腸ポリープ症、ヒトｍｕｔＬ同族体、ヒトｎｕｔＳ同族体（どちらも結腸ガンに関連する）、及びＢＲＡＣ１（家族性乳ガン）に関連する遺伝子は、今では他の疾患と共に、この方法によって突然変異をスクリーンし得る（表１参照）。
【０１０１】
【表１】
2004513604.tif 000002
典型的に、ＰＴＴ法は、調査する遺伝子の領域をカバーするＰＣＲ産物中への、Ｔ７プロモーター部位、リボソーム結合部位、及び人工的メチオニン開始部位の取り込みを含む。ＰＣＲ産物は次に、インビトロウサギ網状赤血球溶解物またはコムギ胚芽溶解物系を使用して、転写かつ翻訳され、増幅された遺伝子領域に対応するタンパク質を発生する。ナンセンス突然変異またはフレームシフトにより生じた配列中の終止コドンの存在は、タンパク質翻訳の時期尚早な終了を起因し、放射性検出を組み合わせた標準ゲル電気泳動（例：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析によって検出し得るトランケート型タンパク質を生産する。
【０１０２】
現在実用されている手法には欠点がある。最も重要な問題の一つは、所望する産物の同定を含む。非特異的に放射性標識された産物のために、これ（同定）は困難となる。これらの問題を提起する試みが行われてきた。一つのアプローチは、開始部位の後かつ所望の遺伝子をコードする領域の前にアフィニティータグを導入することである。Ｒｏｗａｎ 及び Ｂｏｄｍｅｒによる ”Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｙｃ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｔａｑ ｔｏ Ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ Ｔｅｓｔ（タンパク質トランケーション試験を使用する突然変異検出の質向上のためのｍｙｃ レポーターＴａｑの導入）” Ｈｕｍａｎ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ９：１７２ （１９９７）を参照のこと。しかし、そのようなアプローチは、依然として電気泳動に依存するという不利な点を有する。
【０１０３】
本発明は、２または３マーカーを新生タンパク質中に導入する、ゲルフリートランケーション試験（ＧＦＴＴ）を考案する。本発明は、疾患の素因を決定するための出生前及び出生後試験を考案する。本発明による好ましい実施態様では、新組成物及び方法は、フレームシフトまたは鎖終止突然変異を指示する。そのような突然変異を検出するためには、新生タンパク質は、まず突然変異の可能性を含むタンパク質をコードするメッセンジャーＴＮＡまたはＤＮＡから、無細胞または細胞翻訳系において合成される。新生タンパク質は、タンパク質のＮ末端またはその近隣に位置するアフィニティーマーカーを使用して、次に無細胞または細胞翻訳系から分離される。
【０１０４】
タンパク質を次に、タンパク質のＮ末端またはその近隣に位置する検出マーカー（Ｎ末端マーカー）の存在について分析する。次に、タンパク質のＣ末端またはその近隣に位置する配列依存性検出マーカー（Ｃ末端マーカー）上で別の測定を行う。
Ｃ末端マーカーとＮ末端マーカーからの測定値の比較は、新生タンパク質をコードする遺伝子配列中にあるフレームシフトまたは鎖終止突然変異を含む新生タンパク質の分画についての情報を供給する。Ｃ末端部近隣に位置する配列依存性マーカーのレベルは、鎖終止またはフレーム外突然変異を含まないタンパク質分画を反映する。Ｎ末端マーカーの測定は、Ｃ末端マーカーが正規化された測定に対する内部対照を供給する。Ｃ末端マーカーレベルをＮ末端マーカーに対して正規化することは、実験の正確性を損ない得る、翻訳中のタンパク質発現レベルにおける変化のような本質的な変異を排除する。タンパク質のＮ末端部またはその近隣に位置するアフィニティーマーカーを使用して、翻訳混合物からタンパク質を分離することは、翻訳中にタンパク質が、メッセージのコード領域にある内部ＡＵＧから開始される場合に生じ得るフォールススタート（不正開始）の出現を排除する。フォールススタートは、鎖終止またはフレーム外突然変異後に起こり得るために、誤った結果の原因となり得る。これは、内部ＡＵＧがメッセージを有するフレーム内にある場合特に真実である。この場合、メッセージが突然変異を含んでいても、ペプチドＣ末端マーカーは依然として存在する。
【０１０５】
一つの実例では、非天然アミノ酸またはアミノ酸誘導体を含む検出マーカーが、タンパク質合成の開始をシグナルするＡＵＧ開始コドンのみを認識するミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡを使用して、翻訳中にアミノ末端（Ｎ末端部）において新生タンパク質中に取り込まれる。検出マーカーの一例は、蛍光度の強い蛍光化合物ＢＯＤＩＰＹ ＦＬである。マーカーはさらに、光開裂型クマリンまたは光開裂型ビオチンのような光開裂性であってもよい。新生タンパク質は、次にタンパク質のＮ末端に隣接して位置するアフィニティーマーカーに結合する共役因子を使用して、無細胞または細胞翻訳系から分離される。そのようなアフィニティーマーカーの一つは、エピトープとして知られている特定のタンパク質配列である。エピトープは、受容体基を含む分子及び／または物質と選択的に相互作用するという特性を有する。様々なエピトープ配列が文献に報告されており、それらは、ＣｌｏｎＴｅｃｈ により説明されるＨｉｓＸ６ （ＨＨＨＨＨＨ） （配列番号５） 、及びＲｏｃｈｅ−ＢＭ により説明されるＣ−ｍｙｃ （−ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ） （配列番号６） 、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ により説明されるＦｌａｇ （ＤＹＫＤＤＤＤＫ） （配列番号７）、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓにより説明される ＳｔｅｐｔＴａｇ （ＷＳＨＰＱＦＥＫ） （配列番号８） 及びＲｏｃｈｅ−ＢＭ により説明されるＨＡ Ｔａｇ （ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ） （配列番号９） を含む。
【０１０６】
いったん新生タンパク質が翻訳系から分離されると、タンパク質のＮ末端部位に取り込まれた検出マーカーの存否について分析される。ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの場合は、４８８ｎｍ 励起及び５２０ｎｍ 以上の光線を検出器に透過させるような発光フィルターを備えたＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｍｏｄｅｌ ５９５蛍光スキャナーのような様々な市販器械を使用して蛍光レベルを測定することにより検出され得る。
【０１０７】
タンパク質は次に、タンパク質のＣ末端部近隣に位置する配列特異性マーカーの存在について分析される。通常使用では、そのような配列特異性マーカーは、共役因子により認識されるタンパク質のＣ末端部近隣に位置するアミノ酸の特異的配列から成る。例えば、新生タンパク質ｎｏＣ末端部またはその近隣に位置するアミノ酸に対する抗体を利用し得る。そのような抗体は、容易に検出し得る蛍光色素及び容易に検出可能である基質を導出する検出反応を触媒する酵素を含む、様々なマーカーによって標識され得る。選択されたマーカーは、Ｎ末端マーカーに使用されるそれとは異なる検出特性を有するべきである。アミノ酸配列はさらに、抗体の他に共役因子によって認識されるエピトープを含み得る。そのような配列の一つは、６つのヒスチジンであり、時にはコバルト複合体共役因子と結合するｈｉｓタグとして言及されている。
【０１０８】
本実施態様に使用できる様々なＮ末端マーカー、アフィニティーマーカー、Ｃ末端マーカーが入手可能である。Ｎ末端マーカーはＢＯＤＩＰＹ、アフィニティーマーカーはＳｔｒｅｐＴａｇ、さらにＣ末端マーカーはＨｉｓＸ６ ｔａｇであり得る。この場合は、翻訳後に、反応混合物をストレプトアビジンをコートしたマイクロ滴定プレート内でインキュベートするか、またはストレプトアビジンをコートしたビーズを加えてインキュベートする。非結合物質を洗浄後、Ｎ末端マーカーは蛍光スキャナーを使用して直接に測定し、Ｃ末端マーカーは、ＢＯＤＩＰＹと異なる光学特性を有する蛍光色素（ローダミンまたはテキサスレッド）を抱合させた抗ｈｉｓＸ６抗体を使用して定量することができ、従って両方の同時検出を容易にする。
【０１０９】
異なる実例では、Ｎ末端マーカーは、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡ によって取り込まれたビオチンまたは光開裂型ビオチンであり、アフィニティーマーカーはＨｉｓ Ｘ６ ｔａｇ、Ｃ末端マーカーはＣ−ｍｙｃマーカーであり得た。この場合は、翻訳後、反応混合物は、金属キレートビーズを加えてまたは金属キレート加工したマイクロ滴定プレート（例：Ｔａｌｏｎ、 ＣｌｏｎＴｅｃｈ）内でインキュベートされる。非結合タンパク質を洗浄後、ストレプトアビジン抱合蛍光色素及びその他の蛍光色素を抱合したＣ−ｍｙｃ抗体を使用して、プレートまたはビーズに検出反応を行う。さらに、ペルオキシダーゼと抱合した抗体を使用して、化学ルミネッセント検出法も使用することが可能である。
【０１１０】
Ｎ末端マーカー、アフィニティーマーカー、さらにＣ末端マーカーは、全てエピトープを含むことが可能で、これは新生タンパク質をコードするメッセージまたはＤＮＡが特定のエピトープに対応する核酸配列を有するようにデザインすることによって、新生タンパク質中に取り込まれ得ることは、分子生物学及び生化学領域の当業者には理解されるであろう。これは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を使用する、新生タンパク質をコードするＤＮＡ中に所望する核酸配列を取り込むプライマーのデザインのような既知の方法を使用して達成し得る。Ｎ末端マーカー及びＣ末端マーカーの両方を検出するために使用し得る、広く様々な検出方法が利用可能であることは、タンパク質生化学分野の当業者には理解されるであろう。その他の実例は、非化学ルミネッセント基質を化学ルミネッセント産物に転化する酵素が、特定のエピトープに対する抗体に抱合される、化学ルミネッセンスアッセイの使用を含む。
【０１１１】
このアプローチによる一例は、ルミネッセントマーカーを測定するためにルミノメーターを使用することに基づく。ビオチン検出マーカーは、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを使用して、Ｎ末端に取り込まれる。ビオチンは、ウミシイタケ（ｓｅａ ｐａｎｓｙ）由来のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに抱合されるストレプトアビジンを使用することにより検出される。Ｃ末端配列は、ホタルルシフェラーゼに付着された結合因子と相互作用するエピトープを含む。タンパク質のＮ末端部近隣に位置する独特なエピトープを使用することによる新生タンパク質の分離後、タンパク質を、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐにより説明される手技及びＤｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）レポーターアッセイとして知られる手順に基づくデュアルルミネッセント・ルシフェラーゼアッセイ（二重発光ルシフェラーゼアッセイ）にかける。このアッセイは、まずＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．から市販のルシフェラーゼアッセイ試薬ＩＩを分離された新生タンパク質に加え、次に化学ルミネッセンスレベルを測定することから成る。次に、同時にホタルルミネッセンスを消止し、Ｒｅｎｉｌｌａ ルミネッセンスを活性化する、Ｓｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ（登録商標）試薬を加える。ルシフェラーゼアッセイを実施して、秒単位で定量することができる。ホタルとＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼから測定されたルミネッセンスレベルの比較は、新生タンパク質のコードされたメッセージ中に突然変異が存在するか否かの徴候を提供する。
【０１１２】
その他の実例では、Ｎ末端マーカーは、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを使用することにより、翻訳中にタンパク質のＮ末端部に取り込まれたアフィニティーマーカーを含む。アフィニティーマーカーは共役因子と相互作用し、新生タンパク質を翻訳混合物から分離するために作用する。新生タンパク質はまた、タンパク質のＮ末端に隣接または近隣に位置する、アフィニティーマーカーを含む検出マーカーを含む。さらに、それはタンパク質のＣ末端部またはその近隣に配列特異性マーカーを含む。新生タンパク質のＮ末端及びＣ末端部近隣にある検出マーカーを次に測定して、鎖終了またはフレイム外突然変異の存否を検出するために比較する。
【０１１３】
様々な他のアフィニティーマーカー、Ｎ末端マーカー及びＣ末端マーカーが、本実施態様のために利用可能である。アフィニティーマーカーは、ビオチン、または光開裂性ビオチンであり、Ｎ末端マーカーはＳｔｅｐＴａｇ、さらにＣ末端マーカーはＣ−ｍｙｃエピトープであり得る。この場合は、翻訳後に、反応混合物を、ストレプトアビジンでコートされたビーズを加えてまたは、ストレプトアビジンでコートされたマイクロ滴定プレートでインキュベートする。非結合タンパク質の洗浄後、蛍光色素（ローダミンまたはテキサスレッド）を抱合させた抗ｈｉｓＸ６抗体、及びＢＯＤＩＰＹのような他の蛍光色素を抱合させたＣ−ｍｙｃ抗体を使用して、プレートまたはビーズに検出反応を行う。さらに、ペルオキシダーゼと抱合された抗体を使用して、化学ルミネッセント検出法を使用することも可能である。ペルオキシダーゼ抱合抗体の場合でさえ、蛍光性基質を使用することができ、蛍光イメージャーのような装置を使用して、Ｎ末端及びＣ末端標識を定量することができる。
【０１１４】
最適効果を得るためには、Ｎ末端マーカー及びアフィニティーマーカーは、タンパク質のＮ末端部にできるだけ近接して配置されるべきである。例えば、Ｎ末端マーカーがミスアミノアシル開始因子を使用して取り込まれる場合、それはＮ末端アミノ酸に位置する。この場合、アフィニティーマーカーは、Ｎ末端マーカーにすぐ隣接して位置するべきである。従って、メチオニンに抱合されるＢＯＤＩＰＹ から成るＢＯＤＩＰＹマーカーが、ミスアミノアシル開始ｔＲＮＡにより取り込まれると、ＳｔｅｐｔＴａｇ （ＷＳＨＰＱＦＥＫ） （配列番号８）のようなエピトープ配列が次に続くはずであり、従って全Ｎ末端配列は、ＢＯＤＩＰＹ−ＭＷＳＰＱＦＥＫ（配列番号１０）となるであろう。１０）．　しかし、特別の場合は、Ｎ末端マーカーとアフィニティーマーカーまたはアフィニティーマーカーに結合する共役因子間の相互作用を回避するために、ＢＯＤＩＰＹ−Ｍとエピトープ配列間に介在アミノ酸を加えることは好都合となり得る。そのような相互作用は、Ｎ末端マーカー、アフィニティーマーカー及び共役因子の性質に依存して変化する。
【０１１５】
最適効果を得るためには、Ｃ末端マーカーは、タンパク質のＣ末端部にできるだけ近接して配置されるべきである。例えば、Ｈｉｓ−Ｘ６ ｔａｇが使用される場合、タンパク質配列は６ Ｈｉｓで終止する。ある場合は、エピトープは、新生タンパク質の特性を最適化するために、タンパク質Ｃ末端部の数残基前に位置し得る。これは、例えば、特定のアミノ酸配列が、溶解度または疎水性のような望ましい新生タンパク質の特定の特性を修飾するために必要である場合に起こる。
【０１１６】
本方法の通常適用では、正常メッセージから翻訳された新生タンパク質のＮ末端及びＣ末端マーカーの測定レベルの比率を、標準正規化比を計算するために使用し得る。突然変異を含み得るメッセージの場合は、この標準比からの偏差を突然変異の度合いを予測するために使用し得る。例えば、全てのメッセージが欠落している場合は、Ｎ末端マーカーに対するＣ末端マーカーの比率はゼロであると予測される。他方、全てのメッセージが正常である場合は、比率は１であると予測される。メッセージの半分のみが欠落している場合、例えば、鎖終止またはフレイム外読み取りエラーを起因する特定の遺伝的欠損についてヘテロ接合体である患者では、比率は１／２である。
【０１１７】
鎖終止またはフレーム外突然変異を検出するための既存の手法と比較して、本方法にはいくつかのユニークな利点がある。普通では、そのような突然変異は、従来のＤＮＡ配列法を使用して、疑われる遺伝子の全配列を分析することによって検出される。しかし、そのような方法は時間を要し、高価で、多数の試料についての迅速なスループットアッセイには適切ではない。これに変わる方法は、ゲル電気泳動を利用することであり、これは新生タンパク質の予測されるサイズから変異を検出することが可能である。このアプローチは、しばしばタンパク質トランケーション試験として言及されるが、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡによる検出マーカーの取り込みのような非放射性標識法を使用することにより可能なる。しかし、ハイスループットスクリーニングのような、多くの状況において、時間を要する（典型的には６０〜９０分）ゲル電気泳動の使用を避けることが望ましい。本方法においては、ゲル電気泳動を実施する必要性が排除される。さらには、このアプローチは、蛍光性、ルミネッセントまたはその組み合わせであり得る分離された新生タンパク質由来の２つの検出シグナルの比較に依存するために、極めて自動化し易い。
【０１１８】
タンパク質のＣ末端部近隣に位置する配列依存性マーカーの測定は、フレームシフトまたは鎖終止突然変異のいずれかの存在についての情報を提供し、それはいずれかが存在すると不正確な配列を起因することに拠る。Ｎ末端マーカーの測定は、Ｃ末端マーカーが正規化された測定に対する内部対照を供給する。Ｃ末端マーカーレベルをＮ末端マーカーについて正規化することは、実験の正確性を損ない得る翻訳中のタンパク質発現レベルにおける変化のような本質的な変異を排除する。タンパク質のＮ末端部またはその近隣に位置するアフィニティーマーカーを使用して、翻訳混合物からタンパク質を分離することは、タンパク質が翻訳中にメッセージのコード領域にある内部ＡＵＧから開始される場合に生じ得るフォールススタート（不正開始）の出現を排除する。フォールススタートは、鎖終止またはフレーム外突然変異後に起こるために、誤った結果の原因となり得る。これは、内部ＡＵＧがメッセージを有するフレーム内にある場合に特に真実である。この場合、メッセージが突然変異を含んでいても、ペプチドＣ末端マーカーは依然として存在する。
【０１１９】
Ｂ．レポーター基
本発明による他の実施態様は、系から成分を分離することなく、細胞または無細胞タンパク質合成系における新生タンパク質の合成をモニタするための方法を指示する。これらのマーカーは、いったん新生タンパク質中に取り込まれると、溶液中に遊離またはｔＲＮＡと結合されているマーカーから識別可能である。このタイプのマーカーは、レポーターとも称されるが、細胞または無細胞翻訳系において直接に新生タンパク質の合成を検出及び定量するための手段を供給する。
【０１２０】
米国特許第５，６４３，７２２号（本明細書に参考文献として編入）に既に説明されているレポーターの一つのタイプは、タンパク質合成系によって、いったん新生タンパク質中に取り込まれると、その物理的または生理化学的特性の少なくとも一つが変化を受けるという特徴を有する。結果生じる新生タンパク質は、タンパク質合成系をその成分に分離したり、部分的に精製することなく、リアルタイムで、合成系内において独自検出され得る。このタイプのマーカーは、タンパク質合成系中に既存のタンパク質から最初に新生タンパク質を分離する必要なく、その生産をモニタするための便利な非放射性方法を供給する。レポーターマーカーはまた、タンパク質発現中の異なる時期に、その特性が互いに識別可能な複数のマーカーを加えることにより、タンパク質合成中の異なる時期に生産される、異なる新生タンパク質の検出及びその識別のための手段も供給する。これは、分化遺伝子発現研究のための手段を供給する。
【０１２１】
レポーター利用の一例を図１０に概略表示する。ｔＲＮＡ分子は、モニタ及び励起のための特定波長では、弱い蛍光性を有するかまたは蛍光性のないレポーター（Ｒ）でミスアミノアシル化される。このミスアミノアシル・ｔＲＮＡは、次に細胞または無細胞タンパク質合成系中に導入され、レポーター類似体を含む新生タンパク質が徐々に生産される。新生タンパク質中にレポーターが取り込まれると（Ｒ＊）、既知の波長において蛍光の増加を呈する。新生タンパク質の漸次な生産は、特定波長において蛍光の増加を検出することによりモニタされる。
【０１２２】
レポーターの化学的合成は、化学的部分の結合、あるいは天然アミノ酸残基を有するレポーター特性を持つ分子成分に依存し得る。その環境に感受性があり、発光光線の波長は蛍光収量の変化を受ける多数の蛍光分子がある。アミノ酸と結合されている、これらの化学的部分が、合成タンパク質中に取り込まれると、バルク水性媒質とタンパク質内部間の差異が、水分へのアクセスの低下、電荷イオン基への曝露、易動度の低下、及び周囲媒質の誘電率の変化を生起し得るために、その環境が変更される。そのような２つの実例を図１１Ａに示す。
【０１２３】
レポーター分子の一例は、蛍光性アクリジニウム部分に基づき、マイクロ環境の極性または粘度に応じて、その発光特性が変化するというユニークな特性を有する。それは、疎水性環境及び／または粘度に曝されると、量子効率のより高い蛍光を有する。レポーター自体が疎水性であるため、増殖新生ポリペプチド中への取り込み後、レポーターは新生タンパク質の疎水性コアと会合すると思われる。蛍光強度の増加は、翻訳系のタンパク質合成活性の直接的計測法である。しかし、タンパク質中において各レポーター残基の環境は異なり、またある場合は、レポーターはタンパク質表面上に存在して水性媒質に曝されることがあり、タンパク質中に取り込まれたレポーターの総分光特性にネットとしての変化がバルク水性媒質に関連して起こる。タンパク質中のレポーターのサブセットのみに関する分光特性の変化は、そのようなレポーターを取り込むタンパク質合成の検出には十分である。
【０１２４】
その他のアプローチは、必ずしもその環境の変化への応答としてではなく、ペプチド結合形成時にその蛍光特性を変化するレポーターを利用することである。レポーターは、無細胞抽出物において異なる環境を分割するため、レポーター蛍光の変化は、新生タンパク質中へのレポーターの取り込みに際する蛍光の変化と比較して大きなシグナル変化を生じない。
【０１２５】
レポーターの第２の実例は、６，７−（４’， ５’−プロリノ）クマリン［ ６，７−（４’， ５’−ｐｒｏｌｉｎｏ）ｃｏｕｍａｒｉｎ］のようなクマリン基材のマーカーである。この化合物は、ペプチド結合形成後に、フルオロフォアがその発光及び吸光特性を変更するように、クマリンのようなフルオロフォアをアミノ酸構造エレメントと結合することにより、化学的に合成し得る。例えば、二次アミノ官能基を含むプロリン環は、正常一次アミノ基と同様にペプチド結合形成に関与する。既存のフルオロフォアに関して新しく形成されたペプチド基の共平面性のために、蛍光の変化が生じる。これは、窒素孤立電子対のπ‐電子及びペプチド結合のカルボニル基のために、抱合／脱局在化を増加する。そのような化合物の合成は、アセト酢酸エチルを使用する、クマリン合成に基づく（図１１Ｃ）。
【０１２６】
レポーターは、タンパク質中に取り込まれる際にその蛍光特性を変化するそれらの非天然アミノ酸に限定はされない。これらはまた、電磁スペクトルのＵＶ、可視および赤外領域における特定の吸光バンドの変化、ラマン活性で、共鳴ラマンスペクトロスコピー、電子スピン共鳴活性、及び核磁気共鳴によって強化され得る発色団を含む他の電磁または分光特性において変化を受ける分子から合成され得る。一般的には、レポーターは、、電磁場及び放射への相互作用及び反応が、新生タンパク質中への取り込み後に変化を受ける分子成分から形成され得る。
【０１２７】
本発明においては、レポーターはさらに、同一新生タンパク質中に取り込まれている、またはタンパク質が発現されている反応チャンバーに存在する他のマーカー及び因子との相互反応のために、その物理的または生理化学的特性の少なくとも一つに変化を受けることがある。２つの異なるマーカーの互いの相互作用が、特に検出性の原因となる。相互作用の一つのタイプは、２つのマーカーが約１オングストローム（Ａ）〜約５０ Ａ、好ましくは約１０ Ａ以内の距離内にある場合に生じる共鳴エネルギー移動である。この場合、電磁放射を有する一つのマーカーの励起が、検出可能な異なる波長で、第二マーカーの電磁放射放出を起因する。相互作用の第二のタイプは、マーカーが約５ Ａ以内にある場合にのみ生じる、２つの異なるマーカー間の電子伝達に基づく。第三の相互作用は、２つのマーカー間の光化学的反応であり、蛍光のような検出特性を有する新種を生産する。これらのマーカーはまた、新生タンパク質中への取り込みに使用されるミスアミノアシル・ｔＲＮＡ上に存在し得るが、マーカーの相互作用は、主として、その近位性のためにタンパク質中に取り込まれた時に生じる。ある場合は、タンパク質中の２つのマーカーの近位性は、タンパク質の一次、二次、または三次構造のいずれかにおいて、互いに近接する位置にマーカーを取り込むｔＲＮＡ種を選択することにより強化され得る。例えば、チロシン‐ｔＲＮＡ及びトリプトファン‐ｔＲＮＡは、ユニークな隣接対チロシン‐トリプトファンを含むタンパク質配列において、２つの異なるマーカーが互いに近接する可能性を高めるために使用することができる。
【０１２８】
本方法による一つの実施態様では、共役因子と結合する際に、レポーター基が第二マーカーまたは因子と相互作用して、それらを特に検出可能にするように、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを使用して、レポーター基が新生タンパク質中に取り込まれる。そのような相互作用は、いったん特定のアフィニティー要素が共役因子と相互作用すると、レポーター基と第二マーカー間の相互作用を最適化するように、特定のアフィニティー要素を新生タンパク質中に取り込むことにより最適化し得る。そのようなアフィニティー要素は、エピトープまたは非天然アミノ酸を形成する特定のアミノ酸配列を含む。一つの実例では、レポーター基は、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを使用することにより、新生タンパク質のＮ末端部に取り込まれる。エピトープは、共役因子との相互作用時に、レポーターが共役因子と抱合されている第二マーカーの近接部位に来るように、新生タンパク質中に取り込まれる。
【０１２９】
都合よく使用されるマーカー間相互作用の一つのタイプは、２つのマーカーが約１オングストローム（Ａ）〜約５０ Ａ、好ましくは約１０ Ａ以内の距離内にある場合に生じる蛍光共鳴エネルギー移動を起因する。この場合、電磁放射を有する一つのマーカーの励起が、検出可能な異なる波長で、第二マーカーの電磁放射放出を起因する。これは、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ 開始ｔＲＮＡｆｍｅｔを使用して、タンパク質のＮ末端部に蛍光マーカーを取り込むことにより達成され得た。Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓにより説明されるＳｔｅｐｔＴａｇ （ＷＳＨＰＱＦＥＫ） （配列番号８）のようなエピトープが次にＮ末端近辺に取り込まれる。ストレプトアビジンを次に既知の方法を使用して、第一マーカーによって効率よく蛍光エネルギー移行を受けるように選択された第二蛍光マーカーと抱合する。このプロセスの効率は、２つのマーカーのスペクトル特性に依存するフォースターエネルギー移行半径（Ｆｏｒｓｔｅｒ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｒａｄｉｕｓ）を計算することにより測定し得る。マーカー・ストレプトアビジン複合体が次に翻訳混合物中に導入される。新生タンパク質ＳｔｒｅｐｔＴａｇエピトープとストレプトアビジンの特異的相互作用のために、新生タンパク質が生産された時のみ、第一及び第二マーカー間に蛍光エネルギー移行が生じる。
【０１３０】
近隣部位に置かれると容易に検出可能なシグナルを生産する、本方法においてマーカー対として使用し得る様々な色素がある。以前は、そのような色素対は、例えば、ＰＣＲ産物を検出するために、一つのプローブは５’端かつ他のプローブは３’端を色素で標識したプローブにハイブリダイズすることにより、使用されていた。ＰＣＲ産物の生産は、色素対を近隣部位におき、検出可能なＦＲＥＴシグナルを生起する。一つの適用では、色素、フルオレセイン及びＬＣ ６４０は、２つの異なるプライマー（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ−ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−ｍａｎｎｈｅｉｍ．ｃｏｍ／ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ／ｍｏｎｉｔｏ０３．ｈｔｍ）上で使用された。ダイオード・レーザーによって発生される緑色光線（約５００ ｎｍ）で、フルオレセインが励起されると、ＬＣ ６４０は、適切なフィルター及び検出器で容易に検出し得る、赤色蛍光光線（約６４０ ｎｍ）を発光する。新生タンパク質の場合、色素対、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ 及び ＬＣ ６４０は、同様な方法で機能する。例えば、タンパク質のＮ末端部上へのＢＯＤＩＰＹ ＦＬの取り込みとＮ末端エピトープに対して指示されているＬＣ ６４０による結合因子の標識は、新生タンパク質生産の検出を可能とする。
【０１３１】
マーカー対ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬとクマリンの使用は、都合よく使用される第２番目の対である。一つの研究［Ｋｅｌｌｅｒ， Ｒ． Ｃ．、 Ｓｉｌｖｉｕｓ， Ｊ． Ｒ．、 及びＤｅ Ｋｒｕｉｊｆｆ， Ｂ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ２０７（２）、５０８〜１４］では、スペクトルオーバーラップを使用して、クマリン‐（β‐ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ）及びクマリン‐（β‐ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０）についてフォースターエネルギー移行半径（ＲＯ）５０ ＋／− ２ Ａ 及び ４０ ＋／− ２ Ａが共役することが発見された。実験的には、これはそれぞれ、４９．０〜５１．５ Ａ 及び３８．５〜４２．５ Ａと推定された。類似または同一のスペクトル特性を有する２つのマーカーを、消光プロセスのために、マーカー対として使用することも可能である。例えば、一つの研究では、このプロセスは、無傷細胞における外在性タンパク質のプロセシングを研究するために、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬの事例で使用され［Ｒｅｉｓ， Ｒ． Ｃ．、 Ｓｏｒｇｉｎｅ， Ｍ． Ｈ．、及びＣｏｅｌｈｏ−Ｓａｍｐａｉｏ， Ｔ． （１９９８） Ｅｕｒ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７５（２）、 １９２〜７］、また二番目の事例では、細胞内ウィルスアセンブリ動態学研究のために使用された［Ｄａ Ｐｏｉａｎ， Ａ． Ｔ．、 Ｇｏｍｅｓ， Ａ． Ｍ．、及びＣｏｅｌｈｏ−Ｓａｍｐａｉｏ， Ｔ． （１９９８） Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７０（１）、 ４５〜５８］。
【０１３２】
上記に記載のように、レポーターを使用する主要な利点は、それ以上の精製または分離ステップなしに、直接に細胞または無細胞翻訳系におけるタンパク質の合成をモニタするための能力である。レポーターマーカーはまた、必要に応じて、レポーター特性を除去し得る切断可能なマーカーと併用して使用し得る。そのような手法は、取り込まれたマーカーを取り込まれなかったマーカーから区別するために分離ステップを必要とする、放射性アミノ酸を使用する場合では利用できない。インビトロ翻訳系では、これは、タンパク質合成の速度を測定し、また反応条件を変更することにより合成を最適化するための手段を供給する。例えば、インビトロ翻訳系は、特定の較正タンパク質の生産速度をモニタすることにより最適化することができた。これはさらに、細胞または無細胞系における遺伝子制御研究のための信頼でき、かつ正確な方法も供給する。
【０１３３】
Ｃ．アフィニティーマーカー
本発明による他の実施態様は、細胞または無細胞タンパク質合成系において生産される新生タンパク質の検出または分離を容易にするマーカーの用途を指示する。そのようなマーカーは、アフィニティーマーカーと称され、受容体基を含む分子及び／または物質と選択的に相互作用する特性を有する。アフィニティーマーカーは、説明されるように、非天然アミノ酸類似体及び誘導体、さらにレポータータイプのマーカーのような他のマーカーと同一な方法で、ｔＲＮＡをアミノアシル化することにより結合される。これらのアフィニティーマーカーは、いったんミスアミノアシル・ｔＲＮＡが翻訳系に導入されると、新生タンパク質中に取り込まれる。
【０１３４】
アフィニティーマーカーは、共役因子を介する、生物学的または非生物学的起源である他の分子による選択的相互反応のために、新生タンパク質の分離を容易にする。例えば、受容体分子と言及される、アフィニティーマーカーが相互作用する特定の分子は、小有機分子またはスルヒドリル基（−ＳＨ）のような化学基、または抗体のような大型バイオ分子であり得る。結合は、事実上普通は化学的であり、共有または非共有結合の形成、あるいはイオンまたは水素結合のような相互作用を含み得る。結合分子または部分は、溶液中で遊離しているか、またはそれ自体が表面、ポリマーマトリックスに結合されているか、あるいは基質表面に常在し得る。相互作用はまた、光線、温度、圧力または触媒として作用する化学的または生物学的分子の添加のような外部因子によってトリガされ得る。
【０１３５】
反応混合物中にある新生タンパク質と他の既在タンパク質の検出及び／または分離は、アフィニティーマーカーと受容体分子間の相互作用、通常では結合の種類によって起こる。しかし、取り込まれたアフィニティーマーカーのあるものが新生タンパク質内部に埋め込まれているようなある事例においても、アフィニティーマーカーのいくつかが新生タンパク質表面に露出されている限りは、アフィニティーマーカーと受容体分子間の相互作用は起こる。アフィニティーマーカーはタンパク質配列のいくつかの位置に分散されているために、これは普通は問題とならない。
【０１３６】
アフィニティーマーカーは、共役因子が付着または取り込まれている、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸誘導体あるいはアミノ酸類似体を含む。例えば、非天然アミノ酸への共役因子の付着は、共有相互作用を介して起こるが、親水性または疎水性相互作用、水素結合、静電相互作用またはこれらの組み合わせのような非共有相互作用もまた可能である。有用な共役因子の実例は、ハプテン、免疫原性分子、ビオチン及びビオチン誘導体、さらにこれら分子のフラグメント及び組み合わせのような分子を含む。共役因子は、新しく形成された新生タンパク質の選択的結合または付着を可能として、その検出または分離を容易にする。共役因子は、特定の抗体に対する抗原部位を含むか、あるいはストレプトアビジンのような受容体基への強い結合を有することが知られているビオチンのような分子を含み得る。例えば、ビオチンはタンパク質鎖中に取り込まれたアミノ酸に共有結合し得る。ビオチンの存在は、表面上にコートされているアビジン分子中にそのようなマーカーを取り込んでいる新生タンパク質のみを選択的に結合する。適切な表面は、クロマトグラフィー分離用の樹脂、結合プレート用の組織培養表面のようなプラスチック、マイクロ滴定皿及びビーズ、セラミック及びガラス、磁性粒子、ポリマー及び他のマトリックスを含む粒子を含む。処理表面は、例えば、非新生タンパク質及び他の翻訳用試薬を取り除くためにリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄され、新生タンパク質が分離される。ある場合は、これらの物質は、光ファイバー、ＣｈｅｍＦＥＴ、及びプラズモン検出器のようなバイオ分子検知装置の一部であり得る。
【０１３７】
アフィニティーマーカーの一例はダンシルリジン（図５）である。ダンシル環と相互作用する抗体は市販されており（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、または、本明細書に参考文献として特に編入されている、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （抗体：実験室マニュアル）（Ｅ． Ｈａｒｌｏｗ 及び Ｄ． Ｌａｎｅ、編集、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 １９８８）に説明されるような既知のプロトコルを使用して調製し得る。ダンシル部分を含むタンパク質を、特異的抗体‐ダンシル相互作用に基づいて、他のタンパク質から分離することを可能とする多数の従来の手法が存在する。例えば、抗体をクロマトグラフィーカラムの充填材上に不動化することができる。アフィニティーカラムクロマトグラフィーとして知られる本方法は、ターゲットタンパク質を不動化抗体との相互反応によってカラムに保留し、他のタンパク質はカラムを通過することにより、タンパク質の分離を達成する。ターゲットタンパク質は次に、抗原抗体相互作用を破壊することにより遊離される。イオン交換またはアフィニティーセファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）及び他のクロマトグラフィー用樹脂のような特定のクロマトグラフィーカラム材料が市販されている（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ； Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ； Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）。
【０１３８】
分離は、免疫沈降法、及び、フィルター上またはビーズ、プレートまたは樹脂のような他の表面上への抗体の不動化のような他の生化学的分離方法を使用して、抗体‐ダンシル相互作用によって実施され得る。例えば、タンパク質は、タンパク質特異的抗体で磁性ビーズをコートすることにより分離することができた。ビーズは、磁場を使用して抽出物から分離される。アフィニティーマーカーとしてダンシルリジンを使用する特別の利点は、いったんタンパク質が分離されると、その蛍光特性のために好都合にもさらに検出され得ることである。
【０１３９】
抗体の他に、これと等しくターゲット分子または化学的部分と強い相互作用を呈示するその他の生物学的分子が存在する。実例は、ビオチンとアビジンの相互作用である。この場合は、ビオチン部分を含むアフィニティー類似体が、本発明の一部である方法を使用して、タンパク質中に取り込まれる。ビオチン‐リジンアミノ酸類似体は市販されている（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ； Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）。
【０１４０】
アフィニティーマーカーはさらに、マーカー検出前に形成されなければならないマルチ成分複合体の一つの成分を含む。本検出手段による一つの特定の実施態様は、ルミネッセント金属キレート塩、特にルミネッセント希土類金属キレート塩の使用を含む。ある特定の分子は、希土類金属と極めて安定な複合体を形成することが知られている。さらに、これらのキレート塩への発色団の導入は、これらの複合体のルミネッセンスを感作することがよく知られている。ルミネッセント希土類金属キレート塩の使用に基づく様々な検出機構が説明されている：Ｈｅｍｍｉｌａ， Ｉ．Ａ．、 “Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（免疫アッセイ法における蛍光の適用）”、（Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ １９９１）。
【０１４１】
好ましい実施態様では、ｔＲＮＡが、希土類シェルターとしてさらに作用する発色団でミスアミノアシル化される。この修飾アミノアシル・ｔＲＮＡは、次に細胞または無細胞タンパク質翻訳系中に導入され、修飾アミノ酸が新生タンパク質中に取り込まれる。この混合物は次に、ゲル電気泳動を使用して分離され、ゲルは希土類陽イオンを含む溶液を加えてインキュベートされる。これらの条件下、希土類陽イオンは、新生タンパク質中にのみ存在するキレート化剤によって修飾されたアミノ酸とルミネッセント複合体を形成する。新生タンパク質は次に、形成されたランタニド複合体を励起する、中域ＵＶトランスイルミネーター（３５０ ｎｍ）を使用して検出される。画像は次に、ポラロイドカメラまたはＣＣＤアレイ及びフィルターを使用して記録される。一つの実施態様では、二成分検出システムの第一成分としてサリチル酸誘導体、また第二成分としてテルビウムイオンが使用される。
【０１４２】
アフィニティーマーカーはさらに、共役因子を取り込んでいる切断可能マーカーを含み得る。この特性は、タンパク質の天然構造及び機能を維持し、受容体基から新生タンパク質を遊離するために共役因子の除去が必要である場合に重要である。ある場合は、共役因子の切断及び除去は、天然アミノ酸の生産を生起する。一つのそのような実例は、アミノ酸と結合された光開裂型ビオチンである。
【０１４３】
光開裂型ビオチンは、Ｘ、Ｙ 及びＺによって図１２に示す官能基により誘導体化されたフェニル環を含む光開裂部分を含む。Ｘは、反応基Ｘ’を介して、バイオ分子基質へのＰＣＢの結合を可能とする。Ｘ’の実例は、Ｃｌ、 Ｏ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル、 ＯＣＨ２ＣＮ、 ＯＰｈＦ５、 ＯＰｈＣｌ５、 Ｎ３を含む。Ｙは、１またはそれ以上のニトロまたはアルコキシルのような置換を含むフェニル環の置換パターンを示す。官能基Ｚは、クロスリンカー部分の光反応部分への結合を可能とする基を示す。光反応部分は、照射に際して、基質からＰＣＢ分子の切断を生起する光反応を受ける特性を有する。
【０１４４】
リジン‐ｔＲＮＡは、光開裂型ビオチン‐リジンでミスアミノアシル化されるか、または化学的に修飾されて光開裂型ビオチンアミノ酸を付着する。ミスアミノアシル・ｔＲＮＡは、無細胞タンパク質合成系に導入されて、新生タンパク質が生産される。新生タンパク質は、ビーズと磁場の相互作用に基づく従来の方法を使用して、ストレプトアビジンでコートされた磁性ビーズによって、系の他の成分から分離し得る。新生タンパク質は、波長が約２８０ ｎｍであるＵＶ光線の照射により、ビーズから遊離される。
【０１４５】
タンパク質検出のためにデザインされた多数の装置が、ターゲットタンパク質と特定の不動化受容体分子の相互作用に基づいている。そのような装置はまた、ターゲット分子の不動化受容体基との相互作用によって変更された、表面プラズモン、光散乱及び物質の電子特性における変化の検知に基づくバイオディテクター（バイオ検出器）のようなアフィニティーマーカーをいったん含むと、新生タンパク質を検出するために使用され得る。
【０１４６】
アフィニティータイプマーカーを含まないものを含む新生タンパク質は、他の従来の分離手法によって分離され得る。新生タンパク質を分離かつ精製するために適用または併用できるより有用な分離手法のいくつかは、フェノールまたはクロロホルム抽出のような化学抽出法、透析法、硫酸アンモニウムカットのような沈降法、電気泳動及びクロマトグラフィー法を含む。化学的分離法は、一般的には個々のタンパク質の特定な分離を供給しないが、バルク量の非タンパク質性物質の除去に有用である。電気泳動による分離は、新生タンパク質を含む翻訳混合物を、変性または非変性ポリアクリルアミドであるゲルまたはアガロースゲルのウェル中に入れること含む。直流またはパルス電流をゲルに印加し、系の様々な成分が、分子サイズ、形状、電荷またはその物理的特性の組み合わせに従って分離される。いったんゲル上で識別されると、分離タンパク質を含む部分を取り出して、新生タンパク質をゲルから精製する。アクリルアミド及びアガロースゲルからのタンパク質精製法は既知であり、市販されている。
【０１４７】
タンパク質の分離及び精製に有用であるクロマトグラフィー法は、ゲル透過、高速または高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィーを含む。これらの手法は、選択マーカーを含むタンパク質種の分離及び精製に極めて便利である。
本発明による他の実施態様は、新生タンパク質のアミノ末端残基における、マーカーまたはアフィニティー特性を有する非天然アミノ酸またはアミノ酸誘導体の取り込みを指示する（図１３）。これは、アミノ酸の側鎖の使用またはアミノ酸の末端アミノ基を誘導体化することにより達成し得る。どちらの場合も結果生じる分子は、アミノ酸誘導体と称される。タンパク質のアミノ末端残基は遊離基であり及、従ってその誘導体化は、新生ポリペプチドの形成を妨げないであろう。非天然アミノ酸またはアミノ酸誘導体は次に、アミノ酸合成の開始をシグナルする第一ＡＵＧコドンのみを認識する開始ｔＲＮＡをミスアミノアシル化するために使用される。このミスアミノアシル開始ｔＲＮＡのタンパク質合成系への導入後、マーカーは新生タンパク質のアミノ末端にのみ取り込まれる。これらの新生分子はほとんど天然立体配座にフォールドされて（折りたたまれて）いる可能性があるため、Ｎ末端残基に取り込む能力は重要である。これは、機能性新生タンパク質の検出や分離を所望するような研究では便利である。
【０１４８】
新生タンパク質のアミノ末端残基でミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡによって取り込まれた全てのマーカーが、タンパク質翻訳機構による同様な受容を示すわけではない。さらに、異なるマーカーの取り込み範囲は、リジン‐ｔＲＮＡのような非開始ｔＲＮＡの用途に比較するとより限定的であり得る。ミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡによる取り込みについてのマーカー間のこの識別を影響する因子については完全には解明されていないが、一つの可能性は、ホルミルメチオニン−開始ｔＲＮＡをリボソームに運搬するために使用される開始因子（ＩＦ２）が役割を果たすことである。第二の可能性は、マーカー構造とリボソーム間の相互作用が役割を果たすことである。例えば、マーカー、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬは、タンパク質翻訳機構により、ＮＢＤのような小型蛍光マーカーよりも大幅に受容される。この理由で、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ　は、開始ｔＲＮＡを介して取り込まれる場合は、新生タンパク質検出における使用には優れたマーカーである。
【０１４９】
マーカー基はまた、正常ＡＵＧ開始コドンを認識しない突然変異型ｔＲＮＡを使用することにより、Ｎ末端に取り込まれ得る。ある場合は、これはマーカーのより高度な特異的取り込みを誘導し得る。例えば、アンチコドンがＣＡＵからＣＵＡに変更された（開始メチオニンコドンのアンバー終止コドンへの変更を起因）開始ｔＲＮＡの突然変異体は、開始サプレッサーｔＲＮＡとして作用することが示されている（Ｖａｒｓｈｎｅｙ Ｕ、 ＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ ＵＬ、 Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９０ Ｆｅｂ；８７（４）：１５８６〜９０； Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｆｒｏｍ ａ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｏｄｏｎ（終止コドンからのタンパク質合成の開始）。このｔＲＮＡは、正常開始コドンＡＵＧがアンバーコドンＵＡＧによって置換されると、特定の遺伝子のタンパク質合成を開始する。さらには、ＵＡＧとｔＲＮＡ（ｆＭｅｔＣＵＡ）によるタンパク質合成の開始は、メチオニンではなくグルタミンで起こることが発見された。新生タンパク質のＮ末端部にマーカーを導入するためにこのｔＲＮＡを使用するには、この突然変異体ｔＲＮＡは、グルタミンで酵素的にアミノアシル化され、次に適切なマーカーで修飾され得る。他方、このｔＲＮＡは修飾アミノ酸（例えば、メチオニン−ＢＯＤＩＰＹ）を使用して、化学的にアミノアシル化し得る。タンパク質翻訳は、ＵＡＧを含メッセージ上でこのタンパク質によってのみ開始できるため、全てのタンパク質は、タンパク質のＮ末端部にマーカーを含むであろう。
【０１５０】
Ｄ．質量分析法
質量分析法は分子の質量を計測する。生物学における質量分析の用途は、迅速に進歩を続けており、炭水化物、タンパク質、核酸及びバイオ分子複合体の分析を含む多様な領域に適用されている。例えば、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）質量分析（ＭＳ）の開発は、タンパク質、オリゴヌクレオチド、及びオリゴサッカリドを含むバイオ分子の分析のための重要なツールを供給した［Ｋａｒａｓ、 １９８７ ＃６１８０； Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ、 １９９３ ＃６１７５］。この手法の成功は、大型バイオ分子及び非共有結合複合体（＞５００，０００ Ｄａ）の分子量を、高精度（０．０１％）及び感度（フェムトモル量以下）で計測するその能力に基づく。これまでは、これはＤＮＡの迅速配列、生物活性ペプチドのスクリーニング及び膜タンパク質分析を含む生物学及び医学の多様な領域に適用できることが発見されている。
【０１５１】
ミスアミノアシル・ｔＲＮＡによって新生タンパク質中、特にＮ末端部のような特定の位置、に取り込まれたマーカーは、質量分析法によって新生タンパク質を検出するために使用し得る。そのようなマーカーなしでは、抽出物中には類似の質量を有する多数の他の分子が存在するために、細胞または無細胞抽出物中で、合成された新生タンパク質に起因するバンドを検出するのは極めて困難であり得る。例えば、抽出物の総タンパク質量の０．０１％以下が新生タンパク質を含むような場合である。さらには、新生タンパク質と類似の分子量を有する分子が混合物中に存在することがある。そのような分子は、新生タンパク質のピークとオーバーラップするであろう。この問題は、新生タンパク質が無細胞または細胞タンパク質合成に既に存在する転写または翻訳因子である場合に、特に重大である。タンパク質合成系におけるこのタンパク質を余分な量の合成は、ピーク強度がタンパク質濃度と直線的に相関しないために、質量分析法における既知の方法を使用して検出することは困難であろう。
【０１５２】
翻訳系で生産された新生タンパク質の質量分析による検出は、生産された新生タンパク質の質量が未知である場合は、さらに極めて困難である。この状況は、例えば、新生タンパク質が正確な配列が未知であるＤＮＡから翻訳される場合に生じるであろう。そのような一つの実例は、特定の遺伝子または遺伝子フラグメント中に特定の突然変異を有する個体からのＤＮＡの翻訳である。この場合は、突然変異はタンパク質配列の変化を起こすことがあり、突然変異が終止コドンを起因する場合は鎖トランケーションさえ起こす結果となる。翻訳系において生産される新生タンパク質の質量は、ＤＮＡが遺伝子ライブラリーの異なるメンバーまたはそのフラグメントを含む可能性のある細菌コロニーのような未知の原料に由来する場合にも、また未知である。
【０１５３】
本発明による一つの実施態様では、特定の質量を持つマーカーの新生タンパク質中への取り込みが、従来の質量分析法のアプローチに関連する前記に説明する問題全てを排除するために使用され得る。第一に、既知の質量を持つマーカーでミスアミノアシル化されたｔＲＮＡを、タンパク質合成系に添加する。合成系を次に、新生タンパク質を生産するためにインキュベートする。タンパク質合成系の質量スペクトルを次ぎに測定する。新生タンパク質の存在は、未修飾タンパク質の質量と、新生タンパク質及びマーカーの質量を含む修飾アミノ酸の質量に対応する高質量位置にある第二バンドに対応する、タンパク質合成系の質量スペクトルのピークを同定することにより直接検出し得る。
【０１５４】
本方法を使用する新生タンパク質の効率的な検出を最適化するために行い得るいくつかのステップがある。マーカーの質量は、質量分析の分解能を超えるべきであり、従って新生タンパク質の質量の増加分は非修飾質量から解明され得る。例えば、質量が１００ Ｄａを超えるマーカーは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）または電子噴霧イオン化法（ＥＳＩ）のどちらを使用しても、総質量が１００，０００までのタンパク質中で容易に検出し得る。ミスアミノアシル・ｔＲＮＡ量は、質量マーカーの取り込みが、生産される総新生タンパク質の約５０％において生じるように調整されるべきである。開始ｔＲＮＡは新生タンパク質のＮ末端部にのみ取り込まれるため、従って質量マーカーの複数のコピーが新生タンパク質に含まれる可能性が回避されるので、開始ｔＲＮＡが質量マーカーの取り込みには好ましい。
【０１５５】
この方法の一例は、質量が２８２であるマーカーＢＯＤＩＰＹ−ＦＬの、ミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡを使用する、新生タンパク質への取り込みである。ミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡを使用する、新生タンパク質へのこのマーカーの取り込みは、新生タンパク質に出現する正常バンドより上の約２８２ Ｄａでバンドの出現を起こす。非ミスアミノアシルＥ．ｃｏｌｉ ｔＲＮＡｆｍｅｔと競合のために、マーカーの取り込みはタンパク質当たり１以下であるために、非修飾タンパク質に対応するピークもまた出現する。マーカーの質量によって分離されるこれらの２つのバンドの同定は、新生タンパク質由来のバンドの初期同定を可能とする。新生タンパク質由来のバンドのそれ以上の確認は、翻訳混合物中にあるミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡレベルを調整することにより行い得る。例えば、ミスアミノアシル・開始ｔＲＮＡが省かれる場合、非修飾タンパク質に対応するピークのみがタンパク質合成系の質量スペクトルに出現する。ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬを有するミスアミノアシル・ｔＲＮＡを含むタンパク質合成系及び含まないタンパク質合成系からの質量スペクトルを比較することにより、タンパク質合成系中に類似または同一質量を持つタンパク質が既に存在する場合でさえも、新生タンパク質の存在を独自に同定し得る。
【０１５６】
新生タンパク質の質量分析による同定の目的には、光開裂型マーカーの利用がしばしば都合がよい。この場合は、質量スペクトル中にある新生タンパク質のピークは、マーカーを光開裂する照射に露光された、または露光されていないタンパク質合成系の試料からのスペクトルを測定及び比較することにより容易に同定され得る。露光されていない試料は、取り込まれた質量マーカーを有する新生タンパク質の質量に対応するバンドを呈示するが、露光された試料は、質量マーカーが除去された後の新生タンパク質の質量に対応するバンドを呈示する。照射に起因する質量スペクトルの特定バンドのこのシフトは、タンパク質合成系において新生タンパク質に起因するバンドのユニークな識別子を供給する。
【０１５７】
この方法の一例は、光開裂型マーカーである、光開裂型ビオチンの使用を含む。光開裂型ビオチンが、ミスアミノアシル・Ｅ． ｃｏｌｉ 開始ｔＲＮＡｆｍｅｔを使用して、ブドウ球菌によって生産される毒素である、試験タンパク質α‐ヘモリジン中に取り込まれると、質量スペクトルは、新生タンパク質の質量３５，９０４ Ｄａに対応するピークと、３６，４６５ Ｄａに新生タンパク質の質量プラス光開裂型ビオチンの質量に対応する第二ピークの２つのピークを呈示する。細胞または無細胞抽出物を、波長が約３６５ ｎｍであるＵＶ光線に、約１０分露光することによるマーカーの光開裂後、新生タンパク質からマーカーが切断されるために、２つのバンドの強度は変更を受ける。例えば、スペーサーを１つ含む光開裂型ビオチンの場合は、質量の変化は５６１．５７である。これらの特徴の変化は、次に新生タンパク質に対応するピークを独自同定するために使用される。ＭＡＬＤＩ質量分析法の場合は、十分な強度に調整されると、レーザーパルス・プローブは、光開裂型ビオチンの光開裂を達成するために使用され得る。この場合は、変化は、測定期間中に従来の方法で測定することができ、従って新生タンパク質に関連するピークの検出を容易にする。同様なアプローチが、細胞または無細胞翻訳系において、質量が未知である１つ以上の新生タンパク質の同定に使用され得る。
【０１５８】
ミスアミノアシル・ｔＲＮＡによって新生タンパク質中に取り込まれる、アフィニティー特性を有するマーカーはさらに、質量分析によるそのようなタンパク質の検出にも極めて便利である。そのようなマーカーは、新生タンパク質を、残りの無細胞または細胞翻訳系から分離するために使用され得る。この場合は、残りの無細胞混合物からの新生タンパク質の分離は、タンパク質翻訳系にある他の分子のバンドからの妨害を排除する。このアプローチの実例は、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを使用する、新生タンパク質のＮ末端への光開裂型ビオチンの取り込みである。このマーカーが、Ｅ． ｃｏｌｉ ｔＲＮＡｍｅｔを使用して、新生タンパク質のＮ末端部上に取り込まれると、それはストレプトアビジンアガロースのようなストレプトアビジン親和性媒質を使用して結合され得る便利なアフィニティー標識を供給する。この方法によって、いったん新生タンパク質が残りのタンパク質合成系から分離されると、ＵＶ光線によって遊離され、さらに質量分析によって分析され得る。ＭＡＬＤＩ質量分析法の場合は、新生タンパク質の遊離は、ＭＡＬＤＩ システムのＵＶレーザー励起パルスを使用して、大変便利にも達成し得る。他方、ＭＡＬＤＩ または ＥＳＩ質量分析の場合は、質量分析を行う前に試料を照射し得る。
【０１５９】
Ｅ．電気泳動法
本発明による他の実施態様は、電気泳動によって翻訳系において翻訳された新生タンパク質と分子または因子の相互作用を検出するための方法を指示する。この方法は、多数の化合物または因子を、タンパク質が分離されたり、その機能が同定されていなくても、特定遺伝子による発現タンパク質との相互作用の可能性について迅速なスクリーンを行うことを可能とする。この方法はさらに、遺伝子プールによって発現されているタンパク質ライブラリーを、これらのタンパク質または因子を分離する必要なく、化合物または因子との相互作用について迅速にスクリーンすることも可能にする。因子は、化合物の組み合わせライブラリーの一部であるか、または天然試料のような複雑な生物学的混合物中に存在し得る。因子は、新生タンパク質に結合することによりこれと相互作用するか、または相互作用して化学的あるいは酵素的修飾による新生タンパク質の構造の変化を生起する。
【０１６０】
ポリアクリルアミドゲルのようなゲル中でタンパク質の電気泳動易動度を測定する、ゲル電気泳動法の他に、この方法は毛管電気泳動を使用して実施し得る。ＣＥは、分子の電荷質量比に比例する、タンパク質の電気泳動移動時間を測定する。時にはアフィニティー毛管電気泳動と称される、ＣＥの一つの形状は、結合事象後に結合がタンパク質の電荷質量比に変化を起こす限り、小型リガンドを含む他分子とタンパク質の相互作用に極めて感度が高いことが発見されている。タンパク質が、特定の検出性電磁スペクトル特性を有する蛍光色素のようなマーカーと抱合されている場合に最大感度を得ることができる。電気泳動クロマトグラムにおけるピークの検出は、主として可視波長であるレーザー誘導性発光によって達成し得る。蛍光色素の実例は、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド及びＢＯＤＩＰＹを含む。
【０１６１】
高感度検出の必要性と抽出物中に電荷質量比が類似する多数の他分子が存在するため、次の分離及び標識ステップなしには、ＣＥによる細胞または無細胞抽出物中で合成された新生タンパク質の検出は極めて困難である。例えば、抽出物の総タンパク質量の０．０１％以下が新生タンパク質を含むような典型的な場合である。新生タンパク質と類似する電気泳動移動時間を有する他分子が混合物中に存在することがある。そのような分子は、新生タンパク質のピークとオーバーラップするであろう。
【０１６２】
さらに、従来のＣＥ法を使用して、無細胞または細胞合成系において生産される新生タンパク質と分子の相互作用を検出することは極めて困難である。アフィニティー毛管電気泳動は、結合事象後に結合がタンパク質の電荷質量比に変化を起こす限り、小型リガンドを含む他分子とタンパク質の相互作用に極めて感度が高いことが発見されている。しかし、蛍光色素のようなマーカーの新生タンパク質への選択的添加は、ほとんどのマーカー試薬は、タンパク質合成系における新生タンパク質以外の他分子を非選択的に標識するために、従来の手段の使用では不可能である。ある場合は、新生タンパク質とのみ結合する特異的基質またはリガンドを利用することにより可能となり得る。しかし、この方法は、新生タンパク質の結合特性について詳細な知識と、マーカー特性を備えるリガンドの特別なデザインを必要とする。新生タンパク質はまた、タンパク質合成系から分離され、次に検出マーカーで選択的に標識され得る。しかし、これはまた、新生タンパク質分離のための手順の開発を必要とし、時間を要し、タンパク質の特性またはアフィニティーエピトープを取り込むためのタンパク質工学に関する高度な知識を必要とする。新生タンパク質が分離された後でさえ、各標識タンパク質の電荷質量比が同一であるように、タンパク質をマーカーで均一に標識することはしばしば困難である。標識の最も都合のよい形態は、蛍光性の強いマーカーが、タンパク質中の一つの特定位置のみに取り込まれ、従って、異なる電気泳動易動度を持つタンパク質のセットを回避される。
【０１６３】
本発明による方法は、ターゲットタンパク質が翻訳系で発現された新生タンパク質である場合に、米国特許第５，７８３，３９７号（本明細書に参考文献として編入）によって説明されるような、毛管電気泳動を使用する、新しい治療効果のある化合物についての試料の迅速スクリーニングに関連する主要な問題も克服する。これは、普通では長い分離ステップと均一標識のための特別の手法を必要とするＣＥによる高感度分析のために、翻訳系にある発現ターゲットタンパク質をマーカーで均一に標識する必要性を含む。
【０１６４】
この方法はまた、本明細書に参考文献として特に編入している、米国特許第５６５，４５１号に説明されているような新ｃＤＮＡクローンの分離用の発現クローン法と併用しても使用することができる。本特許は、ａ）約１００の個別細菌コロニーのプールを収集し；ｂ）プール中にあるｃＤＮＡによってコードされるタンパク質をインビトロで発現することにより、ｃＤＮＡクローンを同定するための新方法を説明する。この方法によって同定し得るタンパク質は、以下に限定はされないが、核酸結合タンパク質、細胞骨格タンパク質、生長因子、分化因子、翻訳後修飾タンパク質、リン酸化タンパク質、タンパク分解による切断タンパク質、グリコシル化タンパク質、タンパク質複合体のサブユニットまたは複数成分、酵素、既知タンパク質のイソ型、既知タンパク質の突然変異型を含む。重要なことには、本方法は、タンパク質翻訳系から所望するタンパク質を同定する重要なステップを含む。タンパク質同定について説明された２つのそのような方法は、放射性標識及び化学標識を含む。しかし、これらのステップには極めて時間を要し、所望タンパク質についての抽出物を迅速にスクリーンするためには向いていない。
【０１６５】
本発明は前記に説明した問題の全てを回避する。本発明による一つの実施態様では、検出マーカーでミスアミノアシル化されたｔＲＮＡをタンパク質合成系に添加する。検出マーカーを新生タンパク質中に取り込むために系をインキュベートする。１またはそれ以上の分子（因子）を次に、新生タンパク質に併合して（分離の前でも後でもよい）、因子を新生タンパク質と相互作用させる。この混合物のアリコートを次に電気泳動にかける。因子と相互作用した新生タンパク質は、取り込まれたマーカーを有する新生タンパク質の電気泳動の易動度の変化を検出することにより同定される。因子が新生タンパク質と相互作用した場合、タンパク質は分離されて、その後それ以上の分析を行うことができる。因子が新生タンパク質に結合された場合は、新生タンパク質を分離することにより結合因子が同定され得る。
【０１６６】
本方法の一例では、前記に説明するように、蛍光マーカーＢＯＤＩＰＹ−ＦＬを、Ｅ． ｃｏｌｉ 開始ｔＲＮＡｆｍｅｔをミスアミノアシル化するために使用する。このミスアミノアシル・ｔＲＮＡを次に、タンパク質合成系に添加し、さらに系を、Ｎ末端部にＢＯＤＩＰＹ−ＦＬを含む新生タンパク質を生産するためにインキュベートする。新生タンパク質に結合し得る特定の化合物を、次に特定の濃度で、タンパク質合成系に添加する。混合物のアリコートを次に毛管電気泳動用の装置中に注入する。混合物中の新生タンパク質は、４８８ ｎｍに同調されたアルゴンレーザーからの励起光線を使用して、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬからの蛍光の検出によって同定される。特定の化合物の相互作用は、特定の化合物に曝露された新生タンパク質についての電気泳動易動度を、曝露されていない新生タンパク質の同様な測定と比較することにより測定される。化合物の結合強度は、次にタンパク質合成系に添加される特定化合物の濃度を変更し、非複合体化及び複合体化新生タンパク質に当たるバンドの相対強度における変化を測定することにより確認することができる。
【０１６７】
この方法は、タンパク質翻訳系において翻訳された一つの新生タンパク質と一つの因子の相互作用の研究に限定されるわけではない。例えば、化合物ライブラリーをスクリーンして、特定のターゲットタンパク質のリガンドとして作動する化合物を同定し得る。新生タンパク質に１またはそれ以上の因子を結合することを含む相互作用の他に、以下に限定はしないが、リン酸化、タンパク質分解、グリコシル化、他のバイオ分子との複合体の形成を含む、新生タンパク質の修飾を起因する相互作用が、新生タンパク質に取り込まれたマーカーを電気泳動法と組み合わせて使用することにより、検出され得る。例えば、抗体の新生タンパク質との相互作用は、形成された複合体の実際の電気泳動易動度の変化によって検出され得る。同様なアプローチを、新生タンパク質と結合する複合体混合物中にある１またはそれ以上の化合物の存在を同定するために使用し得る。そのような混合物は、組み合わせ化学によって生産される化合物または治療効果のある化合物を含み得る天然試料のような複雑な生物学的混合物中に存在し得る化合物のライブラリーを構成する。
【０１６８】
Ｆ．マイクロスケール法
本発明は、毛管電気泳動（上記参照）を考案するが、他の方法もまた考案される。特に、マイクロスケール法は、新マーカー（例：ＢＯＤＩＰＹ）及び本発明による方法と併用して使用することができる。装置上のチャネルの寸法（及び対応する液体容量）が極めて小さいこと（典型的にはピコメーター領域）において、本方法は「マイクロスケール」である。例えば、チャネルは、典型的には奥行きが約０．１０ 〜 ０．５０ μｍ、幅が約５ 〜 ５００ μｍである。
【０１６９】
統合液体系を構造するためには多数のフォーマット、材料及びサイズのスケールがあるが、本発明は、大スケールスクリーニングの多くの効率の悪さに対するソリューションとしてのマイクロ加工装置を考案する。装置は多数の材料からマイクロ加工され得る。シリコンは、計算用マイクロプロセッサーの構造に使用される材料であり、その加工テクノロジーは過去３０年の間に先例を見ないような速度で発達してきた。セミコンダクター統合サーキット加工のための主要な近代的方法は、所謂プレーナープロセスである。プレーナープロセスは、シリコン特有の特徴に基づき、沈殿、酸化、光リソグラフィー、分散及び／またはイオン注入、及び金属被覆を含む製造ステップから成る複雑なシーケンスを含み、シリコン基質中に「積層」統合サーキット装置を加工する。例えば、本明細書に参考文献として編入する、Ｗ． Ｍｉｌｌｅｒ、米国特許第 ５，０９１，３２８号を参照のこと。この技術は、当初はマイクロエレクトロニックス（超小型電子技術）装置作製に適用されたが、同じ技術が、現在ではマイクロメカニカルシステムのために使用されている。
【０１７０】
連続性流動液体輸送は、シリコンで開発されたミクロ液体装置を使用して説明されている。Ｊ． Ｐｆａｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ａ２１−Ａ２３ （１９９０）、ｐｐ ４３１〜４３４）を参照のこと。シリコンのマイクロ機械加工に基づいて、流動を生起するために外力を使用するポンプがまた、説明されている。Ｈ．Ｔ．Ｇ． Ｖａｎ Ｌｉｎｔｅｌ ｅｔ ａｌ．、 Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ １５：１５３〜１６７ （１９８８）を参照のこと。マイクロ加工チャネルにおけるタンパク質のＳＤＳ毛管電気泳動もまた説明されている。Ｙａｏ Ｓ ｅｔ ａｌ．、 ”ＳＤＳ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｃｈａｎｎｅｌｓ（マイクロ加工チャネルにおけるタンパク質のＳＤＳ毛管電気泳動）” ＰＮＡＳ　９６：５３７２ （１９９９）を参照のこと。さらに伝統的である二次元変性ゲル電気泳動（一般的に時間を要し、相当量の試料を必要とする）と比較して、このマイクロチャネルベースによる分離技術は、迅速で、高分解能を提供することが示された。
【０１７１】
メカニカル建造材料として、シリコンはよく知られている加工特徴を有している。シリコン製装置の経済的魅力は、その関連するマイクロ機械技術が特に写真再生技術であることである。これらのプロセスでは、不透明デザインを含む透明なテンプレートまたはマスクが、シリコン基質表面上で物体を光限定するために使用される。テンプレート上のパターンは、コンピューターデザインプログラムによって発生され、１ミクロン以下の線幅で構造を描写し得る。いったんテンプレートを発生したら、テンプレートをほぼ無期限に使用して、同一のレプリカ構造を生産し得る。従って、構成要素の全てがシリコンマイクロ機械加工に適合性があれば、極めて複雑なマイクロ機械でさえ大量生産かつ低価格で再生が可能である。本発明は、マイクロ加工分析装置を構造するための光リソグラフィー法における使用に、ガラスまたはクオーツのような他の基質を考案するが、同一構造内に広く様々な電子構成要素を加工できるさらなる利点があるために、シリコンが好ましい。
【０１７２】
一つの実施態様では、本発明は、統合分析システムにおけるシリコンマイクロ機械構成要素を考案する。試料（例：試験化合物）及び１またはそれ以上の試薬（例：ＢＯＤＩＰＹ標識新生タンパク質）は、エントリポートを通して装置中に連続的またはパルスで注入され、チャネルを通って、混合と反応が行われる温度制御リアクターのような反応チャンバーに輸送される。生化学的生成物は、次に新しいチャネルを下って（または、必要に応じて、電気泳動モジュールによって）、ここで検出器によって移動データが収集され、記録装置に伝達される。必要に応じて、分子篩による分解能を供給するためにチャネル内にポリマーを使用し得る。生化学的生成物は、フローを転換することにより、その後に行われる分析のために、分離することができる。重要なことには、液体及び電子成分は、その機能及び構造において、生物学的反応及び試薬と完全に適合性があるようにデザインされている。本実施態様では、試験候補化合物は、標識新生タンパク質または翻訳反応系で同時発現されている複数の新生タンパク質との相互作用について迅速にスクリーンされ得る。このようにして、このシステムは、有用な薬物を同定するために相互作用についてスクリーンするために使用され得る。
【０１７３】
他の実施態様では、タンパク質合成系の１またはそれ以上の成分がエントリポートを通して装置内に導入され、チャネルを通って温度制御リアクターのような反応チャンバーに輸送され、そこでＢＯＤＩＰＹのようなマーカーを含む新生タンパク質の発現が起こる。標識新生タンパク質は次に、エントリポートから装置内に導入される１またはそれ以上の試薬（例：試験化合物）と混合され得る。反応が起こった後で、生化学的産物は、次に新しいチャネルを下って（または、必要に応じて、電気泳動モジュールによって）、ここで検出器によって移動データが収集され、記録装置に伝達される。装置内に導入され得るタンパク質合成系の成分は、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アミノ酸及びヌクレオチドを含み得る。成分は連続的あるいは間欠性パルスで導入され得る。ＤＮＡがまた、既に説明されたポリメラーゼ鎖反応のような酵素反応により、マイクロ機械装置内で生産され得る。Ｋｏｐｐ ｅｔ ａｌ．、 ”Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｏｗ　ＰＣＲ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ（チップ上での連続フローＰＣＲの化学的増幅法）” Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８０：１０４６ （１９９８）を参照のこと。
【０１７４】
シリコンマイクロ機械加工では、閉鎖チャネルを形成する単純な技術は、基質表面上での開口トラフの食刻（エッチング）、さらに次に開口チャネル上に第二の食刻を加えていない基質を接着することを含む。広く様々な等方性及び異方性食刻試薬、液体またはガス状、があり、適切に限定された側壁と均一な食刻奥行きを有するチャネルを製造し得る。チャネルパスは光加工マスクによって規定されるために、装置上のチャネルパターンの複雑さは実質的に制限がない。制御食刻はまた、基質を完全に貫通する試料エントリホールを製造することが可能で、装置外側表面上にあるエントリポートをチャネル構造に接続する結果となる。
【０１７５】
Ｇ．複数ミスアミノアシル・ｔＲＮＡ
タンパク質の一種類中に１以上のマーカーを取り込むことが好都合なことがしばしばある。これは、ダンシルリジンのようなマーカー及びビオチン‐リジンのような共役因子の両方でミスアミノアシル化されたリジンｔＲＮＡのような単一ｔＲＮＡ種を使用することによって達成され得る。他方、異なるマーカーでそれぞれミスアミノアシル化された異なるｔＲＮＡもまた使用することができる。例えば、クマリン誘導体がトリプトファンｔＲＮＡのミスアミノアシル化、さらにダンシルリジンがリジンｔＲＮＡのミスアミノアシル化に使用することができる。
【０１７６】
複数ミスアミノアシル・ｔＲＮＡの一つの用途は、レプレッサー（抑制因子）またはアクチベーター（活性化因子）、あるいはプロモーターまたはオペレーターのような異なる遺伝的要素の制御下でタンパク質発現を研究することである。例えば、内部あるいは外部因子に対する応答としての２つの異なる時期でのタンパク質合成は、異なる時期に、細胞または無細胞タンパク質合成系中にミスアミノアシル・ｔＲＮＡを導入することにより識別することができる。ｔＲＮＡｔｙｒはマーカーＡで電荷され、ｔＲＮＡｌｙｓ はマーカーＢで電荷され、それぞれＡ−ｔＲＮＡｔｙｒ と Ｂ−ｔＲＮＡｌｙｓを生ずる。この場合、一つのプロモーターの制御下にあるタンパク質１は、反応系にＡ−ｔＲＮＡｔｙｒ を加えることにより標識され得る。第二番目のミスアミノアシル・ｔＲＮＡであるＢ−ｔＲＮＡｌｙｓ を次に加え、タンパク質２の第二のプロモーターが活性化されると、生産される新生タンパク質は標識ＡとＢのどちらも含むであろう。追加タンパク質の発現をさらに研究するためには、追加ｔＲＮＡ分子を使用して、追加マーカーをさらに加えることができる。複数標識された新生タンパク質の検出及び分析は、複色電気泳動パターン読み取りシステムを使用して行うことが可能であり、これは米国特許第５，０６９，７６９ 号及び第５，１３７，６０９号に説明されており、そのどちらも本明細書に参考文献として特に編入されている。
【０１７７】
複数ミスアミノアシル・ｔＲＮＡの二番目の用途は、新生タンパク質の分離と検出の組み合わせである。例えば、ビオチン‐リジンマーカーを一つのｔＲＮＡのミスアミノアシル化、さらにクマリンマーカーを他のｔＲＮＡのミスアミノアシル化に使用することができる。取り込まれたリジン‐ビオチンに結合するストレプトアビジンでコートされた磁性粒子は、反応混合物から新生タンパク質を分離するために使用され、クマリンマーカーは検出と定量に使用され得る。
【０１７８】
上記の方法の基礎の概略図を図１４に示す。第一ステップでは、レポーター（Ｒ）またはアフィニティー（Ａ）特性を有し得る選択マーカー（Ｍ）が、単一ｔＲＮＡ種または異なるｔＲＮＡから成る混合物について化学的または酵素的にミスアミノアシル化される。タンパク質合成前に、蛍光マーカーで電荷されたミスアミノアシル・ｔＲＮＡの既定量を、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡが対応するｔＲＮＡと効果的に競合するに十分な濃度で、無細胞タンパク質合成反応系に混合する。約１〜３時間のインキュベーション後、反応混合物は、従来のポリアクリルアミドまたはアガロースゲル電気泳動を使用して分析される。電気泳動後、ゲルはＵＶ照射を受ける。新生タンパク質によるバンドは、明確な蛍光を呈示し、既存タンパク質の非蛍光バンドから、可視または写真により、容易かつ迅速に識別され得る。新生タンパク質は、蛍光バンドを切除することにより分離され、抽出ゲル片からタンパク質を電解溶出され得る。新生タンパク質の量及び分子量は、その蛍光を既知分子量及び既知量のタンパク質のセットによって発生される蛍光と比較することにより決定され得る。アッセイ結果を記録し、標準電子イメージング及び写真または分光的方法を使用して、将来の分析のために保存し得る。
【０１７９】
Ｈ．最終組成物
本発明による他の実施態様は、マーカーの存在において翻訳後に従来の方法によって分離または精製された新生タンパク質を含む組成物を指示する。組成物は、組織培養産物のコーティング及び製薬産業における試薬調製目的の製造に利用し得る。
【０１８０】
製造において利用される新生タンパク質中へのマーカーの取り込みは、マーカー検出による最終製造産物または工程の分析を容易にする。例えば、生産された新生タンパク質は、組織培養産物のコーティングとして使用することができる。ある特定のコーティングプロセスの再現性は、コートされた産物表面上のマーカー発光の変異を検出することにより、正確に測定され得る。さらに、ホルモン、ステロイド、免疫製品またはサイトカインのような薬物調製物の範囲に含まれるタンパク質中に取り込まれた非毒性マーカーは、そのタンパク質調製物の安全かつ経済的な分離を容易にするために利用され得る。そのような製品はマーカーを取り除く必要なく、直接に使用することができる。極めて低濃度のマーカーが好ましい場合、限定量のマークを付けたタンパク質を、精製手順を通してタンパク質の追跡に使用し得る。そのようなタンパク質は、効率よく精製され、最終組成物の純度を正確に測定し得る。さらには、マーカーの存在は、試験中の薬物組成物の研究及び分析を容易にし得る。例えば、マーカーは、患者において血清半減期、最適血清レベル、さらに組成物の分解産物の存否を測定するために利用することができる。
【０１８１】
他方、新生タンパク質は、毒性物質のような治療的に有効な化合物として作用する特定のマーカーを含み得る。これらのタンパク質は患者に投与され、タンパク質が同定されそれぞれのターゲットに結合されたと思われた後、治療用部分が遊離される。遊離は、電気的刺激、光化学的切断、または新生タンパク質によりターゲットされる領域にその部分が特に沈殿されるような他の手段であり得る。さらに、新生タンパク質から遊離後にのみ毒性となる修飾毒素のような部分を利用することができる。新生タンパク質はまた、取り込まれたマーカーに活性治療効果のある機能を授けたり、マーカーがその治療またはイメージング作用前に体内で分解することを防止する薬物担体としても作用し得る。
【０１８２】
新生タンパク質中の切断可能なマーカーの取り込みはさらに、マーカーの非天然部分を取り除いて、完全に天然な形状であるタンパク質の分離を容易にする手段を供給する。例えば、新生タンパク質中に導入された光開裂型ビオチンのような切断可能なアフィニティーマーカーは、タンパク質の経済的な分離を容易とし、薬物組成物としてのそれ以後の用途のためにマーカーの除去を可能とする。
【０１８３】
マーカーの存在下において翻訳により調製されたタンパク質から成る薬物組成物はさらに、例えば、水分、油、脂質、ポリサッカリド、グリセロール、コラーゲン、またはこれら担体の組み合わせのような薬学的に受容可能な担体を含んでもよい。有用な免疫組成物は、ワクチンのような免疫活性組成物、ヒトにおいて疾患は障害治療のために使用され得る治療または予防薬のような薬学的活性組成物を含む。
【０１８４】
Ｉ．キット
本発明による他の実施態様は、好ましくは、ｍＲＮＡまたは遺伝子によってコードされた新生タンパク質中にマーカーを取り込む特定のミスアミノアシル・ｔＲＮＡを含む無細胞翻訳を含み、共役された転写‐翻訳系を必要とし、さらに疾病生物学的試料中でのみ検出可能である、診断用キットまたはエイドを指示する。そのようなキットは、ある種の疾患または障害の存在についてヒトまたは他の動物をスクリーンするための迅速な手段として有用であり得る。検出し得る疾患は、感染症、組織異常増殖及び遺伝的障害を含む。最も容易に試験できる生物学的試料は、血液、血清、組織、尿または便、出生前試料、胎児細胞、鼻細胞または髄液から成る試料を含む。一つの実例では、ミスアミノアシルｆｍｅｔ ‐ｔＲＮＡを、原核細胞を含む生物学的試料中の細菌の存在を検出する手段として使用し得る。キットは、タンパク質を合成するために必要な翻訳試薬に加えて検出可能な非放射性マーカーで電荷されたｔＲＮＡ分子を含む。細菌特異性遺伝子を含む生物学的試料の添加は、翻訳に必要とされる核酸を供給する。これらの試料からの細菌は、コリシンＥ１のような細菌毒素またはいくつかのその他の細菌特異性透過化因子を使用して、選択的に分解される。細菌ＤＮＡ由来の特定の遺伝子はまた、本明細書に参考文献として特に編入している、米国特許第４，６８３，１９５号によって説明されているように、特定のオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）と併用することにより、増幅され得る。マーカーを含む新生タンパク質は、必然的に細菌から生産されるべきである。他のマーカーまたは他のタイプの検出キットを使用して、特定の細菌感染が同定し得る。
【０１８５】
本発明はまた、前記に説明するＧＦＴＴを可能とするキットも考案する。例えば、本発明は、家族性腺腫性ポリープ症のような特定の疾病を検出するためのキットを考案する。家族性腺腫性ポリープ症の症例の約３０〜６０％において、疾病組織はまた、ＡＰＣ遺伝子の鎖終止またはトランケート型転写物を含んでいる（Ｓ．Ｍ． Ｐｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、 Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２９：１９８２〜８７、 １９９３）。鎖終止は、フレームシフトがＵＡＧ、ＵＡＡ または ＵＧＡのような終止コドンを、リーディングフレーム内に出現させて、翻訳を終結する場合に起こる。サプレッサーｔＲＮＡをコードするミスアミノアシル・ｔＲＮＡを使用して、そのような転写物を安価なキットで迅速かつ直接に検出し得る。これらのキットは、翻訳系、例えば、光開裂型クマリン・ビオチンのような検出マーカーを含む電荷サプレッサーｔＲＮＡ及び適切な緩衝液と試薬を含む。そのようなキットはまた、プライマーまたは「プレプライマー」を含み、前者はプロモーター、ＲＢＳ、開始コドン、アフィニティータグのコード領域及び鋳型の相補領域を含み、後者はプロモーター、ＲＢＳ、開始コドン、アフィニティータグのコード領域を含むが、鋳型の相補領域を欠如している。プレプライマーは、鋳型の相補領域の連結を可能とする（使用する特定の鋳型の特製化を可能とする）。疾病細胞、組織または分離ＤＮＡまたはｍＲＮＡあるいはＤＮＡのＰＣＲ産物のような生物学的試料は系に添加して、系をインキュベートし、さらに産物を分析する。分析及び、必要に応じて分離は、ＨＲＰに結合されたストレプトアビジンを使用して、その蛍光により特異的に検出され得るクマリンまたはビオチンのようなマーカーによって容易となる。そのようなキットは、迅速で、感度の高い、疾病の存否についての選択的非放射性診断用アッセイを供給する。
【０１８６】
【実施例】
以下の実例は、本発明による実施態様を例示するが、本発明の範囲を限定するものと考察されるべきではない。以下の実例のいくつかにおいて、以下のような特定の試薬及び方法が使用された：
試薬：
ｔＲＮＡｆｍｅｔ、アミノアシル・ｔＲＮＡシンテターゼ、アミノ酸、緩衝塩、及びリボヌクレアーゼ・フリー・ウオーター（リボヌクレアーゼを含まない水）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から購入した。多数の蛍光色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ （Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）から購入した。ルーチンキットを含む翻訳サプライは、Ｐｒｏｍｅｇａ （Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）から購入した。Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５は、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）から購入した。インビトロ翻訳キット及びＣＡＴ （ＰｉｎＰｏｉｎｔ（登録商標））及びルシフェラーゼ （ｐＢＥＳＴｌｕｃ（登録商標））をコードするプラズミドＤＮＡは、Ｐｒｏｍｅｇａ （Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）から、ＤＨＦＲ プラズミド ＤＮＡ （ｐＱＥ１６−ＤＨＦＲ）は、Ｑｉａｇｅｎ （Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）からそれぞれ購入した。α−ヘモリジン用プラズミドＤＮＡ、ｐＴ７−ＷＴ−Ｈ６−αＨＬは、Ｐｒｏｆ． Ｈａｇａｎ Ｂａｙｌｅｙ （Ｔｅｘａｓ Ａ ＆Ｍ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）よりの提供であり、α−ＨＬ ＤＮＡの大規模調製は、Ｑｉａｇｅｎプラズミド分離キットを使用して行った。バクテリオオプシンプラズミドＤＮＡ（ｐＫＫｂｏｐ）は、実験室ストックから使用した。
【０１８７】
フルオロタグｔＲＮＡの調製：
精製ｔＲＮＡｆｍｅｔ をまずメチオニンでアミノアシル化した。典型的な反応では、１５００ ｐＭ （〜１．０ ＯＤ２６０）のｔＲＮＡを過剰アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを使用して、アミノアシル化ミックス中、３７℃で４５分インキュベートした。インキュベーション後、混合物に０．１容積（ｐＨ５．０）の３ Ｍ酢酸ナトリウムを添加して中和し、クロロホルム：酸フェノール抽出（１：１）を行った。エタノール（２．５容積）を水相に添加し、得られたｔＲＮＡペレットを水に溶解した（２５ μｌ）。メチオニンのα−アミノ基への蛍光分子のＮＨＳ−誘導体の結合は、５０ ｍＭ　炭酸ナトリウム（ｐＨ８．５）中で、アミノアシル・ｔＲＮＡ ｆｍｅｔ （２５ μｌ）に蛍光試薬（最終濃度＝２ ｍＭ）を加えて、０℃で１０分インキュベートすることにより行われ、反応はリジン（最終濃度＝１００ ｍＭ）の添加により停止された。修飾ｔＲＮＡをエタノールで沈殿して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過カラム（０．５ × ５ ｃｍ）を通過させて、遊離蛍光試薬が残っている場合は、これを除去した。修飾ｔＲＮＡは、自然解凍を避けるために少量のアリコートにして凍結保存（−７０℃）した。アミノアシルｔＲＮＡの修飾度は、酸‐尿素ゲル電気泳動によって評価した。このｔＲＮＡは、正しく保管される場合は、少なくとも６ヶ月は安定であることが発見された。
【０１８８】
タンパク質の無細胞合成及びその検出：
インビトロ翻訳反応は、典型的には、最適化プレミックスを加えたＥ． ｃｏｌｉ Ｔ７転写‐翻訳システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して行った。典型的な翻訳反応混合物（１０ μｌ ）は、抽出物　３ μｌ、プレミックス　４ μｌ、完全アミノ酸ミックス　１ μｌ、３０ ｐＭ　蛍光メチオニンｔＲＮＡ及び適切なプラズミドＤＮＡ　０．５ μｇを含んだ。最適化プレミックス（１×）は、５７ ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．２）、３６ ｍＭ　酢酸アンモニウム、２１０ ｍＭ　グルタミン酸カリウム、１．７ ｍＭ ＤＴＴ、４％ ＰＥＧ ８０００、１．２５ ｍＭ ＡＴＰ、０．８ ｍＭ ＧＴＰ、０．８ ｍＭ ＵＴＰ、０．８ ｍＭ ＣＴＰ、 ６０ ｍＭ　ホスホエノールピルビン酸、０．６ ｍＭ ｃＡＭＰ、及び１６ ｍＭ酢酸マグネシウムを含む。翻訳反応は、３７℃で４５分進行させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、反応ミックスのアリコート　４〜１０ μｌを、５容積アセトンで沈降させ、さらに沈殿したタンパク質を遠心分離により収集した。ペレットは、１×ローディングバッファー（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）に溶解して、５分間煮沸後ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉに従って行われ、アルゴンレーザーを励起源して使用するＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ５９５を使ってゲルをスキャンした。他方、ポリアクリルアミドゲル中の新生タンパク質はまた、ＵＶトランスイルミネーターを使用して検出され、緑色フィルター（Ｔｉｆｆｅｎ ｇｒｅｅｎ ＃５８、 Ｐｏｌａｒｏｉｄ ＤＳ３４ ｃａｍｅｒａ フィルターキット）を装備したポラロイドカメラを使って、写真撮影を行った。
【０１８９】
ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識タンパク質の可視化には、５３０＋／−３０狭バンド励起フィルターを装備した４８８ ｎｍを励起源として使用した。ゲルは、ＰＭＴ 電圧 １０００ Ｖ、さらに１００／２００ミクロンピクセルサイズを使用してスキャンした。
酵素／タンパク質活性：
α−ヘモリジンの生物学的活性は以下のように行われた：要するに、インビトロ翻訳反応混合物の様々なアリコート（０．５〜２ μｌ）を５００ μｌのＴＢＳＡ （１ ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含むトリス緩衝生理食塩水、 ｐＨ ７．５）に添加した。これに、ウサギ赤血球（ｒＲＢＣｓ）１０％溶液　２５ μｌを加え、室温で２０分インキュベートした。インキュベーション後、このアッセイミックスを１分間遠心分離して、上清の吸光度を４１５ ｎｍで測定した（ヘモグロビンの遊離）。ＴＢＳＡ　５００ μｌ中でインキュベートした等量のｒＲＢＣｓを対照としてとり、水　５００ μｌ中でインキュベートしたｒＲＢＣｓを１００％溶解とした。ＤＨＦＲ活性を分光光度計で測定した。ルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して測定し、さらにルミネッセンス（発光）は、Ｐａｃｋａｒｄ Ｌｕｍｉ−９６ルミノメーターを使用して測定した。
【０１９０】
α−ＨＬの精製及びα−ＨＬへのＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ取り込みの測定：
α−ＨＬ （Ｈｉｓ６）をコードするプラズミドの翻訳を１００ μｌスケールで行い、Ｔａｌｏｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ （ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を製造元の指示に従って使用して、生産されたα−ＨＬを精製した。α−ＨＬ中に取り込まれた蛍光を次に、幾つかの既知濃度の（標準として使用された）遊離ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬと共に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒで測定した。同一試料中にあるタンパク質の量は、Ｐｉｅｒｃｅタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を使用して、標準Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイにより測定した。
【０１９１】
〔ＦＬＡＧ捕捉アッセイ（Ｃａｐｔｕｒｅ Ａｓｓａｙ）〕
（ＦＬＡＧ抗体のビオチン化）
ＦＬＡＧ Ｍ２モノクローナル抗体（ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）ストック液　４．４ ｍｇ／ｍＬを等量の１００ ｍＭ重炭酸ナトリウム（〜１５ ｍＭ最終抗体濃度）で希釈する。その後、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を、最終濃度が１５０ ｍＭ となるように、２ ｍＭストック液（ＤＭＦ中）を加える。反応は氷上で２時間インキュベートする。この混合物を次に、マイクロ遠心分離（１４，０００ Ｒ．Ｐ．Ｍ）で２．５分間遠心分離することにより清澄させる。未反応標識試薬は、ゲル濾過クロマトグラフィーによって除去する。
（ＦＬＡＧ抗体コートＥＬＩＳＡプレートの調製）
ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標）ビオチン結合タンパク質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を、最終濃度が１００ ｍＭ重炭酸ナトリウム中で５０ ｍｇ／ｍＬになるように希釈して、Ｍｉｃｒｏｌｉｔｅ　（ ２＋ 白色不透明 ９６−ウェル ＥＬＩＳＡ プレート （Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ， ＶＡ）をコートするために使用する。プレートをＴＢＳ−Ｔで洗浄し、ＴＢＳ−Ｔ中の５ ｍｇ／ｍＬビオチン化ＦＬＡＧ Ｍ２抗体溶液を使用してコートする。プレートをＴＢＳ−Ｔで洗浄し、翻訳希釈緩衝液（ＴＤＢ）［ＴＢＳ（ ｐＨ ７．５）中、４．５％ Ｔｅｌｅｏｓｔｅａｎ Ｇｅｌａｔｉｎ、２％ 脱脂粉乳、 １０ ｍＭ ＥＤＴＡ、 ０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、 １．２５ ｍｇ／ｍＬ 免疫前マウスＩｇＧ、 ２．５ ｍＭ ｄ−ビオチン］でブロックする。
【０１９２】
（ターゲットタンパク質の結合と検出）
ウサギ網状赤血球抽出物を使用して、インビトロ翻訳によって生産されたトリプル・エピトープタグ付きターゲットタンパク質を、ＴＤＢで１／２５〜１／７５に希釈して、抗体でコートされたＥＬＩＳＡプレートに添加する。ターゲットタンパク質の捕捉後、プレートをＴＢＳ−Ｔで洗浄する。ｃ−ｍｙｃの検出を、ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）、次にペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して実施する。Ｈｉｓ６ タグの検出はペルオキシダーゼ標識ニッケルキレートベース・プローブ（Ｉｎｄｉａ（ Ｈｉｓ Ｐｒｏｂｅ−ＨＲＰ）， Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）で達成される。抗体はＴＤＢで希釈され、Ｉｎｄｉａ（ Ｈｉｓ Ｐｒｏｂｅ−ＨＲＰ）は免疫前マウスＩｇＧ　５ ｍｇ／ｍＬを補充したＴＢＳ−Ｔで希釈される。全ての場合、シグナルが発生には化学ルミネッセント基質系を使用する。
【０１９３】
〔Ｈｉｓタグ　金属アフィニティー捕捉ＥＬＩＳＡアッセイ〕
（ターゲットタンパク質の結合と検出）
ウサギ網状赤血球抽出物を使用して、インビトロ翻訳によって生産されたトリプル・エピトープタグ付きターゲットタンパク質を、１％ ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで１／２５〜１／７５に希釈して、ニッケルキレートでコートしたＥＬＩＳＡプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）に添加する。ターゲットタンパク質の捕捉後、プレートをＴＢＳ−Ｔで洗浄し、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔでブロックする。結合ターゲットタンパク質上のエピトープタグの検出は、モノクローナルＦＬＡＧ Ｍ２抗体（ＳＩＧＭＡ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）またはポリクローナルｃ−ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）を、適切なペルオキシダーゼ標識二次抗体と併用することにより達成される。ビオチン−リジン・ｔＲＮＡｌｙｓ を介してターゲットタンパク質中に取り込まれたビオチンの検出は、ペルオキシダーゼに抱合されているＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（商標） ビオチン結合タンパク質（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を使用して達成される。ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標） 抱合体及び全ての抗体は、１％ ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで希釈する。全ての場合、シグナルが発生には化学ルミネッセント基質系を使用する。
【０１９４】
［実施例１］：マーカーの調製
クマリンアミノ酸の合成：４−（ブロモメチル）−７−メトキシクマリン（図１５、化合物１；６．１８ ｍＭ）及びジエチルアセトアミドマロン酸塩（図１５、化合物２；６．１８ ｍＭ）を、無水エタノール中でナトリウムエトキシド溶液に添加して、混合物を４時間還流した。反応混合物の中和及びクロロホルム抽出後に得られた中間生成物（図１５、化合物３）をさらに、メタノール溶液から結晶化によって精製した。この中間生成物をアセトン及びＨＣｌ（１：１）の混合物中に溶解して、１時間還流した。反応混合物を乾燥するまで蒸発して、アセトンを使用してアミノ酸塩酸塩を沈降した。この塩酸塩は、５０％エタノールに溶解しさらにピリジンを添加してｐＨ４〜５にすることにより、遊離アミノ酸（図１５、化合物４）に転化された。遊離アミノ酸のプロトン（１Ｈ） ＮＭＲスペクトルは以下であった：（ｍ．ｐ． ２７４〜２７６（Ｃ、分解．） −ＯＣＨ３ （δ ３．８５ ｓ， ３Ｈ）、−ＣＨ２−（δ ３．５ ｄ， ２Ｈ）、α−ＣＨ− （δ ２．９ ｔ， １Ｈ）、ＣＨ−ＣＯ （δ ６．２５ ｓ， ｌＨ）， 環Ｈ （δ ７．０５ ｓ， ｌＨ）、 （δ ７．８ ｄ， ２Ｈ）。
【０１９５】
クマリンＦｍｏｃ誘導体の合成：クマリンアミノ酸（１．１４ ｍＭ）を、フルオレニルメチルオキシカルボニルＮ‐ヒドロキシスクシンイミジルエステル（Ｆｍｏｃ−ＮＨＳエステル）１．０８ ｍＭ）と、１．１４ ｍＭトリエチルアミンの存在下、室温で３０分反応させた。反応混合物を酸性化し、さらに沈降物を１ Ｎ ＨＣｌで洗浄してから乾燥した。遊離アミノ酸のＮＭＲスペクトルは以下であった：（ＭＰ ２２３〜２２５℃） −ＯＣＨ３ （δ ３．８５ ｓ， ３Ｈ）、 −ＣＨ２Ｂｒ （δ ３．５ 広域 一重項、 ２Ｈ）、α−ＣＨ−（δ ３．０ ｔ， １Ｈ）、 ＣＨ−ＣＯ （δ ６．２２ ｍ， １Ｈ）、 環 Ｈ （δ ７．０５ ｓ， １Ｈ）、 （δ ７．８ ｄ， ２Ｈ）、 フルオレン Ｈ ＣＨ２−ＣＨ （δ ４．２ ｍ， ２Ｈ）、ＣＨ２−ＣＨ （δ ４．２５ ｍ， １Ｈ）、特徴的多重項を示す芳香族領域。
【０１９６】
ＰＣＢの合成：光開裂型ビオチンは以下に説明するように合成された。２−ブロモ， ２’−ニトロアセトフェノン（図１５、化合物５）は、まずそのヘキサメチルテトラアンモニウム塩に転化され、これは次に分解されて２−アミノ， ２’−ニトロアセトフェノン（図１５、化合物６）を得た。ビオチンＮ‐ヒドロキシスクシンイミジルエステル（図１５、化合物７；Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ； Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を、６‐アミノカプロン酸（図１５、化合物８）と反応させて、その対応酸（図１５、化合物９）を得た。この酸を、ＤＣＣを使用して、２−アミノ， ２’ニトロアセトフェノンと結合して、ケトンを得た（図１５、化合物１０）。ケトンは、水素化ホウ素ナトリウムを使用して還元され、アルコールが得られ（図１５、化合物１１）、これはさらに塩化ギ酸誘導体（図１５、化合物１２）に転化された。誘導体（化合物１２）のプロトンＮＭＲスペクトルは以下であった：（δ １．３ ｍ， ３Ｈ）、 （δ １．４ ｍ， ２Ｈ）、 （δ １．５ ｍ， ５Ｈ）、 （δ １．６２ ｍ， １Ｈ）、（δ ２．１ ｔ， ２Ｈ） （δ ２．４ ｔ， ２Ｈ）、 （δ ２．６ ｄ， １Ｈ）、 （δ ２．８ ｍ， １Ｈ）、 （δ ３．０ ｔ， １Ｈ）、（δ ３．１ ｍ １Ｈ）、 （δ ４．１５ ｑｔ， １Ｈ） （δ ４．４２ ｑｔ， １Ｈ）、 （δ ５．８ ｔ， １Ｈ）、 （δ ６．２５ ｓ， １Ｈ）、 （δ ６．４５ ｓ， １Ｈ）、 （δ ７．５ ｔ， １Ｈ）、 （δ ７．７５ ｍ， ４Ｈ）、（δ ７．９ ｄ， １Ｈ）。
【０１９７】
［実施例２］：　ｔＲＮＡのミスアミノアシル化
ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを生起するために使用される一般的ストラテジーを図１６に示し、これはｔＲＮＡ分子のトランケーション、ジヌクレオチド合成（図１７）、ジヌクレオチドのアミノアシル化（図１８）及びリガーゼ媒介結合を含む。
ａ）トランケート型ｔＲＮＡ分子は、Ｎｅｕ 及び Ｈｅｐｐｅｌ （Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３９：２９２７〜３４， １９６４）によって基本的に説明されるように、リジン及びアルカリホスファターゼの存在下で、過ヨウ素酸分解によって生成された。要するに、４ ｍＭ　非電荷Ｅ． ｃｏｌｉ ｔＲＮＡＬｙｓ 分子（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ；Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）は、５０ ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウムと０．５ ＭリジンをｐＨ ９．０、６０℃で３０分、総容量５０ μｌで、２回連続処理することによりトランケートされた。反応条件は常に５０℃以上で、１０倍の過剰メタ過ヨウ素酸塩を使用した。過剰過ヨウ素酸塩は１ Ｍグリセロール５ μｌで処理することにより破壊された。溶液ｐＨは、最終濃度が０．１ Ｍになるように、トリス・塩酸１５ μｌを加えて、８．５に調整した。反応容量は、水　１００ μｌを加えて１５０ μｌまで増加した。アルカリホスファターゼ（１５ μｌ、 ３０ユニット）を加えて、次に反応混合物を６０℃で２時間再インキュベートした。インキュベーションに続いて、総ｔＲＮＡのエタノール沈降、エタノール洗浄、ペレットの乾燥及びペレットの水２０ μｌへの溶解が行われた。この工程を２回繰り返して、トランケート型ｔＲＮＡが得られた。
【０１９８】
ｂ）ジヌクレオチド合成は、基本的にはＨｕｄｓｏｎ （Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ． ５３：６１７〜２４， １９８８）によって実施されたように行い、デオキシシチジン保護、アデノシン保護及びジヌクレオチド合成の３ステップ工程として説明することができる。
デオキシシチジン保護：全ての反応は、特記されない限りは室温で行われた。第一に、デオキシシチジンの５’及び３’ヒドロキシル基を、４．１当量の塩化トリメチルシリルで、一定の撹拌を加えながら２時間反応させることにより保護した。環外アミノ官能基を１．１当量のＦｍｏｃ−Ｃｌと３時間反応させることにより保護した。５’及び３’ヒドロキシル基の脱保護は、０．０５当量のＫＦを加えて３０分インキュベートすることにより達成された。最終産物（図１７、化合物１９）は収率８７％で生産された。リン酸基は、この化合物を、１当量のビス‐（２‐クロロフェニル）ホスホロクロリデイトを加えてインキュベートし、その混合物を０℃で２時間インキュベートすることによって添加された。この場合の収率は、２５〜３０％であった。
【０１９９】
アデノシン保護：塩化トリメチルシリル（４．１当量）をアデノシン残基に添加して、２時間インキュベートし、その後、１．１当量のＦｍｏｃ−Ｃｌを導入して、インキュベーションを３時間持続した。ＴＭＳ基は、上記に説明するように０．５当量のフッ素イオンで脱保護された。Ｆｍｏｃ保護アデノシン（化合物２２）は収率５６％で得られた。さらに２’‐ヒドロキシル基を保護するために、化合物２２は１．１当量のテトライソプロピルジシロキシル塩化物（ＴＩＰＤＳＣｌ２）で３時間反応され、６８〜７０％の収率で化合物２３を生産した。化合物は、ジオキサン中で２０当量のジヒドロピラン及び０．３３当量のｐ‐トルエンスルホン酸を加えて４〜５時間インキュベートすることにより、化合物２４に転化された。この化合物は、テトラヒドロフラン、ピリジン、及び水の混合物中で８当量のフッ化アンモニウムテトラブチルを加えることにより、分離することなく、化合物２５（図１７）に直接に転化された。
ジヌクレオチド合成：保護デオキシシチジン、化合物２０、と保護アデノシン、化合物２５（図１７）を、テトラヒドロフラン中で、１．１当量の２‐クロロフェニルビス‐（１‐ヒドロキシ‐ベンゾトトリアゾリル）リン酸塩を加えて、３０分間一定の撹拌を加えることにより結合させた。次に、Ｎ‐メチルイミダゾールの存在下で、３０分間１．３当量の保護アデノシン、化合物２５を加えた。結合収率は、約７０％であり、結合産物、化合物２６、のプロトンＮＭＲスペクトルは以下であった：（δ ８．７６ ｍ， ２Ｈ）、 （δ ８．０ ｍ， ３Ｈ）、 （δ ７．８ ｍ， ３Ｈ） （δ ７．６ ｍ， ４Ｈ）、 （δ ７．５ ｍ， ３Ｈ））、（δ ７．４ ｍ， １８Ｈ）、 （δ ７．０ ｍ， ２Ｈ）、 （δ ４．８５ ｍ， １４Ｈ）、 （δ ４．２５ ｍ， １Ｈ）； （δ ３．６ ｍ， ２Ｈ）、 （δ ３．２ ｍ， ２Ｈ）（δ ２．９ ｍ， ３Ｈ）、 （δ ２．６ ｍ， １Ｈ）、 （δ ２．０−１．２ ｍ， ７Ｈ）。
【０２００】
ｃ）ジヌクレオチドのアミノアシル化は、保護マーカーアミノ酸、Ｆｍｏｃ−クマリンをエステル結合でジヌクレオチドに結合することにより達成された。第一に、保護アミノ酸を、テトラヒドロフラン中で、６当量のベンゾトリアゾール‐１‐ｙｌ‐オキシトリス‐（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロリン酸塩及び６０当量の１‐ヒドロキシベンゾトリアゾールで活性化した。混合物に持続的撹拌を加えながら２０分インキュベートした。次に、３当量のＮ‐メチルイミダゾール中で１当量のジヌクレオチドを添加し、反応を室温で２時間持続した。脱保護は、テトラメチルグアニジン及び、４‐ニトロベンザアルドキシムを添加することにより行われ、さらに３時間撹拌を続けた。反応は、酢酸を添加し、さらに０℃で３０分持続的に撹拌を加えインキュベートをすることにより完了され、アミノアシル化ジヌクレオチドを生産した（図１８）。
【０２０１】
ｄ）アミノアシル化ジヌクレオチドへのｔＲＮＡの連結は、基本的にはＴ．Ｇ． Ｈｅｃｋｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４０ ８７〜９４， １９８４）によって説明されるように実施した。要するに、トランケート型ｔＲＮＡ分子（８．６ Ｏ．Ｄ．２６０ ユニット／ｍｌ）及びアミノアシル化ジヌクレオチド（４．６ Ｏ．Ｄ．２６０ ユニット／ｍｌ）を、Ｔ４　ＲＮＡリガーゼ　３４０ ユニット／ｍｌを加えて、４℃で１６時間インキュベートした。反応緩衝液は、５５ ｍＭ Ｎａ−Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ ７．５）、 １５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、 ２５０ μＭ ＡＴＰ、２０ μｇ／ｍｌ ＢＳＡ 及び１０％ ＤＭＳＯを含んだ。インキュベーション後、反応混合物を最終濃度が５０ ｍＭ ＮａＯＡｃ、 ｐＨ ４．５（１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む）となるまで希釈した。最終混合物を、５０ ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ ４．５）， １０ ｍＭ ＭｇＣｌ２で平衡化した、ＤＥＡＥセルロースカラム（１ ｍｌ）に４℃で加えた。カラムを０．２５ ｍＭ　 ＮａＣｌで洗浄して、ＲＮＡリガーゼ及び他の非ｔＲＮＡ成分を除去した。ｔＲＮＡ含有分画をプールして、５０ ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ ４．５）、 １０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び １．０ Ｍ ＮａＣｌ で平衡化したＢＤセルロースカラムに４℃で装填した。未反応ｔＲＮＡは、１０ ｍｌの同じ緩衝液で洗浄することにより除去された。精製ミスアミノアシル・ｔＲＮＡは、２５％エタノールを含む緩衝液でカラムを溶出することにより得られた。
【０２０２】
［実施例　３］：　抽出物及び鋳型の調製
抽出物の調製：コムギ胚芽胚抽出物は、シクロヘキサンと四塩化炭素の混合物（１：６）を使用して、胚濃厚化のためにコムギ胚芽の浮上により調製し、その後一晩乾燥した（約１４時間）。浮上コムギ胚芽胚（５ ｇ）は、微細な粉末を得るために５ ｇの粉末ガラスを加えて、モルタル中で粉砕した。滑らかなペーストが得られるまで、抽出用媒質（緩衝液Ｉ　１０ ｍＭ トリス酢酸緩衝液（ｐＨ ７．６）、１ ｎＭ　酢酸マグネシウム、９０ ｍＭ酢酸カリウム、及び１ ｍＭ ＤＴＴ）を少量ずつ加えた。破壊された胚を含むホモジネート及び抽出用媒質　２５ ｍｌを２３，０００ ｘ ｇで２回遠心分離した。抽出物をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５微細カラムにかけて、緩衝液ＩＩ（１０ ｍＭ トリス酢酸緩衝液（ｐＨ ７．６）、３ ｍＭ 酢酸マグネシウム、５０ ｍＭ 酢酸カリウム、及び １ ｍＭ ＤＴＴ）で溶出した。明るい黄色バンドがゲル粒子以外の容量で移動し、１ ｍｌの分画として回収（Ｓ−２３）され、液体窒素中で凍結された。
【０２０３】
鋳型の調製：鋳型ＤＮＡは、プラズミドｐＳＰ７２−ｂｏｐをＥｃｏＲＩで線形化することにより調製した。制限線形鋳型ＤＮＡは、フェノール抽出及びＤＮＡ沈降により精製した。大規模ｍＲＮＡ合成は、ＳＰ６−ｒｉｂｏｍａｘ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ； Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を使用して、インビトロ転写によって行った。精製ｍＲＮＡは、使用の直前に６７℃で１０分変性した。
【０２０４】
［実施例　４］：　無細胞翻訳反応
取り込み混合物（１００ μｌ ）は、Ｓ−２３ 抽出物を５０ μｌ 、 ５ ｍＭ 酢酸マグネシウム、 ５ ｍＭ トリス酢酸（ｐＨ ７．６）、２０ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ 緩衝液（ｐＨ ７．５）； １００ ｍＭ 酢酸カリウム、 ０．５ ｍＭ ＤＴＴ、０．３７５ ｍＭ ＧＴＰ、２．５ ｍＭ ＡＴＰ、 １０ ｍＭ クレアチンリン酸、クレアチンキナーゼ を６０ μｇ／ｍｌ及びバクテリオオプシンをコードする遺伝配列を含むｍＲＮＡを１００ μｇ／ｍｌ含んだ。ミスアミノアシル・ＰＣＢ−リジンまたはクマリンアミノ酸・ｔＲＮＡｌｙｓ 分子を、１７０ μｇ／ｍｌ加え、マグネシウムイオン及びＡＴＰ濃度を最適化した。混合物を２５℃で１時間インキュベートした。
【０２０５】
［実施例　５］：　ＰＣＢ‐リジンを含む新生タンパク質の分離
ストレプトアビジンでコートされた磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ （Ｄｙｎａｌ； Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒｗａｙ）は、１ ｍｇビーズ当たり１０ μｇのビオチン化タンパク質の結合能力を有する。濃度２ ｍｇ／ｍｌでビーズを少なくとも３回洗浄して、安定化ＢＳＡを除去した。新生タンパク質中に取り込まれたＰＣＢ−リジンを含む翻訳混合物に、ストレプトアビジンでコートされたビーズを加えて混合し、室温で３０分インキュベートした。磁性粒子集線装置（ＭＰＣ：ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ） （Ｄｙｎａｌ；Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒｗａｙ）を使用して、０．５〜１．０分磁場をかけ、上清をピペットで取り除いた。反応混合物を３回洗浄して、磁性ビーズを５０ μｌの水に懸濁した。
【０２０６】
Ｂｌａｃｋ−Ｒａｙ 長波長 ＵＶ ランプ、Ｍｏｄｅｌ Ｂ−１００ （ＵＶ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｉｎｃ．； Ｓａｎ Ｇａｂｒｉｅｌ， ＣＡ）を使用して、クオーツキュベット中で光分解を行った。発光ピーク強度は、３６５ ｎｍで、約１１００ μＷ／ｃｍ２であった。磁性捕捉を反復して、ビーズを取り除いた。得られた新生タンパク質を定量し、収率は推定７０〜９５％であった。
［実施例　６］：　蛍光を使用する検出の低限
ホウ酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）中に０．２５ ｍｇ／ｍｌになるように懸濁したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、５０ ｍｇ／ｍｌ の２５倍モル過剰フルオレサミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ； Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）　と合わせて、修飾蛍光ＢＳＡを生産した。修飾タンパク質の様々な量（１ ｎｇ、 ５ ｎｇ、 １０ ｎｇ、 ２５ ｎｇ、 ５０ ｎｇ、７５ ｎｇ、 １００ ｎｇ、 １５０ ｎｇ、 ２００ ｎｇ）をローディングバッファー（ブロモフェノールブルー、グリセロール、２‐メルカプトエタノール、トリス・塩酸（ｐＨ ６．８）、ＳＤＳ）中に懸濁して、３％濃縮剤を加えた１２％ポリアクリルアミドゲルの１．５ ｍｍの厚さの個別ウェル中に添加した。水冷ゲルを５０Ｖで４時間電気泳動した。電気泳動後、ゲルを電気泳動装置から除去して、ＵＶトランスイルミネーター上に配置し、１０秒の露光時間を使用してｐｏｌａｒｏｉｄ Ｔｙｐｅ ６６７フィルムを使って写真撮影をした。これらの条件で観察された最低限度は１０ ｎｇであった。これらの結果は、典型的な分子生物学実験室で見られる装置を使用して、蛍光標識タンパク質は、ｎｇ量単位で検出され得ることを示した。さらに高度な検出手順や装置を使用すると、検出レベルをさらに向上することができる。
【０２０７】
［実施例　７］：　クマリン‐アミノ酸を含む新生タンパク質
無細胞翻訳を、ベンゾピレン・フルオロフォア部分と結合されたリジンでミスアミノアシル化された電荷ｔＲＮＡｌｙｓ 分子及びリジンに対する２１コドンを含むヒトγ−インターフェロンｍＲＮＡを使用して、説明したように実施する。混合物の試料は、ブロモフェノールブルー、グリセロール、２‐メルカプトエタノール、トリス・塩酸（ｐＨ ６．８）、ＳＤＳを含む緩衝液を補充して、分子量マーカーセットと共に、１２％ポリアクリルアミドゲル（３％濃縮剤）に直接加える。電気泳動を５０Ｖで３時間行う。ゲルを電気泳動装置から除去して、ＵＶ光線下で写真撮影をする。蛍光標識インターフェロンタンパク質のバンドは、分子量約２５ Ｋｄａで特異的に検出される。ゲル上では他の有意な蛍光活性は観察されない。遊離ミスアミノアシル・ｔＲＮＡ分子は、ゲルの外に電気泳動され、特に検出されないであろう。
【０２０８】
［実施例　８］：　薬物組成物のインビボ半減期
無細胞翻訳反応は、上記に説明するように化学的ミスアミノアシル化により調製され、ＴＥ中で１．７ ｍｇ／ｍｌ）となるように懸濁されたＰＣＢ−クマリンアミノ酸・ｔＲＮＡｌｅｕ　１０ μｌ、Ｓ−２３抽出物　５０ μｌ、水　１０ μｌ及び１０ μｌ の５０ ｍＭ酢酸マグネシウム、５０ ｍＭトリス酢酸（ｐＨ ７．６）、２００ ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ 緩衝液（ ｐＨ ７．５）；１ Ｍ酢酸カリウム、５ ｍＭ ＤＴＴ、３．７５ ｍＭ ＧＴＰ、２５ ｍＭ ＡＴＰ、１００ ｍＭクレアチンリン酸から成る溶液及び６００ μｇ／ｍｌのクレアチンキナーゼを混合することにより実施される。この混合物を、組み換え型ＩＬ−２ ｃＤＮＡから転写かつ分離された５００ μｇ／ｍｌヒトＩＬ−２ｍＲＮＡ（２６ロイシンコドンを含む）を２０ μｌ追加するまで、氷上に保持する。混合物は、２５℃で１時間インキュベートして、氷上に置く。ストレプトアビジンでコートした磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓ （２ ｍｇ／ｍｌ）１００ μｌを混合物に加えて、室温で３０分放置する。インキュベーション後、混合物をマイクロフュージで３，０００ ｘ ｇ、５分間遠心分離するか、またはＭＰＣを使用して溶液に磁場をかける。上清を取り除いて、ＴＥを使用して手順を３回繰り返す。最終洗浄ペレットを、５０ ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ７，５）５０ μｌに再懸濁し、クオーツキュベットに移す。Ｂｌａｃｋ−Ｒａｙ 長波長 ＵＶ ランプからのＵＶ光線を、約１秒懸濁液に照射する。ＭＰＣで溶液に１．０分磁場をかけてから、上清をピペットで除去する。上清を滅菌濾過して、５０％グリセロール、１．８％　ＮａＣｌ及び２５ ｍＭ　重炭酸ナトリウムを含む等量の滅菌緩衝液を加えて混合する。タンパク質濃度は、Ｏ．Ｄ．２６０を測定することにより決定される。
【０２０９】
最終組成物（濃度１ ｍｇ／ｍｌ）　０．２５ ｍｌを、２匹のＢａｌｂ／ｃ ｍｉｃｅの尾静脈中に経静脈注射する。２匹の対照マウスはまた、比較可能量の緩衝液を注射される。様々な時点（０、 ５ 分、 １５ 分、 ３０ 分、 ６０ 分、 ２ 時間、及び ６ 時間）において、血清試料　１００ μｌを足裏から得て、０．９％生理食塩水　４００ μｌに加える。血清試料を、抗クマリン抗体でコートされたｄｙｎａｂｅａｄｓ （２ ｍｇ／ｍｌ）溶液に添加して、室温で３０分インキュベートする。ＭＰＣで溶液に１分磁場をかけてから、上清をピペットで除去する。４７０ ｎｍにおける蛍光を測定し、試料をラットＩＬ−２タンパク質特異性モノクローナル抗体で処理する。ＩＬ−２タンパク質含量を各試料について定量し、これを検出された蛍光量に等しいと考える。得られた結果より、インビボＩＬ−２半減期は正確に決定される。
【０２１０】
［実施例　９］：　α−ヘモリジン中への様々なフルオロフォアの取り込み
Ｅ． ｃｏｌｉ ｔＲＮＡｆｍｅｔ をまずメチオニンで定量的にアミノアシル化し、幾つかのフルオロフォアのＮＨＳ‐誘導体を使用して、α−アミノ基を特異的の修飾した。試験された蛍光レポーター分子（フルオロフォア）のリスト及びその特性を表２に示す。修飾条件下で、修飾メチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔ は安定であることが、酸‐尿素ゲルによる評価によって発見されている。試験された全ての蛍光分子は、異なる光学特性（励起及び発光）を有するために、我々は、新生タンパク質を含むゲルの定量のために使用された条件下で、相対蛍光強度を測定した。
【０２１１】
新生タンパク質の蛍光検出は、α−ヘモリジン（α−ＨＬ）をモデルタンパク質（Ｃ末端Ｈｉｓ６−ｔａｇ付き）として使用してまず評価を行った。α−ＨＬは、比較的小型タンパク質（３２ ｋＤａ）であり、インビトロ翻訳で効率的に生産され得た。さらに、その活性は、ウサギ赤血球溶血アッセイを使用して、タンパク質翻訳混合物中で直接に測定し得る。α‐ＨＬのインビトロ翻訳は、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｔ７ Ｓ３０転写／翻訳抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を使用して、上記に説明されたように幾つかの異なる修飾メチオニン・ｔＲＮＡ ｆｍｅｔの存在下で行われた。反応後、アリコート（３〜５ μｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけ、蛍光バンドが検出され、ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ Ｆ５９５ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を使用して定量された。
【０２１２】
データを図２０に示す。レーン１はＤＮＡを含まない対照である。レーン２は、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥの結果を示す。レーン３は、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＥの結果を示す。レーン４は、ＮＢＤの結果を示す（構造については表２を参照）。レーン５は、Ｂｏｄｉｐｙ−ＴＭＲの結果を示す。レーン６は、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇの結果を示す。レーン７、８、９及び１０は、ＦＡＭ、ＳＦＸ、ＰＹＭＰＯ 及び ＴＡＭＲＡで得られた結果をそれぞれ示す（構造については表２を参照）。
【０２１３】
この結果は、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−メチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔ （レーン ２ と ３）の存在下で生産されたα−ＨＬが最も強い蛍光を呈示したことを明らかに指摘する（全てのデータは、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥについて正規化される）。２つの異なるＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ試薬（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬスルホスクシンイミジルエステル（ＳＳＥ）及びＢＯＤＩＰＹ−ＦＬスクシンイミジルエステル（ＳＥ））は、溶解度に関してのみ異なる。評価されたフルオロフォアで次に最も好ましいものは、６‐（テトラメチルローダミン‐５‐（及び‐６）‐カルボキシアミド）ヘキサン酸、スクシンイミジルエステル（ＴＡＭＲＡ−Ｘ、 ＳＥ）で、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥの３５％蛍光（相対蛍光に補正された）を呈示した。ＢＯＤＩＰＹ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＳＥ（６‐（（４，４‐ジフルオロ‐１，３‐ジメチル‐５‐（４‐メトキシフェニル）‐４‐ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセン‐プロピオニル）アミノ）ヘキサン酸、スクシンイミジルエステル）及びＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＳＥ（４，４‐ジフルオロ‐５‐フェニル‐４‐ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセン‐３プロピオン酸、スクシンイミジルエステル）から成る２つの他の形状は、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ， ＳＳＥの蛍光の３％以下しか呈示しなかった。ニューロキニン‐２レセプター中に既に取り込まれている蛍光分子である、スクシンイミジル６‐（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジオゾール−４−ｙｌ）アミノヘキサン酸塩（ＮＢＤ−Ｘ−ＳＥ）、はＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥの蛍光の６％のみを呈示した。２つのフルオレセイン類似体、５−（及び−６）−カルボキシフルオレセイン、 スクシンイミジルエステル（ＦＡＭ， ＳＥ）及び６−（フルオレセイン−５−（及び−６） カルボキシアミド）ヘキサン酸、スクシンイミジルエステル（ＳＦＸ， ＳＥ）はまた極めて低い蛍光を示した（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬと比較して、それぞれ８．４％及び ４．６％）。
【０２１４】
［実施例　１０］：　最適化取り込み
新生タンパク質中に取り込まれるＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ量を最適化するために、存在するＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−メチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔ 量を反応当たり３〜６０ ｐＭの範囲で増加して、α−ＨＬの翻訳反応を行った。反応は、ウサギ赤血球の溶血活性によって測定されるα‐ＨＬと同様な量を生産し、これは、この範囲内で外因的に添加されるＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−メチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔ は、タンパク質合成を阻害しないことを示した。対照的に、α‐ＨＬに対応する蛍光バンド強度は、１０ μｌ反応当たり３０ ｐＭ　ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−メチオニン・ｔＲＮＡまで増加を続けた（データの表示なし）。このレベル以上の増加は、蛍光を増加を生じることはなく、従って、以後の反応はこのＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−メチオニン・ｔＲＮＡレベルを使用して実施した。
Ｂ　ＯＤＩＰＹ−ＦＬ取り込みを最適化するために使用した第二ステップは、反応混合物からＮ‐ホルミル‐テトラヒドロ葉酸塩（ｆＴＨＦ）を省くこと基づいた。原核細胞では、Ｎ‐ホルミル‐テトラヒドロ葉酸塩（ｆＴＨＦ）は、酵素　メチオニン・ｔＲＮＡトランスホルミラーゼの補因子として作用し、メチオニンによるアミノアシル化後に開始ｔＲＮＡをホルミル化する。タンパク質合成は、次にこの修飾ｔＲＮＡ（ホルミル‐メチオニン・ｔＲＮＡ）を使用して開始される。本発明をいずれの特定メカニズムに限定することなく、反応混合物からｆＴＨＦを省くことは、この内在性開始ｔＲＮＡと外因的に添加された修飾開始ｔＲＮＡ間のタンパク質合成開始に対する競合を、内在性開始ｔＲＮＡのホルミル化を防止することにより、低減すると考えられる。これは、反応混合物中にｆＴＨＦが存在する、また存在しない場合の反応についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥから直接蛍光を測定することにより確認された。後者の場合、２〜３倍の蛍光増加が見られた（データの表示なし）
［実施例　１１］：他のタンパク質中への取り込み
このアプローチの一般的適応性を探索するために、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−メチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔを使用する転写／翻訳反応を、ジヒドロフォレート還元酵素（ＤＪＦＲ）、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（アセチル基転移酵素）（ＣＡＴ）及びバクテリオロドプシン（ＢＲ）をコードする様々なプラズミドＤＮＡを使用して実施した。ＢＲは、膜タンパク質を代表するために含まれ、典型的には極めて疎水性である。他のタンパク質への取り込みを調査するために、Ｔａｌｏｎ金属キレート樹脂（ＣｌｏｎＴｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を使用して、遊離ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ及びＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−メチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔ と共に、最適共役化された転写／翻訳系を使用した。結果は図２１Ａ（レーザーベースのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ５９５を使用して可視化）、及び２１Ｂ（ＵＶトランスイルミネーターを使用して可視化）に示す。レーン１はＤＮＡを含まない対照である。レーン２、３、４、５及び６は、それぞれ、ヘモリジン、ＤＨＦＲ、ルシフェラーゼ、ＣＡＴ及びバクテリオロドプシンである。
【０２１５】
蛍光バンドは、各タンパク質について、対応する関連分子の位置で蛍光スキャナーを使用して観察される。ルシフェラーゼの場合、内部メチオニンにおける偽開始による予想産物に対応するバンドが観察される（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＴＢ２１９）。全てのタンパク質に対応するバンドはまた目視により、さらにλ＞４５０ ｎｍ である光線を通す発光フィルターと組み合わせたＵＶトランスイルミネーター（ＵＶＰ ＴＭＷ−２０）を使用して写真撮影によっても観察された。この場合の励起は、３００〜４００ ｎｍから伸びるＢＯＤＩＰＹ−ＦＬのＵＶ吸光バンド内で生じるらしい。
【０２１６】
ＢＯＤＩＰＹ取り込み量を次に、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬの異なる濃度からなる溶液との比較、さらにＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイをそれぞれ使用して、精製試料中に存在する取り込まれたＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ量及びタンパク質量を測定することによって決定した。３度の測定値の平均は、モル比０．２９＋／−０．０３％を生じた。しかし、トリプトファン及びチロシンのようなタンパク質残基を有するＢＯＤＩＰＹ−ＦＬの蛍光消光が、水溶液中のＢＯＤＩＰＹ−ＦＬと比較して蛍光量子収率を低下するであろうから、取り込み収率は、より高いものと思われる。
【０２１７】
合成された新生タンパク質活性への蛍光標識手順の影響をさらに評価した。これは、インビトロ発現クローニング及びインビトロテクノロジーである他のプロテオミック適用の場合のような、下流機能分析の実施を所望するような場合には重要である。Ｎ末端蛍光標識がタンパク質の機能を修飾する可能性があるが、低モル取り込みレベル（〜０．３％）は、抽出物の総活性を大幅に修飾はしないはずである。これは、様々な酵素アッセイにより確認されており、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−メチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔ が存在する場合、また存在しない場合に合成されたＤＨＦＲ、 α−ＨＬ及びルシフェラーゼについて測定された活性には有意差がないことが発見されている（表３を参照）。
【０２１８】
［実施例　１２］：感度の測定
本方法の感度を評価するために、オリジナル反応混合物　０．００３〜０．５ μｌに対応する翻訳抽出物の様々な希釈液をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。対照として、ＤＮＡを欠損して実施された反応からの抽出物を分析した。図２２Ｂに見られるように、オリジナル反応混合物の０．００７ μｌに対応するほど少量のα−ＨＬバンドからの蛍光が検出可能であった。インビトロ系において生産される総新生タンパク質、５０〜８０ μｇ／ｍｌの範囲、に関する我々の推定に基づくと、これは、０．３５〜０．５ ｎｇの α‐ヘモリジンに対応する。これは、新生タンパク質のそのような低い発現はＸ線フィルムへの長時間の曝露を必要とし、その結果重大なバックグラウンド問題を生じることのある、新生タンパク質のラジオアイソトープ標識を使用して得られる感度に劣ることはない。これはさらに、市販されているクーマシーブルー（８〜１００ ｎｇ）を使用して現在ゲル上でタンパク質を測定する感度を超越している。ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ取り込みレベルを向上し、さらにゲル材料、抽出物及び添加された修飾ｔＲＮＡにおける蛍光不純物に起因すると思われるバックグラウンド蛍光を低減することによって、感度はさらに改善されると予測される。
【０２１９】
［実施例　１３］：時間の関数としての合成
新生タンパク質合成を時間の関数としてモニタするための蛍光標識アプローチの能力をまた評価した。この目的には、α−ＨＬ転写／翻訳混合物の小量アリコート（４ μｌ）を、反応中の様々な時間に取り出して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図２２Ａに見られるように、α‐ＨＬに起因するバンドは、早い場合はインキュベーション開始５分後に明らかに検出され得る。蛍光標識α‐ＨＬの合成は、翻訳の１５分後には飽和状態となると思われる。
【０２２０】
［実施例　１４］：修飾試薬
ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを形成するために使用されるアミノアシル化後修飾の場合、重要な要素は、天然アミノ酸に修飾を加えるために使用される修飾試薬である。例えば、フルオロフォアＢＯＤＩＰＹ ＦＬの場合は、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＥ 及び ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）として知られる２種類の異なる市販のＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＮＨＳ試薬がある。どちらの試薬も、脱離基としてＮ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）に基づいている。しかし、スルホン酸（スルホ）基の一つの形状（ＳＳＥ）の存在により、この２つの形状は水溶解性が異なる（構造については表２を参照のこと）。この実例では、これらの２種類の異なる試薬を使用して、メチオニンによってアミノアシル化されている精製ｔＲＮＡｆｍｅｔ に、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬフルオロフォアを添加することを目的として、標準生化学的手順に基づく最適化反応を行った。この目的には、まずｔＲＮＡｆｍｅｔ をメチオニンでアミノアシル化した。典型的な反応では、１５００ ｐＭ （〜１．０ ＯＤ２６０）のｔＲＮＡを過剰量のアミノアシル・ｔＲＮＡシンテターゼを使用して、アミノアシル化ミックス中、３７℃で４５分インキュベートした。アミノアシル化ミックスは、２０ ｍＭ イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、 １５０ ｍＭ ＮａＣｌ、 １０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、 ２ ｍＭ ＡＴＰ 及び １６００ ユニットのアミノアシル・ｔＲＮＡシンテターゼから構成された。アミノアシル化度は、酸‐尿素ゲル、さらに３５Ｓ‐メチオニンを使用することにより測定した。インキュベーション後、混合物に０．１容積の３ Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を添加して中和し、クロロホルム：酸フェノール抽出（１：１）を行った。エタノール（２．５容積）を水相に添加し、得られたｔＲＮＡペレットを水に溶解して（３７．５ （ｌ）、修飾に使用した。
【０２２１】
（Ａ）ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥによるアミノアシル・ｔＲＮＡの修飾
上記のアミノアシル・ｔＲＮＡ溶液に、１Ｎ ＮａＨＣＯ３　２．５ （ｌを加え（最終濃度＝５０ ｍＭ、ｐＨ ８．５）、次に水中で１０ ｍＭ　ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥ溶液　１０ （ｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加えた。混合物を０℃で１０分インキュベートして、リジンを添加して反応を消光した（最終濃度＝１００ ｍＭ）。結果生じる溶液に、０．１容積の３ Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ ５．０）を加えて、修飾ｔＲＮＡを３容積のエタノールで沈降した。沈降物を水５０ｍｌマイクロリットルに溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過カラム（０．５ × ５ ｃｍ）で精製して、遊離蛍光試薬が残っている場合は、これを除去した。修飾ｔＲＮＡは、自然解凍を避けるために少量のアリコートにして凍結保存（−７０℃）した。
【０２２２】
（Ｂ） ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＥによるアミノアシル・ｔＲＮＡの修飾
上記のアミノアシル・ｔＲＮＡ溶液に、１Ｎ ＮａＨＣＯ３　２．５ （ｌを加え（最終濃度＝５０ ｍＭ、ｐＨ ８．５）、次にＤＭＳＯ　２０ （ｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加え、その後、ＤＭＳＯで１０ ｍＭ　ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＥ溶液　１０ （ｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加えた。混合物を０℃で１０分インキュベートして、リジンを添加して反応を消光した（最終濃度＝１００ ｍＭ）。結果生じる溶液に、０．１容積の３ Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ ５．０）を加えて、修飾ｔＲＮＡを３容積のエタノールで沈降した。沈降物を水　５０ｍｌに溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過カラム（０．５×５ ｃｍ）で精製して、遊離蛍光試薬が残っている場合は、これを除去した。修飾ｔＲＮＡは、自然解凍を避けるために少量のアリコートにして凍結保存（−７０℃）した。
【０２２３】
（Ｃ）分析
メチオニンのα‐アミノ基の修飾度は、ＮＨＳＢＯＤＩＰＹ ＦＬ試薬の非スルホン酸化形と比較してＮＨＳ　ＢＯＤＩＰＹ ＦＬのスルホン酸化形を使用ことにより、実質的に高くなることが、ＨＰＬＣを使って経験的に発見されている。さらに、スルホン酸化形を使用して形成されたミスアミノアシル・ ｔＲＮＡｆｍｅｔは、優れた特性を呈示することが発見されている。ＢＩＤＯＰＹ ＦＬをタンパク質（Ｔ７プロモーター制御下でＨＬ遺伝子を含むプラズミドを使用するヘモリジン）中に取り込むために、最適化Ｓ３０ Ｅ．ｃｏｌｉ翻訳系において使用されると、発現されたＨＬに対応するＳＤＳＰＡＧＥゲル上のバンドは、非スルホン酸形を使用して形成されたミスアミノアシル化を使う同様な系と比較して、アルゴンレーザーベースの蛍光イメージャーを使用して検出される際に、約２倍高い蛍光レベルを呈示した。
【０２２４】
（Ｄ）クマリン
上記に説明されたことと同様な結果が、クマリンの非スルホン化及びスルホン化ＮＨＳ誘導体、これらはまた市販されており、それぞれスクシンイミジル７‐アミノ‐メチル‐アミノ‐酢酸クマリン（ＡＭＣＡ−ＮＨＳ； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）及びスルホスクシンイミジル７‐アミノ‐４‐メチルクマリン‐３−酢酸（ＡＭＣＡ−ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ； Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）として言及されている、を比較することにより得られた。この場合は、メチオニンによってアミノアシル化されている精製ｔＲＮＡｆｍｅｔ に、クマリンフルオロフォアを添加するために、標準生化学的手順に基づくこれらの２種類の異なる試薬を使用して、最適化反応を行った。
【０２２５】
上記に説明するアミノアシル・ｔＲＮＡ溶液に、１Ｎ ＮａＨＣＯ３　２．５ （ｌを加え（最終濃度＝５０ ｍＭ、ｐＨ ８．５）、次に水中で１０ ｍＭ　スクシンイミジル７‐アミノ‐４−メチルクマリン‐３‐酢酸溶液（ＡＭＣＡ−ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ； Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）　１０ （ｌを加えた。混合物を０（Ｃで１０分インキュベートして、リジンを添加して反応を消光した（最終濃度＝１００ ｍＭ）。結果生じる溶液に、０．１容積の３ Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ ５．０）を加えて、修飾ｔＲＮＡを３容積のエタノールで沈降した。沈降物を５０ｍｌ の水に溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過カラム（０．５ × ５ ｃｍ）で精製して、遊離蛍光試薬が残っている場合は、これを除去した。修飾ｔＲＮＡは、自然解凍を避けるために少量のアリコートにして凍結保存（−７０℃）した。
【０２２６】
上記のアミノアシル・ｔＲＮＡ溶液に、１Ｎ ＮａＨＣＯ３　２．５ （ｌを加え（最終濃度＝５０ ｍＭ、ｐＨ ８．５）、次にＤＭＳＯ　２０ （ｌを加え、その後、ＤＭＳＯ中で１０ ｍＭ　スクシンイミジル７‐アミノ‐メチル‐アミノ‐酢酸クマリン溶液　１０ μｌ （ＡＭＣＡ−ＮＨＳ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加えた。混合物を０℃で１０分インキュベートして、リジンを添加して反応を消光した（最終濃度＝１００ ｍＭ）。結果生じる溶液に、０．１容積の３ Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ ５．０）を加えて、修飾ｔＲＮＡを３容積のエタノールで沈降した。沈降物を５０ｍｌ の水に溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過カラム（０．５ × ５ ｃｍ）で精製して、遊離蛍光試薬が残っている場合は、これを除去した。修飾ｔＲＮＡは、自然解凍を避けるために少量のアリコートにして凍結保存（−７０℃）した。
【０２２７】
この場合は、クマリン‐ＮＨＳ（ＡＭＣＡ−ＮＨＳ）の非スルホン酸化形を使用して形成されたクマリン‐メチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔは、標準Ｅ． ｃｏｌｉ Ｓ３０翻訳混合物中で使用される際に、標準ＵＶトランスイルミネーターからのＵＶ光線を使用して検出するときに、極めて低レベルの検出性蛍光バンドを 生じた。対照的に、同一の手順を使って添加される際は、スルホン化形（ＡＭＣＡ−スルホ−ＮＨＳ）は、ＵＶトランスイルミネーターを使用することにより容易に検出されるバンドを生じる。
【０２２８】
メチオニンのα‐アミノ基の修飾による開始ｔＲＮＡを使用して、クマリンを取り込む試みは、文献上で報告されているが、失敗に終わっている。開始ｔＲＮＡへのクマリンの付着は、次に化学的クロスリンカーを使用するより高度で複雑な化学的付着を必要とした。これは、まずｔＲＮＡをメチオニンでアミノアシル化し、次にアミノアシル・ｔＲＮＡをＤＴＤＧモノスクシンイミジルエステル（ＤＴＤＧは、ジチオジグリコール酸）と反応することにより達成された。反応生成物は、次にＤＴＴを使用して還元され、さらにＣＰＭ（３‐４’‐マレイミドフェニル）‐４‐メチル‐ジエチルアミノクマリンと反応された。（Ｏｄｏｍ， Ｏ． Ｗ、 Ｋｕｄｌｉｃｋｉ， Ｗ 及び Ｈａｒｄｅｓｔｒｙ， Ｂ． １９９８。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａｃｙｌ−ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ ｔＲＮＡ， Ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（アシル誘導体化ｔＲＮＡを使用するインビトロ工学、タンパク質合成方法及びプロトコル）、 ＰＰ．９３〜１０３、 Ｈｕｍａｎａ ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ）。各マーカーについて特別の手順をデザインする必要があるため、そのようなアプローチは、化学的アミノアシル化後手順によって、ｔＲＮＡへの広範囲のマーカーの一般的な付着のためには実用的ではない。
【０２２９】
スルホン酸化ＮＨＳ試薬を、ｔＲＮＡの化学的アミノアシル化後に有用とする唯一の可能な要素は、水性緩衝液におけるその溶解度である。対照的に、ＢＩＤＯＰＹ ＦＬ ＮＨＳ試薬のような非スルホン酸化試薬は、ポストケミカル・修飾にはＤＭＳＯのような有機性緩衝液を必要とする。有機性緩衝液の使用がなぜ総合的なマーカーの取り込みを低下するのかはまだ明らかではないが、一つの可能性は、アミノ酸とｔＲＮＡ間に形成されたアミノアシル結合の加水分解が修飾の総合的レベルを低下することである。
【０２３０】
［実施例　１５］：水溶解度の分与
一般的に、水溶解度特性は、いくつかの方法によって化学試薬に分与することができる。これらのいくつかを以下に要約する：
‐（スルホン酸化ＮＨＳのような）脱離基への極性官能基の導入。
‐スペーサーアームへの極性官能基の導入。
‐試薬部分それ自体への極性官能基の導入。
−ＳＯ３− Ｎａ＋ （スルホ−）基の導入が好ましいが、（ＤＳＰのような）他の極性電離基もまた使用することができ、ＤＳＰを以下に示す：
【０２３１】
【化１】
2004513604.tif 000003
最終水溶解度は、例えば、ポリエーテルスペーサー（例：テトラエチレングリコールに基づくようなもの）を使用することにより、スペーサーアーム中に巧みに操作処理することができる。一般的に、遊離カルボキシル基を有するいずれの部分も、そのスルホ‐ＮＨＳ活性エステルに転化することができる。この反応は、Ｎ‐ヒドロキシ‐スルホスクシンイミド（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）（モノナトリウム塩）、マーカー及びＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）のような共役因子を含む。
【０２３２】
【化２】
2004513604.tif 000004
典型的な反応では、マーカー（１）、５５ ｍＭを１０ ｍｌのＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）に溶解して、さらに（２）（５ ｍＭ）を添加し、次に（３）（１．１当量）を加える。混合物を室温で一晩撹拌し、沈殿物を濾過除去し、さらに室温減圧下で、濾液を蒸発する。必要に応じて、カラムクロマトグラフィーを使用して生成物を精製し、再結晶化する。
【０２３３】
本発明による一つの好ましい実施態様は、スルホン化ＮＨＳ試薬を含むマーカーを使用するミスアミノアシル・ｔＲＮＡ形成のためのｔＲＮＡのポストケミカル・修飾を含む。そのような試薬は一般的には市販されていないが、様々な有用なマーカーから常套手段により生産され得る。例えば、ＵＶ及び可視励起に高い蛍光量子収率を有するフルオレセインは、スルホン酸化ＮＨＳを含む形に調製することが可能である。
【０２３４】
［実施例　１６］：トリプルマーカーシステム
この実施例では、新生タンパク質を検出するために３マーカーシステム、すなわち、Ｎ末端マーカー、Ｃ末端マーカー、及びアフィニティーマーカー（後者は内在性アフィニティーマーカー）を使用する。実験は、１）マーカーを有するｔＲＮＡの調製、従ってマーカーが（翻訳中）にタンパク質のＮ末端に導入され得る；２）野生型及び突然変異型ヘモリジンをコードする核酸でヘモリジンを翻訳；及び４］マーカーの定量を含む。
【０２３５】
１．ビオチン‐メチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔの調製
精製ｔＲＮＡｆｍｅｔ  （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）をまずにメチオニンでアミノアシル化した。典型的なアミノアシル化反応は、１５００ ｐＭ （−１．０ ＯＤ２６０）　ｔＲＮＡ、２０ ｍＭ イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ ｍＭ メチオニン、２ ｍＭ ＡＴＰ、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ 及び過剰量のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｓｉｇｍａ）を含んだ。反応混合物を３７℃で４５分インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物に０．１容積の３ Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ　５．０）を添加して中和し、クロロホルム：酸フェノール抽出（１：１）を行った。エタノール（２．５容積）を水相に添加し、得られたｔＲＮＡペレットを水に溶解した（２５ μｌ）。メチオニンのα−アミノ基へのＮＨＳ−ビオチンの結合は、５０ ｍＭ　炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　８．０）中で、アミノアシル・ｔＲＮＡ ｆｍｅｔ （２５ μｌ）にＮＨＳ−ビオチン（最終濃度＝２ ｍＭ）を加えて０℃で１０分インキュベートすることにより行われ、反応はリジン（最終濃度＝１００ ｍＭ）の添加により消光された。修飾ｔＲＮＡをエタノールで沈降して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過カラム（０．５ × ５ ｃｍ）を通過させて、遊離試薬が残っている場合は、これを除去した。
【０２３６】
２． α−ＨＬ ＤＮＡのインビトロ翻訳
ＷＴ及びアンバー（１３５位置）突然変異型プラズミドＤＮＡを、そのＣ末端にアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｈｉｓ‐Ｈｉｓ‐Ｈｉｓ‐Ｈｉｓ‐Ｈｉｓ （Ｈｉｓ‐６） （配列番号 ５）を担う３２ ｋＤａタンパク質である、α−ヘモリジン（α‐ＨＬ）をコードするために使用した。ＷＴ及びアンバー突然変異型α−ＨＬ遺伝子（Ａｍｂ １３５）のインビトロ翻訳を、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｔ７環状転写／翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＷＩ）を使用して、ビオチン−メチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔ（ＡｍｂｅｒＧｅｎ， Ｉｎｃ）の存在下で行った。１００ μｌの翻訳反応は、Ｅ． ｃｏｌｉ 抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＷＩ）を３０ μｌ 、アミノ酸を含まないプレミックスを４０ μｌ 、 アミノ酸混合物（１ ｍＭ）を１０ μｌ 、ＷＴ及び突然変異体α−ＨＬ をコードするプラズミドＤＮＡを５ μｇ 、ビオチン−メチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔを１５０ ｐＭ及びリボヌクレアーゼフリー・ウオーターを使用して行った。プレミックス（１×）は、５７ ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．２）、３６ ｍＭ　酢酸アンモニウム、２１０ ｍＭ　グルタミン酸カリウム、１．７ ｍＭ ＤＴＴ、４％ ＰＥＧ ８０００、１．２５ ｍＭ ＡＴＰ、０．８ ｍＭ ＧＴＰ、０．８ ｍＭ ＵＴＰ、０．８ ｍＭ ＣＴＰ、 ６０ ｍＭ　ホスホエノールピルビン酸、０．６ ｍＭ ｃＡＭＰ、及び１６ ｍＭ酢酸マグネシウムを含む。翻訳反応プレミックスから、ｎ‐ホルミル‐テトラヒドロ葉酸塩（ｆＴＨＦ）が省かれた。翻訳は、３７℃で１時間行われた。ＤＮＡを含まずにインキュベートされた翻訳反応混合物を対照とする。翻訳反応混合物が、等量のＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水、ｐＨ ７．５）で希釈された後。各試料を２つのアリコートに分割して、以下に説明するようにそれぞれプロセスした。
【０２３７】
３． 抗−α−ＨＬ抗体マイクロ滴定プレートの調製
抗ウサギ‐ＩｇＧでコートされたマイクロ滴定プレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， Ｉｌ）をＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）で洗浄し、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝溶液中で調製した抗−α−ＨＬポリクローナル抗体溶液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）　１００ μｇ／ｍｌを加えて、マイクロ滴定プレートシェーカー（振とう器）上で、室温で１時間インキュベートした。プレートを次にＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液で洗浄して（３ 回 ｘ ２００ μｌ）、将来の使用のために４℃で保存した。
【０２３８】
４．Ｎ末端（ビオチン）マーカーの定量
対照、ＷＴ及びアンバーα−ＨＬ ＤＮＡ用の翻訳反応混合物（５０ μｌ）を、抗−α−ＨＬ抗体マイクロ滴定プレートの異なるウェル内にいれ、シェーカー上で、室温で３０分インキュベートした。インキュベーション後、２００ μｌ のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液で、ウェルを５回洗浄し（各５〜１０ 分）、上清を捨てた。これらのウェルに、１００ μｌの１：１０００希釈ストレプトアビジン‐西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ； ０．２５ ｍｇ／ｍｌ； Ｐｒｏｍｅｇａ）を加え、プレートを振とう条件下で、室温で２０分インキュベートした。インキュベーション後、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液で念入りに洗浄することにより（各５ 回ｘ５ 分）、過剰ストレプトアビジン‐ＨＲＰを取り除いた。最後に、ＨＰＲ（ＨＰＲ緩衝液中のＯＰＤ）用基質　２００ μｌを加えて、分光高度計を使用して、４４１ ｎｍで吸光度を測定することにより、ＨＰＲ活性を測定した。
【０２３９】
５．Ｃ末端（Ｈｉｓ−６−タグ）マーカーの定量
対照、ＷＴ及びアンバーα−ＨＬ ＤＮＡ用の実施例２からの翻訳反応混合物（５０ μｌ）を、抗−α−ＨＬマイクロ滴定プレートの異なるウェル内にいれ、シェーカー上で、室温で３０分インキュベートした。インキュベーション後、２００ μｌ のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液で、ウェルを５回洗浄し（各５〜１０ 分）、上清を捨てた。これらのウェルに、１００ μｌの１：１０００希釈抗−Ｈｉｓ−６抗体（ＣｌｏｎＴｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を加え、プレートを振とう条件下で、室温で２０分インキュベートした。インキュベーション後、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ緩衝液で念入りに洗浄することにより（各５ 回 ｘ ５ 分）、過剰抗体を取り除いた。その後、ウェルに二次抗体（抗マウスＩｇＧ‐ＨＰＲ、Ｒｏｃｈｅ−ＢＭ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）を加えて、室温で２０分インキュベートした。過剰二次抗体を洗浄後、上記に説明するようにＨＰＲ活性を測定した。
【０２４０】
６．Ｎ及びＣ末端マーカーのゲルフリー定量
上記に説明する定量の結果を図２３Ａ（Ｎ末端、ビオチンマーカーの定量）及び図２３Ｂ（Ｃ末端、Ｈｉｓ−６マーカー）に示す。ビオチン−メチオニン・ｔＲＮＡの存在におけるＷＴ α−ＨＬ ＤＮＡのインビトロ転写／翻訳の場合は、合成されたタンパク質は、タンパク質のＣ末端部に翻訳されたＨｉｓ−６タグを有し、α−ＨＬ分子のいくつかは、さらにそのＮ末端部に、ビオチン−メチオニン・ｔＲＮＡを使用して取り込まれた、ビオチンを担うであろう。α−ＨＬを含む全翻訳反応混合物が、抗−α−ＨＬ抗体プレート上でインキュベートされた場合は、選択的に全てのα−ＨＬが、抗体と内在性アフィニティーマーカーとの相互作用によりプレートに結合するであろう。非結合タンパク質は洗浄除去され、結合タンパク質のＮ及びＣ末端は、ストレプトアビジン‐ＨＰＲ及び抗Ｈｉｓ−６ 抗体を使用して、それぞれ定量し得る。ＷＴ α−ＨＬの場合は、タンパク質は、Ｎ末端（ビオチン）及びＣ末端（Ｈｉｓ−６）タグのどちらも担い、従って、どちらの場合もＨＲＰシグナルを生じ、ストレプトアビジン‐ＨＲＰ及び二次抗体‐ＨＲＰが使用されたＨｉｓ−６と抱合するであろう（ＨＬ、図２３Ａ）。他方、アンバー突然変異型α−ＨＬの場合は、α−ＨＬのＮ末端フラグメント（最初の１３４アミノ酸のみが生産され、Ｎ末端マーカー、ビオチンのみを有するが、コドン番号１３５におけるアンバー突然変異のためにＨｉｓ−６マーカーを有しないであろう。この突然変異の結果、アンバーα−ＨＬ ＤＮＡを使用して生産されたタンパク質は、抗体プレートと結合するが、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＨＬ−ＡＭＢ、 図 ２３Ａ）の場合のみにシグナルを生じ、抗ｈｉｓＸ６抗体（ＨＬ−ＡＭＢ、 図２３Ｂ）にはシグナルを生じないであろう。
【０２４１】
［実施例　１７］　電気泳動易動度シフトアッセイ
膜の存在における光分解またはオリゴマー形成のいずれかによるＳＤＳゲル上の蛍光標識新生タンパク質の電気泳動易動度の変化を実証するために、我々は、Ｃ末端にアミノ酸配列Ｈｉｓ−Ｈｉｓ‐Ｈｉｓ‐Ｈｉｓ‐Ｈｉｓ‐Ｈｉｓ （Ｈｉｓ‐６） （配列番号 ５）を担う３２ ｋＤａタンパク質をコードするα−ヘモリジン（α−ＨＬ）のプラズミドＤＮＡを使用した。α−ＨＬ遺伝子のインビトロ翻訳は、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｔ７環状転写／翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＷＩ）を使用して、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−メチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔ （ＡｍｂｅｒＧｅｎ， Ｉｎｃ）の存在下で行った。本実験は、１）翻訳中のＮ末端マーカーの導入のためのｔＲＮＡマーカーの調製、２）翻訳、３）精製、４）プロテアーゼ処理、または５）オリゴマー形成を含んだ。
【０２４２】
１． ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−メチオニンｔＲＮＡの調製：
ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−メチオニン・ｔＲＮＡは、まず精製ｔＲＮＡｆｍｅｔ （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）をメチオニンを使用してアミノアシル化し、次にメチオニンのα−アミノ基をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥ（４‐ジフルオロ‐５，７‐ジメチル‐４‐ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセンプロピオン酸、スルホスクシンイミジルエステル；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）を使用して修飾することにより調製した。典型的なアミノアシル化反応（１００ μｌ）は、１５００ ｐＭ （−１．０ ＯＤ２６０）　ｔＲＮＡ、２０ ｍＭ イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、１０ ｍＭ 　ＭｇＣｌ２、１ ｍＭ メチオニン、２ ｍＭ　 ＡＴＰ、１５０ ｍＭ　 ＮａＣｌ 及び 過剰量のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｓｉｇｍａ）を含んだ。反応混合物を３７℃で４５分インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物に０．１容積の３ Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を添加して中和し、クロロホルム：酸フェノール抽出（１：１）を行った。エタノール（２．５容積）を水相に添加し、得られたｔＲＮＡペレットを水に溶解した（２５ μｌ）。メチオニンのα−アミノ基へのＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥの結合は、５０ μｌ の反応容積中で、５０ ｍＭ　重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を使用して、２５ μｌのアミノアシル・ｔＲＮＡ ｆｍｅｔ（１．５ ｎＭ）に１０ μｌのｏｆ ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥ （１０ ｍＭ）を加えて、０℃で１０分インキュベートすることにより行われ、反応はリジン（最終濃度＝１００ ｍＭ）の添加により消光した。修飾ｔＲＮＡをエタノールで沈降して、さらにペレットをリボヌクレアーゼフリー・ウオーターに溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過カラム（０．５ × ５ ｃｍ）を通過させて、遊離蛍光試薬が残っている場合は、これを除去した。
【０２４３】
２． α−ヘモリジン ＤＮＡのインビトロ翻訳
１００ μＬの翻訳反応は、Ｅ． ｃｏｌｉ 抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＷＩ）を３０ μｌ 、アミノ酸を含まないプレミックスを４０ μｌ 、 アミノ酸混合物（１ ｍＭ）を１０ μｌ 、α−ＨＬ をコードするプラズミドＤＮＡを５ μｇ 、１５０ ｐＭのＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−メチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔ 及びリボヌクレアーゼフリー・ウオーターを含んだ。プレミックス（１×）は、５７ ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．２）、３６ ｍＭ　酢酸アンモニウム、２１０ ｍＭ　グルタミン酸カリウム、１．７ ｍＭ ＤＴＴ、４％ ＰＥＧ ８０００、１．２５ ｍＭ ＡＴＰ、０．８ ｍＭ ＧＴＰ、０．８ ｍＭ ＵＴＰ、６０ ｍＭ　ホスホエノールピルビン酸、０．６ ｍＭ ｃＡＭＰ、及び６ ｍＭ酢酸マグネシウムを含む。翻訳反応プレミックスから、ｎ‐ホルミル‐テトラヒドロ葉酸塩（ｆＴＨＦ）を省いた。翻訳は、３７℃で１時間行われた。ＤＮＡを含まずにインキュベートされた翻訳反応混合物を対照とする。
【０２４４】
３．Ｈｌｓ−６−α−ＨＬの精製
５０ μｌの翻訳反応混合物（上記より）を、Ｈｌｓ−６−α−ＨＬ精製のために、Ｔａｌｏｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ （ＣｌｏｎＴｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）クロマトグラフィーにかけた。これは粗抽出物を、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ を含む５０ ｍＭ トリス・塩酸（ ｐＨ ８．０ ）で予め平衡化したＴａｌｏｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ カラム上に装填し、さらに非結合タンパク質を除去するためにカラムを洗浄することにより行った。結合タンパク質は次に上記緩衝液に１００ ｍＭイミダゾールを加えることにより溶出された。溶出されたα−ＨＬは、５０ ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）に対して透析された。
【０２４５】
４．プロテアーゼ検出用ＥＭＳＡ
精製蛍光標識α−ＨＬ （−５ μｇ）（実施例３）を、５０ ｎＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）（１００：１；タンパク質：プロテアーゼ比）中で、０．０．５ μｇの精製トリプシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を加えて、３７℃で５分インキュベートした。タンパク質分解反応は、１Ｘ ＳＤＳゲルローディングバッファーを加え、試料を５分煮沸することにより停止された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、４〜２０％勾配ゲル（ｒｅａｄｙ−ｇｅｌ， Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）を使用して、Ｌａｅｍｍｌｉ （Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ． Ｋ． １９７０、 Ｎａｔｕｒｅ ２２７， ６８０〜６８５）により説明されるように行った。ゲル電気泳動後、ゲルを、Ｆｌｕｏｒｌｍａｇｅｒ Ｆ５９５ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を使用して目視観察した。
【０２４６】
α−ＨＬの極めてはっきりした切断を得るために、トリプシンは極めて限定された条件（シングル・ヒット動態学）の元で使用された（５０ ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ ５．０）、１００：１：タンパク質：プロテアーゼ比、３７℃で５分）。これらの条件下で、α−ＨＬ中のグリシン濃厚ループが最も切断されやすく、その結果、１７ ｋＤａのタンパク質分解性フラグメントが観察された（Ｖｅｃｅｓｅｙ−Ｓｅｍｊｅｎ、 Ｂ．， Ｋｎａｐｐ， Ｓ．、 Ｍｏｌｌｂｙ， Ｒ．、 Ｇｏｏｔ， Ｆ．Ｇ． １９９９、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３８ ４２９６〜４３０２）。蛍光標識α−ＨＬが極めて弱いトリプシン処理を受けると、その結果として、α−ＨＬ の切断は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の蛍光バンドの易動度の変化の証拠として、約１７〜１８ ｋＤａの大きさのＮ末端フラグメントを発生した（図２４レーン１は、未処理タンパク質、レーン２はプロテアーゼ処理タンパク質）。この結果は、そのようなアッセイは、新生タンパク質の電気泳動易動度シフトを起因する可能性がある、プロテアーゼ、またはキナーゼ、トランスフェラーゼ等のようなその他の酵素活性をスクリーンするために使用することが可能であることを示す。この特定のアッセイには我々は精製新生タンパク質を使用したが、精製されていない新生タンパク質（全翻訳反応混合物）を使用できないという理由はない。
【０２４７】
５．膜上にある新生タンパク質のオリゴマー形成用ＥＭＳＡ
全翻訳反応混合物（１０ μｌ）（上記参照）を、ウサギ赤血球（ｒＲＢＣｓ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｆａｒｍ， ＣＴ）が存在する場合と存在しない場合について、０℃で３０分インキュベートした。インキュベーション後、過剰非結合α−ＨＬを除去するために洗浄し、さらに１ ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含む （ＴＢＳＡ）トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）中でｒＲＢＣｓ を３７℃で２０分インキュベートし、その期間中にｒＲＢＣｓの分解が起こった。ｒＲＢＣ膜を遠心分離後に分離して、１Ｘ ＳＤＳ−ゲル ローディングバッファーに溶解して、試料を加熱しないで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （４〜２０％勾配ゲル）にかけた。ゲル電気泳動後、ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ Ｆ５９５を使用してゲルを目視観察した。
【０２４８】
α−ＨＬは溶解性単量体タンパク質を発現し、様々な膜の存在において、オリゴマー化してヘプタメリック孔を形成し得る（Ｗａｌｋｅｒ， Ｂ．、 Ｋｒｉｓｈｎａｓａｓｔｒｙ， Ｍ．、 Ｚｏｒｎ， Ｌ．、 Ｋａｓｉａｎｏｗｉｃｚ， Ｊ． 及び Ｂａｙｌｅｙ， Ｈ．、 １９９２， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７， １０９０２〜１０９０９）。さらに、オリゴマーのいくつかの中間形もまた観察された。この実験では、脂質膜の存在におけるオリゴマー形成に起因するα−ＨＬ易動度のシフトを検出するためのＥＭＳＡの適応性を観察するために、全翻訳反応混合物を（全く精製しないで）使用した。新生α−ＨＬを含む全翻訳抽出物にｒＲＢＣを加えてインキュベートすると、ｒＲＢＣ膜上にα−ＨＬのオリゴマー形成を起因し、ＳＤＳ抵抗性である様々な分子量に対応するはっきりした蛍光バンドを生じた（図２５：レーン１は未処理タンパク質のみを示し、レーン２はｒＲＢＣで処理したタンパク質を示す）。
【０２４９】
この結果は、そのようなアッセイは、タンパク質の研究に使用することができ、様々な天然及び人工膜と相互作用し、さらに結果としてタンパク質の易動度がシフトされることを実証する。
［実施例　１８］：リジン・ｔＲＮＡｌｙｓを使用する取り込み
この実施例は、リジン−ｔＲＮＡｌｙｓを使用する、新生タンパク質中への蛍光標識の取り込みを説明する。より詳しくは、様々な蛍光分子は、リジン・ ｔＲＮＡｌｙｓを使用して、１）Ｅ ｃｏｌｉ 翻訳系における翻訳中にヘモリジン、及び２）コムギ胚芽系における翻訳中にルシフェラーゼ中に取り込まれる。実験は、１）ｔＲＮＡマーカー化合物の調製、２）翻訳、及び３）ゲル上の検出を含んだ。
【０２５０】
１．蛍光標識ミスアミノアシル・ｔＲＮＡｌｙｓの調製
精製ｔＲＮＡｌｙｓ （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）をまずにリジンでアミノアシル化した。典型的なアミノアシル化反応（１００ μｌ）は、１５００ ｐＭ （−１．０ ＯＤ２６０）　ｔＲＮＡ、２０ ｍＭ イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、１０ ｍＭ 　ＭｇＣｌ２、１ ｍＭ　 リジン、２ ｍＭ　 ＡＴＰ、１５０ ｍＭ　 ＮａＣｌ 及び過剰量のアミノアシル・ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｓｉｇｍａ）を含んだ。反応混合物を３７℃で４５分インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物に０．１容積の３ Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ　５．０）を添加して中和し、クロロホルム：酸フェノール抽出（１：１）を行った。エタノール（２．５容積）を水相に添加し、得られたｔＲＮＡペレットを水に溶解した（２５ μｌ）。リジンのε −アミノ基への様々な蛍光分子のＮＨＳ−誘導体（表２を参照）の結合は、５０ ｍＭ　 ＣＡＰＳ緩衝液（ ｐＨ１０．５）中で、アミノアシル・ｔＲＮＡｌｙｓ（２５ μｌ）に蛍光試薬（最終濃度＝２ ｍＭ）を加えて０℃で１０分インキュベートすることにより行い、反応はリジン（最終濃度＝１００ ｍＭ）の添加により消光した。修飾ｔＲＮＡをエタノールで沈降して、さらにペレットをリボヌクレアーゼフリー・ウオーター　５０μｌに溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過カラム（０．５ × ５ ｃｍ）を通過させて、遊離蛍光試薬が残っている場合は、これを除去した。修飾ｔＲＮＡは、自然解凍を避けるために少量のアリコートにして凍結保存（−７０℃）した。アミノアシル・ｔＲＮＡの修飾度は、酸‐尿素ゲル電気泳動（Ｖａｒｓｈｎｅｙ， Ｕ．， Ｌｅｅ， Ｃ．Ｐ． 及びＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ， Ｕ．Ｌ．、 １９９１ Ｊ． Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ ２６６， ２４７１２〜２４７１８）により評価された。
【０２５１】
２．原核性（Ｅ． ｃｏｌｉ）翻訳抽出物におけるタンパク質の無細胞合成
典型的な翻訳反応混合物（１０ μｌ）は、Ｅ． ｃｏｌｉ 抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＷＩ）を３μｌ 、プレミックスを４ μｌ 、 アミノ酸ミックス（１ ｍＭ）を１μｌ 、３０ ｐＭ　蛍光リジン・ｔＲＮＡ 、αヘモリジン（αＨＬ）プラズミドＤＮＡを０．５ μｇ含んだ。プレミックス（１×）は、５７ ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．２）、３６ ｍＭ　酢酸アンモニウム、２１０ ｍＭ　グルタミン酸カリウム、１．７ ｍＭ ＤＴＴ、４％ ＰＥＧ ８０００、１．２５ ｍＭ ＡＴＰ、０．８ ｍＭ ＧＴＰ、０．８ ｍＭ ＣＴＰ、６０ ｍＭ　ホスホエノールピルビン酸、０．６ ｍＭ ｃＡＭＰ、及び６ ｍＭ酢酸マグネシウムを含む。翻訳反応は、３７℃で４５分進行させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、反応ミックスのアリコート　４〜１０ μｌを、５容積アセトンで沈降させ、さらに沈殿したタンパク質を遠心分離により収集した。ペレットは、１×ローディングバッファーに溶解して、５分間煮沸後ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉ（（Ｌａｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ． １９７０、 Ｎａｔｕｒｅ， ２２７、 ６８０〜６８５）に従って行った。
【０２５２】
３．真核性（ＴｎＴコムギ胚芽）翻訳抽出物における無細胞合成
典型的な翻訳反応混合物（１０ μｌ）は、ＴｎＴコムギ胚芽抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ）を５μｌ 、ＴｎＴ反応緩衝液を０．４ μｌ、アミノ酸ミックス（１ ｍＭ）を１μｌ 、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを０．２ μｌ、３０ ｐＭ　蛍光リジン・ｔＲＮＡ、 及びルシフェラーゼＲＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を０．５ μｇ、さらにリボヌクレアーゼフリー・ウオーターを含んだ。翻訳反応は、３７℃で４５分進行させ、不溶性物質を除去するために反応混合物を５分遠心分離した。清澄抽出物を次に５容積アセトンで沈降させ、さらに沈殿したタンパク質を遠心分離により収集した。ペレットは、１×ローディングバッファーに溶解して、５分間煮沸後ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉ（（Ｌａｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ． １９７０、 Ｎａｔｕｒｅ， ２２７、 ６８０〜６８５）に従って行った。
【０２５３】
４．新生タンパク質の検出
新生タンパク質を含むゲルは、アルゴンレーザー（４８８ ｎｍ）を励起源として、ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ５９５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を使用してスキャンし、さらにポリアクリルアミドゲル内の新生タンパク質は、ＵＶトランスイルミネーターを使用して検出し、Ｔｉｆｆｅｎ緑色フィルターを装備したポラロイドカメラ（Ｐｏｌａｒｏｉｄ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を使って、写真撮影を行った。図２６Ａ及び２６Ｂは、様々な蛍光ｔＲＮＡｌｙｓの存在において生産されるα−ＨＬのインビトロ翻訳の結果を示す。この結果から、ＮＢＤ、フルオレセイン誘導体等のような色素を含む、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡ（フルオロフォア修飾リジン・ｔＲＮＡｌｙｓ）を使用して新生タンパク質中に様々な蛍光分子を取り込むことができることは明白である　（レーン１：ＤＮＡを含まない対照；レーン２：ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥ（４，４‐ジフルオロ‐５，７‐ジメチル‐４‐ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセンプロピオン酸、スルホスクシンイミジルエステル）；レーン３：ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＥ（４‐ジフルオロ‐５，７‐ジメチル‐４ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセンプロピオン酸、スクシンイミジルエステル）；レーン４：ＮＢＤ−Ｘ−ＳＥ（スクシンイミジル６‐（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジメチル−４−ｙｌ）アミノヘキサン酸塩；レーン５：ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ−ＳＥ（（６−９９４，４−ジフロロ−１，３−ジメチル−５−（４−メトキシフェニル）−４−ボラ−３ａ， ４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−２−プロピオニル） アミノ） ヘキサン酸、 スクシンイミジルエステル；レーン６：ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ−ＳＥ（（４，４−ジフロロ−５−フェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３プロピオン酸、スクシンイミジルエステル）；レーン７：ＦＡＭ−ＳＥ （５−（６−）−カルボキシフルオレセイン、 スクシンイミジルエステル）；レーン８：ＳＦＸ−ＳＥ （６−フルオレセイン−５−（ａｎｄ ６−）カルボキシアミド）ヘキサン酸、 スクシンイミジルエステル）；レーン９：ＰｙＭＰＯ−ＳＥ（１−（３−（スクシンイミジルオキシカルボニル）ベンジル）−４−（５−（４−メトキシフェニル）オキサゾール−２−ｙｌ）臭化ピリジニニウム（ＰｙＭＰＯ））；及びレーン１０：ＴＡＭＲＡ−ＳＥ （６−（テトラメチルローダミン−５−（ａｎｄ−６）−カルボキシアミド）ヘキサン酸、 スクシンイミジルエステル）。
【０２５４】
［実施例　１９］：クマリンのＮＨＳ誘導体
２種類のＢＯＤＩＰＹ分子（すなわち、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥ と ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＥ）について上記の結果が得られたため、取り込みに適するように他のマーカーを誘導体化する試みが行われた。本実施例は、１）標識ｔＲＮＡの調製、２）翻訳、及び３）標識（またはマーカー）を含む新生タンパク質の検出を含む。
【０２５５】
１．蛍光標識ミスアミノアシル・ ｔＲＮＡｆｍｅｔの調製
精製ｔＲＮＡｆｍｅｔ  （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）をまずにメチオニンでアミノアシル化した。典型的なアミノアシル化反応（１００ μｌ）は、１５００ ｐＭ （約１．０ ＯＤ２６０）　ｔＲＮＡ、２０ ｍＭ イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、１０ ｍＭ 　ＭｇＣｌ２、１ ｍＭ　 リジン、２ ｍＭ　 ＡＴＰ、１５０ ｍＭ　 ＮａＣｌ 及び 過剰量のアミノアシル・ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｓｉｇｍａ）を含んだ。反応混合物を３７℃で４５分インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物に０．１容積の３ Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ　５．０）を添加して中和し、クロロホルム：酸フェノール抽出（１：１）を行った。エタノール（２．５容積）を水相に添加し、得られたｔＲＮＡペレットを水に溶解した（２５ μｌ）。クマリンのＮＨＳ誘導体［要するに、スルホスクシンイミジル７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸 ［１］ （ＡＭＣＡ−ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ； Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、 Ａｌｅｘａ ３５０−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジルエステル （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ） 及び スクシンイミジル ７−ａメチル−アミノ−酢酸クマリン （ＡＭＣＡ−ＮＨＳ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）］のメチオニンのα−アミノ基への結合は、５０ ｍＭ　重炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ　８．５）中で、アミノアシル・ｔＲＮＡ ｆｍｅｔ （２５ μｌ）に蛍光試薬（最終濃度＝２ ｍＭ）を加えて０℃で１０分インキュベートすることにより行い、反応は遊離リジン（最終濃度＝１００ ｍＭ）の添加により消光した。ＡＭＣＡ−ＮＨＳの場合は、試薬はＤＭＳＯに溶解され、結合反応は、４０％ＤＭＳＯの存在下で行われた。修飾ｔＲＮＡをエタノールで沈降して、をリボヌクレアーゼフリー・ウオーター　５０μｌに溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過カラム（０．５ × ５ ｃｍ）を通過させて、遊離蛍光試薬が残っている場合は、これを除去した。修飾ｔＲＮＡは、自然解凍を避けるために少量のアリコートにして凍結保存（−７０℃）した。アミノアシル・ｔＲＮＡの修飾度は、酸‐尿素ゲル電気泳動（Ｖａｒｓｈｎｅｙ， Ｕ．， Ｌｅｅ， Ｃ．Ｐ． 及びＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ， Ｕ．Ｌ．、 １９９１ Ｊ． Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ ２６６， ２４７１２〜２４７１８）により評価された。
【０２５６】
２．原核性（Ｅ． ｃｏｌｉ）翻訳抽出物におけるタンパク質の無細胞合成
典型的な翻訳反応混合物（１０ μｌ）は、Ｅ． ｃｏｌｉ Ｓ−３０抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＷＩ）を３μｌ 、プレミックスを４ μｌ 、 アミノ酸ミックス（１ ｍＭ）を１μｌ 、３０ ｐＭ　蛍光メチオニン・ｔＲＮＡ 、及びαヘモリジン（α−ＨＬ）プラズミドＤＮＡを０．５ μｇ を含んだ。プレミックス（１×）は、５７ ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．２）、３６ ｍＭ　酢酸アンモニウム、２１０ ｍＭ　グルタミン酸カリウム、１．７ ｍＭ ＤＴＴ、４％ ＰＥＧ ８０００、１．２５ ｍＭ ＡＴＰ、０．８ ｍＭ ＧＴＰ、０．８ ｍＭ ＵＴＰ、０．８ ｍＭ ＣＴＰ、 ６０ ｍＭ　ホスホエノールピルビン酸、０．６ ｍＭ ｃＡＭＰ、及び６ ｍＭ酢酸マグネシウムを含む。翻訳反応は、３７℃で４５分進行させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥには、反応ミックスのアリコート　４〜１０ μｌを、５容積アセトンで沈降させ、さらに沈殿したタンパク質を遠心分離により収集した。ペレットは、１×ローディングバッファーに溶解して、５分間煮沸後ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ． １９７０、 Ｎａｔｕｒｅ， ２７７、 ６８０〜６８５）に従って行った。
【０２５７】
３．新生タンパク質の検出
新生タンパク質を含むゲルは、長波長用ＵＶ電球（＞３００ ｎｍ ）を装備したＵＶトランスイルミネーターを使用して目視観察し、Ｔｉｆｆｅｎ緑色フィルターを装備したポラロイドカメラ（Ｐｏｌａｒｏｉｄ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）を使って写真撮影を行った。図２７は、様々な蛍光ｔＲＮＡの存在において生産されたα−ＨＬのインビトロ翻訳の結果を示す（レーン１は、ＤＮＡを含まない対照を示し；レーン２は、ＡＭＣＡ−ＮＨＳで修飾されたメチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔ による結果を示し；レーン３は、ＡＭＣＡ−スルホ−ＮＨＳで修飾されたメチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔ による結果を示し；さらにレーン４は、Ａｌｅｘａ−ＮＨＳで修飾されたメチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔ による結果を示す）。明らかに、蛍光分子の水溶性ＮＨＳエステル（レーン３）によって修飾されたミスアミノアシル・ｔＲＮＡを使用して、新生タンパク質中にクマリン誘導体分子を取り込むことができる。さらに、負の電荷を有する色素（Ａｌｅｘａ、レーン４）は、その中性対（ＡＭＣＡ；レーン３）のようには取り込まないように思われる。
【０２５８】
上記の結果及び本明細書による一般的教示より、当業者は、その他のマーカーを選択して、本発明による方法に従って、これを取り込みに適応する（例えば、化学的処理により）ことが可能である。
［実施例　２０］：毛管電気泳動
この実施例は、易動度シフトによるインビトロ合成蛍光タンパク質の検出のための毛管電気泳動（ＣＥ）の用途について説明する。この実施例は、１）ＢＯＤＩＰＹマーカーを含むｔＲＮＡの調製、２）インビトロ翻訳、３）精製、４）プロテアーゼ消化、及び５）易動度シフトアッセイによる検出を説明する。
【０２５９】
１．ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−メチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔの調製
精製ｔＲＮＡｆｍｅｔ をまずメチオニンでアミノアシル化した。典型的な反応では、１５００ ｐＭ （〜１．０ ＯＤ２６０）のｔＲＮＡを過剰量のアミノアシル・ｔＲＮＡシンテターゼを使用して、アミノアシル化ミックス中、３７℃で４５分インキュベートした。アミノアシル化ミックスは、２０ ｍＭ イミダゾール・塩酸緩衝液（ ｐＨ ７．５）、 １５０ ｍＭ ＮａＣｌ、 １０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、 ２ ｍＭ 　ＡＴＰ 及び １６００ ユニットのアミノアシル・ｔＲＮＡシンテターゼを含んだ。アミノアシル化度は、酸‐尿素ゲル、さらに３５Ｓ‐メチオニンを使用することにより測定された。インキュベーション後、混合物に０．１容積の３ Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）を添加して中和し、クロロホルム：酸フェノール抽出（１：１）を行った。エタノール（２．５容積）を水相に添加し、得られたｔＲＮＡペレットを水に溶解して（３７．５ μｌ）、修飾に使用した。上記のアミノアシル・ｔＲＮＡ溶液に、１Ｎ ＮａＨＣＯ３　２．５ μｌを加え（最終濃度＝５０ ｍＭ、ｐＨ ８．５）、次に水中で１０ ｍＭ　ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥ溶液　１０ μｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を加えた。混合物を０℃で１０分インキュベートして、リジンを添加して反応を消光した（最終濃度＝１００ ｍＭ）。結果生じた溶液に、０．１容積の３ Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ ５．０）を加えて、修飾ｔＲＮＡを３容積のエタノールで沈降した。沈降物を５０ｕｌ の水に溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過コラム（０．５ × ５ ｃｍ）で精製して、遊離蛍光試薬が残っている場合は、これを除去した。修飾ｔＲＮＡは、自然解凍を避けるために少量のアリコートにして凍結保存（−７０℃）した。
【０２６０】
２．α−ヘモリジン ＤＮＡのインビトロ翻訳
５００ ｕｌの翻訳反応は、Ｅ． ｃｏｌｉ 抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＷＩ）を１５０ ｕｌ 、アミノ酸を含まないプレミックスを２００ ｕｌ 、 アミノ酸混合物（１ ｍＭ）を５０ ｕｌ 、α−ＨＬ をコードするプラズミドＤＮＡを２５ ｕｇ 、１０００ ｐＭのＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−メチオニン・ｔＲＮＡｆｍｅｔ 及びリボヌクレアーゼフリー・ウオーターを含んだ。プレミックス（１×）は、５７ ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ ８．２）、３６ ｍＭ　酢酸アンモニウム、２１０ ｍＭ　グルタミン酸カリウム、１．７ ｍＭ ＤＴＴ、４％ ＰＥＧ ８０００、１．２５ ｍＭ 　ＡＴＰ、０．８ ｍＭ　 ＧＴＰ、０．８ ｍＭ ＵＴＰ、０．８ ｍＭ　 ＣＴＰ、 ６０ ｍＭ　ホスホエノールピルビン酸、０．６ ｍＭ ｃＡＭＰ、及び１６ ｍＭ酢酸マグネシウムを含む。翻訳反応プレミックスから、ｎ‐ホルミル‐テトラヒドロ葉酸塩（ｆＴＨＦ）を省いた。翻訳は、３７℃で１時間行われた。ＤＮＡを含まずにインキュベートされた翻訳反応混合物を対照とする。
【０２６１】
３． Ｈｌｓ−６−α−ＨＬの精製
５００ μｌの翻訳反応混合物（上記ステップ２を参照）を、Ｈｌｓ−６−α−ＨＬ精製のために、Ｔａｌｏｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ （ＣｌｏｎＴｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）クロマトグラフィーにかけた。これは粗抽出物を、１５０ ｍＭ ＮａＣＩ を含む５０ ｍＭ トリス・塩酸（ ｐＨ ８．０ ）で予め平衡化したＴａｌｏｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ カラムに装填し、さらに非結合タンパク質を除去するためにカラムを洗浄することにより行った。結合タンパク質は次に上記緩衝液中で１００ ｍＭイミダゾールを加えることにより溶出された。溶出されたα−ＨＬは、５０ ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）に対して透析された。精製かつ透析したαＨＬの蛍光をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ Ｆ５９５でチェックした。
【０２６２】
４．プロテアーゼ消化
精製蛍光標識α−ＨＬ （〜５ ｕｇ）（上記ステップ３を参照）を、５０ ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）中で、純正トリプシン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）０．１ ｕｇを加えて（５０：１；タンパク質：プロテアーゼ比）、室温で１０分インキュベートした。タンパク質分解反応は、１Ｘ ＣＥＳＤＳゲルローディングバッファーを加えて試料を１０分煮沸することにより停止された。
【０２６３】
５．易動度シフトアッセイ
ＳＤＳ−毛管電気泳動（ＳＤＳ−ＣＧＥ）は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＢｉｏＦｏｃｕｓ ３０００ＣＥシステムを使用して実施した。毛管は、内径７５ ｕｍ、全長２４ ｃｍ、及び検出器までの長さ１９．５ ｃｍの溶融シリカ製であった。蛍光標識タンパク質試料（α−ＨＬ）　５０μｌを、ＳＤＳ−ＣＧＥ試料ローディングバッファーを加えて混合し、９５℃で１０分インキュベートした。毛管は、各注入前に、０．１ Ｍ ＮａＯＨ、 ０．１ Ｍ ＨＣｌ 及び ＳＤＳ−ランバッファー で、それぞれ６０、 ６０ 及び１２０秒洗浄した。試料は電気泳動注入（１０ ｋＶで２０秒）を使用して注入した。分離は１５ ｋＶ （定圧）で２５分行った。毛管及び試料は２０℃で維持した。試料の検出は、４８８ ｎｍアルゴンレーザー及び５２０ ｎｍ発光フィルターを使用して行った。
【０２６４】
ＳＤＳ−ＣＧＥの結果を図２８に示す。図に見られるように、蛍光標識α−ＨＬは、電気泳動条件下で２４分付近で溶出される主要な種として移動する（上部パネル）。さらに、電気泳動図はまた試料中に存在する微量の不純物の存在を示し、これらは１７及び２０．５分付近で溶出される。蛍光標識α−ＨＬ試料をトリプシン処理して、ＳＤＳ−ＣＧＥを使用して分析すると、早期（１３、１４、及び１５分）に溶出するピークと２１分に主要ピークを示した（下部パネル）。この結果は、α−ＨＬがトリプシンによりタンパク質分解されて、Ｎ末端が蛍光標識された様々なタンパク質分解フラグメントが電気泳動図に観察されることを示した。
【０２６５】
［実施例　２１］：ヘモリジンへの３マーカーの取り込み
これは、ミスアミノアシル・ｔＲＮＡを使用して取り込まれるマーカーと共に、Ｎ及びＣ末端マーカーが取り込まれるような条件下でインビトロでタンパク質が生産される実例である。実施例は、１）Ｎ末端及びＣ末端検出マーカーを有するプライマーによるＰＣＲ、２）ｔＲＮＡの調製、３）インビトロ翻訳、４）新生タンパク質の検出を含む。
【０２６６】
１．α−ヘモリジンＤＮＡのＰＣＲ
α−ヘモリジン、ｐＴ７−ＷＴ−Ｈ６−αＨＬのプラズミドＤＮＡを、以下のプライマーを使用して、ＰＣＲ増幅した。
フォワードプライマー（ＨＬ−５）は：
【０２６７】
【数１】
2004513604.tif 000005
リバースプライマー（ＨＬ−３）は：
【０２６８】
【数２】
2004513604.tif 000006
である。
フォワードプライマーにおける下線配列は、Ｔ７プロモーター、太字領域は、リボソーム結合部位（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）、太字及び下線配列は、Ｃ−ｍｙｃエピトープを含み、イタリック体で示されるヌクレオチドは、α−ヘモリジン配列の相補領域である。リバースプライマーでは、下線配列は、ＨｉｓＸエピトープ配列に対応する。１００ ｕｌのＰＣＲ反応混合物は、鋳型ＤＮＡを１００ ｎｇ、０．５ ｕＭ　各プライマー、１ ｍＭ　 ＭｇＣｌ２、ＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ， ＣＡ）を５０ ｕｌ、及びヌクレアーゼフリー・ウオーター（Ｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）水を含んだ。ＰＣＲは、ホットリドを取り付けたＨｙｂａｉｄ Ｏｍｎｉ−Ｅ ｔｈｅｒｍｏｃｙｌｅｒ （Ｈｙｂａｉｄ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ， ＭＡ）を使用して、以下の条件で行われた：９５℃（２ 分）の後、９５℃（１分）、６１℃（１分）、及び７２℃（２分）から成るサイクルを３５回繰り返し、最終伸長は７２℃で７分行った。ＰＣＲ産物を次に、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ クリーンアップキット （Ｑｉａｇｅｎ， ＣＡ）を使用して精製した。精製ＰＣＲ　ＤＮＡは、翻訳反応に使用された。
【０２６９】
２． ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−リジン・ｔＲＮＡｌｙｓの調製
精製ｔＲＮＡｌｙｓ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）をまずにリジンでアミノアシル化した。典型的なアミノアシル化反応は、１５００ ｐＭ （〜１．０ ＯＤ２６０）　ｔＲＮＡ、２０ ｍＭ イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、１０ ｍＭ 　ＭｇＣｌ２、１ ｍＭ　 リジン、２ ｍＭ　 ＡＴＰ、１５０ ｍＭ　 ＮａＣｌ 及び過剰量のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍ）を含んだ。反応混合物を３７℃で４５分インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物に０．１容積の３ Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ　５．０）を添加して中和し、クロロホルム：酸フェノール抽出（１：１）を行った。エタノール（２．５容積）を水相に添加し、得られたｔＲＮＡペレットを水に溶解した（３５ μｌ）。この溶液に、０．５ Ｍ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ １０．５）　５ ｕｌを加えて（最終濃度　５０ ｍＭ）、その後１０ ｍＭ　ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥ溶液　１０ ｕｌを加えた。混合物を０℃で１０分インキュベートして、リジンを添加して反応を消光した（最終濃度＝１００ ｍＭ）。結果生じた溶液に、０．１容積の３ Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ ５．０）を加えて、修飾ｔＲＮＡを３容積のエタノールで沈降した。沈降物を５０ｕｌ の水に溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過コラム（０．５ × ５ ｃｍ）で精製して、遊離蛍光試薬が残っている場合は、これを除去した。修飾ｔＲＮＡは、自然解凍を避けるために少量のアリコートにして凍結保存（−７０℃）した。アミノアシルｔＲＮＡの修飾度は、酸‐尿素ゲル電気泳動によって評価した。Ｖａｒｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２４７１２〜２４７１８ （１９９１）。
【０２７０】
３．真核性（コムギ胚芽）翻訳抽出物におけるタンパク質の無細胞合成
典型的な翻訳反応混合物（２０ μｌ）は、ＴｎＴコムギ胚芽抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ ）を１０μｌ 、ＴｎＴ反応緩衝液を０．８ μｌ、アミノ酸ミックス（１ ｍＭ）を２μｌ 、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを１ μｌ、３０ ｐＭ　 ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ｌリジン・ｔＲＮＡｌｙｓ、プラズミドまたはＰＣＲ ＤＮＡ（実施例１）を１〜２ ｕｇ、さらにリボヌクレアーゼフリー・ウオーター水を含んだ。翻訳反応は、３７℃で６０分進行させ、不溶性物質を除去するために反応混合物を５分遠心分離した。清澄抽出物を次に５容積アセトンで沈降させ、さらに沈殿したタンパク質を遠心分離により収集した。ペレットは、１×ローディングバッファーに溶解して、５分間煮沸後ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｎａｔｕｒｅ、 ２２７： ６８０〜６８５に従って行った。
【０２７１】
４．新生タンパク質の検出
電気泳動後、ゲルを、励起源としてアルゴンレーザーを備えるＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ５９５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｍａｎｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を使用してスキャンした。ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識新生タンパク質の可視化には、最大励起に最も近値であるために励起源として４８８ ｎｍを使用し、発光には、５３０＋／−３０フィルタを使用した。ゲルは、ＰＭＴ 電圧 １０００ Ｖ、さらに１００または２００ミクロンピクセルサイズのいずれかを使用してスキャンした。
【０２７２】
結果を図２９に示す。図から、所望するマーカーを含むＰＣＲ ＤＮＡからタンパク質をインビトロで生産し得ることが理解できる。この実施例の場合は、タンパク質（α−ヘモリジン）は、Ｎ末端にＣ−ｍｙｃエピトープを有し、さらにＣ末端にＨｉｓＸ６エピトープを有する。さらに、蛍光レポーター分子であるＢＯＤＩＰＹ−ＦＬは、タンパク質中に取り込まれる。レーン１：α−ヘモリジンプラズミドＤＮＡ対照；レーン２：ＤＮＡを含まない対照；レーン３：ＰＣＲ α−ヘモリジンＤＮＡ及びレーン４：ヘモリジンアンバー１３５ＤＮＡ。全てのレーンにおいて上部（Ｔ）及び下部（Ｂ）バンドは、コムギ胚芽抽出物中にあるいくつかのタンパク質、及び翻訳反応に存在する遊離蛍光ｔＲＮＡと蛍光ｔＲＮＡとのそれぞれ非特異的結合に由来する。
【０２７３】
［実施例　２２］：プライマーデザイン
本発明を特定のプライマーに限定することは意図していない。新生タンパク質中に究極的にマーカーを取り込む目的で、本発明において使用するために、（上記の説明のように）様々なプライマーが考案されている。この実施例は、１）マーカーを有するプライマーによるＰＣＲ、２）インビトロ翻訳、及び３）新生タンパク質の検出を含む。
【０２７４】
ＰＣＲには、以下のプライマーが使用された：
フォワードプライマー：
【０２７５】
【数３】
2004513604.tif 000007
リバースプライマー：
【０２７６】
【数４】
2004513604.tif 000008
フォワードプライマーにおける下線配列は、Ｔ７プロモーター、太字及び下線配列は、Ｃ−ｍｙｃエピトープを含み、イタリック体で示されるヌクレオチドは、α−ヘモリジン配列の相補領域である。リバースプライマーでは、太字配列は、Ｈｉｓ−６エピトープに対応し、下線配列は、α−ヘモリジン配列の相補領域に対応する。１００ ｕｌのＰＣＲ反応混合物は、１００ ｎｇの鋳型ＤＮＡ　、０．５ ｕＭ　各プライマー、１ ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ ｕｌのＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ， ＣＡ）及びヌクレアーゼフリー・ウオーター（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）水を含んだ。ＰＣＲは、ホットリドを取り付けたＨｙｂａｉｄ Ｏｍｎｉ−Ｅ ｔｈｅｒｍｏｃｙｌｅｒ （Ｈｙｂａｉｄ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ， ＭＡ）を使用して、以下の条件で行われた：９５℃（２ 分）の後、９５℃（１分）、６１℃（１分）、及び７２℃（２分）から成るサイクルを３５回繰り返し、最終伸長は７２℃で７分行った。ＰＣＲ産物を次に、Ｑｉａｇｅｎ ＰＣＲ クリーンアップキット （Ｑｉａｇｅｎ， ＣＡ）を使用して精製した。精製ＰＣＲ ＤＮＡは次に様々な翻訳反応に使用し得る。検出は上記に説明されたように行うことができる。
【０２７７】
結局、本発明は、特定の所望するエピトープに基づいて様々なプライマーデザインを考案する（エピトープの例示リストについては表４を参照のこと）。一般的に、エピトープはＮ末端またはＣ末端として挿入し得る。さらに、エピトープは、タンパク質中にアフィニティー領域（すなわち、抗体または他のリガンドと結合する領域）を導入するためにも使用し得る。
【０２７８】
［実施例　２３］：プライマーをコードするエピトープの抗体検出
これは、アフィニティー領域がタンパク質中に取り込まれその後に検出されるような条件下でインビトロでタンパク質が生産される実例である。実施例は、１）エピトープをコードする配列を含むプライマーによるＰＣＲ、２）ｔＲＮＡの調製、３）インビトロ翻訳、４）新生タンパク質の検出を含む。
【０２７９】
１．プライマーをコードするエピトープによるＰＣＲ
ヒト結腸由来の全ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）に、ＣｌｏｎＴｅｃｈ ＲＴ−ＰＣＲ キットを使用して、ワンステップＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。フォワードプライマー、ＰＴＴ−Ｔ７−Ｐ５３は、
【０２８０】
【数５】
2004513604.tif 000009
で、リバースプライマー、Ｍｙｃ−Ｐ５３−３’は、
【０２８１】
【数６】
2004513604.tif 000010
であった。フォワードプライマーにおける下線配列は、Ｔ７プロモーター、イタリック体で示されるヌクレオチドは、Ｈｉｓ−６タグに対応し、太字の配列は、ＦＬＡＧ−エピトープをコードし、残りのプライマーは、Ｐ５３ ＤＮＡの相補領域である。リバースプライマーでは、下線配列は、ｃ−Ｍｙｃエピトープ配列に対応する。
【０２８２】
５０μｌのＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲ反応混合物は、全ヒト結腸ＲＮＡを１μｇ、０．５μＭ　各プライマー、ＲＴ−ＰＣＲマスターミックス（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）を４３．５μｌ、及びヌクレアーゼフリー・ウオーター（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）水を含んだＲＴ−ＰＣＲ／ＰＣＲは、ＰＴＣ−１５０ ｔｈｅｒｍｏｃｙｌｅｒ （ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ）で、以下の条件を使用して行った：５０℃（１時間）、９５℃（５分）の後、９５℃（４５秒）、６０℃（１分）、及び７０℃（２分）から成るサイクルを４０回繰り返し、最終伸長を７０℃で７分行った。ＰＣＲ産物は、１％アガロースゲルで分析して、ＰＣＲ増幅ＤＮＡは、さらに精製することなく翻訳反応に使用された。Ｐ５３の人工Ｃ末端トランケート型突然変異体は、リバースプライマー、３’−Ｐ５３−Ｍｕｔが
【０２８３】
【数７】
2004513604.tif 000011
である以外は、上記の説明と全く同じ手順を使用して調製された。
２．ｔＲＮＡ 標識
精製ｔＲＮＡｌｙｓ （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）をまずにリジンでアミノアシル化した。典型的なアミノアシル化反応（１００ μｌ）は、１５００ ｐＭ （−１．０ ＯＤ２６０）　ｔＲＮＡ、２０ ｍＭ イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、１０ ｍＭ 　ＭｇＣｌ２、１ ｍＭ　 リジン、２ ｍＭ　 ＡＴＰ、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ 及び過剰量のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｓｉｇｍａ）を含んだ。反応混合物を３７℃で４５分インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物に０．１容積の３ Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ　５．０）を添加して中和し、クロロホルム：酸フェノール抽出（１：１）を行った。エタノール（２．５容積）を水相に添加し、得られたｔＲＮＡペレットを水に溶解した（３５ μｌ）。この溶液に、０．５ Ｍ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ １０．５）を５ ｕｌ加えて（最終濃度　５０ ｍＭ）、その後１０ ｍＭ　ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥ溶液を１０ ｕｌ加えた。混合物を０℃で１０分インキュベートして、リジンを添加して反応を消光した（最終濃度＝１００ ｍＭ）。結果生じた溶液に、０．１容積の３ Ｍ ＮＡＯＡｃ（ｐＨ ５．０）を加えて、修飾ｔＲＮＡを３容積のエタノールで沈降した。沈降物をリボヌクレアーゼフリー・ウオーター　５０ μｌに溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過コラム（０．５ × ５ ｃｍ）を通過して、遊離蛍光試薬が残っている場合は、これを除去した。修飾ｔＲＮＡは、自然解凍を避けるために少量のアリコートにして凍結保存（−７０℃）した。アミノアシルｔＲＮＡの修飾度は、酸‐尿素ゲル電気泳動 ［Ｖａｒｓｈｎｅｙ， Ｕ．， Ｌｅｅ， Ｃ．Ｐ． 及びＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ， Ｕ．Ｌ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ． ２６６， ２４７１２〜２４７１８（１９９１）、またはＨＰＬＣ［Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７９：２１８〜２２５ （２０００）］ により評価された。
【０２８４】
３．翻訳
Ｐ５３ ＤＮＡの翻訳（上記ステップ１を参照）は、蛍光ｔＲＮＡの存在下（上記ステップ２）、ウサギ網状赤血球翻訳抽出物中で行われた。
４．検出
いったん翻訳が終了したら、アリコート（５μｌ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて、Ｆｌｕｏｒｌｍａｇｅｒ ＳＩ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を使用して、新生タンパク質を目視観察した。目視観察後、ゲルをトランスファーバッファー（１２ ｍＭ トリス、 １００ ｍＭ グリシン 及び０．０１ ％ ＳＤＳ、 ｐＨ ８．５）中に１０分浸した。ゲルからのタンパク質は、次に標準ウェスタンブロッティング・プロトコルにより、ＢｉｏＲａｄ液浸トランスファーユニットを１時間使用して、ＰＶＤＦ膜に転移された。転移後、次に転移量をチェックするために、膜をフェロジン（Ｆｅｒｒｏｚｉｎｅ）／鉄全タンパク質染色を使用して、１分逆染色し、その後、アンバーブロッキング溶液（トリス緩衝生理食塩水（ｐＨ ７．５）中、４．５％　（容量／容量） ｔｅｌｅｏｓｔｅａｎゼラチン、２％　（重量／容量）脱脂粉乳末、０．１％ （重量／容量） Ｔｗｅｅｎ−２０）を使って２時間ブロックして、その後適切に希釈した抗体を加えて、（４℃で１２〜１５ 時間、定速シェーカー上で）一晩インキュベートした。Ｆｌａｇ検出には、２０００倍希釈抗Ｆｌａｇ Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ）、Ｈｉｓ−６検出には、５００倍抗Ｈｉｓ６抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ＣＡ）、及びｃ−Ｍｙｃ検出には、５００倍希釈抗Ｃ−Ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ＣＡ）を使用した。
【０２８５】
一次抗体インキュベーション後、膜をＴＢＳＴ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を加えたトリス緩衝生理食塩水、ｐＨ ７．５）で４回（各１０分洗浄）洗浄し、適切に希釈した二次抗体（１０，０００倍希釈）を加えて、定速シェーカー上、室温で１時間インキュベートした。非結合二次抗体は、ＴＢＳＴで（４洗浄／各１０分）洗浄され、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ化学ルミネッセンス検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ＮＪ）を使用して、ブロットを目視観察した。
【０２８６】
結果は図３０Ａ及び３０Ｂに示す。図３０Ａは、ＤＮＡ欠如ネガティブ対照及びｐ５３ＤＮＡを加えた試料をそれぞれ含む、３複写ブロットのゲルからのタンパク質転移後のＰＶＤＦ膜の全タンパク質染色を示す。図３０Ｂは、標準化学ルミネッセントウェスタンブロット法を使用して、３エピトープタグに対する抗体を使用してプローブされた同一ブロット（全タンパク質染色は可逆性がある）を示す。矢印は、ｐ５３の位置を示す。
【０２８７】
［実施例　２４］：　ガン遺伝子用ゲルベースＰＴＴ
タンパク質におけるトランケート型突然変異の検出は、Ｒｏｅｓｔと共同研究者らにより始めて報告され、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、 Ｋｉｎｚｌｅｒ及び共同研究者らにより、ＡＰＣ遺伝子におけるトランケート型突然変異の検出に応用された。翻訳タンパク質におけるトランケーションは、フレームシフト、スプライシング、及び点突然変異によって起こり、その結果、遺伝子のリーディングフレーム内における終止コドンの出現を生じる。トランケート型ポリペプチドは、放射線標識（例：３５Ｓ−メチオニン）が存在するインビトロ系においてターゲット遺伝子に対応するＤＮＡの特異的領域を翻訳し、さらに標準ＰＡＧＥ法を使用して結果生じたポリペプチドを分析することによって検出し得る。そのようなアプローチは、ＢＲＣＡ１／ＢＲＣＡ２、 ＡＴＭ、ＭＨＳ２、 ＭＬＨ１を含む様々なガン関連遺伝子におけるトランケート型突然変異分析について報告されている。しかし、放射性アイソトープの使用は、検出に必要とされる時間（５時間以上）の点から問題があり、これは、高スループット分析には重大である。この理由で、放射能を検出のためのより迅速な手段に置き換えることは非常に好都合であろう。
【０２８８】
この実施例では、Ｎ末端タグの使用に基づく迅速トランケーション分析の可能性を実証する。本発明は、臨床的意義を持つ広範囲の遺伝子におけるトランケーション突然変異をスクリーンするための、便利で、正確かつ迅速な方法を供給する。実施例は、１）ＡＰＣ遺伝子に相補性である配列を有するプライマーによるＰＣＲ、２）ｔＲＮＡの調製、３）インビトロ翻訳、４）新生タンパク質の検出を含む。
【０２８９】
１．臨床試料のＰＣＲ
臨床試料は、常染色体優性ガン症候群である家族性腺腫性ポリープ症（ＦＡＰ）の特徴である、ＡＰＣ遺伝子における鎖トランケーションについてのスクリーニングのために、ワシントン大学分子診断学検査室から付託された。ゲノムＤＮＡを分離して、ＡＰＣ遺伝子の特定領域（エクソン１５−セグメント２）が、まずＴ７プロモーターとＫｏｚａｋ配列をＤＮＡ中に取り込んだプライマーを使用して、ＰＣＲにより増幅した。フォワードプライマー、Ｔ７−ＡＰＣ２は、
【０２９０】
【数８】
2004513604.tif 000012
で、リバースプライマー、３’−ＡＰＣ２は、
【０２９１】
【数９】
2004513604.tif 000013
であった。フォワードプライマーにおける下線配列は、Ｔ７プロモーターであり、イタリック体で示す配列は、効率的な真核性翻訳開始に必要であるＫｏｚａｋ配列に対応する。５０ μｌのＰＣＲ反応混合物は、２００〜５００ ｎｇの　鋳型ＤＮＡ（ＷＴまたは突然変異体）　、０．５μＭ　各プライマー、及び２５μｌ のＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ， ＣＡ）、さらにヌクレアーゼフリー・ウオーター（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）水を含んだ。ＰＣＲは、ホットリドを取り付けたＨｙｂａｉｄ Ｏｍｎｉ−Ｅ ｔｈｅｒｍｏｃｙｌｅｒ （Ｈｙｂａｉｄ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ， ＭＡ）を使用して、以下の条件で行われた：９５℃（３分）の後、９５℃（４５秒）、５５℃（１分）、及び７２℃（２分）から成るサイクルを４０回繰り返し、最終伸長を７２℃で７分行った。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルで分析して、ＰＣＲ増幅ＤＮＡは、さらに精製することなく翻訳反応に使用された。
【０２９２】
２．ｔＲＮＡの調製
精製ｔＲＮＡｌｙｓ （Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）をまずにリジンでアミノアシル化した。典型的なアミノアシル化反応（１００ μｌ）は、１５００ ｐＭ （−１．０ ＯＤ２６０）　ｔＲＮＡ、２０ ｍＭ イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、１０ ｍＭ 　ＭｇＣｌ２、１ ｍＭ　 リジン、２ ｍＭ　 ＡＴＰ、１５０ ｍＭ　 ＮａＣｌ 及び過剰量のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｓｉｇｍａ）を含んだ。反応混合物を３７℃で４５分インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物に０．１容積の３ Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ　５．０）を添加して中和し、クロロホルム：酸フェノール抽出（１：１）を行った。エタノール（２．５容積）を水相に添加し、得られたｔＲＮＡペレットを水に溶解した（３５ μｌ）。この溶液に、０．５ Ｍ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ １０．５）を５ ｕｌ加えて（最終濃度　５０ ｍＭ）、その後１０ ｍＭ　ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＳＥ溶液を１０ ｕｌ加えた。混合物を０℃で１０分インキュベートして、リジンを添加して反応を消光した（最終濃度＝１００ ｍＭ）。結果生じた溶液に、０．１容積の３ Ｍ ＮＡＯＡｃ（ｐＨ ５．０）を加えて、修飾ｔＲＮＡを３容積のエタノールで沈降した。沈降物をリボヌクレアーゼフリー・ウオーター ５０ μｌに溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過コラム（０．５ × ５ ｃｍ）を通過して、遊離蛍光試薬が残っている場合は、これを除去した。修飾ｔＲＮＡは、自然解凍を避けるために少量のアリコートにして凍結保存（−７０℃）した。アミノアシルｔＲＮＡの修飾度は、酸‐尿素ゲル電気泳動（Ｖａｒｓｈｎｅｙ， Ｕ．， Ｌｅｅ， Ｃ．Ｐ． 及びＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ， Ｕ．Ｌ．、 １９９１ Ｊ． Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ ２６６， ２４７１２〜２４７１８）により評価された。
【０２９３】
３．翻訳
ＰＣＲ産物（上記ステップ１を参照）を精製しないで、ＢＯＤＩＰＹリジン・ｔＲＮＡ （上記ステップ２を参照）もまた含んでいる、Ｐｒｏｍｅｇａウサギ網状赤血球ＴｎＴクイックシステムの少量アリコートに直接に加えた。より詳細には、ＰＣＲ後、０．５ 〜 １μｌのＰＣＲ産物を、ＰＣＲ産物用ウサギ網状赤血球抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ）を８μｌ、１ ｍＭ完全アミノ酸ミックスを０．５μｌ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−リジン・ｔＲＮＡを１μｌ含む翻訳反応混合物に直接に添加した。翻訳反応を１時間進行させ、反応生成物を１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｆｌｕｏｒｌｍａｇｅｒを使用して、画像診断を１〜２分以下で行った。
【０２９４】
４．検出
図３１は、ＡＰＣタンパク質のフラグメント内に蛍光標識を取り込むためにＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−リジン・ｔＲＮＡｌｙｓ を使用した、いくつかの異なるヒトゲノム試料の分析結果を示す。レーン１はＤＮＡ欠如対照である。レーン２は、野生型ＤＮＡの結果を示し、レーン３〜８は、ＦＡＰ（結腸ガン）を罹患する患者から分離された様々な突然変異型ＤＮＡについての結果を示す。最終レーンは、蛍光分子量マーカーである。図３１に示すように、ＷＴ ＤＮＡ（レーン２）は、ＡＰＣ遺伝子フラグメントのセグメント２、正常エクソン１５に対応するバンドを生じる。対照的に、全ての他のレーン（レーン６を除く）は、ＷＴバンド及びエクソン１５‐セグメント２のトランケート型フラグメントに対応する追加バンドを呈示する。従って、これらの個人は異型接合体性であり、ＡＰＣ遺伝子中に１個のＷＴ及び１個の鎖トランケート型突然変異を担っている。対照的に、レーン６の結果は、どちらの遺伝子についても本領域においてＷＴ配列を示す。大学分子診断学検査室が行った、伝統的放射性ＰＡＧＥ法を使用する患者試料の分析によっても、同様な結論が独立して得られた。
【０２９５】
エクソン１５−セグメント３における鎖トランケート型突然変異検出のために、同様な分析が行われた（図３２）。タンパク質は、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−リジン・ｔＲＮＡｌｙｓと併用してインビトロ翻訳系においてウサギ網状赤血球を使用して合成された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離後、翻訳されたタンパク質は、蛍光イメージング（図３２Ａ）、またはＢＯＤＩＰＹフルオロフォアに対するポリクローナル抗体を使用する化学ルミネッセントウェスタンブロッティング法により目視観察された。レーン１はＤＮＡ欠如対照である。レーン２は、ＡＰＣ３野生型ＤＮＡについての結果を示し、レーン３はＡＰＣ３トランケート型突然変異体についての結果を示す。レーン４は、ＡＰＣ２野生型ＤＮＡについての結果を示し、レーン５はＡＰＣ２異型接合体性突然変異体についての結果を示す。
【０２９６】
総合して、これらの結果は、ヒト遺伝性疾患に関連する鎖トランケーションについて、放射性ＰＴＴスクリーニングを、蛍光ベーススクリーニングで置換する可能性を実証する。
［実施例　２５］：　ガン遺伝子用ゲルフリーＰＴＴ
実施例２４（上記）における蛍光標識による放射能の置換は現在のＰＴＴテクノロジーの改良を示すが、未だにハイスループットスクリーニングへの適用が困難であるゲルの使用に依存している。この理由で、この実施例は、化学ルミネッセント検出の使用に基づく非ゲルアプローチを実証する。本アプローチでは、ガン関連タンパク質またはタンパク質由来のポリペプチドフラグメントは、特別にデザインされたプライマーとｔＲＮＡを使用して、Ｎ末端、Ｃ末端及びタンパク質の２端間に取り込まれた異なる検出及び結合タグを有する対応する遺伝子から、インビトロで発現される。検出及び結合タグは、トランケートしているタンパク質分画またはタンパク質フラグメントを定量する手段を供給し、タンパク質の２端間に位置するタグがトランケーション領域を決定するために使用される。例えば、全長タンパク質は、Ｎ及びＣ末端タグの両方を含むが、トランケート型タンパク質はＮ末端タグのみを含む。タンパク質の２端間にあるランダムリジンに取り込まれたタグからのシグナル（鎖内シグナル）は、トランケートフラグメントのサイズに比例して減少するであろう。結合による鎖トランケーションの妨害を回避するために、Ｎ末端に近位にあるマーカーでタンパク質を捕捉することがさらに重要である。
【０２９７】
本方法を評価するために、我々は、ＷＴ配列またはトランケート型突然変異のいずれかを含むＡＰＣ及びｐ５３遺伝子で実験を行った。どちらの場合も、ウサギ網状赤血球システムにおけるインビトロ合成中にターゲットタンパク質に一連のマーカーを取り込むために、プライマーと特別にデザインされたｔＲＮＡの組み合わせを使用した。インビトロ発現後、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート内で、プレートに結合されたアフィニティー因子を使用により、発現タンパク質が捕捉された。Ｎ末端、Ｃ末端及び鎖内シグナルの相対量は、次に別の化学ルミネッセントベースのアッセイを使用して測定した。
【０２９８】
１．ガン遺伝子のＰＣＲ
Ａ．ＡＰＣ　セグメント３
まず、ゲノムＤＮＡ（ＷＴ及び突然変異ＡＰＣ遺伝子を有する細胞株から分離されたもの）を以下のプライマーを使用してＰＣＲ増幅した。フォワードプライマー、， ＰＴＴ−Ｔ７−ＡＰＣ３は、
【０２９９】
【数１０】
2004513604.tif 000014
で、リバースプライマー、ＰＴＴ−Ｍｙｃ−ＡＰＣ３は、
【０３００】
【数１１】
2004513604.tif 000015
であった。
フォワードプライマーにおける下線配列は、Ｔ７プロモーター、イタリック体で示されるヌクレオチドは、Ｈｉｓ−６タグに対応し、太字の配列は、ＦＬＡＧ−エピトープをコードし、残りのプライマーは、ＡＰＣセグメント３ＤＮＡの相補領域である。リバースプライマーでは、下線配列は、ｃ−Ｍｙｃエピトープ配列に対応する。５０ μｌのＰＣＲ反応混合物は、２００〜５００ ｎｇの　鋳型ＤＮＡ（ＷＴまたは突然変異体）、０．５μＭ　各プライマー、及び２５μｌ のＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ， ＣＡ）、さらにヌクレアーゼフリー・ウオーター（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）水を含んだ。ＰＣＲは、ホットリドを取り付けたＨｙｂａｉｄ Ｏｍｎｉ−Ｅ ｔｈｅｒｍｏｃｙｌｅｒ （Ｈｙｂａｉｄ， Ｆｒａｎｋｌｉｎ， ＭＡ）を使用して、以下の条件で行われた：９５℃（３分）の後、９５℃（４５秒）、５５℃（１分）、及び７２℃（２分）から成るサイクルを４０回繰り返し、最終伸長を７２℃で７分行った。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲルで分析して、ＰＣＲ増幅ＤＮＡは、さらに精製することなく翻訳反応に使用された。
【０３０１】
Ｂ．Ｐ５３
ｐ５３ ＤＮＡは、実施例２３（上記）に説明するように調製した。
２．ｔＲＮＡの調製
ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−リジン・ｔＲＮＡｌｙｓは、実施例２３（上記）に説明するように調製した。ビオチンリジン・ｔＲＮＡｌｙｓ ａｎｄ ＰＣ−ビオチン−リジン・ｔＲＮＡｌｙｓ の調製は、以下のように行った。精製ｔＲＮＡｌｙｓ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）をまずにリジンでアミノアシル化した。典型的なアミノアシル化反応は、１５００ ｐＭ （−１．０ ＯＤ２６０）　ｔＲＮＡ、２０ ｍＭ イミダゾール・塩酸緩衝液（ｐＨ ７．５）、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ ｍＭ　 リジン、２ ｍＭ　 ＡＴＰ、１５０ ｍＭ　 ＮａＣｌ 及び過剰アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， Ｍ）を含んだ。反応混合物を３７℃で４５分インキュベートした。インキュベーション後、反応混合物に３Ｍ酢酸ナトリウムの０．１容積（ｐＨ　５．０）を添加して中和し、クロロホルム：酸フェノール抽出（１：１）を行った。エタノール（２．５容積）を水相に添加し、得られたｔＲＮＡペレットを水に溶解した（３５ μｌ）。この溶液に、０．５ Ｍ ＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ １０．５）　５μｌを加えて（最終濃度　５０ ｍＭ）、その後ビオチンまたは光開裂型ビオチンのいずれかの１０ ｍＭ溶液１０ μｌを加えた。混合物を０℃で１０分インキュベートして、リジンを添加して反応を消光した（最終濃度＝１００ ｍＭ）。結果生じた溶液に、０．１容積の３ Ｍ ＮａＯＡｃ（ｐＨ ５．０）を加えて、修飾ｔＲＮＡを３容積のエタノールで沈降した。沈降物を水　５０ｕｌに溶解して、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ゲル濾過コラム（０．５ × ５ ｃｍ）で精製して、遊離」蛍光試薬が残っている場合は、これを除去した。修飾ｔＲＮＡは、自然解凍を避けるために少量のアリコートにして凍結保存（−７０℃）した。アミノアシルｔＲＮＡの修飾度は、酸‐尿素ゲル電気泳動（Ｖａｒｓｈｎｅｙ， Ｕ．， Ｌｅｅ， Ｃ．Ｐ． 及びＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ， Ｕ．Ｌ．、 １９９１ Ｊ． Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ ２６６， ２４７１２２４７１８）により評価された。
【０３０２】
３．翻訳
典型的な翻訳反応混合物（２０μｌ）は、１６μｌのＰＣＲ ＤＮＡ 用ＴＮＴウサギ網状赤血球抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、１μｌのアミノ酸ミックス（１ ｍＭ）、１〜２ μｌのＰＣＲ ＤＮＡ（上記に説明するＡＰＣ及びｐ５３調製法を参照のこと）及びリボヌクレアーゼ・フリーウオーター（Ｒｎａｓｅ−ｆｒｅｅ ｗａｔｅｒ）を含んだ。蛍光検出には、翻訳反応混合物中にＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−リジン・ｔＲＮＡｌｙｓ が含まれた。翻訳反応は、３０℃で６０分進行させた。
【０３０３】
４．検出
図３３Ａは、ＲＴ−ＰＣＲ中にｐ５３タンパク質中に取り込まれた鎖トランケーションを検出するためにデザインされた当初の実験の結果を示す。この場合、Ｎ末端ＦＬＡＧエピトープは、捕捉のために使用され（実験セクションの始めに記載の９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを使用する捕捉アッセイの説明を参照のこと）、Ｈｉｓ６ 及び ｃ−ｍｙｃはそれぞれＮ末端及びＣ末端マーカーとして使用された。Ｎ末端Ｈｉｓタグの検出は、ペルオキシダーゼ標識ニッケルキレートベース・検出用プローブ（Ｉｎｄｉａ （登録商標） Ｈｉｓ Ｐｒｏｂｅ−ＨＲＰ， Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を使用して達成された。Ｃ末端の検出は、ヒトｃ−ｍｙｃエピトープに対するウサギポリクローナル抗体の後、ペルオキシダーゼ標識マウス抗［ウサギＩｇＧ］二次抗体を使用して達成された。観察されるように、Ｃ／Ｎ末端シグナル比は、ＷＴと比較してトランケート型タンパク質では約２５倍低下される。本アッセイのさらに最適化した結果、１／１００突然変異体／ＷＴ　ｐ５３タンパク質のトランケート型突然変異を検出するために十分な感度が得られ、従って非侵襲性結腸ガンスクリーニングへの適用を可能とするにちがいない。
【０３０４】
二番目の実験（図３３Ｂ）では、捕捉は、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグで行われ、ＦＬＡＧ及びｃ−ｍｙｃはそれぞれＮ及びＣ末端マーカーとして使用された。さらに、鎖内光開裂型ビオチンマーカーが、ＰＣ−ビオチン−リジン・ｔＲＮＡをインビトロ混合物中に加えることにより取り込まれた。ビオチン検出は、ペルオキシダーゼ標識ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（登録商標） （Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して達成された。この結果は、ＷＴと比較して、トランケート型ｐ５３のＣ／Ｎ比が１３倍の低下を示した。さらに、鎖内ビオチンシグナルは、Ｎ末端シグナルと比較して、７５％低下した。
【０３０５】
三番目の化学ルミネッセントタンパク質トランケーションアッセイは、突然変異細胞株のＡＰＣ遺伝子における鎖トランケーション検出のためにデザインされた（図３３Ｃ）。捕捉は、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグで行われ、ＦＬＡＧ及びｃ−ｍｙｃはそれぞれＮ及びＣ末端マーカーとして使用された。図３３Ｃに見られるように、トランケート型ＡＰＣは、Ｃ／Ｎ比の明らかな低下（１／６）を呈示し、さらに鎖トランケーションの存在を指摘する。
【０３０６】
結局、これらの実験は、ゲルフリー化学ルミネッセントアプローチを使用して、ガン関連タンパク質における鎖トランケート型突然変異を検出する能力を実証する。
［実施例　２６］：　蛍光免疫沈降法
本実施例では、免疫沈降法におけるフルオロタグｔＲＮＡの使用を説明する。本実験では、標識ｔＲＮＡの存在において、いったん新生タンパク質が合成されると、特異的抗体を使用して、それはプロテイン‐Ｇビーズ上に捕捉された。全ての他（非結合）物質は除去される。所望する結合タンパク質は、次にＳＤＳ−処理によってビーズから遊離され、さらにＰＡＧＥにより分析される。
【０３０７】
ｐ５３タンパク質をコードするＰＣＲ ＤＮＡ、またはα−ヘモリジンをコードするプラズミドＤＮＡ（以前の実施例に説明するように調製された）のいずれかを使用して、インビトロ翻訳が行われた。翻訳反応後、等量の１０％ＳＤＳ（重量／容量）を反応混合物に加え、試料を５分煮沸した。試料をＩＰ緩衝液（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１ ００を添加したトリス緩衝生理食塩水）で希釈し、２μｇの抗ｐ５３抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ＣＡ）または抗−ＨＬ抗体（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）のいずれかを加えて、混合しながら４℃で数時間インキュベートした。ネガティブ対照として、非特異的ＩｇＧ抗体を使用して免疫沈降法を行った。抗体のインキュベーション後、プロテイン‐Ｇビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ， ＩＬ）を反応混合物に加えて、さらに定速混合を加えながら１時間インキュベートした。ビーズを次にペレット化して、０．１％ＳＤＳを加えたＴＢＳで３回洗浄した。最後にビーズを、５０μｌのＳＤＳゲル・ローディングバッファー中に懸濁して、５分煮沸した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ， Ｕ．Ｋ． １９７０、 Ｎａｔｕｒｅ， ２７７、 ６８０〜６８５）に従って行った。
【０３０８】
ゲルを、励起源としてアルゴンレーザーを備えるＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ５９５（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｍａｎｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を使用してスキャンした。ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識新生タンパク質の可視化には、最大励起及び発光に最も近値であるために励起源として４８８ ｎｍを使用した（我々は５３０＋／３０フィルタを使用した）。ゲルは、ＰＭＴ 電圧 １０００ Ｖ、さらに１００または２００ミクロンピクセルサイズのいずれかを使用してスキャンした。
【０３０９】
図３４は結果を示す。レーンＭは蛍光マーカーを含む。レーン１はＤＮＡ欠如対照（＋抗ＨＬ抗体）である。レーン２は、ＨＬ ＤＮＡ ＋マウスＩｇＧについての結果を示す。レーン３は、ＨＬ ＤＮＡ ＋抗ＨＬ抗体についての結果を示す。レーン４はＤＮＡ欠如対照（＋抗Ｐ５３抗体）である。レーン５は、ｐ５３ ＤＮＡ ＋マウスＩｇＧについての結果を示す。レーン６は、ｐ５３ ＤＮＡ ＋抗ｐ５３抗体についての結果を示す。免疫沈降法は、特有な結果かつ実質的なバックグラウンドなしに極めて明晰なシグナルを供給する。
【０３１０】
［実施例　２７］：　サプレッサーｔＲＮＡ
ＢＯＤＩＰＹ標識開始ｔＲＮＡを使用する際、内在性開始ｔＲＮＡ（非標識）間に競合を生じ、標識の取り込み低下を起因する。この競合を克服するために、本発明は、アンバー終止コドン及び対応するサプレッサーｔＲＮＡの使用を考案する。
１．ＢＯＤＩＰＹ−バリン−ｐｄＣｐＡの調製
第一ステップは、サプレッサーｔＲＮＡへの付着用のＢＯＤＩＰＹ−アミノ酸抱合体の調製を含む。この合成は図３５に示す。合成は、５−メチル−１（２−ニトロフェニル）エタノール（化合物　２）の調製から始まる。まず、５−メチル−２−ニトロアミノアセトフェノン（Ｏｌｅｊｎｉｋ， Ｊ．、 Ｓ． Ｓｏｎａｒ、 Ｅ． Ｋｒｚｙｍａｎｓｋａ−Ｏｌｅｊｎｉｋ、 及び Ｋ． Ｊ． Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄ． １９９５ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ９２：７５９０〜４；　Ｏｌｅｊｎｉｋ， Ｊ．、 Ｅ． Ｋｒｚｙｍａｎｓｋａ−Ｏｌｅｊｎｉｋ、及び Ｋ． Ｊ． Ｒｏｔｈｓｃｈｉｌｄ． １９９８． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．　２９１：１３５〜５４）を５ ｍｌのエタノールに溶解した。この溶液に、分析ＴＬＣが５−メチル−１（２−ニトロフェニル）エタノールへの完全転化を示すまで、５ ｍｇの水素化ホウ素ナトリウムを少量ずつ添加した。反応は、５ ｍｌのアセトンを加えることにより停止し、１ Ｎ ＨＣｌでｐＨ＝３．０に酸性化後、クロロホルムで抽出した。有機層を乾燥し、黄色様油としてターゲット化合物が得られるまで蒸発した。この化合物はさらに精製しないで使用された。
【０３１１】
合成機構を継続して、５−メチル−１（２−ニトロフェニル）エタノール（３５０ ｍｇ； １．９５ ｍＭ）（化合物　２）を、１０ ｍｌのアセトニトリルに溶解した。この溶液に、４０７ ｕｌのトリエチルアミン（１．５当量）を加えた後、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミド炭酸塩（７５０ ｍｇ、 １．５当量）を加えた。反応混合物を分析ＴＬＣ（シリカゲル、クロロホルム）が化合物３への定量的転化を示すまで、室温で撹拌した。結果生じる溶液を、バリンのトリエチルアンモニウム塩溶液に直接に添加した。
【０３１２】
バリン（２１８ ｍｇ； １．８６ ｍＭ）を、２ ｍｌの水に懸濁して、これに２６０ ｕｌのトリエチルアミンを加えた。この溶液に、化合物３の溶液を１５分間にｘｘ加えて、この間に混合物のｐＨ値を、必要に応じて、トリエチルアミンを添加することにより調整した。混合物を３０分撹拌して、０．１ Ｎ ＨＣｌを１０ ｍｌ添加することにより酸性化した後、３ ｘ ２０ ｍｌ ＡｃＯＥｔで抽出した。有機層を合わせて、乾燥して、乾燥状態まで蒸発した。粗生成物を２０ ｍｌのクロロホルムに溶解し、０．１ Ｎ ＮａＨＣＯ３　４　ｘ　３０ ｍｌ で抽出し、水相を酸性化し、クロロホルムで再抽出して、純正ターゲットＮｐｅ−バリン（化合物　４）　３２０ ｍｇ を得た。
【０３１３】
Ｎｐｅ−バリン（化合物　４）（３２０ ｍｇ、 １ ｍＭ）を３２０ ｕｌのアセトニトリルに溶解した。この溶液に、トリエチルアミン（２８０ ｕｌ、 ２当量）及びクロロアセトニトリル（１９０ ｕｌ、 ３ 当量）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。２０ ｍｌの塩化メチレンを加えた後、２０ ｍｌの１Ｎ ＮａＨＳＯ４を加え、混合物を４ ｘ ２０ ｍｌ塩化メチレンで抽出した。有機物は乾燥するまで蒸発し、ヘキサン（１０〜５０％）中の酢酸エチルのステップ勾配を使用して、シリカゲルカラムで精製し、純正生成物（化合物　５）を３００ ｍｇ得た。
【０３１４】
テトラブチルアンモニウム対イオンの２．２当量を含むｐｄＣｐＡ （Ａｎｎｏｖｉｓ）の２０ ＯＤを、４０ ｕｌの乾燥ＤＭＦに溶解した。この溶液に、１０ ｕｌ ＤＭＦ中でＮｐｅ−バリン−ＣＯＯＣＨ２ＣＮ （０．６６ ｍｇ）の２当量を含む溶液を加えた。反応を室温で２時間維持し、次に生成物を分離用ＨＰＬＣを使用して分離し、１５ ＯＤの化合物６を得た。
１５ ＯＤ２６０ のＮｐｅ−バリン−ｐｄＣｐＡを、５００ ｕｌ の２５ ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ ＝ ４．５）に溶解し、３６５ ｎｍ光線（ＢｌａｋＲａｙ ＸＸ−１５、 ＵＶＰ）を使用して２０分照射した。１６６ ｕｌのＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−ＳＥ （＠１０ｍｇ／ｍｌ；７当量、が添加された）後、１４０ ｕｌの１Ｎ ＮａＨＣＯ３を加えた。ＢＯＤＩＰＹＦＬＳＥ溶液の他の部分（２ ｘ １６６ ｕｌ、合計 ２１当量）を５分、１０分後にそれぞれ加え、さらに反応混合物を室温で４５分渦を巻くように混合した。生成物（化合物　７）を、分離用ＨＰＬＣ Ｎｏｖａｐａｋ Ｃ１８（１０ｘ１００ｍｍ、５０ ｍＭ ＴＥＡＡ中のアセトニトリルの直線勾配（ｐｈ　５．４）で９０分、速度ｍｌ／ｍｉｎ）を使用して分離し、２６０ 及び５０５ ｎｍにおける吸光によりキャラクタライズした。収率　７．２５ ＯＤ２６０。
【０３１５】
２．アンバー・サプレッサーｆＭｅｔ・ｔＲＮＡ．の発現及び精製
突然変異型ｔＲＮＡｆｍｅｔ（遺伝子を含むｎｕｓＡオペロンのＰｓｔＩフラグメント（Ｓ． Ｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ． ＰＮＡＳ ｖ．８１、 ｐｐ４０９〜４１３、 １９８４）を、ｐＧＥＭ４ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）中にクローンした。Ｅ． ｃｏｌｉ ＸＬ−ｂｌｕｅ ２細胞の一晩培養液（１００ ｍｌ）から、フェノール抽出及びエタノール沈降により全ｔＲＮＡを分離した。サプレッサーｔＲＮＡ ｆｍｅｔ を、天然ＰＡＧＥ（Ｓｅｏｎｇ 及び ＲａｊＢｈａｎｄａｒｙ、 ＰＮＡＳ ｖ．８４ ｐｐ．３３４〜３３８、１９８７）を使用して精製した。
【０３１６】
３．ヘビ毒ホスホジエステラーゼ　Ｉ（ＶＰＤ Ｉ）によるｔＲＮＡトランケーション（図３６）
１ ＯＤ２６０ の精製開始サプレッサーｔＲＮＡを、５０ ｕＬの５０ ｍＭトリス・塩酸（ｐＨ７．５）；１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２ 及び １００ ｍＭ ＮａＣｌに溶解した。この溶液に、０．５ユニットのＶＰＤ Ｉを加え、さらに混合物を０℃で３０分インキュベートした。フェノール抽出後、ｔＲＮＡをＥｔＯＨで沈降、乾燥して、さらに１００ ｕＬの水に溶解した。３’末端からの選択的（−ＣＡ）ジヌクレオチド除去を、８％、７Ｍの尿素ＰＡＧＥ分析で確認した。
【０３１７】
４．トランケート型開始サプレッサーｔＲＮＡを有するＢＯＤＩＰＹ−バリン−ｐｄＣｐＡによる連結
図３６の機構に示すように、ｔＲＮＡは、連結反応において、ＢＯＤＩＰＹ−アミノ酸抱合体で電荷される。０．５ ＯＤ２６０のｔＲＮＡに、１００ ｕｌのリゲーションバッファー（５０ ｍＭ トリス・塩酸（ ｐＨ ７．８）； １０ ｍＭ ＭｇＣｌ２； １０ ｍＭ ＤＴＴ； １ ｍＭ ＡＴＰ ３０％ の ＤＭＳＯ ）中の０．５ ＯＤ２６０ ユニットのｐｄＣｐＡ 及び２００ユニットのＴ４ ＲＮＡ リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡ ）を加えて、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、ｔＲＮＡを３〜４容量のＥｔＯＨで沈降し、５０ｕｌの水に溶解して、Ｇ２５　ＭｉｃｒｏＳｐｉｎカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）を使用して、スピン濾過を行った。結合ｔＲＮＡをアリコートに分けて、−７０℃で保存した。生成物は、開始／アンバーサプレッサーｔＲＮＡと言及される。
【０３１８】
５．翻訳及び分析
翻訳は、２０ ｕｌ総量の無細胞Ｅ． ｃｏｌｉ Ｓ３０抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）中において行った。混合物は、特定のタンパク質（１ ｕｇ）をコードするＤＮＡ及び化学的アミノアシル化によって調製された開始アンバーサプレッサーｔＲＮＡ（１ ｕｇ）を含んだ。混合物を３７℃で１時間インキュベートし、次に１ ｕｌをローディングバッファーと混合して、加熱変性してから１４％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５０ Ｖ、 １ 時間）にかけた。ゲルを次に簡単にリンスして、ＢＯＤＩＰＹ標識の場合は、Ｆｌｕｏｒｏｉｍａｇｅｒを使用して分析した。ＰＣ−ビオチンの場合は、ゲルをＰＶＤＦ膜上にブロットして、ストレプトアビジン‐ＨＲＰを使用してビオチンを検出した。
【０３１９】
図３７は結果を示す。レーン１はＤＮＡ欠如対照＋ＢＯＤＩＰＹ−バリン・開始／アンバーサプレッサーｔＲＮＡである。レーン２は、ルシフェラーゼＤＮＡ ＋ ＢＯＤＩＰＹ−リジン・ｔＲＮＡについての結果を示す。レーン３は、アンバー‐１ルシフェラーゼＤＮＡ＋ＢＯＤＩＰＹ−リジン・ｔＲＮＡを示し、レーン４は、アンバー‐１ルシフェラーゼＤＮＡ＋ＢＯＤＩＰＹ−バリン・開始／アンバーサプレッサーｔＲＮＡについての改良された結果を示す。
【０３２０】
レーン５は、ヘモリジンＤＮＡ ＋ ＢＯＤＩＰＹ−リジン・ｔＲＮＡについての結果を示す。レーン６は、アンバー‐１ヘモリジンＤＮＡ＋ＢＯＤＩＰＹ−リジン・ｔＲＮＡを示し、レーン７は、アンバー‐１ヘモリジンＤＮＡ＋ＢＯＤＩＰＹ−バリン・開始／アンバーサプレッサーｔＲＮＡについての改良された結果を示す。
レーン８は、ＤＨＦＲ ＤＮＡ ＋ ＢＯＤＩＰＹ−リジン・ｔＲＮＡについての結果を示す。レーン９は、アンバー‐１ ＤＨＦＲ ＤＮＡ＋ＢＯＤＩＰＹ−リジン・ｔＲＮＡを示し、レーン１０は、アンバー‐１ ＤＨＦＲ ＤＮＡ＋ＢＯＤＩＰＹ−バリン・開始／アンバーサプレッサーｔＲＮＡについての改良された結果を示す。
【０３２１】
［実施例　２８］：薬物‐プロテオーム・スクリーニング
ヒトゲノムプロジェクトの完了は、創薬における新しい時代を開幕する。薬物ライブラリーが一つのタンパク質に対してスクリーンされる従来の方法とは対照的に、今では全プロテオームのスクリーニングが利用可能である。しかし、そのような薬物‐プロテオームスクリーニングは、ゲノムのプロテオームへの迅速な転換、特別標識タンパク質の工作及び１時間当たりに何千もの試料のスクリーニングを必要とするために、従来のテクノロジーを使って達成することは困難である。
【０３２２】
本発明は、無細胞発現標識タンパク質及び２Ｄマイクロアレイ法を使用して、薬物‐タンパク質の相互作用をスクリーニングすることにより、このような限界を排除することを目的とする方法及び組成物を供給する。本発明は、上記に説明する標識及びマーカー（例：蛍光及びアフィニティータグ）を、その無細胞発現中にタンパク質中に取り込むことを考案する。蛍光タグ（例えば、Ｎ末端部、Ｃ末端部、タンパク質内及び／あるいはタンパク質を通して）は、タンパク質発現をモニタし、さらに薬物候補化合物との相互作用を検出する手段を供給する。アフィニティータグは、無細胞発現タンパク質を、無細胞溶解質から迅速に分離する手段を供給する。ヒトプロテオームの全てあるいは一部を反映する、無細胞発現タンパク質の２Ｄマイクロアレイ上で行われる薬物スクリーンは、高感度検出、ハイスループット及び必要とする試料容量が低いシステムを供給する。
【０３２３】
本発明によるプロテオミックスクリーニングアッセイは、リード薬物化合物とスクリーニングを受ける全プロテオーム（あるいはプロテオームの一部）間の起こり得る相互作用を許すことにより、創薬プロセスを著しく加速する。そのような情報は、薬物作用の分子的基礎を探索し、薬物相互作用マップを構築することにより薬物の起こり得る副作用を同定するために価値がある。
【０３２４】
薬物相互作用マップは、特定化合物（例：リード薬物）のヒトプロテオームとの相互作用についての情報を供給する。薬物相互作用マップを確立するためには、一連のプラズミドｃＤＮＡプールから構成されるフォーマット化されたｃＤＮＡライブラリを使用して、系統的発現と全プロテオームの標識を可能とする方法が考案される。約５０プラズミドまたはそれ以下（より好ましくは約４０プラズミドまたはそれ以下、さらには約３０プラズミドまたはそれ以下、さらに最も好ましくは２５プラズミドまたはそれ以下）から成る各プールを、無細胞反応混合物（例：Ｐｒｏｍｅｇａ ＴｎＴウサギ網状赤血球発現システム）中で同時発現する。タンパク質は、ｔＲＮＡで翻訳中に取り込まれたＰＣ−ビオチンのようなリンカーを使用して、混合物からアフィニティー精製される。発現タンパク質を次に、表面に不動化試験薬物化合物を有する表面（例：ビーズまたはスライド）に曝す。各プール由来の１またはそれ以上のタンパク質の相互作用を次に、取り込まれた蛍光標識を使用して検出する。薬物化合物と相互作用するプール由来の特定のタンパク質のアイデンティティーを次に、プラズミドプールをサブグループに分割する手順または不動化タンパク質のマイクロ分析のいずれかを使用して決定する。他方、各プール中にある発現タンパク質を、取り込まれているアフィニティータグを使用して固体媒質中に移動する。タンパク質の各プールを２Ｄアレイ上に配列して、標識ビーズ上に不動化されている化合物で審問する。ハイスループットスクリーニングは、２ＤマイクロアレイとＤＮＡベースマイクロチップと同様な蛍光イメージャーを使用して達成し得る。
【０３２５】
放射性標識による従来の方法と比較する、取り込まれた蛍光及び／またはアフィニティーマーカーのような非放射性マーカーを有する無細胞発現タンパク質使用の重要な利点は、新生タンパク質の迅速な分離及びハイスループット分析に必要とされる感度を備える迅速な検出実行能力である。このアプローチは、放射性検出が予め含まれている２Ｄマイクロアレイの場合は特に好都合である。さらに、ｃＤＮＡによりコードされている各タンパク質が、検出に十分なレベルで発現するために、各プール中のプラズミド数を限定すること（例えば、５０以下）は重要である。プラズミドプールを発現するために、大量の反応混合物（例えば、１ ｍｌ）を常に利用し得るが、大量反応は実用的プロテオミックスクリーニングには法外に価格が高い。例えば、２０００の１ ｍｌ反応量の利用には、２０００プラズミドプールを発現する必要がある。ＴｎＴウサギ網状赤血球の現在の市販価格を使用すると、これは約＄８００，０００となる。対照的に、２Ｄマイクロアレイフォーマットと使用できる少量５０マイクロリットル反応は、＄２０，０００のみですむ。米国特許第５，６５４，１５０号（本明細書に参考文献として編入）に説明されるようなインビトロ発現クローニングの初期の方法は、約１００の個別細菌コロニーから成るプールの収集及びプール中のｃＤＮＡによってコードされているタンパク質のインビトロにおける発現に基づいている。このアプローチは、米国特許第． ４，６７５，２８５号（参考文献として編入）に説明されるようなさらに初期（非インビトロ）の発現クローニング方法の改良を示すが、それでも、一般的には本発明によって供給されるような薬物‐プロテオミックスクリーニングを実施するための十分な感度を有する方法を供給しない。薬物‐プロテオミックスクリーニングの他に、本発明はさらにプロテオームとＤＮＡ及び他のバイオ分子との相互作用の迅速なスループットスクリーニングを可能とする。
【０３２６】
薬物‐プロテオミックスクリーニング用の２つの異なる関連アプローチが考案され、そのどちらも２Ｄアレイまたはマイクロアレイの利用、蛍光、ルミネッセンス、化学ルミネッセンス、吸光または電磁検出（直接的または間接的）による他の手段を使用する検出に基づく。図３８に示すように、第一アプローチは、プラズミドのプールから生産された無細胞発現タンパク質を利用し、これはフォーマット化されたゲノムライブラリーを含む。反応混合物中に、発現タンパク質よりもはるかに高レベルで存在する既存のタンパク質からの妨害を排除するために、取り込まれたアフィニティータグ及び表面上にコートされた相補性捕捉分子を使用する、プレ精製ステップが必要であり得る。発現タンパク質を含む個々のプールからの各試料を次に、不動化ターゲット薬物を含む表面上にスポット添加する。次に取り込まれている蛍光マーカー使用して、タンパク質を含み、ターゲット薬物と相互作用をする試料を同定する。他方、取り込まれているアフィニティーマーカーと相互作用する蛍光標識分子（例：抗体）を使用してもよい。一つの好ましい実施態様では、ビオチンがアフィニティーマーカーとして使用され、これはストレプトアビジン‐西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体と反応して、反応を触媒して、検出可能なシグナル（例：化学ルミネッセントまたは蛍光）を生じる。
【０３２７】
特定のスポットからの蛍光検出により、ターゲット薬物との相互作用を呈示するタンパク質プールがいったん同定されたら、様々な手順を使用して、実際に相互作用するタンパク質を同定することができる。一つの方法は、プール内の個々のプラズミドの再形質転換後、蛍光タグまたはアフィニティータグの存在において各個別プラズミド由来のタンパク質をインビトロ発現することに基づく。これに代わるアプローチは、陽性蛍光を示すスポット由来の実際の結合タンパク質を回収し、さらに質量分析または化学的手段のいずれかを使用して配列分析を行うことである。
【０３２８】
薬剤‐プロテオームスクリーニングのための第二の関連アプローチがさらに考案されている（図３９）。この場合は、プラズミドプールから生産された無細胞発現タンパク質を含む試料をまず表面に結合し、次に蛍光部分と抱合されている特定のターゲット薬物で審問することである。取り込まれたアフィニティータグは、インビトロ発現タンパク質を、アフィニティータグと相互作用する捕捉分子を含む特別に調製された表面に結合するために使用される。取り込まれたフルオロフォアは、表面結合をモニタするために使用される。ターゲット薬物結合は、デュアル波長蛍光検出法、あるいはその代わりに、タンパク質と結合薬物が近隣位置にあることを確定する、蛍光共鳴エネルギー転移法を使用して検出される。薬物‐タンパク質複合体相互反応を確認するための下流分析、及びさらに薬物またはタンパク質のアイデンティティーの質量分析のために、光開裂型ビオチンリンカーを使用して、薬物‐タンパク質複合体をさらに遊離し得る。
【０３２９】
上記に説明するどちらのシナリオでも、各プール毎に約５０プラズミドを含む２０００の個別プラズミドプールを構成すると推定される、ゲノムライブラリーの平行発現は、迅速な薬物‐プロテオーム分析実施の基礎を提供する。例えば、反応ウェル（各５０μｌ）の既定フォーマットセット及びプラズミドセットを使用して、全平行発現反応を１時間以内に達成することができた。各試料からの発現タンパク質の精製は、適切な装置（例えば、ロボットアーム操作による９６ウェル・ピペッター）が利用される場合は、さらに極めて迅速であり得た。例えば、ピペットフィルターチップが、インビトロで取り込まれた光開裂型タグ（例えば、ビーズに結合されたストレプトアビジン）を介して、捕捉用のアフィニティー媒質を含むように調製することが可能であり、後続する遊離には光線が使用され得る。
【０３３０】
どちらのシナリオでも、試料は、その後の薬物‐タンパク質蛍光アッセイのために、迅速に表面に移動され得る。例えば、ターゲット薬物でコートされたスライドの場合は、１２５ ｕｍ 解像度スポットサイズを提供する、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４１７　アレイヤー（ａｒｒａｙｅｒ）のような市販のアレイヤーを使用して、個々の試料をスポットし得る。原則として、５倍の重複性を有する全プロテオームを１０分以内で配列するために、一枚の顕微鏡用スライドで十分である。スポットサイズを大型にしたり、または重複性を増加するとスライド数が増えるが、それでもなお配列プロテオームの全調製は迅速であり、ハイスループットプロセシングが可能である。「全プロテオームが一枚のスライドの上にある」コンセプトは、そのようなスライドの迅速な製造は、薬物ライブラリーに対する全プロテオームのスクリーニングを可能とするために、特に魅力的である。
【０３３１】
上記に説明するフォーマットでは、蛍光２Ｄマイクロアレイリーダーを使用して、迅速なリードアウト（読み取り）を達成し得る。例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４１８スキャナーは、約１０分以内に全スライドをスキャンすることが可能であり、３色画像を実施し得る。さらには、アレイリーダーは高精度（１０ミクロン）、速度（１８ ｍｍ／ｍｉｎ）及び感度（１平方ミクロン当たり１個以下のＣｙ３色素分子＞３．５ Ｓ／Ｎ）を提供する。
【０３３２】
本発明によるスクリーニングアッセイを評価するために、試験タンパク質ジヒドロフォレートレダクターゼ（還元酵素）（ＤＨＦＲ）中へのＰＣ−ビオチンまたはＢＯＤＩＰＹの取り込みを含む実験を行った。実験は、インビトロ合成中にＤＨＦＲ中に取り込まれたＰＣ−ビオチンまたはＢＯＤＩＰＹマーカーが、正常リガンドがジヒドロフォレートであるＤＨＦＲの競合インヒビターである、小型リガンドのメトトレキセートとの相互作用をアッセイするために使用し得るか否かを評価することを目的とした。メトトレキセートは、細胞生長率を低下し得るために、化学療法における抗ガン薬として広く使用されている。
【０３３３】
一つのアッセイでは、ＰＣ−ビオチンは、ＰＣ−ビオチン−リジン・ｔＲＮＡの存在におけるＳ３０でのインビトロ発現中に、ＤＨＦＲ中に取り込まれた。発現後、粗混合物をメトトレキセートでコートされたアガロースビーズに曝した。十分な洗浄後、ＤＨＦＲのビーズへの特異的結合を、ストレプトアビジン−ＨＲＰを使用してアッセイした。図４０に見られるように、ＰＣ−ビオチン−リジン・ｔＲＮＡが発現系に含まれる場合にのみ、シグナルが得られた。結合前にＵＶ光線に露光させると、対照レベルに関するシグナルが破壊され（データの表示なし）、自動化アッセイ中にバックグラウンドレベルを測定するための便利な方法を提供する。
【０３３４】
二番目の実験では、均質溶液アッセイとして、ＤＨＦＲとメトトレキセートとの相互作用を検出するために、毛管電気泳動（ＣＥ−ＬＩＦ）を使用した。この場合は、ＢＯＤＩＰＹ−ｆｍｅｔ・ｔＲＮＡを使用するインビトロ合成中に、ＢＯＤＩＰＹは、ＤＨＦＲのＮ末端部に取り込まれた。遊離ＤＨＦＲの電気泳動画像は、２．９分にピークを呈示した（データの表示なし）。比較として、室温で３０分メトトレキセートとプレインキュベートされたＤＨＦＲの電気泳動画像は、２．８分に広幅ピークを呈示した（データの表示なし）。移動時間の変化は、ＤＨＦＲとメトトレキセート間の複合体形成に帰因する。
【０３３５】
実験の第三シリーズでは、抗体を使用して、インビトロ発現されたターゲットタンパク質を選択的に結合及び検出する能力を調査した。この目的では、ＰＣ−ビオチンが、プールされたヒトｍＲＮＡ試料のＲＴ−ＰＣＲ後に、ＰＣ−ビオチン−リジン・ｔＲＮＡを使用して、ウサギ網状赤血球溶解質中で発現されたｐ５３中に取り込まれた。このタンパク質は、次に野生型及び突然変異型コンフォーメーションを認識する、モノクローナル抗体クローンＢＰ５３−１２ （Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ， ＣＡ）を使用して、ＥＬＩＳＡプレート上で特異的に捕捉された。ネガティブ対照としては、ｐ５３特異的抗体の代わりに、同量の免疫前マウスＩｇＧが捕捉用に使用された。ビオチンの検出は、標準ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ペルオキシダーゼ標識ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎビオチン結合タンパク質（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を使用して達成された。その結果（表示なし）は、ｐ５３抗体との特異的結合のみが、有意なシグナルを生じることを示した。これらのデータは、異なるｐ５３突然変異体と特異的に反応する、コンフォーメーション特異性抗体のパネルを使用するｐ５３結合の研究の可能性を実証する。
【０３３６】
本発明による他の実施態様及び用途は、本明細書に発表される発明に関する明細と実施を考慮することにより、当業者には明確であろう。明細及び実施例は典型としてのみ考察されることを意図し、本発明による特定の実施態様の範囲は、以下の請求により指示される。
【０３３７】
【表２】
2004513604.tif 000016
【０３３８】
【表３】
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【０３３９】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
（Ａ）アミノ酸及び（Ｂ）ペプチドの構造を示した図。
【図２】
細胞または無細胞系におけるタンパク質合成中に生じる分子的ステップの説明を示した図。
【図３】
（Ａ）ｔＲＮＡ分子、及び（Ｂ）ｔＲＮＡのアミノアシル化に含まれるアプローチの構造を示した図。
【図４】
蛍光マーカーアミノ酸を使用する、新生タンパク質検出方法を示した図。
【図５】
ゲル電気泳動及びＵＶ照射を使用する新生タンパク質の検出に適切な蛍光特性を有する、２種類の異なるマーカーアミノ酸、ダンシルリジン（機構１）及びクマリン（機構２）の合成及びｔＲＮＡへのミスアミノアシル化の機構を示した図。
【図６】
（Ａ）２‐ニトロベンジル部分を含む化合物を示し、（Ｂ）ニトロベンジル結合からの基質の切断を示した図。
【図７】
光開裂型マーカーの実例を示した図。
【図８Ａ】
ＣＢの化学的変異を示した図。
【図８Ｂ】
可能なアミノ酸結合を示した図。
【図９】
ＰＣＢの光分解を示した図。
【図１０】
タンパク質を分離することなく、無細胞タンパク質発現系において、新生タンパク質の生産をモニタする方法の概略表示。
【図１１】
（Ａ）レポーター特性を有する非天然アミノ酸の実例を提供し、（Ｂ）タンパク質合成におけるレポーターの関与を示し、（Ｃ）レポーターの合成を示したず。
【図１２】
光開裂型ビオチンの構造成分を示した図。
【図１３】
新生タンパク質のＮ末端でのマーカーの導入方法の概略表示した図。
【図１４】
新生タンパク質におけるマーカーの検出及び分離方法の説明を提供した図。
【図１５】
ＰＣＢ‐リジン合成の一つの実施態様におけるステップを示した図。
【図１６】
ｔＲＮＡミスアミノアシル化の実験的ストラテジーを提供する。
【図１７】
（ｉ）デオキシシチジン保護、（ｉｉ）アデノシン保護、及び（ｉｉｉ）ジヌクレオチド合成を含む、ジヌクレオチド合成を例示した図。
【図１８】
マーカーアミノ酸を使用するジヌクレオチドのアミノアシル化を示した図。
【図１９】
ジピロメテン二フッ化ホウ素（４，４‐ジフルオロ‐‐ボラ‐３ａ，４ａ‐ジアザ‐ｓ‐インダセン：４，４−ｄｉｆｌｕｏｒｏ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ）色素の構造を示した図。
【図２０】
翻訳中ヘモリジン中への様々な蛍光分子の取り込みを示すゲルの写真。
【図２１Ａ】
様々なタンパク質中へのＢＯＤＩＰＹ−ＦＬの取り込みを示す。レーザーベースのＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＦｌｕｏｒＩｍａｇｅｒ ５９５を使用して可視化された結果を示す。
【図２１Ｂ】
様々なタンパク質中へのＢＯＤＩＰＹ−ＦＬの取り込みを示す。ＵＶトランスイルミネーターを使用して可視化された結果を示す。
【図２２Ａ】
蛍光標識の経時変化を示す。
【図２２Ｂ】
翻訳混合物の様々なアリコートのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示し、系の感度を実証する。
【図２３Ａ】
本発明による方法に従って、新生タンパク質中に導入されたＮ末端マーカーのゲルフリー定量法を示す棒グラフ。
【図２３Ｂ】
本発明による方法に従って定量された、新生タンパク質のＣ末端マーカーのゲルフリー定量法を示す棒グラフ。
【図２４】
プロテアーゼ処理及び未処理タンパク質のゲル結果を示した図。
【図２５】
ＲＢＣ処理及び未処理タンパク質のゲル結果を示した図。
【図２６Ａ】
ミスアミノアシル・リジン−ｔＲＮＡｌｙｓを使用する、Ｅ． ｃｏｌｉ　翻訳系におけるα‐ヘモリジンへの様々な蛍光分子の取り込みを示すゲルである。
【図２６Ｂ】
ミスアミノアシル・リジン−ｔＲＮＡｌｙｓを使用する、ＴｎＴコムギ胚芽系におけるルシフェラーゼへの様々な蛍光分子の取り込みを示す。
【図２７】
ｔＲＮＡ‐クマリン誘導体を含む、様々な蛍光‐ｔＲＮＡの存在下で行われたα−ＨＬのインビトロ翻訳のゲル結果を示す。
【図２８Ａ】
毛管電気泳動による易動度シフト結果を示す。
【図２８Ｂ】
毛管電気泳動による易動度シフト結果を示す。
【図２９】
３つのマーカーが新生タンパク質中に導入された、インビトロ翻訳結果のゲル結果である。
【図３０Ａ】
インビトロ翻訳・トリプルエピトープタグ野生型ｐ５３（ＲＴ−ＰＣＲ由来ＤＮＡ）のウェスタンブロット分析を示す。総タンパク質染色を示す。
【図３０Ｂ】
インビトロ翻訳・トリプルエピトープタグ野生型ｐ５３（ＲＴ−ＰＣＲ由来ＤＮＡ）のウェスタンブロット分析を示す。ウェスタンブロット分析を示す。
【図３１】
ＡＰＣエクソン１５、セグメント２のゲルベースＰＴＴの結果を示す。
【図３２Ａ】
ウェスタンブロッティングによる、インビトロ翻訳・ＢＯＤＩＰＹ標識タンパク質検出を示す。蛍光イメージング（画像法）による結果を示す。
【図３２Ｂ】
ウェスタンブロッティングによる、インビトロ翻訳・ＢＯＤＩＰＹ標識タンパク質検出を示す。ウェスタンブロッティングによる結果を示す。
【図３３Ａ】
ｐ５３とＡＰＣのゲルフリー化学ルミネッセントタンパク質トランケーション アッセイの結果を示す３棒グラフを示す。Ｎ末端ＦＬＡＧエピトープに対するマウスモノクローナル抗体を使用することにより、生成物が９６ウェルＥＬＩＳＡプレートフォーマット中に捕獲される、インビトロ翻訳によって生産されたｐ５３の結果を示す。
【図３３Ｂ】
ｐ５３とＡＰＣのゲルフリー化学ルミネッセントタンパク質トランケーション アッセイの結果を示す３棒グラフを示す。ニッケルキレートプレートを使用することにより、生成物が９６ウェルＥＬＩＳＡプレートフォーマット中に捕獲される、インビトロ翻訳によって生産されたｐ５３の結果を示す。
【図３３Ｃ】
ｐ５３とＡＰＣのゲルフリー化学ルミネッセントタンパク質トランケーション アッセイの結果を示す３棒グラフを示す。生成物がニッケル金属キレート９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上に捕獲される、インビトロ翻訳によって生産されたＡＰＣの結果を示す。全ての野生型Ｎ及びＣ末端シグナルは、突然変異型Ｎ末端シグナルと同様に１００％に正規化された。
【図３４】
ｐ５３とヘモリジンについての免疫沈降結果を示すゲル。
【図３５】
ＢＯＤＩＰＹ−バリン−ｐｄＣｐＡの調製についての合成機構を概略的に示した図。
【図３６】
ｔＲＮＡへの図３５のＢＯＤＩＰＹ−バリン−ｐｄＣｐＡ抱合体の付着についての合成機構を概略的に示した図。
【図３７】
図３６の電荷ｔＲＮＡを使用する翻訳反応の結果を示した図。
【図３８】
薬物／プロテオームスクリーニングアッセイの一つの実施態様を概略的に示す。
【図３９】
薬物／プロテオームスクリーニングアッセイの一つの実施態様を概略的に示す。
【図４０】
薬物／プロテオームスクリーニングアッセイの結果を示す棒グラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004513604.tif 000272