(57)【要約】Ｄ−鏡像体に富むキラルなアミノ酸の製造法であり、該方法においては、対応するＮ−カルバモイルアミノ酸の鏡像体の混合物がＤ−カルバモイラーゼに接触され、アンモニアが放出され、該アンモニアは、燐酸イオン、燐酸一水素イオン又は燐酸二水素イオンの２価金属塩を用いて除去される。１つの実施態様において、酵素的脱カルバモイル化は、燐酸イオン、燐酸一水素イオン又は燐酸二水素イオンの２価金属塩の存在下に行われる。もう１つの実施態様において、反応混合物は、存在する固体の分離後外部ループにより、燐酸イオン、燐酸一水素イオン、又は燐酸二水素イオンの２価金属塩と接触される。Ｄ−鏡像体に富むキラルなアミノ酸は、ヒダントイナーゼを用い、対応するヒダントインを酵素的に対応するＮ−カルバモイルアミノ酸に転化し、それが次に本発明に従ってＤ−鏡像体に富むアミノ酸に転化されることによってもまた得られることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｄ鏡像体に富むキラルなアミノ酸の製造法であり、対応するＮ−カルバモイルアミノ酸の鏡像体の混合物がＤ−カルバモイラーゼと接触させられ、アンモニアが放出されるアミノ酸製造法において、燐酸イオン、燐酸一水素イオン、又は燐酸二水素イオンの２価金属の塩を用いてアンモニアが除去されることを特徴とする、アミノ酸の製造法。
【請求項２】
酵素的な脱カルバモイル化が燐酸イオン、燐酸一水素イオン、又は燐酸二水素イオンの２価金属の塩の存在下に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
反応混合物が、存在する固体の分離の後に外部のループにより、燐酸イオン、燐酸一水素イオン、又は燐酸二水素イオンの２価金属の塩と接触される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｄ−鏡像体に富むキラルなアミノ酸の製造法において、対応するヒダントインが、対応するＮ−カルバモイルアミノ酸にヒダントイナーゼを用いて酵素的に転化され、Ｎ−カルバモイルアミノ酸は、次に請求項１〜３のいずれか１項に従う方法を用いて、Ｄ−鏡像体に富むアミノ酸に転化される方法。
【請求項５】
両方の段階が、１つの容器の中でヒダントイナーゼ及びＤ−カルバモイラーゼの両方の存在下に行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
反応混合物のｐＨが７．０〜９．０である、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
燐酸イオンの２価金属の塩として燐酸一水素マグネシウムが使用される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
得られた反応混合物が次に、９．５〜１０．５のｐＨまでのｐＨ増加、生成された固体の燐酸アンモニウム塩の分離、３．５〜４．５のｐＨまでの母液のｐＨ減少、及び固体Ｄ−アミノ酸の分離を受ける、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
得られた反応混合物が次に、０．５〜１．５のｐＨまでのｐＨの減少、バイオマスの分離、３．５〜４．５のｐＨまでのさらなるｐＨの増加、及び固体Ｄ−アミノ酸の分離を受ける、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
得られた母液が次に、７〜１０の値までのｐＨの増加を受け、生成された固体の燐酸アンモニウム塩が分離される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
燐酸アンモニウム塩が４．５〜６．５のｐＨにおいて鉱酸と接触され、燐酸一水素マグネシウムがアンモニアと鉱酸との塩から分離される、燐酸一水素マグネシウムの回収法。
【請求項１２】
ｐＨが５．５〜６に保たれる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
鉱酸が硫酸である、請求項１１又は１２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｄ−鏡像体に富むアミノ酸の製造法に関し、該方法においては対応するＮ−カルバモイルアミノ酸がＤ−カルバモイラーゼと接触され、アンモニアが放出される。
【０００２】
Ｄ−アミノ酸は、生物学的に活性な製造物、例えばβ−ラクタム、ペプチドホルモン及び殺虫剤のための重要な基礎単位である。これらの「非自然な」アミノ酸の、一般的に使用される製造法は、対応するＤＬ−５−置換のヒダントインが鏡像体選択的にヒダントイナーゼで加水分解され、対応するＮ−カルバモイルアミノ酸を製造する方法である。このＮ−カルバモイルアミノ酸は対応するＤ−アミノ酸に酵素的に転化される。
【０００３】
公知の方法の欠点は、相当な反応時間を実現すること、相対的に大量の生物触媒が必要であることである、なぜならカルバモイル酸の加水分解の原因である酵素(カルバモイラーゼ、Ｎ―カルバモイル−Ｄ−アミノ酸アミドヒドラーゼともよばれる)は、反応生成物であるアンモニアに強く阻害されるからである。アンモニアにより引き起こされる阻害が起きる濃度は、非常に低い（〜１０ｍＭ）と報告されている（Ｏｌｉｖｉｅｒｉら、 “Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，２３，ｐｐ２１７３〜２１８３（１９８１）；Ｒｕｎｓｅｒ，“Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”３３，ｐｐ３８２〜３８８（１９９０）；Ｌｏｕｗｒｉｅｒ“Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９，ｐｐ５６２〜５７１，（１９９６））。公知の方法について、このことは、１０ｍＭのアンモニアの濃度において、カルバモイラーゼは最大速度の半分の活性であることを意味する。２０ｍＭのアンモニア濃度において、カルバモイラーゼの速度は最大速度の１／３に過ぎない。高い生成物濃度、例えば＞５００ｍＭが所望される、工業的に関連する条件下において、カルバモイラーゼの速度は非常に強く阻害されるであろうということは明らかであろう。カルバモイラーゼの活性がほとんど最大である、より低い生成物の濃度（大きさ１０ｍＭのオーダー）は、その低い生産能力のために経済的に魅力がない。
【背景技術】
【０００４】
文献において、酵素的な転化反応の間においてアンモニアの濃度を低く保つための様々な方法が記載されている。インシチューでのアンモニアの除去は、Ｋｉｍ及びＫｉｍ“Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”１７，ｐｐ６３〜６７（１９９５）において記載されており、ヒダントイナーゼ及びカルバモイラーゼを用いるＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンの製造の間のアンモニアの除去のために、吸着剤（ＡＤ３００ＮＳ，トミタ薬品（株）（日本）のシリケート錯体）が利用される。この方法の欠点は、吸着剤が高価であり、従って回収されなければならないことである。
【０００５】
日本特許出願公開第６１２８５９９６号（１９８６年）において記載される、もう１つの方法に従って、生成されるアンモニアは蒸留により除去される。しかし、アンモニアの除去のためのこの方法は、反応混合物が高いｐＨを有するときのみ有効である。そのような高いｐＨにおいては、しかし、カルバモイラーゼ酵素は活性ではない。アンモニアが中性のｐＨ、７〜７．５のｐＨにおいて蒸留により除去されるとき、生成されるアンモニアの６０〜９０％は、反応体積の９０％より多くが除去されたときでさえ、反応混合物中に残る。従って中性ｐＨにおける効果的な除去は可能ではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、より少ない生物触媒が使われる必要があり、より短い反応時間が実現される、簡単で経済的に魅力的な方法を今提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
これは、本発明に従い、燐酸イオン、燐酸一水素イオン、又は燐酸二水素イオンの２価金属の塩、これらはさらなる記載においては簡単に燐酸塩とよばれる、を用いてアンモニアを除去することにより達成される。この目的のために、例えば酵素反応は、（例えば）燐酸塩の存在下に行われ得る。驚いたことに、高いスラリー濃度においてもまた、該反応混合物は簡単に攪拌可能なままでいることがさらに見出された。
【０００８】
もう一つの実施態様は、例えば、不溶の反応成分の分離の後、ループにより、例えば燐酸塩が存在する、第２の反応器、又はカラム又はフィルターを通して反応混合物を導くことにより構成される。したがって、反応混合物に存在するアンモニアは燐酸塩に結合し、対応する燐酸アンモニウム塩を生成し、その後、まだ例えば酵素を含んでいる、残った液体は酵素的脱カルバモイル化反応容器に戻される。
【０００９】
全く、又はずっと少ない酵素阻害しか起きないことが見出された。これは２価の金属が低い濃度（１〜１０μモル）においてもカルバモイラーゼに触媒される反応を妨げる得ることが知られているので、よけいに驚きである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
適する２価金属のイオンの例は、マグネシウム、コバルト、カルシウム、マンガン、ジルコニウム、又はルテニウムイオンである。経済的な理由のために、燐酸一水素マグネシウム（ＭｇＨＰＯ4）、燐酸水素マグネシウムともよばれる、が使用される。ＭｇＨＰＯ4は、得られるｐＨに関して、最適の作業条件に適合し、安価な原料から製造するのに容易である。該燐酸塩はインシチューで製造されることもまたできる。
【００１１】
燐酸塩は、例えばＭｇＨＰＯ4は、燐酸を対応する酸化物又は水酸化物、例えば酸化マグネシウム又は水酸化マグネシウムに添加することにより、燐酸塩を生じ、簡単に製造されることができる。得られた燐酸塩は次に添加されることができる（任意的に濾過及び洗浄の後）。
【００１２】
使用されるべき燐酸塩の量は、反応の間に生成されるアンモニアの量に関して、好ましくは燐酸塩の０．５〜３当量、特に０．８〜１．２当量である。
【００１３】
使用され得る、適する酵素の例は、ヒダントイナーゼ−カルバモイラーゼ法において通常使用される酵素、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、特にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、ｐｕｔｉｄａ又はｄｅｓｍｏｌｙｔｉｃａ、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ，Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ、特にＢａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ又はＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｒｔｒｏｂａｃｔｅｒ，Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、特にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ又はｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ，Ｓａｒｃｉｎａ，Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ，  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ，Ｃａｎｄｉｄａ，Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ，Ｐｉｃｈｉａ又はＰａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓである。
【００１４】
酵素的反応はｐＨ５〜ｐＨ９に存在するｐＨにおいて行われることができ、好ましくはｐＨ６〜８に存在するｐＨにおいて行われる。酵素的反応が行われる温度は、好ましくは０〜５０℃に、特には２０〜４０℃に存在する。
【００１５】
酵素的反応が完結したら、反応混合物は様々な方法において回収されることができる。
【００１６】
適切な回収は、例えば、ｐＨ０〜３のｐＨまで、好ましくは０．５〜１．５のｐＨまで反応混合物を酸性化し、続いてバイオマスを除去することにより行われる。ｐＨを例えば３〜５の値、好ましくは３．５〜４．５の値まで上げた後、Ｄ−アミノ酸が例えば濾過又は遠心分離により分離されることができる。ｐＨを５〜１１、好ましくは７〜１０の値まで上げた後、燐酸塩から生成される対応する燐酸アンモニウム塩は、例えば遠心分離又は濾過により分離されることができる。
【００１７】
もう１つの適する回収は、例えばｐＨを９〜１１の値、好ましくは９．５〜１０．５の値まで上げることにより行われ、その後、燐酸塩から生成される対応する燐酸アンモニウム塩が濾過除去されることができる。バイオマスは次に、得られた母液から例えば精密濾過又は限外濾過により除去される。例えば３〜６、好ましくは４．５〜５．５のｐＨまで酸性化したのち、固体のＤ−アミノ酸は次に例えば濾過により単離されることができる。
【００１８】
得られた燐酸アンモニウム塩は次に公知の方法において、該燐酸アンモニウム塩の乾燥過熱によりアンモニアの放出を伴って簡単に燐酸塩に転化されることができる。もう１つの方法は、燐酸アンモニウム塩のスラリーをｐＨ＞８．５において、特に９〜１１において、アンモニアの放出を伴って加熱することである。さらにもう１つの方法は、ｐＨを４．５〜６．５に、好ましくは５．５〜６に保ちながら、燐酸アンモニウムマグネシウム塩を鉱酸、例えば硫酸で洗浄することである。結果的に、アンモニウムと鉱酸との塩が得られ、燐酸水素Ｍｇが回収されることができる。
【００１９】
１９８４年及び１９８５年の米国特許第４，４６０，５５５号及び米国特許第４，６５０，８５７号において、特定の燐酸水素マグネシウムの粒子がアンモニアのスカベンジャーとして記載されている。これらの特許文献は、尿素から放出されるアンモニアを除去することによりウレアーゼを用いて尿素を除去するための酵素的透析系における使用のためのそのような粒子に特に関する。しかし、ここで放出されるアンモニアの合計量は相対的に低い。しかし、酵素阻害の防止のためのそのような粒子のヒダントイナーゼ／カルバモイラーゼ法における使用は、その時から経過した時間において全く提案されていない。
【００２０】
本発明は、所謂ヒダントインルートによる鏡像体に富むアミノ酸の製造における使用に特に適しており、該ヒダントインルートは、任意的にラセマーゼと組み合わされた、ヒダントイナーゼによる対応するヒダントインからのＤ−鏡像体に富むＮ−カルバモイルアミノ酸の製造、続くＤ−カルバモイラーゼにより脱カルバモイル化を含み、ここで脱カルバモイル化が全体的な律速段階である。燐酸塩及び／又は燐酸アンモニウム塩の存在は、ヒダントイナーゼ、カルバモイラーゼ及び／又はラセマーゼに阻害的又は変性させる効果を有しないことが見出された。公知の方法においては、これらの転化が起きるｐＨはほとんど７〜８に存在する。なぜならより高いｐＨ値においては、ＮＨ3の存在のために実質的に完全な酵素の阻害が起きるからである。およそ中性のｐＨにおいて反応を行うことの欠点は、ほとんどの全てのアミノ酸、特に脂肪族のアミノ酸の製造において、後に残っているヒダントイン鏡像体の遅いラセミ化が起きることである。
【００２１】
本発明に従う反応がより高いｐＨ、例えば７.０〜９.０、好ましくは７．５〜８．５のｐＨにおいて行われるとき、酵素阻害はほとんど全く起こらないが、望まれない鏡像体のラセミ化は起きることが今見出された。その結果、ラセミ化がなしで理論的な可能な最大である50％よりずっと高い収率が達成される。
【００２２】
本発明に従う方法は、Ｄ−選択性のヒダントイン−加水分解性及びＮ−カルバモイルアミノ酸―加水分解性酵素を含む微生物を用いて、ＤＬ−Ｎ−カルバモイルアミノ酸が、Ｄ−鏡像体に富む対応するアミノ酸、及び鏡像体に富む転化されなかったＬ−Ｎ−カルバモイルアミノ酸に転化される分割方法においてもまた使用されることができる。該反応は高められたｐＨ（例えば７．５〜９）において行われることができるので、Ｌ−Ｎカルバモイルアミノ酸の損失はより少ない、なぜなら高められたｐＨにおいてヒダントイナーゼの反応は進行しないからである。
【実施例１】
【００２３】
３４ｇのＤＬ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンのヒダントイン及び３４ｇのＭｇＨＰＯ4・３Ｈ2Ｏが２００ｍｌの水に添加された。反応混合物のｐＨが５ＮＮａＯＨによりｐＨ＝７．２に調節されたのち、３４ｍｌのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの細胞サスペンジョンの添加により反応が開始された。反応は窒素雰囲気下４０℃において行われた。反応混合物のｐＨは、５ＮのＮａＯＨの添加によりｐＨ７．２において一定に保たれた。ＨＰＬＣ分析により、＞９９％の添加率が１０時間の加水分解後にすでに達成されたことが確認された。
【００２４】
比較実験１
実施例１に記載されたものと共通の条件下であるが燐酸塩のない状態において、３４ｇのＤＬ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンのヒダントインが加水分解された。３４ｍｌの同じＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの細胞サスペンジョンの添加により反応が開始された。反応は窒素雰囲気下４０℃において行われた。反応混合物のｐＨは、１．３ＭのＨ3ＰＯ4による自動的滴定によりｐＨ＝７．２において一定に保たれた。反応の進行はＨＰＬＣ分析により定期的に確認された。約１０時間の加水分解後、約５７％の転化率が得られたことが記録された。３０時間後に測定された転化率は＞９９％まで達した。
【実施例２】
【００２５】
ＤＬ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンのヒダントインの加水分解が、１２２ｇのこの化合物を１２２ｇのＭｇＨＰＯ4・３Ｈ2Ｏともに５７５ｍｌの水に添加することにより行われた。この混合物のｐＨは５ＮのＮａＯＨでｐＨ＝７．２に調節され、その後窒素ガスが１時間通された。酵素的転化は、８ｍｌのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの細胞サスペンジョンの添加により開始された。反応混合物のｐＨは、ＮａＯＨ（２５重量％）の添加によりｐＨ＝７．２において一定に保たれた。全部で１９ｇのＮａＯＨの消費が記録された。９５時間の加水分解後、９９．３％の転化率が測定された。
【００２６】
比較実験２
実施例２に記載されたのと共通の条件下、ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンのヒダントイン（１２２ｇ）が５７５ｍｌの水に４０℃において添加された。ｐＨが５ＮのＮａＯＨで７．２に調節された後、窒素ガスが１時間通された。反応は、３０ｍｌの同じＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの細胞サスペンジョンの添加により開始された。ｐＨは３３重量％のＨ3ＰＯ4溶液でｐＨ７．２において一定に保たれた。９５時間の加水分解後、９８．７％の転化率が測定された。９７．５時間の加水分解後に測定された転化率は、９９．３％に達した。
【実施例３】
【００２７】
４０℃において、１７６ｇのＤＬ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンのヒダントイン及び１７６ｇのＭｇＨＰＯ4・３Ｈ2Ｏが５１０ｍｌの水に添加された。この反応混合物は、１時間窒素により不活性化された（ｉｎｅｒｔｉｓｅｄ）。酵素的転化は１５ｍｌのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの細胞サスペンジョンの添加により開始された。反応混合物のｐＨは５ＮのＮａＯＨを用いる自動的滴定によりｐＨ＝７．２において一定に保たれた。ＨＰＬＣ分析により、１２０時間の加水分解後の転化率が９９．８％に達したことが確認されることができた
【００２８】
比較実験３
４０℃において、１７６グラムのＤＬ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンのヒダントインが５５７ｍｌの水に添加され、５ＮのＮａＯＨでｐＨは７．２に調節された。この反応混合物は、１時間窒素により不活性化された。酵素的転化は次に５６ｍｌのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの細胞サスペンジョンが添加された。反応混合物のｐＨは３３重量％のＨ3ＰＯ4を用いる自動的滴定によりｐＨ＝７．２において一定に保たれた。ＨＰＬＣ分析により、転化率は１４６．５時間の加水分解後には９６．５％、１８０時間の加水分解後には９９．８％であることが確認されることができた。
【実施例４】
【００２９】
実施例２に記載されたように得られた反応混合物が、約１３０ｇのＨ2ＳＯ4(９８重量％)でｐＨ＝１に酸性化され、その後、細胞残渣が精密濾過により除去された。停留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）は１００ｇの水を用いてディアフィルターで濾過された（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ）。集められた水性相は約６００ｍｌの体積まで部分的に気化された。約６３ｇのＮａＯＨ（５０％）が得られた残渣に、ｐＨが３．５になるまで添加され、生成されるＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンが分離され、数回洗浄された。この段階の濾液に約５３ｇのＮａＯＨ(５０重量％)が８．５のｐＨまで添加され、その後、生成されたＭｇＮＨ4ＰＯ4が分離されることができた。
【００３０】
ＭｇＮＨ4ＰＯ4は２回５０ｍｌの水で洗浄され、その後、水の中に懸濁された。次に、水とアンモニアとの混合物が減圧下、気化された。
【００３１】
最終的に、１０１．７ｇのＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン及び１１８グラムのＭｇＮＨ4ＰＯ4・３Ｈ2Ｏが得られた。
【実施例５】
【００３２】
実施例２に記載されたように得られた反応混合物のｐＨは、約７０ｇのＮａＯＨ（５０重量％）でｐＨ＝１０に調節された。反応混合物は濾過され、その後、残渣は１００ｍｌの水で２回洗浄された。この段階の濾液は精密濾過装置を通過させられ、いかなる細胞残渣も除去された。停留物は数回洗浄された。透過物は次に約４０ｇのＨ2ＳＯ4で３．５のｐＨまで酸性化され、その上でＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンが結晶する。分離、洗浄、及び乾燥後、１０２ｇの収量のＤ−ｐ−フェニルヒドロキシグリシンが得られた。
【実施例６】
【００３３】
ＤＬ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンのヒダントインのＤ−（−）−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンへの転化は様々なｐＨ値において行われた。
【００３４】
３４ｇ（１７７ｍｍｏｌ）のＤＬ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンのヒダントイン及び３４ｇのＭｇＨＰＯ4・３Ｈ2Ｏが２００ｍｌの水に添加された。反応混合物は５ＮのＮａＯＨで所望されるｐＨにされ、その後、３．０ｍｌのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの細胞サスペンジョンの添加により反応が開始された。反応は窒素雰囲気下、４０℃において行われた。反応混合物のｐＨは５ＮのＮａＯＨを用いる自動滴定により、所望されるｐＨにおいて保たれた。これらの実験の結果は表１に示される。この表は＞９９％の転化が達成される反応時間を与える。
【００３５】
【表１】
2004521623.tif 000002
【実施例７】
【００３６】
４０℃において３０ｇのＤＬ−Ｎ−カルバモイル−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン及び３４ｇのＭｇＨＰＯ4・３Ｈ2Ｏが２００ｍｌの水に添加された。反応混合物のｐＨは約１５ｇ４２％のＫＯＨでｐＨ８．０に調節された。次に窒素雰囲気下、１３ｍｌのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの細胞サスペンジョンが添加された。反応混合物のｐＨはｐＨ８．０において一定に保たれた。反応混合物の組成はＨＰＬＣ分析により監視された。２７時間の反応時間後、４．３重量％のＤ−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン濃度、及び５．４重量％のＬ−Ｎ−カルバモイル−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシン濃度が測定された。反応混合物の組成は続いて一定のままであった。
【実施例８】
【００３７】
１５ｇのＤＬ−バリンヒダントイン及び２０ｇのＭｇＨＰＯ4・３Ｈ2Ｏが２００ｍｌの水に添加された。５ＮのＮａＯＨの添加によりｐＨが８に調節された後、１５ｍｌのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒの細胞サスペンジョンの添加により開始された。反応は４０℃において窒素雰囲気下行われた。反応のｐＨが５ＮのＮａＯＨの添加により、ｐＨ＝８において一定に保たれた。１６時間の加水分解の後、５２ｇ／ｌのＤ−バリン濃度が測定され、これはＤＬ−バリンヒダントインに基づくと＞９９％の転化率に相当する。
【国際公開パンフレット】
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