(57)【要約】糖の構造を改変するための方法が提供される。本発明は、非天然の糖（例えば、新規なグリコシル化ポリケチド）を含む代謝産物を生じる種々の糖生合成経路から糖遺伝子の補充および共同作用を介する特定の代謝産物についての糖構造多様性を変更するための方法を提供する。この変更は、遺伝子操作を介してインビボで達成され得る。例えば、本発明の方法は、非天然の糖構造を有する新規なポリケチドを生成するように遺伝子操作された改変された組換え細菌宿主細胞を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖を含む産物を生成する改変された組換え細菌宿主細胞であって、該糖は、対応する組換え細菌宿主細胞または非組換え細菌宿主細胞によっては生成されず、該改変された組換え宿主細胞および該組換え宿主細胞は、少なくとも１つの糖生合成酵素をコードする核酸配列中に破壊を含み、該改変された組換え宿主細胞は、少なくとも１つの核酸セグメントを含み、該核酸セグメントは、該核酸配列によってコードされる酵素のホモログである少なくとも１つの糖生合成酵素をコードし、そして該改変された組換え宿主細胞によって生成された産物上の糖は、組換え宿主細胞または非組換え宿主細胞の対応する産物上の糖の立体異性体ではない、改変された組換え細菌宿主細胞。
【請求項２】
前記改変された組換え宿主細胞によって生成される産物が、グリコシル化ポリケチドである、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項３】
前記産物が、マクロライド、アントラサイクリン、アングサイクリン、アバメクチン、ミルべマイシン、テトラサイクリン、ポリエン、ポリエーテル、アンサマイシンまたはイソクロマンキノンである、請求項２に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項４】
前記破壊された核酸配列がデソサミンをコードする、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項５】
前記改変された組換え宿主細胞が、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓである、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項６】
請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞であって、前記核酸セグメントが、ストレプトマイシン、カルボマイシン、タイロシン、スピラマイシン、ストレプトスライシン、エリスロマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、クロロエレマイシン、メチマイシン、ピクロマイシン、ウラマイシン、グラナチシン、オレアンドマイシン、ランドマイシン、テトラセノマイシン、ドキソルビシン、ミトラマイシン、エピルビシン、ダウノルビシン、カリチェアミシンまたはナイスタチンを生成する細胞から得られる、改変された組換え宿主細胞。
【請求項７】
ＤｅｓＩまたはＤｅｓＶＩＩＩをコードする前記核酸配列が、破壊されている、請求項４に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項８】
前記核酸セグメントがデヒドラーゼをコードする、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項９】
前記核酸セグメントがレダクターゼをコードする、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１０】
前記核酸セグメントがＴＤＰ−糖シンターゼをコードする、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１１】
前記核酸セグメントがＴＤＰ−糖デヒドラターゼをコードする、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１２】
前記核酸セグメントがアミノトランスフェラーゼをコードする、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１３】
前記核酸セグメントがＮ−メチルトランスフェラーゼをコードする、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１４】
前記核酸セグメントがトートメラーゼをコードする、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１５】
前記核酸セグメントが、核酸配列によってコードされる前記酵素のホモログである酵素をコードする、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１６】
少なくとも２つの異なる核酸セグメントを含む、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１７】
前記核酸セグメントの１つが、エピメラーゼをコードする、請求項１６に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１８】
前記核酸セグメントの１つが、ジヒドロストレプトースシンターゼをコードする、請求項１６に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項１９】
前記核酸セグメントが、ＣａｌＨをコードする、請求項１または７に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項２０】
前記核酸配列がＤｅｓＩをコードし、そして前記核酸セグメントがＳｔｒＬおよびＳｔｒＭをコードする、請求項１６に記載の改変された組換え宿主細胞。
【請求項２１】
対応する非組換え宿主細胞または組換え宿主細胞によって生成されない、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞によって生成される産物。
【請求項２２】
マクロライドを含む、請求項２１に記載の産物。
【請求項２３】
生物学的に活性である、請求項２１に記載の産物。
【請求項２４】
ポリケチドである、請求項２１に記載の産物。
【請求項２５】
変更された糖成分を有する産物を調製するための方法であって、該方法は、対応する非組換え宿主細胞または組換え宿主細胞によって生成される産物と比較して変更された糖成分を有する産物を生じるように、請求項１に記載の改変された組換え宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
改変された組換え宿主細胞によって生成された産物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ）改変された組換え宿主細胞を生じるように少なくとも１つの発現カセットに組換え宿主細胞を導入する工程であって、ここで、該組換え宿主細胞は、少なくとも１つの糖生合成酵素をコードする核酸配列の少なくとも一部分中に破壊を含み、ここで、該発現カセットは、該核酸配列によってコードされる少なくとも１つの酵素と異なる糖生合成酵素をコードする核酸セグメントを含む、工程；および
ｂ）該改変された組換え宿主細胞が、該組換え宿主細胞によって生成される産物と異なる産物を生成するか否かを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２７】
改変された組換え宿主細胞を調製するための方法であって、該方法は、該改変された組換え宿主細胞を生じるように、少なくとも１つの発現カセットに組換え宿主細胞を導入する工程を包含する方法であって、ここで、該組換え宿主細胞は、少なくとも１つの糖生合成酵素をコードする核酸配列の少なくとも一部分中に破壊を含み、ここで、該発現カセットは、該核酸配列によってコードされる少なくとも１つの酵素と異なる糖生合成酵素をコードする核酸セグメントを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（政府の権利の陳述）
本発明は、米国政府の助成金（国立衛生研究所からの助成金ＧＭ４８５６２、ＧＭ３５９０６、ＧＭ５４３４６およびＧＭ５８１９６）を用いて行なった。政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００２】
（発明の背景）
自然は、ほとんどの薬物が導かれる生みの親であり続け、多数の複雑な二次代謝産物によってもたらされる合成課題を与え続け、コンビナトリアル生合成の分野の出現によって、改変された非天然の骨格についての豊富な新しい供給源となっている（Ｋａｔｚら、１９９３；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９９５；Ｃａｒｒｅｒａｓら、１９９７；Ｊａｃｏｂｓｅｎら、１９９７；Ｃａｎｅら、１９９８；Ｍａｒｓｄｅｎら、１９９７；ＭｃＤａｎｉｅｌら、１９９９）。しかし、多数の天然に存在する生理活性二次代謝産物（例えば、ポリケチド）は、生物学的活性に重要な分子認識エレメントとして機能する変わった炭水化物リガンドを保有する（Ｏｍｕｒａ，１９８４；Ｗｅｙｍｏｕｔｈ−Ｗｉｌｓｏｎ，１９９７）。これらの必須な糖結合なしで、ほとんどの臨床的に重要な二次代謝産物の生物学的活性は、完全に無効にされるかまたは劇的に減少されるかのいずれかである。特定の二次代謝産物の最終グリコシル化を担うグルコシルトランスフェラーゼは、ヌクレオチド糖ドナーに対して高度の乱雑性を示す（Ｚｈａｏら、１９９８ａ；Ｚｈａｏら、１９９８ｂ；Ｂｏｒｉｓｏｖａら、１９９９；Ｗｅｂｅｒら、１９９１；Ｄｅｃｋｅｒら、１９９５；Ｓａｓａｋｉら、１９９６；Ｓｏｌｅｎｂｅｒｇら、１９９７；Ｍａｄｄｕｒｉら、１９９８；Ｓａｌａｈ−Ｂｅｙら、１９９８；Ｇａｉｓｓｅｒら、１９９８；Ｗｏｈｌｅｒｔら、１９９８）。これらの発見は、コンビナトリアル様式で、天然または非天然の二次代謝産物の骨格の重要なグリコシル化パターンを改変するための対応する生合成経路の操作の可能性に対するドアを空けた。現在まで、任意の所定の代謝産物についての炭水化物添加物の遺伝子操作は、一般的に、その炭水化物部分を構築および結合することが必要な遺伝子の小さい部分集合の変更および／またはノックアウトに限定されてきた（Ｍａｄｄｕｒｉら、１９９８；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９９８；Ｗｏｈｌｅｒｔら、１９９８）。
【０００３】
従って、必要とされていることは、特定の代謝産物についての糖添加物を有意に改変または変更する方法である。
【０００４】
（発明の要旨）
本発明は、非天然の糖（例えば、新規なグリコシル化ポリケチド）を含む代謝産物を生じる種々の糖生合成経路から糖遺伝子の補充および共同作用を介する特定の代謝産物についての糖構造多様性を変更するための方法を提供する。この変更は、遺伝子操作を介してインビボで達成され得る。例えば、本発明の方法は、非天然の糖構造を有する新規なポリケチドを生成するように遺伝子操作された改変された組換え細菌宿主細胞を提供する。本発明の改変された組換え宿主細胞を調製するために、異種（例えば、非ネイティブまたは異なる）糖生合成経路由来の糖生合成遺伝子、またはインビトロで改変されかつネイティブな（野生型）酵素とは異なる活性または特異性を有する酵素をコードする遺伝子は、遺伝子によってコードされる酵素の基質を生成する組換え宿主細胞に導入され、新規な産物（すなわち、対応する組換え宿主細胞によって生成されない産物）を生成する改変された組換え宿主細胞を生じる。好ましくは、改変された組換え宿主細胞由来の産物は、対応する野生型細胞由来の天然に存在する産物上の糖（例えば、天然に存在する産物上の糖の立体異性体ではない改変された産物上の糖）とは有意に異なる糖を含む。また好ましくは、組換え宿主細胞および改変された組換え宿主細胞は、遺伝子改変され、その結果、その細胞中の（例えば、糖生合成遺伝子クラスターにおける）糖生合成の少なくとも１つの遺伝子は、例えば、挿入または欠失を介して破壊され、破壊される生合成経路における中間体の蓄積を生じる。この破壊は、細胞のゲノム中に存在する核酸配列に存在し得るか、または細胞中の染色体外エレメント中に存在する核酸配列に存在し得る。従って、本発明は、ポリケチドおよび他の糖含有分子（生物学的に活性であるかもしくは活性化され得る）のライブラリーを作製するために有用である。例えば、産物がアセチル化糖である場合、デアセチラーゼを使用して、産物を生物学的に活性にし得る。さらに、このようなライブラリーのバイオアベイラビリティーは、薬物発見の時間を非常に減少し得る。
【０００５】
以下に記載されるように、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓのカリチェアミシン経路由来の４−ケトヘキソースアミノトランスフェラーゼ遺伝子（ｃａｌＨ）は、メチマイシン／ピクロマイシン経路中の４−デヒドラーゼ（ｄｅｓＩ）が欠失するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅの変異株中に導入された。ｄｅｓＩ遺伝子の欠失は、ＣａｌＨの基質である４−ケト−６−デオキシグルコース中間体の蓄積を生じる。結果として、この変異体におけるｃａｌＨの異種発現は、２つのメチマイシン／ピクロマイシン−カリチェアミシンハイブリッドの２つの生成を生じる。これらの結果は、対応するグリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）の無差別の性質を強化するだけでなく、遺伝子の組み合わせの合理的な選択を介する二次代謝産物のグリコシル化を操作する能力を明確に示す。さらに、この結果は、ｃａｌＨ遺伝子が、カリチェアミシン経路のＴＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｌ−トレオ−４−ヘキスロース−４−アミノトランスフェラーゼをコードすることを確認する。
【０００６】
また本明細書中に記載されるように、種々のＬ−糖がマクロライドのような代謝産物に組み込まれている場合、糖の構造的多様性の有意な拡大が、達成され得る。Ｌ−ジヒドロストレプトース経路から選択された遺伝子（例えば、それぞれ６−デオキシ−４−ヘキスロース３，５−エピメラーゼおよびジヒドロストレプトースシンターゼをコードするＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓのｓｔｒＭ遺伝子およびｓｔｒＬ遺伝子）の異種発現は、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ変異体中で達成された。操作されたＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ株の増殖は、一連のメチマイシン／ピクロマイシンアナログ（各々Ｌ−ラムノースを保有する）の蓄積を生じた。これらの新しい誘導体の形成は、デソサミングルコシルトランスフェラーゼＤｅｓＶＩＩの緩やかな基質特異性およびハイブリッド経路の再構築による新規な代謝産物の調製の実現可能性を確認した。さらに、これらの結果は、ＳｔｒＭおよびＳｔｒＬの協同的機能の証拠を提供し、そしてジヒドロストレプトース生合成経路およびアピオース生合成経路の密接な類似点を確立した。
【０００７】
従って、本発明は、少なくとも１つの糖生合成酵素をコードする少なくとも１つの核酸セグメントを含む改変された組換え細菌宿主細胞を提供する。好ましくは、本発明の核酸セグメントは、グルコシルトランスフェラーゼまたはポリケチドシンターゼ配列のような任意の他の非糖生合成配列をコードしない。改変された組換え宿主細胞は、１以上の核酸セグメントを含み得、各々の核酸セグメントは、異なる酵素をコードするか、または１つの核酸セグメントは、１つ以上の酵素をコードする。改変された組換え宿主細胞はまた、好ましくは、破壊された核酸配列を含み、これは、核酸セグメントによってコードされる酵素の経路と異なる経路に由来する少なくとも１つの糖生合成酵素をコードする野生型宿主細胞中の核酸配列に対応する。例えば、破壊されていない野生型核酸配列は、デヒドラーゼ、レダクターゼ、ＴＤＰ−糖シンターゼ、ＴＤＰ−糖デヒドラターゼ、アミノトランスフェラーゼ、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ、および／またはトートメラーゼ（ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ）をコードし得る。破壊は、核酸セグメントによってコードされる酵素の基質の蓄積を生じ、従って新規な糖を生じる。改変された組換え宿主細胞はまた、好ましくは、新規な糖が結合した産物（例えば、別の分子（例えば、アグリコンのようなポリケチド）に新規な糖を移してマクロライドのような新規の産物を生じるネイティブな（内因性の）グルコシルトランスフェラーゼ）を生成する。あるいは、緩やかな基質特異性を有するグルコシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子はまた、改変された組換え宿主細胞中の別の分子に新規な糖を結合する酵素を提供するように、組換え宿主細胞に導入され得る。
【０００８】
本発明における使用のための好ましい細胞は、ポリケチドのような代謝産物、糖を有するかまたは糖を収容するように改変され得る抗癌剤または抗生物質を生成する任意の細胞を含む。抗生物質生成細胞としては、Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられるがこれらに限定されず、これらは、抗生物質を生成するか、または発現される場合に、抗生物質もしくは他の生物学的に活性な化合物を生成する遺伝子を含むかのいずれかである（例えば、遺伝子ｓｎｏ、ｓｔｒ、ｔｙｌ、ｃａｒ、ｓｒｍ、ｔｅｔ、ａｃｔ、ｇｒａ、ｔｃｍ、ｍｉｔ／ｍｍｃ、ｅｌｍ、ｓａｌ、ｒｉｆ、ｇｒｓ、ｓｒｆ、ｂａｃ、ｄａｕ、ｓｔｙ、ｄｎｒ、ｓｎａ、ｆｒｅｎ、ａｖｒ、ｏｌｅ、ｕｒｄ、ｅｒｙ、またはそれらの任意の組み合わせを含む任意の細胞）。ポリケチドを天然に生成する放線菌類の例としては、
【０００９】
【数１】
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が挙げられるが、これらに限定されない。ポリケチドを天然に生成するポリケチド生成微生物の他の例としては、種々のＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ、ＤａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍおよびＮｏｃａｒｄｉａ株が挙げられる。好ましいＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．としては、
【００１０】
【数２】
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が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
さらに、これらの同じ細胞は、本発明の核酸セグメントの好ましい供給源である。従って、糖生合成遺伝子をコードする任意の細胞は、本発明の核酸セグメントの供給源である。例えば、核酸セグメントの供給源は、ストレプトマイシン、カルボマイシン、タイロシン、スピラマイシン、ストレプトスライシン、エリスロマイシン、バンコマイシン、テイコプラニン、クロロエレマイシン（ｃｈｌｏｒｏｅｒｅｍｙｃｉｎ）、メチマイシン（ｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）、ピクロマイシン（ｐｉｋｒｏｍｙｃｉｎ）、ウラマイシン（ｕｒａｍｙｃｉｎ）、グラナチシン（ｇｒａｎａｔｉｃｉｎ）、オレアンドマイシン、ランドマイシン（ｌａｎｄｏｍｙｃｉｎ）、テトラセノマイシン（ｔｅｔｒａｃｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン、ミトラマイシン、エピルビシン、およびダウノルビシンを生成する細胞を含むがこれらに限定されない、糖を有する化合物、またはカリチェアミシンまたはナイスタチンのような他の糖含有化合物を生成する細胞である。これらは、本発明の実施における使用のための核酸セグメントの範囲内に含まれる。
【００１２】
本発明の１つの実施形態において、デソサミン（ｄｅｓｏｓａｍｉｎｅ）生合成を変更するようにデソサミン生合成における酵素の少なくとも１つをコードする核酸配列が破壊されており、そしてこの核酸配列の非破壊形態によってコードされている酵素のホモログをコードする核酸セグメントで増強されている組換え宿主細胞は、改変された組換え宿主細胞を生じる。１つの実施形態において、改変された組換え宿主細胞は、ｄｅｓＩにおける破壊を有さず、そしてｃａｌＨ核酸セグメントから構成されない。参照糖生合成酵素の「ホモログ」は、参照生合成酵素の基質を認識し得、そして反応を触媒し得る酵素である。例えば、ＴｙｌＢは、ＤｅｓＩのホモログであり、ＣａｌＨは、ＤｅｓＩのホモログであり、ＳｔｒＬおよびＳｔｒＭは共に、ＤｅｓＩのホモログであり、そしてＴｙｌＭ２は、ＤｅｓＶＩのホモログである。好ましいホモログは、産物（例えば、糖生合成における中間体）（これは、参照酵素の産物と異なる）を生成する反応を触媒する。ホモログは、本明細書中に記載されるような方法を使用して機能的に同定され得る。一般的に、ホモログは、参照酵素に対して少なくとも約２８％のアミノ酸配列同一性を有する。
【００１３】
本発明における使用のための核酸セグメントを同定するための他の方法は、ハイブリダイゼーション、または、例えば、デフォルト設定を使用するコンピューター補助配列整列による。本発明の１つの実施形態において、本発明の核酸配列は、低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、本発明の核酸セグメントにハイブリダイズする。低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）の９．４７〜９．５１節を参照のこと。例えば、ストリンジェントな条件は、（１）洗浄のための低いイオン強度および高温を使用する（例えば、５０℃で、０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）；０．１％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））、または（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドのような変性剤を使用する（例えば、４２℃で、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いてｐＨ６．５で５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を有する５０％ホルムアミド）。例示的な低ストリンジェンシー条件は、３７℃で、３０〜３５％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液でのハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃での１×〜２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍクエン酸三ナトリウム）中の洗浄を含む。例示的な中程度のストリンジェンシー条件は、３７℃で、４０〜４５％ホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション、および５０〜６０℃での０．５×〜１×ＳＳＣ中の洗浄を含む。例示的な高ストリンジェンシー条件は、３７℃で、５０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション、および６０〜６５℃での０．１×ＳＳＣ中の洗浄を含む。
【００１４】
本発明の改変された組換え宿主細胞を調製する方法、およびこれらを使用する方法（例えば、生物学的に活性な産物または生物学的に活性な産物に改変され得る産物を調製するための方法）もまた提供される。
【００１５】
本発明はまた、単離されかつ精製された核酸セグメントを提供し、この核酸セグメントは、糖（デソサミン）生合成遺伝子クラスター、生物学的に活性なその改変体またはフラグメントを含む核酸配列を含み、ここで、この核酸配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａのｅｒｙＣ遺伝子クラスターに由来しない。この遺伝子クラスターを含む単離された核酸セグメントとしては、好ましくは、配列番号３（本明細書中で参考として援用される、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１４３９８を参照のこと）またはそのフラグメントもしくは改変体を含む核酸配列が挙げられる。このクラスターは、９個のポリペプチド（ＤｅｓＩ（例えば、配列番号７によってコードされる配列番号８）、ＤｅｓＩＩ（例えば、配列番号９によってコードされる配列番号１０）、ＤｅｓＩＩＩ（例えば、配列番号１１によってコードされる配列番号１２）、ＤｅｓＩＶ（例えば、配列番号１３によってコードされる配列番号１４）、ＤｅｓＶ（例えば、配列番号１５によってコードされる配列番号１６）、ＤｅｓＶＩ（例えば、配列番号１７によってコードされる配列番号１８）、ＤｅｓＶＩＩ（例えば、配列番号１９によってコードされる配列番号２０）、ＤｅｓＶＩＩＩ（例えば、配列番号２１によってコードされる配列番号２２）、およびＤｅｓＲ（例えば、配列番号２３によってコードされる配列番号２４）を含む）をコードすることが見出された（図１を参照のこと）。ＤｅｓＲをコードする本発明の核酸セグメントが、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａのｅｒｙＢ遺伝子クラスターにもＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓのｏｌｅＤ遺伝子にも由来しないこともまた好ましい。好ましくは、デソサミン生合成遺伝子クラスターを含む核酸セグメントは、中程度以上の好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号３またはそのフラグメントにハイブリダイズする。
【００１６】
本発明はまた、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４またはこれらのフラグメントを含むアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９５％であるが１００％未満の、連続アミノ酸配列同一性を有する改変体ポリペプチドを提供する。本発明の好ましい改変体ポリペプチド、またはポリペプチドのサブユニットもしくはフラグメントとしては、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２または配列番号２４を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性の、少なくとも約１％、より好ましくは少なくとも約１０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも約５０％を有する改変体ポリペプチドまたはサブユニットポリペプチドが挙げられる。従って、例えば、配列番号２０のポリペプチドのグリコシルトランスフェラーゼ活性は、配列番号２０に対して少なくとも１つのアミノ酸の置換、挿入または欠失を有する配列番号２０の改変体に匹敵し得る。
【００１７】
本発明の改変体核酸配列は、配列番号３、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３またはこれらのフラグメントを含む核酸配列に対して、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも約９５％であるが１００％未満の連続核酸配列同一性を有する。
【００１８】
宿主細胞において機能的なプロモーターに作動可能に連結された、デソサミン生合成遺伝子クラスター、その生物学的に活性な改変体もしくはフラグメントを含む核酸配列を含む発現カセット、ならびに本発明の発現カセットを含む宿主細胞もまた提供される。従って、本発明の発現カセットは、クラスター内の個々の遺伝子（例えば、グリコシダーゼをコードするｄｅｓＲ遺伝子、またはポリケチドおよびデスオキシ糖に対する緩和された基質特異性を有する（すなわち、このグリコシルトランスフェラーゼは、ＴＤＰ−デソサミン以外の糖基質をプロセスする）グリコシルトランスフェラーゼをコードするｄｅｓＶＩＩ遺伝子）を発現するために有用である。従って、このｄｅｓＶＩＩ遺伝子は、種々のポリケチド基質およびデスオキシ糖基質を有するマクロライド化合物のライブラリーを合成するための組み合わせ生物学的アプローチにおいて使用され得る。さらに、マクロライド抗生物質を発現する宿主細胞におけるグリコシダーゼの発現は、抗生物質の毒性を減少させる（例えば、不活化する）ための方法において有用であり得る。例えば、抗生物質を産生する宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼをコードする発現カセットによって形質転換される。この組換えグリコシルトランスフェラーゼは、抗生物質を可逆的に不活化する量で発現される。抗生物質を不活化するために、この抗生物質は、好ましくは、宿主細胞から回収された単離された抗生物質であり、適切なネイティブまたは組換えのグリコシダーゼと接触される。
【００１９】
好ましくは、本発明の発現カセット中のデソサミンをコードする核酸セグメントは、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａのｅｒｙＣ遺伝子クラスターに由来しない。好ましい宿主細胞は、原核生物細胞であるが、真核生物細胞もまた想定される。これらの宿主細胞は、デソサミン、そのアナログもしくは誘導体、ならびにこの宿主細胞から次いで単離され得る個々のポリペプチドを発現するために有用である。デソサミン生合成遺伝子クラスターの少なくとも一部に由来するアンチセンス配列を含む発現カセットまたは宿主細胞もまた提供される。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、組換え宿主細胞（例えば、細菌細胞）であり、この宿主細胞において、デソサミン合成を変更するように、好ましくはデソサミン合成の減少もしくは欠如を生じるように、および／またはデソサミンのアナログもしくは誘導体の合成を生じるように、宿主染色体のデソサミンコード核酸配列の少なくとも一部が、異種配列によって破壊された（例えば、欠失または遮断された（例えば、挿入によって））か、または本発明の改変体核酸配列で置換される。好ましくは、破壊される核酸配列は、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａのｅｒｙＣに由来しない。従って、本発明の組換え宿主細胞は、破壊された少なくとも１つの遺伝子（すなわち、ｄｅｓＩ、ｄｅｓＩＩ、ｄｅｓＩＩＩ、ｄｅｓＩＶ、ｄｅｓＶ、ｄｅｓＶＩ、ｄｅｓＶＩＩ、ｄｅｓＶＩＩＩまたはｄｅｓＲ）を有する。本発明の１つの実施形態は、組換え宿主細胞を含み、この宿主細胞において、ｄｅｓＶＩ遺伝子（これは、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードする）が、例えば、抗生物質耐性遺伝子での置換によって破壊されている。好ましくは、このような宿主細胞は、Ｎ−アセチル化アミノデスオキシ糖、１０−デオキシ−メチロニド（ｍｅｔｈｙｌｏｎｉｄｅ）、式（７）の化合物、式（８）の化合物またはこれらの組み合わせを有するアグリコンを産生する。従って、ｄｅｓＶＩ遺伝子の欠失または破壊は、新規糖を調製するための方法において有用であり得る。
【００２１】
本発明の別の好ましい実施形態は、組換え細菌宿主細胞であり、この細菌宿主細胞において、ｄｅｓＲ遺伝子（これは、β−グリコシダーゼのようなグリコシダーゼをコードする）が破壊されている。好ましくは、この宿主細胞は、Ｃ−２’β−グリコシル化マクロライド抗生物質（例えば、式（１３）の化合物、式（１４）の化合物またはこれらの組み合わせ）を合成する。従って、本発明はさらに、式（８）、（９）、（１３）または（１４）の化合物を提供する。不斉中心を有する本発明の化合物の各原子が、光学活性形態およびラセミ形態で存在し得、そして単離され得ることが、当業者に明らかである。いくつかの化合物は、多型を示し得る。本発明が、本発明の化合物の任意のラセミ形態、光学活性形態、多型形態もしくは立体異性体形態またはこれらの混合物（これらは、本明細書中に記載される有用な特性を有する）を包含し、（例えば、再結晶技術によるラセミ形態の分解によって、光学活性出発物質からの合成によって、キラル合成によって、またはキラル固定相を使用するクロマトグラフィー分離によって）光学活性形態を調製する方法、および本明細書中に記載される標準的試験を使用するか、または当該分野で周知の他の類似の試験を使用することによって、活性を決定するための方法が周知であることが理解される。
【００２２】
ポリケチド産生微生物の遺伝子操作によって、特定のグリコシル化修飾ポリケチドの生合成を指向するための方法もまた、提供される。この方法は、ポリケチド産生微生物に糖生合成（例えば、デソサミン生合成）のための酵素をコードするＤＮＡ配列（例えば、配列番号３、その改変体またはフラグメントを含むＤＮＡ配列を導入して、特定のグリコシル化修飾ポリケチドを産生する微生物を得る工程を包含する。あるいは、本発明のアンチセンスＤＮＡ配列が使用され得る。次いで、このグリコシル化修飾ポリケチドを、微生物から単離する。糖生合成またはポリケチドへの糖の付加における、少なくとも１つの酵素活性の不活化を生じるように、ＤＮＡ配列が改変されることが好ましい。
【００２３】
本発明の組換え宿主細胞によって産生される化合物（産物）および改変された組換え宿主細胞は、生物学的に活性な薬剤として特に有用であり得、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト）における病理学的状態または症状の処置のための医薬を調整するために有用である。従って、この産物としては、医薬（例えば、化学療法剤、免疫抑制剤、喘息、慢性閉塞性肺疾患ならびに呼吸器炎症を含む他の疾患を処置するための薬剤、コレステロール低下剤、または種々の生物（例えば、多剤耐性肺炎球菌および他の呼吸器病原体、ならびにウイルスおよび寄生生物病原体を含む細菌）に対して活性であるマクロライドベースの抗生物質）；または作物保護剤（例えば、殺菌剤または殺虫剤）が挙げられる。例えば、このような治療を必要とする（例えば、細菌、ウイルスまたは寄生生物感染、癌、呼吸器疾患を有する患者）か、あるいは免疫抑制を必要とする（例えば、細胞、組織または器官の移植中に）哺乳動物、鳥類または魚類を処置するための、これらの化合物を使用する方法もまた想定される。
【００２４】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書中で使用される場合、「Ｉ型ポリケチドシンターゼ」は、反復して使用される活性部位の単一セットを有する、単一のポリペプチドである。これは、一連のポリペプチド上の活性部位を使用するＩＩ型ポリケチドシンターゼとは対照的である。
【００２５】
本明細書中で使用される場合、「モジュール」は、多機能タンパク質（例えば、Ｉ型ポリケチドシンターゼまたは脂肪酸シンターゼ）中の一連の反復単位の１つである。
【００２６】
本明細書中で使用される場合、「未成熟最終産物」は、非組換え多機能タンパク質によって産生される産物とは異なる、組換え多機能タンパク質によって産生される産物である。一般に、組み換え多機能タンパク質によって産生される産物は、ほとんどアシル基を有さない。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、「組換え」核酸またはタンパク質（ポリペプチド）分子は、タンパク質をコードする核酸分子がインビトロで修飾され、その結果、その配列が天然には存在しない分子であるか、または修飾されていないゲノム中に位置するようには位置しない、天然に存在する配列には対応しない分子である。
【００２８】
本発明の「組換え」宿主細胞は、糖生合成経路の少なくとも１つの遺伝子の機能または活性を変更する（例えば、減少もしくは破壊するか、あるいは、増大させる）ように、遺伝子操作されている。この操作は、少なくとも１つの遺伝子を含むか、または細胞のゲノムにおける染色体外遺伝的エレメントを生じ得る。対照的に、「野生型」または「非組換え」細胞は、遺伝子操作されていない。組換え細胞における遺伝子操作は、好ましくは、対応する野生型細胞によって産生される産物（化合物）の非存在または対応する野生型細胞によって産生されない産物の産生を生じる。
【００２９】
本発明の「改変された」組換え宿主細胞は、少なくとも１つの単離された核酸セグメントを発現するように、好ましくはプロモーターを含む発現カセット（これは、組換え細胞に導入されて、改変された組換え宿主細胞を形成する）の形態で遺伝子操作された組換え宿主細胞である。改変された組換え宿主細胞における遺伝子操作は、好ましくは、対応する組換え宿主細胞によっても対応する野生型細胞によっても産生されない産物（化合物）の産生を生じる。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、遺伝子または遺伝子クラスターに「由来する」ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡからインビトロで単離および精製されたＤＮＡか、またはゲノムＤＮＡの配列を基礎として合成的に調製されたＤＮＡである。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「ｐｉｋ」または「ｐｉｋ／ｍｅｔ」遺伝子クラスターは、ポリケチドシンターゼ（ｐｉｋＡ）、デソサミン生合成酵素（ｐｉｋＢ、ｄｅｓとも称される）、チトクロムＰ４５０（ｐｉｋＣ）、調節因子（ｐｉｋＤ）および細胞自己耐性のための酵素（ｐｏｉＲ）をコードする配列を含む。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「単離および／または精製された」とは、その天然の細胞環境から、そして細胞の他の成分（例えば、核酸またはポリペプチド）との会合からの、ＤＮＡまたはポリペプチド分子のインビトロの単離をいい、その結果、これは、配列決定、複製および／または発現され得る。例えば、「デソサミン生合成のための酵素をコードする単離されたＤＮＡ分子またはそのフラグメント」は、生物学的に活性なポリペプチド、そのフラグメントまたは改変体をコードし、デソサミン生合成の少なくとも１つの酵素をコードするＲＮＡの非コード鎖に相補的であるか、またはコード鎖に相補的であるか、あるいは当業者に周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）によって定義されるような、低い、中程度もしくは好ましくはストリンジェントな条件下で、デソサミン生合成遺伝子クラスターを含むＲＮＡもしくはＤＮＡにハイブリダイズし、かつ安定な結合を維持する、７より多い、好ましくは１５より多い、そしてより好ましくは２０以上の連続ヌクレオチド塩基を含むＲＮＡまたはＤＮＡである。
【００３３】
「抗生物質」は、本明細書中で使用される場合、天然であるか、または限定された化学的修飾を有するかのいずれかである微生物によって産生される物質であり、別の微生物または真核生物細胞の増殖を阻害するか、またはこれらを殺傷する。
【００３４】
「抗生物質生合成遺伝子」は、一次代謝物を抗生物質に変換するプロセスにおける酵素反応に必要な酵素活性をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、セグメントまたは配列）である。
【００３５】
「抗生物質生合成経路」は、一次代謝物を抗生物質に変換するプロセスに必要な抗生物質生合成遺伝子の完全セットを含む。これらの遺伝子は、当該分野で周知の方法によって単離され得る（例えば、米国特許第４，９３５，３４０号を参照のこと）。
【００３６】
抗生物質産生生物としては、任意の生物が挙げられ、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、ＮｏｃａｒｄｉａおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（これらは、いずれも、抗生物質を産生するか、または発現される場合に抗生物質を産生する遺伝子を含む）。
【００３７】
抗生物質耐性を付与する遺伝子は、抗生物質に対する耐性を付与する酵素または他の活性をコードするＤＮＡセグメントである。
【００３８】
用語「ポリケチド」とは、本明細書中で使用される場合、大きい、多様なクラスの天然産物をいい、これには、抗生物質化合物、殺菌化合物、抗癌化合物および抗寄生生物化合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリケチドとしては、マクロライド、アントラサイクリン、アングサイクリン（ａｎｇｕｃｙｃｌｉｎ）、アバメクチン（ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ）、ミルベマイシン（ｍｉｌｂｅｍｙｃｉｎ）、テトラサイクリン、ポリエン、ポリエーテル、アンサマイシン（ａｎｓａｍｙｃｉｎ）およびイソクロマンキノン（ｉｓｏｃｈｒｏｍａｎｅｑｕｉｎｏｎｅ）などが挙げられるが、これらに限定されない。ポリケチド抗生物質としては、アントラサイクリンおよび異なる型のマクロライド（ポリエンおよびアバマイシンならびにエリスロマイシンのような従来のマクロライド）が挙げられるが、これらに限定されない。マクロライドは、例えば、Ｓ．ｅｒｙｔｈｅｕｓ、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓ．ｆｒａｄｉａｅおよびＳ．ｎａｒｂｏｎｅｎｓｉｓによって産生される。
【００３９】
用語「グリコシル化」は、別の分子に関して、１以上の糖残基を含む分子をいう。
【００４０】
用語「糖（ｓｕｇａｒ）」または「糖（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）」とは、ポリヒドロキシル化されたアルデヒドまたはケトンをいう。ポリヒドロキシル化されたアルデヒドまたはケトンは、必要に応じて、脂質、ペプチドおよび／またはタンパク質に連結され得る。糖は、炭素−水素−酸素核に加えて、さらなる置換基（例えば、アミノ、硫黄またはリン基）を有し得る。２〜１０個の糖単位から構成されるポリマーは、オリゴ糖（ＯＳ）（例えば、単糖、二糖（例えば、ショ糖）および三糖）と称され、１０個以上の糖単位から構成されるポリマーは、多糖（ＰＳ）と称される。これらの単糖構成ブロックは、少なくとも１０の異なる方法で連結されて、天文学的数の異なる組み合わせおよび順列組み合わせを生じ得る。糖としては、例えば、トリオース、ペントースおよびヘキソース、リボース、グルコース、ならびにデオキシ糖（例えば、フルクトース、ラムノースおよびデオキシリボース、ならびに６−デオキシ糖、２，６−デオキシ糖、３，６−デオキシ糖、４，６−デオキシ糖、２，３，６−デオキシ糖（例えば、オリボース（ｏｌｉｖｏｓｅ）、オリオース（ｏｌｉｏｓｅ）、ミカロース（ｍｙｃａｒｏｓｅ）、ロジノース（ｒｈｏｄｉｎｏｓｅ）、ミシノース（ｍｙｃｉｎｏｓｅ））および他の修飾糖（例えば、ミカミノース（ｍｙｃａｍｉｎｏｓｅ）、デソサミン、バンコサミン（ｖａｎｃｏｓａｍｉｎ）およびダウノサミン（ｄａｕｎｏｓａｍｉｎ）を含むアミノ糖）が挙げられる。さらなる適切な糖は、例えば、Ｄ．Ｖｏｅｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９０；Ｌ．Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、（第三版）、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７５；Ｊ．Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、（第二版）、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７７；Ｆ．ＣａｒｅｙおよびＲ．Ｓｕｎｄｂｅｒｇ、Ａｄｂａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｐａｒｔ  Ｂ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、（第二版）、Ｐｌｅｎｕｍ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７７；およびこれらにおいて引用される参考文献）に開示される。糖誘導体は、国際特許出願公開番号ＷＯ９６／３４００５および同ＷＯ９７／０３９９５に記載されるように、簡便に調製され得る。
【００４１】
用語「グリコシル化修飾」とは、特定の分子に関する場合、特定の分子の未修飾状態またはネイティブ状態に対して、変化したグリコシル化パターンまたは構成を有する分子をいう。
【００４２】
用語「ポリケチド産生微生物」は、本明細書中で使用される場合、天然に、または適切に操作（すなわち、遺伝子操作）された後で、ポリケチドを産生し得る任意の微生物を含む。天然にポリケチドを産生する放線菌の例としては、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｒｏｓａｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｍｅｇａｌｏｍｉｃｅａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｅｒｅｔｉｃｕｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｄｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｓｕｋｕｌｕｂａｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｙｃａｒｏｆａｓｃｉｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌａｔｅｎｅｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｏｌａｃｅｏｎｉｇｅｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｉｍｏｓｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｓｅｏｆｕｌｖｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｕｒａｃｏｉおよびＡｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ  ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉが挙げられるが、これらに限定されない。ポリケチドを天然に産生するポリケチド産生微生物の他の例としては、種々のＡｃｔｉｎｏｍａｄｕｒａ、ＤａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍおよびＮｏｃａｒｄｉａ株が挙げられる。
【００４３】
用語「糖生合成遺伝子」とは、本明細書中で使用される場合、糖生合成酵素をコードする、例えば、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｒｇｉｌｌａｃｅｏｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｏｌｉｖａｃｅｕｓのような生物由来の核酸配列またはセグメントをいい、他のポリケチド産生微生物由来の糖生合成ＤＮＡを含むことが意図される。
【００４４】
用語「糖生合成酵素」とは、本明細書中で使用される場合、ポリケチド結合糖ならびにそれらの誘導体および中間体の生合成、および／または結合に関与するポリペプチドをいう。
【００４５】
用語「ポリケチド結合糖」とは、ポリケチドに結合することが既知であるか、またはポリケチドに結合し得る糖をいう。
【００４６】
用語「糖誘導体」とは、ポリケチドと天然に会合するが、非修飾状態またはネイティブ状態に対して変更された糖をいい、Ｎ−３−α−デスジメチルＤ−デソサミンが挙げられるが、これに限定されない。
【００４７】
用語「糖中間体」とは、糖生合成経路で産生される中間体化合物をいう。
【００４８】
本明細書中で使用される場合、用語「誘導体」は、本発明の宿主細胞によって産生されるか、または本発明の核酸分子によってコードされるポリペプチドをインビトロで使用して調製される特定の化合物（産物）を意味し、修飾されて、その結果、他の部分（例えば、ペプチドまたはポリペプチド分子（例えば、抗体またはそのフラグメント）、核酸分子、糖、脂質、脂肪、検出可能なシグナル分子（例えば、放射性同位体（例えば、γ放射体）、小化学物質、金属、塩、合成ポリマー（例えば、ポリラクチドおよびポリグリコリド）、界面活性剤およびグリコサミノグリカン（これらは、共有結合または非共有結合によって、この化合物に結合または連結される）を含む。
【００４９】
不斉中心を有する、本発明の化合物の各原子が、光学活性形態およびラセミ形態で存在し得、そして単離され得ることが、当業者に認識される。いくつかの化合物は、多型を示し得る。本発明が、本発明の化合物の任意のラセミ形態、光学活性形態、多型形態もしくは立体異性体形態またはこれらの混合物（これらは、本明細書中に記載される有用な特性を有する）を包含し、（例えば、再結晶技術によるラセミ形態の分解によって、光学活性出発物質からの合成によって、キラル合成によって、またはキラル固定相を使用するクロマトグラフィー分離によって）光学活性形態を調製する方法、および本明細書中に記載される標準的試験を使用するか、または当該分野で周知の他の類似の試験を使用することによって、活性を決定するための方法が周知であることが理解される。
【００５０】
用語「配列相同性」または「配列同一性」は、２つの核酸配列の間の塩基の一致の比率または２つのアミノ酸配列の間のアミノ酸一致の比率を意味する。配列相同性を百分率（例えば、５０％）として表す場合、この百分率は、何らかの他の配列に対して比較された、配列の長さ全体についての一致の比率を示す。（２つの配列のいずれかにおける）ギャップは、一致を最大にするために許容される；１５塩基以下のギャップ長さが通常用いられ、６塩基以下が好ましく、２塩基以下がより好ましい。オリゴヌクレオチドをプローブとして用いる場合、標的核酸とオリゴヌクレオチド配列との間の配列相同性は一般に、２０の可能なオリゴヌクレオチド塩基対一致のうちの、１７以下の標的塩基の一致（８５％）であり；好ましくは１０の可能な塩基対一致のうちの９以下の一致（９０％）であり、そしてより好ましくは２０の可能な塩基対一致のうちの１９以下の一致（９５％）である。
【００５１】
２つのアミノ酸配列は、それらの配列の間に部分的もしくは完全な同一性が存在する場合、および／または同じもしくは類似の活性を有する場合、相同である。例えば、８５％相同性は、２つの配列を最大に一致するようにアラインメントされた場合にアミノ酸の８５％が同一であることを意味する。（一致させる２つの配列のうちのいずれかにおける）ギャップは、一致を最大にする際に許容される；５以下のギャップ長が好ましく、２以下がより好ましい。あるいは、そして好ましくは、２つのタンパク質配列（またはこれらから誘導された、少なくとも３０アミノ酸長のポリペプチド配列）は、この用語が本明細書において用いられる場合、これらが、変異データマトリクスおよび６以上のギャップペナルティーを用い、プログラムＡＬＩＧＮを用いて（標準偏差単位において）５を超えるアラインメントスコアを有するならば、相同である（Ｄａｙｈｏｆｆ，１９７２）。２つの配列またはその一部はより好ましくは、本明細書中で使用される場合、それらのアミノ酸が２９％以上同一であるならな、相同である。
【００５２】
以下の用語は、２以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列の関係を記載するために用いられる：「参照配列」、「比較ウィンドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）」、「配列同一性」、「配列同一性の百分率」および「実質的同一性」。「参照配列」は、配列比較の基礎として用いられる規定配列である；参照配列は、配列表に与えられる全長ｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントのような、より長い配列のサブセットであり得るか、または完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列を含み得る。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長であり、頻繁に少なくとも２５ヌクレオチド長であり、そしてしばしば少なくとも５０ヌクレオチド長である。２つのポリヌクレオチドは各々（１）この２つのポリヌクレオチド間で類似する配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の一部）を含み得、そして（２）この２つのポリヌクレオチドの間で互いに異なる配列をさらに含み得るので、２つ（以上）のポリヌクレオチドの間の配列比較は代表的に、この２つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって行われる。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、「比較ウィンドウ」とは、少なくとも２０連続したヌクレオチドの概念的セグメントであって、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部が、この２つの配列の最適なアラインメントのために、参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較して２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る、セグメントをいう。比較ウィンドウをアラインメントするための配列の最適なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視によって行われ得、そして種々の方法によって作成された最良のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウにわたって最大の相同性百分率をもたらす）が選択される。好ましくは、デフォルト設定を用い、コンピュータ化アルゴリズムを用いてホモログを同定する。
【００５４】
用語「配列同一性」は、２つのポリヌクレオチド配列が、比較ウィンドウにわたって（すなわち、ヌクレオチ毎に基づいて）同一であることを意味する。用語「配列同一性の百分率」は、２つのポリヌクレオチド配列が、比較ウィンドウにわたって（すなわち、ヌクレオチド毎に基づいて）同一であることを意味する。用語「配列同一性の百分率」は、最適にアラインメントされた２つの配列を比較ウィンドウにわたって比較し、両方の配列において同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）が生じる位置の数を決定して一致した位置の数を得て、一致した位置の数を、比較ウィンドウの位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を乗算して配列同一性の百分率を得ることによって算出される。
【００５５】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的同一性」または「相同性」は、２つのペプチド配列が、（例えば、デフォルトのギャップウェイト（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）を用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによって）最適にアラインメントされた場合、少なくとも約２９パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも約３５パーセントの配列同一性を共有し、そして／または同じもしくは類似の活性を有する、すなわち、１以上の共通の基質を認識し、それによって産物を生成することを意味する。
【００５６】
本発明に従って、組換え宿主細胞から誘導され、そのゲノムが改変されており、必要に応じて、対応する野生型細胞において生じる糖生合成が破壊されている、改変された組換え宿主細胞が提供される。改変された組換え宿主細胞は、破壊の結果として組換え宿主細胞において存在しないかまたは減少した量で存在する、野生型細胞によってコードされる酵素のホモログである、少なくとも１つの糖生合成酵素をコードする核酸セグメントを用いて増強される。従って、この改変された組換え宿主細胞としては、少なくとも１つの発現カセットを含み、この発現カセットは、少なくとも１つの単離および精製された核酸セグメントを含み、このセグメントは、野生型細胞によってコードされる酵素の基質を認識し、そして組換え細胞中では発現されないかまたは減少した量で発現される、糖生合成酵素をコードする。この核酸セグメントによってコードされる酵素は、別の糖生合成酵素またはグリコシルトランスフェラーゼについての基質を産生する。
【００５７】
本明細書中に記載される発明は、糖生合成ＤＮＡ（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．ならびに他のポリケチド産生生物において見出されるもの）の遺伝的再設計を通して、グリコシル化ポリケチドを含め、多様な範囲の新規化合物（例えば、抗生物質）の産生のために用いられ得る。この遺伝子は、新規化合物の産生を含め、特定の化合物の選択的産生を可能にする。例えば、組み合わせ生合成に基づく化合物の改変は、糖遺伝子クラスター内の特定の遺伝子の選択的活性化または破壊、および広範囲な生物学的活性についてアッセイされる生合成ライブラリーへと他の糖生合成遺伝子を発現してさらに大きな科学的多様性を誘導することによって達成され得る。さらなる例としては、特定の宿主細胞へと生合成遺伝子を導入し、その結果、その宿主細胞の他の代謝産物、中間体または成分に対するこの生合成遺伝子の活性に起因して新規化合物の産生をもたらすことが挙げられる。
【００５８】
本発明において用いられる核酸配列およびセグメントとしては、糖生合成酵素（例えば、本明細書中に示される糖生合成酵素）をコードする遺伝子、および／または同じもしくは類似の活性を有する酵素をコードする遺伝子に、低い、中程度の、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする、核酸配列およびセグメントが挙げられる。本発明の核酸分子、セグメントまたは配列はまた、本明細書中に記載されるＤＮＡセグメントまたは配列のいずれかに、対応する、相補的である、または低い、中程度の、もしくはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ＲＮＡ分子、セグメントまたは配列であり得る。従って、本発明は、特定の糖生合成酵素のホモログ（野生型ポリペプチドに対して少なくとも１つのアミノ酸置換（図９；Ａｌｂｅｒｔｓら，１９８９）を有するポリペプチドを含む）をコードする核酸配列およびセグメントを包含する（例えば、ホモログは、そのホモログが、その野生型酵素についての基質を認識し得、そしてこの基質との反応を触媒し得る限り、野生型ポリペプチドに対して少なくとも２９％の同一性を有し得る）。このホモログは、天然に存在する酵素であり得るか、または組換え調製される酵素であり得る。
【００５９】
従って、変異は、本発明のネイティブ（野生型）の核酸のセグメントまたは配列に対してなされて、改変体核酸のセグメントまたは配列を生じ得、そしてこのような改変体は、この改変体が、他の分子と共に機能して、同定可能なグリコシル化分子（例えば、グリコシル化ポリケチドまたはマクロライド）の合成を集合的に触媒する酵素をコードする限り、ネイティブのセグメントまたは配列の代わりに用いら得る。このような変異は、従来の技術（例えば、変異を含む合成オリゴヌクレオチドを調製し、そしてこの変異した配列を、制限エンドヌクレアーゼ消化を用いて遺伝子へと挿入することによって（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ，１９８５；Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄｅｒら、１９８７を参照のこと））を用いて、ネイティブ配列に対してなされ得る。あるいは、この変異は、ミスマッチプライマー（一般的に、１０〜２０のヌクレオチドの長さ）を用いて行われ得、このミスマッチプライマーは、ミスマッチ二重鎖の融解温度未満の温度で、ネイティブヌクレオチドのセグメントまたは配列にハイブリダイズする。このプライマーは、比較的厳密な制限の中で、プライマーの長さおよび塩基組成を維持することによって、ならびに中央に配置した変異塩基を維持することによって、具現化され得る（ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ，１９９３）。プライマー伸長は、ＤＮＡポリメラーゼを用いて行われ得、この産物はクローン化され、変異したＤＮＡ（プライマーが伸長した鎖の分離（ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）により誘導される）を含むクローンが選択される。選択は、ハイブリダイゼーションプローブとして変異プライマーを用いて達成され得る。この技術はまた、複数の点変異を生じさせるために適用可能である。例えば、Ｄａｌｂｉｅ−ＭｃＦａｒｌａｎｄら（１９８２）を参照のこと。ＰＣＲ変異誘発はまた、所望の変異を行うという用途も見出す。
【００６０】
ヌクレオチド配列のランダム変異誘発は、以下のような、当該分野で公知のいくつかの異なる技術により達成され得る：制限エンドヌクレアーゼ部位内の配列を変化させること、オリゴヌクレオチドリンカーをプラスミドへ無作為に挿入すること、Ｘ線または紫外線光の照射、インビトロでのＤＮＡ合成の間に間違ったヌクレオチドを組み込むこと、誤りがちの（ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ変異誘発、合成変異体を調製すること、または化学物質を用いて、プラスミドＤＮＡに損傷を与えること。化学変異としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、塩基に損傷を与えるかまたは塩基を除去して、それにより、正常な塩基対合を妨げる薬剤（例えば、ヒドラジンまたはギ酸）、ヌクレオチド前駆体のアナログ（例えば、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン）、またはアクリジンインターカレーティング剤（例えば、プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなど）が挙げられる。一般的に、プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡフラグメントは、化学物質を用いて処理され、Ｅ．ｃｏｌｉへと形質転換され、そして変異プラスミドのプールまたはライブラリーとして増殖される。
【００６１】
ランダム酵素改変体の大きな集団は、「組換えにより強化された変異誘発（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」を用いて、インビトロで構築され得る。この方法は、例えば、野生型をコードするヌクレオチド配列の各々の、１０６個の変異体（これは、任意の変異誘発技術を用いて作製され、次いでクローニングベクターへと挿入される）の、２つ以上のプールを用いる。
【００６２】
これらの遺伝子配列は、当業者に公知の方法を用いて１つ以上の発現ベクターに挿入され得る。発現ベクターは、所望の遺伝子に作動可能に連結された制御配列を含み得る。本発明と共に用いるための適切な発現系は、真核生物および原核生物の宿主細胞において機能する系を含む。原核生物系が好ましく、詳細には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．と適合性のある系が特に興味深い。このような系に用いるための制御要素は、プロモーター（必要に応じて、オペレーター配列を含む）、およびリボゾーム結合部位を含む。特に有用なプロモーターとしては、本発明の遺伝子クラスターに由来する制御配列が挙げられる。しかし、他の細菌プロモーター（例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）およびマルトースのような糖代謝酵素に由来するもの）もまた、デソサミンをコードする発現カセットにおける用途を見出す。好ましいプロモーターは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーターであり、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓプロモーターとしては、ｅｒｍＥ＊プロモーター、ｐｉｋＡプロモーター、およびｔｉｐＡプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）のような、生合成酵素に由来するプロモーター配列、β−ラクタマーゼ（ｂｌａ）プロモーター系、バクテリオファージλＰＬ、およびバクテリオファージＴ５が挙げられる。さらに、合成プロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター（米国特許第４，５５１，４３３号）、これは、天然には存在しない）はまた、細菌宿主細胞において機能する。
【００６３】
宿主細胞の増殖に対する遺伝子の発現の調節を可能にする、他の調節配列もまた、好適である得る。調節配列は、当業者に公知であり、そして例としては、調節化合物の存在を含む、化学的刺激または物理的刺激に応答して、遺伝子の発現をターンオン（ｔｕｒｎ−ｏｎ）またはターンオフ（ｔｕｒｎ−ｏｆｆ）するものが挙げられる。他の型の調節要素（例えば、エンハンサー配列）もまた、ベクターに存在し得る。
【００６４】
選択可能なマーカーもまた、組換え発現ベクターに含まれ得る。形質転換した細胞株を選択する際に有用である種々のマーカーは公知であり、そして一般的に、細胞が適切な選択培地において増殖される場合に、遺伝子の発現が形質転換した細胞に対して選択可能な表現型を与える遺伝子を含む。
【００６５】
目的の、種々の配列またはセグメントは、個別のカセットとして、別々の制御要素と共にか、または例えば、シグナルプロモーターの制御下で、１つ以上の組換えベクターへとクローニングされ得る。これらの配列またはセグメントは、他の配列またはセグメントの容易な欠失および挿入を可能にする、隣接する制限部位を含み得る。このような固有の制限部位の設計は、当業者に公知であり、そして上記の技術（部位特異的変異誘発およびＰＣＲ）を用いて達成され得る。
【００６６】
ランダム変異誘発により生成される配列について、ベクターの選択は、用いられる変異体配列（すなわち、ドナーまたはレシピエント）のプールに依存する。さらに、ベクターの選択は、本願の方法の引き続く工程において用いられる宿主細胞を決定する。任意の形質導入可能なクローニングベクターが、変異体のドナープールのためのクローニングベクターとして用いられ得る。しかし、ファージミド、コスミド、または類似のクローニングベクターが、変異体をコード化するヌクレオチド配列のドナープールを、宿主細胞へクローニングするために用いられることが好ましい。ファージミドおよびコスミドは、例えば、Ｍ１３ファージおよびλファージの各々においてよりも、より大きなフラグメントを、これらの中に挿入し、そして安定に増殖する能力に起因して、優れたベクターである。本方法における用途を見出すファージミドとしては、一般的に、プラスミドと線状ファージクローニングビークルとの間のハイブリッドが挙げられる。本方法における用途を見出すコスミドとしては、一般的に、ｃｏｓ部位が挿入されているλファージベースのベクターが挙げられる。レシピエントプールクローニングベクターは、任意の適切なプラスミドであり得る。変異体のプールが挿入されるクローニングベクターは、同一であり得るか、または異なる遺伝マーカーを有しかつ発現するように構築され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、を参照のこと）。異なる遺伝子マーカーを有するこのようなベクターを用いることの有用性は、首尾良い形質導入の決定を容易にするために利用される。
【００６７】
従って、例えば、用いられるクローニングベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓシャトルベクター（例えば、米国特許第４，４１６，９９４号、同第４，３４３，９０６号、同第４，４７７，５７１号、同第４，３６２，８１６号、および同第４，３４０，６７４号を参照のこと）、コスミド、プラスミド、人工細菌染色体（例えば、ＺｈａｎｇおよびＷｉｎｇ、１９９７；Ｓｃｈａｌｋｗｙｋら、１９９５；およびＭｏｎａｃｏおよびＬａｖｉｎ、１９９４を参照のこと）、またはファージミドであり得、そして宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐａｔｕｌｕｍ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．（例えば、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ、もしくはＳ．ｌａｖｅｎｄｕｌａｅ）のような細菌細胞、または真菌、酵母、または植物細胞（例えば、単子葉植物細胞および双子葉植物細胞）のような真核生物細胞であり得、好ましい細胞は、再生可能である。
【００６８】
さらに、特定の活性を有する組換えポリペプチドは、「遺伝子シャッフリング」を介して調製され得る。例えば、Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９８；Ｐａｔｔｅｎら、１９９７、米国特許第５，８３７，４５８号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３０，７２７号、同第５，８１１，２３８号、同第５，６０５，７９３号を参照のこと。
【００６９】
ファージミドについて、ファージミドを含む宿主細胞の感染の際、一本鎖ファージミドＤＮＡが、他のファージベクターに類似する様式において形質導入ファージの形態で、産生され、パッケージ化され、そして細胞から放出される。従って、ファージミドにより実施される、変異体をコード化するヌクレオチド配列のクローン増幅は、適切な宿主細胞においてファージミドを増殖させることにより達成される。
【００７０】
クローン増幅の後、クローン化した変異体のドナープールを、ヘルパーファージと感染させて、ヘルパーファージゲノム、またはこの野生型をコード化するヌクレオチド配列のファージミド突然変異体対立遺伝子のいずれかを含むファージ粒子の混合物を得る。
【００７１】
宿主細胞のヘルパーファージとの感染またはトランスフェクションは、一般的に、当該分野で周知の方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出；およびＲｕｓｓｅｌｌら、１９８６を参照のこと）により達成される。
【００７２】
ヘルパーファージは、クローニングファージと組合わせて用いて、感染性の形質導入ファージを生成し得る、任意のファージであり得る。例えば、クローニングベクターがコスミドである場合、ヘルパーファージは、必然的に、λファージである。好ましくは、クローニングベクターは、ファージミドであり、そしてヘルパーファージは、線状ファージ（好ましくは、ファージＭ１３）である。
【００７３】
所望される場合、ファージミドをヘルパーファージと感染させ、ファージ粒子の混合物を得た得た後、形質導入ファージを、大きさの違いに基づいて（Ｂａｒｎｅｓら、１９８３）か、または他の同様に有効な技術に基づいて、ヘルパーファージから分離し得る。
【００７４】
クローン化したドナー変異体の全体のスペクトルは、ここで、クローン増殖されたレシピエント細胞（これは、変異体をコード化するヌクレオチド配列のプールを形質導入または形質転換されている）へと形質導入され得る。本明細書中に開示される方法および本願方法において用いられ得るレシピエント細胞は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、または組換え欠損ではない、他の細菌発現系であり得る。組換え欠損細胞は、組換え事象が非常に減少した細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのｒｅｃ−変異体）である（Ｃｌａｒｋら、１９６５を参照のこと）。
【００７５】
これらの形質導入体を、ここで、所望のタンパク質特性または特徴について選択し、そして必要な場合または所望される場合、増幅され得る。必要に応じて、上記のように、変異体のプールの各々がクローン化されるファージミドが、構築されて異なる遺伝マーカーを発現する場合、形質転換体は、ドナープラスミドマーカーおよびレシピエントプラスミドマーカーの両方の発現により選択され得る。
【００７６】
上記の方法により産生された組換え体は、次いで、任意の適切な方法によって、例えば、酵素活性または他の生物学的活性を、選択またはスクリーニングに供され得る。
【００７７】
増幅、感染、形質導入、および組換えの上記サイクルは、ファージミドに対してクローン化された、さらなるドナープールを用いて、任意の回数で繰り返され得る。上記のように、変異体のプールの各々がクローン化されるファージミドは、異なるマーカー遺伝子を発現するように構築され得る。各サイクルは、１０６のファクターまで、別個の変異体の数を増加させ得る。従って、任意の別々の細胞における対立遺伝子間の組換え事象の発生の確率がｆ（実際には、組換える変異体の間の距離の関数であるパラメーター）である場合、１０６個の対立遺伝子変異体の２つのプール由来の形質導入された培養物は、１０１２／ｆ細胞の集団において１０１２個までの別個の変異体を発現する。
【００７８】
本発明は、以下の非制限的実施例により、さらに記載される。
【００７９】
（実施例）
（デソサミン生合成遺伝子クラスターのｄｅｓＲ遺伝子の欠失）
いくつかのマクロライドは、付着した糖部分を１よりも多く有するので、適切な糖生合成経路に対する糖生合成遺伝子の割当ては、非常に困難であり得る。メチマイシン（ｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）（式（１）の化合物）およびネオメチマイシン（ｎｅｏｎｅｏｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）（式（２）の化合物）（図１）（Ｄｏｎｉｎら、１９５３；Ｄｊｅｒａｓｓｉら、１９５６）（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにより産生される、２つの密接に関連したマクロライド抗生物質）は、それらの唯一の糖成分としてデソサミンを含むので、メチマイシン／ネオメチマイシン遺伝子クラスターにおける糖生合成遺伝子の構成は、あまり複雑ではないであろう。従って、この系を、デソサミン（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ−３，４，６−トリデオキシヘキソース、これはエリスロマイシン構造にもまた存在する（Ｆｌｉｎｎら、１９５４））の生合成の研究のために選択した。
【００８０】
この独特な糖の形成を研究するために、ＤＮＡライブラリーを、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ（ＡＴＣＣ１５４３９）を、Ｓａｕ３Ａ  Ｉを用いて、３５〜４０ｋｂのフラグメント（これをコスミドベクターｐＮＪ１へと連結した）へと部分的に消化することにより構築した（Ｔｕａｎら、１９９０）。組換えＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αをトランスフェクトするために用いたバクテリオファージλへとパッケージ化した。得られたコスミドライブラリーを、ｔｙｌＡ１遺伝子およびｔｙｌＡ２遺伝子をプローブとして用いて、チロシン生合成クラスターから所望のクローンついてスクリーニングした（Ｂａｌｔｚら、１９８８；Ｍｅｒｓｏｎ−Ｄａｖｉｅｓら、１９９４）。これらの２つのプローブは、糖生合成遺伝子に特異的である。これらの遺伝子の産物は、初めの２つの工程を例外なく触媒した後に、これまで研究されている全ての独特な６−デオキシヘキソースへと続く。初めの反応は、α−Ｄ−グルコース−１−ホスフェートチミジルイルトランスフェラーゼ（ＴｙｌＡ１）による、グルコース−１−ホスフェートからＴＤＰ−Ｄ−グルコースへの転換を伴い、引き続いて、ＴＤＰ−Ｄ−グルコースは、ＴＤＰ−Ｄ−グルコース４，６−デヒドラターゼ（ＴｙｌＡ２）により、ＴＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコースへと転換される。３つのコスミドは、ｔｙｌＡ１およびｔｙｌＡ２に相同な遺伝子を含むことを見出された。これらのコスミドのさらなる分析は、ＰＫＳ遺伝子の下流の９つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の同定を導いた（図１）。他の糖生合成遺伝子（特に、エリスロマイシンクラスターに由来するもの（Ｇａｉｓｓｅｒら、１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら、１９９７））に対する配列類似性に基づいて、これらの９つのＯＲＦのうち８つは、ＴＤＰ−Ｄ−デソサミンの生合成に関与すると考えられる。興味深いことに、ｅｒｙクラスターは、デソサミン経路における初めの２つの工程に応答性である、ｔｙｌＡ１遺伝子およびｔｙＡ２遺伝子のホモログ欠く。エリスロマイシン生合成機構は、ミカロース（ｍｙｃａｒｏｓｅ）およびデソサミンの形成のための、ＴＤＰ−Ｄ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコースの一般的な細胞プールに依存し得る可能性がある。ＴＤＰ−Ｄ−デソサミンについての生合成経路を図１に表す。
【００８１】
９つのＯＲＦのうちの８つに、デソサミン形成（ｄｅｓＲの存在）を割り当てた（これらのＯＲＦは、β−グルコシダーゼに対して強い配列相同性（３９％の同一性および４６％の類似性と同じくらい高い）を示す（Ｃａｓｔｌｅら、１９９８））が、デソサミンにおける遺伝子クラスターは難解である。メチマイシン／ネオメチマイシンの生合成に対するＤｅｓＲの機能を研究するために、ｐＫＣ１１３９由来の破壊プラスミド（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｐｌａｓｍｉｄ）（ｐＢＬ１００５）（アプラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）耐性マーカーを含む）（Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２）を、構築した。このプラスミドにおいて、ｄｅｓＲ遺伝子の１．０ｋｂ  ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩフラグメントを欠失させ、そして平滑末端連結を介して、チオストレプトン耐性遺伝子（ｔｓｒ）（１．１ｋｂ）（Ｂｉｂｂら、１９８５）により置換した。このプラスミドを用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１を形質転換した；このＥ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１は、ドナー株として働き、接合伝達を通じて、野生型Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ（Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２）へとｐＢＬ１００５構築物を導入する。染色体ｄｅｓＲが破壊した遺伝子と置換されてる二重交雑変異体を、これらのチオストレプトン耐性およびアプラマイシン−感受性特性に従って選択した。サザンブロットハイブリダイゼーション分析を用いて、遺伝子置換を確認した。
【００８２】
所望の変異体を、播種培地（ｓｅｅｄ  ｍｅｄｉｕｍ）中で２９℃にて４８時間、初めに増殖させ、次いで、接種して、植物培地（ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ  ｍｅｄｉｕｍ）中でさらに４８時間増殖させた（Ｃａｎｅら、１９９３）。発酵ブロスを、１０，０００ｇで遠心分離して、細胞片および菌糸体を取り除いた後、上清を濃ＫＯＨを用いてｐＨ９．５に調整し、等容量のクロロホルムで抽出した（４回）。有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして乾燥するまでエバポレートした。琥珀色のオイル様租生成物を、初めに、クロロホルム中の０〜４０％メタノールの勾配を用いるシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィーに供し、次いで、５７ｍＭの酢酸アンモニウム（ｐＨ６．７）中の４５％アセトニトリルを用いて等組成で溶出される、Ｃ１８カラムのＨＰＬＣに供した。メチマイシン（式（１）の化合物）およびネオメチマイシン（式（２）の化合物）に加えて、２つの新規の生成物を単離した。式（１３）の化合物および式（１４）の化合物の収量は、各々、発酵ブロスの５〜１０ｍｇ／Ｌの範囲である。しかし、式（１）の化合物および式（２）の化合物は、主生成物のままであった。高分解能ＦＡＢ−ＭＳは、両方の化合物が、同一の分子組成を有することを示した。この分子組成は、余分なヘキソースによってメチマイシン／ネオメチマイシンと異なる。これらの２つの新規の化合物の化学的性質は、広範なスペクトル分析により、Ｃ−２’β−グルコシル化メチマイシンおよびネオメチマイシン（それぞれ、式（１３）および式（１４）の化合物）である解明された。
【００８３】
（１３）のスペクトルデータは、以下である：
【００８４】
【化１】
2004534502.tif 000005
（１４）のスペクトルデータは、以下である：
【００８５】
【化２】
2004534502.tif 000006
加えられたグルコースのアノマー水素（１’’−Ｈ）のカップリング定数（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ）およびデソサミンのＣ’２の低磁場シフト（１１．８ｐｐｍ）の大きさは、全て、この指定されたＣ２’−β−コンフィギュレーション（Ｓｅｏら，１９７８）と一致する。
【００８６】
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓに対する式（１３）および（１４）の化合物の抗生物質活性を、滅菌した濾紙ディスクに２０μＬの各サンプル（ＭｅＯＨ中で１．６ｍＭ）を別々に適用することによって調べ、このディスクをＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天プレート（Ｍａｎｇａｈａｓ，１９９６）上で培養したＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの表面に置いた。３７℃で一晩培養した後に、このコントロール（式（１）および式（２）の化合物）のプレートは、明確に視認し得る阻害域を示した。対照的に、このような除去（ｃｌｅａｒｉｎｇ）が式（１３）および（１４）の化合物のディスクの周辺で認識可能であった。明らかに、メチマイシン（ｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）／ネオメチマイシン（ｎｅｏｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）中のデソサミンのＣ−２’におけるβ−グリコシル化は、これらの抗生物質を不活性にする。
【００８７】
グリコシル化によるマクロライド抗生物質の不活性化に関わる類似現象は、公知である（Ｃｅｌｍｅｒら，１９８５；Ｋｕｏら，１９８９；Ｓａｓａｋｉら，１９９６）ことに注目すべきである。例えば、エリスロマイシンがＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓに与えられた場合に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓがマクロライドグリコシルトランスフェラーゼ（ＭｇｔＡ）を含み、この細菌がこれらの薬物のグリコシル化によってそれ自体を防御することが可能であることが見出された（Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ，１９９２；Ｊｅｎｋｉｎｓら，１９９１）。このようなマクロライドグリコシルトランスフェラーゼ活性を、種々のポリケチド抗生物質を産生する総計３２放線菌株のうち１５の放線菌で検出した（Ｓａｓａｋｉら，１９９６）。興味深いことに、グリコシル化によるオレアンドマイシンの不活性化が可能なマクロライドグリコシルトランスフェラーゼ（ＯｌｅＤ）（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚら，１９９３）、および不活性化されたオレアンドマイシンから添加されたグルコースを取り出すことが可能な細胞外β−グリコシダーゼがＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓに共存すること（Ｖｉｌｃｈｅｓら，１９９２）によって、Ｓ．ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓにおける可能な自己耐性機構としてのグリコシル化が推測される。上述したグリコシルトランスフェラーゼの遺伝子は、いくつかの場合（例えば、Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓのｍｇｔＡおよびＳ．ａｎｔｉｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓのｏｌｅＤ）においてクローン化されてきたが、マクロライドβ−グリコシダーゼ遺伝子の所在は、依然として曖昧である。興味深いことに、近年公開されたｅｒｙＢＩ配列は、エリスロマイシン生合成クラスター（群）の一部であるが、ｄｅｓＲに対して高度に相同性（５５％同一性）である（Ｇａｉｓｓｅｒら，１９９７）。
【００８８】
従って、デソサミン遺伝子クラスター（遺伝子群）の中のｄｅｓＲ、マクロライドβ−グリコシダーゼ遺伝子の発見は、重要であり、そして、ｄｅｓＲ破壊後の式（１３）および（１４）の不活性化された化合物の蓄積は、グリコシル化／脱グリコシル化による類似の自己防御機構がまた、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおいても適切に作用することを示す直接的な分子的証拠を提供する。しかし、有意な量のメチマイシンおよびネオメチマイシンがまた、この変異体の発酵ブロスにおいても存在するため、デソサミンのグリコシル化は、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおける主要な自己耐性機構ではあり得ない。実際、この遺伝子クラスターの中でＰＫＳ遺伝子の上流に見出されるｒＲＮＡメチルトランスフェラーゼ遺伝子は、主要な自己耐性保護を与え得る。従って、これらの結果は、抗生物質産生生物が一般に、より多くの防御の選択肢を有するという事実と一致する（Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ，１９８９）。この観察によって、メチマイシン／ネオメチマイシンが、不活性なジグリコシド（式（１３）および（１４）の化合物）として部分的に産生され得、そしてこのｄｅｓＲによってコードされるマクロライド−β−グリコシダーゼが、メチマイシン／ネオメチマイシンをそれらの休眠状態から活性状態へと変換する原因となると考えられ得る。この概念を支持する場合、この翻訳されたｄｅｓＲ遺伝子は分泌タンパク質の特徴であるリーダー配列を有する（ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，１９８６；ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ，１９８９）。従って、ＤｅｓＲは、細胞膜を介して輸送され得、そして、これらの改変された抗生物質を細胞外で加水分解して、それを活性化し得る（図２）。
【００８９】
（要約）
アミノデオキシ糖（これらは、しばしばマクロライド抗生物質の本質的な成分として見出される）の複合体アセンブリ（複合体組織化）および酵素学に触発されて、メチマイシンおよびネオメチマイシン産生株であるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ由来の、デソサミン生合成遺伝子クラスター全体をクローン化し、配列決定し、そしてマッピングした。９つのマップされた遺伝子のうち８つの遺伝子は、エリスロマイシンクラスターに由来する遺伝子との配列類似性に基づいて、ＴＤＰ−Ｄ−デソサミンの生合成に割り当てられた。この残りの遺伝子（ｄｅｓＲとして示される）は、β−グリコシダーゼに対する強い配列相同性を示す。
【００９０】
このコードされたタンパク質（ＤｓｅＲ）の機能を調べるために、破壊変異株を構築し、この変異株において、ｄｅｓＲ遺伝子のＮｃｏＩ／ＸｈｏＩフラグメントを欠失させ、そして、チオストレプトン耐性（ｔｓｒ）遺伝子で置き換えた。メチマイシンおよびネオメチマイシンに加え、２つの新規の産物を変異株の発酵物から単離した。これらの２つの新規化合物は、生物学的に不活性であり、Ｃ−２’βグリコシル化された、メチマイシンおよびネオメチマイシンであることが見出された。この翻訳されたｄｅｓＲ遺伝子は、分泌タンパク質の特徴であるリーダー配列を有しているために、このＤｅｓＲタンパク質は、この改変された抗生物質から加えられたグルコースを取り除き、これらを活性することができる細胞外β−グリコシダーゼであり得る。従って、このデソサミン遺伝子クラスター中のｄｅｓＲの存在およびｄｅｓＲ破壊のときの不活性化されたグリコシル化メチマイシン／ネオメチマイシンの蓄積によって、グリコシル化を介する自己耐性機構がＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおいて適切に作用し得る強力な分子的証拠を提供する。
【００９１】
従って、このｄｅｓＲ遺伝子は、プローブとして使用され得、他の抗生物質生合成経路におけるホモログを同定し得る。他の抗生物質生合成経路における対応するマクロライドグリコシダーゼ遺伝子の欠失によって、グリコシル化された産物の蓄積が生じ、このグリコシル化された産物は、細胞毒性を減じたプロドラッグとして使用され得る。グリコシル化はまた、遺伝子工学的に操作された微生物によって産生される新規のマクロライド抗生物質に関連する潜在的な毒性を制御および／または最小化するためのツールとして有望である。さらには、マクロライドグリコシダーゼの有効性は、コンビナトリアル生合成アプローチ（Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９９０；Ｋａｔｚら，１９９３；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら，１９９５；Ｃａｒｒｅｒａｓら，１９９７；Ｋｒａｍｅｒら，１９９６；Ｋｈｏｓｌａら，１９９６；Ｊａｃｏｂｓｅｎら，１９９７；Ｍａｒｓｄｅｎら，１９９８）を使用する新規抗生物質の開発において有用であり、これらのマクロライドグリコシダーゼは、新規に形成される抗生物質の活性化のために使用され得、この抗生物質は意図的に操作されたグリコシルトランスフェラーゼによって失活される。
【００９２】
（実施例２）
（デソサミン生合成遺伝子クラスターの遺伝子のｄｅｓＶＩ遺伝子の欠失）
多くの通常使用されている抗生物質に耐性である病原性細菌の出現によって、人間の健康に対して深刻な脅威を与え、そして、この出現は、新規の抗細菌剤に対する現在の研究の再燃の原動力となってきた（Ｂｏｘら，１９９７；Ｄａｖｉｅｓ，１９９６；Ｓｅｒｖｉｃｅ，１９９５）。遺伝子工学的技術を使用して、「ハイブリッド」ポリケチドを生成することに関する最初の報告（Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９９５）以来、二次代謝物の生合成を支配する遺伝子を操作して新規の生物学的に活性な化合物（特に、マクロライド抗生物質）を生成する可能性は、多大なる注目を受けている（Ｋｒａｍｅｒら，１９９６；Ｋｈｏｓｌａら，１９９６）。臨床的に重要な薬物であるこのクラスは、以下の２つの本質な構造成分からなる：ポリケチドアグリコンおよび付加されたデオキシ糖（Ｏｍｕｒａ，１９８４）。このアグリコンは、高度に組織化された多酵素複合体である、ポリケチド合成酵素（ＰＫＳ）（Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９９０；Ｋａｔｚ，１９９３；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら，１９９５；Ｃａｒｒｅｒａｓら，１９９７）によって触媒されるアシルチオエステルの一連の縮合によって合成される。ポリケチド生合成の理解における近年の進歩は、ＰＫＳ遺伝子の組換えを可能にし、新規の骨格のめざましいアレイの構築を可能にする（Ｋｒａｍｅｒら，１９９６；Ｋｈｏｓｌａら，１９９６；Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９９０；Ｋａｔｚ，１９９３；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら，１９９５；Ｃａｒｒｅｒａｓら，１９９７；Ｅｐｐら，１９８９；Ｄｏｎａｄｉｏら，１９９３；Ａｒｉｓａｗａら，１９９４；Ｊａｃｏｂｓｅｎら，１９９７；Ｍａｒｓｄｅｎら，１９９８）。しかし、糖成分がない場合、これらの新規の化合物は、通常、生物学的に強力である。従って、コンビナトリアル生合成アプローチによって新規のマクロライド抗生物質を生成することを計画している場合、以下の２つの当面の課題を克服しなければならない：新規の糖構造のレパートリーのアセンブリ（組織化）すること、およびそれに次いで、構造的に多様化したマクロライドアグリコンにこれらの糖を結合する能力を有すること。
【００９３】
不運なことに、これらの抗生物質において独特の糖の形成の知見は、依然として限られたままである（Ｌｉｕら，１９９４；Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇら，１９９７；Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９８）。これについての部分的な理由は、この糖遺伝子は、一般的にＰＫＳ遺伝子の両端に分散しているという事実に由来する。マクロライド生合成遺伝子クラスター中のこのような編成は、また同じ領域に分散されている調節タンパク質またはこれらのアグリコン改変酵素をコードしている遺伝子から、糖遺伝子を識別することを難しくしている。これらのマクロライドが複数の糖成分を含む場合、この課題は、さらにずっと厄介になり得る。この「分散された」性質の糖生合遺伝子の観点において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｚｅｚｕｅｌａｅの、抗生物質メチマイシン（図１における式（１）の化合物）およびその共存代謝産物、ネオメチマイシン（図１における式（２）の化合物）によって、デオキシ糖の形成を研究するためのそれら自体が魅力的な系として提供される（Ｄｏｎｉｎら，１９５３；Ｄｊｅｒａｓｓｉら，１９５６）。第１に、これらは、Ｄ−デソサミン（式（３）の化合物）、エリスロマイシンにも存在する始源型アミノデオキシ糖を保持する。第２に、デソサミンは、式（１）および（２）のマクロラクトン（ｍａｃｒｏｌａｃｔｏｎｅ）に結合した、唯一の糖であるため、このメチマイシン／ネオメチマイシン遺伝子クラスター内の糖生合成遺伝子の同定は、より高い確実性を伴って可能である。
【００９４】
このメチマイシン／ネオメチマイシン遺伝子クラスター（これは、約６０ｋｂ長である）の下流の１０ｋｂのＤＮＡのストレッチを、デソサミン生合成遺伝子クラスターの全体を保有するとして見出した（図３）。このセグメントの中にマップされる９つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のうち、８つはデソサミン形成に関連する可能性があるが、残りの１つ（ｄｅｓＲ）は、マクロライドβ−グリコシダーゼをコードし、このマクロライドβ−グリコシダーゼは、自己耐性機構に関与し得る。これらの同一性（図３に示されている）を、他の糖生合成遺伝子に対する配列類似性に基づいて割り当てた（Ｇａｉｓｓｅｒら，１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９９７）。この提案された経路は、先行文献およびアミノデオキシ糖の構築に対する機構論的洞察において十分に見出されている（Ｌｉｕら，１９９４；Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇら，１９９７；Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９８）。
【００９５】
改変された糖を保持する新規のメチマイシン／ネオメチマイシンのアナログが、デソサミン生合成遺伝子の改変によって生成され得るか否かを決定するために、このｄｅｓＶＩ遺伝子（これは、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードしていると推測されている）を、標的として選択した（Ｇａｉｓｓｅｒら，１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９９７）。この推定ｄｅｓＶＩ産物は、エリスロマイシン産生株Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ由来のｅｒｙＣＶＩ産物に最も近接して関連し（７０％同一性）、そしてこの産物はまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｕｒｐｕｒａｓｃｅｎｓのロドマイシン（ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎ）（Ｎｉｅｍｉら，１９９５）クラスター由来のｒｄｍＤの推定された産物、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓのスピロマイシン（ｓｐｉｒｏｍｙｃｉｎ）クラスター由来のｓｒｍＸ（Ｇｅｉｓｔｌｉｃｈら，１９９２）、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｄｉａｅのチロシンクラスター由来のｔｙｌＭ１（Ｇａｎｄｅｃｈａら，１９９７）に非常に似ている。これらの酵素の全ては、Ｎ末端近くにコンセンサス配列ＬＬＤＶ（Ｉ）ＡＣＧＴＧ（配列番号２５）（Ｇａｉｓｓｅｒら，１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９９７）を含み、このコンセンサス配列は、Ｓ−アデノシルメチオニン結合部位（Ｉｎｇｒｏｓｓｏら，１９８９；Ｈａｙｄｏｃｋら，１９９１）の部分である。
【００９６】
ｄｅｓＶＩの欠失は、他のデソサミン生合成遺伝子の発現に対する極性効果（ｐｏｌａｒ  ｅｆｆｅｃｔ）（Ｌｉｎら，１９８４）をほとんど持たず、これは、ｄｅｓＶＩの直ぐ下流に存在するＯＲＦ（ｄｅｓＲ）は、デソサミン形成には直接的には関係せず、そして、さらに下流に存在する遺伝子は、逆方向に転写されるためである。第２に、Ｎ，Ｎ−ジメチル化が、デソサミン生合成経路においてほとんど確実に最終工程であり（Ｌｉｕら，１９９４；Ｋｉｒｓｃｈｎｉｎｇら，１９９７；Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９８；Ｇａｉｓｓｅｒら，１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９９７）、この工程に摂動を与えることによって、式（４）の化合物の蓄積が生じ得、この式（４）の化合物は、式（６）のマクロラクトンに対する首尾良い結合について、グリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）に認識される全ての他の中間体の中で最良の可能性を示す（図２）。単一の生合成遺伝の欠失および／または破壊は、頻繁に、１を超える特定の工程での経路に影響を及ぼす。実際に、ｅｒｙＣＶＩ、ｄｅｓＶＩ（エリスロマイシンクラスターにおいて等価である）（これは、類似のＮ−メチラーゼをコードすると予測され、エリスロマイシン（Ｇａｉｓｓｅｒら，１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９９７）におけるデソサミンを生成する）の破壊によって、デソサミン部分の全体を欠いている中間体の蓄積を生じる（Ｓｕｍｍｅｒｓら，１９９７）。
【００９７】
プラスミドｐＢＬ３００１（この中で、ｄｅｓＶＩは、チオストレプトン遺伝子（ｔｓｒ）（Ｂｉｂｂら，１９８５）によって置きかえられた）を、構築し、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１（Ｂｉｅｒｍａｎら，１９９２）を使用する接合伝達によって野生型Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅに導入した。チオストレプトン耐性（ＴｈｉｏＲ）およびアパマイシン（ａｐａｍｙｃｉｎ）感受性（Ａｐｍｓ）の表現型を有する、２つの同一の二重交差型改変体（ＫｄｅｓＶＩ−２１およびＫｄｅｓＶＩ−２２）を得た。ｄｅｓＶＩＩ領域からのｔｓｒまたは１．１ＫｂのＨｉｎｃＩＩフラグメントを使用するサザンブロットハイブリダイゼーションによって、ｄｅｓＶＩ遺伝子が、これらの変異体の染色体上でｔｓｒによって実際に置換されたことを確認した。このＫｄｅｓＶＩ−２１変異体を、播種培地（１００ｍｌ）中ではじめに２９℃にて、４８時間増殖させ、そして、これを接種して、成長培地（３Ｌ）中でさらに４８時間増殖させ（Ｃａｎｅら，１９９３）。この発酵ブロスを、遠心分離して、細胞破片および菌糸を取り除き、そしてこの上清を、濃ＫＯＨを使用してｐＨ９．５に調整し、その後、クロロホルムで抽出した。メチマイシンまたはネオメチマイシンは見出されず；そのかわり、この１０−デオキシ−メチノリド（ｍｅｔｈｙｎｏｌｉｄｅ）（６）（３５０ｍｇ）（Ｌａｍｂａｌｏｔら，１９９２）およびＮ−アセチル化アミノ糖を含む２つの新規のマクロライド、式（７）の化合物（２０ｍｇ）および式（８）の化合物（１５ｍｇ）を単離した。これらの構造を、スペクトル分析および高分解能ＭＳによって決定した。
【００９８】
式７のスペクトルデータは以下である：
【００９９】
【化３】
2004534502.tif 000007
。
【０１００】
式８のスペクトルデータは以下である
【０１０１】
【化４】
2004534502.tif 000008
。
【０１０２】
改変されたデソサミンを保有する式（７）および（８）の化合物がｄｅｓＶＩ欠失変異体によって産生されるという事実は、スリリングな発見である。しかし、この結果はまた、幾分驚きである。なぜならば、この産物中の糖成分は、アミノデオキシヘキソース（４）であると予測されるからである。図４において示されるように、式（７）および（８）の化合物は、付加されたアミノデオキシ糖の合成後の非特異的なアセチル化によって、それぞれ、式（９）および（１０）の予測された化合物から誘導される可能性がある。（４）のＮ−アセチル化が最初に起こり、その後、１０−デオキシメチノリド（６）への得られた糖（１１）のカップリング（結合）が続くことがまた考えられる。それにもかかわらず、これらの新規の産物における糖部分のＮ−メチル化の欠失によって、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子としてのｄｅｓＶＩの割り当てを維持する説得力のある証拠を提供する。最も有意であるのは、ｄｅｓＶＩ欠失変異体による式（７）および（８）の化合物の産生によって、メチマイシン／ネオメチマイシン経路におけるグリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）は、ＴＤＰ−デソサミン（５）以外の糖基質を認識しそしてプロセシングを行うができるという事実が証明される。
【０１０３】
式（７）および（８）の両方の化合物は、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ変異体によってインビボで合成された新規化合物であり、この観察されたＮ−アセチル化は、自己保護にのために必要な工程である（Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ，１９８９）。これらの結果の観点において、遺伝的に操作された微生物によって産生される、新規のマクロライド抗生物質に関連する潜在的な毒性を最小化し得、そして（意図的にまたは意図的ではなく）失活された新たに形成された抗生物質を、産生の間に活性化し得る。このようなアプローチは、コンビナトリアル生合成アプローチを使用する新規の抗生物質の開発のための全体的な戦略の一部分であり得る。実際に、式（７）および（８）の精製された化合物は、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天プレート（Ｍａｎｇａｈａｓ，１９９６）で増殖したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓに対して不活性であるが、このコントロール（式（１）および式（２）の化合物）は、明確に視認し得る阻害域を示す。
【０１０４】
抗生物質の生合成に関連するいくつかのグリコシルトランスフェラーゼが、改変されたマクロラクトン（ｍａｃｒｏｌａｃｔｏｎｅ）に対する緩和された特異性を有することが示されている（Ｊａｃｏｂｓｅｎら，１９９７；Ｍａｒｓｄｅｎら，１９９８；Ｗｅｂｅｒら，１９９１）ことが指摘されるべきである。しかし、糖基質に対する類似の緩和された特性は、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）グリコシルトランスフェラーゼについて報告され、このダウノルビシングリコシルトランスフェラーゼは、改変されたダウノサミン（ｄａｕｎｏｓａｍｉｎｅ）を認識し、そしてアグリコン、ε−ロドマイシンノン（ｒｈｏｄｏｍｙｃｉｎｏｎｅ）に対する、そのカップリングを触媒することが可能である（Ｍａｄｄｕｒｉら，１９９８）。従って、メチマイシン／ネオメチマイシングリコシルトランスフェラーゼがまたその糖基質の構造的変異体を許容し得るという事実によって、抗生物質生合成経路における少なくともいくつかのグリコシルトランスフェラーゼは、遺伝子工学による生物学的に活性なハイブリッド天然生成物を生成するのに有用であり得ること示される。
【０１０５】
（要約）
マクロライド抗生物質中に付加された糖は、これらの臨床的に重要な薬物の生物学的活性に不可欠である。従って、生物学的なコンビナトリアルアプローチを介する新規抗生物質の開発は、これらの独特の糖の生合成の詳細な知識、ならびに、この生合成遺伝子を操作し、最終的なマクロライド構造に組み込まれる新規の糖を生成する能力を必要とする。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅのｄｅｓＶＩ遺伝子の標的化された欠失が調製され、改変された糖を保有する新規のメチマイシン／ネオメチマイシンのアナログがデソサミン生合成遺伝子の変化によって生成されるか否かを決定し得、ここで、このアナログは、配列比較によって、Ｎ−メチルトランスフェラーゼをコードすると予測される。Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅの欠失変異株の増殖によって、Ｎ−アセチル化アミノデオキシ糖を保有するメチマイシン／ネオメチマイシンのアナログの蓄積が生じた。これらの誘導体のこれらの単離および特徴付けによって、Ｎ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子としてのｄｅｓＶＩの同一性を確認するための最初の直接的証拠を提供しただけではなく、遺伝子欠失アプローチによって新規の糖を調製する能力を実証した。最も重要ことに、これらの結果はまた、メチマイシン／ネオメチマイシンのグリコシルトランスフェラーゼがその糖基質に対して緩和された特性を示すことを明らかにした。
【０１０６】
（実施例３）
（Ｍｅｔ／Ｐｉｋ生合成遺伝子クラスターのクローニングおよび配列決定）
（材料および方法）
（細菌株および培地）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αを、クローニング宿主（ホスト）として使用した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２は、  Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅゲノムＤＮＡから誘導されるコスミドライブラリーのための宿主であった。ＬＢ培地をＥ．ｃｏｌｉ増殖において使用した。Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ  ＡＴＣＣ  １５４３９を、ＡＴＣＣから凍結乾燥ペレットとして得た。栄養成長および抗生物質産生のための培地を、記述されたように（Ｌａｍｂａｌｏｔら，１９９２）使用した。簡潔には、ＳＧＧＰ液体培地は、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ  ｍｙｃｅｌｉａの増殖のためである。胞子形成寒天（Ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ  ａｇａｒ）（ＳＰＡ）をＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ胞子産生のために使用した。メチマイシン産生を、ＳＣＭ培地または植物性培地のいずれかにおいて実施し、そしてピクロマイシン（ｐｉｋｒｏｍｙｃｉｎ）産生をＳｕｚｕｋｉグルコース−ペプトン培地において実施した。
【０１０７】
（ベクター、ＤＮＡ操作、およびコスミドライブラリーの構築）
ｐＵＣ１１９は、慣例的なクローニングベクターであり、ｐＮＪｌは、ゲノムＤＮＡライブラリー構築のために使用されるコスミドベクターであった。遺伝子破壊についてのプラスミドベクターは、ｐＧＭ１６０（Ｍｕｔｈら，１９８９）またはｐＫＣｌ１３９（Ｂｉｅｒｍａｎら，１９９２）のいずれかであった。プラスミド、コスミド、およびゲノムＤＮＡ調製、制限消化，フラグメント単離、およびクローニングを、標準的な手順を使用して実施した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９；Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９８５）。このコスミドライブラリーを、Ｐａｃｋａｇｅｎｅ  λ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の指示書に従って作製した。
【０１０８】
（ＤＮＡ配列決定およびＤＮＡ分析）
ＰＣＲに基く二重鎖ＤＮＡ配列決定を併用する、エキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＥｘｏＩＩＩ）入れ子欠失シリーズを用いて、ｐｉｋクラスターの配列決定をした。Ｅｒａｓｅａ−Ｂａｓｅプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に従うＥｘｏＩＩＩ手順およびＤＮＡ配列決定反応を、Ｄｙｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。この核酸配列を、両方のＤＮＡ鎖についてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７７シークエンサーで読んだ。ＤＮＡおよび推定タンパク質配列分析をＧｅｎｅＷｏｒｋｓおよび  ＧＣＧ配列解析パッケージを使用して実施した。全ての分析を、特定のプログラムデフォルトパラメーターを使用して実施した。
【０１０９】
（遺伝子破壊）
複製プラスミド媒介ホモログ組換えアプローチを、開発してＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおける遺伝子破壊を実施した。挿入不活性化のためのプラスミドを、カナマイシン耐性マーカーを標的遺伝子中にクローニングすることによって構築し、そして遺伝子欠失／置換のためのプラスミドを、このプラスミド中で標的遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子またはチオストレプトン耐性遺伝子と置換することによって構築する。破壊プラスミドを、ＰＥＧ媒介プロトプラスト形質転換（Ｈｏｐｗｏｏｄら，１９８５）またはＲＫ２媒介抱合（Ｂｉｅｒｍａｎら，１９９２）のいずれかによってＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅに導入した。従って、個々の形質転換体またはトランス結合体（ｔｒａｎｓｃｏｎｊｕｇａｎｔ）由来の胞子を、非選択的なプレート上でクラスター化し、組換えを誘導した。このサイクルを３回繰り返し、組換えの機会を増大させた。二重交差産生標的化（Ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒｓ  ｙｉｅｌｄｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔｅｄ）遺伝子破壊変異体を、選択し、そして抗生物質の適切な組換合わせを使用してスクリーニングし、最終的にサザンハイブリダイゼーションで確認した。
【０１１０】
（抗生物質抽出および分析）
メチマイシン、ピクロマイシン、および関連化合物を、公開された手順に従って抽出した（Ｃａｎｅら，１９９３）。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、慣例的に使用して、メチマイシン、ネオメチマイシン、ナルボマイシンおよびピクロマイシンを検出した。さらなる精製を、フラッシュクロマトグラフィーおよびＨＰＬＣを使用して実施し、そしてこの精製された化合物を、１Ｈ  ＮＭＲ分光法、１３Ｃ  ＮＭＲ分光法およびＭＳ分光分析によって分析した。
【０１１１】
（結果）
（ｐｉｋクラスターのクローニングおよび同定）
異種ハイブリダイゼーション（Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）を使用して、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおいて、メチマイシン、ネオメチマイシン、ナルボマイシンおよびピクロマイシンの生合成のための遺伝子を同定した。Ｉ型ＰＫＳのＤＮＡプローブを使用するはじめのサザンブロットハイブリダイゼーション分析によって、ゲノム中で特徴付けられていない機能の２つの多機能ＰＫＳクラスターを明らかにした。これらの４つの抗生物質は、全て同一のデソサミン残基から構成されるので、（チロシン経路におけるｍｙｃａｍｉｎｏｓｅ／ｍｙｃｏｒｏｓｅ／ｍｙｃｉｎｏｓｅの生合成のための）ｔｙｌＡＩ  α−Ｄ−グルコース−１−ホスフェートチミジルトランスフェラーゼＤＮＡプローブ（Ｍｅｒｓｏｎ  Ｄａｖｉｅｓら，１９９４）を使用して、対応する生合成遺伝子クラスターを位置付けた。この分析によって、唯一のＰＫＳ経路がデソサミン生合成遺伝子のクラスターを含むことを立証した。９つのオーバーラップ（重複）コスミドクローンを単離し、ここで、このクローンは、チマイシン、ネオメチマイシン、ナルボマイシンおよびピクロマイシンの生合成のための遺伝子クラスター全体（ｐｉｋ）を包含する細菌染色体上で８０キロ塩基（ｋｂ）に及んだ（図５）その後の遺伝子破壊を通して、この他のＰＫＳクラスター（ｖｅｐ、連結したデソサミン生合成遺伝子を欠く）は、メチマイシン，ネオメチマイシン、ナルボマイシンまたはピクロマイシンの産生において役割を果たさないことを見出した。
【０１１２】
（ｐｉｋクラスターの核酸配列）
ｐｉｋクラスターの核酸配列を、完全に決定し、そしてこの配列は１８のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むことを示し、ここで、これらのオープンリーディングフレームは、約６０ｋｂに及ぶことを示した。多機能ＰＫＳをコードする４つの大きなＯＲＦ（ｐｉｋＡＩ、ｐｉｋＡＩＩ、ｐｉｋＡＩＩＩ、およびｐｉｋＡＩＶ）が、このクラスターについて中心にある（図５）。これらのｐｉｋ  ＰＫＳを含む６つのモジュールの分析によって、これが、ナルボノライド、ナルボマイシンおよびピクロマイシンの１４員環のアグリコン前駆体の産生を特定することが示された（図５）。
【０１１３】
最初の分析によって、ｐｉｋＡにコードされるＰＫＳにおける２つの重要な構造的な差異を明らかにした。第１に、ｅｒｙＡ（Ｄｏｎａｄｉｏら，１９９８）およびｏｌｅＡ（Ｓｗａｎら，１９９４）、すなわち、ピクロマイシンに類似の１４員環マクロライドエリスロマイシンおよびオレアドマイシン（ｏｌｅａｄｏｍｙｃｉｎ）を産生する２つのＰＫＳクラスターと比較して、別個のＯＲＦである、ｐｉｋＡＩＩＩおよびｐｉｋＡＩＶの存在は、注目すべき、ｅｒｙＡＩＩＩおよびｏｌｅＡＩＩＩにおけるような１つの２モジュール（ｂｉｍｏｄｕｌａｒ）タンパク質とは対照的に、これらのｐｉｋＡＩＩＩおよびｐｉｋＡＩＶは、Ｐｉｋモジュール５およびＰｉｋモジュール６を（個々のモジュールとして）コードする。第２に、Ｉ型ＰＫＳクラスターの直ぐ下流にある、ＩＩ型チオエステラーゼの存在はまた、前代未聞である（図５）。これらの２つの特徴によって、ｐｉｋＡが１２員環のマクロラクトン１０−デオキシメチライドを十分に産生し得る事実が示唆される。
ＰｉｋＡＩ−ＡＩＩＩ（モジュールＬ−５）のこのドメイン構成は、１０デオキシメチライドの予測された生合成物と一致し、但し、Ｐｉｋモジュール５（ＰｉｋＡＩＩＩ）のＣ末端にＴＥ機能は不在である。ＰｉｋＡＩＩＩにおけるＴＥドメインの欠失は、（ｐｉｋＡＶによりコードされる）ＩＩ型ＴＥによって補われ得、このＩＩ型ＴＥはｐｉｋＡＩＶの直ぐ下流に存在する。２つの別個のポリケチド環系はこのｐｉｋ  ＰＫＳからアセンブリされるという仮定と一致して、２つのマクロライド−リンコサミド−ストレプトグラミンであるＢ型耐性遺伝子、ｐｉｋＲ１およびｐｉｋＲ２が、ｐｉｋ  ＰＫＳの上流に見出され（図６）、これは、おそらく、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおいて細胞性自己保護を提供する。
【０１１４】
デソサミン（ｄｅｓｏｓａｍｉｎｅ）生合成およびグリコシル転移のための遺伝子座は、ｐｉｋＡのすぐ下流である。７つの遺伝子（ｄｅｓＩ、ｄｅｓＩＩ、ｄｅｓＩＩＩ、ｄｅｓＩＶ、ｄｅｓＶ、ｄｅｓＶＩおよびｄｅｓＶＩＩＩ）は、デオキシ糖の生合成を担っており、そして８番目の遺伝子ｄｅｓＶＩＩは、デソサミンの代替性の（１２員環および１４員環）ポリケチドアグリコンへの転移を明らかに触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする。たった一セットのデソサミン遺伝子の存在は、ＤｅｓＶＩＩＩが、１０−デオキシメチノリド（ｄｅｏｘｙｍｅｔｈｙｎｏｌｉｄｅ）およびナルボノリド（ｎａｒｂｏｎｏｌｉｄｅ）の両方を基質として受け得ることを示す（Ｊａｃｏｂｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）。ｄｅｓ遺伝子座において、最も大きなＯＲＦ（ｄｅｓＲ）は、細菌自己防御に関する薬物不活性化−活性化サイクルに関与するβ−グリコシダーゼをコードする。
【０１１５】
ｄｅｓ遺伝子座のすぐ下流は、ｅｒｙＦ（Ａｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２）およびｅｒｙＫ（Ｓｔａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３）に類似するチトクロムＣ  Ｐ４５０ヒドロキシラーゼＰｉｃＣをコードする遺伝子（ｐｉｋＣ）、ならびに推定調節タンパク質ＰｉｋＤをコードする遺伝子（ｐｉｋＤ）である（図５）。興味深いことに、ＰｉｋＣは、全ｐｉｋクラスターにおいて同定された唯一のＰ４５０ヒドロキシラーゼであり、この酵素が、１２員環および１４員環のマクロライド基質の両方を受け得、そして、より著しくは、ＹＣ−１７（１２員環中間体）のＣ−１０およびＣ−１２の両方に対して活性であり、メチマイシン（ｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）およびネオメチマイシン（ｎｅｏｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）を生成することを示唆する（図７）。ＰｉｋＤは、ラパマイシン遺伝子クラスター中のＯＲＦＨに類似の推定調節タンパク質である（Ｓｃｈｗｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５）。
【０１１６】
ｐｉｋクラスターにおいて、１８の遺伝子によってコードされる一体化した機能性は、メチマイシン、ネオメチマイシン、ナルボマイシンおよびピクロマイシンの生合成を予想する（表１）。ｐｉｋクラスターの遺伝子座のフランキングは、おそらく一次の代謝に関する遺伝子ならびに一次および二次の代謝の両方に関連し得る遺伝子である。Ｓ−アデノシル−メチオニンシンターゼ遺伝子は、デソサミン合成においてメチル基を提供することを補助し得るｐｉｋＤの下流に位置する。スレオニンデヒドラターゼ遺伝子を、ポリケチド生合成についての前駆体を提供し得るｐｉｋＲ１の上流に同定した。これらの遺伝子のいずれが抗生物質の生合成に理想的なのか、そしてそれらのいずれがｐｉｋクラスターに直接関連していないのかは、明らかではない。
【０１１７】
（表１．ｐｉｋクラスターにおけるＯＲＦの推定機能）
【０１１８】
【表１】
2004534502.tif 000009
ＡＴ（Ａ）、アセテート伸長ユニットを取り込むアシルトランスフェラーゼ；ＡＴ（Ｐ）、プロピオネート伸長ユニットを結合するアシルトランスフェラーゼ。ＫＲ０、不活性なＫＲ。機能の不確定な酵素に、疑問符をつける。
【０１１９】
（表２．ｐｉｋクラスターの変異分析の概要）
【０１２０】
【表２】
2004534502.tif 000010
（ｐｉｋクラスターの変異分析）
ｐｉｋクラスターにおける遺伝子の広範な破壊を、抗生物質生成の主要な酵素の役割を指定するために実施した（表２）。第一に、１０−デオキシメチノリドおよびナルボノリドの生合成に関連する第一の推定酵素（ＰｉｋＡＩ）を、挿入突然変異誘発により不活性化した。生じた変異体（ＡＸ９０３）は、メチマイシンまたはネオメチマイシンも、ナルボマイシン（ｎａｒｂｏｍｙｃｉｎ）またはピクロマイシン（ｐｉｋｒｏｍｙｃｉｎ）のどちらも生成せず、ｐｉｋＡが１２員環および１４員環の両方のマクロラクトン形成について要求されるＰＫＳをコードすることを示す。
【０１２１】
第二に、ｄｅｓＶＩおよびｄｅｓＶの両方の欠失は、メチマイシン、ネオメチマイシン、ナルボマイシンおよびピクロマイシンの生成を破壊し、そして生じた変異体（ＬＺ３００１およひＬＺ４００１）は、１０−デオキシメチノリドおよびナルボノリドを、その培養ブロスに蓄積する。これは、デソサミンの合成および転移に関する酵素がまた、１２員環および１４員環のマクロライドによって共有されることを示す。
【０１２２】
ＰｉｋＡＩＩＩ（ＰＩＫＡＩＩＩ（モジュール５）は、１０−デオキシメチノリドの構造において、終結点であると推測される）でポリケチド鎖終結のメカニズムを理解するために、ｐｉｋ  ＴＥＩＩ遺伝子である、ｐｉｋＡＶを欠失した。欠失／置換変異体（ＡＸ９０５）は、野生型Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅと比較して、５％未満のメチマイシン、ネオメチマイシン、そして５％未満のピクロマイシンを生成する。生成物形成におけるこの抑制は、予想されるアグリコン中間体の有意な蓄積なしに生じ、ｐｉｋ  ＴＥＩＩが、ＰｉｋＡＩＩＩおよびＰｉｋＡＩＶのそれぞれでの、１２員環および１４員環のマクロライドの終結に関連することを示唆する。極性効果は、ＡＸ９０５において観察される表現型に影響し得るが、これは、変異体ＬＺ３００１の考慮の後に除外された。ＬＺ３００１における、ｐｉｋＡＶの下流の酵素における変異は、１０−デオキシメチノリドおよびナルボノリドを蓄積した。変異体ＡＸ９０５がこれらの中間体を蓄積し得なかったという事実は、ポリケチド鎖が、Ｐｉｋ  ＴＥＩＩの非存在下でこのＰＫＳタンパク質から効果的に開放されなかったことを示唆する。それゆえ、Ｐｉｋ  ＴＥＩＩは、ポリケチド鎖の開放および環化において重大な役割を果たし、そして、おそらく、Ｐｉｋポリケチド生合成において代替的な終結についてのメカニズムを提供する。
【０１２３】
最後に、ＰｉｋＣの破壊によって、ＰｉｋＣがＹＣ−１７（Ｃ−１０およびＣ−１２で）ならびにナルボマイシン（Ｃ−１２で）の両方のヒドロキシル化を修飾する唯一の酵素であることを確認した。ＰｉｋＣの緩んだ基質特異性ならびにＣ−１０およびＣ−１２でのその領域特異性は、ｐｉｋがコードする生合成系における、代謝産物多様性の別の階層を提供する。
【０１２４】
（考察）
本明細書中に記載される研究は、メチマイシン、ネオメチマイシン、ナルボマイシンおよびピクロマイシンの生合成が、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおいてｐｉｋクラスターによってコードされることを確定した。３つの主要な酵素およびクラスターの独特な構造は、この比較的コンパクトな系が、複数のマクロライド抗生物質を生成することを可能にする。最も重要なことに、別個のタンパク質としてのｐｉｋモジュール５および６（ＰｉｋＡＩＩＩおよびＰｉｋＡＩＶ）の存在ならびにｐｉｋ  ＴＥＩＩの活性は、細菌が、アセンブリの２つの異なるポイントでポリケチド鎖を終わらせることを可能にし、それゆえ、２つの異なる環サイズのマクロラクトンを生成する。第二に、ｐｉｋクラスターにおけるグリコシルトランスフェラーゼは（ＤｅｓＶＩＩ）、基質として１２員環および１４員環のマクロラクトンの両方を受け得る。最後に、Ｐ４５０ヒドロキシラーゼであるＰｉｋＣは、注目すべき基質およびこの系に別の階層の多様性を導入する領域化学的特異性を有する。
【０１２５】
これらのＰＫＳの各々が１４員環マクロラクトンの合成を特定化するので、ｅｒｙＡおよびｏｌｅＡと類似のラインで、ｐｉｋＡが発達することを考慮することは興味深い。それゆえ、原生のｐｉｋＡＩＩＩ−ｐｉｋＡＩＶリンカー領域における変異が、２つの別個の遺伝子産物へのＰｉｋのモジュール５および６の開裂を引き起こす場合、ｐｉｋは、メチマイシンを生成する能力を獲得し得る。この概念は、ヌクレオチド配列の２つの特徴によって生じる。第一に、ｐｉｋＡＩＩＩとｐｉｋＡＩＶとの間の遺伝子間領域（１０５ｂｐ）は、３５アミノ酸のモジュラー間リンカーペプチドの残りであり得る。さらに、ｐｉｋＡＩＶの独立して調節される発現についての可能性は、比較的ＡＴリッチ（コード領域におけるＧ＋Ｃ含有量（７４％）と比較して６２％）である遺伝子の５’末端での１００ヌクレオチド領域の存在によって暗示される。従って、２モジュラー多機能タンパク質（ＰｉｋＡＩＩＩ−ＰｉｋＡＩＶ）をコードする元々のＯＲＦにおいて変異が生じるので、新規の遺伝子産物（ＰｉｋＡＩＶ）の調節された合成についてのメカニズムもまた判明し得る。
【０１２６】
ポリケチド鎖伸長中間体の代替的な終結におけるＰｉｋ  ＴＥＩＩの役割は、天然生成物生合成において多様性生成の特有な局面を提供する。操作された異なる鎖長のポリケチドは、代表的に、モジュラーＰＫＳにおいて代替的位置にＴＥ触媒ドメインを移動させることによって生成される（Ｃｏｒｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５）。ＴＥドメインの再配置は、元々の全長ポリケチドの生成を必然的に破壊し、たった一つのマクロライドがその度ごとに生成される。固定された位置のＴＥドメインとは対照的に、独立したＰｉｋ  ＴＥＩＩポリペプチドは、おそらくポリケチドアセンブリの異なる段階で終結を触媒するために、可変性を有する。それゆえ、この系が、改変された鎖長の複数の生成物を生成することを可能にする。コンビナトリアルな生物学的技術は、現在、単一の終末工程を触媒することに限定されるＴＥドメイン単独とは反対に、いくつかの新規の分子の同時生成についてＴＥＩＩを用いる新規のＰＫＳ系の構築によって分子の多様性を生成するためにこの系を利用し得る。
【０１２７】
Ｐｉｋ  ＴＥＩＩに対して類似の配列が、ほとんど全ての公知のポリケチドおよび非リボソームポリペプチドの生合成系において見出されることに注目すべきである（Ｍａｒａｈｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）。現在、ｐｉｋ  ＴＥＩＩは、モジュラーＰＫＳにおいて最初に特徴付けられている。しかし、リポペプチドサーファクチン（ｓｕｒｆａｃｔｉｎ）生合成クラスターにおけるＴＥＩＩ遺伝子に関する最近の研究は、ｓｒｆ−ＴＥＩＩが、ポリペプチド鎖開放において重要な役割を果たすことを実証し（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）、およびｓｒｆ−ＴＥＩＩが、ペプチドアセンブリにおいても同様に複数の段階で反応することを示唆し得る（Ｍａｒａｈｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【０１２８】
１０−デオキシメチノリドおよびナルボノリドのポスト−ポリケチドアセンブリに関連するこの酵素は、特に、グリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）、およびＰ４５０ヒドロキシラーゼ（ＰｉｋＣ）と通じている。両方ともが、有意な構造可変性を有する基質を受ける、著しい能力を有する。さらに、ｄｅｓ  ＶＩの破壊は、ＤｅｓＶＩＩがまた、デオキシ糖構造におけるバリエーションに耐性であることを実証した。同様に、ＰｉｋＣは、インビトロでＹＣ−１７をメチマイシン／ネオメチマイシンに、そしてナルボマイシンをピクロマイシンに転換することが最近示された。
【０１２９】
ＯＲＦ１の標的化遺伝子の破壊は、ピクロマイシンおよびメチマイシン両方の生成を破壊し、これは、単一クラスターが両方の抗生物質の生合成を担うことを示す。ＴＥ２遺伝子の欠失は、メチマイシンおよびピクロマイシンの生成を実質的に減少させ、ＴＥ２が位置固定型ＴＥ１ドメインとは対照的に、アセンブリプロセスの間に異なるポイントで、ポリケチド鎖を開放する能力を有し、それゆえ、異なる鎖長のポリケチドを生成することを実証した。
【０１３０】
上記の結果は、１つのＰＫＳクラスターが、２つのマクロライド（これらは、環構造の原子数が異なる）を生成し、ＰＫＳのモジュール５およびモジュール６（スペーサー領域によって分離される）がＯＲＦに存在し、ＰｉｋＡＩＩＩがＴＥを欠き、ＩＩ型チオエステラーゼが存在し、ＴＥＩドメインが分離されておらず、そして２つの耐性遺伝子が、１２員環または１４員環のいずれかに特異的であり得ることを同定されるということが驚くべきことであるという点で予期されなかった。
【０１３１】
４つの活性マクロライドを生成する能力のあるＤＮＡの、６０ｋｂ未満にわたる１８の遺伝子を伴って、ｐｉｋクラスターは、これまでに調査されたなお最も汎用性のモジュラーＰＫＳ系の最小複合体を示す。この単純性は、強制的な発現系の基礎を提供し、新規の活性ケトシド生成物を、新しい生物学的に活性な多様な範囲の化合物の発見についてかなりの容易さで操作および生成する。
【０１３２】
（要約）
複合体ポリケチド合成は、前進的な反応メカニズムに従い、そしてＰＫＳ内の各モジュールは、一続きの３〜６個の酵素ドメインを有する。これらの酵素ドメインは、エリスロマイシン生成ＰＫＳに特に詳細に記載されるようなほぼ直線の形順序で、反応を触媒する（Ｋａｔｚ、１９９７；Ｋｈｏｓｌａ、１９９７；Ｓｔａｕｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。ポスト−ポリケチド作製のための酵素（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ、ヒドロキシラーゼ）をコードする遺伝子に加えてＰＫＳモジュールと触媒ドメインとの組み合わされたセットは、代表的に単一ポリケチド生成物の生成のために生合成系を制限する。
【０１３３】
コンビナトリアル生物学は、新規の薬物発見において使用される天然産物の分子多様性を作り出すための、複数段階の生合成経路の遺伝子操作に関する。その固有な遺伝子編成およびポリケチド代謝産物（細菌（主に、放線菌および粘液細菌）ならびに真菌によって生成される、多様な構造および生物学的活性を有する天然生産物の大きな群である）を生成する能力に起因して、ＰＫＳは、コンビナトリアル技術について最も影響を受けやすい系の１つを示す。複合体ポリケチドは、動物における長鎖の脂肪酸合成に類似のメカニズムに関する多機能なＰＫＳによって生成される（Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０）。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａにおけるエリスロマイシンＰＫＳに関する先駆的研究は、モジュール編成を示した（Ｃｏｒｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９０；Ｄｏｎａｄｉｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１）。このマルチドメインタンパク質系の特徴は、ラパマイシン（Ａｐａｒｉｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６）、ＦＫ５０６（Ｍｏｔａｍｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）、ソラフェンＡ（ｓｏｒａｐｈｅｎ  Ａ）（Ｓｃｈｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５）、ニドダマイシン（ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）（Ｋａｋａｖａｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）およびリファマイシン（ｒｉｆａｍｙｃｉｎ）（Ａｕｇｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）のＰＫＳの分子分析を受けて、多機能な細菌ＰＫＳのモジュラー構造とそのポリケチド生成物の構造との間の同一直線的な関係を証明した。
【０１３４】
異常な代謝産物の構造的可変性を生成し得る微生物系の調査において、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ  ＡＴＣＣ  １５４３９は、２つの異なるマクロライド抗生物質の群を生成するその能力において注目に値する。メチマイシンおよびネオメチマイシンは、１２員環マクロラクトンの１０−デオキシメチノリドから誘導されるが、ナルボマイシンおよびピクロマイシンは、１４員環マクロラクトン（ナルボノリド）から誘導される。これらの抗生物質の生合成遺伝子クラスターのクローニングおよび特徴付けは、代謝派生物を形成することにおいてＩＩ型チオエステラーゼの重要な役割を示し、それによって、異なる鎖長のポリケチドが、ピクロマイシン多機能性ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）により生成される。ＰＫＳ遺伝子（ｐｉｋＡ）のすぐ下流は、デソサミン（ｄｅｓ）生合成およびマクロライド環ヒドロキシル化に関する遺伝子の１セットである。グリコシルトランスフェラーゼ（ｄｅｓＶＩＩＩによってコードされる）は、１２員環および１４員環のマクロラクトンの両方のグリコシル化を触媒する著しい能力を有する。さらに、ｐｉｋＣがコードするＰ４５０ヒドロキシラーゼは、マクロライド環系に領域化学的多様性を導入することによって構造可変性の別の層をさらに提供する。
【０１３５】
（実施例４）
（ｄｅｓＶ欠失変異体はＤ−キノボースを生じる）
破壊されたｄｅｓＶ遺伝子を有するＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅの変異体（ＫｄｅｓＶ−４１）を、構築した（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２０、１２１５９  （１９９８））。ｄｅｓＶは３−アミノトランスフェラーゼ（３−ケト糖１７（図１１）を対応するアミノ糖４に転換することを触媒する）をコードするので、この遺伝子の欠失はＣ−３アミノ基転移を防ぎ、１７の蓄積を生じる。この経路のグリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）が、ケト糖中間体１７を認識および処理することが可能であるならば、ＫｄｅｓＶ−４１変異体によって生成されたマクロライド生成物は、結合した３−ケト糖を有するはずであることが予測された。驚くべきことに、単離された２つの生成物は、メチマイシン／ネオメチマイシンアナログ１８および１９であり、各々４，６−ジデオキシヘキソースを有する（図１２）。この結果は、グリコシルトランスフェラーゼについてのその糖基質に対する緩やかな特異性を証明したが、これはまた、糖代謝産物のＣ−３ケト基を立体特異的に還元し得る、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおける経路非依存性のレダクターゼの存在を示す。
【０１３６】
操作された糖を含むこの種類の新しいマクロライドを合成し得る変異体を生成する可能性を探索するために、デソサミンの生合成においてＣ−４脱酸素を担うデヒドラーゼをコードすることが提唱されているｄｅｓＩ遺伝子が、Ｄ−キノボース（２２；図１３）（これはまた、６−デオキシ−Ｄ−グルコースとして公知である）の最終産物への取り込みを導くという予測を改めた。理論的根拠は以下に基づく：（１）デソサミン生合成は、ｄｅｓＩ欠失に起因して、Ｃ−４脱酸素工程で「終結」し、従って３−ケト−６−デオキシヘキソース１６の蓄積を生じるはずである（図１１）。（２）Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおいて、３−ケトヘキソースレダクターゼの存在の平均をとることによって、この糖中間体１５がＤ−キノボース（２２）に立体特異的に還元されることが予想される。（３）糖基質に対して緩やかな特異性を有するグリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）は、操作された糖Ｄ−キノボースを含む新しいマクロライド２０および２１を得るために、マクロラクトンへの２２のカップリングを触媒するはずである（図１３）。
【０１３７】
アパラマイシン（ａｐｒａｍｙｃｉｎ）耐性マーカーを含むｐＫＣ１１３９から誘導した破壊プラスミド（ｐＤｅｓＩ−Ｋ）を、ｄｅｓＩをネオマイシン耐性遺伝子によって置換するように構築し、これにまた、カナマイシンに対する耐性を付与した。次いで、この構築物を、野生型Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅに、ドナー株としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１を用いる接合伝達によって導入した（Ｂｉｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。いくつかの二重交差変異体を、それらのカナマイシン耐性（ＫａｎＲ）およびアパラマイシン感受性（Ａｐｒｓ）の表現型に基づいて同定した。１つの変異体（ＫｄｅｓＩ−８０）を選択し、そして播種培地（１００ｍＬ）において２９℃にて４８時間増殖させ、次いで接種し、そして成長培地（５Ｌ）においてさらに４８時間増殖させた（Ｃａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９３）。発酵ブロスを遠心分離して、細胞の破片および菌糸体を除去し、そして上清を濃縮水酸化カリウム溶液を用いてｐＨ９．５に調整した。生じた溶液をクロロホルムで抽出し、そしてプールした有機抽出物を硫酸ナトリウムで乾燥し、乾固するまでエバポレートした。黄色油状物を、クロロホルム中の０〜１２％メタノールの勾配を用いるシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーに供し、そして単離された生成物を、定組成的なＣｌ８カラム溶出（水中の５０％アセトニトリルを用いる）を用いるＨＰＬＣによってさらに精製した。予想したように、メチマイシンもネオメチマイシンも検出されなかった；かわりに、１０−デオキシメチノリド２３が、主要生成物として見いだされた（約６００ｍｇ）。多量のメチノリド２４（約４０ｍｇ）およびネオメチノリド２５（約２ｍｇ）をまた、単離した（図１３）。Ｄ−キノボース（３．２ｍｇ）を含む新しいマクロライド１５を、この変異体によって生成した。この構造をスペクトル分析によって十分に確定した。１５についてのスペクトルデータ（Ｊ値はヘルツ）：
【０１３８】
【化５】
2004534502.tif 000011
Ｄ−キノボースを含むマクロライド１５がｄｅｓＩ変異体によって実際に生成されるという事実は、重要である。第一に、予想されたようなキノボースの形成は、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおいて経路に依存しないレダクターゼ（３−ケト糖を還元する）の存在をさらに確証する。興味深いことに、このレダクターゼは、４，６−デオキシ糖１７および６−デオキシ糖１６に対して作用し得、Ｃ−４でのヒドロキシル基の存在を無視することを示唆する。しかし、この時点ではこの還元が遊離の糖で生じるのか、または遊離の糖がアグリコンに付加された後で生じるのかは明らかではない。第二に、ｄｅｓＩ欠失の結果としてのキノボースの４−ＯＨの保持は、Ｃ−４でヒドラーゼをコードするように割り当てられたＤｅｓＩの役割を支持する強力な証拠を提供する。さらに、この結果は、この経路のグリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）が、代替的な糖基質（これらの構造は、元々のアミノ糖基質デソサミンとはかなり異なる）を認識し得ることを再び示す。キノボースの取り込みは重要であるが、予期されていないにもかかわらず、別の注目すべき結果は、単離されたマクロライド１５アグリコンが、メチノリド２４およびネオメチノリド２５ではなく１０−デオキシメチノリド２３であったという事実である。チトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼ（ＰｉｋＣ）（これは、Ｃ−１０位またはＣ−１２位のいずれかでの１０−デオキシメチノリドのヒドロキシル化を触媒する（Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８））は、付加された糖における構造的なバリエーションに感受性である可能性がある。糖部分における４−ＯＨ基の存在が、マクロライドのヒドロキシル化の減少または防止を幾分か担っていることが議論され得る。
【０１３９】
従って、この結果は、所望される構造の糖を操作するために、経路に依存する遺伝子操作と経路に依存しない酵素反応との組み合わせの実行可能性を実証する。経路に依存しない酵素がまた天然の生合成機構と合わせて使用されて、さらなる構造多様性（これは、無作為な化合物のアレイを提供し得る）を生成することが、考えられる。
【０１４０】
（実施例５）
（ハイブリッドマクロライドの操作）
マクロライドの糖構造を変化させるために、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ  ｍｅｔ／ｐｉｋ遺伝子クラスターを、親系として選択し、そしてカリチェアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）生合成遺伝子クラスター（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．、Ｃａｌｉｃｈｅｎｓｉｓに由来）に由来する遺伝子を外来遺伝子として選択した。親クラスターは、メチマイシン、ネオメチマイシン、ピクロマイシンおよびナルボマイシンについての生合成酵素をコードし、これらは全て、抗生物質活性についての唯一の糖成分としてデソサミンを含むマクロライドである  （Ｘｕｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）。このクラスターにおける８つのオープンリーディングフレーム（ｄｅｓＩ〜ｄｅｓＶＩＩＩ）を、デソサミン生合成に関連する遺伝子として割り当てた（図１５）。抗腫瘍薬剤カリチェアミシン（２６）は、密なＤＮＡ結合（Ｋａ約１０６〜１０８）に重要な４つの独特な糖を含み、そのうちの１つ（２９）は、４−アミノ−４，６−ジデオキシグルコース（２８）から誘導され、そして著しく制限された糖Ａと糖Ｂとの間のＮ−Ｏ結合の一部分である（図１６）（Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１；Ｄｒａｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１；Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１；Ｅｌｌｅｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｏｒｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５）。化合物２８は、アミノ基転移反応によって対応する４−ケト糖２７から誘導されることが予想され、そして、最近の研究は、Ｃ−４アミノトランスフェラーゼをコードするとして遺伝子（ｃａｌＨ）の割り当てを導いている（図１６）（Ａｌｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．）。興味深いことに、ｃａｌＨに対して提案された基質（２７）はまた、デソサミン経路の中間体であり、ＤｅｓＩに対する基質との、トートメラーゼ（ｔａｕｔｏｍｅｒａｓｅ）（ＤｅｓＶＩＩＩ）が媒介する平衡状態で存在することが予想される（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）。従って、２７が、ｄｅｓＩまたはｄｅｓＶＩＩＩの破壊／欠失Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ変異株において蓄積され得ることが考えられる。この変異体におけるｃａｌＨの異種性の発現は、２６から誘導した４−アミノ−４，６−ジデオキシグルコースを有する新しいメチマイシン／ピクロマイシン誘導体に指向するハイブリット経路を再構成し得る。
【０１４１】
これを試験するために、１．２ｋｂのｃａｌＨ遺伝子を、ｐＪＳＴ１１９２Ｋｐｎ７．０ｋｂ（コスミド１３ａの７．０ｋｂのＫｐｎＩフラグメントを含むサブクローン）からのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した（Ｔｈｏｒｓｏｎら、１９９９）。増幅した遺伝子を、アプラマイシン耐性マーカーを含む、発現ベクターｐＤＨＳ６１７のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位へとクローン化した。ｐＤＨＳ６１７を、ｐＯＪ４４６（Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２）およびｍｅｔ／ｐｉｋ由来のプロモーター配列（Ｘｕｅら、１９９８）から誘導する。得られたプラスミド（ｐＬＺ−Ｃ２４２）を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓ１７−１（Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２）を用いて、以前に構築したＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ変異体（ＫｄｅｓＩ）（Ｂｏｒｉｓｏｖａら、１９９９）へと接合伝達によって導入した。ここで、ｄｅｓＩを、カナマイシンに対する耐性をも与えるネオマイシン耐性遺伝子によって置き換えた。Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ−ＫｄｅｓＩコロニーを含むｐＬＺ−Ｃ２４２を、アプラマイシン抗生物質（ＡｐｒＲ）に対する耐性に基づいて同定した。操作された株の１つ（ＫｄｅｓＩ／ｃａｌＨ−１）を、最初に、１００ｍＬの播種培地中で２９℃で４８時間増殖させ、次いで、定養培地（５Ｌ）に播種し、さらに４８時間増殖させる（Ｃａｎｅら、１９９３）。発酵ブロスを遠心分離して細胞組織片および菌糸を除去し、上清を濃ＫＯＨでｐＨ９．５に調節した後、クロロホルムで抽出した。粗生成物（７００ｍｇ）を、クロロホルム中の０〜２０％メタノールの勾配を用いてシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーに供した。主生成物（１０−デオキシメチノリド）および副生成物の２種のマクロライド化合物の混合物を得た。この２種のマクロライドをさらに、アセトニトリル／Ｈ２Ｏ（１：１）の定組成移動相を用いて、Ｃ１８カラム上でＨＰＬＣによって精製した。これらの化合物を、スペクトル分析によって３１（１１．０ｍｇ）および３２（１．５ｍｇ）として後に同定した。３１のスペクトルデータは以下である：
【０１４２】
【化６】
2004534502.tif 000012
３２のスペクトルデータは以下である：
【０１４３】
【化７】
2004534502.tif 000013
ＫｄｅｓＩ／ｃａｌＨ−１によるマクロライド３１および３２の産生が観測されたことは、大きな意味を持つ。第１に、添加されたヘキソース（３３）は、予想されたＣ−４でのアミノ基を実際に保有し、カリチェアミシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）経路のＴＤＰ−６−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｌ−スレオ−４−ヘキスロース４−アミノトランスフェラーゼをコードするようなｃａｌＨ遺伝子の配列を明白に支持する。第２に、新規に構築された発現ベクターによってＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅにおけるＣａｌＨタンパク質の首尾良い発現は、この系を使用してこの株において、他の外来遺伝子を発現する可能性を有するさらに同化したコンビナトリアル生合成ストラテジーを開発するための必須条件を強調する。さらに、この結果はまた、この経路のグリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）が、代替の糖基質（例えば、２８）（この構造は、元々のアミノ糖基質（ＴＤＰ−Ｄ−デソサミン）とかなり異なる）を認識し得ることを示す。生成物中の糖成分がアミノデオキシヘキソース２８であると予想される場合、３１および３２中の結合した糖成分の４−アミノ基は、Ｎ−アセチル化されている。アセチル化が、遊離の糖で生じるかまたはアグリコンに付加した後に生じるかという点においては、明らかではない。３１および３２の両方は、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ変異株によってインビボで合成された新規化合物であるため、観測されたＮ−アセチル化は、自己保護のために必要な段階であり得る（Ｃｕｎｄｌｉｆｆｅ，１９８９；Ｃｕｎｄｌｉｆｅ，１９９２；ＭｃＭａｎｕｓ，１９９７）。実際に、精製した３１および３２は、Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天プレート上で増殖したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓに対して不活性であり（Ｍａｎａｇａｈａｓ，１９９６）、一方、コントロール（メチマイシン（ｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）およびピクロマイシン（ｐｉｋｒｏｍｙｃｉｎ））は、明らかに識別できる阻害領域を示す。
【０１４４】
別の注目すべきことは、予測されない結果ではあるが、単離されたマクロライド３１のアグリコンがヒドロキシル化されたメチマイシンアナログおよびネオメチマイシンアナログではなく１０−デオキシメチノリドであったという事実であった。興味深いことに、３２のアグリコンはまた、ヒドロキシル化されていない１４員環ナルボノリドであった。１０−デオキシメチノリドおよびナルボノリド（Ｘｕｅら、１９９８）のヒドロキシル化を触媒するチトクロムＰ４５０ヒドロキシラーゼ（ＰｉｋＣ）は、添加した糖上の構造的バリエーションに感受性である可能性がある。実際に、アグリコンがヒドロキシル化されないことは、３１および３２が精製したＰｉｋＣと共にインビトロでインキュベートされる場合に識別可能であった。同様の観測はまた、デソサミンがキノボース（ｑｕｉｎｏｖｏｓｅ）によって交換されている場合に注目される（実施例４）。糖部分中のＣ−４での置換基（ヒドロキシル基またはアミノ基のいずれか）の存在は、マクロライドのヒドロキシル化を少なくとも一部減少させるかまたは防止する原因となることが議論され得る。
【０１４５】
結論として、この結果は、非天然の二次代謝産物グリコシル化パターンが、異種遺伝子の組み合わせの合理的な選別を通じて操作され得ることを示す。天然生合成の機構と協力して、外来酵素を組み合わせるこの示された能力は、さらなる構造多様性を生成する途方もない可能性を示す。本研究を拡張することによって、多様なヌクレオチド糖グリコシル化前駆体プールの構築は、速やかに、コンビナトリアル生合成の努力を通して、現在の新規な薬物発見を実質的に高め得る。
【０１４６】
（実施例６）
（ハイブリッド糖生合成経路を操作する工程）
デソサミン経路中の６−デオキシ−４−ヘキスロース３３はまた、のＴＤＰ−Ｌ−ジヒドロストレプトース（３５）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ抗生物質ストレプトマイシン（３７）中に見い出されるストレプトースの前駆体（３６）のための生合成中間体として示唆されている（図１６）（Ｏｒｔｍａｎｎら，１９７４；Ｗａｈｌら，１９７５；Ｍａｉｅｒら，１９７５；Ｗａｈｌら，１９７９）。ストレプトマイシンクラスター中の遺伝子の仮の配列（Ｐｉｓｏｗｏｔｚｋｉら，１９９１；Ｄｉｓｔｌｅｒら，１９９２）で、ＴＤＰ−Ｌ−ジヒドロストレプトースのための生合成経路が想定されている。図１６に示されるように、ｓｔｒＭ遺伝子は、３３から３４への変換をになう３，５−エピメラーゼをコードし得、一方、ｓｔｒＬ遺伝子の産物は、３４の環縮小を触媒して３５を得る推測される（Ｐｉｓｏｗｏｔｚｋｉら，１９９１；Ｄｉｓｔｌｅｒら，１９９２）。ＳｔｒＭについて提案された基質（３３）はまた、デソサミン経路における中間体であるため、３３が蓄積するＳ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ  ｄｅｓＩ−変異体におけるＳｔｒＭ、ＳｔｒＬ、またはＳｔｒＭ／ＳｔｒＬの異種発現は、Ｌ−ピラノースまたはＬ−フラノースを運ぶ新規なメチマイシン／ピクロマイシン誘導体に対するハイブリッド経路を再構築し得る。
【０１４７】
これらの実験において、ｓｔｒＭ（０．８ｋｂ）およびｓｔｒＬ（１．０ｋｂ）遺伝子を、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓのゲノムＤＮＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって別個に増幅した。増幅したｓｔｒＭ遺伝子を、発現ベクターｐＤＨＳ７０２（Ｘｕｅら，２０００）のＥｃｏＲＩ／ＮｓｉＩ部位（チオストレプトン耐性マーカーを含む）にクローン化した。ｓｔｒＬ遺伝子を、ベクターｐＤＨＳ６１７のＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩ部位（アプラマイシン耐性マーカーを含む）へとクローン化した。各々のプラスミドを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｓ１７−１へと形質転換し（Ｂｉｅｒｍａｎら，１９９２）、次いで、以前に構築した変異体Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ  ＫｄｅｓＩへと接合伝達によって別個に導入した。得られた株（ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭおよびＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＬ）を、対応する抗生物質に対する耐性に基づいて同定した。同じストラテジーを使用して、ｓｔｒＬ含有プラスミドを、ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭ変異体へとさらに操作して、アプラマイシンおよびチオストレプトンの両方に対して耐性を有する、組換え株ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭ／ｓｔｒＬを産生する。このような株の１つ（ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭ／ｓｔｒＬ−８）を選択して、１５０ｍＬの播種培地中で２９℃で４８時間増殖させ、次いで、播種して定養培地（６Ｌ）中でさらに４８時間増殖させる（Ｃａｎｅら，１９９３）。発酵ブロスを遠心分離し、上清をクロロホルムで抽出した。濃縮後、残った黄色油状物（１．５ｇ）を、溶出液としてクロロホルム中の１０％メタノールを使用してシリカゲル上フラッシュクロマトグラフィーに供した。粗生成物を、Ｃ１８カラム上でＨＰＬＣによって、水中の０〜５０％アセトニトリル直線勾配を２０分用いて溶出して精製し、４種の新規マクロライド誘導体、３８（３１．１ｍｇ）、３９（６．３ｍｇ）、４０（３．０ｍｇ）、および４１（３．９ｍｇ）を得た。
【０１４８】
これらの化合物のスペクトル分析から、３８〜４０は、１２員環マクロライド誘導体であり、一方、４１は、１４員環マクロライドであることがわかった。
【０１４９】
【化８】
2004534502.tif 000014
2004534502.tif 000015
【０１５０】
【化９】
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【０１５１】
【化１０】
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【０１５２】
【化１１】
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興味深いことに、３８〜４１中の、アグリコンと添加した糖の間の結合の立体化学は、（Ｊ１’２’＝０Ｈｚ）であると確立し、これは、野生型構造において見られるグリコシド結合（ｄ，Ｊ１’２’＝６．５−７．５Ｈｚ）とは異なっている。これらの新規化合物は全て同一の６−デオキシヘキソースを有するが、ＮＭＲデータでは、付加した糖がＬ−ラムノース（４２）であるか、またはそのエナンチオマー、６−デオキシ−Ｄ−マンノース（４３）であるかを区別できない。新規に組込まれた糖を明白に同定するために、３８を、ジメトキシプロパンで処理した後、（Ｓ）−または（Ｒ）−ＭＴＡＰクロリドで誘導体化し、対応するＭｏｓｈｅｒエステル（４４および４５）を生成する。ＭＴＡＰのフェニル環の配向が２つのジアステレオマー間で異なるため、ＭＴＡＰに隣接するプロトンは、アリール基の異方性円錐に対する空間的関係に依存して異なる遮蔽を受ける（Ｏｈｔａｎｉら，１９９１；Ｆｅｒｒｅｉｒｏら，１９９１）。この十分に実証された現象に基づいて、キラル中心（Ｃ−４’）の絶対的立体化学は、（Ｓ）−ＭＴＰＡエステル  −  （Ｒ）−ＭＴＰＡエステルとして測定された化学シフトの違いから推定され得る。図１６の底部において示されるように、１’−Ｈ、２’−Ｈ、３’−Ｈ、４’−Ｈ、アセトニド基の２つのメチルシグナルについて正の値が観測され、一方、５’−Ｈおよび５’−Ｍｅについて負の値が記録された。これらの発見は、Ｃ−４’においてＳ構造であることを示し、３８〜４１中の結合した糖がＬ−ラムノースとして割り当てられることを示す。
【０１５３】
操作されたＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭ／ｓｔｒＬ株によって産生される代謝産物３８〜４１の糖成分としてのＬ−ラムノース（４２）の同定を用いて、３３を３４に変換する３，５−エピメラーゼとしてのＳｔｒＭの役割が、明確に確認される。ａ−連結Ｄ−キノボース（ｑｕｉｎｏｖｏｓｅ）（４７，６−デオキシ−Ｄ−グルコース）を保有する、対応するメチマイシン／ピクロマイシン誘導体は、ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＬ株によって産生される（図１６）。これらのキノボース含有マクロライドはまた、宿主株（Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ  ＫｄｅｓＩおよびＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭ株）の代謝産物として見い出された。ＳｔｒＬの基質が、３４であると予測されるため、ＳｔｒＭの非存在下で、３４を提供する３３の必要なＤ−／Ｌ−変換を触媒し、ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＬおよびＫｄｅｓＩ株の両方が、観察されたような同じマクロライドを産生することは驚くべきことではない。新規なマクロライド生成物が、ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭ株のブロスにおいて見い出されないという事実は、インビボで３４が不安定であることに起因し得るか、またはグリコシルトランスフェラーゼ  ＤｅｓＶＩＩが、基質としての３４を処理できないことに起因し得る。明らかに、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ  ＫｄｅｓＩの宿主株は、ＴＤＰ−Ｄ−キノボース（４６）に３３を還元させ得るが、３４を還元するそれ自身のＬ−ヘキソースレダクターゼを欠く、Ｄ−ヘキスロースレダクターゼに依存しない経路を含む。ＳｔｒＭで触媒されるエピマー化は、可逆であると予想される。従って、Ｄ−ヘキソースレダクターゼの存在下、ＫｄｅｓＩ／ｓｔｒＭ株における３３と３４との間の平衡は、３３の方にシフトし、還元の後に、生成物中に観測されるようなキノボースを生じる。Ｌ−ラムノースは、ｓｔｒＬ含有株中にのみ形成されるため、ジヒドロストレプトースシンターゼとしての推定機能に加えて、ＳｔｒＬが、Ｌ−６−デオキシ−４−ヘキソース（例えば、３４）をＴＤＰ−Ｌ−ラムノース（４８）に還元し得る糖レダクターゼとしても役立つということを結論付け得る。
【０１５４】
ジヒドロストレプトース経路における環縮小工程の機構は、アピオースシンターゼによって触媒されるＵＤＰ−Ｄ−グルクロン酸（４９）から誘導されるＵＤＰ−Ｄ−アピオース（５０）の生合成に提案される工程と著しく類似していることに注目されるべきである（図１８）（Ｋｅｌｌｅｈｅｒら，１９７２；Ｇｅｂｂら，１９７５；Ｗａｔｓｏｎら，１９７５；Ｍａｔｅｒｎら，１９７７；Ｗａｈｌら，１９７８）。このシンターゼは、４−ヘキスロースレダクターゼおよび環縮小活性の両方を有する二重機能を有するように割り当てられている。というのは、ＵＤＰ−Ｄ−キシロース（５１）は、アピオースシンターゼの触媒作用の副生成物であるからである（Ｋｅｌｌｅｈｅｒら，１９７２；Ｇｅｂｂら，１９７５；Ｗａｔｓｏｎら，１９７５；Ｍａｔｅｒｎら，１９７７；Ｗａｈｌら，１９７８）。従って、ＳｔｒＬがヘキスロースレダクターゼ活性を有するアピオースシンターゼに似ているという事実が、ジヒドロストレプトース経路における環縮小工程のための触媒のようなＳｔｒＬの類似の役割に関して強力な信用性をもたらす。マクロライド構造への３５の組込みを検出できないことは、その活性部位においてフラノースに適応するＤｅｓＶＩＩの制限を単に反映する。
【０１５５】
明細書中に記載される結果は、基質としてのＤ−糖およびＬ−糖の両方を認識するグルコシルトランスフェラーゼの珍しい例を示す（Ｗｏｈｌｅｒｔら，１９９８）。基質選択におけるグリコシルトランスフェラーゼ（ＤｅｓＶＩＩ）の確立された汎用性は、広範囲の改変された糖を保有する、新規抗生物質のためのより優れたコンビナトリアル生合成ストラテジーをさらに開発する新規マクロライドの構築における触媒としての能力のための必須要件を強調する。この研究は、再度、合理的な遺伝子の組み合わせの選別を通して二次代謝産物のグリコシル化を操作しやすいことを示す。
【０１５６】
（実施例７）
（ＤｅｓＩＩによるＴＤＰ−４−アミノ−４，６−ジデオキシ−Ｄ−グルコースの合成）
炭水化物は、多くの生理学的プロセスにおいて重要な役割を有する認識の増加に起因して、近年において生物学的分子の間で注目され始めている（Ｗｅｙｍｏｕｔｈ−Ｗｉｌｓｏｎら，１９９７）。多くの複合多糖、糖、特にデオキシ糖の成分として、多様なレパートリーの生物学的活性に寄与する。付加した糖の構造を改変することは、親の複合多糖の生物学的活性を変化または向上させるための見込みを保持するので、これらの珍しい糖がどのように生物の産生において作製されるかを探索するためのかなりの継続した努力が存在する（Ｈａｌｌｉｓら，１９９９；Ｈｅら，２０００）。このような努力は、ヘキソース糖のＣ−Ｏ結合を破壊するための天然に進化した、いくつかの優雅なストラテジーの発見を導く。従って、現在、一連のα，β−脱水、その後のヒドリド還元は、ケト糖前駆体のβ−脱酸素に関する機構であり（Ｄｒａｅｇｅｒら，１９９９；Ｃｈｅｎら，１９９９）、一方、ピリドキサミン５’−ホスフェート（ＰＭＰ）に依存性の［２Ｆｅ−２Ｓ］含有酵素（Ｅｌ）およびＮＡＤＨ依存性の鉄−硫黄フラボタンパク質レダクターゼ（Ｅ３）による共同の触媒活性は、ケト糖基質のα−脱酸素のために必要とされる（Ｔｈｏｒｓｏｎら，１９９３；Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９６；Ｃｈａｎｇら，２０００）。
【０１５７】
ヘキソースのＣ−２、Ｃ−３、およびＣ−６でのＣ−Ｏ結合開裂の機構は、十分に確立されている（Ｈａｌｌｉｓら，１９９９；Ｈｅら，２０００）が、４−脱酸素化糖の作製におけるＣ−４でのＣ−Ｏ結合切断の様式についてはほとんど知られていない。Ｄ−デソサミン（図１９中の１）、３−（ジメチルアミノ）−３，４，６−トリデオキシヘキソースの生合成に関する遺伝的研究は、多くの抗生物質において見い出され、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ由来のデソサミン生合成遺伝子クラスター全体の同定を生じ（スキーム１、図１９）（Ｚｈａｏら、１９９８；Ｘｕｅら、１９９８）、メチマイシン（２）、ネオメチマイシン（３）、ピクロマイシン（４）、およびナルボマイシン（５）を産生する。このことから、このクラスター内の８つのオープンリーディングフレーム（ｄｅｓＩ−ｄｅｓＶＩＩＩ）は、Ｃ−４脱酸素工程と関連するように割り当てられるｄｅｓＩおよびｄｅｓＩＩを含むデソサミン生合成中に含まれることが示唆される（Ｚｈａｏら、１９９８；およびエリスロマイシン遺伝子クラスターにおけるＤｅｓＩ／ＤｅｓＩＩ等価体（すなわち、ＥｒｙＣＩＶ／ＥｒｙＣＶ）に関連する、Ｇａｉｓｓｅｒら、１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら、１９９７を参照のこと）。ｄｅｓＩの翻訳された配列が、Ｂ６依存酵素に対して高い相同性を示し、Ｅ１の配列に対して２４％同一性であり、翻訳されたｄｅｓＩＩ配列は、［４Ｆｅ−４Ｓ］中心について特徴的なＣＸＸＸＣＸＸＣ（配列番号５０）の保存されたモチーフを含む（Ｒｕｚｉｃｋａら，２０００）ため、Ｃ−４脱酸素は、ＥｌおよびＥ３によって触媒されるものと類似の経路に従うように想定される（Ｚｈａｏら、１９９８；およびＧａｉｓｓｅｒら、１９９７；Ｓｕｍｍｅｒｓら、１９９７を参照のこと）。スキーム１（図１９）中に示されるように、この反応は、ＤｅｓＶＩＩＩによっておそらく触媒される互変異性工程によって開始されて６（６−デオキシヘキソースのための共通の前駆体）を３−ケト−６−デオキシヘキソース（７）に変換し得る。次いで、ＤｅｓＩおよびＤｅｓＩＩは、７からの４−ＯＨの除去をもたらし、３−ケト−４，６−ジデオキシヘキソース生成物（８）を与え、この生成物（８）は、この経路における次の酵素の基質（ＤｅｓＶ）として以前に確認されている（Ｚｈａｏら、１９９８）。この提案は、４−ＯＨが、ｄｅｓＩ欠失変異体によって産生される改変されたメチマイシンおよびピクロマイシン誘導体の付加した糖（Ｄ−キノボース、９）中に保持されるという事実によって支持される（Ｂｏｒｉｓｏｖａら、１９９９）。このＣ−Ｏ結合開裂事象についてさらに学ぶために、ｄｅｓＩＩ遺伝子の標的化された破壊およびＤｅｓＩ酵素の機能的分析を行なった。
【０１５８】
ＤｅｓＩＩがＣ−４脱酸素機構の一部であるか否かを確認するために、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ変異体を生成し、ここで、野生型Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ染色体を有する適切な挿入物を含有するプラスミドの相同組換えを介して、ｄｅｓＩＩ遺伝子を、カナマイシン耐性遺伝子と交換した（Ｂｉｅｒｍａｎら、１９９２）。この変異株を単離して、以前に記載されたように発酵のために使用した（Ｚｈａｏら、１９９８；Ｃｎａｅら、１９９３）。Ｅ１で触媒される脱水が、逆方向を好む平衡可逆反応であり（Ｗｅｉｇｅｌら、１９９２）、Ｅ３による還元は、全体的な反応を完結させるために必須であることが指摘されるべきである。それ故、Ｃ−４脱酸素は、Ｅ１／Ｅ３触媒活性に類似の経路に従い、ＤｅｓＩＩは、Ｅ３等価体である場合、ｄｅｓＩＩ遺伝子の破壊は、ｄｅｓＩ変異体に対して同一な表現型を有する変異体を与えると予想される。実際に、非野生型の抗生物質を、ｄｅｓＩＩ欠失変異体の発酵ブロス（６Ｌ）中に見い出した；代わりに、２つのマクロライド含有Ｎ−アセチル化４−アミノ糖１１（２．４ｍｇ）および１２（１ｍｇ）を得た（Ｚｈａｏら、１９９８を参照のこと）。化合物１１および１２は、１０とそれぞれのアグリコンのカップリング、その後のＮ−アセチル化から誘導される（スキーム１）。しかし、１０のＮ−アセチル化はまた、アグリコンのカップリングの前に生じる可能性がある。この一連の事象にもかかわらず、１１および１２の産生は、１０が、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅのｄｅｓＩＩ欠失変異体中に蓄積されなければならないことを明確に示す。
【０１５９】
上述の結果は、ＤｅｓＩが４−アミノトランスフェラーゼであり、４−アミノ化は、４−脱酸素の開始段階であるというヒントを提供する。ＤｅｓＩの触媒的機能を確認するために、ｄｅｓＩ遺伝子を、ＰＣＲによって増幅し、Ｎ末端でＨｉｓ６−ｔａｇを用いて、ｐＥＴ−２８ｂ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）へとクローン化した。産生したＤｅｓＩタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）によって、その後ＭｏｎｏＱカラム上でＦＰＬＣによって同質性を近づけるために精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判断されるように、ＤｅｓＩのサブユニットＭｒを、４５ｋＤａであると概算し、これは、４５  ７６５Ｄａ（プラスＨｉｓ６ｔａｇ）の計算された分子量と十分に一致する。サイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる分析は、ＤｅｓＩに関して９５．６ｋＤａのＭｒであることがわかった。それ故、ＤｅｓＩは、溶液中でホモ二量体として存在する。精製したＤｅｓＩのＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、約３００ｎｍより上で認識されない；しかし、より濃縮されたサンプルのスペクトルは、トレース量のＰＬＰの存在を示す。
【０１６０】
興味深いことに、推定基質（ＴＤＰ−３−ケト−デオキシ−Ｄ−グルコース（７））が、Ｌ−グルタメート存在下、精製したＤｅｓＩと共にインキュベートした場合、７は消費されず、新しい生成物は存在しないことを、ＨＰＬＣ分析によって認めた。これに反して、ＴＤＰ−４−アミノ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−グルコース（６）を同一条件下でＤｅｓＩを用いてインキュベートした場合、６（保持時間＝４．５２分）の消費および新規生成物（保持時間＝３．８７分）の形成が観測された。この新規の化合物を、ＭｏｎｏＱカラム上でＦＰＬＣによって精製し、ＴＤＰ−４−アミノ−４，６−ジデオキシ−Ｄ−グルコース（１０）として特性決定した。これらの結果は、ＤｅｓＩは、基質として４−ヘキソース（６）のみを認識することを確実にし、３−ヘキスロース（７）を処理しない。これらの発見は、ｄｅｓＩＩ遺伝子破壊の結果を十分に実証する。ＰＬＰ−依存性の４−アミノトランスフェラーゼのように、５６．２±３．１／分のκｃａｔ値および糖基質６に関する１３０±４μＭのＫＭ値もまた、ＤｅｓＩについて決定した。
【０１６１】
ＤｅｓＩは、ＤｅｓＩＩの非存在下、６におけるアミン交換反応を触媒して、以前に提案されたＴＤＰ−Ｄ−デソサミンのための生合成経路（スキーム１、図１９）の改変のための４−アミノ糖生成物１０を生成する。明らかに、６から７への互変異性は、デソサミン経路において必要な工程ではない。さらに、Ｃ−４脱酸素の機構は、Ｅ１／Ｅ３によって触媒されるＣ−３脱酸素の機構に類似し得ることが暗示される（Ｈａｌｌｉｓら，１９９９；Ｈｅら，２０００；Ｔｈｏｒｓｏｎら，１９９３；Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９６；Ｃｈａｎｇら，２０００）。ＤｅｓＩ／ＤｅｓＩＩ触媒活性が、Ｃ−４での窒素官能基（例えば、１３）の組み込みによって開始されることを考慮すると、アミナール（ａｍｉｎａｌ）中間体（例えば、１４）を生成するＣ−４からＣ−３への１，２−窒素シフトは、Ｃ−４脱酸素の鍵段階であり得る。スキーム２に示されるように、１４のＣ−３からの水もしくはアンモニウム分子のいずれかの脱離は、３−ケト−４，６−ジデオキシ糖生成物（８）を生成する。１，２−アミノシフトを促進し得る酵素が存在する。２つの最もよく研究された例が、エタノールアミンアンモニアリアーゼ、およびエタノールアミンのアンモニアおよびアセトアルデヒドへの分解を触媒するアデノシルコバラミン（ａｄｅｎｏｓｙｌｃｏｂａｌａｍｉｎ）（ＡｄｏＣｂｌ）依存性の酵素（Ｂａｂｉｏｒら、１９８２；ＬｏＢｒｕｔｔｏら、２００１；Ｆｒｅｙら、２０００）、ならびにアミノ基の１，２−−転移を介するＬ−リジンおよびＬ−β−リジンの相互変換を触媒するリジン２，３−アミノムターゼ（Ｂａｂｉｏｒら，１９８２；ＬｏＢｒｕｔｔｏら，２００１；Ｆｒｅｙら，２０００）である。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｕｂｔｅｒｍｉｎａｌｅ  ＳＢ４由来の後者の酵素は、鉄−硫黄中心を含み、ＰＬＰおよびＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存性である。両方の反応は、リジン２，３−アミノムターゼにおけるＳＡＭの還元的開列またはエタノールアミンアンモニアリアーゼ中のアデノシルコブ（ＩＩＩ）アラミンのＣｏ−Ｃ結合の等方性開裂によって生成する、推定５’−デオキシアデノシルラジカルを含むと考えられる。このアデノシルラジカルは、次いで、基質から水素を引き抜き、異性化を開始する。ＤｅｓＩは、ＰＬＰ酵素であり、ＤｅｓＩＩは、最近は、配列分析によって、ラジカルＳＡＭスーパーファミリーのメンバーとして同定されており（Ｓｏｆｉａら、２００１）、ＤｅｓＩおよびＤｅｓＩＩ酵素は、共に働いてリジン２，３−アミノムターゼの働きと同様に１，２−アミノ転移を触媒して（スキーム２、図２０を参照のこと）、Ｃ−４脱酸素を達成する。（ＤｅｓＩＩは、１０から直接３−Ｈ・を引き抜くことによって単独で作用しラジカル中間体を生成することも可能であり、このラジカルは、ＯＨの脱プロトン化の後、ケチル等価体に変換される。４−アミノ基のβ脱離の後、Ｈが戻り、互変異性がまた８を与え得る）。
【０１６２】
本研究が、デソスアミンの生合成のための新規経路を示す証拠を備えることは疑いもない。これらの結果はまた、Ｃ−４脱酸素のための新規機構を推論し得る。Ｃ−３脱酸素の機構を有するこの新規機構の比較は、明らかに、天然において、生合成で珍しい糖中のケトヘキソース前駆体からα−ＯＨの除去を行うための多様性を発展させ、同化させるストラテジーを有することを示す。共に、デオキシヘキソースの生合成に関して行われる研究は、生物学的脱酸素の一般的な経路へと、新しい機構的洞察を吹き込む。これらの発見は、生物学的なＣ−Ｏ結合開裂事象の進化的な多様性に対するすぐれた証拠である（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９９）。
【０１６３】
【数３】
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本明細書で引用される全ての特許、特許書類および明細書の完全な開示は、個々に援用されているかのように、参考として本明細書中で援用される。前述の詳細な説明および実施例は、理解を明快にするためのみに与えられている。ここから、不必要な限定はないと理解されるべきである。本発明は、示され記載される正確な詳細に対して限定されない。というのは、当業者に明らかな改変は、特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内に含まれるからである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、デソサミン生合成経路およびデソサミン生合成ポリペプチドの各々に付随する酵素活性の模式図である。
【図２】
図２は、メチマイシン（ｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）およびピクロマイシン（ｐｉｋｒｏｍｙｃｉｎ）の不活性（ジグリコシル化）形態の、活性形態のメチマイシンおよびピクロマイシンへの変換の模式図である。
【図３】
図３は、デソサミン生合成経路の模式図である。
【図４】
図４は、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのｄｅｓＶＩ変異体における式７および式８の化合物の合成経路を示す。
【図５】
図５は、メチマイシンおよびピクロマイシンならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ  ＡＴＣＣ  １５４３９における関連化合物の構造および生合成を示す。メチマイシン：Ｒ１＝ＯＨ、Ｒ２＝Ｈ、ネオメチマイシン（ｎｅｏｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）：Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＯＨ；ピクロマイシン：Ｒ３＝ＯＨ、ナルボマイシン（ｎａｒｂｏｍｙｃｉｎ）：Ｒ３＝Ｈ。ポリケチドシンターゼ成分ＰｉｋＡＩ、ＰｉｋＡＩＩ、ＰｉｋＡＩＩＩ、ＰｉｋＡＩＶおよびＰｉｋＡＶは、塗りつぶした棒線によって示される。各丸は、Ｐｉｋ  ＰＫＳ系の酵素ドメインを示す。ＫＳ：β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ、ＡＴ：アシルトランスフェラーゼ、ＡＣＰ：アシルキャリアタンパク質、ＫＲ：β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ、ＤＨ：β−ヒドロキシル−チオエステルデヒドラーゼ、ＥＲ：エノイルレダクターゼ、ＫＳＱ：ＫＳ様ドメイン、バツ印付のＫＲ：非機能的ＫＲ、ＴＥ：チオエステラーゼドメイン、およびＴＥＩＩ：ＩＩ型チオエステラーゼ。Ｄｅｓは、デソサミン生合成および転移のための８個全ての酵素を示し、ＰｉｋＣは、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３位でのヒドロキシル化を担うチトクロムＰ４５０モノオキシゲナーゼである（Ｘｉｅら、１９９８）。
【図６】
図６は、Ｓ．ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅのｐｉｋクラスターの編成を示す。各矢印は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を示す。ヌクレオチド配列から推定される転写の方向およびＯＲＦの相対的な大きさが示される。このクラスターは、４つの遺伝子座：ｐｉｋＡ、ｐｉｋＢ（ｄｅｓ）、ｐｉｋＣおよびｐｉｋＲから構成される。コスミドクローンは、重複する線として示される。
【図７】
図７は、ＰｉｋＣ  Ｐ４５０ヒドロキシラーゼによる、ＹＣ−１７およびナルボマイシンの変換を示す。
【図８】
図８は、デソサミン遺伝子クラスターのヌクレオチド配列（配列番号３）および推定アミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図９】
図９は、例示的および好ましいアミノ酸置換を示す。
【図１０】
図１０は、デソサミン生合成経路を示す。
【図１１】
図１１は、メチマイシン／ネオメチマイシンアナログ１８および１９を生じる経路の模式図を示す。
【図１２】
図１２は、Ｄ−キノボースを有するマクロライドを示す。
【図１３】
図１３は、ｄｅｓＩ変異体によって産生される産物を示す。
【図１４】
図１４は、ＣａｌＨを発現するｄｅｓＩ変異体において産生されるマクロライドを示す。
【図１５】
図１５は、ＣａｌＨの天然の基質およびＣａｌＨの産物、ならびにカリキアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｙｃｉｎ）の構造を示す。
【図１６】
図１６は、ＳｔｒＬおよびＳｔｒＭを発現するｄｅｓＩ変異体において産生されるマクロライドを示す。
【図１７】
図１７は、ＳｔｒＬおよびＳｔｒＭの天然の基質ならびにＳｔｒＬおよびＳｔｒＭの産物を示す。
【図１８】
図１８は、アピオースシンターゼの基質および産物を示す。
【図１９】
図１９は、ｄｅｓ変異体におけるデソサミンの生合成および中間体の模式図を示す。
【図２０】
図２０は、デソサミン生合成のための代替のスキームを示す。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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