(57)【要約】本発明は、配列特異的方法において遺伝子の転写および発現を選択的に妨害するために治療的物質として使用される新規オリゴヌクレオチドキメラに関する。特に本発明は、一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、アラビノヌクレオチド残基または修飾されたアラビノヌクレオチド残基から構築されたオリゴヌクレオチドを用いるアンチセンス戦略によりタンパク質生合成を選択的に阻害することに向けられる。詳細に述べると、本発明は、細胞ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡなどの相補的ＲＮＡへハイブリダイズするための、一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、アラビノヌクレオチド残基または修飾されたアラビノヌクレオチド残基から構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。より詳細に述べると、本発明は、相補的ＲＮＡへハイブリダイズしその切断（ＲＮａｓｅ Ｈ活性化による）を誘導するための、一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、アラビノヌクレオチド残基または修飾されたアラビノヌクレオチド残基から構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用に関する。
2004507272.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列特異的方法において遺伝子発現を選択的に妨害する、オリゴヌクレオチド「キメラ」であり、（ａ）ヌクレアーゼ安定性、（ｂ）相補的ＲＮＡ配列へのハイブリダイゼーションの結合強度、（ｃ）該オリゴヌクレオチドの細胞への透過性、（ｄ）ＲＮａｓｅ Ｈによる標的ＲＮＡの切断、または（ｅ）リボース転位の物理的阻止（「翻訳抑止（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｒｒｅｓｔ）」）のうち、少なくとも１種を誘導するために、１本鎖ＲＮＡにハイブリダイズする修飾されたアラビノースと２’−デオキシ糖とのキメラが含まれる、オリゴヌクレオチド「キメラ」。
【請求項２】
一般骨格組成「［ＦＡＮＡ ウィング］−［ＤＮＡ ギャップ］−［ＦＡＮＡ ウィング］」、または５’ＲＯ（ＦＡＮＡ−ｐ）ｘ−（ＤＮＡ−ｐ）ｙ−（ＦＡＮＡ−ｐ）ｚ−（ＦＡＮＡ）３’ＯＨを有する、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
一般式
【化１】
2004507272.tif 000014
（式中、
ｘ≧１、ｙ≧１、およびｚ≧０であり、ならびに
Ｒは、水素、チオリン酸、およびこのようなオリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強するリンカー部分からなる群より選択される）を有する請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドが下記式
【化２】
2004507272.tif 000015
（式中、
ｘ≧１、ｙ≧１、およびｚ≧０であり；
Ｒは、水素、チオリン酸、およびこのようなオリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強するリンカー部分からなる群より選択され；
Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、イノシン、および５−メチルシトシンからなる群より選択され；
Ｙは、ヌクレオチド間リン酸結合において、イオウ、酸素、メチル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ（このアルキル基は１〜約２０個の炭素原子を有する）、メトキシ、およびエトキシからなる群より選択され；
Ｘは、フラノース環（４’位）において、酸素、イオウ、およびメチレン（ＣＨ２）からなる群より選択され；ならびに
Ｚは、この糖環の２’位において、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、アルキル、ハロゲン化アルキル（例えば、−ＣＨ２Ｆ）、アリル、アミノ、アリール、アルコキシおよびアジドからなる群より選択される）を有する請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドが下記式
【化３】
2004507272.tif 000016
（式中、
ｘ≧１、ｙ≧１、およびｚ≧０であり；
Ｒは、水素、チオリン酸、およびこのようなオリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強するリンカー部分からなる群より選択され；
Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、イノシン、および５−メチルシトシンからなる群より選択される）を有する請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
オリゴヌクレオチドが下記式
【化４】
2004507272.tif 000017
（式中、
ｘ≧１、ｙ≧１、およびｚ≧０であり；
Ｒは、水素、チオリン酸、およびこのようなオリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強するリンカー部分からなる群より選択され；
Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、イノシン、および５−メチルシトシンからなる群より選択され；
Ｙは、ヌクレオチド間リン酸結合において、イオウ、酸素、メチル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ（このアルキル基は１〜約２０個の炭素原子を有する）、メトキシ、およびエトキシからなる群より選択され；
Ｘは、フラノース環（４’位）において、酸素、イオウ、およびメチレン（ＣＨ２）からなる群より選択され；ならびに
Ｚは、この糖環の２’位において、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、ヒドロキシル、アルキル、ハロゲン化アルキル（例えば、ＣＨ２Ｆ）、アリル、アミノ、アリール、アルコキシおよびアジドからなる群より選択される）を有する請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
下記の工程を含む、１本鎖ＲＮＡの切断法：
（ｃ）配列特異的方法において請求項１〜６記載のオリゴヌクレオチドを１本鎖ＲＮＡへハイブリダイズし、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘導する工程；および
（ｄ）該誘導したＲＮａｓｅ Ｈに、該ハイブリダイズした１本鎖ＲＮＡを切断させる工程。
【請求項８】
配列特異的方法において請求項１〜６記載のキメラオリゴヌクレオチドを１本鎖ＲＮＡへハイブリダイズし、これにより該１本鎖ＲＮＡにコードされる特異的タンパク質の産生を妨害する工程を含む、該１本鎖ＲＮＡの翻訳を妨害する方法。
【請求項９】
ＲＮＡが相補的ＲＮＡである、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
相補的ＲＮＡが、細胞ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
１本鎖ＲＮＡを切断するための医薬品を調製するための請求項１〜６記載のオリゴヌクレオチドの使用であり、ここで該オリゴヌクレオチドは、配列特異的方法において１本鎖ＲＮＡにハイブリダイズし、該ハイブリダイズした１本鎖ＲＮＡを切断するＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘導する、オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１２】
相補的ＲＮＡが、細胞ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡである、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
１本鎖ＲＮＡを切断するためのプローブまたは実験試薬を調製するための請求項１〜６記載のオリゴヌクレオチドの使用であり、ここで該オリゴヌクレオチドは、配列特異的方法において１本鎖ＲＮＡにハイブリダイズし、該ハイブリダイズした１本鎖ＲＮＡを切断するＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘導する、オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１４】
相補的ＲＮＡが、細胞ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡである、請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
配列特異的方法において遺伝子発現を選択的に妨害する薬学的組成物であり、薬学的に許容される担体と共に、請求項１〜６記載のオリゴヌクレオチド「キメラ」を有効量含有する、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
（ａ）発明の技術分野
本発明は、配列特異的方法において遺伝子の転写および発現を選択的に防止するための治療的物質として使用される新規オリゴヌクレオチドキメラに関する。特に本発明は、一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、アラビノヌクレオチド残基または修飾されたアラビノヌクレオチド残基から構築されたオリゴヌクレオチドを用いるアンチセンス戦略による、タンパク質生合成の選択的阻害に関する。詳細に述べると、本発明は、一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、アラビノヌクレオチド残基または修飾されたアラビノヌクレオチド残基から構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、細胞ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡなどの相補的ＲＮＡにハイブリダイズすることに関する。より詳細に述べると、本発明は、一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、アラビノヌクレオチド残基または修飾されたアラビノヌクレオチド残基から構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、相補的ＲＮＡにハイブリダイズしその切断（ＲＮａｓｅ Ｈ活性化による）を誘導することに関する。
【０００２】
（ｂ）先行技術の説明
アンチセンス戦略
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）は、配列特異的方法において特異的遺伝子発現を阻害することができる治療的物質である。現在多くのＡＯＮが、癌およびウイルス性疾患の治療に関して臨床試験中である。臨床的有用性に関し、ＡＯＮは、血清および細胞ヌクレアーゼによる分解に対する安定性を発揮し、血清および細胞タンパク質に対して低い非特異的結合を示し（この結合は、標的ＲＮＡとの塩基対形成に利用可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドの量を減少させるので）、標的ＲＮＡ配列の認識を増強させ（別の表現をすると、生理的温度で、アンチセンス−標的ＲＮＡ二重鎖の安定性を増大させる）、かつある程度は、細胞膜透過性を示さなければならない。標的遺伝子発現のアンチセンス阻害は、少なくとも２種の主要な機構によって生じると考えられている。第一のものは、「翻訳抑止（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｒｒｅｓｔ）」であり、ここでは、アンチセンスオリゴマーとその標的ＲＮＡとの間の二重鎖形成が、リボソームの完全なｍＲＮＡ配列を認識する能力を阻止することにより、ＲＮＡのタンパク質への完全な翻訳を妨げている。第二の機構は、おそらくより重要であり、これはアンチセンスオリゴヌクレオチドの、標的ｍＲＮＡのリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅ Ｈ）で触媒された分解を指示する能力に関する。ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡが、相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチド（またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）成分と二重鎖化された場合に、ＲＮＡを特異的に分解する内在性細胞酵素である。例えば、アンチセンスＤＮＡオリゴヌクレオチドが、細胞ｍＲＮＡへ相補的塩基対形成を介してハイブリダイズする場合に、細胞ＲＮａｓｅ Ｈは、得られるＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド二重鎖を認識し、次にその部位でｍＲＮＡを分解する。これら両方の機構により遺伝子発現を変調することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビボにおいて可能性のあるアンチセンス化合物の効能を増大させるので、非常に望ましい。
【０００３】
オリゴヌクレオチド類似体
天然型（リボースまたはデオキシリボース）糖およびホスホジエステル（Ｐ０）結合を含むオリゴヌクレオチドは、血清および細胞内のヌクレアーゼにより速やかに分解され、このことは有効な治療的物質としてのそれらの有用性を制限している。ヌクレアーゼ安定性を改善するための化学戦略は、糖部分、塩基部分の修飾、および／またはヌクレオチド間ホスホジエステル結合の修飾または置換を含む。今日まで、最も広く研究された類似体は、ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴデオキシヌクレオチドであり、これはホスホジエステル骨格の非架橋（ｎｏｎ−ｂｒｉｄｇｉｎｇ）酸素原子のひとつがイオウで置換されている。多くのＳ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド類似体が、癌、感染症および他のヒト病理発生の治療について臨床試験において評価中であり、そのいくつかは既に新薬承認申請（ＮＤＡ）が提出されている。Ｓ−ＤＮＡアンチセンスは、標的ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ分解を誘発することができ、かつこれらは血清および細胞ヌクレアーゼによる分解に対しかなり不応性（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ）である。しかし、ＰＳ−ＤＮＡアンチセンスは、ホスホジエステル（Ｐ０）結合を伴うオリゴデオキシヌクレオチドよりも、熱力学的安定性が低い標的ＲＮＡ核酸との二重鎖を形成する傾向がある。更にＳ−ＤＮＡアンチセンスは、対応するＰ０−ＤＮＡよりも、標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ分解を誘発する効率が低い。
【０００４】
作用の特異性は、新規オリゴヌクレオチド類似体の開発により改善され得る。新規オリゴヌクレオチドを作出する現在の戦略は、ヌクレオチド間のリン酸骨格、ヘテロ環式塩基、および糖環、またはこれらの組合せを変更することである。ヌクレオチド間の結合の変更または完全な交換は、最も一般的な方法であり、１９９４年以降６０種を超える修飾されたリン酸骨格が研究されている。ホスホロチオエート骨格を除けば、わずかに２種の他のもの、すなわち、ホスホロジチオエート（ＰＳ２）およびボラノホスホネート骨格が、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を活性化することが報告されている。ホスホロジチオエート結合した（ＰＳ２）オリゴデオキシヌクレオチドは、その高いイオウ含量のために、ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴマーよりもより緊密にタンパク質に結合し、かつＰＳ類似体と比べ低い効率でＲＮａｓｅ Ｈ媒介型切断を活性化するように見える。ボラノホスホネート結合したオリゴデオキシヌクレオチドは、ＲＮａｓｅ Ｈが媒介するＲＮＡ標的の切断を活性化するが、Ｐ０結合またはＰＳ結合したオリゴデオキシヌクレオチドよりもはるかに少ない。
【０００５】
報告されたように、糖修飾したオリゴヌクレオチドにおいて、そのほとんどは５員環を有し、ＤＮＡ（Ｄ−２−デオキシリボース）およびＲＮＡ（Ｄ−リボース）の糖によく似ている。これらの例は、α−オリゴデオキシヌクレオチド類似体であり、ここでは１’（またはアノマー）炭素の立体配置が逆位となっている。これらの類似体は、ヌクレアーゼ抵抗性（ｒｅｓｉｓｔａｎｔ）であり、ＤＮＡ配列およびＲＮＡ配列と共に安定した二重鎖を形成し、かつＲＮａｓｅ Ｈとは無関係のアンチセンス機構により、β−グロビンｍＲＮＡ翻訳を阻害することが可能である。別の例は、キシロＤＮＡ、２’−０−Ｍｅ ＲＮＡおよび２’−Ｆ−ＲＮＡである。これらの類似体は、ＲＮＡ標的と安定した二重鎖を形成するが、これらの二重鎖は、ＲＮａｓｅ Ｈの基質ではない。この制限を克服するために、糖修飾したオリゴヌクレオチドセグメントが両側に隣接したホスホジエステル（Ｐ０）およびホスホロチオエート（ＰＳ）のオリゴデオキシヌクレオチドセグメントのいずれかで構成された混合型骨格オリゴヌクレオチド（「ＭＢＯ」）が、合成された（Ｚｈａｏ， Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５１：１７３（１９９６）；Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ．ら、Ｊ． Ｐｈａｒｍｃｏｌ Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．、２７７：９２３（１９９６））。これらのＭＢＯの中で、今日までに最も研究されているものは、［２’−ＯＭｅ ＲＮＡ］−［ＰＳ ＤＮＡ］−［２’ＯＭｅ ＲＮＡ］キメラである。この鎖の中央のＰＳセグメントは、ＲＮａｓｅ Ｈ活性化ドメインとして利用される一方で、隣接している２’−ＯＭｅ ＲＮＡ領域は、ＭＢＯ鎖の標的ＲＮＡへの親和性を増大する。ＭＢＯは、インビボにおいて増大した安定性を有し、インビトロおよびインビボの両方におけるそれらの生物活性について、ホスホロチオエート類似体よりもより効果的であるように見える。オリゴヌクレオチドの隣接領域に２’−ＯＭｅおよび他のアルコキシ置換基を組込むこの方法の例は、インビボにおける抗腫瘍活性が増強されたことにより、Ｍｏｎｉａらによって説明された（Ｍｏｎｉａ， Ｐ．Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、２：６６８（１９９６））。これらの類似体の前臨床試験がいくつか進行中である。
【０００６】
ペントフラノース糖の代わりにヘキソピラノースを含むオリゴヌクレオチドの合成も報告されている。２、３のこれらの類似体は、増大した酵素安定性を有するが、全般的には標的配列との二重鎖形成能の低下により損なわれている。注目すべき例外は、高度に予め組織化（ｐｒｅ−ｏｒｇａｎｉｚｅｄ）された糖構造により、ＲＮＡと非常に安定した複合体を形成する１，５−アンヒドロヘキシトール単位から構成された６’→４’連結オリゴマーである。しかし、これらのヘキソピラノースオリゴヌクレオチド類似体が、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘発することは示されてはいない。最近、完全に変更された骨格を含むオリゴヌクレオチドが合成された。注目すべき例は、非環式骨格を伴うペプチド核酸（「ＰＮＡ」）である。これらの化合物は、例外的ハイブリダイゼーション特性、ならびにヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対する安定性を有する。しかしアンチセンス構築体としてＰＮＡオリゴマーを使用しようとする試みには、水への低い溶解度、自己凝集特性、細胞取込み不良、およびＲＮａｓｅ Ｈ活性化の不能が足枷となっている。ごく最近になって、キメラのＰＳ−ＤＮＡ部分によってＲＮａｓｅ Ｈ媒介型切断が維持されるように、ＰＮＡ−［ＰＳ−ＤＮＡ］−ＰＮＡキメラが設計された。
【０００７】
アラビノヌクレオシドおよびアラビノ核酸（ＡＮＡ）
アラビノヌクレオシドは、糖環の２’位の立体化学のみが異なる、リボヌクレオシドの異性体である。本発明者らは先に、アラビノースまたは修飾されたアラビノース（特に２’−Ｆアラビノース）糖を含むヌクレオチドにより全体が構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ分解を誘発することができることを示した（Ｄａｍｈａ， Ｍ．Ｊ．ら、ＪＡＣＳ、１２０：１２９７６（１９９８）；Ｎｏｒｏｎｈａ， Ａ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９：７０５０（２０００））。本発明者らは更に、アラビノースオリゴヌクレオチドとＲＮＡからなる二重鎖の熱安定性が、類似体ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖のそれよりも低いことにも注目した（Ｎｏｒｏｎｈａ， Ａ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９：７０５０（２０００））。しかし対照的に、ＲＮＡでハイブリダイズされた２’−Ｆアラビノースヌクレオチドで合成されたオリゴヌクレオチドからなる二重鎖の熱安定性は、一般に類似体ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖のそれよりも高い（Ｄａｍｈａ， Ｍ．Ｊ．ら、ＪＡＣＳ、１２０：１２９７６（１９９８））。ＧｉａｎｎａｒｉｓおよびＤａｍｈａは、ＡＮＡオリゴヌクレオチド中のホスホジエステル（Ｐ０）結合のホスホロチオエート（ＰＳ）結合との交換は、ＰＳ−ＡＮＡ／ＰＯ−ＲＮＡ二重鎖の安定性を著しく低下することを発見した（Ｇｉａｎｎａｒｉｓ， Ｐ．Ａ．；Ｄａｍｈａ， Ｍ．Ｊ．、Ｃａｎ． Ｊ． Ｃｈｅｍ、７２：９０９（１９９４））。この不安定化は、類似体ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＰＯ結合が、Ｓヌクレオチド間結合により交換された場合に認められるものよりも大きかった（Ｇｉａｎｎａｒｉｓ， Ｐ．Ａ．；Ｄａｍｈａ， Ｍ．Ｊ．、Ｃａｎ． Ｊ． Ｃｈｅｍ．、７２：９０９（１９９４））。
【０００８】
Ｗａｔａｎａｂｅとその同僚らは、２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノフラノシルピリミジンヌクレオシド（２’−Ｆ−ａｒａ−Ｎ、ここでＮ＝Ｃ、ＵおよびＴ）を、Ｐ０−ＤＮＡ鎖で主に構成されているオリゴヌクレオチド内のいくつかの位置に組込み、このような（２’−Ｆ）ＡＮＡ−ＤＮＡ「キメラ」の相補的ＤＮＡに対するハイブリダイゼーション特性を評価した（Ｋｏｉｓ， Ｐ．ら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１２：１０９３（１９９３））。２’−Ｆ−ａｒａＵおよび２’−Ｆ−ａｒａＣによる置換は、全体が−ＤＮＡ／ＲＮＡの二重鎖と比べ、二重鎖安定性を不安定にしたのに対し、２’−Ｆ−ａｒａＴとの置換は、二重鎖を安定化した。Ｍａｒｑｕｅｚとその同僚らは最近、２個の内部チミジンが２’−Ｆ−ａｒａＴで交換されたＤＮＡ鎖の自己−会合を評価した（Ｉｋｅｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２６：２２３７（１９９８））。彼らは、内部２’−Ｆ−ａｒａＴ残基は、ＤＮＡ二重らせんを顕著に安定化するというＷａｔａｎａｂｅとその同僚らの知見を確認した。これらの（２’−Ｆ）ＡＮＡ−ＤＮＡ「キメラ」の相補的ＲＮＡ（典型的アンチセンス標的）との会合は報告されていない。
【０００９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる標的ＲＮＡの細胞ＲＮａｓｅ Ｈ分解の誘発
アンチセンスオリゴヌクレオチドが指示した遺伝子発現の阻害に関する最も重要な機構のひとつは、細胞ＲＮａｓｅ Ｈにより認識され得る標的ＲＮＡにより二重鎖化される場合の、これらのアンチセンスオリゴヌクレオチド構造の形成能である。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドＲＮＡが塩基対形成した二重鎖の領域内での、ＲＮａｓｅ Ｈが媒介するＲＮＡ標的の分解を可能にする（Ｍｏｎｉａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６８：１４５１４（１９９３））。
【００１０】
ＲＮａｓｅ Ｈは、ＤＮＡ／ＲＮＡヘテロ二重鎖のＲＮＡ鎖を選択的に分解する。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来のＲＮａｓｅ Ｈ１は、最も簡単に入手でき、かつ最も良く特徴付けられた酵素である。ＲＮａｓｅ Ｈを含む真核細胞抽出物を用いる研究は、原核生物および真核生物の両方の酵素は、類似したＲＮＡ切断特性を示すが、細菌酵素が長さの小さい二重鎖をより良く切断することができることを示している（Ｍｏｎｉａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６８：１４５１４（１９９３））。大腸菌ＲＮａｓｅ Ｈ１は、ＤＮＡ／ＲＮＡ二重らせんの小さい溝に結合し、エンドヌクレアーゼおよびプロセシブ３’から５’エキソヌクレアーゼの両方の活性によりＲＮＡを切断すると考えられている。ＲＮａｓｅ Ｈの分解効率は、最小の配列依存性を示し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの化学変化に対し極めて敏感である。例えばＲＮａｓｅ Ｈは、Ｓ−ＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖のＲＮＡは容易に分解するが、これは、ＲＮＡと共にメチルホスホネートＤＮＡ、α−ＤＮＡ、または２’−ＯＭｅ ＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む二重鎖は分解することができない。更に大腸菌ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖に結合するが、ＲＮＡ／ＲＮＡ二重鎖の全体的らせん状のコンホメーションはＤＮＡ／ＲＮＡ基質二重鎖のコンホメーション（「Ａ」型らせん）に類似しているという事実にもかかわらず、これはいずれのＲＮＡ鎖も切断することはできない。これらの結果は、ＤＮＡ／ＲＮＡ（基質）二重鎖とＲＮＡ／ＲＮＡ（基質）二重鎖の間の局所構造の差異が基質の識別に寄与することを示唆している。
【００１１】
ＲＮａｓｅ Ｈ活性のアクチベーターとしてのアラビノ核酸
アンチセンスアプローチにおいて必須の要件は、オリゴヌクレオチドまたはその類似体が、その相補的標的ＲＮＡを認識しかつこれに緊密に結合することである。得られたアンチセンスオリゴヌクレオチド／ＲＮＡ二重鎖のＲＮａｓｅ Ｈの基質として役立つ能力は、おそらくこの酵素を活性化することができないアンチセンスオリゴヌクレオチドと比べアンチセンス作用を増強することにより、治療的価値を有するであろう。ＰＳ−ＤＮＡ（ホスホロチオエート）、ＰＳ２−ＤＮＡ（ホスホロジチオエート）、ボラノホスホネート結合したＤＮＡ、および内部ＰＳ−ＤＮＡセグメントを含むＭＢＯオリゴ以外の、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘発する完全に修飾されたオリゴヌクレオチドの唯一の例は、アラビノヌクレオチド（ＡＮＡ）または修飾されたアラビノヌクレオチド残基から構築されたものである（国際公開公報第９９／６７３７８号で公開された国際出願；Ｄａｍｈａ， Ｍ．Ｊ．ら、ＪＡＣＳ、１２０：１２９７６（１９９８）；Ｎｏｒｏｎｈａ， Ａ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９：７０５０（２０００））。これらのＡＮＡオリゴヌクレオチドは、天然型β−Ｄ−フラノース立体配置を維持しており、ＤＮＡ鎖のコンホメーションを模倣している（例えば、Ｃ２’末端コンホメーションにパッカーされた糖により）。後者の必要要件は、天然基質のアンチセンス鎖はＤＮＡであるという事実に端を発しており、かつ先に示したように、その一次構造（および／またはコンホメーション）は、ＲＮａｓｅ Ｈ／基質の切断に必須であるように思われ；ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのＤＮＡ糖は、主としてＣ２’末端コンホメーションを採用している。ＡＮＡは、糖環の２’位の立体化学のみが異なるＲＮＡの立体異性体である。ＡＮＡ／ＲＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ／ＲＮＡ基質（「Ａ」型）に非常に類似したらせん構造を採用しており、このことはこれらの複合体の類似した円偏光二色性スペクトルにより示された（Ｄａｍｈａ， Ｍ．Ｊ．ら、ＪＡＣＳ、１２０：１２９７６（１９９８）；Ｎｏｒｏｎｈａ， Ａ．Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９：７０５０（２０００））。
【００１２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドとしての混合型骨格または「ギャップマー」オリゴヌクレオチド構築体
糖修飾されたオリゴヌクレオチド「ウィング（ｗｉｎｇ）」セグメントが５’および３’両端に隣接したホスホジエステルまたはホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチド「ギャップ」セグメントで構成された混合型骨格オリゴヌクレオチド（ＭＢＯ）が、合成された（Ｚｈａｏ， Ｇ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、５１：１７３（１９９６）；Ｃｒｏｏｋｅ， Ｓ．Ｔ．ら、Ｊ． Ｐｈａｒｍｃｏｌ． Ｅｘｐ． Ｔｈｅｒ．、２７７：９２３（１９９６））。おそらく今日までに研究されたほとんどのＭＢＯは、［２’−ＯＭｅ ＲＮＡ］−［ＰＳ ＤＮＡ］−［２’ＯＭｅ ＲＮＡ］キメラであろう。２’−ＯＭｅ ＲＮＡ単独で構成されたオリゴヌクレオチドも、非常に高い親和性で標的ＲＮＡへ結合するが、その標的ＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ分解を誘発することはできない。［２’−ＯＭｅ ＲＮＡ］−［ＰＳ ＤＮＡ］−［２’ＯＭｅ ＲＮＡ］キメラオリゴヌクレオチドにおいて、鎖の中央部のＰＳ−ＤＮＡセグメントは、標的のＲＮａｓｅ Ｈ分解を誘発するために役立つのに対し、この隣接している２’−ＯＭｅ ＲＮＡ「ウィング」領域は、このＭＢＯ鎖の標的ＲＮＡに対する親和性を増大させる。ＭＢＯは、インビボにおいて増大した安定性を有し、インビトロおよびインビボの両方におけるそれらの生物活性において、同じ配列のＰＳ−ＤＮＡ類似体よりも、より効果的であるように見える。オリゴヌクレオチドの隣接領域に２’−ＯＭｅおよび他のアルコキシ置換基を組込むこのアプローチの例は、インビボにおいて抗腫瘍活性が増強することにより、Ｍｏｎｉａらによって明らかにされている（Ｍｏｎｉａ， ＰＢ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．、２：６６８（１９９６））。これらの類似体についていくつかの前臨床試験が進行中である。
【００１３】
しかし、２’−ＯＭｅ ＲＮＡはＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘発することができないので、［２’−ＯＭｅ ＲＮＡ］−［ＰＳ ＤＮＡ］−［２’ＯＭｅ ＲＮＡ］キメラオリゴヌクレオチドのＤＮＡギャップサイズは、慎重に決定されなければならない。大腸菌ＲＮａｓｅ Ｈは、ＤＮＡヌクレオチド４個ほどのＤＮＡギャップを伴う２’−ＯＭｅ ＲＮＡ ＭＢＯを認識し使用することができるが（Ｓｈｅｎ， Ｌ．Ｘ．ら、Ｂｉｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、６：１６９５（１９９８））、真核生物ＲＮａｓｅ Ｈ（例えばヒトＲＮａｓｅ Ｈ）は、最適な分解活性のためには実質的により大きいＤＮＡギャップ（７個のＤＮＡヌクレオチドまたはそれ以上）を必要とする（Ｍｏｎｉａ， Ｂ．Ｐ．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６８：１４５１４（１９９３））。一般に、［２’−ＯＭｅ ＲＮＡ］−［ＰＳ ＤＮＡ］−［２’ＯＭｅ ＲＮＡ］キメラオリゴヌクレオチドによる、真核生物のＲＮａｓｅ Ｈ媒介型標的ＲＮＡ切断効率は、ＤＮＡギャップ長の減少に伴い減少し、６個のＤＮＡヌクレオチドよりも小さいＤＮＡギャップサイズでは次第に無視できるようになる。従って、［２’−ＯＭｅ ＲＮＡ］−［ＰＳ ＤＮＡ］−［２’ＯＭｅ ＲＮＡ］キメラオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性は、ＤＮＡギャップサイズに高度に依存している（Ｍｏｎｉａ， Ｂ．Ｐ．ら、 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６８：１４５１４（１９９３）；Ａｇｒａｗａｌ， Ｓ．およびＫａｎｄｉｍａｌｉａ， Ｅ．Ｒ．、Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ、６：７２（２０００））。
【００１４】
最近になって、完全に変更された骨格を含むオリゴヌクレオチドが合成された。注目すべき例は、非環式骨格を持つペプチド核酸（「ＰＮＡ」） である。これらの化合物は、例外的ハイブリダイゼーション特性、ならびにヌクレアーゼおよびプロテアーゼに対する安定性を有する。しかしアンチセンス構築体としてＰＮＡオリゴマーを使用する試みには、水への低い溶解度、自己凝集特性、細胞取込み不良、およびＲＮａｓｅ Ｈ活性化の不能が足枷となっている。ごく最近になって、キメラのＰＳ−ＤＮＡ部分によってＲＮａｓｅ Ｈ媒介型切断が維持されるように、ＰＮＡ−［ＰＳ−ＤＮＡ］−ＰＮＡが設計された。
【００１５】
相補的ｍＲＮＡへの会合（およびＲＮａｓｅ Ｈが媒介する相補的ｍＲＮＡの切断）による遺伝子発現の配列特異的阻害のために、一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、アラビノヌクレオチド残基または修飾されたアラビノヌクレオチド残基から構成されたオリゴヌクレオチドが提供されることが非常に望ましい。
【００１６】
発明の概要
本発明のひとつの目的は、その標的ＲＮＡ配列と二重鎖を形成する、一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、アラビノヌクレオチド残基または修飾されたアラビノヌクレオチド残基から構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドキメラを提供することである。このような得られたアンチセンスオリゴヌクレオチド／ＲＮＡ二重鎖は、この二重鎖を認識しかつＲＮＡ標的部分を分解する酵素であるＲＮａｓｅ Ｈの基質である。ＲＮａｓｅ Ｈが媒介するＲＮＡ標的の切断は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の主要な機構であると考えられる。
【００１７】
本発明は、あるアンチセンスハイブリッドキメラ、特にβ−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）から構築された限定の配列が隣接している２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）から構築されたものが、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）から構築された限定の配列に隣接している２’−Ｏ−メチル−β−Ｄ−リボヌクレオチド（ＯＭｅＮＡ）から構築されたアンチセンスハイブリッドキメラよりも優れていることの発見に関連している。
【００１８】
従って、β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）から構築された限定の配列が隣接している２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）から構築されたアンチセンスハイブリッドキメラは、治療的物質ならびに／または細胞および器官における特異的遺伝子発現の研究および制御の道具として有用である可能性がある。
【００１９】
本発明に従い、配列特異的方法において遺伝子発現を選択的に妨害するオリゴヌクレオチド「キメラ」が提供されるが、これには修飾されたアラビノースと１本鎖ＲＮＡにハイブリダイズしている２’−デオキシ糖とのキメラが含まれ、下記の少なくともひとつを誘導する：（ａ）ヌクレアーゼ安定性、（ｂ）相補的ＲＮＡ配列へのハイブリダイゼーションの結合強度、（ｃ）オリゴヌクレオチドの細胞への透過性、（ｄ）ＲＮａｓｅ Ｈによる標的ＲＮＡの切断、または（ｅ）リボース転位の物理的阻止（「翻訳抑止」）。
【００２０】
このようなオリゴヌクレオチドは、「［ＦＡＮＡ ウィング］−［ＤＮＡギャップ］−［ＦＡＮＡ ウィング］」、または５’ＲＯ（ＦＡＮＡ−ｐ）ｘ−（ＤＮＡ−ｐ）ｙ−（ＦＡＮＡ−ｐ）ｚ−（ＦＡＮＡ）３’ＯＨの一般骨格組成を有し、およびより正確には一般式
【化５】
2004507272.tif 000003
（式中、ｘ≧１、ｙ≧１、およびｚ≧０であり、ならびに
Ｒは、水素、チオリン酸、およびこのようなオリゴヌクレオチドの細胞取込みを増
強するリンカー部分からなる群より選択される）
を有する。
【００２１】
本発明に従い、下記式
【化６】
2004507272.tif 000004
（式中、ｘ≧１、ｙ≧１、およびｚ≧０であり；
Ｒは、水素、チオリン酸、およびこのようなオリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強するリンカー部分からなる群より選択され；
Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、イノシン、および５−メチルシトシンからなる群より選択され；
Ｙは、ヌクレオチド間リン酸結合において、イオウ、酸素、メチル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ（このアルキル基は１〜約２０個の炭素原子を有する）、メトキシ、およびエトキシからなる群より選択され；
Ｘは、フラノース環（４’位）において、酸素、イオウ、およびメチレン（ＣＨ２）の群より選択され；ならびに
Ｚは、この糖環の２’位において、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、アルキル、ハロゲン化アルキル（例えば、ＣＨ２Ｆ）、アリル、アミノ、アリール、アルコキシおよびアジドからなる群より選択される）
を有するオリゴヌクレオチドが提供される。
【００２２】
本発明に従い、下記式
【化７】
2004507272.tif 000005
（式中、ｘ≧１、ｙ≧１、およびｚ≧０であり；
Ｒは、水素、チオリン酸、およびこのようなオリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強するリンカー部分からなる群より選択され；
Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、イノシン、および５−メチルシトシンからなる群より選択される）
を有するオリゴヌクレオチドが提供される。
【００２３】
本発明に従い、下記式
【化８】
2004507272.tif 000006
（式中、ｘ≧１、ｙ≧１、およびｚ≧０であり；
Ｒは、水素、チオリン酸、およびこのようなオリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強するリンカー部分からなる群より選択され；
Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、イノシン、および５−メチルシトシンからなる群より選択され；
Ｙは、ヌクレオチド間リン酸結合において、イオウ、酸素、メチル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ（このアルキル基は１〜約２０個の炭素原子を有する）、メトキシ、およびエトキシからなる群より選択され；
Ｘは、フラノース環（４’位）において、酸素、イオウ、およびメチレン（ＣＨ２）からなる群より選択され；ならびに
Ｚは、この糖環の２’位において、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、ヒドロキシル、アルキル、ハロゲン化アルキル（例えば、−ＣＨ２Ｆ）、アリル、アミノ、アリール、アルコキシおよびアジドからなる群より選択される）
を有するオリゴヌクレオチドが提供される。
【００２４】
本発明に従い、下記の工程を含む、１本鎖ＲＮＡの切断法が提供される：
（ａ）配列特異的方法において本発明のオリゴヌクレオチドを１本鎖ＲＮＡへハイブリダイズし、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘導する工程；および
（ｂ）誘導したＲＮａｓｅ Ｈに、ハイブリダイズした１本鎖ＲＮＡを切断させる工程。
【００２５】
本発明に従い、この１本鎖ＲＮＡの翻訳を妨害する方法が提供され、これは配列特異的方法において請求項２〜５記載のキメラオリゴヌクレオチドを１本鎖ＲＮＡへハイブリダイズし、これにより１本鎖ＲＮＡにコードされる特定のタンパク質の産生を妨害する工程を含む。
このＲＮＡは、細胞ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡのような、相補的ＲＮＡであってよい。
【００２６】
本発明に従い、１本鎖ＲＮＡを切断する医薬品を調製するための本発明のオリゴヌクレオチドの使用が提供され、ここでオリゴヌクレオチドは、配列特異的方法において１本鎖ＲＮＡにハイブリダイズし、ハイブリダイズした１本鎖ＲＮＡを切断するＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘導する。
【００２７】
本発明に従い、１本鎖ＲＮＡを切断するためのプローブまたは実験用試薬を調製するための本発明のオリゴヌクレオチドの使用が提供され、ここでオリゴヌクレオチドは、配列特異的方法において１本鎖ＲＮＡへハイブリダイズし、ハイブリダイズした１本鎖ＲＮＡを切断するＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘導する。
【００２８】
本発明に従い、配列特異的方法において遺伝子発現を選択的に妨害する組成物が提供され；これは、薬学的に許容される担体と共に、本発明のオリゴヌクレオチド「キメラ」を有効量含有している。
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明に従い、β−Ｄ−アラビノースとその誘導体から、その標的ＲＮＡ配列と二重鎖を形成する、一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、β−Ｄ−アラビノース糖部分または修飾されたβ−Ｄ−アラビノース糖部分を持つヌクレオチドから構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびそのような化合物の治療的用途が提供される。本発明の目的は、特定の遺伝子の発現を阻害する目的のために、ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡ（レトロウイルスＲＮＡを含む）であることができる相補的核酸とハイブリダイズする新規アンチセンスオリゴヌクレオチド類似体を提供することである。より詳細に述べると、本発明は、特異的標的ＲＮＡ配列にハイブリダイズしかつ細胞ＲＮａｓｅ Ｈの作用による標的ＲＮＡの切断を誘発するために、一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、β−Ｄ−アラビノース糖部分または修飾されたβ−Ｄ−アラビノース糖部分を持つヌクレオチドから構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することに関する。
【００３０】
本発明のオリゴヌクレオチドは、下記式（Ｉ）
【化９】
2004507272.tif 000007
（式中、Ｂは、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルのような通常のプリンまたはピリミジン塩基を含むが、必ずしもこれらに限定されるものではない）により表される。このオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの５’および３’末端（「ウィング」）に多くのβ−Ｄ−アラビノフラノースまたは修飾されたβ−Ｄ−アラビノフラノースヌクレオチドが隣接したＤＮＡ伸長（ｓｔｒｅｔｃｈｅ）（ＤＮＡ「ギャップ」）を含み、これによりＡＮＡ−ＤＮＡ−ＡＮＡ、２’Ｆ−ＡＮＡ−ＤＮＡ−２’Ｆ−ＡＮＡなどの「ギャップマー」を形成する。ヌクレオチド間リン酸結合は、酸素、イオウ、メチル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、メトキシおよびエトキシを含むが、必ずしもこれらに限定されるものではない。アラビノース糖の２’置換基は、フッ素、ヒドロキシル、アミノ、アジド、メチル、メトキシおよび他のアルコキシ基（例えば、エトキシ、プロポキシ、メトキシエトキシなど）を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３１】
本発明のギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡ、またはウイルスゲノムＲＮＡの特異的配列に相補的である配列を含み、その結果これらのギャップマーオリゴヌクレオチドは、各々、このｍＲＮＡにコードされるタンパク質の生合成を特異的に阻害するか、またはウイルス複製を阻害することができる。それらのアンチセンス特性（例えばヌクレアーゼ抵抗性）を増強するために５’および／または３’末端、またはリン酸骨格もしくは糖残基に対し示されたオリゴヌクレオチドの部分的修飾は、本発明の範囲内である。
【００３２】
好ましい本発明において有用なオリゴヌクレオチドの一群は、Ｂが天然型塩基（アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル）であり、「ウィング」の糖部分がβ−Ｄ−２’−デオキシ−２’−Ｆ−アラビノフラノースであり、およびヌクレオチド間リン酸結合がイオウ（ホスホロチオエート結合として）を含むものである。これらの修飾は、１本鎖ＲＮＡに対し高い親和性を示すオリゴヌクレオチドを生じる。加えて、これらのオリゴヌクレオチドは、アンチセンス療法に必要な要件に合致することが示されている。例えば、これらのオリゴヌクレオチドは、細胞ＲＮａｓｅ Ｈによる標的ＲＮＡの分解を誘発し、これにより標的ＲＮＡにコードされる特異的タンパク質の細胞内量および活性を減少させる。
【００３３】
本発明のギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、多くの望ましい特性を示す：
（１）これらは、ＲＮａｓｅ Ｈを活性化することにより、１本鎖ＲＮＡに結合し切断することがわかっている。特にβ−Ｄ−２’−デオキシ−２’−Ｆ−アラビノフラノースヌクレオチドで構成された「ウィング」を有するギャップマーオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ標的に対し優れた親和性を有し、これは２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成された「ウィング」を有するギャップマーオリゴヌクレオチドに匹敵し、同じ配列ＤＮＡのものよりも顕著に優れていることがわかっている。
（２）β−Ｄ−２’−デオキシ−２’−Ｆ−アラビノフラノースヌクレオチドで構成された「ウィング」を有するギャップマーオリゴヌクレオチドは、同一配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドよりも、細胞内遺伝子発現の配列特異的阻害がより良く作用することがわかっている。大きいＤＮＡギャップ（１０個のＤＮＡオリゴヌクレオチド）を伴うβ−Ｄ−２’−デオキシ−２’−Ｆ−アラビノフラノースヌクレオチドで構成された「ウィング」を有するギャップマーオリゴヌクレオチドの細胞内アンチセンス活性は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成された「ウィング」を有する同一配列のギャップマーオリゴヌクレオチドのものと同等であった。比較的小さいＤＮＡギャップ（６個のＤＮＡまたはそれ未満）により、β−Ｄ−２’−デオキシ−２’−Ｆ−アラビノフラノースヌクレオチドで構成された「ウィング」を有するギャップマーオリゴヌクレオチドの細胞内アンチセンス活性は、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドで構成された「ウィング」を有する同一配列のギャップマーオリゴヌクレオチドのものよりも顕著に優れていた。
【００３４】
これらの知見により、ＤＮＡの内部配列（「ギャップ」）が隣接しているβ−Ｄ−２’−デオキシ−２’−Ｆ−アラビノフラノースヌクレオチドで構成された「ウィング」を有するギャップマーオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチド物質の優れたモデルであり、かつ治療的物質ならびに／または細胞および生物における遺伝子発現を研究および制御する上での価値のある道具として利用されることが証明される。
【００３５】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定するためではなく本発明を説明するために提供されており、本発明は以下の実施例を参照することでより容易に理解されるであろう。
【００３６】
実施例１
β−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）から構築された所定の配列が隣接している２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）から構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの調製
１．　ＦＡＮＡ、Ｓ−［ＦＡＮＡ］およびＳ−［ＦＡＮＡ−ＤＮＡ−ＦＡＮＡ］の合成
ＰＯ−ＦＡＮＡの合成は、既報のように行った（Ｄａｍｈａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１２０：１２９７６−１２９７７（１９９８））。Ｓ−ＦＡＮＡおよびＳ−［ＦＡＮＡ−ＤＮＡ−ＦＡＮＡ］キメラの合成は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ ８９０９ ＤＮＡ合成装置を用い、１マイクロモルのスケールで行った。長鎖のアルキルアミンで制御された多孔質ガラス（ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ ａｌｋｙｌａｍｉｎｅ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ））を固相支持体として使用した。合成サイクルは下記工程からなる：
１）ＣＰＧ結合したヌクレオシド／チドの脱トリチル化（３％トリクロロ酢酸／ジクロロメタン）：１５０秒
２）２’−Ｆ−アラビノヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシド３’−ホスホロアミダイトモノマーのカップリング：１５分。使用したモノマーの濃度は、ａｒａＦ−Ｔ、ａｒａＦ−ＣおよびＤＮＡモノマーについて５０ｍｇ／ｍＬであり、ａｒａＡおよびａｒａＦ−Ｇについて６０ｍｇ／ｍＬであった（溶媒アセトニトリル）。
３）アセチル化を用いる標準のキャッピング工程：２０秒。キャッピング溶液は、１：１（ｖ／ｖ）の「ｃａｐＡ」および「ｃａｐＢ」試薬からなる。ＣａｐＡ：無水酢酸／コリジン／ＴＨＦ（１：１：８ｍｌ）；ｃａｐＢ：Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ（４：２１ｍｌ）。
４）アセトニトリルによる過度の洗浄（５０パルス）。
５）アセトニトリルを溶媒とする０．２Ｍ ３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オンの新鮮な溶液による硫化：１０分。
６）アセトニトリルによる洗浄：２０パルス。
７）キャッピング試薬の添加による固相支持体の乾燥（工程３参照）：５秒。
８）アセトニトリルによる洗浄（２０パルス）。
【００３７】
鎖を集成した後、オリゴヌクレオチドを固相支持体から切断し、既報のように脱保護した（Ｎｏｒｏｎｈａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９：７０５０−７０６２（２０００））。粗オリゴマーを、（ａ）分取ゲル電気泳動（２４％アクリルアミド、７Ｍ尿素）、その後の脱塩（Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５）、もしくは（ｂ）アニオン交換ＨＰＬＣ、その後の脱塩（ＳｅｐＰａｋ（登録商標）カートリッジ）のいずれかにより精製した。収量：５−３０ Ａ２６０単位。
【００３８】
ＨＰＬＣ精製条件：
カラム：タンパク質Ｐａｋ ＤＥＡＥ−５ＰＷ （７．５ｍｍ Ｘ ７．５ｃｍ、Ｗａｔｅｒｓ（登録商標））
溶媒：緩衝液Ａ：Ｈ２Ｏ；緩衝液Ｂ：１Ｍ ＮａＣｌＯ４、
勾配：１００％緩衝液Ａ定組成、１２分間
１００％Ａ−１５％Ｂ、直線状（５分間以上）
１５％Ｂ−５５％Ｂ、直線状（６０分以上）。
【００３９】
負荷は、分析のためには１−２ Ａ２６０単位で、および分取的分離のためには３０−５０ Ａ２６０単位で行った。流量は１ｍＬ／分に設定し、温度は５０℃に調節した。検出器は、分析のためには２６０ｎｍに、分取クロマトグラフィーのためには２９０ｎｍに設定した。これらの条件下で、望ましい完全長オリゴマーは、最後に流出した。
【００４０】
２．　Ｓ−ＤＮＡおよびＳ−［２’ＯＭｅ−ＲＮＡ−ＤＮＡ−２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ］キメラの合成
ホスホロチオエート化したＤＮＡ（Ｓ−ＤＮＡ）およびＳ−［２’ＯＭｅ−ＲＮＡ−ＤＮＡ−２’ＯＭｅ−ＲＮＡ］キメラは、カルガリー大学ＤＮＡ合成実験施設（カルガリー、ＡＬＴＡ）から購入した。これらは、前述のように（前記パート１参照）、精製し（ＨＰＬＣ）、脱塩した（ＳｅｐＰａｋ（登録商標）カートリッジ）。
【００４１】
合成した様々なオリゴヌクレオチドの塩基配列およびハイブリダイゼーション特性を、表１に示した。
【００４２】
【表１】アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）配列および相補的標的ＲＮＡａを伴うＡＯＮ二重鎖の融点（Ｔｍ）
2004507272.tif 000008
ａ：二重鎖の２．５ｘ１０−６Ｍ水溶液。緩衝液：１４０ｎＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４ （ｐＨ７．２）。ｂコード：Ｎ＝ＦＡＮＡヌクレオチド；ｎ＝ＤＮＡヌクレオチド；Ｎ＝２’ＯＭｅ−ＲＮＡヌクレオチド；Ｓ−＝ホスホロチオエート結合含有；ＰＯ−＝ホスホジエステル結合含有。Ｃ±１℃。
【００４３】
実施例２
様々なアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内遺伝子発現の阻害効率
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された標的ｍＲＮＡの特異的塩基配列を基に、ほぼ全ての遺伝子の発現を阻害する可能性がある。本発明者らは、一連の可変長２’−デオキシリボースヌクレオチド残基（Ｓ−ＦＡＮＡギャップマー）が隣接している２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）から構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドの、ルシフェラーゼ遺伝子により安定的にトランスフェクションされた細胞において、良く特徴付けられたマーカーモデルの発現、すなわち酵素ルシフェラーゼの発現を妨害する能力を試験した。Ｓ−ＦＡＮＡギャップマーの細胞内ルシフェラーゼ発現を阻害する効率を、全体が２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドから構築されるかまたは全体が２’−デオキシリボヌクレオチドから構築されている同じ配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドと比較した。ヌクレオチド間の結合は、ホスホジエステル（ＰＯ）またはホスホロチオエート（ＰＳ）のいずれかである。特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、
2004507272.tif 000009
であり、これはルシフェラーゼ遺伝子のコード領域塩基１５１１〜１５２８位と相補的である。対照として、ランダム化されたオリゴヌクレオチド配列
2004507272.tif 000010
を使用した：特異的ＡＯＮ配列と同じ塩基組成が存在するが、ルシフェラーゼ遺伝子の一部分に対する相補性は持たない。これらのランダム化されたオリゴヌクレオチドは、標的ルシフェラーゼ発現阻害には作用することができない。
【００４４】
ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡの特異領域に対し相補的なオリゴヌクレオチドの能力を、Ｈｅｌａ Ｘ１／５細胞（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、サリスベリー、英国から入手）におけるルシフェラーゼ活性発現の阻害について試験した。Ｈｅｌａ Ｘ１／５細胞は、ルシフェラーゼ遺伝子で安定的にトランスフェクションされ、機能性ルシフェラーゼ酵素を発現する。
【００４５】
オリゴヌクレオチドは、サイトフェクチンＧＳＶ ＧＳ３８１５（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、スターリング、ＶＡ、米国）でオリゴヌクレオチドを複合体化することにより、細胞に送達した。簡単に述べると、オリゴヌクレオチドを、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含まないＤＭＥＭで希釈し、オリゴヌクレオチドの最終濃度を、細胞が曝露される最終濃度よりも１０倍高くした。サイトフェクチンＧＳＶを、血清非含有ＤＭＥＭ中で、最終濃度２５μｇ／ｍｌとなるよう調製した。等容量のオリゴヌクレオチドおよびサイトフェクチン溶液を、ポリスチレンプラスチック中で混合し、室温で１５分間インキュベーションし、その後この混合液を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭで５倍希釈した。
【００４６】
Ｘ１／５細胞を、９６穴プレートに、密度１．５〜２ｘ１０４個細胞／ウェルとなるように播種し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で２４時間増殖させた。これは一般に、顕微鏡で検査した集密度８０％の細胞密度を提供した。次にこの培養培地を、細胞から除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で数回洗浄し、その後オリゴヌクレオチド／サイトフェクチン混合液を含有する培地を積層した。２４時間インキュベーションした後、Ｈｅｌａ細胞を収集し、ホモジナイズし、ルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ルシフェラーゼ活性は、Ｐｒｏｍｅｇａ社（マジソン、ＷＩ、米国）から入手したルシフェラーゼアッセイキット構成成分を使用するルミネセンス測定法により、アッセイした。
【００４７】
様々な異なるヌクレオチドおよび連結化学物質から構築された、アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列
2004507272.tif 000011
）の、Ｘ１／５細胞ルシフェラーゼ活性を阻害する能力を比較した実験結果を、図１に示す。全ての場合において、細胞は、最終濃度２５０ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドに、ルシフェラーゼ活性をアッセイする前に２４時間曝露した。ホスホジエステル結合によりβ−Ｄ−２’−デオキシリボースから全体が構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｐ０−ＤＮＡ；ＩＤ＃１２、表１）は、Ｘ１／５細胞ルシフェラーゼ活性の阻害に作用することができなかったが、ホスホロチオエート結合によりβ−Ｄ−２’−デオキシリボースから構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＰＳ−ＤＮＡ；ＩＤ＃１１、表１）は、ほぼ６０％の阻害を提供した。ホスホジエステル結合（ＰＯ−ＦＡＮＡ；表１のＩＤ＃７）またはホスホロチオエート結合（ＰＳ−ＦＡＮＡ；ＩＤ＃６、表１）のいずれかにより２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドから全体が構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、各々、ルシフェラーゼ活性のおよそ５５％および２５％の阻害を提供した。同じ条件下で、全てホスホロチオエート結合で結合した一連の１０個の２’−デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチドから構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ−ＦＡＮＡギャップマー、ＩＤ＃１、表１）は、Ｘ１／５細胞ルシフェラーゼ活性の少なくとも９０％阻害を提供した。この実験で使用した条件下では、いずれのアンチセンスオリゴヌクレオチドによっても、明らかな細胞毒性は、認められなかった。
【００４８】
これらの結果（図１）は、Ｓ−ＦＡＮＡギャップマー（１０ＤＮＡギャップ）が、Ｘ１／５細胞ルシフェラーゼ活性発現において、ＰＯ−ＤＮＡ、Ｓ−ＤＮＡ、ＰＯ−ＦＡＮＡまたはＳ−ＦＡＮＡのいずれよりも有意に優れたインヒビターであることを示している。Ｘ１／５細胞を、様々なアンチセンスオリゴヌクレオチド（最終濃度２５０ｎＭ）と共にインキュベーションし、全てルシフェラーゼｍＲＮＡの同じ標的配列に対して示した。適宜インキュベーションした後、細胞内のルシフェラーゼ活性残留レベルを測定した。
【００４９】
実施例３
Ｓ−ＤＮＡおよびＳ−ＦＡＮＡギャップマー（１０ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内遺伝子発現阻害の比較
Ｓ−ＤＮＡ（ＩＤ＃１１、表１）およびＳ−ＦＡＮＡギャップマー（ＩＤ＃１、表１）の溶液を、実施例２に記したように、サイトフェクチンＧＳＶ ＧＳ３８１５により調製した。Ｈｅｌａ Ｘ１／５細胞を、二つ組の６穴プレートに、密度５ｘ１０５個細胞／ウェルで播種し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で２４時間増殖させた。その後培養培地を細胞から取除き、細胞を数回リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、その後オリゴヌクレオチド／サイトフェクチン混合液を含有する培地で積層した。２４時間インキュベーションした後、Ｈｅｌａ Ｘ１／５細胞を収集し、その後のアッセイ手法に適した方法で処理した（下記に示す）。
【００５０】
（ａ）ルシフェラーゼ酵素活性アッセイ法
ルシフェラーゼ酵素活性アッセイ法は、Ｐｒｏｍｅｇａ社（マジソン、ＷＩ、米国）のルシフェラーゼアッセイキットシステムを、製造業者のプロトコールに従い用いて行った。簡単に述べると、細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、次にこのキットに付属している細胞溶解緩衝液で溶解した。細胞溶解液の二つ組のアリコートを、９６ウェルアッセイプレートに移した。ルシフェリン基質溶液を添加し、直ぐに、ルミネセンス読み取りモードに設定したＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ ＧＥＭＴＮＩ ＸＳマイクロプレート分光蛍光計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、サニーベール、ＣＡ、米国）を用い、ルミネセンスを測定した。結果を、個々の試料の総細胞タンパク質濃度中の変動に関して正規化した（同じアリコートについてＢｉｏ−Ｒａｄ社タンパク質アッセイ試薬を用いて決定した）。
【００５１】
（ｂ）ルシフェラーゼタンパク質発現のアッセイ法
アンチセンス処理および未処理のＸ１／５細胞中のルシフェラーゼタンパク質レベルを、ウェスタンブロット分析により決定した。Ｘ１／５細胞のタンパク質抽出液は、ルシフェラーゼ酵素アッセイ法のための試料の調製に使用したものと同じ溶解緩衝液中で細胞を溶解し、その後遠心により透明化して、調製した。個々の試料のタンパク質含量を、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ヘラクレス、ＣＡ、米国）を用いて測定した。同量の細胞タンパク質（およそ２０μｇ）を含有する試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、その後ニトロセルロース膜（０．４５μ）へ移した。この膜を、５％スキムミルクを含有するＴＴＢＳ（５００ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）中で、少なくとも１時間インキュベーションした。これらのブロットを次に、ホタルのルシフェラーゼ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、テメキュラ、ＣＡ、米国から入手）と特異的に反応するヤギ抗体と共に、ＴＴＢＳ中抗体濃度１ｍｇ／ｍｌを用い、インキュベーションした。１時間インキュベーションした後、これらの膜を十分にＴＴＢＳで洗浄し、次にＴＴＢＳ中に１：１０，０００希釈したホースラディッシュペルオキシダーゼを複合した抗ヤギＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、テメキュラ、ＣＡ、米国）と共にインキュベーションした。その後ペルオキシダーゼ反応領域を、Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅウェスタンブロットケミルミネセンス試薬キット（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、ボストン、ＭＡ、米国）およびＫｏｄａｋ社Ｘ−ＯＭＡＴフィルムを製造業者の指示に従って用い、検出した。その後現像したフィルムの濃度測定分析により、ルシフェラーゼタンパク質レベルを定量した。
【００５２】
（ｃ）ルシフェラーゼｍＲＮＡのアッセイ法
Ｘ１／５細胞から総ＲＮＡを単離し、かつルシフェラーゼｍＲＮＡレベルのノーザンブロットアッセイ法を行った。総細胞ＲＮＡ（１０〜２０μｇ）の正規化した量を、２．２Ｍホルムアルデヒドを含有する１％アガロースゲル上でサイズ分画し、その後０．４５μニトロセルロース膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、ヘラクレス、ＣＡ、米国）に転写した。ルシフェラーゼｍＲＮＡのハイブリダイゼーションプローブは、Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（ピスカタウェイ、ＮＪ、米国）のオリゴ標識キットを用いて作成した、ホタルのルシフェラーゼ遺伝子の完全長ｃＤＮＡ（プラスミドｐＧＥＭ−Ｌｕｃ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、マジソン、ＷＩ、米国）由来の３２Ｐで内部標識したＤＮＡであった。放射標識したプローブの膜結合したＲＮＡへのハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、０．５％ドデシル硫酸ナトリウムおよびブロッキング試薬を含有する６ｘＳＳＣ緩衝液（９０ｍＭクエン酸ナトリウムを含有する、９００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０）中で行った。ハイブリダイゼーションは、４２℃で１６時間行った。その後膜を０．１％ＳＤＳを含有する１ｘＳＳＣにより、室温で２回洗浄し、その後０．１％ＳＤＳを含有する０．１ｘＳＳＣにより室温で、最後に０．５％ＳＤＳを含有する０．１ｘＳＳＣにより４２℃で洗浄した。膜に結合した放射能は、オートラジオグラフィーにより局在化し、デンシトメトリーにより定量した。
【００５３】
図２の結果は、１５ｎＭ〜２５０ｎＭを変動する濃度範囲のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、Ｓ−ＦＡＮＡギャップマー（１０ＤＮＡ）が、Ｘ１／５細胞ルシフェラーゼ活性の阻害において、Ｓ−ＤＮＡよりも有意により効果的であることを示している（パネルＡ）。
【００５４】
Ｘ１／５細胞のＳ−ＦＡＮＡギャップマー（１０ＤＮＡ）による処理により、総ルシフェラーゼタンパク質において用量依存的な減少が生じた（パネルＢ）が、これはＳ−ＤＮＡアンチセンスで処理した細胞においては明白ではなかった。加えて、Ｘ１／５細胞のＳ−ＦＡＮＡギャップマー（１０ＤＮＡ）による処理は、総ルシフェラーゼｍＲＮＡにおいて用量依存的な減少が生じ （パネルＣ）；この減少は、Ｓ−ＤＮＡアンチセンスによる作用よりも大きかった。ルシフェラーゼタンパク質レベルは、ルシフェラーゼに対し特異性を示す抗体を用いるウェスタンブロット分析により評価した。ルシフェラーゼｍＲＮＡレベルは、ルシフェラーゼｍＲＮＡの配列に対して特異性を示すＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット分析により評価した。
【００５５】
実施例４
Ｓ−ＤＮＡおよびＳ−ＦＡＮＡギャップマー（１０ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチド処理の細胞ルシフェラーゼタンパク質およびｍＲＮＡに対する作用
Ｓ−ＤＮＡ（ＩＤ＃１１、表１）およびＳ−ＦＡＮＡギャップマー（ＩＤ＃１、表１）の溶液を、実施例２に示したように、サイトフェクチンＧＳＶ ＧＳ３８１５により調製した。Ｈｅｌａ Ｘ１／５細胞を、二つ組で６穴プレートに、密度５ｘ１０５個細胞／ウェルで播種し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で２４時間増殖させた。その後培養培地を細胞から取除き、細胞を数回リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、その後オリゴヌクレオチド／サイトフェクチン混合液を含有する培地で積層し、指定された最終濃度のＳ−ＤＮＡまたはＳ−ＦＡＮＡギャップマー（１０ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供した。２４時間インキュベーションした後、Ｈｅｌａ Ｘ１／５細胞を収集し、正確には実施例３に記したように、ルシフェラーゼタンパク質レベルまたはルシフェラーゼｍＲＮＡレベルの分析に適した方法で処理した。
【００５６】
図３パネル（Ａ）の結果は、Ｓ−ＤＮＡ（上側）またはＳ−ＦＡＮＡギャップマー（１０ＤＮＡ）（下側）の異なる濃度で処理した、Ｘ１／５細胞抽出液中のルシフェラーゼタンパク質レベルのウェスタンブロット分析を示している。（Ａ）Ｘ１／５細胞を漸増量のＰＳ−ＤＮＡまたはＰＳ−ＦＡＮＡギャップマー（１０ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかに曝露後のルシフェラーゼタンパク質レベルの変動。
【００５７】
Ｓ−ＦＡＮＡギャップマー（１０ＤＮＡ）で処理された細胞は、総ルシフェラーゼタンパク質の用量依存的な減少を示すのに対し、この作用はＳ−ＤＮＡで処理した細胞においては余り明白ではないことは容易に認められる。ルシフェラーゼタンパク質レベルの定量は、図２のパネル（Ｂ）に示した。（Ｂ）ＰＳ−ＦＡＮＡギャップマー（１０ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドは細胞内ルシフェラーゼｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ切断を誘発する。１は、完全長ルシフェラーゼｍＲＮＡに相当し、２および３は、切断産物である。＋は、２５０ｎＭ ＰＳ−ＦＡＮＡギャップマー（１０ＤＮＡ）で処理した細胞から単離したｍＲＮＡを表し、−は、アンチセンスに曝露されていない細胞から単離したｍＲＮＡを表している。
【００５８】
図３パネル（Ｂ）の結果は、Ｘ１／５細胞の２５０ｎＭ Ｓ−ＦＡＮＡギャップマー（１０ＤＮＡ）処理が、ルシフェラーゼｍＲＮＡ容易に識別可能な切断を生じる（レーン＋）ことを示している。３種のルシフェラーゼｍＲＮＡが認められ、これは完全長（１）、ならびにこのアンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的化された領域の完全長ｍＲＮＡのＲＮａｓｅ Ｈ分解から予想された切断産物に相当する２個の小さい種（２および３）であった。いかなるアンチセンスにも曝露されていない細胞のルシフェラーゼｍＲＮＡプロフィールは、（−）印したレーンに示している。
【００５９】
実施例５
ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞特異的遺伝子発現を阻害する能力に対するＤＮＡ「ギャップ」サイズの作用
本発明者らは、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合（Ｓ−ＦＡＮＡギャップマー）により一連の可変長２’−デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している２’−デオキシ−２’−フルオロ−β−Ｄ−アラビノヌクレオチド（ＦＡＮＡ）で構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、２’−Ｏ−メチルＲＮＡウィングで構築された類似のＭＢＯ、ならびに非−ギャップマーＰＳ−ＤＮＡおよびＰＳ−ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドと、それらの細胞内ルシフェラーゼ活性の発現を阻害する能力について、Ｈｅｌａ Ｘ１／５細胞において比較した。この特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、
2004507272.tif 000012
であり、これはルシフェラーゼ遺伝子コード領域の塩基１５１１〜１５２８位と相補的である。
【００６０】
オリゴヌクレオチドは、正確には実施例２に説明したように、オリゴヌクレオチドをサイトフェクチンＧＳＶ ＧＳ３８１５（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、スターリング、ＶＡ、米国）と複合化することにより、細胞へ送達した。
【００６１】
Ｘ１／５細胞を、９６穴プレートに密度１．５〜２ｘ１０４個細胞／ウェルで播種し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で２４時間増殖させた。その後培養培地を細胞から取除き、細胞を数回リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、その後オリゴヌクレオチド／サイトフェクチン混合液を含有する培地で積層し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度２５０ｎＭを提供した。２４時間インキュベーションした後、Ｈｅｌａ細胞を収集し、ホモジナイズし、Ｐｒｏｍｅｇａ社（マジソン、ＷＩ、米国）から得たルシフェラーゼアッセイキット構成成分を用いるルミネセンス測定法によりルシフェラーゼ活性についてアッセイした。
【００６２】
様々な異なるヌクレオチドから構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列
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）のＸ１／５細胞ルシフェラーゼ活性を阻害する能力を比較する実験結果を、図４に示した。このデータは、最終濃度２５０ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドへ曝露後の残留細胞内ルシフェラーゼ活性を表している。全てのアンチセンスは、ルシフェラーゼｍＲＮＡの同じ配列に対するものである。Ｓ−ＤＮＡはＰＳ−ＤＮＡであり、Ｓ−ＦＡＮＡはＤＮＡギャップを伴わないＰＳ−ＦＡＮＡであり、Ｓ−ＦＡＮＡギャップマーは、指定された長さ（図示）の一連のデオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している２’−フルオロアラビノヌクレオチドから構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、２’−ＯＭｅギャップマーは、指定された長さ（図示）の一連のデオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドから構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００６３】
全ての場合において、これらの細胞は、最終濃度２５０ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドに、ルシフェラーゼ活性のアッセイ前に２４時間曝露されている。ホスホロチオエート結合によりβ−Ｄ−２’−デオキシリボヌクレオチドから全体が構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｓ−ＤＮＡ；ＩＤ＃１１、表１）は、ルシフェラーゼ発現を約６５％阻害したのに対し、ホスホロチオエート結合によりβ−Ｄ−２’−デオキシ−２’−Ｆ−アラビノヌクレオチドから全体が構築されたもの（Ｓ−ＦＡＮＡ；ＩＤ＃６、表１）は、より効果が少なく、ルシフェラーゼ発現の平均２０％の阻害を提供したのみであった。１０ＤＮＡギャップセグメントを伴うＳ−ＦＡＮＡおよび２’−０−メチルＲＮＡ ＭＢＯギャップマー（各々、ＩＤ＃１および８、表１）は、同等の非常に効果的なインヒビターであり、細胞内ルシフェラーゼ活性のおよそ８５〜９０％の低下をもたらした。しかし、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ ＭＢＯギャップマーのアンチセンス活性は、ＤＮＡギャップサイズの低下と共に劇的に低下し；実際、４個のＤＮＡギャップを伴う２’−０−メチルＲＮＡ ＭＢＯギャップマー（ＩＤ＃１０、表１）は、Ｘ１／５細胞ルシフェラーゼ発現に対する阻害活性をほとんどもしくは全く示さなかった。明らかに対照的に、Ｓ−ＦＡＮＡのアンチセンス活性は、ＤＮＡギャップの減少（ＤＮＡ長が４個に減少）の影響を受けなかった。興味深いことに、１個のＤＮＡギャップを伴うＳ−ＦＡＮＡギャップマー（ＩＤ＃５、表１）のアンチセンス活性は、対応する全Ｓ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＩＤ＃１１、表１）のものと同等に良好であった。このことは、全Ｓ−ＦＡＮＡオリゴヌクレオチドはこの点に関して余り優れていなかったので予想外であった。
【００６４】
この実験の結果は、Ｓ−ＦＡＮＡで構成されたウィングで構築されたＭＢＯアンチセンスオリゴヌクレオチドが、Ｓ−２’−Ｏ−メチルＲＮＡで構成されたウィングで構築された対応するＭＢＯにより示される強力なＤＮＡギャップサイズ依存性とは異なり、ＤＮＡギャップサイズへの最小限の依存性を示すことを示唆している。
【００６５】
実施例６
ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞特異的遺伝子発現を阻害する能力に対するＤＮＡ「ギャップ」サイズの作用−アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度の作用
Ｓ−２’−Ｏ−メチルＲＮＡギャップマーＭＢＯと比べＳ−ＦＡＮＡギャップマーのアンチセンス活性をより良く定義するために、本発明者らは、アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度の関数としてのＸ１／５細胞ルシフェラーゼ発現の阻害の用量依存的関係を試験した。
【００６６】
Ｘ１／５細胞を、９６穴プレートに密度１．５〜２ｘ１０４個細胞／ウェルで播種し、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中で２４時間増殖させた。その後培養培地を細胞から取除き、細胞を数回リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、その後オリゴヌクレオチド／サイトフェクチン混合液を含有する培地で積層し、アンチセンスオリゴヌクレオチドの最終濃度範囲０〜２５０ｎＭを提供した。２４時間インキュベーションした後、Ｈｅｌａ細胞を収集し、ホモジナイズし、Ｐｒｏｍｅｇａ社（マジソン、ＷＩ、米国）から得たルシフェラーゼアッセイキット構成成分を用いるルミネセンス測定法によりルシフェラーゼ活性についてアッセイした。
【００６７】
この実験の結果を図５に示した（パネルＡおよびＢ）。このデータは、Ｘ１／５細胞が様々に指示された最終濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドに曝露された後で残留する細胞内ルシフェラーゼ活性を表している。全てのアンチセンスは、ルシフェラーゼｍＲＮＡの同じ配列に対するものである。Ｓ−ＤＮＡはＰＳ−ＤＮＡであり、Ｓ−ＦＡＮＡギャップマーは、指定された長さ（図示）の一連のデオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している２’−フルオロアラビノヌクレオチドから構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ＯＭｅギャップマーは、指定された長さ（図示）の一連のデオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチドから構築されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００６８】
図５Ａにおいて、ギャップ間が４〜１０個のＳ−ＤＮＡヌクレオチドである全てのＳ−ＦＡＮＡギャップマーは、Ｓ−ＤＮＡ単独よりもはるかに優れた、細胞内ルシフェラーゼ発現のインヒビターであることが示されている。この阻害のＩＣ５０値は、約１５ｎＭ（１０ＤＮＡギャップ；ＩＤ＃１、表１）から＜＜１５ｎＭ（８、６および４ＤＮＡギャップオリゴヌクレオチド；各々、ＩＤ＃２、３および４、表１）の範囲であった。対照的に、Ｓ−ＤＮＡ（ＩＤ＃１１、表１）アンチセンス阻害のＩＣ５０値は、約１００ｎＭであった。１ＤＮＡギャップを伴うＳ−ＦＡＮＡ ＭＢＯ（ＩＤ＃５、表１）のＩＣ５０値は、全Ｓ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドと同じであった。
【００６９】
図５Ｂにおいて、Ｓ−２’−Ｏ−メチルＲＮＡギャップマー（１０ＤＮＡギャップ；ＩＤ＃８、表１）の能力に関するＩＣ５０値は、対応するＳ−ＦＡＮＡギャップマー（ＩＤ＃１、表１）のものと本質的に同じであることが認められた。対照的に、試験したその他のＳ−２’−Ｏ−メチルＲＮＡギャップマー（６および４ＤＮＡギャップ；各々、ＩＤ＃９および１０、表１）のアンチセンス活性のＩＣ５０値は、＞＞２５０ｎＭであった。実際に後者のギャップマーは、Ｘ１／５細胞ルシフェラーゼ発現のアンチセンスインヒビターとしてほとんど無効であった。
【００７０】
本発明は、その具体的態様に関連して説明されているが、これは更なる修正が可能であり、本願明細書は、概して本発明の原則に従う、本発明のあらゆる変形、用途、または適応に及ぶものであり、かつ本発明が属する技術分野において公知または慣習的実践の範囲であり、かつ前述の本質的特徴に適用され、添付の特許請求の範囲に従うような本説明からの逸脱を含むことが意図されていることは理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、細胞内遺伝子発現を阻害する、様々なアンチセンスオリゴヌクレオチドの効能を説明している。
【図２】図２Ａ〜Ｃは、ＰＳ−ＤＮＡおよびＰＳ−ＦＡＮＡギャップマー（１０ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内遺伝子発現の阻害を比較説明している。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、ＰＳ−ＤＮＡおよびＰＳ−ＦＡＮＡギャップマー（１０ＤＮＡ）アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理の、細胞ルシフェラーゼタンパク質およびｍＲＮＡに対する作用を説明している。
【図４】図４は、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞特異的遺伝子発現阻害能に対する、ＤＮＡ「ギャップ」サイズの作用を説明している。
【図５】図５は、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞の特異的遺伝子発現阻害能に対する、ＤＮＡ「ギャップ」サイズの作用−アンチセンスオリゴヌクレオチド濃度の作用を説明している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年1月15日(2003.1.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列特異的方法において遺伝子発現を選択的に妨害する、オリゴヌクレオチド「キメラ」であり、（ａ）ヌクレアーゼ安定性、（ｂ）相補的ＲＮＡ配列へのハイブリダイゼーションの結合強度、（ｃ）該オリゴヌクレオチドの細胞への透過性、（ｄ）ＲＮａｓｅ Ｈによる標的ＲＮＡの切断、または（ｅ）リボソーム転位の物理的阻止（「翻訳抑止（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ａｒｒｅｓｔ）」）のうち、少なくとも１種を誘導するために、１本鎖ＲＮＡにハイブリダイズする修飾されたアラビノースと２’−デオキシ糖とのキメラが含まれ、一般式
【化１】
2004507272.tif 000065
（式中、
ｘ≧１、ｙ≧１、およびｚ≧０であり、ならびに
Ｒは、水素、チオリン酸、およびこのようなオリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強するリンカー部分からなる群より選択される）を有するオリゴヌクレオチド「キメラ」。
【請求項２】
配列特異的方法において遺伝子発現を選択的に妨害する、オリゴヌクレオチド「キメラ」であり、（ａ）ヌクレアーゼ安定性、（ｂ）相補的ＲＮＡ配列へのハイブリダイゼーションの結合強度、（ｃ）該オリゴヌクレオチドの細胞への透過性、（ｄ）ＲＮａｓｅ Ｈによる標的ＲＮＡの切断、または（ｅ）リボソーム転位の物理的阻止（「翻訳抑止」）のうち、少なくとも１種を誘導するために、１本鎖ＲＮＡにハイブリダイズする修飾されたアラビノースと２’−デオキシ糖とのキメラが含まれ、
一般式
【化２】
2004507272.tif 000066
（式中、
ｘ≧１、ｙ≧１、およびｚ≧０であり；
Ｒは、水素、チオリン酸、およびこのようなオリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強するリンカー部分からなる群より選択され；
Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、イノシン、および５−メチルシトシンからなる群より選択され；
Ｙは、ヌクレオチド間リン酸結合において、イオウ、酸素、メチル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ（このアルキル基は１〜約２０個の炭素原子を有する）、メトキシ、およびエトキシからなる群より選択され；
Ｘは、フラノース環（４’位）において、酸素、イオウ、およびメチレン（ＣＨ２）からなる群より選択され；ならびに
Ｚは、この糖環の２’位において、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、アルキル、ハロゲン化アルキル（例えば、−ＣＨ２Ｆ）、アリル、アミノ、アリール、アルコキシおよびアジドからなる群より選択される）を有するオリゴヌクレオチド「キメラ」。
【請求項３】
配列特異的方法において遺伝子発現を選択的に妨害する、オリゴヌクレオチド「キメラ」であり、（ａ）ヌクレアーゼ安定性、（ｂ）相補的ＲＮＡ配列へのハイブリダイゼーションの結合強度、（ｃ）該オリゴヌクレオチドの細胞への透過性、（ｄ）ＲＮａｓｅ Ｈによる標的ＲＮＡの切断、または（ｅ）リボソーム転位の物理的阻止（「翻訳抑止」）のうち、少なくとも１種を誘導するために、１本鎖ＲＮＡにハイブリダイズする修飾されたアラビノースと２’−デオキシ糖とのキメラが含まれ、
一般式
【化３】
2004507272.tif 000067
（式中、
ｘ≧１、ｙ≧１、およびｚ≧０であり；
Ｒは、水素、チオリン酸、およびこのようなオリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強するリンカー部分からなる群より選択され；
Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、イノシン、および５−メチルシトシンからなる群より選択される）を有するオリゴヌクレオチド「キメラ」。
【請求項４】
配列特異的方法において遺伝子発現を選択的に妨害する、オリゴヌクレオチド「キメラ」であり、（ａ）ヌクレアーゼ安定性、（ｂ）相補的ＲＮＡ配列へのハイブリダイゼーションの結合強度、（ｃ）該オリゴヌクレオチドの細胞への透過性、（ｄ）ＲＮａｓｅ Ｈによる標的ＲＮＡの切断、または（ｅ）リボソーム転位の物理的阻止（「翻訳抑止」）のうち、少なくとも１種を誘導するために、１本鎖ＲＮＡにハイブリダイズする修飾されたアラビノースと２’−デオキシ糖とのキメラが含まれ、
一般式
【化４】
2004507272.tif 000068
（式中、
ｘ≧１、ｙ≧１、およびｚ≧０であり；
Ｒは、水素、チオリン酸、およびこのようなオリゴヌクレオチドの細胞取込みを増強するリンカー部分からなる群より選択され；
Ｂは、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、シトシン、イノシン、および５−メチルシトシンからなる群より選択され；
Ｙは、ヌクレオチド間リン酸結合において、イオウ、酸素、メチル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ（このアルキル基は１〜約２０個の炭素原子を有する）、メトキシ、およびエトキシからなる群より選択され；
Ｘは、フラノース環（４’位）において、酸素、イオウ、およびメチレン（ＣＨ２）からなる群より選択され；ならびに
Ｚは、この糖環の２’位において、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素、ヨウ素）、ヒドロキシル、アルキル、ハロゲン化アルキル（例えば、ＣＨ２Ｆ）、アリル、アミノ、アリール、アルコキシおよびアジドからなる群より選択される）オリゴヌクレオチド「キメラ」。
【請求項５】
下記の工程を含む、１本鎖ＲＮＡの切断法：
（ａ）配列特異的方法において請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドを１本鎖ＲＮＡへハイブリダイズし、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘導する工程；および
（ｂ）該誘導したＲＮａｓｅ Ｈに、該ハイブリダイズした１本鎖ＲＮＡを切断させる工程。
【請求項６】
配列特異的方法において請求項１〜４記載のキメラオリゴヌクレオチドを１本鎖ＲＮＡへハイブリダイズし、これにより該１本鎖ＲＮＡにコードされる特異的タンパク質の産生を妨害する工程を含む、該１本鎖ＲＮＡの翻訳を妨害する方法。
【請求項７】
ＲＮＡが相補的ＲＮＡである、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
相補的ＲＮＡが、細胞ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
１本鎖ＲＮＡを切断するための医薬品を調製するための請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドの使用であり、ここで該オリゴヌクレオチドは、配列特異的方法において１本鎖ＲＮＡにハイブリダイズし、該ハイブリダイズした１本鎖ＲＮＡを切断するためのＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘導する、オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１０】
相補的ＲＮＡが、細胞ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡである、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
１本鎖ＲＮＡを切断するためのプローブまたは実験試薬を調製するための請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチドの使用であり、ここで該オリゴヌクレオチドは、配列特異的方法において１本鎖ＲＮＡにハイブリダイズし、該ハイブリダイズした１本鎖ＲＮＡを切断するためのＲＮａｓｅ Ｈ活性を誘導する、オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１２】
相補的ＲＮＡが、細胞ｍＲＮＡまたはウイルスＲＮＡである、請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
配列特異的方法において遺伝子発現を選択的に妨害する薬学的組成物であり、薬学的に許容される担体と共に、請求項１〜４記載のオリゴヌクレオチド「キメラ」を有効量含有する、組成物。
【請求項１４】
一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、アラビノヌクレオチド残基または修飾されたアラビノヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチオであり、一連のデオキシリボースヌクレオチド残基が、１０デオキリボースヌクレオチド残基以下のギャップを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、アラビノヌクレオチド残基または修飾されたアラビノヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチオであり、一連のデオキシリボースヌクレオチド残基が、１０デオキリボースヌクレオチド残基のギャップを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、アラビノヌクレオチド残基または修飾されたアラビノヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチオであり、一連のデオキシリボースヌクレオチド残基が、８デオキリボースヌクレオチド残基のギャップを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、アラビノヌクレオチド残基または修飾されたアラビノヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチオであり、一連のデオキシリボースヌクレオチド残基が、６デオキリボースヌクレオチド残基のギャップを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、アラビノヌクレオチド残基または修飾されたアラビノヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチオであり、一連のデオキシリボースヌクレオチド残基が、４デオキリボースヌクレオチド残基のギャップを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
一連の可変長デオキシリボースヌクレオチド残基が隣接している、アラビノヌクレオチド残基または修飾されたアラビノヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチオであり、一連のデオキシリボースヌクレオチド残基が、２ｘ１デオキリボースヌクレオチド残基のギャップを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
【国際調査報告】
2004507272.tif 000069
2004507272.tif 000070
2004507272.tif 000071