(57)【要約】本発明は、ＣＮＳ障害の治療のための薬剤の製造における、チオルチン二酸化物およびその誘導体の使用、微生物ノカルジオプシス種ST 100692、DSM 13834の培養によるこれらの製造方法、および微生物ノカルジオプシス種ST 100692、DSM 13834に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＮＳ障害の治療用薬剤の製造における、一般式Ｉ
【化１】
2004521927.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、アルキル、およびアシルから選択される）
の化合物、ならびにその生理学的に許容された塩類およびその誘導体の使用。
【請求項２】
Ｒ１がアシル、Ｒ２がＨ、そして、Ｒ３がアルキルである請求項１に記載の一般式Ｉの化合物の使用。
【請求項３】
化合物が一般式IIのチオルチン二酸化物である請求項１に記載の使用。
【化２】
2004521927.tif 000010
【請求項４】
微生物 Nocardiopsis種ＳＴ １００６９２、ＤＳＭ  １３８３４またはその突然変異体若しくは変異体を、好気的条件下で、炭素および窒素源を含有する栄養培地において、該栄養培地中に式Ｉの化合物の少なくとも１つが存在するようになるまで培養し、そして該化合物を単離および精製することからなる、一般式Ｉの化合物の製造方法。
【請求項５】
微生物 Nocardiopsis種ＳＴ １００６９２、ＤＳＭ １３８３４またはその突然変異体若しくは変異体を、好気的条件下で、炭素および窒素源を含有する栄養培地において、該栄養培地中にチオルチンが存在するようになるまで培養し、チオルチンを単離し、そしてこのチオルチンを一般式Ｉの少なくとも１つの化合物に変換することからなる、一般式Ｉの化合物の製造方法。
【請求項６】
一般式Ｉの化合物を、その生理学的に許容された塩、誘導体または該誘導体の生理学的に許容された塩に変換することをさらに含む請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Nocardiopsis種ＳＴ １００６９２、ＤＳＭ １３８３４。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＮＳ障害の治療のための薬剤の製造におけるチオルチン二酸化物および誘導体の使用に関し、また、微生物ノカルジオプシス種（Nocardiopsis species）ST 100692、DSM 13834の培養によるこれらの製造方法に関し、さらに、ノカルジオプシス種ST 100692、DSM 13834に関する。
【背景技術】
【０００２】
チオルチンは、市販されている公知の天然化合物である（Apin Chemicals, UK; CMS Speciality Chemicals, UK; Ubichem plc, UK)。チオルチン二酸化物もまた、公知の化合物である。チオルチン二酸化物の公知の製造方法の１つは、Schachtner et al., J. Heterocycl. Chem., 1999, 161-175に述べられるように、チオルチンのｍ−クロル過安息香酸を用いての酸化収率３０％である。
【０００３】
チオルチン二酸化物は、薬剤特性を有するものであるとして既に述べられている。WO 99/12543 は、抗腫瘍薬としてのチオルチン二酸化物の使用を述べており、また、WO 96/32396 は、抗菌剤および抗真菌剤としてのチオルチン二酸化物の使用を述べている。
【０００４】
驚くべきことに、チオルチン二酸化物が、神経溶解素の効果的な阻害剤であることが、今回見出された。神経溶解素は、亜鉛含有メタロプロテアーゼのファミリーに属する。これは、ニューロテンシンの生理学的不活化において、おそらく内因性抗精神病薬の役割を演ずる。チオルチン二酸化物は神経溶解素のニューロテンシン不活化を阻害し、そして、それゆえ、パーキンソン病やアルツハイマー病のような神経変性疾患の治療において有用である。チオルチン二酸化物はまた、エンケファリナーゼや、アンギオテンシン転化酵素のようなその他の亜鉛含有メタロプロテアーゼを阻害しないということにおいて選択的である。
また、ノカルジオプシス種ST 100692、DSM 13834が、比較的高い収率においてチオルチン二酸化物を形成し得ることが今回見出された。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
従って、本発明は、ＣＮＳ障害の治療のための薬剤の製造における、一般式Ｉの化合物：
【化１】
2004521927.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、アルキル、および、アシルから選択されたものである。）
ならびにその生理学的に許容された塩類の使用に関する。
Ｒ１がアシル、Ｒ２がＨ、および／またはＲ３がアルキルである一般式Ｉの化合物、ならびにその生理学的に許容された塩類が好ましい。
【０００６】
一般式Ｉの化合物におけるアシル基は、２〜１０の炭素原子を有する、好ましくは２〜６炭素原子を有し得、そして、直鎖または分枝のもので在り得、飽和または１もしくは２つの不飽和であり得る。
２つの炭素原子を有するアシル基は、例えばアセチル基を意味する。
【０００７】
飽和の、分枝のないアシル基の例は、酢酸残基、プロピオン酸残基、酪酸残基、吉草酸残基、カプロン酸残基、エナント酸残基、カプリル酸残基、ペラルゴン酸残基およびカプリン酸である。
一不飽和である分枝のないアシル残基の例は、アクリル酸残基およびクロトン酸残基である。
二不飽和である分枝のないアシル基の例は、ソルビン酸残基である。
【０００８】
一般式Ｉの化合物中のアルキル基は、１〜６つの炭素原子を有し得、そして、直鎖または分枝のものであり得る。さらに、アルキル基は、飽和基ならびに不飽和基を含み、このうち後者は１つまたは２つの二重結合を含む。１〜６つの炭素原子を含むアルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシル、これらの全ての基のｎ−異性体、イソプロピル、イソブチル、１−メチルブチル、イソペンチル、ネオペンチル、２,２−ジメチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチルおよびイソヘキシルである。
【０００９】
不飽和アルキル基は、例えば、ビニル、１−プロペニル、２−プロペニル（＝アリル）、２−ブテニル、３−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、５−へキセニル、または１,３−ペンタジエニルのようなアルケニル残基である。
【００１０】
一実施態様において、本発明は一般式IIの化合物
【化２】
2004521927.tif 000003
またはその生理学的に許容される塩の、ＣＮＳ障害の治療のための薬剤の製造における使用に関するものである。
【００１１】
一般式Ｉの化合物は、循環神経溶解素の正常値を超えることによって引き起こされる障害を治療するのに有用である。一般式Ｉの化合物で治療され得るＣＮＳ障害は、例えば精神分裂症のような精神障害、および、例えばアルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性障害を含むものである。
【００１２】
一般式Ｉの化合物は、微生物ノカルジオプシス種ST 100692、DSM 13834またはその変異体もしくは突然変異体を適当な条件下で培養し、少なくとも１つの化合物を単離し、そして、必要に応じてこれを生理学的に許容された塩、誘導体または誘導体の生理学的に許容された塩に変換することにより得ることができる。
【００１３】
従って本発明は、微生物ノカルジオプシス種ST 100692、DSM 13834またはその突然変異体若しくは変異体を、水性栄養培地において培養し、そして少なくとも１つの標的化合物を単離および精製し、さらに、場合により、この化合物をその生理学的に許容された塩、誘導体または誘導体の生理学的に許容された塩へ変換することからなる、一般式Ｉの化合物の製造方法に関するものである。
【００１４】
チオルチン二酸化物を生産することに加えて、ノカルジオプシス種ST 100692、DSM 13834はまた、記載されている培養条件で、チオルチンを産生する。
得られたチオルチンは、単離され、そして当業者に公知の方法によってチオルチン二酸化物に変換されることができる。
従って、一般式Ｉの化合物の本発明による別の製造方法は、ノカルジオプシス種ST 100692、DSM 13834またはその突然変異体若しくは変異体を、水性栄養培地において培養し、そしてチオルチンを単離および精製し、チオルチンを少なくとも１つの標的化合物に変換し、さらに、場合により、この化合物をその生理学的に許容された塩、誘導体または誘導体の生理学的に許容された塩へ変換することからなるものである。
【００１５】
微生物ノカルジオプシス種ST 100692、DSM 13834は、2000年11月13日に、ブタペスト条約の条件下に、Mascheroder weg 1b, D-38124 Braunschweig所在のDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturenへ、寄託番号DSM 13834で寄託された。
【００１６】
ガスクロマトグラフィを使用した脂肪酸の分析による、微生物ノカルジオプシス種ST 100692、DSM 13834の分類学的試験は、特徴のある酸が、１４：０  ｉｓｏ、  １５：０  ａｎｔｅｉｓｏ、１５：０  ｉｓｏ、１６：０、１６：０  ｉｓｏ、１７：０、１７：０  ｉｓｏ、１７：０  ａｎｔｅｉｓｏおよび１８：０であることを示した。コロニー色は、特にＩＳＰ２（酵母−麦芽）およびＩＳＰ３（オートミール）培地上で、白色の気菌糸を形成して、クロムイエローである。
【００１７】
株DSM 13834に代えて、その突然変異体および変異体を、これらが本発明に係る化合物を合成する限りにおいて、用いることも可能である。このような突然変異体は、それ自体公知である手法において、物理的手段、例えば、照射、例えば、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）；２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（ＭＯＢ）またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（ＭＮＮＧ）の照射によって、作成することができる。
【００１８】
本発明に係る化合物を産生する突然変異体および変異体のスクリーニングは、培地ブロスに蓄積された活性物質の生物学的活性を測定することによって、例えば、以下に記載した方法を用いて神経溶解素阻害効果を調べることによって、行うことができる。
【００１９】
好気培養のための炭素源として適切かつ好ましいものは、例えば、グルコース、ラクトースまたはＤ−マンニトールのような同化可能な炭水化物および糖アルコール、並びに、例えば麦芽抽出物のような炭水化物含有天然産物である。好ましい窒素含有栄養物は、アミノ酸、ペプチドおよび蛋白質；例えばペプトンまたはトリプトンのような蛋白質分解産物；肉抽出物；例えばとうもろこし、小麦、大豆またはコットン・プラントのような種子粉砕物；アルコール、ミートミールまたは酵母抽出物の製造からの蒸留残留物；ならびにアンモニウム塩および硝酸塩である。前記栄養液が含有し得る無機塩は、例えば、アルカリ金属またはアルカリ土金属、鉄、亜鉛、コバルトおよびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリン酸塩である。
【００２０】
チオルチン二酸化物の調製は、例えば、約０.５〜５％、より好ましくは１〜２％のグルコース、０.５〜５％、より好ましくは１〜２％の大豆ミール、０.１〜１.５％、より好ましくは０.３〜０.８％のコーンスティープ（液体）、０.０５〜１.０％、より好ましくは０.１〜０.５％の炭酸カルシウム、および０.０５〜１％、好ましくは０.３〜０.８％の塩化ナトリウム（いずれも完全栄養液の重量に基づく）を含有する栄養液中で、特に良好に達成することができる。
【００２１】
培養は、好気的、すなわち、例えば振盪フラスコまたは培養槽中で振盪または攪拌しながら液中培養することで行われ、必要に応じて空気または酸素が導入される。培養は、例えば、種々の容積の広口瓶または丸底フラスコ中で、またガラス製培養槽またはステンレス鋼製タンク中で、行うことができる。培養は、約２０〜３５℃、好ましくは約２５〜３０℃の温度範囲において行うことができる。ｐＨは、４〜１０の間、有利には６〜８の間とすべきである。前記微生物は、これらの条件下、一般に、２０〜２００時間、好ましくは２４〜１５０時間の期間で培養される。
【００２２】
培養は、いくつかの段階で有利に実施される、すなわち、１またはそれ以上の予備培養物が液状栄養培地中に最初に産生され、そして次に、この予備培養物が実際の産生培地に、例えば容量比で１：１０の割合で移され、本培養が行われる。予備培養物は、例えば、栄養液中に胞子形成した菌糸体を移し、そして約２０〜１２０時間、好ましくは２４〜９０時間成長させることによって得られる。胞子形成した菌糸体は、例えば、酵母−麦芽寒天またはポテトデキストロース寒天のような、固形または液状栄養培地上で、約１〜４０日間、好ましくは５〜１２日間、株を成長させることによって得ることができる。
【００２３】
培養の経過および本発明に係る化合物の形成の経過は、当業者に公知の方法、例えば、生物学的検定法において生物学的活性を調べることによって、または、薄相クロマトグラフィー（ＴＬＣ）や高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のようなクロマトグラフィー法によって、追跡することが可能である。
【００２４】
一般式Ｉの化合物は、菌糸体中および培養濾液中の双方に生じ得るが、大部分の量は、通常、バイオマス（菌糸体）中に見出される。それゆえ、前者から後者を濾過または遠心分離によって分離することが得策である。濾液は、１−ブタノール、酢酸エチル、クロロホルム等のような水不混和性溶剤で抽出される。菌糸体は、メタノールやアセトンで便宜上抽出されるが、上記水不混和性溶剤を用いることも可能である。
【００２５】
抽出物は、広いｐＨ範囲において実施することができるが、中性媒体、好ましくはｐＨ４およびｐＨ８の間で行うことが好ましい。有機抽出物は、例えば、真空において濃縮され、乾燥されることができる。
【００２６】
１つの精製方法は、吸着樹脂上、例えば、Diaion(R) HP-20（三菱化成、東京）上、Amberlite(R) XAD7（Rohm and Haas, USA）上、Amberchrom(R) CG（Toso Haas, Philadelphia, USA）上での、クロマトグラフィーである。多くの逆相支持体、例えば、ＲＰ１８も、一般的に公知であるように、例えば高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のフレームワーク内で、適したものである。
【００２７】
一般式Ｉの化合物は、上記したものと同様の方法あるいは当業者に公知の他の方法によって単離し、精製することができる。
上記一般式Ｉはまた、チオルチン二酸化物の誘導体にも当てはまる。これらの誘導体は、同様の効果を有するか、あるいはチオルチン二酸化物と同様の効果を有する化合物へと穏やかな条件下で変換される。誘導体は、当業者に公知の方法によって調製可能である。一般式Ｉによって表されるチオルチン二酸化物誘導体のいくつかの調製方法の例は、以下に示される：
１）チオルチン二酸化物の（環外の）アセチル基は、文献、例えば、‘Protective Groups in Organic Synthesis', 3rd Edition, T. Greene & P. Wuts, John Wiley & Sons, 1999, pp 553-555において述べられるように、酸または塩基を用いて切断することができる。
２）チオルチン二酸化物の遊離アミノ基は、例えば、‘Advanced Organic Chemistry',
4th Edition, J. March, John Wiley & Sons, 1992, pp 898-900において述べられるような、還元的アルキル化によって、アルキル化することができる。
３）チオルチン二酸化物のアミノ基は、例えば、酸塩化物または無水物を用い、当業者に公知の標準的手法によってアシル化することができる。
【００２８】
一般式Ｉの化合物のその他の誘導体は、例えば、P. N. Rylander, ‘Hydrogenation Methods’, Academic Press, New York (1985), Chpt. 2のような文献に述べられる方法により、一般式Ｉの化合物、例えば、チオルチン二酸化物の少なくとも１つの二重結合を還元することで得られる化合物、あるいは、H. O. House in ‘Modern Synthetic Reactions’, W.A. Benjamin, Inc., New York (1972), pp 446-452において述べられるような脱ハロゲン化水素によって得られた化合物を含むものである。
本発明に係る化合物は、薬理学的に許容され得る塩に変換することができる。この塩は、当業者にとって公知の標準的手順によって調製することができる。
一般式Ｉの化合物の生理学的に許容される塩は、Remington's Pharmaceutical Sciences (17th edition, page 1418 (1985))において述べられるように、有機および無機の双方の塩を意味する。ナトリウム塩およびカリウム塩のような塩は、例えば、本発明に係る化合物を適当なナトリウムまたはカリウム塩基で処理することによって調製され得る。
【００２９】
本発明の更なる観点は、一般式Ｉの化合物のプロドラッグの使用である。このようなプロドラッグは、生体内において、チオルチン二酸化物のような一般式Ｉの化合物に代謝され得る。プロドラックそれ自体は、活性なものであっても、そうでなくともよい。
一般式Ｉの化合物は、種々の多形体、例えば、非晶性および結晶性多形体として、存在し得る。一般式Ｉの化合物の全ての多形体は、本発明の範囲内のものであり、そして、本発明の別の観点である。
本発明の化合物およびその薬理学的に許容され得る塩および誘導体は、動物、好ましくは哺乳類、特に、ヒトに対して、単独であるいは他との混合物において薬剤として投与可能である。
従って、適当な薬理学的組成物は、１またはそれ以上の一般式Ｉ若しくはIIの化合物、またはその薬理学的に許容され得る塩の有効量を、薬理学的に許容され得る担体と共に有してなるものである。
【００３０】
本発明の化合物は、経口的に、筋肉内注射で、静脈内注射で、あるいは他の投与形態によって投与可能である。これらの化合物またはその薬理学的に許容され得る塩または誘導体、場合により、薬理学的に活性なその他の物質を含む薬理学的組成物は、１またはそれ以上の生理学的に許容される助剤および／または添加剤を、これら活性化合物と混合することによって製造することができる。該混合物は、次に、適当な薬剤形体、例えば、錠剤、被覆錠剤、カプセル、顆粒剤、粉剤、乳剤、懸濁剤、または液剤に換えることができる。
記載され得る助剤および／または添加剤の例は、充填剤、乳化剤、滑剤、被覆風味剤、着色剤および緩衝物質、トラガカント、ラクトース、タルク、寒天、ポリグリコール、エタノールおよび水である。
【００３１】
適当でかつ好ましい非経口投与は、水への懸濁液または溶液である。例えば、カプセル中のような、適当な形体において、ビヒクルまたは希釈剤を用いることなく、活性物質を投与することも可能である。
適当な薬剤の製造方法は、本発明の化合物の少なくとも１つを、薬理学的に適当なかつ生理学的に許容される担体、および必要に応じて、別の適当な活性物質、混和剤、および添加剤と共に、適当な投与形態へと転換することからなる。
特定の症例に適当な、生薬処方および投与方法ならびに投与量は、恒例により、治療すべき種に依存し、およびそれぞれの条件または疾患の状態に依存し、そして、公知技術である方法を使用して最適化することができる。例えば錠剤またはカプセルのような固形の投与形態を用いて、一日当り、最高５００mg、好ましくは０.１〜２５０mgを投与することが可能である。一日当り、最高３００mg、好ましくは０.５〜１５０mgが、非経口投与として与えられ得る。
以下は、本発明の実施例であるが、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００３２】
産生株ノカルジオプシス種DSM 13834の芽胞懸濁液の製造
滅菌された３００ml三角フラスコ中の１００mlの栄養液（水１０００ml中、４ｇ／ｌ  酵母抽出物、１５ｇ／ｌ  可溶性スターチ、１ｇ／ｌ  Ｋ2ＨＰＯ4、０.５ｇ／ｌ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、滅菌前ｐＨ７.０）に、ノカルジオプシス種DSM 13834を接種し、５日間、ロータリーシェーカーにおいて、２８℃、１８０ｒｐｍでインキュベートした。その後、この培地の１.５mlを９９％グリセリン１.５mlで希釈し、そして−２０℃で貯蔵した。
【実施例２】
【００３３】
三角フラスコ中での産生株の培地または予備培地の製造
大豆粉１５ｇ／ｌ、グルコース１５ｇ／ｌ、コーンスティープ液５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌおよびＣａＣＯ3２ｇを含む栄養液１００mlを入れた、滅菌された三角フラスコに、スラント試験管（２％寒天を有する以外は、同様の栄養液）中で成長させた培養株、またはグリセリン培養株（実施例１参照）１mlを接種し、そして振盪器において２５℃、１８０ｒｐｍでインキュベートした。チオルチン二酸化物の最大の産生は、約９６時間後に達せられた。７２時間令の液中培養株（振盪培養に関して述べた方法と同様であるが、グルコース１５ｇ／ｌ、大豆粉１５ｇ／ｌ、コーンスティープ５ｇ／ｌ、ＣａＣＯ3２ｇｌおよびＮａＣｌ ５ｇ／ｌを含むｐＨ７.５の培地を用いて産生された。）は、約５％の接種材料で１０および１００ｌ培養槽に接種するために十分なものであった。
【実施例３】
【００３４】
チオルチン二酸化物の製造
２００ｌ培養槽は、以下の条件で操作された：
2004521927.tif 000004
起泡は、エタノール性ポリオール溶液の１〜２mlの数滴を添加することを繰り返すことによって、抑制された。最大の産生は６９時間後に達せられた。
【実施例４】
【００３５】
チオルチン二酸化物の単離
実施例３で得られた培養溶液３リットルを、凍結乾燥し、その後、凍結乾燥物をメタノール（２〜３ｌ）で抽出した。メタノール抽出物を、真空で濃縮し、メタノール含量１０％を含む水で希釈した。希釈した抽出物を、吸着樹脂CHP-20Pを充填した１リットル容量のカラムにかけた。溶出は、水からアセトニトリルへの溶剤勾配を用いて行われた。カラム通過流（３０ml／分）は、３０mlの分画群とされ、そして所望の化合物含有分画を集め、真空で濃縮し、凍結乾燥して、約３０mgの黄褐色粉末を得た。得られた粉末を、LUNA(R) 10 uC18(2)を充填したカラム(幅×高さ＝21mm×250mm)にかけ、そして、０.１％酢酸アンモニウム／水中におけるアセトニトリルの１０〜６０％の勾配で溶出した。溶離剤の流速は、２５ml／分であり、カラムからの流出物は、２５mlの分画群へと集められた。チロキシン二酸化物は、１５および１６の分画において見出された。該指定分画の凍結乾燥物から、＞９５％純度のチオルチン二酸化物１.８mgを得た。
【００３６】
チオルチン二酸化物の物理化学的なおよび分光学的な特性は、以下のように要約できる：
分子式：Ｃ8Ｈ8Ｎ2Ｏ4Ｓ2
分子量：２６０.３
ＵＶ極大：２３０、３０２、３８８ｎｍ
１Ｈ−および１３Ｃ−ＮＭＲ：表１参照。
【００３７】
【表１】
2004521927.tif 000005
【実施例５】
【００３８】
神経溶解素阻害剤としてのチオルチン二酸化物
検定は、ＣｙＢｉｏピペッテイングシステムにて、３８４ウェル  プレート型において１６μlの最終検定容量で実施された。
簡潔には、４mlの適当に希釈された微生物抽出液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓバッファ、ｐＨ７.５に希釈）を、試験プレート（Greiner、白色の３８４−小容積ウェル  プレート）に分配した。その後、４μlの神経溶解素（１：５に予め希釈されたもの、蛋白質３６０ｎｇ）が、各ウェルへと添加された。試料および酵素の室温での１０分間の予備インキュベーションの後、Ｔｒｉｓバッファ中の基質（Mcc-Pro-Leu-Gly-D-Lys(Dnp)-OH、CALBIOCHEM）８μlの添加によって反応を開始した。
ピペット操作後、プレートを直ちに蛍光測定器（SpectraFluorplus、SLT）内に配置し、そして蛍光の初期量を読み取った（λｅｘ：３６０ｎｍ／λｅｍ４０５ｎｍ）。次いで反応を３０℃で３０分間進行させて、そして最終蛍光量を読み取った。
データは、最初ブランク更正された。次に、３０分後の各値からゼロ時点での値を減算した後、試料阻害活性が
１００−（化合物の正味強度／比較対照の正味強度）×１００（％）
として表された。
各試験プレートは、陽性の比較対照およびブランク（酵素の代わりのバッファ）の適正な数を含んでいた。
チオルチン二酸化物のＩＣ５０は、０.６μＭであることがわかった。
【００３９】
微生物の受託書
2004521927.tif 000006
【００４０】
微生物の受託書
2004521927.tif 000007
【００４１】
微生物の生存に関する証明書
2004521927.tif 000008
【国際公開パンフレット】
2004521927.tif 000011
2004521927.tif 000012
2004521927.tif 000013
2004521927.tif 000014
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2004521927.tif 000017
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2004521927.tif 000020
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2004521927.tif 000025
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2004521927.tif 000027
2004521927.tif 000028
2004521927.tif 000029
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004521927.tif 000030
【国際調査報告】
2004521927.tif 000031
2004521927.tif 000032
2004521927.tif 000033
2004521927.tif 000034