(57)【要約】本発明は、好ましくは抗腫瘍および／または免疫調節サイトカイン特性を有するポリペプチド（これは、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるプロセッシングによって活性化され得る）に関する。このペプチドは、特定の生物学的活性を有する中心領域を含む。そのＣ−末端では、上記領域がプロセッシングユニットおよびインヒビタードメインを含む領域を有し、一方中心領域のＮ−末端では、細胞表面上の高分子および細胞外マトリックスの成分を選択的に認識する領域を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列を有するポリペプチドであって、Ｎ−からＣ−末端へ
（１）細胞表面上の特定のマクロ分子および／または細胞外マトリックスの成分を選択的に認識する領域、
（２）ペプチドリンカーを含む領域、
（３）特定の標的分子に対して生物学的活性を有する領域、
（４）少なくとも１つのプロセッシング部位を特徴とする領域、および
（５）分子内結合および／または相互作用によって、領域（３）の生物学的活性を阻害する領域
（ここで、領域（３）の生物学的活性は、領域（４）中の少なくとも１つのプロセッシング部位のｉｎ　ｖｉｖｏにおけるプロセッシングによって解放される）、
を含む、ポリペプチド。
【請求項２】
領域（３）がサイトカインまたはそのフラグメントのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
該サイトカインが腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、またはその生物学的に活性な誘導体もしくは生物学的に活性な変異体である、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
領域（３）の特定の標的分子が細胞膜−結合サイトカインレセプターである、請求項１〜３のいずれかに１つに記載のポリペプチド。
【請求項５】
領域（３）が配列番号１のアミノ酸残基３２２〜４８６を含む、請求項３または４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
領域（４）中の少なくとも１つのプロセッシング部位がプロテアーゼのための開裂部位である、請求項１〜５の１つに記載のポリペプチド。
【請求項７】
該プロテアーゼが、ウロキナーゼ−型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、活性化凝固因子ＶＩＩａ、マトリックスメタロプロテアーゼ、またはＦＡＰプロテアーゼである、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項８】
領域（４）が配列番号１のアミノ酸残基４８７〜５１２または配列番号３のアミノ酸残基４８７〜５２０を含む、請求項６または７に記載されるポリペプチド。
【請求項９】
領域（５）が領域（３）に対する少なくとも１つの結合部位を有する、請求項１〜８の１つに記載のポリペプチド。
【請求項１０】
領域（５）がサイトカインまたはそのフラグメントに対するレセプターである、請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
該レセプターが、ヒトＴＮＦレセプターの完全なまたは部分的な細胞外ドメインおよび／またはＴＮＦ−結合ウイルスタンパク質またはその変異体あるいは合成ＴＮＦ−結合化合物を含む、請求項１０に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
領域（５）が配列番号１のアミノ酸残基５１３〜６３９または配列番号３のアミノ酸残基５２１〜５８２を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
領域（２）におけるペプチドリンカーが三量体化モジュールであり、そして領域（１）を領域（３）へ結合させる、請求項１〜１２の１つに記載のポリペプチド。
【請求項１４】
該三量体化モジュールが、固有の三量体化特性を有する天然存在または合成ペプチドを含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
領域（２）が配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
領域（１）が、腫瘍病巣および／または新脈管形成のプロセスに関係する増殖性内皮細胞において発現される細胞表面分子に対して特異的である、請求項１〜１５のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項１７】
領域（１）が、腫瘍病巣および／または病理学的病巣の新脈管形成領域に存在する細胞外マトリックスの成分に対して特異的である、請求項１〜１５のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項１８】
領域（１）が、悪性腫瘍細胞自体の成分に対して特異的である、請求項１〜１５のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項１９】
領域（１）が、定義される抗原特異性を有するネズミ、ヒト化もしくはヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項１〜１８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項２０】
該抗体フラグメントがｓｃＦｖまたはＦａｂフラグメントである、請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
領域（１）が配列番号１のアミノ酸残基２０〜２８５を含む、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２３】
請求項２２に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２４】
原核および／または真核細胞において発現および／または増幅し得る請求項２３に記載のベクター。
【請求項２５】
請求項２２に記載の核酸および／または請求項２３または２４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２６】
請求項１〜２１の１つに記載のポリペプチドの生産のための方法であって、以下の工程
（ａ）適切な条件下における培養培地中の請求項２５に記載される宿主細胞の培養および
（ｂ）宿主細胞および／または培養培地からの請求項１〜２１の１つに記載のポリペプチドの単離、
を含む、方法。
【請求項２７】
薬学的有効量の請求項１〜２１のいずれか１つに記載のポリペプチドおよび／または請求項２２に記載の核酸および／または請求項２３または２４に記載のベクターを含み、必要に応じて１つ以上の薬学的に許容される補助剤、希釈剤、および／または担体と混合される、薬学的組成物。
【請求項２８】
固形腫瘍のおよび／または病理学的病巣における新脈管形成の治療的処置を目的とする請求項２７に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
固体、液体、またはエアゾールの形態である請求項２７または２８に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、好ましくは抗腫瘍および／または免疫調節サイトカイン特性を有するポリペプチド（これは、特定の生物学的活性を有する中心領域を含み、ｉｎ　ｖｉｖｏでプロセッシングすることによって活性化され得る）に関する。そのＣ−末端では、前記領域がプロセッシングユニットおよびインヒビタードメインを含む領域を有し、一方中心領域のＮ−末端では、細胞表面上のマクロ分子または細胞外マトリックスの成分を選択的に認識する領域が存在する。
【０００２】
今まで、治療−限界（ｔｈｅｒａｐｙ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ）として見なされなければならない重篤な全身性副作用のせいで、例えば、非常に限られた適応症（四肢の黒色腫／肉腫転移）に対してのみ、特定の複合処置プロトコール（例えば、いわゆる「部分肢灌流（ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｌｉｍｂ　ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）」の方法によって）の下で、腫瘍疾患の処置のために、組換え腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）および他の活性物質をうまく使用することが可能であった。これらの臨床データから、抗腫瘍の効力には重い全身性副作用が許すＭＴＤ（最大耐用量）より約１０〜１００倍高いＴＮＦ用量が必要であると見積もられ得る。
【０００３】
従って、本発明の目的は、治療的に活性なポリペプチド活性物質（ＴＮＦ−含有物質のような）を用いる処置の所望されない結果を避けるまたは低減させることであるが、一方それと同時に、治療的活性（例えば、活性物質（ＴＮＦのような）の抗腫瘍特性）を維持または増強さえすることである。
【０００４】
この目的は、特許請求の範囲に特徴付けられる本発明の実施形態によって達成される。
【０００５】
特に、本発明に従って、Ｎ−からＣ−末端まで
（１）特定の細胞表面上のマクロ分子および／または細胞外マトリックスの成分を選択的に認識する領域、
（２）ペプチドリンカーを含む領域、
（３）特定の標的分子についての生物学的活性を有する領域、
（４）少なくとも１つのプロセッシング部位を特徴とする領域、および
（５）分子内結合および／または相互作用によって領域（３）の生物学的活性を阻害する領域、
（ここで、領域（３）の生物学的活性は、領域（４）中の少なくとも１つのプロセッシング部位のｉｎ　ｖｉｖｏにおけるプロセッシングによって解放され（ｒｅｌｅａｓｅｄ）得る）を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドを、使用可能（ａｖａｉｌａｂｌｅ）にする。
【０００６】
本発明に従うポリペプチド（また、以下「セレクトカイン（ｓｅｌｅｃｔｏｋｉｎｅ）」と呼ばれる）は、モジュラー構築物（ｍｏｄｕｌａｒ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）の活性物質であり、好ましくはサイトカイン、好ましくはＴＮＦあるいはその生物学的に活性な誘導体または生物学的に活性な変異体（抗腫瘍活性物質または領域（３）として）（これは、特に疾患組織（例えば、腫瘍領域）において４つの他の機能モジュールと結合することによってその生物学的活性を解放する）を有するホモ三量体融合タンパク質という特に好ましい実施形態に従う。これは、治療的に活性な物質の（例えば、ＴＮＦ分子の）標的組織に対して特異的である標的化モジュール（１）（例えば、腫瘍−特異的抗体またはその誘導体（ｓｃＦｖ抗体のような））とのＮ−末端結合によって、また治療的に活性な物質に対するインヒビター（５）（特に、ペプチドインヒビター）とのＣ−末端結合によって達成され、これは、ドメイン（４）のプロセッシングによって、好ましくは特定のタンパク質加水分解開裂により融合タンパク質から取り除かれることによって、標的組織（腫瘍領域のような）において選択的に不活性化され、それゆえ選択的標的モジュールに結合する生物活性物質（例えば、ＴＮＦ）が形成される。標的化モジュール（例えば、ｓｃＦｖ抗体フラグメント）と治療的機能を有するモジュール（例えば、ＴＮＦ）との間に、ペプチドリンカードメイン（２）、好ましくは、三量体化ドメイン（これは共有結合ジスルフィド架橋の形成およびそれによる融合タンパク質の規則的かつ安定なホモ三量体化を確実にする）が存在する。
【０００７】
本発明に従う構築物を用いると、治療剤（例えば、血清中のＴＮＦ）の全身的な上昇レベルおよびそれによる治療−制限的な副作用を引き起こすことなく、治療的活性物質（例えば、ＴＮＦ）の局所的に高い活性濃度を達成することが可能である。それと同時に、例えば治療的に活性なドメインとしてのＴＮＦの場合において、内部（ｉｎ　ｓｉｔｕ）活性型ＴＮＦの提示を媒介する標的化モジュール（例えば、抗体）によって、天然膜ＴＮＦのものに相当する効果が達成される（すなわち、これは両ＴＮＦレセプター型の共−活性化およびそれによるＴＮＦの抗腫瘍特性の増強作用をもたらす）。標的化モジュールの特異性を選択することによって、それぞれの腫瘍実体に特異的にマッチされる／最適化される治療剤が生産され得る。
【０００８】
本発明に従うポリペプチドの（アミノ酸配列）領域またはモジュールは、好ましい実施形態への参照を伴って以下に詳述される。
【０００９】
本発明に従うポリペプチド（セレクトカイン）は、新規プロドラッグ技術を利用し、また好ましい実施形態によれば原則として（モノマー中）（Ｎ−末端からＣ−末端へ）以下の構造エレメントの定義配列を含む組換えホモ三量体融合タンパク質を含む構築物である：（１）ＶＨ−リンカー−ＶＬから成る定義された抗原特異性のマウス、ヒト化またはヒト単−鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）；（２）固有の三量体化特性を有するペプチドリンカー；（３）例えば野生型ＴＮＦまたはＴＮＦの細胞外ドメイン（成熟１７ｋＤａ型、ＡＡ　１−１５７、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ　＃Ｐ０１３７５）に相当するＴＮＦ分子あるいはそれに由来する生物学的に活性な改変体；（４）特定のプロテアーゼ開裂部位を有する可変リンカーペプチド；（５）特異的にＴＮＦを結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ　ＴＮＦ−ｂｉｎｄｉｎｇ）タンパク質またはペプチド。
【００１０】
標的化モジュール（１）は、好ましくは、腫瘍病巣において発現されるおよび／または新脈管形成のプロセスと関係する内皮細胞を増殖する細胞表面分子に対して特異的である。別の好ましい実施形態に従うと、標的化モジュール（１）は、腫瘍病巣および／または病理学的病巣の新脈管形成領域内に存在する細胞外マトリックスの成分に対して特異的である。さらに好ましい実施形態に従うと、標的化モジュール（１）は、悪性腫瘍細胞自体の成分に対して特異的である。好ましくは、その領域またはモジュール（１）は、抗体（例えば、マウス、ヒト化またはヒト）またはそのフラグメント（例えば腫瘍組織において好ましくは選択的または優性的に発現される抗原に対する特異性（これによって、この抗原は、原則的として悪性細胞自体において発現され得るが、好ましくは腫瘍、ストロマ細胞または腫瘍内皮の非−悪性部分において発現される）をもつ、マウス起源の、完全にヒト起源の、またはＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ　ｇｒａｆｔｉｎｇ）によってヒト化された、先行技術に従って生産される、Ｆａｂフラグメントまたは代表的な単−鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ））を含む。固形腫瘍（癌腫）の非−悪性組織部分のこのような抗原は、一方で遺伝的に不変であるが、他方で非常に多種多様な腫瘍実体において起こり、それゆえ普遍的な腫瘍マーカーである。例えば、ＶＥＧＦＲ複合体またはＶＥＧＦＲ／ＶＥＧＦ複合体（レセプター／リガンド複合体の例として）、ならびにインテグリンαｖβ３、エンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）、および腫瘍内皮の選択標的構造としてのフィブロネクチンアイソフォームｂＦｎ、および腫瘍ストロマにおいて存在する細胞外マトリックスの成分に対する選択マーカーとしてのいわゆる繊維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）（これは、例えば特異的高−親和性ｓｃＦｖを用いて効率的に検出され得る）がここで言及される。好適な標的化モジュールの他の例は、ペプチド、人工抗体、および鏡像（ｍｉｒｒｏｒ−ｉｍａｇｅ）核酸（Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒｓ）である。
【００１１】
ペプチドリンカー領域（２）は、好ましくは三量体化モジュールであり、そして標的化領域（１）を治療的に活性な領域（３）と連結する。特に好ましい実施形態に従って、この三量体化モジュールは固有の三量体化特性を有する天然存在または合成ペプチドを含む。このようなペプチドの特に適切な例は、テナシン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）分子のドメイン（ＡＡ　１１０−１３９、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ　＃Ｐ１００３９（ニワトリ）、またはＳｗｉｓｓｐｒｏｔ　＃Ｐ２４８２１（ヒト））である。これは、標的化モジュール（１）（例えば、ｓｃＦｖ）と治療剤（３）（例えば、ＴＮＦ）との間の結合を生産し、そして同時に生物発生中の融合タンパク質の共有結合ホモ三量体結合を確実にする。
【００１２】
上に説明したように、治療的に活性なモジュール（３）は、好ましくは、サイトカインまたはその治療的に活性なフラグメントのアミノ酸配列を含む。好ましくは、領域（３）は、ＴＮＦの、さらに好ましくはＴＮＦ前駆体タンパク質の、そして最も好ましくはプロセスされた成熟野生型ＴＮＦ分子（ＡＡ　１−１５７、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ　＃Ｐ０１３７５）と同一のタンパク質のアミノ酸配列、あるいはそれに由来する誘導体または選択的レセプター結合特性を有する変異体またはそれらの特定の生物活性または他の特性（安定性、プロテアーゼ耐性）について最適化された変異体または誘導体を含む。
【００１３】
プロセッシングモジュール（４）は、例えばプロテアーゼ−感受性（すなわち、プロテアーゼの認識配列に相当するプロセッシング部位）であり、そして好ましくはそのアミノ酸組成および全長は、三量体化モジュールおよびＴＮＦ自体によって影響される融合タンパク質のホモ三量体化を可能にするが、またそれと同時に、その分子のＣ−末端（例えば、細胞外ＴＮＦレセプタードメイン）に位置するＴＮＦインヒビターのＴＮＦ部分への高−親和性、安定結合を可能にし、その結果、この方法によってＴＮＦモジュールの細胞−発現ＴＮＦレセプターへの結合が妨げられる。さらに、このリンカーは、好ましくは、選択的に腫瘍組織において好ましく検出されるそれらの細胞外または細胞−結合プロテアーゼに対する少なくとも１つ、好ましくはいくつかの選択的開裂部位を含むように構成される。適切な開裂部位の例は、ウロキナーゼ−型プラスミノーゲンアクチベーター（ｕＰＡ）、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、活性化凝固因子ＶＩＩａ、ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９のようなマトリックスメタロプロテアーゼについて、ならびに腫瘍のストロマにおいて高い選択性を有して膜で発現するＦＡＰプロテアーゼについてのものである。特に好ましいプロテアーゼ−感受性開裂部位は、転移の広がりおよび新脈管形成のプロセスと関係するマトリックスメタロプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ−９認識配列　Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ；配列番号１８）の、ヘパラナーゼ（ｈｅｐａｒａｎａｓｅ）の、壊死病巣において優先的に生じる酵素の、および前立腺癌に関係する酵素（例えば、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、開裂可能なプロセッシングモジュール　グルタリル−（４−ヒドロキシプロピル）−Ａｌａ−Ｓｅｒ−シクロヘキサグリシル−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−ＣＯＯＨ）のものである。リンカーの構造は、プロテアーゼ認識配列が自由にアクセス可能であり（すなわち、特定のプロテアーゼによる効率的なプロセッシングが可能である）、そして融合タンパク質の開裂後にＴＮＦ分子上に残っているかも知れないリンカーのアミノ酸が治療的に活性な領域の生物活性に有害な影響を有さないように選択される。
【００１４】
本発明に従うポリペプチドの好ましい実施形態に従って、インヒビターモジュール（５）は、サイトカインまたはそのフラグメントに対するレセプターである。さらに、このインヒビターモジュールは好ましくは、治療的に活性な領域（３）に対する少なくとも１つの結合部位を特徴とする。ＴＮＦが領域（３）において使用される場合、インヒビターモジュールは、好ましくは、ヒトＴＮＦレセプター（例えば、ｈｕＴＮＦＲ１）（ｐ５５／６０ＴＮＦＲと同義である；Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ　＃Ｐ１９４３８、ＡＡ　１−１９０；またはこの分子のフラグメント（例えば、ＡＡ　１−１５７またはＡＡ６０−１２０）の完全または部分的な細胞外ドメインを含む。ＴＮＦに特異的に結合する他のタンパク質（例えば、ｈｕＴＮＦＲ２（ＥＭＢＬデータバンク　＃Ｍ３２３１５）の細胞外ドメインまたはウイルス起源のタンパク質（例えば、Ｔ２タンパク質のような）およびそれぞれそれらに由来する合成ペプチド（これは、ＴＮＦに結合する能力を有し、そして細胞膜ＴＮＦレセプターへのＴＮＦ結合に干渉する））も同様に適切である。インヒビターの治療的に活性なモジュールとの結合または相互作用に起因して、本発明に従う融合タンパク質は、この状態（すなわちプロ型（ｐｒｏ　ｆｏｒｍ）（プロドラッグ）で存在する）において生物学的に不活性である。
【００１５】
本発明に従うポリペプチドは、さらなるドメインを含み得る。例えば、組換えによって産生されるタンパク質の精製を簡単にし、そしてｉｎ　ｖｉｔｒｏ解析を簡単にするために、適切な標識配列（ｍａｒｋｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）が付加され得る。従って、例えば、ＰＯＰＥベクターに由来するｍｙｃ−Ｈｉｓ６タグが、領域（５）でＣ−末端に、好ましくはＴＮＦＲフラグメントに付加され得る。さらなる標識配列は当業者に公知である。
【００１６】
本発明に従う好ましいＴＮＦセレクトカインは、上で詳しく説明した３つの機能的ドメイン（腫瘍−特異的抗体モジュール、ＴＮＦ、および阻害ＴＮＦ−結合タンパク質（細胞外レセプタードメインまたはそれに由来するペプチド））の融合体、ならびに三量体化特性または特定のプロテアーゼ開裂部位を有する中間の機能的リンカーからなる共有結合ホモ三量体分子であり、これは、完全な状態において、ＴＮＦ活性に関する限り不活性である。ｉｎ　ｖｉｖｏ投与の後、セレクトカインは先ず、抗体部分により特に腫瘍領域において濃縮され（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）、そしてそこで腫瘍自体または反応性腫瘍ストロマ／腫瘍脈管系により形成されるプロテアーゼ（例えば、ＦＡＰ、ｕＰＡ、ｔＰＡ、ＭＭＰ２、第ＶＩＩａ因子）によってプロセスされる（すなわち、阻害ペプチド（５）は開裂される）。選択的タンパク質加水分解開裂の後、ＴＮＦＲフラグメント／インヒビターペプチドは三量体ＴＮＦ分子から解離し、従って後者は生物活性になる（すなわち、領域（４）中のプロセッシング部位をプロセッシングすることによってこの領域の生物学的活性が放出される）。この方法でプロセスされるＴＮＦはここで、これらがホモ多量体分子のように単量体可溶性レセプターフラグメントよりもかなり高い親和性を有することから、好ましくは細胞ＴＮＦレセプターに結合する。それゆえＴＮＦ活性の選択性は、２つの測定方法によって、本発明に従うセレクトカインを用いて達成される：一方は、腫瘍における不活性型プロドラッグのｓｃＦｖ−媒介選択的濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）およびタンパク質加水分解活性化後のその保持を介し、そして他方は、排他的または優先的に腫瘍領域中で顕著な活性において検出され得るプロテアーゼによるプロドラッグの部位−特異的な転換を介する。さらに、セレクトカインのさらなる優先的活性は、ＴＮＦの膜抗原へのｓｃＦｖ−媒介型結合によって達成される（すなわち、慣用的に使用される（可溶性）ＴＮＦ分子と比較して改良された生物学的活性（この活性は天然膜−ＴＮＦ分子のものと類似している））：ＴＮＦのｓｃＦｖ−媒介固定に起因して、ＴＮＦＲ２での解離平衡がより安定な結合にシフトされ、そしてこれによってその活性化が達成される。両ＴＮＦＲの同時活性化が協同的シグナルメカニズムを導き得、そして結果的に細胞反応の増強、特に内皮細胞の活性化および腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導（この点においては、慣用的に使用される（可溶性）ＴＮＦに耐性である）をもたらす。
【００１７】
本発明に従うポリペプチドの特に好ましい実施形態は、図１（配列番号１）および５（配列番号３）中に示されるアミノ酸配列を特徴とする。
【００１８】
本発明のさらなる主題は、本発明に従うポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。用語「核酸」は、天然、半−合成、合成、またはデオキシリボヌクレオチドの修飾核酸分子および／またはリボヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチドを意味する。本発明に従う核酸の好ましい実施形態は、図１（配列番号２）および５（配列番号４）中に示されるヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
さらに、上に定義される核酸を含むベクターは、本発明に従って、使用可能にされる。ベクターは、好ましくは、原核および／または真核細胞において発現および／または増幅することができる。この目的のために、ベクターは、好ましくは、プロモーター、エンハンサー、終結配列などのような適切な調節エレメントを含む。ベクターはまた、宿主細胞の遺伝物質中への本発明に従う核酸の安定な組み込みのために使用され得る。本発明に従うさらなる主題は、上記核酸および／または上記ベクターを含む宿主細胞に関する。適切な宿主細胞は、例えば、全ての哺乳類細胞（ＣＯＳまたはＣＨＯ細胞のような）である。
【００２０】
本発明は同様に、以下の工程を含む本発明のポリペプチドの生産のための方法を使用可能にする、
（ａ）適切な条件下における培養培地中の上記宿主細胞の培養および
（ｂ）本発明のポリペプチドの宿主細胞および／または培養培地からの単離。
【００２１】
本発明に従うポリペプチドは、好ましくは適切な発現系の助けを借りた発現によって、好ましくは細胞系ＣＨＯ　ＤＧ４４の、またはＣＯＳ７における一過性発現の後の、選択可能で安定なトランスフェクタントの分泌産物として、産生される。技術の状態に対応する他の真核生物発現系は、例えば、Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ、昆虫または哺乳類細胞（それぞれの細胞系に好都合な分泌のための発現ベクターを含む）である（例えば、Ｂｒｏｃｋｓら（ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３：１７３−１８４，１９９７）において哺乳類および昆虫細胞について記載される）。ｐＰＩＣＺアルファベクター（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）も同様に、酵母Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓにおける発現および分泌に適する。
【００２２】
本発明に従うポリペプチド、核酸、および／またはベクターは、病理学的疾患の処置のための薬学的組成物の生産のために好都合に使用され得る。
【００２３】
それゆえ、本発明のさらなる開発は、薬学的有効量の本発明に従うポリペプチドおよび／または本発明に従う核酸および／または本発明に従うベクターを含み、必要に応じて１つ以上の薬学的に許容される補助剤、希釈剤、および／または担体と組み合わされる薬学的組成物に関する。この薬学的組成物は、好ましくは、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｓｅｓ）および／または感染症および／または代謝疾患の治療的処置のために使用される。薬学的組成物の適用の特に好ましい分野は、固形腫瘍および病理学的病巣における新脈管形成の処置である。本発明に従う薬学的組成物は、この専門分野において適切であると承認される任意の形態をとり得る。それは、好ましくは、固体、液体、またはエアゾールの形態である。
【００２４】
従って、本発明は同様に、治療的に十分な量の本発明に従う薬学的組成物のこの処置を必要とする患者への投与を含む処置方法を包含する。薬学的組成物の投与の適切な方法は、当業者に公知であり、そして例えば、経口、静脈内、動脈内、筋肉内、鼻腔、直腸、および局所的適用を含む。静脈内投与は、続く注射間隔を伴うおよび／または注入の形態における、例えばボーラス注射の形態で行われ得る。ヒトおよび動物患者の両方が本発明の薬学的組成物を用いて処置され得る。処置方法は、好ましくは、上記疾患を有する患者に対して使用される。
【００２５】
本発明は、以下の非−限定的な例への参照を用いて、より詳細に説明される。
実施例
実施例１：ＴＮＦセレクトカインの配列の例
リンカーおよび種々のレセプターフラグメント中にマルチ開裂部位を含むＴＮＦセレクトカインの配列の例：
１．ｓｃＦｖ−ＴＤテナシン−ｈｕＴＮＦ（ＡＡ１−１５７）−リンカー−ｈｕＴＮＦＲ１（ＡＡ１−１９０）。
２．ｓｃＦｖ−ＴＤテナシン−ｈｕＴＮＦ（ＡＡ１−１５７）−リンカー−ｈｕＴＮＦＲ１（ＡＡ６０−１２０）。
【００２６】
別の改変体においては、例として上に示されるようなｓｃＦｖ、リンカー配列、およびレセプター配列を維持しながら、ｈｕＴＮＦ分子中の潜在的な内因性開裂部位をアミノ酸交換（ＴＮＦｍｕｔ　Ｉ８３Ｆ、Ｒ１３１Ｑ）によって取り除く。
【００２７】
三量体化ドメインに関しては、テナシン−Ｃ（ＡＡ１１０−１３９）のコイルドコイルドメイン（これは、様々な種において高度に保存される）を使用する：
ＡＡ配列の例：
ニワトリ：ＡＣＧＣＡＡＡＰＩＶＫＤＬＬＳＲＬＥＥＬＥＧＬＶＳＳＬＲＥＱ（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ　＃Ｐ１００３９、配列番号５）＊
ヒト：ＡＣＧＣＡＡＡＰＤＶＫＥＬＬＳＲＬＥＥＬＥＮＬＶＳＳＬＲＥＱ　（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ　＃Ｐ２４８２１、配列番号６）＃
＊Ｎｉｅｓ，Ｄ．Ｅ．，　Ｈｅｍｅｓａｔｈ，Ｔ．Ｊ．，　Ｋｉｍ，Ｊ．Ｈ．，　Ｇｕｌｃｈｅｒ，Ｊ．Ｒ．　ａｎｄ　Ｓｔｅｆａｎｓｓｏｎ，Ｋ．　Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅｔｅ　ｃＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　ｈｅｘａｂｒａｃｈｉｏｎ　（Ｔｅｎａｓｃｉｎ）。Ａ　ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｕｎｉｑｕｅ　ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　ｒｅｐｅａｔｓ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６６　（５），　２８１８−２８２３（１９９１）
＃　Ｓｐｒｉｎｇ，Ｊ．，　Ｂｅｃｋ，Ｋ．　ａｎｄ　Ｃｈｉｑｕｅｔ−Ｅｈｒｉｓｍａｎｎ，Ｒ．　Ｔｗｏ　ｃｏｎｔｒａｒｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｅｎａｓｃｉｎ：　ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｉｔｅｓ　ｂｙ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｔｅｎａｓｃｉｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．　Ｃｅｌｌ　５９　（２），　３２５−３３４（１９８９）
実施例２：リンカー配列
本発明に従うプロセッシング配列は、例えば、トロンビン、ｔＰＡ、第ＶＩＩａ因子およびｕＰＡについてプロテアーゼ開裂部位を有するリンカーである（下アミノ酸配列（配列番号７）；上ｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号８）：
【００２８】
【数１】
2004508828.tif 000002
【００２９】
実施例３：ＴＮＦセレクトカインプロドラッグＷ２４の発現、精製、および機能的キャラクタライゼーション
プロドラッグＷ２４
ＴＮＦセレクトカインプロドラッグＷ２４は、以下の成分から成る（Ｎ−からＣ−末端へ、アミノ酸残基（ＡＡ）は配列番号１に関連する）
１．ＡＡ　１−１９：リーダーペプチド配列
２．ＡＡ　２０−２８５：　ｓｃＦｖ　ＯＳ４　（特異性：ヒトＦＡＰ；ｃｆ．　Ｍｅｒｓｍａｎｎ　（２０００）　Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，　Ｖｅｒｌａｇ　Ｇｒａｕｅｒ，　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，　ＩＳＢＮ　３−８６１８６−３３５−９；　Ｒｉｐｐｍａｎｎ　１９９９，　Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，　ＩＳＢＮ　３−８６１８６−２８１−６）
３．ＡＡ　２８６−３１５：テナシンの三量体化ドメイン（ニワトリ、上記を参照のこと）
ＡＡ　３１６−３２１：リンカー
４．ＡＡ　３２２−４８６：Ｎ−末端５６　ＡＡおよびＡＡ　７８−８９の欠失（ＴＮＦΔ１−５６、７８−８９）（すなわち、細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴＮＦ前駆体ポリペプチドのＴＡＣＥ開裂部位の欠失）を伴う天然ヒトＴＮＦ前駆体タンパク質（２６ｋＤａ　膜型、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ　＃Ｐ０１３７５、２３３　ＡＡ）の変異体
５．ＡＡ　４８７−５１２：プロテアーゼ開裂部位を有するリンカー（ｃｆ．実施例２）
６．ＡＡ　５１３−６３９：細胞外ドメイン１−３を含むヒトＴＮＦＲ１フラグメント（Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ　＃Ｐ１９４３８、ＡＡ　１２−１３８；ｃｆ．Ｈｉｍｍｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９０）　ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　９，　７０５−７１５）
７．ＡＡ　６４０−６５２　ｍｙｃタグ
８．ＡＡ　６５３−６５８　Ｈｉｓタグ
アミノ酸配列（配列番号１）および対応するコーディングＤＮＡ配列（配列番号２）を図１に示す。タンパク質部分の計算ＭＷは、７０．３ｋＤａである。
【００３０】
発現および精製
プロドラッグＷ２４を、製造元（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の指示書に従って、ＩＭＡＣによって、ＣＨＯ上清から精製した。クマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、これの４００ｎｇ（２０μＬ）を還元および非−還元条件下においてアプライし、２μＬを抗−ｃ−ｍｙｃ−ｍＡｋ　９Ｅ１０を用いるウェスタンブロットにおいて使用した；ｃｆ．図２。単量体、二量体、および三量体構築物の発現を検出する。
ｔＰＡによるプロドラッグＷ２４の開裂
精製プロドラッグＷ２４（６００ｎｇ）をＰＢＳ（５０μＬ）中またはＰＢＳ＋ｔＰＡ（５０μＬ　ＰＢＳ中に５μｇ　ｔＰＡ）中において３７℃で１６ｈインキュベートした。１２％　ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）およびウェスタンブロットの後、抗−ｃ−ｍｙｃ−ｍＡｋ　９Ｅ１０、次いでアルカリホスファターゼ−複合体化ヤギ抗−マウスＩｇＧ血清を用いて、検出を行った。ｔＰＡを含むバッチ中において、開裂される（ｃｌｅａｖｅｄ−ｏｆｆ）ＴＮＦＲフラグメント（そのＣ−末端にｍｙｃタグを有する）の予測されるサイズ（約１７ｋＤａ）のレベルにおける３３ｋＤａ以下のバンドの状況は、プロドラッグＷ２４の部分的消化を示す；ｃｆ図３。活性化ＴＮＦセレクトカインは、この検出方法を用いて示され得ない。
【００３１】
トリプシンによるプロドラッグＷ２４のタンパク質加水分解活性化
前日に５０μＬ標準培養培地（１０％　ＦＣＳ）中の２０，０００Ｋｙｍ１細胞を、９６ウェル（４倍の値）を有するプレート中にまき、その次の日５０μＬプロドラッグＷ２４希釈液を添加した。ＩＭＡＣ−精製プロドラッグＷ２４（２μｇ）のトリプシン活性化を、最終濃度１００μｇ／ｍＬのトリプシンを含む全体積５０μＬのＰＢＳ中で行った。２００μＬ　ＲＰＭＩ／１０％　ＦＣＳと共に室温にて５分間インキュベーションした後、反応を停止した。非−活性化サンプルを、トリプシンなしで、同様に処理した。１６時間後、ＭＴＴ染色によってバイタリティーを測定した。その結果は、非−プロセス化ＴＮＦセレクトカインが約２−３μｇ／ｍＬの濃度まで生物活性（アポトーシス誘導）を全く有さないが、一方トリプシンによって活性化されたセレクトカインは野生型ＴＮＦ（ＬＤ５０＝０．５ｎｇ／ｍＬ）に匹敵する高特異的生物活性を有することを示す（図４）。ＬＤ５０の決定は、プロセッシングに起因する活性における約４，０００倍の増加を示す。
【００３２】
実施例４：プロドラッグＷ３３
プロドラッグＷ３３構築物は実施例３のプロドラッグＷ２４と同じ機能的特性を有するが、より長いプロテアーゼ−感受性リンカー（ＡＡ　４８７−５２０）およびより短いＴＮＦＲフラグメント（ＡＡ　５２１−５８２；Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ　＃Ｐ１９４３８、ヒトＴＮＦＲ１のＡＡ　５４−１１５；ｃｆ．　Ｈｉｍｍｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０）ＤＮＡ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　９，７０５−７１５）によってそれと異なる。アミノ酸配列（配列番号３）およびプロドラッグＷ３３のコーディングｃＤＮＡ配列（配列番号４）が図５に示される。
【００３３】
実施例５：ＴＮＦセレクトカインプロドラッグＷ３２の発現、精製、および機能的キャラクタライゼーション
プロドラッグＷ３２
実施例３のプロドラッグＷ２４に機能的に相当するが標的化モジュール（１）として異なる抗体フラグメント（ｓｃＦｖ　ＭＯ３６）を含む別の構築物（プロドラッグＷ３２）を生産し、これを、マウスＩｇ遺伝子ライブラリーから独立的に単離し、そしてヒト／マウスＦＡＰ交差反応性について選択した。対照的に、実施例３のプロドラッグＷ２４の標的化特異性は、ｓｃＦｖ　ＯＳ４（これは、排他的にヒトＦＡＰを認識する）に基づく。
【００３４】
ＴＮＦセレクトカインプロドラッグＷ３２の生化学的キャラクタライゼーションおよび抗原結合活性
プロドラッグＷ３２を、構築物Ｗ２４（実施例３）のように発現させ、ＩＭＡＣによって精製し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットによって分析した；ｃｆ．図６Ａ。
【００３５】
さらに、ＦＡＰ結合についてのプロドラッグＷ３２のＫＤ，ａｐｐ．をＦＡＣＳ分析によって測定した；ｃｆ図６Ｂ。ＫＤ，ａｐｐ．を半−最大シグナル（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍｕｍ　ｓｉｇｎａｌ）が得られる濃度から計算した。これは２．４×１０−１０Ｍの値を与えた。
【００３６】
プロドラッグＷ３２のＴＮＦ活性
Ｋｙｍ−１アポトーシス試験（ｃｆ．手順については実施例３）において、活性化プロドラッグＷ３２が天然存在ＴＮＦに匹敵する活性を有するのに対し、非−プロセス化構築物は、非常に高い濃度でのみアポトーシス活性を発揮する；ｃｆ．図７Ａ。
【００３７】
さらに、活性化プロドラッグＷ３２の近接親和性アポトーシス誘導（ｊｕｘｔａｔｒｏｐｉｃ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を、プロドラッグ−提示細胞との共培養において研究した。これのために、ＦＡＰ−陰性ＨＴ１０８０コントロール細胞またはＦＡＰ−陽性ＨＴ１０８０＃３３細胞を、一連の希釈度のプロドラッグまたはトリプシン−活性化プロドラッグと共にインキュベートし、洗浄し、固定し、Ｋｙｍ−１と共培養し、そして１６時間後に細胞のバイタリティーを測定した；ｃｆ図７Ｂ。別の類似するバッチを用いるさらなる実験において、細胞への結合および続く細胞の固定の後にのみ、プロドラッグのトリプシン活性化を行った；ｃｆ図７Ｃ。両方の場合において、活性化プロドラッグによる顕著な近接親和性アポトーシス誘導が見いだされる。
実施例６：本発明に従うポリペプチドセレクトカインＷ２４およびＷ３３の構築融合タンパク質を以下のように生産する：
１．単−鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）ＯＳ４（以下ＯＳ４と呼ばれる）は、ＣＤＲグラフティング（ＣＤＲ　ｇｒａｆｔｉｎｇ）（Ｒｅｔｔｉｇ　ｅｔ　ａｌ．　１９８８）によってヒト化されたＦＡＰ−特異的　ｍＡｂ　Ｆ１９の変型であり、Ｒｉｐｐｍａｎｎ　Ｊ．Ｆ．（Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ　Ｕｎｉ　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｖｅｒｌａｇ　Ｇｒａｕｅｒ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９９）およびＲｉｐｐｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ（Ａｐｐｌ　ＥｎｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ　６４：４８６２−４８６９，１９９８）において記載される。
２．ｍＡｂ　Ｆ１９の重イムノグロブリン鎖についての発現カセットを有する真核生物発現ベクターｐＧ１Ｄ１０５（ＥＰ　０　９５３　６３９に記載される）において、後者を、ＢｓｔＥ２およびＮａｅｌによって、ｓｃＦｖ　ＯＳ４；ｈｕＩｇＧｌのヒンジ−ＣＨ３領域；プラスミドｐＷ７のｍｙｃ／ｈｉｓタグ（Ｗｕｅｓｔ，Ｔ．，Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ　Ｕｎｉ　Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，２００１に記載される）からなる小体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）ＯＳ４カセットへ交換した。Ｆｃフラグメント（ｈｕ　ＩｇＧ１のヒンジ領域およびＣＨ３領域）がＮｏｔ１／ＢａｍＨ１消化によって選択的に取り除かれる。
３．三量体化ドメインのｃＤＮＡ配列（例えば、ニワトリテナシンのＡＡ　１１０−１３９）をプライマー１（配列番号１０）および２（配列番号１１）によるプルーフ−リーディングＰＣＲによって増幅し、その結果として、開裂部位Ｎｏｔ１およびＫｐｎ１が導入された。ヒトＴＮＦフラグメントを、非−開裂可能な膜ＴＮＦ変異体（膜−ＴＮＦ、ＴＮＦデルタ１−１２，Ｇｒｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ，　Ｃｅｌｌ　８３：７９３−８０２，１９９５）由来のプライマー３（配列番号１２）および４（配列番号１３）によって増幅し、その結果として、開裂部位Ｋｐｎ１が５’−末端で導入され、開裂部位Ａｃｃ３およびＢａｍＨ１が３’−末端で導入され、そしてペプチドリンカーＴｙｒＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ（配列番号９）をコード化する配列がテナシンおよびＴＮＦドメインをコード化する配列セグメントの間へ導入された。この２つのフラグメントを、Ｎｏｔｌ、Ｋｐｎｌ、およびＢａｍＨ１開裂部位を用いて、２．の下に記載されるＮｏｔｌ／ＢａｍＨ１−消化クローニング中間体（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ）へ挿入した。
４．プロテアーゼ−感受性リンカーおよびヒトＴＮＦレセプター１フラグメントのクローニングを、いくつかの中間体を介して行った。このために、ＴＮＦレセプター１フラグメント（システイン−リッチドメイン１−３；ＡＡ　１２−１３８；Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ　＃１００３９）を、プラスミドｐＡＤＢＴＮＦ−Ｒ（Ｈｉｍｍｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．　ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ　９：７０５−７１５，１９９０）に由来するプライマー５（配列番号１４）および６（配列番号１５）を用いてＰＣＲ−増幅し、そしてプライマー７（配列番号１６）および６（配列番号１５）を使用して再増幅し、その結果として開裂部位Ａｃｃ３、ＢａｍＨ１、およびプロテアーゼ開裂部位をコード化するＴＮＦＲフラグメントのリンカー５’が導入された。このフラグメントを、開裂部位Ａｃｃ３／ＢａｍＨ１を介して３．中に記載される中間体へクローニングした。
５．リンカーＴＮＦＲ１フラグメント中のプロテアーゼ−感受性リンカーの修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を、プライマー８（配列番号１７）および６（配列番号１５）を用いるＰＣＲ増幅を介して導入した。それゆえ、得られるフラグメントを、開裂部位Ｃｌａ１およびＢａｍＨ１を介して４．の下に記載される中間体へ挿入し、以前に得られたリンカーＴＮＦＲフラグメントを置換した。この方法で生産される真核生物発現プラスミドｐＷ２４は、ＴＮＦセレクトカインプロドラッグＷ２４の発現を可能にする。
６．ＴＮＦセレクトカインプロドラッグのさらなる実施形態において、ＴＮＦレセプターを、プライマー９および１０を用いてＰＣＲ−増幅し、結果としてヒトＴＮＦＲ１のＡＡ　５４−１１５をコードする５’リンカーを有する配列がもたらされる。このフラグメントを、Ｓａｌ１およびＢａｍＨ１開裂部位を介してｐＷ２４へ挿入し、そしてそこに含まれるリンカーＴＮＦＲ１フラグメントを置換する。生じる発現プラスミドｐＷ３３は、ＴＮＦセレクトカインプロドラッグＷ３３の発現を可能にする。
７．ＴＮＦセレクトカインプロドラッグ（Ｗ２４およびＷ３３）を得るために、５．および６．の下に記載される構築物を有するＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、リポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いて製造元の指示書に従ってトランスフェクションし、さらに引き続きヒポキサンチンおよびチミジン−フリー（ＨＴ−）ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって、構築物のゲノムへの安定な組み込みについて選択した。選択試薬メトトレキサート（０．１；１；１０μＭ）の段階的な増加によって、発現の増加が得られた。Ｗ２４およびＷ３３の両方を、Ｒｉｐｐｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．（Ａｐｐｌ　ＥｎｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ　６４：４８６２−４８６９，１９９８）に記載されるような固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｍｅｔａｌ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）（ＩＭＡＣ）の方法によって滅菌条件下において培養上清から精製し、そしてさらなる使用のために４℃にて保存した。
【００３８】
全てのクローニングおよびＰＣＲ増幅工程を、以下のプライマーを使用する慣用的な標準的方法によって行った。全ての構築物をそのｃＤＮＡ配列を実証するために配列決定した。関係する開裂部位を太字で印刷する。
【００３９】
【数２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明に従うセレクトカインプロドラッグＷ２４のアミノ酸配列（配列番号１、上）およびそれに対応するｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号２、下）を示す。
【図２】
図２は、クマシー−染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびそれに対応する抗−ｃ−ｍｙｃ−ｍＡＫ９Ｅ１０とのインキュベーション後のウェスタンブロットの写真図を示す。プロドラッグＷ２４は、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞において発現され、そしてＩＭＡＣの方法によって精製された。精製タンパク質は、還元（ｒｅｄ．）およびさらに非−還元条件下でアプライされた。
【図３】
図３は、抗−ｃ−ｍｙｃ−ｍＡＫ９Ｅ１０を用いた検出後の１２％ＳＤＳゲルのウェスタンブロット分析の写真図である。トラック１：ＰＢＳとのインキュベーション後の精製プロドラッグＷ２４。トラック２：ｔＰＡを加えたＰＢＳとのインキュベーション後の精製プロドラッグＷ２４。
【図４】
図４は、トリプシン−活性化プロドラッグＷ２４（■）または非−活性化プロドラッグＷ２４（▼）を用いたＫｙｍ１細胞についてのアポトーシス誘導試験の結果のグラフ図である。
【図５】
図５は、本発明に従うセレクトカインプロドラッグＷ３３のアミノ酸配列（配列番号３、上）およびそれに対応するｃＤＮＡヌクレオチド配列（配列番号４、下）を示す。
【図６】
図６（Ａ）は、クマシー−染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびそれに対応する抗−ｃ−ｍｙｃ−ｍＡＫ９Ｅ１０とのインキュベーション後のウェスタンブロットの写真図を示す。プロドラッグＷ３２は、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞において発現され、そしてＩＭＡＣによって精製された。精製タンパク質は、還元およびさらに非−還元条件下でアプライされた。（Ｂ）は、ＦＡＣＳ分析によって、ＦＡＰ結合に関して、プロドラッグＷ３２のＫＤ，ａｐｐを決定する結果のグラフ図である。ＦＡＰ−陽性　ＨＴ１０８０＃３３細胞（○）およびＦＡＰ−陰性　ＨＴ１０８０コントロール細胞（●）がプロドラッグＷ３２の連続的希釈液と共にインキュベートされ、そして細胞−結合部分が間接的な免疫蛍光強度によって検出された。使用されるプロドラッグの濃度が中央蛍光強度（ｍｅｄｉａｎ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ＭＦＩ）に対して示される。
【図７】
図７（Ａ）は、非−活性化プロドラッグＷ３２（■）、トリプシン−活性化プロドラッグＷ３２（□）、または野生型ＴＮＦ（●）を用いたＫｙｍ１細胞についてのアポトーシス誘導試験の結果のグラフ図である。３回の実験の代表が示される。ＩＭＡＣ−精製プロドラッグＷ３２（左トラック）およびトリプシン活性化後のＩＭＡＣ−精製プロドラッグＷ３２（右トラック）の還元条件下におけるクマシー−染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの写真図が挿入される。矢印は活性化プロドラッグＷ３２の推定ＭＷに相当する。（Ｂ）は、プロドラッグ−提示、ＦＡＰ−陽性細胞（ＨＴ１０８０＃３３）およびＦＡＰ−陰性コントロール細胞（ＨＴ１０８０）との共−培養物中のＫｙｍ１細胞についてのアポトーシス誘導試験の結果のグラフ図である。ＨＴ１０８０＋非−活性化プロドラッグＷ３２（△）、ＨＴ１０８０＋トリプシン−活性化プロドラッグＷ３２（□）、ＨＴ１０８０＃３３＋非−活性化プロドラッグＷ３２（▲）、ＨＴ１０８０＃３３＋トリプシン−活性化プロドラッグＷ３２（■）。（Ｃ）は、トリプシン活性化がＨＴ細胞への結合およびそれに続く固定後にのみ行われたこと以外は、（Ｂ）中において示すものに相当する実験のグラフ図である。ＨＴ１０８０＋非−活性化プロドラッグＷ３２（○）、ＨＴ１０８０＋トリプシン−活性化プロドラッグＷ３２（□）、ＨＴ１０８０＃３３＋非−活性型プロドラッグＷ３２（●）、ＨＴ１０８０＃３３＋トリプシン−活性化プロドラッグＷ３２（■）。（Ｂ）および（Ｃ）のグラフ図の各々において、３回の実験の代表が示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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