(57)【要約】免疫応答調節活性を有する、色素標識イミダゾナフチリジン、イミダゾピリジンおよびイミダゾキノリン化合物を開示する。その化合物は特に、分子の結合部位および／またはレセプター部位を決定するのに有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｉ）：
【化１】
2004500347.tif 000013
（式中、
Ｒ１は、スペーサー基であり；
Ｒ２は、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アミドアルキル、アルキルアミドアルキル、ジアルキルアミドアルキル、アルカノイルアルキル、アジドアルキル、カルバモイルアルキル、へテロ原子により任意に中断されるアルキル；アルケニル、アルケニルオキシアルキル；シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル；アリール、アラルキル、アラルケニル、ヘテロアリールアルキル（アリールが任意に、炭素原子１〜４個のアルキル、炭素原子１〜４個のアルコキシ、ハロ、アミノ、アルキルアミノもしくはジアルキルアミノによって置換される）；アロイルアルキル、またはヘテロアロイルアルキルであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、アルキル、炭素原子１〜４個のアルコキシ、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノであるか、または一緒になって合わせた場合に、Ｒ３およびＲ４は、炭素原子１〜４個のアルキル、炭素原子１〜４個のアルコキシ、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシおよびアルコキシメチルから選択される１個または複数の置換基によって任意に置換される縮合アリールまたはヘテロアリール基を形成し；あるいは
Ｒ３およびＲ４は、１個または複数のヘテロ原子を任意に含有し、かつ炭素原子１〜４個のアルキル、ハロおよび炭素原子１〜４個のハロアルキルから選択される１個または複数の置換基によって任意に置換される、５〜７員飽和縮合環を形成し；
ＤＹＥは、色素部位がダンシルでないという条件で、色素部位であるか；または薬剤として許容されるその酸付加塩である）の化合物。
【請求項２】
Ｒ１が以下の構造：
【化２】
2004500347.tif 000014
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ１が以下の構造：
【化３】
2004500347.tif 000015
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ＤＹＥが蛍光色素部位である、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
前記蛍光色素部位が、二フッ化ジピロメテンホウ素色素、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、ローダミン、ローダミン誘導体およびテキサスレッドからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記蛍光色素部位が、二フッ化ジピロメテンホウ素色素である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
ＤＹＥが以下の構造：
【化４】
2004500347.tif 000016
を有する、請求項６に記載の化合物。
【請求項８】
前記蛍光色素部位がフルオレセインである、請求項４に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ３およびＲ４が一緒になって、１個または複数のヘテロ原子を任意に含有し、かつ炭素原子１〜４個のアルキル、炭素原子１〜４個のアルコキシ、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシおよびアルコキシメチルから選択される１個または複数の置換基によって任意に置換される、縮合アリール基を形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ３およびＲ４が一緒になって、ベンゼン環を形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ３およびＲ４が一緒になって、１個または複数のヘテロ原子を任意に含有し、かつ炭素原子１〜４個のアルキル、アミノ、ハロおよび炭素原子１〜４個のハロアルキルから選択される１個または複数の置換基によって任意に置換される、５〜７員飽和縮合環を形成する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ３およびＲ４がそれぞれ独立して、水素、炭素原子１〜８個の直鎖もしくは分枝鎖アルキル、炭素原子１〜４個のアルコキシ、ハロ、アミノ、アルキルアミノまたはジアルキルアミノである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
Ｒ２が、水素、炭素原子１〜８個を含有するアルキル、またはそのアルコキシ基が炭素原子１〜４個を含有し、かつそのアルキル基が炭素原子１〜４個を含有するアルコキシアルキルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１４】
以下の構造：
【化５】
2004500347.tif 000017
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１５】
以下の構造：
【化６】
2004500347.tif 000018
を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項１６】
以下の構造：
【化７】
2004500347.tif 000019
を有する、請求項１に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、免疫応答調節活性を有し、かつ色素部位、特に蛍光色素部位を含有するイミダゾナフチリジン、イミダゾピリジンおよびイミダゾキノリン化合物に関する。本発明はまた、色素標識化合物を調製する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
標識化またはタグ付けされた化合物は、化学および生物科学において長い間使用されている。かかる化合物は様々な方法で使用することができる。例えば、生物活性であることが知られる化合物を標識化することによって、化合物の代謝産物をさらに容易に同定することが可能であり、分子の結合部位および／またはレセプター部位を決定し、体内または他の系等にその化合物がどれだけの時間とどまっているかを決定することができる。
【０００３】
化合物を標識化する既知の一方法は、化合物に染色マーカーを付けることによる方法である。これは通常、色素部位を生物活性分子上にグラフトさせるか、またはその合成時に色素部位を生物活性分子中に組み込むことによって行われる。標識化合物は、レセプターまたは核酸への特異的結合、特定の酵素の活性化もしくは抑制、または生体膜中に組み込まれる能力など、未標識化合物の重要な性質を保持することが重要である。例えば、二フッ化ジピロメテンホウ素色素、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、ローダミン、ローダミン誘導体およびテキサスレッド（Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ）を含む、多種多様な色素部位が入手可能である。
【０００４】
イミダゾナフチリジン、イミダゾピリジンおよびイミダゾキノリンは、インターフェロンおよび他のサイトカインの生合成を誘導する能力を有する、特別な種類の免疫応答変更因子化合物の一部である。例えば、Ｇｅｒｓｔｅｒによる米国特許第４，６８９，３３８号；Ｇｅｒｓｔｅｒ他による米国特許第４，９２９，６２４号；Ｇｅｒｓｔｅｒによる米国特許第５，２６８，３７６号；Ｇｅｒｓｔｅｒ他による米国特許第５，３８９，６４０号；Ｎｉｋｏｌａｉｄｅｓ他による米国特許第５，３５２，７８４号；Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ他による米国特許第５，４９４，９１６号；および国際特許出願公開第９９／２９６９３号を参照のこと。色素、特に蛍光色素は通常、比較的大きく、かさ高い分子であり、かかる大きな置換基は、生物学的応答を引き起こす手法で対象の細胞に結合、またはその細胞と相互作用する、化合物の能力を付与することが可能である。
【０００５】
発明の概要
本発明者等は、サイトカインを誘導する能力を保持する種類の色素標識イミダゾナフチリジン、イミダゾピリジンまたはイミダゾキノリン化合物を発見した。これらの化合物には、かさ高い色素基が分子の生物活性を妨げないように、化合物の活性中心から色素部位を分離するためにスペーサー基が用いられている。本発明の化合物は、一般式（Ｉ）：
【化８】
2004500347.tif 000002
（式中、
Ｒ１が、スペーサー基であり；
Ｒ２は、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アミドアルキル、アルキルアミドアルキル、ジアルキルアミドアルキル、アルカノイルアルキル、アジドアルキル、カルバモイルアルキル、へテロ原子により任意に中断されるアルキル；アルケニル、アルケニルオキシアルキル；シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル；アリール、アラルキル、アラルケニル、ヘテロアリールアルキル（アリールが任意に、炭素原子１〜４個のアルキル、炭素原子１〜４個のアルコキシ、ハロ、アミノ、アルキルアミノもしくはジアルキルアミノによって置換される）；アロイルアルキル、またはヘテロアロイルアルキルであり；
Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立して、水素、アルキル、炭素原子１〜４このアルコキシ、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノであるか、または一緒になって合わせた場合に、Ｒ３およびＲ４は、炭素原子１〜４個のアルキル、炭素原子１〜４個のアルコキシ、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシおよびアルコキシメチルから選択される１個または複数の置換基によって任意に置換される縮合アリールまたはヘテロアリール基を形成し；あるいは
Ｒ３およびＲ４は、１個または複数のヘテロ原子を任意に含有し、かつ炭素原子１〜４個のアルキル、アミノ、ハロおよび炭素原子１〜４個のハロアルキルから選択される１個または複数の置換基によって任意に置換される、５〜７員飽和縮合環を形成し；
ＤＹＥは、色素部位がダンシルでないという条件で、色素部位；または薬剤として許容されるその酸付加塩である）を有する。
【０００６】
本発明はさらに、色素標識イミダゾナフチリジン、イミダゾピリジンまたはイミダゾキノリン化合物を調製する方法を提供する。
【０００７】
好ましい実施形態の詳細な説明
上述のように、本発明は、次式（Ｉ）：
【化９】
2004500347.tif 000003
（式中、
Ｒ１が、スペーサー基であり；
Ｒ２は、水素、アルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノアルキル、ジアルキルアミノアルキル、アミドアルキル、アルキルアミドアルキル、ジアルキルアミドアルキル、アルカノイルアルキル、アジドアルキル、カルバモイルアルキル、へテロ原子により任意に中断されるアルキル；アルケニル、アルケニルオキシアルキル；シクロアルキルアルキル、ヘテロシクロアルキル；アリール、アラルキル、アラルケニル、ヘテロアリールアルキル（アリールが任意に、炭素原子１〜４個のアルキル、炭素原子１〜４個のアルコキシ、ハロ、アミノ、アルキルアミノもしくはジアルキルアミノによって置換される）；アロイルアルキル、またはヘテロアロイルアルキルであり；
Ｒ３およびＲ４がそれぞれ独立して、水素、アルキル、炭素原子１〜４このアルコキシ、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノであるか、または一緒になって合わせた場合に、Ｒ３およびＲ４が、炭素原子１〜４個のアルキル、炭素原子１〜４個のアルコキシ、ハロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヒドロキシおよびアルコキシメチルから選択される１個または複数の置換基によって任意に置換される縮合アリールまたはヘテロアリール基を形成し；あるいは
Ｒ３およびＲ４が、１個または複数のヘテロ原子を任意に含有し、かつ炭素原子１〜４個のアルキル、アミノ、ハロおよび炭素原子１〜４個のハロアルキルから選択される１個または複数の置換基によって任意に置換される、５〜７員飽和縮合環を形成し；
ＤＹＥが、色素部位がダンシルでないという条件で、色素部位；または薬剤として許容されるその酸付加塩である）の色素標識免疫応答調節化合物を提供する。
【０００８】
本明細書では、別段の指定がない限り、以下に示す用語は、以下に指定した意味を有する：
アルキルおよびアルケニル基は、炭素原子１〜８個（または２〜８個）を含有し、直鎖または分枝鎖であることが可能である。シクロアルキル基は、３〜８員を含有し、アルキル基によって任意に置換することが可能である。複素環式基は、３〜８員を含有し、Ｏ、Ｓ、およびＮから独立して選択されるヘテロ原子１〜３個を含有することが可能である。
【０００９】
アリール基は、炭素環式芳香環または環構造である。ヘテロアリール基は、Ｏ、Ｓ、およびＮから独立して選択されるヘテロ原子１〜６個を含有する、芳香環または環構造である。好ましいアリール基はベンゼンである。好ましいヘテロアリール基は、５員もしくは６員を有し、かつＯ、Ｓ、およびＮから独立して選択されるヘテロ原子１〜４個を有する単一の環である。
【００１０】
ヘテロ原子は、Ｏ、Ｓ、およびＮである。
【００１１】
「オイル（ｏｙｌ）」という用語は、ラジカル中のカルボニル基の存在を示すために用いられる。例えば、「アロイル（ａｒｏｙｌ）」は、カルボニル基によりその構造の残部に結合する芳香族基を示すために用いられる。
【００１２】
スペーサー基は、生物活性を実質的に低減することなく、イミダゾナフチリジン、イミダゾピリジンまたはイミダゾキノリン化合物に色素部位が結合するのを可能にする、有機連結基である。本発明は、いずれかの操作理論によって束縛されるものではないが、色素部位が活性中心とサイトカインを誘導する細胞との間の相互作用を妨げないように、スペーサー基は、分子の活性中心とかさ高い色素部位との距離を十分に置かれている。したがってスペーサー基は、分子の生物活性をそれ自体で妨げず、かつ生物活性を実質的に低減することなく、分子中に色素部位を含有させることを可能にする、二価有機連結基であることが可能である。この状況では、標識化合物がインターフェロンもしくは腫瘍壊死因子の生合成を誘導する場合、以下に示す試験法１に従って濃度約５０μｇ／ｍｌ以下で試験すると、化合物の生物活性は著しく損なわれてはいない。
【００１３】
好ましいスペーサー基は、構造式（ＩＩ）：
【化１０】
2004500347.tif 000004
を有する。
スペーサー基が式（ＩＩ）を有する場合には、括弧外にあるメチレン基を色素部位に結合させることが好ましい。
【００１４】
他の好ましいスペーサー基は、構造式（ＩＩＩ）：
【化１１】
2004500347.tif 000005
を有する。
【００１５】
色素部位がダンシルでないという条件で、その色素部位は既知の色素、特に蛍光色素から誘導することができる。適切な種類の色素の例には、二フッ化ジピロメテンホウ素色素、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、ローダミン、ローダミン誘導体およびテキサスレッドが含まれる。多くの二フッ化ジピロメテンホウ素色素（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）が既知であり、例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ他による米国特許第４，７７４，３３９号；Ｋａｎｇ他による米国特許第５，１８７，２８８号；Ｈａｕｇｌａｎｄ他による米国特許第５，２４８，７８２号；およびＫａｎｇ他による米国特許第５，２７４，１１３号を参照のこと。二フッ化ジピロメテンホウ素色素の多くは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ社（オレゴン州ユージーン）から商品名ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）蛍光体として市販されている。好ましい色素部位には、フルオレセインおよび以下に示す構造を有する４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセンが含まれる。
【化１２】
2004500347.tif 000006
【００１６】
式（Ｉ）の好ましい化合物には、以下の構造：
【化１３】
2004500347.tif 000007
を有する、Ｎ−［２−（４−アミノ−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）エチル］−６−［（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）アミノ］ヘキサノアミド；
以下の構造：
【化１４】
2004500347.tif 000008
を有する、５−｛［（｛４−［４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］ブチル｝アミノ）カルボンチオイル］アミノ｝−２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸；および
以下の構造：
【化１５】
2004500347.tif 000009
を有する、５−｛［（｛２−［４−アミノ−２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］エチル｝アミノ）カルボンチオイル］アミノ｝−２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸；が含まれる。
【００１７】
本発明の化合物は、以下の反応スキームＩに示す方法に従って調製することができる。式ＩＶのイミダゾナフチリジン、イミダゾピリジンまたはイミダゾキノリンを、式Ｖの色素誘導体と反応させて、式Ｉの化合物が得られる。ＲＡとＲＢのどちらも、互いに反応するように選択される官能基を含有する。例えば、ＲＡが第一級アミンを含有する場合には、次いで、ＲＢがアシルアジド、アルデヒド、無水物、カルボニルハロゲン化物、ハロゲン化物、ハロアセトアミド、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、スクシンイミジルエステルまたは塩化スルホニルを含有する色素誘導体が選択される。ＲＡおよびＲＢは、反応して、所望のスペーサー基Ｒ１（例えば、ＲＡが−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２であり、かつＲＢが−（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）ＮＨ（ＣＨ２）５ＣＯＯＨであり、次いでＲ１が−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）５ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）２−である）が得られるように選択される。ＲＡが官能基を含有する式ＩＶの化合物の製法は既知である。例えば、Ｇｅｒｓｔｅｒによる米国特許第４，６８９，３３８号；Ｇｅｒｓｔｅｒ他による米国特許第４，９２９，６２４号；Ｇｅｒｓｔｅｒによる米国特許第５，２６８，３７６号；Ｇｅｒｓｔｅｒ他による米国特許第５，３８９，６４０号；Ｎｉｋｏｌａｉｄｅｓ他による米国特許第５，３５２，７８４号；Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ他による米国特許第５，４９４，９１６号；Ａｎｄｒｅ他による米国特許第４，９８８，８１５号；Ｇｅｒｓｔｅｒによる米国特許第５，３６７，０７６号；Ｇｅｒｓｔｅｒによる米国特許第５，１７５，２９６号；Ｎｉｋｏｌａｉｄｅｓ他による米国特許第５，３９５，９３７号；Ｇｅｒｓｔｅｒ他による米国特許第５，７４１，９０８号；Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍによる米国特許第５，６９３，８１１号；Ｎａｎｂａ他による米国特許第６，０６９，１４９号を参照のこと。これらの開示内容を参照により本明細書に組み込む。国際特許出願公開第９９／２９６９３号もまた参照のこと。反応性官能基を含有する多くの色素誘導体が市販されており（例えば、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）蛍光体、フルオレセインイソチオシアネート、５−カルボキシフルオレセイン）、または既知の合成経路によって調製することができる。例えば、Ｈａｕｇｌａｎｄ他による米国特許第４，７７４，３３９号；Ｋａｎｇ他による米国特許第５，１８７，２８８号；Ｈａｕｇｌａｎｄ他による米国特許第５，２４８，７８２号；およびＫａｎｇ他による米国特許第５，２７４，１１３号を参照のこと。これらの開示内容を参照により本明細書に組み込む。この反応は一般に、ピリジンもしくはジメチルスルホキシドなどの適切な溶剤中に溶解した式ＩＶの化合物の溶液を、ピリジンもしくはジメチルスルホキシドなどの適切な溶剤中に溶解した式Ｖの色素誘導体の溶液と混合することによって行われる。その反応は、周囲温度または高温で行うことが可能である。次いで、従来の方法を用いて、式Ｉの生成物を単離し、精製する。
【化１６】
2004500347.tif 000010
【００１８】
以下の実施例により本発明を説明するが、決してそれに限定されるものではない。
【００１９】
ヒト細胞におけるサイトカイン誘導−試験法１
ｉｎ　ｖｉｔｒｏのヒト血球系を使用して、本発明の化合物によるサイトカイン誘導を評価する。活性は、Ｔｅｓｔｅｒｍａｎ等著「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ　Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ　ａｎｄ　Ｓ２７６０９」，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，５８，３６５−３７２（１９９５年９月）に記載のように、培地中に分泌されたインターフェロンおよび腫瘍壊死因子（α）（それぞれＩＦＮおよびＴＮＦ）の測定に基づく。
【００２０】
培養に用いるための血球調製
健康なヒトドナーからの全血を、静脈穿刺することによってＥＤＴＡヴァキュテーナーチューブ中に回収する。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０７７（ミズーリ州セントルイス、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）の密度勾配遠心法によって、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を全血から分離する。ＰＢＭＣをハンクス液で２回洗浄し、次いで１０％ウシ胎児血清と、２０ｍＭのＬ−グルタミンと、１％ペニシリン／ストレプトマイシン溶液とを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ完全培地）中に細胞数２×１０６／ｍＬで懸濁する。ＰＢＭＣ懸濁液を１ｍＬずつ、１２または２４ウェル平底滅菌組織培養プレートに加える。
【００２１】
化合物の調製
エタノール、ジメチルスルホキシド、またはパイロジェンを含有しない水にその化合物を可溶化し、次いで組織培養水、０．０１Ｎ水酸化ナトリウムまたは０．０１Ｎ塩酸（溶剤の選択は、試験する化合物の化学的特性によって異なるだろう）で希釈する。培養ウェルに添加するためには、エタノールまたはＤＭＳＯ濃度は、最終濃度が１％を超えないほうがよい。一般に、範囲約０．０１μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度を用いて、その化合物を試験する。
【００２２】
インキュベーション
試験化合物の溶液を、培地中のＰＢＭＣ１ｍｌを含有するウェルに加える。プラスチック製の蓋でプレートを覆い、静かに混合し、次いで二酸化炭素５％の大気中、３７℃で２４時間インキュベートする。
【００２３】
分離
インキュベーションに続いて、細胞を含有しない培養上清を滅菌ポリプロピレン製ピペットで取り、１２×７５ｍｍポリプロピレン製チューブに移す。次いで、そのチューブを４℃で１０〜１５分間、１０００ｒｐｍ（約８００ｘｇ）で遠心分離する。上清を除去し、２ｍＬ滅菌凍結バイアルに入れる。サイトカインについての分析を行うまで、サンプルを−７０℃に維持する。
【００２４】
インターフェロン分析／計算
脳心筋炎で誘発されたＡ５４９ヒト肺癌細胞を用いて、インターフェロン濃度をバイオアッセイにより決定する。バイオアッセイ法の詳細は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇ．Ｌ．ＢｒｅｎｎａｎおよびＬ．Ｈ．Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ著「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｂｉｏａｓｓａｙ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ−ｔｅｓｔ  Ｐｌａｔｅｓ」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６月／７月，７８，１９８３年に記載されている。簡単に述べられているのは以下の方法である：ＩＦＮ標準物質の希釈溶液または試験サンプルで、Ａ５４９セルを３７℃で２４時間インキュベートする。次いで、そのインキュベートした細胞を脳心筋炎ウイルスの接種材料で感染させる。ウイルス性細胞変性効果を定量化する前に、その感染した細胞を３７℃でさらに２４時間インキュベートする。ウイルス性細胞変性効果を、クリスタルバイオレットなどの生体色素でウェルを染色することによって定量化し、続いてプレートを視覚的にスコアリングする。その結果を、ＮＩＨヒト白血球ＩＦＮ基準に対して得られた値に基づいたα基準単位／ｍＬとして表す。
【００２５】
腫瘍壊死因子（α）分析
Ｇｅｎｚｙｍｅ社（マサチューセッツ州ケンブリッジ）から入手可能なＥＬＩＳＡキットを用いて、腫瘍壊死因子（α）（ＴＮＦ）濃度を決定する。その結果は、ｐｇ／ｍｌとして表す。
【００２６】
ヒト細胞におけるサイトカイン誘導−試験法２
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのヒト血球系を使用して、本発明の化合物によるサイトカイン誘導を評価する。活性は、Ｔｅｓｔｅｒｍａｎ等著「Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ  ａｎｄ  Ｓ−２７６０９」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５８，３６５−３７２（１９９５年９月）に記載のように、培地中に分泌されたインターフェロンおよび腫瘍壊死因子（α）（それぞれＩＦＮおよびＴＮＦ）の測定に基づく。
【００２７】
培養に用いるための血球調製
健康なヒトドナーからの全血を、静脈穿刺することによってＥＤＴＡヴァキュテーナーチューブ中に回収する。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ（登録商標）−１０７７の密度勾配遠心法によって、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を全血から分離する。ＰＢＭＣをハンクス液で２回洗浄し、ＲＰＭＩ完全培地中に細胞数３〜４×１０６／ｍＬで懸濁する。そのＰＢＭＣ懸濁液を、試験化合物を含有する、等容積のＲＰＭＩ完全培地を含む４８ウェル平底滅菌組織培養プレート（マサチューセッツ州ケンブリッジ、Ｃｏｓｔａｒ社またはニュージャージー州リンカンパーク、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ社）に加える。
【００２８】
化合物の調製
その化合物をエタノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で可溶化する。培養ウェルに添加するためには、ＤＭＳＯ濃度は、最終濃度が１％を超えないほうがよい。一般に、範囲約０．１２〜３０μＭの濃度で化合物を試験する。
【００２９】
インキュベーション
試験化合物の溶液を、ＲＰＭＩ完全培地を含む第１ウェルに６０μＭで加え、３倍段階希釈液をウェル中に調製する。次いで、ＰＢＭＣ懸濁液をウェルに等容積で加え、試験化合物の濃度を所望の範囲（０．１２〜３０μＭ）にする。ＰＢＭＣ懸濁液の最終濃度は、細胞数１．５〜２×１０６／ｍＬである。プラスチック製の滅菌蓋でプレートを覆い、静かに混合し、次いで二酸化炭素５％の大気中、３７℃で１８〜２４時間インキュベートする。
【００３０】
分離
インキュベーションに続いて、プレートを４℃で５〜１０分間、１０００ｒｐｍ（約２００ｘｇ）で遠心分離する。細胞を含有しない培養上清をポリプロピレン製滅菌ピペットで除去する。分析を行うまで、サンプルを−３０〜−７０℃に維持する。サンプルをインターフェロン（α）および腫瘍壊死因子（α）についてＥＬＩＳＡにより分析する。
【００３１】
インターフェロン（α）および腫瘍壊死因子（α）の分析／計算
ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ニュージャージー州ニューブランズウィック）製のＨｕｍａｎ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｅｃｉｅｓキットを用いてＥＬＩＳＡにより、インターフェロン（α）濃度を決定する。その結果をｐｇ／ｍＬとして表す。
【００３２】
Ｇｅｎｚｙｍｅ社（マサチューセッツ州ケンブリッジ）；またはＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手可能なＥＬＩＳＡキットを用いて、腫瘍壊死因子（α）（ＴＮＦ）濃度を決定する。その結果は、ｐｇ／ｍｌとして表す。
【００３３】
式ＩＶの未標識化合物の調製
２−（４−アミノ−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）エタンアミントリヒドロクロライド
パートＡ
塩化チオニル（３２．３ｍＬ、０．４３３８ｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３２ｍＬ、０．４３３８ｍｏｌ）を、４−ヒドロキシ−３−ニトロキノリン（７５ｇ、０．３９４４ｍｏｌ）のジクロロメタン（７５０ｍｌ）懸濁液に続けて添加した。約２時間半、その反応混合物を還流で加熱し、次いで一晩周囲温度で保持した。反応混合物を氷浴中で冷却し、次いでジクロロメタン中に溶解したトリエチルアミン（８２．５ｍＬ、０．５９１６ｍｏｌ）とエタノールアミン（３５．７ｍＬ、０．５９１６ｍｏｌ）の混合物をゆっくりと加えた。その混合物を数時間還流で加熱し、次いでトリエチルアミンおよびエタノールアミンの両方を、さらに０．５当量添加した。その反応混合物をさらに１時間還流し、次いで周囲温度で一晩保持した。得られた固形物を濾過により単離し、ジクロロメタンで最初に洗浄し、次いで水で洗浄し、乾燥させて、２−［（３−ニトロ−４−キノリニル）アミノ］エタノール７５ｇを得た。
【００３４】
パートＢ
２−［（３−ニトロ−４−キノリニル）アミノ］エタノール（６ｇ）を、エタノール（２００ｍＬ）および炭素担持白金触媒と合わせた。その混合物をＰａｒｒ装置で水素化した。合計３０ｇの出発物質を用いて、この手順をさらに４回繰り返した。次いで、合計５回の水素化から得られた混合物を合わせ、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）濾過助剤の層を通して濾過し、触媒を除去した。真空下で濾液を濃縮して、未精製２−［（３−アミノ−４−キノリニル）アミノ］エタノールを得た。
【００３５】
パートＣ
パートＢから得た未精製物質をエトキシ酢酸（１３．４ｇ）と混合した。その混合物を、反応が完了するまで油浴を用いて加熱した。混合物を周囲温度まで冷却し、次いで水で希釈し、水酸化ナトリウム（６Ｎ）で塩基性にした。その混合物をジクロロメタンで３回抽出した。抽出物を混合し、水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで濾過した。濾液を真空下で濃縮して、未精製２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール３０．８ｇを得た。
【００３６】
パートＤ
過酢酸（３２％過酢酸２５ｍＬ）を、パートＣから得た物質と酢酸メチル（３５０ｍＬ）との混合物に添加した。出発材料がすべて消費されたことが、薄層クロマトグラフィーにより示されるまで、その反応混合物を５４℃で加熱した。反応混合物を周囲温度まで冷却した。固形物を濾過により単離し、酢酸メチルで洗浄し、次いで乾燥させて、２−エトキシメチル−１−（２−ヒドロキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン５Ｎオキシド（収穫物１）２８．５ｇを得た。濾液を真空下で濃縮した。残留物を炭酸水素ナトリウム水溶液で希釈し、次いでジクロロメタンで３回抽出した。その抽出物を混合し、炭酸水素ナトリウム水溶液で１回洗浄し、水で２回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、次いで真空下で濃縮して、さらに生成物（収穫物２）１．６ｇを得た。
【００３７】
パートＥ
パートＤから得た収穫物１および収穫物２を混合し、ジクロロメタン（６００ｍＬ）と混合した、濃水酸化アンモニウム（４５０ｍＬ）を添加した。その反応混合物を氷浴中で冷却し、次いで塩化ｐ−トルエンスルホニル（２２ｇ）を混合物にゆっくりと添加した。その反応混合物を周囲温度で一晩攪拌した。薄層クロマトグラフィーによって、微量の出発物質が存在することが示された。塩化ｐ−トルエンスルホニル１ｇを添加し、反応混合物をさらに１時間攪拌した。固形物を濾過により単離し、ジクロロメタンで洗浄し、次いで乾燥させて未精製４−アミノ−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール２０．２ｇを得た。この物質１ｇをアセトン（約１０ｍＬ）に溶解した。その溶液が酸性になるまで、塩化水素／メタノール（１ｇ／５ｍＬ）を添加した。すぐに沈殿物が形成した。その混合物を蒸気浴で１０分間加熱した。その固形物を濾過により単離し、アセトンで洗浄し、次いでメタノール／アセトンから再結晶化して、４−アミノ−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノールヒドロクロライド０．７ｇをオフホワイトの固形物として得た。分析：Ｃ１５Ｈ１９ＣｌＮ４Ｏの計算値：％Ｃ、５５．８１；％Ｈ、５．９３；％Ｎ、１７．３６；実測値：％Ｃ、５５．９１；％Ｈ、５．９０；％Ｎ、１７．３５。
【００３８】
パートＦ
塩化チオニル（５ｍＬ）と４−アミノ−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノール（１ｇ）を混合し、薄層クロマトグラフィー（２０％メタノール／酢酸エチル）によって出発物質が消失したことが示されるまで、蒸気浴で加熱した。その反応混合物を周囲温度まで冷却し、次いで氷と水の混合物中にゆっくりと注いだ。その混合物を炭酸水素ナトリウムで中和し、次いでジクロロメタンで３回抽出した。抽出物は、化合され、炭酸水素ナトリウム水溶液で３回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、次いで真空下で濃縮した。アセトン（約１０ｍＬ）を残留物に添加し、続いてメタノールに溶解した塩化水素（約１ｍＬ）を添加した。混合物を還流し、沈殿物が形成した。反応混合物を周囲温度に冷却した。沈殿物を濾過により単離し、次いでアセトンで洗浄した。その固形物を熱いメタノールに溶解し、次いでアセトンを添加することによって沈殿させた。濾過により沈殿物を単離し、水で洗浄し、次いで乾燥させて、１−（２−クロロエチル）−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンヒドロクロライドを得た。分析：Ｃ１５Ｈ１８ＣｌＮ４Ｏの計算値：％Ｃ、５２．８０；％Ｈ、５．３２；％Ｎ、１６．４２；実測値：％Ｃ、５２．６７；％Ｈ、５．２１；％Ｎ、１６．２９。
【００３９】
パートＧ
１−（２−クロロエチル）−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（２２．８ｇ、パートＦの方法により調製した）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（７５ｍＬ）溶液に、アジ化ナトリウム（１４．７ｇ）を添加した。その反応混合物を還流で数時間加熱し、次いで一晩かけて周囲温度に冷却した。反応混合物を水（１００ｍＬ）中に注ぎ、次いで酢酸エチルで３回抽出した。その抽出物を混合し、水で３回洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、次いで真空下で乾燥状態まで濃縮して、未精製１−（２−アジドエチル）−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンをオイルとして得た。
【００４０】
パートＨ
パートＧから得た未精製物質のエタノール（２５０ｍＬ）溶液に、炭素担持白金触媒を添加した。その混合物をＰａｒｒ装置で還元した。ビンを数回排気して、窒素を除去し、反応の進行を薄層クロマトグラフィーによりモニターした。Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）濾過助剤の層を通して、反応混合物を濾過して、触媒を除去し、フィルターパッドを温かいエタノールで洗浄した。濾液を真空下で濃縮して、カラムクロマトグラフィー（メタノール／酢酸エチルを用いて溶出するシリカゲル）により精製したオイルを得た。精製オイルの再結晶化を試みて、濾過によって単離された沈殿物が生成した。濾液を真空下で濃縮して、オイルを得た。そのオイルをエタノールに溶解した。後で使用するために、その一部を取り出した。その残りを、エタノールに溶解した１０％塩化水素と混合し、還流した。混合物を氷浴中で冷却し、次いで濾過して、得られた固形物を単離した。その固体をエタノールから再結晶化して、２−（４−アミノ−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）エタンアミントリヒドロクロライドを得た。分析：Ｃ１５Ｈ２２Ｃｌ３Ｎ５Ｏの計算値：％Ｃ、４５．６４；％Ｈ、５．６２；％Ｎ、１７．７４；実測値：％Ｃ、４６．１４；％Ｈ、５．６４；％Ｎ、１７．８３。
【００４１】
実施例１−式Ｉの標識化合物の調製
Ｎ−［２−（４−アミノ−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）エチル］−６−［（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）アミノ］ヘキサノアミド
ジメチルスルホキシド（１ｍＬ）に溶解された６−（（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）アミノ）ヘキサン酸、スクシンイミジルエステル（５ｍｇ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ−Ｘ、ＳＥ）を含有する溶液を、２−（４−アミノ−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）エタンアミントリヒドロクロライド（２．５ｍｇ）と混合した。ピリジン（５滴）を添加し、その反応混合物を周囲温度で一晩振とうした。水中のアセトニトリルの複合勾配で溶出する、Ｂｏｎｄａｐａｋ  Ｃ１８の１２．５ｎｍ逆相カラム（マサチューセッツミルフォード、Ｗａｔｅｒ社から入手可能）を用いた高性能液体クロマトグラフィーによって、反応混合物を精製した。通常の溶出では、アセトニトリル含有量は最初の１５分間に５％〜３０％増大し、続いて１０分間はアセトニトリル３０％でアイソクラティック溶出し、アセトニトリル５０％に対して５分間勾配し、次いでアセトニトリル５０％で５分間アイソクラティック溶出した。溶媒はすべて、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する。遊離蛍光体および未標識化合物のクロマトグラムを反応混合物のクロマトグラムと比較することによって、標識化合物を含有する画分を最初に同定した。次いで、標識化合物を含有する画分を回収し、プールし、凍結乾燥させた。その標識化合物は、エレクトロスプレー質量分析により決定した分子量６７２．０８を有した。提案される実験式Ｃ３５Ｈ４５Ｎ８Ｏ３ＢＦ２に基づく計算値は６７２．３５である。その紫外可視吸収スペクトルは、それぞれ蛍光標識および未標識化合物の特徴である５０５ｎｍおよび３２５ｎｍにおいて吸収バンドを示した。
【００４２】
上述の試験法１を用いて、実施例１の標識化合物および未標識中間体（２−（４−アミノ−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）エタンアミントリヒドロクロライド）を、サイトカイン生合成を誘発する能力について並行して試験した。実施例１の化合物をエタノール中で可溶化した。未標識中間体を組織培養水中で可溶化した。その結果を以下の表に示す。
【００４３】
【表１】
2004500347.tif 000011
【００４４】
フローサイトメトリー分析
健康なヒトドナーからの全血を、静脈穿刺することによってＥＤＴＡヴァキュテーナーチューブ中に回収した。上記のＴｅｓｔｅｒｍａｎによる論文に記載のようにフィコール−ハイパーク（ｆｉｃｏｌｌ　ｈｙｐａｑｕｅ）（ミズーリ州セントルイス、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社）の密度勾配遠心法によって、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を全血から分離した。ＰＢＭＣを、１０％ウシ胎児血清と、２ｍＭのＬ−グルタミンと、ペニシリン／ストレプトマイシン溶液とを含有するＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ完全培地）中に細胞数２×１０６／ｍＬで懸濁した。次いで、１２×７５ｍｍポリプロピレン製チューブ中で、実施例１の標識化合物またはその標識化合物を調製するのに使用するＢＯＤＩＰＹ蛍光体と一緒になって、細胞を３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、細胞を染色緩衝液（カルシウムおよびマグネシウムを含有しないダルベッコリン酸緩衝食塩水、１％熱失活ウシ胎児血清、および０．１％アジ化ナトリウム）で２回洗浄した。染色緩衝液中に細胞を懸濁し、フローサイトメトリーによる分析を行うために１２×７５ｍｍポリスチレン製チューブに移した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社から購入）を用いて、蛍光により単核球への結合を測定した。
【００４５】
図１および図２のヒストグラムには、さらに右側に見られる蛍光細胞集団が多くなるのに伴って蛍光強度をプロットした。ヒストグラムにおいてＭ３として標識化されたピーク領域は、末梢血単核球中の単球集団に結合する蛍光を示す。これらの血球は、イミダゾキノリンに応答するサイトカインを生成する主要細胞であることが示されている（Ｇｉｂｓｏｎ等著「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  Ｉｍｉｑｕｉｍｏｄ  ａｎｄ  Ｓ−２７６０９」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５，５３７−５４５（１９９５年））。図１のヒストグラムは、ＢＯＤＩＰＹ蛍光体と一緒になってインキュベートした細胞から得た。図２のヒストグラムは、実施例１のＢＯＤＩＰＹ標識化合物と一緒になってインキュベートした細胞から得た。実施例１の標識化合物はヒト末梢血単核球に結合するのに対して、ＢＯＤＩＰＹ蛍光体は単独で結合せず、かつ血球は他のＰＢＭＣよりも有効に結合することが、これらのヒストグラムによって示されている。
【００４６】
実施例１の標識化合物は、ヒトＰＢＭＣと一緒になって４℃で１時間インキュベートした場合に、血球への著しい結合を示さなかった。結合が細胞内結合である可能性があることを示す、図１と同様のヒストグラムを得た。
【００４７】
式ＩＶの未標識化合物の調製
４−（４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブタンアミン
パートＡ
３−ニトロキノリン−４−オル（５０ｇ、０．２６ｍｏｌ）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）溶液に、オキシ塩化リン（３０ｍＬ、０．３２ｍｏｌ）を１時間かけてゆっくりと添加した。その反応混合物を３０分間蒸気浴で加熱し、次いで氷と水の混合物に注いだ。得られた固体を濾過により単離し、次いでクロロホルム（７５０ｍＬ）に懸濁した。その懸濁液を蒸気浴で加熱し、次いでまだ熱い間に濾過した。濾液を分液漏斗に注ぎ、残留する水からクロロホルム層を分離した。トリエチルアミン（２９ｍＬ）をそのクロロホルム層に添加し、続いてｔ−ブチルＮ−（４−アミノブチル）カルバメートをゆっくりと添加した。その反応を薄層クロマトグラフィーによってモニターした。出発物質がすべて消失した後に、反応混合物を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで真空下で濃縮して、１，１−ジメチルエチルＮ−｛４−［（３−ニトロキノリン−４−イル）アミノ］ブチル｝カルバメート６６ｇを黄色い固形物として得た。
【００４８】
パートＢ
１，１−ジメチルエチルＮ−｛４−［（３−ニトロキノリン−４−イル）アミノ］ブチル｝カルバメート（３６．１ｇ、１００ｍｍｏｌ）のトルエン（１．５Ｌ）溶液に、炭素担持白金（５％白金３．６ｇ）を加えた。その混合物を５０ｐｓｉ（３．５Ｋｇ／ｃｍ２）で３時間水素化した。その反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）濾過助剤の層を通して濾過し、触媒を除去した。濾液を真空下で濃縮して、未精製１，１−ジメチルエチルＮ−｛４−［（３−アミノキノリン−４−イル）アミノ］ブチル｝カルバメート３０．１ｇをオレンジ色の粘着性シロップとして得た。
【００４９】
パートＣ
窒素雰囲気下において、パートＢから得た物質のジクロロメタン（１Ｌ）溶液を０℃に冷却した。トリエチルアミン（１３ｍＬ、９３．３ｍｍｏｌ）を添加した。塩化メトキシプリピオニル（１１．５ｇ、９１．２ｍｍｏｌ）を１０分間にわたり添加した。氷浴を取り除いた。１時間後、反応混合物を濃縮して、薄いオレンジ色の固形物を得た。この物質をエタノール（１Ｌ）およびトリエチルアミン（３９ｍＬ）と混合した。その混合物を約７５℃で一晩加熱した。その反応混合物を周囲温度に冷却し、次いで真空下で濃縮して、オイルを得た。そのオイルをジエチルエーテル（７５０ｍＬ）と混合し、約１５分間攪拌し、次いで濾過した。濾液を真空下で濃縮して、未精製１，１−ジメチルエチルＮ−［４−（２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブチル］カルバメート３４．５ｇを茶色のシロップとして得た。
【００５０】
パートＤ
窒素雰囲気下において、１，１−ジメチルエチルＮ−［４−（２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブチル］カルバメート（２１．３ｇ、５３．５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２００ｍＬ）溶液に、３−クロロ過安息香酸（＞７７％の３−クロロ過安息香酸１２．８６ｇ）を添加した。その反応混合物を周囲温度で一晩攪拌した。３−クロロ過安息香酸（＞７７％の３−クロロ過安息香酸２００ｍｇ）をさらに添加した。約２時間後、その反応混合物を水、炭酸水素ナトリウム水溶液、水で洗浄し、最後にブラインで洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、次いで窒素下で濃縮して、未精製１−｛４−［（１，１−ジメチルエチルカルボニル）アミノ］ブチル｝−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−５Ｎ−オキシド２２ｇを粘着性のシロップとして得た。
【００５１】
パートＥ
パートＤから得た物質のジクロロメタン（２００ｍＬ）溶液に、濃水酸化アンモニウム（約５０ｍＬ）を添加した。窒素雰囲気下で、その反応混合物を０℃に冷却した。迅速に攪拌しながら、塩化トシル（１０．２ｇ、５３．５ｍｍｏｌ）を１０分間にわたり添加した。氷浴を取り除き、反応混合物を周囲温度で攪拌した。層を分離させた。有機相を１％炭酸ナトリウム（３回）、水およびブラインで洗浄した；硫酸ナトリウムで乾燥させ、次いで真空下で濃縮して、未精製１，１−ジメチルエチルＮ−［４−（４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブチル］カルバメート２０．０ｇをマスタードイエローの固形物として得た。
【００５２】
パートＦ
１，１−ジメチルエチルＮ−［４−（４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブチル］カルバメート（１８．０ｇ）と、塩化水素／エタノール（２Ｍ塩化水素／エタノール４０ｍＬ）との混合物を約７０℃に加熱した。９０分後、塩化水素／エタノール４０ｍＬをさらに添加した。さらに約１時間後、窒素でパージして、余分な塩化水素を除去する間、反応混合物を冷却した。その反応混合物をほぼ乾燥状態まで濃縮した。残留物をジエチルエーテルで粉砕した。その結果得られた固体を濾過により単離し、次いで高真空下で乾燥させて、二塩化水素化物１５．８ｇを薄い茶色の固形物として得た。
【００５３】
その塩の一部（１０ｇ）を水に溶解した。水酸化アンモニウムを添加することによって、その溶液をｐＨ１１に調節し、次いでクロロホルムで数回抽出した。その抽出物を混合し、真空下で濃縮した。残留物をトルエンでスラリー状にし、次いで乾燥状態まで濃縮して、４−（４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブタンアミン６．６ｇを茶色／黄色の固形物として得た。
【００５４】
実施例２−式Ｉの標識化合物の調製
５−｛［（｛４−［４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］ブチル｝アミノ）カルボンチオニル］アミノ｝−２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸
温かいピリジン（２ｍＬ）に溶解した４−（４−アミノ−２−（２−メトキシエチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）ブタンアミン（０．１１ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の溶液を、温かいピリジン（２ｍＬ）に溶解したフルオレセイン−５−イソチオシアネート（０．１３８ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）の溶液にゆっくりと添加した。その反応混合物を周囲温度で一晩保持した。反応混合物をメタノール（１５ｍＬ）でクエンチし、次いで１時間攪拌した。その結果得られた固体を濾過により単離し、沸騰したメタノールでスラリー状にし、次いで乾燥させて、所望の生成物０．１２ｇをオレンジ色の固形物（融点＞２４５°）として得た。薄層クロマトグラフィーおよび高性能液体クロマトグラフィーの両方を用いた分析により、純粋な生成物が示された。分析：Ｃ３８Ｈ３４Ｎ６Ｏ６Ｓの計算値：％Ｃ、６４．９４；％Ｈ、４．８８；％Ｎ、１１．９６；実測値：％Ｃ、６１．３３；％Ｈ、５．０９；％Ｎ、１１．３９。高分解能質量分析：ＴＭ＝７０３．２３３９ダルトン、ＭＭ＝７０３．２３１５ダルトン。
【００５５】
式ＩＶの未標識化合物の調製
２−（４−アミノ−２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）エタンアミン
パートＡ
ｔ−ブチル（Ｎ−２−アミノエチル）カルバメート（５５．０ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（５００ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（６６．８ｇ、０．６６ｍｍｏｌ）に添加した。４−クロロ−３−ニトロキノリン（６８．２ｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。その反応混合物は発熱した。反応混合物を一晩攪拌した。その結果得られた沈殿物を濾過により単離し、水ですすいで、黄色の固形物を得た。濾液を水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、次いで濃縮して、黄色の固形物を得た。固形物の２つのバッチを混合し、ヘキサンでスラリー状にし、濾過し、次いで乾燥させて、１，１−ジメチルエチルＮ−｛２−［（３−ニトロキノリン−４−イル）アミノ］エチル｝カルバメート１０１ｇを黄色の固形物として得た。
【００５６】
パートＢ
トルエン（５００ｍＬ）に溶解した１，１−ジメチルエチルＮ−｛２−［（３−ニトロキノリン−４−イル）アミノ］エチル｝カルバメート（１００ｇ、０．３０ｍｏｌ）のスラリーに、炭素担持白金（１０％白金を１．０ｇ）および硫酸ナトリウム（２ｇ）を添加した。反応容器を水素圧５０ｐｓｉ（３．５Ｋｇ／ｃｍ２）下でＰａｒｒ装置上に周囲温度で一晩置いた。その反応混合物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）濾過助剤の層を通して濾過し、触媒を除去した。真空下で濾液を濃縮して、１，１−ジメチルエチルＮ−｛２−［（３−アミノキノリン−４−イル）アミノ］エチル｝カルバメート７３ｇを暗い金色のオイルとして得た。薄層クロマトグラフィー（シリカゲル；ジクロロメタン中１０％のメタノール）分析によって、その物質が純粋であることが示された。
【００５７】
パートＣ
攪拌しながら、１，１−ジメチルエチルＮ−｛２−［（３−アミノキノリン−４−イル）アミノ］エチル｝カルバメート（１０．０ｇ、３３．１ｍｍｏｌ）の無水トルエン（１００ｍＬ）溶液に、トリメチルオルト吉草酸塩（５．９ｇ、３６．４ｍｍｏｌ）を添加した。その反応混合物を加熱して還流した。トルエン１０ｍＬをＤｅａｎ  Ｓｔａｒｋトラップを用いて除去し、反応混合物を３６時間保持した。トルエンをさらに４０ｍＬ除去し、次いで連続攪拌しながら、反応を室温に冷却した。その結果得られた沈殿物を濾過により単離し、乾燥させて、１，１−ジメチルエチルＮ−［２−（２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）エチル］カルバメート６．２ｇを黄褐色の固形物として得た。薄層クロマトグラフィー（シリカゲル；ジクロロメタン中１０％のメタノール）分析によって、その物質が純粋であることが示された。
【００５８】
パートＤ
激しく攪拌しながら、３−クロロ過安息香酸（６０％３−クロロ過安息香酸５．１５ｇ、１７．９ｍｍｏｌ）を、１，１−ジメチルエチルＮ−［２−（２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）エチル］カルバメート（６．０ｇ、１６．３ｍｍｏｌ）のクロロホルム（６０ｍＬ）溶液に添加した。その反応混合物を周囲温度で一晩保持し、次いで炭酸ナトリウム水溶液（１％炭酸ナトリウム水溶液２５０ｍＬ）でクエンチした。層を分離させた。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させて、次いで真空下で濃縮して、１−｛２−［（１，１−ジメチルエチルカルボニル）アミノ］エチル｝−２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−５Ｎ−オキシド約６．３ｇを黄褐色の泡として得た。
【００５９】
パートＥ
１−｛２−［（１，１−ジメチルエチルカルボニル）アミノ］エチル｝−２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−５Ｎ−オキシド（３９ｇ、１０１ｍｍｏｌ）のクロロホルム（３００ｍＬ）溶液を氷浴中で冷却した。トリクロロアセチルイソシアネート（２１ｇ、１１２ｍｍｏｌ）を攪拌しながら添加した。その反応混合物を周囲温度で一晩保持した。反応混合物を濃水酸化アンモニウム（４０ｍＬ）でクエンチし、次いで周囲温度で４時間攪拌した。水を反応混合物に加えた。層を分離させた。有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させて、次いで真空下で濃縮して、金色のオイルを得た。この物質を９０％イソプロパノールから再結晶化して、１，１−ジメチルエチルＮ−［２−（４−アミノ−２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）エチル］カルバメート３０．２ｇを得た。
【００６０】
パートＦ
１，１−ジメチルエチルＮ−［２−（４−アミノ−２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）エチル］カルバメート（３０．０ｇ、７８．２ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１００ｍＬ）溶液に、攪拌しながらトリフルオロ酢酸（１００ｍＬ）を添加した。その反応混合物を周囲温度で２４時間保持し、次いで真空下で濃縮した。残留物を最小量の水に溶解し、１０％水酸化ナトリウムを用いて、溶液のｐＨをｐＨ１３に調節した。その結果得られた沈殿物を濾過により単離し、高真空下で乾燥させて、２−（４−アミノ−２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）エタンアミン１８．１ｇをオフホワイトの固形物（融点１９６〜１９９℃）として得た。
【００６１】
実施例３−式Ｉの標識化合物の調製
５−｛［（｛２−［４−アミノ−２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］エチル｝アミノ）カルボンチオニル］アミノ｝−２−（６−ヒドロキシ−３−オキソ−３Ｈ−キサンテン−９−イル）安息香酸
フルオレセイン−５−イソチオシアネート（７７８ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）のピリジン（５ｍＬ）溶液を、２−（４−アミノ−２−ブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）エタンアミン（５６６ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）のピリジン（５ｍＬ）溶液に添加した。その反応混合物を還流で３０分間加熱し、次いで水（５０ｍＬ）に注いだ。その結果得られたオレンジ色の固形物を濾過により単離し、高真空下で乾燥させ、次いでピリジンから再結晶化して、オレンジ色の固形物として所望の生成物（融点＞２４５°）０．７６ｇを得た。高性能液体クロマトグラフィーを用いた分析によって、純粋な生成物であることが示された。分析：Ｃ３７Ｈ３２Ｎ６Ｏ５Ｓの計算値：％Ｃ、６６．０６；％Ｈ、４．７９；％Ｎ、１２．４９；実測値：％Ｃ、６３．０３；％Ｈ、４．８９；％Ｎ、１２．５９。高分解能質量分析：ＴＭ＝６７３．２２３３ダルトン、ＭＭ＝６７３．２２５１ダルトン。
【００６２】
上述の試験法２を用いて、サイトカイン生合成を誘導するその能力について、実施例２および３の標識化合物を試験した。その結果を以下の表に示す。表中、「＋」は、示されるサイトカインを、化合物がその特定の濃度で誘導したことを示し、「−」は、示されるサイトカインを、化合物がその特定濃度で誘導しなかったことを示す。
【００６３】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
蛍光色素のみと一緒になってインキュベートされた細胞からの蛍光強度の柱状図プロットである。
【図２】
その標識が、図１のインキュベーションで使用された色素である、本発明の標識化合物でインキュベートされた細胞からの蛍光強度の柱状図プロットである。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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