(57)【要約】白内障の治療又は予防に有用な物質を同定する方法を開示する。また、白内障の形成を促進又は加速する物質を同定する方法も開示する。眼のレンズ、網膜及び／又は黄斑の障害又は疾病を治療又は予防する方法も開示する。より具体的には、本発明は眼のレンズタンパク質の架橋を阻害することにより白内障の治療に有用な薬理学的物質を同定する方法を開示する。該方法は自己酸化性のキヌレニン経路代謝産物と還元しうる酸化還元活性金属源の存在下で標的タンパク質試料の架橋を阻害若しくは促進する物質をスクリーニングする方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
白内障の治療又は予防で用いられる物質を同定する方法であって、該物質が標的タンパク質の架橋の防止又は低減を結果として生ずるものであり、該方法が、
（ａ）還元しうる酸化還元活性金属源を、自己酸化性のキヌレニン経路代謝産物を含む第一標的タンパク質試料に添加する工程、
（ｂ）該第一標的タンパク質試料を、該標的タンパク質を架橋させるのに十分な時間だけ、インキュベートさせる工程、
（ｃ）該還元しうる酸化還元活性金属源を、自己酸化性のキヌレニン経路代謝産物を含む第二標的タンパク質試料に添加する工程であって、該第二試料が薬理学的候補物質をさらに含むものである工程、
（ｄ）該第二試料を該第一試料と同じ時間だけインキュベートさせる工程、
（ｅ）該第一試料及び該第二試料による標的タンパク質の架橋の量を測定する工程、
（ｆ）該第一試料により生じた標的タンパク質の架橋の量を該第二試料により生じた標的タンパク質の架橋の量と比較する工程、
を含むものであり、
これにより、該第一試料と比較して、該第二試料により生じた標的タンパク質の架橋の量の減少が該薬理学的候補物質が白内障の治療又は予防に有用であることを示すものである方法。
【請求項２】
該第一試料及び該第二試料における架橋された標的タンパク質の量が、ウェスタン・ブロッティング、濾過検定、凝集／沈殿、濁度測定、蛍光光度法、分光測光法、及び光学顕微鏡法若しくは光散乱技術と組み合わせたレンズ又は網膜の培養から成る群より選択される方法により測定されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該標的タンパク質がα−クリスタリンである、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該還元しうる酸化還元活性金属源がＣｕ（ＩＩ） を含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該還元しうる酸化還元活性金属源がＦｅ（ＩＩＩ）を含むものである、請求項１記載の方法。
【請求項６】
該自己酸化性のキヌレニン経路代謝産物がｏ−アミノフェノール化合物である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
該ｏ−アミノフェノール化合物が、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、及びキサンツレン酸から成る群より選択されるものである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該ｏ−アミノフェノール化合物が３−ヒドロキシキヌレニンである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該ｏ−アミノフェノール化合物が３−ヒドロキシアントラニル酸である、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
二以上の異なる候補試験物質が標的タンパク質の架橋を変える能力について同時に評価されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
該第一標的タンパク質試料及び第二標的タンパク質試料がＢ領域の紫外線照射下でインキュベートされるものである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物の加齢に伴う白内障を予防又は治療する方法であって、原形質膜を通過でき細胞質に侵入できる疎水性の酸化還元活性遷移金属キレート剤を含む組成物の治療上有効な量を該哺乳動物に投与する工程を含む方法。
【請求項１３】
該キレート剤がクリオキノール又はその誘導体、同族体、類似体、プロドラッグ又は薬学的に許容しうるその塩若しくはエステルである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ある物質が標的タンパク質の架橋を惹起又は加速するか否かを決定する検定方法であって、該標的タンパク質の架橋の増加が潜在的な白内障の形成を示すものであり、該方法が
（ａ）還元しうる酸化還元活性金属源を、自己酸化性のキヌレニン経路代謝産物を含む第一標的タンパク質試料に添加する工程、
（ｂ）該第一標的タンパク質試料を、該標的タンパク質を架橋させるのに十分な時間だけ、インキュベートさせる工程、
（ｃ）該還元しうる酸化還元活性金属源を、自己酸化性のキヌレニン経路代謝産物を含む第二標的タンパク質試料に添加する工程であって該第二試料が薬理学的候補物質をさらに含むものである工程、
（ｄ）該第二試料を該第一試料と同じ時間だけインキュベートする工程、
（ｅ）該第一試料及び該第二試料による標的タンパク質の架橋の量を測定する工程、
（ｆ）該第一試料により生じた標的タンパク質の架橋の量を該第二試料により生じた標的タンパク質の架橋の量と比較する工程、
を含み、
これにより、該第一試料と比較して、該第二試料により生じた標的タンパク質の架橋の量の増加が、該物質が白内障の形成を惹起又は加速しうることを示すものである、検定方法。
【請求項１５】
該第一試料及び該第二試料における架橋された標的タンパク質の量が、ウェスタン・ブロッティング、濾過検定、凝集／沈殿、濁度測定、蛍光光度法、分光測光法、及び光学顕微鏡法若しくは光散乱技術と組み合わせたレンズ又は網膜の培養から成る群より選択される方法により測定されるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該標的タンパク質がα−クリスタリンである、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
該還元しうる酸化還元活性金属源がＣｕ（ＩＩ） を含むものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
該還元しうる酸化還元活性金属源がＦｅ（ＩＩＩ）を含むものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
該自己酸化性のキヌレニン経路代謝産物がｏ−アミノフェノール化合物である、請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
該ｏ−アミノフェノール化合物が、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、及びキサンツレン酸から成る群より選択されるものである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
該ｏ−アミノフェノール化合物が３−ヒドロキシキヌレニンである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
該ｏ−アミノフェノール化合物が３−ヒドロキシアントラニル酸である、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
標的タンパク質の架橋を変える能力について二以上の異なる物質が同時に評価されるものである、請求項１４記載の方法。
【請求項２４】
該第一標的タンパク質試料及び第二標的タンパク質試料がＢ領域の紫外線の照射下でインキュベートされるものである、請求項１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
白内障の治療は米国高齢者医療保障予算で唯一最大の費目であり、一年に５０億ドル以上かかり、約８００万のアメリカ人に影響する。白内障には２０を上回る異なる原因が存在し、該障害の外科治療は有効であるが、現時点ではより保守的な又はより費用のかからない治療の選択肢は無い。その上、世界中の多数の患者がこの障害の外科的治療を利用していない。
【０００２】
アルツハイマー病が冒すと同じ集団の人達を冒す該障害の病因についての明確な理解は欠如している。白内障とアルツハイマー病は、両障害に共通の危険因子である高齢の確率論的結果としての水晶体の銅濃度の上昇により結びつけられうる。幾つかのグループは、銅のレベルが白内障に冒された眼及び白内障のレンズ自体で５０倍の桁で上昇することを観察した（セキック，オー．、Ｂｒ． Ｊ． Ｏｐｔｈａｌ． ８２： １８６−１８８（１９９８））。
【０００３】
白内障の形成（スペクター，エイ．、Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ １０６： ４８−６２（１９８４））、黄斑変性及び網膜色素変性に至る生化学的事象のカスケードにおいて酸化過程が重要な役割を果たすことを示唆する証拠が相当量蓄積している。これらの酸化過程は細胞損傷の最終結果、即ち「下流」の最終共通生化学経路である。酸化還元に活性な金属（以下、「酸化還元活性金属」ともいう）（銅及び鉄など）及び酸素が関与する化学反応は、眼を含む生きている組織のほとんどの細胞に有毒であることが知られている遊離基種を生ずる。これらの化学反応の最終産物は、反応性酸素種（ＲＯＳ）として知られ、過酸化水素、スーパーオキシド・アニオン、一重項酸素、及び極めて反応性であり且つ有毒なヒドロキシル・ラジカルを含む。ＲＯＳは、細胞タンパク質、核酸、脂質膜、及び他の必須細胞構成要素と有毒に相互作用し、架橋及び／又は分解を結果として生じ、最終的に細胞の損傷及び死に至らしめることが知られている。これらの過程の結果として、このように冒された組織の機能的完全性は損なわれる。ＲＯＳへの暴露の耐用時間の経過につれて、生物系は劣化し、最終的に変性又は明白な病気の状態に至る。
【０００４】
白内障において、長命の水晶体のクリスタリン・タンパク質は、翻訳後の化学修飾（例えば、とりわけ、プロテアーゼ分解による断片化、グリケーション（ｇｌｙｃａｔｉｏｎ）、アミノ酸のラセミ化、ジスルフィド及び共有結合による架橋、カルボニル化、及びメチオニンの酸化）を蓄積し、該レンズ内、具体的には該細胞質ゾル内に高分子量タンパク質が架橋した凝集体を形成する。これらの変化の多くはＲＯＳへの暴露の直接的結果である疑いがあり、タンパク質のコンフォメーションに深刻な変化をもたらしうる。従って、白内障発生の間、α−クリスタリンは透明なレンズに見出される可溶性タンパク質から有色不溶性の高度に架橋された凝集体へとコンフォメーションの移行を受ける（チェン，ワイ．シイ．ら、Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ６５： ８３５−８４０（１９９７）；ハーディング，ジェイ．ジェイ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １２９： ９７−１００（１９７２）；ハーディング，ジェイ．ジェイ．、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． ９： １０−１３（１９９８）；ディレイ，ケイ．ジェイ．とピリイ，エイ．、Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． １９： ５９−７２（１９７４））。
【０００５】
クリスタリン・タンパク質は該レンズ内部の繊維細胞におけるタンパク質除去機構の処理を受けにくいため、修飾され且つ凝集したクリスタリン・タンパク質の塊は次第に無秩序な様式で蓄積し（「濃縮する」−ベネデック，ジイ．ビイ．、Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ３８： １９１１−１９２１（１９９７））、一人の卓越した研究者はアルツハイマー病、鎌状赤血球貧血、及びクロイツフェルト−ヤコブ病などのコンフォメーション上の病気（カレル，アール．ダブリュ．とロマス，ディ．エイ．、Ｌａｎｃｅｔ ３５０： １３４−１３８（１９９７））の枠組み内に白内障を位置づける（ハーディング，ジェイ．Ｊ． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． ９： １０−１３（１９９８） ）。この酸化で生じるタンパク質の架橋及び凝集はレンズの進行性混濁（白内障の必須条件）を結果として生じ、網膜への光透過率が低下し、該レンズ自体内で光散乱が増大する。これらの過程の併発により、失明に至る。
【０００６】
酸化過程が白内障発生に関与することを示唆する証拠は、白内障眼の房水における過酸化水素のレベルの増大、高齢で且つ白内障のレンズにおけるマロニドアルデヒドなどの脂質過酸化反応マーカーの増大、及び白内障のレンズにおける酸化防止剤の減少を証明する臨床的証拠（ビュヤン，ケイ．シイ．ら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ３８： １４６３−１４７１（１９８６）；ミシェリ−フェラリ，ティ．ら、Ｂｒ． Ｊ． Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ． ８０： ８４０−８４３（１９９６）；スペクター，エイ．Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ １０６： ４８−６４（１９８４）；ラマチャンドラン，エスら、Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ５３： ５０３−５０６（１９９１））と一致している。上述したように、多数の研究は白内障のレンズで総銅量のレベルが上昇することも証明した（セキック，オー．、Ｂｒ． Ｊ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． ８２： １８６−１８８（１９９８）；バラジ，エム．ら、Ｂｒ． Ｊ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． ７６： ６６８−６６９（１９９２）；ラシ，ブイ．ら、Ａｎｎ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． ２４： ４５９−４６４（１９９２）；スリヴァスタヴァ，ブイ．ケイ．ら、Ａｃｔａ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．（Ｃｏｐｅｎｈ．） ７０： ８３９−８４１（１９９２）；ラクツ，ピイ．とエルドヘルイ，エイ．、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ． Ｒｅｓ． ２０： １０−１３（１９８８）；コック，シイ．エス．とマックガハン，エム．シイ．、Ｃｕｒｒ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ５： ６９−７６（１９８６）；ナス，アール．ら、Ｉｎｄｉａｎ Ｊ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． ７： ２５−２６（１９６９）；スリヴァスタヴァ，ブイ．ケイ．ら、Ａｃｔａ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．、７０： ８３９−８４１（１９９２）；オバラ，ワイ．、Ｎｉｐｐｏｎ Ｇａｎｋａ Ｇａｋｋａｉ Ｚａｓｓｈｉ、９９：１３０３−１３４１（１９９５））。この発見は、Ｃｕ（ＩＩ）が過酸化水素及びスーパーオキシドなどの潜在的に有害なＲＯＳを形成する際の共因子であるので、重要である。ＲＯＳは他の系（例えばアルツハイマー病のＡβ１−４２タンパク質）で注目されているようにタンパク質の凝集を促進しうる（フアング，エックス．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３８： ７６０９−７６１６（１９９９））。さらに、グルタチオン・レダクターゼ、グルタチオン・ペルオキシダーゼ及びスーパーオキシド・ジスムターゼなどの抗酸化的防御酵素のレベルの低下、並びに総グルタチオン量の減少及び酸化型グルタチオンの対応する増加が観察されてきた（ロガース，ケイ．エム．とアウグステン，アール．シイ．、Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ２７： ７１９−７２１（１９７８）；フェコンド，ジェイ．ブイ．とアウグステン，アール．シイ．、Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ３６： １５−２３（１９８３）；ビュヤン，ケイ．シイら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ３８： １４６３−１４７１（１９８６））。
【０００７】
白内障の形成を遅らす上でのビタミンＡ、ビタミンＣ及びビタミンＥなどの酸化防止剤の臨床効果はこの障害における酸化機構の示唆的証拠をさらに提供する（ブラウン，エヌ．エイ．ピイ．ら、Ｅｙｅ １２：１２７−１３３（１９９８）；ビーベ，ディ．シイ．、Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ．、３９：１５３１−１５３４（１９９８））。その上、アスコルビン酸塩、ビタミンＥ及びピルビン酸塩などの酸化防止剤はマウスでの白内障形成を防止することが示された（シャムブフ，ディ．ブイ．、Ａｍ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ． ５３： ３３５Ｓ−３４５Ｓ（１９９１））。
【０００８】
酸化還元に活性な遷移金属は、ハンチントン病（レイノルドら、Ｌａｎｃｅｔ ２：９７９−９８０（１９８９）；ピアーソンら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ． １４４：１９９−２０１（１９９２））、パーキンソン病（オガワら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４２：１７０２−１７０６（１９９２））、ＨＩＶ脳症（サルデルら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６４：９３２−９３５（１９９５））、脳マラリア（サンニら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５２：６１１−６１９（１９９８））、及び母子寛容（サンニら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１１９１−１１９３（１９９８））などの幾つかの障害に関わる有害な酸化過程に関与する。白内障発生における酸化還元活性金属の考えられる意義は、銅又は鉄などの遷移金属を含む眼内異物の導入の後での急速な白内障形成という周知の臨床的観察により浮き彫りにされる。
【０００９】
こうして、白内障の形成及び進行に関与する種々の過程を阻害又は中断させる治療用物質を見出す必要がある。白内障の形成に導く酸化反応や関連する架橋反応を中断させる能力について又はこのような白内障を惹起する反応による失明の進行を遅らせる又は滞らせる分子を発見するために多数の既存化合物及びまだ創出されていない化合物をスクリーニングするために用いられうる検定方法が必要である。
【００１０】
発明の概要
本発明は、白内障の予防及び／又は治療で用いられる潜在的な薬理学的物質を同定する方法並びに白内障の形成を偶然促進又は加速しうる物質を同定する方法を記載する。
【００１１】
より具体的には、本発明は白内障の治療又は予防で用いられる薬理学的物質を同定する方法であって、該物質が標的タンパク質の架橋の低減又は防止のいずれかを結果として生ずるものであり、該方法が、
（ａ）還元しうる酸化還元活性金属源を、自己酸化性のキヌレニン経路の代謝産物を含む第一標的タンパク質試料に添加する工程、
（ｂ）該第一標的タンパク質試料を、該標的タンパク質を架橋させるのに十分な時間だけ、インキュベートさせる工程、
（ｃ）該還元しうる酸化還元活性金属源を、自己酸化性のキヌレニン経路の代謝産物を含む第二標的タンパク質試料に添加する工程であって、該第二試料が薬理学的候補物質をさらに含むものである工程、
（ｄ）該第二試料を該第一試料と同じ時間だけインキュベートさせる工程、
（ｅ）該第一試料及び該第二試料による標的タンパク質の架橋の量を測定する工程、
（ｆ）該第一試料により生じた標的タンパク質の架橋の量を該第二試料により生じた標的タンパク質の架橋の量と比較する工程、
を含むものであり、
これにより、該第一試料と比較して、該第二試料により生じた標的タンパク質の架橋の量の減少が該薬理学的候補物質が白内障の治療又は予防に有用であることを示すものである方法を記載する。
【００１２】
該第一試料及び該第二試料における架橋された標的タンパク質の量は、架橋タンパク質を測定するのに適した任意の方法により測定されうる。該第一試料及び該第二試料における架橋された標的タンパク質の量を測定する好ましい方法は、ウェスタン・ブロッティング、濾過検定、凝集／沈殿、濁度測定、蛍光光度法、分光測光法、及び光学顕微鏡法若しくは光散乱技術と組み合わせたレンズ又は網膜の培養から成る群より選択される。架橋できるタンパク質はいずれも本発明の検定で該標的タンパク質として用いられうる。好ましい標的タンパク質はα−クリスタリンであり、好ましい還元しうる酸化還元活性金属源はＣｕ（ＩＩ）及び／又はＦｅ（ＩＩＩ）を含む。好ましい自己酸化性のキヌレニン経路の代謝産物は、３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）、３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）、キサンツレン酸（ＸＡ）又は他のアミノフェノール化合物から成る群より選択されるｏ−アミノフェノール化合物である。
【００１３】
本発明の一実施態様では、二つ以上の異なる試験候補物質を標的タンパク質の架橋を改変する能力について同時に評価する。
【００１４】
本発明の他の実施態様では、該標的タンパク質試料をＢ領域の紫外線照射下でインキュベートする。
【００１５】
本発明の別の一実施態様においては、該検定方法は物質が標的タンパク質の架橋を惹起又は加速するか否かを決定するために用いられうる。このような方法において、該標的タンパク質の架橋の増加は白内障の形成を惹起又は加速する潜在能力を示している。この方法は、
（ａ）還元しうる酸化還元活性金属源を、自己酸化性のキヌレニン経路の代謝産物を含む第一標的タンパク質試料に添加する工程、
（ｂ）該第一標的タンパク質試料を、該標的タンパク質を架橋させるのに十分な時間だけ、インキュベートさせる工程、
（ｃ）該還元しうる酸化還元活性金属源を、自己酸化性のキヌレニン経路の代謝産物を含む第二標的タンパク質試料に添加する工程であって該第二試料が薬理学的候補物質をさらに含むものである工程、
（ｄ）該第二試料を該第一試料と同じ時間だけインキュベートする工程、
（ｅ）該第一試料及び該第二試料による標的タンパク質の架橋の量を測定する工程、
（ｆ）該第一試料により生じた標的タンパク質の架橋の量を該第二試料により生じた標的タンパク質の架橋の量と比較する工程、
を含み、
これにより、該第一試料と比較して、該第二試料により生じた標的タンパク質の架橋の量の増加が、該物質が白内障の形成を惹起又は加速しうることを示している。
【００１６】
該第一試料及び該第二試料における架橋された標的タンパク質の量は、標的タンパク質分子の混合物の中で架橋を形成する該標的タンパク質の能力により部分的に測定される。
【００１７】
架橋の増加又は減少を測定する検定方法は、未架橋の標的タンパク質から架橋された標的タンパク質を分離できる検定法の使用が前提となる。標的タンパク質の架橋を測定する好ましい検定方法は、ウェスタン・ブロッティング、濾過検定、凝集／沈殿、濁度測定、蛍光光度法、分光測光法、及び光学顕微鏡法若しくは光散乱技術と組み合わせたレンズ又は網膜の培養から成る群より選択される。好ましい標的タンパク質はα−クリスタリンであり、好ましい還元しうる酸化還元活性金属源はＣｕ（ＩＩ）及び／又はＦｅ（ＩＩＩ）を含む。好ましい自己酸化性のキヌレニン経路の代謝産物は、３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、及びキサンツレン酸又は他のアミノフェノール化合物から成る群より選択されるｏ−アミノフェノール化合物である。
【００１８】
本発明の一実施態様においては、二つ以上の異なる試験候補物質を標的タンパク質の架橋を改変する能力について同時に評価する。
【００１９】
本発明の別の一実施態様においては、該標的タンパク質試料をＢ領域の紫外線照射下でインキュベートする。
【００２０】
従って、本発明の検定方法は哺乳動物で白内障を促進するその性向について任意の化合物を評価するために用いられうる。白内障を促進する化合物の能力についての知見により、医薬組成物、環境汚染物質、化粧品、化学製品、放射線などの危険な用量レベルを確立することができる。
【００２１】
本発明の他の実施態様においては、本発明の検定方法は、哺乳動物における加齢に伴う白内障などの眼のレンズ、網膜及び／又は黄斑（ｍａｃｕｌａ） の損傷又は病気を予防又は治療する際に有用な医薬物質としての適性について酸化還元に活性な遷移金属キレート剤を評価するために用いられうる。該酸化還元に活性な遷移金属キレート剤は次に治療に有効な量で哺乳動物に投与されうる。好ましい該酸化還元に活性な遷移金属キレート剤は、バソキュプロイン（ｂａｔｈｏｃｕｐｒｏｉｎｅ）、バソフェナンスロリン（ｂａｔｈｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ）、トリエチレンテトラミン、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ペニシラミン、クリオキノール、デスフェロキサミン（ｄｅｓｆｅｒｒｏｘａｍｉｎｅ）、及びそれらの誘導体、同族体、類似体、プロドラッグ又は薬学的に許容しうる塩若しくはエステルから成る群より選択される。中でも最も好ましい酸化還元に活性な遷移金属キレート剤は、クリオキノールなどの原形質膜を横切り細胞質ゾルに浸入し得る疎水性、即ち親油性のキレート剤、又はその誘導体、同族体、類似体、プロドラッグ又は薬学的に許容しうる塩若しくはエステルである。
【００２２】
好ましい実施態様の詳細な説明
定義
下記の記載において、幾つかの用語は頻繁に使用される。本明細書及び請求の範囲（このような用語が与えられる範囲を含む）の明瞭且つ一貫した理解を与えるために、下記の定義が提供される。
【００２３】
キレート剤：金属イオンと複合体を形成する際に関与し且つ金属に競合して結合する能力について一般的に当分野で周知である二つ以上の極性基により特徴付けられる金属結合分子、並びにある種の抗生物質などの、金属に特異的に又は非特異的に結合できる大分子及び小分子。
【００２４】
α−クリスタリン・タンパク質：大よその単量体分子量が２０，０００ダルトンのレンズタンパク質単量体、精製されたクリスタリン。該α−クリスタリンのレンズタンパク質は、種間で変動するモル比において二つの亜種であるαＡ（ａａ：１７３；ＭＷ１９，９０９ｄ）及びαＢ（ａａ：１７５；ＭＷ２０，１５９ｄ）から構成される（アウグステン，アール．シイ．、及びコレッツ，ジェイ．エフ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２２２：１−５（１９８７））。これらのタンパク質はシャペロン及びタンパク質界面活性剤的機能を示す（ホルヴィッツ，ジェイ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０４４９−１０４５３（１９９２）；カルベール，ジェイ．エイ．ら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １２０４： １９５−２０６（１９９４））。αＡ−クリスタリンは眼のレンズで主に見出され、一方、αＢ−クリスタリンは、心臓、筋肉及び脳を含むレンズ外の組織でも見出され（ブハット，エス．ピイ．ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０２： ７７５−７８１（１９９１））、相同性を共有し、熱ショックタンパク質として機能する（グロエネン，ピイ．ジェイ．ら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２５： １−１９（１９９４））。
【００２５】
錯化剤：Ｃｕ＋又はＦｅ２＋の指示薬として用いられる場合、特徴的な分光学的スペクトルをもつ分子。それらの個々のイオンに特異的に結合した後、既知の特定の波長で周知の吸収を示すことにより、それらのイオンと錯体形成した錯化剤の測定は還元型の銅イオン及び鉄イオンの形成を定量する容易な方法を提供する。Ｃｕ＋用のバソキュプロインジスルホン酸（ＢＣ）アニオン及びＦｅ２＋用のバソフェナンスロリンジスルホン酸（ＢＰ）アニオンが銅イオン及び鉄イオンの存在をそれぞれ測定するために好ましい錯化剤である。
【００２６】
キヌレニン経路
多種多様な知見の集まりから、様々な病的作用において、トリプトファン代謝産物がキヌレニン経路を通って生成したことが示されている。例えば、キヌレニン経路の活性化は、ハンチングトン病（レイノルド，ジイ．ビイ．とピアソン，エス．ジェイ．、Ｌａｎｃｅｔ ２：９７９−９８０（１９８９）；ピアソン，エス．ジェイら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． Ｌｅｔｔ． １４４：１９９−２０１（１９９２））、パーキンソン病（オガワ，ティ．ら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ４２：１７０２−１７０６（１９９２））、ＨＩＶ脳症（サルダー，エイ．エムら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６４： ９３２−９３５（１９９５））、脳マラリア（サンニ，エル．エイ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５２：６１１−６１９（１９９８））、多発性硬化症の動物モデル（フラナガン，イー．エム．ら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６４：１１９２−１１９６（１９９５））、母子寛容（ムン，ディ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１：１１９１−１１９３（１９９８））、灰白髄炎（ヘイエス，エム．ピイ．ら、Ｂｒａｉｎ １１６：１４２５−１４５０（１９９３）；ヘイエス，エム．ピイ．ら、Ｆａｓｅｂ． Ｊ． ６： ２９７７−２９８９（１９９２））、及びウイルス性肺炎（ヨシダ，アールら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１２５５３−１２５５８（１９９６））などの障害で観察される。
【００２７】
キヌレニン経路の代謝産物の二つである、オルト−アミノフェノール化合物の３−ヒドロキシキヌレニン（３−ＨＫ）及び３−ヒドロキシアントラニル酸（３−ＨＡＡ）はニューロンの初代培養においてアポトーシス特性をもつ神経毒である（オクダ，エス．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１２５５３−１２５５８（１９９６）；オクダ，エス．ら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ７０：２９９−３０７（１９９８））。
【００２８】
キヌレニン経路の代謝産物及びそれらのｏ−β−Ｄグルコシド誘導体は眼のレンズ（及び網膜）で見出される。このキヌレニン経路は前皮質上皮細胞において構成的に活性である（ヴァン・ヘイニンゲン，アール．、Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． １５：１２１−１２６（１９７３）；フッド，ビイ．ディ．ら、Ｊ． ｏｆ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４： ３２５４７−３２５５０（１９９９）；チアルギ，エイ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４５３：１９７−２００（１９９９）；ウッド，エイ．エム．ら、Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ５６：３１７−３２５（１９９３）；バンドウ，エムら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（東京）８９：１０３−１０９（１９８１）；スタルケバウム，ジイ．とハルラン，ジェイ．エム．、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７７：１３７０−１３７６（１９８６））。具体的には、３−ＨＫ及びその酸化産物は水晶体のクリスタリンタンパク質のリジン残基と相互作用する（スツッチブリー，ジイ．エム．とトルスコット，アール．ジェイ．ダブリュ．、Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． １０：７−１３ （１９９３））。レンズの天然構成要素として、３−ＨＫは３６５ｎｍで最大吸収する眼の短波紫外線光フィルタとして機能しうる（ヴァン・ヘイニンゲン，アール．、Ｎａｔｕｒｅ ２３０：３９３−３９４（１９７１）；ウッド，エイ．エム．とトルスコット，アール．ジェイ．、Ｖｉｓｉｏｎ Ｒｅｓ． ３４：１３６９−１３７４（１９９４））。霊長類のレンズではそれは約５μＭの濃度で存在する（チアルギ，エイ．ら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４５３：１９７−２００（１９９９）；ウッド，エイ．エム．ら、Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ５６：３１７−３２５（１９９３）；バンドウ，エム．ら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （東京）８９：１０３−１０９（１９８１））。しかしながら、最近の研究は水晶体のタンパク質に結合する３−ＨＫグルコシドの量が年齢と共に増加することを証明した（アクイリナ，ジェイ．エイ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３８：１１４５５−１１４６４（１９９９））。
【００２９】
水晶体上皮で生産される３−ＨＫは代謝不活性なレンズ本体を通って拡散し最終的に硝子体液に流出する。その上、３−ＨＫは、白内障レンズのブルネッセント色の原因となりうる（スツッチブリー，ジイ．エム．とトルスコット，アール．ジェイ．、Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ５７：１４９−１５５（１９９３））且つ白内障発生の間クリスタリンタンパク質の高分子量に重合された凝集体の形成に重要な役割を果たしうるタンパク質凝集体の形成を促進することが示された。
【００３０】
白内障形成のインビトロ・モデルにおける該キヌレニン経路の代謝産物と酸化還元活性金属及びα−クリスタリンとの相互作用が調べられた。実施例で論じられるように、該ｏ−アミノフェノール代謝産物の３−ＨＫ、３−ＨＡＡ及びＸＡは酸化還元活性金属を強力に還元し且つ暗闇でＵＶ照射の下に反応性酸素種（とりわけ過酸化水素）を生成することが示された（しかし、キノリン酸及び非フェノール性キヌレニン異化産物のキヌレニン及びアントラニル酸は反応性酸素種の生成を示さなかった）。３−ＨＫが３−ＨＡＡと異なり銅依存性の様式でスーパーオキシドを生成しなかったことを除いて、これらの反応性酸素種の生成は金属依存性であることが示された。さらに、３−ＨＫ及び３−ＨＡＡの両方はαＢ−クリスタリンのＣｕ（ＩＩ）依存性架橋を増強した。
【００３１】
α−クリスタリン、３−ＨＫ、Ｃｕ（ＩＩ）、及びＦｅ（ＩＩＩ）の間の相互作用を探究する際に、３−ＨＫがＣｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）へ強力に還元することを発見した。３−ＨＫはＦｅ（ＩＩＩ）を還元しない。しかしながら、暗闇で３−ＨＫ又は３−ＨＡＡで修飾された後のα−クリスタリンは、Ｃｕ（ＩＩ）及びＦｅ（ＩＩＩ）を還元し過酸化水素を形成する能力が増強された。アスコルビン酸塩により修飾されたα−クリスタリンはこの性質を共有しなかった。同様に、長波紫外線照明の存在下においてα−クリスタリンをキヌレニン、３−ＨＫ及び３−ＨＡＡに暴露することにより、改変されたタンパク質の金属を還元し過酸化水素を生成する能力が劇的に増強された。また、アスコルビン酸塩により修飾されたα−クリスタリンはこの性質を共有しなかった。
【００３２】
Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元した後、３−ＨＫは酸素を補充しＨ２Ｏ２、Ｏ２及びＯＨ・を形成する。３−ＨＫは、α−クリスタリン上に共有結合付加物を形成し、このように行った後に、このタンパク質のＣｕ媒介によるＲＯＳ生成能力を増強する。仮定されたα−クリスタリンの一時的なラジカル化により、容易に観察される該タンパク質の架橋、ＳＤＳ耐性の凝集、及び断片化が生ずる（３−ＨＫは白内障レンズでα−クリスタリンと高濃度で共凝集することが見出される）。この反応は白内障形成の主要な危険因子である金属キレート化及び紫外線光により強力に増強される。以前には知られていなかったこの反応系列は白内障の形成に関与する可能性がある。
【００３３】
該実施例から作成されるデータは、３−ＨＫ及び３−ＨＡＡの両方がＣｕ（ＩＩ）及び分子状酸素と反応し過酸化水素を生産することを証明するが、３−ＨＫのみがスーパーオキシド中間体を生産することなくＣｕ（ＩＩ）から複数の電子伝達により過酸化水素を形成できる。同様に、アルツハイマー病において、ＡβペプチドはＣｕ（ＩＩ）から分子状酸素への二電子伝達を行い過酸化水素を形成する。３−ＨＫ及び３−ＨＡＡの両方は利用できるＣｕ（ＩＩ）より約３倍以上の過酸化水素を生成するため、該銅は酸化状態と還元状態の間を循環し複数の電子伝達を可能にしている可能性がある。
【００３４】
実施例からのデータは、準化学量論的Ｃｕ（ＩＩ）の存在下で、３−ＨＫ及び３−ＨＡＡが、還元型の酸化還元活性金属イオン及び過酸化水素、即ち、結合すると、フェントン型化学により極めて反応的なヒドロキシル・ラジカルを形成できるであろう産物、を同時に形成することをさらに示す。しかしながら、チオバルビツール酸に反応する物質（ＴＢＡＲＳ）検定を用いたヒドロキシ・ラジカル形成の証拠は得ることができなかった。同様に、ジメチルスルホキシド、サリチル酸塩又はマンニトールなどのヒドロキシル・ラジカル捕捉剤による３−ＨＫ及び３−ＨＡＡが誘導するαＢ−クリスタリン架橋の抑制の証拠も得られなかった。カタラーゼを用いて過酸化水素レベルの低減によるαＢ−クリスタリン架橋の抑制についての証拠も得られなかった。これらの知見はαＢ−クリスタリンの凝集におけるヒドロキシル・ラジカルの役割を支持しないが、この極めて反応性に富む種は実施例で用いられる検定において検出を免れうるので、ヒドロキシル・ラジカル生成の可能性は結論的に排除できない。例えば、３−ＨＫ及び３−ＨＡＡは、フェントン化学によりヒドロキシル・ラジカルの形成を促進し、３−ＨＫが酸化防止剤の性質を有するという報告と一致しているヒドロキシル・ラジカル攻撃部位として同時に役立ちうる（即ち、ヒドロキシル・ラジカル捕捉剤として作用する）（ルスラ，エム．とバラスブラマニアン，ディ．、Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ５５：６４１−６４３（１９９２）；クリステン，エス．ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８７：２５０６−２５１０（１９９０）；ゴシマ，エヌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．１３９：６６６−６７２（１９８６））。他の研究者達はＦｅＣｌ３及びスーパーオキシド・ジスムターゼの存在下における３−ＨＫ及び３−ＨＡＡのＥＳＲスピン捕捉研究でヒドロキシル・ラジカルの生成を観察した（クツネゾヴァ，エル．イー．、Ｎａｔｕｒｅ ２２２：４８４−４８５（１９６９））。ヒドロキシル・ラジカルの生成を惹き起こす同様な機構が、３−ＨＫ及び３−ＨＡＡにより誘導されるＤＮＡの損傷、染色分体の切断及び転座において仮定された（ヒラク，ワイ．ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １６：３４９−３５６（１９９５））。酸化還元に活性な遷移金属イオンとこれらのビシナル・アミノヒドロキシ化合物との反応性は、ドーパミン及び関連するカテコールアミンなどのビシナル・ジヒドロキシ化合物で観察された酸化還元サイクル化学と類似しているかもしれない（ビンドリ，エイ．ら、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． １３：３９１−４０５（１９９２）；レヴェー，ジイら、Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． １４６ ５７０−５７４（１９９７））。
【００３５】
従って、本発明は、キヌレニン経路の幾つかの代謝産物が酸化還元活性金属を還元しそしてクリスタリン・レンズタンパク質の金属依存性重合及び分解を促進するという本発明者らの最近のインビトロでの発見を利用している。酸化還元に活性な３−ＨＫ及び３−ＨＡＡは、酸化還元活性金属との相互作用を通じてα−クリスタリンなどのタンパク質の酸化的損傷における補因子となりうる。該ｏ−アミノフェノール効果の機構は、アニリン・ラジカル又はフェニオキシル・ラジカルの平衡形成、並びに不均化によるキノンイミン構造への酸化（アクイリナ，ジェイ．エイ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３８：１１４５５−１１４６４（１９９９））により又は二量体形成及び／若しくは濃縮によりその後の減衰を含む可能性がある。対応する非フェノール性前駆体と比較したｏ−アミノフェノール代謝産物の３−ＨＫ及び３−ＨＡＡの酸化還元活性の増大という観察は、ｏ−アミノフェノールに由来するラジカルの共鳴安定化によるものでありうる。または、レンズのタンパク質性環境において、ラジカル化されたｏ−アミノフェノール代謝産物は、局部タンパク質（例えばα−クリスタリン）と反応し、タンパク質のラジカル化、付加物の形成、架橋及び断片化に導きうるであろう。
【００３６】
上記のように、白内障において、長寿の水晶体クリスタリンタンパク質は翻訳後化学修飾物を蓄積し細胞質ゾル内で高分子量の架橋タンパク質凝集体を形成する。本発明のスクリーニング検定は試験物質をインビトロのインキュベーション系に添加する工程並びに種々の方法による該タンパク質の架橋及び分解を監視する工程を含む。該タンパク質の架橋及び分解を軽減又は阻止できる物質は白内障の予防又は治療のための候補物質と考えられうる。酸化還元に活性な遷移金属のキレート剤は一つのこのような範疇の物質群を提示する。
【００３７】
白内障の予防及び治療に有用な物質を同定する方法並びに白内障の原因と考えられる物質を評価する方法
一側面において、本発明は、上記の発見を取入れ、白内障の形成に導きうる眼のタンパク質（例えば水晶体のクリスタリン）の機能的改変をもたらす反応を妨げる物質を迅速にスクリーニングするためのインビトロ系を提供する。この系は、１）還元しうる酸化還元活性金属源（例えば水溶性の第二銅化合物又は第二鉄化合物）、２）酸化還元活性金属を強力に還元することが示され且つタンパク質と相互作用することが知られている一つ又は組み合わせのキヌレニン代謝産物（例えば３−ＨＫ、３−ＨＡＡ、ＸＡ又はこれらの化合物の自己酸化的産物のいずれか）、３）標的タンパク質（例えばα−クリスタリン）、及び４）単数又は複数の試験物質、を利用するインビトロのインキュベーションを含む。この反応の強度はＵＶ照射の程度及び酸素分圧を変えることにより変更されうる。白内障の形成（及び／又は反応性酸素種の形成）に特徴的な構造上の変化であるタンパク質の架橋は検定の終点として利用される。
【００３８】
例えば３−ＨＫ又は３−ＨＡＡ及び銅によるα−クリスタリンの架橋は、例えばウェスタン・ブロットにより容易に監視される。従って、本発明の一側面は、上述した経路を妨げ従って白内障の予防又は治療に有用な候補物質を評価するための高処理量に適応できるスクリーニング検定である。ウェスタン・ブロッティング、濾過検定、凝集／沈殿法、濁度測定、蛍光光度法、分光測光法、光学顕微鏡法又は光散乱技術と組み合わせたレンズ又は網膜の培養を含む種々の方法が終点測定用に利用されうる。該タンパク質の架橋を軽減又は阻止できる物質は白内障の予防又は治療のための候補であると考えられる。該検定で評価すべき物質は、白内障患者又は白内障を発症する危険性のありうる人を治療するための潜在的薬物でありうる。
【００３９】
従って、本発明の一側面は白内障の治療又は予防で用いられるべき物質を同定する方法であって、該物質が標的タンパク質の架橋を減少させ又は妨げるものであり、該方法が、
（ａ） 自己酸化性のキヌレニン経路の代謝産物を含む第一標的タンパク質試料に還元しうる酸化還元活性金属源を添加する工程、
（ｂ）該第一標的タンパク質試料を、該標的タンパク質を架橋させるのに十分な時間だけインキュベートする工程、
（ｃ）自己酸化性のキヌレニン経路の代謝産物を含む第二標的タンパク質試料に該還元しうる酸化還元活性金属源を添加する工程であって、該第二試料が薬理学的候補物質をさらに含むものである工程、
（ｄ）該第二試料を該第一試料と同じ時間だけインキュベートする工程、
（ｅ）該第一試料及び該第二試料による標的タンパク質の架橋の量を測定する工程、
（ｆ）該第一試料により生じる標的タンパク質の架橋の量を該第二試料により生じる標的タンパク質の架橋の量と比較する工程
を含むものであり、
これにより、該第一試料と比較して、該第二試料により生じる標的タンパク質の架橋の量の減少が、該薬理学的候補物質が白内障の治療又は予防に有用であることを示すものである方法に関する。
【００４０】
好ましい実施態様において、該標的タンパク質はα−クリスタリンである。
【００４１】
別の好ましい実施態様において、該還元しうる酸化還元活性金属源はＦｅ（ＩＩＩ）を含む。最も好ましくは、該還元しうる酸化還元活性金属源はＣｕ（ＩＩ）を含む。これらの金属イオンはアミノ酸などの小さな配位分子及び他の金属配位分子と組み合わせて用いられうる。
【００４２】
好ましい実施態様において、自己酸化性のキヌレニン経路の代謝産物はｏ−アミノフェノール化合物である。該ｏ−アミノフェノール化合物は３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、及びキサンツレン酸から成る群より選択されるものであることがより好ましい。該ｏ−アミノフェノール化合物は３−ヒドロキシアントラニル酸であることがさらにより好ましい。最も好ましくは、該ｏ−アミノフェノール化合物は３−ヒドロキシキヌレニンであることが最も好ましき。
【００４３】
別の好ましい一実施態様においては、二つ以上の異なる試験候補物質が標的タンパク質の架橋を改変する能力について同時に評価される。
【００４４】
別の好ましい一実施態様においては、該第一標的タンパク質試料及び該第二標的タンパク質試料がＢ領域の紫外線照射下でインキュベートされる。
【００４５】
別の好ましい一実施態様においては、該第一試料及び該第二試料における架橋された標的タンパク質の量が、ウェスタン・ブロッティング、濾過検定、凝集／沈殿、濁度測定、蛍光光度法、分光測光法、及び光学顕微鏡法又は光散乱技術と組み合わせたレンズ又は網膜の培養から成る群より選択される方法により測定される。
【００４６】
本発明の好ましい実施態様においては、酸化還元活性金属は約１〜２５μＭ、好ましくは約２５μＭの最終濃度で存在する。スクリーニングされる試験物質は約１０〜２００μＭの範囲、好ましくは約５０μＭの最終濃度で存在する。キヌレニン経路の代謝産物は約１〜２５μＭ、好ましくは約１０μＭの最終濃度で存在する。同濃度の非ヒドロキシル化代謝産物は陰性対照として代用されうる。該レンズタンパク質は組換えクリスタリンでも精製されたクリスタリンでもよい（約１０〜５０μｇ／ｍｌ）。全レンズタンパク質は約５０〜５００μｇ／ｍｌの最終濃度でありうる。
【００４７】
本発明の他の実施態様において、標的タンパク質の架橋の度合いを検出する方法と同じ検定を用いて、用いられる物質又はヒト若しくは動物の治療で用いられ該環境に放出されるべき物質、又は産業上用いられる物質が検定され評価されうる。白内障を増強し、惹起し又は促進する物質の検出は、このような物質と接触するヒト又は動物を減少させ又は無くするための手段が採られることを可能にし、それにより更に形成される白内障の数及び重症度を低減させる。従って、この検定は潜在的原因としての物質、白内障形成の促進剤及び増強剤を評価するために用いられうる。ここで、該物質は標的タンパク質の架橋を増大又は促進させるものであり、該検定は、
（ａ）自己酸化性のキヌレニン経路の代謝産物を含む第一標的タンパク質試料に還元しうる酸化還元活性金属源を添加する工程、
（ｂ）該第一標的タンパク質試料を、該標的タンパク質を架橋させるのに十分な時間だけインキュベートする工程、
（ｃ）自己酸化性のキヌレニン経路の代謝産物を含む第二標的タンパク質試料に該還元しうる酸化還元活性金属源を添加する工程であって、該第二試料が評価される候補薬物をさらに含むものである工程、
（ｄ）該第二試料を該第一試料と同じ時間だけインキュベートする工程、
（ｅ）該第一試料及び該第二試料による標的タンパク質の架橋の量を測定する工程、
（ｆ）該第一試料により生じる標的タンパク質の架橋の量を該第二試料により生じる標的タンパク質の架橋の量と比較する工程、
を含む。これにより、該第一試料と比較して、該第二試料により生じる標的タンパク質の架橋の量の増加は、試験される該候補物質が白内障の形成を増強又は加速しうることを示している。
【００４８】
好ましい実施態様において、該標的タンパク質はα−クリスタリンである。
【００４９】
好ましい実施態様において、該還元しうる酸化還元活性金属源はＦｅ（ＩＩＩ）を含む。最も好ましくは、該還元しうる酸化還元活性金属源はＣｕ（ＩＩ）を含む。これらの金属イオンはアミノ酸などの小さな配位分子及び他の金属配位分子と組み合わせて用いられうる。
【００５０】
好ましい実施態様において、自己酸化性のキヌレニン経路の代謝産物はｏ−アミノフェノール化合物である。より好ましくは、ｏ−アミノフェノール化合物は３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、及びキサンツレン酸から成る群より選択される。さらにより好ましくは、ｏ−アミノフェノール化合物は３−ヒドロキシアントラニル酸である。最も好ましくは、ｏ−アミノフェノール化合物は３−ヒドロキシキヌレニンである。
【００５１】
他の好ましい実施態様において、二つ以上の異なる試験候補物質は標的タンパク質の架橋を改変する能力について同時に評価される。
【００５２】
他の好ましい実施態様において、該第一標的タンパク質試料及び該第二標的タンパク質試料はＢ領域の紫外線照射下でインキュベートされる。
【００５３】
他の好ましい実施態様において、該第一試料及び該第二試料における架橋された標的タンパク質の量は、ウェスタン・ブロッティング、濾過検定、凝集／沈殿、濁度測定、蛍光光度法、分光測光法、及び光学顕微鏡法又は光散乱技術と組み合わせたレンズ又は網膜の培養から成る群より選択される方法により測定される。
【００５４】
本発明の好ましい実施態様において、酸化還元活性金属は約１〜２５μＭ、好ましくは約２５μＭの最終濃度で存在する。スクリーニングされる試験物質は約１０〜２００μＭの範囲、好ましくは約５０μＭの最終濃度で存在する。キヌレニン経路の代謝産物は約１〜２５μＭ、好ましくは約１０μＭの最終濃度で存在する。同濃度の非ヒドロキシル化代謝産物は陰性対照として代用されうる。該レンズタンパク質は組換えクリスタリンであっても精製されたクリスタリンであってもよい（約１０〜５０μｇ／ｍｌ）。全レンズタンパク質は約５０〜５００μｇ／ｍｌの最終濃度でありうる。
【００５５】
錯化剤
代替的実施態様において、タンパク質試料により生じたＣｕ（Ｉ）は最適な可視吸収波長を有する錯化剤と錯体を形成する。該試料により生じたＣｕ（Ｉ）の量は次に光学的分光測光法又は蛍光光度法を用いて検出される（実施例１及び実施例２を参照）。それらの個々のイオンに特異的に結合することにより、次いで既知の特定波長で周知の吸収を示すことにより、それらの還元型イオンと錯体形成した錯化剤の測定は、還元型の銅イオン及び鉄イオンの形成を定量する容易な方法を提供する。実施例１はこのようなスペクトル分析の背部にある理論を論じる。好ましい実施態様において、生じるＣｕ＋量の測定用に用いられる錯化剤はバソキュプロインジスルホン酸アニオン（ＢＣ）である（実施例２を参照）。錯体のＣｕ＋−ＢＣは約４８３ｎｍの最適可視吸収波長を有する。３−ＨＫ、３−ＨＡＡ又はＸＡは該反応混合物にＣｕ（ＩＩ）を添加したほぼ直後にＨ２Ｏ２及びＣｕ＋を生じる。従って、ＢＣは３−ＨＫ、３−ＨＡＡ又はＸＡの試料にＣｕ（ＩＩ）を添加した直後に該反応物に添加されうる。試料で到達されるべきＢＣ濃度は約１０μＭから約４００μＭであり、より好ましくは約７５μＭから約３００μＭであり、更により好ましくは約１５０μＭから約２７５μＭである。最も好ましい実施態様において、試料で達成されるべきＢＣ濃度は約２００μＭである。無論、当業者は添加されるべきＢＣ濃度をわずかな機械的実験で容易に最適化できる。ビシンコニン酸などの他の錯化剤も同様な方式で使用しうる。
【００５６】
生じたＦｅ（ＩＩ）の量を測定する場合、使用されるべき錯化剤は、例えば、バソフェナンスロリンジスルホン酸（ＢＰ）アニオンである（実施例１及び実施例２を参照）。錯体Ｆｅ２＋−ＢＰは約５３５ｎｍの最適可視吸収波長を有する。３−ＨＫは該反応混合物にＦｅ（ＩＩＩ）を添加したほぼ直後にＨ２Ｏ２及びＦｅ（ＩＩ）を生じる。従って、ＢＰは該３−ＨＫ試料にＦｅ（ＩＩＩ）を添加した直後に該反応物に添加する。試料で到達されるべきＢＰの濃度は約１０μＭから約４００μＭであり、より好ましくは約７５μＭから約３００μＭであり、更により好ましくは約１５０μＭから約２７５μＭである。最も好ましい実施態様において、試料で達成されるべきＢＰの濃度は約２００μＭである。添加されるべきＢＰの濃度はわずかな機械的実験により容易に最適化されうる。例えば、既知濃度の金属イオンに対して、ＢＰなどの錯化剤の量を漸増させながら添加し、吸収スペクトルの読取りが行われる。ＢＰの添加が特徴的波長におけるスペクトル測定値の増加をもはや生じない場合、全ての利用できる還元型金属イオンは錯体を形成している。一般に、僅かに過剰の錯化剤を用いる方が良い。
【００５７】
白内障の治療
本発明の別の一実施態様において、本発明の検定方法は、哺乳動物における加齢に伴う白内障などの、眼のレンズ、網膜及び／又は黄斑の損傷又は病気を予防又は治療する際に有用な医薬物質としての適性を酸化還元活性遷移金属キレート剤について評価するために用いられうる。こうして、別の一実施態様では、本発明は眼のレンズ、網膜及び／又は黄斑の損傷又は病気を治療又は予防する方法であって、キレート剤を含む医薬組成物をその必要性のある哺乳動物に投与する工程を含む方法に関する。
【００５８】
このような損傷の原因には、該網膜、レンズ及び／又は黄斑への外傷、手術、化学物質、光又は他の電磁放射などが含まれるが、これらに限定されない。眼の病気には、加齢及び変性、合併状態の進行、加齢に伴う白内障、黄斑変性、酸素誘導性網膜症、炎症状態、感染などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
酸化還元活性金属イオン及びタンパク質と３−ＨＫ及び３−ＨＡＡとの相互作用は種々の生化学的環境で起きうる。炎症又は感染などの局所アシドーシスの状態の間に、銅及び鉄がタンパク質から遊離し、こうして酸化還元反応及びタンパク質の相互作用に利用される（ハリウェル，ビイ．ら、Ｐｈｙｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄ． Ｂ． Ｂｉｏｌ． Ｓｃｉ． ３１１： ６５９−６７１ （１９８５）； ハリウェル，ビイ．及びグッターリッジ，ジェイ．エム．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２１９ １−１４ （１９８４）；グッターリッジ，ジェイ．エム．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２４５：４１５−４２１ （１９８７））。これらの状態はマクロファージ／単球系統の細胞も活性化する。例えば、キヌレニン代謝経路の律速酵素であるインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼはインターフェロン−γにより誘導される（ヨシダ，アール．ら、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７６：４０８４−４０８６ （１９７９）；テイラー，エム．ダブリュ．とフェング，ジイ．エス．、Ｆａｓｅｂ． Ｊ． ５： ２５１６−２５２２ （１９９１））、これは炎症及び感染の間の因子遊離（ｆａｃｔｏｒ ｒｅｌｅａｓｅ）である。この酵素は活性のためにマクロファージ呼吸バースト中に生じたスーパーオキシド・アニオンを消費する。これらの反応の最終結果は３−ＨＫ及び３−ＨＡＡを含むキヌレニン経路代謝産物の生産増加並びにＲＯＳの形成である。
【００６０】
３−ＨＫ及び３−ＨＡＡによる銅及び鉄の還元並びにＲＯＳの生成並びにその後のタンパク質の損傷は、タンパク質又は感染物質を損傷しそれらの機能的不活性化、分解及び除去を促進することにより感染中の生理的機能に役立ちうる。しかしながら、この経路の不適切な活性化は、重要な宿主タンパク質への酸化的損傷を促進することにより変性状態又は炎症状態に寄与しうる。酸化還元に活性な遷移金属キレート剤は、水晶体のクリスタリンなどのタンパク質の機能的改変をもたらす反応を妨げるのに治療上有効な量で哺乳動物に投与されうる。
【００６１】
好ましい酸化還元活性遷移金属キレート剤は、バソキュプロイン、バソフェナンスロリン、トリエチレンテトラミン、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、ペニシラミン、クリオキノール、デスフェロキサミン、及びそれらの誘導体、同族体、類似体、プロドラッグ又は薬学的に許容しうる塩若しくはエステルから成る群より選択される。中でも最も好ましい酸化還元活性遷移金属キレート剤は、原形質膜を横切り細胞質ゾルに浸入し得る疎水性、即ち親油性のクリオキノールなどのキレート剤、又はその誘導体、同族体、類似体、プロドラッグ又は薬学的に許容しうる塩若しくはエステルである。最も好ましい金属キレート剤はクリオキノールである。クリオキノールは、一日に２回から３回の分割投与で患者の体重１ｋｇ当たり約１．０〜３０ｍｇ、より好ましくは約５〜２０ｍｇ／ｋｇで投与されうるキレート剤である。
【００６２】
投与されるべきキレート剤は植物から実質的に精製された抽出物の形態でありうる。ここで、該キレート剤は有機溶媒を用いて抽出される。
【００６３】
投与される酸化還元活性キレート剤の治療に有効な量は、疾病によって惹起される眼のレンズ、網膜及び／又は黄斑の破壊又は変性を減速させ、損傷後の眼の機能及び生存を促進させ、レンズ、網膜及び／又は黄斑の機能損失の結果として眼のレンズ、網膜及び／又は斑に損傷を負った哺乳動物において視力不足の回復を改善又は緩和し、眼のレンズ、網膜及び／又は黄斑の損傷又は病気の進行として長期にわたって起こる損傷の速度を減少させ、及び／又は毒性物質との接触による損傷又は死からレンズ、網膜及び／又は黄斑を保護するために有効な量を包含する。
【００６４】
該キレート剤は、注射により、大脳内、腹腔内、筋内、心室内、静脈内に投与され、経口的に、局部的に、舌下に、頬に、膣に、直腸に、非経口的に又は眼内に投与される。当業者により理解されるように、該キレート剤が個体に投与される場合、それは、塩、緩衝液、アジュバント、又は組成物の有効性を改良するために望ましい他の物質を含む組成物の状態であってもよい。医薬組成物を調製する際の使用に適した物質の例は、レミングトンの薬剤科学、オゾール，エイ．編、第１８版、１９９０年、マック・パブリッシング社、イーストン、ペンシルバニア州を含む多数の文献で提供される。
【００６５】
非経口投与では、該キレート剤薬を含む調製物は、薬学的に許容しうる滅菌水性溶媒（例えば生理食塩水）、又は非水性溶媒、懸濁液及び乳濁液と組み合わせて、このような治療の必要性のある患者に提供されうる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射可能な有機酸エステルである。水性担体は、水、水−アルコール溶液、リンガー・デキストロース溶液、デキストロースと塩化ナトリウム溶液、ラクトースを含むリンゲル溶液、及び不揮発性油を含む。
【００６６】
注射用途では、滅菌水溶液（水に可溶性の場合）が一般的に用いられ、又は代わりに滅菌注射液を即席調製するための滅菌粉末が用いられうる。該医薬組成物は製造及び保存の条件下で安定でなければならない且つ細菌及び菌類などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。該担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、並びに植物油を含む溶媒又は分散媒体であり得る。微生物の作用の防御は、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより実現され得る。多くの場合、例えば糖類又は塩化ナトリウムなどの等張剤を含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅らせる物質の組成物での使用により実現され得る。
【００６７】
該キレート剤が適切に保護される場合、それは例えば不活性な希釈剤とともに又は同化可能な食用担体とともに経口投与されうる。又はそれらは硬質若しくは軟質のゼラチンカプセルに封入され、錠剤に圧縮され、又は食事で食物とともに直接取り込まれうる。経口治療投与では、該キレート剤は、賦形剤とともに取込まれ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハーなどの剤形で用いられうる。このような組成物及び調製物は少なくとも約１重量％の活性化合物を含むべきである。組成物及び調製物の割合は、無論変更されうるし、便宜上、該単位の重量の約５％から約８０％であればよい。
【００６８】
錠剤、トローチ、ピル、カプセルなどは以下に列挙されるものなどの他の構成要素も含みうる。ゴム、アカシア、コーンスターチ若しくはゼラチンなどの結合剤、第二燐酸カルシウムなどの賦形剤、コーンスターチ、片栗粉、アルギン酸などの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、ショ糖、ラクトース若しくはサッカリンなどの甘味料、並びに／又はペパーミント、冬緑油、又はサクランボの味などの香味料などが添加されうる。投与単位剤形がカプセルの場合、上記の型の物質に加えて、液体担体を含みうる。種々の他の物質を被覆剤として又は投与単位の物理的形態を他の方法で改変するために加えてもよい。例えば、錠剤、ピル、又はカプセルはシェラック、糖類又は両方で被覆されうる。シロップ又はエリキシルは、該キレート剤、甘味料などのショ糖、防腐剤としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素並びにサクランボ又はオレンジの味などの香味料を含みうる。無論、任意の投与単位剤形を調製する際に用いられる材料はいずれも使用量において薬学的に純粋であり且つ実質的に無毒であるべきである。その上、該キレート剤は徐放性の調製物及び製剤に取込まれうる。
【００６９】
薬学的に許容しうる担体及び／又は希釈剤は、ありとあらゆる溶媒、分散溶媒、被覆剤、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのこのような媒体及び物質の使用は当分野で周知である。任意の従来の媒体又は物質が該キレート剤と配合禁忌である場合を除いて、治療用組成物におけるその使用が意図される。
【００７０】
該キレート剤は、損傷が起きた後、病気が発見された後、予期される損傷前、又は起こると予想される病気の発症前に投与されうる。
【００７１】
下記の実施例は、本発明のある種の好ましい実施態様を更に記載するために実例として提供され、特に断らない限り、本発明の制限であることを意図するものではない。
【００７２】
実施例
材料　　金属イオン標準溶液（１０％のＨＮＯ３中１０ｍｇ／ｍｌ）はメリーランド州ガイゼルスバーグのナショナル・インスティチュート・オブ・スタンダード・アンド・テクノロジーから購入した。過酸化水素指示薬の２’，７’−ジクロロフルオレセイン・ジアセテートはオレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブから購入した。全レンズタンパク質は地方の屠殺場から得た仔牛の眼から新たに調製した。組換えのヒトのαＢ−クリスタリンはマサチューセッツ州ボストンのブリガム・アンド・ウィメンズ・ホスピタルのジェイ．リアング博士の寛大な寄贈物であった（サン，ティ．エックス．ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：６２２０−６２２５（１９９７））。αＡ−クリスタリン又はαＢ−クリスタリンのいずれかに対するウサギのポリクローナル抗体はロサンジェルスのカリフォルニア大学のジェイ．ホルヴィッツ博士の寛大な寄贈物であった。他の全ての試薬は、他に明記しない限り、ミズーリ−州セントルイスのシグマ社から購入した。全ての溶液は、ｐＨを７．４に調整され、カルシウム又はマグネシウムを含まない、濾過滅菌した Ｃｈｅｌｅｘ（商標）（Ｃｈｅｌｅｘ （商標）１００樹脂、バイオラッド社、ヘルクレス、カリフォルニア州）で処理されたダルベッコの燐酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ： ＫＣｌ ２．７ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４ １．４ｍＭ、ＮａＣｌ １３７ｍＭ、Ｎａ２ＨＰＯ４ ７．６８ｍＭ）中で調製された。中性の金属イオン溶液中で形成する金属−ヒドロキシ及び金属−オキシの重合体を防ぐためにＣｕ（ＩＩ）−Ｇｌｙ及びＦｅ（ＩＩＩ）−クエン酸塩の保存溶液が用いられた。Ｃｕ（ＩＩ）−グリシン又はＦｅ（ＩＩＩ）−クエン酸塩の金属イオンの通常保存溶液は、１：６のモル比のリガンドで該標準金属イオン保存液を希釈することによりｐＨ７．４のＰＢＳ中で調製された。
【００７３】
該データは、キヌレニンのｏ−アミノフェノール代謝産物がＦｅ（ＩＩＩ）よりもＣｕ（ＩＩ）を強力に還元し、続いてＣｕ−及びＯ２−依存性の過酸化水素生産を生じるが、それらの個々のヒドロキシル化されていない前駆体は生じないことを証明する。α−クリスタリンの存在下において、３−ＨＫ及び３−ＨＡＡの両方はこれもＣｕ依存性であるＳＤＳ耐性重合を促進する。３−ＨＫ及び３−ＨＡＡの両方は、リジン残基を介してクリスタリンなどのレンズタンパク質に直接結合して、全て核性白内障の形成に特徴的な性質である凝集、色素沈着、及び鮮明な青（非トリプトファン）蛍光の発色を生ずることも知られている（ファン・ヘイニンゲン，アール．、Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． １５：１２１−１２６（１９７３）；ウッド，エイ．エム．とトルスコット，アール．ジェイ．、Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ５６： ３１７−３２５（１９９３）；スツッチブリー，ジイ．エム．とトルスコット，アール．ジェイ．、Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ５７：１４９−１５５（１９９３）；ベナベンテ，エム．ジイ．とトルスコット，アール．ジェイ．、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２９０：４５１−４５７ （１９９１））。該データはこのＳＤＳ耐性重合が酸化還元金属に依存性であること、そして３−ＨＫ又は３−ＨＡＡのいずれかで褐色化されたα−クリスタリンは、酸化還元活性金属、とりわけＣｕ（ＩＩ）を還元する能力を増強したことを示す。さらに、全レンズタンパク質又は精製された組換えαＢ−クリスタリンの存在下において、３−ＨＫ及び３−ＨＡＡの両方はＣｕ依存性様式でαＢ−クリスタリンのＳＤＳ−耐性及びβ−メルカプトエタノール−耐性の架橋を促進することが見出された。
【００７４】
ＵＶ光で誘導されたクリスタリンの架橋は３−ＨＫ及び３−ＨＡＡにより増強される（チグラー，ジェイ．エス．ジュニアとゴーセイ，ジェイ．ディ．、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ． Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ． ３３：８６９−８７４（１９８１））。しかしながら、このデータは、Ｃｕ（ＩＩ）が存在する場合、３−ＨＫ及び３−ＨＡＡが暗闇でさえタンパク質の架橋を促進することを示している。実際に、キレート剤の添加が該反応を抑制するため、酸化還元活性金属イオンの存在は該架橋反応の必須条件であるようである。αＢ−クリスタリンの架橋に及ぼす３−ＨＫ及び３−ＨＡＡの効果とは対照的に、これらのキヌレニン代謝産物は仔牛血清アルブミン及びミエリン塩基性タンパク質の減少を促進した（ディケンズ，ジェイ．エイ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３６：２１１−２１７（１９８７）；トルスコット，アール．ジェイ．とマーチン，エフ．、Ｅｘｐ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ． ４９ ９２７−９４０（１９８９））。３−ＨＫ及び３−ＨＡＡで誘導されるタンパク質の酸化における差異は、ｏ−アミノフェノール代謝産物とＣｕ（ＩＩ）が反応する局部のタンパク質微小環境を反映しうる。
【００７５】
生物系における大部分の酸化還元活性金属はタンパク質及び小さな生体分子に結合し遊離の金属イオンとして存在しない。しかしながら、酸化還元活性金属イオンの利用性について論じる二つのシナリオが該レンズにおいて働きうる。第一に、タンパク質に結合した金属イオンは、レンズの核に存在する状態であるアシドーシスにより遊離され得る（マチアス，アール．ティ．ら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９８：１０８５−１１０３（１１９１））。従って、核タンパク質にそれほど強固に結合しない金属イオンは３−ＨＫ及び３−ＨＡＡとの反応により多く利用されうる。第二に、提唱される反応はタンパク質に結合した金属の局部環境で実施されうる。従って、レンズにおける遊離した酸化還元活性金属イオンの増加はこれらの反応が起きるために必須ではないかもしれない。実際に、タンパク質に結合した銅錯体は遊離の銅で観察されるものと同様な幾つかの反応を触媒し得る（マチアス，アール．ティ．ら、Ｊ． Ｇｅｎ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９８：１０８５−１１０３（１９９１）；スタルケバウム，ジイとハルラン，ジェイ．エム．、Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ７７：１３７０−１３７６（１９８６））。これらの機構は互いに排他的でないかもしれない。
【００７６】
本データは加齢に伴う白内障で注目される酸化的損傷に寄与しうる共通の酸化還元生化学と一致している。さらに、本データは、酸化還元活性金属を標的にしたキレート化又は亜鉛などの酸化還元に活性でない金属との置換が加齢に伴う白内障を予防又は治療する際に治療上の潜在能力を有しうることを示唆している。本研究の酸化還元金属反応は他のタンパク質に付加物として付着しうるキヌレニン代謝産物にも適用しうる。
【００７７】
ｏ−アミノフェノール基をもつトリプトファン代謝産物（即ち３−ＨＫ及び３−ＨＡＡ）のみが酸化還元に活性である。ｏ−アミノフェノール効果の機構は、アニリン・ラジカル及びフェノキシ・ラジカルの平衡形成、並びに不均化によるキノンイミン構造への酸化を経た又は二量体形成及び／又は濃縮を経たその後の減衰に関与するようである。または、ラジカル化されたｏ−アミノフェノール代謝産物は、局部タンパク質（例えば該レンズ内のα−クリスタリンなどの構造タンパク質）と反応してタンパク質のラジカル化、付加物の形成、架橋及び断片化に導く。対応する非フェノール性前駆体と比較してｏ−アミノフェノール代謝産物の３−ＨＫ及び３−ＨＡＡの観察された酸化還元活性は、提唱されたｏ−アミノフェノールに由来するラジカルの共鳴安定化に関与するものでありうる。
【００７８】
３−ＨＫ及び３−ＨＡＡは両方とも自己酸化することが知られている。具体的には、３−ＨＡＡは自己酸化し赤色色素のシンナバリン酸（ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｉｃ ａｃｉｄ）を生産し同時にスーパーオキシド・アニオン及び過酸化水素を生産する。他方で、３−ＨＫはＵＶ照射の存在下で褐色発色団のキサントマチン（ｘａｎｔｈｏｍｍａｔｉｎ）に二量体化する。本発見は、準化学量論的Ｃｕ（ＩＩ）の存在下で、３−ＨＫ及び３−ＨＡＡが、還元された金属及び過酸化水素、結合すると、フェントン型化学により極めて反応性のヒドロキシル・ラジカルの形成をもたらしうるであろう産物、を同時に形成することを示している。
【００７９】
実施例１
金属還元検定　　検定は９６穴マイクロタイター・プレート（コスター，ＭＡ）を用いて行った。キヌレニン経路からの試験化合物（１０μＭ）又は陽性対照としてのアスコルビン酸（ＡＳＣ、１０μＭ）を、Ｆｅ（ＩＩＩ）−クエン酸塩（２５μＭ）及びＦｅ（ＩＩ）の指示薬であるバソフェナンスロリン・ジスルホン酸（ＢＰ、２５０μＭ）又はＣｕ（ＩＩ）−グリシン（２５μＭ）及びＣｕ（Ｉ）の指示薬であるバソキュプロイン・ジスルホン酸（ＢＣ）若しくはビシンコニン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ ａｃｉｄ）（ＢＣＡ、２５０μＭ）のいずれかと共に共インキュベートした。インキュベーションはｐＨ７．４のＰＢＳ中暗闇で一時間３７℃でで行った。次いで、吸光度は適切な波長でプレート・リーダー（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ Ｐｌｕｓ、モレキュラー・デバイスズ社、カリフォルニア州）を用いて測定した。Ｆｅ（ＩＩ）−ＢＰ錯体（既知のモル吸光係数、Ｍ５３５＝２２１４０Ｍ−１ｃｍ−１）は５３５ｎｍ、Ｃｕ（Ｉ）−ＢＣ錯体は４８３ｎｍ（Ｍ４８３＝１２２５０Ｍ−１ｃｍ−１）、又はＣｕ（Ｉ）−ＢＣＡ錯体は５６２ｎｍ（Ｍ５６２＝７７００Ｍ−１ｃｍ−１）である。対照試料では、試験化合物の非存在下における該金属イオン及び指示薬からの吸光度並びに金属イオンの存在下で且つ指示薬の非存在下における試験化合物の吸光度が測定された。これらの対照からの吸光度は、試験化合物、金属及び指示薬の存在下で得られるものから推定され正味の吸光度（ΔＡ）を得た。Ｆｅ（ＩＩ）又はＣｕ（Ｉ）の濃度（μＭ）は、Ｃ（μＭ）＝ΔＡ＊１０６／Ｍλの式に従って計算した。
【００８０】
キヌレニン経路（図１）を含む化合物を、Ｆｅ（ＩＩＩ）及びＣｕ（ＩＩ）を還元する能力について検定した（図２Ａ）。オルト−アミノフェノール・キヌレニン代謝産物の３−ＨＫ及び３−ＨＡＡは強力にＣｕ（ＩＩ）（１００％）及びＦｅ（ＩＩＩ）（約５０％）を還元した一方で、ジヒドロキシキナルジン酸・キヌレニン代謝産物のキサンツレン酸（ＸＡ）はＣｕ（ＩＩ）を約４０％還元したがＦｅ（ＩＩＩ）を還元しなかった。高親和性の金属カチオンキレート剤のジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）（２５０μＭ）及び高親和性Ｃｕ（ＩＩ）キレート剤のトリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）（２５０μＭ）は両方とも３−ＨＫ、３−ＨＡＡ及びＸＡによる金属還元を止めた（図２Ｂ）。このことは観察されたシグナルが金属還元によるものであって該活性代謝産物と該指示薬化合物との非特異的相互作用によるものではなかったことを示している。陽性対照のアスコルビン酸（ＡＳＣ）によるＦｅ（ＩＩＩ）及びＣｕ（ＩＩ）の還元もキレート化により止められた。該測定値は該金属イオン及び指示薬化合物によるバックグランドの吸光度について補正された。数値は三回の独立測定についての平均値±ＳＤを表す。それぞれ１０μＭの３−ＨＫ及び３−ＨＡＡは２５μＭのＣｕ（ＩＩ）を還元できた。これは二以上の電子がこれらのトリプトファン代謝産物からＣｕ（ＩＩ）に移動することを示唆している。他のキヌレニン代謝産物（図２Ａ）はＣｕ（ＩＩ）又はＦｅ（ＩＩＩ）のいずれかに無効な還元物質であった。ＢＣは潜在的にＣｕ（ＩＩ）の酸化電位を高めうる（セイレ，エル．エム．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４：１９３３−１９３４（１９９６））ので、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）検定をＣｕ（ＩＩ）の還元を確証するために利用した。試験された物質の還元効率はバソキュプロイン方法により測定された数値と密接に一致することが見出された（図２Ａ）。
【００８１】
実施例２
サイクリック・ボルタンメトリー　　サイクリック・ボルタンメトリーはＥＧ＆ＧＰＡＲポテンショスタット・モデル２７３を用いて環境溶液で室温（２２±２℃）で実施した。該ポテンショスタットはランプ・モードで操作され、０．２５ｍＶ段階の高さの電位階段波形を形成した。Ｃｕ（ＩＩ）は電気活性であるが該代謝産物は電気活性でない＋０．１５Ｖから−０．４Ｖの電位窓を、１００ｍＶ／秒の速度で両方向に走査した。該電流応答は５．３Ｈｚのローパスフィルタを通過した。各走査について最低３サイクルを収集し、電気化学応答の安定性を確実にする。該電気化学電池は０．３２ｃｍ２の活性面積をもつインジウム／酸化スズの作用電極（デルタ・テクノロジーズ社）、白金線補助電極、及びＡｇ／ＡｇＣｌ（１Ｍ ＫＣｌ）参照電極（マイクロエレクトロード社）から構成された。該補助電極及び参照電極の両方は該作用電極に近接した該電池中に配置された。該作用電極は、アルコノックス（〜８ｇ／Ｌ）、９５％エタノール、ミリＱで精製されたＨ２Ｏ（２Ｘ）及びＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で連続的な１０分間の超音波で予め処理した後、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に一晩浸漬した。該ＩＴＯ電極は続いて下記の電位窓（＋０．１５Ｖ⇔−０．４Ｖ、＋０．４Ｖ⇔−０．４Ｖ及び＋１．０Ｖ⇔−０．４Ｖ）のそれぞれで３サイクルＰＢＳ中で連続的に循環させることにより使用直前に「活性化」された。塩化銅（２５μＭ；アライド・ケミカル社）を該Ｃｕ（ＩＩ）源として用いた。バックグランドのボルタモグラムは該キヌレニン経路代謝産物を試験する前にそれぞれの新しい電極で得られた。ＫＹＮ、３−ＨＫ、ＡＮＡ及び３−ＨＡＡのＰＢＳ溶液（各１００μＭ）をＣｕ（ＩＩ）（２５μＭ）の添加及び非添加の下で個別に走査された。各実験には試験化合物が添加されていないＰＢＳ中のＣｕ（ＩＩ）（２５μＭ）の走査も含められた。全ての溶液は調製の数分以内に試験した。各試験は結果の再現性を保証するために反復した。その結果を図３Ａ〜図３Ｄに示す。
【００８２】
図３Ａ〜図３ＤのボルタモグラムはｐＨ７．４のＣｕ（ＩＩ）水溶液中において３−ＨＫ及び３−ＨＡＡをそれらの対応する非フェノール性類似体のキヌレニン（ＫＹＮ）及びアントラニル酸（ＡＮＡ）と比較する。Ｃｕ（ＩＩ）の非存在下における四つの代謝産物化合物のサイクリック・ボルタンメトリーはＰＢＳバックグランドと比べて＋０．１５Ｖから−０．４Ｖの電位窓で有意な酸化還元活性を示さなかった（データは示していない）（各パネルでの走査「ａ」）。＋０．１５Ｖを上回る電位で、該代謝産物は、本明細書でさらに考慮されない反応である直接的な不可逆的酸化を受ける。ＰＢＳ中でのＣｕ（ＩＩ）のサイクリック・ボルタンメトリーは該金属イオンの還元による約−１００ｍＶ での電流応答を得た（各パネルでの走査「ｂ」）。ＫＹＮ又はＡＮＡのいずれかの存在下において、Ｃｕ（ＩＩ）の還元波は概ね影響を受けなかった（ＫＹＮ及びＡＮＡのパネル、走査「ｃ」）が、ＫＹＮは若干僅かな反応性を示すように見える。この結果は、該Ｃｕ（ＩＩ）のほとんどがこれら二つの代謝産物の存在下で依然錯体を形成せず還元に利用できることを示唆している。該Ｃｕ（ＩＩ）の還元波は、３−ＨＫの存在下でほぼ消失し（３−ＨＫのパネル、走査「ｃ」）、３−ＨＡＡの存在下で著しく低減した（３−ＨＡＡのパネル、走査「ｃ」）。
【００８３】
これらの結果は該試験物質と銅の錯体形成により電気化学的に活性なＣｕ（ＩＩ）の除去が起こり、従って、該銅は該電極表面での還元に近づけなくすることを示している。代わりに又は同時に、電気化学的に活性なＣｕ（ＩＩ）の除去は該試験化合物自体によるＣｕ（ＩＩ）の還元により生じ、さらなる還元が該電極で検出され得ないようになるであろう。いずれか又は両方が３−ＨＫ及び３−ＨＡＡの存在下で生じるが、キヌレニン又はアントラニル酸の存在下では生じない。これは、これらのオルト−アミノフェノール・キヌレニン経路代謝産物によるＣｕ（ＩＩ）の還元と一致する発見である（図２）。
【００８４】
実施例３
過酸化水素検定　　過酸化水素についての蛍光検定はジクロロフルオレセイン・ジアセテート（ＤＣＦ）法（モレキュラー・プローブ社、ユージーン、オレゴン州）に基づくものである。１００％エタノール中のＤＣＦ溶液（５ｍＭ）を ０．０１Ｍ ＮａＯＨ の存在下で３０分間ジアセチル化し中和した。次いで、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（２００Ｕ／ｍｌ）を添加し、該ＤＣＦ濃度をＰＢＳで２００μＭに調整した。この反応溶液は、９６穴型プレート（全容量＝３００μＬ／穴）においてｐＨ７．４のＰＢＳ中で実施し、示したように試験化合物（ＫＹＮ、３−ＨＫ、３−ＨＡＡ、ＡＮＡ、又はＡＳＣ、それぞれ１０μＭ）、ジアセチル化ＤＣＦ（２０μＭ）、及びＣｕ（ＩＩ）−グリシン（１μＭ）を含み、３７℃で６０分間インキュベートした。反応は光力学的効果を回避するために暗闇で行った。カタラーゼ（１０００Ｕ／ｍＬ）との共インキュベーションによる該読取りの停止はＨ２Ｏ２の特異性を確立するために用いた。蛍光の読取りは４８５ｎｍの励起フィルタ及び５３０ｎｍの放射フィルタを備えた Ｐａｃｋａｒｄ ＦｌｕｏｒｏＣｏｕｎｔ（商標）蛍光プレートリーダーにより記録された。濃度はＣｈｅｌｅｘ（商標）で処理したＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で試薬用の過酸化水素を用い標準曲線と比較することにより決定した。
【００８５】
反応は、Ｃｕ（ＩＩ）を添加せずに、グリシンと錯体形成したＣｕ（ＩＩ）（１μＭ）を添加して、グリシンと錯体形成したＣｕ（ＩＩ）（１μＭ）及びカタラーゼ（１０００Ｕ／ｍｌ）を添加して、又はグリシンと錯体形成したＣｕ（ＩＩ）（１μＭ）及び銅キレート剤のトリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ、２００μＭ）を添加して行った。その結果は図４Ａ〜図４Ｃに示す。
【００８６】
溶解した分子状酸素（３−ＨＫの場合）又はスーパーオキシド（３−ＨＡＡの場合）の不均化反応への二電子移動のいずれかが過酸化水素の生成を生じうるという仮説がたてられた。アルツハイマー病のＡβ１−４２ペプチド−Ｃｕ錯体（フアング，エックス．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３８：７６０９−７６１６（１９９９））についての最近の観察に基づいて、Ｃｕ（ＩＩ）の存在下における３−ＨＫによる過酸化水素の生産を高い、周囲の、及び低い酸素分圧の条件下で調べた（図４Ａ）。反応は光力学的効果を回避するために暗闇で行った。ごく少量の過酸化水素が、三つの酸素分圧条件（高いＯ２：０．１０μＭのＨ２Ｏ２；周囲のＯ２：０．１１μＭのＨ２Ｏ２；低いＯ２：０．０９μＭのＨ２Ｏ２）の全てでＣｕ（ＩＩ）単独により生産された。３−ＨＫが該インキュベーション溶液に添加された場合は、過酸化水素の生産は高い及び周囲の酸素分圧条件（それぞれ１．８４μＭのＨ２Ｏ２及び１．４９μＭのＨ２Ｏ２）下で著しく増大した。しかしながら、該インキュベーション溶液の酸素分圧が連続的なアルゴン吹き込みにより低下すると、過酸化水素の生産は著しく阻害された（０．３５μＭのＨ２Ｏ２）。このことは、該反応緩衝液に溶解している分子状酸素が過酸化水素生産の基質であることを示している。
【００８７】
次に、過酸化水素生成の時間依存性を３７℃の暗闇で調べた。Ｃｕ（ＩＩ）と反応する３−ＨＫ及び陽性対照のアスコルビン酸塩（ＡＳＣ）の両方による過酸化水素の生成は５時間にわたって継続した（図４Ｂ）。これは３−ＨＫ又はアスコルビン酸塩のいずれも本実験の時間経過の間に消費されないことを示している。銅はこの状況において触媒的に作用し、還元状態（３−ＨＫとの反応により促進される）と酸化状態（分子酸素との反応により促進される）の間を循環しうる。
【００８８】
次に、金属依存性を周囲大気条件下で過酸化水素を生成する能力について３−ＨＫ又は３−ＨＡＡのいずれかをＫＹＮ又はＡＮＡと比較した（図４Ｃ）。微量金属イオンを除去するために Ｃｈｅｌｅｘ（商標）樹脂で処理したＰＢＳを用いた対照条件下において、過酸化水素は生成しなかった。Ｃｕ（ＩＩ）単独（１μＭ）又は非フェノール性代謝産物のＫＹＮ若しくはＡＮＡが Ｃｈｅｌｅｘ（商標）樹脂で処理したＰＢＳに添加された場合、ごく少量（約０．３μＭ）の過酸化水素が生成した。しかしながら、３−ＨＫ又は３−ＨＡＡの添加は著しい過酸化水素の生成（約３μＭ）をもたらし、これは過酸化水素を捕捉する酵素のカタラーゼを添加することにより停止した。Ｃｕ（ＩＩ）と共インキュベートした３−ＨＫ又は３−ＨＡＡによる過酸化水素の生産も銅キレート剤のＴＥＴＡの添加により停止した。これはこの反応の金属依存性を証明する。
【００８９】
二つのフェントン化学基質である過酸化水素及び還元型酸化還元活性金属は３−ＨＫ及び３−ＨＡＡにより生産されるが、ヒドロキシル・ラジカルの証拠はチオバルビツール酸反応性基質検定を用いて検出されなかった（フアング，エックス．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ， ３８：７６０９−７６１６（１９９９））（データは示していない）。この結果は、ＴＢＡＲＳ指示薬化合物と反応する時間を持つ前に該ラジカルが生成部位で消費されうる可能性があるので、３−ＨＫ又は３−ＨＡＡとＣｕ（ＩＩ）の反応によるヒドロキシル・ラジカルの生産の可能性を排除しない。
【００９０】
実施例４
α−クリスタリン架橋の研究　　組換えのヒトαＢ−クリスタリン（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ）又は解剖された仔牛のレンズから得られる新たに調製された全レンズタンパク質（冷たいＰＢＳ、ｐＨ７．４、プロテアーゼ阻害剤のカクテルを添加し、すりガラス組織ホモジナイザーでホモジナイズし、直ちに−８０℃で凍結保存した）の凍結保存部分標本を、２５μｇ／ｍｌ（組換えのαＢ−クリスタリンを含む実験用）又は１００μｇ／ｍｌ（全レンズタンパク質の実験用）の最終濃度に溶解した。３−ＨＫ（１０μＭ）又は他のキヌレニン経路代謝産物（１０μＭ）、Ｃｕ（ＩＩ）−グリシン（１０μＭ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）−クエン酸塩（１０μＭ）、及びトリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ、２００μＭ）を含む種々の溶液を示した組み合わせで添加した。全ての溶液は、最終容量が１．０ｍＬの滅菌ＰＢＳで層流組織培養フード中で無菌状態で調製し、１．５ｍＬの半透明のシリコン処理した滅菌エッペンドルフ・チューブに入れた。溶液は光力学効果を回避するために３７℃の暗闇で５日間インキュベートした。インキュベーション後、全レンズタンパク質溶液の部分標本を、４％のＳＤＳ及び５％のβ−メルカプトエタノールを含む試料緩衝液と混合し、９５℃まで５分間加熱し、１０〜２０％のトリシンゲル（ノベックス社、サンディエゴ、カリフォルニア州）に１μｇ／レーンで充填した。該ゲルを、次に、バイオラッド・トランスビオット・セルを用いてポリビニリデン・ジフルオライド膜に電気ブロッティングし、固定し、ブロッキングした後、ポリクローナルのウサギ抗αＢ−クリスタリン抗体の１：１０００希釈を用いて４℃で一晩探査した。次いで、該ブロットを洗浄し、抗ウサギ・ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ共役体（ピアス社、ロックフォード、イリノイ州）と室温で２時間インキュベートした。化学発光検出は製造業者の取扱説明書に従ってスーパーシグナル・ウルトラ（ピアス社、ロックフォード、イリノイ州）を用いて実施した。組換えのαＢ−クリスタリンを用いた実験では、タンパク質溶液の部分標本を、ＮｕＰＡＧＥ試料緩衝液（ノベックス社、サンディエゴ、カリフォルニア州）及び１０％のβ−メルカプトエタノールを含む試料走行緩衝液と混合し、９５℃まで５分間加熱し、短時間遠心分離した後、ＮｕＰＡＧＥ４〜１２％ビス−トリス・ポリアクリルアミドゲルに３７５ｎｇ／レーンで載せ、製造業者の推薦にしたがって変性３−（Ｎ−モルフォリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）−ＳＤＳ走行緩衝液を用いて電気泳動した。ゲルは製造業者の推奨にしたがって Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｐｌｕｓ（登録商標）（ヘルクレス、カリフォルニア州）を用いて全タンパク質を染色した。その結果は図５、図６Ａ、図６Ｂ及び図７に示す。
【００９１】
３−ＨＫ、過酸化水素及び銅は該レンズにおいてα−クリスタリンと同じ位置に局在化するので、Ｃｕ（ＩＩ）の存在下又は非存在下における仔牛の全レンズタンパク質と３−ＨＫ及び３−ＨＡＡとの相互作用を検討した。これらの実験において、αＢ−クリスタリンの移動はウェスタン・ブロット分析により監視した。該インキュベーションは光力学効果を回避するため暗闇で行った。３−ＨＫを該インキュベーション混合物に添加すると、ＳＤＳ及びβ−メルカプトエタノールに耐性のある見かけの二量体及びより高次のオリゴマーの形成が観察された（図５）。３−ＨＫに誘導されたαＢ−クリスタリン架橋の効果はＣｕ（ＩＩ）（１０μＭ）の存在下で劇的に増強され、銅キレート剤であるＴＥＴＡとの共インキュベーションにより消失した。Ｃｕ（ＩＩ）との３−ＨＫの共インキュベーションにより促進される明白なαＢ−クリスタリン架橋には、単量体タンパク質種の損失及びより小さなタンパク質断片（＜約２０ｋＤ）の生成も付随した。このタンパク質を３−ＨＫ及びＣｕ（ＩＩ）と共インキュベートした場合は、銅キレート剤のＴＥＴＡの添加により、単量体αＢ−クリスタリンの減少が逆転した。該緩衝溶液は、Ｃｈｅｌｅｘ（商標）−１００樹脂による入念な処理の後でさえ、誘導結合高周波プラズマ質量分析により測定されるように、約０．１μＭの全Ｃｕバックグランド夾雑物を依然含んでいたため（データは示していない）、Ｃｕ（ＩＩ）の非添加の下で３−ＨＫを用いて観察される若干の明白な架橋の存在は該インキュベーション溶液に存在する微量のＣｕ（ＩＩ）との相互作用によるものであるかもしれない。
【００９２】
該ウェスタン・ブロットの結果も、非フェノール性３−ＨＫ類似体であるＫＹＮとのインキュベーションがαＢ−クリスタリンの架橋を誘導しないことを示した。これは、該検定において金属還元、スーパーオキシド形成及び過酸化水素生産の活性が欠如していることと一致している。Ｃｕ（ＩＩ）の代わりにＦｅ（ＩＩＩ）が代用された場合、αＢ−クリスタリンの架橋は生じなかった。ウェスタン・ブロットをαＡ−クリスタリンについて探査された場合に同様な結果が得られた（データは示していない）。
【００９３】
図５の観察結果に及ぼす他のレンズタンパク質の影響を排除するために、精製された組換えのヒトαＢ−クリスタリンとのこれらの相互作用が調べられた。３７℃の暗闇で５日間インキュベーションした後、Ｃｕ（ＩＩ）と共インキュベートした場合でさえ、αＢ−クリスタリンは主に単量体として存在した（図６Ａ）。しかしながら、３−ＨＫとインキュベーションした後は、見かけの二量体及びより高次のオリゴマーが観察された（図６Ａ）。Ｃｕ（ＩＩ）及び３−ＨＫと一緒に共インキュベーション後は、単量体及び見かけ二量体のαＢ−クリスタリン種は激減し、顕著な高分子量のスミアが観察された。この効果は銅キレート剤のＴＥＴＡにより実質的に減少した。３−ＨＫ及びＣｕ（ＩＩ）とインキュベートした場合に、ＴＥＴＡの添加は単量体のαＢ−クリスタリンの激減を完全に逆転させた。
【００９４】
３−ＨＡＡとの相互作用は同様な様式のＣｕ（ＩＩ）依存性の見かけオリゴマー形成並びにＴＥＴＡで逆転される単量体の喪失を生じた。電気泳動により観察される産物の質量分析及び銀染色は、ウェスタン・ブロットと合致する共有結合で架橋したオリゴマーの存在を確認した（データは示していない）。種々の濃度のＣｕ（ＩＩ）単独と組換えのαＢ−クリスタリンとのインキュベーションは観察できる明白な架橋又は分解を生じなかった（図７）。
【００９５】
次に、他の標的タンパク質である牛血清アルブミン（ＢＳＡ）（２５μｇ／ｍｌ）の存在下におけるＣｕ（ＩＩ）と３−ＨＫ及び３−ＨＡＡとの相互作用（図６Ｂ）を比較した。３７℃の暗闇で５日間インキュベーションした後、ＢＳＡはＣｕ（ＩＩ）と共インキュベートした場合でさえ主に単量体として存在した（図６Ｂ）。αＢ−クリスタリンの結果と対照的に、３−ＨＫ単独とのインキュベーション後、見かけの二量体及びより高次のオリゴマーは観察されなかった。Ｃｕ（ＩＩ）との３−ＨＫの共インキュベーション後、該単量体は明白な検出できる架橋種の出現なしに激減した。該ＢＳＡ単量体の断片化を示しうる約３０ｋＤから６０ｋＤの間で淡いスミアが検出できた。該タンパク質の激減の効果は銅キレート剤のＴＥＴＡにより停止した。３−ＨＡＡとの相互作用は同様な様式の明白なＣｕ（ＩＩ）依存性タンパク質の激減を生じた。同様な様式のタンパク質の激減はミエリン塩基性タンパク質が標的タンパク質として用いられた場合に観察された（データは示していない）。従って、Ｃｕ（ＩＩ）の存在下において３−ＨＫ及び３−ＨＡＡにより誘導される酸化的架橋は、ＢＳＡ及びミエリン塩基性タンパク質と比較すると、α−クリスタリンに特異的であった。
【００９６】
フェントン化学の基質である過酸化水素及び還元型の酸化還元活性金属は、３−ＨＫ及び３−ＨＡＡにより生成するので、αＢ−クリスタリンの架橋はヒドロキシル・ラジカルの生成により媒介されうるという仮説がたてられた。しかしながら、ＤＭＳＯ、マンニトール、又はサリチル酸塩などのヒドロキシル・ラジカル捕捉剤の存在下における３−ＨＫ又は３−ＨＡＡのいずれか及びＣｕ（ＩＩ）とαＢ−クリスタリンとのインキュベーションはαＢ−クリスタリンの架橋を阻害しなかった（データは示していない）。同様に、カタラーゼもスーパーオキシド・ジスムターゼもＣｕ（ＩＩ）の存在下において３−ＨＫ又は３−ＨＡＡによるαＢ−クリスタリンの架橋を阻害できなかった（データは示していない）。
【００９７】
実施例５
金属還元能についてのクリスタリン・タンパク質の検定における黄褐色の仔牛のレンズのクリスタリンの研究　　仔牛のレンズから得たα−クリスタリン（１０ｍｇ／ｍｌ）を、４℃の暗闇で１２時間ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で３−ＨＫ（１００μＭ）、３−ＨＡＡ（１００μＭ）、又はＡＳＣ（１００μＭ）と反応させることにより修飾した。対照の試料はアスコルビン酸（１００μＭ）とともにインキュベートし又は還元剤を添加せずにインキュベートした。この黄褐色のインキュベーション溶液は該タンパク質の架橋を防止するためトリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ、２００μＭ）も含んでいた。インキュベーション後、遊離の還元剤は、Ｃｈｅｌｅｘ（商標）１００キレーティング・イオン交換樹脂（バイオラッド社、ヘルクレス、カリフォルニア州）を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）を利用して４℃の暗闇で十分に透析することにより黄褐色のα−クリスタリン調製物から除去した。種々の修飾されたα−クリスタリン調製物（１００μｇ／ｍｌ）を３７℃で１時間Ｃｕ（ＩＩ）−グリシン（２５μＭ）又はＦｅ（ＩＩＩ）−クエン酸塩（２５μＭ）のいずれかと共インキュベートし、上で詳述したようにＢＣ及びＢＰの分光学的検定を用いて金属還元能について検定した。インキュベートし透析したα−クリスタリン（１００μｇ／ｍｌ）及び未処理のα−クリスタリン（１００μｇ／ｍｌ）の調製物は手順の対照として用いた。
【００９８】
要約すれば、これらの調製物において、α−クリスタリンを種々のキヌレニン代謝産物とインキュベートした後、遊離の代謝産物は透析により除去し、得られた「黄褐色の」α−クリスタリンを金属還元能について試験した。α−クリスタリンは利用可能なＣｕ（ＩＩ）の約３５％及び無視できる割合のＦｅ（ＩＩＩ）を還元した。３−ＨＫ：α−クリスタリンは利用可能なＣｕ（ＩＩ）のほぼ１００％及び利用可能なＦｅ（ＩＩＩ）の約２０％を還元した。３−ＨＡＡ：α−クリスタリンは利用可能なＣｕ（ＩＩ）の約６５％を還元した。重要なことには、強力な金属還元剤であるアスコルビン酸塩でα−クリスタリンを処理してもα−クリスタリンの還元効率の増大を生じなかったことである（図８）。
【００９９】
実施例６
スーパーオキシド検定　　スーパーオキシドについての蛍光検定はジヒドロエチジウム（ＤＨＥ、Ｈｙｄｒｏｅｔｈｉｄｉｎｅ（商標））法（モレキュラー・プローブ社、ユージーン、オレゴン州）に基づくものであり製造業者の取扱説明書にしたがって用いる。ＤＨＥ（１ｍＭ）は１００％のアルゴンを吹き込んだＤＭＳＯ中で新しく調製した。反応溶液は、９６穴型プレートにおいて周囲大気条件の下、ｐＨ７．４のＰＢＳで実施し、試験化合物（ＫＹＮ、３−ＨＫ、３−ＨＡＡ、及びＡＮＡ、それぞれ１０μＭ）、ＤＨＥ（１００μＭ）、＋／−Ｃｕ（ＩＩ）−グリシン（１μＭ）を含み、３７℃で６０分間インキュベートした。反応は光力学的効果を回避するために暗闇で行った。スーパーオキシドの特異性を確立するために、スーパーオキシド・ジスムターゼ（１０００Ｕ／ｍｌ）との共インキュベーションによる読み取りの停止を用いた。蛍光の読取りは、５１０ｎｍの励起フィルタ及び５９０ｎｍの放射フィルタを備えた Ｐａｃｋａｒｄ ＦｌｕｏｒｏＣｏｕｎｔ（商標）蛍光プレートリーダーにより記録した。脱気したＤＭＳＯに溶解したスーパーオキシド・カリウムを陽性対照として用いた。
【０１００】
この実施例はスーパーオキシドが周囲酸素分圧条件下でＣｕ（ＩＩ）と３−ＨＫ及び３−ＨＡＡとの反応により生成するか否かを試験する（図９）。３−ＨＡＡによる有意なスーパーオキシドの生産はスーパーオキシド・ジスムターゼにより除去されることが見出された。３−ＨＫ、ＫＹＮ及びＡＮＡによるスーパーオキシドの生産はごく無視できるほどであった。３−ＨＡＡによるスーパーオキシドの生成はＣｕ（ＩＩ）の存在により強力に促進されたが、対照的に、Ｃｕ（ＩＩ）は３−ＨＫ、ＫＹＮ又はＡＮＡによるスーパーオキシドの生産を促進しなかった。
【０１０１】
実施例７
白内障の治療又は予防に有用な物質についてのスクリーニング検定　　下記の構成要素を示された順に１．５ｍＬのシリコン処理したエッペンドルフ・チューブに添加する。即ち、ＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含む）、２５μＭの酸化還元活性金属、５０μＭの試験物質（−試験物質の対照）、１０μＭのキヌレニン経路代謝産物、及び非架橋レンズタンパク質から架橋タンパク質を分離して検出するためのゲル電気泳動又は他の検定手順の後、正確な分析又は可視化に適した濃度（５−５００μｇ／ｍｌ）のレンズタンパク質である。Ｃｕ（ＩＩ）はグリシン化錯体（１：６）として調製される。Ｆｅ（ＩＩＩ）はクエン酸塩錯体（１：６）として調製される。酸化還元活性金属は約１〜２５μＭの最終濃度で存在する。該試験物質は約１０〜２００μＭの範囲に及ぶ最終濃度で存在する。キヌレニン経路代謝産物は３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、キサンツレン酸、及び他のｏ−アミノフェノール化合物から成る群より選択され、約１〜２５μＭの最終濃度で存在する。同濃度の非ヒドロキシル化代謝産物は陰性対照として置換されうる。該レンズタンパク質は組換えクリスタリンでも精製されたクリスタリンでもよい（約１０〜５０μｇ／ｍｌ）。全レンズタンパク質は約５０〜５００μｇ／ｍｌの最終濃度でありうる。
【０１０２】
該混合物は暗闇及び／又はＵＶＢ照射下で約１〜１０日間３７℃でインキュベートする（レンズタンパク質の重合及び断片化は約３６５ｎｍ、約１９２０μＷ／ｃｍ２のＵＶＢ照射下で顕著に促進される）。該混合物は毎日反転により静かに混合する。インキュベーション期間の終わりに、１０μＬのインキュベーション混合物のウェスタン・ブロットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ニトロセルロースへの移転、適切な抗体（一次抗体、例えば、ウサギ抗αＡ−クリスタリン又は抗αＢ−クリスタリン）での探査の後適切な二次抗体での探査、及び化学発光による可視化を行うことにより実施する。約２０〜５０ｋＤに集中する分子量マーカーが含まれる（α−クリスタリンの単量体は約２０ｋＤである）。
【０１０３】
試験物質についての陽性結果は、重合スミア及び断片化バンドの阻止（即ち、不存在又は減少）並びに該単量体及びより低次のオリゴマー産物の増大により明らかにされる。比較のための最小の対照には、活性なキヌレニン代謝産物及び／又は酸化還元活性金属の非存在下における該試験物質及び該レンズタンパク質を含まないインキュベーション混合物が含まれる。
【０１０４】
下記に列挙するような、完全な一連の対照を用いることにより、重要な検定構成要素のそれぞれについての必要条件及び単独の場合及び列挙された機能的な組み合わせの場合のそれらの相対的寄与率を決定できる。
１　　タンパク質−新鮮凍結
２　　タンパク質単独
３　　金属の存在下におけるタンパク質
４　　活性なキヌレニン経路代謝産物の存在下におけるタンパク質
５　　金属及び活性代謝産物の存在下におけるタンパク質
６　　不活性なキヌレニン代謝産物の存在下におけるタンパク質
７　　金属及び不活性なキヌレニン代謝産物の存在下におけるタンパク質
８　　試験物質単独の存在下におけるタンパク質
９　　試験物質及び金属の存在下におけるタンパク質
１０　試験物質及び活性なキヌレニン代謝産物の存在下におけるタンパク質
１１　試験物質及び不活性なキヌレニン代謝産物の存在下におけるタンパク質
【０１０５】
対照の１及び２は標的タンパク質単独の様相を示す。対照３は金属イオンのみに依存する活性を示す。対照の４は活性なキヌレニン代謝産物のみに依存する活性を示す。対照の５は金属及び活性なキヌレニン代謝産物に依存する活性を示す。対照の６及び７は不活性なキヌレニン代謝産物が存在する場合の金属依存性を反復する。対照の８は試験物質単独により惹起されるレンズの架橋における変化を測定する。対照の９はレンズタンパク質の架橋に及ぼす金属及び試験物質の効果を測定する。対照の１０及び１１は試験物質及び活性な又は不活性なキヌレニン代謝産物のいずれかに依存する架橋に及ぼす効果を測定する。該対照と完全な検定混合物の間の相違は、該試験物質とともに存在する全ての検定構成要素に依存する相乗効果又は増大する効果を決定する。
【０１０６】
実施例８
白内障の形成を惹起又は促進する物質についてのスクリーニング検定　　下記の構成要素を示された順に１．５ｍＬのシリコン処理したエッペンドルフ・チューブに添加する。即ち、ＰＢＳ（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含む）、２５μＭの酸化還元活性金属、５０μＭの試験物質（−試験物質の対照）、１０μＭのキヌレニン経路代謝産物、及び適切な濃度のレンズタンパク質である。Ｃｕ（ＩＩ）はグリシン化錯体（１：６）として調製される。Ｆｅ（ＩＩＩ）はクエン酸塩錯体（１：６）として調製される。酸化還元活性金属は約１〜２５μＭの最終濃度で存在する。スクリーニングされる試験物質は約１０〜２００μＭの範囲に及ぶ最終濃度で存在する。キヌレニン経路代謝産物は３−ヒドロキシキヌレニン、３−ヒドロキシアントラニル酸、キサンツレン酸、及び他のｏ−アミノフェノールから成る群より選択され約１〜２５μＭの最終濃度で存在する。同濃度の非ヒドロキシル化代謝産物は陰性対照として置換されうる。該レンズタンパク質は組換えクリスタリンでも精製されたクリスタリンでもよい（約１０〜５０μｇ／ｍｌ）。全レンズタンパク質は約５０〜５００μｇ／ｍｌの最終濃度であればよい。
【０１０７】
該混合物を暗闇及び／又はＵＶＢ照射下で約１〜１０日間３７℃でインキュベートする（レンズタンパク質の重合及び断片化はＵＶＢ照射下で顕著に促進される）。該混合物を毎日反転により静かに混合する。インキュベーション期間の終わりに、１０μＬのインキュベーション混合物のウェスタン・ブロットは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ニトロセルロースへの移転、適切な抗体（一次抗体、例えば、ウサギ抗αＡ−クリスタリン又は抗αＢ−クリスタリン）で探査した後、適切な二次抗体で探査、及び化学発光による可視化を行うことにより実施する。約２０〜５０ｋＤに集中する分子量マーカーが含まれる（α−クリスタリンの単量体は約２０ｋＤである）。
【０１０８】
試験物質についての陽性の結果は、重合スミア及び断片化バンド並びに該二量体及びより高次のオリゴマー産物の増大を促進する（即ち、増大又は加速させる）ことにより明らかにされる。比較のための対照としては、活性なキヌレニン代謝産物及び／又は酸化還元活性金属の非存在下において該試験物質及び該レンズタンパク質を含まないインキュベーション混合物が含まれる。
【０１０９】
二量体量及びより高次のオリゴマー産物の量の減少は、該試験物質が白内障の形成を阻害し白内障を治療又は阻害するための治療用産物として用いられうることを示している。または、二量体量及びより高次のオリゴマー産物量の増加は、該試験物質が白内障の形成を促進するので、ヒト及び動物の接触及び摂取が回避されるべきであることを示している。実施例６のように、同じ対照が列挙された反応物質に依存する活性を測定するために本実施例でも使用しうる。これを除いて、この検定はレンズタンパク質の架橋の減少よりむしろ架橋の増加を期待する。
【０１１０】
実施例９
クリオキノールを用いる加齢に伴う白内障（ＡＲＣ）の治療方法　　クリオキノールは、点眼を用いるか若しくは錠剤として経口摂取されるかのいずれかでＡＲＣの治療用に用いられ、又は軟膏として、注射により、座薬により若しくはクリオキノールが血流若しくは眼に入りうる任意の他の剤形により導入され得る。点眼が好ましい方法である。
【０１１１】
点眼が用いられる場合は、該点眼溶液は０．１〜４０マイクロモル、好ましくは１０マイクロモルの中性緩衝化生理食塩水の溶液から成ることが好ましいが、等張食塩水でｐＨを５〜８に変えることができる。１滴から６滴、好ましくは３滴が、１週間から２年間、好ましくは６ヶ月間、予防が必要な場合はおそらく期限なしに、一日に１回から６回、好ましくは３回投与される。
【０１１２】
経口錠剤が用いられる場合は、該錠剤は１０〜１０００ｍｇ、好ましくは１２５ｍｇのクリオキノールを含み、１個から４個の錠剤が１週間から２年間、好ましくは６ヶ月間、予防が必要な場合はおそらく期限なしに、一日に１回から６回摂取される。
【０１１３】
本発明をここに詳細に記述したが、本発明の範囲又はその任意の実施態様に影響を及ぼすことなく、本発明が操作並びに他のパラメータの広範囲の等価物の範囲内で実施され得ることが当業者により理解されるであろう。
【０１１４】
本明細書で引用された全ての特許及び刊行物はそれらの全体が参照により本明細書にインコーポレートされる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はキヌレニン経路の図式的表示である。反応を触媒する酵素はイタリックで表す。この律速反応は、スーパーオキシドの存在を必要とし且つインターフェロン・ガンマにより高レベル調節されるインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼにより触媒される。Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元し過酸化水素を生成する化合物のフェノール性ヒドロキシル基は箱枠で明記される。
【図２】図２ＡはＣｕ（ＩＩ）及びＦｅ（ＩＩＩ）をＣｕ（Ｉ）及びＦｅ（ＩＩ）にそれぞれ還元するキヌレニン経路の代謝産物の能力を示すグラフである。図２Ｂは該キヌレニン経路の代謝産物の個々の還元シグナルを消失させるＣｕ（ＩＩ）キレート剤のトリエチレンテトラミン（ＴＥＴＡ）及びＦｅ（ＩＩＩ）キレート剤のジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）の能力を示す。数値は三回の独立測定についての平均値±ＳＤを表す。略称：ＴＲＰはＬ−トリプトファン、ＫＹＮはＬ−キヌレニン、３−ＨＫは３−ＤＬ−ヒドロキシキヌレニン、ＫＡはキヌレニン酸、ＡＮＡはアントラニル酸、３−ＨＡＡは３−ヒドロキシアントラニル酸、ＱＡはキノリン酸、ＮＡはニコチン酸、ＸＡはキサンツレン酸、そしてＡＳＣはアスコルビン酸である。
【図３】図３Ａ〜図３Ｄは塩化銅（２５μＭ）の存在下におけるＫＹＮ、３−ＨＫ、ＡＮＡ及び３−ＨＡＡ（１００μＭ）のサイクリック・ボルタンメトリーによる電気化学的分析を示すグラフである。各パネルで、ボルタモグラムは（ａ） ＰＢＳのバックグランド、（ｂ）ＰＢＳ中のＣｕ（ＩＩ）、及び（ｃ） 指定された代謝産物の各存在下におけるＣｕ（ＩＩ）について示される。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃはアミノフェノール性キヌレニン代謝産物、アスコルビン酸、ＴＥＴＡ及びカタラーゼの存在下における過酸化水素生成のグラフ描写である。数値は三回の独立測定についての平均値±ＳＤを表す。
【図５】図５：グリシン化（ｇｌｙｃｉｎａｔｅｄ）Ｃｕ（ＩＩ）（１０μＭ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）（１０μＭ）、銅（ＩＩ）キレート剤のＴＥＴＡ（２００μＭ）、Ｌ−キヌレニン（１０μＭ）、及び３−ヒドロキシキヌレニン（１０μＭ）の存在下におけるα−クリスタリンのインキュベーションのウェスタン・ブロット分析。分子量マーカーはパネルの左に注記する。全レンズタンパク質の対照試料（第一レーン）は調製直後に該検定まで凍結した。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂ：グリシン化Ｃｕ（ＩＩ）（１０μＭ）、銅（ＩＩ）キレート剤のＴＥＴＡ（２００μＭ）、３−ヒドロキシキヌレニン（１０μＭ）、及び３−ヒドロキシアントラニル酸（１０μＭ）の存在下でインキュベートした後の組換えヒトαＢ−クリスタリン（図６Ａ）又は仔牛血清アルブミン（図６Ｂ）の精製物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後の全タンパク質の銀染色。分子量マーカーはパネルの右に注記する。全レンズタンパク質の対照試料（第一レーン）は調製直後に該検定まで凍結した。矢印は単量体種を示す。
【図７】図７：グリシン化Ｃｕ（ＩＩ）の種々のマイクロモル濃度の存在下でインキュベートした後の組換えヒトαＢ−クリスタリンのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後の全タンパク質の銀染色。分子量マーカーはパネルの右に注記する。全レンズタンパク質の対照試料（第一レーン）は調製直後に該検定まで凍結した。
【図８】図８：金属還元能についてのα−クリスタリン試験の結果を示すグラフ。ここで、α−クリスタリンは、透析により遊離代謝産物を除去した後に種々のキヌレニン代謝産物とインキュベートする。対照は新鮮なα−クリスタリン及び添加代謝産物の非存在下で処理された未修飾のα−クリスタリンである。数値は三回の独立測定についての平均値±ＳＤを表す。
【図９】図９：スーパーオキシドについての蛍光検定の結果を示すグラフ。ここで、Ｃｕ（ＩＩ）の存在は３−ＨＡＡによるスーパーオキシドの生産を増大させるが、３−ＨＫ、ＫＹＮ又はＡＮＡの場合は増大しない。蛍光値はスーパーオキシド・ジスムターゼ（ＳＯＤ、１０００Ｕ／ｍｌ）の存在下及び非存在下でインキュベートされた試料間の差異を表す。全ての事例において、ＳＯＤの添加は該蛍光値を基線まで下げた。数値は三回の独立測定についての平均値±ＳＤを表す。
【図１】
2004506915.tif 000002
【図２】
2004506915.tif 000003
【図３】
2004506915.tif 000004
【図４Ａ】
2004506915.tif 000005
【図４Ｂ】
2004506915.tif 000006
【図４Ｃ】
2004506915.tif 000007
【図５】
2004506915.tif 000008
【図６】
2004506915.tif 000009
【図７】
2004506915.tif 000010
【図８】
2004506915.tif 000011
【図９】
2004506915.tif 000012
【国際公開パンフレット】
2004506915.tif 000013
2004506915.tif 000014
2004506915.tif 000015
2004506915.tif 000016
2004506915.tif 000017
2004506915.tif 000018
2004506915.tif 000019
2004506915.tif 000020
2004506915.tif 000021
2004506915.tif 000022
2004506915.tif 000023
2004506915.tif 000024
2004506915.tif 000025
2004506915.tif 000026
2004506915.tif 000027
2004506915.tif 000028
2004506915.tif 000029
2004506915.tif 000030
2004506915.tif 000031
2004506915.tif 000032
2004506915.tif 000033
2004506915.tif 000034
2004506915.tif 000035
2004506915.tif 000036
2004506915.tif 000037
2004506915.tif 000038
2004506915.tif 000039
2004506915.tif 000040
2004506915.tif 000041
2004506915.tif 000042
2004506915.tif 000043
2004506915.tif 000044
2004506915.tif 000045
2004506915.tif 000046
2004506915.tif 000047
2004506915.tif 000048
2004506915.tif 000049
2004506915.tif 000050
2004506915.tif 000051
2004506915.tif 000052
2004506915.tif 000053
2004506915.tif 000054
2004506915.tif 000055
2004506915.tif 000056
2004506915.tif 000057
2004506915.tif 000058
2004506915.tif 000059
2004506915.tif 000060
2004506915.tif 000061
2004506915.tif 000062
2004506915.tif 000063
2004506915.tif 000064
2004506915.tif 000065
2004506915.tif 000066
2004506915.tif 000067
2004506915.tif 000068
2004506915.tif 000069
2004506915.tif 000070
2004506915.tif 000071
2004506915.tif 000072
2004506915.tif 000073
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004506915.tif 000074
【国際調査報告】
2004506915.tif 000075
2004506915.tif 000076
2004506915.tif 000077