(57)【要約】本発明は、蠕虫及び節足動物由来の膜貫通受容体に基づく試験システム、蠕虫、節足動物に作用するかあるいは生物及び／又は細胞のカルシウム代謝に対する効果を有する物質を同定しかつ特徴付けるためのその使用に関する。さらに本発明は本試験システムにおける特異的なリガンドの使用、及び駆虫薬又は殺節足動物活性物質としてのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
駆虫活性を有する物質を同定するたの、蠕虫由来のカルシウムチャネル膜貫通受容体の使用。
【請求項２】
殺節足動物活性を有する物質を同定するための、節足動物由来のカルシウムチャネル膜貫通受容体の使用。
【請求項３】
７回膜貫通ドメインを有するＧタンパク共役膜貫通受容体であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の膜貫通受容体の使用。
【請求項４】
セクレチンサブファミリーの膜貫通受容体であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の膜貫通受容体の使用。
【請求項５】
線虫由来の膜貫通受容体であることを特徴とする、請求項１、３又は４のいずれかに記載の膜貫通受容体の使用。
【請求項６】
ダニ類由来の膜貫通受容体であることを特徴とする、請求項２〜４のいずれかに記載の膜貫通受容体の使用。
【請求項７】
ヘモンクス コントルタス由来の膜貫通受容体ＨＣ１１０−Ｒが関与することを特徴とする、請求項１及び３〜５のいずれかに記載の膜貫通受容体の使用。
【請求項８】
膜貫通受容体ＨＣ１１０−Ｒと相同的であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の膜貫通受容体の使用。
【請求項９】
カルシウムチャネル遮断物質を同定するための、請求項１〜８のいずれかに記載の膜貫通受容体の使用。
【請求項１０】
α−ラトロトキシン−結合膜貫通受容体であることを特徴とする、カルシウムチャネル遮断物質を同定するための、請求項１〜８のいずれかに記載の膜貫通受容体の使用。
【請求項１１】
請求項１、３〜５、及び７のいずれかに記載の膜貫通受容体のアゴニストとしての、α−ラトロトキシンの使用。
【請求項１２】
殺線虫剤としてのα−ラトロトキシンの使用。
【請求項１３】
殺線虫活性及び／又は殺節足動物活性を有する化合物を同定するための方法における、α−ラトロトキシンの使用。
【請求項１４】
ＨＣ１１０−Ｒ受容体及びそれと相同的なタンパク質を得るための方法であって、原核生物又は真核生物発現系において該ポリペプチド又はその断片を発現させることを含む方法。
【請求項１５】
真核生物発現系が関与することを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＥＫ２９３又はＣＯＳ７細胞を、その発現に用いることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
受容体ＨＣ１１０−Ｒ及びそれと相同的な、可能性のあるタンパク質を一過的に発現する宿主細胞。
【請求項１８】
受容体ＨＣ１１０−Ｒ及びそれと相同的な、可能性のあるタンパク質を安定に発現する宿主細胞。
【請求項１９】
エクオリンを発現することを特徴とする、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２４６４を付与された安定に形質転換された細胞系であることを特徴とする、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
寄託番号ＤＳＭ ＡＣＣ２４６５を付与された安定に形質転換された細胞系であることを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１８〜２１のいずれかに記載の宿主細胞の安定な形質転換のための、及び請求項１７に記載の宿主細胞の一過性形質転換のためのベクター。
【請求項２３】
ベクターｐＭｙｃ６ｘＨｉｓが関与することを特徴とする、請求項１８又は２０に記載の宿主細胞を安定に形質転換するためのベクター。
【請求項２４】
蠕虫及び／又は節足動物由来のカルシウムチャネル膜貫通受容体のアゴニスト及び／又はアンタゴニストを同定するための方法であって、
ａ）請求項１７〜２１のいずれかに記載の宿主細胞又はそれらの膜と、化合物または化合物の混合物とを、蠕虫及び／又は節足動物由来のカルシウムチャネル膜貫通受容体のポリペプチドと化合物との相互作用が可能な条件下で接触させる工程、及び、
ｂ）該ポリペプチドと特異的に結合する化合物を決定する工程、
を含む方法。
【請求項２５】
蠕虫又は節足動物由来のカルシウムチャネル膜貫通受容体の発現を変化させる化合物の同定方法であって、
ａ）請求項１７〜２１のいずれかに記載の宿主細胞を、化合物又は化合物の混合物と接触させる工程、
ｂ）カルシウムチャネル膜貫通受容体濃度を測定する工程、及び
ｃ）蠕虫又は節足動物由来のカルシウムチャネル膜貫通受容体のポリペプチドの発現に特異的に影響を及ぼす化合物を決定する工程、
を含む方法。
【請求項２６】
セクレチンサブファミリーのＧタンパク共役膜貫通受容体又はその断片が関与することを特徴とする、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
膜貫通受容体ＨＣ１１０−Ｒ又はその断片、及びそれらと相同的なタンパク質が関与することを特徴とする、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２８】
被験物質と膜貫通受容体とを、該受容体分子と該被験物質との相互作用が可能な条件下で接触させ、次いで
ａ）生じた被験物質の結合を検出し、そして
ｂ）被験物質存在下の受容体分子の活性と被験物質の非存在下の該活性とを比較すること
を特徴とする、請求項２４、２６及び２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
細胞ベースの試験システムを用いることを特徴とする、請求項２４〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
請求項１７〜２１のいずれかに記載の細胞を用いることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
無細胞試験システムを用いることを特徴とする、請求項２４及び２６〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
被験物質と膜貫通受容体との相互作用を、それに結合したα−ラトロトキシンの置換によって検出することを特徴とする、請求項２４及び２６〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
被験物質と膜貫通受容体との相互作用を、それに結合したニフェジピンの置換によって検出することを特徴とする、請求項２４及び２６〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
請求項２４及び２６〜３１のいずれかに記載の方法におけるニフェジピンの使用。
【請求項３５】
請求項２４〜３４のいずれかに記載の方法において同定される物質。
【請求項３６】
蠕虫及び／又は節足動物を抑制するための組成物を製造するための請求項３５に記載の物質の使用。
【請求項３７】
駆虫剤及び／又は殺節足動物剤としての、ＨＣ１１０−Ｒ受容体及びそれと相同的なタンパク質の調節物質の使用。
【請求項３８】
遺伝子組換え無脊椎動物を作製するための、ＨＣ１１０−Ｒ受容体をコードするＤＮＡ及びそれと相同的なＤＮＡの使用。
【請求項３９】
ＨＣ１１０−Ｒ受容体又はそれと相同的なタンパク質を含む遺伝子組換え無脊椎動物。
【請求項４０】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ及びＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓであることを特徴とする、請求項３９に記載の遺伝子組換え無脊椎動物。
【請求項４１】
蠕虫由来のＤＮＡを検出するための、ＨＣ１１０−Ｒ受容体をコードするＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮＡオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項４２】
蠕虫由来のＤＮＡを検出するための方法であって、
ａ）ＨＣ１１０−Ｒ受容体をコードするＤＮＡまたはその相補鎖、又はその５’−若しくは３’−隣接領域とハイブリダイズするＤＮＡオリゴヌクレオチドを入手し、
ｂ）該ＤＮＡオリゴヌクレオチドをＤＮＡ含有試料と接触させ、
ｃ）該ＤＮＡオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを検出し、
ｄ）検出した配列の配列を決定し、そして
ｅ）該配列を、ＨＣ１１０−Ｒ受容体をコードするＤＮＡ配列と比較すること
を特徴とする方法。
【請求項４３】
ＨＣ１１０−Ｒ受容体をコードするＤＮＡ配列又はその断片あるいはそれらと相同的なＤＮＡ配列を含む診断用試験キット。
【請求項４４】
ＤＮＡ配列が検出可能な指標と共に提供されていることを特徴とする、請求項４３に記載の診断用試験キット。
【請求項４５】
ワクチン生産のための、ＨＣ１１０−Ｒ受容体又はその断片及びそれらと相同的なタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、蠕虫（ｈｅｌｍｉｎｔｈ）及び節足動物由来の膜貫通受容体に基づく試験システムに関し、並びに蠕虫、節足動物にて作用する又は生物宿主細胞のカルシウムバランスに作用する物質を同定および特徴付けるための本試験システムの使用に関する。さらに本発明は、本試験システムにおける特異的なリガンドの使用、及び駆虫又は殺節足動物活性物質としての該リガンドの使用に関する。
【０００２】
寄生蠕虫及び節足動物は、ヒト及び動物の健康上重大な問題である。農業の分野だけでみても、このような寄生虫により引き起こされる損害を退治又は防止するためにかかる費用は、全世界合計で年間７０億ドイツマルクを超える（１９９７年の統計）。多くの活性物質のクラスに属する数多くの活性物質が、主に蠕虫によって引き起こされる内因的寄生虫病（ｅｎｄｏｐａｒａｓｉｔｏｓｅｓ）及び主として節足動物によって引き起こされる外因的寄生虫病（ｅｃｔｏｐａｒａｓｉｔｏｓｅｓ）を処置するために利用されている。ここ２０年の間に、門（ｐｈｙｌｕｍ）内の多数の寄生生物種（例えば、蠕虫）に対し、または様々な動物学的門（ｚｏｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｈｙｌａ）（例えば、蠕虫及び昆虫）の範囲にまで拡張したとしても、非常に良好な作用を同時に示す活性物質の重要性が特に増大している。とりわけ前者には広範なスペクトルを有する駆虫薬、例えばベンズイミダゾール又はイミダゾチアゾールなどが挙げられ、後者としては大環状ラクトンが挙げられる。
【０００３】
前回、新規の、広範な活性を有する活性物質の群が市場に出まわったのは、約２０年前のことで、それは大環状ラクトンであった。しかしながら、多くの内因的寄生虫及び外因的寄生虫種は、活性物質の個々のクラス及び幾つかの場合には同時に様々なクラスに対する耐性を獲得している。従って、駆虫活性を有する新規物質を開発する必要性が継続し、緊急性が増大している。
【０００４】
現在有効な活性物質の、数少ない有望な新しい群には、多数の特許の対象である環状デプシペプチド （ＷＯ ９３／１９０５３， ＥＰ ６２６ ３７６， ＷＯ ９４／１９３３４， ＷＯ ９５／０７２７２， ＥＰ ６２６ ３７５， ＥＰ ６５７ １７１， ＥＰ ６５７ １７２， ＥＰ ６５７ １７３） が含まれ、活性が調査されている （Ｃｏｎｄｅｒら、１９９５； Ｍａｒｔｉｎら、１９９６； Ｓａｓａｋｉら、１９９２； Ｔｅｒａｄａ Ｍ １９９２； Ｓａｍｓｏｎ−Ｈｉｍｍｅｌｓｔｊｅｒｎａら、２０００）。
【０００５】
この群の活性物質の１つの代表、ＰＦ １０２２Ａ （シクロ（−Ｄ−Ｌａｃ−Ｌ−ＭｅＬｅｕ−Ｄ−ＰｈＬａｃ−Ｌ−ＭｅＬｅｕ−）２）の作用機構を解明すべく、既に多くの研究が記載されている （参照として、ＤＥ−Ａ−１９７ ０４ ０２４中の該当箇所の情報）。これらには、環状デプシペプチドに対して特異的な結合タンパク質やヒツジ寄生虫Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ （ＤＥ−Ａ−１９７ ０４ ０２４）由来のタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を同定し、かつ特徴づけることが記載された。本発明の範囲として、ＨＣ１１０−Ｒと称される上記タンパク質の機能的相互作用、特に環状デプシペプチドの更なる代表としてのリガンドＢＡＹ ４４−４４００ （ｃｙｃｌｏ（−Ｄ−Ｌａｃ−Ｌ−ＭｅＬｅｕ−Ｄ−ｐ−モルホリニル−ＰｈＬａｃ−Ｌ−ＭｅＬｅｕ−）との機能的相互作用、を記載する。この目的のために、先の出願ＤＥ−Ａ−１９７ ０４ ０２４に記載の配列番号２に基づき、ＨＣ１１０−Ｒを発現する組換え真核細胞系を構築した。
【０００６】
従って本発明は、特に蠕虫及び節足動物の、好ましくは線虫及びダニ類由来の、特に好ましくは毛様線虫（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｉｄａｅ）由来の、さらにより好ましくはＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．由来の膜貫通受容体に、とりわけＨ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ由来の受容体ＨＣ１１０−Ｒに基づき、被験化合物の高速大量処理（ハイスループットスクリーニング検定；ＨＴＳ検定）が可能な試験システムを提供することを目的とする。
【０００７】
相同タンパク質は、文献ＤＥ−Ａ−１９７ ０４ ０２４（本文献の教示は本出願に包含される）に記載の配列番号２に示す配列と、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、特に好ましくは３０個の連続したアミノ酸、さらにとりわけ好ましくはその全長にわたって、少なくとも７０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％、より好ましくは９５％同一であるタンパク質とする。
【０００８】
アミノ酸配列の同一性は、標準設定のＧＣＧプログラムパッケージ、バージョン９．１のＧＡＰプログラムを用いて決定することが好ましい （Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４）。
【０００９】
本目的は、ＧＰＣ受容体の少なくとも１つの生物学的活性を発揮するポリペプチドを提供することによって、並びにこれらポリペプチドを得る方法を提供することによって、並びに殺線虫活性及び殺節足動物活性を有する化合物の同定方法を提供することによって、達成される。
【００１０】
組換え微生物に基づく試験システムは、製薬的に活性な物質を同定するために多くの場で既に用いられており、また特に寄生虫遺伝子を組換え発現する微生物も使用されている （Ｋｌｅｉｎ ａｎｄ Ｇｅａｒｙ １９９７）。しかしながら、これまで、寄生虫膜貫通受容体を、標的として真核生物中にて組換え機能性タンパク質として用いたシステムは開示されていない。本発明中に記載する試験システムは、ハイ−スループット−スクリーニング（ＨＴＳ）又は超−ＨＴＳにて受容体の新規クラスを同定するのに用いることができる。
【００１１】
線虫由来の受容体を組換え発現させることは通常困難である。従って、線虫由来のＧタンパク共役受容体（ＧＰＣＲ）を、その機能特性（例えば、インヒビターに対する感受性）が天然受容体の特性に対応するような様式で発現させることは、今のところ一般に不可能である。
【００１２】
真核生物系における、蠕虫、特に線虫由来の、及び節足動物由来の受容体の機能的発現は、例えば新規の駆虫薬又は殺節足動物薬を探索するのに、実用上、非常に重要である。
【００１３】
従って、本発明はさらに、膜貫通受容体、特に線虫及び節足動物由来のＧＰＣ受容体を発現させる可能な方法を提供することを目的とし、これを踏まえて、殺線虫活性及び殺節足動物活性を有する新規物質を同定することができる試験システムを開発することに基づく。
【００１４】
従って、本発明は特に、蠕虫及び節足動物由来、好ましくは線虫及びダニ類由来、特に好ましくは毛様線虫由来、さらにより非常に好ましくは捻転胃虫由来、及び最も好ましくは寄生線虫Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ由来のオーファンＧタンパク共役受容体を、殺線虫活性物質の効率的な探索のための標的タンパク質として発現させること、及び使用することに関する。
【００１５】
この受容体を、胃腸線虫Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓから得られたｃＤＮＡライブラリーにて同定した。そのｃＤＮＡは、１１０ｋＤａサイズの線虫の膜貫通タンパク質であって、ＨＣ１１０−Ｒと称される膜貫通タンパク質をコードしている。このタンパク質は、Ｇタンパク共役受容体（ＧＰＣＲ）のセクレチンファミリーに属しており、ラトロフィリン（ｌａｔｒｏｐｈｉｌｉｎ）と高い類似性を示す（図５）。
【００１６】
標的としてのＨＣ１１０−Ｒ受容体
ＧＰＣＲラトロフィリンは、哺乳類の脳から独自に単離された。ラトロフィリンは分子量２１０ｋＤａであり、第一の膜貫通セグメントの１８残基上流で翻訳後開裂を受け、その結果、２つの非共有結合サブユニットから構成される。ｐ１２０サブユニットはＮ末端の親水性細胞外タンパク質を含み、ｐ８５サブユニットは７回膜貫通ドメインとラトロフィリンの細胞内Ｃ末端領域とを含み、ＧＰＣＲに対して異常に大きい。２つの近似した相同体、ラトロフィリン−２及びラトロフィリン−３が最近同定された（図６も参照のこと）。後者は、ラトロフィリン−１と同様に脳内で優先的に発現されるのに対し、ラトロフィリン−２は、優先的に哺乳類の胎盤、腎臓、脾臓、卵巣、心臓及び肺に偏在して発現される （Ｉｃｈｔｃｈｅｎｋｏら、１９９９； Ｓｕｇｉｔａら、１９９８）。
【００１７】
ＨＣ１１０−Ｒはラトロフィリン２１０ｋＤａの半分の大きさしかないが、配列の類似性は機能的な類似性にも及んでいる。両受容体に対する内因性リガンドは未だに知られていないが、ラトロフィリンとＨＣ１１０−Ｒはいずれも、人工リガンドα−ＬＴＸ（α−ラトロトキシン）により影響を受けることが知られている。
【００１８】
例えば、ＨＥＫ−２９３細胞をラトロフィリンで一過的にトランスフェクトする場合、放射性の４５Ｃａ２＋を用いる実験計画により示すことができるように、α−ＬＴＸの添加により外部Ｃａ２＋の流入を引き起こす。さらにα−ＬＴＸは、ＨＣ１１０−Ｒで一過的にトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞においても、Ｃａ２＋流入を引き起こし、これは例えばＣａ２＋イメージングにより観察できる）（図１０及び１１も参照のこと）。
【００１９】
しかしながら、このＣａ２＋流入は非常に複雑である。ＨＣ１１０−Ｒが、Ｃ末端に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を結合した構築物の形である場合、流入は二相的である。即ち１つの変化は約３分後に、別のもう１つの変化は約２２分後に見られる。しかしながら、ＨＣ１１０−Ｒの前にＮ末端のＭｙｃ−Ｈｉｓタグのみある場合、主の流入は、α−ＬＴＸを添加した約２〜３分後にのみ観察される。この理由についてはまだ分かっていないが、α−ＬＴＸ添加に対する応答は、以下の説明によって示されるように特異的である：
１．Ｃａ２＋流入は、トランスフェクトしていない細胞及びマウスβ２−アドレナリン作動性受容体で一過的にトランスフェクションした細胞では観察されない。
２．［Ｃａ２＋］ｉの変化はα−ＬＴＸの投与量に依存する（図１０）。
３．二相的な変化には、ニフェジピンに対するそれらの感受性から明らかなように、Ｃｄ２＋によってブロックされ得るＣａ２＋チャネル、特にＬタイプのチャネルを介して起きるＣａ２＋流入であることが必要である。
【００２０】
α−ＬＴＸとＨＣ１１０−Ｒとの相互作用及びシグナル伝達の正確なメカニズムには、さらに説明が必要である。ラトロフィリン−１の例については、α−ＬＴＸによって引き起こされるＨＥＫ−２９３細胞中へのＣａ２＋流入に、単一の膜貫通ドメインのみが必要であることを証明することが可能である （Ｋｒａｓｐｅｒｎｏｖら、１９９９）。
【００２１】
本明細書に記載されたシステムにおいてニフェジピンがα−ＬＴＸの効果をブロックするという事実は、本システムは、新規の特異的なカルシウムチャネル遮断物質（ブロッカー）を同定するのにも適当であることを示している。ニフェジピンは、カルシウムチャネルアゴニスト及びアンタゴニストのクラスに属し、それらはカルシウムチャネルの特定の部位に対する結合、例えばＬタイプのチャネルに対する結合に基づいて、分類される。カルシウムチャネル遮断物質の主要な３つのクラス（Ｌタイプ）には、ベンジルアセトニトリル（ｂｅｎｚｙｌａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）（例えば、ベラパミル（ｖｅｒａｐａｍｉｌ）， ＷＯ ９１／０２４９７）、ベンゾチアゼピノン （例えば、ジルチアゼム）、及び１，４−ジヒドロピリジン誘導体（例えば、ニフェジピン、ニバルジピン（ｎｉｖａｌｄｉｐｉｎｅ）、ニモジピン、ニカルジピン、イスラジピン、アムロジピン、ニトレンジピン、フェロジピン又はニソルジピン）がある （Ｂａｃｏｎら、１９８９； ＷＯ ９０／０９７９２）。Ｌ−タイプカルシウムチャネル遮断物質の別のクラスには、１，３−ジホスホナート、例えばベルフォソジルが含まれる。
【００２２】
従って本発明はまた、新規カルシウムチャネル遮断物質を同定するための、α−ＬＴＸ結合膜貫通受容体の使用に関する。７回ラセン膜貫通受容体はこの目的の使用に特に好ましく、Ｇタンパク結合受容体であることが特に好ましい。セクレチンファミリーの膜貫通受容体の使用は特に非常に好ましい。最も好ましいのは、配列番号２に示されるＨＣ１１０−Ｒ受容体、及びそれと７０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％、そして非常に好ましくは９５％相同的である受容体タンパク質の使用である。
【００２３】
入手可能なデータは、さらに、ＨＣ１１０−Ｒが新規駆虫薬デプシペプチドＢＡＹ４４−４４００の標的であることを示している。ＢＡＹ４４−４４００は、ＨＣ１１０−ＲでトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞においてα−ＬＴＸによるシグナル伝達を妨害する（図１２）。この妨害は、他のデプシペプチド、例えばビューヴァリシン（ｂｅａｕｖｅｒｉｃｉｎ）、エニアチン（ｅｎｎｉａｔｉｎ）などに典型的なように、ＢＡＹ４４−４４００のイオン透過活性から生じ得る（Ｇｅβｎｅｒら、１９９６）。しかしながら、ＢＡＹ４４−４４００は非トランスフェクト細胞では何の変化も引き起こさない。さらに、ＢＡＹ４４−４４００は、マウスβ２アドレナリン作動性受容体を用いてトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞を介するイソプロテレノール誘導性シグナル伝達を妨害しない。加えて、ＢＡＹ４４−４４００は、α−ＬＴＸのアンタゴニストとして作用するが、それ単独ではＨＣ１１０−ＲでトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞中のＣａ２＋濃度に影響を及ぼさない。
【００２４】
ＨＣ１１０−Ｒタンパク質
ＤＥ １９７ ０４ ０２４ Ａ１に記載の膜タンパク質は、駆虫薬活性物質 ＰＦ１０２２Ａの可能性のある標的タンパク質であると同定された。寄生線虫Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓのλＺＡＰＩＩ ｃＤＮＡ発現ライブラリーを調製し、ＰＦ１０２２ＡとＫＬＨ （キーホール リンペットヘモシアニン）とのコンジュゲート ＰＦ１０２２Ａ−ＫＬＨおよびこのコンジュゲートに対するポリクローナル抗体を用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、可能性のある標的タンパク質を同定した（実施例１を参照のこと）。非増殖組換えクローン約１．５×１０６の試験により、Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ由来の３．６ｋｂ ｍＲＮＡとハイブリダイズする３０３６ｂｐ長のｃＤＮＡクローンが明らかとなった（実施例２も参照のこと）。ＲＡＣＥ ＰＣＲ法を用いて、３’末端及び５’末端を補完した（実施例４）。最終的に、３５３９ｂｐ長のｃＤＮＡを得、これをＨＣ１１０−Ｒと称した。このｃＤＮＡは、ＡＴＧ１００で始まるオープンリーディングフレームを有する９８６アミノ酸（１１０ｋＤａ）をコードしている（図２）。この開始コドンは、翻訳を最適に開始させるためのコザック配列に囲まれている。このタンパク質の導かれた分子量を、インビトロにて転写されたＨＣ１１０−Ｒ ＲＮＡのインビトロ翻訳により確認した。
【００２５】
ＨＣ１１０−Ｒタンパク質のアミノ酸配列は特定の構造を幾つか示す。このタンパク質の細胞外Ｎ末端部分は、全部で５３５残基から成る。このＮ末端には、２１アミノ酸長のシグナルペプチド及び１８位の開裂部位が含まれる。その次に、レクチン様配列（ＡＡ ２２−２１５）及び１４４位のセリンが唯一割り込んで存在しているいわゆる「Ｔｈｒ ストレッチ」 （ＡＡ １２８−１４７） がある。この「Ｔｈｒ ストレッチ」の下流には、構造 ＣＸ９ＷＸ１２ＣＸ９ＷＸＣＸ５ＷＸ９ＣＸ３Ｗ （ＡＡ １６６−２２１） を有するシステイン豊富（リッチ）モチーフがある。さらに、ＨＣ１１０−Ｒタンパク質は、５３６残基と７７２残基の間に７回疎水性ラセン膜貫通ドメインを含んでいる。この膜貫通領域のすぐ上流に、構造ＣＸＷＷＸ６ＷＸ４ＣＸ１１ＣＸＣ （ＡＡ ４７８−５２４）の４−Ｃｙｓ領域がさらに存在する。膜貫通領域に、残基５８７−５９７， ６５４−６７３及び７４３−７４９を含む３つの細胞外ループと、３つの細胞内ループ （５５９−５６９位， ６２７−６３６位， ６９６−７２４位）がある。Ｃ末端は、２１４残基長（２４ ｋＤａ）であり、プロリン リッチ部分（ＡＡ ８４５−８６１）やＰＥＳＴ領域（ＡＡ ９１５−９３３）を含む。最後に、誘導された細胞内ドメイン中に、さらに残基２６、４９９及び８６２の３個の推定Ｎ−グリコシル化部位、並びに１４個の推定リン酸エステル化部位がある（図６も参照のこと）。
【００２６】
データベース分析により、ＨＣ１１０−Ｒタンパク質は、線虫 Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓのゲノムクローンＢ０４５７（ジーンバンクＴＭアクセッションナンバーＺ５４３０６）から得られる未知の膜貫通タンパク質（１００１４ ＡＡ）と４８％同一で、７８％類似していることが明らかとなった（図３も参照のこと）。
【００２７】
本明細書にて用いる用語「同一性」は、いわゆるアライメントにて一致する配列部位の数を表す。これはアライメント長の百分率として示される。
【００２８】
本明細書中で用いられる用語「類似性」は、類似性計量に基づく配列の類似性であり、言い換えると、例えばバリンをスレオニン又はロイシンと仮定して、どの程度類似しているかの尺度である。
【００２９】
本明細書中で用いられる用語「相同的」は、進化上の関係を意味する、言い換えると、２つの相同タンパク質が共通の祖先配列から派生したものであるかどうかを意味する。この用語は、通常、相同配列の方がより類似している又はアライメントにおける一致部位が非相同配列よりも多いという事実は別にして、同一性又は類似性と何らかの関係がある必要はない。
【００３０】
２つの配列の比較によって、例えばレクチン様配列、「Ｔｈｒ ストレッチ」、Ｃｙｓモチーフ及びＰＥＳＴ配列など、両方のタンパク質に共通する特徴が示される。膜貫通領域で最も高い同一性が見出される（６２％）のに対し、Ｎ末端領域（４４％）及びＣ末端領域（５０％） における同一性はそれほど顕著ではない。
【００３１】
さらに、ＨＣ１１０−Ｒタンパク質は、７回ラセンＧタンパク共役膜貫通受容体（ＧＰＣＲ）、特にセクレチンサブファミリーに対して２０〜３０％の同一性を有する。７回膜貫通ドメインの比較により、構造及び配列に関してセクレチンサブファミリーの種々のＧＰＣＲとＨＣ１１０−Ｒとの間に高い同一性及び類似性が示される（図４）。
【００３２】
セクレチンサブファミリーのメンバーであるラトロフィリン、哺乳類、例えばヒト由来（ジーンバンクＴＭアクセッションナンバー： Ｅ１３６０６９０）、ウシ由来（例えば、Ｇ４１６０２１、Ｇ４１６０５３及びＧ４１８５８０４）、及びラット由来 （Ｕ７８１０５又はＵ７２４８７）は、他のセクレチン受容体よりも、ＨＣ１１０−Ｒに対して幾分高い同一性を示す。特に、膜貫通領域の同一性は４５〜４８％を示す。ＨＣ１１０−Ｒ及び１４６６アミノ酸のラット ラトロフィリン−１ ＧＰＣＲ（Ｕ７８１０５）は、例えば、膜貫通領域の前にレクチンドメイン、システイン豊富ドメイン及び保存的な４−Ｃｙｓモチーフがあるなど共通の特徴を示す。後者は、ラトロフィリン及び他の巨大セクレチンＧＰＣＲのタンパク質分解部位であることが最近示された。比較すると、ＨＣ１１０−ＲのＮ末端は、ラトロフィリンのオルファクトメジン領域及びＰｒｏ／Ｔｈｒ領域を含まないが、ラトロフィリンはその代わり、ＨＣ１１０−Ｒの「Ｔｈｒ ストレッチ」を有しない。
【００３３】
従って、本出願はさらに、駆虫活性を有する物質を同定するための、蠕虫由来の７回膜貫通ドメインを有するＧタンパク共役膜貫通受容体の使用に関する。本発明に基づき、セクレチンサブファミリーが有し得る膜貫通受容体の使用が好ましい。
【００３４】
細胞での局在
一過性トランスフェクション実験は、種々の哺乳類細胞系、例えばＣＯＳ−７細胞又はＨＥＫ−２９３細胞において、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ融合タンパク質を用いて行なった（図７）。Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ細胞系がまだ確立されていないため、非相同的発現を選択した。
【００３５】
パシフィック・クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、生細胞においてタンパク質の場所を特定するために用いることができる（図８を参照のこと）。ＧＦＰは、一過性トランスフェクト又は安定なトランスフェクトの頻度を示すためのインビボレポーターとして細胞レベルで、及びタンパク質の局在を特定するために細胞下レベルで用いられる。野生型ＧＦＰは、ＵＶライト（３６０〜４００ｎｍ； 最大３９５ｎｍ）又は青色ライト（４４０〜４８０ｎｍ； 最大４７５ｎｍ）による励起後に最大５０９ｎｍの緑色光を発する、２３８アミノ酸から構成される２７ｋＤａのモノマーであり、外来物質又は補因子を必要としない（Ｃｈａｌｆｉｅら，　１９９４）。したがって、ＧＦＰは蛍光顕微鏡により直接インビボ検出でき、かつその蛍光特徴は融合タンパク質の一部であっても本質的に変わることはない。ＥＧＦＰ（増強ＧＦＰ）は、野生型ＧＦＰの遺伝的変異体であり、哺乳動物細胞のトランスフェクトに用いられる （Ｙａｎｇら、１９９６）。ＥＧＦＰの最大励起は、Ｓｅｒ６５をＴｈｒに置換することで唯一の４９０ｎｍのピークに移動した。ベクターｐＥＧＦＰ−Ｃ１ （ジーンバンクアクセッションナンバー： Ｕ５５７６３） 及びｐＥＧＦＰ−Ｎ３ （ジーンバンクアクセッションナンバー： Ｕ５５７６２） ［クローンテック， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， Ｕ．Ｓ．Ａ．］ は、強力な構成性ＣＭＶプロモーターの退治下にＥＧＦＰを発現し、ＥＧＦＰのＮ末端及びＣ末端のそれぞれに別のタンパク質を融合させるために用いることができる。
【００３６】
安定な細胞系は、全ての細胞が所望のタンパク質を恒常的に発現し、局在化した後も所望のタンパク質を単離できる点で、一過性発現よりも有利である。蛍光顕微鏡又はウェスタンブロットの助けによってタンパク質を検出するために、所望のタンパク質に対する抗体が必要であるか、または、実際のタンパク質のＣ末端にＭｙｃ又はＨｉｓタグを正しいリーディングフレームで融合させる発現ベクターを選択することが適当であり、大抵の場合、モノクローナル抗体であっても、それに対する抗体を購入することができる。
【００３７】
同様に、本発明は、ＨＣ １１０−Ｒ受容体及び可能であればそれと相同的なタンパク質を安定に発現する細胞に関する。
【００３８】
ＨＣ１１０−Ｒタンパク質に対するα−ラトロトキシンの効果
ＨＣ１１０−Ｒとラトロフィリンとの間の類似性をさらに実証するため、及び組換え的に発現したＨＣ１１０−Ｒの機能を試験するため、ＨＥＫ−２９３細胞を、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ融合タンパク質を用いて一過的にトランスフェクト及び安定にトランスフェクトし、α−ラトロトキシン（α−ＬＴＲ）を用いて刺激した。
【００３９】
α−ラトロトキシンは、クロゴケグモ（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｍａｃｔａｎｓ）毒から単離し得るシナプス前神経毒である。脊椎動物の中枢神経系に対するその毒性は知られており、［Ｃａ２＋］ｉを増大させ、神経伝達物質の非退治型のエキソサイトーシスを刺激することで神経の脱分極を引き起こす。このように、α−ラトロトキシンの効果は、少なくとも部分的にラトロフィリンにより媒介されることも明らかとなった。さらに、α−ラトロトキシンの毒性は、ＧＴＰ結合タンパク質と共役する受容体（ＧＰＣＲ）と相互作用するその能力に拠るものであると推定される。これらの受容体は、通常、内因性ホルモン又は神経ペプチドの効果を媒介する （Ｈｏｌｚ及びＨａｂｅｎｅｒ １９９８）。
【００４０】
トランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞のα−ＬＴＸに対する応答を試験するため、本発明では、この細胞中に存在するＣａ２＋ 即ち［Ｃａ２＋］ｉの変化を測定することによる、いわゆるＣａ２＋イメージング技術を用いた （実施例２４、及び図９、１０及び１１を参照）。
【００４１】
α−ＬＲＸは、［Ｃａ２＋］ｉの二相的な増大を引き起こす。７５ｎＭの濃度で、α−ＬＴＸは、まず、α−ＬＴＸの添加から２分後に僅か５±０．２ｎｍの非常に小さな増大を生じ、２２分後に約２２０±１４．９ｎＭ Ｃａ２＋の大きい遅延型の増大を生じる。α−ＬＴＸの濃度が増加（７．５ ｎＭ〜１２０ ｎＭ）するにつれ、最初の増大は大きくなり、第二の増大は小さくなる。１２０ｎＭのα−ＬＴＸ濃度で、第一の増大値は約１３５±１３．６ｎＭ Ｃａ２＋に達するが、一方で第二の増大値は約５０±７．１ｎＭ Ｃａ２＋にまで落ち込む。９０ｎＭ及び１２０ｎＭのα−ＬＴＸを用いる同じプロファイルでは飽和を示す。
【００４２】
Ｎ末端ＧＦＰタグＨＣ１１０−Ｒ構築物を用いてＨＥＫ−２９３細胞をトランスフェクトし、それをα−ＬＴＸ ７５ｎＭで刺激すると、第二のピークが僅かに低下する。また、ＨＣ１１０−Ｒタンパク質をＮ末端ＧＦＰタグを用いて提供した場合、最終的に、α−ＬＴＸに対する応答がほんの僅か減少した。従って、ＧＦＰタグのＮ−又はＣ−末端への結合は、ＨＣ１１０−Ｒによるα−ＬＴＸ結合及び次のシグナル伝達に対する影響を無視できると考えられる。
【００４３】
トランスフェクトしていない、又はＧＦＰを用いて単に一過的にトランスフェクションした細胞は、α−ＬＴＸに対して応答を示さない。Ｃ末端ＧＦＰタグを有する他のＧタンパク共役受容体、例えばマウスβ２アドレナリン作動性受容体、又はヒト ムスカリン性Ｈ１アセチルコリン受容体を用いてＨＥＫ−２９３細胞を一過的にトランスフェクションした場合に、濃度７５ｎＭのα−ＬＴＸにより引き起こされる［Ｃａ２＋］ｉの増大は、ほんの僅かである（２０分後に約４０±１０．４）か、又はゼロである。
【００４４】
α−ＬＴＸにより引き起こされる［Ｃａ２＋］ｉの増大は、細胞外Ｃａ２＋の流入と細胞内Ｃａ２＋の流出の両方につながり得る。α−ＬＴＸを添加する前又は後に、細胞外Ｃａ２＋を２ｍＭ ＥＧＴＡを用いて除去した場合、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するＨＥＫ−２９３細胞の［Ｃａ２＋］ｉにはほんの僅かな増大が表れる。このことから、α−ＬＴＸは主に、細胞外Ｃａ２＋の流入を引き起こすことが明らかである。このＣａ２＋流入は、単純拡散に基づくものではなく、原形質膜のＣａ２＋チャネルの力により生じる。
【００４５】
１５μＭのニフェジピンは、［Ｃａ２＋］ｉのα−ＬＴＸ誘導性の増大を有意に低下させるに十分であることから、Ｃａ２＋流入に関与するＣａ２＋チャネルの大部分はＬタイプである。さらに、第一の増大が完全に阻害され、第二の増大は２６７±１２．７ｎＭから３０±５．４ｎＭにまで落ち込む。
【００４６】
また、Ｃ末端Ｍｙｃ／Ｈｉｓタグを有するＨＣ１１０−Ｒ受容体を発現する安定な又は一過性のＨＥＫ−２９３細胞系は、α−ＬＴＸに用量依存的に応答する（図１０を参照のこと）。７．５ｎＭのα−ＬＴＸでは、この場合でも同様に、α−ＬＴＸ−誘導性のＣａ２＋流入を生じさせるには少なすぎる。しかしながら、さらに２５ｎＭ α−ＬＴＸは、僅か２分後に［Ｃａ２＋］ｉを１３０±３８．０ｎＭにまで増大させるのに十分である。７５ｎＭ α−ＬＴＸを添加することで２９６±９１．５ ｎＭのＣａ２＋流入が生じる、これはα−ＬＴＸ添加２分後に同様に非常に増大し、たった２７分後にもとのＣａ２＋含有量に戻る。このＣａ２＋シグナルは、シグナルの高さ及びそのプロファイルについて、同じα−ＬＴＸ濃度（７５ｎＭ）のＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の第二の遅延型のＣａ２＋ピークに似ているが、その応答は（また、高濃度（９０ｎＭ及び１２０ｎＭ）のＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰトランスフェクト細胞について同様に）α−ＬＴＸ添加後すぐに起こる。
【００４７】
従って、本発明は同様に、線虫由来のセクレチン（ｓｅｋｒｅｔｉｎ）ファミリーの膜貫通受容体のアゴニストとしての、α−ＬＴＸの使用に関する。α−ＬＴＸは、配列番号２に示すＨＣ１１０−Ｒ受容体、及びそれと７０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％、さらにとりわけ非常に好ましくは９５％相同的である受容体タンパク質のアゴニストとして用いることが好ましい。
【００４８】
同様に、本発明は殺線虫剤としてのα−ＬＴＸの使用に関する。
【００４９】
同様に、本発明は、殺線虫活性又は殺節足動物活性を有する化合物、膜貫通受容体のアゴニスト又はアンタゴニストとして活性である可能性のある化合物を同定する方法における、α−ＬＴＸの使用に関する。
【００５０】
同様に、本発明は、カルシウムチャネルをブロックする化合物を同定する方法における、α−ＬＴＸの使用に関する。
【００５１】
α−ＬＴＸの作用に対するＢＡＹ ４４−４４００の効果
ＰＦ１０２２Ａは、具体的な種に依存して、１００〜８００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲で線虫に対してその効果を発揮する （Ｔｅｒａｄａ， １９９２） 。ＨＣ１１０−ＲとＰＦ１０２２Ａとの間の何らかの可能性のある相互作用、及びＨＣ１１０−Ｒにより媒介されるシグナル伝達を、各場合において調べるため、ＰＦ１０２２Ａの容易に可溶化する誘導体であるＢＡＹ４４−４４００を、ＦＵＲＡ−２をローディングし、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰでトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞における、以下のＣａ２＋イメージング実験に用いた。
【００５２】
４００ｎｇ／ｍＬの濃度では、細胞を活性物質で９０分間プレインキュベーションしても、非常に有効な殺線虫剤 ＢＡＹ４４−４４００及び事実上効果のない鏡像体ＰＦ１０２２−００１のいずれも、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰでトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞においてＣａ２＋応答を引き起こさない。これとは対照的に、両物質は、程度は異なるが、α−ＬＴＸに依存してシグナル伝達に影響を及ぼす（図１２及び１４）。４ｎｇ／ｍＬのＢＡＹ４４−４４００の存在下では、α−ＬＴＸは、１４分後に最大４４±６．０ｎＭ Ｃａ２＋の小さいＣａ２＋増大のみを誘導する（図１２）。しかしながら、ＰＦ１０２２−００１の存在下では、α−ＬＴＸは、６分後に１０３±１１．５ｎＭ Ｃａ２＋のより大きな増大を引き起こす（図１０Ｂ）。別の方法では、細胞を４ｎｇ／ｍＬ又は４００ｎｇ／ｍＬのＢＡＹ４４−４４００及びＰＦ１０２２Ａと９０分間プレインキュベーションし、次いで活性物質を除去したのち、細胞をα−ＬＴＸで刺激した。ＰＦ１０２２ＡとプレインキュベーションしたＨＥＫ−２９３細胞は、α−ＬＴＸに対する応答において有意な変化はなかった。ＢＡＹ４４−４４００のみが、α−ＬＴＸに対する細胞の感受性に影響を及ぼした。濃度４ｎｇ／ｍＬのＢＡＹ４４−４４００において、α−ＬＴＸは、安定なＣａ２＋レベルに達する１９分前に、Ｃａ２＋増大（９５±２０．５ ｎＭ Ｃａ２＋）を誘導した。４００ｎｇ／ｍＬのＢＡＹ４４−４４００では、α−ＬＴＸは、約６５±７．５ｎＭ Ｃａ２＋だけＣａ２＋濃度の増大をもたらした。さらに、この小さな増大は１２分移動した。
【００５３】
これらの結果の特異性を確認するため、さらに、内因性の天然Ｍ１−Ｒに対する１ｍＭカルバコールの効果を、非トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞において測定した。４００ｎｇ／ｍＬのＢＡＹ４４−４４００の存在は、細胞の応答に変化を及ぼさなかった。ＨＥＫ−２９３細胞において、内因性の天然β２−Ｒの、又はニコチンコリン作動性受容体の、イソプロテレノール及びアレコリンにより誘導された刺激はいずれも、ＢＡＹ４４−４４００によって何ら影響を受けなかった。
【００５４】
最後に、本発明の範囲内である、Ｃ末端にＧＦＰを伴って提供されるＨＣ１１０−Ｒタンパク質を一過的にまたは安定に発現するＨＥＫ−２９３細胞におけるＨＣ１１０−Ｒタンパク質に対する、ＰＦ１０２２Ａ変異体のより可溶性の変異体であるＢＡＹ４４−４４００の効果を、Ｃａ２＋イメージングにより調べた。ＨＥＫ−２９３細胞を４００ｎｇ／ｍＬのＢＡＹ４４−４４００のみとインキュベートすると、細胞は、細胞内のＣａ２＋濃度における変化とは類似しない様式で５０分間応答した。しかしながら、ＢＡＹ４４−４４００の効果はα−ＬＴＸの存在下で認められる。７５ｎＭ α−ＬＴＸを加える前に、細胞をＢＡＹ４４−４４００と６分間インキュベートすることで、Ｃａ２＋濃度に対するα−ＬＴＸの効果が低下する。［Ｃａ２＋］ｉにおける最初の小さな増大は見られず、第二の増大はα−ＬＴＸを加えた１５分後に８５％にまで低下する。α−ＬＴＸに対する応答は、細胞をＦＵＲＡで３０分間処理する前に、ＢＡＹ４４−４４００と６０分間プレインキュベーションした場合、さらに強力なものとなる。Ｃａ２＋の最初の増大は全く見られず、７０ｎＭ ［Ｃａ２＋］ｉの非常に小さな第二の増大が、７５ｎＭ α−ＬＴＸを加えた３０分後に見られるのみである。
【００５５】
α−ＬＴＸの作用に対するＢＡＹ４４−４４００の特異的な効果を示すため、２つの対照実験を行なった。最初に、ＨＥＫ−２９３細胞を、Ｃ末端にＧＦＰタグを伴って提供されるマウスβ２−アドレナリン作動性受容体で一過的にトランスフェクト又は安定にトランスフェクトして、イソプロテレノールをリガンドとして用いた。
【００５６】
実際に、イソプロテレノールも有意なＣａ２＋応答を引き起こす：イソプロテレノールを添加した後すぐに、Ｃａ２＋の増大のみが表れる。しかしながら、この増大はＢＡＹ４４−４４００の影響を受けない。
【００５７】
さらに、ＢＡＹ４４−４４００とＨＣ１１０−Ｒとの間の相互作用の特異性は、リガンドとしてＢＡＹ４４−４４００の部位を占める光学対掌体によって示される。駆虫活性が１００倍弱いＰＦ１０２２Ａ誘導体、ＰＦ１０２２−００１：シクロ（−Ｌ−Ｌａｃ−Ｄ−ＭｅＬｅｕ−Ｌ−ＰｈＬａｃ−Ｄ−Ｍｅ−Ｌｅｕ−）２ （光学対掌体とも称する） を４００ｎｇ／ｍＬ用いて、細胞を９０分間前処理した後、７５ｎＭ α−ＬＴＸを添加した６分後に、僅か１１０ｎＭ Ｃａ２＋の増大が表れた、これは５９％にまで低下したことを意味する。４ｎｇ／ｍＬの光学対掌体を、７５ｎＭ α−ＬＴＸを添加する６分前に加えた場合、α−ＬＴＸを添加してすぐに６７ｎＭ ［Ｃａ２＋］ｉの増大がみられる。光学対掌体の濃度を増加した場合、増大は２０ｎＭ Ｃａ２＋にまで低下する。
【００５８】
本明細書中にて用いられる用語「ポリペプチド」は、通常、ペプチド、オリゴペプチド又はオリゴマーと称される短いアミノ酸鎖と、通常タンパク質と称される長いアミノ酸鎖との両方を意味する。これには、天然のプロセス、例えば翻訳後プロセッシングによるか、あるいは最先端の化学的方法によるかのいずれかによって修飾され得るアミノ酸鎖が含まれる。このような修飾は、ポリペプチドの様々な部位で、かつ１つ以上が生じ得る、例えばペプチド骨格（バックボーン）で、アミノ酸側鎖で、アミノ末端宿主カルボキシ末端で生じ得る。これらには、例えばアセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、フラビン、ヘム部分、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド誘導体、脂質若しくは脂質誘導体またはホスファチジルイノシトールとの共有結合、環化、ジスルフィド架橋形成、ジメチル化、シスチン形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質加水分解プロセッシング、リン酸化、セレノイル化及びｔＲＮＡ媒介のアミノ酸付加が包含される。
【００５９】
ポリペプチドは、本発明に基づいて、「成熟」タンパク質の形態において、又は大きなタンパク質（例えば、融合タンパク質）の一部として用いることができる。これには、さらに分泌配列又は「リーダー」配列、プロ配列（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）、簡単な精製を可能にする配列（例えば複数のヒスチジン残基）、又はさらなる安定化アミノ酸が包含され得る。
【００６０】
相同タンパク質又は相同ポリペプチドは、文献ＤＥ−Ａ−１９７ ０４ ０２４（本文献の教示は本出願に包含される）に記載の配列番号２に示す配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％、とりわけ非常に好ましくは９５％一致し、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも２５個、特に好ましくは少なくとも３０個の連続アミノ酸、とりわけ非常に好ましくはその完全長を有するタンパク質又はポリペプチドとする。
【００６１】
本発明のポリペプチドの使用によれば、ポリペプチドは完全な受容体を表す必要はなく、少なくとも完全な受容体の生物学的活性を有してさえいれば、その単なる断片であって良い。さらに、ポリペプチドはＨ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの膜貫通受容体から得られるものである必要もない。蠕虫又はさらに節足動物の別の種の膜貫通受容体に対応するポリペプチドあるいはその受容体の生物学的活性を発揮することさえできればその断片でさえ、本発明に従うものとする。
【００６２】
本発明のポリペプチドの使用に関して、ポリペプチドは、完全なＧＰＣ受容体の生物学的活性を少なくとも１つを発揮しさえすれば、天然のＧＰＣ受容体の対応する領域と比較して欠失又はアミノ酸置換を有していて良い。保存的な置換が好ましい。このような保存的置換には、１つのアミノ酸が以下の群由来の別のアミノ酸に置換された変異体を包含する：
１．小さい脂肪族、無極性又は僅かに極性のある残基： Ａｌａ， Ｓｅｒ， Ｔｈｒ， Ｐｒｏ 及びＧｌｙ；
２．極性、負に帯電している残基及びそのアミド： Ａｓｐ， Ａｓｎ， Ｇｌｕ及びＧｌｎ；
３．極性、正に帯電している残基： Ｈｉｓ， Ａｒｇ及びＬｙｓ；
４．大きな脂肪族、無極性残基： Ｍｅｔ， Ｌｅｕ， Ｉｌｅ， Ｖａｌ 及びＣｙｓ； 並びに
５．芳香族残基： Ｐｈｅ， Ｔｙｒ及びＴｒｐ。
【００６３】
以下のリストは、好ましい保存的置換を示す：
2004508052.tif 000002
【００６４】
上記の配列、及びＤＥ−Ａ−１９７ ０４ ０２４の配列番号１及び配列番号３に記載の配列は、蠕虫又は節足動物中の機能的に類似の膜貫通受容体の構造に関与するポリペプチドをコードする遺伝子を見い出すのにも用いることができる。本発明に基づく機能的に類似の受容体とは、本明細書中に記載のポリペプチドとアミノ酸配列が異なっていても、本質的に同じ生物学的機能を有しているポリペプチドを包含する受容体を意味する。
【００６５】
本明細書にて用いる用語「本質的に同じ生物学的機能」とは、機能することが可能なＧタンパク共役７回ラセン膜貫通受容体、特にセクレチンサブファミリーの受容体、の構造における関与、又はＨ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ由来のＨＣ１１０−Ｒ受容体に相当する機能を意味する。該機能には、該受容体の上記の特性、例えばアゴニストとしてのα−ＬＴＸ又はα−ＬＴＸのアンタゴニストとしてのニフェジピンに対する感受性も、また含まれる。
【００６６】
本明細書にて用いる用語「ハイブリダイズ」は、１本鎖の核酸分子が相補鎖と塩基対を形成するプロセスを表す。本明細書中に記載の情報の配列から出発することで、例えば、Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ以外の他の線虫由来、及び節足動物由来の、ＧＰＣ受容体の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を単離できる。
【００６７】
適当なプローブに関して、アミノ末端及びカルボキシ末端のｃＤＮＡ部分が好ましい。ハイブリダイゼーション条件は、他の生物に由来する類似性の低い配列を検出することもできるように選ばれる。ストリンジェンシーの低いハイブリダイゼーション条件は、以下のようなものでよい：例えば、ハイブリダイゼーション溶液として６×ＳＳＣ／０％ ホルムアミド中、４０〜５５℃でハイブリダイゼーションを行なう。２回目の洗浄工程の条件は試験しなければならない、例えば、まず５０℃にて２×ＳＳＣで行ない、次いでそのシグナルの強度を評価する。次いで、洗浄条件に変更を加える。
【００６８】
適当なハイブリダイゼーション条件を、以下に例示として示す：
ハイブリダイゼーション溶液：６×ＳＳＣ／０％ ホルムアミド、好ましいハイブリダイゼーション溶液：６×ＳＳＣ／０％ ホルムアミド
ハイブリダイゼーション温度：３４℃、好ましいハイブリダイゼーション温度：４２℃
１回目の洗浄工程：４０℃にて２×ＳＳＣ
２回目の洗浄工程：４５℃にて２×ＳＳＣ；好ましい２回目の洗浄工程：５５℃にて０．６×ＳＳＣ：特に好ましい２回目の洗浄工程：６５℃にて０．３×ＳＳＣ。
【００６９】
ハイブリダイゼーション条件は、以下の式により適宜計算する：
融解温度Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６ ｌｏｇ［ｃ（Ｎａ＋）］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ））−５００／ｎ
（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ ａｎｄ Ｚｏｒｂａｓ　１９９８）。
【００７０】
式中、ｃは濃度であり、ｎは塩基対のハイブリダイズする配列部分の長さである。５００／ｎの項は１００ｂｐを超える配列について除外される。最大のストリンジェンシーの洗浄は、Ｔｍより５〜１５℃低い温度で、１５ｍＭ Ｎａ＋のイオン強度（０．１×ＳＳＣに相当する）である。ハイブリダイゼーションにＲＮＡプローブを用いる場合、溶解温度は１０〜１５℃高くなる。
【００７１】
殺線虫活性及び殺節足動活性を有する化合物を同定するための本発明の方法に用いるポリペプチドは、ＤＥ−Ａ−１９７ ０４ ０２４に記載の配列番号１及び配列番号３に記載の核酸によりコードされる。
【００７２】
また、本発明の方法に含まれるものとしては、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも１００個、特に好ましくは少なくとも５００個の連続したヌクレオチド、及びとりわけより好ましくは完全長にわたって、配列番号１又は配列番号３に示される配列と少なくとも７０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％、とりわけより好ましくは９５％一致するのものが挙げられる。
【００７３】
同様に、本発明に記載の核酸は、遺伝子組換え無脊椎動物を作製するのに用いることができる。後者は、本発明の受容体又は野生型とは異なるその変異体の発現に基づく試験システムにおいて用いることができる。これには、他の遺伝子又は遺伝子退治配列（例えば、プロモーター）の修飾が、そのために本発明の受容体またはその変異体の発現における変化を引き起こす、全ての遺伝子組換え無脊椎動物も含まれる。
【００７４】
遺伝子組換え無脊椎動物の作製は、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒにおいてはＰ因子介在の遺伝子導入によって、又はＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓにおいてはトランスポゾン介在の遺伝子導入によって行なわれる（例えばＴｃ１、Ｐｌａｓｔｅｒｋ １９９６）。
【００７５】
従って、本発明は、本発明の少なくとも１つの核酸を含む遺伝子組換え無脊椎動物、好ましくはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ またはＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓの種の遺伝子組換え無脊椎動物、及びその遺伝子組換え体の子孫にも関する。遺伝子組換え無脊椎動物は、本発明に基づく受容体を野生型とは異なる形態で含んでいることが好ましい。
【００７６】
本発明の核酸は、慣用の方法で作製することができる。例えば、核酸分子の完全な化学合成が可能である。さらに、本発明の配列のごく短い１片だけを化学的に合成し、そのようなオリゴヌクレオチドを放射活性又は蛍光染色によって標識することもできる。標識したオリゴヌクレオチドは、線虫ｍＲＮＡ又は昆虫ｍＲＮＡを出発物質として作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いることができる。この標識したオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするクローンを、関連するＤＮＡから単離するために選択する。単離したＤＮＡを特徴付けした後、本発明の核酸を簡単な方法により得る。
【００７７】
また、本発明に基づく核酸は、化学合成したオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ法により作製することもできる。
【００７８】
本明細書にて用いる用語「オリゴヌクレオチド」は、１０〜５０ヌクレオチド、好ましくは１５〜３０ヌクレオチドからなるＤＮＡ分子を意味する。それらは、例えば、化学合成でき、プローブとして用いることができる。
【００７９】
本発明に基づく核酸は、コード領域近傍に天然に存在する調節領域の単離と特徴付けのために用いることができる。
【００８０】
同様に、本発明の方法により、本発明にしたがって使用される核酸又は本発明にしたがって使用されるＤＮＡ構築物を含むベクターを使用する。使用し得るベクターは、分子生物学の実験室で用いられる、全てのファージ、プラスミド、ファージミド、ファスミド、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、人工染色体又は粒子銃に適した粒子である。
【００８１】
好ましいベクターには、植物細胞用のｐＢＩＮおよびその誘導体、酵母細胞用のｐＦＬ６１、細菌細胞用のｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクター、ファージ用のλＺＡＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）がある。
【００８２】
種々のベクターが用いられ、多くの構築物が本発明の範囲内で作製される。同様に、本発明は細胞系の一過性または安定な形質転換およびＨＣ１１０−Ｒ受容体の安定な発現のために用いるベクターに関する。
【００８３】
Ｎ末端ＥＧＦＰタグを有する融合タンパク質（ＥＧＦＰ−ＨＣ１１０−Ｒ）又はＣ末端ＥＧＦＰタグを有する融合タンパク質（ＨＣ１１０−Ｒ−ＥＧＦＰ）を発現するＥＧＦＰ構築物を、真核生物細胞における一過性発現のために作製した。同様に、本発明は、これらのベクター及び慣用のＧＦＰベクターによってコードされるポリペプチド、およびレッドシフト変異体及びブルーシフト変異体に関する。
【００８４】
更なる構築物、ベクターｐＭｙｃ６ｘＨｉｓは安定な発現に用いることができ、同様に本発明はそれらに関する。ベクターｐＭｙｃ６ｘＨｉｓは、制限酵素ＮｈｉＩとＳｆｉＩでの２重消化した後、末端を平滑化し、ベクターを再びライゲーションすることによって、ベクターｐＳｅｃＴａｇＡ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｌｅｅｋ， ＮＬ］から得られる。
【００８５】
さらに、本発明は本発明にしたがって用いられる核酸、又は本発明にしたがって用いられるベクターを含む宿主細胞に関する。
【００８６】
本発明は特に、ＨＣ１１０−Ｒ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓを用いて安定に形質転換したＨＥＫ−２９３細胞系（３８ １２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ、Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨから国際寄託当局 ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇに、ナンバーＤＳＭ ＡＣＣ２４６４として寄託した）に関する。
【００８７】
本発明は同様に、本発明にしたがって用いられる核酸または本発明にしたがって用いられるベクター、及び細胞がＣａ２＋の存在下で発光する発光タンパク質、エクオリンを発現することを可能にするベクターを含む宿主細胞に関する。対応する宿主細胞は、Ｃａ２＋濃度の変化、即ち、例えばＨＣ１１０−Ｒに対する物質の効果を、エクオリン指示薬の助けを借りて追跡することが可能である。本発明は特に、エクオリンを発現することが可能で、３８ １２４ Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ Ｗｅｇ １ｂ、Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨから国際寄託当局 ＤＳＭＺ−Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇに、ナンバーＤＳＭ ＡＣＣ２４６５として寄託されたＨＣ１１０−Ｒ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓによって安定に形質転換したＨＥＫ−２９３細胞系に関する。
【００８８】
本明細書にて用いる用語「宿主細胞」は、本発明の核酸を天然では含まない細胞に関する。
【００８９】
適切且つ好ましい宿主細胞は、酵母、哺乳動物、両生類、昆虫又は植物細胞などの真核生物細胞である。好ましい真核生物宿主細胞には、ＨＥＫ−２９３、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ Ｓ２、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９、Ｋｃ、ＣＨＯ、ＨｅｐＧ−２、Ｋ１、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３又はＢＨＫ細胞があり、特にアフリカツメガエル（ｘｅｎｏｐｕｓ ｏｏｃｙｔｅｓ）及びＨＥＫ−２９３又はＣＯＳ−７細胞がとりわけ好ましい。
【００９０】
同様に、本発明は、蠕虫由来の、特に好ましくは線形動物門、とりわけ好ましくは毛様線虫科由来の、とりわけさらに好ましくは捻転胃虫属由来の、及び最も好ましくはＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ由来のＤＮＡの検出のための、出願番号ＤＥ−Ａ−１９７ ０４ ０２４に記載の配列番号２に対応するＤＮＡの使用に関する。
【００９１】
さらに、本発明は上記のＤＮＡ配列の領域又はその相補鎖に対応するオリゴヌクレオチド、及びそれとハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、それらのオリゴヌクレオチド又はその一部の、
ａ）　ノーザンブロット分析又はサザンブロット分析におけるプローブ、
ｂ） 上記の蠕虫を検出するための診断方法におけるＰＣＲプライマー（ここに、該ＰＣＲプライマーとＰＣＲ技術を利用して、関連する蠕虫のＤＮＡを特異的に増幅し、同定する）
としての使用に関する。
【００９２】
さらに、本発明は、好ましくは線形動物門の、特に好ましくは毛様線虫科の、さらにより好ましくは捻転胃虫属の、及び最も好ましくはＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの蠕虫を検出する方法であって、上記オリゴヌクレオチドは該生物由来のＤＮＡ配列と特異的にハイブリダイズし、次いでＰＣＲ技術により増幅される方法に関する。
【００９３】
既述生物の検出は、例えば
ａ）　本発明のＨＣ１１０−ＲをコードするＤＮＡまたはその相補鎖、またはその５’若しくは３’隣接領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを提供し、
ｂ）　該オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーを、適当に調製したＤＮＡ含有試料と接触させ、
ｃ）　該オリゴヌクレオチド又はプライマーのハイブリダイゼーションを（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて）検出し、
ｄ）　検出したＨＣ１１０−Ｒ遺伝子の配列を決定し、そして、
ｅ）　この配列と本発明に記載のＤＮＡ配列、好ましくは出願番号ＤＥ−Ａ−１９７ ０４ ０２４に記載の配列番号２の配列とを比較する、
ことによって行なうことができる。
【００９４】
同様に、本発明は、好ましくは線形動物門の、特に好ましくは毛様線虫科の、さらにより好ましくは捻転胃虫属の、及び最も好ましくはＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓの蠕虫を検出する診断試験キットに関し、キットは、上記系統の群から種を検出する方法に用いることができる上記オリゴヌクレオチドを特に利用する。
【００９５】
同様に、本発明は上記の診断試験キットに関し、この試験キットに利用できるオリゴヌクレオチドは検出可能なマーカーと共に提供される。そのような検出可能なマーカーには、特に酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害物質、蛍光マーカー、発色団、発光マーカー及び放射性同位体が挙げられる。
【００９６】
さらに、本発明は、蠕虫、好ましくは線形動物門、特に好ましくは毛様線虫科、さらにより好ましくは捻転胃虫属及び最も好ましくはＨａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ由来の、上記ＨＣ１１０−Ｒポリペプチドまたはその断片、またはそれらと７０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％及びよりさらに好ましくは９５％相同な受容体タンパク質の、少なくとも１つのＨＣ１１０−Ｒポリペプチド又はその断片、またはそれらと７０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％及びよりさらに好ましくは９５％相同な受容体タンパク質を含有するワクチンを生産するための使用に関する。この場合、このワクチンは、上記ＨＣ１１０−Ｒタンパク質に特異的な免疫応答を誘発できる。
【００９７】
好ましい態様において、ワクチンは、抗原決定基、例えば出願番号ＤＥ−Ａ−１９７ ０４ ０２４に記載の配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドの一個の決定基、又は上記ＤＮＡ又はその断片によりコードされるポリペプチドの一個の決定基を含んでいる。
【００９８】
さらに本発明は、本発明にしたがって用いられるポリペプチドを生産する方法に関する。周知の核酸によりコードされているポリペプチドは、その核酸を含む宿主細胞を好ましい条件下にて培養することによって製造することができる。次いで、所望のポリペプチドは、従来法により細胞又は培地から単離できる。また、そのポリペプチドをインビトロの系で製造することもできる。
【００９９】
本発明の核酸を用いて宿主細胞によって合成させた本発明に記載のポリペプチドを単離する迅速な方法は、例えば実施例に記載のように、単純な方法で融合パートナーをアフィニティー精製することができる融合タンパク質の発現によって開始される。融合パートナーは、例えばグルタチオンＳトランスフェラーゼが挙げられる。次いで、その融合タンパク質をグルタチオンアフィニティーカラムにて精製できる。融合パートナーは、例えば融合パートナーと精製される本発明ポリペプチドとの間のリンカーでの、部分的なタンパク質加水分解開裂により除去できる。このリンカーは、トリプシンによる開裂のための部位を規定するアルギニンやリシン残基などの標的アミノ酸を含むよう設計することができる。そのようなリンカーは、オリゴヌクレオチドを用いる標準的なクローニング法を用いることによって作製することができる。もう１つの可能な方法は、ヒスチジン融合タンパク質の使用と、Ｎｉ２＋タロン（Ｔａｌｏｎ）カラム上でのその精製に基づく。
【０１００】
さらに可能な精製法としては、調製用電気泳動法、ＦＰＬＣ、ＨＰＬＣ（例えば、ゲルろ過カラム、逆相カラム又は微疎水性（ｓｌｉｇｈｔｌｙ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）カラムを用いる）、ゲルろ過、区別的精製（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、イオン交換クロマトグラフィー及びアフィニティークロマトグラフィーに基づく。
【０１０１】
受容体様タンパク質キナーゼは膜タンパク質であるため、この精製法においては、例えば、本ポリペプチドの２次構造及び３次構造に僅かにしか又は全く影響を及ぼさない界面活性剤、例えば非イオン性界面活性剤を用いて、界面活性剤抽出を行なうことが好ましい。
【０１０２】
本発明にしたがって使用されるポリペプチドの精製には、本発明の核酸を発現する宿主細胞から出発する膜の単離が含まれ得る。そのような細胞は、ＨＣ１１０−Ｒ遺伝子を元来発現する細胞由来の膜と比較して、少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍、さらにより好ましくは少なくとも１０００倍の量で膜区画に見られるポリペプチド量に十分なコピー数のポリペプチドを発現する細胞であることが好ましい。
【０１０３】
本明細書中で用いる用語「単離又は精製」は、ポリペプチドを他のタンパク質又は細胞若しくは組織の他の巨大分子から分離することを意味する。ポリペプチドを含む本発明の組成物は、宿主細胞由来の調製物と比較して、タンパク質量が少なくとも１０倍、特に好ましくは少なくとも１００倍豊富であることが好ましい。
【０１０４】
また、本発明のポリペプチドは、該ポリペプチドに結合する抗体を用いれば、融合パートナーを用いることなくアフィニティー精製できる。
【０１０５】
さらに、本発明は上記ポリペプチド又は受容体と特異的に結合する抗体に関する。そのような抗体は慣用の方法により精製される。例えば、そのような抗体は、実質的な免疫担当宿主に、Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ由来のＨＣ１１０−Ｒ受容体のような本発明の膜貫通受容体、又はその断片の、抗体産生に十分な量を注射し、次いでその抗体を単離することにより製造しうる。さらに、それ自体が周知である方法にて、モノクローナル抗体を産生する不死化細胞系を得ることができる。抗体は、検出試薬を用いて適当に標識化できる。そのような標識試薬の好ましい例としては、酵素、放射標識エレメント、蛍光化学物質、又はビオチンがある。完全抗体に代えて、所望の特異的な結合特性を有する断片を用いることもまた可能である。
【０１０６】
本明細書にて用いる用語「アゴニスト」は、膜貫通受容体を活性化する分子を意味する。
【０１０７】
本明細書にて用いる用語「アンタゴニスト」はアゴニストの結合部位にてアゴニストに取って代わるかアゴニストの機能を阻害する分子を表す。
【０１０８】
本明細書にて用いる用語「モジュレータ」はアゴニスト及びアンタゴニストの総称である。モジュレーターは、本発明に記載のポリペプチドと結合する小さい有機化合物分子、ペプチド又は抗体であっても良い。さらにモジュレーターは、ある分子に結合する小さな有機化合物分子、ペプチドまたは抗体であって、その分子が今度は本発明のポリペプチドに結合することによりその生物学的活性に影響を与えるものであってよい。モジュレーターは、天然の基質及びリガンドの模擬物であっても良い。
【０１０９】
モジュレーターは、小さな有機化合物であることが好ましい。
【０１１０】
ポリペプチドに対するモジュレーターの結合は、それらで処置した蠕虫又は節足動物の細胞のプロセスを変え、死に至らしめ得る。
【０１１１】
従って、本発明はさらに、駆虫剤及び殺節足動物剤としてのポリペプチドのモジュレーターの使用にも及ぶ。
【０１１２】
同様に、本発明は、特に、駆虫剤としてのα−ＬＴＸの使用に関する。
【０１１３】
また、本発明の方法における核酸又はポリペプチドの本発明に従う使用は、本発明の受容体と結合する化合物を見出すことを可能にする。同様に、後者は駆虫剤として、例えば植物については殺線虫剤として、又は動物については駆虫活性物質として用いることができる。例えば、核酸を含み、その対応する受容体又はポリペプチドを発現する宿主細胞、或いはその遺伝子産物を、宿主細胞、受容体又は個々のポリペプチドと少なくとも１つの化合物とが相互作用できる条件下で、化合物又は化合物の混合物と接触させる。
【０１１４】
本発明は、蠕虫又は節足動物由来の膜貫通受容体、好ましくはセクレチンサブファミリーのＧＰＣＲ、特に好ましくはＨ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ由来の受容体ＨＣ１１０−Ｒと結合し、配列がそれらと７０％、好ましくは８０％、特に好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％一致する受容体と結合する、殺線虫活性物質を同定するために適当な方法に、特に関する。しかしながら、本方法は、本明細書に記載の種以外の種由来のＨＣ１１０−Ｒ相同受容体を用いて実施することもできる。本発明のＨＣ１１０−Ｒ以外の受容体を用いる方法は、本発明に完全に包含される。
【０１１５】
本発明に記載の方法には、ハイスループットスクリーニング（例えば、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）及び超ハイスループットスクリーニング（ＵＨＴＳ））が含まれる。この目的のために、本発明の核酸及び／又は本発明に記載のポリペプチドを含む宿主細胞及び無細胞調製物の両方を使用することができる。
【０１１６】
無細胞試験システム
化合物及び天然抽出物を試験することを目的とする多くの試験システムは、与えられた期間に試験する物質の数を最大にするため、ハイスループット用に設計される。無細胞操作に基づく試験システムは、精製した又は半精製したタンパク質を必要とする。これらは、標的タンパク質に対するある物質の効果の可能性を主として検出することを目的とする「初期の」試験に適当である。
【０１１７】
細胞毒性などの効果は、これらインビトロの系では、通常無視する。この試験システムは、物質の阻害または抑制効果と刺激効果の両方をさらに試験する。物質の効果は、一連の濃度依存試験により確認することができる。被験物質を含まない対照混合物は、その効果を評価するために用いることができる。
【０１１８】
細胞ベース試験システム
ＨＣ１１０−Ｒ及び相同受容体の活性を調節する物質を同定するための、細胞ベースの試験システムの開発は、本発明によって利用可能なＨＣ１１０−Ｒ受容体で安定にトランスフェクションした細胞系により開発が可能であるが、本発明に基づいて同定することができる他の種由来の対応する相同受容体によっても開発することができる。
【０１１９】
同様に、本発明はカルシウムチャネル遮断物質として有効なその他の化合物の同定を可能にする。
【０１２０】
モジュレーターは、合成反応混合物（例えば、インビトロ翻訳の産物）または細胞を構成する物質、例えば、膜又は本ポリペプチドを含む他の任意の調製物）をアゴニスト及びアンタゴニストであり得る候補分子の存在下又は非存在下にて、本ポリペプチドの標識した基質又はリガンドと共にインキュベートすることによって見い出すことができる。本発明のポリペプチドの活性を増大又は低下させる候補分子の能力は、標識したリガンドの結合を増大又は低下させることあるいは標識した基質の変換を増大又は低下させることから明らかとなる。十分に結合し且つ本発明のポリペプチドの活性を増大させる分子がアゴニストである。十分に結合するが本発明に記載のポリペプチドの生物学的活性を引き起こさない分子が、おそらく良いアンタゴニストである。
【０１２１】
シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）
ＨＣ１１０−Ｒ及びそれと相同な受容体タンパク質の活性を調節する物質を同定するための１つの可能性として、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）と呼ばれるものがある（ＥＰ−Ａ−０１５ ４７３）。この試験システムは、放射能標識したリガンド（例えば、小さな有機分子又は第二の放射能標識したタンパク質分子）と受容体（例えば、ＨＣ１１０−Ｒ）との相互作用を利用するものである。この場合、受容体を、シンチレーティング分子と共に提供される微粒子又はビーズと結合させる。放射能の減衰の間に、球形のシンチレーティング物質は放射性マーカーの素粒子により励起され、検出可能な光子を発する。シグナルを発するようリガンドにより放射された粒子のみが、受容体又はＨＣ１１０−Ｒと結合したリガンドにより発せられるものとなるよう、試験条件を最適化する。
【０１２２】
１つの可能な態様では、ＨＣ１１０−Ｒを、被験物質との相互作用または結合を伴う又は伴わずにビーズと結合させる。さらに、この場合、ＨＣ１１０−Ｒ受容体の断片を用いることも可能であろう。放射能標識したリガンドは、例えば、標識したα−ＬＴＸ、ニフェジピン又は標識したデプシペプチドであって良い。結合性リガンドを、固定化したＨＣ１１０−Ｒ受容体と結合させる場合、このリガンドは、それ自体を接触部分の領域に結合させるために、固定化したＨＣ１１０−Ｒと標識化リガンドとの間に存在する相互作用を阻害又は破壊する必要があるであろう。次いで、標識したＨＣ１１０−Ｒ受容体とのうまく結合したものを、閃光で検出することができる。同様に、固定化した標識化リガンドと固定化していない標識化リガンドとの間の複合体は、被験物質の結合により破壊され、閃光で検出できる強度に減衰する。次いで、その試験システムは補助的な阻害システムに対応する
【０１２３】
２ハイブリッドシステム
全細胞に基づく試験システムの別の例としては、２ハイブリッドシステムと呼ばれるものがある。その具体的な例としては、相互作用トラップと呼ばれるものがある。これには、酵母における相互作用するタンパク質を遺伝的に選択することが関係する（例えば、Ｇｙｕｒｉｓら、１９９３を参照のこと）。この試験システムは、検出可能なシグナルを生じる相互作用の成功を通じて、２つのタンパク質の相互作用を検出し、そして描写するよう設計される。
【０１２４】
そのような試験システムは、大量の被験物質を所定の期間内に試験するのにも応用できる。
【０１２５】
このシステムは、２つのベクター、即ち「おとり」ベクターと「餌食」ベクターの構築に基づく。本発明のＨＣ１１０−Ｒ又はその断片をコードする遺伝子をおとりベクター中にクローニングした後、ＤＮＡ結合タンパク質であるＬｅｘＡタンパク質との融合タンパク質として発現させる。ＨＣ１１０−Ｒ相互作用パートナー、例えばα−ＬＴＸをコードする第２の遺伝子を、餌食ベクター中にクローニングし、Ｂ４２餌食タンパク質との融合タンパク質として発現させる。両ベクターは、ｌａｃＺ又はＨＩＳ２レポーター遺伝子の５’側にＬｅｘＡ結合ＤＮＡのコピーを含むＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ宿主に存在する。この２つの融合タンパク質の間で相互作用が起こると、受容体遺伝子の転写が活性化される。被験物質の存在により、この相互作用が阻害又は破壊されると、この２つの融合タンパク質はもはや相互作用できず、レポーター遺伝子産物も産生されない。
【０１２６】
置換試験
本発明に記載のポリペプチドのモジュレーターを見つけることができる別の方法の例としては置換試験があり、これは、この目的に適した条件下にて、本発明のポリペプチドと可能性のあるモジュレーターとを、本発明のポリペプチドと結合することが知られている分子、例えば天然の基質若しくはリガンド、又は基質若しくはリガンド模擬体と、共に合わせる試験である。α−ＬＴＸは、本発明の方法に従って、この試験に好ましく使用される。
【０１２７】
既知の分析システム、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ ＡＢ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎのシステムは、完全なＨＣ１１０−Ｒタンパク質、またはＨＣ１１０−ＲのＮ−宿主Ｃ末端欠失変異体、インビトロ突然変異誘発又は他の既知の方法により改変されたＨＣ１１０−Ｒ分子のその他の変異体を用いる、分子相互作用試験に用いることができる。これには、１つに
（ｉ）　ＨＣ１１０−Ｒ受容体又はその断片を、既知の化学的方法（アミン、チオール、アルデヒドを介したカップリング）により結合させること、又はバイオチップへのアフィニティー結合（例えば、ストレプトアビジン−ビオチン， ＩＭＡＣ）させること、あるいはもう１つに、
（ｉｉ）α−ＬＴＸ又は別のモジュレーター、例えばＢＡＹ４４−４４００又は他の可能性のあるリガンドを、（ｉ）に記載したようにそのチップに結合させることが必要である。
【０１２８】
固定化した分子と、溶液中に存在するリガンド（ＨＣ１１０−Ｒタンパク質又は任意のモジュレーター、例えばＢＡＹ４４−４４００など）との結合を、物理的に測定する。Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔにて、金の薄層を有するセンサーチップ上にリガンドを固定化する。分析物の溶液は、チップ上のマイクロフローセルによって拡散する。固定化されたリガンドに分析物が結合することにより、その表面の局所的な濃度が増大し、その媒体付近の金層の屈折率が徐々に増大する。これは、金属中の自由電子（プラズモン）と器具から発せられる光子との間の相互作用に対する効果である。この物理的変化は、チップ上の分子の質量及び数に比例し、そのリガンド−分析物間の結合をリアルタイムで記録し、みかけの結合／解離定数を決定することが可能である （Ｆｉｖａｓｈら、１９９８）。結合の特異性は、競合実験により立証する。
【０１２９】
さらに、対応する測定を、リガンドの結合に重要なＨＣ１１０−Ｒタンパク質ドメインを決定するために、及び新規の、これまで開示されていないＨＣ１１０−Ｒのリガンドを同定するために用いる。
【０１３０】
カルシウムイメージング
カルシウムイメージング又はシグナリングは、ＨＣ１１０−Ｒと相互作用する物質を検出するもう１つの方法と考えられる（例えば、図１１及び１０を参照のこと）。これには、細胞内カルシウムレベルの変化を検出可能にするよう補助するカルシウム指示薬の使用が必要である。カルシウム指示薬をローディングしたＨＣ１１０−Ｒ発現細胞をこの方法に用いる。ＨＣ１１０−Ｒアゴニストにより引き起こされるカルシウム流入が存在する場合、または細胞内カルシウムの放出が存在する場合、指示薬のカルシウム取り込みの関数として、ＵＶ照射下で吸光度の変化が現れる。アンタゴニストは、このシステムでは、アゴニスト（例えば、α−ＬＴＸ）により誘導されるカルシウムシグナルを完全に又は部分的に抑制することによって同定することができる。この目的に好ましい可能なカルシウム指示薬には、Ｆｕｒａ−２（Ｓｉｇｍｅ）又はＩｎｄｏ−１ （ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）がある。
【０１３１】
さらに、カルシウム指示薬は可視光により励起され、その蛍光特性が、カルシウム取り込みに依存して検出可能な形で変化する。指示薬Ｆｌｕｏ−３及びＦｌｕｏ−４は、カルシウム親和性が高い。Ｆｌｕｏ−４は、強い蛍光シグナルを有し、ＨＥＫ−２９３細胞の場合のように、細胞を低濃度でのみ用いる試験システムにおける測定に特に好ましい。さらに、指示薬として、Ｒｈｏｄ−２、ｘ−Ｒｈｏｄ−１、Ｆｌｕｏ−５Ｎ、Ｆｌｕｏ−５Ｆ、Ｍａｇ−Ｆｌｕｏ−４、Ｒｈｏｄ−５Ｆ、Ｒｈｏｄ−５Ｎ、Ｙ−Ｒｈｏｄ−５Ｎ、Ｍａｇ−Ｒｈｏｄ−２、Ｍａｇ−Ｘ−Ｒｈｏｄ−１、カルシウムグリーン−１及び−２、カルシウムグリーン−５Ｎ、オレゴングリーン４８８ ＢＡＰＴＡ−１、オレゴングリーン４８８ ＢＡＰＴＡ−２及び−５Ｎ、Ｆｕｒａレッド、カルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）などがある。
【０１３２】
カルシウム指示薬を細胞にローディングする別法として、標的細胞における発光タンパク質の組換え発現がある。そして、これらの発光タンパク質は、カルシウムイオンと複合体を形成すると、光を発するように応答する。すでに多くの研究や試験システムによく用いられている発光タンパク質として、エクオリンがある。標的タンパク質をエクオリンと同時に発現する細胞は、まず初めに、この試験方法において発光団セレンテラジンと共にローディングする。細胞により形成されるアポエクオリンは、セレンテラジンおよび二酸化炭素と複合体を形成する。続いてカルシウムも細胞に入り、この複合体と結合すると、二酸化炭素を放出し青色の光（最大発光約４６６ｎｍ）を発する。この場合の光の発光は、細胞内存在するカルシウムの濃度と相関する。
【０１３３】
このように、本発明は同様に、ＨＣ１１０−Ｒ、その断片、又は他の生物由来の類似タンパク質の使用に関し、該受容体の機能又は該受容体に対するモジュレーターの結合が、エクオリン又は同様の発光タンパク質により媒介される光シグナルにより検出される。
【０１３４】
また、この方法において、本発明の核酸を含む宿主細胞又は遺伝子導入無脊椎動物を使用することによって、受容体の発現に変化を及ぼす物質を見い出すことができる。そのような物質もまた、価値ある駆虫薬を示し得る。
【０１３５】
したがって、本発明の方法により見出される活性物質は、動物の害虫、特に農場、森林、倉庫において発生する昆虫、クモ及び線虫の退治、材料の保護、及び衛生部門に好ましい。本発明の方法により見出される活性物質は、線虫及びクモを退治するのに特に好ましい。上記の害虫には、以下のものが含まれる。
【０１３６】
Ｉｓｏｐｏｄａ目に属するもの、例えば、Ｏｎｉｓｃｕｓ ａｓｅｌｌｕｓ， Ａｒｍａｄｉｌｌｉｄｉｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ， Ｐｏｒｃｅｌｌｉｏ ｓｃａｂｅｒ。
Ｄｉｐｌｏｐｏｄａ目に属するもの、例えば、Ｂｌａｎｉｕｌｕｓ ｇｕｔｔｕｌａｔｕｓ。
Ｃｈｉｌｏｐｏｄａ目に属するもの、例えば、Ｇｅｏｐｈｉｌｕｓ ｃａｒｐｏｐｈａｇｕｓ， Ｓｃｕｔｉｇｅｒａ ｓｐｐ．。
Ｓｙｍｐｈｙｌａ目に属するもの、例えば、Ｓｃｕｔｉｇｅｒｅｌｌａ ｉｍｍａｃｕｌａｔａ。
Ｔｈｙｓａｎｕｒａ目に属するもの、例えば、Ｌｅｐｉｓｍａ ｓａｃｃｈａｒｉｎａ。
Ｃｏｌｌｅｍｂｏｌａ目に属するもの、例えば、Ｏｎｙｃｈｉｕｒｕｓ ａｒｍａｔｕｓ。
Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ目に属するもの、例えば、Ａｃｈｅｔａ ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｓ， Ｇｒｙｌｌｏｔａｌｐａ ｓｐｐ．， Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉｏｉｄｅｓ， Ｍｅｌａｎｏｐｌｕｓ ｓｐｐ．， Ｓｃｈｉｓｔｏｃｅｒｃａ ｇｒｅｇａｒｉａ。
Ｂｌａｔｔａｒｉａ目に属するもの、例えば、Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ， Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ， Ｌｅｕｃｏｐｈａｅａ ｍａｄｅｒａｅ， Ｂｌａｔｔｅｌｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ。
Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ目に属するもの、例えば、Ｆｏｒｆｉｃｕｌａ ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ。
Ｉｓｏｐｔｅｒａ目に属するもの、例えば、Ｒｅｔｉｃｕｌｉｔｅｒｍｅｓ ｓｐｐ．。
Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａ目に属するもの、例えば、Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ ｈｕｍａｎｕｓ ｃｏｒｐｏｒｉｓ， Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｓｐｐ．， Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｓｐｐ．， Ｔｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ ｓｐｐ．， Ｄａｍａｌｉｎｉａ ｓｐｐ．。
Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ目に属するもの、例えば、Ｈｅｒｃｉｎｏｔｈｒｉｐｓ ｆｅｍｏｒａｌｉｓ， Ｔｈｒｉｐｓ ｔａｂａｃｉ， Ｔｈｒｉｐｓ ｐａｌｍｉ， Ｆｒａｎｋｌｉｎｅｌｌａ ａｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ。
Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒａ目に属するもの、例えば、Ｅｕｒｙｇａｓｔｅｒ ｓｐｐ．， Ｄｙｓｄｅｒｃｕｓ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ， Ｐｉｅｓｍａ ｑｕａｄｒａｔａ， Ｃｉｍｅｘ ｌｅｃｔｕｌａｒｉｕｓ， Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｐｒｏｌｉｘｕｓ， Ｔｒｉａｔｏｍａ ｓｐｐ。
【０１３７】
Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ目に属するもの、例えば、Ａｌｅｕｒｏｄｅｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ， Ｂｅｍｉｓｉａ ｔａｂａｃｉ， Ｔｒｉａｌｅｕｒｏｄｅｓ ｖａｐｏｒａｒｉｏｒｕｍ， Ａｐｈｉｓ ｇｏｓｓｙｐｉｉ， Ｂｒｅｖｉｃｏｒｙｎｅ ｂｒａｓｓｉｃａｅ， Ｃｒｙｐｔｏｍｙｚｕｓ ｒｉｂｉｓ， Ａｐｈｉｓ ｆａｂａｅ， Ａｐｈｉｓ ｐｏｍｉ， Ｅｒｉｏｓｏｍａ ｌａｎｉｇｅｒｕｍ， Ｈｙａｌｏｐｔｅｒｕｓ ａｒｕｎｄｉｎｉｓ， Ｐｈｙｌｌｏｘｅｒａ ｖａｓｔａｔｒｉｘ， Ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ ｓｐｐ．， Ｍａｃｒｏｓｉｐｈｕｍ ａｖｅｎａｅ， Ｍｙｚｕｓ ｓｐｐ．， Ｐｈｏｒｏｄｏｎ ｈｕｍｕｌｉ， Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ， Ｅｍｐｏａｓｃａ ｓｐｐ．， Ｅｕｓｃｅｌｉｓ ｂｉｌｏｂａｔｕｓ， Ｎｅｐｈｏｔｅｔｔｉｘ ｃｉｎｃｔｉｃｅｐｓ， Ｌｅｃａｎｉｕｍ ｃｏｒｎｉ， Ｓａｉｓｓｅｔｉａ ｏｌｅａｅ， Ｌａｏｄｅｌｐｈａｘ ｓｔｒｉａｔｅｌｌｕｓ， Ｎｉｌａｐａｒｖａｔａ ｌｕｇｅｎｓ， Ａｏｎｉｄｉｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉｉ， Ａｓｐｉｄｉｏｔｕｓ ｈｅｄｅｒａｅ， Ｐｓｅｕｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．， Ｐｓｙｌｌａ ｓｐｐ。
【０１３８】
Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目に属するもの、例えば、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ， Ｂｕｐａｌｕｓ ｐｉｎｉａｒｉｕｓ， Ｃｈｅｉｍａｔｏｂｉａ ｂｒｕｍａｔａ， Ｌｉｔｈｏｃｏｌｌｅｔｉｓ ｂｌａｎｃａｒｄｅｌｌａ， Ｈｙｐｏｎｏｍｅｕｔａ ｐａｄｅｌｌａ， Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ， Ｍａｌａｃｏｓｏｍａ ｎｅｕｓｔｒｉａ， Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ ｃｈｒｙｓｏｒｒｈｏｅａ， Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｓｐｐ．， Ｂｕｃｃｕｌａｔｒｉｘ ｔｈｕｒｂｅｒｉｅｌｌａ， Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｓｐｐ．， Ｅｕｘｏａ ｓｐｐ．， Ｆｅｌｔｉａ ｓｐｐ．， Ｅａｒｉａｓ ｉｎｓｕｌａｎａ， Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｓｐｐ．， Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ， Ｐａｎｏｌｉｓ ｆｌａｍｍｅａ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．， Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ， Ｃａｒｐｏｃａｐｓａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ， Ｐｉｅｒｉｓ ｓｐｐ．， Ｃｈｉｌｏ ｓｐｐ．， Ｐｙｒａｕｓｔａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ， Ｅｐｈｅｓｔｉａ ｋｕｅｈｎｉｅｌｌａ， Ｇａｌｌｅｒｉａ ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ， Ｔｉｎｅｏｌａ ｂｉｓｓｅｌｌｉｅｌｌａ， Ｔｉｎｅａ ｐｅｌｌｉｏｎｅｌｌａ， Ｈｏｆｍａｎｎｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｓｐｒｅｔｅｌｌａ， Ｃａｃｏｅｃｉａ ｐｏｄａｎａ， Ｃａｐｕａ ｒｅｔｉｃｕｌａｎａ， Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ， Ｃｌｙｓｉａ ａｍｂｉｇｕｅｌｌａ， Ｈｏｍｏｎａ ｍａｇｎａｎｉｍａ， Ｔｏｒｔｒｉｘ ｖｉｒｉｄａｎａ， Ｃｎａｐｈａｌｏｃｅｒｕｓ ｓｐｐ．， Ｏｕｌｅｍａ ｏｒｙｚａｅ。
Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目に属するもの、例えば、Ａｎｏｂｉｕｍ ｐｕｎｃｔａｔｕｍ， Ｒｈｉｚｏｐｅｒｔｈａ ｄｏｍｉｎｉｃａ， Ｂｒｕｃｈｉｄｉｕｓ ｏｂｔｅｃｔｕｓ， Ａｃａｎｔｈｏｓｃｅｌｉｄｅｓ ｏｂｔｅｃｔｕｓ， Ｈｙｌｏｔｒｕｐｅｓ ｂａｊｕｌｕｓ， Ａｇｅｌａｓｔｉｃａ ａｌｎｉ， Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ， Ｐｈａｅｄｏｎ ｃｏｃｈｌｅａｒｉａｅ， Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｓｐｐ．， Ｐｓｙｌｌｉｏｄｅｓ ｃｈｒｙｓｏｃｅｐｈａｌａ， Ｅｐｉｌａｃｈｎａ ｖａｒｉｖｅｓｔｉｓ， Ａｔｏｍａｒｉａ ｓｐｐ．， Ｏｒｙｚａｅｐｈｉｌｕｓ ｓｕｒｉｎａｍｅｎｓｉｓ， Ａｎｔｈｏｎｏｍｕｓ ｓｐｐ．， Ｓｉｔｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．， Ｏｔｉｏｒｒｈｙｎｃｈｕｓ ｓｕｌｃａｔｕｓ， Ｃｏｓｍｏｐｏｌｉｔｅｓ ｓｏｒｄｉｄｕｓ， Ｃｅｕｔｈｏｒｒｈｙｎｃｈｕｓ ａｓｓｉｍｉｌｉｓ， Ｈｙｐｅｒａ ｐｏｓｔｉｃａ， Ｄｅｒｍｅｓｔｅｓ ｓｐｐ．， Ｔｒｏｇｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．， Ａｎｔｈｒｅｎｕｓ ｓｐｐ．， Ａｔｔａｇｅｎｕｓ ｓｐｐ．， Ｌｙｃｔｕｓ ｓｐｐ．， Ｍｅｌｉｇｅｔｈｅｓ ａｅｎｅｕｓ， Ｐｔｉｎｕｓ ｓｐｐ．， Ｎｉｐｔｕｓ ｈｏｌｏｌｅｕｃｕｓ， Ｇｉｂｂｉｕｍ ｐｓｙｌｌｏｉｄｅｓ， Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｓｐｐ．， Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ， Ａｇｒｉｏｔｅｓ ｓｐｐ．， Ｃｏｎｏｄｅｒｕｓ ｓｐｐ．， Ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ ｍｅｌｏｌｏｎｔｈａ， Ａｍｐｈｉｍａｌｌｏｎ ｓｏｌｓｔｉｔｉａｌｉｓ， Ｃｏｓｔｅｌｙｔｒａ ｚｅａｌａｎｄｉｃａ， Ｌｉｓｓｏｒｈｏｐｔｒｕｓ ｏｒｙｚｏｐｈｉｌｕｓ。
Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ目に属するもの、例えば、Ｄｉｐｒｉｏｎ ｓｐｐ．， Ｈｏｐｌｏｃａｍｐａ ｓｐｐ．， Ｌａｓｉｕｓ ｓｐｐ．， Ｍｏｎｏｍｏｒｉｕｍ ｐｈａｒａｏｎｉｓ， Ｖｅｓｐａ ｓｐｐ。
Ｄｉｐｔｅｒａ目に属するもの、例えば、Ａｅｄｅｓ ｓｐｐ．， Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｐｐ．， Ｃｕｌｅｘ ｓｐｐ．， Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ， Ｍｕｓｃａ ｓｐｐ．， Ｆａｎｎｉａ ｓｐｐ．， Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ ｅｒｙｔｈｒｏｃｅｐｈａｌａ， Ｌｕｃｉｌｉａ ｓｐｐ．， Ｃｈｒｙｓｏｍｙｉａ ｓｐｐ．， Ｃｕｔｅｒｅｂｒａ ｓｐｐ．， Ｇａｓｔｒｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．， Ｈｙｐｐｏｂｏｓｃａ ｓｐｐ．， Ｓｔｏｍｏｘｙｓ ｓｐｐ．， Ｏｅｓｔｒｕｓ ｓｐｐ．， Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．， Ｔａｂａｎｕｓ ｓｐｐ．， Ｔａｎｎｉａ ｓｐｐ．， Ｂｉｂｉｏ ｈｏｒｔｕｌａｎｕｓ， Ｏｓｃｉｎｅｌｌａ ｆｒｉｔ， Ｐｈｏｒｂｉａ ｓｐｐ．， Ｐｅｇｏｍｙｉａ ｈｙｏｓｃｙａｍｉ， Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ ｃａｐｉｔａｔａ， Ｄａｃｕｓ ｏｌｅａｅ， Ｔｉｐｕｌａ ｐａｌｕｄｏｓａ， Ｈｙｌｅｍｙｉａ ｓｐｐ．， Ｌｉｒｉｏｍｙｚａ ｓｐｐ．。
【０１３９】
Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ目に属するもの、例えば、Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ ｃｈｅｏｐｉｓ， Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ ｓｐｐ．。
【０１４０】
Ａｒａｃｈｎｉｄａ網に属するもの、例えば、Ｓｃｏｒｐｉｏ ｍａｕｒｕｓ， Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｍａｃｔａｎｓ， Ａｃａｒｕｓ ｓｉｒｏ， Ａｒｇａｓ ｓｐｐ．， Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｓｐｐ．， Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｕｓ ｇａｌｌｉｎａｅ， Ｅｒｉｏｐｈｙｅｓ ｒｉｂｉｓ， Ｐｈｙｌｌｏｃｏｐｔｒｕｔａ ｏｌｅｉｖｏｒａ， Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．， Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ｓｐｐ．， Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ｓｐｐ．， Ｈｙａｌｏｍｍａ ｓｐｐ．， Ｉｘｏｄｅｓ ｓｐｐ．， Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ ｓｐｐ．， Ｃｈｏｒｉｏｐｔｅｓ ｓｐｐ．， Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｐｐ．， Ｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ ｓｐｐ．， Ｂｒｙｏｂｉａ ｐｒａｅｔｉｏｓａ， Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ ｓｐｐ．， Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｓｐｐ．， Ｈｅｍｉｔａｒｓｏｎｅｍｕｓ ｓｐｐ．， Ｂｒｅｖｉｐａｌｐｕｓ ｓｐｐ．。
【０１４１】
植物寄生線虫としては、例えば、Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．， Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ， Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｉｐｓａｃｉ， Ｔｙｌｅｎｃｈｕｌｕｓ ｓｅｍｉｐｅｎｅｔｒａｎｓ， Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ｓｐｐ．， Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ ｓｐｐ．， Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ．， Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．， Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ ｓｐｐ．， Ｘｉｐｈｉｎｅｍａ ｓｐｐ．， Ｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ ｓｐｐ．， Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．が挙げられる。
【０１４２】
本発明に記載の方法を用いることで見い出された活性物質は、植物、衛生及び貯蔵品の害虫だけでなく、マダニ（ｈａｒｄ ｔｉｃｋｓ）、ヒメダニ（ｓｏｆｔ ｔｉｃｋｓ）、疥癬ダニ（ｍａｎｇｅ ｍｉｔｅｓ）、葉ダニ（ｌｅａｆ ｍｉｔｅｓ）、ハエ （噛むおよび舐める）、寄生性のハエ幼虫、しらみ、毛じらみ、毛皮しらみ（ｆｕｒ ｌｉｃｅ）及びノミなどの動物寄生生物（外寄生生物）に対する動物薬部門についても作用する。この寄生生物には、以下のものが含まれる。
【０１４３】
Ａｎｏｐｌｕｒｉｄａ目に属するもの、例えば、Ｈａｅｍａｔｏｐｉｎｕｓ ｓｐｐ．， Ｌｉｎｏｇｎａｔｈｕｓ ｓｐｐ．， Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ ｓｐｐ．， Ｐｈｔｉｒｕｓ ｓｐｐ．， Ｓｏｌｅｎｏｐｏｔｅｓ ｓｐｐ．。
Ｍａｌｌｏｐｈａｇｉｄａ目に属するもの、並びに、Ａｍｂｌｙｃｅｒｉｎａ及びＩｓｃｈｎｏｃｅｒｉｎａ亜目に属するもの、例えば、Ｔｒｉｍｅｎｏｐｏｎ ｓｐｐ．， Ｍｅｎｏｐｏｎ ｓｐｐ．， Ｔｒｉｎｏｔｏｎ ｓｐｐ．， Ｂｏｖｉｃｏｌａ ｓｐｐ．， Ｗｅｒｎｅｃｋｉｅｌｌａ ｓｐｐ．， Ｌｅｐｉｋｅｎｔｒｏｎ ｓｐｐ．， Ｄａｍａｌｉｎａ ｓｐｐ．， Ｔｒｉｃｈｏｄｅｃｔｅｓ ｓｐｐ．， Ｆｅｌｉｃｏｌａ ｓｐｐ．。
【０１４４】
Ｄｉｐｔｅｒａ目に属するもの、並びにＮｅｍａｔｏｃｅｒｉｎａ及びＢｒａｃｈｙｃｅｒｉｎａ亜目に属するもの、例えば、Ａｅｄｅｓ ｓｐｐ．， Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｐｐ．， Ｃｕｌｅｘ ｓｐｐ．， Ｓｉｍｕｌｉｕｍ ｓｐｐ．， Ｅｕｓｉｍｕｌｉｕｍ ｓｐｐ．， Ｐｈｌｅｂｏｔｏｍｕｓ ｓｐｐ．， Ｌｕｔｚｏｍｙｉａ ｓｐｐ．， Ｃｕｌｉｃｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．， Ｃｈｒｙｓｏｐｓ ｓｐｐ．， Ｈｙｂｏｍｉｔｒａ ｓｐｐ．， Ａｔｙｌｏｔｕｓ ｓｐｐ．， Ｔａｂａｎｕｓ ｓｐｐ．， Ｈａｅｍａｔｏｐｏｔａ ｓｐｐ．， Ｐｈｉｌｉｐｏｍｙｉａ ｓｐｐ．， Ｂｒａｕｌａ ｓｐｐ．， Ｍｕｓｃａ ｓｐｐ．， Ｈｙｄｒｏｔａｅａ ｓｐｐ．， Ｓｔｏｍｏｘｙｓ ｓｐｐ．， Ｈａｅｍａｔｏｂｉａ ｓｐｐ．， Ｍｏｒｅｌｌｉａ ｓｐｐ．， Ｆａｎｎｉａ ｓｐｐ．， Ｇｌｏｓｓｉｎａ ｓｐｐ．， Ｃａｌｌｉｐｈｏｒａ ｓｐｐ．， Ｌｕｃｉｌｉａ ｓｐｐ．， Ｃｈｒｙｓｏｍｙｉａ ｓｐｐ．， Ｗｏｈｌｆａｈｒｔｉａ ｓｐｐ．， Ｓａｒｃｏｐｈａｇａ ｓｐｐ．， Ｏｅｓｔｒｕｓ ｓｐｐ．， Ｈｙｐｏｄｅｒｍａ ｓｐｐ．， Ｇａｓｔｅｒｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．， Ｈｉｐｐｏｂｏｓｃａ ｓｐｐ．， Ｌｉｐｏｐｔｅｎａ ｓｐｐ．， Ｍｅｌｏｐｈａｇｕｓ ｓｐｐ．。
【０１４５】
Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒｉｄａ目に属するもの、例えば、Ｐｕｌｅｘ ｓｐｐ．， Ｃｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ ｓｐｐ．， Ｘｅｎｏｐｓｙｌｌａ ｓｐｐ．， Ｃｅｒａｔｏｐｈｙｌｌｕｓ ｓｐｐ．。
【０１４６】
Ｈｅｔｅｒｏｐｔｅｒｉｄａ目に属するもの、例えば、Ｃｉｍｅｘ ｓｐｐ．， Ｔｒｉａｔｏｍａ ｓｐｐ．， Ｒｈｏｄｎｉｕｓ ｓｐｐ．， Ｐａｎｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．。
【０１４７】
Ｂｌａｔｔａｒｉｄａ目に属するもの、例えば、Ｂｌａｔｔａ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ， Ｐｅｒｉｐｌａｎｅｔａ ａｍｅｒｉｃａｎａ， Ｂｌａｔｔｅｌａ ｇｅｒｍａｎｉｃａ， Ｓｕｐｅｌｌａ ｓｐｐ．。
【０１４８】
Ａｃａｒｉａ （Ａｃａｒｉｄａ）亜網に属するもの、並びにＭｅｔａ−及びＭｅｓｏｓｔｉｇｍａｔａ目に属するもの、例えば、Ａｒｇａｓ ｓｐｐ．， Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｕｓ ｓｐｐ．， Ｏｔｏｂｉｕｓ ｓｐｐ．， Ｉｘｏｄｅｓ ｓｐｐ．， Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ｓｐｐ．， Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｐ．， Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ ｓｐｐ．， Ｈａｅｍｏｐｈｙｓａｌｉｓ ｓｐｐ．， Ｈｙａｌｏｍｍａ ｓｐｐ．， Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ ｓｐｐ．， Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｕｓ ｓｐｐ．， Ｒａｉｌｌｉｅｔｉａ ｓｐｐ．， Ｐｎｅｕｍｏｎｙｓｓｕｓ ｓｐｐ．， Ｓｔｅｒｎｏｓｔｏｍａ ｓｐｐ．， Ｖａｒｒｏａ ｓｐｐ．。
【０１４９】
Ａｃｔｉｎｅｄｉｄａ （Ｐｒｏｓｔｉｇｍａｔａ） 及びＡｃａｒｉｄｉｄａ （Ａｓｔｉｇｍａｔａ）目に属するもの、例えば、Ａｃａｒａｐｉｓ ｓｐｐ．， Ｃｈｅｙｌｅｔｉｅｌｌａ ｓｐｐ．， Ｏｒｎｉｔｈｏｃｈｅｙｌｅｔｉａ ｓｐｐ．， Ｍｙｏｂｉａ ｓｐｐ．， Ｐｓｏｒｅｒｇａｔｅｓ ｓｐｐ．， Ｄｅｍｏｄｅｘ ｓｐｐ．， Ｔｒｏｍｂｉｃｕｌａ ｓｐｐ．， Ｌｉｓｔｒｏｐｈｏｒｕｓ ｓｐｐ．， Ａｃａｒｕｓ ｓｐｐ．， Ｔｙｒｏｐｈａｇｕｓ ｓｐｐ．， Ｃａｌｏｇｌｙｐｈｕｓ ｓｐｐ．， Ｈｙｐｏｄｅｃｔｅｓ ｓｐｐ．， Ｐｔｅｒｏｌｉｃｈｕｓ ｓｐｐ．， Ｐｓｏｒｏｐｔｅｓ ｓｐｐ．， Ｃｈｏｒｉｏｐｔｅｓ ｓｐｐ．， Ｏｔｏｄｅｃｔｅｓ ｓｐｐ．， Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ ｓｐｐ．， Ｎｏｔｏｅｄｒｅｓ ｓｐｐ．， Ｋｎｅｍｉｄｏｃｏｐｔｅｓ ｓｐｐ．， Ｃｙｔｏｄｅｃｔｅｓ ｓｐｐ．， Ｌａｍｉｎｏｓｉｏｐｔｅｓ ｓｐｐ．。
【０１５０】
本発明に記載の方法によって見い出された活性物質もまた、ダニ、特に家塵ダニ、例えばＤｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ及びＤ． ｆａｒｉｎａｅを退治するのに好ましい。
【０１５１】
本発明に記載の方法を用いることで見い出された活性物質もまた、農業生産家畜、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ブタ、ロバ、ラクダ、水牛、ウサギ、ニワトリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ミツバチ、その他ペット（例えば、犬、猫、かごの鳥及び観賞魚）、およびいわゆる実験動物（例えば、ハムスター、ギニーピッグ、ラット及びマウス）などに寄生する節足動物を退治するのに好ましい。これらの節足動物の退治は、死亡率の低減や生産性（肉、ミルク、毛、皮、卵、蜂蜜などの）の減少を低減し、その結果、より経済的でより容易な動物の管理が本発明の活性物質の使用を通じて可能になる。
【０１５２】
同様に、記載された方法により見い出された化合物及びポリペプチドは、ヒトの、または生産性家畜、ペット、動物園の動物並びに研究および実験用動物の病原内因的寄生虫によって感染した動物やヒトを処置するのに有用である。
【０１５３】
正常株、感受性株及び耐性株の開発における全てのストラテジーに、本化合物を用いることができる。これらの化合物の１またはそれ以上を含む組成物を用いる処置によって、生産性家畜における経済的損失を防ぎ、かつヒト及び動物における疾患を処置することが可能である。以下の寄生生物は、見出された活性物質の標的として特に興味深いものである。
【０１５４】
Ｅｎｏｐｌｉｄａ， 例えば、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓ ｓｐｐ．， Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ ｓｐｐ．， Ｔｒｉｃｈｏｍｏｓｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．， Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ ｓｐｐ．
Ｒｈａｂｄｉｔｉａ、例えば、Ｍｉｃｒｏｎｅｍａ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．
Ｓｔｒｏｎｇｙｌｉｄａ、例えば、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｔｒｉｏｄｏｎｔｏｐｈｏｒｕｓ ｓｐｐ．、Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｄｏｎｔｕｓ ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｎｅｍａ ｓｐｐ．、Ｇｙａｌｏｃｅｐｈａｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｐｈａｒｙｎｘ ｓｐｐ．、Ｐｏｔｅｒｉｏｓｔｏｍｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｙｃｌｏｃｏｃｅｒｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｙｌｉｃｏｓｔｅｐｈａｎｕｓ ｓｐｐ．、Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｈａｂｅｒｔｉａ ｓｐｐ．、Ｓｔｅｐｈａｎｕｒｕｓ ｓｐｐ．、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｓｐｐ．、Ｕｎｃｉｎａｒｉａ ｓｐｐ．、Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ ｓｐｐ．、Ｇｌｏｂｏｃｅｐｈａｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｙｎｇａｍｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｙａｔｈｏｓｔｏｍｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｙｌｉｃｏｃｙｃｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｎｅｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｙｓｔｏｃａｕｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｐｉｃｏｃａｕｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｅｌａｐｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｐａｒｅｌａｐｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｒｅｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．、Ｐａｒａｃｒｅｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ．、Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．、Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．、Ｐａｒａｆｉｌａｒｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．、Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ ｓｐｐ．、Ｍａｒｓｈａｌｌａｇｉａ ｓｐｐ．、Ｃｏｏｐｅｒｉａ ｓｐｐ．、Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ ｓｐｐ．、Ｈｙｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｏｂｅｌｉｓｃｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．、Ａｍｉｄｏｓｔｏｍｕｍ ｓｐｐ．、Ｏｌｌｕｌａｎｕｓ ｓｐｐ． Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓ ｓｐｐ．、Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ ｓｐｐ．
【０１５５】
Ｏｘｙｕｒｉｄａ、例えば、Ｏｘｙｕｒｉｓ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｓｐｐ．、Ｐａｓｓａｌｕｒｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｙｐｈａｃｉａ ｓｐｐ．、Ａｓｐｉｃｕｌｕｒｉｓ ｓｐｐ．、ヘテラキス（Ｈｅｔｅｒａｋｉｓ） ｓｐｐ．
【０１５６】
Ａｓｃａｒｉｄｉａ、例えば、回虫 ｓｐｐ．、Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓ ｓｐｐ．、Ｔｏｘｏｃａｒａ ｓｐｐ．、Ｐａｒａｓｃａｒｉｓ ｓｐｐ．、Ａｎｉｓａｋｉｓ ｓｐｐ．、Ａｓｃａｒｉｄｉａ ｓｐｐ．
Ｓｐｉｒｕｒｉｄａ、例えば、Ｇｎａｔｈｏｓｔｏｍａ ｓｐｐ．、Ｐｈｙｓａｌｏｐｔｅｒａ ｓｐｐ．、Ｔｈｅｌａｚｉａ ｓｐｐ．、Ｇｏｎｇｙｌｏｎｅｍａ ｓｐｐ．、Ｈａｂｒｏｎｅｍａ ｓｐｐ．、Ｐａｒａｂｒｏｎｅｍａ ｓｐｐ．、Ｄｒａｓｃｈｉａ ｓｐｐ．、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓ ｓｐｐ．
Ｆｉｌａｒｉｉｄａ、例えば、Ｓｔｅｐｈａｎｏｆｉｌａｒｉａ ｓｐｐ．、Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａ ｓｐｐ．、Ｓｅｔａｒｉａ ｓｐｐ．、Ｌｏａ ｓｐｐ．、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｓｐｐ．、Ｌｉｔｏｍｏｓｏｉｄｅｓ ｓｐｐ．、Ｂｒｕｇｉａ ｓｐｐ．、Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ ｓｐｐ．、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ ｓｐｐ．
Ｇｉｇａｎｔｏｒｈｙｎｃｈｉｄａ、例えば、Ｆｉｌｉｃｏｌｌｉｓ ｓｐｐ．、Ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ ｓｐｐ．、Ｍａｃｒａｃａｎｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ ｓｐｐ．、Ｐｒｏｓｔｈｅｎｏｒｃｈｉｓ ｓｐｐ．
Ｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒａ （Ｆｌａｇｅｌｌａｔａ）
Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａｔｉｄａｅ、例えば、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂ． ｂｒｕｃｅｉ、Ｔ． ｂ． ｇａｍｂｉｅｎｓｅ、Ｔ． ｂ． ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ、Ｔ． ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ、Ｔ． ｃｒｕｚｉ、Ｔ． ｅｖａｎｓｉ、Ｔ． ｅｑｕｉｎｕｍ、Ｔ． ｌｅｗｉｓｉ、Ｔ． ｐｅｒｃａｅ、Ｔ． ｓｉｍｉａｅ、Ｔ． ｖｉｖａｘ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｌ． ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｌ． ｔｒｏｐｉｃａ
Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｄｉｄａｅ 、例えば、Ｇｉａｒｄｉａ ｌａｍｂｉｌｉａ、Ｇ． ｃａｎｉｓ．
Ｓａｒｃｏｍａｓｔｉｇｏｐｈｏｒａ （Ｒｈｉｚｏｐｏｄａ）、例えば、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ
Ｈａｒｔｍａｎｅｌｌｉｄａｅ、例えば、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ｓｐ．、Ｈａｒｔｍａｎｅｌｌａ ｓｐｐ．
Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ （Ｓｐｏｒｏｚｏａ）、例えば、Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ． ａｄｅｎｏｉｄｅｓ、Ｅ． ａｌａｂａｈｍｅｎｓｉｓ、Ｅ． ａｎａｔｉｓ、Ｅ． ａｎｓｅｒｉｓ、Ｅ． ａｒｌｏｉｎｇｉ、Ｅ． ａｓｈａｔａ、Ｅ． ａｕｂｕｒｎｅｎｓｉｓ、Ｅ． ｂｏｖｉｓ、Ｅ． ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅ． ｃａｎｉｓ、Ｅ． ｃｈｉｎｃｈｉｌｌａｅ、Ｅ． ｃｌｕｐｅａｒｕｍ、Ｅ． ｃｏｌｕｍｂａｅ、Ｅ． ｃｏｎｔｏｒｔａ、Ｅ． ｃｒａｎｄａｌｉｓ、Ｅ． ｄｅｂｌｉｅｃｋｉ、Ｅ． ｄｉｓｐｅｒｓａ、Ｅ． ｅｌｌｉｐｓｏｉｄａｌｅｓ、Ｅ． ｆａｌｃｉｆｏｒｍｉｓ、Ｅ． ｆａｕｒｅｉ、Ｅ． ｌａｂｂｅａｎａ、Ｅ． ｌｅｕｃａｒｔｉ、Ｅ． ｍａｇｎａ、Ｅ． ｍａｘｉｍａ、Ｅ． ｍｅｄｉａ、Ｅ． ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ． Ｅ． ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ、Ｅ． ｍｉｔｉｓ、Ｅ． ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ． ｎｉｎａｋｏｈｌｙａｋｉｍｏｖａｅ、Ｅ． ｏｖｉｓ、Ｅ． ｐａｒｖａ、Ｅ． ｐａｖｏｎｉｓ、Ｅ． ｐｅｒｆｏｒａｎｓ、Ｅ． ｐｈａｓａｎｉ、Ｅ． ｐｉｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｅ． ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅ． ｒｅｓｉｄｕａ、Ｅ． ｓｃａｂｒａ、Ｅ． ｓｐｅｃ．、Ｅ． ｓｔｉｅｄａｉ、Ｅ． ｓｕｉｓ、Ｅ． ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ． ｔｒｕｎｃａｔａ、Ｅ． ｔｒｕｔｔａｅ、Ｅ． ｚｕｅｒｎｉｉ、Ｇｌｏｂｉｄｉｕｍ ｓｐｅｃ．、Ｉｓｏｓｐｏｒａ ｂｅｌｌｉ、Ｉ． ｃａｎｉｓ、Ｉ． ｆｅｌｉｓ、Ｉ． ｏｈｉｏｅｎｓｉｓ、Ｉ． ｒｉｖｏｌｔａ、Ｉ． ｓｐｅｃ．、Ｉ． ｓｕｉｓ、Ｎｅｏｓｐｏｒａ ｃａｎｉｎｕｍ、Ｃｙｓｔｉｓｏｓｐｏｒａ ｓｐｅｃ． Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｓｐｅｃ．
Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａｄｉｄａｅ、例えば、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ
Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｄａｅ、例えば、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓ ｂｏｖｉｃａｎｉｓ、Ｓ． ｂｏｖｉｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ． ｎｅｕｖｏｎａ、Ｓ． ｏｖｉｃａｎｉｓ、Ｓ． ｏｖｉｆｅｌｉｓ、Ｓ． ｓｐｅｃ．、Ｓ． ｓｕｉｈｏｍｉｎｉｓ
Ｌｅｕｃｏｚｏｉｄｅ、例えば、Ｌｅｕｃｏｚｙｔｏｚｏｏｎ ｓｉｍｏｎｄｉ
Ｐｌａｓｍｏｄｉｉｄａｅ、例えば、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉ、Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐ． ｍａｌａｒｉａｅ、Ｐ． ｏｖａｌｅ、Ｐ． ｖｉｖａｘ、Ｐ． ｓｐｅｃ．
Ｐｉｒｏｐｌａｓｍｅａ、例えば、Ｂａｂｅｓｉａ ａｒｇｅｎｔｉｎａ、Ｂ． ｂｏｖｉｓ、Ｂ． ｃａｎｉｓ、Ｂ． ｓｐｅｃ．、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ ｐａｒｖａ、Ｔ． ｓｐｅｃ．
Ａｄｅｌｅｉｎａ、例えば、Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎ ｃａｎｉｓ、Ｈ． ｓｐｅｃ．
【０１５７】
さらに、重要なものでは、Ｍｙｘｏｓｐｏｒａ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ、例えば、Ｇｌｕｇｅａ ｓｐｅｃ． 及びＮｏｓｅｍａ ｓｐｅｃ．、及びＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｃｉｌｉｏｐｈｏｒａ （Ｃｉｌｉａｔａ）、例えば、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ ｃｏｌｉ、Ｉｃｈｔｈｉｏｐｈｔｈｉｒｉｕｓ ｓｐｅｃ．、Ｔｒｉｃｈｏｎｄｉｎａ ｓｐｅｃ． 又はＥｐｉｓｔｙｌｉｓ ｓｐｅｃがある。
【０１５８】
見出された化合物及び組成物も同様、昆虫の原生動物、例えばＭｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ門の動物、特にＮｏｓｅｍａ目の動物、さらに特にミツバチの寄生虫であるＮｏｓｅｍａ ａｐｉｓ種の動物、に有効である。
【０１５９】
したがって、本発明は、蠕虫及び／又は節足動物を退治する組成物を生産するための、本発明の方法または本発明の核酸またはポリペプチドを用いて見出された化合物の使用に関する。
【０１６０】
実施例
１．ｃＤＮＡライブラリーの構築及びスクリーニング
ｃＤＮＡライブラリーの構築、ＫＬＨ−ＰＦ１０２２Ａコンジュゲートの製造及びＰＦ１０２２Ａに対する抗血清、及びｃＤＡＮライブラリーの免疫スクリーニング及びＤＮＡ分析は、ＷＯ ９８／１５６２５の記載にしたがって行なった。
【０１６１】
２．ＲＮＡの単離
全ＲＮＡは、ＧＴＣ／ＣｓＣｌクッション法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）により、成虫Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ線虫から抽出して単離するか、あるいはＧＴＣ／フェノール／クロロホルム抽出（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉ １９８７） により一工程で得た。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）セルロースのクロマトグラフィーにより単離した （Ａｖｉｖ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ， １９７２）。
【０１６２】
３．ノーザンブロッティング
Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ由来のグルオキシル化全ＲＮＡ（１レーン当たり２０μｇ）をアガロースゲルにて分画し（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９； ＭｃＭａｓｔｅｒ及びＣａｒｍｉｃｈａｅｌ １９７７）、標準キャピラリー輸送法（ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ， １９９２）によりＨｙｂｏｎｄ Ｎメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移動させた。放射能標識プローブは、メガプライム キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）と５０μＣｉの［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ （３０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ， ＩＣＮ， Ｍｅｃｋｅｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、線状化したプラスミドＤＮＡ（ＨＣ１１０−Ｒ）のランダム標識により調製した。ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣ （１×ＳＳＣ：０．１５ Ｍ ＮａＣｌ， ０．０１５ Ｍ クエン酸ナトリウム）、５×デンハルト試薬 （０．１％ ポリビニルピロリドン， ０．１％ ＢＳＡ， ０．１％ Ｆｉｃｏｌｌ ４００）、０．１％ ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍＬ ニシン精子ＤＮＡ中、６５℃にて一晩行なった。フィルターは、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳ中の高いストリンジェンシーで、６５℃にて洗浄し、露光した（−８０℃のＫｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ ＭＳ フィルム）（図１（Ａ） を参照）。
【０１６３】
４．５’及び３’ＲＡＣＥ ＰＣＲ
５’／３’ ＲＡＣＥ法を用いて、同定したｃＤＮＡクローンに欠けている５’及び３’末端を単離した。
【０１６４】
５’ ＲＡＣＥは、ｍＲＮＡ由来の遺伝子の５’端を特異的に増幅することに基づく。配列特異的プライマー及びＡＭＶ逆転写酵素を用いて、第１のｃＤＮＡ鎖を合成する。ポリ（Ａ）尾部をその生成物に結合させることにより、後のＰＣＲにおいて、オリゴｄＴアンカープライマーおよびネステッド配列特異的プライマーを用いることが可能になる。別のＰＣＲでは、特異性を確保するため、別のネステッドプライマーを用いることが可能である。
【０１６５】
３’ ＲＡＣＥでは、第１のｃＤＮＡ鎖はオリゴｄＴプライマーを用いて合成し、後のＰＣＲ反応は配列特異的プライマーを用いて行なう。
【０１６６】
ｃＤＮＡは、プライマー５’−ＧＧＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＣＧＴ ＣＣＣ ＡＧＡ ＡＡ−３’及びＧＩＢＣＯ ＢＲＬ （Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）の５’ ＲＡＣＥキットを用いて１μｇのＨ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ 全ＲＮＡから合成した。スーパークリプト逆転写酵素をこの目的のために用いた。このｃＤＮＡのＣ末端のＣテイリングは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて行なった。第１の増幅は、４００ｎＭのオリゴデオキシイノシルアンカープライマー （５’−ＣＵＡ ＣＵＡ ＣＵＡ ＣＵＡ ＧＧＣ ＣＡＣ ＧＣＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＣＧ ＧＧＩ ＩＧＧ ＧＩＩ ＧＧＧ ＩＩＧ−３’） と、４００ｎＭの第１のネステッドプライマー ５’−ＣＣＡ ＴＴＣ ＧＡＴ ＴＣＣ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＧ−３’ （Ｂｉｒｓｎｅｒ ｕｎｄ Ｇｒｏｂ， Ｄｅｎｚｌｉｎｇｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ ｍＭのＭｇＣｌ２、５分の１のテイルｃＤＮＡ及び２．５ Ｕの天然Ｔａｑポリメラーゼを含む５０μｌ中にて行なった。最初の変性は、９４℃で５分間行ない、次いで９４℃１分間、５３℃１分間そして７２℃１０分間のサイクルを３５サイクル行ない、次ぎに最後の合成工程を７２℃で１０分間行なった。ネステッドＰＣＲについての反応条件は、テンプレートとして１μｌの最初の増幅産物用い、遺伝子特異的な第２のネステッドプライマー５’−ＧＴＣ ＧＡＴ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＡＴ ＴＴＣ ＧＣ−３’、アンカープライマー（５’−ＣＵＡ ＣＵＡ ＣＵＡ ＣＵＡ ＧＧＣ ＣＡＣ ＧＣＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＣ−３’）の先端欠失型、及びアニーリン温度を５３℃にしてサイクルを２５サイクルのみで行なったことを除いて、上記と同一である。
【０１６７】
３’ ＲＡＣＥ ＰＣＲ （ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ） は、成虫Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ由来の全ＲＮＡ　１μｇ及び５００ ｎＭのオリゴｄＴアダプタープライマー５’−ＧＧＣ ＣＡＣ ＧＣＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＣＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ ＴＴＴ Ｔ−３’を用いて、７０℃、１０分間のプレインキュベーションから開始し、４℃にて２分間行なった。２０μｌ 中の、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、各ｄＮＴＰ５００μＭ、１０μＭ ＤＴＴ及び２００Ｕのスーパー−スクリプトＩＩ逆転写酵素を加えた後、ｃＤＮＡを４２℃で５０分間インキュベーションし、最後の工程で、７０℃で１５分間、４℃で１０分間インキュベーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅ Ｈ ２Ｕを用いて、３７℃で１０分間インキュベーションしてＲＮＡを除去した。第１の増幅は、各ｄＮＴＰ ２００ｍＭ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０分の１のテイルｃＤＮＡ及び２．５Ｕの天然Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼを含む５０μｌ中、ユニバーサルアダプタープライマー４００ｎＭ （５’−ＣＵＡ ＣＵＡ ＣＵＡ ＣＵＡ ＧＧＣ ＣＡＣ ＧＣＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＣ−３’） および４００ｎＭのシークエンス−特異的プライマー５’−ＴＴＴＧＴＴＣＴＴ ＣＣＴ ＴＧＧ ＴＡＴ ＣＣ−３’を用いて行なった。最初の変性工程は、９４℃にて３分間行ない、次いで９４℃にて１分間、５１℃にて１分間及び７２℃にて２分間のサイクルを３５サイクル行い、最後の合成工程は７２℃にて１５分間行った。特に記載しない限り、最初の増幅物２μｌをネステッドＰＣＲに用い、その他の条件は同一であったが、この場合において、短いアダプタープライマー５’−ＧＧＣ ＣＡＣ ＧＣＧ ＴＣＧ ＡＣＴ ＡＧＴ ＡＣ−３’と、ネステッドプライマー５’−ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＡＡ ＴＣＴ ＣＣＡ ＡＣＴ Ｇ−３’を用いて３０サイクル行なった。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて分析し、溶出し、ＴＡ ベクターｐＭｏｓＢｌｕｅ （Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中にクローニングした。
【０１６８】
５．ＲＮＡのトランスファー
中性のＨｙｂｏｎｄ Ｎ ナイロンメンブレン［Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ］への、グリオキサルゲルからの分画したＲＮＡの移動、及びＴＢＥアガロースゲルからのゲノムＤＮＡの移動は、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ法 （１９９２） により、アルカリントランスファー溶液中、下向きのアルカリ性の毛細管輸送によって２時間行なう。次いで、このメンブレンを０．２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ６．８）中で２０分間中和し、８０℃にて２０〜６０分間乾燥させ、焼き付けた。放射能標識したプローブとハイブリダイズさせるために、メンブレンをプラスチック製バッグ中、５ｍｌ／ｃｍ２ のプレハイブリダイゼーション溶液でシールし、６５℃で３時間インキュベーションした。緩衝液を、ハイブリダイゼーション用のハイブリダイゼーション溶液に変える。Ｒａｐｉｄ Ｈｙｂ．溶液［Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ］を使用すれば、プレハイブリダイゼーションは、プレハイブリダイゼーション溶液をさらに加えることなく、６５℃にて３０分間で起きる。ランダムプライミングにより放射能標識したしたプローブを加えた後、ハイブリダイゼーションを６５℃にて一晩行なう。その後、そのメンブレンを、２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳを用いて６５℃にて２０分間を１回、０．１×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳを用いてそれぞれ１時間を３回で洗浄した。このメンブレンは、適当な増強スクリーンを用いて、コダックＸ−ＯＭＡＴ又はコダックＢＩＯＭＡＸ−ＭＳ Ｘ線フィルムに−８０℃にて露光する。
【０１６９】
６．インビボ転写及び翻訳
ＴＮＴ Ｔ７／Ｔ３カップリングした網赤血球リゼートシステム （Ｐｒｏｍｅｇａ）を、製造元のプロトコルに従って用い、３５Ｓ標識メチオニン及びシステイン （ＩＣＮ， Ｅｓｃｈｗｅｇｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ） の存在下、ＨＣ１１０−Ｒのコード配列の全長を転写及び翻訳した。４０ μＣｉ ３５Ｓ標識化混合物 （＞１０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ， ＩＣＮ， Ｍｅｃｋｅｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、１μｇの環状化ＨＣ１１０−Ｒ プラスミドＤＮＡ及び１０ＵのＴ３ ＲＮＡポリメラーゼを用いるウサギ網赤血球リゼートシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｓｅｒｖａ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を用いて、ＲＮＡを翻訳した。反応は３０℃にて９０分間行った。ポジティブコントロールには、１μｇのルシフェラーゼコントロールＤＮＡを含有させた。
【０１７０】
反応産物をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 （Ｌａｅｍｍｌｉ １９７０）により分画し、増幅フルオログラフィー溶液（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）又は１Ｍのサリチル酸ナトリウム（ｐＨ ７）（Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ １９７９）を用いて蛍光光度分析し、そしてそのゲルを乾燥させ、露光した （増感剤とともに−８０℃にてＫｏｄａｋ ＢｉｏＭａｘ ＭＲフィルム）（図１（Ｂ）を参照）。
【０１７１】
あるいは、Ａｍｂｉｏｎ （Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）のＭＡＸＩｓｃｒｉｐｔインビトロ 転写キットを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ中にクローニングしたＨＣ１１０−Ｒ ｃＤＮＡからのＲＮＡ転写物のインビトロ合成のために用いた。ＨＣ１１０−ＲプラスミドＤＮＡ ４μｇを、制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ又はストップコドンの後のＳａｌ Ｉを用いて直線化し、フェノール／クロロホルムで抽出し、３倍量のエタノールを用いて沈殿させ、ＤＥＰＣ／Ｈ２Ｏ中に溶解した。反応混合物５０μｌ中のＨＣ１１０−Ｒ ｃＤＮＡ２μｇを、２００ｍＭ ＤＴＴ ２．５μｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ， ＣＴＰ， ＧＴＰ及びＵＴＰ各々２．５μｌ、１０×転写緩衝液 ５μｌ、ＲＮａｓｉｎインヒビター （４０Ｕ／μｌ） （Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ） １．６μｌ、及びＴ３ファージポリメラーゼ （１０Ｕ／μｌ） ２μｌ と混合し、３７℃で２時間インキュベーションした。１時間後、Ｔ３ファージポリメラーゼ （１０Ｕ／μｌ） ２μｌをさらに加えた。この混合物を、ＲＮａｓｅ不含ＤＮａｓｅ Ｉ （２Ｕ／μｌ） １．５μｌ及びＲＮａｓｉｎインヒビター （４０ Ｕ／μｌ） １μｌと混合し、３７℃で１５分間インキュベーションし、フェノール／クロロホルムを用いて抽出し、３倍量のエタノール中にて沈殿させ、ＤＥＰＣ／Ｈ２Ｏ ２５μｌ中に再懸濁した。試料の１／５の容量をグリオキサールゲルにて分析した。
【０１７２】
７．ＤＮＡ分析
クローンは、自動レーザー蛍光配列分析（ＬＩＣＯＲ ４０００； ＭＷＧ， Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＴｈｅｒｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ蛍光標識サイクル配列分析キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）の支援によりジデオキシヌクレオチド鎖終止法で配列を決定した。両方の鎖の配列を決定し、その配列データをＧＣＧソフトウェアー （Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ， ＵＳＡ） 及びＰＣ／ＧＥＮＥソフトウェアー （Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， ＣＡ， ＵＳＡ）で　した。プログラムＦＡＳＴＡ （Ｐｅａｒｓｏｎ 及びＬｉｐｍａｎ １９８８）、ＢＬＩＴＺ （Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ １９８１）、及びＢＬＡＳＴ （Ａｌｔｓｃｈｕｌ及びＬｉｐｍａｎｎ １９９０） を用いて、得られたタンパク質配列の配列類似性についてＥＭＢＬおよびスイスプロット プロテインデータベース（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅｓ）をスクリーニングした。タンパク質配列は、ＳＡＰＳ （Ｂｒｅｎｄｅｌら、１９９２）およびＰＲＯＳＩＴＥおよびＰｒｏｔ−Ｐａｒａｍ （Ａｐｐｅｌら、１９９４）を用いて分析した。
【０１７３】
８．Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ由来のタンパク質抽出物の調製
液体窒素中にて凍結させたＨ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ５０〜１００ｍｇをＴＲＩＺＯＬ ［Ｇｉｂｃｏ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ］ １ｍｌ中に加えた。線虫を、ガラス容器中、ＴＲＩＺＯＬと共に３×１５秒間ホモジナイズし、室温で５分間インキュベーションした。ＴＲＩＺＯＬ １ｍｌ当たりクロロホルム２００μｌ 加えた後、この試料を１５秒間攪拌し、混合物を室温でさらに２〜３分間インキュベーションし、４℃で１０分間７０００〜１２０００ｒｐｍで遠心分離した。上部の水相にはＲＮＡ、中間相にはゲノムＤＮＡ、赤色の有機相にはタンパク質が含まれている（Ｃｏｏｍｂｓら、１９９０； Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ １９９３）。水相を除去し、別々に処理した。中間相と有機相を、ＴＲＩＺＯＬ １ｍｌ当たり３００μｌの１００％エタノールとともに混合し、十分に混合し、室温で２〜３分間インキュベーションした。４℃で５分間、２０００ｒｐｍで遠心分離した後、タンパク質の上清を慎重にエッペンドルフ容器に移し、イソプロパノール１ｍｌを用いて室温にて１０分間沈殿させた。再度、遠心分離を、４℃で１０分間、１２０００ｒｐｍで行ない、上清を廃棄し、タンパク質沈殿物を９５％エタノール中の０．３Ｍ 塩酸グアニジン溶液２ｍｌと混合して、攪拌し、室温で２０分間インキュベーションし、４℃にて５分間、７，５００ｒｐｍで３回遠心分離した。次いで、ペレットを１００％エタノール２ｍｌ中に溶解し、室温で２０分間沈殿させ、そして４℃で５分間、７５００ｒｐｍにてペレット化した。ペレットを簡単に真空乾燥し、尿素溶解緩衝液 （８Ｍ）中に再懸濁した。不溶性の物質を４℃で１０分間、１００００ｒｐｍの遠心分離で取り除き、上清を新しいエッペンドルフ容器に移した後、タンパク質濃度を決定し、さらなる処理を行うまで−２０℃で保存した。
【０１７４】
９．酵母細胞由来のタンパク質抽出物の調製
タンパク質抽出物は、ＹＰＡＤ培地５ｍｌに単一の酵母コロニーを植え、飽和するまで（２日間）３０℃で振盪することで酵母培養細胞から調製した。この培養酵母の一部２ｍｌを４℃で２分間、３０００ｒｐｍで遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｂｉｏｆｕｇｅ １５ Ｒ）し、Ｈ２Ｏで一度洗浄し、酵母溶解緩衝液２５０μｌ中に再懸濁し、小さい試験管に移し、ガラスビーズ（φ ０．５ｍｍ）を液面のすぐ下まで入れ、最大設定で５分間攪拌した。次いで、４×ＲｏｔｉＬｏａｄ緩衝液 （Ｒｏｔｈ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）を加え、混合物を９５℃で５分間インキュベーションした。破壊した細胞をエッペンドルフ容器に移し、細胞破片を５分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離（エッペンドルフ遠心分離機（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ） ５４１５ Ｃ）することによって除去した。この方法により調製した試料の一部２０μｌを、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに流した。
【０１７５】
１０．Ｅ．ｃｏｌｉ細胞由来のタンパク質抽出物の調製
タンパク質抽出物は、一晩培養した培養液５ｍｌから、Ｈｅｒａｅｕｓフロー遠心分離機にて４℃で５分間、５０００ｒｐｍで遠心分離して、１×１０７のＥ． ｃｏｌｉ細胞をペレット化し、ＰＢＳ５ｍｌを用いて洗浄し、再び遠心分離することにより調製した。次いで、このペレットをＴＲＩＺＯＬ （Ｇｉｂｃｏ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）１ｍｌ中に再懸濁し、処理をさらに行なった。
【０１７６】
これに代わる方法として、ＰＢＳ洗浄した細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し、細胞を数回の短い超音波パルス（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ Ｂ−１２， Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｄａｎｂｕｒｙ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）、液体窒素及びリゾチームにより破壊した。
【０１７７】
続くタンパク質分析では、４×ＲｏｔｉＬｏａｄ緩衝液 （Ｒｏｔｈ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）を加え、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに流して画分を分析した。１レーンあたりに流したタンパク質の全量は１０〜２０μｇであった。
【０１７８】
１１．培養細胞からのタンパク質抽出物の調製
３５ｍｍの接着細胞の集密細胞培養皿、又はＦＣＳ含有培地中の５〜１０６個の非接着動物細胞を、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液でトリプシン化することにより予め取り出すかあるいは冷却した後に細胞スクレイパーを用いて機械的に剥がし、エッペンドルフ容器に移し、室温で１０秒間、１３０００ｒｐｍにてペレット化し、ＰＢＳで２回洗浄し、再び遠心分離した。その細胞をＴＲＩＺＯＬ １ｍｌ中に溶解した後、これを激しく攪拌するか、又は使い捨てできる注射器の針の中に細胞を数回吸引することにより、細胞を溶解させ、室温で５分間インキュベーションした。この別法として、細胞ペレットをＰＢＳ１ｍｌ中、又は尿素溶解緩衝液（８Ｍ）中に再懸濁し、非常に短かい時間、超音波処理（Ｓｏｎｉｆｉｅｒ Ｂ−１２， Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｄａｎｂｕｒｙ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）した。次いで、タンパク質量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ （１９７６）又はＬｏｗｒｙら、（１９５１））の方法により測定する。
【０１７９】
１２．Ｅ． ｃｏｌｉにおける誘導的タンパク質発現
ＨＣ１１０−Ｒタンパク質に対するポリクローナル抗体は、発現ベクターｐＲＳＥＴ Ｂ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｌｅｅｋ， ＮＬ） にクローニングされ、その結果６×Ｈｉｓがリーディングフレームを満足しながらＮ末端に融合された３つのＨＣ１１０−Ｒ断片、即ち、完全ＨＣ１１０−Ｒ ｃＤＮＡ、膜貫通ドメインを含まないＮ末端、及び７番目の膜貫通ドメインの後のＣ−末端により製造した。
【０１８０】
ＨＣ１１０−Ｒの完全なコード領域を、Ｐ８４＿ＡＴＧ ＢａｍＨＩ　５’プライマー ５’−ＣＴＧ ＣＣＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＣＧＧ ＴＴＴ ＡＡＴ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＡＧＧ−３’および、Ｐ３１２１＿ＴＧＡ ＨｉｎｄＩＩＩ ３’プライマー ５’−ＧＣＡ ＣＴＡ ＡＧＣ ＴＴＧ ＡＣＴ ＧＡＡ ＧＣＧ ＣＡＣ ＡＡＣ ＣＴＣ Ｇ−３’を用いて増幅し、第１の膜貫通ドメインまでのＮ末端を、Ｐ８４＿ＡＴＧ ＢａｍＨＩ ５’プライマー （上記参照）およびＰ１４３４＿ＴＧＡ ＨｉｎｄＩＩＩ ３’プライマー ５’−ＧＧＣ ＴＣＡ ＡＧＣ ＴＴＡ ＴＣＡ ＧＡＧ ＡＡＣ ＡＡＧ ＣＧＡ ＣＡＣ ＧＧＣ−３’を用いて増幅し、そして第７の膜貫通ドメインの後から始まるＣ末端は、Ｐ２４８６＿ＡＴＧ ＢａｍＨＩ ５’プライマー ５’−ＣＴＡ ＴＣＧ ＧＡＴ ＣＣＣ ＡＡＣ ＡＴＧ ＧＣＴ ＧＧＣ ＴＣＣ ＣＧＴ ＧＡＴ ＡＣＣ ＴＣＴ ＡＧＧ−３’およびＰ３１２１＿ＴＧＡ ＨｉｎｄＩＩＩ ３’プライマー （上記参照）を用いて増幅した。３つの全てのプラスミドＰＣＲのアニーリング温度は、最初の５サイクルは５６℃、後の３０サイクルは６２℃で行なった。ＰＣＲ産物はＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ酵素を用いて消化し、同様にＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いて直線化したｐＲＳＥＴ Ｂ発現ベクター中に直接ライゲートした。
【０１８１】
ｐＲＥＳＴ Ｂベクターにおいて、発現は、バクテリオファージ Ｔ７のウィルスプロモーターにより制御されている。従って、クローニングは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有していないＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｅ． ｃｏｌｉ株にて行なった。次いで、この組換えプラスミドを、クロラムフェニコール耐性により安定化したプラスミドｐＡＣＹＣ１８４をさらに含み、かつＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの天然のインヒビターであるＴ７リゾチームの発現量が少ない、Ｔ７ポリメラーゼ発現性ＢＬ２１（Ｄｅ３）ｐＬｙｓＳ大腸菌細胞中へ形質転換した。これらの細胞はｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にあるため、ＩＰＴＧ誘導によりＴ７ ＲＮＡポリメラーゼが発現し、その結果融合タンパク質を発現する。
【０１８２】
目的のＨＣ１１０−Ｒプラスミドを有する単一のコロニーを、５０μｇ／ｍＬアンピシリン及び３５μｇ／ｍＬ クロラムフェニコールを添加した新鮮なＬＢプレートから、同じ選択圧下のＬＢ培地 ５０ｍｌに移し、静止期になるまで３７℃にて２８０ｒｐｍで一晩振盪した。この一晩培養した培養物をＯＤ６００が０．３になるよう希釈し、この培養物１００ｍｌをＯＤ６００が０．６〜０．５になるまで３７℃にて２８０ｒｐｍでさらに振盪した。
【０１８３】
１ ＯＤ６００のユニットを採取し、未誘導細胞を手短かに遠心分離し、ｐＨ８．０の８Ｍ 尿素溶解緩衝液１５０ μｌ及び４×ＲｏｔｉＬｏａｄ緩衝液 ［Ｒｏｔｈ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ］５０μｌ中に溶解した。この未誘導試料を２分間変性させ、ゲノムＤＮＡをＳｏｎｉｆｉｅｒ Ｂ−１２の短い超音波パルス ［Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｃ Ｐｏｗｅｒ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｄａｎｂｕｒｙ， Ｕ．Ｓ．Ａ．］ を２、３秒間行なうことにより剪断し、不溶性部分を１４０００ｒｐｍで３分間遠心分離することによりペレット化した。
【０１８４】
融合タンパク質の発現は、１ｍＭ ＩＰＴＧを加えることにより誘導し、培養物１００ｍｌをさらに３〜４時間３７℃にてインキュベーションした。インキュベート後、誘導した細胞を５０００ｒｐｍ、４℃にて１５分間遠心分離（Ｈｅｒａｅｕｓ 蛍光遠心分離機）し、ペレットをＰＢＳ中にて洗浄した後、８Ｍ 尿素溶解緩衝液８ｍｌ中に再懸濁した。細胞を液体窒素に液沈して破壊し、３７℃で３回融解した。最初の窒素処理後に、０．７５ｍｇ／ｍｌリゾチームを加えた。液体窒素における最後のインキュベートの後、１６℃で２０分間インキュベーションした後、氷水浴中で冷却しながら、溶液が水と同等の粘度になるまで各１０秒間の短い超音波パルスを与えた。１３０００ｒｐｍで、４℃にて１０分間遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ２−２１； ＪＳ １３．１−Ｒｏｔｏｒ）した後、誘導した試料１５０μｌを取り出し、４×ＲｏｔｉＬｏａｄ緩衝液 （Ｒｏｔｈ）５０μｌと混合し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、次いでクマシー染色又はマウス抗Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタンブロット分析により、特定のＨＣ１１０−Ｒタンパク質断片を未誘導試料と一緒にチェックした。
【０１８５】
残りの上清を新しい容器に移し、アフィニティークロマトグラフィーによりさらに精製するために−２０℃で保存した。
【０１８６】
１３．金属アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製
濃縮は、変性条件下にて、クローンテック社［Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｕ．Ｓ．Ａ．］のＴＡＬＯＮスピン カラムにてＩＭＡＣ システム（「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」）を用い、Ｎ末端６×Ｈｉｓタグにより行なった。最初に、カラム内の樹脂をｐＨ８の８Ｍ 尿素溶解緩衝液の５倍量で別個に平衡化し、３０００ｒｐｍにて４℃で４分間沈降させて、ゆっくり攪拌しながらＨＣ１１０−Ｒタンパク質上清と室温にて２０分間インキュベーションした。再び遠心分離した後、樹脂を、ゆっくり室温で１０分間攪拌しながら、１０倍量のｐＨ８の８Ｍ 尿素溶解緩衝液で３回洗浄し、再度遠心分離した。最後の洗浄工程の後に、ペレットを８Ｍ 尿素溶解緩衝液１ｍｌ中にとり、カラムにローディングするのに用いた；後者は、３倍量の８Ｍ 尿素溶解緩衝液で２回洗浄し、イミダゾール含有８Ｍ 尿素溶解緩衝液で溶出し、各々１５０μｌのいくつかの画分に分画した。画分中の融合タンパク質量を、ゲル分析及びＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質測定法により測定する。
【０１８７】
１４．アフィニティークロマトフラフィーによるタンパク質精製
金属アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製は、本明細書中の実施例に記載する。
濃縮は、変性条件下にて、クローンテック社［Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｕ．Ｓ．Ａ．］のＴＡＬＯＮスピン カラムにてＩＭＡＣ システム（「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」）を用い、Ｎ末端６×Ｈｉｓタグにより行なった。最初に、カラム内の樹脂をｐＨ８の８Ｍ 尿素溶解緩衝液の５倍量で別個に平衡化し、３０００ｒｐｍにて４℃で４分間沈降させて、ゆっくり攪拌しながらＨＣ１１０−Ｒタンパク質上清と室温にて２０分間インキュベーションした。再び遠心分離した後、樹脂を、ゆっくり室温で１０分間攪拌しながら、１０倍量のｐＨ８の８Ｍ 尿素溶解緩衝液で３回洗浄し、再度遠心分離した。最後の洗浄工程の後に、ペレットを８Ｍ 尿素溶解緩衝液１ｍｌ中にとり、カラムにローディングするのに用いた；後者は、３倍量の８Ｍ 尿素溶解緩衝液で２回洗浄し、イミダゾール含有８Ｍ 尿素溶解緩衝液で溶出し、各々１５０μｌのいくつかの画分に分画した。画分中の融合タンパク質量を、ゲル分析及びＢｒａｄｆｏｒｄタンパク質測定法により測定する。
【０１８８】
１５．アミノ酸配列分析
ｃＤＮＡ全長クローンＨＣ１１０−Ｒから推定されるアミノ酸配列を確認するため、上流の開始コドン及びコザック（Ｋｏｚａｋ）配列を含む６８８ｂｐ（（２４８６〜３１８２位））を含有する３’末端を、ｐＲＳＥＴ Ｂ発現ベクター中にクローニングし、コンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳＥ． ｃｏｌｉ細胞における２１ｋＤタンパク質（１８９ ＡＡ）の発現を、１ｍＭ ＩＰＴＧを加えることにより誘導した。このＮ末端Ｈｉｓタグを伴って発現した融合タンパク質を、Ｔａｌｏｎマトリックスにて濃縮し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎチューブにより濃縮し、脱塩した。Ｎ末端Ｈｉｓタグのため、１ｎＭの２１ｋＤ ＨＣ１１０−Ｒタンパク質の部分的なＣ末端タンパク質の配列分析は、ＴｏｐＬａｂ （Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ）によるＢｏｙｄ （Ｂｏｙｄら、１９９２）の変法の段階的なＳｃｈｌａｃｋ−Ｋｕｍｐｆ分解（Ｓｃｈｌａｃｋら、１９２６）により行なった。除去したアミノ酸の配列分析はＰＲＯＣＩＳＥ ４９２アミノ酸配列分析装置（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ）において行ない、ＡＢＩ １４０Ｃマイクロ勾配システム及びＡＢＩ ７８５Ａ ＵＶ／ＶＩＳ検出器からなるＰＲＯＣＩＳＥ Ｃ逆相ＨＰＬＣシステムを用いて分析し、ＰＲＯＣＩＳＥ Ｃコントロールソフトウェアー及びＡＢＩ データ解析ソフトウェアを用いて同定した。
【０１８９】
最初に、２１ｋＤ ＨＣ１１０−Ｒタンパク質２５ｐｍｏｌを、２％トリプシン（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて３７℃にて一晩分解した。トリプシン自己分解産物の配列分析を除外するため、トリプシン無しでの分解物のクロマトグラムを、トリプシン消化後のＨＣ１１０−Ｒ標準クロマトグラムと比較することによって、合計４つのペプチド断片を選択した。これら４つのペプチド断片を、ＴｏｐＬａｂ （Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ）によってＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、（１９８３）により改変された階段的Ｅｄｍａｎ消化法によって、Ｎ末端部分のタンパク質配列分析を行った。分解したペプチド断片を分離し、ＨＰＬＣにより分画した。イモビロンにてブロッティングされたペプチド画分を、ＰＲＯＣＩＳＥ ４９２アミノ酸配列分析装置 （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ）の反応チャンバーに移し、アミノ酸を１４０ Ｃ−ＰＴＨ−分析器及びＵＶ検出器 ７８５ Ａ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ）にて分離した。アミノ酸を逆相ＨＰＬＣにより定量し、配列分析前に作製した標準クロマトグラムと保持時間を比較することにより同定した。
【０１９０】
１６．細胞培養系
以下の細胞培養系は、Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ ＧｍｂＨ ［Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ］ ［Ｄｒｅｘｌｅｒら、１９９５］を介してＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇから購入した：
ＣＯＳ−７細胞（ＤＳＭ： ＡＣＣ ６０）　　　　−　サル、腎臓
ＨＥＫ−２９３細胞 （ＡＴＣＣ： ＣＲＬ １５７３）　−　ヒト、胚、腎臓
【０１９１】
１７．種々の細胞培養系の培養
接着細胞系ＣＯＳ−７やＨＥＫ−２９３は、１１０ｍｍ組織培養皿 ［Ｇｒｅｉｎｅｒ， Ｓｏｌｉｎｇｅｎ］にて、１０ｍＬの培地中、３７℃、５％ＣＯ２及び９５％湿度で培養した。培養細胞は、ＤＭＥＭ培地中でＣＯＳ−７およびＨＥＫ−２９３細胞を培養することにより維持した。３．０２４ ｇ／ｌ ＮａＨＣＯ３、１０％ ＦＣＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリン及び５０μｇ／ｍＬ ストレプトマイシンを含む培地を使用前に３７℃に温めた。ＣＯＳ−７の前培養について、それらを４℃で２時間保存した後、細胞スクレイパーを用いて機械的に培養皿から分離した。ガラスピペットを用いて、ＨＥＫ−２９３細胞を培養皿の底から直接分離できた。
【０１９２】
１８．真核生物細胞の一過性トランスフェクション及び安定なトランスフェクション
Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ （Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の非リポソームトランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥ ６を、動物細胞内へ外来ＤＮＡを一過的に導入するために用いた（Ｋｕｒａｃｈｉら、１９９８）。この目的のため、１％ゼラチンでコーティングした滅菌ガラススライドを後の共焦点レーザースキャンニング顕微鏡のために設置した３５ｍｍ 組織培養皿に、培地２ｍｌ中の約０．５〜１．５× １０５個の細胞を置いた。細胞を、３７℃で５％ ＣＯ２及び９５％湿度にて一晩培養した。培地をトランスフェクトの前に再度交換した。トランスフェクションのために、ＦｕＧＥＮＥ６ ［Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ］ ３μｌを血清不含培地９７μｌ中に希釈し、各反応混合物について５分間室温でインキュベーションした。各混合物につき、プラスミド−ＤＮＡ２μｇ（０．５〜１μｇ／μｌ）に、希釈したＦｕＧＥＮＥ ６の一部１００μｌをピペッティングして滴下し、慎重に混合した後、室温でさらに１５分間インキュベーションした。その後、完全反応混合物を細胞に滴加して、トランスフェクト混合物を、皿をゆっくり回転させて均一に分配した。培地を交換せずに、細胞をさらに１〜２日間培養した。以下の３つのネガティブコントロール（陰性対照）を、各トランスフェクションに必ず入れた：３５ｍｍ 組織培養皿に０．５〜１．５×１０６細胞を入れトランスフェクトしない、第２の培養皿はＤＮＡをトランスフェクション混合物に加えるが、ＦｕＧＥＮＥ ６は添加しない、そして第３の培養皿には、ＦｕＧＥＮＥ ６を添加するがＤＮＡは添加しない。
【０１９３】
安定なトランスフェクションについては、所望のプラスミドＨＣ１１０−Ｒを、若干の修飾を加えた発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ Ａ ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｌｅｅｋ， ＮＬ］ 又はｐＩＲＥＳｎｅｏ ［Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｕ．Ｓ．Ａ．］中へ正しいリーディングフレームでクローニングした。これらのベクターは、マーカーとして耐性遺伝子を有し、その結果、ゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）及びＧ４１８又はブレオマイシン ４８を一過性トランスフェクションの７２時間後およびその後の培地の各交換時にそれぞれ加えた時に、恒常的に耐性遺伝子産物を発現するトランスフェクに成功した細胞のみが生き残る。Ｚｅｏｃｉｎ又はＧ４１８含有選択培地の最適な濃度は、それぞれの細胞系の希釈系列を設定することで予め決定される。
【０１９４】
１９．動物細胞における組換えタンパク質の細胞内局在化
ＨＣ１１０−Ｒタンパク質をＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）にＣ末端連結させるため、ＨＣ１１０−Ｒ ＤＮＡの完全コード化領域を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３のＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩサイトにクローニングした。 １３７ｋＤａ融合タンパク質は、一過的にトランスフェクションした組換え細胞系において発現させ、ウェスタンブロット分析により実証することができる。ＣＬＳＭ（共焦点レーザースクリーニング顕微鏡）により、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ融合タンパク質がＣＯＳ−７及びＨＥＫ−２９３細胞の細胞質内に存在し、より小さい程度で、細胞質膜上にも局在化していることが示される（図８も参照）。
【０１９５】
Ｌｅｉｃａ ＣＬＳＭ付属ＴＣＳ ＮＴ （「共焦点レーザースキャンニング顕微鏡」、Ｌｅｉｃａ Ｌａｓｅｒｔｅｃｈｎｉｋ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、バージョン１．５．４５１を備えたＺｅｉｓｓ ＩＭ ３５顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ， Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ）を、共焦点レーザースキャンニング顕微鏡に用いた。ＧＦＰタンパク質の蛍光及び蛍光色素 イソチオシアン酸フルオロセインの蛍光はアルゴンレーザーを用いて４８８ｎｍにて励起され、ローダミン、Ｔｅｘａｓレッド、フィコエリトリン、Ａｌｅｘａ ５６８、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒＴＭＲｅｄ ＤＮＤ−９９、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒＴＭＲｅｄ ＣＭＸ Ｒｏｓ及びヨウ化プロピジウムはクリプトンレーザーを用いて５６８ｎｍにて励起した。細胞を透過する光学分画のＺシリーズは、１０２４×１０２４ピクセルの分解能で厚さ０．５μｍをスキャンした（Ｇｉｅｓｅら、１９９５）。評価は、ＡＶＳソフトウェアー（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて行なわれ、後者はウィンドウズ用のＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ５．０およびＣｏｒｅｌ Ｄｒａｗ ８．０を用いて後に行なった。
【０１９６】
酸性オルガネラを標識するためのプローブＬｙｓｏｔｒａｃｋｅｒＴＭを用いて示されるように、融合タンパク質は酸リソソームに特に局在する。ＨＣ１１０−Ｒタンパク質を含む粒子は、核酸付近で数の増加が見られた。ＧＦＰ及びマウスβ２−アドレナリン作動性ＧＰＣＲの融合タンパク質をコントロールとして調製し（アクセッションナンバー Ｘ１５５６４３， Ｎａｋａｄａら、１９８９）、そのトランスフェクションは、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ融合タンパク質の場合と同様に細胞内と同じ分配パターンを生じた（図８）。
【０１９７】
２０．一過発現のためのＥＧＦＰ構築物
ベクターｐＥＧＦＰ Ｃ１及びｐＥＧＦＰ Ｎ３ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を、制限酵素Ｈｏｎｄ ＩＩＩとＳａｌ Ｉを用いて切断した。ＨＣ１１０−Ｒ全長ｃＤＮＡの増幅は、Ｐ８３ＥＧＦＰ＿ＡＴＧ ＨｉｎｄＩＩＩ ５’プライマー ５’−ＧＧＴ ＡＧＡ ＡＧＣ ＴＴＴ ＴＣＧ ＧＴＴ ＴＡＡ ＴＡＣ ＣＡＡ ＣＡＴ ＧＡＧ Ｇ−３’と、Ｐ３０５７ＥＧＦＰ＿ｏ．ＴＧＡ ＳａｌＩ ３’プライマー ５’−ＣＴＧ ＴＧＴ ＣＧＡ ＣＡＡ ＣＡＴ ＴＴＣ ＧＣＣ ＡＡＴ ＡＧＴ ＴＡＧ Ｇ−３’を用いてアニーリング温度６５℃にて行なった。次いで、そのＰＣＲ産物を同様に、酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＳａｌＩを用いて切断し、特定のベクターのＨｉｎｄ ＩＩＩとＳａｌＩとの開裂部位の間のオープンリーディングフレームを形成させるためにライゲートし、形質転換した。その結果得られたＮ末端ＧＦＰタグを有する融合タンパク質をＧＦＰ−ＨＣ１１０−Ｒと称し、Ｃ−末端ＥＧＦＰを有するものをＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰと称する。マウスβ２アドレナリン作動性受容体（ジーンバンクアクセッションナンバー．： Ｐ１８７６２； Ｎａｋａｄａら、１９８９）は、Ｐ１１７ マウスβ２ＡＲ ＸｈｏＩ ５’プライマー ５’−ＴＡＣ ＣＴＣ ＧＡＧ ＣＴＧ ＣＴＡ ＡＣＣ ＴＧＣ ＣＡＧ ＣＣＡ ＴＧ−３’と、Ｐ１３４９マウスβ２ＡＲ ＥｃｏＲＩ ３’ プライマー ５’−ＴＧＴ ＡＧＡ ＡＴＴ ＣＴＴ ＣＣＴ ＴＣＣ ＴＴＧ ＧＧＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＣＴ−３’とを用いてアニーリング温度５５／６０℃にて全長ｃＤＮＡを増幅させ、制限酵素ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩとを用いて切断し、そしてＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ直線化ｐＥＧＦＰ Ｎ３中にライゲートすることで、Ｃ−末端にＥＧＦＰを融合させた。５５／６０℃にて、Ｐ７０ＨｕｍＭ１Ｒｅｚ ＸｈｏＩ ５’プライマー ５’−ＡＴＡ ＴＣＴ ＣＧＡ ＧＡＧ ＣＣＣ ＣＡＣ ＣＴＡ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＴＧ ＡＡＣ Ａ−３’と、Ｐ１４６５ＨｕｍＭ１Ｒｅｚ ＥｃｏＲＩ ３’プライマー ５’−ＧＡＣ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＡＴ ＴＧＧ ＣＧＧ ＧＡＧ ＧＧＡ ＧＴＧ ＣＧＧ Ｔ−３’とを用いて、既に増幅されたヒトムスカリン性受容体１の全長ｃＤＮＡ（ｈｕＭ１Ｒｅｚ．； ジーンバンクアクセッション Ｎｏ．： Ｙ００５０８； Ａｌｌａｒｄら、１９８７）を、同様にしてＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ切断ｐＥＧＦＰ Ｎ３ベクター中にライゲートした。この結果得られたオープンリーディングフレームを有する融合タンパク質を、マウスβ２ＡＲ−ＥＧＦＰ及びｈｕＭ１Ｒｅｚ−ＥＧＦＰと称する。
【０１９８】
２１．安定なトランスフェクション又は一過性トランスフェクション用のＨＣ１１０−Ｒ−ＭｙｃＨｉｓタグ構築物
ベクターｐＭｙｃ６ｘＨｉｓは、ベクターｐＳｅｃＴａｇＡ［Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｌｅｅｋ， ＮＬ］ を、制限酵素ＮｈｉＩ及びＳｆｉＩを用いて二重消化した後に、末端を平滑化してそのベクターを再度ライゲーションすることにより得られる。ＨＣ１１０−Ｒのコード領域は、ＰＣＲプライマー Ｐ８３ＭｙｃＴａｇ＿ＡＴＧ ＢａｍＨＩ ５’プライマー ５’−ＡＴＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＴＣ ＧＧＴ ＴＴＡ ＡＴＡ ＣＣＡ ＡＣＡ ＴＧＡ ＧＧ−３’と、Ｐ３０５８ＭｙｃＴａｇ＿ｏ．ＴＧＡ ＸｂａＩ ３’プライマー ５’−ＣＣＴ ＧＴＣ ＴＡＧ ＡＡＡ ＣＡＴ ＴＴＣ ＧＣＣ ＡＡＴ ＡＧＴ ＴＡＧ Ｇ−３’とをアニーリング温度５６／６０℃にて用いて増幅し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩを用いて切断し、そして同様にＢａｍＨＩ及びＸｂａＩを用いて直線化したｐＭｙｃ６ｘＨｉｓベクター中にライゲートし、Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞中にトランスフェクションした。続いて、ＣＯＳ−７細胞を、この構築物を用いて安定にトランスフェクトし、Ｚｅｏｃｉｎ選択圧下にて維持した。
【０１９９】
これと平行して、ＨＣ１１０−ＲＭｙｃＨｉｓ ｃＤＮＡを、プライマーＰ８３＿ＡＴＧＮｏｔＩ−５’ ５’−ＡＴＡ ＴＴＧ ＣＧＧ ＣＣＧ ＣＴＴ ＣＧＧ ＴＴＴ ＡＡＴ ＡＣＣ ＡＡＣ ＡＴＧ−３’と、ｐＭｙｃＨｉｓ＿ＴＧＡＢａｍＨＩ−３’ ５’−ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＴＡＧ ＡＡＧ ＧＣＡ ＣＡＧ ＴＣＧ ＡＧＧ−３’とを用いて増幅し、次いで切断して、同様にＢａｍＨＩ及びＮｏｔＩを用いて制限切断されたバイシストロン性発現ベクターｐＩＲＥＳ１ｎｅｏ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション Ｎｏ．： Ｕ８９６７３） （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）中にライゲートした。ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏベクターは、さらにネオマイシン耐性遺伝子（Ｒｅｅｓら、１９９６）の開始部位ＡＴＧのすぐ前にある脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）のリボソーム内結合部位（ＩＲＥＳ）を含んでいる。この方法において、ＨＣ１１０−Ｒの、及び抗生物質耐性マーカーの２つのオープンリーディングフレームは、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９０； Ｊａｎｇら、１９８８）を有する１つのｍＲＮＡからのみ翻訳される。選択は、ＣＯＳ−７細胞及びＨＥＫ−２９３細胞中のＧ４１８ （Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ， Ｕ．Ｓ．Ａ．） を用いて行なった。
【０２００】
２２．共焦点レーザースキャンニング顕微鏡
Ｌｅｉｃａ ＣＬＳＭ付属ＴＣＳ ＮＴ （「共焦点レーザースキャンニング顕微鏡」、Ｌｅｉｃａ Ｌａｓｅｒｔｅｃｈｎｉｋ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、バージョン１．５．４５１を備えたＺｅｉｓｓ ＩＭ ３５顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ， Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ）を、共焦点レーザースキャンニング顕微鏡に用いた。蛍光はアルゴンレーザーを用いて４８８ｎｍにて励起され、そしてクリプトンレーザーを用いて５６８ｎｍにて励起された。細胞を透過する光学分画のＺシリーズは、１０２４×１０２４ピクセルの分解能で厚さ０．５μｍをスキャンした（Ｇｉｅｓｅら、１９９５）。評価は、ＡＶＳソフトウェアー（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｗａｌｔｈａｍ， ＭＡ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて行なわれ、後者はウィンドウズ用のＡｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ ５．０およびＣｏｒｅｌ Ｄｒａｗ ８．０を用いて後に行なった。
【０２０１】
２３．ＨＣ１１０−Ｒ断片に対するα−ＬＴＸの結合の研究
タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍｍｌｉら、１９７０）により分画し、ニトロセルロース膜上で電気泳動した。α−ＬＴＸ結合実験の場合、その染色は、ＴＳＴ中、濃度２０ｎＭのα−ＬＴＸを用いて室温で２時間インキュベーションした。ＴＳＴを用いて３回洗浄した後、抗−α−ＬＴＸ抗体（ウサギ由来Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）を濃度０．１μｇ／ｍＬにて用い、そしてペルオキシダーゼを連結した抗体及びウサギＩｇＧに対する抗体（ヤギ由来、１：２５０００希釈）を用いた。抗体は、全ての実験でＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて検出した（図９を参照）。
【０２０２】
２４．カルシウムイメージング
細胞内の遊離Ｃａ２＋濃度［Ｃａ２＋］ｉは、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ又はβ２−ＡＲ−ＥＧＦＰ構築物を用いて一過的にトランスフェクションしたＤＯＳ−７細胞及びＨＥＫ−２９３細胞にて、カルシウムイメージング法を用いて測定した（図１１も参照）。各々の場合について、２×１０５ ＣＯＳ−７細胞及びＨＥＫ−２９３細胞を、ＤＭＥＭ培地（１０％ ＦＣＳ及びｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含む）５ｍｌを有する５５ｍｍ組織培養皿にて１％ゼラチンを用いてコーティングした４２ｍｍカバーガラスに用いた。トランスフェクションは、非トランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥ ６（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて行なった。これには、ＦＣＳを含まないＤＭＥＭ培地２００μｌにて初めに室温で５分間インキュベーションしたＦｕＧＥＮＥ ６ ６μｌを含み、その後プラスミドＤＮＡ４μｇを加え、さらに１５分間室温にてインキュベーションし、完全トランスフェクション混合物をその細胞にピペットにて滴加した。正しいリーディングフレームに融合されたＧＦＰタグを有するＨＣ１１０−Ｒ全長クローンの構築物、及び同様にその３’端にＧＦＰタグを有するβ２−アドレナリン駆動性受容体の完全ｃＤＮＡの構築物をトランスフェクションした。純粋なｐＥＧＦＰ−Ｎ３発現ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）のプラスミドＤＮＡ４μｇと、トランスフェクション試薬ＦｕＧＥＮＥをＤＮＡなしで加えた非トランスフェクト細胞をコントロールとして保存した。
【０２０３】
１μＭ Ｆｕｒａ−２−アセトキシメチルエステル （Ｆｕｒａ−２ ／ ＡＭ） （Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ） を用いた細胞のローディングは、３７℃、５％ ＣＯ２及び９５％湿度で、３０分間、Ｎａ＋−ＨＢＳ 溶液 （水中、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ； ５．４ ｍＭ ＫＣｌ； １．８ ｍＭ ＣａＣｌ２； ０．８ ｍＭ ＭｇＳＯ４． ７ Ｈ２Ｏ； ２０ ｍＭ フルコース； ２０ ｍＭ ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）， ｐＨ ７．３） 中にてトランスフェクションした４８時間後に行なった。インキュベート後にＦｕｒａ−２／ＡＭと共にローディングした細胞を、倒立顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ， Ａｘｉｏｖｅｒｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）の下で、及びそれと平行して、デジタルイメージング蛍光顕微鏡（ＰＴＩ）の下で試験し、４４０ｎｍと４９０ｎｍそれぞれの波長でトランスフェクト細胞と、非トランスフェクト細胞を区別した。平均して、５〜７のトランスフェクト細胞及び非トランスフェクト細胞は、ＲＯＩ（目的領域）を固定化することで、選択した。吸光は３４０ｎｍ（カルシウム結合Ｆｕｒａ−２／ＡＭ）と、３８０ｎｍ（遊離Ｆｕｒａ−２／ＡＭ）にて測定され、発光は５１０ｎｍにて測定された。イメージマスター（Ｉｍａｇｅ Ｍａｓｔｅｒ） １×ソフトウェアーを用いて、加えた試薬の機能としての３４０：５１０ｎｍ、３８０：５１０ｎｍ及び３４０／３８０：５１０ｎｍの比率の商 （バックグラウンド補正した画像）を形成することで、評価した。
【０２０４】
試薬は、常に、Ｎａ＋ ＨＢＳ緩衝液の適当量を取り測定を開始した６分後に加え、さらに３０〜５０分間、試料容器中に直接ピペッティングする。試料容器中の全量を、実験を通じて１．５ｍｌと一定にした。それぞれの場合、実験を始める分前に、初めに３０ｎＭ及び７５ｎＭ α−ラトロトキシン（α−ＬＴＸ， ＲＢＩ． Ｎａｔｉｃｋ， Ｕ．Ｓ．Ａ．）を、用量依存を決定するため、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ融合タンパク質を発現するＣＯＳ−７細胞に種々の濃度のα−ＬＴＸ（７．５ ｎＭ； ２５ ｎＭ； ５０ ｎＭ， ７５ ｎＭ， ９０ ｎＭ 及び１２０ ｎＭ）を加える、及び最適な活性濃度を決定するため、種々の濃度の環状デプシペプチド ＢＡＹ ４４−４４００ （１００ｎｇ／ｍＬ （８９．３ ｎＭ）、３３３ｎｇ／ｍＬ （２９７ ｎＭ）； ４００ｎｇ／ｍＬ （３５７ ｎＭ）、１μｇ／ｍＬ （８９３ ｎＭ）、１０μｇ／ｍＬ （８．９μＭ）を、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰを発現するＨＥＫ−２９３細胞に加える。幾つかの実験において、ＨＥＫ−２９３細胞を、駆虫活性を有しない、Ｎａ＋ ＨＢＳ中の光学対掌体ＰＦ１０２２−００１ ４又は４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ ４４−４４００あるいは４又は４００ｎｇ／ｍＬと共に、３７℃で５％ＣＯ２及び９７％湿度にて９０分間、プレインキュベーションし、細胞は、１μＭ Ｆｕｒａ−２／ＡＭをＢＡＹ４４−４４００溶液又はＰＦ１０２２−００１に加えることによって６０分後にローディングし、３０分間維持した。細胞を器具に導入した後、７５ｎＭ α−ＬＴＸをさらにそれらに実験開始の６分後に添加した。最適なα−ＬＴＸ濃度 ７５ｎＭを、Ｃ−末端ＧＦＰタグを有するβ２−アドレナリン作動性受容体（β２−Ｒ−ＧＦＰ）を発現するＨＥＫ−２９３細胞にて試験した。ＣｄＣｌ２（それぞれの場合に１μＭ及び１０μＭ）をＮａ＋ ＨＢＳ中に溶解し、ニフェジピン（１５μＭ）及びＥＧＴＡ（２ｍＭ）を０．１％ ＤＭＳＯ中に溶解した。ＣｄＣｌ２及びニフェジピンを実験開始時にすぐ加え、次いでα−ＬＴＸを加え、そしてＥＧＴＡを実験の開始時とα−ＬＴＸの添加の４分後の両方で加えた。溶解α−ＬＴＸは、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ中で濃度３００ｎＭにて存在する；ＢＡＹ４４−４４００は最初、純粋なＤＭＳＯ中に溶解した（ストック溶液は０．００４〜１０μｇ／ｍＬ）。ストック溶液は、Ｎａ＋ ＨＢＳ緩衝液中にて所望の濃度に調整した。最終濃度０．１％ ＤＭＳＯに溶解した活性物質ＢＡＹ４４−４４００の最大量は、Ｎａ＋ ＨＢＳにおける希釈系列を行なって見出した。０．１％ ＤＭＳＯ及びそのたの被験成分のいずれもが、Ｆｕｒａ−２／ＡＭと選択した濃度では相互作用しなかった。
【０２０５】
エクセル（Ｅｘｃｅｌ）９８ の表計算プログラムを用いて、このデータを分析した。結果は少なくとも２〜４回の再現実験、それぞれの場合４〜８のトランスフェクト細胞から導く。
【０２０６】
細胞内カルシウム濃度は、ＭｃＣｏｒｍａｃｋらの方法（１９９１）により前較正した後に、Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃｚらの方法により（１９８５）計算した。
【０２０７】
２５．ＨＣ１１０−Ｒに対するＰＦ１０２２Ａの結合
ＨＣ１１０−Ｒに対するＰＦ１０２２Ａ及びモルホリン誘導体ＢＡＹ４４−４４００の結合は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、リガンド調製及び以下の分析流動細胞計測器（フローサイトメトリー）により示される。さらに、ＰＦ１０２２Ａ及びその誘導体が、α−ＬＴＸのように、ＨＣ１１０−ＲトランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞の［Ｃａ２＋］ｉに変化を引き起こすか否かあるいはＨＣ１１０−Ｒ媒介α−ＬＴＸシグナリングにも影響があるか否かを確認する。
【０２０８】
場合によって、免疫蛍光において明らかなシグナルを与える抗体又はタンパク質が、免疫ブロット法を使用しても反応しないことがある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なうには、タンパク質の変性が必要なため、コンフォメーションに依存するエピトープが破壊され得る。そのようなエピトープを特異的に認識する抗体又はタンパク質はもはや、結合できない。したがって、ＨＣ１１０−Ｒ特異的結合はウェスタンブロットにおいて、ビオチン化活性物質ＰＦ１０２２Ａを用いるか、又はヒトＰＦ１０２２Ａよりもより可溶性のモルホリン誘導体 ＢＡＹ４４−４４００を用いるかのいずれかによっては同定できない。ＢＡＹ４４−４４００は、ＰＦ１０２２ＡのＤ−フェニルアクチル（ｐｈｅｎｙｌｌａｃｔｙｌ）ラジカルのフェニル環と共有結合している２個のモルホリン残基についてＰＦ１０２２Ａと異なっている。しかしながら、疎水性相互作用を破壊することを通じて、ＳＤＳを部分的に除去して、タンパク質を、尿素を用いてＳＤＳ分離ゲルにて再生させる場合、ウェスタンブロットにおいてＨＣ１１０−Ｒ特異的結合を検出することができる。この目的のために、非トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞及びＨＣ１１０−Ｒ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓを一過的に発現するＨＥＫ−２９３細胞由来の全タンパク質、及びＥ． ｃｏｌｉにて発現されるＨＣ１１０−Ｒの５４ ｋＤａのＮ末端及び２１ ｋＤａのＣ末端を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、再生して常法によりブロッティングした。免疫検出は、リガンドＢＡＹ４４−４４００と共に、ウサギ抗ＰＦ１０２２Ａ−ＫＬＪ免疫血清と共に、及びヤギ抗−ウサギＩｇＧ ＨＲＰ抗体と共にインキュベーションした後に行なった。さらに、非トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞、ＨＣ１１０−Ｒ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓを用いて一過的にトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞、及びＥ． ｃｏｌｉ中にて発現されるＨＣ１１０−ＲのＮ末端、及びＨ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ由来の全タンパク質を用いた部分的再生ＳＤＳポリアクリルアミドゲルをブロッティングし、ＰＦ１０２２Ａ−ビオチンと共にインキュベーションし、ストレプトアビジン ＨＲＰを用いて検出した。２つのブロットの各々については、ＨＣ１１０−Ｒ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓを安定に発現するＨＥＫ−２９３細胞ではサイズ１１６ｋＤａの明確なバンドを示したのに対し、非トランスフェクト細胞を用いたレーンではこのレベルではバンドを示さない。さらに、モルホリン誘導体ＢＡＹ４４−４４００と、２１ｋＤａのＣ−末端を除くＨＣ１１０−Ｒの５４ｋＤａ Ｎ末端と結合しているビオチン化ＰＦ１０２２Ａとの両方が、特異的ＰＦ１０２２Ａ結合を示さない。成虫Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ 線虫由来の全タンパク質分画の２つのバンドンの全量は、ビオチン化ＰＦ１０２２Ａを用いて検出できる：サイズ１１０ｋＤａのバンド及びサイズ約８８ｋＤａの別のバンド。特に、サイズ１１０ｋＤａのバンドとは対照的に検出をストレプトアビジンＨＲＰを用いて排他的に行なった場合でさえ検出されるため、おそらく後者は、すでに線虫ヘテラキスｓｐｕｍｏｓａについて記載した８３ｋＤａのタンパク質のようなビオチン化タンパク質である。もう一方は、ＨＣ１１０−Ｒ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓを用いて安定にトランス���ェクションしたＨＥＫ−２９３細胞はもはや、ストレプトアビジンＨＲＰのみのサイズ１１６ｋＤａのバンドを示さない。さらにヤギ抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ二次抗体単独により生じる非特異的シグナルを排除できた。
【０２０９】
さらにこの結果を検証すために、以下のリガンド沈殿を行なった。磁性Ｄｙｎａｌ Ｍ−２８０ストレプトアビジン結合ビーズの一部２ｍｇ及び４ｍｇを、ビオチン化ＰＦ１０２２Ａ５００μｇと共に混合した。Ｄｙｎａｌビーズ４ｍｇを用いたコントロール混合物において、ＴＳＴ緩衝液をＰＦ１０２２Ａに代えて加えた。過剰量のＰＦ１０２２Ａビオチンを磁性分離により除去し、次いでＥ． ｃｏｌｉにて発現され、事前にアフィニティークロマトフラフィーにより精製したＰＦ１１０−Ｒ末端及びＣ末端を加えた。非結合ＨＣ１１０−Ｒ断片を除去するための再生磁性分離の後に、Ｄｙｎａｌビーズ２ｍｇ、及び４ｍｇから得られる部分標本をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、ブロッティングした。沈殿物の検出は、マウス抗−Ｈｉｓ ＩｇＧ及びウサギ抗−マウス ＩｇＧ ＨＲＰ抗体を有するＮ末端融合Ｈｉｓタグを介して行なった。ＰＦ１０２２Ａに結合しないＨＣ１１０−ＲのＣ−末端が事前に磁性分離により分離されていることに基づいて、ＨＣ１１０−ＲのＮ末端 ５４ｋＤａ領域のみをＰＦ１０２２Ａにより沈殿させる。ストレプトアビジン結合ビーズに対するＨＣ１１０−ＲのＮ−又はＣ−末端の非特異的結合は、反応混合物にビオチン化ＰＦ１０２２Ａを加えないことで排除した。
【０２１０】
インビボにおけるＨＣ１１０−Ｒに対するリガンドＰＦ１０２２Ａの結合を、さらにＦＡＣＳ分析により分析した（図１３）。この目的のために、ＨＥＫ−２９３細胞を、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ又はＧＦＰ−ＨＣ１１０−Ｒを用いて一過トランスフェクションするか、その他にはＨＣ１１０−Ｒ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓ及びＧＦＰを用いて同時トランスフェクションした。非トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞、及びβ２−Ｒ−ＧＦＰ又はＭ１−Ｒ−ＧＦＰを用いて一過的にトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３をコントロールとして用いた。トランスフェクションの２４時間後に、細胞をビオチン化ＰＦ１０２２Ａと共にインキュベーションし、、ＰＦ１０２２Ａ結合細胞をストレプトアビジン−フィコエリトリンを用いて検出し、最終的に固定化した。ネガティブコントロールであるＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰを用いてトランスフェクションした細胞を、ＰＦ１０２２Ａ−ビオチンを用いず、ストレプトアビジン−フィコエリトリンのみを用いてインキュベーションした。
【０２１１】
ＦＡＣＳｃａｎは、細胞サイズ、粒状度及び蛍光染色についてそれぞれ１００００ ＨＥＫ−２９３細胞を蛍光分析するために、励起波長４８８ｍｍを用いて使用した。フィコエリトリンは、ＴＲＩＴＣのように、ＥＧＦＰとオーバーラップした吸光スペクトルを有する一方で、発光スペクトルは十分に離れているため、両方の蛍光色素を単一の波長のみで励起できる。細胞破砕物は、主な細胞集団に「ゲート」を設けることで蛍光強度測定から排除できる。定量的評価については、非トランスフェクト細胞及びＧＦＰトランスフェクト細胞の基礎に基づく陰性（ネガティブ）、非染色及び陽性（ポジティブ）、ＧＦＰ−蛍光細胞についての制限は固定した。非トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞の緑色蛍光４．６％（自己蛍光）は、他のＧＦＰ蛍光試料から引いた；そしてフィコエリトリン−結合ストレプトアビジン （５．４％） による細胞の非特異的染色の値を、全てのレッド蛍光細胞から引いた（表１）。
表１　ＦＡＣＳｃａｎによる、ＨＣ１１０−Ｒを用いてトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞に結合するＰＦ１０２２Ａの検出
【表１】
2004508052.tif 000003
【０２１２】
自己蛍光及びストレプトアビジン−フィコエリトリンによる非特異的な赤染色を引いた後の、赤（レッド）蛍光でもある緑色蛍光細胞の百分率を計算することで、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰを発現する細胞が４１．２％、ＧＦＰ−ＨＣ１１０−Ｒを発現する細胞が２６．８％、そしてＨＣ１１０−Ｒ−Ｍｙｃ／ＨｉｓとＧＦＰ結合ＰＦ１０２２Ａとを用いて同時トランスフェクションした細胞が４４．５％であることが示されたが、ＧＦＰを発現している細胞は僅かに７．５％であり、β２−Ｒ−ＧＦＰを発現している細胞は９．９％、そしてＭ１−Ｒ−ＧＦＰ ｂｉｎｄ ＰＦ １０２２Ａを発現している細胞は１９．２％であった（図１３）。
【０２１３】
２６．ＨＣ１１０−Ｒ媒介性α−ＬＴＸシグナル伝達を用いたＰＦ１０２２Ａ誘導体の相互作用
ＰＦ１０２２Ａは、線虫種に応じて１０−９〜１０−３ｍｇ／ｍｌの間のインビトロにおける神経薬理学的活性を示す。ＨＣ１１０−Ｒ及びＨＣ１１０−Ｒにより媒介されるα−ＬＴＸシグナリングを用いてＰＦ１０２２Ａとその誘導体の任意の干渉を検出するため、ＢＡＹ４４−４４００、より可溶性のＰＦ１０２２Ａモルホリン変異体の効果は、Ｃａ２＋イメージング法を用いて、ＨＣ１１０−Ｒを一過又は安定に発現するＨＥＫ−２９３細胞において調査した。ＰＦ１０２２Ａの光学対掌体であって、インビトロ及びインビボにおいて１００倍以上の活性を有するＰＦ１０２２−００１を、コントロールとして用いた。ＢＡＹ４４−４４００及びＰＦ１０２２Ａ−００１の疎水性のため、初めにＢＡＹ４４−４４００及びＰＦ１０２２−００１を、純粋なＤＭＳＯ中に溶解した。０．１％ＤＭＳＯがいつも実験混合物中に存在するように、ストック濃度を選択した。対照実験においては、非トランスフェクトＨＣ１１０−Ｒ細胞及びＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰを用いてトランスフェクションしたＨＣ１１０−Ｒ細胞の実験結果に支障をきたさない最大のＤＭＳＯ濃度、０．１％にまで排除できる（図１４）。Ｆｕｒａ−２−ローディングした非トランスフェクト細胞及びＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰを用いてトランスフェクションした細胞を、一方では１００、３００又は４００ｎｇ／ｍＬ及び１又は１０μｇ／ｍＬのＢＡＹ４４−４４００か、又は他方では同じ濃度のＰＦ１０２２−００１を用いて刺激した。濃縮なしで、Ｃａ２＋媒介応答は５０分の前期間に渡って検出可能であった。図１４Ｂ及びＣは、４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００及びＰＦ１０２２−００１を用いた、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ及びＭ１−Ｒ−ＧＦＰでトランスフェクションした細胞の刺激を、実施例のように示す。さらにＰＦ１０２２Ａ変異体は細胞に取り込まれ、シグナル伝達経路を２次的に阻害して、寄生虫に応じて寄生虫内で長期間、ＰＦ１０２２Ａ誘導体は維持され得るため、幾つかの実験において細胞を該誘導体と共に９０秒間プレインキュベーションした。４ｎｇ／ｍＬ又は４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００又はＰＦ１０２２−００１を用いてプレインキュベーションした細胞は、［Ｃａ２＋］ｉに変化がない（図１４Ｄ）。濃度３００ｎｇ／ｍＬ又はそれ以上のＢＡＹ４４−４４００を直接加える場合は、光学対掌体とは対照的に、４０倍の倍率をもって細胞を表すモニター上で、数分のうちに逆転する僅かな膨張が、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰを用いてトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞における駆虫薬の効果を直接的に観察できた。
【０２１４】
最近の実験では、ピペラジンが、インビトロ及びインビボにおいてヘテラキスｓｐｕｍｏｓａを用いた実験においてＰＦ１０２２Ａ／ＢＡＹ４４−４４００の効果を相乗的に増大することが示された。４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００を１又は１０μＭ ピペラジンと同時に与えた場合（図１４Ｆ）、非トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞又はＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰを用いて一過的にトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞のいずれにおいても、［Ｃａ２＋］ｉの変化は検出できなかった。１０μＭ ピペラジンを用いたコントロール混合物は、同様に、非トランスフェクト及びＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰトランスフェクト細胞のＣａ２＋バランスに変化を引き起こさなかった（図１４Ｅ）。
【０２１５】
これとは対照的に、範囲は変えてあるが、ＢＡＹ４４−４４００及び光学対掌体ＰＦ１０２２−００１の両方は、７５ ｎＭα−ＬＴＸの存在下にて、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ発現ＨＥＫ−２９３細胞のα−ＬＴＸ誘導型シグナル伝達に影響を及ぼした（図１４Ｂ〜Ｅ）。ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ又はＭ１−Ｒ−ＧＦＰを用いてトランスフェクションした細胞を、刺激の６分前に７５ｎＭ α−ＬＴＸ、０．１％ ＤＭＳＯを用いて処置する対照実験においては、後者の濃度のＢＡＹ４４−４４００及びＰＦ１０２２−００１に用いられる溶媒により発揮される［Ｃａ２＋］ｉにおけるα−ＬＴＸ誘導型変化の効果を排除できる。Ｍ１−Ｒ−ＧＦＰ発現細胞とは対照的に、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ発現細胞は、α−ＬＴＸを加えた後の［Ｃａ２＋］ｉの値と匹敵する上記の二相性のプロファイルを示した（図１５Ａ）。４ｎｇ／ｍＬのＢＡＹ４４−４４００で６分間、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−発現細胞を誘導した後、α−ＬＴＸを加え、Ｃａ２＋ 濃度に対するα−ＬＴＸの記載された効果を減少させた。：α−ＬＴＸによって誘導される［Ｃａ２＋］ｉ の最初の小さな増加は、消失し、２番目の送れたピークは、α−ＬＴＸの添加から１４分後に４４±６．０ ｎＭ Ｃａ２＋ に減少した （図１５Ｂ）。４ｎｇ／ｍＬのＰＦ１０２２−００１の存在下で、α−ＬＴＸでの刺激の６分前に添加を行った、１０３±１１．５ ｎＭ Ｃａ２＋ の急速な増加がみられた（図１５Ｂ）。４００ ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００をα−ＬＴＸの添加の６分前にＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−発現細胞に添加した場合、４ ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００ （図１５Ｂ）の場合と同様に、２３分間で４９±４．２ ｎＭの、［Ｃａ２＋］ｉ の遅延された増加がみられ、８分後に水平に減少し、最初の値と比較して、１１±１．４ ｎＭにわずかに増加した（図１５Ｃ）。α−ＬＴＸとインキュベーションする６分前に、４００ ｎｇ／ｍＬ ＰＦ１０２２−００１ ７５ ｎＭ添加すると、以前４ ｎｇ／ｍＬ ＰＦ１０２２−００１の添加で観察された（図１５Ｂ）のと同様に、１１２±１４．３ ｎＭ Ｃａ２＋というＣａ２＋の急速な増加がみられた（図１５Ｃ）。別の実験計画では、各ケースにおいて、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−発現 ＨＥＫ−２９３細胞を４ ｎｇ／ｍＬ （図１５Ｄ）または４００ ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００またはＰＦ１０２２−００１と９０分間プレインキュベーションした （図１５Ｅ）。インキュベーション後、結合しなかったまたは取り出した活性物質を注意深く洗浄し、細胞にＦｕｒａ−２／ＡＭを加えた後、細胞を７５ ｎＭα−ＬＴＸで刺激した。光学対掌体 ＰＦ１０２２−００１とプレインキュベーションしたＨＣ１１０−Ｒ−トランスフェクト細胞は、４ ｎｇ／ｍＬ ＰＦ１０２２−００１で、１０２±６．４ ｎＭの［Ｃａ２＋］ｉ の増加を示し（図１５Ｄ）、４００ ｎｇ／ｍＬで１０９±８．４ ｎＭ Ｃａ２＋ の同様の増加を示した（図１５Ｅ）。α−ＬＴＸの添加後たった２、３分で観察されたＣａ２＋のこの増加は、α−ＬＴＸによる刺激の直前にＰＦ１０２２−００１を添加した場合、図１５Ｂおよび１５Ｃにおいて前に観察された［Ｃａ２＋］ｉ の急速な変化と類似していた。対照的に、ＢＡＹ４４−４４００は、ＨＣ���１０−Ｒ−ＧＦＰ−発現細胞を４ ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００と９０分プレインキュベーションした場合、α−ＬＴＸ−減少したＣａ２＋ 流入と関係して、異なった反応を示した：α−ＬＴＸ誘発は、２３±２．６ ｎＭ Ｃａ２＋ に上昇した広範囲の水平になる前に、１０分で９５±２０．５ ｎＭという最大の増加を導いた［Ｃａ２＋］ｉ（図１５Ｄ）。４００ ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００でのプレインキュベーションでは、α−ＬＴＸ刺激の後、 ［Ｃａ２＋］ｉ が最大６５±７．５ ｎＭに増加し（図１５Ｄ）、これは４ ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００でのプレインキュベーションと比較して１２分の遅延であった （図１５Ｃ）。
【０２１６】
４００ ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００の、α−ＬＴＸの添加の６分前の、ＨＣ１１０−Ｒ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓを安定に発現しているＨＥＫ−２９３細胞への添加により、２６７±４５．８ ｎＭ の［Ｃａ２＋］ｉ の観察された急速な増加の完全な阻害がみられた （図１５Ｆ）。これとは対照的に、４００ ｎｇ／ｍＬ ＰＦ１０２２−００１の添加は、 ［Ｃａ２＋］ｉの有意の変化は誘導せず、Ｃａ２＋の増加は２０９±３３．４ ｎＭ Ｃａ２＋ であった（図１５Ｆ）。
【０２１７】
ＨＣ１１０−Ｒ−発現細胞におけるα−ＬＴＸ−媒介Ｃａ２＋ シグナル伝達に対するＢＡＹ４４−４４００の特異的な効果を証明するために、以下の対照実験を行った：最初の非トランフェクトＨＥＫ−２９３細胞を、４００ ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００の存在下および非存在下で、ムスカリン性アセチルコリン受容体に対するリガンドである、１ ｍＭ　塩化カルバミルコリン（カルバコール）で刺激した（図１５Ｇ）。両ケースにおいて、ＢＡＹ４４−４４００の存在下でＨＥＫ−２９３細胞について５８±８．１ ｎＭ Ｃａ２＋および駆虫薬の非存在下で５３±６．８ ｎＭ Ｃａ２＋の、内因性の、天然のムスカリン性アセチルコリン受容体による［Ｃａ２＋］ｉ の類似した急速な増加が見られた。ＧＦＰ （Ｍ１−Ｒ−ＧＦＰ）にＣ末端融合したヒトムスカリン性 Ｍ１−アセチルコリン受容体による、ＨＥＫ−２９３細胞の更なる一過性トランスフェクションは、４００ ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００の存在下で８９±５．５ ｎＭ、非存在下で８５±６．１ ｎＭ Ｃａ２＋ の、非トランスフェクト細胞（図１５Ｇ）と比較して［Ｃａ２＋］ｉのわずかな増加につながった（図１５Ｈ）。Ｍ１−Ｒ−ＧＰＣＲに対するＢＡＹ４４−４４００の有意な効果は観察できなかった。非トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞における、１ ｍＭ イソプロテレノールでの、内因的に存在する天然のβ２−アドレナリン作動性受容体の刺激、または１ ｍＭアレコリンでの、ニコチン受容体の刺激は、カルバコールについて記載したように、４００ ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００の存在下および非存在下では、またしても、［Ｃａ２＋］ｉ の有意な違いはなかった（図１５Ｉ）。イソプロテレノールは、ＢＡＹ４４−４４００の存在下で４５±４．７ ｎＭ［Ｃａ２＋］ｉ、およびＢＡＹ４４−４４００非存在下で４８±５．７ ｎＭ Ｃａ２＋の増加を誘導したアレコリン刺激後、ＢＡＹ４４−４４００の存在下でＣａ２＋の２８±４．１ ｎＭ、およびこの活性物質の非存在下で２７±３．５ ｎＭ ｉｎ Ｃａ２＋の増加がみられた（図１５Ｉ）。
【０２１８】
２７．抗体の入手
抗体は、雌性ＮＭＲＩマウスおよびウサギ （チンチラクロス） を用いることによって入手した。ＮＭＲＩマウスの免疫は、３×１５μｇの精製２１ｋＤ　Ｃ末端ＨＣ１１０−Ｒタンパク質断片をそれぞれ１００ μｌのＦＣＡとともに１００μｌのＰＢＳ− 中に溶解し、１、８および１５日目に２匹のナイーブ ＮＭＲＩマウスに皮下注射した。血液サンプルの採取と血清の入手は２３日目に行った。
【０２１９】
血清を入手するために、心臓穿刺により得た血液を、最初に３７℃で１時間インキュベーションした後、４℃で少なくとも２時間インキュベーションした。次いで、細胞の構成成分を、Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＰＫＲ 遠心機にて、２回、３０００ ｒｐｍ、４℃で１０分間ペレット化し、上清を５６℃で４５分間不活化した。Ｈｅｒａｅｕｓ ｂｉｏｆｕｇｅ １５Ｒ にて、１３ ０００ ｒｐｍ、４℃で１０分間さらに遠心した後、血清を取り出し、さらに使用するまで−２０℃で保存することができる。
【０２２０】
最初の血液採取および免疫前血清の入手の後、２匹のウサギに最初に、等部分のＰＢＳ−およびＦＣＡからなる懸濁液中の、５０ μｇのＣ末端２１ ｋＤ ＨＣ１１０−Ｒタンパク質、および５０ μｇの５４ ｋＤ Ｎ末端ＨＣ１１０−Ｒタンパク質を皮下注射で投与した。最初の免疫後、３１日目および７９日目に、さらに２回、１００ μｇの抗原を用いて免疫した。最初の血液採取は４３日目に行った。２回目の血液採取と血清の入手は、最初の免疫から９８日目に行った。
【０２２１】
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６４．Ｔａｇａｋｉ Ｍ．， Ｓａｓａｋｉ Ｔ．， Ｙａｇｕｃｈｉ Ｔ．， Ｋｏｄａｍａ Ｙ．， Ｏｋａｄａ Ｔ．， Ｍｉｙａｄｏｈ Ｓ． 及びＫｏｙａｍａ Ｍ． （１９９１）駆虫効果を有する新規シクロデプシペプチド、ＰＦ１０２２Ａについて． Ｎｉｐｐｏｎ Ｎｏｇｅｉｋａｇａｋｕ Ｋａｉｓｈｉ ６５， ３２６ （Ａｂｓｔｒ．）。
６５．Ｔｅｒａｄａ Ｍ． （１９９２） 広東住血線虫及び単離されたカエル直筋における、シクロデプシペプチドの新規構造を有する抗線虫駆虫薬、ＰＦ１０２２Ａの神経薬理学的作用機構． Ｊｐｎ． Ｊ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ４１， １−１８。
６６．　Ｔｅｒａｄａ Ｍ．， Ｉｓｈｉｈ Ａ．， Ｔｕｎｇｔｒｏｎｇｃｈｉｔｒ Ａ．， Ｓａｎｏ Ｍ． 及びＳｈｏｍｕｒａ Ｔ． （１９９３） 経路、用量及び剤系に対する特別の基準を用いた、マウスにおいて広東住血線虫の幼虫を発育させる際のＰＦ１０２２Ａの効果． Ｊｐｎ． Ｊ． Ｐａｒａｓｉｔｏｌ． ４２， １９９−２１０。
６７．　Ｔｈｏｍａｓ Ａ．Ｐ． 及びＤｅｌａｖｉｌｌｅ Ｆ． （１９９１） 細胞集団及び単一細胞において細胞基質不含カルシウム濃度を測定するための蛍光指標の使用． ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １−５４．
６８．　Ｗａｌｌｅｒ Ｐ．Ｊ． （１９９７） 駆虫薬 ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ． Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ７２， ３９１−４１２ 。
６９．　Ｗａｌｌｅｒ Ｐ．Ｊ． （１９９８） 家畜の線虫寄生虫を統合退治する概念に対する国際的アプローチ． Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ ７３， １５５−１６４。
７０．　Ｙａｎｇ Ｆ．， Ｍｏｓｓ Ｌ．Ｇ． 及びＰｈｉｌｌｉｐｓ Ｇ．Ｎ． Ｊｒ． （１９９６ａ．） 緑色蛍光タンパク質の分子構造． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， １２４６−１２５１。
７１．Ｙａｎｇ Ｔ．Ｔ．， Ｃｈｅｎｇ Ｌ．Ｚ． 及びＫａｉｎ Ｓ． Ｒ． （１９９６ｂ） 最適コドン使用頻度及び発色団突然変異により、感受性が増進された緑色蛍光タンパク質が提供される． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２４， ４５９２−４５９３。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＣ１１０−Ｒ ｍＲＮＡ及びタンパク質
（Ａ） ヘモンクス コントルタス由来の全量ＲＮＡ及びＨＣ１１０−Ｒの３．６ｋｂｐ ｃＤＮＡを使用したノーザンブロット分析。
（Ｂ）インビトロ翻訳３５Ｓ−標識化ＨＣ１１０−Ｒタンパク質の１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥフルオログラム。インビトロ転写ＨＣ１１０−Ｒ ｍＲＮＡ （ＨＣ１１０−Ｒ）１μｇのインビトロ翻訳、ＨＣ１１０−Ｒ ｍＲＮＡ （コントロール）を含まないネガティブコントロール、ポジティブコントロールとしてのルシフェラーゼｍＲＮＡ（ルシフェラーゼ） １μｇ。
【図２】ＨＣ１１０−Ｒの全長ｃＤＮＡ配列及び誘導アミノ酸配列
ＨＣ１１０−ＲのＫｏｚａｋモチーフ（Ｋｏｚａｋ， １９８９）及びポリアデニル化シグナル（ジーンバンクアクセッション Ｎｏ．： ＡＪ２７２２７０）は下線で示す；１００位の開始コドンは太字で示す。シグナルペプチド（残基１〜２１、太字）、レクチン様配列（残基２２〜１２５、点）、Ｔｈｒストレッチ（残基１２８から１４７、グレーの網掛け）；構造ＣＸ９ＷＸ１２ＣＸ９ＷＸＣＸ５ＷＸ９ＣＸ３Ｗのシステイン リッチ（豊富）領域（残基１６６−２２１、波線、Ｃｙｓ及びＴｒｐ残基はさらに太字）；構造ＣＸＷＷＸ６ＷＸ４ＣＸ１１ＣＸＣの４−Ｃｙｓ領域（残基７８−５２４、破線、Ｃｙｓ及びＴｒｐ残基はさらに太字）；７回膜貫通領域（残基５６３〜７７２の間、グレーの網掛け）ＰＥＳＴ領域（残基９１５〜９３３、グレーの網掛け）；Ｎ−グリコシル化部位（残基２６、４９９及び８６２、太字）；セクレチンＧＰＣＲ間（部位５９５及び６６６、太字及び二重下線）のＣｙｓ−Ｃｙｓペアーの高保存推定ジスルフィド結合。
【図３】Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ ＨＣ１１０−Ｒ及び線虫エレガンス コスミドクローン Ｂ０４５７ （ＣＥ−Ｂ０４５７； ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．： Ｚ５４３０６）の誘導アミノ酸配列のアライメント
シグナルペプチド（ＳＰ、残基１〜２１、太字）、レクチン様配列（レクチン、残基２２〜１２５、点）；Ｔｈｒストレッチ（Ｔ−リッチ、残基１２８〜１４７、グレーの網掛け）；構造ＣＸ９ＷＸ１２ＣＸ９ＷＸＣＸ５ＷＸ９ＣＸ３ＷのＣｙｓ−リッチ領域（Ｃシグネーチャー、残基１６６〜２２１、波線、Ｃｙｓ及びＴｒｐ残基はさらに太字）；構造ＣＸＷＷＸ６ＷＸ４ＣＸ１１ＣＸＣの４−Ｃｙｓモチーフ（４Ｃ 領域、残基４７８−５２４、破線、Ｃｙｓ及びＴｒｐ残基はさらに太字）；７回膜貫通領域（残基５３６〜７７２の間、太字及び下線）Ｐｒｏ−リッチストレッチ（Ｐ−リッチ、残基８４５〜８６１、グレーの網掛け）；ＰＥＳＴ領域（ＰＥＳＴ、残基９１５〜９３３、グレーの網掛け）；Ｎ−グリコシル化部位（残基２６、４９９及び８６２、太字）；セクレチンＧＰＣＲ間のＣｙｓ−Ｃｙｓペアーの高保存推定ジスルフィド結合（５９５及び６６６部位、太字及び二重下線）。同一アミノ酸は星印をもって、非常に関連するアミノ酸はコロンをもって、関連のあるアミノ酸は単一の点をもって示す。
【図４】７回膜貫通受容体 ＨＣ１１０−Ｒ及びセクレチン サブファミリーの種々の他の受容体のアライメント
ＨＣ１１０−Ｒ： ヘモンクス コントルタス７回ラセンオーファン膜貫通受容体 （アクセッション ｎｏ．： ＡＪ２７２２７０）； ＢＴＬＡＴ３： Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ラトロフィリン−３ （種々のスプライシング変異体アクセッション ｎｏ．： Ｇ４１６４０５３−Ｇ４１６４０７５）； ＲＮＬＡＴ１： ラッタス（Ｒａｔｔｕｓ）ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ラトロフィリン−１ （アクセッション ｎｏ．： Ｕ７８１０５， Ｕ７２４８７）； ＭＭＥＭＲ１： Ｍｕｓ 筋肉ＥＭＲ１ホルモン受容体前駆体 （アクセッション ｎｏ．： Ｑ６１５４９）； ＨＳＣＤ９７： ホモサピエンス白血球活性化抗原ＣＤ９７ （アクセッション ｎｏ．： Ｐ４８９６０）； ＭＭＣＡＤＨ： Ｍ． ｍｕｓｃｕｌｕｓ幼虫７回膜貫通受容体前駆体 （アクセッション ｎｏ．： Ｇ３８００７３８）； ＸＬＸＲＦ１： Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓコルチコトロピン関連受容体前駆体 （アクセッション ｎｏ．： Ｏ４２６０２）； ＲＮＶＩＰ１： Ｒ． ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ血管作動性腸管ポリペプチド受容体前駆体２ （アクセッション ｎｏ．： Ｑ０２６４３）。この７回膜貫通ドメインはグレーの網掛け（Ｉ−ＶＩＩ）で示し、高度に保存された推定ジスルフィド結合を太字で示す。
【図５】Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ ＨＣ １１０−Ｒ及びＲ． ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ラトロフィリン−１ （ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ． Ｎｏ． Ｕ７８１０５， Ｕ７２４８７）の誘導アミノ酸配列のアライメント
シグナルペプチド （ＳＰ、残基１〜２１、太字）、レクチン様配列 （ｌｅｃｔｉｎ、残基２２〜１２５、点）； Ｔｈｒストレッチ （Ｔ−リッチ、残基１２８〜１４７、グレーの網掛け）； 構造ＣＸ９ＷＸ１２ＣＸ９ＷＸＣＸ５ＷＸ９ＣＸ３Ｗ のＣｙｓ−リッチ領域 （Ｃシグネーチャー、残基１６６〜２２１、破線、Ｃｙｓ及びＴｒｐ残基はさらに太字）； 構造ＣＸＷＷＸ６ＷＸ４ＣＸ１１ＣＸＣの４−Ｃｙｓモチーフ （４Ｃ領域、残基４７８〜５２４、破線、Ｃｙｓ及びＴｒｐ残基はさらに太字）； ７回膜貫通領域 （残基５３６と７７２との間、太字及び下線）； Ｐｒｏ−リッチストレッチ （Ｐ−リッチ、残基８４５〜８６１、グレーの網掛け）； ＰＥＳＴ領域 （ＰＥＳＴ、残基９１５〜９３３、グレーの網掛け）； Ｎ−グリコシル化部位 （残基２６、４９９及び８６２、太字）； セクレチンＧＰＣＲｓ間 （部位５９５及び６６６、太字及び二重下線）のＣｙｓ−Ｃｙｓペアーの高度に保存された推定ジスルフィド結合。同一アミノ酸は星印により、非常に関連するアミノ酸はコロンにより、関連アミノ酸は１個の点で示す。
【図６】ＨＣ１１０−Ｒタンパク質の構造及びラトロフィリン−１の構造
（Ａ）　７回膜貫通ドメインを有するＨＣ１１０−Ｒの疎水性ブロッティング。
（Ｂ）　以下の特徴的なモチーフを有するＨＣ１１０−Ｒのタンパク質構造：シグナル配列 （ＳＰ）、レクチンドメイン （レクチン）、Ｔｈｒストレッチ （Ｔ−ストレッチ）、Ｃｙｓモチーフ （シグネーチャー）、４−Ｃｙｓ領域 （４Ｃ領域）、７回膜貫通ドメイン （１−７、黒色）、Ｐｒｏ−リッチモチーフ （Ｐ−リッチ） 及びＰＥＳＴ配列 （ＰＥＳＴ）。推定グリコシル化領域部位は下部のダイアグラム（Ｎ）にて示す、推定ジスルフィド結合 （大文字なしの細線）の４Ｃ領域のＣｙｓ残基及び２つの保存Ｃｙｓ残基である。
（Ｃ）　ラトロフィリン−１のタンパク質構造。ラトロフィリン−１は、Ｔｈｒストレッチを有していないが、付加的なオルファクトメディンモチーフ（オルファクトメディン）、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ領域（Ｐ−Ｔ領域）、リンカードメイン（リンカー）及び幾つかの繰り返しを含む長い領域を含む。
【図７】ＨＥＫ−２９３及びＣＯＳ−７細胞におけるＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰの発現
（Ａ）　ＧＦＰ （ＧＦＰ） 又はＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ （ＨＣ１１０−Ｒ） を用いて一過的にトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３及びＣＯＳ−７細胞、及び非トランスフェクト （ｎ． ｔ．） ＨＥＫ−２９３及びＣＯＳ−７細胞由来の全タンパク質は、トランスフェクションの２４時間後にＴｒｉｚｏｌ法により単離した。
（Ｂ）　β２−Ｒ−ＧＦＰ （β２−Ｒ）又はＭ１−Ｒ−ＧＦＰ （Ｍ１−Ｒ）を用いて一過的にトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞、及び非トランスフェクト （ｎ． ｔ．） ＨＥＫ−２９３細胞由来の全タンパク質は、トランスフェクションの２４時間後にＴｒｉｚｏｌ法により単離した。ＳＤＳマーカーバンドは、１１６、９０、７０及び５５ｋＤａ （マーカー）である。
レーン当たり全タンパク質２０μｇを１０％ポリアクリルアミドゲルにて分画化し、ニトロセルロース膜にブロットした。ＲｏｔｉＢｌｏｃｋ溶液中にて一晩中ブロッキングして、モノクローナルマウス抗−ＧＦＰ ＩｇＧ一次抗体（０．４μｇ／ｍＬ）とモノクローナルウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ二次抗体（１：２５０００）を用いて、ＥＣＬシステムによる免疫検出を行なった。
【図８】ＣＬＳＭによるトランスフェクトＣＯＳ−７におけるＨＣ１１０−Ｒ及びβ２−Ｒの細胞局所化
いずれもＣ末端ＧＦＰタグを有しているＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ及びβ２−Ｒ−ＧＦＰを用いて、ＣＯＳ−７細胞をトランスフェクションした。トランスフェクトの２４時間後にＣＬＳＭを行なった。棒線は１０μｍに相当する。
（Ａ）　ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰは、原形質膜上及び細胞区画中に発現する。細胞小胞のコンパクションが核近傍に見られる。
（Ｂ）　 酸リソソームと緑色ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰタンパク質とのＣＬＳＭ共存は、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＤＮＤ−９９を用いて、３７℃で１時間染色した。
（Ｃ）　β２−Ｒ−ＧＦＰ−トランスフェクト細胞は、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰと類似のＧＦＰ蛍光パターン、又は以下の（Ａ）に記載のようなＧＦＰ蛍光パターンを示す。この受容体は、原形質膜及び小胞中に局在化し、幾つかの場合には酸リソソームと共に局在化し得る（染色はＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ Ｒｅｄ ＤＮＤ−９９を用いて３７℃にて１時間で行なった）。
（Ｄ）　発現したβ２−Ｒ−ＧＦＰは、幾つかの場合、小胞体と共に局在化する（染色はモノクローナル抗ＫＤＥＬ抗体を用いて行なった）。
【図９】ＨＣ１１０−Ｒに対するα−ラトロトキシンの結合
（Ａ）　単離したＬａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ ｒｅｖｉｖｅｎｓｉｓ 毒液腺（ｖｅｎｏｍ ｇｌａｎｄｓ）（１）由来の全タンパク質５μｇ、及び純粋な１３０ ｋＤａ α−ＬＴＸ （２）、ｐＩＲＥＳ１ｎｅｏベクターのＨＣ１１０−Ｒ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓ構築物を用いて安定にトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞由来の各ケースの全タンパク質４０μｇ （３）、非トランスフェクト細胞 （４） 及び５ Ｅ． ｃｏｌｉに導入したＨＣ１１０−Ｒの４ ｋＤａ Ｎ末端（６） 及び２１ ｋＤａ Ｃ末端（７） を、１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて分画し、一晩中ブロッティング及びブロッキングした。変性タンパク質は、２０ｎＭ α−ＬＴＸと共に２時間インキュベーションし、ウサギ抗−α−ＬＴＸ ＩｇＧ−ＨＲＰ（１：５０００）及びヤギ抗−ウサギＩｇＧ抗体（１：２５０００）及びＥＣＬシステムを用いて検出されるα−ＬＴＸの結合が可能となる。
（Ｂ）　Ｅ． ｃｏｌｉに導入したＨＣ１１０−ＲのＣ末端（１）及びＮ末端（２）由来の各ケースの全タンパク質４０μｇ、及び非トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞由来の全タンパク質（３）、及びＨＣ１１０−Ｒ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓを用いて安定にトランスフェクションしたＨＥＫ−２９３細胞（４）、及び生体Ｈ． ｃｏｎｔｏｒｔｕｓ 線虫（５）を、１０％ ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにて分画し、４Ｍ 尿素含有再生緩衝液を用いて部分的に再生させた。ブロットを一晩中ブロッキングし、２０ｎＭ 純粋α−ＬＴＸを用いてインキュベーションし、、そしてα−ＬＴＸ結合タンパク質をウサギ抗−α−ＬＴＸ ＩｇＧ抗体（１：５０００）、ビオチンタンパク質Ａ（１：１００）、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（１：３０００）及びＥＣＬシステムを用いて検出した。
【図１０】ＨＣ１１０−Ｒ媒介Ｃａ２＋シグナリングにおけるα−ＬＴＸの用量依存性
ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰを用いて一過的にトランスフェクションした４８時間後に、ＨＥＫ−２９３細胞を１μＭ Ｆｕｒａ−２／ＡＭを用いて３０分間ローディングした。この細胞を、種々のα−ＬＴＸ濃度の測定を開始した６分後にさらに４４分間刺激した。３４０／３８０ｎｍの商（比率） は、時間の機能として計測した。選択した細胞の数をｎとして表す。
（Ａ）　ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−発現細胞は、７．５ｎＭ （黒線） 又は２５ｎＭ α−ＬＴＸ （グレーの線）を用いて刺激した。
（Ｂ）　５０ ｎＭ （グレーの線） 又は７５ｎＭ α−ＬＴＸ （黒線） を、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−発現細胞に加えた。
（Ｃ）　ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−発現細胞は、９０ｎＭ （グレーの線） 又は１２０ｎＭ α−ＬＴＸ （黒線）を用いて刺激した。
（Ｄ）　［Ｃａ２＋］ｉ は、横軸にｎＭでプロットし、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ発現ＨＥＫ−２９３細胞を刺激して得られた第一の迅速型ピーク（第一のピーク、グレーの線）及び第二の遅延型ピーク（第二のピーク、黒線）についてα−ＬＴＸ濃度（０， ７．５， ２５， ５０， ７５， ９０及び１２０ｎＭ）を縦軸にプロットした。
【図１１】ＨＣ１１０−ＲトランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞のＣａ２＋イメージング
（Ａ）　Ｃ−末端ＧＦＰタグを有するＨＣ１１０−Ｒ（ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ）： 黒線。Ｎ末端ＧＦＰタグを有するＨＣ１１０−Ｒ（ＧＦＰ−ＨＣ１１０−Ｒ）： 灰色線。
（Ｂ）　非トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞（ｎ． ｔ．、黒線）及びＧＦＰトランスフェクト細胞を用いた７５ｎＭ α−ＬＴＸ （ＧＦＰ、灰色線）。
（Ｃ）　Ｃ−末端標的ヒトＭ１ ムスカリン性アセチルコリン受容体 （Ｍ１−Ｒ−ＧＦＰ、灰色線）及びＣ−末端標的化マウスβ２アドレナリン作動性アセチルコリン受容体 （β２−Ｒ−ＧＦＰ、黒線）を用いてトランスフェクションした細胞を用いた７５ ｎＭα−ＬＴＸ。
（Ｄ）　ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−トランスフェクト細胞を、２ｍＭ ＥＧＴＡを用いて６分間処理した後、α−ＬＴＸ （７５ ｎＭ） （＋ＥＧＴＡ、灰色線）を加えた。ＥＧＴＡはコントロールから省いた （−ＥＧＴＡ、黒線）。
（Ｅ）　２ｍＭ ＥＧＴＡは、α−ＬＴＸ（７５ ｎＭ）を加えた１０分後に加えた（＋ＥＧＴＡ、灰色線）。コントロール混合物にはＥＧＴＡは加えなかった （−ＥＧＴＡ、灰色線）。
（Ｆ）　コントロールとして、非トランスフェクト細胞 （ｎ． ｔ．、灰色線） 及びＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−発現細胞 （黒線）を、２ｎＭ ＥＧＴＡと共に３０分間混合した。
【図１２】α−ＬＴＸにより生じるシグナル伝達を用いた、ＢＡＹ４４−４４００による干渉
ＨＥＫ−２９３を、ＧＦＰタグ化ＨＣ１１０−Ｒタンパク質を用いて一過的にトランスフェクトし、そのトランスフェクションの４８時間後に刺激した（矢印）。Ｃａ２＋イメージングを５０分間行なった（図Ａ〜Ｄ）、非トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞の種々の内因性天然受容体を用いた対照実験は２０分間行なった。ｎは細胞の数を示す。
（Ａ）　４００ｎｇ／ｍＬのＢＡＹ４４−４４００ （黒線）又はＰＦ１０２２−００１ （灰色線）を細胞に添加する。コントロールとして、ＢＡＹ４４−４４００又はＰＦ１０２２−００１を加えた後に、その細胞を、種々の物質の溶剤としても供するＮａ＋ ＨＢＳ／ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＨＢＳ）を用いて処理した。
（Ｂ）　４ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００ （黒線） 及びＰＦ１０２２−００１ （灰色線）の存在下にて、α−ＬＴＸ（７５ｎＭ）により生じるシグナル伝達。
（Ｃ）　４ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００ （黒線） 又はＰＦ１０２２−００１ （灰色線）と共に９０分間、プレインキュベーションした細胞におけるα−ＬＴＸにより生じるシグナル伝達。この物質はα−ＬＴＸを加える前に除いた。
（Ｄ）　４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００ （黒線） 又はＰＦ１０２２−００１ （灰色線）と共に９０分間、プレインキュベーションしたＨＥＫ−２９３−ＧＦＰトランスフェクト細胞により生じるシグナル伝達。この物質はα−ＬＴＸを加える前に除いた。
（Ｅ）　非トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞は、１ｍＭ 塩化カルバミルコリン（カルバコール）を用いて、４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００の存在下（４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００、黒線）又は非存在下（灰色線、−ＢＡＹ４４−４４００）にて１００秒間刺激した。
（Ｆ）　非トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞は、１ｍＭ イソプロテレノール及び１ｍＭアレコリンを用いて、４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００の存在下（４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００、黒線）又は非存在下（灰色線、−ＢＡＹ４４−４４００）にて、各場合において１００秒間刺激した。
【図１３】ＦＡＣＳｃａｎによるＨＣ１１０−ＲトランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞に対するＰＦ１０２２Ａ結合の検出
トランスフェクトしていない、ＧＦＰ、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ、ＧＦＰ−ＨＣ１１０−Ｒ、β２−Ｒ−ＧＦＰ及びＭ１−Ｒ−ＧＦＰを用いて一過的にトランスフェクションした、及びＨＣ１１０−Ｒ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓを用いて一過的に同時トランスフェクションした５×１０５ ＨＥＫ−２９３細胞の各場合において、トランスフェクション後、０．５μｇ／ｍＬ ＰＦ１０２２Ａ−ビオチン及びストレプトアビジン−フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）（１：３００）と共に２４時間インキュベーションし、そして固定した。ネガティブコントロールとして、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰトランスフェクト細胞を、ＰＦ１０２２Ａ−ビオチンを除いてストレプトアビジン−フィコエリトリンのみとインキュベーションした。自己蛍光の減算、即ち、全ての緑色蛍光細胞の緑色チャネルにおける非トランスフェクト細胞 （ｎ． ｔ．） ４．６％ 、及び赤色チャネルにおけるストレプトアビジン−フィコエリトリンにより生じる非特異的染色４．４％の減算の後、ＰＦ１０２２Ａと結合しているＧＦＰ蛍光細胞 （ＧＦＰ、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ、ＧＦＰ−ＨＣ１１０−Ｒ、β２−Ｒ−ＧＦＰ、Ｍ１−Ｒ−ＧＦＰ及びＨＣ１１０−Ｒ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓ＋ＧＦＰ）の比率を見出した （％におけるＰＦ１０２２Ａ結合）。３組みの混合物の平均を決定して、標準偏差を求めた。
【図１４】ＨＣ１１０−Ｒ媒介Ｃａ２＋シグナル伝達に対するＢＡＹ４４−４４００及び光学対掌体ＰＦ１０２２−００１の効果
１μＭ Ｆｕｒａ−２／ＡＭを用いた細胞のローディングを、非トランスフェクトＨＥＫ−２９３細胞、およびＨＥＫ−２９３−ＧＦＰ又はＭ１−Ｒ−ＧＦＰを用いて一過的にトランスフェクションした４８時間後に行なった。３４０／３８０ｎｍの商 （比率） を、時間の関数として測定した。選択した細胞の数をｎにより示す。
（Ａ）　非トランスフェクト （ｎ． ｔ、灰色線） 及びＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−トランスフェクト（ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ、黒線） 細胞を、Ｎａ＋ ＨＢＳ緩衝液中の０．１％溶媒ＤＭＳＯを用いてコントロールとして６分後に混合した。
（Ｂ）　ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ− （黒線） 及びＭ１−Ｒ−ＧＦＰ− （灰色線） トランスフェクト細胞を、４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００を用いて６分後に刺激した。
（Ｃ）　（Ｂ）と同様に、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ− （黒線） 及びＭ１−Ｒ−ＧＦＰ− （灰色線） トランスフェクト細胞を、４００ｎｇ／ｍＬ ＰＦ１０２２−００１を用いて６分後に刺激した。
（Ｄ）　ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−発現細胞を、４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００ （黒線） 又はＰＦ１０２２−００１ （灰色線） を用いて９０分間プレインキュベーションし、非結合物質を測定前に洗い流した。
（Ｅ）　１０μＭ ピペラジンを、非トランスフェクト細胞 （ｎ． ｔ．、灰色線） 及びＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−発現細胞 （ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ、黒線） に６分後に加えた。
（Ｆ）　１０μＭ ピペラジン及び４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００の混合物を、非トランスフェクト細胞 （ｎ． ｔ．、灰色線） 及びＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−発現細胞 （ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ、黒線） に６分後に加えることを除いて、（Ｅ）と同様に行った。
【図１５】ＰＦ１０２２Ａ誘導体を介するＨＣ１１０−Ｒ媒介α−ＬＴＸシグナル伝達の相互作用
１μＭ Ｆｕｒａ−２／ＡＭを用いた細胞のローディングは、非トランスフェクトＨＥＫ−２９３、およびＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ又はＭ１−Ｒ−ＧＦＰを用いて一過的にトランスフェクションした４８時間後に行なった。用いたα−ＬＴＸの量は、常に７５ｎＭであった。コントロール物質を用いた実験については、細胞は、流速１．６ｍｌ Ｎａ＋ ＨＢＳ／分で流した。３４０／３８０ｎｍの商 （比率） は、時間の関数として測定した。選択した細胞の数はｎにて示す。
（Ａ）　［Ｃａ２＋］ｉ．におけるα−ＬＴＸで誘導される変化に対する効果を有するＤＭＳＯを排除するため、α−ＬＴＸ刺激の６分前に、ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ− （黒線） 及びＭ１−Ｒ−ＧＦＰ− （灰色線） 発現細胞を、０．１％ ＤＭＳＯと混合した。
（Ｂ）　ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−トランスフェクト細胞は、α−ＬＴＸを添加する６分前に４ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００ （黒線） 又はＰＦ１０２２−００１ （灰色線）と混合した。
（Ｃ）α−ＬＴＸを用いた刺激の６分前に、４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００ （黒線） 又はＰＦ１０２２−００１ （灰色線）をＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−発現細胞に添加したことを除き、（Ｂ）と同様に行った。
（Ｄ）　ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−トランスフェクト細胞は、４ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００ （黒線） 又はＰＦ１０２２−００１ （灰色線） と９０分間プレインキュベーションし、非結合物質を測定前に除去した。細胞の刺激はα−ＬＴＸを用いて６分後に行なった。
（Ｅ）　ＨＣ１１０−Ｒ−ＧＦＰ−トランスフェクト細胞を４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００ （黒線） 又はＰＦ１０２２−００１ （灰色線）と９０分間プレインキュベーションして、非結合物質を測定前に除去し、細胞をα−ＬＴＸで６分後に刺激したことを除いて、（Ｄ）と同様に行った。
（Ｆ）　ＨＣ１１０−Ｒ−Ｍｙｃ／Ｈｉｓを安定に発現する細胞を、α−ＬＴＸの添加の６分前に、４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００ （黒線） 又はＰＦ１０２２−００１ （灰色線）と混合した。
（Ｇ）　コントロールとして、１ｍＭ 塩化カルバミルコリン（カルバコール） を６分後に１００秒間加え、再びＮａ＋ ＨＢＳを用いて洗浄し、４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００の存在下（４００ ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００、黒線）及び非存在下（−ＢＡＹ４４−４４００、灰色線）にて非トランスフェクト細胞に対し、再度Ｎａ＋ ＨＢＳ用いて洗浄した。
（Ｈ）　Ｍ１−Ｒ−ＧＦＰ−トランスフェクト細胞を、４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００の存在下 （４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００、黒線） 又は非存在下 （−ＢＡＹ４４−４４００、灰色線） で６分後に１ｍＭ カルバコールで１００秒間刺激し、再度Ｎａ＋ ＨＢＳを用いて洗浄することを除いては、（Ｇ）と同様に行った。
（Ｉ）　コントロールとして、４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００の存在下（４００ｎｇ／ｍＬ ＢＡＹ４４−４４００、黒線） 又は非存在下 （−ＢＡＹ４４−４４００、灰色線）で、３分後に１ｍＭ イソプロテレノールで１００秒間刺激し、１２分後に１ｍＭアレコリンで１００秒間刺激した。１００秒後に、物質をＮａ＋ ＨＢＳを用いて再度洗浄した。
【図１】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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