(57)【要約】種々の感度で第１の相互作用分子と第２の相互作用分子との相互作用を検出する方法。この種々の感度は、ＤＮＡ結合ドメインを含有する餌（ｂａｉｔ）ハイブリッドタンパク質（感度低下）またはレポーター遺伝子のＤＮＡ活性化ドメインを含有する獲物（ｐｒｅｙ）ハイブリッドタンパク質（感度増強）の過剰発現を提供することにより得られる。特定の系のニーズに従って、いずれかの外因性アクチベーターの使用が容易に達成される。
2004500805.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
種々の感度で第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との相互作用を検出する方法であって：
（ａ）宿主細胞を提供し、ここで宿主細胞は、検出可能なレポーター遺伝子産物を発現することができる検出可能なレポーター遺伝子を含み；
（ｂ）宿主細胞に、ＤＮＡに結合する領域を含む第１の相互作用分子（これは、巨大分子または小分子でもよい）と、転写活性化する領域を含む第２の相互作用分子（これは、巨大分子または小分子でもよい）とを提供し、ここで宿主細胞はさらに、第１のまたは第２の巨大分子または小分子の絶対量または相対量を制御する能力を有し；
（ｃ）検出可能なレポーター遺伝子が活性化されるように、第１のもしくは第２の巨大分子もしくは小分子の量を制御し；そして
（ｄ）検出可能なレポーター遺伝子が活性化されている程度を測定する、
ことを含んでなる上記方法。
【請求項２】
検出可能なレポーター遺伝子の活性化により、検出可能なレポータータンパク質が産生される、請求項１の方法。
【請求項３】
第２の相互作用分子は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸、他の巨大分子、小分子、薬剤、または他の生物学的または化学的相互作用分子である、請求項１の方法。
【請求項４】
第１のまたは第２の相互作用分子は巨大分子であり、宿主細胞中で転写される第１のまたは第２のキメラ遺伝子を宿主細胞中に導入することにより提供される、タンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡでもよい、請求項３の方法。
【請求項５】
第１のキメラ遺伝子は、第１の外因的に活性化されるプロモーター、ＤＮＡ結合領域もしくはポリペプチドをコードする配列、および巨大分子をコードする配列を含む、請求項４の方法。
【請求項６】
第１の外因的に活性化されるプロモーターは第１の外因性アクチベーターにより活性化される、請求項５の方法。
【請求項７】
第１の相互作用分子は、宿主細胞中で転写される第２のキメラ遺伝子を宿主細胞に導入することにより提供される、請求項４の方法。
【請求項８】
第２のキメラ遺伝子は、第２の外因的に活性化可能なプロモーター、転写活性化ドメインもしくはポリペプチドをコードする配列、および第２の巨大分子をコードする配列を含む、請求項７の方法。
【請求項９】
第２の外因的に活性化可能なプロモーターは、第２の外因性アクチベーターにより活性化される、請求項８の方法。
【請求項１０】
第１のまたは第２の外因性アクチベーターの少なくとも１つは、天然もしくは合成の、代謝活性のあるもしくは不活性のステロイド、ステロイド類似体、またはステロイド模倣物である、請求項６または９の方法。
【請求項１１】
第１のまたは第２の外因性アクチベーターの少なくとも１つは、コルチゾール、ヒドロコルチゾン、ミネラルコルチコイド、エストロゲン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、アンドロゲン、エクダイソン、レチノイド、オーファン受容体に相補的なステロイド、ミネラルコルチコイドおよびミネラルコルチコイド類似体、またはステロイド応答性成分と相互作用する他の物質よりなる群から選択される、請求項１０の方法。
【請求項１２】
選択されたレポーター感度の少なくとも１つの連続的または不連続の調整を与えるために、宿主細胞を、１つ以上の細胞外、膜、細胞内、または核部位で作用する調節物質に応答して、第１のもしくは第２の相互作用分子または他の巨大分子もしくは小分子の相対量もしくは総量を制御できるようにすることをさらに含む、請求項１の方法であって、調節物質は：
（ａ）天然または合成の、代謝活性のあるまたは不活性の、ステロイド類似体もしくはステロイド模倣物（糖質コルチコイド、デキサメタゾン、コルチゾン、コルチゾール、ヒドロコルチゾン、ミネラルコルチコイド、エストロゲン、エストラジオール、エストロン、プロゲステロン、アンドロゲン、エクダイソン、レチノイド、オーファン受容体に相補的なステロイド、ミネラルコルチコイドおよびミネラルコルチコイド類似体を含む）、またはステロイド応答性成分と相互作用することができる他の物質；
（ｂ）イオノフォア、麻酔剤、界面活性剤、両親媒性物質、疎水性物質、脂質活性物質、溶媒、トランスメンブランシグナル伝達物質、膜内シグナル伝達物質、およびファルネシル化剤を含む、膜活性物質またはその類似体；
（ｃ）抗生物質、抗癌剤、核酸結合剤、細胞骨格活性物質、キレート化物質、インデューサー、同時レプレッサー、および外因性もしくは内因性メディエーター、ホルモンおよび分子の細胞内輸送、局在化、防御、および崩壊に影響を与える物質を含む、小分子薬剤；
（ｄ）増殖因子、サイトカイン、ホルモン、およびこれらの細胞受容体、ならびにその断片および模倣物を含む、生物分子または天然もしくは合成生物学的薬剤の少なくとも１つからなる、上記方法。
【請求項１３】
感度は、複数のステップの用量応答ベースを含む、用量応答ベースで連続的に調整可能である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
感度は不連続に調整可能である、請求項１２の方法。
【請求項１５】
感度は、不連続および連続的に調整可能である、請求項１２の方法。
【請求項１６】
第１のまたは第２の相互作用分子の相対量または絶対量を制御するために、調節物質の機能を妨害することができる物質が加えられる、請求項１２の方法。
【請求項１７】
請求項１２の方法であって、宿主細胞は：
第１が、定量可能な生成物を与える構築体であり、第２と第３は、活性化されると、栄養要求性突然変異体のレスキューに適している、２ハイブリッド相互作用の検出のための３つの組み込まれた受容体
を含有するサッカロミセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来であり、ここで第１の相互作用分子は
（ａ）アンピシリンもしくはカナマイシン耐性遺伝子、ＣｏｌＥ１複製開始点、および餌ポリペプチドを含む第１のハイブリッドタンパク質と、その発現が組み込まれたエストロゲン誘導性プロモーターにより制御されるＧＡＬ４ｐＢＤ  ＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドを、宿主細胞に導入し；次に
（ｂ）プロモーターの誘導を活性化することができる外因性アクチベーター中で宿主細胞をインキュベートすることにより、第１のハイブリッドタンパク質の発現を誘導することにより提供され、そして
第２の相互作用分子は
（ａ）アンピシリンもしくはカナマイシン耐性遺伝子、ＣｏｌＥ１複製開始点、およびライブラリーから得られる獲物ポリペプチドを含む第２のハイブリッドタンパク質とその発現がラット糖質コルチコイド誘導性プロモーターにより制御されるＧＡＬ４ｐＡＤ  転写活性化ドメインのカルボキシル末端をコードするＤＮＡ配列を含有するプラスミドを、宿主細胞に導入し；次に
（ｂ）プロモーターを活性化することができる外因性アクチベーター中で宿主細胞をインキュベートして、第２のハイブリッドタンパク質の発現を誘導することにより提供される、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連文献の相互参照）
１９９９年１０月７日に出願された米国仮出願第６０／１５８，０７９号（参照することにより本明細書に組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
（本発明の背景）
遺伝子ベースの相互作用系は、一般に科学的研究およびその研究から得られた商業的かつ治療的応用に使用されている。現在の遺伝子ベースの相互作用系は、感度が完全に「ある」かまたは完全に「無い」かという固定された相互作用感度レベルにより厳しく制限されている（フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）とソング（Ｓｏｎｇ）、１９８９；バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）ら、１９９３；ギウリス（Ｇｙｕｒｉｓ）ら、１９９３；メンデルソーン（Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ）とブレント（Ｂｒｅｎｔ）、１９９４；フィジッキイ（Ｐｈｉｚｉｃｋｙ）とフィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）、１９９５；ベイ（Ｂａｉ）とエレッジ（Ｅｌｌｅｄｇｅ）、１９９７；ブラックマン（Ｂｒａｃｈｍａｎｎ）とブーケ（Ｂｏｅｋｅ）、１９９７；フィンレイ（Ｆｉｎｌｅｙ）とブレント（Ｂｒｅｎｔ）、１９９７；ヤング（Ｙｏｕｎｇ）、１９９８）。これは、多くの生物学的に無関係の相互作用の検出、ならびに関係のある生物学的相互作用を検出することができないことの両方に関連して、問題を引き起こす。この問題の結果は、重要な生物学的に関係のある相互作用、細胞経路、および関係する可能性のある調節物質や薬剤を解明することが完全に不可能であるか、または解明するのに長時間かかることである。
【０００３】
歴史的に、分子的相互作用を検出する遺伝子系の最初の記載は、２ハイブリッド系である（フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）とソング（Ｓｏｎｇ）、１９８９；図１）。これは、サッカロミセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中でタンパク質−タンパク質相互作用を検出する元々の概念と実施を記載している。この元々の系の特徴は、酵母細胞の核内のタンパク質−タンパク質のインビボ検出である。これらの細胞は、相互作用の存在下で視覚的に検出可能な細菌遺伝子ｌａｃＺを発現するように作成された。基本的には、宿主細胞を、ＤＮＡ結合ドメインと第１のポリペプチドとからなる第１のハイブリッドタンパク質をコードする発現可能な遺伝子で形質転換した。さらに宿主細胞を、転写活性化ドメインと、第１のタンパク質断片の安定な相互作用をする第２のポリペプチドとからなる第２のハイブリッドタンパク質で形質転換した。最後に細胞をまた、第１のハイブリッドタンパク質のＤＮＡ結合ドメインの少なくとも１つのＤＮＡ結合配列を含有し、第２のハイブリッドタンパク質の転写活性化ドメインが近傍にある時、上昇した検出可能なレベルで転写され得るｌａｃＺレポーター遺伝子で、形質転換した。フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）とソング（Ｓｏｎｇ）は、２つのハイブリッドタンパク質が発現されると、宿主細胞中のｌａｃＺレポータータンパク質のレベルが劇的に増加することを証明した。これは、第１のハイブリッドタンパク質中のＤＮＡ結合ドメインが、レポーター遺伝子のＤＮＡ結合配列に結合し、第１のハイブリッドタンパク質の第１のポリペプチドが第２のハイブリッドタンパク質の第２のポリペプチドと、第２のハイブリッドタンパク質の転写活性化ドメインをｌａｃＺ遺伝子の近傍に持っていき、こうして転写と以後の発現を増加させるように、相互作用していることを示した。
【０００４】
この基本的なアプローチは、後のすべての２ハイブリッド系および３ハイブリッド系で使用されている。この研究を拡張したものは、真核生物（アロンハイム（Ａｒｏｎｈｅｉｍ）ら、１９９７；ギウリス（Ｇｙｕｒｉｓ）ら、１９９７）、ならびに原核生物（ブストス（Ｂｕｓｔｏｓ）とシュレイフ（Ｓｃｈｌｅｉｆ）、１９９３；ブンカー（Ｂｕｎｋｅｒ）とキングストン（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ）、１９９５；ヘイズ（Ｈａｙｓ）ら、２０００）の核、細胞質、または膜中のそのような検出能力を記載している。初期の技術が、以後拡張されて、多くの原核生物（ブストス（Ｂｕｓｔｏｓ）とシュレイフ（Ｓｃｈｌｅｉｆ）、１９９３；ブンカー（Ｂｕｎｋｅｒ）とキングストン（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ）、１９９５；ヘイズ（Ｈａｙｓ）ら、２０００）、および真核生物（他の真菌株、節足動物、植物、および哺乳動物細胞）（例えば、バサバダ（Ｖａｓａｖａｄａ）ら、１９９１；フィアロン（Ｆｅａｒｓｏｎ）ら、１９９２；ルオ（Ｌｕｏ）ら、１９９７；ショーダ（Ｓｈｏｄａ）ら、２０００）が含まれている。
【０００５】
遺伝子的分子的相互作用検出への並行したアプローチが、ＲＮＡおよびＤＮＡとの、ならびに小リガンド（ペプチドや薬剤を含む）との、タンパク質の相互作用を検出するのに記載されている（リー（Ｌｉ）とヘルスコウィッツ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ）、１９９３；ヤング（Ｙａｎｇ）ら、１９９５；セングプタ（ＳｅｎＧｕｐｔａ）ら、１９９６；ブラックマン（Ｂｒａｃｈｍａｎｎ）とブーケ（Ｂｏｅｋｅ）、１９９７；ヤング（Ｙｏｕｎｇ）、１９９８）。これらすべては、２つの細胞内分子間の相互作用を検出する手段として、生きた細胞を使用するという同じ基本的概念で作用する。
【０００６】
元々のフィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）の２ハイブリッド系後の遺伝子的分子的検出系もまた、通常遺伝子的選択の追加の特徴を有する（フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）とソング（Ｓｏｎｇ）、１９８９）。選択は、生存の表現型を選ぶことにより相互作用の検出を可能にする。すなわち、充分に強く相互作用しないかまたは全く相互作用しないタンパク質を含有する細胞は増殖できず、従ってもう考慮されない。現在の選択法は、「すべてまたは全くなし」の栄養要求株の栄養素、抗生物質選択、または生存に影響を与える他の手段に限定されている（フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）とソング（Ｓｏｎｇ）、１９８９；ギウリス（Ｇｙｕｒｉｓ）ら、１９９３；ベイ（Ｂａｉ）とエレッジ（Ｅｌｌｅｄｇｅ）、１９９７）。おそらく無関係な対の相互作用分子候補を含有する細胞は、科学者または他の自動分析による介入無しに排除されるため、選択は、種々の検出系の大きな利点を与える。
【０００７】
しかし、遺伝子的選択の導入は、インビボの遺伝子的分子的検出系に新しくかつ厳しい制限的側面を導入した。インビボの分子的相互作用について選択する現在のすべての方法は、検出すべき相互作用の強さについてあらかじめ推測しなければならない。それ以上では相互作用が検出され、それ以下では検出されない閾値があるように、系を構築しなければならない。すなわち、非常に弱いかまたは一過性の相互作用は、おそらく真実ではないかまたは重要ではないという暗黙の仮定がある。系の感度が高過ぎるとバックグランドを検出し過ぎるため、これらの相互作用を排除するように、系が設計される。しかしもし系が高感度でないと、重要な相互作用が見逃されるであろう。これらの系を構築する者は、検出感度を妥当に妥協させて、系を作成し、試験し、そして使用してきた。簡単に述べると、彼らは、平均すると許容されるバックグランドを与え、許容される数の生物学的に関連する相互作用を見逃す組成を選択してきた。
【０００８】
出力を報告するこの「すべてまたは全くなし」の閾値を克服するための初期の粗雑な試みには、以下のものがある：（ａ）酵母を、亜致死濃度の毒性栄養類似体（例えばヒスチジン合成インヒビターとして３−ＡＴ）に暴露（マングス（Ｍａｎｇｕｓ）ら、１９９８）；および（ｂ）いくつかの異なる固定（調整不可能）レベルの検出を与える、レポーターの複雑な遺伝子的修飾物の作成（ジェームズ（Ｊａｍｅｓ）ら、１９９６；フィンレイ（Ｆｉｎｌｅｙ）とブレント（Ｂｒｅｎｔ）、１９９７；セレブリイスキイ（Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ）ら、１９９９）。そのような複雑修飾物には、（ｂ．１．）可変数のレポーター結合部位（フィンレイ（Ｆｉｎｌｅｙ）とブレント（Ｂｒｅｎｔ）、１９９７に記載のように、ロイシンレポーターについて、複数のＬｅｘＡ結合部位（例えば、フィンレイ（Ｆｉｎｌｅｙ）とブレント（Ｂｒｅｎｔ）、１９９７に記載のように、ロイシンレポーターについて、複数のＬｅｘＡ結合部位）の使用により例示される）、および（ｂ．２．）レポーター結合部位と転写開始部位との可変の距離（ウェスト（Ｗｅｓｔ）ら、１９８４）の使用がある。
【０００９】
現在の検出系の特徴は、標準的栄養条件下で２ハイブリッドライブラリー融合体を発現させてまたは発現させないで、タンパク質相互作用の検出を完全にオンまたはオフにする能力である。ギウリス（Ｇｙｕｒｉｓ）ら（１９９３）は、高レベルで２つのハイブリッドタンパク質の１つを発現させることができるか、またはそのような１つのタンパク質の発現を制限することができることにより、両方のハイブリッドタンパク質の存在が、レポーター遺伝子の活性化に必要であることをインビボで示すことができることを見いだした。すなわち、相互作用成分の１つのオンまたはオフ調節を可能にするスイッチを加えた。この調節は有用であり、レポーター活性を調節することによりその作用を及ぼすが、これは、２ハイブリッドタンパク質相互作用系の感度の連続的調整可能性を提供しない。すなわち、ギウリス（Ｇｙｕｒｉｓ）系は、先行技術の限界をさらに証明している（それは、オンかオフのいずれかであり、系を構築した時に選択されたレポーターにより設定される同じ閾値の上か下のいずれかである）。
【００１０】
２ハイブリッド系の特定の分子−分子相互作用から得られるレポーター遺伝子発現のレベルは、そのレポーターと組合せて使用される分子について均一である。ブレント（Ｂｒｅｎｔ）ラボはまず、従来の２ハイブリッドタンパク質−タンパク質相互作用系を使用した実験でこれを証明した。この実験は、定量的ｌａｃＺレポーターの出力は、ハイブリッドタンパク質で使用されるタンパク質断片についてのタンパク質−タンパク質相互作用の独立に決定された強度（またはＫｄ）に正比例することを示した。２つのタンパク質がインビトロで強く相互作用した場合は、これらは、２ハイブリッドレポーターから頑丈な発現を与えたのであり、その逆も真である。従ってこれらはまた、あるレポーターの出力は、ある対の相互作用タンパク質について一定であることを証明した。遺伝子的分子的相互作用についての多くの刊行物が、相互作用自身の強度の相対的指標として、相互作用系からの定量的レポーター出力を含んでいるため、これは現在一般に受け入れられている（エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら、１９９７）。
【００１１】
本発明は、そのような検出系の調整可能性を提供するのに、初期の系と比較して驚くべきかつ予想外の利点を与える。
【００１２】
（発明の要約）
本発明は、改良された２ハイブリッドまたは３ハイブリッド検出法およびこの方法を利用するキットを含む。本発明の方法は、任意の従来の２ハイブリッドまたは３ハイブリッド法（阻害または競合２ハイブリッド法を含む）ならびにこれらの方法の将来の変法とともに使用される。本発明のすべての実施態様において、宿主細胞中の検出可能なレポーター遺伝子は、宿主細胞に提供される相互作用分子の相対量または絶対量を変化させることにより、連続的に調整することができる。この方法は、任意の型の分子（特に限定されないが、タンパク質、ポリペプチド、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、薬剤、他の生物学的または化学物質、および他の小分子または巨大分子を含む）の間の相互作用を検出するのに使用される。この方法は、原核生物と真核生物または細胞の両方の相互作用を検出するのに使用される。分子的相互作用は、種々の位置（特に限定されないが、細胞外領域、細胞膜、細胞質、核膜、核、および他の細胞内領域）で起きる。
【００１３】
好適な実施態様において、第１のキメラ遺伝子と第２のキメラ遺伝子が宿主細胞中に導入される。次に宿主細胞は、第１のハイブリッドタンパク質と第２のハイブリッドタンパク質が、活性化される宿主細胞内の検出可能なレポーター遺伝子について少なくとも充分な量で発現される条件に付される。第１のキメラ遺伝子は、第１の外因性に活性化可能なプロモーターと、第１のハイブリッドタンパク質をコードする配列とを含有する。第１のハイブリッドタンパク質は、レポーター遺伝子の近くで結合可能なＤＮＡ結合ドメインと第１の相互作用ポリペプチド（ｂａｉｔ、餌）を含有する。第２のキメラ遺伝子は、第２の外因性に活性化可能なプロモーターと、第２のハイブリッドタンパク質をコードする配列とを含有する。第２のハイブリッドタンパク質は、レポーター遺伝子の転写を誘導または上昇することができる転写活性化ドメインと、第２の相互作用ポリペプチド（ｐｒｅｙ、獲物）を含有する。この第２のポリペプチドは、ライブラリー由来でもよい。レポーター遺伝子の感度は、第１のおよび／または第２の外因性アクチベーターを加え、第１のおよび／または第２のハイブリッドタンパク質の相対量または絶対量を変化させることにより、改変される。これらの改変は、活性に影響を与え、従ってレポーター遺伝子の感度に影響を与える。活性化の感度は、第１の外因性プロモーターを活性化することができる第１の外因性アクチベーターを加えることにより低下する。これは、第１のハイブリッドタンパク質の産生を上昇させ、第２のハイブリッドタンパク質のレベルに対して宿主細胞中のそのレベルを上昇させる。すなわちこの上昇後、レポーター遺伝子のより多くのＤＮＡ結合部位が、第１のハイブリッドタンパク質により占められ、第２のハイブリッドタンパク質が相互作用に利用できない。従ってより少ないレポーター遺伝子が活性化され、活性化は弱い。
【００１４】
レポーター活性化の感度は、第２の外因性プロモーターを活性化することができる第２の外因性アクチベーターを加えることにより上昇する。これは、第２のハイブリッドタンパク質の産生を上昇させ、第１のハイブリッドタンパク質のレベルに対して、宿主細胞中のそのレベルを上昇させる。すなわちこの上昇後、レポーター遺伝子のより多くのＤＮＡ結合部位が、第２のハイブリッドタンパク質とさらに相互作用する第１のハイブリッドタンパク質により占められる。従ってより多くのレポーター遺伝子が活性化され、活性化はより強い。ハイブリッドタンパク質の発現に続いて、検出可能なレポーター遺伝子発現が測定され、第１の試験タンパク質と第２の試験タンパク質との相互作用の非存在下での発現量と比較される。
【００１５】
本発明の方法を利用するキットも調製される。このキットは、上記の任意の宿主細胞、上記の任意の第１のまたは第２のキメラ遺伝子、またはこれらの組合せを含有してもよい。キットはまた、第１の外因性アクチベーターと第２の外因性アクチベーターを含有し、また検出可能なレポーター遺伝子産物を検出するための化学物質または測定法を含む。
【００１６】
（好適な実施態様の説明）
遺伝子巨大分子相互作用系の感度の調整法
本発明は、遺伝子検出系の感度を連続的および／または不連続に調整して、分子相互作用の大幅に改良された検出と分析を可能にする新規組成物、方法、および使用を含む。分子相互作用は、細胞外、膜、および細胞内部位での相互作用を含み、特に限定されないが、真核生物および原核生物中の、タンパク質−タンパク質相互作用、タンパク質−ＤＮＡ相互作用、タンパク質−ＲＮＡ相互作用、およびタンパク質−小分子相互作用を含む。
【００１７】
本発明の方法は、実際の相互作用対の絶対量または相対量が系内で変化するように、系内に提供された各巨大分子または小分子成分の相対量を変化させることを含む。相互作用分子（特に、検出可能なレポーター遺伝子に結合した分子）の相対量を変化させることにより、レポーター遺伝子発現を介する系の出力もまた変化させられる。
【００１８】
本発明の方法において、検出可能なレポーター遺伝子を有する宿主細胞が提供される。このレポーター遺伝子は、相互作用分子または他の成分が提供される前または後に提供される。しかし、レポーター遺伝子を含まない宿主細胞が、相互作用分子または他の成分が導入される前に排除されるように、レポーター遺伝子は好ましくは最初に提供される。レポーター遺伝子は、現在公知のまたは後に開発される遺伝子移動の任意の方法を介して提供される。好適な実施態様においてにおいてレポーター遺伝子は、宿主細胞の電気穿孔法により提供される。レポーター遺伝子はまた、選択された移動法を使用して、宿主細胞に移動可能な任意の型で提供される。例えば、これはプラスミドの一部として提供される。
【００１９】
相互作用分子の相互作用により活性化される任意の検出可能なレポーター遺伝子が、本方法に適している。例えばレポーター遺伝子は、検出可能なレポータータンパク質または他の検出可能な遺伝子産物を産生してもよい。本発明の方法は相互作用性巨大分子自身を変化させるため、本発明の方法は、任意の検出可能なレポーター遺伝子とともに機能する。報告すべき多くの相互作用があるなら、レポーター遺伝子はこれを、レポーター遺伝子の比較的強い活性化として報告するであろう。報告すべき相互作用が比較的少ないなら、レポーター系はこれを比較的弱い出力として報告するであろう。
【００２０】
好適な実施態様においてレポーター遺伝子は、ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド、または他のＤＮＡ結合分子（例えば、小分子または薬剤）と相互作用可能な、少なくとも１つのＤＮＡ結合部位を含む。このＤＮＡ結合部位は、第１の相互作用分子がこの部位に結合し、さらに第２の相互作用分子と相互作用するなら、第２の分子の転写活性化ドメインがレポーター遺伝子の転写を活性化できるように位置する。
【００２１】
巨大分子または小分子でもよい第１の相互作用分子は、宿主細胞またはその細胞外領域へ導入される。この分子は、ＤＮＡ結合ドメインを含有するポリペプチドを含有するか、またはＤＮＡに結合できる他の分子領域を含有する。この第１の相互作用分子は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくは薬剤、またはＤＮＡ結合領域もしくはドメインを含有する分子を含有するかまたはこれに結合した他の任意の分子でもよい。
【００２２】
好適な実施態様において、分子はタンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡである。そのような好適な実施態様において、宿主細胞中で転写されることができる第１のキメラ遺伝子を宿主細胞中に導入することにより、巨大分子が提供される。この第１のキメラ遺伝子は、第１の外因性に活性化可能なプロモーター、ポリペプチドをコードする配列、ＤＮＡ、またはＤＮＡ結合領域を含むＲＮＡ、および第１の相互作用巨大分子をコードする配列を含有してもよい。さらに好適な実施態様において、第１のキメラ遺伝子は、第１の外因性に活性化可能なプロモーターと第１のハイブリッドタンパク質を含む。第１のハイブリッドタンパク質は、ＤＮＡ結合ポリペプチドと、少なくとも１つの第２の相互作用ポリペプチド（獲物）と相互作用することができる第１の相互作用ポリペプチド（餌）を含有する。
【００２３】
第２の相互作用巨大分子または小分子もまた、宿主細胞またはその細胞外領域へ導入される。この分子は、転写活性化ドメインを含有する。この転写活性化ドメインは、転写を活性化できるポリペプチドまたは別の分子の領域（例えば、薬剤または核酸の領域）でもよい。好適な実施態様においてこの第２の分子は、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、薬剤、または上記要件を満たす任意の他の分子でもよい。さらに好適な実施態様において、これは、タンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡである。そのような好適な実施態様において巨大分子は、宿主細胞中で転写され得る第２のキメラ遺伝子を導入することにより、宿主細胞中で産生される。この第２のキメラ遺伝子は、第２の外因性に活性化可能なプロモーター、転写活性化ドメインをコードする配列、および第２の巨大分子をコードする配列を含んでよい。さらに好適な実施態様において、キメラ遺伝子は、第２の外因性に活性化可能なプロモーターと第２のハイブリッドタンパク質を含有してもよい。この第２のハイブリッドタンパク質は、転写活性化ドメインを含有するポリペプチドと第２の相互作用ポリペプチド（獲物）を含有してもよい。
【００２４】
本発明のすべての実施態様において、宿主細胞中の検出可能なレポーター遺伝子の感度は、宿主細胞に提供される第１の相互作用分子および／または第２の相互作用分子の相対量または絶対量を変えることにより、連続的に調整することができる。好適な実施態様において宿主細胞自身は、第１の分子または第２の分子の絶対レベルまたは相対レベルを制御する能力を有する。上記の好適な実施態様で示したように、これは、第１の巨大分子と第２の巨大分子とをコードし、第１のおよび第２の外因性に活性化可能なプロモーターを含有する、キメラ遺伝子を誘導することにより行われる。これらの外因性に活性化可能なプロモーターは、外因性アクチベーターにより活性化される。
【００２５】
任意のプロモーターおよびアクチベーターが本発明の方法で使用されるが、好適な実施態様においてアクチベーターは、天然または合成の、代謝的に活性なまたは不活性なステロイド、ステロイド類似体、または模倣物であり、プロモーターはアクチベーターに応答して転写を誘導する。次に少なくとも１つのハイブリッドタンパク質の相対量または絶対量は、１つ以上のこれらのアクチベーター、その類似体、またはそのアンタゴニストの用量に応答して制御される。一般に、もし両方のキメラ遺伝子が外因性に活性化可能なプロモーターの制御下にあるなら、プロモーターは、各遺伝子で異なり、異なる分子により活性化されるであろう。
【００２６】
第１の相互作用分子と第２の相互作用分子の相対的レベルを制御することにより、レポーターの感度を変化させることが可能である。例えばもし系が１つの成分（通常第２の分子）であふれていたら、系を、レポーターに結合した第１の分子の、第２の分子との相互作用に向けて、レポーター活性が上昇するようにすることができる。最大感度では、レポーターに結合しているすべての第１の分子が、第２の分子との相互作用に関与し、従ってレポーターは、より頻繁にまたはより強く活性化される。
【００２７】
また２つの相互作用分子のうちの１つ（通常第１の分子）の相対量を上昇させて、レポーターの出力を緩和することも可能である。もしこれが行われるなら、レポーターに結合したほとんどの第１の分子は、さらに第２の分子に結合することはなく、こうしてレポーター活性化が低下する。
【００２８】
任意の２つの分子の間の相互作用の強さは変化しないため、２つの相互作用分子のいずれかの相対量または総量を制御する能力は、連続的に調整可能なレベルの感度で相互作用を報告する系をもたらす。すなわち、もし相互作用が弱いなら、相互作用の相対数を増加させて感度を上昇させてもよい。より多くの相互作用があるため、レポーターは、相互作用の弱さにもかかわらずより強く報告するであろう。もし相互作用が強いなら、相互作用の相対数を減少させて感度を低下させてもよい。相互作用はより少ないため、レポーターはより弱く報告するであろう。すなわち、従来の２ハイブリッド系を使用すると重要ではないかまたは検出不可能と思われる相互作用が、本発明では検出される。
【００２９】
本発明の別の実施態様において、第１の相互作用分子と第２の相互作用分子との相互作用を仲介するかまたは妨害する他の巨大分子または小分子を有する細胞が、提供される。例えば、３ハイブリッド系では、第１の分子と第２の分子との相互作用を促進するかまたはこれに必要な第３の巨大分子または小分子が、提供される。この第３の分子は一般にタンパク質である。これは、第１の分子と第２の分子との相互作用を安定化させてその作用を及ぼすか、または本来相互作用しない時、これらの連結を形成してその作用を及ぼす。
【００３０】
好適な実施態様において、この第３の分子はまた、最初の２つの相互作用を妨害してもよい。例えばもしすべての分子がタンパク質であるなら、第３の分子は、餌または獲物ポリペプチドと同一または類似のポリペプチドを含有してもよい。すなわち第３の分子は、餌と獲物が相互作用する能力を妨害するであろう。２ハイブリッド系のこの変法は、一般に阻害または競合２ハイブリッド測定法として知られている。そのような測定法は現在正確な結果を提供していないため、これは本発明の方法に特に応用しやすい。すなわち、餌と獲物のポリペプチドの相対量は、第３の分子が餌−獲物相互作用を阻害する能力に大きく影響を与え、従ってレポーター系の感度に影響を与えるため、阻害２ハイブリッド測定法は本発明から大きな利益を受けるであろう。本発明のハイブリッドタンパク質の量を微調整または変化させる方法はまた、阻害２ハイブリッド測定法における第３の阻害ポリペプチドの相対量または絶対量を制御するのに適用される。
【００３１】
細胞内のあらゆる場所で、第１の相互作用分子と第２の相互作用分子との相互作用が起き、検出される。例えばこれは核、細胞質、膜の外または中、または小器官中でも起きる。原核生物と真核生物（細菌、酵母、植物、節足動物、および哺乳動物細胞を含む）で系は同様に作用すると予測される。
【００３２】
本発明の１つの好適な実施態様において本方法は、遺伝子的分子的相互作用検出系に応用される。ハイブリッドタンパク質の量の制御は、下流ハイブリッドタンパク質または分子の発現の異なる固有レベルについて、交互のプロモーターを含む組成物を使用して行われる。これらのプロモーターは、天然または合成起源、酵母、または非酵母供給源でもよい。制御は、特に限定されないが以下を含むいくつかの方法により行われる：（ａ）以下に詳述するように、ハイブリッドタンパク質（例えば第２の相互作用（獲物）ポリペプチドがライブラリー由来であるハイブリッド）の上流のプロモーターを変化させて、ＧＡＬ１／１０プロモーター、ＣＹＣ１プロモーター、またはＡＤＨ１プロモーター（これらは、異なるレベルの発現を示す）を使用して、異なるレベルの発現を与える（グアレンテ（Ｇｕａｒｅｎｔｅ）とプタシュネ（Ｐｔａｓｈｎｅ）、１９８１；グアレンテ（Ｇｕａｒｅｎｔｅ）ら、１９８２；アンマーラー（Ａｍｍｅｒｅｒ）、１９８３；グアレンテ（Ｇｕａｒｅｎｔｅ）ら、１９８３；キャントウェル（Ｃａｎｔｗｅｌｌ）ら、１９８６）；または（ｂ）さらに以下に特定し例示するように、上流活性化配列（ＵＡＳＧまたはＵＡＳＣ）または他の活性化配列（これらのいずれも、転写開始部位から種々の距離に位置してもよい（ウェスト（Ｗｅｓｔ）ら、１９８４））を有するそれぞれＧＡＬ１／１０またはＣＹＣ１プロモーター（または他のプロモーター）を使用して、プロモーター自身を修飾する。
【００３３】
本発明の別の好適な実施態様において、ハイブリッドタンパク質量の制御は、単一のプロモーター（例えば、ＧＡＬ１／１０、ＣＹＣ１、ＡＤＨ１または他の天然もしくは合成酵母、または非酵母プロモーター）を、酵母または非酵母供給源からの異なる上流エンハンサー配列と組合せて使用して行われる。
【００３４】
別の好適な実施態様において本発明の方法は、他のタンパク質とのおよび任意の他のクラスの分子との、タンパク質相互作用を検出かつ分析するためのすべての既知の遺伝子系に適用可能な、驚くべきかつ予想外の結果を開示する。これは、その感度が連続的に調整可能である（すなわち、感度は、複数のステップの用量応答ベースで調整される）ことに基づき、先行技術からは明確かつ絶対的に区別される。ある好適な実施態様において、これは、融合タンパク質または分子の転写または発現を薬理学的に修飾し、一回のスクリーニングで種々のレポーター遺伝子発現レベルを検出することを含む。
【００３５】
本発明のこの実施態様は、特に限定されないが、以下の大きな技術的利点を有する：（ａ）相互作用強度の範囲についての前知識さえ無しで、種々の強度の相互作用を検出および分析；（ｂ）生物学的に無関係な相互作用を避けること；（ｃ）非常に重要な可能性があるが、現在はシステム的に検出できない弱い相互作用の検出；および（ｄ）解離定数（Ｋｄ）により特徴的に規定されるように、分子間結合のインビボの強度を実際に定量できる可能性（エストジャック（Ｅｓｔｏｊａｋ）ら、１９９５）。これら利点および関連の利点の実用的な意味は、特に限定されないが：（ａ）タンパク質−分子相互作用の検出と分析の実質的な加速；（ｂ）生物学的に無関係であるが以前検出された相互作用の大きなサブセットの排除；（ｃ）生物学的に重要な新しい相互作用の検出；（ｄ）Ｋｄの真のインビボ推定値と補正値の可能性；（ｅ）大規模な商業的スクリーニングの実質的な増強；および（ｆ）細胞経路、可能な薬剤標的、可能な補足的薬剤、ならびに種々の他の科学的および商業的に重要な分子相互作用の同定と解明の、実質的に改良された有効性と効率を含む。
【００３６】
本発明のある好適な実施態様において、細胞外リガンドは、特異的トランスメンブラン受容体に結合しその活性を調節して、１つ以上の相互作用分子の発現または活性の用量応答性変化を引き起こす。そのような細胞外リガンドの例には、特に限定されないが、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、合成物質および生物学的薬剤、およびこれらの細胞受容体がある（メルクリオ（Ｍｅｒｃｕｒｉｏ）とマニング（Ｍａｎｎｉｎｇ）、１９９９；ボールドウィン（Ｂａｌｄｗｉｎ）、１９９６；モハール（Ｍｏｈａｌ）とスターンバーグ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）、１９９９）。
【００３７】
別の好適な実施態様において、細胞内リガンドは、細胞質でまたは核内で相互作用して、相互作用分子の発現または活性を調節する。そのような細胞内リガンドの例には、特に限定されないが、小分子薬剤および調節物質（特に限定されないが、抗生物質、抗癌剤、核酸結合物質、細胞骨格活性剤、キレート化剤、インデューサー、同時レプレッサー、ならびに細胞内輸送、局在化および防御または崩壊に影響を与える物質）がある（シェナ（Ｓｃｈｅｎａ）ら、１９９１；ロッシ（Ｒｏｓｓｉ）とブラウ（Ｂｌａｕ）、１９９８）。
【００３８】
別の好適な実施態様において、膜活性物質は相互作用して、細胞活性化または応答可能性のレベルを調節する。そのような物質の例には、特に限定されないが、イオノフォア、両親媒性および疎水性脂質活性物質および界面活性剤、種々の麻酔剤および溶媒、トランスメンブランおよび膜内シグナル伝達物質、およびファルネシル化（ｆａｒｎｅｓｙｌａｔｉｎｇ）物質がある（ベリッジ（Ｂｅｒｒｉｄｇｅ）ら、１９９９）。
【００３９】
さらに好適な実施態様において、餌および／または獲物または他のタンパク質および分子を含有するハイブリッドタンパク質の量は、外因性に活性化されるプロモーター、外因性活性化物質、および特に限定されないが、以下を含む他の分子を使用して、変化させられるかまたは制限される：（ｉ）ステロイド応答成分（ＳＲＥ’ｓ）、特に限定されないが、天然または合成エストロゲン（例えば、エストラジオール、エストロンなど）、アンドロゲン、プロゲステロン、糖質コルチコイド（例えば、特にデキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾンおよびコルチゾール）、ミネラルコルチコイド、エクダイソン、代謝的に不活性なコルチコイド、他のステロイド（例えば、オーファン受容体に相補的なもの）、およびレチノイド）を含む；および／または（ｉｉ）（ｉ）と組合せたアゴニストおよびアンタゴニスト物質；（ｉｉｉ）種々の量の（ｉｉｉ．ａ）餌ポリペプチドを含有するハイブリッドタンパク質、（ｉｉｉ．ｂ）獲物ポリペプチドを含有するハイブリッドタンパク質（これらは、ライブラリー由来でもよい）、および／または（ｉｉｉ．ｃ）遺伝子的分子的相互作用系に関与する一般に任意の分子発現とを連続的に提供して、前記の生物学的に関係のある相互作用の関連する検出と分析を可能にするように提供するのに有効な、任意のまたはすべての組合せの、任意の他の分子、受容体および応答成分（シェナ（Ｓｃｈｅｎａ）ら、１９８８；ピカード（Ｐｉｃａｒｄ）ら、１９９０；クラリ（Ｋｒａｌｌｉ）ら、１９９５；マンゲルスドルフ（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ）とエバンス（Ｅｖａｎｓ）、１９９５；クリーワー（Ｋｌｉｅｗｅｒ）、１９９９；マルチネス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ）ら、１９９９）。
【００４０】
下記の例の基礎である別のさらに好適な実施態様は、新規な相互作用ハイブリッド系（ＩＨＳ）を含み、これは、ステロイドホルモン依存性で、連続的に調整可能で、かつサッカロミセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）２ハイブリッド系中の従来の３重レポーターを含有する。これは、スタン・フィールズ（Ｓｔａｎ Ｆｉｅｌｄｓ）（米国特許第５，２８３，１７３号）（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）が最初に提示し特許を取った酵母２ハイブリッド系の原理と基本的設計に関し、かつこれを新規に拡張する。
【００４１】
選択マーカーｌｅｕ２、ａｄｅ２、ｔｒｐ１、ｕｒａ３、およびａｒｇ４の栄養要求性突然変異体を含有するサッカロミセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｙＨＹＢ００１株を構築した。この株は、ｄｅｌｔａＧＡＬ４およびｄｅｌｔａＧＡＬ８０であり、まさしく元々のフィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）の２ハイブリッド系で使用された２ハイブリッド相互作用検出のための融合体としての、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン（ＧＡＬ４ｂｄ）とＧＡＬ４転写活性化ドメイン（ＧＡＬ４ａｄ）の使用を可能にする。この株はまた、組み込まれたヒトエストロゲン受容体と組み込まれたラット糖質コルチコイド受容体遺伝子（構成性に発現される）を含有する。この株はｌｅｍ１であり、おそらく膜ポンプを排除して、酵母中のデキサメタゾンの低濃度の使用を可能にする（クラリ（Ｋｒａｌｌｉ）ら、１９９５）。この株は、２ハイブリッド相互作用の検出のための３つの組み込まれた受容体を含有する。第１は、比色および定量測定法とスクリーニングのためのＵＡＳＧ−ＬａｃＺ構築体である。第２と第３は、それぞれＵＡＳＧ−ＡＤＥ２とＵＡＳＧ−ＬＥＵ２である；これらはそれぞれ、栄養要求性突然変異体のレスキューに基づき、相互作用ハイブリッドタンパク質または他の分子を含有する酵母の定量的選択を可能にする。
【００４２】
この実施態様において第１のハイブリッドタンパク質では、餌は、ＧＡＬ４ｂｄ（ＤＮＡ結合ドメイン）のカルボキシル末端に融合してもよい（図２）。この第１のハイブリッドタンパク質は、５オーダーの強度までの連続的範囲の量でかつ正常な最小プロモーター内のエストロゲン応答成分（ＥＲＥ）の影響下で、転写される。これは、酵母増殖培地中のエストロゲンまたはエストロゲンアンタゴニストのレベルの変化に応じた連続的範囲の量にわたって、餌の第１のハイブリッドタンパク質の可変発現を引き起こす。このプロモーター−第１のハイブリッドタンパク質構築体は、ＡＲＧ４またはＵＲＡ３選択下で、２ミクロンプラスミド上で提供される。
【００４３】
第２のハイブリッドタンパク質は、獲物タンパク質またはタンパク質断片（これは、ライブラリー由来でもよい）を、ＧＡＬ４ａｄ（転写活性化ドメイン）のカルボキシル末端に融合して形成される（図３）。この第２のハイブリッドタンパク質は、５オーダーの強度までの連続的範囲の量で、かつ好ましくは最小のプロモーター（例えば、特に限定されないが、ＣＹＣ１由来のものを含む）内の１〜６、および本例では、３つの糖質コルチコイド応答成分（ＧＲＥ）の影響下で、転写される。これは、酵母増殖培地中の糖質コルチコイドまたはそのアンタゴニスト（特に限定されないが、デキサメタゾンを含む）のレベルの変化に応じた連続的範囲の量にわたって、第２のハイブリッドタンパク質の可変発現を引き起こす。このプロモーター−第２のハイブリッドタンパク質構築体は、ＴＲＰ１選択下で、２ミクロンプラスミド上で提供される。両方のハイブリッドタンパク質プラスミドもまた、アンピシリンまたはカナマイシン耐性およびＣｏｌＥ１複製開始点（これは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）細菌の操作を提供する）を含有するシャトルベクターである。
【００４４】
酵母培地中の広範囲のエストロゲンとデキサメタゾン濃度により、ハイブリッドタンパク質の広範囲の可変的および相対的発現が得られる。エストロゲンは、少なくとも約１０−１２〜１０−８Ｍの濃度範囲で使用され、一方デキサメタゾンは少なくとも約１０−７〜１０−４Ｍの濃度範囲で使用される。エストラジオールは、１０−６より高い濃度で、酵母増殖にある程度の作用を及ぼす。
【００４５】
本発明の好適な実施態様のみを以下に具体的に記載するが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく、本発明の修飾や変更が可能であることは理解されるであろう。
【００４６】
以下の非限定例は、本発明の態様を明確に例示するために提供されるものであり、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【００４７】
例
例１−レポーター系を修飾することなく可変の定量的レポーター出力を与えるように調整した相互作用ハイブリッド系
上記したように、ブレント（Ｂｒｅｎｔ）ラボは、あるセットの２ハイブリッドタンパク質相互作用物質が、その相互作用の強さに正比例した均一な定量的レポーター出力を与えることを証明した（エストジャック（Ｅｓｔｏｊａｋ）ら、１９９５）。上記段落でより好適な実施態様として導入され記載された新規の調整可能な酵母相互作用ハイブリッド系（ＩＨＳ）を使用して、２ハイブリッド系で相互作用することがすでに証明された３セットのタンパク質対が、異なる相対濃度で発現されると、可変レベルのレポーター出力を与えることが証明される。餌を含有する第１のハイブリッドタンパク質の発現レベルは、エストラジオールの濃度に比例し、ライブラリーから得られる獲物を含有する第２のハイブリッドタンパク質のレベルは、デキサメタゾン濃度に比例する（クラリ（Ｋｒａｌｌｉ）ら、１９９５；ガイド（Ｇａｉｄｏ）ら、１９９７（図４と５））。
【００４８】
2004500805.tif 000003
【００４９】
表１は、エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら（１９９７）が既に記載したタンパク質を使用して行った従来の２ＨＳと新規な相互作用ハイブリッド系を示す。２ハイブリッドスクリーニングの分析法は、エドワーズ（Ｅｄｗａｒｄｓ）ら（１９９７）に記載されている。ＩＨＳ中の低感度測定法は、１０−１０Ｍエストラジオールと１０−７Ｍデキサメタゾンを使用した。中程度の感度の測定法は、１０−１０Ｍエストラジオールと１０−５Ｍデキサメタゾンを使用した。高感度測定法は、１０−１２Ｍエストラジオールと１０−４Ｍデキサメタゾンを使用した。
【００５０】
表１は、新規ＩＨＳ系において餌とライブラリー（獲物）ハイブリッドタンパク質の異なる相対レベルの発現は、種々のレベルのレポーター活性を与えることを証明している。明らかに、相互作用のＫｄは変化しないため、およびレポーター出力の感度は変化していないため、ｌａｃＺレポーターからの定量的発現レベルは、ハイブリッドタンパク質自身の相対的濃度の変化により変化しているはずである（表１）。
【００５１】
図６は、一定のレポーターセットでの遺伝子的相互作用系のレポーター出力を変化させる原理を例示する。同一の株において同一のハイブリッドタンパク質を含有する酵母コロニーが、種々のステロイドの組合せに暴露された時に、異なるレベルのレポータータンパク質を発現することが観察された。餌と獲物ベクター（それぞれ、表１を参照されたい）に融合したＳＮＦ１とＳＮＦ４またはｐｅｌｌｅとｔｕｂｅ構築体を含有する酵母細胞を、異なる濃度のエストラジオールおよび／またはデキサメタゾンの存在下で、対応する最小培地に蒔いた。ＵＡＳＧ−ｌａｃＺの組み込まれたコピーを、相互作用のレポーターとして使用した。酵母コロニー中の青色の発色により、ＵＡＳＧ−ｌａｃＺ発現が検出された。１０−１２Ｍのエストラジオールと１０−４Ｍのデキサメタゾンを含有するプレート中で増殖させた細胞は、ＵＡＳＧ−ｌａｃＺの最高の発現を示した。１０−１０Ｍのエストラジオールと１０−５Ｍのデキサメタゾンの濃度では、ｌａｃＺ発現レベルは低下し、細胞を１０−９Ｍのエストラジオールと１０−７Ｍのデキサメタゾンで増殖させると、最も低かった。観察されたｌａｃＺ発現の異なるレベルは、測定法の感度と一致し、従って高感度では、青い色の強度は最大であった。測定法の感度が低下すると、青色は弱くなった。最も低レベルの感度では、薄青色が観察された。１０−９Ｍのエストラジオールの存在下では、餌のハイブリッドのみを含有する酵母コロニーでは、青色の発色はなかった。
【００５２】
同様に、１０−４Ｍのデキサメタゾンの存在下で餌のハイブリッドのみを含有する酵母コロニー、または餌のハイブリッドも獲物のハイブリッドも含まない酵母コロニーでは、両方のハイブリッド遺伝子構築体が存在する時に最も高い感度レベルを発生するのに充分なレベルのステロイド中で増殖させると、青色は観察されなかった。
【００５３】
例２−混合餌について低感度に調整した相互作用ハイブリッド系
哺乳動物の餌ＩＲＡＫキナーゼ、そのキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）同族体のペレ（Ｐｅｌｌｅ）キナーゼ、またはその植物キナーゼ同族体のスクリーニングにおけるように、低感度が所望の時、１０−９Ｍのエストラジオール（例えば、以下の表２のように）を使用して、餌ハイブリッドタンパク質の高発現が得られる。ライブラリー／餌ハイブリッドタンパク質の低い相対的発現は、１０−７Ｍデキサメタゾンでのみ得られる（例えば、以下の表２のように）。過剰の餌ハイブリッドタンパク質は、これらのキナーゼに共通の弱く無関係の相互作用のバックグランド発現を低下させる（図６を参照）。これは、ランダムｃＤＮＡライブラリーからのアクチベーターおよび骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）とのそれぞれ相互作用の選択、スクリーニング、および発見を可能にする。バックグランドシグナルを弱めることにより、多くの無関係な相互作用（これは、これらのスクリーニング結果のタイムリーでコストの低い分析を妨害するであろう）が低下するかまたは排除される。
【００５４】
2004500805.tif 000004
【００５５】
＊　結果は、本例と、擬陽性を減少させるために低感度に較正した、混合餌が含有し改良された連続的に調整可能な系を使用する発明で、ユニークに得られたものである。
＊＊　結果は、餌とライブラリー／獲物ハイブリッドタンパク質の間の発現の差が無い標準的な調整不可能な２ハイブリッド系を使用して特徴的に得られたものと比較したものである。
【００５６】
表２は、前記段落でより好適な実施態様として導入され記載された新規な調整可能な酵母相互作用ハイブリッド系を使用して、酵母培地上の標準的相互作用測定法が、表２に示すように種々の濃度のステロイド物質を含有するように修飾されることを示す。読み値は、相互作用の選択をパスしたコロニーの数を含む総陽性である。擬陽性は、別々のインビボまたはインビトロ確認測定法（遺伝子的分析および免疫沈降法を含む）により測定した餌Ｐｅｌｌｅと相互作用しないタンパク質を含有するコロニーである。表２の第１行と第３行を比較することにより、調整された低スクリーニング（１行目参照）で最大で１３のみの擬陽性が得られ、一方餌とライブラリー／獲物ハイブリッドタンパク質の間で発現の差が無い条件下のスクリーニングでは、少なくとも９０の擬陽性が観察されることが明らかである（３行目参照）。真の陽性まで感度が低下することは観察されなかった（データは示していない）。注意：エストロゲンクラスのステロイドの応答に関して、ｌｅｍ１−１と野生型酵母との間に差はない（クラリ（Ｋｒａｌｌｉ）ら、１９９５）。
【００５７】
例３−低品質の餌について高感度に調整した相互作用ハイブリッド系
哺乳動物の餌インターロイキン−１受容体、またはそのキイロショウジョウバエ同族体Ｔｏｌｌ、またはその植物もしくは哺乳動物同族体のスクリーニングのように、高感度が所望の場合、１０−９Ｍのエストラジオールを使用して餌ハイブリッドタンパク質の最小の発現が得られる。ライブラリー／獲物ハイブリッドタンパク質の高い相対的発現は、１０−５Ｍのデキサメタゾンを使用して達成される。過剰のライブラリー／獲物ハイブリッドタンパク質は明らかに、弱い相互作用平衡をヘテロダイマーの形成側に移動させ；豊富なライブラリー／獲物ハイブリッドタンパク質との相互作用により、ある時点でより多くの制限性餌ハイブリッドタンパク質が占められる（図６）。従ってこの系は、これらの受容体の、その細胞骨格アダプターと細胞質タンパク質との弱い（高Ｋｄ）相互作用を検出する。
【００５８】
2004500805.tif 000005
【００５９】
＊　結果は、餌とライブラリー／獲物ハイブリッドタンパク質の間に発現の差が無い標準的な調整不可能な２ハイブリッド系を使用して特徴的に得られたものと比較したものである。
＊＊　結果は、本例と、総陽性を増加させるために高感度に較正した、低品質の餌を含有し改良された連続的に調整可能な系を使用する発明で、ユニークに得られたものである。
ｎ／ａ：選択をパスしたコロニーが無いため「該当せず」を意味する。
【００６０】
表３は、例２で上記したものと同じ修飾相互作用ハイブリッド系を使用して、酵母培地上の標準的相互作用測定法が、種々の濃度のステロイド物質を含有するように修飾されることを示す。再度読み値は、相互作用の選択をパスしたコロニーの数を含む総陽性である。擬陽性は、ＤＮＡ配列分析に基づき餌Ｔｏｌｌと相互作用する可能性の低い獲物ハイブリッドタンパク質を含有するコロニーである。表３の第３行と第４行を比較することにより、先行技術に特徴的な調整不可能な２ハイブリッド測定法（３行目参照）と同等のスクリーニングからは、非常に少ない陽性が得られ、一方本例のユニークに調整可能な高感度スクリーニングから、陽性の有意な上昇が得られることを示す（４行目参照）。この試料について非特異的相互作用の増加は観察されなかった。
【００６１】
例２と３を要約すると、調節（餌とライブラリー／獲物ハイブリッドタンパク質の発現の連続的かつ用量応答調節を含む）は、本発明の新規な相互作用ハイブリッド系が、系自身の中のレポーターを変化させる必要無く、弱い相互作用と強い相互作用を検出することを可能にする。標準的な調整不可能な相互作用ハイブリッド系を使用している時に特徴的に起きるように、強い相互作用はバックグランドレベルに混同されることなく、弱い相互作用は完全に見逃されることが無い。
【００６２】
例４−混合餌（ヒトＩｒａｋ１キナーゼ）との新規相互作用物質の発見を促進する例１のアプローチの応用の利点
例４は、混合餌（特に限定されないが、ヒトＩｒａｋ１キナーゼ餌を含む）との既知の機能的に関連した新規相互作用物質の発見の、顕著に改良された有効性と効率を証明する。Ｉｒａｋ１を餌として使用する２つの並行セットのスクリーニングを、ロジャーブレント（Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ）ＬｅｘＡ調整不可能酵母相互作用トラップ（ギウリス（Ｇｙｕｒｉｓ）ら、１９９３）と本発明の調整可能な相互作用ハイブリッド系を用いて開始した。各系について構築したリンパ球ｃＤＮＡライブラリーを使用して、１０７の可能な相互作用を選択する。選択をパスし、従ってＩｒａｋ１と相互作用するであろう推定タンパク質を含有する酵母コロニーが陽性である。ブレント（Ｂｒｅｎｔ）系の結果は、約５０００の総陽性で、そのうち９６０は、時間とコストの現実的制限に基づきさらに分析が可能である。調整可能な系のパーセントを使用してかつ同時に５レベルの感度でスクリーニングして比較すると、低感度で２０７の酵母コロニーが推定陽性として選択され、そのすべてが、さらなる分析が可能である。
【００６３】
ブレント（Ｂｒｅｎｔ）系からの処理で選択された９６０コロニーの分析により、４８パーセンタイルは、Ｉｒａｋ１と相互作用することが知られている２つの別々のユニークなタンパク質についてヒットする。すべての他の推定陽性は、擬陽性とされるランダムで無関係なタンパク質である。比較すると、本発明の調整可能な系からの選択をパスする２０７コロニーのすべてを分析すると、１０２は、同じ２つのユニークな既知のタンパク質であり、そして重要なことは、２つの追加の陽性は、ｃＤＮＡライブラリーでは珍しいと考えられる１つの未知のタンパク質である。
【００６４】
同等の人手と材料を使用するスクリーニングと初期分析には、ブレント（Ｂｒｅｎｔ）系を使用して４ヶ月が必要であるが、本発明の調整可能な系を使用するとわずかに４．５週間である。さらに材料コストのみに基づくと、本系は、分析コストが約５倍低下する。分析工程に必要な技術者の時間が低下したことに基づき、並行して人件費の５倍の低下が達成される。
【００６５】
最も有利なことは、ランダムな弱い相互作用が排除され、おそらくインターロイキン−１受容体の下流の炎症性シグナル伝達に関与するまれで有用な未知のタンパク質の検出が可能になることである。
【００６６】
例５−低品質の餌を使用して新規相互作用物質の発見を促進する例２のアプローチの応用の利点
例５は、低品質の餌（ヒトＦｃガンマ受容体１細胞内ドメイン（ＦｃガンマＲ１））との新規相互作用を発見する、顕著に改良された有効性を解明する。ＦｃガンマＲ１を餌として使用する２つの並行セットのスクリーニングを、ロジャーブレント（Ｒｏｇｅｒ Ｂｒｅｎｔ）ＬｅｘＡ調整不可能酵母相互作用トラップ（ギウリス（Ｇｙｕｒｉｓ）ら、１９９３）を、本発明の調整可能な相互作用ハイブリッド系と比較して開始する。各系について構築したリンパ球ｃＤＮＡライブラリーを使用して、標準的ブレント（Ｂｒｅｎｔ）相互作用系について１０８の可能な相互作用を選択し、本発明の調整可能な系について１０７の可能な相互作用を選択する。選択をパスし、従ってＦｃガンマＲ１と相互作用するであろう推定タンパク質を含有する酵母コロニーが陽性である。ブレント（Ｂｒｅｎｔ）系の結果は、陽性が０であり、さらに分析の可能性はない。本発明の調整可能な系を使用してかつ同時に５レベルの感度でスクリーニングして比較すると、最高感度のみで１５の酵母コロニーが推定陽性として選択され、そのすべてが、さらなる分析が可能である。１５のすべての陽性は、単一の推定タンパク質相互作用物質のコピーであり、これは、Ｂリンパ球活性化の重要な調節物質としてのさらなる生化学的および遺伝子的分析の候補である。
【００６７】
例６−商業的および科学的関連
本発明の調整可能な系は、薬剤候補および薬剤標的として機能できる既知のおよび新規機能を有する新しいおよび既知のタンパク質について、対応するタンパク質構造および機能的情報とともに、クローン化したＤＮＡ配列を得るための顕著に改良した手段を提供する。この系を繰り返し使用すると、すべての科学的および商業的に関係のあるＤＮＡベースの生物で使用される、細胞膜を核に連結する全シグナル伝達経路の改良されかつ加速された解明が、可能になる。本発明の調整可能な相互作用ハイブリッド系により示されるタンパク質−タンパク質相互作用および他の関連相互作用についてのスクリーニングの有効性と効率の向上は、広く適用されて、単位時間とコスト当たりのスクリーニング量を顕著に増加させ、顕著に低下した分析負荷を含む大量スクリーニングを可能にする。これは、多くの生物学的関連のより小さい（しかし、有用かつ生物学的に重要な相互作用物質を保持し増加させる）相互作用物質を与える。そしてこれは、特に医学、薬学および生物学的発見、農業ビジネス、およびバイオインフォーマティクス（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）の分野での科学的および商業的発展に有利である。この改良された新規の技術を応用すると、細胞シグナル伝達経路のバイオ情報（この知識は、薬剤、抗生物質、生物学的薬剤、診断薬、医学的介入および農業産物の合理的な進展、ならびに遺伝子ベースの疾患の機構解明の強化に必須になっている）を顕著に増強する可能性がある。従ってこの技術は、学問的かつ商業的に最先端の相互作用ハイブリッド系を利用する、多様な活動に広範な利点を提供する可能性がある。これらの活動には、遺伝子的機能経路の解明、そのような情報と遺伝子配列決定および誘導される遺伝子的（例えば、ＲＮＡ発現）測定法との迅速な相関、および無数の実用的遺伝子的産物の商業的発見と進展、および将来の応用を含む。
【００６８】
例７−他の分子遺伝子的検出系の応用
問題の相互作用物質について一定レベルの発現、転写、または存在が与えられる時の検出の閾値を有するレポーターの一般的原理は、すべてのインビボの分子的遺伝子的検出系への、本明細書に記載の改良の明らかな拡張を含む。この系は、相互作用物質が、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、炭水化物、小分子、薬剤、または他の可能な生物学的相互作用物質であっても、同等に機能すると予測される。この拡張はまた、相互作用の検出が、核、細胞質、膜内、または細胞の膜であっても明らかである。最後に、同じ修飾は、原核生物ならびに他の真核生物（哺乳動物細胞ベースの２ハイブリッド系を含む）に応用することができる。
【００６９】
以下の引用文献リストは、本文に記載された理由により、関連部分が参照することにより本文中に組み込まれる。
【００７０】
参考文献
１． Ａｍｍｅｒｅｒ， Ｇ．； １９８３． ＡＣＤＩプロモーターを使用する酵母中の遺伝子発現． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １０１， １９２−２０１．
２． Ａｒｏｎｈｅｉｍ， Ａ．； Ｚａｎｄｉ， Ｅ．； Ｈｅｎｎｅｍａｎｎ， Ｈ．； Ｅｌｌｅｄｇｅ， Ｓ． Ｊ．； ａｎｄ Ｋａｒｉｎ， Ｍ．； １９９７．  タンパク質−タンパク質相互作用を検出する新規方法によるＡＰ−１受容体の単離．  Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １７， ３０９４−３１０２．
３． Ｂａｉ， Ｃ．； ａｎｄ Ｅｌｌｅｄｇｅ， Ｓ． Ｊ．； １９９７． 酵母２ハイブリッド系を使用する遺伝子同定． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２８３， １４１−１５６．
４． Ｂａｌｄｗｉｎ， Ａ． Ｓ．； １９９６． ＮＦ−κＢとＩκＢタンパク質：新しい発見と考察． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４， ６４９−６８１
５． Ｂａｒｔｅｌ， Ｐ．； Ｃｈｉｅｎ， Ｃ．； Ｓｔｅｒｎｇｌａｎｚ， Ｒ．； ａｎｄ Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．； １９９３． ２ハイブリッド系の使用で発生する擬陽性の排除． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４， ９２０−９２４．
６． Ｂｅｒｒｉｄｇｅ， Ｐ．； Ｌｉｐｐ， Ｐ．； ａｎｄ Ｂｏｏｔｍａｎ， Ｍ．； １９９９． カルシウムシグナル伝達． Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌｏｇｙ ９， Ｒ１５７−Ｒ１５９．
７． Ｂｒａｃｈｍａｍｌ， Ｒ． Ｋ．； ａｎｄ Ｂｏｅｋｅ， Ｊ． Ｄ．； １９９７． 酵母中のｔａｇ獲物：２ハイブリッド系とそれ以上． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８， ５６１−５６８．
８． Ｂｕｎｋｅｒ， Ｃ． Ａ．； ａｎｄ Ｋｉｎｇｓｔｏｎ， Ｒ． Ｅ．； １９９５． 新規細菌発現系におけるｃ−Ｍｙｃ癌タンパク質との相互作用によるＳＳＲＰ１（ＨＭＢ−ボックスタンパク質）のｃＤＮＡの同定． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２３， ２６９−２７６．
９． Ｂｕｓｔｏｓ， Ｓ． Ａ．； ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｉｆ， Ｒ． Ｆ．； １９９３． ＡｒａＣタンパク質の機能的ドメイン． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９０， ５３６８−５６４２
１０． Ｃａｎｔｗｅｌｌ， Ｂ． Ａ．； Ｂｒａｚｉｌ， Ｇ．； Ｍｕｒｐｈｙ， Ｎ．； ａｎｄ ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ， Ｄ． Ｊ．； １９８６． ＣＹＣ１とＡＤＨ１プロモーターからのサッカロミセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中の枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のエンド−β−１，３−１，４−グルカナーゼ遺伝子の発現の比較． Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１， ６５−７０．
１１． Ｅｄｗａｒｄｓ， Ｄ． Ｎ．； Ｔｏｗｂ， Ｐ．； ａｎｄ Ｗａｓｓｅｒｍａｎ， Ｓ． Ａ．； １９９７． 相互作用の活性依存性ネットワークは、Ｒｅｌタンパク質Ｄｏｒｓａｌをその細胞質制御物質と連結させる． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２４， ３８５５−３８６４．
１２． Ｅｓｔｏｊａｋ， Ｊ．； Ｂｒｅｎｔ， Ｒ．； ａｎｄ Ｇｏｌｅｍｉｓ， Ｅ． Ａ．； １９９５． ２ハイブリッド親和性データとインビトロ測定値との相関． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １５， ５８２０−５８２９．
１３． Ｆｅａｒｏｎ， Ｅ． Ｒ．； Ｆｉｎｋｅｌ， Ｔ．； Ｇｉｌｌｉｓｏｎ， Ｍ． Ｌ．； Ｋｅｎｎｅｄｙ， Ｓ． Ｐ．； Ｃａｓｅｌｌａ， Ｊ． Ｆ．； Ｔｏｍａｓｅｌｌｉ， Ｇ． Ｆ．； Ｍｏｒｒｏｗ， Ｊ． Ｓ．； ａｎｄ Ｖａｎ Ｄａｎｇ， Ｃ．； １９９２． 核細胞質相互作用選択法：哺乳動物細胞中のタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための一般的方策． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８９， ７９５８−７９６２．
１４． Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．； ａｎｄ Ｓｏｎｇ， Ｏ． ； １９８９． タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための新規遺伝子系． Ｎａｔｕｒｅ ３４０， ２４５−２４６．
１５． Ｆｉｎｌｅｙ， Ｒ． Ｌ．； ａｎｄ Ｂｒｅｎｔ， Ｒ．； １９９７． 酵母２ハイブリッド系中の遺伝子的制御ネットワークの２ハイブリッド分析． Ｂａｒｔｅｌ， Ｐ． Ｌ．； Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ． 編； ｐｐ． １９７−２１４， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖ． Ｐｒｅｓｓ．
１６． Ｇａｉｄｏ， Ｋ． Ｗ．； Ｌｅｏｎａｒｄ， Ｌ． Ｓ．； Ｌｏｖｅｌｌ， Ｓ．； Ｇｏｕｌｄ， Ｊ． Ｃ． ｂａｂａｉ， Ｄ．； Ｐｏｒｔｉｅｒ， Ｃ． Ｊ．； ａｎｄ ＭｃＤｏｎｅｌｌ， Ｄ． Ｐ．； １９９７． 酵母ベースのステロイドホルモン受容体遺伝子転写測定法における内分泌調節活性を有する化学物質の評価． Ｔｏｘｉｃ ａｎｄ Ａｐｐ． Ｐｈａｒｍ． １４３， ２０５−２１２．
１７． Ｇｕａｒｅｎｔｅ， Ｌ．； １９８３． 酵母のクローン化遺伝子の発現を研究するために設計した酵母プロモーターとｌａｃＺ融合体． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １０１， １８１−１９１．
１８． Ｇｕａｒｅｎｔｅ， Ｌ．； ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ， Ｍ．； １９８１． サッカロミセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のサイトクロームＣ遺伝子への大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ｌａｃＺの融合． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７８， ２１９９−２２０３．
１９． Ｇｕａｒｅｎｔｅ， Ｌ．； Ｙｏｃｕｍ， Ｒ． Ｒ．； ａｎｄ Ｇｉｆｆｏｒｄ， Ｐ．； １９８２． ＧＡＬ１０ハイブリッド酵母プロモーターは、ＧＡＬ４制御領域を上流部位として同定する． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７９， ７４１０−７４１４．
２０． Ｇｙｕｒｉｓ， Ｊ．； Ｇｏｌｅｍｉｓ， Ｅ．； Ｃｈｅｒｔｋｏｖ， Ｈ； ａｎｄ Ｂｒｅｎｔ， Ｒ．； １９９３． Ｃｋｄ２と関連するＣｄｉｌ、ヒトＧ１およびＳ期タンパク質ホスファターゼ． Ｃｅｌｌ ７５， ７９１−８０３．
２１． Ｈａｙｓ， Ｌ． Ｂ．； Ｃｈｅｎ， Ｙ−Ｓ． Ａ．； ａｎｄ Ｈｕ， Ｊ． Ｃ．； ２０００． 大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）中のタンパク質−タンパク質相互作用の性状解析のための２ハイブリッドスクリーニング． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９， ２８８−２９４．
２２． Ｊａｍｅｓ， Ｐ．； Ｈａｌｌａｄａｙ， Ｊ．； ａｎｄ Ｃｒａｉｇ， Ｅ． Ａ．； １９９６． 酵母中の高度に効率的な２ハイブリッド選択のために設計されたゲノムライブラリーと宿主株． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４４， １４２５−１４３６．
２３． Ｋｌｉｅｗｅｒ， Ｓ． Ａ．； Ｌｅｈｍａｎｎ， Ｊ． Ｍ．； ａｎｄ Ｗｉｌｌｓｏｎ， Ｔ． Ｍ．； １９９９． オーファン核受容体：内分泌を逆転させる． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４， ７５７−７６０
２４． Ｋｒａｌｌｉ， Ａ．； Ｂｏｈｅｎ， Ｓ． Ｐ．； ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｋ． Ｒ．； １９９５． ＬＥＭ１（ＡＴＰ結合カセットトランスポーター）はステロイドホルモンの生物活性を選択的に調節する． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９２， ４７０１−４７０５．
２５． Ｌｉ， Ｊ． Ｊ．； ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ， Ｉ． ； １９９３． 酵母起源認識複合体の成分であるＯＲＣ６の１ハイブリッド系による単離． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２， １８７０−１８７４．
２６． Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ， Ｄ． Ｊ．； ａｎｄ Ｅｖａｎｓ， Ｒ． Ｍ．； １９９５． ＲＸＲヘテロダイマーとオーファン受容体． Ｃｅｌｌ ８３， ８４１−８５０．
２７． Ｍａｎｇｕｓ， Ｄ． Ａ．； Ａｍｒａｎｉ， Ｎ．； ａｎｄ Ｊａｃｏｂｓｏｎ， Ａ．； １９９８． サッカロミセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ポリ（Ａ）−結合タンパク質と相互作用する因子であるＰｂｌｌｐは、ポリアデニル化を制御する． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １８， ７３８３−７３９６．
２８． Ｍａｒｔｉｎｅｚ， Ａ．； Ｓｐａｒｋｓ， Ｃ．； Ｄｒａｙｔｏｎ， Ｐ．； Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｊ．； Ｇｒｅｅｎｌａｎｄ， Ａ．； ａｎｄ Ｊｅｐｓｏｎ， Ｉ．； １９９９． 遺伝子発現制御のための植物でのエクダイソン受容体の作成． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２６１， ５４６−５５２．
２９． Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ， Ａ． Ｒ．； ａｎｄ Ｂｒｅｎｔ， Ｒ．； １９９４． 相互作用トラップ／２ハイブリッド系のバイオテクノロジー研究への応用． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５， ４８２−４８６
３０． Ｍｅｒｃｕｒｉｏ， Ｆ．； ａｎｄ Ｍａｎｎｉｎｇ， Ａ． Ｍ．； １９９９． ＮＦ−κＢに収束する複数のシグナル． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１， ２２６−２３２
３１． Ｍｏｇｈａｌ， Ｎ．； ａｎｄ Ｓｔｅｍｂｅｒｇ， Ｐ． Ｗ．； １９９９． ＥＧＲ受容体によるシグナル伝達の複数の陽性および陰性制御物質． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１， １９０−１９６．
３２． Ｐｈｉｚｉｃｋｙ， Ｅ． Ｍ．； ａｎｄ Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．； １９９５． タンパク質−タンパク質相互作用：検出法と分析法． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ， Ｖｏｌ． ５９ｋ， Ｎｏ． １， ｐｐ． ９４−１２３．
３３． Ｐｉｃａｒｄ， Ｄ．； Ｋｈｕｒｓｈｅｅｄ， Ｂ．； Ｇａｒａｂｅｄｉａｎ， Ｍ． Ｊ．； Ｆｏｒｔｉｎ， Ｍ． Ｇ．； Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ， Ｓ．； ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｋ． Ｒ．； １９９０． ｈｓｐ９０のレベルの低下はインビボでステロイド受容体作用を低下させる． Ｎａｔｕｒｅ ３４８， １６６−１６８．
３４． Ｒｏｓｓｉ， Ｆ． Ｍ． Ｖ．； ａｎｄ Ｂｌａｕ， Ｈ． Ｍ．； １９９８． 誘導性遺伝子発現系の最近の進歩． Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ９， ４５１−４５６．
３５． Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ．； Ｐｉｃａｒｄ， Ｄ．； ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｋ． Ｒ．； １９９１． 酵母での構成性および誘導性遺伝子発現のためのベクター． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ９４， ３８９−３９８．
３６． Ｓｃｈｅｎａ， Ｍ．； ａｎｄ Ｙａｍａｍｏｔｏ， Ｋ． Ｒ．； １９８８． 哺乳動物糖質コルチコイド受容体誘導体は酵母での転写を増強する． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１， ９６５−９６７．
３７． ＳｅｎＧｕｐｔａ， Ｄ． Ｊ．； Ｚｈａｎｇ， Ｂ． ： Ｋｒａｅｍｅｒ， Ｂ．； Ｐｏｃｈａｒｔ， Ｐ．； Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．； ａｎｄ Ｗｉｃｋｅｎｓ， Ｍ．； １９９６． インビボでＲＮＡ−タンパク質相互作用を検出するための３ハイブリッド系． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３， ８４９６−８５０１．
３８． Ｓｅｒｅｂｒｉｉｓｋｉｉ， Ｉ． ； Ｋｈａｚａｋ， Ｖ．； ａｎｄ Ｇｏｌｅｍｉｓ Ｅ． Ａ．； １９９９． タンパク質相互作用の特異性を区別するための２ハイブリッド二重系． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４ （２４）， １７０８０−１７０８７．
３９． Ｓｈｉｏｄａ， Ｔ．； Ａｎｄｒｉｏｌｅ， Ｓ； Ｙａｈａｔａ， Ｔ．； ａｎｄ Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ， Ｋ． Ｊ．； ２０００． 獲物プラスミドの染色体外維持を有する緑の蛍光性タンパク質−レポーター２ハイブリッド系：相互作用性スクリーニングの応用． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９７， ５２２０−５２２４．４０． Ｖａｓａｖａｄａ， Ｈ． Ａ．； Ｇａｎｇｕｌｙ， Ｓ．； Ｇｅｒｍｉｎｏ， Ｆ． Ｊ．； Ｗａｎｇ， Ｚ． Ｘ．； ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｍａｎ， Ｓ． Ｍ．； １９９１． 動物細胞でのタンパク質−タンパク質相互作用の偶然的複製測定法． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８８， １０６８６−１０６９０．
４１． Ｗｅｓｔ， Ｒ． Ｗ．， Ｊｒ．； Ｙｏｃｕｍ， Ｒ． Ｒ．； ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ， Ｍ．； １９８４． サッカロミセス・セレビッシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ１−ＧＡＬ１０発散性プロモーター領域：上流活性化配列ＵＳＡＧの位置と機能． Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４， ２４６７−２４７８．
４２． Ｙａｎｇ， Ｍ； Ｗｕ， Ｚ．； ａｎｄ Ｆｉｅｌｄｓ， Ｓ．； １９９５． 酵母２ハイブリッド系で分析したタンパク質−ペプチド相互作用． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２３， １１５２−１１５６．
４３． Ｙｏｕｎｇ， Ｋ． Ｈ．； １９９８． 酵母２ハイブリッド：こんなに多くの相互作用、こんなに少ない時間で・・・． Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ５８， ３０２−３１１．
【図面の簡単な説明】
【図１】
元々の２ハイブリッド系が、２つのタンパク質（ＸおよびＹとする）の相互作用を報告する機能性転写因子の再構築に依存することを示す。フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）の２ハイブリッド系は、Ｇａｌ４ｐ転写因子のＤＮＡ結合ドメインと活性化ドメインを使用する（図は、フィールズ（Ｆｉｅｌｄｓ）とソング（Ｓｏｎｇ）、１９８９から改変した）。
【図２】
本明細書に記載の新規ライブラリーベクターは、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）での選択のためのアンピシリンとｃｏｌＥ１複製開始点と、酵母での選択のためのＴＲＰ１と２ミクロン複製開始点とを含有するシャトルベクターであることを示す。未知のｃＤＮＡはＧａｌ４ｐ活性化ドメインに融合され、ＣＹＣ１プロモーターに結合したＧＲＥ上流活性化成分の誘導により、連続的な可変の発現が得られる。ＫＡＮ＝カナマイシン、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）選択マーカー；ｏｒｉ＝ＣｏｌＥ１細菌複製開始点；ＵＲＡ＝ＵＲＡ３遺伝子、酵母選択マーカー；２μｍ＝酵母の複製開始点；ＥＲＥ＝エストロゲン応答成分；ＣＹＣ１ｐ＝酵母からのＣＹＣ１プロモーター；Ｇａｌ４ｐＢＤ＝Ｇａｌ４ｐＤＮＡ結合ドメイン（１〜１４７）；ＡｄｈＴ＝アルコール脱水素酵素ターミネーター。
【図３】
大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）での選択のためのカナマイシンとｃｏｌＥ１複製開始点と、酵母での選択のためのＵＲＡ３と２μｍ複製開始点とを含有するシャトルベクター中の新規餌ベクターを示す。既知のｃＤＮＡはＧａｌ４ｐ  ＤＮＡ結合ドメインに融合され、ＣＹＣ１プロモーターに結合したＧＲＥ上流活性化成分の誘導により連続的な可変の発現が得られる。ＡＭＰ＝アンピシリン、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）選択マーカー；ｏｒｉ＝ＣｏｌＥ１細菌複製開始点；ＴＲＰ＝ＴＲＰ１遺伝子、酵母選択マーカー；２μｍ＝酵母の複製開始点；ＧＲＥ＝糖質コルチコイド応答成分；ＣＹＣ１ｐ＝酵母からのＣＹＣ１プロモーター；Ｇａｌ４ｐＡＤ＝Ｇａｌ４アクチベータードメイン（７６８〜８８１）；ＡｄｈＴ＝アルコール脱水素酵素ターミネーター。
【図４】
ｙＨＹＢ００１株中の「餌ベクター」中のＧａｌ４ｐＢＤに融合したタンパク質の連続的用量応答発現を示す。餌ベクターを有する株ｙＨＹＢ００１を、異なる濃度のエストラジオールを有する選択最小培地で増殖させる。餌ベクターは、マーカーｌａｃＺに融合したＧａｌ４ｐＢＤを含有する。１エストラジオール濃度について３回のβ−ｇａｌ発現測定を行う；データは、１試料当たりの３回の測定の平均を示す。増殖は一晩であり、測定した時、株はＯＤ６００が約０．８であった。株ｙＨＹＢ００１は、本文に記載されている。β−ｇａｌ発現測定法は、グアレンテ（Ｇｕａｒｅｎｔｅ）（１９８３）中に記載されている。
【図５】
ｙＨＹＢ００１株中の「餌ベクター」中のＧａｌ４ｐＢＤに融合したタンパク質の連続的用量応答発現を示す。ライブラリーベクターを有する株ｙＨＹＢ００１を、異なる濃度のデキサメタゾンを有する選択最小培地で増殖させる。餌ベクターは、マーカーｌａｃＺに融合したＧａｌ４ｐＢＤを含有する。１デキサメタゾン濃度について３回のβ−ｇａｌ発現測定を行う；データは、１試料当たりの３回の測定の平均を示す。増殖は一晩であり、測定した時、株はＯＤ６００が約０．８であった。株ｙＨＹＢ００１は、本文に記載されている。β−ｇａｌ発現アッセイは、グアレンテ（Ｇｕａｒｅｎｔｅ）（１９８３）中に記載されている。
【図６】
新規の分子的遺伝子的相互作用検出系中の相互作用物質の相対的濃度の変化を有する可変レポーター出力の原理を示す。棒の数は、細胞中に存在するライブラリー融合タンパク質と餌融合タンパク質の相対レベルを示す。平衡では、ある時点で融合タンパク質の一部のみが物理的に対をなし、相互作用のＫｄを示す（この例では、我々は、ある時点で５０％が結合していると仮定する）。両方の融合タンパク質がほぼ等量存在する時、中程度の感度の測定法が得られる。平衡では、その半分が相互作用し、レポーターからの理論最大値の１／２である出力が得られる。レポーターでＤＮＡ結合ドメイン融合体の半分は、活性化ライブラリー融合体と対を形成していないため、これは真実である。より低い感度は、ライブラリー融合体の量を減少させるかおよび／または餌融合体の量を増加させることにより、達成される。平衡で２倍のレベルの差は、レポーターからの理論最大値の１／４を与える。ライブラリー融合体の過剰により高感度が得られる；平衡での２倍過剰は、レポーターからの理論最大値に近い出力を与える。
【図１】
2004500805.tif 000006
【図２】
2004500805.tif 000007
【図３】
2004500805.tif 000008
【図４】
2004500805.tif 000009
【図５】
2004500805.tif 000010
【図６】
2004500805.tif 000011
【国際公開パンフレット】
2004500805.tif 000012
2004500805.tif 000013
2004500805.tif 000014
2004500805.tif 000015
2004500805.tif 000016
2004500805.tif 000017
2004500805.tif 000018
2004500805.tif 000019
2004500805.tif 000020
2004500805.tif 000021
2004500805.tif 000022
2004500805.tif 000023
2004500805.tif 000024
2004500805.tif 000025
2004500805.tif 000026
2004500805.tif 000027
2004500805.tif 000028
2004500805.tif 000029
2004500805.tif 000030
2004500805.tif 000031
2004500805.tif 000032
2004500805.tif 000033
2004500805.tif 000034
2004500805.tif 000035
2004500805.tif 000036
2004500805.tif 000037
2004500805.tif 000038
2004500805.tif 000039
2004500805.tif 000040
2004500805.tif 000041
2004500805.tif 000042
2004500805.tif 000043
2004500805.tif 000044
2004500805.tif 000045
2004500805.tif 000046
2004500805.tif 000047
2004500805.tif 000048
2004500805.tif 000049
2004500805.tif 000050
2004500805.tif 000051
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500805.tif 000052
2004500805.tif 000053
【国際調査報告】
2004500805.tif 000054
2004500805.tif 000055
2004500805.tif 000056