(57)【要約】本発明は、カリウムチャンネルに結合して、カリウムチャンネルが媒介する活性を変調させる、ＰＣＩＰ核酸分子と呼ばれる単離された核酸分子を提供する。本発明は、アンチセンス核酸分子、ＰＣＩＰ核酸分子を有する組換え発現ベクター、前記発現ベクターが導入された宿主細胞及びＰＣＩＰ遺伝子が導入又は破壊されたヒト以外のトランスジェニック動物も提供する。本発明は、単離されたＰＣＩＰタンパク質、融合タンパク質、抗原ペプチド及び抗ＰＣＩＰ抗体も更に提供する。本発明の組成物を利用した診断方法も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２、ＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列或いはその相補配列と少なくとも６０％相補なヌクレオチド配列を有する核酸分子と；
ｂ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２、ＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列或いはその相補配列を有する核酸の少なくとも５８３個のヌクレオチドからなる断片を有する核酸分子と；
ｃ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％相補なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子と；
ｄ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片をコードする核酸分子であって、前記断片が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基を有する、核酸分子と；
ｅ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子バリアントをコードする核酸分子であって、前記核酸分子が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートを有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、核酸分子と；
からなる群から選択される、単離された核酸分子。
【請求項２】
ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列或いはその相補配列を有する核酸分子と；
ｂ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸分子と；
からなる群から選択される、請求項１の単離された核酸分子。
【請求項３】
ベクター核酸配列を更に有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
非相同なポリペプチドをコードする核酸配列を更に有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分子を有する宿主細胞。
【請求項６】
哺乳類の宿主細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項１の核酸分子を有する、非ヒト哺乳類の宿主細胞。
【請求項８】
ａ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片であって、前記断片が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続するアミノ酸を有する、ポリペプチドの断片と；
ｂ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子バリアントであって、前記ポリペプチドが、配列番号：１、配列番号：３  配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートを有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、ポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子バリアントと；
ｃ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を有する核酸と少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされるポリペプチドと；
ｄ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドと；
からなる群から選択される、単離されたポリペプチド。
【請求項９】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
非相同なアミノ酸配列を更に有する、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項８のポリペプチドと選択的に結合する抗体。
【請求項１２】
ａ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドと；
ｂ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドの断片であって、前記断片が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続するアミノ酸を有する、ポリペプチドの断片と；
ｃ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子バリアントであって、前記ポリペプチドが、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４又はＰＴＡ−３１６で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートを有する核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされる、ポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子バリアントと；
からなる群から選択されるポリペプチドの作製方法であって、請求項５の宿主細胞を、前記核酸分子が発現される条件下で培養することが含まれる、方法。
【請求項１３】
試料中の請求項８に記載のポリペプチドの存在を検出するための、以下を含む方法：
ａ）前記試料を、前記ポリペプチドと選択的に結合する化合物と接触させることと；
ｂ）前記化合物が前記試料中の前記ポリペプチドと結合するか否かを調べることにより、前記試料中の請求項８に記載のポリペプチドの存在を検出すること。
【請求項１４】
前記ポリペプチドと結合する前記化合物が抗体であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項８に記載のポリペプチドと選択的に結合する化合物と、使用説明書と、が含まれるキット。
【請求項１６】
試料中の請求項１に記載の核酸分子の存在を検出するための、以下を含む方法：
ａ）前記試料を、前記核酸分子と選択的にハイブリダイズする核酸プローブ又はプライマと接触させることと；
ｂ）前記核酸プローブ又はプライマが前記試料中の核酸分子と結合するか否かを調べることにより、前記試料中の請求項１に記載の核酸分子の存在を検出すること。
【請求項１７】
前記試料にｍＲＮＡ分子が含有され、かつ前記試料を核酸プローブと接触させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１に記載の核酸分子と選択的にハイブリダイズする化合物と、使用説明書と、が含まれるキット。
【請求項１９】
請求項８に記載のポリペプチドと結合する化合物を同定するための、以下を含む方法：
ａ）前記ポリペプチド又は前記ポリペプチドを発現している細胞を試験化合物と接触させることと；
ｂ）前記ポリペプチドが前記試験化合物と結合するか否かを調べること。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、前記試験化合物と前記ポリペプチドとの結合を：
ａ）試験化合物とポリペプチドとの結合を直接に検出することによる、結合の検出と；
ｂ）競合的結合アッセイを利用した、結合の検出と；
ｃ）ＰＣＩＰ活性のアッセイを利用した、結合の検出と；
からなる群より選択される方法によって検出する、方法。
【請求項２１】
請求項８に記載のポリペプチドの活性を調節する方法であって、前記ポリペプチド又は前記ポリペプチドを発現している細胞を、前記ポリペプチドの前記活性を調節するのに十分な濃度の、前記ポリペプチドと結合する化合物と接触させることが含まれる、方法。
【請求項２２】
請求項８に記載のポリペプチドの活性を調節する化合物を同定するための、以下を含む方法：
ａ）請求項８に記載のポリペプチドを試験化合物と接触させることと；
ｂ）前記試験化合物が前記ポリペプチドの前記活性に及ぼす影響を調べることにより、前記ポリペプチドの前記活性を調節する化合物を同定すること。
【請求項２３】
異常なＰＣＩＰ核酸発現又はＰＣＩＰタンパク質活性によって特徴付けられる障害を治療することの可能な化合物の同定方法であって、前記化合物又は物質が請求項１に記載のＰＣＩＰタンパク質核酸分子の発現又は請求項８に記載のＰＣＩＰポリペプチドの活性を調節する能力を分析することにより、異常なＰＣＩＰ核酸発現又はＰＣＩＰタンパク質活性によって特徴付けられる障害を治療することの可能な化合物を同定することが含まれる、方法。
【請求項２４】
前記障害が中枢神経系障害であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記障害がてんかんであることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記障害が脊髄小脳失調であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記障害が心臓血管障害であることを特徴とする、請求項２３に記載の方法。
【請求項２９】
前記心臓血管障害が異常なＩｔｏ電流を伴うことを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
対象が異常な又は病的なＰＣＩＰ核酸発現及び／又はＰＣＩＰタンパク質活性によって特徴付けられる障害に罹患する危険性があるか否かの判定方法であって、前記対象からの試料細胞中の遺伝子損傷の有無を検出することが含まれる方法において、前記遺伝子損傷が、請求項８に記載のＰＣＩＰポリペプチドをコードする遺伝子の完全性に影響を与える変化又は請求項１に記載のＰＣＩＰ核酸分子の誤った発現によって特徴付けられることを特徴とする、方法。
【請求項３１】
前記障害が中枢神経系障害であることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記障害がてんかんであることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記障害が脊髄小脳失調であることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記障害が心臓血管障害であることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記心臓血管障害が異常なＩｔｏ電流を伴うことを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
異常な又は病的なＰＣＩＰ核酸発現及び／又はＰＣＩＰタンパク質活性によって特徴付けられる障害に罹患している対象の特定方法であって、前記対象から生体試料を採取し、該試料中の遺伝子損傷の有無を検出することが含まれる方法において、前記遺伝子損傷が、請求項８に記載のＰＣＩＰポリペプチドをコードする遺伝子の完全性に影響を与える変化又は請求項１に記載のＰＣＩＰ核酸分子の誤った発現によって特徴付けられることによって、異常な又は病的なＰＣＩＰ核酸発現及び／又はＰＣＩＰタンパク質活性によって特徴付けられる障害に罹患している対象が特定されることを特徴とする、方法。
【請求項３７】
前記障害が中枢神経系障害であることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記障害がてんかんであることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記障害が脊髄小脳失調であることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記障害が心臓血管障害であることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記心臓血管障害が異常なＩｔｏ電流を伴うことを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
カリウムチャネル関連障害を有する対象の治療方法であって、前記対象に請求項８に記載のＰＣＩＰポリペプチド又はその一部分を、治療効果が生じるように投与することが含まれる、方法。
【請求項４３】
前記障害が中枢神経系障害であることを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記障害がてんかんであることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記障害が脊髄小脳失調であることを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記障害が心臓血管障害であることを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記心臓血管障害が異常なＩｔｏ電流を伴うことを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
カリウムチャネル関連障害を有する対象の治療方法であって、前記対象に、請求項８に記載のＰＣＩＰポリペプチド又はその一部分を、治療効果が生じるように投与することが含まれる、方法。
【請求項４９】
前記障害が中枢神経系障害であることを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記障害がてんかんであることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記障害が脊髄小脳失調であることを特徴とする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記障害が心臓血管障害であることを特徴とする、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記心臓血管障害が異常なＩｔｏ電流を伴うことを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項２３に記載の方法で同定された化合物のカリウムチャネル関連障害の治療への使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、それらの内容全体が引用をもってここに援用された、１９９８年１１月２５日出願の米国特許仮出願第６０／１１０，０３３号、１９９８年１１月２０日出願の米国特許仮出願第６０／１０９，３３３号、１９９８年１１月３０日出願の米国特許仮出願第６０／１１０，２７７号、１９９９年４月２３日出願の米国特許出願第０９／２９８，７３１号、１９９９年７月９日出願の米国特許出願第０９／３５０，６１４号、１９９９年７月９日出願の米国特許出願第０９／３５０，８７４，号、１９９９年９月２１日出願の米国特許出願第０９／３９９，９１３号、１９９９年９月２１日出願の米国特許出願第０９／４００，４９２号、１９９９年１１月１９日出願のＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／２７４２８号、２０００年９月２７日出願の米国特許出願第０９／６７０，７５６，号及び２０００年１０月３１日出願の米国特許出願第０９／７０３，０９４号に基づいて優先権を主張する。
【０００２】
発明の背景
哺乳類の細胞膜は、多くの細胞及び組織の構造上の完全性及び活性にとって重要である。膜に関する生理学の中でも特に注目されるのが、様々な薬理学的、生理学的及び細胞学的機序を直接に制御する作用を持つ膜透過イオンチャネルに関する研究である。カルシウムチャネル、ナトリウムチャネル及びカリウムチャネルを含めた数多くのイオンチャネルが同定されており、これらのそれぞれが脊椎動物及び昆虫細胞内で果たす役割を解明するための研究が行われてきた。
【０００３】
カリウムチャネルが細胞の正常なホメオスタシスの維持に関与していることから、カリウムチャネルに関する多くの研究がなされてきた。これらのカリウムチャネルのうちの多くは、細胞膜電位の変化に応答して開く。多くの電位依存性カリウムチャネルは、その電気生理学的及び薬理学的特性によって特定及び特徴付けられる。カリウム電流は、ナトリウム電流又はカルシウム電流よりも多様であり、細胞の外部刺激に対する反応の決定にも更に関与している。カリウムチャネルは、その多様性と生理学的役割の重要性とによって、様々な疾患に対する治療薬を開発する上での標的となりうるきわだって高い可能性を持っている。
【０００４】
種々のカリウムチャネルの中でもその特性が最もよく分かっている種類の一つが、電位依存性カリウムチャネルである。この種のカリウムチャネルの原型となるメンバーが、キイロショウジョウバエのＳｈａｋｅｒ遺伝子によってコードされるタンパク質である。Ｓｈａｌ又はＫｖ４ファミリーのタンパク質は、複数の異なる一次細胞から記録された天然のＡ型電流の多くの基本形となる電位依存性カルシウムチャネルの一種である。Ｋｖ４チャネルは、心臓の活動電位の再分極で重要な役割を果たす。ニューロンにおいては、Ｋｖ４チャネル及びこれらの持ちうるＡ電流が、発火率の変動、活動電位の発生及びシナプス入力への樹状突起の応答において重要な役割を果たす。
【０００５】
ニューロンの基本的な機能は、シグナルの受信、伝達及び送信である。伝達されるシグナルの目的は、ニューロンの種類によって様々に異なるが、シグナルは常に、ニューロンの原形質膜内外の電位の変化という同じ形をとる。１つのニューロンの原形質膜は、複数の電位依存性のカチオンチャネルを有し、これらが要因となって、この原形質膜内外の電位（活動電位又は神経インパルスとも呼ぶ）の伝搬が起こる。
【０００６】
Ｋｖファミリーのチャネルには、（１）活動電位の発生の度に膜を再分極させて、細胞の再発火に備える、遅延整流カリウムチャネルと、（２）主に閾下電圧で活性であり、興奮性細胞が発火閾点に達する率を減少させるべく作用する、急速失活（Ａ型）カリウムチャネルと、が含まれる。Ｋｖチャネルは、活動電位の伝達に不可欠であることに加えて、例えばシナプス入力などの脱分極性の入力に対する応答を制御すると共に、神経伝達物質の放出において関与する。電位依存性カリウムチャネルは、これらの活性を持つことから、神経の興奮作用を調節する上で重要である（Ｈｉｌｌｅ  Ｂ．，Ｉｏｎｉｃ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ｏｆ  Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，第２版，マサチューセッツ州サンダーランド：Ｓｉｎａｕｅｒ，（１９９２））。
【０００７】
Ｋｖカリウムチャネルのスーパーファミリーは、非常に広範な構造上及び機能上の多様性を有する。この多様性は、マルチプル遺伝子の存在と、同じ遺伝子から作製されたＲＮＡ転写産物の選択的スプライシングとの双方によって生じる。それでもなお、これらの既知のＫｖカリウムチャネルのアミノ酸配列は、非常に類似している。これらのアミノ酸配列は全て、４つの小孔形成α−サブユニットからなり、そのうちいくつかは、４つの細胞質（β−サブユニット）ポリペプチドを有する（Ｊａｎ  Ｌ．Ｙ．他（１９９０）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １３：４１５−４１９，及び  Ｐｏｎｇｓ，Ｏ．他（１９９５）  Ｓｅｍ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：１３７−１４６）。これらの既知のＫｖチャネル（α−サブユニット）は、ショウジョウバエから最初に単離されたチャネルと相同であることに因んで名付けられた４つのサブファミリー：Ｋｖ１又はＳｈａｋｅｒ関連サブファミリー；Ｋｖ２又はＳｈａｂ関連サブファミリー；Ｋｖ３又はＳｈａｗ関連サブファミリー；及びＫｖ４又はＳｈａｌ関連サブファミリーに分類される。
【０００８】
Ｋｖ４．２及びＫｖ４．３は、Ｓｈａｌ関連サブファミリーのＫｖチャネル（α−サブユニット）の例である。Ｋｖ４．３は、そのｍＲＮＡが脳幹のモノアミン作動性ニューロン及び前脳のコリン作動性ニューロン中に高度に発現されているという点で独自の神経解剖学的分布を呈し、そこにおいて、神経伝達物質であるドーパミン、ノルエピネフリン、セロトニン及びアセチルコリンの放出に関与している。
【０００９】
このチャネルはまた、皮質錐体細胞及び介在ニューロン中にも高度に発現されている（Ｓｅｒｄｉｏ  Ｐ．他（１９９６）Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓ  ７５：２１７４−２１７９）。興味深いことに、Ｋｖ４．３ポリペプチドは、対応するｍＲＮＡを発現しているニューロン中で高度に発現される。Ｋｖ４．３ポリペプチドは、これらの細胞の細胞体樹状突起膜中に発現され、このことによって、前記急速失活カリウムチャネルの伝導性に貢献すると考えられる。Ｋｖ４．２ｍＲＮＡは脳内で広く発現され、またこれに対応するポリペプチドも細胞体樹状突起膜内に集中しており、このことも、前記急速失活カリウムチャネルの伝導性に貢献している（Ｓｈｅｎｇ他（１９９２）  Ｎｅｕｒｏｎ  ９：２７１−８４）。Ｋｖ４．２及びＫｖ４．３などのこれらの細胞体樹状突起Ａ型Ｋｖチャネルは、閾下シナプス応答の統合及び逆伝搬活動電位の伝導といった、学習及び記憶の基本となるプロセスに関与していると考えられる（Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｄ．Ａ．他（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：８６９−８７５）。
【００１０】
このように、例えばＫｖ４．２又はＫｖ４．３サブユニットを有するカリウムチャネルなどのカリウムチャネルタンパク質と相互作用してその活性を調節するタンパク質は、これらのチャネルを発現している細胞における、例えば活動電位の伝導性、体性樹状突起の興奮性及び神経伝達物質の放出などの神経又は心臓の興奮性を調節するための新規な分子標的となる。加えて、これらのタンパク質をコードしている遺伝子の遺伝的損傷を検出することで、てんかん、脊髄小脳失調、不安、うつ病、加齢に伴う記憶喪失、偏頭痛、肥満、パーキンソン病又はアルツハイマー病などの中枢神経系の障害或いは心不全、高血圧、心房細動、拡張型心筋症、特発性心筋症又は狭心症などの心臓血管障害を診断及び治療することが可能である。
【００１１】
発明の概要
本発明は、少なくとも部分的には、カリウムチャネルタンパク質と相互作用する、又はカリウムチャネルタンパク質と相互作用する本発明の遺伝子産物と実質的に相同な（パラログ）遺伝子産物をコードする、新規な核酸分子の発見に基づく。カリウムチャネルタンパク質は、例えば、Ｋｖ４．２又はＫｖ４．３サブユニットを有するカリウムチャネルである。本発明の核酸分子及びこれらの遺伝子産物を、ここで「カリウムチャネル相互作用タンパク質」、「ＰＣＩＰ」又は「ＫＣｈＩＰ」核酸及びタンパク質分子と呼ぶ。本発明のＰＣＩＰタンパク質は、カリウムチャネルタンパク質と、例えば結合するなどの相互作用を行い、カリウムチャネルタンパク質の活性を調節し、及び／又は、例えば神経細胞又は心細胞などの細胞における、カリウムチャネルが媒介する活性を調節する。本発明のＰＣＩＰ分子は、例えば神経細胞又は心細胞プロセスなどの様々な細胞プロセスを調節する調節物質として有用である。従って、一局面においては、本発明は、ＰＣＩＰタンパク質又はその生物学的活性部分をコードする、単離された核酸分子を提供すると共に、ＰＣＩＰをコードする核酸を検出するためのプライマ又はハイブリダイゼーションプローブとして好適な核酸断片を提供する。
【００１２】
一実施態様においては、本発明のＰＣＩＰ核酸分子は、配列番号：１、配列番号：３  配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるヌクレオチド配列（の例えば全長ヌクレオチド配列など）或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列或いはその相補配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上相同である。
【００１３】
別の好適な一実施態様においては、前記単離された核酸分子に、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるヌクレオチド配列或いはその相補配列が含まれる。別の好適な一実施態様においては、前記核酸分子に、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるヌクレオチド配列の、少なくとも３００個、３５０個、４００個、４２６個、４７１個又は５８３個のヌクレオチドからなる断片或いはその相補配列が含まれる。
【００１４】
別の一実施態様においては、ＰＣＩＰ核酸分子に、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９で表されるアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートでコードされるアミノ酸配列と十分に相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれる。好適な一実施態様においては、ＰＣＩＰ核酸分子に、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９で表されるアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートでコードされるアミノ酸配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【００１５】
別の好適な一実施態様においては、単離された核酸分子が、１ｖ、９ｑ、ｐ１９、Ｗ２８５５９、ＫＣｈＩＰ４ａ、ＫＣｈＩＰ４ｂ、３３ｂ０７、１ｐ及びラット７ｓタンパク質のアミノ酸配列をコードする。更に別の好適な一実施態様においては、前記核酸分子に、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９で表されるアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートでコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列が含まれる。更に別の好適な一実施態様においては、前記核酸分子が、少なくとも４２６、４７１又は５８３ヌクレオチド長であり、（本願中に記載の）ＰＣＩＰ活性を有するタンパク質をコードする。
【００１６】
本発明の別の一実施態様は、非ＰＣＩＰタンパク質をコードする核酸分子に比較してＰＣＩＰ核酸分子を特異的に検出する、好適にはＰＣＩＰ核酸分子である核酸分子を提供する。例えば、一実施態様においては、そのような核酸分子は、少なくとも４２６、４００乃至４５０、４７１、４５０乃至５００、５００乃至５５０、５８３、５５０乃至６００、６００乃至６５０、６５０乃至７００、７００乃至７５０、７５０乃至８００又はそれ以上のヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるヌクレオチド配列、ＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を有する核酸分子或いはその相補配列とハイブリダイズする。複数の好適な実施態様においては、前記核酸分子は少なくとも（例えば連続する）１５ヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で、配列番号：７のヌクレオチド９３乃至１２６、３６０乃至４６２、７３２乃至８２５、１０２８乃至１０５４又は１５１７乃至１５３４とハイブリダイズする。別の複数の好適な実施態様においては、前記核酸分子は、配列番号：７のヌクレオチド９３乃至１２６、３６０乃至４６２、７３２乃至８２５、１０２８乃至１０５４又は１５１７乃至１５３４を有する。
【００１７】
別の複数の好適な実施態様においては、前記核酸分子は少なくとも（例えば連続する）１５ヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１３のヌクレオチド１乃至１４、４９乃至１１６、１３７乃至３１１、３４５乃至４１０、４３０乃至４８２、５０３乃至５１８、６６２乃至６９３、１４０６乃至１４２１、１４４１乃至１４５７、１４７８乃至１４９４又は１８８２乃至１９５９とハイブリダイズする。別の複数の好適な実施態様においては、前記核酸分子が、配列番号：１３のヌクレオチド１乃至１４、４９乃至１１６、１３７乃至３１１、３４５乃至４１０、４３０乃至４８２、５０３乃至５１８、６６２乃至６９３、１４０６乃至１４２１、１４４１乃至１４５７、１４７８乃至１４９４又は１８８２乃至１９５９を有する。
【００１８】
複数の好適な実施態様においては、前記核酸分子は少なくとも（例えば連続する）１５ヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下で、配列番号：３５のヌクレオチド９３２乃至１５２７、１５４８乃至１７６５、１７８６乃至１８７１、１９０８乃至２０９１、２２５９乃至２２６５又は２６３０乃至２６５４とハイブリダイズする。別の複数の好適な実施態様においては、前記核酸分子が、配列番号：３５のヌクレオチド９３２乃至１５２７、１５４８乃至１７６５、１７８６乃至１８７１、１９０８乃至２０９１、２２５９乃至２２６５又は２６３０乃至２６５４を有する。
【００１９】
別の複数の好適な実施態様においては、前記核酸分子が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９で表されるアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートでコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドの天然に存在する対立遺伝子バリアントをコードし、ここで、前記核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２を有する核酸分子とハイブリダイズする。
【００２０】
本発明の別の一実施態様は、ＰＣＩＰ核酸分子のアンチセンスである、例えばＰＣＩＰ核酸分子のコード鎖などの単離された核酸分子を提供する。
【００２１】
本発明の別の一局面は、ＰＣＩＰ核酸分子を有するベクターを提供する。複数の実施態様においては、前記ベクターは組換え発現ベクターである。別の一実施態様においては、本発明は、本発明のベクターを含有する宿主細胞を提供する。本発明はまた、好適にはＰＣＩＰタンパク質であるタンパク質を、組換え発現ベクターを含有する、非ヒト哺乳類細胞などの哺乳類宿主細胞を一例とする本発明の宿主細胞を、前記タンパク質が作製されるような仕方で好適な培地中で培養することによって、作製する方法を提供する。
【００２２】
本発明の別の一局面は、単離された又は組換え型のＰＣＩＰタンパク質及びポリペプチドを提供する。一実施態様においては、前記単離されたタンパク質は、好適にはＰＣＩＰタンパク質であり、少なくとも１つのカルシウム結合ドメインを有する。好適な一実施態様においては、前記タンパク質は、好適にはＰＣＩＰタンパク質であり、少なくとも１つのカルシウム結合ドメインを有し、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列と少なくともおよそ５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上相同なアミノ酸配列を有する。別の好適な一実施態様においては、前記タンパク質は、好適にはＰＣＩＰタンパク質であり、少なくとも１つのカルシウム結合ドメインを有し、カリウムチャネルが媒介する活性を調節する。更に別の好適な一実施態様においては、前記タンパク質は、好適にはＰＣＩＰタンパク質であり、少なくとも１つのカルシウム結合ドメインを有し、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる。
【００２３】
別の一実施態様においては、本発明は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列を有するタンパク質の断片を提供し、ここで、前記断片は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列の（例えば連続する複数のアミノ酸などの）少なくとも１５個のアミノ酸を有する。別の一実施態様においては、前記タンパク質は、好適にはＰＣＩＰタンパク質であり、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のアミノ酸配列を有する。
【００２４】
別の一実施態様においては、本発明は、好適にはＰＣＩＰタンパク質である単離されたタンパク質を提供し、このタンパク質は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２のヌクレオチド配列と少なくともおよそ５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上相同なヌクレオチド配列を有する核酸分子又はその相補配列によってコードされる。
【００２５】
本発明のタンパク質又はその生物学的活性部分を、（例えば非相同なアミノ酸配列などの）非ＰＣＩＰポリペプチドに作動的に連結させて、融合タンパク質を形成してもよい。本発明は更に、モノクローナル又はポリクローナル抗体などの、好適にはＰＣＩＰタンパク質である本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体を提供する。加えて、前記ＰＣＩＰタンパク質又はその生物学的活性部分を、薬学上許容可能な担体を任意に含む薬剤組成物中に組み込んでもよい。
【００２６】
別の一局面においては、本発明は、生体試料中のＰＣＩＰ核酸分子、タンパク質又はポリペプチドの存在を、前記生体試料中のＰＣＩＰ核酸分子、タンパク質又はポリペプチドの存在が検出されるような仕方で、ＰＣＩＰ核酸分子、タンパク質又はポリペプチドを検出することの可能な物質と前記生体試料とを接触させることにより検出する方法を提供する。
【００２７】
別の一局面においては、本発明は、生体試料中のＰＣＩＰ活性の存在を、前記生体試料中のＰＣＩＰ活性の存在が検出されるような仕方で、ＰＣＩＰ活性のインジケータを検出することの可能な物質と前記生体試料とを接触させることにより検出する方法を提供する。
【００２８】
別の一局面においては、本発明は、ＰＣＩＰを発現することの可能な細胞を、前記細胞中のＰＣＩＰ活性が調節されるようにＰＣＩＰ活性を調節する物質と接触させることが含まれる、ＰＣＩＰ活性の調節方法を提供する。一実施態様においては、前記物質はＰＣＩＰ活性を阻害する。別の一実施態様においては、前記物質はＰＣＩＰ活性を刺激する。一実施態様においては、前記物質は、ＰＣＩＰタンパク質に特異的に結合する抗体である。別の一実施態様においては、前記物質は、ＰＣＩＰ遺伝子の転写又はＰＣＩＰ  ｍＲＮＡの翻訳を調節することで、ＰＣＩＰの発現を調節する。更に別の一実施態様においては、前記物質は、ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ又はＰＣＩＰ遺伝子のコード鎖のアンチセンスであるヌクレオチド配列を有する核酸分子である。
【００２９】
一実施態様においては、本発明の方法を、異常なＰＣＩＰタンパク質又は核酸の発現又は活性を特徴とする障害を有する対象を、前記対象に対するＰＣＩＰモジュレータである物質を投与することによる治療に使用する。一実施態様においては、前記ＰＣＩＰモジュレータはＰＣＩＰタンパク質である。別の一実施態様においては、前記ＰＣＩＰモジュレータは、ＰＣＩＰ核酸分子である。更に別の一実施態様においては、前記ＰＣＩＰモジュレータは、ペプチド、ペプチドミメティック又はその他の小分子である。好適な一実施態様においては、異常なＰＣＩＰタンパク質又は核酸の発現を特徴とする前記障害は、中枢神経系障害又は心臓血管障害である。
【００３０】
本発明はまた、（ｉ）ＰＣＩＰタンパク質をコードする遺伝子の異常な修飾又は変異；（ｉｉ）前記遺伝子の調節不全；及び（ｉｉｉ）ＰＣＩＰタンパク質の異常な翻訳後修飾のうちの少なくとも１つを特徴とし、前記遺伝子の野生型がＰＣＩＰ活性を有するタンパク質をコードする、遺伝子の変化の有無を調べるための診断アッセイを提供する。
【００３１】
別の一局面においては、本発明は、ＰＣＩＰタンパク質に結合するか又はその活性を調節する化合物を、ＰＣＩＰ活性を有するＰＣＩＰタンパク質を含有するインジケータ組成物を提供し、前記インジケータ組成物を試験化合物と接触させ、前記試験化合物が前記インジケータ組成物のＰＣＩＰ活性に及ぼす影響を調べることにより同定する方法を提供する。
【００３２】
本発明のその他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び請求項から明らかとなろう。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、カリウムチャネルタンパク質と相互作用する新規な核酸分子又はカリウムチャネルタンパク質と相互作用する本発明の遺伝子産物と実質的に相同な（パラログ）新規な核酸分子の発見に基づく。カリウムチャネルタンパク質は、例えば、Ｋｖ４．２又はＫｖ４．３サブユニットを有するカリウムチャネルである。本発明の核酸分子及びその遺伝子産物を、ここで「カリウムチャネル相互作用タンパク質」、「ＰＣＩＰ」又は「ＫＣｈＩＰ」核酸及びタンパク質分子と呼ぶ。好適には、本発明のＰＣＩＰタンパク質は、カリウムチャネルタンパク質と、例えば結合するなどの相互作用を行い、カリウムチャネルタンパク質の活性を調節し、及び／又は、例えば神経細胞又は心細胞などの細胞中のカリウムチャネルが媒介する活性を調節する。
【００３４】
ここで使用する「ＰＣＩＰファミリー」という用語は、本発明のタンパク質及び核酸分子を言及する場合には、本願中で定義するＰＣＩＰ活性を有する２つまたはそれ以上のタンパク質又は核酸分子を指すことを意図されている。そのようなＰＣＩＰファミリーメンバーは、天然にも非天然にも発生し、同じ種からも異なる種からも発生しうる。例えば、あるＰＣＩＰファミリーは、ヒトに由来する第１のタンパク質と共に、ヒトに由来する別のタンパク質を含む場合もあるし、又は、ヒト以外に由来する相同体を含む場合もある。
【００３５】
ここで交換可能に使用される「ＰＣＩＰ活性」、「ＰＣＩＰの生物学的活性」又は「ＰＣＩＰの機能活性」という用語は、ＰＣＩＰタンパク質、ポリペプチド又は核酸分子が、ＰＣＩＰ応答性細胞又はＰＣＩＰタンパク質の基質に対して発揮する活性を、標準的な技術に基づいてｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで調べたものを呼ぶ。一実施態様においては、ＰＣＩＰ活性は、ＰＣＩＰ標的分子との結合などの直接的な活性である。ここで使用される「標的分子」又は「結合相手」という用語は、ＰＣＩＰが媒介する機能が達成されるようにＰＣＩＰタンパク質が天然に結合するか又は相互作用する分子を指す。ＰＣＩＰ標的分子は、本発明の非ＰＣＩＰ分子であっても、ＰＣＩＰ分子であっても、ポリペプチドであってもよい。一実施態様においては、ＰＣＩＰ標的分子はＰＣＩＰリガンドである。又は、ＰＣＩＰ活性は、ＰＣＩＰタンパク質とＰＣＩＰリガンドとの相互作用によって媒介される細胞シグナリング活性などの間接的な活性である。ＰＣＩＰの生物学的活性について、以下に記載する。
【００３６】
例えば、本発明のＰＣＩＰタンパク質は、以下の活性のうちの１つ又はそれ以上を有してもよい：（１）カリウムチャネルタンパク質又はその一部分と（例えば結合するなどの）相互作用可能である；（２）カリウムチャネルタンパク質又はその一部分のリン酸化状態を調節可能である；（３）カルシウムと（例えば結合するなど）結び付くことが可能であると共に、例えばカリウムチャネル又はＧタンパク質結合レセプタをカルシウム依存的にリン酸化するカルシウム依存性キナーゼとして作用可能である；（４）カルシウムと（例えば結合するなど）結び付くことが可能であると共に、例えばカルシウム依存性の転写因子として作用するなど、細胞プロセスにおいてカルシウム依存的に作用することが可能である；（５）（例えば知覚ニューロン細胞又は運動ニューロン細胞などの神経細胞或いは心細胞などの）細胞における、カルシウムチャネルによって媒介される活性を調節して、例えば前記細胞に有益な作用を及ぼすことが可能である；（６）例えば神経細胞又は心細胞などの細胞におけるクロマチン形成を調節することが可能である；（７）例えば神経細胞又は心細胞などの細胞における小胞輸送及びタンパク質輸送を調節することが可能である；（８）例えば神経細胞又は心細胞などの細胞におけるサイトカインシグナリングを調節することが可能である；（９）カリウムチャネルタンパク質又はその一部分と細胞骨格との結び付きを調節可能である；（１０）細胞増殖を調節することが可能である；（１１）神経伝達物質の放出を調節することが可能である；（１２）膜興奮性を調節することが可能である；（１３）膜の静止電位に影響を及ぼすことが可能である；（１４）活動電位の波形及び周波数を調節することが可能である；（１５）興奮現象のしきい値を調節することが可能である。
【００３７】
ここで使用される「カリウムチャネル」という用語には、興奮性の細胞におけるシグナルの受信、伝達及び送信に関与するタンパク質又はポリペプチドが包含される。カリウムチャネルは、典型的には、例えば神経細胞、心細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、腎細胞、内分泌細胞及び卵細胞などの電気興奮性の細胞中で発現され、例えば小孔形成サブユニットと細胞質サブユニットとからなるヘテロ多重結合構造を形成可能である。カリウムチャネルの例には：（１）電位依存性カリウムチャネル、（２）リガンド依存性カリウムチャネル、及び（３）機械刺激受容カリウムチャネルが含まれる。カリウムチャネルの詳細な説明については、その内容が引用をもってここに援用された、Ｋａｎｄｅｌ  Ｅ．Ｒ．他、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ第２版（エルゼビア・サイエンス・パブリッシング社、ニューヨーク（１９８５））を参照のこと。本発明のＰＣＩＰタンパク質は、例えばＫｖ４．３サブユニット又はＫｖ４．２サブユニットを有するカリウムチャネルと相互作用することが示されている。
【００３８】
ここで使用される「カリウムチャネルが媒介する活性」という用語には、例えば神経細胞又は心細胞におけるカリウムチャネルなどのカリウムチャネルが、例えば神経系又は心臓においてシグナルを受信、伝達及び送信することに関する活性が含まれる。カリウムチャネルが媒介する活性には、例えばドーパミン又はノルエピネフリンなどの神経伝達物質を、例えば神経細胞又は心細胞などの細胞から放出させることと；膜の静止電位、活動電位の波形及び周波数並びに興奮現象のしきい値を調節することと；閾下シナプス応答の統合及び、例えば神経細胞又は心細胞における逆伝搬活動電位の伝達などのプロセスを調節すること、が含まれる。
【００３９】
本発明のＰＣＩＰタンパク質は、カリウムチャネルが媒介する活性を調節することから、カリウムチャネルに関連した障害及び／又は神経系関連障害の新規な診断及び治療物質として有用であろう。更に、本発明のＰＣＩＰタンパク質が、例えばＫｖ４．２又はＫｖ４．３サブユニットを有するカリウムチャネルなどのＫｖ４カリウムチャネルを調節することが原因となって、哺乳類の心臓における、Ｉｔｏ（一過性外向き電流）として知られている電位依存性Ｋ＋電流が起こる（Ｋａａｂ  Ｓ．他（１９９８）  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８（１４）：１３８３−９３；  Ｄｉｘｏｎ  Ｊ．Ｅ．他（１９９６）  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７９（４）：６５９−６８；  Ｎｅｒｂｏｎｎｅ  ＪＭ  （１９９８）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３７（１）：３７−５９；  Ｂａｒｒｙ  Ｄ．Ｍ．他（１９９８）  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８３（５）：５６０−７；  Ｂａｒｒｙ  Ｄ．Ｍ．他（１９９６）  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ５８：３６３−９４）。この電流が原因となって、心筋細胞の活動電位の急速な再分極が起こる。この電流はまた、心筋細胞が次の活動電位の発火しきい点に達する発火率を制御することによって、心拍間隔にも関与している。
【００４０】
この電流はまた、心肥大症患者において下方調節され、この結果心臓の活動電位の遅延を引き起こすことが知られている。これらの患者の場合、活動電位の遅延が心筋のカルシウム負荷とカルシウム動態との変化を引き起こし、これが一因となって、心肥大症から心不全へと至る心疾患が進行すると考えられている（Ｗｉｃｋｅｎｄｅｎ他（１９９８）  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３７：３１２）。興味深いことに、本発明の幾つかのＰＣＩＰ（例えば配列番号：１３、１５、１７、１９、２１、２３及び２５で表される９ｑｌ、９ｑｍ、９ｑｓ）は、Ｋｖ４．２及びＫｖ４．３サブユニットを有するカリウムチャネルに結合してこれを調節し、カルシウム結合ＥＦ−ｈａｎｄドメインを有する。これらのＰＣＩＰ遺伝子に突然変異があったり、これらのカルシウム結合ＰＣＩＰタンパク質自体の発現或いはこれらのＰＣＩＰとＫｖ４．２又はＫｖ４．３チャネルとの間の相互作用に異常があったりすると、心筋におけるＫｖ４．３又はＫｖ４．３（Ｉｍ）電流が減少すると予想されることから、ＰＣＩＰの発現を変化させるか或いはこれらのＰＣＩＰとＫｖ４．２又はＫｖ４．３との間の相互作用を調節する薬剤は、疾患の心肥大症から心不全への進行を遅延させるか又は防止する上で非常に有効であろう。
【００４１】
ここで使用される「カリウムチャネル関連障害」という用語には、カリウムチャネルが媒介する活性の調節不全を特徴とする障害、疾患又は状態が含まれる。カリウムチャネル関連障害は、知覚インパルスの末梢から脳への伝達及び／又は運動インパルスの脳から末梢への伝達；反射統合；知覚インパルスの解釈；及び情緒、（例えば学習及び記憶などの）知能又は運動プロセスに有害な影響を及ぼしうる。カリウムチャネル関連障害は、心筋線維を刺激して収縮させる電気インパルスにも有害な影響を及ぼしうる。カリウムチャネル関連障害の例には、神経系関連障害及び心臓血管障害が含まれる。
【００４２】
ここで使用される「神経系関連障害」という用語には、神経系に影響を及ぼす障害、疾患又は状態が含まれる。カリウムチャネル関連障害及び神経系関連障害の例には、例えば健忘症、失行、失認、健忘性失名詞症、健忘性空間識障害、クリューバー・ビューシー症候群、アルツハイマー病に伴う記憶喪失（Ｅｇｌｅｎ  Ｒ．Ｍ．（１９９６）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．７８（２）：５９−６８；Ｐｅｒｒｙ  Ｅ．Ｋ．（１９９５）Ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ２８（３）：２４０−５８）及び学習不能といった記憶及び学習障害などの認知障害；例えば幻視、知覚障害又はレーヴィ体痴呆に伴うせん妄などの意識障害；分裂情動性障害（Ｄｅａｎ  Ｂ．（１９９６）Ｍｏｌ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １（１）：５４−８）、気分変動を伴う統合失調症（Ｂｙｍａｓｔｅｒ  Ｆ．Ｐ．（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  ５８（付録１０）：２８−３６；Ｙｅｏｍａｎｓ  Ｊ．Ｓ．（１９９５）  Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１２（１）：３−１６；  Ｒｅｉｍａｎｎ  Ｄ．（１９９４）Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓ．２８（３）：１９５−２１０）、（一次性又は二次性の）抑うつ性疾患；感情障害（Ｊａｎｏｗｓｋｙ  Ｄ．Ｓ．（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５４（４）：３３５−４４）；例えばうつ病（Ｒｉｅｍａｎｎ  Ｄ．（１９９４）Ｊ．Ｐｓｙｃｈｏｓｏｍａｔｉｃ  Ｒｅｓ．３８  付録１：１５−２５；Ｂｏｕｒｇｉｎ  Ｐ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ  ６（３）：５３２−６）、逆説睡眠異常（Ｓａｋａｉ  Ｋ．（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ９（３）：４１５−２３）、睡眠覚醒及び睡眠中の体温又は呼吸抑制異常（Ｓｈｕｍａｎ  Ｓ．Ｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６９（２  Ｐｔ  ２）：Ｒ３０８−１７；Ｍａｌｌｉｃｋ  Ｂ．Ｎ．（１９９７）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７５０（１−２）：３１１−７）の患者におけるＲＥＭ睡眠異常などの睡眠障害（Ｋｉｍｕｒａ  Ｆ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．７７（２）：７０９−１６）が含まれる。神経系関連障害のその他の例には、例えば過敏性腸症候群に伴う痛み（Ｍｉｔｃｈ  Ｃ．Ｈ．（１９９７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４０（４）：５３８−４６；Ｓｈａｎｎｏｎ  Ｈ．Ｅ．（１９９７）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ．ａｎｄ  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ２８１（２）：８８４−９４；Ｂｏｕａｚｉｚ  Ｈ．（１９９５）Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ  ａｎｄ  Ａｎａｌｇｅｓｉａ  ８０（６）：１１４０−４；又はＧｕｉｍａｒａｅｓ  Ａ．Ｐ．（１９９４）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．６４７（２）：２２０−３０）又は胸痛などの、痛覚発生機序障害；例えばパーキンソン病に伴う運動障害（Ｆｉｎｎ  Ｍ．（１９９７）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ５７（１−２）：２４３−９；Ｍａｙｏｒｇａ  Ａ．Ｊ．（１９９７）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ５６（２）：２７３−９）などの運動障害（Ｍｏｎａｓｓｉ  Ｃ．Ｒ．（１９９７）Ｐｈｙｓｉｏｌ．ａｎｄ  Ｂｅｈａｖ．６２（１）：５３−９）；例えばインシュリン分泌過多に伴う肥満症（Ｍａｃｃａｒｉｏ  ���．（１９９７）Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０（１）：８−１２；Ｐｒｅｍａｗａｒｄｈａｎａ  Ｌ．Ｄ．（１９９４）Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４０（５）：６１７−２１）などの摂食障害；例えば糖尿病性の多渇症（Ｍｕｒｚｉ  Ｅ．（１９９７）Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．７５２（１−２）：１８４−８；Ｙａｎｇ  Ｘ．（１９９４）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．＆  Ｂｅｈａｖｉｏｒ  ４９（１）：１−６）などの飲水障害；例えばアルツハイマー病、アルツハイマー病に伴う（ピック病などの）痴呆、パーキンソン病及びその他のレーヴィ体びまん性疾患、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、てんかん、脊髄小脳失調、てんかん性症候群及びヤコブ−クロイツフェルト病などの神経変性障害；例えばうつ病、分裂病性障害、コルサコフ精神病、躁病、不安障害、双極性感情病又は恐怖症などの精神障害；例えば偏頭痛、脊髄損傷、脳卒中及び頭部外傷などの神経障害が含まれる。
【００４３】
ここで使用される「てんかん」という用語には、脳の正常な電気的機能の障害によって起こる周知の神経障害が含まれる。正常な脳機能では、何百万もの微小な電荷が、脳内の神経細胞から身体のあらゆる部分へと伝達される。てんかん患者の場合、この正常なパターンが、異常に強い電荷の突発によって中断され、このために、患者の意識、身体運動又は感覚が一時的に影響を受けることがある。これらの身体的変化は、てんかん性発作と呼ばれる。発作は２つのカテゴリー、即ち脳の一領域で発生する部分発作と、脳全体にわたって神経細胞に影響を及ぼす全般発作と、に分類される。てんかんは、出産前、出産中又は出産後の脳損傷；頭部外傷；栄養不足；感染症；脳腫瘍；及び幾つかの毒物に起因する場合がある。しかし、多くの場合、その原因は不明である。てんかんの発作の前に、前兆と呼ばれる不安感や不快感が起こることがあり、これが発作が始まる徴候となる。てんかんの発作が差し迫っていることを示す徴候は、患者によって様々であるが、その一つに光の点滅即ち「閃光」などの視覚的現象がある。最近、１０番染色体長腕（１０ｑ）上のマーカＤ１０Ｓ１９２の近くの１０ｑ２２−ｑ２４に、てんかんに関与する遺伝子連鎖が発見された（Ｏｔｔｍａｎ他（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １０：５６−６０）。てんかんには多くの型があり、その中には、大発作、ジャクソンてんかん、進行性家族性ミオクローヌスてんかん、小発作、レノックス−ゲシュタウト症候群、熱性けいれん、精神運動性てんかん、側頭葉てんかんが含まれる。本願中に記載する研究結果は、一部のてんかんの治療方法を明らかにする上でとりわけ有用である。
【００４４】
ここで使用される「運動失調」という用語には、脳内の正常な電気的機能が阻害されるために起こる周知の神経障害が含まれる。脊髄小脳失調１型（ＳＣＡ１）は、その遺伝子が６番染色体短腕に連鎖する常染色体優性型障害であり、ヒト主要組織適合抗原複合体（ＨＬＡ）に連鎖している。例えば、Ｈ．Ｙａｋｕｒａ他（１９７４）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，２９１，１５４−１５５；及びＪ．Ｆ．Ｊａｃｋｓｏｎ他（１９７７）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ２９６，１１３８−１１４１を参照のこと。ＳＣＡ１は、６番染色体短腕上のマーカＤ６Ｓ８９（ＨＬＡのテロメア側にある）に強く連鎖することが示されている。例えば、Ｌ．Ｐ．Ｗ．Ｒａｎｕｍ他，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４９，３１−４１（１９９１）；及びＨ．Ｙ．Ｚｏｇｈｂｉ他，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，４９，２３−３０（１９９１）を参照のこと。本願中に記載する研究結果は、乳児期に発病する脊髄小脳失調（ＩＯＳＣＡ）の治療方法を明らかにする上でとりわけ有用である。
【００４５】
ここで使用される「心臓血管障害」という用語には、例えば心臓などの心臓血管系に影響を及ぼす障害が含まれる。心臓血管障害の例には、動脈硬化、虚血性再潅流損傷、再狭窄、動脈炎症、血管壁の肥厚、心室肥厚、心室高頻度ペーシング、冠状動脈微小塞栓症、頻脈、徐脈、圧負荷、大動脈屈曲、冠状動脈結紮、血管性心疾患、心房細動、遺伝性ＱＴ延長性症候群、うっ血性心不全、洞結節機能不全、狭心症、心不全、高血圧、心房細動、心房粗動、拡張型心筋症、特発性心筋症、心筋梗塞、冠状動脈疾患、冠状動脈痙攣又は不整脈が含まれる。好適な一実施態様においては、心臓血管障害が異常なＩｔｏ電流と関連している。
【００４６】
ＰＣＩＰファミリーのいくつかのメンバーは、ここに定義した共通の構造ドメイン又はモチーフを有するか或いはアミノ酸又はヌクレオチド配列の相同性が十分に高いなどの共通の構造上の特徴を有してもよい。ＰＣＩＰファミリーのそのようないくつかのメンバーは、天然にも非天然にも発生し、同じ種からも異なる種からも発生しうる。例えば、あるＰＣＩＰファミリーは、ヒトに由来する第１のタンパク質と共に、ヒトに由来する別のタンパク質を保有する場合もあるし、又は、ヒト以外に由来する相同体を保有する場合もある。
【００４７】
例えば、共通の構造上の特徴を有するあるＰＣＩＰファミリーの複数のメンバーが、少なくとも１つの「カルシウム結合ドメイン」を有してもよい。ここで使用される「カルシウム結合ドメイン」という用語には、例えばカルシウム結合に関与するＥＦ−ｈａｎｄ（Ｂａｉｍｂｒｉｄｇｅ  Ｋ．Ｇ．他（１９９２）ＴＩＮＳ  １５（８）：３０３−３０８）などのアミノ酸ドメインが含まれる。好適には、カルシウム結合ドメインは、コンセンサス配列：
ＥＯ・・ＯＯ・・ＯＤＫＤＧＤＧ・Ｏ・・・ＥＦ・・ＯＯ．（配列番号：４１）
と実質的に相同な配列を有する。ここでＯはＩ、Ｌ、Ｖ又はＭであってもよく、「・」は必須ではない残基の位置を示す。これらの各残基は配列中２５％以上を占め、下線で示した要素は配列中８０％以上を占める。ヒト１ｖタンパク質のアミノ酸残基１２６−１５４及び１７４−２０２、ラット１ｖタンパク質のアミノ酸残基１２６−１５４及び１７４−２０２、ラット１ｖｌタンパク質のアミノ酸残基１３７−１６５及び１８５−２１３、ラット１ｖｎタンパク質のアミノ酸残基１４２−１７０、マウス１ｖタンパク質のアミノ酸残基１２６−１５４及び１７４−２０２、マウス１ｖｌタンパク質のアミノ酸残基１３７−１６５及び１８５−２１３、ヒト９ｑ１タンパク質のアミノ酸残基１４４−１７２、１８０−２０８及び２２８−２５６、ヒト９ｑｍタンパク質のアミノ酸残基１２６−１５４、１６２−１９０及び２１０−２３８、ヒト９ｑｓタンパク質のアミノ酸残基９４−１２２、１３０−１５８及び１７８−２０６、ラット９ｑｍタンパク質のアミノ酸残基１２６−１５４、１６２−１９０及び２１０−２３８、ラット９ｑｌタンパク質のアミノ酸残基１３１−１５９、１６７−１９５及び２１５−２４３、ラット９ｑｃタンパク質のアミノ酸残基１２６−１５４、１６２−１９０及び２１０−２３８、ラット８ｔタンパク質のアミノ酸残基９９−１２７、１３５−１６３及び１８３−２１１、マウス９ｑｌタンパク質のアミノ酸残基１４４−１７２、１８０−２０８及び２２８−２５６、サル９ｑｓタンパク質のアミノ酸残基９４−１２２、１３０−１５８及び１７８−２０６、ヒトｐ１９タンパク質のアミノ酸残基９４−１２２、１３０−１５８及び１７８−２０６、ラットｐ１９タンパク質のアミノ酸残基１９−４７及び６７−９５並びにマウスｐ１９タンパク質のアミノ酸残基１３０−１５８、１６６−１９４及び２１４−２４２は、カルシウム結合ドメイン（ＥＦ−ｈａｎｄ）を有する（図２１参照）。サルＫＣｈＩＰ４ａ及びＫＣｈＩＰ４ｂタンパク質のアミノ酸残基１１６−１２７及び１５２−１６３は、カルシウム結合ドメインを有する。
【００４８】
別の一実施態様においては、本発明の単離されたＰＣＩＰタンパク質は、およそ１００乃至２００アミノ酸残基長、好適には１５０乃至２００アミノ酸残基長、より好適には１８５アミノ酸残基長のアミノ酸配列と３つのＥＦ−ｈａｎｄとを有する、少なくとも１つの保存されたカルボキシル末端ドメインの存在に基づいて特定される。本発明のＰＣＩＰタンパク質は、好適には、ラット１ｖ、ラット９ｑ又はマウスｐ１９の前記カルボキシル末端の１８５個のアミノ酸残基と、少なくとも約７０％、７１％、７４％、７５％、７６％、８０％又はそれ以上相同なカルボキシル末端ドメインを有する（図２１、２５及び４１を参照のこと）。
【００４９】
共通の構造上の特徴を有する複数のＰＣＩＰファミリーメンバーを、表Ｉに列挙する。例えば共通の構造上の特徴を持たないなどのＰＣＩＰファミリーのその他のメンバーを表ＩＩに列挙し、また以下に記載する。本発明は全長ヒト及び部分長ラット３３ｂ０７クローン並びにこれらのｃＤＮＡによってコードされるタンパク質を提供する。本発明は更に、部分長ラット１ｐクローン及びこのｃＤＮＡによってコードされるタンパク質を提供する。加えて、本発明は、部分長ラット７ｓクローン及びこのｃＤＮＡによってコードされるタンパク質を提供する。
【００５０】
本発明は、既に同定されているｃＤＮＡ（２９ｘ、２５ｒ、５ｐ、７ｑ及び１９ｒ）を表す複数のＰＣＩＰファミリーメンバーを更に提供する。これらの既に同定されているｃＤＮＡを、ここでＰＣＩＰファミリーメンバー即ち本願中に記載のＰＣＩＰ活性を有する分子とする。従って、本発明は、例えばこれらのｃＤＮＡをここに記載のスクリーニングアッセイ、診断アッセイ、予測アッセイ及び治療に使用する方法などの、これらの既に同定されているｃＤＮＡの使用方法を提供する。
【００５１】
本発明のＰＣＩＰタンパク質分子を、最初に、これらがラットＫｖ４．３サブユニットのアミノ末端の１８０個のアミノ酸と相互作用する能力に基づき、酵母２ハイブリッドアッセイ（例１に詳述する）にて同定した。その他のカリウムサブユニットについても結合実験を行って、ＰＣＩＰのＫｖ４．３及びＫｖ４．２に対する特異性を立証した。次に、ｉｎ  ｓｉｔｕでの局在化実験、免疫組織化学的方法、共免疫沈降法及びパッチクランプ法によって、本発明のＰＣＩＰが、カリウムチャネル、とりわけ４．３又は４．２サブユニットを有するカリウムチャネルと相互作用してその活性を調節することが明確に立証された。
【００５２】
幾つかの新規なヒト、マウス、サル及びラットのＰＣＩＰファミリーメンバーが同定されており、ここで１ｖ、９ｑ、ｐ１９、Ｗ２８５５９、ＫＣｈＩＰ４、３３ｂ０７、１ｐ及びラット７ｓタンパク質及び核酸分子として言及する。１ｖポリペプチドをコードするヒト、ラット及びマウスｃＤＮＡは、配列番号：１、３及び５で表され、それぞれを図１、２及び３に示す。脳内では、１ｖ  ｍＲＮＡが、新皮質及び海馬の介在ニューロン、視床網様体核及び手綱内側、基底前脳及び線条体コリン作動性ニューロン、上丘並びに小脳顆粒細胞において高度に発現される。１ｖポリペプチドは、１ｖ  ｍＲＮＡを発現している細胞の細胞体、樹状突起、軸索及び軸索終末において高度に発現される。１ｖ遺伝子のスプライスバリアントがラット及びマウスで同定されており、配列番号．７、９及び１１で表され、それぞれを図４、５及び６に示す。１ｖポリペプチドは、Ｋｖ４．３またはＫｖ４．２サブユニットを有するカリウムチャネルと相互作用するが、Ｋｖ１．１サブユニットを有するカリウムチャネルとは相互作用しない。ノーザンブロット法で調べた結果、１ｖ転写産物（ｍＲＮＡ）は主に脳内で発現される。
【００５３】
８ｔ  ｃＤＮＡ（配列番号：２９）は、配列番号：３０で表される分子量約２６ｋＤのポリペプチドをコードする（図１５参照）。この８ｔポリペプチドは、Ｋｖ４．３またはＫｖ４．２サブユニットを有するカリウムチャネルと相互作用するが、Ｋｖ１．１サブユニットを有するカリウムチャネルとは相互作用しない。ノーザンブロット法で調べた結果及びｉｎ  ｓｉｔｕデータから、８ｔ  ｍＲＮＡは主に心臓及び脳で発現される。８ｔ  ｃＤＮＡは、９ｑのスプライスバリアントである。
【００５４】
ヒト、ラット、サル及びマウスの９ｑ  ｃＤＮＡの単離も行った。スプライスバリアントには、ヒト９ｑｌ（配列番号：１３；図７）ラット９ｑｌ（配列番号：１５；図８）、マウス９ｑｌ（配列番号：１７；図９）、ヒト９ｑｍ（配列番号：１９；図１０）、ラット９ｑｍ（配列番号：２１；図１１）、ヒト９ｑｓ（配列番号：２３；図１２）、サル９ｑｓ（配列番号：２５；図１３）及びラット９ｑｃ（配列番号：２７；図１４）が含まれる。９ｑのゲノムＤＮＡ配列も調べた。エキソン１及びそのフランキングイントロン配列（配列番号：４６）を図２２Ａに示す。エキソン２−１１及びそのフランキングイントロン配列（配列番号：４７）を図２２Ｂに示す。９ｑポリペプチドは、Ｋｖ４．３またはＫｖ４．２サブユニットを有するカリウムチャネルと相互作用するが、Ｋｖ１．１サブユニットを有するカリウムチャネルとは相互作用しない。ノーザンブロット法で調べた結果及びｉｎ  ｓｉｔｕデータから、９ｑタンパク質は主に心臓及び脳で発現される。脳内では、９ｑ  ｍＲＮＡは、新線条体、海馬構成体、新皮質の錐体細胞及び介在ニューロン、視床、上丘及び小脳で高度に発現される。
【００５５】
ヒト、ラット及びマウスｐ１９  ｃＤＮＡの単離も行った。ヒトｐ１９を配列番号：３１及び図１６並びに配列番号：３９及び図２０（３’配列）に示す。ラットＰ１９を配列番号：３３及び図１７に、マウスＰ１９を配列番号：３５及び図１８に示す。Ｐ１９ポリペプチドは、Ｋｖ４．３又はＫｖ４．２サブユニットを有するカリウムチャネルとは相互作用するが、Ｋｖ１．１サブユニットを有するカリウムチャネルとは相互作用しない。ノーザンブロット分析で調べた結果、Ｐ１９転写産物（ｍＲＮＡ）は主に脳内で発現される。
【００５６】
ＰＣＩＰ分子の部分ヒトパラログの同定も行った。このパラログを、ここでＷ２８５５９として言及し、配列番号：３７及び図１９に示す。
【００５７】
サルＫＣｈＩＰ４ａ及びそのスプライスバリアントＫＣｈＩＰ４ｂ、ＫＣｈＩＰ４ｃ及びＫＣｈＩＰ４ｄの同定も行った。サルＫＣｈＩＰ４ａを配列番号：４８及び図２３に示す。サルＫＣｈＩＰ４ｂを配列番号：５０及び図２４に示す。サルＫＣｈＩＰ４ｃを配列番号：６９及び図３５に示す。サルＫＣｈＩＰ４ｄを配列番号：７１及び図３６に示す。
【００５８】
全長ラット３３ｂ０７  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びラット３３ｂ０７ポリペプチドの推定アミノ酸配列を図２６並びに配列番号：５２及び５３にそれぞれ示す。ラット３３ｂ０７  ｃＤＮＡは、分子量約４４．７ｋＤ、４０７アミノ酸残基長のタンパク質をコードする。ラット３３ｂ０７は、酵母２ハイブリッドアッセイでｒＫｖ４．３Ｎ及びｒＫｖ４．２Ｎに結合するが、ｒＫｖ４．２Ｎへの結合が僅かに多い。
【００５９】
全長ヒト３３ｂ０７  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びヒト３３ｂ０７ポリペプチドの推定アミノ酸配列を、図２７並びに配列番号：５４及び５５にそれぞれ示す。
【００６０】
部分長ラット１ｐ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びラット１ｐポリペプチドの推定アミノ酸配列を、図２８並びに配列番号：５６及び５７にそれぞれ示す。ラット１ｐ  ｃＤＮＡは、分子量約２８．６ｋＤ、２６７アミノ酸残基長のタンパク質をコードする。ラット１ｐは酵母２ハイブリッドアッセイでｒＫｖ４．３Ｎ及びｒＫｖ４．２Ｎに結合するが、ｒＫｖ４．３Ｎへの結合が僅かに多い。
【００６１】
部分長ラット７ｓ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びラット７ｓポリペプチドの推定アミノ酸配列を、図２９並びに配列番号：５８及び５９にそれぞれ示す。ラット７ｓ  ｃＤＮＡは、分子量約２８．６ｋＤ、２７０アミノ酸残基長のタンパク質をコードする。ラット７ｓは酵母２ハイブリッドアッセイでｒＫｖ４．３Ｎ及びｒＫｖ４．２Ｎに結合するが、ｒＫｖ４．３Ｎへの結合が僅かに多い。
【００６２】
本発明の配列を、以下の表Ｉ及び表ＩＩに要約する。
【００６３】
表Ｉ
2004525610.tif 000002
2004525610.tif 000003
2004525610.tif 000004
2004525610.tif 000005
2004525610.tif 000006
【００６４】
表ＩＩ
2004525610.tif 000007
【００６５】
ヒト、ラット及びサルＰＣＩＰをコードするヌクレオチド配列を有するプラスミドを、２０１１０−２２０９、バージニア州マナッサス、ユニバーシティ・ブルヴァード１０８０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に、１９９８年１１月１７日に上述の登録番号にて寄託した。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に基づいて保管される。これらの寄託は、当業者の便宜を図るために行われたものであり、米国特許法第１１２条に基づいて寄託が必要であることを示すものではない。
【００６６】
ヒトｐ１９（クローンＥｐｈＰ１９）及びヒト３３ｂ０７（クローンＥｐｈ３３ｂ０７）をコードするｃＤＮＡ分子を持つクローンは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（バージニア州マナッサス）に、それぞれが特定のｃＤＮＡクローンを持つ１つの組換えプラスミドを有する２つの菌株の組合せを表す複合寄託の一部として、１９９８年７月８日に登録番号ＰＴＡ−３１６にて寄託された。（ｈＰ１９とｈ３３ｂ０７との組合せについてのＡＴＣＣ菌株表示は、ＥｐｈＰ１９ｈ３３ｂ０７ｍｉｘである）。
【００６７】
複数の菌株を区別して、特定のｃＤＮＡクローンを保有する菌株を単離するために、この組合せのアリコートを、１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンを入れたＬＢプレート上の複数の単独のコロニにストリークし、これらの単独コロニの成長後、標準的なミニプレパレーション法にてプラスミドＤＮＡを抽出してもよい。次に、このＤＮＡミニプレパレーションの試料をＮｏｔＩで消化し、その結果得られた産物を、標準的なＤＮＡ電気泳動条件下で０．８％アガロースゲル上で解析してもよい。この消化物は以下のバンドパターンを示す：ＥｐｈＰ１９：７ｋｂ  ９（単一バンド）、Ｅｐｈ３３ｂ０７：５．８ｋｂ（単一バンド）。
【００６８】
本発明の様々な局面を、以下のサブセクションに更に詳細に記載する：
【００６９】
Ｉ．単離された核酸分子
本発明の一局面は、ＰＣＩＰタンパク質又はその生物学的活性部分をコードする単離された核酸分子並びに、（例えばＰＣＩＰｍＲＮＡなどの）ＰＣＩＰをコードする核酸分子を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用可能な核酸断片及びＰＣＩＰ核酸分子を増幅又は変異させるためのＰＣＲプライマとして使用する断片に関する。ここで使用される「核酸分子」という用語は、（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡなどの）ＤＮＡ分子及び（例えばｍＲＮＡなどの）ＲＮＡ分子及びヌクレオチド類似体を使用して作製した前記ＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を包含するものとして意図されている。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、二本鎖ＤＮＡであることが望ましい。
【００７０】
「単離された」核酸分子は、天然に存在する別の核酸分子から分離された核酸分子である。好適には、「単離された」核酸分子は、その核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸を天然にフランキングする２つの配列（即ちその核酸の５’末端及び３’末端に位置する配列）を持たない。例えば、様々な実施態様において、単離されたＰＣＩＰ核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸を天然にフランキングする、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂ未満の２つのヌクレオチド配列を保有してもよい。更に、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、組換え技術を用いて作製した場合の別の細胞材料又は培地を実質的に含有しないか、或いは化学合成した場合の化学的前駆物質又はその他の化学物質を実質的に含有しなくてもよい。
【００７１】
例えば配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２のヌクレオチド配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列或いはその一部分を有する核酸分子などの本発明の核酸分子を、標準的な生物学的手法及びここに記載の配列情報を用いて単離してもよい。配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２の核酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列の全て又は一部分をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、ＰＣＩＰ核酸分子を、（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、１９８９に記載の）標準的なハイブリダイゼーション及びクローニング技術によって単離してもよい。
【００７２】
更に、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列の全て又は一部分を持つ核酸分子を、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２の配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３、９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列に基づいてデザインされた合成オリゴヌクレオチドプライマを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にて単離してもよい。
【００７３】
本発明の核酸分子を、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを鋳型及び適切なオリゴヌクレオチドプライマとして用いて、標準的なＰＣＲ増幅方法にて増幅させてもよい。このように増幅した核酸分子を、適切なベクター中にクローニングして、ＤＮＡ配列分析によってその特性を解析してもよい。更に、ＰＣＩＰヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、例えば自動化されたＤＮＡシンセサイザなどを用いた標準的な合成技術によって作製してもよい。
【００７４】
好適な一実施態様においては、本発明の単離された核酸分子が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるヌクレオチド配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列或いはこれらのヌクレオチド配列のいずれか一部分を有する。
【００７５】
別の好適な一実施態様においては、本発明の単離された核酸分子が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるヌクレオチド配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列或いはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部分と相補な核酸分子を有する。配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるヌクレオチド配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列と相補な核酸分子は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるヌクレオチド配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列とハイブリダイズして安定な二本鎖を形成できる程度に十分に、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：９で表されるヌクレオチド配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列と相補な核酸分子である。
【００７６】
更に別の好適な一実施態様においては、本発明の単離された核酸分子は、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるヌクレオチド配列の全長或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列の全長或いはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの一部分と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又はそれ以上相同なヌクレオチド配列を有する。
【００７７】
更に、本発明の核酸分子が、例えばプローブ又はプライマとして使用可能な断片或いはＰＣＩＰタンパク質の生物学的活性部分をコードする断片などの、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２の核酸配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列の一部分のみを有してもよい。ＰＣＩＰ遺伝子のクローニングによって調べたヌクレオチド配列を用いて、他のＰＣＩＰファミリーメンバー及び他の種からのＰＣＩＰ相同体の同定及び／又はクローニングに使用すべくデザインされたプローブ及びプライマを作製することが可能である。
【００７８】
プローブ／プライマは、典型的には、実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを有する。このオリゴヌクレオチドは、典型的には、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００もしくは配列番号：１０２又はＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３もしくは９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列のセンス配列或いは配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００もしくは配列番号：１０２又はＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３もしくは９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列のアンチセンス配列或いは配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００もしくは配列番号：１０２又はＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３もしくは９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列の天然に存在する対立遺伝子バリアント又はミュータントの、少なくとも約１２個又は１５個、好適には約２０個又は２５個、より好適には約３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個又は７５個の連続したヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の一領域を有する。一実施態様においては、本発明の核酸分子は、ヌクレオチド長３５０乃至４００、４００乃至４５０、４５０乃至５００、５００乃至５５０、５５０乃至６００、６００乃至６５０、６５０乃至７００、７００乃至７５０、７５０乃至８００、８００乃至８５０、８５０乃至９００、９４９、９５０乃至１０００又はそれ以上であり、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列の核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する。
【００７９】
ＰＣＩＰヌクレオチド配列に基づくプローブを、同じ又は相同なタンパク質をコードする転写産物又はゲノム配列の検出に用いてもよい。好適な複数の実施態様においては、前記プローブに、例えば放射性同位元素、蛍光性化合物、酵素又は酵素補助因子などであってもよい標識群が更に付加されていてもよい。対象からの細胞試料におけるＰＣＩＰをコードする核酸のレベルを、例えばＰＣＩＰ  ｍＲＮＡのレベルを検出するか又はゲノムＰＣＩＰ遺伝子が突然変異又は欠失しているか否かを調べることなどによって、ＰＣＩＰタンパク質を誤って発現している細胞又は組織を特定するための診断テストキットの一部として、前記のようなプローブを使用してもよい。
【００８０】
「ＰＣＩＰタンパク質の生物学的活性部分」をコードする核酸断片を、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２のヌクレオチド配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列のうちの、ＰＣＩＰ生物学的活性（ＰＣＩＰタンパク質の生物学的活性については本願中に記載されている）を有するポリペプチドをコードする一部分を単離し、前記ＰＣＩＰタンパク質の前記コードされた部分を（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換え発現などにより）発現させ、前記ＰＣＩＰタンパク質の前記コードされた部分の前記活性を評価することによって、作製してもよい。
【００８１】
本発明には、遺伝コードの縮重のために、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるヌクレオチド配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列とは異なり、従って配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるヌクレオチド配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列によってコードされるＰＣＩＰタンパク質と同じＰＣＩＰタンパク質をコードする核酸分子が更に包含される。別の一実施態様においては、本発明の単離された核酸分子が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００８２】
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるＰＣＩＰヌクレオチド配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列に加えて、ＰＣＩＰタンパク質のアミノ酸配列の変化を引き起こすＤＮＡ配列の多型が、（例えばヒト集団などの）集団中に存在してもよいことが、当業者に理解されよう。ある集団中の個体間におけるＰＣＩＰ遺伝子のそのような多型は、対立遺伝子が天然に多様であることによって存在しうる。ここで使用される「遺伝子」及び「組換え遺伝子」という用語は、好適には哺乳類のＰＣＩＰタンパク質であるＰＣＩＰタンパク質をコードする読み枠を持ち、非コード調節配列及びイントロンを更に有してもよい核酸分子を指す。
【００８３】
ヒトＰＣＩＰの対立遺伝子バリアントには、機能的ＰＣＩＰタンパク質と非機能的ＰＣＩＰタンパク質との双方が含まれる。機能的対立遺伝子バリアントは、ＰＣＩＰリガンドに結合する能力及び／又はここに記載するＰＣＩＰ活性のいずれかを調節する能力を有するヒトＰＣＩＰタンパク質の、天然に存在するアミノ酸配列バリアントである。機能的対立遺伝子バリアントは、典型的には、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９で表されるアミノ酸のうちの１つ又は複数の保存的置換或いはこのタンパク質の重要でない領域の重要でない残基の置換、欠失又は挿入のみを有する。
【００８４】
非機能的対立遺伝子バリアントは、ＰＣＩＰリガンドに結合する能力及び／又はここに記載のＰＣＩＰ活性のいずれかを調節する能力を持たないヒトＰＣＩＰタンパク質の、天然に存在するアミノ酸配列バリアントである。非機能的対立遺伝子バリアントは、典型的には、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９で表されるアミノ酸配列の非保存的置換、欠失又は挿入又は成熟前切断或いは重要な残基又は重要な領域における置換、挿入又は欠失を有する。
【００８５】
本発明は、ヒトＰＣＩＰタンパク質の非ヒトオルソログを更に提供する。ヒトＰＣＩＰタンパク質のオルソログは、非ヒト生物から単離されたタンパク質であり、ヒトＰＣＩＰタンパク質と同じＰＣＩＰリガンド結合及び／又はカリウムチャネルによって媒介される活性の調節能力を有する。ヒトＰＣＩＰタンパク質のオルソログは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９と実質的に相同なアミノ酸配列を持つことから、容易に同定可能である。
【００８６】
更に、その他のＰＣＩＰファミリーメンバーをコードし、従って、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるＰＣＩＰ配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子も、本発明の範囲に含まれるものとして意図される。例えば、別のＰＣＩＰ  ｃＤＮＡを、ヒトＰＣＩＰのヌクレオチド配列に基づいて同定してもよい。更に、異なる種からのＰＣＩＰタンパク質をコードし、従って配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるＰＣＩＰ配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子も、本発明の範囲に含まれるものとして意図される。例えば、マウスのＰＣＩＰ  ｃＤＮＡを、ヒトＰＣＩＰのヌクレオチド配列に基づき同定してもよい。
【００８７】
本発明のＰＣＩＰ  ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子バリアント及び相同体に対応する核酸分子を、ここに開示したＰＣＩＰ核酸へのこれらの相同性に基づいて、ここに開示したｃＤＮＡ又はその一部分をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での標準的なハイブリダイゼーション法にて単離してもよい。
【００８８】
従って、別の一実施態様においては、本発明の単離された核酸分子は、ヌクレオチド長が少なくとも１５、２０、２５、３０又はそれ以上であり、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるヌクレオチド配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズする。別の実施態様においては、前記核酸のヌクレオチド長は、少なくとも３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３０７、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９４９又は９５０である。ここで使用される「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズした状態を典型的に維持するハイブリダイゼーション及び洗浄条件を表すものとして意図されている。好適には、前記条件は、互いに少なくとも約７０％、より好適には約８０％、更に好適には約８５％又は９０％相同なヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズした状態を典型的に維持する条件である。
【００８９】
そのようなストリンジェントな条件は、当業者に周知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ他編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社（１９９５）セクション２、４及び６に記載されている。更なるストリンジェントな条件が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、（１９８９）第７、９及び１１章に記載されている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好適な非限定的な一例には、塩化ナトリウム又はクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）４倍液中で約６５乃至７０℃でハイブリダイズ（又はＳＳＣ４倍液プラス５０％ホルムアミド中で約４２乃至５０℃でハイブリダイズ）した後に、ＳＳＣ１倍液中で約６５乃至７０℃で１回又は複数回洗浄することが含まれる。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好適な非限定的な一例には、ＳＳＣ１倍液中で約６５乃至７０℃でハイブリダイズ（又はＳＳＣ１倍液プラス５０％ホルムアミド中で約４２乃至５０℃でハイブリダイズ）した後に、ＳＳＣ０．３倍液中で約６５乃至７０℃で１回又は複数回洗浄することが含まれる。軽度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好適な非限定的な一例には、ＳＳＣ４倍液中で約５０乃至６０℃でハイブリダイズ（又はＳＳＣ６倍液プラス５０％ホルムアミド中で約４０乃至４５℃でハイブリダイズ）した後に、ＳＳＣ２倍液中で約５０乃至６０℃で１回又は複数回洗浄することが含まれる。例えば６５乃至７０℃又は４２乃至５０℃などの上述の複数の値の間の範囲も本発明に包含されるものとして意図されている。ハイブリダイゼーション及び洗浄緩衝液で、ＳＳＰＥ（ＳＳＰＥ１倍液は、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４及び１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）の代わりにＳＳＣ（ＳＳＣ１倍液は、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸ナトリウムである）を用いてもよい；ハイブリダイゼーション完了毎に、洗浄を１５分間行う。ハイブリッドが５０塩基対よりも短いと予想される場合のハイブリダイゼーション温度は、このハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５乃至１０℃低い温度であるべきだが、ここでＴｍは以下の式によって決定される。１８塩基対よりも短いハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基数）。１８乃至４９塩基対のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）、式中、Ｎはこのハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（ＳＳＣ１倍液の［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。（例えばＢＳＡ或いはサケ又はニシン精子の担体ＤＮＡなどの）阻害物質、（例えばＳＤＳなどの）界面活性剤、（例えばＥＤＴＡなどの）キレート化剤、フィコール、ＰＶＰなどが含まれるがこれらに限定されることはない更なる試薬をハイブリダイゼーション及び／又は洗浄緩衝液に加えて、核酸分子の例えばニトロ��ルロース又はナイロン製の膜などの膜との非特異的なハイブリダイゼーションを減少させてもよいことも、当業者に理解されよう。とりわけ、ナイロン製の膜を使用する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の更なる好適な非限定的な一例においては、ＳＤＳを７％含有する０．２５−０．５ＭのＮａＨ２ＰＯ４中で約６５℃でハイブリダイゼーションを行った後に、ＳＤＳを１％含有する０．０２ＭのＮａＨ２ＰＯ４中で６５℃で（例えばＣｈｕｒｃｈ及びＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１９９１−１９９５を参照のこと）、又はＳＤＳを１％含有するＳＳＣ０．２倍液中で、１回又は複数回の洗浄を行う。
【００９０】
好適には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号：１の配列とハイブリダイズする本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応している。ここで使用される「天然に存在する」核酸分子は、（例えば天然のタンパク質をコードするなどの）天然に存在するヌクレオチド配列を有するＲＮＡ又はＤＮＡ分子を指す。
【００９１】
前記集団中に存在しうるＰＣＩＰ配列の天然に存在する対立遺伝子バリアントに加えて、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるヌクレオチド配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列が突然変異によって変化し、この結果、前記コードされたＰＣＩＰタンパク質の機能的能力の変化を伴わずに前記ＰＣＩＰタンパク質のアミノ酸配列が変化しうることが、当業者に更に理解されよう。例えば、「必須ではない」アミノ酸残基におけるアミノ酸の置換を引き起こすヌクレオチドの置換が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表される配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列中で起こってもよい。「必須ではない」アミノ酸残基は、「必須な」アミノ酸残基が生物学的活性に必要であるのに対して、（例えば配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９で表される配列などの）ＰＣＩＰの野生型配列から、生物学的活性の変化を伴わずに変化しうる残基である。例えば、本発明の複数のＰＣＩＰタンパク質に共通に保存されているアミノ酸残基は、特に変化しにくいと予想される。更に、本発明の複数のＰＣＩＰタンパク質と、ＰＣＩＰファミリータンパク質のその他のメンバーに共通に保存されているアミノ酸残基も、変化を受けにくいと考えられる。
【００９２】
従って、本発明の別の一局面は、活性に必須ではないアミノ酸残基が変化したＰＣＩＰタンパク質をコードする核酸分子に関する。そのようなタンパク質は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９とはアミノ酸配列が異なるが、生物学的活性を維持している。一実施態様においては、前記単離された核酸分子は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９と少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００９３】
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９で表されるタンパク質と相同なＰＣＩＰタンパク質をコードする単離された核酸分子を、１つ又は複数のアミノ酸の置換、付加又は欠失が前記コードされたタンパク質に導入されるような具合に、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるヌクレオチド配列或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列中に１つ又は複数のヌクレオチドの置換、付加又は欠失を導入することで作製してもよい。突然変異を、配列番号：１、配列番号：３  配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１０���又は配列番号：１０２或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列中に、部位特異的変異導入法及びＰＣＲを利用した変異導入法などの標準的な技術を用いて導入してもよい。好適には、アミノ酸配列の保存的置換が、１つ又は複数の予測された必須ではないアミノ酸残基で起こる。「アミノ酸の保存的置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基と置換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基の複数のファミリーが、当業で明らかにされている。これらのファミリーには、（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジンなどの）塩基性側鎖、（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸などの）酸性側鎖、（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システインなどの）非荷電極性側鎖、（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンなどの）非極性側鎖、（例えばトレオニン、バリン、イソロイシンなどの）β−分枝側鎖及び（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなどの）芳香族側鎖を有するアミノ酸が含まれる。従って、ＰＣＩＰタンパク質中の予想される必須ではないアミノ酸残基は、好適には、同じ側鎖ファミリーからの別の一アミノ酸残基と置換される。又は、別の一実施態様においては、ＰＣＩＰコード配列の全て又は一部分にわたって、例えば飽和突然変異誘発などによって突然変異をランダムに導入し、その結果得られたミュータントをＰＣＩＰ生物学的活性についてスクリーニングして、活性を保持しているミュータントを特定してもよい。配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列の突然変異誘発を行った後に、前記コードされたタンパ��質を組換え発現させて、前記タンパク質の活性を調べてもよい。
【００９４】
好適な一実施態様においては、ミュータントＰＣＩＰタンパク質が、（１）カリウムチャネルタンパク質又はその一部分と（例えば結合するなどの）相互作用を行う能力；（２）カリウムチャネルタンパク質又はその一部分のリン酸化状態を調節する能力；（３）カルシウムと（例えば結合するなど）結びつき、例えばカルシウムチャネルをカルシウム依存的にリン酸化するなど、カルシウム依存性キナーゼとして作用する能力；（４）カルシウムと（例えば結合するなど）結びつき、例えばカルシウム依存性転写因子として作用する能力；（５）（例えば神経細胞又は心細胞などの）細胞内の、カリウムチャネルが媒介する活性を調節し、例えば前記細胞に有益な影響を与える能力；（６）神経伝達物質の放出を調節する能力；（７）膜興奮性を調節する能力；（８）膜の静止電位に影響を与える能力；（９）活動電位の波形及び周波数を調節する能力；及び（１０）興奮現象のしきい値を調節する能力を分析するアッセイを行ってもよい。
【００９５】
本発明の別の一局面は、ＰＣＩＰタンパク質をコードする上述の核酸分子に加えて、これらのアンチセンスである単離された核酸分子に関する。「アンチセンス」核酸分子は、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子と相補であるか又はｍＲＮＡ配列と相補であるなどの、タンパク質をコードする「センス」核酸と相補的なヌクレオチド配列を有する。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸に水素結合可能である。前記アンチセンス核酸は、ＰＣＩＰコード鎖全体と相補的であってもよいし、又は、その一部分のみと相補的であってもよい。一実施態様においては、アンチセンス核酸分子は、ＰＣＩＰをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」とアンチセンスである。「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを有するヌクレオチド配列領域を指す。別の一実施態様においては、前記アンチセンス核酸分子は、ＰＣＩＰをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」とアンチセンスである。「非コード領域」という用語は、コード領域をフランキングする、アミノ酸に翻訳されない５’側配列及び３’側配列を指す（５’側非翻訳領域及び３’側非翻訳領域とも呼ぶ）。
【００９６】
ここに開示するＰＣＩＰをコードするコード鎖配列の場合、本発明のアンチセンス核酸を、ワトソン−クリック型塩基対合の法則に基づいてデザインしてもよい。このアンチセンス核酸分子は、ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡのコード領域全体と相補的であってもよいが、より好適には、ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡのコード領域又は非コード領域の一部分のみとアンチセンスなオリゴヌクレオチドである。例えば、前記アンチセンスなオリゴヌクレオチドが、ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡの翻訳開始部位の周囲の領域と相補的であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドのヌクレオチド長が、例えばおよそ５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０であってもよい。本発明のアンチセンス核酸を、化学合成反応及び酵素ライゲーション反応によって、当業で公知の方法で作製してもよい。例えば、（アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの）アンチセンス核酸を、天然に存在するヌクレオチド或いは前記分子の生物学的安定性を高めるべくデザインされた、又は前記アンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成された二本鎖の物理的安定性を高めるべくデザインされた、例えばホスホチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドなどの様々に変化したヌクレオチドを用いて化学合成してもよい。前記アンチセンス核酸の生成に使用可能な変化したヌクレオチドの例には、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルキュェオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンが含まれる。又は、前記アンチセンス核酸を、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされた発現ベクターを用いて生物学的に作製してもよい（即ち、前記挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向となる。詳細については以下のサブセクションにて説明する）。
【００９７】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、ＰＣＩＰタンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡとハイブリダイズするか又は結合して、前記タンパク質の発現を、例えば転写及び／又は翻訳を阻害することなどにより阻害するように、対象に投与されるか、又はｉｎ  ｓｉｔｕで作製される。前記ハイブリダイゼーションを、安定な二本鎖を形成する通常のヌクレオチドの相補性を利用して行ってもよいし、又は、ＤＮＡ二本鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合には、二重らせんの主溝における特異的な相互作用を利用して行ってもよい。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位への直接の注射が含まれる。又は、アンチセンス核酸分子を、選択された細胞を標的とすべく変化させた後に、全身投与してもよい。例えば、全身投与の場合、アンチセンス分子を、例えば細胞表面受容体又は抗原に結合するペプチド又は抗体に前記アンチセンス核酸分子を結合させるなどの方法で、選択された細胞の表面に発現されている受容体又は抗原に特異的に結合するような具合に変化させてもよい。アンチセンス核酸分子を、ここに記載のベクターを用いて細胞に送達させてもよい。前記アンチセンス分子の細胞内濃度を十分とするためには、前記アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌＩＩ又はｐｏｌＩＩＩプロモータによって制御されるベクターコンストラクトを用いることが望ましい。
【００９８】
更に別の一実施態様においては、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補なＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成するが、これらの鎖は、通常のβ−ユニットとは異なり、互いに平行に延伸する  （Ｇａｕｌｔｉｅｒ他（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。前記アンチセンス核酸分子が、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅ他（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅ他（１９８７）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）を有してもよい。
【００９９】
更に別の一実施態様においては、本発明のアンチセンス核酸分子は、リボザイムである。リボザイムは、それと相補な領域を有する、例えばｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を開裂させることの可能な、リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子である。従って、（例えばハンマーヘッドリボザイム（Ｈａｓｅｌｈｏｆｆ及びＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３４：５８５−５９１に記載）などの）リボザイムを用いて、ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ転写産物を触媒作用によって開裂させることにより、ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡの翻訳を阻害してもよい。ＰＣＩＰをコードする核酸への特異性を有するリボザイムを、ここに記載のＰＣＩＰ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（即ち、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２或いはＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサートのヌクレオチド配列）に基づいてデザインしてもよい。例えば、活性部位のヌクレオチド配列が、ＰＣＩＰをコードするｍＲＮＡの前記開裂されるヌクレオチド配列と相補な、テトラヒメナのＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡの誘導体を構成してもよい。例えばＣｅｃｈ他による米国特許第４，９８７，０７１号；及びＣｅｃｈ他による米国特許第５，１１６，７４２号を参照のこと。又は、ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡを用いて、特定のリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを、ＲＮＡ分子プールから選択してもよい。例えば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．及びＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１４１１−１４１８を参照のこと。
【０１００】
又は、ＰＣＩＰ遺伝子の発現を、前記ＰＣＩＰの調節領域と相補的な（例えばＰＣＩＰプロモータ及び／又はエンハンサなどの）ヌクレオチド配列を標的として、標的細胞における前記ＰＣＩＰ遺伝子の転写を妨げる三重らせん構造を形成することで阻害してもよい。概略は、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．６（６）：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．他（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；及びＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏａｓｓａｙｓ１４（１２）：８０７−１５を参照のこと。
【０１０１】
更に別の一実施態様においては、本発明のＰＣＩＰ核酸分子の塩基成分、糖成分又はリン酸バックボーンを変化させて、前記分子の例えば安定性、ハイブリダイゼーション又は溶解度を向上させてもよい。例えば、前記核酸分子のデオキシリボースリン酸バックボーンを変化させて、ペプチド核酸を生成させてもよい（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．他（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４（１）：５−２３を参照のこと）。ここで使用される「ペプチド核酸」又は「ＰＮＡ」という用語は、デオキシリボースリン酸バックボーンが擬似ペプチドバックボーンと置き換えられ、４つの天然の核酸塩基のみが残された、例えば擬似ＤＮＡなどの擬似核酸を指す。ＰＮＡはバックボーンが中性であるため、低いイオン強度条件下でＤＮＡ及びＲＮＡと特異的にハイブリダイズすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成を、Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．他（１９９６）同上；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ他  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１４６７０−６７５に記載の標準的な固相ペプチド合成プロトコルを用いて行ってもよい。
【０１０２】
ＰＣＩＰ核酸分子のＰＮＡを、治療及び診断に用いてもよい。例えば、ＰＮＡを、転写又は翻訳を停止させること或いは複製を阻害することなどによる遺伝子発現の配列特異的調節のためのアンチセンス又はアンチジーン物質として使用してもよい。ＰＣＩＰ核酸分子のＰＮＡを、（例えばＰＮＡを利用したＰＣＲクランピングなどの）遺伝子中の一塩基対突然変異の分析において、（例えばＳ１ヌクレアーゼ（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．（１９９６）同上）などの）他の酵素と組み合わせて使用した場合の人工的な制限酵素として；或いはＤＮＡ塩基配列決定又はハイブリダイゼーションのプローブ又はプライマ（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．他（１９９６）同上；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅ  同上）として使用してもよい。
【０１０３】
別の一実施態様においては、ＰＣＩＰのＰＮＡを、（例えばその安定性又は細胞内への取り込みを促進させるべく）親油基又はその他の補助的な基をＰＮＡに結合させることにより、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを形成することにより、或いはリポゾーム又はその他の当業で公知の薬剤送達技術を用いることにより、変化させてもよい。例えば、ＰＮＡ及びＤＮＡの利点を併せ持つ、ＰＣＩＰ核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラを作製してもよい。そのようなキメラでは、（例えばリボヌクレアーゼＨ及びＤＮＡポリメラーゼなどの）ＤＮＡ認識酵素が前記ＤＮＡ部分と相互作用可能である一方で、前記ＰＮＡ部分が高い結合親和性及び特異性を付与する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合の数及び配向に基づいて選択された適切な長さのリンカを用いて連結させてもよい（Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．（１９９６）同上）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成を、Ｈｙｒｕｐ  Ｂ．（１９９６）同上及びＦｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．他（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７−６３に記載の方法で行ってもよい。例えば、ＤＮＡ鎖を、標準的なホスホロアミダイト化学合成法を用いて固相合成してもよく、例えば５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホロアミダイトなどの変化したヌクレオシド類似体を、ＰＮＡと、ＤＮＡ５’末端との間に使用してもよい（Ｍａｇ，Ｍ．他（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８）。次に、複数のＰＮＡ単量体を順次結合させて、５’ＰＮＡセグメント及び３’ＤＮＡセグメントを有する一キメラ分子を作製する（Ｆｉｎｎ  Ｐ．Ｊ．他（１９９６）同上）。又は、５’ＤＮＡセグメント及び３’ＰＮＡセグメントを有する複数のキメラ分子を合成してもよい（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ，Ｋ．Ｈ．他（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１１２４）。
【０１０４】
別の複数の実施態様においては、前記オリゴヌクレオチドに、（例えば宿主細胞受容体をｉｎ  ｖｉｖｏで標的とするための）ペプチドなどの別の基が付加されていてもよいし、或いは細胞膜を介した輸送（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒ他（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅ他（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公報Ｎｏ．Ｗ０８８／０９８１０を参照のこと）又は血液脳関門を介した輸送（例えばＰＣＴ公報Ｎｏ．Ｗ０８９／１０１３４を参照のこと）を容易にするための物質が付加されていてもよい。更に、オリゴヌクレオチドを、ハイブリダイゼーションによって誘発される開裂物質（例えばＫｒｏｌ他（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６を参照のこと）又は介在物質（例えばＺｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９を参照のこと）を用いて変化させてもよい。このために、前記オリゴヌクレオチドが、（例えばペプチド、ハイブリダイゼーションによって誘発される交差結合物質、輸送物質又はハイブリダイゼーションによって誘発される開裂物質などの）別の一分子と結合可能であってもよい。
【０１０５】
ＩＩ．単離されたＰＣＩＰタンパク質及び抗ＰＣＩＰ抗体
本発明の一局面は、抗ＰＣＩＰ抗体を産生させるための免疫原としての使用に好適な、単離されたＰＣＩＰタンパク質、その生物学的活性部分及びポリペプチド断片に関する。一実施態様においては、天然のＰＣＩＰタンパク質を、標準的なタンパク質精製技術を用いた適切な精製方式によって、細胞又は組織から単離してもよい。別の一実施態様においては、ＰＣＩＰタンパク質を、組換えＤＮＡ技術によって作製する。組換え発現の代わりに、ＰＣＩＰタンパク質又はポリペプチドを、標準的なペプチド合成技術を用いて化学合成してもよい。
【０１０６】
「単離された」又は「精製された」タンパク質又はその生物学的活性部分は、前記ＰＣＩＰタンパク質が由来する細胞又は組織からの細胞材料又はその他の夾雑タンパク質を実質的に含有しないか、或いは化学合成を行った場合の化学的前駆物質又はその他の化学物質を実質的に含有しない。「細胞材料を実質的に含有しない」という用語には、ＰＣＩＰタンパク質調製品のタンパク質が、その単離又は組換えによる作製元である細胞の細胞成分から分離されていることが包含される。一実施態様においては、「細胞材料を実質的に含有しない」という用語には、ＰＣＩＰタンパク質調製品が（乾燥重量で）約３０％未満の非ＰＣＩＰタンパク質（ここでは「夾雑タンパク質とも呼ぶ」）、より好適には約２０％未満の非ＰＣＩＰタンパク質、更に好適には約１０％未満の非ＰＣＩＰタンパク質、最も好適には約５％未満の非ＰＣＩＰタンパク質を含有することが包含される。ＰＣＩＰタンパク質又はその生物学的活性部分を組換えによって作製する場合にも、前記ＰＣＩＰタンパク質が培地を実質的に含有しないことが望ましく、即ち、前記タンパク質調製品の体積中、培地が約２０％未満、より好適には約１０％未満、最も好適には約５％未満であることが望ましい。
【０１０７】
「化学的前駆物質又はその他の化学物質を実質的に含有しない」という用語には、ＰＣＩＰタンパク質調製品のタンパク質が、前記タンパク質の合成に関与する化学的前駆物質又はその他の化学物質から分離されていることが包含される。一実施態様においては、「化学的前駆物質又はその他の化学物質を実質的に含有しない」という用語には、ＰＣＩＰタンパク質調製品が（乾燥重量で）約３０％未満の化学的前駆物質又は非ＰＣＩＰ化学物質、より好適には約２０％未満の化学的前駆物質非ＰＣＩＰ化学物質、更に好適には約１０％未満の化学的前駆物質又は非ＰＣＩＰ化学物質、最も好適には約５％未満の化学的前駆物質又は非ＰＣＩＰ化学物質を含有することが包含される。
【０１０８】
ここで使用されるＰＣＩＰタンパク質の「生物学的活性部分」という用語には、ＰＣＩＰ分子と非ＰＣＩＰ分子との間の相互作用に関与するＰＣＩＰタンパク質の断片が含まれる。ＰＣＩＰタンパク質の生物学的活性部分には、例えば配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９で表されるアミノ酸配列などの、前記ＰＣＩＰタンパク質のアミノ酸配列と十分に相同な、又はこれから誘導されたアミノ酸配列を有するペプチドが包含されるが、これらのペプチドは、全長ＰＣＩＰタンパク質よりも少ないアミノ酸を持ち、ＰＣＩＰタンパク質の少なくとも１つの活性を発揮する。典型的には、生物学的活性部分は、例えばカリウムチャネルサブユニットの結合などの、ＰＣＩＰタンパク質の少なくとも一活性を有するドメイン又はモチーフを有する。ＰＣＩＰタンパク質の生物学的活性部分は、アミノ酸長が例えば１０、２５、５０、１００、２００又はそれ以上のポリペプチドであってもよい。ＰＣＩＰタンパク質の生物学的活性部分を、カリウムチャネルが媒介する活性を調節する物質を開発するための標的として使用してもよい。
【０１０９】
一実施態様においては、ＰＣＩＰタンパク質の生物学的活性部分は、少なくとも１つのカルシウム結合ドメインを有する。
【０１１０】
本発明の好適なＰＣＩＰタンパク質の生物学的活性部分が上述の構造ドメインの少なくとも１つを有してもよいことが理解されるべきである。ＰＣＩＰタンパク質のより好適な生物学的活性部分は、上述の構造ドメインのうちの少なくとも２つを有してもよい。更に、前記タンパク質のその他の領域が欠失したその他の生物学的活性部分を、組換え技術によって作製し、天然のＰＣＩＰタンパク質の機能活性の１つ又は複数について評価してもよい。
【０１１１】
好適な一実施態様においては、ＰＣＩＰタンパク質は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９で表されるアミノ酸配列を有する。別の複数の実施態様においては、前記ＰＣＩＰタンパク質は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９と実質的に相同であり、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９のタンパク質の機能活性を保持しているが、上述のサブセクションＩで詳細に述べたような、天然の対立遺伝子変異又は変異導入法によってアミノ酸配列が異なる。従って、別の一実施態様においては、前記ＰＣＩＰタンパク質は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９と少なくともおよそ５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又はそれ以上相同なアミノ酸配列を有するタンパク質である。
【０１１２】
好適には１ｖ、９ｑ、ｐ１９、Ｗ２８５５９、ＫＣｈＩＰ４ａ、ＫＣｈＩＰ４ｂ、３３ｂ０７、１ｐ又は７ｓタンパク質である本発明の単離されたタンパク質は、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９で表されるアミノ酸配列と十分に相同なアミノ酸配列を有するか、或いは配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２と十分に相同なヌクレオチド配列によってコードされる。ここで使用される「十分に相同な」という用語は、第１のアミノ酸又はヌクレオチド配列が、第２のアミノ酸又はヌクレオチド配列に対して、十分な数の又は最小数の（例えば類似の側鎖を有するアミノ酸残基などの）アミノ酸残基又はヌクレオチドを持つことにより、前記第１及び第２のアミノ酸又はヌクレオチド配列が共通の構造ドメインもしくはモチーフ及び／又は共通の機能活性を有することを指す。例えば、共通の構造ドメインのアミノ酸配列が少なくとも３０％、４０％又は５０％、好適には６０％、より好適には７０乃至８０％、更に好適には９０乃至９５％相同であり、かつ構造ドメイン又はモチーフを少なくとも１つ、好適には２つ持つ複数のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列は、ここで十分に相同であるとして定義される。更に、少なくとも３０％、４０％又は５０％、好適には６０％、より好適には７０乃至８０％又は９０乃至９５％相同であり、かつ共通の機能活性を有する複数のアミノ酸配列又はヌクレオチド配列は、ここで十分に相同であるとして定義される。
【０１１３】
好適なタンパク質は、少なくとも１つのカルシウム結合ドメインと、好適にはＰＣＩＰ活性とを有するＰＣＩＰタンパク質である。その他の好適なタンパク質は、少なくとも１つのカルシウム結合ドメインを有し、かつストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるヌクレオチド配列を有する核酸分子とハイブリダイズするヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされるＰＣＩＰタンパク質である。
【０１１４】
２つのアミノ酸配列間の又は２つの核酸配列間の同一性パーセントを調べるために、これらの配列の最適な比較のためのアライメントを行う（例えば第１及び第２のアミノ酸配列又は核酸配列の一方又は双方にギャップを導入し、非相同な配列を比較の対象から外してもよい）。好適な一実施態様においては、比較のためにアライメントされる基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、好適には少なくとも４０％、より好適には少なくとも５０％、更に好適には少なくとも６０％、更により好適には少なくとも７０％、８０％又は９０％である（例えば、第２の配列と、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９  で表される、アミノ酸残基１７７個を有するＰＣＩＰアミノ酸配列とのアライメントを行う場合、少なくとも８０個、好適には少なくとも１００個、より好適には少なくとも１２０個、更に好適には少なくとも１４０個、更により好適には１５０個、１６０個又は１７０個のアミノ酸残基がアライメントされる）。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められている場合、その位置における分子は同一である（ここで使用されるアミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」と同義である）。これら２つの配列間の同一性パーセントは、これら２つの配列の最適なアライメントのために導入する必要のあるギャップの数及び各ギャップの長さを考慮に入れた、これら２つの配列が共通に持つ同一な位置の数の関数である。
【０１１５】
数学的アルゴリズムを用いて配列を比較し、２つの配列間の同一性パーセントを求めてもよい。好適な一実施態様においては、２つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈのアルゴリスム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））を利用して求める。このアルゴリズムは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて入手可能）のＧＡＰプログラム中に組み込まれており、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスを使用し、ギャップ重みは１６、１４、１２、１０、８、６又は４、ギャップ長重みは１、２、３、４、５又は６である。更に別の好適な一実施態様においては、２つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントを、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて入手可能）のＧＡＰプログラムを用いて、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用して、ギャップ重み４０、５０、６０、７０又は８０、ギャップ長重み１、２、３、４、５又は６で求めてもよい。別の一実施態様においては、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性パーセントを、Ｅ．Ｍｅｙｅｒｓ及びＷ．Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））を利用して求める。このアルゴリズムは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０又は２．０Ｕ）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０重み残基テーブルを利用し、ギャップ長ペナルティが１２、ギャップペナルティが４である。
【０１１６】
本発明の核酸及びタンパク質配列を、「照会配列」として使用して、公共のデータベースの検索を行い、例えば他のファミリーメンバー又は関連する配列を同定することも可能である。そのような検索を、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行ってもよい。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝１００、ワード長＝１２で行って、本発明のＰＣＩＰ核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得てもよい。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝５０、ワード長＝３で行って、本発明のＰＣＩＰタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得てもよい。Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載の方法でＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用して、比較のためのギャップ付きアライメントを行ってもよい。ＢＬＡＳＴプログラム及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴなどの）各プログラムのデフォルトパラメータを用いてもよい。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【０１１７】
本発明は、ＰＣＩＰキメラ又は融合タンパク質も提供する。ここで使用されるＰＣＩＰ「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、非ＰＣＩＰポリペプチドに作動的に連結したＰＣＩＰポリペプチドを有する。「ＰＣＩＰポリペプチド」は、ＰＣＩＰに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、一方、「非ＰＣＩＰポリペプチド」は、例えば、同じ生物に由来するか又は異なる生物に由来する、ＰＣＩＰタンパク質とは異なるタンパク質などの、ＰＣＩＰタンパク質と実質的に相同ではないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。ＰＣＩＰ融合タンパク質においては、ＰＣＩＰポリペプチドは、ＰＣＩＰタンパク質の全て又は一部分に対応しうる。好適な一実施態様においては、ＰＣＩＰ融合タンパク質は、ＰＣＩＰタンパク質の少なくとも１つの生物学的活性部分を有する。別の好適な一実施態様においては、ＰＣＩＰ融合タンパク質は、ＰＣＩＰタンパク質の少なくとも２つの生物学的活性部分を有する。融合タンパク質においては、「作動的に連結した」という用語は、ＰＣＩＰポリペプチドと非ＰＣＩＰポリペプチドとがインフレームで互いに融合していることを示すことを意図されている。非ＰＣＩＰポリペプチドは、前記ＰＣＩＰポリペプチドのＮ末端に融合してもＣ末端に融合してもよい。
【０１１８】
例えば、一実施態様においては、前記融合タンパク質は、ＰＣＩＰ配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合した、ＧＳＴ−ＰＣＩＰ融合タンパク質である。そのような融合タンパク質によって、組換え型ＰＣＩＰの精製が容易となる。
【０１１９】
別の一実施態様においては、前記融合タンパク質は、Ｎ末端に非相同なシグナル配列を有するＰＣＩＰタンパク質である。（例えば哺乳類宿主細胞などの）幾つかの宿主細胞においては、ＰＣＩＰの発現及び／又は分泌を、非相同なシグナル配列を用いて増加させてもよい。
【０１２０】
本発明のＰＣＩＰ融合タンパク質を、薬学的組成物中に組み込んで、ｉｎ  ｖｉｖｏで対象に投与してもよい。前記ＰＣＩＰ融合タンパク質を、ＰＣＩＰ基質の生物学的利用能に影響を与えるべく使用してもよい。本発明のＰＣＩＰ融合タンパク質は、例えばアルツハイマー病、アルツハイマー病に伴う（ピック病などの）痴呆、パーキンソン病及びその他のレーヴィ体びまん性疾患、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、てんかん、脊髄小脳失調及びヤコブ−クロイツフェルト病などの神経変性障害；例えばうつ病、分裂病性障害、コルサコフ精神病、躁病、不安障害又は恐怖症などの精神障害；例えば健忘症又は加齢に伴う記憶喪失などの学習又は記憶障害；及び例えば偏頭痛などの神経障害などの中枢神経系などのカリウムチャネル関連障害の治療に有用であろう。ＰＣＩＰ融合タンパク質はまた、動脈硬化、虚血性再潅流損傷、再狭窄、動脈炎症、血管壁の肥厚、心室肥厚、心室高頻度ペーシング、冠状動脈微小塞栓症、頻脈、徐脈、圧負荷、大動脈屈曲、冠状動脈結紮、血管性心疾患、心房細動又はうっ血性心不全などの心臓血管障害などのカリウムチャネル関連障害の治療にも有用であろう。
【０１２１】
更に、本発明のＰＣＩＰ融合タンパク質を、対象中で抗ＰＣＩＰ抗体を産生させるための免疫原として使用してもよいし、ＰＣＩＰリガンドの精製に用いてもよいし、またスクリーニングアッセイにおいて、ＰＣＩＰとＰＣＩＰ基質との相互作用を阻害する分子を同定するために使用してもよい。
【０１２２】
好適には、本発明のＰＣＩＰキメラタンパク質又は融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードする複数のＤＮＡ断片を、例えば平滑末端又は付着末端を用いたライゲーション、制限酵素の消化による適切な末端の形成、適切なアルカリホスファターゼ処理で付着末端を埋めることによる不必要な結合の防止及び酵素を利用したライゲーションなどの従来の技術でインフレームで互いに連結させてもよい。別の一実施態様においては、前記融合遺伝子を、ＤＮＡ自動合成装置を含めた従来の技術によって合成してもよい。又は、２つの連続する遺伝子断片間の相補な突出を増加させるアンカープライマを用いて遺伝子断片のＰＣＲ増幅を行った後に、これらをアニーリングして再増幅させ、キメラ遺伝子配列を作製してもよい（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙＡｕｓｕｂｅｌ他編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：１９９２を参照のこと）。更に、（例えばＧＳＴポリペプチドなどの）融合成分を既にコードしている多くの発現ベクターが市販されている。ＰＣＩＰをコードする核酸をそのような発現ベクター中にクローニングして、前記融合成分をインフレームで前記ＰＣＩＰタンパク質に結合させてもよい。
【０１２３】
本発明は、ＰＣＩＰアゴニスト（ミメティック）又はＰＣＩＰアンタゴニストのいずれかとして機能するＰＣＩＰタンパク質のバリアントに関する。ＰＣＩＰタンパク質のバリアントを、例えばＰＣＩＰタンパク質の不連続な点変異又は切断などの変異導入法によって作製してもよい。ＰＣＩＰタンパク質のアゴニストは、天然に存在するＰＣＩＰタンパク質の生物学的活性と同じ生物学的活性を有するか又はその部分集合を有してもよい。ＰＣＩＰタンパク質のアンタゴニストは、天然に存在するＰＣＩＰタンパク質の生物学的活性の１つ又は複数を、例えばＰＣＩＰタンパク質のカリウムチャネルが媒介する活性を競合的に調節することで阻害してもよい。従って、限定された機能を持つバリアントで治療することで、特定の生物学的作用を引き出すことが可能である。一実施態様においては、天然に存在する前記タンパク質の生物学的活性の部分集合を持つバリアントで対象を治療すると、天然に存在する前記ＰＣＩＰタンパク質で対象を治療した場合と比較して副作用が少ない。
【０１２４】
一実施態様においては、ＰＣＩＰアゴニスト（ミメティック）又はＰＣＩＰアンタゴニストのいずれかとして機能するＰＣＩＰタンパク質のバリアントを、ＰＣＩＰタンパク質の例えば切断ミュータントなどのミュータントのコンビナトリアルライブラリを、ＰＣＩＰタンパク質アゴニスト又はアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることによって、同定してもよい。一実施態様においては、ＰＣＩＰバリアントの混合（原語ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）ライブラリを核酸レベルのコンビナトリアル変異導入法によって作製し、混合（原語ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）遺伝子ライブラリでコードする。ＰＣＩＰバリアントの混合（原語ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）ライブラリを、例えば複数の推定されるＰＣＩＰタンパク質配列を変性させた一集合が、個々のプリペプチドとして、又は前記複数のＰＣＩＰ配列を持つ（例えばファージディスプレイ用の）より大きな複数の融合タンパク質からなる一集合として発現可能であるような具合に、複数の合成オリゴヌクレオチドの混合物を複数の遺伝子配列中に酵素によってライゲーションすることで作製してもよい。潜在的ＰＣＩＰバリアントのライブラリを変性オリゴヌクレオチド配列から作製する様々な方法がある。変性遺伝子配列をＤＮＡ自動合成装置で化学合成して、合成した遺伝子を適切な発現ベクター中にライゲーションしてもよい。変性遺伝子の集合を用いることで、複数の潜在的ＰＣＩＰ配列からなる前記所望の集合をコードする配列の全てを一混合物中に提供することが可能である。変性オリゴヌクレオチドの合成方法は当業で周知である（例えばＮａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａ他（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａ他（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６；Ｉｋｅ他（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照のこと）。
【０１２５】
加えて、ＰＣＩＰタンパク質をコードする配列の複数の断片からなるライブラリを用いて、ＰＣＩＰタンパク質のバリアントのスクリーニング及び選択のための複数のＰＣＩＰ断片からなる混合（原語ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）ライブラリを作製してもよい。一実施態様においては、ＰＣＩＰコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、ニッキングが分子毎におよそ１回しか起こらない条件下でヌクレアーゼで処理し、前記二本鎖ＤＮＡを変性させ、前記ＤＮＡを復元させて、別々のニッキング産物からのセンス／アンチセンス対が含まれてもよい二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼ処理により復元した二本鎖から一本鎖部分を除去し、得られた断片ライブラリを発現ベクター中にライゲーションすることにより、複数のコード配列断片からなるライブラリを作製してもよい。この方法で、ＰＣＩＰタンパク質の様々なサイズのＮ末端、Ｃ末端及び内部断片をコードする発現ライブラリを作製することができる。
【０１２６】
点変異又は切断によって作製された遺伝子産物のコンビナトリアルライブラリ及びｃＤＮＡライブラリを、選択された特性を有する遺伝子産物についてスクリーニングするための幾つかの方法が、当業で知られている。そのような技術を、ＰＣＩＰタンパク質のコンビナトリアル変異導入法によって作製した遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングに応用可能である。ハイスループットの分析に使用可能な、最も広範に用いられている大規模遺伝子ライブラリのスクリーニング技術には、典型的には、複製可能な発現ベクター中に前記遺伝子ライブラリをクローニングすることと、得られたベクターのライブラリで適切な細胞を形質転換させることと、ある所望の活性の検出によって、その産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易になるような条件下で前記コンビナトリアル遺伝子を発現させることと、が含まれる。リカーシブアンサンブル（原語：ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ）変異導入法（ＲＥＭ）は、前記ライブラリ中の機能ミュータントの頻度を増加させる新しい技術であるが、これをスクリーニングアッセイと組み合わせて用いて、ＰＣＩＰバリアントを同定してもよい（Ａｒｋｉｎ及びＹｏｕｒｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌｇｒａｖｅ他（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６（３）：３２７−３３１）。
【０１２７】
一実施態様においては、細胞ベースのアッセイで混合（原語ｖａｒｉｅｇａｔｅｄ）ＰＣＩＰライブラリの分析を行ってもよい。例えば、複数の発現ベクターからなるライブラリを、カリウムチャネルが媒介する活性を通常に有する細胞系統中にトランスフェクトしてもよい。前記ＰＣＩＰミュータントが前記カリウムチャネルが媒介する活性に及ぼす影響を、例えば数多くの酵素アッセイのうちのいずれかによって、又は神経伝達物質の放出を検出することによって、検出してもよい。次に、前記カリウムチャネルが媒介する活性の阻害又は増強が記録された細胞からプラスミドＤＮＡを回収し、個々のクローンの特性を更に分析してもよい。
【０１２８】
単離されたＰＣＩＰタンパク質又はその一部分もしくは断片を免疫原として、ＰＣＩＰに結合する抗体を、標準的なポリクローナル及びモノクローナル抗体作製技術を用いて作製してもよい。全長ＰＣＩＰタンパク質を使用してもよいが、本発明は、免疫原として用いるＰＣＩＰの抗原ペプチド断片を提供する。前記ＰＣＩＰの抗原ペプチドは、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７６、配列番号：７８、配列番号：８１、配列番号：８３、配列番号：８５、配列番号：８７、配列番号：８９、配列番号：９１、配列番号：９３、配列番号：９５、配列番号：９７、配列番号：９９、配列番号：１０１、配列番号：１０３又は配列番号：１０９で示されるアミノ酸配列の少なくとも８個のアミノ酸残基を有し、前記ペプチドに対して産生された抗体がＰＣＩＰと特異的な免疫複合体を形成するように、ＰＣＩＰのエピトープを有する。好適には、前記抗原ペプチドは、少なくとも１０個、より好適には少なくとも１５個、更に好適には少なくとも２０個、最も好適には少なくとも３０個のアミノ酸残基を有する。
【０１２９】
前記抗原ペプチドが有する好適なエピトープは、ＰＣＩＰタンパク質の表面上の、例えば親水性の領域及び抗原性の高い領域などの領域である。
【０１３０】
ＰＣＩＰ免疫原は、典型的には、（例えばウサギ、ヤギ、マウス又はその他の哺乳類などの）適切な対象を前記免疫原で免疫化することで抗体を作製するために使用される。好適な免疫原調製品に、例えば組換え発現されたＰＣＩＰタンパク質又は化学合成されたＰＣＩＰポリペプチドが含まれてもよい。前記調製品が更に、例えばフロイント完全アジュバント又はフロイント不完全アジュバントなどのアジュバント或いは同様の免疫刺激物質を含有してもよい。適切な対象を免疫原ＰＣＩＰ製剤で免疫化することにより、ポリクローナル抗ＰＣＩＰ抗体応答が誘発される。
【０１３１】
従って、本発明の別の一局面は、ポリクローナル抗ＰＣＩＰ抗体応答に関する。ここで使用される「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫活性部分、即ち、ＰＣＩＰなどの抗原に特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を有する分子を指す。免疫グロブリン分子の免疫活性部分の例には、抗体をペプシンなどの酵素で処理することで作製可能なＦ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。本発明は、ＰＣＩＰに結合するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を提供する。ここで使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、ＰＣＩＰの特定のエピトープと免疫反応することの可能な抗原結合部位を１種類だけ持つ複数の抗体分子からなる一集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、従って、典型的には、自身が免疫反応を行う特定のＰＣＩＰタンパク質に対して、単一の結合親和性を呈する。
【０１３２】
ポリクローナル抗ＰＣＩＰ抗体を、上述のように、適切な対象をＰＣＩＰ免疫原で免疫化することで作製してもよい。免疫化した前記対象における抗ＰＣＩＰ抗体価を、固定化したＰＣＩＰを用いた酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＺＡ）などの標準的な技術によって、長期にわたって観察してもよい。所望の場合には、ＰＣＩＰに対抗する前記抗体分子を、前記哺乳類から（例えば血液などから）単離し、更に、タンパク質Ａクロマトグラフィーなどの周知の技術で精製して、ＩｇＧ断片を得てもよい。免疫化後の、例えば前記抗ＰＣＩＰ抗体価が最も高い時点などの適切な時点で、抗体産生細胞を前記対象から採取し、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に発表されたハイブリドーマ法（（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）（Ｂｒｏｗｎ他（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎ他（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ．２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈ他（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：２９２７−３１；及びＹｅｈ他（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２９：２６９−７５も参照のこと）、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ他（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅ他（１９８５）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）又はトリオーマ法などの標準的な技術によるモノクローナル抗体の作製に使用してもよい。モノクローナル抗体ハイブリドーマの作製方法は、周知である（概略はＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ中のＲ．Ｈ．Ｋｅｎｎｅｔｈ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ、プレナム・パブリッシング社、ニューヨーク州ニューヨーク（１９８０）；Ｅ．Ａ．Ｌｅｒｎｅｒ  （１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２；Ｍ．Ｌ．Ｇｅｆｔｅｒ他（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６を参照のこと）。簡単に言うと、（典型的には骨髄腫である）不死化細胞系統を、ＰＣＩＰ免疫原で上述のように免疫化した哺乳類からの（典型的には脾細胞である）リンパ球に融合させ、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、ＰＣＩＰに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを特定する。
【０１３３】
リンパ球と不死化細胞系統との融合に用いる周知の数多くのプロトコルのいずれも、抗ＰＣＩＰモノクローナル抗体の作製に適用可能である（例えばＧ．Ｇａｌｆｒｅ他（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０−５２；Ｇｅｆｔｅｒ他  Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．同上；Ｌｅｒｎｅｒ、Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．同上；Ｋｅｎｎｅｔｈ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  同上を参照のこと）。更に、これらの方法を変化させた数多くの方法もまた有用であろうことが、当業者に理解されよう。典型的には、（例えば骨髄腫細胞系統などの）不死化細胞系統は、リンパ球と同じ哺乳類種に由来する。例えば、マウスのハイブリドーマを、本発明の免疫原調製品で免疫化したマウスからのリンパ球と不死化マウス細胞系統とを融合させることで作製してもよい。好適な不死化細胞系統は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培地（ＨＡＴ培地）に感受性の、マウスの骨髄腫細胞系統である。例えばＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３又はＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫系統などの数多くの骨髄腫細胞系統のいずれも、標準的な技術で融合相手として使用可能である。これらの骨髄腫系統はＡＴＣＣから入手可能である。典型的には、ＨＡＴ感受性のマウス骨髄腫細胞を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いてマウス脾細胞に融合させる。この融合によって生じたハイブリドーマ細胞を、未融合の及び非生産的に融合した骨髄細胞（未融合の脾細胞は、形質転換されていないために数日後に死ぬ）を死滅させるＨＡＴ培地を用いて選別する。前記ハイブリドーマ培養上清を、例えば標準的なＥＬＩＳＡアッセイなどによって、ＰＣＩＰに結合する抗体についてスクリーニングすることで、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を検出する。
【０１３４】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製する代わりに、（例えば抗体ファージディスプレイライブラリなどの）組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリをＰＣＩＰでスクリーニングし、ＰＣＩＰに結合する免疫グロブリンライブラリのメンバーを単離することで、モノクローナル抗ＰＣＩＰ抗体を同定及び単離してもよい。ファージディスプレイライブラリの作製及びスクリーニングキット（例えばファーマシア社のＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；及びストラタジーン社のＳｕｒｆＺＡＰ（登録商標）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２など）が市販されている。更に、抗体のディスプレイライブラリの作製及びスクリーニングへの使用に特に適した方法及び試薬の例が、例えばＬａｄｎｅｒ他  米国特許Ｎｏ．５，２２３，４０９；Ｋａｎｇ他  ＰＣＴ国際公開公報Ｎｏ．ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒ他  ＰＣＴ国際公開公報Ｎｏ．ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒ他  ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄ他  ＰＣＴ国際公開公報Ｎｏ．ＷＯ９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ他  ＰＣＴ国際公開公報ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他  ＰＣＴ国際公開公報Ｎｏ．ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄ他  ＰＣＴ国際公開公報Ｎｏ．ＷＯ９２／０９６９０；Ｌａｄｎｅｒ他  ＰＣＴ国際公開公報Ｎｏ．ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓ他（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ他（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ他（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ他（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ他（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎ他（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ他（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｄ他（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ他（１９９１）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓ他（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７９７８−７９８２；及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ他  Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２−５５４に示されている。
【０１３５】
加えて、キメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体などの、ヒトの及び非ヒト部分の双方を持つ組換え抗ＰＣＩＰ抗体は、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて作製可能であり、本発明の範囲に包含される。そのようなキメラモノクローナル抗体及びヒト化モノクローナル抗体を、例えばＲｏｂｉｎｓｏｎ他  ＰＣＴ国際出願  Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Ａｋｉｒａ他  欧州特許出願  １８４，１８７；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．  欧州特許出願  １７１，４９６；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ他  欧州特許出願  １７３，４９４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ他  ＰＣＴ国際公開公報Ｎｏ．ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙ他  米国特許Ｎｏ．４，８１６，５６７；Ｃａｂｉｌｌｙ他  欧州特許出願  １２５，０２３；Ｂｅｔｔｅｒ他（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕ他（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕ他（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎ他（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ他（１９８７）Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄ他（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４４６−４４９；及びＳｈａｗ他（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ他（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ  米国特許  ５，２２５，５３９；Ｊｏｎｅｓ他（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ他（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４；及びＢｅｉｄｌｅｒ他（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に述べられている方法などの当業で周知の組換えＤＮＡ技術を用いて作製してもよい。
【０１３６】
（例えばモノクローナル抗体などの）抗ＰＣＩＰ抗体を、アフィニティクロマトグラフィ又は免疫沈降法などの標準的な技術を用いたＰＣＩＰの単離に使用してもよい。抗ＰＣＩＰ抗体は、細胞からの天然のＰＣＩＰの精製及び宿主細胞中で発現される組換え作製されたＰＣＩＰの精製を容易にする。更に、抗ＰＣＩＰ抗体を用いて（例えば細胞溶解物又は細胞上清中で）ＰＣＩＰタンパク質を検出し、前記ＰＣＩＰタンパク質の発現の発生量及びパターンを評価してもよい。抗ＰＣＩＰ抗体を臨床検査法の一環として診断的に使用して、組織中のタンパク質レベルをモニタし、例えば所定の治療方針の有効性を調べてもよい。前記抗体を検出可能な物質と結び付ける（即ち物理的に連結させる）ことによって、検出を容易にしてもよい。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質及び放射性物質が含まれる。好適な酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが含まれる；好適な補欠分子団複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれる；好適な蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリトリンが含まれる；発光物質の例には、ルミノールが含まれる；生物発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが含まれる；好適な放射性物質の例には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈが含まれる。
【０１３７】
ＩＩＩ．組換え発現ベクター及び宿主細胞
本発明の別の一局面は、ＰＣＩＰタンパク質（又はその一部分）をコードする核酸を有する、好適には発現ベクターであるベクターに関する。ここで使用する「ベクター」という用語は、自身が連結した別の核酸を輸送することの可能な核酸分子を指す。ベクターの一種が「プラスミド」であるが、これは、更なるＤＮＡ部分をその中にライゲーションすることの可能な環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。ベクターの別の一種はウィルスベクターであり、この場合、更なるＤＮＡ部分が前記ウィルスのゲノム中にライゲーションされる。（例えば複製の起源が細菌である細菌ベクター及びエピゾーム型の哺乳類ベクターなどの）幾つかのベクターは、導入された宿主細胞内で自律複製可能である。（例えば非エピソーム型の哺乳類ベクターなどの）その他のベクターは、宿主細胞中に導入されると前記宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、前記宿主のゲノムと一緒に複製される。更に、幾つかのベクターは、自身が作動的に連結している遺伝子の発現を命令することが可能である。そのようなベクターを、ここで「発現ベクター」と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で用いられる発現ベクターは、プラスミドの形をとっている場合が多い。プラスミドはベクターの最もよく用いられる形であることから、本明細書においては、「プラスミド」と「ベクター」を交換可能に使用してもよい。但し、本発明は、同等の機能を果たす（例えば複製能のないレトロウィルス、アデノウィルス及びアデノ随伴ウィルスなどの）ウィルスベクターなどの、発現ベクターの他の形をも包含することを意図されている。
【０１３８】
本発明の組換え発現ベクターは、本発明の核酸を、宿主細胞中での前記核酸の発現に適した形で有するが、このことは、前記組換え発現ベクターに、発現に使用する前記宿主細胞に基づいて選択された、発現対象の前記核酸の配列に作動的に連結した１つ又は複数の調節配列が含まれることを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作動的に連結した」という用語は、目的の前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列の発現が可能となるように（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系中で又は前記ベクターが宿主細胞中に導入される場合には前記宿主細胞中で）前記調節配列に連結していることを意味することを意図されている。「調節配列」という用語は、プロモータ、エンハンサ及びその他の（例えばポリアデニル化シグナルなどの）発現制御因子を包含することを意図されている。そのような調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデミックプレス社、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に述べられている。調節配列には、様々な種類の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的発現を命令するものと、（例えば組織特異的調節配列などの）限定された宿主細胞のみににおけるヌクレオチド配列の発現を命令するものとがある。発現ベクターのデザインが、これらのような、形質転換する宿主細胞の選択や所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に左右されうることが当業者に理解されよう。本発明の発現ベクターを宿主細胞中に導入して、（例えばＰＣＩＰタンパク質、ＰＣＩＰタンパク質の突然変異型、融合タンパク質などの）本願中に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質又はペプチドを含めたタンパク質又はペプチドを作製してもよい。
【０１３９】
本発明の組換え発現ベクターを、原核細胞又は真核細胞におけるＰＣＩＰタンパク質の発現用にデザインしてもよい。例えば、ＰＣＩＰタンパク質を、大腸菌などの細菌の細胞、昆虫の細胞（バキュロウィルス発現ベクターを使用）、酵母細胞又は哺乳類の細胞中で発現させてもよい。好適な宿主細胞について、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデミックプレス社、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）に更に述べられている。又は、前記組換え発現ベクターを、例えばＴ７プロモータ調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写及び翻訳してもよい。
【０１４０】
原核生物におけるタンパク質の発現は、大腸菌中で、融合タンパク質又は非融合タンパク質のいずれかの発現を命令する構成性の又は誘導性のプロモータを持つベクターを用いて行われる場合が最も多い。融合ベクターは、その中でコードされるタンパク質の、通常は前記組換えタンパク質のアミノ末端に、多数のアミノ酸を付加する。そのような融合ベクターは、典型的には、１）組換えタンパク質の発現を増加させる；２）前記組換えタンパク質の溶解度を向上させる；及び３）アフィニティ精製のリガンドとして作用することで、前記組換えタンパク質の精製の一助となる、という３つの目的を果たす。多くの場合、融合発現ベクターでは、融合成分と組換えタンパク質との連結部にタンパク分解性の開裂部位が導入されることで、前記融合タンパク質の精製後の前記組換えタンパク質の前記融合成分からの分離が可能となる。そのような酵素及びこれらと同様の性質を持つ配列には、Ｘａ因子、トロンビン及びエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、それぞれグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質又はプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる、ｐＧＥＸ（ファーマシアバイオテック社；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（ニューイングランドバイオラブズ社、マサチューセッツ州ベヴァリー）及びｐＲＩＴ５（ファーマシア社、ニュージャージー州ピスカタウェイ）が含まれる。
【０１４１】
精製された融合タンパク質を、（例えば以下に詳述する直接アッセイ又は競合アッセイなどの）ＰＣＩＰ活性アッセイに使用してもよいし、或いは、例えばＰＣＩＰタンパク質に特異的な抗体の産生に使用してもよい。好適な一実施態様においては、本発明のレトロウィルス発現ベクター中で発現されているＰＣＩＰ融合タンパク質を用いて骨髄細胞を感染させ、次にこれらの骨髄細胞を放射線照射を受けたレシピエントに移植してもよい。次に、前記レシピエントの病状を、（例えば６週間などの）十分な時間が経過した後に調べてもよい。
【０１４２】
適切な誘導性の非融合大腸菌発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ他（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ他、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５アカデミックプレス社、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）６０−８９）が含まれる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子の発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモータからの宿主ＲＮＡポリメラーゼの転写に左右される。ｐＥＴ  １１ｄベクターからの標的遺伝子の発現は、同時に発現されているウィルスのＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎ１）が媒介するＴ７  ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモータからの転写に左右される。このウィルスのポリメラーゼは、宿主菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって、宿主に組み込まれたＴ７  ｇｎ１遺伝子を持つプロファージから、ｌａｃＵＶ５プロモータによる転写制御の下で供給される。
【０１４３】
大腸菌において組換えタンパク質を最大に発現させる一つの方法に、宿主菌における前記タンパク質の発現の際の、前記組換えタンパク質のタンパク質分解による開裂能力を低下させる方法がある（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、アカデミックプレス社、カリフオルニア州サンディエゴ（１９９０）１１９−１２８）。別の一方法としては、発現ベクター中に挿入する核酸の核酸配列を、各アミノ酸の個々のコドンが大腸菌において選択的に利用されるコドンとなるように変化させる（Ｗａｄａ他（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のそのような変更を、標準的なＤＮＡ合成技術によって行ってもよい。
【０１４４】
別の一実施態様においては、ＰＣＩＰ発現ベクターが酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．セレビジエにおける発現ベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ他（１９８７）Ｅｍｂｏ  Ｊ．６：２２９−２３４、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ及びＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ他（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（インビトロジェン社、カリフォルニア州サンディエゴ）及びｐｉｃＺ（インビトロジェン社、カリフォルニア州サンディエゴ）が含まれる。
【０１４５】
又は、ＰＣＩＰタンパク質を、昆虫の細胞中で、バキュロウィルス発現ベクターを用いて発現させてもよい。（例えばＳｆ９細胞などの）培養された昆虫細胞におけるタンパク質の発現に利用可能なバキュロウィルスには、ｐＡｃ系（Ｓｍｉｔｈ他（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬ系（Ｌｕｃｋｌｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が含まれる。
【０１４６】
更に別の一実施態様においては、本発明の核酸を、哺乳類の細胞中で、哺乳類発現ベクターを用いて発現させる。哺乳類発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ  Ｋａｕｆｍａｎ他（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）が含まれる。哺乳類細胞中で使用する場合、前記発現ベクターの制御機能は、ウィルスの調節因子によって付与されることが多い。例えば、広く使用されているプロモータは、ポリオーマ、アデノウィルス２、サイトメガロウィルス及びシミアンウィルス４０に由来する。原核細胞及び真核細胞の双方についてのその他の好適な発現系は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、１９８９の第１６章及び第１７章を参照のこと。
【０１４７】
別の一実施態様においては、前記哺乳類の組換え発現ベクターが、特定の細胞種において選択的に核酸の発現を命令することが可能である（例えば組織特異的調節因子が前記核酸の発現に使用される）。組織特異的調節因子は、当業で知られている。好適な組織特異的プロモータの例には、アルブミンプロモータ（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ他（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ球特異的プロモータ（Ｃａｌａｍｅ及びＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモータ（Ｗｉｎｏｔｏ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：７２９−７３３）及び免疫グロブリンのプロモータ（Ｂａｎｅｒｊｉ他（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ及びＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、（例えば神経フィラメントプロモータ；Ｂｙｒｎｅ及びＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７などの）神経細胞特異的プロモータ、脾臓特異的プロモータ（Ｅｄｌｕｎｄ他（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）及び（例えばミルクホエープロモータ；米国特許Ｎｏ．４，８７３，３１６及び欧州特許出願公開公報Ｎｏ．２６４，１６６などの）乳腺特異的プロモータが含まれるが、これらに限定されることはない。例えばネズミのｈｏｘプロモータ（Ｋｅｓｓｅｌ及びＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）及びα−フェトプロテインプロモータ（Ｃａｍｐｅｓ及びＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）などの発生段階特異的プロモータも包含される。
【０１４８】
本発明は、アンチセンス方向にクローニングされた本発明のＤＮＡ分子を有する組換え発現ベクターを更に提供する。即ち、前記ＤＮＡ分子は、ある調節配列に、ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡのアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現が（前記ＤＮＡ分子の転写によって）可能となるように作動的に連結されている。アンチセンス方向にクローニングされた核酸に作動的に連結する調節配列としては、例えばウィルスプロモータ及び／又はエンハンサなどの、様々な細胞種において前記アンチセンスＲＮＡ分子の継続的な発現を命令する調節配列を選択してもよいし、或いは、アンチセンスＲＮＡの組織特異的な又は細胞種特異的な構成性発現を命令する調節配列を選択してもよい。前記アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が高効率の調節領域の制御下で作製され、前記ベクターが導入された細胞種によってその活性が決定される、組換えプラスミド、ファージミド又は弱毒化ウィルスの形であってもよい。アンチセンス遺伝子を用いた遺伝子発現の調節については、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．他、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ａｓ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６を参照のこと。
【０１４９】
本発明の別の一局面は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」という用語を、ここで交換可能に用いる。これらの用語は、当然のことながら、特定の対象細胞のみならず、そのような細胞の後代又は潜在的後代をも指す。突然変異又は環境的な影響要因のいずれかによって、後続の世代に何らかの変化が起こりうることから、そのような後代は、実際には、親細胞と同一でなくてもよいが、そのような場合でも、ここで使用される用語の範囲内に包含される。
【０１５０】
宿主細胞は、いかなる原核細胞又は真核細胞であってもよい。例えば、ＰＣＩＰタンパク質を、大腸菌などの細菌細胞、昆虫の細胞、酵母又は（チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣＯＳ細胞などの）哺乳類の細胞中で発現させてもよい。その他の好適な宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１５１】
ベクターＤＮＡを、原核細胞又は真核細胞中に、通常の形質転換又はトランスフェクション技術によって導入してもよい。ここで使用する「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は、（例えばＤＮＡなどの）外来の核酸を宿主細胞中に導入するための、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥデキストランが媒介するトランスフェクション、リポフェクション又はエレクトロポレーションを含めた様々な当業で公知の技術を指す。宿主細胞の好適な形質転換又はトランスフェクション方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、１９８９）及びその他の実験用マニュアルに見受けられる。
【０１５２】
哺乳類細胞の安定なトランスフェクションを行う上で、使用する発現ベクター及びトランスフェクション技術の種類にもよるが、細胞のわずかな画分のみのゲノム中に外来のＤＮＡを組み込んでもよいことが知られている。前記組み込まれたＤＮＡを同定及び選別するために、一般には（例えば抗生物質耐性であるなどの）選別可能なマーカをコードする遺伝子を、目的の遺伝子と一緒に宿主細胞中に導入する。好適な選別可能なマーカには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキセートなどの薬剤への耐性を付与するマーカが包含される。選別可能なマーカをコードする核酸を、ＰＣＩＰタンパク質をコードするベクターと同じベクターを用いて宿主細胞中に導入してもよいし、又は、別のベクターを用いて導入してもよい。導入された前記核酸によって安定にトランスフェクトされた細胞を、薬剤による選別によって特定してもよい（例えば、前記選別可能なマーカ遺伝子を組み込んだ細胞は生き残るが、その他の細胞は死ぬ）。
【０１５３】
培地中の原核宿主細胞又は真核宿主細胞などの本発明の宿主細胞を、ＰＣＩＰタンパク質の作製（即ち発現）に用いてもよい。従って、本発明は、本発明の宿主細胞を用いたＰＣＩＰタンパク質の作製方法を更に提供する。一実施態様においては、前記方法には、（ＰＣＩＰタンパク質をコードする組換え発現ベクターが導入された）本発明の宿主細胞を、ＰＣＩＰタンパク質が作製されるのに適切な培地中で培養することが含まれる。別の一実施態様においては、前記方法に、ＰＣＩＰタンパク質を前記培地又は前記宿主細胞から単離することが更に含まれる。
【０１５４】
本発明の宿主細胞を、非ヒトトランスジェニック動物の作製に使用してもよい。例えば、一実施態様においては、本発明の宿主細胞は、ＰＣＩＰをコードする配列が導入された、受精した卵母細胞又は胚の幹細胞である。そのような宿主細胞を用いて、外来性のＰＣＩＰ配列がゲノム中に導入された非ヒトトランスジェニック動物又は内在性のＰＣＩＰ配列が変化した相同組換え動物を作製してもよい。そのような動物は、ＰＣＩＰの機能及び／又は活性の研究並びにＰＣＩＰ活性モジュレータの特定及び／又は評価に有用である。ここで使用する「トランスジェニック動物」という用語は、その動物の１つ又は複数の細胞が導入遺伝子を持つ、非ヒト動物、好適には哺乳類、より好適にはラット又はマウスなどの齧歯類を指す。トランスジェニック動物のその他の例には、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、雌牛、ヤギ、ニワトリ、両生類などが含まれる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物の発生源である細胞のゲノム中に組み込まれた外来性のＤＮＡであり、成熟した前記動物のゲノム中に留まることによって、前記トランスジェニック動物の１つ又は複数の細胞種又は組織において、コードされた遺伝子産物の発現を命令する。ここで使用する「相同組換え動物」という用語は、内在性のＰＣＩＰ遺伝子が、前記内在性の遺伝子と、前記動物の、例えば胚細胞などの細胞中にその動物の発生前に導入されたＤＮＡ分子との間の相同的な組換えによって変化した、非ヒト動物、好適には哺乳類、より好適にはマウスを指す。
【０１５５】
ＰＣＩＰをコードする核酸を、例えばマイクロインジェクション、レトロウィルス感染などによって、受精した卵母細胞の雄前核中に導入し、前記卵母細胞を偽妊娠した雌の里親動物中で発育させることによって、本発明のトランスジェニック動物を作製してもよい。配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表されるＰＣＩＰのｃＤＮＡ配列を、導入遺伝子として非ヒト動物のゲノム中に導入してもよい。或いは、マウス又はラットのＰＣＩＰ遺伝子などの、ヒトＰＣＩＰ遺伝子の非ヒト相同体を、導入遺伝子として用いてもよい。或いは、別のＰＣＩＰファミリーメンバーなどのＰＣＩＰ遺伝子相同体を、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００もしくは配列番号：１０２で表されるＰＣＩＰのｃＤＮＡ配列又はＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３もしくは９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサート（先のサブセクションＩにて詳述した）とのハイブリダイゼーションによって単離し、導入遺伝子として用いてもよい。前記導入遺伝子の発現効率を高めるイントロン配列及びポリアデニレーションシグナルが前記導入遺伝子中に含まれていてもよい。ＰＣＩＰタンパク質を特定の細胞で発現させる組織特異的調節配列が、ＰＣＩＰ導入遺伝子に作動的に連結していてもよい。トランスジェニック動物、とりわけマウスなどの動物を胚の操作及びマイクロインジェクションによって作製する方法は、当業で知られており、例えばＬｅｄｅｒ他による米国特許Ｎｏ．４，７３６，８６６及びＮｏ．４，８７０，００９、Ｗａｇｎｅｒ他による米国特許Ｎｏ．４，８７３，１９１並びに、Ｈｏｇａｎ，Ｂ．、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、１９８６）に記載されている。同様の方法を、その他のトランスジェニック動物の作製にも使用する。初代トランスジェニック動物を、そのゲノム中のＰＣＩＰ導入遺伝子の存在及び／又はその動物の組織又は細胞中のＰＣＩＰ  ｍＲＮＡの発現に基づいて特定してもよい。初代トランスジェニック動物を、次に、前記導入遺伝子を持つ更なる動物の育種に用いてもよい。更に、ＰＣＩＰタンパク質をコードする導入遺伝子を持つトランスジェニック動物を、別の導入遺伝子を持つ別のトランスジェニック動物と更に交配させてもよい。
【０１５６】
相同組換え動物を作製するために、ＰＣＩＰ遺伝子の少なくとも一部分を有し、このＰＣＩＰ遺伝子中に欠失、付加又は置換が導入されているために、前記ＰＣＩＰ遺伝子が、例えば機能の破壊などの変化を受けているベクターを作製してもよい。前記ＰＣＩＰ遺伝子は、（例えば配列番号．１のｃＤＮＡなどの）ヒト遺伝子であってもよいが、より好適には、（例えば配列番号．３又は５のｃＤＮＡなどの）ヒトＰＣＩＰ遺伝子の非ヒト相同体である。例えば、マウスのＰＣＩＰ遺伝子を用いて、前記マウスのゲノム中の内在性ＰＣＩＰ遺伝子を変化させるのに適した相同組換えベクターを構成してもよい。好適な一実施態様においては、前記ベクターは、相同組換えによって前記内在性ＰＣＩＰ遺伝子の機能が破壊される（即ち、機能タンパク質をコードしなくなる；「ノックアウトベクター」とも呼ぶ）ような具合にデザインされる。又は、前記ベクターを、相同組換えによって、前記内在性ＰＣＩＰ遺伝子が突然変異もしくは変化するが、機能タンパク質はコードする（例えば、上流側の調節配列を変化させて、前記内在性ＰＣＩＰタンパク質の発現を変化させる）ようにデザインしてもよい。前記相同組換えベクターにおいては、前記ＰＣＩＰ遺伝子の前記変化した部分は、前記ベクターによってもたらされた前記外来性ＰＣＩＰ遺伝子と胚の幹細胞の内在性ＰＣＩＰ遺伝子との間での相同組換えを可能とすべく、その５’末端及び３’末端が前記ＰＣＩＰ遺伝子の更なる核酸配列によってフランキングされている。前記更なるフランキングＰＣＩＰ核酸配列の長さは、前記内在性遺伝子との相同組換えを成功させるのに十分な長さである。典型的には、数キロベースのフランキングＤＮＡ（５’末端及び３’末端の双方において）が前記ベクター中に含まれている（相同組換えベクターの説明については、例えばＴｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．及びＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照のこと）。前記ベクターを、胚の幹細胞系統中に（例えばエレクトロポレーションによって）導入し、前記導入されたＰＣＩＰ遺伝子が前記内在性のＰＣＩＰ遺伝子と相同組換えした細胞を選別する（例えばＬｉ，Ｅ．他（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６９：９１５を参照のこと）。前記選別された細胞を次に（例えばマウスなどの）動物の胚盤胞中に注入して、集合キメラを形成してもよい（例えばＢｒａｄｌｅｙ，Ａ．  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ編（ＩＲＬ、オックスフォード、１９８７）ｐｐ．１１３−１５２を参照のこと）。次に、キメラ胚を好適な偽妊娠した雌の里親動物中に移植して、前記胚を出産させる。前記相同組換えしたＤＮＡを生殖細胞中に持つ後代を用いて、前記導入遺伝子の生殖細胞系列による伝達によって前記相同組換えしたＤＮＡを全ての細胞中に持つ動物を育種してもよい。相同組換えベクター及び相同組換え動物の作製方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８２３−８２９及びＰＣＴ国際公開公報Ｎｏ．：Ｌｅ  ＭｏｕｅｌｌｅｃによるＷＯ  ９０／１１３５４；Ｓｍｉｔｈｉｅｓ他によるＷＯ  ９１／０１１４０；Ｚｉｊｌｓｔｒａ他によるＷＯ  ９２／０９６８；及びＢｅｒｎｓ他によるＷＯ  ９３／０４１６９に更に記載されている。
【０１５７】
別の一実施態様においては、前記導入遺伝子の発現の調節を可能にする選択された系を有する、非ヒトトランスジェニック動物を作製してもよい。そのような系の一例に、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系がある。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系の説明については、例えばＬａｋｓｏ他（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６を参照のこと。リコンビナーゼ系の別の一例には、サッカロミセス‐セレビジエのＦＬＰリコンビナーゼ系（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ他（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５）がある。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼ系を用いて導入遺伝子の発現を調節する場合には、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択されたタンパク質との双方をコードする導入遺伝子を持つ動物が必要となる。そのような動物を、例えば一方は選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を持つ２つのトランスジェニック動物を交配させることなどによって「二重」トランスジェニック動物を作製することで提供してもよい。
【０１５８】
ここに記載の非ヒトトランスジェニック動物のクローンを、Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ．他（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３及びＰＣＴ国際公開公報Ｎｏ．ＷＯ  ９７／０７６６８及びＷＯ  ９７／０７６６９に記載の方法に従って作製してもよい。簡単に言うと、トランスジェニック動物からの、例えば体細胞などの細胞を単離し、生長周期を脱してＧ０期に入るように誘導する。次に、静止状態の前記細胞を、例えば電気パルスを用いて、前記静止状態の細胞の単離元である動物と同種の動物の除核卵母細胞と融合させる。次に、前記再構成した卵母細胞を培養して、桑実胚又は未分化胚芽細胞にまで成長させた後に、偽妊娠した雌の里親動物中に移入させる。この雌の里親動物から生まれた子孫は、例えば体細胞などの前記細胞の単離元である前記動物のクローンとなる。
【０１５９】
ＩＶ．薬学的組成物
本発明のＰＣＩＰ核酸分子、ＰＣＩＰタンパク質の断片及び抗ＰＣＩＰ抗体（ここで「活性化合物」とも呼ぶ）を、投与に適した薬学的組成物中に組み込んでもよい。そのような組成物には、典型的には、前記核酸分子、タンパク質又は抗体と、薬学上許容可能な担体とが含有される。ここで使用する「薬学上許容可能な担体」という用語は、薬剤投与に適した任意の及び全ての溶剤、分散媒、コーティング、抗細菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを包含するものとして意図されている。これらのような媒質及び薬剤を薬学上活性な物質に使用することは、当業で周知である。従来の媒質又は薬剤のいずれもが前記活性化合物と適合しない場合を除いては、前記組成物中にこれらの媒質又は薬剤を使用することが企図されている。補助的な活性化合物を前記組成物中に組み込んでもよい。
【０１６０】
本発明の薬剤組成物は、その意図された投与経路に適合すべく製剤される。投与経路の例には、例えば静脈内投与、皮内投与、皮下投与、（例えば吸入などの）経口投与、経皮（局所）投与、経粘膜投与及び直腸内投与が含まれる。非経口、皮内又は皮下に用いる溶剤又は懸濁剤には、以下の成分が含まれてもよい：注射用の水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又はその他の合成溶剤などの滅菌希釈液；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗細菌剤；アスコルビン酸又は硫酸水素ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸、クエン酸又はリン酸などの緩衝剤及び、塩化ナトリウム又はデキストロースなどの張度調整剤。塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基を用いてｐＨを調整してもよい。非経口製剤が、ガラス製又はプラスチック製のアンプル、ディスポーザブル注射筒又は多人数用バイアルに封入されていてもよい。
【０１６１】
注射に適した薬剤組成物には、（水溶性の場合の）滅菌水溶剤又は分散剤及び滅菌注射用溶剤又は分散剤の即時調製用の滅菌粉末が含まれる。静脈内投与に適した担体には、生理的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ社、ニュージャージー州パーシッパニー）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれる。全ての場合において、前記組成物は無菌でなければならず、また注射が容易である程度に流動性であるべきである。前記組成物は、製造及び保管条件下で安定でなければならず、また細菌及び真菌などの微生物の汚染活動から保護されなければならない。前記担体は、例えば水、エタノール、（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなどの）ポリオール類及びこれらの好適な混合物などを含有する溶液又は分散媒であってもよい。適切な流動性を、例えばレシチンなどのコーティングを使用することにより、分散剤の場合には必要な粒度を維持することにより、及び表面活性剤を使用することにより、維持してもよい。微生物の活動を、例えばパラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの様々な抗細菌剤及び抗真菌剤を用いて防止してもよい。多くの場合、例えば糖類、マンニトールなどの多価アルコール類、ソルビトール、塩化ナトリウムなどの等張剤が前記組成物中に含有されることが望ましいであろう。前記組成物に、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの、吸収を遅延させる物質を含有させることで、前記注射用組成物を持続的に吸収させてもよい。
【０１６２】
（例えばＰＣＩＰタンパク質の断片又は抗ＰＣＩＰ抗体などの）前記活性化合物を、必要に応じて上述の成分のうちの１つ又は複数の組合せと共に適切な溶液中に必要量含有させた後に、濾過除菌することにより、滅菌注射用溶剤を調製してもよい。一般に、分散剤を調製するには、前記活性化合物を、塩基性の分散媒と上述の成分のうちの必要なその他の成分とを含有する無菌の送達剤中に組み込む。滅菌注射用溶剤を調製するための滅菌粉末を調製する好適な方法は、予め濾過滅菌した前記活性成分と任意の更なる望ましい成分との溶液から粉末を生じさせる真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０１６３】
経口組成物には、一般に、不活性の希釈剤又は食用の担体が含有される。これらをゼラチンカプセルに封入してもよいし、又は圧縮して錠剤としてもよい。経口の治療的投与の目的で、前記活性化合物を賦形剤と組み合わせ、錠剤、トローチ剤又はカプセル剤の形で使用してもよい。経口組成物を、含嗽剤として使用するために流動性の担体を用いて調製しても良く、この場合、前記流動性の担体中の前記化合物は、口内に含まれ、うがい後に吐出又は嚥下される。製薬に適した結合剤及び／又はアジュバント材料を、前記組成物の一部として含有させてもよい。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などに、以下の成分又は同様の性質を持つ化合物が含有されてもよい：微結晶性セルロース、トラガカントガム又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又はラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ又はコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｓなどの潤滑剤；コロイド状２酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味料；或いはペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジ香料などの着香料。
【０１６４】
吸入による投与の場合には、前記化合物は、例えば二酸化炭素などのガスなどの好適な噴射剤を入れた加圧容器又はディスペンサ或いはネブライザから、エアロゾールスプレイの形で送達される。
【０１６５】
経粘膜的又は経皮的手段を用いて全身投与を行ってもよい。経粘膜又は経皮投与の場合には、製剤中に、浸透対象の障壁に適した浸透剤が用いられる。そのような浸透剤は、当業で周知であり、例えば経粘膜投与の場合には、界面活性剤、胆汁酸塩類及びフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与を、鼻スプレー又は座剤を用いて行ってもよい。経皮投与の場合には、前記活性化合物は、当業で周知の軟膏剤、眼軟膏剤、ゲル剤又はクリーム剤に製剤される。
【０１６６】
前記組成物を、直腸内送達のための（例えばカカオバター及びその他のグリセリド類などの通常の座剤基剤などを含有した）座剤又は停留性の浣腸剤の形で調製してもよい。
【０１６７】
一実施態様においては、前記活性化合物を、例えば制御放出製剤などのための、前記化合物の体内からの急速な排出を防止する、インプラント及びマイクロカプセルに封入した送達系を含めた担体と一緒に調製する。例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの、生分解性の生体適合性ポリマーを使用してもよい。そのような製剤の調製方法は、当業者に明らかであろう。これらの材料を、アルザ社及びノバ・ファーマシューティカル社から購入してもよい。（ウィルス抗原に対抗するモノクローナル抗体を封入した、導入遺伝子を標的とするリポゾームを含有する）リポゾーム懸濁液を、薬学上許容可能な担体として使用してもよい。これらを、当業で周知の、例えば米国特許Ｎｏ．４，５２２，８１１に記載の方法で調製してもよい。
【０１６８】
投与を容易にするため及び投与量の均一化を図るために、経口又は非経口組成物を一回服用単位に製剤すると特に有利である。ここで使用する一回服用単位という用語は、治療対象への単位投与に適した物理的に個別の単位を指す；各単位には、前記必要な薬学的担体と組み合わせて前記所望の治療効果を上げるべく計算された所定量の活性化合物が含まれる。本発明の一回服用単位の詳細は、前記活性化合物の独自の特性、達成すべき特定の治療効果及び、個人を治療するためのそのような活性化合物の調剤技術に固有の制約によって左右され、及びこれらに直接に依存する。
【０１６９】
これらのような化合物の毒性及び治療効果を、培養細胞又は実験動物を用いて、例えばＬＤ５０（集団の５０％にとって致死的な投与量）及びＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な投与量）を調べるなどの標準的な薬学的手法で調べてもよい。毒性効果と治療効果との間の用量比は、治療係数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。高い治療係数を発揮する化合物が望ましい。毒性の副作用を発揮する化合物を用いてもよいが、罹患していない細胞が受けると予想される損傷を最小限に抑えて副作用を減じるために、そのような化合物を罹患組織部位へと送達させる送達系のデザインに当たっては注意が必要である。
【０１７０】
細胞培養アッセイ及び動物を用いた研究から得られたデータを用いて、ヒトに使用する容量範囲を定めてもよい。そのような化合物の用量は、毒性が殆ど又は全く伴わないＥＤ５０を含めた循環血中濃度の範囲内であることが望ましい。前記用量が、使用する剤形及び投与経路によって、この範囲内で変動してもよい。本発明の方法で使用するいかなる化合物についても、前記治療上有効量を最初に細胞培養アッセイから推測することが可能である。ＩＣ５０（即ち、症状を最大の５０％阻害する試験化合物濃度）を含めた循環血漿中濃度の範囲を定めるために、細胞培養で調べたように、動物モデルで用量を定めてもよい。そのような情報を利用して、ヒトに使用できる用量をより正確に調べてもよい。血漿中のレベルを、例えば高性能の液体クロマトグラフ法で測定してもよい。
【０１７１】
ここで定義するタンパク質又はポリペプチドの治療上有効量（即ち有効投与量）の範囲は、およそ０．００１乃至３０ｍｇ／ｋｇ体重、好適にはおよそ０．０１乃至２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好適にはおよそ０．１乃至２０ｍｇ／ｋｇ体重、更により好適にはおよそ１乃至１０ｍｇ／ｋｇ、２乃至９ｍｇ／ｋｇ、３乃至８ｍｇ／ｋｇ、４乃至７ｍｇ／ｋｇ、又は５乃至６ｍｇ／ｋｇ体重である。疾患又は障害の重度、治療歴、全身の健康状態及び／又は対象の年齢並びに他の疾患の存在が含まれるがこれらに限定されることはない幾つかの要因が、対象の有効な治療に要する前記用量に影響を与えうることは、当業者に理解されるであろう。更に、対象を治療上有効量のタンパク質、ポリペプチド又は抗体で治療することに、１回のみの治療が含まれてもよいが、好適には一連の複数回の治療が含まれてもよい。
【０１７２】
好適な一例においては、対象を、およそ０．１乃至２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内の抗体、タンパク質又はポリペプチドで、週１回、およそ１乃至１０週間、好適には２乃至８週間、より好適にはおよそ３乃至７週間、更により好適にはおよそ４、５又は６週間にわたって治療する。治療に使用する抗体、タンパク質又はポリペプチドの有効投与量が、特定の治療の過程で増加又は減少しうることも、理解されるであろう。用量の変更は、ここに記載の診断アッセイの結果実施され、またそのような結果から理解されよう。
【０１７３】
本発明は、発現又は活性を調節する薬剤を包含する。薬剤が、例えば小分子であってもよい。例えば、そのような小分子には、ペプチド、ペプチドミメティック、アミノ酸、アミノ酸類似体、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド類似体、ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、分子量約１０，０００グラム毎モル未満の有機又は無機化合物（即ち、ヘテロ有機化合物及び有機金属化合物を含む）、分子量約５，０００グラム毎モル未満の有機又は無機化合物、分子量約１，０００グラム毎モル未満の有機又は無機化合物、分子量約５００グラム毎モル未満の有機又は無機化合物並びにこれらの化合物の塩類、エステル類及びその他の薬学上許容可能な形が含まれるが、これらに限定されることはない。
【０１７４】
当然のことながら、小分子薬剤の適切な用量は、通常の熟練した医師、獣医又は研究者の知識の範囲内の様々な要因に左右される。前記小分子の用量は、例えば治療する対象又は試料の種類、大きさ及び状態によって異なるであろうし、更に、前記組成物の適切な投与経路及び、医師が前記小分子に期待する本発明の核酸又はポリペプチドに及ぼす作用にも左右されるであろう。
【０１７５】
用量の例には、対象又は試料の重量キログラム当たり、ミリグラム又はマイクログラム量の小分子（例えばキログラム当たり約１マイクログラム乃至キログラム当たり約５００ミリグラム、キログラム当たり約１００マイクログラム乃至キログラム当たり約５ミリグラム、又はキログラム当たり約１マイクログラム乃至キログラム当たり約５０マイクログラム）が含まれる。更に、小分子の適切な用量が、調節すべき発現又は活性に対する前記小分子の効力に左右されることも当然である。そのような適切な用量を、ここに記載のアッセイで決定してもよい。本発明のポリペプチド又は核酸の発現又は活性を調節するためにこれらの小分子の１つ又は複数を（例えばヒトなどの）動物に投与する場合には、医師、獣医又は研究者は、例えば最初に比較的低用量を処方し、その後次第に、適切な応答が得られるまで用量を増やしてもよい。更に、任意の特定の動物対象に対する特定の用量レベルが、使用する特定の化合物の活性、前記対象の年齢、体重、全身の健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路、排出率、配合する薬、及び調節すべき発現又は活性の程度を含めた様々な要因に左右されるであろうことも当然である。
【０１７６】
更に、抗体（又はその断片）を、細胞毒素、治療薬又は放射性金属イオンなどの治療成分と結合させてもよい。細胞毒素又は細胞毒性の薬剤には、細胞に有害なあらゆる薬剤が含まれる。その例には、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テニポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン（原語ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｉｎ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、糖質コルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにこれらの類似体又は同族体が含まれる。治療薬には、（例えばメトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル  ダカルバジンなどの）代謝拮抗物質、（例えばメクロレタミン、チオテパ  クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロフォスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ及びシス−ジクロロジアミン（原語ｄｉｃｈｌｏｒｏｄｉａｍｉｎｅ）白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチンなどの）アルキル化剤、（例えばダウノルビシン（旧ダウノマイシン）及びドキソルビシンなどの）アントラサイクリン、（例えばダクチノマイシン（旧アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアンスラマイシン（原語ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ（ＡＭＣ）などの）抗生物質並びに（例えばビンクリスチン及びビンビラスチンなどの）抗有糸分裂剤が含まれるが、これらに限定されることはない。
【０１７７】
本発明の結合体を用いて任意の生体応答を調節してもよいが、その薬剤成分は、典型的な化学治療薬に限定されるとは解釈されない。例えば、前記薬剤成分が、所望の生物学的活性を有するタンパク質又はポリペプチドであってもよい。そのようなタンパク質に、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌体外毒素又はジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質；又は、例えばリンフォカイン、インターロイキン１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）又はその他の成長因子などの生体応答調節物質が含まれてもよい。
【０１７８】
これらのような治療成分を抗体と結合させる技術は周知であり、例えばＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ他（編），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）に記載のＡｒｎｏｎ他による”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（第２版）、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ他（編）、ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）に記載のＨｅｌｌｓｔｒｏｍ他による”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａ他（編）、ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）に記載のＴｈｏｒｐｅによる”Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ”；  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎ他（編）、ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）に記載の”Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”及びＴｈｏｒｐｅ他、”Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）を参照のこと。又は、ある抗体を第２の抗体に結合させて、Ｓｅｇａｌによる米国特許４，６７６，９８０に記載されているように、ヘテロ結合抗体（原語ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を形成してもよい。
【０１７９】
本発明の核酸分子をベクター中に挿入して、遺伝子治療ベクターとして使用してもよい。遺伝子治療ベクターを、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許５，３２８，４７０を参照のこと）又は定位注射（原語ｓｔｅｒｅｏｔａｃｔｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）（例えばＣｈｅｎ他（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって対象に送達してもよい。遺伝子治療ベクター製剤に、許容可能な希釈剤に希釈した前記遺伝子治療ベクターが含まれてもよいし、又は、遺伝子送達剤が埋め込まれた徐放性のマトリックスが含まれてもよい。又は、例えばレトロウィルスベクターなどの組換え細胞を使用せずに完全な遺伝子送達ベクターを作製可能である場合には、前記製剤に、遺伝子送達系を形成する１つ又は複数の細胞が含まれてもよい。
【０１８０】
前記薬剤組成物が、投与説明書と共に容器、包装又はディスペンサ中に封入されていてもよい。
【０１８１】
Ｖ．本発明の用途及び方法
ここに記載する核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体及び抗体を、次の方法のうちの１つ又は複数に用いてもよい：ａ）スクリーニングアッセイ；ｂ）（例えば診断アッセイ、予後判定アッセイ、臨床検査のモニタ及び薬理遺伝学的医療などの）予測的医療；及びｃ）（例えば治療的及び予防的処置などの）処置方法。ここに記載する本発明のＰＣＩＰタンパク質は、以下の活性のうちの１つ又は複数を有する：（１）カリウムチャネルタンパク質又はその一部分と（例えば結合するなどの）相互作用を行う；（２）カリウムチャネルタンパク質又はその一部分のリン酸化状態を調節する；（３）カルシウムと（例えば結合するなど）結び付くと共に、例えばカリウムチャネル又はＧタンパク質結合レセプタをカルシウムに依存的にリン酸化するカルシウム依存性キナーゼとして作用することが可能である；（４）カルシウムと（例えば結合するなど）結び付くと共に、例えばカルシウム依存性の転写因子として作用することが可能である；（５）（例えば神経細胞又は心細胞などの）細胞における、カルシウムチャネルによって媒介される活性を調節して、例えば前記細胞に有益な作用を及ぼす；（６）例えば神経細胞又は心細胞などの細胞におけるクロマチン形成を調節する；（７）例えば神経細胞又は心細胞などの細胞における小胞輸送及びタンパク質輸送を調節する；（８）例えば神経細胞又は心細胞などの細胞におけるサイトカインシグナリングを調節する；（９）カリウムチャネルタンパク質又はその一部分と細胞骨格との結び付きを調節する；（１０）細胞増殖を調節する；（１１）神経伝達物質の放出を調節する；（１２）膜興奮性を調節する；（１３）膜の静止電位に影響を及ぼす；（１４）活動電位の波形及び周波数を調節する；（１５）興奮現象のしきい値を調節する。従って、ここに記載する本発明のＰＣＩＰタンパク質を、例えば、（１）カリウムチャネルタンパク質又はその一部分の活性を調節する；（２）カリウムチャネルタンパク質又はその一部分のリン酸化状態を調節する；（３）カリウムチャネル又はＧタンパク質結合レセプタのリン酸化状態をカルシウム依存的に調節する；（４）カルシウムと（例えば結合するなど）結び付くと共に、カルシウム依存性の転写因子として作用する；（５）（例えば神経細胞又は心細胞などの）細胞における、カルシウムチャネルによって媒介される活性を調節して、例えば前記細胞に有益な作用を及ぼす；（６）例えば神経細胞又は心細胞などの細胞におけるクロマチン形成を調節する；（７）例えば神経細胞又は心細胞などの細胞における小胞輸送及びタンパク質輸送を調節する；（８）例えば神経細胞又は心細胞などの細胞におけるサイトカインシグナリングを調節する；（９）カリウムチャネルタンパク質又はその一部分と細胞骨格との結び付きを調節する；（１０）細胞増殖を調節する；（１１）神経伝達物質の放出を調節する；（１２）膜興奮性を調節する；（１３）膜の静止電位に影響を及ぼす；（１４）活動電位の波形及び周波数を調節する；（１５）興奮現象のしきい値を調節することなどに使用してもよい。
【０１８２】
本発明の単離された核酸分子を、例えば、（遺伝子治療に適用した場合の宿主細胞中の組換え発現ベクターなどによる）ＰＣＩＰタンパク質の発現、（例えば生体試料中の）ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ又はＰＣＩＰ遺伝子中の遺伝子変化の検出及び、以下に更に詳述するようなＰＣＩＰ活性の調節に用いてもよい。ＰＣＩＰタンパク質を、ＰＣＩＰ基質の不十分な又は過剰な生成或いはＰＣＩＰ阻害物質の生成を特徴とする障害の治療に用いてもよい。加えて、ＰＣＩＰタンパク質を、天然に存在するＰＣＩＰ基質を選別するスクリーニング、ＰＣＩＰ活性を調節する薬剤又は化合物を選別するスクリーニング及び、ＰＣＩＰタンパク質の不十分な又は過剰な生成或いはＰＣＩＰ野生型タンパク質と比較して低い又は異常な活性を有するＰＣＩＰタンパク質の生成を特徴とする障害（例えばアルツハイマー病、アルツハイマー病に伴う（ピック病などの）痴呆、パーキンソン病及びその他のレーヴィ体びまん性疾患、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、てんかん、脊髄小脳失調及びヤコブ−クロイツフェルト病などの神経変性障害；例えばうつ病、分裂病性障害、コルサコフ精神病、躁病、不安障害、双極性感情病又は恐怖症などの精神障害；例えば健忘症又は加齢に伴う記憶喪失などの学習又は記憶障害；例えば偏頭痛などの神経障害；例えば痛覚過敏又は筋骨格障害に伴う痛みなどの痛覚障害；脊髄損傷；卒中；及び頭部外傷などの中枢神経系障害或いは洞結節機能不全、狭心症、心不全、高血圧、心房細動、心房粗動、拡張型心筋症、特発性心筋症、心筋梗塞、冠状動脈疾患、冠状動脈痙攣又は不整脈などの心臓血管障害）の治療に用いてもよい。更に、本発明の抗ＰＣＩＰ抗体を、ＰＣＩＰタンパク質の検出及び単離、ＰＣＩＰタンパク質の生物学的利用能の調節及びＰＣＩＰ活性の調節に用いてもよい。
【０１８３】
Ａ．スクリーニングアッセイ：
本発明は、モジュレータ、即ちＰＣＩＰタンパク質に結合する、例えばＰＣＩＰ発現又はＰＣＩＰ活性に対して刺激作用又は阻害作用を持つ、或いは、例えばＰＣＩＰ基質の発現又は活性に対して刺激作用又は阻害作用を持つ、（例えばペプチド、ペプチドミメティック、小分子又はその他の薬剤などの）候補物質又は試験化合物又は薬剤を特定する方法（ここで「スクリーニングアッセイ」とも呼ぶ）を提供する。
【０１８４】
一実施態様においては、本発明は、ＰＣＩＰタンパク質又はポリペプチド又はその生物学的活性部分の基質である候補物質又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。別の一実施態様においては、本発明は、ＰＣＩＰタンパク質又はポリペプチド又はその生物学的活性部分に結合するか又はその活性を調節する候補物質又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の前記試験化合物を、生物学的ライブラリ；空間的処理の可能な並列固相又は液相ライブラリ；デコンボリューションを要する合成ライブラリ法；「１ビード１化合物」ライブラリ法；及びアフィニティクロマトグラフィによる選別を利用した合成ライブラリ法を含めた当業で周知のコンビナトリアルアリブラリ技術の分野における数多くの手法を用いて得てもよい。前記生物学的ライブラリ法はペプチドライブラリに限定されるが、その他の４つの手法は、化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリ又は小分子ライブラリに適用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。
【０１８５】
分子ライブラリの合成方法は、当業において、例えばＤｅＷｉｔｔ他（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６９０９；Ｅｒｂ他（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ他（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏ他（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌ他（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌ他（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；及びＧａｌｌｏｐ他（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３などに述べられている。
【０１８６】
化合物のライブラリを、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）に構築してもよいし、或いは、ビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌上（Ｌａｄｎｅｒによる米国特許５，２２３，４０９）、胞子上（Ｌａｄｎｅｒによる米国特許５，２２３，４０９）、プラスミド上（Ｃｕｌｌ他（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）又はファージ上（Ｓｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａ他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）；（Ｌａｄｎｅｒ  同上）に構築してもよい。
【０１８７】
一実施態様においては、アッセイが、ＰＣＩＰタンパク質又はその生物学的活性部分を発現している細胞を試験化合物と接触させ、前記試験化合物の、例えばカリウムチャネル又はその一部分と結合するなどのＰＣＩＰ活性を調節する能力を調べる細胞ベースのアッセイである。前記試験化合物がＰＣＩＰ活性を調節する能力を、ＰＣＩＰを発現している例えば黒質細胞などの神経細胞又は心細胞などの細胞からの、例えばドーパミンなどの神経伝達物質の放出をモニタすることで調べてもよい。更に、前記試験化合物がＰＣＩＰ活性を調節する能力を、例えばＰＣＩＰを発現している心細胞などの細胞からのＩｔｏ電流又は神経伝達物質の放出をモニタすることで調べてもよい。細胞中の例えばＩｔｏ電流などの電流を、例のセクションで述べるパッチクランプ法で、例えばＨａｍｉｌｌ他  １９８１．Ｐｆｌｕｅｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．３９１：８５−１００に記載の技術を用いて測定してもよい。前記細胞が、例えば哺乳類由来細胞であってもよい。前記試験化合物がＰＣＩＰの基質結合能力を調節する能力を、例えば前記ＰＣＩＰ基質のＰＣＩＰへの結合を、複合体中の標識した前記ＰＣＩＰ基質を検出することで調べられるように、前記ＰＣＩＰ基質を放射性標識又は酵素標識と結合させることによって調べてもよい。例えば、（ＰＣＩＰ基質などの）化合物を、直接又は間接に１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３Ｈで標識し、放射線放出の直接計数又はシンチレーション計数によって放射性同位体を検出してもよい。或いは、化合物を、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はルシフェラーゼなどで酵素標識した後に、適切な基質からの産物の生成を調べることで、前記酵素標識を検出してもよい。
【０１８８】
（例えばＰＣＩＰ基質などの）化合物がＰＣＩＰと相互作用する能力を上記反応体のいずれをも標識することなく調べることも、本発明の範囲に含まれる。例えば、マイクロフィジオメータを用いて、ある化合物がＰＣＩＰと相互作用する能力を、前記化合物又は前記ＰＣＩＰのいずれをも標識することなく検出してもよい。ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．他（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１９０６−１９１２。ここで使用する（例えばＣｙｔｏｓｅｎｓｏｒ（登録商標）などの）「マイクロフィジオメータ」は、ある細胞がその環境を酸性化させる速度を、光アドレス可能電位計測計（ＬＡＰＳ）を用いて測定する分析機器である。この酸化速度の変化を、ある化合物とＰＣＩＰとの間の相互作用の指標として使用してもよい。
【０１８９】
一実施態様においては、アッセイが、（例えばカリウムチャネル又はその断片などの）ＰＣＩＰ標的分子を発現している細胞を試験化合物と接触させ、前記試験化合物が前記ＰＣＩＰ標的分子の活性を（例えば刺激又は阻害するなど）調節する能力を調べることが含まれる、細胞ベースのアッセイである。前記試験化合物がＰＣＩＰ標的分子の活性を調節する能力を、例えば前記ＰＣＩＰタンパク質がカリウムチャネル又はその断片などのＰＣＩＰ標的分子と結合するか又は相互作用する能力を調べることによって決定してもよい。
【０１９０】
前記ＰＣＩＰタンパク質又はその生物学的活性断片がＰＣＩＰ標的分子と結合するか又は相互作用する能力を、直接結合を調べるための上述の複数の方法のうちの１つによって調べてもよい。好適な一実施態様においては、ＰＣＩＰタンパク質がＰＣＩＰ標的分子と結合するか又は相互作用する能力を、前記標的分子の活性を調べることによって調べてもよい。例えば、前記標的分子の前記活性を、前記標的の細胞内セカンドメッセンジャー（即ち、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）の導入を検出することにより、前記標的の適切な基質に対する触媒／酵素活性を検出することにより、（例えばルシフェラーゼなどの検出可能なマーカをコードする核酸に作動的に連結した標的応答性の調節要素を持つ）レポータ遺伝子の導入を検出することにより、又は標的により調節される、例えば神経伝達物質の放出などの細胞応答を検出することにより、調べてもよい。
【０１９１】
更に別の一実施態様においては、本発明のアッセイが、ＰＣＩＰタンパク質又はその生物学的活性部分を試験化合物と接触させて、前記試験化合物が前記ＰＣＩＰタンパク質又はその生物学的活性部分と結合する能力を調べる無細胞アッセイである。本発明のアッセイで使用する前記ＰＣＩＰタンパク質の好適な生物学的活性部分には、例えばカリウムチャネル又はその断片或いは表面に存在する確率の高い断片などの、非ＰＣＩＰ分子との相互作用に参加する断片が含まれる。前記試験化合物の前記ＰＣＩＰタンパク質への結合を、上述の方法で直接に又は間接に調べてもよい。好適な一実施態様においては、前記アッセイに、前記ＰＣＩＰタンパク質又はその生物学的活性部分を、ＰＣＩＰと結合してアッセイ混合物を形成する既知の化合物に接触させることと、前記アッセイ混合物を試験化合物に接触させることと、前記試験化合物がＰＣＩＰタンパク質と相互作用する能力を調べることと、が含まれ、ここで、前記試験化合物がＰＣＩＰタンパク質と相互作用する能力を調べることに、前記試験化合物が、ＰＣＩＰ又はその生物学的活性部分に、前記既知の化合物と比較して優先的に結合する能力を調べることが含まれる。
【０１９２】
別の一実施態様においては、前記アッセイが、ＰＣＩＰタンパク質又はその生物学的活性部分を試験化合物と接触させ、前記試験化合物が前記ＰＣＩＰタンパク質又はその生物学的活性部分の活性を（例えば刺激するか又は阻害するなど）調節する能力を調べる無細胞アッセイである。前記試験化合物が前記ＰＣＩＰタンパク質の活性を調節する能力を、例えば、前記ＰＣＩＰタンパク質がＰＣＩＰ標的分子と結合する能力を、直接結合を調べるための上述の複数の方法のうちの１つを用いて調べることによって調べてもよい。また、前記ＰＣＩＰタンパク質がＰＣＩＰ標的分子と結合する能力を、リアルタイム生体分子間相互作用解析（ＢＩＡ）などの技術を用いて調べてもよい。Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．及びＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５並びにＳｚａｂｏ他（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５。ここで使用する「ＢＩＡ」は、反応体のいずれをも標識することなく生体特異的相互作用をリアルタイムで観察するための、（例えばＢＩＡｃｏｒｅなどの）技術である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象の変化を、生体分子間のリアルタイム反応の指標として用いてもよい。
【０１９３】
別の一実施態様においては、試験化合物がＰＣＩＰタンパク質の活性を調節する能力を、前記ＰＣＩＰタンパク質がＰＣＩＰ標的分子の下流エフェクタの活性を更に調節する能力を調べることで調べてもよい。例えば、先に述べたように、前記エフェクタ分子の適切な標的に対する活性を調べてもよいし、又は、前記エフェクタの適切な標的への結合を調べてもよい。
【０１９４】
更に別の一実施態様においては、前記無細胞アッセイに、ＰＣＩＰタンパク質又はその生物学的活性部分を、前記ＰＣＩＰタンパク質と結合してアッセイ混合物を形成する既知の化合物と接触させることと、前記アッセイ混合物を試験化合物と接触させることと、前記試験化合物が前記ＰＣＩＰタンパク質と相互作用する能力を調べることと、が含まれ、ここで、前記試験化合物が前記ＰＣＩＰタンパク質と相互作用する能力を調べることに、前記ＰＣＩＰタンパク質がＰＣＩＰ標的分子と優先的に結合するか又はその活性を調節する能力を調べることが含まれる。
【０１９５】
本発明の無細胞アッセイでは、単離されたタンパク質の溶解可能な形及び／又は膜結合した形の双方を使用可能である。（例えばカリウムチャネルなどの）膜結合した形の単離されたタンパク質を使用する無細胞アッセイの場合は、前記単離されたタンパク質の膜結合した形が溶液中で維持されるような具合に可溶化剤を利用することが望ましいであろう。そのような可溶化剤の例には、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、  ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ（登録商標）、イソトリデシポリ（原語Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ）（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）又はＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１９６】
本発明の上述のアッセイ方法のうちの複数の実施態様においては、ＰＣＩＰ又はその標的分子を固定して、前記２つのタンパク質の一方又は双方の、複合体を形成している形から複合体を形成していない形への分離を容易にすると共に、アッセイの自動化を図ることが望ましいであろう。試験化合物のＰＣＩＰタンパク質への結合又は候補化合物の存在下及び非存在下におけるＰＣＩＰタンパク質の標的分子との相互作用を、これらの反応物を入れるのに適したいかなる容器中で実施してもよい。そのような容器の例には、マイクロタイタプレート、試験管及び微量遠心分離管が含まれる。一実施態様においては、これらのタンパク質の一方又は双方を基質に結合可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供してもよい。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＰＣＩＰ融合タンパク質又はグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（モンタナ州セントルイス、シグマケミカル社）又はグルタチオンで誘導体化した複数のマイクロタイタプレート上に吸着させ、次にこれらを、前記試験化合物と混合させるか、或いは前記試験化合物及び吸着されていない前記標的タンパク質又はＰＣＩＰタンパク質と混合させ、この混合物を（例えば生理的な食塩及びｐＨ条件などの）複合体を形成可能な条件下でインキュベートしてもよい。インキュベーション後に、前記複数のビーズ又はマイクロタイタプレートを洗浄して未結合成分を全て除去し、ビーズの場合には前記マトリックスを固定し、複合体を、例えば上述のように直接又は間接に調べる。又は、前記複合体を前記マトリックスから解離させ、ＰＣＩＰ結合又は活性のレベルを標準的な技術を用いて測定してもよい。
【０１９７】
タンパク質をマトリックス上に固定するためのその他の技術も、本発明のスクリーニングアッセイで使用可能である。例えば、ＰＣＩＰタンパク質又はＰＣＩＰ標的分子のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して固定してもよい。ビオチン標識したＰＣＩＰタンパク質又は標的分子を、（例えばビオチン標識キット、イリノイ州ロックフォード、ピアースケミカル社などの）当業で周知の技術を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から作製し、ストレプトアビジンでコートした９６ウェルプレートのウェル中に固定してもよい。又は、ＰＣＩＰタンパク質又は標的分子と反応するが前記ＰＣＩＰタンパク質とその標的分子との結合は妨害しない抗体を、前記プレートの前記ウェル中で誘導体化させ、未結合の標的又はＰＣＩＰタンパク質を、抗体結合によって前記ウェル中に捕捉してもよい。そのような複合体を検出する方法には、ＧＳＴ固定複合体について上述した方法に加えて、前記ＰＣＩＰタンパク質又は標的分子と反応する抗体を用いた複合体の免疫検出法や、前記ＰＣＩＰタンパク質又は標的分子に関連した酵素活性の検出に依存した酵素結合アッセイが含まれる。
【０１９８】
好適な一実施態様においては、候補又は試験化合物又は物質を、これらがＰＣＩＰ分子の、例えば神経細胞又は心細胞などの細胞内の小胞輸送及びタンパク質輸送調節能力を阻害するか又は刺激する能力について、例えばその内容が引用をもってここに援用された、Ｋｏｍａｄａ  Ｍ．他（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３（１１）：１４７５−８５及びＲｏｔｈ  Ｍ．Ｇ．他（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｌｉｐｉｄｓ．９８（１−２）：１４１−５２に記載のアッセイを用いて検査する。
【０１９９】
別の好適な一実施態様においては、候補又は試験化合物又は物質を、これらがＰＣＩＰ分子のカリウムチャネルタンパク質又はその一部分のリン酸化状態調節能力を阻害するか又は刺激する能力について、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏのキナーゼアッセイを利用して検査する。簡単に説明すると、そのような分子を発現している細胞系統からの免疫沈降させたカリウムチャネルなどのＰＣＩＰ標的分子を、例えば１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び５ｍＭのＭｎＣｌ２などのＭｇＣｌ２及びＭｎＣｌ２を含有する緩衝液中で、前記ＰＣＩＰタンパク質と、例えば［γ−３２Ｐ］ＡＴＰなどの放射性ＡＴＰと共にインキュベートしてもよい。前記インキュベーション後に、前記免疫沈降させた、例えばカリウムチャネルなどのＰＣＩＰ標的分子を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法にて還元条件下で分離し、例えばＰＶＤＦ膜なとの膜に転写し、オートラジオグラフ検出を行ってもよい。オートラジオグラフ上に現れた検出可能なバンドが、例えばカリウムチャネルなどの前記ＰＣＩＰ基質がリン酸化されたことを示す。前記リン酸化された基質のホスホアミノ酸分析を行って、前記ＰＣＩＰ基質上のどの残基がリン酸化されたのかを調べてもよい。簡単に説明すると、放射線によりリン酸化された前記タンパク質のバンドを前記ＳＤＳゲルから切り離し、部分的酸加水分解を行ってもよい。次に生成物を一次元電気泳動法にて分離し、例えばホスホイメージャ（原語ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）を用いて分析して、ニンヒドリン染色ホスホアミノ酸基準と比較してもよい。例えば、その内容が引用をもってここに援用されたＴａｍａｓｋｏｖｉｃ  Ｒ．他（１９９９）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０（５）：５６９−７８に記載のアッセイを行ってもよい。
【０２００】
別の好適な一実施態様においては、候補又は試験化合物又は物質を、これらがＰＣＩＰ分子のカルシウムと（例えば結合するなど）結び付く能力を阻害するか又は刺激する能力について、例えば、その内容が引用をもってここに援用されたＬｉｕ  Ｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ．１１（５）：３１７−２４及びＫａｗａｉ  Ｔ．他（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８（２３）：３４７１−８０に記載のアッセイによって検査する。
【０２０１】
別の好適な一実施態様においては、候補又は試験化合物又は物質を、これらがＰＣＩＰ分子の細胞内クロマチン形成調節能力を阻害するか又は刺激する能力について、例えば、その内容が引用をもってここに援用されたＯｋｕｗａｋｉ  Ｍ．他（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３（５１）：３４５１１−８及びＭｉｙａｊｉ−Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｍ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９０（２）：５４７−５５７に記載のアッセイによって検査する。
【０２０２】
更に別の好適な一実施態様においては、候補又は試験化合物又は物質を、これらがＰＣＩＰ分子の細胞増殖調節能力を阻害するか又は刺激する能力について、例えばその内容が引用をもってここに援用されたＢａｋｅｒ  Ｆ．Ｌ．他（１９９５）Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ．２８（１）：１−１５、Ｃｈｅｖｉｒｏｎ  Ｎ．他（１９９６）Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆ．２９（８）：４３７−４６、Ｈｕ  Ｚ．Ｗ．他（１９９９）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９０（１）：２８−３７及びＥｌｌｉｏｔｔ  Ｋ．他（１９９９）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １８（２４）：３５６４−７３に記載のアッセイによって検査する。
【０２０３】
好適な一実施態様においては、候補又は試験化合物又は物質を、これらがＰＣＩＰ分子の、カリウムチャネルタンパク質又はその一部分と細胞骨格との結合調節能力を阻害するか又は刺激する能力について、例えばその内容が引用をもってここに援用されたＧｏｎｚａｌｅｚ  Ｃ．他（１９９８）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４４（７）：１１１７−２７及びＣｈｉａ  Ｃ．Ｐ．他（１９９８）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２４４（１）：３４０−８に記載のアッセイによって検査する。
【０２０４】
別の好適な一実施態様においては、候補又は試験化合物又は物質を、これらがＰＣＩＰ分子の膜興奮性調節能力を阻害するか又は刺激する能力について、例えばその内容が引用をもってここに援用されたＢａｒ−Ｓａｇｉ  Ｄ．他（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（８）：４７４０−４及びＢａｒｋｅｒ  Ｊ．Ｌ．他（１９８４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．４７（３）：３１３−８に記載のアッセイによって検査する。
【０２０５】
別の好適な一実施態様においては、候補又は試験化合物又は物質を、これらがＰＣＩＰ分子の、例えば神経細胞又は心細胞などの細胞におけるサイトカインシグナリング調節能力を阻害するか又は刺激する能力について、例えばその内容が引用をもってここに援用されたＮａｋａｓｈｉｍａ  Ｙ．他（１９９９）Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．Ａｍ．８１（５）：６０３−１５に記載のアッセイによって検査する。
【０２０６】
別の一実施態様においては、ＰＣＩＰ発現のモジュレータを、細胞を候補化合物と接触させ、前記細胞中のＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を調べる方法によって特定する。前記候補化合物の存在下でのＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルを、前記候補化合物の非存在下でのＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現レベルと比較する。この比較に基づき、前記候補化合物がＰＣＩＰ発現のモジュレータであることを確認する。例えば、ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が、前記候補化合物の非存在下におけるよりも前記候補化合物の存在下における方が多い（統計学上有意に多い）場合には、前記候補化合物がＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の刺激物質であることが確認される。又は、ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現が、前記候補化合物の非存在下におけるよりも前記候補化合物の存在下における方が少ない（統計学上有意に少ない）場合には、前記候補化合物がＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ又はタンパク質の阻害物質であることが確認される。細胞内のＰＣＩＰ  ｍＲＭＡ又はタンパク質の発現レベルを、ここに記載のＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ又はタンパク質検出方法を用いて調べてもよい。
【０２０７】
本発明の更に別の一局面においては、前記ＰＣＩＰタンパク質を、２ハイブリッドアッセイ又は３ハイブリッドアッセイにおける「おとりタンパク質」として使用して（例えば、米国特許Ｎｏ．５，２８３，３１７；Ｚｅｒｖｏｓ他（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７２：２２３−２３２；Ｍａｄｕｒａ他（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌ他（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉ他（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ８：１６９３−１６９６；及びＢｒｅｎｔ  ＷＯ９４／１０３００を参照のこと）、ＰＣＩＰと結合するか又は相互作用してＰＣＩＰ活性に関与する（詳細は後述の例のセクションに記載）その他のタンパク質（「ＰＣＩＰ結合タンパク質」又は「ＰＣＩＰ−ｂｐ」）を特定してもよい。これらのようなＰＣＩＰ結合タンパク質は、ＰＣＩＰが媒介するシグナリング経路の下流要素として、前記ＰＣＩＰタンパク質又はＰＣＩＰ標的によるシグナル伝達にも関与する可能性がある。又は、これらのようなＰＣＩＰ結合タンパク質は、ＰＣＩＰ阻害物質である可能性がある。
【０２０８】
前記２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ活性化ドメインとから構成される大多数の転写因子のモジュール的特性に基づいている。簡単に説明すると、このアッセイは、２つの異なるＤＮＡコンストラクトを利用する。一方のコンストラクトにおいては、あるＰＣＩＰタンパク質をコードする遺伝子が、（例えばＧＡＬ−４などの）既知の転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子と融合している。他方のコンストラクトにおいては、ＤＮＡ配列のライブラリから得た、ある不特定のタンパク質（「餌食」又は「試料」）をコードするあるＤＮＡ配列が、前記既知の転写因子の前記活性化ドメインをコードする遺伝子と融合している。前記「おとり」タンパク質と前記「餌食」タンパク質とがｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用してＰＣＩＰ依存性の複合体を形成可能である場合には、前記転写因子の前記ＤＮＡ結合ドメインと前記ＤＮＡ活性化ドメインとはきわめて近接している。これらが近接していることにより、（例えばＬａｃＺなどの）転写調節部位に作動的に連結したレポータ遺伝子の前記転写因子に応えた転写が可能となる。前記レポータ遺伝子の発現を検出して、前記機能的転写因子を含有した細胞コロニを単離し、前記ＰＣＩＰタンパク質と相互作用する前記タンパク質をコードするクローン化遺伝子の作製に使用してもよい。
【０２０９】
本発明は、上述のスクリーニングアッセイで確認された新規な物質に更に関する。従って、ここに記載の方法で確認された物質を適切な動物モデル中で更に使用することも、本発明の範囲に含まれる。例えば、ここに記載の方法で確認された（例えばＰＣＩＰ調節物質、アンチセンスＰＣＩＰ核酸分子、ＰＣＩＰ特異的抗体又はＰＣＩＰ結合相手などの）物質を動物モデル中で使用して、そのような物質を用いた治療の有効性、毒性又は副作用を調べてもよい。又は、ここに記載の方法で確認された物質を動物モデル中で使用して、そのような物質の作用機序を調べてもよい。更に、本発明は、上述のスクリーニングアッセイで確認された新規な物質を、例えばここに記載の中枢神経系障害又は心臓血管障害の治療などの治療に使用することに関する。
【０２１０】
Ｂ．検出アッセイ
ここで同定されたｃＤＮＡ配列（及び対応する完全な遺伝子配列）の部分又は断片を、様々な方法でポリヌクレオチド試薬として使用可能である。例えば、これらの配列を、（ｉ）各遺伝子の染色体マッピングによる、遺伝子疾患に関連する遺伝子領域の特定；（ｉｉ）微小な生体試料からの個体識別（組織タイピング）；及び（ｉｉｉ）生体試料の法医学的識別の補助に使用してもよい。これらの用途について、以下のサブセクションで説明する。
【０２１１】
１．染色体マッピング
ある遺伝子の配列（又は前記配列の一部分）を単離すると、この配列を染色体上の前記遺伝子の位置決定に使用することができる。この過程は、染色体マッピングと呼ばれる。従って、ここに記載のＰＣＩＰヌクレオチド配列の部分又は断片を、前記ＰＣＩＰ遺伝子の染色体上の位置決定に使用することが可能である。ＰＣＩＰ配列の染色体マッピングは、これらの配列を疾患関連遺伝子と相関させる上で重要な最初のステップである。
【０２１２】
簡単に説明すると、ＰＣＩＰ遺伝子を、これらのＰＣＩＰヌクレオチド配列から（好適には１５乃至２５塩基長の）ＰＣＲプライマを作製することにより、染色体上にマッピングすることが可能である。これらのＰＣＩＰ配列のコンピュータ分析によって、前記ゲノムＤＮＡ中で１エキソンを超えない長さのプライマを予測することにより、増幅プロセスを複雑化させてもよい。次にこれらのプライマを、ヒト個体の染色体を持つ体細胞雑種のＰＣＲスクリーニングに使用してもよい。前記ＰＣＩＰ遺伝子配列に対応する前記ヒト遺伝子を持つこれらの雑種のみから、増幅された断片が産生される。
【０２１３】
体細胞雑種は、（例えばヒト細胞とマウス細胞などの）異なる複数の哺乳類からの体細胞を融合させることで作製される。ヒト及びマウス細胞の雑種は、成長し分化するにつれて、次第にヒト染色体をランダムな順序で失っていくが、マウスの染色体は維持し続ける。マウス細胞はある特定の酵素を持たないためにその中では成長できないがヒト細胞はその中で成長可能な培地を用いると、この必要な酵素をコードする遺伝子を持つヒトの一染色体が残る。様々な培地を用いることで、複数の雑種細胞株からなるパネルを樹立することが可能である。一パネル中の各細胞株には、単一のヒト染色体又は少数のヒト染色体のいずれかと、マウス染色体の完全な一組とが含まれるので、各遺伝子を特定のヒト染色体に容易にマッピング可能である（Ｄ’Ｅｕｓｔａｃｈｉｏ  Ｐ．他（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０：９１９−９２４）。ヒト染色体の断片のみを持つ体細胞雑種もまた、転座及び欠失を有するヒト染色体を用いて作製可能である。
【０２１４】
体細胞雑種のＰＣＲマッピングは、特定の配列を特定の染色体に割り当てる迅速な一方法である。一台のサーマルサイクラーを用いて、一日当たり３つ又はそれ以上の配列を割り当てることが可能である。ＰＣＩＰヌクレオチド配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマをデザインすることで、特定の複数の染色体からの断片からなるパネルのサブローカライザーション（原語ｓｕｂｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）を行ってもよい。ＰＣＩＰ配列をその染色体にマッピングするために同様に使用可能なその他のマッピング方法には、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｆａｎ，Ｙ．他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６２２３−２７に記載）、標識されたフローソーティングした染色体を用いたプレスクリーニング、及び染色体特異的なｃＤＮＡライブラリとのハイブリダイゼーションによるプリセレクション（原語ｐｒｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）が含まれる。
【０２１５】
ＤＮＡ配列の分裂中期染色体スプレッドへの蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブイダリゼーションにより、正確な染色体位置決定を一ステップで行ってもよい。染色体スプレッドは、有糸分裂紡錘体を破壊する、例えばコルセミドなどの化学薬品によって分裂中期で分化が停止した細胞を用いて作製可能である。これらの染色体をトリプシンで短時間処理した後に、ギームザで染色してもよい。各染色体上に明暗の帯のパターンが現れるので、これらの染色体を個々に識別することができる。５００又は６００塩基長程度のＤＮＡ配列の場合は、ＦＩＳＨ法を用いてもよい。しかし、１０００塩基長を超えるクローンの場合は、十分な信号強度で独自の染色体位置に結合する可能性がより高いので、検出が容易である。好適には１０００塩基長、より好適には２０００塩基長であれば、相当な時間で良い結果を得るのに充分であろう。この方法については、Ｖｅｒｍａ他、Ｈｕｍａｎ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（パーガモンプレス社、ニューヨーク  １９８８）を参照のこと。
【０２１６】
染色体マッピング用の試薬を個々に用いて、単一の染色体又はその染色体上の単一の部位を標識してもよいし、或いは、複数の試薬からなるパネルを用いて、複数の部位及び／又は複数の染色体を標識してもよい。遺伝子の非コード領域に対応する試薬が、実際にはマッピング用として好適である。コード配列は、複数の遺伝子ファミリーで保存されている可能性がより高いので、染色体マッピングの際にクロスハイブリダイゼーションを起こす確率が高い。
【０２１７】
ある配列をある正確な染色体位置にマッピングすると、その配列の前記染色体上の前記物理的位置を、遺伝子マップデータと相関させることができる。（そのようなデータは、例えばジョンズ・ホプキンズ大学ウェルチ・メディカル・ライブラリからオンラインで入手可能な、Ｖ．ＭｃＫｕｓｉｃｋ，Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎに見受けられる）。こうすることで、同じ染色体領域にマッピングされた遺伝子と疾患との間の関連性を、例えばＥｇｅｌａｎｄ，Ｊ．他（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ，３２５：７８３−７８７に記載されたリンケージ解析（物理的に隣り合った遺伝子が同時に遺伝すること）によって確認することが可能である。
【０２１８】
更に、ＰＣＩＰ遺伝子に関連したある疾患に罹患している個体と罹患していない個体とのＤＮＡ配列間の相違を調べることもできる。ある突然変異が前記罹患している個体の一部又は全てに観察され、罹患していない個体には全く観察されない場合には、この突然変異は、前記特定の疾患の原因因子である可能性がある。一般に、罹患している個体と罹患していない個体との比較においては、最初に、欠失又は転座などの、染色体スプレッドで見分けられるか又はそのＤＮＡ配列に基づくＰＣＲによって検出可能な、染色体の構造上の変化を調べる。最終的には、複数の個体からの遺伝子の完全な配列決定を行って、突然変異の存在を確認し、多型による変異と区別してもよい。
【０２１９】
２．組織タイピング
本発明のＰＣＩＰ配列は、微小な生体試料からの個体の識別にも使用可能である。例えば、米国陸軍は、その職員らの識別に、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）の使用を検討している。この方法では、個人のゲノムＤＮＡを１つ又は複数の制限酵素で消化し、サザンブロット法にて標識して生じた固有のバンドを識別に使用する。この方法は、現在使用されている「認識票」の、紛失、変造又は盗難のおそれがあるために確実な識別が困難であるという制約を受けない。本発明の配列は、ＲＦＬＰ用の更なるＤＮＡマーカとして有用である（米国特許５，２７２，０５７に記載）。
【０２２０】
更に、本発明の配列は、ある個体のゲノムの選択された部分の実際の塩基毎のＤＮＡ配列を調べる代替的な方法に使用可能である。従って、ここに記載のＰＣＩＰヌクレオチド配列を用いて、これらの配列の５’末端及び３’末端から２つのＰＣＲプライマを作製可能である。これらのプライマを次に、ある個体のＤＮＡの増幅及び配列決定に使用してもよい。
【０２２１】
この方法で作製した、複数の個体からの対応するＤＮＡ配列からなるパネルを用いると、各個体が対立遺伝子の相違のために固有のそのようなＤＮＡ配列の一組を持つことから、特定の個体を識別することが可能である。本発明の配列を用いて、そのような識別配列を、個体及び組織から得てもよい。本発明のＰＣＩＰヌクレオチド配列は、ヒトゲノムの部分を固有に表している。対立遺伝子による変異は、これらの配列のコード領域にある程度の割合で起こり、非コード領域にはより高い割合で起こる。ヒト個体間の対立遺伝子変異は、５００塩基毎に１つの割合で起こると推定される。ここに記載の配列はそれぞれ、ある程度まで、ある個体からのＤＮＡを識別のために比較する基準として使用可能である。非コード領域ではより多数の多型が起こるので、個体の識別に要する配列がより少なくて済む。非コード配列の場合は、それぞれが１００塩基の非コード増幅配列を生成する１０乃至１０００個程度のプライマからなるパネルを用いて、十分に確実な個体識別が可能である。推定コード配列を使用する場合には、確実な個体識別に適したプライマの数は、５００乃至２０００であろう。
【０２２２】
ここに記載のＰＣＩＰヌクレオチド配列からの試薬のパネルを使用して、ある個体の固有の識別データベースを作成する場合には、後にこれらと同じ試薬を、その個体からの組織の識別に使用することができる。この固有の識別データベースを使用すると、生存しているか又は死亡した前記個体の確実な識別を、非常に小さな組織試料からでも行うことが可能である。
【０２２３】
３．法医生物学における部分ＰＣＩＰ配列の使用
ＤＮＡに基づく識別技術を、法医生物学で使用してもよい。法医生物学は、犯罪現場で発見された生物学的証拠の遺伝子タイピングを、例えば実行犯の確実な識別のための手段として利用する学問分野である。そのような識別を実施するために、ＰＣＲ法により、犯罪現場で発見された、例えば毛髪又は皮膚などの組織或いは血液、唾液又は精液などの体液などの非常に微小な生体試料から採取したＤＮＡ配列を増幅してもよい。この増幅した配列を、次に、基準と比較して、前記生体試料の出所を識別してもよい。
【０２２４】
本発明の配列を、ヒトゲノム中の特定の遺伝子座を標的とする、例えばＰＣＲプライマなどのポリヌクレオチド試薬の作製に使用して、例えばもう一つの「識別マーカ」（即ち、特定の個体に固有の別の一ＤＮＡ配列）を作製することにより、ＤＮＡに基づく法医学的識別の信頼度を高めてもよい。上述したように、実際の塩基配列情報を、制限酵素によって生じた断片によって形成されるパターンに正確に代わるものとして、識別に使用してもよい。非コード領域を標的とする配列は、非コード領域ではより多くの多型が起こり、この方法を用いた個体の区別が容易であることから、この用途にとりわけ適している。ポリヌクレオチド試薬の例には、少なくとも２０塩基長、好適には少なくとも３０塩基長のＰＣＩＰヌクレオチド配列又はその部分が含まれる。
【０２２５】
ここに記載のＰＣＩＰヌクレオチド配列を、例えばｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法で使用可能な、例えば標識された又は標識可能なプローブなどのポリヌクレオチド試薬の作製に更に使用して、例えば脳組織などの特定の組織を識別してもよい。この用法は、法医病理学者に提示された組織の出所が不明である事例において、特に有用であろう。複数のそのようなＰＣＩＰプローブからなるパネルを、組織の種別の及び／又は器官別の識別に用いてもよい。
【０２２６】
同様の方法で、例えばＰＣＩＰプライマ又はプローブなどのこれらの試薬を、組織培地のコンタミネーション検査（即ち、培地中に異なる種類の細胞が混入しているか否かを調べる検査）に用いてもよい。
【０２２７】
Ｃ．予測薬
本発明は、診断アッセイ、予測アッセイ及び臨床検査のモニタを予後診断（予測）の目的で行って個体を予防的に治療する、予測薬の分野にも関する。従って、本発明の一局面は、（例えば血液、血清、細胞、組織などの）生体試料におけるＰＣＩＰタンパク質及び／又は核酸の発現並びにＰＣＩＰ活性を調べることにより、ある個体がある疾患又は障害に罹患しているか否か、或いは異常なＰＣＩＰ発現又は活性に関連した障害を発生するおそれがあるか否かを調べるための診断アッセイに関する。本発明はまた、ある個体がＰＣＩＰタンパク質、核酸の発現又は活性に関連する障害を発生するおそれがあるか否かを調べるための予後診断（又は予測）アッセイも提供する。例えば、あるＰＣＩＰ遺伝子の突然変異を生体試料でアッセイしてもよい。そのようなアッセイを予後診断又は予測の目的で行って、ＰＣＩＰタンパク質、核酸の発現又は活性を特徴とする、或いはこれらに関連した障害をある個体が発生する前に、前記個体を予防的に治療してもよい。
【０２２８】
本発明の別の一局面は、臨床検査においてＰＣＩＰの発現又は活性に（例えば薬剤、化合物などの）物質が及ぼす影響をモニタすることに関する。
【０２２９】
これらの及びその他の物質について、次のサブセクションでより詳細に説明する。
【０２３０】
１．診断アッセイ
生体試料中のＰＣＩＰタンパク質又は核酸の有無を検出する方法の一例は、対象から生体試料を採取し、前記生体試料中でＰＣＩＰタンパク質又は核酸の存在が検出できるような方法で、前記生体試料を、ＰＣＩＰタンパク質をコードする（例えばｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡなどの）ＰＣＩＰタンパク質又は核酸を検出することの可能な化合物又は物質と接触させることに関する。ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出するための好適な物質は、ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることの可能な標識された核酸プローブである。前記核酸プローブは、例えば、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７４、配列番号：７５、配列番号：７７、配列番号：７９、配列番号：８０、配列番号：８２、配列番号：８４、配列番号：８６、配列番号：８８、配列番号：９０、配列番号：９２、配列番号：９４、配列番号：９６、配列番号：９８、配列番号：１００又は配列番号：１０２で表される核酸などの全長ＰＣＩＰ核酸、ＡＴＣＣに登録番号９８９３６、９８９３７、９８９３８、９８９３９、９８９４０、９８９４１、９８９４２、９８９４３、９８９４４、９８９４５、９８９４６、９８９４７、９８９４８、９８９４９、９８９５０、９８９５１、９８９９１、９８９９３又は９８９９４で寄託されたプラスミドのＤＮＡインサート、或いは、例えばストリンジェントな条件下でＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡと特異的にハイブリダイズするのに十分な、少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０又は５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドなどの、その一部分であってもよい。本発明の診断アッセイに使用するその他の好適なプローブは、本願中に記載されている。
【０２３１】
ＰＣＩＰタンパク質を検出するための好適な一物質は、ＰＣＩＰタンパク質と結合可能な抗体であり、好適には検出可能に標識された抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体であってもよいが、より好適にはモノクローナル抗体である。完全な抗体又はその（例えばＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２などの）断片を使用してもよい。プローブ又は抗体に関して使用される「標識された」という用語は、前記プローブ又は抗体に検出可能な物質を結合させる（即ち物理的に連結させる）ことによって前記プローブ又は抗体を直接に標識することと、前記プローブ又は抗体を、直接に標識された別の一試薬との反応性によって間接に標識することと、を包含するものとして意図されている。間接標識の例には、蛍光標識された二次抗体を用いて一次抗体を検出することと、ＤＮＡプローブを、蛍光標識したストレプトアビジンで検出可能であるような方法で、ビオチンで末端標識することと、が含まれる。「生体試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞及び体液と、対象内に存在する組織、細胞及び体液と、を包含するものとして意図されている。即ち、本発明の前記検出方法は、生体試料中のＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ、タンパク質又はゲノムＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出とｉｎ  ｖｉｖｏ検出との双方に使用可能である。例えば、ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法には、ノーザンハイブリダイゼーション及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。ＰＣＩＰタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＺＡ）、ウェスタンブロット法、免疫沈降法及び免疫蛍光法が含まれる。ＰＣＩＰゲノムＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出方法には、サザンハイブリダイゼーションが含まれる。更に、ＰＣＩＰタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ検出方法には、対象中に標識された抗ＰＣＩＰ抗体を導入することが含まれる。例えば、前記抗体を、対象中におけるその存在と位置とを標準的な撮像方法で検出可能な放射性マーカで標識してもよい。
【０２３２】
一実施態様においては、前記生体試料が、前記検査対象からのタンパク質分子を含有する。又は、前記生体試料が、前記検査対象からのｍＲＮＡ分子又は前記検査対象からのゲノムＤＮＡ分子を含有してもよい。好適な一生体試料は、対象から常法で単離された血清試料又は髄液である。
【０２３３】
別の一実施態様においては、前記複数の方法が、コントロール対象からコントロール生体試料を採取し、前記コントロール試料を、ＰＣＩＰタンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡが前記生体試料中で検出されるような方法で、ＰＣＩＰタンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出することの可能な化合物又は物質と接触させ、前記コントロール試料中のＰＣＩＰタンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在を、前記検査試料中のＰＣＩＰタンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの存在と比較することに更に関する。
【０２３４】
本発明は、生体試料中のＰＣＩＰの存在を検出するためのキットも包含する。例えば、前記キットに、生体試料中のＰＣＩＰタンパク質又はｍＲＮＡを検出することの可能な標識された化合物又は物質と、前記試料中のＰＣＩＰの量を測定するための手段と、前記試料中の前記ＰＣＩＰ量を基準と比較するための手段と、が含まれてもよい。前記化合物又は物質が適切な容器中に封入されていてもよい。前記キットに、前記キットをＰＣＩＰタンパク質又は核酸の検出に使用するための使用説明書が更に含まれてもよい。
【０２３５】
２．予測アッセイ
ここに記載の診断方法を、更に、異常なＰＣＩＰ発現又は活性に関連した疾患又は障害を有するか又は発生するおそれのある対象を特定するために利用してもよい。例えば、前述の診断アッセイ又は後述のアッセイなどの、ここに記載するアッセイを、例えばアルツハイマー病、アルツハイマー病に伴う（ピック病などの）痴呆、パーキンソン病及びその他のレーヴィ体びまん性疾患、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、てんかん、脊髄小脳失調及びヤコブ−クロイツフェルト病などの神経変性障害；例えばうつ病、分裂病性障害、コルサコフ精神病、躁病、不安障害、双極性感情病又は恐怖症などの精神障害；例えば健忘症又は加齢に伴う記憶喪失などの学習又は記憶障害；例えば偏頭痛などの神経障害；例えば痛覚過敏又は筋骨格障害に伴う痛みなどの痛覚障害；脊髄損傷；卒中；及び頭部外傷或いは洞結節機能不全、狭心症、心不全、高血圧、心房細動、心房粗動、拡張型心筋症、特発性心筋症、心筋梗塞、冠状動脈疾患、冠状動脈痙攣又は不整脈などの心臓血管障害などの、ＰＣＩＰタンパク質活性又は核酸発現の調節不全に関連した障害を有するか又は発生するおそれのある対象を特定するために使用してもよい。
【０２３６】
又は、前記予測アッセイを、カリウムチャネル関連障害などの、ＰＣＩＰタンパク質活性又は核酸発現の調節不全に関連した障害を有するか又は発生するおそれのある対象を特定するために利用してもよい。このように、本発明は、異常なＰＣＩＰ発現又は活性に関連した疾患又は障害を特定するための、検査試料を対象から採取し、ＰＣＩＰタンパク質又は（例えばｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡなどの）核酸を検出し、ＰＣＩＰタンパク質又は核酸の存在によって、異常なＰＣＩＰ発現又は活性に関連した疾患又は障害を有するか又は発生するおそれのある対象が診断される方法を提供する。ここで使用する「検査試料」は、目的の対象から採取した生体試料を指す。例えば、ある検査試料が、（例えば血清などの）体液、細胞試料又は組織であってもよい。
【０２３７】
更に、ここに記載の予測アッセイを、異常なＰＣＩＰ発現又は活性に関連した疾患又は障害を治療するために、対象に（例えばアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子又はその他の薬剤候補などの）物質を投与してもよいか否かを調べるために用いてもよい。例えば、そのような方法を用いて、ある対象の中枢神経系障害又は心臓血管障害をある物質で有効に治療できるか否かを調べてもよい。このように、本発明は、ある対象の異常なＰＣＩＰ発現又は活性に関連した障害をある物質で有効に治療できるか否かを調べるための、検査試料を採取してＰＣＩＰタンパク質又は核酸の発現又は活性を検出する方法（例えば、ＰＣＩＰタンパク質又は核酸の発現又は活性が高度であれば、異常なＰＣＩＰ発現又は活性に関連した障害を治療するために対象に前記物質を投与可能であると診断される）を提供する。
【０２３８】
本発明の方法を、ＰＣＩＰ遺伝子における遺伝子の変化の検出に用いて、前記変化した遺伝子を持つ対象が、ＰＣＩＰタンパク質の活性又は核酸の発現の調節不全を特徴とする中枢神経系障害又は心臓血管障害などの障害に罹患するおそれがあるか否かを調べてもよい。好適な複数の実施態様においては、前記方法に、前記対象からの細胞試料における、ＰＣＩＰタンパク質をコードする遺伝子の完全性を損なう変化又は前記ＰＣＩＰ遺伝子の誤った発現の少なくとも一方を特徴とする遺伝子の変化の有無を検出することが含まれる。例えば、そのような遺伝子の変化を、１）ＰＣＩＰ遺伝子からの１つ又は複数のヌクレオチドの欠失；２）ＰＣＩＰ遺伝子への１つ又は複数のヌクレオチドの付加；３）ＰＣＩＰ遺伝子の１つ又は複数のヌクレオチドの置換；４）ＰＣＩＰ遺伝子の染色体再構成；５）ＰＣＩＰ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写産物レベルでの変化；６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンなどの、ＰＣＩＰ遺伝子の異常な修飾；７）ＰＣＩＰ遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写産物の非野生型スプライシングパターンの存在；８）ＰＣＩＰタンパク質の非野生型レベル；９）ＰＣＩＰ遺伝子の対立遺伝子欠失及び、１０）ＰＣＩＰタンパク質の不適切な翻訳後修飾のうちの少なくとも１つの存在を確認することで検出してもよい。ここに記載するように、ＰＣＩＰ遺伝子の変化の検出に使用可能なアッセイは、当業で数多く知られている。好適な生体試料は、常法で対象から単離された組織又は血清試料である。
【０２３９】
複数の実施態様においては、前記変化の検出の際に、アンカーＰＣＲ又はＲＡＣＥ  ＰＣＲなどのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許Ｎｏ．４，６８３，１９５及び４，６８３，２０２を参照のこと）において、或いは、ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎ他（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７−１０８０；及びＮａｋａｚａｗａ他（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３６０−３６４を参照のこと）においてプローブ／プライマを使用する。後者の方法はとりわけ、ＰＣＩＰ遺伝子中の点突然変異の検出に有用であろう（Ａｂｒａｖａｙａ他（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２を参照のこと）。この方法に、対象から細胞試料を採取するステップと、前記細胞試料から（例えばゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ又はこれらの双方などの）核酸を単離するステップと、前記核酸試料を、ＰＣＩＰ遺伝子に特異的にハイブリダイズする１つ又は複数のプライマと、前記ＰＣＩＰ遺伝子（存在する場合には）のハイブリダイゼーション及び増幅が起こるような条件下で接触させるステップと、前記増幅産物の有無を検出するステップ又は前記増幅産物の大きさを検出して、その長さをコントロール試料と比較するステップと、が含まれてもよい。ＰＣＲ及び／又はＬＣＲは、ここに記載の突然変異検出方法のいずれかと組み合わせた予備的な増幅ステップとして用いることが望ましいであろう。
【０２４０】
その他の増幅方法には：３ＳＲ法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．他（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．他（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．他（１９８８）Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）又は任意のその他の核酸増幅方法と、これに続いて、前記増幅した分子を当業で周知の方法を用いて検出することと、が含まれる。これらの検出方法は、存在する数の非常に少ない核酸分子を検出する場合に、特に有用であろう。
【０２４１】
別の一実施態様においては、試料細胞からのＰＣＩＰ遺伝子における突然変異を、制限酵素の開裂パターンの変化によって識別してもよい。例えば、試料ＤＮＡとコントロールＤＮＡとを単離し、（任意に）増幅し、１つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼで消化し、断片長サイズをゲル電気泳動法にて測定して比較する。試料ＤＮＡとコントロールＤＮＡとの断片長サイズが異なる場合は、試料ＤＮＡに突然変異があることが示される。更に、配列特異的リボザイム（例えば米国特許Ｎｏ．５，４９８，５３１を参照のこと）を用いて、リボザイムによる開裂部位の発生又は消失によって、特定の突然変異の存在を判定してもよい。
【０２４２】
別の複数の実施態様においては、ＰＣＩＰにおける遺伝子の突然変異を、試料と、例えばＤＮＡ又はＲＮＡなどの複数のコントロール核酸とをハイブリダイズさせて、数百個又は数千個のオリゴヌクレオチドプローブを有する複数の高密度アレイを作製することで、確認してもよい（Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．他（１９９６）Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌ  Ｍ．Ｊ．他（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：７５３−７５９）。例えば、ＰＣＩＰにおける遺伝子の突然変異を、Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．他、同上に記載の光学的に生成されたＤＮＡプローブが含まれる二次元アレイで確認してもよい。簡単に説明すると、第１のプローブのハイブリダイゼーションアレイを用いて、試料及びコントロールの長いＤＮＡ鎖をスキャンし、配列が重複しているプローブの直線状のアレイを作製することで、これら２つの配列間の塩基の相違を調べることが可能である。このステップで、点突然変異を確認できる。次に、第２のハイブリダイゼーションアレイのステップで、検出された全てのバリアント又は突然変異と相補的な、より小さな特化した複数のプローブアレイを用いて、特定の突然変異の特徴を明らかにする。各突然変異アレイは、一方が前記野生型遺伝子と相補的であり他方が前記突然変異遺伝子と相補的な、互いに対応するプローブ対から構成される。
【０２４３】
更に別の一実施態様においては、当業で周知の様々なシーケンシング反応のうちの任意の反応により、ＰＣＩＰ遺伝子を直接に配列決定し、試料ＰＣＩＰの配列を対応する野生型（コントロール）配列と比較することにより、突然変異を検出してもよい。シーケンシング反応の例には、Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔ（（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５６０）又はＳａｎｇｅｒ（（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３）によって開発された技術に基づく反応がある。また、診断アッセイ（（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９：４４８）を実施する場合に、質量分析法によるシーケンシング（例えばＰＣＴ国際公開公報Ｎｏ．ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎ他（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２；及びＧｒｉｆｆｉｎ他（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９を参照のこと）を含めた様々な自動化シーケンシング法のうちの任意の方法を利用してもよいことも企図されている。
【０２４４】
ＰＣＩＰ遺伝子における突然変異のその他の検出方法には、開裂剤からの保護作用によって、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖におけるミス対合した塩基を検出する方法が含まれる（Ｍｙｅｒｓ他（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：１２４２）。一般に、「ミス対合開裂」方法では、最初に、野生型ＰＣＩＰ配列を持つ（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを、組織試料から採取した、突然変異している可能性のあるＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリダイズさせることにより、ヘテロ二本鎖を作製する。この二本鎖を、前記二本鎖の、例えばコントロール鎖と試料鎖との間の塩基対のミス対合によって存在する一本鎖部分を開裂させる物質で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖をリボヌクレアーゼで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理して、ミス対合している領域を酵素で消化してもよい。別の複数の実施態様においては、ＤＮＡ／ＤＮＡ二本鎖またはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のいずれかをヒドロキシルアミン又は四酸化オスミウムとピペリジンとで処理して、ミス対合した領域を消化してもよい。前記ミス対合領域の消化後、産物を変性ポリアクリルアミドゲル上でサイズ別に分離させ、突然変異部位を調べる。例えば、Ｃｏｔｔｏｎ他（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａ他（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５を参照のこと。好適な一実施態様においては、前記コントロールＤＮＡ又はＲＮＡが検出用に標識されていてもよい。
【０２４５】
更に別の一実施態様においては、前記ミス対合開裂反応で、細胞試料から採取したＰＣＩＰ  ｃＤＮＡ中の点突然変異の検出及びマッピングのための既知のシステムにおいて、二本鎖ＤＮＡ中のミス対合した塩基対を認識する１つ又は複数のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡミス対合修復」酵素）を利用する。例えば、大腸菌のｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／Ａミス対合におけるＡを開裂し、ＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼは、Ｇ／Ｔミス対合におけるＴを開裂する（Ｈｓｕ他（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ  １５：１６５７−１６６２）。一実施態様によれば、例えば野生型ＰＣＩＰ配列配列などのＰＣＩＰ配列に基づくプローブを、検査細胞からのｃＤＮＡ又はその他のＤＮＡ産物とハイブリダイズさせる。前記二本鎖をＤＮＡミス対合修復酵素で処理し、開裂産物がある場合には、これを電気泳動法などによって検出してもよい。例えば米国特許Ｎｏ．５，４５９，０３９を参照のこと。
【０２４６】
別の複数の実施態様においては、電気泳動移動度の相違を利用して、ＰＣＩＰ遺伝子における突然変異を確認する。例えば、一本鎖コンホメーション多型（ＳＳＣＰ）によって、突然変異核酸と野生型核酸との間の電気泳動移動度の相違を検出してもよい（Ｏｒｉｔａ他（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ：８６：２７６６；Ｃｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４；及びＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９を参照のこと）。試料ＰＣＩＰ核酸及びコントロールＰＣＩＰ核酸の一本鎖ＤＮＡ断片を変性させ、復元させる。一本鎖核酸の二次構造が配列によって異なるために生じる電気泳動移動度の相違によって、一塩基の変化でも検出可能である。ＤＮＡ断片を標識してもよいし、又は標識したプローブで検出してもよい。アッセイの感度を、（ＤＮＡの代わりに）ＲＮＡを用いることで向上させてもよい。この場合、前記二次構造は、配列変化に対する感受性がより高くなる。好適な一実施態様においては、本方法でヘテロ二本鎖分析を利用して、電気泳動移動度の相違に基づいてヘテロ二本鎖分子を分離させる（Ｋｅｅｎ他（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ７：５）。
【０２４７】
更に別の一実施態様においては、変性剤の勾配を有するポリアクリルアミドゲル中の突然変異断片又は野生型断片の移動を、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）にてアッセイする（Ｍｙｅｒｓ他（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３：４９５）。ＤＧＧＥを分析方法として用いる場合には、例えばおよそ４０塩基対の高融点のＧＣリッチなＤＮＡからなるＧＣクランプをＰＣＲにて付加することにより、ＤＮＡを完全には変性しないような具合に変化させる。更なる一実施態様においては、変性勾配の代わりに温度勾配を利用して、コントロールＤＮＡと試料ＤＮＡとの間の移動度の相違を調べる（Ｒｏｓｅｎｂａｕｍ及びＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ  ２６５：１２７５３）。
【０２４８】
点突然変異のその他の検出方法には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅法又は選択的プライマ伸長法が含まれるが、これらに限定されることはない。例えば、既知の突然変異が中央部に位置するオリゴヌクレオチドプライマを作製し、これを、完全な対合が見つかった場合にのみハイブリダイゼーションが起こるような条件下で標的ＤＮＡとハイブリダイズさせてもよい（Ｓａｉｋｉ他（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉ他（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：６２３０）。前記対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイゼーション膜に付着させて、標識された標的ＤＮＡとハイブリダイズさせると、ＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡとハイブリダイズするか、又は多数の異なる突然変異体とハイブリダイズする。
【０２４９】
又は、選択的ＰＣＲ増幅に依存した対立遺伝子特異的増幅法を本発明と組み合わせて用いてもよい。特異的増幅法用のプライマとして使用されるオリゴヌクレオチドによって、目的の突然変異が前記分子の中央部に位置してもよいし（この結果、増幅がディファレンシャルハイブリダイゼーションに依存する）（Ｇｉｂｂｓ他（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４４８）、或いは、適切な条件下ではミス対合を防止することができるか又はポリメラーゼ伸長が軽減される、プライマの３’末端に位置してもよい（Ｐｒｏｓｓｎｅｒ（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ  １１：２３８）。前記突然変異領域に新規な制限部位を導入して、開裂に基づく検出を可能にすることが望ましいであろう（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ他（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｂｅｓ  ６：１）。複数の実施態様においては、増幅用のＴａｑリガーゼを用いて増幅を行ってもよいと考えられている（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：１８９）。このような場合、５’配列の３’末端に完全な対合がある場合にのみライゲーションが起こるので、増幅の有無を調べることで、ある特定の部位における既知の突然変異の存在を検出することが可能である。
【０２５０】
ここに記載の方法を、例えばここに記載の少なくとも１つのプローブ核酸又は抗体試薬が含まれる予めパッケージされた診断キットを利用して実施してもよい。そのようなキットは、例えばＰＣＩＰ遺伝子が関与する疾患又は疾病の症状又は家族病歴を持つ患者を診断する臨床事例において有用であろう。
【０２５１】
更に、ＰＣＩＰが発現されているいかなる細胞種又は組織でも、ここに記載の予測アッセイに利用可能である。
【０２５２】
３．臨床検査における効果のモニタ
（例えば膜興奮性又は静止電位などの）ＰＣＩＰタンパク質の発現又は活性に対する（例えば薬剤などの）物質の影響のモニタを、基本的な薬剤スクリーニングだけではなく、臨床検査において行ってもよい。例えば、ここに記載のスクリーニングアッセイでＰＣＩＰ遺伝子発現及びタンパク質レベルを増加させるか又はＰＣＩＰ活性を上方調節することが判明した薬剤の有効性を、ＰＣＩＰ遺伝子発現及びタンパク質レベルの減少又はＰＣＩＰ活性の下方調節が観察される対象の臨床検査でモニタしてもよい。又は、スクリーニングアッセイでＰＣＩＰ遺伝子発現及びタンパク質レベルを減少させるか又はＰＣＩＰ活性を下方調節することが判明した薬剤の有効性を、ＰＣＩＰ遺伝子発現及びタンパク質レベルの増加又はＰＣＩＰ活性の上方調節が観察される対象の臨床検査でモニタしてもよい。これらのような臨床検査においては、例えばカリウムチャネル関連障害に関与しているＰＣＩＰ遺伝子及び好適にはその他の遺伝子の発現又は活性を、特定の細胞の表現型の「読み出し」又はマーカとして使用してもよい。
【０２５３】
例えば、限定する訳ではないが、（例えばここに記載のスクリーニングアッセイで確認された）ＰＣＩＰ活性を調節する（例えば化合物、薬剤又は小分子などの）物質での処理によって細胞内で調節される、ＰＣＩＰを含めた遺伝子を確認してもよい。従って、例えば臨床検査において薬剤のカリウムチャネル関連障害に対する作用を調べるために、細胞を単離してＲＮＡを作製し、前記カリウムチャネル関連障害に関与するＰＣＩＰ及びその他の遺伝子の発現レベルをそれぞれ分析してもよい。（例えば遺伝子発現パターンなどの）遺伝子発現レベルを、ここに記載のノーザンブロット法又はＲＴ−ＰＣＲで、或いはここに記載の方法の何れかを用いてタンパク質の産生量を測定することで、或いはＰＣＩＰ又はその他の遺伝子のレベルを測定することで、定量してもよい。このように、遺伝子発現パターンは、前記細胞の前記薬剤に対する物理的反応を示すマーカとして機能しうる。従って、この反応状況を、前記個体の前記薬剤による治療の前及びその途中の様々な時点で調べてもよい。
【０２５４】
好適な一実施態様においては、本発明は、対象の（例えば、ここに記載のスクリーニングアッセイで確認されたアゴニスト、アンタゴニスト、ペプチドミメティック、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子又はその他の薬剤候補などの）物質による治療の有効性をモニタするための、（ｉ）前記物質の投与前に、対象から投与前試料を採取するステップと；（ｉｉ）前記投与前試料中のＰＣＩＰタンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの発現レベルを検出するステップと；（ｉｉｉ）前記対象から１つ又は複数の投与後試料を採取するステップと；（ｉｖ）前記投与後試料中のＰＣＩＰタンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの発現レベルを検出するステップと；（ｖ）前記投与前試料中のＰＣＩＰタンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの発現レベルを、前記１つ又は複数の投与後試料中のＰＣＩＰタンパク質、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの発現レベルと比較するステップと；（ｖｉ）これに応じて前記薬剤の前記対象への投与を変更するステップと、が含まれる方法を提供する。例えば、ＰＣＩＰの発現又は活性を、検出されたレベルよりも向上させる、即ち前記物質の有効性を増加させるべく、前記物質の投与を増加させることが望ましい場合がある。又は、ＰＣＩＰの発現又は活性を、検出したレベルよりも減少させる、即ち前記物質の有効性を減少させるべく、前記物質の投与を減少させることが望ましい場合もある。そのような実施態様においては、ＰＣＩＰの発現又は活性を、観察可能な表現型反応が存在しない場合でも、ある薬剤の有効性の指標として使用してもよい。
【０２５５】
Ｄ．治療方法
本発明は、異常なＰＣＩＰ発現又は活性を伴う疾患に罹患するおそれのある（又は易罹患性の）或いはそのような疾患に罹患している対象を治療するための予防的方法及び治療的方法の双方を提供する。予防的療法及び治療的療法の双方ともに、ゲノム薬理学の分野から得た知識に基づき、特定の調整又は変更を加えてもよい。ここで使用する「ゲノム薬理学」という用語は、遺伝子シーケンシング、統計遺伝学及び遺伝子発現分析などのゲノム技術を、臨床開発段階の及び市場に流通している薬剤に応用することを指す。より詳細には、この用語は、（例えばある患者の「薬剤反応表現型」又は「薬剤反応遺伝子型」などの）ある患者の遺伝子がある薬剤に対するその患者の反応の仕方を如何にして決定するのかについての研究を指す。従って、本発明の別の一局面は、個体の予防的療法又は治療的療法を、本発明のＰＣＩＰ分子又はＰＣＩＰモジュレータを用いて、その個体の薬物反応遺伝子型に基づいて調整する方法を提供する。ゲノム薬理学によって、臨床医又は医師が、予防的療法又は治療的療法を、前記療法が最も有益であろう患者に限定して実施し、毒性の薬物関連副作用を生じるであろう患者の治療を回避することが可能である。
【０２５６】
１．予防的方法
一局面においては、本発明は、対象における異常なＰＣＩＰ発現又は活性を伴う疾患又は障害を、前記対象にＰＣＩＰ発現又は少なくとも１つのＰＣＩＰ活性を調節するＰＣＩＰ又は物質を投与することで予防する方法を提供する。異常なＰＣＩＰ発現又は活性に起因するか又はこれを一因とする疾患に罹患するおそれのある対象を、例えば、ここに記載の診断アッセイ又は予測アッセイのいずれか又はこれらの組合せによって特定してもよい。予防物質の投与を、疾患又は障害が予防されるような方法で、ＰＣＩＰ異常を特徴とする症状が発生する前に行ってもよいし、又は、その進行中に遅延的に行ってもよい。ＰＣＩＰ異常の種類により、例えばＰＣＩＰ、ＰＣＩＰアゴニスト又はＰＣＩＰアンタゴニスト物質を前記対象の治療に用いてもよい。適切な物質を、ここに記載のスクリーニングアッセイに基づいて決定してもよい。
【０２５７】
２．治療的方法
本発明の別の一局面は、ＰＣＩＰ発現又は活性を治療の目的で調節する方法に関する。従って、一実施態様においては、本発明の前記調節方法には、ある細胞を、前記細胞に関連したＰＣＩＰタンパク質活性の１つ又は複数の調節するＰＣＩＰ又は物質と接触させることが含まれる。ＰＣＩＰタンパク質活性を調節する物質が、例えば核酸又はタンパク質、ＰＣＩＰタンパク質の（例えばＰＣＩＰ基質などの）天然に存在する標的分子、ＰＣＩＰ抗体、ＰＣＩＰアゴニスト又はアンタゴニスト、ＰＣＩＰアゴニスト又はアンタゴニストのペプチドミメティック或いはその他の小分子などの、ここに記載の物質であってもよい。一実施態様においては、前記物質は、１つ又は複数のＰＣＩＰ活性を刺激する。そのような刺激物質の例には、前記細胞中に導入されたＰＣＩＰをコードする活性なＰＣＩＰタンパク質及び核酸分子が含まれる。別の一実施態様においては、前記物質がＰＣＩＰ活性の１つ又は複数を阻害する。そのような阻害物質の例には、アンチセンスＰＣＩＰ核酸分子、抗ＰＣＩＰ抗体及びＰＣＩＰ阻害剤が含まれる。これらの調節方法を、（例えば前記細胞を前記物質で培養するなど）ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行ってもよいし、又は（例えば前記物質を対象に投与するなど）ｉｎ  ｖｉｖｏで行ってもよい。このように、本発明は、ＰＣＩＰタンパク質又は核酸分子の異常な発現又は活性を特徴とする疾患又は障害に罹患した個体の治療方法を提供する。そのような障害の例には、アルツハイマー病、アルツハイマー病に伴う（ピック病などの）痴呆、パーキンソン病及びその他のレーヴィ体びまん性疾患、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、てんかん及びヤコブ−クロイツフェルト病などの神経変性障害；例えばうつ病、分裂病性障害、コルサコフ精神病、躁病、不安障害、双極性感情病又は恐怖症などの精神障害；例えば健忘症又は加齢に伴う記憶喪失などの学習又は記憶障害；例えば偏頭痛などの神経障害；例えば痛覚過敏又は筋骨格障害に伴う痛みなどの痛覚障害；脊髄損傷；卒中；及び頭部外傷などの中枢神経系障害或いは動脈硬化、虚血性再潅流損傷、再狭窄、動脈炎症、血管壁の肥厚、心室肥厚、心室高頻度ペーシング、冠状動脈微小塞栓症、頻脈、徐脈、圧負荷、大動脈屈曲、冠状動脈結紮、血管性心疾患、心房細動、遺伝性ＱＴ延長性症候群、うっ血性心不全、洞結節機能不全、狭心症、心不全、高血圧、心房細動、心房粗動、拡張型心筋症、特発性心筋症、心筋梗塞、冠状動脈疾患、冠状動脈痙攣又は不整脈などの心臓血管障害が含まれる。一実施態様においては、前記方法に、ＰＣＩＰ発現又は活性を（例えば上方調節又は下方調節するなど）調節する、（例えばここに記載のスクリーニングアッセイで特定された物質などの）単一の物質又は複数の物質の組合せを投与することが含まれる。別の一実施態様においては、前記方法に、ＰＣＩＰタンパク質又は核酸分子を、過少な又は異常なＰＣＩＰ発現又は活性を補正する療法として投与することが含まれる。
【０２５８】
本発明の好適な一実施態様は、ＰＣＩＰ関連疾患又は障害を治療するための、治療上有効量のＰＣＩＰ抗体を対象に投与するステップが含まれる方法に関する。ここに記載する抗体の治療上有効量（即ち有効投与量）の範囲は、およそ０．００１乃至３０ｍｇ／ｋｇ体重、好適にはおよそ０．０１乃至２５ｍｇ／ｋｇ体重、より好適にはおよそ０．１乃至２０ｍｇ／ｋｇ体重、更により好適にはおよそ１乃至１０ｍｇ／ｋｇ、２乃至９ｍｇ／ｋｇ、３乃至８ｍｇ／ｋｇ、４乃至７ｍｇ／ｋｇ又は５乃至６ｍｇ／ｋｇ体重である。疾患又は障害の重度、治療歴、全身の健康状態及び／又は対象の年齢並びに他の疾患の存在が含まれるがこれらに限定されることはない幾つかの要因が、前記対象の有効な治療に要する用量を左右しうることは、当業者に理解されるであろう。更に、対象を治療上有効量の抗体で治療することに、１回のみの治療が含まれてもよいし、或いは、好適には一連の複数回の治療が含まれてもよい。好適な一例においては、対象を、およそ０．１乃至２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内の抗体で、週１回、およそ１乃至１０週間、好適には２乃至８週間、より好適にはおよそ３乃至７週間、更により好適にはおよそ４、５又は６週間にわたって治療する。治療に使用する抗体の有効投与量が、特定の治療の過程で増加又は減少しうることも、理解されるであろう。用量の変更は、ここに記載の診断アッセイの結果実施されよう。
【０２５９】
ＰＣＩＰ活性の刺激は、ＰＣＩＰが異常に下方調節されている場合及び／又はＰＣＩＰ活性の増加が有益な効果をもたらすと考えられる場合に望ましい。例えば、あるＰＣＩＰが下方調節されている場合及び／又はＰＣＩＰ活性の増加が有益な効果をもたらすと考えられる場合には、ＰＣＩＰ活性を刺激することが望ましい。同様に、ＰＣＩＰが異常に上方調節されている場合及び／又はＰＣＩＰ活性の減少が有益な効果をもたらすと考えられる場合には、ＰＣＩＰ活性を阻害することが望ましい。
【０２６０】
３．ゲノム薬理学
ここに記載のスクリーニングアッセイで、（例えばＰＣＩＰ遺伝子発現などの）ＰＣＩＰ活性に刺激作用又は阻害作用を及ぼすことが確認される本発明のＰＣＩＰ分子、物質又はモジュレータを、（例えばアルツハイマー病、アルツハイマー病に伴う（ピック病などの）痴呆、パーキンソン病及びその他のレーヴィ体びまん性疾患、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、てんかん及びヤコブ−クロイツフェルト病などの神経変性障害；例えばうつ病、分裂病性障害、コルサコフ精神病、躁病、不安障害、双極性感情病又は恐怖症などの精神障害；例えば健忘症又は加齢に伴う記憶喪失などの学習又は記憶障害；例えば偏頭痛などの神経障害；例えば痛覚過敏又は筋骨格障害に伴う痛みなどの痛覚障害；脊髄損傷；卒中；及び頭部外傷などの中枢神経系障害或いは動脈硬化、虚血性再潅流損傷、再狭窄、動脈炎症、血管壁の肥厚、心室肥厚、心室高頻度ペーシング、冠状動脈微小塞栓症、頻脈、徐脈、圧負荷、大動脈屈曲、冠状動脈結紮、血管性心疾患、心房細動、遺伝性ＱＴ延長性症候群、うっ血性心不全、洞結節機能不全、狭心症、心不全、高血圧、心房細動、心房粗動、拡張型心筋症、特発性心筋症、心筋梗塞、冠状動脈疾患、冠状動脈痙攣又は不整脈などの心臓血管障害などの）異常なＰＣＩＰ活性を伴うカリウムチャネル関連障害を（予防的に又は治療的に）治療するために、個体に投与してもよい。そのような治療と組み合わせて、ゲノム薬理学（即ち、個体の遺伝子型と、その個体の外来の化合物又は薬物に対する反応との関係についての研究）を考慮してもよい。活性の薬理作用を持つ前記薬物の用量と血中濃度との関係を変化させることで生じる治療薬の代謝の違いが、重大な毒性又は治療過誤を招くことがありうる。従って、医師又は臨床医が、ＰＣＩＰ分子又はＰＣＩＰモジュレータを投与するか否かの決定、或いはＰＣＩＰ分子又はＰＣＩＰモジュレータを用いた治療の用量及び／又は方針の調整の際に、関連するゲノム薬理研究において得た知識を応用することを考慮してもよい。
【０２６１】
ゲノム薬理学は、患者の異常な薬物動態及び異常な機能のために起こる、薬物に対する応答の臨床上重大な遺伝性の異常を扱う。例えば、Ｅｉｃｈｅｌｂａｕｍ，Ｍ．他（１９９６）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２３（１０−１１）：９８３−９８５及びＬｉｎｄｅｒ，Ｍ．Ｗ．他（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４３（２）：２５４−２６６を参照のこと。一般に、薬理遺伝的状態は、薬物が身体に作用する仕方を変化させる単一の因子として伝達される遺伝状態（異常な薬物作用）と、身体が薬物に作用する仕方を変化させる単一の因子として伝達される遺伝状態（異常な薬物代謝）との２種類に分類される。これらの薬理遺伝的状態は、稀に発生する遺伝的欠陥としても、又は天然に発生する多型現象としても起こりうる。例えば、グルコース−６−リン酸脱水素酵素欠乏症（Ｇ６ＰＤ）は、よく知られた遺伝性の酵素病であり、その主な臨床症状は、酸化剤（抗マラリア薬、サルファ剤、鎮痛剤、ニトロフラン）の注射及びソラマメの摂食後に起こる溶血である。
【０２６２】
薬物応答性を予測する遺伝子を特定するためのゲノム薬理学的方法の一つは、「ゲノムワイド関連性解析」として知られており、主として（例えばそれぞれが２つのバリアントを持つヒトゲノム上の６０，０００乃至１００，０００個の多型又は変異部位からなる「二対立遺伝子」遺伝子マーカマップなどの）既知の複数の遺伝子関連マーカからなるヒトゲノムの高分解能マップを利用する。そのような高分解能遺伝子マップを、第２相／第３相薬物試験に参加した統計学上有意に多数の患者のそれぞれのゲノムのマップと比較して、観察された特定の薬物応答性又は副作用に関連するマーカを特定してもよい。又は、そのような高分解能マップを、ヒトゲノム中の数百万個の既知の一塩基多型（ＳＮＰ）の組合せから作製してもよい。ここで使用する「ＳＮＰ」という用語は、一本のＤＮＡ中の一ヌクレオチド塩基に頻繁に発生する変化を指す。例えば、あるＳＮＰは、ＤＮＡの１０００塩基毎に１つの割合で発生しうる。あるＳＮＰが疾患過程に関与していることもあるが、大多数のＳＮＰは疾患とは無関係である。そのようなＳＮＰの発生に基づく遺伝子マップを用いることで、複数の個体を、その個々のゲノム中の特定のＳＮＰパターンに基づいて複数の遺伝的カテゴリーに分類することが可能である。このような方法で、遺伝的に類似した個体群に適した治療方針を、そのような遺伝的に類似した個体群に共通な特性を考慮して調整することが可能である。
【０２６３】
又は、「候補遺伝子アプローチ」と呼ばれる手法を利用して、薬物応答性を予測する遺伝子を特定してもよい。この方法では、ある薬物の標的をコードする（例えば本発明のＰＣＩＰタンパク質などの）遺伝子が判明している場合に、前記個体群に共通するそのような遺伝子の全バリアントをきわめて容易に確認可能であり、そのような遺伝子が別の一個体と比べて一つだけ異なっていることが特定の薬物応答性に関連するか否かを調べることが可能である。
【０２６４】
一実施態様においては、薬物代謝酵素の活性が、薬物作用の強度及び持続性の双方の主要な決定因子となっている。（例えばＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）及びチトクロームＰ４５０酵素であるＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９などの）薬物代謝酵素の遺伝子多型の発見により、一部の患者が、ある薬物を標準的で安全な用量投与された後に、予想される薬物効果を示さないか又は過剰な薬物効果及び重篤な毒性応答を示す理由が明らかになった。これらの多型は、前記個体群中の高代謝能群（ＥＭ）と低代謝能群（ＰＭ）の２つの表現型に発現される。ＰＭの有病率は、個体群によって異なる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする遺伝子は、多型性が高く、ＰＭ中で複数の突然変異が確認されているが、これらの突然変異は全て、機能性ＣＹＰ２Ｄ６の欠損を引き起こす。ＣＹＰ２Ｄ６及びＣＹＰ２Ｃ１９の低代謝能群は、標準用量を投与されると、非常に高い頻度で過剰な薬物応答及び副作用を示す。ＣＹＰ２Ｄ６による代謝の産物であるモルヒネを中間体とするコデインの鎮痛効果に例証されるように、ある代謝産物が活性な治療的成分である場合、ＰＭは治療的応答を全く示さない。これとは逆に、いわゆる超高代謝能群は、標準的な用量に全く応答しない。最近になって、超高代謝性の分子レベルの素因がＣＹＰ２Ｄ６の遺伝子増幅であることが確認された。
【０２６５】
又は、「遺伝子発現プロファイリング」と呼ばれる手法を利用して、薬剤応答性を予測する遺伝子を特定してもよい。例えば、（本発明のＰＣＩＰ分子又はＰＣＩＰモジュレータなどの）ある薬剤を投与されたある動物の遺伝子発現を、毒性に関連する遺伝経路の有無を示す指標としてもよい。
【０２６６】
以上のゲノム薬理学的手法のうちの複数から得た情報を用いて、ある個体の予防的又は治療的療法のための適切な用量及び治療方針を決定してもよい。この知識を投薬又は薬物の選択に適用することで、対象を、例えばここに記載のスクリーニングアッセイの一例で確認されたモジュレータなどのＰＣＩＰ分子又はＰＣＩＰモジュレータで治療する際の副作用又は治療過誤を防止し、治療又は予防効果を向上させることが可能である。
【０２６７】
４．代用マーカとしてのＰＣＩＰ分子の使用
本発明のＰＣＩＰ分子は、対象の障害又は疾患状態のマーカとして、疾患状態の前兆のマーカとして、疾患状態の素質のマーカとして、薬物活性のマーカとして、又はゲノム薬理学的特性のマーカとしても有用である。ここに記載の方法を用いて、本発明のＰＣＩＰ分子の存在、非存在及び／又は量をｉｎ  ｖｉｖｏで検出し、１つ又は複数の生物学的状態と相関させてもよい。例えば、本発明のＰＣＩＰ分子を、１つ又は複数の障害又は疾患状態或いは疾患状態を誘発する条件の代用マーカとして使用してもよい。
【０２６８】
ここで使用する「代用マーカ」という用語は、ある疾患又は障害の有無、或いはある疾患又は障害の（例えば腫瘍の有無などの）進行の有無と相関した客観的な生化学的マーカを指す。そのようなマーカの存在又は量は、前記疾患の原因とは無関係である。従って、そのようなマーカを、特定の治療方法がある疾患状態又は障害の軽減に有効であるか否かの指標とすることが可能である。代用マーカは、（例えば初期段階の腫瘍などの）ある疾患状態又は障害の存在又は程度の診断が、標準的な手法では困難である場合や、危険が予想される臨床上のエンドポイントに達する以前に疾患の進行を診断することが望ましい場合に、特に有用である（例えば、心臓血管疾患の診断を、コレステロールレベルを代用マーカとして、また、ＨＩＶ感染の分析を、ＨＩＶ  ＲＮＡレベルを代用マーカとして、心筋梗塞又はＡＩＤＳの全面的な発症といった望ましくない臨床上の結果に至るよりも十分に先立って行ってもよい）。当業における代用マーカの使用例には：Ｋｏｏｍｅｎ他（２０００）Ｊ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．３５：２５８−２６４；及びＪａｍｅｓ（１９９４）ＡＩＤＳ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｎｅｗｓ  Ａｒｃｈｉｖｅ  ２０９が含まれる。
【０２６９】
本発明のＰＣＩＰ分子は、薬力学的マーカとしても有用である。ここで使用する「薬力学的マーカ」という用語は、薬物作用と特異的に相関した客観的な生化学的マーカを指す。ある薬力学的マーカの存在又は量は、前記薬物の投与対象である疾患状態又は障害とは無関係である；従って、前記マーカの存在又は量が、対象中の前記薬物の存在又は活性の指標となる。例えば、ある薬力学的マーカが、そのマーカのある生体組織における発現又は転写の有無と前記薬物のレベルとの関係を調べることによって、前記生体組織中の前記薬物の濃度を示す指標となってもよい。この方法で、前記薬物の分布又は摂取を、薬力学的マーカを利用してモニタ可能である。同様に、前記薬力学的マーカの存在又は量を、前記マーカの存在又は量がある薬物のｉｎ  ｖｉｖｏでの分解の相対的な速度を表す指標となるような仕方で、前記薬物の代謝産物の存在又は量と相関させてもよい。薬力学的マーカは、特にある薬物を低用量で投与する場合に、薬物効果の検出感度を高める上で特に有用である。ある薬物を少量用いるだけで、（例えばＰＣＩＰマーカなどの）マーカを多数回転写又は発現させられる場合でも、前記増幅させたマーカの量は、前記薬物自体よりも遙かに容易に検出できる量であろう。また、前記マーカが、前記マーカ自体の特性のために、より検出が容易な場合もある；例えば、ここに記載の方法で、抗ＰＣＩＰ抗体をＰＣＩＰタンパク質マーカの免疫利用検出システムに用いてもよいし、又は、ＰＣＩＰ特異的放射線標識プローブを用いて、ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡマーカを検出してもよい。更に、薬力学的マーカを用いることで、薬物治療に伴うリスクを、直接に観察することの可能な範囲を超えて、機序に基づいて予測することが可能であろう。当業における薬力学的マーカの使用例には：Ｍａｔｓｕｄａ他による米国特許６，０３３，８６２；Ｈａｔｔｉｓ他（１９９１）Ｅｎｖ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．９０：２２９−２３８；Ｓｃｈｅｎｔａｇ（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５６  Ｓｕｐｐｌ．３：Ｓ２１−Ｓ２４；及びＮｉｃｏｌａｕ（１９９９）Ａｍ．Ｊ．Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．５６  Ｓｕｐｐｌ．３：Ｓ１６−Ｓ２０が含まれる。
【０２７０】
本発明のＰＣＩＰ分子は、ゲノム薬理学的マーカとしても有用である。ここで使用する「ゲノム薬理学的マーカ」という用語は、対象における特定の臨床的薬物応答又は感受性と相関した客観的な生化学的マーカを指す（例えば、ＭｃＬｅｏｄ他（１９９９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ３５（１２）：１６５０−１６５２を参照のこと）。ゲノム薬理学的マーカの存在又は量は、特定の薬物又は薬物種に対する、前記薬物の投与前に予想される対象の応答と相関している。ある対象中の１つ又は複数のゲノム薬理学的マーカの存在又は量を評価することで、前記対象に最適な、又は成功率のより高い薬物療法を選択することが可能である。例えば、ある対象中の特定の腫瘍マーカに対応する（例えばＰＣＩＰタンパク質又はＲＮＡなどの）ＲＮＡ又はタンパク質の存在又は量に基づき、前記対象中に存在する可能性のある特定の腫瘍の治療に向けて最適化された薬物又は治療方法を選択してもよい。同様に、ＰＣＩＰ  ＤＮＡ中の特定の配列変異の有無を、ＰＣＩＰ薬物応答性と相関させてもよい。このように、ゲノム薬理学的マーカを用いることで、各対象に最適な治療方法を、その療法を実際に実施することなく決定することが可能である。
【０２７１】
本発明について更に説明する以下の例は、本発明を限定するものとして理解されるべきではない。本願全体を通じて引用された参考文献、登録特許及び公開特許出願並びに図面及び配列表の内容はすべて、引用をもってここに援用されたものである。
【０２７２】
実施例
以下の材料及び方法を実施例で使用した。
【０２７３】
菌株、プラスミド、おとりｃＤＮＡ及び一般的な微生物学的方法
この作業で使用する基本酵母菌株（ＨＦ７ｃ、Ｙ１８７）、おとり（ｐＧＢＴ９）及び餌食（ｐＡＣＴ２）のプラスミドを、クロンテック社（カリフオルニア州パロアルト）から購入した。ラットＫｖ４．３、Ｋｖ４．２及びＫｖ１．１をコードするｃＤＮＡを、ワイエス・アイエルスト・リサーチ社（ニュージャージー州０８８５２、マンモスジャンクション、リッジロード８６５）から入手した。Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン及びＬ−ヒスチジンを含有しない合成完全培地を含めた複数の標準的な酵母培地を作製し、酵母の遺伝子操作をＳｈｅｒｍａｎ（１９９１）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：３−２１に記載の方法で実施した。標準的なプロトコルを用いて酵母を形質転換させた（Ｇｉｅｔｚ他（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：１４２５；Ｉｔｏ他（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５３：１６３−１６８）。プラスミドＤＮＡを、標準的な方法で酵母菌株から単離した（Ｈｏｆｆｍａｎ及びＷｉｎｓｔｏｎ（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５７：２６７−２７２）。
【０２７４】
おとり及び酵母菌株の構築
ｒＫｖ４．３の最初の１８０個のアミノ酸（Ｓｅｒｄｉｏ  Ｐ．他（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓ  ７５：２１７４−２１７９に記載）をＰＣＲにて増幅し、インフレームでｐＧＢＴ９にクローニングして、プラスミドｐＦＷＡ２（以降「おとり」と呼ぶ）を得た。このおとりを、２ハイブリッドスクリーニング菌株ＨＦ７ｃ中に形質転換させ、発現及び自己活性化について検査した。前記おとりの発現をウェスタンブロット法にて確認した。ｒＫｖ４．３おとりは、１０ｍＭの３−アミノ−１，２，３−トリアゾール（３−ＡＴ）の存在下では自己活性化しなかった。
【０２７５】
ライブラリの構築
ラットの中脳組織を、ワイエス・アイエルスト・リサーチ社（ニュージャージー州マンモスジャンクション）から入手した。標準的な技術を用いて、前記組織から全細胞ＲＮＡを抽出した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（１９８９））。ニュー・イングランド・バイオラブズ社（マサチューセッツ州ベヴァリー）から入手したＰｏｌｙ−Ａ−Ｓｐｉｎ  ｍＲＮＡ単離キットを用いて、ｍＲＮＡを作製した。このｍＲＮＡ試料からのｃＤＮＡを、ストラタジーン社（カリフォルニア州ラホーヤ）から入手したｃＤＮＡ合成キットを用いて合成し、ｐＡＣＴ２のＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位に連結させて、２ハイブリッドライブラリを構築した。
【０２７６】
２ハイブリッドスクリーニング
２ハイブリッドスクリーニングを、Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．他（１９９３）”Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  Ｈａｒｔｌｅｙ，  Ｄ．Ａ．編、オックスフォード・ユニバーシティ・プレス、オックスフォード、ｐｐ．１５３−１７９に記載の方法に概ね基づき、ｒｋｖ４．３おとり−ラット中脳ライブラリのおとり−ライブラリ対を用いて実施した。フィルタディスクベータガラクトシダーゼ（ｂｅｔａ−ｇａｌ）アッセイを、前述の方法に概ね基づき実施した（Ｂｒｉｌｌ他（１９９４）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．５：２９７−３１２）。双方のレポータ遺伝子活性（Ｈｉｓ及びベータガラクトシダーゼ）が陽性であったクローンの値を記録し、餌食プラスミドを酵母から単離し、大腸菌株ＫＣ８中に形質転換させ、ＤＮＡプラスミドを精製して、得られたプラスミドを従来の方法で配列決定した（Ｓａｎｇｅｒ  Ｆ．他（１９７７）ＰＮＡＳ，７４：５４６３−６７）。
【０２７７】
特異性テスト
陽性の相互作用因子クローンについて、これらを前述の相互作用方式で、関連性があるおとり及び無関連のおとりからなるパネルに曝露する結合特異性テストを実施した（Ｆｉｎｌｅｙ  Ｒ．Ｌ．Ｊｒ．他（１９９４）ＰＮＡＳ，９１（２６）：１２９８０−１２９８４）。簡単に説明すると、陽性の餌食プラスミドをＹ１８７中に形質転換させ、おとりのパネルをＨＦ７ｃ中に形質転換させた。形質転換した餌食細胞及びおとり細胞を、選択培地プレート上にストリークし、ＹＰＡＤプレート上で相互作用させ、レポータ遺伝子活性についてテストした。
【０２７８】
分析
ＰＣＩＰヌクレオチドを、核酸のヒットについて、ＢＬＡＳＴＮ  １．４．８ＭＰプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ．  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）で分析した。ＰＣＩＰタンパク質を、ポリペプチドのヒットについて、ＢＬＡＳＴＮ  １．４．９ＭＰプログラムで分析した。
【０２７９】
電気生理学的方法
哺乳類のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究
ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞を使用して、一過性トランスフェクションの１乃至３日後に記録を取った。緑色蛍光で表される、ＧＦＰを発現している細胞から、全細胞電流が記録された。フィラメント状のホウケイ酸ガラス（サッター・インストルメント社、カリフォルニア州ノヴァト）から導出した電極の初期抵抗は３乃至５Ｍオームであった。ギガシール及び全細胞破裂コンフィギュレーションアクセス後に、抵抗は１０Ｍオーム未満となった。全細胞バス液を１０倍のハンクス液（ギブコＢＲＬ社）から、以下の最終濃度（ｍＭ）にて作製した：１３８ＮａＣｌ、５．４ＫＣｌ、１．３ＭｇＣｌ２、１．３ＣａＣｌ２、５．５Ｄ−Ｇｌｕｋｏｓ及び１０ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４。細胞内電極液の成分（ｍＭ）は、１４０ＫＣｌ、１０ＨＥＰＥＳ、１０ＥＧＴＡ、０．５ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．３であった。化学薬品は全て、シグマ社（モンタナ州セントルイス）又はフィッシャー・サイエンティフィック社（テキサス州ヒューストン）から入手した。膜電流を、ＥＰＣ９パッチクランプ増幅器（ＨＥＫＡ社、ドイツ）を用いて記録した。データをＭａｔｌａｂ（ナティック社、マサチューセッツ州）を用いて分析し、必要に応じてリーク減算を行った。実験は全て、室温にて実施した。
【０２８０】
アフリカツメガエル卵母細胞の研究
カエル１匹当たり２回未満の手術を、確立した技術を用いて実施した。カエルを氷冷麻酔した。前日に採取したステージ４の複数のアフリカツメガエル卵母細胞中に、全ｃＲＮＡ（１乃至１０ｎｇ）を注入した。前記複数のアフリカツメガエル卵母細胞を、以下の成分（ｍＭ）：９６ＮａＣｌ、２ＫＣｌ、１．８ＣａＣｌ２、１ＭｇＣｌ２、５ＨＥＰＥＳを含有するｐＨ７．６のＮＤ９６にゲンタマイシン５０μｇ／ｍｌを加えた中で、１８℃で培養した。アフリカツメガエル卵母細胞を、注入後３乃至７日間観察した。二電極電圧クランプによる記録を、ＮＤ９６溶液中で、ＴＵＲＢＯ  ＴＥＣ  ０３クランプ増幅器（ＡＬＡサイエンティフィック・インストルメント社、ニューヨーク州ウェストベリー）を用いて行った。双方の電極は３ＭのＫＣｌで満たされ、電極抵抗は０．２乃至１Ｍオームであった。電流信号を１０００Ｈｚでフィルタリングした後に、ＰＵＬＳＥソフトウェア（ＨＥＫＡ社、ドイツ）を用いてＰＣ（ゲートウェイ社、カリフォルニア州）上に伝送した。
【０２８１】
例１：ラットＰＣＩＰ  ｃＤＮＡの同定
Ｋｖ４．３遺伝子のコード配列（最初のアミノ酸１８０個をコードする）をＰＣＲにて増幅し、ｐＧＢＴ９中にクローニングして、ＧＡＬ４  ＤＮＡ−結合ドメイン−Ｋｖ４．３（１−１８０）遺伝子融合体（プラスミドｐＦＷＡ２）を形成した。このコンストラクトでＨＦ７ｃを形質転換させた。この結果得られた細胞株は、１０ｍＭの３−ＡＴの存在下で、Ｌ−トリプトファンを含有しない合成完全培地上では成長したが、Ｌ−トリプトファン及びＬ−ヒスチジンを含有しない合成完全培地上では成長しなかった。このことは、｛ＧＡＬ４  ＤＮＡ−結合ドメイン｝−｛ｖＫｖ４．３（１−１８０）｝遺伝子融合体が持つ転写活性化活性が、１０ｍＭの３−ＡＴが許容するしきい値以下であることを示している。
【０２８２】
この例で、｛ＧＡＬ４  ＤＮＡ−結合ドメイン｝−｛ｖＫｖ４．３（１−１８０）｝遺伝子融合体を持つプラスミドを、上述の酵母２ハイブリッドスクリーニング株ＨＦ７ｃ中に導入する酵母２ハイブリッドアッセイを行った。次に、ＨＦ７ｃをラット中脳２ハイブリッドライブラリで形質転換させた。およそ６００万個の形質転換株が得られ、これらを選択培地中で培養した。前記選択培地中で成長し、ベータ−ガラクトシダーゼレポータ遺伝子を発現したコロニの特性を更に解析し、再形質転換アッセイ及び特異性アッセイを行った。前記再形質転換アッセイ及び特異性アッセイで、前記Ｋｖ４．３ポリペプチドと結合可能な３つのＰＣＩＰクローン（ラット１ｖ、８ｔ及び９ｑｍ）が生じた。
【０２８３】
前記ラット１ｖ遺伝子の全長配列並びに８ｔ及び９ｑ遺伝子の部分配列を、以下の方法で得た。前記部分ラットＰＣＩＰ配列を用いてプローブを作製し、これらのプローブを用いて、例えばラットの中脳ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングを行った。陽性のクローンを同定し、標準的な方法で増幅及び配列決定して、全長配列を得た。更に、既存のラットＰＣＩＰ  ｃＤＮＡ末端（例えばギブコＢＲＬ社から入手した５’ＲＡＣＥを使用）の高速増幅により、前記転写産物の５’末端を終結させた。
【０２８４】
例２：ヒト１ｖ  ｃＤＮＡの同定
ヒト１ｖ核酸分子を得るために、ヒト海馬（クロンテック社、カリフォルニア州パロアルト）から得たｃＤＮＡライブラリを、低ストリンジェントな条件下で以下のようにスクリーニングした：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｈｙｂ溶液中で、４２℃で４時間プレハイブリダイゼーションした後に、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。使用したプローブは、ＰＣＲで生成した断片であり、３２ｐのｄＣＴＰで標識した前記ラット配列のヌクレオチド４９乃至７１１を含有した。フィルタを、２倍のＳＳＣ／０．１％のＳＤＳ中で、５５℃で６回洗浄した。陽性の分離株の二次スクリーニングについても同じ条件を使用した。このようにして得られたクローンを、ＡＢＩ自動化ＤＮＡシーケンシングシステムを用いて配列決定し、配列番号：３で表される前記ラット配列と比較すると共に、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからの既知の複数の配列とも比較した。次に、前記ライブラリスクリーニングの結果最大であったクローンを、ｐＢＳ−ＫＳ＋（ストラタジーン社、カリフォルニア州ラホーヤ）中にサブクローニングして、配列を照合した。５１５塩基対のクローンが、５’ＵＴＲの２１１塩基対と、３０４塩基対からなるコード領域とを含有し、前記１ｖ遺伝子のヒト相同体を表すことが判明した。全長ｃＤＮＡを作製するために、製造者の使用説明書（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲキット）に基づいて３’ＲＡＣＥを使用した。
【０２８５】
例３：１Ｖスプライスバリアントの単離及び特性の解析
配列番号：５で表されるマウス１ｖ及び配列番号：７で表されるラット１ｖｌスプライスバリアントを、例１で述べた２ハイブリッドアッセイ法により単離した。配列番号：７で表されるマウス１ｖｌスプライスバリアントを、マウスの脳ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングにより単離し、配列番号：１１で表されるラット１ｖｎスプライスバリアントを、ＢＬＡＳＴ検索により単離した。
【０２８６】
例４：９Ｑ及びその他のＰＣＩＰの単離及び配列決定
ラット９ｑｌ（配列番号：１５）を、データベースマイニングにより単離し、ラット９ｑｍ（配列番号：２１）を、２ハイブリッドアッセイ法により単離し、ラット９ｑｃ（配列番号：２７）を、データベースマイニングにより同定した。ヒト９ｑｌ（配列番号：１３）及びヒト９ｑｓ（配列番号：２３）を、例２で述べた方法で同定した。マウス９ｑｌ（配列番号：１７）、サル９ｑｓ（配列番号：２５）、ヒトｐ１９３（配列番号：３９）、ラットｐ１９（配列番号：３３）及びマウスｐ１９（配列番号：３５）を、データベースマイニングにより同定した。ラット８ｔ（配列番号：２９）を、２ハイブリッドアッセイ法を用いて同定した。Ｗ２８５５９（配列番号：３７）の配列を、データベースマイニング及び前記同定されたＥＳＴのＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＩ３５２４５４による配列決定によって同定した。前記タンパク質配列は、１ｖ、９ｑｌ及びｐ１９との相同性の高い、４１個のアミノ酸からなる領域を含有することが判明した（図２５のアライメントを参照のこと）。しかし、この相同な領域の下流側では、前記配列は前記ＰＣＩＰファミリーとは異なっている。この配列で、前記ＰＣＩＰファミリーメンバー中に見受けられる同様なドメインと相同な４１個のアミノ酸を持つ遺伝子を表すことが可能であろう。
【０２８７】
ヒトゲノム９ｑ配列（配列番号：４６及び４７）を、ヒト９ｑｍ  ｃＤＮＡの配列に基づいてデザインされたプライマを用いたＢＡＣゲノムライブラリ（リサーチジェネティック社）のスクリーニングによって単離した。２つの陽性クローンが確認され（４４８Ｏ２及び７２１Ｉ１７）、これらを配列決定した。
【０２８８】
例５：ラット組織における１Ｖ、８Ｔ及び９Ｑ  ｍＲＮＡの発現
ラット及びマウスのマルチプルティシューノーザンブロット（クロンテック社）に、ラット１ｖ配列の５’非翻訳領域及び５’コード領域（ヌクレオチド３５乃至１２４；配列番号：３）（このプローブはラット１ｖ及びラット１ｖｌに特異的である）、８ｔ配列の５’コード領域（ヌクレオチド１乃至８８；配列番号：２９）又はラット９ｑｍ配列の５’末端（ヌクレオチド１乃至１９５；配列番号：２１）（このプローブは、８ｔを除く全ての９ｑイソフォームに特異的である）を標的とする［３２Ｐ］−標識ｃＤＮＡプローブをハイブリダイズさせた。ブロットのハイブリダイゼーションを標準的な方法で実施した。ラット１ｖプローブでハイブリダイズされたノーザンブロットでは、脳ＲＮＡを含有するレーンにおいてのみ２．３ｋｂのシングルバンドが認められ、１ｖの発現が脳に特異的であることが示唆された。ラット８ｔプローブでハイブリダイズされたノーザンブロットでは、２．４ｋｂの太いバンドが認められた。ラット８ｔの前記バンドは、心臓ＲＮＡを含有するレーンで最も強かったが、脳ＲＮＡを含有するレーンでも、これよりも弱いバンドが確認された。９ｑ  ｃＤＮＡプローブでハイブリダイズされたノーザンブロットでは、２．５ｋｂの太いバンドと４ｋｂを超える細いバンドとが認められ、主に脳及び心臓における発現を示した。前記細いバンドは、９ｑ  ＲＮＡが不完全にスプライス又は処理されていることを表すと考えられる。前記ノーザンブロットの結果、ｐ１９が主に心臓で発現されることが更に示された。
【０２８９】
例６：脳における１Ｖ、８Ｔ及び９Ｑの発現
ラットの脳における１ｖ及び８ｔ／９ｑ遺伝子の発現を、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション組織化学法（ＩＳＨＨ）にて、［３５Ｓ］−標識ｃＲＮＡプローブ及びＲｈｏｄｅｓ他（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６：４８４６−４８６０に述べられた方法と同じハイブリダイゼーション方法を用いて調べた。前記ｃＲＮＡプローブの作製のための鋳型を、標準的なＰＣＲ方法で作製した。簡単に説明すると、オリゴヌクレオチドプライマを、前記標的ｃＤＮＡの３’−又は５’−非翻訳領域の断片を増幅させ、更にＴ７及びＴ３ポリメラーゼのプロモータ認識配列を付加すべくデザインした。従って、前記１ｖ  ｍＲＮＡの３’−非翻訳領域を標的とする３００個のヌクレオチドからなるプローブを作製するために、以下のプライマを使用した：
５−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＣＴＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＴＣＴＣＡＧ−３（Ｔ７、正方向、センス；配列番号：４２）
５−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＣＡＣＴＡＣＴＧＴＴＴＡＡＧＣＴＣＡＡＧ−３（Ｔ３、逆方向、アンチセンス；配列番号：４３）。下線を付けた塩基は、Ｔ７及びＴ３プロモータ配列に対応する。８ｔ及び９ｑ  ｍＲＮＡに共通する３’−非翻訳配列の３２５塩基対領域を標的とするプローブを作製するために、以下のプライマを使用した：
５−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＣＴＣＣＧＧＣＴＧＴＴＣ−３（Ｔ７、正方向、センス；配列番号：４４）
５−ＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＧＣＡＧＧＧＴ−３（Ｔ３、逆方向、アンチセンス；配列番号：４５）。
【０２９０】
１ｖ又は８ｔ／９ｑ  ｍＲＮＡ発現のＩＳＨＨ局在化用に処理されたラットの脳組織切片のオートラジオグラムで、１ｖ  ｍＲＮＡが脳内で広く発現され、そのパターンが、神経細胞を標識した場合とは一致するが、グリア細胞又は内皮細胞を標識した場合とは一致しないことが判明した。１ｖ  ｍＲＮＡは、皮質、海馬及び線条体の介在ニューロン、視床網様体核、手綱内側、小脳顆粒細胞において高度に発現される。１ｖ  ｍＲＮＡは、黒質及び上丘を含めた中脳核、幾つかのその他の視床核並びに基底前脳の内側中隔核及び対角帯核において中程度に発現される。
【０２９１】
８ｔ及び９ｑの発現の分析に用いたプローブが、８ｔ  ｍＲＮＡと９ｑ  ｍＲＮＡとで一致する３’−非翻訳領域中の一領域にハイブリダイズするために、このプローブが生じる合成像は、８ｔ／９ｑ  ｍＲＮＡが脳内で広く発現され、そのパターンが、上述の１ｖの発現パターンと部分的に重複することを示す。しかし、８ｔ／９ｑ  ｍＲＮＡは、線条体、海馬構成体、小脳顆粒細胞及び新皮質で高度に発現される。８ｔ／９ｑ  ｍＲＮＡは、中脳、視床及び脳幹では中程度に発現される。これらの領域の多くでは、８ｔ／９ｑ  ｍＲＮＡは、主細胞に加えて介在ニューロンにも集中しており、また、全ての領域において、８ｔ／９ｑ発現は神経細胞には集中しているがグリア細胞には集中していないと考えられる。
【０２９２】
単一標識及び二重標識免疫組織化学法によって、ＰＣＩＰポリペプチドとＫｖ４ポリペプチドとが、ＰＣＩＰ  ｍＲＮＡ及びＫｖ４  ｍＲＮＡが同時に発現されている細胞種及び脳領域の多くで正確に共局在することが判明した。例えば、９ｑｍとＫｖ４．２とは、海馬の顆粒細胞及び錐体細胞の細胞体及び樹状突起、手綱内側核内の神経細胞及び小脳籠細胞において共局在し、一方、１ｖとＫｖ４．３とは、後部帯状回皮質の第２層神経細胞、海馬の介在ニューロン及び小脳顆粒細胞の一サブセットにおいて共局在した。免疫沈降分析によって、１ｖ及び９ｑｍがラットの脳膜において共にＫｖ４  α−サブユニットと結び付いていることが示された。
【０２９３】
例７：ＣＯＳ細胞及びＣＨＯ細胞における複数のＰＣＩＰチャネルとＫｖ４チャネルとの結び付き
ＣＯＳ１細胞及びＣＨＯ細胞を、リポフェクトアミンプラス法にて、製造者（ベーリンガー・マンハイム社）の記載した方法に概ね従い、個々のＰＣＩＰ（ＫＣｈＩＰ１、ＫＣｈＩＰ２、ＫＣｈＩＰ３）のみを単独で用いて、或いはＫｖ４．２又はＫｖ４．３を併用して一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後に、細胞を洗浄し、固定し、前述の免疫蛍光法による視覚化のための処理を行った（Ｂｅｋｅｌｅ−Ａｒｃｕｒｉ他（１９９６）Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，３５：８５１−８６５）。前記Ｋｖ４チャネル又は前記ＰＣＩＰタンパク質に対するアフィニティ精製されたウサギのポリクローナル抗体又はマウスのモノクローナル抗体を、前記標的タンパク質の免疫蛍光検出に用いた。
【０２９４】
前記ＰＣＩＰは、単独に発現された場合には、ＣＯＳ−１細胞及びＣＨＯ細胞の細胞質全体に分散して存在したが、細胞質タンパク質でも同様であると予想される。これに対し、Ｋｖ４．２及びＫｖ４．３ポリペプチドは、単独に発現された場合には、核周囲のＥＲ及びゴルジ区画に集中し、一部の免疫反応が前記細胞の外縁部に集中した。前記ＰＣＩＰがＫｖ４  α−サブユニットと同時に発現された場合には、前記ＰＣＩＰの分散特性は大きく異なり、前記ＰＣＩＰは前記Ｋｖ４  α−サブユニットと正確に共局在した。前記ＰＣＩＰのこの再分布は、Ｋｖ１．４  α−サブユニットと同時に発現された場合には起こらなかった。このことは、異常なＰＣＩＰ局在は過剰な発現の結果として起こるのではなく、これらのＰＣＩＰはＫｖ４−ファミリーのα−サブユニットと特異的に結び付くことを示している。
【０２９５】
ＰＣＩＰポリペプチドとＫｖ４ポリペプチドとが、同時にトランスフェクトされた細胞内で単に共局在しているだけではなく、緊密に結び付いていることを立証するために、上述のＰＣＩＰ及びチャネル特異的抗体を用いたレシプロカル（原語ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）免疫沈降分析を実施した。抗Ｋｖ４．２抗体及び抗Ｋｖ４．３抗体が、同時にトランスフェクトされた細胞から作製した溶解産物からＫＣｈＩＰ１、ＫＣｈＩＰ２及びＫＣｈＩＰ３タンパク質を免疫沈降させる能力を有すること及び、抗ＰＣＩＰ抗体が、これらと同じ溶解産物からＫｖ４．２及びＫｖ４．３  α−サブユニットを免疫沈降させる能力を有することから、３つのＰＣＩＰポリペプチドが全て、同時にトランスフェクトされた細胞中でＫｖ４  α−サブユニットと結び付いていることが立証された。これらの細胞を、界面活性剤及びプロテアーゼ阻害物質を含有する緩衝液中で溶解させ、前述の方法（Ｎａｋａｈｉｒａ他（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：７０８４−７０８９）に概ね従って免疫沈降反応用に調製した。免疫沈降を、Ｎａｋａｈｉｒａ他（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：７０８４−７０８９並びにＨａｒｌｏｗ  Ｅ．及びＬａｎｅ，Ｄ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ｃ１９８８に記載の方法で実施した。前記免疫沈降の産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にてサイズ分画し、標準的な方法でニトロセルロースフィルタに転写した。
【０２９６】
Ｋｖ４チャネルの細胞質内のＮ末端が、前記ＰＣＩＰとの相互作用に充分であるか否かを確認するために、ＫＣｈＩＰ１又はＫＣｈＩＰ２を、２１９個のアミノ酸からなる細胞内Ｃ末端全体を欠くＫｖ４．３ミュータント（Ｋｖ４．３ΔＣ）と同時に発現させた。一過性にトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞では、前記Ｋｖ４．３ΔＣミュータントは核周囲のＥＲ及びゴルジ体内に集中して存在し、前記細胞の外縁部では、殆ど又は全く観察されなかった。それにもかかわらず、ＫＣｈＩＰ１及びＫＣｈＩＰ２は、同時にトランスフェクトされた細胞でＫｖ４．３ΔＣと正確に共局在し、更に、Ｋｖ４．３ΔＣはＰＣＩＰ抗体によって効率的に共免疫沈降された。このことは、これらのＰＣＩＰとＫｖ４  α−サブユニットとの相互作用が前記チャネルの細胞内Ｃ末端を必要としないことを示している。
【０２９７】
例８：天然の組織における複数のＰＣＩＰチャネルと複数のＫｖ４チャネルとの結び付き
天然の組織において複数のＰＣＩＰが複数のＫｖ４サブユニットと共局在及び結合するか否かを調べるために、複数のＫｖ４特異的抗体及び複数のＰＣＩＰ特異的抗体を用いて、ラットの脳膜の単一標識及び二重標識免疫組織化学分析並びにレシプロカル（原語ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）共免疫沈降分析を行った。ラットの脳切片の免疫組織化学染色によって、ＫＣｈＩＰ１及びＫＣｈＩＰ２が、領域特異的及び細胞種特異的にＫｖ４．２及びＫｖ４．３と共局在することが示された。例えば、ＫＣｈＩＰ１は、海馬の介在ニューロン、小脳顆粒細胞、小脳糸球体、小脳の籠細胞及びゴルジ細胞の樹状突起と苔状線維終末と間の特定のシナプス配列において、Ｋｖ４．３と共局在した。ＫＣｈＩＰ２は、歯状回の顆粒細胞の樹状突起、海馬及び新皮質の錐体細胞の先端樹状突起及び基底樹状突起、線条体及び上丘を含めた複数の皮質下構造において、Ｋｖ４．３及びＫｖ４．２と共局在した。ラットの脳全体から作製したシナプス膜を用いて実施した共免疫沈降分析の結果、前記ＰＣＩＰ（ＫＣｈＩＰ１、２及び３）が、脳のＫ＋チャネル複合体中でＫｖ４．２及びＫｖ４．３と緊密に結び付いていることが判明した。抗ＰＣＩＰ抗体は、脳膜からのＫｖ４．２及びＫｖ４．３を免疫沈降させ、抗Ｋｖ４．２及びＫｖ４．３抗体は、前記ＰＣＩＰを免疫沈降させた。前記ＰＣＩＰポリペプチドのいずれも、抗Ｋｖ２．１抗体によっては免疫沈降されなかったが、このことは、これらのＰＣＩＰと脳Ｋｖチャネルとの結び付きがＫｖ４  α−サブユニットに特異的である可能性があることを示している。以上を併せて考慮すると、これらの解剖学的及び生化学的分析は、これらのＰＣＩＰが天然のＫｖ４チャネル複合体の必須の構成要素であることを示している。
【０２９８】
例９：ＰＣＩＰはカルシウム結合タンパク質である
ＫＣｈＩＰ１、２及び３がＣａ２＋と結合するか否かを調べるために、ＧＳＴ−融合タンパク質を各ＰＣＩＰについて作製し、前記ＧＳＴ−融合タンパク質及びＧＳＴから酵素開裂された組換えＰＣＩＰポリペプチドが４５Ｃａ２＋と結合する能力を、フィルタ重層アッセイ（例えばＫｏｂａｙａｓｈｉ他（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１８９（１）：５１１−７に記載）にて検査した。このアッセイで、３つのＰＣＩＰポリペプチドは全て、４５Ｃａ２＋との強い結合を示したが、無関係なＧＳＴ−融合タンパク質は前記結合を示さなかった。更に、３つのＰＣＩＰポリペプチドは全て、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＣａ２＋に依存した移動度の変化を示したが、このことは、このファミリーの他のメンバーと同様に、ＫＣｈＩＰ１、２及び３が実際にはＣａ２＋結合タンパク質であることを示している（Ｋｏｂｕｙａｓｈｉ他（１９９３）同上；Ｂｕｘｂａｕｍ他  Ｎｅｆ（１９９６）．Ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｅｎｓｏｒｓ（ｔｈｅ  ＮＣＳ−１  ｓｕｂｆａｍｉｌｙ）．Ｉｎ：Ｃｅｌｉｏ  ＭＲ（編）Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｉｕｍ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ニューヨーク州オックスフォード・ユニバーシティ・プレス社、ｐｐ９４−９８；Ｂｕｘｂａｕｍ  Ｊ．Ｄ．，他（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４（１０）：１１７７−８１）。
【０２９９】
例１０：ＰＣＩＰの電気生理学的特性の解析
例えばＫＣｈＩＰ１（１ｖ）、ＫＣｈＩＰ２（９ｑｌ）及びＫＣｈＩＰ３（ｐ１９）などのＰＣＩＰが、脳内でＫｖ４  α−サブユニットと共局在及び結合していることから、これらのＰＣＩＰがＫｃ４チャネルの伝達特性を変化させるのか否かを調べることが別の重要な課題であった。この問題に対処するために、Ｋｖ４．２及びＫｖ４．３を、単独で及び各ＰＣＩＰと組み合わせて発現させた。ＣＨＯ細胞を、ＤＯＴＡＰリポフェクション法を用いて、製造者（ベーリンガー・マンハイム社）が記載する方法で、ｃＤＮＡにより一過性にトランスフェクトさせた。強化型ＧＦＰと目的の遺伝子とを同時にトランスフェクトさせた後に、前記細胞が緑色ＧＦＰ蛍光を発するか否かを調べることにより、トランスフェクトされた細胞を特定した。ＣＨＯ細胞内の電流を、パッチクランプ法にて測定した（Ｈａｍｉｌｌ他  １９８１．Ｐｆｌｕｅｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．３９１：８５−１００）。
【０３００】
ＣＨＯ細胞におけるラットＫｖ４．２  α−サブユニットの一過性トランスフェクションの結果、典型的なＡ型Ｋ＋伝達が発現された。Ｋｖ４．２とＫＣｈＩＰ１とが同時に発現されることで、ＫＣｈＩＰ１が前記チャネルに対して及ぼす幾つかの顕著な効果が明らかになった（図４１及び表１）。第一に、Ｋｖ４．２の電流振幅は、ＫＣｈＩＰ１の存在下でおよそ７．５倍に増加した（Ｋｖ４．２のみの振幅＝０．６０＋／−０．０９６ｎＡ／細胞；Ｋｖ４．２＋ＫＣｈＩＰ１＝４．５＋／−０．５５ｎＡ／細胞）。細胞表面膜面積の一尺度である細胞の静電容量を補正することによって電流密度に換算すると、Ｋｖ４．２の電流密度は、ＫＣｈＩＰ１との同時発現によって１２倍に増加し（Ｋｖ４．２のみ＝２５．５＋／−３．２ｐＡ／ｐＦ；Ｋｖ４．２＋ＫＣｈＩＰ１＝３０６．９＋／−５７．９ｐＡ／ｐＦ）、ＫＣｈＩＰ１がＫｖ４．２の表面での発現を促進及び／又は安定化させることが示された。この電流密度の増加に加えて、Ｋｖ４．２及びＫＣｈＩＰ１を発現している細胞において、Ｋｖ４．２電流を活性化させるためのしきい値が大幅に左側に変動した（Ｋｖ４．２のみの活性化Ｖ１／２＝２０．８＋／−７．０ｍＶ、Ｋｖ４．２＋ＫＣｈＩＰ１＝−１２．１＋／−１．４ｍＶ）。最後に、Ｋｖ４．２の失活反応速度は、Ｋｖ４．２がＫＣｈＩＰ１と同時に発現された場合には、大幅に遅くなった（Ｋｖ４．２のみの失活時定数＝２８．２＋／−２．６ｍｓ；Ｋｖ４．２＋ＫＣｈＩＰ１＝１０４．１＋／−１０．４ｍｓ）が、一方、Ｋｖ４．２とＫＣｈＩＰ１との双方を発現している細胞（回復タウ＝５３．６＋／−７．６ｍｓ）においては、チャネルは、Ｋｖ４．２のみを発現している細胞（回復タウ＝２７２．２＋／−２６．１ｍｓ）よりも迅速に失活から回復した。
【０３０１】
ＫＣｈＩＰ１、２及び３は、Ｎ末端がそれぞれ異なるが、Ｃ末端「コア」ドメイン内のアミノ酸の種類はかなり一致する。Ｎ末端の相違にもかかわらず、ＫＣｈＩＰ２及びＫＣｈＩＰ３がＫｖ４．２電流密度及び反応速度に与える作用は、ＫＣｈＩＰ１が及ぼす前記作用と酷似している（表１）。従って、３つのＥＦハンド全てを持つ前記保存されているＣ末端コアドメインがＫｖ４電流密度及び反応速度を調節するのに十分であることを確認するために、ＫＣｈＩＰ１及びＫＣｈＩＰ２のＮ末端切断ミュータントを作製した。ＫＣｈＩＰ１ΔＮ２−３１及びＫＣｈＩＰ２ΔＮ２−６７ミュータントはそれぞれ、ＫＣｈＩＰ１及びＫＣｈＩＰ２を切断してＣ末端の１８５個のアミノ酸コア配列としたものである。ＣＨＯ細胞においてＫＣｈＩＰ１ΔＮ２−３１又はＫＣｈＩＰ２ΔＮ２−６７をＫｖ４．２と同時に発現させることにより、Ｋｖ４．２の電流密度及び反応速度が変化したが、これらの変化は、全長ＫＣｈＩＰ１又はＫＣｈＩＰ２によってもたらされる変化と殆ど同じであった（表１）。
【０３０２】
これらのＫＣｈＩＰによる調節作用がＫｖ４チャネルに特異的であるのか否かを調べるために、ＫＣｈＩＰ１をアフリカツメガエルの卵母細胞中でＫｖ１．４及びＫｖ２．１と同時に発現させた。アフリカツメガエルの卵母細胞に、標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他  １９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・プレス社）を用いて作製した１乃至３ｎｇ／卵母細胞のｃＲＮＡを注入した。アフリカツメガエルの卵母細胞内の電流を、二電極電圧クランプにて測定した。ＫＣｈＩＰ１は、Ｋｖ１．４及びＫｖ２．１に対してはいかなる作用も及ぼさない（表２）と思われ、このことは、これらの機能作用がＫｖ４チャネルに特異的である可能性があることを示している。ＫＣｈＩＰ作用に対する最終的なコントロールとして、及びＫＣｈＩＰがＫｖ４電流に及ぼす作用が発現系とは無関係であることを立証するために、アフリカツメガエルの卵母細胞においてＫｖ４．３及びＫＣｈＩＰ  ｍＲＮＡを発現させた後に、上述の反応速度アッセイを繰り返した。アフリカツメガエルの卵母細胞系においてＫＣｈＩＰ１がＫｖ４．３に及ぼす作用は、ＣＨＯ細胞においてＫｖ４．２に及ぼされる前記作用と酷似していた（表１）。
【０３０３】
これらのＫＣｈＩＰがＣａ＋に結合することから、ＫＣｈＩＰ１がＫｖ４．２電流に及ぼす作用がＣａ＋に依存するのか否かを調べることも重要な課題である。この課題に間接的に対処するために、ＫＣｈＩＰ１のＥＦハンドドメインのそれぞれに点変異を導入した：一方のミュータントは、最初の２つのＥＦハンドに点変異を有し（Ｄ１９９からＡ、Ｇ１０４からＡ、Ｄ１３５からＡ及びＧ１４０からＡ）、他方のミュータントは、３つのＥＦハンド全てに点変異を有した（Ｄ１９９からＡ、Ｇ１０４からＡ、Ｄ１３５からＡ、Ｇ１４０からＡ、Ｄ１８３からＡ及びＧ１８８からＡ）。これらの変異は、前記ＥＦハンドコンセンサス中の最も高度に保存されたアミノ酸をアラニンに置換するものであった（図２５；Ｌｉｎｓｅ，Ｓ．及びＦｏｒｓｅｎ，Ｓ．（１９９５）  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｔｈａｔ  ｇｏｖｅｒｎ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃａｌｃｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｉｎ  Ｍｅａｎｓ，Ｓ．（編）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｓｅｃｏｎｄ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．ニューヨーク、レーヴンズプレス社、３０：８９−１５０）。このＫｃｈＩＰ１の３つのＥＦハンドミュータントとＫｖ４．２又はＫｖ４．３とのＣＯＳ細胞における同時発現は、このミュータントが、ＣＯＳ−１細胞においてＫｖ４  α−サブユニットと共局在および効率的に共免疫沈降することを示した。しかし、これらのＥＦハンド点変異は、ＫＣｈＩＰ１がＫｖ４．２の反応速度に及ぼす作用を完全に打ち消した（表１）。併せて考慮すると、これらの結果は、ＫＣｈＩＰ１とＫｖ４．２との相互作用はＣａ＋とは無関係であるが、Ｋｖ４．２の反応速度のＫＣｈＩＰ１による調節は、Ｃａ２＋依存性であるか又は前記ＥＦハンドドメイン内の点変異により引き起こされる構造上の変化に感応性であることを示している。
【０３０４】
（表１）
2004525610.tif 000008
【０３０５】
（表２）
2004525610.tif 000009
【０３０６】
例１１：ＫＣｈＩＰ１がＣＯＳ−１細胞表面におけるＫＶ４−αサブユニットの発現に及ぼす影響
ＫＣｈＩＰ１がＫｖ４チャネルの表面発現を促進する能力を調べるために、ＫＣｈＩＰ１がＫｖ４チャネルとＰＳＤ−９５とをＫｖ４チャネルの表面上に一緒に集中的に形成させる能力をモニタした。ＰＳＤ−９５を、前記複合体の視覚化のために使用した。
【０３０７】
Ｋｖ４．３とＰＳＤ−９５との相互作用を容易にするために、ｒＫｖ１．４（ＳＮＡＫＡＶＥＴＤＶ、配列番号：７３）からのＣ末端の１０個のアミノ酸がＫｖ４．３のＣ末端に付加されたキメラＫｖ４．３サブユニット（Ｋｖ４．３ｃｈ）を作製した。前記ｒＫｖ１．４からのＣ末端の１０個のアミノ酸は、ＰＳＤ−９５と結合し、かつ前記Ｋｖ４．３のＣ末端と融合すると、前記Ｋｖ４．３タンパク質にＰＳＤ−９５との結合能力を付与するという理由で使用した。ＣＯＳ−１細胞におけるＫｃ４．３ｃｈの発現は、前記細胞の外縁部で検出されたＫｖ４．３ｃｈの免疫活性がわずかであったことから、前記Ｋｖ４．３ｃｈポリペプチドが核周囲の細胞質中に捕捉されたことを示した。Ｋｖ４．３ｃｈがＰＳＤ−９５と同時に発現された場合には、ＰＳＤ−９５は核周囲の細胞質中に捕捉され、Ｋｖ４．３ｃｈと共局在した。しかし、ＫＣｈＩＰ１がＫｖ４．３ｃｈ及びＰＳＤ−９５と同時に発現された場合には、Ｋｖ４．３ｃｈ、ＫＣｈＩＰ１及びＰＳＤ−９５の大きな斑状の集合が表面上に観察された。三重標識免疫蛍光検査によって、これらの表面集合に３つのポリペプチド全てが含まれることが確認され、また、レシプロカルな（原語ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）共免疫沈降分析によって、これら３つのポリペプチドがこれらの表面集合中で互いに結び付いていることが示された。コントロール実験で、ＫＣｈＩＰ１はＰＳＤ−９５のみとは相互作用せず、また表面集合中でＫｖ１．４及びＰＳＤ−９５とは共局在しないことが示された。併せて考慮すると、これらのデータは、ＫＣｈＩＰ１がＫｖ４．３サブユニットの細胞表面への移行を促す可能性があることを示している。
【０３０８】
例１２：ＰＣＩＰタンパク質の特性の解析
この例では、ＰＣＩＰタンパク質のアミノ酸配列を既知のタンパク質のアミノ酸配列と比較し、様々なモチーフを同定した。
【０３０９】
配列番号：３で表されるアミノ酸配列を持つ１ｖポリペプチドは、アミノ酸残基２１６個を持つ新規なポリペプチドである。カルシウム結合に関与すると推定されるドメイン（Ｌｉｎｓｅ，Ｓ．及びＦｏｒｓｅｎ，Ｓ．（１９９５）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０、チャプター３、ｐ８９−１５１、Ｍｅａｎｓ，ＡＲ．編、レーヴンプレス社、ニューヨーク）を、配列アライメント（図２１を参照のこと）によって同定した。
【０３１０】
配列番号：３０で表されるアミノ酸配列を持つ８ｔポリペプチドは、アミノ酸残基２２５個を持つ新規なポリペプチドである。カルシウム結合に関与すると推定されるドメイン（Ｌｉｎｓｅ，Ｓ．及びＦｏｒｓｅｎ，Ｓ．（１９９５）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０、チャプター３、ｐ８９−１５１、Ｍｅａｎｓ，ＡＲ．編、レーヴンプレス社、ニューヨーク）を、配列アライメント（図２１を参照のこと）によって同定した。
【０３１１】
９ｑポリペプチドは、カルシウム結合に関与すると推定されるドメイン（Ｌｉｎｓｅ，Ｓ．及びＦｏｒｓｅｎ，Ｓ．（１９９５）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０、チャプター３、ｐ８９−１５１、Ｍｅａｎｓ，ＡＲ．編、レーヴンプレス社、ニューヨーク）を持つ新規なポリペプチドである（図２１を参照のこと）。
【０３１２】
ｐ１９ポリペプチドは、カルシウム結合に関与すると推定されるドメイン（Ｌｉｎｓｅ，Ｓ．及びＦｏｒｓｅｎ，Ｓ．（１９９５）Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０、チャプター３、ｐ８９−１５１、Ｍｅａｎｓ，ＡＲ．編、レーヴンプレス社、ニューヨーク）が含まれる新規なポリペプチドである（図２１を参照のこと）。
【０３１３】
ラット１ｖｌのヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴＮ  ２．０．７検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３）によって、ラット１ｖｌがラットｃＤＮＡクローンＲＭＵＡＨ８９（登録番号ＡＡ８４９７０６）と類似していることが判明した。ラット１ｖｌ核酸分子は、ヌクレオチド１０６３乃至１４８８の９８％が、ラットｃＤＮＡクローンＲＭＵＡＨ８９（登録番号ＡＡ８４９７０６）と相同である。
【０３１４】
ヒト９ｑｌのヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴＮ  ２．０．７検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３）によって、ヒト９ｑｌがヒトｃＤＮＡクローン１３０９４０５（登録番号ＡＡ７５７１１９）と類似していることが判明した。ヒト９ｑｌ核酸分子は、ヌクレオチド９３７乃至１４０５の９８％が、ヒトｃＤＮＡクローン１３０９４０５（登録番号ＡＡ７５７１１９）と相同である。
【０３１５】
マウスＰ１９のヌクレオチド配列のＢＬＡＳＴＮ  ２．０．７検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３）によって、マウスＰ１９がハツカネズミｃＤＮＡクローンＭＮＣｂ−７００５（登録番号ＡＵ０３５９７９）と類似していることが判明した。マウスＰ１９核酸分子は、ヌクレオチド１乃至５８３の９８％が、ハツカネズミｃＤＮＡクローンＭＮＣｂ−７００５（登録番号ＡＵ０３５９７９）と相同である。
【０３１６】
例１３：細菌細胞における組換えＰＣＩＰタンパク質の発現
この例では、ＰＣＩＰは大腸菌中で組換えグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ポリペプチドとして発現され、この融合ポリペプチドを単離してその特性を解析する。具体的には、ＰＣＩＰをＧＳＴと融合させ、この融合ポリペプチドを、例えばＢＩ２１株などの大腸菌中で発現させる。前記ＧＳＴ−ＰＣＩＰ融合タンパク質のＢＩ２１中での発現を、ＩＰＴＧにて誘導する。この組換え融合ポリペプチドを、前記誘導後のＢＩ２１株の溶菌液から、グルタチオンビーズ上でのアフィニティクロマトグラフィによって精製する。前記溶菌液から精製したポリペプチドのポリアクリルアミドゲル電気泳動分析により、前記得られた融合ポリペプチドの分子量を測定する。
【０３１７】
ラット１ｖ及び９ｑｌを、ｐＧＥＸ−６ｐ−２（ファーマシア社）中にクローニングした。得られた組換え融合タンパク質を、大腸菌細胞中で発現させ、当業で公知の方法（例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙＡｕｓｕｂｅｌ他編、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ社：１９９２に記載）に従って精製した。前記精製したタンパク質の種類を、ラット１ｖ及び９ｑｌのペプチドエピトープに対抗する抗体を用いたウェスタンブロット法にて確認した。
【０３１８】
例１４：ＣＯＳ細胞における組換えＰＣＩＰタンパク質の発現
ＣＯＳ細胞におけるＰＣＩＰ遺伝子の発現に、インビトロジェン社（カリフォルニア州サンディエゴ）のｐｃＤＮＡ／Ａｍｐベクターを使用する。このベクターは、ＳＶ４０複製起点と、アンピシリン耐性遺伝子と、大腸菌複製起点と、ポリリンカ領域がその後に続くＣＭＶプロモータと、ＳＶ４０イントロン及びポリアデニレーション部位と、を有する。前記ＰＣＩＰタンパク質全体をコードする断片及び前記断片の３’末端にインフレームで融合したＨＡ標識（Ｗｉｌｓｏｎ他（１９８４）Ｃｅｌｌ  ３７：７６７）又はＦＬＡＧ標識を、前記ベクターの前記ポリリンカ領域内にクローニングすることにより、前記組換えタンパク質を前記ＣＭＶプロモータの制御下で発現させる。
【０３１９】
プラスミド作製のために、前記ＰＣＩＰ  ＤＮＡ配列を、２つのプライマを用いたＰＣＲで増幅させる。５’プライマには、目的の制限部位が含まれ、その後に、開始コドンから始まる前記ＰＣＩＰのコード配列の約２０個のヌクレオチドが続く；３’末端配列には、もう一方の目的の制限部位の相補的配列と、翻訳終了コドンと、前記ＨＡ標識又はＦＬＡＧ標識と、前記ＰＣＩＰコード配列の最後の２０個のヌクレオチドとが含まれる。ＰＣＲ増幅した前記断片と前記ｐｃＤＮＡ／Ａｍｐベクターとを、適切な制限酵素で消化し、前記ベクターをＣＩＡＰ酵素（ニューイングランドバイオラブズ社、マサチューセッツ州ベヴァリー）を用いて脱リン酸化させる。前記ＰＣＩＰ遺伝子が正しい方向に挿入されるように、前記選択した２つの制限部位は互いに異なることが望ましい。前記ライゲーション混合物を大腸菌細胞（カリフォルニア州ラホーヤ、ストラタジーンクローニングシステムズ社から入手可能なＨＢ１０１、ＤＨ５ａ、ＳＵＲＥ株を使用可能）中に形質転換させ、前記形質転換した培養株をアンピシリン培地プレート上で培養し、耐性のコロニを選択する。プラスミドＤＮＡを形質転換体から単離し、正しい断片の有無を制限分析で調べる。
【０３２０】
次に、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストランを用いたトランスフェクション、リポフェクション又はエレクトロポレーションにより、ＣＯＳ細胞をＰＣＩＰ−ｐｃＤＮＡ／ＡｍｐプラスミドＤＮＡでトランスフェクトさせる。宿主細胞をトランスフェクトさせるためのその他の好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、１９８９に記載されている。前記ＰＣＩＰポリペプチドの発現を、放射線標識法（ＮＥＮ社、マサチューセッツ州ボストンから入手可能な３５Ｓ−メチオニン又は３５Ｓ−システインを使用可能）及び免疫沈降法（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．及びＬａｎｅ，Ｄ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、１９８８）により、ＨＡ特異的モノクローナル抗体を用いて検出する。簡単に説明すると、前記細胞を３５Ｓ−メチオニン（又は３５Ｓ−システイン）で８時間標識する。次に、培地を回収し、界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、０．１％のＳＤＳ、０．５％のＤＯＣ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５）を用いて細胞を溶解させる。前記細胞溶解産物及び前記培地の双方を、ＨＡ特異的モノクローナル抗体で沈降させる。次に、沈降したポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法にて分析する。
【０３２１】
又は、前記ＰＣＩＰコード配列を有するＤＮＡを、適切な制限部位を用いて前記ｐｃＤＮＡ／Ａｍｐベクター中に直接にクローニングする。得られたプラスミドを上述の方法でＣＯＳ細胞中にトランスフェクトさせ、ＰＣＩＰポリペプチドの発現を、放射線標識及びＰＣＩＰ特異的モノクローナル抗体を用いた免疫沈降法にて検出する。
【０３２２】
ラット１ｖを哺乳類の発現ベクターｐＲＢＧ４中にクローニングした。ＬｉｐｏｆｅｃｔＡｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（ギブコＢＲＬ社）を用いて、製造者の使用説明書に従い、ＣＯＳ細胞へのトランスフェクションを行った。発現した１ｖタンパク質を、ウサギ又はマウス中で１ｖに対抗して産生された抗体を用いて、免疫細胞化学反応及び／又はウェスタンブロット分析で検出した。
【０３２３】
例１５：ヒト全長Ｐ１９の同定及び特性の解析
ヒト全長ｐ１９配列を、ＲＡＣＥ  ＰＣＲ法にて同定した。ｐ１９（ＫＣｈＩＰ３とも呼ぶ）の配列を図１６に示す。ヒトｐ１９のアミノ酸配列は、マウスｐ１９遺伝子（配列番号：３５）と９２％相同である。
【０３２４】
ヒトｐ１９のタンパク質配列を用いたＴＢＬＡＳＴＮ検索により、ヒトｐ１９が、２つの配列、カルセニリン（（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１１７７−１１８１に記載）並びに、プロジノルフィン（原語ｐｒｏｄｙｎｏｒｐｈｉｎ）及びｃ−ｆｏｓ転写のＣａ２＋依存性の調節因子であるＤＲＥＡＭ（Ｃａｒｒｉｏｎ他（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：８０−８４に記載）と相同であることが判明した。ヒトｐ１９は、ヌクレオチドレベルでカルセニリンと１００％相同であり（但し、発表されている配列の３’側に伸びている）、またヌクレオチドレベルでＤＲＥＡＭと９９％相同である。
【０３２５】
ｐ１９（及びその他のＰＣＩＰファミリーメンバー）がプレセニリンと共局在して転写因子として作用する能力を、ノーザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、β−ｇａｌアッセイ、ＤＮＡ移動度アッセイ（例えばＣａｒｒｉｏｎ他（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９８：８０に記載）及びＤＮＡ移動度スーパーシフトアッセイなどの当業で周知の方法により、ＫＣｈＩＰに特異的な抗体を用いて調べる。
【０３２６】
ＰＣＩＰファミリーメンバーとプレセニリンとの結び付きを調べるためのその他の好適なアッセイは、共免疫沈降法（例えばＢｕｘｂａｕｍ他（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：１１７７に記載）である。
【０３２７】
例１６：サルＫＣｈＩＰ４の同定及び特性の解析
この例では、サルＫＣｈＩＰ４ａ（ｊｌｋｂｄ３５２ｅ０１ｔ１）及び選択的にスプライスされたサルＫＣｈＩＰ４ｂ（ｊｌｋｂｂ２３１ｃ０４ｔ１）、ＫＣｈＩＰ４ｃ（ｊｌｋｘａ０５３ｃ０２）及びＫＣｈＩＰ４ｄ（ｊｌｋｘ０１５ｂ１０）をコードする遺伝子の同定及び特性の解析について述べる。プロプライエタリなデータベースを既知のＰＣＩＰファミリーメンバーの配列でＴＢＬＡＳＴＮ検索した結果、４つのクローンｊｌｋｂｂ２３１ｃ０４ｔ１、ｊｌｋｂｄ３５２ｅ０１ｔ１、ｊｌｋｘａ０５３ｃ０２及びｊｌｋｘ０１５ｂ１０が同定された。前記４つのサルクローンを取得して配列決定した。
【０３２８】
プロプライエタリなサルクローンｊｌｋｂｂ２３１ｃ０４ｔ１及びｊｌｋｂｄ３５２ｅ０１ｔ１は、ここでＫＣｈＩＰ４と呼ぶ更なる一ＰＣＩＰファミリーメンバーの選択的にスプライスされたバリアントに対応することが判明した。クローンｊｌｋｂｂ２３１ｃ０４ｔ１は、ｊｌｋｂｄ３５２ｅ０１ｔ１と比較して８２２塩基対の（エキソンのスプライスアウトによると推定される）欠失を有し、このために、最後のＥＦハンドドメインが欠落している。クローンｊｌｋｂｄ３５２ｅ０１ｔ１では、前記最後のＥＦハンドドメインは保存されており、そのＣ末端はＰＣＩＰファミリーメンバー１ｖ、９ｑｌ及びｐ１９のＣ末端と高度に相同である。ＫＣｈＩＰ４、１ｖ、９ｑｌ及びｐ１９の互いに相同なＣ末端の全体的な相同度は、アミノ酸レベルで７１％乃至８０％であった（ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いたアライメントを実施した）。
【０３２９】
サルＫＣｈＩＰ４ｃ及びＫＣｈＩＰ４ｄは、サルＫＣｈＩＰ４ａを検索キーワードとしたプロプライエタリなデータベースのＢＬＡＳＴＮ検索によって発見された。
【０３３０】
サルＫＣｈＩＰ４ａ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び前記ＫＣｈＩＰ４ａポリペプチドの推定アミノ酸配列は、図２３並びに配列番号：４８及び４９にそれぞれ示される。
【０３３１】
サルＫＣｈＩＰ４ｂ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び前記ＫＣｈＩＰ４ｂポリペプチドの推定アミノ酸配列は、図２４並びに配列番号：５０及び５１にそれぞれ示される。
【０３３２】
サルＫＣｈＩＰ４ｃ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び前記ＫＣｈＩＰ４ｃポリペプチドの推定アミノ酸配列は、図３５並びに配列番号：６９及び７０にそれぞれ示される。
【０３３３】
サルＫＣｈＩＰ４ｄ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び前記ＫＣｈＩＰ４ｄポリペプチドの推定アミノ酸配列は、図３６並びに配列番号：７１及び７２にそれぞれ示される。
【０３３４】
図３７は、タンパク質配列ＫＣｈＩＰ４ａ、ＫＣｈＩＰ４ｂ、ＫＣｈＩＰ４ｃ及びＫＣｈＩＰ４ｄのアライメントを図示したものである。
【０３３５】
ラットＫＣｈＩＰ４は、主に脳内で発現され、腎臓でも若干発現されるが、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋又は精巣では発現されないことが、クロンテック社から購入したノーザンブロットをラットＫＣｈＩＰ４の３’側非翻訳領域からのＤＮＡ断片で標識したノーザンブロット実験によって示された。
【０３３６】
例１７：ヒト及びラット３３ｂ０７の同定及び特性の解析
この例では、ラット及びヒト３３ｂ０７をコードする遺伝子の同定及び特性の解析について述べる。部分長ラット３３ｂ０７（クローン名９ｏ）を、ｒＫｖ４．３Ｎをおとりとした上述の２ハイブリッドスクリーニングから陽性クローンとして単離した。全長ラット３３ｂ０７クローンを、プロプライエタリなデータベースのマイニングによって同定した。
【０３３７】
全長ラット３３ｂ０７  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び前記ラット３３ｂ０７ポリペプチドの推定アミノ酸配列は、図２６及び配列番号：５２及び５３にそれぞれ示される。前記ラット３３ｂ０７  ｃＤＮＡは、分子量約４４．７ｋＤ、４０７アミノ酸残基長のタンパク質をコードする。
【０３３８】
ラット３３ｂ０７は、酵母２ハイブリッドアッセイでｒＫｖ４．３Ｎ及びｒＫｖ４．２Ｎと結合するが、ｒＫｖ４．２Ｎに対して僅かに選択性を示す。一方、ラット３３ｂ０７はｒＫｖ１．１Ｎとは結合しない。このことは、ラット３３ｂ０７−Ｋｖ４Ｎ相互作用が特異的であることを示す。
【０３３９】
ラット３３ｂ０７は、主に脳内で発現されることがノーザンブロット分析で示されている。
【０３４０】
ヒト３３ｂ０７オルソログ（クローン１０６ｄ５）も、プロプライエタリなデータベースのマイニングによって同定した。全長ヒト３３ｂ０７  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及び前記ヒト３３ｂ０７の推定アミノ酸配列は、図２７及び配列番号：５４及び５５にそれぞれ示される。前記ヒト３３ｂ０７  ｃＤＮＡは、分子量約４５．１ｋＤ、４１４アミノ酸残基長のタンパク質をコードする。
【０３４１】
ヒト３３ｂ０７は、ヒトＫＩＡＡ０７２１タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＢ０１８２６４）と、アミノ酸レベルで９９％相同である。但し、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＢ０１８２６４には機能アノテーションがない。ヒト３３ｂ０７は、精巣特異的（Ｙ−コード化された）タンパク質（ＴＳＰ（Ｙ））、ＳＥＴ及びヌクレオソーム構成タンパク質（ＮＡＰ）とも相同である。ヒト３３ｂ０７は、ヒトＳＥＴタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ０１１０５＝Ｕ５１９２４）と、アミノ酸２０４乃至３３７で３８％相同であり、アミノ酸３３４乃至３８７で４６％相同である。
【０３４２】
ヒトＳＥＴは、ＨＬＡ−ＤＲ関連タンパク質ＩＩ（ＰＨＡＰＩＩ）（Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ（１９９４）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３７５：１１３−１２６）とも呼ばれ、ＳＥＴ−ＣＡＮ融合遺伝子を形成させる転座事象の結果として起こる急性未分化型白血病（ＡＵＬ）に関与する場合がある（Ｖｏｎ  Ｌｉｎｄｅｒｎ  Ｍ．他（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：３３４６−３３５５）。ＳＥＴの別の一スプライス形は、鋳型活性化因子−Ｉアルファ（ＴＡＦ）と呼ばれる。ＴＡＦは、骨髄性白血病の発生に関与することが判明している（Ｎａｇａｔａ  Ｋ．他（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２  （１０），４２７９−４２８３）。ヒトＳＥＴも、ホスファターゼ２Ａのタンパク質阻害物質となりうる（Ａｄａｃｈｉ  Ｙ．他（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２２５８−２２６２）。ＮＡＰは、クロマチン形成の調節に関与し、細胞増殖の調節に寄与する可能性がある（Ｓｉｍｏｎ  Ｈ．Ｕ．他（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２９７，３８９−３９７）。
【０３４３】
このように、３３ｂ０７は、上述のタンパク質との相同性から、ホスファターゼのタンパク質阻害物質、腫瘍遺伝子及び／又はクロマチンモジュレータとして機能する可能性がある。特に注目すべきは、タンパク質ホスファターゼ阻害物質であるＳＥＴとの３３ｂ０７の相同性である。多くのチャネル、とりわけＫｖ４チャネル（３３ｂ０７がこれに関与している）は、ＰＫＣ及びＰＫＡによるリン酸化によって調節されることが知られている（（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １８（１０）：３５２１−３５２８；Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７３：Ｈ１７７５−８６（１９９７）。従って、３３ｂ０７は、カリウムチャネルのリン酸化状態を調節することによってＫｖ４活性を調節する可能性がある。
【０３４４】
例１８：ラット１ｐの同定及び特性の解析
この例では、ラット１ｐをコードする遺伝子の同定及び特性の解析について述べる。部分長ラット１ｐを、ｒＫｖ４．３Ｎをおとりとして使用した上述の酵母２ハイブリッドスクリーニングから陽性クローンとして単離した。
【０３４５】
部分長ラット１ｐ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びラット１ｐポリペプチドの推定アミノ酸配列は、図２８並びに配列番号：５６及び５７にそれぞれ示される。前記ラット１ｐ  ｃＤＮＡは、分子量約２８．６ｋＤ、２６７アミノ酸残基長のタンパク質をコードする。
【０３４６】
ラット１ｐは、酵母２ハイブリッドアッセイでｒＫｖ４．３Ｎ及びｒＫｖ４．２Ｎと結合するが、ｒＫｖ４．３Ｎに対して僅かに選択性を示す。一方、１ｐはｒＫｖ１．１Ｎとは結合しない。このことは、１ｐ−Ｋｖ４Ｎ相互作用が特異的であることを示す。
【０３４７】
ラット１ｐは、主に脳内で発現されることがノーザンブロット分析で示されている。
【０３４８】
スコア１００、ワード長３で行ったラット１ｐのアミノ酸配列のＢＬＡＳＴＰ１．４検索（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３）で、ラット１ｐがヒトＲｅｓｔｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｐ３０６２２；細胞質リンカタンパク質−１７０  アルファ−２（ＣＬＩＰ−１７０）、Ｍ９７５０１とも呼ばれる）と類似していることが判明した。このラット１ｐタンパク質は、ヒトＲｅｓｔｉｎとアミノ酸残基１０５乃至１８２で５８％相同であり、ヒトＲｅｓｔｉｎとアミノ酸残基１１５乃至１８６で５５％相同であり、ヒトＲｅｓｔｉｎとアミノ酸残基１７３乃至２４６で２２％相同であり、ヒトＲｅｓｔｉｎとアミノ酸残基１６９乃至２１８で２２％相同であり、ヒトＲｅｓｔｉｎとアミノ酸残基２１７乃至２２８で５８％相同である。
【０３４９】
Ｒｅｓｔｉｎは、Ｒｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ中間径フィラメント関連タンパク質とも呼ばれる。Ｒｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ細胞は、ホジキン病に特徴的な腫瘍性の細胞である。Ｒｅｓｔｉｎの過剰な発現は、ホジキン病の進行に寄与する一要因である可能性があることが示唆されており（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３）、またＲｅｓｔｉｎは、細胞内小胞を微小管に繋げる中間径フィラメント関連タンパク質であると思われる（Ｐｉｅｒｒｅ  Ｐ，他（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７０（６），８８７−９００）。
【０３５０】
細胞骨格は、カリウムチャネルの活性を調節する（例えば、Ｈｏｎｏｒｅ  Ｅ他（１９９２）ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：２４６５−２４７１及びＬｅｖｉｎ  Ｇ他（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９３２１−２９３２８）と共に、例えばＣａ＋＋チャネル（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｂ．Ｄ．他（１９９３）Ｎｅｕｒｏｎ  １０：７９７−８０４）又はＮａ＋チャネル（Ｆｕｋｕｄａ  Ｊ．他（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：８２−８５）などの他のチャネルの活性も調節する。
【０３５１】
従って、ラット１ｐタンパク質は、前記Ｒｅｓｔｉｎタンパク質との相同性から、細胞骨格と結び付いている可能性があり、また、前記細胞骨格との結び付きを介して、例えばＫｖ４などのカリウムチャネルの活性を調節する可能性がある。
【０３５２】
例１９：ラット７ｓの同定及び特性の解析
この例では、ラット７ｓをコードする遺伝子の同定及び特性の解析について述べる。部分長ラット７ｓを、ｒＫｖ４．３Ｎをおとりとして使用した上述の酵母２ハイブリッドスクリーニングから、陽性クローンとして単離した。ラット７ｓは、ヒト空胞Ｈ（＋）−ＡＴＰアーゼ触媒サブユニットＡ（登録番号Ｐ３８６０６及びＢ４６０９１）のラットオルソログであり、例えばｖａｎ  Ｈｉｌｌｅ  Ｂ．他（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１０），７０７５−７０８０に記載されている。
【０３５３】
部分長ラット７ｓ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びラット７ｓポリペプチドの推定アミノ酸配列は、図２９並びに配列番号：５８及び５９にそれぞれ示される。前記ラット７ｓ  ｃＤＮＡは、分子量約２８．６ｋＤ、２７０アミノ酸残基長のタンパク質をコードする。
【０３５４】
ラット７ｓは、酵母２ハイブリッドアッセイでｒＫｖ４．３Ｎ及びｒＫｖ４．２Ｎと結合するが、ｒＫｖ４．３Ｎに対して選択性を示す。一方、７ｓはｒＫｖ１．１Ｎとは結合しない。このことは、７ｓ−Ｋｖ４Ｎ相互作用が特異的であることを示す。
【０３５５】
ラット７ｓは、胚、肝臓、心臓、精巣及び骨格筋におけるよりも、脳及び腎臓において有意に高いレベルで発現されることが、ノーザンブロット分析で示されている。
【０３５６】
例２０：ラット２９ｘ及び２５ｒの同定及び特性の解析
この例では、ラット２９ｘをコードする遺伝子の同定及び特性の解析について述べる。ラット２９ｘを、ｒＫｖ４．３Ｎをおとりとして使用した上述の酵母２ハイブリッドアッセイから、陽性クローンとして単離した。ラット２５ｒは、２９ｘのスプライスバリアントである。これら２つは５’側非翻訳領域が異なるが、コード領域及びアミノ酸レベルでは相同である。
【０３５７】
ラット２９ｘ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びラット２９ｘポリペプチドの推定アミノ酸配列は、図３０並びに配列番号：６０及び６１にそれぞれ示される。前記ラット２９ｘ  ｃＤＮＡは、分子量約４０．４ｋＤ、３５１アミノ酸残基長のタンパク質をコードする。
【０３５８】
ラット２５ｒ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、図３１及び配列番号：６２にそれぞれ示される。前記ラット２５ｒ  ｃＤＮＡは、分子量約４０．４ｋＤ、３５１アミノ酸残基長のタンパク質をコードする。
【０３５９】
ラット２９ｘは、脾臓、肺、腎臓、心臓、脳、精巣、骨格筋及び肝臓において発現されるが、このうち脾臓において最も高いレベルで、肺において最も低いレベルで発現される。
【０３６０】
ラット２９ｘは、酵母２ハイブリッドアッセイでｒＫｖ４．３Ｎ及びｒＫｖ４．２Ｎと結合するが、ｒＫｖ４．３Ｎに対して僅かに選択性を示す。一方、２９ｘはｒＫｖ１．１Ｎとは結合しない、このことは、２９ｘ−Ｋｖ４Ｎ相互作用が特異的であることを示す。
【０３６１】
ラット２９ｘは、Ｓｔａｒｒ  Ｒ．他（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：９１７−９２１に記載のラットＳＯＣＳ−１（サイトカインシグナリングの抑圧遺伝子）；Ｅｎｄｏ  Ｔ．Ａ．他（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：９２１−９２４に記載のＪＡＢ；及びＮａｋａ  Ｔ．他（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：９２４−９２８に記載のＳＯＣＳ−１（ＳＴＡＴ誘導性ＳＴＡＴ阻害物質−１）とアミノ酸レベルで相同である。これらのタンパク質は、ＳＨ２ドメインを有し、ＪＡＫキナーゼに結合してこれを阻害し、この結果サイトカインシグナリングを調節することを特徴とする。
【０３６２】
ここで使用する「ＳＨ２ドメイン」という用語は、Ｓｒｃ相同２ドメインとも呼ばれるが、例えば他のタンパク質のホスホチロシン残基などのホスホチロシン残基の結合に関与する、約１００アミノ酸長のタンパク質ドメインを持つ。この標的部位は、ＳＨ２結合部位と呼ばれる。前記ＳＨ２ドメインは、２つのアルファヘリックス及び６つ乃至７つのベータ鎖からなる保存された三次元構造を有する。前記ＳＨ２ドメインのコアは、２つの互いに接続されたベータシートからなる連続的なベータメアンダ（原語ｂｅｔａ  ｍｅａｎｄｅｒ）によって形成される（Ｋｕｒｉｙａｎ  Ｊ．他（１９９７）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：８２８−８３７）。ＳＨ２ドメインは、ホスホチロシンを含有する標的ペプチドと高い親和度で配列特異的かつ完全にリン酸化依存的な仕方で相互作用することにより、細胞内シグナリングカスケードの調節モジュールとして機能する（Ｐａｗｓｏｎ  Ｔ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：５７３−５８０）。幾つかのタンパク質は、リンタンパク質との結合親和性を高めるか又は複数の異なるリンタンパク質への結合能力を付与する複数のＳＨ２ドメインを有する。ラット２９ｘは、配列番号：６１のアミノ酸残基２１９乃至３０８にＳＨ２ドメインを有する。
【０３６３】
チロシンリン酸化は、カリウムチャネル活性を調節する（Ｐｒｅｖａｒｓｋａｙａ  Ｎ．Ｂ．他（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２４２９２−２４２９９）。ＪＡＫキナーゼは、タンパク質をチロシンでリン酸化させ、チャネル活性の調節に関与している（Ｐｒｅｖａｒｓｋａｙａ  Ｎ．Ｂ．他、同上）。従って、ＳＯＣＳ−１、ＪＡＢ及びＳＳＩ−１との相同性に基づき、ラット２９ｘは、例えばＫｖ４などのカリウムチャネルの活性を、ＪＡＫキナーゼ活性を調節することによって調節する可能性がある。
【０３６４】
例２１：ラット５ｐの同定及び特性の解析
この例では、ラット５ｐをコードする遺伝子の同定及び特性の解析について述べる。ラット５ｐを、ｒＫｖ４．３Ｎをおとりとして使用した上述の酵母２ハイブリッドスクリーニングから陽性クローンとして単離した。
【０３６５】
ラット５ｐ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びラット５ｐポリペプチドの推定アミノ酸配列は、図３２並びに配列番号：６３及び６４にそれぞれ示される。前記ラット５ｐ  ｃＤＮＡは、分子量約１１．１ｋＤ、９５アミノ酸残基長のタンパク質をコードする。
【０３６６】
ラット５ｐは、酵母２ハイブリッドアッセイで、ｒＫｖ４．３Ｎ及びｒＫｖ４．２Ｎと同程度の強度で結合する。一方、５ｐはｒＫｖ１．１Ｎとは結合しない。このことは、５ｐ−Ｋｖ４Ｎ相互作用が特異的であることを示す。
【０３６７】
ラット５ｐは、脾臓、肺、骨格筋、心臓、腎臓、脳、肝臓及び精巣において発現されることが、ノーザンブロット分析で示されている。
【０３６８】
ラット５ｐは、ラットＣａｌｐａｃｔｉｎ  Ｉ軽鎖又はＰ１０（登録番号Ｐ０５９４３）と相同である。Ｐ１０は、アネキシンＩＩ（ｐ３６）と結合し、その二量体化を誘導する。Ｐ１０は、ｐ３６単量体がチロシン特異的キナーゼの好適な標的である（Ｍａｓｉａｋｏｗｓｋｉ  Ｐ．他（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５（４）：１２７７−１２８１）ことから、タンパク質リン酸化の調節物質として機能する可能性がある。
【０３６９】
チロシンリン酸化は、カリウムチャネル活性を調節する（Ｐｒｅｖａｒｓｋａｙａ  Ｎ．Ｂ．他、同上）。従って、Ｐ１０との相同性に基づき、ラット５ｐは、例えばＫｖ４などのカリウムチャネルの活性を、チロシン特異的キナーゼの活性を調節することによって調節する可能性がある。
【０３７０】
例２２：ラット７ｑの同定及び特性の解析
この例では、ラット７ｑをコードする遺伝子の同定及び特性の解析について述べる。ラット７ｑを、ｒＫｖ４．３Ｎをおとりとして使用した上述の酵母２ハイブリッドスクリーニングから陽性クローンとして単離した。全長ラット７ｑを、ＲＡＣＥ  ＰＣＲで作製した。
【０３７１】
ラット７ｑ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びラット７ｑポリペプチドの推定アミノ酸配列は、図３３並びに配列番号：６５及び６６にそれぞれ示される。前記ラット７ｑ  ｃＤＮＡは、分子量約２３．５ｋＤ、２１２アミノ酸残基長のタンパク質をコードする。
【０３７２】
ラット７ｑは、酵母２ハイブリッドアッセイで、ｒＫｖ４．３Ｎ及びｒＫｖ４．２Ｎと同程度の強度で結合する。一方、７ｑはｒＫｖ１．１Ｎとは結合しない。このことは、７ｑ−Ｋｖ４Ｎ相互作用が特異的であることを示す。
【０３７３】
ラット７ｑは、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓及び精巣において発現されることが、ノーザンブロット分析で示されている。
【０３７４】
ラット７ｑは、アミノ酸レベルでＲＡＢ２（ラットＲＡＳ関連タンパク質、登録番号Ｐ０５７１２）と相同である。ＲＡＢ２は、小胞輸送及びタンパク質輸送に関与すると思われる（Ｔｏｕｃｈｏｔ  Ｎ．他（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４（２３）：８２１０−８２１４）。従って、ラット７ｑは、ＲＡＢとの相同性に基づき、例えばＫｖ４などのカリウムチャネル輸送に関与している可能性がある。
【０３７５】
例２３：ラット１９ｒの同定及び特性の解析
この例では、ラット１９ｒをコードする遺伝子の同定及び特性の解析について述べる。部分長ラット１９ｒを、ｒＫｖ４．３Ｎをおとりとして用いた上述の酵母２ハイブリッドスクリーニングから、陽性クローンとして単離した。全長ラット１９ｒをＲＡＣＥ  ＰＣＲで作製した。
【０３７６】
ラット１９ｒ  ｃＤＮＡのヌクレオチド配列及びラット１９ｒポリペプチドの推定アミノ酸配列は、図３４並びに配列番号：６７及び６８にそれぞれ示される。前記ラット１９ｒ  ｃＤＮＡは、分子量約３１．９ｋＤ、２７１アミノ酸残基長のタンパク質をコードする。
【０３７７】
ラット１９ｒは、心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓及び精巣において発現されることが、ノーザンブロット分析で示されている。
【０３７８】
ラット１９ｒは、酵母２ハイブリッドアッセイで、ｒＫｖ４．３Ｎ及びｒＫｖ４．２Ｎと結合するが、ｒＫｖ４．３Ｎに僅かに選択性を示す。一方、１９ｒはｒＫｖ１．１Ｎとは結合しない。このことは、１９ｒ−Ｋｖ４Ｎ相互作用が特異的であることを示す。
【０３７９】
ラット１９ｒは、Ｄｉｃｋｅｓｏｎ  Ｓ．Ｋ．他（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６５５７−１６５６４に記載のラットホスファチジルイノシトール（ＰＴＤＩＮＳ）輸送タンパク質アルファ（ＰＴＤＩＮＳＴＰ、登録番号Ｍ２５７５８又はＰ１６４４６）と相同である。ＰＴＤＩＮＳＴＰは、ホスホリパーゼＣ−ベータ（ＰＬＣ−ベータ）シグナリング、ホスファチジルイノシトール輸送タンパク質（ＰｔｄＩｎｓ−ＴＰ）合成、分泌小胞の形成及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰｔｄＩｎｓ３−キナーゼ）活性の促進（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  Ｅ．他（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５（７）：７７５−７８３；（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７７（６５４９）：５４４−５４７；及びＰａｎａｒｅｔｏｕ  Ｃ．他（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４）：２４７７−２４８５）に関与すると考えられている。
【０３８０】
従って、ラット１９ｒは、ＰＴＤＩＮＳＴＰとの相同性に基づき、例えばＫｖ４などのカリウムチャネルの活性を、ＰＬＣ−ベータシグナリング経路及び／又はＰｔｄＩｎｓ３−キナーゼシグナリング経路を介して調節する可能性がある。ラットｐ１９ｒは、例えばＫｖ４などのカリウムチャネルの輸送にも関与している可能性がある。
【０３８１】
例２４：ヒト９ｑの染色体局在化
この例では、放射線ハイブリッドパネル（Ｐａｎｅｌ  ＧＢ４）を用いたヒトＰＣＩＰ  ９ｑの染色体マッピングを行った。ｈ９ｑは、部分てんかんとの連関を有することが以前に示されている染色体１０ｑの一領域であるＤ１０Ｓ１９２：１０ｑ２２−ｑ２４（Ｏｔｔｍａｎ他（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １０：５６−６０）（図４３参照）に位置した。この観察に基づき、本発明は、９ｑタンパク質ファミリーが抗てんかん薬開発の標的及びてんかんへの医療的介入の標的となりうることを明確に立証する。
【０３８２】
更に、ｈ９ｑは、ＩＯＳＣＡとの連関を有することが以前に示されている染色体１０ｑの一領域であるＤ１０Ｓ１９２及びＤ１０Ｓ１２６５：１０ｑ２４−Ｎｉｋａｌｉ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ３９：１８５−１９１（１９９７））（図４２及び４３参照）に位置した。この観察に基づき、本発明は、９ｑタンパク質ファミリーが抗脊髄小脳失調薬開発の標的及び脊髄小脳失調への医療的介入の標的となりうることを明確に立証する。
【０３８３】
例２５：Ｋｖ４／ＫＣｈＩＰチャネルのアラキドン酸による調節
ＡＡによるＫｖ４電流の反応速度調節はＫＣｈＩＰ依存性である
アラキドン酸（ＡＡ）は、アフリカツメガエル卵母細胞において発現される組換えＫｖ４電流を抑制することが示されている（Ｖｉｌｌａｒｒｏｅｌ，Ａ．及びＳｃｈｗａｒｚ，Ｔ．Ｌ．（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １６：２５２２−３２）。しかし、この調節が観察されたのはピーク電流振幅においてのみであり、電流反応速度パラメータは、ＡＡの存在下では影響を受けなかった。これに対し、海馬神経細胞からの膜パッチの記録から、ＡＡは、ピーク振幅を抑制するのに加えて、Ｋｖ４チャネルによるＡ電流の反応速度パラメータを変化させることが示された（Ｋｅｒｏｓ，Ｓ．及びＭｃＢａｉｎ，Ｃ．Ｊ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １７：３４７６−８７）。特に注目すべき点として、失活時定数が大幅に減少した（注：失活時定数は、失活速度と逆相関する）。従って、失活速度が増加した（Ｋｅｒｏｓ（１９９７）同上）。
【０３８４】
この例では、ＫＣｈＩＰが上述の反応速度の差異の原因となる欠落した補助サブユニットなのではないかという仮説を、ＣＨＯ細胞及びアフリカツメガエル卵母細胞の双方において、Ｋｖ４を単独で又はＫＣｈＩＰと同時に発現させ、これらの失活時定数を測定することで検証した（例えばＡｎ他（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：５５３−６；Ｋｅｒｏｓ，Ｓ．及びＭｃＢａｉｎ，Ｃ．Ｊ．（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １７：３４７６−８７；及びＶｉｌｌａｒｒｏｅｌ，Ａ．及びＳｃｈｗａｒｚ，Ｔ．Ｌ．（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １６：２５２２−３２に記載の当業で周知の方法を用いた）。
【０３８５】
ＡＡによるＫｖ４の反応速度の調節は、ＫＣｈＩＰ依存性であることが示された（表３）。Ｋｖ４．２がＣＨＯ細胞中で単独で発現された場合には、発生した電流の失活時定数は、ＡＡ１０μＭの有無にかかわらず変化しなかった（３２±３対３２±２ミリ秒（ｍｓ）±標準誤差（ＳＥＭ））。これに対し、ＫＣｈＩＰ１と同時に発現させた場合には、Ｋｖ４．２の失活時定数は、ＡＡの非存在下における８８±８ｍｓから、ＡＡ１０μＭの存在下では３７±３ｍｓまで減少した。アフリカツメガエル卵母細胞中のＫＣｈＩＰ１（表４）及びＫＣｈＩＰ２についても、同様の結果が得られた。これらの結果は、ＡＡによるＫｖ４電流の反応速度の調節が、ＫＣｈＩＰの存在に依存していることを示す。ＡＡの存在下におけるＫｖ４／ＫＣｈＩＰの反応速度の変化は、神経細胞膜に関する上述の記載（Ｋｅｒｏｓ（１９９７）同上）と一致し、ＫＣｈＩＰがＫｖ４電流の内在性サブユニットであるという仮説を支持するものである。
【０３８６】
ＡＡがＣＨＯ細胞及びアフリカツメガエル卵母細胞の双方におけるＫｖ４／ＫＣｈＩＰ電流のピーク振幅をも抑制した（表３及び４）点にも注目すべきである。このことは、Ｋ４電流のピーク振幅の調節がＫＣｈＩＰとは無関係であることを示している。
【０３８７】
（表３）
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【０３８８】
Ａ電流に及ぼすアラキドン酸の影響についても、Ｋｖ４及びＫＣｈＩＰの双方が存在する神経細胞系（培養された初代小脳顆粒細胞）で調べた。ＴＥＡ（１０ｍＭ）を加えて、少量の持続的な外向き電流成分を遮断した。アラキドン酸１０μＭの非存在下及び存在下におけるＡ電流の失活時定数は、それぞれ、４４±５ｍｓ及び２１±３ｍｓ（平均±ＳＥＭ）であった。対応するピーク振幅は、２．０±０．６ｎＡから１．２±０．４ｎＡまで減少した。これらの結果は、アラキドン酸が天然の細胞においてＫｖ４  Ａ電流の振幅及び反応速度の双方を調節することを裏付けるものである。
【０３８９】
アラキドン酸によるＫｖ４／ＫＣｈＩＰ電流の調節は濃度依存的かつ可逆的である
アラキドン酸の様々な濃度がＫｖ４／ＫＣｈＩＰ電流に及ぼす影響を、アフリカツメガエル卵母細胞で調べた。アラキドン酸の生理的濃度は多くの場合１０μＭ未満である（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ他、１９８６  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５５：６９−１０２；Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＷｅｌｓｈ，１９９０，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８７：７３３４−８；Ｍｅｖｅｓ，１９９４，Ｐｒｏｇ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ４３：１７５−８６）ので、アラキドン酸を１乃至１０μＭの範囲内で検査した。Ｋｖ４．３電流のピーク振幅の濃度依存性の遮断は、ＫＣｈＩＰ１の存在とは無関係であった（図６４Ａ参照）。更に、濃度増加の関数としての振幅減少の傾きは、ＫＣｈＩＰの有無に無関係に非常に類似していた。ピーク電流の遮断は、１０μＭまでは飽和しないと思われた。Ｖｉｌｌａｒｒｏｅｌ及びＳｃｈｗａｒｚ，（１９９６）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６：２５２２−３２は、アラキドン酸のＫｖ４  αサブユニットに対するＩＣ５０が、卵母細胞でおよそ８μＭであることを報告している。ＫＣｈＰＩ１の非存在下での失活時定数は、検査した全てのアラキドン酸濃度で不変であった。しかし、ＫＣｈＩＰ１の存在下では、失活時定数は濃度依存的に減少した（図６４Ｂ参照）。
【０３９０】
アラキドン酸１０μＭによるＫＣｈＩＰ依存性失活の加速開始及びＫＣｈＩＰに無関係なＫｖ４．３電流の遮断は、殆ど同時であった（図６５）。僅かな遅れ（１４秒）の少なくとも一部は、溶液をリザーバから記録チャンバに移したことによるものであった。振幅の遮断は、長時間にわたって徐々に発生した（図６５Ａ）。ＫＣｈＩＰ１の存在によって、電流遮断の減少率又は速度が長時間にわたって大幅に変化することはなく、またＫｖ４．３電流振幅の回復速度が長時間にわたって変化することもなかった（図６５Ａ）。前記振幅遮断の緩やかな発生とは異なり、Ｋｖ４反応速度に対するＫＣｈＩＰ１依存性の作用は、アラキドン酸の潅流後により急速に発生し、迅速に安定状態に向かった（図６５Ｂ）。アラキドン酸の洗浄除去後、Ｋｖ４．３電流振幅及び失活時定数は、ＫＣｈＩＰ１の存在下における場合と同様の速度で完全に回復した（図６５Ａと６５Ｂとを比較されたい）。パネルＢのＫｖ４．３のみの場合のプロットにおける２つの小さな変曲は、緩衝液の交換による人為現象であった。
【０３９１】
その他の脂肪酸によるＫｖ４／ＫＣｈＩＰの調節
幾つかの脂肪酸は、アフリカツメガエル卵母細胞においてＫｖ４  αが単独で発現された場合のＫｖ４電流に対するアラキドン酸の作用と同様の作用を及ぼすことが以前に示されている（Ｖｉｌｌａｒｒｏｅｌ及びＳｃｈｗａｒｚ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６：２５２２−３２（１９９６））。従って、ＫＣｈＩＰの存在下における脂肪酸のＫｖ４電流に対する選択性を調べた。アラキドン酸は、炭素骨格数２０、４つのｃｉｓ二重結合を持ち、最初の二重結合がＣ５（２０：４ｃ５）の脂肪酸である。構造上の特徴が異なる以下のアラキドン酸類似体について調べた：γ−リノレン酸（１８：３  ｃ９）は、４つの二重結合の代わりに３つのｃｉｓ二重結合を持ち、リノエライジン酸（原語ｌｉｎｏｌｅｌａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）（１８：２  ｔ９）は４つのｃｉｓ二重結合の代わりに２つのｔｒａｎｓ二重結合を持ち、５，８，１１，１４−エイコサテトライン酸（原語ｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｙｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）（ＥＴＹＡ、２０：４  ｎ５）は、アラキドン酸に見られる二重結合の代わりに、４つの三重結合を有し（ｎは最初の三重結合の位置を表す）、５，８，１１−エイコサトリイン酸（原語ｅｉｃｏｓａｔｒｉｙｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）（ＥＴＩ、２０：３  ｎ５）は３つの三重結合を有する。図６６Ａは、Ｋｖ４．３のピーク振幅が、脂肪酸を含まないコントロールと比較して、γ−リノレン酸、ＥＴＩ、ＥＴＹＡ及びアラキドン酸１０μＭによって、ＫＣｈＩＰ１の有無に無関連に有意に抑制されたことを示す。Ｋｖ４のみの場合とＫｖ４／ＫＣｈＩＰの場合とで、振幅の抑制率は、これらの脂肪酸のいずれについても有意な差はなかった。リノエライジン酸（原語ｌｉｎｏｌｅｌａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）１０μＭによるＫｖ４電流振幅の少量だが統計学上有意な遮断が、値をそれぞれのコントロールと比較した場合に、ＫＣｈＩＰ１の存在下では観察され、ＫＣｈＩＰ１の非存在下では観察されなかった。しかし、Ｋｖ４．３のみの場合とＫｖ４．３／ＫＣｈＩＰ  ＫＣｈＩＰ１の場合とを比較すると、有意な差はなかった。
【０３９２】
ＫＣｈＩＰ１の非存在下では、検査対象のいずれの脂肪酸も、Ｋｖ４．３失活時定数に対する有意な作用を示さなかった（図６６Ｂ）。ＫＣｈＩＰとは無関係に有意な電流遮断を発生させた脂肪酸（γ−リノレン酸、ＥＴＩ、ＥＴＹＡ及びアラキドン酸）のみが、ＫＣｈＩＰ１と同時に発現された場合にＫｖ４．３失活時定数を減少させた。ＫＣｈＩＰ依存性のＫｖ４．３電流遮断がわずかであったリノレン酸は、Ｋｖ４．３失活時定数に影響を及ぼさなかった（図６６Ｂ）。従って、幾つかの長鎖脂肪酸は、アラキドン酸と同様に、Ｋｖ４電流の反応速度をＫＣｈＩＰ依存的に調節する可能性がある。一般に、ある任意の脂肪酸がピーク振幅を遮断する能力と、再構成されたＫｖ４／ＫＣｈＩＰ電流の反応速度を調節する能力との間には、高い関連性がある。
【０３９３】
アラキドン酸はＫｖ４とＫＣｈＩＰとの結び付きを分断しない
この実験では、以下のアッセイを利用した。
【０３９４】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイ
ラットＫｖ４．３のＮ末端ドメインをＧＳＴ融合体（ＧＳＴ−Ｋｖ４．３Ｎ）として発現させ、アマーシャム・ファーマシア・バイオテック社（ニュージャージー州ピスカタウェイ）が提供するプロトコルに概ね従って大腸菌から精製した。組換えラットＫＣｈＩＰ１タンパク質を最初に発現させ、ＧＳＴ融合体として精製した後に、前記ＧＳＴ成分をＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（アマーシャム・ファーマシア・バイオテック社）を用いて開裂させ、遊離状態のＫＣｈＩＰ１タンパク質を生成させた。ＧＳＴ−Ｋｖ４．３Ｎタンパク質及びＫＣｈＩＰタンパク質は、双方ともに、変性ゲルのクーマシー染色による評価で９５％を上回る純度であった。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイを、スウェーデン、ウプサラのバイオコアＡＢ社からのＢｉｏｃｏｒｅ３０００を使用して実施した。前記実験を、１ｍＭのＣａＣｌ２と０．０５％のポリソルベートＰ−２０とを加えたｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中にて行った。抗ＧＳＴ抗体（バイオコアＡＢ社）を、２０００レゾナンスユニット（ＲＵ）のレベルで、アミン結合により、３フローセルのＣＭ−５チップ（バイオコアＡＢ社）に結合させた。最後のフローセルが、基準コントロール表面として使用したエタノールアミンによって活性化及び遮断された。ＧＳＴ−Ｋｖ４．３Ｎ末端ドメインは、前記抗ＧＳＴフローセルのうちの２つに捕捉され、ＧＳＴ単独のドメインは、第３の抗ＧＳＴフローセルに１５０ＲＵのレベルで結合した。次に、アラキドン酸１０μＭの存在下及び非存在下で、１μＭの精製ＫＣｈＩＰ１を、４つのフローセル全てに注入した。アラキドン酸（１０μＭ）単独の注入も行った。データをＧＳＴ基準減算センサーグラムとして示す。
【０３９５】
酵母２ハイブリッド株及び増殖アッセイ
おとり（Ｋｖ４．３のＮ末端ドメイン又は空ベクターｐＧＢＴ９）プラスミド及び餌食（ＫＣｈＩＰ１）プラスミドが含まれる二倍体株を、Ａｎ他、２０００に記載の方法で作製した。同期化のために、これらの株を飽和まで増殖させた後、均等なＯＤ６００値で、相互作用依存性の増殖を選択する５ｍｌの合成完全ＴｒｐＬｅｕＨｉｓドロップアウト（ＳＣ−ＷＬＨ）培地又は１０μＭのＥＴＹＡの存在下でも非存在下でも非選択的な５ｍｌのＳＣ−ＷＬ培地中に接種した。前記Ｋｖ４．３Ｎ末端ドメインおとりからの弱い自己活性化活性を抑制するために、前記培地に５ｍＭの３−ＡＴ（３−アミノ−１，２，４−トリアゾール）を含有させた。培養株を３０℃で１７時間増殖させ、ＯＤ６００値を分光光度計にて読み取った。
【０３９６】
アラキドン酸がＫｖ４とＫＣｈＩＰとの間の結合を妨害することによって作用するという仮説を検証するために、最初に表面プラスモン共鳴測定（バイオセンサ社）によって、アラキドン酸の存在下及び非存在下におけるＫｖ４−ＫＣｈＩＰ相互作用の結合相及び分離相をモニタした。Ｋｖ４．３の細胞内Ｎ末端ドメインは、ＧＳＴ融合タンパク質（ＧＳＴ−Ｋｖ４．３Ｎ）として発現され、バイオセンサチップの表面上に固定化された。組換えＫＣｈＩＰ１タンパク質は、アラキドン酸１０μＭの存在下でも非存在下でも、前記チップ表面上を通過した。図６７Ａに図示するように、ＫＣｈＩＰ１タンパク質はＧＳＴ−Ｋｖ４．３Ｎ表面に結合したが、ＫＣｈＩＰ１とＫｖ４．３のＮ末端ドメインとの結合相においても分離相においても、質的な差は観察されなかった。このバイオセンサの結果は、酵母２ハイブリッドアッセイにおいて、ＳＣ−ＷＬＨ選択培地中のＫｖ４−ＫＣｈＩＰ相互作用依存性の増殖が１０μＭのＥＴＹＡによる作用を受けなかったことで、更に確証された（図６７Ｂ）。これらの実験では、アラキドン酸の代わりにＥＴＹＡを用いたが、これは、ＥＴＹＡとアラキドン酸とはＫｖ４電流にほぼ同じ作用を及ぼすが、ＥＴＹＡは非代謝性であり、従ってこの実験により適しているからである。併せて考慮すると、これらの結果は、検査した脂肪酸のいずれも、Ｋｖ４とＫＣｈＩＰとの間の結合を阻害しないことを示している。
【０３９７】
Ｋｖ４／ＫＣｈＩＰはＫｖ１．１／Ｋｖβ１よりもＡＡ調節感受性が高い
カリウムチャネルを含めたイオンチャネルの小孔形成アルファサブユニットは、単独では機能しない場合が多い。これらのサブユニットは、補助サブユニットと結合するが、これらの補助サブユニットは、チャネル活性を大きく変化させうる。従って、生理学的に関連した複数のチャネルは複数のアルファ補助サブユニットからなる複合体であることから、アルファサブユニットとこれらの補助サブユニットとを組み合わせて研究するとより有益であろう。
【０３９８】
組換えＫｖ４アルファサブユニットは、単独で発現された場合、幾つかの他の（例えばＫｖ１．１などの）電圧依存性カリウムチャネルのアルファサブユニットよりも遙かにＡＡ阻害に対する感受性が高いことが示されている（Ｖｉｌｌａｒｒｏｅｌ（１９９６）同上）。しかし、この論文は、これらのチャネルのアルファサブユニットのみのＡＡ調節を検証したものである。全てのチャネルを、それらの同源の補助サブユニットの存在下で検査した場合でも、Ｋｖ４電流のＡＡ調節に対する感受性が他のチャネルの電流の前記感受性よりも高いか否かは、知られていなかった。
【０３９９】
この例では、２つのアルファ／補助複合体：Ｋｖ４．３／ＫＣｈＩＰ１及びＫｖ１．１／Ｋｖβ１を測定することで、上述の点を検査した。（Ｋｖβ１は、典型的なカリウムチャネルベータサブユニットの１つであり、Ｋｖ１．１の反応速度を大きく変化させる）。Ｋｖ４．３／ＫＣｈＩＰ１及びＫｖ１．１／Ｋｖβ１を、アフリカツメガエル卵母細胞中でそれぞれ発現させ、その結果生じた電流を、１０μＭのＡＡ存在下又は非存在下で記録した。結果は、Ｋｖ１．１／Ｋｖβ１電流のピーク振幅は、１０μＭのＡＡ存在下では有意に増加しなかった（１１±４から１４±１μＡ）が、一方、Ｋｖ４．３／ＫＣｈＩＰ１のピーク振幅は、大幅に減少した（４４±１０から２１±４μＡ、表４）。反応速度の点では、Ｋｖ４．３／ＫＣｈＩＰ１は、Ｋｖ１．１／Ｋｖβ１よりもＡＡ調節に対する感受性が高かった（図４）。Ｋｖ１．１／Ｋｖβ１の失活時定数は、１０μＭのＡＡによっては統計学上有意に減少しなかった（１１±１から９±１ｍｓ）が、Ｋｖ４．３／ＫＣｈＩＰ１の失活時定数は、同濃度のＡＡによって大幅に減少した（１０４±７から５５±４ｍｓ）。これらの結果は、天然の神経細胞におけるＫｖ４．３／ＫＣｈＩＰ１カリウム電流の反応速度及び振幅は、Ｋｖ１．１／Ｋｖβ１の反応速度及び振幅よりもＡＡによる調節を受けやすいことを示している。
【０４００】
（表４）
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【０４０１】
例２６：Ｋチャネル相互作用タンパク質−２（ＫＣｈＩＰ２）のスプライスバリアント、染色体構成及び局在化
この例では、ＫＣｈＩＰ２のバリアント及びこれらの染色体構成を、標準的な技術を用いて同定した。ＫＣｈＩＰ２遺伝子は、ヒト、ラット及びマウス間で、アミノ酸レベルで高度に保存されている。複数のヒトスプライスバリアントが、データベースマイニング及びｃＤＮＡライブラリスクリーニングによって同定されている。選択的スプライシングによって、長さは様々に異なるが、コアＣ末端ドメインはＫｖ４と結合してこれを調節することの可能な複数のＮ末端ドメインが生成される。ヒトＫＣｈＩＰ２遺伝子は、ヒト１０番染色体のｑ２３領域のＷＩ−８４８８とＷＩ−６７５０との間に１８ｋｂにわたって存在する。この領域は、マウス１９番染色体のＤ１９Ｍｉｔ４０からＤ１９Ｍｉｔ１１までに相当する。データベースマイニングによって発見されたラットの一バリアントは、最後のアミノ酸５個が変化していたが、Ｋｖ４と結び付いてこれを調節する能力は保持していた。従って、これらのＫＣｈＩＰ２の複数のバリアントは、同じＫｖ４調節機能を有するものと思われる。
【０４０２】
例２７：ＫＣｈＩＰ１Ｌの機能及び発現
ＲＴ−ＰＣＲを実施して、ラットＫＣｈＩＰ１ｌ（ＫＣｈＩＰ１の長型）スプライスバリアントの組織発現を調べた。心臓、脳、肺、脾臓、肝臓、骨格筋、腎臓及び精巣からのポリＡ＋ＲＮＡを、クロンテック社より購入した。ＲＴ−ＰＣＲの実施に当たっては、クロンテック社のワンステップＲＴ−ＰＣＲキットを用いて、増幅用５’プライマＧＧＴＡＣＣＴＴＣＴＣＧＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＣＣＡＡＡＣＡＡＡＧ（配列番号：１０４）及び３’プライマＣＧＧＴＡＡＡＧＧＡＣＴＴＧＣＡＧＴＴＣＴＣＴＣ（配列番号：１０５）を使用し、ＰＣＲ条件を以下のように変化させた：５０℃で１時間；９４℃で３分間；９４℃で３０秒間、６５℃で３０秒間、６８℃で２秒間を５０サイクル。５’プライマはＫＣｈＩＰ１特異的である。同じプライマ対を用いてＫＣｈＩＰ１とＫＣｈＩＰ１ｌとを増幅させ、電気泳動で２つのバンドに分離する２つのサイズの異なるＰＣＲ産物を生成させることが可能である。ＫＣｈＩＰ１ｌ特異的バンドは、脳のみにおいて観察された。このことは、ＫＣｈＩＰ１ｌが脳において特異的に発現されることを示す。同じ反応で、強いＫＣｈＩＰ１特異的信号が脳において観察され、骨格筋では可視バンドが僅かに現れた。ＫＣｈＩＰ１又はＫＣｈＩＰ１ｌ信号は、検査したその他のいずれの組織でも観察されなかった。要約すると、ＫＣｈＩＰ１ｌ発現は脳に特異的であるのに対し、ＫＣｈＩＰ１は主に脳で発現され、骨格筋ではきわめて低いレベルで発現される。
【０４０３】
アフリカツメガエル卵母細胞におけるＫＣｈＩＰ１ｌの機能についても調べた。Ｋｖ４．３  ｃＲＮＡを、ＫＣｈＩＰ１ｌ  ｃＲＮＡと一緒に又は単独でアフリカツメガエル卵母細胞に注入した。ＫＣｈＩＰ１と同様に、ＫＣｈＩＰ１ｌは、Ｋｖ４．３のピーク振幅を１５±４から５５±７μＡに増加させ、失活時定数を５６±４から１００±８ｍｓに増加させた（表５）。これらのデータは、ＫＣｈＩＰ１ｌが、ＫＣｈＩＰ１と同様に、Ｋｖ４電流のピーク振幅及び反応速度をｉｎ  ｖｉｔｒｏで調節することを示している。
【０４０４】
ＫＣｈＩＰ１とＫＣｈＩＰ１ｌとに共通するＣ末端の１８５個のアミノ酸がＫｖ４．３への結合の原因であると仮定すると、ＫＣｈＩＰ１ｌは脳内でＫｖ４とも結び付いている可能性がある。前記ＫＣｈＩＰ１ｌタンパク質中に別のアミノ酸を挿入することが、未知の機能を生じさせる重要な条件である可能性があり、これらのアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を、この特定のスプライスバリアントの細胞組織及び／又は細胞種特異的な発現を検出するための遺伝子特異的マーカとして用いてもよい。
【０４０５】
前記ＫＣｈＩＰ１ｌスプライスバリアントに特異的な前記ＤＮＡ及びタンパク質配列は、ラットとヒトとの間で相同である。従って、一方の種からのＫＣｈＩＰ１ｌ分子について得た機能データは、他方の種からのＫＣｈＩＰ１ｌ分子についても当てはまる。
【０４０６】
（表５）
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【０４０７】
例２８：ＫＣｈＩＰ１Ｎの機能及び発現
ラットＫＣｈＩＰ１Ｎの発現を、Ｔａｑｍａｎ法にて、プローブＧＧＣＡＡＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＴＴＴＴ（配列番号：１０６）、正プライマＴＣＣＣＧＧＧＴＡＧＧＣＡＡＧＣＡ（配列番号：１０７）及び逆プライマＣＣＴＧＣＴＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡ（配列番号：１０８）を使用して調べた。前記プローブは、ＫＣｈＩＰ１Ｎに特異的である。図６８に示すように、ＫＣｈＩＰ１Ｎは後根神経節（ＤＲＧ）において主に発現され、脊髄及び脳で低レベルに発現される。
【０４０８】
アフリカツメガエル卵母細胞におけるＫＣｈＩＰ１Ｎの機能についても調べた。Ｋｖ４．３  ｃＲＮＡを、ＫＣｈＩＰ１Ｎ  ｃＲＮＡと一緒に又は単独でアフリカツメガエル卵母細胞に注入した。ＫＣｈＩＰ１及びＫＣｈＩＰ１ｌの場合とは異なり、ＫＣｈＩＰ１ＮはＫｖ４．３のピーク振幅に影響を及ぼさなかった（単独の場合とＫＣｈＩＰ１Ｎと一緒の場合とで、１５±４と１８±３、表５）。驚くべきことに、ＫＣｈＩＰ１Ｎは、ＫＣｈＩＰ１又はＫＣｈＩＰ１ｌよりも遙かに大きくＫｖ４．３の失活時定数を増加させた（ＫＣｈＩＰ１Ｎでは３２倍の増加、ＫＣｈＩＰ１又はＫＣｈＩＰ１ｌでは２倍以下の増加、表５）。
【０４０９】
上述のデータは、ＫＣｈＩＰ１Ｎは、ＫＣｈＩＰ１又はＫＣｈＩＰ１ｌとは異なる仕方で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＫｖ４電流を調節することを示している。第１に、ＫＣｈＩＰ１Ｎによる失活時定数の増加度は、ＫＣｈＩＰ１又はＫＣｈＩＰ１ｌによる前記増加度よりも著しく大きかった。この結果、ＫＣｈＩＰ１Ｎは、急速に失活するＫｖ４．３電流（２００ｍｓで殆ど完全に失活）を、５００ｍｓの間殆ど失活しない＋４０ボルトのパルスへと変化させることができた。第２に、ＫＣｈＩＰ１Ｎは、検査した特定の濃度では、Ｋｖ４のピーク振幅に影響を及ぼさなかった。全てのＫＣｈＩＰ１スプライスバリアントが共通のＣ末端のアミノ酸１９６個を持つことから、これらのデータは、ＫＣｈＩＰ１Ｎに固有の３６個のアミノ酸からなるＮ末端ドメインが重要かつ独自の機能を有することを示している。
【０４１０】
例２９：ＫＣｈＩＰ２スプライスバリアントの機能
この例では、ＫＣｈＩＰ２スプライスバリアントであるラットＫＣｈＩＰ２ｌ、ヒトＫＣｈＩＰ２及びラットＫＣｈＩＰ２Ｃのアフリカツメガエル卵母細胞における機能を調べた。実験の結果を以下の表に要約する。
【０４１１】
（表６）
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【０４１２】
これらのデータは、これらのＫＣｈＩＰ２スプライスバリアントが、ＫＣｈＩＰ２ｍと同様にＫｖ４電流を調節することを示している（表６）。ラット及びヒトのＫＣｈＩＰ２はアミノ酸レベルでの相同性が非常に高い（＞９５％）ことから、一方の種からのＫＣｈＩＰ２分子を用いて得られた結果は、他方の種からのＫＣｈＩＰ２分子についての結果と同様であろうと考えられる。
【０４１３】
例３０：ＫＣｈＩＰ４の機能及び発現
ノーザン分析を実施して、ＫＣｈＩＰ４の組織発現を調べた。ＫＣｈＩＰ４の全てのＮ末端スプライスバリアントに共通なラットＫＣｈＩＰ４の３’ＵＴ領域（５９８−９０９）から作製したプローブを用いて、ラットのクロンテックＭＴＶノーザンブロットを行った。前記ノーザンブロットで使用した組織（心臓、脳、肺、脾臓、肝臓、筋肉、腎臓及び精巣）のうち、約２．４ｋｂの太いバンドが、脳のみにおいて観察された。移動度の僅かに高い微弱なバンドが、腎臓で現れた。従って、ＫＣｈＩＰ４のＮ末端スプライスバリアントが主に脳で発現され、より低いレベルで腎臓で発現されることは明白である。
【０４１４】
ＫＣｈＩＰ４がＫｖ４と結び付く能力についても、酵母２ハイブリッドアッセイにて調べた。標準的な技術を用いて、ＫＣｈＩＰ４の全てのＮ末端スプライスバリアントに共通であり、かつその他のＫＣｈＩＰと相同な、ＫＣｈＩＰ４のＨドメイン（Ｃ末端のアミノ酸１８５個）を「餌食」として発現させ、Ｋｖ４．３、Ｋｖ４．２の各Ｎ末端ドメインを「おとり」（それぞれＫｖ４．３Ｎ、Ｋｖ４．２Ｎ）として発現させた。増殖アッセイ及びβ−ガラクトシダーゼアッセイの双方において、ＫＣｈＩＰ４ＨはＫｖ４．３Ｎ及びＫｖ４．２Ｎと結合したが、Ｋｖ１．１Ｎ又はその他のコントロールおとりとは結合しなかった。これらの結果は、ＫＣｈＩＰ４がＫｖ４チャネルと特異的に結合することを示している。
【０４１５】
例３１：ＫＣｈＩＰ４Ｎ２の機能の分析
ＫＣｈＩＰ４Ｎ２は、ＫＣｈＩＰ１、ＫＣｈＩＰ２及びＫＣｈＩＰ３とは異なり、アフリカツメガエル卵母細胞にＫｖ４．３と一緒に注入された場合に、Ｋｖ４．３のピーク振幅に対して用量依存性の影響を示した（表７）。（例えば原液の５倍希釈などの）高い濃度では、ＫＣｈＩＰ４Ｎ２はＫｖ４．３電流振幅を抑制したが、より低濃度に希釈した場合では、ＫＣｈＩＰ４Ｎ２は、Ｋｖ４電流振幅を増加させるか、または影響を全く及ぼさなかった（表７）。
【０４１６】
ＫＣｈＩＰ４Ｎ２は、ＫＣｈＩＰ１、ＫＣｈＩＰ２及びＫＣｈＩＰ３とは異なり、アフリカツメガエル卵母細胞にＫｖ４．３と一緒に注入された場合に、Ｋｖ４．３の失活反応速度に対して用量依存性の影響を示した（表７）。ＫＣｈＩＰ４は、高い濃度では、急速に失活するＫｖ４．３電流を、殆ど失活しない電流へと変化させた（例えば原液の５倍希釈の場合、電流曲線は長時間にわたって非常にゆっくりと低下するので、失活時定数に達することはなかった）。より低濃度に希釈したＫＣｈＩＰ４Ｎ２  ｃＲＮＡを注入した場合は、失活時定数はＫＣｈＩＰ４Ｎ２の非存在下で得られた値に向かって低減した。
【０４１７】
（表７）
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【０４１８】
ＫＣｈＩＰ４Ｎ２のＮ末端ドメインは、ＫＣｈＩＰ４Ｎ２の前記観察された作用に不可欠である。前記Ｎ末端ドメインが欠失していると、野生型ＫＣｈＩＰ４Ｎ２がＫｖ４．３のピーク振幅及び失活時定数に対して及ぼす作用が失われた（表８）。
【０４１９】
ＫＣｈＩＰ４Ｎ２のＮ末端ドメインの前記作用は、他のＫＣｈＩＰ分子に対して優性であると考えられる。ＫＣｈＩＰ４Ｎ２の前記Ｎ末端ドメインがＫＣｈＩＰ１のＣ末端のアミノ酸１８５個からなるＨドメイン（ＫＣｈＩＰ１Ｈ、他のＫＣｈＩＰと相同である）と融合したキメラ分子である４Ｎ−１Ｈを作製した。ＫＣｈＩＰ１Ｈは、Ｋｖ４と同時に発現された場合に、ＫＶ４電流をＫＣｈＩＰ１と殆ど同様に調節し、ＫＣｈＩＰ４Ｎ２によって惹起される調節プロフィールとは全く異なる調節プロフィールを示した（以前の出願、［Ａｎ  Ｆ．他（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０３：５５３−５５６）。しかし、Ｋｖ４．３と同時に発現された場合には、４Ｎ−１Ｈの調節プロフィールは、ＫＣｈＩＰ１Ｈ又はＫＣｈＩＰ１の場合（表６）とは異なり、ＫＣｈＩＰ４Ｎ２の調節プロフィールと殆ど同じであった。このことは、ＫＣｈＩＰ４Ｎ２のＮ末端ドメインが一モジュールとして機能可能であり、その調節作用が他のＫＣｈＩＰの調節作用に対して優性であることを示している。
【０４２０】
（表８）
2004525610.tif 000015
【０４２１】
ＫＣｈＩＰ４とその他のＫＣｈＩＰとがＫｖ４のＮ末端ドメイン（Ｋｖ４Ｎ）と結び付くことから、これらのＫＣｈＩＰはＫｖ４Ｎの前記同じ部位に結合すると考えることができる。もしそうであるならば、ＫＣｈＩＰ４Ｎ２とＫＣｈＩＰ１とは、これらが双方ともにＫｖ４と同時に発現された場合に、Ｋｖ４電流の調節に当たって互いに競合するはずである。この仮定を検証し、図６１に示すように、ＫＣｈＩＰ４Ｎ２とＫＣｈＩＰ１とは、Ｋｖ４電流の調節に当たって実際に互いに競合した。アフリカツメガエル卵母細胞に注入するＫＣｈＩＰ４  ｃＲＮＡの濃度を一定に保つ一方で、ＫＣｈＩＰ１  ｃＲＮＡの濃度を次第に増加させると、Ｋｖ４．３電流プロフィールはＫＣｈＩＰ４とＫＣｈＩＰ１とで異なっていた。逆に、ＫＣｈＩＰ１  ｃＲＮＡの濃度を一定に保つ一方で、ＫＣｈＩＰ４  ｃＲＮＡの濃度を次第に増加させた場合でも、Ｋｖ４．３電流プロフィールはＫＣｈＩＰ１とＫＣｈＩＰ４とで異なっていた。
【０４２２】
これらの結果は、ＫＣｈＩＰ１とＫＣｈＩＰ４とは、おそらくＫｖ４．３Ｎの同じ部位への競合的な結合のために、互いに機能的に競合することを示している。これらの結果はまた、ＫＣｈＩＰ４Ｎ２とその他のＫＣｈＩＰとの異なる組合せから生じる電流が、親のプロフィールと量的及び質的に同じか又は異なる雑種プロフィールを有するであろうことをも示している。ＫＣｈＩＰ４Ｎ２とその他のＫＣｈＩＰとは、（例えば脳内などの）幾つかの細胞種においてｉｎ  ｖｉｖｏで同時に発現されると考えられる。従って、ある特定の細胞種におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの濃度により、ＫＣｈＩＰ４Ｎ２とその他のＫＣｈＩＰとは、小孔形成アルファサブユニットが同じＫｖ４分子である場合でも、全く異なる電流を生じさせる可能性がある。
【０４２３】
ＫＣｈＩＰ４Ｎ２に関する上述の観察からは、多くの推測が得られる。これらのデータは、前記Ｎ末端ドメインが、前記Ｈドメインの機能とは別個の優勢な調節機能（Ａｎ他、同上に記載のＫｖ４との結合及びＫｖ４電流振幅及び反応速度の調節であるが、ＫＣｈＩＰ４Ｎ２のＮ末端ドメインの前記機能とは異なる）をもたらすことを示している。従って、ＫＣｈＩＰ４Ｎ２のＮ末端ドメインは、Ｋｖ４の前記Ｎ末端ドメイン以外のカリウムチャネル部分と相互作用すると考えられる。ＫＣｈＩＰ４Ｎ２が失活反応速度に劇的な作用を及ぼすのであれば、Ｋｖ４上のこれらのその他の部位は、前記チャネルを介したカリウムイオンの移動の制御において重要な役割を果たすと考えられる。それならば、ＫＣｈＩＰ４Ｎ２の前記Ｎ末端ドメインを、これらの特有の活性を読み出しとして使用したタンパク質／ペプチド／化合物スクリーニングのデザイン及び実施のためのツールとして用いることが可能である。これらのスクリーニングアッセイによって、ＫＣｈＩＰ依存的に又は非依存的にＫｖ４活性を調節するタンパク質／ペプチド／化合物を得ることが可能である。
【０４２４】
上述のように、ＫＣｈＩＰ１ＮとＫＣｈＩＰ４Ｎ２とは、同じＫｖ４電流調節特性を有する。双方とも、急速に失活するＫｖ４電流を、殆ど失活しない電流へと変化させることが可能である。双方とも、Ｋｖ４のピーク振幅に対しては影響を及ぼさない。これらの特性は、ＫＣｈＩＰ１、ＫＣｈＩＰ２及びＫＣｈＩＰ３の作用とは異なる。興味深いことに、ヒトＫＣｈＩＰＮとサルＫＣｈＩＰ４Ｎ２との前記Ｎ末端ドメインを（ＤＮＡスター社のＭｅｇａｌｉｎを使用して）アライニングすると、これらのドメインは、相当な相同性を示した（図６２）。このことは、ＫＣｈＩＰＮ及びＫＣｈＩＰ４Ｎ２に特有の調節が、あるタンパク質モチーフの存在によって起こることを示唆している。これに対し、ヒト／ラットＫＣｈＩＰ１及びサルＫＣｈＩＰ４Ｎ２のＮ末端ドメインは、全く異なっていた（図６２）。
【０４２５】
例３２：ＫＣｈＩＰ４Ｎ１及びＫＣｈＩＰ４Ｎ３の機能の分析
ＫＣｈＩＰ４Ｎ１及びＫＣｈＩＰ４Ｎ３を、Ｋｖ４．３  ｃＲＮＡと一緒にアフリカツメガエル卵母細胞に注入した。これらのタンパク質がＫｖ４．３に及ぼす調節作用を、表９に要約する。双方とも、Ｋｖ４．３の失活時定数を増加させた。ＫＣｈＩＰ４Ｎ３はＫｖ４．３のピーク振幅を増加させたが、ＫＣｈＩＰ４Ｎ１はＫｖ４．３のピーク振幅に対して統計学上有意な作用を及ぼさなかった（ｎｓ）。
【０４２６】
（表９）
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【０４２７】
等価物
当業者は、本明細書に記載した発明の実施態様の等価物を数多く、通常の実験で理解し、あるいは確認することが可能であろう。そのような等価物については、請求項に含まれるものとする。
【０４２８】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ヒト１ｖのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：１の核酸１乃至１４６３に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：２のアミノ酸１乃至２１６に対応する。
【図２】ラット１ｖのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：３の核酸１乃至１８５６に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：４のアミノ酸１乃至２４５に対応する。
【図３】マウス１ｖのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：５の核酸１乃至１９０７に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：６のアミノ酸１乃至２１６に対応する。
【図４】ラット１ｖｌのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：７の核酸１乃至１５３４に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：８のアミノ酸１乃至２２７に対応する。
【図５】マウス１ｖｌのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：９の核酸１乃至１５４０に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：１０のアミノ酸１乃至２２７に対応する。
【図６】部分長ラット１ｖｎのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：１１の核酸１乃至９５５に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：１２のアミノ酸１乃至２０３に対応する。（全長ラット１ｖｎ配列については、以下の図６３で述べる）
【図７】ヒト９ｑｌのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：１３の核酸１乃至２００９に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：１４のアミノ酸１乃至２７０に対応する。
【図８】ラット９ｑｌのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：１５の核酸１乃至１２４７に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：１６のアミノ酸１乃至２５７に対応する。
【図９】マウス９ｑｌのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：１７の核酸１乃至２３４３に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：１８のアミノ酸１乃至２７０に対応する。
【図１０】ヒト９ｑｍのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：１９の核酸１乃至１９５５に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：２０のアミノ酸１乃至２５２に対応する。
【図１１】ラット９ｑｍのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：２１の核酸１乃至２３００に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：２２のアミノ酸１乃至２５２に対応する。
【図１２】ヒト９ｑｓのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：２３の核酸１乃至１８５９に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：２４のアミノ酸１乃至２２０に対応する。
【図１３】サル９ｑｓのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：２５の核酸１乃至２１９１に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：２６のアミノ酸１乃至２２０に対応する。
【図１４】ラット９ｑｃのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：２７の核酸１乃至２０５７に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：２８のアミノ酸１乃至２５２に対応する。
【図１５】ラット８ｔのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：２９の核酸１乃至１９０４に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：３０のアミノ酸１乃至２２５に対応する。
【図１６】ヒトｐ１９のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：３１の核酸１乃至６１９に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：３２のアミノ酸１乃至２００に対応する。
【図１７】ラットｐ１９のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：３３の核酸１乃至４４２に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：３４のアミノ酸１乃至１０９に対応する。
【図１８】マウスｐ１９のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：３５の核酸１乃至２６４４に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：３６のアミノ酸１乃至２５６に対応する。
【図１９】ヒトＷ２８５５９のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：３７の核酸１乃至３８０に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：３８のアミノ酸１乃至１２６に対応する。
【図２０】ヒトｐ１９３のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：３９の核酸１乃至２１７６に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：４０のアミノ酸１乃至４１に対応する。
【図２１】ラット１ｖ、ラット９ｐｍ及びマウスｐ１９タンパク質の概略図であり、これらのタンパク質間で保存されているドメインを示すべくアライメントしたものである。
【図２２】ヒト９ｑのゲノムＤＮＡ配列である。
【図２２Ａ】エキソン１及びそのフランキングイントロン配列（配列番号：４６）である。
【図２２Ｂ】エキソン２乃至１１及びそのフランキングイントロン配列（配列番号：４７）である。
【図２３】サルＫＣｈＩＰ４ａのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：４８の核酸１乃至２４１３に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：４９のアミノ酸１乃至２３３に対応する。
【図２４】サルＫＣｈＩＰ４ｂのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：５０の核酸１乃至１５９１に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：５１のアミノ酸１乃至２３３に対応する。
【図２５】ＫＣｈＩＰ４ａ、ＫＣｈＩＰ４ｂ、９ｑｌ、１ｖ、ｐ１９及び関連するヒトパラログ（ｈｓｎｃｓｐａｒａ）Ｗ２８５５９のアライメントである。コンセンサス配列と一致するアミノ酸には黒、保存されているアミノ酸には灰色で網かけした。
【図２６】ラット３３ｂ０７のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：５２の核酸１乃至２０５１に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：５３のアミノ酸１乃至４０７に対応する。
【図２７】ヒト３３ｂ０７のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：５４の核酸１乃至４１４８に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：５５のアミノ酸１乃至４１４に対応する。
【図２８】ラット１ｐのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：５６の核酸１乃至２６４３に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：５７のアミノ酸１乃至２６７に対応する。
【図２９】ラット７ｓのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：５８の核酸１乃至２９２９に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：５９のアミノ酸１乃至２７０に対応する。
【図３０】ラット２９ｘのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：６０の核酸１乃至１４８９に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：６１のアミノ酸１乃至３５１に対応する。
【図３１】ラット２５ｒのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：６２の核酸１乃至１１９４に対応する。
【図３２】ラット５ｐのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：６３の核酸１乃至６００に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：６４のアミノ酸１乃至９５に対応する。
【図３３】ラット７ｑのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：６５の核酸１乃至６３９に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：６６のアミノ酸１乃至２１２に対応する。
【図３４】ラット１９ｒのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：６７の核酸１乃至８１６に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：６８のアミノ酸１乃至２７１に対応する。
【図３５】サルＫＣｈＩＰ４ｃのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：６９の核酸１乃至２２６３に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：７０のアミノ酸１乃至２２９に対応する。
【図３６】サルＫＣｈＩＰ４ｄのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：７１の核酸１乃至２２５９に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：７２のアミノ酸１乃至２５０に対応する。
【図３７】ＫＣｈＩＰ４ａ、ＫＣｈＩＰ４ｂ、ＫＣｈＩＰ４ｃ及びＫＣｈＩＰ４ｄのアライメントである。
【図３８】Ｋｖ４．２をＫＣｈＩＰ２（９ｑｌ）と同時に又は単独で発現しているＣＨＯ細胞からの電流トレースを示すグラフである。細胞を−８０ｍＶで電圧クランプし、２００ｍｓの間、−６０ｍＶから＋５０ｍＶまで段階的に増加させた。様々なテスト電圧におけるピーク電流振幅を、右側のパネルに示す。更に、ＫＣｈＩＰ２（９ｑｌ）がＫｖ４．２に及ぼす振幅及び反応速度作用を記した表も示す。ＫＣｈＩＰ２発現は、ピーク電流振幅、失活時定数、失活からの回復時定数及び活性化Ｖ１／２を変化させる。
【図３９】Ｋｖ４．２をＫＣｈＩＰ３（ｐ１９）と同時に又は単独で発現しているＣＨＯ細胞からの電流トレースを示すグラフである。細胞を−８０ｍＶで電圧クランプし、２００ｍｓの間、−６０ｍＶから＋５０ｍＶまで段階的に増加させた。様々なテスト電圧におけるピーク電流振幅を、右側のパネルに示す。更に、ＫＣｈＩＰ３（ｐ１９）がＫｖ４．２に及ぼす振幅及び反応速度作用を記した表も示す。ＫＣｈＩＰ３発現は、ピーク電流振幅、失活時定数及び失活からの回復時定数を変化させる。
【図４０】ＫＣｈＩＰ１との同時発現が、ＣＨＯ細胞内で発現されるＫｖ４．２チャネルの電流密度及び反応速度を大きく変化させることを示す、電気生理学的実験の結果を図示したものである。
【図４０Ａ】Ｋｖ４．２によってトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの複数の電流トレースを示す。細胞を、−８０ｍＶの保持電位から−６０乃至５０ｍＶのテスト電位まで連続的に脱分極させることにより、電流を誘発した。ｐ／５プロトコルを用いて、電流トレースのリーク減算を行った。電流振幅の変化を強調するために、電流軸を（ｂ）と同じ倍率で示す。挿入図は、電流軸を拡大した５０ｍＶでの単独の電流トレースであり、電流の活性化及び失活の反応速度を示す。
【図４０Ｂ】（ａ）と同様の電流トレースであるが、Ｋｖ４．２及びＫＣｈＩＰ１について等量のＤＮＡでトランスフェクトされた細胞からの電流トレースである。
【図４０Ｃ】Ｋｖ４．２のみでトランスフェクトされた細胞（細胞数＝１１）又はＫＣｈＩＰ１と一緒にトランスフェクトされた細胞（細胞数＝９）からの全ての電圧におけるピーク電流振幅を図示したものである。
【図４０Ｄ、４０Ｅ】２つのパルスプロトコルを用いた失活からの回復を図示したものである。単独で発現されたＫｖ４．２（Ｄ）又はＫＣｈＩＰ１と同時に発現されたＫｖ４．２（Ｅ）を、５０ｍＶの第１のパルスで失活状態とし、前記第１のパルス後の様々な時点で、５０ｍＶの第２のパルスを印加する。全てのパルスの前後で、保持電流は−８０ｍＶである。
【図４０Ｆ】Ｋｖ４．２でトランスフェクトされた細胞（細胞数＝８）とＫｖ４．２及びＫＣｈＩＰ１でトランスフェクトされた細胞（細胞数＝５）のパルス間のピーク電流回復率を総括した図である。失活からの回復時定数は、単一の指数関数に一致する。
【図４１】ヒトＫＣｈＩＰファミリーメンバーと、Ｃａ２＋感知タンパク質のリカバリンファミリーの密接に関連したメンバーとのアライメントを図示したものである。（ＨＩＰ：ヒトのヒポカルシン；ＮＣＳ１：ラット神経細胞のカルシウムセンサ１）。前記アライメントを、ＰＡＭ２５０残基重量テーブル及びデフォルトパラメータを用いたＭａｃｉｎｔｏｓｈ（ＤＮＡＳＴＡＲ社からのバージョン４．００）用のＭｅｇＡｌｉｇｎプログラムにて実施し、ＢＯＸＳＨＡＤＥを用いて網かけを行った。コンセンサス配列と相同な残基は黒で、保存的置換は灰色で網かけした。Ｘ、Ｙ、Ｚ及び−Ｘ、−Ｙ、−Ｚは、ＥＦハンドにおけるカルシウムイオンへの結合を起こさせる残基の位置を表す。
【図４２】ＩＯＳＣＡ領域の物理的マップである。
【図４３】ｈ９ｑの位置並びにＩＯＳＣＡ及びてんかんと連関した既知のマーカを示す連鎖マップである。
【図４４】ヒト１ｖｌ（ＫＣｈＩＰ１ｌ）のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：７９の核酸１乃至１４７７に対応する。大文字と小文字との違いは、個々のエキソンを表す。ＫＣＩＰ１ｌ（ＫＣｈＩＰ１の長型）特異的エキソンは、図示した配列の第２のエキソンである。このアミノ酸配列は、配列番号：１０９のアミノ酸１乃至２２７に対応する。
【図４５】ヒトＫＣｈＩＰ１ＮのＮ末端スプライスバリアントのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：８０の核酸１乃至１６３９に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：８１のアミノ酸１乃至２３２に対応する。
【図４６】ラット及びヒトＫＣｈＩＰ１ＮのＮ末端ドメインのアライメントを図示したものであり、このＮ末端ドメインがこれら２つの配列間で保存されていることを示す。
【図４７】ヒトＫＣｈＩＰ２（ＫＣｈＩＰ２ｌ、ｍ、ｓ及びＮを含む）のゲノムＤＮＡ配列を図示したものである。このヌクレオチド配列は、配列番号：７４の核酸１乃至１７，８０３に対応する。大文字はエキソンを、小文字はイントロンを表す。
【図４８】ラットＫＣｈＩＰ２ＬのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：７５の核酸１乃至１２８５に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：７６のアミノ酸１乃至２７０に対応する。
【図４９】ヒト８ｔ（ＫＣｈＩＰ２Ｎ）のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：７７の核酸１乃至２０７６に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：７８のアミノ酸１乃至２２５に対応する。
【図５０】ラット及びヒトＫＣｈＩＰ２Ｎ（８ｔ）タンパク質のＮ末端ドメインのアライメントを図示したものであり、これらのタンパク質が９６．５％の相同性を有することを示す。
【図５１】全長ヒトＫＣｈＩＰ３のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：８２の核酸１乃至２８３５に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：８３のアミノ酸１乃至２５６に対応する。大文字と小文字との違いは、個々のエキソンを表す。
【図５２】ラットＫＣｈＩＰ３のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：８４の核酸１乃至２４１４に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：８５のアミノ酸１乃至１７８に対応する。大文字はコード領域を、小文字は３’ＵＴＲを表す。
【図５３】サルＫＣｈＩＰ４ＸＣ（ＫＣｈＩＰ４ｂ）のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：８６の核酸１乃至１００５に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：８７のアミノ酸１乃至１２７に対応する。
【図５４】マウスＫＣｈＩＰ４Ｎ２（ＫＣｈＩＰ４ｃ）のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：８８の核酸１乃至２１８１に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：８９のアミノ酸１乃至２２９に対応する。
【図５５】ラットＫＣｈＩＰ４のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：９０の核酸１乃至２０２２に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：９１のアミノ酸１乃至１９８に対応する。
【図５６】ＫＣｈＩＰ４Ｎ１の短い方のスプライスバリアントであるヒトＫＣｈＩＰ４ａＳ（ＫＣｈＩＰ４Ｎ１Ｓ）のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：９２の核酸１乃至２３６６に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：９３のアミノ酸１乃至１８８に対応する。
【図５７】ヒトＫＣｈＩＰ４ａ（ＫＣｈＩＰ４Ｎ１）のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：９４の核酸１乃至２４３１に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：９５のアミノ酸１乃至２３３に対応する。
【図５８】ヒトＫＣｈＩＰ４ｃ（ＫＣｈＩＰＮ２）のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：９６の核酸１乃至２２６１に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：９７のアミノ酸１乃至２２９に対応する。
【図５９】ヒトＫＣｈＩＰ４ｄ（ＫＣｈＩＰ４Ｎ３）のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：９８の核酸１乃至２２９９に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：９９のアミノ酸１乃至２５０に対応する。
【図６０】ＫＣｈＩＰ４Ｎ１のスプライスバリアントであるラットのＫＣｈＩＰ４Ｎ１ｘのｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：１００の核酸１乃至２２４６に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：１０１のアミノ酸１乃至２７２に対応する。
【図６１】ＫＣｈＩＰ４Ｎ２及びＫＣｈＩＰ１によるＫｖ４．３失活時定数の競合的調節を示す一対のグラフである。ｃＲＮＡのセクションに注入したｃＲＮＡの種類を列記し、４．３はＫｖ４．３を、１はＫＣｈＩＰ１を、４はＫＣｈＩＰ４を表す。括弧内の数字は、注入したｃＲＮＡの希釈倍数であり、１ｘ＝原液である。棒グラフ上方の三角形は、ＫＣｈＩＰ４Ｎ２又はＫＣｈＩＰ１の一定量及びＫＣｈＩＰ１又はＫＣｈＩＰ４Ｎ２の増加量をそれぞれ表す。
【図６２】ヒトＫＣｈＩＰ１ＮのＮ末端ドメインとサルＫＣｈＩＰ４Ｎ２のＮ末端ドメインとが相同であり、ヒト／ラットＫＣｈＩＰ１のＮ末端ドメインとサルＫＣｈＩＰ４Ｎ２のＮ末端ドメインとが異なることを示すタンパク質アライメントである。
【図６３】ラットＫＣｈＩＰ１Ｎ（１ｖｎ）のｃＤＮＡ配列及び推定アミノ酸配列である。このヌクレオチド配列は、配列番号：１０２の核酸１乃至１８５６に対応する。このアミノ酸配列は、配列番号：１０３のアミノ酸１乃至２３２に対応する。
【図６４】アフリカツメガエル卵母細胞におけるＫｖ４．３電流及びＫｖ４．３／ＫＣｈＩＰ１電流のアラキドン酸による濃度依存的調節を示すグラフである。保持電位−８０ｍＶ乃至＋４０ｍＶへの脱分極パルス（持続時間＝５００ｍｓ）。アラキドン酸は、Ｋｖ４．３  ｃＲＮＡのみを注入した卵母細胞（実線）並びにＫｖ４．３及びＫＣｈＩＰ１双方のｃＲＮＡを同時に注入した卵母細胞（点線）において、１乃至１０μＭでピーク振幅（Ａ）を抑制し（Ａ）、失活時定数（τｉｎａｃｔ）を減少させた（Ｂ）。各データポイントにおける卵母細胞数＝５である。
【図６５】Ｋｖ４．３電流及びＫｖ４．３／ＫＣｈＩＰ１電流のアラキドン酸による調節が可逆的であることを示すグラフである。アフリカツメガエル卵母細胞において、保持電位−８０ｍＶ乃至＋４０ｍＶ（持続時間＝５００ｍｓ）への脱分極パルスで、電流を７秒間隔で誘発させた。ピーク振幅（Ａ）及び失活時定数（τｉｎａｃｔ）（Ｂ）に対する作用を、アラキドン酸１０μＭの投与を網かけした棒で、ＢＳＡ０．５ｍｇ／ｍｌを添加したＮＤ９６培地による洗浄を中抜きの棒で示す（各データポイントにおける卵母細胞数＝５）。
【図６６】Ｋｖ４．３及びＫｖ４．３／ＫＣｈＩＰ１の脂肪酸による調節を図示したものである。（Ａ）アフリカツメガエル卵母細胞における、リノエライジン酸（原語ｌｉｎｏｌｅｌａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）（Ｋｖ４．３、Ｋｖ４．３／ＫＣｈＩＰ１の各卵母細胞数＝９、８）、γ−リノレン酸（卵母細胞数＝９、８）、ＥＴＩ（卵母細胞数＝４，６）、ＥＴＹＡ（卵母細胞数＝４、６）及びアラキドン酸（卵母細胞数＝８、９）１０μＭによるＫｖ４（中抜きの棒）及びＫｖ４．３／ＫＣｈＩＰ１（網かけの棒）ピーク振幅の抑制率。リノエライジン酸（原語ｌｉｎｏｌｅｌａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）／Ｋｖ４のみの場合を除いた全ての値は、脂肪酸を含まないコントロールと比較して統計上有意であった。全ての脂肪酸について、Ｋｖ４．３の値とＫｖ４．３＋ＫＣｈＩＰ１の値との差は、統計学上有意ではなかった。（Ｂ）パネルＡにおける電流の、同じ条件下での失活時定数（τｉｎａｃｔ）の抑制率。各値を平均±ＳＥＭとして示す。Ｋｖ４．３のみの場合の値は全て、脂肪酸を含まないコントロールと比較して統計学上有意ではなかった。リノエライジン酸（原語ｌｉｎｏｌｅｌａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）を除いては、Ｋｖ４．３＋ＫＣｈＩＰ１の値は全て、脂肪酸を含まないコントロールと比較して統計学上有意であった。Ｋｖ４．３の値とＫｖ４．３＋ＫＣｈＩＰ１の値との間の差は、リノエライジン酸（原語ｌｉｎｏｌｅｌａｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）を除いた全ての脂肪酸処理で有意であった。
【図６７】アラキドン酸がＫＣｈＩＰ１とＫｖ４．３のＮ末端との結合を阻害しないことを示すグラフである。（Ａ）バイオセンサアッセイにおいて、Ｋｖ４の細胞内Ｎ末端ドメインとＫＣｈＩＰ１との間の相互作用の結合相及び分離相のいずれも、アラキドン酸１０μＭによる質的変化を受けないことを示す重畳センサーグラム。（Ｂ）ＳＣ−ＷＬＨ選択培地中で、Ｋｖ４．３のＮ末端ドメインとＫＣｈＩＰ１との相互作用依存性の増殖は、ＥＴＹＡ１０μＭによる変化を受けなかった。前記Ｋｖ４．３のＮ末端とＫＣｈＩＰ１との間の相互作用に無関係に株を増殖させる非選択培地ＳＣ−ＷＬを、ＥＴＹＡが前記株に及ぼす非特異的な作用を調節するために使用した。値を平均±ＳＥＭとして示す。各データポイントにおける卵母細胞数＝４である。
【図６８】ラットＫＣｈＩＰ１Ｎの組織発現のＴａｑｍａｎ分析の結果を示すグラフである。
【図２１】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ−Ｅ】
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【図４０Ｆ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図５０】
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【図６１】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【国際公開パンフレット】
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2004525610.tif 000490
2004525610.tif 000491
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004525610.tif 000492
【国際調査報告】
2004525610.tif 000493
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