(57)【要約】本発明は、Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２からなる群より選択される組換えＨＣＶ単一または特異的オリゴマー上エンベロープタンパク質を精製する方法であって、組換えによって発現されたタンパク質を単離するために形質転換された宿主を溶解する際に、ジスルフィド結合切断剤を用いてジスルフィド結合切断または還元工程を行うことを特徴とする方法に関する。本発明はまた、このような方法によって単離された組成物にも関する。本発明は、これらの組成物の診断および治療用の適用にも関する。さらに、本発明は、ＨＣＶ治療の臨床的結果および／または臨床的有効性の予後またはモニタリングのためのＨＣＶ  Ｅ１タンパク質およびペプチドの用途にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的に有効な量の、
Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つの精製組換えＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状組換えエンベロープタンパク質；および場合により薬学的に許容可能なアジュバントを含む組成物
を含む、治療ワクチン組成物。
【請求項２】
前記組換えＨＣＶエンベロープタンパク質が、組換え哺乳動物細胞によって産生される、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記組換えＨＣＶエンベロープタンパク質が、組換え酵母細胞によって産生される、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
以下のＥ１およびＥ２ペプチド：
コア／Ｅ１  Ｖ１領域のアミノ酸１８１〜２００にわたるＥ１−３１（配列番号５６）、
Ｅ１領域のアミノ酸１９３〜２１２にわたるＥ１−３３（配列番号５７）、
Ｅ１  Ｖ２領域のアミノ酸２０５〜２２４にわたるＥ１−３５（配列番号５８）（エピトープＢ）、
Ｅ１  Ｖ２領域のアミノ酸２０８〜２２７にわたるＥ１−３５Ａ（配列番号５９）（エピトープＢ）、
Ｅ１領域Ｖ１、Ｃ１、およびＶ２領域のアミノ酸１９２〜２２８にわたる１ｂＥ１（配列番号５３）（エピトープＢを含む）、
Ｅ１領域のアミノ酸３０１〜３２０にわたるＥ１−５１（配列番号６６）、
Ｅ１  Ｃ４領域のアミノ酸３１３〜３３２にわたるＥ１−５３（配列番号６７）（エピトープＡ）、
Ｅ１領域のアミノ酸３２５〜３４４にわたるＥ１−５５（配列番号６８）、
Ｅ２領域のアミノ酸位置３９７〜４１８にわたるＥｎｖ６７すなわちＥ２−６７（配列番号７２）（エピトープＡ）、
Ｅ２領域のアミノ酸位置４０９〜４２８にわたるＥｎｖ６９すなわちＥ２−６９（配列番号７３）（エピトープＡ）、
Ｅ２領域の位置５８３〜６０２にわたるＥｎｖ２３すなわちＥ２−２３（配列番号８６）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置５９５〜６１４にわたるＥｎｖ２５すなわちＥ２−２５（配列番号８７）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置６０７〜６２６にわたるＥｎｖ２７すなわちＥ２−２７（配列番号８８）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置５４７〜５８６にわたるＥｎｖ１７８すなわちＥ２−１７８（配列番号８３）（エピトープＤ）、
Ｅ２領域の位置５２３〜５４２にわたるＥｎｖ１３ＢすなわちＥ２−１３Ｂ（配列番号８２）（エピトープＣ）、
Ｅ１領域の位置１９２〜２１１にわたるＩＧＰ１６２６（配列番号１１２）、
Ｅ１領域の位置２０４〜２２３にわたるＩＧＰ１６２７（配列番号１１３）、
Ｅ１領域の位置２１６〜２３５にわたるＩＧＰ１６２８（配列番号１１４）、
Ｅ１領域の位置２２８〜２４７にわたるＩＧＰ１６２９（配列番号１１５）、
Ｅ１領域の位置２４０〜２５９にわたるＩＧＰ１６３０（配列番号１１６）、
Ｅ１領域の位置２５２〜２７１にわたるＩＧＰ１６３１（配列番号１１７）、
Ｅ１領域の位置２６４〜２８３にわたるＩＧＰ１６３２（配列番号１１８）、
Ｅ１領域の位置２７６〜２９５にわたるＩＧＰ１６３３（配列番号１１９）、
Ｅ１領域の位置２８８〜３０７にわたるＩＧＰ１６３４（配列番号１２０）、
Ｅ１領域の位置３００〜３１９にわたるＩＧＰ１６３５（配列番号１２１）、
および
Ｅ１領域の位置３１２〜３３１にわたるＩＧＰ１６３６（配列番号１２２）
の少なくとも１つを含む治療的に有効な量の組成物を含む治療ワクチン組成物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載の有効量の組成物、および場合により医薬的に許容可能なアジュバント、を投与することを含む、ＨＣＶ感染した哺乳動物を処置する方法。
【請求項６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つの精製組換えＨＣＶ組換えエンベロープタンパク質、および場合によってはアジュバント、を含む組成物。
【請求項８】
以下のＥ１およびＥ２ペプチド：
コア／Ｅ１  Ｖ１領域のアミノ酸１８１〜２００にわたるＥ１−３１（配列番号５６）、
Ｅ１領域のアミノ酸１９３〜２１２にわたるＥ１−３３（配列番号５７）、
Ｅ１  Ｖ２領域のアミノ酸２０５〜２２４にわたるＥ１−３５（配列番号５８）（エピトープＢ）、
Ｅ１  Ｖ２領域のアミノ酸２０８〜２２７にわたるＥ１−３５Ａ（配列番号５９）（エピトープＢ）、
Ｅ１領域Ｖ１、Ｃ１、およびＶ２領域のアミノ酸１９２〜２２８にわたる１ｂＥ１（配列番号５３）（エピトープＢを含む）、
Ｅ１領域のアミノ酸３０１〜３２０にわたるＥ１−５１（配列番号６６）、
Ｅ１  Ｃ４領域のアミノ酸３１３〜３３２にわたるＥ１−５３（配列番号６７）（エピトープＡ）、
Ｅ１領域のアミノ酸３２５〜３４４にわたるＥ１−５５（配列番号６８）、
Ｅ２領域のアミノ酸位置３９７〜４１８にわたるＥｎｖ６７すなわちＥ２−６７（配列番号７２）（エピトープＡ）、
Ｅ２領域のアミノ酸位置４０９〜４２８にわたるＥｎｖ６９すなわちＥ２−６９（配列番号７３）（エピトープＡ）、
Ｅ２領域の位置５８３〜６０２にわたるＥｎｖ２３すなわちＥ２−２３（配列番号８６）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置５９５〜６１４にわたるＥｎｖ２５すなわちＥ２−２５（配列番号８７）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置６０７〜６２６にわたるＥｎｖ２７すなわちＥ２−２７（配列番号８８）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置５４７〜５８６にわたるＥｎｖ１７８すなわちＥ２−１７８（配列番号８３）（エピトープＤ）、
Ｅ２領域の位置５２３〜５４２にわたるＥｎｖ１３ＢすなわちＥ２−１３Ｂ（配列番号８２）（エピトープＣ）、
Ｅ１領域の位置１９２〜２１１にわたるＩＧＰ１６２６（配列番号１１２）、
Ｅ１領域の位置２０４〜２２３にわたるＩＧＰ１６２７（配列番号１１３）、
Ｅ１領域の位置２１６〜２３５にわたるＩＧＰ１６２８（配列番号１１４）、
Ｅ１領域の位置２２８〜２４７にわたるＩＧＰ１６２９（配列番号１１５）、
Ｅ１領域の位置２４０〜２５９にわたるＩＧＰ１６３０（配列番号１１６）、
Ｅ１領域の位置２５２〜２７１にわたるＩＧＰ１６３１（配列番号１１７）、
Ｅ１領域の位置２６４〜２８３にわたるＩＧＰ１６３２（配列番号１１８）、
Ｅ１領域の位置２７６〜２９５にわたるＩＧＰ１６３３（配列番号１１９）、
Ｅ１領域の位置２８８〜３０７にわたるＩＧＰ１６３４（配列番号１２０）、
Ｅ１領域の位置３００〜３１９にわたるＩＧＰ１６３５（配列番号１２１）、
および
Ｅ１領域の位置３１２〜３３１にわたるＩＧＰ１６３６（配列番号１２２）
の少なくとも１つを含む組成物。
【請求項９】
治療的に有効な量の、精製組換えＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状組換えＥ１またはＥ２タンパク質から形成されたＥ１／Ｅ２複合体；および場合により医薬的に許容可能なアジュバントを含む組成物、を含む、ＨＣＶ特異的抗体を誘導するための治療用組成物。
【請求項１０】
前記組換えＨＣＶエンベロープタンパク質が、組換え哺乳動物細胞によって産生される、請求項９記載の組成物。
【請求項１１】
前記組換えＨＣＶエンベロープタンパク質が、組換え酵母細胞によって産生される、請求項９記載の組成物。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項記載の有効量の組成物、および場合により医薬的に許容可能なアジュバント、を投与することを含む、ＨＣＶ感染した哺乳動物を処置する方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
治療的に有効な量の、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つの精製組換えＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状組換えエンベロープタンパク質；および場合により医薬的に許容可能なアジュバント、を含む治療的に有効な量の組成物を含む、ＨＣＶ特異的抗体を誘導するための治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、組換えタンパク質発現、組換えタンパク質の精製、合成ペプチド、ＨＣＶ感染の診断、ＨＣＶ感染に対する予防的処理の一般的な分野、および慢性肝炎を有する個体の処理の臨床的効率の予後／モニタリング、または天然疾患の予後／モニタリングに関する。
【０００２】
より具体的には、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質のための精製方法、診断における用途、本発明において記載された方法により精製されたＨＣＶエンベロープタンパク質の診断、予防または治療における用途、疾患のモニタリングのためのアッセイにおける単一または特異的オリゴマー状Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２エンベロープタンパク質の用途、および／または疾患の診断、および／または疾患の処理に関する。本発明はまた、Ｅ１および／またはＥ２エンベロープタンパク質のエピトープおよびそれらに対するモノクローナル抗体、ならびに診断、予防または処理におけるそれらの用途にも関する。
【０００３】
【発明の背景】
本発明に記載された方法にしたがって細胞ライセートから精製されたＥ２タンパク質は、患者血清の約９５％と反応する。この反応性は、ＣＨＯ細胞から分泌されたＥ２で得られた反応性と同様である（Ｓｐａｅｔｅら、１９９２）。しかし、Ｅ２の細胞内発現された形態は、高マンノース炭水化物モチーフを含有することから、ネイティブなウイルスエンベロープタンパク質とよりよく似ている可能性がある。一方、ＣＨＯ細胞から分泌されたＥ２タンパク質は、ガラクトースおよびシアル酸糖モチーフでさらに修飾される。Ｅ２のアミノ末端側の半分をバキュロウイルス系で発現させた場合、いくつかの患者群の約１３〜２１％の血清しか検出されない（Ｉｎｏｕｅら、１９９２）。Ｅ． ｃｏｌｉからのＥ２の発現の後、ＨＣＶ血清の反応性はさらに低く、１４（Ｙｏｋｏｓｕｋａら、１９９２）〜１７％（Ｍｉｔａら、１９９２）の範囲であった。ＨＣＶ血清の約７５％（および慢性患者の９５％）は、本発明の精製ワクシニア発現組換えＥ１タンパク質を用いて抗Ｅ１陽性であり、Ｋｏｈａｒａら（１９９２）およびＨｓｕら（１９９３）の結果とはっきりした対比を成す。Ｋｏｈａｒａらはワクシニアウイルス発現Ｅ１タンパク質を用いて７〜２３％の患者において抗Ｅ１抗体を検出し、一方、Ｈｓｕらはバキュロウイルス発現Ｅ１を用いて１４／５０（２８％）しか検出しなかった。
【０００４】
これらの結果は、ヒト患者血清とのエンベロープタンパク質の高い反応性を達成するためには、よい発現系のみでなく、よい精製プロトコールもまた必要であることを示す。これは、タンパク質の自然な折りたたみ（フォールディング）の保存を保証する適正な発現系および／または本発明の精製プロトコール、およびコンフォメーションを保存し、したがってＨＣＶエンベロープタンパク質の反応性を保存し、夾雑タンパク質の排除を保証する本発明の精製プロトコールを用いて、得ることができる。診断スクリーニングアッセイに必要な精製ＨＣＶエンベロープタンパク質の量は、１年当たりグラム単位の範囲である。ワクチンの目的には、より高い量のエンベロープタンパク質が必要となる。したがって、ワクシニアウイルス系は、最良の発現構築体の選択および限られた増量のために使用されうるが、高マンノース炭水化物含有単一または特異的オリゴマー状エンベロープタンパク質の大量発現および精製はいくつかの酵母株から発現させた場合に達成されうる。たとえばＢ型肝炎の場合、哺乳動物細胞からのＨＢｓＡｇの製造は酵母由来Ｂ型肝炎ワクチンと比較してはるかにコストが高いものであった。
【０００５】
【本発明の目的】
組換えタンパク質が夾雑物を含まず凝集物の代わりに単一または特異的オリゴマー状組換えタンパク質として診断およびワクチン目的に直接使用可能な、組換えにより発現されたＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質のための新規な精製方法を提供することは本発明の目的である。
【０００６】
ＨＣＶのＥ１および／またはＥ２ドメイン由来のコンフォメーショナルエピトープを含む精製（単一または特異的オリゴマー状）組換えＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２糖タンパク質を含む組成物を提供することは本発明の別の目的である。
【０００７】
Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質を組換えにより発現させるための新規な組換えベクター構築体、ならびにこのベクター構築体で形質転換された宿主細胞を提供することは本発明のさらに別の目的である。
【０００８】
組換えＨＣＶ  Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質を生産し精製する方法を提供することもまた、本発明の目的である。
【０００９】
本発明の組換えＨＣＶ  Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質の診断および免疫原の用途を提供すること、ならびに本発明の組換えＨＣＶ  Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質のいずれかを含む診断用途のキット、ワクチンまたは治療薬を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１０】
ＨＣＶ感染を受けた患者の処理（たとえばインターフェロンでの）に対する応答をモニタリングする／予見するための、Ｅ１、Ｅ２、および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質、またはそれらの好適な部分の新規な用途を提供することは本発明のさらなる目的である。
【００１１】
ＨＣＶスクリーニングおよび確認抗体試験における本発明の組換えＥ１、Ｅ２、および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質の用途を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１２】
ＨＣＶ感染の診断および抗体生成に使用しうるＥ１および／またはＥ２ペプチドを提供することもまた、本発明の目的である。このようなペプチドは、ヒトモノクローナル抗体を単離するためにも使用しうる。
【００１３】
モノクローナル抗体、より具体的には、組換えタンパク質に含まれるコンフォメーショナルエピトープまたはペプチドに含まれる、Ｅ１および／またはＥ２エピトープと特異的に反応する、ヒトモノクローナル抗体またはヒト化されたマウスモノクローナル抗体を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１４】
慢性ＨＣＶ感染の治療またはＨＣＶ抗原検出のための抗Ｅ１または抗Ｅ２モノクローナル抗体の可能な用途を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１５】
疾患の結果をモニタリング／予見するため、またはＨＣＶ感染を受けた患者の（たとえばインターフェロンでの）処理に対する応答をモニタリング／予見するためのキットを提供することもまた、本発明の目的である。
本発明のこれらのすべての目的は、以下に記載する態様によって満足されていると考えられる。
【００１６】
定義
以下の定義は、本発明において用いられる異なる用語および表現を説明するために役立つ。
「Ｃ型肝炎ウイルス単一エンベロープタンパク質」という用語は、Ｅ１またはＥ２領域の少なくとも１つのＨＣＶエピトープを定義するアミノ酸配列（および／またはアミノ酸アナログ）を含むポリペプチドまたはそのアナログ（たとえばミモトープ）を指す。この言葉の広い意味でのこれらの単一エンベロープタンパク質は、組換えにより発現されたエンベロープタンパク質のモノマー形態またはホモオリゴマー形態の両方でありうる。典型的には、エピトープを定義する配列は、ＨＣＶのＥ１またはＥ２領域のアミノ酸配列に相当する（同一、またはエピトープを破壊しないネイティブアミノ酸残基のアナログの置換のいずれかによる）。一般に、エピトープを定義する配列は、長さが３アミノ酸以上であり、より典型的には長さが５アミノ酸以上であり、さらに典型的には長さが８アミノ酸以上であり、さらにもっと典型的には長さが１０アミノ酸以上である。コンフォメーショナルエピトープに関しては、エピトープを定義する配列の長さは広い変動があり得る。これは、これらのエピトープは抗原の三次元形体（たとえばフォールディング）によって形成されると信じられているためである。したがって、エピトープを定義するアミノ酸は比較的少数でありうるが、分子の長さに沿って広く分散し、フォールディングを介して正しいエピトープコンフォメーションがもたらされる。エピトープを定義する残基間の抗原の部分は、エピトープのコンフォメーションの構造に重要ではない可能性がある。たとえば、これらの介在配列の欠失または置換は、エピトープのコンフォメーションに重要な配列（たとえばジスルフィド結合に関与するシステイン、グリコシル化部位等）が維持されている場合は、コンフォメーショナルエピトープに影響しない可能性がある。コンフォメーショナルエピトープは、１つのホモオリゴマーまたはへテロオリゴマーの複数のサブユニットの２以上の必須領域によって形成されている可能性がある。
【００１７】
本発明のＨＣＶ抗原は、ＨＣＶのＥ１および／またはＥ２（エンベロープ）ドメイン由来のコンフォメーショナルエピトープを含む。Ｅ１ドメインは、ウイルスエンベロープタンパク質に相当すると信じられており、現在ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜３８３にわたると推定されている（Ｈｉｊｉｋａｔａら、１９９１）。哺乳動物系における発現（グリコシル化される）の際、それはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した場合３５ｋＤａのおよその分子量を有すると信じられている。Ｅ２タンパク質は、以前はＮＳ１と呼ばれていたものであり、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３８４〜８０９または３８４〜７４６にわたると信じられており（Ｇｒａｋｏｕｉら、１９９３）、これもまたエンベロープタンパク質であると信じられている。ワクシニア系における発現（グリコシル化される）の際、それは約７２ｋＤａの見かけのゲル分子量を有すると信じられている。これらのタンパク質の終点は近似であることが理解されている（たとえばＥ２のカルボキシ末端は７３０〜８２０アミノ酸領域のどこかにあり得、たとえばアミノ酸７３０、７３５、７４０、７４２、７４４、７４５、好ましくは７４６、７４７、７４８、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８０９、８１０、８２０で終わることがあり得る）。Ｅ２タンパク質は、Ｅ１、Ｐ７（アミノ酸７４７〜８０９）、ＮＳ２（アミノ酸８１０〜１０２６）、ＮＳ４Ａ（アミノ酸１６５８〜１７１１）またはＮＳ４Ｂ（アミノ酸１７１２〜１９７２）と共にも発現されうる。これらの他のＨＣＶタンパク質と一緒での発現は、正しいタンパク質フォールディングを得るために重要であり得る。
【００１８】
本発明の実施例の章において用いられる単離株は本発明の範囲を制限することを意図されておらず、タイプ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または他のあらゆる新規なＨＣＶゲノタイプ由来の任意のＨＣＶ単離株は本発明の実施のためのＥ１および／またはＥ２配列の好適な供給源であることもまた理解される。
【００１９】
本発明において用いられるＥ１およびＥ２抗原は、全長ウイルスタンパク質、それらの実質的に全長のバージョン、またはそれらの機能的なフラグメント（たとえばエピトープの形成または保持に必須の配列を欠いていないフラグメント）であることができる。さらに、本発明のＨＣＶ抗原は、目的のコンフォメーショナルエピトープの形成を妨害または遮断しない他の配列を含むこともできる。コンフォメーショナルエピトープの存在または不存在は、抗体（ポリクローナル血清またはコンフォメーショナルエピトープに対するモノクローナル）を用いて目的の抗原をスクリーニングし、その反応性を、リニアエピトープのみを保持する（あるとすれば）その抗原の変性バージョンの反応性と比較することにより、容易に決定することができる。ポリクローナル抗体を用いたこのようなスクリーニングにおいて、まず変性抗原でポリクローナル血清を吸収し、それが目的の抗原に対する抗体を維持しているかどうか調べるのが有利である。
【００２０】
本発明のＨＣＶ抗原は、目的のエピトープを提供するいかなる組換え方法によって作製することもできる。たとえば、哺乳動物または昆虫細胞における組換え体の細胞内発現は、天然のＨＣＶ抗原の場合のように「ネイティブな」コンフォメーションのグリコシル化されたＥ１および／またはＥ２抗原を提供する好ましい方法である。酵母細胞および突然変異体酵母株（たとえばｍｎｎ９突然変異体（Ｋｎｉｓｋｅｒｎら、１９９４）またはバナジウム酸耐性選択法により誘導されたグリコシル化突然変異体（Ｂａｌｌｏｕら、１９９１））は、分泌される高マンノースタイプ糖類の生産に理想的に適しており、一方、哺乳動物細胞から分泌されるタンパク質は、ガラクトースまたはシアル酸を含む修飾を有する可能性があり、これはある種の診断またはワクチンの適用については望ましくない可能性がある。しかし、タンパク質について知られているように、他の組換え宿主（Ｅ． ｃｏｌｉ等）において抗原を発現させ、回収後に元に戻すこともまた可能であり、ある適用については十分である可能性がある。
【００２１】
「融合ポリペプチド」という用語は、ポリペプチド内でＨＣＶ抗原がアミノ酸の単一の連続鎖の一部であって、その鎖が天然には生じないポリペプチドを意図する。ＨＣＶ抗原はペプチド結合によって直接連結されているか、または介在アミノ酸配列によって分離されていることができる。融合ポリペプチドは、ＨＣＶに対して外来性のアミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００２２】
「固相」という用語は、個々のＨＣＶ抗原またはＨＣＶ抗原を含む融合ポリペプチドが、共有結合により、または疎水性吸着のような非共有結合手段により結合される固体を意図する。
【００２３】
「生物学的試料」という用語は、個体により産生された抗体、より具体的にはＨＣＶに対する抗体を一般に含む、哺乳動物個体（たとえば類人猿またはヒト）の流体または組織を意図する。これらの流体または組織は、ＨＣＶ抗原をも含んでいてもよい。このような成分は、当業界で公知であり、制限なしに、血液、血漿、血清、尿、脊髄液、リンパ液；呼吸器、腸もしくは生殖泌尿器管の分泌物；涙、唾液、乳汁、白血球細胞およびミエローマを含む。身体成分は、生物学的液体を含む。「生物学的液体」という用語は、生物から得られる流体を指す。ある生物学的流体は、凝固因子（たとえばＶＩＩＩ：Ｃ因子）、血清アルブミン、成長ホルモン等のような他の製品の供給源として使用される。このような場合においては、生物学的流体の供給源がＨＣＶのようなウイルスによる汚染がないことは重要である。
【００２４】
「免疫学的に反応性」という用語は、問題の抗原がＨＣＶ感染個体由来の身体成分に存在する抗ＨＣＶ抗体と特異的に反応することを意味する。
【００２５】
「免疫複合体」という用語は、抗原上のエピトープに抗体が結合した場合に形成される組み合わせを意図する。
【００２６】
ここで用いられる「Ｅ１」は、ＨＣＶポリタンパク質の最初の４００アミノ酸内で発現されるタンパク質またはポリペプチドを指し、場合によってはＥ，ＥＮＶまたはＳタンパク質と呼ばれる。その天然の形態においては、３５ｋＤａ糖タンパク質であり、膜に強く結合して見出される。ほとんどの天然ＨＣＶ株において、Ｅ１タンパク質は、Ｃ（コア）タンパク質に続いてウイルスポリタンパク質中にコードされる。Ｅ１タンパク質は、全長ポリタンパク質のアミノ酸約１９２からアミノ酸約３８３まで広がる。
【００２７】
ここで用いられる「Ｅ１」という用語は、天然のＥ１と免疫学的に交差反応性のアナログおよび短縮型をも含み、ゲノタイプ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または任意の他の新規に同定されたＨＣＶタイプまたはサブタイプのＥ１タンパク質を含む。
【００２８】
ここで用いられる「Ｅ２」という用語は、ＨＣＶポリタンパク質の最初の９００アミノ酸内で発現されるタンパク質またはポリペプチドを指し、場合によってはＮＳ１タンパク質と呼ばれる。その天然の形態においては、これは７２ｋＤａ糖タンパク質であり、膜に強く結合して見出される。ほとんどの天然のＨＣＶ株において、Ｅ２タンパク質は、Ｅ１タンパク質に続いてウイルスポリタンパク質内にコードされる。Ｅ２タンパク質は、アミノ酸位置約３８４からアミノ酸位置７４６まで広がり、別の形態のＥ２はアミノ酸位置８０９まで広がる。ここで用いられる「Ｅ２」という用語は、天然のＥ２と免疫学的に交差反応性のアナログおよび短縮型をも含む。たとえば、コドン３８３と３８４との間への複数コドンの挿入、ならびにアミノ酸３８４〜３８７の欠失が、Ｋａｔｏらによって報告されている（１９９２）。
【００２９】
ここで用いられる「Ｅ１／Ｅ２」は、少なくとも１つのＥ１成分および少なくとも１つのＥ２成分を含むエンベロープタンパク質のオリゴマー形態を指す。
【００３０】
「特異的オリゴマー（状）」Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２エンベロープタンパク質という用語は、凝集塊ではない、組換えにより発現されたＥ１および／またはＥ２エンベロープタンパク質のすべての可能なオリゴマー形態を指す。Ｅ１および／またはＥ２特異的オリゴマー状エンベロープタンパク質はまた、ホモオリゴマー状Ｅ１またはＥ２エンベロープタンパク質とも呼ばれる（以下を参照されたい）。
【００３１】
「単一または特異的オリゴマー（状）」Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２エンベロープタンパク質という用語は、単一モノマー状Ｅ１またはＥ２タンパク質（この言葉の厳密な意味での単一）ならびに特異的オリゴマー状Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２組換え発現タンパク質を指す。本発明のこれらの単一または特異的オリゴマー状エンベロープタンパク質は、以下の式：（Ｅ１）ｘ（Ｅ２）ｙによってさらに定義することができる（式中、ｘは０から１００の間の数であることができ、ｙは０から１００の間の数であることができるが、ｘおよびｙは両方が０であることはない）。ｘ＝１かつｙ＝０の場合、そのエンベロープタンパク質はモノマー状Ｅ１を含む。
【００３２】
ここで用いられる「ホモオリゴマー」という用語は、２以上のＥ１またはＥ２モノマーを含むＥ１および／またはＥ２の複合体、たとえばＥ１／Ｅ１ダイマーを指す。Ｅ１／Ｅ１／Ｅ１トリマーまたはＥ１／Ｅ１／Ｅ１／Ｅ１テトラマーおよびＥ２／Ｅ２ダイマー、Ｅ２／Ｅ２／Ｅ２トリマーまたはＥ２／Ｅ２／Ｅ２／Ｅ２テトラマー、Ｅ１ペンタマーおよびヘキサマー、Ｅ２ペンタマーおよびヘキサマーまたはＥ１もしくはＥ２のあらゆる高次のホモオリゴマーは、この定義の範囲内ですべて「ホモオリゴマー」である。オリゴマーは、Ｃ型肝炎ウイルスの異なるタイプまたはサブタイプ由来の１、２、またはいくつかの異なるモノマーを含んでいてもよく、たとえばＷＯ９４／２５６０１として公開された国際出願およびヨーロッパ出願第９４８７０１６６．９号（いずれも本出願人によるもの）に記載されたものが挙げられる。このような混合オリゴマーは、本発明の範囲においてはなおホモオリゴマーであり、ＨＣＶのより普遍的な診断、予防または治療を可能にしうる。
【００３３】
ここでタンパク質に関して用いられる「精製（された）」という用語は、所望のタンパク質が組成物中の総タンパク質成分の少なくとも３５％を構成する組成物を指す。所望のタンパク質は、総タンパク質成分の、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約７０％、なおさらに好ましくは少なくとも約８０％、なおさらに好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％を構成する。組成物は、たとえば炭水化物、塩類、脂質、溶剤等の、他の成分を、ここで用いられる純度パーセンテージの決定に影響することなく含んでいてもよい。「単離された」ＨＣＶタンパク質は、少なくとも３５％純粋なＨＣＶタンパク質組成物を意図する。
【００３４】
「実質的に精製されたタンパク質」という用語は、インビトロ診断法において、および治療化合物として、使用されうるように精製されたタンパク質を指す。これらのタンパク質は、実質的に細胞タンパク質、ベクター由来タンパク質または他のＨＣＶウイルス成分を含まない。通常、これらのタンパク質は、均質（少なくとも８０％純粋、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、より好ましくは９７％、より好ましくは９８％、より好ましくは９９％、さらにより好ましくは９９．５％、そして最も好ましくは、夾雑タンパク質がＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色のような慣用法によって検出不能）になるまで精製されている。
【００３５】
本発明の文脈において用いられる「組換えによって発現された」という用語は、本発明のタンパク質が、それが以下に詳しく述べるような原核生物においてであろうと、下等または高等真核生物においてであろうと、組換え発現法によって産生されたという事実を指す。
【００３６】
「下等真核生物」という用語は、酵母、菌類等の宿主細胞を指す。下等真核生物は、一般に（必ずとは限らないが）単細胞である。好ましい真核生物は酵母であり、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ， Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ， Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ（たとえばＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）， Ｈａｎｓｅｎｕｌａ（たとえばＨａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）， Ｙａｒｏｗｉａ， Ｓｃｈｗａｎｉｏｍｙｃｅｓ， Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ， Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ等に属する種のものである。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ， Ｓ． ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓおよびＫ． ｌａｃｔｉｓは、
最も一般的に使用される酵母宿主であり、好都合な菌類宿主である。
「原核生物」という用語は、Ｅ． ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ， Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓのような宿主を指す。これらの宿主もまた、本発明の範囲内で企図される。
【００３７】
「高等真核生物」という用語は、哺乳動物、爬虫類、昆虫等の高等動物由来の宿主細胞を指す。現在好ましい高等真核生物宿主細胞は、チャイニーズハムスター（たとえばＣＨＯ）、サル（たとえばＣＯＳおよびＶｅｒｏ細胞）、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）、ブタ腎（ＰＫ１５）、ウサギ腎１３細胞（ＲＫ１３）、ヒト骨肉腫細胞株１４３Ｂ、ヒト細胞株ＨｅＬａおよびヒト肝ガン細胞株（たとえばＨｅｐ  Ｇ２）、および昆虫細胞株（たとえばＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｑｉｐｅｒｄａ）由来である。宿主細胞は、浮遊またはフラスコ培養、組織培養、器官培養等で提供されてもよい。あるいは、宿主細胞は、トランスジェニック動物であってもよい。
【００３８】
「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーを指し、生成物の特定の長さを意味せず、したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質はポリペプチドの定義に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、たとえばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等を意味したり、排除したりもしない。この定義に含まれるものとしては、たとえばアミノ酸の１以上のアナログ（たとえば非天然アミノ酸、ＰＮＡ等を含む）を含むポリペプチド、置換された連結を有するポリペプチド、ならびに天然に生じるものおよび非天然のものの両方の、当業界で公知の他の修飾物がある。
【００３９】
「組換えポリヌクレオチドまたは核酸」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成起源のポリヌクレオチドまたは核酸であって、その起源または操作の性質によって（１）天然に連結しているポリヌクレオチドの全部または一部と連結していない；（２）天然に連結しているもの以外のポリヌクレオチドと連結している；または（３）天然には生じないもの、を意図する。
【００４０】
「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養」および単細胞体として培養された高等真核生物細胞株または微生物を意味する他のそのような用語は、組換えベクターまたは他のトランスファーポリヌクレオチドのレシピエントとして用いられ得るまたは用いられた細胞を指し、トランスフェクションされた元の細胞の子孫を含む。天然の、偶発的な、または意図的な突然変異のため、単一の親細胞の子孫は、元の親と、ゲノムまたは総ＤＮＡ相補性においてまたは形態学において、必ずしも完全に同一とは限らないことは理解される。
【００４１】
「レプリコン」という用語は、任意の遺伝性要素、たとえばプラスミド、染色体、ウイルス、コスミド等であって、細胞内においてポリヌクレオチド複製の自律的単位として行動するもの、すなわちそれ自身の制御下において複製可能な任意の遺伝性要素である。
【００４２】
「ベクター」という用語は、所望のオープンリーディングフレームの複製および／または発現を提供する配列をさらに含むレプリコンである。
【００４３】
「制御配列」という用語は、それらに連結されているコード配列の発現を実現するのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物によって異なる。原核生物においては、このような制御配列は一般にプロモーター、リボソーム結合部位および終結因子（ターミネーター）を含み、真核生物においては、一般に、このような制御配列は、プロモーター、ターミネーター、そしてある場合にはエンハンサーを含む。「制御配列」という用語は、最低限として、その存在が発現のために必要なすべての成分を含み、その存在が有利である付加的な成分、たとえば分泌を支配するリーダー配列をも含むことができる。
【００４４】
「プロモーター」という用語は、隣接する構造遺伝子のために正常な転写開始部位でｍＲＮＡ産生が始まるようにＤＮＡ鋳型へのＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にするコンセンサス配列を含むヌクレオチド配列である。
【００４５】
「作動可能に連結された」という表現は、そのように記載された成分がその意図された方式で機能することを可能にする関係にある並置である。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列と適合性の条件下でコード配列の発現が達成されるように連結されている。
【００４６】
「オープンリーディングフレーム」（ＯＲＦ）は、ポリペプチドをコードし、終止コドンを含まないポリヌクレオチド配列の領域である。この領域は、コード配列の部分または総コード配列を表す可能性がある。
【００４７】
「コード配列」は、適切な調節配列の制御下におかれた場合、ｍＲＮＡに転写され、および／またはポリペプチドに翻訳される、ポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５′末端の翻訳開始コドンおよび３′末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）、および組換えポリヌクレオチド配列を含むことができるが、これらに限らない。
【００４８】
ここで用いられる場合、「エピトープ」または「抗原決定基」は、免疫反応性のアミノ酸配列を意味する。一般に、エピトープは少なくとも３〜４アミノ酸からなり、より通常は少なくとも５または６アミノ酸からなり、場合によってはエピトープは約７〜８個、さらには約１０個のアミノ酸からなる。ここで用いられる場合、指定したポリペプチドのエピトープは、その指定したポリペプチド中のエピトープと同じアミノ酸配列を有するエピトープ、およびそれらの免疫学的等価物をいう。このような等価物はまた、株、サブタイプ（＝ゲノタイプ）またはタイプ（グループ）特異的変異体、たとえばゲノタイプ１ａ，１ｂ，１ｃ，１ｄ，１ｅ，１ｆ，２ａ，２ｂ，２ｃ，２ｄ，２ｅ，２ｆ，２ｇ，２ｈ，２ｉ，３ａ，３ｂ，３ｃ，３ｄ，３ｅ，３ｆ，３ｇ，４ａ，４ｂ，４ｃ，４ｄ，４ｅ，４ｆ，４ｇ，４ｈ，４ｉ，４ｊ，４ｋ，４ｌ，５ａ，５ｂ，６ａ，６ｂ，６ｃ，７ａ，７ｂ，７ｃ，８ａ，８ｂ，９ａ，９ｂ，１０ａまたはその他のあらゆる新規に定義されたＨＣＶ（サブ）タイプに属する現在公知の配列または株を含む。エピトープを構成するアミノ酸は、リニア配列の一部である必要はなく、任意の数のアミノ酸によって分断され、コンフォメーショナルエピトープを構成していてもよいことは理解される。
【００４９】
「免疫原性（の）」という用語は、単独の場合またはキャリアに連結されている場合か、アジュバントの存在下でまたは不存在下で、にかかわらず、体液性および／または細胞性応答を起こすある物質の能力を指す。「中和」は、感染性因子の感染性を、部分的にまたは完全に、遮断する免疫応答を指す。「ワクチン」は、部分的か完全かにかかわらず、ＨＣＶに対する保護を誘起することができる免疫原性組成物である。ワクチンは、個体の処理にも有用であり、この場合、それは治療（用）ワクチンと呼ばれる。
【００５０】
「治療薬」という用語は、ＨＣＶ感染を処理することができる組成物を指す。
「有効量」という用語は、投与された個体において免疫原性応答を誘導するか、あるいはその意図された系（たとえばイムノアッセイ）において検出可能なように免疫反応するのに充分なエピトープ担持ポリペプチドの量を指す。好ましくは、有効量は、上記で定義されたように処理を実行するのに充分である。必要な正確な量は適用によって変化することになる。たとえば、ワクチン適用またはポリクローナル抗血清／抗体の作製については、有効量は、種、年齢、および個体の全体的な状態、処理すべき状態の重症度、選択された特定のポリペプチドおよびその投与モード等によって変化しうる。有効量は、比較的大きい、非臨界的範囲内に見出されることも信じられている。適切な有効量は、ルーチンの実験のみを用いて容易に決定することができる。ＨＣＶ疾患の予防のためのＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２単一または特異的オリゴマー状エンベロープタンパク質の好ましい範囲は、０．０１〜１００μｇ／用量、好ましくは０．１〜５０μｇ／用量である。充分な免疫応答およびその後のＨＣＶ疾患に対する予防を達成するためには、１個体当たりいくつかの用量が必要とされうる。
【００５１】
発明の詳細な説明
より具体的には、本発明は、Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２からなる群より選択される組換えＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状エンベロープタンパク質を単離または精製する方法であって、組換えにより発現されたタンパク質を単離するために形質転換された宿主細胞を溶解する際に、ジスルフィド結合切断剤を用いてジスルフィド結合切断または還元工程を行うことを特徴とする方法を企図する。
【００５２】
本発明のこれらの「単一または特異的オリゴマー状」エンベロープタンパク質の本質は、それらが夾雑タンパク質を含まないこと、およびそれらが夾雑タンパク質とジスルフィド結合で連結されていないことである。
【００５３】
本発明のタンパク質は、下等または高等真核生物細胞または原核生物において組換えにより発現される。本発明の組換えタンパク質は、好ましくはグリコシル化されており、高マンノースタイプ、ハイブリッド、または複合グリコシル化を含んでいることができる。好ましくは、これらのタンパク質は、実施例の章に詳細に述べられているように哺乳動物細胞から発現され、または同じく実施例の章に詳述されているように突然変異酵母株のような酵母において発現される。
【００５４】
本発明のタンパク質は、ＥＲまたはゴルジ装置のような、細胞の成分内で発現されるか、分泌されてもよい。しかし、好ましくは、本発明のタンパク質は高マンノースタイプのグリコシル化を有し、哺乳離細胞のＥＲまたはゴルジ装置に保持されるか、酵母細胞内に保持されるもしくは酵母細胞から分泌され、好ましくはｍｎｎ９突然変異体のような酵母突然変異株（Ｋｎｉｓｋｅｒｎら、１９９４）から、またはバナデート耐性によって選択された突然変異体から（Ｂａｌｌｏｕら、１９９１）分泌される。
【００５５】
ＨＣＶエンベロープタンパク質の発現に際し、本発明は、分子内または分子間ジスルフィド架橋に関与しないシステインの遊離チオール基のいくつかが宿主もしくは発現系由来（たとえばワクシニア）タンパク質または他のＨＣＶエンベロープタンパク質（単一またはオリゴマー状）のシステインと反応し、非特異的分子間架橋を形成することを生じうる。これは、ＨＣＶタンパク質と夾雑タンパク質との「凝集塊」の形成をもたらす。ＷＯ９２／０８７３４において、「凝集塊」は精製後に生じることも示されているが、どのタンパク質相互作用が関与するかは記載されていなかった。ＷＯ９２／０８７３４特許出願においては、ワクシニアウイルス系を用いて発現された組換えＥ１／Ｅ２タンパク質は、凝集塊として部分的に精製され、７０％の純度でしかないことが見出され、これらの精製凝集塊は診断、予防または治療目的には有用ではないものとなっていた。
したがって、本発明の主要な目的は、夾雑タンパク質からの単一または特異的オリゴマー状ＨＣＶエンベロープタンパク質の分離にあり、精製タンパク質（＞９５％純粋）を診断、予防および治療目的に用いることである。これらの目的に対して、本発明者らは、凝集したタンパク質複合体（「凝集塊」）はジスルフィド架橋および非共有結合性タンパク質−タンパク質相互作用に基づいて形成されることの証拠を提供することができた。本発明は、したがって、特異的条件下でジスルフィド結合を選択的に切断し、切断されたタンパク質を診断、予防および治療の適用に対して大きく干渉する夾雑タンパク質から分離する手段を提供する。遊離チオール基は、ジスルフィド架橋の再形成を防止するために（可逆的にまたは不可逆的に）ブロックしてもよく、または酸化して他のエンベロープタンパク質とオリゴマー形成するにまかせてもよい（ホモオリゴーの定義を参照されたい）。このようなタンパク質オリゴマーは、夾雑タンパク質のレベルが検出不可能であるので、本質的にＷＯ９２／０８７３４およびＷＯ９４／０１７７８に記載された「凝集塊」とは異なることは理解されるべきである。
【００５６】
このようなジスルフィド結合切断は、以下のようにして達成してもよい：
（１）システイン酸（ｃｙｓｔｅｉｃ ａｃｉｄ）による過蟻酸酸化（Ｍｏｏｒｅら、１９６３）、この場合システイン残基がシステイン酸に修飾される。
（２）たとえばＣｕ２＋のような適切な酸化剤と共に亜硫酸塩（ＳＯ２−３）を用いることによる、スルフィトリシス（Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ  −  ２  Ｒ−ＳＯ３）、この場合、システインはＳ−スルホ−システインに修飾される（ＢａｉｌｅｙおよびＣｏｌｅ、１９５９）。
（３）ジチオスレイトール（ＤＤＴ）、β−メルカプトエタノール、システイン、グルタチオンレッド、ε−メルカプトエチルアミン、またはチオグリコール酸のようなメルカプタンによる還元、これらのうちＤＴＴおよびβ−メルカプトエタノールが一般に用いられる（Ｃｌｅｌａｎｄ、１９６４）、この方法は水環境において実行でき、システインが修飾されないので、本発明の好ましい方法である。
（４）ホスフィン（たとえばＢｕ３Ｐ）による還元（ＲｕｅｇｇおよびＲｕｄｉｎｇｅｒ、１９７７）。
すべてのこれらの化合物は、こうして本発明にしたがってジスルフィド結合を切断する手段または薬剤としてみなされる。
【００５７】
本発明のこのジスルフィド結合切断（または還元）工程は、好ましくは（部分的切断または還元条件下で行われる）部分的ジスルフィド結合切断（還元）工程である。
【００５８】
本発明にしたがった好ましいジスルフィド結合切断または還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。部分的還元は、低濃度のこのような還元剤を用いて得られ、すなわち、たとえばＤＴＴについては、約０．１〜約５０ｍＭ、好ましくは約０．１〜約２０ｍＭ、好ましくは約０．５〜約１０ｍＭ、好ましくは１ｍＭ超、２ｍＭ超もしくは５ｍＭ超、より好ましくは約１．５ｍＭ、約２．０ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭもしくは約７．５ｍＭの濃度範囲である。
【００５９】
このようなジスルフィド結合切断工程は、発現されたタンパク質を壊すことができる（切断剤と組み合わせて、またはジスルフィド結合を切断する手段の一例として）好適な界面活性剤、たとえばデシルＰＥＧ、ＥＭＰＩＧＥＮ−ＢＢ、ＮＰ−４０、コール酸ナトリウム、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、の存在下で行ってもよい。
【００６０】
このような還元または切断工程（好ましくは部分的還元または切断工程）は、好ましくは界面活性剤の存在下で（界面活性剤を用いて）行う。本発明にしたがった好ましい界面活性剤は、Ｅｍｐｉｇｅｎ−ＢＢである。用いる界面活性剤の量は、Ｅｍｐｉｇｅｎ−ＢＢのような界面活性剤の好ましくは１〜１０％、好ましくは３％超、より好ましくは約３．５％の範囲である。
【００６１】
ジスルフィド結合切断を得る特に好ましい方法は、上記で詳述した古典的なジスルフィド結合切断剤と、界面活性剤（これも上記で詳述した）との組み合わせを用いる。実施例の章において企図されているように、低濃度のＤＴＴ（１．５〜７．５ｍＭ）と約３．５％のＥｍｐｉｇｅｎ−ＢＢとの特定の組み合わせは、組換えにより発現されたＥ１およびＥ２タンパク質の精製のための特に好ましい還元剤および界面活性剤の組み合わせであることが示されている。ゲルろ過クロマトグラフィの際、この部分的還元は、おそらくダイマー状のＥ１タンパク質の生成と、イムノアッセイにおいて使用する際に偽反応性を引き起こす夾雑タンパク質からのこのＥ１タンパク質の分離とをもたらすことが示されている。
【００６２】
しかし、当業界で公知のあらゆる還元剤と、システインをよりアクセス可能にする当業界で公知のあらゆる界面活性剤または他の手段との、他のあらゆる組み合わせもまた、その組み合わせが本発明において例示された好ましい組み合わせと同じジスルフィド架橋切断のゴールに到達する限りにおいて、本発明の範囲内であることは理解されるべきである。
【００６３】
ジスルフィド結合を還元することを除いて、本発明に従ったジスルフィド結合切断手段は、以下のタイプの反応が起こることを可能にする当業界で公知の任意のジスルフィド架橋交換剤（有機またはタンパク質性である競合剤、たとえばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ、１９８８を参照されたい）を含んでいてもよい：
Ｒ１Ｓ−ＳＲ２  ＋  Ｒ３ＳＨ−Ｒ１Ｓ−ＳＲ３  ＋  Ｒ２ＳＨ
＊Ｒ１、Ｒ２はタンパク質凝集塊の化合物である
＊Ｒ３ＳＨは競合剤（有機、タンパク質性）である
「ジスルフィド架橋交換剤」という用語は、ジスルフィド結合ブロッキング剤ならびにジスルフィド結合再形成剤を含むと解釈されるべきである。
【００６４】
本発明は、上述のＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状エンベロープタンパク質を単離または精製する方法であって、以下のリストから選択されるもののような当業界で公知の任意のＳＨ基ブロッキングまたは結合試薬の使用をさらに含む方法にも関する：
−  グルタチオン
−  ５，５′−ジチオビス−（２−ニトロベンゼン酸）またはビス−（３−カルボキシ−４−ニトロフェニル）−ジスルフィド（ＤＴＮＢまたはエルマン試薬）（Ｅｌｍａｎｎ、１９５９）
−  Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ；Ｂｅｎｅｓｃｈら、１９５６）
−  Ｎ−（４−ジメチルアミノ−３，５−ジニトロフェニル）マレイミドまたはＴｕｐｐｙのマレイミド、これはタンパク質に色を与える
−  Ｐ−クロロメルクリベンゾエート（Ｇｒａｓｓｅｔｔｉら、１９６９）
−  ４−ビニルピリジン（ＦｒｉｅｄｍａｎおよびＫｒｕｌｌ、１９６９）、酸加水分解による反応後に遊離されうる
−  アクリロニトリル、酸加水分解による反応後に遊離されうる（ＷｅｉｌおよびＳｅｉｂｌｅｓ、１９６１）
−  ＮＥＭ−ビオチン（たとえばＳｉｇｍａ  Ｂ１２６７から入手される）
−  ２，２′−ジチオピリジン（ＧｒａｓｓｅｔｔｉおよびＭｕｒｒａｙ、１９６７）
−  ４，４′−ジチオピリジン（ＧｒａｓｓｅｔｔｉおよびＭｕｒｒａｙ、１９６７）
−  ６，６′−ジチオジニコチン酸（ＤＴＤＮＡ；ＢｒｏｗｎおよびＣｕｎｎｉｇｈａｍ、１９７０）
−  ２，２′−ジチオビス−（５′−ニトロピリジン）（ＤＴＮＰ；米国特許第３５９７１６０号）または他のジチオビス（ヘテロ環型誘導体）化合物（ＧｒａｓｓｅｔｔｉおよびＭｕｒｒａｙ、１９６９）
【００６５】
引用した出版物の調査により、しばしばスルフヒドリル基についての異なる試薬が同じタンパク質または酵素分子の異なる数のチオール基と反応することが示される。チオール基の反応性におけるこの変動は、分子の形および原子の周囲の基およびそれらの電荷のようなこれらの基の立体的環境、ならびに試薬分子またはイオンのサイズ、形および電荷によると結論することができる。頻繁に、ドデシル硫酸ナトリウム、尿素またはグアニジン塩酸のような適切な濃度の変性剤の存在は、タンパク質分子の充分なアンフォールディングを引き起こしてチオール基についての試薬のすべてへの等しいアクセスを可能にすることになる。変性剤の濃度を変化させることによって、アンフォールディングの程度は制御され得、このようにして反応性の程度の異なるチオール基が解明されうる。現在まで、報告された研究のほとんどは、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、Ｎ−エチルマレイミドおよびＤＴＮＢを用いて行われていたが、その他のより最近開発された試薬は同様に有用であると証明されうる。それらの異なる構造のため、実際、それらはチオール基の立体的環境における変化に対して異なって応答しうるようである。
【００６６】
あるいは、遊離ＳＨ基の酸化を防止し、したがってＥ１およびＥ２（エンベロープ）タンパク質の組換え発現および精製の際の大きい分子間凝集塊の形成を防止するための低ｐＨ（好ましくはｐＨ６未満）のような条件も、本発明の範囲内である。
【００６７】
本発明にしたがった好ましいＳＨ基ブロッキング試薬は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）である。このＳＨ基ブロッキング試薬は、組換え宿主細胞の溶解の間および上述の部分的還元プロセスの後またはジスルフィド架橋を切断するための他の任意のプロセスの後に投与してもよい。このＳＨ基ブロッキング試薬は、検出可能な標識を提供することができる任意の基および／または固体基材にこの組換えタンパク質を固定化することを補助する任意の基、たとえばビオチン化ＮＥＭ、で修飾されていてもよい。
【００６８】
システイン架橋を切断し、遊離システインをブロッキングする方法は、Ｄａｒｂｒｅ（１９８７）、ＭｅａｎｓおよびＦｅｅｎｅｙ（１９７１）、およびＷｏｎｇ（１９９３）によっても記載されている。
【００６９】
上で定義された本発明の単一または特異的オリゴマー状組換えＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質を精製する方法は、さらに以下の工程を含むことを特徴とする：
−  組換えＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２発現宿主細胞を、好ましくはＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）のようなＳＨ基ブロッキング剤、およびおそらくは好適な界面活性剤（好ましくはＥｍｐｉｇｅｎ−ＢＢ）の存在下で、溶解し、
−  このＨＣＶエンベロープタンパク質を、アフィニティ精製によって、たとえばレンチルレクチンクロマトグラフィのようなレクチンクロマトグラフィ、または抗Ｅ１および／または抗Ｅ２特異的モノクローナル交代を用いるイムノアフィニティクロマトグラフィによって回収し、続いて、
−  ＤＴＴのようなジスルフィド結合切断剤を用いて、好ましくはＮＥＭまたはビオチン−ＮＥＭのようなＳＨ基ブロッキング剤の存在下で、ジスルフィド結合を切断または還元し、
−  還元されたＨＣＶ  Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２エンベロープタンパク質を、たとえばゲルろ過（サイズ排除クロマトグラフィまたは分子ふるい）によって、場合により付加的なＮｉ２＋−ＩＭＡＣクロマトグラフィおよび脱塩工程にもよって、回収する。
【００７０】
上述の回収工程は、当業者に公知の任意の好適な技術を用いても行うことができることは理解されるべきである。
【００７１】
好ましいレクチンクロマトグラフィ系としては、実施例の章に説明されているようなＧａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓアグルチニン（ＧＮＡ）クロマトグラフィ、またはＬｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｎｓアグルチニン（ＬＣＡ）（レンチル）レクチンクロマトグラフィが挙げられる。他の有用なレクチンとしては、高マンノースタイプの糖類を認識するもの、たとえばＮａｒｃｉｓｓｕｓ ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓアグルチニン（ＮＰＡ）、Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ（アグルチニン（ＰＳＡ）、またはＡｌｌｉｕｍ ｕｒｓｉｎｕｍアグルチニン（ＡＵＡ）が挙げられる。
【００７２】
好ましくは、上記の方法は、上で詳述したように細胞内で産生された単一または特異的オリゴマー状ＨＣＶエンベロープタンパク質の精製のために使用可能である。
【００７３】
分泌されたＥ１またはＥ２またはＥ１／Ｅ２オリゴマーについては、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓアグルチニンＩ（ＲＣＡ  Ｉ）のようなレクチン結合複合糖類が好ましいレクチンである。
本発明は、より具体的には、上述の方法によって単離または精製されたことを特徴とする、Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２からなる群より選択される、実質的に精製された組換えＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状エンベロープタンパク質を企図する。
【００７４】
本発明は、より具体的にはワクシニアのような組換え哺乳動物細胞から発現された組換えエンベロープタンパク質の精製または単離に関する。
【００７５】
本発明はまた、組換え酵母細胞から発現された組換えエンベロープタンパク質の精製または単離にも関する。
【００７６】
本発明は、同様に組換え細菌（原核生物性）細胞から発現された組換えエンベロープタンパク質の精製または単離にも関する。
【００７７】
本発明はまた、ベクター配列、適切な原核生物性、真核生物性またはウイルス性または合成プロモーター配列、続いて本発明の単一または特異的オリゴマー状Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２の発現を可能にするヌクレオチド配列、を含む組換えベクターをも企図する。
【００７８】
特に、本発明は、ベクター配列、適切な原核生物性、真核生物性またはウイルス性または合成プロモーター配列、続いて本発明の単一Ｅ１またはＥ１の発現を可能にするヌクレオチド配列、を含む組換えベクターを企図する。
【００７９】
特に、本発明は、ベクター配列、適切な原核生物性、真核生物性またはウイルス性または合成プロモーター配列、続いて本発明の単一Ｅ１またはＥ２の発現を可能にするヌクレオチド配列、を含む組換えベクターを企図する。
【００８０】
ベクター配列に挿入された所望のＥ１および／またはＥ２配列をコードするＨＣＶ  ｃＤＮＡのセグメントは、シグナル配列に付着していてもよい。このシグナル配列は、非ＨＣＶ材料由来のものであってもよく、たとえば哺乳動物細胞での発現のためのＩｇＧまたは組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔｐａ）リーダー配列、または酵母細胞での発現のためのα−メイティング因子配列であってもよいが、本発明にしたがった特に好ましい構築体は、Ｅ１およびＥ２タンパク質のそれぞれの開始点の前にＨＣＶゲノム中で出現するシグナル配列を含む。ベクターに挿入された所望のＥ１および／またはＥ２配列をコードするＨＣＶ  ｃＤＮＡのセグメントは、たとえば実施例の章に説明されているような疎水性ドメインの、またはＥ２超可変性領域Ｉの、欠失を含んでいてもよい。
【００８１】
より具体的には、本発明にしたがった組換えベクターは、ＨＣＶ単一Ｅ１タンパク質の発現のための、アミノ酸位置１〜１９２の間の領域で始まり、ＨＣＶポリタンパク質の位置２５０〜４００の間の領域で終わり、より好ましくは、位置２５０〜３４１の間の領域で終わり、さらにより好ましくは位置２９０〜３４１の間の領域で終わる、ポリタンパク質をコードするＨＣＶ  ｃＤＮＡセグメントを有する核酸を含む。最も好ましくは、本発明の組換えベクターは、ＨＣＶ単一Ｅ１タンパク質の発現のための、位置１１７〜１９２の間の領域で始まり、位置２６３〜３２６の間の領域の任意の位置で終わる、ＨＣＶポリタンパク質の一部をコードするＨＣＶ  ｃＤＮＡセグメントを有する組換え核酸を含む。同じく本発明の範囲内にあるのは、最初の疎水性ドメインが欠失した形態（位置２６４〜２９３プラスまたはマイナス８アミノ酸）、または５′末端ＡＴＧコドンおよび３′末端終止コドンが付加された形態、またはＸａ因子切断部位および／または３〜１０、好ましくは６個のヒスチジンコドンが付加された形態である。
【００８２】
より具体的には、本発明にしたがった組換えベクターは、ＨＣＶ単一Ｅ２タンパク質の発現のために、アミノ酸位置２９０〜４０６の間の領域で始まり、ＨＣＶポリタンパク質の位置６００〜８２０の間の領域で終わり、より好ましくは位置３２２〜４０６の間の領域で始まり、さらにより好ましくは位置３４７〜４０６の間の領域で始まり、さらにより好ましくは位置３６４〜４０６の間の領域で始まる、ポリタンパク質をコードするＨＣＶ  ｃＤＮＡセグメントを有する核酸を含む。最も好ましくは、本発明の組換えベクターは、ＨＣＶ単一Ｅ２タンパク質の発現のための、位置２９０〜４０６の間の領域で始まり、位置６２３、６５０、６６１、６７３、７１０、７１５、７２０、７４６または８０９の任意の位置で終わる、ポリタンパク質をコードするＨＣＶ  ｃＤＮＡセグメントを有する組換え核酸を含む。同じく本発明の範囲内にあるのは、５′末端ＡＴＧコドンおよび３′末端終止コドンを付加された形態、または付加されたＸａ因子切断部位および／または３〜１０、好ましくは６個のヒスチジンコドンを有する形態である。
【００８３】
多様なベクターが、本発明のＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状エンベロープタンパク質の組換え発現を得るために使用され得る。酵母のような下等真核生物およびグリコシル化突然変異株は、典型的にはプラスミドで形質転換され、または組換えウイルスで形質転換される。ベクターは、独立して宿主内で複製してもよく、あるいは宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよい。
【００８４】
高等真核生物は、ベクターで形質転換されてもよく、あるいは組換えワクシニアウイルスのような組換えウイルスに感染されてもよい。ワクシニアウイルスへの外来性ＤＮＡの挿入のための技術およびベクターは当業界で周知であり、たとえば相同組換えが用いられる。多様なウイルスプロモーター配列、おそらくはターミネーター配列およびポリ（Ａ）付加配列、おそらくはエンハンサー配列およびおそらくは増幅配列（これらはすべて哺乳動物の発現に必要である）は、当業界において入手可能である。ワクシニアは、宿主細胞タンパク質の発現を停止させるので、特に好ましい。ワクシニアはまた、生きた組換えワクシニアウイルスで免疫された細胞または個体においてＨＣＶのＥ１およびＥ２タンパク質の発現を可能にするので、非常に好ましい。ヒトのワクチン接種のためには、アビポックスおよびＡｎｋａｒａ改変ウイルス（ＡＭＶ）が特に有用なベクターである。
【００８５】
バキュロウイルスＡｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体症ウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の昆虫発現トランスファーベクターもまた公知であり、これは、ヘルパー非依存性ウイルス発現ベクターである。この系由来の発現ベクターは、通常、異種遺伝子の発現を駆動するために強いウイルスポリヘドリン遺伝子プロモーターを用いる。バキュロウイルスの所望の部位に異種ＤＮＡを導入する方法ならびに異なるベクターは、バキュロウイルス発現についての当業者には利用可能である。昆虫細胞によって認識される転写後修飾のための異なるシグナルもまた当業界で公知である。
【００８６】
同じく本発明の範囲内にあるのは、精製組換え単一または特異的オリゴマー状ＨＣＶ  Ｅ１またはＥ２またはＥ１／Ｅ２タンパク質を産生する方法であって、この方法では、凝集塊の形成が防止されるように、凝集塊形成に関与するシステイン残基は核酸配列のレベルで他の残基によって置換される。このような突然変異Ｅ１および／またはＥ２タンパク質をコードする核酸を担持する組換えベクターによって発現された組換えタンパク質もまた、本発明の範囲内である。
【００８７】
本発明はまた、組換えＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質であって、それらのグリコシル化部位の少なくとも１つが除去されていることを特徴とし、その結果グリコシル化突然変異体と呼ばれるタンパク質にも関する。実施例の章で説明されるように、異なるグリコシル化突然変異体が、問題の患者についてＨＣＶ疾患を診断（スクリーニング、確認、予後診断等）し、防止するために望ましい可能性がある。たとえば、ＧＬＹ４を欠くＥ２タンパク質グリコシル化突然変異体は、診断においてある種の血清の反応性を改良することが見出された。これらのグリコシル化突然変異体は、好ましくは本発明に開示された方法にしたがって精製される。本発明について同様に企図されるのは、このようなＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２グリコシル化突然変異体をコードする核酸インサートを担持する組換えベクター、ならびにこのような組換えベクターで形質転換された宿主細胞である。
【００８８】
本発明はまた、本発明の一部を形成するポリヌクレオチドを含む組換えベクターにも関する。本発明は、より具体的には、配列番号３、５、７、９、１１、１３、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７および４９に表される組換え核酸、またはそれらの一部に関する。
【００８９】
本発明はまた、上記で定義された組換えベクターで形質転換された宿主細胞を企図し、ここでは、上記のベクターは、上記で定義されたＨＣＶ  Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、このＨＣＶ  Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２配列に作動可能に連結され、このＨＣＶ  Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質の発現を調節することができる調節配列に加えて含む。
【００９０】
真核生物宿主は、定義の章で記載されたように下等および高等真核生物宿主を含む。下等真核生物宿主は、当業界で周知の酵母細胞を含む。高等真核生物宿主は、主に当業界で公知の哺乳動物細胞株を含み、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎（ＢＨＫ）細胞、ＰＫ１５、ＲＫ１３および多数の他の細胞株を含む、ＡＴＣＣから入手可能な多数の不死化細胞株を含む。
【００９１】
本発明は、特に、上記で定義された組換えベクターを含む上記で定義された宿主細胞によって発現された組換えＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質に関する。これらの組換えタンパク質は、本発明の方法によって特に精製される。
【００９２】
上記で定義されたＨＣＶエンベロープタンパク質を精製または単離する好ましい方法は、少なくとも以下の工程を含むことをさらに特徴とする：
−  本発明の組換えベクターまたはＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２  ＨＣＶエンベロープタンパク質を発現する公知の組換えベクターで形質転換された上記で定義した宿主細胞を、好適な培地中で生育させる工程、
−  好適な条件下で上記で定義したこのベクター配列を発現させる工程、および
−  この形質転換された宿主細胞を、好ましくはＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）のようなＳＨ基ブロッキング剤（およびおそらくは好適な界面活性剤（好ましくはＥｍｐｉｇｅｎ−ＢＢ））の存在下で、溶解させる工程、
−  このＨＣＶエンベロープタンパク質を、レクチンクロマトグラフィまたは抗Ｅ１および／または抗Ｅ２特異的モノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティクロマトグラフィ等によって（このレクチンは好ましくはレンチルレクチンまたはＧＮＡである）アフィニティ精製することにより、回収する工程、続いて、
−  前記の工程の溶出液を、ＤＴＴのようなジスルフィド結合切断手段とともにインキュベーションし、好ましくは続いてＮＥＭまたはビオチン−ＮＥＭのようなＳＨ基ブロッキング剤とともにインキュベーションする工程、および
−  ＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質を、ゲルろ過およびおそらくは後続のＮｉ２＋−ＩＭＡＣクロマトグラフィとその後の脱塩工程とのような手段によって、単離する工程。
【００９３】
上述のプロセスの結果、Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質は、実施例の章で説明されるようにゲルろ過カラムまたはＩＭＡＣカラムのボイド容量中の細胞成分および／またはベクター由来成分を含む大きな凝集塊とは異なって溶出する形態で生成され得る。ジスルフィド架橋切断工程は、有利なことに、宿主および／または発現系由来タンパク質の存在による偽陽性をも排除する。細胞の溶解中のＮＥＭおよび好適な界面活性剤の存在は、既に、ＨＣＶエンベロープタンパク質と夾雑物との凝集を、部分的にまたは完全に、防止し得る。
【００９４】
Ｎｉ２＋−ＩＭＡＣクロマトグラフィとその後の脱塩工程は、好ましくは、Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら（１９９１）およびＨｏｃｈｕｌｉら（１９８８）によって記載されたような（Ｈｉｓ）６を担持する構築体について使用される。
【００９５】
本発明は、本発明のＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状エンベロープタンパク質を用いて、マウスまたはラットのような小動物においてモノクローナル抗体を生産する方法、ならびに抗ＨＣＶ抗体を認識するヒトＢ細胞を単離およびスクリーニングする方法にも関する。
【００９６】
本発明は、さらに表３に列挙された以下のＥ１ペプチドの少なくとも１つを含む組成物に関する：
コア／Ｅ１  Ｖ１領域のアミノ酸１８１〜２００にわたるＥ１−３１（配列番号５６）、
Ｅ１領域のアミノ酸１９３〜２１２にわたるＥ１−３３（配列番号５７）、
Ｅ１  Ｖ２領域のアミノ酸２０５〜２２４にわたるＥ１−３５（配列番号５８）（エピトープＢ）、
Ｅ１  Ｖ２領域のアミノ酸２０８〜２２７にわたるＥ１−３５Ａ（配列番号５９）（エピトープＢ）、
Ｅ１領域Ｖ１、Ｃ１、およびＶ２領域のアミノ酸１９２〜２２８にわたる１ｂＥ１（配列番号５３）（エピトープＢを含む）、
Ｅ１領域のアミノ酸３０１〜３２０にわたるＥ１−５１（配列番号６６）、
Ｅ１  Ｃ４領域のアミノ酸３１３〜３３２にわたるＥ１−５３（配列番号６７）（エピトープＡ）、
Ｅ１領域のアミノ酸３２５〜３４４にわたるＥ１−５５（配列番号６８）。
本発明は、表３に列挙された以下のＥ２ペプチドの少なくとも１つを含む組成物にも関する：
Ｅ２領域のアミノ酸位置３９７〜４１８にわたるＥｎｖ６７またはＥ２−６７（配列番号７２）（エピトープＡ、モノクローナル抗体２Ｆ１０Ｈ１０によって認識される；図１９参照）、
Ｅ２領域のアミノ酸位置４０９〜４２８にわたるＥｎｖ６９またはＥ２−６９（配列番号７３）（エピトープＡ）、
Ｅ２領域の位置５８３〜６０２にわたるＥｎｖ２３またはＥ２−２３（配列番号８６）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置５９５〜６１４にわたるＥｎｖ２５またはＥ２−２５（配列番号８７）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置６０７〜６２６にわたるＥｎｖ２７またはＥ２−２７（配列番号８８）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置５４７〜５６６にわたるＥｎｖ１７ＢまたはＥ２−１７Ｂ（配列番号８３）（エピトープＤ）、
Ｅ２領域の位置５２３〜５４２にわたるＥｎｖ１３ＢまたはＥ２−１３Ｂ（配列番号８２）（エピトープＣ；モノクローナル抗体１６Ａ６Ｅ７によって認識される、図１９を参照されたい）。
本発明は、以下のＥ２コンフォメーショナルエピトープの少なくとも１つを含む組成物にも関する：
モノクローナル抗体１５Ｃ８Ｃ１、１２Ｄ１１Ｆ１および８Ｇ１０Ｄ１Ｈ９によって認識されるエピトープＦ、
モノクローナル抗体９Ｇ３Ｅ６によって認識されるエピトープＧ、
モノクローナル抗体１０Ｄ３Ｃ４および４Ｈ６Ｂ２によって認識されるエピトープＨ（またはＣ）、
モノクローナル抗体１７Ｆ２Ｃ２によって認識されるエピトープＩ。
【００９７】
本発明はまた、ペプチドまたはタンパク質組成物で免疫して生成されたＥ１またはＥ２特異的抗体であって、この抗体は、上述のポリペプチドまたはペプチドのいずれかと特異的に反応性であって、この抗体は好ましくはモノクローナル抗体であるものにも関する。
【００９８】
本発明はまた、当業界で公知の方法によって、ヒトＢ細胞集団から、またはプラスミドまたはファージ中の可変鎖ライブラリーからスクリーニングされたＥ１またはＥ２特異的抗体であって、この抗体は上記で定義されたポリペプチドまたはペプチドのいずれかと反応性であり、この抗体は好ましくはモノクローナル抗体であるものにも関する。
【００９９】
本発明のＥ１またはＥ２特異的モノクローナル抗体は、一方では、上記で定義されたように、本発明のＨＣＶポリペプチドまたはペプチドに対して免疫された動物の（特にマウスまたはラットの）脾臓細胞から、そして他方ではミエローマ細胞株の細胞から、古典的な方法によって形成され得、最初の動物の免疫のために使用されたポリペプチドを認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの能力によって選択されるべき任意のハイブリドーマによって作製することができる。
【０１００】
本発明に包含される抗体は、酵素、蛍光または放射能タイプの適切な標識によって標識されることができる。
【０１０１】
本発明のこの好ましい態様にしたがったモノクローナル抗体は、Ｈ鎖およびＬ鎖をコードするｃＤＮＡまたはゲノムクローンからのＨ鎖およびＬ鎖をコードするマウスおよび／またはヒトゲノムＤＮＡ配列の部分から出発して、組換えＤＮＡ技術によって作製された、マウスモノクローナル抗体のヒト化バージョンであることができる。
【０１０２】
あるいは、本発明のこの好ましい態様に従ったモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル抗体であることができる。本発明のこの態様にしたがったこれらの抗体は、ＨＣＶ感染した、またはＨＣＶに対してワクチン接種された患者のヒト末梢血リンパ球由来であることもできる。このようなヒトモノクローナル抗体は、たとえば重症複合性免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）リポピュレーションによって調製される（最近の総説については、Ｄｕｃｈｏｓａｌら、１９９２を参照されたい）。
【０１０３】
本発明は、レパートリークローニングの方法による組換え抗体の選択（Ｐｅｒｓｓｏｎら、１９９１）のための、本発明のタンパク質またはペプチドの用途にも関する。
【０１０４】
ある種のゲノタイプ由来のペプチドまたは単一もしくは特異的オリゴマー状エンベロープタンパク質に対する抗体は、医薬として、より具体的にはＨＣＶゲノタイプの検出についてのイムノアッセイ中への取り込み（ＨＣＶ  Ｅ１またはＥ２抗原の存在の検出のための）用、ＨＣＶ疾患の予後診断／モニタリング用、または治療剤として、使用することができる。
【０１０５】
あるいは、本発明は、生物学的試料中のＥ１またはＥ２抗原の存在を検出するためのイムノアッセイキットの調製用、ＨＣＶ疾患の予後診断／モニタリングのためのキットの調製用、またはＨＣＶ医薬の調製用の、任意の上述のＥ１またはＥ２特異的モノクローナル抗体の用途にも関する。
【０１０６】
本発明はまた、少なくとも以下の工程を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原の検出またはインビトロ診断のための方法にも関する：
（ｉ）前記生物学的試料を、上記で定義されたＥ１および／またはＥ２特異的モノクローナル抗体のいずれかと、好ましくは固定化形態で免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）結合していない成分を除去する工程、
（ｉｉｉ）分析すべき試料中に存在する抗体に特異的に結合する異種抗体と形成された免疫複合体を、適切な条件下で検出可能な標識とのコンジュゲートにされた上記異種抗体とインキュベートする工程、
（ｉｖ）上記免疫複合体の存在を、視覚的にまたは機械的に（たとえば分光計測、蛍光計測、比色計測によって）検出する工程。
本発明はまた、以下のものを含む生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原のインビトロ診断のためのキットにも関する：
−  上記で定義された少なくとも１つのモノクローナル抗体、この抗体は固体基材上に優先的に固定化される、
−  生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原とこれらの抗体との間の結合反応を可能にする緩衝液を作製するために必要な成分または緩衝液、
−  前の結合反応において形成された免疫複合体を検出するための手段、
−  おそらくは観察された結合パターンから試料中に存在するＨＣＶ抗原を推測するための自動化されたスキャンおよび解釈装置をも含む。
【０１０７】
本発明は、本発明の方法に従って精製されたＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２組換えＨＣＶタンパク質を含む組成物または医薬としての用途のために上記で特定された少なくとも１つのペプチドを含む組成物にも関する。
【０１０８】
本発明は、より具体的には、充分な量の組成物を、おそらくは医薬的に許容されうるアジュバントを伴って投与し、免疫応答を生じることを含む、哺乳動物（好ましくはヒト）をＨＣＶに対して免疫するためのワクチンとしての用途のための、少なくとも１つの上記で特定したエンベロープペプチドを含む組成物または上記で定義された組換えエンベロープタンパク質組成物に関する。
【０１０９】
より具体的には、本発明は、上で記載されたワクチンの調製のための、ここで上に記載された任意の組成物の用途に関する。
【０１１０】
また、本発明は、上で記載されたＥ１および／またはＥ２領域由来のＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状タンパク質またはペプチドを含む、哺乳動物（好ましくはヒト）をＨＣＶに対して免疫するためのワクチン組成物にも関する。
【０１１１】
免疫原性組成物は、当業界で公知の方法に従って調製することができる。本発明の組成物は、免疫原性の量の上記の定義された組換えＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２単一または特異的オリゴマー状タンパク質または上記で定義されたＥ１またはＥ２ペプチドを、通常は医薬的に許容可能な、好ましくはアジュバントをさらに含むキャリアとの組み合わせで、含む。
【０１１２】
本発明の単一または特異的オリゴマー状エンベロープタンパク質、すなわちＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２は、Ｅ１またはＥ２に対する抗体の形成は他のエンベロープタンパク質に対するものよりも望ましい可能性があるので、そしてＥ２タンパク質はＨＣＶタイプ間で交差反応性であり、Ｅ１タンパク質はタイプ特異的であるので、特に有用なワクチン抗原を提供すると期待される。いくつかのゲノタイプから由来するタイプ１のＥ２タンパク質およびＥ１タンパク質を含むカクテルは、特に有利であり得る。Ｅ２に対してＥ１のモル過剰またはＥ１に対してＥ２のモル過剰を含むカクテルもまた、特に有用であり得る。免疫原性組成物は、抗体の供給源を提供するため、または動物に保護免疫を誘導するため、動物に投与されて抗体の産生を誘導することができる。
【０１１３】
医薬的に許容可能なキャリアとしては、それ自身はその組成物を受容する個体に有害な抗体の産生を誘導しない、任意のキャリアが挙げられる。好適なキャリアは、典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー；および不活性ウイルス粒子のような、大きい、ゆっくり代謝される巨大分子である。このようなキャリアは当業者には周知である。
【０１１４】
組成物の有効性を強化するために好ましいアジュバントとしては、水酸化アルミニウム（ミョウバン）、米国特許第４，６０６，９１８号に見出されるようなＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１′−２′−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリロキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）およびＲＩＢＩ（これは細菌から抽出された３つの成分、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレート、および細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクワレン／Ｔｗｅｅｎ ８０乳化液中に含む）が挙げられるが、これらに限らない。３つの成分ＭＰＬ、ＴＤＭまたはＣＷＳのいずれかを、単独で用いてもよく、あるいは２つずつ組み合わせてもよい。付加的に、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ （Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ， ＭＡ）またはＳＡＦ−１（Ｓｙｎｔｅｘ）のようなアジュバントを用いてもよい。さらに、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）を非ヒト適用および研究目的については使用してもよい。
【０１１５】
免疫原性組成物は、典型的には水、生理食塩水、グリセロール、エタノール等のような医薬的に許容可能な賦形薬を含有する。さらに、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、保存剤等の補助剤を、このような賦形薬に含んでいてもよい。
【０１１６】
典型的には、免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能に調製される。注射の前に液体賦形薬中に溶解または懸濁させるのに好適な固体形態もまた調製され得る。調製物は、強化されたアジュバント効果のために、乳化させるか、リポソーム中に封入してもよい。Ｅ１およびＥ２タンパク質は、サポニンとともに免疫刺激複合体中に取り込ませてもよい（たとえばＱｕｉｌ Ａ（ＩＳＣＯＭＳ））。
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、「充分な量」または「免疫学的に有効な量」の本発明のエンベロープタンパク質を、必要に応じて上述の任意の他の成分とともに含む。「免疫学的に有効な量」は、単一用量またはシリーズの一部での、個体に対するその量の投与が、上記で定義されたように処理に有効であることを意味する。この量は、処理されるべき個体の健康および身体的状態、処理されるべき個体の分類学的グループ（たとえば非ヒト霊長類、霊長類等）、抗体を合成するための個体の免疫系の能力、望ましい保護の程度、ワクチンの処方、処理医師の医学的状態の評価、感染しているＨＣＶの株、および他の関連要因に依存する。その量はルーチンの試験によって決定することができる比較的広い範囲内に入ることが期待される。通常、その量は、０．０１〜１０００μｇ／用量、より具体的には０．１〜１００μｇ／用量まで変化する。
【０１１７】
単一または特異的オリゴマー状エンベロープタンパク質は、Ｂ型肝炎表面抗原と同じ様式で（ヨーロッパ特許出願１７４４４４を参照されたい）、本発明の同種（たとえばコア、ＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４またはＮＳ５領域由来のＴ細胞エピトープまたはＢ細胞エピトープ）または異種（非ＨＣＶ）ハプテンについてのワクチンキャリアとしても役立ちうる。この用途においては、エンベロープタンパク質は、凝集塊にコンジュゲート化された抗原またはハプテンに対する免疫応答を刺激することができる免疫原性キャリアを提供する。抗原は、従来の化学的方法によってコンジュゲート化されていてもよく、またはタンパク質の親水性領域に相当する位置でＥ１および／またはＥ２をコードする遺伝子中にクローニングされていてもよい。このような親水性領域としては、Ｖ１領域（アミノ酸位置１９１〜２０２にわたる）、Ｖ２領域（アミノ酸位置２１３〜２２３にわたる）、Ｖ３領域（アミノ酸位置２３０〜２４２にわたる）、Ｖ４領域（アミノ酸位置２３０〜２４２にわたる）、Ｖ５領域（アミノ酸位置２９４〜３０３にわたる）、およびＶ６領域（アミノ酸位置３２９〜３３６にわたる）が挙げられる。ハプテンの挿入について有用な別の位置は、疎水性領域（アミノ酸位置約２６４〜２９３にわたる）である。本発明において、この領域を、欠失Ｅ１タンパク質の抗血清との反応性に影響することなしに欠失させ得ることが示されている。したがって、ハプテンは、欠失の部位に挿入してもよい。
【０１１８】
免疫原性組成物は、従来は非経口、たとえば典型的には皮下または筋内注射によって投与されている。他の投与方法について好適なさらなる製剤としては、経口製剤および坐剤が挙げられる。用量処理は単一用量スケジュールまたは複数用量スケジュールであることができる。ワクチンは、他の免疫調節剤と一緒に投与されてもよい。
【０１１９】
本発明は、生物学的試料に存在するＨＣＶ抗体のインビトロ検出のための、上述のペプチドまたはポリペプチドを含む組成物にも関する。
【０１２０】
本発明はまた、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体を検出するためのイムノアッセイキットの製造のための上述の組成物の用途にも関する。
【０１２１】
本発明は、少なくとも以下の工程を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体のインビトロ診断の方法にも関する：
（ｉ）前記生物学的試料を、上記で定義されたエンベロープペプチドまたはタンパク質のいずれかを含む組成物と、好ましくは固定化形態で免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で接触させる工程、ここでこれらのペプチドまたはタンパク質はストレプトアビジンまたはアビジン複合体によって固体基材に共有結合されているビオチニル化ペプチドまたはタンパク質であることができる、
（ｉｉ）結合していない成分を除去する工程、
（ｉｉｉ）形成された免疫複合体を、適切な条件下で検出可能な標識とのコンジュゲートにされた上記異種抗体とインキュベートする工程、
（ｉｖ）上記免疫複合体の存在を、視覚的にまたは機械的に（たとえば分光計測、蛍光計測、比色計測によって）検出する工程。
【０１２２】
また別に、本発明は、上で開示された組換えにより産生された単一または特異的オリゴマー状タンパク質Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質が、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体に関して競合するためにＥ１および／またはＥ２ペプチドとの組み合わせで用いられる競合イムノアッセイフォーマットにも関する。
【０１２３】
本発明はまた、以下のものを含む、生物学的試料中のＨＣＶ抗体の存在を決定するためのキットにも関する：
−  おそらくはＨＣＶまたはＨＣＶの他のタイプ由来の他のポリペプチドまたはペプチドとの組み合わせでの、上で定義された少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質組成物、ここでこれらのペプチドまたはタンパク質は、固体基材上に、より好ましくは同じＥＬＩＳＡプレートの異なるマイクロウェルに、そしてさらに優先的には同じ１つのメンブレンストリップに、優先的に固定化される、
−  生物学的試料中に存在するＨＣＶに対する抗体とこれらのポリペプチドまたはペプチドとの間の結合反応を可能にする緩衝液を製造するのに必要な成分または緩衝液、
−  先の結合反応において形成された免疫複合体を検出する手段、
−  おそらくは観察された結合パターンから試料中に存在するＨＣＶゲノタイプを推測するための自動化スキャンニングおよび解釈装置をも含む。
【０１２４】
本発明のイムノアッセイ方法は、ＨＣＶ感染した個体からの血清中の抗体によって認識されるコンフォメーショナルエピトープ（単一または特異的オリゴマー状タンパク質）およびリニア（ペプチドの場合）エピトープを維持する、Ｅ１および／またはＥ２ドメイン由来の単一または特異的オリゴマー状抗原を用いる。たとえば単一または特異的オリゴマー状抗原、ダイマー状抗原、ならびに単一または特異的オリゴマー状抗原の組み合わせを使用することは、本発明の範囲内である。本発明のＨＣＶ  Ｅ１およびＥ２抗原は、抗体を検出するための公知の抗原を使用する本質的に任意のアッセイフォーマットにおいて使用され得る。もちろん、ＨＣＶコンフォメーショナルエピトープを変性させるフォーマットは回避または採用すべきである。これらのアッセイのすべての共通の特徴は、抗原を、ＨＣＶ抗体を含有する疑いのある身体成分と、その成分中に存在するこのような任意の抗体に抗原が結合することを可能にする条件下で接触させることである。このような条件は、典型的には過剰の抗原を用いて生理学的な温度、ｐＨおよびイオン強度である。検体と抗原とのインキュベーションに続いて抗原を含む免疫複合体の検出が行われる。
【０１２５】
イムノアッセイの設計は、広範な変更の対象であり、多くのフォーマットが当業界で公知である。たとえば、プロトコールは、固体支持体、または免疫沈降を用いることができる。ほとんどのアッセイは、標識抗体またはポリペプチドの使用を含む。標識は、たとえば、酵素的、蛍光性、化学発光性、放射性、または色素分子であることができる。免疫複合体からのシグナルを増幅するアッセイもまた公知である。それらの例としては、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンを用いるアッセイ、およびＥＬＩＳＡアッセイのような酵素標識および媒介性イムノアッセイがある。
【０１２６】
イムノアッセイは、制限なしに、異種または同種フォーマットであることができ、標準的または競合的タイプのものであることができる。異種フォーマットにおいては、ポリペプチドは、典型的には、インキュベーション後にポリペプチドからの試料の分離を容易にするために固体マトリックスまたは支持体に結合している。用いることができる固体支持体の例は、ニトロセルロース（たとえば、メンブレンまたはマイクロタイターウェル）、ポリビニルクロリド（たとえば、シートまたはマイクロタイターウェル）、ポリスチレンラテックス（たとえば、ビーズまたはマイクロタイタープレート）、フッ化ポリビニリデン（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ（商標）として公知）、ジアゾ化紙、ナイロンメンブレン、活性化ビーズ、およびプロテインＡビーズである。たとえば、Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｎ（商標）１またはＩｍｍｕｎｌｏｎ（商標）２マイクロタイタープレートまたは０．２５インチポリスチレンビーズ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｂａｌｌ）は、異種フォーマットにおいて使用することができる。抗原性ポリペプチドを含有する固体支持体は、典型的には試験試料からそれを分離した後、結合抗体の検出の前に、洗浄される。標準および競合フォーマットの両方が当業界で公知である。
【０１２７】
同種フォーマットにおいては、試験試料は溶液中の抗原の組み合わせとともにインキュベートされる。たとえば、形成されたあらゆる抗原−抗体複合体と一緒に沈降する条件下であろう。これらのアッセイについて標準的および競合的の両方のフォーマットが当業界で公知である。
【０１２８】
標準的フォーマットにおいて、抗体−抗原複合体中のＨＣＶ抗体の量は、直接モニタリングされる。これは、抗ＨＣＶ抗体上のエピトープを認識する標識抗異種（たとえば抗ヒト）抗体が複合体形成のために結合するかどうかを決定することにより、達成されることができる。競合的フォーマットにおいては、試料中のＨＣＶ抗体の量は、複合体中の標識抗体（または他の競合リガンド）の既知の量の結合に対する競合的効果をモニタリングすることによって推定される。
【０１２９】
抗ＨＣＶ抗体を含んで形成された複合体（または競合的アッセイの場合、競合抗体の量）は、フォーマットに応じて多数の公知の技術のいずれかによって検出される。たとえば、複合体中の非標識ＨＣＶ抗体は、標識（たとえば酵素標識）との複合体を形成した抗異種Ｉｇのコンジュゲートを用いて検出することができる。
【０１３０】
免疫沈降または凝集アッセイフォーマットにおいては、ＨＣＶ抗原と抗体との反応は、溶液または懸濁液から沈降するネットワークを形成し、沈降物の可視的な層またはフィルムを形成する。試験検体中に抗ＨＣＶ抗体が存在しない場合、可視的沈降物は形成されない。
【０１３１】
現在、３つの特異的タイプの粒子凝集（ＰＡ）アッセイが存在する。これらのアッセイは、支持体にコーティングされると種々の抗原に対する抗体の検出のために用いられる。このアッセイの１つのタイプは、赤血球（ＲＢＣ）に対し受動的に吸着する抗原（または抗体）によって感作された赤血球（ＲＢＣ）を用いるヘマグルチネーションアッセイである。身体成分中に存在する特異的抗原抗体の添加（存在する場合）は、精製抗原でコーティングされたＲＢＣの凝集を引き起こす。
【０１３２】
ヘマグルチネーションアッセイにおける潜在的な非特異的反応を排除するために、ＰＡにおいてＲＢＣの代わりに２つの人工的キャリアを用いることができる。これらの最も一般的なものは、ラテックス粒子である。しかし、ゼラチン粒子もまた使用することができる。これらのキャリアのいずれかを使用するアッセイは、精製抗原でコーティングされた粒子の受動的凝集に基づいている。
【０１３３】
コンフォメーショナルエピトープを含む本発明のＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２抗原は、典型的にはこれらのイムノアッセイにおける用途のためのキットの形態で包装されることになる。このキットは、通常は、ネイティブなＨＣＶ抗原、対照抗体製剤（陽性および／または陰性）、アッセイフォーマットが必要とする場合には標識抗体、および標識がシグナルを直接生成しない場合にはシグナル生成試薬（たとえば酵素基質）を、別個の容器内に含む。ネイティブＨＣＶ抗原は、固体マトリックスに既に結合されていてもよく、またはマトリックスに結合させるための試薬と別々であってもよい。アッセイを行うための指示書（たとえば書面、テープ、ＣＤ−ＲＯＭ等）は、通常、キットに包含される。
【０１３４】
ネイティブＨＣＶ抗原を使用するイムノアッセイは、潜在的に感染性のＨＣＶのない製品の製造のための血液のスクリーニングにおいて有用である。血液製品の製造の方法は、以下の工程を含む。個々の供血からの、身体成分、好ましくは血液または血液成分を、本発明のＨＣＶ  Ｅ１および／またはＥ２タンパク質と反応させて、存在する場合のＨＣＶ抗体とＨＣＶ抗原との間の免疫学的反応を可能にする工程。抗ＨＣＶ抗体−ＨＣＶ抗原複合体が反応の結果として形成されたかどうかを検出する工程。血液製品に寄付される血液は、ネイティブＨＣＶ抗原、Ｅ１またはＥ２に対する抗体を示さないドナー由来である。
【０１３５】
ＨＣＶ抗原に対する陽性の反応性の場合、イムノアッセイを繰り返して、偽陽性の確率を下げることが好ましい。たとえば、血液製品（たとえば輸血、血漿、第ＶＩＩＩ因子、免疫グロブリン等）の製造のための血液の大規模スクリーニングの場合、「スクリーニング」試験は、典型的には、特異性を犠牲にして感度を増大させるように（汚染血液の通過がないことを確実にするため）フォーマットされる。すなわち、偽陽性率は増大する。したがって、「反復的に反応性」、すなわち供与された試料に対する２回以上のイムノアッセイの実行において陽性であるドナーを、さらにテストするためにのみ据え置くことが典型的である。しかし、ＨＣＶ陽性の確認については、「確認」試験は、典型的には感度を犠牲にして特異性を増大させる（偽陽性試料が確認されないことを確実にするため）ようにフォーマットされる。したがって、本発明においてＥ１およびＥ２について記載された精製方法は、単一または特異的オリゴマー状エンベロープタンパク質をＨＣＶ診断アッセイに含ませるために非常に有利である。
【０１３６】
選択された固相は、ポリマー性またはガラスのビーズ、ニトロセルロース、微粒子、反応トレーのマイクロウェル、試験管および磁性ビーズを含むことができる。シグナル生成化合物は、酵素、発光性化合物、クロモゲン、放射性元素および化学発光性化合物を含むことができる。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、およびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。エンハンサー化合物の例としては、ビオチン、抗ビオチンおよびアビジンが挙げられる。エンハンサー化合物結合部材の例としては、ビオチン、抗ビオチンおよびアビジンが挙げられる。リューマチ因子様物質の影響をブロックするために、試験試料はリューマチ因子様物質の影響をブロックするのに充分な条件に供される。これらの条件は、試験試料を、ある量の抗ヒトＩｇＧと接触させて混合物を形成させる工程、およびこの混合物を、実質的にリューマチ因子様物質を含まない反応混合物生成物が形成されるのに充分な時間および条件下でインキュベートする工程を含む。
【０１３７】
本発明は、以下の工程を含む、Ｅ１タンパク質、またはそれらの部分、より具体的には上で定義されたＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状Ｅ１タンパク質、のＨＣＶ疾患のインビトロモニタリングまたはＨＣＶ感染を受けた患者の処理（たとえばインターフェロンでの）に対する応答の予後のための用途をさらに企図する：
−  Ｃ型肝炎感染を有する患者由来の生物学的試料を、Ｅ１タンパク質またはその好適な部分とともに、免疫学的複合体の形成を可能にする条件下でインキュベートする工程、
−  非結合成分を除去する工程、
−  上記試料中に存在する抗Ｅ１タイターを算出する工程（たとえば治療の開始時および／または（インターフェロン）治療期間中）、
−  ＨＣＶ疾患の自然の経過をモニタリングする工程、または処理の開始時および／または処理の期間中の上記試料中に見出される抗Ｅ１タイターの量に基づいての上記患者の処理に対する応答の予後診断の工程。
【０１３８】
最初の抗Ｅ１タイターの２，３、４、５、７、１０、１５または好ましくは２０倍を超える低減を示す患者は、ＨＣＶ療法、より具体的にはインターフェロン療法に対する長期持続的応答者であると結論づけることができる。実施例の章において、抗Ｅ１アッセイがＩＦＮ処理、または一般にＣ型肝炎ウイルス疾患の処理に対する長期応答の予後診断のために、非常に有用であり得ることが説明されている。
【０１３９】
より具体的には、表３に列挙されている以下のＥ１ペプチドは、ＨＣＶ疾患のインビトロモニタリングまたはＨＣＶ感染を受けた患者のインターフェロン処理に対する応答の予後診断のために有用であることが見出された：
コア／Ｅ１  Ｖ１領域のアミノ酸１８１〜２００にわたるＥ１−３１（配列番号５６）、
Ｅ１領域のアミノ酸１９３〜２１２にわたるＥ１−３３（配列番号５７）、
Ｅ１  Ｖ２領域のアミノ酸２０５〜２２４にわたるＥ１−３５（配列番号５８）（エピトープＢ）、
Ｅ１  Ｖ２領域のアミノ酸２０８〜２２７にわたるＥ１−３５Ａ（配列番号５９）（エピトープＢ）、
Ｅ１領域のアミノ酸１９２〜２２８にわたる１ｂＥ１（配列番号５３）（Ｖ１、Ｃ１、およびＶ２領域（エピトープＢを含む））、
Ｅ１領域のアミノ酸３０１〜３２０にわたるＥ１−５１（配列番号６６）、
Ｅ１  Ｃ４領域のアミノ酸３１３〜３３２にわたるＥ１−５３（配列番号６７）（エピトープＡ）、
Ｅ１領域のアミノ酸３２５〜３４４にわたるＥ１−５５（配列番号６８）。
【０１４０】
上述のペプチドのより小さいフラグメントもまた本発明の範囲内であることは理解されたい。上記のより小さいフラグメントは、化学合成によって容易に調製することができ、上述および実施例の章に詳述されているようにアッセイにおいて使用されるためのそれらの能力について試験されることができる。
【０１４１】
本発明は、以下のものを含む、ＨＣＶ疾患のモニタリングまたはＨＣＶ感染を受けた患者の処理に対する（たとえばインターフェロンに対する）応答の予後のためのキットにも関する：
−  少なくとも１つのＥ１タンパク質またはＥ１ペプチド、より具体的には上記で定義されたＥ１タンパク質またはＥ１ペプチド、
−  生物学的試料中に存在する抗Ｅ１抗体とこれらのタンパク質またはペプチドとの間の結合反応を可能にする緩衝液を作製するために必要な成分または緩衝液、
−  先の結合反応において形成された免疫複合体を検出する手段、
−  おそらくは、さらに、処理の進行の間の抗Ｅ１タイターの低減を推測するための自動化スキャンニングおよび解釈装置。
【０１４２】
本発明にしたがったＥ２タンパク質およびペプチドも、Ｅ１タンパク質またはペプチドについて上に示したようなＨＣＶ処理のモニタリング／予後のためにある程度使用され得ることは理解されたい。これは、抗Ｅ２レベルもまた、他のＨＣＶ抗原に対する抗体と比較して低減するためである。しかし、ＨＣＶ疾患のモニタリング／予後についての試験における使用について好適なＥ２領域内のある種のエピトープを決定することも可能であろうことは理解されたい。
【０１４３】
本発明は、少なくとも以下の工程を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶの１または２以上の血清学的タイプを検出するための、より具体的には１つのアッセイフォーマットにおいて一緒にされた検出されるべきＨＣＶの異なるタイプの抗体を検出するための、セロタイプアッセイにも関する：
（ｉ）１または２以上の血清学的タイプのＨＣＶ抗体の存在について分析すべき生物学的試料を、上で定義された少なくとも１つのＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質組成物または少なくとも１つのＥ１またはＥ２ペプチド組成物と、優先的には固定化された形態で免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）非結合成分を除去する工程、
（ｉｉｉ）異種抗体と形成された免疫複合体をインキュベートする工程、ここで上記の異種抗体は適切な条件下で検出可能な標識とコンジュゲート化されている、
（ｉｖ）上記の免疫複合体の存在を視覚的にまたは機械的に（たとえば分光計測、蛍光計測、比色計測によって）検出し、観察された結合パターンから存在する１または２以上のＨＣＶ血清学的タイプの存在を推測する工程。
【０１４４】
この方法において使用されるタンパク質またはペプチドの組成物は、組換えによって発現されたタイプ特異的エンベロープタンパク質またはタイプ特異的ペプチドであることは理解されたい。
【０１４５】
本発明は、さらに、以下のものを含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶの１または２以上の血清学的タイプをセロタイピングするための、より具体的にはこれらの血清学的タイプのＨＣＶに対する抗体を検出するための、キットにも関する：
−  上で定義された、少なくとも１つのＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質またはＥ１もしくはＥ２ペプチド、
−  生物学的試料中に存在する抗Ｅ１抗体とこれらのタンパク質またはペプチドとの間の結合反応を可能にする緩衝液を作製するために必要な成分または緩衝液、
−  先の結合反応において形成された免疫複合体を検出する手段、
−  おそらくは、観察された結合パターンから存在する１または２以上の血清学的タイプの存在を検出するための自動化されたスキャンニングおよび解釈装置。
【０１４６】
本発明は、固体基材上への固定化および逆相ハイブリダイゼーションアッセイ中への取り込みのための、好ましくはメンブレンストリップのような固体支持体上への平行線としての固定化のための、上で定義された方法にしたがったＨＣＶのゲノタイプまたは存在を決定するための、上で定義されたペプチドまたはタンパク質組成物の用途にも関する。他のＨＣＶポリタンパク質領域由来の他のタイプ特異的抗原との組み合わせもまた本発明の範囲内にある。
【０１４７】
本発明は、組換えプロセスによって産生されたＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質から選択される組換えＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状エンベロープタンパク質を精製する方法であって、上記タンパク質をジスルフィド結合切断または還元剤と接触させる工程を含む方法を提供する。本発明の方法の接触工程は、部分的切断または還元条件下で行ってもよい。好ましくは、ジスルフィド結合切断剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）であり、好ましくは０．１〜５０ｍＭ、好ましくは０．１〜２０ｍＭ、より好ましくは０．５〜１０ｍＭの範囲内のものである。あるいは、ジスルフィド結合切断剤は、Ｅｍｐｉｇｅｎ−ＢＢ（これは主成分としてＮ−ドセシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシンを含有する混合物である）のような界面活性剤であってもよく、好ましくは１〜１０％の濃度、より好ましくは３．５％の濃度のものである。界面活性剤、ジスルフィド結合切断剤および／または還元剤の混合物もまた使用することができる。１つの態様においては、ジスルフィド結合再形成は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）またはその誘導体のようなＳＨ基ブロッキング剤で防止される。好ましい態様においては、ジスルフィド結合再形成は、低ｐＨ条件の使用によってブロックされる。
【０１４８】
本発明は、以下の工程をさらに含む、ここで記載された方法を提供する：組換えＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２発現宿主細胞を、場合によってはＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）のようなＳＨブロッキング剤の存在下で、溶解させる工程；レンチルレクチンクロマトグラフィのようなレクチンクロマトグラフィ、または抗Ｅ１および／または抗Ｅ２特異的モノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティ手段のようなアフィニティ精製によって、上記ＨＣＶエンベロープタンパク質を回収する工程；ＤＴＴのようなジスルフィド結合切断剤で、好ましくはＮＥＭまたはビオチン−ＮＥＭのようなＳＨブロッキング剤の存在下で、ジスルフィド結合を還元または切断する工程；およびゲルろ過と、場合によっては付加的に後続のＮｉ−ＩＭＡＣクロマトグラフィおよび脱塩工程とによって、還元されたＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２エンベロープタンパク質を回収する工程。
【０１４９】
本発明は、好ましくはここで記載された方法から単離された、Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２から選択される、実質的に単離されたおよび／または精製された、および／または単離されたおよび／または精製された組換えＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状組換えエンベロープタンパク質を含有する、組成物を提供する。好ましい態様においては、本発明の組換えＨＣＶエンベロープタンパク質は、ワクシニアのような組換え哺乳動物細胞、組換え酵母細胞において発現されたものである。
【０１５０】
本発明は、ベクター配列；原核、真核またはウイルスプロモーター配列；および単一または特異的オリゴマー状Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質の発現を可能にするヌクレオチド配列を、作動可能な組み合わせで含む、組換えベクターを提供する。１つの態様においては、ベクターのヌクレオチド配列は、アミノ酸位置１〜１９２の間の領域で始まってアミノ酸位置２５０〜４００の間の領域で終わる、より具体的には位置２５０〜３４１の間の領域で終わる、さらに好ましくは位置２９０〜３４１の間の領域で終わる、単一ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質をコードする。別の態様においては、ベクターのヌクレオチド配列は、アミノ酸位置１１７〜１９２の間の領域で始まってアミノ酸位置２６３〜４００の間の領域で終わる、より具体的には位置２５０〜３２６の間の領域で終わる、単一ＨＣＶ  Ｅ１タンパク質をコードする。さらに別の態様においては、ベクターのヌクレオチド配列は、位置２６４〜２９３プラスまたはマイナス８アミノ酸の間の最初の疎水性ドメインの欠失を有する単一のＨＣＶ  Ｅ１タンパク質をコードする。さらなる態様においては、ベクターのヌクレオチド配列は、アミノ酸位置２９０〜４０６の間の領域で始まり、アミノ酸位置６００〜８２０の間の領域で終わる、より具体的には位置３２２〜４０６の間の領域で始まり、さらにより好ましくは位置３４７〜４０６の間の領域で始まり、もっとも好ましくは位置３６４〜４０６の間の領域で始まり；かつ好ましくはアミノ酸位置６２３，６５０，６６１，６７３，７１０，７１５，７２０，７４６または８０９のいずれかで終わる、単一ＨＣＶ  Ｅ２タンパク質をコードする。本発明のベクターは、１つの態様においては、ヌクレオチド配列に作動可能に連結された５′末端ＡＴＧコドンおよび３′末端終止コドンを含む。ベクターは、１つの態様においては、さらに、Ｘａ因子切断部位に、および／またはコード領域の３′末端に付加された３〜１０、好ましくは６個のヒスチジンコドンをさらに含むヌクレオチド配列を含む。本発明のベクターは、場合によっては、Ｅ１またはＥ２タンパク質中に存在するグリコシル化部位の少なくとも１つが核酸レベルで除去されているヌクレオチド配列を含む。
【０１５１】
本発明は、配列番号３，５，７，９，１１，１３，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７および４９、またはそれらの部分のいずれかを含む核酸を提供する。本発明のベクターは、好ましくは配列番号３，５，７，９，１１，１３，２１，２３，２５，２７，２９，３１，３５，３７，３９，４１，４３，４５，４７および４９、またはそれらの部分のいずれかを含有する核酸を含むヌクレオチド配列を含んでいることができる。
【０１５２】
本発明の組成物は、ここで記載されたベクターの発現生成物である、または発現された、組換えＨＣＶエンベロープタンパク質をさらに含む。
【０１５３】
本発明は、ベクターが、ここで記載されたＨＣＶ  Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、宿主細胞において作動可能でありＨＣＶ  Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質の発現を調節することができる調節配列に加えて含む、ここで記載された少なくとも１つの組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、本発明の宿主細胞によって発現された組換えＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質を提供する。
【０１５４】
本発明は、ここで記載され、以下の工程を含む方法をさらに提供する：ここで記載された組換えベクターで形質転換されたここで記載された宿主細胞を、好適な培地中で生育させる工程；好適な条件下で、ここで記載されたベクターのベクターヌクレオチド配列の発現を引き起こす工程；形質転換された細胞を、好ましくはＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）のようなＳＨ基ブロッキング剤の存在下で、溶解させる工程；たとえばレクチンクロマトグラフィ（上記レクチンクロマトグラフィは好ましくはレンチルレクチンである）、または抗Ｅ１および／または抗Ｅ２特異的モノクローナル抗体を用いるイムノアフィニティクロマトグラフィのようなアフィニティ精製と、続いての、好ましくはこれもＮＥＭまたはビオチン−ＮＥＭのようなＳＨ基ブロッキング剤の存在下での、先の工程の溶出液の、ＤＴＴのようなジスルフィド結合切断剤とのインキュベーションとによって、ＨＣＶエンベロープタンパク質を回収する工程；およびＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状Ｅ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質を、ゲルろ過によって、おそらくは付加的なＮｉ２＋−ＩＭＡＣクロマトグラフィおよび脱塩工程の手段にもよって、単離する工程。
【０１５５】
本発明は、以下のＥ１および／またはＥ２ペプチドの少なくとも１つを含む組成物を提供する：
コア／Ｅ１  Ｖ１領域のアミノ酸１８１〜２００にわたるＥ１−３１（配列番号５６）、
Ｅ１領域のアミノ酸１９３〜２１２にわたるＥ１−３３（配列番号５７）、
Ｅ１  Ｖ２領域のアミノ酸２０５〜２２４にわたるＥ１−３５（配列番号５８）（エピトープＢ）、
Ｅ１  Ｖ２領域のアミノ酸２０８〜２２７にわたるＥ１−３５Ａ（配列番号５９）（エピトープＢ）、
Ｅ１領域のアミノ酸１９２〜２２８にわたる１ｂＥ１（配列番号５３）（Ｖ１、Ｃ１、およびＶ２領域（エピトープＢを含む））、
Ｅ１領域のアミノ酸３０１〜３２０にわたるＥ１−５１（配列番号６６）、
Ｅ１  Ｃ４領域のアミノ酸３１３〜３３２にわたるＥ１−５３（配列番号６７）（エピトープＡ）、
Ｅ１領域のアミノ酸３２５〜３４４にわたるＥ１−５５（配列番号６８）、
Ｅ２領域のアミノ酸位置３９７〜４１８にわたるＥｎｖ６７またはＥ２−６７（配列番号７２）（エピトープＡ）、
Ｅ２領域のアミノ酸位置４０９〜４２８にわたるＥｎｖ６９またはＥ２−６９（配列番号７３）（エピトープＡ）、
Ｅ２領域の位置５８３〜６０２にわたるＥｎｖ２３またはＥ２−２３（配列番号８６）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置５９５〜６１４にわたるＥｎｖ２５またはＥ２−２５（配列番号８７）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置６０７〜６２６にわたるＥｎｖ２７またはＥ２−２７（配列番号８８）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置５４７〜５６６にわたるＥｎｖ１７ＢまたはＥ２−１７Ｂ（配列番号８３）（エピトープＤ）、
Ｅ２領域の位置５２３〜５４２にわたるＥｎｖ１３ＢまたはＥ２−１３Ｂ（配列番号８２）（エピトープＣ）。
【０１５６】
本発明は、以下のＥ２コンフォメーショナルエピトープの少なくとも１つを含む組成物を提供する：
モノクローナル抗体１５Ｃ８Ｃ１，１２Ｄ１１Ｆ１，および８Ｇ１０Ｄ１Ｈ９によって認識されるエピトープＦ、
モノクローナル抗体９Ｇ３Ｅ６によって認識されるエピトープＧ，
モノクローナル抗体１０Ｄ３Ｃ４および４Ｈ６Ｂ２によって認識されるエピトープＨ（またはＣ）、
モノクローナル抗体１７Ｆ２Ｃ２によって認識されるエピトープＩ。
【０１５７】
本発明は、ここで記載された組成物で免疫した際に生成されるＥ１および／またはＥ２特異的モノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、たとえば医薬剤として、ＨＣＶ  Ｅ１またはＥ２抗原の存在を検出するためのイムノアッセイキットへの取り込み用、疾患の予後／モニタリング用またはＨＣＶ治療用に、使用することができる。本発明は、ＨＣＶ  Ｅ１またはＥ２抗原を検出するためのイムノアッセイキットの製造用、ＨＣＶ疾患の予後／モニタリングのためのキットの製造用、またはＨＣＶ医薬剤の製造用の、ここで記載されたＥ１および／またはＥ２特異的モノクローナル抗体の用途を提供する。
【０１５８】
本発明は、少なくとも以下の工程を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原のインビトロ診断の方法を提供する：
（ｉ）上記生物学的試料を、ここで記載されたＥ１および／またはＥ２特異的モノクローナル抗体と、好ましくは固定化された形態で免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）非結合成分を除去する工程、
（ｉｉｉ）異種抗体と形成された免疫複合体をインキュベートする工程、ここで異種抗体は適切な条件下で検出可能な標識とコンジュゲート化されている、
（ｉｖ）免疫複合体の存在を、視覚的にまたは機械的に検出する工程。
【０１５９】
本発明は、少なくとも以下のものを含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原の存在を決定するためのキットを提供する：好ましくは固体基材上に固定化された形態の、少なくとも１つのここで記載されたＥ１および／またはＥ２特異的モノクローナル抗体、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原とこれらの抗体との間の結合反応を可能にする緩衝液を作製するのに必要な成分または緩衝液、および場合によっては先の結合反応において形成された免疫複合体を検出するための手段。
【０１６０】
本発明の組成物は、薬物の形態で提供してもよい。
本発明は、上記組成物の有効量を、場合により薬学的に許容可能なアジュバントとともに投与して免疫応答を生じさせる工程を含む、ＨＣＶに対して哺乳動物、好ましくはヒトを免疫するためのワクチンとしての使用のための、ここで記載された組成物を提供する。
【０１６１】
本発明は、上記組成物の有効量を、場合により薬学的に許容可能なアジュバントとともに投与して免疫応答を生じさせる工程を含む、ＨＣＶに対して哺乳動物、好ましくはヒトを免疫するためのワクチンの製造のため、ここで記載された組成物を使用する方法を提供する。
【０１６２】
本発明は、ここで記載されたＥ１および／またはＥ２含有組成物を含む組成物の有効量を、場合により薬学的に許容可能なアジュバントとともに、含む、ＨＣＶに対して哺乳動物、好ましくはヒトを免疫するためのワクチン組成物を提供する。
【０１６３】
本発明の組成物は、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体のインビトロ検出のための形態で提供されることができる。本発明は、生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗原を検出するためのイムノアッセイキットを製造する方法、および生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体を診断するための、本発明のキットを用いて生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体を検出する方法をも提供する。本発明のこのような方法は、少なくとも以下の工程を含む：
（ｉ）上記生物学的試料を、ここで記載された組成物と、好ましくは固定化された形態で生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体との免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で接触させる工程、
（ｉｉ）非結合成分を除去する工程、
（ｉｉｉ）形成された免疫複合体を、適切な条件下で検出可能な標識とコンジュゲート化された異種抗体とインキュベートする工程、
（ｉｖ）免疫複合体の存在を、視覚的にまたは機械的に検出する工程。
本発明は、以下のものを含む、生物学的試料中のＨＣＶ抗体の存在を決定するためのキットを提供する：好ましくは固体基材上に固定化された形態の、少なくとも１つのここで記載されたペプチドまたはタンパク質組成物；生物学的試料中に存在するＨＣＶ抗体とこれらのペプチドまたはタンパク質との間の結合反応を可能にする緩衝液を作製するのに必要な成分または緩衝液；および、場合によっては先の結合反応において形成された免疫複合体を検出するための手段。
【０１６４】
本発明は、ＨＣＶ疾患のインビトロモニタリングまたは処理（好ましくはインターフェロンでの）に対するＨＣＶ感染を受けた患者の応答の診断の方法を提供し、この方法は以下の工程を含む：ＨＣＶ感染を受けた患者由来の生物学的試料を、免疫学的複合体の形成を可能にする条件下でＥ１タンパク質またはその好適な部分とインキュベートする工程；非結合成分を除去する工程；処理の開始時および処理の経過中に試料中に存在する抗Ｅ１タイターを算出する工程；処理の開始時および／または処理の経過中に試料中に見出された抗Ｅ１タイター量に基づいて、ＨＣＶ疾患の自然の経過をモニタリングする工程または処理に対する患者の応答を診断する工程。
【０１６５】
本発明は、ＨＣＶ感染を受けた患者の、処理、特にインターフェロンでの処理に対する応答の予後診断またはＨＣＶ疾患のモニタリングのためのキットを提供し、このキットは以下のものを含む：少なくとも１つのＥ１タンパク質またはＥ１ペプチド、より具体的にはここで記載されたＥ１タンパク質またはＥ１ペプチド；生物学的試料中に存在する抗Ｅ１抗体とこれらのタンパク質またはペプチドとの間の結合反応を可能にする緩衝液または緩衝液を作製するのに必要な成分；および、場合によっては先の結合反応において形成された免疫複合体を検出する手段、および場合によってはさらに処理の進行中の抗Ｅ１タイターの低減を推測するための自動化されたスキャンニングおよび解釈装置。
【０１６６】
本発明は、少なくとも以下の工程を含む、生物学的試料中に存在するＨＣＶの１または２以上の血清学的タイプを検出するための、より具体的には１つのアッセイフォーマットに一緒にされた検出されるべきＨＣＶの異なるタイプの抗体を検出するための、セロタイピングアッセイを提供する：（ｉ）１または２以上の血清学的タイプのＨＣＶ抗体の存在について分析されるべき生物学的試料を、ここで記載された少なくとも１つのＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質組成物またはここで記載された少なくとも１つのＥ１またはＥ２ペプチド組成物と、優先的には固定化された形態で免疫複合体の形成を可能にする適切な条件下で接触させる工程；（ｉｉ）非結合成分を除去する工程；（ｉｉｉ）形成された免疫複合体を、異種抗体とインキュベートする工程、ここで異種抗体は適切な条件下で検出可能な標識とコンジュゲート化されている；および、場合によっては、（ｉｖ）上記免疫複合体の存在を視覚的にまたは機械的に検出する工程（たとえば分光計測、蛍光計測、比色計測）および観察された結合パターンから存在する１または２以上のＨＣＶ血清学的タイプの存在を推測する工程。
【０１６７】
本発明は、以下のものを含む、生物学的試料中に存在する１または２以上の血清学的タイプのＨＣＶのセロタイピングのための、より具体的にはこれらの血清学的タイプのＨＣＶに対する抗体を検出するための、キットを提供する：ここで記載された少なくとも１つのＥ１および／またはＥ２および／またはＥ１／Ｅ２タンパク質またはここで記載されたＥ１またはＥ２ペプチド；生物学的試料中に存在する抗Ｅ１抗体とこれらのタンパク質またはペプチドとの間の結合反応を可能にする緩衝液または緩衝液を作製するのに必要な成分；場合によっては先の結合反応において形成された免疫複合体を検出する手段、および場合によってはさらに観察された結合パターンから存在する１または２以上の血清学的タイプを検出するための自動化されたスキャンニングおよび解釈装置。
【０１６８】
本発明は、固体基材上への固定化および逆相ハイブリダイゼーションアッセイへの取り込みのための、好ましくはメンブレンストリップのような固体支持体上への平行な線としての固定化のための、ここで記載された方法にしたがったＨＣＶのゲノタイプまたは存在を決定するための、ここで記載されたペプチドまたはタンパク質組成物を提供する。
【０１６９】
本発明は、治療的有効量の、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つの精製組換えＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状組換えエンベロープタンパク質；および場合により薬学的に許容可能なアジュバントを含む組成物、を含む治療用ワクチン組成物を提供する。本発明のワクチンのＨＣＶエンベロープタンパク質は、場合によっては組換え哺乳動物細胞または組換え酵母細胞によって産生される。本発明は、以下のＥ１およびＥ２ペプチドの少なくとも１つを含む治療的有効量の組成物を含む治療ワクチン組成物を提供する：
コア／Ｅ１  Ｖ１領域のアミノ酸１８１〜２００にわたるＥ１−３１（配列番号５６）、
Ｅ１領域のアミノ酸１９３〜２１２にわたるＥ１−３３（配列番号５７）、
Ｅ１  Ｖ２領域のアミノ酸２０５〜２２４にわたるＥ１−３５（配列番号５８）（エピトープＢ）、
Ｅ１  Ｖ２領域のアミノ酸２０８〜２２７にわたるＥ１−３５Ａ（配列番号５９）（エピトープＢ）、
Ｅ１領域Ｖ１、Ｃ１、およびＶ２領域のアミノ酸１９２〜２２８にわたる１ｂＥ１（配列番号５３）（エピトープＢを含む）、
Ｅ１領域のアミノ酸３０１〜３２０にわたるＥ１−５１（配列番号６６）、
Ｅ１  Ｃ４領域のアミノ酸３１３〜３３２にわたるＥ１−５３（配列番号６７）（エピトープＡ）、
Ｅ１領域のアミノ酸３２５〜３４４にわたるＥ１−５５（配列番号６８）、
Ｅ２領域のアミノ酸位置３９７〜４１８にわたるＥｎｖ６７またはＥ２−６７（配列番号７２）（エピトープＡ）、
Ｅ２領域のアミノ酸位置４０９〜４２８にわたるＥｎｖ６９またはＥ２−６９（配列番号７３）（エピトープＡ）、
Ｅ２領域の位置５８３〜６０２にわたるＥｎｖ２３またはＥ２−２３（配列番号８６）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置５９５〜６１４にわたるＥｎｖ２５またはＥ２−２５（配列番号８７）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置６０７〜６２６にわたるＥｎｖ２７またはＥ２−２７（配列番号８８）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置５４７〜５８６にわたるＥｎｖ１７８またはＥ２−１７８（配列番号８３）（エピトープＤ）、および
Ｅ２領域の位置５２３〜５４２にわたるＥｎｖ１３ＢまたはＥ２−１３Ｂ（配列番号８２）（エピトープＣ）。
【０１７０】
本発明は、上述のワクチンのような、ここで記載された組成物の有効量を、場合によっては医薬的に許容されうるアジュバントとともに、投与する工程を含む、ＨＣＶに感染した、ヒトのような哺乳動物を処置する方法を提供する。１つの態様においては、本発明の組成物は、抗ウイルス治療と組み合わせて、またはそれの際に、本発明の組成物の投与の少し前、その後、またはそれとともに、投与される。
【０１７１】
本発明は、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つの精製組換えＨＣＶ組換えエンベロープタンパク質、および場合によってはアジュバント、を含む組成物を提供する。好ましい態様においては、この組成物は、以下のＥ１およびＥ２ペプチドの少なくとも１つを含む：
コア／Ｅ１  Ｖ１領域のアミノ酸１８１〜２００にわたるＥ１−３１（配列番号５６）、
Ｅ１領域のアミノ酸１９３〜２１２にわたるＥ１−３３（配列番号５７）、
Ｅ１  Ｖ２領域のアミノ酸２０５〜２２４にわたるＥ１−３５（配列番号５８）（エピトープＢ）、
Ｅ１  Ｖ２領域のアミノ酸２０８〜２２７にわたるＥ１−３５Ａ（配列番号５９）（エピトープＢ）、
Ｅ１領域Ｖ１、Ｃ１、およびＶ２領域のアミノ酸１９２〜２２８にわたる１ｂＥ１（配列番号５３）（エピトープＢを含む）、
Ｅ１領域のアミノ酸３０１〜３２０にわたるＥ１−５１（配列番号６６）、
Ｅ１  Ｃ４領域のアミノ酸３１３〜３３２にわたるＥ１−５３（配列番号６７）（エピトープＡ）、
Ｅ１領域のアミノ酸３２５〜３４４にわたるＥ１−５５（配列番号６８）、
Ｅ２領域のアミノ酸位置３９７〜４１８にわたるＥｎｖ６７またはＥ２−６７（配列番号７２）（エピトープＡ）、
Ｅ２領域のアミノ酸位置４０９〜４２８にわたるＥｎｖ６９またはＥ２−６９（配列番号７３）（エピトープＡ）、
Ｅ２領域の位置５８３〜６０２にわたるＥｎｖ２３またはＥ２−２３（配列番号８６）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置５９５〜６１４にわたるＥｎｖ２５またはＥ２−２５（配列番号８７）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置６０７〜６２６にわたるＥｎｖ２７またはＥ２−２７（配列番号８８）（エピトープＥ）、
Ｅ２領域の位置５４７〜５８６にわたるＥｎｖ１７８またはＥ２−１７８（配列番号８３）（エピトープＤ）、
Ｅ２領域の位置５２３〜５４２にわたるＥｎｖ１３ＢまたはＥ２−１３Ｂ（配列番号８２）（エピトープＣ）。
【０１７２】
本発明は、精製ＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状組換えＥ１またはＥ２タンパク質から形成されたＥ１／Ｅ２複合体；および場合により薬学的に許容可能なアジュバントを含む治療的有効量の組成物を含む、ＨＣＶ特異的抗体を誘導するための治療組成物を提供する。本発明の組換えＨＣＶエンベロープタンパク質は、組換え哺乳動物細胞によって生産されてもよく、あるいは、組換えエンベロープタンパク質は組換え酵母細胞によって生産される。本発明は、ここで記載された有効量の組成物および場合により薬学的に許容可能なアジュバントを投与する工程を含む、ＨＣＶ感染したヒトのような哺乳動物を処置する方法を提供する。本発明は、Ｅ１タンパク質およびＥ２タンパク質の群から選択される少なくとも１つの精製組換えＨＣＶ単一または特異的オリゴマー状エンベロープタンパク質；および場合により薬学的に許容可能なアジュバントを含む治療的有効量の組成物を含むＨＣＶ特異的抗体を誘導するための治療組成物を提供する。
【０１７３】
【実施例】
実施例１：Ｃ型肝炎ウイルスＥ１タンパク質のクローニングおよび発現
１．ワクシニアウイルス組換えベクターの構築
ｐｇｐｔＡＴＡ１８ワクシニア組換え用プラスミドは、ワクシニアウイルス１３中間プロモーターの制御下にＥ． ｃｏｌｉキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含む付加的な挿入を有するｐＡＴＡ１８の改変されたバージョン（Ｓｔｕｎｎｅｎｂｅｒｇら、１９８８）である（図１）。プラスミドｐｇｓＡＴＡ１８は、ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＡＴＡ１８ベクター中に、３つのリーディングフレーム中に終止コドンを含む配列番号１／９４のオリゴヌクレオチドリンカーを挿入することによって構築した。これは、余分のＰａｃＩ制限部位を生じさせた（図２）。もとのＨｉｎｄＩＩＩ部位は復旧しなかった。
配列番号１／９４を有するオリゴヌクレオチドリンカー：
【０１７４】
【表１】
2004525885.tif 000002
【０１７５】
組換えタンパク質に融合した操作されたヒスチジンストレッチのＮｉ２＋キレート化による迅速で効率的な精製を容易にするために、付加的なカルボキシ末端ヒスチジンタグを有する分泌タンパク質を発現するようにワクシニア組換え用ベクターｐＭＳ６６を設計した。平滑末端を生成する３つの制限酵素（ＳｍａＩ、ＳｔｕＩ、およびＰｍｌＩ／ＢｂｒＰＩ）のためのユニーク部位を含む配列番号２／９５を有するオリゴヌクレオチドリンカーは、任意のｃＤＮＡのカルボキシ末端を、プロテアーゼＸａ因子切断部位をコードする配列およびそれに続く６つのヒスチジンおよび２つの終止コドンをコードするヌクレオチド配列とフレームを合わせて挿入し得るように合成した（新規のＰａｃＩ部位もまた３′末端の下流に生成された）。配列番号２／９５を有するこのオリゴヌクレオチドを、ｐｇｐｔＡＴＡ１８のＸｍａＩおよびＰｓｔＩ部位の間に導入した（図３）。
配列番号２／９５を有するオリゴヌクレオチドリンカー：
【０１７６】
【表２】
2004525885.tif 000003
【０１７７】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ  ＭＣ１０６１（ラムダ）内に含まれるプラスミドｐｇｐｔＡＴＡ−１８は、ブダペスト条約の規定の下でＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ（Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ ｖｏｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ − Ｐｌａｓｍｉｄｅｎｃｏｌｌｅｃｔｉｅ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ Ｇｅｎｔ， Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ ３５， Ｂ−９０００ Ｇｈｅｎｔ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）に寄託されており、受託番号ＬＭＢＰ４４８６を有する。この寄託は、２００２年１月９日になされた。
【０１７８】
実施例２．ＨＣＶ組換えプラスミドの構築
２．１  Ｅ１タンパク質の異なる形態をコードする構築物
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物は、ＲＮＡ調製およびその後の逆転写およびＰＣＲによって、以前記載されたとおりに（Ｓｔｕｙｖｅｒら、１９９３ｂ）血清試料から派生させた。表１は、それぞれのクローンおよび増幅に用いたプライマーの特徴を示す。ＰＣＲフラグメントは、ＳｍａＩ切断ｐＳＰ７２（Ｐｒｏｍｅｇａ）プラスミド中にクローニングした。図２１に示したように、以下のクローンを、ワクシニア組換えベクター中への挿入のために選択した：ＨＣＣｌ９Ａ（配列番号３）、ＨＣＣｌ１０Ａ（配列番号５）、ＨＣＣｌ１１Ａ（配列番号７）、ＨＣＣｌ１２Ａ（配列番号９）、ＨＣＣｌ１３Ａ（配列番号１１）、およびＨＣＣｌ１７Ａ（配列番号１３）。Ｅ１コード領域を含むｃＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限によってそれぞれのｐＳＰ７２プラスミドから切断し、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐｇｐｔＡＴＡ−１８ワクシニア組換えベクター（実施例１に記載したもの）中に、１１Ｋワクシニア後期プロモーターの下流に挿入した。それぞれのプラスミドを、ｐｖＨＣＶ−９Ａ、ｐｖＨＣＶ−１０Ａ，ｐｖＨＣＶ−１１Ａ，ｐｖＨＣＶ−１２Ａ，ｐｖＨＣＶ−１３ＡおよびｐｖＨＣＶ−１７Ａと名付けた。このうち、ｐｖＨＣＶ−１１Ａを図４に示す。
【０１７９】
２．２  疎水性領域Ｅ１欠失突然変異体
コドンＡｓｐ２６４〜Ｖａｌ２８７（ヌクレオチド７９０〜８６１、疎水性ドメインＩをコードする領域）の欠失を有するクローンＨＣＣｌ３７を、以下のようにして作製した：２つのＰＣＲフラグメントを、クローンＨＣＣｌ１０ＡからプライマーセットＨＣＰｒ５２（配列番号１６）／ＨＣＰｒ１０７（配列番号１９）およびＨＣＰｒ１０８（配列番号２０）／ＨＣＰＲ５４（配列番号１８）を用いて生成した。これらのプライマーを図２１に示す。これらの２つのＰＣＲフラグメントを、電気泳動後にアガロースゲルから精製し、１ｎｇの各フラグメントを、プライマーＨＣＰｒ５２（配列番号１６）およびＨＣＰｒ５４（配列番号１８）によるＰＣＲのための鋳型として一緒に使用した。得られたフラグメントを、ＳｍａＩ切断ｐＳＰ７２ベクター中にクローニングし、欠失を有するクローンを２４コドン（７２塩基対）の欠失によって容易に同定した。クローンＨＣＣｌ３７（配列番号１５）を含むプラスミドｐＳＰ７２ＨＣＣｌ３７を選択した。疎水性ドメインＩを欠く全長Ｅ１  ｃＤＮＡを含む組換えワクシニアプラスミドを、ワクシニアプラスミドｐｖＨＣＶ−１０ＡのＸｍａＩ−ＢａｍＨＩ部位中に、欠失を取り囲むＨＣＶ配列（ＸｍａＩおよびＢａｍＨＩによってベクターｐＳＰ７２−ＨＣＣｌ３７から切断されたフラグメント）を挿入することによって構築した。得られたプラスミドをｐｖＨＣＶ−３７と名付けた。確認的配列決定の後、内部欠失を含むアミノ末端領域をこのベクターｐｖＨＣＶ−３７から単離し（ＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＥＩＩによる切断）、ＥｃｏＲＩおよびＢｓｔＥＩＩ切断ｐｖＨＣＶ−１１Ａプラスミド中に再挿入した。この構築体は、両方の疎水性ドメインが欠失したＥ１タンパク質を発現すると期待され、ｐｖＨＣＶ−３８と名付けられた。クローンＨＣＣｌ３８のＥ１コード領域を、配列番号２３に示す。
Ｅ１カルボキシ末端の疎水性領域（理論的にアミノ酸３３７〜３４０付近に広がる）は構築体ｐｖＨＣＶ−３８中に完全には包含されていなかったので、疎水性ドメインＩを欠くより大きいＥ１領域をｐｖＨＣＶ−３７プラスミドからＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断によって単離し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断ｐｇｓＡＴＡ−１８ベクター中にクローニングした。得られたプラスミドはｐｖＨＣＶ−３９と名付けられ、クローンＨＣＣｌ３９（配列番号２５）を含んでいた。同じフラグメントをｐｖＨＣＶ−３７ベクターからＢａｍＨＩで切断し（その粘着末端はクレノウＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で充填した）、続いてＥｃｏＲＩ（５′粘着末端）によって切断した。この配列を、ＥｃｏＲＩおよびＢｂｒＰＩで切断したベクターｐＭＳ−６６中に挿入した。これにより、そのカルボキシ末端に６ヒスチジンテールを含む、プラスミドｐｖＨＣＶ−４０中のクローンＨＣＣｌ４０（配列番号２７）が得られた。
【０１８０】
２．３  他のゲノタイプのＥ１
クローンＨＣＣｌ６２（配列番号２９）は慢性Ｃ型肝炎を有するタイプ３ａ感染患者（ＷＯ９４／２５６０１における血清ＢＲ３６，クローンＢＲ３６−９−１３，配列番号１９；Ｓｔｕｙｖｅｒら、１９９３ａも参照されたい）から由来し、ＨＣＣｌ６３（配列番号３１）は輸血後肝炎を有するタイプ５ａに感染した子供（ＷＯ９４／２５６０１における血清ＢＥ９５、クローンＰＣ−４−１、配列番号４５）から由来した。
【０１８１】
２．４  Ｅ２構築体
ＨＣＶ  Ｅ２ＰＣＲフラグメント２２を、血清ＢＥ１１（ゲノタイプ１ｂ）からＳｔｕｙｖｅｒら（１９９３ｂ）に記載されているようにＲＮＡ調製、逆転写およびＰＣＲの技術を用いてＨＣＰｒ１０９（配列番号３３）およびＨＣＰｒ７２（配列番号３４）のプライマーによって入手し、フラグメントをＳｍａＩ切断ｐＳＰ７２ベクター中にクローニングした。クローンＨＣＣｌ２２Ａ（配列番号３５）をＮｃｏＩ／ＡｌｗＮＩまたはＢａｍＨＩ／ＡｌｗＮＩで切断し、フラグメントの粘着末端を平滑化した（クレノウＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）でＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ部位、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）でＡｌｗＮＩ）。次に、ＢａｍＨＩ／ＡｌｗＮＩ  ｃＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ切断によって線状化し粘着末端をクレノウＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）で充填したワクシニアｐｇｓＡＴＡ−１８ベクター中に挿入した。得られたプラスミドはｐｖＨＣＶ−４１と名付けられ、シグナル配列として役立つＥ１タンパク質の（Ｍｅｔ３４７〜Ｇｌｎ３８３の）３７アミノ酸を含む、アミノ酸Ｍｅｔ３４７〜Ｇｌｎ６７３の領域をコードしていた。同じＨＣＶ  ｃＤＮＡを、後にクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑化されたＥｃｏＲＩおよびＢｂｒＰＩ切断ベクターｐＭＳ６６中に挿入した。得られたプラスミドは、ｐｖＨＣＶ−４２と名付けられ、これもアミノ酸３４７〜６８３をコードしていた。ＮｃｏＩ／ＡｌｗＮＩフラグメントを、同様にしてｐｇｓＡＴＡ−１８（ｐｖＨＣＶ−４３）またはｐＭＳ−６６ワクシニアベクター（ｐｖＨＣＶ−４４）の同じ部位に挿入した。ｐｖＨＣＶ−４３およびｐｖＨＣＶ−４４は、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３６４〜６７３をコードしており、そのうちアミノ酸３６４〜３８３は、Ｅ２のためのシグナル配列をコードするＥ１タンパク質の天然カルボキシ末端領域から、そしてアミノ酸３８４〜６７３は成熟Ｅ２タンパク質から由来していた。
【０１８２】
２．５  組換えＨＣＶ−ワクシニアウイルスの作製
ウサギ腎ＲＫ１３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３７）、ヒト骨肉腫１４３Ｂチミジンキナーゼ欠損（ＴＫ−）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８３０３）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、およびＨｅｐ  Ｇ２（ＡＴＣＣ  ＨＢ８０６５）細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）から入手した。これらの細胞を、１０％ウシ胎児血清と、ＲＫ１３および１４３Ｂ（ＴＫ−）についてはＥａｒｌｅの塩類（ＥＭＥＭ）、Ｈｅｐ  Ｇ２についてはグルコース（４ｇ／ｌ）とを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で生育させた。ワクシニアウイルスＷＲ株（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ， ＡＴＣＣ  ＶＲ１１９）を、１４３ＢまたはＲＫ１３細胞のいずれかにおいて、以前記載されたようにルーチンに増殖させた（Ｐａｎｉｃａｌｉ＆Ｐａｏｌｅｔｔｉ，１９８２；Ｐｉｃｃｉｎｉら、１９８７；Ｍａｃｋｅｔｔら、１９８２，１９８４、および１９８６）。１４３Ｂ細胞のコンフルエント単層培養を、０．１の感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）で（すなわち０．１プラーク形成単位（ＰＦＵ）／細胞）野生型ワクシニアウイルスに感染させた。２時間後、ワクシニア組換えプラスミドを、５００ｎｇのプラスミドＤＮＡを含むリン酸カルシウム共沈殿の形態で感染細胞にトランスフェクションし、相同組換えを起こさせた（Ｇｒａｈａｍ＆ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、１９７３；Ｍａｃｋｅｔｔら、１９８５）。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）タンパク質を発現する組換えウイルスを、選択培地（２５μｇ／ｍｌ  ミコフェノール酸（ＭＰＡ）、２５０μｇ／ｍｌキサンチン、および１５μｇ／ｍｌヒポキサンチンを含有するＥＭＥＭ；Ｆａｌｋｎｅｒ＆Ｍｏｓｓ，１９８８；Ｊａｎｋｎｅｃｈｔら、１９９１）中でインキュベートされたウサギ腎ＲＫ１３細胞上で選択した。単独の組換えウイルスを、選択培地中０．９％アガロース重層下のＲＫ１３細胞の新鮮単層培養上で精製した。チミジンキナーゼ欠損（ＴＫ−）組換えウイルスは、２５μｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−２′−デオキシウリジンの存在下でヒト１４３Ｂ細胞（ＴＫ−）の新鮮単層培養上で選択し、プラーク精製した。精製組換えＨＣＶ−ワクシニアウイルスのストックは、ヒト１４３ＢまたはウサギＲＫ１３細胞のいずれかを０．０５のｍ．ｏ．ｉ．で感染させることによって調製した（Ｍａｃｋｅｔｔら、１９８８）。組換えワクシニアウイルス中へのＨＣＶ  ｃＤＮＡフラグメントの挿入は、それぞれのＨＣＶフラグメントをクローニングするために使用したプライマーを用いるＰＣＲによってＭＰＡ選択後の細胞ライセートのアリコート（５０μｌ）で確認した（表１を参照されたい）。組換えワクシニア−ＨＣＶウイルスは、ワクシニア組換え用プラスミド番号にしたがって名付け、たとえば組換えワクシニアウイルスｖｖＨＣＶ−１０Ａは野生型ＷＲ株のｐｖＨＣＶ−１０Ａプラスミドとの組換えに由来していた。
【０１８３】
実施例３：組換えワクシニアウイルスによる細胞の感染
ＲＫ１３細胞のコンフルエント単層培養を、３のｍ．ｏ．ｉ．で組換えＨＣＶ−ワクシニアウイルスに、実施例２に記載したように感染させた。感染のためには、細胞単層培養をリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）で２回洗浄し、組換えワクシニアウイルスストックをＭＥＭ培地中で希釈した。１０６細胞当りウイルス溶液２００μｌを、ｍ．ｏ．ｉ．が３になるように添加し、２４℃で４５分間インキュベートした。ウイルス溶液を吸引除去し、１０６細胞当り２ｍｌの完全生育培地（実施例２を参照）を添加した。細胞を３７℃で２４時間インキュベートし、その間にＨＣＶタンパク質の発現が起こった。
【０１８４】
実施例４：ウェスタンブロットによる組換えタンパク質の分析
感染細胞をＰＢＳで２回洗浄し、溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００， ５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１μｇ／ｍｌアプロチニン（Ｓｉｇｍａ、Ｂｏｒｎｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）で直接溶解させるか、または５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ中で５分間のインキュベーションによってフラスコからはがし、遠心分離（１０００ｇで５分間）によって集めた。細胞ペレットを、次に１０６細胞当り２００μｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、アプロチニン、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中に再懸濁した。細胞ライセートをエッペンドルフ遠心機中で１４，０００ｒｐｍで５分間清澄化し、不溶性破砕物（デブリス）を除去した。２０μｌライセートのタンパク質を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した。次に、トランスファー緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１９２ｍＭグリシン、２０％（ｖ／ｖ）メタノール）中で１００Ｖ定電圧で２時間、４℃に冷却されたＨｏｅｆｅｒ ＨＳＩトランスファーユニットを用いて、タンパク質を、ゲルからニトロセルロースシート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に電気的にトランスファーした。ニトロセルロースフィルターをＢｌｏｔｔｏ（ＰＢＳ中５％（ｗ／ｖ）無脂肪インスタントミルク粉末；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９８１）でブロッキングし、Ｂｌｏｔｔｏ／０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０ 中で希釈された一次抗体とともにインキュベートした。通常、非特異的結合を減少させるため、ヒト陰性対照血清またはＨＣＶ感染患者血清は、２００倍希釈し、２００倍希釈された野生型ワクシニアウイルス感染細胞ライセートと１時間室温でプレインキュベートした。Ｂｌｏｔｔｏ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ ２０中で洗浄後、ニトロセルロースフィルターをＢｌｏｔｔｏ／０．１％  Ｔｗｅｅｎ ２０中で希釈したアルカリホスファターゼ基質溶液とインキュベートした。ＰＢＳ中０．１％  Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄後、フィルターをアルカリホスファターゼ基質溶液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３８μｇ／ｍｌニトロブルーテトラゾリウム、０．１６５μｇ／ｍｌ  ５−ブロモ−４−クロロ―３−インドリルホスフェート）とインキュベートした。すべての工程は、電気的トランスファーを除き、室温で行った。
【０１８５】
実施例５：組換えＥ１またはＥ２タンパク質の精製
５．１  溶解
感染ＲＫ１３細胞（Ｅ１またはＥ２構築物を担持する）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中でのインキュベーションによって培養容器からはがした。はがれた細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０５細胞当り１ｍｌの溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１μｇ／ｍｌアプロチニン（Ｓｉｇｍａ， Ｂｏｒｎｅｍ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）、２ｍＭビオチン化Ｎ−エチルマレイミド（ビオチン―ＮＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）含有）を４℃で添加した。このライセートを、タイプＢダウンサー（ｄｏｕｎｃｅｒ）でホモジナイズし、室温で０．５時間置いた。１０ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ， Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｂｏｒｎｅｍ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）を含有する別の５倍容量の溶解緩衝液を一次ライセートに添加し、混合物を室温に１５分置いた。不溶性の細胞破砕物を１４，０００ｒｐｍ（ｆｍａｘで３０１００ｇ）で４℃、１時間のＢｅｃｋｍａｎ ＪＡ−１４ローター中での遠心によって溶液から除去した。
【０１８６】
５．２  レクチンクロマトグラフィ
清澄化した細胞ライセートを、１ｍｌ／分の速度で５カラム容量の溶解緩衝液で平衡化しておいた０．８×１０ｃｍのレンチルレクチンＳｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に、１ｍｌ／分の速度で注入した。このレンチルレクチンカラムを、５〜１０カラム容量の緩衝液１（０．１Ｍ  リン酸カリウム、ｐＨ７．３、５００ｍＭ  ＫＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ  ６−ＮＨ２−ヘキサン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、および１％デシルＰＥＧ（ＫＷＡＮＴ， Ｂｅｄｕｍ， Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で洗浄した。いくつかの実験においては、続いてカラムを、１％デシルＰＥＧの代わりに０．５％Ｅｍｐｉｇｅｎ−ＢＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）を含む１０カラム容量の緩衝液１で洗浄した。結合した物質を、溶出緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．３、５％グリセロール、１ｍＭヘキサン酸、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５％Ｅｍｐｉｇｅｎｎ−ＢＢおよび０．５Ｍ  α−メチル−マンノピラノシド）を適用することによって溶出した。溶出した物質を分画し、フラクションを、実施例６に記載するＥＬＩＳＡによってＥ１またはＥ２タンパク質の存在についてスクリーニングした。図２２は、ｗＨＣＶ３９（タイプ１ｂ）、ｗＨＣＶ４０（タイプ１ｂ）、ｗＨＣＶ６２（タイプ３ａ）、およびｗＨＣＶ６３（タイプ５ａ）に感染した細胞ライセートの４つの異なるＥ１精製物のレンチルレクチン溶出液フラクションから得られたＥＬＩＳＡの結果を示す。図２３は、図２２に示す値から得られたプロフィールを示す。これらの結果は、レクチンアフィニティカラムを、異なるタイプのＨＣＶのエンベロープタンパク質について使用し得ることを示す。
【０１８７】
５．３  濃縮および部分的還元
Ｅ１またはＥ２陽性フラクションをプールし、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ３０ ｋＤａ（Ａｍｉｃｏｎ）上でＢｅｃｋｍａｎ ＪＡ−２０ローター中で４℃、５０００ｒｐｍで３時間の遠心によって濃縮した。いくつかの実験においては、Ｅ１またはＥ２陽性フラクションをプールし、窒素エバポレーションによって濃縮した。３×１０８細胞の等量を約２００μｌに濃縮した。部分的還元のためには、３０％Ｅｍｐｉｇｅｎ−ＢＢ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ， ＵＳＡ）をこの２００μｌに最終濃度３．５％になるように添加し、水中１Ｍ  ＤＴＴを続いて最終濃度１．５〜７．５ｍＭになるように添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。ＮＥＭ（ジメチルスルホキシド中１Ｍ）を最終濃度５０ｍＭになるように続いて添加し、遊離のスルヒドリル基をブロックするために３７℃でさらに３０分間反応させた。
【０１８８】
５．４  ゲルろ過クロマトグラフィ
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００ＨＲ １０／２０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を３カラム容量のＰＢＳ／３％Ｅｍｐｉｇｅｎ−ＢＢで平衡化した。還元された混合物をＳｍａｒｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の５００μｌサンプルループ中に注入し、ゲルろ過のためにＰＢＳ／３％Ｅｍｐｉｇｅｎ−ＢＢ緩衝液を添加した。２５０μｌのフラクションをＶ０〜Ｖｔまで集めた。これらのフラクションを、実施例６に記載したようにＥ１またはＥ２タンパク質の存在についてスクリーニングした。
図２４は、ｗＨＣＶ３９（タイプ１ｂ）、ｗＨＣＶ４０（タイプ１ｂ）、ｗＨＣＶ６２（タイプ３ａ）、およびｗＨＣＶ６３（タイプ５ａ）に感染した細胞ライセートの４つの異なるＥ１精製物のゲルろ過クロマトグラフィ後に得られたＥＬＩＳＡの結果を示す。図２５は、タイプ１ｂ、３ａ、および５ａのＥ１タンパク質の精製物（それぞれｗＨＣＶ３９、ｗＨＣＶ６２、およびｗＨＣＶ６３に感染したＲＫ１３細胞由来；先の実施例におけるようにレンチルレクチン上で精製され還元されたもの）から得られたプロフィールを示す。「１」、「２」、および「３」で示すピークは、純粋Ｅ１タンパク質のピークを表す（Ｅ１反応性は主にフラクション２６〜３０中）。これらのピークは、ダイマー状Ｅ１タンパク質に相当する、約７０ｋＤａの非常に類似した分子量を示す。３つのプロフィール中の他のピークは、実施例５．３に概略を記した還元工程のためのみに、そして適正な界面活性剤の存在下での後続のゲルろ過工程のためのみに、Ｅ１から分離され得たワクシニアウイルスおよび／または細胞タンパク質を表す。図２６に示すように、プール１（フラクション１０〜１７を表す）およびプール２（フラクション１８〜２５）は、Ｅ１プール（フラクション２６〜３０）に存在しない夾雑タンパク質を含む。Ｅ１ピークフラクションを、ＳＤＳ／ＰＡＧＥに供し、実施例４に記載したようにブロッティングした。ＮＥＭ−ビオチンで標識したタンパク質は、図２７に示すようにストレプトアビジン−アルカリホスファターゼによって検出した。中でも特に、ゲルろ過クロマトグラフィ前に存在する２９ｋＤａおよび４５ｋＤａの夾雑タンパク質（レーン１）がフラクション２６〜３０中には非常に低レベルでしか存在しないことは容易に観察され得る。約６５ｋＤａのバンドは、完全にはモノマーＥ１形態に破壊できなかったＥ１ダイマー形態を表す。同様の結果は、タイプ３ａ  Ｅ１タンパク質（レーン１０〜１５）についても得られ、それらは、６ではなく５しかない炭水化物の存在のため、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ上でより速い移動度を示す。図２８は、図２６と同一の条件下で行ったＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルの銀染色を示す。精製手順の完全な俯瞰図を図２９に示す。
精製Ｅ１タンパク質の存在は、実施例４に記載したウェスタンブロッティングによってさらに確認した。ダイマー状Ｅ１タンパク質は、凝集しておらず、夾雑物質を含まないようであった。上記のスキームにしたがってｗＨＣＶ−４０感染細胞から精製したサブタイプ１ｂのＥ１タンパク質を、４７７  Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒシークエンサーで配列決定し、最初の残基としてチロシンを含むようであった。これは、Ｅ１タンパク質が正しい位置（Ａ１９１とＹ１９２との間）でシグナル配列からシグナルペプチダーゼによって切断されたことを確認した。これは、成熟Ｅ１タンパク質のアミノ末端がアミノ酸位置１９２で始まるというＨｉｊｉｋａｔａら（１９９１）の知見を確認する。
【０１８９】
５．５  Ｅ２タンパク質の精製
Ｅ２タンパク質（アミノ酸３８４〜６７３）を、実施例５．１〜５．４に示したようにｗＨＣＶ４４に感染したＲＫ１３細胞から精製した。図３９は、レンチルレクチンクロマトグラフィのＯＤ２８０プロフィール（連続線）を示す。点線は、ＥＬＩＳＡによって検出されたＥ２反応性を表す（実施例６を参照されたい）。図３１は、レンチルレクチンＥ２プールのゲルろ過クロマトグラフィから得られた同じプロフィールを示す（図３０を参照されたい）。その一部は実施例５．３に述べたような方法に従って還元およびブロックされ、一部は直ちにカラムに適用された。Ｅ２プールの両部分を、別個のゲルろ過カラムに供した。還元をまったく行わなかった場合、Ｅ２が夾雑タンパク質と共有結合した凝集塊を形成することが明らかになった。還元およびブロッキングの後、夾雑タンパク質の大部分はＶ０フラクションに分離した。Ｅ２タンパク質と共精製された他の夾雑タンパク質は、もはやＥ２タンパク質に共有結合していなかったが、これは、これらの夾雑物質が後続の工程で除去され得たためである。図３２は、Ｅ２タンパク質精製のために行った付加的なＮｉ２＋−ＩＭＡＣ精製工程を示す。このアフィニティ精製工程は、ｗＨＣＶ４４から発現されたＥ２タンパク質に付加された６個のヒスチジン残基を使用する。夾雑タンパク質は、カラムを素通りするか、または３０ｍＭイミダゾール洗浄によって除去され得る。図３３は、０．５μｇの精製Ｅ２タンパク質および３０ｍＭイミダゾール洗浄の銀染色されたＳＤＳ／ＰＡＧＥを示す。純粋Ｅ２タンパク質は、２００ｍＭイミダゾール溶出工程によって容易に回収され得た。図３４は、イミダゾールを除去し、所望の緩衝液、たとえばＰＢＳ、カーボネート緩衝液、生理食塩水に切り替えることができることを意図した、付加的な脱塩工程を示す。
Ｅ１の生産のためのｗＨＣＶ１１Ａ（またはｗＨＣＶ４０）、またはＥ２タンパク質の生産のためのｗＨＣＶ４１、ｗＨＣＶ４２、ｗＨＣＶ４３もしくはｗＨＣＶ４４に感染した約５０，０００ｃｍ２のＲＫ１３細胞から出発して、実施例５．１〜５．５に記載した手順は、約１．３ｍｇのＥ１タンパク質および０．６ｍｇのＥ２タンパク質の精製を可能にする。
分泌されたＥ２タンパク質（約３０〜４０％を構成、６０〜７０％は細胞内形態である）が（予想に反して）凝集塊形成を特徴とすることもまた顕著である。したがって、同じ問題は分泌されたＥ２にも存在する。分泌されたＥ２は、上で開示したようにして精製することができる。
【０１９０】
実施例６：抗Ｅ１または抗Ｅ２抗体の検出あるいはＥ１またはＥ２タンパク質の検出のためのＥＬＩＳＡ
Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ， Ｒｏｃｋｉｌｄｅ， Ｄｅｎｍａｒｋ）を、１ウェル当たり１容量（たとえば５０μｌ、または１５０μｌ、または２００μｌ）のＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）溶液で、４℃で１６時間または３７℃で１時間、コーティングした。あるいは、ウェルを、１容量の５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中５μｇ／ｍｌのＧａｌａｎｔｈｕｓ ｎｉｖａｌｉｓアグルチニン（ＧＮＡ）で、４℃で１６時間または３７℃で１時間コーティングした。ＧＮＡでのコーティングの場合には、プレートを、４００μｌのＩｎｎｏｔｅｓｔ ＨＣＶ Ａｂ ＩＩＩキット（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）の洗浄液で２回洗浄した。未結合のコーティング表面を、１．５〜２容量のブロッキング溶液（ＰＢＳ中０．１％カゼインおよび０．１％ＮａＮ３）で３７℃で１時間または４℃で１６時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を吸引除去した。精製Ｅ１またはＥ２を１００〜１０００ｎｇ／ｍｌ（Ａ＝２８０ｎｍで測定した濃度）に希釈し、あるいは、Ｅ１またはＥ２についてスクリーニングすべきカラムフラクション（実施例５を参照されたい）、または未精製細胞ライセート中のＥ１またはＥ２（実施例５．１）を、ブロッキング溶液中で２０倍希釈し、１容量のＥ１またはＥ２を各ウェルに添加してストレプトアビジンまたはＧＮＡでコートされたプレート上で３７℃で１時間インキュベートした。マイクロウェルを１容量のＩｎｎｏｔｅｓｔ ＨＣＶ Ａｂ ＩＩＩキット（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）の洗浄液で３回洗浄した。Ｉｎｎｏｔｅｓｔ ＨＣＶ Ａｂ ＩＩＩキットの試料希釈液で、血清試料を２０倍希釈し、またモノクローナル抗Ｅ１または抗Ｅ２抗体を２０ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈し、１容量の溶液を３７℃で１時間、Ｅ１またはＥ２タンパク質と反応させた。マイクロウェルを４００μｌのＩｎｎｏｔｅｓｔ ＨＣＶ Ａｂ ＩＩＩキット（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）の洗浄液で５回洗浄した。結合した抗体を、１容量のＩｎｎｏｔｅｓｔ ＨＣＶ Ａｂ ＩＩＩキット（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）のコンジュゲート希釈液で１／８０，０００希釈したヤギ抗ヒトまたは抗マウスＩｇＧ、ペルオキシダーゼ結合二次抗体（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と、３７℃で１時間、各ウェルをインキュベートすることによって検出し、発色を、４００μｌのＩｎｎｏｔｅｓｔ ＨＣＶ Ａｂ ＩＩＩキット（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）の洗浄液でプレートを３回洗浄した後、２４℃で３０分間の、１容量のＩｎｎｏｔｅｓｔ ＨＣＶ Ａｂ ＩＩＩキット（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）の基質溶液中で１００倍希釈したＩｎｎｏｔｅｓｔ ＨＣＶ Ａｂ ＩＩＩキット（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）の基質の添加によって得た。
【０１９１】
実施例７：異なる臨床的プロフィールの患者群のフォローアップ
７．１  抗Ｅ１および抗Ｅ２抗体のモニタリング
現在のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）診断アッセイは、ＨＣＶ抗体の存在のスクリーニングおよび確認のために開発されてきた。このようなアッセイは、処理のモニタリングまたは疾患の結果の予後診断のために有用な情報を提供するとは思われない。しかし、Ｂ型肝炎の場合におけるように、抗エンベロープ抗体の検出および定量は、臨床的な環境においてはより有用であり得る。Ｃ型肝炎疾患の結果についての予後診断のマーカーとしての抗Ｅ１抗体タイターおよび抗Ｅ２抗体タイターの使用の可能性を研究するために、長期持続的応答を示すＩＦＮ−α処理患者のシリーズ（処理後少なくとも１年の期間について血液中に正常のトランスアミナーゼレベルおよび陰性ＨＣＶ−ＲＮＡ試験（５′非コード領域中のＰＣＲ）を有する患者として定義される）を、応答を示さない、または処理の終了時に再発をした生化学的応答を示す患者と比較した。
長期持続的応答を示す８人のＩＦＮ−α処理患者の群（ＬＴＲ、１〜３．５年のフォローアップ（追跡）、タイプ３ａ  ３人およびタイプ１ｂ  ５人）を、処理に対して不完全応答を示す９人の患者（ＮＲ、１〜４年の追跡、タイプ１ｂ  ６人およびタイプ３ａ  ３人）と比較した。タイプ１ｂ（ｗＨＣＶ−３９、実施例２．５参照）およびタイプ３ａ  Ｅ１（ｗＨＣＶ−６２、実施例２．５参照）タンパク質を、ワクシニアウイルス系によって発現させ（実施例３および４参照）、均質になるまで精製した（実施例５）。実施例６に記載したＥＬＩＳＡにおいて、タイプ１ｂのＣ型肝炎ウイルスに感染した患者由来の試料を精製タイプ１ｂ  Ｅ１タンパク質との反応性について試験し、一方、タイプ３ａ感染の試料を抗タイプ３ａ  Ｅ１抗体との反応性について試験した。異なる患者に感染しているＣ型肝炎ウイルスのゲノタイプは、Ｉｎｎｏ−ＬｉＰＡゲノタイプアッセイ（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）によって決定した。図５は、インターフェロン処理の経過中および処理後のフォローアップ期間中に追跡したこれらの患者の抗Ｅ１シグナル対ノイズ比を示す。ＬＴＲの症例は、迅速に低下する抗Ｅ１レベル（３例においては完全に陰性）を一致して示し、一方、ＮＲ症例の抗Ｅ１レベルは大体一定にとどまっていた。得られた抗Ｅ１データのいくつかを、平均Ｓ／Ｎ比±ＳＤ（平均抗Ｅ１タイター）として表２に示す。抗Ｅ１タイターは、図５，６，７および８に示すようにシグナル対ノイズ比から推定し得た。
既に処理の終了時に、この２つの群間で顕著な差異が観察された。ＬＴＲにおいては抗Ｅ１タイターが６．９倍低減したが、ＮＲでは１．５倍にすぎなかった。追跡の終了時に、抗Ｅ１タイターは、持続的応答の患者においては２２．５倍低減したが、ＮＲにおいてはむしろやや上昇した。したがって、これらのデータに基づいて、ＩＦＮ−α治療のモニタリング中の抗Ｅ１抗体レベルの低減は、処理に対する長期の持続的応答と相関する。抗Ｅ１アッセイは、ＩＦＮ処理、またはＣ型肝炎疾患の処理一般に対する長期応答の予後のために非常に有用であり得る。
この知見は、予測されなかった。それと反対に、本発明者らは、抗Ｅ１抗体レベルは長期応答患者においてＩＦＮ処理の経過中に上昇すると予測していた。Ｂ型肝炎の場合におけるように、ウイルスは抗ＨＢｓＡｇ抗体についての血清転換（セロコンバージョン）の結果として除去される。また、多くの他のウイルス感染においても、ウイルスは、抗エンベロープ抗体が上昇すると排除される。しかし、本発明の実験においては、抗Ｅ１抗体は、処理に対する長期応答患者においては明らかに減少したが、不応答患者においては抗体レベルは大体同じにとどまっていた。これらの実験の結果は予測されていなかったが、この非自明な知見は非常に重要である可能性があり、ＨＣＶ感染の臨床診断に有用であり得る。図９，１０，１１および１２に示すように、抗Ｅ２レベルは、研究した同じ患者において非常に異なった挙動を示し、抗Ｅ１抗体についてはタイターの顕著は低減は観察されなかった。図３５はパイロット研究の完全な俯瞰図を与える。
表２から推定し得るように、抗Ｅ１タイターは、処理に対する不完全応答者と比較して長期応答者においては処理の開始時に平均で少なくとも２倍高かった。したがって、処理の開始時に抗Ｅ１抗体のタイターを測定すること、または感染の経過中に患者をモニタリングすることおよび抗Ｅ１タイターを測定することは、Ｃ型肝炎の臨床診断のための有用なマーカーとなり得る。さらに、実施例７．３に示すように、Ｅ１またはＥ２タンパク質のより定義された領域の使用は望ましくなり得る。
【０１９２】
７．２  より大きい患者コホートにおけるＥ１およびＥ２抗体の分析
パイロット研究により、本発明者らは、感染が完全に排除された場合には、ＨＣＶエンベロープタンパク質に対する抗体は、より慣例的に研究されるＨＣＶ抗原に対する抗体よりも迅速に変化する、そしてＥ１抗体は最も激しく変化する、と結論するに至った。したがって、本発明者らは、より多くのタイプ１ｂおよび３ａ感染ＬＴＲを包含させ、その上、マッチングさせたＮＲのシリーズでコホートをさらに補充して、両群がそれぞれ１４人の患者を含むようにした。幾人かの部分的応答者（ＰＲ）および再発ありの応答者（ＲＲ）もまた分析した。
図３６は、ＬＴＲおよびＮＲ群における平均Ｅ１抗体（Ｅ１Ａｂ）およびＥ２抗体（Ｅ２Ａｂ）レベルを描き、表４および５は、統計的分析を示す。このより大きいコホートにおいては、ＩＦＮ−α治療前のより高いＥ１抗体レベルは、ＬＴＲと関連していた（Ｐ＜０．０３）。タイプ１ｂ感染患者と比較してタイプ３ａ感染患者においてはるかに高いＥ１抗体レベルが観察されたため（図３７）、ゲノタイプを考慮に入れた（表４）。タイプ１ｂ感染群内で、処理の開始時にＬＴＲはＮＲよりも高いＥ１抗体レベルを有していた（ｐ＜０．０５）。タイプ３ａ感染ＮＲの数が限られていたため、統計的分析は不可能であった。
１．５年間の追跡期間中にＬＴＲにおいてモニタリングされた抗体レベルのうち、Ｅ１抗体のみが処理の開始時に測定されたレベルと比較して迅速に除去された（治療終了時、Ｐ＝０．００５８；治療後６ヶ月および１２ヶ月でそれぞれＰ＝０．００４７およびＰ＝０．００５１）。このクリアランスは、タイプ１またはタイプ３感染ＬＴＲ内でも有意のままであった（平均Ｐ値＜０．０５）。これらのデータは、消散の初期においてＥ１Ａｂレベルが迅速に低減するという当初の知見を確認した。この特徴は、ウイルスのゲノタイプには依存しないようである。ＮＲ、ＰＲまたはＲＲにおいては、追跡期間中を通して測定したいずれの抗体においても変化が観察されなかった。処理中にＡＬＴレベルの正常化およびＨＣＶ−ＲＮＡ陰性を示した、処理に対して好ましく応答した患者においては、持続的応答者（ＬＴＲ）と再発ありの応答者（ＲＲ）との間で顕著な差異があった。ＬＴＲとは対照的に、ＲＲは、Ｅ１抗体レベルのいかなる低減も示さず、ＰＣＲまたはＨＣＶ−ＲＮＡの検出のための他の古典的な技術によっても、上昇したＡＬＴレベルによっても明らかにすることができないオカルトＨＣＶ感染の存在を示した。少量のウイルスＲＮＡは、処理中にＲＲグループになお存在し、抗Ｅ１  Ｂ細胞刺激が可能なようであった。したがって、抗Ｅ１モニタリングは、ＮＲからＬＴＲを区別することができるだけでなく、ＲＲからも区別し得る。
【０１９３】
７．３  Ｅ１タンパク質の定義された領域の抗体のモニタリング
ＨＣＶ抗原の同定の分子生物学的アプローチは、ウイルス診断薬の開発において先例のないブレークスルーをもたらしたが、λｇｔ１１ライブラリーの免疫スクリーニングの方法は、主に、コアおよび非構造領域全体に分散したリニアエピトープを生じ、エンベロープ領域の分析は、哺乳動物細胞におけるＥ１／Ｅ２領域のクローニングおよび発現を待たなければならなかった。このアプローチは、ゲノム構造が解読されるはるか以前にエンベロープ領域のエピトープが既にマッピングされていた多くの他のウイルス感染と鋭い対照を成す。このようなエピトープおよび相当する抗体は、しばしばワクチン開発に有用な中和活性を有しており、および／または臨床または予後において有意な診断アッセイの開発を可能にした（たとえばＢ型肝炎表面抗原に対する抗体）。今日、Ｃ型肝炎疾患の臨床診断および予後診断を可能にするＨＣＶワクチンまたは試験は存在しないので、免疫サーベイランスにさらされるウイルスエンベロープ領域の特徴付けは、ＨＣＶ診断および予防における新規な方向性に多大に貢献しうる。
各々８アミノ酸ずつ重複するいくつかの２０マーペプチド（表３）を、ＨＣ−Ｊ１配列に基づいて（Ｏｋａｍｏｔｏら、１９９０）以前記載された方法にしたがって合成した（ＥＰ−Ａ−０４８９９６８）。これらのいずれもが、ペプチドｅｎｖ３５（Ｅ１−３５とも呼ばれる）を除いては、約２００のＨＣＶ症例の血清中の抗体を検出できなかった。２つの血清のみが、ｅｎｖ３５ペプチドとわずかに反応した。しかし、実施例６に記載した抗Ｅ１ＥＬＩＳＡによって、以下のように更なるエピトープを発見することが可能であった：実施例６に記載した抗Ｅ１−ＥＬＩＳＡを、５０μｇ／ｍｌのＥ１ペプチドを試料希釈液中の１／２０希釈ヒト血清と混合することによって改変した。図１３は、単独Ｅ１ペプチドまたはＥ１ペプチド混合物の存在下での、ヒト血清の組換えＥ１（ｗＨＣＶ−４０から発現されたもの）タンパク質に対する反応性を示す。２％の血清のみがライン・イムノアッセイフォーマットのストリップ上にコーティングされたＥ１ペプチドによって検出可能であったにすぎないが、一方で、半分以上の血清が、組換えＥ１タンパク質で試験した場合、同じペプチドによって競合されうる抗Ｅ１抗体を含んでいた。精製Ｅ１タンパク質での注射の後にＢａｌｂ／Ｃマウスから得られたマウスモノクローナル抗体のいくつかを、続いて単独のペプチドと、Ｅ１に対する反応性に関して競合させた（図１４）。ｅｎｖ５３の添加はＥ１といくつかの血清の反応性について実質的に競合できたので、明らかに、ｅｎｖ５３の領域は優勢エピトープを含んでおり、ｅｎｖ３１領域も検出された。ｅｎｖ５３およびｅｎｖ３１ペプチドは固相に直接コーティングした場合にはいかなる反応性も示していなかったので、この知見は驚くべきことであった。
したがって、本出願人によって以前記載された技術（ＷＯ９３／１８０５４）を用いてペプチドを合成した。以下のペプチドを合成した：
ペプチド  ｅｎｖ３５Ａ−ビオチン
ＮＨ２−ＳＮＳＳＥＡＡＤＭＩＭＨＴＰＧＣＶ−ＧＫ−ビオチン（配列番号５１）
Ｅ１領域のＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸２０８〜２２７にわたる。
ペプチド  ビオチン−ｅｎｖ５３（「エピトープＡ」）
ビオチン−ＧＧ−ＩＴＧＨＲＭＡＷＤＭＭＭＮＷＳＰＴＴＡＬ−ＣＯＯＨ（配列番号５２）
Ｅ１領域のＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸３１３〜３３２にわたる。
ペプチド  １ｂＥ１（「エピトープＢ」）
Ｈ２Ｎ−ＹＥＶＲＮＶＳＧＩＹＨＶＴＮＤＣＳＮＳＳＩＶＹＥＡＡＤＭＩＭＨＴＰＧＣＧＫ−ビオチン（配列番号５３）
Ｅ１領域のＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１９２〜２２８にわたる。
そして、ゲノタイプ１ａおよび１ｂの配列の同じ領域からそれぞれ由来し、ＩＸｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ Ｍｅｅｔｉｎｇ ｉｎ Ｇｌａｓｇｏｗ、１９９３で記載されていたペプチド  Ｅ１ａ−ＢＢ（ビオチン−ＧＧ−ＴＰＴＶＡＴＲＤＧＫＬＰＡＴＱＬＲＲＨＩＤＬＬ、配列番号５４）およびＥ１ｂ−ＢＢ（ビオチン−ＧＧ−ＴＰＴＬＡＡＲＤＡＳＶＰＴＴＴＩＲＲＨＶＤＬＬ、配列番号５５）（「ペプチドＣ」）の反応性と比較した。ＨＣＶ血清のパネルの反応性を、エピトープＡ，ＢおよびＣについて試験し、エピトープＢは、ｅｎｖ３５Ａとも比較した（４７のＨＣＶ陽性血清のうち、８がエピトープＢについて陽性であり、ｅｎｖ３５Ａとはいずれも反応しなかった）。エピトープＡ，ＢおよびＣに対する反応性を、実施例６に記載したようにストレプトアビジンでコーティングしたプレートに結合したビオチン化ペプチド（５０μｇ／ｍｌ）に対して直接試験した。明らかに、エピトープＡおよびＢは、最も反応性であったが、エピトープＣおよびｅｎｖ３５Ａ−ビオチンははるかに反応性が低かった。完全Ｅ１タンパク質に対する反応性についてモニタリングした同じシリーズの患者（実施例７．１）を、エピトープＡ，ＢおよびＣに対する反応性について試験した。エピトープＣについてはほとんど反応性が見られなかったが、図１５，１６，１７および１８に示すように、エピトープＡおよびＢは、大部分の血清と反応した。しかし、最も反応性のエピトープ（エピトープＡ）に対する抗体は、疾患の軽快を予測しないようであったが、抗１ｂＥ１抗体（エピトープＢ）は、ＩＦＮ処理の開始時にほとんど長期応答者のみに存在した。したがって、抗１ｂＥ１（エピトープＢ）抗体および抗ｅｎｖ５３（エピトープＡ）抗体は、Ｃ型肝炎疾患の予後診断のための有用なマーカーであることが示された。ｅｎｖ５３エピトープは、交差反応性抗体（主要ゲノタイプ間で交差反応する抗体）の検出のために有利に使用し得、ｅｎｖ５３領域に対する抗体は、血清中または肝臓組織中の普遍的Ｅ１抗原検出のために非常に有用であり得る。ｅｎｖ５３領域を認識するモノクローナル抗体は、ランダムエピトープライブラリーと反応した。モノクローナル抗体５Ｅ１Ａ１０でのイムノスクリーニングで反応した４つのクローンにおいて、配列−ＧＷＤ−が存在した。ｅｎｖ５３領域中のすべてのＨＣＶ変異体に存在する普遍的ＨＣＶ配列との類似性のため、配列ＡＷＤは、ｅｎｖ５３交差反応性マウスエピトープの必須配列を含むと考えられている。ｅｎｖ３１もまた、アミノ末端配列−ＹＱＶＲＮＳＴＧＬ−（配列番号９３）中のエピトープを含みうる可変性領域を含み、診断に有用であり得る。表３に示すように、Ｅｎｖ３１またはＥ−３１は、ペプチド１ｂＥ１の部分である。ペプチドＥ１−３３およびＥ１−５１もまた、マウス抗体とある程度反応し、ペプチドＥ１−５５（可変性領域６（Ｖ６）を含む；アミノ酸位置３２９〜３３６にわたる）もまた患者血清のいくつかと反応した。
抗Ｅ２抗体は、明らかに抗Ｅ１抗体とは異なるパターンを、特に処理に対して長期応答する患者においてとった。したがって、抗エンベロープ抗体の低減は、組換えＥ１／Ｅ２タンパク質を用いるアッセイでは単一抗Ｅ１または抗Ｅ２タンパク質と同じように効率的には測定できなかったことは明らかである。抗Ｅ２応答は、両種類の抗体を同時に測定するアッセイにおいては抗Ｅ１応答を不鮮明にしたであろう。したがって、単独のＥ１およびＥ２タンパク質に対する抗エンベロープ抗体を試験する能力は、有用であることが示された。
【０１９４】
７．４  抗Ｅ２抗体のマッピング
２４の抗Ｅ２モノクローナル抗体のうち、３つのみがペプチドによって組換えＥ２に対する反応性について競合し得たが、そのうち２つはＨＶＲＩ領域と反応し（ペプチドＥ２−６７およびＥ２−６９、エピトープＡと名付けられている）、１つはペプチドＥ２−１３Ｂによって競合されるエピトープ（エピトープＣ）を認識した。マウス抗体の大部分は、コンフォメーショナル抗Ｅ２エピトープを認識した（図１９）。ＨＶＲＩ（エピトープＡ）、およびより少ない程度でＨＶＲＩＩ（エピトープＢ）および第３のリニアエピトープ領域（ペプチドＥ２−２３，Ｅ２−２５またはＥ２−２７によって競合された；エピトープＥと名づけられている）および第４のリニアエピトープ領域（ペプチドＥ２−１７Ｂによって競合された；エピトープＤ）、に対するヒト応答もまた頻繁に観察されたが、血清の大部分はコンフォメーショナルエピトープと反応した（図２０）。これらのコンフォメーショナルエピトープは、それらの相対的位置によって以下のようにグループ分けできた：コンフォメーショナルエピトープを認識するハイブリドーマ１５Ｃ８Ｃ１，１２Ｄ１１Ｆ１，９Ｇ３Ｅ６，８Ｇ１０Ｄ１Ｈ９，１０Ｄ３Ｃ４，４Ｈ６Ｂ２，１７Ｆ２Ｃ２，５Ｈ６Ａ７，１５Ｂ７Ａ２の上清中のＩｇＧ抗体を、プロテインＡアフィニティカラムによって精製し、１ｍｇ／ｍｌの得られたＩｇＧをビオチンの存在下でホウ酸緩衝液中でビオチン化した。ビオチン化抗体を、ゲルろ過クロマトグラフィによって遊離ビオチンから分離した。プールしたビオチン化抗体フラクションを、１００〜１０，０００倍に希釈した。固相に結合したＥ２タンパク質を、１００倍量の非ビオチン化競合抗体の存在下でビオチン化ＩｇＧによって検出し、続いてアルカリホスファターゼで標識したストレプトアビジンで検出した。
競合のパーセンテージを、表６に示す。これらの結果に基づいて、４つのコンフォメーショナル抗Ｅ２エピトープ領域（エピトープＦ，Ｇ，ＨおよびＩ）を描画できた（図３８）。あるいは、これらのモノクローナル抗体は、この研究で使用されたペプチドによって表されない突然変異リニアエピトープを認識し得る。モノクローナル抗体４Ｈ６Ｂ２および１０Ｄ３Ｃ４は、１６Ａ６Ｅ７の反応性と競合したが、１６Ａ６Ｅ７とは違って、それらはペプチドＥ２−１３Ｂを認識しなかった。これらのモノクローナル抗体は、同じリニアエピトープ（エピトープＣ）の変異体を認識するか、立体的に制約を受けた、またはＥ２−１３Ｂ領域に対する１６Ａ６Ｅ７の結合後にコンフォメーションを変える、コンフォメーショナルエピトープ（エピトープＨ）を認識する可能性がある。
【０１９５】
実施例８：Ｅ１グリコシル化突然変異体
８．１  序論
哺乳動物細胞から発現された、ｗＨＣＶ１０ＡによってコードされるＥ１タンパク質およびｗＨＣＶ４１〜４４によってコードされるＥ２タンパク質は、それぞれ６個および１１個の炭水化物部分を含む。これは、ｗＨＣＶ１０Ａ感染またはｗＨＣＶ４４感染ＲＫ１３細胞のライセートを、減少する濃度のグリコシダーゼ（ＰＮＧアーゼＦまたはエンドグリコシダーゼＨ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ））とともに製造者の指示に従ってインキュベートし、ライセート中のタンパク質（Ｅ１を含む）が部分的に脱グリコシル化されるようにすることによって示された（それぞれ図３９および４０）。
グリコシル化部位のいくつかを持たない突然変異体は、改良された免疫反応性を有するエンベロープタンパク質の選択を可能にし得た。たとえばＨＩＶについては、ある種の選択された糖付加モチーフを欠くｇｐ１２０タンパク質が、診断またはワクチン目的に特に有用であることが見出された。Ａ／Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ／３／６８（Ｈ３Ｎ２）インフルエンザウイルスのエスケープ突然変異体のヘマグルチニンタンパク質中の新規のオリゴ糖側鎖の付加は、中和モノクローナル抗体との反応性を妨害する（Ｓｋｅｌｅｌら、１９８４）。部位特異的突然変異誘発によってインフルエンザのヘマグルチニンタンパク質中に新規のグリコシル化部位を導入した場合、劇的な抗原の変化が観察され、炭水化物が抗原性の調節因子として作用することが示唆された（Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、１９８８）。別の分析においては、フレンドマウス白血病ウイルスの表面タンパク質ｇｐ７０の８個の炭水化物付加モチーフを欠失させた。突然変異のうち７つはウイルスの感染性に影響しなかったが、アミノ末端に関して４番目のグリコシル化シグナルの突然変異は、非感染性フェノタイプをもたらした（Ｋａｙｍａｎら、１９９１）。さらに、Ｎ−結合炭水化物鎖の付加が、フォールディング中間体の安定化、したがって効率的なフォールディング、過誤フォールディングおよび小胞体での分解の防止、オリゴマー化、生物活性、および糖タンパク質の輸送に重要であることが当業界で公知である（Ｒｏｓｅらによる総説、１９８８； Ｄｏｍｓら、１９９３；Ｈｅｌｅｎｉｕｓ， １９９４を参照されたい）。
ＨＣＶゲノタイプの異なるエンベロープタンパク質配列の整列後、ＨＣＶサブタイプ１ｂＥ１タンパク質上の６個全部のグリコシル化部位が正しいフォールディングおよび反応性のために必要ではないことが推測されうる。これは、いくつかはある（サブ）タイプには存在しないからである。タイプ１ｂ、６ａ、７，８および９に存在する４番目の炭水化物モチーフ（Ａｓｎ２５１上）は、今日公知の他のすべてのタイプには存在しない。この糖付加モチーフは、突然変異して改良された反応性を有するタイプ１ｂＥ１タンパク質を生じる可能性がある。また、タイプ２ｂ配列はＶ５領域に余分のグリコシル化部位を示す（Ａｓｎ２９９上）。ゲノタイプ２ｃに属する単離株Ｓ８３は、Ｖ１領域の１番目の炭水化物モチーフ（Ａｓｎ上）さえ欠いているが、これはその他のすべての単離株には存在する（Ｓｔｕｙｖｅｒら、１９９４）。しかし、完全に保存された糖付加モチーフ間でさえ、この炭水化物の存在は、フォールディングに必要ではないかもしれないが、免疫サーベイランスの回避において役割を有する可能性がある。したがって、正しいフォールディング（および反応性）に必要ではない炭水化物付加モチーフの同定は明らかではなく、反応性について各突然変異体を分析し試験しなければならない。グリコシル化モチーフの突然変異誘発（ＮＸＳまたはＮＸＴ配列）は、Ｎ，ＳまたはＴのコドンを、これらのコドンがＮの場合にはＮと異なるアミノ酸、および／またはＳの場合およびＴの場合にはＳまたはＴと異なるアミノ酸をコードするように、突然変異させることによって達成できる。あるいは、ＮＰＳまたはＮＰＴは頻繁には炭水化物で修飾されないことが公知であるので、Ｘの位置をＰに突然変異させてもよい。どの炭水化物付加モチーフがフォールディングおよび／または反応性に必要か、およびどれが必要でないか、を確立した後、そのような突然変異の組み合わせを作製することができる。
【０１９６】
８．２  Ｅ１タンパク質の突然変異誘発
すべての突然変異は、クローンＨＣＣｌ１０Ａ（配列番号５）のＥ１配列に対して行った。ＰＣＲの第１ラウンドを、ワクシニア１１Ｋ後期プロモーターの上流に位置するＧＰＴ配列を標的としたセンスプライマー「ＧＰＴ」（表７参照）、および突然変異誘発を得るための所望の塩基変化を含むアンチセンスプライマー（ＧＬＹ＃と名付けたもの；ここで＃はグリコシル化部位の番号を表す、図４１参照）を用いて行った。６つのＧＬＹ＃プライマー（特定のグリコシル化部位に対して各々特異的）を、以下のように設計した：
−  Ｎ−グリコシル化Ａｓｎ（ＡＡＣまたはＡＡＴ）をコードするコドンのＧｌｎコドン（ＣＡＡまたはＣＡＧ）への修飾。グルタミンは、アスパラギンに非常に類似しているため選択した（両アミノ酸とも、中性で、非極性残基を含む；グルタミンはより長い側鎖（１つ多い−ＣＨ２−基）を有する）。
−  新規のユニークまたは希少（たとえばＥ１Ｇｌｙ５についての第２のＳｍａＩ部位）制限酵素部位を作製するための、グリコシル部位の下流の１つまたはいくつかのコドンへのサイレント突然変異の導入。アミノ酸配列を改変せずに、この突然変異は、突然変異配列を元のＥ１配列（ｐｖＨＣＶ−１０Ａ）から、または互いから、区別する方法を提供することになる（図４１）。この付加的な制限部位は、新規のハイブリッド（二重、三重等）グリコシル化突然変異体の構築についても有用であり得る。
−  最初のミスマッチのヌクレオチドの５′側の１８ヌクレオチドの伸長部（エクステンド）および３′末端への１２〜１６ヌクレオチドの伸長部。表７は、Ｎ−結合グリコシル化部位の配列と重複する６つのＧＬＹ＃プライマーの配列を描く。
部位特異的突然変異誘発のために、「ミスプライミング」または「重複伸長」（Ｈｏｒｔｏｎ、１９９３）を用いた。そのコンセプトは図４２および４３に説明されている。最初に、２つの別個のフラグメントを、各突然変異部位について標的遺伝子から増幅した。５′末端から得られたＰＣＲ生成物（生成物ＧＬＹ＃）を、５′センスＧＰＴプライマー（表７参照）、およびそれぞれの３′アンチセンスＧＬＹ＃プライマーで増幅した。第２のフラグメント（生成物ＯＶＲ＃）を、３′アンチセンスＴＫＲプライマーおよびそれぞれの５′センスプライマーで増幅した（ＯＶＲ＃プライマー、表７、図４３参照）。
ＯＶＲ＃プライマーは、ＧＬＹ＃プライマー配列の部分を標的とする。したがって、２つのグループのＰＣＲ生成物は、同一配列の重複領域を共有する。これらの中間体生成物を混合し（ＧＬＹ−１とＯＶＲ−１，ＧＬＹ−２とＯＶＲ−２等）、高温で融解し、再アニーリングした場合、２つの鎖がお互いに対してのプライマーとして作用するようなやり方で、生成物ＧＬＹ＃のトップのセンス鎖は、生成物ＯＶＲ＃のアンチセンス鎖に（および逆も）アニーリングしうる（図４２Ｂ参照）。２回のＰＣＲサイクルの間のＴａｑポリメラーゼによるアニーリングした重複物の伸長によって、全長突然変異体分子Ｅ１Ｇｌｙ＃が作製され、これは、グリコシル部位番号＃を破壊する突然変異を有する。クローニングのために充分な量のＥ１ＧＬＹ＃生成物を、２つの内部ネステッドプライマーの共通のセットによって第３のＰＣＲで生成させた。これらの２つの新規なプライマーは、それぞれワクシニア１１Ｋプロモーターの３′末端（センスＧＰＴ−２プライマー）およびワクシニアチミジンキナーゼ遺伝子座の５′末端（アンチセンスＴＫＲ−２プライマー、表７参照）に重複する。すべてのＰＣＲ条件は、Ｓｔｕｙｖｅｒら（１９９３）に記載されたように行った。
これらのＰＣＲ生成物の各々を、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断によって、元のＥ１配列を含むＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断ワクシニアベクター（ｐｖＨＣＶ−１０Ａ）中にクローニングした。
選択したクローンを、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ切断によって、インサートの長さについて、および各新規制限部位の存在について分析した。突然変異部位に重複する配列を、二本鎖配列決定によって確認した。
【０１９７】
８．３  Ｅ１グリコシル化突然変異体の分析
実施例８．２に記載した突然変異Ｅ１配列を含む６つのプラスミドから出発して、実施例２．５に記載したにようにｗｔワクシニアウイルスとの組換えによって組換えワクシニアウイルスを生成した。簡単に言うと、１７５ｃｍ２のフラスコのサブコンフルエントＲＫ１３細胞を、突然変異Ｅ１配列を有する６つの組換えワクシニアウイルス、ならびにｗＨＣＶ−１０Ａ（非突然変異Ｅ１配列を有する）およびｗｔワクシニアウイルスに感染させた。細胞を、２４時間のインキュベーション後に溶解し、実施例４に記載したようにウェスタンブロット上で分析した（図４４Ａ参照）。すべての突然変異体は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で元のＥ１タンパク質よりも速い移動度（約２〜３ｋＤａ小さい分子量に相当）を示し、１個の炭水化物部分が付加されていないことが確認された。異なる突然変異体の内容を確認するために、組換えウイルスをＰＣＲおよび制限酵素分析によっても分析した。図４４Ｂは、（図４１に示すように）すべての突然変異体が、予測された付加的制限部位を含むことを示す。細胞ライセートの別の部分を用いて、ＥＬＩＳＡによって異なる突然変異体の反応性を試験した。ライセートを２０倍希釈して、実施例６に記載したようにレクチンＧＮＡでコーティングしたマイクロウェルプレートに添加した。捕獲された（突然変異）Ｅ１糖タンパク質を、実施例６に記載したように２４のＨＣＶ感染患者の２０倍希釈血清と反応させた。６つの突然変異体およびＥ１についてのシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）値（ＧＬＹ＃のＯＤ／ｗｔのＯＤ）を表８に示す。この表は、ＧＬＹ＃およびＥ１タンパク質のＳ／Ｎ値間の比をも示す。患者血清との反応性の比較のために異なる突然変異体の細胞ライセートを使用するアプローチは、反応性レベルというよりも異なる発現レベルの結果である観察をもたらしうることは理解されるべきである。このような困難は、実施例５に記載したような異なる突然変異体の精製によって、そして異なるＥ１タンパク質すべての同量を試験することによって克服しうる。しかし、表５に示す結果は、１番目（ＧＬＹ１）、３番目（ＧＬＹ３）および６番目（ＧＬＹ６）のグリコシル化モチーフの除去が、いくつかの血清の反応性を低減させるが、一方２番目および５番目の部位の除去はそうではないことを既に示している。ＧＬＹ４の除去は、ある種の血清の反応性を改良するようである。これらのデータは、異なる患者が本発明のグリコシル化突然変異体に対して異なって反応することを示す。したがって、このような突然変異Ｅ１タンパク質は、ＨＣＶ疾患の診断（スクリーニング、確認、予後等）および予防のために有用であり得る。
【０１９８】
実施例９：グリコシル化欠損酵母におけるＨＣＶ  Ｅ２タンパク質の発現
クローンＨＣＣＬ４１に相当するＥ２配列は、α−メイティング因子プレ／プロシグナル配列つきで、酵母発現ベクター中に挿入されて提供され、この構築体で形質転換されたＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞は、生育培地中にＥ２タンパク質を分泌した。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株でのこのような構築体の発現に際し、ほとんどのグリコシル化部位が高マンノースタイプのグリコシル化で修飾されたことが観察された（図４５）。これは、高すぎるレベルの異質性および反応性の隠蔽をもたらし、これはワクチンまたは診断目的いずれについても望ましくなかった。この問題を克服するために、改変されたグリコシル化経路を有するＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ突然変異体を、バナデート耐性クローンの選択によって生成した。このようなクローンを、糖タンパク質インベルターゼの異質性および分子量の分析によって、改変されたグリコシル化経路について分析した。これにより、異なるグリコシル化欠損Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ突然変異体を同定することが可能になった。続いて、Ｅ２タンパク質を、いくつかの選択した突然変異体において発現させ、実施例４に記載したようにウェスタンブロット上で、実施例７に記載したモノクローナル抗体と反応させた（図４６）。
【０１９９】
実施例１０：一般的有用性
本結果は、良好な発現系のみでなく、良好な精製プロトコールもまた、ヒト患者血清とのＨＣＶエンベロープタンパク質の高い反応性を達成するために必要であることを示す。これは、タンパク質の天然のフォールディングの保存を保証する、本発明の精製プロトコールおよび／または適正なＨＣＶエンベロープタンパク質発現系と、夾雑タンパク質の排除を保証し、コンフォメーションを保存する、したがってＨＣＶエンベロープタンパク質の反応性を保証する、本発明の精製プロトコールとを用いて得ることができる。診断スクリーニングアッセイに必要とされる精製ＨＣＶエンベロープタンパク質の量は、年間グラム単位の範囲である。ワクチン目的には、より多量のエンベロープタンパク質が必要とされるであろう。したがって、ワクシニアウイルス系は、最良の構築体の選択および限られた大量化のために使用でき、高マンノース炭水化物を含む単一または特異的オリゴマー化エンベロープタンパク質の大量発現および精製は、いくつかの酵母株から発現される場合に達成されうる。たとえばＢ型肝炎の場合、哺乳動物細胞からのＨＢｓＡｇの製造は、酵母由来Ｂ型肝炎ワクチンと比較してはるかに費用がかかるものであった。
本発明に開示した精製方法は、「ウイルスエンベロープタンパク質」一般についても使用しうる。例としては、フラビウイルス類、新規に発見されたＧＢ−Ａ、ＧＢ−Ｂ、およびＧＢ−Ｃ肝炎ウイルス、ペスチウイルス類（たとえばウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）、ブタコレラウイルス（ＨＣＶ）、ボーダー病ウイルス（ＢＤＶ））由来のものがあるが、Ｂ型肝炎ウイルス（主にＨＢｓＡｇの精製のため）のような関連性のより低いウイルスもある。
本発明のエンベロープタンパク質精製方法は、詳細な説明の章において詳述したように、下等または高等真核生物細胞において、または原核生物において、細胞内または細胞外発現されたタンパク質について用いることができる。
【０２００】
実施例１１：予防および治療上の有用性の証明
ＨＣＶに慢性感染したチンパンジーにおける肝臓疾患は、Ｅ１で免疫することによって低減することができる。しかし、有意な免疫応答を達成するためには複数回の免疫が必要であった。当業者は、ウイルス残存性が、ウイルス自身によってまたは宿主によって支配された免疫調節に伴って生成されることを理解するであろう。このような免疫調節がＨＣＶにおいて存在するかどうかを分析するために、ナイーブ（未感染）および慢性感染チンパンジーにおけるＥ１およびＮＳ３に対する免疫応答を比較した。慢性感染動物においてより低い応答が予想されたので、この群の動物を、以下を含む、より徹底的な免疫スケジュールのために選択した：マウスにおいてミョウバン（これはナイーブ動物について使用したアジュバントである）と比較して細胞性応答の誘導（表９）についてより強力であることが証明されたアジュバントの使用；そして、慢性感染動物についての免疫スケジュールは、ナイーブ動物については６回であったのに対し、１２回の免疫から成っていた（図４７）。
免疫した動物の数は、統計的分析を可能にしなかったが、以下の明確な傾向が液性応答において検知され得る（表１０）：血清転換（セロコンバージョン）のための免疫回数は、ナイーブ動物においてより少ない；そして、免疫応答の程度はナイーブ動物において実質的により大きく、２／３の感染動物が、１２回の免疫の後でさえ、１０内部単位のレベルに到達しない。
３回の免疫後の細胞性応答の分析により、以下のことを含むさらに大きな差異が明らかになった（図４８ａ〜ｄ）：Ｅ１特異的Ｔ細胞増殖は、慢性感染動物においてはほとんどないのに対し、ナイーブな環境では明確な刺激が見られる；ＩＬ−２測定は、慢性キャリアにおけるＴ細胞コンパートメントの低い刺激を確認した；および、ミョウバンアジュバント含有ワクチンについて予測されるように、ナイーブ動物において明確なＴｈ２（ＩＬ−４）応答が誘導される。
これは、少なくともＥ１免疫がナイーブ動物において予防的効果を提供することを確認するものであり、Ｅ２、および／またはＥ１およびＥ２タンパク質および／またはペプチドとの組み合わせが、ナイーブ動物において有用な治療的および／または予防的利益を提供しうることを示唆する。
ＨＣＶ  Ｅ１抗原に対する細胞性および液性の両方の応答を誘導するための「欠陥」は、以下の結果によって証明されるように、複数回の免疫によって部分的にのみ克服できる：各注射後の抗体タイターの上昇は記録されたが、ナイーブ動物におけるようなレベルには２／３の動物においては到達しなかった；および、Ｔ細胞増殖応答は非常に低いままであった（図４９）。しかし、ＥＬＩＳＰＯＴの結果は、ＩＬ−２のわずかな上昇（示していない）、ＩＦＮ−ｇの無変化（示していない）、およびＩＬ−４の上昇（図４９）を示し、これは、Ｔｈ２タイプの応答がより容易に誘導されることを示す。ＩＬ−４はナイーブ動物における３回の免疫後に到達されたレベルと比較して低いレベルのままであることが記録された。
非常に類似した観察が、慢性チンパンジーにおいてさらに強力なアジュバント（ＲＩＢＩ）を使用したＮＳ３免疫について、なされた。ナイーブ動物におけるミョウバン処方と比較して、以下の点が注目される：誘導された抗体タイターは、両群において匹敵する（示していない）；および、サイトカイン分泌およびＴ細胞増殖の両方が、ナイーブ動物における応答と比較して慢性動物ではほとんど見られない（図４９ａ−ｂ）。
現在のところ、慢性キャリアにおけるＨＣＶに対する免疫応答は低いか、少なくとも感染を排除するには不充分である兆候があった。上記の結果は、ＨＣＶ慢性キャリアの免疫系は欠陥している可能性があり、ナイーブな状況におけるように効率的にはそれらはＨＣＶ抗原に対して応答しない、という仮説を支持する。
Ｗｉｅｄｍａｎｎらによる研究（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０００；３１：２３０−２３４）において、ＨＢＶについてのワクチン接種は、ＨＣＶ慢性キャリアにおいては効果が低かったが、これは、このような免疫欠陥がＨＣＶ抗原に限らないことを示す。Ｄｅ Ｍａｒｉａら（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２０００；３２：４４４−４４５）は、これらのデータを確認し、ＨＣＶ患者のために適合させたワクチン用量決定処方を提案した。ここで提示したデータは、免疫の回数を増大させることが、液性免疫を実際に高めうるが、しかし、強力なアジュバントを使用してさえ、細胞性（特にＴｈ１）応答は誘導が困難であることを示す。免疫系がより応答しやすい抗ウイルス治療の時に免疫を開始するのが有利である可能性がある。
【０２０１】
表の説明
表１：実施例１に示すＥ１タンパク質の異なる形態を構築するための増幅に用いたそれぞれのクローンおよびプライマーの特徴。
表２：抗Ｅ１試験の概要。
表３：競合研究のための合成ペプチド。
表４：経時的エンベロープ抗体レベルの変化。
表５：ＬＴＲおよびＮＲ間の差異。
表６：マウスＥ２モノクローナル抗体間の競合実験。
表７：Ｅ１グリコシル化突然変異体の構築のためのプライマー。
表８：ＥＬＩＳＡによるＥ１グリコシル化突然変異体の分析。
表９：アジュバント処理Ｅ１  Ｂａｌｂ／ｃマウスのプロフィール。
表１０：液性応答：異なるＥ１抗体レベルのために必要な免疫回数。
【０２０２】
【表３】
2004525885.tif 000004
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【０２０３】
【表４】
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【０２０４】
【表５】
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【０２０５】
【表６】
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【０２０６】
【表７】
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【０２０７】
【表８】
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【０２０８】
【表９】
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【０２０９】
【表１０】
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【０２１０】
【表１１】
2004525885.tif 000014
１  ３回のｓｃ／ｉｍ免疫の後、３匹のランダムに選択したマウスを個別に分析し、結果を、Ｅ１刺激（１μｇ／ｍｌ）の４日後に得られた平均特異的ｃｐｍとして表した。かっこ内の数字は、バックグラウンドを超える特異的刺激を示したマウスの数である。
２  １回の単独の肢掌（ｆｏｏｔｐａｔｈ）内免疫の後（ｎ＝２）、結果をＥ１刺激（１μｇ／ｍｌ）の５日後に得られた平均特異的ｃｐｍとして表す。
【０２１１】
【表１２】
2004525885.tif 000015
１  免疫前にＥ１抗体が存在しなかった場合、カットオフレベルより高いＥＬＩＳＡシグナルとして定義した。その他の場合においては、３つの個別の時点のプレ免疫タイターより高いタイターの観察をセロコンバージョンのポイントとして考えた。
２  単位は以下のようにして定義する：インターフェロン治療の前のゲノタイプ１ｂに感染したヒト慢性キャリアにおけるＥ１抗体のレベルは５０％の患者について＜０．１Ｕ／ｍｌであり；患者の２５％については０．１〜１Ｕ／ｍｌであり、残りの２５％の患者においては＞１Ｕ／ｍｌである。ｎ＝５８。
【０２１２】
実施例１２：ＨＣＶサブタイプ１ｂに慢性感染したチンパンジーの免疫
ＨＣＶサブタイプ１ｂ株に既に１３年（免疫前５０１５日）以上感染していたチンパンジー（フィル）を、異なるゲノタイプの株から由来し、アミノ酸レベルで同一性９５．１％の（ＷＯ９９／６７２８５の表２も参照されたい；その全体は参照によりここに援用される）、そしてＷＯ９９／９７２８５の実施例１〜３に記載されたように調製した、Ｅ１（アミノ酸１９２〜３２６）でワクチン接種した。このチンパンジーは、製造者（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＭＴ）のプロトコールにしたがってＲＩＢＩ  Ｒ−７３０（ＭＰＬＡ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）と混合したＰＢＳ／０．０５％ＣＨＡＰＳ中の、それぞれ５０μｇのＥ１の合計６回の筋内免疫を受けた。この６回の免疫は、３週間の間隔をあけた３回の注射の２つのシリーズで、その２つのシリーズ間に６週間のラグ期間をおいて与えた。免疫前１５０日から出発して、免疫期間中および免疫後１年間まで（しかし、以下およびＷＯ９９／６７２８５を参照されたい）、このチンパンジーを、ＨＣＶ誘発疾患の活性についての種々のパラメーター指標について連続的にモニタリングした。これらのパラメーターは、血液化学、ＡＬＴ，ＡＳＴ，ガンマＧＴ，血液化学、血清中ウイルス量、肝臓内ウイルス量および肝臓組織学を含んでいた。さらに、免疫に対する免疫回答を、液性および細胞性レベルでモニタリングした。この期間中、動物を、行動の変化、臨床症状、体重、体温および局所反応（赤み、腫脹、硬化）のような免疫のあらゆる悪影響についてもモニタリングした。このような影響は検出されなかった。
明らかに、ＡＬＴ（および特にガンマＧＴ、データは示していない）レベルはＥ１に対する抗体レベルが最高に達すると直ちに減少した（ＷＯ９９／６７２８５の図８参照）。ＡＬＴは、抗体レベルが低下し始めるや否やむしろ迅速に再上昇したが、ガンマＧＴは抗Ｅ１が検出可能のままである限りは低いレベルにとどまった。
肝臓のＥ２抗原は、この期間中にほとんど検出不能のレベルに低下し、この期間中に、抗Ｅ１は検出可能であり、Ｅ２抗原はこれらの抗体の消失後ほどなく再上昇した。コアおよびＥ２抗原が肝臓において検出不能になるとともに、肝臓の炎症は顕著に軽快した（ＷＯ９９／６７２８５の図３も参照）。これは、ワクチンが、おそらくウイルス抗原を少なくとも部分的にその主要標的器官である肝臓から除去することによって、肝臓損傷の軽快を誘発することの主要な証拠である。
ウイルス血症（ｖｉｒａｅｍｉａ）レベルは、Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ （Ｒｏｃｈｅ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって測定したところ、研究期間全体のあいだ血清中でほぼ不変のままであった。
液性応答のさらに詳細な分析により、最高終点タイターが１４．５×１０３（６回の免疫後）に達したこと、およびこのタイターが免疫１年後に検出不能まで低下したことが解明された（ＷＯ９９／６７２８５の図８）。ＷＯ９９／６７２８５の図９は、ペプチドによって模倣することができ、Ｂ細胞によって認識される主要エピトープは、Ｅ２のＮ末端領域に位置することを示す（ペプチドＶ１Ｖ２およびＶ２Ｖ３、使用したペプチドに関する詳細についてはＷＯ９９／６７２８５の表４参照）。組換えＥ１に対する反応性はより高く、長く存続するので、この図から、これらのペプチドを認識する抗体は、Ｅ１に対する抗体集団全体のほんの一部のみを表すことも推定されうる。残りの部分は、ペプチドによって模倣され得ないエピトープ、すなわち不連続エピトープに対するものである。このようなエピトープは、完全Ｅ１分子上、または粒子様構造上のみに存在する。このようなＥ１に対する免疫応答は、少なくとも、感染の自然の経過中に抗Ｅ１抗体を生じるヒト慢性ＨＣＶキャリアにおいて（ＭａｅｒｔｅｎｓらのＷＯ９６／１３５９０）およびチンパンジーにおいて（ｖａｎ Ｄｏｏｒｎら、１９９６）、通常観察されるものと比較して、ユニークである。これらの患者において、抗Ｅ１は、一部分は不連続エピトープにも向けられているが、大部分はＣ４エピトープ（±５０％の患者血清）に対して、小部分はＶ１Ｖ２（ゲノタイプによって２〜７０％の範囲にわたる）に対して向けられており、Ｖ２Ｖ３に対する反応性は例外的に記録されるに過ぎない（Ｍａｅｒｔｅｎｓら、１９９７）。
Ｔ細胞反応性の分析は、これらのＴ細胞の刺激インデックスが１から２．５に上昇し、追跡期間中いくらか上昇したままにとどまるので、免疫系のこのコンパートメントがワクチンによって特異的に刺激されることを示した（ＷＯ９９／６７２８５の図１０）。インターフェロン治療に対する長期応答者において唯一見られるのは、このＴ細胞反応性である（Ｌｅｒｏｕｘ−ＲｏｅｌｓらのＰＣＴ／ＥＰ９４／０３５５５；Ｌｅｒｏｕｘ−Ｒｏｅｌｓら、１９９６参照）。
【０２１３】
実施例１３：異なるサブタイプを有する慢性ＨＣＶキャリアの免疫
ゲノタイプ１ａ由来ＨＣＶに既に１０年（免疫前３８０９日）以上感染しているチンパンジー（トン）を、アミノ酸レベルで７９．３％しか同一性がなく（ＷＯ９９／６７２８５の表２も参照されたい）、先の実施例に記載したように調製した、ゲノタイプ１ｂ由来のＥ１でワクチン接種した。このチンパンジーは、製造者（Ｒｉｂｉ Ｉｎｃ．， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＭＴ）のプロトコールにしたがってＲＩＢＩ  Ｒ−７３０と混合したＰＢＳ／０．０５％ＣＨＡＰＳ中の５０μｇのＥ１の合計６回の筋内免疫を受けた。この６回の免疫は、３週間の間隔をあけた３回の注射の２つのシリーズで、その２つのシリーズ間に４週間のラグ期間をおいて与えた。免疫前２５０日から出発して、免疫期間中および免疫後９ヶ月まで（しかし、以下およびＷＯ９９／６７２８５を参照されたい）このチンパンジーを、ＨＣＶ誘発疾患の活性についての種々のパラメーター指標について連続的にモニタリングした。これらのパラメーターは、血液化学、ＡＬＴ，ＡＳＴ，ガンマＧＴ，血清中ウイルス量、肝臓内ウイルス量および肝臓組織学を含んでいた。さらに、免疫に対する免疫回答を、液性および細胞性レベルでモニタリングした。この期間中、動物を、行動の変化、臨床症状、体重、体温および局所反応（赤み、腫脹、硬化）のような免疫のあらゆる悪影響についてもモニタリングした。このような影響は検出されなかった。
明らかに、ＡＬＴレベル（およびガンマＧＴレベル、データは示していない）はＥ１に対する抗体レベルが最高に達すると直ちに低減した（ＷＯ９９／６７２８５の図１１）。ＡＬＴおよびガンマＧＴは、抗体レベルが低下し始めるや否や再上昇したが、ＡＬＴおよびガンマＧＴは、完全な追跡期間中低いレベルにとどまった。ＡＬＴレベルは、ワクチン接種前（８５±１１Ｕ／ｌ）と比較してワクチン接種後にむしろ有意に低減した（６２±６Ｕ／ｌ）。より少ない組織損傷のマーカーが血清中で回収されたので、これらの知見は、ワクチン接種が肝臓疾患の改善を誘導したことの最初の指標であった。
Ｅ２抗原レベルは、抗Ｅ１が１．０×１０３のタイターを超えるままであった期間中に、検出不能となったが、より低いＥ１抗体レベルの時には再び検出可能となった。ＨＣＶ抗原の消失とともに、肝臓の炎症は、中程度の慢性活性肝炎から慢性持続性肝炎の最小限の形態へと顕著に軽減した（ＷＯ９９／６７２８５の表３）。これは、ワクチンが、おそらく（少なくとも部分的に）ウイルスをその主要な標的器官である肝臓から除去することによって、肝臓損傷の軽快を誘導したことの別の主要な証拠である。
ウイルス血症レベルは、Ａｍｐｌｉｃｏｒ ＨＣＶ Ｍｏｎｉｔｏｒ（Ｒｏｃｈｅ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）によって測定したところ、研究期間全体のあいだ血清中でほぼ同じレベルのままであった。液性応答のさらに詳細な分析により、最高終点タイターが３０×１０３（６回の免疫後）に達したこと、およびこのタイターが免疫９ヶ月後に０．５×１０３まで低下したことが解明された（ＷＯ９９／６７２８５の図１１）。ＷＯ９９／６７２８５の図１２は、ペプチドによって模倣することができ、Ｂ細胞によって認識される主要エピトープが、Ｎ末端領域に位置することを示す（ペプチドＶ１Ｖ２およびＶ２Ｖ３、使用したペプチドに関する詳細についてはＷＯ９９／６７２８５の表４参照）。組換えＥ１に対する反応性はより高く、長く存続するので、この図から、これらのペプチドを認識する抗体は、Ｅ１に対する抗体集団全体のほんの一部のみを表すことも推定されうる。残りの部分は、ペプチドによって模倣され得ないエピトープ、すなわち不連続エピトープに対するものである可能性が最も高い。このようなエピトープは、おそらく完全Ｅ１分子上または粒子様構造上のみに存在する。このようなＥ１に対する免疫応答は、少なくとも、検出可能な抗Ｅ１を有するヒト慢性ＨＣＶキャリアにおいて通常観察されるものと比較して、ユニークである。これらの患者において、抗Ｅ１は、一部分は不連続エピトープにも向けられているが、大部分はＣ４エピトープ（５０％の患者血清）に対して、小部分はＶ１Ｖ２（ゲノタイプによって２〜７０％の範囲にわたる）に対して向けられており、Ｖ２Ｖ３に対する反応性は例外的に記録された（Ｍａｅｒｔｅｎｓら、１９９７）。このチンパンジーは１ａ単離株に感染しているので、抗体応答を、Ｅ１−１ａ抗原に対する交差反応性についても評価した。ＷＯ９９／６７２８５の図１３において見られるように、このような交差反応性抗体は、抗体集団全体のほんの一部を形成するにすぎないとしても、確かに生成されている。顕著なのは、肝臓中のウイルス抗原の再出現と血清中の検出可能な抗１ａ  Ｅ１抗体の消失との相関である。
Ｔ細胞反応性の分析は、これらのＴ細胞の刺激インデックスが０．５から５に上昇し、追跡期間中上昇したままにとどまるので、免疫系のこのコンパートメントがワクチンによって特異的に刺激されることを示した（ＷＯ９９／６７２８５の図１４）。
【０２１４】
実施例１４：Ｅ１でのＨＣＶ慢性キャリアの再増強（ｒｅｂｏｏｓｔｉｎｇ）
実施例１２および１３において観察されたＥ１抗体タイターは安定ではなく、時間とともに低下したので（１ｂ感染チンパンジーにおいては検出不能レベルにまで）、この抗体応答が、付加的な追加免疫によって再び増大し得るかどうかを調べた。両チンパンジーを、３週間の間隔で３回の連続的筋内免疫によって再度免疫した（ＲＩＢＩアジュバントと混合された５０μｇのＥ１）。ＷＯ９９／６７２８５の図８および１１から判定し得るように、抗Ｅ１応答は、実際、増強され得、再び肝臓中のウイルス抗原レベルは検出限界未満に低減した。しかし、トンにおいては、血清中のウイルス量は一定のままであった（ＷＯ９９／６７２８５の図１１）。追跡期間中初めて、１ｍｌ当り＜１０５ゲノム等量のウイルス血症レベルが測定された。
注目すべきは、最初のシリーズの免疫について既にそうであったように、サブタイプ１ｂのＨＣＶ株に感染したチンパンジー（フィル）はサブタイプ１ａのＨＣＶ株に感染したチンパンジーよりも低い抗Ｅ１タイターで応答する（トンについて最初のラウンドにおける最高タイター１４．５×１０３対３０×１０３、そして付加的な追加免疫後フィルについてわずか１．２×１０３対トンについて４０×１０３）という知見である。両方の動物について有益な効果は同様であるように見えるが、この実験から、別のサブタイプまたはゲノタイプ由来のＥ１タンパク質での慢性キャリアの免疫は、より高いタイターに達するのに特に有益であり得、おそらく、感染サブタイプまたはゲノタイプによって誘導された、先に存在する、宿主中に存在する特異的免疫抑制を回避しうる、と結論することができる。あるいは、相同の環境（１ｂワクチン＋１ｂ感染）において観察されたより低いタイターは、ウイルスに対する抗体の大部分の結合を示す可能性がある。したがって、誘導された抗体は中和能を有する可能性がある。
【０２１５】
実施例１５：チンパンジーにおけるＥ１ワクチン接種の予防的有用性の証明
ＨＣＶ  Ｅ１ｓタンパク質（アミノ酸１９２〜３２６）を、組換えワクシニアウイルスＨＣＶ１１Ｂを用いてＶｅｒｏ細胞において発現させた。このワクシニアウイルスは、（米国特許第６１５０１３４号に記載されたとおり；その内容全体は参照によりここに援用される）ｖｖＨＣＶ１１Ａと本質的に同一であるが、ＲＫ１３からＶｅｒｏ細胞に継代された。このタンパク質を、本質的にＰＣＴ／Ｅ９９／０４３４２（ＷＯ９９／６７２８５）の実施例９に記載されたように、（レンチルクロマトグラフィ、還元アルキル化およびサイズ排除クロマトグラフィによって）システインのアルキル化剤としてヨードアセタミドを使用して精製した。精製後、ＰＣＴ／Ｅ９９／０４３４２の実施例１に記載されたようにサイズ排除クロマトグラフィによって３％Ｅｍｐｉｇｅｎ−ＢＢを３％ベタインに交換した。このプロセスは、Ｅ１ｓを粒子として回収することを可能にする。最後に、この物質を、０．５％ベタインおよび５００μｇ／ｍｌのＥ１ｓ濃度を有するＰＢＳに脱塩した。このＥ１を、等量のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  １．３％（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ， Ｄｅｎｍａｒｋ）と混合し、最終的に８倍容量の０．９％ＮａＣｌでさらに希釈し、５０μｇ／ｍｌのＥ１および０．１３％のＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌの濃度のミョウバンアジュバント含有Ｅ１を生じた。
ＨＣＶ  Ｅ２デルタＨＶＲＩ（アミノ酸４１２〜７１５）を、ＰＣＴ／Ｅ９９／０４３４２の実施例８に記載されたｐｖＨＣＶ−１０１と野生型ワクシニアウイルスから組換えされた組換えワクシニアウイルスＨＣＶ１０１を用いて、本質的にＥ１について記載したようにＶｅｒｏ細胞で発現させ、精製した。Ｅ２デルタＨＶＲＩもまた、Ｅｍｐｉｇｅｎからベタインに交換した後、粒子として挙動する（動的光散乱によって測定）。
ＨＣＶ−ＲＮＡおよびＨＣＶ抗体について陰性の試験結果を与えた５匹のチンパンジーを選択した。動物のうち１匹（ハウブ）は免疫せず、２匹の動物はミョウバンでアジュバント化した５０μｇのＥ１での６回の免疫を受け（マーティおよびヨーラン）、残りの２匹の動物はミョウバンでアジュバント化した５０μｇのＥ２デルタＨＶＲＩでの６回の免疫を受けた（ジョーストおよびカーリン）。すべての免疫は、３週間の間隔で筋内投与した。液性および細胞性応答を、各動物においてそれらを免疫した抗原に対して評価し、各動物において表１１に示すように両タイプの応答が検出された。
表１１：６回目の免疫の２週間後に抗体タイターをＥＬＩＳＡによって決定した。試料の連続希釈物を社内（インハウス）標準と比較した（１０００ｍＵ／ｍｌのＥ１または抗Ｅ２デルタＨＶＲＩ抗体を有すると定義されたこの社内標準は、高抗エンベロープタイターに基づいて選択されたＨＣＶ慢性キャリア由来の３つの血清の混合物である）。刺激インデックス（細胞性免疫応答を反映する）は、エンベロープ抗原の存在下または不存在下で、３回目の免疫後２週間の動物から採取したＰＢＭＣを培養し、培養５日後の１８時間のパルス中にこれらの細胞に取り込まれたトリチウム化チミジンの量を決定することによって得られた。刺激インデックスは、エンベロープ抗原と培養された細胞に取り込まれたチミジン対抗原なしで培養されたものの比である。＞３の刺激インデックスは陽性シグナルと考えられる。
【０２１６】
【表１３】
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【０２１７】
６回の免疫の最後の３週間後、対照を含むすべての動物を、１００ＣＩＤ（チンパンジー感染用量）のゲノタイプ１ｂ接種物（Ｊ４．９１；ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭａｒｙｌａｎｄのＪ． Ｂｕｋｈ博士の好意により提供された）で攻撃した。ワクチンタンパク質とＪ４．９１単離株（その配列情報は受託番号ＢＡＡ０１５８３として利用可能である）とのアミノ酸配列多様性は、Ｅ１ｓについて７％（１３５アミノ酸のうち９個）、そしてＥ２デルタＨＶＲＩについて１１％（３０４アミノ酸のうち３２個）である。結果として、この攻撃は非相同と考えられ、現実生活の攻撃を反映する。
すべてのチンパンジーは、攻撃後７日にＨＣＶ−ＲＮＡ陽性（Ｍｏｎｉｔｏｒ ＨＣＶ、Ｒｏｃｈｅ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄで決定した）となり、最初のＡＬＴおよびガンマＧＴピークは第３５日と６３日の間に測定された。これは、すべてのチンパンジーが急性肝炎を発症したことを証明する。顕著なことに、Ｅ１で免疫した両方の動物は、その感染を散らしたが、Ｅ２デルタＨＶＲＩおよび対照の動物はそうではなかった。これは、Ｅ１で免疫された動物が第９８日（ヨーラン）および１３３日（マーティ）にＨＣＶ−ＲＮＡを失い（Ｍｏｎｉｔｏｒ ＨＣＶ、Ｒｏｃｈｅ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって決定した）、毎月試験して第２７３日まで陰性のままであったという事実によって証明される。その他のすべての動物は、２７３日間の追跡期間全体の間ＲＮＡ陽性のままであり、それまではＡＬＴおよびガンマＧＴ値はＥ１で免疫されたチンパンジーについてのように正常に戻らず、次第に増大した。
結論として、本発明者らは、Ｅ１免疫が、ＨＣＶに関する主要な健康問題である慢性感染への発展を防止することによって、ＨＣＶ感染の自然の経過を変えることを示した。
【０２１８】
実施例１６：チンパンジーにおいて感染の除去を可能にした同様のＥ１応答はヒトにおいて誘導することができる
ヒトにおいてＥ１免疫の予防的効果を得るためには、チンパンジーと比較して同様の免疫応答がヒトにおいて誘導されうることが必要である。したがって、本発明者らは、抗Ｅ１応答（液性または細胞性）が全く検出できなかった２０人のヒト男性志願者を、０．５ｍｌ中の０．１３％Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌで処方された２０μｇのＥ１ｓの３用量で免疫した。すべての免疫は、３週間の間隔をあけて筋内で与えた。表１２で証明するように、２０人の志願者のうち１７人は、Ｅ１に対して有意な液性および細胞性免疫を実際に示し、これは深刻な悪影響を伴わなかった。１人の志願者（個体０２１）のみが、３回のＥ１免疫後に液性も細胞性もどちらの応答もカットオフレベルを超えなかったため、不応答者と考えられた。チンパンジーと比較して液性応答が低いという観察は、２０μｇでの３回の免疫のみが与えられ、５０μｇでの６回ではなかったという事実に関連している。
表１２：抗体タイターを、３回目の免疫後２週間でＥＬＩＳＡによって決定した。試料の連続希釈物を社内標準と比較した（１０００ｍＵ／ｍｌのＥ１または抗Ｅ２デルタＨＶＲＩ抗体を有すると定義されたこの社内標準は、高抗エンベロープタイターに基づいて選択されたＨＣＶ慢性キャリア由来の３つの血清の混合物である）。刺激インデックス（細胞性免疫応答）は、１μｇのＥ１ｓの存在下または不存在下で、３回目の免疫後２週間の個体から採取したＰＢＭＣを培養し、培養５日後の１８時間のパルス中にこれらの細胞に取り込まれたトリチウム化チミジンの量を決定することによって得られた。刺激インデックスは、エンベロープ抗原と培養された細胞に取り込まれたチミジン対抗原なしで培養されたものの比である。＞３の刺激インデックスは陽性シグナルと考えられる。
【０２１９】
【表１４】
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【０２２０】
＊この個体は、ＥＬＩＳＡシグナルの有意な増大が免疫前試料と３回免疫後の試料との間に見られず、しかしタイターが非常に低く、正確な決定が不可能であるため、免疫後抗Ｅ１陽性と考えられる。
【０２２１】
実施例１７：ワクチン接種した健常志願者におけるＥ１応答の増強
実施例１６の２０人のヒト志願者のうち１９人を、０．５ｍｌ中の０．１３％Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌで処方した２０μｇのＥ１ｓで第２６週（すなわち３回目の免疫の２０週間後）にもう一度追加免疫した。再び抗体タイターおよび細胞性免疫応答をこの付加的な免疫の２週間後に決定した。すべての個体において、抗体タイターは２０週間の間隔のあいだに低減していたが、この付加的な免疫によって第８週に観察されたレベルと同じまたはそれ以上まで容易に増強され得た。平均で、抗体タイターは、第８週のタイターと比較してこの追加免疫後は２倍高く、第２６週のタイターと比較して７倍高かった（表１３）。
表１３：抗体タイターを、３回目の免疫後２週間（＝第８週）および２０週間（＝第２６週）、および最後に追加免疫後２週間（＝第２８週）にＥＬＩＳＡによって決定した。試料の連続希釈物を社内標準と比較した（１０００ｍＵ／ｍｌのＥ１抗体を有すると定義されたこの社内標準は、高抗エンベロープタイターに基づいて選択されたＨＣＶ慢性キャリア由来の３つの血清の混合物である）。正確な比較のために、第８週でのタイターの決定を、第２６週および２８週の試料と同じアッセイ内で反復したが、これは実施例１６の表１２との違いを説明する。
【０２２２】
【表１５】
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【０２２３】
顕著なことに、Ｔ細胞応答は個体の大多数について２０週間の間隔の後にもなお高かった。以前のワクチン接種の結果としてほとんどの個体に存在する破傷風（ｔｅｔａｎｏｓ）応答に対する標準化を考慮に入れると、刺激インデックスの幾何平均には変化はない。付加的な追加免疫後、破傷風応答に対する標準化を考慮にいれて、変化が見られない（図５１）。これは、強いＴヘルプ応答が３回のＥ１免疫後に誘導されたことを確認するものであり、これらの免疫が、少なくとも６ヶ月の間、さらなる追加免疫を必要としない、既に非常に良好なＴヘルプメモリーを誘導したことを示す。
図５１の凡例：刺激インデックス（細胞性免疫応答）は、３μｇの組換えＥ１ｓまたは２μｇの破傷風トキソイドの存在下または不存在下で、免疫前（第０週）、３回目の免疫の２週間後（第８週）、追加免疫前（第２６週）および追加免疫の２週間後（第２８週）に個体から採取したＰＢＭＣ（１０５細胞）を培養し、培養５日後の１８時間のパルス中にこれらの細胞に取り込まれたトリチウム化チミジンの量を決定することによって得られた。刺激インデックスは、エンベロープ抗原と培養された細胞に取り込まれたチミジン対抗原なしで培養されたものとの比である。第０週および第８週の試料を最初のアッセイ（Ａ）で決定し、第２６週および第２８週の試料を第２のアッセイ（Ｂ）（第０週の試料を再分析した）で決定した。結果は、２０人すべての（Ａ，実験）または１９人（Ｂ，実験）の志願者の幾何平均刺激インデックスとして表す。
さらに、Ｔｈ１サイトカインであるインターフェロン−γおよびＴｈ２サイトカインであるインターロイキン−５を、第２６および２８週に採取しＥ１で再刺激した試料のＰＢＭＣ培養の上清中で測定した。図５２から判定され得るように、Ｅ１刺激ＰＢＭＣによって分泌される優勢サイトカインはインターフェロン−γである。ミョウバンはＴｈ２誘導因子として知られているので、ミョウバンでアジュバント化したＥ１について強いＴｈ１偏向型の応答が観察されるのを見ることは、非常に驚くべきことである。再度、最終追加免疫前（第２６週）に既に非常に強い応答が観察されるので、これらの結果は、良好なＴ細胞メモリー応答が誘導されることを確認する。インターフェロン−γ分泌は、特異的であることが見出されたが、これは、更なる実験において本発明者らは第０週に採取した試料を用いてこれらの志願者のＥ１刺激細胞培養と非刺激細胞培養との間でインターフェロン−γ分泌に差を見出さなかったからである。
図５２の凡例：追加免疫前（第２６週）および追加免疫２週間後（第２８週）に個体から採取したＰＢＭＣ（１０５細胞）を、３μｇの組換えＥ１ｓ（Ｅ１）または２μｇの破傷風トキソイド（ＴＴ）の存在下、または抗原なし（ＢＩ）で培養した。２４時間後（インターロイキン−５）または１２０時間後（インターフェロン‐γ）に採取された上清においてＥＬＩＳＡによってサイトカインを測定した。刺激インデックスは、エンベロープ抗原と培養された細胞の上清中で測定されたサイトカイン対抗原なしで培養されたものとの比である。結果は、１９人すべての志願者の分泌されたｐｇサイトカイン／ｍｌの幾何平均として表す。検出限界を下回るサイトカイン量の試料には、検出限界の値を与えた。同様に、アッセイの直線範囲を逸脱する非常に高濃度のサイトカインを有する試料には、アッセイの直線範囲の限界の値を与えた。
【０２２４】
実施例１８：ワクチン接種した健常志願者におけるＥ１に対する細胞性応答の詳細マッピング
Ｅ１特異的応答をマッピングするために、標準Ｆｍｏｃ化学を用いて、８アミノ酸の重複を有し、Ｅ１ｓの全体の配列をカバーする、一連の２０マーペプチドを合成した。すべてのペプチドを、Ｃ末端でアミド化し、Ｎ末端でアセチル化した（ＩＧＰ１６２６は遊離アミノ末端を有し、例外である）。
【０２２５】
【表１６】
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【０２２６】
Ｅ１ｓでワクチン接種されていない異なる１４人の健常ドナーおよびＥ１ｓでワクチン接種された１０人のドナー由来のＰＢＭＣを、２５μｇ／ｍｌ（未ワクチン接種者）または１０μｇ／ｍｌ（ワクチン接種者、３回目または追加免疫注射後に試料を採取）の各ペプチド別個の存在下で培養した。図５３から判定され得るように、ペプチドＩＧＰ１６２７、１６２９、１６３０，１６３１，１６３３，１６３５および１６３５はすべて、未ワクチン接種者と比較してワクチン接種者において有意に高い応答を誘導した。カットオフとして３という刺激インデックスを用いて、ペプチドＩＧＰ１６２７、１６２９、１６３１および１６３５はもっとも高頻度で認識された（すなわち、試験したワクチン接種者の少なくとも半数に認識された）。この実験は、哺乳動物細胞培養に由来するＥ１ｓによって誘導されたＴ細胞応答が、Ｅ１に対して特異的であることを証明する。これは、これらの応答が、哺乳動物細胞培養由来の同じＥ１ｓによって呼び起こされるのみでなく、合成ペプチドによっても呼び起こされるからである。さらに、この実験は、Ｅ１において最も免疫原性のＴ細胞ドメインが、アミノ酸２０４〜２２３、２２８〜２７１、２７６〜２９５、３００〜３３１の間、そしてより具体的にはアミノ酸２０４〜２２３、２２８〜２４７、２５２〜２７１および３００〜３１９の間に位置することを明らかにする。
図５３の凡例：刺激インデックス（細胞性免疫応答）は、ペプチドの存在下または不存在下でＰＢＭＣ（３×１０５細胞）を培養し、培養５〜６日後のパルス中にこれらの細胞に取り込まれたトリチウム化チミジンの量を滴定することによって得られた。刺激インデックスは、ペプチドと培養された細胞に取り込まれたチミジン対ペプチドなしで培養されたものとの比である。結果は、ワクチン接種者（上のパネル）または未ワクチン接種者（下のパネル）について個別の値として表す。
本発明はまた、そのために、以下のＥ１ペプチド、タンパク質、それらを含む組成物およびキット、これらのペプチドおよびそれらを含むタンパク質をコードする核酸配列、およびそれらの製造および使用の方法をも、それらが本発明の他のＥ１および関連ペプチドについてここで一般的に記載されているように、提供する。
ＩＧＰ１６２６、Ｅ１領域の位置１９２〜２１１にわたる（配列番号１１２）、
ＩＧＰ１６２７、Ｅ１領域の位置２０４〜２２３にわたる（配列番号１１３）、
ＩＧＰ１６２８、Ｅ１領域の位置２１６〜２３５にわたる（配列番号１１４）、
ＩＧＰ１６２９、Ｅ１領域の位置２２８〜２４７にわたる（配列番号１１５）、
ＩＧＰ１６３０、Ｅ１領域の位置２４０〜２５９にわたる（配列番号１１６）、
ＩＧＰ１６３１、Ｅ１領域の位置２５２〜２７１にわたる（配列番号１１７）、
ＩＧＰ１６３２、Ｅ１領域の位置２６４〜２８３にわたる（配列番号１１８）、
ＩＧＰ１６３３、Ｅ１領域の位置２７６〜２９５にわたる（配列番号１１９）、
ＩＧＰ１６３４、Ｅ１領域の位置２８８〜３０７にわたる（配列番号１２０）、
ＩＧＰ１６３５、Ｅ１領域の位置３００〜３１９にわたる（配列番号１２１）、
ＩＧＰ１６３６、Ｅ１領域の位置３１２〜３３１にわたる（配列番号１２２）。
【０２２７】
【表１７】
2004525885.tif 000020
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【図面の簡単な説明】
【図１】
プラスミドｐｇｐｔ  ＡＴＡ１８の制限地図。
【図２】
プラスミドｐｇｓ  ＡＴＡ１８の制限地図。
【図３】
プラスミドｐＭＳ６６の制限地図。
【図４】
プラスミドｐｖ  ＨＣＶ−１１Ａの制限地図。
【図５】
ＩＦＮ処理に対する無応答者における抗Ｅ１レベル。
【図６】
ＩＦＮ処理に対する応答者における抗Ｅ１レベル。
【図７】
ＩＦＮ処理に対する完全応答患者における抗Ｅ１レベル。
【図８】
ＩＦＮ処理に対する不完全応答者における抗Ｅ１レベル。
【図９】
ＩＦＮ処理に対する不応答者における抗Ｅ２レベル。
【図１０】
ＩＦＮ処理に対する応答者における抗Ｅ２レベル。
【図１１】
ＩＦＮ処理に対する不完全応答患者における抗Ｅ２レベル。
【図１２】
ＩＦＮ処理に対する完全応答者における抗Ｅ２レベル。
【図１３】
ペプチドと競合したヒト抗Ｅ１反応性。
【図１４】
ペプチドとの抗Ｅ１モノクローナル抗体の反応性の競合。
【図１５】
ＩＦＮ処理に対する不応答者における抗Ｅ１（エピトープ１）レベル。
【図１６】
ＩＦＮ処理に対する応答者における抗Ｅ１（エピトープ１）レベル。
【図１７】
ＩＦＮ処理に対する不応答者における抗Ｅ１（エピトープ２）レベル。
【図１８】
ＩＦＮ処理に対する応答者における抗Ｅ１（エピトープ２）レベル。
【図１９】
ペプチドとの抗Ｅ２モノクローナル抗体の反応性の競合。
【図２０】
ペプチドと競合したヒト抗Ｅ２反応性。
【図２１】
本発明の核酸配列。本発明のＥ１またはＥ２タンパク質をコードする核酸配列は、配列表に示すそれぞれのＥ１またはＥ２タンパク質のアミノ酸配列に翻訳され得る（配列番号３〜１３、２１〜３１、３５および４１〜４９は残基番号１から開始するリーディングフレームで翻訳され、配列番号３７〜３９は残基番号２から開始するリーディングフレームで翻訳される）。
【図２２】
ｗＨＣＶ３９（タイプ１ｂ）、ｗＨＣＶ４０（タイプ１ｂ）、ｗＨＣＶ６２（タイプ３ａ）およびｗＨＣＶ６３（タイプ５ａ）に感染した細胞ライセートの４回の異なるＥ１精製のレンチルレクチンクロマトグラフィ溶出液フラクションから得られたＥＬＩＳＡ結果。
【図２３】
図２２に示す値に基づいた４つの異なるＥ１構築物のレンチルレクチンクロマトグラフィから得られた溶出プロフィール。
【図２４】
ｗＨＣＶ３９（タイプ１ｂ）、ｗＨＣＶ４０（タイプ１ｂ）、ｗＨＣＶ６２（タイプ３ａ）およびｗＨＣＶ６３（タイプ５ａ）に感染した細胞ライセートの４回の異なるＥ１精製のゲルろ過クロマトグラフィ後に得られたフラクションから得られたＥＬＩＳＡ結果。
【図２５】
タイプ１ｂ（１）、タイプ３ａ（２）、およびタイプ５ａ（３）（それぞれｗＨＣＶ３９、ｗＨＣＶ６２、ｗＨＣＶ６３に感染したＲＫ１３細胞由来；実施例５．２〜５．３におけるようにレンチルレクチン上で精製され、還元されたもの）および標準（４）のＥ１タンパク質の精製から得られたプロフィール。「１」、「２」および「３」で示すピークは、純粋Ｅ１タンパク質ピークを表す（図２４を参照されたい、Ｅ１反応性は主にフラクション２６〜３０中）。
【図２６】
Ｅ１  ｗＨＣＶ４０（タイプ１ｂ）の生ライセート（レーン１）、図２５に示すフラクション１０〜１７を表すｗＨＣＶ４０のゲルろ過のプール１（レーン２）、図２５に示すフラクション１８〜２５を表すｗＨＣＶ４０のゲルろ過のプール２（レーン３）、およびＥ１プール（フラクション２６〜３０）（レーン４）の、実施例４に記載されたＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色。
【図２７】
Ｅ１構築物３９（タイプ１ｂ）および６２（タイプ３ａ）のゲルろ過のフラクションのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼブロット。タンパク質は、ＮＥＭ−ビオチンで標識された。レーン１：出発ゲルろ過構築物３９；レーン２：フラクション２６構築物３９；レーン３：フラクション２７構築物３９；レーン４：フラクション２８構築物３９；レーン５：フラクション２９構築物３９；レーン６：フラクション３０構築物３９；レーン７：フラクション３１構築物３９；レーン８：分子量マーカー；レーン９：出発ゲルろ過構築物６２；レーン１０：フラクション２６構築物６２；レーン１１：フラクション２７構築物６２；レーン１２：フラクション２８構築物６２；レーン１３：フラクション２９構築物６２；レーン１４：フラクション３０構築物６２；レーン１５：フラクション３１構築物６２。
【図２８】
図２６と同一の条件下で行ったｗＨＣＶ−３９（Ｅ１ｓ、タイプ１ｂ）およびｗＨＣＶ−６２（Ｅ１ｓ、タイプ３ａ）のゲルろ過フラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色。レーン１：出発ゲルろ過構築物３９；レーン２：フラクション２６構築物３９；レーン３：フラクション２７構築物３９；レーン４：フラクション２８構築物３９；レーン５：フラクション２９構築物３９；レーン６：フラクション３０構築物３９；レーン７：フラクション３１構築物３９；レーン８：分子量マーカー；レーン９：出発ゲルろ過構築物６２；レーン１０：フラクション２６構築物６２；レーン１１：フラクション２７構築物６２；レーン１２：フラクション２８構築物６２；レーン１３：フラクション２９構築物６２；レーン１４：フラクション３０構築物６２；レーン１５：フラクション３１構築物６２。
【図２９】
精製手順の完全な概略を与える抗Ｅ１マウスモノクローナル抗体５Ｅ１Ａ１０でのウェスタンブロット分析。レーン１：粗ライセート；レーン２：レンチルクロマトグラフィの素通り物（フロースルー）；レーン３：レンチルクロマトグラフィ後のＥｍｐｉｇｅｎｎ−ＢＢでの洗浄物；レーン４：レンチルクロマトグラフィの溶出液；レーン５：レンチル溶出液の濃縮中のフロースルー；レーン６：サイズ排除クロマトグラフィ（ゲルろ過）後のＥ１のプール。
【図３０】
ｗＨＣＶ４４に感染したＲＫ１３細胞由来のＥ２タンパク質のレンチルレクチンクロマトグラフィのＯＤ２８０プロフィール（連続線）。点線は、（実施例６のように）ＥＬＩＳＡによって検出されたＥ２反応性を表す。
【図３１Ａ】
ｗＨＣＶ４４に感染したＲＫ１３細胞由来のレンチルレクチンゲルろ過クロマトグラフィのＥ２タンパク質のプールのＯＤ２８０プロフィール（連続線）。ここでは、Ｅ２プールはゲルろ過カラムに直ちに適用されている（非還元条件）。点線は、（実施例６のように）ＥＬＩＳＡによって検出されたＥ２反応性を表す。
【図３１Ｂ】
ｗＨＣＶ４４に感染したＲＫ１３細胞由来のレンチルレクチンゲルろ過クロマトグラフィのＥ２タンパク質のプールのＯＤ２８０プロフィール（連続線）。ここでは、Ｅ２プールは実施例５．３のように還元され、ブロックされた（還元条件）。点線は、（実施例６のように）ＥＬＩＳＡによって検出されたＥ２反応性を表す。
【図３２】
図３１Ｂに示すような還元条件下のゲルろ過後のｗＨＣＶ４４から発現されたＥ２タンパク質のＥＬＩＳＡ反応性およびＮｉ２＋−ＩＭＡＣクロマトグラフィ。
【図３３】
図３２に示すＮｉ２＋−ＩＭＡＣクロマトグラフィの２００ｍＭイミダゾール溶出工程（レーン２）および３０ｍＭイミダゾール洗浄（レーン１）によって回収された精製Ｅ２タンパク質０．５μｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥの銀染色。
【図３４】
イミダゾールを除去することを意図した、図３３に示すような２００ｍＭイミダゾールによって回収された精製Ｅ２タンパク質の脱塩工程のＯＤプロフィール。
【図３５Ａ】
ＬＩＡスキャン法によって決定された処理中および処理後６〜１２ヶ月の間に追跡された、ＮＲおよびＬＴＲについての異なるＨＣＶ抗原（コア１、コア２、Ｅ２ＨＣＶＲ、ＮＳ３）に対する抗体レベル。平均値は、白四角を付した曲線で示す。
【図３５Ｂ】
ＬＩＡスキャン法によって決定された処理中および処理後６〜１２ヶ月の間に追跡された、ＮＲおよびＬＴＲについての異なるＨＣＶ抗原（ＮＳ４、ＮＳ５、Ｅ１およびＥ２）に対する抗体レベル。平均値は、白四角を付した曲線で示す。
【図３６】
ＬＴＲおよびＮＲ群における平均Ｅ１抗体（Ｅ１Ａｂ）およびＥ２抗体（Ｅ２Ａｂ）レベル。
【図３７】
タイプ１ｂおよびタイプ３ａに関して不応答者（ＮＲ）および長期応答者（ＬＴＲ）についての平均Ｅ１抗体（Ｅ１Ａｂ）レベル。
【図３８】
抗Ｅ２モノクローナル抗体の相対地図位置。
【図３９】
ＨＣＶ  Ｅ１エンベロープタンパク質の部分的脱グリコシル化。ｗＨＣＶ１０Ａ感染ＲＫ１３細胞のライセートを、製造者の指示にしたがって異なる濃度のグリコシダーゼとともにインキュベートした。右パネル：グリコペプチダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）。左パネル：エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）。
【図４０】
ＨＣＶ  Ｅ２エンベロープタンパク質の部分的脱グリコシル化。ｗＨＣＶ６４感染（Ｅ２）およびｗＨＣＶ４１感染（Ｅ２ｓ）ＲＫ１３細胞のライセートを、製造者の指示にしたがって異なる濃度のグリコペプチダーゼＦ（ＰＮＧアーゼＦ）とともにインキュベートした。
【図４１】
ＨＣＶ  Ｅ１糖タンパク質のインビトロ突然変異誘発。変異配列および新規の制限部位の作製の地図。
【図４２Ａ】
ＨＣＶ  Ｅ１糖タンパク質のインビトロ突然変異誘発（パート１）。ＰＣＲ増幅の第一段階。
【図４２Ｂ】
ＨＣＶ  Ｅ１糖タンパク質のインビトロ突然変異誘発（パート２）。重複伸長およびネストＰＣＲ。
【図４３】
ＨＣＶ  Ｅ１糖タンパク質のインビトロ突然変異誘発。増幅の第一段階中に合成されたＰＣＲ突然変異フラグメント（ＧＬＹ−＃およびＯＶＲ−＃）の地図。
【図４４Ａ】
ＨｅＬａ（左）およびＲＫ１３（右）細胞において発現されたＥ１糖タンパク質突然変異体のウェスタンブロットによる分析。レーン１：野生型ＶＶ（ワクシニアウイルス）；レーン２：もとのＥ１タンパク質（ｗＨＣＶ−１０Ａ）；レーン３：Ｅ１突然変異体Ｇｌｙ−１（ｗＨＣＶ−８１）；レーン４：Ｅ１突然変異体Ｇｌｙ−２（ｗＨＣＶ−８２）；レーン５：Ｅ１突然変異体Ｇｌｙ−３（ｗＨＣＶ−８３）；レーン６：Ｅ１突然変異体Ｇｌｙ−４（ｗＨＣＶ−８４）；レーン７：Ｅ１突然変異体Ｇｌｙ−５（ｗＨＣＶ−８５）；レーン８：Ｅ１突然変異体Ｇｌｙ−６（ｗＨＣＶ−８６）。
【図４４Ｂ】
ＰＣＲ増幅／制限によるＥ１グリコシル化突然変異体ワクシニアウイルスの分析。レーン１：Ｅ１（ｗＨＣＶ−１０Ａ）、ＢｓｐＥＩ；レーン２：Ｅ１  ＧＬＹ−１（ｗＨＣＶ−８１）、ＢｓｐＥＩ；レーン４：Ｅ１（ｗＨＣＶ−１０Ａ）、ＳａｃＩ；レーン５：Ｅ１  ＧＬＹ−２（ｗＨＣＶ−８２）、ＳａｃＩ；レーン７：Ｅ１（ｗＨＣＶ−１０Ａ）、ＳａｃＩ；レーン８：Ｅ１  ＧＬＹ−３（ｗＨＣＶ−８３）、ＳａｃＩ；レーン１０：Ｅ１（ｗＨＣＶ−１０Ａ）、ＳｔｕＩ；レーン１１：Ｅ１  ＧＬＹ−４（ｗＨＣＶ−８４）、ＳｔｕＩ；レーン１３：Ｅ１（ｗＨＣＶ−１０Ａ）、ＳｍａＩ；レーン１４：Ｅ１  ＧＬＹ−５（ｗＨＣＶ−８５）、ＳｍａＩ；レーン１６：Ｅ１（ｗＨＣＶ−１０Ａ）、ＳｔｕＩ；レーン１７：Ｅ１  ＧＬＹ−６（ｗＨＣＶ−８６）、ＳｔｕＩ；レーン３−６−９−１２−１５：低分子量マーカー、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ＋、ＭｓｐＩ。
【図４５】
Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて発現された組換えＥ２のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。接種物をロイシン選択培地中で７２時間生育させ、完全培地で１／１５希釈した。２８℃での培養１０日後、培地試料を採取した。スピードバックで濃縮した培養上清２００μｌ等量をゲルに適用した。２つの別個の形質転換体を分析した。
【図４６】
グリコシル化欠損Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ突然変異体において発現された組換えＥ２のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。接種物をロイシン選択培地中で７２時間生育させ、完全培地で１／１５希釈した。２８℃での培養１０日後、培地試料を採取した。イオン交換クロマトグラフィで濃縮した培養上清３５０μｌ等量をゲルに適用した。
【図４７】
チンパンジーのプロフィールおよび免疫スケジュール。
【図４８】
３回の免疫後の細胞性応答。
【図４９】
繰り返したＥ１免疫に際しての細胞性応答の進展。
【図５０】
ＮＳ３免疫に際しての細胞性応答。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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