(57)【要約】安定化対照細胞、その製法およびその安定化細胞を含むキットが開示される。また、生物学的試料中の希少細胞を検出するための改良方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
希少細胞（rare cell）を単離および同定する方法における内部対照として用いるための安定化細胞の製法であって、該安定化対照細胞が、該希少細胞と共通した決定基を有し、
ａ）該対照細胞を同一のスペクトル特性を有する少なくとも２つの蛍光標識で重複して標識し；
ｂ）該標識細胞と細胞固定剤とを接触させ、該固定剤が該対照細胞上に存在する細胞構造および抗原部位の双方に影響し；
ｃ）過剰な固定剤を引き続いて除去して、該対照細胞の長期保存を促し、該対照細胞が、少なくとも６ヶ月までの期間物理的および生物学的に安定となることを含むことを特徴とする該製法。
【請求項２】
該細胞固定剤が、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の製法。
【請求項３】
該蛍光標識が、長鎖疎水性カルボシアニン、長鎖疎水性インドカルボシアニン、長鎖疎水性インドジカルボシアニン、およびそのアナログ、疎水性アミノスチリル色素ならびにＣ１８ローダミンＢおよびＣ１８フルオレセイン色素の長鎖アナログよりなる群から選択されることを特徴とする請求項１記載の製法。
【請求項４】
該対照細胞が、該細胞上に存在する抗原に免疫学的に特異的な抗体で標識され、該抗体が、蛍光分子にコンジュゲートすることを特徴とする請求項１記載の製法。
【請求項５】
該対照細胞の細胞成分が、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、アクリジンオレンジ、ローダミン誘導体、ニュートラルレッドおよび疎水性ＢＯＤＩＰＹＴＭよりなる群から選択される色素で標識されることを特徴とする請求項１記載の製法。
【請求項６】
該細胞成分が、核酸、核、リソソーム、ゴルジ装置、ミトコンドリアおよび小胞体よりなる群から選択されることを特徴とする請求項５記載の製法。
【請求項７】
希少細胞を単離および同定する方法における内部対照として用いる安定化細胞の製法であって、該安定化対照細胞が、該希少細胞と共通した決定基を有し、
ａ）該対照細胞を同一のスペクトル特性を有する少なくとも２つの蛍光標識で重複して膜標識し；
ｂ）該標識細胞と細胞固定剤とを接触させ、該固定剤が該対照細胞上に存在する細胞構造および抗原部位の双方に影響し；
ｃ）過剰な固定剤を引き続いて除去して、該対照細胞の長期保存を促し、該対照細胞が、少なくとも６ヶ月までの期間物理的および生物学的に安定となり、ここに、該対照細胞が、その表面上で上皮細胞付着分子（ＥｐＣａｍ）を発現することを含むことを特徴とする該製法。
【請求項８】
該細胞固定剤が、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７記載の製法。
【請求項９】
該膜色素が、長鎖疎水性カルボシアニン、長鎖疎水性インドカルボシアニン、長鎖疎水性インドジカルボシアニン、およびそのアナログ、疎水性アミノスチリル色素ならびにＣ１８ローダミンＢおよびＣ１８フルオレセイン色素の長鎖アナログよりなる群から選択されることを特徴とする請求項７記載の製法。
【請求項１０】
希少細胞を単離および同定する方法における内部対照として用いる安定化細胞であって、該対照細胞が該希少細胞と共通した決定基を有し、ここに、該対照細胞は、同一のスペクトル特性を有する少なくとも２つの蛍光標識で重複して標識され、該対照細胞の細胞成分および抗原部位は、固定剤に対する曝露により少なくとも６ヶ月までの期間安定化される該安定化細胞。
【請求項１１】
浮遊密度媒体中で懸濁された請求項１０記載の対照細胞。
【請求項１２】
該細胞固定剤が、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択される請求項１０記載の対照細胞。
【請求項１３】
該蛍光標識が、長鎖疎水性カルボシアニン、長鎖疎水性インドカルボシアニン、長鎖疎水性インドジカルボシアニン、およびそのアナログ、疎水性アミノスチリル色素ならびにＣ１８ローダミンＢおよびＣ１８フルオレセイン色素の長鎖アナログよりなる群から選択される膜標識である請求項１０記載の対照細胞。
【請求項１４】
該対照細胞が、該細胞上に存在する抗原に免疫学的に特異的な抗体で標識され、該抗体が、蛍光分子にコンジュゲートした請求項１０記載の対照細胞。
【請求項１５】
該対照細胞の細胞成分が、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、アクリジンオレンジ、ローダミン誘導体、ニュートラルレッドおよび疎水性ＢＯＤＩＰＹＴＭよりなる群から選択される色素で標識された請求項１０記載の対照細胞。
【請求項１６】
希少細胞を単離および同定する方法における内部対照として用いられる安定化細胞であって、該安定化対照細胞が、該希少細胞と共通した決定基を有し、検出可能に標識された膜を含み、該細胞が、安定化細胞成分および抗原部位をさらに含み、該安定化が、固定剤に対する曝露により達成され、ここに、該対照細胞は、その表面上のＥｐＣａｍおよび細胞内でサイトケラチンを発現する腫瘍細胞である該安定化細胞。
【請求項１７】
浮遊密度媒体中で懸濁された請求項１６記載の対照細胞。
【請求項１８】
該細胞固定剤が、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択される請求項１６記載の対照細胞。
【請求項１９】
該膜標識が、長鎖疎水性カルボシアニン、長鎖疎水性インドカルボシアニン、長鎖疎水性インドジカルボシアニン、およびそのアナログ、疎水性アミノスチリル色素ならびにＣ１８ローダミンＢおよびＣ１８フルオレセイン色素の長鎖アナログよりなる群から選択される請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２０】
該膜が、同一のスペクトル特性を有する少なくとも２つの蛍光標識で重複して標識された請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２１】
マモグロブリン（mammoglobulin）、ヒト乳脂グロブリン（human milk fat globulin）およびＨＥＲ−２／ｎｅｕよりなる群から選択される第２の検出可能に標識された表面決定基をさらに含むＳＫＢＲ３乳癌細胞である請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２２】
ＭＣＦ−７乳癌細胞であって、さらに、エストロゲン受容体である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２３】
ＬＮＣａＰ前立腺癌細胞であって、さらに、ＰＳＭＡ、ＰＳＡおよびアンドロゲン受容体よりなる群から選択される第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２４】
ＣＥＭ  Ｔ細胞白血病癌細胞であって、さらに、ＣＤ４分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２５】
Ｒａｊｉ  Ｂ細胞白血病細胞であって、さらに、ＣＤ１９分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２６】
ＳＵ−ＤＨＬ非ホジキン白血病細胞であって、さらに、ＣＤ２０分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２７】
Ｃ３２黒色腫癌細胞であって、さらに、ＣＤ１４６分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項１６記載の対照細胞。
【請求項２７】
希少細胞を単離および同定する方法における内部対照として用いる安定化細胞であって、該安定化対照細胞が、該希少細胞と共通した決定基を有し、重複して標識された膜を含み、該膜が、同一のスペクトル特性を有する少なくとも２つの蛍光標識で標識され、該細胞が、さらに安定化細胞成分および抗原部位を含み、該安定化が、固定剤に対する曝露により達成され、ここに、該対照細胞が、腫瘍細胞、細菌感染細胞、ウイルス感染細胞、心筋細胞、循環系における内皮細胞、および母体循環系における胎児細胞よりなる群から選択される該安定化細胞。
【請求項２８】
該細胞固定剤が、パラホルムアルデヒド、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドおよびグリオキサールよりなる群から選択される請求項２７記載の対照細胞。
【請求項２９】
該蛍光標識が、長鎖疎水性カルボシアニン、長鎖疎水性インドカルボシアニン、長鎖疎水性インドジカルボシアニン、およびそのアナログ、疎水性アミノスチリル色素、ならびにＣ１８ローダミンＢおよびＣ１８フルオレセイン色素の長鎖アナログよりなる群から選択される膜標識である請求項２７記載の対照細胞。
【請求項３０】
該対照細胞が、該細胞上に存在する抗原に免疫学的に特異的な抗体で標識され、該抗体が、蛍光分子にコンジュゲートした請求項２７記載の対照細胞。
【請求項３１】
該対照細胞の細胞成分が、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、アクリジンオレンジ、ローダミン誘導体、ニュートラルレッドおよび疎水性ＢＯＤＩＰＹＴＭよりなる群から選択される色素で標識された請求項２７記載の対照細胞。
【請求項３２】
該細胞成分が、核酸、核、リソソーム、ゴルジ装置、ミトコンドリアおよび小胞体よりなる群から選択される請求項３１記載の対照細胞。
【請求項３３】
浮遊密度媒体中で懸濁された請求項２７記載の対照細胞。
【請求項３４】
混合細胞集団中で希少細胞を検出および計数する方法であって、該集団中の該希少細胞の存在が、疾患状態の重篤度を表し、
ａ）試験対象から血液試料を得、ここに、該試料は該希少細胞を含有すると疑われる混合細胞集団を含み；
ｂ）免疫磁気（immunomagnetic）試料を調製し、ここに、該生物学的標本が、他の試料成分の実質的な排除のために、希少細胞の決定基と特異的に反応するリガンドと結合した磁気粒子と混合され；
ｃ）該免疫磁気試料と該希少細胞の決定基を標識する少なくとも１つの試薬とを接触させ；次いで
ｄ）該標識された希少細胞を分析して、該免疫磁気試料中のいずれかの希少細胞の存在および細胞数を決定し、該試料中に存在する希少細胞数が大きくなるにつれ、該疾患の重篤度が大きくなり、ここに、改良は、該方法における内部対照細胞として用いる安定化細胞の添加を含み、該対照細胞が、該希少細胞と共通した決定基を有し、該対照細胞の該膜を検出可能に標識し、該対照細胞の細胞成分および抗原部位が、固定剤に対する曝露により少なくとも６ヶ月までの期間安定化されることを特徴とする該方法。
【請求項３５】
該希少細胞が癌細胞であって、該疾病状態が癌であることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
該膜が、同一のスペクトル特性を有する少なくとも２つの蛍光標識で重複して標識されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
該膜標識が、長鎖疎水性カルボシアニン、長鎖疎水性インドカルボシアニン、長鎖疎水性インドジカルボシアニン、およびそのアナログ、疎水性アミノスチリル色素ならびにＣ１８ローダミンＢおよびＣ１８フルオレセイン色素の長鎖アナログよりなる群から選択されることを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
該リガンドが抗−ＥｐＣａｍであって、該試薬が細胞内サイトケラチンを標識し、該ＥｐＣａｍおよび該サイトケラチンが、該希少細胞および該対照細胞の双方に存在することを特徴とする請求項３４記載の方法。
【請求項３９】
対照細胞がＳＫＢＲ３乳癌細胞であって、さらに、マモグロブリン、ヒト乳脂グロブリンおよびＨＥＲ−２／ｎｅｕよりなる群から選択される第２の検出可能に標識された表面決定基を含むことを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
対照細胞がＭＣＦ−７乳癌細胞であって、さらに、エストロゲン受容体である第２の検出可能に標識された表面決定基を含むことを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
対照細胞がＬＮＣａＰ前立腺癌細胞であって、さらに、ＰＳＭＡ、ＰＳＡおよびアンドロゲン受容体よりなる群から選択される第２の検出可能に標識された表面決定基を含むことを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４２】
対照細胞がＣＥＭ  Ｔ細胞白血病癌細胞であって、さらに、ＣＤ４分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含むことを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４３】
対照細胞がＲａｊｉ  Ｂ細胞白血病細胞であって、さらに、ＣＤ１９分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含むことを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４４】
対照細胞がＳＵ−ＤＨＬ非ホジキン白血病細胞であって、さらに、ＣＤ２０分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含むことを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４５】
対照細胞がＣ３２黒色腫癌細胞であって、さらに、ＣＤ１４６分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含むことを特徴とする請求項３８記載の方法。
【請求項４６】
循環している腫瘍細胞の存在につき患者の試料をスクリーニングする改良キットであって、
ａ）磁心材料、蛋白質ベースのコーティング材料および該ベースのコーティング材料に直接または間接的に結合した抗−ＥｐＣＡＭを含むコーティングされた磁気ナノ粒子；
ｂ）癌細胞決定基に結合特異性を有する少なくとも１つの抗体；
ｃ）分析から該腫瘍細胞以外の試料成分を排除する細胞特異的な色素を含み、
ここに、改良は内部対照として用いた安定化細胞を含む容器の付加を含み、該安定化対照細胞が、該希少細胞と共通した決定基を有し、ここに、該対照細胞の該膜は検出可能に標識され、かつ、該対照細胞の細胞成分および抗原部位が固定剤に対する曝露により少なくとも６ヶ月までの期間安定化され、該安定化対照細胞が浮遊密度媒体中で懸濁される該改良キット。
【請求項４７】
対照細胞がＳＫＢＲ３乳癌細胞であって、マモグロブリン、ヒト乳脂グロブリンおよびＨＥＲ−２／ｎｅｕよりなる群から選択される第２の検出可能に標識された表面決定基をさらに含む請求項４６記載のキット。
【請求項４８】
対照細胞がＭＣＦ−７乳癌細胞であって、さらに、エストロゲン受容体である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項４６記載のキット。
【請求項４９】
対照細胞がＬＮＣａＰ前立腺癌細胞であって、さらに、ＰＳＭＡ、ＰＳＡおよびアンドロゲン受容体よりなる群から選択される第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項４６記載のキット。
【請求項５０】
対照細胞がＣＥＭ  Ｔ細胞白血病癌細胞であって、さらに、ＣＤ４分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項４６記載の方法。
【請求項５１】
対照細胞がＲａｊｉ  Ｂ細胞白血病細胞であって、さらに、ＣＤ１９分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項４６記載の方法。
【請求項５２】
対照細胞がＳＵ−ＤＨＬ非ホジキン白血病細胞であって、さらに、ＣＤ２０分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項４６記載の方法。
【請求項５３】
対照細胞が、Ｃ３２黒色腫癌細胞であって、さらに、ＣＤ１４６分子である第２の検出可能に標識された表面決定基を含む請求項４６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、１９９９年２月１２日付で出願された米国出願番号０９／２４８,３８８号（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）の一部継続出願である。
【０００２】
発明の分野
本発明は、細胞選択および分析手順における内部機能対照としての予め標識された細胞の使用に関する。本発明は、希少細胞（rare cell）の単離に関連する手順における磁気標識、磁気選択、粘性、温度、試薬添加、試薬活性、および操作者の誤りのような種々のパラメーターにつき制御できる単一の存在物を提供する。本発明は、癌検診、ステージング（staging）、化学療法による治療のモニタリング、再発のモニタリング、ＤＮＡハイブリダイゼーション、および医学的診断ならびにモニタリングの多数の他の形態を含めた細胞選択の態様に有用である。本発明は、特に希少細胞分離に有用である。
【０００３】
発明の背景
大部分の癌による死亡は第一の腫瘍により惹起されない。代わりに、死は転移から生じる。すなわち、複数の広範囲の腫瘍コロニーが悪性細胞により確立され、それは元来の腫瘍部位からそれ自体を切り離し、体中、しばしば離れた部位まで移動する。第一の腫瘍が十分早期に検出されたならば、手術、放射線、化学療法、これらの処置のいくつかの組合せはしばしばそれを消失できる。不運にも、転移性コロニーは検出および除去するのがより難しく、それらをすべてうまく処置することは多くの場合不可能である。従って、臨床上の観点から、転移は癌の自然な進行における終局の事象と考えることができる。
【０００４】
さらに、転移能力は悪性腫瘍をユニークに特徴付ける性質である。癌転移は、以下の複合した一連の連続事象を含む：
１．第一の位置から周囲組織への拡張；
２．体腔および管への侵入；
３．循環系を介する離れた部位への輸送のための腫瘍細胞の放出；
４．停止部位（site of arrest）での組織の再侵入；および
５．腫瘍細胞の生存、血管形成および腫瘍成長を促すような新しい環境への適応。
【０００５】
癌および癌転移の複雑性、ならびに長年の癌患者の治療におけるフラストレーションに基づき、多数の試みが治療に導き、転移または再発に対するかかる治療の効果をモニターするような診断テストを開発するために成されてきた。また、かかるテストは、癌スクリーニングにおそらく用いることができ、乳房腫瘍についての乳房撮影法（mammography）、または前立腺癌についてのデジタル直腸検査（digital rectal exams）のごとき比較的大まかなテストに置き換えることができる。そのゴールに向けて、多数のテストが最近２０年間にわたり開発され、それらの利点が評価されている。最初の試みの一つは、癌胎児抗原［ＣＥＡ］用の免疫アッセイの構築であった。この抗原は、胎児細胞に現われ、ある種の癌における腫瘍細胞上で再び現れる。広範囲な努力が、ＣＥＡ、ならびにＰＳＡ、ＣＡ  １５.３、ＣＡ１２５、ＰＳＭＡ、ＣＡ２７.２９のごとき多数の他の「腫瘍」抗原についてのテストの有用性を評価するために成されてきた。これらの努力により、テスト試料中のかかる抗原の出現が一般的に予測されず役に立たないものであり、それが患者にほどんど希望がない場合にしばしば検出されるであることが判明した。しかしながら、最近数年において、一つのテストが、癌の早期検出、すなわち、前立腺癌についてのＰＳＡに有用であると判明した。追跡の理学的検査および生体組織検査と共に用いられた場合、ＰＳＡテストはそれが最良に処置される時点にて、前立腺癌の早期検出において顕著な役割を果たしている。
【０００６】
ＰＳＡテストの成功にも拘らず、そのテストは所望されたままである。例えば、高レベルのＰＳＡは、必ずしも癌と関連するとは限らなず、また、それらは腫瘍の転移の可能性の指標であるようでもない。これは、一部、ＰＳＡが正常な前立腺組織の成分ならびに他の未知の因子であるという事実によるかもしれない。さらに、かなり多くの前立腺癌患者が、生命を危うくしない疾患を局部に留め続けるであろうことが明らかになりつつある。転移する癌を持った患者と転移しない癌を持った患者間の良好な一致を得るための望みに基づいて、前立腺細胞が循環系において存在するかを決定するための試みが成されてきた。高いＰＳＡレベルおよび生体組織検査データに加えた場合、循環している腫瘍細胞の存在は、患者がどれくらい活発に治療されるべきかに関して支持を与えることができる。
【０００７】
循環している前立腺腫瘍細胞の存在を決定するための推奨されるアプローチは、血中ＰＳＡのメッセンジャーＲＮＡの発現につきテストすることである。これは、血液試料から全てのｍＲＮＡを単離し、ＲＴ−ＰＣＲを行う根気のいる手順を通して行われている。血中のかかる細胞の存在と、患者が積極的な処置を必要としていると予測される能力との間には良好な相関性は存在しない（ＬＧ  Ｇｏｍｅｌｌａ、Ｊ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ、１５８：３２６−３３７（１９９７））。ＰＣＲは、多数の状況で不可能でないならば、定量的に行う、すなわち、生体試料の容量当たりの腫瘍細胞数を測定するのに困難であることは注目すべきである。加えて、偽陽性は、この手法を用いてしばしば観察される。付加される欠点は、評価される試料サイズに基づくこの手法の感度に対する有限でかつ実際上の限界である。典型的には、テストは、赤血球の干渉から離れて精製された１０５ないし１０６個の細胞に対して行なわれる。正常な血液中の５〜１０×１０６個の白血球を用い、これは、１個の腫瘍細胞／０.１ｍｌ血液の感度の実用上の下限に相当する。従って、シグナルが検出できる前に、１ｍｌの血液中に約１０個の腫瘍細胞が存在する必要がある。さらに潜在的な複雑さとして、腫瘍細胞はしばしば遺伝学的に不安定である。従って、遺伝的再構成および配列変化を有する癌細胞は、ＰＣＲプライマーと標的配列との間の必要な配列の相補性を消失しかねないので、ＰＣＲアッセイにおいて見逃されかねない。
【０００８】
要約では、有用な診断テストは高度に敏感で、かつ確実に定量的である必要がある。かかるテストは、１ｍｌの血液中で単一の腫瘍細胞の存在を検出することができるべきであり、かくして、平均して、循環中で３０００〜４０００個の合計細胞まで対応すべきである。
動物に腫瘍を確立するための接種研究では、その細胞数は、確かに腫瘍の確立に導くことができる。さらに、３０００〜４０００個の循環する細胞は、腫瘍における合計細胞の０.０１％を示すならば、それは約４×１０７個の合計細胞を含むであろう。その細胞数を含む腫瘍は、現在存在するいずれの手法によっても可視化できないであろう。従って、腫瘍細胞が癌の初期の段階において流れれば、前記の感度を持つテストは癌を検出するであろう。腫瘍細胞が腫瘍サイズといくらか機能的に関連して流れれば、定量テストは、腫瘍負担の評価に有益であろう。以前には、非常に早期の癌における循環している腫瘍細胞の存在に関して報告された情報は存在しなかった。さらに、かかる細胞の存在およびかかる情報の可能性に関する医学文献において非常に多数の疑問点が存在する。一般的なレビューは、腫瘍が最初にうまく制限され、従って、疾病の早期ステージのいずれの循環している細胞、および循環における癌細胞のその初期の検出も、実現可能であったとしても、恐らくいかなる有用な情報も与えないであろう。
【０００９】
上記に基づいて、第２の腫瘍の確立に先立った転移可能性を持つ循環系におけるそれらの細胞を同定する方法が、特に癌の早期ステージの間に、非常に望ましいことは明白である。かかるテストが従来の免疫アッセイを越えるであろう利点を認識するためには、高度に敏感な免疫アッセイが１０−１７モルの機能的感度の下限を有すると考えられる。１ｍｌの血液から１個の腫瘍細胞を捕捉でき分析するならば、表面受容体のモル数は、１個の細胞当たり１００,０００個の受容体と仮定すると、１０−１９モルとなるであろう。細胞上で約３００個の分子を検出することができるので、かかるアッセイは１０−２２モルのオーダーで機能的感度を有し、それは全く顕著なものである。かかる希少細胞の単離においてそのレベルの感度を達成すること、およびそれらの特徴付けを危うくも干渉もしない様式でそれらを単離することは厄介な課題である。
【００１０】
細胞集団を区別するフローサイトメトリーの導入は、形態学的な特徴によって識別することができない細胞集団の成分を正確に同定および計測する能力をかなり改良した。異種の細胞混合物のフローサイトメトリー検査のさらなる感度の改良は、データの多次元分析によって得られている。細胞集団は、光散乱および蛍光のパラメーターの同時評価によって同定される。光散乱パラメーターは細胞サイズおよび細胞の粒状度（granularity）を測定する。蛍光パラメーターは細胞表面抗原、細胞内抗原、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび蛋白質含量を評価するために用いることができる。レーザー光線を通過する個々の細胞の光散乱および蛍光パラメーターの同時分析により、多次元空間が創製され、ここに、異なる特性を持つ細胞は異なる位置でまとまる。フローサイトメトリーによる珍しく／希少な細胞を検出するのに必要な条件は次の通りである：
１．分析のための十分な試料容積；
２．合理的な時間量でのフローサイトメトリーによる分析；
３．注目する細胞集団がユニークな位置で位置するようなパラメーターの選択；
４．標的細胞の頻度は１０５個の細胞中１個を越えるべきである。
【００１１】
血液試料を蛍光標識抗体とインキュベートし、赤血球溶解剤を添加する現在の試料調製手順は、試料を１０倍に希釈し、かくして希少細胞の検出に適さない。研究室では、密度分離または赤血球を溶解する手順は、試料容量の低下および細胞濃度の増加を達成する。これらの手順は可変性の細胞損失に導き、研究室間で標準化するのは困難である。さらに、標的細胞のかなりの富化は得られない。
【００１２】
分析と計数のための循環している腫瘍細胞を単離する１つの方法は、１９９９年２月１２日付けで出願され、Ｉｍｍｕｎｉｖｅｓｔ社によって所有される米国特許出願番号０９／２４８,３８８号に記載されている。本明細書に記載された方法は、患者血液試料から磁気的に選択できる循環している腫瘍細胞に共通して見出されたマーカーに対する抗体で標識した磁気粒子を用いる。この方法に基づいたアッセイは、乳房撮影法（mammography）による検出の下限で腫瘍を持った患者の血液中で乳癌腫瘍細胞を見つけることができるだけでなく、循環している腫瘍細胞数を通常の療法に関連づけることができることを示した。たとえば、循環している腫瘍細胞数は化学療法上の治療または手術と共に減少する。この方法を用いる他のテストは、循環している腫瘍細胞数が大腸癌を持った数人の患者において腫瘍の大きさに比例することを示した。依然として、他のテストは、癌患者が回復しないと、循環している腫瘍細胞数が増加することを示した。これらの顕著な結果は、乳癌、前立腺癌および大腸癌を含めた様々な癌で見出された。
【００１３】
これらの結果は興味深いので、それらは適切な量の科学的制限で緩和されなければならない。人の血中に循環している腫瘍細胞の検出は患者を怯えさせるが、陰性のテスト結果は患者には癌がないという指示であることはまだ証明されていない。いっそう悪いことは、循環している血液細胞につき偽陽性結果になるであろう。試薬の失敗、装置の故障および操作者の誤りは、すべて誤った陰性結果に導き得る。血中の癌細胞がまれなので（しばしば１個未満の細胞／ｍｌ血液）、テストを行うために必要とされる血液容量は限定的に大きい。かかる大量の血液についての要求は、従来の外部対照目的のためのさらなる血液試料の使用を禁止する。希少ではない、従来の細胞検出アッセイにおける非特異的（陰性）結合をテストするための「フローサイトメトリーによる、血液および骨髄中の希少細胞の検出」Hematopoietic Stem Cell Therapy, A. Ho, Marcel編 Dekker Inc. pp. １３７-１５２,（２０００）中でＴｅｒｓｔａｐｐｅｎによって言及されるように、計数された細胞数は、一般的には、出発細胞集団の１％未満である。実際のテストでは、特異的な試薬は一般的に１％を越える細胞集団を検出し、かくして、その試薬が現実に作動していることを確認する。１０７個の細胞および１％の非特異的結合（ＮＳＢ）で開始すれば、このＮＳＢは１０５個の細胞の細胞カウントを生じるであろう。しかしながら、癌細胞検出において、０個の細胞の特異的結合を癌のない患者において検出しかねず、再発している患者における１〜１００個の循環している腫瘍細胞の存在とを識別しなければならない。０個の細胞の検出により、試薬および／またはプロセスが働いているかを知る方法を有していない。テストで用いた各成分の内部／内在の対照はかくして望ましい。
【００１４】
テスト結果が有効であるという必要な確実性を有するために、プロセスにおける多数の本質的なポイントでの対照が必要である。対照を必要とする第一の本質的なポイントは磁気標識工程である。テスト試料における非常に少数の腫瘍細胞で、これらの細胞が抗体担持磁気粒子により標的とされることは重要である。もう一つのポイントは磁気的に標識された標的の磁気的選択であり、それは過剰の液体および選択されていない細胞を吸引し、さらに、磁気粒子／細胞複合体を洗うことを含む。依然として、その手順におけるもう一つのポイントは、そのいくらかの標的抗原が細胞表面に存在するが、そのいくらかは細胞および／または核膜の透過を必要とする抗原特異的な蛍光色素で標識する工程である。さらにもう一つのポイントは、実際の標的細胞の計数である。１９９９年２月１２日付で出願された米国特許出願番号０９／２４８,３８８号に記載のごとく、計数がフローサイトメトリーにより行われるが、１９９９年９月２３日付で出願された米国特許出願番号０９／３８１,７９５号または米国特許第５,９８５,１５３号に記載されたシステムの使用も所望ならば使用し得る。これらの特許をここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
【００１５】
実験上の対照の一例は、化学反応または精製における収量を測定するための「同位体希釈（isotopic dilution）」の使用である。この手順において、注目する分子または化合物の精製試料は、分子中の原子のうちの一つの放射性同位体で標識される。既知量の同位体で標識された化合物を出発物質に添加し、化学反応または単離手順を試行する。プロセスの終わりに、同位体で標識された化合物のパーセンテージを計算する。元来の出発物質と最終生成物との間の比較は、収量または出発物質のパーセンテージ回収率の計算を可能とする。また、このタイプの対照は、プロセスにおけるどの工程が生成物の損失または低収量を生じるかの精巧な分析を可能とする。真の「同位体希釈」プロトコールの使用は、細胞、特に腫瘍細胞のごとき生物学的材料の単離において可能ではない。しかしながら、標的細胞からそれらを区別するための特徴的なマーカーで標識し、かつ、その標的細胞に非常に類似すると判明できる方法で挙動する細胞の使用は、パーセンテージ回収率についてのいくらかの情報を研究者に知らせるのに有用であろう。
【００１６】
細胞の免疫表現型の決定（immunophenotyping）のための従来の対照はアイソタイプ対照である。アイソタイプ対照において、そのテストは同一アイソタイプの同種のモノクローナル抗体を用いて試行されるが、無関係な抗原に対して指向される。前記の循環している腫瘍細胞アッセイにおいては、磁気粒子上のモノクローナル抗体は上皮細胞付着分子（ＥｐＣＡＭ）に指向される。本明細書中の実施例で用いられるクローンはマウス抗体ＩｇＧｌκである。この粒子についての従来のアイソタイプ対照は、同一に調製された磁気粒子であるべきであり、今はキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）のごときヒトでは出現しない抗原に指向されたマウス抗体ＩｇＧｌκで標識される。磁気粒子に対するこのアイソタイプ抗体での磁気分離の後に選択された細胞は、非特異的に結合し、多数の非特異的に選択された細胞を決定できる。白血球抗原ＣＤ４５に指向されたそのＩｇＧ１κモノクローナル抗体は、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）で標識される。従来のアイソタイプ対照は、ＫＬＨのごときヒトで発現しない抗原に指向されたＦＩＴＣ標識モノクローナルＩｇＧｌκ抗体である。磁気分離の後に選択され、このＦＩＴＣで標識されたアイソタイプ抗体で染色された細胞は、ＦＩＴＣチャネルで染色されているバックグラウンドを決定する。サイトケラチン４、５、６、８、１０、１３および１８に指向されたモノクローナル抗体は、フィコエリチン（phycoerythin）（ＰＥ）で標識される。この抗体はマウスモノクローナル抗体、ＩｇＧｌκである。従来のアイソタイプ対照は、ＫＬＨのごときヒトでは出現しない抗原に指向されたＰＥ標識モノクローナルＩｇＧｌκ抗体である。磁気分離の後に選択され、このＰＥ標識されたアイソタイプ抗体で染色された細胞は、そのＰＥチャネルで染色されているバックグラウンドを決定する。かくして、本システムにおいて全ての抗体は、特異性を除いて患者試料におけるものと同一であろう。これらの試薬での細胞選択は、患者血液の同一のアリコートを用いて、患者試料と同時に試行されるであろう。複数パラメーターのフローサイトメトリーが最終分析に用いられるならば、その結果は、細胞の集団を示し、腫瘍細胞の検出［ＦＩＴＣ−、ＰＥ＋］の検出用のゲートが選択できる。
【００１７】
非特異的に染色されている細胞と非特異的に選択された細胞との間を区別するために、腫瘍細胞がないさらなる血液試料はアイソタイプ対照磁気粒子、ＣＤ４５−ＦＩＴＣおよびアイソタイプ対照ＰＥを用いて試行されるであろう。複数パラメーターフローサイトメトリーを用いたならば、そのＦＩＴＣ［＋］細胞は非特異的に選択された白血球となるであろう。ＦＩＴＣ［−］、ＰＥＴ［＋］である細胞は非選択的に選択され、かつ、非特異的に染色された細胞となるであろう。ＦＩＴＣ［−］、ＰＥ［＋］である細胞は、ＰＥに非特異的に結合しているが、ＦＩＴＣ  ＭＡｂに特異的に結合していない非特異的に選択された細胞であろう。それは両抗体のアイソタイプが同一であるためである。この非特異的な結合は、抗体のためではなく、蛍光色素のためであるか、またはコンジュゲーションにより引き起こされた変化のためである。おおよそ、同一の白血球数は、特異的試薬で患者試料において現れ、それは非特異的に選択され、まだ特異的に染色されてもいるであろう。差異分析（differential analysis）は、テスト結果からこれらの白血球を排除し、そのテストにおいて検出されたいずれの「腫瘍細胞」も実際に循環している上皮細胞であり、非特異的に結合した血液細胞ではないとさらに保証する。
【００１８】
より正確な対照は、ＥｐＣＡＭ  ＦＦ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣおよびアイソタイプＰＥ  ＭＡｂを用いることであろう。患者試料において、大多数の選択された細胞は非特異的に選択される。これらの細胞は、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ  ＭＡｂによって認識され、かくして、計数でき、それらは、ＥｐＣＡＭ  ＦＦによる真の非特異的な選択を表わす。実際の腫瘍細胞はＣＤ４５−ＦＩＴＣでも、アイソタイプ対照ＰＥ抗体でも染色されない。しかしながら、頻度が非常に低いと、腫瘍細胞が患者試料の中に現実にあるかどうか決定することができない。
【００１９】
前記の従来のアイソタイプ対照は、細胞選択に適当なタイプの対照を示すが、それらは真の機能的対照ではない。最初に、バックグラウンドのレベルは、どの抗体がアイソタイプ対照につき選択されるかに依存して、相当に変化する。かくして、アイソタイプ対照の選定は、より高いまたはより低いバックグラウンド閾値に影響するように成すことができる。第２に、このタイプの対照は、実際の患者テストにおいて用いる試薬とみなされない。例えば、患者テストにおけるその抗−サイトケラチン抗体は、テスト混合物から不注意に省略されかねない。この誤りは、そのアイソタイプ対照により検出されない。最後にかつ最も重要なことには、このタイプのアイソタイプ対照は、少量の血液試料に用いることができ、それは５０〜１５０μｌの血液を必要とする。しかしながら、希少細胞の単離において、十分な試験管および最適には５〜３０ｍｌの全血を腫瘍細胞の検出に必要とする。１細胞／ｍｌ血液の低い細胞数が検出され、かくして、より大量の試料では、テストにより、循環している腫瘍細胞の低い発生率を持つ患者をミスしないようである。これらの癌患者は、様々な医学検査に既に付され、限定された値のアイソタイプ対照についての余分な２０〜３０ｍｌの血液の流出を許容しない。また、アイソタイプ対照についての少量の血液試料の使用は、限定された値のものである。血液試料のアイソタイプ対照および実際のテスト試料への分割は、感度を低下させ、低レベルの循環している腫瘍細胞を持つそれらの患者はミスされるであろう。Stelzerら, Cytometry ３０: ２１４-２３０（１９９７） および Keeneyら, Cytometry ３４: ２８０-２８３（１９９８）により証明されるように、コンセンサスは、アイソタイプ対照を含めたいずれのタイプの対照としても用いられている患者試料の消失へ向けて確立されている。
【００２０】
Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎの米国特許第５,９８５,１５３号は内部対照を記載し、それは実質的に外部のアイソタイプ対照とは異なる。その’１５３特許の実施例６および７において、癌細胞で判明したものと類似する磁気「負荷」または抗原「負荷」を持つビーズが血液試料に添加される。そのテストにより検出されたビーズのパーセンテージまたは数を用いて、テストの効力を決定する。対照としてのビーズの使用は、当該技術分野においてよく知られ、そのテストの分析の間細胞用のビーズを間違える機会はないので、明白な有利さを有する。また、ビーズは良好に貯蔵され、再生産可能であり、それを用いて試料容積を正確に決定できるという付加された利益を有する。Stewartら, Cytometry ２（４）: ２３８-２４３（１９８２）により記載されるごとく、既知量の蛍光ビーズの使用は、フローサイトメトリーにより実際に分析された試料量を決定するという共通した問題を克服する。しかしながら、対照としてのビーズの使用は限定を有する。ビーズは非常に頑丈であり、それ自体は細胞を破壊するであろう多数の条件によって影響さなく、かくして、操作者の誤りに対する対照としてのそれらの有用性を限定する。温度、ｐＨおよび等張性の強さのごとき条件に対するビーズの感度は、実際の細胞のそれに類似するであろう。細胞選択についての対照を供するための適切な抗原、抗原密度および色素でかかるビーズを形成するための設計および製造上の考慮は難しいであろう。ビーズは適切な抗原を有さなければならないだけでなく、それらは実際の細胞に類似する条件下でアクセス可能でなければならない。例えば、立体因子と結合定数は考慮に入られなければならない。最後に、ビーズは、浸透化反応により影響を受けない固体であり、その不可欠な工程にて対照としてのそれらの有用性を制限する。従って、細胞表面を完全に複製できたとしても、ビーズは依然として細胞選択テストにつき真の内部の、陽性対照として機能できない。
【００２１】
対照を供するもう一つのアプローチは、対照として実際の細胞を用いるべきであろう。事実、細胞表面表現型の決定用の標準的な品質管理手順は、正常なドナーから標本を得、患者の試料と同時に調製および分析されることである。理想的には、正常な標本は同一タイプのものであり、同時に患者の試料として得られるが、これは末梢血以外の標本では一般的には可能ではない。末梢血を用いてさえ、新鮮な血液の使用は、高価で、時間消費であり、常に入手可能とは限らず、多くの検査室をそれらの対照の源として、貯蔵された細胞製品に向けさせる。種々の医学的テストのための対照として調製され、商業的に入手され、保存された細胞の使用は当該技術分野においてよく知られている。ゼラチン、パラフィンまたは寒天に埋め込まれた対照細胞は、米国特許第５,６１０,０２２号（Ｂａｔｔｉｆｏｒａ）および第５,１８７,０９９号（Ｈｅａｌｙら）に記載されている。細胞カウンターについての参照対照につき保存された細胞の使用は、米国特許第５,９８１,２８２号（Ｒｙａｎ）；第５,４３２,０８９号（Ｒｙａｎ）；第５,３４２,７５４号（Ｍａｐｌｅｓら）；および第５,７６３,２０４号（Ｍａｐｌｅｓら）に記載されている。また、凍結乾燥による保存は、米国特許第５,０５９,５１８号（Ｋｏｒｔｒｉｇｈｔら）；第５,９６８,８３１号（Ｓｈｕｋｌａら）；および欧州特許第４６９  ７６６Ｂ１号（Ｄａｖｉｓ）に記載のごとく用いることができる。細胞カウンター、フロサイトメトリーおよび他の装置に用いた標準溶液の創製は、米国特許第５,５２９,９３３号（Ｙｏｕｎｇら）；第５,８８８,８２３号（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏら）；および日本国で受付された明細書の第０１２５９２６１号に記載されている。血液学アナライザー、フローサイトメトリーおよび他の細胞分析プラットフォーム用の試薬の主な供給者のカタログのレビューは、これらの装置用の多数の細胞ベースの対照を明らかにする。いくつかの例には、Streck Laboratories Cell-ChexXＲおよび Chem-Chexの試薬、 R & D Systems R & D Retic 試薬, BeckmanCoulter Cyto-TrolＲ 対照細胞、ならびに安定化白血球のBioErgonomics FIuoroTroIＲ系が含まれる。
【００２２】
前記の特許において記載された対照細胞および種々の商業的に入手可能な試薬系は、細胞手順についての安定化細胞の多数の形態を提供するが、記載された方法および試薬は、細胞選択および分析手順についての外部対照を提供できるだけであろう。循環している細胞のごとき希少細胞の選択および計数のための適当な内部対照を提供するものはない。加えて、細胞の安定性は１４〜３０日に限定されている。長期の安定性があるそれらの場合において、細胞は凍結乾燥され、それは貯蔵寿命を増加させるが、不適切な再構成のため再現性を低下しかねない。
【００２３】
希少な細胞選択のために内部の陽性対照として細胞を用いるならば、多数の問題が存在する。例えば、どのように細胞を入手できるか？  どのように対照細胞は標的細胞と弁別可能とできるのか？  どのように対照細胞は標的細胞と類似して挙動すると判別できるか？  どのようにして細胞を用いて実験を制御できるか？  使用、再現性および効力は、細胞選択につき内部陽性対照としての細胞の使用に関係する本質的な関心事項であり、その全てが本明細書中の後記に検討されている。
【００２４】
発明の概要
非標的細胞も含む試料から希少標的細胞を単離する手順において、再現性がある標準化された内部対照系が必要である。従って、標的となる希少細胞に存在する表面および細胞内抗原を発現する既知数の細胞は、それらが標的となる希少細胞から明確に区別されるように、安定化および修飾される。これらの「対照細胞」は、試料を処理する前に、患者の全血試料に直接的に添加される。対照細胞数は、患者試料が分析された後に検出され、試薬が適切に作用していることを確認し、対照細胞の蛍光特性は、患者試料が正確に処理されたことを示すための分析プラットホームを介して測定される。
【００２５】
現在、乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３は対照細胞としての使用につきうまく安定化されている。細胞は、疎水性膜色素の、３,３'−ジヘキサデシクロヘキサカルボシアニン過塩素酸塩（３,３'−dohexadecycloxarbocyanine perchlorate）（ＤｉＯＣ１６（３））（ＤｉＯＣｌ８（５））または他の色素で蛍光標識され、対照細胞が「真」の腫瘍細胞から明確に区別できるように標識される。これらのＳＫＢＲ−３細胞は、腫瘍細胞の選択において対照細胞としてそれらの使用を増強するある種の特徴を有し、
１．それらは上皮細胞付着分子（ＥｐＣＡＭ）抗原を発現し、ＥｐＣＡＭ  ＭＡｂで覆われた磁気粒子によって血液から選択され；
２．対照細胞の膜は、浸透化試薬によって透過可能とでき；
３．対照細胞は細胞内サイトケラチンを発現し、蛍光標識された抗サイトケラチンＭＡｂにより同定され；
４．対照細胞は、ＣＤ４５抗原を発現せず、蛍光標識された抗−ＣＤ４５抗体で染色されず；また
５．対照細胞は、核を染色する蛍光化合物で染色される
ことが含まれる。
【００２６】
対照細胞の回収率は、患者試料中の循環している腫瘍細胞の回収率を正確に反映する。対照細胞が循環している上皮腫瘍細胞のように正確に挙動するということを示すことは困難であるが、記載された磁気分離技術は培養された腫瘍細胞の回収率において有意差を見出さないことを示すことができる。利用できる細胞系の抗原密度範囲は、癌患者に見られる腫瘍細胞の範囲に同様である。
【００２７】
かくして、本発明の一の態様において、希少細胞を単離および同定する方法における内部対照として用いる安定化細胞が提供される。本発明の対照細胞は、希少細胞と共通した決定基を有し、その細胞は膜標識される。対照細胞の細胞成分および抗原部位は固定剤への曝露により少なくとも６ヶ月までの期間安定化される。所望により、細胞は、同一スペクトル特性を有する少なくとも２つの蛍光標識で重複して膜標識してもよい。
【００２８】
本発明のさらにもう一つの態様において、安定化された内部対照細胞の製法が提供される。例示的な製法には、以下の工程が含まれる：
ｉ）該対照細胞を同一のスペクトル特性を有する少なくとも２つの蛍光標識で重複して標識し；
ｉｉ）該標識細胞と細胞固定剤とを接触させ、該固定剤が該対照細胞上に存在する細胞構造および抗原部位の双方の安定性に影響し；
ｉｉｉ）過剰な固定剤を引き続いて除去して、該対照細胞の長期保存を促し、該対照細胞が、少なくとも６ヶ月までの期間物理的および生物学的に安定となることを含む。
【００２９】
また、本発明に従い、希少細胞を単離および計数する方法が改良され、希少細胞数の増加は疾患状態を示す。特に好ましい具体例には、希少細胞は癌細胞であり、疾患状態は癌である。本発明の例示的な方法には、以下の工程が含まれる：ｉ）テスト対象から血液試料を得、ここに、該試料は該希少細胞を含有すると疑われる混合細胞集団を含み；ｉｉ）免疫磁気（immunomagnetic）試料を調製し、ここに、該血液試料は、他の試料成分の実質的な排除のために、希少細胞の決定基と特異的に反応するリガンドと結合する磁気粒子と混合され；ｉｉｉ）該免疫磁気試料と、該希少細胞の決定基を標識する少なくとも１つの試薬とを接触させ；次いで、ｉｖ）該標識された希少細胞を分析して、該免疫磁気試料中のいずれかの希少細胞の存在および数を決定し、該試料中に存在する希少細胞数が大きくなるにつれ、該疾患の重篤度が大きくなり、ここに、改良は、該方法における内部対照細胞として用いる安定化細胞の添加を含み、該対照細胞が、該希少細胞と共通した決定基を有し、該対照細胞の該膜を検出可能に標識し、該対照細胞の細胞成分および抗原部位が、固定剤に対する曝露により少なくとも６ヶ月までの期間安定化される。後記の具体例において、リガンドは、抗−ＥｐＣａｍ抗体であって、試薬はサイトケラチンに特異的に結合する。
【００３０】
本発明のさらなる具体例において、本明細書に記載された方法の実施を促すキットが提供される。ヒト血中の循環している上皮（腫瘍）細胞を単離する例示的なキットには：磁心材料（magnetic core material）、蛋白質ベースのコーティング材料および上皮細胞由来細胞に特異的に結合する抗体よりなるコーティングされた磁気ナノ粒子、ここに、その抗体は、該ベースのコーティング材料に直接的または間接的に結合し；検出可能な標識で標識された上皮細胞由来の腫瘍細胞に結合特異性を有する少なくとも１つの抗体；および検出可能な標識で標識され、かつ注目する希少細胞と共通した少なくとも１つの表面抗原を持つ安定化対照細胞が含まれる。このキットは、所望により、浸透化試薬、洗浄および／または希釈緩衝液、凝集試薬、さらに検出可能に標識された抗体またはさらなる細胞特異的な色素を含む。
【００３１】
本発明のさらなる態様は、対照細胞と同様の密度の貯蔵媒体、すなわち、中性の浮遊密度媒体である。これらは、対照細胞が、それらがより大きな精度でピペッティングできるように良好に分散したままとすることを保証する。
【００３２】
発明の詳細な記載
Ｉ．一般的な定義
特記しない限りは、本明細書を通じて一般的に使用した用語は以下の通り規定される。
【００３３】
本明細書に用いた「標的生物学的存在物（target bioentity）」なる用語は、生物学的または医学的に注目さる種々の材料をいう。例には、ホルモン、蛋白質、ペプチド、レクチン、オリゴヌクレオチド、薬物、化学物質、核酸分子、（例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）ならびに生物学的な起源の粒子分析物が含まれ、それには、細胞、ウイルス、細菌等が含まれる。
【００３４】
本明細書に用いた「希少細胞」なる用語は、種々の細胞、微生物、細菌等をいう。細胞は、試料中でまれに特徴付けされる。というのは、それらが、１）同一起源の正常な試料中に存在せず、および２）正常な試料中の典型的な細胞より濃度が数オーダー低いためである。本発明の好ましい具体例において、循環している癌細胞、ウイルス感染細胞、または母体循環における胎児細胞は本発明の組成物、方法およびキットを用いて非標識細胞および／または他の生物学的存在物から効率的に単離できる。
【００３５】
「生物学的標本」には、限定なくして、細胞含有体液、末梢血、骨髄穿刺液、骨髄生検、リンパ系組織生検、組織ホモジェネート、細い針での吸引、漿膜液（serosal fluid）、脊髄液、皮膚、粘膜、乳首吸引、ならびにヒト対象から入手できるいずれかの他の源の細胞が含まれる。例示的な組織ホモジネートは、乳癌患者におけるセンチネルノード（sentinel node）から得ることができる。また、生物学的標本は、処置された水試料および食品から入手できる。
【００３６】
前記のいずれかの標的生物学的存在物を引用して用いた場合の「決定基」なる用語は、生物学的に特異的なリガンドまたは生物学的に特異的な試薬により特異的に結合でき、特定の結合物質に関与し、かつそれを担い、選択的に結合する標的生物学的存在物のある部分をいう。基本的な用語において、決定基は特異的な結合ペア反応における受容体により認識される標的生物学的存在物上の分子接触領域である。
【００３７】
本明細書に用いた「特異的な結合ペア」なる用語は、標的生物学的存在物上の決定基を選択的に認識し、それと相互作用するいずれかの物質をいう。特異的な結合ペアには、抗原−抗体、受容体−ホルモン、受容体−リガンド、アゴニスト−アンタゴニスト、レクチン−炭水化物、核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）ハイブリダイズ配列、Ｆｃ受容体またはマウスＩｇＧ−蛋白質Ａ、アビジン−ビオチン、ストレプトアビジン−ビオチンおよびウイルス−受容体の相互作用が含まれる。種々の他の決定基に特異的な結合物質の組合せは、本発明方法の実施における使用と考えられる。本明細書に用いた「抗体」なる用語には、免疫グロブリン、モノクローナルまたはポリクローナル抗体、免疫反応性免疫グロブリン断片、および単鎖抗体が含まれる。また、本発明における使用と考えられるものには、従来に生成された抗体に類似する特異性で決定基を特に認識する、ペプチド、オリゴヌクレオチドまたはその組合せである。
【００３８】
本明細書に用いた「検出可能な標識」とは、物理的または化学的手段により直接的または間接的のいずれかで、検出または測定がテスト試料中の標的生物学的存在物の存在を示すいずれかの物質をいう。有用な検出可能な標識の代表例には、限定されるものではないが、光吸光度、蛍光、反射率、光散乱、リン光またはルミネセンス特性に基づいて、直接的または間接的に検出できる分子またはイオン；それらの放射活性特性により検出できる分子またはイオン；それらの核磁気共鳴または常磁性の特性によって検出できる分子またはイオンが含まれる。光吸光度または蛍光に基づいて、間接的に検出できる分子の群に含まれるのは、例えば、適当な物質を、例えば、光を吸収しない分子から光吸収分子へ、または非蛍光性分子から蛍光性分子へ変換させる種々の酵素である。
【００３９】
「細胞特異的色素」なる用語は、特定の細胞要素を染色する（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡを区別する核染色法）遊離のまたはコンジュゲートしない色素、または特異的な細胞受容体に選択的に結合および染色する結合剤にコンジュゲートした色素を示す。
【００４０】
「の実質的な排除のために」なる語句は、生物学的なリガンドまたは生物学的に特異的な試薬と、その対応する標的決定基との間の結合反応の特異性をいう。生物学的に特異的なリガンドおよび試薬は、それらの標的決定基につき特異的結合活性を有し、また他の試料成分に低レベルの非特異的結合をさらに示す。
【００４１】
本明細書に用いた「早期ステージの癌」なる用語は、器官限定されると臨床的に決定されたそれらの癌をいう。また、乳癌患者についての乳房撮影法、または肺癌患者についてのＸ線のごとき従来の方法により検出されるにはあまりにも小さな腫瘍が含まれる。乳房撮影法では、約２×１０８細胞を有する腫瘍を検出できるが、本発明の方法は、このサイズ以下付近の腫瘍から循環している癌細胞の検出を可能とするであろう。
【００４２】
本明細書に用いた「富化」なる用語は、生体試料中の合計の細胞に対する標的細胞の比の増加をいう。末梢血を出発物質として用いる場合において、赤血球は、富化の範囲を評価する場合に計数されない。本発明の方法を用いて、循環している上皮細胞は、白血球に比較して、少なくとも２５００倍、より好ましくは５０００倍、および最も好ましくは１００００倍の範囲まで富化できる。
【００４３】
本明細書に用いた「アッセイ」なる用語は、生物学的標本中の標的生物学的存在物の存在または不存在を決定する目的のための既知試薬を用いるある手順または一連の手順をいう。アッセイは、生物学的存在物の存在、不存在または活性を評価するための定量された試薬および確立されたプロトコールを含み得る。
【００４４】
「テスト系」なる用語は、生物学的標本中の標的生物学的存在物中の不存在または存在を決定するための既知試薬を用いる全ての手順を示すために本明細書に用いられる。そのテストは、少なくとも１つのアッセイを含むシステムで、その（複数の）アッセイを行うために用いた（もしあれば）ハードウェアおよびソフトウエア、ならびにその（複数の）アッセイの結果分析を用いて操作者により行われる。
【００４５】
「標準」なる用語は、装置を設定および／または較正するのに用い、さらなる調製を必要としない材料を表わすのに本明細書で用いている。加えて、標準は、分析物、例えば、装置の分析範囲を設定する、および／または蛍光強度を定量化するための特定の強度および波長を有するマイクロビーズ集団に類似する特定の特性を有する。
【００４６】
「対照」なる用語は、予め決定された範囲内にある特性を持つ物質または公知の組成物の混合物を示し、試薬および／または細胞調製が期待されたごとく働くことを保証するために、注目する分析物または物質として同一処理プロトコールを受けるように設計されている。
【００４７】
「アイソタイプ対照」なる用語は、同一アイソタイプ、同一種のモノクローナル抗体の使用をいうが、不可逆的な抗原に指向される。アイソタイプ対照は、非特異的なバックグラウンドと陽性蛍光染色との間の区別されるレベルを設定するのに広範囲に用いられる。
【００４８】
本明細書に用いた「外部対照」なる用語は、テスト物質との比較の基礎を確立するためのアッセイまたはテスト系内でテスト物質として同一条件に付される既知の組成物のいずれかの物質または混合物をいう。外部対照は、陽性または陰性の対照であり得、複数の対照が１つのテスト系内で用いることができる。
【００４９】
「内部対照」なる用語は、テスト物質との比較の基礎を確立するためのテスト系内でテスト物質に添加されるか、またはそれと混合される既知の組成物のいずれかの物質または混合物をいう。テスト物質および対照物質の同時の存在によって、その２つの物質は、テスト系内の同一条件を受け、全テスト系の効力の明確な測定を提供する。本発明の好ましい具体例において、患者の血液試料に添加され定量化され、適当に標識された機能的な対象細胞アリコートは、テスト系における内部対照だけではなく、テスト系における細胞回収率の定量可能でかつ分析上の対照を提供する。換言すれば、分析の終わりでの対照細胞の回収率に基づき、いくつの標的細胞が実際に回収されかだけではなく、どれだけの試料容積が実際に処理されたかを考えることができる。これは、患者試料中の腫瘍細胞の発現の範囲のより正確な予測を可能とする。
【００５０】
本明細書に用いた「陰性対照」なる用語は、標的生物学的存在物に一般的に類似する方法で挙動する内部または外部対照物質をいう。しかしながら、その陰性対照物質は、アッセイまたはテスト手順の終わりにて、陰性対照物質が検出されないように、他の生物学的な存在物から標的生物学的存在物を区別する少なくとも１つの特徴的な決定基を欠如する。
【００５１】
「陽性対照」なる用語は、標的生物学的存在物に類似する方法で挙動し、他の生物学的存在物から標的生物学的存在物を区別するアッセイまたはテスト手順において用いられる特徴的な決定基を含む内部または外部の対照物質をいう。事実、いくらかの場合、陽性対照は、標的生物学的存在物として実際に機能する。アッセイまたはテスト系を通して置く陽性対照は、アッセイまたはテスト手順の終わりに存在し、かくして、陽性対照が標的生物学的存在物であるならば、それは検出されるであろうことを保証する。陽性対照は標的物質から「分離される」という結果の分析に対してだけであることを留意すべきである。
【００５２】
本明細書に用いた「固定された」なる用語は、分析につき細胞構造を保存するために化学化合物を添加することの実施をいう。伝統的な固定剤には、限定されるものではないが、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、メタノールまたは他のアルコールが含まれる。固定された細胞が延長した期間物理的に安定したままであるが、いくつかの細胞抗原は保存されないかもしれず、それは抗原完全性を必要とする全てのプロセス（染色、分離、標識化等）に有害である。
【００５３】
「安定化」なる用語は、経時的に再現可能な方法で抗原完全性を維持する固定された細胞を示すために本明細書に用いた。従って、安定化細胞は、抗原特異的な反応において、うまくかつ再現可能に染色、分離および標識できる。
【００５４】
本発明を実施するのに用いた好ましい磁気粒子または磁性流体はコロイドとして挙動する粒子である。かかる粒子は、一般的には約２００ナノメーター（ｎｍ）未満であるそれらのサブミクロン粒子サイズ、および延長された時間の溶液からの重力分離に対するそれらの抵抗により特徴付けられる。多数の他の有利さに加えて、このサイズ範囲は、それらを細胞分析に一般的に適用される最適な分析技術では可視ではない。９０−１５０ｎｍの範囲内で、かつ７０−９０％の磁気量の間を有する粒子は、本発明に用いられると考えられる。適当な磁気粒子は、例えば、磁心に物理的に吸着したか、または共有結合し、コロイド特性を安定化させるコーティング分子により囲まれた超磁気材料の結晶心よりなる。そのコーティング材料は、好ましくは、試料中で見出される生物学的マクロ分子と磁心との間の非特異的な相互作用を防止するのに有効な量にて適用すべきであろう。かかる生物学的マクロ分子には、非標的細胞、レクチン、糖タンパク質および他の膜成分の表面上のシアル酸残基を含み得る。加えて、コーティング材料は、出来るだけ高い磁気量／ナノ粒子比率を含むべきである。芯を含む磁気水晶のサイズは十分に小さく、それらが完全な磁気ドメインを含んでいない。ナノ粒子のサイズは、それらのブラウン運動のエネルギーがそれらの磁気モーメントを越えるようなものである。従って、これらのコロイド状の磁気粒子の北極−南極整列および引き続いての相互の引力／反発力は、それらの溶液安定性に寄与して、中程度の強磁場においてさえ生じないらしい。最後に、磁気粒子は高磁気勾配外部場分離器において分離可能であろう。その特性は、試料処理を促進し、強磁性ビーズまたは鋼綿が負荷されたより複雑な内部勾配カラムに対して経済的有利さを提供する。前記の特性を有する磁気粒子は、米国特許第５,６９８,２７１号に記載されたベース材料の修飾により調製できる。本発明の好ましい具体例において、抗−ＥｐＣＡＭ抗体でコーティングされた磁気粒子は、米国出願番号０９／２４８,３８８に記載のごとく調製される。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＢｉｏｔｅｃおよびＤｙｎａｌを含めた他の会社によって販売されている抗−上皮抗体で覆われた磁気粒子も、これらの希少細胞単離手順において用いることができる。
【００５５】
次の表は、対照細胞の源として用いることができる典型的な細胞系を示す。これらの細胞系の各々は、疾病に特有の表面マーカーを発現し、対照細胞につきそれらを有用な候補物とする。
【００５６】
【表１】
2004534210.tif 000002
【００５７】
他の腫瘍細胞系を対照細胞の源として用いてもよい。但し、それらは表面マーカーおよびさらなる標識を受ける能力を有するものである。乳癌および前立腺癌についてのさらなる細胞系と同様に大腸癌および膀胱癌に類似する細胞系が存在する。
【００５８】
循環している腫瘍細胞の決定に適用されるような希少細胞アッセイは、血中に存在する癌細胞の選択および検出を含む。上皮由来腫瘍を持つ患者における腫瘍細胞は、１ｍｌ血液当り１個未満の細胞頻度で存在できる。それは１アッセイ当たりの５−１０ｍｌの血液を処理するのが好ましい理由である。本発明の例示的なアッセイには、いくつかの工程よりなる：
１）  血液中の上皮腫瘍細胞を標識するために上皮細胞に特異的である抗体に結合した磁気粒子での血液のインキュベーション；
２）  磁気分離による非標識細胞からの磁気的に標識された細胞の分離に続いていずれのキャリーオーバーの白血球も除去するための洗浄工程；
３）  蛍光色素にコンジュゲートした上皮細胞に特異的な抗体で標識することによる上皮細胞のさらなる選択；および
４）  細胞数およびタイプを確認するための異なる光学的プラットフォームによる細胞の分析。
【００５９】
２種のタイプの対照を用いることができる。一つの対照は外部的であり、ここに、既知数の上皮腫瘍細胞を正常な対照血液試料に添加し、次いで、患者の試料と共にアッセイする。外部対照アッセイは、加えた腫瘍細胞の回収率を決定するのを可能とし、それはセットされた本明細書中にあるであろう。研究室は血液に加えるための細胞を有さず、５−１０ｍｌ血液の通常試料を得ることができないかもしれないために、そのようなアッセイを利用するのは困難であり得る。アッセイ方法のマニュアル工程において、試薬の添加およびいずれかの（複数の）試薬の抜かしに関するランダムな操作者の誤りを制御できないので、外部対照は理想できでないかもしれない。かかる場合において、最良の対照は、患者試料に加えた上皮細胞数を回収率および検出できる内部的なものである。
【００６０】
患者血液中に存在する少数の実際の腫瘍細胞から、加えた多数の対照細胞を識別するために、その加えた対照細胞は、特異的な蛍光色素で、または高い標識効率（１０５個中に１個の非標識細胞より少ない）を持つ他のマーカーで予め標識されなければならない。１を越えるタイプの標識を用いて、非標識対照細胞が存在しないことをさらに保証できる。しかしながら、かかる重複した標識は通常は必要ではない。分析中の細胞に対するこの特異的な標識の存在は、対照細胞を示すであろう。かかるテストを利用するために、そのアッセイと共に陽性標識対照を提供することが必要である。適当なマーカーと共にインキュベートした腫瘍細胞は、陽性対照として用いることができるが、それらは２４時間を超えて安定ではない。従って、陽性標識対照細胞は予め標識され、長期間に使用につき安定化されるべきである。陽性対照上に存在する特定の抗原は、予め標識する間保存されなければならず、安定な貯蔵条件下で保存されたままでなければならない。
【００６１】
手順の終わりにて回収された対照細胞数は、分析に対するある種の情報を伝える。テストは正確に行われ、試薬および系は適切に作動したことが保証される。米国特許第０９／２４８,３８８号に記載のごとき全血からの腫瘍細胞の回収率は、対照細胞の使用を言及しない。血中の培養された腫瘍細胞を用いて人工的に創製された生物学的試料、例えば、培養され加えられた対照細胞において、加えた細胞の回収率は、６０−９５％の範囲にある。細胞は、分離、洗浄、再懸濁および分析プラットフォームに試料を移すことを含めた手順における多数の工程にて喪失し得る。フローサイトメトリーを分析プラットフォームとして用いる場合、少量の液体は、しばしば、試料試験管の底に残り、その結果、誤差の大きな要素となる。フローサイトメトリーの当業者は、一般的には、それらのカウントと比較するための独立した源の事象を用いて、それらの分析におけるこの再現できない一定の源の誤差を説明する。
【００６２】
不運にも、生物学系において、２つの異なる細胞は同一に挙動するであろうとは決して推測できない。従って、希少細胞単離手順において、標的細胞および対照細胞は同一割合にて回収されるとは推測できない。しかしながら、患者の腫瘍細胞および培養された乳癌細胞は、多数の適切な特徴を共有し、同様に挙動し、回収率を正確に反映するように用いることができる。対照細胞および循環している上皮細胞が同一割合にて回収されること、単に、それらが同一範囲内で回収されるということは本明細書に供された発明の記載から意味しないことに注意することは重要である。１９９９年７月１２日付で出願された米国特許出願番号０９／３５１,５１５（’５１５出願）（ここに出典明示してその全ての内容を本明細書の一部とみなす）に記載のごとく、磁気収集につき用いるＥｐＣＡＭ抗原の密度範囲は、患者の試料中および培養された細胞系において類似する。Ｃｏｌｏ２０４、ＳＫＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＢＴ４７４およびＰＣ３の系を含めた分析者に利用できる多数の細胞系が存在する。これらの細胞系は、ＥｐＣＡＭ抗原の程度を変更して発現するが、図３に示すように、細胞系の抗原密度は、乳癌患者において実際見出された腫瘍細胞の抗原密度を反映する。さらに、’５１５出願および本明細書の実施例５に示されるように、低抗原密度細胞（ＰＣ３系）の磁気分離後の細胞回収率は高抗原密度細胞（ＳＫＢＲ−３系）よりかなり小さい。しかしながら、’５１５出願において教示された凝集制御技術の使用は、低抗原密度につき補正して同一範囲に２つの細胞系の回収率を持ってくる。本出願に記載された対照細胞はこれらの細胞系から選定された修飾された細胞である。また、対照細胞の抗原密度は、実際の乳癌患者において判明した抗原密度の範囲内にある。加えて、’５１５出願に記載された凝集制御技術は、高抗原密度を持つ細胞と同一範囲内へ低抗原密度腫瘍細胞の回収率を持ってくるように用いる。かくして、対照細胞および患者腫瘍細胞の回収率は、患者における腫瘍細胞が低レベルの抗原密度を有しさえすれば、適合するであろう。
【００６３】
この説明に徴して、１０００個の対照細胞が１０ｍｌの癌患者からの全血に添加され、８００個の対照および８個の腫瘍細胞を回収されたならば、従って、元来の１０ｍｌの血液試料に１０個の腫瘍細胞が存在したと推測することが導かれる。しかしながら、まさに認められたように、対照細胞の回収率および腫瘍細胞の細胞は同様であり、同一ではない。加えて、希少な事象を扱う場合、かかる比例計算は保証されない。８個の腫瘍細胞がテストにおいて１０ｍｌの出発容量から回収され、また、８０％の対照細胞が回収されたと結論することがより正確である。もちろん、この結果は、対照細胞が、異なる光学的プラットフォームが用いられるならば、フローサイトメトリーヒストグラムの適当な領域内で、かつ適当な蛍光特性で回収されたということを推測する。
【００６４】
本発明の対照細胞およびその使用方法の有利さは、適当な対照細胞数を適当な蛍光特性で回収するならば、上皮細胞が患者の血液試料から回収される場合にそれらは上皮細胞以外のいずれかであるという異論を唱えることができない。いくつかの不明瞭な疾患を除いて、循環している上皮細胞の源は腫瘍から放出されたものである。用いた抗体の設計は、非特異的な結合を、一桁の腫瘍細胞カウントが１０ｍｌ血液試料中の５−１０×１０７個の白血球に共通して見ることができるそのような程度まで有効に消失させる。しかしながら、このテストの精度は、対照の使用を介して増強して、試薬およびプロセスが正確に作動しているということを確認できる。内部陽性対照として作用する適当に位置した多数の対照細胞の出現は、テスト方法および結果を認証する。
【００６５】
以下の実施例は、本発明の対照細胞を用いるプロセスをさらにいくらか詳細に記載する。また、本発明の方法を実施するいくらかの好ましい具体例が記載されている。これらの例は、本発明を限定するよりむしろ、例示を意図するものである。これらの例は循環している腫瘍細胞の選択における対照細胞の有効な使用を示すが、当業者には、抗体、細胞系、および磁気粒子の適当な選定で、本発明の教示は、他の生物学的な標本からの他の希少細胞の選択まで拡張できることは明らかであろう。
【００６６】
実施例１：安定化された予め標識された対照細胞の調製
陽性対照細胞は、様々なマーカーで予め標識できる。１つの方法は、疎水性の膜特異的な蛍光色素を用いて細胞の標識を必要とする。商業的に入手可能である当該技術分野において知られた多数のタイプの膜色素が存在する。カルボシアニンは、公知の最も強力に吸着される膜色素に属する。膜色素は、膜脂質に結合することにより細胞を標識する。この標識付けは抗体が特異的な上皮抗原に結合するを防げないことは重要である。色素の細胞への結合は、本質的には非可逆的であり、漏出は貯蔵およびテスト手順の間生じないであろう。もう一つのアプローチは、細胞表面抗原に特異的な蛍光−抗体複合体を用いる細胞の標識である。さらなるアプローチは、蛍光色素での細胞成分の標識を伴う。このアプローチの例には、限定なくして、二本鎖ＤＮＡ用のＤＡＰＩおよびＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、ＤＮＡおよびＲＮＡ用のアクリジンオレンジ、ミトコンドリアおよび小胞体用の様々なローダミン誘導体、リソソーム用のニュートラルレッド、またはゴルジ装置用の疎水性ＢＯＤＩＰＹが含まる。この例において、疎水性蛍光膜色素での細胞の標識が記載される。
【００６７】
乳癌から由来する培養細胞をこの例に用いた。フラスコに付着するＳＫＢＲ−３細胞をトリプシンで遊離し、遠心によりリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄した。細胞は、Ｄｉｌｕｅｎｔ Ｃ（Sigma、カタログ番号ＣＧＬ−ＤＩＬ）で２回洗浄した。次いで、細胞をＤｉｌｕｅｎｔ Ｃに再懸濁させ、細胞濃度を１×１０６細胞／ｍｌに調整した。蛍光性の３,３'−ジヘキサデシクロヘキサカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＯＣ１６（３））膜特異性色素を選択して、細胞を標識した。ＤｉＯＣ１６（３）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅより購入した（カタログ番号Ｄ−１１２５）。色素は、５０１ｎｍにて最大蛍光発光を有する。５０μＭのＤｉＯＣ１６（３）の貯蔵溶液を１％ジメチルスルホキシドを含む５％マンニトール中で調製した。洗浄した細胞を１：１にてＤｉＯＣ１６（３）溶液と混合した。次いで、試験管をアルミ箔できっちりと覆い、時々混合して室温にて３０分間続けるように標識した。試料を２０００ｒｐｍにて５分間遠心して、細胞から反応していない色素を除去した。上清を吸引し、細胞ペレットをＰＢＳで再懸濁した。細胞を遠心により再度洗浄した。細胞ペレットを浸透化溶液（Immuniconパーツ番号６０２５）に再懸濁し、細胞濃度を１×１０６個／ｍｌに調整した。浸透化工程は、抗原−特異的抗体による細胞内抗原の結合を可能とする。細胞を浸透化溶液と室温にて１５分間インキュベートした。
【００６８】
浸透化工程後に、細胞は安定性を増強するために固定した。細胞を遠心して、過剰な浸透化溶液を除去した。細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し、遠心により１回洗浄した。最後に、細胞を１×１０６細胞／ｍｌまでの細胞濃度でＰＢＳ中に再度再懸濁した。パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を０.５％の最終濃度にて細胞懸濁物を添加した。試験管をアルミ箔で覆い、細胞を混合しつつ室温にて２時間インキュベートした。２時間後、過剰なＰＦＡを遠心により除去した。細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し、細胞濃度を約１.０−２.０×１０５細胞／ｍｌに調整した。細胞を暗所で４℃にて貯蔵した。細胞ＤｉＯＣ１８（５）および他のマーカーは同様のプロトコールを用いた。また、当該技術分野において知られている付着細胞を染色するのに適当なプロトコールを用いることもできる。
【００６９】
対照を調製するのに好ましい色素は疎水性細胞膜成分に高親和性を持つ蛍光疎水性色素である。かかる色素についての要件は：標的細胞用の検出色素との干渉を最小化するのに適当な励起／発光スペクトル、全細胞の十分でかつ均質な染色、細胞膜への実質的に不可逆的な結合、貯蔵に対する最小の漏出および移動、長期保存およびレーザー光による強い照射の双方の間の光退色に対する光学的安定性である。これらの要件に非常に合う膜色素は、カルボシアニン、および対応するカルボインドシアニン（Ｄｉｌ）およびカルボインドジシアニン（ＤｉＤ）アナログならびにその誘導体につき略号ＤｉＯＣ１２（３）、ＤｉＯＣ１２（５）、ＤｉＯＣ１２（７）、ＤｉＯＣ１４（３）、ＤｉＯＣ１４（５）、ＤｉＯＣ１４（７）、ＤｉＯＣｌ６（３）、ＤｉＯＣ１６（５）、ＤｉＯＣ１６（７）、ＤｉＯＣ１８（３）、ＤｉＯＣ１８（５）、ＤｉＯＣ１８（７）により示される長鎖疎水性のカルボシアニン、インドカルボシアニンおよびインドジカルボシアニンとして集合的に例示される。かかる重複した標識は、第２の予め標識する色素の同時または引き続いての添加により、および対照細胞の固定前後のいずれかで所望により行うことができる。また、ＤｉｌＣ１８（５）−ＤＳおよびＳＰ−ＤｉＯＣ１８（３）により例示された、より可溶性のジスルホン化（ＤＳ）およびスルホプロピル（ＳＰ）誘導体は、膜色素として用いることができる。また、ＤｉＡ色素、例えば、４−Ｄｉ−１６−ＡＳＰと示される疎水性アミノスチリル色素が適当である。また、一般的には、多数の蛍光色素の長鎖アナログ、例えば、Ｃ１８ローダミンＢおよびＣ１８−フルレセインが、高い膜親和性を有する。また、他の細胞の細胞器官についての染色が利用可能でかつ適用可能である。大部分のこれらの色素は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ,Ｉｎｃ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから入手でき、公開された方法により合成できる（F. M. Hamer, The Cyanine Dyes and Related Compounds, Interscience, １９６４）。
【００７０】
また、対照細胞は、蛍光ＨＥＲ８１抗体で標識した対照ＳＫＢＲ細胞を調製することにより例示されるごとく、かかる抗原に親和性を持つ蛍光抗体で細胞表面抗原を標識することによって成すことができる。また、２つの異なる細胞成分の標識は、２つの構造上およびスペクトル的に異なるフルオロフォア（fluorophore）での対照細胞の容易な二重標識を可能とする。異なるか、または同一の構造上の細胞要素の重複した予めの標識は、対照細胞まで上げ、それは腫瘍細胞と対照細胞を誤って分類する既に低い可能性をさらに低下させる。例えば、対照細胞を単一標識する場合、それは１０００中の＜１が検出可能に標識されない可能性が存在する。対照細胞の重複した標識は、標識可能性でこの失敗を１００万個の細胞中の＜１に低下させる。
【００７１】
図１は、５００μｌＰＢＳ中の５０００個の対照細胞のフローサイトメトリー分析を示す。閾値は、前方光散乱で設定され、細胞は、前方および直角散乱でゲートで制御した。図１ａはＦＬ１（λ＝５３０±３０ｎｍ）における蛍光強度のヒストグラムを示す。図１ｂはＦＬ２（λ＝５８５±４２ｎｍ）における蛍光強度のヒストグラムを示す。図１ｃはＦＬ３（λ＝６７０±ｎｍ）における蛍光強度のヒストグラムを示す。そのヒストグラムに見られるように、全細胞は均質に染色された。
【００７２】
実施例２：蛍光色素にコンジュゲートした抗体を用いる予め標識された対照細胞の調製
この例において、実施例１に記載されたＳＫＢＲ−３培養腫瘍細胞を再度用いた。しかしながら、細胞は、シアニン色素にコンジュゲートしたＨｅｒ２ｎｅｕ抗体で予め標識した。抗−Ｈｅｒ２ｎｅｕは、ＳＫＢＲ−３を含めたある種の腫瘍細胞に存在する表面抗原に特異的に結合する。そのＨｅｒ２ｎｅｕ ＭＡｂは、製造者の推奨に従いＣｙ２ＴＭ色素のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Amershamカタログ番号ＰＡ２２０００）を用いてＣｙ２ＴＭ色素にコンジュゲートした。
【００７３】
フラスコに付着したＳＫＢＲ−３細胞は、トリプシンで遊離させ、遠心によりＰＢＳで２回洗浄した。細胞を浸透化溶液に再懸濁させ、次いで、標識するためにＨｅｒ２ｎｅｕ−Ｃｙ２Ｒ色素で染色した。浸透化試薬は、抗体での細胞の染色に対していずれの効果も有さなかった。染色中の抗体の最終濃度は２μｇ／ｍｌであって、細胞濃度は１×１０６細胞／ｍｌであった。染色および浸透化は、アルミ箔で試験管を１５分間覆うことにより暗所で成された。浸透化および染色の後、細胞を安定化させるために以下のとおり固定した。
【００７４】
細胞を遠心して、過剰な浸透化溶液および反応していない抗体を除去した。細胞ペレットを再懸濁し、ＰＢＳでさらに１回洗浄した。細胞をＰＢＳに再度再懸濁し、細胞濃度を１×１０６細胞／ｍｌに調整した。５パーセントのＰＦＡを細胞に添加し、その結果、最終ＰＦＡ濃度を０.５％とした。細胞を一定で混合しつつ、アルミ箔で覆った試験管中で室温にて２時間インキュベートした。２時間後、試料を２つの試験管に分けた。一方の試験管を過剰なＰＦＡを除去せず４℃にて暗所で貯蔵した。過剰なＰＦＡは、遠心により第２の試験管から除去した。細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁し、遠心により２回洗浄した。第２の洗浄後、細胞ペレットをＰＢＳ中に再懸濁し、細胞濃度を約１.０−２.０×１０５細胞／ｍｌに調整した。最終細胞懸濁物を４℃にて暗所で貯蔵した。
【００７５】
実施例３：予め標識した対照細胞の安定性
新たな細胞は、一般的には１または２日間だけ安定である。この時点の後、抗原を流し始め、すぐに、細胞を崩壊させ、細胞数を劇的に減少させる。実施例１および２に記載された予め標識した対照細胞は非常に長期間安定のままであった。２つの重要な基準を以下の安定性：物理的安定性および生物学的安定性に用いた。物理的安定性は懸濁液中の無傷の細胞の存在と定義される。生物学的安定性は、細胞表面上および細胞の内側に存在する抗原の保存と定義される。物理的および生物学的な安定性の双方は対照細胞の機能的な安定性の重要な指標である。
【００７６】
対照細胞の物理的安定性は細胞サイズ、核の存在および抗原の完全性につきフローサイトメトリーを用いて懸濁物中に存在する細胞数を決定することにより時間の関数として観察した。２つの抗原が完全性につきチェックされ、それは対照細胞としての使用につき本発明において重要である。第１の抗原は細胞を捕捉するのに用いるＥｐＣＡＭである。第２の抗原は検出のために用いるサイトケラチンである。正常な血液への既知数の細胞を加えることは、ＥｐＣＡＭ−磁性流体／抗−サイトケラチン−蛍光色素を用いる回収率および引き続いての検出による抗原安定性を供する。この例において、実施例２で調製された対照細胞の安定性を評価した。
【００７７】
物理的安定性：細胞数
実施例２に記載されたごとく調製された細胞を４℃にて暗所でそのままで貯蔵した。一組の対照細胞をＰＦＡで固定し、過剰なＰＦＡを２時間後除去した。ＰＦＡを固定後除去しないことを除いて、他の組の細胞を同定した。双方の場合において、貯蔵ストックを希釈し、細胞数を後記のごとく決定した。全細胞は、三連にて測定した。
【００７８】
２００ｍｌの浸透化溶液を１２×７５ｍｍのポリスチレン試験管に添加した。細胞ストックをボルテックスすることにより混合し、２０μｌの細胞を浸透化溶液試験管に添加した。次いで、５μｌのＰＥにコンジュゲートした抗−サイトケラチンを細胞に添加して、サイトケラチン抗原を染色した。細胞を混合し、室温にて１５分間インキュベートした。３００μｌのＰＢＳを各試料に添加し、混合した。１０μｌのＰｒｏＣＯＵＮＴ核酸色素（Becton Dickinson Immunocytometry Systems（BDIS）, San Jose, CA）を試料に添加して、細胞中に存在するＤＮＡを染色し、１００００個（１０μｌ）の蛍光ビーズ（Beckman-Coulter,カタログ番号６６０７００７）を添加した。次いで、試料を閾値としてＦＬ１を用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーターにより分析した。フローサイトメーターに必要な蛍光ビーズの一部を用いて、フローサイトメトリーにより分析された試料量を決定し、今度はそれを用いて試料中に存在する対照細胞数を計算した。この試験は、時間の関数として従った。その結果を表１ａに示す。
【００７９】
【表２】
2004534210.tif 000003
【００８０】
生物学的安定性：血液からの加えた対照細胞の回収率
（前記に測定された）既知数の対照細胞、ＰＦＡ含有貯蔵細胞、または細胞緩衝液中の新鮮な細胞を１２×７５ｍｍ試験管中の１ｍｌの血漿を涸渇させた血液に加えた。血漿涸渇血液を血液を遠心し、血漿から血液細胞を分離して調製した。遠心後に、大部分の血漿を吸引により除去した。次いで、０.５ｍｌの洗浄希釈緩衝液（Immuniconカタログ番号Ｂ２１１０）をペレットに添加した。試料を混合後に、２０μｌのＥｐＣＡＭ磁性流体を血液試料に添加し、よく混合した。その試験管を磁気分離器（Immuniconカタログ番号ＱＳ−０１２）に１０分間入れた。試験管を磁石から取出し、試料をボルテックスにより混合し、磁気標識した細胞の収集のために１０分間磁気分離器に戻した。収集されなかった試料を吸引し、試験管を磁気分離器から取出した。磁気的に収集した細胞を０.７５ｍｌの洗浄−希釈緩衝液に再懸濁させ、磁気分離器中で１０分間再分離した。収集されない試料を破棄し、収集された細胞を、磁気分離器から試験管を取出した後、２００μｌの浸透化溶液に再懸濁した。
【００８１】
次いで、試料を標識した抗体で染色して、フローサイトメトリーにより腫瘍細胞の回収率を以下の通り測定した。サイトケラチンに特異的であって、対照細胞に存在するＰＥ−コンジュゲートしたＭａｂの５μｌを試料に添加し、１５分間インキュベートした。インキュベートションの後、１ｍｌの洗浄−希釈緩衝液を試験管に添加し、磁気分離を過剰の染色用抗体を除去するために１０分間行った。磁気的に収集された細胞を５００μｌの洗浄−希釈緩衝液に再懸濁させた。次いで、１０μｌのＰｒｏＣＯＵＮＴ核酸色素および１００００個（１０μｌ）の蛍光ビーズ（Beckman-Coulter,カタログ番号６６０７００７）を添加した。次いで、試料を閾値としてＦＬ１を用いてＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒフローサイトメーターにより分析した。フローサイトメーターに必要な蛍光ビーズの一部を用いて、フローサイトメトリーにより分析された試料量を決定し、次いでそれを用いて、加えた対照細胞の回収率を計算した。対照細胞のパーセンテージ回収率を表１ｂに与える。
【００８２】
【表３】
2004534210.tif 000004
【００８３】
表１ａは、細胞の物理的安定性を示す。過剰なＰＦＡの存在および不存在下で２７０日（９ヶ月）まで細胞濃度の有意な変化はない。１時点からもう一つの時点への細胞濃度における変化は、実験誤差内のためである。２７０日の期間にわたり傾向はない。これらのデータは、細胞安定性が、ＰＦＡで細胞を処理し、過剰なＰＦＡの有無でそれらを貯蔵することによって維持できる。
【００８４】
表１ｂは、時間の関数として対照細胞の回収率を示す。これらのデータを図２に図示し、それは対照細胞の生物学的安定性を示す。細胞上および細胞内に存在する抗原は、血液細胞からの選択および検出につき保存されるであろう。対照細胞の表面上に存在するＥｐＣＡＭを細胞の選択に用い、それは磁気粒子への抗−ＥｐＣＡＭ ＭＡｂをコンジュゲートすることにより達成される。抗−ＥｐＣＡＭ磁気粒子による対照細胞の結合および選択は、細胞上のＥｐＣＡＭ抗原の存在および保存に直接的に関連する。そのＥｐＣＡＭ抗原が保存されないならば、磁気粒子は対照細胞に結合しないので、対照細胞の回収率は低下するであろう。選択後の対照細胞は、蛍光色素に対してコンジュゲートした抗−サイトケラチンを用いて検出した。サイトケラチン抗原は、対照細胞中にのみ存在し、血液細胞中には存在しない。磁気的に選択された対照細胞は、サイトケラチン抗原が保存されないかは検出せず、対照細胞の回収率は低くなるであろう。ＥｐＣＡＭおよびサイトケラチン抗原の双方の保存は、対照細胞の回収率に本質的である。
【００８５】
対照細胞の回収率は、各時点にて新鮮な細胞と比較した。新鮮な細胞は、それらが試験された日に調製した。表１ｂに見られるように、新鮮な細胞および過剰のＰＦＡなく貯蔵された対照細胞の回収率において、時間の関数としての有意な変化は存在しなかった。過剰なＰＦＡの存在下で貯蔵された対照細胞の回収率は、新鮮な細胞に比較して有意に低下する傾向にあった。これは、細胞貯蔵の間のＰＦＡの存在が曝露された活性部位と反応することにより抗原に損傷を与えたことを示す。この試験は、制限された量の時間での細胞へのＰＦＡの曝露が、細胞を物理的および生物学的に安定に保つであろうことを示す。
【００８６】
実施例４：乳癌の患者における腫瘍細胞に関するＥｐＣＡＭ抗原レベルの分析
このおよび以下の実施例において、患者で判明した乳癌細胞は１−３対数範囲にわたり変化し得る高度に可変性のＥｐＣＡＭ抗原密度を有することが示されるであろう。しかしながら、この高度の可変性にも拘らず、使用された磁気分離技術は再現可能なパーセンテージの腫瘍細胞をうまく捕捉し、それらが高いまたは低い抗原密度を有するかどうかも以下の例において示される。これらの結果から描かくことができる結論は、対照細胞の回収率が患者の試料中の循環している腫瘍細胞の回収率を正確に反映することである。
【００８７】
セーライン中で貯蔵された、０.１−２.５ｃｍのサイズの範囲にある乳癌を病理学的に確認した１８個の生検をハサミで細かくし、次いで５３μｍのナイロンフィルター（SpectraMesh, SPECTRUM, Houston, TX）を通過させて、大きな細胞の塊を除去した。細胞をＰＢＳ／１％ ＢＳＡ／５０ｍＭ ＥＤＴＡ（細胞緩衝液）中で洗浄し、次いで細胞緩衝液に再懸濁させた。核となる合計細胞カウントは、アクリジンオレンジ／臭化エチジウムでの血球計により行った。
【００８８】
約２０,０００−５０,０００個の核となる合計細胞（１０−５０μｌの細胞懸濁物）は、各々の１８組の３本の１２×７５ｍｍ試験管に入れた。容量は細胞緩衝液で１５０μｌとした。次いで、全試験管が０.２５μｇのＣＤ４５  ＰｅｒＣＰを受けた。試験管１は、試薬を受けず（自己蛍光対照）、試験管２は２０μｌのFastImmune PE IsotypeControlを受け、次いで、試験管３は０.２５μｇのＥｐＣＡＭ Ｍａｂ−ＰＥを受けた。細胞懸濁物は、試薬と１５分間インキュベートし、次いで、１ｍｌの細胞緩衝液を各試験管に添加し、その試験管を遠心した。上清を注意深く除去し、細胞ペレットを５００μｌのFACS Lysing Solution（BDIS）に再懸濁した。この時点にて、３.０μｌ（１０μｌ＠３００μｇ／ｍＬ）のそのＰｒｏＣＯＵＮＴ核酸色素および５０μｌのFACSCount Counting Control High beads（BDIS）を各試験管に添加した。次いで、試料をＦＬ１で設定された閾値を持つFACSCalibur（BDIS）で試行し、ＦＬ２の光電子増倍管の電圧は、染色されていない細胞の自己螢光シグナルが最初の十年間に存在するように設定した。
【００８９】
核酸色素およびＥｐＣＡＭで染色されたが、ＣＤ４５で染色されなかった細胞集団は、細胞懸濁物内の腫瘍細胞と考えた。ＥｐＣＡＭ陽性細胞の平均蛍光強度は、各乳房腫瘍試料につき決定した。図３は、１８の乳癌生検の各々における各腫瘍細胞の平均蛍光強度を示す。染色されているバックグラウンドの範囲は、縦軸に添って破線矢印で示した。種々の腫瘍細胞系、Ｃｏｌｏ２０４（高い）、ＳＫＢＲ−３、ＭＣＦ−７、ＢＴ４７４およびＰＣ３（低い）についての平均蛍光強度で判明した範囲を右軸で示す。
【００９０】
実施例５：ＣＡ−ＥｐＣＡＭ  ＭＡｂ磁性流体の凝集の有無での血液からの加えた低および高ＥｐＣＡＭ抗原密度細胞の回収率。
乳癌細胞（ＳＫＢＲ−３）はＰＣ３細胞と比較して、約７倍高いＥｐＣＡＭ抗原密度を有し、この例につき高抗原密度腫瘍細胞のモデルに選定した。細胞緩衝液中で既知数のＳＫＢＲ−３またはＰＣ３細胞を１２×７５ｍｍ試験管中で別々に洗浄された１ｍｌの血液に加えた。洗浄した血液を１０ｍｌの酸クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）抗凝固血と、細胞の試薬へのいずれの非特異的な結合も防止するために蛋白質を含有するリン酸緩衝液よりなる洗浄希釈緩衝液（WDB Immunicon カタログ番号B２１１０）の１０ｍｌとを混合することにより調製した。次いで、それを２０００ｒｐｍにて１０分間遠心した。上清を吸引し、次いで容量をＷＤＢで２０ｍｌまで上げた。それを混合し、再度遠心した。上清を吸引し、容量を１０ｍｌまで上げ、１０ｍｌの「洗浄した血液」を得る。５００μｌのＷＤＢおよび１５μｌの、凝集試薬（Streptavidin Immunicon パーツ番号６０２６）を含有するＰＢＳを試料に添加した。試料を混合後、２５μｌの制御された凝集上皮細胞付着分子磁性流体（CA-EpCAM FF, Immuniconパーツ番号６０２９）を添加し、血液試料をよく混合させ、次いで１５分間インキュベートする。インキュベーション後、試験管を１０分間四極磁気分離器に入れて、磁気的に標識された細胞を収集した。その磁気的に単離された細胞をフローサイトメトリーにより腫瘍細胞の回収率につき分析した。
【００９１】
【表４】
2004534210.tif 000005
【００９２】
そのデータは、凝集試薬が血液試料に添加されない場合に低および高抗原密度細胞の間の腫瘍細胞の回収率におけるかなりの差を明らかとした。また、顕微鏡で観察されるような溶液中または細胞表面上に磁性流体凝集物はなかった。凝集試薬の血液試料への添加は、低抗原密度ＰＣ３細胞の回収率をかなり（３倍）増加させ、溶液中および細胞上の磁性流体凝集が相応に増加した。他方、血液試料中に存在する凝集試薬の有無での高抗原密度ＳＫＢＲ−３細胞の回収率において小さな差だけ存在した。磁性流体凝集がなくても、それを効率的に収集し、高い回収率を供するのに十分な磁性流体がＳＫＲＢ−３細胞上に存在した。低抗原密度細胞の場合において、磁気方法により効率的に収集されるのに十分な磁性流体が細胞上に存在した。凝集試薬による磁性流体凝集は、これらの細胞上の磁性流体量を増加させ、その結果、効率的により高回収率を生じる。また、磁性流体の凝集は、高抗原密度細胞で得られたものに近くまで低抗原密度細胞の回収率を増加させたことに注目すべきである。換言すれば、磁性流体凝集物の血液試料への添加に際して、低および高抗原密度腫瘍細胞の回収率の有意差は存在しなかった。
【００９３】
実施例６：Ｃｅｌｌ ＳｐｏｔｔｅｒＲを介する検出での実際の患者試料中の対照細胞。
５ｍＬのＷＤＢを前立腺癌の患者からの５ｍｌの血液試料に添加した。混合後、血液を２０００ｒｐｍにてブレーキをオフにして１０分間遠心した。血漿を吸引により除去し、容量をＷＤＢで１０ｍｌとした。試料を再度混合し、遠心した。その上清を吸引により回収し、洗浄した血液の容量をＷＤＢで５ｍｌに増加させた。対照細胞を実施例１に記載された方法を用いて調製し、次いで、５ｍｌの洗浄した血液試料に加えた。２０μｌの５.０×１０３細胞／ｍｌの対照細胞ストックを用い、その結果、１００個の対照細胞を加えた。次いで、２.５ｍｌのＷＤＢ、５０μｌの凝集試薬および７５μｌのＣＡ−ＥｐＣＡＭ ＦＦをその順序で添加し、一度に混合した。混合後、試験管を磁気細胞分離器に１０分間入れた。次いで、試験管を取出し、反転させ、次いで、その分離器にさらに１０分間戻した。試験管を再度取出し、反転させ、次いで２０分間分離した。次いで、試験管の側面で細胞および磁気材料を乱すことなく注意深く、試験管内の液体を注意深く吸引した。試験管を磁気分離器から取出し、３ｍｌのＷＤＢを試験管に添加し、それを試験管側でボルテックスし、材料を再懸濁させた。次いで、試験管を磁気分離器に１０分間再度挿入した。液体は、試験管が磁気分離器に残存する間に吸引により除去した。試験管を磁気分離器から取出し、以下の試薬を添加した：２００μｌ Permeabilization Reagent（Immunicon part No. ６０３２）、２０μｌ ＣＤ４５ ＦＩＴＣ（Becton Dickinson カタログ番号 ３４７６４３）、１０μｌ ＤＡＰＩ（１００μｇ／ｍｌ, Molecular Probes カタログ番号D-３５７１）、１５μｌ α−サイトケラチン−Ｃｙ３Ｒ（５０μｇ/ｍｌ）、および ５μｌ α-ＨＥＲ２ｎｅｕ-Ｃｙ５Ｒ（５０μｇ/ｍｌ）。Ｃｙ３ＲおよびＣｙ５Ｒの双方を製造者（Amersham）により推奨されている手順に従い抗体とコンジュゲートする。試料をボルテックスして、磁気的に収集された細胞を再懸濁させ、次いで１５分間インキュベートした。次いで１０ｍｌの細胞緩衝液（Immunicon パーツ番号６０１３）を添加し、反転により混合した。遠心（１３００ｒｐｍ、１０分間、ブレーキ・オフ）後、液体を約２００μｌまで吸引し下げ、２０μｌの５％パラホルムアルデヒドを添加した。全試料をCell SpotterＲチャンバーにピペットで入れ、画像をＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３ＲおよびＣｙ５Ｒ用のフィルターセットを用いて得た。
【００９４】
細胞スポッティングの結果を図４、パネルＡ−Ｅに示す。図４Ａは、Ｃｙ３Ｒ画像の一つを示す。４つのボックスは、細胞様の特徴を持つサイトケラチンＣｙ３＋物の周囲に描いた。矢印は、これらの各ボックスからパネルＢ、Ｃ、ＤおよびＥまで描いている。これらの各パネルの頂部において、重複がα−サイトケラチン−Ｃｙ３Ｒ画像（緑色）およびＤＡＰＩ画像（紫色）から示され；中間の画像は、ＣＤ４５−ＦＩＴＣおよびＤｉＯＣ１６（３）染色が見られるフィルターであって；底部画像において、Ｈｅｒ２Ｃｙ５Ｒの染色である。画像がパネルＤおよびＥに示されるボックスは、核、ＦＩＴＣフィルターにおける明るい染色（ＤｉＯＣ１６（３）＋＋）およびＨｅｒ２ｎｅｕ−Ｃｙ５Ｒにつき陽性染色を有する細胞を含む。これらの細胞の双方は、対照細胞であり、テストにおける試薬が機能的であることを確認する。これらの場合において、５８個の対照細胞を同定し、それは試料調製で誤りがなされなかったことを示した。パネルＢおよびＣに示された他の２つのボックスは、核を有するが、ＦＩＴＣフィルターにおいて出現せず、また、Ｃｙ５Ｒフィルターにおいて出現しない細胞を含む。これらの細胞は、Ｈｅｒ２ｎｅｕを発現しない腫瘍細胞に特異的な特性を有する。また、そのボックスには、核の存在により示され得る他の細胞もあり、しかしながら、これらの細胞はＣＤ４５−ＦＩＴＣで染色され、かつ白血球である。α−サイトケラチン−Ｃｙ３Ｒに対して非特異的に結合している白血球は、細胞特性が白血球のものとは区別されるかを識別のみすることができ、その場合にはそれらは疑わしいと指定する。正常な上皮細胞は、核染色（ＤＡＰＩ）および細胞質染色（サイトケラチン）により評価されるようなそれらの形態学的な特徴に基づく悪性の特徴を持つ上皮細胞とは識別できる。
【００９５】
実施例７：フローサイトメトリーにより分析された循環している腫瘍細胞アッセイ用の内部対照細胞
乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３の細胞を固定し、化合物ＤｉＯＣ１６（３）で蛍光標識する。この化合物は、細胞膜を染色し、フローサイトメトリーにおいて共通して用いたアルゴンイオンレーザー線（４８８ｎｍ）で励起できる。その色素の発光は、ＦＩＴＣにより発光した蛍光シグナルを検出するのに用いるのと同一の光電子増倍管によって検出される。ＤｉＯＣ１６（３）で染色された細胞を５００００細胞／ｍｌの濃度にて貯蔵した。本明細書に記載された実験において、１００μｌの対照細胞（５０００細胞）を１２×７５ｍｍポリスチレン試験管中の２つの２ｍｌＡＣＤ抗凝固血液に添加した。これらの試料の一方に、乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３の１００μｌの非標識細胞を添加し、約５０００個の細胞を含有させた。２ｍｌの緩衝液を血液に添加し、注意して混合し、次いで８００ｒｐｍで１０分間遠心した。次いで、２.５ｍｌの血漿−緩衝液混合物を吸引し、廃棄した。試料を混合し、１.５ｍｌの緩衝液、９μｇの凝集試薬および９μｇのＣＡ−ＥｐＣＡＭ ＦＦをその順序で試料に添加し、一度に混合した。次いで、試験管を磁気細胞分離器に入れた。１０分間後、試料を分離器から取出し、混合し、その分離器にさらに１０分間戻した。試験管を再度取出し、混合し、分離器に２０分間戻した。上清を注意深い吸引により除去し廃棄し、１ｍｌの緩衝液を試験管に添加した。試料を分離器から取出し、試験管の壁に付着した全ての細胞および磁性流体が再懸濁するのを保証した。試料を分離器に戻した。１０分間後、緩衝液を吸引し、廃棄した。試験管を分離器から取出し、２００μｌの細胞膜を浸透化する溶液、１０μｌの、サイトケラチンに指向されるモノクローナル抗体で標識したＰＥ、および２０μｌのＦＩＴＣ標識抗体をその試験管に添加した。試料を再度混合し、壁に付着した全ての磁性流体および細胞を再懸濁することを保証した。１５分のインキュベーション後、２ｍｌの緩衝液を添加し、混合し、試料を分離器に１０分間戻した。緩衝液を吸引および廃棄した後、試料を分離器から取出し、０.５ｍｌの非凝集試薬（Immunicon パーツ番号６０２７）を添加した。次いで、試料をフローサイトメトリーにより分析した。
【００９６】
フローサイトメトリーの装置設定は、前方光散乱に対する閾値を用いて設定した。この設定は、磁性流体粒子（１７０ｎｍ）、およびサイズに基づく残存する蛍光標識抗体を含めて所望ではない事象を消失させる。加えて、ゲートを用いて、赤血球および血漿板のごときＦＩＴＣまたはＰＥで染色されない全ての事象を消失させた。図５は、両試料の分析を示す。頂部の２つのパネル（図５ａ−ｂ）は、対照細胞だけを含有した試料の分析を示し、底部の２つのパネル（図５ｃ−ｄ）は両対照細胞ならびに腫瘍細胞を含有した試料の分析を示す。前方および直角光散乱ドットプロットは、左（図５ａ，５ｃ）に示され、ＦＩＴＣ−対−ＰＥシグナルに関連するドットプロットは、右（図５ｂ、５ｄ）に示される。４つのゲートが右パネルに示されている。ゲートＲ３は、全ての陰性ＦＩＴＣおよびＰＥ事象を排除する。対照細胞はゲートＲ１に現れ、ＤｉＯＣ１６（３）（ＦＬ１）で明るく染まり、ならびにサイトケラチンＰＥで明るく染まっている。白血球はゲートＲ４に現れ、ＣＤ４５ＦＩＴＣで染まるが、サイトケラチンＰＥでは染まらない。腫瘍細胞は、ゲートＲ２に現れ、ＣＤ４５ ＦＩＴＣまたはＤｉＯＣ１６（３）で染まらないが、サイトケラチンＰＥに陽性である。これらの領域外の事象は、残骸（Ｒ３−（Ｒ１＋Ｒ２＋Ｒ４））と考えられる。頂部パネルにおいて、４０３個の白血球、２６４７個の対照細胞、および０個の腫瘍細胞が検出された。５０００個の対照細胞を元来の血液試料に添加したので、２３５３個をその手順で喪失した。細胞のこの喪失は、標識、分離、吸引のごとき多数の工程において生じかねなく、この場合には、主要な誘因は、フローサイトメトリーでのデータ取得後に約１００μｌが試験管内に残っているという事実であった（試料の２０％）。アッセイ開発において、細胞の喪失に最も重要である工程を同定することが重要である。アッセイを用いて、患者が血中に癌細胞を有するか否か、および容量単位当り何個の癌細胞が存在するかを測定する場合、試料が正確に処理されたか否か、または試薬が適切に機能しているか否かを知ることが重要である。この例において、５０００個のうち２６７４個の対照細胞が検出され、出発血液量は２ｍｌであるので、２６７４／５０００×２ｍｌ＝１.１ｍｌだけが有効に分析されたと結論できる。腫瘍細胞数が０であるので、１.１ｍｌの血液中に０個の腫瘍細胞が検出されたと結論できる。しかしながら、この場合には、２ｍｌの血液が分析され、０個の腫瘍細胞が存在すると結論できない。対照細胞は示されたゲートより下の領域にあるであろう場合には、試薬は機能せず、結果は報告できない。底部パネルにおいて、３０４個の白血球、２６６７個の対照細胞、および２１２９個の腫瘍細胞を検出した。この例において、５０００個のうち２６６７個の対照細胞を検出し、出発血液量は２ｍｌであるので、２６６７／５０００×２ｍｌ＝１.１ｍｌだけが有効に分析されたと結論できる。腫瘍細胞数が２１２９個であったので、１.１ｍｌの血液中に２１２９個の腫瘍細胞が検出されたと結論できる（１９９５個の腫瘍細胞／ｍｌ血液）。
【００９７】
実施例８：自動細胞分析プラットホームにより分析できる循環している腫瘍細胞アッセイのための内部対照細胞
この例において、フローサイトメトリーは、４８８ｎｍのアルゴンイオンレーザーならびに６３５ｎｍのレーザーダイオードを装備している。しかしながら、５３５ｎｍのレーザーダイオードならびに６３５ｎｍのレーザーダイオードを装備した、米国特許第５,９８５,１５３号に記載の光学的細胞分析装置も分析のために用いることができた。末梢血中の癌細胞を同定するための異なったプローブを標識するために用いた蛍光色素の組合わせは、容易に変更できる。この例において、サイトケラチンを認識する抗体は、ＰＥで依然として標識され、４８８ｎｍのレーザー線または５３５ｎｍのレーザーダイオードで励起される。５３５ｎｍの光源はＰＥの最大吸収ピークに接近し、かくして、より良好なシグナル−対−ノイズ比を生じる。また、白血球を認識する抗体は、この配置で非特異的に結合する細胞または事象を消失させるために用いられる。ＣＤ４５抗体は、アロフィコシアニン（allophycocyanine）（ＡＰＣ）で標識され、４８８ｎｍのレーザー線または５３５ｎｍのレーザーダイオードではなく６３５ｎｍのレーザーダイオードで励起される。前記の例に記載されたＦＩＴＣ／ＰＥの組合せに比較してこの組合せの利点は、両蛍光色素の発光スペクトルのクロストーク（cross talk）が発生しないということである（すなわち、補償は必要ない）。
【００９８】
対照細胞を染色および同定するのに用いる色素は、ＡＰＣチャネルと同一のチャネルにおいて好ましくは測定され、但し、対照細胞は前記の例のごとき白血球から実際には分離できる。この例において、乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３の細胞を固定し、疎水性膜色素の１,１'−ジオクタデシル−３,３,３',３'−テトラメチルインドジカルボシアニン（ＤｉｌＣ１８（５）、Ｆｌｕｋａ）で蛍光標識する。この化合物は細胞膜を染色し、６３５ｎｍレーザーダイオードで励起できる。その色素の発光は、ＡＰＣにより発光される蛍光性シグナルを検出するために用いるのと同一の光電子増倍管によって検出される。ＤｉＩＣｌ８（５）で染色された細胞は、１×ｌ０５細胞／ｍｌのワーキング濃度で用いられる。本明細書に記載された実験において、５０μｌの対照細胞（５０００細胞）を２ｍｌの洗浄された血液の２つの試料に添加した。これらの一方には、約５０００個の細胞を含む５０μｌの乳癌細胞系ＳＫＢＲ−３の非標識細胞を添加した。試料を混合し、１.０ｍｌの緩衝液、９μｇの凝集試薬および９μｇのＣＡ−ＥｐＣＡＭ ＦＦをその順序で試料に添加し、一度に混合し、次いで、磁気細胞分離器に入れた。１０分間後、試料を分離器から取出し、混合し、その分離器にさらに１０分間戻した。試料を分離器から再度取出し、混合し、その分離器にさらに２０分間戻した。試験管を分離器から取出し、次いで１００μｌの細胞膜を浸透化溶液、１０μｌの、サイトケラチンに指向されるモノクローナル抗体で標識したＰＥ、および２０μｌのＣＤ４５−ＡＰＣ標識抗体（Pharmingen）をその試験管に添加した。試料を混合し、壁に付着した全ての磁性流体および細胞を再懸濁することを保証した。１５分のインキュベーション後、１ｍｌのＷＤＢを添加し、混合し、試料を分離器に１０分間戻した。緩衝液を吸引および廃棄した後、試料を分離器から取出し、０.５ｍｌの非凝集試薬（Immunicon パーツ番号６０２７）を添加した。次いで、試料をフローサイトメトリーにより分析した。
【００９９】
フローサイトメトリーの装置設定は、前方光散乱に対する閾値を用いて設定した。このれは、磁性流体粒子（１７０ｎｍ）およびサイズに基づき残存する蛍光標識抗体を含めて所望ではない事象を消失させる。加えて、ゲートを用いて、赤血球および血漿板のごときＡＰＣまたはＰＥで染色されない全ての事象を消失させた。図６および７は、両試料の分析を示す。図６ａ−ｃは、対照細胞だけを含有した試料の分析を示し、図７ａ−ｃは両対照細胞ならびに腫瘍細胞を共に含有した試料の分析を示す。前方および直角光散乱ドットプロットを、図６ａおよび７ａに示す。ＰＥシグナル−対−ＦＬ１（５３０±３０ｎｍ）と関連するドットブロットを、図６ａおよび７ｂに示す。ＰＥ［＋］事象を同定するゲートＲ１を示す。矢印は、ＰＥおよびそのＦＬ１チャネルにおける非特異的な蛍光を示す事象の位置を示す。ＰＥ−対−ＡＰＣドットプロットを図６ｃおよび７ｃに示す。４つのゲートを示す。白血球はゲートＲ２に現れ、ＣＤ４５ＡＰＣで染まるが、サイトケラチンＰＥでは染まらない。ゲートＲ３において、腫瘍細胞は、ＣＤ４５ ＡＰＣまたはＤｉＯＣ１８（５）で染まらないが、サイトケラチンＰＥに陽性である。ゲートＲ５において、対照細胞が現れ、ＤｉＯＣ１８（５）で明るく染まり、ならびにサイトケラチンＰＥで明るく染まっている。ゲートＲ４に現れる細胞は、ＣＤ４５−ＡＰＣに非特異的に結合でき、ＰＥで染色される非特異的に結合した白血球または可能な腫瘍細胞であり得る。図６ｄにおいて、１１４４個の白血球［Ｒ２］、２０２３個の対照細胞［Ｒ５］、３個の可能な腫瘍細胞［Ｒ４］および０個の腫瘍細胞［Ｒ３］を検出した。可能な腫瘍細胞は、標識された腫瘍細胞の蛍光特性を呈するが、腫瘍細胞についての閾値外にある。これらの事象は、それらが実際の腫瘍細胞と確認されるであろうある種の特徴を常に欠如している。
【０１００】
５０００個の対照細胞を元来の血液試料に添加したので、２９７７個をその手順で喪失した。この例において、５０００個のうち２０２３個の対照細胞が検出され、出発血液量は２ｍｌであったので、２０２３／５０００×２ｍｌ＝０.８ｍｌだけが有効に分析されたと結論できる。腫瘍細胞数が０であるので、０.８ｍｌの血液中に０個の腫瘍細胞が検出されたと結論できる。しかしながら、この場合には、２ｍｌの血液が分析され、０個の腫瘍細胞が存在すると結論できない。対照細胞が示されたゲートより下の領域にあるであろう場合には、試薬は機能せず、結果を報告できなかった。図７ｄにおいて、１６３２個の白血球［Ｒ２］、２０４２個の対照細胞［Ｒ５］、８２個の可能な腫瘍細胞［Ｒ４］および１６４４個の腫瘍細胞［Ｒ３］を検出した。この例において、５０００個のうち２０４２個の対照細胞を検出し、出発血液量は２ｍｌであったので、２０４２／５０００×２ｍｌ＝０.８ｍｌだけが有効に分析されたと結論できる。腫瘍細胞数が１６４４個であったので、０.８ｍｌの血液中に１６４４個の腫瘍細胞が検出されたと結論できる（２０５５個の腫瘍細胞／ｍｌ血液）。
【０１０１】
実施例９：中立的浮力条件下の対照細胞の貯蔵
全細胞でのごとき対照細胞での多数の仕事を通じて、細胞操作の再現性は共通した問題である。ピペットで吸われた細胞はしばしば再生不可能であり、細胞の有効な混合および懸濁に依存し、それは直ちに静置に際して沈みはじめる。腫瘍細胞を加えること、対照細胞の添加、および対照としての新鮮な細胞の使用は全て誤差の潜在的な源となる。対照細胞の使用における再現性を増加させる一つの新規な方法は、中立な浮力貯蔵システムを用いることである。この系において、安定化された対照細胞の比重は、貯蔵媒体の密度と同一であろう。かくして、細胞は決して沈まず、永久に混合されたままであろう。
【０１０２】
この例において、異なる密度媒体を異なる濃度にてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いることにより調製した。４５％のＢＳＡ溶液（Sigma）をＰＢＳ中で２５％、１５％、１０％および５％に希釈した。勾配は、遠心分離管中で以下の通り調製した：まず、３ｍｌの２５％のＢＳＡを空の１５ｍｌ遠心分離管に添加した。次いで、３ｍｌの１５％ＢＳＡ溶液を混合せず２５％ＢＳＡ溶液の頂部で穏やかに層とした。その１０％ＢＳＡ溶液は、１５％の頂部で穏やかに層とした。５％ＢＳＡ溶液は、１０％の頂部で穏やかに層とした。ＢＳＡ溶液の異なる層ははっきり見ることができる。ＰＢＳ中の新鮮なＳＫＢＲ−３培養腫瘍細胞（２×１０６細胞／ｍｌ）１％ＢＳＡを５％ＢＳＡ溶液の頂部で層とした。１５ｍｌの試験管を４００ｇでブレーキ・オフにて３０分間遠心した。遠心後、試験管中にメジャーおよびマイナーなバンドが見えた。メジャーなバンドは１５％ＢＳＡ溶液の頂部で細胞の広範囲のバンドであり、マイナーなバンドは１０％ＢＳＡ溶液の頂部で非常に少量のバンドであった。マイナーなバンドは大部分死細胞を含有した。これらのデータは、培養されたＳＫＢＲ−３腫瘍細胞が、１５％ＢＳＡ溶液に入らないので、１０％ＢＳＡを越えて１５％ＢＳＡ以下の密度を有することを示した。
【０１０３】
ＳＫＢＲ−３細胞が１５％ＢＳＡ溶液中で懸濁のままであるかをテストするために、以下の実験を設計した。ＳＫＢＲ−３細胞（１×１０５個）を１２×７５ｍｍポリスチレン試験管中の１ｍｌのＰＢＳ、１５％ＢＳＡ溶液に添加しよく混合した。対照として、１×１０５個のＳＫＢＲ−３細胞をもう一つの１２×７５ｍｍポリスチレン試験管中の１ｍｌのＰＢＳ、１％ＢＳＡ溶液に添加した。両試験管を４００ｇで１０分間遠心した。遠心は、通常の緩衝液において試験管の底まで細胞を下げるであろう。ＰＢＳ試験管中の１％ＢＳＡの底で細胞ペレットが存在した。しかしながら、全ての細胞が懸濁したままであるために、１５％ＢＳＡを含む試験管の底にて細胞ペレットは存在しなかった。この実験は、細胞および媒体が同一密度を有する媒体において、重力のための沈降は止まるであろうことを示す。かくして、ストック溶液からのピペッティングは再混合を必要とせず、再現可能な行動となるであろう。かかる媒体中で貯蔵された細胞は、他の理由のために従来の方法で貯蔵された細胞より優れているであろう。細胞を損傷するいずれかがそれら密度を変化させ得るので、クランピングおよび架橋は生じなく、バイアルの底の隅に貼り付かず、細胞の均一性が保証されるであろう。かくして、この方法の密度遠心において、さらなる精製が導入される。
【０１０４】
かかる貯蔵系の使用が希少細胞選択および癌検出の分野をはるかに越えて拡張することを細胞培養の技術分野における当業者により直ちに認識されるであろう。
【０１０５】
実施例１０：異なる細胞濃度の内部対照の使用
実施例７および８は、ある特定の細胞濃度で内部対照として予め標識された細胞の使用を示す。ある細胞濃度での内部対照は、テストが正確に成されたが、異なる細胞濃度での細胞回収の効率を示さない。患者の試料中に存在する腫瘍細胞数は変化し、用いた対照細胞数と同様ではないかもしれない。しかしながら、加えた培養腫瘍細胞の回収率はそのモデル試験における１細胞／ｍｌないし５０００細胞／ｍｌ血液で直線である。しかし、患者試料からの対照細胞の回収率が種々の濃度で挙動する理由は知られていない。これは、患者の試料に対する異なる濃度で対照細胞を加え、次いでそれらを回収することにより回答できる。それは、異なる濃度についての同一蛍光強度を持つ対照細胞を用いることによっては達成できない。それは、異なる強度の同一蛍光マーカーを含む、または異なる蛍光マーカーを含む異なる対照細胞を用いることによって達成できる。
【０１０６】
例えば、対照細胞は、異なる特徴的な蛍光特性を有する異なる蛍光マーカーで調製でき、容易に区別できる。実施例７および８において、異なる蛍光特性を持つ２つの異なるタイプの対照細胞を用いた。実施例７で用いた対照細胞は、ＦＩＴＣに類似する蛍光発光を有するＤｉＯＣ１６（３）で予め標識した。実施例８において、ＤｉＯＣ１８（５）で予め標識した対照細胞を用い、それらはＡＰＣに類似する蛍光を発光する。ＦＩＴＣは、５１９ｎｍで最大蛍光を発光し、ＡＰＣは６６０ｎｍで最大蛍光を発光する。これらの２つの対照細胞は、米国特許第５,９８５,１５３号に記載されたものを含めた、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、または他の光学的な分析プラットホームにより容易に区別できる。ＤｉＯＣ１６（３）で標識した対照細胞を高濃度（５０００細胞／ｍｌ血液）対照細胞として用い、ＤｉＯＣ１８（５）で標識した対照細胞を低濃度（５細胞／ｍｌ血液）対照細胞として用いることができる。既知数の高および低対照細胞を患者血液に加え、次いで、高および低対照細胞の双方の回収率を測定する。両細胞のパーセンテージ回収率は、低および高細胞濃度で対照細胞の回収の効率が同一であるならば同様であろう。腫瘍細胞の回収率は、低および高対照細胞濃度の間にあり得る。次いで、低および高対照細胞回収率の双方を用いて腫瘍細胞の回収率を計算することが可能である。
【０１０７】
種々の細胞濃度の対照細胞を用いるもう一つの方法は、異なる蛍光強度を有する対照細胞を加えることによる。ある蛍光強度を持つ対照細胞は、特定の細胞集団を表す。異なる蛍光強度を持つ対照細胞は、色素濃度または染色時間のごとき標識条件を変化させることにより調整できる。
【０１０８】
前記の例の方法を用いて、本発明の組成物および方法を他の細胞タイプに適用して、他のアッセイ用の内部対照を生成できる。出願番号０９／２４８,３８８（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす）に記載された多数の疾患を検出する方法を含めて、循環している細胞の単離および富化についての新しい方法が開発されているので、内部対照につての要求が存在するであろう。その標的細胞に類似して挙動することが示された公知の細胞系を標識すれば、前記の例は、これらの対照を創製するのに可能性を示すであろう。標的細胞には、限定されるものではないが、乳癌、前立腺癌、大腸癌、肺癌、腎臓癌、卵巣癌、白血病、黒色腫、神経膠腫および他の多数の癌タイプのいずれかのごとき循環している癌細胞が含まれる。これらの各々は、対照細胞を生成するのに適当であり得る腫瘍細胞系を有する。さらに、内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞のごとき、疾患状態を示す他の循環している標的細胞をアッセイでき、また対照を必要とする。また、これらの細胞は、対応する細胞系を有するか、あるいは培養または増殖させて機能的な対照を生成できる。最後に、ウイルス感染細胞（ＨＩＶ）、細菌または他の微生物のごとき循環している標的細胞を生じる感染についてのアッセイ方法は、本発明の方法により提供できる内部対照を必要とするであろう。
【０１０９】
本発明のある種の好ましい具体例が前記され、特に例示されているが、本発明はかかる具体例に限定することを意図するものではない。本発明の精神から逸脱することなく、種々の修飾をそれになすことができ、その十分な範囲は特許請求の範囲に示される。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１Ａ−１Ｃは、対照細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
【図２】図２は、新鮮な細胞に比較した、過剰なパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）の有無での（ＨＥＲ２ｎｅｕ−Ｃｙ２ＴＭ ＭＡｂで予め標識した）固定されたＳＫＢＲ−３細胞の安定性を示す。
【図３】図３は、１８名の乳癌患者における平均蛍光強度により測定された抗原密度を示す。
【図４】図４ａ−ｅは、前立腺癌患者の血液から選択されたＥｐＣＡＭ磁性流体（ferrofluid）のＣｅｌｌ ＳｐｏｔｔｅｒＲ分析を示す。
【図５】図５ａ−ｄは、腫瘍細胞添加の有無による血液から選択されたＥｐＣＡＭ磁性流体のフローサイトメトリー分析を示す。
【図６】図６ａ−ｄは、腫瘍細胞添加の無い血液から選択されたＥｐＣＡＭ磁性流体のフローサイトメトリー分析を示す。
【図７】図７ａ−ｄは、腫瘍細胞添加された血液から選択されたＥｐＣＡＭ磁性流体のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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