(57)【要約】本発明は患者の腫瘍を治療する方法に関する。この方法は、患者のサンプルから得られたプロゲステロン誘発ブロッキングファクター（ＰＩＢＦ）あるいはその誘導体、あるいはその断片を測定する方法を含んでいる。また、抗ＰＩＢＦ抗体、ＰＩＢＦ、あるいはその誘導体、あるいはその断片を使用し、また、ポリヌクレオチドコードＰＩＢＦを抗腫瘍薬として使用する。
2004514909.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者からサンプルを採取し、
上記サンプル中のＰＩＢＦ（プロゲステロン誘発ブロッキングファクター）またはその誘導体またはその断片の濃度を測定し、
上記サンプル中の上記ＰＩＢＦ濃度が所定の閾値より上か下かどうかを決定し、
上記濃度が閾値より高い場合には患者が腫瘍を有すると特定する患者の腫瘍を診断する方法。
【請求項２】
上記腫瘍が上皮性ガン、特に肺ガン、大腸ガン、乳ガンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記サンプルは体液、特に尿または血清であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
上記サンプルは組織サンプルであることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
上記閾値は健康な人間のサンプル中の上記ＰＩＢＦ濃度であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
上記閾値は患者のサンプル中のＰＩＢＦ濃度に対応する少なくとも一人の健康な人間の上記ＰＩＢＦ濃度を測定することによって決められることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
陽性コントロールとして、上記患者の上記サンプル中の上記ＰＩＢＦまたはその誘導体またはその断片の上記濃度の決定に対応して、所定濃度のＰＩＢＦまたはその誘導体またはその断片を含むサンプル中のＰＩＢＦまたはその誘導体またはその断片の濃度を測定することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
上記サンプル中の上記ＰＩＢＦ濃度を免疫学的に測定し、特に、競合アッセイ、サンドイッチアッセイ、免疫染色、またはこれらの方法の組み合わせによって測定することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
上記サンプル中の上記ＰＩＢＦ濃度を、上記サンプル中のＰＩＢＦ−ｍＲＮＡ濃度を測定することによって間接的に測定することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
患者の腫瘍の陽性または陰性進行を決定する方法であって、
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法に従って患者の腫瘍を診断し、
上記サンプル中の上記測定されたＰＩＢＦまたはその誘導体またはその断片の濃度が、同じ患者から前回採取された少なくとも一つの上記サンプル中の少なくとも一つの前回測定されたＰＩＢＦまたはその誘導体またはその断片の濃度より上か下かを決定し、
上記前回測定された濃度より上の濃度の場合、陽性進行であることを決定する方法。
【請求項１１】
抗ＰＩＢＦ抗体、好ましくはモノクローナル抗体あるいはその断片を使用する請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＩＢＦまたはその誘導体またはその断片を使用する請求項７〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
上記ＰＩＢＦは組み換え体ＰＩＢＦであることを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも一つの抗ＰＩＢＦ抗体またはその断片からなる第一の試薬、および、所定濃度のＰＩＢＦまたはその誘導体またはその断片からなる第二の試薬を有するキット。
【請求項１５】
少なくとも一つの上記抗ＰＩＢＦ抗体またはその断片または上記ＰＩＢＦまたはその誘導体またはその断片が結合する固相を有する請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
上記ＰＩＢＦが組み換え体であることを特徴とする請求項１４または１５に記載のキット。
【請求項１７】
上記第一の抗ＰＩＢＦ抗体またはその断片によって認識されるエピトープに特有の上記ＰＩＢＦのエピトープに結合する第２抗ＰＩＢＦ抗体またはその断片からなるさらにもう一つの試薬を含むことを特徴とする請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１８】
それぞれ患者の腫瘍を診断し患者の腫瘍の進行度を決定するためのものである請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１９】
抗腫瘍薬の調製のための、抗ＰＩＢＦ抗体、好ましくはモノクローナル抗体、特にヒト化した抗ＰＩＢＦ抗体あるいはその断片の使用。
【請求項２０】
上記抗体は単一鎖抗体であることを特徴とする請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
上記抗体は分子に付着することを特徴とする請求項１９または２０に記載の使用。
【請求項２２】
上記分子は誘導物質であり、特にそれぞれ放射性核種化学療法薬または化学療法毒、そしてプロドラッグであることを特徴とする請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
抗腫瘍薬の調製のためのＰＩＢＦまたはその誘導体またはその断片の使用。
【請求項２４】
上記薬はワクチンであることを特徴とする請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
上記ワクチンはさらに免疫賦活剤を含むことを特徴とする請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
上記ＰＩＢＦまたはその誘導体またはその断片は組み換え体であることを特徴とする請求項２３または２４に記載の使用。
【請求項２７】
上記ＰＩＢＦまたはその誘導体またはその断片は化学合成された分子であることを特徴とする請求項２３または２４に記載の使用。
【請求項２８】
抗腫瘍薬の調製のためのＰＩＢＦまたはその誘導体またはその断片またはＰＩＢＦアンチセンス分子をコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項２９】
配列番号１に示されるアミノ酸配列またはＦＡＳＴ／Ａアルゴリズムによって決定される配列番号１に対して少なくとも９８％のアミノ酸同一性があるアミノ酸配列またはＦＡＳＴ／Ａアルゴリズムによって決定される上記配列番号１に示されるアミノ酸残基５８０〜６３０からの配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性があるアミノ酸配列と、
野生ヒトＰＩＢＦ分子の少なくとも５０％のＰＩＢＦ活性を含むプロゲステロン誘発ブロッキングファクター活性とを有する組み換えタンパク質。
【請求項３０】
配列番号１に示されるアミノ酸残基３００〜３５０から与えられるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２９に記載の組み換えタンパク質。
【請求項３１】
配列番号１に示されるアミノ酸残基５８０〜６３０から与えられるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項２９または３０に記載の組み換えタンパク質。
【請求項３２】
ＦＡＳＴ／Ａアルゴリズムによって決定される、上記配列番号４による配列に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸同一性のあるアミノ酸または上記配列番号４によるアミノ酸配列からなるＰＩＢＦ活性を有するタンパク質。
【請求項３３】
ＦＡＳＴ／Ａアルゴリズムによって決定される、配列番号６、８、１０、１４、１５、１７、１９、２０、２３、２５、２７、２９、３１、３２、３４および３６を含む群から選ばれる配列に対して、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％アミノ酸配列の同一性を有する二者択一的に処理されたＰＩＢＦタンパク質。
【請求項３４】
請求項２９〜３２のいずれか１項に記載のＰＩＢＦ活性を有する組み換え体タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項３５】
配列番号７、９、１１、１２、１３、１６、１８、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３５および３７を含む群から選ばれる配列に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列、または上記配列のいずれか一つと厳密な条件下でハイブリダイゼーション形成する配列または上記配列のいずれか１つへの遺伝子コードによって変性する配列を含む、二者択一的に処理されたＰＩＢＦタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項３６】
請求項３４または３５に記載の核酸配列および適切な調整要素を含む核酸ベクター。
【請求項３７】
さらに選択マーカーを含むことを特徴とする請求項３６に記載の核酸ベクター。
【請求項３８】
請求項３４〜３６のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞。
【発明の詳細な説明】
本発明はプロゲステロン誘発免疫調整タンパク質−（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＰＩＢＦ−）活性を有する組換えタンパク質、ＰＩＢＦ活性を有する組換えタンパク質をコードする核酸分子、ベクターから成る細胞、そしてガン患者を診断するための方法に関するものである。
【０００１】
正常な妊娠を維持するために、プロゲステロン―広範囲の免疫抑制効果をもつステロイドホルモン―の生成は絶対に必須である。健康な妊婦の末梢リンパ球はこのホルモンを感受するための核レセプターを発現し（Ｓｚｅｋｅｒｅｓ−Ｂａｒｔｈｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６， ２３９ （１９８９）； Ｓｚｅｋｅｒｅｓ−Ｂａｒｔｈｏ ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２５， ２７３ （１９９０））、中間体タンパク質であるプロゲステロン誘導防御因子（Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｆａｃｔｏｒ）（ＰＩＢＦ）を生産する（Ｓｚｅｋｅｒｅｓ−Ｂａｒｔｈｏ ｅｔ ａｌ． Ａｍ． Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ９， １５ （１９８５））。ヒトの肝臓のＰＩＢＦのｃＤＮＡ配列は、既知のタンパク質のどれに対しても相同性をもたないことが示されている （ＨＳＰＩＢＦ， Ａｃｃ． Ｎｏ． Ｙ０９６３１）。コードされた前駆体タンパク質は高い疎水性をもち、分子量が８９ ｋＤａである。発見された当初の自然に発生するＰＩＢＦは、７５７アミノ酸の配列長をもつ３４−３６ ｋＤａの免疫調整タンパク質である。
【０００２】
健康な妊婦の尿サンプルのＰＩＢＦ濃度は約１〜１０ｎｇ／ｍｌであると定義されているが、第２三半期（ｔｈｅ ２ｎｄ ｔｒｉｍｅｓｔｅｒ）の妊婦のＰＩＢＦ濃度は、約７０〜１５０ ｎｇ／ｍｌの範囲である。このような高い値は流産や出産後にすぐに正常値に戻る。
【０００３】
プロゲステロンの効果を媒介するＰＩＢＦは、ｉｎ ｖｉｖｏと同様、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいても非常に効果のある免疫を調整する機能を有することが示されている。実際に、ＰＩＢＦは、マウスモデルにおいて妊娠に必須であることが示されている。というのも、培養上清から単離されたマウスリンパ球は、抗プロゲステロンによって誘発される再吸収（ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）から胎児を保護するからである。加えて、マウスＰＩＢＦに対する中和抗体には胎芽の再吸収を引き起こし、結果として堕胎を引き起こす。ヒト再生成においてＰＩＢＦの重要な役割は、病理学的な妊娠から体液を低レベルで測定することによってもまた実証される。ＰＩＢＦはナチュラルキラーリンパ球を阻害することによって妊娠を維持するという重要な役割を担う。重要なことは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、ＰＩＢＦ量を実験的に操作することによって、ＰＩＢＦがＮＫ（ナチュラルキラー）細胞を含む末梢血液リンパ球の致死活性を調整することができるということである。ＮＫ細胞におけるＰＩＢＦの働きには２つの機構が少なくとも存在するとされている。一つには、ＮＫ細胞活性の直接阻害である。ＮＫ細胞は標的細胞を、効果因子と標的細胞との間の連絡領域内のパーフォリンおよびセリンエステラーゼ含有顆粒をエキソサイトーシスすることによって致死させる。脱落膜の（Ｄｅｃｉｄｕａｌ）リンパ球（該リンパ球の６０％がＮＫ表面マーカーをもつ）のパーフォリンの含有量は高いが、しかしながら、細胞傷害活性は低い。活性化されたＮＫ細胞はＰＩＢＦ存在下にて標的細胞を探し結合するが、保存顆粒からのパーフォリン放出はできず、結果として標的細胞は分解されない。ＰＩＢＦはＮＫ細胞を麻痺状態にし、そして抑制された下で脱顆粒を阻害することで細胞障害性機構を保ち、そしてこのようにして致死物質を放出する。
【０００４】
他に、直接的ではない機構がある。この機構によって、ＰＩＢＦは、サイトカイン発現を変更することを通じて抗ＮＫ効果を及ぼす。ＰＩＢＦ存在下においてＮＫ細胞によって生成されるＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ α）はかなり減少する。このＮＫ細胞は、ＮＫ活性の下流調整（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）にも含まれているとされる。分泌されるＴＮＦ量は反対に、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＩＢＦ生成に関係する。
【０００５】
ＰＩＢＦ作用の２つめの主たる機構は、ＴＨ２サイトカイン優性の誘導である。ＴＨ２優性は、減少した細胞媒介応答およびＢ細胞促進に寄与する。これに反して、ＴＨ１優性の体液性応答および細胞免疫学的機構の恩恵は結果として減少する。分泌されたＰＩＢＦはＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１０のようにＴＨ２サイトカイン生産を促進し、一方でｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ−１２やＩＦＮ−γのようにＴＨ１サイトカインを抑制する。特定の抗体によるＰＩＢＦの中和は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＴＨ１ シフトとなり、また失敗した妊娠に特徴的なものでもある。体液性免疫応答におけるＰＩＢＦの効果は単なる促進だけではなく、不斉抗体の生成の誘導にもある。これは抗体（ａｂ）の個体数が、分子のＦａｂアームのひとつにおけるマンノースリッチオリゴ糖残基の存在のために、不斉構造をもっており、エフェクター機能を全くもっていない、またはわずかにもつ。しかしこれらａｂは防御抗体として働くとされる。雑種細胞の上清における不斉ＩｇＧの割合は、ＰＩＢＦ存在下のほうがＰＩＢＦ非存在下よりも高かった。さらなる研究によって、リンパ球における血清（ｔｈｅ ｓｅｒａ）の不斉抗体内容物とＰＩＢＦ発現の間の陽性関係（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ）が明らかになった。なおまた、プロゲステロンレセプターのＲＵ ４８６による防御、または特定の抗ＰＩＢＦ抗体による内在性ＰＩＢＦ活性の中和は、妊娠マウス内での不斉抗体の生成をかなり減少させた。
【０００６】
例えばガンのような悪性腫瘍は、全ての先進国において心臓疾患に続いて２番目に主要な死亡原因であり、３人に１人がガンにかかる。４人に１人はガンで死亡する。ガンは、細胞腫瘍塊を形成するために増殖し、これらの悪性腫瘍細胞による隣接した組織への侵害、そしてもとのリンパ節また離れたところへ血液やリンパ系システムを介して広がり悪性細胞になる正常な組織から分裂する異常、または悪性の、細胞数が増加することによって基本的に機能解析されている。後者の悪性腫瘍への進行を（ガンの）転移と呼んでいる。
【０００７】
ガンは、隣接した正常細胞を含む悪性細胞とその周囲の環境との伝達の破壊に起因する。成長刺激および成長阻害の両方の信号は、組織内の細胞間で決まって変換されている。普通は、細胞は刺激信号がないときには分裂はしない。また同様に阻害信号があるときには分裂をやめない。ガンのような、または悪性の状態では、細胞はこれらの信号を“無視”し、正常な細胞では成長しない条件下において増殖する。
【０００８】
増殖するために、腫瘍細胞は、他とは全く異なる多数の異常な特徴を得なければならない。この要求を反映するのは、あるよく研究された腫瘍の染色体が、活性化されたガン遺伝子および不活性化された腫瘍抑制遺伝子を含むいくつかの異なる独立した変異遺伝子を持つという事実である。これら遺伝子的変化は、凝集したときに、完全な腫瘍性表現型を表すという特徴が与えられることに原因があるようにみえる。
【０００９】
腫瘍細胞は、身体にとって異物であると認識される抗原を持っている。そのような細胞が大きな腫瘍を形成する前に、そのような細胞を除去するのが免疫機構の主要な機能の一つである。進行した悪性疾患の患者には免疫監視の効果が明らかにない。自己反応を抑制し、免疫機構の腫瘍細胞を根絶するための能力において主要な防御を示すと同定される保護限界の範囲がある。腫瘍細胞によってもたらされる多数の機構には、１．古典的（ｃｌａｓｓｉｃａｌ）非発現、またクラスＩＭＨＣ限定ＣＴＬｓに特異的な（腫瘍）抗原の致死影響を害する非古典自己特定（ｎｏｎ−ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｅｌｆ−ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）クラスＩＭＨＣ分子（ＨＬＡ−Ｇのような）の発現、２． ＴＨ２ 応答、ＴＨ１ヘルパー機能抑制、そしてその結果としての効率的な細胞傷害性抗腫瘍応答、３．部分的また全身の免疫応答を下流調整（ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）する免疫抑制因子（例えば、Ｔ細胞の増殖と細胞傷害を減らすＴＧＦ−βの分泌、ＣＴＬｓのアポトーシスを誘導するｆａｓ リガンドの発現）の生成がある。これらの累積した効果の結果として、腫瘍は免疫学的に特権的な形勢をもち、免疫機構の限られた制御の有無によらず成長する。
【００１０】
感染症、ガン、自己免疫疾患などの多くの病理上の条件は、特定分子の不適当な発現によって機能解析され非常によく確立されている。これらの分子は従って特定の病理上または異常な条件に対するマーカーとされる。診断上の“標的”例えばこれら異常な条件を診断するため同定される材料、として使用されるのとは別に、上記分子は診断また（は）治療剤を生産するために使用されることができる試薬となる。
【００１１】
本発明のねらいは患者の腫瘍を診断するための方法にある。この方法は、患者に特別な問題を引き起こさず、高度な設備を必要とせず、容易かつ安全に実行される。そしてこの方法は、結果として健康な患者と腫瘍をもつ患者とを迅速に区別することができるという方法である。
【００１２】
本発明のさらなる目的は患者の腫瘍を診断するためのキットを提供することにある。
【００１３】
またさらに、本発明のさらなる目的は、効果的な抗腫瘍薬を提供することにある。
【００１４】
患者の腫瘍を上記の目的で診断するための本発明にかかる方法は、患者からサンプルを採り、サンプル中のＰＩＢＦ（プロゲステロン誘発ブロッキングファクター）、またはその誘導体、またはその断片の濃度を測定し、そしてサンプル中のＰＩＢＦ濃度が所定の閾値より上か下かどうかを決定し、閾値より高い濃度を示した場合には患者が腫瘍を有すると特定するものである。
【００１５】
妊娠の維持にとって重要な免疫調整分子としてのＰＩＢＦの機能解析の間に、驚くことに、腫瘍細胞はＰＩＢＦまたはＰＩＢＦ様物質を発現することが示されたが、これに反して、隣接する正常組織では、ＰＩＢＦ反応を全く示さない、あるいは低いＰＩＢＦ反応性を示すことが見出されている。これはＰＩＢＦが悪性形質転換細胞に対して免疫学的耐性の発達あるいは維持を含み、従って腫瘍細胞に対して便利なマーカーを構成していることを示している。
【００１６】
従って、本発明にかかる方法では、試験された患者から採取したサンプルのＰＩＢＦ濃度は健康な人から採取したサンプルのＰＩＢＦ濃度よりも高い、という事実を利用する。
【００１７】
本発明の範囲において、患者から採取されたサンプルには身体の様々な部位によって様々な種類、流動性の有無があるだろう。ＰＩＢＦ濃度測定は、ＰＩＢＦ濃度を測定できる従来のすべての技術に従って測定できる。これは体液、組織サンプルなどにおいて化学的、微生物学的、物理学的技術や染色などからなる。放射性核種および常磁性（例えばガドリニウム）ラベルによってラベルするなどした後にコンピューター断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴画像（ＭＲＩ）を用いてｉｎ ｖｉｖｏで画像化することを含む方法が可能である。
【００１８】
ＰＩＢＦが患者の体内での代謝または他の変化に従うのではないかとされたことから、ＰＩＢＦが上記患者から採られたサンプルに依存した修飾を含む。ＰＩＢＦの断片だけが与えられたサンプル内に存在するように、例えばＰＩＢＦを除去する。そのサンプルまたはその誘導体の断片においてもＰＩＢＦ誘導体が存在するように、ＰＩＢＦはさらに修飾された。代わりに処理されたＰＩＢＦのｍＲＮＡは正常の細胞と比較して異なる濃度で腫瘍細胞に存在し、従って、これらの異なった形のｍＲＮＡまたはその断片から翻訳されたタンパク質または断片は“断片”から構成される。従って、ＰＩＢＦ誘導体も、またはＰＩＢＦまたはその誘導体またはＰＩＢＦ様物質（例えば３４ ｋＤａの除去された生成物または二者択一的にスプライシングされた１４ ｋＤａ生成物）もまた患者のＰＩＢＦ濃度の指標として使用することができ、従ってそれぞれの濃度は本発明に応じて、患者の腫瘍診断のための方法として使用することができる。
【００１９】
本発明の範囲において“ＰＩＢＦまたはＰＩＢＦ断片”という言葉は―制限なしに―ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ（配列番号）：１， ３， ４， ６， ８， １０， １４， １５， １７， １９， ２０， ２３， ２５， ２７， ２９， ３１， ３２， ３４， および３６または、その断片またはその誘導体に従う配列を述べている。従って、本発明にしたがって検出または定量されるＰＩＢＦまたはＰＩＢＦ断片の例はこれら上記に示した配列である。エキソン１７および１８（図参照）を含むＰＩＢＦ断片を同定したほぼ全てのｍＲＮＡに含まれているエキソン１７および１８は、サンプルのＰＩＢＦの検出または定量に使用するのが好ましい。
【００２０】
本発明の範囲において、ＰＩＢＦまたはその誘導体の断片は、例えば７１５アミノ酸よりも少ないものからなり、好ましくは５００アミノ酸より少ないものである、またさらに２００アミノ酸より少ないのものが好ましく、最も好ましいのは５０アミノ酸より少ない断片である。
【００２１】
本発明の範囲において、“誘導体（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）”とは例えば自然にまたは自然でなくとも修飾、例えば除去（切断）、グリコシル化、メチル化、アセチル化、アミノ化、リン酸化、硫酸化、欠失、置換などを引き起こす。
【００２２】
また、本発明の範囲において、“閾値”は、一般に健康なサンプル提供者のＰＩＢＦの中間サンプル濃度である濃度値に関係している。文献に対応した健康な人間の公知の中間ＰＩＢＦ濃度を採用すること、または本発明を実施する際、健康な提供者のサンプル中のＰＩＢＦサンプル濃度を決定することは可能である。閾値は、同じ人から前回（健康なときに）採られた健康な（正常な）サンプルでもあるだろう。そのような閾値の例として、腫瘍の型とともに決定方法に依存した濃度によって例えば１〜１０ ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは１〜５ ｎｇ／ｍｌの間となるだろう。またさらには、閾値は、ＰＩＢＦ ｍＲＮＡ生成物が、二者択一的に処理された腫瘍細胞にのみ存在し、健康な細胞に存在しない場合にはゼロになるだろう。従って、閾値というのはＰＩＢＦ分子にも依存し、特異的なＰＩＢＦ分子ごとに対して決定しなければならない。
【００２３】
しかし、閾値を決めたときに妊婦のサンプルにおけるＰＩＢＦ濃度は妊娠していない女性のサンプルにおけるＰＩＢＦ濃度より高いので、健康な人間からのサンプルを採らないということは重要なことである。
【００２４】
患者から採られたサンプルから測定されたＰＩＢＦ濃度が所定の閾値より上であったときには腫瘍の疑いがあるとする。ここでいう“腫瘍”とは、悪性、良性に関わらず、すべての腫瘍性細胞成長および増殖のことをいい、そして全ての前ガン細胞およびがん細胞、そして組織のことをいう。
【００２５】
“患者”とは、本発明の範囲において、腫瘍のある患者だけでなく一般的な定期件検診を受けている、腫瘍を持つ可能性の高い健康な人間も含む。もちろん、“患者”には全ての動物、特にマウス、ラット、モルモット、サル、そして例えば特異的な腫瘍の発見や抗腫瘍物質または発ガン物質の試験に適しているなど、分析に用いる実験動物に適した動物も含まれている。さらには、腫瘍の発達の為の性質を前もって有する遺伝子組換え動物も含まれる。
【００２６】
妊娠においてもＰＩＢＦレベルが上昇するので、妊娠可能な女性は腫瘍患者であると考慮する前に簡易な妊娠検査（例えばｈＣＧに基づいたもの）によって検査しなくてはならない。これはまた、三半期までの妊婦が患者だった場合、腫瘍の成長を検出するためにこの試験を用いることは非常に難しいということを意味している。しかし、妊娠に関連する悪性腫の主要部分は妊娠関連組織（例えば、奇胎の栄養芽層細胞）の制御不能な成長に関係しており、非常に高いレベル（＞１５０〜２００ ｎｇ／ｍｌ）のＰＩＢＦが、生存能力のある新生児が存在しても存在していなくても、腫瘍成長を示す。
【００２７】
本発明にかかる方法により診断される腫瘍は、上皮性ガン腫に適したものである。ヒトの腫瘍の膨大な数が上皮性ガン腫（肝臓、肺、大腸など）であるので、本発明にかかる方法は特にこのような種類の腫瘍の診断に有効である。
【００２８】
上皮性ガン腫はほとんどが肝臓（上皮性）ガン腫、大腸（上皮性）ガン腫、肺（上皮性）ガン腫である。上で述べた腫瘍を持つ患者から採られたサンプルのＰＩＢＦ濃度は、健康な患者のＰＩＢＦ濃度に比べ特に高い。従って、もし上で述べた腫瘍の一つを診断するために用いられる本発明にかかる方法は、腫瘍の疑いがある個人を特定する。しかし、ある場合において閾値を下回る濃度は、腫瘍の存在を考慮する必要はない。
【００２９】
本発明の有効な実施例によれば、サンプルは体液であり、好ましくはそれぞれ尿および血清である。これにより、外科的処置によらず、特別な高度な機器を必要とせずに患者から非常に簡単な方法でサンプルを採ることができる。体液はどのような研究室でもまたは患者の自宅でも採ることができ、定期診断や、非常に虚弱な患者における診断や患者の腫瘍進行の規則的なチェックに対して特に有効である。ＰＩＢＦ濃度は固相化学分析方法、例えば滴下したサンプルのＰＩＢＦ濃度に応じて色を変化させるようなストリップ（ｓｔｒｉｐ）を用いて測定することができる。
【００３０】
代わりに、サンプルは組織サンプルである。けれども患者からのこのような種類のサンプルを採取することは、体液を採取するほど簡単ではなく、本発明にかかる患者からの組織サンプルを用いた方法は、特にもし他の組織サンプルが採られその間で比較されている場合に、腫瘍の直接的位置を特定することが出来る。さらに腫瘍の進行を直接的に追うこともできる。さらに、腫瘍を持つ組織の発見によって、本発明にかかる方法はさらに、患者の身体のどの組織、そしてどの部分を外科的に取り除かなくてはならないかを決定するためのさらなる方法として少なくとも使用することができる。
【００３１】
本発明の実施の形態にかかる閾値は、健康な人間のサンプルにおけるＰＩＢＦ濃度である。もちろん、閾値は、健康な人間の、複数のサンプルのＰＩＢＦ中間濃度であれば、特に正確である。
【００３２】
閾値は、患者のサンプル中のＰＩＢＦ濃度に対応する少なくとも一人の健康な人間のＰＩＢＦ濃度を測定することによって決めることが好ましい。測定した濃度はＰＩＢＦ濃度を測定する方法に依存しているので、もしＰＩＢＦ濃度測定の方法で患者のサンプルと健康な人のサンプルとが同一人物によるものであるならば、診断はより明確で具体的である。この方法の精度をさらに高めるために、結果に影響を与える温度や緩衝液などの障害因子を除くため、例えば同時に測定するのが好ましい。“陰性サンプル”としての比較として測定されるのが好ましいだろう。陽性コントロールとして、ＰＩＢＦ、またはその誘導体、またはその断片の濃度の決定に対応して、所定濃度のＰＩＢＦまたはその誘導体、またはその断片を構成するサンプル中のＰＩＢＦ濃度を測定する。陽性コントロールを並行して測定することで、結果をコントロールし、そして方法の相違を検出することができる。
【００３３】
なるべくなら、サンプルのＰＩＢＦ濃度は、特に競合アッセイ、サンドイッチアッセイ、免疫染色またはこれらの方法の組み合わせによって免疫学的に測定する。どのような免疫学的方法においても当業者であれば応用できるであろう。免疫学的方法は分子を検出するための高い感受性をもつ方法である、従って特にサンプルのＰＩＢＦ濃度測定に有利である。免疫学的方法を実行するため、ＰＩＢＦ、その誘導体、その断片に特異的に結合する抗ＰＩＢＦ抗体を少なくとも一つ持っている必要がある。抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってもよい。そしてさらに組み換え体であってもよい。さらに、ヒト化モノクローナル抗体または単一鎖をコードしたファージモノクローナル抗体が使用されてもよい。
【００３４】
上で述べたような使用ができる組換えモノクローナル抗ヒトＰＩＢＦ抗体の例は、ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｅｃｓ， Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕｎｇａｒｙにあるハイブリドーマ細胞バンクに保管番号１１から１４／２００１、細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）コード ＨＹＢ ２５５−２５８で保存されている。
【００３５】
“単一鎖抗体”は、抗体の様々な領域からのの第一のポリペプチドの結合部位を含んでいる構造として定義されており、抗体の様々な領域からの第二のポリペプチドの結合部位と関連し、２つのポリペプチドはペプチドリンカーによって第一および第二のポリペプチドを単一のポリペプチド鎖に連結することによって結合する。この単一ポリペプチド鎖は、従ってポリペプチドリンカーによって連結された様々な領域の組を持つものからなる。Ｌ鎖とＨ鎖の様々な領域が相補性決定領域（ＣＤＲｓ）と適宜組になったものからなる領域の場合に、上記領域は機能的な抗原結合部位を形成に関連するだろう。
【００３６】
“ヒト化抗体”とは、ここではヒトの抗体により類似させた、元の結合能を保持したままで抗原結合試薬の中においてアミノ酸置換した抗体分子のことである。
【００３７】
抗体は従来の技術で知られている方法を用いて生成される。そのような抗体は、これに限られないが、ポリクローナル、モノクローナル、組み換え体、キメラ、単一鎖、Ｆａｂ断片、そしてＦａｂ発現ライブラリーによって生成される断片を含む。中和抗体（すなわち、これらがダイマーを形成するのを防ぐもの）は特に治療に用いられるのに適している。
【００３８】
抗体を生成するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ニワトリ、ヒトなどを含む様々な宿主が、ＰＩＢＦ野生タンパク質、または組換えタンパク質、またはどのような断片または免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ）特性を持つオリゴペプチド、またはＰＩＢＦ−ＤＮＡ（断片）などによって感染されることで免疫化される。宿主となる種によって、様々な免疫賦活剤が免疫応答を増加するために用いられる。そのような免疫賦活剤は、フロインドの、アルミニウム水酸化物のようなミネラルゲル、そしてジゾレシチン、多価ポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ｐｏｌｙｏｌｓ）、ポリアニオン、アルミニウム、ポリカチオン（例えばポリアルギニン）、ペプチド、油乳濁液（ｏｉｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ）、鍵穴吸着（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノールのような界面活性剤を含むがこれに限られない。ヒトに使用される免疫賦活剤のなかでは、ＢＣＧ （ｂａｃｉｌｌｉ ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリアパルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）が特に適している。
【００３９】
ペプチド、断片、または抗体をＰＩＢＦへ誘導するために用いられるオリゴペプチドは、５つのアミノ酸を少なくとも含んだアミノ酸配列を持っていることが好ましく、またさらに１０アミノ酸であることが好ましい。また野生タンパク質のアミノ酸配列の部分と一致していることが好ましい。ＰＩＢＦアミノ酸の短いストレッチはそれらほかの鍵穴吸着ヘモシアニンのようなタンパク質と融合し、キメラ分子に対しる抗体が生成される。
【００４０】
ＰＩＢＦに対するモノクローナル抗体は、培地内の連続的な細胞株によって抗体分子の生産を提供するすべての手法を用いて準備される。これは、これに限られないがハイブリドーマ手法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ手法、そしてＥＢＶ−ハイブリドーマ手法を含む。
【００４１】
加えて、“キメラ抗体”の生成のため発展した手法では、特異的そして生物学的活性のある、適した抗原をもつ分子を得るためにマウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングが用いられる。代わりに単一鎖抗体の生成のための記述された手法は、従来の技術を用いてＰＩＢＦ特異的単一鎖抗体を生成するために改良される。関連した特性をもつ、しかし個別の異地模式標本的構成の抗体は、ランダムな組み合わせ的な免疫グロブリンライブラリーからの混合により生み出される。
【００４２】
抗体はまた、リンパ球群におけるｉｎ ｖｉｖｏ生成誘導による、またイムノグロブリンライブラリーまたは高い特異的結合試薬のパネル組み換え体をスクリーニングすることによって生成される。
【００４３】
ＰＩＢＦに特定に結合する部位をもつ抗体断片もまた生産される。例えば、これに限られないが、抗体分子のペプシン消化によって生産されるＦ（ａｂ’）２断片や、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド結合を還元することによって生成されることができるＦａｂ断片を含むものがそれらの断片である。
【００４４】
所望の特性をもつ抗体を同定するスクリーニングのために、様々なイムノアッセイが用いられる。特異性を確立したポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いる競合結合アッセイやイムノラジオメトリックアッセイのための多数のプロトコルは、従来技術としてよく知られている。そのようなイムノアッセイは、ＰＩＢＦとそれに特異的抗体との複合体形成の測定に典型的に含まれる。２つの非妨害（ｎｏｎ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）ＰＩＢＦエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用するモノクローナルベースのイムノアッセイである２つの部位は適しており、しかし競合結合アッセイもまた用いられる。
【００４５】
好ましい一形態においては、サンプルのＰＩＢＦ濃度は競合結合アッセイによって測定される。この方法に従って、固相は特定の濃度において望ましい組換えヒトＰＩＢＦで覆われる。ラベルされた抗ＰＩＢＦ抗体は測定される例とともに加えられる。高いものはサンプルのＰＩＢＦ濃度で、低いものは対応した検出値である。これらの見解に基づいて、ＰＩＢＦの絶対濃度は決定できる。これは、特にサンプルが体液で例えばＥＬＩＳＡで実行することができる場合にとりわけ正確な方法である。
【００４６】
さらに本発明の実施の形態に従って、サンプルのＰＩＢＦ濃度はサンドイッチアッセイによって測定される。このアッセイに対して、ＰＩＢＦ分子の異なるエピトープにそれぞれ結合する２つの抗ＰＩＢＦ抗体を持つ必要がある。第一の抗ＰＩＢＦ抗体は、測定用のサンプルが加えられた後、サンプル内のＰＩＢＦは、第一の抗ＰＩＢＦ抗体と結合するために、固定票（ｓｏｌｉｄ ｓｕｐｐｏｒｔ）に固定される。第二の、なるべくラベルされている抗ＰＩＢＦ抗体は、ＰＩＢＦと結合するために加えられる。第二の抗ＰＩＢＦ抗体の結合量は測定され、そしてサンプルのＰＩＢＦの絶対濃度用指標として使用される。またこの方法は測定されるためのサンプルが患者の体液である場合そしてＥＬＩＳＡによって実行できる場合に使用されるのが適している。
【００４７】
本発明の実施の形態によれば、サンプルのＰＩＢＦ濃度は免疫染色によって測定される。この方法は測定されるサンプルが患者の組織である場合に用いることが好ましい。この方法に従って、抗ＰＩＢＦ抗体は、組織サンプルに存在するＰＩＢＦと結合するので直接組織サンプルに加えられる。結合した抗体は、組織サンプルのＰＩＢＦ濃度を直接示すことによって定量される。この方法はサンプルにおけるＰＩＢＦの位置を特定することが可能である。
【００４８】
ＰＩＢＦ濃度はサンプルにおけるＰＩＢＦ−ｍＲＮＡ濃度を測定することによって間接的に測定されるのが好ましい。オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子、そしてＰＮＡｓを含めて、このポリヌクレオチドのために使用される。ポリヌクレオチドは、腫瘍細胞と関連しているＰＩＢＦ発現においてサンプルの遺伝子発現を検出し、定量するために使用される。従って、キットは、与えられたサンプルにおけるＰＩＢＦ−ｍＲＮＡ測定を実行するために上に記した（ラベルした）ポリヌクレオチドを含んだ試薬を含んだものを提供することができる。ここに再度、二者択一的に処理されたｍＲＮＡ濃度を測定するのがさらに好ましい。また、特定のｍＲＮＡの有無は、細胞が腫瘍細胞であるかどうかに関する情報を与えることができる。
【００４９】
ある局面においては、ＰＩＢＦ−ｍＲＮＡ配列を同定するために、ヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションを用いる。ＰＩＢＦ−ｍＲＮＡと相同性であるヌクレオチド配列は一般的な方法によってラベルされ、ハイブリダイゼーションを形成するのに適した環境下において患者からの流動または組織サンプルに加えられる。適切な期間で培養した後、サンプルは洗浄されシグナルは定量され、閾値と比較される。
【００５０】
高特異的領域からか、あるいは低特異的領域からかというプローブの特異性およびハイブリダイゼーション（最大、高い、中間または低い）の厳密性（ｔｈｅ ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）はプローブがＰＩＢＦ、対立遺伝子、または関連した配列をコードした配列が自然に起こった配列だけを特定するのかを決定する。
【００５１】
ＰＩＢＦ−ｍＲＮＡ（関連した）配列のハイブリダイゼーションに使用されたプローブは、配列またはその断片をコードしたＰＩＢＦと少なくとも５０％、好ましくは７０％、さらに好ましくは９０％の相同性を示すことが好ましい。発明の主題のハイブリダイゼーションプローブは、ＤＮＡまたはＲＮＡで、配列番号（ＳＥＱ． ＩＤ． Ｎｏ） ３または５（ＰＩＢＦ−ｃＲＮＡ）のヌクレオチド配列から提供される。
【００５２】
検出および／または定量されるそのようなＰＩＢＦ−ｍＲＮＡ分子の例は例として、配列番号５、７、９、１１、１２、１３、１６、１８、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３５、３７（ＰＩＢＦ−ｃＲＮＡ）のヌクレオチド配列から提供されるＤＮＡまたはＲＮＡによって検出される。エキソン１７と１８（図参照）をコードする配列から提供され、同定されたＤＮＡまたはＲＮＡはほぼ全てのｍＲＮＡ型を含むエキソン１７と１８であるから、サンプルのＰＩＢＦ−ｍＲＮＡの検出または定量化のために使用されるのが好ましい。
【００５３】
ハイブリダイゼーションプローブは、レポーターグループの種類によってラベルされ、例えば３２Ｐや３５Ｓのようなラジオヌクレオチド、またはアビジン／ビオチンカップリングシステムを介してプローブと対になるアルカリホスファターゼのようなものによる酵素的ラベル等である。
【００５４】
ＰＩＢＦをコードしたポリヌクレオチド配列は、ＰＩＢＦ−ｍＲＮＡを検出するために患者の生体組織からの体液または組織を使用して、ノーザンブロット分析、ドット分析、または他の膜をもとにした技術、つまり尿試験紙（ｄｉｐ ｓｔｉｃｋ）、ピン、ＥＬＩＳＡまたは（ｍｉｃｒｏ−）チップ分析にさらに使用される。そのような方法は従来の技術としてよく知られている。
【００５５】
加えて、ＰＩＢＦ−ｍＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲによって検出測定される。まず始めにｍＲＮＡは、ｃＤＮＡがＰＣＲによって検出定量されたのちにｃＤＮＡに逆転写酵素によって転写される。ＰＣＲのためのオリゴマーは化学的に合成されるか、酵素的に生成したか、または組み換え体をもとにして生成される。オリゴマーは２つのヌクレオチド配列（一つはセンス鎖ともう一つはアンチセンス鎖）の構成になるのが好ましく、特異的配列の同定のための最適化された条件で使われる。同じ２つのオリゴマー、またはオリゴマーの重なったセット、またはオリゴマーの変性（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）プールでさえ密接に関連した配列の検出および／または定量のために少なくとも厳しい条件下で使用される。
【００５６】
本発明のさらなる局面は、本発明にかかる上述した方法の一つに従って患者の腫瘍を診断することを含み、サンプルの測定されたＰＩＢＦ、その誘導体、その断片濃度が少なくとも一つ前の同じ患者から採られたもののＰＩＢＦ、その誘導体、その断片濃度を上回るか下回るかどうかを決定することが、患者の腫瘍の陽性または陰性進行を決定するための方法と関連し、濃度が前回測定した濃度を上回っていたときには、陽性進行と判断する。サンプルのＰＩＢＦ濃度は腫瘍の進行（例えば大きさや発達など）と直接的に比例しているので、本発明にかかる方法は、病気の道筋の直接的な分析を可能にする。腫瘍の進行の完全な機能解析のためには特に特定の処置の前と後で時間を超えて多くのサンプルを採るのが、特定の処置の有効性を分析することができる場合においては、もちろん有利である。ここで用いた“陽性進行”とは、腫瘍がさらに進行していることを示す。
【００５７】
本発明のさらなる局面は、本発明にかかる上述の方法における抗ＰＩＢＦ抗体または抗ＰＩＢＦ抗体の断片の使用と関係している。上述したように、抗ＰＩＢＦ抗体はモノクローナル、ポリクローナルであり、さらに、組換え、ヒト化抗体または単一鎖抗体をコードした抗体である。もし抗体の断片だけが用いられたら、この断片はＰＩＢＦを認識する抗ＰＩＢＦ抗体のエピトープからなる。
【００５８】
最も特定の、そして正確な結果を達成するためモノクローナル抗体の使用が好ましい。モノクローナル抗体は上述したように生産され、上で与えられた実施例がここでも当てはまる。
【００５９】
本発明のさらなる面は、本発明にそった上述した方法の一つにおいてＰＩＢＦ、その誘導体、その断片の使用と関連している。すでに上で述べたように、断片はＰＩＢＦまたはその誘導体の断片である。ここで、同じ定義が、実施の形態または上述した実施例とともに当てはまる。
【００６０】
ＰＩＢＦは、誘導体または断片もまた組み換え体であることが望ましい。
【００６１】
本発明のさらなる局面は、少なくとも一つの抗ＰＩＢＦ抗体またはその断片からなる第一の試薬および所定の濃度のＰＩＢＦ、またはその誘導体、またはその断片からなる第二の試薬からなるキットに関係する。もちろん、抗ＰＩＢＦ抗体とＰＩＢＦは、乾燥、凍結乾燥、凍結、または不溶性型という保存方法が可能な形式において存在している。さらに、キットは他のさらなる試薬や酵素、塩などからなり、これらは上記の方法を実行するために必要なものである。
【００６２】
好ましくは、キットは固相からなることであり、この固相には、少なくとも１つの抗ＰＩＢＦ抗体あるいはこの抗ＰＩＢＦ抗体断片、あるいはＰＩＢＦあるいはその誘導体、あるいはその断片が結合していることである。固相は、当業者に公知のどのような固相であってもよく、例えば、基質に、タンパク質やペプチドを、例えば乾燥断片の形で固定化できる不溶物質であってもよい。上記基質は、ナイロン、アミノ酸、ガラス、セルロース等を含んでいてもよい。このキットは、好ましくは、競合アッセイ、あるいはサンドイッチアッセイのために使用されることである。それにより、さらに試薬には、固相に固定化される抗体あるいはＰＩＢＦが含まれ、そうしてサンプルが固相に加えられる。
【００６３】
好ましくは、上述したキットに存在するＰＩＢＦは組み換え体であり、当然のことながら、ＰＩＢＦ誘導体およびその断片も、それぞれ組み換え体である。
【００６４】
好ましくは、キットはさらに、ＰＩＢＦエピトープに結合する第２抗ＰＩＢＦ抗体またはその断片からなる試薬からなることである。上記ＰＩＢＦエピトープは、第１抗ＰＩＢＦ抗体あるいはこの第１抗ＰＩＢＦ抗体断片によって認識されるエピトープとは区別される。このキットは特に、サンドイッチアッセイを実施するのに有利である。
【００６５】
本発明にかかる上述したキットは、それぞれ、患者の腫瘍の診断や、患者の腫瘍の進行度を明らかにするのに用いられることが好ましく、そのための方法は、上述した方法と同様である。それによって、ＰＩＢＦあるいはその誘導体、あるいはその断片からなる試薬は、上述した陽性コントロールとして、あるいは上述した競合アッセイ（そしてそれによって、試薬は患者のサンプル中に存在するＰＩＢＦと競合するために使用される）、あるいは、上述の陽性コントロールおよび競合アッセイの両方を実施するために使用される。
【００６６】
本発明のさらなる局面は、抗腫瘍薬の調製のために、抗ＰＩＢＦ抗体あるいは抗ＰＩＢＦ抗体断片を使用することに関係している。抗ＰＩＢＦ抗体あるいは抗ＰＩＢＦ抗体断片は、ＰＩＢＦを特異的に阻止したり無能にしたりする。そしてこれによって腫瘍内のＰＩＢＦ活性を特異的に破壊し、このようにして腫瘍がＮＫ（そして潜在的に、ＣＤ８＋および他のＴ細胞媒介溶解）に影響されやすくなるようにする。さらに、単特異的抗体および両特異的抗体は、腫瘍細胞の表面上のＰＩＢＦを特異的に認識することができる。そして単特異的抗体および両特異的抗体は、患者の体の腫瘍部分に有毒物質を送達するのに使用される。抗腫瘍薬の主たる策略は、腫瘍細胞は高濃度のＰＩＢＦを生成するという知見の利用にある。この情報を元に、患者の腫瘍と戦うための様々な戦略が展開されている。
【００６７】
より好ましい実施形態では、抗体は、モノクローン抗体、ヒト抗体、および単一鎖抗体であることである。上述の堆積された抗体はまた、本発明のこの局面のために使用されてもよい。
【００６８】
好ましくは、抗体は分子に付着していることである。この場合、抗ＰＩＢＦ抗体は、分子（たとえば医薬品）を、ＰＩＢＦを発現する細胞あるいは組織に導くためのターゲティング機構あるいは送達機構として使用される。患者に投与された抗体は、ＰＩＢＦを発現している腫瘍と結合し、そしてそれによって、有毒分子は腫瘍と直に接触するようになる。当業者に公知の様々な方法および分子がある。例えば有毒分子は腫瘍細胞に入り込み、そして例えば本質的な代謝的段階を妨害し、それによって細胞を殺す。また、有毒分子は細胞溶解を誘発したり、あるいは他の有毒物質、あるいは、腫瘍細胞を殺す酵素として作用する。しかしながら、有毒分子の機能方法とは別に、要点は、上記分子は、抗ＰＩＢＦ抗体によって腫瘍細胞に特異的に方向づけられ、健全な細胞を妨害しないことにある。
【００６９】
上記分子は、好ましくは、それぞれ、有毒物質および体内で麻薬になる物質であることであり、特には、放射性核種薬、毒素薬、および化学療法薬であることである。標的腫瘍に物質を送達することによって、抗腫瘍薬の効果は達成される。
【００７０】
本発明のさらなる局面は、ＰＩＢＦ、あるいはその誘導体、あるいはその断片を抗腫瘍薬の調製のために使用することに関係する。本発明によれば、これら抗腫瘍薬には２つの方策がある。結合によって細胞（例えばＮＫ細胞）上に存在するＰＩＢＦに対する推定レセプターを阻止あるいは不活性にすることＰＩＢＦ活性を妨害するタンパク質あるいはペプチドを抑制するために、ＰＩＢＦ誘導体あるいはその誘導体断片を使用する。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態では、薬物はワクチンである。ＰＩＢＦ誘導体またはＰＩＢＦ断片は、ＰＩＢＦの免疫原性ペプチドを含んでおり、抗原特異的抗腫瘍細胞障害性Ｔ細胞反応を誘発するため、および／または、ＰＩＢＦによる抑圧からＮＫ細胞を解放するガン患者自身の免疫系による中和抗体の生成を刺激するためのワクチン接種として使用される。
【００７２】
好ましくは、ワクチンは免疫賦活剤からなることである。そのような免疫賦活剤は、例えば、アルミニウム水酸化物や、リジゾレシチン、多価ポリオール、ポリアニオン、ポリカチオン（例えばポリアルギニン）、ペプチド、油乳濁液、鍵穴吸着ヘモシアニン、およびジニトロフェノールのような界面活性剤に限定されるものではない。ヒトに対しての使用としてふさわしい免疫賦活剤は、ＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｉ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリアパルブムである。好ましくは、ＰＩＢＦあるいはその誘導体、あるいはその断片は、それぞれ組み換え体であり、化学合成された分子であることである。
【００７３】
本発明の有利な局面は、ＰＩＢＦあるいはその誘導体、あるいはその断片、あるいは、抗腫瘍薬の調製のためのＰＩＢＦアンチセンス分子をコードするポリヌクレオチドの使用に関係している。本発明の応用の範囲では、”ポリフクレオチドコードＰＩＢＦ”あるいは”ＰＩＢＦ−ｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列”は、好ましくは、配列番号．３、５、７、９、１１、１２、１３、１６、１８、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３５、３７あるいはこれらの断片あるいはこれらの誘導体から選択される配列に由来していることである。
【００７４】
ＰＩＢＦをコードする遺伝子は、ＰＩＢＦをコードする高レベルのポリヌクレオチドあるいは該ポリヌクレオチド誘導体、あるいは該ポリヌクレオチド断片を発現する発現ベクターを有する細胞あるいは組織を形質転換することによって生成することができる。そのような構成を、細胞内に翻訳不可能なセンス配列あるいはアンチセンス配列を導入するのに使用してもよい。ＤＮＡへの組込みの非存在下でも、そのようなベクターは、これらベクターが内在性ヌクレアーゼによって無能になるまで、ＲＮＡ分子を転写し続ける。
【００７５】
遺伝子発現の修飾は、遺伝子コードＰＩＢＦ（すなわち、プロモーター、エンハンサー、およびイントロン）の制御域にアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ，あるいはＰＮＡを設計することで行われる。転写開始部位（例えば、開始部位から−１０および＋１０の間の位置）に由来のオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、”三重らせん”塩基対形成方法論によって抑制できる。この三重らせん対は便利である。というのも、この三重らせんは、ポリメラーゼ、転写ファクター、あるいは調節性分子を結合するために二重らせんが開かないように、二重らせんの能力を抑制するからである。
【００７６】
ここでの”アンチセンス”という用語は、特異的ＤＮＡ配列あるいは特異的ＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を言及するため使用している。アンチセンス分子は、関与する遺伝子を逆方向でウイルスプロモーターに結合することで合成することを含むどのような方法でも生成することができる。上記ウイルスプロモーターは、相補鎖の合成を許容するものである。転写鎖がいったん細胞内に導入されると、この転写鎖は、細胞によって二重鎖を形成するために生産された中和配列と結合する。これらの二重鎖は、それから、さらなる転写または翻訳を阻止する。
【００７７】
一つの局面として、ポリヌクレオチドコードＰＩＢＦに対するアンチセンス分子は、ｍＲＮＡの転写を阻止するために使用されるのが望ましい。特に、細胞は、ポリヌクレオチドコードＰＩＢＦと相補的な配列でもって形質転換されることである。このように、アンチセンス分子はＰＩＢＦ活性を変調するのに使用されてもよく、あるいは、遺伝子機能の調整のために使用されてもよい。そのような技術は公知であり、センスオリゴマーあるいはアンチセンスオリゴマー、あるいはより大きな断片を、コードＰＩＢＦ配列のコード領域あるいは制御領域に従った様々な位置から設計することができる。
【００７８】
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス、あるいはワクチニアウイルス、あるいは様々な細菌性プラスミド由来のベクターの発現は、ヌクレオチド配列を標的腫瘍器官、組織あるいは細胞集団に送達するために使用される。従来から当業者に公知の方法を用いてＰＩＢＦをコードする遺伝子のポリヌクレオチドと相補的なアンチセンス分子を発現する組み換え体ベクターを構築することができる。
【００７９】
ＲＮＡの特異的開裂に触媒作用を及ぼすために、リボザイム、酵素ＲＮＡ分子を使用してもよい。リボザイム作用のメカニズムには、相補ＲＮＡへのリボザイム分子のハイブリダイゼーション、その後のヌクレオチド鎖切断の開裂が含まれている。使用される例には、特異的に、そして効果的に配列コードＰＩＢＦのヌクレオチド鎖切断の開裂に触媒作用を及ぼす人工槌型基調のリボザイム分子が含まれている。
【００８０】
潜在的なＲＮＡ標的内の特異的リボザイム開裂部位は、初めに、次の配列を含むリボザイム開裂部位に対する標的分子を走査することによって同定される。次の配列とはＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣである。いったん同定されると、開裂部位を含んでいる標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０リボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列は、油乳濁液を動作不能にする第２の構造的特徴として評価される。リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的油乳濁液とのハイブリダイゼーションのし易さを試験することによって、候補として挙げられるふさわしい標的を評価してもよい。
【００８１】
本発明のアンチセンス分子およびリボザイムは、公知のどのような核酸分子の合成方法によって調製されてもよい。これらは、油乳濁液の化学的合成（例えば、固相ホスホラミダイド化学合成）に関する技術を含んでいる。あるいは、ＲＮＡ分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、および、ｉｎ ｖｉｖｏでのＤＮＡ配列コードＰＩＢＦの転写によって生成されてもよい。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７あるいはＳＯＰ６といった適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターと共に、多種多様なベクターに組み込まれてもよい。あるいは、アンチセンスＲＮＡを構造的あるいは誘導的に合成するこれらｃＤＮＡ構造は、細胞株、細胞、あるいは組織内に導入されてもよい。
【００８２】
ＲＮＡ分子は、細胞内の安定性および半減期を増大するために修飾されていてもよい。修飾には、分子の５’および／または３’末端にある側方の配列の付加や、ホルホロチオネート、あるいは分子の中心におけるホスホロチオネートの連鎖というよりはむしろ２’ Ｏ−メチルの使用が含まれることも可能であるが、これに限定されるものではない。この概念は、ＰＮＡｓの生産に固有のものである。またこの概念は、イノシン、クエオシン、およびワイブトシン、ならびにアセチル−、メチル−、チオ−、およびこれらに類似した形であり、内在性のエンドヌクレアーゼによって簡単に認識されないアデニン、シチジン、グアニン、チミンおよびウリンといった非従来的な基材を包含することによって、これらすべての分子に展開することができる。
【００８３】
ベクターを細胞あるいは組織に導入するための多くの方法を利用することができ、また、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、および、ｅｘ ｖｉｖｏでの利用にも同様に適している。Ｅｘ ｖｉｖｏ治療では、ベクターは患者から採取され、自己移植のために同じ患者に戻されるようにクローン的に繁殖された幹細胞に導入されてもよい（異質遺伝子型幹細胞移植）。形質移入による送達およびリポソーム注入は、従来公知の技術を使用することによって実現される。
【００８４】
上述した抗腫瘍薬は、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サルといった哺乳動物（最も好ましくはヒト）を含む適切な対象に適用される。
【００８５】
本発明のさらなる局面は、腫瘍のある患者を治療する方法にあり、上記方法は、患者に効果的な量の抗ＰＩＢＦ抗体あるいは抗ＰＩＢＦ断片の投与を含んでいる。２つの刊行物（Ｓｚｅｋｅｒｅｓ−Ｂａｒｔｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｉｍｍｕｎｏ． ２４， １０５， １９９０； Ｓｚｅｋｅｒｅｓ−Ｂａｒｔｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７７， １９４， １９９７）では、中和抗ＰＩＢＦ抗体の付加により、マウスの妊娠の妨害に成功したことが実証されている。さらに、プロゲステロン処理マウスリンパ球の培養上清から単離されたＰＩＢＦは、ｉｎ ｖｉｖｏに導入されると、抗プロゲステロン薬としての効果を発揮した。これらのデータは、これらの試薬が、ガンあるいは自己免疫病の患者に同様に作用することを示唆している。
【００８６】
本発明の他の局面は、患者の腫瘍の治療方法に関係しており、上記方法は、効き目がある量のＰＩＢＦあるいはその誘導体あるいはその断片の投与を含んでいる。
【００８７】
本発明のより好ましい局面は、患者の腫瘍の治療方法に関係しており、上記方法は、効き目がある量のポリヌクレオチドコードＰＩＢＦあるいはポリヌクレオチドコードＰＩＢＦ誘導体、あるいはポリヌクレオチドコードＰＩＢＦ断片、あるいはＰＩＢＦアンチセンス分子の投与を含んでいる。
【００８８】
本発明の他の局面は、患者の腫瘍を治療するための医薬品を言及することにあり、上記医薬品は、抗ＰＩＢＦ抗体、あるいは抗ＰＩＢＦ抗体断片、ＰＩＢＦ、あるいはその誘導体、あるいはその断片、そしてＰＩＢＦでコードされたポリヌクレオチド、あるいは該ポリヌクレオチド誘導体、あるいは断片、あるいはＰＩＢＦアンチセンス分子を含んでいる。もちろん、ここでも、上述と同じ定義および好ましい実施形態が適用される。
【００８９】
医薬品を単独で投与してもよく、あるいは、少なくとも１つの他の試薬（例えば、生理的食塩水、緩衝生理的食塩水、ブドウ糖、および水を含む、無菌の生体適合性医薬的キャリアの投与された安定化化合物）と組み合わせて投与してもよい。医薬品を単独で患者に投与してもよく、あるいは、他の試薬、薬剤、ホルモンと組み合わせて投与してもよい。患者の腫瘍の治療方法に利用される医薬品は、どのような手段で投与されてもよく、例えば、経口静脈注射、筋肉内、動脈内、髄内、鞘内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、あるいは直腸法により投与されてもよく、これらは限定されるものではない。
【００９０】
活性成分に加えて、これらの医薬成分は、医薬的に使用される医薬品となるように促進する賦形剤や補助剤を含む、医薬的に認可された適当なキャリアを含んでいてもよい。キャリアは、医薬品を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等の形にすることができる。
【００９１】
本発明の他の局面は、配列番号 １およびその誘導体にかかるＰＩＢＦ活性を有する組み換え体タンパク質と関係していることにある。本発明にかかるＰＩＢＦタンパク質は、野生ＰＩＢＦ（配列番号 ２にかかる配列を含んでいる）に比べてＰＩＢＦ活性が高いけれども、アミノ酸５９５〜６１４、および、野生ＰＩＢＦ配列（配列番号 ２）に基づいたアミノ酸Ｎｏ．３３３を正確に示さない。本発明にかかる組み換え体ＰＩＢＦタンパク質（配列番号 １）は、７５７のアミノ酸残基を含んでいる。それゆえ、本発明では、配列番号 １あるいはその誘導体あるいはその相同体を有する新しい組み換え体ＰＩＢＦタンパク質を提供する。それゆえ、本発明にかかるＰＩＢＦ活性を有する組み換え体タンパク質は、配列番号 １によるアミノ酸配列、あるいは、ＦＡＳＴ／Ａアルゴリズムによって決定される配列番号 １に対応するアミノ酸配列またはＦＡＳＴ／Ａアルゴリズムによって決定される配列番号 １に対して少なくとも９８％のアミノ酸同一性があるアミノ酸配列、または、ＦＡＳＴ／Ａアルゴリズムによって決定される配列番号 １のアミノ酸残基５８０〜６３０からの配列に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性があるアミノ酸配列、および野生ヒトＰＩＢＦ分子の少なくとも５０％のＰＩＢＦ活性を含んでいる。
【００９２】
ＰＩＢＦ活性は、ＮＫ阻害あるいはＣＴＬ阻害として定義され、定量化されてもよい。ＮＫ阻害は、ＰＩＢＦ、さもなければ、有効な効果細胞（これは、ＰＩＢＦの非存在下で試験されたものである）が無力である場合に考慮される。換言すれば、標的細胞の認識機能や結合（共役）機能、あるいは標的細胞を死滅させる機能は、ＰＩＢＦ濃度により減少する。活性は、阻害／μｇＰＩＢＦ（あるいは類似の基質）と、ＰＩＢＦのないときとを比較したときの割合で表される。このことは、同様にＣＴＬ阻害活性にも適用される（Ｓｚｅｋｅｒｅｓ−Ｂａｒｔｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７７ （１９９７）， １９４−１９９）， Ｓｚｅｋｅｒｅｓ−Ｂａｒｔｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４， １０５， （１９９０））。さらに、ＰＩＢＦ活性は、Ｔｈ２（ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−銃）対Ｔｈ１（ＩＬ−１に、ＩＦＮ−ｇ）リンホカインを、タンパク質レベルあるいはｍＲＮＡレベルで数量化することによって測定され、それからＴｈ２対Ｔｈ１信号の割合を得るＴｈ２エンハンスメントとして定義され、定量化される。Ｔｈ２の増加およびそれに付随するＴｈ１サイトカインの減少は、Ｔｈ２サイトカインポジディブの割合の増加、および、Ｔｈ１サイトカインポジティブ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）／μｇＰＩＢＦの割合の減少で表される。ＰＩＢＦ濃度の働きにより培養上清、あるいは体液へと分泌されたこれらサイトカインの全量を（文献に基づいた従来の方法で）測定するのも適切である。サイトカインｍＲＮＡｓは、標準的な、定量的ＲＴ−ＰＣＲに基づいたアッセイ、Ｓｚｅｋｅｒｅｓ−Ｂａｒｔｈｏ ｅｔ ａｌ．， ＡＪＲＩ ３５ （１９９６）， ３４８−３５１， Ｓｚｅｋｅｒｅｓ−Ｂａｒｔｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３， ２６ （１９９０）， Ｓｚｅｋｅｒｅｓ−Ｂａｒｔｈｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｏｂ． Ｇｙｍ． １６３， １３２０， （１９９０）によって測定することが可能である。
【００９３】
本発明にかかるＰＩＢＦタンパク質のアミノ酸配列は、野生ヒトＰＩＢＦ配列と著しく違っているにも関わらず、上記で定義した（配列番号１）配列を有する組み換え体タンパク質を生成することが可能であり、上記組み換え体タンパク質は、野生タンパク質に対してとりわけ高い機能的類似性を示す。
【００９４】
本発明のより好ましい実施形態では、組み換え体タンパク質は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎ０１．のアミノ酸残基３００〜３５０から与えられるアミノ酸配列からなることである。野生ヒトＰＩＢＦタンパク質（配列番号１）内のＮｏ．３３３のアミノ酸は、本発明（配列番号１）によれば、アルギニンの代わりにシステインである。それゆえ、本発明にかかる組み換え体タンパク質は、好ましくは配列番号１に基づいたアミノ酸Ｎｏ．３３３として、アルギニンを含んでいることであり、かなりのＰＩＢＦ活性（＞５０％）であることである。しかしながら、本発明にかかる組み換え体タンパク質は、この組み換え体タンパク質が野生ヒトＰＩＢＦ分子の少なくとも５０％のＰＩＢＦ活性を示す限り、配列番号１のアミノ酸残基と同一、あるいはそれと相同関係にある、あるいはそれと異なるアミノ酸残基をさらに一方あるいは両方の末端に含んでいてもよい。
【００９５】
本発明のより好ましい実施形態によれば、組み換え体タンパク質は、ＳＥＱ．ＩＤ．Ｎ０１のアミノ酸残基５８０〜６３０から与えられるアミノ酸配列、および、多量のＰＩＢＦ活性（＞５０％）からなることである。この組み換え体タンパク質はそれゆえ配列番号１のアミノ酸残基５８０〜６３０の間に、工夫に富んだＰＩＢＦの配列を含んでいる。さらに、組み換え体タンパク質が野生ヒトＰＩＢＦ分子の少なくとも５０％のＰＩＢＦ活性を示す限り、配列番号１のアミノ酸残基と同一、あるいはそれと相同関係にある、あるいはそれと異なるアミノ酸残基をさらに一方あるいは両方の末端に含んでいてもよい。
【００９６】
本発明のさらなる局面は配列番号 ４によるアミノ酸配列、あるいは、ＦＡＳＴ／Ａアルゴリズムによって決定される配列番号 ４による配列に対して少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性のあるアミノ酸を含んでいる、ＰＩＢＦ活性を有するタンパク質を提供することにある。このタンパク質は、マウスから単離されたＰＩＢＦ活性を有する８９−ｋＤＡタンパク質であることが示されている。このアミノ酸配列は、特に、マウスのみならず他の実験動物の腫瘍、抗腫瘍物質、発ガン性物質の検出、診断、および解析に有利である。さらに、この工夫に富んだタンパク質試験の助けを借りて、腫瘍の素因のある動物（例えば、マウス、モルモット、ハムスター、ラット）に対して実施することができる。他の特徴は、動物、特にマウスに関係するものであり、上記動物やマウス内で、このタンパク質は、阻害されるかタンパク質の活性が阻止される。これは、このタンパク質の結合相手の類似体を提供することで実施される。
【００９７】
本発明のより好ましい特徴は、ＦＡＳＴ／Ａアルゴリズムによって決定されるアミノ酸配列であって、その少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％が、配列番号６、８、１０、１４、１５、１７、１９、２０、２３、２５、２７、２９、３１、３２、３４および３６を含む群から選ばれる配列と同一性を有するアミノ酸配列を含んでいるタンパク質に関係しており、上記タンパク質は、ＰＩＢＦタンパク質は二者択一的に処理されたタンパク質である。二者択一的に処理されたｍＲＮＡ分子は異なる組織に存在し、それゆえ、また、二者択一的に処理されたタンパク質を発現する。驚くべきことに、これらの二者択一的に処理されたタンパク質は、正常組織と比較して、別の濃度でも腫瘍組織に存在する。これは、サンプル内の腫瘍の検出や解析に有利であり、それによって、特に配列番号６および８が選ばれる。というのも、これら配列番号６および８は、ヒト原発腫瘍内に見出される２つの小さなＰＩＢＦ形であり、配列番号 ６は、胃腺ガンであり、配列番号 ８は、子宮内膜腺ガンである。同じ患者に対応する正常組織はこれらＰＩＢＦ−ｍＲＮＡ開裂変異体の検出可能レベルを表さない。しかしながら、エキソン１７および１８は、ほとんどすべての特定された形に含まれることが示されている。それゆえ、これらのエキソンを含んでいるペプチドが特に有利である。”二者択一的に開裂したＰＩＢＦタンパク質”という用語は、ＰＩＢＦ活性を有するタンパク質由来のタンパク質を意味している。
【００９８】
本発明にかかるさらなる局面は、本発明にかかるＰＩＢＦ活性と共に上述した組み換え体タンパク質をコードする核酸分子を提供することにある。もちろん、さらに、核酸分子はＰＩＢＦ以外の第２タンパク質を少なくとも１つコードする付加的な配列を含み、それによって、少なくともペプチドの一部分にＰＩＢＦ活性を含んでいる融合タンパク質をコードする核酸配列を提供することもできる。
【００９９】
配列番号５あるいはその断片では、ノックアウトマウス（例えば、ＰＩＢＦ遺伝子あるいはその断片の発現が阻止されているか、阻害されているマウス）を生産するのに、マウス核酸分子、例えば、配列番号 ５あるいはその断片が使用されるのが好ましい。このことは、例えば、アンチセンスマウスＰＩＢＦ核酸分子またはその断片を提供することによって実現でき、その方法は上述している。それゆえ本発明の他の局面は、活性ＰＩＢＦタンパク質の発現が阻害あるいは低減されたノックアウトマウスに関係している。
【０１００】
二者択一的に処理したＰＩＢＦをコードする核酸分子は、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは９５％が、配列番号 ７、９、１１、１２、１３、１６、１８、２１、２２、２４、２６、２８、３０、３３、３５および３７を含む群から選ばれる配列と同一性を有する核酸配列、または、上記配列のいずれか一つと厳密な状況下でハイブリダイゼーション形成する配列、または、上記配列のいずれか１つへの遺伝子コードによって変性する配列を含んでいることが好ましい。これらは、様々な組織内で見出される、二者択一的にスプライジングされたｍＲＮＡ分子に対応する核酸配列であり、これにより配列番号 ７および配列番号 ９は、腫瘍組織内にのみ見出され、野生組織には含まれない、二者択一的にスプライジングされたｍＲＮＡ分子と特に関与する。それゆえ、とりわけこれらは、腫瘍、および正常細胞、組織の検出あるいは解析に有利である。
【０１０１】
本発明のさらなる特徴は、工夫に富んだ核酸配列を含んでいる核酸ベクターに関係している。
【０１０２】
本発明にかかる上述したベクターが適当な宿主に導入されると、本発明にかかるＰＩＢＦ活性を有する組み換え体タンパク質、あるいは工夫に富んだタンパク質の翻訳のためのＲＮＡ鎖を提供するｍＲＮＡが生成される。
【０１０３】
当業者に公知の適当な成分、特に、組み換え体タンパク質が最大限に生産されるために、ベクターが導入される特異的宿主に基づいて選択される特異的プロモーターを調整要素とすることができる。調整成分は、さらに転写を促進させるためにエンハンサーを含んでいてもよい。
【０１０４】
好ましくは、核酸ベクターはさらに選択マーカーを含んでいることである。当業者に非常によく知られている、ベクターが導入された細胞あるいは宿主生物体を選択するための適当なマーカーを選択マーカーとすることができる。そのような選択マーカーは、抗生物質抵抗性授与タンパク質をコードする遺伝子、あるいは、細胞の代謝に必要なタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。それによって、上述したベクターが導入される細胞あるいは宿主細胞は、このタンパク質を欠乏する。選択マーカーは、さらに、上述したベクター、例えばカラー細胞あるいは宿主生物体の表現型を変化させる遺伝子であってもよい。
【０１０５】
本発明のさらなる局面は、本発明の応用にかかる上述したベクターを含んでいる細胞に関係している。ベクターは細胞のゲノム内に組み込まれていてもよい。あるいはまた、相補的核酸分子の転写が続く間、サイトプラズマの外因性ＤＮＡとして存在していてもよい。本発明の範囲では、”細胞”という用語は、原核細胞あるいは真核細胞を含んでいる。これらの細胞は、本発明にかかるＰＩＢＦ活性を有する組み換え体タンパク質を生成するために使用されるのが好ましい。これらの生成された組み換え体タンパク質は、従来から公知の方法で分離し、精製すればよく、そしてさらに、例えば、本発明にかかるＰＩＢＦ活性を有する組み換え体タンパク質を含んでいる医薬品の生産のために使用される。
【０１０６】
本発明を以下の実施例および図によってより詳細に述べるが、当然のことながら、本発明はこれらに限定されるものではない。
【０１０７】
図１は、組み換え体および（野生）マウスＰＩＢＦアミノ酸配列の配列を示している。
【０１０８】
図２は、クロモソーム１３上のＰＩＢＦ遺伝子領域内のエキソンおよびイントロンの略図を示している。
【０１０９】
図３は、異なる組織におけるＰＩＢＦ−ｍＲＮＡの検出のためのノーザンブロットを示している。
【０１１０】
図４は、ヒト原発腫瘍の免疫組織化学分析を示している。
【０１１１】
図５Ａ−５Ｄは、ＮＫ細胞標的上の腫瘍細胞を殺す抗ＰＩＢＦ処理の影響を示している。
【０１１２】
図６Ａ−６Ｃは、非妊娠リンパ球のＩＬ−１０およびＩＬ１２上の組み換え体ＰＩＢＦの効果を示している。
【０１１３】
図７は、非腺ガン腫瘍および非固体腫瘍の患者の、尿サンプルのＰＩＢＦレベルを示している。
【０１１４】
図８は、単クローン性抗体および多クローン性抗体の助けによる上昇したｐｉｂｆレベルの検出を示している。
【０１１５】
図９は、手術後あるいは化学治療後のＰＩＢＦレベルの標準化を示している。
【０１１６】
図１０は、ヒト原発腫瘍内に過剰発現した、異なるＰＩＢＦ−ｍＲＮＡを示している。
【０１１７】
図１１は、ヒトＰＢＭＣに結合するＰＩＢＦを示している。
【０１１８】
図１２は、二者択一的につなぎ合わされたＰＩＢＦ−ｍＲＮＡを示している。
【０１１９】
図１は、組み換え体（ヒト）およびマウス（野生）ＰＩＢＦの組み換え体の配列を示しており、Ａは組み換え体配列、ＢはＩＣマウス配列（これはマウス精巣ライブラリーからクローン化されている）、Ｃはヒト配列に基づいているｄＥＳＴライブラリーが断片となったＥＳＴマウスであり、Ｄはウシ配列である。ＸはＰＳＧ予測法による信号配列を示し、ｙはＧｖＨ予測による信号配列、ｚはＥＲメンブレン保持信号、ｗはロイシンジッパーパターン−ＤＮＡ結合モチーフ、ｖはペルオキソーム標的信号、そしてｕは各局在化信号を表している。
【０１２０】
ＰＩＢＦ遺伝子は、クロモソーム１３に位置している。多数のイントロンがＰＩＢＦ遺伝子（ｓ．図２）に存在している。これにより、イントロン２には二者択一的なスプライジングのための部位としての、複数のＡｌｕ繰り返し成分の複製が与えられる。Ａはゲノムのコンティグの間隔を示している。
【０１２１】
図３は、様々な正常組織：胃（Ａ）、甲状腺（Ｂ）、脊髄（Ｃ）、リンパ節（Ｄ）、気管（Ｅ）、副腎（Ｆ）、骨髄（Ｇ）、脾臓（Ｈ）、胸腺（Ｉ）、前立腺（Ｊ）、精巣（Ｋ）、子宮（Ｌ）、小腸（Ｍ）、結腸（Ｎ）、ＰＢＬ（Ｏ）、心臓（Ｐ）、脳（Ｑ）、胎盤（Ｒ）、肺（Ｓ）、肝臓（Ｔ）、骨格筋（Ｕ）、腎臓（Ｖ）、膵臓（Ｗ）内の、ＰＩＢＦ−ｍＲＮＡの検出のためのノーザンブロットを示している。図４中、矢印は３つの異なるｍＲＮＡ形を示している。
【０１２２】
例１：ヒトＰＩＢＦ配列に適合するエントリー
ヒトＰＩＢＦ配列に適合するヒトｃＤＮＡライブラリーのＥＳＴｓエントリーを調べた。３７７６ヒトｃＤＮＡライブラリーにある２２０万のｄＥＳＴから、４３のエントリーを備えるＰＩＢＦ配列を発見した。これら４３のエントリーは、’２７の異なるライブラリーに属する。２７のライブラリーのうち、７ライブラリー（２５％）を、野生（非妊娠、非成人腫瘍）とする。免疫の与えられた精巣は、頻繁にＰＩＢＦｍＲＮＡの存在を示したことが重要である。２７のライブラリーのうち、１３のライブラリーが、腫瘍組織内に発現されたｍＲＮＡｓを含んでいる（〜５０％）。残りは、胎児組織、あるいは妊娠組織由来である。発育、妊娠、および悪性の間、ＰＩＢＦは優先的に発現された。しかしながら、ＥＳＴｓに適合する数は、多数のｍＲＮＡと相関関係にあったが、主にライブラリーの特性に依存している。このことから、直接発現レベルとして測定することができないことが分かる（表１）。
【０１２３】
【表１】
2004514909.tif 000003
【０１２４】
2004514909.tif 000004
【０１２５】
2004514909.tif 000005
【０１２６】
例２：ガン患者の尿サンプル中のＰＩＢＦ濃度の決定
ガン患者の尿中にあるＰＩＢＦを測定する競合的ＥＬＩＳＡアッセイは確立された。ＥＬＩＳＡプレートは２ｍｇ／ｍｌ濃度の組み換えヒトＰＩＢＦでコートされた。ビオチンでラベルされたポリクローナル抗ＰＩＢＦＩｇＧはＰＩＢＦ内容物を決定するためにサンプルと一緒に加えられた。サンプル中のＰＩＢＦ濃度が高いほど、対応するＥＬＩＳＡ値は低くなる。これらのＥＬＩＳＡ読み込みを基礎として、ＰＩＢＦの絶対濃度を決定できる。
【０１２７】
尿サンプルはガン患者より集められ、採取後に新鮮なまま又は凍らせて使用され、解析まで−２０℃で保存された。血清中のＰＩＢＦレベルは、非妊娠女性のレベルや病気の妊婦のレベルに比べると、健康的な妊婦では有意に高いことが以前に決定された。ガン患者からの尿ＰＩＢＦへのアッセイを確認するため、健康な妊婦と正常で健康な妊娠中でない個体からの尿サンプルは、それぞれ陽性と陰性のコントロールとして貢献した。結果は表２に要約されている。正常な（健康な、非妊娠中の）個体は低濃度のＰＩＢＦを有していた（５ｎｇ／ｍｌ）。妊婦からの尿は平均して１１０ｎｇ／ｍｌ濃度のＰＩＢＦで特徴付けられた。重要なことに、高ＰＩＢＦレベルは、堕胎または分娩に続いて、正常レベルにすばやく回復した。６５人のガン患者からの尿サンプルの解析は、腫瘍発生患者が、５〜１８０ｎｇ／ｍｌの範囲で、健康な非妊娠中の個体に比べて有意に高いＰＩＢＦ量を尿中に有することを明白に示している。進行したガン（巨大サイズの原発性腫瘍および／または転移）を有する患者はより高い値を有するようであり、転移がある場合に２８ｎｇ／ｍｌ、転移が無い場合に４３ｎｇ／ｍｌの濃度を有する肺ガン患者の尿サンプルデータによって検証された。
【０１２８】
このデータは、ＰＩＢＦ濃度は腫瘍塊に関連しており、そして尿中のＰＩＢＦの検知が病気の進行や再発をモニターすることに使用できることを示している。ＰＩＢＦ産生性腫瘍の存在を結果とした尿ＰＩＢＦ濃度の上昇はなおいっそう明白である。なぜなら、すべての腫瘍型がＰＩＢＦ陽性（これまでテストした７０〜８０％の腫瘍）であるとは限らないからだ。患者において最も流行性の腫瘍型は２３ケースの肺ガンであった。大半の肺ガン患者は高濃度ＰＩＢＦを有していた。尿中における高ＰＩＢＦの欠如は、臨床性の病気状態に関連していた可能性があり、すなわち、原発性腫瘍を除去した後及び寛解ではＰＩＢＦ濃度は有意に低く、または正常値でさえあった。
【０１２９】
【表２】
2004514909.tif 000006
【０１３０】
例３：腫瘍組織中のＰＩＢＦの検出
ＭＣＦ−７（ヒト乳腺上皮性ガン）細胞系統によるＰＩＢＦ発現の証明に続いて、一連のヒト原発性腫瘍がＰＩＢＦ発現のために研究された。ＰＩＢＦはＭＣＦ−７細胞の培養液上澄みに現れることが明白になり、このことは、このタンパク質は、培養液中にある妊婦リンパ球または活性リンパ球に見出されたものと同様に発現されて分泌されることを示唆している。プロテオミック解析によると、二次元ウエスタン解析によって、抗ＰＩＢＦ抗体は細胞可溶化液中で二つの異なるサイズのタンパク質を認識する。３４ｋＤａの斑点はおそらく分泌形態に関連している。もう一つの主な６０−６２ｋＤａの二重線が検知され、これは主要細胞関連ＰＩＢＦ形態であろう。
【０１３１】
ホルマリン固定されたヒト初期腫瘍の多くが、ヒト野生ＰＩＢＦ（３４ｋＤａ）または組み換えＰＩＢＦ（８９ｋＤａ）との免疫化によって生成されたウサギのポリクローナル抗血清を用いて、免疫組織学によって生体外で解析された。その結果は、テストされた多くの腫瘍型が、ＰＩＢＦまたはＰＩＢＦ関連物質、たとえば、異なる長さのＰＩＢＦ分子、異なってスプライスされたｍＲＮＡ由来のＰＩＢＦ分子、切断分子、融合タンパク質、など（表３）を発現したことを示している。２７個の腫瘍のうち１５個（５５％）は、陽性染色を示した。正常組織対応物の特定免疫染色の欠如は、形質転換された腫瘍細胞は差次的にＰＩＢＦを発現する（図４を参照）ことを証明している。図４では、”Ａ”と称する左列には正常組織が示され、”Ｂ”と称する右列には腫瘍組織が示される。第一行（”１”と称する）は肺ガン（小さい細胞）、第二行（”２”と称する）は尿中の膀胱ガン（一過性（ｔｒａｎｓｉｔｏｒｉａｌ）細胞）、そして”３”行では、胃ガン（腺ガン）が示されている。これらのデータはまた、ＰＩＢＦが陽性になることは、腫瘍細胞自身による発現の結果であり、細胞外溶液由来のＰＩＢＦ（浸潤リンパ球から分泌される）の結合による結果ではないことを実証する。
【０１３２】
【表３】
2004514909.tif 000007
【０１３３】
上述の結果を基に、ＰＩＢＦ産生は極めて一般的な悪性または未分化の状態の現象であり、その結果、ＰＩＢＦは腫瘍マーカーとして役立つことができる。
例４：ＰＩＢＦの存在によるＮＫ活性の変調
抗腫瘍応答の抑制でのＰＩＢＦの潜在的な重要性におけるすべてのデータをまとめると、腫瘍細胞によって産生され、分泌され又は細胞表面に発現されたＰＩＢＦは、系統的にまたは局所的にキラー細胞活性を抑制することがもっともらしい。ＮＫアッセイにはよい標的であるが他にはそうではない細胞系統があることが長く知れていた。ヒト腫瘍細胞系統であるＭＣＦ−７は乏しい標的カテゴリに属する。ＭＣＦ−７細胞系統はＰＩＢＦを産生することが示されているため、これらの細胞に対する低い死滅活性はＰＩＢＦ産生の結果である確かな可能性はある。この可能性をテストするため、ＰＩＢＦ発現ＭＣＦ−７細胞は、ＧｒｉｍｍとＢｏｎａｖｉｄａの”Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｓｓａｙ”； Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ９３， ２７０ （１９８３）による四時間シングルセル細胞障害性アッセイで、標的として使用された。図５では、抗ＰＩＢＦ処理はＮＫ細胞標的の腫瘍細胞死滅を増強することが示された：マイナスとプラスは、抗ＰＩＢＦであるＩｇＧがある場合と無い場合の処置を示し、数字は図５Ｃと図５ＤでのＮＫ活性の割合である。ＮＫ細胞の出所は、健康な個体から新鮮に単離されたＰＭＢＣである。事実、これらの細胞を抗ＰＩＢＦであるＩｇＧで処理すると、ＮＫが介在する溶解に対する感受性が劇的に、およそ８〜１０倍に増加する（図５Ａ）。ＭＣＦ−７細胞に対する基本的な死滅活性は大変低く（１〜２％）、一方、Ｋ５６２細胞が平行アッセイで標的として使用されたときには高い値（５０〜８０％）が測定される。同じ抗ＰＩＢＦ処理は、腫瘍細胞の標的活性を増加するには効果的のようであるが、しかしながら、非腫瘍細胞系統にはなんらの効果も持たない（ＭｃＣｏｙ，ヒト胚性線維芽細胞）。両方のグループからの代表的なメンバー（良好な標的対乏しい標的）を特徴付けることによって、ＰＩＢＦ発現とＮＫ細胞活性の間の相関を作ることができる。さらに、このアッセイにより、ＰＩＢＦ標的細胞死滅を減少する外来性のＰＩＢＦの有効性をテストし、さらに重要なことに、ＰＩＢＦ＋腫瘍細胞の溶解を刺激する際の抗ＰＩＢＦ抗体を中和する力を評価することができる。これらのポリクローナル抗体が野生ＰＩＢＦをｉｎ ｖｉｔｒｏ（ＮＫアッセイにおけるヒトリンパ球培養液）またはｉｎ ｖｉｖｏ（動物モデルとしての妊娠マウス）で失活させることができることによって、中和ウサギ抗ヒト血清および抗マウス血清は生産された。組み換えＰＩＢＦをＫ５６２細胞（標的として）とＰＢＭＣ（ＮＫ細胞ソース）に加えることによって、基礎死滅活性を６０〜７０％減少させることができる（図５）。組み換えＰＩＢＦに対して産生された抗体は、その阻害または死滅活性をほとんど完全に減少させた（図５Ｄ）。
例５：サイトカインバランスの変調
ＰＩＢＦの妊娠促進作用の主要機構の一つは、Ｔｈ２サイトカインの誘発である。ＰＩＢＦの組み換え体もまた活性型であり、末梢性血液リンパ球によるサイトカイン発現をｉｎ ｖｉｔｒｏで調節する証拠がここにある。Ｅ．ｃｏｌｉで発現されてＧＳＴ−ｔａｇで生成された組み換えヒトＰＩＢＦの機能性をテストするために、ｒＰＩＢＦがＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配で単離されて１０６／ｍｌの細胞濃度で培養された非妊娠末梢性リンパ球に加えられた。このプロトタイプＴｈ２リンパ球であるＩＬ−１０は、２４時間の処理の後、ＩＬ−１０陽性のリンパ球（サイトスピンにおける免疫組織学によって）の数を検知して数えることによって測定された。ＩＬ−１０陽性リンパ球のパーセントは０．３５＋／〜−０．１５〜３．５＋／〜１．５％のｒＰＩＢＦ濃度の関数として増加した。ＲＰＩＢＦの最大濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）では、コントロール培養液中に比べて１０倍かそれ以上のＩＬ−１０陽性リンパ球が存在した。同じ処理で、逆の効果がＩＬ−１２（Ｔｈ１リンパ球）生産性リンパ球では見られた。ＩＬ−１２陽性のリンパ球の数は、ＰＩＢＦ濃度の関数として最大ＰＩＢＦ量においておよそ８分の１に減少した。野生ＰＩＢＦのサイトカイン産生における効果の中和もまた成功した。妊娠リンパ球（ＰＩＢＦを産生している）を３時間、抗ＰＩＢＦＩｇＧで処理すると、ＩＬ−１０陽性の数が有意に減少し、ＩＬ−１２陽性細胞の数が有意に増加した（図６Ｂと図６Ｃ）。これらの結果は、ＰＩＢＦの組み換え体はＴｈ２サイトカイン発現を誘発する際に活性があることを証明する。さらに重要なことに、中和抗体はｉｎ ｖｉｖｏで細胞によって産生される活性型ＰＩＢＦを取り除くことができ、その結果、Ｔｈ１サイトカインを増強することができる。
【０１３４】
例６：診断アッセイ
尿中ＰＩＢＦの悪性レベルの診断値は、腺ガン腫瘍を有せずに非固形腫瘍を有する患者の尿サンプルを使用してさらに検証された（図７）；点は個々の血清による結果を表す。平均値が示されている。Ｎは患者数を意味する。
【０１３５】
例：
異なる血液悪性、特にリンパ腫（ＬＹ，Ｎ：３６）、そしてまた白血病（Ｌｅｕ、Ｎ＝１８）、形質細胞腫（ＰＬ、Ｎ＝１１）、そして骨髄増殖性の病気（ＭＯＰ，Ｎ＝７）は、尿中ＰＩＢＦの濃度が通常濃度（コントロールＣ，Ｎ＝８６）に比べて高くなることによって特徴付けられている（図７Ａ）。Ａは全ての腫瘍である。他の例は頭と首の腫瘍（図７Ｃ）、そして尿路の悪性（図７Ｂ）、＋は転移があるときでＮ＝１５、−は転移が無いときでＮ＝１４、である。腫瘍組織、すなわち転移がある病気又は無い病気、腫瘍の除去、は著しくＰＩＢＦ濃度に影響することもまた明白である（図７Ｂ，図７Ｃ）。
【０１３６】
ポリクローナル抗体は、類似抗原捕獲サンドイッチアッセイにおいて、Ｎ末の４８ｋＤａのｒＰＩＢＦを抗原として使用して、マウスで生産される一対のモノクローナル抗体（ａｂ）に置き換えられた。およそ２０の異なるハイブリドーマクローンがテストされ、そして、四つの安定で生産力の高いクローンがＥＬＩＳＡアッセイに選択され、そしてまた別の診断方法（免疫組織学）にも選択された。これらのハイブリドーマクローンは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｅｃｓにあるハイブリドーマセルバンクに預けられている（デポジションナンバーは１１〜１４／２００１、細胞系統コード：ＨＹＢ２５５〜２５８）。腫瘍患者の尿サンプル中での上昇したＰＩＢＦレベルはポリクローナル抗体に類似したモノクローナル抗体の対によって検知される（図８）。ここでＣはコントロール、Ａはすべてのｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ腫瘍、Ｌはリンパ腫、Ｌｕｅは白血病、Ｐはプラズマ細胞腫、Ｎは定義されておらず、Ｎｏ．は患者数、ＰＯＬＹはポリクローナルａｂ、ＭＯＮＯはモノクローナルａｂである。
【０１３７】
さらに過剰なデータもまた、診断面だけではなく、しかし特に、尿中および血清ＰＩＢＦ ＥＬＩＳＡの腫瘍監視潜在力を強調する。このテストは、治療上の成功と失敗を検知して予測できる。なぜなら、どちらもポリクローナルそしてモノクローナル抗ＰＩＢＦ抗体で、手術あるいは化学療法の後のＰＩＢＦレベルの正常化と、再発した患者（図９ａ：ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ、Ｂ：尿路腫瘍）における有意な上昇によって示されるからである。ここでＣはコントロール、Ｂは処理前、ＲＥＬは再発、ＲＥＭは寛解である。
例７：ＰＩＢＦの異なる形
全長ヒトＰＩＢＦに加えて、マウス全長ＰＩＢＦのｍＲＮＡとタンパク質配列が特定された（配列番号 ４、５）。マウスＰＩＢＦもまた、１８エキソンを構成し、８９％のアミノ酸相似を示す。
【０１３８】
ＲＴ−ＰＣＲで正常組織と腫瘍組織のＰＩＢＦレベルを比較する試みの間、多くの代わりにスプライスされたＰＩＢＦのｍＲＮＡ形成が発見された。代わりにスプライスされたＰＩＢＦのｍＲＮＡの構造と、対応するタンパク質生産物は、表４にまとめられている。一つの種で特定されたすべての型は、起こる可能性があり、そして、多種でも同様の機能を有する可能性がある。それは、相似の３５ｋＤａのＰＩＢＦタンパク質型によって検証された。支配的な前駆ｍＲＮＡではイントロン配列である代わりのエキソン１４’ＤＮＡを含むｍＲＮＡの一型の例外により、それらの全ては、全長に相対的ないくつかのエキソンを失う完璧なエキソンスキッピングによって生産される。エキソン１７・１８配列は、特定されたほとんどすべての型に含まれる。それは、これらのエキソンによってコードされたアミノ酸配列は、ＰＩＢＦ機能に不可欠であることを示唆する。さらに、異なる配列を有するいくつかのｍＲＮＡ型は、予測された１０ｋＤａ分子量であるこの同じＣ末ＰＩＢＦポリペプチドの結果となる。ＲＮＡサンプルのＲＴ−ＰＣＲ解析で特定された切断型のＰＩＢＦは異なるヒト組織（配列番号６、Ｎｏ１０〜２０）とマウス組織と細胞系統（配列番号８，９、２３〜３７）から単離された。
【０１３９】
異なるＰＩＢＦ型は差動的に発現され、そして異なる機能特性を有する。
例：
全長ｍＲＮＡ（エキソン１〜１８）は、細胞核の８９ｋＤａタンパク質をコードする。イオインフォマティクスは、エキソン７と１３にある二つの細胞核の局在化信号とエキソン１４〜１６にある核酸結合領域を基にして細胞核の区画化を予測する。細胞分画、それとモノクローナル抗ＰＩＢＦ抗体でのウエスタンブロッティングによると、８９ｋＤａタンパク質は実際、排他的に細胞核画分に局在化する。より小さい分子量型は、異なるヒトおよびマウス原発性腫瘍、胚、そして細胞系統の細胞基質および分泌画分に存在する。
【０１４０】
全長ｍＲＮＡは、ノザン解析（図３）およびＲＴ−ＰＣＲ解析（図１０）を基礎として、異なる量ではあるが、ほとんど全ての組織において発見可能である。半定量的ＲＴ−ＰＣＲは合致した腫瘍組織または正常組織の対で行われた。同じ量のＲＮＡが、同じサンプルの、ＰＩＢＦ特異的エキソン１／エキソン１８とエキソン２／エキソン１８のプライマー対、またはリボソームタンパク質Ｓ９特異的プロモーター（添加コントロール）のどちらかで増加された。サンプルは、１が胎盤ｃＤＮＡ、２が胃の腫瘍、３が胃の正常、４が子宮腫瘍、５が子宮正常、６がネガティブコントロール：ｗ／ｏ雛形である。急速に成長する細胞、たとえば、腫瘍や胚の中、免疫特権組織（精巣、胎盤）の細胞は、さらに多いＰＩＢＦ全長ｍＲＮＡを含む。ヒト原発性腫瘍のＲＴ−ＰＣＲ解析と、それに続くクローニングとＰＩＢＦのｃＤＮＡのＤＮＡ配列決定は、代わりに処理されたＰＩＢＦのｍＲＮＡ型が、異なって発現していることを明らかにする。それはヒト原発性腫瘍において発見される二つのより小さいＰＩＢＦ型によって証明された。胃の腺ガンにおけるエキソン（１〜５）〜（１７〜１８）型と、子宮内膜腺ガンにおけるエキソン１〜（１３〜１８）型の発現は、腫瘍組織に限定されている、なぜなら、同じ患者由来の対応する正常組織は、検知可能なレベルのＰＩＢＦのｍＲＮＡスプライスバリアントを発現しないからだ。重要なことに、これらと代わりに処理された他のＰＩＢＦのｍＲＮＡもまた、免疫特権細胞（胎盤、胚、精巣）および免疫細胞において発見される。
【０１４１】
ＰＩＢＦの機能もまた、成熟したタンパク質型の構造に依存している。もっとも興味深い型は、しばしば、ヒト及びマウス胎盤、ヒトリンパ球、マウス胚そしてヒト胃腫瘍のような、ヒト組織とマウス組織で見つかるエキソン２〜３〜４〜５〜１７〜１８ｍＲＮＡによってコードされている。それは予言された３５ｋＤＡ分子量の２９８２９８および２９７アミノ酸の長いポリペプチドを符号化する。二つのタンパク質は８６％相同である。ＦＡＣＳ解析は、ヒト３５ｋＤａ型がヒト面積細胞に特異的に結合するということを明らかにした（図１１）：３５ｋＤａのＰＩＢＦとα−ＰＩＢＦ抗体（抗ウサギＦＩＴＣ）によるヒトＰＢＭＣのＦＡＣＳ染色。細胞は単球細胞領域（図１１Ａ）とリンパ球ゲート（図１１Ｂ）において見られる増加蛍光ゲートにおける割合（％）で表現されたＭは細胞の数であり、数字が言及するのは、１がＰＢＭＣ＋抗エキソン１７ＰＩＢＦ２がＰＢＭＣ＋ＰＩＢＦ〜３５ｋＤａ（１μｇ）＋抗エキソン１７、３がＰＢＭＣ＋ＰＩＢＦ〜３５ｋＤａ（５μＧ）＋抗エキソン１７３がＰＢＭＣ＋ＰＩＢＦ〜３５ｋＤａ（１５μｇ）＋抗エキソン１７である。ヒトリンパ球と単球に対する結合はこれらの免疫細胞上のＰＩＢＦレセプターを示唆する。エキソン１〜９（４８〜ｋＤａ）を有し、この機能的ＰＩＢＦ型のＮ末部分を有し、Ｃ末部分（エキソン１７〜１８）を欠損しているｒＰＩＢＦの折とり版は、免疫細胞への結合という意味において機能的でない（データは示されていない）。
【０１４２】
【表４】
2004514909.tif 000008
【０１４３】
2004514909.tif 000009
【０１４４】
図１２Ａはマウス全長８９−ｋＤａＰＩＢＦ（配列番号．４）を示し、図１２Ｂは胃腫瘍、ヒト末端胎盤、オスとメスのリンパ球、メスの妊娠リンパ球にあるエキソン（１〜５）〜（１７〜１８）（配列番号．６）を示し、図１２Ｃはマウス胎盤と胚にあるエキソン（１〜５）〜（１７〜１８）（配列番号．８）を示し、図１２Ｄはエキソン１〜（１３〜１８）（配列番号．１１）を示し、図１２ＥはＭＣＦ−７細胞と妊娠リンパ球にあるエキソン１〜（１５〜１８）（配列番号．１２）を示し、図１２Ｆはイントロン１４の一部とエキソン１５〜１８（配列番号．１３）を示し、図１２ＧはＭＣＦ−７細胞と妊娠リンパ球にあるエキソン１＋（９〜１０）＋（１２〜１５）＋（１７〜１８）（配列番号．１４）を示し、図１２ＨはＭＣＦ−７細胞−ヒト乳腺腫瘍細胞系統にあるエキソン１＋（３〜７）＋（９〜１０）＋１２＋（１７〜１８）（配列番号．１７）を示し、図１２ＩはＭＣＦ−７細胞−ヒト乳腺腫瘍細胞系統にあるエキソン（１〜７）＋（９〜１５）＋（１７〜１８）（配列番号．１９）を示し、図１２ＪはＭＣＦ−７細胞−ヒト乳腺腫瘍細胞系統にあるエキソン（１〜７）＋（９〜１０）＋１２＋（１７〜１８）（配列番号．２２）を示し、図１２Ｋはマウス胚と胎盤にあるエキソン（１〜２）〜（１７〜１８）（配列番号．２３）を示し、図１２Ｌはマウス胎盤にあるエキソン（１〜４）〜（１６〜１８）（配列番号．２５）を示し、図１２Ｍはマウス精巣にあるエキソン（１〜２）〜（１５〜１８）（配列番号．２７）を示し、図１２Ｎはマウス胚にあるエキソン１〜１１ １８（配列番号．２９）を示し、図１２Ｏはマウス胚にあるエキソン（１〜１１）〜１８（配列番号．３１）を示し図１２Ｐはマウス胚にあるエキソン１〜（８〜１４）〜（１７〜１８）（配列番号．３４）を示し、図１２Ｑはマウス精巣にあるエキソン（１〜１）〜（１５〜１８）（配列番号．３６）を示す。
【０１４５】
〔引用文献〕
2004514909.tif 000010
【０１４６】
2004514909.tif 000011
【０１４７】
2004514909.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【図１】
組み換え体および（野生）マウスＰＩＢＦアミノ酸配列の配列を示す図である。
【図２】
クロモソーム１３上のＰＩＢＦ遺伝子領域内のエキソンおよびイントロンの略図を示す図である。
【図３】
異なる組織におけるＰＩＢＦ−ｍＲＮＡの検出のためのノーザンブロットを示す図である。
【図４】
ヒト原発腫瘍の免疫組織化学分析を示す図である。
【図５Ａ】
図５Ａは、ＮＫ細胞標的上の腫瘍細胞を殺す抗ＰＩＢＦ処理の影響を示す図である。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、ＮＫ細胞標的上の腫瘍細胞を殺す抗ＰＩＢＦ処理の影響を示す図である。
【図５Ｃ】
図５Ｃは、ＮＫ細胞標的上の腫瘍細胞を殺す抗ＰＩＢＦ処理の影響を示す図である。
【図５Ｄ】
図５Ｄは、ＮＫ細胞標的上の腫瘍細胞を殺す抗ＰＩＢＦ処理の影響を示す図である。
【図６Ａ】
図６Ａは、非妊娠リンパ球のＩＬ−１０およびＩＬ１２上の組み換え体ＰＩＢＦの効果を示す図である。
【図６ＢＣ】
図６ＢＣは、非妊娠リンパ球のＩＬ−１０およびＩＬ１２上の組み換え体ＰＩＢＦの効果を示す図である。
【図７】
非腺ガン腫瘍および非固体腫瘍の患者の、尿サンプルのＰＩＢＦレベルを示す図である。
【図８】
単クローン性抗体および多クローン性抗体の助けによる上昇したＰＩＢＦレベルの検出を示す図である。
【図９】
手術後あるいは化学治療後のＰＩＢＦレベルの標準化を示す図である。
【図１０】
ヒト原発腫瘍内に過剰発現した、異なるＰＩＢＦ−ｍＲＮＡを示す図である。
【図１１】
ヒトＰＢＭＣに結合するＰＩＢＦを示す図である。
【図１２】
二者択一的につなぎ合わされたＰＩＢＦ−ｍＲＮＡを示す図である。
【図２】
2004514909.tif 000013
【図５Ｄ】
2004514909.tif 000014
【図６ＢＣ】
2004514909.tif 000015
【図７】
2004514909.tif 000016
【図８】
2004514909.tif 000017
【図９】
2004514909.tif 000018
【図１０】
2004514909.tif 000019
【図１１】
2004514909.tif 000020
【国際公開パンフレット】
2004514909.tif 000021
2004514909.tif 000022
2004514909.tif 000023
2004514909.tif 000024
2004514909.tif 000025
2004514909.tif 000026
2004514909.tif 000027
2004514909.tif 000028
2004514909.tif 000029
2004514909.tif 000030
2004514909.tif 000031
2004514909.tif 000032
2004514909.tif 000033
2004514909.tif 000034
2004514909.tif 000035
2004514909.tif 000036
2004514909.tif 000037
2004514909.tif 000038
2004514909.tif 000039
2004514909.tif 000040
2004514909.tif 000041
2004514909.tif 000042
2004514909.tif 000043
2004514909.tif 000044
2004514909.tif 000045
2004514909.tif 000046
2004514909.tif 000047
2004514909.tif 000048
2004514909.tif 000049
2004514909.tif 000050
2004514909.tif 000051
2004514909.tif 000052
2004514909.tif 000053
2004514909.tif 000054
2004514909.tif 000055
2004514909.tif 000056
2004514909.tif 000057
2004514909.tif 000058
2004514909.tif 000059
2004514909.tif 000060
2004514909.tif 000061
2004514909.tif 000062
2004514909.tif 000063
2004514909.tif 000064
2004514909.tif 000065
2004514909.tif 000066
2004514909.tif 000067
2004514909.tif 000068
2004514909.tif 000069
2004514909.tif 000070
2004514909.tif 000071
2004514909.tif 000072
2004514909.tif 000073
2004514909.tif 000074
2004514909.tif 000075
2004514909.tif 000076
2004514909.tif 000077
2004514909.tif 000078
2004514909.tif 000079
2004514909.tif 000080
2004514909.tif 000081
2004514909.tif 000082
2004514909.tif 000083
2004514909.tif 000084
2004514909.tif 000085
2004514909.tif 000086
2004514909.tif 000087
2004514909.tif 000088
2004514909.tif 000089
2004514909.tif 000090
2004514909.tif 000091
2004514909.tif 000092
2004514909.tif 000093
2004514909.tif 000094
2004514909.tif 000095
2004514909.tif 000096
2004514909.tif 000097
2004514909.tif 000098
2004514909.tif 000099
2004514909.tif 000100
2004514909.tif 000101
2004514909.tif 000102
2004514909.tif 000103
2004514909.tif 000104
2004514909.tif 000105
2004514909.tif 000106
2004514909.tif 000107
2004514909.tif 000108
2004514909.tif 000109
2004514909.tif 000110
2004514909.tif 000111
2004514909.tif 000112
2004514909.tif 000113
2004514909.tif 000114
2004514909.tif 000115
2004514909.tif 000116
2004514909.tif 000117
2004514909.tif 000118
2004514909.tif 000119
2004514909.tif 000120
2004514909.tif 000121
2004514909.tif 000122
2004514909.tif 000123
2004514909.tif 000124
2004514909.tif 000125
2004514909.tif 000126
2004514909.tif 000127
2004514909.tif 000128
2004514909.tif 000129
2004514909.tif 000130
2004514909.tif 000131
2004514909.tif 000132
2004514909.tif 000133
2004514909.tif 000134
2004514909.tif 000135
【手続補正書】
【提出日】平成15年3月3日(2003.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項３２】
ＦＡＳＴ／Ａアルゴリズムによって決定される、上記ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ４による配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸同一性のあるアミノ酸または上記ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ４によるアミノ酸配列からなるＰＩＢＦ活性を有するタンパク質。
【国際調査報告】
2004514909.tif 000136
2004514909.tif 000137