(57)【要約】液体中の酵素を検出する、一体型の使い捨て分析デバイスである。このデバイスは、手操作用の支持構造体と、この支持構造体と結びついた組成物とを有し、この組成物が、デバイスの外観の変化を引き起こすように酵素に感応する。このデバイスは、ある部類の酵素に選択的に感応する組成物を有することにより、多くの部類から酵素を検出するのに適合し得、それぞれの部類の酵素の存在を示すデバイスの外観の変化を引き起すようにそれぞれが感応する。さらに、本発明のテストストリップを液体中に挿入する工程、および挿入したときから、予め定められたテストストリップの外観の変化が認められるまでにかかる時間を、または予め定められた時間後にストリップの外観の変化がないかを測定する工程、を包含する、液体中の酵素の活性を評価する方法が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
適切な温度で液体中の酵素を検出する、一体型の使い捨て分析デバイスであって、
該デバイスが、手操作用の支持構造体と、該支持構造体と結びついた組成物とを有し、
該組成物が、デバイスの外観の変化を引き起こすように酵素に感応する、
デバイス。
【請求項２】
適切な温度で、液体中の、第１の部類から選択される酵素および／または第２の部類から選択される酵素を検出する、一体型の使い捨て分析デバイスであって、
該デバイスが、手操作用の支持構造体と、それぞれ支持構造体と結びついた第１組成物および第２組成物とを有し、
該第１組成物が選択的に第１の部類の酵素に感応し、および第２組成物が第２の部類の酵素に感応し、
それぞれの部類の酵素の存在を示すデバイスの外観の変化を引き起こすようにそれぞれが感応する、
デバイス。
【請求項３】
前記デバイスの外観の変化が、前記基体と結びついた組成物の層が消化されて消化された層と異なる外観である下部積層が露出することに起因する、請求項１または２記載のデバイス。
【請求項４】
露出される、下部積層が、支持構造体または支持構造体上のコーティングである、請求項３記載のデバイス。
【請求項５】
前記基体と結びついた組成物が不透明または半透明である、請求項３または４記載のデバイス。
【請求項６】
前記基体と結びついた組成物が、細かく分割された固体分散物を含む、請求項５記載のデバイス。
【請求項７】
前記分散物が硫酸バリウムである、請求項６記載のデバイス。
【請求項８】
前記デバイスの外観の変化が、結びついた組成物の表面層の消化によって該組成物の下部積層と外観上異なる表面層中または表面上に取り込まれている物質が放たれることに起因する、請求項３記載のデバイス。
【請求項９】
前記取り込まれている物質が、前記組成物の表面に設けられたインクまたは顔料である、請求項８記載のデバイス。
【請求項１０】
前記基体と結びついた組成物が固体分散物を含み、その少なくとも表面層部分が、残りと異なるように着色される、請求項３記載のデバイス。
【請求項１１】
前記表面層が、前記組成物の表面にインクまたは染料を設けることにより着色された、請求項１０記載のデバイス。
【請求項１２】
外観の変化が、デバイスの結びついた組成物の成分と液体中の酵素とが反応して、異なる外観の生成物を直接的にまたは１以上のメディエーターを介して産出することに起因する、請求項１または２記載のデバイス。
【請求項１３】
デバイスの予め定められた部分の液体中の挿入時から、予め定められた変化がある場合は、それが観察されるまでの時間が、液体温度で検出される酵素の活性を示すものである、
従前請求項いずれかに記載のデバイス。
【請求項１４】
前記デバイスの外観が、適切な温度の酵素を含む液体中にデバイスの予め定められた部分を浸漬した後に時間とともに変化し、および
予め定められた時間後の外観が、該温度における検出される酵素の活性を示すものである、
請求項１〜１２いずれかに記載のデバイス。
【請求項１５】
結びついた組成物がプロテアーゼ消化可能である、従前請求項いずれかに記載のデバイス。
【請求項１６】
結びついた組成物がセルラーゼ消化可能である、従前請求項いずれかに記載のデバイス。
【請求項１７】
結びついた組成物がリパーゼ消化可能である、従前請求項いずれかに記載のデバイス。
【請求項１８】
結びついた組成物がアミラーゼ消化可能である、従前請求項いずれかに記載のデバイス。
【請求項１９】
結びついた組成物がオキシダーゼ消化可能である、従前請求項いずれかに記載のデバイス。
【請求項２０】
結びついた組成物が均一の厚さの層を形成し、それが予め定められた活性の適切な酵素によって予め定められた時間で選択的に消化される、従前請求項いずれかに記載のデバイス。
【請求項２１】
結びついた組成物が、徐々に増加する厚さの層を形成し、それが予め定められた活性の適切な酵素によって予め定められた時間で選択的に消化され、予め定められた時間で消化された厚さは酵素の活性を示す、請求項１〜１９いずれかに記載のデバイス。
【請求項２２】
結びついた組成物が、予め定められた厚さの段階で厚さが増加する層であり、それが予め定められた活性の適切な酵素によって段階の厚さに従い予め定められた時間で選択的に消化されて、予め定められた時間で消化された段階の数が酵素の活性を示す、請求項１〜１９いずれかに記載のデバイス。
【請求項２３】
前記支持構造体がプラスチックシートまたはフィルムで作られる、従前請求項いずれかに記載のデバイス。
【請求項２４】
テストストリップを液体中に挿入する工程であって、該テストストリップが支持構造体、該支持構造体と結びついた組成物を有し、該組成物がテストストリップの外観の変化を引き起こすように酵素に感応する工程、および
挿入時から、テストストリップの予め定められた外観の変化が観察されるまでにかかる時間を測定する工程、
を包含する、適切な温度における液体中の酵素の活性を評価する方法。
【請求項２５】
前記組成物が酵素消化可能組成物であって、前記テストストリップの外観の変化が該組成物の表面での外観の変化による、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記テストストリップの前記外観の変化が、前記組成物がストリップから消化されて組成物の下部支持構造体が露出することによるものである、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記外観の変化がテストストリップの透明性の変化である、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
前記液体が予め定められた温度に維持される、請求項２４〜２７いずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記テストストリップが支持構造体上に複数の組成物を有し、各部類の酵素によってそれぞれが選択的に消化されることが可能であり、各組成物の外観の変化にかかる時間が測定される、請求項２４〜２８いずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記酵素を含む液体中にテストストリップを挿入する工程であって、該テストストリップが、支持構造体から外観上認識できる、予め定められた時間に予め定められた活性の酵素によって消化可能な組成物の、予め定められた厚さの増加する１またはそれ以上の層でコートされた支持構造体を有する、工程、および
予め定められた時間で消化された該組成物の厚さを記録する工程
を包含する、酵素の活性を測定する方法。
【請求項３１】
請求項１〜２０いずれかに記載のデバイスと、それがある場合はデバイスの外観の予め定められた変化の外観の標識とを含むキット。
【請求項３２】
任意の１の実施例に関して本明細書中に実質的に記載されており、任意の比較例が除かれている、デバイス。
【請求項３３】
任意の１の実施例に関して本明細書中に実質的に記載されており、任意の比較例が除かれている、酵素活性を評価する方法。
【請求項３４】
任意の１の実施例に関して本明細書中に実質的に記載されている、キット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、酵素または酵素の組み合わせの活性を測定する装置、およびその装置の使用に関する。
【０００２】
背景技術
本明細書全体にわたっての先行技術の何れの記載も、先行技術が広く知られているという、または当分野での通常の一般的な知識の一部を形成するという承認として考慮されるべきでない。
【０００３】
生きている細胞は、生命体内に存する条件下で生じる反応を加速する目的で、一連の触媒を作り出す。これらの生体触媒は酵素とよばれている。これらは、これ自体は反応に影響されることなく、ある化学反応の速度を上げるタンパク質である。これらは現在、大規模で製造され、そして多くの目的に対して使用されている。
【０００４】
酵素は、食品の加工および製造などの工業プロセス、および家庭用品で広く使用されている。例えばこれらは、家庭用品などで洗濯洗剤として使用され、生物学的由来の汚れの消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を助力し、食器用洗剤中で使用され、食物のくずの消化／除去を助力する。これらは製造業、例えば皮のなめし、フリースのデウーリング（ｄｅｗｏｏｌｉｎｇ）、チーズ、紙、パンの製造で、および他の工業で広く使用されている。酵素は、病院、医療、歯科業務などにおいて、消化を助力し、そして外科用の器具および道具一式から生物学的汚染を除去するために使用されている。
【０００５】
たくさんのアッセイ方法が、酵素の存在を決定し、そしてその活性を計る目的で提案されている。これは一般に、精巧な処理、そして通常多大な時間がかかり、熟練した分析者による処理が必要とされる化学アッセイを伴う。本明細書に添付され、そして「添付１」と記されているものは、プロテアーゼのタンパク質分解活性を決定するためのそしてＵＳＰ方法に基づく典型的な方法である。この方法は、分光光度計と他の装置、試薬（それらの幾つかは毎日新たに作成しなければならない）と、それに加えて作業を実施する熟練した技術者が必要とされる。この手順を約２時間未満で終えることはできない。
【０００６】
特定の酵素または酵素の部類が組成物のサンプル中に存在するか否かを迅速に検出する方法も有用であると考えられる。系中の１またはそれ以上の酵素の活性の程度を知ることも重要であることが多く、そして比較的迅速で、簡便で費用のかからないアッセイ方法が望まれており、好ましくは比較的熟練していない人によっても実施することができる方法が望まれていると考えられる。
【０００７】
近年、固定化された酵素を使用してサンプル中の所定の検体を検出する、例えば血液サンプル中のグルコースまたは糞（便）の物質中の血液を測定する、数多くのテストストリップが開発されている。これらのデバイスの多くは、読出しを提供する複雑な電流滴定測定デバイスを必要とし、そして比較的複雑で高価な構成である。このようなデバイスは酵素を使用するが、酵素活性の測定は提供されず、また検体中の存在の表示も提供されない。
【０００８】
本発明の目的は、上記の先行技術の１またはそれ以上の不利点を回避するまたは少なくとも改善する、または商業的に有用な代替品を提供する、酵素の検出および／または活性アッセイの方法を提供することにある。
【０００９】
発明の概要
本発明の１つの態様は、適切な温度で液体中の酵素を検出する、一体型の使い捨て（ｓｉｎｇｌｅ ｕｓｅ）分析デバイスであって、このデバイスが手操作用の支持構造体と、支持構造体と結びついた組成物とを有し、この組成物が、デバイスの外観の変化を引き起こすように酵素に感応する、デバイスを提供する。
【００１０】
内容が他を明確に必要としない限り、明細書および請求の範囲の全体に渡って、「含む・有する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる・有している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の単語およびそれらの類似語は、排他的または排出的な意味とは反対の、包括的な意味として、すなわち「含む・有するが限定されるものではない」という意味として解釈されるべきである。
【００１１】
本発明の好ましい実施態様では、上記デバイスは、酵素の存在について試験されるまたはその活性の評価する液体中に手で浸すまたは挿入するのに適したテストストリップの形態の支持構造体からなる。上記支持体は、望ましくは、プラスチックのシートまたはその類似物などの不活性なキャリアであるが、しかし幾つかの実施態様では、紙または厚紙のシートも支持構造体の条件に適合し得る。他の支持体、例えばガラス、金属、セラミックまたは複合材料を使用することもできる。支持体は重合体ビーズまたは無機粒子などの分散の形態であってもよい。結びついた組成物は、好ましくは支持体上にコートまたは印刷されており、そして、例えば、特定の酵素の部類の酵素によって選択的に消化可能な組成物であるかまたはその組成物を含んでもよい。例えば、結びついた組成物は、プロテアーゼの部類の酵素によって選択的に消化可能なタンパク質であるかまたはそれを含んでもよく；またはリパーゼの部類の酵素によって消化可能な脂質であるかまたはそれを含んでもよく；またはセルラーゼの部類の酵素によって消化可能なセルロースであるかまたはそれを含んでもよいものなどであり、または複数のこのような組成物が単一の支持体と結びついてもよい。この組成物は、必要に応じて支持体と結びつきを維持するバインダーを含んでもよく、またそれ自身が結合性のあるシートを形成できる酵素消化可能な組成物の場合は、シートとして支持体に接着させてもよい。
【００１２】
本発明の実施態様では、上記組成物と試験される液体中の酵素との相互作用が、例えば組成物が変色し得る、または組成物が消化されて異なる外観の下部積層が露出するなどの、テストストリップの外観の変化を引き起こす。酵素の検出に応じてデバイスの外観の変化が達成できる種々の方法を、以下により詳細に記載する。
【００１３】
本発明の、非常に好ましい形態では、上記組成物は酵素消化可能であり、固体（例えば硫酸バリウム）の細かい分散を含み、それのさらされた表面のまたはそれに近い層、またはその層の１部が着色されている。組成物の消化に有効な酵素は、着色された層中で着色された粒子を放ち、それはテストストリップから離れて落下する。表面のまたはその近くの着色された層は、下部の残りと異なる外観であり（硫酸バリウムの場合は、分散物は乳白色である）、表面層の消化は、ストリップの視認できる色の変化をもたらす。
【００１４】
好ましい実施態様では、酵素活性量の測定は、テストストリップの浸漬時から、外観の変化が観察されるまでの時間を測定し、そしてその時間を参照チャートまたはサンプルと比較することにより、行なうことができる。他の実施態様では、予め定められた時間間隔で生じる外観の変化の度合いを使用して、酵素活性を示す。
【００１５】
図面の簡単な説明
本発明の種々の実施態様を、添付の図面に、例示説明のみとして記載する：
図１は、本発明の第１の実施態様の概略平面図を示し、
図２は、図１のライン２−２に沿った断面を示し、
図３は、本発明の第２の実施態様の概略平面図を示し、
図４は、図３のライン３−３に沿った断面を示し、
図５は、本発明の第３の実施態様の概略平面図を示し、
図６は、図５のライン５−５に沿った断面を示し、そして、
図７は、図６と同様の断面中の、第３の実施態様の好ましい変形を示す。
【００１６】
発明の最良の実施態様
本発明の第１の実施態様を、デバイスの単純な形態が提供される図１および２に示す。図１のデバイスは、プロテアーゼを検出し次いで処分される、使い捨てを対象とするテストストリップである。このデバイスは支持構造体１で構成され、そして図解例ではストリップの形態をしているが長方形形状である必要はなく、必ずしも平面である必要もない。本例で、支持体１はプラスチックであり、意図される使用の方法に関して手操作を助力するよう形づくられている。支持構造体１は着色され（例えば支持構造体１は青色に着色されたプラスチックであり得る。）、酵素消化可能組成物２と、組成物の予め定められた厚さの接着性層でのコートによって結びついている。組成物２は、乳白色組成物が得られる、細かく分割された硫酸バリウムが分散したゼラチンである。テストストリップの使用の前に、支持構造体１の青色を、白色組成物２の表面的な（ｏｖｅｒｌｙｉｎｇ）コーティングによって覆い隠す。使用において、ストリップを、知られた温度で、活性がアッセイされるプロテアーゼ酵素を含む液体中に挿入する。ストップウオッチを使用して、ストリップの液体への挿入時から、組成物２の層が消化され、組成物２の白色から支持体１の青色への、テストストリップのコートされた部分の外観の変化で明示されるまでの時間を測定する。それからストップウオッチを止め、そして酵素の活性は、時間対上記組成物の予め定められた厚さにおける活性の、予め校正した表を参照して評価される。酵素活性および酵素による基体の消化の速度は、温度に依存し、そしてそのサンプルは、特定の適切な温度に予め調整すべきか、または溶液の温度を測定し、温度調節ファクターを適用すべきであることは、当業者には明らかであろう。図１の実施態様では、支持構造体全体が、結びついた組成物によって被覆される必要はない。しかしながら、この実施態様において、上記ストリップを酵素活性の評価に使用する場合は、支持体１上の組成物２のコーティングの厚さを正確にそして再現可能に制御することが重要である。
【００１７】
所望に応じて、上記ストリップに校正チャートを添えて（２つのものが１つのキットを形成する）、使用者に支持体の終点色を示してもよく、またはさらされ覆われていない支持体部分を残しておき、色比較を容易にしてもよい。使用する場合の固体懸濁物は硫酸バリウムである必要はなく、シリカ、二酸化チタン、金属コロイドまたは他の乳白剤であってもよい。
【００１８】
支持体は着色される必要はない。支持体１が透明なフィルムであって、任意の時間調節回路を併せ持つ光ビームおよびフォトダイオードなどを使用して、組成物の消化、終点の記録（光ビームがキャリアおよび組成物層を通過する時）そして消化時間を観察してもよい。他の実施態様では、消化可能コーティングが、消化された場合に、キャリア上に印刷された下部のしるし、例えば「プロテアーゼ」の単語または「Ｐ」などの略語が露出される。
【００１９】
上記の実施態様はプロテアーゼの活性の検出および測定を目的とする。しかしながら、他の組成物を、他の酵素類からの酵素の検出に使用してもよい。例えば、セルロース基体を利用する組成物を使用してセルラーゼの酵素を検出してもよく、脂質を含む組成物を使用してリパーゼ類の酵素を検出してもよく、アミロペクチンを含む組成物を使用して、アミラーゼ類などの酵素を検出してもよい。
【００２０】
さらに好ましい実施態様を、図３および４に示す。図３のデバイスは、単一の支持構造体１が数種の異なる酵素消化可能組成物と結びつき、それぞれの組成物は１つの酵素または酵素の１部類に特異的であり、そして上記ストリップが２つ以上の酵素の存在を試験することができ、そして混合物中に共存する数部類の異なる酵素をアッセイすることができることが、図１のデバイスと異なる。この場合、異なる組成物は、例えば色などで互いに外観上認識できてもよく、または組成物は同じ色であるが、外観上区別できる支持体部分をふさいでもよい。同一または異なる、下部の色またはしるしを有してもよい。
【００２１】
好ましい実施態様では、支持体と結びついた組成物が、予め定められた均一の厚さのコーティングとして支持体に設けられ、そして消化時間が測定されるのであるが、望ましい実施態様で、連続的に変化するまたは段階で変化する厚さのコーティングを使用して、与えられた時間内で消化された厚さを評価してもよい。この場合、異なる値が各厚さ段階の下で露出され、そして、予め定められた時間内で露出された最高値が、活性を表示し得る。
【００２２】
図３に関して、本発明によるデバイスの概略図を例として示しており、支持構造体１で構成されるテストストリップがセルロースアセテートフィルムの形状であり、第１の組成物２の表面的な層またはストリップ、第２の組成物２’の層、第３の組成物２’’の層、および第４の組成物２’’’の層でコートされた、各組成物２、２’、２’’、２’’’は、互いに異なる個別の酵素または酵素の部類によって選択的に消化可能である。
【００２３】
表面的な層またはストリップの２、２’、２’’、２’’’それぞれは、互いに異なる酵素または酵素の部類によって選択的に消化可能である。層２は、タンパク質層であり、層２’は脂質層であり、層２’’はセルロースであり、そして層２’’’は炭化水素である。より具体的には、本事例で、層２’’’は、アミラーゼによって消化可能であるがセルラーゼでは消化されないアミロペクチンである。層２、２’、２’’、２’’’は、平行なストリップとして使い捨てられてもよく、また、連続して（図１に示すように）または基体１の上に離して間隔を空けてもよい。
【００２４】
図２の断面に示すように、ストリップ２、２’、２’’、２’’’は均一の厚さでなく、レベル３、４、５などの厚さで徐々に段をつけてもよい。レベルの多くなるまたは少なくなる変化があってもよく、または厚さが連続的に増加してもよい。
【００２５】
コーティングを、任意の適切な工程によって、例えば輪転グラビアを使用する印刷、スクリーン印刷、インクジェット印刷、ナイフコーティング、または予め定められた厚さの層を付着させるのに適した他の手段によって、基体に設けてもよい。
【００２６】
各組成物は、支持体をコーティングする前に、細かく分散した硫酸バリウムの懸濁物が組成物に導入され、不透明にされる。この分散物は下部支持体を隠す。支持体は、透明であっても、着色されていても、または着色された層で覆われていてもよい。支持体の色は、望ましくは各組成物２、２’、２’’、２’’’の下で異なる。組成物の厚さの各段階３、４、５の下にしるしがあってもよい。あるいは、この組成物が染色されまたは着色され、予め定められた時間の後に残存する厚さを、 色合いチャートを用いた比較により判断することもできる。
【００２７】
第３の実施態様は、図５および６に関して記載する。へら形状の支持体１は、浸漬に適した部分１１とハンドル部分１２を有する。部分１１は、複数の酵素消化可能組成物２、２’、２’’でコートされており、それぞれの組成物は異なる部類の酵素によって選択的に消化可能である。各組成物２、２’、２は、表面層上または表面層中で着色される。図６に示されるこの技術の１つの変形において、これは、インク６の印刷またはコーティングによって、例えば組成物２、２’、２’’のさらされた表面の上へのドットまたはグリッドパターンによって達成される。インク６は、試験される、酵素を含む液体に、不溶性である。適切なインクとして水不溶性顔料、例えばＤ＆Ｃｖｉｏｌｅｔ Ｎｏ．２を用いる。部分１１を、適切な酵素を含む液体中に挿入する場合、感応する組成物２が消化され、同時に液体接触面が消費され、インク６が放たれ、そして剥がれて、外観の変化が出現する。
【００２８】
第３の実施態様の好ましい形態は、平面図としては図５の態様と同様であるが、立面図としてとしては図７に示すとおりである。この形態で、組成物２、２’、２’’が、細かく分割された固体、例えば硫酸バリウムの懸濁物を含む。インクまたは染料は、例えばインクジェット印刷により、組成物２の表面に、測定された量で設けられる。インクは組成物２、２’、２’’に浸透し、組成物の表面でまたはその近くで、懸濁した固体の薄い層７を着色する。部分１１が酵素を含む溶液中に垂直に挿入される場合、酵素に感応する組成物２が消化され、同時に液体接触面上の組成物が消費され、層７の着色された粉末が比重または拡散で剥がれ、そして着色された層７の下部積層８が白色であるので、外観の変化が生じる。もちろん白色でない固体を懸濁物として使用してもよい。所望に応じて、着色された固体を、他の手段によって、組成物２の表面層の上または表面層中に捉えさせることもできる。例えば感光性固体粒子は、光にさらす方法によって、表面でまたはその近くで色を変化させることができる。表面層が下部積層と異なる外観である、酵素消化可能組成物を利用する実施態様は、支持体上の組成物のコーティングの厚さの正確なそして再現可能な制御の必要性を回避することが判明した。薄い層を再現可能に着色することは、予め定められた厚さのコーティングを提供することよりもかなり容易であり、そしてこれは、驚くべきことに再現可能であって正確な終点の表示を与える。硫酸バリウムが、その高い比重により、この目的において分散物として好ましい。
【００２９】
実施態様で、これまでに記載した、支持体と結びついた組成物は全て、特定の部類の酵素によって選択的に消化可能な性質を有する。しかしながら、組成物は酵素消化可能である必要はない。この組成物が、酵素と反応し、直接的にまたは１またはそれ以上の反応中間体またはメディエーターを経由してのいずれかで生成物を産出し、色の変化が生じるように選択してもよい。例えば、組成物２は、フェリシアン化物、フェロセン、メチレンブルー、ｐ−ベンゾキノン、２，６−ジクロロフェニルインドフェノール、ピオシアニンまたはチオニンなどの電子伝達メディエーターと併せたスクロースで固定化された、多孔性の結合媒体を含んでもよい。液体中にグルコースオキシダーゼが存在する場合、測定される活性は、デバイス中のグルコースがグルコン酸に酸化し、そしてメディエーターは例えばフェリシアン化物からフェロシアン化物に還元される。この型の反応は色変化を伴ってもよく、または、オキシダーゼの活性を表示し得る適切なレドックス指示薬を使用して色変化をもたらしてもよい。他の基体／メディエーターシステムを、他の酵素類に使用することもできる。
【００３０】
実施例
本発明での使用用のコーティング組成物を、以下に例示説明のみとして記載する：
１．プロテアーゼ消化可能コーティング
【表１】
2004500127.tif 000002
【００３１】
２．セルラーゼ消化可能コーティング
【表２】
2004500127.tif 000003
【００３２】
３．リパーゼ消化可能コーティング
【表３】
2004500127.tif 000004
【００３３】
４．アミラーゼ消化可能コーティング
【表４】
2004500127.tif 000005
混合物を３２〜３５℃にし、薄い層として付着させることができる。
【００３４】
アミロペクチンまたは、冷水に不溶性の任意の他の長鎖多糖類を、アガロース／アガロペクチン混合物の代わりに配合で使用することができる。
【００３５】
５．プロテアーゼとの反応の生成物／副生成物を検出する組成物
この方法は、基体中の冷水不溶性タンパク質の分解（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ）により生じる、冷水に可溶性のタンパク質フラグメントのポリペプチド結合の検出をベースとしている。ストリップは、２つの空間的に離れたパーツであって、一方が基体を有し、他方が試薬を有するものを含んでもよく、あるいは２つのパーツがマトリックスと複合してもよい。
【００３６】
【表５】
2004500127.tif 000006
プロテアーゼ作用をうける場合、ゼラチンは、ＤＮＦと反応し鮮黄色を形成する小さな水溶性ポリペプチドに分解される。
【００３７】
６．アミラーゼとの反応の生成物／副生成物を検出する組成物
【表６】
2004500127.tif 000007
【００３８】
７．セルラーゼとの反応の生成物／副生成物を検出する組成物
【表７】
2004500127.tif 000008
当業者は、本明細書の教示に基づいた他の適切な基体を選択することができるであろう。
【００３９】
１の実施態様の特徴を、他のものの特徴と併せてもよい。本明細書の教示から明らかであろうように、本発明で使用される組成物を異なる方法で配合してもよく、本明細書に開示された発明の思想から離れることなく、多くの他の形態で、互いにそして適切な基体を用いて組み合わせてもよい。
【００４０】
添付　１
１．０．範囲および目的：
この方法は、酵素の調製および洗浄剤（アゾカゼイン基体）中のタンパク質分解活性を測定する。
２．０．独特の安全対策：
なし
３．０．方法の原理：
プロテアーゼで、アゾカゼインを、４０℃で３０分間加水分解させる。消化されていないタンパク質をトリクロロ酢酸を用いて沈殿させ、そして消化された生成物の量を分光測光法によって測定する。
【００４１】
４．０．装置：
４．１　分光光度計
４．２　ｐＨメーター
４．３　４０℃±０．５℃の水浴
４．４　タイマー
４．５　ボルテックスミキサー
４．６　１６×１２５ｍｍ試験管
４．７　繰り返しディスペンサー、許容体積５ｍｌ
４．８　小さな漏斗およびフィルターペーパー、Ｗｌｉａｔｍａｎ Ｎｏ．３または均等物
４．９　１ｍｌおよび０．１ｍｌピペットに置きかえる
【００４２】
５．０．試薬
６．１　２．０Ｍトリス緩衝液原液
トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｚｍａ Ｂａｓｅ Ｔ １５０３または均等物）２４２ｇを、脱イオン水７００〜８００に溶かした。１０Ｎ Ｈ２ＳＯ４を用いてｐＨ８．５に調節した。体積を１リットルに調節した。この濃縮物を、最終希釈０．２Ｍトリス緩衝液の体積１００ｍｌに、１０ｍｌで使用した。
【００４３】
６．２　５０％尿素溶液
脱イオン温水５０ｍｌ中に尿素５０ｇ（分析グレード）を溶かした。体積を１リットルに調節した。
【００４４】
６．３　１０％トリクロロ酢酸溶液（停止試薬）
脱イオン水２００ｍｌ中にトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を１００ｇを溶かした。体積を１リットルに調節した。
【００４５】
６．４　アゾカゼイン（基体溶液）
毎日新たに作成する。未使用の基体は破棄する
２５０ｍｌビーカー中：
アゾカゼイン（Ｓｉｇｍａ Ａ−２７６５） ０．６ｇの重さを測定し、
５０％尿素溶液 １０ｍｌを加え、溶解するまで撹拌する。
２．０Ｍトリス緩衝液原液 １０ｍｌを加える。
脱イオン水３０〜５０ｍｌを加え、粒子が透明になるまで撹拌を続ける。
希硫酸を使用してｐＨ８．５に調節する。
体積を１００ｍｌに調節し、十分に混合する。
アッセイを始めるまで冷蔵する。
【００４６】
７．０　酵素サンプルおよび標準
プロテアーゼアッセイ用のエイザイムラピッドサンプル（Ｅｐｉｚｙｍｅ Ｒａｐｉｄ Ｓａｍｐｌｅ）を溶かすために、この溶液のｐＨをチェックし、必要に応じて８．５±０．１単位に調節することを強く推奨する。
【００４７】
洗浄剤中のプロテアーゼの正確な活性レベルを知るのが望ましい場合は、使用される特定の配合がプロテアーゼ活性に影響を及ぼさないと既に知られている場合を除いて、洗浄剤ベースを標準溶液中に含めるのがよい。ベース洗浄剤の濃度は、プロテアーゼを含む洗浄剤のサンプル溶液で使用されるものの濃度と同じであってよい。
【００４８】
ＮＴＡまたはＥＤＴＡなどの強力なキレート剤の溶液が存在すると、アッセイ用の種々の材料の調製に必要とされる時間にわたってプロテアーゼの不活性化をもたらし得る。この不活性化の原因は、サンプル溶液へのカルシウムの過剰な添加によって克服することができる。
【００４９】
６．０．手順
６．１　水浴を４０℃±０．５℃に予め加熱する（約１時間）。
【００５０】
６．２　アッセイ開始からおよそ１０分前に、基体溶液を、４０℃の水浴におき、つりあわせる。
【００５１】
６．３　５０℃水浴中で１０分間、試験管をインキュベートする。
【００５２】
６．４　試験管を水浴から取り出し、着色反応溶液 ５００μｌを、ほぼ同じ時間間隔で、各試験管に素早く加える。着色反応溶液は全ての試験管に１分以内で加えるのがよい。再びキャップをしてボルテックスする。かさねて、マイクロ遠心分離管の上部上に反応液をはねさせないよう注意する。
【００５３】
６．５　試験管を、８０℃の水浴中で２０分間インキュベートする。
【００５４】
６．６　全試験管を氷水浴中に置き、１５分間冷却する。
【００５５】
６．７　全試験管の反応物を１．５ｍＬキュベットに移し、５６０ｎｍの吸光度を読み取る。
【００５６】
７．０　計算
各標準、およびサンプル複製の平均吸光度を計算する。平均正味吸光度読取を得るために、各値から平均ブランク吸光度読取りを差し引く。
正味吸光度　対　標準の酵素濃度の標準曲線を作成する。相関係数（ｒ） ２０．９９９が得られ得る。
【００５７】
各液体サンプルについてのＮＰＣ／ｇ値を、標準曲線から計算する。
【数１】
2004500127.tif 000009
【００５８】
各顆粒サンプルのＮＰＣ／ｇ 顆粒の値を、標準曲線から計算する。
【数２】
2004500127.tif 000010
【００５９】
８．０　参照
ＵＳＰ
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施態様の概略平面図を示す。
【図２】図１のライン２−２に沿った断面を示す。
【図３】本発明の第２の実施態様の概略平面図を示す。
【図４】図３のライン３−３に沿った断面を示す。
【図５】本発明の第３の実施態様の概略平面図を示す。
【図６】図５のライン５−５に沿った断面を示す。
【図７】図６と同様の断面中の、第３の実施態様の好ましい変形を示す。
【符号の説明】
１…支持体、２…組成物（の層）、２’…組成物（の層）、２’’…組成物（の層）、２’’’…組成物（の層）、３…厚さ、４…厚さ、５…厚さ、６…インク、７…薄い層、８…積層、１１…部分、１２…ハンドル部分。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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