(57)【要約】常用のパップテストのためのパップテストスライド標本、特にシンプレップパップテスト標本を染色するための方法であって、多数回の水和、染色及び脱水段階が約１秒の均一な浸漬時間での１０〜１５回の均一な回数の浸漬で実施される方法。標本を予備的に染色する固定溶液は、１：２の体積比の１０％緩衝化ホルマリン溶液及び９５％低級アルコールである。当該方法は染色工程及び検査技師の誤りを単純化し、一方、結果として起こる常用の、且つシンプレップパップテストの染色標本におけるきれいなバックグラウンドを有する向上した染色のコントラストを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
産婦人科のパップテストスライド標本を染色するための方法であって、
ａ．当該スライド標本を固定し；
ｂ．段階（ａ）由来のスライド標本を水和し；
ｃ．段階（ｂ）由来のスライド標本を少なくとも約１０〜１５秒間染色し；
ｄ．段階（ｃ）由来のスライド標本を水和し；
ｅ．段階（ｄ）由来のスライド標本を少なくとも約１０〜１５秒間染色し；そして
ｆ．段階（ｅ）由来のスライド標本を脱水すること、
を含んで成り、段階（ａ）〜（ｆ）の合計時間がわずかに約１００〜１５０秒間である、方法。
【請求項２】
段階（ｆ）が、（ｆ）（ｉ）アルコールで少なくとも約１０〜１５秒間脱水し；（ｆ）（ｉｉ）アルコールで少なくとも約１０〜１５秒間脱水し；そして（ｆ）（ｉｉｉ）アルコールで少なくとも約１０〜１５秒間脱水すること、を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｂ）及び（ｄ）が少なくとも約１０〜１５秒である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｂ）〜（ｆ）（ｉｉｉ）が各浸漬につき約１秒の、１０〜１５回の浸漬を含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
段階（ｃ）がスライド標本をヘマトキシリン染色液中に浸漬することを含んで成り、そして段階（ｅ）がスライド標本を細胞染色液中に浸漬することを含んで成る、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
段階（ａ）〜（ｆ）（ｉｉｉ）の合計時間がわずかに約１００〜１５０秒である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
パップテストスライド標本がシン　プレパレーション（ｔｈｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）標本である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
パップテストスライド標本がシン　プレパレーション標本である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｆ）（ｉｉｉ）由来の標本を有機溶媒で処理することを更に含んで成る、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
段階（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）がスライド標本を９５％アルコール溶液中に浸漬することを含んで成り、そして段階（ｆ）（ｉｉｉ）がスライド標本を１００％アルコール溶液中に浸漬することを含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
段階（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）が９５％低級アルコール溶液中で浸漬することを含んで成り、そして段階（ｆ）（ｉｉｉ）が１００％低級アルコール溶液中で浸漬することを含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
パップテスト標本を染色するための方法であって：
（ａ）当該スライド標本を緩衝化ホルマリン及びアルコール溶液で固定し；
（ｂ）段階（ａ）由来のスライド標本を第一の水に１０〜１５回浸漬し；
（ｃ）段階（ｂ）由来のスライド標本をヘマトキシリン中に１０〜１５回浸漬し；
（ｄ）段階（ｃ）由来のスライド標本を第二の水に１０〜１５回浸漬し；
（ｅ）段階（ｄ）由来のスライド標本を第一のアルコールに１０〜１５回浸漬し；
（ｆ）段階（ｅ）由来のスライド標本を第一を第三の水に１０〜１５回浸漬し；
（ｇ）段階（ｆ）由来のスライド標本を細胞染色液中に１０〜１５回浸漬し；
（ｈ）段階（ｆ）由来のスライド標本を第二のアルコールに１０〜１５回浸漬し；
（ｉ）段階（ｈ）のためのスライド標本を第三のアルコールに１０〜１５回浸漬し；
（ｊ）段階（ｉ）のためのスライド標本を第四のアルコールに１０〜１５回浸漬し；
（ｋ）段階（ｊ）のためのスライド標本を低分子量の有機溶媒中に１０〜１５回浸漬し；そして
（ｌ）各浸漬が約１秒であること、を含んで成る方法。
【請求項１３】
パップテストスライド標本がシンプレップ（ＴｈｉｎＰｒｅｐ）パップテストスライド標本である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
段階（ｂ）〜（ｋ）のそれぞれが、ほぼ同一の数の浸漬であって、それぞれがほぼ同一の時間の浸漬を含んで成る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
段階（ｂ）〜（ｋ）のそれぞれが、等しい回数の１秒の浸漬を含んで成る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
パップテストスライド標本を染色するための方法であって；
（ａ）当該スライド標本を固定し；
２．段階（ａ）由来のスライド標本を水和し；
３．段階（ｂ）由来のスライド標本をヘマトキシリンで染色し；
４．段階（ｃ）由来のスライド標本を水和し；
５．段階（ｄ）由来のスライド標本を細胞染色液で染色し；そして
６．段階（ｅ）由来のスライド標本を脱水すること、
を含んで成り、段階（ａ）〜（ｅ）が１０〜１５秒のほぼ同一の時間である、方法。
【請求項１７】
段階（ａ）がスライド標本を９５％アルコール溶液及び１０％緩衝化ホルマリンで処理することを含んで成る、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１０％緩衝化ホルマリン及び９５％アルコールが約１：２の体積比である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ヘマトキシリンが氷酢酸を含んで成る、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
婦人科のパップテストスライド標本を染色するための方法であって、
（ａ）当該スライド標本を固定し；
（ｂ）段階（ａ）由来のスライド標本を水和し；
（ｃ）段階（ｂ）由来のスライド標本を染色し；
（ｄ）段階（ｃ）由来のスライド標本を水和し；
（ｅ）段階（ｄ）由来のスライド標本を染色し；そして
（ｆ）段階（ｅ）由来のスライド標本を（ｆ）（ｉ）〜（ｆ）（ｉｉｉ）の三段階で脱水すること、
を含んで成り、段階（ａ）〜（ｆ）（ｉｉｉ）の各段階がほぼ同一の時間である、方法。
【請求項２１】
段階（ａ）〜（ｆ）（ｉｉｉ）の合計時間が約１００〜１５０秒である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
段階（ａ）〜（ｆ）（ｉｉｉ）の各段階が約１０〜１５秒の間である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の背景
本発明は、細胞染色に関する。具体的には、本発明は、常用の塗抹標本及びシンプレップ（ＴｈｉｎＰｒｅｐ）パップテストスライドを含む、パップスライド標本の染色に関する。
【０００２】
従来技術の背景及び考察
米国においては、約５０００人の女性が毎年子宮頸ガンで命を落としている。頸膣のパパニコローテスト又はパップテストは、ガン性及び前ガン性の頸部の病変を検出するための強力なツールである。パップテストの塗抹標本は、子宮頸ガンによる死亡率をほぼ７０％に低下することで信用されてきた。
【０００３】
パップテストは染色方法に関連する。この染色方法は、細胞の形態の多くの変化を示して細胞の成熟度及び代謝活性の程度を証明することを求める多染性の反応を含む。パップテスト染色法の４つの主要な段階として、（１）スライド固定、（２）ヘマトキシリンによる核染色、（３）一般的にオレンジＧとＥＡの対比染色による、細胞質染色、及び（４）透徹及び封入、がある。用語「パップ染色法」又は「パップテスト染色法」は、本明細書の前文及び後文で使用する場合、通常前述の方法を言及する。
【０００４】
パップテスト染色法は一般的に、常用の頸膣パップ塗抹標本に使用されてきた。しかしながら、常用のパップテストの塗抹標本は、１０〜１５％に及ぶ偽陰性の割合を示し、そして最大９０％のその偽陰性の割合は、その様な標本の染色及びスライドの調製における制限に起因していた。更に近年、Ｃｙｔｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎがシンプレップ（ＴｈｉｎＰｒｅｐ）パップテストを開発した。スライド上で細胞を塗抹する代わりに、細胞が輸送培地中で回収され、これからフィルター調製物を有するスライドが当該テストのために得られる。
【０００５】
当該技術は、時間及び浸漬が大きく変化する多数の段階を包含する複数の複雑なパップテスト染色法を提供した。パップテスト染色法のいくつかの従来技術による短縮版は、２０分以上の過大な時間を必要とし、そして複雑であり、検査技師による誤りを招きやすかった。これらの従来技術のパップテスト染色の短縮法は、一般的に穿刺吸引細胞診（ＦＮＡ）標本及び常用の頸膣塗抹標本に関するものであり、シンプレップパップテスト標本に関するものではない。
【０００６】
全体の時間を短縮させることを求めたその様な常用の従来技術の短縮方法の１つとして、以下のような、Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｃｙｔｏｐａｈｔｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅｍ ＭＤ．によって開発された「Ｑｕｉｃｋ パップａｎｉｃｏｌａｏｕ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ Ｓｔａｔ Ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ」がある。
【表１】
2004506199.tif 000002
Ｊｏｈｎｓ Ｈｏｐｋｉｎｓの方法は、１２回の、固定後で且つカバースリップ前の段階を必要とし、そして数分かかった。各段階及び順序についての手順の時間における大きな差は、検査技師に誤りを、そして当該染色方法の機械化の難しさを招いた。
【０００７】
パップテスト染色法の時間を短縮する別の試みは、”Ｕｌｔｒａｆａｓｔ Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ Ｓｔａｉｎ−Ａｎ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｆｉｎｅ Ｎｅｅｄｌｅ Ａｓｐｉｒａｔｉｏｎ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ” Ｇ．Ｃ．Ｈ． Ｙａｎｇ ａｎｄ Ｉ．Ｉ． Ａｌｖａｒｅｚ， ＡＣＴＡ Ｃｙｔｏｌ．， ｖｏｌ．３９， ｎｏ．１， Ｊａｎ−Ｆｅｂ １９９５に開示されている穿刺吸引細胞診（ＦＮＡ）標本と共に具体的に行われた。Ｙａｎｇ−Ａｌｖａｒｅｚ ＦＮＡ染色法は以下の通りである：
【表２】
2004506199.tif 000003
【０００８】
Ｙａｎｇ−Ａｌｖａｒｅｚ ＦＮＡ染色法は、比較的複雑な固定混合溶液、８回の固定後で且つカバースライド前の段階を必要とし、そしてその結果として染色標本は向上を示したが、またも検査技師は大きく異なる浸漬の手順及び時間に直面し、そしてそれによって誤りを招いた。すなわち、検査技師は、１０秒の固定から水和のための６回の浸漬へ、そして続いてヘマトキシリン染色のための２回の浸漬へと変えていかなければならない。これらの異なる手順の時間は誤りを招いた。更に、Ｙａｎｇ−Ａｌｖａｒｅｚ染色法は、ＦＮＡ標本特異的であり、そして頸膣標本用ではなかった。
【０００９】
”Ｕｌｔｒａｆａｓｔ Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｃｅｒｖｉｃｏｖａｇｉｎａｌ Ｓｍｅａｒｓ” Ｇ．Ｃ．Ｈ． Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， ＡＳＣ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １， １９９５に開示されているように、Ｙａｎｇ−Ａｌｖａｒｅｚ ＦＮＡのアプローチを頸膣塗抹標本に適用させるための１つの試みが行われた。このＹａｎｇ−Ａｌｖａｒｅｚ ＦＮＡ染色法の頸膣塗抹標本に対しての修正は、以下の通りである：
【表３】
2004506199.tif 000004
Ｙａｎｄ等によるＹａｎｇ−Ａｌｖａｒｅｚ ＦＮＡ染色法の改作及び修正は、１２回の別々の、染色後で且つカバースライド前の段階を必要とし、そして、約６秒かかる６回の浸漬段階から５分以上かかる細胞染色段階に及ぶ、異なる手順の時間を合計すると１５分以上必要となる。この方法も、異なる浸漬の手順並びに段階の数及び異なる段階の時間のために誤りを招き、そして自動染色機の使用を困難にすることで、検査技師に優しくなかった。
【００１０】
当該技術は、単純で、より速く、そして検査技師に優しいパップテスト染色法を必要としていた。当該技術はまた、常用のパップス塗抹標本に使用され、そして特にシンプレップパップテスト標本に有用なパップテスト染色法を必要としていた。当該技術は更に、前述のような、誤りが最小で又はそれ無しに大量のパップテストのスライド標本を扱うために結果として適合可能で、且つ当該染色方法のための自動化の使用を容易にするパップテスト染色法を必要としていた。当該技術はまた更に、前述のような染色標本が改善した、特にバックグラウンド及び対比染色の質が改善した方法を必要としていた。本発明は、改善を必要としていたそれらの技術に関するものであり、そしてそれを提供する。
【００１１】
本発明の要約
常用のパップテストの塗抹のためのパップテストスライド標本、更に詳細にはシンプレップパップテスト標本を染色するための方法は、ほぼ同じ浸漬数及び時間の水和、染色及び脱水段階を示す。各段階は、各浸漬につき約１秒の約１０〜１５回浸漬される。染色後の脱水は、各段階につき同じく１０〜１５回の１秒の浸漬がされる少なくとも３つの別々のアルコール段階を必要とする。ヘマトキシリン及び細胞染色段階もそれぞれ１０〜１５回の１秒浸漬がされる。本発明のパップテスト染色法は、わずかに１０回の、固定後の且つカバースライド前の段階を必要とし、それぞれの段階は約１０〜１５秒の最小で且つ更に等しい時間のものであり、合計の時間は１００〜１５０秒である。当該方法は、手順の時間が異なる段階を排除し、そして当該手順及び合計の時間を短縮し、その結果として誤りの可能性を減らすことで検査技師に優しく、このことが自動染色機の使用又は適合を容易にする。当該方法はまた、染色標本の改善、特にバックグラウンド及び対比染色の質が改善されたものを提供する。
【００１２】
本発明は、研究室に入手可能な１０％の緩衝化されたホルムアルデヒドしかない場合に問題となりうる、純粋なホルムアルデヒド（３８〜４０％）、水及びアルコールの混合物に依存する固定段階を必要とした、ＦＮＡのために使用されていたＹａｎｇ−Ａｌｖａｒｅｚ染色法以上に改善されている。例えば、研究設備が、保存及び安全性の理由のために、純粋な又は濃縮されたホルムアルデヒドを所持しておらず、又は使用していない場合である。別の観点において、本発明は改善された固定段階、すなわち１０％の緩衝化ホルマリンと９５％の低級アルコールの１：２の比の固定溶液が使用されるものを提供する。当該固定溶液におけるこの改善は、検査技師のための過程を単純化し、そして更に濃ホルムアルデヒドの扱いに関連する危険性を低下させる。
【００１３】
好ましい態様の説明
１つの態様において、本発明は、連続的に
（ａ）スライド標本を固定し；
（ｂ）段階（ａ）由来のスライド標本を水和し；
（ｃ）少なくとも約１０〜１５秒間段階（ｂ）由来のスライド標本を染色し；
（ｄ）段階（ｃ）由来のスライド標本を水和し；
（ｅ）少なくとも約１０〜１５秒間段階（ｄ）由来のスライド標本を染色し；そして
（ｆ）少なくとも３回の連続的な段階で段階（ｅ）由来のスライド標本を脱水することによってパップテストスライド標本を染色するための方法であって、特に段階（ｆ）が（ｆ）（ｉ）少なくとも約１０〜１５秒間アルコールで脱水し；（ｆ）（ｉｉ）少なくとも約１０〜１５秒間アルコールで脱水し；そして少なくとも約１０〜１５秒間脱水することを含む、方法である。
【００１４】
別の態様において、本発明は、約１０〜１５秒の等しい時間の段階を有する、既に具体的に述べた方法である。当該段階は、各培地又は溶液中に浸漬することによって達成され、これは各浸漬につき約１秒かかる。検査技師は、これらの本質的に変化しない１秒の浸漬を請け負うために訓練され、そして間違えることなく容易に実施できる。このことは特に、本方法の場合には、各段階につき等しい数の連続浸漬があることによる。
【００１５】
更に具体的には、本発明は、パップテストスライド標本を染色するための方法であって、以下の
（ａ）１０％の緩衝化ホルムアルデヒドと９５％のアルコール溶液でスライド標本を固定し；
（ｂ）段階（ａ）由来のスライド標本を第一の水槽中で１０〜１５回、各浸漬につき１秒浸漬し；
（ｃ）段階（ｂ）由来のスライド標本をヘマトキシリン中で１０〜１５回、各浸漬につき１秒浸漬し；
（ｄ）段階（ｃ）由来のスライド標本を第二の水槽中で１０〜１５回、各浸漬につき１秒浸漬し；
（ｅ）段階（ｄ）由来のスライド標本を第一のアルコール槽中で１０〜１５回、各浸漬につき１秒浸漬し；
（ｆ）段階（ｅ）由来のスライド標本を第三の水槽中で１０〜１５回、各浸漬につき１秒浸漬し；
（ｇ）段階（ｆ）由来のスライド標本を細胞染色液（ｃｙｔｏｓｔａｉｎ）中で１０〜１５回、各浸漬につき１秒浸漬し；
（ｈ）段階（ｆ）由来のスライド標本を第二のアルコール槽中で１０〜１５回、各浸漬につき１秒浸漬し；
（ｉ）段階（ｈ）のためのスライド標本を第三のアルコール槽中で１０〜１５回、各浸漬につき１秒浸漬し；
（ｊ）段階（ｉ）のためのスライド標本を第四のアルコール槽中で１０〜１５回、各浸漬につき１秒浸漬し；そして
（ｋ）段階（ｊ）のためのスライド標本を低分子量の有機溶媒中で１０〜１５回、各浸漬につき１秒浸漬する、段階を含む方法である。
【００１６】
段階（ｈ）〜（ｊ）は３つの異なるアルコール槽を提供し、それぞれの段階につき同様に１０〜１５回の１秒の浸漬を行う。段階（ｈ）は、好ましくは９５％アルコールのアルコール溶液であり、一方、段階（ｉ）及び（ｊ）は好ましくは１００％アルコール溶液である。
【００１７】
更に別の観点において、本発明は前述の通りであるが、具体的には標本がシンプレップパップテスト標本のものである。
【００１８】
また更なる観点において、本発明は前述の通り、固定溶液が１：２の体積比の１０％緩衝化ホルマリン及び９５％低級アルコールであるものである。
【００１９】
以下の例は本発明を例示する。
【００２０】
実施例
シンプレップパップテスト標本は、Ｃｙｔｙｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｏｘｂｏｒｏｕｇｈ， ＭＡ．）によって開発され、そしてシンプレップシステムとして当業界で知られた周知の方法に従い調製した。ＴｈｉｎＰｒｅｐパップテスト標本は、以下の様にＴｈｉｎＰｒｅｐシステムに従い調製した：
段階１−　婦人科の試料をほうき型又は細胞採取用ブラシ／へらの膣試料採取装置を用いて回収した。
段階２−スライド上で細胞を塗抹する代わりに、試料採取装置をすすいでＰｒｅｓｅｖＣｙｔ（商標）輸送媒体を含むＴｈｉｎＰｒｅｐ容器に注いだ。当該装置を廃棄した。
段階３−試料の容器に蓋をし、ラベルを貼り、そしてスライド調製のために研究所に送った。
段階４−研究所において、当該容器をＴｈｉｎＰｒｅｐ２０００処理装置に備え付けた。最初に、穏やかな分散段階が血液、粘膜、診断目的外の細片を破壊し、そして次に徹底的に試料を混合する。薄く均等な層の診断用の細胞性材料を回収するＴｒａｎｓＣｙｔ（商標）フィルターを介して液体を引く、引圧のパルスを発生させた。ＴｈｉｎＰｒｅｐ２０００処理装置は、回収過程の間、ＴｒａｎｓＣｙｔフィルターを通過する流速を一定期間モニタリングして細胞の提示が乏しすぎたり、又は密集しすぎたりするのを防ぐ。細胞性の材料を続いてスライドガラスに移した。
【００２１】
固定溶液は、１：２の体積比の１０％緩衝化ホルマリン及び９５％エタノールを用いて調製した。前述のシンプレップパップテスト標本を前述の固定溶液中に１０回、各浸漬又は段階につき１秒浸漬した。続いて、当該標本を水道水又は蒸留水槽中で１０回、各浸漬につき１秒浸漬した。続いて、当該標本をリチャード−アランヘマトキシリン−２染色槽で１０回、各浸漬につき１秒浸漬した。続いて、当該標本を新鮮な水道水又は蒸留水槽中で１０回、各浸漬につき１秒浸漬した。続いて、当該標本を９５％エタノール槽中で１０回、各浸漬につき１秒浸漬した。続いて、当該標本を新鮮な水道水又は蒸留水槽中で１０回、各浸漬につき１秒浸漬した。続いて、当該標本をリチャード−アラン細胞染色槽で１０回、各浸漬につき１秒浸漬した。続いて、当該標本を新鮮な９５％エタノール槽中で１０回、各浸漬につき１秒浸漬した。続いて、当該標本を新鮮な１００％エタノール槽中で１０回、各浸漬につき１秒浸漬した。続いて、当該標本を１００％キシレン槽中で１０回、各浸漬につき１秒浸漬した。
【００２２】
続いて、当該標本を封入し、そして当業界で周知の手段によってカバースリップを備え付けた。封入が終了した標本を顕微鏡のもとで試験し、そしてはっきりとし、且つ明るい染色のコントラストによる優れた染色の質を有し、そしてバックグラウンドのザラザラとし、且つもやもやとしものが減少したことが明らかとなった。
【００２３】
本発明の方法の全体的な時間は１００〜１５０秒である。これは一般的に従来技術のものと比較して実質的に全体の時間が減少しており、そして等しい１秒の浸漬／段階と組み合わせて、当業界でこれまでに実施されていたものよりも更に効率的で誤りの少ない検査方法を提供する。
【００２４】
本発明の実施例で使用した染色液はリチャード−アランヘマトキシリン−２（カタログ番号７２３１）であった：
成分
−エチレングリコール　　　　　　　　　　　　ＣＡＳ番号１０７−２１−１
−氷酢酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＣＡＳ番号６４−１９−７
−ヘマトキシリン　　　　　　　　　　　　　　ＣＡＳ番号５１７−２８−２
−硫酸アルミニウム　　　　　　　　　　　　ＣＡＳ番号１００４３−０１−３
−ヨウ素酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　ＣＡＳ番号７６８１ー５５−２
リチャード−アラン細胞染色液（カタログ番号７５１１）
成分
−エチルアルコール　　　　　　　　　　　　　ＣＡＳ番号６４−１７−５
−イソプロピルアルコール　　　　　　　　　　ＣＡＳ番号６７−６３−０
−細胞染色液
【００２５】
氷酢酸を含むヘマトキシリン染色液が、シンプレップパップテストスライド標本において、きれいさが向上した染色のバックグラウンドを提供するのに特に有用であったことが明らかとなった。前記の染色液はＲｉｃｈａｒｄ−Ａｌｌａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋａｌａｍａｚｏｏ， ＭＩから入手可能である。
【００２６】
本発明において有用なアルコールは低級アルコールであり、そして好ましくはエタノールである。本発明において有用な低分子量の有機溶媒は、好ましくは芳香族炭化水素である。好ましい低分子量の芳香族炭化水素はキシレンである。溶液を保存するのに使用される緩衝化したホルマリンは容易に購入可能である。
【００２７】
本発明の染色方法は、
（１）ホルムアルデヒドに対する曝露の最小化と、それと両立する免疫細胞化学活性の低下の回避；
（２）固定溶液の調製の容易さ；及び
（３）細胞膜のタンパク質構造を変えることがあり、且つ細胞形態学を変化させることがある、高濃度のホルムアルデヒドに対する曝露の回避、
を含む複数の追加の利点を提供する。
【００２８】
前述の記載から、本発明が、子宮頸ガンの診断及び処置において有用で、且つ従来のパップ塗抹標本のための大量の活性のパップテストスライド標本、特にシンプレップパップテストスライド標本のために特に適合され、標本調製の誤りが減少し、そしてより良い染色のコントラストを有し、そして最終的な標本におけるバックグラウンドが向上した、パップテストスライド標本の染色のための新規の迅速で且つ簡便な方法を提供する。前述の発明は、均一な浸漬段階及び時間によって、機械化された自動又は半自動の作業に容易に適合され、この中では検査技師は誤りを犯しにくい。本発明の方法は自動染色機のためのその適合及び使用を容易にする。
【００２９】
使用してきた用語及び表現は、説明の用語として使用され、限定するものとしては使用されておらず、そしてその様な用語及び表現の使用において、示し又は記載した特徴のうちのいずれかの任意な相当するもの、又はそれらの一部を排除することを意図するものではない。更に、好ましい態様の様々な修飾が本発明の範囲内で可能である。
【国際公開パンフレット】
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2004506199.tif 000019
2004506199.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】平成14年4月25日(2002.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
産婦人科のパップテストスライド標本を染色するための方法であって、
ａ．当該スライド標本を固定し；
ｂ．段階（ａ）由来のスライド標本を水和し；
ｃ．段階（ｂ）由来のスライド標本を少なくとも約１０〜１５秒間染色し；
ｄ．段階（ｃ）由来のスライド標本を水和し；
ｅ．段階（ｄ）由来のスライド標本を少なくとも約１０〜１５秒間染色し；そして
ｆ．段階（ｅ）由来のスライド標本を脱水すること、
を含んで成り、段階（ａ）〜（ｆ）の合計時間がわずかに約１００〜１５０秒間である、方法。
【請求項２】
段階（ｆ）が、（ｆ）（ｉ）アルコールで少なくとも約１０〜１５秒間脱水し；（ｆ）（ｉｉ）アルコールで少なくとも約１０〜１５秒間脱水し；そして（ｆ）（ｉｉｉ）アルコールで少なくとも約１０〜１５秒間脱水すること、を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
段階（ｂ）及び（ｄ）が少なくとも約１０〜１５秒である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
段階（ｂ）〜（ｆ）（ｉｉｉ）が各浸漬につき約１秒の、１０〜１５回の浸漬を含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
段階（ｃ）がスライド標本をヘマトキシリン染色液中に浸漬することを含んで成り、そして段階（ｅ）がスライド標本を細胞染色液中に浸漬することを含んで成る、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
段階（ａ）〜（ｆ）（ｉｉｉ）の合計時間がわずかに約１００〜１５０秒である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
パップテストスライド標本がシン　プレパレーション（ｔｈｉｎ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）標本である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
パップテストスライド標本がシン　プレパレーション（標本である、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
段階（ｆ）（ｉｉｉ）由来の標本を有機溶媒で処理することを更に含んで成る、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
段階（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）がスライド標本を９５％アルコール溶液中に浸漬することを含んで成り、そして段階（ｆ）（ｉｉｉ）がスライド標本を１００％アルコール溶液中に浸漬することを含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
段階（ｆ）（ｉ）及び（ｆ）（ｉｉ）が９５％低級アルコール溶液中で浸漬することを含んで成り、そして段階（ｆ）（ｉｉｉ）が１００％低級アルコール溶液中に浸漬することを含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
パップテスト標本を染色するための方法であって：
（ａ）当該スライド標本を緩衝化ホルマリン及びアルコール溶液で固定し；
（ｂ）段階（ａ）由来のスライド標本を第一の水に１０〜１５回浸漬し；
（ｃ）段階（ｂ）由来のスライド標本をヘマトキシリン中に１０〜１５回浸漬し；
（ｄ）段階（ｃ）由来のスライド標本を第二の水に１０〜１５回浸漬し；
（ｅ）段階（ｄ）由来のスライド標本を第一のアルコールに１０〜１５回浸漬し；
（ｆ）段階（ｅ）由来のスライド標本を第一を第三の水に１０〜１５回浸漬し；
（ｇ）段階（ｆ）由来のスライド標本を細胞染色液中に１０〜１５回浸漬し；
（ｈ）段階（ｆ）由来のスライド標本を第二のアルコールに１０〜１５回浸漬し；
（ｉ）段階（ｈ）のためのスライド標本を第三のアルコールに１０〜１５回浸漬し；
（ｊ）段階（ｉ）のためのスライド標本を第四のアルコールに１０〜１５回浸漬し；
（ｋ）段階（ｊ）のためのスライド標本を低分子量の有機溶媒中に１０〜１５回浸漬し；そして
（ｌ）各浸漬が約１秒であること、を含んで成る方法。
【請求項１３】
パップテストスライド標本がシン　プレップ（ＴｈｉｎＰｒｅｐ）パップテストスライド標本である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
段階（ｂ）〜（ｋ）のそれぞれが、ほぼ同一の数の浸漬であって、それぞれがほぼ同一の時間の浸漬を含んで成る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
段階（ｂ）〜（ｋ）のそれぞれが、等しい回数の１秒の浸漬を含んで成る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
パップテストスライド標本を染色するための方法であって；
（ａ）当該スライド標本を固定し；
２．段階（ａ）由来のスライド標本を水和し；
３．段階（ｂ）由来のスライド標本をヘマトキシリンで染色し；
４．段階（ｃ）由来のスライド標本を水和し；
５．段階（ｄ）由来のスライド標本を細胞染色液で染色し；そして
６．段階（ｅ）由来のスライド標本を脱水すること、
を含んで成り、段階（ａ）〜（ｅ）が１０〜１５秒のほぼ同一の時間である、方法。
【請求項１７】
段階（ａ）がスライド標本を９５％アルコール溶液及び１０％緩衝化ホルマリンで処理することを含んで成る、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１０％緩衝化ホルマリン及び９５％アルコールが約１：２の体積比である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ヘマトキシリンが氷酢酸を含んで成る、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
婦人科のパップテストスライド標本を染色するための方法であって、
（ａ）当該スライド標本を固定し；
（ｂ）段階（ａ）由来のスライド標本を水和し；
（ｃ）段階（ｂ）由来のスライド標本を染色し；
（ｄ）段階（ｃ）由来のスライド標本を水和し；
（ｅ）段階（ｄ）由来のスライド標本を染色し；そして
（ｆ）段階（ｅ）由来のスライド標本を（ｆ）（ｉ）〜（ｆ）（ｉｉｉ）の三段階で脱水すること、
を含んで成り、段階（ａ）〜（ｆ）（ｉｉｉ）の各段階がほぼ同一の時間である、方法。
【請求項２１】
段階（ａ）〜（ｆ）（ｉｉｉ）の合計時間が約１００〜１５０秒である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
段階（ａ）〜（ｆ）（ｉｉｉ）の各段階が約１０〜１５秒の間である、請求項２０に記載の方法。
【国際調査報告】
2004506199.tif 000021