(57)【要約】真菌関連病の攻撃を受ける植物および農作物は、シュードモナス・シリンゲから最初に単離されたシュードマイシン組成物の施用によって保護または処理される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物または農作物に１種またはそれ以上のシュードマイシン組成物の有効量を施用することを含む、真菌関連病から植物および農作物を保護または処理する方法。
【請求項２】
シュードマイシンが植物関連バクテリア  シュードモナス・シリンゲから単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シュードマイシンがシュードマイシンＡ、シュードマイシンＡ′、シュードマイシンＢ、シュードマイシンＢ′、シュードマイシンＣ、シュードマイシンＣ′からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
シュードマイシンを植物または農作物に、１ｍｌ当たり約１〜１００マイクログラムの範囲の濃度の水性の懸濁液、溶液またはエマルジョンとして施用する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
シュードマイシン組成物を Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｓｐ． に感受性の植物に該真菌の不完全期に施用する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
植物および農作物がバナナ、プランテーン、ヒマワリ、テンサイ、オオムギ、タマネギ、トウモロコシ、ブドウ、ｂｏｒｔｕｌａｃａ、コムギ、トマトおよびトウモロコシからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、植物および農作物病に対して有効な殺菌剤としてのシュードマイシン類の使用に関し、より詳細には植物および農作物に病気を引き起こす特定クラスの真菌に対するシュードマイシン類の使用に関する。
【０００２】
【背景】
新しい抗真菌剤の一クラスであるシュードマイシン類は、種々の患者の真菌感染症の処置に対して大いに有望である。（すなわち Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｌ． ら，“Ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｉｎｓ， ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ”， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １３７（１２）， ２８５７−６５ （１９９１） および米国特許第 ５，５７６，２９８ および ５，８３７，６８５ 号参照。）シュードマイシン類は Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ の単離物に由来する天然産物である。Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ は、植物関連バクテリアの大きなグループであり、これらは幾つかの生物活性物質、例えばバシトラシンおよびシリンゴマイシン類のソースであった。Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ の天然株およびトランスポゾンで生じた変異体は、抗真菌活性を有する化合物を産生する。ＭＳＵ １６Ｈ（ＡＴＣＣ ６７０２８）として知られている Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ＭＳＵ １７４ の野生型株のトランスポゾンから生じた調節性変異体は、幾つかのシュードマイシン類を産生する。シュードマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＣ′が単離され、化学的特性決定がなされ、ヒトおよび植物の両者における重要な真菌病原体に対する活性を含む広いスペクトルの抗真菌活性を有することが示されている。シュードマイシン類は、Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ の単離物からのシリンゴマイシンおよび他の抗かび剤に構造的に関連するが、それらとは異なっている。シュードマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｃ′のペプチド部分は、Ｌ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｄａｂ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｄａｂ−Ｌ−ａＴｈｒ−Ｚ−Ｄｈｂ−Ｌ−Ａｓｐ（３−ＯＨ）−Ｌ−Ｔｈｒ（４−Ｃｌ）に相当し、末端カルボキシル基がＮ−末端 Ｓｅｒ の ＯＨ 基上でマクロサイクリック環を閉じている。これら類似物はＮ−アシル側鎖によって区別され、すなわちシュードマイシンＡは ３，４−ジヒドロキシテトラデカノエートで、シュードマイシンＢは３−ヒドロキシテトラデカノエートで、シュードマイシンＣは ３，４−ジヒドロキシヘキサデカノエートで、そしてシュードマイシンＣ′は３−ヒドロキシヘキサデカノエートで Ｎ−アシル化されている。（すなわち Ｂａｌｌｉｏ， Ａ． ら，“Ｎｏｖｅｌ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｌｉｐｏｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ： Ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｉｎｓ， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， ３５５（１）， ９６−１００ （１９９４） および Ｃｏｉｒｏ， Ｖ．Ｍ． ら，“Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ＭＳＵ １６Ｈ ｐｈｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｉｐｏｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｉｎ Ａ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｃｏｍｐｕｔｅｒ ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｆｒｏｍ ＮＭＲ ｄａｔａ”， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２５７（２）， ４４９−４５６ （１９９８） 参照。）
本発明は、植物および農作物を真菌病から保護するのに特に有用なシュードマイシンのグループを提供する。
【０００３】
【発明の概要】
本発明の目的は、植物および農作物を病気に対して処理または保護する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、ある一定のシュードマイシン類の施用により植物および農作物を処理または保護する方法を提供することである。
本発明のもう一つの目的は、ある一定のシュードマイシン類の施用により植物および農作物を真菌に起因する病気に対して処理または保護する方法を提供することである。
本発明の他の目的および利点は、発明の説明が進むにつれて明らかになるであろう。
前記の目的および利点を満足させるのに、本発明は、植物または農作物に１種またはそれ以上のシュードマイシン組成物の有効量を施用することを含む、植物または農作物を真菌関連病に対して保護または処理する方法を提供する。
【０００４】
【好ましい実施形態の説明】
本発明の開示は、集合的にシュードマイシン類として知られているリポペプチドのクラスの、殺菌剤または抗かび剤としての、以前には予想されなかった新規な用途の発見に関する。好ましい実施形態において、シュードマイシン類は、個々におよびグループとして、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ａｓｐ．（この真菌の完全期または性的期）、およびこの真菌の公知の実際上全ての種々の不完全期に関連する Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｏｕｓ 真菌のグループ（Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｓｐ． および Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐ． を含む）で攻撃された植物の処理または保護に特に有用である。加えて、Ｔａｐｅｓｉａ ｙａｌｌｕｎｄａｅ、Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ、Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｓｐ． および Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ を含む多数の他の経済的に著しく重要な植物病原性真菌が、シュードマイシンによって殺される。従って、シュードマイシン類は単独でまたは別個に、これらの真菌に起因する害から植物を保護するために植物の処理に使用される。
【０００５】
これらの微生物に起因する病気の種類は、貯蔵中の植物（果実および野菜）からバナナの Ｂｌａｃｋ Ｓｉｇａｔｏｋａ およびコムギのストローブレーカーおよびブロッチのような著しく重要な圃場病の範囲に及ぶ。
【０００６】
この発見は、生物学的に関連しているらしく、１種またはそれ以上のシュードマイシン類に感受性であり、これらによって阻害および殺される以前には推測されなかった一組の著しく重要な植物病原性真菌に関する。これらの真菌および以前は開示されなかった他の数種は、幾つかの最も重要な植物病を植物に引き起こす。現在、これらの真菌に起因する病気は、人工殺菌剤の単純なまたはもっと複雑な混合物で防除されているが、これらは環境ダメージを引き起こし、ヒトの健康に疑いのない脅威となりうる。一方、シュードマイシン類は、ある一定の植物病を防除するための人工化学薬品の使用に対する安全かつ有効な選択肢を提供する。加えて、植物病の防除のためのシュードマイシン類の使用はある一定の利点を有する。なぜならば、病気の防除に天然産物を使用することは、生産者が農作物を生物学的／有機的条件下で栽培したと宣言することができ、より高い利益が作物に見込まれるからである。これは、世界中の主要農作物のどれにも、現在のところ植物病防除のために天然産生殺菌剤が施用されていないので、注目に値する。シュードマイシン類は確実に、農業生産者ならびに消費者の両方に多くの利益を与える。
【０００７】
シュードマイシン類がどんなふうに、かつなぜ世界の農業に有用でありうるのかの一例として、シュードマイシン類の幾つか、例えばシュードマイシンＡ、Ｂ、Ｂ′、ＣおよびＣ′の最小阻止濃度（ＭＩＣ）は、１ｍｌ当たり１ｍｇまたはそれ以下の範囲にある。これは農業上の状況における有効施用にとって著しく望ましい濃度である。これらの化合物は、Ｍ． ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ 単離物 ８０８８／８８ に対して試験したときに、さらに大きな効果（１．０ｍｇ未満）を生じる。Ｍ． ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ は、バナナおよびプランテーン（Ｐｌａｎｔａｉｎｓ）の Ｂｌａｃｋ Ｓｉｇａｔｏｋａ 病の原因微生物である。現在これらの農作物の生産者は、世界的に、バナナ農作物を得るために殺菌剤（人工）の３種混合物を１年当たり３０回の割合でスプレーする必要がある。この一つの病気だけでも、世界中で１農作物当たりの殺菌剤の最大消費量を示す。これらの合成殺菌剤を使用する欠点は数多あり、これらの欠点としては：１．そのコストが著しく高いこと（数百万ドル）；２．殺菌剤を施用したために生産者が有機栽培生産物として販売できないこと；および３．数１０年間にわたっての殺菌剤の連続使用に伴うヒトならびに環境の健康上の危険性の不確かが挙げられる。天蓋でおおわれたバナナプランテーションの下の土壌は動物生命に不妊性であるようであり、残留殺菌剤の蓄積が示される。一方、天然産生シュードマイシン類は ｓｉｇａｔｏｋａ 病の防除にいっそう有効であることが明らかであり、同時に環境およびヒトの健康に利益を与える。
【０００８】
加えて、シュードマイシン類は、多数の他の植物病原因真菌に対して有効であり、これらには貯蔵中に植物生産物を破壊する真菌、例えば Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．、Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｓｐ． および Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ． が含まれる。収穫した果実に施用されるシュードマイシン混合物は、真菌感染症および貯蔵腐れを防止するであろう。
【０００９】
シュードマイシン類の施用のさらに他の可能性は、Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｓｐ． に起因する病気、具体的には Ｓ． ｎｏｄｕｒｕｍ および Ｓ． ｔｒｉｔｉｃｉｉ に起因するコムギの病気を防除するための施用だけでなく、世界中の植物病の原因となる実際上全ての Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｓｐ． に起因する病気を防除するのための、シュードマイシン分子の生物学的活性に基づく施用である。同様に、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｅｌｌａ ｓｐ． に関連する他の真菌も影響を受け、これらにはテンサイおよび他の多くの農作物の葉面斑点病の原因となる Ｃｅｒｃｏｓｐｈｏｒａ ｓｐ． に起因する植物病が含まれる。他の病気原因微生物もまた、シュードマイシン類で影響を受け、これらの微生物には Ｄｒｅｓｃｈｓｌｅｒａ ｐｏｒｔｕｌａｃｃｅａｅ が含まれる。
【００１０】
本発明により、本明細書に記載するシュードマイシン類が、以前は推測されず植物病原性真菌の密接に関連するグループに対して莫大な抗かび活性を有することが見出された。この主要グループは、完全期の真菌種、Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｅｌｌａ ｓｐ．、および不完全期（非性的期）にあるその各代表物、例えば Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｓｐ． および Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｐ． によって代表される。一般的に、シュードマイシン類は単独でまたは処方物の混合物として、植物を真菌感染症から保護するために使用することができる。圃場ならびに貯蔵における農作物への施用は、これらの化合物の潜在的用途を視覚化するものである。
【００１１】
このように、本発明の目的は、多数の経済的に著しく重要な植物病原性真菌が植物関連細菌−Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ から元来単離された１種またはそれ以上のシュードマイシン類に感受性であることを実証することである。
【００１２】
本発明の方法に有用なシュードマイシン類は、好ましくは Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ によって産生されるシュードマイシン類であり、シュードマイシンＡ、Ａ′、Ｂ、Ｂ′、ＣおよびＣ′として同定されるシュードマイシン類、ならびに誘導体、例えばシュードマイシンＡ−ＰＯ４、すなわちリン酸塩誘導体およびシュードマイシンＡ−ＦＢ（これらの両者は公知である）が含まれる。
【００１３】
これらのシュードマイシン類は、真菌に起因する寄生病に感受性である種々の植物および農作物に対して施用される。これに関して、本発明のシュードマイシン組成物は、真菌に起因する寄生病の発症の予防に主に有用であり、従って病気の発症前に植物および農作物を処理することが好ましい。しかしながら、シュードマイシン組成物は感染した植物の処理にも有用である。
【００１４】
本発明のシュードマイシン組成物は、水溶液１ｍｌ当たり約１〜１００マイクログラムまでの極めて低い濃度で有効である。これに関して、本発明のシュードマイシン組成物の好ましい施用方法は、処理すべき植物または農作物に上記の濃度を用いて直接スプレーするような処理による。本発明のシュードマイシン組成物は、溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態、または植物および農作物へのスプレーに適する他の任意の形態にあってよい。
【００１５】
本発明に用いられる好ましいシュードマイシン類およびそれらの製造方法は公知であるか、または同時係属出願である２０００年４月１４日出願のＰＣＴ／ＵＳ００／０８７２８および２０００年４月１４日出願のＰＣＴ／ＵＳ００／０８７２７（両出願は米国を指定している）に充分に開示され記載されている。これら両方の出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００１６】
本明細書で用いられるように、「シュードマイシン」という用語は下記の式Ｉ：
【化１】
2004517044.tif 000002
（式中、Ｒは親油性部分である）を有する化合物を指す。シュードマイシン化合物Ａ、Ａ′、Ｂ、Ｂ′、ＣおよびＣ′は、Ｒが以下のように定義される上記式Ｉで表される。
【００１７】
シュードマイシンＡ    Ｒ＝ ３，４−ジヒドロキシテトラデカノイル
シュードマイシンＡ′  Ｒ＝ ３，４−ジヒドロキシペンタデカノエート
シュードマイシンＢ    Ｒ＝ ３−ヒドロキシテトラデカノイル
シュードマイシンＢ′  Ｒ＝ ３−ヒドロキシドデカノエート
シュードマイシンＣ    Ｒ＝ ３，４−ジヒドロキシヘキサデカノイル
シュードマイシンＣ′  Ｒ＝ ３−ヒドロキシヘキサデカノイル
【００１８】
本明細書で用いられるように、シュードマイシンはバクテリア Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ から単離された殺菌剤ファミリーの１種またはそれ以上のメンバーを指す。シュードマイシンは、リポデプシペプチド、すなわち一つまたはそれ以上の特異なアミノ酸を含み、そして一つまたはそれ以上の結合した疎水性または脂肪酸側鎖を有する環状ペプチドである。特定的には、シュードマイシン類はリポデプシノナペプチドであり、環状ペプチド部分がラクトン結合によって閉じられており、そして特異なアミノ酸４−クロロトレオニン、３−ヒドロキシアスパラギン酸、デヒドロ−２−アミノ酪酸および２，４−ジアミノ酪酸を含む。これらの特異なアミノ酸は、シュードマイシン類の生物学的特性、例えば血清中での安定性およびそれらの致死作用に関連すると信じられる。シュードマイシン類は、シュードマイシンＡ、シュードマイシンＡ′、シュードマイシンＢ、シュードマイシンＢ′、シュードマイシンＣおよびシュードマイシンＣ′を包含する。これらのシュードマイシン類のそれぞれは同じ環状ペプチド核を有するが、この核に結合した疎水性側鎖が異なっている。
【００１９】
シュードマイシンＡ、Ａ′、Ｂ、Ｂ′、ＣおよびＣ′は、それぞれ単離され、精製され、それらの構造はアミノ酸シーケンシング、ＮＭＲおよび質量分析を含む方法で確認された。シュードマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＣ′は、１９９６年１１月１９日付けで Ｓｔｒｏｂｅｒ らに発行された米国特許第 ５，５７６，２９８ 号； Ｈａｒｒｉｓｏｎ ら，“Ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｉｎｓ， ａ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｒｏｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｏｓｓｅｓｓｉｎｇ ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ ａｎｔｉｆｕｎｇａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ”， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １３７， ２８５７−２８６５ （１９９１）；および Ｂａｌｌｉｏ ら，“Ｎｏｖｅｌ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｌｉｐｏｄｅｐｓｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ｆｏｒｍ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ： ｔｈｅ Ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｉｎｓ”， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３５５， ９６−１００ （１９９４） で論じられている。シュードマイシンＡ′およびＢ′は、本願と同日出願の“Ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ” と題する Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎ Ｋｕｌａｎｔｈａｉｖｅｌ らによる米国特許出願連続番号 ＰＣＴ／ＵＳ００／０８７２７ に記載されており、実施例に例示されている。該米国特許出願はその全体が参照により本明細書に組み入れられる。幾つかのシュードマイシン類による殺菌活性を、カナマイシン耐性を含む因子をコードする Ｔｎ ９０３ として知られているトランスポゾンを有する Ｐ． Ｓｙｒｉｎｇａｅ で追跡した。トランスポゾン Ｔｎ ９０３ の配列および操作方法は公知である。Ｏｋａ ら，“Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｋａｎａｍｙｃｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ Ｔｎ ９０３”， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １４７， ２１７−２２６ （１９８１）。この節で引用した各参考文献は、参照により本明細書に明確に組み入れられる。
【００２０】
シュードマイシン類は構造および性質が異なっている。好ましいシュードマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＣ′は、広範囲の真菌に対して活性を示し、そして一般的に許容される毒性をも示す。他の好ましいシュードマイシン類と比較して、シュードマイシンＢは、一定の真菌に対して大きな効力および低レベルの毒性を有する。従って、本発明の方法にはシュードマイシンＢがより好ましい。各シュードマイシンは、配列 Ｓｅｒ−Ｄａｂ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｄａｂ−ａＴｈｒ−Ｄｈｂ−ＨＯＡｓｐ−ＣｌＴｈｒ（セリン；２，４−ジアミノ酪酸；アスパラギン酸；リジン；２，４−ジアミノ酪酸；ａｌｌｏ−トレオニン；デヒドロ−２−アミノ酪酸；３−ヒドロキシアスパラギン酸；４−クロロトレオニン）、より特定的には Ｌ−Ｓｅｒ−Ｄ−Ｄａｂ−Ｌ−Ａｓｐ−Ｌ−Ｌｙｓ−Ｌ−Ｄａｂ−Ｌ−ａＴｈｒ−Ｚ−Ｄｈｂ−Ｌ−Ａｓｐ（３−ＯＨ）−Ｌ−Ｔｈｒ（４−Ｃｌ） を有する環状ナノペプチド環を有し、ＣｌＴｈｒ のカルボキシル基およびセリンのヒドロキシル基がラクトン結合して環を閉じている。シュードマイシンｒ類は、Ｎ−末端セリンのアミン基に結合した親油性部分の性質が異なっている。セリンのアミン基は、シュードマイシンＡでは３，４−ジヒドロキシテトラデカノイル部分の、シュードマイシンＢでは３−モノヒドロキシテトラデカノイル部分の、シュードマイシンＣでは３，４−ジヒドロキシヘキサデカノイル部分の、シュードマイシンＣ′では３−モノヒドロキシヘキサデカノイル部分のカルボキシルと、アミド結合を形成している。セリンのカルボキシル基は、環の Ｄａｂ とアミド結合を形成している。
【００２１】
本発明に用いられるシュードマイシン類は、それらの許容される塩として使用することができる。「許容される塩」という用語は、本明細書で用いられるように、生きた生物に対して実質的に無毒性である、上記の化合物の塩を指す。典型的な許容される塩としては、本発明の化合物を無機酸または有機酸または無機塩基と反応させることによって製造される塩が挙げられる。このような塩は、酸付加塩および塩基付加塩として知られている。
【００２２】
酸付加塩の形成に普通に用いられる酸は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸およびリン酸、および有機酸、例えばｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ−ブロモフェニルスルホン酸、炭酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸および酢酸である。このような製薬上許容される塩の例は、硫酸塩、ピロ硫酸塩、重硫酸塩、亜硫酸塩、重亜硫酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、プロピオン酸塩、デカン酸塩、カプリル酸塩、アクリル酸、ギ酸塩、イソ酪酸塩、カプロン酸塩、ヘプタン酸塩、プロピオール酸塩、シュウ酸塩、マロン酸塩、コハク酸塩、スベリン酸塩、セバシン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、ブチン−１，４−ジオエート、ヘキシン−１，６−ジオエート、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、フタル酸塩、スルホン酸塩、キシレンスルホン酸塩、フェニル酢酸塩、フェニルプロピオン酸塩、フェニル酪酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、ガンマ−ヒドロキシ酪酸塩、グリコール酸塩、酒石酸塩、メタンスルホン酸塩、プロパンスルホン酸塩、ナフタレン−１−スルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸塩およびマンデル酸塩である。好ましい製薬上許容される酸付加塩は、鉱酸例えば塩酸および臭化水素酸で形成されるもの、および有機酸、例えばマレイン酸およびメタンスルホン酸で形成されるものである。
【００２３】
塩基付加塩としては、無機塩基、例えばアンモニウムまたはアルカリ金属およびアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩および重炭酸塩から誘導されるものが挙げられる。従って、本発明の塩の製造に有用なこのような塩基としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、水酸化カルシウムおよび炭酸カルシウムが挙げられる。カリウム塩およびナトリウム塩の形態が特に好ましい。
【００２４】
本発明の塩の一部を形成する特定のカウンターイオンは、全体としての塩が製薬上許容される限り、そして対イオンが全体としての塩に望ましくない質を与えない限り、決定的性質ではないと認識すべきである。
下記の実施例を参照すると、本発明をよりよく理解できるであろう。これらの実施例は本発明の特定の実施形態を代表することを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図するものでない。
【００２５】
寄託された生物学的材料
Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ ＭＳＵ １６Ｈ は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ から受託番号 ＡＴＣＣ ６７０２８ として公に入手することができる。Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ 株 ２５−Ｂ１、７Ｈ９−１ および ６７ Ｈ１ は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ に ２０００年３月２３日に寄託され、下記の受託番号が与えられた：
２５−Ｂ１    受託番号 ＰＴＡ−１６２２
７Ｈ９−１    受託番号 ＰＴＡ−１６２３
６７ Ｈ１    受託番号 ＰＴＡ−１６２１
【００２６】
シュードマイシン類は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ の液体培養物から単離された。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ は、種々のフィトトキシンおよび他の複合ペプチドを産生する植物関連微生物である１−３。１９８０年代の後期に、Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ が殺菌剤を産生することが示された。基本的には、植物上で成長する内共生生物が殺菌剤を産生して植物を真菌病から保護するという概念である。シュードマイシン類は、生物活性殺菌剤と同定された。Ｐ． ｓｙｒｉｎｇａｅ 野生型のトランスポゾンから生じた変異体は、これらの天然産物の過剰生産者であることが示された。モンタナ州立大学で開発されたこれらのトランスポゾン変異株４を用いてニレの木に接種し、オランダエルム病の防除に成功した５−６。加えて、これらの天然産物は圃場農作物、果実および他の植物で認められる病気に対して選択的抗真菌活性を示した（表１〜３）。例えば、シュードマイシン類は、Ｍ． ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ に対して有望な活性を示す（バナナの ｂｌａｃｋ ｓｉｇａｔｏｋａ の原因となる Ｍ． ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ は、今日の世界中の他の植物病よりも多くの殺菌剤および殺菌剤の施用を必要とする）。シュードマイシン類は、マンゴーの未成熟損傷を防止することも示された。
【００２７】
実施例１
これらの天然産物の再現可能な大規模製造（キログラム）を、成功裏に実証した。遊離塩基および別の塩形態の精製サンプルを製造した。およそ３４の真菌植物病原体を用いてシュードマイシンＡ、Ｂ、Ｂ′、Ｃ、Ｃ′の抗真菌特性を評価した。阻止濃度を二つの時点、すなわち第２日および第５日に測定した。
表１：問題の病原体を用いて試験した抗真菌活性：
2004517044.tif 000003
【００２８】
材料および方法
試験すべき真菌を、馬鈴薯ブドウ糖寒天（ＰＤＡ）プレート上で室温において増殖させた。シュードマイシン類およびデプシペプチドのストック溶液をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（Ｓｉｇｍａ） に５ｍｇ／ｍｌで懸濁させ、−２０℃で貯蔵した。化合物の連続希釈を実験日に行った。全ての連続希釈をＤＭＳＯで行った。注意：シュードマイシンＢおよびＢ′の初期実験を、若干の真菌についてメタノール中で行い、幾つかの真菌はメタノールの存在下で阻害された成長を示した。これらを生データの節に示す。
【００２９】
アッセイを、２４−ウェル細胞培養クラスター（Ｃｏｓｔａｒ ３５２４）で、各ウェル当たり９９０ｕｌの馬鈴薯ブドウ糖ブロス（ＰＤＢ、Ｄｉｆｃｏ）および１０ｕｌの試験すべき化合物を用いて行った。試験した初期濃度は５０〜１．５６ｕｇ／ｍｌ（シュードマイシンの最終濃度）であった。試験したシュードマイシン類の実際の濃度は５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２および１．５６ｕｇ／ｍｌであった。各ウェルを適切な真菌で接種した。特記しない限り、真菌接種物は真菌菌糸体を含む約４ｍｍ２のＰＤＡ片からなっていた。例外は次のとおりであった。Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ：この真菌はＰＤＡ上で酵母のように成長するので、細胞をＰＤＡストックプレートから掻き取り、ＰＤＢに再懸濁させ、１０ｕｌの接種物を各ウェルに加えた。Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｓｐ．：この真菌菌糸体はＰＤＡの上部で極めてゆるいシートとして成長するので、寒天ブロックに付着しないであろう。真菌菌糸体を金属棒で５００ｕｌのＰＤＢ中で磨砕し、１０ｕｌの接種物を各ウェルに加えた。Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｐａｓｓｅｒｉｎｉｉ、Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉｉ：これらの真菌は成長が極めて遅く、寒天上に真菌菌糸体を有する寒天小片を接種物として用いると、結果をスコアすることが困難であった。これらの真菌では、菌糸体を金属棒で５００ｕｌのＰＤＢ中で磨砕し、１０ｕｌの接種物を各ウェルに加えた。
【００３０】
ウェルを２日および５日に真菌の成長についてスコアした。成長の遅い若干の真菌は、２日または５日に評価ができなかったので、より遅い日にスコアした。９９０ｕｌの馬鈴薯ブドウ糖ブロスおよび１０ｕｌのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）中に接種した真菌からなるコントロールとの比較によって成長をスコアした。ＰＤＢ単独中の真菌接種物からなる追加のコントロールを行い、ＤＭＳＯが真菌の成長に対して阻害性でないことを確かめた。ＤＭＳＯは、Ｄｒｅｓｃｈｓｌｅｒａ ｐｏｒｔｕｌａｃａｅ（この場合は若干の阻害が認められた）を除いて、試験した真菌に影響を及ぼさなかった。
【００３１】
阻害を示した真菌を再試験した。アッセイを繰り返えすために、新たなストック溶液を第二発送シュードマイシン類から調製した。シュードマイシンＢ′およびデプシペプチドのストック溶液は、これらが第二発送に含まれていなかったので、最初の発送材料から再調製した。これらの真菌の幾つかは添加したシュードマイシン類の最低レベルで成長を示さなかったので、３回目に、より低レベルのシュードマイシン類（２〜０．０６２５ｕｇ／ｍｌのシュードマイシン最終濃度）を用いて再試験した。試験した実際のシュードマイシン濃度は、２．１、０．５、０．２５、０．１２５および０．０６２５ｕｇ／ｍｌであった。Ａ−ＰＯ４およびＡ−ＦＢ＝それぞれシュードマイシンＡのリン酸塩および遊離塩基である。
【００３２】
表２：２日の結果 − 示した濃度は成長を生じない化合物の最低レベル（ｕｇ／ｍｌ）である。ＮＩは、阻害しない；ｐ（部分的）は、少なくとも５０％の阻害；−は、測定せず。アッセイ数が２以上の場合は、その真菌について行ったアッセイ数を括弧内に示す。幾つかの成長の遅い真菌については、観察前に経過した日数を（２とは異なる場合に）示す。
【表１】
2004517044.tif 000004
【００３３】
表３：５日の結果 − 示した濃度は成長を生じない化合物の最低レベル（ｕｇ／ｍｌ）である。ＮＩは、阻害しない；ｐ（部分的）は、少なくとも５０％の阻害；−は、測定せず（遅い成長）。アッセイ数が２以上の場合は、その真菌について行ったアッセイ数を括弧内に示す。幾つかの成長の遅い真菌については、観察前に経過した日数を（５とは異なる場合に）示す。
【表２】
2004517044.tif 000005
【００３４】
上記の実験の再検討は、試験した真菌が、試験した全ての化合物に同様に挙動するよりはむしろ、一つまたは幾つかのシュードマイシン類によって最もよく阻害されたことを示している。六つの真菌は最初に試験したシュードマイシン最低濃度、１５６ｕｇ／ｍｌでも成長を示さなかった。これらの真菌をさらに低い濃度のシュードマイシン類で再試験した。例えば、Ｄｒｅｓｃｈｓｌｅｒａ ｐｏｒｔｕｌａｃａｅ は、０．０６２５ｕｇ／ｍｌのシュードマイシンＡ（ＰＯ４）、ＢおよびＣでも成長しないことが明らかであった（９日）。Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｅｌｌａ ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ の二つの異なる単離物は、より低用量のシュードマイシン類に異なって挙動した。Ｓｉｇａｔｏｋａ 単離物は約１ｕｇ／ｍｌまでの低い各シュードマイシン類で阻害されることが明らかであった。しかしながら、８０８８／８８ 単離物はシュードマイシンＢで最もよく阻害され、０．１２５ｕｇ／ｍｌで２１日に成長しなかった。Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ および Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｐａｓｓｅｒｉｎｉｉ は全てのシュードマイシン類で強く阻害され、Ｓ． ｔｒｉｔｉｃｉ は５日に０．０６２５ｕｇ／ｍｌのシュードマイシンＢで成長を示さず、Ｓ． ｐａｓｓｅｒｉｎｉｉ は５日にシュードマイシンＡ（遊離塩基）、Ｂ、ＣおよびＣ′で成長を示さなかった。Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ はシュードマイシンＣまたはＣ′で最もよく阻害され、０．２５ｕｇ／ｍｌで５日に成長しなかった。これらの真菌の若干は試験したシュードマイシンの最高レベルで僅かな成長阻害しか示さなかった（Ａｌｔｅｒａｒｉａ ｈｅｌｉａｎｔｈｉ、Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ａｌｌｉ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ、Ｔａｐｅｓｉａ ａｃｕｆｏｒｍｉｓ、Ｔａｐｅｓｉａ ｙａｌｌｕｎｄａｅ および Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ）。幾つかの真菌は、一つまたは幾つかのシュードマイシン類で良好な阻害を示したが、全てではなかった。これらには、Ｂ′で最もよく阻害された Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ Ｓｏｌａｎｉ（６．２５ｕｇ／ｍｌで５日に成長しない）、ＢおよびＣ′で最もよく阻害された Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｓｐ．（６．２５ｕｇ／ｍｌで５日に成長しない）、Ｂで最もよく阻害された Ｇｅｏｔｒｉｃｈｉｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ（３．１２ｕｇ／ｍｌで５日に成長しない）、およびＢ′で最もよく阻害された Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ（１．５６ｕｇ／ｍｌで５日に成長しない）が含まれる。
【００３５】
このデータから、シュードマイシン類は選択的な「天然」殺菌剤のグループであると結論することができる。収穫後の農作物および他の植物種に見出される感染症の原因となる若干の真菌は、シュードマイシン類に感受性である（例えば Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ および Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）。シュードマイシンは Ｍ． ｆｉｊｉｅｎｓｉｓ（バナナ）に対して印象的な活性を示す。粗製調製物ならびに精製材料は植物病の防除に可能性ある役割を有する。シュードマイシン類の大規模製造は容易であり、その製造が比較的安価である。天然産物は環境適合性のようであり、潜在的に安全のようである。
【００３６】
参考文献
１． Ａ．Ｂａｌ１ｉｏ， Ｆ． Ｂｏｓｓａ， Ｄ． ＤｉＧｉｏｒｇｉｏ， Ｐ． Ｆｅｒｒａｎｔｉ， Ｍ． Ｐａｃｉ， Ｐ． Ｐｕｃｃｉ， Ａ．Ｓｃａｌｏｎｉ， Ａ． Ｓｅｇｒｅ， Ｇ．Ａ． Ｓｔｒｏｂｅｌ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９９４， ３５５， ９６−１００．
２． Ｃ． Ｐｏｔｅｒａ。Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９４， ２６５， ６０５．
３． Ｌ． Ｈａｒｒｉｓｉｏｎ， Ｄ．Ｂ． Ｔｅｐｌｏｗ， Ｍ． Ｒｉｎａｌｄｉ， Ｇ．Ａ． Ｓｔｒｏｂｅｌ． Ｊ． Ｇｅｎｅｒａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９１， １３７， ２８５７−２８６５．
４． Ｂ． Ｌａｍ， Ｇ Ｓｔｒｏｂｅｌ， Ｌ． Ｈａｒｒｉｓｏｎ， Ｓ． Ｌａｍ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． １９８７， ８４， ６４４７−６４５１．
５． Ｒ． Ｓｃｈｅｆｆｅｒ， Ｄ． Ｅｌｇｅｒｓｍａ， Ｇ． Ｓｔｒｏｂｅｌ， Ｎｅｔｈ． Ｊ． Ｐｌ． Ｐａｔｈ． １９８９， ９５， ２９３−３０４．
６． Ｒ． Ｓｃｈｅｆｆｅｒ， Ｄ． Ｅｌｇｅｒｓｍａ， Ｌ．Ａ． ＤｅＷｅｇｅｒ、Ｇ． Ｓｔｒｏｂｅｌ， Ｎｅｔｈ． Ｊ． Ｐｌ． Ｐａｔｈ． １９８９， ９５， ２８１−２９２．
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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