(57)【要約】抗微生物活性を有するカチオン性ポリフェムシン様ペプチドのクラスが提供される。このようなペプチドの例は、ＦＲＷＣＦＲＶＣＹＫＧＲＣＲＹＫＣＲ（配列番号：３）、ＲＲＷＣＦＲＶＣＹＫＧＦＣＲＹＫＣＲ（配列番号：４）、およびＲＲＷＣＦＲＶＣＹＲＧＲＦＣＹＲＫＣＲ（配列番号：１１）を含む。更に、本発明のペプチドを使用する、細菌、酵母およびウイルスのような微生物の増殖を阻害する方法も提供される。これらのペプチドは、対象における内毒素血症を阻害するのに特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗微生物活性および下記群から選択されたアミノ酸配列を有する単離されたペプチド：
2004507228.tif 000016
（配列中、Ｚ１は、塩基性アミノ酸残基であるかまたはアミノ酸残基なし；Ｚ２は、塩基性または芳香族残基であり、Ｚ３は、塩基性アミノ酸残基であり、Ｚ４は、アルギニン、バリンまたはアラニンであり、ならびにＺ５は、芳香族または脂肪族アミノ酸残基である）。
【請求項２】
配列中、Ｚ１は、リシン、アルギニン、ヒスチジンであるか、または存在せず；
Ｚ２は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンであり；
Ｚ３は、リシン、アルギニンまたはヒスチジンであり；
Ｚ４は、アルギニン、バリンまたはアラニンであり；ならびに
Ｚ５は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファンである、請求項１記載のペプチド。
【請求項３】
ペプチドが、下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のペプチド：
2004507228.tif 000017
【請求項４】
ペプチドがカルボキシ末端修飾を含む、請求項１記載のペプチド。
【請求項５】
カルボキシ末端修飾がアミド化である、請求項４記載のペプチド。
【請求項６】
請求項１または２記載のペプチドをコードしている、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項７】
下記からなる群より選択されるペプチドをコードしている、単離されたポリヌクレオチド：
2004507228.tif 000018
【請求項８】
下記からなる群より選択されるアミノ酸を有するペプチドの阻害有効量を、微生物に接触させることを含む、微生物の増殖を阻害する方法：
2004507228.tif 000019
（配列中、Ｚ１は、塩基性アミノ酸残基であるかまたはアミノ酸残基なし；Ｚ２は、塩基性または芳香族残基であり、Ｚ３は、塩基性アミノ酸残基であり、Ｚ４は、アルギニン、バリンまたはアラニンであり、ならびにＺ５は、芳香族または脂肪族アミノ酸残基であり、これにより微生物増殖を阻害する）。
【請求項９】
配列中、Ｚ１は、リシン、アルギニン、ヒスチジンである、または存在せず；
Ｚ２は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンであり；
Ｚ３は、リシン、アルギニンまたはヒスチジンであり；
Ｚ４は、アルギニン、バリンまたはアラニンであり；ならびに
Ｚ５は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファンである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ペプチドが、下記からなる群より選択される、請求項８記載の方法：
2004507228.tif 000020
【請求項１１】
ペプチドが下記からなる群より選択される、請求項８記載の方法：
2004507228.tif 000021
【請求項１２】
微生物が細菌である、請求項８記載の方法。
【請求項１３】
細菌がグラム陽性菌である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
細菌が、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、または腸球菌である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
細菌がグラム陰性菌である、請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
細菌が、大腸菌、緑膿菌またはネズミチフス菌である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
微生物が真菌である、請求項８記載の方法。
【請求項１８】
真菌がカンジダ・アルビカンスである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
微生物がウイルスである、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ウイルスがエンベロープウイルスである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）、水疱性口内炎ウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはＣ型肝炎ウイルスである、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ペプチドが、少なくとも１種の抗生物質と組合せて投与される、請求項８記載の方法。
【請求項２３】
抗生物質が、アミノグリコシド、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、モノバクタム、キノロン、テトラサイクリン、グリコペプチド、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、トリメトロプリム、スルファメトキサゾール、ニトロフラントイン、リファンピン、およびムピロシンからなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
抗生物質が、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルミシン、トブラマイシン、ストレプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストラート／エチルスクシネート／グルセプテート／ラクトビオナート／ステアレート、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジシクロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、チカルシリン、カルベニシリン、メズロシリン、アズロシリン、ピペラシリン、セファロチン、セファゾリン、セファクロル、セファマンドール、デフォキシチン、セフロキシム、セフォニシド、デフメタゾール、セフォテタン、セフプロジル、ロラカルベフ、セフェタメト、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフィキシム、セフポドキサミン、セフスロジン、イミペネム、アズトレオナム、フレロキサシン、ナリジキシ酸、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、シノキサシン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、バンコマイシン、およびテイコプラニンからなる群より選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
ペプチドが、少なくとも１種のリゾチームと組合せて投与される、請求項８記載の方法。
【請求項２６】
ペプチドが、少なくとも１種の抗ＴＮＦ抗体またはＴＮＦアンタゴニストと組合せて投与される、請求項８記載の方法。
【請求項２７】
内毒素血症または敗血症関連障害を有するまたはそのリスクのある対象において、内毒素血症または敗血症関連障害を阻害する方法であり、これが対象に下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを治療的有効量を投与することを含む、方法：
2004507228.tif 000022
（配列中、Ｚ１は、塩基性アミノ酸残基であるかまたはアミノ酸残基なし；Ｚ２は、塩基性または芳香族残基であり、Ｚ３は、塩基性アミノ酸残基であり、Ｚ４は、アルギニン、バリンまたはアラニンであり、ならびにＺ５は、芳香族または脂肪族アミノ酸残基である）。
【請求項２８】
配列中、Ｚ１は、リシン、アルギニン、ヒスチジンであるか、または存在せず；
Ｚ２は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンであり；
Ｚ３は、リシン、アルギニンまたはヒスチジンであり；
Ｚ４は、アルギニン、バリンまたはアラニンであり；ならびに
Ｚ５は、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、またはトリプトファンである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ペプチドが下記からなる群より選択される、請求項２７記載の方法：
2004507228.tif 000023
【請求項３０】
障害が敗血症性ショックである、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
ペプチドが、少なくとも１種の抗生物質と組合せて投与される、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
抗生物質が、アミノグリコシド、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、モノバクタム、キノロン、テトラサイクリン、グリコペプチド、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、トリメトロプリム、スルファメトキサゾール、ニトロフラントイン、リファンピン、およびムピロシンからなる群より選択される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
抗生物質が、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルミシン、トブラマイシン、ストレプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストラート／エチルスクシネート／グルセプテート／ラクトビオナート／ステアレート、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジシクロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、チカルシリン、カルベニシリン、メズロシリン、アズロシリン、ピペラシリン、セファロチン、セファゾリン、セファクロル、セファマンドール、デフォキシチン、セフロキシム、セフォニシド、デフメタゾール、セフォテタン、セフプロジル、ロラカルベフ、セフェタメト、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフィキシム、セフポドキサミン、セフスロジン、イミペネム、アズトレオナム、フレロキサシン、ナリジキシ酸、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、シノキサシン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン、バンコマイシン、およびテイコプラニンからなる群より選択される、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
ペプチドが、少なくとも１種の抗ＴＮＦ抗体またはＴＮＦアンタゴニストと組合せて投与される、請求項２７記載の方法。
【請求項３５】
ペプチドが、少なくとも１種のリゾチームと組合せて投与される、請求項２７記載の方法。
【請求項３６】
下記を有する単離されたペプチド：
（ａ）２つ以上のジスルフィド結合により安定化された、２つの逆平行β鎖；
（ｂ）βヘアピンループ；および
（ｃ）抗微生物活性。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、一般に抗微生物ペプチドに関し、より詳細にはポリフェムシン様ペプチドと称される抗微生物ペプチドの新規クラスに関する。
【０００２】
発明の背景
１９８１年に、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）におけるポリカチオン性抗生物質の機構を説明するために、自己促進型取込み仮説（ｓｅｌｆ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｕｐｔａｋｅ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）が、最初に提唱された。この仮説に従い、ポリカチオンは、二価カチオンが隣接するリポ多糖分子と架橋しているグラム陰性菌の外膜上の部位と相互作用する。ポリカチオンのこれらの部位との高い親和性のために、ポリカチオンは、二価のカチオンと置き換わり、かつこのポリカチオンは、二価カチオンよりもかさ高（ｂｕｌｋｙ）であるので、外膜において構造的混乱を引き起す。これらの混乱は、β−ラクタム系抗生物質ニトロセフィン、真核生物非特異性防御タンパク質リゾチームおよび疎水性物質などの化合物に対する、増大した外膜浸透性を生じる。同様に、この経路に接近する分子は、それら自身の取込みを促進することが提唱されている。
【０００３】
グラム陰性菌の外膜は、抗生物質および宿主防御分子の細菌細胞内のそれらの標的へのアクセスを制限する半透性分子「篩」であることが明らかに示されている。従って、自己促進型取込みシステムに接近するカチオンおよびポリカチオンは、それらの外膜透過性障壁と相互作用しおよびこれを破壊する能力に関して、グラム陰性病原菌の抗生物質および宿主防御分子に対する感受性を増大することが可能である。ハンコック（Ｈａｎｃｏｃｋ）およびワン（Ｗｏｎｇ）は、広い範囲のこのような化合物は、透過性障壁に打ち勝つことを明らかにし、かつこれらを説明するために「透過性上昇物（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅｒ）」という名称を作った（ＨａｎｃｏｃｋおよびＷｏｎｇ、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２６：４８（１９８４））。自己促進型取込みおよび透過性上昇物は、最初に緑膿菌について説明されたが、これらは現在様々なグラム陰性菌について説明されている。
【０００４】
過去１０年にわたり、非特異的防御分子が、昆虫およびヒトを含む多くの動物において説明されている。これらの分子のひとつのサブセットは、一般に下記の特徴を有する：（ａ）これらは、通常長さが１５〜３５個のアミノ酸残基の小ペプチドであり、（ｂ）これらは、４個またはそれより多い正帯電したアミノ酸残基、リシンまたはアルギニンのいずれかを含み、ならびに（ｃ）これらは、それらが由来した生物において非常に豊富に認められる。これらの分子のいくつかが単離され、アミノ酸が配列決定され、特許文献において開示されている（例えば、セクロピン：国際公開公報第８９００１９９号、国際公開公報第８８０５８２６号、国際公開公報第８６０４３５６号、国際公開公報第８８０５８２６号；デフェンシン：欧州特許第１９３３５１号、欧州特許第８５２５０号、欧州特許第１６２１６１号、米国特許第４６５９６９２号、国際公開公報第８９１１２９１号）。しかしこれらのペプチドの制限された量のみが、宿主種から単離されている。例えば、サウヤー（Ｓａｗｙｅｒ）ら（Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．、５６：６９３（１９８８））は、１０９個のプライミングした腹腔好中球またはリポ多糖で誘起した肺胞マクロファージ（すなわち、動物全体に存在する数）から、ウサギ好中球デフェンシン１およびデフェンシン２を１００〜２００ｍｇ単離した。
【０００５】
ペプチド合成技術を使用するこれらのペプチドの生成は、限定された量のペプチドを生じ、かつスケールアップする場合または多くの変種ペプチドが作出されなければならない場合には経費がかかる。更にアミノ酸合成技術を用いひどく高価である１５Ｎ−および１３Ｃ−標識したアミノ酸を特異的に組込まない限りは、構造解析は困難である。
【０００６】
カブトガニの血球は、ポリフェムシンＩおよびＩＩ並びにタキプレシンＩからＩＩＩを含む、β−シートペプチド抗生物質の独自のファミリーを含んでいる（Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６３：１６７０９−１６７１３（１９８８）；および、Ｍｉｙａｔａら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０６：６６３−６６８（１９８９））。これらのペプチドは、構造的に密接に関連しており、かつ血球細片（ｄｅｂｒｉｓ）中に非常に豊富に存在する。アメリカカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）から単離されたポリフェムシン、およびカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ ｔｒｉｄｅｎｔａｔｕｓ）、ミナミカブトガニ（Ｔａｃｈｙｐｌｅｕｓ ｇｉｇａｓ）およびマルオカブトガニ（Ｃａｒｃｉｎｏｓｃｏｒｐｉｕｓ ｒｏｔｕｎｄｉｃａｕｄａ）から単離されたタキプレシンは、各々、長さ１８および１７個のアミノ酸残基である。これらのペプチドは、細菌および真菌の増殖の阻害、並びに水疱性口内炎ウイルス、インフルエンザＡ型ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）−１（Ｍｉｙａｔａら、Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０６：６６３−６６８（１９８９）；Ｍａｓｕｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１８９：８４５−８５０（１９９２）；Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、３７：２０６−２１１（１９９１）；および、Ｍｕｒａｋａｍｉら、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ、３７：３２７−３３４（１９９１））、ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＣ型肝炎ウイルスなどを含むエンベロープウイルスの複製の阻害のような、様々な生物活性を示す。別の研究は、タキプレシンＩは、ＤＮＡおよびリポ多糖（ＬＰＳ）のようなアニオン性分子に結合し、かつカブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ）凝固カスケードにおける開始因子であるＩ因子のＬＰＳ媒介した活性化を阻害することを示している（Ｎａｋａｍｕｒａら、前掲；Ｍｉｙａｔａら、前掲；Ｙｏｎｅｚａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１：２９９８−３００４（１９９２））。従ってこれらの節足動物のペプチドは、抗内毒素療法の潜在的な治療物質として特に薬学的に関心が高い。
【０００７】
５種の節足動物ペプチドにおいて、タキプレシンＩの二次構造のみが、核磁気共鳴スペクトルにより決定されている（Ｋａｗａｎｏら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６５：１５３６５−１５３６７（１９９０））。これが２つのジスルフィド橋により拘束されかつＩＩ型β−ターンにより連結された、逆平行β−シート構造からなるかなり剛性の平面コンホメーションを有することはわかっている。この平面コンホメーションにおいて、５個のかさ高な疎水性側鎖基がこの平面の一方の側に位置し、かつ６個のカチオン性側鎖基がこの分子の「尾部」に分布されている。ポリフェムシンおよびタキプレシンは、多くの天然の抗微生物ペプチドと同様、ポリカチオン性および両親媒性であり、かつそのＣ末端がアミド化されている。これらの特性は、タキプレシンＩの作用様式および毒性に関係している（Ｐａｒｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１：１２２４１−１２２４７（１９９２））。この群のペプチドのＨＩＶ−１に対する抗ウイルス作用に関する多くの研究が実施されている（Ｔａｍａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１１６３：２０９−２１６（１９９３）；Ｔａｍａｍｕｒａら、Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．、６：１０３３−１０４１（１９９８）；Ａｒａｋａｋｉら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、７３：１７１９−１７２３（１９９９））。しかし抗微生物機構および抗内毒素活性に焦点をあてた研究はほとんどない。限られたデータが、タキプレシンＩは、高濃度（阻害濃度の＞１００倍）で、細菌細胞およびヒト赤血球の形態学的および透過性の変化を引き起し、黄色ブドウ球菌および大腸菌細胞のＫ＋透過性を上昇し、同時に細胞生存力を低下することを示している（Ｋａｔｓｕら、Ｂｉｏ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．、１６：１７８−１８１（１９９３））。
【０００８】
グラム陰性菌は、２つの細胞エンベロープ膜を有する。外膜は、外側の小葉状の部分（ｌｅａｆｌｅｔ）において細胞表面の９０％を超えてかさ高の糖脂質リポ多糖（ＬＰＳ）がおおい、かつ内側の小葉状の部分において細胞膜の組成と類似の組成のリン脂質を伴う非対称膜である。多くの抗微生物カチオン性ペプチドが、グラム陰性菌外膜のＬＰＳと相互作用し、自己促進型取込みによりこの膜を超えて通過し、その後負帯電した細胞膜と相互作用しかつその中に挿入されることが示されている（Ｈａｎｃｏｃｋ、Ｌａｎｃｅｔ、３４９：４１８−４２２（１９９７））。しかし、これらのカチオン性ペプチドの標的は、十分には理解されていない。多くのペプチドに関してモデル膜における病巣の形成が観察されているが、このような相互作用を細菌細胞死を引き起す事象へ関連づける説得力のある証拠はほとんどなく、少なくとも一部のペプチドが細胞膜を超え、ポリアニオン性核酸のような細胞質標的に接近することが提唱されている（Ｋａｇａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．、８７：２１０−２１４（１９９０）；Ｌｕｄｔｋｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５：１３７２３−１３７２８（１９９６））。
【０００９】
従って、グラム陰性菌、グラム陽性菌、真菌、原虫、ウイルスなどを含む多くの微生物に対する、広範な抗微生物活性を強力に有するポリペプチドを開発する必要がある。
【００１０】
発明の概要
本発明は、抗微生物活性を有する、ポリフェムシン様ペプチドと称される、カチオン性ペプチドを提供する。またそれらの類似体、誘導体および保存的変種も含む。
【００１１】
第一の態様において、本発明は、下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する単離されたペプチドを提供する：
2004507228.tif 000002
（配列中、Ｚ１は、塩基性アミノ酸残基であるかまたはアミノ酸残基なし；Ｚ２は、塩基性または芳香族残基であり、Ｚ３は、塩基性アミノ酸残基であり、Ｚ４は、アルギニン、バリンまたはアラニンであり、ならびにＺ５は、芳香族または脂肪族アミノ酸残基である）。これらの一般式のペプチドの例は、配列番号：１から配列番号：１１を含む。
【００１２】
本発明は、また、細菌および酵母のような微生物の増殖を阻害する方法であって、下記からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する単離されたペプチド：
2004507228.tif 000003
（配列中、Ｚ１は、塩基性アミノ酸残基であるかまたはアミノ酸残基なし；Ｚ２は、塩基性または芳香族残基であり、Ｚ３は、塩基性アミノ酸残基であり、Ｚ４は、アルギニン、バリンまたはアラニンであり、ならびにＺ５は、芳香族または脂肪族アミノ酸残基である。）の阻害有効量を、単独で、または抗生物質と組合わせて細菌または酵母と接触させることを含む、方法を提供する。本発明の方法の実施において使用されるペプチドの例は、配列番号：１から配列番号：１１に示したアミノ酸配列を有するペプチドである。本発明のペプチドは、抗生物質、リゾチーム、抗ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）抗体およびＴＮＦアンタゴニストと組合せて投与することができる。本発明のペプチドとの相乗療法として使用できる抗生物質の種類は、アミノグリコシド、ペニシリン、セファロスポリン、フルオロキノロン、カルバペネム、テトラサイクリンおよびマクロライドを含む。
【００１３】
別の態様において、本発明は、対象に治療的有効量の本発明のペプチドを投与することを含む、内毒素血症または敗血症に関連した疾患に罹患したまたはその危険性がある対象において内毒素血症または敗血症に関連した疾患を阻害する方法を提供する。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、抗微生物活性を有しかつ抗生物質耐性生物の増殖の阻害に高い活性があるカチオン性ペプチドを提供する。これらのペプチドは、微生物の感染または増殖の阻害に加え、内毒素血症の作用の低下に有用であり、かつ従来型の抗生物質および／またはリゾチームと相乗性であることが多い。加えてこのようなペプチドは、抗真菌剤、抗腫瘍剤または抗ウイルス剤として有用である。
【００１５】
本明細書において使用される用語「抗微生物」は、本発明のペプチドが、細菌、真菌、ウイルスなどの微生物の増殖または繁殖を阻害、予防または破壊することを意味する。本明細書において使用される用語「抗ウイルス」は、本発明のペプチドが、ウイルスのまたはウイルスに感染した細胞の増殖または繁殖を阻害、予防または破壊することを意味する。本明細書において使用される用語「抗腫瘍」は、本発明のペプチドが、腫瘍の増殖を阻害するまたは腫瘍を破壊するために使用することができることを意味する。本明細書において使用される用語「抗真菌」は、本発明のペプチドが、真菌の増殖を阻害するまたは真菌を破壊するために使用することができることを意味する。
【００１６】
第一の態様において、本発明は、下記のアミノ酸配列を有する単離された抗微生物ペプチドを提供する：
2004507228.tif 000004
（配列中、Ｚ１は、塩基性アミノ酸残基であるかまたはアミノ酸残基なし；Ｚ２は、塩基性または芳香族残基であり、Ｚ３は、塩基性アミノ酸残基であり、Ｚ４は、アルギニン、バリンまたはアラニンであり、ならびにＺ５は、芳香族または脂肪族アミノ酸残基である）。
【００１７】
示されたタンパク質配列（配列番号：１から配列番号：１１）において、変動するＺ１は、そのポリペプチド配列のその位置に、塩基性側鎖を有するアミノ酸残基であるかまたはアミノ酸残基が存在しないことを示す。「塩基性」アミノ酸の例は、リシン、アルギニン、ヒスチジンなどである。変動するＺ２は、塩基性側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸を表す。この種のアミノ酸の例は、リシン、アルギニン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンなどである。変動するＺ３は、塩基性側鎖を有するアミノ酸を表す。変動するＺ４は、アミノ酸アルギニン、バリンまたはアラニンを表す。変動するＺ５は、芳香族側鎖または脂肪族側鎖を有するアミノ酸を表す。この種のアミノ酸の例は、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、グリシンなどである。
【００１８】
本発明のこのようなペプチドの例は、以下：
2004507228.tif 000005
それらの類似体、誘導体および保存的変種を含むが、これらに限定されるものではない（ここでこれらのペプチドは抗微生物活性を有する）。本発明のペプチドは、配列番号：１から配列番号：１１に加え、親水性および疎水性置換を有するペプチド、並びにそれらの保存的変種の広範な群を含む。
【００１９】
本発明のペプチドは、配列番号：１から配列番号：１１に示されたポリフェムシン様ペプチドに加え、そのペプチドの生物活性を維持する限りは、それらの類似体または誘導体を含む。本発明のペプチドの一次アミノ酸配列の小さい修飾は、本明細書において説明された特異的ペプチドと比べ、実質的に同等の活性を有するペプチドを生じることができる。このような修飾は、位置指定突然変異誘発によるような、意図的であるか、または自然発生的であることができる。これらの修飾により生じたペプチド全てが、当初のペプチドの生物活性が依然存在する限りは本明細書に含まれる。本明細書に示された全てのペプチド配列が、最初（最も左側の位置）のアミノ末端アミノ酸残基および最後（最も右側の位置）のカルボキシ末端のアミノ酸残基を伴い示されている。
【００２０】
更に、１つまたは複数のアミノ酸の欠失も、その生物活性を顕著に変更することなく、得られる分子の構造の修飾を生じることができる。これは、同じく有用性のあるより小さい活性分子の開発へとつながることができる。例えば、特定のペプチドの生物活性には必要ではないアミノまたはカルボキシ末端のアミノ酸は、取除くことができる。本発明のペプチドは、本明細書において説明された生体活性が維持される限りは、本発明において説明されたペプチドの類似体、ホモログ、突然変異体、異性体または誘導体のいずれかを含む。全てのペプチドは、Ｌアミノ酸を用いて合成されるが、これらのペプチドのＤ型は全て合成的に生成することができる。加えて、本発明のペプチドの抗微生物活性を増大するために、カルボキシ末端メチルエステル、カルボキシ末端アミドなどのようなカルボキシ末端誘導体を生成することができる。当業者は、例えば本願明細書に説明されたように、本発明のペプチドの他の関連したペプチド、類似体または誘導体を同定するために、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）アッセイ法を行うことができる。
【００２１】
本発明のペプチドは、当業者に公知の方法により、カルボキシ末端で容易に修飾することができる。このカルボキシ末端の修飾は、アミド化などを含む。
【００２２】
本発明のペプチドは、本明細書に具体的に例証されたペプチドの保存的変種であるペプチドを含む。本明細書において使用された用語「保存的変種」とは、アミノ酸残基を、別の生物学的に類似した残基との置換を意味する。保存的変種の例は、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシンまたはメチオニンを別の疎水性残基１つの置換、もしくはリシンについてのアルギニンの置換またはその逆、アスパラギン酸についてのグルタミン酸の置換またはその逆、アスパラギンについてのグルタミンの置換またはその逆のような、ひとつの極性残基の別のものとの置換を含む。別のものと置換することができる中性の親水性アミノ酸は、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびトレオニンを含む。用語「保存的変種」は更に、該ペプチドの生物活性が維持されるならば、未置換の親アミノ酸の代わりに置換されたアミノ酸を使用することも含む。このような保存的置換は、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、およびＺ５に関し、本発明のペプチドの種類の定義内である。
【００２３】
本明細書に説明されたポリフェムシンおよびポリフェムシンの構造的変種は、βヘアピンループ含有ペプチドである。各ペプチドは、２つのジスルフィド結合により安定化された２本の逆平行β鎖、βターンが存在するβ鎖領域間のループ領域を含む。アミノおよびカルボキシ末端に位置しかつβ鎖領域の外側にあるアミノ酸残基は、このペプチドの尾部領域を形成する。
【００２４】
ポリフェムシンＩおよびポリフェムシンＩの構造類似体のアミノ酸配列を図１に示した。好ましい構造変種は、両媒性を増大するようにデザインされている。合成された３種の例証的変種の中で、ポリフェムシンＩに最も近い構造類似体は、配列番号：４（ＰＶ７）であり、これはＲ１４とＹ１５の間の位置スイッチに加え、１０位での保存的置換がある（Ｒ１０からＫ１０）。配列番号：１１（ＰＶ５）は、ループ領域のＧ１０とＦ１２の間に挿入された追加のアルギニン残基を伴う変種である。この構造修飾は、ペプチドの総正電荷を増大し、かつループサイズも増大する。配列番号：３（ＰＶ８）において、位置１および１２の残基はスイッチされ（Ｆ１２からＲ１２およびＲ１からＦ１）、正味の正電荷およびループの疎水性の増大を生じる。このスイッチは更に、フェニルアラニンのかさ高な芳香族環および疎水親水性性質により、柔軟性を減少しかつ疎水性を増加することにより、尾部領域を変更する。一般に、３種の変種の３種全てが、インサイトＩＩタンパク質ペプチドモデリングプログラムを用いる分子モデリングから判断されるように、ポリフェムシンＩと比べ、増大した両親媒性を有すると推定される（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社、サンディエゴ、ＣＡ）。加えて、これらの変種は、より親水性でありかつひとつの変種ペプチド（配列番号：１１）についてより大きいと予想される変更されたループ領域を有する。
【００２５】
これらのペプチドの生物活性は、「最小発育阻止濃度」（ＭＩＣ）アッセイ法のような当業者に公知の標準法により決定することができる（ＷｕおよびＨａｎｃｏｃｋ、Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．、２７４：２９−３５（１９９９）および実施例の項参照）。ＭＩＣアッセイ法は、微生物の複製および増殖を阻害するペプチドの最低濃度の決定を可能にする。微生物集団の変化は、ブロスまたは培地中の集団の光学濃度（ＯＤ）の測定により評価される。ペプチドＭＩＣは、様々な条件下様々な微生物について決定することができる。ペプチドの生物活性に関する別のアッセイ法は、「分画阻止濃度（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）」（ＦＩＣ）アッセイ法がある。このアッセイ法は、本発明のペプチド間の、および本発明のペプチドと公知の抗生物質のような他の化合物との間の相乗作用を決定するために特に有用である。ＦＩＣアッセイ法は、追加の変数、例えば公知の抗生物質などを伴う、ＭＩＣアッセイ戦略を使用する。ＦＩＣアッセイ法の一型は、ブロス内に微生物を含むマイクロウェルプレート内で行われる。マイクロウェルプレートのひとつの次元（ｄｉｍｅｎｔｉｏｎ）のパターに従い、希釈範囲のペプチドを、各ウェルに添加し、かつ他方の次元において抗生物質を添加する。ＦＩＣは、抗生物質のペプチドＭＩＣに対する衝撃および相反関係を調べることにより計算される。ＦＩＣが１である場合、化合物の影響が相加効果であることを示し、ＦＩＣが１未満の場合は相乗効果であることを示している。相乗効果にとって０．５未満のＦＩＣが得られることが好ましい。本明細書において使用したように、ＦＩＣは、以下のように決定することができる：
2004507228.tif 000006
【００２６】
細菌内毒素（ＬＰＳ）は、高い毒性があり、かつグラム陰性菌感染時に放出された場合ヒトおよび動物の両方において高致死率を生じ得る。中用量の内毒素に曝露されたガラクトサミン処置したマウスは、典型的には、曝露後１７時間以内に内毒素性ショックにより死亡した。本発明のペプチドは、それらの内毒素誘導した死に対しマウスを防御する能力について試験することができる（実施例の項参照）。本発明のペプチドの抗内毒素活性は、マクロファージ細胞株を使用するインビトロアッセイ法においても試験することができる（Ｇｏｕｇｈら、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．、６４：４９２２−４９２７（１９９６）；および、実施例の項参照）。
【００２７】
本発明のペプチドの毒性は、ヒト赤血球細胞を溶解するペプチドの能力を評価する溶血アッセイ法を用い評価することができる（Ｚｈａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８：８１０２−８１１１（１９９９）；および実施例の項参照）。
【００２８】
本発明のペプチドの生物活性は、ペプチドの細菌膜および膜成分（リポソーム）の相互作用する能力を試験することにより、および細菌膜を透過するそれらの能力により評価することもできる（実施例の項参照）。
【００２９】
本発明のペプチドは、αアミノ基のｔ−ＢＯＣまたはＦＭＯＣ保護のような一般に使用される方法により合成することができる。両方法共、ペプチドのカルボキシ末端から始まり、１つのアミノ酸が各段階で追加されることによる段階的合成に関連している（Ｃｏｌｉｇａｎら、「免疫学最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ社、１９９１年、単元９参照）。本発明のペプチドは、当該技術分野において周知である固相ペプチド合成法により合成することもできる（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、８５：２１４９（１９６２）、並びにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、「固相ペプチド合成（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、Ｐｉｅｒｃｅ社、ロックフォード、ＩＬ（１９８４））。ペプチドは、０．１〜１．０ｍモルアミン／ｇポリマーを含有するコポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）を用いて合成することができる。化学合成完了時には、これらのペプチドは、脱保護しかつ液体ＨＦ−１０％アニソールによる０℃で約０．２５〜１時間の処理によりポリマーから切断することができる。これらの試薬の蒸発後、ペプチドを１％酢酸溶液によりポリマーから抽出し、これをその後凍結乾燥し、粗物質を得る。これは典型的には、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５上での５％酢酸を溶媒として使用するゲル濾過のような技術、高速液体クロマトグラフィーなどにより、精製することができる。カラムの適当な画分の凍結乾燥は、均質なペプチドまたはペプチド誘導体を生じ、次にこれは、アミノ酸解析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外線吸収スペクトル、分子旋光度、溶解度および固相エドマン分解による評価のような常法に従い特徴決定することができる（例えば、「タンパク質精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、Ｍ．Ｐ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編集、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８２巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、１９９０年参照）。ＦＭＯＣ固相合成法を用いる自動化された合成は、自動ペプチド合成装置を用いて実現することができる（Ｍｏｄｅｌ ４３２Ａ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）。ペプチドは、Ｔｒｉｘ−ＤＭＳＯ−イソプロパノール（ｐＨ７．５）中で約１５〜約２０時間、約２３℃で酸化し、ジスルフィド結合の形成を可能にする（Ｔａｍら、Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、１１３：６６５７−６６６２（１９９１））。ジスルフィド結合形成後、この懸濁液は、逆相ＦＰＬＣを用い精製され、これにより約２０％の収量が得られる。
【００３０】
本発明のポリペプチドは、アニオン性担体ペプチドがカチオン性ペプチドに融合される融合タンパク質微生物法を用いて合成することもできる。このような抗微生物活性を有するカチオン性ペプチドの微生物作成法は、１９９７年１月１４日に公開された米国特許第５，５９３，８６６号に開示されており、その全内容が本明細書に参照として組入れられている。
【００３１】
本発明は、以下をコードしている単離されたポリヌクレオチドを含む：
2004507228.tif 000007
（配列中、Ｚ１は、塩基性アミノ酸残基であるかまたはアミノ酸残基でない；Ｚ２は、塩基性または芳香族残基であり、Ｚ３は、塩基性アミノ酸残基であり、Ｚ４は、アルギニン、バリンまたはアラニンであり、ならびにＺ５は、芳香族または脂肪族アミノ酸残基である）。
【００３２】
より詳細には、本発明は同じく以下をコードしている単離されたポリヌクレオチドを含む：
2004507228.tif 000008
【００３３】
加えて、本発明は、本発明のペプチドの類似体、突然変異体および変種をコードしている単離されたポリヌクレオチドを含む。本明細書において使用される用語「単離された」とは、ポリヌクレオチドが、例えばそれが天然に会合されているタンパク質、脂質、核酸を実質的に含まないことを意味する。本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」とは、個別の断片の形または比較的大きい構築体の成分としてのようなデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを意味する。本発明のペプチドをコードしているＤＮＡは、組換え転写ユニットにおいて発現されることが可能であるような合成遺伝子を提供するｃＤＮＡ断片からまたはオリゴヌクレオチドから集成することができる。本発明のポリヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列を含む。ポリヌクレオチド配列は、遺伝暗号から推定することができるが、暗号の縮重を考慮しなければならない。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝暗号の結果として縮重している配列を含む。このようなポリヌクレオチドは、配列番号：１から配列番号：１１のペプチドのような、大量の関心のあるペプチドの組換え生成に有用である。
【００３４】
本発明において、本発明のカチオン性ペプチドをコードしているポリヌクレオチドは、組換え「発現ベクター」に挿入することができる。用語「発現ベクター」は、当該技術分野においてカチオン性遺伝子配列の挿入または組入れにより操作されることが公知のプラスミド、ウイルスまたは他のビヒクルを意味する。本発明のこのような発現ベクターは、挿入された遺伝子配列の宿主における効率的転写を促進するプロモーター配列を含むプラスミドが好ましい。この発現ベクターは、典型的には複製起点、プロモーター、更には形質転換された細胞の表現型選択を可能にする特異的遺伝子を含む。例えば、本発明のペプチドの発現は、酵素β−ガラクトシダーゼの同化によりラクトース利用を媒介するラクトースまたはｌａｃオペロンを含む大腸菌染色体ＤＮＡの制御下で行うことができる。ｌａｃ制御システムは、ＩＰＴＧにより誘導することができる。プラスミドは、ＩＰＴＧが添加されるまでｌａｃプロモーターを抑制することができる、ｌａｃ Ｉｑリプレッサー遺伝子を含むように構築することができる。当該技術分野において公知の他のプロモーターシステムは、βラクタマーゼ、λプロモーター、プロテインＡプロモーター、およびトリプトファンプロモーターシステムを含む。これらは最も一般的に使用されるが、誘導的および構成的の両方のその他の微生物プロモーターも同じく利用することができる。このベクターは、宿主細胞と共存できる種に由来したレプリコン部位および制御配列を含む。加えてこのベクターは、形質転換された細胞における表現型選択を提供することが可能である特異的遺伝子を保持することができる。例えば、β−ラクタマーゼ遺伝子は、β−ラクタマーゼ遺伝子を伴うベクターを含むそれらの形質転換された細胞にアンピシリン耐性を付与する。
【００３５】
ポリヌクレオチドを伴う宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の通常の技術により行うことができる。例えば宿主が大腸菌のような原核生物である場合、ＤＮＡ取込みが可能であるコンピテント細胞を、指数増殖期以後に収集された細胞から調製し、引き続き当該技術分野において周知の手法を用いＣａＣｌ２法で処理することができる。あるいは、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを使用することができる。
【００３６】
従来の化学的形質転換法に加え、本発明のプラスミドベクターは、電気穿孔または微量注入のような物理的手段により、宿主細胞に導入することができる。電気穿孔は、宿主の形質膜に孔を形成する高電圧の電気インパルスによるベクターの転移を可能にし、当該技術分野において周知の方法に従い実行される。加えてクローニングされたＤＮＡは、当該技術分野において周知の方法を使用するプロトプラスト融合により、宿主細胞に導入することができる。
【００３７】
カチオン性ペプチドをコードしているＤＮＡ配列は、適当な宿主細胞へのＤＮＡ転移によりインビボにおいて発現することができる。本発明の「宿主細胞」は、その中でベクターが繁殖することができかつそのＤＮＡが発現されるものである。この用語は、対象宿主細胞の後代も含む。複製時に生じる突然変異が存在し得るので、全てではない後代が、親細胞と同じであると理解される。しかしこのような後代は、前記用語が使用される場合には含まれる。好ましい本発明の宿主細胞は、大腸菌、黄色ブドウ球菌および緑膿菌を含むが、当該技術分野において公知の他のグラム陰性菌およびグラム陽性菌を、発現ベクターが複製起点を含み宿主における発現を可能にする限りは利用することができる。
【００３８】
本発明の方法に従い使用されるカチオン性ペプチドポリヌクレオチド配列は、生物から単離するかまたは実験室において合成することができる。関心のあるカチオン性ペプチドをコードしている特異的ＤＮＡ配列は、以下により得ることができる：１）ゲノムＤＮＡからの２本鎖ＤＮＡ配列の単離；２）関心のあるカチオン性ペプチドに必要なコドンを提供するためのＤＮＡ配列の化学的作出；および３）ドナー細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写による、２本鎖ＤＮＡ配列のインビトロ合成。後者の場合、一般にｃＤＮＡと称されるｍＲＮＡに相補的な２本鎖ＤＮＡ配列が、最終的には形成される。
【００３９】
合成ＤＮＡ配列は、所望のペプチド産物のアミノ酸残基の全配列がわかっている場合の選択法であることが多い。本発明において、ＤＮＡ配列の合成は、おそらく細菌宿主により認識されるであろうコドンの組込みを可能にし、これにより翻訳に問題を伴わずに高レベルの発現を可能にするという利点を有する。加えて、天然のカチオン性ペプチド、その変種、または合成ペプチドをコードしているものを含む、いずれかのペプチドが実際に合成され得る。
【００４０】
所望のペプチドの全配列がわかっていない場合、ＤＮＡ配列の直接合成は可能ではなく、かつ選択される方法は、ｃＤＮＡ配列の形成である。関心のあるｃＤＮＡ配列の単離の標準手法の中には、高レベルの遺伝子発現を有するドナー細胞において豊富であるｍＲＮＡの逆転写に由来したｃＤＮＡライブラリーを含むプラスミドまたはファージの形成がある。ポリメラーゼ連鎖反応法と組合わせて使用する場合、稀な発現産物さえもがクローニングされる。カチオン性ペプチドのアミノ酸配列の重要な部分がわかっている場合には、おそらく標的ｃＤＮＡ中に存在する配列を二つ組にする標識され１本鎖または２本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡプローブ配列を、１本鎖型へ変性されたｃＤＮＡのクローニングしたコピー上で実行されるＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーション法において使用することができるであろう（Ｊａｙら、Ｎｕｃ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１１：２３２５（１９８３））。
【００４１】
本発明は更に、下記を含む、本発明のペプチドの阻害有効量と細菌を接触することを含む、細菌の増殖を阻害する方法を提供する：
2004507228.tif 000009
（配列中、Ｚ１は、塩基性アミノ酸残基であるかまたはアミノ酸残基なし；Ｚ２は、塩基性または芳香族残基であり、Ｚ３は、塩基性アミノ酸残基であり、Ｚ４は、アルギニン、バリンまたはアラニンであり、ならびにＺ５は、芳香族または脂肪族アミノ酸残基である）。
【００４２】
より詳細に述べると、本発明は、
2004507228.tif 000010
並びにそれらの類似体、誘導体または保存的変種のような、本発明のペプチドの阻害有効量と細菌を接触することを含む、細菌の増殖を阻害する方法を提供する。
【００４３】
用語「接触する」は、ペプチドが細菌を効果的に阻害、殺傷もしくは溶解し、内毒素（ＬＰＳ）に結合し、またはグラム陰性菌の外膜を透過性とすることができるように、細菌をペプチドに曝露することを意味する。接触は、例えば、細菌のペプチドに対する感受性を試験するためのペプチドの細菌培養物への添加により、インビトロであることができる。接触は、例えば、敗血症性ショックのような細菌性障害を有する対象へのペプチドの投与により、インビボであることができる。「阻害」または「阻害有効量」は、静菌または殺菌作用を生じるのに必要なペプチドの量を意味する。阻害され得る細菌の例は、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅ． ｃｌｏａｃａｅ）、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｃａｅｌｉｓ）および黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｄｕｏｍｏｎａｓ ａｅｕｒｇｉｎｏｓａ）、およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を含む。
【００４４】
細菌の増殖を阻害する方法は更に、併用または相乗療法のための抗生物質の追加を含む。投与される適当な抗生物質は、典型的には、細菌がグラム陰性菌またはグラム陽性菌であるかどうかのような細菌の感受性によって左右され、かつ当業者により容易に識別されるであろう。本発明のペプチドとの相乗療法に有用な抗生物質の特定の種類の例は、アミノグリコシド（例えばトブラマイシン）、ペニシリン（例えばピペラシリン）、セファロスポリン（例えばセフタジヂム）、フルオロキノロン（例えばシプロフロキサシン）、カルバペネム（例えばイミペネム）、テトラサイクリン、およびマクロライド（例えばエリスロマイシンおよびクラリスロマイシン）である。細菌の増殖を阻害する方法は更に併用または相乗療法のための抗生物質の追加を含む。投与されるのに適した抗生物質は、典型的には細菌がグラム陰性菌またはグラム陽性菌であるかどうかのような細菌の感受性によって左右され、かつ当業者により容易に識別されるであろう。先に列記した抗生物質に加え、代表的抗生物質は、アミノグリコシド（アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネチルミシン、トブラマイシン、ストレプトマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、エリスロマイシンエストラート／エチルスクシネート／グルセプテート／ラクトビオナート／ステアレート）、β−ラクタム、例えばペニシリン（例えば、ペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジシクロキサシリン、アンピシリン、アモキシシリン、チカルシリン、カルベニシリン、メズロシリン、アズロシリン、ピペラシリン）、またはセファロスポリン（例えば、セファロチン、セファゾリン、セファクロル、セファマンドール、セフォキシチン、セフロキシム、セフォニシド、セフメタゾール、セフォテタン、セフプロジル、ロラカルベフ、セフェタメト、セフォペラゾン、セフォタキシム、セフチゾキシム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフェピム、セフィキシム、セフポドキサミン、およびセフスロジン）がある。他の種類の抗生物質は、例えば、カルバペネム（例えばイミペネム）、モノバクタム（例えばアズトレオナム）、キノロン（例えば、フレロキサシン、ナリジキシ酸、ノルフロキサシン、シプロフロキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ロメフロキサシン、およびシノキサシン）、テトラサイクリン（例えば、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリン）、およびグリコペプチド（例えば、バンコマイシン、テイコプラニン）がある。その他の抗生物質は、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、トリメトロプリム、スルファメトキサゾール、ニトロフラントイン、リファンピン、およびムピロシンがある。
【００４５】
これらのペプチドおよび／またはそれらの類似体もしくは誘導体は、ヒトまたはヒト以外の動物を含む、いずれかの宿主に、細菌の増殖のみではなく、ウイルスまたは真菌（酵母）の増殖も阻害するのに有効量投与することができる。これらのペプチドは、抗微生物剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤として有用である。これらのペプチドおよび／またはそれらの類似体もしくは誘導体は、ヒトまたはヒト以外の動物を含む、いずれかの宿主に、細菌の増殖のみではなく、ウイルスまたは真菌の増殖も阻害するのに有効量投与することができる。これらのペプチドは、抗微生物剤、抗ウイルス剤および抗真菌剤として有用である。
【００４６】
本発明のペプチドは、注射によるかまたは時間をかけた持続点滴により投与することができる。このペプチドは、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または経皮的に投与することができる。ペプチド送達の好ましい方法は、ミクロスフェアまたはプロテイノイド中の封入により、肺へのエアロゾル送達により経口的に、またはイオントホレシスもしくは経皮的電気穿孔による経皮的にを含む。他の投与法は、当業者には公知であろう。
【００４７】
本発明のペプチドの非経口投与のための調製物は、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液および乳液を含む。非水性溶剤の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注射可能な有機エステルがある。水性担体は、水、アルコール性／水性溶液、乳液または懸濁液があり、生理食塩水および緩衝された媒質を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸を加えたリンガー液、または不揮発性油がある。静脈内用ビヒクルは、液体および栄養補充液、電解質補充液（例えば、リンガーデキストロースを基にしたもの）などがある。保存剤および、例えば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤および不活性ガスなどのような他の添加物も存在することができる。
【００４８】
本発明は、敗血症の症状を呈しているまたは敗血症発症のリスクのある対象に、治療的有効量の本発明のカチオン性ペプチド、例えば配列番号：１から配列番号：１１またはそれらの類似体、誘導体もしくは保存的変種を投与することを含む、内毒素血症または敗血症性ショック（敗血症）に関連した障害、または敗血症の１種または複数の症状を、治療または緩和する方法を提供する。用語「緩和」とは、治療される障害の症状の減少または低下を意味する。このような緩和され得る症状は、発熱、高血圧、好中球減少症、白血球減少症、血小板減少症、播種性血管内凝固、成人呼吸窮迫症候群、ショックおよび多臓器不全のような、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）の血中レベルの一過性の増加に関連したものを含む。このような治療を必要とする患者は、例えばグラム陰性菌感染症から生じた内毒素血症、毒液中毒症（ｖｅｎｏｍ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ）、または肝不全のような、毒血症のリスクのあるものまたはこれに罹患したものを含む。加えて、グラム陽性菌、ウイルスまたは真菌の感染症に罹患した患者は、敗血症の症状を提示することがあり、かつ本明細書に説明したような治療的方法の恩恵を受けることができる。更に特に本発明の方法により恩恵を受け得る患者は、大腸菌、ヘモフィルス・インフルエンザＢ、髄膜炎菌、ブドウ球菌、または肺炎球菌の感染症に罹患したものである。敗血症のリスクのある患者は、銃創、腎または肝不全、外傷、火傷、免疫不全症（ＨＩＶ）、造血系新生物形成、多発性骨髄腫、Ｃａｓｔｌｅｎｉａｎ症または心臓粘液腫に罹患したものを含む。
【００４９】
内毒素血症の治療に関して本明細書において使用される用語「治療的有効量」は、ＬＰＳに対する対象の反応を減少しかつ敗血症の症状を減少するのに十分な量で使用したカチオン性ペプチドの量を意味する。従って用語「治療的有効性」は、カチオン性ペプチドの量が、ＴＮＦ血漿レベルの臨床的に有意な増加を、防止するのに十分であること、ならびに好ましくは少なくとも５０％低下する、およびより好ましくは９０％低下するのに十分であることを含む。カチオン性ペプチドの投与のための用量範囲は、望ましい作用を生じるのに十分大きい範囲である。一般にこの用量は、患者における年齢、状態、性別、および細菌または前述の他の物質による感染の程度により変動し、かつ当業者は決定することができるであろう。用量は、あらゆる禁忌の事象において、医師個人により調節することができる。いかなる事象においても、治療有効性は、患者のＬＰＳおよびＴＮＦのレベルをモニタリングすることにより決定することができる。血清ＬＰＳおよびＴＮＦレベルの低下は、患者の回復と相関しているはずである。
【００５０】
加えて、敗血症のリスクのあるまたは症状を呈している患者は、前述の方法、更にはカチオン性ペプチドの治療的投与と実質的に同時に、ＴＮＦインヒビター、抗生物質または両方を投与することを含む方法により治療することができる。例えば、抗ＴＮＦ抗体および／またはＴＮＦアンタゴニストの使用によるような、敗血症におけるＴＮＦの役割への直接または間接の介入は、敗血症症状を予防または緩和することができる。特に好ましいのは、活性成分としての抗ＴＮＦ抗体、例えばＴｒａｃｅｙらが説明しているようなＴＮＦ特異性を伴うモノクローナル抗体の使用である（Ｎａｔｕｒｅ、３３０：６６２（１９８７））。
【００５１】
敗血症の症状を呈する患者は、カチオン性ペプチドによる治療に加え、抗生物質により治療することができる。代表的抗生物質は、ゲンタマイシンのようなアミノグリコシドもしくはペニシリンのようなβ−ラクタム、またはセファロスポリンもしくは先に一覧した抗生物質のいずれかを含む。従って、本発明の好ましい治療法は、殺菌量の抗生物質の投与と実質的に同時の、カチオン性ペプチドの治療的有効量を投与することを含む。好ましくは、カチオン性ペプチドの投与は、抗生物質投与の約４８時間以内に、および好ましくは約２〜８時間、ならびに最も好ましくは実質的に同時に行う。
【００５２】
本明細書において使用される用語「殺菌量」は、治療を受ける患者において細菌殺傷血中濃度に到達するのに十分な量を意味する。ヒトへの投与について安全であると一般に見なされる抗生物質の殺菌量は、当該技術分野において周知であり、かつ当該技術分野において公知であるように、具体的抗生物質および治療される細菌感染症の種類に応じて変動する。
【００５３】
これらのペプチドの抗生性、抗微生物性および抗ウイルス性の特性のために、これらは微生物またはウイルス混入に対し感受性のある保存剤または滅菌剤として使用することもできる。本発明のペプチドは、様々な具体的適用に対し指示された広域スペクトルの抗微生物剤として利用することができる。このような適用は、加工食品の保存剤としてのこれらのペプチドの、単独で、またはリゾチームなどの抗菌食品添加物との組合せのいずれかでの使用（サルモネラ、エルシニア、シゲラを含む生物）；局所用物質（シュードモナス、ストレプトコッカス）として、および臭気発生微生物（ミクロコッカス）の殺傷を含む。本発明のカチオン性ペプチドの説明した適用に関する相対有効性を、当業者は、該ペプチドのひとつに対する生物の感受性を決定することにより容易に決定することができる。本発明のペプチドは、細菌および真菌の増殖の阻害、並びに水疱口内炎ウイルス、インフルエンザＡ型ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）−１、ヘルペスウイルス、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルスなどを含むエンベロープウイルスの複製の阻害について有用である。
【００５４】
下記の実施例は、本発明を例証することが意図されているが、限定されることを意図されるものではない。これらは使用することができる典型例であるが、当業者に公知の他の手法を代わりに使用することができる。
【００５５】
実施例１：カチオン性ペプチドのＭＩＣ値
菌株および試薬
抗微生物活性アッセイ法に使用した細菌株は、大腸菌ＵＢ１００５（Ｆ−， ｎａｌＡ３７， ｍｅｔＢ１）およびその外膜欠損変異体ＤＣ２（１６）、大腸菌ＫＦ１３０（ｇｙｒＡ）である（Ｈｏｏｐｅｒら、Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ．、８２：（補遺４Ａ）１２−２０（１９８７））、野生型ネズミチフス菌株１４０２８ｓ（Ｆｉｅｌｄｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３：１０５９−１０６２（１９８９））、黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９２３、黄色ブドウ球菌ＳＡＰＯＯ１７およびＲ１４７がある。更に、Ｄ．スピアート博士（Ｄｒ． Ｄ． Ｓｐｅｅｒｔ）（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）から得た表皮ブドウ球菌臨床単離体、および緑膿菌ＰＡＯ１（ＨａｎｃｏｃｋおよびＣａｒｅｙ、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．、１４０：９０２−９１０（１９７９））、Ｈ３７４およびＨ７４４（Ｐｏｏｌｅら、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．、１７５：７３６３−７３７２（１９９３））並びに腸球菌ＡＴＣＣ２９２１２を含んだ。抗真菌活性は、カンジダ・アルビカンスの臨床検査単離体を用い試験した。全ての菌株は、特に記さない限りは、Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｈｉｎｔｏｎ（ＭＨ）ブロス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、デトロイト、ＭＩ）上で、３７℃で増殖した。ダンシル−ポリミキシンＢ置換アッセイ法に使用した大腸菌ＵＢ１００５および緑膿菌Ｈ１０３のリポ多糖（ＬＰＳ）は、Ｍｏｏｒｅらの説明のように単離した（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２９：４９６−５００（１９８６））。ポリミキシンＢ、１−Ｎ−フェニルナフチルアミン（ＮＰＮ）、カルボニルシアニド−ｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）、サルモネラ・ミネソタＲ５９５（Ｒｅ突然変異体）由来のＲｅ ＬＰＳおよび大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４由来のＬＰＳは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（セントルイス、ミズリー州）から購入した。ダンシルポリミキシンＢは、既報のように合成した（Ｍｏｏｒｅら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２９：４９６−５００（１９８６））。脂質１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）および卵黄由来のホスファチジルグリセロール（ｅｇｇ−ＰＧ）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ社（アラバスター、ＡＬ）から購入した。蛍光色素３，３−ジプロピルチアカルボシアニン（ｄｉＳＣ３５）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社（ユージーン、ＯＲ）から購入した。
【００５６】
ＭＩＣアッセイ法
いくつかの本発明のペプチドの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を、別に説明された方法を用い決定した（ＷｕおよびＨａｎｃｏｃｋ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７４：２９−３５（１９９９））。細胞を、ＬＢ−Ｓ（塩補充剤を含まないＬｕｒｉａブロス）において３７℃で一晩増殖し、同じ培地で１／１０，０００希釈し、濃度約１０４〜１０５ＣＦＵ／ｍｌを得た。ブロス希釈物を、カラム１に抗生物質または化合物の初期濃度を含有するＬＢ−Ｓの２００μｌ、並びにカラム２−１２に同じ培地を１００μｌを入れ、９６−ウェルマイクロタイタープレートを準備した。これらの化合物は、カラム１からブロス１００μｌを採取し、かつこれをカラム２と混合し、１／２希釈を得ることにより希釈した。この手法を、カラム１０まで連続した。最後に、細菌１０μｌを、カラム１−１１にピペットで添加し、これらのプレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートをウェル中での増殖についてスコア化し、ＭＩＣを決定した。
【００５７】
溶血アッセイ法
本発明のペプチドの溶血活性を、ヒト赤血球細胞に対して試験した。新たに採取したヒト血液をヘパリン処理し、これを遠心し白血球層を除去し、これにより得た赤血球を生理食塩水（０．８５％ ＮａＣｌ）で３回洗浄した。生理食塩水中のペプチドの連続希釈物を、総容量１００μｌを用い、丸底マイクロタイタープレートに調製した。赤血球細胞を、生理食塩水で希釈し、赤血球沈殿容積を１／２５とし、細胞５０μｌを各ウェルに添加した。揺らしながらプレートを３７℃でインキュベートし、かつ４時間後に溶解に必要なペプチド濃度を、最小溶血濃度として測定した。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
表１にまとめた結果は、試験したペプチド（配列番号：３、４および１１）が、０．１２５〜０．５μｇ／ｍＬの範囲の濃度で、様々なグラム陽性菌およびグラム陰性菌に対し有効な抗微生物剤であることを示している。加えて、全てのペプチドが、酵母カンジダ・アルビカンスに対して有効であった。メチルエステル修飾、もしくはＬ型からＤ型アミノ酸のようなペプチドの修飾は、活性抗微生物剤の広範な種類を提供する。
【００６０】
ポリフェムシンＩおよび試験したペプチド（配列番号：３、４および１１）は、赤血球細胞を使用する溶血アッセイ法において、溶血活性を示している。
【００６１】
実施例２：ＬＰＳ誘導したＴＮＦのカチオン性ペプチドによる減少
本発明のペプチドのＬＰＳによって誘導された腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）生成を減少する能力を、インビトロアッセイ法において試験した。マウスのマクロファージ細胞株ＲＡＷ ２６４．７を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（マナサス、ＶＡ）から入手し、かつ１０％ウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭ培地において増殖した。これらの細胞を、２４ウェルプレート内に密度１０６細胞／ウェルで播種し、一晩インキュベートし、その後新鮮な培地で洗浄した。大腸菌０１１１：Ｂ４（１００ｎｇ／ｍｌ）を、０時点にＲＡＷマクロファージに添加した。本発明のペプチド２０μｇ／ｍｌを、０、３０および６０分の時点で添加し、細胞を６時間刺激した。６時間後、ＴＮＦおよびインターロイキン−６（ＩＬ−６）のレベルを測定した。細胞上清を、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６について、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）により製造業者の指示に従いアッセイした（Ｅｎｄｏｇｅｎ社、ホンビー、ＯＮ、カナダ）。結果を表２に示す。
【００６２】
【表２】
2004507228.tif 000012
【００６３】
本発明のペプチドは、大腸菌０１１１：Ｂ４ ＬＰＳによって誘導されたＲＡＷマクロファージにおけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の生成を阻害することができる。これらのペプチド２０μｇ／ｍｌは全て、ＬＰＳ−刺激したマクロファージのサイトカイン産生を有意に阻害することができる（表２）。配列番号：１１（ＰＶ５）は、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の最良のインヒビターであった。
【００６４】
実施例３：マウス内毒素血症ショックモデルにおける致死的ＬＰＳ内毒素性からの防御
本発明のペプチドを、それらの緑膿菌感染症を防御する能力について、好中球減少マウスモードにおいてアッセイした。シクロホスファミドの３回注射により好中球減少症とした（Ｇｏｕｇｈら、Ｉｎｆｅｃｔ． Ｉｍｍｕｎ．、６４：４９２２−４９２７（１９９６）参照）メスＣＤ−１マウスに、１００％致死用量の緑膿菌Ｍ２（およそ２００生体）を腹腔内注射した。３０分後、マウスに、本発明のペプチド（２００μｇ／１００μｌ）を腹腔内注射した。生存を２４から７２時間後に評価した。
【００６５】
本発明のペプチドのＬＰＳ誘導した内毒素血症を防御する能力を、インビボにおいて評価した。ガラノス（Ｇａｌａｎｏｓ）らの方法に従いマウス（８〜１０週齢）に、ＬＰＳに対して敏感になるように、Ｄ−ガラクトサミン（Ｄｇａｌ）２０μｇを腹腔内注射した（Ｇａｌａｎｏｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ、７６：５９３９−５９４３（１９７９））。内毒素性ショックは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の大腸菌Ｏ１１１：Ｂ４ ＬＰＳの３μｇ／ｍｌの腹腔内注射により誘導した。本発明のペプチド（２００μｇ／１００μｌ滅菌水）を、ＬＰＳ注射の１０分以内に別の部位に腹腔内注射し、注射後２４時間まで生存をモニタリングした。
【００６６】
これらの結果を表３に示す。
【表３】
2004507228.tif 000013
【００６７】
表３は、本発明のペプチドが、緑膿菌感染症に対する防御を提供することができること、およびこの防御が親ペプチド、すなわちポリフェムシンＩよりも優れていることを示している。本発明のペプチドで処置した５０％より多くのマウスが、４８時間以上生存した。対照的に、ペプチドを受け取らなかったマウスは、細菌曝露後速やかに死亡し、これは２４時間以内の死亡率５０％および４１時間内の死亡率１００％を示した。細菌感染による曝露を実施しなかったマウスは、観察期間を通じて生存率１００％を示した。
【００６８】
表３は更に、本発明のペプチドは、内毒素血症に対する防御を提供することができることを例証している。細菌内毒素（ＬＰＳ）は、高い毒性があり、かつグラム陰性菌感染症時に放出された場合、ヒトおよび動物の両方において高い致死率を生じることができる。中用量の内毒素が投与されたガラクトサミンで処置したマウスは、通常１７時間以内に内毒素性ショックにより死亡した。本発明のペプチドは、内毒素が誘導する死に対する防御を提供することができる。
【００６９】
実施例４：ＬＰＳへのペプチド結合親和性
本発明のペプチドがグラム陰性菌外膜のＬＰＳと相互作用することができるかどうかを決定するために、ペプチドのＬＰＳに関する結合親和性を、ダンシルポリミキシンＢ置換アッセイ法を用いて決定した（Ｍｏｏｒｅら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２９：４９６−５００（１９８６））。このアッセイ法は、結合した際のみ高度に蛍光性であるカチオン性プローブであるダンシルポリミキシンおよび大腸菌ＵＢ１００５から単離したＬＰＳを使用した。ＬＰＳに結合し続けるダンシルポリミキシンＢの画分を、ペプチド濃度の関数としてプロットし、このデータから、最大置換５０％（Ｉ５０）まで結合したダンシルポリミキシンＢ（１０μｌ）の量を低下するのに必要なペプチド濃度を示した（表４）。ＬＰＳの最大置換は、ポリミキシンＢで観察される、ダンシルポリミキシンＢの１００％置換が生じた割合（％）として表した。
【００７０】
【表４】
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【００７１】
表４の結果は、全ての試験したペプチドが、ダンシルポリミキシンと同程度置換することができ、Ｉ５０値は２倍未満異なることを示している。
【００７２】
実施例５：膜透過性上昇活性
本発明のペプチドの外膜透過性上昇活性を、大腸菌ＵＢ１００５の無傷の細胞を使用する、Ｌｏｈらの１−Ｎ−フェニルナフチルアミン（ＮＰＮ）取込みアッセイ法により決定した（Ａｎｔｉｍｉｃｏｒ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、２６：５４６−５５１（１９８４））。
【００７３】
これらのペプチドの細胞膜脱分極活性は、膜電位感受性色素３，３−ジプロピルチアカルボシアニンｄｉＳＣ３５（２８）および大腸菌ＤＣ２を用いて決定した（ＷｕおよびＨａｎｃｏｃｋ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７４：２９−３５（１９９９））。中−対数相の細菌細胞を遠心し、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．８）で洗浄し、かつ同じ緩衝液中に再懸濁し、ＯＤ６００を０．０５とした。ｄｉＳＣ３５の保存液を、最終濃度０．４μＭとなるよう添加し、かつ室温で２０〜３０分間消光した。この細胞懸濁液にＫＣｌを添加し、最終濃度１００ｍＭとし、細胞質および外部Ｋ＋濃度を平衡化した。細胞懸濁液２ｍＬを、１ｃｍキュベット内に入れ、被験ペプチドの望ましい濃度を添加した。細胞膜の膜電位の崩壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）による蛍光の変化を、パーキンエルマーモデル６５０−１０Ｓ蛍光分光光度計を用い励起波長６２２ｎｍおよび発光波長６７０ｎｍで連続測定した。ＮＰＮ取込みの５０％最大増加をもたらすペプチド濃度を、Ｐ５０として記録した。
【００７４】
ペプチドの大腸菌ＵＢ１００５外膜の透過性上昇能を、表４に示した。ＮＰＮは、通常無傷の外膜により排泄されるが、外膜完全性の破壊後に細菌外膜を区分した（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）場合に増加した蛍光を示す、小さい疎水性分子である。従ってペプチド存在下での蛍光の増加は、ペプチドの細菌外膜透過性上昇能を示している。表４に示したように、ポリフェムシンＩおよび本発明のペプチドは両方とも、同程度外膜を超えるＮＰＮ取込みを媒介することができ、かつＰ５０値の変動は平均３．６μｇ／ｍｌから３０％未満であった。
【００７５】
グラム陰性菌の外膜を通過後、またはグラム陽性菌の透過性細胞壁を通った後、カチオン性抗微生物ペプチドは、細菌細胞膜と相互作用する。各ペプチドの大腸菌細胞膜電位勾配を脱分極する能力を、図３に示した。ポリフェムシンＩは、比較的良好な膜透過性上昇物であり、細胞懸濁液へのペプチドの添加時の、細胞からの膜電位感受性蛍光色素ｄｉＳＣ３５の放出で示されるように、濃度０．２５μｇ／ｍｌ（２ｘＭＩＣ）での細胞膜電位の５分以内の急激な散逸を引き起す（図３）。対照的に、同じペプチド濃度で、配列番号：４（ＰＶ７）および配列番号：３（ＰＶ８）の両方は、有意なより遅い膜透過性上昇を生じ、蛍光増加前に３分よりも長い遅延時間が検出され（図３）、かつ最大色素放出は、ポリフェムシンＩにより媒介されたものの５０％未満であった。配列番号：１１（ＰＶ５）は、０．２５μｇ／ｍｌ（１ｘＭＩＣ）で、細胞から放出された色素の有意なレベルを引き起すことができない。
【００７６】
実施例６：リポソームとのペプチド相互作用
ペプチドの細菌細胞膜との相互作用を理解するために、モデルシステムを用いた。本発明のペプチドの３位にあるトリプトファン残基は、蛍光放出がその環境に対し感度よいため、リポソームへの結合をモニタリングする機会を提供した。ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）中の単層リポソーム（０．１μｍ）を、ＰＯＰＣ／ＰＯＰＧ（７：３ ｗ／ｗ）またはＰＯＰＣ単独で、凍結乾燥法を用い調製し（Ｍａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、８１７：１９３−１９６（１９８５））、その後押出装置（Ｌｉｐｅｘ Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ社、バンクーバー、ＢＣ．、カナダ）を用い、０．１μｍの二重重ねのＮｕｃｌｅｐｏｒｅフィルターを通して押出した。トリプトファン蛍光およびＫＩ消光の測定を、ルミネッサンス・スペクトロメータＬＳ５ＯＢ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて行った（ＥｆｔｉｎｋおよびＧｈｉｒｏｎ、Ｊ． Ｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ．、８０：４８６−４９３（１９７６）参照）。
【００７７】
【表５】
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【００７８】
各ペプチドの大腸菌細胞膜のリン脂質の帯電対非帯電の比（ＰＯＰＣ：ＰＯＰＧ， ７：３）を反映した組成物を持つアニオン性リポソームへの添加時に、蛍光放出の最大値が、１１から１４ｎｍの青色偏移を示し、かつ蛍光放出強度が顕著に増加し（１．３から３．７倍）、これはこのトリプトファン残基がより疎水性の環境への再配置したことを示している（表５）。これらのペプチド間に有意差は認められなかった。
【００７９】
これらのデータを確認するために、水溶性消光剤ＫＩのペプチドトリプトファン蛍光を抑制する能力を試験した。緩衝液中で、水溶性消光剤ＫＩは、濃度−依存的方法で蛍光を完全に抑制することができた（図４）。しかし、消光剤がリポソーム（ＰＯＰＣ／ＰＯＰＧ， ７：３）の状況でペプチドに添加された場合、蛍光強度の減少は認められず、これはリポソーム中のペプチドのトリプトファン残基が、この水性消光剤とは接近不能であることを示している（図４）。非帯電のＰＯＰＣリポソームへのペプチドの添加は、蛍光の青色偏移を生じず（一般に２ｎｍ未満）、かつこれらのペプチド３種のトリプトファン蛍光を減少したのに対し、配列番号：４（ＰＶ７）はＨＥＰＥＳ緩衝液に比べ、ＰＯＰＣリポソームにおいてわずか約５０％のみ増加した（表５）。ＰＯＰＣリポソームの状況における消光剤ＫＩのペプチドへの添加は、緩衝液中のペプチド同様、濃度依存的方法でトリプトファン蛍光の抑制を生じ（表５）、これはＰＯＰＣ中のポリフェムシンペプチドのトリプトファン残基が依然消光剤と接近可能であることを示唆している。従ってＰＯＰＣの存在下でのトリプトファン蛍光強度の変化は、おそらくリポソームによる光散乱および／またはペプチドのリポソーム表面との会合を反映しているであろう。
【００８０】
ラングミュア単層アッセイ法
脂質単層を、円形テフロン製トラフ（ｄ＝４．５ｃｍ、総容積１１．５ｍｌ）中に入った水の上に、ヘキサンまたはクロロホルムに溶解した適当な脂質を載せることにより形成した。トラフの側面の小さいポートは、単層を崩すことなく、亜相へ試薬を注入することを可能にした。この亜相を、磁気撹拌子で４５ｒｐｍで穏やかに混合した。表面圧力測定値を、Ｗｈｉｌｈｅｌｍｙプレート法（Ｍａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２：３１６−３２１（１９８３））を用いて得た。このプレートは、メタノールで３回洗浄し、２度蒸留した水で完全にすすぎ、その後各表面圧力測定した。実験は２３℃で行った。
【００８１】
緩衝液単独（５ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１５０ｍＭ ＮａＣｌ）または２ｍＭもしくは５ｍＭ ＭｇＣｌ２の存在する緩衝液上に、ＬＰＳ溶液（クロロホルム／メタノール／Ｈ２Ｏ、１７／７／１（ｖ／ｖ）中０．５ｍｇ／ｍｌ）を広げることにより、気液界面のＬＰＳ単層フィルムを得た（ＦｒｉｅｄおよびＲｏｔｈｆｉｅｌｄ、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、５１４：６９−８２（１９７８））。
【００８２】
大腸菌細胞のリン脂質は、中性脂質ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびアニオン性脂質ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）およびカルジオリピン（ＣＬ）の７８：４．７：１４．４の比の混合物、更に少量の脂質種を含む（Ｈｒｉｓｔｏｖａら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７２：２４２２４−２４２３３（１９９７））。大腸菌細胞膜を模倣する単層を、ＰＯＰＥ：ｅｇｇ−ＰＧ：ＣＬ（７８：４．７：１４．４）から作成し、かつポリフェムシン−様ペプチドのこのような単層と相互作用する能力を評価した。所定の脂質単層のヘッド基とのみ相互作用する分子は、この単層の表面圧力を増大しなかった。従って、タンパク質またはペプチド分子が単層を浴している亜相に注入された場合、対応する表面圧力の変化（Δπ）は、この膜へのタンパク質またはペプチド挿入の結果および脂肪アシルコアの妨害として理解され得る。図５Ａは、ペプチド濃度の関数としての表面圧力の変動を示している。全てのペプチドは、ペプチド濃度のＳ字関数として表面圧力の上昇を誘導するように見え（図５Ａ）、結果は、ペプチド分子の単層との協力的な相互作用と一致する。ポリフェムシンＩは、プラトーのΔπ値により示されるように、表面圧力を変調するのに最も効果的なペプチドであり、これはポリフェムシンＩ、配列番号：１１（ＰＶ５）、配列番号：４（ＰＶ７）および配列番号：３（ＰＶ８）について、各々、７．４、５．２、４．７および４．５であった。
【００８３】
各ペプチドの脂質特異性を、ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ｅｇｇ−ＰＧまたはＣＬ単層の亜相へのペプチド１μｇ／ｍｌの添加時の、表面圧力変化の程度をモニタリングすることにより評価した（図５Ｂ）。全てのペプチドが、負帯電した脂質と選択的に相互作用し、かつ一般にＰＧ単層の方がＣＬ単層よりもより大きい作用を有した。図５Ａの知見と一致するが、ポリフェムシンＩは、ＰＧ単層に対して最大の作用を有した。しかしこれらのペプチドはいずれも、ＰＯＰＣまたはＰＯＰＥのような中性脂質により作成された単層は貫通することができた。
【００８４】
外膜との相互作用を模倣するために、ＬＰＳで作成した単層を用い、グラム陰性菌外膜の外側小葉を模倣した。こうしてペプチドのＬＰＳ単層と相互作用する能力は、それが外膜を透過する能力を反映している。図６に示したように、概してＬＰＳ単層との相互作用に関する実質的差異は、ポリフェムシンＩとその変種の間に認められなかった。これらのペプチドの、添加されたＭｇ２＋の非存在下でのＬＰＳ単層を透過する同様の能力が明らかにされた。ペプチドは一般にＬＰＳ上の二価カチオン結合部位と相互作用するという知見と一致するように、Ｍｇ２＋の添加は、濃度依存的に、ペプチドが媒介した表面圧力の変化の減少を和らげた（図６）。
【００８５】
実施例７：ポリフェムシン−様ペプチドの特徴決定
円偏光二色性（ＣＤ）分光分析
本発明のペプチドのＣＤスペクトルは、経路長１−ｍｍの石英セルを用い、Ｊａｓｃｏスペクトルマネージャーに連結したＭｏｄｅｌ Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ社、東京、日本）上で記録した。ＣＤスペクトルは、１０ｍＭ ＳＤＳ存在および非存在下の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中２５℃で、１９０〜２５０ｎｍの間で、走査速度１０μｍ／分で測定した。緩衝液またはＳＤＳによる円示差走査（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）の小さい寄与は、緩衝液またはＳＤＳ単独のＣＤスペクトルを、緩衝液またはＳＤＳ中のペプチドの値から減ずることにより除去した。示されたスペクトルは、１０回の走査の平均値である。
【００８６】
円偏光二色性（ＣＤ）分光分析を、ある本発明のペプチドについて行った。緩衝液中のポリフェムシンＩのＣＤスペクトルは、約２２４ｎｍおよび２０２ｎｍに２本の正のバンドを示し、これはＩＩ型β−ターンにより支配された構造のスペクトル典型であり（図２）、および事実上タキプレシンＩについて公表されたＣＤスペクトルと同じであった（Ｒａｏ、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３６１：１２７−１３４（１９９９））。芳香族アミノ酸が、２２４ｎｍバンドに部分的に寄与することが示唆されていることに注意することは価値がある（Ｃｈａｎｇら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、９１：１３−１７（１９７８））。アニオン性−膜環境は、１０ｍＭ ＳＤＳを用いて模倣した。この条件下で、ポリフェムシンＩは、２００ｎｍ近傍に強力な正の楕円率および２１７ｎｍ近傍に負の楕円率を伴う異なるＣＤスペクトルを示し（図２Ａ）、これらは両方とも典型的β−シート構造であり、かつ酸性リポソームの存在下でタキプレシンＩについても認められた（Ｍａｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２２：３１６−３２１（１９８３））。従ってポリフェムシンＩのＮＭＲ構造は決定されていないが、ジスルフィド結合により安定化された逆平行β−シート構造およびＩＩ型β−ターンを伴うタキプレシンＩのものに類似している可能性は高い。試験した３種のペプチド（配列番号：３、４および１１）は、１０ｍＭ ＳＤＳの存在下およびリン酸緩衝液体中の両方において同様のスペクトルを有したが、ピーク楕円率の大きさはペプチド毎に異なり、特にリン酸緩衝液存在下での２００−２０４ｎｍ周辺の正のピークは、大きさおよび実際のピーク波長が若干変動した。おそらくこれらのペプチドは、この領域に誘導された残基の変化のために、リン酸緩衝液中でより顕著でないβ−ターンを示しているが、ＳＤＳ中では同様のβ−シート構造が明らかである。
【００８７】
本発明は現時点で好ましい態様により説明されているが、本発明の精神から逸脱しない限りは、様々な変更を行うことができることは理解されなければならない。従って本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】タキプレシン、ポリフェムシンＩおよびその変種のアミノ酸配列（一文字アミノ酸コードを使用）を示している。ジスルフィド結合は、実線で示した。変種において置換されたアミノ酸には下線をつけた（ＰＶ５：配列番号：１１；ＰＶ７：配列番号：４、およびＰＶ８：配列番号：３）。
【図２】ポリフェムシンＩおよび選択された本発明のペプチドの円偏光二色スペクトルを示している。Ａは、ポリフェムシンＩのスペクトルを示し；Ｂは、配列番号：１１（ＰＶ５）のスペクトルを示し；Ｃは、配列番号：４（ＰＶ７）のスペクトルを示し；およびＤは、配列番号：３（ＰＶ８）のスペクトルを示している。このスペクトルは、リン酸緩衝液（実線）および１０ｍＭ ＳＤＳ（点線）中で示した。ペプチドは、濃度２５μＭで使用した。
【図３】ｄｉＳＣ３５アッセイ法により評価した、ペプチドによる大腸菌ＤＣ２細胞膜の脱分極を示している。矢印は、ペプチド０．２５μｇ／ｍｌが添加された時点を示す。ＰＶ５：配列番号：１１；ＰＶ７：配列番号：４、およびＰＶ８：配列番号：３。
【図４】水性消光剤ＫＩによる、ペプチドトリプトファン蛍光データの消光のＳｔｅｒｎ−Ｖｏｌｍｅｒプロットである。点線は、リポソーム懸濁液（ＰＯＰＣ／ＰＯＰＧ、７：３）に添加したペプチドのデータを表し、実線は１０ｍＭ ＨＩＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．５）における消光のデータを表している。
【図５】水性亜相に浴している脂質単層へのペプチド添加の、ラングミュアバランスで測定した表面圧力に対する影響を示している。Ａは、ペプチド濃度の関数としての表面圧力増加のプロットである。単層は、混合した脂質（ＰＯＰＣ：ｅｇｇ−ＰＧ：ＣＬ、容量比７８：４．７：１４．７）により薄く広げられ、初期圧力２０±１ｍＮ／ｍを生じ、ペプチド添加前に５分間安定化させた。表面圧力の測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）は、ペプチド連続量を亜相へ添加しながら、フィルム表面圧力をモニタリングすることにより達成した。Ｂは、ＰＯＰＣ、ＰＯＰＥ、ｅｇｇ−ＰＧまたはＣＬのいずれかにより作成された水性亜相に浴している単層へのペプチド１μｇ／ｍｌ添加の表面圧力への影響を示している。結果は、２回の個別の実験の平均を示している。
【図６】水性亜相に浴しているサルモネラ・ミネソタ Ｒｅ ＬＰＳ単層へのペプチド０．８μｇ／ｍｌ添加の表面圧力への影響を示している。亜相のＭｇ２＋濃度は変動した。単層は薄く広げ、初期圧力１８±１ ｍＮ／ｍを達成させ、ペプチド添加前に５分間安定化させた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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