(57)【要約】この発明は、検出可能な信号を送信することのできるラベルを含む少なくとも１つの第１のアームと、マイクロアレイ上のＲＮＡ試薬に付着させた捕捉配列に相補的なヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第２のアームとを有する捕捉試薬を用いて、ターゲット試料のＲＮＡ試薬に特定のヌクレオチド配列が存在するかどうかを判定するための方法に向けられる。
2004506179.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット試料のＲＮＡ試薬に特定のヌクレオチド配列が存在するかどうかを判定するための方法であって、
ａ）　混合物をインキュベートするステップを含み、前記混合物は、
（ｉ）　ターゲット試料から直接抽出されたＲＮＡ試薬を含む第１の成分を含み、前記ＲＮＡ試薬は、ターゲットヌクレオチド配列および捕捉配列を有し、前記混合物はさらに、
（ｉｉ）　検出可能な信号を送信することのできるラベルを含む少なくとも１つの第１のアームと、前記第１の成分の前記ＲＮＡ試薬の前記捕捉配列に相補的なヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第２のアームとを有する捕捉試薬を含む、第２の成分を含み、前記インキュベートするステップは、
第１の温度で、前記第１の成分の前記ＲＮＡ試薬の前記捕捉配列が前記第２の成分の前記捕捉試薬の前記相補的なヌクレオチド配列に結合し、それにより、前記ターゲットヌクレオチド配列を含む、プレハイブリダイズされたＲＮＡ−捕捉試薬複合体を形成するのに十分な時間だけ行なわれ、前記方法はさらに、
ｂ）　前記プレハイブリダイズされたＲＮＡ−捕捉試薬複合体を、各々が特定のプローブヌクレオチド配列を含む複数の形をその上に有するマイクロアレイに接触させるステップと、
ｃ）　前記プレハイブリダイズされたＲＮＡ−捕捉試薬複合体を、マイクロアレイ上において第２の温度で、前記プレハイブリダイズされたＲＮＡ−捕捉試薬複合体の前記ターゲットヌクレオチド配列が、前記形の中に含まれる前記相補的なプローブヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに十分な時間だけ、インキュベートするステップとを含み、このようなハイブリダイゼーションが存在する場合は、前記対応する形から前記検出可能な信号が結果的に送信され、このようなハイブリダイゼーションが存在しない場合は、前記対応する形から前記検出可能な信号が結果的に送信されず、したがって、後の分析のために検出可能なハイブリダイゼーションパターンを生成する、方法。
【請求項２】
前記捕捉試薬は、デンドリマー、炭水化物、たんぱく質、および核酸を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記捕捉試薬はデンドリマーである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
塩基溶液を前記マイクロアレイ上に通して、前記ハイブリダイズされたＲＮＡ試薬を前記プローブヌクレオチド配列から分離して除去し、前記マイクロアレイの再使用を可能にするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記塩基溶液は、約５０〜６０℃の温度で前記マイクロアレイ上に通される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記塩基溶液は、０．０５Ｍの水酸化ナトリウムである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡ試薬の前記捕捉配列は、少なくとも１つのアデニン塩基を含む、一本鎖のオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記捕捉配列に相補的な前記ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのチミン塩基を含む、一本鎖のオリゴヌクレオチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡ試薬と前記捕捉試薬とは、約４５〜６０℃の前記第１の温度でインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ試薬と前記捕捉試薬とは、約１５分〜２４時間の範囲の十分な時間だけインキュベートされる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プレハイブリダイズされたＲＮＡ／捕捉試薬複合体は、前記マイクロアレイ上で、約４５〜６５℃の前記第２の温度でインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記プレハイブリダイズされたＲＮＡ／捕捉試薬複合体は、前記マイクロアレイ上で、約１５分〜２４時間の範囲の十分な時間だけインキュベートされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マイクロアレイの前記プローブヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２の温度は、約６０〜６５℃である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記マイクロアレイの前記プローブヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の温度は、約４５〜５５℃である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記マイクロアレイ上で前記プレハイブリダイズされたＲＮＡ／再捕捉試薬複合体をインキュベートするステップの後に、遊離する、ハイブリダイズされなかったＲＮＡ／捕捉試薬複合体のすべてを前記マイクロアレイから洗浄するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１および第２の成分のインキュベートの後に、ブロッキング核酸を前記第１および第２の成分の混合物に加えるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ターゲット試料のＲＮＡ試薬に特定のヌクレオチド配列が存在するかどうかを判定するための方法であって、
ａ）　各々が特定のプローブヌクレオチド配列を含む複数の形をその上に有するマイクロアレイに対し、ターゲット試料から直接抽出されたＲＮＡ試薬を含む第１の成分を接触させるステップを含み、前記ＲＮＡ試薬は、ターゲットヌクレオチド配列と捕捉配列とを有し、前記方法はさらに、
ｂ）　前記ＲＮＡ試薬と前記相補的なプローブヌクレオチド配列とを、前記マイクロアレイ上において第１の温度で、前記ＲＮＡ試薬の前記ターゲットヌクレオチド配列が、前記形の中に含まれる前記相補的なプローブヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに十分な時間だけ、インキュベートするステップと、
ｃ）　検出可能な信号を送信することのできるラベルを含む少なくとも１つの第１のアームと、前記第１の成分の前記ＲＮＡ試薬の前記捕捉配列に相補的なヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第２のアームとを有する捕捉試薬を含む、第２の成分に接触するステップと、
ｄ）　前記捕捉試薬と前記ＲＮＡ試薬の前記捕捉配列とを、第２の温度で、前記第１の成分の前記ＲＮＡ試薬の前記捕捉配列が、前記第２の成分の前記捕捉試薬の前記相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに十分な時間だけ、インキュベートするステップとを含み、前記ハイブリダイゼーションが存在する場合は、前記対応する形から前記検出可能な信号が結果的に送信され、前記ハイブリダイゼーションが存在しない場合は、前記対応する形から前記検出可能な信号が結果的に送信されず、したがって、後の分析のために検出可能なハイブリダイゼーションパターンを生成する、方法。
【請求項２０】
前記捕捉試薬は、デンドリマー、炭水化物、たんぱく質、および核酸を含む群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記捕捉試薬はデンドリマーである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
塩基溶液を前記マイクロアレイ上に通して、前記ハイブリダイズされたＲＮＡ試薬を前記プローブヌクレオチド配列から分離して除去し、前記マイクロアレイの再使用を可能にするステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記塩基溶液は、約５０〜６０℃の温度で前記マイクロアレイ上に通される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記塩基溶液は、０．０５Ｍの水酸化ナトリウムである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＲＮＡ試薬の前記捕捉配列は、少なくとも１つのアデニン塩基を含む、一本鎖のオリゴヌクレオチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記捕捉配列に相補的な前記ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのチミン塩基を含む、一本鎖のオリゴヌクレオチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＲＮＡ試薬および前記マイクロアレイ上の前記相補的なプローブヌクレオチド配列は、約４５〜６０℃の前記第１の温度でインキュベートされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＲＮＡ試薬および前記マイクロアレイ上の前記相補的なプローブヌクレオチド配列は、約１５分〜２４時間の範囲の十分な時間だけインキュベートされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記マイクロアレイの前記プローブヌクレオチド配列は、ｃＤＮＡを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１の温度は、約６０〜６５℃である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記マイクロアレイの前記プローブヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチドを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２の温度は、約４５〜５５℃である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記捕捉試薬と前記ＲＮＡ試薬の前記捕捉配列とは、約４５〜６０℃の範囲の第２の温度でインキュベートされる、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記捕捉試薬と前記ＲＮＡ試薬の前記捕捉配列とは、約１５分〜２４時間の範囲の十分な時間だけインキュベートされる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記マイクロアレイ上で前記ＲＮＡ試薬の前記捕捉配列と前記捕捉試薬とをインキュベートするステップの後に、ブロッキング核酸を前記マイクロアレイに加えるステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
前記マイクロアレイ上で前記ＲＮＡ試薬および前記相補的なヌクレオチドプローブをインキュベートするステップの後に、前記マイクロアレイを緩衝液で洗浄して、ハイブリダイズされなかった過剰なＲＮＡ試薬を除去するステップをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＲＮＡ試薬の前記捕捉配列は、少なくとも１つの固定核酸ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＲＮＡ試薬の前記捕捉配列は、少なくとも１つの固定核酸ヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願】
この出願は、この明細書で引用により完全に援用される、２０００年７月１９日に出願された米国仮出願連続番号第６０／２１９，３９７号の優先権を主張する。
【０００２】
【発明の分野】
この発明は、一般に、核酸分析に関し、より特定的に、ハイブリダイゼーションにより核酸配列を検出および分析するための方法に関する。
【０００３】
【発明の背景】
遺伝子発現パターンまたはＤＮＡ配列の変化は、生物学的機能に強い影響を及ぼし得る。遺伝子発現のこのような変化は、結果的に、生理学的および病理学的な過程の変更を生じる。ＤＮＡ技術の開発により、大規模なレベルで遺伝子の発現および遺伝子の変化を同定するための、迅速でありかつ費用効果の高い方法が提供されている。有用な開発の１つには、核酸配列の試料を迅速に検出し、分析するのに有用なＤＮＡマイクロアレイがある。各マイクロアレイは、短い時間期間に、数千もの個別の「試験管」実験に相当する実験を行なうことができ、それによって数千の発現遺伝子を迅速にかつ同時に検出することができる。マイクロアレイは、遺伝子の変異または突然変異の存在を判定するための試料分析（すなわち遺伝子型決定）、または遺伝子発現パターンを得るための試料分析等の適用の範囲で実現されてきた。
【０００４】
一般に、マイクロアレイは、直径が約２０ミクロン以下の小さな点または形からなる格子で被覆された、ガラスカバースライド、シリコンプレート、またはナイロン膜等の実質的に平面の基板を含む。点または形の各々は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の鎖から抽出された、核酸の特定の配列のコピーを数百万個含む。このような数の形が含まれているために、予め定められた形の各々に置かれた各配列をたどるために、典型的にはコンピュータが用いられる。メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が細胞の試料から抽出される。鋳型として働くｍＲＮＡは、逆転写されて相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生じる。先行技術の第１の例として、蛍光等のラベルまたはマーカーの１つ以上が逆転写の過程中にｃＤＮＡのコピーに直接取込まれる。ラベリングされたｃＤＮＡのコピーを短いフラグメントに破壊して、マイクロアレイ上で洗浄する。好適なハイブリダイゼーション状態下において、ラベリングされたフラグメントを迅速に検出するために、それらをマイクロアレイの形に付着させた相補的な核酸配列（すなわち、遺伝子プローブ）とハイブリダイズするか、またはアニールする。このラベリング方法は、一般に、「直接取込み」と呼ばれてきた。
【０００５】
ｃＤＮＡがマイクロアレイにハイブリダイズされると、そこに付着させた相補的な核酸配列とハイブリダイズしたｃＤＮＡフラグメントを含む形の各々から、検出可能な信号（蛍光等）が陽性結果として送出される。検出可能な信号は、適切なセンサ装置または顕微鏡にとって可視であり、次に、コンピュータまたはユーザに検出されて、ハイブリダイゼーションパターンを生成することができる。各形における核酸配列が既知であるために、特定の形における陽性結果（すなわち、信号生成）はすべて、試料細胞に相補ｃＤＮＡ配列が存在することを示す。ミス対合が時々生じるが、点または形の各々に数百万の遺伝子プローブを付着させることにより、試験試料の相補ｃＤＮＡが存在さえしていれば、検出可能な信号が確実に強く送出される。
【０００６】
マイクロアレイで検出しかつ分析するための核酸配列試料を調製する先行技術の方法の第２の例を図１に示し、以下に説明する。公知の方法を用いて、既知の核酸配列を含む複数の遺伝子プローブの各々が、マイクロアレイの表面上の予め定められた位置に添付または印刷される。マイクロアレイへの遺伝子プローブの付着は、典型的に、公知の機械またはレーザによるリトグラフ処理を介して行なわれる。試料は、ＲＮＡの形態で細胞から抽出される。ＲＮＡは比較的不安定であり、急速にかつ容易に分解するために、核酸の、より安定しかつ抵抗力のある形態が典型的に用いられる。安定した核酸は、逆転写という公知の技術によってＲＮＡ試料（全ＲＮＡおよびポリ（Ａ）＋ＲＮＡ等）から調製される、相補ＤＮＡである。付着させた捕捉配列を有する逆転写プライマ（ＲＴプライマ）が逆転写の過程で用いられる。その結果、ターゲットｃＤＮＡは、５’の端に捕捉配列を位置付けて形成される。次に、捕捉配列を有して新規に形成されたターゲットｃＤＮＡを、ｍＲＮＡ試料から単離して沈殿させる。ターゲットｃＤＮＡを、マイクロアレイに添付した相補的な遺伝子プローブにハイブリダイズする。ターゲットｃＤＮＡとマイクロアレイとをハイブリダイズした後に、マイクロアレイを洗浄して、ラベリングの前にあらゆる過剰なＲＴプライマを除去する。次に、ラベリングされた「樹状核酸分子」、または「デンドリマー」を含んだ混合物を調製する。
【０００７】
デンドリマーは、複雑な、細かく分岐した分子であり、二本鎖ＤＮＡの天然または合成の単量体サブユニットを複数個だけ相互接続したものからなり、安定した球様コア構造を形成し、そこから予め定められた数の「自由端」または「アーム」を伸張させている。デンドリマーは蛍光等のラベリング反応のための効率のよい手段をもたらし、予め定められた信号生成強度およびマイクロアレイ上に結合されたｃＤＮＡとの比例関係により、結合された転写の数の直接計算を容易にする。
【０００８】
各デンドリマーは、コア表面から延びる、２種類のハイブリダイゼーション用の「自由端」または「アーム」を含む。各デンドリマーは、各種類のアームを少なくとも１００本含むよう構成されてよい。これらのアームの各々は、ターゲットまたはラベル等の機能分子に結合またはハイブリダイズされ得る特定の配列の一本鎖ＤＮＡを含む。ターゲット分子を一方の種類のアームに付着させて、デンドリマーにターゲティング能力を与えることができ、ラベル分子を他方の種類のアームに付着させて、デンドリマーにそれを検出するための信号送出能力を与えることができる。ターゲット分子は典型的に、ターゲットの捕捉配列に相補的なオリゴヌクレオチドであり、ラベル分子は典型的に、ラベルまたはマーカーに連結されたオリゴヌクレオチドである。簡単なＤＮＡラベリング、ハイブリダイゼーション、および結合反応を用いることにより、デンドリマーは、高度にラベリングされた、ターゲットに特異的なプローブとして働くよう構成され得る。デンドリマーは、ジャーナル・オブ・セオレティカル・バイオロジー（Ｊ． Ｔｈｅｏｒ． Ｂｉｏｌ．）１８７、２７３〜２８４頁（１９９７年）のニルセン（Ｎｉｌｓｅｎ）他による「樹状核酸構造（Ｄｅｎｄｒｉｃ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」、およびフィジオロジカル・ゲノミクス（Ｐｈｉｓｉｏｌ． Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）、３：９３〜９９頁（２０００年）のスティアズ（Ｓｔｅａｒｓ）他による「デンドリマー技術を用いた高密度マイクロアレイのための新規の高感度検出システム（Ａ Ｎｏｖｅｌ， Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ Ｕｓｉｎｇ Ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」に詳細に記載されており、各々の内容のすべてをこの明細書で引用により援用する。
【０００９】
準備された混合物を好適な緩衝剤内で調整し、一方の種類のアームにはラベルを付着させかつ他方の種類のアームにはｃＤＮＡの捕捉配列に相補的なオリゴヌクレオチドを付着させたデンドリマーを含むデンドリマーハイブリダイゼーション混合物を生じる。ラベリングしたデンドリマーをマイクロアレイに加え、結合されたｃＤＮＡの捕捉配列とハイブリダイズさせ、対応する形から検出可能な信号を生成する。マイクロアレイを洗浄して、ハイブリダイズされなかった過剰なデンドリマー分子のすべてを除去し、所望しない雑音の生成を減じる。従来技術を用いてマイクロアレイを走査して、ラベルによって送信される検出可能な信号を検出し、分析用に特定のハイブリダイゼーションパターンを生成する。上述の先行技術の方法では、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のステップを含む、試料の調製および分析において、かなりの時間、作業、および労力を要することが公知である。
【００１０】
感度、少ないバックグラウンド「ノイズ」、および最小の「偽陽性」等の望ましい属性を犠牲にすることなく、試料を調製して分析を行なうのに必要とされるステップ数および時間量を実質的に減じることが極めて望ましいであろう。遺伝子試料を調製するのに必要とされる複雑さおよび労力を著しく減じ、ハイブリダイゼーション前に試料から直接抽出されてｃＤＮＡに転換されるべきＲＮＡを必要とせず、この発明の、遺伝子発現を分析するための方法において、ＲＮＡ試料を直接用い、従来の実験試薬、設備、および技術を用いて実行することのできる方法をさらに提供することが、遺伝子発現検出マイクロアレイにおいて大きな進歩となるであろう。
【００１１】
【発明の概要】
この発明は、ハイブリダイゼーションの過程を介して、試料の核酸ターゲット分子にヌクレオチドの特定の配列が存在するかどうかを分析して検出し、かつ、その試料を時間および労力を消費して酵素的に相補コピーへと変換する必要のない方法に関する。この発明は、ターゲット核酸試料の遺伝的プロファイルおよびその試料が得られたソースに関する情報を得るために、核酸ターゲット分子を処理して分析するのに典型的に必要とされる時間および労力を著しく減じる。この発明は、感度が非常に良く、バックグラウンド「ノイズ」が少なく、「偽陽性」が最小のマイクロアレイをさらに提供する。この発明の方法は、遺伝子発現プロファイリングおよび高スループットの機能的ゲノム解析等のゲノミックアプリケーションの範囲で用いることができる。
【００１２】
この発明は、ターゲット試料のＲＮＡ試薬内に特定のヌクレオチド配列が存在するかどうかを検出するための方法に向けられる。この発明の特定の局面において、この発明は、
ａ）　混合物をインキュベートするステップを含み、この混合物は、
（ｉ）　ターゲット試料から直接抽出されたＲＮＡ試薬を含む第１の成分を含み、ＲＮＡ試薬は、ターゲットヌクレオチド配列および捕捉配列を有し、この混合物はさらに、
（ｉｉ）　検出可能な信号を送信することのできるラベルを含む少なくとも１つの第１のアームと、第１の成分のＲＮＡ試薬の捕捉配列に相補的なヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第２のアームとを有する捕捉試薬を含む、第２の成分を含み、このインキュベートするステップは、
第１の温度で、第１の成分のＲＮＡ試薬の捕捉配列が第２の成分の捕捉試薬の相補的なヌクレオチド配列に結合し、それにより、ターゲットヌクレオチド配列を含む、プレハイブリダイズされたＲＮＡ−捕捉試薬複合体を形成するのに十分な時間だけ行なわれ、この方法はさらに、
ｂ）　プレハイブリダイズされたＲＮＡ捕捉試薬複合体を、各々が特定のプローブヌクレオチド配列を含む複数の形をその上に有するマイクロアレイに接触させるステップと、
ｃ）　プレハイブリダイズされたＲＮＡ−捕捉試薬複合体を、マイクロアレイ上において、第２の温度で、プレハイブリダイズされたＲＮＡ−捕捉試薬複合体のターゲットヌクレオチド配列が、形の中に含まれる相補的なプローブヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに十分な時間だけ、インキュベートするステップとを含み、このようなハイブリダイゼーションが存在する場合は、対応する形から検出可能な信号が結果的に送信され、このようなハイブリダイゼーションが存在しない場合は、対応する形から検出可能な信号が結果的に送信されず、したがって、後の分析のために検出可能なハイブリダイゼーションパターンを生成する。
【００１３】
この発明の別の局面において、ターゲット試料のＲＮＡ試薬に特定のヌクレオチド配列が存在するかどうかを判定するための方法が提供される。この方法は、
ａ）　各々が特定のプローブヌクレオチド配列を含む複数の形をその上に有するマイクロアレイに対し、ターゲット試料から直接抽出されたＲＮＡ試薬を含む第１の成分を接触させるステップを含み、ＲＮＡ試薬は、ターゲットヌクレオチド配列と捕捉配列とを有し、この方法はさらに、
ｂ）　ＲＮＡ試薬と相補的なプローブヌクレオチド配列とを、マイクロアレイ上において第１の温度で、ＲＮＡ試薬のターゲットヌクレオチド配列が、形の中に含まれる相補的なプローブヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに十分な時間だけ、インキュベートするステップと、
ｃ）　検出可能な信号を送信することのできるラベルを含む少なくとも１つの第１のアームと、第１の成分のＲＮＡ試薬の捕捉配列に相補的なヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第２のアームとを有する捕捉試薬を含む、第２の成分に接触するステップと、
ｄ）　捕捉試薬とＲＮＡ試薬の捕捉配列とを、第２の温度で、第１の成分のＲＮＡ試薬の捕捉配列が第２の成分の捕捉試薬の相補的なヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに十分な時間だけ、インキュベートするステップとを含み、ハイブリダイゼーションが存在する場合は、対応する形から検出可能な信号が結果的に送信され、ハイブリダイゼーションが存在しない場合は、対応する形から検出可能な信号が結果的に送信されず、したがって、後の分析のために検出可能なハイブリダイゼーションパターンを生成する。
【００１４】
この発明の好ましい形態において、好ましい捕捉試薬はデンドリマーである。
同じ参照記号が同じ部分を示す以下の図面は、この発明の実施例を例示するものであり、この出願の一部をなす請求項によって包含されるように、この発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【００１５】
［詳細な説明］
この発明は、一般に、マイクロアレイ上のゲノム試料を分析する際に典型的に必要とされる時間および労力を著しく減じる態様で、マイクロアレイ上での検出および分析のために核酸配列試料を調製するための方法に向けられる。この発明の方法は、用いるステップの数を減じながらも、研究用および臨床用に使用するのに必要とされる感度、バックグラウンド「ノイズ」の低減、および最小の「偽陽性」をもたらし、核酸配列の試料をより短い時間期間内で調製する利点を提供する。この発明は、費用効果および費用効率の高い態様で、核酸配列試料を調製しかつこの発明の方法を従来の実験用技術、設備、および試薬を用いて実現することができるため、遺伝子発現プロファイリングおよび高スループットの機能的ゲノム解析等のゲノミックアプリケーションで使用するのに特に好適である。
【００１６】
この発明をさらに説明する前に、この発明が、以下に説明する発明の特定の実施例に限定されないことを理解されたい。なぜなら、特定の実施例の変形物が形成されてよく、それらもまた前掲の請求項の範囲内にあり得るからである。また、使用された用語が特定の実施例を説明するためのものであり、限定するために意図されていないことを理解されたい。代わりに、この発明の範囲は前掲の請求項によって確立される。
【００１７】
この発明の方法では、実質的に平面の基板表面に固定されたか、または安定した態様で連結されたＤＮＡまたは遺伝子プローブのアレイを、当該技術においてこれまで公知であるように調製する。使用することのできる、さまざまな異なるマイクロアレイが当該技術では公知である。遺伝子プローブが安定した態様で連結される基板は、プラスチック、セラミック、金属、ゲル、膜、ガラス等のさまざまな材料で製作されてよい。マイクロアレイは、遺伝子プローブを予め形成した後にそれらを安定した態様で担体表面に結合させるか、または遺伝子プローブを担体上で直接成長させる等の、従来の任意の方法に従って生成されてよい。たとえば、この明細書においてその内容が引用により援用される、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２８３、８３頁、１９９９年に記載された、多数の異なるマイクロアレイ構成およびそれらを生成するための方法が、当業者には公知である。
【００１８】
細胞のターゲット試料から抽出されたターゲット核酸配列と、配列特異的にハイブリダイズすることのできるマイクロアレイのＤＮＡまたは遺伝子プローブは、リン酸ジエステル結合が、ホスホロチオアート、メチルイミノ、メチルホスホネート、ホスホルアミデード、グアニジン等の代用結合群に置換えられた核酸と、リボースのサブユニットを代用した核酸、たとえば、ヘキソースリン酸ジエステル、ペプチド核酸等とを含む、ポリヌクレオチドまたはそれらがハイブリダイズした類似物もしくは擬似物を含み得るが、それに限定されない。プローブの長さは一般に、１０〜１０００ヌクレオチドの範囲である。好ましい実施例において、ＤＮＡまたは遺伝子プローブの各々は、関心のある遺伝子からのＲＮＡ、より好ましくはｍＲＮＡを含むターゲット核酸配列とハイブリダイズするよう、構成または配列される。
【００１９】
この発明のいくつかの実施例において、プローブは、１５〜１５０ヌクレオチド、より一般には１５〜１００ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドである。他の実施例では、プローブがより長くなり、通常は１５０〜１０００ヌクレオチド長の範囲であり、ポリヌクレオチドのプローブは、１本または２本の鎖状であってよく、通常は１本の鎖状であり、ｃＤＮＡ、クローニングされた遺伝子、または核酸配列の他の好適なソースから増幅されたＰＣＲフラグメントであってよい。基板の表面上のＤＮＡまたは遺伝子プローブは、好ましくは、陽性のハイブリダイゼーション事象が、ターゲット核酸試料が得られた生理学的ソース内の特定の遺伝子の発現と相関し得るように、分析されている生理学的ソースの既知の遺伝子に対応してマイクロアレイ上の既知の位置に置かれるが、それに限定されない。以下に説明する、ターゲット核酸試料が生成される態様により、遺伝子プローブのマイクロアレイは、一般に、それらが対応する遺伝子の、メッセンジャーＲＮＡ鎖を含むがそれに限定されないＲＮＡ鎖に対して、相補的な配列を有する。
【００２０】
この明細書で用いられる「ラベル」という用語は、広い意味で、直接に、または信号生成システムの１つ以上のさらなる要素と相互作用することによって、検出可能な信号を生成することのできる作用因子を指す。この発明において直接検出され得、かつ使用され得るラベルには、たとえば、フルオレセイン、ローダミン、ＢＯＤＩＰＹ、シアニン染料（アマーシャム・ファルマシア社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）から等）、アレクサ（Ａｌｅｘａ）染料（モレキューラー・プローブ社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．）から等）、蛍光性染料のホスホルアミダイト等の蛍光性ラベル、および、３２Ｓ、３２Ｐ、３Ｈ等の放射性同位元素が含まれる。信号生成システムの１つ以上のさらなる要素と相互作用することによって検出可能な信号をもたらすラベルの例は、相補的に結合する対要素と特異的に結合する捕捉部分を含み、相補的に結合する対要素は、上述の蛍光性の部分等の直接検出され得るラベル部分を含む。ラベルは、好ましくは、可変信号をもたらさず、その代わりに所与の時間期間にわたって一定かつ再現可能な信号をもたらすものである。
【００２１】
この発明は、検出可能な信号を送信することのできるラベルを含む少なくとも１つの第１のアームと、たとえばＲＮＡ等のターゲット核酸に付着させた捕捉配列に相補的であるヌクレオチド配列を有する少なくとも１つの第２のアームとを含む捕捉試薬をさらに用いる。このような例の１つが「樹状核酸分子」、または「デンドリマー」である。簡潔には、デンドリマーは、複雑な、細かく分岐した分子であり、二本鎖ＤＮＡの天然または合成の単量体サブユニットを複数個だけ相互接続したものからなり、安定した球様のコア構造を形成し、この明細書に説明される目的で、そこから予め定められた数の「アーム」または「自由端」を伸張させている。典型的に、捕捉試薬は、複数の、典型的には多くの第１および第２のアームを有する。デンドリマーの他に、捕捉試薬として、炭水化物、タンパク質、核酸等を用いてよい。デンドリマーは、好適な捕捉試薬の例としてこの明細書で説明される。
【００２２】
各デンドリマーは、コア表面から延びる、２種類のハイブリダイゼーション用の「自由端」または「アーム」を含むよう構成され得る。各デンドリマーは、各種類のアームを少なくとも１００本含むよう構成されてよい。これらのアームの各々は、ターゲットまたはラベル等の機能分子に結合またはハイブリダイズされ得る特定の配列の一本鎖ＤＮＡを含む。ターゲット分子を一方の種類のアームに付着させて、デンドリマーにターゲティング能力を与えることができ、ラベル分子を他方の種類のアームに付着させて、デンドリマーに検出のための信号生成能力を与えることができる。ターゲティング分子は、典型的に、ターゲット核酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドであり、ラベル分子は典型的に、ラベルまたはマーカーに連結されたオリゴヌクレオチドである。簡単なＤＮＡラベリング、ハイブリダイゼーション、および結合反応を用いることにより、デンドリマーは、高度にラベリングされた、ターゲットに特異的なプローブ分子として働くよう構成され得る。
【００２３】
デンドリマーの構造、構成、および生成に関するさらなる情報は、米国特許第５，１７５，２７０号、第５，４８４，９０４号、および第５，４８７，９７３号にも開示されており、この明細書において各々の内容は引用により援用される。
【００２４】
この発明の一実施例によると、ターゲット核酸は、好ましくはＲＮＡの形態をとり、試料から直接抽出されたものであるが、ＤＮＡマイクロアレイとハイブリダイゼーションが生じる十分な条件下でＤＮＡマイクロアレイに接触させて、結果的に相補的遺伝子プローブ／ターゲット複合体のハイブリダイゼーションパターンを生成する。ターゲット核酸とマイクロアレイとのハイブリダイゼーションの前または後に、好適な条件下でラベリングされた捕捉試薬（デンドリマー等）が、ターゲット核酸に結合され、そこで検出可能な信号が生成され、後に特定のハイブリダイゼーションパターンを可視の状態にすることができる。ターゲット核酸とマイクロアレイとの間のハイブリダイゼーション、およびターゲット核酸と捕捉試薬（デンドリマー等）との間のハイブリダイゼーションが、任意の好適な順序で行なわれてよいことに注目されたい。ラベリングされた捕捉試薬（デンドリマー等）の各々は、既知の強度の同じ信号を生成することができ、したがって、マイクロアレイにおける陽性信号の各々が、ターゲット核酸試料の遺伝子プロファイルに関する定量的情報を得るために「カウント」され得る。
【００２５】
この発明の一実施例において、蛍光がラベリングされたデンドリマーは、核酸配列またはターゲット核酸の捕捉配列に相補的な鎖、好ましくはポリデオキシリボチミジン（ポリｄＴ）を、上述の方法により調製された、精製済みの樹状コア材料に結合することによって調製され得る（ニルソン（Ｎｉｌｓｏｎ）他、スティアズ他、上述の内容、および上で述べた特許引用の’２７０号、’９０４号、および’９７３号参照）。ポリｄＴに結合され、ラベリングされたデンドリマーは、ポリデオキシリボアデニジン（ポリｄＡ）を含む捕捉配列を有するポリアデニル化されたＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）等のターゲット核酸とターゲット結合し、かつハイブリダイズすることができる。
【００２６】
上述のとおり、好ましいターゲット核酸はＲＮＡである。ＲＮＡは動作結果が良好でないために、先行技術のゲノミック分析においてターゲット核酸試料として直接用いられることはほとんどなかった。ＲＮＡは急速にかつ容易に分解するという望ましくない傾向を有し、従来のラベリング方法をＲＮＡとともに用いると、適切な信号を生成することができない。捕捉試薬（デンドリマー等）およびこの発明の方法を用いることにより、ゲノミック分析を行なうのに必要とされる時間量およびステップ数が減じられ、したがって、先行技術のゲノミック分析と典型的に関連していたＲＮＡの劣化および分解の程度が少なくとも実質的にない、ＲＮＡの使用が可能になる。さらに、ＲＮＡを直接用いることにより、ＲＮＡ試料を逆転写してターゲットｃＤＮＡを生成する必要がなくなり、分析を行なう際の時間および労力をさらに減じることができる。
【００２７】
また、ＲＮＡを用いることにより、この発明のマイクロアレイは、たとえば０．０５Ｍの水酸化ナトリウムを含む弱塩基の溶液を用いて好適な温度で単に洗浄することによって、再利用され得る。塩基溶液は、ＤＮＡプローブに損傷を与えることなく、または、後の分析でバックグラウンドノイズを生じ得る核酸残基をまったく残すことなく、ハイブリダイズされたターゲットＲＮＡを変成させて、マイクロアレイから除去する。洗浄温度の好ましい範囲は、約５０〜６０℃である。
【００２８】
図２を参照すると、この発明の一実施例のための方法は、一般に、ポリアデニル化された３’端を有するＲＮＡターゲット試料を、相補的な５’デンドリマーポリｄＴ捕捉配列にハイブリダイズして、プレハイブリダイズされたＲＮＡ／デンドリマー複合体を形成するステップを含む。プレハイブリダイズされたＲＮＡ／デンドリマー複合体は、後に、各々が典型的にはｃＤＮＡフラグメントの形態をとった特定の核酸配列を含む、複数の形を含んだマイクロアレイと接触する。ＲＮＡ分子は、特定の形において相補ｃＤＮＡとハイブリダイズする。マイクロアレイを洗浄し、ハイブリダイズされたＲＮＡ／ｃＤＮＡの信号検出および結果的に生じるハイブリダイゼーションパターンを不明瞭にするおそれのある、ハイブリダイズされなかったデンドリマーのすべてを除去する。次に、ハイブリダイズされたＲＮＡ／ｃＤＮＡマイクロアレイを、工業用に使用することのできる任意の好適なマイクロアレイスキャナを用いて走査する。
【００２９】
この発明において、ターゲット核酸は一般に、自然発生ソースから得られたＲＮＡを含み、ＲＮＡを全ＲＮＡ、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ、増幅されたＲＮＡ等から選択することができる。最初のＲＮＡソースはさまざまな異なる試料に存在することが考えられ、試料は典型的に生理学的ソースから得られる。生理学的ソースを、さまざまな真核生物のソースから得ることができ、興味深い生理学的ソースには、酵母菌等の単細胞生物および植物、動物、特に哺乳類を含む多細胞生物から得られたソースが含まれ、多細胞生物からの生理学的ソースは、多細胞生物の特定の器官もしくは組織から、またはそれらから得た分離細胞から得ることができる。
【００３０】
分析すべき試料ＲＮＡを得る際に、生理学的ソースを多数の異なる処理のステップにかけてよく、このような公知の処理のステップには、組織ホモジネート、細胞分離および細胞質抽出、核酸抽出等が含まれてよい。細胞、組織、器官、または生物全体からＲＮＡを分離する方法は、当業者には公知であり、たとえば、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他による『分子クローニング実験マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．）』、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス社（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、１９８９年、およびオーズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他による『分子生物学における現代のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）』、ジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．）、１９９８年に記載されており、各々の内容はこの明細書において引用により援用される。
【００３１】
より好ましくは、ターゲット核酸はポリアデニル化されたＲＮＡ（ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）である。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、アデニン塩基の一本鎖またはポリｄＡ配列を含むオリゴヌクレオチドであり、チミン塩基の一本鎖またはポリｄＴ配列を含む相補的なオリゴヌクレオチドを有するデンドリマーに対し、ハイブリダイゼーション用の場所をもたらす。ポリ（Ａ）＋ＲＮＡおよびポリｄＴ配列を有するデンドリマーを用いることにより、好適なハイブリダイゼーション条件下でＲＮＡ／デンドリマー複合体を容易に形成することができる。次に、ＲＮＡは、好適なハイブリダイゼーション条件下で、マイクロアレイ上の相補ｃＤＮＡと結合する。
【００３２】
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡが、ほとんどのゲノミック試料、および、ヒト、マウス、ラット、ブタ等からの哺乳動物由来のゲノミック試料のすべてに典型的に存在することが注目される。この発明はまた、非ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ試料とともに用いることもできる。このような非ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、この発明では捕捉配列として有用なポリｄＡ配列を欠く。したがって、このような非ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、デンドリマーまたはマイクロアレイに接触させる前に、捕捉配列を付着または結合させることによって調製される。
【００３３】
この発明の一実施例において、酵素による手段を介する等の、ＲＮＡをスプライシングする従来の方法を用いて、好適な捕捉配列をＲＮＡに結合することができる。このような好適な捕捉配列は、当業者に公知の方法を介して付着された、ポリｄＡ配列またはカスタマイズされた核酸配列を含み得る。典型的に、リガーゼ酵素を好適な態様で用いて、２つのオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ鎖を互いにスプライシングするか、または、合成配列をＲＮＡの端部に共有結合させることができる。代替例では、ＲＮＡが捕捉配列として有用な特定のオリゴヌクレオチドを含む場合、この発明の目標を達成するために、相補的なオリゴヌクレオチドをデンドリマーに付着させることができる。好ましい実施例では、非ポリ（Ａ）＋ＲＮＡは、アデニン塩基のオリゴヌクレオチドをＲＮＡ鎖上に形成することのできる酵素を用いることによってポリｄＡ配列に結合される。このような酵素は、ポリ−ＡＤＰ−リボースポリメラーゼを含み得る。これらの方法はいずれも、選択したＲＮＡ試料が、この発明の方法を実施するのに必要とされる適切な捕捉配列を有さない場合に、特に望ましい。上述の酵素による処理は、当業者によって容易に実行され得る。
【００３４】
この発明において、この発明の捕捉配列は、固定型核酸（ＬＮＡ）を含む、変更されたヌクレオチドを含むようさらに適合されて、標準的な、変更されていない配列と通常は関連する上述のものにアニールされた、対応する捕捉配列のヌクレオチドの、融解またはアニーリングの温度属性を高めることができる。ハイブリダイゼーションの過程中に、特に最適温度よりも高い温度でハイブリダイズされた場合に、低融解温度属性によってデンドリマーの捕捉配列とＲＮＡとの間の結合が脆弱なものとなるおそれがある。このように変更された、より高い融解温度のヌクレオチドを含むことにより、より強固なアニーリング結合が形成され、相補的なヌクレオチド間において、耐久性がありかつ永続的なハイブリダイゼーションを生じる。ＬＮＡ変更ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドは、ワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）の塩基対法則に従い、相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズする。しかしながら、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション性能の改良を示す。ＬＮＡ／ＤＮＡおよびＬＮＡ／ＲＮＡの二本鎖分子は、より熱的に安定し、変更した塩基１つにつき、３〜８℃の熱的安定性の上昇を示す。固定核酸は、２’酸素位置を４’炭素位置に接続することによってＤＮＡの骨格を変化させて、核酸の二本鎖分子を安定させるメチレン基リンカーを含むよう変更されたヌクレオチドのフラノース環を有する、核酸類似物の新規のクラスである。このようなＬＮＡ変更ヌクレオチドは、ペプチド核酸等を含んでよいが、これに限定されない。ＬＮＡヌクレオチドを含む合成オリゴヌクレオチドは、ＰＲＯＬＯＧＯ（コロラド州、ボルダー（Ｂｏｕｌｄｅｒ））から利用可能である。この発明の一実施例では、いくつかの位置にＬＮＡ（固定核酸）チミジンヌクレオチド（ＬＮＡ−Ｔ）を含むよう、ポリｄＴ配列を合成することができる。この実施例において、ＬＮＡ変更ポリｄＴを用いて調製されたデンドリマー試薬は、ラベリングされたデンドリマー上の、チミン塩基（ＬＮＡ−Ｔ）配列を含む固定核酸とＲＮＡのポリＡ捕捉配列との間のハイブリダイゼーションの熱的安定性を増大させ、好ましくは、デンドリマーがＲＮＡターゲットを次々と交換することを防ぐ、有益な効果を有するであろう。
【００３５】
この発明の好ましい実施例では、デンドリマーは好適な条件下でポリ（Ａ）＋ＲＮＡとハイブリダイズされ、ポリｄＴユニットのオリゴヌクレオチドを含む捕捉配列を介してＲＮＡの５’端に結合することができる。次に、このＲＮＡ／デンドリマー複合体は、ＲＮＡと特定の形において位置付けられた相補ｃＤＮＡとの間でマイクロアレイにハイブリダイズされ、次に、結合しなかったデンドリマーが洗浄され、除去される。Ｃｙ３またはＣｙ５等のシアン染料で予めラベリングリングされたデンドリマーは、高密度ＤＮＡマイクロアレイに特に好適な、高感度の検出試薬である。
【００３６】
ＲＮＡ／デンドリマー複合体が形成されると、「偽陽性」を生じるおそれのある所望しないハイブリダイゼーションを防ぐために、ｄＡおよび／またはｄＴのオリゴヌクレオチドを含むがこれに限定されないブロッキング核酸または試薬を、ブロッキング核酸または試薬として加えることができる。このようなブロッキング核酸は、デンドリマー上の捕捉配列およびターゲットＲＮＡにそれぞれ相補的な短いセグメントを含む。ブロッキング核酸を加えることにより、非特異的なハイブリダイゼーションを不本意にも生じるおそれのあるデンドリマー上の捕捉配列に対して相補的なポリｄＡの短いセグメントまたは配列を含み得るマイクロアレイ上の特定の形に対し、過剰なデンドリマーが結合することを防ぐ。プレハイブリダイズされたＲＮＡ／デンドリマーにブロッキング核酸を加えることにより、デンドリマーがターゲットＲＮＡを次々と交換することを防ぐことがさらに望ましい。このようなブロッキング核酸は、約１５〜２００塩基単位の範囲であってよい。ブロッキング核酸の好ましい量は、分析に用いられるＲＮＡ試料の１マイクログラム当り、約０．１〜１０マイクログラムの範囲であってよい。ＲＮＡとマイクロアレイとの後のハイブリダイゼーション中に、ＲＮＡが劣化するのを防ぐ助けとなるように、或る量の酵母菌ｔＲＮＡを加えることもまた、望ましいであろう。
【００３７】
検出および分析に好適な、無損傷のかつ安定した状態でターゲットＲＮＡを維持するために、ヌクレアーゼ阻害剤、より好ましくは、リボヌクレアーゼ阻害剤を加え、ハイブリダイゼーションのステップ中にターゲットＲＮＡを保護することがより好ましい。ＲＮＡ　ＳＥＣＵＲＥ（Ｒ）（テキサス州、オースティン（Ａｕｓｔｉｎ）、アンビオン社（ＡＭＢＩＯＮ）から利用可能）等のＲＮＡ保存液をターゲットＲＮＡに加え、ターゲットＲＮＡの分解および劣化の速度を実質的に低減することもできる。
【００３８】
この発明の方法を実施する際に、ポリｄＡ捕捉配列を有する或る量のポリ（Ａ）＋ＲＮＡを、ＲＮＡ捕捉配列に相補的なオリゴヌクレオチド（すなわちポリｄＴ）を有するデンドリマーとハイブリダイズする。捕捉配列およびその相補配列とは、当業者には公知のとおり、デンドリマーがターゲットＲＮＡにハイブリダイズするのを促進するのに十分な時間および温度を含む、好適な条件下において、不可逆的にハイブリダイズするのに十分な塩基単位を有する。好適なハイブリダイゼーション条件は、マニアティス他において開示されているが、ハイブリダイゼーションにおける所望の特異性を達成するために、条件を変更してもよい。この発明において、任意の好適なハイブリダイゼーション緩衝液を用いてよいことがさらに注目される。第１のハイブリダイゼーション温度の好ましい範囲は、約４５〜６５℃、より好ましくは５５℃である。混合物は、約１５分〜２４時間、好ましくは約１５分〜１６時間、より好ましくは約１５〜２０分間インキュベートされて、ターゲットＲＮＡがデンドリマーとハイブリダイズすることを可能にし、プレハイブリダイゼーション混合物を生じる。
【００３９】
プレハイブリダイゼーション混合物をマイクロアレイに加え、第２のハイブリダイゼーション温度で、ＲＮＡがマイクロアレイに結合できる十分な時間だけ、インキュベートする。プレハイブリダイゼーション混合物およびマイクロアレイを、約１５分〜２４時間、好ましくは約２〜１６時間、加湿したチャンバ内において第２のハイブリダイゼーション温度でインキュベートする。第２のハイブリダイゼーション温度の好ましい範囲は、ｃＤＮＡから得られた遺伝子プローブで調製されたマイクロアレイに対しては約６０〜６５℃であり、オリゴヌクレオチドから得られた遺伝子プローブから調製されたマイクロアレイについては約４５〜５５℃である。選択されたマイクロアレイに対してハイブリダイゼーションが完全に確実に生じるのに必要とされる要件を満たすよう、上述の温度は、調整されてもよく、当業者によって好適な態様で決定され得る。
【００４０】
ハイブリダイゼーションのステップに続き、ハイブリダイズされなかったデンドリマーが検出のステップ中に信号を送信し得る場合、洗浄のステップを用いて、ハイブリダイズされなかった複合体をマイクロアレイから除去することにより、マイクロアレイに結合された、ハイブリダイズされたＲＮＡ−デンドリマーの可視的な離散パターンを残す。さまざまな洗浄液およびそれらを用いるためのプロトコルが当業者には公知であり、使用されてよい。用いられる特定の洗浄条件は、用いられる信号生成システムの特有の性質に必然的に依存し、用いられる特定の信号生成システムに精通した当業者にとって公知である。
【００４１】
ラベリングリングされたＲＮＡフラグメントの結果として生じたハイブリダイゼーションパターンは、さまざまな方法で視覚化されるか、または検出されてよく、検出の特定の態様が、この発明で用いられるデンドリマーの特定のラベルに基づいて選択され、標本検出システムには、シンチレーション計測、オートラジオグラフィ、蛍光測定、熱量測定、光射出測定等が含まれる。
【００４２】
上述のとおり、ハイブリダイゼーションおよび任意の洗浄のステップおよび／または後の処理に続き、結果として生じたハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションパターンを検出または視覚化する際に、ラベルの強度または信号値が定性的および／または定量的に検出され得る。
【００４３】
検出または視覚化の後にハイブリダイゼーションパターンを用いることにより、マイクロアレイに接触させてハイブリダイゼーションパターンを生成した、ラベリングされたターゲット核酸試料の遺伝子プロファイルだけでなく、ラベリングされたターゲット核酸試料の得られた生理学的ソースにも関する、定性的および／または定量的な情報を判定することができる。このデータから、生理学的ソースである組織または細胞に発現した遺伝子のタイプだけでなく、各遺伝子の発現レベル等の情報も得ることができる。２つ以上の生理学的ソースからのターゲット核酸を比較する際に本願の方法を用いる場合、ハイブリダイゼーションパターンを比較してパターン間の差を同定することができる。異なるプローブの各々が既知の遺伝子に対応しているマイクロアレイを用いると、あらゆる差異は、比較されている生理学的ソースの特定の遺伝子の発現差に関連し得る。したがって、本願の方法は、遺伝子発現差の分析で用いることができ、有疾患組織および正常な組織、たとえば、腫瘍性の組織および正常な組織、異なる組織または下位組織（ｓｕｂｔｉｓｓｕｅ）のタイプ等の発現差の分析に用いることができる。
【００４４】
上述の説明は、この発明の例示的な実施例を単に開示しかつ説明している。当業者は、これらの説明および前掲の請求項から、前掲の請求項に規定されるとおり、この発明の精神および範囲から逸脱することなく、変形、変更、および修正を行なうことができることを容易に認識するであろう。
【００４５】
例１
マイクロアレイ上の核酸ターゲット分子試料にヌクレオチドの特定の配列が存在するかどうかを判定するための方法を以下に記載する。
【００４６】
マイクロアレイの調製
マイクロアレイの調製は、増幅された１，７００個のｃＤＮＡを、マイクロアレイ作製装置（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ）（カルテシアン・テクノロジーズ社（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を用いてシリアル化ガラススライド（セル・アソシエーツ社（Ｃｅｌｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ））上に配置し、その後、ｃＤＮＡをストラタリンカー（Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ）（ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））でスライド表面に紫外線（ＵＶ）架橋結合することによって行なわれた。
【００４７】
ターゲット核酸配列試料の調製および濃縮
ターゲット核酸配列は、標準的な方法を用いて細胞の試料から抽出した全ＲＮＡとして調製した。この特定の例においては、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡとして公知のかつメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と一般に呼ばれるものを含む、全ＲＮＡ集団の一部を特定のターゲット試料として用いた。１つのアデニン塩基のオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡの配列が、所望の捕捉配列として働いた。
【００４８】
ラベリングされたデンドリマーの調製
デンドリマーを７つのオリゴヌクレオチド、すなわち、鎖１〜７から構成した。７つの鎖を、対にする態様で、Ｔ５０Ｎ２００Ｅ１０８緩衝液（Ｔ５０Ｎ２００Ｅ１０８：５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、および２００ｍＭのＮａＣｌ）内でハイブリダイズし、５つの構築ブロック「単量体」：Ａ、Ｂ’、Ｂ’’、Ｃ’、およびＣ’’を形成した。鎖１および鎖２をハイブリダイズして、「Ａ」単量体を形成した。同様に、鎖３を鎖４にハイブリダイズし、鎖４を鎖５にハイブリダイズして、それぞれＢ’およびＢ’’単量体を生成した。鎖２および鎖６をハイブリダイズすることによってＣ’単量体を調製し、鎖２および鎖７をハイブリダイズすることによってＣ’’単量体を調製した。各単量体は、３１ヌクレオチドの一本鎖アームを４本と、５０塩基の中央部を１つ含む。これらの構築ブロックから、コア樹状構造を構成した。
【００４９】
デンドリマーコアアセンブリは、１つの開始Ａ単量体を、Ｔ５０Ｎ２００Ｅ１０８緩衝液内で２０分間、４２℃において、２つのＢ’単量体および２つのＢ’’単量体とハイブリダイズさせて、１層のデンドリマーを形成することによって得た。Ｃ’単量体およびＣ’’単量体からなる第２の層を１層のアセンブリに加えて２層のデンドリマーを形成し、Ａ単量体上に存在する元の配列を再生成した。３層および４層のデンドリマーは、Ｂ’単量体およびＢ’’単量体に続き、Ｃ’単量体およびＣ’’単量体を順次加えることによって調製した。アセンブリの各層において、４，５’，８−トリメチルスラレン（トリオキサレン）を用い、樹状構造を共有結合で架橋結合した。これは、或る容量のトリオキサレン飽和エタノール溶液の１／１５をハイブリダイゼーション混合物に加えることによって達成された。
【００５０】
２０分間のインキュベーションの後、ハイブリダイゼーション混合物をＵＶ光化学反応チャンバ（モデル　ＨＲＩ１００、シムズ・インストラメンツ社（Ｓｉｍｍｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））内で１０分間、４２℃で架橋結合した。第４の層を構成した後に、４層の樹状コアを、４０℃で動作する、５０％の脱イオン化したホルムアミドを含む１０〜５０％のショ糖勾配液上で超遠心分離を用いて精製した。４層デンドリマーを含む勾配画分をプールし、エタノール沈殿させ、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、および１０ｍＭのＥＤＴＡで再懸濁した。
【００５１】
蛍光でラベリングしたデンドリマーを調製するために、精製した樹状コア材料に合成ｄＴ７０配列を結合させた。４層デンドリマーの外側のアームに相補的であって、かつ、５’端においてＣｙ３−、Ｃｙ５−、または他の等価の望ましいラベルを有する、３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを合成した（オリゴス（Ｏｌｉｇｏｓ）Ｅｔｃ．社）。単一チャネル解析のための一実施例において、コア材料を含むｄＴ７０を別の１つの容器内に置き、Ｃｙ３を結合させたオリゴヌクレオチドをデンドリマー材料の外表面にハイブリダイズして、共有結合で架橋結合した。二重チャネル解析のための第２の実施例では、コア材料を含むｄＴ７０を別の２つの容器／集団に分割した。Ｃｙ３の結合されたヌクレオチド、およびＣｙ５の結合されたオリゴヌクレオチドを、２つのデンドリマー集団の外表面に別々にハイブリダイズして、共有結合で架橋結合することにより、Ｃｙ３ラベルと関連したオリゴｄＴ７０を有する第１のデンドリマー試薬と、Ｃｙ５ラベルと関連したオリゴｄＴ７０を有する第２の別の試薬とを生成した。３つ以上のチャネル解析のための第３の実施例では、コア材料を含むｄＴ７０を、容器／集団のそれぞれの数に分割した。二重チャネル試薬におけるように、ラベリングしたオリゴヌクレオチドを適切な集団に加えて、別の試薬としてハイブリダイズし、架橋結合することにより、各々が関連するラベルによって固有であると規定される、３つ以上の異なる試薬を生成した。
【００５２】
過剰な捕捉オリゴヌクレオチドおよび蛍光オリゴヌクレオチドのあらゆるものを、サイズ排除クロマトグラフィを用いて除去した。デンドリマーの濃度を、分光光度計上の２６０ｎｍにおいて精製された材料の光学密度を測定することによって判定した。蛍光は、蛍光光度計（ＳＰＥＸインダストリーズ社（ＳＰＥＸ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）のフルオロマックス（ＦｌｕｏｒｏＭａｘ））を用いて、最適信号／ノイズ波長で測定した。Ｃｙ３は５４２ｎｍで励起して、発光を５７０ｎｍで測定した。Ｃｙ５は６４１ｎｍで励起して、発光を６７６ｎｍで測定した。
【００５３】
ＲＮＡとラベリングされたデンドリマーとのハイブリダイゼーション
ＲＮＡハイブリダイゼーション緩衝液を以下の構成で、すなわち、４．５％の硫酸ドデシルナトリウム、２００ｍＭの塩化ナトリウム、および０．１Ｍのリン酸ナトリウムで調製した。ＲＮＡハイブリダイゼーション緩衝液を解凍して、１０〜１２分間、６５℃まで過熱することによって再懸濁した。緩衝液を逆さまにして混合し、成分が確実に均一に再懸濁されるようにした。加熱および混合は、全材料が再懸濁するまで繰返された。ＲＮＡを５．０μＬのハイブリダイゼーション緩衝液で再懸濁した。
【００５４】
一実施例では、単一チャネル解析においては、ラベリングされたデンドリマーの一方のタイプ（Ｃｙ３またはＣｙ５）の２．５μｌを、１２．５μＬのＲＮＡハイブリダイゼーション緩衝液と共に再懸濁したＲＮＡに加えた。代替的実施例において、二重チャネル解析については、Ｃｙ３およびＣｙ５でそれぞれラベリングされたデンドリマーの２つのタイプの２．５μｌを、１０μＬのＲＮＡハイブリダイゼーション緩衝液と共に再懸濁したＲＮＡに加えた。複数のチャネル解析（３つ以上のチャネルを含む）のさらなる実施例では、Ｃｙ３，Ｃｙ５、および別のラベル部分を用いて調製された１つ以上のものを含む、ラベリングされたデンドリマーの３つ以上のタイプの２．５μｌのそれぞれを、１０μＬのＲＮＡハイブリダイゼーション緩衝液と共に再懸濁したＲＮＡに加えた。
【００５５】
より大量のハイブリダイゼーション緩衝液については、さらなるＲＮＡハイブリダイゼーション緩衝液を所望の最終量に加えることができる。３５μＬを超える量のハイブリダイゼーション緩衝液が、また、さらなる量のラベリングされたデンドリマーを必要とし得ることに注目されたい。
【００５６】
ＲＮＡハイブリダイゼーション緩衝液混合物を５５℃で１５〜２０分間インキュベートして、ＲＮＡとラベリングされたデンドリマーとのプレハイブリダイゼーションを可能にした。二重または複数のチャネル解析が実施される一実施例では、約２マイクログラムの量のオリゴｄＴ７０を、プレハイブリダイズされたＲＮＡ／デンドリマー混合物に加えて、ＲＮＡ間におけるデンドリマーの交換を防いだ。
【００５７】
プレハイブリダイズされた混合物をマイクロアレイに加え、次に、２時間から１晩、５５℃で、加湿したチャンバ内において、ｃＤＮＡから調製したマイクロアレイについては約６０〜６５℃の温度で、オリゴヌクレオチドから調製したマイクロアレイについては約４５〜５５℃の温度で、インキュベートした。この段階で、ＲＮＡを遺伝子プローブにハイブリダイズした。
【００５８】
ハイブリダイゼーション後の洗浄
マイクロアレイを軽く洗浄し、ラベリングされた過剰なデンドリマーをすべて除去した。まず、マイクロアレイを１０分間、５５℃で０．２％のＳＤＳを含む２Ｘ　ＳＳＣ緩衝液で洗浄した。次に、マイクロアレイを１０分間、室温において２Ｘ　ＳＳＣ緩衝液で洗浄した。最後に、マイクロアレイを１０分間、室温において０．２Ｘ　ＳＳＣ緩衝液で洗浄した。
【００５９】
信号検出
次に、マイクロアレイを共焦点レーザスキャナ（ＧＳＩルモニクス社（Ｌｕｍｏｎｉｃｓ）から利用可能である、スキャンアレイ（ＳｃａｎＡｒｒａｙ）３０００）を用いて走査した。信号およびバックグラウンド信号を検出し、イマジーン（Ｉｍａｇｅｎｅ）定量化ソフトウェアを用いて定量化した。信号は、限局された形の各々内のピクセル強度の平均として測定され、平均バックグラウンドは、マイクロアレイ内のブランクの（遺伝子プローブがない）形のピクセル強度の平均を用いることにより、特定の信号を計算するための、限局された形の直径外のピクセル強度の平均として測定された。
【図面の簡単な説明】
【図１】マイクロアレイ上のターゲット核酸試料を調製しかつ分析するための、先行技術のステップを概略的に示す図である。
【図２】この発明の一実施例において、マイクロアレイ上のターゲット核酸試料を調製および分析するための方法を概略的に示す図である。
【図１】
2004506179.tif 000003
【図２】
2004506179.tif 000004
【国際公開パンフレット】
2004506179.tif 000005
2004506179.tif 000006
2004506179.tif 000007
2004506179.tif 000008
2004506179.tif 000009
2004506179.tif 000010
2004506179.tif 000011
2004506179.tif 000012
2004506179.tif 000013
2004506179.tif 000014
2004506179.tif 000015
2004506179.tif 000016
2004506179.tif 000017
2004506179.tif 000018
2004506179.tif 000019
2004506179.tif 000020
2004506179.tif 000021
2004506179.tif 000022
2004506179.tif 000023
2004506179.tif 000024
2004506179.tif 000025
2004506179.tif 000026
2004506179.tif 000027
2004506179.tif 000028
2004506179.tif 000029
2004506179.tif 000030
2004506179.tif 000031
2004506179.tif 000032
2004506179.tif 000033
2004506179.tif 000034
2004506179.tif 000035
2004506179.tif 000036
2004506179.tif 000037
2004506179.tif 000038
2004506179.tif 000039
2004506179.tif 000040
2004506179.tif 000041
2004506179.tif 000042
2004506179.tif 000043
2004506179.tif 000044
2004506179.tif 000045
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004506179.tif 000046
2004506179.tif 000047
【国際調査報告】
2004506179.tif 000048