(57)【要約】本発明はＤＰＩＶ−阻害剤の新規な使用を提供するものである。本発明の化合物、およびそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩の形は、ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素によって仲介される状態、例えば、発作、腫瘍、虚血、パーキンソン病および片頭痛よりなる群から選択される免疫、自己免疫または中枢神経系疾患の治療に有用である。より好ましい態様では、本発明の化合物は多発性硬化症の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ（ＤＰＩＶ）またはＤＰＩＶ様酵素活性の少なくとも１種の阻害剤の、発作、虚血、パーキンソン病、多発性硬化症および片頭痛よりなる群から選択される免疫、自己免疫または中枢神経系関連疾患を緩和するための使用。
【請求項２】
疾患が多発性硬化症である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ様酵素が、線維芽細胞活性化たんぱく質α、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶβ、ジペプチジルアミノぺプチダ−ゼ様たんぱく質、Ｎ−アセチル化α−結合酸性ジぺプチダ−ゼ、休止細胞プロリンジぺプチダ−ゼ、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＩ、アトラクチン、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ関連たんぱく質（ＤＰＰ８）、ジペプチジルぺプチダ−ゼ９（ＤＰＰ９）、ＫＩＡＡ１４９２、ＤＰＲＰ１、ＤＰＲＰ２およびＤＰＲＰ３よりなる群から選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ様酵素の構造が未知である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
阻害剤が、アミノ酸およびチアゾリジンまたはピロリジン基から形成されるジペプチド化合物、およびその塩である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
ジペプチド化合物が、Ｌ−トレオ−イソロイシルピロリジン、Ｌ−アロ−イソロイシルチアゾリジン、１−アロ−イソロイシルピロリジン、Ｌ−グルタミニルチアゾリジン、Ｌ−グルタミニルピロリジン、Ｌ−グルタミン酸チアゾリジン、Ｌ−グルタミン酸ピロリジンおよびそれらの塩よりなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
阻害剤が、一般式
【化１】
2004534836.tif 000029
（式中、
Ａは、Ｄ−アミノ酸以外のアミノ酸であり、
Ｂは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸およびピペコリン酸から選択されるアミノ酸であり、
Ｃは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸、ピペコリン酸以外およびＮ−アルキル化アミノ酸、例えばＮ−メチルバリンおよびサルコシン以外のいずれかのアミノ酸であり、
Ｄは、いずれかのアミノ酸であるか、または欠けており、そして
Ｅは、いずれかのアミノ酸であるか、または欠けており、
あるいは、
Ｃは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸、ピペコリン酸以外、Ｎ−アルキル化アミノ酸、例えば、Ｎ−メチルバリンおよびサルコシン以外およびＤ−アミノ酸以外のいずれかのアミノ酸であり、
Ｄは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸およびピペコリン酸から選択されるいずれかのアミノ酸であり、そして
Ｅは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸、ピペコリン酸以外およびＮ−アルキル化アミノ酸、例えばＮ−メチルバリンおよびサルコシン以外のいずれかのアミノ酸である）
で表されるジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ触媒作用の拮抗調節に有用なペプチド化合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
阻害剤が、あらゆる立体異性体および薬学的に許容される塩を含めた、一般式
【化２】
2004534836.tif 000030
（式中、
Ａは、
【化３】
2004534836.tif 000031
から選択され、ここで、
Ｘ１は、Ｈまたはアシルもしくはオキシカルボニル基またはアミノ酸もしくはペプチド残基であり、
Ｘ２は、Ｈ、−（ＣＨ）ｎ−ＮＨ−Ｃ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（ｎ＝２〜４）またはＣ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（２価ピリジル残基）であり、Ｙは、Ｈ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ２またはＣＮから選択され、
Ｘ３は、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていない、フェニルまたはピルジル残基であり、
Ｘ４は、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていない、フェニルまたはピルジル残基であり、
Ｘ５は、Ｈ、またはアルキル、アルコキシもしくはフェニル残基であり、
Ｘ６は、Ｈまたはアルキル残基であり、
ｎ＝１である場合、
Ｘは、Ｈ、ＯＲ２、ＳＲ２、ＮＲ２Ｒ３、Ｎ＋Ｒ２Ｒ３Ｒ４から選択され、ここで、
Ｒ２は、１、２もしくはそれ以上のアルキル、シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール残基で置換されたもしくは置換されていないアシル残基、あるいはあらゆるアミノ酸およびペプチド残基、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール残基で置換されたもしくは置換されていないアルキル残基を表し、
Ｒ３はアルキルおよびアシル官能基を表し、ここで、Ｒ２およびＲ３は飽和および不飽和炭素環式または複素環式構造の１つ以上の環構造の一部でもよく、
Ｒ４はアルキル残基を表し、ここで、Ｒ２およびＲ４またはＲ３およびＲ４は飽和および不飽和炭素環式または複素環式構造の１つ以上の環構造の一部でもよく、
ｎ＝０である場合、
Ｘは、
【化４】
2004534836.tif 000032
（式中、
Ｂは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ５を表し、ここで、Ｒ５は、Ｈ、アルキリデンまたはアシルであり、
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈは、非置換および置換アルキル、オキシアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、カルボニルアルキル、アシル、カルバモイル、アリールおよびヘテロアリール残基から独立して選択される）
から選択され、そして
ｎ＝０およびｎ＝１である場合、
Ｚは、Ｈ、またはＣ１−Ｃ９の分枝鎖もしくは単鎖アルキル残基、またはＣ２−Ｃ９の分枝鎖もしくは単鎖アルケニル残基、Ｃ３−Ｃ８のシクロアルキル残基、Ｃ５−Ｃ７のシクロアルケニル残基、アリール−もしくはヘテロアリール残基、またはあらゆる天然アミノ酸もしくはその誘導体のあらゆる側鎖より選ばれる側鎖から選択される）
で表されるペプチジルケトンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
阻害剤が、あらゆる立体異性体および薬学的に許容される塩を含めた、一般式５、６、７、８、９、１０および１１
【化５】
2004534836.tif 000033
（式中、
Ｒ１は、Ｈ、分枝もしくは線状Ｃ１−Ｃ９アルキル残基、分枝もしくは線状Ｃ２−Ｃ９アルケニル残基、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル−、Ｃ５−Ｃ７シクロアルケニル−、アリール−もしくはヘテロアリール残基、または天然アミノ酸もしくはその誘導体の側鎖であり、
Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノまたはハロゲンから独立して選択され、
Ａは、Ｈまたは炭酸のイソスター、例えばＣＮ、ＳＯ３Ｈ、ＣＯＮＨＯＨ、ＰＯ３Ｒ５Ｒ６、テトラゾール、アミド、エステル、無水物、チアゾールおよびイミダゾールから選択される官能基であり、
Ｂは
【化６】
2004534836.tif 000034
（式中、
Ｒ５は、Ｈ、−（ＣＨ）ｎ−ＮＨ−Ｃ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（ｎ＝２〜４）およびＣ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（２価ピリジル残基）であり、Ｙ＝Ｈ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ２またはＣＮであり、
Ｒ１０は、Ｈ、アシル、オキシカルボニルまたはアミノ酸残基であり、
Ｗは、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていないフェニルまたはピリジル残基であり、
Ｗ１は、Ｈ、アルキル、アルコキシまたはフェニル残基であり、
Ｚは、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていないフェニルまたはピリジル残基であり、
Ｚ１は、Ｈまたはアルキル残基である）
から選択され、
Ｄは、１、２もしくはそれ以上のアルキル基または環式４〜７員へテロアルキルまたは環式４〜７員へテロアルケニル残基で置換されたもしくは置換されていない環式Ｃ４−Ｃ７アルキル、Ｃ４−Ｃ７アルケニル残基であり、
Ｘ２は、Ｏ、ＮＲ６、Ｎ＋（Ｒ７）２、またはＳであり、
Ｘ３〜Ｘ１２は、ＣＨ２、ＣＲ８Ｒ９、ＮＲ６、Ｎ＋（Ｒ７）２、Ｏ、Ｓ、ＳＯおよびＳＯ２から独立して選択され、あらゆる飽和および不飽和構造を含み、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、Ｈ、分枝もしくは線状Ｃ１−Ｃ９アルキル残基、分枝もしくは線状Ｃ２−Ｃ９アルケニル残基、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル残基、Ｃ５−Ｃ７シクロアルケニル残基、アリールもしくはヘテロアリール残基から独立して選択され、
ただし、
式６：ＡがＨでなければ、Ｘ６はＣＨであり、
式７：ＡがＨでなければ、Ｘ１０はＣであり、
式８：ＡがＨでなければ、Ｘ７はＣＨであり、
式９：ＡがＨでなければ、Ｘ１２はＣである）
で表されるアミノケトン誘導体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素活性の阻害剤が、あらゆる立体異性体および薬学的に許容される塩を含めた、一般式
【化７】
2004534836.tif 000035
（式中、
Ａは、側鎖に少なくとも１つの官能基を有するアミノ酸であり、
Ｂは、Ａの側鎖の少なくとも１つの官能基に共有結合した化合物、特に、
−  ２０以下のアミノ酸の鎖長を有するオリゴペプチド、または
−  ２０，０００ｇ／ｍｏｌ以下の分子量を有するポリエチレングリコール、
−  ８〜５０の炭素原子を有する置換されていてもよい有機アミン、アミド、アルコール、酸または芳香族化合物
であり、そして
Ｃは、Ａにアミド結合したチアゾリジン、ピロリジン、シアノピロリジン、ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリンまたはピペリジン基である）
で表される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
Ａが、アミノ酸、好ましくはα−アミノ酸、特に、トレオニン、チロシン、セリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステインよりなる群から選択される、側鎖に少なくとも１つの官能基を有する天然α−アミノ酸である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
阻害剤が、薬学的に許容される担体または希釈剤および治療に有効な量の阻害剤またはその薬学的に許容される酸付加塩を含む医薬組成物である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
阻害剤が、薬学的に許容される担体および／または希釈剤と組み合わせて用いられる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶおよびジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ様酵素活性の阻害剤、さらに詳しくは、該化合物を含有する医薬組成物、並びに中枢神経系疾患、免疫および自己免疫疾患を治療するための該化合物の使用に関する。本発明は多発性硬化症の治療法を特に提供する。
【０００２】
背景
ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ（ＤＰＩＶ）は、好ましくは端から２番目の位置にプロリン残基を含むペプチド鎖からＮ−末端ジペプチドを切り取るセリンプロテアーゼである。哺乳動物組織におけるＤＰＩＶの生物学的役割は完全に確立されていないが、神経ペプチド代謝、Ｔ−細胞活性化、およびＨＩＶのリンパ細胞への進入において重要な役割を演じると考えられる。
【０００３】
同様に、ＤＰＩＶが、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、およびガストリック・インヒビトリー・ペプチド（ＧＩＰ）としても公知のグルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチドの不活性化を招くことは見出されている。ＧＬＰ−１は膵臓インスリン分泌の主な刺激物質であり、グルコース廃棄に直接有利に作用するので、ＷＯ９７／４０８３２およびＵＳ６，３０３，６６１では、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性の阻害が非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療に魅力的な対処法を提示することが示された。
【０００４】
本発明は、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素の阻害によって仲介される状態を予防および治療するための、特に、多発性硬化症を含めたニューロン性疾患および免疫疾患を予防および治療するためのＤＰＩＶ阻害剤の新規な使用、並びに、例えばＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素の阻害に有用な、医薬組成物、並びに該酵素活性を阻害する方法を提供する。
【０００５】
本発明は、治療法、特に、中枢神経系疾患、免疫および自己免疫疾患、とりわけ多発性硬化症の予防および治療法、並びにそのような方法に用いるための組成物に関する。ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ（ＤＰＩＶ）は腎臓、肝臓および腸を含めた体の様々な組織に見られるポスト−プロリン（より少ない程度ではポスト−アラニン、ポスト−セリンまたはポスト−グリシン）切断セリンプロテアーゼである。
【０００６】
ＤＰＩＶ阻害剤がグルコース耐性障害および真性糖尿病の治療に有用であることは知られている〔国際特許出願、公開番号ＷＯ９９／６１４３１、ペデルソン  ピーエー等、ダイアビーティーズ． １９９８年８月；４７（８）： １２５３−８（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ ＰＡ ｅｔ ａｌ， Ｄｉａｂｅｔｅｓ． １９９８ Ａｕｇ；４７（８）： １２５３−８）およびパウリー  アールピー等、メタボリズム  １９９９年３月；４８（３）： ３８５−９（Ｐａｕｌｙ ＲＰ ｅｔ ａｌ， Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ １９９９ Ｍａｒ；４８（３）： ３８５−９）〕。特にＷＯ９９／６１４３１には、アミノ酸残基およびチアゾリジンまたはピロリジン基を含むＤＰＩＶ阻害剤、並びにその塩、特にＬ−トレオ−イソロイシルチアゾリジン、Ｌ−アロ−イソロイシルチアゾリジン、Ｌ−トレオ−イソロイシルピロリジン、Ｌ−アロ−イソロイシルチアゾリジン、Ｌ−アロ−イソロイシルピロリジン、およびそれらの塩が開示されている。
【０００７】
低分子量ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ阻害剤の別の例としては、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキサミド誘導体、Ｎ−置換２−シアノピロールおよび−ピロリジン、Ｎ−（Ｎ´−置換グリシル）−２−シアノピロリジン、Ｎ−（置換グリシル）−チアゾリジン、Ｎ−（置換グリシル）−４−シアノチアゾリジン、アミノ−アシル−ボロノ−プロリル−阻害剤およびシクロプロピル縮合ピロリジン等の薬剤がある。ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶの阻害剤は、ＵＳ６，０１１，１５５；ＵＳ６，１０７，３１７；ＵＳ６，１１０，９４９；ＵＳ６，１２４，３０５；ＵＳ６，１７２，０８１；ＷＯ９９／６１４３１；ＷＯ９９／６７２７８；ＷＯ９９／６７２７９；ＤＥ  １９８  ３４  ５９１；ＷＯ９７／４０８３２；ＤＥ  １９６  １６  ４８６  Ｃ２；ＷＯ９８／１９９９８；ＷＯ００／０７６１７；ＷＯ９９／３８５０１；ＷＯ９９／４６２７２；ＷＯ９９／３８５０１；ＷＯ０１／６８６０３；ＷＯ０１／４０１８０；ＷＯ０１／８１３３７；ＷＯ０１／８１３０４；ＷＯ０１／５５１０５；ＷＯ０２／０２５６０およびＷＯ０２／１４２７１に記載されており、これらの教示は、これらの阻害剤、それらの使用、定義およびそれらの製造に関するそれらの全てを参照することによってここに記載されたものとする。
【０００８】
用語ＤＰＩＶ様酵素は、ＤＰＩＶ／ＣＤ２６関連酵素たんぱく質〔セドおよびマリック、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ様分子；相同性たんぱく質または相同性活性  クエスチョンマーク  バイオキミカ  エト  バイオフィジカ  アクタ  ２００１， ３６５０６： １−１０（Ｓｅｄｏ ＆ Ｍａｌｉｋ， Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ−ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ； ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｑｕｅｓｔｉｏｎ ｍａｒｋ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ２００１， ３６５０６： １−１０）〕に構造的および／または作用的に関係がある。本質的に、酵素のこの小さな基は進化の間、進化して、オリゴ−およびポリペプチドのＮ−末端からＨ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−ジペプチドおよびＨ−Ｘａａ−Ａｌａ−ジペプチドを放ってきた。それらは、Ｐｒｏ−位置にさらにＡｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＧｌｙまたはＶａｌのような小さい疎水性側鎖を有する他のアミノ酸を受け入れるという共通の特徴を示す。加水分解効果は、Ｐｒｏ＞Ａｌａ≫Ｓｅｒ，Ｔｈｒ≫Ｇｌｙ，Ｖａｌである。同じたんぱく質は、ただポスト−Ｐｒｏまたはポスト−Ａｌａ切断が認められるだけのような少量で利用されるのみであった。たんぱく質：ＤＰＩＶ、ＤＰＩＩ、ＦＡＰα（Ｓｅｐｒａｓｅ）、ＤＰ６、ＤＰ８およびＤＰ９は構造的に関係があり、高い配列同族性を示すが、アトラクチンは、類似の活性および阻害パターンを特徴とする非常に官能的なＤＰＩＶ様酵素である。
【０００９】
別のＤＰＩＶ様酵素は、ＷＯ０１／１９８６６、ＷＯ０２／３４９００およびＷＯ０２／３１１３４に開示されている。ＷＯ０１／１９８６６には、ＤＰＩＶおよび線維芽細胞活性化たんぱく質（ＦＡＰ）に類似の構造および機能を有する新規なヒトジペプチジルアミノぺプチダ−ゼ８（ＤＰＰ８）が開示されている。ＷＯ０２／３４９００には、ＤＰＩＶおよびＤＰＰ８のアミノ酸配列にかなりの同族性を示す新規なジペプチジルぺプチダ−ゼ９（ＤＰＰ９）が開示されている。ＷＯ０２／３１１３４には、３つのＤＰＩＶ様酵素、ＤＰＲＰ１、ＤＰＲＰ２およびＤＰＲＰ３が開示されている。配列分析から、ＤＰＲＰ１はＷＯ０１／１９８６６に記載のようなＤＰＰ８と同一であること、ＤＰＲＰ２はＤＰＰ９と同一であること、そしてＤＰＲＰ３はＷＯ０２／０４６１０に記載のようなＫＩＡＡ１４９２と同一であることが分かった。
【００１０】
多発性硬化症（ＭＳ）は、自己抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞およびサイトカインがかかわる仮定自己免疫病因による中枢神経系の脱ミエリン化疾患である〔ロホウスキー−コーチャン，シー．、モリナロ，デー．およびクック，エスデー、多発性硬化症におけるミエリン塩基たんぱく質特異的Ｔ細胞のサイトカイン分泌プロフィール、多発性硬化症  ６， ６９−７７， ２００１（Ｒｏｈｏｗｓｋｙ−Ｋｏｃｈａｎ， Ｃ． Ｍｏｌｉｎａｒｏ， Ｄ． ａｎｄ Ｃｏｏｋ， ＳＤ． Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ｍｙｅｌｉｎ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ６， ６９−７７， ２００１）。
ＭＳを引き起こす変性は、神経繊維を囲み、かつ電気信号のすばやい伝導を可能にする電気絶縁性脂肪層であるミエリン鞘の破壊に起因する。ミエリンのこの減少は、神経が電気信号を効率的に伝達する能力をひどく損なうことになる。症状は、中枢神経系（ＣＮＳ）において、ミエリンの減少がどこで生じ、そしてその時どの神経経路が損なわれるかによる。
【００１１】
この病気は本質的には自己免疫であると思われる。すなわち、体自体の免疫系が損傷を招くのである。他のＭＳ抗原が言われてきたが、自己免疫反応の主なターゲットは明らかにミエリン塩基性たんぱく質（ＭＢＰ）であると思われる。病気の初期段階では、乏突起神経膠細胞と呼ばれるある種のＣＮＳ細胞がこの損傷を修復し、失われたミエリンに取って代わる。しかしながら、これらの細胞はまたＭＳで破壊され、そのため患者は時を経て損傷を修復する能力を失い、これによって病気が進行することになる。
【００１２】
病気の進行のメカニズムは複雑であり、免疫システムのいくつかの要素は病気に関連づけられてきた。根底にある組織損傷は主にＴ細胞仲介反応の結果として生じるのは明らかであるが、ＭＳ抗原に対する抗体は脳脊髄液（ＣＳＦ）および活性病変にしばしば存在する。抗体はＣＳＦに通常存在せず、ＣＮＳを取り囲む保護膜である血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊もいくらか生じことによって、抗体、Ｔ細胞およびマクロファージがＣＳＦに入り込むことができるに違いない。ＢＢＢの浸透性の変化はＭＳ発生の定義事項の１つであるようだ。
【００１３】
活性化マクロファージはＴＮＦ−αおよびインターフェロン−γのような早期炎症性サイトカインを分泌し、有害な酵素および遊離ラジカルを生じることにつながる。免疫反応自体が複雑であることに加えて、この病気は多くのターゲットに影響を及ぼすことにもなる。ミエリン鞘と同様に、星状細胞および小膠細胞のような他の細胞は攻撃されて、斑または病変として知られる損傷の離散領域を形成する。病変は硬化症としても知られており（それでこういう名前がついている）、脳および脊髄の両方に生じうる。病変の部位は血管近くにある傾向があり、視神経、小脳、心室周囲領域および脊髄で一般に見られる。
【００１４】
病気開始の初期のメカニズムはほとんど不明のままであり、どの時点における活性病変の数も実際にかなり少ない。病気の異質性およびこの病気がつくり出す臨床の副次的種類の数から、ＭＳは１つの病気というよりは一連の関連状態であることが示唆されている。
【００１５】
発明の概要
本発明はＤＰＩＶ阻害剤の新規な使用を提供する。式１〜１２の化合物、およびそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩の形は、ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素によって仲介される状態、例えば、発作、腫瘍、虚血、パーキンソン病、および片頭痛よりなる群から選択される免疫、自己免疫または中枢神経系疾患の治療に有用である。さらに好ましい態様では、本発明の化合物は多発性硬化症の治療に有用である。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ（ＤＰＩＶ）阻害剤の分野、さらに詳しくは、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性の阻害剤の、ニューロン性および免疫疾患の予防および治療のための、特に多発性硬化症を治療するための新規な使用、並びに該化合物を含有する医薬組成物に関する。
【００１７】
１つの態様では、本発明は、アミノ酸およびチアゾリジンまたはピロリジン基から形成されるジペプチド化合物およびジペプチド化合物の類似化合物、並びにそれらの塩に関する。これらの化合物は以後、ジペプチド化合物と呼ぶ。
【００１８】
本発明の目的に特に適したものは、アミノ酸が天然アミノ酸、例えば、ロイシン、バリン、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、イソロイシン、アスパラギンおよびアスパラギン酸から選択されるのが好ましいジペプチド化合物である。
本発明で用いられるジペプチド化合物は１０μＭの（ジペプチド化合物の）濃度（表７に示す）で、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶまたはＤＰＩＶ類似酵素の活性を少なくとも１０％、特に少なくとも４０％減少させる。しばしば少なくとも６０％または少なくとも７０％の活性減少も必要とされる。好ましいエフェクターは最高２０％または３０％の活性減少を示す。
【００１９】
好ましい化合物は、Ｌ−アロ−イソロイシルチアゾリジン、Ｌ−トレオ−イソロイシルピロリジンおよびその塩、特にフマル酸塩、並びにＬ−アロ−イソロイシルピロリジンおよびその塩である。特に好ましい化合物は、式１および２：
【化８】
2004534836.tif 000002
のグルタミニルピロリジンおよびグルタミニルチアゾリジンである。さらに好ましい化合物を下記「さらに好ましいジペプチド化合物の構造」に示す。
ジペプチド化合物の塩は、１：１または２：１のジペプチド（−類似体）成分対塩成分モル比で存在しうる。そのような塩は、例えば、（Ｉｌｅ−Ｔｈｉａ）２フマル酸塩である。
【００２０】
さらに好ましいジペプチド化合物の構造
エフェクター
Ｈ−Ａｓｎ−ピロリジン
Ｈ−Ａｓｎ−チアゾリジン
Ｈ−Ａｓｐ−ピロリジン
Ｈ−Ａｓｐ−チアゾリジン
Ｈ−Ａｓｐ（ＮＨＯＨ）−ピロリジン
Ｈ−Ａｓｐ（ＮＨＯＨ）−チアゾリジン
Ｈ−Ｇｌｕ−ピロリジン
Ｈ−Ｇｌｕ−チアゾリジン
Ｈ−Ｇｌｕ（ＮＨＯＨ）−ピロリジン
Ｈ−Ｇｌｕ（ＮＨＯＨ）−チアゾリジン
Ｈ−Ｈｉｓ−ピロリジン
Ｈ−Ｈｉｓ−チアゾリジン
Ｈ−Ｐｒｏ−ピロリジン
Ｈ−Ｐｒｏ−チアゾリジン
Ｈ−Ｉｌｅ−アジジジン
Ｈ−Ｉｌｅ−ピロリジン
Ｈ−Ｌ−アロ−Ｉｌｅ−チアゾリジン
Ｈ−Ｖａｌ−ピロリジン
Ｈ−Ｖａｌ−チアゾリジン
【００２１】
別の好ましい態様では、本発明は、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ触媒作用の拮抗調節に有用な式３：
【化９】
2004534836.tif 000003
のペプチド化合物を提供するものであり、式中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは独立して、たんぱく質原性アミノ酸、非たんぱく質原性アミノ酸、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸を含めたアミノ酸部分であり、ここで、Ｅおよび／またはＤは以下に詳記するような追加条件では不在でもよい。
【００２２】
式３の追加条件：
Ａは、Ｄ−アミノ酸以外のいずれかのアミノ酸であり、
Ｂは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸およびピペコリン酸から選択されるいずれかのアミノ酸であり、
Ｃは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸、ピペコリン酸以外およびＮ−アルキル化アミノ酸、例えばＮ−メチルバリンおよびサルコシン以外のいずれかのアミノ酸であり、
Ｄは、いずれかのアミノ酸であるか、または欠けており、そして
Ｅは、いずれかのアミノ酸であるか、または欠けており、
あるいは、
Ｃは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸、ピペコリン酸以外、Ｎ−アルキル化アミノ酸、例えば、Ｎ−メチルバリンおよびサルコシン以外およびＤ−アミノ酸以外のいずれかのアミノ酸であり、
Ｄは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸およびピペコリン酸から選択されるいずれかのアミノ酸であり、そして
Ｅは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸、ピペコリン酸以外およびＮ−アルキル化アミノ酸、例えばＮ−メチルバリンおよびサルコシン以外のいずれかのアミノ酸である．
【００２３】
請求項および説明におけるアミノ酸の例を以下に示す：
アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）およびシステイン（Ｃｙｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アラニン（Ａｌａ）、プロリン（Ｐｒｏ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ベータ−アラニン（ベータ−Ａｌａ）、２−アミノオクタン酸（Ａｏａ）、アゼチジン−２−カルボン酸（Ａｃｅ）、ピペコリン酸（Ｐｉｐ）、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸等、アルファ−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、サルコシン（Ｓａｒ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモアルギニン（Ｈａｒ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ブチル−Ａｌａ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ブチル−Ｇｌｙ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−Ｍｅｌｌｅ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、システイン酸（Ｃｙａ）およびメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）、アセチル−Ｌｙｓ、装飾アミノ酸、例えばホスホリル−セリン（Ｓｅｐ（Ｐ））、ベンジル−セリン（Ｓｅｒ（Ｂｚｌ））およびホスホリル−チロシン（Ｔｙｒ（Ｐ））、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、アミノエチルシステイン（ＡＥＣｙｓ）、カルボキシメチルシステイン（Ｃｍｃ）、デヒドロアラニン（Ｄｈａ）、デヒドロアミノ−２−酪酸（Ｄｈｂ）、カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、シス−ヒドロキシプロリン（ｃｉｓＨｙｐ）、トランス−ヒドロキシプロリン（ｔｒａｎｓＨｙｐ）、イソバリン（Ｉｖａ）、ピログルタミン酸（Ｐｙｒ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、２−アミノ安息香酸（２−Ａｂｚ）、３−アミノ安息香酸（３−Ａｂｚ）、４−アミノ安息香酸（４−Ａｂｚ）、４−（アミノメチル）安息香酸（Ａｍｂ）、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（４−Ａｍｃ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、２−アミノ−４−シアノ酪酸（Ｃｂａ）、シクロアルカン−カルボン酸。
【００２４】
ω−アミノ酸の例は、例えば、５−Ａｒａ（アミノ吉草酸）、６−Ａｈｘ（アミノヘキサン酸）、８−Ａｏｃ（アミノオクタン酸）、９−Ａｎｃ（アミノノナン酸）、１０−Ａｄｃ（アミノデカン酸）、１１−Ａｕｎ（アミノウンデカン酸）、１２−Ａｄｏ（アミノドデカン酸）である。
【００２５】
別のアミノ酸は、インダニルグリシン（Ｉｇｌ）、インドリン−２−カルボン酸（Ｉｄｃ）、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸（Ｏｉｃ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）、ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）、（２−Ｎａｌ）、４−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＨ２））、４−ベンゾイルフェニルアラニン（Ｂｐａ）、ジフェニルアラニン（Ｄｉｐ）、４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｂｒ））、２−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｃｌ））、３−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｃｌ））、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））、３，４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３，４−Ｃｌ２））、３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））、４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、３，４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３，４−Ｆ２））、ペンタフルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（Ｆ５））、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−グアニジノ））、ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）、３−ヨードフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｊ））、４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｊ））、４−メチルフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｍｅ））、４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｈｅ−４−ＮＯ２）、ビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）、４−ホスホノメチルフェニルアラニン（Ｐｍｐ）、シクロヘキシルグリシン（Ｇｈｇ）、３−ピリジニルアラニン（３−Ｐａｌ）、４−ピリジニルアラニン（４−Ｐａｌ）、３，４−デヒドロプロリン（Ａ−Ｐｒｏ）、４−ケトプロリン（Ｐｒｏ（４−ケト））、チオプロリン（Ｔｈｚ）、イソニペコチン酸（Ｉｎｐ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、プロパルギルグリシン（Ｐｒａ）、６−ヒドロキシノルロイシン（ＮＵ（６−ＯＨ））、ホモチロシン（ｈＴｙｒ）、３−ヨードチロシン（Ｔｙｒ（３−Ｊ））、３，５−ジヨードチロシン（Ｔｙｒ（３，５−Ｊ２））、ｄ−メチル−チロシン（Ｔｙｒ（Ｍｅ））、３−ＮＯ２−チロシン（Ｔｙｒ（３−ＮＯ２））、ホスホチロシン（Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２））、アルキルグリシン、１−アミノインダン−１−カルボン酸、２−アミノインダン−２−カルボン酸（Ａｉｃ）、４−アミノ−メチルピロール−２−カルボン酸（Ｐｙ）、４−アミノ−ピロリジン−２−カルボン酸（Ａｂｐｃ）、２−アミノテトラリン−２−カルボン酸（Ａｔｃ）、ジアミノ酢酸（Ｇｌｙ（ＮＨ２））、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソイノール−カルボン酸（Ｄｉｓｃ）、ホモシクロヘキシルアラニン（ｈＣｈａ）、ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅまたはＨｏｆ）、トランス−３−フェニルアゼチジン−２−カルボン酸、４−フェニル−ピロリジン−２−カルボン酸、５−フェニル−ピロリジン−２−カルボン酸、３−ピリジルアラニン（３−Ｐｙａ）、４−ピリジルアラニン（４−Ｐｙａ）、スチリルアラニン、テトラヒドロイソキノリン−１−カルボン酸（Ｔｉｑ）、１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−３−カルボン酸（Ｔｐｉ）、β−（２−チエニル）−アラニン（Ｔｈａ）である。
【００２６】
遺伝コードにコードされる他のアミノ酸置換基も本発明の範囲のペプチド化合物に含めることができ、これらはこの一般式の中に入るものとして分類しうる。
たんぱく質原性アミノ酸は天然たんぱく質由来α−アミノ酸として定義される。非たんぱく質原性アミノ酸は他の全てのアミノ酸として定義され、これらは一般的な天然たんぱく質の構成単位ではない。
【００２７】
得られるペプチドは遊離Ｃ−末端酸としてまたはＣ−末端アミド形として合成されうる。遊離酸ペプチドまたはアミドは側鎖修飾によって変えうる。そのような側鎖修飾は、例えば、これらに限定されないが、ホモセリン形成、ピログルタミン酸形成、ジスルフィド結合形成、アスパラギンまたはグルタミン残基の脱アミド化、メチル化、ｔ−ブチル化、ｔ−ブチルオキシカルボニル化、４−メチルベンジル化、チオアニシル化、チオクレシル化、ベンシロキシメチル化、４−ニトロフェニル化、ベンシロキシカルボニル化、２−ニトロベンコイル化、２−ニトロスルフェニル化、４−トルエンスルホニル化、ペンタフルオロフェニル化、ジフェニルメチル化、２−クロロベンジルオキシカルボニル化、２，４，５−トリクロロフェニル化、２−ブロモベンジルオキシカルボニル化、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル化、トリフェニルメチル化、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル化、ヒドロキシル化、メチオニンの酸化、ホルミル化、アセチル化、アニシル化、ベンシル化、ベンコイル化、トリフルオロアセチル化、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシル化、ホスホリル化、硫酸化、システイニル化、ペントース、デオキシヘキソース、ヘキソサミン、ヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソサミンでのグリコール化、ファルネシル化、ミリストール化、ビオチニル化、パルミトイル化、ステアロイル化、ゲラニルゲラニル化、グルタチオニル化、５´−アデノシル化、ＡＤＰ−リボシル化、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ピリドキサルホスフェート、リポ酸、４´−ホスホパンテテイン、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドでの修飾である。
【００２８】
式（３）の化合物において、アミノ酸部分Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、標準命名法によると、アミド結合によって隣接部分にそれぞれ結合しており、その結果、アミノ酸（ペプチド）のアミノ末端（Ｎ−末端）は左側に引っ張られ、アミノ酸（ペプチド）のカルボキシル末端は右側に引っ張られる。
【００２９】
出願人による本発明までは、試験管内のプロリン特異的セリンプロテアーゼジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶのペプチド基質は、トリペプチドジプロチンＡ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ）、ジプロチンＢ（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ）およびジプロチンＣ（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ）が知られている。出願人は、ここに記載の化合物が、哺乳動物において、生体内のジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶの基質として作用すること、およびこれらが、薬理学的投与量で、拮抗触媒作用によって内因性基質の生理学的転換を阻害することを意外にも見出した。
【００３０】
ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素のモジュレーターとして有用な本発明の特に好ましい化合物には、ウイスターラットにｉ．ｖ．および／またはｐ．ｏ．投与した後の生体内ＤＰＩＶ阻害において効果的にＤＰＩＶ結合するためのＫｉ値を示す化合物が含まれる。
【００３１】
本発明で用いることができるさらに好ましい化合物は式４：
【化１０】
2004534836.tif 000004
のペプチジルケトンであり、式中、
Ａは、
【化１１】
2004534836.tif 000005
から選択され、
Ｘ１は、Ｈ、またはあらゆるアミノ酸およびペプチド残基を含めたアシルもしくはオキシカルボニル基であり、
Ｘ２は、Ｈ、−（ＣＨ）ｎ−ＮＨ−Ｃ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（ｎ＝２〜４）またはＣ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（２価ピリジル残基）であり、Ｙは、Ｈ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ２またはＣＮから選択され、
Ｘ３は、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていない、フェニルまたはピルジル残基であり、
Ｘ４は、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていない、フェニルまたはピルジル残基であり、
Ｘ５は、Ｈ、またはアルキル、アルコキシもしくはフェニル残基であり、
Ｘ６は、Ｈまたはアルキル残基であり、
ｎ＝１である場合、
Ｘは、Ｈ、ＯＲ２、ＳＲ２、ＮＲ２Ｒ３、Ｎ＋Ｒ２Ｒ３Ｒ４から選択され、ここで、
Ｒ２は、１、２もしくはそれ以上のアルキル、シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール残基で置換されたもしくは置換されていないアシル残基、あるいはあらゆるアミノ酸およびペプチド残基、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール残基で置換されたもしくは置換されていないアルキル残基を表し、
Ｒ３はアルキルおよびアシル官能基を表し、ここで、Ｒ２およびＲ３は飽和および不飽和炭素環式または複素環式構造の１つ以上の環構造の一部でもよく、
Ｒ４はアルキル残基を表し、ここで、Ｒ２およびＲ４またはＲ３およびＲ４は飽和および不飽和炭素環式または複素環式構造の１つ以上の環構造の一部でもよく、
ｎ＝０である場合、
Ｘは、
【化１２】
2004534836.tif 000006
（式中、
Ｂは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ５を表し、ここで、Ｒ５は、Ｈ、アルキリデンまたはアシルであり、
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈは、非置換および置換アルキル、オキシアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、カルボニルアルキル、アシル、カルバモイル、アリールおよびヘテロアリール残基から独立して選択される）
から選択され、そして
ｎ＝０およびｎ＝１である場合、
Ｚは、Ｈ、またはＣ１−Ｃ９の分枝鎖もしくは単鎖アルキル残基、またはＣ２−Ｃ９の分枝鎖もしくは単鎖アルケニル残基、Ｃ３−Ｃ８のシクロアルキル残基、Ｃ５−Ｃ７のシクロアルケニル残基、アリール−もしくはヘテロアリール残基、またはあらゆる天然アミノ酸もしくはその誘導体のあらゆる側鎖より選ばれる側鎖から選択される。
【００３２】
さらに、本発明では式５、６、７、８、９、１０および１１の化合物、並びにそれらの全ての立体異性体および薬学的に許容される塩が開示されており、これらを用いることができる。
【００３３】
【化１３】
2004534836.tif 000007
式中、
Ｒ１は、Ｈ、分枝もしくは線状Ｃ１−Ｃ９アルキル残基、分枝もしくは線状Ｃ２−Ｃ９アルケニル残基、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル−、Ｃ５−Ｃ７のシクロアルケニル−、アリール−もしくはヘテロアリール残基、または天然アミノ酸もしくはその誘導体の側鎖であり、
Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノまたはハロゲンから独立して選択され、
Ａは、Ｈまたは炭酸のイソスター、例えばＣＮ、ＳＯ３Ｈ、ＣＯＮＨＯＨ、ＰＯ３Ｒ５Ｒ６、テトラゾール、アミド、エステル、無水物、チアゾールおよびイミダゾールから選択される官能基であり、
Ｂは
【化１４】
2004534836.tif 000008
（式中、
Ｒ５は、Ｈ、−（ＣＨ）ｎ−ＮＨ−Ｃ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（ｎ＝２〜４）およびＣ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（２価ピリジル残基）であり、Ｙ＝Ｈ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ２またはＣＮであり、
Ｒ１０は、Ｈ、アシル、オキシカルボニルまたはアミノ酸残基であり、
Ｗは、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていないフェニルまたはピリジル残基であり、
Ｗ１は、Ｈ、アルキル、アルコキシまたはフェニル残基であり、
Ｚは、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていないフェニルまたはピリジル残基であり、
Ｚ１は、Ｈまたはアルキル残基である）
から選択され、
Ｄは、１、２もしくはそれ以上のアルキル基または環式４〜７員へテロアルキルまたは環式４〜７員へテロアルケニル残基で置換されたもしくは置換されていない環式Ｃ４−Ｃ７アルキル、Ｃ４−Ｃ７アルケニル残基であり、
Ｘ２は、Ｏ、ＮＲ６、Ｎ＋（Ｒ７）２、またはＳであり、
Ｘ３〜Ｘ１２は、ＣＨ２、ＣＲ８Ｒ９、ＮＲ６、Ｎ＋（Ｒ７）２、Ｏ、Ｓ、ＳＯおよびＳＯ２から独立して選択され、あらゆる飽和および不飽和構造を含み、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、Ｈ、分枝もしくは線状Ｃ１−Ｃ９アルキル残基、分枝もしくは線状Ｃ２−Ｃ９アルケニル残基、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル残基、Ｃ５−Ｃ７シクロアルケニル残基、アリールもしくはヘテロアリール残基から独立して選択され、
ただし、
式６：ＡがＨでなければ、Ｘ６はＣＨであり、
式７：ＡがＨでなければ、Ｘ１０はＣであり、
式８：ＡがＨでなければ、Ｘ７はＣＨであり、
式９：ＡがＨでなければ、Ｘ１２はＣである。
【００３４】
説明および請求項において、「アシル」という表現は、Ｃ１−２０アシル残基、好ましくはＣ１−８アシル残基、特に好ましくはＣ１−４アシル残基を意味し、「シクロアルキル」はＣ３−１２シクロアルキル残基、好ましくはＣ４、Ｃ５またはＣ６シクロアルキル残基を意味し、「炭素環式」はＣ３−１２炭素環式残基、好ましくはＣ４、Ｃ５またはＣ６炭素環式残基を意味する。「ヘテロアリール」はアリール残基として定義され、１〜４、好ましくは１、２または３個の環原子がＮ、ＳまたはＯのような複素原子に取って代わられている。「複素環式」はシクロアルキル残基として定義され、１、２または３個の環原子がＮ、ＳまたはＯのような複素原子に取って代わられている。「ペプチド」は、ジペプチドないしデカペプチドから選択され、好ましいのはジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドおよびペンタペプチドである。「ペプチド」を形成するためのアミノ酸は、上に挙げたものから選択することができる。
【００３５】
たんぱく質は体内に広く分布しており、そしてＤＰＩＶ、ＤＰＩＶ活性およびＤＰＩＶ関連たんぱく質がかかわる様々なメカニズムがあるため、ＤＰＩＶ阻害剤での全身的治療（腸内または非経口投与）は一連の望ましくない副作用を招き得る。
さらに、解決すべき課題は、局部的に限定された病態生理学的および生理学的過程を標的として影響を与えるのに用いうる化合物を提供することであった。本発明の課題は特に、局部活性基質の活性の調節を標的介入するためにＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様活性を局部的に限定阻害することにある。
【００３６】
この課題は、一般式（１２）
【化１５】
2004534836.tif 000009
（式中、
Ａは、側鎖に少なくとも１つの官能基を有するアミノ酸であり、
Ｂは、Ａの側鎖の少なくとも１つの官能基に共有結合した化合物であり、そして
Ｃは、Ａにアミド結合したチアゾリジン、ピロリジン、シアノピロリジン、ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリンまたはピペリジン基である）
の化合物により本発明に従って解決される。
【００３７】
これらの化合物は免疫、自己免疫または中枢神経系関連疾患の緩和に用いることができる。
本発明の好ましい態様では、一般式（１２）の少なくとも１種の化合物および作用部位に適した少なくとも１種の通常の補助薬を含む医薬組成物が用いられる。
【００３８】
好ましくは、Ａはα−アミノ酸、特に、側鎖に１、２またはそれ以上の官能基を有する天然α−アミノ酸、好ましくは、トレオニン、チロシン、セリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステインである。
好ましくは、Ｂは、２０以下のアミノ酸の鎖長を有するオリゴペプチド、分子量が２０，０００ｇ／ｍｏｌ以下のポリエチレングリコール、８〜５０個の炭素原子を有する置換されていてもよい有機アミン、アミド、アルコール、酸または芳香族化合物である。
【００３９】
説明および請求項において、「アルキル」は、Ｃ１−５０アルキル基、好ましくはＣ６−３０アルキル基、特にＣ８−１２アルキル基を意味し；例えば、アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルまたはブチル基である。例えば「アルコキシ」、「アルカン」および「アルカノイル」に含まれるアルキルは「アルキル」で定義したとおりであり；芳香族化合物は好ましくは置換されたまたは任意に置換されていないフェニル、ベンジル、ナフチル、ビフェニルまたはアントラセン基であり、好ましくは少なくとも８個の炭素原子を有し；「アルケニル」はＣ２−１０アルケニル基、好ましくはＣ２−６アルケニル基を意味し、望ましい位置に二重結合を有し、そして置換されていても置換されていなくてもよく；「アルキニル」はＣ２−１０アルキニル基、好ましくはＣ２−６アルキニル基を意味し、望ましい位置に三重結合を有し、そして置換されていても置換されていなくてもよく；「置換されている」または置換基は、１つ以上、好ましくは１つまたは２つの、アルキル、アルケニル、アルキニル、モノ−もしくは多価アシル、アルカノイル、アルコキシアルカノイルまたはアルコキシアルキル基による望ましい置換を意味し；上記の置換基は１つ以上（好ましくはゼロ）のアルキル、アルケニル、アルキニル、モノ−もしくは多価アシル、アルカノイル、アルコキシアルカノイルまたはアルコキシアルキル基を側基として有していてもよく；それぞれ８〜５０個、好ましくは１０〜２０個の炭素原子を有する有機アミン、アミド、アルコールまたは酸は、式（アルキル）２Ｎ−またはアルキル−ＮＨ−、−ＣＯ−Ｎ（アルキル）２または−ＣＯ−ＮＨ（アルキル）、−アルキル−ＯＨまたは−アルキル−ＣＯＯＨを有しうる。
【００４０】
側鎖機能を拡大したにもかかわらず、式（１２）の化合物は酵素ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶおよび類似酵素の活性中心に依然として結合することができるが、ペプチド輸送体ＰｅｐＴ１によってもはや活性的に輸送されることはない。本発明による化合物の輸送性の減少または大きな制限は、理想的に、局所または部位が指示されたＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様活性阻害をもたらす。
【００４１】
式（１２）の化合物または本発明に従って用いられる他の化合物は、それぞれ、ラセミ化合物の形でまたは光学的対掌的に純粋な化合物の形で、好ましくは式（１２）の部分Ａに対してＬ−トレオまたはＬ−アロ形で存在または使用することができる。
【００４２】
側鎖修飾の拡大／延長、例えば炭素原子数７を越えることによって、輸送性を劇的に減少させることが可能である（実施例１２参照）。表１２．１の実施例から明らかなように、側鎖の空間的な大きさを増加させるにつれて、物質の輸送性は減少する。側鎖を空間的におよび立体的に拡大することによって、例えばモノ置換フェニル基、ヒドロキシルアミン基またはアミノ酸残基の原子基より大きくすることによって、標的物質の輸送性を調節したりまたは抑制することは本発明により可能である。
【００４３】
本発明によると、式（１２）の化合物は、哺乳動物の体内において、部位特異的に、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様活性を阻害する。従って、効果的にかつ副作用を劇的に減少させて、局所的生理学的および病態生理学的状態（炎症、乾癬、関節炎、免疫、自己免疫疾患、アレルギー、さらに、中枢神経系関連疾患）に影響を及ぼすことが可能である。
【００４４】
式（１２）の好ましい化合物は、オリゴペプチドが３〜１５、特に４〜１０のアミノ酸の鎖長を有し、および／またはポリエチレングリコールが少なくとも２５０ｇ／ｍｏｌ、好ましくは少なくとも１５００ｇ／ｍｏｌおよび１５，０００ｇ／ｍｏｌ以下の分子量を有し、および／または任意に置換された有機アミン、アミド、アルコール、酸または芳香族化合物が少なくとも１２個そして好ましくは３０個以下の炭素原子を有する化合物である。
【００４５】
本発明の化合物は酸付加塩、特に薬学的に許容される酸付加塩に変換することができ、そしてそれらのまま使用することができる。薬学的に許容される塩は、アミノ酸塩基性側鎖が無機または有機酸でプロトン化されている形を一般にとる。代表的な有機または無機酸には、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、シュウ酸、パモエ酸、２−ナフタレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、糖酸またはトリフルオロ酢酸が含まれる。式１〜１２の化合物のあらゆる薬学的に許容される酸付加塩形は本発明の範囲に包含される。
遊離化合物とそれらの塩の形の化合物との間の近い関係を考慮すると、化合物がこの文脈で示されているときはいつでも、状況下で可能または適切ならば、相当する塩も意味する。
【００４６】
本発明はさらに、本発明の化合物のプロドラッグをその範囲に含める。一般に、そのようなプロドラッグは、望ましい治療活性化合物に生体内で容易に変換しうる化合物の機能性誘導体である。従って、これらの場合、本発明の使用は、１種以上の請求化合物のプロドラッグ変形体での、記載されている各種疾患の治療を包含し、これらの化合物は患者に投与した後に生体内で上記特定化合物に変換する。適したプロドラッグ誘導体の選択および製造の一般的な方法は、例えば、「プロドラッグの設計」、編集  エイチ．ブンドガード，エルセヴィア，１９８５ （「Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」， ｅｄ． Ｈ． Ｂｕｎｄｇａａｒｄ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， １９８５） および特許出願ＤＥ  １９８  ２８  １１３およびＤＥ  １９８  ２８  １１４（参照することによってここに記載されたものとする）に記載されている。
【００４７】
本発明の化合物またはプロドラッグが少なくとも１つのキラル中心を有する場合、それらは光学的対掌体として存在しうる。本発明の化合物またはプロドラッグが２つ以上のキラル中心を有する場合、それらはさらにジアステレオマーとして存在しうる。そのような異性体およびそれらの混合物の全てが本発明の範囲に入ることは無論のことである。さらに、化合物またはプロドラッグの結晶形のいくつかは多形体として存在し、それゆえそれらは本発明に含まれる。さらに、いくつかの化合物は水との溶媒和物（すなわち、水和物）または一般的な有機溶媒と溶媒和物を形成する。そのような溶媒和物も本発明の範囲に包含される。
化合物（それらの塩を含む）はそれらの水和物の形でも得ることができ、あるいはそれらには結晶化に用いられた他の溶媒が含まれる。
【００４８】
上記のように、本発明の化合物およびプロドラッグ、並びにそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形は、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性の阻害に有用である。本発明の化合物およびプロドラッグ、並びにそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形が、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性を阻害する能力は、実施例７および８に記載のように、試験管内でのＫｉ値およびＩＣ５０値を測定するためのＤＰＩＶ活性分析を用いて証明しうる。
本発明の化合物、およびそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形が、生体内でＤＰＩＶを阻害する能力は、実施例１１に記載のように、ウイスターラットへの経口または血管内投与によって証明しうる。本発明の化合物は、ウイスターラットへ経口および血管内投与した後、生体内でＤＰＩＶ活性を阻害する。
【００４９】
ＤＰＩＶは広範囲な哺乳動物器官および組織、例えば、腸刷毛子縁〔グトシュミット  エス．等、「イン  シトゥ」−ラット空腸絨毛に沿った領域の腸刷毛子縁におけるたんぱく質含有量の測定および４種の酵素活性とそれらとの相関性、組織化学 １９８１， ７２ （３）， ４６７−７９（Ｇｕｔｓｃｈｍｉｄｔ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， 「Ｉｎ ｓｉｔｕ」− ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｂｒｕｓｈ ｂｏｒｄｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ａｌｏｎｇ ｒａｔ ｊｅｊｕｎａｌ ｖｉｌｌｉ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｆｏｕｒ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８１， ７２ （３）， ４６７−７９）〕、外分泌上皮、肝細胞、尿細管、内皮、筋線維芽細胞〔フェラー  エー．シー．等、ヒト組織におけるジペプチジルペプチダーゼＩＶを検出するモノクロナール抗体、ヴィールチョウズ  アルク．エー．パソール．アナト．ヒストパソール． １９８６； ４０９ （２）： ２６３−７３（Ｆｅｌｌｅｒ Ａ． Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ． Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ． Ａ． Ｐａｔｈｏｌ． Ａｎａｔ． Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ． １９８６； ４０９ （２）： ２６３−７３）〕、神経細胞、特定の胚上皮、例えばファローピウス管、子宮の外膜、および、例えば小胞腺上皮の管腔細胞質中、およびブルンナー腺の粘膜細胞中の小胞腺〔ハーテル  エス．等、ラット器官におけるジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）ＩＶ、免疫組織化学と活性組織化学との比較、組織化学 １９８８； ８９ （２）： １５１−６１（Ｈａｒｔｅｌ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ （ＤＰＰ）ＩＶ ｉｎ ｒａｔ ｏｒｇａｎｓ． Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８８； ８９ （２）： １５１−６１）〕、生殖器官、例えば精巣上体尾および膨大部、精嚢およびそれらの分泌物〔アグラワルおよびヴァンハ−ペルトゥラ、ウシ属の再生器官および分泌物におけるジペプチジルペプチダーゼ、イント．ジェー．アンドロール  １９８６， ９ （６）： ４３５−５２（Ａｇｒａｗａｌ ＆ Ｖａｎｈａ−Ｐｅｒｔｔｕｌａ， Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ ｉｎ ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｓ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓ． Ｉｎｔ． Ｊ． Ａｎｄｒｏｌ． １９８６， ９ （６）： ４３５−５２）〕に存在する。ヒトの血清中には、ジペプチジルぺプチダ−ゼの２分子形が存在する〔クレペラ  イー．等、通常のヒト血清におけるジペプチジルペプチダーゼＩＶの２分子形の証明、フィジオール．ボヘモソルブ．１９８３， ３２ （６）： ４８６−９６（Ｋｒｅｐｅｌａ Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ ｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂｏｈｅｍｏｓｌｏｖ． １９８３， ３２ （６）��� ４８６−９６）〕。ＤＰＩＶの血清高分子量形は活性化Ｔ細胞表面で発現される〔ドゥーク−コハン  ジェー．エス．等、血清高分子量ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＣＤ２６） は活性Ｔ細胞から放出される新規抗原ＤＰＰＴ−Ｌに類似している、ジェー．イミュノール  １９９６， １５６ （５）： １７１４−２１（Ｄｕｋｅ−Ｃｏｈａｎ Ｊ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｒｕｍ ｈｉｇｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ （ＣＤ２６） ｉｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｔｉｇｅｎ ＤＰＰＴ−Ｌ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９６， １５６ （５）： １７１４−２１）〕。
【００５０】
本発明の化合物およびプロドラッグ、並びにそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩は、生体内でＤＰＩＶを阻害することができる。本発明の１つの態様では、あらゆる哺乳動物の組織および器官からのＤＰＩＶの全ての分子形、同族体およびエピトープ、そしてさらにまだ発見されていないこれらのものは、本発明の範囲に入る。
【００５１】
プロリン特異的プロテアーゼのまれなグループの中で、ＤＰＩＶは、ポリペプチド鎖のアミノ末端のペナルティメート残基として、プロリンに特異的な唯一の膜結合酵素であると初めは考えられた。しかしながら、ＤＰＩＶと構造的に非同族体であっても相当する酵素活性を有する他の分子が最近確認された。これまでに確認されているＤＰＩＶ様酵素は、例えば、線維芽細胞活性化たんぱく質α、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶβ、ジペプチジルアミノぺプチダ−ゼ様たんぱく質、Ｎ−アセチル化α−結合酸性ジぺプチダ−ゼ、休止細胞プロリンジぺプチダ−ゼ、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＩ、アトラクチンおよびジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ関連たんぱく質（ＤＰＰ８）であり、これらはＳｅｄｏ ＆ Ｍａｌｉｋ の報告論文〔セドおよびマリック、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ様分子；相同性たんぱく質または相同性活性  クエスチョンマーク  バイオキミカ  エト  バイオフィジカ  アクタ  ２００１， ３６５０６： １−１０ （Ｓｅｄｏ ＆ Ｍａｌｉｋ， Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ−ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ： ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｑｕｅｓｔｉｏｎ ｍａｒｋ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ２００１， ３６５０６： １−１０）〕に記載されている。別のＤＰＩＶ様酵素は、ＷＯ０１／１９８６６、ＷＯ０２／３４９００およびＷＯ０２／３１１３４に開示されている。ＷＯ０１／１９８６６には、ＤＰＩＶに類似の構造および機能を有する新規なヒトジペプチジルアミノぺプチダ−ゼ８（ＤＰＰ８）および線維芽細胞活性化たんぱく質（ＦＡＰ）が開示されている。ＷＯ０２／３４９００には、ＤＰＩＶおよびＤＰＰ８のアミノ酸配列にかなり同族的な新規なジペプチジルぺプチダ−ゼ９（ＤＰＰ９）が開示されている。ＷＯ０２／３１１３４には、３つのＤＰＩＶ様酵素、ＤＰＲＰ１、ＤＰＲＰ２およびＤＰＲＰ３が開示されている。
【００５２】
本発明の別の好ましい態様では、あらゆる哺乳動物の組織および器官からの、ＤＰＩＶ様酵素活性を有する全ての分子形、同族体およびエピトープ、そしてさらにまだ発見されていないこれらのものは、本発明の範囲に入る。
【００５３】
本発明の化合物およびプロドラッグ、並びにそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形のＤＰＩＶ様酵素を阻害する能力は、実施例９に記載のように、試験管内でのＫｉ値を測定する酵素活性分析を用いて証明しうる。ブタのジペプチジルぺプチダ−ゼＩＩに対する本発明の化合物のＫｉ値は、例えば、グルタミニルピロリジンについてはＫｉ＝８．５２＊１０−５Ｍ±６．３３＊１０−６Ｍ、グルタミニルチアゾリジンについてはＫｉ＝１．０７＊１０−５Ｍ±３．８１＊１０−７Ｍであった。
【００５４】
別の態様では、本発明の化合物およびプロドラッグ、並びにそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形の非ＤＰＩＶおよび非ＤＰＩＶ様プロリン特異的酵素に対する阻害活性はないかほんのわずかである。実施例１０に記載のように、例えばグルタミニルチアゾリジンおよびグルタミニルピロリジンについては、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩおよびプロリルオリゴぺプチダ−ゼの阻害は見られなかった。プロリダーゼに対しては、両化合物ともＤＰＩＶと比較して著しく低い効果を示した。プロリダーゼに対するＩＣ５０値は、グルタミニルチアゾリジンについてはＩＣ５０＞３ｍＭ、グルタミニルピロリジンについてはＩＣ５０＝３．４＊１０−４Ｍ±５．６３＊１０−５と測定された。
【００５５】
ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性を阻害する能力を考慮すると、本発明の化合物およびプロドラッグ、並びにそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形は、該酵素活性によって仲介される状態の治療に有用である。本発明の実施例および文献に記載の結果から、ここに開示されている化合物が、発作、腫瘍、虚血、パーキンソン病、および片頭痛よりなる群から選択される免疫、自己免疫疾患または中枢神経系疾患のような状態の治療に有用であることが分かる。
【００５６】
より好ましい態様では、本発明の化合物およびプロドラッグ、並びにそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形は、多発性硬化症の治療に有用である。本発明の化合物およびプロドラッグ、並びにそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形が多発性硬化症の徴候を軽減する能力は、ＥＡＥ（実験自己免疫脳脊髄炎）ラットモデルを用いて測定することができる。その方法は実施例１３に記載されている。
【００５７】
従って、本発明は、ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素活性の調節によって仲介される状態を予防または治療する方法であって、その必要のある患者に、本発明の化合物またはその医薬組成物を、その状態の治療に有効な量および投与回数で投与することを含む方法を提供する。さらに、本発明は、本発明の化合物およびプロドラッグ、並びにそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形の、患者におけるＤＰＩＶ活性の調節によって仲介される状態の予防または治療用の薬剤製造のための使用が含まれる。化合物は、これらに限定されないが、静脈内、経口、皮下、筋肉内、経皮、非経口およびこれらの組み合わせを含めた一般的な投与ルートによって、患者に投与しうる。
【００５８】
実例となる別の態様では、本発明は、式１〜１２の化合物、およびそれらの相当する薬学的に許容されるプロドラッグおよび酸付加塩形のための配合物を医薬組成物の形で提供する。
【００５９】
ここで用いるように、「患者」という用語は、治療、観察または実験の対象である動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくは人を指す。
ここで用いるように、「治療に有効な量」という用語は、研究者、獣医、医者または他の臨床医によって求められる、組織系、動物または人において、治療すべき病気または障害の症状の緩和を含めた生物学的または医学的反応を引き出す活性化合物または薬剤の量を意味する。
ここで用いるように、「組成物」という用語は、治療に有効な量の請求化合物を含む生成物、並びに請求化合物の組み合わせから直接または間接的に得られる生成物を包含する。
【００６０】
本発明で用いられる医薬組成物を製造するには、１種以上の式１〜１２の化合物、またはそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形を、活性成分として、一般的な薬剤配合技術により薬学的担体と均質に混合する。担体は、投与（例えば、経口投与または筋肉内のような非経口投与）に望ましい製剤の形により、広範囲な形をとりうる。経口投与形の組成物の製造には、通常の薬学的媒質を用いうる。従って、液体経口製剤、例えば懸濁液、エリキシルおよび溶液の場合、適した担体および添加剤には、有利には、水、グリコール、油、アルコール、フレーバー剤、防腐剤、着色剤等が含まれ；固体経口製剤、例えば粉剤、カプセル、ゲルキャップおよび錠剤の場合、適した担体および添加剤には、デンプン、糖、希釈剤、粒状化剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等が含まれる。投与のしやすさから、錠剤およびカプセルが最も有利な経口投与単位形であり、それらの場合、固体の薬学的担体が用いられる。望ましいならば、錠剤を標準技術で糖コーティングしたり、または腸用コーティングしてもよい。非経口投与の場合、担体は、例えば、可溶性を助けるためにまたは防腐のために、他の成分を通して滅菌水を通常含む。
【００６１】
注射用懸濁液も製造しうる。これらの場合、適当な液体担体、懸濁化剤等を用いうる。ここにおける医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉剤、注射、茶匙１杯の量等のような投与単位当たり、上記のような有効投与量を投与するのに必要な量の活性成分を含む。ここにおける医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉剤、注射、座薬、茶匙１杯の量等のような投与単位当たり、約０．０１〜約１０００ｍｇ（好ましくは約５〜約５００ｍｇ）の活性成分を含み、約０．１〜約３００ｍｇ／ｋｇ体重／日（好ましくは１〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日）の投与量で与えてもよい。しかしながら、投与量は、患者の要件、治療すべき状態の重症度および使用化合物によって変化する。投与は毎日でもまたは周期後でもよい。一般に、投与量は、患者の特性、状態および望ましい治療効果に基づいて医者が調節する。
【００６２】
好ましくは、これらの組成物は、経口、非経口、鼻内、舌下もしくは直腸投与の場合、または吸入もしくは注入による投与の場合、錠剤、ピル、カプセル、粉末、顆粒、滅菌非経口溶液もしくは懸濁液、計量エーロゾルもしくは液体スプレー、ドロップ、アンプル、自己注射器デバイスまたは座薬のような単位投与形になっている。あるいは、組成物は、週に１回または月に１回の投与に適した形で提供してもよい。例えば、デカン酸塩のような活性化合物の不溶性塩を、筋肉内注射用の貯蔵製剤としてもよい。錠剤のような固体組成物を製造する場合、主活性成分を、理想的には、薬学的な担体、例えば、コーンスターチ、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガム、および水のような他の薬学的希釈剤と混合して、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の均質混合物を含有する固体予備配合物を形成する。これらの予備配合物が均質であるというとき、それは、活性成分が組成物中に理想的に均一分散されており、その結果、組成物を錠剤、ピルおよびカプセルのような同じように有効な投与形に容易に小分けしうることを意味する。この固体予備配合物はその後、約０．０１〜約１０００ｍｇ、好ましくは約５〜約５００ｍｇの本発明の活性成分を含有する上記タイプの単位投与形に小分けしうる。
【００６３】
新規組成物の錠剤またはピルは、被覆したりまたは別の方法で配合して、長期作用性の利点をもたらす投与形にしてもよい。例えば、錠剤またはピルは内部投与成分および外部投与成分からなり、後者が前者を包む形にしてもよい。２つの成分は、胃での崩壊に耐えるように作用し、そして内部成分が損なわれずにそのまま十二指腸へ通過することができたり、または放出を遅らせることができる腸内分解性層によって分けることができる。様々な物質がそのような腸内分解性層またはコーティングに用いることができる。そのような物質には、セラック、セチルアルコールおよびセルロースアセテートのような物質を有する多くの高分子量酸が含まれる。
【００６４】
経口または注射で投与するために本発明の新規組成物を有利に混合しうるこの液体形には、水溶液、適当に風味をつけたシロップ、水性もしくは油性懸濁液、および綿実油、ごま油、ココナッツ油もしくはピーナッツ油のような食用油で風味をつけたエマルジョン、並びにエリキシルおよび類似の薬学的賦形剤が含まれる。水性懸濁液に適した分散剤もしくは懸濁化剤には、合成および天然ガム、例えばトラガカント、アカシア、アルギン酸塩、デキストラン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンが含まれる。
【００６５】
本発明の化合物の製造過程で立体異性体混合物が生じる場合、これらの異性体は調製用クロマトグラフィーのような一般的な技術によって分離しうる。化合物はラセミ形で製造しても、個々の光学的対掌体を光学対掌特異的合成または分割のいずれかによって製造してもよい。例えば、化合物は、（−）−ジ−ｐ−トルオイル−ｄ−酒石酸および／または（＋）−ジ−ｐ−トルオイル−ｌ−酒石酸のような光学的に活性な酸で塩を形成し、その後、分別結晶化および遊離塩基の再生によって、ジアステレオマー対を形成するような標準技術によって、それらの成分の光学的対掌体に分割しうる。化合物はまた、ジアステレオマーエステルまたはアミドを形成し、その後、クロマトグラフィー分離およびキラル助剤の除去を行なうことによって分割しうる。あるいは、化合物は、キラルＨＰＬＣカラムを用いて分割してもよい。
【００６６】
本発明の化合物の製造工程中、関係分子の敏感なまたは反応性の基の保護は必要でありおよび／または望ましい。これは、一般的な保護基、例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 編集Ｊ． Ｆ． Ｗ． ＭｃＯｍｉｅ， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， １９７３； およびＴ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ＆ Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９１（参照することによってここに記載されたものとする）に記載のような一般的な保護基によって行いうる。保護基は、本技術分野で公知の方法を用いて都合のよいその後の段階で除去しうる。
【００６７】
本発明に記載のジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素によって調節される状態の治療法は、ここで定義される１種以上の化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を用いて実施してもよい。医薬組成物は約０．０１〜約１０００ｍｇ、好ましくは約５〜約５００ｍｇの化合物を含み、そして選択される投与方式に適したどのような形にしてもよい。担体には、必要なかつ不活性な薬学的賦形剤、例えば、これらに限定されないが、結合剤、懸濁化剤、潤滑剤、風味剤、甘味剤、防腐剤、染料、およびコーティングが含まれる。経口投与に適した組成物には、固体形、例えば、ピル、錠剤、キャプレット、カプセル（それぞれ、即時放出、時間限定放出および持続放出製剤がある）、顆粒、および粉末、並びに液体形、例えば、溶液、シロップ、エリキシル、エマルジョン、および懸濁液が含まれる。非経口投与に有用な形には、滅菌溶液、エマルジョンおよび懸濁液が含まれる。
【００６８】
有利なことには、本発明の化合物は１日に１回の投与でも、あるいは１日の合計投与量を１日に２、３または４回に分けて投与してもよい。さらに、本発明の化合物は、適した鼻腔内賦形剤の局所使用、または本技術分野における当業者に周知の経皮パッチによって鼻腔内形で投与してもよい。経皮放出系の形で投与するには、もちろん、投与の間、断続的ではなく、連続的に投与し、そして投与濃度は望ましい治療効果が得られるように調節する必要がある。
【００６９】
より好ましくは、錠剤またはカプセルの形で経口投与する場合、活性薬剤成分は経口非毒性の薬学的に許容される不活性担体、例えば、エタノール、グリセロール、水等と組み合わせてもよい。さらに、望ましいまたは必要なとき、適した結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤を混合物に混入させてもよい。適した結合剤には、これらに限定されないが、デンプン、ゼラチン、天然の糖、例えばグルコースまたはベータラクトース、コーン甘味剤、天然および合成ガム、例えばアカシア、トラガカントまたはオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が含まれる。崩壊剤には、これらに限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムおよび本技術分野で公知の他の成分が含まれる。
【００７０】
液体形は風味をつけた懸濁化剤または分散剤、例えばトラガカント、アカシア、メチルセルロース等のような合成および天然ガムの形が適している。非経口投与の場合、滅菌懸濁液および溶液が望ましい。適当な防腐剤を一般に含む等張性製剤は、静脈内投与が望ましいときに用いられる。
【００７１】
本発明の化合物はリポソーム送達系、例えば小さい単ラメラ小胞、大きい単ラメラ小胞、および多重ラメラ小胞の形で投与することもできる。リポソームは、本技術分野において十分に説明されている方法を用いて、様々なリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンから形成することができる。
【００７２】
本発明の化合物は、標的としうる薬剤担体としての可溶性ポリマーと結合してもよい。そのようなポリマーには、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンが含まれる。さらに、本発明の化合物は薬剤の調整放出に有用なある種の生分解性ポリマー、例えば、ポリアクチック酸（ｐｏｌｙａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーに結合しうる。
【００７３】
本発明の化合物は、上記疾患の治療が必要なときはいつでも、本技術分野で確立された投与方式に従ってどのような上記組成物の形でも投与しうる。
【００７４】
生成物の１日の投与量は成人で１日当たり０．０１〜１．０００ｍｇの広い範囲で変えうる。経口投与の場合、組成物は、治療を受ける患者への投与量を症状によって調節するために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、１５０、２００、２５０、５００および１０００ｍｇの活性成分を含有する錠剤の形で提供するのが好ましい。薬剤の有効な量は約０．１〜約３００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与レベルで通常供給される。約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲が好ましい。化合物は１日当たり１〜４回投与しうる。
【００７５】
最適投与量は、本技術分野に熟知した人々であれば容易に決定でき、使用される個々の化合物、投与方式、製剤の濃度、投与方式による生物学的利用能、および病気状態の進行で変わる。さらに、治療される個々の患者に伴う要因、例えば患者の年齢、体重、食事および投与時間を、投与量の調整の際に一般に考慮すべきである。
【００７６】
本発明の化合物または組成物は、食前、食事中または食後にとりうる。
【００７７】
実施例
実施例１：ジペプチド化合物の合成
１．１  イソロイシルチアゾリジン塩の一般的な合成
Ｂｏｃ保護アミノ酸ＢＯＣ−Ｉｌｅ−ＯＨを酢酸エチルの中に入れ、バッチを約−５℃に冷却する。Ｎ−メチルモルホリンを滴加し、ピバル酸塩化物（実験室スケール）または塩化ネオヘキサノイル（パイロットプラントスケール）を一定温度で滴加する。活性化するため、反応混合物を数分間、攪拌する。Ｎ−メチルモルホリン（実験室スケール）およびチアゾリジン塩酸塩（実験室スケール）を連続滴加し、チアゾリジン（パイロットプラントスケール）を加える。実験室での仕上げは、塩溶液を用いる一般的な方法で行い、パイロットプラントスケールでバッチをＮａＯＨおよびＣＨ３ＣＯＯＨ溶液を用いて精製する。
【００７８】
ＢＯＣ保護基の除去はＨＣｌ／ジオキサン（実験室スケール）またはＨ２ＳＯ４（パイロットプラントスケール）を用いて行う。実験室で、塩酸塩をＥｔＯＨ／エーテルから結晶化する。
パイロットプラントスケールで遊離アミンをＮａＯＨ／ＮＨ３を加えることによって製造する。フマル酸を熱エタノールに溶解し、遊離アミンを滴加し、そして（Ｉｌｅ−Ｔｈｉａ）２フマル酸塩（Ｍ＝５２０．７１ｇｍｏｌ−１）を沈殿させる。異性体および光学的対掌体の分析は電気泳動によって行う。
【００７９】
１．２  グルタミニルピロリジン遊離塩基の合成
アシル化：
Ｎ−ベンジル−オキシカルボニルグルタミン（２．０２ｇ、７．２１ｍｍｏｌ）を３５ｍｌのＴＨＦに溶解し、−１５℃にした。その混合物にＣＡＩＢＥ（イソブチルクロロホルミエート）（０．９３７ｍｌ、７．２１ｍｍｏｌ）および４−メチルモルホリン（０．７９５ｍｌ、７．２１ｍｍｏｌ）を加え、溶液を１５分間攪拌した。混合無水物の形成をＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）によりチェックした。−１０℃に温めた後、ピロリジン（０．５９６ｍｌ、７．２１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温にし、一晩攪拌した。
【００８０】
仕上げ：
形成された沈殿を濾過し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物を酢酸エチル（２０ｍｌ）にとり、硫酸水素ナトリウム飽和溶液で、次いで、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液、水およびブラインで洗浄した。有機層を分離、乾燥および蒸発させた。得られた生成物はＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）により純度をチェックした。
収量：１．１８ｇ、ワックス状固体
【００８１】
切断：
１．１８ｇの得られた固体Ｚ−保護化合物を４０ｍｌの無水エタノールに溶解した。溶液に約２０ｍｇのＰｄ担持炭（１０％、ＦＬＵＫＡ）を加え、懸濁液を水素雰囲気下で３時間振とうした。反応の進行はＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）でモニターした。反応完了後、溶媒を除去して遊離塩基を得た。
収率：９９％
純度はＴＬＣでチェックした：ｎ−ブタノール／ＡｃＯＨ／水／酢酸エチル：１／１／１／１、Ｒｆ＝０．４。反応生成物の同定はＮＭＲ分析で行った。
【００８２】
１．３  グルタミニルチアゾリジン塩酸塩の合成
アシル化：
Ｎ−ｔ−ブチル−オキシカルボニルグルタミン（２．０ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＴＨＦに溶解し、−１５℃にした。その混合物にＣＡＩＢＥ（イソブチルクロロホルミエート）（１．０６ｍｌ、８．１２ｍｍｏｌ）および４−メチルモルホリン（０．８９５ｍｌ、８．１２ｍｍｏｌ）を加え、溶液を１５分間攪拌した。混合無水物の形成はＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）によりチェックした。−１０℃に温めた後、別の等量の４−メチルモルホリン（０．８９５ｍｌ、８．１２ｍｍｏｌ）およびチアゾリジン塩酸塩（１．０２ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温にし、一晩攪拌した。
【００８３】
仕上げ：
形成された沈殿を濾過し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物をクロロホルム（２０ｍｌ）にとり、硫酸水素ナトリウム飽和溶液で、次いで、炭酸水素ナトリウム飽和溶液、水およびブラインで洗浄した。有機層を分離、乾燥および蒸発させた。得られた生成物はＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）により純度をチェックした。
収量：１．６４ｇ、固体
【００８４】
切断：
６４０ｍｇの得られた固体Ｂｏｃ−保護化合物を３．１ｍｌの氷冷したジオキサン中のＨＣｌ（１２．９８Ｍ、２０当量）に溶解し、氷上で放置した。反応の進行はＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）によりモニターした。反応完了後、溶媒を除去し、得られた油状物をメタノールに取り、再び蒸発させた。その後、得られた油状物をリン−Ｖ−オキシド上で乾燥し、ジエチルエーテル中で２回粉砕した。純度はＨＰＬＣでチェックした。
収量：０．２６５ｇ
純度はＨＰＬＣでチェックした。反応生成物の同定はＮＭＲ分析でチェックした。
【００８５】
１．４  グルタミニルピロリジン塩酸塩の合成
アシル化：
Ｎ−ｔ−ブチル−オキシカルボニルグルタミン（３．０ｇ、１２．１８ｍｍｏｌ）を７ｍｌのＴＨＦに溶解し、−１５℃にした。その混合物にＣＡＩＢＥ（イソブチルクロロホルミエート）（１．６ｍｌ、１２．１８ｍｍｏｌ）および４−メチルモルホリン（１．３ｍｌ、１２．１８ｍｍｏｌ）を加え、溶液を１５分間攪拌した。混合無水物の形成をＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）によりチェックした。−１０℃に温めた後、１当量のピロリジン（１．０ｍｌ、１２．１８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温にし、一晩攪拌した。
【００８６】
仕上げ：
形成された沈殿を濾過し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物をクロロホルム（２０ｍｌ）にとり、硫酸水素ナトリウム飽和溶液で、次いで、炭酸水素ナトリウム飽和溶液、水およびブラインで洗浄した。有機層を分離、乾燥および蒸発させた。得られた生成物はＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）により純度をチェックした。
収量：２．７ｇ、固体
【００８７】
切断：
２．７ｇの得られた固体を１３．０ｍｌの氷冷したジオキサン中のＨＣｌ（１２．９８Ｍ、２０当量）に溶解し、氷上で放置した。反応の進行はＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）によりモニターした。反応完了後、溶媒を除去し、得られた油状物をメタノールに取り、再び蒸発させた。その後、得られた油状物をリン−Ｖ−オキシド上で乾燥し、ジエチルエーテル中で２回粉砕した。
収量：９８０ｍｇ
純度はＨＰＬＣでチェックした。反応生成物の同定はＮＭＲ分析でチェックした。
【００８８】
実施例２：選択されたジペプチド化合物の化学特性決定
２．１  融点測定
融点はＬｅｉｃａ社のＫｏｆｌｅｒ加熱プラットフォーム顕微鏡で測定した。値は未補正であるか、またはＤＳＣ装置（Ｈｅｕｍａｎｎ−Ｐｈａｒｍａ）での値である。
【００８９】
２．２  旋光度
回転値はＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社の「Ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ ３４１」またはそれ以上で様々な波長にて記録した。
【００９０】
２．３  質量分光分析の測定条件
質量スペクトルは、ＰＥ Ｓｃｉｅｘ社の「ＡＰＩ  １６５」または「ＡＰＩ  ３６５」でのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によって記録した。操作はｃ＝１０μｇ／ｍｌのおおよその濃度で行い、物質はＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ  ５０：５０、０．１％ＨＣＯ２Ｈにとり、注入はスプレーポンプを使用して行う（２０μｌ／分）。測定はポジティブモード［Ｍ＋Ｈ］＋で行い、ＥＳＩ電圧はＵ＝５６００Ｖである。
【００９１】
２．４  結果
２．４．１  イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩（異性体）の試験
【表１】
2004534836.tif 000010
ＩＴ＊Ｆ＝イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩
ＮＭＲおよびＨＰＬＣデータは問題の物質が同一であることを裏づけている。
【００９２】
２．４．２  他のイソロイシルチアゾリジン塩の試験
【表２】
2004534836.tif 000011
【００９３】
実施例３：  Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｙａａトリペプチドの合成
合成はいずれもＦｍｏｃ／ｔＢｕ法を用いるペプチド合成器ＳＰ  ６５０（Ｌａｂｏｒｔｅｃ社）で行った。保護アミノ酸はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ社またはＢａｃｈｅｍ社から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はＭｅｒｃｋ社から購入し、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）はＦｌｕｋａ社から購入した。
【００９４】
Ｐｒｅ−を含むＦｍｏｃ−Ｙａａ−Ｗａｎｇ樹脂（２．８ｇ／置換レベル０．５７ｍｍｏｌ／ｇ）を２０％ピペリジン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄した後、２当量（１．１ｇ）のＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ溶液をＤＭＦ（１ｇの樹脂当たり溶媒１２ｍｌ）に溶解した。２当量（１．０４ｇ）の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロ硼酸塩（ＴＢＴＵ）および４当量（１．１１ｍｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を加え、反応容器に入れた。混合物を室温で２０分間振とうした。次に、カップリングサイクルを繰り返した。その後、ＤＭＦ、ジクロロメタン、イソプロパノールおよびジエチルエーテルで洗浄した後、得られたＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｗａｎｇ樹脂を乾燥し、次に、６部に分け、その後、最後のアミノ酸誘導体をカップリングした。
【００９５】
Ｆｍｏｃ保護基は上記のように除いた。その後、ＤＭＦ中の、Ｂｏｃ−アミノ酸０．５４ｍｍｏｌ、ＴＢＴＵ０．５４ｍｍｏｌおよびＤＩＥＡ０．１０８ｍｍｏｌを２０分間振とうした。カップリングサイクルを繰り返した。最後に、ペプチド樹脂を上記のように洗浄し、乾燥した。
ペプチドは、２．５時間、次のスカベンジャーを含有するトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）混合物を用い、樹脂から切り取った：ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）＝９．５／０．２５／０．２５。
粗製ペプチドの収率は平均８０〜９０％であった。粗製ペプチドは、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルの濃度を６ｍｌ／分で上げながら（４０分で５％から６５％へ）、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏの線勾配を用いて、ヌクレオシルＣ１８カラム（７μｍ、２５０＊２１．２０ｍｍ、１００Ａ）上でＨＰＬＣにより精製した。
凍結乾燥によって純粋なペプチドが得られた。これはエレクトロスプレー質量分析およびＨＰＬＣ分析で確認した。
【００９６】
３．１  結果  −  化学合成後のＸａａ−Ｐｒｏ−Ｙａａトリペプチドの同定
【表３】
2004534836.tif 000012
【００９７】
１［Ｍ＋Ｈ＋］はプラスイオン化モードでのエレクトロスプレー質量分析によって測定した。
２ＲＰ−ＨＰＬＣ条件：
カラム：  ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ ＲＰ １８ （５μｍ）、１２５×４ｍｍ
検出（ＵＶ）：  ２１４ｎｍ
勾配系：  アセトニトリル（ＡＣＮ）／Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）
１５分で５％（ＡＣＮ）から５０％へ
流量：  １ｍｌ／分
ｋδ＝（ｔｒ−ｔ０）／ｔ０
ｔ０＝１．１６分
【００９８】
ｔ−ブチル−Ｇｌｙは次のように定義する：
【化１６】
2004534836.tif 000013
Ｓｅｒ（Ｐ）およびＳｅｒ（Ｂｚｌ）はホスホリルセリンおよびベンジルセリンと定義する。Ｔｙｒ（Ｐ）はホスホリルチロシンと定義する。
【００９９】
実施例４：  ペプチジルケトンの合成
【化１７】
2004534836.tif 000014
【０１００】
Ｈ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ＊ＨＣｌ  ２
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（３．００ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解し、−１５℃に冷却した。混合物にＣＡＩＢＥ（１．８０ｍｌ、１３．８ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（１．５２ｍｌ、１３．８ｍｍｏｌ）を加え、混合無水物の形成が完了するまで溶液を攪拌した。次に、混合物を−１０℃にし、ＮＭＭ（１．５２ｍｌ、１３．８ｍｍｏｌ）、次いで、Ｈ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ＊ＨＣｌ（２．２９ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温にし、一晩放置した。溶媒を除去し、そして通常の仕上げをした後、得られたエステル１を特性決定せずに得た。エステル１をＨＣｌ／ＨＯＡｃ（５ｍｌ、６Ｎ）に溶解し、Ｂｏｃ基の除去が完了するまで０℃で放置した。次に、溶媒を除去し、得られた油状物をジエチルエーテルで処理して、白色固体２を得た。
収量：  ２．５ｇ、８０％
【０１０１】
Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ  ３
Ｚ−ＡｌａＯＨ（３．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）および２（４．１８ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）を１について上記したのと同じ方法で処理して、３を白色固体として得た。
収量（未精製）：  ４．２ｇ、６４％
【０１０２】
Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ  ４
３（４．２ｇ、９．６ｍｍｏｌ）を３０ｍｌの水／アセトン（１／５ ｖ／ｖ）に溶解し、１１．６ｍｌのＮａＯＨ（１Ｎ）を加えた。反応完了後、有機溶媒を蒸発によって除去し、得られた溶液を１５ｍｌのＮａＨＣＯ３溶液（飽和）で希釈した。次に、混合物を１０ｍｌの酢酸エチルエステルで３回抽出した。その後、ＨＣｌ（水中の１５％）を加えることによって溶液をｐＨ２にした。得られた混合物を３０ｍｌの酢酸エチルエステルで３回抽出した。有機層を分離し、ブラインで３回洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして蒸発させた。
収量：  ３．５ｇ、８７％
【０１０３】
Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ２−Ｂｒ  ５
４（２．００ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）を１５ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解し、ＣＡＩＢＥ（０．６２３ｍｌ、４．７６ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（０．５２５ｍｌ、４．７６ｍｍｏｌ）を用いて、混合無水物（化合物１参照）に変えた。形成された沈殿を濾過し、−１５℃に冷却した。次に、ジアゾメタン（３０ｍｌエーテル中の２３．８ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で溶液に滴加した。混合物を０℃で１時間放置した後、１．２７ｍｌのＨＢｒ（ＡｃＯＨ中の３３％）を加え、溶液を室温で３０分間攪拌した。その後、７０ｍｌのエーテルを加え、混合物を２０ｍｌの水で洗浄した。有機層を分離し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして蒸発させた。
収量：  １．８ｇ、８０％
【０１０４】
Ｚ−保護アシルオキシメチレンケトン
酸（２当量）をＤＭＦに溶解し、等モル量のＫＦを加えた。懸濁液を室温で１時間攪拌した。次に、ブロムメチレン（１当量）を加え、溶液を一晩攪拌した。その後、溶媒を真空下で除去し、得られた油状物をクロロホルムに溶解し、ブラインで洗浄した。次に、有機層を分離し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして溶媒を除去した。生成物は、シリカゲルおよびヘプタン／クロロホルムを用いるカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０１０５】
Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ３  ６
酢酸（２３０μｌ、４．０２ｍｍｏｌ）、ＫＦ（０．２３４ｇ、４．０２ｍｍｏｌ）、５（１．００ｇ、２．０１ｍｍｏｌ）
収量：  ０．３５１ｇ、３６％
Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｐｈ  ７
安息香酸（０．２７５ｇ、２．２５ｍｍｏｌ）、ＫＦ（０．１３１ｍｇ、２．２５ｍｍｏｌ）、５（０．５６ｇ、１．１３ｍｍｏｌ）
収量：  ０．３４ｇ、５６％
【０１０６】
脱保護
Ｚ−保護化合物をＨＢｒ／ＡｃＯＨに溶解し、攪拌した。反応完了後、エーテルを加え、形成された白色沈殿を濾過し、乾燥した。
【０１０７】
Ｈ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３＊ＨＢｒ  ８
６（０．３５１ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）
収量：  ０．２５２ｇ、９８％
Ｈ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｐｈ＊ＨＢｒ  ９
７（０．３４ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）
収量：  ０．２５１ｇ、９９％
【０１０８】
実施例５：  シクロアルキルケトンの合成
【化１８】
2004534836.tif 000015
【０１０９】
Ｂｏｃ−イソロイシナール  ２
塩化オキサリル（７１４μｌ、８．２８ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解し、−７８℃にした。次に、ＤＭＳＯ（８１７μｌ、８．２８ｍｍｏｌ）を滴加した。溶液を−７８℃で２０分間攪拌した。次に、１（１．００ｇ、４．６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２０分間攪拌した。ＴＥＡ（２．５８ｍｌ、１８．４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温にした。混合物をヘキサン／酢酸エチル（２／１ ｖ／ｖ）で希釈し、１０ｍｌのＨＣｌ（水中の１０％）を加えた。有機層を分離し、水性層を２０ｍｌの塩化メチレンで抽出した。全ての有機層を集め、ブライン、次いで水で洗浄し、乾燥した。生成物は、シリカゲルおよびヘプタン／クロロホルムを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。
収量：  ０．５２ｇ、５２％
【０１１０】
ｔ−ブチル  Ｎ−１−［シクロペンチル（ヒドロキシ）メチル］−２−メチルブチルカルバメート  ３
２（０．５２ｇ、２．４２ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解し、０℃に冷却した。次に、シクロペンチルマグネシウムブロミド（２Ｍ溶液の１．４５ｍｌ）を加えた。反応完了後、水（２ｍｌ）を加え、水性ＨＣｌを加えることによって溶液を中和した。次に、塩化メチレンを加え、有機層を分離し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。蒸発させた後、さらなる特性決定することなく、得られた油状物を用いた。
【０１１１】
ｔ−ブチル  Ｎ−［１−（シクロペンチルカルボニル）−２−メチルブチル］カルバメート  ４
３（０．６１ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）を、塩化オキサリル（３３３μｌ、３．８７ｍｍｏｌ）、ＤＭＳＯ（３８２μｌ、５．３７ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（１．２ｍｌ、８．５９ｍｍｏｌ）を用いて、１のように処理した。
収量：  ０．１８０ｇ、３０％
【０１１２】
１−シクロペンチル−３−メチル−１−オキソ−２−ペンタナミニウムクロリド  ５
４（０．１８ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を２ｍｌのＨＣｌ（ジオキサン中の７Ｎ）に溶解した。反応完了後、溶媒を除去し、得られた油状物を、クロロホルム／メタノール／水勾配を用いるシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。得られた油状物はエーテル中で粉砕した。
収量：  ０．０６０ｇ、５４％
【０１１３】
実施例６：  側鎖修飾されたＤＰＩＶ阻害剤の合成
６．１  Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｈｉａの合成
方法Ｂ（方法については６．４の項を参照）によるＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−ＯＨとＴｈｉａ＊ＨＣｌとの反応、方法ＧによるＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｔｈｉａの加水分解
【０１１４】
６．１．１  Ｂｏｃ−グルタミルチアゾリジンの分析データ
【表４】
2004534836.tif 000016
【０１１５】
１ 薄層クロマトグラフィー
系Ａ：クロロホルム／メタノール  ９０：１０
系Ｂ：ベンゼン／アセトン／酢酸  ２５：１０：０．５
系Ｃ：ｎ−ブタノール／ＥＡ／酢酸／Ｈ２Ｏ  １：１：１：１
２ ＨＰＬＣ分離条件
カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ−１８、７μ、２５０ｍｍ×２１ｍｍ
溶離剤：イソクラチック、４０％ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ
流量：６ｍｌ／分
λ＝２２０ｎｍ
【０１１６】
６．２  側鎖修飾されたＢｏｃ−グルタミルチアゾリジン
Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｈｉａを、様々な大きさの基を導入することによってγ−カルボン酸官能基において修飾した。基はγ−カルボン酸官能基にアミド結合を形成することによってアミノ基を経て結合させた。基によって様々なカップリング法が用いられる。次のアミノ成分を、記載の方法を用いて、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｈｉａに結合した：
【０１１７】
【表５】
2004534836.tif 000017
【０１１８】
下記の２つの場合、反応生成物の精製は合成の一般的な記載とは異なる。
Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｇｌｙ５）−Ｔｈｉａ
生成物は一晩の攪拌で混合物からすでに沈殿している；それをその後ろ過し、０．１Ｎ  ＨＣｌおよび多量の水で洗浄し、真空中、Ｐ４Ｏ１０上で乾燥する。
Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＰＥＧ）−Ｔｈｉａ
一般的な手順とは対照的に、合成のための出発物質を５００倍過剰のＤＭＦに溶解する。反応完了後、ＤＭＦを真空中で完全に除去し、残留物を多量のメタノールに溶解する。エーテルを注いで、上層が形成された後、生成物は未反応ＰＥＧと共に沈殿する。精製は、ゲル濾過カラム（Ｐｈａｒｍａｚｉａ、 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５、９０μｍ、２６０〜１００ｍｍ）での調製用ＨＰＬＣ分離によって行った。
分離条件：  溶離剤：水；流量：５ｍｌ／分；λ＝２２０ｎｍ
【０１１９】
６．２．２  側鎖修飾されたＢｏｃ−グルタミルチアゾリジンの合成データ
【表６】
2004534836.tif 000018
【０１２０】
２ ＨＰＬＣ分離条件
カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ−１８、７μ、２５０ｍｍ×２１ｍｍ
溶離剤：イソクラチック、４０％ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ
流量：６ｍｌ／分
λ＝２２０ｎｍ
【０１２１】
６．３  側鎖修飾されたグルタミルチアゾリジン
Ｎ−末端Ｂｏｃ保護基は、方法Ｆを用いて表６．２．２に記載の化合物から切断した。Ｇｌｙ誘導体で修飾された物質は調製用ＨＰＬＣ分離によって精製した。これらはトリフルオロアセテートとして存在する。Ｈ−Ｇｌｕ（ＰＥＧ）−ＴｈｉａはＢｏｃ保護先駆体と同じようにゲル濾過カラムで精製した。
【０１２２】
６．３．１  側鎖修飾されたグルタミルチアゾリジンの合成データ
【表７】
2004534836.tif 000019
【０１２３】
３ ＨＰＬＣ分離条件
カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  Ｃ−１８、７μ、２５０ｍｍ×２１ｍｍ
溶離剤：ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ
勾配：３０分間で２０％ＡＣＮ→９０％ＡＣＮ
流量：６ｍｌ／分
λ＝２２０ｎｍ
ｎ．ｄｍ．  −  測定せずまたは測定不可
【０１２４】
６．４  一般的な合成手順
方法Ａ：  活性化試薬としてＣＦＩＢＥを用いる混合無水物法によるペプチド結合の取り付け
１０ｍｍｏｌのＮ−末端保護アミノ酸またはペプチドを２０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解する。溶液を−１５℃±２℃に冷却する。いずれの場合も攪拌しながら、１０ｍｍｏｌのＮ−ＭＭおよび１０ｍｍｏｌのクロロギ酸イソブチルエステルを連続して加える。記載の温度範囲は厳守する。約６分後、１０ｍｍｏｌのアミノ成分を加える。アミノ成分が塩であるとき、さらに１０ｍｍｏｌのＮ−ＭＭを反応混合物に加える。次に、反応混合物を冷えた状態で２時間、そして室温で一晩攪拌する。
回転蒸発器を用いて反応混合物を濃縮し、ＥＡにとり、５％ＫＨ２ＳＯ４溶液、飽和ＮａＨＣＯ３溶液およびＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＮａＳＯ４上で乾燥する。真空中で溶媒を除去した後、化合物をＥＡ／ペンタンから再結晶する。
【０１２５】
方法Ｂ：  活性化試薬としてピバル酸塩化物を用いる混合無水物法によるペプチド結合の取り付け
１０ｍｍｏｌのＮ−末端保護アミノ酸またはペプチドを２０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解する。溶液を０℃に冷却する。いずれの場合も攪拌しながら、１０ｍｍｏｌのＮ−ＭＭおよび１０ｍｍｏｌのピバル酸塩化物を連続して加える。記載の温度範囲は厳守する。約６分後、混合物を−１５℃に冷却し、より低い温度に達したら、１０ｍｍｏｌのアミノ成分を加える。アミノ成分が塩であるとき、さらに１０ｍｍｏｌのＮ−ＭＭを反応混合物に加える。次に、反応混合物を冷えた状態で２時間、そして室温で一晩攪拌する。
さらなる仕上げは方法Ａにおけるように行う。
【０１２６】
方法Ｃ：  活性化試薬としてＴＢＴＵを用いるペプチド結合の取り付け
１０ｍｍｏｌのＮ−末端保護アミノ酸またはペプチドおよび１０ｍｍｏｌのＣ−末端保護アミノ成分を２０ｍｌの無水ＤＭＦに溶解する。溶液を０℃に冷却する。いずれの場合も攪拌しながら、１０ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡおよび１０ｍｍｏｌのＴＢＴＵを連続して加える。反応混合物を０℃で１時間、そして室温で一晩攪拌する。ＤＭＦを真空中で完全に除去し、生成物を方法Ａに記載のように仕上げる。
【０１２７】
方法Ｄ：  活性エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の合成
１０ｍｍｏｌのＮ−末端保護アミノ酸またはペプチドおよび１０ｍｍｏｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを２０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解する。溶液を０℃に冷却し、攪拌しながら１０ｍｍｏｌのジシクロヘキシルカルボジイミドを加える。反応混合物を０℃でさらに２時間、そして室温で一晩攪拌する。得られたＮ，Ｎ´−ジシクロヘキシル尿素を濾過し、溶媒を真空中で除去し、残留生成物をＥＡ／ペンタンから再結晶する。
【０１２８】
方法Ｅ：  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いるアミド結合の取り付け
１０ｍｍｏｌのＣ−末端非保護アミノ成分をＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍｌの水中の２０ｍｍｏｌ）に導入する。室温で攪拌しながら、１０ｍｌのジオキサンに溶解した１０ｍｍｏｌのＮ−末端保護Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをゆっくり滴加する。反応混合物の攪拌を一晩続け、その後、溶媒を真空中で除去する。
さらなる仕上げは方法Ａにおけるように行う。
【０１２９】
方法Ｆ：  Ｂｏｃ保護基の切断
３ｍｌの１．１Ｎ  ＨＣｌ／氷酢酸（方法Ｆ１）または３ｍｌの１．１Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサン（方法Ｆ２）またはＤＣＭ中の５０％ＴＦＡ３ｍｌ（方法Ｆ３）を１ｍｍｏｌのＢｏｃ保護アミノ酸ピロリジド、チアゾリジドまたはペプチドに加える。室温での切断はＴＬＣによってモニターする。反応完了（約２時間）後、無水ジエチルエーテルを用いて化合物を塩酸塩の形で沈殿させ、吸引で単離し、真空中、Ｐ４Ｏ１０上で乾燥する。メタノール／エーテルを用い、生成物を再結晶または再沈殿させる。
【０１３０】
方法Ｇ：  加水分解
１ｍｍｏｌのペプチドメチルエステルを１０ｍｌのアセトンおよび１１ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液に溶解し、室温で攪拌する。加水分解の経過はＴＬＣによってモニターする。反応完了後、アセトンを真空中で除去する。ｐＨ２〜３に達するまで、濃縮ＫＨ２ＳＯ４溶液を用いて残留水溶液を酸性にする。次に、ＥＡを用いて生成物を数回抽出する。一緒にした酢酸エチルフラクションを飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＮａＳＯ４上で乾燥し、溶媒を真空中で除去する。ＥＡ／ペンタンから結晶化する。
【０１３１】
実施例７：  Ｋｉ−測定
グルタミニルピロリジンおよびグルタミニルチアゾリジンのＫｉ測定の場合、３７．５Ｕ／ｍｇのグリシルプロリル−４−ニトロアニリンおよび１．４１ｍｇ／ｍｌストック溶液の酵素濃度に対して特異的活性を有するブタの腎臓からのジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶを用いた。
【０１３２】
分析混合物：
濃度範囲１＊１０−５Ｍ〜１＊１０−８Ｍの１００μｌ試験化合物を異なる濃度（０．４ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０５ｍＭ）のグリシルプロリル−４−ニトロアニリン５０μｌおよびＨＥＰＥＳ（４０ｍＭ、ｐＨ７．６；イオン濃度＝０．１２５）１００μｌと混合した。分析混合物は３０℃で３０分間予備インキュベートした。予備インキュベートの後、２０μｌのＤＰＩＶ（１：６００希釈）を加え、プレートリーダー（ＨＴＳ７０００プラス、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， ドイツ、ウエイテルスタット）を用いて、４−ニトロアニリン放出による黄色発現の測定を３０℃およびλ＝４０５ｎｍで１０分間行った。
Ｋｉ値は、Ｇｒａｐｈｉｔバージョン４．０．１３、４．０．１３および４．０．１５（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、英国）を用いて計算した。
【０１３３】
７．１  結果  −  ＤＰＩＶ阻害のＫｉ値
【表８】
2004534836.tif 000020
【０１３４】
【表９】
2004534836.tif 000021
【０１３５】
ｔ−ブチル−Ｇｌｙは次のように定義する：
【化１９】
2004534836.tif 000022
Ｓｅｒ（Ｐ）およびＳｅｒ（Ｂｚｌ）はホスホリルセリンおよびベンジルセリンと定義する。Ｔｙｒ（Ｐ）はホスホリルチロシンと定義する。
【０１３６】
実施例８：  ＩＣ５０値の測定
１００μｌの阻害剤ストック溶液を１００μｌの緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６）および５０μｌの基質（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ、最終濃度０．４ｍＭ）と混合し、３０℃で予備インキュベートした。反応は２０μｌの精製したブタのＤＰＩＶを加えることによって出発させた。生成物ｐＮＡの形成は、ＨＴＳ７０００Ｐｌｕｓプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を用いて４０５ｎｍで１０分間測定し、勾配を計算した。最終阻害濃度は１ｍＭ〜３０ｎＭの間であった。ＩＣ５０は、ＧｒａＦｉｔ ４．０．１３（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）を用いて計算した。
【０１３７】
８．１  結果  −  ＩＣ５０値の測定
【表１０】
2004534836.tif 000023
【０１３８】
【表１１】
2004534836.tif 000024
【０１３９】
Ｓｅｒ（Ｐ）およびＳｅｒ（Ｂｚｌ）はホスホリルセリンおよびベンジルセリンと定義する。Ｔｙｒ（Ｐ）はホスホリルチロシンと定義する。
【０１４０】
実施例９：  ＤＰＩＶ様酵素−ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＩ−の阻害
Ｎ−末端がプロトン化されていなければ、ＤＰ  ＩＩ（３．４．１４．２）はオリゴペプチドからＮ−末端ジペプチドを放出する（ＭｃＤｏｎａｌｄ， Ｊ． Ｋ．， Ｅｌｌｉｓ， Ｓ． ＆ Ｒｅｉｌｌｙ．， Ｔ． Ｊ．， １９６６， Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４１， １４９４−１５０１）。Ｐ１−位置のＰｒｏおよびＡｌａは好ましい残基である。酵素活性はＤＰＩＶ様活性と記されているが、ＤＰ  ＩＩの最適ｐＨは酸性である。使用酵素はブタの腎臓から精製した。
【０１４１】
分析：
濃度範囲１＊１０−４Ｍ〜５＊１０−８Ｍの１００μｌのグルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジンを、１００μｌの緩衝溶液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、０．０１５％  Ｂｒｉｊ、１ｍＭ  ＤＴＴ）、５０μｌのリシルアラニルアミノメチルクマリン溶液（５ｍＭ）および２０μｌのブタＤＰ  ＩＩ（緩衝溶液中で２５０倍希釈）と混合した。蛍光測定は、プレートリーダー（ＨＴＳ７０００プラス、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社， ドイツ、ウエイテルスタット）を用いて、３０℃およびλ励起＝３８０ｎｍ、λ発光＝４６５ｎｍで２５分間行った。Ｋｉ値は、Ｇｒａｐｈｉｔ ４．０．１５（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、英国）を用いて計算し、グルタミニルピロリジンについてはＫｉ＝８．５２＊１０−５Ｍ±６．３３＊１０−６Ｍ、グルタミニルチアゾリジンについてはＫｉ＝１．０７＊１０−５Ｍ±３．８１＊１０−７Ｍと測定された。
【０１４２】
実施例１０：  交差反応酵素
グルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジンを、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩ、プロリルオリゴぺプチダ−ゼおよびプロリダーゼに対する交差反応効力について試験した。
【０１４３】
ジペプチジルぺプチダ−ゼＩ（ＤＰ  Ｉ、カテプシンＣ）：
ＤＰ  ＩまたはカテプシンＣは、ジペプチドをそれらの基質のＮ−末端から切断するリソソマールシステインプロテアーゼである（Ｇｕｔｍａｎ， Ｈ． Ｒ． ＆ Ｆｒｕｔｏｎ， Ｊ． Ｓ．， １９４８， Ｊ． Ｂｉｏｌ： Ｃｈｅｍ．， １７４， ８５１−８５８）。それはシステインプロテアーゼとして分類される。使用酵素はＱｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ社、ドイツ、ヒルデン）から購入した。十分に活性な酵素を得るために、酵素をＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．６（４０ｍＭ  ＭＥＳ、４ｍＭ  ＤＴＴ、４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１５％Ｂｒｉｊ）で１０００倍に希釈し、そして３０℃で３０分間予備インキュベートした。
【０１４４】
分析：
濃度範囲が１＊１０−５Ｍ〜１＊１０−７Ｍのグルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジン５０μｌを、緩衝液−酵素−混合物１１０μｌと混合した。分析混合物は３０℃で１５分間予備インキュベートした。予備インキュベート後、１００μｌのヒスチジルセリル−β−ニトロアニリン（２＊１０−５Ｍ）を加え、そしてプレートリーダー（ＨＴＳ７０００プラス、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社， ドイツ、ウエイテルスタット）を用いて、β−ニトロアニリン放出による黄色発現の測定を３０℃およびλ励起＝３８０ｎｍ、λ発光＝４６５ｎｍで１０分間行った。
ＩＣ５０値は、Ｇｒａｐｈｉｔ ４．０．１５（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、英国）を用いて計算した。グルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジンによるＤＰ  Ｉ酵素活性の阻害は見られなかった。
【０１４５】
プロリルオリゴぺプチダ−ゼ（ＰＯＰ）
プロリルオリゴぺプチダ−ゼ（ＥＣ３．４．２１．２６）は、Ｘａａ−Ｐｒｏ結合のＮ−末端部でペプチドを切り取る一連のエンドプロテアーゼである（Ｗａｌｔｅｒ， Ｒ．， Ｓｈｌａｎｋ， Ｈ．， Ｇｌａｓｓ， Ｊ． Ｄ．， Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｉ． Ｌ．， ＆ Ｋｅｒｅｎｙｉ， Ｔ． Ｄ．， １９７１， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １７３， ８２７−８２９）。基質は分子量が３０００Ｄａ以下のペプチドである。使用酵素は組換えヒトプロリルオリゴペプチドであった。組換え発現は、本技術の現状で記載されているような標準条件下においてＥ． ｃｏｌｉで行った。
【０１４６】
分析：
濃度範囲が１＊１０−４Ｍ〜５＊１０−８Ｍのグルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジン１００μｌを、緩衝液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、０．０１５％  Ｂｒｉｊ、１ｍＭ  ＤＴＴ）１００μｌおよびＰＯＰ溶液２０μｌと混合した。分析混合物は３０℃で１５分間予備インキュベートした。予備インキュベート後、５０μｌのグリシルプロリルプロリル−４−ニトロアニリン溶液（０．２９ｍＭ）を加え、そしてプレートリーダー（Ｓｕｎｒｉｓｅ， Ｔｅｃａｎ， ドイツ、クライルシェイム）を用いて、４−ニトロアニリン放出による黄色発現の測定を３０℃およびλ＝４０５ｎｍで１０分間行った。ＩＣ５０値は、Ｇｒａｐｈｉｔ ４．０．１５（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、英国）を用いて計算した。グルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジンによるＰＯＰ活性の阻害は見られなかった。
【０１４７】
プロリダーゼ（Ｘ−Ｐｒｏジぺプチダ−ゼ）
プロリダーゼ（ＥＣ  ３．４．１３．９）はＢｅｒｇｍａｎｎ ＆ Ｆｒｕｔｏｎ （Ｂｅｒｇｍａｎｎ， Ｍ． ＆ Ｆｒｕｔｏｎ， ＪＳ， １９３７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １８９−２０２）によって最初に報告された。プロリダーゼはＸａａ−Ｐｒｏジぺプチダ−ゼからＮ−末端アミノ酸を放出し、最適ｐＨは６〜９である。
ブタの腎臓からのプロリダーゼ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社， ドイツ、エシュベーグ）を分析緩衝液（２０ｍＭ  ＮＨ４（ＣＨ３ＣＯＯ）２、３ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．６）に溶解した（１ｍｇ／ｍｌ）。十分に活性な酵素を得るために、溶液を室温で６０分間インキュベートした。
【０１４８】
分析：
濃度範囲が５＊１０−３Ｍ〜５＊１０−７Ｍのグルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジン４５０μｌを、緩衝液（２０ｍＭ  ＮＨ４（ＣＨ３ＣＯＯ）２、ｐＨ７．６）５００μｌおよびＩｌｅ−Ｐｒｏ−ＯＨ（分析混合物中の０．５ｍＭ）２５０μｌと混合した。分析混合物は３０℃で５分間予備インキュベートした。予備インキュベート後、７５μｌのプロリダーゼ（分析緩衝液中で１：１０に希釈）を加え、そしてＵＶ／Ｖｉｓ光度計、ＵＶ１（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ社， 英国、ケンブリッジ）を用いて、測定を３０℃およびλ＝２２０ｎｍで２０分間行った。
ＩＣ５０値は、Ｇｒａｐｈｉｔ ４．０．１５（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、英国）を用いて計算した。これらの測定値は、グルタミニルチアゾリジンについてはＩＣ５０＞３ｍＭ、グルタミニルピロリジンについては３．４＊１０−４Ｍ±５．６３＊１０−５Ｍであった。
【０１４９】
実施例１１：  ウイスターラットへの血管内および経口投与後のＤＰＩＶ阻害活性の測定
動物
体重２５０〜３５０ｇのオスのウイスターラット（Ｓｈｏｅ： Ｗｉｓｔ（Ｓｈｏ））はＴｉｅｒｚｕｃｈｔ Ｓｃｈｏｎｗａｌｄｅ 社（ドイツ、シェーンワルド）から購入した。
収容条件
動物は、１２／１２時間の明／暗サイクル（ＡＭ６：００に明るくする）で温度調整（２２±２℃）した一般的な条件下で１つのケージに入れた。標準のペレット状の餌（ｓｓｎｉｆｆ（登録商標） Ｓｏｅｓｔ， ドイツ）およびＨＣｌで酸性にした水道水は自由にまかせた。
【０１５０】
頚動脈へのカテーテル挿入
収容条件に適応させて１週以上経過後、カテーテルを一般的な麻酔（０．２５ｍｌ／ｋｇ ｂ．ｗ． Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）［２％］， ＢａｙｅｒＶｉｔａｌ社、 ドイツおよび０．５ｍｌ／ｋｇ ｂ．ｗ．  Ｋｅｔａｍｉｎ １０、Ａｔａｒｏｓｔ社、ドイツ、ツイストリンゲンのｉ．ｐ．注射）の下でウイスターラットの頚動脈に埋め込んだ。動物の回復を１週間待った。カテーテルをヘパリン−食塩水（１００ＩＵ／ｍｌ）で週３回洗った。カテーテルが機能不良の場合、第２のカテーテルを各ラットの反対側の頚動脈に挿入した。手術から１週間回復させた後、この動物を研究に再び組み入れた。第２のカテーテルが機能不良の場合、動物は研究から除いた。新しい動物を補充し、実験を手順どおりに続け、カテーテル植え込み後、少なくとも７日で開始した。
【０１５１】
実験計画
カテーテルの機能が損なわれていないラットに、偽薬（１ｍｌ食塩水、０．１５４ｍｏｌ／Ｌ）または試験化合物を経口および血管内（動脈内）ルートにより投与した。一晩絶食させた後、ヘパリン化動脈血試料１００μｌを−３０、−５、および０分で集めた。試験物質を１．０ｍｌ食塩水に新たに溶解し（０．１５４ｍｏｌ／ｌ）、供給管（７５ｍｍ；ファイン・サイエンス・ツール社、ドイツ、ハイデルベルグ）または血管内ルートのいずれかにより０分で経口投与した。経口投与の場合、さらに追加食塩水１ｍｌを動脈カテーテルに注入した。動脈内投与の場合、カテーテルを３０μｌの食塩水で直ちに洗い、さらに追加の食塩水１ｍｌを供給管により口から与えた。
【０１５２】
偽薬または試験物質を与えた後、動脈血試料を意識のある非抑制ラットの頚動脈カテーテルから、２．５、５、７．５、１０、１５、２０、４０、６０および１２０分で採取した。全ての血液試料を、血漿ＤＰＩＶ活性測定のために、１０μｌ  １Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で満たされた氷冷エッペンドルフ管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｎｅｔｈｅｌｅｒ−Ｈｉｎｚ社， ドイツ、ハンブルグ）に集めた。エッペンドルフ管を直ちに遠心分離した（２分間１２０００ｒｐｍ、Ｈｅｔｔｉｃｈ Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ＥＢＡ １２、ドイツ、チューリンゲン）：血漿フラクションは分析まで氷上で貯蔵するか、あるいは分析まで−２０℃で冷凍した。全ての血漿試料を次のデータで標識した：
・コード番号
・動物番号
・試料採取日
・試料採取時間
【０１５３】
分析法
血漿ＤＰＩＶ活性測定用分析混合物は、８０μｌの試薬および２０μｌの血漿試料からなる。基質グリシルプロリル−４−ニトロアニリンからの黄色生成物４−ニトロアニリン形成の動的測定は、３０℃で２分間予備インキュベートした後、３０℃で１分間３９０ｎｍで行った。ＤＰＩＶ活性はｍＵ／ｍｌで表した。
【０１５４】
統計法
統計的評価およびグラフ作成はＰＲＩＳＭ（登録商標）  ３．０２（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社）で行った。全てのパラメーターは平均およびＳＤを含めて記載の方法で分析した。
【０１５５】
１１．１  結果  −  ｔｍａｘでの生体内ＤＰＩＶ阻害
【表１２】
2004534836.tif 000025
【０１５６】
実施例１２：  非即輸送性ＤＰＩＶ阻害剤としての側鎖修飾されたグルタミルチアゾリジンの作用
構造Ｈ−Ｇｌｕ（Ｘ）−Ｔｈｉａを有する側鎖修飾されたグルタミルチアゾリジンを、Ｘとして用いられる様々な鎖長のポリエチレングリコールまたはグリシンオリゴマ−と共に合成した（合成の説明の実施例における方法Ａを参照）。これらの誘導体の結合特性およびペプチド輸送体ＰｅｐＴ１によるそれらの輸送性を調べた。
意外なことに、側鎖修飾は化合物のＤＰＩＶへの結合特性をわずか変えるだけであることが分かった。これに対して、阻害剤がペプチド輸送体によって輸送される能力は、側鎖修飾によって劇的に小さくなる。
従って、ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素の側鎖修飾された阻害剤は、体内でＤＰＩＶの部位指向阻害を行うのに十分に適している。
【０１５７】
１２．１  結果  −  選択されたＤＰＩＶ阻害剤の輸送性
【表１３】
2004534836.tif 000026
【０１５８】
１ ３Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（８０ｍＭ）のＰｅｐＴ１−発現Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞への結合を５０％まで阻害する化合物の有効濃度（ＥＣ５０値）
２ Ｘ． ｌｅａｖｉｓのＰｅｐＴ１発現卵母細胞における輸送特性  −  ２電極電圧クランプ法、Ｉ＝輸送によって生じた内部電流
【０１５９】
実施例１３：  多発性硬化症のモデルにおけるジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ（ＤＰＩＶ；ＣＤ２６）阻害剤の効果
１３．１  実験１：  １〜１５日のｉ．ｐ． 治療（０〜３０ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩／日）。１５日ｐ．ｉ．までの評点
材料および方法
動物
第１の実験では、平均体重１９０±６ｇのメスの近交系ルイスラット（ｎ＝５０）をチャールズ・リバー社（ドイツ、バッドスルツフェルド）から得た。動物は異なる実験条件にランダムに割り当てた。ラットは、餌（Ａｌｔｒｏｍｉｎ実験用餌ペレット）および水道水が自由に得られる、特定病原菌を含まない空調コロニールーム内に、１２：１２時間  明：暗サイクル（１８：００消灯）および一定温度（２４℃）の下で、ケージ当たり４匹収容した。動物には週１回定期的なケージメンテナンスを施した。
【０１６０】
ＥＡＥの導入
モルモットＭＢＰ（５０μｇ／ラット）を、加熱殺菌したヒト結核菌（Ｈ３７Ｒａ；２２５μｇ／ラット）を含む完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に乳化し、総体積１００μｌ（１２）で尾の付け根にｓ．ｃ．注射した。ＣＦＡ（シグマ）および加熱殺菌したヒト結核菌（Ｈ３７Ｒａ）はライフ・テクノロジー社（メリーランド州ロックビル）から購入した。臨床疾患は次の基準で評価した：０．５：尾の正常な状態の部分的喪失；１．０：尾の完全な弛緩；２．０：後足の衰弱；２．５：片方の後足の麻痺；３．０：両後足の麻痺；３．５：３本の足の麻痺；４．０：４本の足の麻痺および瀕死状態；５．０：ＥＡＥによる死亡。実験は免疫化後１５日で終えた。これはほとんどの動物が最高臨床評点になって約４８時間後であった。尾の付け根を免疫化部位としたときのアジュバント誘導関節炎の発生は著しく少なかった（第１の実験ではｎ＝０）。一般に、関節炎の徴候を示すまたはＥＡＥの徴候を示さないまたは解剖時に腹膜炎の兆候を示す動物は、その後の分析から除いた。第１の実験では、関節炎の徴候および腹腔（ｉ．ｐ．）内注射の繰り返しによる突然死および／または腹膜炎は見られなかった。１ｍｇ／ｋｇ処理グループの２匹の動物は、ＥＡＥのはっきりした徴候（評点＞１）を示さなかった。従って、これらは結果として治療効果を示しているはずであるが、その後の分析から除外した。尾の付け根の免疫化は急性炎症を引き起こすはずである。つまり、免疫化後の初日の尾の正常な状態に影響を及ぼすはずである。
【０１６１】
統計分析
反復測定の分散の２要因分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、治療条件が異なるＥＡＥの臨床経過間の経時比較を行った。ＥＡＥの臨床評点の合計、病気の開始およびピークは、１日当たりの臨床評点に基づいて計算し、適切ならば、１要因ＡＮＯＶＡおよびポストｈｏｃフィッシャーのＰＬＳＤ試験を用いて分析した。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表す。
【０１６２】
結果
ルイスラットにおけるＥＡＥの臨床経過中でのイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の毎日の注射効果
ＥＡＥの臨床経過は図１に示す。反復測定の２要因ＡＮＯＶＡ（治療×経時臨床評点）は、病気の経過の差を示す２つの要因の有意な相互作用を示した（Ｆ（４，５６）＝１．７；ｐ＝０．００１）。この相互作用は、阻害剤治療がＥＡＥの初期経過を悪化させるが、病気の回復を増進するという事実による可能性が最も高い。
日によって分けた個々の１要因ＡＮＯＶＡは、免疫化後（ｐ．ｉ．）１１および１２日における１ｍｇ投与量で、有意な病気悪化効果を示し（１１日：Ｆ（４，４３）＝２．８；ｐ＜０．０５；１２日：Ｆ（４，４３）＝３．０；ｐ＜０．０５）、一方、１０ｍｇの投与量では、１５日ｐ．ｉ．において臨床評点を有意に低下させた（Ｆ（４，４３）＝４．８；ｐ＜０．００１）。このことはさらにまた、阻害剤は初めに病気を悪化させる傾向があるが、遅い段階で病気の回復を早めることを示している。臨床経過から誘導される重要なパラメーターをさらに分析すると、１０ｍｇ／ｋｇでの阻害剤治療は、病気の開始までの潜伏期を約１日短縮したことを証明している。
【０１６３】
結論
ＣＦＡ中のＭＢＰでの免疫化後１５日間、ルイスラットに広範囲な投与量のＤＰＩＶ阻害剤イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩を毎日腹腔内投与する治療では、薬剤は初めに病気を悪化させ、回復期では病気の臨床経過を改善することを示した。急性疾患期の初期の早期炎症効果が、病気のピークに達した後、抗炎症または他の臨床改善効果に切り替わることができる。これらの後期の効果は総合的に有益である。さらなる実験で「早期」対「後期」または「誘導」対「進行」疾患効果を比較することによって、この仮定を試験する。
【０１６４】
１３．２  実験２：  ５〜１５日のｉ．ｐ．治療（０〜３０ｍｇ／ｋｇ  ｂ．ｗ．イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩／日）、２１日ｐ．ｉ．までの評点
材料および方法
動物
第２の実験では、平均体重２３０±１２ｇのオスの近交系ルイスラット（ｎ＝５０）をチャールズ・リバー社（ドイツ、バッドスルツフェルド）から得た。動物は異なる実験条件にランダムに割り当てた。ラットは、餌（Ａｌｔｒｏｍｉｎ実験用餌ペレット）および水道水が自由に得られる、特定病原菌を含まない空調コロニールーム内に、１２：１２時間  明：暗サイクル（１８：００消灯）および一定温度（２４℃）の下で、ケージ当たり４匹収容した。動物には週１回定期的なケージメンテナンスを施した。
【０１６５】
ＥＡＥの導入
モルモットＭＢＰ（５０μｇ／ラット）を、加熱殺菌したヒト結核菌（Ｈ３７Ｒａ；２２５μｇ／ラット）を含む完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に乳化し、総体積１００μｌ（１２）で尾の付け根にｓ．ｃ．注射した。ＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ）および加熱殺菌したヒト結核菌（Ｈ３７Ｒａ）はライフ・テクノロジー社（メリーランド州ロックビル）から購入した。臨床疾患は次の基準で評価した：０．５：尾の正常な状態の部分的喪失；１．０：尾の完全な弛緩；２．０：後足の衰弱；２．５：片方の後足の麻痺；３．０：両後足の麻痺；３．５：３本の足の麻痺；４．０：４本の足の麻痺および瀕死状態；５．０：ＥＡＥによる死亡。実験は免疫化後（ｐ．ｉ．）２１日で終えた。
【０１６６】
第２の実験におけるＥＡＥ期の一般的な観察
尾の付け根を免疫化部位としたときのアジュバント誘導関節炎の発生は著しく少なかった（第２の実験ではｎ＝０）。第２の実験では、関節炎の徴候は見られなかった。意外にも、そして第１の実験と比較して同様に、１ｍｇ／ｋｇ処理グループの４匹の動物は、ＥＡＥのはっきりした徴候（評点＞１）は示さなかった。この結果はおそらく治療によるものであるので、今回、これらの動物は分析に残した。この実験では、「疾患解離」と言われる現象が観察された。何匹かの動物において、後足の明らかな衰弱を伴う、尾の明らかな緊張（ｔｏｎｕｓ）があった。これらの動物は最大限に、すなわち２に評価した。
【０１６７】
統計分析
反復測定の分散の２要因分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、治療条件が異なるＥＡＥの臨床経過間の経時比較を行った。ＥＡＥの臨床評点の合計、病気の開始およびピークは、１日当たりの臨床評点に基づいて計算し、適切ならば、１要因ＡＮＯＶＡおよびポストｈｏｃフィッシャーのＰＬＳＤ試験を用いて分析した。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表す。
【０１６８】
結果
オスのルイスラットにおける進行ＥＡＥ期でのイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の毎日の注射効果
ＥＡＥの臨床経過は図３に示す。反復測定の２要因ＡＮＯＶＡ（治療×経時臨床評点）は、要因治療の有意な効果および病気の経過の差を示す（Ｆ（４，４５）＝４．３；ｐ＝０．００４８）２つの要因の有意な相互作用を示した（Ｆ（４，４５）＝３．５；ｐ＜０．０００１）。この相互作用は、低用量阻害剤治療がＥＡＥの初期経過において悪化させたかまたは早期ピークを「誘導」したが、高用量が病気の急性期を明らかに抑制して改善するという事実による可能性が最も高い。
日によって分けた個々の１要因ＡＮＯＶＡは、病気の２つのピークで有意な病気悪化効果を示した。３ｍｇおよび１０ｍｇの投与量は、治療開始直後の６〜９日において、病気活性の有意な第１ピークを誘導した（図３参照；６日：Ｆ（４，４１）＝６．７；ｐ＝０．０００３；７日：Ｆ（４，４１）＝１３．４；ｐ＜０．０００１；８日：Ｆ（４，４１）＝１０．０；ｐ＜０．０００１；９日：Ｆ（４，４１）＝６．０；ｐ＝０．０００７）。第１ピークより重症な「典型的急性ＥＡＥ」である第２のピークでは、１ｍｇの投与量は臨床評点を悪化させ、３０ｍｇ／ｋｇの高用量は効果の有意な遅延および好転効果を発揮した（図４参照；１０日：Ｆ（４，４１）＝１６；ｐ＜０．０００１；１１日：Ｆ（４，４１）＝１３．５；ｐ＜０．０００１；１２日：Ｆ（４，４１）＝８．０；ｐ＜０．０００１；１３日：Ｆ（４，４３）＝３．４；ｐ＝０．０１７）。このことは、低用量阻害剤治療が早期炎症効果をもたらし、高用量阻害剤がＭＳのこのモデルで保護または抗炎症のような作用をすることを示している。臨床経過から導かれる重要パラメーターをさらに分析すると、１ｍｇ／ｋｇの投与量での阻害剤治療は早期炎症効果を示すが、３０ｍｇ／ｋｇの投与量での阻害剤治療は、発生の遅延と共に、仲介保護または抗炎症効果を示すことを証明している。
【０１６９】
５〜１５（２１）日ｐ．ｉ．の治療したオスのルイスラットにおけるＥＡＥの臨床評点
【表１４】
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【０１７０】
ＥＡＥ評点から導かれた各種重要パラメーターは、５〜１５日の異なる投与量のイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩で治療されたラットにおいて有意に異なる。１ｍｇの早期炎症効果および３０ｍｇ／ｋｇの抗炎症効果は明らかである。データは平均を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照。
【０１７１】
結論
この実験では、ＣＦＡ中のＭＢＰでの免疫化後５日で治療を開始し、オスのルイスラットに１０日間、広範囲な投与量のＤＰＩＶ阻害剤イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩を毎日腹腔内投与する治療の効果を調べた。治療は、ＭＳについてのこの計画およびモデルにおいて、有意な投与量依存性および２モード治療効果をもたらした。イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の中用量（３および１０ｍｇ）は、病気開始直後の病気の早期「第１ピーク」を誘導し、生体内の早期炎症効果を示唆する。薬剤の高用量（３０ｍｇ）は、明らかに、有効な抗炎症効果および病気開始の遅延をもたらす。
【０１７２】
１３．３  実験３：  病気進行中のｉ．ｖ．治療（５〜１５日、毎日、ラット当たり、０〜５０ｎｍｏｌイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩／５μｌ）
材料および方法
動物
第３の実験では、平均体重２０１±５ｇのメスの近交系ルイスラット（ｎ＝５０）をドイツのチャールズ・リバー社から得た。動物は異なる実験条件にランダムに割り当てた。ラットは、餌（Ａｌｔｒｏｍｉｎ実験用餌ペレット）および水道水が自由に得られる、特定病原菌を含まない空調コロニールーム内に、１２：１２時間  明：暗サイクル（１８：００消灯）および一定温度（２４℃）の下で、ケージ当たり４匹収容した。動物には週１回定期的なケージメンテナンスを施した。
【０１７３】
手術およびｉ．ｃ．ｖ．適用
ケタミン／キシラシン（１００／５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）麻酔の下で、ラットをＫｏｐｆ定位フレームに固定し、他で詳しく記載されているような標準定位法を用いて、側脳室の上（座標：Ａ：−０．７ｍｍ尾方、Ｌ：プレグマに対して１．４ｍｍ横；およびＶ：頭蓋表面に対して３．２ｍｍ下面；歯稜＋３．０耳稜上）にカニューレ（プラスチック・ワン社、米国バージニア州ロアノーク）を植え込んだ。４日間の回復期間の後、ラットを毎日偽注射でさらにもう３日間、実験手法に慣らした。ｉ．ｃ．ｖ．カニューレ植え込み後、７日でＥＡＥが誘導された。
【０１７４】
ＥＡＥの導入
モルモットＭＢＰ（５０μｇ／ラット）を、加熱殺菌したヒト結核菌（Ｈ３７Ｒａ；２２５μｇ／ラット）を含む完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）に乳化し、総体積１００μｌ（１２）で尾の付け根にｓ．ｃ．注射した。ＣＦＡ（Ｓｉｇｍａ）および加熱殺菌したヒト結核菌（Ｈ３７Ｒａ）はライフ・テクノロジー社（メリーランド州ロックビル）から購入した。臨床疾患は次の基準で評価した：０．５：尾の正常な状態の部分的喪失；１．０：尾の完全な弛緩；１．５：尾の完全な弛緩および片方の後足の衰弱：２．０：両後足の衰弱；２．５：後足の衰弱および片方の後足の麻痺；３．０：両後足の麻痺；３．５：３本の足の麻痺；４．０：４本の足の麻痺および瀕死状態；５．０：ＥＡＥによる死亡。実験は免疫化後（ｐ．ｉ．）１５日で終えた。
【０１７５】
第３の実験におけるＥＡＥ期の一般的な観察
第３の実験では、関節炎の徴候は見られなかった。賦形剤対照グループの１匹の動物はｉｃｖ−カニューレをなくしてしまい、その後の分析から除いた。他の全ての動物はいやがったり、吐き気を示さず、治療に耐えた。
【０１７６】
統計分析
反復測定の分散の２要因分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて、治療条件が異なるＥＡＥの臨床経過間の経時比較を行った。ＥＡＥの臨床評点の合計、病気の開始およびピークは、１日当たりの臨床評点に基づいて計算し、適切ならば、１要因ＡＮＯＶＡおよびポストｈｏｃフィッシャーのＰＬＳＤ試験を用いて分析した。全てのデータは平均±ＳＥＭとして表す。
【０１７７】
結果
メスのルイスラットにおける進行ＥＡＥ期でのイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の毎日のｉｃｖ注射効果
ＥＡＥの臨床経過は図５に示す。反復測定の２要因ＡＮＯＶＡ（治療×経時臨床評点）は、要因治療の有意な効果および病気の経過の差を示す（Ｆ（４，５６）＝３．０；ｐ＝０．０３）２つの要因の有意な相互作用を示した（Ｆ（４，５６）＝２．１；ｐ＜０．０００１）。この相互作用は、全ての投与量の化合物がＥＡＥの臨床経過を遅延および／または好転させるという事実による可能性が最も高い。
臨床経過から誘導される重要なパラメーターをさらに分析すると、阻害剤治療は、調べた全てのパラメーターで抗炎症効果を発揮することが証明された。
【０１７８】
５〜１５日ｐ．ｉ．のｉｃｖ治療したメスのルイスラットにおけるＥＡＥの臨床評点
【表１５】
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【０１７９】
ＥＡＥ評点から導かれた各種重要パラメーターは、５〜１５日の異なる投与量のイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩で治療されたラットにおいて有意に異なる。５〜５０ｎｍｏｌの投与量依存性および有効な抗炎症効果は明らかである。データは平均を示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．０００１対対照。
【０１８０】
結論
この実験では、ＣＦＡ中のＭＢＰでの免疫化後５〜１５日治療し、メスのルイスラットを１０日間、広範囲な投与量のＤＰＩＶ阻害剤イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩により毎日ｉｃｖ治療する効果を調べた。この計画は、ＥＡＥの間、ＣＮＳ内の局部的炎症を引き起こす細胞成分への薬剤の効果を調べることをねらった。イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の５〜５０ｎｍｏｌでのｉｃｖ治療は、投与量依存性抗炎症効果をもたらした。これらの発見は有効な抗炎症効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
実験自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の臨床経過を説明する。成長したメスのルイスラットにおけるＥＡＥの臨床経過での異なる投与量のイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の効果を調べた。記号は１日当たりの平均臨床評点の平均±ＳＥＭを表す。反復測定の２要因ＡＮＯＶＡは、要因である「治療」と「経時臨床評点」との間に有意な相互作用があることを示し、９〜１２（１３）日の間の病気初期急性期間は、ＤＰＩＶ阻害剤が病気を悪化させ、一方、１３〜１５日の間は、それらが病気を改善したりまたは回復を早めることを示した。
【図２】
免疫化後１０〜１５日のイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩処理したラットにおける、実験自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の臨床経過を説明する。個々の１要因ＡＮＯＶＡは、１１および１２日ｐ．ｉ．の１ｍｇ投与量で病気を有意に悪化させ、一方、１０ｍｇ投与量は１５日ｐ．ｉ．で臨床評点を有意に減少させたことを示した。このことは、阻害剤は初めに病気を悪化させる傾向があるが、後の段階で病気の回復を促進することを示している。縦軸は１日当たりの平均臨床評点の平均±ＳＥＭを表す。星印はＰＬＳＤ試験での有意なポスト−ｈｏｃ効果を示し、＊＜０．０５および＊＊＜０．００１である。
【図３】
実験自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の臨床経過を説明する。成長したオスのルイスラットにおいて、ＥＡＥの臨床経過の病気進行中（５〜１５日ｐ．ｉ．）における異なる投与量のイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の効果を調べた。記号は１日当たりの平均臨床評点の平均±ＳＥＭを表す。反復測定の２要因ＡＮＯＶＡは、要因治療の有意な主要効果および要因「治療」と「経時臨床評点」との間の有意な相互作用を示し、治療が病気の経過を有意に調節すること、そしてさらに異なる投与量が特異的に作用することを示した。治療開始後、中程度の投与量は早期炎症を引き起こし、病気の「早期ピーク」または「悪化」を招く。９〜１３日の間の急性期間、高投与量のイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩は臨床経過を明らかに改善した。
【図４】
免疫化後１０〜１５日のイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩処理したラットにおける実験自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の臨床経過を説明する。個々の１要因ＡＮＯＶＡは、１１および１２日ｐ．ｉ．の１ｍｇ投与量で病気を有意に悪化させ、一方、１０ｍｇ投与量は１５日ｐ．ｉ．で臨床評点を有意に減少させたことを示した。このことは、阻害剤は初めに病気を悪化させる傾向があるが、後の段階で病気の回復を促進することを示している。縦軸は１日当たりの平均臨床評点の平均±ＳＥＭを表す。星印はＰＬＳＤ試験での有意なポスト−ｈｏｃ効果を示し、＊＜０．０５および＊＊＜０．００１である。
【図５】
実験自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）の臨床経過を説明する。成長したメスのルイスラットにおいて、ＥＡＥの臨床経過の病気進行中（５〜１５日ｐ．ｉ．）における、ｉｃｖ注射した異なる投与量のイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の効果を調べた。記号はグループの１日当たりの平均臨床評点の平均±ＳＥＭを表す。反復測定の２要因ＡＮＯＶＡは、要因治療の有意な主要効果および要因「治療」×「経時臨床評点」間の有意な相互作用を示し、治療は病気の経過を有意に調節することを示した。ＤＰＩＶ阻害剤の全ての投与量は抗炎症効果を示し、開始を遅らせ、そして臨床経過を改善した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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