(57)【要約】本発明の組成物は、ナトリウムチャンネルアルファサブユニットの細胞外部位、ＳＳ１部位またはＳＳ２部位上のどちらかにある位置に特異的に結合する能力を持つナトリウムチャンネル遮断化合物と、薬剤条件を満たすキャリアから構成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのＳＳ１部位またはＳＳ２部位上の、ある位置に特異的に結合するナトリウムチャンネル遮断化合物を最低１つと、弱有機酸とプロピレングリコールの水溶液で構成されｐＨ範囲が３．０から５．０の薬剤条件を満たすキャリアを含む組成物。
【請求項２】
弱有機酸が酢酸である請求項１記載の組成物。
【請求項３】
最低１つのナトリウムチャンネル遮断化合物が、テトロドトキシンまたは類縁体である請求項１記載の組成物。
【請求項４】
最低１つのナトリウムチャンネル遮断化合物が、サキシトキシンまたは類縁体である請求項１記載の組成物。
【請求項５】
テトロドトキシンの類縁体が、アンヒドロテトロドトキシン、テトロダミノトキシン、メトキシテトロドトキシン、エトキシテトロドトキシン、デオキシテトロドトキシンまたはテトロドニック酸である請求項１記載の組成物。
【請求項６】
さらに希酢酸、希塩酸および希クエン酸から選択された酸性の補助溶媒を最低１つ含む請求項１記載の組成物。
【請求項７】
さらに酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液またはホウ酸塩緩衝液から選択された最低１つのｐＨ緩衝剤を含む請求項１記載の組成物。
【請求項８】
プロピレングリコールが、溶液の全容量中に１０％から８０％存在する請求項１記載の組成物。
【請求項９】
プロピレングリコールが、溶液の全容量中に３０％から５０％存在する請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
プロピレングリコールが、溶液の全容量中に３０％から５０％存在する請求項２記載の組成物。
【請求項１１】
さらに血管収縮薬、抗生物質およびステロイド系または非ステロイドの抗炎症薬を含む請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
さらに塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、酢酸フェニル水銀および硝酸フェニル水銀を含むグループから選択された保存剤を含む請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
さらに塩化ナトリウム、マンニトールおよびグリセリンのグループから選択された弾性調整剤を含む請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
さらにグリコール、オレイン酸、アルキルアミンを含むグループから選択された浸透促進剤を含む請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのＳＳ１部位またはＳＳ２部位上の、ある位置に特異的に結合するナトリウムチャンネル遮断化合物を最低１つと、弱有機酸媒体の水溶液で構成されｐＨ範囲が３．０から５．０の薬剤条件を満たすキャリアを含む組成物。
【請求項１６】
弱有機酸が、酢酸である請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
最低１つのナトリウムチャンネル遮断化合物が、テトロドトキシンまたは類縁体である請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
最低１つのナトリウムチャンネル遮断化合物が、テトロドトキシンまたは類縁体である請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】
ナトリウムチャンネルアルファサブユニットのＳＳ１部位またはＳＳ２部位上の、ある位置に特異的に結合するナトリウムチャンネル遮断化合物を最低１つと、Ｃ２からＣ６アルカングリコールの水溶液で構成されｐＨ範囲が３．０から５．０の薬剤条件を満たすキャリアを含む組成物。
【請求項２０】
グリコールが、プロピレングリコールである請求項１９記載の組成物。
のことである。
【請求項２１】
最低１つのナトリウムチャンネル遮断化合物が、テトロドトキシンまたは類縁体である請求項１９記載の組成物。
【請求項２２】
最低１つのナトリウムチャンネル遮断化合物が、テトロドトキシンまたは類縁体である請求項２０記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明分野
本発明は、ナトリウムチャンネル遮断化合物を少なくとも１つ含んだ薬剤組成物に関するものである。
【０００２】
発明の背景
本発明の使用方法と組成物は臨床使用における要件を満たすものである。この処方は、鎮痛を必要とする疼痛や、薬剤依存の治療（これらに限られないが）を含む適応症に対して全身投与できる（Ｓｅｅ， ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ ５，８４６，９７５）。この処方の投与は、Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ａｎａｌｇｅｓｉａ， Ｄｏｎｇ Ｑ． ｅｔ ａｌ， ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ０９／６９５，０５３， ｆｉｌｅｄ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２５， ２０００， Ａｔｔｏｒｎｅｙ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ． ３５１９−０１０３Ｐに説明されている通りである。
テトロドトキシンは強い効力のある非タンパク性の神経毒で、フグ、ハゼ、イモリ、カエル類、ヒョウモンダコを含む多種多様な動物種に見られる。
高い選択性を持つナトリウムチャンネル遮断化合物であるため、テトロドトキシンおよびサキシトキシンは、ナトリウムチャンネルアルファサブユニットの細胞外部位、ＳＳ１部位またはＳＳ２部位上の、ある位置に特異的に結合する。ナトリウムチャンネルのＳＳ１またはＳＳ２部位に結合した化合物は、意外にも、深刻な副作用を何ら起こすことなく、長時間効用を保ち、かつ強力な鎮痛または麻酔効果をもたらすことが可能である（Ｄｏｎｇ Ｑ． ｅｔ ａｌ， ｓｕｐｒａ， ａｎｄ Ｋｕ Ｂ． ｅｔ ａｌ， ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ０９／７０２，８２６， ｆｉｌｅｄ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １， ２０００， Ａｔｔｏｒｎｅｙ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ． ３５１９−０１０６Ｐ）。
【０００３】
テトロドトキシン（ＴＴＸ）は化学式Ｃ１１Ｈ１７Ｎ３Ｏ８を持ち、分子量３１９．２８である。Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ， １０ｔｈ Ｅｄ．（１９８３）では、テトロドトキシンは、化合物ｏｃｔａｈｙｄｒｏ−１２−（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）−２−ｉｍｉｎｏ−５，９：７， １０ａ−ｄｉｍｅｔｈａｎｏ−１０ａＨ−（１，３）ｄｉｏｘｏｃｉｎｏ（６，５−ｄ）−ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−４，７，１０，１１， １２−ｐｅｎｔｏｌの一般名称で、下図の通りの構造である：
【０００４】
【化１】
2004513186.tif 000002
【０００５】
ＴＴＸ分子は、グアニジン（１）とヒドロキシル（６）のあるペルヒドロキナゾリングループから成る。純粋なＴＴＸは白い結晶構造の粉で、無味無臭である。２２０℃程度で分解することなく黒変する。ＴＴＸは酸性水溶液で溶解できるが、有機溶媒には溶性がない。ＴＴＸのｐＫａ（水溶性）は８．７６である。このようにＴＴＸは塩基性アルカロイドである。強酸性の水溶液はＴＴＸを分解できるので、ＴＴＸは通常、弱酸性水溶液で溶解する。ＴＴＸは中性から弱酸性溶液の中では、比較的に熱的安定性があるほうだが、強酸性または塩基性水溶液の中では即座に破壊される。
【０００６】
本発明では原薬として最低純度９６％のテトロドトキシンを利用する。テトロドトキシンは、Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ Ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ， Ｚｈｏｕ Ｍ． ｅｔ ａｌ， ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．０９／６９５，７１１， ｆｉｌｅｄ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２５， ２０００， Ａｔｔｏｒｎｅｙ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ． ３５１９−０１０１Ｐで説明されている技術により得られる。ＴＴＸのさらなる精製についてはＣｈｉｎｅｓｅ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．００１３２６７３．２， ｆｉｌｅｄ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２２， ２０００、および、Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＿＿＿＿＿＿， ｆｉｌｅｄ ＿＿＿＿＿＿＿＿， Ａｔｔｏｒｎｅｙ Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ． ３５１９−０１１０Ｐに説明されている。
テトロドトキシンの類縁体を本発明での処方に使用できる。好ましいＴＴＸ類縁体は、アンヒドロテトロドトキシン、テトロダミノトキシン、メトキシテトロドトキシン、エソキシテトロドトキシン、デオキシテトロドトキシン、およびテトロドニック酸である。
【０００７】
ＴＴＸは胃酸で容易に分解するため、経口摂取は投与経路として望ましくない。そのため、本発明での組成物は主に注射用であり、なるべくなら筋肉注射が好ましい。最も注射向きの処方は溶液であり、溶解度、安定性、安全性のような薬の特性を注射液設計の段階で考慮に入れなければならない（Ｂｉ Ｄ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ， ４ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
注射用ＴＴＸの投与量の計算は、臨床前薬理および薬力学研究の結果に基づく。臨床用薬物投与量の計算は、動物における有効投与量に基づく。一般的には、動物における有効投与量の１／５として計算される。ヒトの体重値として、５０、６０、７０ｋｇがそれぞれ使用される。
【０００８】
マウスの酢酸誘発性ツイスト試験における、ＴＴＸの鎮痛剤ＩＤ５０（５０％抑制量）は２．８０μｇ／ｋｇ（筋内注射：ＩＭ）である。従って、ヒトへの推奨される臨床投与量は以下のとおりである。
２．８０ μｇ／ｋｇ×（１／５）×５０ （６０， ７０） ｋｇ ＝ ２８．０ （３３．６， ３９．２） μｇ
ラットのホルマリン誘発性炎症試験における、ＴＴＸの有効量は、２．５ ｍｇ／ｍｇ （ＩＭ） （Ｐ＜０．０１）である。従って、ヒトへの推奨される臨床投与量は、以下のとおりである。
２．５０ μｇ／ｋｇ×（１／５）×５０ （６０， ７０） ｋｇ ＝ ２５．０ （３０．０， ３５．０） μｇ
ＬＤ５０値をもとにして、初期の臨床投与量を計算することも可能である。薬力学調査の結果を考慮して、臨床投与量を、ＬＤ５０の１／５０として計算することもできる。ヒトの体重値として、５０、６０、７０ｋｇがそれぞれ使用される。我々の最近の調査では、マウスのＬＤ５０は１１．１μｇ／ｋｇ （ＩＭ）であり、推奨される臨床投与量は、以下のとおりである。
１１．１ μｇ／ｋｇ×（１／５０）×５０ （６０， ７０） ｋｇ ＝１１．１ （１３．３２， １５．５４） μｇ
【０００９】
薬力学研究の結果およびその分野での知識に基づき、注射用ＴＴＸの濃度は１５μｇ／ｍｌに設計され、ＴＴＸ注射の充填量は通常１または２ ｍｌである。
ＴＴＸはペルヒドロキナゾリン化合物で、水にはほとんど溶けないが、酸性または塩基性ｐＨの水溶液には溶解する。従って、処方用にＴＴＸを溶解するのに、希酢酸、塩酸およびクエン酸のような一般的な補助溶媒を使える。ＴＴＸは弱酸性溶媒で安定する傾向にあるので、酸性ｐＨを保つことは、ＴＴＸ処方の安定性に役立つ。酸には弱有機酸が好ましく、蟻酸、酢酸またはプロピオン酸が望ましい。
処方のｐＨを許容範囲に保つためには、酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液またはホウ酸塩緩衝液のような適切な緩衝液を使うことが望ましい。これまでの調査では（例１を参照）、ＴＴＸ処方のｐＨは３．５−７．０内、より望ましくは３．５−５．０内に保たれるべきである。緩衝液は処方重量の０．５％までなら加えられる（処方液には濃度１ｇ／ｍｌを適用）。例えば、０．２Ｍ酢酸溶液５５．５ｍｌと０．２Ｍ酢酸ナトリウム溶液４．５ｍｌを作り、処方容量につき５％までを処方に加える。この例では、緩衝液は処方重量の０．０６％を構成することになる。このように、緩衝液は普通、処方重量の約０．１％を構成できる。
加えて、処方内のＴＴＸの安定性を向上させるためには、グリコール（Ｃ２−Ｃ６アルカングリコールが好ましく、最適なのはプロピレングリコール）と水を含む混合溶媒が望ましい。処方にグリコールを加えることによりｐＨを上げても許容範囲で安定し、注射時に患者が耐えやすい処方を提供できる。
【００１０】
要求品質に見合う処方と製造技術を考案するために、気温、光、湿気および酸素といった環境要因がＴＴＸ処方の安定性に与える影響を調査した。調査結果（例４を参照）では、ＴＴＸ処方に湿気と光は何ら大きな影響は与えないが、温度が上がるとＴＴＸの含有量が減ることが明らかである。従って、ＴＴＸ処方は安定性を確実にするためには低温で保存すべきである。
作用向上と保存の便宜性を考慮して、ポリビニールアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロースのようなセルロース類、およびカルボマーのような粘性増加剤、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、酢酸フェニル水銀および硝酸フェニル水銀のような保存剤、塩化ナトリウム、マンニトールおよびグリセリンのような弾性調整剤、グリコール、オレイン酸、アルキンアミンおよび同様の浸透促進剤を含めて、さらなる成分を加えることができる。血管収縮薬も処方に加えられる。持続型ナトリウムチャンネル遮断化合物と抗生物質、ステロイド系または非ステロイド系の抗炎症薬あるいは血管収縮薬を含む混合処方が考慮される。
薬の安全性については、Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ａｎａｌｇｅｓｉａ， Ｄｏｎｇ Ｑ． ｅｔ ａｌ， ｓｕｐｒａに説明されている例によると、ＴＴＸ処方は低毒性、低溶血および低局所刺激の要件を満たしている。Ｄｏｎｇ Ｑらはさらに、ＴＴＸ処方の投与は深刻な副作用や非可逆作用を起こさないことも指摘している。
【００１１】
本発明に好ましい組成物は、純度９６％かそれより高い純度を持つテトロドトキシンを活性成分とし、希酢酸、希塩酸およびクエン酸から選択した補助溶媒、およびｐＨ３．５−５．０に保つための５％酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を含む。処方の製造中は、高温は避け、無菌プロセスが好ましい。運送中は過度の直射日光にさらすことは避け、完成製品は冷所（４−２０ ℃が好ましい）に保存することが推奨される。
サキシトキシンは、テトロドトキシンに似た物理的・化学的性質を持つ。サキシトキシンはＡｌｅｘａｎｄｒｉｕｍ ｔａｍａｒｅｎｓｅ、Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ ｃａｔｅｎａｔｕｍおよびＰｙｒｏｄｉｎｉｕｍ ｂａｈａｍｅｎｓｅを含む渦鞭毛藻に見られる。サキシトキシンの構造は次の通りである：
【００１２】
【化２】
2004513186.tif 000003
【００１３】
サキシトキシンも酸性水溶液に安定性がある。サキシトキシンは高い選択性を持つナトリウムチャンネル遮断物で、このメカニズムにより鎮痛または麻酔効果をもたらす。従って、本発明の組成物において、サキシトキシンはＴＴＸと同じ方法で使用できる。
本発明の処方には、希酢酸、希塩酸またはクエン酸から選択された補助溶媒、および酢酸塩緩衝液、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液およびホウ酸塩緩衝液から選んだ緩衝液を任意に含ませられる。
【００１４】
例
以下の例は本発明の手法と組成物を例証しているが、後述の特許請求範囲に定義されている本発明を制限するものではない。
【００１５】
例１−スクリーニング
この実験で主に調査したのは、様々な補助溶媒、ｐＨ値、温度、光、酸素および緩衝液の量が、テトロドトキシン（ＴＴＸ）薬剤液の安定性に及ぼす影響である。それに従ってＴＴＸ処方の最適な配合が決められる。実験結果によると、最も好ましい配合は、希酢酸を補助溶媒とし、ＴＴＸ薬剤液のｐＨ安定剤として５％酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を用いたものである。最適ｐＨは３．５−４．５の範囲内である。高温は避けるべきである。処方製造段階では無菌状態に保つべきである。運送中は過度の日光照射を避け、完成製品は冷所で保存することが推奨される。
上記に説明された処方技術に沿って準備された全ての試験バッチは、全てのテストパラメータにおいて注射用の品質基準に見合うものであった。その安定性と再現性は良好で、この処方の設計が適切かつ実現可能なものであることを示している。
【００１６】
１．　補助溶媒の選択
一般的に処方に使用される補助溶液である希塩酸、希酢酸、クエン酸水溶液は、それぞれ注射用ＴＴＸの処方のために調査された。その上で、これら３つの酸性水溶液におけるＴＴＸの安定性は、１００℃の水槽加速試験により比較された。
【００１７】
サンプル準備
バッチＮｏ．１：ＴＴＸは０．０１Ｎ希塩酸に溶解、水を加え、ＴＴＸ溶液を濃度１２ μｇ／ｍｌに準備、そのｐＨは約４．４０に調節し、２ｍｌアンプルに充填して密封する。
バッチＮｏ．２：ＴＴＸは０．５％希酢酸に溶解、ｐＨ４．４０の酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を加え、水を加えてＴＴＸ溶液を濃度１２ μｇ／ｍｌに準備、２ｍｌアンプルに充填し密封する。
バッチＮｏ．３：ＴＴＸは０．５％クエン酸水溶液に溶解、ｐＨ４．４０のクエン酸−クエン酸ナトリウム緩衝液を加え、水を加えてＴＴＸ溶液を濃度１２ μｇ／ｍｌに準備、２ｍｌアンプルに充填し密封する。
【００１８】
試験方法
上記サンプルを加速試験用の１００℃の水槽で温める。ｐＨ値とＴＴＸ含有量を０分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分および６０分の時点でサンプルを採り測定する。結果は表１に示すとおりである。
１００℃での水槽加速試験を選択し、ｐＨ値とＴＴＸ含有量を測定するために６０分以内でサンプルを取る根拠は、滅菌注射の通常プロセスが、処方を１００℃の蒸気循環に１５−３０分あてることにより滅菌するためである。これらの条件下で実験を行うとき、処方の安定性の試験結果がより短時間で手に入れられるだけでなく、滅菌条件も適切に選ぶことができる。
【００１９】
【表１】
2004513186.tif 000004
【００２０】
考察
表１に示されるように、三種の処方方法にはそれぞれ、ｐＨにばらつきがあった。１００℃で熱するにあたり、全てのバッチでＴＴＸ含有量が減った。ＴＴＸ塩酸溶液のｐＨは緩衝液が何も加えられなかった場合には相当な変化があった。希有機酸を補助溶媒として使用し、緩衝液が加えられた残り二つの方法では、ｐＨはほとんど変わらなかった。従って、ｐＨを一定に保つためには、ある程度の緩衝液を処方に加える必要がある。表１では加熱がＴＴＸ含有量の大幅な低下原因になり得ることも示している。サンプル（２）の含有量の低下は、他二つのサンプルに比べて少なく、ＴＴＸが酢酸溶液で、より安定性を持つことを示している。
【００２１】
２．　空気中の酸素と高熱での加熱がＴＴＸ溶液に及ぼす影響
表１に示された実験結果によれば、１００℃で１０分加熱されたときの各バッチのＴＴＸ含有量は２０〜３５％減少し、高熱での加熱がＴＴＸ含有量に大きな影響を持つことを示している。一方で、空気中の酸素がＴＴＸ含有量の大幅な低下につながる一要因であるかどうかも判断する必要があった。従って、準備段階で脱酸素処理をしたものとしないものとでＴＴＸ溶液の高熱加速試験を行った。また、アンプルをそれぞれＮ２およびＣＯ２で充填して比較した。
【００２２】
サンプル準備
バッチＮｏ．１：ＴＴＸは０．５％希酢酸に溶解、ｐＨ４．４０の酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を加え、水を加えてＴＴＸ溶液を濃度１２ μｇ／ｍｌに準備、２ｍｌアンプルに充填し密封する（脱酸素処理なし）。
バッチＮｏ．２：ＴＴＸは上記バッチＮｏ．１と同様に調合するが、最初に水をＮ２で脱酸素処理し、Ｎ２下で２ｍｌアンプルに充填し密封する（脱酸素処理あり）。
バッチＮｏ．３：ＴＴＸは上記バッチＮｏ．１と同様に調合するが、最初に水をＣＯ２で脱酸素処理し、ＣＯ２下で２ｍｌアンプルに充填し密封する（脱酸素処理あり）。
試験方法
バッチは加速試験用の１００℃の水槽で温める。ｐＨ値とＴＴＸ含有量を０分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分および６０分の時点でサンプルを採り測定する。結果は表２に示すとおりである。
【００２３】
【表２】
2004513186.tif 000005
【００２４】
考察
表２で示される結果によると、脱酸素処理の有無に関わらずＴＴＸ含有量に目立つ相違はなく、空気中酸素が溶液のＴＴＸ含有量には何ら影響を持たないことを示唆している。これらの試験では、１００℃で１０分加熱された場合、全てのバッチでＴＴＸ含有量が平均２５％減少し、高温加熱が溶液のＴＴＸ含有量低下の主原因であることを示唆している。従って、処方プロセスにおける高温加熱は避けるべきである。加熱による滅菌処理の変わりに濾過滅菌が推奨される。
【００２５】
３．　ＴＴＸ溶液の安定性への光の影響
文献ではＴＴＸは光に対して比較的安定性があると報告されている。その処方における光の影響を拡散照明（室内自然光）と直射日光で別途観察した。
サンプル準備
サンプルは前述項１．で述べたとおりに準備する。
試験方法
サンプルを拡散照明と日光それぞれに様々な期間さらして、内容の変化を調べる。結果は表３と表４に示すとおりである。
【００２６】
【表３】
2004513186.tif 000006
【００２７】
【表４】
2004513186.tif 000007
【００２８】
考察
表３と表４は試験結果が文献に報告されている通りであることを示している。ＴＴＸ溶液は光に対し比較的安定性を持つため製品を光から防ぐ必要はない。しかしながら、直射日光にさらされた場合、含有量がわずかに変化したため、過度の日光は避けるべきで、処方は冷暗所に保管されるべきである。
【００２９】
４．　様々なｐＨにおけるＴＴＸ溶液の安定性の観察
文献ではＴＴＸは酸性および中性水溶液では比較的安定性があると報告されている。ＴＴＸの安定性を様々なｐＨで調べた。
サンプル準備
ｐＨ値が３．００、３．５０、４．００、４．５０、５．００、５．５０にそれぞれ達するように、様々な量の緩衝剤を含ませたＴＴＸ溶液が準備された。ＴＴＸは０．５％希酢酸に溶解させ、上記のｐＨ値を得るために必要な酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を加え、水を加えてＴＴＸ溶液を濃度１２ μｇ／ｍｌに準備、２ｍｌアンプルに充填し密封する。
試験方法
サンプルは７０℃で温めた。０、０．５、１、２、４、８時間でそれぞれサンプルを採り、ＴＴＸ含有量を測定した。結果は表５に示されている。
【００３０】
【表５】
2004513186.tif 000008
【００３１】
考察
試験結果はｐＨによるＴＴＸ溶液の劣化を示したものである。より高いｐＨでの劣化がより大きい。ＴＴＸはｐＨが３．００−４．０８の範囲内でより安定性を持つ。
５．　酢酸塩緩衝液の追加量の選択
上記試験で示されたように、温められたＴＴＸ溶液の劣化の度合いは、ｐＨが上がるに連れて高くなる。従って、調合の設計は、ＴＴＸ注射液のｐＨは決められた酸性範囲におさめ、適切な量の緩衝液を加えるべきである。このようにすれば、指定の保存期限内、処方の安定性を保証するために、比較的に一定のｐＨ環境を保つことができる。ゆえに、様々なｐＨ値における酢酸塩緩衝液の追加量を設計するために直交法を試験に用いた。
試験設計
酢酸塩緩衝液のｐＨ値とそれぞれの追加量は直交法での設計により最適化される。試験用に選択・使用するファクタとそのレベルは以下の表６に示す。
【００３２】
【表６】
2004513186.tif 000009
【００３３】
試験方法
直交法に従い、サンプル準備のために様々なｐＨ値と、関連した追加量の酢酸塩緩衝液を選ぶ。前述項４．で述べられている試験条件下で、サンプルを７０℃の水槽で２時間熱してから、サンプル内のＴＴＸ含有量を調べ、残留率を計算する。結果は表７に示される。
【００３４】
【表７】
2004513186.tif 000010
【００３５】
【表８】
2004513186.tif 000011
Ｆ０．０５ （３，６）＝４．７６，　　　　 Ｆ０．０１（３，６）＝９．７８，
Ｆ０．０５ （２，６）＝５．１４，　　　　 Ｆ０．０１（２，６）＝１０．９２
【００３６】
考察
試験結果と変動分析の表に基づいて、ファクタＡとファクタＢは大きく異なり（Ｐ＜０．０１）、酢酸塩緩衝液のｐＨ値とその追加量が処方の安定性に実質的な影響を持つことを示唆している。試験結果に基づき、最適な組み合わせはＡ２Ｂ３、すなわち、ＴＴＸ溶液の最高安定性が得られるのはｐＨが３．５で、加えられた緩衝液の量が５％のときである。
上記調査から、好ましいＴＴＸ処方は希酢酸を補助溶媒として、ｐＨ範囲が３．５から４．０の５％酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液を含む。処方の製造プロセスにおいて、高熱での加熱は避けるべきで、滅菌には無菌下での調剤か、完成した処方の濾過が推奨される。運送中は直射日光に当てないようにするべきである。完成製品は冷所での保存が推奨される。
上記処方技術で用意された全試作品は、全ての基準において検査された結果、薬剤注射用の品質条件を満たし、上質の再生産性と安定性を示した。
【００３７】
【表９】
2004513186.tif 000012
【００３８】
参考文献
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【００３９】
例２−テトロドトキシン処方の品質調査
１．　特徴
この製品は無色透明の液体である。
2004513186.tif 000013
結論：この３バッチの全サンプルは無色透明の液体である。
【００４０】
２．　確認試験
２．１ 紫外線（ＵＶ）吸収：テトロドトキシン自体にはＵＶ吸収特性はない。しかしながら、アルカリ水で加水分解され、２−アミノ６−メチロール８−ヒドロキシキナゾリン（Ｃ９ベース）とある程度のシュウ酸ナトリウムがを生じ、これがＵＶ域の顕著な吸収特性を示すので、特定・確認用に使用できる。
方法：製品の１０ｍｌを栓付の試験管に入れ、６．０ Ｍ ＮａＯＨ溶液を１ｍｌ加えてよく振り混ぜ、８０℃の水槽で４５分間熱した上で室温までにすぐ冷まし、分光測光法（Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＶ Ａ， Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ｏｆ Ｐ．Ｒ．Ｃｈｉｎａ， Ｖｏｌ． ２， １９９５に記載）にのっとって３４０−２２０ｎｍの範囲での吸収スペクトルを測定する。結果は図１および２と以下の表に示されている。
【００４１】
2004513186.tif 000014
【００４２】
２．２ 高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）：ＨＰＬＣは後述の「内容測定」に述べられている通り行われた。クロマトグラムは図３に示されている。製品サンプルと対照サンプルは同じ保持時間を示している。
【００４３】
2004513186.tif 000015
【００４４】
３．　検査
３．１ 酸性度：
サンプル溶液のｐＨ
2004513186.tif 000016
結論：この３バッチのサンプルのｐＨ値は全て３．９である。
３．２ 溶液の透明度：
３バッチのそれぞれから２００アンプルずつ、Ｃｌａｒｉｔｙ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ａｎｄ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（透明度検査方法・基準）に照らし合わせて透明度を検査する。結果は以下に示されている。
【００４５】
2004513186.tif 000017
結論：この３バッチのサンプルは全て透明である。
【００４６】
３．３ 溶液透過率：
この３バッチから採ったサンプルの透過率は分光測光法（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ｏｆ Ｐ．Ｒ． Ｃｈｉｎａ， Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＩＶ Ａ， Ｖｏｌ． ２， １９９５）にて４３０ｎｍで測定する。結果は以下のとおりである。
2004513186.tif 000018
結論：この３バッチのサンプルの光透過率は全て９８％を越える。
【００４７】
３．４ 容量：
この３バッチからそれぞれ５アンプルずつ抜き出し、Ａｐｐｅｎｄｉｘ Ｉ Ｂ， Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ｏｆ Ｐ．Ｒ． Ｃｈｉｎａ， ， Ｖｏｌ． ２， １９９５記載の注射液容量検査の方法にて、その容量を調べる。結果は次の通りである。
2004513186.tif 000019
結論：これらのサンプルは全てラベル表示量２．０ｍｌより多い。
【００４８】
３．５ 滅菌：
製品をＡｐｐｅｎｄｉｘ ＸＩ Ｈ， Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ｏｆ Ｐ．Ｒ． Ｃｈｉｎａ， Ｖｏｌ． ２， １９９５記載の方法で検査する。製品は基準を満たしている。
３．６ バクテリア内毒素：
製品をＡｐｐｅｎｄｉｘ ＸＩ Ｅ， Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ｏｆ Ｐ．Ｒ． Ｃｈｉｎａ， Ｖｏｌ． ２， １９９５記載の方法で検査する。バクテリア内毒素の内容は７．５ＥＵ／ｍｌより少ない。
３．７ 異常毒性
製品を１：７５の比率で希釈し、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ｏｆ Ｐ．Ｒ． Ｃｈｉｎａ， Ａｐｐｅｎｄｉｘ ＸＩ Ｃ， Ｖｏｌ． ２， １９９５記載の方法で検査する。結果は基準を満たしている。
【００４９】
３．８ 過敏症テスト
方法：６匹のモルモット（雌雄半々）それぞれに、一日おきに０．５ｍｌ ＴＴＸ腹腔内注射を、１匹あたり合計３投与行った。最終投与の１４日後に、そのうち３匹のそれぞれに１．５ｍｌの試薬を静脈注射し、過敏反応をテストした。注射後１５分から２４時間の間モルモットの過敏反応を注意深く観察した。以下のような臨床的症状が二つ以上観察されたときに過敏症の陽性反応と結論付けた：立毛、呼吸困難、くしゃみ、嘔吐、咳。また、ラ音、痙攣、死のいずれかが見られた場合も過敏症とした。これらの反応がない場合は陰性反応とした。最終投与の２１日後に、同様の方法で残り３匹にテストし、同様の基準で反応を調べた。
【００５０】
３．９ 不純物
後述の「内容測定」のとおり、適量の製品を正確に量り、水を加えて濃度０．７５μｇ／ｍｌの対照溶液を作る。この対照溶液から１００μｌを採り、予備検査用にクロマトグラフに注入する。主成分のピークの高さがフルスケールの１０−２５％になるように調節する。製品の１００μｌを正確に採り、クロマトグラフに注入し、主成分の保持時間の二倍にわたってクロマトグラムを記録する。不純物のピークの合計を測定するが、これが主成分のピーク面積を越えるべきではない。
2004513186.tif 000020
【００５１】
４．　内容測定
ＨＰＬＣ検定法を内容測定の分析方法として採用した。
４．１ 機材と試薬
機材：ベックマンＨＰＬＣ（アメリカ。Ｍｏｄｅｌ １２５ポンプを含む。Ｍｏｄｅｌ １６６可変波長検出器、Ｇｏｌｄ Ｎｏｕｖｅａｕクロマトグラフィーワークステーション）。
薬剤：テトロドトキシン（Ｎａｎｎｉｎｇ Ｍａｐｌｅ Ｌｅａｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｌｔｄ． （ＭＬＰ）により精製）とＴＴＸの対照サンプル（ＭＬＰ提供）。
試薬：ナトリウム１−ヘプタンスルフォン酸塩（東京化成工業株式会社）、メタノール（Ｍｅｒｃｋ）、脱イオン水。
４．２ クロマトグラフの条件とシステム：
カラム：ＯＤＳ（５ μｍ）、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ
カラム温度：３０℃
移動相：０．０１Ｍナトリウム１−ヘプタンスルフォン酸塩（ｐＨ５．３０）−メタノール（１００：１）
流量：１．５ｍｌ／分
検出波長：２０５ｎｍ
クロマトグラムは図４に示されている。
カラム効率（ｎ）
理論段数／メートルｎ ＝ ４３２２７をテトロドトキシンピークとして計算した。
テトロドトキシンピークとその隣接ピークの分離（Ｒ）＝１．８
テトロドトキシンピークの非対称ファクタ（Ｔ）＝１．１４
４．３ 精度
クロマトグラフにサンプル溶液を１００μｌ注入し、クロマトグラムを記録してピーク面積を測定する。この検査を６回繰り返す。テトロドトキシンピーク面積のＲＳＤは０．２％ （ｎ＝６）である。
【００５２】
４．４ 直線範囲と最小検出限度
ＴＴＸ対照サンプルから１３．９０ｍｇを正確に量り、１００ｍｌ容積測定フラスコに入れ、０．０２％酢酸溶液を加えて目盛りまで希釈してよく振り混ぜる。溶液の８０、４０、２０、８、４μｌを正確にクロマトグラフに注入しそれぞれのクロマトグラムを記録する。標準較正曲線を描くために、ピーク面積を縦軸、サンプル量を横軸として用いる。直線回帰式はｙ ＝ ３４０３．９１ ＋ ２４３２２６ｘ、直線範囲１２．６２５〜０．５０５μｇ、相関係数０．９９９９。
最低検出限度はノイズ比（Ｓ／Ｎ≧３）に基づき０．０１ｎｇである。
【００５３】
４．５ 回収試験
2004513186.tif 000021
方法：テトロドトキシンなしで、上記調合に従い溶液を準備し、溶液Ａと呼ぶ。
テトロドトキシンを１４．０８ｍｇ量り、０．２％酢酸を加えて溶液の５０ｍｌを作る。これを溶液Ｂと呼ぶ。
溶液Ｂの０．５ｍｌに０．２％酢酸溶液を加え１０ｍｌにする。これを溶液Ｃと呼ぶ。
溶液Ｂの０．５ｍｌに溶液Ａを加え１０ｍｌにする。これを溶液Ｄと呼ぶ。
溶液Ａ、Ｃ、Ｄから１００μｌを採り、ＨＰＬＣシステムにそれぞれ注入し、クロマトグラムを記録する（図５）。回収率を計算する。ここで調べたテトロドトキシンの回収率は１０１．８％であった。
【００５４】
2004513186.tif 000022
回収率Ｒ （％） ＝ １．４２２５６／１．３９６５９×１００＝１０１．８５％ ≒ １０１．８％
【００５５】
４．６ サンプル内容測定
サンプルの１００ μｌを正確に採ってＨＰＬＣカラムに注入し、クロマトグラムを記録し（図４）、ピーク面積を測定する。含有量は標準較正曲線に基づき計算する。３バッチのサンプルの結果は下記のとおりである。
2004513186.tif 000023
【００５６】
５．　参考文献
Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ｏｆ Ｐ．Ｒ． Ｃｈｉｎａ，　Ａｐｐｅｎｄｉｘ， Ｖｏｌ． ２， １９９５
Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ Ｆｏｒ Ｐｒｅ−Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｏｆ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ （Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）， １９９３
Ｈｕｏｚｈｏｎｇ Ｚｈａｎｇ ａｎｄ Ｙｕｌｉｎｇ Ｗｅｎ， Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ａｃｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ． Ｔｉａｎｊｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９５
【００５７】
例３−ＴＴＸ処方に最適な水とプロピレングリコールの比率の選別
水とプロピレングリコールの様々な割合の混合液におけるＴＴＸの安定性を測定した。ＴＴＸ処方を用意するために、様々な割合での水・プロピレングリコール混合液を使用し、それぞれを１００℃の水槽で１０分間熱した。
器具と試薬
Ｗａｔｅｒｓ ５１０ ＨＰＬＣ
電気温水槽（Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒｙ）
ＴＴＸ・純度９６．８５％（Ｎａｎｎｉｎｇ Ｍａｐｌｅ Ｌｅａｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）
１．２プロピレングリコール（ＡＲ， Ｘｉｎｎｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｌａｎｔ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ）
実験設計
【００５８】
2004513186.tif 000024
2004513186.tif 000025
【００５９】
上記に述べられたＴＴＸ処方を準備し２ｍｌアンプルに充填する。アンプル（グループにつき６）は１００℃の水槽で１０分間熱する。次に、それぞれのグループのサンプル内ＴＴＸ含有量を０時間の時点と比較調査し、ＴＴＸの残留率をそれぞれのグループで計算する。結果は表１０のとおりである。
【００６０】
【表１０】
2004513186.tif 000026
【００６１】
分析と結論：
ＴＴＸの安定性、すなわち、ＴＴＸの残留量は概ねプロピレングリコールの比率に沿って増加する。ＴＴＸ残留量はプロピレングリコールの量が容量の６０％以上のときに８８．５％程度に保たれる。プロピレングリコールを適量加えることでＴＴＸ処方の安定性が向上する。
上記の選別実験では、ＴＴＸ処方の安定性は、酢酸と緩衝液からなる溶媒に比べて水とプロピレングリコール（ｐＨは３．５に調整）混合溶媒において向上する。つまり、安定性を向上させる目的で水とプロピレングリコールの混合溶媒でＴＴＸを調合できる。この調査で、ＴＴＸ処方の安定性には水との混合液内のプロピレングリコールの最適な割合は６０％であることを示している。
【００６２】
例４−テトロドトキシン（ＴＴＸ）注射液の安定性の調査
注射用に調合されたテトロドトキシン（ＴＴＸ）の光、熱、保存期間に対する安定性を色々な条件下で調査した。結果が示すところによると光は特に注射用ＴＴＸには影響がなく、物理的な外見や含有量にも明らかな変化は見られなかった。しかしながら、製品は温度に敏感で、温度が上がるにつれて含有量が減少した。ＴＴＸ注射液は低温で保存することが推奨される。
１．　目的
テトロドトキシン注射液処方のバッチから（バッチナンバー９９０１２０−１Ａ）パッケージを取り去ることにより、ＴＴＸ注射液安定性に対する光、熱および保存期間の影響を観察する。
２．　試験条件
光：蛍光灯（２０００−４０００Ｌｘ）で１、３、５、１０日間露光。
高温：４０℃、６０℃、８０℃に１、３、５、１０日間さらす。
加速試験：４０℃・相対湿度７５％に２ヶ月間さらす。
３．　試験項目と方法
外見：目視観測
内容測定：ＨＰＬＣによる（詳細については例２を参照のこと）
４．　試験結果
表１１および図８から１９を参照。
５．　結論
蛍光灯（３０００Ｌｘ）に露光した試験サンプルグループでは、サンプルの外見と内容に変化はなかった。４０℃、６０℃、８０℃にさらされた時は、外見には特に変化はなかったが、含有量にかなりの減少が見られた。保存期間は同じでも温度が高いほど含有量が低くなった。
テトロドトキシン注射液は低温（２℃−８℃）保存されるべきであることを試験結果は示している。
【００６３】
【表１１】
2004513186.tif 000027
【００６４】
参考文献
Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ ｏｆ Ｐ．Ｒ． Ｃｈｉｎａ， Ｖｏｌ． ２， １９９５
Ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ （Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｄｒｕｇｓ）， １９９３．
Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐ．Ｒ． Ｃｈｉｎａ
この中に引用されている様々な科学定期刊行物や特許文献は、ここでの引用により全面的に全目的において開示に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
テトロドトキシン注射液（９９０１２０−１Ａ）確認試験のＵＶスペクトルである。
【図２】
テトロドトキシン注射液（９９０１２１−２Ａ）確認試験のＵＶスペクトルである。
【図３】
テトロドトキシン注射液（９９０１２２−３Ａ）確認試験のＵＶスペクトルである。
【図４】
テトロドトキシン対照サンプル（Ｓ−１）確認試験のＵＶスペクトルである。
【図５】
３バッチのテトロドトキシンと対照サンプルの保持時間のクロマトグラムである。
【図６】
テトロドトキシン注射液（９９０１２０−１Ａ）の内容測定のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図７】
テトロドトキシン注射液処方の回収試験のＨＰＬＣクロマトグラムである。
【図８】
ＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラム（日数０）である。
【図９】
蛍光灯に５日間さらされたＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラムである。
【図１０】
蛍光灯に１０日間さらされたＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラムである。
【図１１】
４０℃で５日間保存されたＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラムである。
【図１２】
４０℃で１０日間保存されたＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラムである。
【図１３】
６０℃で５日間保存されたＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラムである。
【図１４】
６０℃で１０日間保存されたＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラムである。
【図１５】
８０℃で５日間保存されたＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラムである。
【図１６】
８０℃で１０日間保存されたＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラムである。
【図１７】
湿度７５％で５日間保存されたＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラムである。
【図１８】
湿度７５％で１０日間保存されたＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラムである。
【図１９】
湿度９２．５％で５日間保存されたＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラムである。
【図２０】
湿度９２．５％で１０日間保存されたＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラムである。
【図２１】
４０℃での加速テストにおけるＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラム（１ヶ月）である。
【図２２】
４０℃での加速テストにおけるＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラム（２ヶ月）である。
【図２３】
４−５℃で保存されたＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラム（１ヶ月）である。
【図２４】
４−５℃で保存されたＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラム（３ヶ月）である。
【図２５】
４−５℃で保存されたＴＴＸ注射液サンプル（バッチ９９０１２０−１Ａ）のクロマトグラム（６ヶ月）である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004513186.tif 000111
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