(57)【要約】本発明は、脈管内皮成長因子ペプチド細胞レセプターを結合するポリペプチド、そのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドを含む組成物、ならびに前記物質が関係する方法および用途を提供する。本発明に記載する一部のポリペプチドは、天然に存在する既知の脈管内皮成長因子と比較して、独特の受容体結合特性を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
種々の血管内皮増殖因子受容体結合プロフィールを有する２つまたはそれ以上の自然発生脊椎動物血管内皮増殖因子ポリペプチドに由来する複数のペプチドサブユニットを含むキメラポリペプチドであって、
該キメラポリペプチドは、１つの自然発生血管内皮増殖因子ポリペプチドの少なくとも１つの受容体において結合し、および
該キメラポリペプチドは、自然発生増殖因子ポリペプチドと異なる受容体結合プロフィールを有する、キメラポリペプチド。
【請求項２】
自然発生増殖因子ポリペプチドが、血管内皮増殖因子Ａ、血管内皮増殖因子Ｂ、血管内皮増殖因子Ｃ、血管内皮増殖因子Ｄ、血管内皮増殖因子Ｅ、血小板由来増殖因子Ａ、血小板由来増殖因子Ｂおよび胎盤増殖因子からなるグループから選択される請求項１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３】
医薬的に許容される担体中に、請求項１に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項４】
ポリペプチドが、ヒトＶＥＧＦＲ−１およびヒトＶＥＧＦＲ−３に結合し、ヒトＶＥＧＦＲ−２に結合しない請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドが、ヒトＶＥＧＦＲ−１、ヒトＶＥＧＦＲ−２およびヒトＶＥＧＦＲ−３に結合する請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項７】
発現調節配列に操作可能に結合された請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項８】
それによってコード化されるキメラポリペプチドを発現する請求項６に記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項９】
式：
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−ＣＯＯＨ
［式中、Ｘ１は、配列番号：１２８のアミノ酸３〜１１および配列番号：１３７のアミノ酸３〜１１からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ２は、配列番号：１２９および１３８からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ３は、配列番号：１３０および１３９からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ４は、配列番号：１３１および１４０からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ５は、配列番号：１３２および１４１からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ６は、配列番号：１３３および１４２からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ７は、配列番号：１３４および１４３からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ８は、配列番号：１３５および１４４からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ９は、配列番号：１３６および１４５からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−ＣＯＯＨは、配列番号：２のアミノ酸３４〜１３５または配列番号：２２のアミノ酸１１２〜２１６と同じでない］
で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドが、ヒトＶＥＧＦＲ−１、ヒトＶＥＧＦＲ−２およびヒトＶＥＧＦＲ−３からなるグループから選択される少なくとも１つの受容体に結合するポリペプチド。
【請求項１０】
ポリペプチドが、ヒトＶＥＧＦＲ−１、ヒトＶＥＧＦＲ−２およびヒトＶＥＧＦＲ−３からなるグループから選択される１つの受容体に正確に結合する請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ポリペプチドが、式
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−ＣＯＯＨ
のアミノ酸配列に結合したシグナルペプチドアミノ酸配列をさらに含む請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
ポリペプチドが、アミノ末端メチオニン残基をさらに含む請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
ポリペプチドが、式
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−ＣＯＯＨ
のアミノ酸配列に結合したタグアミノ酸配列をさらに含む請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ポリペプチドが、プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃシグナルペプチド、プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃアミノ末端ペプチド、およびプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃカルボキシ末端プロペプチドからなるグループから選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸配列をさらに含む請求項９に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
式：
ＸＮ−Ｖ／ＰＨＤ−Ｘｃ
［式中、ＸＮは、配列番号：２のアミノ酸１〜３４、配列番号：２２のアミノ酸１〜１１１、配列番号：４７のアミノ酸１〜３４、またはそれらの断片からなるグループから選択され；
Ｖ／ＰＨＤは、請求項９に記載のポリペプチドであり；
Ｘｃは、配列番号：２のアミノ酸１３６〜１９１、配列番号：２２のアミノ酸２１７〜４１９、アミノ酸１３６〜２３２、またはそれらの断片からなるグループから選択され；
ＸＮおよびＸｃは、自然発生ヒトＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃ先駆タンパク質、または自然発生ヒトＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃイソホームにおけるアミノ酸配列と同じである］で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項１６】
医薬的に許容される担体中に、請求項９に記載のポリペプチドを含む組成物。
【請求項１７】
請求項９に記載のポリペプチドをコード化するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。
【請求項１８】
式：
５’−Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４−Ｎ５−Ｎ６−Ｎ７−Ｎ８−Ｎ９−３’
［式中、Ｎ１は、Ａ１−ＦまたはＣ１−Ｆ（配列番号：３または２３）のＶＥＧＦヌクレオチド配列を含み；
Ｎ２は、Ａ２−ＦまたはＣ２−Ｆ（配列番号：４または２４）のＶＥＧＦヌクレオチド配列を含み；
Ｎ３は、Ａ３−ＦまたはＣ３−Ｆ（配列番号：５または２５）のＶＥＧＦヌクレオチド配列を含み；
Ｎ４は、Ａ４−ＦまたはＣ４−Ｆ（配列番号：６または２６）のＶＥＧＦヌクレオチド配列を含み；
Ｎ５は、Ａ５−ＦまたはＣ５−Ｆ（配列番号：７または２７）のＶＥＧＦヌクレオチド配列を含み；
Ｎ６は、Ａ６−ＦまたはＣ６−Ｆ（配列番号：８または２８）のＶＥＧＦヌクレオチド配列を含み；
Ｎ７は、Ａ７−ＦまたはＣ７−Ｆ（配列番号：９または２９）のＶＥＧＦヌクレオチド配列を含み；
Ｎ８は、Ａ８−ＦまたはＣ８−Ｆ（配列番号：１０または３０）のＶＥＧＦヌクレオチド配列を含み；
Ｎ９は、Ａ９−ＦまたはＣ９−Ｆ（配列番号：１１または３１）のＶＥＧＦヌクレオチド配列を含む］
で示されるヌクレオチド配列を含む請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１７に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドによって、形質転換されるかまたは発現される宿主細胞。
【請求項２１】
該ポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドを発現する請求項２０に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
哺乳動物内皮細胞または哺乳動物内皮先駆細胞の増殖を調節する方法であって、哺乳動物内皮細胞の増殖を調節するのに有効な量の請求項１に記載のポリペプチドに該細胞を接触させる段階を含む方法。
【請求項２３】
哺乳動物造血前駆細胞の増殖を調節する方法であって、哺乳動物内皮細胞の増殖を調節するのに有効な量の請求項１に記載のポリペプチドに該細胞を接触させる段階を含む方法。
【請求項２４】
哺乳動物対象における内皮細胞の増殖を調節するために、哺乳動物対象を治療する方法であって、請求項１に記載のポリペプチドを哺乳動物対象に投与する段階を含む方法。
【請求項２５】
哺乳動物対象がヒトである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
非自然発生血管内皮増殖因子アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、該非自然発生血管内皮増殖因子アミノ酸配列が、式：
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−ＣＯＯＨ
［式中、Ｘ１は、配列番号：１２８のアミノ酸３〜１１および配列番号：１３７のアミノ酸３〜１１からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ２は、配列番号：１２９および１３８からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ３は、配列番号：１３０および１３９からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ４は、配列番号：１３１および１４０からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ５は、配列番号：１３２および１４１からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ６は、配列番号：１３３および１４２からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ７は、配列番号：１３４および１４３からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ８は、配列番号：１３５および１４４からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；
Ｘ９は、配列番号：１３６および１４５からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み］
で示されるアミノ酸配列に少なくとも９５％同じアミノ酸配列からなり、該ポリペプチドは、ヒトＶＥＧＦＲ−１、ヒトＶＥＧＦＲ−２およびヒトＶＥＧＦＲ−３からなるグループから選択される少なくとも１つの受容体に結合するポリペプチド。
【請求項２７】
哺乳動物内皮細胞の増殖を調節するポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを製造する方法であって、該方法が、
少なくとも２つの脊椎動物血管内皮増殖因子ポリペプチドのアミノ酸断片をコード化するポリヌクレオチドを用意する工程；
ポリヌクレオチドを組み換えてハイブリッドポリヌクレオチドを形成する条件下に、ポリヌクレオチドを混合する工程；
ハイブリッドポリヌクレオチドを発現させて、ハイブリッドポリヌクレオチドによってコード化されたハイブリッドポリペプチドを製造する工程；
ハイブリッドポリペプチドをスクリーニングして、脊椎動物血管内皮増殖因子の受容体に結合するハイブリッドポリペプチドを同定する工程；および
スクリーニング工程において受容体に結合するハイブリッドポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを選択する工程、を含む方法。
【請求項２８】
該スクリーニング工程が、受容体を発現する細胞にハイブリッドポリペプチドを接触させることを含み、ハイブリッドポリペブチドによって誘発された細胞増殖または細胞生存の変化が、ハイブリッドポリペプチドと受容体との結合を示す請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
該スクリーニング工程が、ヒトＶＥＧＦＲ−１およびヒトＶＥＧＦＲ−３に結合するハイブリッドポリペプチドを同定するためにスクリーニングすることを含み、該選択工程が、ヒトＶＥＧＦＲ−１およびヒトＶＥＧＦＲ−３に結合するハイブリッドポリペプチドを選択することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
該スクリーニング工程が、ヒトＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびヒトＶＥＧＦＲ−３に結合するハイブリッドポリペプチドを同定するためにスクリーニングすることを含み、該選択工程が、ヒトＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびヒトＶＥＧＦＲ−３に結合するハイブリッドポリペプチドを選択することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
哺乳動物内皮細胞の増殖を調節するポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを製造する方法であって、該方法が、
ポリヌクレオチド断片の組であって、
該組は、コード化ポリヌクレオチド断片の第一サブセットを含み、第一サブセットの各コード化ポリヌクレオチド断片は、第一哺乳動物血管内皮増殖因子のアミノ酸配列の少なくとも４つのアミノ酸をコード化し、
該組は、コード化ポリヌクレオチド断片の第二サブセットを含み、第二サブセットの各コード化ポリヌクレオチド断片は、第二哺乳動物血管内皮増殖因子のアミノ酸配列の少なくとも４つのアミノ酸をコード化する、特性を有するポリヌクレオチド断片の組を用意する工程；
第一および第二サブセットからのコード化ポリヌクレオチド断片を組み換えてハイブリッドポリヌクレオチドを形成する条件下に、該組を含むポリヌクレオチド断片を混合する工程；
ハイブリッドポリヌクレオチドを発現させて、ハイブリッドポリヌクレオチドによってコード化されたハイブリッドポリペプチドを製造する工程；
ハイブリッドポリペプチドをスクリーニングして、哺乳動物内皮細胞の増殖を調節するハイブリッドポリペプチドを同定する工程；
スクリーニング工程において哺乳動物内皮細胞の増殖を調節するハイブリッドポリペプチドをコード化するポリヌクレオチドを選択する工程、を含む方法。
【請求項３２】
哺乳動物血管内皮増殖因子が、ヒト血管内皮増殖因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、ヒト血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）、ヒト血管内皮増殖因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）、およびヒト血管内皮増殖因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）に保存されている８つのシステインを特徴とする受容体結合ドメインを含む請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
第一および第二哺乳動物血管内皮増殖因子が、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−Ｅ、Ｐ１ＧＦ、ＰＤＧＦ−αおよびＰＤＧＦ−βポリペプチドからなるグループから選択される請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
第一および第二哺乳動物血管内皮増殖因子がヒトである請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
配列番号：５１に記載のアミノ酸１〜１０２を含むポリペプチド。
【請求項３６】
配列番号：５９に記載のアミノ酸１〜１０２を含むポリペプチド。
【請求項３７】
配列番号：６３に記載のアミノ酸１〜１０２を含むポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号：６７に記載のアミノ酸１〜１０４を含むポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号：７１に記載のアミノ酸１〜１０４を含むポリペプチド。
【請求項４０】
配列番号：７５に記載のアミノ酸１〜１０４を含むポリペプチド。
【請求項４１】
配列番号：７７に記載のアミノ酸１〜１０４を含むポリペプチド。
【請求項４２】
配列番号：１５３に記載のアミノ酸１〜１０４を含むポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号：１５５に記載のアミノ酸１〜１０５を含むポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号：１５７に記載のアミノ酸１〜１０５を含むポリペプチド。
【請求項４５】
配列番号：１５９に記載のアミノ酸１〜１０５を含むポリペプチド。
【請求項４６】
配列番号：１６１に記載のアミノ酸１〜１０３を含むポリペプチド。
【請求項４７】
配列番号：１６３に記載のアミノ酸１〜１０２を含むポリペプチド。
【請求項４８】
配列番号：１６５に記載のアミノ酸１〜１０４を含むポリペプチド。
【請求項４９】
配列番号：１６７に記載のアミノ酸１〜１０４を含むポリペプチド。
【請求項５０】
配列番号：１６９に記載のアミノ酸１〜１０４を含むポリペプチド。
【請求項５１】
配列番号：１７１に記載のアミノ酸１〜１０４を含むポリペプチド。
【請求項５２】
配列番号：１７３に記載のアミノ酸１〜１０４を含むポリペプチド。
【請求項５３】
配列番号：１７５に記載のアミノ酸１〜１０４を含むポリペプチド。
【請求項５４】
請求項３５乃至５３のいずれか１つに記載のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項５５】
請求項３５乃至５３のいずれか１つに記載のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５６】
請求項３５乃至５３のいずれか１つに記載のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項５７】
Ｘ４が配列番号：１４０を含み、ポリペプチドがＶＥＧＦＲ−３に結合する、請求項９または２６に記載のポリペプチド。
【請求項５８】
Ｘ５が配列番号：１４１を含む請求項５７に記載のポリペプチド。
【請求項５９】
Ｘ８が配列番号：１４４を含む請求項５７または５８に記載のポリペプチド。
【請求項６０】
ペプチド配列ＴＮＴＦＸｎＰ［Ｘｎは１〜７つのアミノ酸を含む］を含む分子であって、ＶＥＧＦＲ−３のＶＥＧＦ−Ｃ媒介活性化を阻害する分子。
【請求項６１】
Ｘｎが３つのアミノ酸を含む請求項６０に記載の分子。
【請求項６２】
ヒトＶＥＧＦ−Ｃペプチド配列ＥＦＧＶＡＴＮＴＦＦＫＰＰＣＶＳＶＹＲＣＧ、またはその断片または変異形を含む分子であって、ＶＥＧＦＲ−３のＶＥＧＦ−Ｃ媒介活性化を阻害する分子。
【請求項６３】
該分子が、アミノ酸配列ＥＦＧＶＡＴＮＴＦＦＫＰＰＣＶＳＶＹＲＣＧを含む請求項６２に記載の分子。
【請求項６４】
該分子が、アミノ酸配列ＴＮＴＦＦＫＰＰを含む請求項６３に記載の分子。
【請求項６５】
該断片または変異形が、アミノ酸配列ＴＮＴＦＦＫＰＰＣＶＸＸＸＲを含む請求項６２に記載の分子。
【請求項６６】
該断片または変異形が、アミノ酸配列ＴＮＴＦＦＫＰＰＣＶＸＸＸＲＣＧＧＣＣを含む請求項６２に記載の分子。
【請求項６７】
Ｘ２が配列番号：１２９を含み、ポリペプチドがＶＥＧＦＲ−１に結合する、請求項９または２６に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
Ｘ７が配列番号：１３４を含む請求項６７に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
Ｘ４が配列番号：１４０を含み、ポリペプチドがＶＥＧＦＲ−３に結合する、請求項６７または６８に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
Ｘ５が配列番号：１４１を含む請求項６９に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
Ｘ８が配列番号：１４４を含む請求項７０に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
ＶＥＧＦＲ−１のＶＥＧＦ−Ａへの結合のモジュレーターを同定する方法であって、該方法が、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１のＶＥＧＦ−Ａへの結合を可能にする条件下に、被験化合物の存在および不存在において、ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦ−Ａとの結合を測定する工程、および（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１のＶＥＧＦ−Ａへの結合を変化させ、配列番号：２のＰｈｅ４３、Ｍｅｔ４４、Ｔｙｒ４７、Ｇｌｎ４８、Ｔｙｒ５１、Ｇｌｎ１０５およびＭｅｔ１０７によって規定される部位においてＶＥＧＦ−Ａと結合するか、または配列番号：２の該残基とインターフェースするＶＥＧＦＲ−１残基においてＶＥＧＦＲ−１と結合する被験化合物をモジュレーターとして同定する工程、を含む方法。
【請求項７３】
ＶＥＧＦＲ−１のＶＥＧＦ−Ａへの結合のモジュレーターを同定する方法であって、該方法が、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−１のＶＥＧＦ−Ａへの結合を可能にする条件下に、被験化合物の存在および不存在において、ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦ−Ａとの結合を測定する工程、および（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−１のＶＥＧＦ−Ａへの結合を変化させ、配列番号：２のＬｙｓ４２、Ｐｈｅ４３、Ｍｅｔ４４、Ｔｙｒ４７、Ｇｌｎ４８、Ｔｙｒ５１、Ｉｌｅ７２、Ｌｙｓ７４、Ａｓｐ８９、Ｇｌｙ９１、Ｌｅｕ９２、Ｇｌｎ１０５、Ｍｅｔ１０７、Ｉｌｅ１０９、Ｐｈｅ１１１、Ｈｉｓ１１２、Ｇｌｎ１１５、Ｉｌｅ１１７、Ｇｌｕ１２９、Ａｒｇ１３１およびＰｒｏ１３２によって規定される部位においてＶＥＧＦ−Ａと結合するか、または配列番号：２の該残基とインターフェースするＶＥＧＦＲ−１残基においてＶＥＧＦＲ−１と結合する被験化合物をモジュレーターとして同定する工程、を含む方法。
【請求項７４】
ＶＥＧＦＲ−３のＶＥＧＦ−Ｃへの結合のモジュレーターを同定する方法であって、該方法が、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−３のＶＥＧＦ−Ｃへの結合を可能にする条件下に、被験化合物の存在および不存在において、ＶＥＧＦＲ−３とＶＥＧＦ−Ｃとの結合を測定する工程、および（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−３のＶＥＧＦ−Ｃへの結合を変化させ、配列番号：２２のＬｙｓ１２０、Ｓｅｒ１２１、Ｉｌｅ１２２、Ｔｒｐ１２６、Ａｒｇ１２７、Ｇｌｎ１３０、Ｐｈｅ１５１、Ｌｙｓ１５３、Ｓｅｒ１６８、Ｇｌｙ１７０、Ｌｅｕ１７１、Ｔｙｒ１８４、Ｐｈｅ１８６、Ｉｌｅ１９０、Ｐｒｏ１９１、Ｐｒｏ１９６、Ｐｒｏ１９８、Ａｒｇ２１０、Ｍｅｔ２１２およびＳｅｒ２１３によって規定される部位においてＶＥＧＦ−Ｃと結合するか、または配列番号：２２の該残基とインターフェースするＶＥＧＦＲ−３残基においてＶＥＧＦＲ−３と結合する被験化合物をモジュレーターとして同定する工程、を含む方法。
【請求項７５】
ＶＥＧＦＲ−３のＶＥＧＦ−Ｃへの結合のモジュレーターを同定する方法であって、該方法が、（ｉ）ＶＥＧＦＲ−３のＶＥＧＦ−Ｃへの結合を可能にする条件下に、被験化合物の存在および不存在において、ＶＥＧＦＲ−３とＶＥＧＦ−Ｃとの結合を測定する工程、および（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ−３のＶＥＧＦ−Ｃへの結合を変化させ、配列番号：２２のＴｈｒ１４８、Ａｓｎ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｐｈｅ１５１およびＰｒｏ１５５によって規定される部位においてＶＥＧＦ−Ｃと結合するか、または配列番号：２２の該残基とインターフェースするＶＥＧＦＲ−３残基においてＶＥＧＦＲ−３と結合する被験化合物をモジュレーターとして同定する工程、を含む方法。
【請求項７６】
請求項７２または７３に記載の方法によって同定されたモジュレーターを含む医薬組成物。
【請求項７７】
請求項７４または７５に記載の方法によって同定されたモジュレーターを含む医薬組成物。
【請求項７８】
ＶＥＧＦＲ−１に結合する自然リガンドへのＶＥＧＦＲ−１の結合によって生じる病状を改善する薬剤の製造における、請求項７２または７３に記載の方法によって同定されたモジュレーターの使用。
【請求項７９】
ＶＥＧＦＲ−３に結合する自然リガンドへのＶＥＧＦＲ−３の結合によって生じる病状を改善する薬剤の製造における、請求項７４または７５に記載の方法によって同定されたモジュレーターの使用。
【請求項８０】
ＶＥＧＦＲ−１に結合する自然リガンドへのＶＥＧＦＲ−１の結合を阻害する方法であって、ＶＥＧＦＲ−１を発現する細胞を、請求項７６に記載の医薬組成物に接触させる工程を含む方法。
【請求項８１】
ＶＥＧＦＲ−３に結合する自然リガンドへのＶＥＧＦＲ−３の結合を阻害する方法であって、該方法が、ＶＥＧＦＲ−３を発現する細胞を、請求項７７に記載の医薬組成物に接触させる工程を含む方法。
【請求項８２】
ＶＥＧＦＲ−１に結合する自然リガンドへのＶＥＧＦＲ−１の結合によって生じる病状を改善する方法であって、該方法が、該リガンドへのＶＥＧＦＲ−１の結合を阻害するのに有効な量の、該リガンドへのＶＥＧＦＲ−１の結合の負のレギュレーターを、それを必要とする対象に投与する工程を含み、該負のレギュレーターが、配列番号：２のＰｈｅ４３、Ｍｅｔ４４、Ｔｙｒ４７、Ｇｌｎ４８、Ｔｙｒ５１、Ｇｌｎ１０５およびＭｅｔ１０７によって規定される部位、および配列番号：２のＬｙｓ４２、Ｐｈｅ４３、Ｍｅｔ４４、Ｔｙｒ４７、Ｇｌｎ４８、Ｔｙｒ５１、Ｉｌｅ７２、Ｌｙｓ７４、Ａｓｐ８９、Ｇｌｙ９１、Ｌｅｕ９２、Ｇｌｎ１０５、Ｍｅｔ１０７、Ｉｌｅ１０９、Ｐｈｅ１１１、Ｈｉｓ１１２、Ｇｌｎ１１５、Ｉｌｅ１１７、Ｇｌｕ１２９、Ａｒｇ１３１およびＰｒｏ１３２によって規定される部位からなるグループから選択されるＶＥＧＦＲ−１調節部位に結合する方法。
【請求項８３】
ＶＥＧＦＲ−３に結合する自然リガンドへのＶＥＧＦＲ−３の結合によって生じる病状を改善する方法であって、該方法が、該リガンドへのＶＥＧＦＲ−３の結合を阻害するのに有効な量の、該リガンドへのＶＥＧＦＲ−３の結合の負のレギュレーターを、それを必要とする対象に投与する工程を含み、該負のレギュレーターが、配列番号：２２のＬｙｓ１２０、Ｓｅｒ１２１、Ｉｌｅ１２２、Ｔｒｐ１２６、Ａｒｇ１２７、Ｇｌｎ１３０、Ｐｈｅ１５１、Ｌｙｓ１５３、Ｓｅｒ１６８、Ｇｌｙ１７０、Ｌｅｕ１７１、Ｔｙｒ１８４、Ｐｈｅ１８６、Ｉｌｅ１９０、Ｐｒｏ１９１、Ｐｒｏ１９６、Ｐｒｏ１９８、Ａｒｇ２１０、Ｍｅｔ２１２およびＳｅｒ２１３によって規定される部位、および配列番号：２２のＴｈｒ１４８、Ａｓｎ１４９、Ｔｈｒ１５０、Ｐｈｅ１５１およびＰｒｏ１５５よって規定される部位からなるグループから選択されるＶＥＧＦＲ−３調節部位に結合する方法。
【請求項８４】
請求項１、２、４〜６、９〜１５、２６、３５〜５３、５７〜５９、および６７〜７１のいずれか１つに記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項８５】
請求項６０〜６６のいずれか１つに記載の分子を含む医薬組成物。
【請求項８６】
請求項８４に記載の医薬組成物を、ＶＥＧＦＲ−１を選択的に刺激するのに有効な投与量において投与することによって哺乳動物対象を治療する方法。
【請求項８７】
請求項８４に記載の医薬組成物を、ＶＥＧＦＲ−３を選択的に刺激するのに有効な投与量において投与することによって哺乳動物対象を治療する方法。
【請求項８８】
請求項８５に記載の医薬組成物を、ＶＥＧＦＲ−１を選択的に刺激するのに有効な投与量において投与することによって哺乳動物対象を治療する方法。
【請求項８９】
請求項８５に記載の医薬組成物を、ＶＥＧＦＲ−３を選択的に刺激するのに有効な投与量において投与することによって哺乳動物対象を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本願は、２０００年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／２０５，３３１号、および２０００年２月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／１８５，２０５号の優先権を主張する。
各優先権出願の全文および図面は、何らの予断や放棄を伴わずして、参考までに本明細書に組み込まれる。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】
ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）タンパク質類およびそれらの受容体類（ＰＤＧＦＲｓ）は、数種の細胞タイプの細胞増殖、生存および移動の調節に関係している。
ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）タンパク質類およびそれらの受容体類（ＶＥＧＦＲｓ）は、早期分化内皮細胞からの胎児脈管構造の発達である脈管形成、および先在血管から新規血管を形成するプロセスである血管新生の両方において重要な役割を果たす［Ｒｉｓａｕ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ １２５：４４１−４５０（１９８８）；Ｚａｃｈａｒｙ，Ｉｎｔｌ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ３０：１１６９−１１７４（１９９８）；Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ １３：９−２２（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）］。
どちらのプロセスも厳密に制御された内皮細胞の増殖、移動、分化および生存に左右される。
内皮細胞調節システムの機能不全は、癌および例えば増殖性網膜症、加齢性筋変性症、慢性関節リウマチおよび乾癬のような血管形成異常に関連する数種の疾患の重要な特徴である。
内皮細胞の調節に関係する中心的存在が果たす特定の生物学的機能を理解できれば、結果としてそのような疾患を治療するためのより効果的な治療適用につながるであろう［Ｚａｃｃｈａｒｙ， Ｉｎｔｌ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ３０：１１６９−１１７４（１９９８）；Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，　ＦＡＳＥＢ Ｊ １３：９−２２（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）］。
【０００３】
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリー
成長因子のＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーのメンバーには、少なくとも次のものが含まれる：ＰＤＧＦ−Ａ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０６３７４を参照）、ＰＤＧＦ−Ｂ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１２７８３を参照）、ＶＥＧＦ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｑ１６８８９を参照；ここでは明瞭にするためにＶＥＧＦ−Ａまたは特定アイソフォームと称する）、ＰｌＧＦ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５４９３６を参照；胎盤由来成長因子）、ＶＥＧＦ−Ｂ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ４８８０１を参照；ＶＥＧＦ関連因子（ＶＲＦ）としても知られている）、ＶＥＧＦ−Ｃ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ９４２１６を参照；ＶＥＧＦ関連タンパク質（ＶＲＰ）としても知られている）、ＶＥＧＦ−Ｄ（ｃ−ｆｏｓ誘発性成長因子（ＦＩＧＦ）としても知られている；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０００１８５を参照）、ＶＥＧＦ−Ｅ（ＮＺ７ ＶＥＧＦまたはＯＶ ＮＺ７としても知られている；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｓ６７５２２を参照）、ＮＺ２　ＶＥＧＦ（ＣＶ ＮＺ７２としても知られている；例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｓ６７５２０を参照）、Ｄ１７０１ ＶＥＧＦ様タンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１０６０２０を参照；Ｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ １８：３６３−３７４）、およびＮＺ１０ ＶＥＧＦ様タンパク質（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／２５８６９号に記載されている）［Ｓｔａｃｋｅｒ ａｎｄ Ａｃｈｅｎ， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １７：１−１１（１９９９）；Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，　ＦＡＳＥＢ Ｊ １３：９−２２（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）］。
【０００４】
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーのメンバーは、下記の配列によって定義される保存されたＰＤＧＦモチーフを含む多数の構造モチーフを特徴とする：Ｐ−［ＰＳ］−Ｃ−Ｖ−Ｘ（３）−Ｒ−Ｃ−［ＧＳＴＡ］−Ｇ−Ｃ−Ｃ。
角括弧は、ポリペプチド内のこの位置が角括弧内に含まれるアミノ酸のいずれか１つであってよいことを示している。
丸括弧内に含まれている数は“Ｖ”および“Ｒ”残基を分離するアミノ酸の数を示している。
この保存されたモチーフは、一部は分子間および分子内ジスルフィド結合を形成する８個の高度に保存されたシステイン残基によって定義される７０〜１５０アミノ酸の大きなドメイン内に含まれている。
このドメインは、例えばトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）のような他のシステインノット成長因子において所見されるものに類似する、２つの隣接βストランド間で共有結合したリング構造を形成する２個のジスルフィド結合と、そのリングに貫通する第３のジスルフィド結合とからなるシステインノットモチーフを形成している［例えば、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：１３２５−１３３８（１９９７）に記載の図１を参照］。
ＶＥＧＦ−Ｅ以外は全部がよく知られているＰＤＧＦ／ＶＥＧＦタンパク質のアミノ酸配列はＰＤＧＦドメインを含有している。
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリータンパク質類は、主としてそれらのサブユニットがアンチパラレル法で配列されているジスルフィド結合もしくは非共有結合ホモダイマーもしくはヘテロダイマーのどちらかを形成する分泌糖タンパク質である［Ｓｔａｃｋｅｒ ａｎｄ Ａｃｈｅｎ， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １７：１−１１（１９９９）；Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５：１３２５−１３３８（１９９７）］。
【０００５】
ＰＤＧＦサブファミリー
ＰＤＧＦｓは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで数多くの細胞タイプの細胞増殖、細胞生存および化学走化性を調節する［Ｈｅｌｄｉｎ ｅｔ ａｌ．，　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １３７８：Ｆ７９−１１３（１９９８）］。
ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ−ＡおよびＰＤＧＦ−Ｂを作り上げる２つの鎖は、ＰＤＧＦ− ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢまたはＰＤＧＦ−ＢＢの３種のアイソフォームを産生しながらホモダイマー化またはへテロダイマー化することができる。
ＰＤＧＦ−ＡはＰＤＧＦα受容体（ＰＤＧＦＲ−α）にしか結合できないが、他方ＰＤＧＦ−ＢはＰＤＧＦ−αと第２ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦ−β）の両方に結合することができる。
Ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、ＰＤＧＦタンパク質類はパラクリン（傍分泌）法でそれらの機能を発揮するが、それはＰＤＧＦタンパク質類がしばしばＰＤＧＦ受容体発現間充織に密接に付着している上皮（ＰＤＧＦ−Ａ）または内皮（ＰＤＧＦ−Ｂ）細胞中で発現するからである［Ａｔａｌｉｏｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，　Ｉｎｔ Ｒｅｖ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ １７２：９５−１２７（１９９７）において検討されている］。
ＰＤＧＦｓの過剰発現は、悪性腫瘍、アテローム硬化症および線維増殖性疾患を含む数種の病的状態において観察されている。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖した腫瘍細胞および細胞株では、ＰＤＧＦｓおよびＰＤＧＦ受容体の共発現は、細胞形質転換のために重要である自己分泌ループを発生させる［Ｂｅｔｓｈｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ３９：４４７−５７（１９８４）；Ｋｅａｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：９１４−６（１９８８）］。
【０００６】
細胞増殖および細胞生存の調節物質としてのＰＤＧＦｓの重要性は、マウスにおいて最近実施された遺伝子標的試験によって明確に証明されている。
ＰＤＧＦ−ＡまたはＰＤＧＦ−Ｂのどちらかに対するホモ接合性ヌル突然変異はマウスにおいて致死性である。
約５０％のホモ接合性ＰＤＧＦ−Ａ欠損マウスは早期致死性表現型を有しており、生き残った動物は不適切な肺胞中隔形成を原因とする肺気腫を伴う複雑な後天性表現型、そして、薄い真皮、奇形毛嚢および薄い毛髪を特徴とする皮膚表現型を有している。
ＰＤＧＦ−Ａはさらにまた、希突起膠細胞の正常な発達および引続いての中枢神経系の髄鞘形成のためにも必要とされる。
ＰＤＧＦ−Ｂ欠損マウスは、腎臓、血液および心血管の異常を発生する；腎臓および心血管欠損は、少なくとも一部には、壁細胞（血管平滑筋細胞、周囲細胞もしくはメサンギウム細胞）から血管への適正な補充現象の欠如を原因とする。
【０００７】
ＶＥＧＦサブファミリー
ＶＥＧＦサブファミリーは、次の配列を特徴とするＶＥＧＦホモロジードメイン（ＶＨＤ）を共有するＰＤＧＦ／ＶＥＧＦメンバーからなる：Ｃ−Ｘ（２２−２４）−Ｐ−［ＰＳＲ］−Ｃ−Ｖ−Ｘ（３）−Ｒ−Ｃ−［ＧＳＴＡ］−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｘ（６）−Ｃ−Ｘ（３２−４１）−Ｃ。
ＶＥＧＦサブファミリーメンバーの解析から決定されたＶＨＤドメインは、ＰＤＧＦモチーフを含んでいるが、より特異的である。
【０００８】
ＶＤＧＦ−Ａは、最初は内皮細胞に向かう有糸分裂促進活性に基づいて、およびそのために血管透過性亢進因子（ＶＰＦ）とも呼ばれている微小血管透過性を誘発する能力によって数種の起源から精製された。
ＶＥＧＦ−Ａはその後、細胞内カルシウムの可動化、プラスミノーゲンアクチベーターおよびプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１合成の誘導、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの単球移動の促進、内皮細胞における窓形成の誘導、内皮細胞における細胞付着分子発現の促進および酸化窒素媒介性血管拡張および降圧の誘導を含む多数の生物学的プロセスを誘導することが証明されている［Ｆｅｒｒａｒａ， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）；Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ １３：９−２２（１９９９）；Ｚａｃｃｈａｒｙ， Ｉｎｔｌ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ３０：１１６９−１１７４（１９９８）］。
【０００９】
ＶＥＧＦ−Ａは２３ｋＤサブユニットからなる分泌ジスルフィド結合ホモダイマー糖タンパク質である。
別個のｍＲＮＡスプライス変種によってコードされた長さが１２１、１４５、１６５、１８９もしくは２０６アミノ酸の５種のヒトＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム（ＶＥＧＦ１２１−２０６）が報告されており、それらはいずれも内皮細胞中で有糸分裂生起を刺激することができる。
しかし、各アイソフォームは、生物学的活性、受容体特性、およびＶＥＧＦ−Ａに対する低親和性受容体として挙動する細胞表面マトリックスおよび細胞外マトリックス関連性ヘパラン硫酸プロテオグリカン類に対する親和性に関しては相違している。
ＶＥＧＦ１２１はヘパリンにもヘパラン硫酸にも結合しない；ＶＥＧＦ１４５およびＶＥＧＦ１６５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３２９７７）はどちらもヘパリンに結合することができる；ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６はヘパリンおよびヘパラン硫酸に対して最強の親和性を示す。
ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５およびＶＥＧＦ１６５は可溶形で分泌されるが、ほとんどのＶＥＧＦ１６５は細胞表面および細胞外マトリックスプロテオグリカンに限定され、他方、ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６は細胞外マトリックスに結び付いたままとなる。
ＶＥＧＦ１８９およびＶＥＧＦ２０６はどちらもヘパリンまたはヘパリナーゼを用いた処理によって遊離させることができるが、これはこれらのアイソフォームがプロテオグリカン類によって細胞外マトリックスに結合されていることを示している。
細胞定着ＶＥＧＦ１８９はさらにまたプラスミンのようなプロテアーゼ類によって分解させることもでき、活性可溶性ＶＥＧＦ１１０の遊離を生じさせる。
【００１０】
ＶＥＧＦを発現するほとんどの組織は同時に数種のＶＥＧＦアイソフォームを発現することが観察されているが、ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５が優勢なアイソフォームであり、他方、ＶＥＧＦ２０６はめったに検出されない［Ｆｅｒｒａｒａ， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）］。
ＶＥＧＦ１４５は、主として生殖器に由来する細胞中で発現する点で相違している［Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ １３：９−２２（１９９９）］。
【００１１】
ＶＥＧＦ−Ａ発現のパターンは、ＶＥＧＦ−Ａが正常血管系の発達および維持、ならびに腫瘍増殖および、例えば、慢性関節リウマチのような他の病的状態に関連する血管形成に関係していることを示唆している。
ＶＥＧＦ−Ａは発達中の血管系に関連する胎児組織内で発現するが、極めて多数の腫瘍細胞株によっても分泌される。
【００１２】
標的遺伝子破壊によってＶＥＧＦ−Ａがノックアウトされたマウスの解析は、ＶＥＧＦ−Ａが生存のために極めて重要であること、および心血管系の発達がＶＥＧＦ−Ａ濃度勾配に高度に感受性であることを指摘している。
ＶＥＧＦ−Ａの単一コピーが欠如するマウスは妊娠第１１〜１２日目に死亡した。
これらのマウス胎児は成長障害および発達中の心血管構造における欠損を含む数種の発達異常を示している。
ＶＥＧＦ−Ａはさらにまた、出生後にも成長、器官発達、成長板形態形成の調節および軟骨内骨形成のために必要とされる。
ＶＥＧＦ−Ａに対する必要は、加齢とともに、特に生後第４週後には減少する。
成体動物では、ＶＥＧＦ−Ａは、主として、例えば、創傷治癒および黄体の発達のようなプロセスにおける活性血管形成のために必要とされる［Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ １３：９−２２（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）］。
ＶＥＧＦ−Ａ発現は、主として低酸素状態および多数のホルモン類や上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−βを含むサイトカイン類、さらに種々のインターロイキン類による影響を受ける。
調節は転写によって、および、さらに、例えば、ｍＲＮＡ安定性の増加によってのように転写後に発生する［Ｆｅｒｒａｒａ， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）］。
【００１３】
ＶＥＧＦサブファミリーの第２メンバーであるＰ１ＧＦは、ＶＥＧＦ−Ａに比較して血管形成および内皮細胞増殖の不良な刺激因子であり、Ｐ１ＧＦのｉｎ ｖｉｖｏでの役割は明確には判明していない。
選択的ｍＲＮＡスプライシングによって産生するＰｌＧＦの３種のアイソフォームが報告されている［Ｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，　Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ９：２５９−２６８（１９９３）；Ｍａｇｌｉｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ８：９２５−９３１（１９９３）］。
ＰｌＧＦは、ＶＥＧＦ−Ａとのジスルフィド結合ホモダイマーおよびヘテロダイマーの両方を形成する。
ＰｌＧＦ−ＶＥＧＦ−Ａヘテロダイマーは内皮細胞増殖および血管形成を誘導することに関しては、ＰｌＧＦホモダイマーより有効である。
ＰｌＧＦは主として胎盤中で発現し、さらにまた傍卵黄嚢の絨毛性巨細胞における早期胎児形成中にはＶＥＧＦ−Ａと共発現する［Ｓｔａｃｋｅｒ ａｎｄ Ａｃｈｅｎ， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １７：１−１１（１９９９）］。
【００１４】
国際公開公報第ＷＯ９６／２６７３６号および米国特許第５，８４０，６９３号および第５，６０７，９１８号に詳細に記載されているＶＥＧＦ−ＢはＶＥＧＦ−Ａと約４４％のアミノ酸同一性を共有している。
ＶＥＧＦ−Ｂのｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的機能はまだ完全には判明していないが、血管形成特性を有することは証明されており、さらに細胞付着および移動、および細胞外マトリックスの変性を調節することに関係している可能性がある。
ＶＥＧＦ−Ｂは選択的スプライシングによって産生する１６７および１８６アミノ酸配列を有する２種のアイソフォームとして発現する。
ＶＥＧＦ−Ｂ１６７は、ヘパリン結合ドメインを介して細胞表面もしくは細胞外マトリックスと結び付いているが、他方ＶＥＧＦ−Ｂ１８６は分泌される。
ＶＥＧＦ−Ｂ１６７およびＶＥＧＦ−Ｂ１８６は、どちらもＶＥＧＦ−Ａとともにジスルフィド結合ホモダイマーまたはヘテロダイマーを形成することができる。
ＶＥＧＦ１６５−ＶＥＧＦ−Ｂ１６７ヘテロダイマーの細胞表面とのつながりは、ＶＥＧＦ−Ｂコンポーネントによって決定されると思われ、これはＶＥＧＦ−Ａを隔離するためにヘテロダイマー化が重要である可能性を示唆している。
ＶＥＧＦ−Ｂは、主として胎児および成体心臓および骨格筋組織中で発現する［Ｊｏｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，　Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １７３：２１１−２１５（１９９７）；Ｓｔａｃｋｅｒ ａｎｄ Ａｃｈｅｎ， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １７：１−１１（１９９９）］。ＶＥＧＦ−Ｂが欠如するマウスは生き残るが、小さな心臓、機能不全の冠血管構造を有しており、さらに心虚血の結果として生じる回復障害を示す［Ｂｅｌｌｏｍｏ ｅｔ ａｌ．，　Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２０００；Ｅ２９−Ｅ３５］。
【００１５】
ＶＥＧＦサブファミリーの第４のメンバーであるＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦ−Ａとアミノ酸レベルで約３０％同一性であるＶＨＤを備えている。
ＶＥＧＦ−Ｃは、バルビアニリング３タンパク質に典型的なモチーフ内に縦列反復システイン残基を含有するＣ末端ペプチドとともに、ＶＨＤに隣接する広範囲のアミノ末端およびカルボキシ末端ペプチド配列を有する大きな前駆タンパク質であるプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃとして発現する。
プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃは、シグナルペプチド、Ｃ末端プロペプチドおよびＮ末端プロペプチドの連続開裂を含む広範囲のタンパク質分解性成熟を受ける。
分泌ＶＥＧＦ−Ｃタンパク質は、その中で各モノマーがＶＨＤを含有している１種の非共有結合ホモダイマーからなる。
部分タンパク質溶解性プロセッシングによって産生するＶＥＧＦ−Ｃの中間体は、ＶＥＧＦＲ−３受容体に対する親和性増加を示し、さらに成熟タンパク質もまたＶＥＧＦＲ−２受容体に結合することができる［Ｊｏｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１６：（１３）：３８９８−３９１１（１９９７）］。
その中で第１５６位にある単一システインが別のアミノ酸によって置換されているか欠失している突然変異ＶＥＧＦ−ＣはＶＥＧＦＲ−２に結合する能力を消失しているが、依然としてＶＥＧＦＲ−３に結合して活性化することはできることも証明されている［国際公開公報第ＷＯ９８／３３９１７号］。
【００１６】
マウス胎児では、ＶＥＧＦ−Ｃ ｍＲＮＡは主として尿膜、頸部領域および後腎において発現する［Ｊｏｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １７３：２１１−２１５（１９９７）］。
ＶＥＧＦ−Ｃは、リンパ管形成の調節に関係している：ＶＥＧＦ−Ｃがトランスジェニックマウスに皮膚中で過剰発現すると、過形成リンパ管網が観察されるが、これはＶＥＧＦ−Ｃがリンパ成長を誘導することを示唆している［Ｊｅｌｔｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，　Ｓｃｉｅｎｃｅ，　２７６：１４２３−１４２５（１９９７）］。
成体におけるＶＥＧＦ−Ｃの持続的発現は、さらに分化リンパ内皮の維持において重要な役割を果たすことを示している［Ｆｅｒｒａｒａ， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）］。
ＶＥＧＦ−Ｃは、さらにまた血管形成特性も示している：ＶＥＧＦ−Ｃは、コラーゲン中のウシ毛細管内皮（ＢＣＥ）細胞の移動を刺激したり、ヒト内皮細胞の成長を促進したりすることができる［例えば、参照してここに組み込まれる国際公開公報第ＷＯ９８／３３９１７号を参照］。
【００１７】
ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦ−Ｃに構造的および機能的に極めて密接に関連している［例えば、参照してここに組み込まれる国際公開公報第ＷＯ９８／０７８３２号を参照］。ＶＥＧＦ−Ｃと同様に、ＶＥＧＦ−Ｄは、最初はプレプロ−ペプチドとして発現し、Ｎ−末端およびＣ−末端タンパク質溶解性プロセッシングを受け、非共有結合ダイマーを形成する。
ＶＥＧＦ−Ｄは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで内皮細胞における有糸分裂誘起反応を刺激する。
胎児形成中に、ＶＥＧＦ−Ｄは複雑な時間的および空間的パターンで発現し、その発現は成体における心臓、肺および骨格筋において存続する。ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣと指定されているＶＥＧＦ−Ｄの生物学的に活性な断片の単離については、参照してここに組み込まれる国際公開公報第ＷＯ９８／０７８３２号に記載されている。
ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣは、親和性タグペプチドＦＬＡＧ（登録商標）へ連結されたＶＥＧＦ−Ｄの９３〜２０１アミノ酸残基からなる。
【００１８】
ＶＥＧＦサブファミリーのさらに４種のメンバーは、ヒト、ヒツジおよびヤギに感染するポックスウイルスにおいて同定されている。
オルフウイルスをコードするＶＥＧＦ−ＥおよびＮＺ２ ＶＥＧＦは、強力な有糸分裂促進剤であり、透過性強化因子である。
どちらも哺乳類ＶＥＧＦ−Ａとの約２５％のアミノ酸同一性を示し、ジスルフィド結合ホモダイマーとして発現する。
これらのウイルスによる感染症は、これらのウイルスＶＥＧＦタンパク質によって誘発される内皮細胞増殖および血管透過性を含む可能性がある嚢胞性皮膚炎を特徴とする［Ｆｅｒｒａｒａ， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）］。
ＶＥＧＦ様タンパク質は、さらにまたオルフウイルスのさらに２つの菌株であるＤ１７０１［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１０６０２０；Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，　ＥＭＢＯ Ｊ　１８：３６３−３７４（１９９９）に記載されている］およびＮＺ１０［参照までに本明細書に組み込んだ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５８６９号に記載されている］からも同定されている。
【００１９】
これらのウイルスＶＥＧＦ様タンパク質は、宿主内皮上に存在するＶＥＧＦＲ−２に結合することが証明されており、この結合は感染症の発生および血管形成のウイルス誘導にとって重要である［Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，　ＥＭＢＯ Ｊ　１８：３６３−３７４（１９９９）；国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５８６９号を参照］。
【００２０】
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ受容体
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーメンバーと相互作用する７種の細胞表面受容体が同定されている。
これらには、ＰＤＧＦＲ−α（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００２６０６を参照）、ＰＤＧＦＲ−β（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００２６０９を参照）、ＶＥＧＦＲ−１／Ｆ１ｔ−１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５１６０２；Ｄｅ Ｖｒｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：９８９−９９１（１９９２））、ＶＥＧＦＲ−２／ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１（受容体／胎児肝キナーゼ−１を含有するキナーゼ挿入ドメイン；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５９３９７（Ｆｌｋ−１）およびＬ０４９４７（ＫＤＲ）；Ｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ １８７：１５７９−１５８６（１９９２）；Ｍａｔｔｈｅｗｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：９０２６−９０３０（１９９１）を参照）、ＶＥＧＦＲ−３／Ｆｔ４（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−４；米国特許第５，７７６，７５５号およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６８２０３およびＳ６６４０７；Ｐａｊｕｓｏｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９：３５４５−３５５５（１９９４）を参照）、ニューロピリン−１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００３８７３）を参照、およびニューロピリン−２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００３８７２を参照）が含まれる。
２種のＰＤＧＦ受容体は上記のようにＰＤＧＦｓのシグナリングを媒介する。
ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＰｌＧＦ−１およびＰｌＧＦ−２はＶＥＧＦ−Ｒ１に結合する；ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦ−ＥおよびＮＺ２ ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ−Ｒ２に結合する；ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦＲ−３に結合する；ＶＥＧＦ１６５、ＰｌＧＦ−２およびＮＺ２ ＶＥＧＦは、ニューロピリン−１に結合する；そしてＶＥＧＦ１６５はニューロピリン−２に結合する［Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ １３：９−２２（１９９９）；Ｓｔａｃｋｅｒ ａｎｄ Ａｃｈｅｎ， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １７：１−１１（１９９９）；Ｏｒｔｒｅｇａ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｏｎ Ｂｉｏｓｃｉ ４：１４１−１５２（１９９９）；Ｚａｃｈａｒｙ， Ｉｎｔｌ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ３０：１１６９−１１７４（１９９８）；Ｐｅｔｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２５３：１１７−１３０（１９９９）］。
【００２１】
ＰＤＧＦ受容体はそれらの細胞外ドメインに５個の免疫グロブリン様ループを含有するタンパク質チロシンキナーゼ受容体（ＰＴＫｓ）である。
ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３は、それらの細胞外ドメインに７個のＩｇドメインおよび細胞質領域内には１個の分断キナーゼドメインが存在することによって特徴付けられるＰＴＫｓのＰＤＧＦサブファミリーのサブグループを備えている。
ニューロピリン−１およびニューロピリン−２はどちらも非ＰＴＫ−ＶＥＧＦ受容体である。
ＮＰ−１は、ＭＡＭドメイン；凝固因子ＶおよびＶＩＩＩ、ＭＦＧＰｓおよびＤＤＲチロシンキナーゼに相同性の領域；および２個のＣＵＢ様ドメインを含む細胞外部分を有している。
【００２２】
ＶＥＧＦ受容体類のいくつかは２種以上のアイソフォームとして発現する。
第７Ｉｇ様ループ、膜貫通ドメインおよび細胞質領域が欠けているＶＥＧＦＲ−１の可溶性アイソフォームは、ヒト臍静脈内皮細胞中で発現する。
このＶＥＧＦＲ−１アイソフォームは、高度の親和性でＶＥＧＦ−Ａに結合し、ＶＥＧＦ−Ａ誘発性有糸分裂誘起反応を防止することができる［Ｆｅｒｒａｒａ， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）；Ｚａｃｈａｒｙ， Ｉｎｔｌ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ３０：１１６９−１１７４（１９９８）。
ＶＥＧＦＲ−２から切断されたＣ末端もまた報告されている［Ｚａｃｈａｒｙ， Ｉｎｔｌ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ３０：１１６９−１１７４（１９９８）］。
ヒトでは、それらのＣ末端の長さが相違するＶＥＧＦＲ−３タンパク質の３種のアイソフォームがある。
これまでに実施された試験は、長い方のアイソフォームがＶＥＧＦＲ−３の生物学的特性のほとんどの原因となっていることを示唆している。
【００２３】
ＰＤＧＦに対する受容体であるＰＤＧＦα−受容体（ＰＤＧＦＲ−α）およびβ受容体
（ＰＤＧＦＲ−β）は、多数のｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた細胞株によって発現するが、それらはｉｎ ｖｉｖｏでは主として間葉細胞によって発現する（［Ｒａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｐｔｉｄｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（ペプチド成長因子およびそれらの受容体），Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９０）の中で検討されている］。
上記のように、ＰＤＧＦ−Ｂは両方のＰＤＧＦＲｓに結合するが、ＰＤＧＦ−ＡはＰＤＧＦＲ−αへ選択的に結合する。
【００２４】
マウスにおける遺伝子標的試験は、ＰＤＧＦＲｓのリガンド特異性が重複しているにもかかわらず、ＰＤＧＦ受容体に対して別個の生理学的役割を有することを解明した［Ｒｏｓｅｎｋｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １６：２０１−１６（１９９９）］。
２種のＰＤＧＦ受容体のいずれについてのホモ接合性突然変異は、致死性である。
ＰＤＧＦＲ−α欠損マウスは、胎児形成中に妊娠第１０日目で死亡し、不完全な頭部閉鎖、神経堤発達障害、心血管欠損、骨格欠損および水腫を示す。
ＰＤＧＦＲ−β欠損マウスは、腎臓、血液および心血管異常を特徴とするＰＤＧＦ−Ｂが欠損している動物に類似する表現型を発生する；腎臓および心血管欠損は、少なくとも一部には、壁細胞（血管平滑筋細胞、周囲細胞もしくはメサンギウム細胞）から血管への適正な補充現象の欠如が原因である。
【００２５】
ＶＥＧＦＲ−１の発現は、主として血管内皮細胞において発生するが、一部は単球、栄養膜細胞および腎メサンギウム細胞に存在する可能性がある［Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ １３：９−２２（１９９９）］。
高レベルのＶＥＧＦＲ−１ ｍＲＮＡはさらに成体器官中でも検出されており、これはＶＥＧＦＲ−１が細胞増殖に関連しない成熟血管の静止内皮における機能を有することを示唆している。
ＶＥＧＦＲ−１−／−マウスは、子宮内で第８．５〜９．５日の間に死亡する。
これらの動物において、内皮細胞は発達していたが、機能的血管の形成は重度に損傷されており、これはＶＥＧＦＲ−１がおそらく細胞移動に関連する細胞−細胞もしくは細胞−マトリックス相互作用に関係していることを示唆している。
最近、チロシンキナーゼドメインだけが消失している突然変異ＶＥＧＦＲ−１を発現するマウスが正常な血管形成および生存を示すことが証明されたが、これはＶＥＧＦＲ−１のシグナリング能力が必須ではないことを示唆している［Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ １３：９−２２（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）］。
【００２６】
ＶＥＧＦＲ−２発現は、血管内皮において広汎に発現するＶＥＧＦＲ−１の発現に類似しているが、ＶＥＧＦＲ−２発現は、造血幹細胞、巨核球、および腎前駆細胞においても存在する［Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ １３：９−２２（１９９９）］。
ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の発現パターンは広範囲に重複するが、これまでに得られた証拠は、大多数の細胞タイプにおいて、ＶＥＧＦｓの大多数がそれらの生物学的活性を発揮することを通してＶＥＧＦＲ−２が主要受容体であることを示唆している。
ＶＥＧＦＲ−２が欠けているマウス胎児の試験は、さらにこの受容体が内皮細胞分化および造血幹細胞の発達の両方のために必要とされることを指摘している［Ｊｏｕｋｏｖ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １７３：２１１−２１５（１９９７）］。
【００２７】
ＶＥＧＦＲ−３は、早期胎児形成中に内皮細胞中で広汎に発現する。
発達の後期中、ＶＥＧＦＲ−３の発現はリンパ管を発達させることに制限されるようになる［Ｋａｉｐａｉｎｅｎ Ａ． ｅｔ ａｌ．，　Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２：３５６６−３５７０（１９９５）］。
成体では、リンパ管内皮および一部の高内皮小葉脈がＶＥＧＦＲ−３を発現し、転移性リンパ節におけるリンパ洞およびリンパ管腫において発現増加が発生する。
ＶＥＧＦＲ−３はさらにまた、過剰発現試験によって証明されたＶＥＧＦ−Ｃの骨髄造血活性を媒介することができるＣＤ３４＋造血幹細胞のサブセットにおいても発現する［国際公開公報第ＷＯ９８／３３９１７号］。
マウス胎児中でのＶＥＧＦＲ−３遺伝子の標的破壊は、主要血管網のリモデリングの不成功、および第９．５日後の胎児死亡を引き起こす［Ｄｕｍｏｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８２：９４６−９４９（１９９８）］。
これらの試験は、胎児血管構造の発達およびさらにリンパ管形成中におけるＶＥＧＦＲ−３が本質的役割を果たすことを示唆している。
【００２８】
ＶＥＧＦ受容体類の構造解析は、ＧＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２上のＶＥＧＦ−Ａ結合部位が第２および第３Ｉｇ様ループに位置することを示している。
同様に、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３上のＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ結合部位もまた第２Ｉｇループ内に含まれている［Ｔａｉｐａｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｕｎｏｌ　２３７：８５−９６（１９９９）］。
第２Ｉｇ様ループは、さらにドメインスワッピング実験によって証明されたようにリガンド特異性を付与する［Ｆｅｒｒａｒａ，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）］。
【００２９】
受容体−リガンド試験は、ＶＥＧＦファミリータンパク質によって形成されたダイマー類が２個のＶＥＧＦ受容体分子に結合することができ、それによってＶＥＧＦ受容体類をダイマー化できることを示している。
ＶＥＧＦＲ−１上、およびおそらくはさらにＶＥＧＦＲ−２上の第４Ｉｇ様ループはリガンドダイマーに受容体類が結合すると２個の受容体分子を結合させる受容体ダイマー化ドメインとして機能する［Ｆｅｒｒａｒａ，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）］。
ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２に結合するＶＥＧＦ−Ａの領域は相当に大きく重複しているが、これまでに実施された試験はＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２のどちらかと相互作用するＶＥＧＦ−Ａ内の２つの別個のドメイン、ならびにリガンド−受容体相互作用のために決定的に重要であるこれらのドメイン内の特定アミノ酸残基を解明した。
１個の特定ＶＥＧＦ受容体への結合を特異的に防止するどちらかのＶＥＧＦ受容体特異的ドメイン内の突然変異もまた復元されている［Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ １３：９−２２（１９９９）］。
【００３０】
ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２は構造的に類似であり、共通リガンド（ＶＥＧＦ１２１およびＶＥＧＦ１６５）を共有しており、さらに発達中に類似の発現パターンを示す。
しかし、同一リガンドによってＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２を通して媒介されるシグナルはわずかに相違しているように思われる。
ＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦ−Ａに反応して自己リン酸化を受けることが証明されているが、同一条件下でのＶＥＧＦＲ−１のリン酸化はほとんど検出されなかった。
ＶＥＧＦＲ−２媒介性シグナルは、この受容体を組換え的に過剰発現するブタ大動脈内皮細胞の形態、アクチン再構成、およびラッフリングにおける著しい変化を惹起する。
これらの細胞では、ＶＥＧＦＲ−２はさらにまたリガンド誘発性化学走化性および有糸分裂誘起性を媒介したが、他方ＶＥＧＦＲ−１トランスフェクト細胞は、ＶＥＧＦ−Ａに対する有糸分裂誘起反応が欠如していた。
ＶＥＧＦＲ−２への結合を破壊するＶＥＧＦ−Ａにおける突然変異は内皮細胞の増殖を誘導することに成功しないが、他方ＶＥＧＦＲ−１への結合能力が欠損しているＶＥＧＦ−Ａ突然変異体はまだ内皮増殖を促進することができる。
同様に、ＶＥＧＦＲ−２だけを発現する細胞のＶＥＧＦ刺激は有糸分裂誘起反応を引き起こすが、他方ＶＥＧＦＲ−１だけを発現する細胞の匹敵する刺激は細胞移動を生じさせるが細胞増殖は誘導しない。
さらに、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２と共沈するリンタンパク質類は別個であるので、これは相違するシグナリング分子が受容体特異的細胞内配列と相互作用することを示唆している。
【００３１】
ここで浮上する仮説は、血管形成におけるＶＥＧＦＲ−１の主要機能は、ＶＥＧＦ−Ａに結合し、従ってそれとＶＥＧＦＲ−２との相互作用を防止することによってＶＥＧＦ−Ａの活性をマイナス調節することであり、他方ＶＥＧＦＲ−２は内皮細胞におけるＶＥＧＦ−Ａシグナルの主要トランスデューサーであると考えられるというものである。
この仮説を支持して、ＶＥＧＦＲ−１が欠けているマウスは胎児として死亡するが、他方ＶＥＧＦ−Ａには結合できるがチロシンキナーゼドメインが欠けているＶＥＧＦＲ−１受容体を発現するマウスは生き残り、異常な胎児発達または血管形成を示さない。
さらに、ＶＥＧＦＲ−２にだけ結合するＶＥＧＦ−Ａ突然変異体の解析は、それらが内皮細胞内における有糸分裂誘起反応を誘導する能力を保持していることを証明している。
しかし、単球のＶＥＧＦ媒介性移動はＶＥＧＦＲ−１に左右されるので、これはこの受容体を通してのシグナリングが少なくとも１つの生物学的機能のために重要であることを示している。
さらに、樹状細胞の成熟を防止するＶＥＧＦ−Ａの能力もまたＶＥＧＦＲ−１シグナリングに関連しており、これはＶＥＧＦＲ−１が内皮細胞以外の細胞タイプにおいて機能する可能性があることを示唆している［Ｆｅｒｒａｒａ，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）；Ｚａｃｈａｒｙ， Ｉｎｔｌ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ ３０：１１６９−１１７４（１９９８）］。
【００３２】
ニューロピリン−１は、最初は軸索誘導に関係するタンパク質のコラプシン／セマホリンファミリーに対する受容体としてクローニングされた［Ｓｔａｃｋｅｒ ａｎｄ Ａｃｈｅｎ， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １７：１−１１（１９９９）］。
ニューロピリン−１は、胎児形成中に内皮および特定サブセットのニューロンの両方で発現するので、神経系および血管系の発達を調整することに関係していると思われる。
ニューロピリン−１の活性化は、ＶＥＧＦファミリーチロシンキナーゼ受容体類の不在下で生物学的反応を引き出すとは思われないが、細胞上でのそれらの存在はより効率的なＶＥＧＦ１６５の結合およびＶＥＧＦＲ−２媒介性反応をもたらす［Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ １３：９−２２（１９９９）］。
ニューロピリン−１が欠如するマウスは胎児心血管系の発達において異常を示す［Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ １３：９−２２（１９９９）］。
【００３３】
ニューロピリン−２は発現クローニングによって同定されており、ニューロピリン−１に密接に関連するコラプシン／セマホリン受容体である。
ニューロピリン−２は、ＶＥＧＦ１６５だけに結合するアイソフォーム特異的ＶＥＧＦ受容体である。
ニューロピリン−１と同様に、ニューロピリン−２は、内皮および特定ニューロンの両方で発現するが、相当に短い細胞内ドメインのために独立して機能するとは予測されていない。
血管発達におけるニューロピリン−２の機能は不明である［Ｆｅｒｒａｒａ，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）；国際公開公報第ＷＯ９９／３０１５７号］。
【００３４】
ＶＥＧＦポリペプチドおよびアンタゴニストに対する治療適用
ＶＥＧＦ−Ａが、血管発達の重要な調節物質であるとの発見は、心血管医学においてＶＥＧＦをベースとする治療的血管形成を使用する積極的な研究ならびにＶＥＧＦアンタゴニストを用いた病理的血管形成を特徴とする疾患の治療を鼓舞してきた。
引続いて追加のＶＥＧＦファミリータンパク質の同定およびそれらが血管信性において果たす役割の解明もまた、これらの成長因子に基づく治療法の発達をもたらしてきた［Ｆｅｒｒａｒａ ａｎｄ Ａｌｉｔａｌｏ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ５：１３５９−１３６４（１９９９）］。
裸ＤＮＡまたはアデノウイルスベクターを使用した組換えタンパク質もしくは遺伝子導入の適用によって送達されるＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃを使用した後肢虚血および心筋虚血の動物試験の結果は、これらの分子が血管新生を促進し、冠動脈血流量を増加させることを意味している。
これらの前途有望な試験結果は、裸ＤＮＡをコードするＶＥＧＦ１６５の動脈内または筋内遺伝子導入によって四肢虚血を有する患者が治療される臨床試験を導いた。
心筋虚血またはビュルガー病（閉塞性血栓血管炎）を有する患者にもＶＥＧＦ１６５プラスミドＤＮＡが局所注射された。
これらの臨床試験はプラセボ対照試験ではなかったが、患者は臨床的改善および虚血性組織における血管形成の証拠を示した。
心筋虚血を有する患者を治療するために、ＶＥＧＦ−Ｃ裸ＤＮＡの遺伝子導入またはアデノウイルスベクターを用いたＶＥＧＦ１２１による遺伝子療法を使用した臨床試験は、現在フェーズＩが進行中である［Ｆｅｒｒａｒａ，Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ７７：５２７−５４３（１９９９）；Ｎｅｕｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， ＦＡＳＥＢ Ｊ １３：９−２２（１９９９）；
Ｆｅｒｒａｒａ ａｎｄ Ａｌｉｔａｌｏ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ５：１３５９−１３６４（１９９９）］。
組換えＶＥＧＦ−Ａタンパク質を投与する治療効果についてもまた現在進行中の臨床試験で調査中である。
組換えＶＥＧＦ１６５の冠動脈内注射によって治療された冠虚血症を有する患者のフェーズＩ試験からの結果は、潅流改善および側副血管形成の証拠を示している。
しかし、引続いてのフェーズＩＩ試験では、患者はプラセボ対照群に比較して統計的有意な改善を示さなかった。
ＶＥＧＦ成長因子についての他の潜在的治療使用には、乳癌手術中に腋窩リンパ節が切除された患者におけるリンパ管形成を促進するためのＶＥＧＦ−Ｃの使用が含まれる。
組織中の血管形成を促進するために成長因子の組み合わせを使用する治療法もまた、一定の疾患を治療することに関して望ましいことが証明される可能性がある［Ｆｅｒｒａｒａ ａｎｄ Ａｌｉｔａｌｏ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ５：１３５９−１３６４（１９９９）］。
【００３５】
ＶＥＧＦ成長因子の活性を阻害することに基づく治療法は現在、病的血管形成を特徴とする疾患状態を治療するために試験中である。
ＶＥＧＦ発現は、原発性乳癌および胃癌を含むヒトの大多数の腫瘍においてアップレギュレーションされる。
マウスにおける試験は、ＶＥＧＦ−Ａに対するモノクローナル抗体を用いて動物を治療することによって腫瘍関連性血管形成および腫瘍細胞増殖を阻害できることを示している。
また別の動物試験は、ＶＥＧＦＲ−２受容体を通してのシグナリングを防止する優勢陰性ＶＥＧＦＲ−２突然変異体の発現、またはＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２受容体の細胞外部分だけを含有する組換えＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２突然変異体の投与が数種の腫瘍細胞株の増殖を抑制することを証明した。
これらの有望な試験結果は、ＶＥＧＦ−ＡインヒビターとしてＶＥＧＦ−Ａに対するヒト化高親和性モノクローナル抗体類（ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ）を使用する臨床試験を導いた。
非小細胞肺癌、結腸直腸癌、乳癌および腎細胞癌を治療するためのｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦを使用したフェーズＩＩ試験もまた現在進行中である。
ＶＥＧＦ−Ｃ活性の阻害を目標とする化合物もまた癌患者における治療使用について現在試験中である：ＶＥＧＦ−Ｃの小分子インヒビター類はフェーズＩＩ臨床試験中であり、ＶＥＧＦ−Ｃに対するモノクローナル抗体類は臨床試験に入りつつある。
【００３６】
糖尿病性網膜症、網膜中心静脈閉塞または未熟児はＶＥＧＦ−Ａのレベル上昇と関連付けられてきた。
ＶＥＧＦ−Ａに対するモノクローナル抗体類または免疫グロブリンγＦｅドメインへ融合した細胞外ドメインだけを含有する可溶性ＶＥＧＦＲ−１もしくはＶＥＧＦＲ−２突然変異体を使用した動物試験は、網膜血管形成の抑制を証明している。
ＶＥＧＦ−Ａはさらにまた加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）においても検出されており、その発現はこの疾患における新血管形成の原因であると考えられる。
ＡＭＤを治療するための組換えヒト化抗ＶＥＧＦ−Ａ Ｆａｂ抗体断片の硝子体内送達または２’−フルオロピリミジンＲＮＡオリゴヌクレオチドリガンド（アプタマー）の注射については現在、臨床試験進行中である。
ＶＥＧＦ成長因子の活性を阻害する化合物もまた異常血管形成に関係するその他の疾患状態を治療するために使用できる可能性がある。
これらには、虚血性再潅流関連性脳水腫および脳損傷、例えば多嚢胞性卵巣症候群、子宮内膜症および卵巣過激刺激症候群のような卵巣の過形成および過剰血管分布に関連する状態が含まれる［Ｆｅｒｒａｒａ ａｎｄ Ａｌｉｔａｌｏ， Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ ５：１３５９−１３６４（１９９９）］。
【００３７】
上述の考察から、ＶＥＧＦファミリーの成長因子類、およびそれらのインヒビター類が治療薬として極めて大きな可能性を有していることは明白であろう。
例えば、そのような成長因子類およびインヒビター類は、虚血性障害の治療、創傷治癒の促進、または血管形成依存性である新生腫瘍障害の阻害または排除におけるように、必要な場合に血管形成を促進または阻害するために有用である。
しかし、この成長因子ファミリーの様々な天然型メンバーはしばしば多数の受容体に結合し、さらに種々のよく知られている受容体は複数の細胞タイプ上で発現して発達工程および病的状態の存在もしくは不在に依存して変化する可能性がある発現パターンを有している。
あらゆる特定成長因子の生物学的作用は受容体依存性、アイソフォーム依存性、および細胞タイプ依存性である可能性がある。
１つの受容体を通して媒介される望ましい治療作用には別の受容体を通して媒介される望ましくない副作用が付随することがある。
あるいはまた、望ましい治療作用は複数の受容体類の刺激を通して強化できる可能性があるが、これは天然型のよく知られているいずれかの単一の成長因子を用いて刺激することはできない。
このため、固有の受容体結合のユニークなプロフィールおよび受容体刺激活性または受容体阻害活性を備える新規のペプチド成長因子に対する必要が存在する。
【００３８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、自然発生血管内皮増殖因子受容体のための新規ポリペプチド結合分子、および該新規ポリペプチドをコード化し、該ポリペプチドの組換え発現に有用なポリヌクレオチドを提供することによって、前記の要求を満たす。
本発明を説明するために、「血管内皮増殖因子」という用語およびその略語「ＶＥＧＦ」（修飾因子なし）は本明細書において総称的に使用され、血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、血管内皮増殖因子−Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）、血管内皮増殖因子−Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）、血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、血小板由来増殖因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、血小板由来増殖因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）およびウイルスコード化ＶＥＧＦ様分子を包含するがそれらに限定されない増殖因子ポリペプチドのファミリーのいずれかを意味する。
【００３９】
例えば、１つの局面において、本発明は、種々の血管内皮増殖因子受容体結合プロフィールを有する２つまたはそれ以上の自然発生脊椎動物血管内皮増殖因子ポリペプチドに由来する複数のペプチドサブユニットを含むキメラポリペプチドを提供し、該キメラポリペプチドは、１つの自然発生血管内皮増殖因子ポリペプチドの少なくとも１つの受容体において結合し、および、該キメラポリペプチドは、自然発生増殖因子ポリペプチドと異なる受容体結合プロフィールを有する。
【００４０】
これに関連して、「自然発生脊椎動物血管内皮増殖因子ポリペプチド」という用語は、下記の特性を有するポリペプチドを意味する：
（１） ポリペプチドは、脊椎動物（例えば、爬虫類、両生類、鳥類または哺乳類、好ましくは鳥類または哺乳類、最も好ましくは哺乳類、特に、有尾猿、無尾猿またはヒトのような霊長類哺乳動物）のゲノムＤＮＡによってコード化されるか、または哺乳動物ポックスウイルスのような脊椎動物病原体のゲノムによってコード化される；
（２） ポリペプチドは、脊椎動物によって発現される（すなわち、脊椎動物のゲノムＤＮＡの転写／翻訳からか、またはウイルス核酸によってコード化されるポリペプチドの場合は、ウイルス誘発転写／翻訳から）アミノ酸配列の全てまたは一部を含む；
（３） ポリペプチドまたは部分は、自然発生受容体に結合し、アミノ酸モティーフ：Ｃ−Ｘ（１８−２８）−Ｐ−Ｘ−Ｃ−Ｘ（４）−Ｒ−Ｃ−Ｘ−Ｇ−Ｃ（１−２）−Ｘ（６−１２）−Ｃ−Ｘ（３０−４６）−Ｃ［式中、Ｘはアミノ酸を表し、括弧内の数字はアミノ酸の許容範囲を表し（例えば、Ｘ（１８−２８）は１８−２８アミノ酸のストレッチを表す）；Ｃ（１−２）は１つまたは２つのシステイン残基を表す］によって部分的に特徴づけられる約７０〜１５０アミノ酸のＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ相同ドメイン（Ｖ／ＰＨＤ）を含む。Ｖ／ＰＨＤは、ヒト血管内皮増殖因子Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ（ＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃおよび−Ｄ）、およびヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に見られるのと同様のシステインノットモティーフを形成する８つの保存システインを一般に有する。
好ましいポリペプチドまたは部分は、より特徴的なアミノ酸モティーフ：Ｃ−Ｘ（２２−２４）−Ｐ−［ＰＳＲ］−Ｃ−Ｖ−Ｘ（３）−Ｒ−Ｃ−Ｘ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｘ（６）−Ｃ−Ｘ（３２−４１）−Ｃ［式中、括弧内のアミノ酸（例えば［ＰＳＲ］）は、アミノ酸配列における１つの位置における代替物を表す］を特徴とするＶ／ＰＨＤを含む；および
（４） ポリペプチドは、脊椎動物の血管またはリンパ管の内表面を形成する内皮細胞、または血管の内表面を形成し、血管を支える周皮／平滑筋細胞において発現される少なくとも１つの細胞表面受容体に結合する。
好ましいポリペプチドは、内皮細胞において発現される少なくとも１つの細胞表面受容体に結合する。
【００４１】
従って、「自然発生脊椎動物ＶＥＧＦポリペプチド」という用語は、ある特定の構造特性および機能特性を有するポリペプチドを意味する。
これに関連して、該用語は起源を意味するものではない。
従って、前記の基準を満たす組換え産生ポリペプチドは、自然に存在するＶＥＧＦポリペプチドのアミノ酸配列および受容体結合特性を有する故に、「自然発生」であると考えられる。
ヒト血管内皮増殖因子−Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、血管内皮増殖因子−Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）、血管内皮増殖因子−Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）、血管内皮増殖因子−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、血小板由来増殖因子−Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ）、血小板由来増殖因子−Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ）、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）；それらの哺乳類および鳥類オルトログ（「オルトログ」という用語は種相同体を意味する）；および血管内皮増殖因子−Ｅ（ＶＥＧＦ−Ｅ）、ＮＺ２ ＶＥＧＦ、およびポックスウイルスにおいて同定された菌株Ｄ１７０１およびＺＮ１０において同定された２つのＶＥＧＦ様タンパク質を包含するがそれらに限定されない多くの例示的自然発生血管内皮増殖因子ポリペプチドが当分野において既に知られている。
自然発生ヒトＶＥＧＦの使用は、ヒト治療法として有効なキメラ分子を発現させて、ヒトにおいて免疫反応を生じるキメラの発現の可能性を最小限にするのに好ましい。
しかし、多くの場合、特に受容体結合ドメインにおいて、ＶＥＧＦ種オルトログの間に極めて高い相同が存在し、非ヒト自然発生ＶＥＧＦを使用して、ヒト治療に使用されるキメラ分子を発現させることもできると考えられる。
本明細書において部分的に特にＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃキメラポリペプチドに関して本発明を説明するが、本明細書に記載する２つ、または３つ、または４つ、またはそれ以上のＶＥＧＦ、またはそれらの種オルトログに由来するキメラポリペプチドが特に考えられる。
【００４２】
本発明のこの局面を説明するために使用される「キメラ」という用語は、キメラ分子のアミノ酸配列が、それが由来する各自然発生ＶＥＧＦからの１つまたはそれ以上のアミノ酸の少なくとも１つのストレッチ（好ましくは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上のアミノ酸のストレッチ）を有することを必要とする。
従って、キメラポリペプチドは、２つまたはそれ以上のポリペプチドの「ハイブリッド」または「モザイク」である。
「キメラ」という用語は、本発明のポリペプチドが、あらゆる自然発生ＶＥＧＦ配列（または自然ＶＥＧＦ配列の断片）と同じでないことを意味する。
【００４３】
本発明のこの局面を説明するために使用される「由来する」（例えば、「２つまたはそれ以上の自然発生ＶＥＧＦポリペプチドに由来する」）という用語は、キメラポリペプチドおよび２つまたはそれ以上の自然発生ＶＥＧＦのアミノ酸配列を標準アルゴリズムを使用して整列した場合に、キメラポリペプチドにおける実質的に全てのアミノ酸が、該キメラが由来する１つまたはそれ以上の自然発生ＶＥＧＦにおける同じ残基と整列することを意味する。
標準タンパク質配列アルゴリズム、例えばクラストラル法（Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２；４６７３−８０（１９９４））、Ｊｏｔｕｎ−Ｈｅｉｎ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １８３；６２６−６４５（１９９０））、またはＦｅｎｇ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ法（Ｊ Ｍｏｌ Ｅｖｏｌ ２５；３５１−３６０（１９８７））を使用して、自然発生脊椎動物血管内皮増殖因子ポリペプチドを整列することができ、そのような整列は、Ｖ／ＰＨＤに分布した８つの高保存システインの存在によって円滑に促進される。
従って、一般に認められているタンパク質配列アルゴリズムを使用して整列を行うことによって、キメラポリペプチドが２つまたはそれ以上の自然発生ＶＥＧＦに「由来する」ことを容易に確認することができる。
標準アルゴリズムを使用して、キメラポリペプチドおよび２つまたはそれ以上の自然発生ＶＥＧＦのアミノ酸配列を整列した後に、キメラポリペプチドにおける実質的に全てのアミノ酸が、１つまたはそれ以上の天然ＶＥＧＦにおける同じ残基と整列する場合、キメラポリペプチドは自然発生ＶＥＧＦに由来している。
１つの実施形態において、キメラ分子の全てのアミノ酸がこのように整列する。
しかし、「実質的に全ての」という用語の使用は、キメラポリペプチドを製造する本明細書に記載されている方法は、挿入、欠失または置換のような変異を導入し、親配列への１００％の相関を妨げる場合があることを示している。
【００４４】
そのような場合、キメラポリペプチドの残基の少なくとも約９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％が、少なくとも１つの天然ＶＥＧＦからの同じ残基と整列する。
【００４５】
キメラポリペプチドが由来した天然ＶＥＧＦポリペプチドと完全にあるいは実質的に整列している本発明のキメラポリペプチドを提示する場合、突然変異（特に保存的変異）をそのキメラポリペプチドに意図的に導入して、また、その受容体結合プロフィールに関してこうした修飾キメラポリペプチドを試験することは、熟練した技術を有する当業者の技術の範囲内にある。
受容体結合プロフィールにおいて実質的な変化を導入することがないキメラポリペプチドの修飾（特に保存的アミノ酸置換）は、本発明の範囲内の等価物と考えられる。
【００４６】
こうしたキメラポリペプチドの文脈では、「複数のペプチドサブユニット」という用語は、２つあるいはそれ以上のペプチドサブユニットを意味する。
本明細書で例示されているのは、それぞれ約８〜１６コドンの９サブユニットの中に２つの自然発生ＶＥＧＦ ｃＤＮＡのもの（ヒトＶＥＧＦ−ＡおよびヒトＶＥＧＦ−Ｃ）の中にキメラポリペプチドを断片化して入れ、また、これら断片をその９つのサブユニットの全５１２の配列（サブユニットの順序を維持して）内に組み込み、また、その結果生じたキメラｃＤＮＡを発現させることにより得られるキメラポリペプチドである。
断片の数とサイズは、１つの非常に重要な特徴であるとは考えられていない。
好適な実施形態では、複数のものは、２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４あるいは２５あるいはそれ以上のサブユニットからなる。
本明細書に例示されているように、「サブユニット」は、ポリペプチド鎖を形成するペプチド結合により結合される。
【００４７】
本発明のキメラポリペプチドあるいは自然発生ＶＥＧＦポリペプチドの文脈では、「血管内皮成長因子受容体結合プロフィール」の測定は、ポリペプチドが結合するであろう受容体、およびそれが結合しないであろう受容体の測定を意味する。ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３を含む公知のＶＥＧＦ受容体は、本明細書中の他の箇所にさらに詳細に説明されている。
公知のＰＤＧＦ受容体はまた、本明細書中の他の箇所でさらに詳細に説明されている。
キメラポリペプチドが自然発生するＰＤＧＦ配列から一部分得られた場合は、ＰＤＧＦ受容体に結合するためのキメラポリペプチドをスクリーニングすることが、その受容体結合プロフィール測定の一部分として考えられている。
例として、キメラポリペプチドが、ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３に結合するＶＥＧＦ−Ａから、また、ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３に結合するＶＥＧＦ−Ｃから獲得された場合には、そのキメラポリペプチドはそれがその３つの受容体のうちの１つのみに結合する場合、あるいはそれが全３つの受容体に結合する場合、あるいはそれがＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−３には結合するが、ＶＥＧＦＲ−２には結合しない場合には、その親分子のいずれとも異なる受容体結合プロフィールを有する。
１つの好適な実施形態では、本発明は、そのキメラポリペプチドは、自然発生するその２つあるいはそれ以上の脊椎動物ＶＥＧＦポリペプチドのそれぞれによって結合される少なくとも２つのＶＥＧＦ受容体にキメラポリペプチドが結合し、また、そのキメラポリペプチドが得られたその自然発生ＶＥＧＦポリペプチドが、その少なくとも２つのＶＥＧＦポリペプチドの１つあるいはそれ以上に結合することには失敗するキメラポリペプチドを提供する。
【００４８】
ＮＰ−１とＮＰ−２の結合を司っているＶＥＧＦ（またその他のファミリーメンバー）のその部分はＶ／ＰＨＤコア領域の外側の部分であるため、そのニューロピリン｛ｎｅｕｒｏｐｉｌ＝ニューロピル＝神経絨｝ＮＰ−１に対して結合するために本発明のポリペプチドをスクリーニングすることは、受容体結合プロフィール測定の一部分としては考えられていない。
ＮＰ−１結合はＶＥＧＦ−Ａに関しては、配列番号：２のアミノ酸残基１４２〜１８５により仲介され、また、ＶＥＧＦ−Ｂに関しては、アミノ酸残基１３８〜１８２により仲介される［Ｓｏｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：５７６１−７（１９９６）；Ｍａｋｉｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７４：２１２１７−２２（１９９９）］。
下記に説明されているように、本発明のキメラポリペプチドに対して上流あるいは下流を付加することが企図され、また、いくつかの付加配列が、ＮＰ−１およびＮＰ−２結合を結果的に生じるよう、企図される。
【００４９】
本発明は、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３の全てに結合することができるポリペプチドの最初の開示を提供するものであると考えられる。
この受容体結合プロフィールを有する全てのポリペプチドは、本発明の範囲内にあるものと考えられる。
【００５０】
自然発生ＶＥＧＦポリペプチドは一般的には高い親和性をもって、すなわち、これはサブナノモル解離定数をもってそれぞれの受容体を結合させることを意味していることがこの文脈では理解される。
例えば、ＶＥＧＦ−Ａは、それぞれおよそ１６ｐＭおよび７６０ｐＭのＫｄをもって、ＶＥＧＦ−１とＶＥＧＦＲ−２を結合させ、また、ＶＥＧＦ−Ｃは、それぞれおよそ４１０ｐＭおよび１３５ｐＭのＫｄをもって、ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３を結合させる。
正常血清濃度を越える濃度を達成するために、治療用の成長因子を投与すること、また、生物学的半減期を増大させるためにこうしたポリペプチドを製剤化することが可能であるため、より小さな受容体親和性（すなわち、より高い解離定数）を有するキメラポリペプチドは、それでもなお、受容体アゴニストおよびアンタゴニストとして有用となる。
キメラポリペプチドの受容体結合を評点する目的で、５０ナノモルの解離定数の切り捨てが選択される。参考文献として本明細書に組み込まれている、Ｃｏｌｉｎｇａｎ ｅｔ ａｌ．， 『タンパク質の科学における現行プロトコル』、第２巻，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社刊、Ａ．５Ａ．１〜Ａ．５Ａ．４０ページ（１９９８）に記載されているそうしたものなどの何らかの通常および認められている方法により、測定された５０ナノモルよりも小さなものの解離定数により受容体を結合させるキメラポリペプチドは、受容体に結合するものとして評点され、また、より低い親和性を有するポリペプチドは、非結合のものとして評点される。
【００５１】
自然発生ＶＥＧＦのものは、タンパク質分解プロセスを受けるスプライス変異体および／またはプレタンパク質分子および／またはプレプロタンパク質分子として発現される。
本発明のキメラポリペプチドには、前出の段落で説明されているように、キメラ（ハイブリッド）受容体結合ドメインが含まれ、また、任意には、自然発生循環ＶＥＧＦのものの成熟イソ型に存在している上流および下流配列および／または正常細胞内あるいは細胞外プロセス時に取り除かれる上流あるいは下流プロペプチド配列を含む自然発生ＶＥＧＦのものから得られる付加的な上流あるいは下流配列が含まれることがある。
説明図により、実施例１に説明されているキメラポリペプチドは、ＶＥＧＦ−Ａの残基３４〜１３５（配列番号：２）を使用して、また、ヒトプレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃ（配列番号：２２）の｛残基｝１１２〜２１６を使用して調製された。
本発明のキメラポリペプチドには、実際に例示されたペプチドが含まれ、また、配列番号：２あるいは２２から得られた上流あるいは下流ＶＥＧＦ−ＡあるいはＶＥＧＦ−Ｃ配列により修飾されたこうしたペプチドもまた含まれる。
本明細書に例示されているように、ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃキメラポリペプチドに関しては、天然ＶＥＧＦ−ＡあるいはＶＥＧＦ−Ｃイソ型の特徴を有するアミノ−および／またはカルボキシル−末端配列と一致する上流および下流配列の付加が特に企図されている。
【００５２】
イニシエーターであるメチオニンにより、異種シグナルペプチドにより、その他のポリペプチドとの融合など、精製を容易にする１つあるいはそれ以上のタグ配列により、あるいはその他により、タンパク質を組換え的に発現させることもまた、この文脈では周知のことである。
また、糖鎖形成、ポリエチレングリコール化、あるいはその他の修飾によりポリペプチドを修飾することが周知のものであり、安定性、循環半減期を改善するそのうちのあるものは、あるいは（糖鎖形成の場合は）内因性血管内皮成長因子にさらに類似しているポリペプチドを作ることもある。
本発明によるキメラポリペプチドは、２つあるいはそれ以上の自然発生脊椎動物血管内皮成長因子ポリペプチドから得られたアミノ酸配列に対するいずれかのこうした修飾および付加からなることがある。
【００５３】
異なる受領体結合プロフィールを有するキメラ分子に加えて、本発明の付加的な実施態様には、増加する受容体結合親和性を有するキメラ分子が含まれる。
例えば、本発明は、２つあるいはそれ以上の自然発生脊椎動物血管内皮成長因子ポリペプチドから得られた複数のペプチドサブユニットからなるキメラポリペプチドを提供し、そのキメラポリペプチドは、その受容体に対する２つあるいはそれ以上の自然発生血管内皮成長因子の結合親和性に比較して増大した結合親和性をもって少なくとも１つの自然発生血管内皮成長因子受容体を結合させる。
自然発生ＶＥＧＦのものよりも大きな親和性により受容体を結合させるキメラ分子は、たとえキメラ分子に関する受容体結合プロフィールが自然発生ＶＥＧＦのそれと同じものであっても、本発明の好適なキメラ分子の間にある。増加した受容体結合親和性は、受容体活性化剤あるいは阻害剤としての大きな力価と相関していることが考えられる。
一般的には、いずれかの受け入れられている手順により測定された解離定数（Ｋｄ）は、大きな結合親和性を示す低いＫｄにより受容体親和性を示す。特に企図されているのは、そのキメラが得られた自然発生分子に比べて、並列試験においては、ｐ＜０．０５のレベルで統計的に有意なものであるＫｄで何らかの減少を示すキメラ分子である［例えば、Ｃｏｌｉｎｇａｎ ｅｔ ａｌ．， 『タンパク質の科学における現行プロトコル』、第２巻，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社刊、Ａ．５Ａ．１〜Ａ．５Ａ．４０ページ（１９９８）を参照］。ＶＥＧＦ受容体に関してはＫｄで２０パーセント減少を示すキメラが好ましい。
３５％あるいは５０％の減少は非常に好ましい。
解離定数の３分の１に減少（例えば、自然発生ＶＥＧＦの１００ｐＭ Ｋｄと比べて、キメラポリペプチドの３３．３ｐＭというＫｄ値）、５分の１に減少、１０分の１に減少、あるいは２０分の１に減少することが非常に好ましい。
【００５４】
キメラ分子に関するもう１つの関連好適クラスとは、そのキメラが由来した自然発生分子に比較して、並列試験でｐ＜０．０５のレベルで統計的に有意なものとなっているＥＣ５０濃度において何らかの減少を示す、そういった分子である。
１つのＶＥＧＦ受容体に対してＥＣ５０において２０パーセントの減少を示す（すなわち、結合親和性が増加）キメラが好ましい。
３３％あるいは５０％といった減少は非常に好ましい。
ＥＣ５０すなわち、５０％有効濃度とは、最大効果の５０％を産み出す濃度である。
特定受容体に対する推定リガンドのＥＣ５０を測定するための１つの例示的なアッセイについては実施例６で以下に詳細に述べる。
【００５５】
以下に述べる実施例は、本発明の非常に数多くの特定ハイブリッドポリペプチドの合成および検査の説明を提供し、その１つ１つがそれ自体、本発明の１つの実施態様と考えられる。
例示されているポリペプチドの中にある、ハイブリッドポリペプチドの１つの好ましいグループは、この式のアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
すなわち、
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−ＣＯＯＨ
ここで、Ｘ１は、配列番号：１２８のアミノ酸３〜１１および配列番号：１３７のアミノ酸３〜１１からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み；Ｘ２は、配列番号：１２９および１３８からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ３は、配列番号：１３０および１３９からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ４は、配列番号：１３１および１４０からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ５は、配列番号：１３２および１４１からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ６は、配列番号：１３３および１４２からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ７は、配列番号：１３４および１４３からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ８は、配列番号：１３５および１４４からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ９は、配列番号：１３６および１４５からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−ＣＯＯＨは、配列番号：２のアミノ酸３４〜１３５または配列番号：２２のアミノ酸１１２〜２１６と同じではなく、また、ここでは、そのポリペプチドはヒトＶＥＧＦＲ−１、ヒトＶＥＧＦＲ−２、ヒトＶＥＧＦＲ−３からなるグループから選択される少なくとも１つの受容体に結合する。
以下に、さらに詳細に説明されているように、特定アミノ酸配列対のそれぞれ（例えば、配列番号：１２８と１３７）が標準的な整列化アルゴリズムを使用して、配列相同性を最大にするためにＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦ−Ｃの受容体結合ドメインが整列化されるときに、それぞれが互いに整列するＶＥＧＦ−Ａ ｃＤＮＡ断片あるいはＶＥＧＦ−Ｃ ｃＤＮＡ断片によりコード化される。
【００５６】
ポリペプチドのハイブリッドの前者の属に関しては、１つの好ましい亜属は、ヒトＶＥＧＦＲ−１、ヒトＶＥＧＦＲ−２、ヒトＶＥＧＦＲ−３からなるグループから選択される正確に１つの受容体に結合するそうしたポリペプチドからなる。
初期スクリーニングでは、以下の特定構築物（以下に詳細に記載されている）は、この基準を満たしていることが示唆される。
すなわち、８２〜１４、８２〜１６、２２〜３、７２〜６、１２〜１４、１２〜１６、３２〜９、３２〜１１、３２〜１４、３２〜１５、３２〜１６、５２〜９、５２〜１１、５２〜１４、５２〜１５、１４〜７、２３〜１０、２３〜１２、２３〜１４、３３〜１、３３〜３、３３〜６、３３〜９、５３〜１、５３〜３、５３〜７、６２〜８、６２〜１０、６２〜１３、６３〜３、６３〜６、７３〜７、７３〜１５、〜８、７４〜１０、７４〜１２、１１〜９、１１〜１３、１２〜１、１２〜５、８１〜９、８１〜１３、１３〜９、１３〜１１、１３〜１３、１３〜１５、１４〜１、１４〜５、４１〜１、４３〜１、８３〜９、８３〜１３、８３〜１５、６１〜１、６１〜３、６２〜１、８２〜５、８４〜１、８４〜５である。
【００５７】
もう１つの好ましい亜属は、ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−３には結合するが、ＶＥＧＦＲ−２には結合しないそうしたハイブリッドポリペプチドからなる。
初期スクリーニングでは、以下の特定構築物（以下に詳細に記載されている）はこの基準を満たしていることが示唆される。
すなわち、１２〜９、１２〜１３、１４〜９、８２〜９、８２〜１３、８４〜９である。
【００５８】
１つの非常に好ましい亜属は、ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２と、ＶＥＧＦＲ−３とを結合させる本発明のハイブリッドポリペプチドからなる。
初期スクリーニングでは、以下の特定構築物（以下に詳細に記載されている）はこの基準を満たしていることが示唆される。
すなわち、１２〜７、１２〜１１、８２〜１１、８４〜１１である。
【００５９】
他の亜属には、ＶＥＧＦＲ−１と、ＶＥＧＦＲ−２と（その両方ともＶＥＧＦ−Ａにより結合される）は結合させるが、ＶＥＧＦＲ−３に結合させない、そうしたハイブリッドポリペプチドと、ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３（その両方とも完全に処理されたＶＥＧＦ−Ｃにより結合される）は結合させるが、ＶＥＧＦＲ−１は結合させない、そうしたハイブリッドポリペプチドと、が含まれる。
【００６０】
以下にさらに詳細に教示されているように、第４断片（Ｘ４）には、ＶＥＧＦＲ−３結合親和性を与えるために重要なものである残基が含まれているようにみえる。このため、そのハイブリッドポリペプチドのもう１つの好適な属は、Ｘ４が配列番号：１４０からなるそうしたものであり、また、そのポリペプチドが、ＶＥＧＦＲ−３に結合するそうしたものである。
ＶＥＧＦ−Ｃの断片５と８もまた、ＶＥＧＦＲ−３結合に貢献しているようにみえる。
このように、非常に好適なものであるのは、配列番号：１４１からなるＸ５、および／または配列番号：１４４からなるＸ８によりさらに特徴付けられるポリペプチドである。
【００６１】
同様に、以下のデータでは、ＶＥＧＦ−Ａの断片２と７は、ＶＥＧＦ−Ｒ１結合に貢献していることが示唆されている。
したがって、もう１つの好適なハイブリッドポリペプチドの遺伝子は、Ｘ２が配列番号：１２９からなり、また、そのポリペプチドがＶＥＧＦＲ−１に結合する、そうした遺伝子である。
１つの非常に好適な実施形態では、Ｘ７は配列番号：１３４からなる。ＶＥＧＦＲ−３にも結合するこのポリペプチドには非常に望ましいものである１つの実施形態では、１つの好適な構築物はＸ４が配列番号：１４０からなるものである。ＶＥＧＦＲ−３結合を付与するためには、Ｘ５にとっては、配列番号：１４１から構成されることがさらに好適であり、および／またはＸ８にとっては、配列番号：１４４から構成されることがさらに好適である。
【００６２】
ハイブリッド分子を生成するために以下に説明されている組換え実験は、ＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦ−Ｃあるいはプレタンパク質あるいはプレプロタンパク質配列の自然分泌形態に相当する配列によるのではなく、ヒトＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦ−Ｃの受容体結合ドメインによってのみ実施された。
しかし、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， （編）、『分子生物学におけるプロトコル』，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ社刊（１９９４〜１９９９）あるいはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， （編）、『分子クローニング−研究室マニュアル』，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ社刊、ニューヨーク州 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ （１９８９）に説明されているそうした技術などの日常的な組換えＤＮＡ技術は、自然に発生するタンパク質中の受容体結合ドメインの上流あるいは下流で見つかるＶＥＧＦ−ＡあるいはＶＥＧＦ−Ｃ配列、特に、ＶＥＧＦ−ＡあるいはＶＥＧＦ−Ｃの自然に発生する分泌および循環形態で見つかる配列をコードするポリヌクレオチドと、そのハイブリッドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを結合するのに使用することができる。
【００６３】
したがって、本発明は、式ＸＮ−Ｖ／ＰＨＤ−ＸＣのアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供し、ここでは、ＸＮは配列番号：２のアミノ酸１〜３４、配列番号：２２のアミノ酸１〜１１１、配列番号：１４７のアミノ酸１〜３４、あるいはそれらの断片からなるグループから選択される。
【００６４】
ここでは、Ｖ／ＰＨＤは本明細書の他の箇所で説明されているキメラポリポリペプチドであり、
ここでは、ＸＣは、配列番号：２のアミノ酸１３６〜１９１、配列番号：２２のアミノ酸２１７〜４１９、配列番号：１４７のアミノ酸１３６〜２３２、あるいはそれらの断片からなるグループから選択され、また、
ここでは、ＸＮとＸＣはそれぞれ自然発生ヒトＶＥＧＦ−ＡあるいはＶＥＧＦ−Ｃ前駆体タンパク質あるいは自然発生ヒトＶＥＧＦ−ＡあるいはＶＥＧＦ−Ｃイソ型中のアミノ酸配列に同一である。
【００６５】
１つの特定な変化では、本発明は、上述されているように、ハイブリッドポリペプチドを提供し、ここでは、そのポリペプチドにはさらに、プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃシグナルペプチドと、プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃアミノ末端プロペプチドと、プレプロ−ＶＥＧＦ−Ｃカルボキシ末端プロペプチドとからなるグループから選択される１つあるいはそれ以上のアミノ酸配列が含まれる。
【００６６】
しかし、本発明のハイブリッドポリペプチドの発現は、自然発生フランキングＶＥＧＦ−ＡあるいはＶＥＧＦ−Ｃ配列によってのみの発現に限定されているわけではない。
細菌における本発明のポリペプチドの発現は、ハイブリッドＶＥＧＦ配列の上流にあるイニシエーターであるメチオニンあるいはメチオニン−リジンを含むことにより達成されることもあり、ここでは、哺乳動物細胞における発現と分泌は、少なくともシグナルペプチドを含むことによりもっとも好都合に達成される。
したがって、１つの実施形態では、本発明は、上述のように、ポリペプチドを提供し、ここでは、そのポリペプチドにはさらに、アミノ末端メチオニン残基あるいはアミノ末端Ｍｅｔ−Ｌｙｓ配列が含まれる。もう１つの実施形態では、そのポリペプチドにはさらに、式ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−ＣＯＯＨのアミノ酸配列に接続されているシグナルペプチドアミノ酸配列が含まれる。
【００６７】
精製を容易にするタグ配列あるいは、より大きな融合ペプチドの一部分としての発現などのその他の異種配列との融合としての本発明ポリペプチドの発現もまた、企図されている。
このタイプの１つの例示的なタグは、ニッケルキレート化を用いてそのように標識化された化合物の分離を可能にする一般的にはだいたい６つのヒスチジン残基であるポリヒスチジン配列である。
当業者には周知のものであり、また日常的に使用されているＦＬＡＧ（登録商標）タグ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ社製，ニューヨーク州ロチェスター市）などの他の標識とタグは、本発明により受け入れられる。
例示的な融合には、グルタチオン−Ｓ−転移酵素（ＧＳＴ）融合産物の一部分として、所望されるポリペプチドを発現させる市販されていて入手可能なベクターの使用が含まれる。
所望されるポリペプチドからそのＧＳＴ成分を切断した後、位置−１で付加的グリシン残基が残ることがある。
他のベクターシステムにおける発現から得られる変異体もまた、企図されている。
【００６８】
本明細書に説明されている受容体結合と活性アッセイのため、本適用もまた、本発明のハイブリッドポリペプチドの変異体（類似体）を提供し、ここでは、ハイブリッドペプチドアミノ酸配列の１つあるいはそれ以上のアミノ酸が付加され、欠失され、あるいは別のアミノ酸により置換され、また、ここでは、ハイブリッドは、そのハイブリッドポリペプチドのその受容体結合および／または生物学的活性特性を保持する。
【００６９】
単なる保存的な置換が導入された置換変異体（例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾により）は、本発明のハイブリッドポリペプチドの等価物と考えられる。
アミノ酸は物理的特性と、２次と３次タンパク質構造により分類することができる。
保存的置換は、当業者には、同様な特性を有する別のアミノ酸に対する１つのアミノ酸の置換として認識される。
アミノ酸側鎖特性に基づいた例示的な保存的置換は、標準的な１文字略語を使用してすぐ下にある表の中に掲載されている。
【００７０】
【表１】
2004507208.tif 000002
【００７１】
代替的には直ぐ下の表に掲載したとおりに、保存的アミノ酸がＬｅｈｎｉｎｇｅｒ、『生化学』，第２版；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ刊、ニューヨーク州ニューヨーク市（１９７５），７１〜７７ページ］の中に記載されているようにグループ化することができる。
【００７２】
【表２】
2004507208.tif 000003
【００７３】
以下の表は、さらにもう１つの代替的な、保存的アミノ酸置換体の例示的セットを提供する。
１文字と３文字略語の両方をともに示す。
すなわち、
【００７４】
【表３】
2004507208.tif 000004
【００７５】
多くのタンパク質について言えることであるが、アミノ酸変化に関するいずれかの個々の基あるいは小さな基の効果は、特にその変化が保存的置換である場合は、その変化が非常に重要な残基では導入されないという条件であれば、有意に生物学的特性を改変するような可能性はない。
本発明のハイブリッドポリペプチドの好適な変異体は、自然発生ＶＥＧＦのものから得られたアミノ酸配列から全部構成されるハイブリッドと、少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％あるいは９９％アミノ酸同一性を共有する。
【００７６】
関連核酸分子とポリペプチドの同一性と類似性は、公知の諸方法により容易に計算することができる。こうした諸方法には、Ｌｅｓｋ， Ａ．Ｍ．編『計算分子生物学』，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ社刊、ニューヨーク、１９８８；Ｓｍｉｔｈ， Ｄ．Ｗ．編『バイオコンピューティング−インフォーマティックスとゲノム計画』、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社刊、ニューヨーク、１９９３；Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ａ．Ｍ．， Ｇｒｉｆｆｉｎ， Ｈ．Ｇ．編『シーケンスデータのコンピュータ分析』，第１部、Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ社刊、ニュージャージー州、１９９４；ｖｏｎ Ｈｅｉｈｊｅ， Ｇ．， 『分子生物学におけるシーケンス分析』，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９８７；Ｇｒｉｂｓｋｏｖ， Ｍ．， Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ． 編『シーケンス分析プライマー』，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ社刊、ニューヨーク州、１９９１；Ｃａｒｉｌｌｏ ｅｔ ａｌ．， ＳＩＡＭ Ｊ． Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．， ４８：１０７３（１９８８）に記載されているそうしたものが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００７７】
同一性および／または類似性を測定するための好適な諸方法は、試験された配列間で最大適合を与えるように設計される。
同一性と類似性を測定するための諸方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラムに記載されている。
２つの配列間の同一性と類似性を測定するための好適なコンピュータプログラムの諸方法には、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， １２：３８７（１９８４）；ウィスコンシン大学のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，ウィスコンシン州マディソン市）を含むＧＣＧプログラムパッケージ、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａ；．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５：４０３−４１０（１９９０））が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
そのＢＬＡＳＴＰプログラムは、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｒｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ＮＣＢＩ））とその他の情報源（ＢＬＡＳＴ マニュアル、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．， ＮＣＢ／ＮＭＬＭ／ＮＩＨ、メリーランド州 ２０８９４ Ｂｅｔｈｅｓｄａ市；Ａｌｔｓｃｈｕｌｓ ｅｔ ａｌ．， 同上掲書）から公的に入手可能である。
周知であるＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムはまた、同一性を測定するのにも使用されうる。
【００７８】
ポリペプチド配列比較のための好適なパラメーターには、以下のものが含まれる。
すなわち、
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８， ４４３〜４５３（１９７０）；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）からＢＬＯＳＵＭ６２
ギャップペナルティ：１２
ギャップ長さペナルティ：４
類似性の閾値：０
核酸分子配列比較のために好適なパラメーターには、以下のものが含まれる。すなわち、
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４８， ４４３〜４５３（１９７０）；
比較マトリックス：適合＝＋１０，不適合＝０
ギャップペナルティ：５０
ギャップ長さペナルティ：３
このように、さらにもう１つの実施形態では、本発明は非自然発生血管内皮成長因子アミノ酸配列からなるポリペプチドを提供し、前記非自然発生血管内皮成長因子アミノ酸配列は、以下の式のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列からなる。
すなわち、
ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−ＣＯＯＨ
ここでは、Ｘ１は、配列番号：１２８のアミノ酸３〜１１および配列番号：１３７のアミノ酸３〜１１からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ２は、配列番号：１２９および１３８からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ３は、配列番号：１３０および１３９からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ４は、配列番号：１３１および１４０からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ５は、配列番号：１３２および１４１からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ６は、配列番号：１３３および１４２からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ７は、配列番号：１３４および１４３からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ８は、配列番号：１３５および１４４からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、Ｘ９は、配列番号：１３６および１４５からなるグループから選択されるアミノ酸配列を含み、また、ここでは、そのポリペプチドはヒトＶＥＧＦＲ−１、ヒトＶＥＧＦＲ−２、ヒトＶＥＧＦＲ−３からなるグループから選択される少なくとも１つの受容体に結合する。
１つの好適な実施形態では、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−ＣＯＯＨは、配列番号：２のアミノ酸３４〜１３５または配列番号：２２のアミノ酸１１２〜２１６と同じでない。
【００７９】
「非自然発生血管内皮成長因子アミノ酸配列」により、いずれかの公知のものである自然発生アミノ酸配列、この場合は、公知のものであるＶＥＧＦ−ＡあるいはＶＥＧＦ−Ｃ配列から得られる受容体結合ドメインなどの自然発生アミノ酸配列に対しては同一ではない配列を意味する。
【００８０】
さらに一般的に言うと、本発明は、本発明のいずれかの特定のアミノ酸配列に対して少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％同一であるアミノ酸配列からなり、また、その自然発生血管内皮成長因子の少なくとも１つを結合させ、また、異なる受容体結合プロフィールあるいは自然発生成長因子ポリペプチドよりも改善されている受容体結合親和性を有するポリペプチドを提供する。
パーセント同一性評価基準を満たし、また、指示対象ポリペプチドと同じ受容体結合プロフィールを表示するポリペプチドが特に企図されている。
例えば、本発明は、構築物１２−７（配列番号：６３）、１２−１１（配列番号：７１）、８２−１１あるいは８４−１１によりコードされたアミノ酸配列と少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、あるいは９９％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを提供し、そのポリペプチドのうちの少なくとも１つが、本発明によるポリペプチドであり、そのポリペプチドはＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３を結合させる。
【００８１】
さらにもう１つの実施態様では、本発明は、第２ポリペプチドと会合されている第１ポリペプチドからなる二量体タンパク質分子を提供し、ここではそのポリペプチドの少なくとも１つが本発明によるポリペプチドである。そのポリペプチドの間の会合は共有結合によるものでありうる（例えば、ジスルフィド結合）、あるいはポリペプチド鎖の非共有結合（例えば、水素結合、安定あるいは誘起双極子−双極子相互作用による結合、疎水性あるいは親水性相互作用による結合、これら結合メカニズムの組み合わせ、など）。
【００８２】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明のポリペプヂトのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド（例えば、ｃＤＮＡ、真核系における発現を容易にするために導入されたイントロンを備えたｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはそれらを組み合わせたもの、一本鎖あるいは二本鎖のもの）を提供する。
精製および分離ポリヌクレオチドが好ましい。
遺伝子コードの周知の縮重により、本発明の各ポリペプチドアミノ酸配列をコードするいくつかのポリヌクレオチド配列が存在する。
こうしたポリヌクレオチドは、本発明の本ポリペプチドを組換え的に発現させるのに有用である。
【００８３】
本発明はまた、ＶＥＧＦ受容体結合ポリペプチドをコードするポリペプチド、また、ＶＥＧＦ受容体結合ポリペプチドをコードする、本明細書に詳細に説明されているそのポリヌクレオチドの完全な非コード鎖あるいは補体に、適度な緊縮性あるいは高い緊縮性条件下でハイブリダイズされるポリヌクレオチドを受け入れる。
ポリヌクレオチドのこの属は、本明細書に詳細に教示されているアミノ酸配列に比して、１つあるいはいくつかのアミノ酸差異（付加、挿入あるいは欠失）を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを受け入れる。
こうした変化は、部位定方向突然変異誘発を行うことにより、あるいは例えば、本発明のハイブリッドポリペプチドを構築するのに使用されるヒトＶＥＧＦ−ＡあるいはＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドの断片に、非ヒト相同分子種ＶＥＧＦ−ＡあるいはＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドから得た断片を置換することにより、容易に導入される。
【００８４】
例示的な高い緊縮性ハイブリダイゼーション条件とは以下のようなものである。すなわち、
５×ＳＳＰＥ，５×デンハード溶液、０．５％ＳＤＳ、１００ｍｌハイブリダイゼーション溶液当たり２ｍｇ音波非相同性ＤＮＡからなるハイブリダイゼーション溶液の中に６５℃にて少なくとも１２時間ハイブリダイゼーションを行う；２×ＳＳＰＥと０．１％ＳＤＳからなる洗浄溶液の中に室温にて１０分間２回洗浄する；引き続いて、２×ＳＳＰＥと０．１％ＳＤＳで６５℃にて１５分間１回洗浄する；引き続いて、０．１×ＳＳＰＥと０．１％ＳＤＳで６５℃にて１０分間最終洗浄する。
適度なストリンジェント洗浄は、６５℃にて１０分間で行う最終洗浄の０．１×ＳＳＰＥの代わりに、０．５×ＳＳＰＥで洗浄することにより達成することができる。
低度のストリンジェント洗浄は６５℃にて１５分間洗浄１×ＳＳＰＥを使用して、また、最終１０分間の洗浄は省略することにより、達成することができる。
等価緊縮性の条件は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（編）『分子生物学におけるプロトコル』，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （１９９４），６．０３〜６．４．１０ページに記載されているように、温度と緩衝液、あるいは塩濃度に変化をつけることにより達成することができる。
ハイブリダイゼーション条件における修飾は、経験的に測定するか、あるいはそのプローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対の長さとパーセンテージに基づいて正確に計算することができる。
そのハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，（編）、『分子クローニング−研究室マニュアル』，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ刊：ニューヨーク州 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ市（１９９８）、９．４７〜９．５１ページに説明されているように計算することができる。
【００８５】
例えば、本発明は、本発明のいずれかの特定のヌクレオチド配列に、適度のストリンジェントあるいは高いストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズされるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、少なくとも１つの自然発生血管内皮成長因子あるいは血小板由来成長因子を結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、また、異なる受容体結合プロフィールを有し、あるいは自然発生成長因子ポリペプチドよりも改善された受容体結合親和性を有するポリヌクレオチドを提供する。
そのハイブリダイゼーション評価基準を満たし、また、指示対象であるポリヌクレオチドと同じ受容体結合プロフィールを表示するポリヌクレオチドが特に企図される。
例えば、本発明は、構築物１２−７（配列番号：６２），１２−１１（配列番号：７０），８２−１１，あるいは８４−１１に関して本明細書に教示されているヌクレオチド配列に、適度なストリンジェントあるいは高いストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズされるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを提供し、ここでは、そのポリヌクレオチドは、ＶＥＧＦＲ−１と、ＶＥＧＦＲ−２と、ＶＥＧＦＲ−３と、を結合させるポリペプチドをコードする。
【００８６】
１つの関連実施形態では、本発明は、本発明のいずれかの特定のヌクレオチド配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、あるいは９９％同一であるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、少なくとも１つの自然発生血管内皮成長因子あるいは血小板由来成長因子を結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、また、異なる受容体結合プロフィールを有し、あるいは自然発生成長因子ポリペプチドよりも改善された受容体結合親和性を有するポリヌクレオチドを提供する。
そのハイブリダイゼーション評価基準を満たし、また、指示対象であるポリヌクレオチドと同じ受容対結合プロフィールを表示するポリヌクレオチドが特に企図される。
例えば、本発明は、構築物１２−７（配列番号：６２），１２−１１（配列番号：７０），８２−１１，あるいは８４−１１に関して本明細書に教示されているヌクレオチド配列に、適度なストリンジェントあるいは高いストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズされるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを提供し、ここでは、そのポリヌクレオチドは、ＶＥＧＦＲ−１と、ＶＥＧＦＲ−２と、ＶＥＧＦＲ−３と、を結合させるポリペプチドをコードする。
【００８７】
１つの関連実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドからなるベクターを提供する。
こうしたベクターは、例えば、有用なそれらの品質を作り出すために宿主細胞の中でポリヌクレオチドを増殖するのに有用である。
好適な実施形態では、そのベクターは、本発明のそのポリペプチド発現制御配列からなるポリヌクレオチドに操作可能にリンクされる、発現ベクターである。
本発明のポリヌクレオチドを組み込むプラスミドとウイルスＤＮＡベクターなどの自律的に複製する組換え発現構築物は特に企図される。
発現制御ＤＮＡ配列には、プロモーターと、エンハンサーと、オペレーターが含まれ、また、一般的には、その発現構築物が利用されるべき発現システムに基づいて選択される。
好適なプロモーターとエンハンサー配列は一般的には、遺伝子発現を増加させる能力で選択され、一方、オペレーター配列は一般的には、遺伝子発現を調節する能力で選択される。
本発明の発現構築物にはまた、その構築物を有する宿主細胞の同定を可能にする１つあるいはそれ以上の選択可能なマーカーをコードする配列が含まれる。
発現構築物にはまた、宿主細胞中で、相同性組換えを容易にし、また好適には促進する配列が含まれる。
本発明の好適な構築物にはまた、宿主細胞中での複製に必要な配列が含まれる。
【００８８】
ベクターはまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、その対象中の細胞にｉｎ ｖｉｖｏにて本発明の本ポリペプチドを発現させる形態で、血管内皮成長因子受容体の調節（刺激あるいは阻害）を含む治療が必要である対象の中に導入される、「遺伝子治療」治療処方計画には有用である。
【００８９】
もう１つの関連実施形態では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドあるいは本発明のベクターにより形質転換される、あるいはトランスフェクションされる（安定的にあるいは一過性に）原核細胞および真核細胞を含む宿主細胞を提供する。
本発明のポリヌクレオチドは、円形プラスミドの一部として、あるいは分離タンパク質コード領域あるいはウイルスベクターからなる線形ＤＮＡとして、宿主細胞の中に導入されうる。
当業者には周知の、また、日常的に実施されているＤＮＡを宿主細胞の中に導入するための諸方法には、形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、核注入、あるいはリポソーム、ミセル、ゴースト菌体、プロトプラストなどのキャリヤーによる融合が含まれる。
上述されているように、こうした宿主細胞はそのポリヌクレオチドを増幅するのに有用であり、また、そのポリヌクレオチドによりコードされる本発明の本ポリペプチドを発現させるのにも有用である。
こうした宿主細胞は、本明細書に記載されているように、アッセイにおいて有用である。
本発明のポリペプチドの発現に関しては、細菌、酵母、植物、無脊椎動物（例えば、昆虫）、脊椎動物、哺乳動物の宿主細胞を含む、いずれの宿主細胞も受け入れ可能であるが、それらに限定されるわけではない。
治療用調製剤を開発することに関しては、哺乳動物細胞系統、特にヒト細胞系統における発現が好ましい。
本発明の組換え発現産物についての最適生物学的活性を与えるのに望ましいものとなるように、哺乳動物宿主細胞の使用では、こうした翻訳後修飾（例えば、糖鎖形成、切断、脂質化、リン酸化）を用意することが考えられる。
ポリペプチドの糖鎖形成および非糖鎖形成形態は本発明により受け入れられる。
同様に、本発明はさらに、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコール、あるいはポリプロピレングリコールなどの１つあるいはそれ以上の水溶性ポリマー添加物を含むように共有結合的に修飾された上述されているポリペプチドを受け入れる。
【００９０】
本発明のポリペプチドはまた、化学的に合成されうる。
【００９１】
さらにもう１つの関連実施形態では、本発明は、栄養培地中の本発明の宿主細胞を増殖させ、また、その細胞あるいはその培地からそのポリペプチドあるいはその変異体を分離させるステップからなる血管内皮成長因子受容体結合タンパク質を産生するための方法を提供する。
その細胞が増殖されているその細胞からあるいはその培地からそのポリペプチドを分離することは、当業者には公知の精製の諸方法、例えば、免疫親和性クロマトグラフィー、受容体親和性クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、レクチン親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、カチオンあるいはアニオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、逆相ＨＰＬＣなど通常のクロマトグラフィーの諸方法により達成される。
精製のさらに他の諸方法には、特異的結合パートナーあるいは薬剤により認識される特定タグ、標識あるいはキレート化部分を有する融合タンパク質として、その所望されるタンパク失が発現されまた精製される、そうした方法が含まれる。
その精製タンパク質は、その所望されるタンパク質を産生する、あるいは完全な融合タンパク質として残されるように、切断することができる。
その融合成分の切断により、その切断プロセスの結果として、付加的なアミノ酸残基を有するその所望されるタンパク質の１つの形態を作り出すことが可能である。
【００９２】
本発明のポリペプチドあるいはポリヌクレチドからなる組成もまた本発明の範囲内にある。
１つの好適な実施形態では、こうした組成物は、製薬的に受け入れられうる（例えば、滅菌および非毒性）希釈液あるいはキャリヤーにより製剤化された本発明の１つあるいはそれ以上のポリヌクレオチドあるいはポリペプチドからなる。
製薬的な賦形剤、補形薬あるいは培地として役に立つ液体、半固体、あるいは固体希釈剤が好ましい。
当業者には公知のいずれの希釈剤も使用されうる。
例示的な希釈剤には、水、食塩水溶液、一ラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ステアリン酸マグネシウム、メチル−およびプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、アルギン酸塩、デンプン、ラクトース、スクロース、デキストロース、ソルビトール、マンニトール、グリセロール、リン酸カルシウム、鉱油、ココアバターが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
こうした製剤は、例えば、治療計画における哺乳動物（ヒトを含む）対象に対して本発明のポリペプチドあるいはポリヌクレオチドの投与のためには、有用である。
【００９３】
同様に、本発明は、血管新生形成が望ましい、望ましくない内皮細胞増殖および／または虚血により特徴付けられる障害および／または血管閉塞により特徴付けられる障害を含む、本明細書に記載されている障害の治療に関する医薬品の製造に向けて、本発明のポリペプチドあるいはポリヌクレオチドの使用法を用意しているが、それらに限定されるわけではない。
【００９４】
１つの関連実施形態では、本発明は、バイアルあるいは瓶などの容器の中にパッケージされた本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチド、あるいは組成物からなり、その容器に貼付させた、あるいはその容器と一緒にパッケージされた標識からさらになるキットを提供するが、その標識は本明細書に記載されているように１つあるいはそれ以上の疾患の諸容態を治療するために、その容器の内容物を記載し、また、その容器の内容物の使用法に関する表記および／または指示書を提供する。
【００９５】
その上さらにもう１つの実施態様では、本発明は、新規なＶＥＧＦ受容体結合および刺激特性を有するポリペプチドを産生する諸方法と、こうしたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを産生するための諸方法を提供する。例えば、本発明は、哺乳動物内皮細胞あるいは哺乳動物の周皮細胞／平滑筋細胞の増殖を調節するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作り出すための方法を提供し、本発明は、少なくとも２つの脊椎動物血管内皮成長因子ポリペプチドのアミノ酸断片をコードするポリヌクレオチドを調製する工程と、ポリヌクレオチドがハイブリッドポリヌクレオチドを形成するように組み換える条件下でそのポリヌクレオチドを混合する工程、そのハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされるハイブリッドポリペプチドを作り出すためにそのハイブリッドポリヌクレオチドを発現させる工程、脊椎動物血管内皮成長因子に対する受容体に結合するハイブリッドポリペプチドを同定するためにそのハイブリッドポリペプチドをスクリーニングする工程、そのスクリーニングステップでその受容体に結合するそのハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを選択する工程からなる。
その選択されたポリヌクレオチドの発現（所望されるポリペプチドを産生するために）もまた企図される。
【００９６】
この文脈では、「哺乳動物内皮細胞の増殖を調節する」という語句は、血管内皮細胞上で発現した結合細胞表面受容体により、分裂促進シグナルを誘導することによりこうした増殖を刺激すること、あるいは、こうした増殖を阻害することを意味する。
本明細書の他の箇所で説明されているように、阻害は、血管内皮成長因子受容体の妨害、あるいはその内皮成長因子による内在性受容体の刺激を防ぐ内在性成長因によるヘテロ二量体の形成によることがある。
阻害はまた、ＶＥＧＦ受容体を結合させる本発明のポリペプチドに、細胞毒性薬剤を共役させることにより達成されうる。
例示的な毒素は、当業者には公知のものであり、また、本明細書の他の箇所に記載されている。
細胞増殖を調節する細胞毒性薬剤あるいはその他の薬剤に共役された本発明のポリペプチドは、本発明のもう１つの実施態様として企図される。
【００９７】
この文脈では、「脊椎動物血管内皮成長因子ポリペプチド」はまた、以下の特徴を有するポリペプチドを意味する。
すなわち、
（１） そのポリペプチドは、脊椎動物（例えば、爬虫類、両生類、鳥、あるいは哺乳動物、好適には、鳥あるいは哺乳動物、もっとも好適には、哺乳動物である；特に、サル、類人猿、あるいはヒト霊長類哺乳動物）あるいは、哺乳動物ポックスウイルスなどの脊椎動物病原体のゲノムＤＮＡによりコードされ、
（２） そのポリペプチドは、脊椎動物により発現されるコード配列の全てあるいは一部分からなり（すなわち、脊椎動物のゲノムＤＮＡの転写／翻訳から、あるいは、ウイルス核酸によりコードされるポリペプチドの場合は、ウイルスにより誘導される転写／翻訳から）、
（３） そのポリペプチドあるいは部分は、自然発生受容体に結合する約７０〜１５０アミノ酸のＶＥＧＦ相同ドメイン（Ｖ／ＰＨＤ）からなり、そのアミノ酸モチーフ：Ｃ−Ｘ（１８−２８）−Ｐ−Ｘ−Ｃ−Ｘ（４）−Ｒ−ＣＸＧ−Ｃ（１−２）−Ｘ（６−１２）−Ｃ−Ｘ−（３０−４６）−Ｃにより部分的に特徴付けられ、ここでは、Ｘは、アミノ酸の許容範囲を表わす括弧内のいずれかのアミノ酸および番号を表わしている（例えば、Ｘ（１８−２８）は、いずれかの１８−２８アミノ酸の伸長を表わす；Ｃ（１−２）は、１つあるいは２つのシステイン残基を表わす）。
Ｖ／ＰＨＤには、ヒト血管内皮成長因子Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ（ＶＥＧＦ−Ａ，−Ｂ，−Ｃ，−Ｄとヒト血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ））で見つかったものに類似のシステインノットモチーフを形成する８つの保存的システインが含まれる。
好適なポリペプチドあるいは部分は、さらに詳細なアミノ酸モチーフ：Ｃ−Ｘ（２２−２４）−Ｐ−［ＰＳＲ］−Ｃ−Ｖ−Ｘ（３）−Ｒ−Ｃ−Ｘ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｘ（６）−Ｃ−Ｘ（３２−４１）−Ｃにより特徴付けられるＶＰＨＤからなり、ここでは、括弧内（例えば、［ＰＳＲ］）のアミノ酸は、アミノ酸配列における単一位置に対する代替物を表わし、
（４） そのポリペプチドは、脊椎動物の血管あるいはリンパ管を一列に並べる内皮細胞上あるいは血管を一列に並べかつ支持している周皮細胞／平滑筋細胞上で発現させる少なくとも１つの細胞表面受容体に結合する。
好適なポリペプチドは、内皮細胞上で発現させる少なくとも１つの細胞表面受容体に結合する。
【００９８】
調製工程を実施するための方法がいくつか存在する。
１つの変形例では、哺乳動物ＶＥＧＦポリペプチド配列と国際遺伝子コードの知識に基づき、かつ通常の化学合成技術を使用して、調製される。
下記の実施例１はこうした技術を示しており、ここでは、ヒトＶＥＧＦ−ＡとヒトＶＥＧＦ−Ｃの断片をコードした、一本鎖コヒーシブエンドを有する二本鎖ポリヌクレオチドを調製するために、合成オリゴヌクレオチド対が調製され、また、アニーリングされる。
もう１つの変形例では、天然ＶＥＧＦのものをコードするｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡ（好適にはｃＤＮＡ）が、１つあるいはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを使用して、ＤＮアーゼＩあるいは、エキソヌクレアーゼＩＩＩを使用して断片化される［例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １７：７９３−７９７（１９９９）（ＤＮアーゼＩ手順）；Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ，２３６：１５９−１６７（１９９９）（制限エンドヌクレア−ゼ手順）；Ｈａｒａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＴＥＣＨ， １６：７６−８２（１９９８）（総説）；Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８：７２４−７３３（１９９７）（総説、ＤＮアーゼＩ）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９４：４５０４−０９（１９９７）（ＤＮアーゼＩ手順）；Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：１０７４７−１０７４（１９９７）（ＤＮアーゼＩ手順）；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ， ３７０：３８９−３９１（１９９４）（ＤＮアーゼＩ手順）；Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， 、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７：１２０５−１２０９ （１９９９）（ＥｘｏＩＩＩ手順）、全て参考文献として本明細書に全体として組み込まれている、を参照］。
さらにもう１つの変形例では、ｃＤＮＡ（コードあるいは非コード鎖）が、ＤＮＡポリメラーゼと鎖終止試薬を使用して、相補的断片を合成するためにテンプレートとして使用される［例えば、Ｌｅｈｔｏｖａａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２：６３−６８（１９８８），参考文献として組み込まれている、を参照］。
【００９９】
混合工程を実施するための諸方法もまたいくつか存在する。
１つの変形例では、ポリヌレオチドは、ポリヌクレオチドの通常のアニーリングおよびライゲーション条件下で所望の順序で断片のアニーリングを容易にするために、相補的なコヒーシブ一本鎖末端により調製される。
下記の実施例１は、５１０ヒトＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃハイブリッドを生成するために、この技術の呈示を提供する。
こうした技術はまた、制限エンドヌクレアーゼにより加水分解された２つあるいはそれ以上のＶＥＧＦ ｃＤＮＡの断片混合物をアニ−リングするのに適当でありうる。
代替的には、その混合工程は、そのポリヌクレオチドを混合し、また、それらを、変性、アニーリング、伸長の連続工程を含む自己プライミングＰＣＲ反応を受けさせることにより達成される［例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）；Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， （１９９９）；Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）；Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：１０７４７−１０７４（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ， ３７０：３８９−３９１（１９９４）を参照］。
任意には、ＰＣＲは、ＰＣＲ産物に誤り（変異）を導入する条件下で実施される。
こうした変異は付加的な分子変異を導入し、また、生物学的に活性な分子の全体的なパーセンテージを減少させることが予想されるが、また、予想されない、優れた活性を備えた分子を産生することもありうる。
【０１００】
そのハイブリッドＤＮＡを合成した後、その分子は当業者には公知のいずれかの手段により発現させる。
１つの変形例では、その分子はクローン化して発現ベクターの中に入れ、それを今度はそのポリペプチドを発現させるために、細胞を形質転換あるいはトランスフェクションするのに使用される。
もう１つの変形例では、そのポリヌクレオチドは、スクリーニングのためにクローン化してファージ表示ベクターシステムの中に入れる［例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）を参照］。
そのスクリーニングアッセイは、実施例３において以下に説明されるように、直接受容体結合アッセイを伴うことがある。
代替的には、受容体結合は、受容体結合により誘導される生物学的活性に関して測定することにより間接的に測定されうる。
このように、１つの変形例では、スクリーニング工程は、その受容体を発現する細胞にハイブリッドポリペプチドを接触させることからなり、ここでは、そのハイブリッドポリペプチドにより誘導される細胞増殖あるいは細胞生存の変化により、そのハイブリッドポリペプチドと受容体の間の結合が示される。
【０１０１】
本方法の１つの好適な変形例では、スクリーニング工程と選択工程は、そのポリペプチドが由来した自然発生ＶＥＧＦのものにより所有されてはいない新規な受容体結合プロフィールを有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを選択するように設計されている。
例えば、その方法が実施され、ここでは、スクリーニング工程は、ヒトＶＥＧＦＲ−１とヒトＶＥＧＦＲ−３を結合するハイブリッドポリペプチドを同定するスクリーニングからなり、また、選択工程は、ヒトＶＥＧＦＲ−１と、ヒトＶＥＧＦＲ−２と、ヒトＶＥＧＦＲ−３を結合するハイブリッドポリペプチドを選択することからなる。
【０１０２】
１つの関連実施形態では、本発明は哺乳動物内皮細胞の増殖を調節するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを作り出すための方法を提供し、本発明は、（ａ） 以下の特徴を有するポリヌクレオチド断片のセットを調製し、（ｉ） そのセットには、コードポリヌクレオチド断片の第１サブセットが含まれ、ここでは、第１サブセットの各コードポリヌクレオチド断片が第１哺乳動物血管内皮成長因子のアミノ酸配列の少なくとも４つのアミノ酸をコードし、（ｉｉ） そのセットには、コードポリヌクレオチド断片の第２セットが含まれ、ここでは、第１サブセットの各コードポリヌクレオチド断片が第２哺乳動物血管内皮成長因子のアミノ酸配列の少なくとも４つのアミノ酸をコードする工程と、（ｂ） 第１と第２サブセットから得られたコードポリヌクレオチド断片が、ハイブリッドポリヌクレオチドを形成するために組み換える工程と、（ｃ） ハイブリッドポリヌクレオチドによりコードされるハイブリッドポリペプチドを作り出すために、そのハイブリッドポリヌクレオチドを発現させる工程と、（ｄ） 哺乳動物内皮細胞の増殖を調節するハイブリッドポリペプチドを同定するためにハイブリッドポリペプチドをスクリーニングする工程と、（ｅ） 前記スクリーニング工程で哺乳動物内皮細胞の増殖を調節するハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを選択する工程と、からなる。
【０１０３】
ヒト血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、ヒト血管内皮成長因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）、ヒト血管内皮成長因子Ｃ（ＶＥＧＦ−Ｃ）、ヒト血管内皮成長因子Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）の中に保存されている８つのシステインにより特徴付けられる受容体結合ドメインからなる哺乳動物血管内皮成長因子を使用して、ハイブリッドポリヌクレオチドを生成するこれらの諸方法の実施が好ましい。
例示的な開始分子には、ヒトとその他の哺乳動物のＶＥＧＦ−Ａ，ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＶＥＧＦ−Ｅ，ＰＩＧＦ，ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂポリペプチドが含まれる。また、成長因子のＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの構造的な特徴を有するＥＭＢＬデータベース（受託番号ＡＦ０９１４３４）（配列番号：１４９）に開示され、最近記載されたタンパク質には、ファロティンが含まれる。
このように、その他の哺乳動物ＶＥＧＦと一緒にハイブリッドタンパク質を生成する際に、ファロティンを使用することもまた企図されている。
【０１０４】
前者の諸方法のポリヌクレオチドとコードされたポリペプチド産物は、それら自体、本発明の付加的な実施態様であると考えられる。
【０１０５】
本発明のポリペプチドに対して生成されうる抗体、いずれかの自然発生ＶＥＧＦに対してよりも大きな親和性を備えた本発明のポリペプチドを結合させる抗体もまた、本発明の実施態様として企図される。
こうした抗体の抗原結合断片からなるポリペプチドもまた、本発明の１つの実施態様として企図される。
本発明の本ポリペプチドに結合するが、脊椎動物のＶＥＧＦのものには結合しない抗体が企図される。
【０１０６】
その上さらにもう１つの実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドとポリヌクレオチドを使用する非常に数多くのｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの諸方法を提供する。
こうした諸方法は、詳細な説明において以下により詳細に説明される。一般的に言うと、本発明のポリペプチドは、ＰＤＧＦＲ−αと、ＰＤＧＦＲ−βと、ＶＥＧＦ−１と、ＶＥＧＦ−２と、および／またはＶＥＧＦ−３などの受容体のＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーのいずれかにより仲介される細胞プロセスを調節する（刺激するあるいは阻害する）のに有用である。これら受容体はある種のプロセスの中に、また、組み合わせの中に、他のプロセスの中にさまざまな程度で単独で含まれうる。
本発明のポリペプチドは多くの異なる受容体結合プロフィールを所有しており、また、本発明の長所の１つは、調節されるように生物学的プロセスの受容体発現プロフィールを適合させる受容体結合プロフィールによりポリペプチドを選択する能力である。
【０１０７】
このように、１つの変形例では、本発明は、細胞の中にあるＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧＦ−２、および／またはＶＥＧＦ−３の１つあるいはそれ以上のシグナリングを調節する方法を提供し、本発明は、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧＦ−２、および／またはＶＥＧＦ−３の１つあるいはそれ以上を発現させる細胞を本発明のポリペプチドからなる組成物と接触させる工程からなる。
１つの変形例では、シグナリングを活性化させるための調節が企図され、また、その細胞を１つあるいはそれ以上の受容体に結合し、また受容体シグナリングを誘導するのに十分な量で受容体シグナリングを刺激する原発明のポリペプチドと接触させる。
【０１０８】
もう１つの変形例では、シグナリングを阻害するための調節が企図される。
その細胞を、その細胞の環境において内在性に存在する受容体リガンド成長因子ポリペプチドにより誘発されるシグナリングを阻害するのに十分な量でリガンド誘導受容体活性化（あるいは細胞毒素に共役されるポリペプチド）を阻害するポリペプチドと接触させる。
用量反応研究では、用いるポリペプチドの適当な量を正確に測定することが可能である。
有効量は、標的受容体に対するポリペプチドの結合親和性、標的細胞上に存在する受容体の量、予想循環血液量（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ実施形態に関する患者体重と血液量）、ポリペプチドクリアランス速度の測定から推測することができる。
【０１０９】
もう１つの変形例では、本発明は、１つあるいはそれ以上のＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧＦ−２および／またはＶＥＧＦ−３のシグナリングを調節する方法を提供し、その患者の細胞が、そのポリヌクレオチドにより形質転換あるいはトランスフェクションされ、また、それによってコードされた本発明のポリペプチドを発現させ、ここでは、その発現させたポリペプチドが１つあるいはそれ以上の受容体のシグナリングを調節するという条件下で、１つあるいはそれ以上のこれら受容体のシグナリング調節を必要としている患者に、本発明のポリヌクレオチドからなる組成物を投与する工程からなる。
【０１１０】
以下に論じられているように、そのキメラ受容体結合特性と、ＶＥＧＦ−Ａの配列に関するＶＥＧＦＲ−３リガンドの配列の分析からは、ＶＥＧＦ−Ｃ分子から得た断片４と５は、また、特に、断片４と５内で見つかった残基ＴＮＴＦｘｘｘＰの配列は、ＶＥＧＦＲ−３結合親和性を与えるためには重要である。
したがって、もう１つの変形例では、本発明は、ＶＥＧＦＲ−３生物学的活性を調節するために、これらコア残基と他の置換基とを使用して設計した分子を提供する。
例えば、１つの実施形態では、本発明は、そのペプチド配列ＴＮＴＦＸｎＰ７からなる分子を提供し、ここではＸｎは１つ〜７つのアミノ酸からなり、またここでは、その分子はＶＥＧＦＲ−３のＶＥＧＦ−Ｃ仲介活性化を阻害する。
その分子には、付加的な残基あるいは有機的部分が含まれうる。
１つの変形例では、こりのエピトープは、非ＶＥＧＦ−Ｃアミノ酸配列により、受容体結合に含まれるほかのエピトープにリンクされるようになり、それによってリガンド結合に含まれる受容体座位と相互作用することができる分子を作り出す。
１つの好適な実施形態では、Ｘｎは３つのアミノ酸からなり、それは在来ＶＥＧＦ−Ｃと同じアミノ酸スペーシングを表わしている。
【０１１１】
１つの関連実施形態では、本発明は、ヒトＶＥＧＦ−Ｃペプチド配列ＥＦＧＶＡＴＮＴＦＦＫＰＰＣＶＳＶＶＲＣＯあるいは１つの断片あるいはその変異体からなる分子を提供し、ここではその分子は、ＶＥＧＦＲ−３のＶＥＧＦ−Ｃ仲介活性化を阻害する。
１つの変形例では、その断片は、アミノ酸配列ＥＦＧＶＡＴＮＴＦＦＫＰＰＣＶＳＶＶＲＣＯからなるようなそうしたものである。
もう１つの変形例では、その断片は、その分子が、アミノ酸配列ＴＮＴＦＦＫＰＰからなるようなそうしたものである。
さらにもう１つの変形例では、その断片あるいは変異体は、アミノ酸配列ＴＮＴＦＦＫＰＰＣＶｘｘｘＲあるいはアミノ酸配列ＴＮＴＦＦＫＰＰＣＶｘｘｘＲＣＧＧＣＣからなる。
【０１１２】
本発明の結合特性とキメラ分子の配列に関するデータからはまた、受容体／リガンド相互作用のモジュレーターを合成設計するための重要なアミノ酸標的についての洞察が提供される。
例えば、１つの実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａに結合するＶＥＧＦＲ−１のモジュレーターを同定するための方法を提供し、本発明は、（ｉ） ＶＥＧＦＲ−１のＶＥＧＦ−Ａへの結合を可能にする条件下で、試験化合物の存在下でおよび存在しない場合で、ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦ−Ａの間の結合を測定する工程と、（ｉｉ） ＶＥＧＦ−ＡへのＶＥＧＦＲ−１の結合を改変し、また、配列番号：２のＰｈｅ４３，Ｍｅｔ４４，Ｔｙｒ４７，Ｇｌｎ４８，Ｔｙｒ５１，Ｇｌｎ１０５，Ｍｅｔ１０７により定義される部位でＶＥＧＦ−Ａを結合させる、あるいは配列番号：２の前記残基と界面上で接続されるＶＥＧＦＲ−１残基の箇所でＶＥＧＦＲ−１を結合させる試験化合物をモジュレーターとして同定する工程と、からなる。
阻害座位として作用し、また、望ましくないあるいは過剰なリガンド仲介受容体活性化により特徴付けられる条件を改善するのには有用であるモジュレーターは、モジュレーターの１つの好適なクラスである。
【０１１３】
１つの関連実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａに結合するＶＥＧＦＲ−１のモジュレーターを同定するための方法を提供し、本発明は（ｉ） ＶＥＧＦＲ−１のＶＥＧＦ−Ａへの結合を可能にする条件下で、試験化合物の存在下でおよび存在しない場合で、ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦ−Ａの間の結合を測定する工程と、（ｉｉ） ＶＥＧＦ−ＡへのＶＥＧＦＲ−１の結合を改変し、また、配列番号：２のＬｙｓ４２，Ｐｈｅ４３，Ｍｅｔ４４，Ｔｙｒ４７，Ｇｌｎ４８，Ｔｙｒ５１，Ｉｌｅ７２，Ｌｙｓ７４，Ａｓｐ８９，Ｇｌｙ９１，Ｌｅｕ９２，Ｇｌｎ１０５，Ｍｅｔ１０７，Ｉｌｅ１０９，Ｐｈｅ１１１，Ｈｉｓ１１２，Ｇｌｎ１１５，Ｉｌｅ１１７，Ｇｌｕ１２９，Ａｒｇ１３１，Ｐｒｏ１３２により定義される部位でＶＥＧＦ−Ａを結合させる、あるいは配列番号：２の前記残基と界面上で接続されるＶＥＧＦＲ−１残基の箇所でＶＥＧＦＲ−１を結合させる試験化合物をモジュレーターとして同定する工程と、からなる。
【０１１４】
同様に、本発明は、ＶＥＧＦ−Ｃに結合するＶＥＧＦＲ−３のモジュレーターを同定するための方法を提供し、本発明は（ｉ） ＶＥＧＦＲ−３のＶＥＧＦ−Ｃへの結合を可能にする条件下で、試験化合物の存在下でおよび存在しない場合で、ＶＥＧＦＲ−３とＶＥＧＦ−Ｃの間の結合を測定する工程と、（ｉｉ） ＶＥＧＦ−ＣへのＶＥＧＦＲ−３の結合を改変し、また、配列番号：２２のＬｙｓ１２０，Ｓｅｒ１２１，Ｉｌｅ１２２，Ｔｒｐ１２６，Ａｒｇ１２７，Ｇｌｎ１３０，Ｐｈｅ１５１，Ｌｙｓ１５３，Ｓｅｒ１６３，Ｇｌｙ１７０，Ｌｅｕ１７１，Ｔｙｒ１８４，Ｐｈｅ１８６，Ｉｌｅ１９０，Ｐｒｏ１９６，Ｐｒｏ１９８，Ａｒｇ２１０，Ｍｅｔ２１２，Ｓｅｒ２１３，により定義される部位でＶＥＧＦ−Ｃを結合させる、あるいは配列番号：２２の前記残基と界面上で接続されるＶＥＧＦＲ−３残基の箇所でＶＥＧＦＲ−３を結合させる試験化合物をモジュレーターとして同定する工程と、からなる。
本発明はまた、ＶＥＧＦ−Ｃに結合するＶＥＧＦＲ−３のモジュレーターを同定するための方法を提供し、本発明は（ｉ） ＶＥＧＦＲ−３のＶＥＧＦ−Ｃへの結合を可能にする条件下で、試験化合物の存在下でおよび存在しない場合で、ＶＥＧＦＲ−３とＶＥＧＦ−Ｃの間の結合を測定する工程と、（ｉｉ） ＶＥＧＦ−ＣへのＶＥＧＦＲ−３の結合を改変し、また、配列番号：２２のＴｈｒ１４８，Ａｓｎ１４９，Ｔｈｒ１５０，Ｐｈｅ１５１，Ｐｒｏ１５５により定義される部位でＶＥＧＦ−Ｃを結合させる、あるいは配列番号：２２の前記残基と界面上で接続されるＶＥＧＦＲ−３残基の箇所でＶＥＧＦＲ−３を結合させる試験化合物をモジュレーターとして同定する工程と、からなる。
【０１１５】
本発明の実施態様として企図されているのはまた、前記諸方法により同定されるモジュレーターからなる組成物、特に、製薬的に受け入れ可能なキャリヤー中の実質的に精製されたモジュレーターからなる組成物である。
同様に、異常血管内皮成長因子受容体活性により特徴付けられる疾患状態の治療のための医薬品の製造におけるこうしたモジュレーターの使用法が企図される。
【０１１６】
その上さらにもう１つの変形例では、前記諸方法のいずれかには、任意に、受容体活性の望ましくない値により特徴付けられる疾患状態に対する治療を必要としている患者に、その同定されたモジュレーターを投与するという付加的な工程、あるいはその細胞中の受容体活性値を調節するために、その受容体を発現させる細胞を接触させる工程が含まれる。
【０１１７】
本発明の付加的な実施形態、特長および変形例は、図面と詳細な説明を含む本出願の全体から熟練した技術を有する当業者には自明のものとなり、また、すべてのこうした特長は本発明の実施態様と考えられる。
【０１１８】
同様に、本明細書に記載されている特長は、特長を組み合わせたものが本発明の１つの実施態様あるいは実施形態として詳細に上述されているかどうかには無関係に、また本発明の実施態様として考えられる付加的な実施形態の中で再び組み合わせることができる。
また、本発明にとって非常に重要なものとして本明細書に記載されているこうした限定のみ、このように考えるべきである。
すなわち、非常に重要なものとして本明細書に記載されなかった限定を欠いている本発明の変形例は、本発明の実施態様として考える。
【０１１９】
集合あるいは属として記載された本発明の実施態様に関しては、その集合あるいは属のすべての個々の要素は、個々が、本発明の１つの実施態様として考えられる。
【０１２０】
加えて、本発明には、１つの付加的な実施態様として、詳細に上述されている変形例よりも、いかなる点でも範囲においてより狭い本発明の全ての実施様態が含まれる。
本出願人（ら）は、本明細書に添付されている請求項の完全な範囲を発明したが、これに添付されている請求項は他の先行技術の仕事をその範囲内に包含することは意図されていない。
したがって、請求項の範囲内にある制定法上の先行技術が特許庁あるいはその他の実体あるいは個人により、本出願人の注意に及ぶところとなる場合には、本出願人（ら）は、こうした特許請求の範囲から、こうした制定法上の先行技術あるいは制定法上の自明の変形例を詳細に除外するように、こうした請求項の主題を再び定義するために、適用可能な特許法下で補正の権利を行使する権利を留保する。
このような補正により定義された本発明の変形例はまた、本発明の実施態様と考えられる。
【０１２１】
【発明の実施の形態】
本発明は、血管内皮成長因子ポリペプチドのための細胞受容体を結合する新規なポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオシド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドからなる組成物、ならびに前記に関する方法および使用を提供する。
これらの材料および方法は、前記発明の要約の部分に詳細に説明するが、これによりそれをその全体において詳細な説明に取り込む。
本発明のいくつかのポリペプチドは、既知の天然に生じる血管内皮成長因子に比べて独特の受容体結合特徴を表す。
【０１２２】
ペプチドの調製方法
本発明のペプチドは、発明の要約および実施例に記載するものを含む、種々の方法を用いて合成するとよい。
本発明のペプチドは、慣用の技術に従って溶液内で、または固体支持体上で合成することができる。
種々の自動合成装置が市販で入手可能であり、既知のプロトコルに従って用いることができる。
例えば、参考文献として本明細書中に取り込まれているＳｔｅｗａｒ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｄ． ｅｄ．， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， （１９８４）；Ｔａｒｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １０５：６４４２（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３２：３４１−３４７ （１９８６）；および Ｂｅｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ， Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， ｅｄｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １−２８４；Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．， ３０， ７０５−７３９（１９８７）；ならびに米国特許第５，４２４，３９８号を参照するとよい。
【０１２３】
固相ペプチド合成方法は、０．１〜１．０ｍＭｏｌアミン／ｇポリマーを含有するコポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）を用いる。
ペプチド合成のためのこれらの方法は、アルファ−アミノ基のブチロキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）または９−フルオレニルメチロキシ−カルボニル（ＦＭＯＣ）保護を用いる。
両方法とも、一つのアミノ酸をペプチドのＣ末端から始まる各工程で加える工程的合成を含む（Ｃｏｌｉｇａｎ　ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， １９９１， Ｕｎｉｔ ９）。
化学的合成を完成するに際しては、ペプチドを脱保護してｔ−ＢＯＣまたはＦＭＯＣアミノ酸ブロッキング基を除去し、温度を下げて酸処理することによりポリマーから開裂するとよい（例えば、０℃で約０．２５〜約１時間、液体ＨＦ−１０％アニソール）。
試薬を蒸発後、１％酢酸溶液を用いてポリマーからペプチドを抽出し、次に粗材料を得るために凍結乾燥する。
通常はこれを溶媒として５％酢酸を用いたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５でのゲル濾過といった技術により精製するとよい。
カラムの適切な画分の凍結乾燥により、均一なペプチドまたはペプチド誘導体を産生し、次にアミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外線吸光光度法、モル旋光度、溶解性および固相Ｅｄｉｍａｎ分解による定量といった標準的な技術により特徴づけることができる。
【０１２４】
ファージディスプレーライブラリーからペプチドを選択する他の方法を、本明細書中に特に記載するペプチドを改良するために得ることができる。
ライブラリーは、本明細書中に記載するアミノ酸セットから調製するとよい。
ファージディスプレーは、本発明により有用な結合ペプチド特定において特に有効であろう。
要約すると、４〜約８０アミノ酸残基の挿入を表すファージライブラリー（例えば、ｍｌ１３，ｆｄまたはラムダファージを用いる）を調製する。
挿入は、例えば完全な縮重アレイまたは偏向アレイを示すであろう。
次に、標的ＶＥＧＦ受容体に結合する挿入を担持するファージを選択する。
この過程を標的受容体に結合するファージ再選択のいくつかのサイクルを通じて繰り返すとよい。
繰り返しにより特別な配列を担持する豊富なファージに至る。
ＤＮＡ配列分析を行い、発現したポリペプチドの配列を特定してもよい。
標的受容体に結合する配列の最小直線部を決定してもよい。
最小直線部の部分または全体プラスその上流または下流の１つ以上のさらなる縮重残基を含む偏向ライブラリーを用いた操作を繰り返してもよい。
これらの技術により本明細書中にすでに特定したペプチドよりもより大きい受容体結合アフィニティーを有する本発明のペプチドを特定することもありうる。
多重受容体に対する耐性ペプチドをスクリーニングでは、多重受容体結合アフィニティーを有するペプチドを特定するであろう。
Ｙキャスト２ハイブリッドスクリーニング方法を用いて、標的受容体に結合するポリペプチドを特定してもよい。
【０１２５】
代替的には、種々の発現ベクター／宿主系を用いて本発明のキメラペプチドを含ませ、発現させてもよい。
これらには組換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌、酵母発現ベクターで形質転換した酵母、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）で感染させた、または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系といった微生物、または動物細胞系が挙げられるが、これらに限定されない。
組換えタンパク質生産において有用なほ乳類細胞には、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−７など）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２および２９３細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
タンパク質組換え発現についての例示的プロトコルを、本明細書中以下に記載する。
【０１２６】
例えば、市販で入手できる発現系、例えばＰｉｃｈｉａ発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って酵母でキメラペプチドを組み換えて発現するとよい。
この系は直接分泌するためのプレプロアルファ配列にもあるが、挿入の転写はメタノールによる誘発の際アルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターにより支配される。
【０１２７】
分泌ペプチドを酵母成長培地から、例えば、細菌および、哺乳類細胞上清からキメラペプチドを精製するために用いられる方法により精製する。
【０１２８】
代替的には、ペプチドをコードするｃＤＮＡをバキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３（ＰｈａｒＭｉａｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）にクローニングするとよい。
次に、このベクター（ＰｈａｒＭｉａｇｅｎ）を製造者の指示に従って用い、ｓＦ９タンパク質非含有培地中のＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｄａを感染させ、組換えタンパク質を製造する。
タンパク質を精製し、ヘパリン−セファロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）、連続分子サイズカラム（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて培地から濃縮し、そしてＰＢＳに再懸濁する。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析では単一バンドを示し、タンパク質のサイズを確認し、Ｐｏｒｔｏｎ ２０９０ペプチドシーケンサーでのＥｄｍａｎ配列決定ではそのＮ末端配列を確認する。
【０１２９】
代替的には、ペプチドを昆虫系で発現してもよい。
タンパク質発現のための昆虫系は当該技術分野における通常の知識を有する者によく知られている。
このような系の一つでは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いてＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅ内で外来遺伝子を発現する。
配列をコードするペプチドをポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非本質的領域にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターのコントロール下におく。
ペプチドの挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子が不活化し、被覆タンパク質被覆を欠いた組換えウイルスが製造される。
【０１３０】
次に、組換えウイルスを用いてペプチドが発現するＳ． ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｌａｒｖａｅを感染する（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｖｉｒｏｌ ４６：５８４，１９８３；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ ＥＫ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：３２２４−７，１９９４）。
【０１３１】
別の実施例では、ペプチドをコードするＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅し、例えばｐＧＥＸ−３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）といった適切なベクターにクローニングする。
ｐＧＥＸベクターを設計してベクターによりコードされるグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびベクターのクローニング部位に挿入されるＤＮＡ断片によりコードされるタンパク質からなる融合タンパク質を製造する。
ＰＣＲのためのプライマーを産生して、例えば適切な開裂部位を含ませてもよい。
【０１３２】
融合パートナーを単独で用いて発現を容易にするか、さもなくば目的のペプチドへのアタッチメントとして望ましくない場合は、次に組換え融合タンパク質を融合タンパク質のＧＳＴ部分から開裂するとよい。
ｐＧＥＸ−３Ｘ／キメラペプチド構築物をＥ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ブルー細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）に形質転換し、各形質転換体を単離して成長させた。
各形質転換体からのプラスミドＤＮＡを精製し、自動シーケンサーを用いて部分的に配列決定し、正しい配向での核酸挿入をコードする目的キメラペプチドの存在を確認する。
【０１３３】
本発明の特に好ましいペプチド組成物は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）といった抗腫瘍ペプチドに接合するものである。
特に好ましい方法では、ＴＮＦ（Ｎｏｖａｇｅｎ）コード配列とフレームがあうように融合したペプチドコード配列を有する組換え融合体としてＴＮＦペプチドキメラを産生する。
ペプチドＴＮＦ ｃＤＮＡをｐＥＴ−１１ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、ＢＬ２１ Ｅ． ｃｏｌｉ内のＴＮＦペプチド発現をｐＥＴ１１ｂの製造者の指示に従って誘導する。
可溶性ＴＮＦペプチドを硫酸アンモニウム調製、フェニル−セファロース６ファーストフロウでの疎水性相互作用クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファロースファーストフロウでの陰イオン交換クロマトグラフィーおよびセファクリルＳ３００ＨＲでのゲル濾過クロマトグラフィーにより細菌溶解物から精製する。
【０１３４】
組換えタンパク質製造を用いてキメラペプチド組成物を製造することも検討する。
例えば、ＧＳＴ／キメラペプチドの誘導を３７℃でＬＢ培地中（カルベニシリンを添加している）光学密度を波長６００ｎｍで０．４まで形質転換したＸＬ−１ブルー培養を成長させ、その後さらに０．５ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ ＭＯ）の存在下４時間インキュベーションすることにより達成する。
【０１３５】
細菌内で不溶性封入体として製造されることが期待される融合タンパク質を以下のように精製するとよい。
細胞を遠心分離により播き、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄し、室温で１５分間０．１ｍｇ／ｍｌリゾチーム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）で処理する。
ライゼートを音波処理によりきれいにして、細胞残骸を１０分間１２，０００×ｇで遠心分離することによりペレットとする。
ペレットを含む融合タンパク質を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８および１０ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁し、５０％グリセロール上に重層し、３０分間、６０００×ｇで遠心分離する。
ペレットをＭｇ＋＋およびＣａ＋＋を含まない標準的なリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に再懸濁する。
さらに融合タンパク質を変性したＳＤＳポリアクリルアミドゲル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前記）に再懸濁下ペレットを分画することにより精製する。
ゲルを０．４Ｍ ＫＣｌに浸してタンパク質を可視化し、これを切り出してＳＤＳを欠いたゲル泳動緩衝液で電気溶出する。
ＧＳＴ／キメラペプチド融合タンパク質を可溶性タンパク質として細菌内に製造する場合は、ＧＳＴ精製モジュール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて精製してもよい。
【０１３６】
融合タンパク質を消化して本発明のキメラペプチドからＧＳＴを開裂してもよい。
消化反応（２０〜４０μｇ融合タンパク質、２０〜３０ユニットのヒトトロンビン（０．５ｍｌ ＰＢＳに４０００Ｕ／ｍｇ（Ｓｉｇｍａ）））は１６〜４８時間室温でインキュベートし、編成ＳＤＳ−ＰＡＧＥにのせて反応産物を分画する。
ゲルを０．４Ｍ ＫＣｌに浸してタンパク質バンドを可視化する。
キメラペプチドの予想分子量に相当するタンパク質バンドの特定は、自動シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ ４７３Ａ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いてアミノ酸配列分析により確認するとよい。
代替的には、タンパク質のＨＰＬＣおよび／または質量分析を実施することにより確認してもよい。
【０１３７】
代替的には、キメラペプチドをコードするＤＮＡ配列を所望とするプロモーター、および任意にリーダー配列（例えば、Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４０：１０４１−４３，１９８８を参照のこと）を含むプラスミドにクローニングしてもよい。
この構築物の配列を自動配列決定により確認するとよい。
次に、プラスミドを細菌のＣａＣｌ２インキュベーションおよび熱ショック処理（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，前記）を採用する標準的操作を用いてＥ． ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１に形質転換する。
形質転換した細菌をカルベニシリンを添加したＬＢ培地で成長させ、発現したタンパク質の製造を適切な培地で成長させることにより誘導する。
もし存在しておれば、リーダー配列はキメラペプチドの分泌に有効となり、分泌中に開裂するであろう。
【０１３８】
分泌した組換えタンパク質を本発明中以下に記載する方法により細菌培養物から精製する。
【０１３９】
組換えタンパク質の発現のためのほ乳類宿主系も当該技術分野の通常の知識を有する者にはよく知られる。
宿主細胞株を発現したタンパク質を進行させまたはタンパク質活性を与えるのに有用となる翻訳後修飾をうむ特別な能力により選択するとよい。
ポリペプチドのこのような修飾としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。
ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などといった異なる宿主細胞は特異的細胞機構およびこのような修飾後活性について特徴的なメカニズムを有し、誘導される外来タンパク質の正しい修飾および進行を確実とするために選択するとよい。
【０１４０】
形質転換した細胞を長期間、多量のタンパク質製造に用いることが好ましく、このような安定した発現が望ましい。
一旦このような細胞を所望とする発現カセットと共に選択可能なマーカーを含むベクターで形質転換すると、細胞を選択培地に交換する前に豊富な培地で１〜２日間成長させるとよい。
選択可能なマーカーを設計して選択に対する耐性を与え、その存在により誘導した配列の発現に成功した細胞の成長および回収を可能とする。
適切に形質転換した細胞の耐性塊を、細胞に適した組織培養技術を用いて増殖させるとよい。
【０１４１】
多数の選択系を用いて組換えタンパク質製造のために形質転換した細胞を回収することができる。
このような選択系には、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞におけるＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
また、抗代謝産物耐性を、メトトレキセートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ、ミコフェノリックアシッドに対する耐性を与えるｇｐｔ、アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性を与え、またクロルスルフロンに対する耐性を与えるｎｅｏ、およびヒグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏのための選択の基本として用いることもできる。
細胞がトリプトファンの場所にインドールを用いることを可能とするｔｒｐＢ、または細胞がヒスチジンの場所にヒスチノールを用いることを可能とするｈｉｓＤといった他の適切な遺伝子も有用であろう。
形質転換体の特定を可視的に指示するマーカーとしては、アントシアン、ベータ−グルクロニダーゼおよびその基質、ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質、ルシフェリンが挙げられる。
【０１４２】
特定の適用には、タンパク質分解による消化に対して耐性のある本発明のペプチドまたはポリペプチドを製造することが望ましいであろう。
このようなペプチドとしては、加水分解不能ペプチド結合、およびＣ末端でアミド（例えば、ＣＯＮＨ２）またはＮ末端でアセチル基といった末端修飾を有するペプチドが挙げられるであろう。
本発明のペプチドを、そのｉｎ ｖｉｖｏ半減期が増大し、その物質安定性が増大し、ｉｎ ｖｉｖｏ放出速度およびｉｎ ｖｉｖｏクリアランスも影響されるように修飾することを検討する。
【０１４３】
加水分解不能なペプチドを調製するために、ライブラリー加水分解不能ペプチドからペプチドを選択してもよく、または修飾を誘導して１つ以上のＤアミノ酸または１つ以上の加水分解不能なペプチド結合連結アミノ酸といったペプチドを選択してもよい。
例えば、望ましい受容体結合特徴を有するペプチドを選択し、次にプロテアーゼによる加水分解のためのポテンシャルを減ずる必要に応じてこのようなペプチドを修飾することができる。
例えば、タンパク質分解による開裂に対する感受性を決定するには、ペプチドを標識し、細胞抽出物または精製プロテアーゼと共にインキュベートして、次に単離してどのペプチド結合がタンパク質分解に対し感受性があるかを、例えば、ペプチドおよびタンパク質断片配列決定により決定するとよい。
代替的には、潜在的に感受性のあるペプチド結合は、本発明のペプチドのアミノ酸配列をプロテアーゼパネルの既知の開裂部位特異性と比較することにより特定されるであろう。
このようなアッセイの結果に基づいて、タンパク質分解に対して感受性のある各ペプチド結合をペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成による加水分解不能なペプチドと置き換えることができる。
【０１４４】
多くの加水分解不能なペプチドが、このような結合を含むペプチド合成のための操作と共に当該技術分野で知られる。
加水分解不能な結合としては、−［ＣＨ２ＮＨ］−還元アミドペプチド結合、−［ＣＯＣＨ２］−ケトメチレンペプチド結合、−［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−（シアノメチレン）アミノペプチド結合、−［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）］−ヒドロキシエチレンペプチド結合、−［ＣＨ２Ｏ］−ペプチド結合、および−［ＣＨ２Ｓ］−チオメチレンペプチド結合（例えば、米国特許第６，１７２，０４３号を参照のこと）が挙げられる。
【０１４５】
本発明において有用なペプチドは直線であればよく、環状または天然または合成方法により環状化していてもよい。
例えば、システイン残基間のジスルフィド結合がペプチド配列を環状化してもよい。
二作用の試薬を用いてペプチドの２以上のアミノ酸間の連結を提供することができる。
Ａｎｗｅｒ ｅｔ ａｌ．， （Ｉｎｔ． Ｊ Ｐｅｐ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３６：３９２−３９９，１９９０）およびＲｉｖｅｒ−Ｂａｅｚａ ｅｔ ａｌ．， （Ｎｅｕｒｏｐｅｐｕｔｉｄｅｓ ３０：３２７−３３３，１９９６）といったペプチドの環状化についての他の方法も、当該技術分野では知られている。
【０１４６】
さらに、安定な構造または低減した生分解を提供するペプチドの非ペプチド類似体も検討する。
ペプチド擬似類似体は、非ペプチド部分で１つ以上の残基を置換することにより選択されたペプチドに基づいて調製することができる。
好ましくは、非ペプチド部分はペプチドがその天然のコンホメーションを保持し、または好ましい、例えば生活性なコンホメーションを安定にする。
ペプチドから非ペプチド擬似類似体を調製する方法の一例が、Ｎａｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｇｕｌ． Ｐｅｐｔ． ５７：３５９−３７０（１９９５）に記載されている。
本明細書中に用いるペプチドには、前記全てが包含される。
【０１４７】
本発明のポリペプチドは、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化またはリン酸化により、または、酸添加塩、アミド、エステル、特にＣ末端エステルおよびＮ末端アシル誘導体の作成により修飾する。
【０１４８】
また前記のように、本発明は他の部分との共有または非共有複合体を形成することにより修飾されたポリペプチドを包含する。
共有結合した複合体は、化学的部分をペプチドからなるアミノ酸の側鎖上で、またはＮまたはＣ末端で官能基に連結することにより調製することができる。
【０１４９】
特に、前記ペプチドを蛍光標識、酵素（例えば、クロロメトリックまたはフルオロメトリック反応を触媒するもの）、基質、固体マトリックスまたは担体（例えば、ビオチンまたはアビジン）といった、しかしこれらに限定されない受容体基に接合することができることを見込む。
従って、本発明は２以上の血管内皮成長因子ポリペプチド由来の複数のペプチド基質を含むキメラポリペプチドを含む分子であって、キメラポリペプチドは好ましくはさらに放射標識，蛍光標識、酵素、基質、固体マトリックスおよび担体からなる群より選択されるレポーター基を含む分子を提供する。
このような標識の使用はよく知られ、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、米国特許第３，８５０，７５２号、米国特許第３，９９６，３４５号および米国特許第４，２７７，４３７号に記載されている。
放射活性標識、蛍光標識および化学的発光標識といった他の標識も有用であろうが、これらに限定されない。このような標識の使用に関する米国特許としては、例えば米国特許第３，８１７，８３７号、米国特許第３，８５０，７５２号、米国特許第３，９３９，３５０号および米国特許第３，９９６，３４５号が挙げられる。
本発明のペプチドはいずれも１、２またはそれ以上のこれらの標識のいずれかを含むとよい。
【０１５０】
本発明のポリペプチドを用いる方法
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ受容体ファミリー（血管内皮細胞および血管の成長および移動に影響し、リンパ内皮細胞およびリンパ管の成長を促進し、血管浸透性を増大し、かつ骨髄造血に影響することを含むが、これらに限定されない）により媒介される多くの生物活性は、これらの生物活性をモジュレート（刺激または阻害）するためのＶＥＧＦ受容体ファミリーの１つ以上のメンバーを結合することができる本発明のポリペプチドのための多数の診断ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ臨床使用を支持する。
【０１５１】
本発明のどのポリペプチドが成長因子として（すなわち、アニストまたは受容体刺激剤）働くかについては、多重メカニズムが存在する。
例えば、ＶＥＧＦ受容体ファミリーの１つ以上のメンバーを結合および活性化するホモ二量体を形成する本発明のポリペプチドは、血管内皮成長因子として有用であろう。
代替的には、内皮成長因子ポリペプチド（ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃまたは他のファミリーメンバー）とヘテロ二量体を形成する本発明のポリペプチドもアゴニストに影響し、こうして形成されたヘテロ二量体が受容体を結合し、活性化してシグナル形質導入を誘導することができるようにする。
【０１５２】
本発明のどのポリペプチドがＶＥＧＦファミリーの成長因子の阻害剤（アンタゴニスト）として機能するかについては、多重なメカニズムが存在する。
１つ以上の受容体に結合するが、刺激しない本発明のポリペプチドは内皮成長因子により受容体の刺激を阻害し、それにより内皮成長因子の阻害剤として働くであろう。
【０１５３】
このように刺激を損ねるのは、全体としてまたは部分的に受容体を二量化できないこと、恐らく本発明のハイブリッドポリペプチドが成長因子ホモ二量体を形成することができないによるであろう。
ヘテロ二量体が受容体を結合し損ねたり、ヘテロ二量体が各受容体のみまたは受容体活性およびシグナル形質導入を妨げるようにヘテロの受容体対に結合した場合には、内皮成長因子ポリペプチドとヘテロ二量体を形成する本発明のポリペプチドはＶＥＧＦファミリー受容体の刺激を阻害するであろう。
いずれのメカニズムにしても、内皮ＶＥＧＦポリペプチド（および活性ホモ二量体を形成しないもの）と活性破壊ヘテロ二量体を形成する本発明のポリペプチドは、天然の内皮ＶＥＧＦ活性のアンタゴニストとして有用である。
【０１５４】
また受容体を結合するポリペプチドはいずれも、細胞毒性または細胞増殖抑制剤に接合して、このような標的細胞に対する薬剤を送達することができる。
このような薬剤の付着が、ＶＥＧＦポリペプチドが分裂応答を表す細胞の成長を阻害するための別の方法である。
毒素の例としては、化学治療、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素などが挙げられる。
【０１５５】
本発明の２以上のハイブリッドポリペプチドは混ぜることができ、こうして形成されたヘテロ二量体はその受容体結合および刺激特性に依存するモジュレーターとして有用であることは明らかであろう。
本発明のポリペプチドは異なる受容体結合特性を有するであろう天然に生じる血管内皮成長因子由来のハイブリッドであるから、ハイブリッドのいくつかは１つ以上の受容体の活性剤として機能するであろうし、いくつかは１つ以上の受容体の阻害剤として働くであろうことが検討される。
本明細書中に記載する操作および当該技術分野で知られる他の操作を用いて、本発明のポリペプチドの受容体結合、受容体活性化および受容体阻害特性を決定することができる。
【０１５６】
１つ以上のＶＥＧＦ受容体を結合し、活性化する本発明のポリペプチドは、血管形成および／またはリンパ管形成を促進するのに有用であり、例えば、損傷治癒を促進し、組織移植を容易にし、動脈口狭窄まわりの側副血管の形成を促進し、梗塞形成後の傷ついた組織には虚血を治療する。
他方、内皮ＶＥＧＦタンパク質のアンタゴニストとして機能する本発明のポリペプチドは、血管形成の抑制が望ましい腫瘍形成、網膜症、リウマチ様関節炎および乾癬を治療するための治療学的適用に用いることもできる。
【０１５７】
本発明のポリペプチドは、それらのいくつかがＶＥＧＦ受容体の一つを選択的に結合し、こうして一つの特別なＶＥＧＦ受容体を通して特異的にシグナリングを誘導するために用いることができる点で、天然のＶＥＧＦ受容体リガンドとは異なる。
例えば、単にＶＥＧＲ−３シグナリングを誘導するポリペプチドを治療学的に用いて、リンパ疾患を患った患者のリンパ内皮を標的とし、このような患者のリンパ管の構造および機能を改善することができる。
またこのようなポリペプチドを用いて、その表面上のＶＥＧＦＲ−３を発現する細胞により特徴付けられる腫瘍形成を標的とすることができる。
ＶＥＧＦによる単球／マクロファージの化学走性［Ｂａｒｌｅｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８７：３３３６−３３４３（１９９６）］は、ＶＥＧＦＲ−１により媒介される。
このように、特異的にＶＥＧＦＲ−１受容体を標的とする分子を用いて、この特別なＶＥＧＦ受容体上に治療学的影響を及ぼす。
例えば、ＶＥＧＦＲ−１の阻害剤を用いてウイルス性誘発腫瘍形成を予防したり、特異的にＶＥＧＦＲ−１を活性化する分子を用いて単球／マクロファージ移動を高めたりすることができる。
ＶＥＧＦＲ−２は腫瘍形成に必須であり、ウイルス性誘発腫瘍形成にとって充分である。
このように、ウイルス性ＶＥＧＦにより誘導されるような腫瘍形成を阻害するために、ＶＥＧＦＲ−２の阻害剤を用いればよく、ＶＥＧＦＲ−２を刺激する分子は腫瘍形成を促進するために用いることができる。
【０１５８】
本発明のポリペプチドのサブセットは、既知の天然のＶＥＧＦリガンドについては実証されないＶＥＧＦ受容体の組み合わせを結合することができ、全ての３つの既知のＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ−１、Ｒ−２およびＲ−３を結合することができる。
これらのポリペプチドは、ＶＥＧＦ受容体の異なる組み合わせの活性化または阻害を望む治療にとって有用である。
【０１５９】
ＶＥＧＦＲ−３を活性化することができる本発明のポリペプチドを用いて、リンパ管およびリンパ管の損傷、リンパ管の閉塞、リンパ管腫および主要な特発性リンパ水腫、ミルロイ病および早発性リンパ水腫などだけでなく、リンパ節および管の除去、癌、損傷および乾癬の治療における放射治療および手術から生じる二次的リンパ水腫を治療するための組織の内皮機能を促進することができる。
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、リンパ水腫進行のリスクがある患者にリンパ水腫を防ぐための予防的治療として、またはリンパ水腫を患った患者に治療学的処置として、例えばその症状（例えば、リンパの蓄積による腫れ）を改善する目的で、単純に投与することができるであろう。
【０１６０】
ＶＥＧＦＲ−３を活性化する本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いて、腋窩のリンパ管が癌治療（例えば、乳ガン）における手術介入の際に除去された患者のリンパ管の再成長または浸透性を促進することができる。
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いれば、例えば、臓器移植患者における血管新生を治療することができる。
本発明のポリペプチドを含む組成物を、ｉｎ ｖｉｖｏで移植する前に単離した管のセグメントに直接適用して、移植した材料の拒絶を最小とし、移植材料の血管新生を刺激してもよい。
【０１６１】
ＶＥＧＦ受容体活性を活性化する本発明のポリペプチドを用いて、創傷、手術による切開、傷、および新血管形成の過程が誘導および／または促進されうる場合には治癒が適当に促進されることが期待される他の症状を治療するとよい。
【０１６２】
前記により詳細に説明し、文献に報告されるように、血管内皮成長因子についての受容体の発現は、造血前駆細胞などの特定の前駆細胞において観察され、ＶＥＧＦ−Ｃは骨髄造血活性を有することが観察されている。
これらの観察は、本発明に従ったポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて、免疫細胞または造血細胞の増殖、分化および成熟または移動をモジュレートすることにより炎症、感染または免疫疾患を治療または予防してもよいという予見を与える。
また本発明に従ったポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて、組織およびリンパ管の間の白血球の通行、ならびに胸腺内外の移動を促進または阻害してもよい。
【０１６３】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、骨髄造血（特に、好中球の成長）を刺激するためまたはそれを阻害するために用いることができる。
このように、本発明はほ乳類患者に骨髄造血のモジュレーションの必要に応じて骨髄造血をモジュレートするのに有効な本発明のポリペプチド量を投与することを含むほ乳類患者における骨髄造血モジュレート方法を含む。
１実施形態では、顆粒球減少を患ったほ乳類患者を選択し、方法は骨髄造血を刺激するのに有効なポリペプチド量を患者に投与することを含む。
特に、本発明のポリペプチドを患者の血液中の好中球カウントを増大するのに有効な量で投与する。
【０１６４】
関連する実施形態では、本発明は患者の細胞内で血液好中球の数を増大する必要に応じて、ＶＥＧＦ受容体によりシグナリングを活性化することができる本発明のポリヌクレオチドをコードするＤＮＡを発現する工程であって、ＤＮＡは動作可能なように細胞内のＤＮＡの発現を促進する他のコントロールまたはプロモーター配列に連結している工程を含むほ乳類患者の血液における好中球の数を増大する方法を含む。
同様に、本発明はほ乳類幹細胞を本発明のポリペプチドとほ乳類内皮細胞の成長をモジュレートするのに有効な量で接触させる工程を含むｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの好中球顆粒球の成長をモジュレートする方法を含む。
【０１６５】
また本発明は、ほ乳類ＣＤ３４＋前駆細胞を本発明のポリペプチドとほ乳類内皮細胞の成長をモジュレートするのに有効な量で接触させる工程を含むｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ３４＋前駆細胞（特に、造血前駆細胞および内皮前駆細胞）の成長をモジュレートする方法を含む。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法では、臍帯血または骨髄から単離したＣＤ３４＋前駆細胞を特異的に検討する。
ＣＤ３４＋前駆細胞の成長を刺激するための本発明のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ方法はまた、本発明のポリペプチドを造血／骨髄造血または内皮細胞増殖をモジュレートする目的で他のポリペプチドと共に（同時にまたは連続して）採用する方法を含む。
このような他の因子としては、コロニー刺激因子（「ＣＳＦ」、例えば顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、マクロファージ−ＣＳＦ（ＭＣＳＦ）および顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターロイキン−３（ＩＬ−３，マルチコロニー刺激因子ともいわれる）、他のインターロイキン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、他のポリペプチド因子、ならびに当該技術分野で記載され、知られるその類似体が挙げられる。
一般的には、Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．， Ａｎｇｕｓ Ｔｈｏｍｓｏｎ （ｅｄｉｔｏｒ）， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （１９９６）；Ｃａｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｇｅａｒｉｎｇ，Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ＦａｃｔＢｏｏｋ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．（１９９４）；およびＣｏｗｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｘｔｅｒ，ＴＩＢＴＥＣＨ． １０（１０）：３４９−３５７（１９９２）を参照のこと。
前駆細胞または骨髄造血細胞成長因子または１つ以上の前記因子を有する共因子としての本発明のポリペプチドの使用は、前記因子に欠いた使用が本発明のポリペプチドがなく必要となる一方で、予め最適化しうる骨髄造血効果を高め、および予め影響しうる骨髄造血効果を高めるであろう。
【０１６６】
また、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを肺疾患の治療に用いて、体液蓄積を弱めるように血管浸透性に影響を及ぼすことにより、肺および血流管の肺における血液循環および／またはガス交換を改善し、心不全の場合には心臓への血液循環および酸素ガス浸透性を改善し、慢性閉塞性気道疾患における血流およびガス交換を改善し、および例えば血管浸透性における増大から生じる肺での体液の蓄積に関与する鬱血性心不全といった症状を治療してもよい。
【０１６７】
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを用いて、その血液循環増大および血管浸透性増大活性の結果として腸管での吸収不良性症候群を治療することもできるであろう。
【０１６８】
１つ以上のＶＥＧＦ受容体により結合するが、シグナリングを刺激しない本発明のポリペプチドを用いて、血管浸透性増大、糖尿病に関連する網膜症、リウマチ様関節炎および乾癬により引き起こされる慢性的炎症を治療してもよい。
【０１６９】
１つ以上のＶＥＧＦ受容体の機能を阻害することができる本発明に従ったポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて、水腫、末梢動脈疾患、カポジ肉腫または成熟前の新生骨における異常な網膜発達を治療することもできる。
【０１７０】
別の実施形態では、本発明はほ乳類内皮細胞の成長をモジュレートするのに有効な量の本発明に従ったポリペプチドにほ乳類内皮細胞をさらす工程を含むほ乳類患者の内皮細胞の成長をモジュレートする方法を提供する。
１実施形態では、成長のモジュレーションはＶＥＧＦ受容体を発現する宿主細胞内でＶＥＧＦ受容体のチロシンリン酸化を刺激できるポリペプチドを用いることにより影響される。
内皮細胞の成長をモジュレートすることにおいて、本発明は内皮細胞関連疾患のモジュレーションを検討する。
好ましい実施形態では、患者および内皮細胞はヒトである。
内皮細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで提供すればよく、これらが組織移植片に含まれていてもよい。
ポリペプチドの有効量は、（細胞倍増時間の顕微的または巨視的可視化および見積または核酸合成アッセイにより決定されるような）細胞成長速度において再生可能な変化を達成するために必要な量である。
【０１７１】
血管新生および新血管新生は腫瘍成長について本質的であるので、血管新生活性の阻害はさらに成長を妨げ、固体腫瘍の後退にすら至ることができる。
さもなくば、リンパ管新生の阻害は転移を予防するのに役立つであろう。
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、腫瘍血管新生を阻害することにより肉腫、黒色腫、癌腫およびグルムス血管腫といった腫瘍形成を治療するのに有用であろう。
【０１７２】
このように、脳（グリア芽腫、星状細胞腫、乏突起膠腫上衣細胞腫）、肺、肝臓、脾臓、腎臓、リンパ節、膵臓、小腸、血液細胞、大腸、胃、胸、子宮内膜、前立腺、精巣、卵巣、皮膚、心臓および首、食道、骨髄、血液または他の組織の癌といった広い範囲の癌を、本発明のペプチドを用いて治療するとよい。
【０１７３】
多くの場合、腫瘍細胞を殺傷、または通常の細胞死または「アポプトーシス」に被らせるよう誘導することができることは必要ではない。
むしろ、意味のある治療とするために必要な全てとは腫瘍の成長がある程度まで示されまたは特異的に領域に位置し、かつ疾患部位まで広がるのを阻害することである。
しかしながら、腫瘍成長は完全に遮断されるか、いくらかの腫瘍退化が達成されるであろう。
「沈静化」および「腫瘍の減少」義務といった臨床的用語も、その通常の用法を与えると考える。
本発明の背景から、治療学的効果は血管新生の阻害および／またはリンパ管新生の阻害から生じるであろう。
【０１７４】
このように、本発明は細胞内の１つ以上のＶＥＧＦ受容体の発現により特徴付けられる新生疾患を患ったほ乳類生物を治療する方法であって、該方法はＶＥＧＦ受容体の発現により特徴付けられる新生疾患を患ったほ乳類生物を特定する工程、およびこのような治療を必要とするほ乳類生物に組成物を投与する工程を含む、該組成物は細胞のＶＥＧＦ受容体媒介増殖を阻害するのに有効な本発明の１つ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む方法を含む。
このような治療方法論は、特に沈静期管と結ばれる内皮細胞と相応して、１つ以上のＶＥＧＦ受容体のレベル増大を表す内皮細胞と結ばれる管に関与する新血管新生により特徴付けられる新生疾患状態およびＶＥＧＦ受容体を発現する癌細胞により特徴付けられる疾患状態について示される。
腫瘍想定においてＶＥＧＦＲ−３を標的とすることおよび抗腫瘍治療は、参考文献により本明細書中に取り込まれているＰＣＴ／ＵＳ９９／２３５２５５（ＷＯ ００／２１５６０）、２０００年４月２０日発行に記載されている。
他のＶＥＧＦ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ−１）も、腫瘍血管新生または転移に関係するとみなされている。
【０１７５】
少なくとも成長因子のＶＥＧＦファミリーのＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄが血管の狭窄または再狭窄を予防するのに有用である証拠がある。
参考文献により本明細書中にその全体において取り込まれている国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２４０５４号（ＷＯ ００／２４４１２）、「再狭窄を予防するためのＶＥＧＦ−ＣまたはＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子またはタンパク質の使用」、１９９９年１０月２６日出願を参照のこと。
また本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、これらの指示についても有用であろう。
このように別の観点では、本発明は血管の狭窄または再狭窄を予防するためにほ乳類患者を治療する方法であって、血管の狭窄または再狭窄を予防する処置を必要とするほ乳類患者に本発明の１つ以上のポリペプチドを血管の狭窄または再狭窄を予防するのに有効量投与する工程を含む方法を提供する。
好ましい実施形態では、投与は哺乳類患者において血管内ステントを移植することを含む、ステントが組成物で被覆または植え付けられている。
薬剤被覆または薬剤植え付けステントを構築するための材料の例は前記文献に記載され、Ｌｉｎｃｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０：２０７０−２０８４（１９９４）に総説されている。
別の好ましい実施形態では、組成物はその粒子が本発明のポリペプチドを封入するかポリペプチドにより植え付けられているＰＧＬＡ、非崩壊性ポリマーまたは生物ポリマー（例えば、デンプン）などの生物崩壊しうるポリマーからなる微粒子を含む。
このような粒子は、例えば、導入血管形成カテーテルを用いて血管内壁に送達される。
局所的な持続性薬物送達を達成するための他の方法は、参考文献により本明細書中に取り込まれているＷｉｌｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｉｄｏｖａｓｏ． Ｍｅｄ．， ３：１６３−１７０（１９９３）に総説されている。
【０１７６】
血管形成またはバイパス生産に続く１つ以上の血管内導入を介した投与も検討する。
操作部位に本発明のポリペプチドをおくことは、増殖する内皮細胞上のＶＥＧＦ受容体発現により起こる。
さらに局所化は、融合ポリペプチドとして本発明のポリペプチドを組換え発現することにより（例えば、Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，８７：１４３６−１４４０（１９９０）に記載されているアポリポタンパク質Ｂ−１００オリゴペプチドに融合している）容易となる。
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドを共投与することも検討する。
【０１７７】
同様に、本発明は血管内または血管該ステント、バルーンカテーテル、注入灌流カテーテル、血管外カラー、エラストマー膜などといった循環系疾患を治療するために用いられる手術器具であって、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含でなる装置で被覆、植え付け、付着または封入することにより改善されている器具をも提供する。
【０１７８】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、狭窄を予防するための予防的治療として、または患者の管の再狭窄を予防する目的で、経皮血管冠動脈形成操作のわずか前におよび／または同時におよび／またはわずか後に単に投与することができる。
別の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドをバイパス操作（例えば、冠動脈バイパス操作）の前、間および／またはわずか後に投与して、移植した管内または付近の狭窄または再狭窄、特には移植片自身の位置での狭窄を予防する。
なおも別の実施形態では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを、周辺虚血または間欠性跛行を治療するために実施された血管周囲内の血管移植前、間または後に投与する。
狭窄または再狭窄の予防により、このような手術操作でしばしば起こる狭窄または再狭窄の量／重篤性を減少し、および／または実質的に見積る予防的治療となる。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、哺乳類患者の血管内ＶＥＧＦ受容体の刺激を促進するのに有効量で組成物に含まれ、これにより血管の狭窄または再狭窄が予防される。
【０１７９】
好ましい実施形態では、哺乳類患者はヒト患者である。
例えば、患者は治療的バルーン血管形成（血管内ステントの挿入をしてまたはせずに）操作から、または冠動脈バイパス操作から有益となるであろう候補者として心臓内科医により特定される冠動脈疾患を患ったヒトである。
他の哺乳類患者、特にはヒトにおいて治療学的効果を実証するためのモデルとして共通して用いられる哺乳類（例えば、霊長類、ブタ、イヌまたはウサギ動物）における本発明の方法の使用も検討する。
【０１８０】
本発明に従ったポリペプチドは、適切な薬学的に許容しうる担体、例えば、薬学的に許容しうる希釈剤、補助薬、賦形剤または担体を用いたいずれの適切な方法においても投与されるであろう。
本発明の方法に従って投与される組成物は、好ましくは水、食塩水、リン酸緩衝液、グルコースまたは血管内治療を送達するために慣用で用いられる他の担体といった薬学的に許容しうる担体溶液を（ポリヌクレオチドまたはベクターに加えて）含む。
また組成物が任意に本発明のポリヌクレオチド／ベクターおよび再狭窄を予防するために選択される別のポリヌクレオチド／ベクターの両者を含む場合には、多重遺伝子治療も検討する。
本発明のポリペプチドをコードするトランス遺伝子を用いて共トランスフェクションするための候補遺伝子／ベクターの例としては、前記文献に記載され、細胞毒因子、内皮成長因子および平滑筋細胞成長／移動阻害剤をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１８１】
本方法に従って実施される「投与」は、注射（例えば、静脈内、筋肉内、腹膜内またはカテーテル）、経口摂取、鼻腔内または局所投与などの、しかしこれらに限定されない哺乳類患者の血管への治療的に直接または間接的導入のための医薬的に許容される方法を用いて実施されるであろう。
好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドを含む組成物の投与は、静脈、動脈または冠動脈注射といった血管内に行われる。
治療的組成物を多重部位で患者に送達してもよい。
多重投与は、同時にしてもよく、または数時間にわたって投与してもよい。
【０１８２】
特定の場合には、治療的組成物の連続フロウを提供することが有益であろう。さらなる治療は、例えば日、週または月ごとの期間で投与するとよい。
【０１８３】
一般的に、ペプチドの治療的送達のための経口投与剤は効き目のためのこのような製剤のために効果がなく、ペプチドを胃腸管の酵素環境から保護しなければならない。
さらに、ペプチドを治療結果に影響する充分な条件で内皮細胞バリアにより容易に吸収されるように製剤化しなければならない。
本発明のペプチドはその効果を増大するように取り込みまたは吸収エンハンサーを有するよう製剤化するとよい。
このようなエンハンサーとしては、例えば、サリチル酸塩、グリココール酸塩／リノール酸塩、グリコール酸塩、アプロチニン、バシトラシン、カプリン酸ＳＤＳなどが挙げられる。
治療的送達のためのペプチドの経口製剤のさらなる記載は、当該技術分野において通常の知識を有する者にはＦｉｓ（Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， ８５（１２） １２８２−１２８５，１９９６）ならびにＯｌｉｙａｉ ａｎｄ Ｓｔｅｌｌａ（Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．， ３２：５２１−５４４，１９９３）に参照される。
【０１８４】
与える投与量におけるペプチド量は、治療する疾患の特徴に加えて、治療を投与する個体のサイズにより変わるであろう。
治療の例としては、約５０ｍｇ／日、７５ｍｇ／日、１００ｍｇ／日、１５０ｍｇ／日、２００ｍｇ／日、２５０ｍｇ／日を投与することが必要であろう。
これらの濃度は、単一投与剤または多重投与として投与するとよい。
【０１８５】
またポリペプチドをこのようなポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏ発現により本発明に従って採用してもよく、これはしばしば遺伝子治療を参考とする。
本発明は、微生物または真核生物細胞に挿入することができ、コードするタンパク質を発現することができる本発明のポリペプチドをコードする異種セグメントを含む組換えＤＮＡベクターを提供する。
【０１８６】
非常に好ましい実施形態では、組成物を局所的に投与する。
このように、再狭窄または狭窄を治療する場合、血管形成またはバイパスの部位へ直接投与することが好ましい。
例えば、投与は哺乳類患者の血管への、特に哺乳類患者の冠動脈へのトランス遺伝子含有組成物のカテーテル媒介トランスファーを含む。
局所送達のための材料および方法の例としては、両者共に参考文献により本明細書中に取り込まれているＬｉｎｃｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９０：２０７０−２０８４（１９９４）；およびＷｉｌｅｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． ｍｅｄ．， ３：１６３−１７０（１９９３）に総説されている。
例えば、組成物は冠動脈内薬剤注入についての文献に記載されているように注入灌流バルーンカテーテル（好ましくは微小孔バルーンカテーテル）を用いて投与する。
例えば、米国特許第５，７１３，８６０号（注入アレイを有する血管内カテーテル）、米国特許第５，０８７，２４４号、米国特許第５，６５３，６８９号およびＷｏｌｉｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｏｌｌ． Ｃａｒｄｉｏｌ．， １５：４７５−４８１（１９９０）（Ｗｏｌｉｎｓｋｙ注入カテーテル）、およびＬａｍｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｒｏｎ． Ａｒｔｅｒｙ Ｄｉｓ．， ４：４６９−４７５（１９９３）であって、その全てが参考文献によりその全体において本明細書中に取り込まれているものを参照のこと。
部位直接体細胞遺伝子治療のためのこのようなカテーテルの使用は、例えば参考文献により本明細書中に取り込まれているＭａｚｕｒ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｘａｓ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｊｏｕｒｎａｌ，２１；１０４−１１１（１９９４）に記載されている。
本発明のポリペプチドをコードするトランス遺伝子をアデノウイルスベクターにおいて投与する実施形態では、好ましくはベクターを１０７−１０１３ウイルス粒子の力価で、およびより好ましくは１０９−１０１１ウイルス粒子の力価で薬学的に許容しうる担体において投与する。
好ましくは、アデノウイルスベクター組成物を１５秒〜３０分間、より好ましくは１〜１０分間の期間にわたって注入する。
【０１８７】
例えば、冠動脈における単一または多重損傷による狭心症を有し、ＰＴＣＡが主要な冠動脈血管造影図による知見に基づいて予見されている患者では、プロトコルの例として大腿骨アプローチを用いて標準的臨床実施に従って７ＦガイドカテーテルによりＰＴＣＡを実施することが挙げられる。
最適な結果がＰＴＣＡ単独で得られない場合には、次に血管外ステントも移植する。
（通常の結果は、視覚的見積りおよびＢまたはＣ型切開によれば管腔の３０％より大きい過剰狭窄として定義される。）
バルーン拡張部位での動脈遺伝子トランスファーは、血管形成後すぐではあるがステント移植前に、注入灌流バルーンカテーテルを用いて、本発明のポリペプチドを発現する複製不完全アデノウイルスベクターを用いて実施する。
【０１８８】
カテーテルのサイズは、血管造影図から測定される動脈径にマッチするように選択され、例えば、３．０〜３．５Ｆ径で変わる。
バルーンを最適圧力に膨張させ、遺伝子トランスファーを１．１５×１０１３ウイルスタイターで０．５ｍｌ／分の速度で１０分間注入して実施する。
【０１８９】
別の実施形態では、他のトランス遺伝子を導入するための文献に記載されるように、ゲル被覆カテーテルを用いた血管内投与を検討する。
例えば、全てが参考文献により本明細書中に取り込まれている米国特許第５，６７４，１９２号（頑強に接着した膨張ヒドロゲルポリマー）；Ｒｉｅｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，４；７４９−７５８（１９９３）；およびＳｔｅｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９６：４０８−４１１（１９９７）および９０：１６４８−１６５６（１９９４）を参照のこと。
要約すると、ＤＮＡ溶液（例えば、本発明のポリヌクレオチド）をヒドロゲルポリマー（例えば、ハイドロプラスを有するＳｌｉｄｅｒ， Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ Ｂｏａｓｔｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐ．， Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ， ＭＡ）で被覆した炎症血管形成カテーテルバルーンの表面へｅｘ ｖｉｖｏで一回以上適用する。
ハイドロプラス被覆は、バルーンに強く接着した高分子量ハイドロゲルを形成するようにバルーンに架橋する親水性ポリアクリル酸ポリマーである。
ＤＮＡ被覆したハイドロゲルを、バルーンの収縮前に乾燥させる。
血管形成過程におけるバルーンの血管内再膨張は、管壁へのＤＮＡのトランスファーを引き起こす。
【０１９０】
なおも別の実施形態では、バルーン血管形成カテーテルまたはステントを有する総体またはマウントする拡張伸縮膜または類似の構造を採用して、本発明のポリペプチドをコードするトランス遺伝子を送達する。
例えば、全て本明細書中に参考文献により取り込まれている米国特許第５，７０７，３８５号、第５，６９７，９６７号、第５，７００，２８６号、第５，８００，５０７号および第５，７７６，１８４号を参照のこと。
【０１９１】
別の変型では、本発明のポリペプチドをコードするトランス遺伝子を含有する組成物を血管外に、例えば管部分の取り囲みまたは囲みをするための装置を用いて投与する。
例えば、参考文献により本明細書中に取り込まれている国際公開公報ＷＯ９８／２００２７で、プラスミドまたはリポソームベクターを介して動脈壁にトランス遺伝子を送達するために動脈外周囲にカラーをおくこと（例えば、バイパス操作中に）が記載されている。
【０１９２】
なおも別の変型では、内皮細胞または内皮前記細胞を本発明のポリペプチドをコードするトランス遺伝子、および哺乳類患者に投与するようなトランスフェクション細胞を用いてｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクションする。
一般的に修飾した内皮細胞を用いて血管移植する操作の例は、参考文献により本明細書中に取り込まれている米国特許第５，７８５，９６５号に記載されている。
【０１９３】
好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドはさらに遺伝子治療を容易にする追加の配列を含む。
１実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする「裸の」トランス遺伝子（すなわち、ウイルス、リポソームまたは他のトランスフェクションを容易にするベクターを有しない）を遺伝子治療に採用する。
この実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは好ましくは適切なプロモーターおよび／またはエンハンサー配列（例えば、サイトメガウイルスプロモーター／エンハンサー［Ｌｅｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｌ．， ２９：２４９４−２５０２（１９９１）；Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）］、ラウス肉腫ウイルスプロモーター［Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ４：１５１（１９９３）］、Ｔｉｅプロモーター｛Ｋｏｒｈｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ，８６（５）：１８２８−１８３５（１９９５）］、またはサルウイルス４０プロモーター）を標的哺乳類細胞で発現するために含む、プロモーターはポリペプチドコード配列の上流（すなわち、５’）に操作可能に連結されている。
また本発明のポリペプチドは、好ましくはさらにポリペプチドコード配列の下流（すなわち、３’）に操作可能に連結した適切なポリアデニル化配列（例えば、ＳＶ４０またはヒト成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化配列）を含む。
また本発明のポリヌクレオチドは、好ましくはポリペプチド配列とフレームがあうように融合した分泌シグナルペプチドをコードするヌクレオチドを含む。
分泌シグナルペプチドは、ポリペプチドを発現する細胞による本発明のポリペプチドの分泌を目的とし、分泌したポリペプチドから細胞により開裂される。
シグナルペプチド配列を他の分泌タンパク質のものとすることもでき、または哺乳類患者の細胞内での分泌を目的とするのに有効な完全合成シグナル配列とすることもできる。
【０１９４】
ポリヌクレオチドは、さらに例えば複製の細菌オリジンおよび選択可能なマーカーをコードする配列といった、細菌内で、唯一目的とする機能がベクターの大量生産を容易とする配列を任意に含んでもよい。
しかしながら、好ましい実施形態では、このような外来配列は少なくとも本発明の方法に従ったヒトへの投与前に開裂される。
このようなポリヌクレオチドを製造し、投与して、他のトランス遺伝子についての文献に記載されている操作を用いて遺伝子治療の成功に至る。
例えば、参考文献によりその全体において本明細書中に取り込まれているＩｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ， ９１：２６８７−２６９２（１９９５）；およびＩｎｓｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，７：９８９−１０１１（１９９６）を参照のこと。
【０１９５】
いずれかの適切なベクターを用いて宿主への本発明のポリペプチドの一つをコードするトランス遺伝子を導入してもよい。
文献に記載されているベクターの例としては、複製不完全レトロウイルスベクターが挙げられ、レンチウイルスベクター［Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ７２（１）：８１１−８１６（１９９８）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｓｃｒｉｐ Ｍａｇａｚｉｎｅ，１９９８年１０月，ｐｐ．４３−４６］；アデノ関連ウイルスベクター［米国特許第５，４７４，９３５号、米国特許第５，１３９，９４１号、米国特許５，６２２，８５６号、米国特許第５，６５８，７７６号、米国特許第５，７７３，２８９号、米国特許第５，７８９，３９０号、米国特許第５，８３４，４４１号、米国特許第５，８６３，５４１号、米国特許第５，８５１，５２１号、米国特許第５，２５２，４７９号；Ｇｎａｔｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔｉｇ． Ｍｅｄ．， ４５：８７−９８（１９９７）］；アデノウイルスベクター［例えば、米国特許第５，７９２，４５３号、米国特許第５，８２４，５４４号、米国特許第５，７０７，６１８号、米国特許第５，６９３，５０９号、米国特許第５，６７０，４８８号、米国特許第５，５８５，３６２号；Ｑｕａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８９：２５８１−２５８４（１９９２）；Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｄｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９０：６２６−６３０（１９９２）；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ，６８：１４３−１５５（１９９２）］；アデノウイルス−アデノ関連ウイルスハイブリッド（例えば、米国特許第５，８５６，１５２号を参照のこと）またはワクシニアウイルスまたはヘルペスウイルス（例えば、米国特許第５，８７９，９３４号、米国特許第５，８４９，５７１号、米国特許第５，８３０，７２７号、米国特許第５，６６１，０３３号、米国特許第５，３２８，６８８号を参照のこと）；リポフェクチン媒介遺伝子トランスファー（ＢＲＬ）；リポソーマルベクター［例えば、米国特許第５，６３１，２３７号（センダイウイルスタンパク質を含むリポソーム）を参照のこと］；およびそれらの組み合わせがある。
前記文献は全てその全体において参考文献により本明細書中に取り込まれている。
複製不完全アデノウイルスベクターは好ましい実施形態を構成する。
【０１９６】
検討した他の非ウイルス送達メカニズムとしては、リン酸カルシウム沈殿（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　Ｄｅｒ　Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７，１９９３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ，Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，７：２７４５−２７５２，１９８７；Ｒｉｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５，１９９０）、ＤＥＡＥデキストラン（Ｇｏｐａｌ，Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，５：１１８８−１１９０，１９８５）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，６：７１６−７１８，１９８６；Ｐｏｔｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１−７１６５，１９８４）、直接のマイクロ注入（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｊ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１０１：１０９４−１０９９，１９８５）、ＤＮＡ取り込みリポソーム（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０，１９８２；Ｆｒａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，７６：３３４８−３３５２，１９７９；Ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｓｃｉ　Ａｍ．２７６（６）：１０２−６，１９９７；ｆｅｌｇｎｅｒ，Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ，７（１５）：１７９１−３，１９９６）、細胞音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，８４：８４６３−８４６７，１９８７）、高速マイクロ噴射を用いた遺伝子衝撃（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，８７：９５６８−９５７２，１９９０）、および受容体媒介トランスフェクション（ＷｕおよびＷｕ，　Ｊ　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２，１９８７；ＷｕおよびＷｕ，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２７：８８７−８９２，１９８８；ＷｕおよびＷｕ，　Ａｄｖ．　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｒｅｖ．，１２：１５９−１６７，１９９３）が挙げられる。
【０１９７】
本発明の特別な実施形態では、発現構築物（または前記実際のペプチド）をリポソームに取り込んでもよい。
リポソームは、リン脂質二層膜および内部水性液により特徴付けられる小胞構造である。
多重ラメラリポソームは水性液により分離される多重脂質層を有する。
それらは、リン脂質が過剰な水溶液に懸濁されると、自然に形成する。
リン成分は閉鎖構造の形成前に自己再配置をうけ、そして脂質二層間に水および溶解した溶液を取り込む（ＧｈｏｓｈおよびＢａｃｈｈａｗａｔ，「肝臓病、標的診断および特異的受容体およびリガンドを用いた治療」，Ｗｕ Ｇ， Ｗｕ Ｃ 編集，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｍｅｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，ｐｐ． ８７−１０４，１９９１）。
陽イオン性リポソームへのＤＮＡの添加は、リポソームから光学的に複屈折な液体結晶濃縮小球への位相的移行を引き起こす（Ｒａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５（５３０１）：８１０−４，１９９７）。
これらのＤＮＡ液体複合体は、遺伝子治療および送達における用途のための有効な非ウイルスベクターである。
【０１９８】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの外来ＤＮＡのリポソーム媒介核酸送達および発現は、非常に成功している。
また本発明では、「リポフェクション」技術といった種々の市販によるアプローチも検討している。
本発明の特定の実施形態では、リポソームを赤血球凝集ウイルス（ＨＶＪ）と複合してもよい。
これは細胞膜との融合を容易にし、リポソーム取り囲みＤＮＡの細胞侵入を促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３：３７５−３７８，１９８９）。
他の実施形態では、リポソームを核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）との接合で複合または採用するとよい（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：３３６１−３３６４，１９９１）。
なおもさらなる実施形態では、リポソームをＨＶＪおよびＨＮＧ−１の両者との接合で複合または採用してもよい。
このような発現では、構築物をｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの核酸のトランスファーおよび発現に採用するのに成功し、次にそれらを本発明のために適用することができる。
【０１９９】
細胞への治療的遺伝子をコードする核酸を送達するために採用することができる他のベクター送達システムとしては、受容体媒介送達ビークルが挙げられる。
【０２００】
これらは、ほとんど全ての真核生物細胞での受容体媒介エンドサイトーシスによりマクロ分子の選択的取り込みを有利にする。
種々の受容体の細胞型特異的分布により、送達は非常に特異的にされうる（ＷｕおよびＷｕ，１９９３，前記）。
【０２０１】
媒介物を標的とする受容体媒介遺伝子は、一般的に２つの成分、すなわち細胞受容体特異的リガンドおよびＤＮＡ結合剤を構成する。
いくつかのリガンドが受容体媒介遺伝子トランスファーに用いられている。
最も広く特徴付けられているリガンドは、アシアロオロソムコイド（ＡＳＯＲ）（ＷｕおよびＷｕ，１９８７，前記）およびトランスフェリン（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，８７（９）：３４１０−３４１４，１９９０）である。
最近、ＡＳＯＲと同じ受容体を認識する合成新糖タンパク質が、遺伝子送達媒体として用いられており（Ｆｅｒｋｏｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ　Ｊ．，７：１０８１−１０９１，１９９３；Ｐｅｒａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．，ＵＳＡ９１：４０８６−４０９０，１９９４）、上皮成長因子（ＥＧＦ）も扁平上皮腫瘍細胞へ遺伝子を送達するために用いられた（Ｍｙｅｒｓ，　ＥＰＯ ０２７３０８５）。
【０２０２】
他の実施形態では、送達媒体はリガンドおよびリポソームを含むとよい。
例えば、Ｎｉｃｏｌａｕら（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６，１９８７）はラクトシルセラミド、ガラクトース末端アシアルガングリオシドをリポソームへ取り込み、肝細胞によりインシュリン遺伝子の取り込みにおける増大を観察した。
このように、治療的遺伝子をコードする核酸をリポソームを用いてまたは用いずにいくつかの受容体リガンドシステムにより特別な細胞型へ特異的に送達してもよい。
【０２０３】
本発明の別の実施形態では、発現構築物は単に裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドから構成される。
構築物のトランスファーは、物理的にまたは化学的に細胞膜を浸透させる前記方法のいずれかにより実施するとよい。
これはｉｎ ｖｉｔｒｏでのトランスファーについて特に適用しうるが、ｉｎ ｖｉｖｏ使用についても同様に適用するとよい。
Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，８１：７５２９−７５３３，１９８４）は、ＣａＰＯ４沈殿の形態のポリオマウイルスＤＮＡを急性ウイルス複製および急性感染を実証した大人および生まれたてのマウスの肝臓および脾臓に注入した。
ＢｅｎｖｅｎｉｓｔｙおよびＮｅｓｈｉｆ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：９５５１−９５５５，１９８６）も、ＣａＰＯ４沈殿プラスミドの直接複腔内注入がトランスフェクションした遺伝子の発現に至ることを実証した。
【０２０４】
細胞に裸のＤＮＡ発現構築物をトランスファーするための本発明の別の実施形態では、粒子衝撃に関するであろう。
この方法は、ＤＮＡ被覆マイクロ噴射が細胞膜を貫通し、それらを殺すことなく細胞侵入させるほどの高速加速能力に依存する（Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２７：７０−７３，１９８７）。
小さい粒子を加速するためのいくつかの装置が開発されている。
このような装置の一つは、高電圧放電して電流をだし、次に誘因力を提供する（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ　ＵＳＡ．８７：９５６８−９５７２，１９９０）。
用いたマイクロ噴射は、タングステンまたは金粒子といった生物的内部物質から構成されている。
【０２０５】
ウイルスベクターを採用する実施形態では、好ましいポリヌクレオチドはさらに前記適切なプロモーターおよびポリアデニル化配列を含む。
さらにこれらの実施形態では、ポリヌクレオチドはさらに本発明のポリペプチドをコードする配列に動作可能に接続されたベクターポリヌクレオチド配列（例えば、アデノウイルスポリヌクレオチド配列）を含むことが容易にわかるであろう。
【０２０６】
このように１実施形態では、投与する組成物はベクターを含む、該ベクターは本発明のポリヌクレオチドを含む。
好ましい実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。
非常に好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターは複製不完全であり、すなわちアデノウイルスゲノムからの実質的なウイルス複製配列の欠失により哺乳類患者内では複製されえない。
例えば、本発明はベクターが複製不完全アデノウイルスを含む、アデノウイルスがプロモーターに動作可能に接続され、アデノウイルスポリヌクレオチド配列によりいずれかの末端にフランクされた本発明のポリヌクレオチドを含む方法を検討する。
【０２０７】
同様に、本発明はその使用が本発明の方法を実施するのを容易にするようにパッケージとされた本発明の成分または組成物を含むキットを含む。
もっとも単純な実施形態では、このようなキットは本発明の実施に用いられるような本明細書中に記載される成分または組成物を含む（例えば、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド）、密封したボトルまたは容器といった入れ物に、パッケージに張り付けたまたは入れた本発明の方法を実施するための成分または組成物の使用を記載するラベルとともにある。
好ましくは、成分または組成物は投与型単位でパッケージとされる。
別の好ましい実施形態では、本発明のキットはステント、カテーテル、血管該カラー、ポリマーフィルムなどといった本発明の方法を実施するのに有用な物的器具と共にパッケージとされたポリヌクレオチドまたはポリペプチドの両者の組成物を含む。
別の実施形態では、本発明のキットはヒドロゲルポリマーまたは微粒子ポリマーまたは患者にポリヌクレオチドまたはポリペプチドを送達するのに有用な本明細書中に記載する他の担体と共にパッケージとされた本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの両者の組成物を含む。
【０２０８】
本発明のポリペプチドは、ＶＥＧＦ受容体タンパク質発現を検出するための診断または予知アッセイにおいて有用である。
１つ以上のＶＥＧＦ受容体に結合する本発明のポリペプチドを用いて、例えば医学的イメージ、検出、スクリーニングまたは標的治療といった目的に試料内の特異的受容体タンパク質の存在を検出および測定するとよい。
酵素標識またはビオチン／アビジン系の標識を含む、放射活性または非放射活性標識といった検出可能な標識を用いて、本発明のポリペプチドにタグするとよい。
またポリペプチドをイメージのための適切なスーパー磁気性、パラ磁気性、電気密度、環境遺伝的または放射活性の剤に共有してまたは共有せずに結合させてもよい。
【０２０９】
また、本発明は、正常なコントロール組織試料に比べてタンパク質の過剰発現が、例えば、異常な細胞成長または分化といった疾患または疾患に対する疑いの存在を検出するので、種々の組織内のＶＥＧＦ受容体タンパク質のレベル変化を検出するための診断アッセイにも関する。
本発明のポリペプチドは、結合アッセイにおける活性受容体またはリガンドの存在について生検材料をアッセイすることまたは本発明の検出可能な標識ポリペプチドを用いたキットにより、将来の転移リスクを定量するために用いることができる。
【０２１０】
本発明に関連する観点は、例えば内皮細胞といった特異的細胞を検出する方法である。
これらの細胞はｉｎ ｖｉｖｏでまたはｅｘ ｖｉｖｏで生物組織試料に見い出されるであろう。
検出方法は、例えば内皮細胞を含む生物組織を、ハイブリッドポリペプチドが細胞に結合する条件下、ＶＥＧＦＲに結合することができる本発明によるハイブリッドポリペプチドと接触させる工程、任意に生物組織を洗浄する工程、および生物組織内で細胞に結合したハイブリッドポリペプチドを検出する工程、これにより細胞を検出する工程を含む。
本発明の特定のポリペプチドが１つ以上のＶＥＧＦＲを発現する細胞を検出および／またはイメージするのに有用となり、他のポリペプチドは特別なＶＥＧＦＲを特異的に発現する細胞をイメージするのに有用となることは明らかであろう。
【０２１１】
また本発明は、特異的ＶＥＧＦＲを発現する細胞を含む疑いのある脊椎動物組織をイメージする方法であって、（ａ） 脊椎動物組織を特別なＶＥＧＦＲに特異的に結合する本発明のポリペプチドを含む組成物と接触させる工程、および（ｂ） 組織に結合したＶＥＧＦＲ結合ポリペプチドを検出することにより組織をイメージする工程を含む方法を目的とする。
好ましくは、組織はヒト組織であり、かつ方法はさらに接触工程後でイメージ工程前に、組織から組織内でＶＥＧＦＲに結合していないポリペプチドを除去する条件下、組織を洗浄する工程を含む。
【０２１２】
関連する変型では、本発明は脊椎動物体から組織の腫瘍をイメージする方法であって、該方法は（ａ） 腫瘍を含む疑いのある脊椎動物組織をＶＥＧＦＲ結合化合物を含む組成物と接触させる工程、および（ｂ） 該組織内の細胞に結合したＶＥＧＦＲ結合化合物を検出する工程、および（ｃ） ＶＥＧＦＲ結合化合物により結合した血管内皮細胞を特定することにより固体腫瘍をイメージする工程を含む、該ＶＥＧＦＲを発現している血管が組織内の腫瘍の存在および位置と関連する方法を提供する。
【０２１３】
また本発明は、特別な組織および細胞型についての特異的なマーカーとしてＶＥＧＦＲ受容体に結合する本発明のハイブリッドポリペプチドの使用を目的とする。
【０２１４】
例えば、ＶＥＧＦＲ−３を特異的に結合する本発明のこれらのポリペプチドは、リンパ内皮細胞のためのマーカーとして働くことができる。
【０２１５】
同様に、本発明のポリペプチドは単離した細胞または細胞系の成長をモジュレートする能力についてスクリーニングしてもよい。
例えば、特定の新生疾患状態は細胞表面上のＶＥＧＦＲ受容体の出現により特徴付けられる［Ｖａｌｔｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈ１５４：１３８１−９０（１９９９）］。
本発明のポリペプチドを、新生細胞の成長をモジュレートするポリペプチドの能力を決定するためにスクリーニングしてもよい。
他の疾患状態が、ＶＥＧＦ受容体における突然変異により特徴付けられることもありうる［Ｆｅｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ　Ｍｏｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ７：２０７３−７８（１９９８）］。
天然に生じる動脈内皮成長因子とは異なるようにＶＥＧＦ受容体の変異型の活性をモジュレートする本発明のポリペプチドは、このような疾患状態の症状および重篤性をモジュレートするにも有用であろう。
【０２１６】
Ｉｎ ｖｉｖｏイメージまたは組織生検は、特定の新生細胞が受容体の特別な組み合わせを発現することを表し、これにより発現した受容体セットを結合し、リガンド媒介成長を阻害する本発明のポリペプチドについての指示を提供する。
【０２１７】
このような診断的イメージの使用は、特に例えば腫瘍塊または腫瘍塊付近の新血管形成の像を得ることにおいて特に適切である。
本発明のペプチドを、参考文献により本明細書中に取り込まれる米国特許第６，１０７，０４６号に開示される抗体に基づく方法に類似の方法でのイメージに採用してもよいことが検討される。
【０２１８】
多くの適切なイメージ剤が当該技術分野で知られ、本発明のペプチドに標識剤を付着する方法と同様である（例えば、参考文献により本明細書中に取り込まれている米国特許第４，９６５，３９２号、米国特許第４，４７２，５０９号、米国特許第，５，０２１，２３６号および米国特許第５，０３７，６３０号を参照のこと）。
標識したペプチドを薬学的に許容しうる担体において患者に投与し、ＶＥＧＦＲ−３受容体を有する標的部位で蓄積させる。
次に、このペプチドイメージ剤は、標的部位のＸ線、磁気共鳴、超音波またはシンチグラフィーイメージのためのコントラスト剤として働く。
本発明のペプチドは、癌および他のＶＥＧＦＲ−３関連疾患の臨床的調査のための入手可能な医学的イメージツールの保有に加えて、便利かつ重要である。
【０２１９】
本発明のイメージ剤において有用なパラ磁気的イオンとしては、例えば、クロム（ＩＩＩ）、マンガン（ＩＩ）、鉄（ＩＩＩ）、鉄（ＩＩ）、コバルト（ＩＩ）、ニッケル（ＩＩ）、銅（ＩＩ）、ネオジウム（ＩＩＩ）、サマリウム（ＩＩＩ）、イッテルビウム（ＩＩＩ）、ガドリニウム（ＩＩＩ）、バナジウム（ＩＩ）、テルビウム（ＩＩＩ）、ジスプロシウム（ＩＩＩ）、ホルミウム（ＩＩＩ）およびエルビウム（ＩＩＩ）が挙げられる。
Ｘ線イメージについて有用なイオンとしては、ランタニューム（ＩＩＩ）、金（ＩＩＩ）、鉛（ＩＩ）および特別なビスマス（ＩＩＩ）が挙げられるが、これらに限定されない。
臨床適用のための放射性アイソトープとしては、例えば、２１１アスタチン、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、６７銅、１５２Ｅｕ、６７ガリウム、３水素、１２３ヨウ素、１１１インジウム、５９鉄、３２リン、１３レニウム、７５セレニウム、３５硫黄、９９ｍテクニシウムおよび９０イットリウムが挙げられる。
【０２２０】
本発明のペプチドを、当該技術分野の通常の知識を有する者によく知られる技術に従って標識してもよい。
例えば、ペプチドをヨウ化ナトリウムまたはカリウムおよび塩酸ナトリウムといった化学的酸化剤またはラクトペルオキシダーゼといった酵素性酸化剤と接触させることによりヨウ化することができる。
ペプチドを、例えばスズ溶液を用いて過テクネチウム酸塩を還元し、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム上に還元したテクネチウムをキレートし、かつカラムにペプチドをのせることにより、リガンド交換によるテクネチウム−９９ｍで標識してもよい。
タンパク質およびペプチドを標識するこれらのおよび他の技術は、当該技術分野の通常の知識を有する者にはよく知られる。
【０２２１】
新形成障害のための組合せ治療における本発明のポリペプチドの使用
ＤＮＡ損傷剤に対する腫瘍細胞抵抗性は、臨床的腫瘍学における主要な問題を表す。
現在の癌研究の１つの目標は、化学的および放射線治療の効率を改良する道を見出すことにある。
前記したごとく、本発明のペプチドは、化学的−または放射線治療的介入、免疫治療と組み合わせて、または他の抗−血管形成／抗−リンパ管形成治療と組合せて投与することができる。
【０２２２】
本発明の方法および組成物を用い、細胞を殺し、細胞増殖を阻害し、転移を阻害し、血管形成を阻害し、または組合せ治療を介して腫瘍細胞の悪性表現型を逆行または低下させるには、一般に、「標的］細胞または組織（例えば、腫瘍および／またはその血管系）と（ペプチド組成物として、または該ペプチドを発現する発現構築体としての）本発明の治療ペプチドおよび少なくとも１つの他の剤とを接触させ、該他の剤は所望により、本発明のペプチドとコンジュゲートさせる。
これらの組成物は、癌細胞および／または癌細胞を供給しそれを働かさせる血管およびリンパ系管の内皮細胞の増殖を殺傷および／または阻害することによって、癌を殺しまたはその増殖を阻害するのに有効な組合せ量で供されるであろう。
このプロセスは、細胞を、同時にペプチドまたは発現構築体および剤または因子と接触させることを含むことができる。
これは、細胞を、双方の剤を含む単一組成物または薬理学的処方と接触させるか、あるいは、同時に、細胞を２つの区別される組成物または処方と接触させることによって達成することができ、ここに、１つの組成物は、ペプチドまたは発現構築体および第２の剤を含む他のものを含む。
【０２２３】
別法として、本発明のペプチドを使用する治療的処置は、数分乃至数週間の範囲の間隔だけ他の剤の治療より先行するかそれに続くことができる。
他の剤および発現構築体を別々に投与する具体例において、一般に、有意な期間が各送達の時点の間に消滅しないことを保証し、従って、剤およびペプチド−ベースの治療在は、依然として、有利には組合せ効果を発揮させることができるであろう。
【０２２４】
そのような例において、相互から約１２〜２４時間内に、より好ましくは相互から約６〜１２時間内に双方の様式を投与することが考えらえ、ただ１２時間の遅延時間が最も好ましい。
いくつかの状況では、治療用の期間をかなり延長するのが望ましいが、数日（２、３、４、５、６または７）乃至数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）が各投与の間に経過する。
一方のまたは双方の剤での反復された治療が具体的には考えられる。
特別の具体例においては、抗癌治療を送達することができ、これは、癌細胞を殺し、阻害しまたは壊死させるように癌細胞に直接的に攻撃し、加えて、本発明のペプチドに基づく治療組成物を、抗血管形成および／または抗−リンパ管形成効果を有するのに有効な量にて個体に投与される。
他の抗癌剤の前に、あるいは事実、所望により他の剤とコンジュゲートさせた、他の抗癌剤と同時に、ペプチド組成物は、他の抗癌剤に続いて投与することができる。
【０２２５】
組合せ治療で用いるのに適した剤または因子は、細胞に適用された場合にＤＮＡ損傷を誘導するいずれの化学化合物または治療方法でもある。
そのような剤および因子は、γ−照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子エミッションなどを誘導する放射線および波を含む。
「化学療法剤」とも記載される種々の化学化合物はＤＮＡ損傷を誘導するように機能し、その全ては、本明細書中に開示する組合せ治療方法で用いられることを意図している。
用いることが考えらえる化学療法在は、例えば、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）および過酸化水素さえ含む。
また、本発明は、放射線−ベースのまたは現実の化合物であるかを問わず、シスプラチンとＸ線の使用、またはシスプラチンとエトポシドの使用のごとき、１つ以上のＤＮＡ損傷剤の組合せの使用を含む。
【０２２６】
本発明による癌の治療においては、腫瘍細胞および／または腫瘍欠陥の内皮細胞を、本発明の１つ以上のペプチドを含む治療剤に加えて、剤と接触させる。
これは、局所的腫瘍部位を、Ｘ線、ＵＶ光、ガンマ線またはマイクロ波のごとき放射線を照射することによって達成することができる。
別法として、対象に、アドリアアイシン、５−フルオロウラシル、エトポシド、カンポトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣまたはシスプラチンのごとき化合物を含む医薬組成物の治療的に有効な量を投与することによって、腫瘍細胞を剤と接触させることができる。
キナーゼ阻害剤もまた、本発明のペプチドとの組合せ治療で有用であると考えられる。
剤は、それを前記したごとき本発明のキメラペプチドと組み合わせることによって、組合せ治療組成物またはキットとして調製し、使用することができる。
【０２２７】
核酸、特別にはＤＮＡを直接架橋させる剤は、ＤＮＡ損傷を促進すると考えられ、キメラペプチド−ベースの治療との相乗的な抗新形成組合せに導く。
シスプラチンおよび他のＤＮＡアルキル化剤のごとき剤を用いることができる。
シスプラチンは、３コースの全体の間、３週間毎に５日間、２０ｍｇ／ｍ２の臨床的適用で用いる効果的な用量にて、癌を治療するのに広く用いられてきた。
シスプラチンは経口では吸収されず、従って、静脈内、皮下、筋肉内または腹腔内注射を介して送達されなければならない。
【０２２８】
また、ＤＮＡを損傷する剤は、ＤＮＡ複製、有糸分裂および染色体分離と干渉する化合物も含む。
そのような化学療法化合物はドキソルビシンとしても知られているアドリアマイシン、エトポシド、ベラパミル、ポドフィロトキシン等を含む。
【０２２９】
新形成の治療のための臨床的設定で広く使用され、これらの化合物は、アドリアマインシでは２１日間隔で２５〜７５ｍｇ／ｍ２の範囲の用量にての静脈内ボーラス注射を介して、エトポシドでは３５〜５０ｍｇ／ｍ２の範囲の用量にて静脈内または静脈内用量の２倍にて経口的に投与される。
【０２３０】
また、核酸前駆体およびサブユニットの合成および忠実度を破壊する剤はＤＮＡ損傷に導く。
多数の核酸前駆体それ自体が開発されてきた。
特に有用なのは、広いテストを受けた剤であり、容易に入手できる。
それ自体、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）のごとき剤は、新形成組織によって優先的に使用され、この剤を、新形成細胞に対して標的化するのに特に有用にする。
かなり毒性ではあるが、５−ＦＵは、局所を含めて、広い範囲の担体中にて適用可能であるが、３乃至１５ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量での静脈内投与が通常は使用される。
【０２３１】
以下の例は、化学療法剤およびかかる剤の投与によって管理されることが示されてきた癌のリストである。
これらの化学治療剤と本発明のペプチドの組合せは、種々の新形成障害の緩和で有用であることが証明できる。
これらの化合物の例は（ドキソルビシンとしても知られている）アドリアマインシ、（エトポシドとしても知られている）ＶＰ−１６等、（ＤＮＡにインターカレートし、ＤＮＡ指向性ＲＮＡポリメラーゼをブロックし、ＤＮＡ合成を疎外する）ダウノルビシンを含み；（ムタマイシンおよび／またはマイトマイシン−Ｃとしても知られている）マイトマイシンは、抗腫瘍活性を有することが知られているＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｅｓｐｉｔｏｓｕｓのブロスから単離された抗生物質であり；アクチノマイシンＤもまた、本発明のペプチドと組み合わせて使用される有用な薬物であろう。
なぜならば、全身治療に応答しない腫瘍は、時々、放射性治療を増強することが知られているダクチノマイシンでの局所的灌流に応答するからである。
また、それは、一次的外科処置、放射線治療、および他の薬物、特にビンクリスチンおよびシクロホスファミドと組み合わせて用いられ、エーウィン腫瘍、カポシ肉腫、および軟組織肉腫、絨毛癌、転移性精巣癌腫、保持筋病および非−保持筋リンパ腫に対して効果的であることが判明している。
【０２３２】
ブレオマイシンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓの株から単離された細胞毒性糖ペプチド抗生物質の混合物であり、単一剤として、または当部および首（口、舌、扁桃、鼻咽頭、洞、口蓋、唇、頬粘膜、歯肉、喉頭蓋、口蓋を含む）、皮膚、ペニス、頸部、および外陰部のごとき鱗状細胞癌腫における他の認可された化学療法剤との証明された組合せにおいて、前記新形成の管理で効果的である。
また、それはリンパ腫および精巣癌腫の治療でも用いられてきた。
【０２３３】
シスプラチンは、転移性精巣または卵巣癌腫、進行した膀胱癌、頭部または首部癌、頸癌、肺癌または他の腫瘍のごとき癌を治療するのに広く用いられており、本発明のペプチドとの有用な組合せであろうＶＰ１６（エトポシド）は、ブレオマイシンおよびシスプラチンとの組合せにて、および肺の小細胞癌腫のためにシスプラチンとの組合せにて、精巣腫瘍の治療で主として用いられる。
また、それは、非−保持筋リンパ腫、急性非リンパ系白血病、乳房の癌腫、および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）と関連したカポシ肉腫に対しても活性である。
いくつかの種類の癌細胞を殺し、サイトカインの生産を活性化し、マクロファージおよび肺非細胞を活性化し、コラーゲンおよびコラゲナーゼの生産を促進する腫瘍壊死因子［ＴＮＦ；カシャクチン］糖タンパク質は炎症メディエーターであり、また、敗血症ショックのメディエーターであり、かつ異化、発熱および睡眠を促進する。
【０２３４】
ＴＮＦは効果的な用量にて単独で用いた場合かなり毒性であり得、従って最適な療法は、おそらくは、それを他の薬物と組み合わせて低用量で用いる。
その免疫抑制作用はγ−インターフェロンによって増強され、従って、組合せは潜在的には危険である。
ＴＮＦおよびインターフェロンαのハイブリッドは、抗癌活性を保有することが判明している。
【０２３５】
タキソール、アッシュツリー、Ｔａｘｕｓ ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａの皮から元来単離された抗有糸分裂剤、およびその誘導体のパクリタキソールは乳癌に対して有用であることが判明しており、本発明の組合せ療法で用いることができる。
【０２３６】
ビンクリスチンに対する有利な応答は、種々の他の新形成、特にウイルムズ腫瘍、神経芽腫、脳腫瘍、横紋筋肉腫、および乳房、膀胱および男性および女性生殖系の癌腫を持つ患者で報告されている。
ビンブラスチンもまたビンクリスチンと同一の癌で有用な治療剤として示されている。
ビンブラスチンの最も頻繁な臨床的腫瘍は、転移性精巣腫瘍の治療的処置においてブレオマイシンおよびシスプラチンと共に用いるものである。
それは、カポシ肉腫、神経芽細胞腫およびＬｅｔｔｅｒｅｒ−Ｓｉｗｅ病（組織球増殖症Ｘ）、ならびに乳房の癌腫および婦人における絨毛腫において活性である。
【０２３７】
アルケラン、Ｌ−フェニルアラニンマスタード、フェニルアラニンマスタード、Ｌ−ＰＡＭまたはＬ−サルコリシンとしても知られているメルファラニンは窒素マスタードのフェニルアラニン誘導体である。
メルファラニンは、選択的ヒト新形成病気に対して活性な二官能性アルキル化剤である。
メルファランは、ある種の動物腫瘍に対して活性が低く、染色体に対する効果を生じるのに必要な用量はＬ−異性体で必要なものよりも大きい、メドファランとしても知られているＤ−異性体の活性なＬ−異性体である。
メドファランは経口投与に適した形態で入手でき、多発性骨髄腫を治療するのに用いられてきた。
入手できる証拠は、多発性骨髄腫を持つ患者のほぼ１／３乃至１／２が薬物の経口投与に対して好都合な応答を示すことを示唆する。
メドファランは、上皮卵巣癌腫の治療で用いられてきた。
【０２３８】
シクロホスファミドは胃腸間で安定であり、よく許容されており、経口および非経口経路によって効果的であり、局所的な小胞形成、壊死、静脈炎または苦痛でさえ引きおこさない。
クロラムブシルは、選択されたヒト新形成病に対して活性であることが判明している窒素マスタードタイプの二官能性アルキル化剤である。
クロラムブシルは、慢性リンパ系（リンパ球）白血病、リンパ肉腫を含めた悪性リンパ腫、巨大濾胞性リンパ腫および保持菌病の治療において示されている。
それは、これらの障害のいずれにおいても治療できではないが、臨床的に有用な緩和を生じ得る。
【０２３９】
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く用いられてきた他の因子は、ガンマ線、Ｘ線および／または腫瘍細胞に対する放射性同位体の指向された送達として通常知られているものを含む。
マイクロ波およびＵＶ照射のごとき、ＤＮＡ損傷因子の他の形態も考えられる。
これらの因子の全ては、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復および染色体の組み立ておよび維持に対して広い範囲の損傷ＤＮＡを行うようである。
Ｘ−線についての用量範囲は、延長された期間（３乃至４週間）についての５０乃至２００レントゲンの日用量乃至２０００乃至６０００レントゲンの単一用量の範囲である。
放射性同位体についての用量範囲は広く変化し、同位体の半減期、照射された放射線の強度およびタイプ、新形成細胞による摂取に依存する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１５版、第３３章、特に６２４〜６５２頁参照）。
用量におけるいくつかの変形は、治療すべき対象の状態に依存して必然的に起こるであろう。
投与を担うヒトは、いずれにせよ、ここの対象についての適切な用量を決定するであろう。
さらに、人投与では、製剤は、ＦＤＡのＯｆｆｉｃｉａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ標準によって要求される滅菌性、発熱原性、一般的安全性および純度の標準に適合すべきである。
【０２４０】
キメラペプチドーベースの療法と化学−および放射線療法との組合せに加えて、遺伝子治療との組み合わせが有利であることも考えられる。
例えば、キメラペプチド−ベースの療法およびｐ５３またはｐ１６突然変異の同時の標的化は改良された抗癌治療を生じるであろう。
ｐ２１、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＢＣＲＡ２、ｐ１６、ＦＨＩＴ、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ｒａｓ、ｍｉｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｓｒｃ、ｆｉｎｓ、ｊｕｎ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ｂｃｌおよびａｂｌのごとき、いずれの他の腫瘍−関連遺伝子も、概念的には、このように標的化できる。
【０２４１】
前記した抗癌治療剤に加えて、本発明のペプチドは他の欠陥形成疎外剤と組み合わせることができると考えられる。
本発明のペプチドは、抗−リンパ管形成および抗−血管形成特性を共に有すると予測される。
多くの抗−血管形成薬物は抗−リンパ管形成特性も有するであろう。
ｈｔｔｐ：／／ｃａｎｃｅｒｔｒｉａｌｓ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｅｗｓ／ａｎｇｉｏは、抗−血管形成剤で現在行われている試験についての現在の情報を提供するＮａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈによって維持されているウエブサイトである。
これらの剤は、例えば、マリマスタット（Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ａｎｎａｐｏｌｉｓ　ＭＤ；非−小細胞肺、小細胞肺および乳癌で示されている）；ＡＧ３３４０（Ａｇｏｕｒｏｎ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ；神経膠芽細胞腫多形について）；ＣＯＬ−３（Ｃｏｌｌａｇｅｎｎｘ，Ｎｅｗｔｏｗｎ　ＰＡ；脳腫瘍について）、ネオバスタット（Ｎｅｏｖａｓｔａｔ）（Ａｅｔｅｍａ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ　；腎臓および非−小細胞肺癌）；ＢＭＳ−２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　Ｓｑｕｉｂｂ，Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄ　ＣＴ；転移性非−小細胞肺癌）；タリドマイド（Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）（Ｃｅｌｇｅｎ；メラノーマ、頭部および首癌、卵巣、転移性前立腺、およびカポシ肉腫；再発性または転移性結直腸癌（アジュバントと共に）；婦人科学肉腫、肝臓癌、多発性骨髄腫；ＣＬＬ、再発性または進行性脳癌、多発性骨髄腫、非−小細胞肺、非転移性前立腺、難治性多発性骨髄腫、および腎臓癌について）；スクアラミン（Ｓｑｕａｌａｍｉｎｅ）（Ｍａｇａｉｍｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　Ｐｌｙｍｏｕｔｈ　Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ；非−小細胞癌および卵巣癌について）；エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｉｎ）（ＥｎｔｅｒＭＥｄ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ；固体腫瘍について）；ＳＵ５４１６（Ｓｕｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；再発性頭部および首、進行した固体腫瘍、ＩＩＩｂまたはＩＶ工程の乳癌；再発性または進行性脳（小児科）；卵巣、ＡＭＬ；神経膠腫、進行した悪性腫瘍、進行した結直腸、ｖｏｎ−Ｈｉｐｐｅｌ　Ｌｉｍｄａｕ病、進行した軟組織；前立腺癌、結直腸癌、転移性メラノーマ、多発性骨髄腫、悪性中皮腫；転移性腎臓、進行したまたは再発性頭部および首、転移性結直腸癌について）；ＳＵ６６６８（Ｓｕｇｅｎ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，　ＣＡ；進行した腫瘍について）；インターフェロン−α；抗−ＶＥＧＦ抗体（ＮＡｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，　Ｂｅｔｈｅｓｄａ　ＭＤ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，　ＣＡ；難治性個体腫瘍；転移性腎臓細胞癌、未処理の進行した結直腸について）（ＥＭＤ１２１９７４（Ｍｅｒｃｋ　ＫＣｇａＡ，Ｄａｍｓｔａｄｔ，　Ｇｅｒｍａｎｙ；ＨＩＶ関連カポシ肉腫、進行性または再発性退生神経膠腫について）；インターロイキン１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，　ＭＡ；カポシ肉腫について）およびＩＭ８６２（Ｇｙｔｒａｎ，Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＷＡ；卵巣癌、結腸および直腸起源の未処理転移性癌およびカポシ肉腫について）を含む。
該剤の後のかっこにいれた情報は、該剤がこれらの試験で持ちいられつつある癌を示す。
これらの障害のいずれも本発明のペプチド単独で、またはリストした剤と組み合わせて治療することができると考えられる。
【０２４２】
【実施例】
本発明のさらなる特徴は以下の実施例から明らかであろう。
【０２４３】
実施例１
ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃハイブリッド分子の構築
ＶＥＧＦファミリーメンバーの受容体結合ドメインのアミノ酸残基は共有された保存モチーフであるが、これらのタンパク質は異なる受容体特異性を呈する。
以下の実験では、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃいずれかの受容体結合ドメインの異なる部分を含有するポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を、ユニークな構造および機能的特徴を持つ新規なハイブリッド分子を創製するためのコンビナトリアルアプローチを用いて構築した。
【０２４４】
新規な分子を創製するために、ＶＥＧＦ−Ａおよび成熟ＶＥＧＦ−Ｃのヌクレオチド配列を分析して、合成でき、容易に組換えることができる短いＤＮＡ断片を設計するのに適するであろうヌクレオチド同一性の局所化領域を決定した。
同一性の８つの対応する領域を、（９つの断片への）断片化およびキメラ（ハイブリッド）分子への組換えのための部位として各々の分子において選択した。
これらの断片化部位はヌクレオチド配列に基づいて選択し、これは、得られた断片はＶＥＧＦ−Ａの結晶構造に基づく構造エレメント（例えば、アルファラセン、ループ等）に対応するからである（図１参照）。
【０２４５】
ＶＥＧＦ−Ａの断片化
（配列番号：１のヌクレオチド１５６乃至４６１に対応し、配列番号：２のアミノ酸残基３４乃至１３５をコードする）ＶＥＧＦ−Ａの受容体結合ドメインコーディング領域を含む９つのＤＮＡ断片を形成する目的で、ＶＥＧＦ１２１についてのコーディング配列に基づき、合成ヌクレオチドの９つの対を設計した。
各オリゴヌクレオチド対は、コーディング配列を含む順方向プライマーおよび該順方向プライマーの１部に相補的なヌクレオチド配列を持つ逆方向プライマーよりなって、プライマーを相互に対してアニーリングして二本鎖ＤＮＡ断片とするのを可能とする。
各対の順方向または逆方向プライマーのいずれも、その対となったプライマーのいずれかの配列に相補的でない短い５’および３’ヌクレオチド配列も含む。
これらの短いさらなる配列は、前記したヌクレオチド同一性の局所化領域に対応する。
プライマー対のアニーリングに続き、このさらなる配列は、後記にて非常に詳細に記載するごとく、他の二本鎖のアニールしたプライマー対とのアニーリングと適合する一本鎖突出を形成した。
ＶＥＧＦ−Ａ順方向および逆方向プライマーからのヌクレオチド配列は、各々、表１Ａおよび１Ｂに記載されている。
【０２４６】
【表４Ａ】
2004507208.tif 000005
【０２４７】
順方向プライマーＡ１−Ｄ乃至Ａ９−Ｆのヌクレオチド配列は、各々、配列番号：３〜１１に記載されている。
リストしたプライマーの各々について、頂部ストランドは、ＤＮＡ配列を示し、底部ストランドは特定のプライマーによってコードされたアミノ酸を示す。
いくつかの例において、与えられたコドンの２つのヌクレオチドのみが１つのプライマーに含まれ、コドンの残りのヌクレオチドは先行または後行プライマーに含まれる。
これらの例において、アミノ酸は、その特定のコドンの３つのうち２つを含むプライマー下にリストされる。
太文字部分は、タンパク質リンカー領域を構成し、親ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃ分子の１部ではないアミノ酸をコードするヌクレオチドを示し；下線を施したヌクレオチドは、断片のハイブリッド構築体への組み立ての間に除去されるものであり；ロワーケースの文字は、オリゴヌクレオチド対が相互にアニールされて９つの断片を生じる場合に突出を生じるヌクレオチドである。
【０２４８】
【表４Ｂ】
2004507208.tif 000006
【０２４９】
逆方向プライマーＡ１−Ｒ乃至Ａ９−Ｒのヌクレオチド配列は、各々、配列番号：１２〜２０に記載される。
太文字、下線を施した小文字は表１Ａに記載されたごとく用いる。
【０２５０】
９つのＶＥＧＦ−Ａポリヌクレオチド断片は、合成オリゴヌクレオチドプライマーのマッチした対をアニールすることによって組み立てた。
例えば、断片Ａ１は、プライマーＡ１−ＦをプライマーＡ１−Ｒとアニールすることによって創製し、断片Ａ２は、Ａ２−ＦとＡ２−Ｒとをアニールすることによって創製し、等など。
【０２５１】
アニーリングは、２ピコモル／μｌの各適当なプライマー、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．４を９５℃にて５分間インキュベートし、続いて溶液を１℃／分の速度で３７℃まで冷却することによって達成した。
表１Ａに示すごとく、断片Ａ１は配列番号：２のアミノ酸残基３４乃至４２、およびアミノ酸４３の部分をコードし；断片Ａ２は配列番号：２のアミノ酸４３の部分、およびアミノ酸４４〜５３をコードし；断片Ａ３は配列番号：２のアミノ酸５４乃至６３、およびアミノ酸６４をコードし；断片Ａ４は配列番号：２のアミノ酸６４の部分、アミノ酸６５乃至７１、およびアミノ酸７２の部分をコードし；断片Ａ５は配列番号：２のアミノ酸７２の部分、アミノ酸７３乃至８３、および８４の部分をコードし；断片Ａ６は配列番号：２のアミノ酸８４の部分、アミノ酸８５乃至９２、およびアミノ酸９３の部分をコードし；断片Ａ７は配列番号：２のアミノ酸９３の部分、アミノ酸９４乃至１０７、およびアミノ酸１０８の部分をコードし；断片Ａ８は配列番号：２のアミノ酸１０８、およびアミノ酸１０９乃至１２２をコードし；および断片Ａ９は配列番号：２のアミノ酸１２３乃至１３５をコードする。
【０２５２】
ＶＥＧＦ−Ｃの断片化
同様にして、（配列番号：２２のアミノ酸残基１１２乃至２１６をコードする配列番号：２１のヌクレオチド６５８乃至９９９に対応する）ＶＥＧＦ−Ｃの受容体結合ドメインのアミノ酸配列の基づき、オリゴヌクレオチドの９つの対を設計し、合成した。
９つの順方向プライマーおよび９つの逆方向プライマーのヌクレオチド配列を、各々、表２Ａ（配列番号：２３〜３１）および表２Ｂ（配列番号：３２〜４０）に記載される。
【０２５３】
【表５Ａ】
2004507208.tif 000007
【０２５４】
【表５Ｂ】
2004507208.tif 000008
【０２５５】
太文字、下線を施したおよび小文字は表１Ａに記載したごとく表２Ａおよび２Ｂで用いる。
【０２５６】
ＶＥＧＦ−Ａについて前記したごとく、プライマー対をアニールして、一緒にＶＥＧＦ−Ｃの受容体結合ドメインをコードし、かつ他の断片へのアニーリングのための適当な一本鎖突出を保有する９つの二本鎖ＤＮＡ断片を形成した。
【０２５７】
断片Ｃ１は配列番号：２２のアミノ酸残基１１２乃至１２０、およびアミノ酸１２１の部分をコードし；断片Ｃ２は配列番号：２２のアミノ酸１２１の部分およびアミノ酸１２２乃至１３２をコードし；断片Ｃ３は配列番号：２２のアミノ酸１３３乃至１４２、およびアミノ酸１４３の部分をコードし；断片Ｃ４は配列番号：２２のアミノ酸１４３の部分、アミノ酸１４４乃至１５０、およびアミノ酸１５１の部分をコードし；断片Ｃ５は配列番号：２２のアミノ酸１５１の部分、アミノ酸１５２乃至１６２、およびアミノ酸１６３の部分をコードし；断片Ｃ６は配列番号：２２のアミノ酸１６３の部分、アミノ酸１６４乃至１７１、およびアミノ酸１７２の部分をコードし；断片Ｃ７は配列番号：２２のアミノ酸１７２の部分、アミノ酸１７３乃至１８６、およびアミノ酸１８７の部分をコードし；断片Ｃ８は配列番号：２２のアミノ酸１８７の部分、アミノ酸１８８乃至２０３をコードし；および断片Ｃ９は配列番号：２２のアミノ酸２０４乃至２１６をコードする。
【０２５８】
ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃの断片の合成に対する考察
かくして、ＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸配列から設計したプライマーの９つの対およびＶＥＧＦ−Ｃのアミノ酸配列から設計したプライマーの９つの対を合成し、それをアニールすることによって、１８のＤＮＡ断片を創製した。
図２は、９つのＶＥＧＦ−Ａおよび９つのＶＥＧＦ−ＣのＤＮＡ断片の構築を示す模式的ダイアグラムである。
オリゴヌクレオチドを設計して、アニーリングに際してユニークな粘着末端を含む二本鎖ＤＮＡ断片を生じさせた。
９つのＶＥＧＦ−ＡのＤＮＡ断片を連結すると、ＶＥＧＦ−Ａのアミノ酸３４−１３５をコードする単一の線状二本鎖ＤＮＡを生じ（配列番号：２）、および９つのＶＥＧＦ−ＣのＤＮＡ断片を連結する結果、ＶＥＧＦ−Ｃのアミノ酸１１２−２１６をコードする単一のＤＮＡが得られる（配列番号：２２）。
【０２５９】
粘着末端の挿入は、所望の順序および向きでの断片の連結を大いに促進したが、断片の連結は粘着末端なしでも達成できることが認識されよう。
平滑末端断片を合成し、それをアニールして、前記した方法を用いてハイブリッドタンパク質を創製することもできる。
平滑末端戦略では、親分子のヌクレオチド配列は、粘着末端の創製を可能とするヌクレオチド同一性の存在につき調べる必要はない。
しかしながら、さらなる連結後スクリーニングが、所望の順序および向きで断片を含むハイブリッドを同定するのに必要であろう。
【０２６０】
合成プライマーおよび二本鎖ＤＮＡ断片についてのいくつかのさらなる詳細は強調するのに値する。
まず、ＦＧＥＦ−Ａ断片Ａ−１およびＶＥＧＦ−Ｃ断片Ｃ１では、最初の２つのコードされたアミノ酸ＡｓｐおよびＰｒｏは（作成されたＢａｍＨＩ認識部位によってコードされた）タンパク質リンカーを構成し、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃ配列いずれかに応答しないことは言及に値する。
【０２６１】
第２に、図１および２を参照し、ＶＥＧＦファミリータンパク質の受容体結合ドメイン内の区別される構造エレメントに対応するように断片の多くを設計したことは言及するのに値する。
断片２はＮ−末端ラセンに対応し；断片４はβ２に対応し；断片６はβ３−β４ループに対応し、断片７はβ５に対応し；断片８はβ５−β６ループに対応し；および断片９はβ７に対応する。
【０２６２】
第３に、オリゴヌクレオチドはヒトＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドのコードされたアミノ酸配列を保持するように設計されたという事実に拘わらず、設計された３６のオリゴヌクレオチドは、天然ヒトＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃ　ｃＤＮＡ配列（すなわち、天然に生じるヒトｍＲＮＡ配列のＤＮＡカウンターパーート）に正確には対応しない。
例えば、オリゴヌクレオチドは、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃ双方についての受容体結合ドメインをコードする天然（内因性）ヒトヌクレオチド配列が新しい制限部位を生じるように、重複が「Ａ」および「Ｃ」断片の間で望まれる場合にヌクレオチド同一性のより長いストレッチを供するように、またはヒト細胞培養における発現用のコドン用法を改良するように修飾される用に設計された。
（天然配列に重要な）全てのヌクレオチド突然変異はサイレントであった。
かくして、（アニーリング断片Ａ１−Ａ９に由来する）ＶＥＧＦ−Ａおよび（アニーリング断片Ｃ１−Ｃ９からの）ＶＥＧＦ−Ｃの受容体結合ドメインのアミノ酸配列は、各親分子のそれと同一である。
【０２６３】
第４に、図２を参照し、９つのＶＥＧＦ−Ａ断片の各々は対応するＶＥＧＦ−Ｃ断片と整列し、かつ他の分子からの隣接断片にアニールする適合粘着末端を有することは言及に値する。
例えば、断片Ａ１およびＣ１は、各々、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−−Ｃの同一相対的部分に対応し、同一の頂部ストランド粘着末端を有する。
これらの粘着末端は、Ａ１がＡ２またはＣ２いずれかにアニールでき、Ｃ１がやはりＡ２またはＣ２にアニールできるように、双方の断片Ａ２およびＣ２の底部ストランド粘着末端に正確に相補的である。
断片Ａ２およびＣ２はＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃの同一の相対的部分に対応し、各々は、断片Ａ３およびＣ３の頂部ストランド粘着末端に正確に相補的であるもう１つの底部ストランド粘着末端を保有する、等など。
かくして、９つの断片の各組は、その親ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃ分子の隣接末端にアニールするのみならず、他の分子の隣接断片にアニールするように設計された。
【０２６４】
キメラ（ハイブリッド）ＶＥＧＦ分子の組み立て
９つのＶＥＧＦ−Ａおよび９つのＶＥＧＦ−ＣのＤＮＡ断片の、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃ双方からの領域を含むハイブリッドＤＮＡへの組み立ては、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−ＣのＤＮＡ断片の異なる組合せを連結することによって達成された。
全てのＤＮＡ断片は、適当な制限酵素での消化およびＱｉａｅｘ ＩＩビーズ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いるゲル電気泳動の後に単離した。
もし断片の適当な順序（１−２−３−４−５−６−７−８−９）が保存されていれば、９つのＶＥＧＦ−Ａ断片および９つのＶＥＧＦ−Ｃ断片は組み替えることができ、５２０の区別されるハイブリッドにアニールにすることができ、その２つは天然に生じる配列（Ａ１−Ａ２−Ａ３−Ａ４−Ａ５−Ａ６−Ａ７−Ａ８−Ａ９およびＣ１−Ｃ２−Ｃ３−Ｃ４−Ｃ５−Ｃ６−Ｃ７−Ｃ８−Ｃ９）を表し、その５１は新規なハイブリッドを表すことは明らかであろう。
すべての５１２の配列は、以下の３工程プロセスを用いて再構築した。
【０２６５】
まず、図２に示すごとく、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃの受容体結合ドメインを、Ｎ１２３、Ｎ４５、Ｃ６７およびＣ８９と命名された４つのサブドメインに分割した。
Ｎ１２３はＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃ双方の受容体結合ドメインをコードする最初の３つのＤＮＡ断片よりなる。
Ｎ４５、Ｃ６７およびＣ８９は、各々、２つのＤＮＡ断片よりなり、ここに、Ｎ４５は断片４および５を含み、Ｃ６７は断片６および７よりなり、およびＣ８９は断片８および９を含む。
【０２６６】
Ｎ１２３領域に対応する連続ＤＮＡは、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃいずれかからの断片１、２および３を連結し、かくして、図３に模式的に示された８つの可能な異なるＮ１２３のＤＮＡセグメントの全てを生じさせることによって構築した。
同様に、Ｎ４５、Ｃ６７およびＣ８９領域に対応する連続ＤＮＡは、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃからの２つの適当なＤＮＡ断片を連結することによって構築された。
これらの場合において、全ての４つの可能な異なる分子が領域の各々について生じた。
【０２６７】
図４は全ての４つな可能なＮ４５のＤＮＡセグメントを示す模式的ダイアグラムであり、図５は全ての４つの可能なＣ６７のＤＮＡセグメントを示し、および図６は全ての４つの可能なＣ８９のＤＮＡセグメントを示す。
これらの分子の全てを、連結反応の１部としてｐＫＯ−Ｓｃｒａｍｂｌｅｒ−Ｖ９１２−ＢＸベクター（Ｌｅｘｉｃｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）の多重クローニング部位にクローン化した。
全ての連結は、インサートのベクターへのクローニングを可能とする適当な制限酵素で切断され、かつ脱リン酸化された８ナノモル／μｌのベクター；ベクターに挿入されるべき各々８０ナノモル／μｌのＤＮＡ断片；および５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌ ＢＳＡ、および５％ＰＥＧ−４０００、ｐＨ ７．５中の５ Ｗｅｉｓｓ単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを合わせ、続いて１６℃にて１２時間インキュベートすることによって行った。
図７Ａ−７Ｄは、断片Ａ１−Ａ９の各々によってコードされたアミノ酸配列を示し；および８つのＮ１２３構築体（図７Ａ）、４つのＮ４５構築体（図７Ｂ）、４つのＣ６７構築体（図７Ｃ）、および４つのＣ８９構築体（図７Ｄ）を形成する組換えに由来するコードされたペプチドの全ての順列を模式的に示す。
【０２６８】
第２の工程において、Ｎ１２３断片をＮ４５断片と連結し、およびＣ６７断片をＣ８９断片と連結した。
Ｎ１２３乃至Ｎ４５の連結を可能とし、かつ断片３および４の非−タンパク質コーディング領域の除去も達成した制限酵素の消化によって、Ｎ１２３およびＮ４５断片をそれらのｐＫＯ−Ｓｃｒａｍｄｌｅｒ−Ｖ９１２宿主ベクターから除去した（表１Ａ、１Ｂ、２Ａおよび２Ｂ）。
８つの異なるＮ１２３領域の各々を全ての４つの可能なＮ４５領域に連結することによって、受容体結合ドメインの３２の区別されるＮ−末端部分を得た。
これらのクローンをさらにｐＳｅｃＴａｇＩベクターに挿入した（配列番号：４１）。
ｐＳｅｃＴａｇＩベクターは、ｐＳｅｃＴａｇＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を修飾することによって構築された組合せＥ． ｃｏｌｉ／哺乳動物発現ベクターである。
ｐＳｅｃＴａｇＡを修飾して、部位特異的突然変異誘発および合成リンカーを用いて特異的制限部位を排除し、ｐＩＣＺα−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＴＲＡＣＥＲ−ＣＭＶからのＥＭ７プロモーターを、ｐＳｅｃＴａｇＡのＣＭＶプロモーターの下流に付加した。
ｐＳｅｃＴａｇＩおよびその親ベクターｐＳｅｃＴａｇＡは共に、適当な細胞系、例えば２９３Ｔ細胞を用いる哺乳動物細胞培養における高レベルの発現、安定にトランスフェクトされた哺乳動物細胞のゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）選択を可能とし、発現されたタンパク質の分泌用の哺乳動物シグナルペプチドを含み、かつ発現されたタンパク質の検出、定量および精製のためのＣ−末端ｍｙｃエピトープおよびポリヒスチジンタグを含む。
ｐＳｅｃＴａｇＩベクターは、Ｅ． ｃｏｌｉにおける発現が構成的であり、制限部位の修飾がハイブリッド構築体のクローニングを促進した点でｐＳｅｃＴａｇＡベクターとは異なる。
【０２６９】
Ｖ６７およびＣ８９断片は、やはり断片６および９の非−タンパク質コーディング領域の除去を達成した、適当は制限酵素での消化によってそれらのｐＫＯ−Ｓｃｒａｍｂｌｅｒ−Ｖ９１２宿主ベクターから除去した（表１Ａ、１Ｂ、２Ａおよび２Ｂ参照）。
４つの異なるＣ６７分子の４つの異なるＣ８９分子への連結により、受容体結合ドメインの１６の区別されるＣ＝末端半体を生じた。
これらの連結の間にＣ６７−Ｃ８９断片はｐＫＯ−Ｓｃｒａｍｂｌｅｒベクターにクローン化された。
最後に、３２の異なるＮ−末端部分および１６の区別されるＣ−末端領域を合わせる５１２最終連結の結果、その５１０がＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃ双方のアミノ酸残基よりなるハイブリッドである合計５１２の区別される分子が得られた。
この工程の間に、３２の異なるＮ−末端部分を含むｐＳｅｃＴａｇＩベクターに５１２の構築体がクローン化された。
残りの２つの分子は、受容体結合ドメインをコードする元々のＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃ配列に対応する。
【０２７０】
また、ハイブリッド分子の組み立ては、前記で概説したものよりも少ない連結工程にて達成することもできる。
例えば、Ｎ１２３、Ｎ４５、Ｃ６７およびＣ８９の連結は単一の連結反応で完了することができる。
隣接断片の粘着末端のみを持つ完全な相補体である粘着末端を持つ断片を設計することによって、単一連結反応にて正しい順番で複数断片を連結することが可能である。
【０２７１】
実施例２
ハイブリッド分子の発現
５１２の構築体の各々を２９３Ｔ細胞に別々に一過的にトランスフェクトして、異なるハイブリッド構築体を発現させた。
ダルベッコの修飾イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ）および１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）よりなる培地中での標準的なプロトコルに従い、２９３Ｔ細胞を増殖させた。
トランスフェクションに２４時間先立ち、密集皿を新鮮な培地で６つのウェルに１：１０に希釈した。
トランスフェクションに４時間先立ち、培地を交換した。
各構築体につき、リン酸カルシウム−媒介トランスフェクションについての標準的なプロトコルを用い、３μｇのＤＮＡをトランスフェクトした「Ｓａｍｂｒｏｋ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　ｐｐ．１６．３３−１６．３６（１９８９）」。
トランスフェクションの２４時間後に、細胞を暖かいＴＢＳで２回洗浄し、２ｍｌの培地を各ウェルに添加した。
【０２７２】
最初の実験を行って、トランスフェクトされた細胞が、ハイブリッドＤＮＡ分子によってコードされたハイブリッドＶＥＧＦポリペプチドを発現しているかを判断した。
かくして、トランスフェクションから４８時間後に、システインおよびメチオニンを欠くＭＥＭ、０．１％ｂｓａ、２４μＣｉ３５Ｓ−メチオニン−システイン／ｍｌ（Ｒｅｄｉｖｕｅ　ＰＲＯ−ＭＩＸ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）よりなる１．３ｍｌ／ウェルの標識培地を用い、３５Ｓ−メチオニンおよび３５Ｓ−システインでの代謝標識を開始した。
細胞上清をトランスフェクションから７２〜７８時間後に収穫し、遠心によって透明化し、４℃で保存した。
【０２７３】
撹拌しつつ、１７５μｌの試料上清を１００μｌ　ＩＰミックス（１．５％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０および１２μｌ／ｍｌ抗−ペンタヒスチジン抗体を含むＰＢＳ）と４℃にて一晩混合することによって、上清を抗−ペンタヒスチジン抗体（Ｑｉａｇｅｎ）で免疫沈殿させた（ｐＳｅｃＴａｇＩ発現ベクターを作成して、ポリヒスチジンタグを持つハイブリッドＶＥＧＦタンパク質の各々を発現させた）。
免疫沈殿したタンパク質を収集するために、ＰＢＳ中の５０μｌの３０％プロテインＡセファロース（ＰＡＳ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）スラリーを添加し、少なくとも１．５時間４℃にて撹拌下でインキュベートした。
標準緩衝液免疫沈殿試料に添加し、９５℃にて５分間沸騰させ、その間に免疫沈殿したタンパク質はプロテインＡセファロースから解離する。
遠心後、１０μｌの各試料を、還元条件下で１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。
ゲルを乾燥し、ホスホルイメージャープレート上で１２時間、またはＸ線フィルム上で４週間露出した。
これらの実験の結果を、発現につき「ＥＸＰ」の印をつけた欄にて、以下の表３に示す。
「Ｙｅｓ」を伴う表に示すごとく、ハイブリッド構築体のほとんど大部分を発現させようとする最初の試みは成功した。
弱い発現（「ｗｅａｋ」）および発現なし（「ｎｏｎｅ」）が予備実験で観察された構築体を示す。
最初の実験において発現を達成できないのは完全性のために報告し、非−生存率または他の確認された問題の結論を反映する意図のものではない。
しかしながら、非−発現構築体の内、ほとんど全てが、断片−３がＶＥＧＦ−Ａに由来し、断片７がＶＥＧＦ−Ｃに由来するキメラ分子であったことは注目に値する。
これらの２つの断片の間の物理的関係の分析は、これらの２つの断片からの残基が、ＶＥＧＦ−Ａ結晶構造から判断して原子レベルで相互にまれにしか接触しないことを示す。
ＶＥＧＦ−Ａからの断片−３およびＶＥＧＦ−Ｃからの断片７の不適合性は分子の正しくない折り畳みから起こり、おそらくは、分子が小胞体に出現する場合にＶＥＧＦ−Ｃ−由来断片７の迅速なグリコシル化によって部分的には引き起こされた。
ＶＥＧＦ−Ａ内のグリコシル化部位は受容体結合ドメインから一定の距離のところに位置し、他方、ＶＥＧＦ−Ｃ内のグリコシル化部位は、受容体の第３のドメインと接触を形成することが予測される断片３によって形成された分子の領域により近く位置する。
また、炭水化物残基はリガンドおよび受容体の間の相互作用に関与するであろう。
【０２７４】
実施例３
可溶性ＶＥＧＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質に関するハイブリッド分子の結合アッセイ
２９３Ｔ細胞で発現されたハイブリッドタンパク質（実施例２および表１参照）を、可溶性ＶＥＧＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質に結合する能力につきテストした。
全ての３つのＶＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３に対するハイブリッドタンパク質の結合を同様に分析した。
例示的な結合アッセイは、引用によりその全体を一体化させるＡｒｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９５：５４８−３３（１９９８）に記載されている。
【０２７５】
結合アッセイは、限定されるものではないが、天然で受容体を発現する、または受容体を発現するように組換え修飾されている全細胞；受容体の切形された可溶化細胞外リガンド結合ドメイン；アルカリ性ホスファターゼ（例えば、Ｃａｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１５４−６２（１９９６）に記載されたＶＥＧＦＲ−２−ＡＰ）または免疫グロブリン配列のごとき他のタンパク質に融合した受容体細胞外ドメインを含む融合；および抗体でまたは個体支持体でタンパク質を捕獲するのに有用なタグ配列（例えば、ポリヒスチジンタグ）に融合した受容体細胞外ドメインを含む融合；およびＣＮＢｒ−活性化セファロースビーズのごとき固体支持体に化学的に結合した受容体細胞外ドメインを含めた、それらの各リガンドに結合する能力を保持する天然に生じるＶＥＧＦ受容体のいずれかの形態で行うことができるのは認識されよう。
【０２７６】
本実験では、受容体結合は、免疫グロブリン定常領域鎖に融合したＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインを含む構築体を用いてアッセイした。
【０２７７】
ＶＥＧＦＲ−１の最初の３つのＩｇドメインを、シグナル−ｐＩｇＰｌｕｓベクター（Ｉｎｇｅｎｉｕｓ／Ｎｏｖａｇｅｎ／Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）からのＦｃ断片に融合させた。
【０２７８】
この構築体（ＶＥＧＦＲ−１−Ｆｃ）はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ　Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ２（Ｓ２）細胞で安定に発現され、プロテインＡセファロースを用いて精製された。
純度はＰＡＧＥゲルの銀染色によって分析し、融合タンパク質の機能性は、３５Ｓ−標識ＶＥＧＦタンパク質に結合するその能力によってテストした。
ＶＥＧＦＲ−２−Ｆｃ受容体は、ｐＩｇベクター中のＦｃ断片に融合した（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃ．Ｎｏ．Ｘ６１６５６のヌクレオチド６４−９７２によってコードされた）ＶＥＧＦＲ−２の最初の３つのＩｇドメインを含む。
ＶＥＧＦＲ−３−Ｆｃ受容体は、ｐＩｇベクターのＦｃ断片に融合した（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃ．Ｎｏ．　Ｘ６８２０３のヌクレオチド２０−１００５によってコードされた）ＶＥＧＦＲ−３の最初の３つのＩｇドメインより同様になる。
ＶＥＧＦＲ−２−ＦｃおよびＶＥＧＦＲ−３−Ｆｃタンパク質を２９３Ｔ細胞で発現させ、ＶＥＧＦＲ−１−Ｆｃについて記載したごとく精製した。
【０２７９】
結合アッセイの手法は、免疫沈殿（ＩＰ）ミックスの組成とは別に、実施例２に記載されたペンタヒスチジン抗体を用いる免疫沈殿と同一であった。
受容体結合分析で用いたＩＰミックスは以下の通りであった：ＶＥＧＦＲ−１結合アッセイでは、ＩＰミックスは、１．５ ＢＳＡ、０．０６％ Ｔｗｅｅｎ ２０、３μｇ／ｍｌヘパリンおよび４００ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦＲ−１−Ｆｃ融合タンパク質を含有するリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）であり（このＩＰミックスの１００μｌを２００μｌの試料上清に添加した）；ＶＥＧＦＲ−２結合アッセイでは、ＩＰミックスは、５％ＢＳＡ、０．２％ Ｔｗｅｅｎ ２０および１０μｇ／ｍｌヘパリンを含む１８％ＰＢＳ溶液を含む混合物中で、ＶＥＧＦＲ−２−Ｆｃ融合タンパク質を一過的に発現する２９３Ｔ細胞からの８２％条件細胞上清であった（２５０μｌのＩＰミックスを２００μｌの試料上清に添加した）；およびＶＥＧＦＲ−３結合アッセイでは、ＩＰミックスは、５％ＢＳＡ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０および１０μｇ／ｍｌヘパリンを含む１８％ＰＢＳ中でＶＥＧＦＲ−３−Ｆｃ融合タンパク質を一過的に発現する２９３Ｔ細胞からの８２％条件細胞上清であった（２５０μｌのＩＰミックスを２００μｌの試料上清に添加した）。
少数の選択した構築体（クローン１２−１、１２−５、１２−７、１２−９、１２−１１、１２−１３、１２−１４、１４−９、２３−１、３２−１４、５２−１５、５３−３、８２−７、８２−９、８２−１１、８２−１３、８３−１５、８４−９および８４−１１）を一回を越えて調べた。
【０２８０】
３５Ｓ標識ハイブリッドタンパク質を用いる結合アッセイからの結果を以下の表３にまとめる。
検出されたタンパク質の見掛けの分子量は１８および２７ｋＤの間であった。
通常、２つのバンドが異なるバンド強度にて目に見えた。
時々、第２のバンドのみが長い露出後に検出できた。
２つのバンドの存在は、調べたハイブリッドタンパク質の断片７および９の起源と相関する。
断片７は、それがＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃに由来するか否かとは無関係に潜在的なＮ−グリコシル化部位を含み、他方、断片９のみがそれがＦＥＧＦ−Ｃに由来すればＮ−グリコシル化部位を含む。
かくして、複数のバンドは、分析すべきハイブリッドタンパク質の異なるグリコシル化によるものらしい。
以下のものはグリコシル化部位の異なる組合せについての予測されるバンドである：
（１） ＶＥＧＦ−Ａに由来する断片７およびＶＥＧＦ−Ａからの断片９は〜１８および〜２２ｋＤの２つのバンドを生じる。
【０２８１】
（２） ＶＥＧＦＲ−Ａに由来する断片７およびＶＥＧＦ−Ｃからの断片９は〜２６ｋＤバンドを生じる（〜２２ｋＤの第２のバンドは時々失われ、〜１８ｋＤの第３のごく弱いバンドは時々目に見える）。
【０２８２】
（３） ＶＥＧＦ−Ｃに由来する断片７およびＶＥＧＦ−Ａからの断片９は〜２２ｋＤバンドを生じる（〜１８ｋＤの第２のバンドは時々失われる）。
【０２８３】
（４） ＶＥＧＦ−Ｃに由来する断片７およびＶＥＧＦ−Ｃからの断片９は〜２３ｋＤの１つのバンドを生じる。
【０２８４】
結合アッセイの結果は、もし当方のグリコシル化部位がＶＥＧＦ−Ｃに由来するならば。
異種グリコシル化が観察されるのは少ないことを示す。
ＶＥＧＦ−Ａからの断片７およびＶＥＧＦ−Ｃからの断片７双方を含む分子は人工的な高グリコシル化を促進するようである。
断片７に含まれたＶＥＧＦ−Ａグリコシル化部位もまた不完全なグリコシル化の傾向がある。
【０２８５】
結合アッセイデータは、ハイブリッド分子のいくつかが新規な結合特性を呈することを示す。
分析は定量的ではなかったが、ハイブリッド分子のいくつかは異なる相対的シグナル強度を示す。
例えば、クローン７２−１０は、ＶＥＧＦＲ−ー２に対するその親和性の保持しつつ、ＶＥＧＦＲ−３に対するその親和性の多くを喪失してしまったように見える。
これらの結果は、親タンパク質（ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃ）いずれかの受容体特異性を保持するハイブリッドタンパク質の中で、いくつかが、対応する受容体に対するそれらの結合親和性の異なる変化を受けることができることを示唆する。
【０２８６】
以下の表３において、欄１は調べた構築体をリストする。
欄２は続いて各構築体の９つの断片をリストし、ここに、Ａ＝ＶＥＧＦ−Ａからの断片、およびＣ＝ＶＥＧＦ−Ｃからの断片である。
「ＥＸＰ」と記した欄３は、実施例２に記載したごく２９３Ｔ細胞において構築体を発現させた実験からの結果をリストする。
この欄において、「ｎｏｎｅ」は、検出可能なタンパク質が発現されなかったことを示し；「ｗｅａｋ」は弱い発現が検出可能であることを示し；および「ｙｅｓ」は発現されたタンパク質が容易に検出可能であることを示す。
最後の３つの欄は実施例３に記載した受容体結合アッセイからの結果をリストし、ここに、ＶＥＧＦＲ−１−Ｆｃ、ＶＥＧＦＲ−２−ＦｃおよびＶＥＧＦＲ−３−Ｆｃへの結合を調べた。
これらの最後の３つの欄では、「あり」は結合を示し、「なし」は受容体への結合はないことを示し、および「０」は、この構築体が２９３Ｔ細胞で発現されず、かくして、結合アッセイで使用できなかったことを示す。
【０２８７】
【表６Ａ】
2004507208.tif 000009
【０２８８】
【表６Ｂ】
2004507208.tif 000010
【０２８９】
【表６Ｃ】
2004507208.tif 000011
【０２９０】
【表６Ｄ】
2004507208.tif 000012
【０２９１】
【表６Ｅ】
2004507208.tif 000013
【０２９２】
【表６Ｆ】
2004507208.tif 000014
【０２９３】
【表６Ｇ】
2004507208.tif 000015
【０２９４】
【表６Ｈ】
2004507208.tif 000016
【０２９５】
【表６Ｉ】
2004507208.tif 000017
【０２９６】
【表６Ｊ】
2004507208.tif 000018
【０２９７】
【表６Ｋ】
2004507208.tif 000019
【０２９８】
【表６Ｌ】
2004507208.tif 000020
【０２９９】
【表６Ｍ】
2004507208.tif 000021
【０３００】
【表６Ｎ】
2004507208.tif 000022
【０３０１】
【表６Ｏ】
2004507208.tif 000023
【０３０２】
【表６Ｐ】
2004507208.tif 000024
【０３０３】
【表６Ｑ】
2004507208.tif 000025
【０３０４】
【表６Ｒ】
2004507208.tif 000026
【０３０５】
【表６Ｓ】
2004507208.tif 000027
【０３０６】
【表６Ｔ】
2004507208.tif 000028
【０３０７】
【表６Ｕ】
2004507208.tif 000029
【０３０８】
【表６Ｖ】
2004507208.tif 000030
【０３０９】
【表６Ｗ】
2004507208.tif 000031
【０３１０】
受容体結合特性は、発現された構築体についてのみ分析した。
もしクローンが弱く発現されれば、その受容体結合特性は、そのサイズが内因性ＶＥＧＦ−Ａ発現からの区別を可能とする場合、あるいはもしそのアミノ酸組成が、受容体結合のアッセイに先だってモノクローナル抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体を用いる内因性ＶＥＧＦ−Ａの除去を可能とする場合のみ分析した。
この抗−ＶＥＧＦ−Ａ抗体によって認識されたエピトープは特徴付けされていないが、我々の予備的結果によれば、該エピトープはＶＥＧＦ−Ａの断片２、３、４、７または９のうちの１つ以上内に位置することが示されている。
かくして、内因性ＶＥＧＦ−Ａの抗体沈殿を、断片２、３、４、７および９がＶＥＧＦ−Ｃに由来する全ての構築体について行った。
この抗体のエピトープのさらなるマッピングは、さらなる構築体の同様な実験を可能とするであろう。
例えば、もし引き続いての分析が、エピトープが断片２に存在しないことを示せれば、断片２がＶＥＧＦ−Ａに由来する構築体もこの方法によって分析することができる。
ＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２への結合に対してこの手法を行って、どのようにして、多くの低い親和性結合ハイブリッド分子が、内因性ＶＥＧＦとの干渉により検出されないかを評価した。
受容体結合アッセイにおって、シグナルを検出できないか、または弱いシグナルの検出は、受容体結合親和性の欠如、または低い受容体結合親和性を結論的に示すものではない。
実験の固有の設定は、弱く発現されるＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の低い親和性バインダーの検出か可能としない。
かくして、結合アッセイは、弱く発現されたハイブリッドタンパク質のいくつかについてＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の低い親和性バインダーを検出しなかったであろう。
【０３１１】
このアッセイにおいて、低レベルで発現されたハイブリッド分子のみかけの低い受容体結合親和性は、内因性ＶＥＧＦとのヘテロ二量体化によるものであろう。
例えば、もしハイブリッドタンパク質が受容体−親和性それ自体を有しないが、内因性ＶＥＧＦ−Ａとで二量体化できれば、そのようなヘテロダイマーは、低い親和性をもって、より多くの受容体のうちの１つに結合できるであろう。
（例えば、ｍｙｃまたはＨＡタグ配列いずれかを認識する抗体での免疫アフィニティークロマトグラフィーを用い）および受容体結合アッセイにおいて精製されたポリペプチドを用いる本発明のキメラポリペプチドの精製は、条件培地中で内因性ＶＥＧＦ−Ａによって引き起こされたいずれの曖昧さも解決するであろう。
あるいは、ハイブリッドタンパク質が昆虫細胞、例えば、Ｓ９の細胞で発現されて、内因性ＶＥＧＦ−Ａでの汚染を回避するであろう。
【０３１２】
特定の構築体の発現の欠如または低いレベルの発現は、ハイブリッドタンパク質それ自体の特性、ＤＮＡ質の変化によるものであろう、あるいはハイブリッドクローンの構築の間に獲得されたＤＮＡの突然変異を反映するものであろう。
この場合において、最初の連結工程の後に全ての構築体を配列決定し、第２の連結工程の後に、選択されたクローンを配列決定した。
これらの配列の分析は、第１の工程の間に突然変異は起こらず、および構築体の第２の工程後に調べて配列で突然変異を含むものはなかったことを示した。
かくして、最終クローンに存在するいずれの突然変異も、最も有り得るのは、最終連結工程の間に起こった。
【０３１３】
５１２のクローンの内、３６を配列決定して、アミノ酸レベルで変化をもたらしたクローンの構築の間に構築体が突然変異を獲得した頻度を決定した。
配列決定された構築体はクローン１１〜１（配列番号：４２〜４３）、１１〜１６（配列番号：４４〜４５）、２２〜１（配列番号：４６〜４７）、２２〜１６（配列番号：４８〜４９）、１２〜１乃至１２〜１６（配列番号：５０〜８１）、および３１〜１乃至３１〜１６（配列番号：８２〜１１３）であった。
３６のクローンの内、２つのみ（１２〜１３および１２〜１６）が、予測された配列から偏りを示した。
クローン１２〜１６はＮ４５およびＣ６７の間の連結接合において２つの塩基対の喪失を受け、その結果、断片Ｃ５のＲＣＧトリプレットおよびそれからただ数個のコドン後の停止コドンの後にフレームシフト突然変異が得られた。
クローン１２〜１３は、このハイブリッドタンパク質の最後のＣ−末端アミノ酸におけるＡｓｐのＡｓｎによる置換をもたらす点突然変異を獲得した。
【０３１４】
調べた５１２のハイブリッド構築体から、配列決定して、ハイブリッドタンパク質の構築および最初の結果を確認するための結合アッセイの反復の間にいずれかの突然変異が起こったかを決定することを含めたさらなる分析のため４つを選択した。
これらの４つの特定のハイブリッドタンパク質：構築体１２−１３、１２−１１、１２−９および１２−７の結合アッセイからの結果は、それらが、公知のＶＥＧＦ受容体リガンドによって呈されない新規な結合パターンを示すことを示す。
１２−９および１２−１３はＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−３に対する結合を示すが、ＶＥＧＦＲ−２に対する結合は示さず、他方、１２−７および１２−１１は全ての３つのＶＥＧＦ受容体に対する結合を呈する。
【０３１５】
これらの結果は、それが、修飾された特性を有するＶＥＧＦ−関連成長因子を供するコンビナトリアルアプローチによって可能であることを示す。
いくつかの場合に構築された新規分子は、それらの野生型先祖と比較して修飾された生物学的効果を有することが示されており、かくして、生物学的効果の特異性および微妙なチューニングが必要である適用で用いることができる。
特に、これらの実験は、全ての３つの公知のＶＥＧＦＲに結合し、従って、血管増殖の誘導においてユニークに優れているはずであるクローン１２〜７および１２〜１１のごとき「スーパー−ＶＥＧＦ」を構築することができることを示す。
【０３１６】
実施例４
ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃ受容体結合エピトープの調査
ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃハイブリッドタンパク質を用いて、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃとそれらの受容体との間の相互作用を調べることができる。
表３および実施例３に記載したもののごとき受容体結合アッセイからの結果の分析は、これらの２つのＶＥＧＦ成長因子の受容体−結合エピトープの注意深い調査を可能とする。
ＶＥＧＦ受容体の内の１つに結合する特定のハイブリッドタンパク質の能力は、親分子の１つに由来する１つ以上の特定の断片の存在に相関するであろう。
そのようなデータは、特異的ＶＥＧＦ受容体への結合に重要なアミノ酸残基を規定するのを助けることができる。
特定のＶＥＧＦタンパク質の正確な受容体結合エピトープの知識は、治療目的で有用な阻害性分子の設計を促進することができる。
【０３１７】
ＶＥＧＦＲ−１と相互作用することで重要な２１のＶＥＧＦ残基を大きな太文字で示す：
ＧＱＮＨＨＥＶＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰＩＥＴＬＶＤＩＦＱＥＹＰＤＥＩＥＹＩＦＫＰＳＣＶＰＬＭＲＣＧＧＣＣＮＤＥＧＬＥＣＶＰＴＥＥＳＮＩＴＭＱＩＭＲＩＫＰＨＱＧＱＨＩＧＥＭＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰＫＫＤ
キメラ実験からのデータは、Ｎ−末端螺旋に対応する断片２からの残基およびストランドβ５に対応する断片７からの残基が、ＶＥＧＦＲ−１特異性を付与するのに特に重要に見えることを示す。
図８は、ＶＥＧＦ−Ａダイマーと２つのＶＥＧＦＲ−１分子との相互作用の三次元モデルである。
２つのＶＥＧＦ−Ａモノマーは、各々、緑色および青色の色を付す。
２つのＶＥＧＦＲ−１受容体のドメイン２は灰色で示す。
【０３１８】
赤色は、ＶＥＧＦＲ−１インターフェーシングで重要なＶＥＧＦ−Ａモノマー内の残基の位置を表す。
これらの残基はＶＥＧＦダイマーも２つの端部でクラスターとなっており、Ｎ−末端ラセンおよびβ５鎖の一部を含む。
【０３１９】
同様にＶＥＧＦＲ−３への調和に関与するＶＥＧＦ−Ｃ中の対応する２１の残基を大きな太文字で以下に示す：
ＡＨＹＮＴＥＩＬＫＳＩＤＮＥＷＲＫＴＱＣＭＰＲＥＶＣＩＤＶＧＫＥＦＧＶＡＴＮＴＦＦＫＰＰＣＶＳＶＹＲＣＧＧＣＣＮＳＥＧＬＱＣＭＮＴＳＴＳＹＬＳＫＴＬＦＥＩＴＶＰＬＳＱＧＰＫＰＶＴＩＳＦＡＮＨＴＳＣＲＣＭＳＫＬＤ
興味深いことに、キメラ実験からの受容体パターンの分析は、ＶＥＧＦ−Ｃ−由来の断片４（分子のβ２ストランドを含有）は、ＶＥＧＦＲ−３結合特異性に絶対的に必要であることを示す（β３ストランドを含む）断片５は、ＶＥＧＦＲ−３結合のための２つの他の重要なＦＥＧＦ−Ｃ断片を表すようである。
ＶＥＧＦ−Ｃ断片４および５のアミノ酸配列は、ＥＦＧＶＡＴＮＴＦＦＫＰＰＣＶＳＶＹＲＣＧである。
残基のＴＮＴＦｘｘｘＰクインテッドは特に注目に値する。
なぜならば、これらの残基はヒト、ウズラおよびウシＶＥＧＦ−ＣおよびヒトＶＥＧＦ−Ｄ（このすべてがＶＥＧＦＲ−３に結合する）で保存されているからである。
ＶＥＧＦＲ−３に結合しないヒトＶＥＧＦ−Ａ中の類似の残基は異なる：ＩＥＹＩｘｘｘＳ。
図１０は、ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦＲ−１モデルから外挿された、ＶＥＧＦ−Ｃダイマーの部分および単一ＶＥＧＦＲ−３分子の間の相互作用の三次元モデルである。
青色および緑色は２つのＶＥＧＦ−Ｃモノマーを表し、灰色はＶＥＧＦＲ−３を表す。
緑色ＶＥＧＦ−Ｃモノマーの断片５はオレンジ色で示し、同一モノマーの断片４は白色で示す。
赤色の残基は、受容体に恐らくは接触している断片４または５内に位置したものである。
【０３２０】
図９は、ＶＥＧＦＲ−３特異性に重要であるらしい断片によって形成された溝を示す三次元モデルである。
この溝は、ＶＥＧＦＲ−３受容体のドメイン２および３の間のリンカー領域を収容すると推定される。
この溝の入り口および側面は、ＶＥＧＦＲ−３特異性を付与するのに重要であるらしい断片によって形成される。
緑色および青色は２つのＶＥＧＦ−Ｃモノマーを示し、灰色はＶＥＧＦＲ−３受容体分子を示す。
ＶＥＧＦＲ−３への結合に参画すると考えられＶＥＧＦ−Ｃ残基を黄色で示す。
【０３２１】
断片６および９はＶＥＧＦ受容体との相互作用に関与するが、これらの断片は受容体特異性の決定に関与するように見えない。
【０３２２】
実施例５
ハイブリッドＶＥＧＦタンパク質による受容体活性化および阻害の分析
ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃハイブリッドタンパク質は、１つ以上のＶＥＧＦ受容体の阻害のいずれかの活性化が望まれる治療適用で用いることができる。
例えば、その活性化が細胞生存に必要な特定のＶＥＧＦ受容体を発現する安定な細胞系に候補ハイブリッドを添加することができる。
細胞系の生存は、候補ハイブリッドタンパク質がその特定のＶＥＧＦ受容体に結合し、それを活性化できることを示す。
他方、細胞系の死滅は、候補ハイブリッドタンパク質が受容体を活性化できないことを示す。
そのような細胞−生存アッセイノ例示的な例は、ここに引用して一体化させる国際公開公報第ＷＯ９８／０７８３２およびＡｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ９５：５８４−５５３（１９９８）に記載されている。
このアッセイは、ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインおよびエリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）の細胞質ドメインよりなるキメラ受容体をコードするプラスミドでトランスフェクトされているＢａ／Ｆ３プレ−Ｂ細胞であるＢａ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ細胞を使用する。
これらの細胞はインターロイキン−３（ＩＬ−３）中でルーティン的に継代され、ＩＬ−３の不存在下では死滅するであろう。
しかしながら、もしシグナリングがキメラ受容体の細胞質ドメインから誘導されれば、これらの細胞はＩＬ−３の不存在下で生存し、増殖する。
そのようなシグナリングは、キメラ受容体のＶＥＧＦＲ−２細胞外ドメインに結合するリガンドによって誘導される。
例えば、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦＲ−２細胞外ドメインへの結合は、細胞がＩＬ−３の不存在下で生存し、増殖するようにする。
キメラ受容体を欠く親Ｂａ／Ｆ３細胞はＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｄいずれかによって誘導されて、ＩＬ−３の不存在下で増殖するということなはく、これは、これらのリガンドに対するＢａ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ細胞の応答が全体としてキメラ受容体に依存することを示す。
【０３２３】
ＩＬ−３の不存在下での細胞生存をアッセイすることによって、ＶＥＧＦＲ−２細胞外ドメインへの結合、引き続いてのキメラ受容体の活性につき候補ハイブリッドタンパク質を試験することができる。
他方、細胞外ドメインに対する、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−ＤのごときＶＥＧＦＲ−２リガンドの結合に、または細胞質ドメインの活性化に干渉するハイブリッドタンパク質は、ＩＬ−３の不存在下で細胞死滅を引き起こすであろう。
【０３２４】
細胞を必要となるまでＩＬ−３の存在下で培養し、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で３回洗浄し、無ＩＬ−３細胞培養基（胎児子ウシ血清（１０％）、Ｌ−グルタミン（１％）、ゲネチシン（１ｍｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびペニシリン（６０μｇ／ｍｌ）を補足したダルベッコの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ））に再懸濁し、ほぼ１００細胞／ウェルの密度にて７２−ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ，デンマーク国）中で再度平板培養した。
受容体活性についてアッセイするために、候補ハイブリッドタンパク質を培養ウェルに１０−１０乃至１０−５Ｍの最終濃度にて添加し、１０％ＣＯ２中で３７℃にて１時間インキュベートした。
ＶＥＧＦＲ−２／ＥｐｏＲ受容体の活性化を疎外する候補ハイブリッドタンパク質の能力をアッセイするためには、組換えＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｄをハイブリッドタンパク質含有ウェルに、Ｂａ／Ｆ３−ＮＹＫ−ＥｐｏＲ細胞の最大近くの生存を生じる濃度（典型的には５００ｎｇ／ｍｌ）にて添加する。
陽性対照培養はＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｄ上清単独いずれかを、陽性対照培養はハイブリッドタンパク質も成長因子も含まない。
【０３２５】
次いで、細胞を４８時間培養にて増殖させ、その時点の後、３−（３，４−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイドの溶液（ＭＴＴ；５００μｇ／ｍｌ）を培養に添加し、さらに３０分間インキュベートする。
ミトコンドリアによってＭＤＴを青色ホルマザン生成物に変換し、かくして、生細胞を青色に染色する。
活性化（ハイブリッドタンパク質単独）または疎外（ハイブリッドタンパク質＋ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｄ）いずれかをアッセイした実験において生存する青色細胞を、倒立オプティックスを備えた顕微鏡下（１０００×倍率）で計測し、陽性対照（ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｄのみ）ウェルにおける細胞生存と比較する。
陰性対照における生存が０に設定され（典型的には、陰性対照では生きた細胞は見られない）、他方、陽性対照での生存が１００％に設定される（典型的には３００〜４００細胞／ウェル）用に、細胞生存を正規化する。
【０３２６】
ハイブリッドタンパク質単独（受容体の結合および活性化をアッセイするため）、またはＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｄ単独（陽性対照）と共にハイブリッドタンパク質＋ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｄ（受容体活性化の阻害をアッセイするため）の個々の培養の間の差につきテストするためにその後に行ったＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ多重比較にて、片側偏差分析（ＡＮＯＶＡ）によってデータを分析する。
【０３２７】
異なるキメラ受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ−３／ＥｐｏＲ）でトランスフェクトした細胞を用いる同一アッセイの反復は、異なるＶＥＧＦＲの活性化についてのスクリーニングを可能とする。
【０３２８】
ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ）およびＶＥＧＦＲ−３（ＦＩｔ４）自己リン酸化アッセイ
活性の別のインジケートとして、特定のＶＥＧＦ受容体の自己リン酸化を刺激するハイブリッドタンパク質の能力を調べることもできる。
特定のＶＥＧＦ受容体を発現する細胞に候補ハイブリッドタンパク質を添加する。
次いで、細胞を溶解させ、抗−ＶＥＧＦ受容体抗血清で免疫沈殿させ、抗−ホスホチロシン抗体を用いるウエスタンブロッティングによって分析して、ＶＥＧＦ受容体のハイブリッドタンパク質−誘導リン酸化を測定する。
【０３２９】
本発明のハイブリッドＶＥＧＦ分子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、リン酸カルシウムトランスフェクション方法を用いて、適当な宿主細胞（例えば、２９３−ＥＢＮＡ細胞）にトランスフェクトする。
トランスフェクションの約４８時間後に、トランスフェクトされた細胞の増殖培地を（例えば、胎児子ウシ血清を欠くＤＭＥＭ培地）に変更し、細胞を（例えば、さらに３６時間）インキュベートして条件培地を供する。
条件培地を収集し、５０００×ｇにて２０分間遠心し、上清を濃縮する。
【０３３０】
濃縮された条件培地を用いて、ＶＥＧＦ受容体を発現する細胞を刺激する。
例えば、ＰＡＥ−ＫＤＲ細胞（Ｐａｊｕｓｏｌａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９：３５４５−５５（１９９４）；Ｗａｌｔｏｎｂｅｒｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：２６９８８−２６９９５（１９９４））をハムのＦ１２培地−１０％胎児子ウシ血清（ＦＣＳ）中で増殖させ、あるいはＶＥＧＦＲ−３を発現する密集ＮＩＨ ３Ｔ３細胞をＤＭＥＭ培地中で増殖させる。
ＤＭＥＭ培地または０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補足したハムのＦ１２中で細胞を一晩飢餓状態とし、次いで、濃縮されていない、２倍、５倍および／または１０倍濃縮した条件培地と共に５分間インキュベートする。
組換えヒトＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃおよびモック−トランスフェクト細胞からの条件培地は例示的対照である。
条件培地に加えて、精製されたハイブリッドポリペプチドを、このアッセイまたは本明細書中に記載した他のアッセイで使用することができる。
【０３３１】
条件培地での刺激の後、１００ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含有する氷冷トリス−緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）で細胞を２回洗浄し、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＦＳ）、０．１Ｕ／ｍｌアプロチニンおよび１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含有するＲＩＰＡ緩衝液中で溶解させた。
溶解物を音波処理し、１６，０００×ｇにて２０分間遠心することによって透明化し、ＶＥＧＦＲ−３またはＶＥＧＦＲ−２に特異的な３〜５μｌの抗血清と共に氷上で３〜６時間インキュベートする。
免疫沈殿をプロテインＡ−セファロースに結合させ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウムを含有するＲＩＰＡ緩衝液で３回洗浄し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）で２回洗浄し、７％ゲルを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥに付す。
ウエスタンブロッティングによってポリペプチドをニトロセルロースに移し、ＰＹ２０ホスホチロシン−特異的モノクローナル抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）または受容体−特異的抗血清およびＥＣＬ検出方法（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ．）を用いて分析する。
【０３３２】
（抗−ホスホチロシン抗体を用いて検出された）自己リン酸化を刺激するハイブリッドポリペプチドの能力を、受容体の刺激としてスコア取りする。
ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃの既知濃度に対するハイブリッドポリペプチドの種々の濃度について観察された刺激のレベルは、受容体刺激の能力の尺度を提供する。
受容体に結合することが示されているが、受容体リン酸化を刺激することができないポリペプチドは阻害剤として認定される。
組換えＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃのような公知の受容体アゴニストと培地単独、または濃縮された調製培地と混合することによって、阻害活性をさらにアッセイして、濃縮された調製培地がＶＥＧＦ−Ａ−媒介またはＶＥＧＦ−Ｃ−媒介受容体リン酸化を阻害するかを決定することができる。
【０３３３】
ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−３に結合する選択されたハイブリッド分子によって媒介されたＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３のチロシンリン酸化を調べる最初の実験において、テストしたすべてのハイブリッドタンパク質は受容体のリン酸化を誘導することができるが、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃによって媒介されたものよりは程度が低いことが観察された。
タンパク質を生じさせるのに用いたバキュロウイルス系におけるハイブリッドタンパク質の発現レベルのさらなる調査は、タンパク質が全ては匹敵する量では発現されないことを示す。
ハイブリッドタンパク質の異なる発現レベルは、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３のチロシンリン酸化を刺激するそれらの能力のアッセイにおいてこれらのタンパク質によって呈されたより低い活性のいくつかを説明することができる。
加えて、この特別のアッセイを用いて測定されたこれらのハイブリッド分子によって誘導されたリン酸化の程度は、ｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的活性とは相関しないであろう。
【０３３４】
実施例６
ハイブリッドタンパク質の受容体結合親和性の分析
５１２のハイブリッドタンパク質の予備的分析は、それらの多数が１つ以上のＶＥＧＦＲに結合できることを示す。
加えて、これらの実験からの結果は、いくつかは、１つ以上のＶＥＧＦＲに対する異なる結合親和性を示すことを示唆する。
これらの実験では、ハイブリッドタンパク質が昆虫細胞系、例えば、Ｓ９細胞で発現されて、哺乳動物細胞で見出された内因性ＶＥＧＦ−Ａでの汚染を排除する。
選択されたハイブリッドタンパク質の相対的結合親和性を測定するために、ＥＬＩＳＡ−タイプの方法を用いる。
例えば、ＶＥＧＦＲ−１に対する結合親和性を調べるために、競合するＶＥＧＦＲ−１−ＩｇＧ融合タンパク質およびＭＹＣエピトープでタグを付した飽和下濃度の候補ハイブリッドタンパク質の系列希釈を、ＶＥＧＦＲ−１を被覆したマイクロタイタープレートに添加し、平衡が確立されるまでインキュベートする。
次いで、プレートを洗浄して未結合タンパク質を除去する。
ＶＥＧＦＲ−１被覆プレートに結合したままであるハイブリッド分子を、容易に検出可能な標識、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗−ｍｙｃ抗体を用いて検出する。
結合親和性（ＥＣ５０）は、最大の半分の結合をもたらす競合ＶＥＧＦＲ−ＩｇＧ融合タンパク質の濃度として計算することができる。
これらの値を、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃの分析から得られたものと比較して、１つ以上のＶＥＧＦＲの結合親和性の変化を決定することができる。
同様に、ＶＥＧＦＲ−２に対する結合はＶＥＧＦＲ−２−ＩｇＧ融合タンパク質を用いて達成され、ＶＥＧＦＲ−３に対する結合はＶＥＧＦＲ−３−ＩｇＧ融合タンパク質を用いて測定される。
【０３３５】
実施例７
ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃハイブリッドタンパク質によって
媒介されたコラーゲンゲル中の内皮細胞移動
ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃは共にコラーゲンゲル中の内皮細胞移動を刺激する。
【０３３６】
本発明のハイブリッドタンパク質を調べて、それらがコラーゲンゲル中の内皮細胞移動を刺激でき、かくして、生物学的活性のもう１つの指標を供することができるかを決定する。
そのような細胞移動の例は、参考までに本明細書に引用した国際公開公報第ＷＯ９８／３３９１７号に記載されている。
簡単に述べれば、ウシ毛細血管内皮細胞（ＢＣＥ）を、組織培養プレート中のコラーゲン層の頂部に蒔く。
【０３３７】
候補ハイブリッドタンパク質を生産する発現ベクターでトランスフェクトされた細胞からの条件培地を、付着したＢＣＥ細胞の位置からほぼ４ｍｍ離れたコラーゲンゲル中で作成されたウェルに入れる。
次いで、ハイブリッドタンパク質を含有するウェルに向けて、コラーゲン中の付着の元来の領域から移動したＢＣＥ細胞の数をカウントして、細胞移動を誘導するハイブリッドタンパク質の能力を評価する。
【０３３８】
ＢＣＥ細胞（Ｆｏｌｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），７６：５２１７−５２２１（１９７９））は、Ｐｅｒｔｏｖａａｒａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：６２７１−７４（１９９４）に記載されている。
コラーゲンゲルは、Ｉ型コラーゲンストック溶液（１ｍＭ ＨＣｌ中５ｍｇ／ｍｌ）を、等容量の２×ＭＥＭおよび２容量の１０％新生児子ウシ血清を含有するＭＥＭと混合することによって調製する。
組織培養プレート（５ｃｍ直径）を溶液の約１ｍｍ厚みの層で被覆し、これは３７℃での重合を可能とする。
【０３３９】
ＢＣＥ細胞をこの層の頂上に蒔く。
【０３４０】
移動アッセイでは、最初のコラーゲン層の頂部に置かれたプラスティックリング（１ｃｍ直径）の内部に細胞を付着させる。
３０分後、リングを取り出し、未付着細胞をすすいで除去する。
０．７５％低融点寒天（ＦＭＣ ＢｉｏＰｒｏｄｃｔｓ， Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）によって固化したコラーゲンの第２の層および増殖培地（５％新生児子ウシ血清（ＮＣＳ））の層を添加する。
４ｍＭの距離に置いて細胞スポットの両側の全ての層を通してウェル（３ｍｍ直径）をパンチし、ハイブリッドＶＥＧＦポリペプチドを含有する培地（または対照として供するための培地単独またはＶＥＧＦ−ＡもしくはＶＥＧＦ−Ｃを含有する培地）をピペットで毎日ウェルに入れる。
スポットのエッジから外に移動する細胞の顕微鏡写真を、例えば、６日後に、相−コントラストオプティックスを備えたオリンパスＣＫ２倒立顕微鏡を通して撮る。
蛍光色素ビスベンズイミド（１ｍｇ／ｍｌ，Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３２５８，Ｓｉｇｍａ）での核染色の後に移動する細胞をカウントする。
【０３４１】
非−トランスフェクトされた（対照）またはトランスフェクトされた（モック；ハイブリッド；ＶＥＧＦ−Ｃ：またはＶＥＧＦ−Ａ）細胞によって条件付けされた培地を含有する細胞に向けて、付着の元来の領域から異なる距離において移動する細胞の数を、培地の添加から６日後に測定する。
付着の元のリングから外に移動する細胞の数を、蛍光顕微鏡にて、顕微鏡接眼レンズグリッドおよび１０×倍率を用い、５つの隣接する０．５ｍｍ×０．５ｍｍ角でカウントする。
０．５ｍｍよりさらに移動する細胞を、０．５ｍｍ工程でグリッドを取り出すことによって同様にカウントする。
【０３４２】
ＢＣＥ細胞の移動を誘導するハイブリッドポリペプチドの能力は、受容体アゴニストの活性の指標である。
ハイブリッドタンパク質−対−同様な濃度のＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃの存在下における移動細胞の数は、アゴニスト活性の能力の指標を提供する。
ＢＣＥ細胞で発現された受容体に結合することが示されているが、移動を刺激することができないポリペプチドを潜在的疎外剤として認定する。
組換えＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃのような公知の受容体アゴニストと、培地単独と、または濃縮された調製培地と混合することによって、阻害活性をさらにアッセイして、濃縮された調製培地がＶＥＧＦ−Ａ−媒介またはＶＥＧＦ−Ｃ−媒介（ＢＣＥ移動を阻害するかを決定することができる）。
【０３４３】
実施例８
ハイブリッドタンパク質の脈管透過性誘発能力の分析
ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃは、共に脈管の透過性を高める能力を有する。
本発明のハイブリッドタンパク質を試験にかけ、両タンパク質のいずれが、この生物活性を有し、いずれが、それを阻害するかを決定する。
たとえば、脈管透過性の検定には、ＭｉｌｅｓおよびＭｉｌｅｓの方法（Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１１８：２２８〜２５７（１９５２）；全体を参照してここに組み込む）が使用される。
【０３４４】
その概要を説明すると、まず、実験動物、たとえばモルモットにポンタミン・スカイ・ブルーのような生体色素を静脈注射し、その後で試験候補であるハイブリッドタンパク質を含む組成物を皮内注射する。
比較対照として、培養液単独か、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃを含む培養液を同様に注射する。
ある時間が経過したのち、皮膚の注射部位に蓄積した色素量を測定する。
透過性を高めるこれらのハイブリッドタンパク質は、脈管透過性を誘発しないハイブリッドタンパク質と比べて、注射部位に蓄積する色素量を増加させる。
【０３４５】
この試験法の変法によれば、まず、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃのインヒビターではないかと疑われるハイブリッドタンパク質に、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃを比率を変えて混合し（たとえば、５０：１、１０：１、５：１、２：１、１：１、１：２、１：５、１：１０）、それら混合物を実験動物の皮内に注射する。
このようにして、ハイブリッドタンパク質が、ＶＥＧＦ−ＡまたはＶＥＧＦ−Ｃがそれぞれ仲介する脈管透過性を阻害する能力を検定する。
【０３４６】
実施例９
内皮細胞増殖試験
ハイブリッドタンパク質の分裂促進活性は、たとえばＢｒｅｉｅｒら（Ｄｅｖ．１１４：５２１〜５３２（１９９２）；）が記載している内皮細胞増殖試験を使って検査することができる。
ハイブリッドタンパク質は、哺乳動物細胞系、たとえばＣＯＳ細胞に発現される。
培養物上清を集め、それをウシ大動脈内皮（ＢＡＥ）細胞に添加して、ＢＡＥ細胞に対する分裂活性を検定する。
３日後、トリプシンで細胞を切り離し、細胞数計数計を使って、ＢＡＥ細胞の増殖に対するハイブリッドタンパク質の効果の有無を決定する。
ネガテイブな対照としては、１０％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭおよびベクターを移入していないＣＯＳ細胞またはベクターを移入したＣＯＳ細胞からの条件調整した培養液を単独で使用することができる。
【０３４７】
また、ポジテイブな対照としては、ＢＡＥ細胞の増殖を誘発することが証明されているタンパク質（たとえばＶＥＧＦ−Ａ）を発現する構築体を移入した細胞上清を使用することができる。
【０３４８】
実施例１０
ヒトＫ１４ケラチン・プロモーターを通して発現されるハイブリッドタンパク質
が、トランスジェニック・マウスの皮膚にリンパ管の成長を誘発する能力試験
組織内にハイブリッドタンパク質を過度に発現する特異的効果を分析するための試験を、トランスジェニック・マウスを使って行う。
生体内での生理的効果は、受容体の活性化／阻害プロフィールの指標となるばかりでなく、ハイブリッドタンパク質が有する治療作用の可能性を示す指標ともなる。
一例を挙げれば、重層扁平上皮の基底細胞中で活性を示すヒトＫ１４ケラチン・プロモーター（Ｖａｓｓａｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８６：１５６３〜１５６７（１９８９））を、組換えハイブリッドタンパク質導入遺伝子の発現制御要素として使用することができる。
Ｋ１４ケラチン・プロモーターを含むベクターは、Ｖａｓｓａｒら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．，５：７１４〜７２７（１９９１）およびＮｅｌｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．９７：２４４〜２５１（１９８３）に記載されている。
【０３４９】
Ｋ１４プロモーター、ハイブリッドタンパク質ｃＤＮＡおよびＫ１４ポリアデニル化シグナルを含むＤＡＮ断片を合成し、分離後、ＦＶＢ−ＮＩＨマウス系の受精卵母細胞に注入する。
注入した接合子を疑似妊娠したＣ５７ＢＬ／６×ＤＢＡ／２Ｊハイブリッド・マウスの卵管に移植する。
このようにして作製したファウンダー・マウスの導入遺伝子を、該当するプライマーを使ったテイルＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応か、サザン分析法によって分析する。
【０３５０】
つぎに、これらのトランスジェニック・マウスに対して、脈管形成またはリンパ管形成、たとえばＶＥＧＦ−Ｃを過度に発現するリンパ管形成（国際公開公報第ＷＯ９８／３３９１７号を参照）を示す証拠がないか検査する。
Ｋ１４−ＶＥＧＦ−Ｃトランスジェニック・マウスの組織を調べた結果、野生型同腹子の皮膚と比較して、背部の真皮は萎縮し、そして結合組織は、赤色細胞を持たない大裂孔で置き換えられ、薄い内皮層で覆われていることがわかった。
これらの拡張した脈管類似の構造は、ヒトのリンパ管腫に見られる構造と似ていた。
皮膚付属器と毛嚢の数は減少した。
口吻部では脈管数が増えていることもわかった。
【０３５１】
血管またはリンパ管に特定のタンパク質を認識する抗体を使ってトランスジェニック・マウスの皮膚の脈管を調べたところ、これらの脈管が同一であることも確認された。
タイプＩＶおよびＸＶＩＩＩコラーゲン（Ｍｕｒａｇａｋｉら、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：８７６３〜８７６６（１９９５））およびラミニンは脈管内皮細胞に発現されるのに対して、デスモプラキンＩおよびＩＩ（プロゲン）はリンパ管内皮細胞に発現される。
Ｓｃｈｍｅｒｚら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，５７：９７〜１１７（１９９４）を参照。
【０３５２】
実施例１１
骨髄造血の促進または抑制におけるハイブリッドタンパク質の分析
Ｋ１４−ＶＥＧＦ−Ｃトランスジェニック・マウスの皮膚におけるＶＥＧＦ−Ｃの過度な発現は、白血球集団の明確な変化と相関性を示す（国際公開公報第ＷＯ９８／３３９１７号を参照）。
トランスジェニック・マウスで好中球の顕著な増加が認められたことは注目に値する。
特異的白血球集団に発現するタンパク質を認識する抗体を使用する蛍光活性化細胞選別分析法によって、造血に対するハイブリッドタンパク質の効果を分析することができる。
白血球集団の分析は、実施例１３に記載のＦ１トランスジェニック・マウスおよびそれらと同腹の非トランスジェニック・マウスから採取した血液で行う。
【０３５３】
実施例１２
Ｉｎ ＶｉｔｒｏにおけるヒトＣＤ３４＋前駆細胞の増殖
および分化に対するハブリット・タンパク質の効果
臍帯血液のＣＤ３４＋細胞の細胞培養物にＶＥＧＦ−Ｃを添加すると細胞増殖が誘発される。
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３またはＧＭ−ＣＳＦ＋ＳＣＦとＶＥＧＦ−Ｃとを共培養すると脊髄細胞の比率が増加する（国際公開公報第ＷＯ９８／３３９１７号を参照）。
本発明のハイブリッドタンパク質が、ＣＤ３４＋前駆細胞の増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏで誘発する能力を調べることもできる。
ヒトＣＤ３４＋前駆細胞（ＨＰＣ、１０×１０３）は、骨髄または臍帯血液単核球から、ＭＡＣＳ　ＣＤ３４前駆細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｈ　Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用し、製造者の使用説明書に従って分離し、Ｌ−グルタミン（２．５ｍＭ）、ペニシリン（１２５ＩＥ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１２５μｇ／ｍｌ）およびプールした１０％臍帯血液（ＣＢ）血漿を添加したＲＰＭＩ １６４０培養液中、１０ｎｇ／ｍｌ乃至乃至１μｇ／ｍｌの濃度範囲でハイブリッドタンパク質の存在下または不在下に、５％ＣＯ２含有調湿雰囲気中、３７℃で数日間培養する。
数日間経過後、各培養物についてそれぞれ全細胞数を決定する。
【０３５４】
組換えヒト幹細胞因子（ｒｈＳＣＦ、２０ｎｇ／ｍｌ　ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ　Ｈｉｌｌ，ＮＹ）単独か、顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、１００ｎｇ／ｍｌ、サンド、バーゼル、スイス）＋ＳＣＦの組み合わせ、のいずれかを添加した培養物中におけるハイブリッドタンパク質の共刺激効果を調べることもできる。
ＧＭ−ＣＳＦ単独か、ＩＬ３（ｒｈＩＬ−３、１００Ｕ／ｍｌ、Ｂｅｈｒｉｎｇ　ＡＧ、マールブルク、ドイツ）単独か、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−３の組み合わせの、いずれかを添加したＣＢ ＣＤ３４＋ＨＰＣ細胞の血清不含培養物の全細胞収率に対する、ハイブリッドタンパク質の共刺激効果を分析する実験も行うことができる。
【０３５５】
上記の血漿を添加した細胞（７日）についても、早期顆粒単細胞マーカー分子リゾチーム（ＬＺ）およびミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ならびに糖脂質（ＬＰＳ）受容体ＣＤ１４の発現が、免疫蛍光法によて分析される。
【０３５６】
別の実験シリーズでは、５０ｎｇ／ｍｌ Ｍ−ＣＳＦを添加し、１００ｎｇ／ｍｌハイブリッドタンパク質を含む、または含まない培養液中でＣＤ３４＋細胞を７日間培養する。
７日後に培養物を分析にかけ、ＣＤ３４＋細胞百分率と平均蛍光強度を決定する。
【０３５７】
実施例１３
ＣＡＭアッセーによるハイブリッドタンパク質の分析
Ｉｎ ｖｉｖｏにおける脈管形成因子の効果を調べるには、たとえばＯｈ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１８８：９６〜１０９（１９９７）（全体を参考までに本明細書に組み込む）に記載の尿漿膜（ＣＡＭ）アッセーが広く使用されている。
このアッセーを使って、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃの両者を含め、ＶＥＧＦ成長因子が、血管の形成を誘発することが明らかにされている（Ｏｈら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１８８：９６〜１０９（１９９７））。
このように、ハイブリッドタンパク質の血管形成特性を研究するために、この方法を使用することができる。
【０３５８】
実験方法の概要を述べれば、成長過程の４日目にニワトリまたはウズラの卵の殻に窓を切り開ける。
胚が正常に成長していることを検査し、殻の窓をセロテープ（登録商標）でふさぎ、それから発育１３日目まで卵を保温する。
あらかじめ直径約５ｍｍの円板に切って乾燥させたＴｈｅｒｍａｎｏｘカバースリップ（Ｎｉｍｅ社、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、ＩＬ）に蒸留水５μｌに溶かしたハイブリッドタンパク質約３．３μｇを加える。
対照にはタンパク質を加えない円板を使用する。
次に、乾燥した円板を上記卵の尿漿膜（ＣＡＭ）上に当てがう。
３日後に円板を取り去り、３％グルタルアルデヒドおよび２％ホルムアルデヒド中で固定し、０．１２Ｍカコジル酸ナトリウム緩衝液中ですすぐ。
固定された標本を写真撮影し、半（０．７５μｍ）および超薄（７０ｎｍ）切片を作製するためにエプソン樹脂（Ｓｅｒｖａ社、ドイツ）中に埋め込む。
Ｕｌｔｒａｃｕｔ　Ｓ（Ｌｅｉｋａ社、ドイツ）半薄切片および超薄切片を切り出す。
超薄切片をＥＭ１０（Ｚｅｉｓｓ社、ドイツ）で分析する。
標本は、毛細血管が新たに成長しているか否かの証拠を得るために分析され、もし証拠が得られれば、試験対象であるハイブリッドタンパク質が血管形成を刺激しうることが示唆される。
【０３５９】
実施例１４
ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃハイブリッドタンパク質の同種間または異種間での二量化の分析
チロシン・受容体の活性化には、多くの場合、リガンドによって誘発される受容体の二量化が介在する。
ＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２の間の相互作用の研究から、受容体の二量化は、両受容体が、ホモ二量体またはヘテロ二量体を構成する二つのリガンドタンパク質のそれぞれの部分を結合する、リガンドの二量化を経由して行われることが示唆される。
ＶＥＧＦＲ−２に結合することができても、二量化することのできない突然変位ＶＥＧＦは、受容体を活性化することはできない（Ｆｕｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１１１９７〜１１２０４（１９９８））。
ＶＥＧＦファミリーに属するメンバーは、すべて同種および／または異種間で二量化することができる。
ＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦ−Ｃは、互いに異種間で二量化することはできない。
しかし。
ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃハイブリッドタンパク質の一部は、場合によっては、相互に二量することができるかもしれ乃至、母体分子の一方または両方と二量化することができるかもしれない。
さらに、ハイブリッドタンパク質は、同種間で二量化することができるかもしれない。
次に述べるプロトコルは、本発明のハイブリッドタンパク質が二量化できる能力があることを確認できるように作成されている。
候補となるハイブリッドタンパク質は、異なるハイブリッドタンパク質と共発現されるか、ある細胞系統、たとえば２９３Ｔ細胞またはＳ９細胞の母体分子の一つと共発現される。
これらの細胞から抽出物を調製し、それを、検査対象である二種類のタンパク質の一方だけを認識する抗体を使う免疫沈殿に使用する。
次に、免疫沈殿によって沈殿したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて分析する。
両タンパク質をゲル上で検出する場合は、検査対象である二つのタンパク質間でヘテロ二量化が起こった。
それに対して、免疫沈殿法で使用された抗体で認識されるタンパク質のみが検出される場合は、両タンパク質間で二量化は起こらなかった。
二量化は、受容体の活性化にきわめて重要であるように思われるため、受容体を結合しても、それ自身同士で、または細胞によって内因的に発現される天然のＶＥＧＦ成長因子とは、二量化しないハイブリッドタンパク質は、内因性脈管内皮成長因子の活性の阻害剤となることが期待される。
【０３６０】
本発明の一つのポリペプチドと、本発明の残りのポリペプチドまたは成長因子のＶＥＧＦファミリーの天然に存在するメンバーと、を含むヘテロ二量体は、基本的には、Ｃａｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１５４〜６２（１９９６）に記載されているようにして生成させることができよう。
簡潔に説明すると、組換えによって形成されるハイブリッドポリペプチドを、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＵＧＦ、ＰＤＧＦα、ＰＤＧＦβまたはｃ−ｆｏｓによって誘発される成長因子ポリペプチドなど、組換えによって形成される別の対象ハイブリッドペプチドと混合する（たとえば、Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３１６：７４８〜７５０（１９８５）を参照）（ＰＤＧＦ−β、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ０２８１１）；Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６（１３）：４９１７〜４９２１（１９８９）（ＰＤＧＦ−α、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ２２７３４）；Ｃｌａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３４７６３４８６（１９８８）（ＰＤＧＦ−β、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｍ２１６１６）；Ｏｌｏｆｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），９３：４２５７６〜２５８１（１９９６）（ＶＥＧＦ−Ｂ、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｕ４８８０１）；Ｍａｇｌｉｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），８８（２０）：９２６７〜９２７１（１９９６）（Ｐ１ＧＦ、ＧｅｎＢａｎｋ　Ａｃｃ．Ｎｏ．Ｘ５４９３６）；Ｈｅｌｄｉｎら、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ、８：２４５〜２５２（１９９３）；Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｎａｔｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．１：２７〜３１（１９９５）；Ｆｒｉｅｓｅｌら、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．９：９１９〜２５（１９９５）；Ｍｕｓｔｏｎｅｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２９：８９５〜９８（１９９５）；Ｏｒｌａｎｄｉｎｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３（２１）：１１６７５〜１１６８０（１９９６）；および本明細書の別の所に引用されている参照文献。
混合したポリペプチドをグアニジン塩酸塩およびＤＴＴの存在下に保温する。
つづいて、チオール基をＳ−スルホン化によって保護し、タンパク質を、まず尿素／グルタチオン−ＳＨ、グルタチオン−Ｓ−Ｓ−グルタチオンに対して、それから２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌに対して一晩透析をする。
【０３６１】
ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦファミリー（特に、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３）の受容体に対する結合親和性および受容体を刺激する能力を決定する（たとえば、関係受容体を表面に発現する細胞中で行われる、二量体刺激受容体の、リン酸化を検定する）ため、ヘテロ二量体をスクリーニングにかける。
結合アッセーは、本明細書および従来技術に記載されている競争的結合アッセーであってもよい。
最初の結合アッセーでは、上記ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３に対する実施例に記載したように、受容体の細胞外ドメインを含む、組換えによって形成されるタンパク質を使用することができる。
受容体を結合し、これを刺激するヘテロ二量体は、組換え成長因子ポリペプチドとして有用である。
それに対して、受容体を結合しても、これを刺激しないヘテロ二量体は、成長因子拮抗体として有用である。
【０３６２】
スクリーニング・アッセーで作動活性または拮抗活性を示すヘテロ二量体は、さらに内皮細胞移動アッセー、脈管透過性アッセーおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセーなどの検定法を使ってスクリーニングされる。
二種類のＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドを含む二量体（すなわち同じＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドの二量体でも、異なるＶＥＧＦ−Ｃポリペプチドの二量体でも）の作動活性および拮抗活性が同じアッセーを使って有利にスクリーニングされることも、上記実施例から明らかであろう。
【０３６３】
実施例１５
ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃハイブリッドタンパク質の生物学的半減期の決定
ある化合物のｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的半減期を明らかにすることは治療に応用する上で重要なことである。
ハイブリッドタンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの半減期は、決定されていないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの予備的な結果によると、上に記載したＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃハイブリッドタンパク質の半減期はさまざまであることが示唆されている。
特定のハイブリッドタンパク質を含む上清を４℃に約２か月間保温すると、各ハイブリッドタンパク質で異なるタンパク質安定性を示す。
ｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的半減期は、ヨウ素で標識したハイブリッドタンパク質を動物に注射することによって決定することができる。
その概要を簡単に述べると、まず、ＩＯＤＯ−ＧＥＮ（Ｐｉｅｒｃｅ社）を使用し製造者の指示に従って、ハイブリッドタンパク質５０μｇをヨウ素化し、約２〜１０μＣｉ／μｇタンパク質の比放射能を得る。
ＰＤ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ（ファルマシア社）を使用し製造者の指示に従って、ヨウ素化したタンパク質を精製する。
使用する１２〜１６週齢のマウス（体重２０〜２５ｇ）は、実験中ペントバルビタールナトリウム（１ｍｇ／マウスの体重２０ｇ）で麻酔する。
滅菌食塩水１００μｌで希釈した放射能標識タンパク質５〜１０ｐｍｏｌを尾部血管に３０秒間かけて注入する。
所定の時間（１、２、４、８、１５、３０、６０および１２０分）に４０〜５０μｌの血液を眼窩周辺部から出血させて採血するか、尾部動脈から採血する。
各血液試料から血漿フラクション２５μｌをワットマンの濾紙上にスポットし、１０％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿させ、それからエタノールですすぐ。
ガンマ線カウンターで放射能を測定して、血漿フラクション中に存在する放射能標識タンパク質の量を定量する。
天然に存在するＶＥＧＦより半減期が向上したポリペプチドは、本発明のポリペプチドの中でも好ましい部類に入る。
とりわけ、天然に存在するＶＥＧＦより２５％、５０％、７５％または１００％半減期が向上したポリペプチドは特に好ましい。
【０３６４】
実施例１６
他のＶＥＧＦまたはＰＤＧＦファミリーのタンパク質を使用する
ハイブリッドタンパク質の構築
実施例１に記載した手順を拡張し、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ成長因子のどれを使用してもハイブリッド分子を作り出すことができる。
少なくともＶＥＧＦ−Ａ（配列番号：１および２）、Ｐ１ＧＦ（配列番号：１１４および１１５）、ＶＥＧＦ−Ｂ（配列番号：１１６および１１７）、ＶＥＧＦ−Ｃ（配列番号：２１および２２）、ＶＥＧＦ−Ｄ（配列番号：１１８および１１９）、ＶＥＧＦ−Ｅ（配列番号：１２０および１２１）、およびＮ２２　ＶＥＧＦ（配列番号：１２２および１２３）、Ｄ１７０１　ＶＥＧＦ（配列番号：ＸおよびＸ）、ＮＺ１０　ＶＥＧＦ（国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５８６９号の配列番号：１１に記載されている；全体を参考までに本明細書に組み込む）、ＰＤＧＦ−Ａ（配列番号：１２４および１２５）、ＰＤＧＦ−Ｂ（配列番号：１２６および１２７）およびｆａｌｌｏｔｅｉｎ（配列番号：１４８および１４９）を含むＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーのメンバーは、受容体を結合するドメイン内に十分な同族関係を共有しているため、ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃに関して実施例１が教える独特な接着末端を有するオリゴヌクレオチドの設計が可能である。
そして、実施例１〜３に記載の成功例から分かるように、３〜６塩基の短い接着末端であっても接着末端を有する二重らせんの断片が得られるよう設計されたオリゴヌクレオチドであれば、新規ハイブリッド分子への組換えは十分可能である（意図に反する変異はきわめて少ない）。
【０３６５】
接着末端が存在すると、望む順序で望む方向に断片を結合することがきわめて容易になるが、接着末端がなくても、断片の結合は実現可能であることが理解できよう。
上に記載する方法に従い、平滑末端の断片を合成し、アニールさせてハイブリッドタンパク質を作り出すこともできる。
平滑末端を使用する方法の場合、接着末端の形成を可能にするヌクレオチドの同一性が存在するか否か、母体分子の塩基配列を調べる必要はない。
しかし、望む順序で望む方向に断片を含むハイブリッドを確認するには、結合後の追加的なスクリーニングが必要になるかもしれない。
【０３６６】
以上の指針に基づき、実施例１の記載に従ってオリゴヌクレオチド対を設計しアニールして、二個以上のＶＥＧＦタンパク質のドメインを結合するための受容体ＤＮＡ断片を得る。
各種ＤＮＡ断片をコンビナトリアル的に結合させて新規ハイブリッドタンパク質を合成し、それらを、受容体との結合、および生物学的な特性、たとえば内皮細胞の増殖と移動の促進または抑止能力および脈管透過性変調能力などに関して、スクリーニングにかける。
【０３６７】
実施例１７
ＰＣＲによって推進されるＤＮＡシャッフリング法を使用する
ハイブリッド分子の創出
次に記載するプロトコルは、ハイブリッド脈管内皮成長因子をコードするポリヌクレオチドおよびポリペプチドを合成するための別法、「ＤＮＡシャッフリング」法である。
文献には、酵素、具体的には抗生物質抵抗性を与えるタンパク質や少数の別のタンパク質ファミリーのためのＤＮＡシャッフリング法が記載されている。
（例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １７：７９３〜７９７（１９９９）；Ｋｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ，２３６：１５９〜１６７（１９９９）；Ｈａｒａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， ＴＩＢＴＥＣＨ， １６：７６〜８２（１９９８）；Ｃａｒｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，　Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２８８２９１（１９９８）；Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：７２４〜７３３（１９９７）；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９４：４５０５〜０９（１９９７）；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，９１：１０７４７〜１０７４（１９９４）およびＳｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９〜３９１（１９９４）を参照。
これらすべての文献の全体を参照してここに組み込む）。
【０３６８】
最初に、二個以上のｃＤＮＡをコードする脈管内皮成長因子ポリペプチドをクローニングし、増幅させる。
好ましい実施形態では、ＶＥＧＦ受容体を結合する最小ドメインをコードするｃＤＮＡの該当する部分のみと、随意に、ｃＤＮＡからの小さい５’および３’追加配列とを増幅する。
【０３６９】
精製、分離したｃＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼおよび／またはデオキシリボヌクレアーゼＩで約１０〜７５塩基対の断片分解し、この所期サイズ範囲の断片を
（たとえば、アガロースゲル電気泳動法、電気溶離法およびエタノール沈殿法によって）精製し単離する。
【０３７０】
二個以上のＶＥＧＦから得られた精製分離した断片を混合し、自己開始ポリメラーゼ連鎖反応にかけ、断片を、新規ハイブリッド分子を形成するためにシャッフルする。
模範的なプロトコルがＫｉｋｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ（１９９９）およびＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）に記載されている。
元のｃＤＮＡ間の配列の一致度に基づいて、ＰＣＲ反応におけるアニール温度を調整し、適合が不完全な異種配列のアニーリングを可能にする。
プライマーなしでＰＣＲを２５〜５０回行ったのち、ＰＣＲ反応から一部を選択し、それを、元のｃＤＮＡの５’および３’配列に基づくプライマーによる第二ラウンドＰＣＲのテンプレートとして使用する。
得られる第二ラウンドＰＣＲ産生物を発現ベクターにクローニングするのを助けるためには、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をプライマーに組み込むことが好ましい。
【０３７１】
作製したクローンを発現ベクターに連結して形質転換させるか、宿主細胞に移入し、（もしあれば）それによってコードされた新規ハイブリッドＶＥＧＦポリペプチドを発現する。
上記実施例で述べた受容体結合法および／または活性アッセーを使ってタンパク質をスクリーニングし、望ましい受容体作動体／拮抗体プロフィールを持つポリペプチドをコードするクローンを選び出す。
【０３７２】
配列表の目次
配列番号：１および２は、ＶＥＧＦ−Ａの塩基配列およびアミノ酸配列である。
【０３７３】
配列番号：３〜１１は、ＶＥＧＦ−Ａの正プライマーである。
【０３７４】
配列番号：１２〜２０は、ＶＥＧＦ−Ａの逆プライマーである。
【０３７５】
配列番号：２１および２２は、ＶＥＧＦ−Ｃの塩基配列およびアミノ酸配列である。
【０３７６】
配列番号：２３〜３１は、ＶＥＧＦ−Ｃの正プライマーである。
【０３７７】
配列番号：３２〜４０は、ＶＥＧＦ−Ｃの逆プライマーである。
【０３７８】
配列番号：４１は、ｐＳｅｃＴａｇＩの塩基配列である。
【０３７９】
配列番号：４２および４３は、クローン１１−１の塩基配列およびアミノ酸配列である。
ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン（ＶＥＧＦ−ＡおよびＶＥＧＦ−Ｃから誘導）は、配列番号：４３のアミノ酸１〜１０２に対応する。
【０３８０】
配列番号：４４および４５は、クローン１１−１６の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：４５のアミノ酸１〜１０４）。
【０３８１】
配列番号：４６および４７は、クローン２２−１の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：４７のアミノ酸１〜１０３）。
【０３８２】
配列番号：４８および４９は、クローン２２−１６の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：４９のアミノ酸１〜１０５）。
【０３８３】
配列番号：５０〜５１は、クローン１２−１の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：５１のアミノ酸１〜１０２）。
【０３８４】
配列番号：５２〜５３は、クローン１２−２の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：５３のアミノ酸１〜１０２）。
【０３８５】
配列番号：５４〜５５は、クローン１２−３の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：５５のアミノ酸１〜１０２）。
【０３８６】
配列番号：５６〜５７は、クローン１２−４の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：５７のアミノ酸１〜１０２）。
【０３８７】
配列番号：５８〜５９は、クローン１２−５の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：５９のアミノ酸１〜１０２）。
【０３８８】
配列番号：６０〜６１は、クローン１２−６の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：６１のアミノ酸１〜１０２）。
【０３８９】
配列番号：６２〜６３は、クローン１２−７の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：６３のアミノ酸１〜１０２）。
【０３９０】
配列番号：６４〜６５は、クローン１２−８の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：６５のアミノ酸１〜１０２）。
【０３９１】
配列番号：６６〜６７は、クローン１２−９の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：６７のアミノ酸１〜１０４）。
【０３９２】
配列番号：６８〜６９は、クローン１２−１０の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：６９のアミノ酸１〜１０４）。
【０３９３】
配列番号：７０〜７１は、クローン１２−１１の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：７１のアミノ酸１〜１０４）。
【０３９４】
配列番号：７２〜７３は、クローン１２−１２の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：７３のアミノ酸１〜１０４）。
【０３９５】
配列番号：７４〜７５は、クローン１２−１３の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：７５のアミノ酸１〜１０４）。
【０３９６】
配列番号：７６〜７７は、クローン１２−１４の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：７７のアミノ酸１〜１０４）。
【０３９７】
配列番号：７８〜７９は、クローン１２−１５の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：７９のアミノ酸１〜１０４）。
【０３９８】
配列番号：８０〜８１は、クローン１２−１６の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：８１のアミノ酸１〜５４）。
【０３９９】
配列番号：８２〜８３は、クローン３１１２−１の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：８３のアミノ酸１〜１０３）。
【０４００】
配列番号：８４〜８５は、クローン３１−２の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：８５のアミノ酸１〜１０３）。
【０４０１】
配列番号：８６〜８７は、クローン３１−３の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：８７のアミノ酸１〜１０３）。
【０４０２】
配列番号：８８〜８９は、クローン３１−４の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：８９のアミノ酸１〜１０３）。
【０４０３】
配列番号：９０〜９１は、クローン３１−５の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：９１のアミノ酸１〜１０３）。
【０４０４】
配列番号：９２〜９３は、クローン３１−６の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：９３のアミノ酸１〜１０３）。
【０４０５】
配列番号：９４〜９５は、クローン３１−７の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：９５のアミノ酸１〜１０３）。
【０４０６】
配列番号：９６〜９７は、クローン３１−８の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：９７のアミノ酸１〜１０３）。
【０４０７】
配列番号：９８〜９９は、クローン３１−９の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：９９のアミノ酸１〜１０５）。
【０４０８】
配列番号：１００〜１０１は、クローン３１−１０の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１０１のアミノ酸１〜１０５）。
【０４０９】
配列番号：１０２〜１０３は、クローン３１−１１の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１０３のアミノ酸１〜１０５）。
【０４１０】
配列番号：１０４〜１０５は、クローン３１−１２の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１０５のアミノ酸１〜１０５）。
【０４１１】
配列番号：１０６〜１０７は、クローン３１−１３の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１０７のアミノ酸１〜１０５）。
【０４１２】
配列番号：１０８〜１０９は、クローン３１−１４の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１０９のアミノ酸１〜１０５）。
【０４１３】
配列番号：１１０〜１１１は、クローン３１−１５の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１１１のアミノ酸１〜１０５）。
【０４１４】
配列番号：１１２〜１１３は、クローン３１−１６の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１１３のアミノ酸１〜１０５）。
【０４１５】
配列番号：１１４および１１５は、Ｐ１ＧＦの塩基配列およびアミノ酸配列である。
【０４１６】
配列番号：１１６および１１７は、ＶＥＧＦ−Ｂの塩基配列およびアミノ酸配列である。
【０４１７】
配列番号：１１８および１１９は、ＶＥＧＦ−Ｄの塩基配列およびアミノ酸配列である。
【０４１８】
配列番号：１２０および１２１は、ＶＥＧＦ−Ｅの塩基配列およびアミノ酸配列である。
【０４１９】
配列番号：１２２および１２３は、ＶＮＺ２ ＶＥＧＦの塩基配列およびアミノ酸配列である。
【０４２０】
配列番号：１２４および１２５は、ＶＥＧＦ−Ａの塩基配列およびアミノ酸配列である。
【０４２１】
配列番号：１２６および１２７は、ＶＥＧＦ−Ｂの塩基配列およびアミノ酸配列である。
【０４２２】
配列番号：１２８〜１３６は、Ａ１〜Ａ９断片のアミノ酸配列である。
【０４２３】
配列番号：１３７〜１４５は、Ｃ１〜Ｃ９断片のアミノ酸配列である。
【０４２４】
配列番号：１４６および１４７は、ＶＥＧＦ−Ａの２３２アミノ酸がイソ型の塩基配列およびアミノ酸配列である。
【０４２５】
配列番号：１４８および１４９は、ｆａｌｌｏｔｅｉｎの塩基配列およびアミノ酸配列である。
【０４２６】
配列番号：１５０および１５１は、Ｄ１７０１ ＶＥＧＦの塩基配列およびアミノ酸配列である。
【０４２７】
配列番号：１５２および１５３は、クローン１４−９の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１５３のアミノ酸１〜１０４）。
【０４２８】
配列番号：１５４および１５５は、クローン２３−１０の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１５５のアミノ酸１〜１０５）。
【０４２９】
配列番号：１５６および１５７は、クローン３２−１４の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１５７のアミノ酸１〜１０５）。
【０４３０】
配列番号：１５８および１５９は、クローン５２−１５の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１５９のアミノ酸１〜１０５）。
【０４３１】
配列番号：１６０および１６１は、クローン５３−３の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１６１のアミノ酸１〜１０３）。
【０４３２】
配列番号：１６２および１６３は、クローン８２−７の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１６３のアミノ酸１〜１０２）。
【０４３３】
配列番号：１６４および１６５は、クローン８２−９の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１６５のアミノ酸１〜１０４）。
【０４３４】
配列番号：１６６および１６７は、クローン８２−１１の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１６７のアミノ酸１〜１０４）。
【０４３５】
配列番号：１６８および１６９は、クローン８２−１３の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１６９のアミノ酸１〜１０４）。
【０４３６】
配列番号：１７０および１７１は、クローン８３−１５の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１７１のアミノ酸１〜１０４）。
【０４３７】
配列番号：１７２および１７３は、クローン８４−９の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１７３のアミノ酸１〜１０４）。
【０４３８】
配列番号：１７４および１７５は、クローン８４−１１の塩基配列およびアミノ酸配列である（ＶＥＧＦ受容体結合ドメイン＝配列番号：１７５のアミノ酸１〜１０４）。
【０４３９】
本明細書で引用したすべての文献および特許は、それら全体を参考までに本明細書に組み込む。
【０４４０】
具体的な実施例に沿って本発明を説明してきたが、当業者が様々な変更態様を想到できることは容易に理解されよう。
従って、特許請求の範囲に記載の制限のみが、本願発明に付加されるべきである。
【０４４１】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】選択２次構造要素が同定される、ＶＥＧＦ−Ａ単量体の３次元モデルの斜視図を描いている。ＶＥＧＦ−Ａ−コードポリヌクレオチドは、ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃキメラの構築物に関して、９つのセグメントに分けられ、また、標識１〜９が、その９つのセグメントのそれぞれによりコードされるペプチドの位置を同定する。
【図２】ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦ−Ｃハイブリッド分子を構築するのに使用された９つのＶＥＧＦ−Ａと９つのＶＥＧＦ−Ｃ　ＤＮＡ断片の略図である。これら断片は上面に１から９まで番号が振られている。
断片のＮ１２３、Ｎ４５、Ｃ６７、Ｃ８９グループもまた表記されている。
Ｎ１２３は３つのＶＥＧＦ−Ａ断片と３つのＶＥＧＦ−Ｃ断片と（断片１〜３）からなり、一方、Ｎ４５（断片４〜５）、Ｃ６７（断片６〜７）、Ｃ８９（断片８〜９）は、それぞれ、２つのＶＥＧＦ−Ａ断片と、２つのＶＥＧＦ−Ｃ断片からなる。
選択された制限エンドヌクレアーゼ部位もまた描かれている。
【図３】ＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦ−Ｃから断片４と５の異なる組み合わせを結合させることから結果的に生じたＣ６７領域に相当する全ての４つの可能性のあるＤＮＡ分子を図式的に描いている。
【図４】ＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦ−Ｃから断片４と５の異なる組み合わせを結合させることから結果的に生じたＮ４５領域に相当する全ての４つの可能性のあるＤＮＡ分子を図式的に描いている。
【図５】ＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦ−Ｃから断片６と７の異なる組み合わせを結合させることから結果的に生じたＣ６７領域に相当する全ての４つの可能性のあるＤＮＡ分子を図式的に描いている。
【図６】ＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦ−Ｃから断片８と９の異なる組み合わせを結合させることから結果的に生じたＣ８９領域に相当する全ての４つの可能性のあるＤＮＡ分子を図式的に描いている。
【図７】ボックスの中に、ＤＮＡ断片Ａ１〜Ａ９（配列番号：１２８〜１３６）と、Ｃ１〜Ｃ９（配列番号：１３７〜１４５）によりコードされているアミノ酸配列を描き、また、より長くコードされているアミノ酸配列がＮ１２３ライゲーションにおける断片Ａ１〜Ａ３とＣ１〜Ｃ３の結合により形成されたやり方を描いており（図７Ａ）、Ｎ４５ライゲーションにおける断片Ａ４〜Ａ５とＣ４〜Ｃ５の結合により形成されたやり方を描いており（図７Ｂ）、Ｃ６７ライゲーションにおける断片Ａ６〜Ａ７とＣ６〜Ｃ７の結合により形成されたやり方を描いており、Ｃ８９ライゲーションにおける断片Ａ８〜Ａ９とＣ８〜Ｃ９の結合により形成されたやり方を描いている。
各図では、矢印は、適合性ＤＮＡ断片の適当なライゲーションから結果的に生じるコードアミノ酸配列間のペプチド結合と、結果的に連結したＤＮＡの翻訳を表わしている。
【図８】ＶＥＧＦ−Ａ二量体の２つのＶＥＧＦＲ−１分子との相互作用を示す３次元モデルである。
ＶＥＧＦＲ−１と界面上で接続するために重要なＶＥＧＦ−Ａ単量体内の残基は、ＶＥＧＦ−Ａ二量体の２つの端部でクラスター化され、また、Ｎ末端へリックスとβ５鎖の一部分を含む。
【図９】ＶＥＧＦ−Ｃ二量体により形成された溝を描いている３次元モデルである。
この溝の入口と両側は、実施例４で説明されている断片により形成され、ＶＥＧＦＲ−３特異性を与えるために重要であると考えられている。
【図１０】ＶＥＧＦ−Ｃ二量体と、単一ＶＥＧＦＲ−３分子との間の相互作用についての３次元モデルであり、ＶＥＧＦ−Ａ／ＶＥＧＦＲ−Ａモデルから補外されたものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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