(57)【要約】ジアミノジカルボン酸：ペプチド双子型界面活性化合物が開示される。ジアミノジカルボン酸：ペプチド系双子型界面活性化合物の使用及びその製造方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジアミノジカルボン酸主鎖を有し、式(I)：
【化１】
2004520316.tif 000022
[式中、
X=(CH2)n2であり、n2は1〜8であり、n1は0であるか；
X=NHC(O)(CH2)n3C(O)NHであり、n3は1〜8であり、n1は2〜4であるか；又は
X=(CH2)n4NHC(O)(CH2)n5C(O)NH(CH2)n4であり、n4は2〜4であり、n5は1〜8であり、n1は0であり；
且つ
R3、R4、R5及びR6は水素であるか；
R3及びR5は水素であり、R4とR6は同じであっても異なっていてもよく、アミド(CONH)結合により互いに連結された1個以上のアミノ酸から形成され、さらにアミド結合によりジアミノジカルボン酸主鎖に連結されており、一般式(II)：
【化２】
2004520316.tif 000023
(式中、p1及びp2の値は、同じであっても異なっていてもよく0〜5であり、好ましくは1であり；
p3及びp4の値は、同じであっても異なっていてもよく0〜5であり、好ましくは0であり；
A1、A3及びA4は、同じであっても異なっていてもよくセリン、リジン、オルニチン、トレオニン、ヒスチジン、システイン、アルギニン及びチロシンから選択されるアミノ酸であり、A2はリジン、オルニチン及びヒスチジンから選択されるアミノ酸である）
を有する直鎖もしくは分枝鎖のペプチド基であるか；又は
R4及びR6は、同じであっても異なっていてもよく式(III)：
【化３】
2004520316.tif 000024
を有する基であり、R3及びR5は、同じであっても異なっていてもよく式(IV)：
【化４】
2004520316.tif 000025
を有する基であり（ここで、式(III)、式(IV)中、p1、p2、p3及びp4は、同じであっても異なっていてもよく0〜5であり；
mは0〜5であり；qは1〜5であり；
A1〜A4は上記で定義された通りである)；
且つ
R1及びR2は最大32個の炭素原子を有し、アミド結合によりジアミノジカルボン酸主鎖に連結された飽和又は不飽和アミノヒドロカルビル基である]
で表される一般構造に一致するジアミノジカルボン酸：ペプチド系双子型化合物、又はその塩、好ましくは製薬上許容し得る塩。
【請求項２】
対称的である、すなわち、R1とR6が同じであり、R2とR4が同じであり、R3とR5が同じである、請求項１に記載のジアミノジカルボン酸：ペプチド系双子型化合物。
【請求項３】
式(II)のペプチド基において、p1及びp2が共に1であり、p3及びp4が共に0である、請求項１又は２に記載のジアミノジカルボン酸：ペプチド系双子型化合物。
【請求項４】
A1がセリンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のジアミノジカルボン酸：ペプチド系双子型化合物。
【請求項５】
A2がリジンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のジアミノジカルボン酸：ペプチド系双子型化合物。
【請求項６】
アミノヒドロカルビル基が、
-NH(CH2)11CH3
-NH(CH2)13CH3
-NH(CH2)15CH3
-NH(CH2)17CH3
-NH(CH2)19CH3
-NH(CH2)23CH3
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)5CH3
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3
-NH(CH2)8CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3
-NH(CH2)8(CH=CHCH2)3CH3
-NH(CH2)4CH=CH(CH2CH=CH)3(CH2)4CH3
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)5CH3トランス
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3トランス
-NH(CH2)9CHCH3(CH2)7CH3
から選択される、請求項１に記載のジアミノジカルボン酸：ペプチド系双子型化合物。
【請求項７】
アミノヒドロカルビル基が、
-NH(CH2)11CH3
-NH(CH2)13CH3
-NH(CH2)15CH3
-NH(CH2)17CH3
-NH(CH2)19CH3
-NH(CH2)23CH3
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)5CH3
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3
-NH(CH2)8CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3
-NH(CH2)8(CH=CHCH2)3CH3
-NH(CH2)4CH=CH(CH2CH=CH)3(CH2)4CH3
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)5CH3トランス
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3トランス
-NH(CH2)9CHCH3(CH2)7CH3
-NHCH2CHOH(CH2)2CH3
-N((CH2)15CH3)2
から選択される、請求項１に記載のジアミノジカルボン酸：ペプチド系双子型化合物。
【請求項８】
下記式で表される化合物。
【化５】
2004520316.tif 000026
【請求項９】
下記式で表される化合物。
【化６】
2004520316.tif 000027
【請求項１０】
下記式で表される化合物。
【化７】
2004520316.tif 000028
【請求項１１】
式：
【化８】
2004520316.tif 000029
で表される化合物GSC61。
【請求項１２】
式：
【化９】
2004520316.tif 000030
で表される化合物GSC144。
【請求項１３】
式：
【化１０】
2004520316.tif 000031
で表される化合物GSC150。
【請求項１４】
in vitro及びin vivoで細胞へのポリヌクレオチドの送達を行うための請求項１に記載のジアミノジカルボン酸：ペプチド系双子型化合物の使用。
【請求項１５】
in vitro及びin vivoで細胞への非ヌクレオチド系薬剤化合物の送達を行うための請求項１に記載のジアミノジカルボン酸：ペプチド系双子型化合物の使用。
【請求項１６】
前記化合物を、
(i) 中性担体；及び
(ii) 錯化剤
からなる群より選択される1種以上の補助剤と組合せて使用する、請求項１４又は１５に記載のジアミノジカルボン酸：ペプチド系双子型化合物の使用。
【請求項１７】
前記中性担体がジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記錯化剤が、
i) PLUS試薬；
ii) 主に塩基性アミノ酸を含むペプチド；
iii) 塩基性アミノ酸からなるペプチド；ならびに
iv) リジン及びアルギニンから選択される塩基性アミノ酸からなるペプチド
からなる群より選択される、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規に同定されたジアミノジカルボン酸：ペプチド系双子型(gemini)界面活性化合物、そのような化合物の使用、及びその製造に関する。本発明はまた、薬剤送達のための細胞への化合物の輸送を容易にするためのジアミノジカルボン酸：ペプチド系双子型化合物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
界面活性剤は、低濃度であっても、液体の表面特性に顕著に影響を与える物質である。例えば、界面活性剤は、水又は水性溶液に溶解した場合、表面張力を有意に低下させ、2種の液体間又は液体と固体の間の界面張力を低下させる。界面活性分子のこの特性は、工業、特に洗剤及び油工業において幅広く利用されてきた。1970年代に、疎水性架橋により連結された極性頭部を有する2つの疎水性鎖を特徴とする、新しいクラスの界面活性分子が報告された(Deinega, Yら、Kolloidn. Zh. 36, 649, 1974)。「双子型」(Menger, FM及びLittau, CA, J. Am. Chem. Soc. 113, 1451, 1991)と呼ばれたこれらの分子は、そのモノマー対応物と比較して非常に望ましい特性を有している。例えば、それらは、油及び水に基づく液体間の界面張力の低下において非常に有効であり、極めて低い臨界ミセル濃度を有する。
【０００３】
陽イオン性界面活性剤は特に、培養細胞へのポリヌクレオチドのトランスフェクションに用いられてきたが、これらは遺伝子技術に関わる科学者のために市販されている薬剤の例である(例えば、Promega Corp. WI, USAから入手可能な真核細胞のトランスフェクションのための試薬TfxTM-50)。
【０００４】
遺伝子治療又はアンチセンス治療のための、in vivoでの細胞へのDNAの効率的な送達はここ数年の主要な目標であった。送達ビヒクルとしてのウイルス、例えば、嚢胞性線維症(CF)の正確な遺伝子治療の目的で、気管の上皮細胞に対するアデノウイルスの使用に多くの注目が集められてきた。しかしながら、CF患者における遺伝子導入のいくつかの成功の証拠にも拘わらず、アデノウイルス経路には炎症性副作用及び導入遺伝子の限定的一過性発現に起因する問題がある。陽イオン性界面活性剤を使用する研究を含む、in vivoでの遺伝子送達のためのいくつかの代替的な方法が調査されてきた。Gao, Xら(1995) Gene Ther. 2, 710-722は、陽イオン脂質を担持するアミンを用いて、CFマウスの気道上皮中への嚢胞性線維症膜貫通調節因子(CFTR)の正常ヒト遺伝子を用いるこの手法の実現可能性を証明した。このグループは続いてリポソーム性CF遺伝子治療試験を行い、部分的な成功のみではあったが、ヒトにおけるこの手法に関する可能性を証明した(Caplen, NJ.ら、Nature Medicine, 1, 39-46, 1995)。より最近では、他のグループが、例えば、コレステロール誘導体について、遺伝子送達のための他の陽イオン性脂質の可能性を調査している(Oudrhiri, Nら、Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 1651-1656, 1997)。この限定的研究は、in vitro及びin vivoの双方で上皮細胞への遺伝子の導入を容易にするこれらのコレステロールに基づく化合物の能力を証明することによって、この一般的手法の有効性を支持した。
【発明の開示】
【０００５】
これらの研究、及びその他の研究は、この新しい研究分野において、in vitroでの細胞に基づく実験におけるトランスフェクション並びにin vivoでの遺伝子治療及びアンチセンス治療の双方のために、細胞へのポリヌクレオチドの効率的な導入を容易にする新規な低毒性界面活性分子を開発する継続的必要性が存在することを示している。本発明は、既存の化合物により示される困難を克服することを追求する。
【０００６】
最近、遺伝子トランスフェクション特性を有するいくつかのペプチド系双子型界面活性剤が国際公開第99/29712号パンフレット(SmithKline Beecham)に開示された。
【０００７】
本発明は、ジアミノジカルボン酸主鎖を有し、式(I)：
【化１】
2004520316.tif 000002
【０００８】
[式中、
X=(CH2)n2であり、n2は1〜8であり、n1は0であるか；
X=NHC(O)(CH2)n3C(O)NHであり、n3は1〜8であり、n1は2〜4であるか；又は
X=(CH2)n4NHC(O)(CH2)n5C(O)NH(CH2)n4であり、n4は2〜4であり、n5は1〜8であり、n1は0であり；
且つ
R3、R4、R5及びR6は水素であるか；
R3及びR5は水素であり、R4とR6は同じであっても異なっていてもよく、アミド(CONH)結合により互いに連結された1個以上のアミノ酸から形成され、さらにアミド結合によりジアミノジカルボン酸主鎖に連結されており、一般式(II)：
【化２】
2004520316.tif 000003
【０００９】
(式中、p1及びp2の値は、同じであっても異なっていてもよく0〜5であり、好ましくは1であり；
p3及びp4の値は、同じであっても異なっていてもよく0〜5であり、好ましくは0であり；
A1、A3及びA4は、同じであっても異なっていてもよくセリン、リジン、オルニチン、トレオニン、ヒスチジン、システイン、アルギニン及びチロシンから選択されるアミノ酸であり、A2はリジン、オルニチン及びヒスチジンから選択されるアミノ酸である）
を有する直鎖もしくは分枝鎖のペプチド基であるか；又は
R4及びR6は、同じであっても異なっていてもよく式(III)：
【化３】
2004520316.tif 000004
【００１０】
を有する基であり、R3及びR5は、同じであっても異なっていてもよく式(IV)：
【化４】
2004520316.tif 000005
【００１１】
を有する基であり（ここで、式(III)、式(IV)中、p1、p2、p3及びp4は、同じであっても異なっていてもよく0〜5であり；
mは0〜5であり；qは1〜5であり；
A1〜A4は上記で定義された通りである)；
且つ
R1及びR2は最大32個の炭素原子を有し、アミド結合によりジアミノジカルボン酸主鎖に連結された飽和又は不飽和アミノヒドロカルビル基である]
で表される一般構造に一致するジアミノジカルボン酸：ペプチド系双子型化合物、又はその塩、好ましくは製薬上許容し得る塩に関する。
【００１２】
好ましくは、前記化合物は対称的であり、すなわち、R1とR2は同じであり、R3とR5は同じであり、R4とR6は同じである。
【００１３】
好ましい実施形態において、A1はセリン又はトレオニン、好ましくはセリンである。好ましくは、A3及びA4はリジン、オルニチン、ヒスチジン又はアルギニンである。
【００１４】
さらに好ましい実施形態において、前記アミノヒドロカルビル基は、
-NH(CH2)11CH3
-NH(CH2)13CH3
-NH(CH2)15CH3
-NH(CH2)17CH3
-NH(CH2)19CH3
-NH(CH2)23CH3
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)5CH3
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3
-NH(CH2)8CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3
-NH(CH2)8(CH=CHCH2)3CH3
-NH(CH2)4CH=CH(CH2CH=CH)3(CH2)4CH3
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)5CH3トランス
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3トランス
-NH(CH2)9CHCH3(CH2)7CH3
-NHCH2CHOH(CH2)2CH3
-N((CH2)15CH3)2
-NH(CH2)8C≡C(CH2)7CH3
-NH(CH2)11CH3
-NH(CH2)13CH3
-NH(CH2)15CH3
-NH(CH2)17CH3
-NH(CH2)19CH3
-NH(CH2)23CH3
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)5CH3
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3
-NH(CH2)8CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3
-NH(CH2)8(CH=CHCH2)3CH3
-NH(CH2)4CH=CH(CH2CH=CH)3(CH2)4CH3
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)5CH3トランス
-NH(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3トランス
から選択される。
【００１５】
本発明の化合物は、当業者には公知の合成ペプチド化学を用いて容易に入手可能な出発物質から調製することができる。図1に示されるスキームは、アミノヒドロカルビル基をアミド結合によりジアミノジカルボン酸部分に連結させる本発明の化合物の合成に関する一般的スキームを示し、図2に示されるスキームは、頭部基がジアミノ酸部分のα-アミノ基にアミド結合により連結された二酸である本発明の化合物の合成に関する一般的スキームを示し、図3に示されるスキームは、頭部基がジアミノ酸部分の非α-アミノ基にアミド結合により連結された二酸である本発明の化合物の合成に関する一般的スキームを示す。
【００１６】
本発明の別の態様は、ジアミノジカルボン酸：ペプチド系双子型化合物の使用方法に関する。そのような使用としては、全生物におけるアンチセンス治療、遺伝子治療及び遺伝子免疫化(抗体産生のため)のために、細胞中へのオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの導入を容易にすることが挙げられる。他の使用としては、例えば、特に、遺伝子発現研究及びアンチセンス制御実験においてそのような導入が必要である場合、培養細胞へのポリヌクレオチドのトランスフェクションを容易にするために本発明の化合物を用いることが挙げられる。このポリヌクレオチドを前記化合物と混合し、細胞に添加し、インキュベートしてポリヌクレオチドを取り込ませる。さらにインキュベートした後、トランスフェクトされたDNAによりもたらされた表現型特性について細胞をアッセイするか、又は該DNAから発現されたmRNAのレベルをノーザンブロッティングもしくは例えば、Taqman(登録商標)法(Perkin Elmer, Connecticut, USA)などのPCRに基づく定量法を用いることにより測定することができる。本発明の化合物は、従来技術の化合物と比較して、培養細胞へのDNAの細胞取り込みの効率を、典型的には3〜6倍、有意に改善させる。トランスフェクションプロトコルにおいて、前記双子型化合物を1種以上の補助剤と組合せて使用して、トランスフェクションの効率を増加させることができる。そのような補助剤を、例えば、(i)中性担体、例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)(Farhood, H.,ら、(1985) Biochim. Biophys. Acta 1235 289);(ii) 錯化剤、例えば、市販のPLUS試薬(Life Technologies Inc. Maryland, USA)又は、ポリリジンもしくはポリオルニチンペプチドなどのペプチド又は主にではあるが、独占的にではなく、塩基性アミノ酸、例えば、リジン、オルニチン及び／もしくはアルギニンなどを含むペプチドから選択することができる。上記のリストは包括的であることを意図するものではなく、トランスフェクションの効率を増加させる他の補助剤も本発明の範囲内にある。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の化合物を用いた遺伝子治療における遺伝物質の導入に関する。
【００１８】
さらに別の本発明の態様は、本発明の化合物を用いてin vitro及びin vivoでの細胞への非ヌクレオチド系薬剤化合物の送達を行うための方法に関する。
【００１９】
以下の定義は本明細書で頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするために提供される。
【００２０】
「アミノ酸」とは、+H3NCH(R)CO2-という形態の二極性イオン(双極性イオン)を指す。これらは基Rの性質によって区別され、Rが水素と異なる場合、不斉でもあり、D及びLファミリーを形成する。例えば、R基が、非極性(例えば、アラニン、ロイシン、フェニルアラニン)又は極性(例えば、グルタミン酸、ヒスチジン、アルギニン及びリジン)である20種の天然アミノ酸が存在する。非天然アミノ酸の場合、Rは天然に見出されるアミノ酸には見出されない任意の他の基であってよい。
【００２１】
「ポリヌクレオチド」とは、一般的には、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドを指し、これは未修飾RNAもしくはDNA又は修飾RNAもしくはDNAであってもよい。「ポリヌクレオチド」は、限定されるものではないが、一本鎖及び二本鎖DNA、一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるDNA、一本鎖及び二本鎖RNA、並びに一本鎖及び二本鎖領域の混合物であるRNA、一本鎖もしくは、より典型的には二本鎖又は一本鎖及び二本鎖領域の混合物であってもよいDNA及びRNAを含むハイブリッド分子を含む。さらに、「ポリヌクレオチド」はRNAもしくはDNA又はRNA及びDNAの双方を含む三本鎖領域を指す。用語「ポリヌクレオチド」はまた、安定性又は他の理由のために1種以上の修飾塩基と修飾された骨格を有するDNA又はRNAとを含むDNA又はRNAを含む。「修飾」塩基としては、例えば、トリチル化塩基及び通常でない塩基、例えば、イノシンが挙げられる。種々の改変がDNA及びRNAに対してなされた。従って、「ポリヌクレオチド」は、典型的に天然に見出される化学的、酵素的もしくは代謝的に改変された形態のポリヌクレオチド、並びにウイルス及び細胞に特徴的なDNA及びRNAの化学的形態を包含する。「ポリヌクレオチド」はまた、しばしばオリゴヌクレオチドと呼ばれる比較的短いポリヌクレオチドをも包含する。
【００２２】
「トランスフェクション」とは、化学的又は物理的手段のいずれかにより細胞膜の改変を含む方法を用いた培養細胞中へのポリヌクレオチドの導入を指す。そのような方法は、例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載されている。ポリヌクレオチドは線状でも環状でも、一本鎖でも二本鎖であってもよく、該ポリヌクレオチドの複製又は該ポリヌクレオチドの一部を含む相同遺伝子もしくは異種遺伝子の発現を制御するエレメントを含んでもよい。
【実施例】
【００２３】
ここで、本発明を以下の実施例を用いて説明する。
【００２４】
実施例1
RG 00/184
【化５】
2004520316.tif 000006
【００２５】
D,L-α,ε-ジアミノピメリン酸(29.0 mmol; 5.52 g)を、THF／水 （1/1、50 ml)に溶解した後、NaOH(11.6 mmol; 2.55 g; 2.2当量)及びBoc2O(11.6 mmol; 13.94 g; 2.2当量)を加えた。混合物を室温にて一晩攪拌した。THFのほとんどを除去し、混合物をHCl 3MでpH 2に酸性化した。沈殿をクロロホルムで2回抽出した後、有機相を合わせ、続いて水及び塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させたところ、ビス-保護された化合物(9.52 g, 84％)が得られた。
【００２６】
実施例2
RG 00/190
【化６】
2004520316.tif 000007
【００２７】
実施例1のビス-Bocジアミノピメリン酸(7.07 g, 18.1 mmol)を、THF(160 mL)に溶解した後、N-ヒドロキシスクシンイミド(4.34 g, 37.7 mmol, 2.1当量)及びDCC(7.62 g, 36.9 mmol; 2.04当量)を加えた。混合物を室温にて20時間攪拌した。沈殿を濾過除去し、EtOAcで洗浄した。溶媒を除去し、残渣をEtOAcに再溶解し、0℃に冷却し、濾過した。溶媒を蒸発させた後、Et2Oを加えて固体を沈降させる。Et2Oの濾過後、白色の固体(9.81 g, 93％)が得られる。質量スペクトル(+ESI):607.2231 (M+Na)。
【００２８】
実施例3
RG 00/219
【化７】
2004520316.tif 000008
【００２９】
実施例2のビス活性化ジアミノピメリン酸誘導体(1.48 g, 2.53 mmol)をTHF(60 mL)に溶解した後、5 mlの水に溶解したオレイルアミン2.2当量(1.49 g, 5.57 mmol)及びK2CO3 2.2当量(0.77g, 5.57 mmol)を加えた。混合物を室温にて24時間攪拌しながら放置した。THFのほとんどを蒸発により除去した後、水(100 mL)を加えた。混合物をCHCl3(2 x 60 ml)で抽出した。合わせた有機相を塩水で洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、蒸発させた。残渣をシリカゲル上でエーテル／ジクロロメタン(1/2, v/v, rf:0.3)を用いるクロマトグラフィーにより精製したところ、白色の固体泡状物(1.68 g, 75％)が得られた。質量スペクトル(+ESI):911.7554 (M+Na)。
【００３０】
実施例4
RG 00/220
【化８】
2004520316.tif 000009
【００３１】
実施例3のジ-Boc保護されたRG 00/219 (1.50 g, 1.69 mmol)をCH2Cl2/TFAの1/1混合物(20 mL)中で1時間攪拌した。溶媒は蒸発させた。油性の残渣をCHCl3中に希釈し、1M K2CO3、水及び塩水で順に洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させたところ、黄色がかった固体が得られた。Et2O中で摩砕した後、濾過したところ、白色の粉末(1.15 g, 99％)が得られた。
【００３２】
実施例5
PG991005.1
【化９】
2004520316.tif 000010
【００３３】
ジアミンPG32788 100 mg(0.11 mmol)を、THF(10 ml)に溶解した後、水(2 ml)に溶解した炭酸カリウム2.2当量(34 mg;0.24 mmol)及びTHF(8 ml)に溶解したNα,Nε-ビス-ter-ブチル-カルバメート-L-リジン-L-セリン-O-スクシンイミダート(通常のペプチド合成により構築)2.05当量(0.22 mmol; 119 mg)を加えた。混合物を室温にて一晩攪拌した。THFのほとんどを除去した後、水(15 ml)を加えて、沈殿をクロロホルム(2 x 25 ml)で抽出した。有機相を合わせ、4％ NaHCO3 (15 mL)、水(15 mL)、4％クエン酸(15 mL)、水(15 mL)、塩水(15 mL)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濃縮したところ、160 mg(96％)のカップリング化合物が得られた。
【００３４】
実施例6
GSC61
【化１０】
2004520316.tif 000011
【００３５】
実施例5からのPG991005.1(155 mg, 0.102 mmol)を、メタノール／濃HClの混合物(1/1、20 ml)に溶解した。混合物を室温にて2時間攪拌した。溶媒を除去し、粗生成物を水(80 ml)に再溶解し、焼結融解漏斗(No3)上で濾過した後、凍結乾燥したところ、108 mg(83％)のGSC61が得られた。
【００３６】
実施例7
RG 00/265
【化１１】
2004520316.tif 000012
【００３７】
テトラヒドロフラン(180 ml)中のアジポイルクロリド(3.66 g, 20 mmol)の溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(4.60 g, 40 mmol, 2当量)及びトリエチルアミン(5.69 mL, 40 mmol, 2当量)を加えた。室温にて24時間後、溶媒を蒸発させ、残渣を希塩酸水溶液とクロロホルムの間に分配した。有機相を抽出し、水及び塩水で順に洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させたところ、白色の固体(5.99 g, 88％)が得られた。
【００３８】
NMR 1H(CDCl3): δ 1.69(m, 2H, CH3), 2.69 (m, 2H), 2.78 (s, 4H, スクシンイミド)。
【００３９】
実施例8
RG 00/274
【化１２】
2004520316.tif 000013
【００４０】
テトラヒドロフラン(150 mL)中のアジポイルジスクシンイミダート(1.50 g, 4.41 mmol)の攪拌された溶液に、30 mlの水に溶解したα-もしくはε-Boc-保護されたリジン(2.17 g, 8.82 mmol, 2当量)及び炭酸カリウム(1.30 g, 9.40 mmol, 2.1当量)を加えた。反応物を室温にて20時間攪拌する。THFのほとんどを除去し、混合物を3 M HClでpH 2に酸性化した。沈殿をクロロホルムで2回抽出した後、有機相を合わせ、水及び塩水で順に洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させたところ、白色の粉末(2.66 g, 77％)が得られた。
【００４１】
実施例9
RG 00/285
【化１３】
2004520316.tif 000014
【００４２】
テトラヒドロフラン(180 mL)中のジ-N-(N-ε-tert-ブチルカルボナート-リジニル)アジペート(2.30 g, 3.82 mmol)の溶液に、N-ヒドロキシスクシンイミド(0.90 g, 7.80 mmol, 2.05当量)及びDCC(1.57 g, 7.66 mmol, 2当量)を加えた。混合物を室温にて24時間攪拌し、DCUを濾過し、EtOAcで洗浄した(3 x 30 mL)。溶媒を蒸発させ、残渣をEtOAc(40 mL)に溶解し、沈殿を濾過した。蒸発させた後、油状物をEt2O中で結晶化させたところ、白色の粉末(2.80 g, 92％)が得られた。
【００４３】
実施例10
RG 00/292
【化１４】
2004520316.tif 000015
【００４４】
THF(80 mL)に溶解した実施例9のスクシンイミジルエステルRG 00/285(1.50 g, 1.88 mmol)の溶液に、水(10 mL)に溶解したオレイルアミン(1.01 g, 3.78 mmol, 2.02当量)及び炭酸カリウム(0.53 g, 3.83 mmol, 2.1当量)を加えた。反応物を室温にて20時間攪拌した。THFのほとんどを除去し、混合物を水とクロロホルムの間に分配した。有機相を抽出し、水、1 M HCl、水及び塩水で順に洗浄した。硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させた後、残渣をCHCl3/MeOH (97/3, v/v, Rf: 0.33)中、シリカゲル上でのクロマトグラフィーにより精製したところ、油状物(1.35 g, 65％)が得られた。質量スペクトル(+ESI):1123.89793 (M+Na)。
【００４５】
実施例11
RG 00/296
【化１５】
2004520316.tif 000016
【００４６】
実施例10のジ-Boc保護されたRG 00/292(1.20 g, 1.09 mmol)を、CH2Cl2/TFAの1/1混合物(20 mL)中で1時間攪拌した。溶媒を蒸発させた。油性残渣をCHCl3中で希釈し、1 M K2CO3、水及び塩水で順に洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させたところ、黄色がかった固体が得られた。Et2O中で摩砕した後、濾過したところ、白色の粉末(0.95 g, 97％)が得られた。質量スペクトル(+ESI):901.82280 (MH+)。
【００４７】
実施例12
RG 00/299
【化１６】
2004520316.tif 000017
【００４８】
THF/水混合物(9/1, 40 mL, v/v)中の実施例11からのジアミノRG 00/296(228 mg, 0.25 mmol)及びK2CO3(74 mg, 0.54 mmol, 2.1当量)の溶液に、活性化されたペプチドBoc2K-ε-K(Boc)-ε-K(Boc)-S-Osu(500 mg, 0.5 mmol, 2当量)を加えた。反応物を室温にて24時間攪拌した。減圧下でTHFのほとんどを除去した。4％ Na2CO3溶液(10 mL)を加え、水相をCHCl3(3 x 40 mL)で抽出した。合わせた有機相を水(20 mL)、4％クエン酸(20 mL)、水(20 mL)、塩水(20 mL)で順に洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させたところ、薄い黄色がかった固体(543 mg, 81％)が得られた。質量スペクトル(+ES):2666.848 (M+Na)。
【００４９】
実施例13
GSC 144
【化１７】
2004520316.tif 000018
【００５０】
MeOH(10 mL)中の実施例12からのBoc保護された双子型化合物RG 00/299(500 mg, 0.19 mmol)の溶液に、濃塩酸水溶液(10 mL)を加えた。反応物を室温にて1.5時間攪拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を水(80 mL)に溶解し、No3融解焼結物上で濾過した。水相を乾燥するまで蒸発させた。残渣をMeOH(4 mL)に溶解し、Et2Oを加えた。沈殿を回収したところ、薄い桃色の粉末(348 mg, 86％)が得られた。質量スペクトル(+ESI):1844.446 (MH+)。
【００５１】
実施例14
RG 00/348
【化１８】
2004520316.tif 000019
【００５２】
THF/水の9/1混合物(80 mL)中の実施例13からのジアミノ誘導体(255 mg, 0.28 mmol)及び炭酸カリウム(82 mg, 0.59 mmol, 2.1当量)の溶液に、Nα,Nε-ビス-ter-ブチル-カルバメート-L-リジン-L-セリン-O-スクシンイミダート(300 mg, 5.65 mmol, 2.05当量)を加えた。反応物を室温にて20時間攪拌した。蒸発によりTHFのほとんどを除去し、水性の残渣を4％ NaHCO3 (20 mL)で希釈した。次いで、水相をCHCl3(25 mL)で2回抽出した。合わせた有機相を水(10 mL)、0.01 M HCl(10 mL)、水(15 mL)及び塩水(20 mL)で順に洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、蒸発させたところ、白色の固体(462 mg, 94％)が得られた。
【００５３】
実施例15
GSC 150
【化１９】
2004520316.tif 000020
【００５４】
MeOH(10 mL)中の実施例14からの保護された双子型化合物RG 00/348(441 mg, 0.25 mmol)の溶液に、濃HCl(10 mL)を加えた。次いで、混合物を室温にて1時間攪拌した。溶媒を乾燥するまで蒸発させた。残渣を水(80 mL)に再溶解し、焼結融解漏斗(No3)上で濾過し、共溶媒としてエタノールを用いて蒸発させた。次いで、残渣をMeOH(5 mL)に溶解し、完全に沈降するまでEt2Oを加えた。固体をデカンテーションにより分離し、高圧下で乾燥させたところ、黄色がかった粉末(341 mg, 91％)が得られた。
【００５５】
実施例16-化合物GSC 112
化合物GSC 112は、本明細書に記載されたスキームに従って合成されるアミノピメリン双子型化合物であり、以下の構造を有する。
【化２０】
2004520316.tif 000021
【００５６】
実施例17-アミノピメリン及びアジペート-リジン：ペプチド系双子型界面活性化合物を用いる、細胞へのルシフェラーゼを発現する組換えプラスミドのトランスフェクション
トランスフェクション試験を、接着細胞系CHO-K1(Puckら、1958)を用いて実施した。完全培地は10％ v/vウシ胎仔血清及び1 x L-グルタミンを補給したMEMα培地からなっていた。全培地及び補給物はLife Technologiesから取得した。
【００５７】
in vitroでの遺伝子トランスフェクション
細胞を、96穴MTPプレート(Nunc)に播種し、16〜18時間後、約1 x 104細胞／ウェルの密度でトランスフェクションした。トランスフェクションのために、ウェルあたり0.064μgのルシフェラーゼレポーター遺伝子プラスミドpGL3-Control Vector (Promega)を、種々の濃度の双子型化合物GSC112又はGSC150と錯化剤と共に、最終容量100μlでインキュベートした。RTで30分インキュベートした後、OPTI-MEM(登録商標)培地(Life Technologies)をトランスフェクション混合物に添加し、溶液を細胞上に注いだ(ウェルあたりの最終容量：100μl)。37℃で3時間又は一晩インキュベートした後、トランスフェクション溶液を完全培地と置換し、細胞をさらに37℃でインキュベートした。トランスフェクションの約48時間後、レポーター遺伝子アッセイを製造業者のガイドライン(Roche Diagnostics)に従って実施した。Packard TopCount NXT Microplate Scintillation及びLuminescence Counter中でルミネッセンスを測定した。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】アミノヒドロカルビル基をアミド結合によりジアミノジカルボン酸部分に結合させる、本発明の化合物の合成のための一般的スキームを示す。
【図２】頭部基がジアミノ酸部分のα-アミノ基にアミド結合により結合された二酸である、本発明の化合物の合成のための一般的スキームを示す。
【図３】頭部基がジアミノ酸部分の非α-アミノ基にアミド結合により結合された二酸である、本発明の化合物の合成のための一般的スキームを示す。
【図４】双子型界面活性剤GSC112を用いたCHO-K1細胞のトランスフェクションを示す。x軸に沿った数字はμMでの双子型化合物の濃度を指す。図の右側の5つのバーの一群は、DNAをポリリジンと予め混合した場合に得られたデータを示す。図の左側の5つのバーの一群は、ポリリジンを用いない場合のデータを示す。Y軸上の数字は、ルシフェラーゼアッセイからのCPS(1秒あたりのカウント)を表す。バーは、4回の実験の平均CPS(1秒あたりのカウント)±平均の標準誤差を表す。
【図５】双子型界面活性剤GSC150を用いたCHO-K1細胞のトランスフェクションを示す。x軸に沿った数字はμMでの双子型化合物の濃度を指す。図の右側の5つのバーの一群は、DNAをポリリジンと予め混合した場合に得られたデータを示す。図の左側の5つのバーの一群は、ポリリジンを用いない場合のデータを示す。Y軸上の数字は、ルシフェラーゼアッセイからのCPS(1秒あたりのカウント)を表す。バーは、4回の実験の平均CPS(1秒あたりのカウント)±平均の標準誤差を表す。
【図１】
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【図２】
2004520316.tif 000033
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004520316.tif 000074
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