(57)【要約】ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（ＤＤＡＨ）もしくはそのフラグメントまたはアルギニンデイミナーゼ（ＤＩ）もしくはそのフラグメントを含む結晶をＸ線回折測定に供し、回折測定から構造座標を求めることによって得られる構造座標は、化学物質を同定し、選別し、特徴づけし、設計しまたは修飾するために使用される。そのようにして得られた化学物質は、治療方法において、またはＤＤＡＨもしくはＤＩの基質の存在の有無を確認するために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（ＤＤＡＨ）もしくはそのフラグメントまたはアルギニンデイミナーゼ（ＤＩ）もしくはそのフラグメントを含む結晶をＸ線回折測定に供することおよび回折測定から構造座標を求めることによって得られる、化学物質を同定し、選別し、特徴づけし、設計しまたは修飾するための、構造座標の使用。
【請求項２】
ＤＤＡＨが細菌ＤＤＡＨである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
細菌ＤＤＡＨが緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＤＤＡＨ（ＰａＤＤＡＨ）である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
ＤＩが緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＤＩ（ＰａＤＩ）である、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
ＤＤＡＨまたはＤＩが野生型ＤＤＡＨまたは野生型ＤＩの不活性な変異型である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＤＤＡＨまたはＤＩが、ＰａＤＤＡＨまたはＰａＤＩのＥ１１４またはＨ１６２またはＣ２４９に等価なアミノ酸を異なるアミノ酸に変異させることによって不活性にされている、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
異なるアミノ酸がアラニンまたは立体的に類似するアミノ酸である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
結晶が、基質または生成物に結合したＤＤＡＨまたはＤＩの結晶である、請求項５から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
化学物質を同定し、選別し、特徴づけし、設計しまたは修飾するための、表ＩＩに示されている構造座標の使用。
【請求項１０】
化学物質が修飾型ＤＤＡＨまたは修飾型ＤＩである、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
修飾型ＤＤＡＨまたは修飾型ＤＩが不活性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
化学物質がＤＤＡＨまたはＤＩに結合する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
化学物質がＤＤＡＨまたはＤＩの阻害剤または活性化因子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記請求項のいずれか一項に記載される化学物質。
【請求項１５】
治療によってヒトまたは動物の身体を処置する方法において使用される、請求項１４に記載の化学物質。
【請求項１６】
異常な一酸化窒素代謝が関係する状態を処置する方法において使用されるか、または細菌感染症を処置する方法において使用される、請求項１５に記載の化学物質。
【請求項１７】
修飾型ＤＤＡＨもしくは修飾型ＤＩである化学物質、またはＤＤＡＨもしくはＤＩに結合する化学物質を同定し、選別し、特徴づけしまたは設計するための方法であって、ＤＤＡＨまたはＤＩの構造モデルを前記化学物質に対する構造モデルと比較すること、それにより前記化学物質が修飾型ＤＤＡＨもしくは修飾型ＤＩであり得るか、または前記化学物質がＤＤＡＨもしくはＤＩに結合し得るかを決定することを含み、ＤＤＡＨの前記構造モデルが、請求項１から８のいずれか一項に記載されるＤＤＡＨもしくはＤＩまたはそれらのフラグメントを含む結晶をＸ線回折測定に供することによって決定される構造座標から得られる、前記方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法によって同定される化学物質。
【請求項１９】
治療によってヒトまたは動物の身体を処置する方法において使用される、請求項１８に記載の化学物質。
【請求項２０】
異常な一酸化窒素代謝が関係する状態を処置する方法において使用されるか、または細菌感染症を処置する方法において使用される、請求項１９に記載の化学物質。
【請求項２１】
請求項１４に記載の化学物質または請求項１８に記載の化学物質および医薬適合性のキャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項１４に記載される化学物質のまたは請求項１８に記載の化学物質の治療上有効量を宿主に投与することを含む、異常な一酸化窒素代謝が関係する状態にまたは細菌感染症に罹っている宿主を処置するための方法。
【請求項２３】
（ａ）サンプルを、請求項５から７のいずれか一項に記載のＤＤＡＨと、または請求項１０もしくは１１に記載される修飾型ＤＤＡＨと、または請求項１７に記載の方法によって同定された修飾型ＤＤＡＨと接触させること、および
（ｂ）ＤＤＡＨが非対称メチル化アルギニン誘導体に結合するかどうかを明らかにすること
を含む、サンプル中の非対称メチル化アルギニン誘導体の存在または非存在を同定するための方法。
【請求項２４】
ＤＤＡＨもしくはそのフラグメントまたはＤＩもしくはそのフラグメントを含む結晶。
【請求項２５】
ＤＤＡＨが請求項１から３または５から８のいずれか一項に記載のＤＤＡＨである、請求項２４に記載の結晶。
【請求項２６】
ＤＩが請求項１または４から８のいずれか一項に記載のＤＩである、請求項２４に記載の結晶。
【請求項２７】
請求項１から３または５から８のいずれか一項に記載のＤＤＡＨを含む物質の結晶を形成させることを含む、結晶の調製方法。
【請求項２８】
請求項１または４から８のいずれか一項に記載のＤＩを含む物質の結晶を形成させることを含む、結晶の調製方法。
【請求項２９】
請求項５から８のいずれか一項に記載のＤＤＡＨまたはＤＩ。
【請求項３０】
適切な装置によって読み取られたとき、請求項２４から２６に記載の結晶の三次元表示図を表示することができる装置読み取り可能なデータでコード化されたデータ保存物を含む装置読み取り可能なデータ保存媒体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、酵素の結晶およびそのような結晶の作製方法に関する。結晶の構造座標は、修飾された酵素である化学物質または酵素が結合する化学物質を同定または設計するために使用することができる。
【０００２】
（発明の背景）
広範囲の真核生物タンパク質におけるアルギニンのＮＧ−メチル化誘導体が長年知られているが、それらの機能は依然として十分には明らかにされていない。タンパク質内のアルギニンのメチル化はタンパク質−アルギニンメチルトランスフェラーゼ（ＰＲＭＴ）ファミリーの酵素によって行われる。メチル−アルギニン含有タンパク質のタンパク質分解により、自由なメチルアルギニン誘導体が細胞質内に放出される。メチルアルギニンのレベルは種々の組織間で非常に変化しており、上昇したレベルが様々な病理学的状態および臨床的障害で見出されている。２つの非対称メチル化アルギニン誘導体、すなわち、ＮＧ，ＮＧ−ジメチル−Ｌ−アルギニン（ＡＤＭＡ）およびＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）のシトルリンおよびモノメチルアミンまたはジメチルアミンへの異化作用が、ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（ＤＤＡＨ、ＥＣ３．５．３．１８）によって行われる。しかし、この酵素は、対称的なＮＧ，ＮＧ−ジメチル−Ｌ−アルギニン（ＳＤＭＡ）を加水分解しない。
【０００３】
ＡＤＭＡおよびＬ−ＮＭＭＡ（ＳＤＭＡではない）は、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）の３つのすべてのイソ型の可逆的な阻害剤であり、ＮＯＳの内因性調節因子としてインビボで作用し得る。従って、非対称メチル化アルギニン誘導体のレベルを制御するＤＤＡＨは、ＮＯＳの活性に間接的に影響を及ぼすその能力により治療的可能性を有し得る。
【０００４】
２つのヒトＤＤＡＨイソ型が同定されている（ＤＤＡＨＩおよびＤＤＡＨＩＩ）。このことはいくつかの他の動物にも当てはまる。２つの酵素は、神経型ＮＯＳまたは内皮型ＮＯＳのいずれともそれぞれ非常に一致する限定された組織分布を有する。このことは、メチルアルギニンを介してＮＯＳ活性を調節するイソ型特異的な機構を示唆している。より最近には、微生物のＤＤＡＨ酵素が同定された（Ｓａｎｔａ　Ｍａｒｉａら、１９９９）が、これまでのところ、それぞれの種には１つのイソ型が存在するだけである。細菌はＮＯＳを有しないので、それらの機能的役割は、哺乳動物における機能とは異なると考えられる。配列比較により、ヒトＤＤＡＨと、アルギニンをシトルリンおよびアンモニアに変換する微生物酵素であるアルギニンデイミナーゼ（ＤＩ、ＥＣ３．５．３．６）との類似性が示唆されている。
【０００５】
（発明の概要）
本発明者らは、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｕｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の細菌ＤＤＡＨ（ＰａＤＤＡＨ）の結晶構造を決定した。
【０００６】
従って、本発明により、化学物質を同定し、選別し、特徴づけし、設計しまたは修飾するための、ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（ＤＤＡＨ）もしくはそのフラグメントまたはアルギニンデイミナーゼ（ＤＩ）もしくはそのフラグメントを含む結晶をＸ線回折測定に供することおよび回折測定から構造座標を求めることによって得られる構造座標の使用が提供される。
【０００７】
本発明はまた、
・本発明による使用によって得られる化学物質；
・修飾型ＤＤＡＨもしくは修飾型ＤＩである化学物質またはＤＤＡＨもしくはＤＩに結合する化学物質を同定し、選別し、特徴づけしまたは設計するための方法であって、ＤＤＡＨまたはＤＩの構造モデルを前記化学物質に対する構造モデルと比較すること、およびそれにより前記化学物質が修飾型ＤＤＡＨもしくは修飾型ＤＩであり得るか、またはＤＤＡＨもしくはＤＩに結合し得るかを決定することを含み、ＤＤＡＨの前記構造モデルが、ＤＤＡＨもしくはＤＩまたはそれらのフラグメントを含む結晶をＸ線回折測定に供することによって決定される構造座標から得られる、前記方法；
・本発明の方法によって同定される化学物質；
・本発明の化学物質の治療効果的な量を宿主に投与することを含む、異常な一酸化窒素代謝が関係する状態にまたは細菌感染症に罹っている宿主を処置するための方法；
（ａ）サンプルを本発明の修飾型ＤＤＡＨと接触させること、および
（ｂ）修飾型ＤＤＡＨが非対称メチル化アルギニン誘導体に結合するかどうかを明らかにすること
を含む、サンプル中の非対称メチル化アルギニン誘導体の存在または非存在を同定するための方法；
・ＤＤＡＨもしくはそのフラグメントまたはＤＩもしくはそのフラグメントを含む結晶；
・ＤＤＡＨまたはＤＩを含む物質の結晶を形成させることを含む、結晶の調製方法；
・不活性な変異型であるＤＤＡＨまたはＤＩ；および
・適切な装置によって読み取られたとき、本発明の結晶の三次元表示図を表示することができる装置読み取り可能なデータでコード化されたデータ保存物を含む装置読み取り可能なデータ保存媒体；
を提供する。
【０００８】
（図面の簡単な説明）
図１は、ＤＤＡＨの全体的な折り畳みを示す。１０残基毎に番号が付けられている。
【０００９】
図２は、示された触媒作用残基（Ｓｅｒ（Ｓ、Ｃｙｓからの変異）；Ｈｉｓ（Ｈ）；Ｇｌｕ（Ｅ））およびシトルリン阻害剤（Ｃ）を有する、ＤＤＡＨの骨格のワーム表示図を示す。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明者は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｕｒｕｇｉｎｏｓａ）由来の細菌ＤＤＡＨ（ＰａＤＤＡＨ）を結晶化させることに成功した。これはＤＤＡＨの最初の結晶化である。これにより、ＰａＤＤＡＨの結晶構造を決定することができた。この結果、この酵素が、アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＴ、ＥＣ２．１．４．１）およびアルギニンデイミナーゼ（ＤＩ、ＥＣ３．５．３．６）を含むアルギニン修飾酵素の構造スーパーファミリーに属することが明らかにされる。ＰａＤＤＡＨの三次元構造が図１に示される。本発明者らはさらに、活性部位に関係する残基として、Ｇｌｕ１１４、Ｈｉｓ１６２およびＣｙｓ２４９を特定した。これらの残基のそれぞれの部位特異的変異誘発により、不活性な酵素が得られた。Ｃｙｓ：ｓｅｒ（Ｃ２４９Ｓ）変異型が、ＤＤＡＨ：基質（ＡＤＭＡ）複合体およびＤＤＡＨ：生成物（シトルリン）複合体（図２）の結晶構造の決定において使用された。これにより、活性部位の周りのリガンド結合残基を特定することができた。
【００１１】
この結晶化研究により、本発明者らは、ＤＤＡＨ酵素の構造座標を明らかにすることができた。本発明は、化学物質を同定し、特徴づけし、設計しまたは選別するための、アルギニン修飾酵素の構造座標の使用を提供する。具体的には、目的とする化学物質は、修飾されたアルギニン修飾酵素であるか、またはアルギニン修飾酵素に結合する化学物質である。目的とする具体的なアルギニン修飾酵素は各種のＤＤＡＨおよびＤＩである。
【００１２】
以前には、ＤＤＡＨまたはＤＩを結晶化することはできなかった。例えば、哺乳動物のＤＤＡＨを結晶化しようとする試みは成功しておらず、細菌細胞におけるＤＩの過剰発現は細胞死をもたらしている。本発明者らは、今回、変異させたとき、不活性なＰａＤＤＡＨを生じさせる残基を特定した。それらの残基はＰａＤＤＡＨおよびＤＩの間で保存されている。従って、今回、不活性なＤＩを作製することが可能であり、従って、そのような酵素を問題なく過剰発現させることが可能である。従って、本発明者らの結果を考慮して、今回、ＤＩの結晶化が初めて可能になった。さらに、細菌ＤＤＡＨおよび哺乳動物ＤＤＡＨとの類似性により、哺乳動物状況で使用される化学物質の設計における本発明者らの細菌データの使用が可能になる。
【００１３】
本発明の化学物質は、例えば、治療、診断、ＤＤＡＨまたはＤＩの基質濃度の定量、および他の研究適用において使用される。
【００１４】
典型的には、使用される構造座標は、化学物質を同定し、選別し、特徴づけし、設計しまたは修飾するために、ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ（ＤＤＡＨ）もしくはそのフラグメントまたはアルギニンデイミナーゼ（ＤＩ）を含む結晶をＸ線回折測定に供すること、および回折測定から構造座標を求めることによって得ることができる。
【００１５】
構造座標により、結晶内の個々の原子の位置が示され、そして化学物質を設計するとき、個々の原子の位置を適合させるための利用可能な空間が示される。
【００１６】
天然型ＰａＤＤＡＨの構造座標が表ＩＩに示され、Ｃ２４９Ｓ＋シトルリンの構造座標が表ＩＩＩに示される。そのような構造座標は、本発明による使用には好適である。さらに、表Ｉにおけるデータ統計値を解くことによって得られる構造座標を使用することができる。
【００１７】
Ｘ線回折法に供される結晶はＤＤＡＨもしくはそのフラグメントまたはＤＩもしくはそのフラグメントを含む。ＤＤＡＨまたはＤＩは任意の供給源に由来し得る。従って、ＤＤＡＨまたはＤＩは細菌ＤＤＡＨであってもよい。例えば、ＤＤＡＨまたはＤＩは、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｕｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｓｔｒｅｐｙｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒまたは結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来するＤＤＡＨであり得る。細菌のアルギニン修飾酵素の配列の例が、Ｓａｎｔａ　Ｍａｒｉａら、１９９９、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３３、１２７８〜１２７９に表されている。
【００１８】
あるいは、ＤＤＡＨは哺乳動物に由来し得る。そのような場合、ＤＤＡＨはＤＤＡＨＩ（例えば、ヒトＤＤＡＨＩ）またはＤＤＡＨＩＩ（例えば、ヒトＤＤＡＨＩＩ）であり得る。好適なヒトＤＤＡＨ配列が、Ｌｅｉｐｅｒら、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４３、２０９〜２１４に表されている。
【００１９】
ＤＤＡＨまたはＤＩのフラグメントもまた使用することができる。典型的には、好適なフラグメントは１０アミノ酸までの長さであり、または２０アミノ酸までの長さであり、または５０アミノ酸までの長さであり、または１００アミノ酸までの長さであり、または２００アミノ酸までの長さであり、または３００アミノ酸までの長さであり、または４００アミノ酸までの長さであり、または５００アミノ酸までの長さであり、またはＤＤＡＨポリペプチドもしくはＤＩポリペプチドの全長までである。
【００２０】
好ましいフラグメントは、研究中のＤＤＡＨまたはＤＩの活性部位を形成するために必要とされるアミノ酸のすべてを含むものである。他の好ましいフラグメントは、問題としているＤＤＡＨまたはＤＩの抗原性エピトープを形成するフラグメントである。
【００２１】
ＤＤＡＨは、完全なＤＤＡＨもしくはＤＩの修飾された形態またはそのフラグメントの修飾された形態であり得る。例えば、ＤＤＡＨまたはＤＩは、アミノ酸の挿入、アミノ酸の欠失、Ｎ末端もしくはＣ末端のアミノ酸付加、または別のアミノ酸によるアミノ酸置換によって修飾することができる。そのようなタイプの修飾は、本発明において使用される修飾型ＤＤＡＨまたは修飾型ＤＩを作製するために組み合わせることができる。アミノ酸置換は保存的置換であってもよい。１個、２個、３個、５個または１０個から２０個、３０個または５０個までの修飾を、対応する野生型のＤＤＡＨまたはＤＩの配列との比較において行うことができる。従って、本発明において使用されるＤＤＡＨまたはＤＩは変異型の配列であってもよい。すなわち、本発明において使用されるＤＤＡＨまたはＤＩは、対応する野生型の配列とは異なるポリペプチド配列を有し得る。典型的には、結晶化したとき、ＤＤＡＨもしくはＤＩの変異体またはそのフラグメントは、対応するＤＤＡＨもしくはＤＩまたはそのフラグメントが取る三次元構造に類似する三次元構造を取る。
【００２２】
変異型は不活性なＤＤＡＨまたはＤＩであってもよい。不活性なＤＤＡＨまたはＤＩは、変異型および野生型が、Ｌｅｉｐｅｒら、１９９９（上記）に記載される比色アッセイ使用して比較されたとき、対応する野生型酵素が示す酵素活性の２０％未満を示すものである。好ましくは、不活性な酵素は、対応する野生型酵素が示す酵素活性の１０％未満を示すものであるか、または好ましくは実質的に酵素活性を示さないものである。
【００２３】
好ましい不活性なＤＤＡＨまたはＤＩは、ＰａＤＤＡＨのＥ１１４またはＨ１６２またはＣ２４９と等価なアミノ酸において変異を有するものである。それらの残基は、ＰａＤＤＡＨにより触媒される反応に直接的に関与している。等価なアミノ酸は、他の緑膿菌種に由来するＤＤＡＨにおけるアミノ酸またはＤＩにおけるアミノ酸で、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ配列における特定のアミノ酸と類似／対応する位置に存在し、そして等価であるアミノ酸、例えば、触媒作用に関与するアミノ酸とほぼ同じ機能を果たすアミノ酸である。様々なアルギニン修飾酵素に対する等価なアミノ酸の例が表ＩＶに表される。例えば、ＰａＤＤＡＨと比較したとき、調べたほとんどの種について共通して、ＰａＤＤＡＨの触媒作用Ｇｌｕがヒト配列ではＡｓｐであることを除き、ヒトＤＤＡＨは、活性部位残基が保存されていることを示している。
【００２４】
等価なアミノ酸は、例えば、配列アラインメントを行うことによって当業者により容易に同定可能である。配列アラインメントを行うための様々なコンピュータープログラムが当業者に知られており、これには、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５、３３８９〜３４０２に記載されるようなＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴが含まれる。
【００２５】
本発明において使用されるＤＤＡＨまたはＤＩは化学修飾することができる。従って、特定のアミノ酸を重金属で標識することができ、例えば、メチオニン残基をセレンで標識することができる。本発明において使用されるＤＤＡＨまたはＤＩはまた翻訳後修飾され得る。例えば、本発明において使用されるＤＤＡＨまたはＤＩはグリコシル化され得るか、または修飾アミノ酸残基を含み得る。ＤＤＡＨまたはＤＩは、アミドおよびポリペプチドとの結合体を含む様々な形態のポリペプチド誘導体であり得る。
【００２６】
化学修飾されたＤＤＡＨまたはＤＩにはまた、官能性側鎖基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有するものが含まれる。そのような誘導体化された側鎖基には、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基およびホルミル基を形成するために誘導体化された基が含まれる。自由なカルボキシル基は、塩、メチルエステルおよびエチルエステルもしくは他のタイプのエステルまたはヒドラジドを形成させるために誘導体化することができる。自由なヒドロキシル基は、Ｏ−アシル誘導体またはＯ−アルキル誘導体を形成させるために誘導体化することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成させるために誘導体化することができる。
【００２７】
ＤＤＡＨまたはＤＩは、結晶化研究における使用のために、任意の好適な手段によって単離することができる。例えば、ＤＤＡＨまたはＤＩは、好適な供給源から生化学手段を使用して精製することができる。しかし、典型的には、ＤＤＡＨまたはＤＩを細胞で過剰に発現させ、ＤＤＡＨまたはＤＩをそのような細胞から精製することが便利である。従って、本明細書中に記載されるようなＤＤＡＨまたはＤＩをコードするポリヌクレオチドをベクターの構築において使用することができる。上記に規定されるような不活性なＤＤＡＨまたはＤＩをコードするポリヌクレオチドを使用することが必要になる場合がある。これは、活性なＤＤＡＨまたはＤＩの過剰発現により、細胞機能が、発現を所望のレベルまで生じさせることができない程度に破壊される場合には必要になることがある。
【００２８】
好ましくは、ベクター内のポリヌクレオチドは、構築物が宿主細胞に移されたとき、宿主細胞によるコード配列の発現をもたらし得る制御配列に機能的に連結される。すなわち、ベクターは発現ベクターである。用語「機能的に連結される（された）」は、記載された構成成分が、その意図された様式でその構成成分を機能させることができる関係にある位置関係にあることをいう。コード配列に「機能的に連結された」調節配列（プロモーターなど）は、調節配列と適合する条件のもとでコード配列の発現が達成されるような方法で配置される。
【００２９】
ベクターは、例えば、複製起点、場合により前記ポリヌクレオチドの発現に必要なプロモーター、そして場合によりプロモーターの調節因子を備えるプラスミドベクター、ウイルスベクターまたはファージベクターであり得る。ベクターは１つ以上の選択マーカー遺伝子を含有することができ、例えば、細菌プラスミドの場合にはアンピシリン耐性遺伝子を含有することができ、または真菌ベクターについては抵抗性遺伝子を含有することができる。ベクターは、宿主細胞（例えば、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物の宿主細胞）をトランスフェクションまたは形質転換するために使用することができる。
【００３０】
プロモーターおよび他の発現調節シグナルは、発現が計画された宿主細胞と適合し得るように選択することができる。例えば、酵母プロモーターには、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧＡＬ４プロモーターおよびＡＤＨプロモーター、Ｓ．ｐｏｍｂｅのｎｍｔ１プロモーターおよびａｄｈプロモーターが含まれる。哺乳動物性には、β−アクチンプロモーター、またはカドミウムなどの重金属に応答して誘導され得るメタロチオネインプロモーターなどのプロモーターが含まれる。ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーターまたはアデノウイルスプロモーターなどのウイルスプロモーターもまた使用することができる。これらのプロモーターはすべて、この分野では容易に得ることができる。ベクターはさらに、ＤＤＡＨまたはＤＩの発現において役立つポリヌクレオチドを生じさせるポリヌクレオチドに隣接する配列を含むことができる。
【００３１】
ＤＤＡＨまたはＤＩをコードするポリヌクレオチドを含む構築物は、細胞がＤＤＡＨまたはＤＩを発現するように、例えば、形質転換またはトランスフェクションによって細胞に移すことができる。そのような細胞はＤＤＡＨまたはＤＩを一時的または安定的に発現することができる。好適な細胞には、高等真核生物細胞株（例えば、哺乳動物細胞または昆虫細胞など）、下等真核生物細胞（酵母細胞など）、または原核生物細胞（細菌細胞など）を挙げることができる。細胞株は、適切な翻訳後修飾が生じるように選択することができる。本発明のタンパク質は、例えば、バキュロウイルス発現システムなどで、細胞株または膜において一時的に発現させることも可能である。本発明によるタンパク質を発現するようにされたそのようなシステムもまた本発明の範囲に含まれる。
【００３２】
ＤＤＡＨまたはＤＩは、当業者に知られている任意の方法に従って結晶化させることができる。
【００３３】
Ｘ線回折は、当業者に知られている任意の方法に従って行うことができる。Ｘ線回折実験から集められたデータは、当業者に十分に知られている方法を使用して、研究中のＤＤＡＨまたはＤＩの構造座標を求めるために処理することができる。
【００３４】
本発明はまた、基質または生成物に結合したＤＤＡＨもしくはそのフラグメントまたはＤＩもしくはそのフラグメントを含む結晶をＸ線回折測定に供し、回折測定から構造座標を求めることによって得られる構造座標の使用を提供する。好適な基質は、ＤＤＡＨの場合には、非対称メチル化アルギニン誘導体、例えば、ＮＧ，ＮＧ−ジメチル−Ｌ−アルギニン（ＡＤＭＡ）またはＮＧ−モノメチル−Ｌ−アルギニン（Ｌ−ＮＭＭＡ）であり、ＤＩの場合にはアルギニンである。好適な生成物は、ＤＤＡＨまたはＤＩの場合にはシトルリンである。
【００３５】
基質または生成物に結合したアルギニン修飾酵素を含む結晶が使用されるとき、典型的には、不活性形態のＤＤＡＨまたはＤＩが使用される。ＤＤＡＨまたはＤＩは、それらが基質に結合するが、その基質を実質的に代謝することができない意味で不活性である。別の好適な不活性なＤＤＡＨまたはＤＩは、典型的には、その生成物を代謝することなく生成物と結合することができる。好適な不活性なＤＤＡＨまたはＤＩは基質および生成物の両方と結合することができる。
【００３６】
本発明は、化学物質を同定し、特徴づけし、設計しまたは選別するための構造座標の使用を提供する。化学物質は、例えば、修飾型ＤＤＡＨもしくは修飾型ＤＩであり得るか、またはＤＤＡＨもしくはＤＩに結合する化学物質であり得る。ＤＤＡＨまたはＤＩに結合する化学物質は、例えば、そのようなＤＤＡＨまたはＤＩの阻害剤または活性化因子であり得る。
【００３７】
修飾型ＤＤＡＨまたは修飾型ＤＩは、その対応するＤＤＡＨまたはＤＩに対して異なる配列を有し得る。あるいは、修飾型ＤＤＡＨまたは修飾型ＤＩは、その対応する野生型の配列と同じ配列を有し得るが、１つ以上の化学修飾されたアミノ酸を含み得る。
【００３８】
好ましい修飾は、ＤＤＡＨまたはＤＩの活性特性を変化させるが、ＤＤＡＨまたはＤＩの形状を実質的に変化させない修飾である。
【００３９】
ＤＤＡＨまたはＤＩに結合する化学物質は、ＤＤＡＨまたはＤＩとの会合を形成し得る任意の化学物質である。化学物質は、ＤＤＡＨまたはＤＩに非特異的に結合することができ（そのような場合、化学物質は他の相手に結合する）、あるいはＤＤＡＨまたはＤＩに特異的に結合することができる。ＤＤＡＨまたはＤＩと結合する化学物質は小分子（例えば、小さい有機分子または無機分子）であり得る。あるいは、化学物質は大きい分子／高分子（例えば、ポリペプチドまたはペプチド）であり得る。ポリペプチドまたはペプチドは、例えば、抗体または抗体のフラグメントであり得る。
【００４０】
ＤＤＡＨまたはＤＩの阻害剤は、存在するとき、Ｌｅｉｐｅｒら（１９９９、上記）に記載される比色アッセイでＤＤＡＨ活性またはＤＩ活性の測定可能な低下を生じさせるものである。ＤＤＡＨまたはＤＩの活性化因子は、存在するとき、Ｌｅｉｐｅｒら（１９９９、上記）に記載される比色アッセイでＤＤＡＨ活性またはＤＩ活性の測定可能な増大を生じさせるものである。
【００４１】
好ましい阻害剤は、１μｇｍｌ−１、１０μｇｍｌ−１、１００μｇｍｌ−１、５００μｇｍｌ−１、１ｍｇｍｌ−１、１０ｍｇｍｌ−１、１００ｍｇｍｌ−１の阻害剤の濃度で、ＤＤＡＨ活性またはＤＩ活性を、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％低下させるものである。
【００４２】
好ましい活性化因子は、１μｇｍｌ−１、１０μｇｍｌ−１、１００μｇｍｌ−１、５００μｇｍｌ−１、１ｍｇｍｌ−１、１０ｍｇｍｌ−１、１００ｍｇｍｌ−１の活性化因子の濃度で、ＤＤＡＨ活性またはＤＩ活性を、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％または少なくとも１０００％増大させるものである。
【００４３】
阻害率または活性化率は、試験物質の存在下および非存在下でのアッセイの比較における活性の減少率または増大率を表す。阻害率または活性化率の上記に述べられた程度と、阻害剤または活性化因子の濃度とのいずれかの組合せを、本発明の阻害剤または活性化因子を定義するために使用することができる。この場合、より低い濃度でのより大きい阻害または活性化が好ましい。
【００４４】
阻害は、例えば、阻害剤が基質に類似し、そしてＤＤＡＨまたはＤＩの活性部位において結合する場合に生じ得る。従って、基質は、同じ活性部位への結合が妨げられ、そして触媒作用速度は、基質に結合する酵素分子の割合を低下させることによって減少する（競合的阻害）。阻害剤はまた、阻害剤および基質がＤＤＡＨまたはＤＩに同時に結合し、従って、種々の重ならない部位において結合し得る場合、非競合的な阻害によってその作用を示すことができる。阻害は、ＤＤＡＨまたはＤＩの代謝回転数が低下するときに生じる。
【００４５】
活性化は、例えば、調節因子がＤＤＡＨまたはＤＩに対する基質の親和性または逆の親和性を増大させる場合に生じ得る。このことは、基質に結合したＤＤＡＨ分子またはＤＩ分子の割合が増大し、従って、触媒作用の速度が増大することを意味する。
【００４６】
ＤＤＡＨ結晶またはＤＩ結晶の構造座標、具体的には、その基質に結合したＤＤＡＨまたはＤＩの結晶の構造座標により、当業者は、どのアミノ酸が活性部位の形成において重要であり得るか、そしてどのアミノ酸が基質および生成物との接触において重要であるかを予測することが可能になり得る。ＤＤＡＨペプチドまたはＤＩペプチドに結合した基質結合部位は、物理的なモデルによって二次元表示図（例えば、ＬＩＧＰＬＯＴのような表示図）もしくは三次元表示図として示されるか、またはコンピュータースクリーンにおける表示として示される。そのような表示図は、例えば、変化した活性特性を有するＤＤＡＨもしくはＤＩの設計においてＤＤＡＨもしくはＤＩの修飾を設計するために、またはＤＤＡＨもしくはＤＩと結合する化学物質を設計するために、またはＤＤＡＨもしくはＤＩと結合する化学物質に対する修飾を設計するために使用することができる。
【００４７】
修飾の例には、その基質または生成物に対するＤＤＡＨまたはＤＩの活性を増大させるための修飾が含まれる。そのようなタイプの修飾は、ＤＤＡＨもしくはＤＩの活性を増大させることができ、またはＤＤＡＨもしくはＤＩの基質に対する不活性なＤＤＡＨもしくはＤＩの親和性を増大させることができ、または問題とするＤＤＡＨもしくはＤＩの基質特異性を変化させることができる。あるいは、修飾は、化学物質がＤＤＡＨまたはＤＩと結合する親和性を増大させることができる。従って、様々な修飾を、知られている阻害剤または活性化因子が増大した親和性でＤＤＡＨまたはＤＩと結合し、従ってこれら阻害剤または活性化因子の効力を増大させるように、ＤＤＡＨまたはＤＩの知られている阻害剤または活性化因子に対して行うことができる。
【００４８】
ＤＤＡＨもしくはＤＩのその基質もしくは生成物に対する親和性、または化学物質のＤＤＡＨもしくはＤＩに対する親和性は、結合に有利な相互作用の量および数を増大させるために活性部位を修飾することによって増大させることができる。有利な相互作用は、基質もしくは生成物の結合部位または化学物質の構造を、水分子によって占有されていないこと、または水分子で満たされることが二次元表示図または三次元表示図で示される空間に拡大することによって増大させることができる。
【００４９】
構造の表示図は、ＤＤＡＨまたはＤＩの構造を改変するために他の方法で使用することができる。ＤＤＡＨまたはＤＩの活性部位の表示図は、ＤＤＡＨまたはＤＩが基質または生成物に結合するときにともに接近する原子間に共有結合を仮想的に導入することによって制約をモデル化するために使用することができる。１つ以上の化学的リンカーを、要求される立体配座に活性部位を拘束するためにＤＤＡＨもしくはＤＩの原子間に使用することができ、かつ／またはＤＤＡＨもしくはＤＩの１つ以上のアミノ酸を、活性部位の立体配座を拘束するために役立つ、天然型アミノ酸のアナログによって置換することができる。そのようなモデリングに基づいて、修飾型ＤＤＡＨまたは修飾型ＤＩを同定しまたは特徴づけしまたは設計しまたは選別するを行うことができる。
【００５０】
基質に結合した活性部位の表示図は、ＤＤＡＨまたはＤＩのどの残基が立体的障害に関与し得るかを予測するために使用することができる。そのような残基は、親和性を増大させるために、修飾または置換または欠失され、立体的障害を低下させることができる。
【００５１】
一般に、所望する分子構造を有する化学物質を同定しもしくは設計するためには、または目的とする別の化学物質の全体もしくは一部にその構造が類似する化学物質を同定するためには、コンピューターに基づいた方法で本発明に従って得られる構造座標を処理することが必要である。
【００５２】
従って、ＤＤＡＨもしくはそのフラグメントまたはＤＩもしくはそのフラグメントに類似する構造を有する化学物質を同定しまたは設計することができる。また、ＤＤＡＨまたはＤＩに結合する化学物質も同定しまたは設計することができる。好ましくは、そのようなタイプの化学物質はＤＤＡＨまたはＤＩの活性部位において結合する。
【００５３】
コンピューターに基づくそのような方法は、データベース法およびデノボ設計法の２つの広いクラスに分けられる。データベース法では、目的とする化学物質が、化学構造のデータベースに存在するすべての化学物質と比較され、目的とする化合物に対して何らかの点でその構造が類似する化学物質が同定される。データベース内の構造は、ＮＭＲもしくはＸ線結晶学によって得られた実験的データ、または二次元データに基づくモデル化された三次元構造のいずれかに基づく。デノボ設計法では、目的とする化合物に対して何らかの点でその構造が類似する化学物質のモデルが、既知の構造および／または理論的規則から導かれた情報を使用してコンピュータープログラムによって作製される。
【００５４】
構造座標を使用して、ＤＤＡＨまたはＤＩの表面（特に、活性部位）の三次元表示図を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ　Ｌｔｄ．（２４０／２５０　Ｔｈｅ　Ｑｕｏｒｕｍ、Ｂａｒｎｗｅｌｌ　Ｒｏａｄ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）から入手可能なＣａｔａｌｙｓｔ／ＳＨＡＰＥ、Ｃａｔａｌｙｓｔ／ＣＯＭＰＡＲＥ、ＤＢＳｅｒｖｅｒ　ＨｉｐＨｏｐ、Ｌｕｄｉ、ＭＣＳＳおよびＨｏｏｋなどのＣａｔａｌｙｓｔ　Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して作製することができる。修飾型ＤＤＡＨまたは修飾型ＤＩは、例えば、ＤＤＡＨに類似する表面を有する化合物を、コンピューターを使用して同定するか、または基質もしくは生成物と結合すると考えられる表面を有する化合物を、コンピューターを使用して設計するかのいずれかによって作製することができる。
【００５５】
様々な方法を、好ましくは活性部位においてＤＤＡＨまたはＤＩと結合する化学物質の表面と同じまたは類似する三次元表面を作製するために使用することができる。この形状に基づいて、Ｃａｔａｌｙｓｔ／ＳＨＡＰＥおよびＣａｔａｌｙｓｔ／ＣＯＭＰＡＲＥなどのパッケージを使用して、類似する三次元形状を有する化合物をデータベースから選択することができる。従って、ＤＤＡＨまたはＤＩと結合する化学物質を、例えば、類似する表面を有する化合物を、コンピューターを使用して同定するか、またはＤＤＡＨもしくはＤＩと結合すると考えられる表面を有する化合物を、コンピューターを使用して設計するかのいずれかによって作製することができる。
【００５６】
目的とする化合物と類似する活性を有する化合物を同定するためのデータベース法およびデノボ法の両方法が成功するかどうかは、目的とする化合物の機能的に関連する部分を同定することに依存する。ＤＤＡＨまたはＤＩと相互作用する化学物質の場合、機能的に関連する部分はファルマコホアと呼ばれる。ファルマコホアは、生物学的活性に重要な構造的特徴部および官能基の配置である。同様に、ＤＤＡＨまたはＤＩに結合する所与の化学物質について１つ以上のファルマコホアを同定することができる。この場合、ファルマコホアは、例えば、ＤＤＡＨまたはＤＩに結合することにおいて、従ってＤＤＡＨまたはＤＩの活性化または阻害のための、重要な役割を果たす原子の集団である。
【００５７】
本明細書中に提供されるデータは、ＤＤＡＨの構造および基質に結合したＤＤＡＨの構造に関しており、アルギニン修飾酵素（具体的には、ＤＤＡＨまたはＤＩ）に対する結合のために重要なファルマコホアの同定を可能にする。
【００５８】
ファルマコホアの選択および設計のために好適なプログラムには、ＤＩＳＣＯ（Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ　Ｐａｒｋ、ＩＬ）およびｃａｔａｌｙｓｔ（Ｂｉｏ−ＣＡＤ　Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ　ｖｉｅｗ、ＣＡ）が含まれる。化学構造のデータベースは、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｄａｔａ　Ｃｅｎｔｒｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）およびＣｈｅｍｉｃａｌ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）から入手することができる。デノボ設計プログラムには、Ｌｕｄｉ（Ｂｉｏｓｙｍ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＡｌａｄｄｉｎ（Ｄａｙｌｉｇｈｔ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）が含まれる。そのようなプログラムは当業者には十分に知られている。ＤＢＳｅｒｖｅｒ１およびＨｉｐＨｏｐなどのパッケージを使用して、類似するファルマコホアによってその表面が記載される化合物についてデータベースを検索することができる。
【００５９】
化学物質が上記の方法によって設計または選択されると、そのような物質がＤＤＡＨもしくはＤＩまたは基質もしくは生成物と結合する効率を、コンピューター評価または実験的評価を使用して試験し、最適化することができる。様々なパラメーターを、所望する結果に依存して最適化することができる。これらには、特異性、親和性、オン／オフ速度、および当業者によって容易に特定され得る他の特性が含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
コンピューターによる手段では、Ｃａｔａｌｙｓｔ／ＳＨＡＰＥ、Ｃａｔａｌｙｓｔ／ＣＯＭＰＡＲＥ、ＤＢＳｅｒｖｅｒ、ＨｉｐＨｏｐ、ＬｕｄｉおよびＭＣＳＳなどのパッケージを、選択された修飾型ＤＤＡＨまたは修飾型ＤＩおよび新しいＤＤＡＨ結合性物質またはＤＩ結合性物質を評価するために用いることができる。実験的手段は、例えば、Ｌｅｉｐｅｒら、１９９９（上記）に記載される比色アッセイを含むことができる。
【００６１】
従って、結合特性を改善しまたは改変するために、場合に応じて、置換、欠失または挿入を、ＤＤＡＨもしくはＤＩの構成成分のいくつかにおいて、またはＤＤＡＨもしくはＤＩと結合する物質に対して行うことができる。一般に、最初の置換は保存的である。すなわち、置換基は、最初の成分とほぼ同じサイズ、形状、疎水性および電荷を有する。そのような修飾は、最初の候補の化学物質と同じ様式でコンピューターまたは実験によって評価することができる。必要な場合には、さらなる修飾を行うことができる。評価および修飾のこのプロセスは何回も繰り返すことができる。
【００６２】
従って、本発明は、修飾型ＤＤＡＨもしくは修飾型ＤＩである化学物質、またはＤＤＡＨもしくはＤＩに結合する化学物質を同定し、選別し、特徴づけしまたは設計するための方法を提供する。この方法は、ＤＤＡＨまたはＤＩの構造モデルを前記化学物質に対する構造モデルと比較し、それにより、前記化学物質がＤＤＡＨもしくはＤＩに結合し得るか、またはＤＤＡＨもしくはＤＩを模倣し得るかを明らかにすることを含む。この場合、ＤＤＡＨまたはＤＩの前記構造モデルは、ＤＤＡＨまたはＤＩを含む結晶をＸ線回折測定に供することによって決定される構造座標から得られる。本発明はまた、化学物質を同定し、選別し、特徴づけしまたは設計するための本発明の方法によって同定される化学物質を提供する。
【００６３】
本発明において（例えば、本発明の使用によって、または（修飾ＤＤＡＨもしくは修飾ＤＩであるまたはＤＤＡＨもしくはＤＩに結合する）化学物質を同定し、選別し、特徴づけしまたは設計するための本発明の方法によって）同定された化学物質は、医学的状態または獣医学的状態の処置において使用することができる。従って、本発明は、治療によってヒトまたは動物の身体を処置する方法において使用される化学物質を提供する。具体的には、本発明の化学物質は、ＮＯの異常な代謝が関係する状態を処置する方法において使用することができる。本発明において同定される化学物質はまた、ＮＯの異常な代謝が関係する状態の処置において使用される医薬品を製造するために使用することができる。そのようなタイプの状態に罹患している患者の状態を、本発明において同定された化学物質を投与することによって改善することができる。本発明において同定される化学物質の治療効果的な量を、それを必要としているヒト患者に与えることができる。
【００６４】
ＤＤＡＨの活性化因子である化学物質は、低下したＮＯ産生が関係する状態の処置において使用することができる。具体的には、高脂血症、腎不全、高血圧、血管形成術後の再狭窄、心不全の合併症、またはアテローム性動脈硬化症およびその合併症のような状態を処置することができ、そして精神分裂病、多発性硬化症またはガンの患者もまた処置することができる。その対応する野生型ＤＤＡＨとの比較において増大したＤＤＡＨ活性を示す修飾型ＤＤＡＨもまた、上記状態の処置において使用することができる。
【００６５】
ＤＤＡＨの阻害剤である化学物質は、増大したＮＯ産生が関係する状態の処置において使用することができる。具体的には、脳もしくは心臓の虚血−再灌流傷害、ガン、敗血症ショックもしくは多臓器不全などの重篤な炎症状態における致死性低血圧、または関節炎を含む局所的および全身的な炎症性障害、皮膚障害、炎症性心臓疾患、または片頭痛などの状態を処置することができる。
【００６６】
あるいは、ＤＤＡＨの阻害剤である化学物質は、ＮＯＳ活性の阻害剤（例えば、メチルアルギニン）と一緒に関節治療として使用することができる。例えば、ＤＤＡＨイソ型の特異的な阻害剤をメチルアルギニンＬ−ＮＭＭＡとともに使用することができる。この方法はＬ−ＮＭＭＡの活性プロフィルを劇的に変化させることができ、そして特定のＮＯＳイソ型に対して増大した阻害作用を有するＬ−ＮＭＭＡをもたらし得る。従って、本発明は、脳もしくは心臓の虚血−再灌流傷害、ガン、敗血症ショックもしくは多臓器不全などの重篤な炎症状態における致死性低血圧、または関節炎を含む局所的および全身的な炎症性障害、皮膚障害、炎症性心臓疾患、または片頭痛の処置において同時または分割的または連続して使用される混合調製物としての、ＤＤＡＨの活性および／または発現の阻害剤とメチルアルギニン化合物を含有する製造物を提供する。
【００６７】
ＤＤＡＨまたはＤＩの阻害剤である化学物質はまた、抗微生物剤として、例えば、抗菌剤として使用することができる。従って、本発明はまた、細菌感染症の処置において使用される化学物質を提供する。
【００６８】
本発明の化学物質の配合は、正確なアンタゴニストの性質、薬学的使用または獣医学的使用が意図されるかどうかなどの要因に依存する。本発明の製造物は同時使用または分割使用または連続使用のために配合され得る。
【００６９】
本発明の製造物は、典型的には、医薬適合性のキャリアまたは希釈剤とともに本発明における投与のために配合される。医薬適合性のキャリアまたは希釈剤は、例えば、等張性の溶液であり得る。例えば、固体の経口用形態物は、活性な化合物と一緒に、希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプン；滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウム、および／またはポリエチレングリコール；結合剤、例えば、デンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン；崩壊剤、例えば、デンプン、アルギン酸、アルギン酸塩、またはナトリウムスターチグリコラート；発泡剤混合物；色素；甘味剤；湿潤化剤、レシチン、ポリスルベート、ラウリル硫酸塩など；そして、一般に、薬学的配合物において使用される非毒性の薬理学的に不活性な物質を含むことができる。そのような薬学的調製物は、知られている様式で、例えば、混合、造粒、錠剤化、糖衣コーティングまたはフィルムコーティングの様々なプロセスによって製造することができる。
【００７０】
経口投与される液体分散物は、シロップ、エマルションまたは懸濁物であり得る。シロップは、キャリアとして、例えば、サッカロース、あるいはグリセリンおよび／またはマンニトールおよび／またはソルビトールとともにサッカロースを含むことができる。
【００７１】
懸濁物およびエマルションは、キャリアとして、例えば、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルアルコールを含むことができる。筋肉内注射される懸濁物または溶液は、活性な化合物と一緒に、医薬適合性のキャリア、例えば、滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール類（例えば、プロピレングリコール）、そして所望する場合には、好適な量の塩酸リドノカインを含むことができる。
【００７２】
静脈内投与用または注入用の溶液は、キャリアとして、例えば、滅菌水を含むことができ、または好ましくは、水性で、等張性の無菌生理食塩水溶液の形態であり得る。
【００７３】
本発明の製造物の治療効果的な量が患者に投与される。本発明の製造物の用量は、様々なパラメーターに従って、特に、使用される物質；処置される患者の年齢、体重および状態；投与経路；そして必要とされる療法に従って決定することができる。再度ではあるが、医師は、任意の特定の患者について必要とされる投与経路および投薬量を決定することができる。典型的な１日あたり用量は、特定の阻害剤の活性、処置される対象者の年齢、体重および状態、変性のタイプおよび重篤度、そして投与頻度および投与経路に従って、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇ体重である。好ましくは、１日あたりの投薬量レベルは５ｍｇから２ｇである。
【００７４】
本発明は、特定のイソ型ＤＤＡＨの特異的な調節をもたらす化学物質、従って、ＮＯＳの特異的な調節をもたらす化学物質の同定、選別、特徴づけ、設計または修飾を可能にする。１つの特定のＤＤＡＨイソ型（例えば、ＤＤＡＨＩまたはＤＤＡＨＩＩ）に対して特異的な作用を有する化学物質を非特異的に投与することができる。これは、そのような化学物質は、特定のメチルアルギニナーゼの発現または活性、従って、ＮＯＳの１つの特定のイソ型の活性を調節するだけであるからである。ペプチドまたはポリペプチドである化学物質は、ネイクド核酸構築物の形態で投与することができる。哺乳動物細胞によるネイクド核酸構築物の取り込みが、いくつかの知られているトランスフェクション技術によって、例えば、トランスフェクション剤の使用を含むトランスフェクション技術によって高められる。このような薬剤の例には、カチオン性薬剤（例えば、リン酸カルシウムおよびＤＥＡＥ−デキストラン）およびリポフェクタント（例えば、リポフェクタム（商標）およびトランスフェクタム（商標））が含まれる。
【００７５】
典型的には、核酸構築物は、組成物を作製するためにトランスフェクション剤と混合される。好ましくは、ネイクド核酸構築物、ポリヌクレオチドを含むウイルスベクター、または組成物は、薬学的組成物を作製するために、医薬適合性のキャリアまたは希釈剤と一緒にされる。好適なキャリアおよび希釈剤には、等張性の生理的食塩水溶液、例えば、リン酸塩緩衝化生理的食塩水が含まれる。組成物は、非経口投与、筋肉内投与、静脈内投与、皮下投与または経皮投与のために配合され得る。
【００７６】
薬学的組成物は、本発明のポリヌクレオチド、すなわち、遺伝子治療用のウイルスベクターが適切な領域において細胞内に取り込まれ得るような方法で投与される。本発明のポリヌクレオチドがウイルスベクターによって細胞に送達されるとき、投与ウイルス量は、アデノウイルスベクターの場合、１０６ｐｆｕから１０１０ｐｆｕの範囲であり、好ましくは１０７ｐｆｕから１０９ｐｆｕの範囲であり、より好ましくは約１０８ｐｆｕである。注射されるとき、典型的には、医薬適合性の好適なキャリアまたは希釈剤における１ｍｌ〜２ｍｌのウイルスが投与される。本発明のポリヌクレオチドがネイクド核酸として投与されるとき、投与核酸量は、典型的には１μｇから１０ｍｇの範囲内である。
【００７７】
生成物をもたらすポリヌクレオチドが誘導性プロモーターの制御下にある場合、遺伝子発現を処置の継続期間にわたって誘導することだけが必要され得る。状態が処置されると、誘導因子が除かれ、本発明のポリヌクレオチドの発現が停止する。これは、臨床的な利点を明らかに有している。そのようなシステムは、例えば、ｔｅｔリプレッサー／ＶＰ１６融合タンパク質に対するその作用を介して遺伝子発現を活性化するために抗生物質テトラサイクリンを投与することを伴い得る。
【００７８】
組織特異的なプロモーターの使用は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよびベクターを使用する疾患の処置を助ける。関連する罹患細胞タイプだけにおいて治療遺伝子を発現できることは、特に、そのような遺伝子が、他の細胞タイプで発現したときに毒性である場合には好都合である。
【００７９】
上記に記載された投与経路および投薬量は指針として意図されるだけである。医師は、最適な投与経路および投薬量を任意の特定の患者および状態について容易に決定することができるからである。
【００８０】
本発明において同定される化学物質は、ヒトまたは動物の身体に対して行われる診断方法において使用することができる。従って、修飾されたＤＤＡＨ（例えば、不活性な修飾型ＤＤＡＨ）を、被験体から得られたサンプルにおける非対称的なメチルアルギニン化合物（例えば、ＡＤＭＡ）の濃度についてアッセイするために使用することができる。これにより、特定の医学的状態に関して被験体の状態の指標を得ることができる。例えば、被験体が心臓血管疾患に罹患しているか否かが示され得る。好適なサンプルには、体液、例えば、血液、尿または唾液のいずれもが含まれる。さらに、組織サンプル（例えば、血管生検物）を使用することができる。そのようなアッセイがどのように行われ得るかは当業者には明かである。修飾されたＤＤＡＨ（例えば、不活性な修飾型ＤＤＡＨ）はまた、インビボでの非対称なメチルアルギニンの造影のために使用することができる。一般に、修飾型ＤＤＡＨはそのような用途では標識される。
【００８１】
本発明において同定される化学物質はまた、サンプルにおける非対称メチル化アルギニン誘導体（例えば、ＡＤＭＡ）の存在または非存在を確認する方法において使用することができる。この方法は、サンプルを修飾型ＤＤＡＨと接触させ、そして修飾型ＤＤＡＨが非対称メチル化アルギニン誘導体に結合するかどうかを明らかにすることを含む。この方法は、放射免疫アッセイまたはリガンド結合アッセイに関連して適用することができる。好適なアッセイ形式は当業者には十分に知られている。修飾型ＤＤＡＨは、好ましくは、不活性な修飾型ＤＤＡＨである。
【００８２】
類似する方法を、サンプルにおけるアルギニンの存在または非存在を明らかにするために修飾型ＤＩを用いて行うことができる。
【００８３】
本発明はまた、ＤＤＡＨもしくはそのフラグメントまたはＤＩもしくはそのフラグメントを含む結晶を提供する。ＤＤＡＨまたはＤＩは、任意のＤＤＡＨまたはＤＩであり、例えば、上記に記載されるものであり得る。ＤＤＡＨまたはＤＩは、その基質またはその生成物と組み合せて結晶化させることができる。結晶は、表Ｉに示されるデータ統計量を有し得る。あるいは、またはさらに、結晶は、表ＩＩに示される構造座標を有し得る。
【００８４】
本発明はまた、ＤＤＡＨまたはＤＩを提供する。本発明のＤＤＡＨまたはＤＩは、好ましくは、本発明の結晶をＸ線回折に供することにより得られる構造座標の使用によって同定され、設計されおよび／または修飾されたものである。好ましいＤＤＡＨまたはＤＩは不活性化体である。そのようなＤＤＡＨまたはＤＩの例には、ＰａＤＤＡＨにおけるＥ１１４またはＨ１６２またはＣ２４９に等価なアミノ酸が異なるアミノ酸によって置換されているものが挙げられる。これに関連して用語「等価」は前に説明されている。好ましくは、異なるアミノ酸はアラニンまたは立体的に小さい残基である。
【００８５】
活性なポケットの一部を形成し、そしてその構造を安定化する他の残基には、ＰａＤＤＡＨ配列におけるＤ６０、Ｆ６３、Ｅ６５、Ｄ６６、Ｒ８５、Ｅ８８、Ｄ１１７、Ｒ１３２、Ｌ１６１、Ｉ２４３、Ｋ１６４、Ｓ２４８、Ｓ２５１、Ｌ２５２およびＲ２５３に等価な残基が含まれる。従って、本発明は、上記の列挙のいずれかに対応する１つ以上の残基が変異している（例えば、置換されている）ＤＤＡＨを提供する。不活性なＤＤＡＨまたはＤＩをもたらし得る２つのタイプの変異が有利である：（ｉ）基質に対する直接的な水素結合を形成する残基（ＰａＤＤＡＨ配列におけるＤ６６およびＥ６５に等価にそのような残基）の塩基性残基による置換；および（ｉｉ）リガンドの疎水性部分と接触して、活性部位を阻止するか、またはあまり有利でない相互作用をもたらす疎水性残基（Ｆ６３およびＬ１６１に等価な残基など）の置換。より広範囲の変異、例えば、活性部位の裂け目を取り囲む柔軟なループの長さを変化させることもまた、ＤＤＡＨまたはＤＩの活性を変化させるために使用することができる。本発明のＤＤＡＨまたはＤＩは、本発明の使用に従ってＸ線回折測定に後で供される本発明の結晶を調製するために使用することができる。
【００８６】
本発明はさらに、本発明のＤＤＡＨまたはＤＩをコードするポリヌクレオチド、およびそのようなポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドがプロモーターに機能的に連結された構築物を調製するために使用することができる。そのような構築物は、その後、細胞を形質転換またはトランスフェクションするために使用することができる。そのような細胞は、本発明のＤＤＡＨまたはＤＩを過剰発現させるために使用することができる。そのようにして発現させられたＤＤＡＨまたはＤＩは、結晶を調製するために使用することができ、そしてそのような結晶は、化学物質の同定、スクリーニング、特徴づけ、設計または修飾を行うために本発明に従って使用することができる。好適なプロモーターおよび細胞は上記に記載される。
【００８７】
本発明はまた、本発明の結晶を調製するための方法を提供する。この方法は、ＤＤＡＨもしくはそのフラグメントまたはＤＩもしくはそのフラグメントを含む物質を結晶化させることを含む。ＤＤＡＨまたはＤＩは、本発明のいずれかのＤＤＡＨまたはＤＩであり得る。
【００８８】
下記の実施例により、本発明は例示される。
【００８９】
（実施例）
材料および方法
Ｐ．ａのＤＤＡＨの調製
野生型ＰａＤＤＡＨおよびＣ２４９Ｓ変異型形態のサンプルを、下記に記載されたように結晶化のために作製した。ｐＰＲＯＸ．Ｈｔａ．ＰａＤＤＡＨまたはｐＰＲＯＸ．Ｈｔａ．ＰａＤＤＡＨ−Ｃ２４９Ｓで形質転換されたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ　Ｉｎｃ．）を、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ培地において３０℃で、６００ｎｍにおける光学濃度が０．８になるまで増殖させ、その後、０．５ｍＭのＩＰＴＧとともにインキュベーションした。培養物を４時間後〜６時間後に遠心分離によって集めた。セレノメチオニンを用いたＰａＤＤＡＨの生合成的標識のために、ｐＰＲＯＸ．Ｈｔａ．ＤＤＡＨで形質転換されたＢ８３４（ＤＥ３）細胞を、セレノメチオニンが補充された最少培地において３０℃で増殖させ、そして上に記載されたように誘導して、１２時間後に集めた。細胞ペレットを２５ｍｌの緩衝液Ａ（５０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭイミダゾール、０．３Ｍ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ｂ−メルカプトエタノール、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、５ｍＭベンズアミジン、ＮａＯＨでｐＨ８．０に調節）に再懸濁して、−８０℃で凍結した。解凍した細胞懸濁物にＤＮＡａｓｅＩを１０μｇ／ｍｌに加えて、細胞をフレンチプレス（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｉｎｓｔｒｉｍｅｎｔｓ　Ｉｎｃ．）によって破壊した。細胞溶解物を４℃において４０，０００ｇで３０分間遠心分離した。溶解物上清を、Ｎｉ−ＮＴＡ（Ｑｉａｇｅｎ　Ｉｎｃ．）カラム（Ｖｔ＝１０ｍｌ、ｄｉ＝１６ｍｍ）において１００ｍｌの緩衝液Ａで洗浄し、次いで１００ｍｌの緩衝液Ｂ（５０ｍＭイミダゾールを有する緩衝液Ａ、ｐＨ８．０）で洗浄し、その後、５０ｍｌの緩衝液Ｃ（２５０ｍＭイミダゾールを有する緩衝液Ａ）によるステップグラジエントによって精製した。ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）をＤＤＡＨプールに加え、その後、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＤＴＴで平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Ｖｔ＝１００ｍｌ、ｄｉ＝１６ｍｍ）におけるゲルろ過によってさらに精製した。精製されたＤＤＡＨプールを、その後、１０ｍｇのＰａＤＤＡＨに対して５００ＵのｒＴＥＶを使用して室温においてｒＴＥＶプロテアーゼ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）で一晩消化した。切断された６Ｈｉｓ標識およびｒＴＥＶを、４℃で、２ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースに対するバッチ吸着によって除いた。その後、ＰａＤＤＡＨをゲルろ過によって再び精製した。脱標識されたＰａＤＤＡＨのプールを、その後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ遠心濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、ｐＨ８．０に緩衝液交換し、そして１４ｍｇ／ｍｌに濃縮した。最初の培養物の１リットルあたり１０ｍｇから１５ｍｇのＰａＤＤＡＨの最終収量が得られた。精製ＰａＤＤＡＨサンプルのタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度測定によって推定された。ＰａＤＤＡＨの吸光係数は、プログラム「Ｐｅｐｔｉｄｅｓｏｒｔ」（ＧＣＧ　Ｉｎｃ．）を使用して、１２，９６０Ｍ−１ｃｍ−１であると計算された。
【００９０】
生物物理分析
質量スペクトルをＶＧプラットホームエレクトロスプレー質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）で集めた。サンプルを、脱イオン水への限外ろ過により脱塩した。その後、サンプルを標準的な条件（５０％アセトニトリル、０．２５％ギ酸において８０〜２００ｐｍｏｌ／μｌ）で注入した（１０μｌ）。送達溶媒（５０％アセトニトリル）は１０μｌ／分の流速で送液された。１２回の１０秒走査を７５０〜１１５０のｍ／ｚ範囲で各サンプルについて積算した。ソース温度は４５℃で設定され、コーン電圧は４１ボルトであった。スペクトルは、装置とともに供給された「Ｍａｓｓｌｙｎｘ」ソフトウエア（バージョン３．０ｂ５）を使用して処理された。ウシ心臓ミオグロビンを使用して、装置を校正した（Ｍｒ＝１６９５１．５、Ａｓｈｔｏｎら（１９９４）によって測定されたとき）。「脱標識された」野生型およびＣ２４９Ｓ変異型のＰａＤＤＡＨ構築物の質量は、それぞれ、２９，２１７および２９，２０１であると計算された。測定された質量は、実験誤差（４質量単位）の範囲内で計算質量と一致し、そして両サンプルが本質に均一であることを示していた。
【００９１】
分析ゲルろ過および動的光散乱を、様々なタンパク質濃度についてＰａＤＤＡＨの見かけ分子量およびオリゴマー状態を推定するために使用した。両分析は、ＤＤＡＨが０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲の溶液中では二量体であることを示唆していた。
【００９２】
分析ゲルろ過クロマトグラフィーを、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、５ｍＭ　ＤＴＴにおいて０．５ｍｌ／分の流速で平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ＨＲカラム（１０／３０）（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して行った。このとき、１００μｌのサンプル容量を、０．１ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌおよび１０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で使用した。カラムは、見かけ分子量の推定を可能にするために様々なタンパク質分子量標準物で校正された（Ｐｒｅｎｅｔａ、１９９０）。
【００９３】
動的光散乱測定値を、１００ｕｌのセルを備えたＤｙｎａＰｒｏ−８０１装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ、ＶＡ）を使用して得た。ＰａＤＤＡＨのサンプルを、２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．０、５ｍＭＤＴＴの緩衝液において０．５ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、６．０ｍｇ／ｍｌおよび１２ｍｇ／ｍｌの濃度で、注入時に０．２μｍメンブランフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ、英国）でろ過した。測定値は製造者の説明書に従って室温で採取され、データは、「Ａｕｔｏｐｒｏ」ソフトウエアを使用して分析された。プログラムは、下記のストークス−アインスタイン式によって見かけのストークス半径Ｒｓａｐｐに変換される並進拡散係数Ｄの計算を可能にした：
Ｒｓ，ａｐｐ＝ｋＴ／６πη０Ｄ
式中、ｋはボルツマン定数であり、Ｔはケルビン度での温度であり、η０は水の粘度であると考える溶媒の粘度である。装置は、拡散係数の測定値からの分子量の信頼できる推定を可能する、Ｍｒが８から１２５０ｋのサイズ範囲にある２３個の標準タンパク質セットで校正された。光子計数率はすべての実験において３％未満の変動であった。すべての読み取り値に対する平方誤差の和は１．０未満であった。このことは、データが、大きいシグナル対ノイズ比を有して高品質であったことを示している。
【００９４】
分析ゲルろ過および動的光散乱は、様々なタンパク質濃度についてＰａＤＤＡＨの見かけ分子量およびオリゴマー状態を推定するために使用された。両分析は、ＤＤＡＨが０．１ｍｇ／ｍｌから１０ｍｇ／ｍｌの濃度範囲の溶液中では二量体であることを示唆していた。タンパク質濃度が低下するに従い、見かけ分子量が低下することがある程度はっきり示された。このことは、二量体のある程度の解離を示唆している。さらに、動的光散乱データは、ＰａＤＤＡＨが１２ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度で本質的には単分散型二量体として存在することを示した。
【００９５】
部位特異的変異誘発
シュードモナスＤＤＡＨのオープンリーディングフレームを、プラスミドｐＰｒｏＥＸＨＴａ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のポリヒスチジン配列およびリンカー配列の下流に読み枠を合わせてクローン化した。組換えプラスミドをコンピテント大腸菌ＤＨ５αにトランスフェクションして、大腸菌を液体培地に接種した。培養物が０．５のＯＤに達したとき、タンパク質発現を、ＩＰＴＧの添加（１ｍＭの最終濃度）により誘導した。２時間の誘導の後、細胞を遠心分離により集め、超音波処理によって溶解した。細胞質ゾルタンパク質を細胞破片から遠心分離により分離し、組換えタンパク質をアフィニティークロマトグラフィー（ポリヒスチジン標識に結合するニッケルアガロース）によって精製し、その後、サイズ分画した。ポリヒスチジン配列およびリンカー配列を、組換えタバコエンベロープウイルスプロテアーゼ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いたタンパク質分解によって除いた。
【００９６】
部位特異的変異誘発を、ＰＣＲに基づく方法を使用して行った。所望するヌクレオチド置換をコードする相補的なオリゴヌクレオチド（順方向および逆方向）を設計した。クローン化されたＰａＤＤＡＨをテンプレートとして使用する別々のＰＣＲ反応では、それぞれの変異生成オリゴヌクレオチドが、隣接するベクター配列に対して相補的なプライマーととも含まれた。２つのＰＣＲ反応の生成物をゲル精製して、一緒にし、その後、全長のオープンリーディングフレームを、最初のＰＣＲ反応において前もって含まれた２つのベクタープライマーを使用して増幅した。ＰＣＲ産物をｐＰｒｏＥＸＨＴａにクローン化し、配列決定して、正しい配列を確認した。
【００９７】
変異型の活性は、Ｌｅｉｐｅｒら（１９９９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４３、２０９〜２１４に記載される比色アッセイによって測定された。
【００９８】
結晶学
結晶化。すべての結晶を、１．５μｌの各タンパク質溶液およびウエル溶液／液滴を使用するシッティング・ドロップ法によって室温で成長させた。
【００９９】
天然型およびＳｅＭｅｔ誘導体の場合、タンパク質ストック溶液は、５ｍＭ　ＤＴＴを含む５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８）において、１２ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌの間であった。変異型タンパク質の同時結晶化のために、１０〜１５：１のモル比をもたらす濃度でリガンドをタンパク質溶液に加えた。ウエル溶液は、０．１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）、０．１５Ｍから０．３Ｍの酢酸Ｎａ、２５％から３５％ｗ／ｖのＰＥＧ４０００の範囲であった。
【０１００】
データ収集。天然型、ＳｅＭｅｔ型、シトルリン同時結晶型およびＡＤＭＡ同時結晶型のデータセットに対する実験詳細およびデータ統計量を表Ｉに示す。データ処理はＭＯＳＦＬＭ（Ｌｅｓｌｉｅ、１９９２、Ｊｏｉｎｔ　ＣＣＰ４　ａｎｄ　ＥＳＦ−ＥＡＭＣＢ　Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒ　ｏｎ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ、Ｎｏ２６）を用いて行われ、そしてその後の計算では、ＣＣＰ４プログラム（ＣＣＰ４、１９９４、共同コンピューター処理プロジェクト（第４回）。ＣＣＰ４セット：コンピューター処理結晶学用プログラム、Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ　Ｄ、５０、７６０〜６７３）が使用された。
【０１０１】
構造解明および精密化。ＰａＤＤＡＨのＳｅＭｅｔ誘導体の構造は、ＭＡＤデータセットを使用するＳＯＬＶＥ（ＴｅｒｗｉｌｉｇｅｒおよびＢｅｒｅｎｄｚｅｎ、１９９９、ＭＩＲおよびＭＡＤに対する自動化された構造解明、Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ　Ｄ５５、８４９〜８６１）を使用することによって解明された。これにより、１４カ所の可能なＳｅ部位のうちの１０カ所が明らかにされ、それらは、２回軸によって関連づけられる５個の２つの群にグループ化された。プログラムＤＭ（Ｃｏｗｔａｎ、１９９４）における密度修飾および２回平均化の使用により、目印としてのＳｅ部位を利用して、主鎖のほとんどを突き止めることができるマップが得られた。
【０１０２】
天然型ＰａＤＤＡＨおよびＳｅＭｅｔ誘導体は同じ空間群で結晶化するが、同じ大きさではない。天然型ＰａＤＤＡＨの構造は、ＤＭにおける密度修飾および２回平均化に対する入力として、天然のＦを有するＳｅＭｅｔ誘導体についてＳＯＬＶＥから得られた位相を使用することによって解明された。この構造は二量体構造を示した。これは、ＳｅＭｅｔ誘導体の構造と本質的には同じであったが、二量体の一方の分子の小さい置換があった。同じ反射セットが、天然型およびＳｅＭｅｔ型の両データセットにおける交差評価（Ｒｆｒｅｅ）計算のために使用された。Ｃ２４９Ｓ型ＰａＤＤＡＨとシトルリンおよびＡＤＭＡとの同時結晶化により、それぞれ、天然型とは異なる性質の結晶が得られ、より大きい分解能の回折を有した。これは、天然型およびＳｅＭｅｔ型の両データセットに対する４０Å２と比較して、それぞれ、１６Å２および１８Å２のウィルソンプロットからの全体的なＢ値において反映される。
【０１０３】
シトルリン含有型およびＡＤＭＡ含有型のＣ２４９Ｓ変異型結晶は、空間群がそれぞれＣ２（１分子／非対称ユニット）およびＰ２１（４分子／非対称ユニット）であり、それらはそれぞれ、ＡｍｏＲｅにおける部分的に精密化された天然型構造を使用する分子置換によって解明された（Ｎａｖａｚａ、１９９４、ＡｍｏＲｅ：分子置換のための自動化されたパッケージ、Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ　Ａ、５０、１５７〜１６３）。ＡＤＭＡ含有結晶の単位格子の大きさは天然型の単位格子との類似性を示すが、シトルリン誘導体の単位格子は明らかに関連性がない。
【０１０４】
モデル組立を、プログラムＯ（Ｊｏｎｅｓら、１９９１、電子密度マップにおいてタンパク質モデルを組み立てるための改良法およびこれらのモデルにおける誤差位置、Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔ．Ａ．、４７、１１０〜１１９）およびｒｅｆｍａｃによる精密化（Ｍｕｒｓｈｏｄｏｖら、１９９７、最尤法による高分子構造の精密化、Ａｃｔａ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ　Ｄ、５３、２４０〜２５５）を用いて行った。これらの構造のすべてにおいて、ｃｉｓ−Ｐｒｏが１１０位に存在する。
【０１０５】
Ｃ２４９Ｓ−シトルリンおよびＣ２４９Ｓ−ＡＤＭＡの構造において、ｐｈｉ−陽性のＨ１７２の前に位置するＥ１７１を除いて、すべての残基がラマチャンドランプロットの許容領域内に存在する。これらの残基はループ領域内に存在するが、電子密度は不明瞭である。機能的理由は未だ理解されていない。
【０１０６】
結果
ＤＤＡＨの折り畳み
セレノメチオニン誘導体としての緑膿菌由来ＤＤＡＨ（残基０〜２５４）の結晶構造が、ＭＡＤ法によって、２．４Åの分解能で解明された。Ｎ末端にクローン化されていたアミノ端残基は電子密度マップでは見られない。Ｓｅ部分構造からの位相が、２．４Åの分解能で天然型酵素を解明するために使用された。天然型構造からの座標が、分子置換によって、ＡＤＭＡと同時結晶化されたＣ２４９Ｓ変異型の構造を２．０Åの分解能で、そしてシトルリンと同時結晶化されたＣ２４９Ｓ変異型の構造を１．８Åの分解能で解明するためのモデルとして使用された。天然型ＰａＤＤＡＨに対する構造座標が表ＩＩに表され、シトルリンと同時結晶化されたＣ２４９Ｓの構造座標が表ＩＩＩに表される。
【０１０７】
示される緑膿菌ＤＤＡＨ（ＰａＤＤＡＨ）の全体的な折り畳みは、活性部位を囲む、弱く保存されたββαβ構造モチーフの５個のモジュールから形成されるタイプのバレルを含む。Ｎ末端およびＣ末端はバレルの一方（「底」）から突き出て、そして反対（「上部」）側において、ループ領域が活性部位入り口を取り囲んでいる。それぞれのβ１β２αβ３モジュール内では、３つの鎖が、バレル軸に対してほぼ平行しており、そして（バレルの外側で）β３に対して平行であるβ２に対して逆平行の（バレル内部の）β１とともにシートとして配置される；らせんがシートの１つの面に存在する。これらの二次構造エレメント間にはいくぶん複雑なループが存在する。
【０１０８】
モジュール１は残基０〜６７およびＣ末端鎖２４９〜２５４を含み、β１として作用する；モジュール２は残基６８〜１１７を含む；モジュール３は残基１１８〜１６６を含む；モジュール４は残基１６７〜２０５を含む；モジュール５は残基２０６〜２４８を含む。
【０１０９】
ＰＳＩＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、ギャップ付きＢＬＡＳＴおよびＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：新世代のタンパク質データベース検索プログラム、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５、３３８９〜３４０２）および３Ｄ−ＰＳＳＭ折り畳み予測サーバー（Ｋｅｌｌｅｙら、２０００、プログラム３Ｄ−ＰＳＳＭにおける構造プロフィルを使用する増強されたゲノム注釈、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９９、５０１〜５２２）から得られる両方のアラインメント精査によって予測されるように、ＤＤＡＨの折り畳みは、ヒトのＬ−アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（ＡＴ、ＤＰＢコードｌｊｄｗ）の折り畳みに関連づけられるが、ＰａＤＤＡＨははるかに小さく（３６０アミノ酸残基とは対照的に２５４残基）、そしてヒトＤＤＡＨ１およびＡＴとの間の配列同一性は１８％である。ＰａＤＤＡＨおよびＡＴのＣα軌跡の重ね合わせが示される。２１７個の等価なＣα原子に基づくｒｍｓは１．８Åである。モジュール４が特に概略的に示され、α−らせんが３１０らせんの立体配座で４つの残基によって表される。しかし、ＡＴの触媒作用残基（Ｃ４０７、Ｈ３０３、Ｄ２５４）と、ＤＤＡＨのＣ２４９およびＨ１６２およびＥ１１４との間には明瞭な対応がある。興味深いことに、これらの残基および機構的に重要なＤ６６はすべてが、バレルの内部で同じレベルで鎖β１の直前に位置するねじれた領域において、モジュール構造に関してほぼ同じ位置に存在することが見出される。
【０１１０】
二量体の形成
ＡＴおよびＤＤＡＨはともに結晶で二量体であり、そしてＤＤＡＨは、分析ゲルろ過および動的光散乱によって溶液中で二量体であることが明らかにされた（実験の節を参照のこと）。本研究で形成された各結晶において、二量体が同じ様式で形成されたので、それが結晶化の際の人為的な結果である可能性は低い。それぞれの二量体の中央部には、バレルの外側の鎖と、２回軸の周りのその等価体との相互作用が存在する。ＤＤＡＨでは、これはモジュール１の鎖β３（残基４８〜５３）であり、これに対して、ＡＴではモジュール２のβ３（残基２０９〜２１２）であり、このために、それらのそれぞれの二量体におけるプロトマー（ｐｒｏｔｏｍｅｒ）の異なる空間的配置がもたらされる。ＧＲＡＳＰにおけるＤＤＡＨの単量体および二量体に対する接近可能な表面積の計算は、境界においてプロトマーあたり、１１５４Å２の平均埋没面積をもたらす。これは、この分子量のタンパク質に対する範囲内である（ＪｏｎｅｓおよびＴｈｏｒｎｔｏｎ、１９９５、タンパク質−タンパク質相互作用：タンパク質二量体構造の検討、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、６３、３１〜１６５）。ＡＴの境界は、ＤＤＡＨの境界よりも複雑であり、モジュール１およびモジュール３に由来するさらなる残基を伴う（Ｈｕｍｍら、１９９７、ヒトのアルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ（クレアチン生合成に関与するミトコンドリア酵素）の結晶構造および機構、ＥＭＢＯ　Ｊ、１６、３３７３〜８５）；二量体形成のときに埋もれる表面積／プロトマーはＡＴでは１１７３Å２である。
【０１１１】
バレル内の擬似５重軸と二量体軸との角度はＡＴおよびＤＤＡＨにおいて異なる。ＡＴでは、これらの軸はほぼ平行しており、従って、Ｎ末端残基が二量体の同じ側に突き出て、膜アンカーとして作用することができることが示唆された。ＤＤＡＨでは、２重軸はバレル軸に関してより大きく傾き、その結果、鎖の端部がより広く分かれている。これは、ＤＤＡＨが優勢的に細胞質ゾルに存在することと一致する（Ｂｉｒｄｓｅｙら、２０００、内皮細胞株で過剰発現したジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼの細胞内局在化、Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．、１６８、７３〜７９）。
【０１１２】
２つの境界鎖の角度も同様に、ＡＴおよびＤＤＡＨでは著しく異なる。ＤＤＡＨでは、２回軸にまたがる２対の水素結合が存在し、その結果、６員のβシートが、プロトマーの２つの隣接する３鎖状のβ１β２β３シートから形成される。ＡＴでは、２つの鎖の角度は、連続したβシートの形成には大きすぎ、そして中央の鎖が、ＤＤＡＨには存在しない構造の一部からの残基による寄与を受ける境界接触部の大部分と１つの残基において相互作用する。
【０１１３】
非常に類似する酵素のホモ二量体における類似する変化が、原核生物スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）の構造において、真核生物ＳＯＤと比較して報告されている（Ｂｏｕｒｎｅら、１９９６、細菌のＣｕ，Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼにおける新規な二量体境界および静電的認識、Ｐｒｏｇ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１２７７４〜１２７７９）。両酵素は同じ折り畳みおよび機能を有するが、グリークキーβ−バレルとは異なる鎖が２つの境界で使用され、そして異なる静電的な基質誘導が主張される。ＤＤＡＨおよびＡＴはＳＯＤの２つの形態よりもはるかに遠い関係であるが、それらが、異なる細胞局在化ならびに異なる基質特異性に応答して２つの異なる二量体を形成することによって共通の祖先から分かれたかどうかという興味深い疑問が存在する。
【０１１４】
ＤＤＡＨの活性部位
ＳｅＭｅｔ誘導体の活性部位は、タンパク質原子によって説明されない密度を示さない。天然型形態は、β−メルカプトエタノールであり得る密度を有し、ＡＴ（ＰＤＢコードｌｊｄｗ）の調製物の１つで見出された密度に類似する。シトルリン共結晶化実験は、モデルにシトルリン分子が含まれなかった場合と異なる密度で非常に明瞭なシトルリン分子を含む。ＡＤＭＡ共結晶化実験は、非対称ユニットに４つの分子を伴う結晶をもたらした。
【０１１５】
構造の多くは平均化マップに組み立てることができ、そしてリガンドに対する平均化された差マップは、ＡＤＭＡのメチル基が存在することを示す。しかし、精密にみると、それらは、ＡＤＭＡ分子の残り部分よりも少し大きい温度因子を有する。これは、ＡＤＭＡによって部分的に、そして生成物（シトルリン）によって部分的に占められる活性部位をもたらすＡＤＭＡの運動または遅い代謝回転のいずれかの結果であり得る。予想され得るように、ジメチルアミン（反応のもう一方の生成物）の証拠はない。
【０１１６】
ＤＤＡＨにおけるリガンド結合
活性部位残基を同定することにより、変異型（Ｃ２４９Ｓ、Ｈ１６２ＦおよびＥ１１４Ｑ）を作製することが可能になった。３つの変異型はすべて、インビトロアッセイによって不活性であることが示された。
【０１１７】
活性部位変異型Ｃ２４９ＳのＰａＤＤＡＨとＡＤＭＡ（基質）およびシトルリン（生成物／阻害剤）との共結晶化により、反応の極限における結合形式に関する証拠が得られた。結合部位をＡＴにおけるアルギニンの結合部位と比較することにより、リガンドは、切断可能な結合の配向を保ちながら、活性部位溝に関して約８０ｏ変化した配向を有することが示される。この理由から、本発明者らは、ジメチルアルギニンのグアニジノ基の炭素原子に対するＣ２４９のＳ原子による求核攻撃を伴う類似する機構を提案する。置換されたグアニジノ基の平面性からのわずかなずれが、活性部位において基質が結合することによって誘導され得るし、そして切断に対するこの結合の感受性を増大させる。
【０１１８】
ＤＤＡＨの部位が、バレルの中心部の負に荷電した裂け目に存在する。酵素のアポ形態では、この部位は開放されているが、リガンドが存在するとき、すなわち、基質（ＡＤＭＡ）および生成物／阻害剤（シトルリン）のいずれかが存在するとき、活性部位は、その先端がＨ２２である残基１４および残基２７の間のループを折り畳むことによってふさがれる。この蓋は、タンパク質のアポ形態では非常に可動性／乱れているが、ＡＤＭＡまたはシトルリンと結合したときには、より配列した状態になり、同時に回折の分解能を増大させる。リガンド（ＡＤＭＡまたはシトルリン）と蓋との間には直接的な接触が１つ存在する。Ｌｅｕ１８のカルボニルＯがＡＤＭＡのペプチドＮと結合する。Ｄ６０の側鎖はまた、ＡＤＭＡのＮとＬ１８のＮとを架橋する（ＡＤＭＡではＣＩＴを阻止する）。蓋領域は、種々の種に由来するＤＤＡＨの中で極めて変化しやすく、ＰａＤＤＡＨと比較した場合、哺乳動物ＤＤＡＨではここに１残基の挿入が存在する。従って、この接触は、駆動力ではなく、リガンド結合の後期事象であると考えられる。この蓋の動きは、Ｌ−アルギニンの結合が開いた立体配座を誘導するＡＴにおける動きとは異なる意味である。
【０１１９】
触媒作用残基は配列の３つの異なるモジュールによりもたらされる：モジュール３によるＥ１１４、モジュール４によるＨ１６２、およびモジュール５によるＣ２４９。それらはすべて、１つのそれらのモチーフの鎖β３と次のモチーフの鎖β１との間のリンカー領域に存在する。Ｅ１１４およびＨ１６２は小さい３１０らせんの直前に位置し、Ｃ２４９もまたらせん状の立体配座の中にある。
【０１２０】
活性部位内において、水素結合のネットワークにより、リガンドが所定位置に保たれる：触媒作用三つ組残基のＣ２４９が一方にあり、Ｈ１６２およびＥ１１４が反対側にある。分子のペプチド端は、Ｌ１８およびＩ２４３のＯ原子に対して、そしてＲ１３２およびＤ６０の側鎖に対して、水素結合を形成する。ＤＤＡＨの拡がった骨格の疎水性部分が、Ｆ６３およびＬ１６１の側鎖によって裂け目の周りの荷電した残基から保護される。ＡＤＭＡのグアニジニウム端がＤ６６に水素結合し、これによりＮｅおよび非メチル化ＮＧを架橋し、そしてこのＨ結合はシトルリン複合体において同様である。
【０１２１】
水素結合の広範囲のネットワークが活性部位の裂け目の周りには存在し、二次構造エレメント（リガンドおよび触媒作用残基）間の関係を安定化させている。
【０１２２】
ＤＤＡＨの活性部位とアミジノトランスフェラーゼの活性部位との比較
ＤＤＡＨ複合体およびＡＴ複合体において同じ配向で切断可能な結合を有することは、２つのリガンドの骨格が、それらの間の角度が約８０度で、活性部位残基に関して異なるように配置されることを意味する。これはまた、いくつかの残基は、２つの酵素間で外見上は保存されている一方で、実際にはわずかに異なる役割を有するという結果である。
【０１２３】
Ｄ６６（ＰａＤＤＡＨ）およびその配列等価体Ｄ１７０（ＡＴ）はともにそれらのリガンドと接触するが、Ｄ６６（ＰａＤＤＡＨ）は、１つではなく、２つの水素結合を形成し、これによりグアニジノ基を所定位置に効果的に固定する。この位置におけるＤは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを除くすべてのＤＤＡＨ配列において、そしてＡＴファミリーにおいて保存されている。Ｄ６６は、Ｒ８５（Ｒ１８９）およびＥ８８（Ｅ１９２）によって所定位置に保たれる。Ｒ８５およびＥ８８は、すべての知られているＤＤＡＨ配列およびＡＴ配列において保存されている。
【０１２４】
Ｄ６６に対して等価な二重の水素結合を形成する機能は、知られているＡＴ配列において保存されているＡＴにおけるＤ３０５によって行われる。ＡＴのＤ３０５に対するＰａＤＤＡＨにおける配列等価残基はＲ１６４であり、これは、知られているＤＤＡＨ配列（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを除く）ではＫまたはＲであり、その側鎖はリガンドと接触しない。Ｅ６５の側鎖はＡＤＭＡのＮＧに対して水素結合を形成し、主にＤＤＡＨ配列において保存されている；これは、ＡＴにおける保存されたＲ１６９と一列に並び、その側鎖はアルギニンリガンドから離れるように向いている；等価な結合がＡＴのＤ１７０によって形成され、これはそのファミリーにおいて保存されている。
【０１２５】
リガンドのペプチド端に対する水素結合形成に関与する残基は、ＤＤＡＨおよびＡＴでは全く異なる。Ｌ１８の主鎖との相互作用は上記に述べられている；別の例はＤ６０であり、その側鎖がＡＤＭＡのＮに対して水素結合するが、ＡＴにおける等価なＹ１６４はＲリガンドと接触しない。
【０１２６】
それぞれの複合体におけるリガンドは２つの疎水性側鎖と接触するが、関与する残基は異なる：ＤＤＡＨではＬ１６１およびＦ６３；ＡＴではＭ３０２およびＬ３５８。
【０１２７】
提案される機構
Ｏｇａｗａら（１９８９、ラット腎臓からの新しい酵素ＮＧ，ＮＧ−ジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼの精製および性質、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６４、１０２０５〜９）は、ラット腎臓から得られたＤＤＡＨは、補因子を要求することなく、そして他の生成物をもたらすことなく、１分子のＡＤＭＡをそれぞれ１分子のＬ−シトルリンおよびジメチルアミンに不可逆的に変換することを示した。Ｈ２１８Ｏの存在下、１８Ｏがシトルリンのウレイド基に取り込まれた。これは加水分解段階の関与を示している。Ｏｇａｗａらは、完全ではなく、部分的ではあるが、ＳＨ遮断剤が、ある種の二価金属イオンが作用するように阻害剤として作用することを示した。構造データにより、ＰａＤＤＡＨにおいて、触媒作用残基がＣ２４９、Ｈ１６２およびＥ１１４であることが示唆された。このことは、活性を失わせるこれらの３つの位置における変異によって確認された。ＤＤＡＨ配列のほとんどにおいて、Ｅ１１４の等価体はＤであるが、Ｄもまた使用されるＡＴ構造との比較により、わずかな調節のみが、種々の側鎖長さを可能にするために要求されることが示唆される。下記の議論では、Ｅ１１４は、機構に対する大きい変化を伴うことなくＤに置換され得ることを仮定することができる。
【０１２８】
ＡＤＭＡ（基質）およびシトルリン（生成物／阻害剤）はともに水素結合によって活性部位内に強く固定される。メチルを有するグアニジノ窒素原子をＮＧとして、そして水素を有する窒素をＮＧ’として示す場合、Ｄ６６の側鎖は両方の複合体においてＮＥおよびＮＧ’の両方に水素結合する。ＮＧ’はまた、Ｅ６５の側鎖に水素結合し、そしてＥ６５およびＤ６６はともにさらなるＨ結合によって所定位置に保たれる。これらの結合は、反応時に基質を所定位置に保つための代わりとして役立つことが示唆される。Ｓ２４９のＯＧ（および従って天然型酵素のＳＧ）、基質のＣＺ、およびＨ１６２のＮＤは、グアニジノ基の面に直交する線上にある。
【０１２９】
本発明者らの仮説では、活性部位のＣｙｓおよびＨｉｓは、システインプロテアーゼのイオン対（ＳｔｏｒｅｒおよびＭｅｎａｒｄ、１９９４、パパインファミリーのシステインペプチダーゼの触媒作用機構、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２４４、４８６〜５００）に類似するチオラート−イミダゾリニウムのイオン対を形成する。
【０１３０】
従って、提案された機構は、ＣＺおよびＮＧの両方における四面体中心の形成を伴う、基質のＣＺにおけるＣ２４９のＳＧによる求核攻撃を含むが、この機構は認められている。ＡＤＭＡに対する電子密度は、この場合、平面性からのある程度のひずみを示し、これはグアニジノ基の結合の共役の喪失を意味する。ＣＺ、ＮＧ原子におけるねじれと非平面性との間で配分することは困難であるが、その影響が、この結合の反応性を増大させることになることが示唆される。
【０１３１】
ジメチルアミンが活性部位から放出され、そして拡散し、これによりチオウレアオキシアニオン誘導体を遊離させる。反応の第２部分において、中間体の加水分解が、おそらくはＨ１６２との相互作用で活性化された水分子により生じる（近傍には明らかに一般的な塩基は存在しない）。最後に、四面体中心の崩壊およびプロトンの放出により、シトルリンは活性部位に結合したままになる；その放出は、おそらくは、酵素の開いた形態に戻る立体配座的変化を必要とする。今までのところ、中間体の形成に関する明確な証拠は得られておらず、１段階の反応が考えられ得るが、この識別には、中間体の直接的な観測が必要である。
【０１３２】
ＤＤＡＨの特異性
ＡＤＭＡおよびＬＭＭＡはともにＤＤＡＨにおける活性部位にはまり、そして両者は、切断可能な結合を活性化することを助けることが提案される立体的なひずみを受けやすい。しかし、ＳＤＭＡの導入は、立体的に、そしてＡＤＭＡの非メチル化ＮＧによって占められる負荷電環境によって、その両方で遮られる。
【０１３３】
ＰａＤＤＡＨは、弱いデイミナーゼ活性を有することが示されている（Ｓａｎｔａ　Ｍａｒｉａら、１９９９、微生物のジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼの同定、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３３、１２７８〜１２７９）。ＡＤＭＡの代わりに、アルギニンをＤＤＡＨの活性部位に適合させることは全く可能であり、そして同じように結合することが予想され得る。しかし、アルギニンデイミナーゼの活性部位（下記参照）は、ＤＤＡＨの活性部位とはかなり異なると考えられる。
【０１３４】
非メチル化アルギニンが結合ポケットにはまっている間、シトルリン構造において見出されるように１つ以上の水分子に対する空間が存在し、そしてまた、活性部位にはまるためにグアニジニウム基がねじれる傾向はほとんどない。局所的残基および仮定のより密接な適合は、脱離基になるためのアルギニンＮＧ原子の１つに対する化学的要件がＤＤＡＨでは最適化されないということである。
【０１３５】
他のファミリーメンバーに対するＰａＤＤＡＨ構造の関係
２つの疑問が、ファミリー内の他の構造に対するＰａＤＤＡＨの活性部位の構造の関係、およびスーパーファミリー内の他の配列に対するその意味を検討したときに生じるが、それは、（ｉ）ＰａＤＤＡＨはヒト／哺乳動物のＤＤＡＨにに対する良好なモデルであるか、そして（ｉｉ）アルギニンデイミナーゼの活性部位はどのようなものであるか、である。ＰａＤＤＡＨの活性部位の周りの重要な残基のいくつかが、アルギニン：グリシンアミジノトランスフェラーゼ、アルギニン：イノサミンリン酸アミジノトランスフェラーゼ、哺乳動物ＤＤＡＨのイソ型Ｉおよびイソ型ＩＩ、ならびにアルギニンデイミナーゼと一緒に、表Ｖに示される。
【０１３６】
（ｉ）ＰａＤＤＡＨはヒト／哺乳動物のＤＤＡＨに対する良好なモデルであるか？
配列に基づくアラインメントにおいて、触媒作用のＨｉｓおよびＤ／Ｅが一致する一方で、ＤＤＡＨＩＩの触媒作用Ｃｙｓが、細菌型およびＤＤＡＨＩの触媒作用Ｃｙｓよりも２残基後に存在し、その結果、先行するループに対する調節が必要になる。これは蓋領域と接触しており、その位置を少し変化させ得る。蓋領域の配列はＤＤＡＨ配列では保存されておらず、しかし、リガンドが主鎖原子と接触することが唯一要求されるので、これは予想外のことではない。しかしながら、全体的な構造を維持する一方で、ＰａＤＤＡＨと哺乳動物ＤＤＡＨとの局所的な構造的違いをもたらすと考えられる極めて注目すべき大きい挿入および欠失が、特にモジュール４およびモジュール５に存在する。
【０１３７】
活性部位の周りにおいて、ＰａＤＤＡＨ残基のほとんどがＤＤＡＨＩおよび細菌ＤＤＡＨでは保存されている。これらの残基の中に、ＰａＤＤＡＨおよびＤＤＡＨＩＩイソ型との間で保存されていない１つまたは２つの驚くべき位置が存在する。２つの明かな例が、Ｅ６５（これはＤＤＡＨＩＩではＧである）およびＤ６０（これはＤＤＡＨＩＩではＬである）である。ＤＤＡＨＩおよび細菌ＤＤＡＨにおけるＲ１３２は、ＤＤＡＨＩＩではＷであり、従って、明らかに、これは必須残基ではない。さらに、１３２は、ＤＤＡＨ１およびＤＤＡＨ２の間における別の変異残基（Ｇ８１Ｗ）と空間的に近く、そしてある程度の再詰込みが、ＤＤＡＨ２においてこれらの２つの側鎖を収容するためには必要である。
【０１３８】
哺乳動物ＤＤＡＨで報告されているが、ＰａＤＤＡＨでは報告されていない別の特徴は、亜鉛イオンの存在であり、その機能は構造的であると推定される；Ｚｎ２＋はまた酵素活性を阻害する（Ｂｏｇｕｍｉｌら、１９９８、ウシの脳から得られたジメチルアルギニナーゼの特徴づけ：亜鉛結合部位に関する証拠、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７、４７９１〜４７９８）。Ｚｎ２＋イオンの証拠は、本発明の構造のいずれにおいても見出されなかった。Ｚｎ２＋はシステイン側鎖およびヒスチジン側鎖に結合すると考えられるが、残基が、細菌の配列においてではなく、哺乳動物ＤＤＡＨにおいてこれらの１つとして保存されている場所がいくつかある：これには、３５、１６８、１９０、２０５および２１４（ＰａＤＤＡＨの番号）が含まれる。３５は別として、これらの残基はすべてが、挿入／欠失、従って、予想される構造的変化がＰａＤＤＡＨと哺乳動物配列との間に存在する構造の様々な部分に存在する。配列および構造のこれまでの検討では、この結合部位について可能な位置は解明されていないが、その阻害作用の観点から可能性のある結合は、活性部位に由来する少なくとも１つの残基と関連している。
【０１３９】
（ｉｉ）アルギニンデイミナーゼの活性部位はどのようなものであるか？
アルギニンデイミナーゼは、微生物における重要なエネルギー源であるアルギニンジヒドロラーゼ経路の最初の段階を触媒する細菌酵素である。アルギニンデイミナーゼは、シトルリンおよびアンモニアへのアルギニンの加水分解を触媒し、これには、ＤＤＡＨによって切断される結合と等価な結合の切断が含まれる。しかし、基質は交換することができない；ラットＤＤＡＨはアルギニンデイミナーゼ活性を有しないと報告され（Ｏｇａｗａら、１９８９、上記）、そしてＰａＤＤＡＨは非常に低いレベルを有するだけであると報告された（Ｓａｎｔａ　Ｍａｒｉａら、１９９９、上記）。
【０１４０】
アラインメントされたデイミナーゼ配列の検討（Ｋｎｏｄｌｅｒら、１９９８、原始的な真核生物Ｇｉａｒｄｉａ　ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓに由来する原核生物酵素アルギニンデイミナーゼのクローニングおよび発現、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３、４４７０〜４４７７）により、保存されたＣｙｓおよびＨｉｓおよびＧｌｕの各残基がＤＤＡＨの場合と同じ順序で明らかにされる。その結果、デイミナーゼが、ＤＤＡＨと類似する触媒作用三つ組残基および機構を有すると推定することは妥当なことである。ＤＤＡＨとアルギニンデイミナーゼとの相同性が認められている（Ｌｅｉｐｅｒら、１９９９、上記）が、相同性は、主として、触媒作用のＧｌｕ残基およびＨｉｓ残基の間の残基に、そして触媒作用Ｃｙｓのすぐ隣接する残基に限定される。モジュール２における配列長さは、ＰａＤＤＡＨにおける長さとほぼ同じであるが、大きい挿入がモジュール４に存在する。
【０１４１】
表ＩＶには、アルギニンデイミナーゼの活性部位がＤＤＡＨおよびＡＴの両方の部位の特徴のいくつかを有することが示される。
【０１４２】
デイミナーゼの活性部位をモデル化するための予備的な試験が、ＰａＤＤＡＨの構造を取得して、局所的な変異を作製することによって行われた（かっこ内の残基はＰａＤＤＡＨからＰａＤＥＩＭまで保存されている）：Ｄ６０Ｎ（６３Ｆ）Ｅ６５Ｒ（６６Ｒ）（８５Ｒ）（８８Ｅ）１１７（Ｄ）（１３２Ｒ）Ｌ１６１Ｍ　Ｋ１６４Ｄ。Ｅ６５ＲおよびＫ１６４Ｄの変異対（この場合、ＲおよびＤはデイミナーゼでは保存されている）は、ＤＤＡＨの活性部位が特に注目されることよりも、ＡＴに、より特徴的である。これらの側鎖は、ＤＤＡＨおよびＡＴではかなり異なる空間位置を占め、その結果、水素結合対の逆転よりも複雑になった再配置がデイミナーゼについては可能である。Ｒ１３２は保存されており、ＰａＤＤＡＨの活性部位の場合と同じ機能を有すると考えることができる。しかし、ヒトおよびマウスのＤＤＡＨＩＩにおけるＲ１３２に等価な残基はＷであり、従って、この位置は重要でないかもしれない。
【０１４３】
上記の置換を調べたとき、活性部位付近の変化により影響されると考えられる他の変異は、Ｙ３８Ｌ、Ａ８２Ｗ、Ｎ２０４、Ｉ２０６Ｑ、Ｖ２４７Ｇ、Ｓ２４８Ｈ、Ｓ２５１Ｔ、Ｌ２５２ＣおよびＰ２５３Ｐであったが、これらの中で、Ｖ２４７Ｇのみが、デイミナーゼファミリーにおいて保存されている残基に対する変化を表す。上記変異のグラフィック検討から、そして分子の仮想的なループ領域の種々の長さに留意して、アルギニンデイミナーゼが、異なる蓋領域および基質の違う配向をおそらくは伴う活性部位のそれ自身の特徴的な変化体を有することは極めて可能である。
【０１４４】
この構造はＣｙｓ−Ｈｉｓ−Ａｓｐの三つ組残基を有する他の構造とどの程度似ているか？
ＤＤＡＨの触媒作用三つ組残基はシステインプロテアーゼの触媒作用三つ組残基を連想させるが、見出された二次構造エレメントはシステインプロテアーゼに類似していない。従って、アリールアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（システインプロテアーゼスーパーファミリーのメンバー）（Ｓｉｎｃｌａｉｒら、２０００、アリールアミンＮ−アセチルトランスフェラーゼの構造は触媒作用三つ組残基を明らかにする、Ｎａｔｕｒｅ　Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７、５６０〜５６４）の触媒作用三つ組残基との、ＤＤＡＨの触媒作用三つ組残基の側鎖の（Ｏを使用した）手作業による重ね合わせにより、Ｃα原子の３つの等価な対の間の距離が２．９Åおよび２．８Åおよび１．８Åであることが示される。しかし、二次構造エレメントの一般的なアラインメントは存在せず、そして触媒作用残基の配列順序は逆になっている。従って、それらが共通の祖先を有する可能性は考えられない。これは、システインプロテアーゼスーパーファミリーにおける触媒作用三つ組残基の収束的な進化の例であり、セリンプロテアーゼと、Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐの触媒作用三つ組残基を無関係に進化させた他の酵素との関係に類似すると考えられる（Ｄｏｄｓｏｎ，ＧおよびＷｌｏｄａｗｅｒ，Ａ、１９９８、触媒作用三つ組残基およびその関連体、ＴＩＢＳ、２３、３４７〜３５２）。
【０１４５】
アルギニンおよび関連分子をプロセシンングする他の酵素とどの程度似ているか？
アルギニンの合成および代謝に関与する多くの酵素（ＷｕおよびＭｏｒｒｉｓ、１９９８、アルギニン代謝：一酸化窒素など、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３６、１〜１７）の中で、様々な構造が、ＮＯＳ（Ｆｉｓｃｈｍａｎｎら、１９９９、一酸化窒素シンターゼイソ型の構造的特徴づけは活性部位の驚くべき保存を明らかにする、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６、２３３〜４２）、アルギナーゼ（Ｃｏｘら、１９９９、アルギナーゼ−ホウ素酸複合体は勃起機能における生理学的役割を強調する、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６、１０４３〜１０４７）、ＰＲＭＴ３（Ｚｈａｎｇら、２０００、タンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼＰＲＭＴ３の保存されたコアの結晶構造、ＥＭＢＯ　Ｊ、１９、３５０９〜３５１９）、アルギニノコハク酸リアーゼ（Ｔｕｒｎｅｒら、１９９７、ヒトアルギニノコハク酸リアーゼ：遺伝子内相補に対する構造的基礎、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４、９０６３〜８）、およびＡＴについて知られているが、ＡＴは別にして、いずれもＤＤＡＨの構造との類似点を何ら有しない。アルギニンを脱イミノ化する２つの酵素が存在する：アルギニンデイミナーゼ（ＥＣ３．５．３．６）、これは自由な基質に作用し、これまでのところ細菌において知られているだけである；タンパク質アルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ、ＥＣ３．５．３．１５）、これは主に脊椎動物において見出され、タンパク質内のアルギニン残基をカルシウムイオンの存在下でシトルリンに変換する。ＤＤＡＨは自由な様々なメチルアルギニンをプロセシングするが、これまでのところ、タンパク質状況内のメチルアルギニン残基をプロセシングする等価な酵素は知られていない。
【０１４６】
ＤＤＡＨとタンパク質アルギニンデイミナーゼとの間には類似性はほとんどないようである。ＤＤＡＨは基質を包み隠し、従ってタンパク質状況内では、これは不可能であるので、これは驚くことではない。ＰＡＤは触媒作用Ｃｙｓ残基を有することが示唆されており（ＭｃＧｒａｗら、１９９９、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓから得られた潜在的な毒性因子のペプチジルアルギニンデイミナーゼの精製、特徴づけおよび配列分析、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、６７、３２４８〜３２５６）、類似する触媒作用三つ組残基の存在は極めて最もらしいようである。
【０１４７】
【表１】
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【０１４８】
【表２】
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【０１４９】
【表３】
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【０１５０】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＤＤＡＨの全体的な折り畳みを示す。１０残基毎に番号が付けられている。
【図２】示された触媒作用残基（Ｓｅｒ（Ｓ、Ｃｙｓからの変異）；Ｈｉｓ（Ｈ）；Ｇｌｕ（Ｅ））およびシトルリン阻害剤（Ｃ）を有する、ＤＤＡＨの骨格のワーム表示図を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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