(57)【要約】ヒト副甲状腺ホルモンを生産するための新規なサッカロミセス・セレビシエ変異株を提供する。新規な株は、ヤップシン１、ヤップシン２及びヤップシン３のヤップシンファミリーのプロテアーゼをエンコードする遺伝子の少なくとも１つにおいて遺伝学的に崩壊しており、そのゲノムにヒト副甲状腺ホルモンを有している。新規な株を培養することにより、高収率で完全なｈＰＴＨが培養培地に分泌される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤップシンファミリーのプロテアーゼであるヤップシン１、ヤップシン２及びヤップシン３をエンコードする少なくとも１つの遺伝子での欠失変異に酵母宿主を付し；
ヒト副甲状腺ホルモンをエンコードする遺伝子を含む発現ベクターで酵母宿主を形質転換し；かつ
形質転換酵母宿主を適当な培地で培養する
工程からなる、酵母宿主からの組換えヒト副甲状腺ホルモン（ｈＰＴＨ）の生産方法。
【請求項２】
欠失変異が、酵母選択マーカーを用いて、ヤップシンファミリーのプロテアーゼであるヤップシン１、ヤップシン２及びヤップシン３をエンコードする遺伝子の少なくとも１つを崩壊させて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酵母宿主が、ＹＰＳ１及びＹＰＳ３遺伝子の双方を崩壊させている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
酵母宿主が、ＹＰＳ１、ＹＰＳ２及びＹＰＳ３遺伝子の全てを崩壊させている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ヒト副甲状腺ホルモン遺伝子を有する発現ベクターで酵母ｙｐｓ１Δｙｐｓ３Δ変異体を形質転換して作製される、酵母株。
【請求項６】
酵母株がサッカロミセス・セレビシエ ＳＬＨ１６／ ｐＧ１０−ｈＰＴＨ（受託番号ＫＣＴＣ ０８１５ＢＰ）であり、発現ベクターがｐＧ１０−ｈＰＴＨ１である請求項５に記載の酵母株。
【請求項７】
ヒト副甲状腺ホルモン遺伝子を有する発現ベクターで酵母ｙｐｓ１Δｙｐｓ２Δｙｐｓ３Δ変異体を形質転換して作製される、酵母株。
【請求項８】
酵母株がサッカロミセス・セレビシエＳＬＨ１８／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ （ＫＣＴＣ ０８１６ＢＰ）であり、発現ベクターがｐＧ１０−ｈＰＴＨ１である請求項７に記載の酵母株。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．　発明の分野
本発明は、ヒト副甲状腺ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ）（以降、「ｈＰＴＨ」とする）の製造に関する。より詳細には、この発明は、アスパラギン酸プロテアーゼのＹＰＳ１、ＹＰＳ２及びＹＰＳ３のヤップシン（ｙａｐｓｉｎ）ファミリーの少なくとも１つにおいて遺伝学的に崩壊（ｄｉｓｒｕｐｔ）し、ｈＰＴＨ遺伝子を有する発現ベクターで形質転換される、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）変異株のホルモン産生における使用に関する。
【０００２】
２．　従来技術の説明
ｈＰＴＨは、副甲状腺によって生産される、８４アミノ酸残基からなるペプチドである。ｈＰＴＨは、カルシウムの代謝及び骨形成を促進する生理学的機能を有するので、腎臓と骨でカルシウムの恒常性を維持する。米国と欧州では、エストロゲン又はカルシトニンが骨粗鬆症の治療として広く使用されているが、骨吸収を妨げることが認められている。したがって、世界中の第一流の製薬会社が、ｈＰＴＨの骨形成促進能力を利用することによって骨粗鬆症の治療剤を開発するため、徹底的かつ広範囲にわたってｈＰＴＨを研究している。特に、現代社会は高齢化社会になりつつあるので、骨粗鬆症の予防と治療に多くの重大な関心が払われている。上記の理由から、活発な研究は、今では、従来の骨粗鬆症の治療に代わる治療となることが期待されるｈＰＴＨを大量生産するためのバイオテクノロジーの手法を開発することに向けられている。
【０００３】
例えば、原核細菌は比較的高い発現効率を示すので、宿主細胞として大腸菌を用いることによる組換えｈＰＴＨの大量生産方法の開発が、種々試みられている。しかし、大腸菌から生産される組換えタンパク質を再生し、精製することは、非常に難しい。これに対し、単細胞真核細胞である酵母は、遺伝子転写及び翻訳系ならびにそのタンパク質−分泌系において高等種に極めて近いので、適切に折りたたまれ、その結果、活性なタンパク質を発現し、分泌する利点を有する。したがって、酵母は、細胞外タンパク質をほとんど分泌せず、外因性タンパク質を回収し、精製しやすい点で、対象タンパク質の生産用宿主として有用である。さらに、酵母サッカロミセス・セレビシエは、身体に病原性でなく、内毒素を生産しない（一般に安全とされている）ＧＲＡＳ微生物である。医療用の組換えｈＰＴＨの生産体として極めて有用であるとの期待から、サッカロミセス・セレビシエは、ｈＰＴＨ発現系の開発で研究されている。組換えｈＰＴＨの生産用発現宿主としてのその種々の利点にもかかわらず、サッカロミセス・セレビシエは、そのような宿主として工業的には利用されていない。というのは、細胞外に分泌された組換えｈＰＴＨは、酵母自体の内因性タンパク質分解酵素によって分解され、完全なｈＰＴＨ分子はごく少量しか回収できないからである（Ｇａｂｒｉｅｌｓｅｎら、Ｇｅｎｅ ９０，２５５（１９９０））。
【０００４】
最近の１０年において、組換えｈＰＴＨのタンパク質分解の問題を解決するために、広範囲な研究が行われている。例えば、ｈＰＴＨが、酵母ゴルジ体に存在するプロテアーゼであるＫＥＸ２の認識部位と同一のＡｒｇ−２５とＬｙｓ−２６との間で切断されるという知見に基づいて、リシンの代わりにアミノ酸配列の２６位にグルタミンを有するｈＰＴＨの置換変異体が、ｈＰＴＨを切断するとの推定上のプロテアーゼであるＫＥＸ２によるタンパク質分解を妨害する目的で作製された（Ｒｅｐｐｅら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６， １４１９８（１９９１））。遺伝子組換え技術を用いては、ｈＰＴＨ−関連タンパク質を酵母ユビキチン遺伝子の３’−末端に直接連結して、切断不可能なｈＰＴＨ−関連タンパク質が生産された（Ｒｉａｎら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２１３， ６４１（１９９３））。しかし、タンパク質変異体を医療に用いる場合には、一般的に新規な薬剤と認識されるため、その医療用途の認可を得るために厳重な試験が必要となる。遺伝子融合技術を用いる際には、予定される消化によって融合部位を除く必要がある。なぜなら、対象のタンパク質は融合部位があるために、比較的低い収率で生産される可能性があるためである。
【０００５】
ｈＰＴＨタンパク質の変異体又は融合体に頼ることなくｈＰＴＨの分解を妨げる研究の結果として、本発明者らは、培養培地にＬ−アルギニンを高濃度で単に添加することにより、ｈＰＴＨの切断を有意な程度まで防止できる方法を開発した（Ｃｈｕｎｇ及びＰａｒｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ５７， ２４５ （１９９８））。培養培地中のＬ−アルギニンの存在によってｈＰＴＨの切断が有意な程度まで防止されるという事実は、ｈＰＴＨ切断が細胞内プロテアーゼＫｅｘ２ｐによるよりむしろ細胞外プロテアーゼによって主に行われていることを示している。この知見から、本発明者らは、１個又は１対の塩基性アミノ酸のＣ−末端部又は中央部を切断でき、酵母の細胞質膜に結合する、ＫＥＸ２のようなＹａｐ３ｐ（酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３）が、酵母培養培地へ分泌されるｈＰＴＨの切断に特に責任を果たしていると推論した。この推論に基づいて、本発明者らは、ＹＡＰ３遺伝子−崩壊酵母株（ｙａｐ３Δ）を作製し、酵母変異体の使用によりｈＰＴＨ生産系を構築した。フラスコでの培養によって、ｈＰＴＨ生産系は、８０％と同じくらい高い効率でｈＰＴＨの切断を防止し、その結果、高収率で完全なｈＰＴＨ分子を生産することが分かった（Ｋａｎｇら、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ５０， １８７（１９９８）； 韓国特許登録第０２４６９３２号（１２月８日１９９９年））。野生型株よりもかなり高いｈＰＴＨ生産性を示すにもかかわらず、ｙａｐ３Δ変異体は、高濃度培養の後期段階で有意な程度までｈＰＴＨを切断できることが認められた（Ｓｏｎｇ及びＣｈｕｎｇ、 Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ ３５， ５０３（２０００）。これは、ｈＰＴＨがＹａｐ３ｐによっては切断されず、後期の培養段階で他のプロテアーゼによって切断されることを示している。サッカロミセス・セレビシエは、構造及び機能の上でＹａｐ３ｐに極めて類似しているアスパラギン酸プロテアーゼＭｋｃ７ｐを有することが報告されている（Ｋｏｍａｎｏ及びＦｕｌｌｅｒ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ＵＳＡ， ９２， １０７５２（１９９５））。本発明者らは、培養段階終期のｈＰＴＨ切断に対する酵素の影響の観察で用いるため、双方の遺伝子が崩壊している（ｙａｐ３Δ／ｍｋｃ７Δ）酵母変異体を作製した。しかし、変異体ｙａｐ３Δとｙａｐ３Δ／ｍｋｃ７Δとで有意な相違は認められなかった（Ｃｈｏｉら、Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ＢｉｏｔＥＣｈｎｏＬ ９，６７９（１９９９））。これらの結果は、Ｍｋｃ７ｐプロテアーゼが、Ｙａｐ３ｐと高いホモロジーを有し（５３％のホモロジー）、Ｋｅｘ２ｐの不在下でプロ−α−接合因子の処理に関与していることをとおして、ｈＰＴＨの切断に大きく責任を果たしているわけではないことを立証した。
【０００６】
最近開示されたサッカロミセス・セレビシエについてのゲノム情報の分析を通じて、ＹＡＰ３（最近はＹＰＳ１に改名された）と同類の遺伝子について検索が行われ、ＰＥＰ４及び ＢＡＲ１に加えて、未知のアスパラギン酸プロテアーゼをコードする３個の新規な遺伝子が存在するとの知見が得られた（Ｏｌｓｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３３９， ４０７（１９９９））。ＹＰＳ１及びＹＰＳ２のようなヤップシンファミリーのアスパラギン酸プロテアーゼの新たなメンバーをエンコードすると推測されることから、３個の新規な遺伝子は、それぞれＹＰＳ３、ＹＰＳ６及びＹＰＳ７と命名された。ＹＰＳ３はＹＰＳ１及びＹＰＳ２の双方と５０％のホモロジーを有することが分かったが、ＹＰＳ６とＢＡＲ１、ならびにＹＰＳ７とＰＥＰ４では、それぞれ３５％及び２５％のホモロジーが見られた。ＹＰＳ３とＹＰＳ１とのホモロジーから、本発明者らは、ｙｐｓ１Δ（先のｙａｐ３Δ）株の終期培養段階に起こるｈＰＴＨ切断はヤップシン ３によって行われている可能性があると推定した。
【０００７】
発明の要約
前記の背景に留意して、本発明は、ｈＰＴＨを高収率で生産できるタンパク質発現系を提供することを目的とする。
本発明の別の目的は、高収率のｈＰＴＨの生産法を提供することである。
ｈＰＴＨの翻訳後修飾の知識によって、本発明に至る修飾及び適用が可能である。
徹底的な研究の結果として、またｈＰＴＨの生物学的生産の研究をとおして、本発明者らは、ヤップシン遺伝子の崩壊により、サッカロミセス・セレビシエでの組換えｈＰＴＨの内因性分解が驚くべきことに低下することを見出した。
本発明の観点によれば、ＹＰＳ１及びＹＰＳ３遺伝子の双方、又はＹＰＳ１、ＹＰＳ２及びＹＰＳ３遺伝子の全てが崩壊したサッカロミセス・セレビシエの変異株が提供される。
本発明の別の観点によれば、生産体としてサッカロミセス・セレビシエ変異株を用いることによるｈＰＴＨの生産方法が提供される。
【０００８】
図面の簡単な説明
本発明の上記及び他の目的、特徴ならびに他の利点は、添付の図面に関連する以下の詳細な記載からより明らかに理解されるであろう。
図１は、ポップ−アウト（ｐｏｐ−ｏｕｔ）のＵＲＡ３選択マーカーの使用による、ＹＰＳ３遺伝子崩壊用カセットの構築工程を示す図である；
図２は、サッカロミセス・セレビシエのＹＰＳ３遺伝子を崩壊させ、ＵＲＡ３選択マーカーを回収する工程を示す図である；
【０００９】
図３は、２４時間（ａ）及び４８時間（ｂ）成長させた、サッカロミセス・セレビシエ２８０５（レーン１）、サッカロミセス・セレビシエ ２８０５／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン２及び３）、サッカロミセス・セレビシエ ＳＹ２８Ｙ３／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン４及び５）ならびにサッカロミセス・セレビシエ ＳＹ２８Ｙ４／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン６及び７）の培養物から得たｈＰＴＨ分子のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、１μｇの天然のｈＰＴＨ（Ｃ）及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー（Ｍ）とともに示す。バンドｉは完全なｈＰＴＨを表し（１〜８４ａ．ａ）、バンドｄ１は切断した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ｈＰＴＨ（２７〜８４ａ．ａ）を表し、かつバンドｄ２はｈＰＴＨ（１〜８０ａ．ａ）を表している；
【００１０】
図４は、２４時間（ａ）及び４８時間（ｂ）成長させた、サッカロミセス・セレビシエＬ３２６２（レーン１）、サッカロミセス・セレビシエ Ｌ３２６２／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン２及び３）、サッカロミセス・セレビシエ ＳＬＨ１５／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン４及び５）、サッカロミセス・セレビシエ ＳＬＨ１６／ ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン６及び７）、サッカロミセス・セレビシエ ＳＬＨ１７／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン８及び９）ならびにサッカロミセス・セレビシエ ＳＬＨ１８／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン１０及び１１）の培養物から得たｈＰＴＨ分子のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、１μｇの天然のｈＰＴＨ（Ｃ）及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー（Ｍ）とともに示す。バンドｉは完全なｈＰＴＨを表し（１〜８４ａ．ａ）、バンドｄ１は切断したｈＰＴＨ（２７〜８４ａ．ａ）を表し、かつバンドｄ２はｈＰＴＨ（１〜８０ａ．ａ）を表している；及び
【００１１】
図５は、ガラクトースを連続的に供給して７２時間成長させた、サッカロミセス・セレビシエ Ｌ３２６２（レーン１）、サッカロミセス・セレビシエ Ｌ３２６２のＹＰＳ１／ＹＰＳ３−二重崩壊体（ａ）：サッカロミセス・セレビシエ Ｌ３２６２／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン２〜７）及びサッカロミセス・セレビシエＳＬＨ１１／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン８〜１３）、サッカロミセス・セレビシエ Ｌ３２６２のＹＰＳ１／ＹＰＳ２／ＹＰＳ３−三重崩壊体（ｂ）：サッカロミセス・セレビシエ ＳＬＨ１６／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン２〜７）及びサッカロミセス・セレビシエ ＳＬＨ１８／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン８〜１３）の培養物から得たｈＰＴＨ分子のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、１μｇの天然のｈＰＴＨ（Ｃ）及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー（Ｍ）とともに示す。バンドｉは完全なｈＰＴＨを表し（１〜８４ａ．ａ）、バンドｄ１は切断したｈＰＴＨ（２７〜８４ａ．ａ）を表し、かつバンドｄ２はｈＰＴＨ（１〜８０ａ．ａ）を表している。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、ヤップシンファミリーのＹＰＳ１、ＹＰＳ２及びＹＰＳ３プロテアーゼの少なくとも１つを生産できない酵母宿主から、組換えｈＰＴＨを生産する方法に関する。
エキソプロテアーゼ活性はｈＰＴＨのＣ−又はＮ−末端からの残基の切断を示すので、プロテアーゼのヤップシン１（以降「ＹＰＳ１」とする）、ヤップシン２（以降「ＹＰＳ２」とする）又はヤップシン３（以降「ＹＰＳ３」とする）は、酵母宿主で完全なｈＰＴＨ分子を生産しにくくする。したがって、本発明は、３個のプロテアーゼＹＰＳ１、ＹＰＳ２及びＹＰＳ３の少なくとも１つを発現できない酵母変異体を宿主細胞として用いることによる高収率での完全なｈＰＴＨ分子の生産法からなる。
【００１３】
ＹＰＳ１とＹＰＳ２は、主としてｈＰＴＨ生産用の形質転換体の初期培養段階で酵素活性を発揮するが、ＹＰＳ３は、主に後期培養段階でｈＰＴＨを切断するものと考えられている。ＹＰＳ１遺伝子が損傷しているｙｐｓ１Δ株の場合、ｈＰＴＨは、ＹＰＳ１を欠いているために初期培養段階に高収率で得ることができるが、ＹＰＳ３の必然的なタンパク質分解活性のために後期培養段階では低い収率で得られる。
したがって、酵母宿主の培養をとおしてｈＰＴＨの生産率を改善するには、好ましくはＹＰＳ１とＹＰＳ３の双方（ｙｐｓ１Δ／ｙｐｓ３Δ）、より好ましくはＹＰＳ１、ＹＰＳ２及びＹＰＳ３の全て（ｙｐｓ１Δ／ｙｐｓ２Δ／ｙｐｓ３Δ）を欠く変異体が宿主として用いられる。
【００１４】
プロテアーゼの欠失は、酵素選択マーカーの使用によって、ＹＰＳ１、ＹＰＳ２及びＹＰＳ３からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子を崩壊させて行うことができる。
酵母の選択マーカーは特に限定されないが、ポップアウトできるものが好ましい。本発明の好ましい具体例では、ＵＲＡ３選択マーカーはカセットの形態で提供される。酵母選択マーカーを含むポップ−アウトカセットは、酵母ゲノムに含まれる標的遺伝子、つまりｙｐｓ１、ｙｐｓ２及びｙｐｓ３をホモロジー組換え法によって崩壊できるように、その両端にＹＰＳ１、ＹＰＳ２及びＹＰＳ３のＮ−ならびにＣ−末端部位をコードする遺伝子フラグメントを有する。ゲノムにカセットを有する酵母を選択できれば、いずれの選択マーカーも用いることができる。ここで、ｙｐｓ３遺伝子がＵＲＡ３選択マーカーによって崩壊しているｙｐｓ３Δ変異体は、ｙｐｓ３：：ＵＲＡ３と示される。
【００１５】
この発明によれば、ｈＰＴＨ遺伝子は、発現ベクターによって酵母に保持される。したがって、この発明は、ｈＰＴＨ遺伝子が挿入されている組換え発現ベクターに関する。この発明で有用な発現ベクターは、酵母で遺伝子を発現させる手段であり、かつ発現を制御する手段を有する。ベクターの選択と組換えベクターの構築は当業者に自明であり、またその詳細を以下の実施例に記載する。
別の観点で、この発明は、組換え発現ベクターを用いてｙｐｓ１Δ／ｙｐｓ３Δ又はｙｐｓ１Δ／ｙｐｓ２Δ／ｙｐｓ３Δ酵母変異体から調製される形質転換体に関する。
【００１６】
この発明の好ましい具体例で、組換えベクターｐＧ１０−ｈＰＴＨ１を、サッカロミセス・セレビシエ変異体（ｙｐｓ１Δ／ｙｐｓ３Δ及びｙｐｓ１Δ／ｙｐｓ２Δ／ｙｐｓ３Δ）に形質転換し、形質転換体ＳＬＨ１６／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ及びＳＬＨ１８／ｐＧ１０−ｈＰＴＨを作製した。これらは、２０００年７月６日にそれぞれＫＣＴＣ ０８１５ＢＰ及びＫＣＴＣ ０８１６ＢＰの受託番号で韓国生命工学研究所（ＫＲＩＢＢ）の韓国の培養コレクション（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）に寄託された。
この発明は、例示であって、この発明を限定しない以下の実施例に照らしてより良く理解される。
【００１７】
実験株及びプラスミド
サッカロミセス・セレビシエでのｈＰＴＨの発現には、ＧＡＬ１０プロモーター ：：ｐｐＬ：：ｈＰＴＨ：：ＧＡＬ７タミネーターからなるｈＰＴＨ発現カセットを含むプラスミドｐＧ１０−ｈＰＴＨ１を用いた（Ｃｈｕｎｇ及びＰａｒｋ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． ５７、２４５（１９９８））。ポップ−アウトのＵＲＡ３選択マーカー（ＵＲＡ３：：ｔｃ５）カセットは、ｐＴｃＵＲ３由来の１．８ｋｂ ＢａｍＨＩフラグメントから調製した（Ｋａｎｇら、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ５３， ５７５−５８２ （２０００））。サッカロミセス・セレビシエ２８０５とサッカロミセス・セレビシエＬ３２６２ａを、ＹＰＳ３−欠失変異体調製用親細胞として用いた（Ｋａｎｇら、Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ８， ４２−４８（１９９８））。また、本発明で用いた細胞は、ＹＰＳ１遺伝子が欠失している、酵母株ＳＬＨ１１（Ｋａｎｇら、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ５９， １８７（１９９８））、 ＳＬＨ１２とＳＬＨ１４（Ｃｈｏｉら、Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． Ｂｉｏｅｎｇｉｎ．， ８９， ７７（２０００））（先のＹＡＰ３）、ＹＰＳ２遺伝子（先のＭＫＣ７）又はその双方であった。酵母株の遺伝学的特徴を、以下の表１に要約する。
【００１８】
【表１】
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【００１９】
培地組成及び培養条件
酵母株を、ＹＰＳ３遺伝子を崩壊するＵＲＡ３カセット又は発現ベクターｐＧ１０−ｈＰＴＨ１で形質転換する際、ウラシルを欠く合成培地ＳＣ−ＵＲＡのみを用いた。得られたｙｐｓ３：：ＵＲＡ３変異体からＵＲＡ選択マーカーを回収するために、５−ＦＯＡ（５−フルオロテート（ｆｌｕｏｒｏｔａｔｅ））培地を用いた（Ａｄａｍｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｙｅａｓｔ ｇｅｎｅｔｉｃｓ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９７）。ＧＡＬ１０ プロモーター制御下のｈＰＴＨ発現の誘導で用いるため、ＹＰＤＧ（酵母抽出物１％、バクトペプトン２％、グルコース１％、ガラクトース １％）培地で４８時間のあいだ培養した。
【００２０】
実施例１：ＹＰＳ３遺伝子−崩壊酵母変異体の確立
ＹＰＳ３遺伝子の崩壊で用いるためのＵＲＡ３カセットを含む組換えベクターの構築を、図１に例示する。
ＹＰＳ３遺伝子の崩壊をもたらすホモロジー組換えに必要なＹＰＳ３遺伝子のＮ−及びＣ−末端フラグメントを、ＧｅｎＢａｎｋに登録されたサッカロミセス・セレビシエのＹＰＳ３塩基配列に基づいて合成した２対のプライマーを用いてＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により作製した。あとの遺伝子操作を簡便にするため、Ｎ−末端フラグメント増幅用のプライマーセット（５’−ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＧＧＡＧ−３’及び５’−ＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＡＣＴＣＴＡＣＣＧＡＡＴＧＣＣＧ−３）を、各５’−末端部位にＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩの認識部位（下線部）を有するように設計したが、ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩの認識部位を、Ｃ−末端フラグメントの増幅用のプライマーセット（５’−ＧＡＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＡＣＧＴＣＴＧＡＧＴＧＧＡＧ−３’及び５’−ＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＴＡＣＴＣＴＡＣＣＧＡＡＴＧＣＣＧ−３）の５’−末端部位に導入した（下線部）。ＰＣＲを、「ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ２４００」のようなＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ製のサーマルサイクラーで、変性に９５℃／３０秒、アニーリングに５５℃／３０秒、かつ伸長に７２℃／３０秒からなる２５サーマルサイクルを用いて行い、それぞれＹＰＳ３遺伝子領域のＮ−末端及びＣ−末端領域をエンコードする８００ｂｐ及び７００ｂｐ ＤＮＡフラグメントをサッカロミセス・セレビシエのゲノムＤＮＡから作製した。ＰＣＲ産物、つまりＹＰＳ３ Ｎ−末端及びＣ−末端フラグメントを、制限酵素ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ及びＢａｍＨＩ／ＸｂａＩそれぞれを用いて二重に消化し、あらかじめＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩで処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ（＋）ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）に２つの制限酵素消化物を連結した。得られた組換えベクターｐＢ−ＹＰＳ３ＮＣの２つの末端フラグメント間に位置するＢａｍＨＩ認識部位に、ＵＲＡ３ポップアウト選択マーカーを導入し、ＹＰＳ３遺伝子の崩壊に使用するためのｐＢ−ｙｐｓ３：：ＵＲＡ３：ｔｃ５ベクターを構築した。
【００２１】
次に、図２に例示するように、ＵＲＡ３カセットを用い、ＵＲＡ３選択マーカーをそれから回収することにより、サッカロミセス・セレビシエのＹＰＳ３遺伝子を崩壊させた。
詳細には、ＥｃｏＲＩ／ＸｂａＩを用いるベクターｐＢ−ｙｐｓ３：：ＵＲＡ３：ｔｃ５の制限酵素処理によって得られるＤＮＡフラグメントをサッカロミセス・セレビシエ 株２８０５、Ｌ３２６２ａ、ＳＬＨ１１ （ｙｐｓ１△）、ＳＬＨ１２ （ｙｐｓ２△）、及びＳＬＨ１４ （ｙｐｓ１△／ｙｐｓ２△）にトランスフェクトした後、Ｕｒａ＋形質転換体の一次選択をＳＣ−ＵＲＡ選択培地で行った。ＰＣＲを行い、Ｕｒａ＋形質転換体がＹＰＳ３遺伝子を崩壊させているかどうかを同定し、その後、こうして選択したｙｐｓ３：：ＵＲＡ３：ｔｃ５形質転換体を５−ＦＯＡプレートに広げ、ホモロジー組換えによるＵＲＡ３遺伝子のポップアウトから生じるｙｐｓ３：：ｔｃクローンを選択した。
【００２２】
最終的に得られたｙｐｓ３△変異体のＹＰＳ３遺伝子の崩壊をＰＣＲによって再同定し、他のヤップシンプロテアーゼ遺伝子を任意に欠くｙｐｓ３−崩壊体、Ｓ２８Ｙ４、 ＳＬＨ１５、 ＳＬＨ１６、ＳＬＨ１７及びＳＬＨ１８を得た。これらの変異体株を以下の表２に要約する。
【００２３】
【表２】
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【００２４】
実施例２： ｈＰＴＨ 発現性の組換え酵母株の確立及びｈＰＴＨ発現の分析
サッカロミセス・セレビシエ野生型株２８０５及びＬ３２６２ならびにサッカロミセス・セレビシエ変異体Ｓ２８Ｙ４、ＳＬＨ１５ （ｙｐｓ３△）、ＳＬＨ１６ （ｙｐｓ１△／ｙｐｓ３△）、ＳＬＨ１７（ｙｐｓ２△／ｙｐｓ３△）及びＳＬＨ１８（ｙｐｓ１△／ｙｐｓ２△／ｙｐｓ３△）を、発現ベクターｐＧ１０−ｈＰＴＨ１で形質転換し、次いでＵｒａ＋形質転換体を選択した。ｈＰＴＨを発現できる、これらの組換え酵母株を、ｈＰＴＨ発現分析に付した。
【００２５】
酵母変異体を、最少選択培地（アミノ酸−欠損酵母窒素基質０．６７％、グルコース２％、カサミノ酸（ｃａｓａｍｉｎｏ ａｃｉｄ） ０．５％）で２４時間３０℃で前培養した。各培養物をＹＰＤＧ培地（酵母抽出物１％、バクトペプトン２％、グルコース１％、ガラクトース１％）に２％量で接種し、次いで４８時間３０℃で培養した。この培養中、試料を２４時間と４８時間で回収した。各試料５００μｌを５分５，０００ｒｐｍで遠心分離し、バイオマスから上清を分離した。ＤＯＣ（デオキシコール酸）とＴＣＡ（トリクロロ酢酸）それぞれを上清の１／１０量で加え、次いで３０分０℃に置き、中に含まれるタンパク質を沈澱させた。１０分１２，０００ ｒｐｍで遠心分離して得たペレットを、アセトンで洗浄し、沈澱タンパク質中に残存するＴＣＡ溶液を除き、溶解緩衝液２５μｌ中に溶解し、５分１００℃で加熱して、細胞外タンパク質画分を得た。細胞外タンパク質画分１０μｌを１５％ポリアクリルアミド分離ゲル（ｐＨ８．８、１０ｃｍ幅、８ｃｍ長、０．７ｍｍ厚）に充填し、１．５時間１２５Ｖかつ２５ｍＡで電気泳動に付した。ゲルで動いたタンパク質をクマシーブルーで視覚化した。２４時間の試料についての電気泳動の結果を図３ａに、４８時間の試料についての結果を図３ｂに示す。
【００２６】
これらの電気泳動写真に見られるように、サッカロミセス・セレビシエ株から分泌される組換えｈＰＴＨをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したところ、３つのバンド：完全な分子についてのｉ（１−８４）；Ｎ−末端切断型分子についてのｄ１（２７−８４）；及びＣ−末端切断型分子についてのｄ２（１〜８０）として現れた。バンドｉ及びバンドｄ１に位置するタンパク質を、ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオライド）膜に移した。Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｍ６０００タンパク質シーケンサーでのタンパク質のＮ−末端アミノ酸シークエンスにより、バンドｉ及びｄ１のタンパク質のＮ−末端領域でアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ及びＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌがそれぞれ同定され、バンドｉのタンパク質は完全なｈＰＴＨ分子であるが、ｄ１バンドのタンパク質は、ｈＰＴＨのＮ−末端領域の２６アミノ酸残基を欠く切断型（２７〜８４）であることが示された。バンドｄ２については、完全な分子より１４ｋＤａ大きい電気泳動のバンドが示されたが、ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ質量分析及びＣ−末端アミノ酸シークエンスによって分析されるように、そのタンパク質が、Ｃ−末端（１〜７９、８０）の４〜５アミノ酸残基を欠く切断型ｈＰＴＨであることが分かった。特徴的な電気泳動のパターンは、Ｃ−末端の除去によるタンパク質の配座変化に帰することが報告されている（Ｖａｄ ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． １３： ３９６−４０２ （１９９８））。
【００２７】
実施例３：ヤップシンプロテアーゼ−欠損変異体におけるｈＰＴＨ発現パターン
ｈＰＴＨ発現に対するＹＰＳ１及びＹＰＳ３遺伝子の崩壊の影響を調べるため、野生型サッカロミセス・セレビシエ株２８０５非形質転換体、野生型サッカロミセス・セレビシエ２８０５／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１形質転換体、ｙｐｓ１△変異Ｓ２８Ｙ３／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１形質転換体及びｙｐｓ３△変異Ｓ２８Ｙ４／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１形質転換体から分泌されるｈＰＴＨ分子を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動に付した。電気泳動の結果を図３に示す。
【００２８】
電気泳動写真に見られるように、非形質転換体の野生型株ではｈＰＴＨ分子は発現されなかった（レーン１）。形質転換体の野生株２８０５で発現される約５０％以上のｈＰＴＨが、切断型ｄ１で存在した（レーン３及び４）。ｙｐｓ１△変異体Ｓ２８Ｙ３の場合には、２４時間培養物から得た際に、培地に分泌されるｈＰＴＨの切断型は全ｈＰＴＨの５％未満であった。これに対し、４８時間培養物から得られるｈＰＴＨの約３０〜４０％は、ｄ１型で存在することが分かった。ＹＰＳ３遺伝子のみを崩壊させた株Ｓ２８Ｙ４は、ｈＰＴＨ発現パターンにおいて野生型株と異ならなかった：２４時間以内に分泌されるｈＰＴＨの約５０％以上が切断型で存在することが分かった。
【００２９】
ひとまとめにして考慮すると、図３に示す結果は、初期培養段階でｈＰＴＨ切断を引き起こす主たるプロテアーゼはヤップシン１であり、ヤップシン１以外のプロテアーゼは後期培養段階でｈＰＴＨの切断の原因であることを立証している。しかし、ＹＰＳ３遺伝子のみを崩壊させた株の場合には、有意な作用は得られない。というのは、ヤップシン１の活性は、初期培養段階で有意な程度までｈＰＴＨを既に切断しているからである。
【００３０】
したがって、ＹＰＳ３遺伝子を他のヤップシン遺伝子ＹＰＳ１及びＹＰＳ２と組み合わせて崩壊させた際の、ｈＰＴＨ生産の発現パターンについて調べた。この目的のため、野生型サッカロミセス・セレビシエＬ３２６２非形質転換体を対照として、Ｌ３２６２／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１形質転換体、ｙｐｓ３△変異ＳＬＨ１５／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１形質転換体、ｙｐｓ１△／ｙｐｓ３△ 変異ＳＬＨ１６／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１形質転換体、ｙｐｓ２△／ｙｐｓ３△変異ＳＬＨ１７／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１形質転換体及びｙｐｓ１△／ｙｐｓ２△／ｙｐｓ３△変異ＳＬＨ１８／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１形質転換体でｈＰＴＨを発現させた。分泌されるタンパク質を上記と同様にして電気泳動し、２４時間培養後に回収した試料についての電気泳動の結果を図４ａ、４８時間培養後に回収した試料についての結果を図４ｂに示す。
【００３１】
図４に示されるように、非形質転換株でｈＰＴＨは検出されなかった（レーン１）。２４時間での回収時、形質転換野生株（レーン２及び３）、ＹＰＳ３−崩壊株（レーン４及び５）ならびにＹＰＳ２及びＹＰＳ３−二重崩壊株（レーン６及び７）から分泌されるｈＰＴＨ の５０％が、Ｎ−末端切断型ｄ１で存在した。４８時間後、ｈＰＴＨ切断は、切断型ｈＰＴＨの割合をさらに増加させることが分かった。他方、興味深いことに、４８時間で得たとしても、ＹＰＳ１及びＹＰＳ３−二重崩壊株（レーン６及び７）、ならびにＹＰＳ１、ＹＰＳ２、ＹＰＳ３−三重崩壊株（レーン１０及び１１）から分泌されるｈＰＴＨ分子は、いずれもＮ−末端切断型ｄ１を有しなかった。さらに、バンドｄ２の切断型はＹＰＳ１及びＹＰＳ３−二重崩壊株から分泌される全ｈＰＴＨの約２０％であることが示されたが、バンドｉの完全なｈＰＴＨは、ＹＰＳ１／ＹＰＳ２／ＹＰＳ３−三重崩壊株の４８時間培養後ですら観察される一方、ｄ２バンドタンパク質は見られなかった。これらの結果は、ひとまとめにすると、野生型酵母株が有するｈＰＴＨの分解の問題が、ＹＰＳ１、ＹＰＳ２及びＹＰＳ３の遺伝子全てが崩壊している株の使用によりほぼ完全に解消することを示した。
【００３２】
実施例４：高濃度培養におけるｈＰＴＨ発現パターン
上記のように作製したヤップシンプロテアーゼ−欠損変異体から発現されるｈＰＴＨがタンパク質分解を受けるか否かを調べるために、実験を行った。これに関して、ガラクトースを、発酵槽での高濃度培養条件を模倣するためにフラスコに連続的に供給した。ＹＰＤＧ培地で２４時間前培養後、株をさらに７２時間培養したが、２％レベルで培地のガラクトース濃度を維持するため、２４時間間隔でガラクトースを培地に供給した。
【００３３】
これらの条件下、野生型サッカロミセス・セレビシエ Ｌ３２６２非形質転換体を対照として、Ｌ３２６２／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１形質転換体、ｙｐｓ１△変異ＳＬＨ１１／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１形質転換体、ｙｐｓ１△／ｙｐｓ３△変異ＳＬＨ１６／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１形質転換体、及びｙｐｓ１△／ｙｐｓ２△／ｙｐｓ３△変異ＳＬＨ１８／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１形質転換体でｈＰＴＨを発現させた。分泌されたタンパク質を上記と同様にして電気泳動し、Ｌ３２６２／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１及びＳＬＨ１１／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１株についての電気泳動の結果を図５ａ、ＳＬＨ１６／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１及びＳＬＨ１８／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１についての結果を図５ｂに示す。
【００３４】
図５に示すように、２４時間での回収時、野生型酵母（レーン２〜７、図５ａ）から分泌されるｈＰＴＨの約５０％が、Ｎ−末端切断型ｄ１で既に存在していた。他方、ｙｐｓ１△変異体（図５ａ、レーン８〜１３）及びｙｐｓ１△／ｙｐｓ３△変異体（レーン２〜７、図５ｂ）の培養物の場合、２４時間培養ではｈＰＴＨは分解しなかったが、ガラクトースを連続的に与えた４８時間の高濃度培養ではｈＰＴＨ分解が有意に観察された。これに対し、ｙｐｓ１△／ｙｐｓ２△／ｙｐｓ３△変異体の培養物（レーン８〜１３、図５ｂ）は、７２時間での回収時ですら、Ｎ−末端切断型ｄ１のｈＰＴＨを有さず、完全なｈＰＴＨ（ｉバンド）を有意に増加することが分かった。さらに１４４時間ですら、三重−崩壊変異体の培養物は、ｈＰＴＨの切断型を有しないことが観察された。これらの結果は、後期の高濃度培養段階で生じるｈＰＴＨの分解の問題が、ＹＰＳ１、ＹＰＳ２及びＹＰＳ３の遺伝子全てが崩壊している変異体を用いて完全に解消できることを明らかにした。
【００３５】
前記のとおり、ヤップシン１（先のＹＰＡ３）とヤップシン３遺伝子がともに崩壊している酵母変異体（ｙｐｓ１△／ｙｐｓ３△）、又はヤップシン１、ヤップシン２（先のＭＫＣ７）とヤップシン３遺伝子が全て崩壊している変異株（ｙｐｓ１△／ｙｐｓ２△／ｙｐｓ３△）は、種々の疾患の治療に有用な完全ｈＰＴＨを、ホルモンペプチドを分解できないために、高収率で分泌することができる。
この発明は例示的に記載されており、使用される用語は限定ではなく、説明を意図していることが理解されるべきである。上記の示唆に照らして、本発明の多くの改変及び変更が可能である。したがって、添付の請求の範囲内で、本発明は、詳述される以外の点で実施され得ることが理解されるべきである。
【００３６】
【表Ａ】
2004507270.tif 000005
【００３７】
【表Ｂ】
2004507270.tif 000006
【００３８】
【図面の簡単な説明】
【図１】
ポップ−アウト（ｐｏｐ−ｏｕｔ）のＵＲＡ３選択マーカーの使用による、ＹＰＳ３遺伝子崩壊用カセットの構築工程を示す図である。
【図２】
サッカロミセス・セレビシエのＹＰＳ３遺伝子を崩壊させ、ＵＲＡ３選択マーカーを回収する工程を示す図である。
【図３】
２４時間（ａ）及び４８時間（ｂ）成長させた、サッカロミセス・セレビシエ２８０５（レーン１）、サッカロミセス・セレビシエ ２８０５／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン２及び３）、サッカロミセス・セレビシエ ＳＹ２８Ｙ３／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン４及び５）ならびにサッカロミセス・セレビシエ ＳＹ２８Ｙ４／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン６及び７）の培養物から得たｈＰＴＨ分子のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、１μｇの天然のｈＰＴＨ（Ｃ）及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー（Ｍ）とともに示す。バンドｉは完全なｈＰＴＨを表し（１〜８４ａ．ａ）、バンドｄ１は切断した（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ｈＰＴＨ（２７〜８４ａ．ａ）を表し、かつバンドｄ２はｈＰＴＨ（１〜８０ａ．ａ）を表している。
【図４】
２４時間（ａ）及び４８時間（ｂ）成長させた、サッカロミセス・セレビシエＬ３２６２（レーン１）、サッカロミセス・セレビシエ Ｌ３２６２／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン２及び３）、サッカロミセス・セレビシエ ＳＬＨ１５／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン４及び５）、サッカロミセス・セレビシエ ＳＬＨ１６／ ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン６及び７）、サッカロミセス・セレビシエ ＳＬＨ１７／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン８及び９）ならびにサッカロミセス・セレビシエ ＳＬＨ１８／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン１０及び１１）の培養物から得たｈＰＴＨ分子のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、１μｇの天然のｈＰＴＨ（Ｃ）及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー（Ｍ）とともに示す。バンドｉは完全なｈＰＴＨを表し（１〜８４ａ．ａ）、バンドｄ１は切断したｈＰＴＨ（２７〜８４ａ．ａ）を表し、かつバンドｄ２はｈＰＴＨ（１〜８０ａ．ａ）を表している。
【図５】
ガラクトースを連続的に供給して７２時間成長させた、サッカロミセス・セレビシエ Ｌ３２６２（レーン１）、サッカロミセス・セレビシエ Ｌ３２６２のＹＰＳ１／ＹＰＳ３−二重崩壊体（ａ）：サッカロミセス・セレビシエ Ｌ３２６２／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン２〜７）及びサッカロミセス・セレビシエＳＬＨ１１／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン８〜１３）、サッカロミセス・セレビシエ Ｌ３２６２のＹＰＳ１／ＹＰＳ２／ＹＰＳ３−三重崩壊体（ｂ）：サッカロミセス・セレビシエ ＳＬＨ１６／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン２〜７）及びサッカロミセス・セレビシエ ＳＬＨ１８／ｐＧ１０−ｈＰＴＨ１（レーン８〜１３）の培養物から得たｈＰＴＨ分子のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、１μｇの天然のｈＰＴＨ（Ｃ）及び予備染色されたタンパク質分子量マーカー（Ｍ）とともに示す。バンドｉは完全なｈＰＴＨを表し（１〜８４ａ．ａ）、バンドｄ１は切断したｈＰＴＨ（２７〜８４ａ．ａ）を表し、かつバンドｄ２はｈＰＴＨ（１〜８０ａ．ａ）を表している。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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2004507270.tif 000046
2004507270.tif 000047
2004507270.tif 000048