(57)【要約】本発明は、カルパイン３によって開裂することのできる少なくとも１つのアミノ酸配列を含有することを特徴とする、少なくとも１つの蛍光性または発色性レポーター分子と結合したペプチドに関する。本発明はさらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生体試料のカルパイン３またはカルパイン３のイソ型の活性を検出する方法であって、その方法によって、第１のステップにおいて、前記生体試料を請求項１に記載のペプチドに接触させ、第２のステップにおいて、カルパイン３またはカルパイン３のイソ型による前記ペプチドの開裂の存在または不在を、発色または蛍光反応の強度を測定することによって検出する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルパイン３またはカルパイン３のイソ型によって開裂され得る少なくとも１つのアミノ酸配列を含有することを特徴とする少なくとも１つの蛍光性または発色性レポーター分子と結合したペプチド。
【請求項２】
カルパイン３またはカルパイン３のイソ型の少なくとも１つの自己分解部位を含有し、そのアミノ酸数が１０未満であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
カルパイン３の自己分解部位のアミノ酸配列が、以下の配列、ＮＭＴＹＧＴＳ（配列番号１）、ＮＭＤＮＳＬＬ（配列番号２）、ＰＶＱＹＥＴＲ（配列番号３）から選択されることを特徴とする請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
カルパイン３の自己分解部位のアミノ酸配列が、以下の配列、ＶＡＰＲＴＡ ＡＥＰＲＳＰ（配列番号４）、ＱＳＫＡＴＥ ＡＧＧＧＮＰ（配列番号５）、および以下のマウス配列、ＶＡＰＲＴＧ ＡＥＰＲＳＰ（配列番号６）、ＱＧＫＴＴＥ ＡＧＧＧＨＰ（配列番号７）から選択されることを特徴とする請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
自己分解部位のアミノ酸配列が、Ｌｐ８２と称するカルパイン３のイソ型に由来し、以下のアミノ酸配列、ＮＰＹＬＬＰＧＦＦＣ（配列番号１８）、およびＴＩＳＶＤＲＰＶＰ（配列番号１９）から選択されることを特徴とする請求項２に記載のペプチド。
【請求項６】
カルパイン３またはカルパイン３のイソ型によって開裂され得る配列が、基質タンパク質に由来し、以下の配列、ＲＥＶＴＩＰＰＫＹＲＥＬＬ（配列番号１０）、ＫＥＧＴＩＰＰＥＹＲＫＬＬ（配列番号１１）、ＰＶＳＲＥＥＫＰＴＳＡＰＳＳ（配列番号１２）、ＰＶＳＲＥＥＫＰＳＳＡＰＳＳ（配列番号１３）、ＫＳＴＶＬＱＱＱＹＮＲ（配列番号１４）から選択されることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
ペプチドが、カルパイン３またはカルパイン３のイソ型を用いるペプチド・ライブラリのスクリーニングによって得られることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
それぞれの端に合成蛍光性レポーター分子、それぞれＭＣＡ（ドナー分子）およびＤｎｐ（アクセプタ分子）を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
レポーター分子がタンパク質であることを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
それぞれの端に変異ＧＦＰを有することを特徴とする請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
変異ＧＦＰが、それぞれＣＦＰおよびＹＦＰであることを特徴とする請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
請求項１に記載のペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【請求項１３】
請求項１２に記載のＤＮＡ配列、および宿主細胞においてＤＮＡ配列の発現を低減するプロモータを含有するベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで生体試料のカルパイン３またはカルパイン３のイソ型の活性を検出する方法であって、その方法によって、
−第１のステップにおいて、前記生体試料を請求項１に記載のペプチドに接触させ、
−第２のステップにおいて、カルパイン３またはカルパイン３のイソ型による前記ペプチドの開裂の存在または不在を、発色または蛍光反応の強度を測定することによって検出する方法。
【請求項１６】
第１のステップが、宿主細胞を請求項１３に記載のベクターでトランスフェクトすることにあることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第１のステップが、請求項１に記載のペプチドを、細胞抽出物または組織切片に接触させることにあることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ペプチドが、それぞれの端に、それぞれ蛍光性ドナー分子および蛍光性アクセプタ分子を有し、蛍光性反応の強度がＦＲＥＴによって求められることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＧＭＤ２Ａを診断するための、請求項１５に記載の方法の使用。
【請求項２０】
カルパイン３またはカルパイン３のイソ型を活性化または阻害する物質をスクリーニングする方法であって、前記方法が、
−前記物質で処理した生体試料を調製すること、
−次いで、そのように処理した前記試料を、請求項１に記載のペプチドと接触させること、および
−カルパイン３またはカルパイン３のイソ型を活性化または阻害する物質の存在または不在をそれぞれ示す、発色または蛍光反応の存在または不在を検出することにある方法。
【請求項２１】
ペプチドが、それぞれの端に、それぞれ蛍光性ドナー分子および蛍光性アクセプタ分子を有し、蛍光性反応の強度がＦＲＥＴによって求められることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
カルパイン３またはカルパイン３のイソ型を活性化または阻害する物質をスクリーニングする方法であって、前記方法が、
−請求項１に記載のペプチドを含有する生体試料を調製すること、
−次いで、前記試料を同定される物質と接触させること、および
−カルパイン３またはカルパイン３のイソ型を活性化または阻害する物質の存在または不在をそれぞれ示す、発色または蛍光反応の存在または不在を検出することにある方法。
【請求項２３】
ペプチドが、それぞれの端に、それぞれ蛍光性ドナー分子および蛍光性アクセプタ分子を有することを特徴とする請求項２２に記載の方法であって、その方法が、
ａ／前記ペプチドを含有する生体試料を調製すること、
ｂ／カルパイン３またはカルパイン３のイソ型を活性化または阻害する物質の不在下、ＦＲＥＴの量を測定すること、
ｃ／ペプチドを含有する生体試料を、カルパイン３またはカルパイン３のイソ型を活性化または阻害する物質に接触させること、
ｄ／カルパイン３またはカルパイン３のイソ型を活性化または阻害する物質の存在下、ＦＲＥＴの量を測定すること、
ｅ／ｂ／で測定したＦＲＥＴの量がｄ／で測定したＦＲＥＴの量より大きい場合、活性化物質の存在を、または
ｂ／で測定したＦＲＥＴの量がｄ／で測定したＦＲＥＴの量と等しい場合、阻害物質の存在を断定することにある方法。
【請求項２４】
カルパイン３遺伝子の転移の効率を分析する方法であって、その方法が、
最初に、カルパイン３遺伝子で動物またはヒト細胞をトランスフェクトすること、
次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、トランスフェクトされた細胞を請求項１に記載のペプチドに接触させること、および
発色または蛍光反応の強度を測定することにある方法。
【請求項２５】
ペプチドが、それぞれの端に、それぞれ蛍光性ドナー分子および蛍光性アクセプタ分子を有し、蛍光性反応の強度がＦＲＥＴによって求められることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞、細胞系、または組織からなる生体試料において、カルパイン３活性を検出する方法に関する。本発明はまた、前記方法で用いるためのペプチドに関する。本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで肢帯筋ジストロフィー２Ａ型（ＬＧＭＤ２Ａ）を診断するための前記ペプチドの使用に関する。さらに本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの動物またはヒト細胞、およびｉｎ ｖｉｖｏでの動物へのカルパイン３遺伝子の転移の効率を分析する方法に関する。本発明はまた、カルパイン３を阻害または活性化する物質をスクリーニングする方法に関する。最後に、カルパイン３活性を検出する方法は、カルパイン３の機能を研究するための一手段である。
【０００２】
【従来の技術】
カルパインは、カルシウム活性化可能、非リソソーム系システイン・プロテアーゼのファミリーである（Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ、１９９７）。このファミリーは現在のところ、２つの遍在性のタンパク質を含む１１のメンバーを含む。カルパインの生理的機能は、大部分はまだ知られていない。カルパインは調節型プロテアーゼとして、重要な細胞機能を調節するはずである。特に、遍在性のカルパインは、アポトーシス（Ｓｑｕｉｅｒ、１９９４）、筋分化（Ｋｗａｋ、１９９３）、ならびに細胞分裂および融合（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、１９９４）、（Ｓｃｈｏｌｌｍｅｙｅｒ、１９８６）、（Ｂａｌｃｅｒｚａｋ、１９９５）に関わる。
【０００３】
ｐ９４としても知られるカルパイン３は、骨格筋に特異的に発現するカルパインのファミリーに属するカルシウム依存性システイン酵素である（Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ、１９８９）。カルパイン３は肢帯筋ジストロフィー２Ａ型と呼ばれる常染色体劣性遺伝病に関与する（Ｒｉｃｈａｒｄ、１９９５）。このミオパシーは、下肢帯および上肢帯の筋肉の萎縮および進行性脱力、ならびに筋生検での壊死・再生の出現によって特徴づけられる（Ｆａｒｄｅａｕ、１９９６）。ヒトの染色体１５に位置する遺伝子は、それ自体が９４ｋＤａのタンパク質をコードする３．５ｋｂのトランスクリプトをコードする。カルパイン３は、ＩＳ２領域を介して、筋節の弾性タンパク質タイチンに結合でき、Ｃｏｓ７細胞に発現したとき、翻訳後直ちに自己分解を受けることが実証されている（Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ、１９９３）、（Ｓｏｒｉｍａｃｈｉ、１９９５）。この領域は、カルパインが細胞質または核に位置し得ることを暗示する核局在化シグナルを含む。さらに、カルパイン３は、インターロイキン６を過剰に発現するトランスジェニック・マウスにおいて発現不足であり、これらのマウスは筋萎縮を示すことが明らかになっている。カルパイン３はまた、筋萎縮成分（悪液質など）を含む様々な状態において発現不足であると考えられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
したがって現在の知識では、ＬＧＭＤ２Ａは、カルパイン３遺伝子に出現し、骨格筋に存在するカルパイン３のタンパク分解の抑制をもたらす突然変異によるものであることが明らかになっている。ＬＧＭＤ２Ａの臨床診断は、患者が少なくとも約１０種の他の病的状態と類似の臨床症状を示すので、非常に困難である。分子診断に関しては、様々な方法により行うことができる。
【０００５】
第１の可能性は、カルパイン遺伝子の突然変異探索を行うことである。しかしながら、遺伝子が比較的に大きく、したがって多数の異なる突然変異が存在し、差別的な突然変異がないため、そのような技法は非常に困難である。
【０００６】
他の技法は、特異抗体を用いてタンパク質の存在を検出することにある。しかしながら、カルパイン遺伝子上の突然変異は、そのタンパク質が存在するものの、自己分解の現象は存在しないことを示す可能性があるので、たとえ試料にカルパイン３が存在しても、その個体が病気でないことを示すものではない。他方で、カルパインが存在しない、または減少している場合、カルパイン以外の遺伝子上の突然変異による２次性カルパイン異常症を含む可能性がある。
【０００７】
換言すれば、本発明が解決しようとする問題は、生体試料のカルパイン３の存在を検出することではなく、むしろその活性を検出することである。
【０００８】
Ｇｕｔｔｍａｎｎ等は、文献「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」１４４巻、１８章に、精製カルパインを非特異蛍光ペプチド（Ｓｕｃｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ）に接触させ、その後、分子が開裂するときに現れる蛍光の変動を測定することによる、遍在性なカルパインの活性を測定する方法を記載している。別の方法では、カルパインを全ＴＡＵタンパク質に接触させ、その後、ウエスタンブロット法を行う。この文献は、特にカルパイン３に関するものではない。さらに、基質は非特異（ｍ−カルパインおよびμ−カルパインの基質）または全タンパク質である。
【０００９】
本発明が解決しようとする問題は、生体試料においてカルパイン３活性を検出するために用いることのできる、カルパイン３に特異的な新規な基質を開発することである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明は第１に、少なくとも１つの蛍光性または発色性レポーター分子と結合したペプチドに関し、前記ペプチドは、カルパイン３またはカルパイン３のイソ型によって開裂され得る少なくとも１つのアミノ酸配列を含有することを特徴とする。
【００１１】
「カルパイン３のイソ型」という表現は、別のプロモータまたは別のスプライシング型の別の事象に起因する、カルパイン３遺伝子によって産生された任意のタンパク質を意味する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
第１の実施形態において、カルパイン３の自己分解特性を考えると、本発明のペプチドは、有利にはカルパイン３またはカルパイン３のイソ型の少なくとも１つの自己分解部位を含有し、そのアミノ酸数は１０未満である。
【００１３】
以下の説明および請求の範囲において、「自己分解部位」という表現は、カルパイン３またはそのイソ型の１つに含有され、カルパイン３またはそのイソ型の１つによって少なくとも２つのペプチドに開裂され得るアミノ酸配列、さらに任意の誘導配列を意味する。
【００１４】
実施においては、カルパイン３の自己分解部位のアミノ酸配列は、以下の説明でそれぞれ部位１、部位２、および部位３と称する、配列ＮＭＴＹＧＴＳ（配列番号１）、ＮＭＤＮＳＬＬ（配列番号２）、およびＰＶＱＹＥＴＲ（配列番号３）から選択される。これらの部位は、今日までカルパイン３配列が知られているすべての種で同一である（ヒト、マウス、ラット）。
【００１５】
カルパイン３の自己分解部位のアミノ酸配列は、以下のヒト配列ＶＡＰＲＴＡ ＡＥＰＲＳＰ（配列番号４）、ＱＳＫＡＴＥ ＡＧＧＧＮＰ（配列番号５）、および以下のマウス配列ＶＡＰＲＴＧ ＡＥＰＲＳＰ（配列番号６）、ＱＧＫＴＴＥ ＡＧＧＧＨＰ（配列番号７）から選択することもできる。
【００１６】
本発明のペプチドがカルパイン３のイソ型の少なくとも１つの自己分解部位を含有する実施形態において、自己分解部位のアミノ酸配列は、げっ歯類、ラット、およびマウスに存在するＬｐ８２と称するカルパイン３のイソ型に由来し、以下のアミノ酸配列ＮＰＹＬＬＰＧＦＦＣ（配列番号８）、およびＴＩＳＶＤＲＰＶＰ（配列番号９）から選択される。
【００１７】
第２の実施形態において、カルパイン３またはカルパイン３のイソ型によって開裂され得るアミノ酸配列は、たとえばカルパスタチン、フィラミン、タリン、遍在性なカルパイン、クリスタリン、熱ショックタンパク質などの基質タンパク質に由来する。
【００１８】
有利には、基質タンパク質は、以下の配列を有する。
ＲＥＶＴＩＰＰＫＹＲＥＬＬ（配列番号１０）（ヒト・カルパスタチン）
ＫＥＧＴＩＰＰＥＹＲＫＬＬ（配列番号１１）（マウスおよびラット・カルパスタチン）
ＰＶＳＲＥＥＫＰＴＳＡＰＳＳ（配列番号１２）（ヒト・アルファ−Ａ−クリスタリン）
ＰＶＳＲＥＥＫＰＳＳＡＰＳＳ（配列番号１３）（マウスおよびラット・アルファ−Ａ−クリスタリン）
ＫＳＴＶＬＱＱＱＹＮＲ（配列番号１４）（ヒト・タリン）
アクセッション番号ＸＰ ０４５８５６で公表の配列（ヒト・フィラミン２）
アクセッション番号Ｐ １０８０９で公表の配列（ヒト熱ショックタンパク質６０）
アクセッション番号ＮＰ ００４３５５で公表の配列（ヒトｃ／ＥＢＰベータ）
アクセッション番号Ｐ １７６５５で公表の配列（ヒトｍ−カルパイン）
【００１９】
第３の実施形態において、カルパイン３またはカルパイン３のイソ型によって開裂され得る配列を含有するペプチドは、カルパイン３またはカルパイン３のイソ型を用いるペプチド・ライブラリのスクリーニングによって得られる。
【００２０】
その後の発色または蛍光分析によるカルパイン活性の検出を可能にするために、本発明のペプチドは、すでに述べたように、発色または蛍光レポーター分子に結合している。
【００２１】
レポーター分子が発色性分子であるとき、カルパイン３によるアミノ酸配列の開裂は、発色化合物の出現によって分光光度計で検出されることになる。実施において、用いられる発色化合物はパラ−ニトロアニリドである。チオエステルも用いることができる。
【００２２】
ペプチドが蛍光性化合物に結合しているとき、その開裂は蛍光放射の変化によって検出される。この場合、実施において用いられる蛍光化合物は、４−メチル−７−クマリルアミド（ＭＣＡ）、またはナフチルアミドである。ナフチルアミド、および７−アミノ−３−フルオロメチルクマリルアミドは、発色性または蛍光性基質として用いることができる。
【００２３】
他の実施形態において、カルパイン３で開裂され得るペプチドは、その両端で２つの蛍光性化合物と結合しており、その開裂は、開裂に次いで、ペプチドの他方の側に位置し、これらの分子が接近しているときに第１の蛍光を吸収する第２の化合物（アクセプタ分子）が離れることによる、第１の化合物（ドナー分子）の蛍光放射の変化によって検出される。この技法は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）の名称でよく知られている（Ｆｏｒｓｔｅｒ、１９４８）。より詳細には、ＦＲＥＴは、ある一定の条件下で２つの蛍光分子間に起こり得る物理的現象であり、この２つの分子は互いに十分に接近していなければならず（１００Å未満）、分子のうちの１つ（ドナー分子）の放射スペクトルは、第２の分子（アクセプタ分子）の励起スペクトルを含んでいなければならない。こうして、ドナー分子がその励起波長で励起されたとき、より高いエネルギーのレベルに達する。数ピコ秒のうちに、エネルギーの一部は異なる形態（熱など）で媒体に分散する。ドナー分子が最適な配向にあり、アクセプタ分子に近接している場合、そのエネルギーは光子の関与なしに、または２分子間の衝突を必要とせずに、このアクセプタ分子に移動され得る。次いで、アクセプタ分子は励起され、それ自体の放射波長において光を放射する。ペプチドが開裂しているとき、このエネルギーはもはや吸収されず、ドナー分子は蛍光を放射する。したがって、蛍光の増加は、ペプチド開裂の測定可能な活性に相当する。蛍光性レポーター分子は、化学合成によって得られた合成分子、または蛍光シグナルの放射を可能にするタンパク質であってよい。
【００２４】
第１の実施形態において、ペプチドはそれぞれの端に、合成蛍光性レポーター分子を有し、それぞれＭＣＡ（ドナー分子）およびＤｎｐ（アクセプタ分子）である。
【００２５】
第２の実施形態において、そのドナーは、５−［（２’−アミノ−エチル）アミノ］ナフタレンスルホン酸（ＥＤＡＮＳ）であり、アクセプタは、４−［［４’−（ジメチルアミノ）フェニル］アゾ安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）である。
【００２６】
上述のすべての場合において、発色性または蛍光性分子に結合している本発明のペプチドは、化学合成によって得られる。
【００２７】
すでに述べたように、レポーター分子は、蛍光シグナルの放射を可能にするタンパク質であってもよい。したがって、有利な実施形態において、ペプチドはそれぞれの端に変異ＧＦＰを有する。
【００２８】
ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）は、パシフィッククラゲ（Ａｅｑｕｏｒａ Ｖｉｃｔｏｒｉａ）によって合成され、その動物がストレスを受けたときに緑色蛍光を放射する２７ｋＤａのタンパク質である（Ｐｒａｓｈｅｒ、１９９２）。このタンパク質を精製し、その遺伝子を同定することがすでに可能である。ＧＦＰをコードする配列は、非常に多様なタンパク質をコードする配列と同調してクローン化できる。ＧＦＰは他のタンパク質に結合したとき、その蛍光の特性を保ち、そのことが、ＧＦＰが結合したタンパク質によって起こる多くの現象の研究、たとえば細胞移動、または様々な細胞画分内部でのタンパク質の移動の研究などを容易にする。発蛍光団を形成する、または発蛍光団と相互に作用するアミノ酸におけるＧＦＰのある種の変異は、特定の蛍光の特徴を有する変異の同定を可能にした（Ｅｌｌｅｎｂｅｒｇ、１９９９、Ｐｏｌｌｏｃｋ、１９９９）。特に、ＣＦＰ、シアン蛍光タンパク質（励起４４０ｎｍ、放射４８０ｎｍ）、およびＹＦＰ、黄色蛍光タンパク質（励起５１４ｎｍ、放射５３０ｎｍ）のタンパク質が単離された。これら２種のタンパク質は、理論上、ＦＲＥＴ現象によって結合され得る。実際に、ＣＦＰ（ドナー分子）の放射スペクトルとＹＦＰ（アクセプタ分子）の励起スペクトルとの間に重複部分がある。
【００２９】
これらの２つのタンパク質が互いに十分に近接し、ＣＦＰがその励起波長で励起されるとき、ＣＦＰは活性化エネルギーをＹＦＰに移動することができ、次いでＹＦＰは５３５ｎｍで光を放射することができる。上述したカルパイン３の自己分解部位に対応する配列は、したがってＣＦＰとＹＦＰ配列との間でクローン化されることになる。この系は、ＣＦＰがカルパイン３開裂可能ペプチドによってＹＦＰに結合されるキメラタンパク質を生細胞において産生することによって、カルパイン３を検出するために用いられる。
【００３０】
本発明の対象はさらに、少なくとも１つの蛍光タンパク質に結合したペプチドをコードするＤＮＡ配列であり、前記ペプチドは、カルパイン３またはカルパイン３のイソ型によって開裂可能な少なくとも１つのアミノ酸配列を含有する。好ましい実施形態において、このＤＮＡ配列は以下のペプチドをコードする。
ＣＦＰ−部位１−ＹＦＰ
ＣＦＰ−部位２−ＹＦＰ
ＣＦＰ−部位３−ＹＦＰ
【００３１】
本発明はまた、前記ＤＮＡ配列、および宿主細胞でＤＮＡ配列の発現を誘導するプロモータに含有されるベクター関する。そのようなベクターは、たとえば（Ｖａｎｄｅｒｋｌｉｓｈ、２０００）に記載のプラスミドから直接誘導された、出願者によって開発されたプラスミドｐＴＯＭである。本発明はさらに、前記ベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【００３２】
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生体試料におけるカルパイン３またはカルパイン３のイソ型の活性を検出する方法であって、その方法によって第１のステップにおいて、前記生体試料を上述のペプチドに接触させ、第２のステップにおいて、カルパイン３またはカルパイン３のイソ型による前記ペプチドの開裂の存在または不在を比色または蛍光反応の強度を測定することによって検出する方法に関する。
【００３３】
第１のステップは、その検出が動物またはヒト由来の細胞である生細胞または細胞抽出物、あるいは組織からなる生体試料で行われるのかに応じて、様々な形態を取る可能性がある。
【００３４】
試料が生細胞からなるとき、ペプチドとの接触は２つの方法で行うことができる。第１の実施形態において、ペプチドが細胞に浸透する十分な透過性を示すような方法で、ペプチドを直接細胞に接触させる。ペプチドの透過性は、レポーター分子の性質に応じて決定される。第２の実施形態において、生体試料は、本発明のペプチドに対応するＤＮＡ配列をコードするベクターでトランスフェクトされた宿主細胞に対応し、レポーター分子は、蛍光シグナルの放射を可能にするタンパク質に対応する。
【００３５】
試料が細胞抽出物の形態であるとき、ペプチドを単純に前記抽出物と接触させる。
【００３６】
活性の検出は、すでに述べたように、組織切片上で直接行うこともできる。実施においては、生体試料（器官、器官の一部、たとえば筋生検）を採り、その後、液体窒素で冷却したイソペンタン中で凍結させる。使用するまで、それを−８０℃で貯蔵する。低温保持装置を用いて、５から１５μｍの切片を調製し、スライドガラスに置く。この切片も、すぐに使用しない場合−８０℃で貯蔵する。カルパイン活性の検出は、スライドガラスの上にペプチドを直接載せることによって行うことができる。
【００３７】
有利な実施形態において、ペプチドは、それぞれの端にそれぞれ蛍光ドナー分子および蛍光アクセプタ分子を有し、蛍光反応の強度はＦＲＥＰによって求められる。このように、カルパインが細胞内で活性でない場合、ＦＲＥＴ現象が起こる。これに反して、カルパインが活性である場合、カルパインはペプチドを開裂し、次いでＦＲＥＴ現象が減少する。
【００３８】
カルパイン３またはカルパイン３のイソ型の活性を検出するこの方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＧＭＤ２Ａを診断する有利な適用例となる。したがって本発明はさらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＬＧＭＤ２Ａを診断するための、上述の検出方法の使用に関する。
【００３９】
本発明はまた、カルパイン３またはカルパイン３のイソ型を阻害または活性化する物質をスクリーニングする方法に関する。前記方法は、２つの異なる実施形態を取ることができる。
【００４０】
第１の実施形態によれば、この方法は、
−前記物質で処理した生体試料を調製すること、
−次いで、そのように処理した前記試料を本発明のペプチドと接触させること、
−カルパイン３またはカルパイン３のイソ型を活性化または阻害する物質の存在または不在をそれぞれ示す発色または蛍光反応の存在または不在を検出することにある。
【００４１】
生体試料は、細胞、細胞抽出物、または組織の形態であることができる。ペプチドを含有する生体試料の調製は、処理試料（細胞、細胞抽出物、または組織抽出物）をペプチドと混合することによって行う。実施において、ペプチドは、それぞれの端にそれぞれ蛍光ドナー分子および蛍光アクセプタ分子を有し、蛍光反応の強度はＦＲＥＰによって求められる。
【００４２】
第２の実施形態によれば、この方法は、
−本発明によるペプチドを含有する生体試料を調製すること、
−次いで、前記試料を同定する物質と接触させること、
−カルパイン３またはカルパイン３のイソ型を活性化または阻害する物質の存在または不在をそれぞれ示す、発色または蛍光反応の存在または不在を検出することにある。
【００４３】
この場合、生体試料は、レポーター分子がタンパク質由来であるとき、本発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むベクターでトランスフェクトされた細胞または細胞系からなる。
【００４４】
有利な実施形態において、ペプチドは、それぞれの端にそれぞれ蛍光ドナー分子および蛍光アクセプタ分子を有し、この方法は、
ａ／前記ペプチドを含有する生体試料を調製すること、
ｂ／カルパイン３またはカルパイン３のイソ型を活性化または阻害する物質の不在下、ＦＲＥＴの量を測定すること、
ｃ／ペプチドを含有する生体試料を、カルパイン３またはカルパイン３のイソ型を活性化または阻害する物質に接触させること、
ｄ／カルパイン３またはカルパイン３のイソ型を活性化または阻害する物質の存在下、ＦＲＥＴの量を測定すること、
ｅ／ｂ／で測定したＦＲＥＴの量がｄ／で測定したＦＲＥＴの量より大きい場合、活性化物質の存在を、またはｂ／で測定したＦＲＥＴの量がｄ／で測定したＦＲＥＴの量と等しい場合、阻害物質の存在を断定することにある。
【００４５】
本発明の対象はまた、カルパイン３遺伝子の転移の効率を分析する方法であって、この方法は、
−最初に、カルパイン３をコードするプラスミドで動物またはヒト細胞をトランスフェクトすること、
−次いで、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、トランスフェクトした細胞を本発明のペプチドと接触させること、
−発色性または蛍光性反応の強度を測定することにある。
【００４６】
有利な実施形態において、ペプチドは、それぞれの端にそれぞれ蛍光ドナー分子および蛍光アクセプタ分子を有し、蛍光反応の強度はＦＲＥＰによって求められる。
【００４７】
カルパイン３遺伝子は完全に同定されており、そのトランスフェクション技法は文献ＥＰ７１７１１０に精確に記載されているので、これ以上詳細には説明しない。
【００４８】
本発明、およびその結果として起こる利点は、添付の図面に加えて、以下の実施例からより明らかになるであろう。
【００４９】
【実施例】
Ｉ／タンパク質抽出物を用いるカルパイン３の活性の検定
カルパイン３（図１）の自己分解部位に対応する合成ペプチドの開裂によって、ＦＲＥＴを含む技法を用いる活性の検出が可能となる。
【００５０】
Ａ／材料および方法
１／蛍光光度計  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＸＳ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ蛍光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）
【００５１】
２／蛍光ペプチドの配列
Ｍｃａ−ＮＭＴＹＧＴＳ−Ｄｎｐ（部位１）
Ｍｃａ−ＮＭＤＮＳＬＬ−Ｄｎｐ（部位２）
Ｍｃａ−ＰＶＱＹＥＴＲ−Ｄｎｐ（部位３）
【００５２】
３／用いた市販の酵素および阻害剤の参照
カルパイン１：ヒト赤血球（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）
カルパイン２：ラット、組換え、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）
カルパイン３：ヒト、組換え、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）
【００５３】
４／反応条件
最終量２００μｌ、カルシウム（ＣａＣｌ２）最終濃度１０ｍＭ、蛍光ペプチド最終濃度１．９μＭ
【００５４】
５／蛍光の検出
反応は、１時間（この場合、５０秒毎に蛍光を測定）、または６時間（２分毎に測定）かけて、３７℃で行う。
【００５５】
各測定と測定の間、媒質を攪拌する。ペプチドの蛍光を検出するために用いる波長は以下のとおりである。
−Ｍｃａの励起波長  ３２５ｎｍ
−Ｄｎｐの放射波長  ３９２ｎｍ
【００５６】
６／バッファーの構成
最初に、反応条件、特に反応バッファーの組成を構成した。実際上、蛍光の検出は非常に鋭敏であることがわかった。最初の検定は、バッファーの種々の成分、およびその濃度を変えることにあった。ＮａＣｌの様々な濃度を試験した。ペプチドを再懸濁するＤＭＳＯが低濃度であることの重要性が実証された。反応媒質中のＣＨＡＰＳ、さらにＢＳＡの存在が、蛍光の最適な検出を可能にすることも示された。カルパイン３の活性化を確実なものにするため、反応は１０ｍＭのカルシウムの存在下、３７℃で行った。実際上、ほぼナノモル濃度のカルシウムの存在下にあるとき、カルパイン３は活性である。
【００５７】
バッファーの組成
市販カルパインの再懸濁バッファー：１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、５０ＭｍのトリスＨＣｌ、５ｍＭのβ−メルカプトエタノール、４０％グリセロール、ｐＨ＝７．８。周囲温度で貯蔵。蛍光ペプチドの再懸濁バッファー：ペプチドを１００％ＤＭＳＯに１ｍｇ／ｍｌで再懸濁する。４℃で暗所に貯蔵。
反応バッファー：１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．１％ＣＨＡＰＳ、１００ｎｇ／μｌのＢＳＡ、ｐＨ＝７．４。周囲温度で貯蔵。
【００５８】
７／真核細胞の培養
用いた細胞系：Ｃ２Ｃ１２、マウス筋芽細胞
用いた培地：
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
ＭＥＭ：可欠アミノ酸の溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
ＦＣＳ：子ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
Ｃ２Ｃ１２に用いた培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ
【００５９】
カルパインの活性化：最終濃度６ｍＭの塩化カルシウム、および最終濃度０．５μＭのイオノマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を培地に添加する。
【００６０】
８／真核細胞への発現ベクターのトランスフェクションのプロトコル
材料：種々のプラスミドのＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ＥｎｄｏＦｒｅｅプロトコルに従って調製する（参照１２３６２）。
用いたプラスミド：ｐＥＣＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＹＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
【００６１】
方法：
第１日：所望の細胞をトリプシン処理し、その後、翌日に細胞が５０〜８０％コンフルエントとなるようにウェルに接種する。
第２日：子ウシ胎児血清を含まない９４μｌの培地を、第１の滅菌ポリスチレン管（Ｔ１）に入れる。ＦＵＧＥＮＥ６バッファー（Ｂｏｅｒｉｎｇｈｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）６μｌを、管Ｔ１それぞれに添加する。周囲温度で５分間、インキュベーションを行う。ＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミド１〜２μｇを、第２の滅菌ポリスチレン管（Ｔ２）の底部に入れる。５分のインキュベーションの終わりに、ベクターを含有する管Ｔ２に、ＦＵＧＥＮＥ６（Ｔ１）バッファーおよび培地を１滴ずつ入れる。攪拌せずに、周囲温度で３０分間、インキュベーションを行う。ウェルの培地を変える。３０分後、各ウェルにトランスフェクション混合物を１滴ずつ加え、液滴をウェルの表面全体に分布する。３７℃／７％ＣＯ２で、細胞を増殖させる。
【００６２】
コメント：各トランスフェクションに関して、ＦＵＧＥＮＥ６に接触させていないウェル（細胞コントロール）、およびＦＵＧＥＮＥ６のみに接触させた細胞のウェル（ＦＵＧＥＮＥ６の毒性のコントロール）を提供する。
【００６３】
９／細胞溶解プロトコル
原理：トランスフェクトされている、またはされていない動物細胞を、その特性を研究することのできるタンパク質抽出物を調製するために溶解する。
【００６４】
方法：ウェルから培地を除去し、ウェルをＰＢＳ（リン酸緩衝化ダルベッコ溶液（カルシウム、マグネシウム、炭酸水素ナトリウムを含まない）Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で洗浄する。細胞を採取し、５００ｇ、４℃で１０分間遠心分離する。上澄みを除去し、ウェル当たり溶解バッファー７００μｌの割合の溶解バッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ＝７．４）に細胞を採る。このバッファーを４℃で５分間作用させる。１００００ｇ／１０分／４℃で遠心分離を行う。上澄みを回収し、−２０℃で貯蔵する。
【００６５】
１０／組織溶解プロトコル
原理：その特性を研究することのできるタンパク質抽出物を調製するために、筋肉を摩砕する。
【００６６】
材料：正常マウス、およびカルパイン３欠損マウスの大腿四頭筋。
【００６７】
方法：筋肉を液体窒素に摩砕する。摩砕組織１ｍｇ当たり溶解バッファー１９μｌの割合で、溶解バッファーに摩砕材料を再懸濁する（上述の細胞溶解プロトコルの組成を参照）。バッファーを、氷中１０分間作用させる。１００００ｇ、４℃で１０分間遠心分離を行う。上澄みを回収し、−２０℃で貯蔵する。
【００６８】
Ｂ／カルパイン３による「自己分解部位」ペプチド開裂の特異性の検定
カルパイン３が、自己分解部位に対応するペプチドを開裂できるかどうかを確かめる前に、第１の検定は、これらのペプチド（部位１、部位２、部位３）が他のプロテアーゼ、特に遍在性なカルパインによって開裂され得ないことを確かめることにあった（図２を参照）。コントロールの「酵素を含まないペプチド」の曲線を「ペプチド＋酵素」の曲線に重ねることができるので、カルパイン１および２は、各自己分解部位に開裂活性を有さない。他のプロテアーゼ、カスパーゼ３でも類似の結果が得られた。
【００６９】
タイチンの存在により、カルパイン３は筋肉細胞において、より高い安定性を有することが知られている。カルパイン３がそれ自体の自己分解部位を開裂できたことを証明するために、カルパイン３をコードするプラスミドでＣ２Ｃ１２細胞をトランスフェクトすることによって、Ｃ２Ｃ１２細胞に過発現させた。カルパイン３をコードするプラスミドによるトランスフェクションと同時に、ｐＥＣＦＰによるコントロールのトランスフェクションを行った。Ｃ２Ｃ１２のトランスフェクション効率は１０％未満である。次いでタンパク質を抽出し、それらの活性を自己分解部位で検定した（図３）。
【００７０】
部位１および２に対するトランスフェクトまたは非トランスフェクトＣ２Ｃ１２抽出物の活性を表す曲線は、蛍光のわずかな増加を示しており、カルパイン３がこれらの部位を開裂できることを意味する可能性がある。カルパイン３は筋肉に発現するタンパク質であり、したがって非トランスフェクト細胞抽出物に観察される基礎活性は正常である。しかしながら、部位１および２に関して、トランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞との間に相違を検出することはできない。それに反して、部位３では、トランスフェクト細胞において開裂活性が高い。相違は最小であるが、トランスフェクト細胞の低いパーセンテージと矛盾しない。
【００７１】
次いでカルパイン３を欠損している、または欠損していない細胞培養の抽出物でこの系を検定する。これを行うために、筋原性細胞培養物を誘導した（Ｒｉｃｈａｒｄ、２０００）カルパイン３遺伝子欠損マウスを用いる。これによって、カルパイン３欠損筋肉細胞（−／−細胞）の培養の抽出物を、正常筋肉細胞（＋／＋細胞）の培養の抽出物と比較することができる。最初は、未分化細胞（筋芽細胞）で検定を行った（図４）。
【００７２】
これらの実験によって、部位１において低い開裂活性が検出され得たことが示された。しかしながら、＋／＋細胞と−／−細胞との活性の相違は非常に小さい。部位２では、開裂活性は検出され得なかった。部位３では、開裂活性が検出されるが、＋／＋細胞と−／−細胞との活性の相違は明らかでない。
【００７３】
＋／＋抽出物と−／−抽出物との間のより大きな活性の相違を実証するために、筋管に分化した筋肉細胞の抽出物で同じ検定を行った（図５）。具体的には、カルパイン３は理論上、筋芽細胞に比べて筋管において多く発現する。
【００７４】
この実験によって、−／−細胞の抽出物における部位３の開裂活性が、＋／＋細胞の抽出物に比べて高いことが示され、これは＋／＋細胞と−／−細胞との唯一の相違はカルパイン３の欠損であるので驚くべきことである。したがって、カルパイン３欠損細胞における活性の低下はより確実であろう。
【００７５】
＋／＋抽出物と−／−抽出物との間のより大きな活性の相違を実証するために、１時間ではなく６時間にわたって同じ反応を行った（図６）。
【００７６】
部位１および部位２の開裂活性は、＋／＋細胞の抽出物および−／−細胞の抽出物において高くなっている。反応を６時間にわたって行ったとき、部位３の活性の増加が確認される。活性は、＋／＋細胞の抽出物に比べて−／−細胞の抽出物で高い。これらの実験によって、検定を６時間にわたって行ったとき、部位３の開裂活性が＋／＋細胞型と−／−細胞型とに差異を生じさせることを示すことができる。
【００７７】
さらにカルパイン３を欠損している、または欠損していないマウス由来の筋肉の溶解産物で活性検定を行った。この検定は、大腿四頭筋を用いて行った（図７）。
【００７８】
＋／＋組織抽出物による部位１および部位２の開裂活性は、−／−組織抽出物の活性より高い。−／−組織抽出物による部位３の開裂活性は、＋／＋組織抽出物の活性より高い。これらの実験によって、組織抽出物を用いて得られた結果は、細胞抽出物を用いて得られた結果と類似していることが示される。特に、カルパイン３が存在しない抽出物を用いた部位３で高い活性が確認される。したがって、この活性はおそらく他のプロテアーゼによるものであり、その活性はカルパイン３の不在下で活性化されると考えられる。
【００７９】
ＩＩ／細胞でのカルパイン３の活性の検定
Ａ／材料および方法
発現ベクターｐＴＯＭへのオリゴヌクレオチドのクローニング
原理：カルパイン３の自己分解部位に対応する２本鎖配列を形成するように、２つの相補オリゴヌクレオチドを結集する。このオリゴヌクレオチドは、対合によってそれぞれの端で制限部位が形成されるように選択される。これらのフラグメントを、制限酵素で前消化させた発現ベクターｐＴＯＭにクローン化する。
【００８０】
材料：
オリゴヌクレオチド：部位１、部位２、部位３
制限酵素：ＢａｍＨ１、ＢｓｐＥ１、ＳｍａＩ（ＢｉｏＬａｂｓ）、Ｅｃｌ１３６ＩＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）
用いた細菌株：ＳＣＳ１１０、ｄａｍ−ＳｔｒＲ細菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
プラスミド・ベクター： ｐＴＯＭ（Ｇｅｎｅｔｈｏｎ）（図１２）
【００８１】
方法：２つの相補オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション
１本鎖相補オリグヌクレオチドを、それぞれ最終濃度２０ｎｇ／μｇで、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲバッファー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中互いに接触させる。ハイブリダイゼーションは、以下の条件に従って、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行う。９５℃／１分→９０℃／３０秒→８５℃／３０秒→８０℃／３０秒→７５℃／３０秒→７０℃／３０秒→６５℃／３０秒→６０℃／３０秒→５５℃／３０秒。対合の進展は、ソフトウェアＳｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ１．６．３を用いて経時的にモニターする。
【００８２】
ベクターｐＴＯＭの消化
ベクターｐＴＯＭを、２種の酵素ＢａｍＨ１およびＢｓｐＥ１を用いて、酵素それぞれに関して２時間３７℃で消化する。
【００８３】
ｐＴＯＭでのオリゴヌクレオチドのライゲーション
ライゲーション混合物において、挿入物の量とベクターの量との比は３（モル）である。ライゲーション反応を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下、１６℃で一晩行う。
【００８４】
電気的コンピテント細菌調製のプロトコル
ＬＢ１５ｍｌおよび選別剤に、２０％グリセロール中−８０℃で貯蔵した細菌１０μｌを接種する。振とうしながら（約３００ｒｐｍ）、インキュベーションを３７℃で８時間行う。ＬＢ２００ｍｌおよび可能な選択剤に、前培養物２ｍｌを接種する。ＯＤ（６００ｎｍ）＝０．５まで、細菌を増殖させる。用いられるすべての材料は、事前に４℃に冷却しなければならない。培養物を１５分間氷中に静置し、その後、管当たり２５ｍｌの割合で分配する（８本）。４０００ｒｐｍ、４℃で２０分間、遠心分離を行う。上澄みを除去し、ペレットを静かに氷水２００ｍｌに溶解し（管当たり２５ｍｌ、８本）、前と同様に遠心分離を行う。上澄みを除去し、ペレットを氷水１００ｍｌに溶解し（管を２本ずつ合わせる、４本）、前と同様に遠心分離を行う。上澄みを注意深く除去し、ペレットをそれぞれ１０％グリセロール５ｍｌ（オートクレーブにかけ、−２０℃で貯蔵） に溶解し、４つを１本の管に合わせ、前と同様に遠心分離を行う。上澄みを除去し、ペレットを１０％グリセロール４００μｌに溶解する。４０μｌのアリコートをエッペンドルフに分配し、−８０℃で凍結する。
【００８５】
応答性細菌のコントロール：それらを以下に記載のプロトコルに従って、コントロール・プラスミドで形質転換する。力価は、形質転換ベクターのマイクログラム当たり、１０８コロニーを超えるべきである。
【００８６】
形質転換のプロトコル
ライゲートしたＤＮＡ１μｌ（≒０．１ｎｇ）を、電気的コンピテント細菌４０μｌに添加し、氷中で４分間接触させる。混合物をエレクトロポレーション・タンクに入れる（Ｂｉｏｒａｄジーンパルサー、キュベット０．２ｃｍ）。エレクトロポレーション条件：２５００Ｖ、２００ｏｈｍ、２５μＦ。ＳＯＣ１ｍｌをすぐに添加し、抗生物質に対して耐性の遺伝子を発現させるために、３７℃で３０分から１時間静置する。２０μｌおよび２００μｌを、最終濃度１０μｇ／ｍｌで、ＬＢおよびカナマイシンのペトリ皿に平板培養する。細菌を３７℃で一晩増殖させる。
【００８７】
コロニーの分析
コロニーをカウントし、最終濃度１０μｇ／ｍｌで、カナマイシンおよびＬＢ１００μｌ中、９６ウェル・プレートで継代培養する。コロニー中のプラスミドの存在を確かめるために、ｍｉｄＥＹＦＰ．ａおよびｍｉｄＥＣＦＰ．ｍの対、または以下のフォワード・オリゴの１つおよびリバース・オリゴヌクレオチドｍｉｄＥＣＦＰ．ｍの対のいずれかを用いて、これらのコロニーでＰＣＲを行う。
【表１】
2004520850.tif 000002
各オリゴヌクレオチドは、クローン化２本鎖フラグメントに特異的である。これらはＢｓｐＥＩ制限部位に集中している。
【００８８】
ＰＣＲ産物を、最終濃度０．５μｇ／ｍｌで、０．８％アガロースおよび臭化エチジウムからなるゲルに添加する。プラスミド中の挿入物の存在を確かめるために、いくつかのポジティブ・クローンのＰＣＲ産物を、オリゴヌクレオチドｍｉｄＥＣＦＰ．ｍを用いて配列決定する。
【００８９】
２−真核細胞の培養
用いた細胞系：Ｃ２Ｃ１２、マウス筋芽細胞
用いた培地：
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
ＭＥＭ：可欠アミノ酸の溶液（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
ＦＣＳ：子ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）
９１１系に用いた培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ＋１％ＭＥＭ
Ｃｏｓ７およびＣ２Ｃ１２系に用いた培地：ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ
【００９０】
カルパインの活性化：最終濃度６ｍＭの塩化カルシウム、および最終濃度０．５μＭのイオノマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を培地に添加する。
【００９１】
３−真核細胞に発現ベクターをトランスフェクトするためのプロトコル
材料：種々のプラスミドのＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ ＥｎｄｏＦｒｅｅプロトコルに従って調製する（参照１２３６２）。
用いたプラスミド：ｐＥＣＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＥＹＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）
【００９２】
方法：
第１日：所望の細胞をトリプシン処理し、その後、翌日に細胞が５０〜８０％コンフルエントとなるようにウェルに接種する。
第２日：子ウシ胎児血清を含まない９４μｌの培地を、第１の滅菌ポリスチレン管（Ｔ１）に入れる。ＦＵＧＥＮＥ６バッファー（Ｂｏｅｒｉｎｇｈｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）６μｌを、管Ｔ１それぞれに添加する。周囲温度で５分間、インキュベーションを行う。ＥｎｄｏＦｒｅｅプラスミド１〜２μｇを、第２の滅菌ポリスチレン管（Ｔ２）の底部に入れる。５分のインキュベーションの終わりに、ベクターを含有する管Ｔ２に、ＦＵＧＥＮＥ６（Ｔ１）バッファーおよび培地を１滴ずつ入れる。攪拌せずに、周囲温度で３０分間、インキュベーションを行う。ウェルの培地を変える。３０分後、各ウェルにトランスフェクション混合物を１滴ずつ加え、液滴をウェルの表面全体に分布する。３７℃／７％ＣＯ２で、細胞を増殖させる。
【００９３】
コメント：各トランスフェクションに関して、ＦＵＧＥＮＥ６に接触させていないウェル（細胞コントロール）、およびＦＵＧＥＮＥ６のみに接触させた細胞のウェル（ＦＵＧＥＮＥ６の毒性のコントロール）を提供する。
【００９４】
Ｂ／結果
生細胞でのカルパイン３のタンパク分解活性を検出するために、３つの自己分解部位の開裂を、ＦＲＥＴ現象を用いて研究する。「ＦＲＥＴポジティブ」コントロール、すなわちカルパインによって開裂されず、その内部でＦＲＥＴ現象が起こり得るＥＣＦＰ−ＥＹＦＰキメラタンパク質をコードするプラスミドを得るために、ベクターｐＴＯＭを、このベクターにある２つの蛍光タンパク質、強化ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）および強化ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）のコード配列が同調するように、最初に改変した。次いで、カルパイン３の３つの自己分解部位をコードするＤＮＡフラグメントを、それらの配列の間に挿入した。本出願人等は、産生されたキメラタンパク質が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実際に遍在性なカルパインによって開裂され得ないことを確認した。最後に、この開裂を細胞中で蛍光画像分析によって研究した。この分析、特にＦＲＥＴの分析のために、３つの異なる方法を用いた。
【００９５】
１−コントロール・ベクターおよび開裂部位をコードするＤＮＡフラグメントを有するベクターのクローニング
同調する２つの蛍光タンパク質をコードするベクターの構築
同調するＥＣＦＰおよびＥＹＦＰをコードする２つの配列を有するベクター（ｐＴＯＭと呼ばれる）を構築するための方策は、ｐＴＯＭ上に唯一の部位を有し、平滑末端を生じる２つの制限酵素、Ｅｃｌ１３６ＩＩおよびＳｍａＩでプラスミドｐＴＯＭを消化することにあった（図８）。その線状化ベクターを精製し、それ自体にベクターをライゲートする反応を行った。形質転換およびポジティブ・コロニーの継代培養の後、ＰＣＲ反応によって、これらのコロニーにプラスミドが存在することを確認できた（図９）。継代培養されたコロニーの約１／３をこうして増幅でき、したがってベクターｐＴＯＭｐを含有したはずである。その制限部位がＥｃｌ１３６ＩＩ−ＳｍａＩフラグメントの削除によって消失したＥｃｏＲＩによるＰＣＲ産物の消化によって、継代培養されたコロニーが実際に、元のプラスミドではなく、プラスミドｐＴＯＭｐを含有することが確認された。ＰＣＲ産物の配列決定によって、２つの配列が実際に互いに同調していることが確認された。
【００９６】
２−発現ベクターｐＴＯＭでのカルパイン３による開裂部位をコードするオリゴヌクレオチドのクローニング
２つのタンパク質ＥＹＦＰとＥＣＦＰとの間のＦＲＥＴ現象を促進するために、グリシンがキメラタンパク質の柔軟性を助長し、セリンが水性培地中での溶解性を高め、２つのタンパク質の結集を促進するように、開裂部位の両端にアミノ酸グリシンおよびセリンを添加した（図１０）。オリゴヌクレオチドの配列は、それらが対になったとき、それぞれの端にＢｓｐＥ１およびＢａｍＨＩの制限部位が形成されるような配列である。
【００９７】
オリゴヌクレオチドの配列中、太字で示した塩基および下線を付した塩基は、タンパク質の配列を変えないが、ゲノム配列とは異なる塩基である。２本鎖オリゴヌクレオチドの形成を妨げる可能性のある相同性プライマー複合体形成を制限するように、これらの塩基を改変した。塩基の改変は、マウスにおけるコドン使用頻度に応じても行われる。
【００９８】
クローニングに用いる制限部位は、唯一の部位である。酵素ＢｓｐＥ１は、クローニング部位がメチル化されている場合、不活性である。したがって２本鎖オリゴヌクレオチドを受け取ることを意図したベクターｐＴＯＭのクローニングは、Ｄａｍメチラーゼをコードする遺伝子が変異している細菌で行った。酵素ＢｓｐＥ１およびＢａｍＨＩによるベクターの消化、オリゴヌクレオチドのライゲーション、およびエレクトロポレーションの後、いくつかの耐性コロニーを試料とする。プラスミドの存在は、ｍｉｄＥＣＦＰ．ｍおよびその制限部位に特異のオリゴヌクレオチドによるＰＣＲによって確認される（図１１）。ＰＣＲによって得られたいくつかのポジティブ・クローンの配列決定によって、ｐＴＯＭにおける挿入物の存在、それらの挿入物がＥＣＦＰおよびＥＹＦＰタンパク質をコードする配列と実際に同調していること、およびそれらが突然変異を含んでいないことが確認できた。３つのクローン化プラスミドを含有する３つのコロニーを保存する。これら３つのプラスミドは、３つの挿入ＤＮＡフラグメント、３つのカルパイン３開裂部位に対応する（プラスミドｐＴＯＭｓ１、ｐＴＯＭｓ２、およびｐＴＯＭｓ３）（図１３）。
【００９９】
【参考文献】
2004520850.tif 000003
2004520850.tif 000004
2004520850.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】
カルパイン３の部分配列を示す図である。自己分解部位の位置を矢印で示す。ペプチドに用いられる配列には下線が付され、今日までカルパイン３の配列が知られているすべての種で同一である（ヒト、マウス、サル、ラット、ウシ）。
【図２】
組換えカルパイン１（左側）およびカルパイン２（右側）による、カルパイン３の自己分解部位１、２、および３（それぞれ曲線Ａ、Ｂ、およびＣ）に対応するペプチドの開裂活性の経時的測定を示す図である。
【図３】
カルパイン３をコードするプラスミドでトランスフェクトされた、またはトランスフェクトされていないＣ２Ｃ１２細胞の抽出物による、カルパイン３の自己分解部位に対応するペプチドの開裂活性の経時的測定を示す図である。
【図４】
正常（＋／＋）、またはカルパイン３欠損（−／−）マウス筋芽細胞の抽出物による、カルパイン３の自己分解部位に対応するペプチドの開裂活性の経時的測定を示す図である。
【図５】
正常（＋／＋）、またはカルパイン３欠損（−／−）マウス筋管の抽出物による、カルパイン３の自己分解部位３に対応するペプチドの開裂活性の経時的測定を示す図である。
【図６】
正常（＋／＋）、またはカルパイン３欠損（−／−）マウス筋芽細胞の抽出物による、カルパイン３の自己分解部位に対応するペプチドの開裂活性の６時間にわたる測定を示す図である。
【図７】
正常（＋／＋）、またはカルパイン３欠損（−／−）マウス大腿四頭筋の抽出物による、カルパイン３の自己分解部位に対応するペプチドの開裂活性の６時間にわたる測定を示す図である。
【図８】
プラスミドｐＴＯＭの部分配列を示す図である。イタリック体のアミノ酸は、ＥＹＦＰの配列の部分である。太字体のアミノ酸は、ＥＣＦＰの配列の部分である。ベクターｐＴＯＭにおいてＥＹＦＰの終止コドンはすでに除去されている。イタリック体および太字体の塩基は、それぞれＥＹＦＰおよびＥＣＦＰ配列のフェーズ（ｐｈａｓｅ）を示す。下線を付した塩基は、ベクターｐＴＯＭｐを構築するために除去されたフラグメントに対応する。タンパク質配列ＡおよびＢは、Ｅｃｌ１３６ＩＩとＳｍａＩ制限部位の間に位置する２本鎖フラグメントのそれぞれ除去前および除去後の、コード配列ＥＹＦＰのＡＴＧからのベクターｐＴＯＭの翻訳に対応する。配列Ａにおいて、ＥＹＦＰおよびＥＣＦＰをコードする配列は同調していない。配列Ｂでは、それらは同調している。
【図９】
Ａ：ｐＴＯＭｐによる形質転換後、継代培養されたコロニーにおけるＰＣＲ産物のアガロース・ゲルでの移動を示す図である。ＰＣＲは、オリゴヌクレオチドｍｉｄＥＹＦＰ．ａおよびｍｉｄＥＣＦＰ．ｍを用いて行った。Ｂ：ＥｃｏＲＩによる消化後のＰＣＲ産物の移動。ウェルＮｏ．１：１ｋｂラダー、Ｎｏ．２：ｐＴＯＭ、Ｎｏ．３：ＥｃｏＲＩによる消化後のｐＴＯＭ、Ｎｏ．４からＮｏ．９： ＥｃｏＲＩによる消化後のゲルＡのＰＣＲ産物の移動。それらの大きさは常に８００ｂｐである。
【図１０】
ベクターｐＴＯＭのクローニング部位（１０ａ）、およびカルパイン３の自己分解部位をコードするオリゴヌクレオチドの配列（１０ｂ、１０ｃ、１０ｄ）を示す図である。相補オリゴヌクレオチドの各対は、名称が「ａ」で終わるオリゴヌクレオチド、および名称が「ｍ」で終わるオリゴヌクレオチドからなる。
【図１１】
ｐＴＯＭおよび自己分解部位２をコードする挿入物による形質転換後、継代培養されたコロニーにおけるＰＣＲ産物のアガロース・ゲルでの移動を示す図である。ＰＣＲは、オリゴヌクレオチドＳＧｐ９４Ｓ２．ａおよびｍｉｄＥＣＦＰ．ｍを用いて行った。
【図１２】
プラスミドｐＴＯＭの制限酵素地図を示す図である。
【図１３】
プラスミドｐＴＯＭｓ１、ｐＴＯＭｓ２、およびＴＯＭｓ３の制限酵素地図を示す図である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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