(57)【要約】本発明はイヌＭＣＨ受容体に関連するポリペプチド及び核酸と、前記ポリペプチド及び核酸の使用に関する。イヌＭＣＨ受容体はその活性がＭＣＨ結合により刺激されるＧタンパク質共役型受容体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも９連続アミノ酸長の配列番号１のユニークなアミノ酸領域を含む精製ポリペプチドであって、前記ユニーク領域が配列番号２又は配列番号３には存在しない前記ポリペプチド。
【請求項２】
前記ユニーク領域が、
配列番号７　ＬＥＡＳＬＬＰＰＧＰ、
配列番号８　ＳＥＧＰＤＮＬＴＳＡＧＰ、
配列番号９　ＲＲＴＧＮＶＳＹＩＮ、
配列番号１０　ＰＦＰＧＧＴＶＧＣＧ、及び
配列番号１１　ＩＬＱＲＭＭＳＳＶＡ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが配列番号１のアミノ酸配列からなる請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、精製核酸。
【請求項６】
少なくとも１８連続ヌクレオチド長の配列番号４のユニークヌクレオチド配列領域又はその相補体を含む精製核酸であって、前記ユニーク領域が配列番号５、配列番号６、又は配列番号５もしくは配列番号６の相補体には存在しない、前記精製核酸。
【請求項７】
前記ユニーク領域が、
配列番号１２　ＣＣＴＣＧＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＡＣＡＡＣＣ、
配列番号１３　ＡＣＣＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＣＣＴＣＧＴ、
配列番号１４　ＧＣＣＣＴＴＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＡＣＡＧＣＣＧＣＧＴＡＴ、
配列番号１５　ＴＧＴＣＣＴＣＧＧＴＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＣＴＣＡＡ、及び
配列番号１６　ＴＴＣＧＡＧＣＣＧＴＣＡＧＣＡＡＴＧＣＴ
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む請求項６に記載の精製核酸。
【請求項８】
前記核酸が配列番号３のヌクレオチド配列を含む請求項６に記載の精製核酸。
【請求項９】
前記核酸が配列番号３のヌクレオチド配列からなる請求項８に記載の精製核酸。
【請求項１０】
少なくとも９連続アミノ酸長の配列番号１のユニークアミノ酸領域を含むポリペプチドをコードする組換えヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ユニーク領域が配列番号２又は配列番号３には存在しない前記核酸。
【請求項１１】
前記ユニーク領域が、
配列番号７　ＬＥＡＳＬＬＰＰＧＰ、
配列番号８　ＳＥＧＰＤＮＬＴＳＡＧＰ、
配列番号９　ＲＲＴＧＮＶＳＹＩＮ、
配列番号１０　ＰＦＰＧＧＴＶＧＣＧ、及び
配列番号１１　ＩＬＱＲＭＭＳＳＶＡ
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
前記ユニークアミノ酸領域が配列番号１のアミノ酸配列を含む請求項１０に記載の核酸。
【請求項１３】
前記ユニークアミノ酸領域が配列番号１のアミノ酸配列からなる請求項１０に記載の核酸。
【請求項１４】
前記核酸が発現ベクターである請求項１０から１３のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の発現ベクターを含む組換え細胞。
【請求項１６】
前記細胞に請求項１４に記載の発現ベクターを導入する工程を含む方法により作製された組換え細胞。
【請求項１７】
試験化合物がＭＣＨ受容体活性を刺激する能力を測定する方法であって、
ａ）少なくとも９連続アミノ酸長の配列番号１のユニークアミノ酸領域（但し、前記ユニーク領域は配列番号２又は３には存在しないものとする）を含む機能的ＭＣＨ受容体を発現する組換え核酸を含む組換え細胞を前記化合物と接触させる工程と、
ｂ）ＭＣＨ受容体活性を測定する工程を含む前記方法。
【請求項１８】
前記ＭＣＨ受容体が配列番号１の配列からなる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記接触工程が更にＭＣＨアゴニストを使用してＭＣＨ受容体活性を刺激し、前記化合物がＭＣＨ受容体活性を調節する能力を測定する操作を含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＣＨ受容体ポリペプチドの産生方法であって、前記発現ベクターから前記ポリペプチドを発現させる条件下で請求項１４に記載の組換え細胞を培養する工程を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本明細書に引用する文献は請求の範囲に記載した発明の先行技術とは認められない。
【０００２】
視床下部に存在する神経ペプチドは体重調節に重要な役割を果たす（Ｆｌｉｅｒら，１９９８，Ｃｅｌｌ，９２，４３７−４４０）。メラニン凝集ホルモン（ＭＣＨ）は神経ペプチドＮＥＩ及びＮＧＥをもコードするより大きいプレ−プロホルモン前駆体の一部として視床下部で合成される環状１９アミノ酸神経ペプチドである（Ｎａｈｏｎら，１９９０，．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，４，６３２−６３７）。ＭＣＨはサケの脳下垂体で最初に同定され、魚類でＭＣＨはメラニン凝集に関与し、従って、皮膚色素沈着に関与する。マスとウナギでＭＣＨはストレス誘導又はＣＲＦ刺激ＡＣＴＨ放出に関与することも示されている（Ｋａｗａｕｃｈｉら，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ，３０５，３２１−３２３）。
【０００３】
ヒトでは脳で発現されるＭＣＨをコードする２種の遺伝子が同定されている（Ｂｒｅｔｏｎら，１９９３，Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．，１８，２９７−３１０）。哺乳動物でＭＣＨは摂食調節に関与する視床下部神経細胞体（例えば外側視床下部の核周部や不確帯）に主に見出されている（Ｋｎｉｇｇｅら，１９９６，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１７，１０６３−１０７３）。
【０００４】
薬理及び遺伝データによるとＭＣＨの主要作用態様は摂食促進（食欲促進）であることが示唆されている。ＭＣＨｍＲＮＡは絶食させたマウス及びラットとｏｂ／ｏｂマウスでアップレギュレートされる（Ｑｕら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ，３８０，２４３−２４７）。ＭＣＨを中枢に注射（ＩＣＶ）すると摂食が刺激され、ＭＣＨはαメラノサイト刺激ホルモン（αＭＣＨ）で見られる食欲低下作用に拮抗する（Ｑｕら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ，３８０，２４３−２４７）。ＭＣＨ欠乏マウスは痩せて食欲が低下し、代謝率が上昇している（Ｓｈｉｍａｄａら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ，３９６，６７０−６７３）。
【０００５】
ＭＣＨ作用は摂食調節のみならず、視床下部−脳下垂体系に作用することも報告されている（Ｎａｈｏｎ，１９９４，Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅｖ．ｉｎ　Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，８，２２１−２６２）。ＭＣＨはストレスにより視床下部からＣＲＦが放出され、脳下垂体からＡＣＴＨが放出されるのを調節しうるので、ストレスに対する身体応答に関与していると思われる。更に、ＭＣＨ神経系は性機能又は母性機能にも関与してと思われる。
【０００６】
ＭＣＨに結合すると示唆される受容体について記載している文献が幾つかある（Ｃｈａｍｂｅｒｓら，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４００，２６１−２６５；　Ｓａｉｔｏら，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ，４００，２６５−２６９；　Ｂａｃｈｎｅｒら，１９９９，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，４５７，５２２−５２４；　Ｓｈｉｍｏｍｕｒａら，１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２６１，６２２−６２６；　及びＬｅｍｂｏら，１９９９，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，１，２６７−２７１）。
【０００７】
発明の要約
本発明はイヌＭＣＨ受容体に関連するポリペプチド及び核酸と、前記ポリペプチド及び核酸の使用に関する。イヌＭＣＨ受容体はＭＣＨ結合によりその活性が刺激されるＧタンパク質共役型受容体である。
【０００８】
イヌＭＣＨ受容体に関連するポリペプチドはイヌＭＣＨ受容体に存在する少なくとも９連続アミノ酸の領域を含む。このようなポリペプチドはイヌＭＣＨ受容体に存在するまたは存在しない領域を含む付加領域を含んでいてもよい。
【０００９】
イヌＭＣＨ受容体に関連する核酸はイヌＭＣＨ受容体核酸に存在する少なくとも１８連続ヌクレオチドの領域を含む。このような核酸はイヌＭＣＨ受容体核酸に存在するまたは存在しない領域を含む付加領域を含んでいてもよい。
【００１０】
従って、本発明の第１の態様はイヌＭＣＨ受容体のユニークアミノ酸領域を含む精製ポリペプチドに関する。ユニーク領域は少なくとも９連続アミノ酸長である。
【００１１】
イヌＭＣＨ受容体の「ユニークアミノ酸領域」は配列番号１に存在する連続アミノ酸領域であり、配列番号２又は３には存在しない。本明細書のイヌＭＣＨ受容体である配列番号１はヒトプライマーを使用してイヌ核酸から誘導したため、イヌ由来ではなくヒト由来に対応する１個以上のＮ末端アミノ酸を含む可能性がある。配列番号２はヒトＭＣＨ受容体アミノ酸配列であり、配列番号３はラットＭＣＨ受容体アミノ酸配列である。ユニーク領域は指定ユニーク領域範囲より狭い配列番号２又は３に存在する連続アミノ酸のセグメントを含んでいてもよい。
【００１２】
「精製ポリペプチド」は試料又は調製物中に存在する全タンパク質の少なくとも１０％に相当する。好適態様では、精製ポリペプチドは試料又は調製物中に存在する全タンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約９５％に相当する。「精製ポリペプチド」とは、ポリペプチドは精製されてなくてもよく、例えば化学的に合成された、未精製のポリペプチドでもよい。
【００１３】
本発明の別の態様はイヌＭＣＨ受容体からのユニークアミノ酸領域をコードするヌクレオチド配列を含む精製核酸に関する。コードされる領域は少なくとも９アミノ酸長である。
【００１４】
「精製核酸」は試料又は調製物中に存在する全核酸の少なくとも１０％に相当する。好適態様では、精製核酸は試料又は調製物中に存在する全核酸の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、又は少なくとも約９５％に相当する。「精製核酸」とは、核酸は精製されていなくてもよく、例えば化学的に合成された、未精製の核酸でもよい。
【００１５】
本発明の別の態様はイヌＭＣＨ受容体核酸配列のユニークヌクレオチド配列領域又はその相補体を含む精製核酸に関する。ユニークヌクレオチド配列領域は少なくとも１８ヌクレオチド長である。
【００１６】
イヌＭＣＨ受容体核酸の「ユニークヌクレオチド配列領域」は配列番号４の少なくとも１８連続ヌクレオチドを含む領域であり、配列番号５又は６には存在しない。本明細書でいうイヌＭＣＨ受容体をコードするヌクレオチド配列の配列番号４はヒトプライマーを使用してイヌ核酸から誘導したため、イヌ由来ではなくヒト由来に対応する１個以上の５’ヌクレオチドを含む可能性がある。配列番号５はヒトＭＣＨ受容体をコードするヌクレオチド配列であり、配列番号６はラットＭＣＨ受容体をコードするヌクレオチド配列である。ユニーク領域は指定ユニーク領域範囲よりも狭い配列番号５又は６に存在する連続ヌクレオチドのセグメントを含んでいてもよい。
【００１７】
本発明の別の態様はイヌＭＣＨ受容体のユニークアミノ酸領域をコードする組換えヌクレオチド配列を含む核酸に関する。各種態様で核酸は発現ベクターであるか又は宿主ゲノムの一部である。
【００１８】
「組換えヌクレオチド配列」とは天然には該当配列に関連しない１個以上の核酸領域を含む核酸に存在する配列である。このような領域の例として、本来は該配列に結合しない１個以上の調節因子、ウイルス因子及び選択マーカーがある。
【００１９】
本発明の別の態様はイヌＭＣＨ受容体のユニークアミノ酸領域をコードする発現ベクターを含む組換え細胞に関する。発現ベクターはユニーク領域をコードする核酸に機能的に結合したプロモーターを含み、細胞に存在するＲＮＡポリメラーゼにより認識される。
【００２０】
本発明の別の態様はイヌＭＣＨ受容体のユニークアミノ酸領域をコードする発現ベクターを細胞に導入することにより作製された組換え細胞に関する。発現ベクターはイヌ核酸を宿主のゲノムに挿入するために使用しうるし、独自に核酸断片として存在しうる。
【００２１】
本発明の別の態様は試験化合物のＭＣＨ受容体活性刺激能を測定する方法に関する。前記方法は組換え核酸から固有のイヌアミノ酸領域を含む機能的ＭＣＨ受容体を発現する組換え細胞に前記化合物をもたらす工程と、ＭＣＨ受容体活性を測定する工程を含む。組換え核酸は発現ベクターにあることが好ましい。
【００２２】
本発明の別の態様はＭＣＨ受容体ポリペプチドの産生方法に関する。前記方法は発現ベクターから前記ポリペプチドを発現させる条件下でイヌＭＣＨ受容体ポリペプチドを発現することが可能な組換え細胞を培養する工程を含む。
【００２３】
本発明の他の特徴及び利点は種々の実施例を含む以下の付加説明から自明である。以下の実施例では本発明の実施に有用な種々の構成要素と方法を例示する。これらの実施例は請求の範囲に記載した発明を限定するものではない。本明細書の開示に基づき、当業者は本発明の実施に有用な他の構成要素と方法に想到し、利用しうる。
【００２４】
図面の簡単な説明
図１はイヌＭＣＨ受容体（配列番号１）、ヒトＭＣＨ受容体（配列番号２）及びラットＭＣＨ受容体（配列番号３）のアミノ酸配列の比較を示す。
【００２５】
図２Ａ〜２ＣはイヌＭＣＨ受容体（配列番号４）、ヒトＭＣＨ受容体（配列番号５）及びラットＭＣＨ受容体（配列番号６）をコードするヌクレオチド配列の比較を示す。
【００２６】
発明の詳細な説明
イヌＭＣＨ受容体に関連するポリペプチド及び核酸はある化合物は、ヒト受容体とイヌ受容体で作用が異なるか又はＭＣＨ受容体活性を刺激するかを測定するｉｎ　ｖｉｔｒｏ機能アッセイで使用することが好ましい。このようなアッセイを使用すると、イヌモデルでヒト治療化合物を探索し、ＭＣＨ受容体活性化合物をアッセイするのに有用な試験システムとなるか否かの調査を容易にしうる。
【００２７】
ＭＣＨ受容体は、患者に標的を提供し、これにより、種々の効能が得られる。体重減少、体重増加、癌治療（例えば大腸癌又は乳癌）、疼痛緩和、糖尿病治療、ストレス緩和又は性機能障害治療の１種以上を達成するようにＭＣＨ受容体活性を調節することが好ましい。
【００２８】
ＭＣＨ受容体に対する応答を誘起するか又はＭＣＨ受容体アゴニストもしくはアンタゴニストにより誘起される応答を変化させることで、ＭＣＨ受容体活性を調節しうる。ＭＣＨ受容体活性を調節する化合物としてはアゴニスト、アンタゴニスト及びアロステリックモジュレーターがある。一般に、ＭＣＨ受容体アンタゴニスト及び活性に負に作用するアロステリックモジュレーターを使用すると、体重減少、癌治療（例えば大腸癌又は乳癌）、疼痛緩和、ストレス緩和及び／又は性機能障害治療がなされ、ＭＣＨ受容体アゴニスト及び活性に正に作用するアロステリックモジュレーターを使用すると体重増加が起こる。
【００２９】
体重減少をするか又は患者の糖尿病を治療するようにＭＣＨ受容体活性を調節することが好ましい。糖尿病は、例えば、ＭＣＨ受容体活性を調節して、グルコース耐性を増強又はインスリン抵抗性を低下又はその両方により治療しうる。
【００３０】
体重過多は高血圧、糖尿病、脂血不全、心血管疾患、胆石、変形性関節炎及び所定形態の癌を含む種々の疾患の関連要因である。例えば該疾患の可能性提言すべく、該疾患の治療の一環として体重減少を誘発しうる。例えば、ＭＣＨ受容体活性を調節して、食欲低下、代謝率増加、脂肪摂取低下又は炭水化物欲求低下のうち１以上の効果が得られれば、体重が減少しうる。
【００３１】
体重減少を伴う疾患もしくは障害又は体重減少を伴う治療中の患者には体重増加、体重維持又は食欲増進を助長することが特に有用である。体重減少を伴う疾患又は障害の例としては拒食症、過食症、癌性悪液質、エイズ、衰弱、悪液質及び虚弱老人の衰弱がある。体重減少を伴う治療の例としては化学療法、放射線療法、一時的又は永久固定及び透析がある。
【００３２】
ＭＣＨ受容体関連ポリペプチド
イヌＭＣＨ受容体に関連するポリペプチドはユニークイヌアミノ酸領域を含むことが好ましい。ユニークアミノ酸領域に加え、イヌＭＣＨ受容体ポリペプチドに関連してもしなくてもよい領域が存在していてもよい。このようなポリペプチドは種々の用途があり、例えば機能的ＭＣＨ受容体成分の提供、ＭＣＨ受容体結合抗体を産生するための免役原としての使用、ＭＣＨ受容体結合化合物を同定するための標的としての使用、及び／又はある化合物がＭＣＨ受容体活性刺激能を測定するアッセイでの使用がある。
【００３３】
ユニークイヌアミノ酸領域は本明細書に記載するイヌＭＣＨ受容体配列とヒト及びラットＭＣＨ受容体アミノ酸配列の比較に基づいて容易に同定しうる。このような配列比較を図１に示す。ユニークイヌアミノ酸領域の例としては、
配列番号７　ＬＥＡＳＬＬＰＰＧＰ、
配列番号８　ＳＥＧＰＤＮＬＴＳＡＧＰ、
配列番号９　ＲＲＴＧＮＶＳＹＩＮ、
配列番号１０　ＰＦＰＧＧＴＶＧＣＧ、及び
配列番号１１　ＩＬＱＲＭＭＳＳＶＡ
がある。
【００３４】
ヒト及びラットＭＣＨ受容体との比較により、ユニークアミノ酸領域を定義する。従って、ヒトもしくはラット配列以外の１以上のＭＣＨ受容体アミノ酸配列又は非ＭＣＨ受容体配列にもユニークアミノ酸領域が存在する可能性がある。
【００３５】
種々の態様においてイヌＭＣＨ受容体関連ポリペプチドは少なくとも１８、少なくとも２７、又は少なくとも５４アミノ酸長のユニークアミノ酸領域を含むか又はこの領域からなる。イヌＭＣＨ受容体関連ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列を含むか又はこの配列からなることが好ましい。
【００３６】
ポリペプチドは化学合成によるものと生化学合成によるものを含む標準技術を使用して産生しうる。ポリペプチドの化学合成技術は当分野で周知である（例えばＶｉｎｃｅｎｔ，Ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｄｅｄｄｅｒ，１９９０参照）。
【００３７】
ポリペプチドの生化学合成技術も当分野で周知である。このような技術はポリペプチド合成用核酸鋳型を利用する。特定アミノ酸をコードする核酸トリプレット配列を提供する遺伝コードは当分野で周知である（例えばＬｅｗｉｎ　ＧＥＮＥＳ　ＩＶ，ｐ．１１９，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９０参照）。核酸を細胞に導入して核酸を発現させ、タンパク質を産生する技術はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８及びＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９等の文献にされている。
【００３８】
機能的ＭＣＨ受容体誘導体
機能的ＭＣＨ受容体はＭＣＨ結合により刺激される。機能的ＭＣＨ受容体としては配列番号１のＭＣＨ受容体と、ＭＣＨ受容体活性をもち、ユニークイヌアミノ酸領域を成分として含む受容体がある。
【００３９】
特定ソースから得たＭＣＨ受容体からＭＣＨ受容体活性をもつ誘導体を産生しうる。このような誘導体としてはアミノ酸置換、付加及び欠失を含むポリペプチドがある。機能的誘導体を産生するために行う改変は三次構造を変えないようにＭＣＨ結合ドメインの外側で実施する必要がある。ポリペプチドがＭＣＨ受容体活性をもつか否かはＧタンパク質活性測定等の技術を使用して確認しうる。
【００４０】
図１はヒト、ラット及びイヌＭＣＨ受容体間で変動するアミノ酸の配列比較を示す。このような可変アミノ酸は改変の良好な標的となる。
【００４１】
更に、アミノ酸はそのＲ基の構造に基づいて分類される。ロイシン→バリン、リジン→アルギニン及びグルタミン→アスパラギン等の特定群内におけるアミノ酸の置換はポリペプチドの機能に変化を生じさせないと思われる。
【００４２】
ＭＣＨ抗体
配列番号１のポリペプチド又はそのフラグメントを免役原として使用し、イヌＭＣＨ受容体ポリペプチドを認識する抗体を産生しうる。フラグメントは少なくとも９アミノ酸長とすべきで、ユニークアミノ酸領域を含むことが好ましい。
【００４３】
ＭＣＨ受容体に対する抗体はＭＣＨ受容体ポリペプチドを確認するためや、ＭＣＨ受容体ポリペプチドを単離する等の種々の用途がある。抗体の産生及び使用方法はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｔｏｒａｂｏｔｏｒｙ，１９９８及びＫｏｈｌｅｒら，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５−４９７に記載されている。
【００４４】
結合アッセイ
配列番号１のポリペプチド又はそのフラグメントを標的として使用し、ある化合物のイヌＭＣＨ受容体結合能を測定するアッセイを実施しうる。フラグメントは少なくとも９アミノ酸長とすべきで、アゴニスト、アンタゴニスト又はアロステリックモジュレーターが結合する部位を含む。競合及び非競合アッセイ等の種々のアッセイフォーマットを利用しうる。
【００４５】
全長受容体又は受容体フラグメントに結合することが確認された化合物を使用すると、化合物がもっと短いフラグメントに結合しうるかを試験することにより結合部位の遺伝子座を決定しうる。例えば、ＭＣＨはＭＣＨ受容体に結合するので、標識ＭＣＨを使用すると、ＭＣＨが結合する受容体の部分を同定しうる。化合物結合部位を含むことが確認されたフラグメントを使用すると、結合部位に結合する付加化合物があるかどうかを試験しうる。
【００４６】
結合アッセイで使用する好適ポリペプチドはユニークアミノ酸領域からなる。しかし、例えばカラムに固定し易くするために付加アミノ酸配列を含むフラグメントを利用してもよい。
【００４７】
結合アッセイは個々の化合物又は種々の化合物を含む調製物を使用して実施しうる。１種以上の化合物がＭＣＨ受容体に結合する種々の化合物を含む調製物をもっと細かく分類すると、ＭＣＨ受容体に結合する化合物を同定しうる。本発明の一態様では、少なくとも１０種の化合物を含む試験調製物を結合アッセイで使用する。
【００４８】
結合アッセイは種々の環境に存在する組換え産生ＭＣＨ受容体ポリペプチドを使用して実施しうる。このような環境としては例えば組換え核酸から発現されるＭＣＨ受容体ポリペプチドを含む細胞抽出液及び精製細胞抽出液や、組換え手段で産生され、他環境に導入される精製ＭＣＨ受容体ポリペプチドの使用がある。
【００４９】
機能アッセイ
機能的イヌＭＣＨ受容体及びキメラ受容体に関するアッセイを利用すると、ＭＣＨ受容体に活性な化合物を選択し、化合物受容体活性刺激能を評価しうる。ＭＣＨ受容体活性はＭＣＨ受容体の細胞内構造変化の検出、Ｇタンパク質活性測定、細胞内伝達物質レベルの測定等の種々の技術を使用して測定しうる。
【００５０】
組換え発現ＭＣＨ受容体ポリペプチドを使用すると、化合物がＭＣＨ受容体又は別の受容体に活性か否かを決定し易くしうる。例えば、ＭＣＨ受容体は発現ベクターをもたないか又はＭＣＨ受容体をコードしない発現ベクターをもつ同一細胞系を対照とし、本来的には該受容体を発現しないＨＥＫ２９３、ＣＯＳ７及びＣＨＯ等の細胞系で発現ベクターで発現しうる。
【００５１】
ＭＣＨ受容体活性は例えばホスホリパーゼＣ情報伝達経路を測定するアッセイで測定しうる。ホスホリパーゼＣ情報伝達経路の活性は細胞内Ｃａ２＋の測定等の標準技術を使用して測定しうる。Ｃａ２＋測定のために利用可能な当分野で周知の技術の例として、Ｆｕｒａ−２等の色素の使用や、エクオリン等のＣａ２＋生物発光感受性リポータータンパク質の使用がある。Ｇタンパク質活性を測定するためにエクオリンを利用する細胞系の１例はＨＥＫ２９３／ａｅｑ１７である（いずれも参考資料として本明細書に組込むＢｕｔｔｏｎら，１９９３，Ｃｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ，１４，６６３−６７１、及びＦｅｉｇｈｎｅｒら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４，２１８４−２１８８）。
【００５２】
他のＧタンパク質からのポリペプチドに機能的に共役した１以上のＭＣＨ受容体領域を含むキメラ受容体を使用して活性を測定しうる。キメラＭＣＨ受容体はＮ末端細胞外ドメインと、膜貫通領域、細胞外ループ領域及び細胞内ループ領域からなる膜貫通ドメインと、細胞内カルボキシ末端ドメインを含む。好適キメラ受容体はイヌＭＣＨ受容体からのこれらのドメインの１以上を含む。
【００５３】
Ｇタンパク質共役の特異性は細胞内ドメインにより決定される。特定Ｇタンパク質に機能的に共役するようにキメラＧタンパク質共役型受容体を作製しうる。例えば、通常はＧｓに共役するＧタンパク質をＧｑ又はＧｉに共役させると、Ｇｑ又はＧｉ活性を測定することにより受容体活性を検出しうるようになる。キメラ受容体を作製し、Ｇタンパク質共役応答を測定する技術は例えばいずれも参考資料として本明細書に組込む国際出願第ＷＯ９７／０５２５２号及び米国特許第５，２６４，５６５号に記載されている。
【００５４】
機能アッセイは個々の化合物又は種々の化合物を含む調製物を使用して実施しうる。１以上の化合物がＭＣＨ受容体又はキメラ受容体活性を変化させる種々の化合物を含む調製物の化合物群をもっと細分化すると、ＭＣＨ受容体活性を刺激する化合物を同定しうる。本発明の一態様では、少なくとも１０種の化合物を含む試験調製物を機能アッセイで使用する。
【００５５】
機能アッセイは種々の環境に存在する組換え産生ＭＣＨ受容体ポリペプチド又はキメラ受容体ポリペプチドを使用して実施しうる。このような環境としては例えば組換え核酸から発現されるＭＣＨ受容体ポリペプチドを含む細胞抽出液及び精製細胞抽出液や、組換え手段により産生され、他の環境に導入される精製ＭＣＨ受容体ポリペプチドの使用がある。
【００５６】
ＭＣＨ受容体関連核酸
イヌＭＣＨ受容体に関連する核酸はユニークイヌユニークヌクレオチド配列領域又はその相補体を含むことが好ましい。このような核酸は種々の用途があり、例えばイヌＭＣＨ核酸を確認するためのハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーとしての使用、種々の由来からのＭＣＨ受容体に関連する受容体をコードする核酸を同定又はクローニングするためのハイブリダイゼーションプローブ又はＰＣＲプライマーとしての使用、及び／又はイヌＭＣＨ受容体ポリペプチドの組換え発現のための使用がある。
【００５７】
ユニークイヌ核酸領域は本明細書に記載するイヌＭＣＨ受容体核酸配列とヒト及びラットＭＣＨ受容体核酸配列の比較に基づいて容易に同定しうる。このような配列比較を図２Ａ〜２Ｃに示す。
【００５８】
ユニークイヌ核酸領域の例としては、
配列番号１２　ＣＣＴＣＧＧＡＧＧＧＣＣＣＧＧＡＣＡＡＣＣ、
配列番号１３　ＡＣＣＴＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＡＣＣＴＣＧＴ、
配列番号１４　ＧＣＣＣＴＴＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＡＣＡＧＣＣＧＣＧＴＡＴ、
配列番号１５　ＴＧＴＣＣＴＣＧＧＴＡＧＣＣＣＣＴＧＣＣＴＣＴＣＡＡ、及び
配列番号１６　ＴＴＣＧＡＧＣＣＧＴＣＡＧＣＡＡＴＧＣＴ
がある。
【００５９】
本明細書に記載する指針は、全長イヌＭＣＨ受容体をコードする核酸配列を得るため、付加由来からのＭＣＨ受容体をコードする核酸を得るため、及びＭＣＨ受容体を人工的に作製するために使用しうる。縮重プローブ及びプライマー系を使用し、ハイブリダイゼーション条件を適正に選択して、種々のソースからＭＣＨ受容体をコードする核酸の獲得が容易となる。縮重プローブ及びプライマー系は遺伝コードの縮重を考慮して作製する。ハイブリダイゼーション条件の調整は類似配列をもつ核酸とハイブリダイズしうるようにプローブ又はプライマー特異性を制御するために有用である。
【００６０】
ハイブリダイゼーション検出及びＰＣＲクローニングに利用する技術は当分野で周知である。核酸検出技術は例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。ＰＣＲクローニング技術は例えばＷｈｉｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，第６７巻，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，１９９７に記載されている。
【００６１】
ＭＣＨ受容体プローブ及びプライマーは例えばゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを含む核酸ライブラリーをスクリーニングするために使用しうる。このようなライブラリーは市販されており、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８に記載されているような技術を使用して作製しうる。
【００６２】
特定アミノ酸配列と遺伝コードの既知の縮重から、多数の異なるコーディング核酸配列を獲得しうる。遺伝コードの縮重が生じるのは、ほぼ全アミノ酸がヌクレオチドトリプレット即ち「コドン」の種々の組合せによりコードされるためである。特定コドンから特定アミノ酸への翻訳は当分野で周知である（例えばＬｅｗｉｎ　ＧＥＮＥＳ　ＩＶ，ｐ．１１９，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９０参照）。アミノ酸は以下のようにコドンによりコードされる。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ，ＧＣＣ，ＧＣＧ，ＧＣＵ
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ，ＵＧＵ
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ，ＧＡＵ
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：ＧＡＡ，ＧＡＧ
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ，ＵＵＵ
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ，ＧＧＣ，ＧＧＧ，ＧＧＵ
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ，ＣＡＵ
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ，ＡＵＣ，ＡＵＵ
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リジン：コドンＡＡＡ，ＡＡＧ
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ，ＵＵＧ，ＣＵＡ，ＣＵＣ，ＣＵＧ，ＣＵＵ
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ
Ｎ＝Ａｓｎ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ，ＡＡＵ
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ，ＣＣＣ，ＣＣＧ，ＣＣＵ
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ，ＣＡＧ
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ，ＡＧＧ，ＣＧＡ，ＣＧＣ，ＣＧＧ，ＣＧＵ
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ，ＡＧＵ，ＵＣＡ，ＵＣＣ，ＵＣＧ，ＵＣＵ
Ｔ＝Ｔｈｒ＝スレオニン：コドンＡＣＡ，ＡＣＣ，ＡＣＧ，ＡＣＵ
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ，ＧＵＣ，ＧＵＧ，ＧＵＵ
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ，ＵＡＵ。
【００６３】
所望の配列をもつ核酸は化学及び生化学技術を使用して合成しうる。化学技術の例はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８及びＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。
【００６４】
生化学合成技術は核酸鋳型とＤＮＡ及び／又はＲＮＡポリメラーゼ等の適当な酵素を使用する。このような技術の例としてはＰＣＲや転写による増幅等のｉｎ　ｖｉｔｒｏ増幅技術とｉｎ　ｖｉｖｏ核酸複製がある。適切な技術の例はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９及びＫａｃｉａｎら，米国特許第５，４８０，７８４号に記載されている。
【００６５】
各種態様においてイヌＭＣＨ受容体関連核酸は少なくとも２７又は少なくとも５４塩基長のユニーク核酸領域又はその相補体を含むか又はこのような領域からなる。イヌＭＣＨ受容体関連核酸は配列番号４の核酸配列を含むか又は前記配列からなることが好ましい。
【００６６】
ＭＣＨ受容体プローブ
イヌＭＣＨ受容体の検出プローブはユニークイヌ核酸領域又はその相補体を含むことが好ましい。このようなプローブはイヌＭＣＨ受容体核酸に相補的でもよいしそうでなくてもよい付加核酸を含むことがしうる。存在する付加核酸は特異性増加、リポーター配列、又は捕獲配列等の特定目的をもつことが好ましい。しかし、付加核酸は特定目的をもたなくてもよい。
【００６７】
ＭＣＨ受容体のプローブは適当なハイブリダイゼーション（即ち標的核酸を１種以上の非標的核酸分子から区別する）条件下でＭＣＨ受容体標的核酸と特異的にハイブリダイズしうる。好ましい非標的核酸はヒトＭＣＨ受容体をコードする核酸又はその相補体である。ハイブリダイゼーションはプローブとＭＣＨ受容体核酸に存在する相補的ヌクレオチド塩基を介して行われる。ハイブリダイゼーション条件は２種の分子が安定なハイブリッドを形成するのに十分に強い相互作用をもつか否かを決定する。
【００６８】
プローブは核酸又は修飾核酸やペプチド核酸等のその誘導体から構成される。修飾核酸は、１個以上の改変糖基、改変ヌクレオチド間結合及び／又は改変ヌクレオチドプリン又はピリミジン塩基を有する。修飾核酸に関する文献としては、各々参考資料として本明細書に組込む国際公開第ＷＯ９８／０２５８２号、米国特許第５，８５９，２２１号及び米国特許第５，８５２，１８８号がある。
【００６９】
相互にハイブリダイズする２種の分子間の相互作用の程度は作製されるハイブリッドのＴｍにより左右される。Ｔｍが高いほど相互作用は強く、ハイブリッドは安定する。Ｔｍは相補度、存在する相補的塩基の種類（例えばＡ−ＴハイブリダイゼーションかＧ−Ｃハイブリダイゼーションか）、核酸主鎖の構造及び溶液成分等の当分野で周知の多数の要因に依存する。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９参照。
【００７０】
ハイブリッドのＴｍが特定系列のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で使用する温度よりも高い場合には安定なハイブリッドが形成される。プローブの特異度はハイブリダイゼーションの緊縮条件を調節することにより変更しうる。検出可能な標識を使用すればプローブハイブリダイゼーションが検出し易くなる。検出可能な標識の例としては発光、酵素及び放射能標識がある。
【００７１】
緊縮条件の例はＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載されている。高緊縮条件の１例を以下に挙げる。ＤＮＡを含むフィルターを６×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液及び変性サケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌから構成される緩衝液中で２時間〜一晩６５℃でプレハイブリダイズする。変性サケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌと３２Ｐ標識プローブ５〜２０×１０６ｃｐｍを含むプレハイブリダイゼーション混合物中でフィルターを１２〜４８時間６５℃でハイブリダイズする。２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む溶液で３７℃で１時間フィルターを洗浄する。次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５０℃で４５分間洗浄した後、オートラジオグラフィーにかける。高緊縮条件を使用する他の手順としては、例えば５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、５０％ホルムアミド中で４２℃で１２〜４８時間実施するハイブリダイゼーション工程や、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳで６５℃で３０〜６０分間実施する洗浄工程がある。
【００７２】
組換え発現
ＭＣＨ受容体関連ポリペプチドは翻訳系を使用して適切な宿主又は試験管で組換え核酸から発現しうる。組換え発現ＭＣＨ受容体ポリペプチドはＭＣＨ受容体に結合して受容体活性調節化合物をスクリーニングするためのアッセイで使用することが好ましい。
【００７３】
発現は発現ベクターを使用して宿主細胞で行うことが好ましい。発現ベクターは所望のポリペプチドをコードする組換え核酸と、適正な転写とプロセシングのための調節因子を含む。調節因子としては本来的に組換え核酸に関与するものと本来的には組換え核酸に関連しない外来調節因子がある。特定宿主で組換え核酸を発現させるには外来プロモーター等の外来調節因子が有用であると思われる。
【００７４】
一般に、調節因子としては転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、及び場合により存在するオペレーターがある。他の好ましい因子は真核細胞でのプロセシングを可能にするポリアデニル化シグナルである。発現ベクターは更に宿主細胞での自己複製のための複製起点、選択マーカー、有用制限酵素部位の制限数及び高コピー数に対する潜在能力を含むことが好ましい。発現ベクターの例はクローニングベクター、修飾クローニングベクター、特定設計プラスミド及びウイルスである。
【００７５】
種々の宿主で適切なレベルのポリペプチド発現を得るために使用可能な発現ベクターは当分野で周知である。当分野で周知の哺乳動物発現ベクターとしてはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）、ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）及びλＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）がある。当分野で周知の細菌発現ベクターとしてはｐＥＴ１１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、λｇｔ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）がある。当分野で周知の真菌細胞発現ベクターとしてはｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｐｉｃｈｉａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がある。当分野で周知の昆虫細胞発現ベクターとしてはＢｌｕｅ　Ｂａｃ　ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がある。
【００７６】
組換え宿主細胞は原核細胞でも真核細胞でもよい。組換え宿主細胞の例としては、細菌類（例えば大腸菌）、真菌細胞（例えば酵母）、哺乳動物細胞（例えばヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類）、及び昆虫細胞（例えばショウジョウバエ及びカイコに由来する細胞系）がある。市販哺乳動物細胞系としてはＬ細胞Ｌ−Ｍ（ＴＫ．ｓｕｐ．−）（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ−Ｍ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ１．２）、２９３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ８６）、ＣＶ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ　ＣＣＬ１７１）がある。
【００７７】
発現ベクターは標準技術を使用して宿主細胞に導入しうる。このような技術の例としては形質転換、トランスフェクション、リポフェクション、プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションがある。
【００７８】
ＭＣＨ受容体核酸は発現ベクターを使用せずに、例えば合成ｍＲＮＡ又は天然ｍＲＮＡを利用して細胞で発現しうる。更に、ｍＲＮＡをコムギ胚芽エキスや網状赤血球エキス等の無細胞系及びカエル卵母細胞等の細胞系で翻訳しうる。ｍＲＮＡを細胞系に導入するには例えばマイクロインジェクションを利用しうる。
【００７９】
実施例
以下、実施例により本発明の種々の特徴を更に説明する。以下の実施例は本発明の実施に有用な方法も例示する。これらの実施例は請求の範囲に記載した発明を限定するものではない。
【００８０】
実施例１：イヌＭＣＨ受容体のクローニング
イヌ視床下部ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリー（哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋），Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎで作製）のＲＴ−ＰＣＲとハイブリダイゼーションスクリーニングによりイヌＭＣＨ受容体の完全コーディング配列を得た。ヒトＭＣＨ受容体配列に由来する配列番号１７（ＡＴＧ　ＧＡＣ　ＣＴＧ）の順方向（センス）ＰＣＲプライマーを使用してイヌＭＣＨ受容体を増幅した。従って、得られたイヌＭＣＨ受容体は天然に存在するイヌＭＣＨ受容体に対応するアミノ酸に類似又は一致し得るＮ末端メチオニンに隣接する６個のアミノ酸（配列番号１８：ＤＬＥＡＳＬ）を含む。Ｎ末端メチオニン（ＡＴＧ）はイヌ及びヒトＭＣＨ受容体の両者で同一であった。残りの３５３アミノ酸（アミノ酸８〜３５３）はイヌＭＣＨ受容体からのものであった。
【００８１】
イヌＭＣＨ受容体タンパク質配列は配列番号２及び３のヒト及びラットＭＣＨ受容体に大いに関連している。ヒト及びラットＭＣＨ受容体に対するタンパク質配列一致度は夫々９７．５％及び９４．６％である。
【００８２】
イヌＭＣＨ受容体のアミノ酸配列及びコーディングヌクレオチド配列は以下の通りである。
【００８３】
イヌＭＣＨ受容体アミノ酸配列：配列番号１
【００８４】
【化１】
2004506419.tif 000002
【００８５】
イヌＭＣＨ受容体をコードするヌクレオチド配列（停止コドンを含む）：配列番号４
【００８６】
【化２】
2004506419.tif 000003
【００８７】
実施例２：イヌＭＣＨ受容体の発現
Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ　Ｐｏｗｅｒ　ＰＣ６１００用カスタムソフトウェアによる制御下にＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ　ＲＴルミノメーター（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ　Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用し、エクオリンを発現する安定なリポーター細胞系２９３−ＡＥＱ１７（Ｂｕｔｔｏｎら，１９９３，Ｃｅｌｌ　Ｃａｌｃｉｕｍ，１４，６６３−６７１）におけるＭＣＨ受容体発現を測定した。２９３−ＡＥＱ１７細胞（トランスフェクションの１８時間前に８×１０５細胞をＴ７５フラスコに播種）にイヌＭＣＨ受容体プラスミドＤＮＡ２２μｇ：リポフェクタミン２６４μｇをトランスフェクトした。
【００８８】
発現から約４０時間後にＥＣＢ緩衝液（１４０ｍＭ　ＮａＣｌ，２０ｍＭ　ＫＣｌ，２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ［ｐＨ＝７．４］，５ｍＭグルコース，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１ｍＭ　ＣａＣｌ２，０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン）中で還元条件下（３００μＭ還元型グルタチオン）に細胞内のアポエクオリンにセレンテラジン（１０μＭ）を４時間負荷させた。細胞を回収し、ＥＣＢ培地で１回洗浄し、５００，０００細胞／ｍｌとなるように再懸濁した。次にＭＣＨを加えた試験プレートに細胞懸濁液１００μｌ（５×１０４細胞に対応）を注入し、累積発光を０．５秒おきに３０秒間記録した。次に溶解溶液２０μＬ（最終濃度０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）を注入し、累積発光を０．５秒おきに１０秒間記録した。
【００８９】
初期誘発に対する累積応答とＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００溶解応答を含む合計累積発光の比を求めることにより各ウェルの「分画応答」値を計算した。イヌＭＣＨ受容体の活性化のＥＣ５０値は〜３０ｎＭであった。
【００９０】
他の態様も請求の範囲に含まれる。数種の態様を示し、説明したが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく種々の変更が可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
イヌＭＣＨ受容体（配列番号１）、ヒトＭＣＨ受容体（配列番号２）及びラットＭＣＨ受容体（配列番号３）のアミノ酸配列の比較を示す。
【図２Ａ】
イヌＭＣＨ受容体（配列番号４）、ヒトＭＣＨ受容体（配列番号５）及びラットＭＣＨ受容体（配列番号６）をコードするヌクレオチド配列の比較を示す。
【図２Ｂ】
イヌＭＣＨ受容体（配列番号４）、ヒトＭＣＨ受容体（配列番号５）及びラットＭＣＨ受容体（配列番号６）をコードするヌクレオチド配列の比較を示す。
【図２Ｃ】
イヌＭＣＨ受容体（配列番号４）、ヒトＭＣＨ受容体（配列番号５）及びラットＭＣＨ受容体（配列番号６）をコードするヌクレオチド配列の比較を示す。
【図１】
2004506419.tif 000004
【図２Ａ】
2004506419.tif 000005
【図２Ｂ】
2004506419.tif 000006
【図２Ｃ】
2004506419.tif 000007
【国際公開パンフレット】
2004506419.tif 000008
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2004506419.tif 000039
2004506419.tif 000040
【国際調査報告】
2004506419.tif 000041
2004506419.tif 000042
2004506419.tif 000043