(57)【要約】本発明は老化関連核酸配列及びタンパク質に関するものであって、より詳細には本発明は細胞老化に関連されたアンフィファイシン及びカベオリンの核酸配列及びタンパク質そしてそれらの用途に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞老化に関連されたタンパク質の量を決定する段階を含み、前記タンパク質はアンフィファイシン（ａｍｐｈｉｐｈｙｓｉｎ）タンパク質及びカベオリン（ｃａｖｅｏｌｉｎ）タンパク質からなる群から選択される老化細胞の検出方法。
【請求項２】
前記細胞は哺乳動物細胞から由来のものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アンフィファイシンタンパク質はアンフィファイシン−１であり、前記カベオリンタンパク質はカベオリン−１タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記方法はウェスタンブロッティング法により実施されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドの量を決定する段階を含み、前記タンパク質はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される老化細胞の検出方法。
【請求項６】
前記細胞は哺乳動物細胞から由来のものであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドはアンフィファイシン−１またはカベオリン−１タンパク質をコードするものであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリヌクレオチドはｇＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びｍＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
細胞老化に関連されたタンパク質の有効量を含み、前記タンパク質はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化調節用組成物。
【請求項１０】
細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドの有効量を含み、前記タンパク質はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化調節用組成物。
【請求項１１】
細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズし前記タンパク質が発現されることを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を含み、前記タンパク質はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化調節用組成物。
【請求項１２】
カベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基をメチル化または脱メチル化するメチル化剤または脱メチル化剤の有効量を含む細胞老化調節用組成物。
【請求項１３】
前記細胞は哺乳動物の細胞から由来のものであることを特徴とする請求項９乃至１２のいずれか一つの項に記載の細胞老化調節用組成物。
【請求項１４】
細胞老化に関連された前記タンパク質はアンフィファイシン−１またはカベオリン−１であることを特徴とする請求項９乃至１２のいずれか一つの項に記載の細胞老化調節用組成物。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドはｇＤＮＡまたはｃＤＮＡであることを特徴とする請求項１０に記載の細胞老化調節用組成物。
【請求項１６】
細胞老化に関連されたタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは真核細胞用発現ベクターに含まれていることを特徴とする請求項１０に記載の細胞老化調節用組成物。
【請求項１７】
細胞老化に関連された前記タンパク質はカベオリンタンパク質であることを特徴とする請求項１１に記載の細胞老化調節用組成物。
【請求項１８】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはカベオリンｍＲＮＡの翻訳開始部位とハイブリダイズすることを特徴とする請求項１７に記載の細胞老化調節用組成物。
【請求項１９】
前記メチル化剤はメチルアゾキシメタノールアセテート（ｍｅｔｈｙｌａｚｏｘｙｍｅｔｈａｎｏｌ ａｃｅｔａｔｅ）、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）及びＮ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の細胞老化調節用組成物。
【請求項２０】
前記脱メチル化剤は５−アザ−デオキシシチジン、５−アザシチジン、６−アザシチジン及び８−アザグアニンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１２に記載の細胞老化調節用組成物。
【請求項２１】
前記メチル化剤または脱メチル化剤はカベオリン−１タンパク質をコードするポリヌクレオチドのプロモーターにあるＣｐＧアイランドをメチル化または脱メチル化するものであることを特徴とする請求項１９または２０に記載の細胞老化調節用組成物。
【請求項２２】
ドミナントネガティブアンフィファイシン−１遺伝子の有効量を含む細胞老化調節用組成物。
【請求項２３】
前記ドミナントネガティブアンフィファイシン−１遺伝子は配列番号２として示すアミノ酸配列２５０乃至５８８を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであることを特徴とする請求項２２に記載の細胞老化調節用組成物。
【請求項２４】
細胞老化に関連されたタンパク質の有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含み、前記タンパク質はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化調節方法。
【請求項２５】
細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドの有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含み、前記タンパク質はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化調節方法。
【請求項２６】
細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズし前記タンパク質が発現されることを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含み、前記タンパク質はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化調節方法。
【請求項２７】
カベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基をメチル化または脱メチル化するメチル化剤または脱メチル化剤の有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含む細胞老化調節方法。
【請求項２８】
前記細胞は哺乳動物の細胞から由来のものであることを特徴とする請求項２４乃至２７のいずれか一つの項に記載の細胞老化調節方法。
【請求項２９】
細胞老化に関連された前記タンパク質はアンフィファイシン−１またはカベオリン−１であることを特徴とする請求項２４乃至２７のいずれか一つの項に記載の細胞老化調節方法。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチドはｇＤＮＡまたはｃＤＮＡであることを特徴とする請求項２５に記載の細胞老化調節方法。
【請求項３１】
細胞老化に関連されたタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは真核細胞用発現ベクターに含まれていることを特徴とする請求項２５に記載の細胞老化調節方法。
【請求項３２】
細胞老化に関連された前記タンパク質はカベオリンタンパク質であることを特徴とする請求項２６に記載の細胞老化調節方法。
【請求項３３】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはカベオリンｍＲＮＡの翻訳開始部位とハイブリダイズすることを特徴とする請求項３２に記載の細胞老化調節方法。
【請求項３４】
前記メチル化剤はメチルアゾキシメタノールアセテート（ｍｅｔｈｙｌａｚｏｘｙｍｅｔｈａｎｏｌ ａｃｅｔａｔｅ）、テモゾロミド（Ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）及びＮ−メチル−Ｎ−ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｏｕｒｅａ）からなる群から選択されることを特徴とする請求項２７に記載の細胞老化調節方法。
【請求項３５】
前記脱メチル化剤は５−アザ−デオキシシチジン、５−アザシチジン、６−アザシチジン及び８−アザグアニンからなる群から選択されることを特徴とする請求項２７に記載の細胞老化調節方法。
【請求項３６】
前記メチル化剤または脱メチル化剤はカベオリン−１タンパク質をコードするポリヌクレオチドのプロモーターにあるＣｐＧアイランドをメチル化または脱メチル化するものであることを特徴とする請求項３４または３５に記載の細胞老化調節方法。
【請求項３７】
次の段階を含む細胞老化に影響を及ぼす物質の同定方法：
（ａ） 試験対象の前記物質の存在下で前記細胞を培養する段階；
（ｂ） 前記細胞からタンパク質を分離する段階；
（ｃ） アンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質に対して特異性を有する抗体と前記分離されたタンパク質とを接触させる段階；及び
（ｄ） 前記抗体に結合された前記分離されたタンパク質の量を決定する段階。
【請求項３８】
次の段階を含む細胞老化に影響を及ぼす物質の同定方法：
（ａ） 試験対象の前記物質の存在下で前記細胞を培養する段階；
（ｂ） 前記細胞からＲＮＡを分離する段階；
（ｃ） アンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドから誘導されたプローブと前記分離されたＲＮＡとを接触させる段階；及び
（ｄ） 細胞老化関連タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記分離されたＲＮＡの量を決定する段階。
【請求項３９】
前記細胞は哺乳動物細胞から由来のものであることを特徴とする請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記タンパク質はアンフィファイシン−１タンパク質またはカベオリン−１タンパク質であることを特徴とする請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４１】
アンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドから由来のプローブを含む老化細胞検出用キット。
【請求項４２】
前記細胞は哺乳動物細胞から由来のものであることを特徴とする請求項４１に記載のキット。
【請求項４３】
前記タンパク質はアンフィファイシン−１タンパク質またはカベオリン−１タンパク質であることを特徴とする請求項４１に記載のキット。
【請求項４４】
前記プローブは固体支持体上に固定化されたものであることを特徴とする請求項４１に記載のキット。
【請求項４５】
前記キットはプローブの存在を検出するに利用される標識（ラベル）を追加的に含むことを特徴とする請求項４１乃至４４のいずれか一つの項に記載のキット。
【請求項４６】
アンフィファイシン及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質を含む細胞老化同定用バイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）。
【請求項４７】
アンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞老化同定用バイオマーカー。
【請求項４８】
前記タンパク質はアンフィファイシン−１またはカベオリン−１タンパク質であることを特徴とする請求項４６または４７に記載のバイオマーカー。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は老化に関連された核酸配列及びタンパク質に関するものであって、より詳細には細胞老化に関連された核酸配列及びタンパク質そしてそれらの用途に関するものである。
【０００２】
従来の技術
老化の機構に対しての活発な研究があり、多様な仮説が提示された。前記仮説は（ａ）老化のフリーラジカル理論（Ｈａｒｍａｎ Ｄ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７８， ７１２４−７１２８（１９８１））、 （ｂ）交互結合理論（Ｂｊｏｒｋｓｔｅｎ Ｊ．， Ｊ． Ａｍ． Ｇｅｒｉａｔｒ Ｓｏｃ．， １６， ４０８−４２３（１９６８））、（ｃ）ミトコンドリア理論（Ｌｅｅ ＣＭ ｅｔ ａｌ．， Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．， ２２， １２５９−１２６９（１９９７）； 及びＷａｌｌａｃｅ ＤＣ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ， ７， １８７−１９０（１９９８））、そして （ｄ）遺伝的プログラム理論（Ｈａｒｌｅｙ ＣＢ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ．， ５， ２４９−２５５（１９９５））などを含む。
【０００３】
また、老化は細胞レベル（即ち、細胞老化）で研究が進行された。研究によると、老化細胞は（ａ）細胞サイクルのＧ１段階で止まっていて、（ｂ）低下された生理学的機能を示し（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：１１２９−１１３３（１９９０）； Ｃａｍｐｉｓｉ Ｊ．， Ｃｅｌｌ， ８４：４９７−５００（１９９６））、そして （ｃ）アポトーシス−プログラム−細胞死滅に対しての耐性を示す（Ｗａｎｇ Ｅ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５５：２２８４−２２９２（１９９５））特徴を有する。
【０００４】
細胞が個体水準での老化現象を反映するということが解明（Ｃａｍｐｉｓｉ Ｊ．， Ｃｅｌｌ， ８４：４９７−５００（１９９６））された以後、細胞老化に対しての多様な研究が行われてきた。
【０００５】
一方、老化過程に関与する核酸及びタンパク質に関する特許出願はＷＯ ９９／５２９２９及びＷＯ ０１／２３６１５に開示されている。
【０００６】
前述したように、多様な理論が提示されているが、細胞老化に対してのより明白な解明、老化細胞を同定することのできる特定バイオマーカー及び細胞老化を調節することのできる生体分子に対しての要求がある。
【０００７】
特に、老化関連疾病、例えば、Ｗｅｒｎｅｒシンドローム及びＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎ−Ｇｉｌｆｏｒｄシンドロームの疾病を治療するために、老化現象を逆転して正常的な生理的機能を回復させることのできる方法に対しての重要性が台頭される。
【０００８】
本明細書の全体に掛けて多数の特許文献及び論文が参照されてその引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容はその全体として本明細書に参照に挿入されて本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【０００９】
発明の構成
本発明の一態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質の有効量を含む細胞老化調節用組成物を提供する。
【００１０】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドの有効量を含む細胞老化調節用組成物を提供する。
【００１１】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズし前記タンパク質が発現されることを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を含む細胞老化調節用組成物を提供する。
【００１２】
本発明の他の態様によると、本発明はカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基をメチル化または脱メチル化するメチル化剤または脱メチル化剤の有効量を含む細胞老化調節用組成物を提供する。
【００１３】
本発明の他の態様によると、本発明はドミナントネガティブアンフィファイシン−１遺伝子の有効量を含む細胞老化調節用組成物を提供する。
【００１４】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質の有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含む細胞老化調節方法を提供する。
【００１５】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドの有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含む細胞老化調節方法を提供する。
【００１６】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化に関連されたタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズし前記タンパク質が発現されることを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含む細胞老化調節方法を提供する。
【００１７】
本発明の他の態様によると、本発明はカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基をメチル化または脱メチル化するメチル化剤または脱メチル化剤の有効量を細胞老化調節を必要とする患者に投与する段階を含む細胞老化調節方法を提供する。
【００１８】
本発明の他の態様によると、本発明は（ａ）試験対象の前記物質の存在下で前記細胞を培養する段階；（ｂ）前記細胞からタンパク質を分離する段階；（ｃ）アンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質に対して特異性を有する抗体と前記分離されたタンパク質とを接触させる段階；及び（ｄ）前記抗体に結合された前記分離されたタンパク質の量を決定する段階を含む細胞老化に影響を及ぼす物質の同定方法を提供する。
【００１９】
本発明の他の態様によると、本発明は（ａ）試験対象の前記物質の存在下で前記細胞を培養する段階；（ｂ）前記細胞からＲＮＡを分離する段階；（ｃ）アンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドから誘導されたプローブと前記分離されたＲＮＡとを接触させる段階；及び（ｄ）細胞老化関連タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドにハイブリダイズした前記分離されたＲＮＡの量を決定する段階を含む細胞老化に影響を及ぼす物質の同定方法を提供する。
【００２０】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドから由来のプローブを含む老化細胞検出用キットを提供する。
【００２１】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシン及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質を含む細胞老化同定用バイオマーカー（ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）を提供する。
【００２２】
本発明の他の態様によると、本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質からなる群から選択される細胞老化関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む細胞老化同定用バイオマーカーを提供する。
【００２３】
従って、本発明の目的は老化細胞の検出方法を提供することにある。
【００２４】
本発明の他の目的は細胞老化調節用組成物を提供することにある。
【００２５】
本発明のまた他の目的は細胞老化調節を必要とする患者の細胞老化を調節する方法を提供することにある。
【００２６】
本発明の他の目的は細胞老化に影響を及ぼす物質の同定方法を提供することにある。
【００２７】
本発明の他の目的は老化細胞検出用キットを提供することにある。
【００２８】
本発明の他の目的は細胞老化同定用バイオマーカーを提供することにある。
【００２９】
本発明の他の目的及び利点は発明の詳細な説明、請求範囲及び図面によりさらに明確になる。
【００３０】
本発明は、基本的に、細胞老化を調節する核酸及びタンパク質に関するものである。本発明者らはアンフィファイシン及びカベオリンが各々異なる方式で細胞老化に関与されていることを発見し、これは実施例に例示されている。
【００３１】
クラスリン−コーティングされた小胞を通する収容体−媒介エンドサイトシスの過程は多段階からなっていて、これはクラスリンコートの募集（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）及びコーティングされたバッド（ｂｕｄ）の分裂を含む（Ｓｃｈｍｉｄ ＳＬ， Ａｎｎｕ． Ｒｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６６：５１１−５４８（１９９７））。表皮成長因子（以下、ＥＧＦと称する）が収容体に結合した後、収容体チロシンキナーゼはクラスリンをリン酸化して、これはアンフィファイシンのＳｒｃ−ホモロジー（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）−３（ＳＨ３）ドメインに対する結合位置を提供する（Ｓｌｅｐｎｅｖ， Ｖ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８１：８２１−８２４（１９９８）； Ｗａｎｇ， Ｌ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７０：１００７９−１００８３（１９９５）；及びＲａｍｊａｕｎ， Ａ．Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．， ７０：２３６９−２３７６（１９９８））。アンフィファイシン−１の正確な作用機構は解明されていないが、前記タンパク質はエンドサイトシスバッド（ｂｕｄ）の首部位で募集及びオリゴマー化に関与すると考えられる（Ｓｃｈｍｉｄ， Ｓ．Ｌ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６６：５１１−５４８（１９９７）； 及びＴａｋｅｉ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １３３−１３９（１９９９））。アンフィファイシン−１はＡＰ２／クラスリンコート及びダイナミン−１を連結してエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）小胞を作る（Ｓｌｅｐｎｅｖ， Ｖ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８１：８２１−８２４（１９９８）； Ｓｈｕｐｌｉａｋｏｖ， Ｏ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７６：２５９−２６３（１９９７）； ＭｃＭａｈｏｎ， Ｈ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４１３：３１９−３２２（１９９７）； Ｄａｖｉｄ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９３：３３１−３３５（１９９６）； 及びＵｒｒｕｔｉａ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９４：３７７−３８４（１９９７））。アンフィファイシンのカルボキシル−末端ドメインはＧＴＰａｓｅダイナミンを利用してコーティングされたバッド（ｂｕｄ）を落とす （Ｄａｖｉｄ， Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９３：３３１−３３５（１９９６）；及びＵｒｒｕｔｉａ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９４：３７７−３８４（１９９７））。アンフィファイシンとダイナミンまたはクラスリンとの相互作用の破壊及びＡＰ−２はクラスリン−媒介エンドサイトシスを抑制する（Ｓｌｅｐｎｅｖ， Ｖ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８１：８２１−８２４（１９９８）； Ｓｈｕｐｌｉａｋｏｖ， Ｏ．， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７６：２５９−２６３（１９９７）； 及びＷｉｇｇｅ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ７：５５４−５６０（１９９７））。前述の発見はエンドサイトシス小胞のクラスリン−媒介バッディング（ｂｕｄｄｉｎｇ）をダイナミン−媒介小胞分裂に連結するにアンフィファイシンが関与することを示す。また、アンフィファイシンは多数のサブタイプを有していて、アンフィファイシン−２はＳＨ３ドメインを有していてアンフィファイシン−１のようにダイナミンに対しての結合−親化性を有していることも知られている。
【００３２】
カベオレは直径５０−１００ｎｍの細胞膜小胞含入体であり、トランスサイトシスとピノサイトシス（ｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）のようなエンドサイトシス及び信号伝達体系に関与する（Ｅｎｇｅｌｍａｎ， Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．， ４２８：２０５（１９９８））。２１−２４ ｋＤａの膜タンパク質、カベオリンはｉｎ ｖｉｖｏでカベオレ膜の重要な構造成分である。カベオリンのない哺乳動物細胞でカベオリン−１または−３遺伝子を安定に発現させる場合にはカベオレ構造の形成を誘導することができるということが知られている（Ｌｉｐａｒｄｉ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １４０：６１７（１９９８））。カベオリンはｉｎ ｖｉｖｏで多数のサブタイプを有するものとして知られている。カベオリン−２は大部分の細胞種で発現されて、カベオレの後部側面でヘテロ−オリゴマーを形成すると知られている（Ｓｃｈｅｉｆｆｅｌｅ， Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １４０：７９５（１９９８））。カベオリン−３の発現は横紋筋細胞でのみ起こるものとして報告されている（Ｔａｎｇ， Ｚ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１：２２５５（１９９６））。
【００３３】
Ｉ．老化細胞の同定方法及び細胞老化に影響を与える物質の同定方法
本発明はアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質のようなエンドサイトシスに関与するタンパク質を利用する。
【００３４】
本発明の方法において、細胞老化を示す信号は細胞内のアンフィファイシンタンパク質の減少された量またはカベオリンの増加された量を測定することにより測定される。
【００３５】
本明細書で用語“老化（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ）”は“老化（ａｇｉｎｇ）”と同一な意味を有する。用語“老化細胞（ｏｌｄ ｃｅｌｌ）”は“老化細胞（ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌ）”と同一な意味を有する。特に特定されなかったら、本明細書内のすべての技術的及び科学的用語は本発明の属する技術分野の当業者が共通的に理解するものと同一な意味を有する。例えば、本明細書内の用語はＢｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ ＶＩＩ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（２０００）； ａｎｄ Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．（１９９４）に開示されている。
【００３６】
本発明の望ましい具現例によると、前記細胞はヒト細胞のような哺乳動物細胞から由来のものである。
【００３７】
本発明で利用されるアンフィファイシンは前述のアンフィファイシンサブタイプから選択されることができる。望ましくは、前記アンフィファイシンタンパク質はアンフィファイシン−１であり、これは前述したように主サブタイプとして知られたものである。また、本発明に利用されるカベオリンタンパク質はカベオリン−１、カベオリン−２及びカベオリン−３から選択されることができる。望ましくは、前記カベオリンタンパク質はカベオリン−１タンパク質であり、これは前述したように主サブタイプとして知られたものである。
【００３８】
アンフィファイシンまたはカベオリンに対しての抗体を利用する本発明の方法において、前記抗体は当業者に公知された方法により収得できる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８８））。前記抗体はポリクローンまたはモノクローン抗体である。モノクローン抗体は例えば、米国特許第４，１９６，２６５号に例示された方法のように公知された技術により容易に収得することができる。抗体に結合された分離タンパク質の量を決定する段階は放射能免疫分析及び酵素−結合免疫吸着分析のような当業者に公知された方法により実施されることができる。前記方法は放射能、蛍光、生物学的または酵素的標識などのような標識またはマーカーの検出に一般的に基づく。
【００３９】
本発明の望ましい具現例によると、前記方法はウェスタンブロッティング方法により実施される。ウェスタンブロッティング方法の一般的な過程はＰｅｔｅｒ Ｂ． Ｋａｕｆｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １０８−１２１， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓに開示されている。本発明においてのウェスタンブロッティングは、望ましくは、（ａ）測定対象の細胞試料を破壊する段階；（ｂ）破壊された細胞からタンパク質を収得する段階；（ｃ）ＳＤＳ及び２−メルカプトエタノールを含む溶液内で前記収得したタンパク質を変性させる段階；（ｄ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施する段階；（ｅ）ゲル状の前記タンパク質をニトロセルロース（以下、“ＮＣ”と称する）膜に転移させる段階；（ｆ）ＮＣ膜上のタンパク質をアンフィファイシンまたはカベオリン、望ましくはアンフィファイシン−１またはカベオリン−１に対する１次抗体と反応させる段階；（ｇ）発色反応を触媒する酵素に結合された２次抗体と前記１次抗体を反応させる段階；（ｈ）前記段階（ｇ）の酵素の基質を添加して発色反応を誘導する段階；そして（ｉ）前記段階（ｇ）の酵素により展開された色相の程度を測定する段階を含む。
【００４０】
発色反応のための酵素の望ましい例は、アルカリンフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びホースラディッシュペルオキシダーゼを含むが、これに限定されるものではない。アルカリンフォスファターゼを利用する場合、ブロモクロロインドリールフォスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及びＥＣＦが脂質として利用され；ホースラディッシュペルオキシダーゼを利用する場合には、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン及びルミノールが基質として利用される。
【００４１】
実施例に記載されたように、本発明者らは老化段階で細胞内アンフィファイシンの量が大いに減少し、反対にカベオリンの量は大いに増加することを確認した。従って、本発明は定性的な方法で実施することができる。例えば、アンフィファイシン検出のためのウェスタンブロッティングバンドの強さ及び厚さは視覚的に検出することができるほど大いに減少し；カベオリンを検出するためのウェスタンブロッティングの場合にはバンドの強さ及び厚さは大いに増加する。結論的に、老化細胞及び若い細胞から得られたウェスタンブロッティングバンドを比較して、老化を容易に検出することができる。
【００４２】
さらに、本発明は定量的にも実施することができる。例えば、ウェスタンブロッティングから得られたバンドをデンシトメーターで定量的データに変換させることができる。４０μｇタンパク質を分析する特定実施例で、試験対象の細胞内にあるアンフィファイシン−１の発現程度が若い細胞より４５倍くらい低い場合、前記試験対象の細胞は老化されたものとして決定することができる。
【００４３】
本発明のアンフィファイシンタンパク質及びカベオリンタンパク質のようなエンドサイトシスに関与するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを利用する。
【００４４】
本発明の方法において、細胞老化を示す信号は細胞内のアンフィファイシンをコードするヌクレオチドの減少された量またはカベオリンをコードするポリヌクレオチドの増加された量を測定することにより検出される。
【００４５】
本発明の望ましい具現例によると、前記細胞はヒト細胞のような哺乳動物細胞から由来のものである。望ましくは、前記ポリヌクレオチドはアンフィファイシン−１またはカベオリン−１タンパク質をコードするものである。本発明で利用される前記ポリヌクレオチドはｇＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡである。
【００４６】
本発明の望ましい具現例によると、前記方法はノーザンブロッティング方法により実施されることができる。ノーザンブロッティングの一般的な過程はＰｅｔｅｒ Ｂ． Ｋａｕｆｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， １０２−１０８， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓに開示されている。本発明のノーザンブロッティングは（ａ）試験対象の細胞からＲＮＡを収得する段階；（ｂ）収得したＲＮＡで電気泳動を実施する段階；（ｃ）ナイロンまたはＮＣ膜に前記ＲＮＡを転移させる段階；（ｆ）アンフィファイシンまたはカベオリン、望ましくはアンフィファイシン−１またはカベオリン−１ ｍＲＮＡに相補的な放射能−標識オリゴヌクレオチドプローブと前記転移されたＲＮＡをハイブリダイズさせる段階；（ｇ）最終バンドの強さを測定する段階を含む。
【００４７】
実施例に記載されたように、本発明者らは老化段階で細胞内アンフィファイシンＲＮＡの量が大いに減少し、反対にカベオリンＲＮＡの量は大いに増加することを確認した。従って、本発明は定性的な方法で実施することができる。例えば、アンフィファイシンＲＮＡ検出のためのノーザンブロッティングバンドの強さ及び厚さは視覚的に検出することができるほど大いに減少し；カベオリンＲＮＡを検出するためのノーザンブロッティングの場合にはバンドの強さ及び厚さは大いに増加する。結論的に、老化細胞及び若い細胞から得られたノーザンブロッティングバンドを比較して、老化を容易に検出することができる。
【００４８】
さらに、本発明は定量的にも実施することができる。例えば、ノーザンブロッティングから得られたバンドをデンシトメーターで定量的データに変換させることができる。アンフィファイシン−１ ＲＮＡ ５０μｇを分析する特定実施例で、試験対象の細胞に対するバンドの強さが若い細胞より１５倍くらい低い場合、前記試験対象の細胞は老化されたものとして決定することができる。
【００４９】
ＩＩ．細胞老化調節用組成物
本発明の細胞老化調節用組成物は細胞老化を調節することのできる生体分子を含む。前記生体分子は（ａ）アンフィファイシン及びカベオリンタンパク質のようなタンパク質；（ｂ）アンフィファイシンまたはカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。また、前記生体分子はアンフィファイシンまたはカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズすることのできるアンチセンスヌクレオチドを含む。一方、本発明の組成物はカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基をメチル化または脱メチル化するメチル化剤または脱メチル化剤を含む。
【００５０】
前述のように、前記タンパク質を直接的に送達することもできるが、望ましくは、アンフィファイシンまたはカベオリンタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００５１】
本発明の望ましい具現例によると、前記細胞はヒト細胞のような哺乳動物細胞から由来のものである。望ましくは、前記エンドサイトシスに関与するタンパク質はアンフィファイシン−１またはカベオリン−１タンパク質である。
【００５２】
ポリヌクレオチドを含む本発明の組成物で、前記ポリヌクレオチドはｇＤＮＡまたはｃＤＮＡが望ましく、これは真核細胞用発現ベクターにより運搬される。アンフィファイシン−１をコードするポリヌクレオチドは、望ましくは、配列２として示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、より望ましくは、配列１として示すヌクレオチド配列のヌクレオチド１１１−２１９５に該当するヌクレオチドを含む。カベオリン−１をコードするポリヌクレオチドは、望ましくは、配列４として示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、より望ましくは、配列３として示すヌクレオチド配列のヌクレオチド２６−５５９に該当するヌクレオチドを含む。
【００５３】
本発明に利用される発現ベクターは真核細胞宿主、望ましくは哺乳動物細胞、より望ましくはヒト細胞から外来遺伝子を発現する。発現ベクターのプロモーターは哺乳動物細胞のゲノムから由来のもの（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳動物ウイルスから由来のもの（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクチニアウイルス７．５Ｋプロモーター）である。万一、調節遺伝子が宿主細胞システムと両立することができる場合には、所望の遺伝子配列に連結されているプロモーターまたは調節配列を利用することも望ましい。ウイルスを利用する多くの発現システムが利用でき、例えば、一般的に利用されるプロモーターはポリオマ及びアデノウイルス２から由来のものであり、最も多く利用されるものはシミアンウイルス４０（ＳＶ ４０）から由来のプロモーターである。適合なポリアデニル化部位を転写単位に挿入することが望ましい。本発明に利用できる商業的に購入可能なベクターの例はｐｃＤＮＡ ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；サイトメガロウイルスプロモーター及びポリアデニル化信号包含）、ｐＳＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ； ＳＶ ４０プロモーター及びポリアデニル化信号包含）、ｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ；サイトメガロウイルスプロモーター及びポリアデニル化信号包含）、及びｐＲＥＰ７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；ＲＳＶプロモーター及びＳＶ ４０ポリアデニル化信号包含）を含む。
【００５４】
また、アンフィファイシンまたはカベオリンをコードするポリヌクレオチドを含む本発明の組成物で、前記ポリヌクレオチドは遺伝子治療のためのウイルスベクターを利用して運搬されることができる。例えば、前記運搬システムは（ａ）アデノウイルスベクター（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ａｎｄ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， Ｉｎ： Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ， Ｅｄｓ．， Ｃｏｈｅｎ−Ｈａｇｕｅｎａｕｅｒ ａｎｄ Ｂｏｉｒｏｎ， Ｅｄｉｔｉｏｎｓ Ｊｏｈｎ Ｌｉｂｂｅｙ Ｅｕｒｏｔｅｓｔ， Ｆｒａｎｃｅ， ５１−６１（１９９１）； ａｎｄ Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １：２４１−２５６（１９９１））； （ｂ） アデノ−関連ウイルスベクター（ＬａＦａｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６２：４８３−４８６（１９９８）； Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２１：９２８−９３３（１９９３）； ａｎｄ Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９４：１４４０−１４４８（１９９４））； 及び（ｃ） モロニーマウス白血病ウイルスの遺伝子操作された変異体のようなレトロウイルスベクター（Ｋａｓａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６６：１３７３−１３７６（１９９４））を含む。
【００５５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む本発明の組成物で、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内条件下で、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合するようになる。二重鎖ＤＮＡにアンチセンスオリゴヌクレオチドが結合するようになると、三重−ヘリックスを形成するようになり、ＲＮＡに結合するようになると二重−へリックスを形成するようになる。アンチセンスオリゴヌクレオチドはプロモーター及び他の調節部位、目的遺伝子のエキソン及びイントロンに結合するように製作することができる。本発明に利用されるアンチセンスオリゴヌクレオチドは目的のポリヌクレオチドに実質的に相補的である。即ち、アンチセンスコンストラクトは目的遺伝子に幾つかの不一致塩基を有することができる。より望ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはカベオリンタンパク質、さらに望ましくはカベオリン−１タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。最も望ましくは、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはカベオリン−１ ｍＲＮＡの翻訳開始部位にハイブリダイズする。
【００５６】
メチル化剤または脱メチル化剤を含む本発明の組成物で、前記製剤はカベオリン遺伝子の塩基のメチル化程度を調節する。実施例に記載されたように、メチル化されきれなかったカベオリン遺伝子はより増加された発現程度を示す。望ましい具現例で、メチル化または脱メチル化されるカベオリン遺伝子はカベオリン−１遺伝子である。より望ましくは、前記変形される部位はカベオリン−１遺伝子のプロモーターであり、最も望ましくは、カベオリン−１遺伝子のプロモーターにあるＣｐＧアイランドである。本発明に利用されるメチル化剤の例はメチルアゾキシメタノールアセテート、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）及びＮ−メチル−Ｎ−ニトロソウレアを含むが、これに限定されるものではない。脱メチル化剤の非−制限的な例は５−アザ−デオキシシチジン、５−アザシチジン、６−アザシチジン及び８−アザグアニンを含む。
【００５７】
細胞老化を調節する組成物として、本発明はドミナントネガティブアンフィファイシン−１遺伝子の有効量を含む組成部を提供する。前記ドミナントネガティブアンフィファイシン−１遺伝子はアンフィファイシン−１の機能を抑制するものとして知られている（Ｓｈｕｐｌｉａｋｏｖ， Ｏ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７６：２５９（１９９７）； ａｎｄ Ｗｉｇｇｅ Ｐ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ７：５５４（１９９７））。ドミナントネガティブアンフィファイシン−１遺伝子による処置は細胞老化を誘導し、これは実施例で確認することができる。本発明の望ましい具現例によると、前記ドミナントネガティブアンフィファイシン−１遺伝子は配列２として示すアミノ酸配列２５０乃至５８８を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００５８】
ＩＩＩ．細胞老化調節方法
本発明の方法において、アンフィファイシンまたはカベオリンに関連された生体分子の有効量は典型的に細胞に投与される。特に、アンフィファイシンまたはカベオリンをコードするポリヌクレオチドまたはこれらのアンチセンスオリゴヌクレオチドは次の方法によりｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで投与されることができる：（ａ） 微細注入（Ｃａｐｅｃｃｈｉ， Ｍ．Ｒ．， Ｃｅｌｌ， ２２：４７９（１９８０））； （ｂ） カルシウムフォスフェート共沈澱（Ｇｒａｈａｍ， Ｆ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６（１９７３））； （ｃ） 電気穿孔（Ｎｅｕｍａｎｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １：８４１（１９８２））； （ｄ） リポソーム−媒介形質感染（Ｗｏｎｇ， Ｔ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １０：８７（１９８０））； （ｅ） ＤＥＡＥ−デキストラン処理（Ｇｏｐａｌ， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ５：１１８８−１１９０（１９８５））； 及び（ｆ） 粒子ボンバード（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ） （Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８７：９５６８−９５７２（１９９０））。
【００５９】
本発明の望ましい具現例によると、利用される細胞は哺乳動物、より望ましくはヒト細胞から由来のものである。望ましくは、投与されるタンパク質、ポリヌクレオチド及びアンチセンスオリゴヌクレオチドはアンフィファイシン−１またはカベオリン−１に対するものである。望ましくは、投与されるポリヌクレオチドはｇＤＮＡまたはｃＤＮＡである。より望ましくは、投与されるポリヌクレオチドは真核細胞用発現ベクターで運搬される。アンチセンスコンストラクトを利用する本発明の望ましい具現例で、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはカベオリン、より望ましくはカベオリン−１をコードする遺伝子に実質的に相補的なものである。最も望ましい具現例はカベオリン−１ ｍＲＮＡの翻訳開始部位にハイブリダイズするものである。
【００６０】
メチル化剤または脱メチル化剤を利用する本発明の方法で、前記製剤はカベオリン遺伝子の塩基のメチル化程度を調節する。望ましい具現例で、メチル化または脱メチル化されるカベオリン遺伝子はカベオリン−１遺伝子である。より望ましくは、前記変形される部位はカベオリン−１遺伝子のプロモーターであり、最も望ましくは、カベオリン−１遺伝子のプロモーターにあるＣｐＧアイランドである。本発明に利用されるメチル化剤の例はメチルアゾキシメタノールアセテート、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）及びＮ−メチル−Ｎ−ニトロソウレアを含むが、これに限定されるものではない。脱メチル化剤の非−制限的な例は５−アザ−デオキシシチジン、５−アザシチジン、６−アザシチジン及び８−アザグアニンを含む。
【００６１】
前記Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩの共通的な事項は過度な重複を招来する本明細書の複雑性を避けるためにその記載を省略する。
【００６２】
ＩＶ．キット及びバイオマーカー
前述のように、本発明は老化細胞検出用キットを提供する。老化細胞を検出するに必要なすべての必須的な物質及び試薬は一つのキット内に包含させることができる。試験対象の細胞から分離されるＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズするに有用なプローブが利用される。また、前記プローブはＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲのように当業者に公知された分子生物学分析方法に利用されるプライマーであることができる。また、本発明のキットは核酸増幅に適合な酵素、例えば、Ｔａｑ重合酵素、増幅反応に必要な反応混合物を提供することのできるｄＮＴＰ混合物及び緩衝液を含むことができる。
【００６３】
本発明の望ましい具現例で、前記プローブはアンフィファイシン−１タンパク質またはカベオリン−１タンパク質をコードするポリヌクレオチドから由来のものである。望ましくは、前記プローブは固体支持体上に固定化されたものである。本発明のキットに利用される固体支持体は当業者に公知されたものであって、ガラス、プラスチック、重合体、金属、準金属、セラミックまたは有機物を含む。本発明のより望ましい具現例によると、本発明はアンフィファイシン−１タンパク質またはカベオリン−１タンパク質をコードするポリヌクレオチドから由来のプローブのアレイを含むキットを提供する。個体支持体を含むマイクロアレイに対しての一般的な技術はＷＯ ８９／１０９７７、米国特許第５，２０２，２３１号、 第５，００２，８６７号及び第５，１４３，８５４号に開示されている。
【００６４】
本発明の望ましい具現例によると、本発明のキットはプローブの存在を検出するに利用される標識（ｌａｂｅｌ）を追加的に含む。前記標識はプローブと試料から分離されたヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションを検出できるようにする。最も一般的な標識は３Ｈ、１４Ｃ及び３２Ｐのような放射線物質である。
【００６５】
本発明は細胞老化同定用バイオマーカーを提供する。望ましい具現例で、本発明に適合なタンパク質またはポリヌクレオチドはアンフィファイシン−１またはカベオリン−１から由来のものである。
【００６６】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。
【００６７】
実施例
実施例Ｉ：細胞培養
実施例Ｉ−１：表皮繊維芽細胞の培養
表皮繊維芽細胞の分離及び培養はＢｏｙｃｅとＨａｍの方法（Ｂｏｙｃｅ ＳＴ． ａｎｄ Ｈａｍ ＲＧ．， Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏ．， ８１：３３−４０（１９８３））　により次のように実施した：先ず、７歳の男児から表皮を収得し、これを薄く剥がして切片にした後、表皮切片を０．２５％のコラゲナーゼが含まれたハンクス塩溶液（Ｈａｎｋ’ｓ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ： Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）１０ｍｌに入れて、９０分間５％ＣＯ２、３７℃の恒温培養機で培養させた後、上皮と真皮とを相互分離した。次いで、分離した真皮に０．２５％のトリプシン溶液１ｍｌを添加して、抗生剤であるストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌとペニシリン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社）１００ユニット／ｍｌを含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ： Ｓｉｇｍａ社）１０ｍｌに入れた後、３７℃の恒温培養機で１０分間培養した。前記過程により得られた表皮繊維芽細胞を１０ｍｌのＰＢＳで洗浄した後、前記のＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ及び抗生剤包含）で継代培養を次のように続けて実施した：恒温培養機は５％のＣＯ２濃度及び３７℃を維持するようにし、ＤＭＥＭは三日毎に交換して、サブコンフルエンシ（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が維持されるようにし、継代培養（ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ）は１：４で実施した。２５群落ダブリング（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇｓ）以下の細胞は増殖が非常に活発で、これは前老化細胞（または若い細胞）として見做し、反面、６０群落ダブリング以上の細胞は老化細胞として見做し、この細胞は延長された群落ダブリング期間（３週以上）を示した。
【００６８】
Ｉ−２：肺繊維芽細胞（ｆｅｔａｌ ｌｕｎｇ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）の培養
肺繊維芽細胞であるＩＭＲ−９０細胞はＡＴＣＣ（ＣＣＬ−１８６）から購入して使用した。ＩＭＲ−９０の培養は前記の皮膚繊維芽細胞と同様に実施した。
【００６９】
実施例ＩＩ：細胞老化誘導
ＩＩ−１：Ｈ２Ｏ２による細胞老化誘導
先ず、前記実施例Ｉ−１で継代培養されたＰＤＬ １６の皮膚繊維芽細胞を細胞培養皿に敷いて細胞培養恒温機（３７℃， ５％ ＣＯ２， ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）で一週間維持して細胞がＧｌ細胞基に停止されるようにした。一方、Ｇｌ細胞基に停止されたかのことは次のように確認した：細胞を７０％氷冷エタノールで固定した後、ＰＩ染色溶液（ＰＢＳに５０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ Ａと５０μｇ／ｍｌのプロピニウムヨージド（ｐｒｏｐｉｎｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）が包含）を用いて室温で細胞を染色した。これをＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）を用いてＤＮＡが各々２ｎと４ｎの中でどのような形態を示すかを確認することにより細胞基を確認した。Ｇｌ細胞基の細胞の場合、大部分のＤＮＡ染色状態が２ｎ状態を示した。
【００７０】
Ｇｌ細胞基に停止された皮膚繊維芽細胞に４００μＭ Ｈ２Ｏ２を処理して３時間培養した後、ＰＢＳ　１０ｍｌで２回洗浄した。次いで、細胞を１：４で継代培養した後正常的な細胞培養条件（３７℃， ５％ ＣＯ２， ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）で培養を持続した。Ｈ２Ｏ２を処理して７日以後から細胞老化の指標として使用されている老化関連β−ガラクトシダーゼ活性染色をして細胞が老化状態に入ったことを確認して実験に使用した。β−ガラクトシダーゼ活性染色は下記実施例ＩＩＩのように実施した。
【００７１】
ＩＩ−２：ヒドロキシウレア（Ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）による細胞老化誘導
先ず、前記実施例Ｉ−１で継代培養されたＰＤＬ １６の皮膚繊維芽細胞をＤＭＥＭが含まれた細胞培養皿に敷いて、１４時間細胞培養機（３７℃， ５％ ＣＯ２， ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）で培養した。次いで、４００μＭのヒドロキシウレアを処理して培養を持続した。培養培地は三日毎に交換し、培地を交換するたびに４００μＭのヒドロキシウレアを新しく添加した。ヒドロキシウレアを処理して１４日後から老化関連β−ガラクトシダーゼ活性染色を下記実施例ＩＩＩのように実施し老化状態への進入を確認して実験に使用した。
【００７２】
実施例ＩＩＩ：老化関連β−ガラクトシダーゼ活性染色
老化関連β−ガラクトシダーゼ活性染色（以下、“ＳＡ β−ｇａｌ活性染色”と称する）はＤｉｍｒｉらの方法（Ｄｉｍｒｉ ＧＰ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９２：９３６３−９３６７（１９９５））により次のように行った：先ず、セミコンフルエント（ｓｅｍｉｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）繊維芽細胞をＰＢＳ １０ｍｌで２回洗浄した後、２％のパラホルムアルデヒドで室温で５分間固定した。固定された細胞をＰＢＳで再び洗浄し、β−ガラクトシダーゼ活性染色溶液（１ｍｇ／ｍｌのＸ−Ｇａｌ， ４０ ｍＭクエン酸／ソジウムフォスフェート（ｐＨ ６．０）， ５ｍＭポタシウムフェロシアニド（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｆｅｒｒｏｃｙａｎｉｄｅ）， １５０ｍＭ ＮａＣｌ及び２ｍＭ ＭｇＣｌ２）５ｍｌを添加して、３７℃の恒温培養機で１２〜１６時間反応させた。反応が進行される間、光が入らないようにアルミホイルで培養皿を包んで培養した。最終的に、位相差顕微鏡で発色程度を確認した。ヒト表皮繊維芽細胞の場合はＰＤＬ ５０、ＩＭＲ ９０の場合にはＰＤＬ ６５からβ−ガラクトシダーゼ活性が現れて、Ｈ２Ｏ２で処理した場合は処理して１０日以後から、ヒドロキシウレアで処理した場合は処理して１４〜２０日以後からβ−ガラクトシダーゼ活性が現れ細胞が老化に進入したことを確認することができた。
【００７３】
実施例ＩＶ：エンドサイトシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）の変化確認
ＩＶ−１：老化細胞でのエンドサイトシスの機能低下観察
老化細胞で収容体−媒介エンドサイトシスの機能に変化があるかを確認するためにトランスフェリン（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ）の運搬程度を次のように観察した：先ず、細胞をカバーグラスの上に敷いた後、細胞培養機（３７℃， ５％ ＣＯ２， ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）で培養した後、２５μｇ／ｍｌテトラメチルロダミン−接合トランスフェリン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ社）を５分間処理した。次いで、ＰＢＳ １０ｍｌで洗浄した後、ＰＢＳ内４％パラホルムアルデヒドで室温で１０分間固定して、細胞の核をＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。トランスフェリンの運搬程度は共焦点顕微鏡（Ｂｉｏｒａｄ社、＃ＭＲＣ １０２４）を用いて観察し、その結果は図１に示した。
【００７４】
図１で、パネルＡは若い繊維芽細胞（ＰＤＬ ２０）及び老化繊維芽細胞（ＰＤＬ ５４）を示し、パネルＢはＩＭＲ細胞（ＰＤＬ ３２及び６８）を示す。図１で分かるように、若い繊維芽細胞及び若いＩＭＲ細胞の場合は蛍光性トランスフェリンが細胞内に運搬されて核の周囲に集まっている様子を示すが、これは細胞内運搬時に現れる典型的な様子として報告されたことがある。これとは反対に、老化細胞は前老化細胞のようにトランスフェリンを効率的に細胞内に運搬することはできなかった。
【００７５】
ＩＶ−２：処理時間によるトランスフェリン運搬の観察
表皮繊維芽細胞を２５μｇ／ｍｌテトラメチルロダミン−接合トランスフェリンで１０、２０、４０及び６０分間処理して、その実験結果は図２に示した。図２でパネルＹ、Ｍ及びＯは各々若い細胞（ＰＤＬ ２４）、中間細胞（ＰＤＬ ３８）及び老化細胞（ＰＤＬ ５４）を示す。図２から確認できるように、ＰＤＬ ２４及び３８の若い細胞ではトランスフェリン運搬が効果的に発生し１０分から細胞内の核の周辺にその蛍光像が現れ、時間が経過するにつれて持続的に運搬されたトランスフェリンが蓄積されてさらに多い蛍光が観察された。これに反して老化細胞では６０分間培養した後にも細胞内に運搬された蛍光が現れなかった。
【００７６】
ＩＶ−３：トランスフェリン運搬のパルス−チェーシング（ｐｕｌｓｅ−ｃｈａｓｉｎｇ）
ＩＭＲ ９０に５分間２５μｇ／ｍｌロダミン（ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）−接合トランスフェリンを処理した後、０分、５分及び１０分間チェーシングした。その後、前記のように固定して、トランスフェリンの運搬程度を共焦点顕微鏡で観察した（参照：図３）。図３で、パネルＹ、Ｍ及びＯは若い細胞（ＰＤＬ ２６）、中間細胞（ＰＤＬ ４８）及び老化細胞（ＰＤＬ ７２）を示す。図３から分かるように、若い細胞の場合はただ５分でトランスフェリンを細胞内の骨脂細網系部位に位置させ、５分間のパルスの後固定させた時には既にその蛍光が核周辺で観察されて、１０分後には細胞内で処理されその蛍光像が拡散されて現れた。これに反しＰＤＬ ４８の細胞の場合は、トランスフェリンの運搬が遅延され、１０分後細胞内の骨脂細網系部位に蛍光像が淡く現れていることを確認することができた。 一方、ＰＤＬ ７２細胞では時間が経過してもトランスフェリンの運搬自体が行われなかった。
【００７７】
ＩＶ−４：人為的に誘導された老化細胞でのエンドサイトシスの機能低下確認
前記実施例ＩＩで人為的に老化が誘導された細胞に前記のように２５μｇ／ｍｌテトラメチルロダミン−接合トランスフェリンを処理して、蛍光性トランスフェリンの運搬程度を共焦点顕微鏡で観察した（参照：図４）。図４から分かるように、継代培養による自然的老化でだけではなくＨ２Ｏ２やヒドロキシウレアを処理して得られた人為的老化細胞でも収容体−媒介エンドサイトシス機能が低下されていることを確認することができた。
【００７８】
本実施例を通じてヒト繊維芽細胞が老化されるとエンドサイトシス機能が低下されトランスフェリンのようなリガンドを細胞内に流入することができないということを確認した。
【００７９】
実施例Ｖ：収容体−媒介エンドサイトシスに関与するタンパク質発現分析
老化細胞でのエンドサイトシスの機能低下を分子的次元から解明するために、収容体−媒介エンドサイトシスに関与するタンパク質の発現をウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）実験を通じて次のように確認した。
【００８０】
サブコンフルエント（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）の初期、中期及び末期−継代細胞を細胞溶解緩衝液（１％トリトンＸ−１００， ０．５％ ＮＰ−４０， ５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ ７．５）， １５０ ｍＭ ＮａＣｌ， １ ｍＭ ＥＤＴＡ， １ ｍＭ ＰＭＳＦ， ５μｇ／ｍｌアプロチニン， ５μｇ／ｍｌロイペプチン， １ ｍＭ ＮａＶＯ４及び１ ｍＭ ＮａＦ）を利用し溶解して、音波破砕した後、破砕物を１４０００×ｇで１０分間遠心分離した後、その上層液を取った。このようにして得られた上層液に対して、ブラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ， Ｍ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２：２４８−２５４（１９７６））を利用してタンパク質を定量した後、同量（４０μｇ）のタンパク質を取って５Ｘ ＳＤＳ試料緩衝液（６０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ ６．８）， ２５％グリセロール， ２％ ＳＤＳ， １４．４ ｍＭ ２−メルカプトエタノール， ０．１％ブロモフェノールブルー）を添加して５分間煮って変性させた。細胞破砕液（１０−１５μｇタンパク質を包含）を電気泳動キット（Ｂｉｏｒａｄ社）を利用して８％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動をして分離させて、分離されたタンパク質をトランスファーキット（Ｂｉｏｒａｄ社）を利用してＮＣメンブレンに転移させた。このブロットを５％脱脂粉乳（Ｄｉｆｃｏ社）を含むＴＴＢＳ（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ ２０）で１時間ブロッキングさせた。前記ブロットを５％脱脂粉乳を含むＴＴＢＳ内の各々の１次抗体で１時間室温で免疫ブロットして、ＴＴＢＳで３回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ−接合抗−マウス２次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を処理した。前記１次抗体として使用された抗体の中で、抗−ダイナミン抗体、抗−α−アダプチン抗体、抗−β−アダプチン抗体及び抗−クラスリン重鎖抗体はＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入したものであり、マウス単一クローン抗−アンフィファイシン−１抗体は大韓民国の忠北大学校医科大学、キムスンリョル博士から得たものであり（Ｊｉｎ， Ｙ．， Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（ｉｎ ｐｒｅｓｓ）， Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ａｍｐｈｉｐｈｙｓｉｎ， Ｅｘｐ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．）、抗−ホスホチロシン抗体と抗−トランスフェリン収容体抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入したものである。シグナルは改善された化学発光システム（ＥＣＬキット， Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を利用して可視化して、その結果は図５に示した。
【００８１】
図５から確認できるように、ただアンフィファイシン−１だけが老化細胞で大幅減少されて、他のエンドサイトシスタンパク質はほとんど変化がなかった。アンフィファイシン−１タンパク質の発現減少は繊維芽細胞及びＩＭＲ ９０細胞各々の老化細胞で観察された。さらに、Ｈ２Ｏ２またはヒドロキシウレアから誘導された老化細胞（“＋”で表示）も図５と同一な実験結果を示した（参照：図６）。
【００８２】
前記実験結果から細胞老化過程はアンフィファイシン−１の発現減少と連関されていることが分かる。
【００８３】
実施例ＶＩ：収容体−媒介エンドサイトシスに関与するタンパク質をコードするｍＲＮＡのノーザンブロット分析
前記実施例Ｖから確認した細胞老化時アンフィファイシン−１タンパク質の発現減少の正確な機構を解明するために、ノーザンブロッティングを次のように実施した。
【００８４】
酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルムを利用して前記実施例Ｉのヒト表皮繊維芽細胞からＲＮＡを分離して、ホルムアルデヒド試料緩衝液（５Ｘ ＭＯＰＳ， １７．５％ホルムアルデヒド及び５０％ホルムアミド）と混合した後、電気泳動キット（Ｈｏｅｆｅｒ社）を利用して１％アガロースゲルで電気泳動を行った。電気泳動が終了された後、ＮＣメンブレンにＲＮＡを転移させて、自動ＵＶ交互結合剤（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ社）を利用してＲＮＡをメンブレンに交互結合させた。その後、３２Ｐ−標識されたプローブ（アンフィファイシン−１　ｃＤＮＡのヌクレオチド１１１−１１１６を包含）とハイブリダイゼーション反応をさせた後、最終的に自動放射線写真を得た（参照：図７）。図７で、パネルＹはＰＤＬが２７、ＭはＰＤＬが３６そしてＯはＰＤＬが６０である表皮繊維芽細胞である。図７から分かるように、老化が進行されるにつれてアンフィファイシンｍＲＮＡ量が減少されることを確認することができた。
【００８５】
前記の実験結果から細胞老化進行は転写段階でのアンフィファイシン−１の減少と連関されていることが分かる。
【００８６】
実施例ＶＩＩ：アンフィファイシン−１遺伝子のクローニング
ヒトアンフィファイシン−１遺伝子の全長ｃＤＮＡは添付の配列１として示すヌクレオチド配列を有し、前記ｃＤＮＡを運搬するベクターは大韓民国の忠北大学校から入手した。前記ベクターはｐＧＥＸ−２Ｔベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩ制限位置に前記ｃＤＮＡを挿入してアンフィファイシン−１とグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼが融合された形態に発現されるように製作された。図８はヒトアンフィファイシン−１をコードするｃＤＮＡを運搬するベクターの遺伝子地図である。全長ｃＤＮＡは次のプライマーを利用してＰＣＲ増幅した：５＿−ＡＡＣＴＧＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＣＧＧＧＣ−３＿ 及び ５＿−ＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＴＣＴＡＡＧＣＧＴＣＧＧＧＴ−３＿。ＰＣＲ増幅はＰｙｒｏｂｅｓｔ Ｔａｑ重合酵素（Ｔａｋａｒａ社）を使用して次の温度で３０サイクルを行った：５５℃で３０秒（アニーリング）、７２℃で１．５分（伸長反応）及び９２℃で３０秒（変性）。増幅されたｃＤＮＡをｐＴ７　ｂｌｕｅベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社）にクローニングして塩基配列を確認した。次いで、Ｈｉｎｄ ＩＩＩと Ｂａｍ ＨＩで処理した後、繊維芽細胞にアンフィファイシン−１　ｃＤＮＡを微細注入するためにｐｃＤＮＡ３ベクター（サイトメガロウイルスのプロモーター及びポリアデニル化シグナル包含）にサブクローニングした。アンフィファイシン−１のｃＤＮＡを含むｐｃＤＮＡ ３の遺伝子地図は図９に示されている。
【００８７】
実施例ＶＩＩＩ：アンフィファイシン−１遺伝子による老化細胞の細胞膜収容体性エンドサイトシスの回復
ＶＩＩＩ−１：アンフィファイシン−１遺伝子の微細注入
実施例Ｉの老化されたヒト表皮繊維芽細胞（ＰＤＬ ５８）をカバーグラス上に敷いてＦＢＳが入っていないＤＭＥＭ培地を用いて細胞培養機（３７℃， ５％ ＣＯ２， ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）で２４時間培養した。次いで、前記実施例ＶＩＩでｐｃＤＮＡ ３ベクターにクローニングされたアンフィファイシン−１遺伝子（１０ｎｇ／ｍｌ） １０−１４ｌ及びラビットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ社， ５ｍｇ／ｍｌ）１０−１４ｌ を老化細胞の核に微細注入した。ベクターは微細注入バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ， ｐＨ ７．２， １００ｍＭ ＫＣｌ， ５０ｍＭ ＮａＰＯ４）で１０ｎｇ／ｍｌに希釈した。希釈したベクターをトランスゼクター５２４６　（ｔｒａｎｓｊｅｃｔｏｒ５２４６；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）及びマイクロマニピュレーター（ｍｉｃｒｏｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ；Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）を使用して細胞核に微細注入した。
【００８８】
ＶＩＩＩ−２：微細注入された細胞でのアンフィファイシン−１の発現分析
微細注入された細胞でアンフィファイシン−１の発現を次のように重複免疫蛍光染色を実施して確認した：微細注入後、２４時間ＦＢＳのないＤＭＥＭ培地で成長させた細胞を３．７％パラホルムアルデヒド溶液（ｉｎ ＰＢＳ）で１０分間固定させて、ＰＢＳ内０．３％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で室温で１０分間透過化した。次いで、抗−アンフィファイシン−１抗体及びＦＩＴＣ−接合抗−ラットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社）で細胞を連続的に３７℃で１時間処理した後、ロダミン−接合抗−ラビットＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社：１：１００に希釈）で３７℃で１時間処理した。像は蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社， Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２５， ＣＦＬ４５１２１０）で観察した（参照：図１０）。図１０から分かるように、抗−ラビットＩｇＧはロダミンにより赤色蛍光で確認でき、アンフィファイシン−１は２次抗体のＦＩＴＣにより緑色蛍光で確認することができた。アンフィファイシン−１の存在を示す緑色蛍光は細胞質で観察された。
【００８９】
従って、アンフィファイシン−１タンパク質は実施例ＶＩＩＩ−１の微細注入された細胞で発現されることが分かる。
【００９０】
ＶＩＩＩ−３：老化細胞でのエンドサイトシス機能回復の分析
微細注入された細胞をＦＢＳが入っていないＤＭＥＭで恒温機（３７℃， ５％ ＣＯ２， ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ）で２４時間培養した。次いで、１２５ｎｇ／ｍｌテトラメチルロダミン−接合トランスフェリンで細胞を３０分間処理し、１０ｍｌＰＢＳで洗浄した後、ＰＢＳ内４％パラホルムアルデヒド１０ｍｌで１０分間固定した。その後、免疫蛍光染色を前記実施例ＶＩＩＩ−２と同様に実施した。蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ社、Ａｘｉｏｖｅｒｔ　１００）を利用して、微細注入された細胞の確認及びトランスフェリンの運搬程度を観察した。実験結果は表１に示した。
【００９１】
【表１】
2004508031.tif 000002
【００９２】
前記表１から確認できるように、ｐｃＤＮＡ ３ベクターがモック（ｍｏｃｋ）で微細注入した細胞に比べて、アンフィファイシン−１遺伝子が含まれたｐｃＤＮＡ ３ベクターを微細注入した細胞でトランスフェリンの細胞内運搬が大いに増加されることが分かる。即ち、老化細胞のエンドサイトシス活性はアンフィファイシン−１ ｃＤＮＡの注入により急激に増加する。このような実験結果はアンフィファイシン−１が老化細胞のエンドサイトシスの機能回復に必須的であり、細胞老化を調節する重要な要素であることを証明する。
【００９３】
実施例ＩＸ：ドミナントネガティブアンフィファイシン−１遺伝子のクローニング
アンフィファイシン−１の機能を遮断するものとして知られているドミナントネガティブアンフィファイシン−１遺伝子（Ｓｈｕｐｌｉａｋｏｖ， Ｏ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７６：２５９（１９９７）；及びＷｉｇｇｅ Ｐ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ７：５５４（１９９７））を、アンフィファイシン−１ ｃＤＮＡを鋳型にして特定プライマーを利用しＰＣＲを実施することにより増幅して、これによりアンフィファイシン−１タンパク質の中間部分（アミノ酸２５０乃至５８８）をコードする部分的なヌクレオチド配列を増幅した。利用された前方向プライマー及び逆方向プライマーは次の配列を有する； ５’−ＡＡＣＴＧＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＡＴＴＣＧＧＧＴＣＣＴＣＴＣＣＧＣ−３’ 及び５’−ＧＧＡＴＣＣＣＴＡＣＴＧＣＴＣＣＧＴＡＧＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧ−３’。ＰＣＲ増幅産物を実施例ＶＩＩの方法と同様にｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にサブクローニングした。最終ベクターの遺伝子地図は図１１に示されている。
【００９４】
実施例Ｘ：ドミナントネガティブアンフィファイシン−１遺伝子による若い細胞のエンドサイトシス機能の抑制
前記実施例ＩＸで製作されたベクターを利用して、若い繊維芽細胞（ＰＤＬ １６）を次のように形質転換させた：前記実施例９で製造したベクター２μｇ及びｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）０．５μｇをＤＭＥＭとプラス試薬８μｌと混合した後、室温で１５分間放置した。その後、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）とＤＭＥＭの混合物を前記混合物とよく混合した後、室温で１５分間放置した。その後、ＤＭＥＭ ２ｍｌを追加的に添加して、前記最終混合物を若い繊維芽細胞に添加した後３７℃で３時間培養した。３時間経過した後、２０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ ２．５ｍｌを加えて、４０時間培養した。次いで、細胞に２５μｇ／ｍｌロダミン−接合トランスフェリンを１０分間処理した後、共焦点顕微鏡（Ｂｉｏｒａｄ社， ＃ＭＲＣ１０２４）で像を観察し、形質転換された細胞（ＥＧＦＰ−由来緑色蛍光発散）または非−形質転換された細胞でのトランスフェリンの運搬程度を解明した（参照：図１２）。図１２から確認できるように、ドミナントネガティブアンフィファイシン−１ ｃＤＮＡが挿入されたベクターとｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターで同時形質転換された細胞（左側パネル）ではロダミン−接合トランスフェリンの赤色蛍光が観察されなく、即ち、ロダミン−接合トランスフェリンの細胞内運搬が発生されなくて、形質転換されていない細胞（右側パネル）では赤色蛍光が観察された。
【００９５】
前記実験結果はアンフィファイシン−１の機能的不能は収容体−媒介エンドサイトシスを抑制して、これは結局細胞老化を誘導することを示す。
【００９６】
実施例ＸＩ：ウェスタンブロッティングを利用したＥｒｋ−１／２の活性分析
ヒト繊維芽細胞またはＩＭＲ−９０の若い細胞（ＰＤＬ ３０以下）、中間細胞（ＰＤＬ ３５−４５）及び老化細胞（ＰＤＬ ６０以上）の各々にＥＧＦ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社， ＃１３２４７−０５１， ｈｕｍａｎ， ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）１００ｎｇ／ｍｌを処理して刺激させた。次いで、前記実施例Ｖに記載された方法に従ってウェスタンブロッティングを実施した。モノクローン抗−ホスホ−Ｅｒｋ−１／２抗体、ポリクローン抗−Ｅｒｋ−１／２抗体及びポリクローン抗−ＥＧＦＲ抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入したものである。図１３（ａ）から確認できるように、若い細胞及び中間細胞はＥＧＦ刺激後５分以内にＥｒｋ−１／２キナーゼがリン酸化（活性化）されて、１５分間持続された。しかし、老化細胞の場合はＥｒｋ−１／２キナーゼのリン酸化が１５分経過するまで検出されなかった。一方、群落ダブリングが増加する場合、ＥＧＦからＥｒｋキナーゼへの信号伝達が減少するにも関わらず、Ｅｒｋキナーゼ及びＥＧＦＲの発現度は変化がないことをウェスタンブロッティングを通じて確認した（参照：図１３（ｂ））。
【００９７】
従って、老化細胞で現れる成長刺激因子に対しての反応の減少はＥｒｋ−１／２キナーゼの活性化、即ちリン酸化の減少によるものであることが分かる。
【００９８】
実施例ＸＩＩ：ウェスタンブロッティングを利用したカベオリン（ｃａｖｅｏｌｉｎ）発現の分析
カベオリン発現分析のために、ヒト繊維芽細胞またはＩＭＲ−９０の若い細胞（ＰＤＬ ３０以下）、中間細胞（ＰＤＬ ３５−４５）及び老化細胞（ＰＤＬ ６０以上）の各々に対して前記実施例Ｖと同様にウェスタンブロッティングを実施した。単一クローン抗−カベオリン−１抗体、単一クローン抗−カベオリン−２抗体及び単一クローン抗−カベオリン−３抗体はＴｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入したものである。図１４から分かるように、老化が進行されるにつれてヒト繊維芽細胞またはＩＭＲ−９０でカベオリン−１、カベオリン−２及びカベオリン−３の全てがその発現が増加される。
【００９９】
実施例ＸＩＩＩ：免疫沈澱によるＥＧＦＲ及びカベオリン−１の相互作用の分析
ヒト繊維芽細胞の若い細胞（ＰＤＬ ３０以下）及び老化細胞（ＰＤＬ ６０以上）の各々の細胞試料をＩＰ溶解緩衝溶液（１０ｍＭフォスフェート緩衝溶液， ｐＨ ７．４， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， １％ ＮＰ−４０， ２ｍＭ ＥＤＴＡ， １ｍＭ ＰＭＳＦ， ２μｇ／ｍｌアプロチニン， ２μｇ／ｍｌロイペプチン， ５０ｍＭ ＮａＦ及び０．２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４）で溶出して、短く音波破砕した後９０００ｒｐｍで５分間遠心分離しその上層液を取った。次いで、上層液を正常マウス血清、抗−ＥＧＦＲ抗体または抗−カベオリン−１抗体と反応させた後タンパク質Ａ−セファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で免疫複合体を沈澱させて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後、前記実施例Ｖと同様にウェスタンブロッティングを実施した（参照：図１５）。
【０１００】
図１５から分かるように、ヒト繊維芽細胞の老化細胞でＥＧＦＲ免疫複合体はカベオリン−１タンパク質を含んでいると分析されたが、若い繊維芽細胞はそうではなかった。
【０１０１】
従って、老化が進行されるにつれて、カベオリン−１タンパク質の発現が増加されて、増加されたカベオリン−１はＥＧＦＲと相互作用してＥＧＦＲによるＥｒｋ−１／２キナーゼの活性化作用を抑制することが分かる。
【０１０２】
実施例ＸＩＶ：カベオリン−１に対しての電子顕微鏡分析
ヒト繊維芽細胞の若い細胞（ＰＤＬ ２０）と老化細胞（ＰＤＬ ６５）を１０００ｒｐｍで遠心分離して細胞を沈澱させて、３％グルタルアルデヒド／ＰＢＳ（ｐＨ ７．４）で固定させた後、０．２Ｍソジウムカコジレート緩衝溶液（ｐＨ ７．４）で洗浄した。次いで、細胞沈殿物をカコジレート緩衝溶液内の１％オスミウムテトロキシドで１時間処理した後、プロピレンオキシドを通した等級のエタノール処理により脱水させて、Ｅｍｂｅｄ８１２（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）内に細胞試料を埋めた。その後、埋められたマイクロトーム（ｍｉｃｒｏｔｏｍｂ；Ｌｅｉｃｈｅｒｔ−ＪＵＮＧ社）を利用して２００ｎｍに切断して、切断片をメチレンブルー及びアジュレＩＩ（ａｚｕｒｅＩＩ）を利用して染色させた後、光学顕微鏡で観察し、電子顕微鏡で観察する部位を選択した。その後、選択された部位を再びマイクロトームを利用して６０ｎｍの厚さで超薄切断して、ウラニルアセテート及びリードシトレートで染色した後、透過電子顕微鏡（Ｈ−６００， Ｈｉｔａｃｈｉ）で観察した。図１６から分かるように、老化細胞の場合カベオレ（ｃａｖｅｏｌａｅ）−類似構造の数が若い細胞より多い。
【０１０３】
実施例ＸＶ：カベオリン−１ ｃＤＮＡ運搬用プラスミドＤＮＡの製作
ヒト繊維芽細胞の老化細胞からＴＲＩｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社， ＃１５５９６−０２６）を利用して総ＲＮＡを分離し、これを鋳型にしてＲＴ−ＰＣＲを実施して、カベオリン−１のｃＤＮＡを得た。この際使用したプライマーは次のようである：前方向プライマー、 ５’−ａｔｃｃａａｇｃｔｔｃｃａｃｃａｔｇｔｃｔｇｇｇｇｇｃａａａｔａｃｇｔ−３’及び逆方向プライマー、 ５’−ｇｃａｇｇａｔｃｃｃｔａｔａｔｔｔｃｔｔｔｃｔｇｃａａｇｔｔｇａｔ−３’。逆転写酵素はＰｒｏｍｅｇａ社のＡＭＴ ＲＴａｓｅを使用し、ＴａｑポリマラーゼはＴａｋａｒａ社のＥｘ Ｔａｑを使用した。温度条件は次のようである：６０℃で３０秒（アニーリング）、７２℃で５０秒（伸長反応）及び９２℃で３０秒（変性）。次いで、カベオリン−１のｃＤＮＡを確認するために増幅されたｃＤＮＡを鎖終結方法（Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ７４：５４６３（１９７７））で配列付け（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）した。 カベオリン−１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列は添付の配列３のようである。増幅されたｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＨｉｎｄ ＩＩＩとＢａｍ ＨＩ制限位置を利用してサブクローニングした。最終的に製作されたベクターの遺伝子地図は図１７のようである。
【０１０４】
実施例ＸＶＩ：カベオリン−１ ｃＤＮＡによるヒト繊維芽細胞の形質転換
前記実施例ＸＶで製作されたベクターを利用してヒト繊維芽細胞の若い細胞（ＰＤＬ ２５）を次のように形質転換させた：細胞を皿に敷いて１８時間培養し７０−８０％の融合度（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）になるようにした。前記実施例ＸＶで製造したベクター２μｇとプラス試薬８μｌを混合した後、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）１２μｌとＤＭＥＭ ２３８μｌ混合液とよく混合した後、室温で１５分間放置した。次いで、再びＤＭＥＭ ２ｍｌを加えた後、最終混合物を若い繊維芽細胞に処理して３７℃で３時間培養した。３時間後、２０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ ２．５ｍｌを加えて、２４時間培養した。３０時間が経過した後、１００μｇ／ｍｌのＥＧＦで形質転換された細胞を刺激した。最終的に、前記実施例Ｖと同様にウェスタンブロッティングを実施してＥｒｋ−１／２の活性化を調査した。図１８で、Ａパネルの１番レーンはｐｃＤＮＡ ３のみで形質転換したものであり、２番レーンはカベオリン−１ ｃＤＮＡが挿入されたｐｃＤＮＡ ３で形質転換したものである。図１８から確認できるように、カベオリン−１ ｃＤＮＡが挿入されたｐｃＤＮＡ ３で形質転換された細胞はカベオリンが発現されていることが分かる。図１８でＢパネルの１〜３番レーンはｐｃＤＮＡ ３で形質転換された細胞にＥＧＦを各々０分、５分及び２０分間処理したものであり、４〜６番レーンはカベオリン−１ ｃＤＮＡが挿入されたｐｃＤＮＡ ３で形質転換された細胞にＥＧＦを各々０分、５分及び２０分間処理したものである。
【０１０５】
図１８から分かるように、カベオリン−１が過発現される細胞ではＥｒｋ−１／２キナーゼの細胞内発現は変化がないが、モック（ｍｏｃｋ）で形質転換された細胞に比べてそのリン酸化が大いに抑制されたことが分かる。
【０１０６】
従って、カベオリン−１のＤＮＡで細胞を形質転換させる場合には、ＥＧＦによるＥｒｋ−１／２キナーゼの活性化が遮断されて、外部刺激に対しての反応性が減少され細胞が老化状態に誘導されることが分かる。このような結果は、老化細胞でＥＧＦによるＥｒｋ−１／２キナーゼの活性化が低下されることはカベオリン−１タンパク質の発現増加によるものであることを示す。
【０１０７】
実施例ＸＶＩＩ：カベオリン−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染ＸＶＩＩ−１：カベオリン−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの合成
カベオリン−１タンパク質の発現を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造するために、アンチセンスオリゴヌクレオチドと相互作用するカベオリン−１ ｍＲＮＡの適合な部位を選択した。次いで、カベオリン−１ ｍＲＮＡの翻訳開始部位に結合して翻訳開始を妨害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成した。合成されたオリゴヌクレオチドはその５’−末端にフルオレセイン（Ｇｅｎｏｔｅｃｈ）が接合されていて、安定性を増加させるためにホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）で変形されたものである。例えば、合成されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは次のヌクレオチド配列を有する：５’−ｔｔｔｇｃｃｃｃｃａｇａ−３’。前記部位に結合するセンスオリゴヌクレオチドも合成した：　５’−ａｔｇｔｃｔｇｇｇｇｇｃ−３’。
【０１０８】
ＸＶＩＩ−２：カベオリン−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染
老化されたヒト繊維芽細胞（ＰＤＬ ６４）をＦＢＳのないＤＭＥＭを含む２４ウェル−プレートまたは皿に敷いて、細胞培養機（３７℃， ５％ ＣＯ２）で１２時間培養した。次いで、１００ ｕＭ合成アンチセンスオリゴヌクレオチド１〜５μｌ及びプラス試薬（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を５００μｌ ＤＭＥＭと混合して室温で１５分間反応させた後、結果混合物を１２μｌ　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）とＤＭＥＭの混合液５００μｌによく混合して、室温で１５分間定置させてリポソーム複合体を形成させた。その後、細胞をＤＭＥＭ（血清なし）で２回洗浄した後、前記リポソーム複合体１ｍｌを処理して、３７℃で３時間反応させた。形質感染された細胞に、１０％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ １〜５ｍｌを添加して、２４時間培養した後、培地を１０％ ＦＢＳを含有するＤＭＥＭに交替した。次いで、一定時間培養した後、免疫染色及びウェスタンブロッティングを次のように実施した。
【０１０９】
ＸＶＩＩ−３：免疫染色
アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞を４％パラホルムアルデヒド０．５ｍｌで２０分間室温で固定させた後、ＰＢＳ内０．５％トリトンＸ−１００ ０．５ｍｌで１０分間処理し透過化させて、２％ ＢＳＡ（ｉｎ ＰＢＳ）でブロッキングした。次いで、細胞に抗−カベオリン−１抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を４℃で一晩中処理した後、ロダミン−接合２次抗体（Ｓａｎｔａ Ｇｒｕｚ）で室温で１時間処理した。核を可視化するために、ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）を添加した。観察は共焦点顕微鏡（Ｂｉｏｒａｄ， ＃ＭＲＣ１０２４）を利用して実施した。図１９から分かるように、細胞内でのカベオリン−１の発現はアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞で処理時間が経過するにつれて大いに減少したが、センスオリゴヌクレオチドで処理された細胞では変化がなかった。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞は変形された細胞形態を示した：拡大されて広がる形状から小さなスピンドル形状に。反対に、センスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞は前記した細胞形態変化を示さなかった。
【０１１０】
ＸＶＩＩ−４：ウェスタンブロッティング
オリゴヌクレオチドを処理した細胞に対して実施例ＸＩＩと同様にウェスタンブロッティングを実施した。アンチセンスオリゴヌクレオチドが処理された細胞はカベオリン−１に該当する弱いバンドを示し、これはアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された細胞でカベオリン−１の発現が減少されることを示すものである。
【０１１１】
前記の免疫染色及びウェスタンブロッティングの結果から、カベオリン−１が細胞老化に直接的な関連があり、カベオリン−１の発現を減少させる場合には細胞老化を防止することができるだけではなく老化細胞を若い細胞に転換させることもできるということが分かる。
【０１１２】
実施例ＸＶＩＩＩ：カベオリン−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染によるＥｒｋ−１／２活性の分析
前記実施例ＸＶＩＩと同様にアンチセンスオリゴヌクレオチドを老化繊維芽細胞及び若い繊維芽細胞に処理した。ＥＧＦ刺激及びウェスタンブロッティングを実施例ＸＩと同様に実施した。図２０は本実施例の結果を示す。図２０から分かるように、若い細胞でＥｒｋ−１／２キナーゼは強くリン酸化（活性化）された。しかし、非処理された老化細胞及びセンスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞は若い細胞に比べてさらに高い基本的Ｅｒｋ−１／２活性を示し、ＥＧＦで刺激した場合、Ｅｒｋ−１／２活性は変化がなかった。アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞で、ＥＧＦによるＥｒｋ−１／２活性化は若い細胞と同様に大いに増加した。
【０１１３】
前記実験結果から老化細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを処理してカベオリン−１の発現を抑制するとＥｒｋにより仲裁される信号伝達を若い細胞と類似に正常的に回復させることができるということが分かる。
【０１１４】
実施例ＸＩＸ：カベオリン−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染によるｐ−Ｅｒｋ−１／２の核への転位観察
前記実施例ＸＶＩＩＩで活性化されたＥｒｋ−１／２が核内に転位されて他の遺伝子の発現を調節するのかどうかを確認するために、次のように免疫染色を実施した：実施例ＸＩＩＩと同様にアンチセンスオリゴヌクレオチドで若い繊維芽細胞及び老化繊維芽細胞を処理した。処理された細胞を抗−ｐ−Ｅｒｋ（リン酸化されたＥｒｋ）抗体（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ）で４℃で一晩中処理した後、ＦＩＴＣ−接合２次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）で室温で１時間処理した。核を可視化するために、ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅ）を添加した。ｐ−Ｅｒｋ−１／２局部化像は共焦点顕微鏡（Ｂｉｏｒａｄ， ＃ＭＲＣ１０２４）を利用して可視化し、これは図２１及び図２２に示した。図２１及び図２２で、矢印はｐ−Ｅｒｋ−１／２キナーゼが核へ転位されたことを示す。
【０１１５】
図２１から分かるように、若い細胞で、ｐ−Ｅｒｋ−１／２は処理後５分辺りに細胞質で強く観察されて、核内に転位されたｐ−Ｅｒｋ−１／２は処理後３０分辺りに観察されて、処理後６０分辺りにｐ−Ｅｒｋ−１／２はただ細胞質でのみ弱く観察された。 前記実験結果から、処理後５分内にＥｒｋ−１／２が活性化（リン酸化）されて、３０分辺りにｐ−Ｅｒｋ−１／２は核内に転位され幾遺伝子の転写を調節し、６０分辺りに非活性化されることが分かる。若い細胞とは違って、老化細胞ではＥＧＦ処理とは無関係にｐ−Ｅｒｋ−１／２が細胞質で強く観察されて、これはウェスタンブロッティング分析で確認された。老化細胞では核内に転位されたｐ−Ｅｒｋ−１／２が観察されなかった。
【０１１６】
また、図２２から分かるように、センスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞は核内でｐ−Ｅｒｋ−１／２が観察されなかったが、アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された老化細胞では観察された。
【０１１７】
前記実験結果は、Ｅｒｋ−仲介シグナル伝達の回復がアンチセンスオリゴヌクレオチドによるカベオリン−１の発現抑制により達成できることを示す。また、前記実験結果は、老化細胞で一般的に抑制されている核内への転位を回復するにカベオリン−１が関与できることを示す。
【０１１８】
実施例ＸＸ：カベオリン−１遺伝子のＣｐＧアイランドのメチル化
老化が進行されるにつれて、ｐ１６／Ｉｎｋ４ａのプロモーターに位置したＣｐＧアイランドのメチル化が減少され、これはｐ１６／Ｉｎｋ４ａの発現を増加させるということは公知されている（Ｊａｒｒａｒｄ ＤＦ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １５；５９（１２）：２９５７−２９６４（１９９９））。また、癌細胞でカベオリン−１も類似なメチル化傾向を有するということも解明されている（Ｃｕｉ Ｊ．， Ｐｒｏｓｔａｔｅ， １５；４６（３）：２４９−２５６（２００１））。従って、本発明者らはカベオリン−１の減少された発現が前記のメチル化によるものであるかを分析した。
【０１１９】
若いヒト繊維芽細胞（ＰＤＬ ２０）にＤＭＳＯ内１ｕＭ脱メチル化剤５−アザ（ａｚａ）−デオキシシチジン（Ｓｉｇｍａ）を処理して、一定時間毎に培地を交替しながら同時に脱メチル化剤を添加して２〜３週間処理した。細胞老化の誘導は実施例ＩＩＩのようにＳＡ β−ｇａｌ染色で確認した。関連タンパク質の発現を調べるために、処理された細胞を日付別に収穫して前記実施例と同様にウェスタンブロッティングを実施した。ウェスタンブロッティングで、抗−ｐ５３抗体、抗−ｐ１６抗体、抗−カベオリン−１抗体及び抗−アクチン抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手したものである。
【０１２０】
ＳＡ β−ｇａｌ染色の結果を示した図２３（ａ）から確認できるように、約２週間処理された若い細胞は老化細胞−類似形質を示した。ウェスタンブロッティングの結果を示した図２３（ｂ）から確認できるように、脱メチル化によりｐ１６及びカベオリン−１の発現は増加してｐ５３の発現は変化がなかった。ｐ１６の増加は細胞老化の初期段階で検出された反面、カベオリン−１の増加はｐ１６より早い段階で検出された。前記実験結果は、老化細胞でのカベオリン−１の増加は細胞老化またはｐ１６の増加により直接的に招来されるものではなくカベオリン−１遺伝子のプロモーター内ＣｐＧアイランドの脱メチル化により直接的に招来されるということを示す。
【０１２１】
結論的に、細胞老化はカベオリン−１遺伝子、特にＣｐＧアイランドのメチル化により調節できることが分かる。
【０１２２】
以上、本発明の望ましい具現例を記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とその等価物により定義されると言える。
【０１２３】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】老化細胞での低下されたエンドサイトシスを示す共焦点顕微鏡写真である。
【図２】若い細胞及び老化細胞での時間によるトランスフェリンの細胞内運搬を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図３】若い細胞及び老化細胞でのトランスフェリンに対してのパルス−チェーシング結果を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図４】Ｈ２Ｏ２またはヒドロキシウレアにより人為的に老化が誘導された細胞でのトランスフェリンの細胞内運搬程度を確認した共焦点顕微鏡写真である。
【図５】細胞老化に関連されたタンパク質の分析のためのウェスタンブロッティング結果を示す写真である。
【図６】Ｈ２Ｏ２またはヒドロキシウレアにより人為的に老化が誘導された細胞で細胞老化に関連されたタンパク質の分析のためのウェスタンブロッティング結果を示す写真である。
【図７】細胞老化に関連されたタンパク質をコードするｍＲＮＡを分析するためのノーザンブロッティング結果を示す写真である。
【図８】実施例ＶＩＩで利用されたヒトアンフィファイシン−１をコードするｃＤＮＡを含むベクターの遺伝子地図である。
【図９】実施例ＶＩＩで製作されたヒトアンフィファイシン−１をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターの遺伝子地図である。
【図１０】微細注入された細胞でアンフィファイシン−１の発現を分析するための蛍光顕微鏡で観察された像を示す写真である。
【図１１】ドミナントネガティブアンフィファイシン−１遺伝子を含む発現ベクターの遺伝子地図である。
【図１２】ドミナントネガティブアンフィファイシン−１遺伝子で処理された若い細胞の低下されたエンドサイトシス機能を確認する共焦点顕微鏡写真である。
【図１３】（ａ）若い細胞及び中間細胞でＥｒｋ−１／２キナーゼの活性（リン酸化）を分析するためのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
（ｂ）老化細胞でＥｒｋ−１／２キナーゼの活性（リン酸化）を分析するためのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１４】若い細胞、中間細胞及び老化細胞でカベオリンのサブタイプ、即ち、カベオリン−１、カベオリン−２及びカベオリン−３の発現を分析するためのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１５】若い細胞及び老化細胞で表皮成長因子収容体（ＥＧＦＲ）及びカベオリン−１の相互作用を確認するための免疫沈澱の結果を示す写真である。
【図１６】若い細胞及び老化細胞でカベオレ構造を示す電子顕微鏡写真である。
【図１７】実施例ＸＶで製作されたカベオリン−１ ｃＤＮＡが挿入された発現ベクターの遺伝子地図である。
【図１８】カベオリン−１ ｃＤＮＡで形質転換された若い細胞に対してのウェスタンブロッティングの結果を示す写真である。
【図１９】カベオリン−１発現がアンチセンスオリゴヌクレオチドにより大いに減少されるということを証明する共焦点顕微鏡写真である。
【図２０】図２０はカベオリン−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染によるＥｒｋ−１／２の活性を分析するためのウェスタンブロッティング結果を示す写真である。
【図２１】若い細胞及び老化細胞で表皮成長因子（ＥＧＦ）刺激によるＥｒｋ−１／２の活性化及び局部化を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図２２】カベオリン−１の下向調節、即ち、カベオリン−１に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの形質感染後、若い細胞及び老化細胞でＥＧＦ刺激によるＥｒｋ−１／２の活性化及び局部化を示す共焦点顕微鏡写真である。
【図２３】（ａ）脱メチル化剤、５−アザ−デオキシシチジンで処理された若い細胞に対しての老化−関連β−ガラクトシダーゼ活性染色の結果を示す写真である。
（ｂ）脱メチル化剤、５−アザ−デオキシシチジンで処理された若い細胞に対してのウェスタンブロッティング結果を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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