(57)【要約】本発明は、薬の薬物動態学及び代謝に関して他の動物の薬物動態学及び代謝とより一層似るように動物の生理を改変するため、特定の遺伝子又は遺伝子の部分が別の動物由来の相同染色体で置換されたマウスなどの非ヒトトランスジェニック動物を生産すること、育種すること、そして使用することに関する。具体的には、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物であって、該他の動物で本来発現される、該薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドを発現するトランスジェニック動物が提供される。本発明は薬理学的研究及び／又は毒性学的研究における本発明の遺伝的に改変された非ヒト動物の使用にも及ぶ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物であって、該他の動物で本来発現される、該薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドを発現するトランスジェニック動物。
【請求項２】
該外来性ポリペプチドが、該他の動物により発現されるポリペプチド又はその等価物の薬の挙動及び／又は代謝と関連する少なくとも一部に相当するものである、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項３】
該外来性ポリペプチドが、薬と結合するポリペプチド、薬を代謝するポリペプチド、又は薬と結合し且つ薬を代謝するポリペプチドから選択されるものである、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項４】
該外来性ポリペプチドが、血清アルブミン、α−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、チトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）、ウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰｓ）を含む多剤耐性（ＭＤＲ）タンパク質、アセチル−トランスフェラーゼ、プレニルタンパク質トランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、アセチラーゼ、グルクロニダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、又は酸化反応、抱合反応（conjugation reaction) 、加水分解反応、還元的代謝又は生体異物を含む他の異化的若しくは同化的反応から選択される反応を促進する又は触媒するポリペプチドから選択されるものである、請求項３記載のトランスジェニック動物。
【請求項５】
該外来性ポリペプチドが、血清アルブミン、α−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、チトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）、ウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）又は多剤耐性タンパク質から選択されるものである、請求項３記載のトランスジェニック動物。
【請求項６】
該外来性ポリペプチドがヒト血清アルブミンである、請求項３記載のトランスジェニック動物。
【請求項７】
該外来性ポリペプチドがＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３から選択されるヒトα−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）である、請求項３記載のトランスジェニック動物。
【請求項８】
該外来性ポリペプチドがＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３又はＣＹＰ４ファミリーから選択されるヒトチトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）である、請求項３記載のトランスジェニック動物。
【請求項９】
該外来性ポリペプチドがＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ４Ａ９又はＣＹＰ４Ａ１１から選択されるヒトチトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）である、請求項３記載のトランスジェニック動物。
【請求項１０】
該外来性ポリペプチドがヒトウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である、請求項３記載のトランスジェニック動物。
【請求項１１】
該外来性ポリペプチドがヒトＭＤＲ１（Ｐ−糖タンパク質）又はＭＲＰ１である、請求項３記載のトランスジェニック動物。
【請求項１２】
該外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをさらに発現する、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項１３】
該相同体がオルソログ（orthologue) である、請求項１２記載のトランスジェニック動物。
【請求項１４】
該相同体がパラログ（paralogue)である、請求項１２記載のトランスジェニック動物。
【請求項１５】
該トランスジェニック動物が機能を有する内因性ポリペプチド又は該内因性ポリペプチドの検出可能なレベルを生産する能力を失っているものである、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
該外来性ポリペプチドが該内因性ポリペプチドの機能を有する相同体である、請求項１５記載のトランスジェニック動物。
【請求項１７】
該相同体がオルソログである、請求項１６記載のトランスジェニック動物。
【請求項１８】
該相同体がパラログである、請求項１６記載のトランスジェニック動物。
【請求項１９】
そのゲノムへの改変を含む、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項２０】
該改変が、外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子をこの外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子で置き換えることを含むものである、請求項１９記載のトランスジェニック動物。
【請求項２１】
該改変が、上記外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の破壊と上記外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子の該ゲノム中への挿入を含むものである、請求項１９記載のトランスジェニック動物。
【請求項２２】
該改変が上記外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の破壊であり、この破壊が結果として内因性ポリペプチドの発現レベルを低減させるものである、請求項１９記載のトランスジェニック動物。
【請求項２３】
該改変が上記外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の破壊であり、この破壊が結果としてこの内因性ポリペプチドの発現レベルをゼロにするものである、請求項１９記載のトランスジェニック動物。
【請求項２４】
該改変が上記外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の破壊を含む、請求項１９記載のトランスジェニック動物であって、機能を有する内因性ポリペプチドを生産する能力を失っている動物。
【請求項２５】
該改変が上記外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の破壊であり、この破壊がその内因性遺伝子の欠失を含むものである、請求項１９記載のトランスジェニック動物。
【請求項２６】
該改変が上記外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の破壊であり、この破壊がその内因性ポリペプチドの領域若しくはドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失を含むものである、請求項１９記載のトランスジェニック動物。
【請求項２７】
該改変が上記外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の破壊であり、この破壊がその内因性遺伝子の発現を少なくとも部分的に制御する調節ポリヌクレオチドの欠失を含むものである、請求項１９記載のトランスジェニック動物。
【請求項２８】
該改変が上記外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の破壊であり、この破壊がその内因性ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム全体の欠失を含むものである、請求項１９記載のトランスジェニック動物。
【請求項２９】
そのゲノムが、調節ポリヌクレオチドに機能しうるように連結されている上記外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むものである、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項３０】
該調節ポリヌクレオチドが該トランスジェニック動物又は該他の動物に本来存在するポリヌクレオチドである、請求項２９記載のトランスジェニック動物。
【請求項３１】
該調節ポリヌクレオチドが該トランスジェニック動物又はその先祖の内因性ポリヌクレオチドである、請求項２９記載のトランスジェニック動物。
【請求項３２】
該調節ポリヌクレオチドが上記他の動物の内因性ポリヌクレオチドである、請求項２９記載のトランスジェニック動物。
【請求項３３】
該調節ポリヌクレオチドが上記内因性遺伝子のコード配列の上流に本来位置するヌクレオチド配列を含むものである、請求項２９記載のトランスジェニック動物。
【請求項３４】
該調節ポリヌクレオチドが上記外来性ポリペプチドをコードする遺伝子のコード配列の上流に本来位置するヌクレオチド配列を含むものである、請求項２９記載のトランスジェニック動物。
【請求項３５】
該調節ポリヌクレオチドが、該トランスジェニック動物、該トランスジェニック動物の先祖又は該他の動物から選択される動物以外の動物又は起源に由来するものである、請求項２９記載のトランスジェニック動物。
【請求項３６】
該調節ポリヌクレオチドが誘導プロモーターを含むものである、請求項２９記載のトランスジェニック動物。
【請求項３７】
該改変が、核酸構築物が該動物のゲノムに安定に組み込まれるように、該導入遺伝子を含む、胚性幹細胞中の該構築物と一緒に、相同組換え、無差別組み込み又はリコンビナーゼ系（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ又はＦＬＰ−ＦＲＴ系）の使用によりトランスジェニック動物のゲノム中に導入されたものである、請求項１９記載のトランスジェニック動物。
【請求項３８】
該導入遺伝子についてヘテロ接合体である、請求項１９記載のトランスジェニック動物。
【請求項３９】
該導入遺伝子についてホモ接合体である、請求項１９記載のトランスジェニック動物。
【請求項４０】
該トランスジェニック動物が哺乳動物である、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項４１】
該トランスジェニック動物がネズミ目の動物から選択されるものである、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項４２】
該トランスジェニック動物がマウスである、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項４３】
該他の動物が霊長類から選択されるものである、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項４４】
該他の動物がヒトである、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項４５】
該トランスジェニック動物がマウスであり、且つ該他の動物がヒトである、請求項１記載のトランスジェニック動物。
【請求項４６】
別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する一つ以上の外来性ポリペプチドを発現するものであり、その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが該他の動物で本来発現されるものであるトランスジェニック動物。
【請求項４７】
別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する一つ以上の外来性ポリペプチドを発現するものであり、その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが該他の動物で本来発現されるものであり且つ血清アルブミン、α酸性糖タンパク質、チトクロームＰ４５０、ウリジン・ジホスホ−グルクロノシルトランスフェラーゼ及び多剤耐性タンパク質からなる群より選択されるものであるトランスジェニック動物。
【請求項４８】
別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する一つ以上の外来性ポリペプチドを発現するものであり、その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが該他の動物で本来発現されるものであり且つ血清アルブミン、α酸性糖タンパク質、亜ファミリー３Ａから選択されるチトクロームＰ４５０、亜ファミリー１Ａから選択されるウリジン・ジホスホ−グルクロノシルトランスフェラーゼ及びＰ糖タンパク質からなる群より選択されるものであるトランスジェニック動物。
【請求項４９】
別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する一つ以上の外来性ポリペプチドを発現するものであり、その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが該他の動物で本来発現されるものであり、該外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子が相同組換えを経て又は胚性幹細胞におけるリコンビナーゼ系の使用により該非ヒト動物又は該非ヒト動物の先祖に導入されるものであるトランスジェニック動物。
【請求項５０】
別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する一つ以上の外来性ポリペプチドを発現するものであり、その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが該他の動物で本来発現されるものであり、該外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子が胚又は胚性幹細胞内での無差別組み込みを経て該非ヒト動物又は該非ヒト動物の先祖に導入されるものであるトランスジェニック動物。
【請求項５１】
別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を生産するのに使用するための核酸構築物であって、該構築物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むものであり、該外来性ポリペプチドが該他の動物で本来発現されるものである核酸構築物。
【請求項５２】
該標的に向かう構築物が該導入遺伝子を挟む二つの領域を含むものであり、該領域が該非ヒト動物のゲノムの部分との相同組換えを受けるのに十分な程該部分と相同であるものである、請求項５１記載の構築物。
【請求項５３】
該部分が、該外来性ポリペプチドの相同体である非ヒト動物のポリペプチドをコードする内因性遺伝子に隣接する配列又はそれに含まれる配列を含むものである、請求項５２記載の構築物。
【請求項５４】
上記外来性ポリペプチドをコードする該配列に機能しうるように連結された調節ポリヌクレオチドを含む、請求項５１記載の構築物。
【請求項５５】
選択可能マーカー遺伝子を含む、請求項５１記載の構築物。
【請求項５６】
別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成するための核酸構築物の使用であって、該構築物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むものであり、上記外来性ポリペプチドが該他の動物で本来発現されるものである使用。
【請求項５７】
別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物で本来発現される外来性ポリペプチドをコードする配列を含む導入遺伝子を提供する工程、及び
−  この導入遺伝子を非ヒト動物のゲノムに導入する工程、
を含む方法。
【請求項５８】
該導入遺伝子が標的に向かう構築物の形で導入されるものである、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
ゲノムへの該導入遺伝子の導入が内因性遺伝子の機能的破壊を含むものである、請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
該機能的破壊が該外来性ポリペプチドの相同体であるポリペプチドをコードする内因性遺伝子の構造を破壊することにより達成されるものである、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
ゲノムへの導入遺伝子の導入が該外来性ポリペプチドの相同体であるポリペプチドをコードする内因性遺伝子の部位以外の部位への導入遺伝子の挿入を生ずるものである、請求項５７記載の方法。
【請求項６２】
ゲノムへの導入遺伝子の導入が、該外来性ポリペプチドの相同体であるポリペプチドをコードする内因性遺伝子又は該内因性遺伝子をコードする部分の、該導入遺伝子での置換を生ずるものである、請求項５７又は請求項５９記載の方法。
【請求項６３】
ゲノムへの導入遺伝子の導入が、該外来性ポリペプチドの相同体であるポリペプチドをコードする内因性遺伝子の機能を破壊するものである、請求項５７記載の方法。
【請求項６４】
ゲノムへの導入遺伝子の導入が、該ゲノムへの選択可能マーカーの挿入を生ずるものである、請求項５７記載の方法。
【請求項６５】
別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物で本来発現される外来性ポリペプチドをコードする導入遺伝子、及び該非ヒト動物のゲノムの部分との相同組換えを受けるのに十分な程該部分と相同であり且つ該導入遺伝子の両側に隣接する領域、を含む標的に向かう構築物を提供する工程、及び
−  該導入遺伝子が該部分の間に介在するゲノムの領域中に相同組換えを起こすのに十分な条件の下で非ヒト細胞のゲノム中に標的に向かう構築物を導入する工程、
を含む方法。
【請求項６６】
別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物で本来発現される外来性ポリペプチドをコードする核酸配列を含む導入遺伝子を含む核酸構築物を提供する工程、及び
−該導入遺伝子がゲノム中に無差別に組み込まれるような条件の下で非ヒト細胞のゲノム中に該構築物を導入する工程、
を含む方法。
【請求項６７】
別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物で本来発現される外来性ポリペプチドをコードする導入遺伝子、及び該非ヒト動物のゲノムの部分との相同組換えを受けるのに十分な程該部分と相同であり且つ該導入遺伝子の両側に隣接する領域を含む標的に向かう構築物であり、該部分が該外来性ポリペプチドの相同体である非ヒト動物のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の両側に隣接するか又は内因性遺伝子の中に含まれるものである構築物を提供する工程、及び
−  該導入遺伝子が該細胞のゲノム中の内因性遺伝子の少なくとも一つと相同組換えをするのに十分な条件の下で非ヒト細胞のゲノム中に標的に向かう構築物を導入し、それにより導入遺伝子で置換された又は破壊された内因性遺伝子の対立遺伝子を少なくとも一つ含む細胞を作成する工程、
を含む方法。
【請求項６８】
別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物で本来発現される外来性ポリペプチドをコードし且つ非ヒト細胞のゲノムの部分で挟まれている配列を含む導入遺伝子を含む第一の標的に向かう構築物を提供する工程、及び
−  ｉ）該外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の少なくとも一部、及び ii)この内因性遺伝子を破壊できるポリヌクレオチド、を含む第二の標的に向かう構築物を提供する工程、
−  該第一の標的に向かう構築物が該部分に相当する該細胞のゲノムの領域と相同組換えをするような条件の下で該非ヒト細胞中に該導入遺伝子を導入する工程、及び
−  該第二の標的に向かう構築物が該細胞のゲノムの内因性遺伝子の少なくとも一つと相同組換えをするのに十分な条件の下で該細胞中に該ポリヌクレオチドを導入し、それにより該内因性遺伝子の少なくとも一つが破壊された対立遺伝子を含む細胞を作成する工程、
を含む方法。
【請求項６９】
別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物で本来発現される外来性ポリペプチドをコードする配列を含む導入遺伝子を含む核酸構築物を提供する工程、
−  ｉ）該外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の少なくとも一部、及び ii)内因性遺伝子を破壊できるポリヌクレオチド、を含む標的に向かう構築物を提供する工程、
−  該核酸構築物が該細胞のゲノムの領域に無差別に組み込まれるのに十分な条件の下で、該導入遺伝子を該細胞中に導入する工程、及び
−  該標的に向かう構築物が該細胞のゲノムの内因性遺伝子の少なくとも一つと相同組換えをするのに十分な条件の下で、該ポリヌクレオチドを該細胞中に導入し、それにより該内因性遺伝子の少なくとも一つが破壊された対立遺伝子を含む細胞を作成する工程、
を含む方法。
【請求項７０】
該細胞が胚性幹細胞である、請求項６５〜請求項６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
該細胞がネズミ目内の哺乳動物由来の胚性幹細胞である、請求項６５〜請求項６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
該細胞がマウスの胚性幹細胞である、請求項６５〜請求項６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
非ヒト動物の胚盤胞又は他の初期発生段階に少なくとも一つの導入遺伝子を含む胚性幹細胞を注入する工程をさらに含む、請求項６５〜請求項６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
擬似妊娠の非ヒト動物に注入された胚盤胞を導入する工程及び該擬似妊娠動物に少なくとも一つの相同組換えされた導入遺伝子を含む子孫を分娩させる工程をさらに含む、請求項６５〜請求項６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
少なくとも一つの相同組換えされた導入遺伝子を含む子孫が、検出可能なレベルで上記外来性ポリペプチドを発現することによりさらに特徴付けられるものである、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
少なくとも一つの相同組換えされた導入遺伝子を含む子孫が、上記内因性ポリペプチドの発現レベルの低下又は検出不可によりさらに特徴付けられるものである、請求項７４記載の方法。
【請求項７７】
該子孫が機能的な内因性ポリペプチドを生産する能力を欠失しているものである、請求項７４記載の方法。
【請求項７８】
該子孫が、上記導入遺伝子についてホモ接合である動物を生産するように同系交配されるものである、請求項７４記載の方法。
【請求項７９】
異なる外来性ポリペプチドをコードする異なる導入遺伝子を含むトランスジェニック動物が二以上の異なる導入遺伝子を含む動物を生産するように同系交配されるものである、請求項７４記載の方法。
【請求項８０】
目的の動物における薬の代謝及び／又は挙動を評価する方法であって、薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該目的の動物で本来発現される外来性ポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物に試験物質を投与する工程、及び薬の代謝及び／又は挙動を決定するため分析試験を行なう工程を含む方法。
【請求項８１】
該分析試験がそれが投与されたトランスジェニック動物における薬の濃度及び／又は分布を直接的又は間接的に評価する工程を含むものである、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
該分析試験がそれが投与されたトランスジェニック動物における薬の効力を直接的又は間接的に評価する工程を含む、請求項８０記載の方法。
【請求項８３】
該分析試験がそれが投与されたトランスジェニック動物における薬の毒性を直接的又は間接的に評価する工程を含む、請求項８０記載の方法。
【請求項８４】
該分析試験がそれが投与されたトランスジェニック動物における薬の半減期を直接的又は間接的に評価する工程を含む、請求項８０記載の方法。
【請求項８５】
該分析試験がそれが投与されたトランスジェニック動物における薬の薬力学を直接的又は間接的に評価する工程を含む、請求項８０記載の方法。
【請求項８６】
該分析試験がそれが投与されたトランスジェニック動物における薬の薬物動態学を直接的又は間接的に評価する工程を含む、請求項８０記載の方法。
【請求項８７】
別の動物における薬の代謝及び／又は挙動の研究における非ヒトトランスジェニック動物の使用であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドを発現するものであり、該外来性ポリペプチドが該他の動物で本来発現されるものである、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的にトランスジェニック動物を作成するためにその中に外来性核酸が導入された非ヒト動物に関する。より具体的には、本発明はマウスなどの非ヒトトランスジェニック動物の生産、育種及び使用に関する。このトランスジェニック動物では、特定の遺伝子又は遺伝子の部分が別の動物由来の相同染色体で置換され、薬物の薬物動態学や薬物の代謝に関して該動物の生理学をこの他の動物の生理学に似るように改変されている。本発明は薬力学的及び／又は毒物学的な研究のために本発明の遺伝的に改変された非ヒト動物の利用にも拡大される。
【背景技術】
【０００２】
新薬を市場に出すまでの費用は極端に高い。通常、製薬会社は、市販するための１個の薬を選択するために、数百から数十万の化合物をスクリーニングする。最初のスクリーニングは最も有望な化合物についてイン・ビトロで行い、動物研究に進む。さらなる開発や臨床試験のために最良の薬（単数又は複数）が選択されるのは、これらの動物研究に基づく。薬品開発に伴う費用のかなりの量はこの動物研究の後に生ずるから、薬物のヒトにおける挙動を予測する際の動物モデルの精度が重要であることは明らかである。
【０００３】
薬の発見及び開発の過程で、動物モデルは薬の候補の特性決定をするという繰り返し行なわれるプロセスにおいて使用される。初期の動物研究は薬物動態学（薬の吸収、体内分布及び体内からのその最終的排出の力学）を決定する。それに続く動物研究は薬力学（薬の作用機作、及び薬の濃度と薬の効果の間の関係）を測定する。通常、これらの研究は効力（例えば、その化合物が腫瘍の増殖を阻止するか、又はこの化合物が神経学的障害を回復するのに有効であるか）、短期毒性、最適投与方法及び投与計画、などをも調べる。これらの動物研究に基づいて、最も有望な化合物（単数又は複数）がさらに開発される。この段階は、継続動物研究（例えば、より長期の毒性研究、徹底的な代謝研究、複数投与の薬物動態学的研究、薬の組み合わせ研究をしばしば含む拡大された効力研究）、化学的開発（例えば、生産）及び薬剤開発（例えば、薬の製剤及び送達）を含む。これらの段階の全てを首尾よく完了した化合物は次にヒト患者でテストされる（フェーズＩ〜III 臨床試験) 。フェーズＩ試験の成功は良好な許容性、適当な薬物動態そして場合によってはヒトにおける意図された薬力学的性質を証明することになろう。このような薬は最適な投与計画並びに病気の治療における効力を試験するためフェーズII及びフェーズIII 臨床試験に進むことになろう。
【０００４】
１個の薬の開発はしばしばマウス又は他の動物種における多数の異なる化合物の試験を必要とする。これらの動物研究はさらなる開発及びさらなる臨床試験のための化合物の選択を決定する。臨床試験段階での薬の脱落の主な理由は、不適当な薬物動態学的及び毒性学的効果（両者ともしばしば薬の代謝に関係する）であり、そしてより程度は小さいが、誤ったコンセプトによる効果の欠如又は薬力学的効果の欠如である。臨床試験へ化合物が進んだ後この後期の段階で不合格となるのは、通常、現存する動物モデルの予想可能性が貧弱だからである。
【０００５】
ヒトにおける薬の挙動を正確に反映しなかった動物モデルからのデータに基づいてなされた不正確な決定は貴重な資源、数百万ドルそして何年もの労働を浪費し得る。さらに、他の候補化合物を追求しないことによって失われる機会は、収益損失として潜在的に数十億ドルに達するであろう。例えば、現在のマウスモデルはしばしば（そして予測不可能なしかたで）ヒトにおける薬物動態学、代謝及び毒性学を正確に反映しない。多数の薬がマウスで有望な結果を示すが、ヒトでは効果的に働くことに失敗する。同様に、マウスで失敗し従って拒絶された他の薬がヒトで良く機能することがある。こうして、さらなる開発及び臨床試験のために薬の候補を選択するというプロセスは現在欠陥のある動物モデルから得られたデータに基づいている。この結果は、ａ）ヒトで働かない薬を追求して貴重な資源を浪費すること、ｂ）ヒトで働くであろうくろたを追求しないことにより機会損失、そしてｃ）フェーズＩ臨床試験で未知の危険に患者を曝すことを含むことになる。
【０００６】
目的の動物（例えば、ヒトや家畜動物、愛玩動物を含む他の哺乳動物）における薬の挙動（例えば、分布、代謝、効力及び毒性）をより正確に予測する改良された動物モデルは、薬品産業及び／又は畜産業にそしてこれらの動物に悪影響を与える疾病の治療に共に極めて大きな利益を与えるであろう。
【特許文献１】
記載なし。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は改良された動物モデルを開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
従って、本発明の一つの側面では、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドを発現するものであり、該外来性ポリペプチドが該他の動物で生来発現されるものであるトランスジェニック動物が提供される。この外来性ポリペプチドは薬と結合するポリペプチド、薬を代謝するポリペプチド又は薬と結合し且つ薬を代謝するポリペプチドから選択されることが好ましい。
【０００９】
トランスジェニック動物は該外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをさらに発現してもよい。しかしながら、このトランスジェニック動物は機能を有する内因性ポリペプチド又は検出可能なレベルの該内因性ポリペプチドを生産する能力を欠如していることが好ましい。この外来性ポリペプチドは好ましくは該内因性ポリペプチドの機能を有する相同体である。このタイプの実施態様では、外来性ポリペプチドは該内因性ポリペプチドのオルソログ（orthologue) である。このタイプの別の実施態様では、外来性ポリペプチドは該内因性ポリペプチドのパラログ（paralogue)である。
【００１０】
トランスジェニック動物はそのゲノムの改変を含んでもよい。その改変は外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子（transgene)による内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の置換を含んでいる。または、その改変は該内因性遺伝子の破壊を含むことがある。該破壊は内因性ポリペプチドの発現レベルを結果として低減させるものであることが好ましい。好ましい実施態様では、該破壊は内因性ポリペプチドの発現レベルの排除を結果として生ずる。別の好ましい実施態様では、該動物は機能的な内因性ポリペプチドを生産する能力を欠いている。別の実施態様では、該破壊は内因性遺伝子の欠失を含む。該欠失は内因性ポリペプチドの領域若しくはドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失を含むことが好ましい。または、該欠失は内因性遺伝子の発現を少なくとも部分的に制御する調節ポリヌクレオチドの欠失を含む。好ましい実施態様では、該欠失は該内因性ポリペプチドをコードする全オープンリーディングフレームの欠失を含む。
【００１１】
外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は調節ポリヌクレオチドに機能しうにように連結していることが好ましい。この調節ポリヌクレオチドは１〜１０ｋｂのヌクレオチド配列を含んでもよい。該調節ポリヌクレオチドは該トランスジェニック動物又は該他の動物に天然で存在するポリヌクレオチドであることが好ましい。一つの実施態様では、調節ポリヌクレオチドはトランスジェニック動物又はその先祖の内因性ポリヌクレオチドである。別の実施態様では、調節ポリヌクレオチドは他の動物の内因性ポリヌクレオチドである。好ましい実施態様では、調節ポリヌクレオチドは該内因性遺伝子のコード配列の上流に天然で位置するヌクレオチド配列を含む。別の好ましい実施態様では、調節ポリヌクレオチドは外来性ポリペプチドをコードする遺伝子のコード配列の上流に天然で位置するヌクレオチド配列を含む。代わりの実施態様では、調節ポリヌクレオチドは該トランスジェニック動物、該トランスジェニック動物の先祖、又は該他の動物から選択された動物以外の動物又は資源に由来する。別の実施態様では、調節ポリヌクレオチドは誘導プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）を含む。
【００１２】
該改変は、構築物が該動物のゲノム中に安定に組み込まれるように胚性幹細胞中で、導入遺伝子を含む核酸構築物との相同組換え、無作為組み込み又はリコンビナーゼ系（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ又はＦＬＰ−ＦＲＴ系）の使用によりトランスジェニック動物のゲノム中に導入されたものであることが好ましい。
【００１３】
トランスジェニック動物は、該導入遺伝子に関してヘテロ接合体であってもよいが、ホモ接合体であることが好ましい。
【００１４】
一つの実施態様では、トランスジェニック動物は哺乳動物である。好ましい実施態様では、このトランスジェニック動物はネズミ目から選択される。特に好ましい実施態様では、このトランスジェニック動物はマウスである。
【００１５】
好ましい実施態様では、該他の動物は霊長類から選択される。特に好ましい実施態様では、この他の動物はヒトである。
【００１６】
該外来性ポリペプチドは該他の動物又はその等価物により発現される、薬の挙動及び／又は代謝と関連するポリペプチドの少なくとも一部に対応しうる。この外来性ポリペプチドは、血清アルブミン、α−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、チトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）、ウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰｓ）を含む多剤耐性（ＭＤＲ）タンパク質、アセチルトランスフェラーゼ、プレニルタンパク質トランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、アセチラーゼ、グルクロニダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、又は酸化反応、共役反応（conjugation reaction) 、加水分解反応、還元的代謝又は生体異物を含む他の異化的若しくは同化的反応から選択される反応を促進又は触媒するポリペプチドから選択してもよい。一つの実施態様では、外来性ポリペプチドは血清アルブミンであり、好ましくはヒト血清アルブミンであるが、これに限られるわけではない。ヒト血清アルブミンは配列番号：２に記載された配列を含むことが好ましい。好ましい実施態様では、ヒト血清アルブミンをコードするヌクレオチド配列は配列番号：１及び配列番号：３のいずれか一つに記載された配列を含む。別の好ましい実施態様では、内因性血清アルブミンの発現が改変される。この内因性血清アルブミンは配列番号：６に記載された配列を含むマウス血清アルブミンであることが好ましい。マウス血清アルブミンの内因性遺伝子は配列番号：５に記載された配列を含む転写物をコードすることが好ましい。該調節ポリヌクレオチドはこの内因性遺伝子に関するコード配列の上流に生来位置しているヌクレオチド配列を含むことが好ましい。該調節ポリヌクレオチドは配列番号：７に記載されたような配列を含むことが好ましい。
【００１７】
別の実施態様では、外来性ポリペプチドはα酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）である。このタイプの好ましい実施態様では、外来性ポリペプチドはＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３から選択されるヒトＡＧＰである。ヒトＡＧＰ−１（オロソムコイド（ＯＲＭ）−１としても知られている）は配列番号：１４に記載された配列を含むことが好ましい。ヒトＡＧＰ−１をコードするヌクレオチド配列は配列番号：１３に記載された配列を含むことが好ましい。ヒトＡＧＰ−２（ＯＲＭ−２としても知られる）は配列番号：１６に記載された配列を含むことが好ましい。ヒトＡＧＰ−２をコードするヌクレオチド配列は配列番号：１５に記載された配列を含むことが好ましい。別の好ましい実施態様では、内因性ＡＧＰの発現は改変されている。この内因性ＡＧＰはＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３から選択されるマウスＡＧＰであることが好ましい。このマウスＡＧＰ−１は配列番号：１０に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−１をコードする内因性遺伝子は配列番号：９に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−３は配列番号：１２に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−３をコードする内因性遺伝子は配列番号：１１に記載された配列を含むことが好ましい。この例では、調節ポリヌクレオチドは外来性ポリペプチドをコードする遺伝子に関するコード配列の上流に生来位置しているヌクレオチド配列を含むことが好ましい。この調節ポリヌクレオチドは、それぞれがヒトＡＧＰ−１遺伝子及びヒトＡＧＰ−２遺伝子の上流に生来位置している調節ポリヌクレオチドに対応する配列番号：２１及び／又は配列番号：２２に記載された配列を含むことが好ましい。
【００１８】
別の側面では、本発明は別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する一つ以上の外来性ポリペプチドを発現するものであり、その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが該他の動物において生来発現されるものであるトランスジェニック動物を意図する。
【００１９】
さらに別の側面では、本発明は別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する一つ以上の外来性ポリペプチドを発現するものであり、その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが該他の動物において生来発現されるものであり、且つ、血清アルブミン、α酸性糖タンパク質、チトクロームＰ４５０、ウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ、及び多剤耐性タンパク質から成る群より選択されるものである非ヒトトランスジェニック動物を包含する。
【００２０】
別の一側面では、本発明は別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する一つ以上の外来性ポリペプチドを発現するものであり、その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが該他の動物において生来発現されるものであり、且つ、血清アルブミン、α酸性糖タンパク質、下位群３Ａから選択されるチトクロームＰ４５０、下位群１Ａから選択されるウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ、及びＰ糖タンパク質から成る群より選択されるものである非ヒトトランスジェニック動物を意図する。
【００２１】
さらに別の一側面において、本発明は別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する一つ以上の外来性ポリペプチドを発現するものであり、その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが該他の動物において生来発現されるものであり、且つ、該外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子が胚性幹細胞中で相同組換え又はリコンビナーゼ系（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ又はＦＬＰ−ＦＲＴ系）を経て該非ヒト動物又は該非ヒト動物の先祖に導入されたものである非ヒトトランスジェニック動物を特徴とする。
【００２２】
別の一側面では、本発明は別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する一つ以上の外来性ポリペプチドを発現するものであり、その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが該他の動物において生来発現されるものであり、且つ、該外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子が胚又は胚性幹細胞中で無差別組み込み（random integration) を経て該非ヒト動物又は該非ヒト動物の先祖に導入されたものである非ヒトトランスジェニック動物を提供する。
【００２３】
さらに別の一側面では、本発明は別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する際に使用するための、好ましくはしかしそれに限らないが標的に向かう構築物である核酸構築物であって、該構築物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むものであり、外来性ポリペプチドが該他の動物において生来発現されるものである核酸構築物を包含する。一つの実施態様では、この核酸構築物は該導入遺伝子の両側の二つの領域を含む標的に向かう構築物であって、該領域（複数）が該非ヒト動物のゲノムの部分（複数）と相同組換えを受ける程に十分に該部分と相同である構築物である。この種の好ましい実施態様では、該部分は該外来性ポリペプチドの相同体である非ヒト動物のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の両側にある又は内因性遺伝子に含まれる配列を含む。導入遺伝子は外来性ポリペプチドをコードする該配列に機能しうるように連結された調節ポリヌクレオチドを含むことが好ましい。この核酸構築物は選択可能マーカー遺伝子を含むことが好ましい。
【００２４】
さらなる側面において、本発明は、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物において生来発現される外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を提供する工程、及び
−  この導入遺伝子を非ヒト動物のゲノム中に導入する工程、
を含む方法に存する。
【００２５】
この導入遺伝子のゲノム中への導入には、上に概述したような核酸構築物を作成する工程が含まれることが好ましい。
【００２６】
ゲノムへの導入遺伝子の導入は内因性遺伝子を機能的に破壊する工程を含むことが好ましく、これは該内因性遺伝子の構造を破壊することにより達成することが好ましい。または、ゲノムへの導入遺伝子の導入は該内因性遺伝子の部位以外の部位への導入遺伝子の挿入を含んでもよい。一つの実施態様では、ゲノムへの導入遺伝子の導入は内因性遺伝子又はその部分を導入遺伝子で置換する工程を含む。好ましい実施態様では、内因性遺伝子の機能は、例えば適当な標的に向かう構築物を用いて破壊される。
【００２７】
この方法は、非ヒト動物のゲノム中に選択可能マーカー遺伝子を導入する工程をさらに含むことが好ましい。この種の好ましい実施態様では、該選択可能マーカー遺伝子は、例えば、上述した標的に向かう構築物の中に組み込まれる。
【００２８】
さらなら側面では、本発明は、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物において生来発現される外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子、及び該導入遺伝子の両側にあり、該非ヒト動物のゲノムの部分と相同組換えを受ける程に十分相同性を有する領域、を含む標的に向かう構築物を提供する工程、及び
−  該導入遺伝子が該部分（複数）の間に挟まれたゲノムの領域中に相同的に組み換わるのに十分な条件の下で、非ヒト細胞のゲノム中に該標的に向かう構築物を導入する工程を含む方法に存する。
【００２９】
別の側面によれば、本発明は、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物において生来発現される外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む核酸構築物を提供する工程、及び
−  該導入遺伝子が非ヒト細胞のゲノム中に無差別に組み込まれるような条件の下で、該ゲノム中に該構築物を導入する工程、
を含む方法を提供する。
【００３０】
さらなる側面では、本発明は、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物において生来発現される外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子、及び該外来性ポリペプチドの相同体である非ヒト動物のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の両側にあるか又は内因性遺伝子の内部に含まれる該非ヒト動物のゲノムの部分（複数）との相同組換えを受けるのに十分な該部分との相同性を有し且つ該導入遺伝子の両側にある領域（複数）、とを含む、標的に向かう構築物を提供する工程、及び
−  非ヒト細胞のゲノム中の内因性遺伝子の少なくとも一つに該導入遺伝子が相同組換えを起こすのに十分な条件の下で該細胞のゲノム中に該標的に向かう構築物を導入し、それにより該導入遺伝子で置換され又は破壊された内因性遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子を含む細胞を作成する工程、
を含む方法に存する。
【００３１】
本発明はさらに、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物で生来発現される外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み且つ非ヒト細胞のゲノムの部分により両側を挟まれている導入遺伝子を含む第一の標的に向かう構築物を提供する工程、及び
−  ｉ）該外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の少なくとも一部分、及びii）該内因性遺伝子を破壊できるポリヌクレオチド、を含む第二の標的に向かう構築物を提供する工程、
−  該部分に対応する、該細胞のゲノムの領域に導入遺伝子が相同組換えを起こすのに十分な条件の下で該非ヒト細胞中に第一の標的に向かう構築物を導入する工程、
−  該細胞のゲノム中の内因性遺伝子の少なくとも一つの中に該ポリヌクレオチドが相同組換えを起こすのに十分な条件の下で該細胞の中に第二の標的に向かう構築物を導入し、それにより該内因性遺伝子の少なくとも一つの破壊された対立遺伝子を含む細胞を作成する工程、
を含む方法に存する。
【００３２】
本発明は、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物で生来発現される外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む核酸構築物を提供する工程、
−  ｉ）該外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の少なくとも一部分、及びii）該内因性遺伝子を破壊できるポリヌクレオチド、を含む標的に向かう構築物を提供する工程、
−  該細胞のゲノムの領域中に導入遺伝子が無差別に組み込まれるのに十分な条件の下で該非ヒト細胞の中に該核酸構築物を導入する工程、及び
−  該細胞のゲノム内の内因性遺伝子の少なくとも一つの中に該ポリヌクレオチドを相同組換えするのに十分な条件の下で該細胞中に該標的に向かう構築物を導入し、それによって該内因性遺伝子の少なくとも一つの破壊された対立遺伝子を含む細胞を作成する工程、
を含む方法にさらに及ぶ。
【００３３】
上記の作成方法で用いられた細胞は胚性幹細胞であることが好ましく、ネズミ目内の哺乳動物由来の胚性幹細胞であることが好ましく、マウスの胚性幹細胞であることが最も好ましい。
【００３４】
好ましい実施態様では、この方法は、非ヒト動物の胚盤胞又は他の発生初期段階中に少なくとも一つの導入遺伝子を含む胚性幹細胞を注入する工程をさらに含む。
【００３５】
別の好ましい実施態様では、この方法は注入された胚盤胞を偽妊娠非ヒト動物中に導入し、偽妊娠動物に少なくとも一つの相同組換えされた導入遺伝子を含む子孫に送達させる工程をさらに含む。
【００３６】
別の好ましい実施態様では、少なくとも一つの相同組換えされた導入遺伝子を含む該子孫は該外来性ポリペプチドを検出可能なレベルで発現することによりさらに特徴付けられる。
【００３７】
別の好ましい実施態様では、少なくとも一つの相同組換えされた導入遺伝子を含む子孫は、該内因性ポリペプチドの発現レベルの低下又は検出不可能によりさらに特徴付けられる。
【００３８】
代替的な好ましい実施態様では、この子孫は機能的な内因性ポリペプチドを生産する能力を欠如する。
【００３９】
この方法は、上に概述した方法により作成された非ヒトトランスジェニック動物を育種し、この動物の子孫を生産する工程をさらに含んでもよい。例えば、同一の導入遺伝子を含む動物を該導入遺伝子に関してホモ接合である動物を生産するため同系交配することができる。代替的に若しくは追加的に、本発明で記述された異なる導入遺伝子を含むトランスジェニック動物は二つ以上の異なる導入遺伝子を含む動物を作成するため交配することができる。代替的に又は追加的に、これらのトランスジェニック動物のいずれかを、本発明に記載された導入遺伝子（単数又は複数）のみでなく交雑戦略で使用される他の動物の望ましい遺伝的特性をも含む動物を得るために、同種の動物の任意の他の遺伝的に改変された、野性型の、又は突然変異型の動物と交配することができる。トランスジェニック動物がマウスの場合、交雑戦略はトランスジェニックマウスと、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、ＢＡＬＢ／ｃなどの同系交配マウス系統、ヒトの特定の疾病を模倣するように設計されたマウス又は有用なレポーター構築物有するマウスを含むがこれらに限定されない別のマウスとの交雑を含んでもよい。
【００４０】
トランスジェニック動物及びそれに由来する細胞は、薬を含む生物活性物質をスクリーニングするためにそして該物質の分布、効力、代謝及び／又は毒性を研究するために有用である。これらのスクリーニング法は、目的の動物における薬の挙動及び／又は代謝を改良された予測可能性を以て評価するためにとりわけ有用である。従って、さらなる側面において本発明は、目的の動物における薬の代謝及び／又は挙動を評価する方法であって、薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ目的の該動物で生来発現される外来性ポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物にテストされる物質を投与する工程、及び薬の代謝及び／又は挙動を決定するため分析試験を行なう工程を含む方法を特徴とする。
【００４１】
一つの実施態様では、この分析試験は薬が投与されたトランスジェニック動物における該薬の濃度及び／又は分布を直接的又は間接的に評価する工程を含む。別の実施態様では、該分析試験は薬が投与されたトランスジェニック動物における該薬の効力を直接的又は間接的に評価する工程を含む。さらに別の実施態様では、該分析試験は薬が投与されたトランスジェニック動物における該薬の毒性を直接的又は間接的に評価する工程を含む。さらなる実施態様では、該分析試験は薬が投与されたトランスジェニック動物における該薬の半減期を直接的又は間接的に評価する工程を含む。なおさらなる実施態様では、該分析試験は薬が投与されたトランスジェニック動物における該薬の薬力学を直接的又は間接的に評価する工程を含む。なお別の実施態様では、該分析試験は薬が投与されたトランスジェニック動物における該薬の薬物動態学を直接的又は間接的に評価する工程を含む。
【００４２】
本発明は上に概説したように薬の代謝及び／又は挙動の研究におけるトランスジェニック動物の使用をも包含する。
【００４３】
【表Ａ】
2004533826.tif 000002
【００４４】
【表Ａ−１】
2004533826.tif 000003
【００４５】
【表Ａ−２】
2004533826.tif 000004
【００４６】
【表Ａ−３】
2004533826.tif 000005
【００４７】
【表Ａ−４】
2004533826.tif 000006
【００４８】
発明の詳細な説明
１．定義
特に断らない限り、本明細書で用いられる技術的及び科学的用語は全て本発明が属する技術分野における当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載されたものと同じ又は等価の全ての方法及び材料は本発明の実施又は試験において使用できるが、好ましい方法及び材料が記載されている。本発明の目的のために、下記の用語を以下に定義する。
【００４９】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は一つ又は冠詞の文法上の一つよりも大きな数（即ち、少なくとも一つ）を指すために用いられる。例を挙げれば、「an element」は１要素又は１より大の要素を意味する。
【００５０】
「物質」とは、そのレベル及び／又は機能的活性が改変されるべき標的と直接的又は間接的のいずれかで相互作用する、天然に生ずる又は合成的に生産される分子を意味する。
【００５１】
「ＡＧＰ」とは、α酸性糖タンパク質ファミリーを意味する（ＡＡＧとも略する）。
【００５２】
「抗原結合分子」とは標的抗原に対する結合親和性を有する分子を意味する。この用語は免疫グロブリン、免疫グロブリン断片及び抗原結合活性を示す非免疫グロブリン由来のタンパク質骨格にまで及ぶものと理解される。
【００５３】
「オートロガス」とは同一生物に由来するもの（例えば、細胞、組織など）を意味する。
【００５４】
本明細書で用いるとき、用語「挙動」とは、薬に関して使用される場合、薬の分布、半減期、効力及び毒性及び薬の代謝物並びに該薬／化合物の投与の生理学的又は病理学的如何なる他の結果をも含むが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書で用いるとき、用語「シスで作用する配列」又は「シスで調節する領域」又は「調節領域」又は同様な用語は、発現しうる遺伝子配列に関して適当に配置された場合その遺伝子配列の発現を少なくとも一部調節することができる任意のヌクレオチド配列を意味すると解すべきである。当業者は、シスで調節する領域が、転写レベル又は転写後のレベルで遺伝子配列の発現及び／又は細胞型特異性及び／又は発生特異性のレベルを活性化し、沈黙化（silencing)し、強化し、抑制し又は他の方法で改変することができることに気付くはずである。
【００５６】
本明細書を通じて、論旨が他の意味を要求しない限り、「含む（comprise, comprises, comprising)」という用語は述べられた工程又は要素或いは工程又は要素の群を含むことを意味するが、他の如何なる工程又は要素或いは工程又は要素の群を排除することを意味しないと解すべきである。
【００５７】
「に対応する（corresponds to, corresponding to) 」とは、（ａ）参照されたポリヌクレオチド配列の全て又は一部と実質的に同一又は相補的であるヌクレオチド配列、又は（ｂ）ぺプチド又はタンパク質中のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチドを意味する。この言葉はその範囲内に参照されたぺプチド又はタンパク質中のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するぺプチド又はポリペプチドをも含んでいる。
【００５８】
「誘導体」とは、改変により、例えば、他の化学的部分との結合若しくは複合体形成により又は当分野で理解されるような翻訳後修飾により、基本配列から誘導されたポリペプチドを意味する。この用語「誘導体」はその範囲内に機能的に等価な分子を生ずる付加、又は欠失を含む親配列に加えられた改変をも含む。従って、用語誘導体は機能及び／又は免疫反応を調節する分子を包含する。
【００５９】
「薬」とは、生物、器官、組織又は細胞の生理学又は病理学を改変する目的で用いられる任意の化合物、ぺプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、又は他の分子若しくは部分を指す。
【００６０】
「エキソン」とは、成熟ｍＲＮＡ分子中に存在するＤＮＡセグメント又はそれがコードするｍＲＮＡセグメントの領域を意味する。
【００６１】
用語「外来性ポリヌクレオチド」又は「外因性ポリヌクレオチド」又は「異質ポリヌクレオチド」とは、実験操作により動物のゲノム中に導入される任意の核酸（例えば、遺伝子配列）を指し、該導入された遺伝子が天然に生ずる遺伝子に関して何らかの改変（例えば、点突然変異、選択可能マーカー遺伝子の存在、ｌｏｘＰ部位の存在など）を含む限りその動物中で見出される遺伝子配列を含んでもよい。
【００６２】
用語「遺伝子」とは、本明細書で用いられるとき、細胞のゲノムの考えられる全ての分離したコード領域並びに関連する非コード領域及び調節領域を指す。遺伝子は発現の調節に関与する特定のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、イントロン、及び隣接する５’及び３’非コードヌクレオチド配列をも意味すると意図される。この点で、遺伝子は、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル及び／又はポリアデニル化シグナルなどの内因性の（即ち、生来所与の遺伝子と関連している）又は異質の制御シグナルをさらに含んでもよい。ＤＮＡ配列はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ又はそれらの断片であってよい。遺伝子は染色体外で維持するため又は宿主中に組み込むため適当なベクター中に導入してもよい。
【００６３】
用語「相同体」とは、ポリペプチドとの文脈では、異なる動物のポリペプチドのコードされたアミノ酸配列に類似する配列を有する、参照動物のポリペプチドを指す。二つのポリペプチドは「相同である」と言われるが、これは該タンパク質の間で進化上の関係が必ずあることを意味するものではない。そうではなく、用語「相同である」とは該二つのポリペプチドが類似のアミノ酸配列を有することを意味すると定義される。さらに、多くの場合、類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドは類似の機能を有することになるが、用語「相同である」とは該ポリペプチドが機能的に相互に類似せねばならないことを意味するものではない。「相同である」がポリぺプチド又はぺプチドを指して用いられる場合、同一でない残りの位置はしばしば同類アミノ酸置換しか異ならないことが認識される。「同類アミノ酸置換」はアミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を持つ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されている場合の置換である。一般に、同類アミノ酸置換はタンパク質の機能的性質を実質的に変化させない。二つ以上のアミノ酸配列が同類置換だけ相互に異なる場合には、配列同一性パーセント又は相同性の程度は該置換の同類性を修正するため上方に補正してもよい。この補正をする手段は当業者に良く知られている（例えば、ピアソンら（1949）Method in Molecular Biology 24: 307-31) 。次の６個の群は、それぞれが相互に同類置換であるアミノ酸を含んでいる。（１）アラニン（Ａ），セリン（Ｓ），スレオニン（Ｔ）、（２）アスパラギン酸（Ｄ），グルタミン酸（Ｅ）、（３）アスパラギン（Ｎ），グルタミン（Ｑ）、（４）アルギニン（Ｒ），リジン（Ｋ）、（５）イソロイシン（Ｉ），ロイシン（Ｌ），メチオニン（Ｍ），バリン（Ｖ）、及び（６）フェニルアラニン（Ｆ），チロシン（Ｙ），トリプトファン（Ｗ）。
【００６４】
ポリペプチドの配列相同性は、配列同一性とも呼ばれるが、通常、配列分析ソフトウェアを用いて求められる。例えば、ウィスコンシン州５３７０５，マジソン，ユニバーシティ  アベニュー  ９１０のユニバーシティ・オブ・ウィスコンシン・バイオテクノロジー・センターのシーケンス・アナリシス・ソフトウェア・バッケージ・オブ・ザ・ジェネティクス・コンピュータ・グループ（ＧＣＧ）を参照せよ。タンパク質分析ソフトウェアは種々の置換、欠失及び同類アミノ酸置換を含む他の修飾に割当られた相同性の尺度を用いて類似の配列を適合させる。例えば、ＧＣＧは、例えば異なる種の生物由来の又は野性型タンパク質とその突然変異タンパク質の間の相同的なポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチドの間の配列相同性又は配列同一性を決定するためデフォルト・パラメータで使用できる「Ｇａｐ」や「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含む。異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと参照配列を比較する場合に好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴであり、とりわけｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ（アルチュールら，1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) である。ｂｌａｓｔｐの好ましいパラメータは、
予想値                          １０              （デフォルト）
フィルター                      ｓｅｇ            （デフォルト）
ギャップを開くための費用        １１              （デフォルト）
ギャップを拡大するための費用    １                （デフォルト）
最大整列                        １００            （デフォルト）
ワードサイズ                    １１              （デフォルト）
記載（descriptions) の数        １００            （デフォルト）
ペナルティマトリックス          ＢＬＯＷＳＵＭ６２
である。
【００６５】
相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは、一般に少なくとも約１６アミノ酸残基、通常少なくとも約２０アミノ酸残基、より普通には少なくとも約２４アミノ酸残基、典型的には少なくとも約２８残基、そして好ましくは約３５残基より多い。アミノ酸配列を用いるデータベース調査は当分野で知られたｂｌａｓｔ以外のアルゴリズムにより求めることができる。例えば、ポリペプチド配列はＧＣＧ６．１版におけるプログラムであるＦａｓｔａを用いて比較できる。Ｆａｓｔａは質問配列と調査配列の間の最良の重なりの領域の整列と配列同一性パーセントを与える（ピアソン（1990) Methods in Enzymology 183: 63-98))。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性パーセントは、ＧＣＧ６．１版で提供される、Ｆａｓｔａとそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ２、ＰＡＭ250 評点マトリックス）を用いて決定できる。本発明は、ポリペプチド「相同体」の二つの一般型を意図する。タイプ１相同体は強い相同体である。タイプ１相同体である二つのポリペプチドの比較は、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムと上に列挙したパラメータを用いて１×１０-40 より小さいｂｌａｓｔｐ評点を結果として生ずるであろう。ｂｌａｓｔｐ評点が低い程、即ちそれがゼロに近づく程、両ポリペプチド配列の間の適合は良くなる。タイプ２相同体はより弱い相同体である。タイプ２相同体である二つのポリペプチドの比較は、Ｂｌａｓｔアルゴリズムと上に列挙したパラメータを用いて、１×１０-40 と１×１０-10 の間のｂｌａｓｔｐ評点を結果として生ずるであろう。当業者は他のアルゴリズムが弱い相同性又は強い相同性を決定するために使用できることを認めるはずである。
【００６６】
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は二つのぺプチド又はポリペプチドの間又は二つの核酸分子の間の配列類似性を指す。相同性は、比較のために整列させた各配列における一つの位置を比較することにより決定できる。比較された配列の一つの位置が同じ塩基又はアミノ酸により占められる場合は、該分子（複数）はその位置において相同である。配列間の相同性の程度は該配列により共有される適合位置又は相同位置の数の関数である。「無関係な」又は「非相同な」配列は、参照配列と４０％未満の同一性、好ましくは２５％未満の同一性であるが、を共有する。
【００６７】
「ヒト化」とは、必ずしもヒトの等価物と同一ではないが、機能及び／又は構造においてヒトにより似せることを意味する。ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に関して本明細書で用いるとき、用語「ヒト」は、機能においてヒトに似ている全ての配列を含んでもよい。
【００６８】
「イントロン」とは一般に一次ｍＲＮＡからスプライスにより除かれるＤＮＡの領域又はそれがコードするｍＲＮＡセグメントであり、成熟ｍＲＮＡ分子には存在しないものである。
【００６９】
「分離された」とは、その本来の状態でそれに通常伴う成分を実質的に又は本質的に含まない物質を意味する。
【００７０】
「ノックイン」動物とは、本明細書で用いるとき、特定の遺伝子又はその部分が外来性遺伝子又は外来性ＤＮＡ配列により置き換えられている遺伝子的に改変された動物を指す。
【００７１】
「ノックアウト」動物とは、遺伝子が除去され又は機能できなくされている遺伝的に改変された動物を意味する。
【００７２】
用語「哺乳動物」は、本明細書では最も広い意味で用いられ、ゲッ歯類、霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ（caprices) 、ウマ、イヌ、及びネコを含む。好ましい非ヒト哺乳動物はねずみ（例えば、ラットやマウス）を含むネズミ目から選択され、最も好ましいのはマウスである。
【００７３】
「ｍＲＮＡ（Messenger RNA 又は mRNA)」とは、鋳型としてのＤＮＡを用いて細胞中で生産される「転写物」であって、それ自体タンパク質をコードするものである。
【００７４】
薬又はそれが相互作用するポリペプチドに関して用いられる場合、用語「代謝（metabolism又はmetabolising) 」などは、外因性物質の吸収、結合、摂取、分泌、分布、輸送、処理、変換又は分解を含む、これらに限定されないが、化合物の生変換並びに該薬の投与から直接的又は間接的に結果として生ずる病理学的反応の全ての側面を指す。
【００７５】
用語「５’非コード領域」は、該遺伝子のポリペプチド産物を含むアミノ酸残基をコードする配列以外の、発現可能な遺伝子の上流領域から誘導される全てのヌクレオチド配列を含めるためその最も広い意味で本明細書中で用いられる。この場合、５’非コード領域は該遺伝子を少なくとも一部発現させ、発現を活性化し、又は他の方法で発現を容易にする。
【００７６】
「ヌードマウス」は、ヒト腫瘍細胞を増殖させるための宿主としてしばしば使用される胸腺欠損マウスとしても知られる免疫不全マウスの一血統である。
【００７７】
本明細書で用いられるとき用語「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合（又は関連する構造変異型又はそれらの合成類似体）を介して連結されている多数のヌクレオチド単位（デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又は関連する構造変異型又はそれらの合成類似体）からなるポリマーを指す。従って、用語「オリゴヌクレオチド」は通常ヌクレオチド及びそれらの間の連結が天然に生ずるものであるヌクレオチドポリマーを指すが、この用語はその範囲内にぺプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ホスホン酸メチル、リボ核酸２−Ｏ−メチルなど、これらに限定されないが、を含む様々な類似体をも含むものと理解される。これらの分子の正確な大きさは特定の適用に応じて変化しうる。オリゴヌクレオチドは通常長さがかなり短く、一般に約１０から３０ヌクレオチドまでであるが、この用語は任意の長さの分子を指すことができる、ただし用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は通常大きなオリゴヌクレオチドに対して用いられる。
【００７８】
「機能しうるように連結した（operably linked 又は operably connected など) 」とは、機能的な関係でポリヌクレオチド要素を連結することを意味する。核酸配列はそれが別の核酸配列と機能的な関係で配置される場合「機能しうるように連結されて」いる。例えば、プロモーター又はエンハンサーはそれがコード配列の転写に影響を与える場合、該コード配列に機能しうるように連結されている。機能しうるように連結されるとは、連結されている核酸配列が通常隣接しており、二つのタンパク質コード領域を結合させる必要がある場合は隣接し且つリーディングフレーム内にあることを意味する。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼが二つのコード配列を１個のｍＲＮＡに転写でき、次いでそれが両方のコード配列から誘導されるアミノ酸を有する１個のポリペプチドに翻訳される場合に、別のコード配列に「機能しうるように連結され」ている。これらのコード配列は、発現された配列が最終的に所望のタンパク質を生産するようにプロセスされる限り、相互に隣接している必要はない。転写可能なポリヌクレオチドにプロモーターを「機能しうるように連結する」とは、該転写可能なポリヌクレオチド（例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は他の転写物）をプロモーターの調節的制御の下に置くことを意味する。このプロモーターは次いで該ポリヌクレオチドの転写及びときには翻訳を制御する。異質のプロモーター／構造遺伝子の組み合わせを構築する際には、転写可能なポリヌクレオチドの転写開始部位からある距離を置いてプロモーター又はその変異型を配置することが一般に好ましい。その距離はプロモーターとその本来の構成においてこのプロモーターが制御する遺伝子、即ち、該プロモーターがそれから誘導された遺伝子との間の距離とほぼ同じである。当分野で知られているように、この距離には幾らかの変動が機能の損失なしに許容される。同様に、その制御の下に置こうとする転写可能なポリヌクレオチドとの関係で調節配列要素（例えば、オペレーター、エンハンサーなど）の好ましい配置は、その天然の構成における該要素、即ち、それがそこから誘導された遺伝子の配置によって規定される。
【００７９】
用語「オルソログ（orthologue) 」とは、種分化を介する相同体、例えば、構造的及び機能的考察に基づいて密接に関係しておりそして共通の一定水準を持つと仮定される相同体である遺伝子又はタンパク質を意味する。オルソログのタンパク質は異なる種において同じ活性又は類似の活性を認識しうるように働く。用語「パラローグ（paralogue)」とは、遺伝子重複を介して、即ちゲノム内の一つの遺伝子の重複した変異型を介して相同である遺伝子又はタンパク質を意味する。フリッチ，ダブリューエム（1970) Syst Zool 19: 99-113を参照。
【００８０】
「ＰＣＲ」とは、ＤＮＡを増幅するための方法であるポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【００８１】
本明細書で用いられるとき用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とはｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを指し示す。この用語は通常長さが３０ヌクレオチドより大きなオリゴヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド配列は相補鎖並びに本明細書で記載された代替的骨格を包含するものと理解される。
【００８２】
用語「ポリヌクレオチド変異型」及び「変異型」とは、参照配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド又は以下に定義されるストリンジェント条件下で参照配列とハイブリッドを形成するポリヌクレオチドを意味する。これらの用語は、一つ以上のヌクレオチドが付加され若しくは欠失し若しくは異なるヌクレオチドで置換されたポリヌクレオチドをも包含する。この点で、突然変異、付加、欠失及び置換を含む一定の変更が、参照ポリヌクレオチドに施され、それにより改変されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物機能若しくは生物活性を保持し得ることは当分野で良く知られている。用語「ポリヌクレオチド変異型」及び「変異型」は天然に生ずる対立遺伝子変異型をも含む。
【００８３】
「ポリペプチド」、「ぺプチド」及び「タンパク質」は本明細書では、アミノ酸残基のポリマー及びその変異型及びその合成類似対立遺伝子を指すために互換的に使用される。従って、これらの用語は、天然に生ずるアミノ酸ポリマーのみでなく、一つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に生ずるアミノ酸の化学類似体などの天然に生じない合成アミノ酸であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００８４】
用語「ポリペプチド変異型」とは、参照ポリペプチドのそれと比べそのアミノ酸配列において何らかの相違を有するポリペプチドを意味する。従って、ポリペプチド変異型は、少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失又は置換により参照ポリペプチドから識別される。
【００８５】
「プライマー」とは、ＤＮＡ鎖と対合された場合、適当な重合物質の存在下でプライマー伸長生産物の合成を開始できるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは増幅の最大効率のためには一本鎖であることが好ましいが、代替的に二本鎖であってもよい。プライマーは重合物質の存在下で伸長生産物の合成を開始するのに十分な程長くなければならない。プライマーの長さは、適用、用いられる温度、鋳型反応条件、他の試薬、及びプライマーの起源などの多数の因子に依存する。例えば、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは通常１５〜３５又はそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含んでいてもよい。プライマーは、約２００ヌクレオチドから数千塩基又はそれ以上までの大きなポリヌクレオチドであることもできる。プライマーは、それがハイブリッドを形成しそして合成の開始部位として役立つように設計される鋳型の配列に「実質的に相補的」であるように選択されうる。「実質的に相補的」とは、このプライマーが標的ヌクレオチド配列とハイブリッドを形成するのに十分な程相補的であることを意味する。プライマーはそれがハイブリッドを形成するように設計される鋳型との不適合を含まないことが好ましいが、これは必須ではない。例えば、プライマー配列の残りが該鋳型に相補的であれば、非相補的ヌクレオチドがプライマーの５’末端に付着しうる。または、プライマー配列が鋳型配列とハイブリッドを形成するのに十分な程相補的でありそれにより該プライマーの伸長生産物を合成するための鋳型を形成するとするならば、非相補的ヌクレオチド又は非相補的ヌクレオチドのストレッチがプライマー中に散在できる。
【００８６】
「プローブ」は、特定の配列又は部分配列又は別の分子の他の部分に結合する分子を指す。特に断らない限り、用語「プローブ」は通常相補的塩基対合を介して「標的核酸」としばしば呼ばれる別の核酸に結合するポリヌクレオチドプローブを指す。プローブはハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブとの完全な配列相補性を持たない標的核酸に結合しうる。プローブは直接的又は間接的に標識できる。
【００８７】
「プロモーター」とは転写の開始及び転写レベルを制御する、ｍＲＮＡをコードする領域の一般に上流（５’）のＤＮＡ領域を意味する。本明細書での「プロモーター」への言及はその最も広い意味にとられるべきであり、ＴＡＴＡボックス配列やＣＣＡＡＴボックス配列などの古典的ゲノム遺伝子の転写調節配列を含み、並びに発生的及び／又は環境からの刺激への応答として遺伝子発現を改変する、又は組織特異的若しくは細胞型特異的な方式で遺伝子発現を改変する付加的調節因子（即ち、上流の活性化配列、エンハンサー及びサイレンサー）を含む。プロモーターは通常、しかし必ずしも常にではなく、それがその発現を調節する構造遺伝子の上流即ち５’に配置される。さらに、プロモーターを含む調節因子は通常該遺伝子の転写の開始部位の２ｋｂ以内に配置される。本発明のプロモーターは細胞中での発現をさらに強化するため、及び／又はそれが機能しうるように連結される構造遺伝子の発現のタイミング又は誘導可能性を改変するため、開始部位からさらに遠位に配置された付加的な特異的調節因子を含んでもよい。
【００８８】
用語「組換えポリヌクレオチド」は、本明細書で用いられるとき、核酸の操作により天然で普通には発見されない形態にイン・ビトロで形成されたポリヌクレオチドを指す。例えば、組換えポリヌクレオチドは発現ベクターの形態であってもよい。一般に、このような発現ベクターはヌクレオチド配列に機能しうるように連結された転写調節核酸及び翻訳調節核酸を含む。
【００８９】
「組換えポリペプチド」とは、組換え技法を用いて、即ち組換えポリヌクレオチドの発現により、作成されたポリペプチドを意味する。
【００９０】
本明細書で用いられるとき「レポーター分子」とは、その化学的性質により、分析的に同定可能なシグナルを提供する分子を意味する。例えば、抗原結合分子及びその標的抗原を含む複合体の検出である。用語「レポーター分子」は細胞凝集の使用又はラテックスビーズ上の赤血球などの凝集の阻害の使用にも及ぶ。
【００９１】
「ＳＣＩＤマウス」とは重症複合免疫不全症を持つ免疫不全マウスの一血統を意味する。
【００９２】
本明細書で用いるとき用語「配列同一性」は、比較窓の上でヌクレオチドごと又はアミノ酸ごとに配列が同一であるというその程度を指す。従って、「配列同一性パーセンテージ」とは、比較窓の上で最適に整列させた二つの配列を比較し、両配列において同一核酸塩基（例えば、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｉ）又は同一アミノ酸残基（例えば、Ａｌａ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が生ずる位置の数を決定して適合位置の数を求め、該適合位置の数を比較窓中の位置の総数（即ち、窓のサイズ）で割り、そしてその結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることにより計算される。本発明の目的では、「配列同一性」は、ＤＡＮＳＩＳコンピュータプログラム（ウィンドウズ（登録商標）用２．５版，米国，カリフォルニア，サウスサンフランシスコのヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング・コウ．リミティッド）により、このソフトウェアに添付された参照マニュアルで使用されているような標準的デフォルトを用いて計算された「適合パーセンテージ」を意味するものと理解すべきである。
【００９３】
「サザンブロット」は、特異的ＤＮＡ配列を検出するための方法である。簡単に述べれば、ＤＮＡ試料を制限酵素で切断し、電気泳動にかけ、膜に移転させ、ついで目的の標識化ＤＮＡ断片で精査する。
【００９４】
「標準的マウス」とは、本発明の遺伝子改変を保持しないマウスの任意の血統を意味する。
【００９５】
本明細書で用いるとき「ストリンジェンシー」とは、ハイブリダイゼーション手順及び洗浄手順の間の温度とイオン強度、及び一定の有機溶媒の存在又は非存在を意味する。ストリンジェンシーが高い程、固定化された標的ヌクレオチド配列と洗浄後に該標的とハイブリッド形成をしたまま残っている標識化プローブポリヌクレオチド配列との間の相補性の程度は高くなる。
【００９６】
「ストリンジェント条件」は、高頻度の相補塩基を有するヌクレオチド配列のみがハイブリッドを形成する、温度及びイオンの条件を指す。要求されるストリンジェンシーはヌクレオチド配列に依存し、且つ、ハイブリダイゼーション及びその後の洗浄の間存在する種々の成分に依存し、そしてこれらの処理の時間に依存する。一般に、ハイブリダイゼーションの割合を最大にするため、非ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択され、熱融点（Ｔm ）よりも約２０〜２５℃低い温度が選択される。このＴm は、規定されたイオン強度及びｐＨで溶液中の完全に相補的なプローブに特定の標的配列の５０％がハイブリッドを形成する温度である。一般に、ハイブリッドを形成した配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を要求するためには、高ストリンジェント洗浄条件はＴm よりも約５〜１５℃低い温度が選択される。ハイブリッドを形成した配列の少なくとも約７０％ヌクレオチド相補性を要求するためには、中ストリンジェント洗浄条件はＴm よりも約１５〜３０℃低い温度が選択される。高度に許容性の（低ストリンジェンシー）洗浄条件は、ハイブリッドを形成した配列の間の高レベルの不適合を許容する、Ｔm より５０℃も低い温度である。当業者は、ハイブリダイゼーション及び洗浄段階で他の物理的及び化学的パラメータが標的配列及びプローブ配列の間の相同性の特定のレベルからの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響するように改変することもできることを認めるはずである。ストリンジェンシー条件の他の例はセクション３．３に記載される。
【００９７】
本明細書で用いられるとき、用語「実質的に精製された」とは、天然の環境から分離され、単離又は分別され、自然界で結合している他の成分を少なくとも６０％、好ましくは７５％、最も好ましくは９０％含まない、核酸配列又はアミノ酸配列のいずれかである分子を意味する。従って、「単離されたポリヌクレオチド」は実質的に精製されたポリヌクレオチドである。
【００９８】
「ｔ1/2 」とは、薬がその濃度を１／２まで低減するために必要な時間（半減期としても知られる）を意味する。
【００９９】
「トランスフェクション」とは、核酸分子（例えば、プラスミド又はＤＮＡ断片）が真核細胞中に挿入される過程のプロセスを意味する。通常、２〜５０％の細胞が該プラスミドを取込み、該プラスミドＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ断片を細胞の染色体に組み込むことなく約３日間タンパク質生産物を発現する（＝一過性のトランスフェクション）。これらの細胞の小さな割合が最終的にプラスミドＤＮＡを細胞の染色体に組み込み、永久にタンパク質生産物を発現する（＝安定なトランスフェクション）。
【０１００】
用語「導入遺伝子（transgene)」とは、生きている動物の細胞、とりわけ哺乳動物細胞のゲノム中に人工的に挿入された又はされる予定の遺伝子物質を記述するために本明細書で用いられる。該導入遺伝子は細胞を形質転換するために用いられ、永久的又は一過性の遺伝子変化、好ましくは永久的遺伝子変化が、外因性の核酸（通常ＤＮＡ）の組み込みの後に細胞内で誘導されることを意味する。永久的遺伝子変化は一般に細胞のゲノム中へのＤＮＡの導入により達成される。安定な組み込みのためのベクターには、プラスミド、レトロウイルス、及び他の動物ウイルス、ＹＡＣｓ（酵母人工染色体）、ＢＡＣｓ（細菌人工染色体）などが含まれる。導入遺伝子は、脊椎動物、好ましくはゲッ歯類、ヒト、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ目の動物、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、エイブ（aves) などの哺乳動物を含む、これらに限定されないが、動物に由来するものが好ましい。
【０１０１】
本明細書で用いるとき用語「トランスジェニック」とは、内因性ゲノムが外来性遺伝子又は外来性配列の無差別組み込み又は部位特異的組み込みにより補充され又は改変されている遺伝子的に改変された動物を意味する。
【０１０２】
本発明の「トランスジェニック動物」は、好ましくは動物の生殖細胞系列のゲノムの実験的操作により生産される。これらの遺伝子工学処理された動物は、核酸（通常ＤＮＡ）を含む「導入遺伝子」の胚の標的細胞中への導入、又は本明細書で記載された方法によるなどのヒトの介入により動物の体細胞及び／又は生殖系列細胞の染色体中への「導入遺伝子」の組み込みを含む幾つかの方法により作成される。導入遺伝子を含む動物は「トランスジェニック動物」と呼ばれる。トランスジェニック動物はそのゲノムが導入遺伝子の導入により改変された動物である。
【０１０３】
「ＵＧＴｓ」又は「ＵＤＰＧＴｓ」とは、ウリジン・グルクロノシルトランスフェラーゼ又はウリジン・ジホスホグルクロノシルトランスフェラーゼを意味する。
【０１０４】
「ベクター」とは、核酸配列が挿入され又はクローニングされうる、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、又は植物ウイルスに由来する核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子を意味する。ベクターは一つ以上のユニークな制限部位を含み、そして標的細胞若しくは組織又はその先祖の細胞若しくはその組織を含む一定の宿主細胞中で自律複製でき、又は該クローニングされた配列が再生できるように一定の宿主のゲノムと一体化しうるものであることが好ましい。従って、ベクターは、自律複製可能ベクター、即ち、その複製が染色体の複製と無関係な染色体外実体、例えば、線状プラスミド若しくは閉環状プラスミド、染色体外因子、ミニクロモソーム、又は人工染色体、として存在するベクターでありうる。ベクターは自己複製を確実にするための任意の手段を含んでもよい。または、ベクターは宿主細胞に導入された場合、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（単数又は複数）と一緒に複製するものであってもよい。ベクター系は１個のベクター又はプラスミドを含んでもよく、宿主細胞のゲノム中に導入されるべき総ＤＮＡを共に含む二つ以上のベクター又はプラスミドを含んでもよく、トランスポゾンを含んでもよい。ベクターの選択は通常該ベクターが導入される宿主細胞と該ベクターの適合性に左右される。ベクターは適当な形質転換体を選択するために用いることができる抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含んでもよい。このような耐性遺伝子の例は当業者に良く知られている。
【０１０５】
用語「野性型」とは、天然資源から単離されたときの遺伝子又は遺伝子産物の特徴を持っているその遺伝子又は遺伝子産物を意味する。野性型遺伝子は集団において最も頻繁に観察され、従って該遺伝子の「正常」型又は「野性」型と恣意的に命名される。対照的に、用語「改変された」、「変異型」又は「突然変異型」は、野性型の遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合配列の特性又は機能的特性における改変（即ち、改変された特徴）を示す遺伝子又は遺伝子産物を指す。天然に生ずる突然変異体を単離することができることに注意すべきである。これらは野性型遺伝子又は野性型遺伝子産物と比較した場合改変された特徴を有するという事実により確認される。
【０１０６】
本明細書で用いるとき、遺伝子の名前に下線を引いたもの又はイタリックにしたものは遺伝子を示すと解すべきである。これは下線を引いたりイタリックにしたりしないで示された該遺伝子のタンパク質生産物と対照的である。例えば、「ＡＧＰ−１」はＡＧＰ−１遺伝子を意味するが、「ＡＧＰ−１」は「ＡＧＰ−１」遺伝子のタンパク質生産物を示す。
【０１０７】
２．本発明のトランスジェニック動物
本発明は他の一動物の薬の代謝により近似する薬の代謝を示す非ヒトトランスジェニック動物を提供する。とりわけ好ましい実施態様では、該他の動物はヒトであり、従って、このトランスジェニック動物は、その野性型動物の薬の代謝よりももっとヒトに近似しした薬の代謝を示す。このようなトランスジェニック動物は、薬のスクリーニング、薬の前臨床的評価及び種々の毒性学的及び薬理学的研究を含む適用を有するが、これらに限定されない。
【０１０８】
本発明はとりわけ、薬の挙動及び／又は薬の代謝と関連したポリペプチドの発現のための非ヒトトランスジェニックモデルに向けられている。より具体的には、本発明は別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する少なくとも一つの外来性ポリペプチドを発現するものであり、該少なくとも一つの外来性ポリペプチドが該他の動物内で生来発現されるものである非ヒトトランスジェニック動物を提供する。一つの実施態様では、外来性ポリペプチドは、導入遺伝子内に含まれるヌクレオチド配列によりコードされ、該ヌクレオチド配列が該他の動物の野性型遺伝子又は野性型様遺伝子物質に相当するものである。この野性型様遺伝子物質は一遺伝子全体から成るものでも、遺伝子群の塊又はその部分から成るものであってもよい。それは野性型遺伝子の生物活性断片から成るものでもよい。導入遺伝子はゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを含んでもよい。好ましい実施態様では、トランスジェニック動物は、そのゲノムに挿入された、薬と結合するポリペプチド及び／又は薬を代謝するポリペプチドをコードする少なくとも一つのヒト遺伝子又はヒト様遺伝子を持つという特徴を有する。このトランスジェニック動物は、その細胞の全体又は一部への導入遺伝子の安定な組み込みにより、その生殖細胞系配列に安定な変化を含むことが好ましい。
【０１０９】
薬の効力は標的組織に到達する薬の量及び該標的に対しその化合物が持つ親和性に依存する。同様に、薬の毒性は攻撃されやすい組織に到達する薬又はその代謝物の量に依存する。薬は、身体組織に薬を送達するため通常、血液、血清、脳脊髄液及びリンパ液などの、これらに限定されないが、循環液を用いる種々の技法（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、経口、皮下）により投与できる。幾つかの薬を代謝するポリペプチドは循環液内に存在し、この循環液は薬及びその代謝物の両者の半減期に影響を与えることができる。毒性を決定しそして効力に寄与できるのは該薬それ自体ではなく二次代謝物であることがしばしばある。一般に、代謝には二つのタイプが起こり得る。フェーズＩ代謝は通常酸化、還元又は加水分解によりこの分子の極性を増加させる。そしてフェーズII反応は該薬への内因性基質の何らかの結合が起こるという点で合成的である（例えば、アセチル化については、表１及びギルマンら（編），1985，The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan Publishing Co., New York を参照）。しかしながら、薬代謝における種差が起こり得る。例えば、フェーズII反応では、ラットでグルクロニド形成が硫酸化よりも優先しており、一方イヌ及びヒトでは、例外も起こるが硫酸化が優先する（リン及びルー，1997,Pharmacol. Rev. 49: 403-449) 。薬の代謝における周知の差は、アモバルビタールのヒドロキシル化がヒト、イヌ、モルモット、ラット、ハムスター、及びマウスの間で一貫した特徴であるにもかかわらず、Ｎ−グルクロニド形成はヒト特異的であり、一方ジオール誘導体の形成は研究されたヒト以外の種でのみ起こるようにみえるということである（タングら，1980，Canadian J. Physiol. Pharmacol. 58: 1167-1169)。薬の代謝には無数の酵素が関与し、これらには幾つかのチトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）イソ型、エステラーゼ、アセチル−トランスフェラーゼ、アセチラーゼ、グルクロノシル−トランスフェラーゼグルクロニダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ及びさらに多く（例えば、表１を参照）が含まれる。通常、異なる種由来の薬を代謝するポリペプチド同族体の間には構造的相違があり、これはそれらの基質特異性を含むそれらの薬代謝能力に影響し得る。こうして、一つの実施態様では、外来性ポリペプチドは薬を代謝するポリペプチドである。このタイプの好ましい外来性ポリペプチドには、脱アルキル化反応（Ｏ−又はＮ−結合）、脱アミノ化反応、デスルフレーション（desulphuration) 、ヒドロキシル化（脂肪族又は芳香族側鎖）、ヒドロキシル化（Ｎ−結合）及びスルホキシド誘導体化を含むがこれらに限定されない酸化反応、アセチル化、グルクロニド形成、グリシン・コンジュゲーション、メチル化（Ｏ−，Ｎ−，又はＳ−結合の）、及び硫酸コンジュゲーションを含むがこれらに限定されないコンジュゲーション反応、エステル又はアミドのの加水分解を含むがこれらに限定されない加水分解反応、並びにアゾ基又はニトロ基の還元的代謝を含むがこれらに限定されない還元的代謝から選択される反応を促進し又は触媒するポリペプチドが含まれる。とりわけ好ましい実施態様では、薬物を代謝するポリペプチドはチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）である。これは、ＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３及びＣＹＰ４を含むがこれらに限定されないＣＹＰ群から適切に選択される。このタイプの好ましい実施態様では、外来性ポリペプチドはヒト又はヒト様のＣＹＰ亜群又はハロタイプである。これはＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ４Ａ９又はＣＹＰ４Ａ１１から選択されることが好ましいが、常にそうとは限らない。内因性ＣＹＰ群の発現は変化せず又は破壊されずに残る。このタイプの特に好ましい実施態様では、ＣＹＰはＣＹＰ３Ａ４である。別の好ましい実施態様では、該薬物を代謝するポリペプチドはウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である。
【０１１０】
薬物を代謝するタンパク質及び遺伝子の他の例には、多剤耐性（ＭＤＲ）群及び多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）群が含まれる。例えば、ヒトのＭＤＲ−１遺伝子は、本来細胞内に蓄積する薬物の量を制限する薬物流出ポンプとして働くＰ−糖タンパク質をコードする。ＭＲＰ−１は識別可能ではあるが類似の効果を有する。
【０１１１】
循環液も一定の薬物に対し結合親和性を有し、それによりこれらの薬物又はその代謝物の分布、効力及び／又は毒性に影響を与える幾つかのタンパク質（及び他の因子）を含んでいる。典型的には、異なる種から得られるそのような薬物結合ポリペプチドは構造上の差異を有し、それがこれらの薬物結合能力に影響を与え得る。従って、代わりの実施態様では、外来性ポリペプチドは薬物結合ポリペプチドである。このタイプの好ましい実施態様では、該薬物結合ポリペプチドは、通常酸性の薬物若しくは薬物代謝物に結合する血清アルブミンである。この外来性ポリペプチドは、配列番号：２に記載された配列を適切に含むヒトの血清アルブミンであることが好ましい。このタイプの好ましい実施態様では、ヒトの血清アルブミンをコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号：１及び配列番号：３のいずれか一つに記載された配列を含む。このトランスジェニックマウス又はその先祖の内因性血清アルブミンは配列番号：６に記載の配列を含むマウスの血清アルブミンであることが好ましい。マウス血清アルブミンに対する内因性遺伝子は配列番号：５に記載された配列を含む転写物をコードすることが好ましい。その調節ポリヌクレオチドはその内因性遺伝子に関するコード配列の上流に本来配置されるヌクレオチド配列を含むことが好ましい。その調節ポリヌクレオチドは配列番号：７に記載された配列を含むことが好ましい。
【０１１２】
別の薬物結合ポリペプチドはα酸性糖タンパク質（ＡＡＧ，ＡＧＰ又はオロソムコイド，ＯＲＭとしても知られる）であり、これは以下ＡＧＰと呼ばれる。ＡＧＰの血漿濃度は健常個人では０．０２８から０．０９２ｇ／１００ｍＬに及び、炎症、感染又は癌への応答として増加する（ドゥチェＪＣら，1998, J Chromatogr. B Biomed Sci Appl 715: 103-109; ドゥチェＪＣら，2000, Clin Biochem 33: 197-202; ナカムラ H  ら，2000 Biochem Biophys Res Commun 276: 779-784) 。ＡＧＰのレベルはこれらの疾病状態で大きく変化できる、従ってＡＧＰに強く結合する薬物の薬物動態学に大きな影響を与えることができる。ＡＧＰの幾つかの亜群が記述されており、以下ＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３と呼ばれる、２〜３の縦列に配列した遺伝子によりコードされる。一般に、ＡＧＰは中性及び塩基性の化合物と結合するが、その例外も生ずる（リン及びルー，1997，Pharmacol. Rev. 49: 403-449)。従って、別の実施態様では、該薬物結合ポリペプチドはＡＧＰである。このタイプの好ましい実施態様では、外来性ポリペプチドは、ＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３から選択されるヒトＡＧＰである。このヒトＡＧＰ−１（オロソムコイド（ＯＲＭ）−１としても知られる）は配列番号：１４に記載された配列を含むことが好ましい。一つの実施態様では、ヒトＡＧＰ−１をコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号：１３に記載された配列を含む。ヒトＡＧＰ−２（ＯＲＭ−２としても知られる）は配列番号：１６に記載された配列を含むことが好ましい。一つの実施態様では、ヒトＡＧＰ−２をコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号：１５に記載された配列を含む。別の好ましい実施態様では、内因性ＡＧＰの発現は改変される。この内因性ＡＧＰはＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２、ＡＧＰ−３及びＡＧＰ−４から選択されるマウスのＡＧＰであることが好ましい。マウスＡＧＰ−１は配列番号：１０に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−１をコードする内因性遺伝子は配列番号：９に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−３は配列番号：１２に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−３をコードする内因性遺伝子は配列番号：１１に記載された配列を含むことが好ましい。この例では、調節ポリヌクレオチドは該外来性ポリペプチドをコードする遺伝子に関するコード配列の上流に本来位置するヌクレオチド配列を含むことが好ましい。この調節ポリヌクレオチドはそれぞれヒトＡＧＰ−１及びＡＧＰ−２の上流に本来位置する調節ポリヌクレオチドに相当する配列番号：２１及び／又は配列番号：２２に記載された配列を含むことが好ましい。
【０１１３】
薬物結合タンパク質も特定の薬物の標的を含みうる。例えば、薬物ヘルセプチン（Herceptin)はヒト（マウスではなく）のＥｒｂＢ２の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、ＥｒｂＢ２を過剰発現する腫瘍の増殖を低減する効果を有する。多くのｍＡｂは最初にマウスで形成されるから、ヘルセプチンやその前駆体である４Ｄ５などの多くのｍＡｂ類が相同的なマウスタンパク質を認識しないのは驚くべきことではない。ヘルセプチンの前臨床試験はヒト腫瘍を持ったヌードマウスの治療を含むものであった。このような研究はヘルセプチンの潜在的心臓毒性を明らかにしない。何故ならマウス組織が発現するＥｒｂＢ２はヘルセプチンにより認識されなかったからである。この薬との関係では、ＥｒｂＢ２は薬物結合タンパク質と考えられ、従ってこの発明はこのような如何なる薬物標的をもこの発明の外来性ポリペプチドだと考える。好ましい実施態様では、本発明はトランスジェニック動物でＥｒｂＢ２のような薬物標的のヒト化を意図する。
【０１１４】
トランスジェニック動物は、標準的トランスジェニック（無差別組み込み）法又は「ノックイン」（部位特異的）法により作成してもよく、そして宿主の細胞遺伝子、とりわけ導入遺伝子と相同な、類似する、又はそうでなければ導入遺伝子の少なくとも一部に相当する宿主遺伝子の破壊と関連しうる。好ましい実施態様では、非ヒト起源、例えば非ヒト霊長類などのヒトに似た動物から一つ以上の遺伝子又はその部分を誘導することが好ましいが、この導入遺伝子の核酸配列は通常ヒト起源からのものである。または、この導入遺伝子は合成ポリヌクレオチド及び／又はヒトのポリヌクレオチド及び／又は他の起源由来のポリヌクレオチド配列のハイブリッド／キメラであってもよい。
【０１１５】
目的の導入遺伝子は薬物結合及び／又は薬物代謝と関連するポリペプチドをコードするその能力について選択される。１個の胚に挿入するため一つ以上の導入遺伝子を同時に使用することは本発明の範囲内にはいる。
【０１１６】
トランスジェニック動物は哺乳動物であることが好ましい。この哺乳動物はネズミ目の動物から選択することが好ましい。好ましいトランスジェニック哺乳動物はマウスであるが、ラットもとりわけ有用である。しかしながら、本発明はこれらの種には限定されないことが理解されるであろう。例えば、トランスジェニック動物はヒト化されたイヌ若しくはモルモットであってもよい。
【０１１７】
本発明のトランスジェニック動物を作成するために有用な配列には、発現の調節に関与する特定のポリペプチド又はドメイン、イントロン、及び隣接する５’及び３’非コードヌクレオチド配列をコードするオープンリーディングフレームが含まれるが、これらに限定されない。目的のポリペプチドをコードする核酸配列はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ又はそれらの断片であってもよい。
【０１１８】
目的のゲノム配列はタンパク質をコードする領域、例えばリストされた配列で規定されたような領域を含み、そして本来の染色体に正常では存在するイントロンのいずれか若しくは全てを含んでもよい。成熟ｍＲＮＡで見出される３’及び５’非翻訳領域をさらに含んでもよい。
【０１１９】
プロモーター及び他の調節因子を含む調節ポリヌクレオチドも本発明を実施する際に使用される。一部の適用では、受容する動物と同じ種に由来する調節因子を使用することが好ましい。別の適用、とりわけ、トランスジェニック動物における遺伝子発現のパターンが他の動物のそれとより類似することが要求される場合では、該他の動物の調節因子、又は該他の動物に似ている調節因子、又はこのような調節因子とトランスジェニック動物の調節因子の混合物を使用することが好ましいことがある。従って、ヒトに一層似た遺伝子発現のパターンが要求される好ましい実施態様では、ヒト調節因子又はヒトに似た調節因子又はヒト調節因子と宿主の調節因子の混合物を使用することが好ましいことがある。この調節因子は、約１〜約１０ｋｂの長さの、受容するゲノムに挿入されるべき宿主哺乳動物遺伝子又は対応するヒト遺伝子の領域をコードするｍＲＮＡの５’の上流の配列及びおそらくは３’の下流の配列に相当するゲノム配列を必ずではないが典型的には含むことが好ましい。遺伝子の５’非翻訳配列、３’−非翻訳配列及びタンパク質をコードする配列を含む他の調節因子は、イントロン又はエキソン中に配置されてもよい。こうして、調節ポリヌクレオチドは、転写制御配列及び／又は翻訳制御配列及び／又は他の転写後制御配列を含むことが好ましい。この調節ポリヌクレオチドには、プロモーター配列、５’非コード領域、転写調節タンパク質又は翻訳調節タンパク質に対する機能的結合部位などのシス調節領域、上流のオープンリーディングフレーム、転写開始部位、翻訳開始部位、及び／又はリーダー配列、終止コドン、翻訳停止部位及び３’非翻訳領域をコードするヌクレオチド配列が含まれるがこれらに限定されない。３’非翻訳配列は、ポリアデニル化シグナル及びｍＲＮＡのプロセシング又は遺伝子発現を行なうことができる任意の他の調節シグナルを含むＤＮＡセグメントを含む遺伝子の部分を指す。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端にポリアデニル酸部分の付加を行なうことを特徴とする。ポリアデニル化シグナルは、標準的な形である５’ＡＡＴＡＡＡ−３’への相同性の存在により通常認識され、極めて近く（一般にＡＡＴＡＡＡから２０〜６０ヌクレオチド）にＴ豊富又はＧＴ豊富な配列を含むが、変異は稀ではない。この３’非翻訳調節ＤＮＡ配列は約５０から１０００ヌクレオチド塩基対までを含むことが好ましく、ｍＲＮＡ切断シグナル又は転写終結配列、並びにポリアデニル化シグナルに加えた翻訳終結配列及びｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現を行なうことができる任意の他の調節シグナルを含んでもよい。当分野で知られている構成プロモーター又は誘導プロモーターは本発明で意図される。これらのプロモーターは天然に生じるプロモーター、又は一つ以上のプロモーターの要素を結合するハイブリッドプロモーターのいずれでもよい。本発明により意図されるプロモーター配列は導入される宿主細胞にとって天然のものであってもよく、又はその領域が宿主細胞内で機能する場合は代替的起源から誘導してもよい。本発明で使用されるポリヌクレオチドは目的のポリペプチド又は適当な場合はそのドメインの全部又は一部をコードすることがある。ＤＮＡ配列の断片は従来法に従ってオリゴヌクレオチドを化学的に合成することにより、制限酵素消化により、ＰＣＲ増幅（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，９６５，１８８号、及びアウスベルら（「分子生物学の現代のプロトコール」，John Wiley & Sons Inc, 1994-1998) 又はロング・テンプレートＰＣＲシステム（ベーリンガー・マンハイム，インディアナポリス，インディアナ州、スキアダス J. ら 1999, Mammalian Genome 10: 1005-1009)及び「インバースＰＣＲ」（例えば、アキヤマ K. ら 2000, Nucleic Acids Research 28(16)e77 i-viにより記載されたもの) などの長距離ＰＣＲ技術を含むそれらの改良法により、又は例えば米国特許第５，４２２，２５２号に記載されたような鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、例えばリューら（1996，J. Am. Chem. Soc. 118: 1587-1594及び国際出願 WO 92/01813) 及びリザルディら（国際出願 WO 97/19193) に記載されたようなローリング・サークル複製（ＲＣＲ）、例えばスークナナンら（1994, Biotechniques 17: 1077-1080)  により記載されたような核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び例えばタイアギら（1996, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 93: 5395-5400) に記載されたようなＱ−βレプリカーゼ増幅法などの任意の他の核酸増幅法により得てもよいが、これらに限定されない。大部分については、ＤＮＡ断片は少なくとも１０ヌクレオチド、通常は少なくとも１８ヌクレオチドである。このような小さなＤＮＡ断片はＰＣＲ又は他の核酸増幅法、ハイブリダイゼーションスクリーニングなどのためのプライマーとして有用である。より大きなＤＮＡ断片、即ち１００ヌクレオチドより大きな断片はコードされたポリペプチド又はその部分の生産に有用である。ＰＣＲなどの増幅反応に使用するためには、一対のプライマーが使用される。一例として、目的のＤＮＡセグメントの５’末端及び３’末端の領域に相当するプライマーが化学的に合成され、目的のセグメントを形成させ且つ増幅させるために、鋳型としてのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡと共にＰＣＲ反応で使用される。
【０１２０】
３．核酸構築物
本発明は、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成するための核酸構築物又はベクターであって、該構築物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むものであり、該外来性ポリペプチドが該他の動物で本来発現されるものである核酸構築物又はベクターを提供する。特に好ましい実施態様では、この導入遺伝子はヒト起源のポリヌクレオチド又はヒト様ポリヌクレオチド又は他の等価物を含む。
【０１２１】
一つの実施態様では、上記核酸構築物は該導入遺伝子を挟む二つの領域であって、該非ヒト動物のゲノムの部分と十分に相同的であるため該部分と相同組換えを受ける領域を含む標的に向かうベクターである。このタイプの好ましい実施態様では、該部分は非ヒト動物のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の両側の配列又は内因性遺伝子に含まれる配列を含み、そのポリペプチドは該外来性ポリペプチドの対応する相同体である。この導入遺伝子は外来性ポリペプチドをコードする該配列に機能しうるように連結した調節ポリヌクレオチドを含むことが好ましい。上記標的に向かうベクターは選択可能なマーカー遺伝子を含むことが好ましい。
【０１２２】
相同組換えのための標的に向かうベクターは目的の外来性遺伝子又は異種の遺伝子の少なくとも一部を含み、そして標的遺伝子座に相同な領域を含む。無差別組み込みのためのＤＮＡベクターは、組換えを媒介するための相同な領域を含む必要はない。正の選択及び負の選択のためのマーカーを含めるのが便利である。標的化された遺伝子の相同組換えによる改変を受けた細胞を形成させる方法は当分野で知られている。哺乳動物細胞をトランスフェクトする種々の方法についてはケオウンら（1990, Methods in Enzymology 185: 527-537) を参照せよ。
【０１２３】
標的非ヒト細胞又は受容体非ヒト細胞（例えば、ＥＳ細胞）の染色体に存在する内因性遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子の中に導入遺伝子を相同組換えさせるために、領域は十分な長さをもち該ゲノムの部分と十分な相同性をもつように選択されることが好ましい。この領域は、挿入が意図された宿主ゲノムの部位に相同なＤＮＡの約１〜１５ｋｂを含むことが好ましい（用いられる量が内因性遺伝子中への相同組換えを可能とするのに十分である限り、１５ｋｂを越えるか又はその１ｋｂ未満の内因性遺伝子配列も使用されうる）。
【０１２４】
この核酸構築物は選択可能なマーカー遺伝子を含むことが好ましい。好ましい実施態様では、該核酸構築物は、非ヒト動物のゲノムの部分との相同組換えを受けるのに十分に該部分と相同な領域により両側を挟まれた選択可能なマーカー遺伝子を含む標的に向かうベクターである。一つの実施態様では、このゲノムの部分は非ヒト動物のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の両側の配列又は内因性遺伝子の内部の配列に相当し、そのポリペプチドは該外来性ポリペプチドの対応する相同体である。この例では、標的に向かうベクターは内因性遺伝子を破壊するように改変される。
【０１２５】
この核酸構築物は二つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含んでもよい。この選択可能なマーカーは、該選択可能なマーカーを発現する細胞に抗生物質又は薬に対する耐性を与える酵素活性をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。選択可能なマーカーは「正」であってもよい。正の選択可能なマーカーは通常優性な選択可能マーカーであり、即ち、全ての動物、好ましくは哺乳動物の細胞又は細胞系統（ＥＳ細胞を含む）中で検出できる酵素活性をコードする遺伝子である。優性な選択可能マーカーの例としては、薬Ｇ４１８に対する耐性を動物細胞に与える細菌のアミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ハイグロマイシンへの耐性を与える細菌のハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子、及びミコフェノール酸の存在下で増殖する能力を与える細菌のキサンチン−グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子とも呼ばれる）が挙げられる。選択可能なマーカーは「負」であってもよい。負の選択可能マーカーは適当な選択性培地中で増殖される場合その発現が細胞に毒性となる酵素活性をコードする。例えば、単純ヘルペスウイルスｔｋ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子は負の選択可能マーカーとして普通に使用される。ガンシクロヴィル（gancyclovir)又はアシクロヴィル（acyclovir)の存在下で増殖した細胞中でのＨＳＶ−ｔｋの発現は毒性であり、従って、ガンシクロヴィル又はアシクロヴィルを含む選択培地中での細胞の増殖は機能的なＨＳＶ・ＴＫ酵素を発現できる細胞を選択的に排除する。
【０１２６】
二つ以上の選択可能マーカー遺伝子を標的に向かうベクターと共に用いてもよい。この場合、標的に向かうベクターは、導入遺伝子内に正の選択可能マーカー（例えば、ｎｅｏ遺伝子）を、そしてこの導入遺伝子を挟む外側の領域の一つ以上に負の選択可能マーカー（例えば、ＨＳＶ−ｔｋ）を含むことが好ましい。正の選択可能マーカーの存在は、該標的に向かうベクターの組み込まれたコピーを含む受容細胞の選択を、この組み込みが標的部位で起ころうと無作為部位で起ころうと、可能とする。負の選択可能マーカーの存在は標的化された部位（即ち、該標的部位中への相同組換えにより組み込まれた部位）に標的に向かうベクターを含む受容細胞の同定を可能とする。負の選択可能マーカーの発現を選択的に排除する培地で増殖した場合に生き残る細胞は負の選択可能マーカーのコピーを含まない。
【０１２７】
本発明の標的に向かうベクターは「置換型」であることが好ましい。置換型ベクターの組み込みは標的遺伝子中への選択可能マーカーの挿入を結果として生ずる。本明細書で証明するように、標的に向かう置換型ベクターは無効な対立遺伝子（即ち、機能的なタンパク質を発現することができない対立遺伝子、無効な対立遺伝子はコード領域の一部の欠失、遺伝子全体の欠失、挿入の導入、及び／又はフレームシフト突然変異などにより形成されうる）の形成を結果として生ずる遺伝子の破壊のために用いられ、又は遺伝子に変更を加えるため又は遺伝子の一部又は全部を置換するために用いられうる。この方法は動物の内因性遺伝子又は野性型遺伝子を破壊したい場合に使用してもよい。
【０１２８】
または、標的に向かうベクターはリコンビナーゼ系を含んでもよい。この系は導入遺伝子の遺伝子組換えを触媒するリコンビナーゼの発現を可能とする。この導入遺伝子はリコンビナーゼの認識配列により両側を挟まれており、一般にリコンビナーゼ活性を発現する細胞中で切断されるか又は逆転される。例示的な実施態様では、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ−ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（ラスコら，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236、オーバンら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6861-6865）又はサッカロミセス・セレビシエのＦＬＰリコンビナーゼ系（オ' ゴルマンら，1991，Science 251: 1351-1355、国際公開 WO 92/15694）のいずれかがイン・ビボ部位特異的遺伝子組換え系を形成するために用いることができる。ＣｒｅリコンビナーゼはｌｏｘＰ配列の間に配置された介在する標的配列又は導入遺伝子の部位特異的組換えを触媒する。ｌｏｘＰ配列はＣｒｅリコンビナーゼが結合する３４塩基対のヌクレオチド反復配列であり、Ｃｒｅリコンビナーゼにより媒介される遺伝子組換えに必要である。ｌｏｘＰ配列の向きはＣｒｅリコンビナーゼが存在する場合に介在する導入遺伝子が切断されるか逆転されるかを決定する（アブレムスキーら，1984, J. Biol. Chem. 259: 1509-1514)。ｌｏｘＰ配列が直接反復として方向付けされている場合は導入遺伝子の切断を触媒し、ｌｏｘＰ配列が逆の反復として方向付けされている場合は導入遺伝子の逆転を触媒する。
【０１２９】
本明細書の非ヒトトランスジェニック動物を作成する際に使用されるベクターは、受容体の非ヒト動物細胞中へのその挿入の前又は後に該ベクターの最適機能化に有用な他の因子を含んでもよい。これらの因子は当業者に良く知られており、例えば、サムブルックら，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，1989に記載されている。該ベクターの導入遺伝子成分は、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）などのプラスミドベクター内で組み込まれ、標的細胞の形質転換の前に、このプラスミドＤＮＡから単離されることが好ましい。
【０１３０】
哺乳動物胚を形質転換するために使用されるベクターは当分野で良く知られた方法を用いて構築される。これらの方法には、例えば、サムブルック，フリッチュ及びマニアティス編，Molecular: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]) に記載されたような制限エンドヌクレアーゼ消化、連結、プラスミド、ＤＮＡ及びＲＮＡ精製、ＤＮＡの配列決定などの標準的手法が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３１】
４．本発明のトランスジェニック動物を作成する方法
本発明のトランスジェニック動物は胚幹（ＥＳ）細胞中に標的に向かうベクターを導入することにより形成することが好ましい。ＥＳ細胞は適当な条件（エバンスら，1981，Nature 292: 154-156 、ブラドレーら, 1984, Nature 309: 255-258 、ゴスラーら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065-9069、及びロバートソンら, 1986，Nature 322: 445-448 ）の下でイン・ビトロで移植前の胚を培養することにより得ることができる。  導入遺伝子は、電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈殿法、プロトプラスト融合又はスフェロプラスト融合、リポフェクション、及びＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションを含む当分野で知られた様々な方法を用いたＤＮＡトランスフェクションによりＥＳ細胞中に効率的に導入することができる。導入遺伝子はレトロウイルスにより媒介される形質導入又はミクロインジェクションによりＥＳ細胞中に導入してもよい。このようなトランスフェクトされたＥＳ細胞はその後胚盤胞期の胚の胞胚腔中にそれらが導入された後胚をコロニー形成して、生ずるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する。総説としては、ジェニッシュ（1988, Science 240: 1468-1474）を参照せよ。トランスフェクトされたＥＳ細胞を胞胚腔中に導入する前に、トランスフェクトされたＥＳ細胞を種々の選択計画に付して、導入遺伝子がこのような選択手段を持つことを前提に該導入遺伝子を組み込んだＥＳ細胞を濃縮してもよい。または、該導入遺伝子を組み込んだＥＳ細胞をスクリーニングするためにポリメラーゼ連鎖反応を使用してもよい。この手法により、胞胚腔中に移送する前に適当な選択条件の下でトランスフェクトされたＥＳ細胞を増殖させる必要性がなくなる。
【０１３２】
トランスジェニック動物を形成する代替的方法は当業者に知られている。例えば、トランスジェニック動物を作成するため、導入遺伝子を導入するのに種々の発生段階の胚細胞を用いることができる。胚細胞の発生の段階に応じて異なる方法が使用される。接合体、とりわけ前核段階の接合体（即ち、雄性前核及び雌性前核の融合の前）は、ミクロインジェクションの好ましい標的である。マウスでは、雄性前核は直径約２０マイクロメータの大きさに達する。これは１〜２ピコリットル（ｐｌ）のＤＮＡ溶液の再現可能な注射を可能とする。遺伝子移送の標的として接合体を使用することは、多くの場合注入されたＤＮＡが最初の切断の前に宿主ゲノムの中に組み込まれる点で大きな利点を有する（ブリンスターら，1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442) 。その結果、非ヒトトランスジェニック動物の細胞は全て組み込まれた導入遺伝子を保持することになる。これは一般に創始細胞の子孫への導入遺伝子の効率的移送にも反映される、というのは生殖細胞の５０％が導入遺伝子を保持するからである。接合体のミクロ−インジェクションは導入遺伝子の無差別組み込みにとって好ましい方法である。米国特許第４，８７３１９１号は接合体のミクロ−インジェクションの方法を記載する。
【０１３３】
レトロウイルス感染も非ヒト動物に導入遺伝子を導入するために使用できる。発生中の非ヒト胚は、胚盤胞期までイン・ビトロで培養できる。この期間に、分割球はレトロウイルス感染の標的となることができる（ヤネニッヒら，1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 1260-1264) 。分割球の効率的な感染は酵素処理して透明帯を除去することにより得られる（ホーガンら，1986，マウス胚の操作, Cold Spring Harbor Laboratory Press ，プレインビュー, N.Y.) 。導入遺伝子を導入するために使用されるウイルスベクター系は通常導入遺伝子を保持する複製に欠陥のあるレトロウイルスである（ヤーネル，D.ら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6927-6931、バンデアプッテンら, 1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152) 。レトロウイルス感染はウイルス生産細胞の単層の上で分割球を培養することにより容易且つ効率的に得られる（バンデアプッテン，上掲、スチュワートら，1987，EMBO J. 6: 383-388) 。または、感染は後期で行なうことができる。ウイルス又はウイルス生産細胞を胞胚腔中に注入できる（ヤーネル，D.ら, 1982, Nature 298: 623-628)。創始細胞の大部分はその導入遺伝子についてモザイクとなる。何故なら組み込みはトランスジェニック動物を形成する細胞の部分集合でのみ起こるからである。さらに、創始細胞は子孫で一般にセグリゲートすることになるゲノム中の異なる位置において該導入遺伝子の種々のレトロウイルスの挿入を含むことがある。さらに、妊娠中期（midgestation) の胚の子宮内レトロウイルス感染により生殖系中に導入遺伝子を導入することも可能であるが、効率は低い（ヤーネル，D.ら, 1982, 上掲）。当分野で知られた、レトロウイルス又はレトロウイルスベクターを用いてトランスジェニック動物を作成するさらなる手段には、受精卵又は初期胚の卵黄周囲腔中にレトロウイルス粒子又はレトロウイルスを生産するマイトマイシンＣ処理細胞をミクロ−インジェクションする方法が含まれる（国際公開 WO90/08832 及びハスケルとバウエン, 1995, Mol. Reprod. Dev. 40: 386)。
【０１３４】
本発明を実施するため任意の哺乳動物種の系統を選択する際、これらは胚の収率、胚中での前核の見易さ、生殖適合性、トランスジェニック子孫の色選択性又はＥＳ細胞クローンの利用可能性などの基準により選択しうる。例えば、もしトランスジェニックマウスを作成したい場合、Ｃ５７／Ｂ１６又は１２９が使用しうる。
【０１３５】
胚を得るためそして代理宿主として働くために用いられる哺乳動物の年齢は使用する種の関数である。例えば、マウスを使用する場合、思春期前の雌が好ましい、何故ならこれらはより多くの胚を作りそしてホルモン注射により良く反応するからである。
【０１３６】
ホルモン又は他の化合物の投与は卵生産、交配及び／又は胚の移植に適する雌を準備するために必要であることがある。通常、欲情した雌（即ち、受精しうる卵を生産している雌）を種畜の雄と交配させ、その結果受精した胚を導入遺伝子（単数又は複数）を導入するため取り出す。または、卵と精子を適当な雌及び雄から取得し、イン・ビトロ受精のために使用して導入遺伝子の導入に適する胚を作成してもよい。
【０１３７】
通常、受精した胚は、前核が現れるまで適当な培地中でインキュベートする。ほぼこの時期に、目的の導入遺伝子を含む外因性の核酸配列が雄性前核又は雌性前核の中に導入される。マウスのような一部の種では、雄性前核が好ましい。
【０１３８】
核酸の導入は、例えばミクロインジェクションなどの当分野で知られた任意の手段により達成しうる。胚への核酸の導入の後、その胚は代理宿主に再移植する前に種々の長さの時間イン・ビトロでインキュベートしてもよい。一つの普通の方法はイン・ビトロで１〜７日間上記の胚をインキュベートし、次いでそれを代理宿主中に再移植することである。
【０１３９】
再移植は標準的方法を用いて実施される。通常、代理宿主には麻酔をかけ、上記の胚を輸卵管中に挿入する。特定の宿主中に移植される胚の数は異なることになり、通常該種が天然で生産する子孫の数に匹敵するか又はそれより高くなる。代理宿主のトランスジェニック子孫は任意の適当な方法で導入遺伝子の存在についてスクリーニングしうる。スクリーニングは、該導入遺伝子の少なくとも一部（及び／又は導入遺伝子の両側の領域）に相補的なプローブを用いたサザン分析又はノーザン分析により、又は導入遺伝子の部分（及び／又は導入遺伝子の両側の領域）に相補的なプライマーを用いるＰＣＲにより実施してもよい。該導入遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体を用いるウェスタンブロット分析をスクリーニングのための代替的又は付加的な方法として用いてもよい。
【０１４０】
導入遺伝子の存在を評価する代替的又は付加的な方法には、酵素検定法及び／又は免疫学的検定法、特定のマーカー又は酵素活性のための組織学的染色などの適当な生化学的検定法が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４１】
トランスジェニック哺乳動物の子孫は、トランスジェニック哺乳動物を適当な相手と交配させることにより、又はトランスジェニック哺乳動物から得た卵子及び／又は精子を用いてイン・ビトロ受精を行なうことにより得てもよい。イン・ビトロ受精を用いる場合、受精した胚は代理宿主中に再移植するか、又はイン・ビトロでインキュベートするか又はその両方を行なう。トランスジェニック子孫を作成するために交配が用いられる場合、このトランスジェニック哺乳動物は親の系統へ戻し交雑することがあり、そうでなければ純粋種となり又は他の所望の遺伝的特性を有する哺乳動物との交雑種となることがある。これらの子孫は上述の方法又は他の適当な方法を用いて該導入遺伝子の存在について評価されうる。
【０１４２】
前記の議論はトランスジェニック動物を作成するための幾つかの方法を参照してなされたが、本発明はこれらの方法のいずれか一つに基礎を置くものでもそれに限定されるものでもない。そうではなくて、上に広く述べたようにその生殖細胞又は体細胞が導入遺伝子を含む遺伝的に改変された動物を作成するための適当な手段をすべて意図することが理解されるべきである。
【０１４３】
５．遺伝的に改変されたマウスの使用
本発明のトランスジェニック動物は、それが誘導された標準的動物の代わりに、又はそれに加えて用いられる。例となる手法のリストを以下に示すが、それは本発明のトランスジェニック動物の様々な利用を記述する。これらの手法には、薬物動態学的検定法、薬力学的検定法（効力の測定を含む）、毒性学的検定法、並びに吸収、分布、分泌及び代謝の研究が含まれる。標準的動物の代わりに使用される場合、トランスジェニック動物はヒトにおける薬の挙動をより正確に予想するデータを提供する。標準的動物に加えて用いられる場合、トランスジェニック動物と標準的動物の間の薬の挙動に関する差異は研究している特定の薬の代謝における導入遺伝子の潜在的役割を示す。
【０１４４】
本発明で記載されたトランスジェニック動物は、正常な動物又は他の遺伝的な改変を有する動物の利用に類似した方法で幾つかの標準的適用に使用できる。以下の一般的な記述は本発明のトランスジェニック動物の可能な利用を例示することを意図するものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。この記述は当業者に知られた一般的検定法の幾つかの可能な修飾を網羅することが意図される。
【０１４５】
例えば、トランスジェニック動物には、種々の可能な経路（静脈内 (iv) 、皮下(sc)、腹腔内(ip)、経口（po) 、筋肉内(im)、鞘内(intrathecially)又は他の非経口経路、又は皮膚、粘膜に適用することにより、又は食餌若しくは飲料水に該物質を入れることにより）により、ある化合物（おそらく放射性同位元素又は蛍光基などの標識を保持する化合物）の種々の用量を投与しうる。通常１群当たりのマウスの数は１〜２０の範囲であるが、実験者が実際の数を決定する。化合物は１回又は多数回投与でき、化合物の混合物は同時又は逐次のいずれかで投与してもよい。記述した分析法は制限することを意図するものではなく、単なる例示である。
【０１４６】
５．１  薬物動態学的検定法
このような検定法はある時間経過にわたって動物の体内での化合物の消失及び代謝を決定する。例えば、本発明のトランスジェニック動物に化合物を投与し、次いで血液、又は他の体液又は組織又は排泄物（尿又は糞）を投与後の異なる時点で集める。化合物（単数又は複数）又はその代謝物の濃度は適当な分析法（例えば、ＨＰＬＣを用いる被験体の分光学的測定）により決定する。次いで、動力学的データは通常グラフやコンピュータ手法により分析される。
【０１４７】
５．２  薬力学的検定法
この検定法は通常ある時間経過にわたって動物の体内における化合物の活性を測定する。投与後、標的に対する化合物（単数又は複数）の活性は「全身」検定（例えば、血圧、呼吸速度、心電図、筋電図、電磁パルスを測定することによる神経活性）を用いるか、又はイメージング技法（例えば、ボジトロン放射分光法、核磁気共鳴イメージング、超音波検査、など）により行なうことができる。該化合物の活性は生化学的手段によっても測定できる。これは該化合物と標的との相互作用の直接測定か又は薬力学的活性の指標となる上流又は下流のマーカーの測定のいずれかを含む。例えば、本発明のトランスジェニック動物に化合物を投与し、次いで血液、又は他の体液若しくは組織、又は排泄物（尿又は糞）を投与後の異なる時点で集める。生体試料中の標的の活性又はマーカーの活性の直接測定は種々の手段（例えば、標的又はマーカーの活性を測定するための酵素検定、標的の豊富さ及び／又は活性のいずれかを測定するためのウェスタンブロット法又はＥＬＩＳＡ法、標的又はマーカーのｍＲＮＡレベルを測定するためのノーザンブロット分析など）により行なうことができる。標的又はマーカーの間接的測定には、種々の分析法（例えば、ＨＰＬＣを用いる被験体の分光学的測定）による基質又は生産物のレベルの測定を含めることができる。薬力学的活性の試験は動物へのチャレンジ（例えば、化学的手段又は機械的手段による人為的血圧の上昇、生理学的変化を促進するため食餌の変化、疾病状態を作成するため外科的介入、感染因子の注入など）をも含めることができる。次いで薬力学的データをグラフ的手段及びコンピュータ手法により通常分析し、しばしば組織中の化合物のレベルに相関させる。薬力学的研究には、疾病の治療における薬の効力の測定が含まれる。例えば、腫瘍増殖を阻害するために又は感染因子を消失させるために必要な用量。
【０１４８】
５．３  吸収、分布、代謝及び排泄（ＡＤＭＥ）の研究
このような研究では、通常動物に放射活性化合物（単数又は複数）を投与する。この化合物の体内への吸収の程度の測定には、薬物動態学的検定法について記述した取り組みを用いることができる。化合物の分布の研究は該化合物の体組織中への分布を決定し、通常全身の組織学的グレードの切片のオートラジオグラフィを使用する。排泄の研究は、薬物動態学的検定法で記述したように、糞又は尿（ただし、胆汁などの抽出された体液を含めることができる）の中の化合物又は代謝物のレベルを測定することにより身体からの化合物の消失の経路を解明する。代謝の研究は動物によって生産される親化合物の代謝物の性質及び量を決定する。それは身体から排泄された代謝物又は体内に残存する代謝物を含む。代謝物の量及び同定には種々の分析法（例えば、質量分析法）を用いることができる。
【０１４９】
５．４  毒性学的検定法
このような検定法はある時間経過にわたって動物の体内の化合物の毒性活性を決定する。これらの検定は通常毒性効果が観察され得ない用量を決定するためマウスの群に同時か逐次のいずれかで段階的に増加する用量を使用する。これらの検定は化合物（単数又は複数）の一回投与又は多数回投与を用いることができ、長期間（通常２週間から２年）続けることができる。投与の後、化合物（単数又は複数）の毒性活性を、病的状態の程度（例えば、該動物の臨床的外観）の肉眼観察によるモニターにより、又は現れる死亡率、体重減少又は一般的活動力（例えば、運動、探索的活動、睡眠時間など）の測定、食物や水の消費量、尿及び／又は糞の外観により決定することができる。化合物（単数又は複数）の毒性活性の測定は「全身」検定を使用することもでき或いはイメージング法（薬力学的検定法について上述した）によることもできる。化合物の毒性活性は生化学的手段（例えば、一般的毒物反応と関連する遺伝子誘導又は遺伝子の生産物の測定、毒物の障害への反応と関連する生体代謝の測定）によっても測定することができる。動物の死又は犠牲の際に分離された体組織の組織学的検討も、循環細胞の数及び特性における血液学的変化と同様に、毒性効果をモニターするために使用することができる。発癌性の研究は化合物処置の間の腫瘍の形成又は癌に移行し易い遺伝的損傷の形成をモニターする。奇形発生の研究は胎児の発生に対する化合物投与の効果を決定する。
【０１５０】
本発明が容易に理解されそして実施されるように、特に好ましい実施態様が非限定的な実施例を用いて以下に記述される。
【実施例１】
【０１５１】
ヒト血清アルブミンが内因性のマウス血清アルブミンに置き代わっているノック−インマウスの取得。
【０１５２】
工程１．ヒトをコードする配列の取得
ヒトアルブミンｃＤＮＡ配列（ＸＭ−０３１３２０）は、ジェンバンク寄託番号ＸＭ−０３１３２０[ 配列番号：３ ]に記載された配列から及びそれに基づいて設計されたプライマーを用いたヒト胎児肝臓のｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲによって得られる。例えば、以下に述べる二つの別々のＰＣＲ反応はＢｓｕ３６Ｉ部位を横切って重なる遺伝子の５’及び３’部分を形成する。Ｂｓｕ３６Ｉで消化した後、この二つの半分を酵素連結によってｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）のような適当なベクター中に結合し、ｎｅｏ遺伝子の平滑末端をＳｍａＩ部位に連結し、ＢａｍＨＩ部位を該遺伝子の３’末端でポリリンカーに連結する。該ＰＣＲ反応の実施には以下のプライマーを使用することができる。
【０１５３】
ヒトＡＬＢｃＤＮＡの５’部分：
前向きプライマー（開始コドンから、重なっているＢｓｔＥII部位＝配列番号：３のヌクレオチド３９−６３）、ＨＡＬＢ１Ｆ＝（5') ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＣ (3') [ 配列番号：２６] 。逆向きプライマー（コード領域の末端から、停止コドン及びＢｓｕ３６Ｉ部位と重なる部分を含む、＝配列番号：３のヌクレオチド１８４３−１８６９の逆向き相補鎖）、ＨＡＬＢ３Ｒ＝（5') ＴＴＡＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＣＴＴＧＣ (3') [ 配列番号：２７] 。この断片をＢｓｔＥII（５’マウス隣接配列の３’末端への結合）及びＢｓｕ３６Ｉ（ヒトＡＬＢ遺伝子の３’部分への結合）で切断する。
【０１５４】
ヒトＡＬＢ遺伝子の３’部分：
前向きプライマー（停止コドンと重なる、Ｂｓｕ３６Ｉ部位及びＨＡＬＢ３Ｒ＝配列番号：３のヌクレオチド１８５５−１８８５）、ＨＡＬＢ５Ｆ＝（5') ＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡＣＡＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＧＣ (3') [ 配列番号：２８] 。逆向きプライマー（第二のポリアデニル化シグナルの３’＝配列番号：３のヌクレオチド２１９７−２２１６の逆向き相補鎖）、ＨＡＬＢ４Ｒ＝（5') ＡＡＣＴＴＡＧＡＡＧＡＧＴＡＴＴＡＡＴＧ (3') ）[ 配列番号：２９ ]。この断片は適当な向き（該ベクターの３’末端に最も近いＳｐｅＩ部位）でｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結し、クローニングし、ＳｐｅＩ及びＢｓｕ３６Ｉで切り出す。ＳｐｅＩ部位はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づく標的に向かうベクターのＳｐｅＩ部位中にクローニングすること、そして５’ＢｓｔＥII部位は上述のヒトｃＤＮＡの５’部分の３’末端に連結することを可能とする。
【０１５５】
ｍＲＮＡをコードする領域（及び効率的なポリアデニル化を促進しうる）を越えて伸びる追加の３’配列は、追加の下流の（ゲノム）配列を含むＨＡＬＢ４Ｒの伸長版を使用することにより得ることができる。例えば、（5') ＴＣＡＴＡＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＴＴＴＡＴＡＡＴＣＣＡＴＡＡＣＴＴＡＧＡＡＧＡＧＴＡＴＴＡＡＴＧ (3') 、即ち配列番号：１のヌクレオチド１８８８９−１８８３０の逆向き相補鎖である。
【０１５６】
代わりのアプローチはヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを配列番号：３内のコード配列に基づいたプローブを用いてスクリーニングすることである。次に、全長アルブミンをコードする配列を標準的分子生物学的手法（例えば、制限酵素消化及び／又はＰＣＲ）を用いて正のクローンから誘導することができる。全長ｃＤＮＡは配列番号：３に記載されたようなヒトＡＬＢｍＲＮＡに相当する。
【０１５７】
工程２．両側に接するマウスゲノム配列の取得
選択枝  Ａ
５’側のマウス隣接配列は、配列番号：７に示され、導入遺伝子の発現を駆動するマウスアルブミンプロモーターを含む。この配列は下記のプロモーターを用いるマウスゲノムＤＮＡのＰＣＲにより得られる。即ち、前向きプライマーとして、配列番号：７（Ｊ０４７３８）のヌクレオチド１−３２、即ち（5') ＡＡＧＣＴＴＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＣＴＧＣＣＴＴＡＧＡＡＧＴＡＡＣ (3') [ 配列番号：３０ ]を用い、逆向きプライマーとして配列番号：７（Ｊ０４７３８）からのヌクレオチド２０３５−２０６５の逆向き相補鎖、即ち（5') ＧＴＧＧＧＧＴＴＧＡＴＡＧＧＡＡＡＧＧＴＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＣ (3') [ 配列番号：３１ ]（マウスアルブミン遺伝子の５’−ＵＴＲ内の）を用いる。
【０１５８】
３’側のマウス隣接配列も、マウスゲノムＤＮＡのＰＣＲにより作成される。前向きプライマーは配列番号：５（ＡＪ０１１４１３）のヌクレオチド１９７３−２００２から誘導される、即ち（5') ＴＴＴＡＡＡＣＡＴＴＴＧＡＣＴＴＣＴＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＣ (3') [ 配列番号：３２ ]（マウスアルブミンｍＲＮＡの３’−ＵＴＲに相当する）である。逆向きプライマーは配列番号：８（Ｊ０５２４６）のヌクレオチド１−２９の逆向き相補鎖である、即ち（5') ＧＴＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＴＴＧＣＴＡＡ (3') [ 配列番号：３３ ]（マウスαフェトプロテイン[ ＡＦＰ ]５’プロモーター領域）である。これはマウスＡＬＢ遺伝子の下流約１２．６ｋｂにある領域に相当する。こうして、記述されたＰＣＲ反応はマウスＡＬＢ遺伝子の３’側に直ちに続く領域に相当する約１２．６ｋｂの増幅体を形成する。この増幅体は標的に向かうベクターの構築に直接使用することができる。または、この増幅体はより小さな３’側隣接配列（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）のようなベクター中にサブクローニングし、制限酵素消化を行なうことにより）を誘導するために使用できる。より小さな隣接領域は、大きなゲノムコード配列を利用する場合、しばしば好ましい。
【０１５９】
選択枝  Ｂ
マウスアルブミン遺伝子（配列ＩＤ c077802366)の最初の１１エキソンを覆う１５２９５ｂｐのコンティグ（contig) は図１に図式的に例示してあり、その配列は配列番号：３４に記載されている。このコンティグには、プロモーター配列の大部分を含むこの遺伝子の上流約２ｋｂも含まれる。マウスのプロモーター領域とこのコンティグの位置３５３−２３８２からのマウスアルブミン遺伝子の５’ＵＴＲを覆う５’腕は、下記のプライマー及び鋳型としてマウスゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲにより形成される。この断片は適当な向き（ベクターの５’末端に最も近いＳａｃII部位）でｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ中に連結され、クローニングされ、ＮｏｔＩ及びＢｓｔＥIIで切り出される。そのＮｏｔＩ部位はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づく標的に向かうベクターのＮｏｔＩ部位にクローニングすることを可能とし、３’ＢｓｔＥII部位は上述のヒトアルブミンｃＤＮＡの５’末端に連結することを可能とする。この５’横腹はｃＤＮＡの両半分と共に、ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩで切断された標的に向かうベクター中に連結される。得られる構築物はマウスプロモーター及びヒトコード領域に連結した５’ＵＴＲ及びヒト３’ＵＴＲを含む。最初の３−６コドンはマウス起源のものであるが、これらのコドンはヒト及びマウスのアルブミンｍＲＮＡと１００％同一である。
【０１６０】
上のＰＣＲ増幅のために有用なプロモーターの例には以下のものが含まれる。即ち
Malb353F (5') ＣＡＴＡＴＡＧＧＡＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧ (3') ( 開始コドンの上流約２ｋｂ＝配列番号：３４のヌクレオチド３５３−３７５）[ 配列番号：３５] 、及び Malb2382R (5') ＧＧＴＴＡＣＣＣＡＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＡＴＡＧＧ (3') [ 配列番号：３６] （これはＢｓｔＥII部位、開始コドン及び５’ＵＴＲの一部と重なる、即ち配列番号：３のヒト配列ヌクレオチド７８−９３の逆向き相補鎖を含むオリゴの５’末端を持つ配列番号：３４のヌクレオチド２３５４−２３９７の逆向き相補鎖）。
【０１６１】
３’腕（該コンティグ中の位置６３１０から位置１３３８２まで）はプライマーとして下記のオリゴを用いてマウスのゲノムＤＮＡのＰＣＲにより形成される。即ち
Malb6310F  (5') ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣ (3') [ 配列番号：３７] 、及び Malb13382R  (5') ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＡＴＴＣＡＣＣＣＡＡＣＣ (3') [ 配列番号：３８] 。
【０１６２】
その結果得られる７ｋｂ断片は、エキソン５の中央から下流にイントロン１０の末端近くまで伸びるが、これをＸｈｏＩ（部位は前向きプライマー中に存在する）及びＳａｌＩ（部位は逆向きプライマー中に存在する）で切断して標的に向かうベクターのＳａｌＩ部位中に連結する。
【０１６３】
相同組換えの後、この標的に向かうベクターはマウスＡＬＢエキソン１〜４をヒトＡＬＢｃＤＮＡで置き換えることができる。これはマウスＡＬＢ遺伝子の残りの欠失していない部分の発現を阻止するポリアデニル化シグナルを含む（図２）。
【０１６４】
代わりの戦略は、マウスアルブミン遺伝子の全体の下流の断片を増幅しこうして全遺伝子座を欠失させる工程を含む。２７７８１ｂｐのマウスコンティグ（配列番号：３９に記載されたようなサンガー・アセンブリＮｏ．F105491 ）を用いて、約７ｋｂの３’腕を増幅するようにプライマーを設計できる。例えば、次のようである。逆向きプライマー、albt9649R  (5') ＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＴＴＣＣＴＣＣ (3') [ 配列番号：４０] 、そして前向きプライマー albt2842F (5') ＡＧＴＡＧＴＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＴＧＡＴＣＣ (3') [ 配列番号：４１] 。
【０１６５】
この逆向きプライマーは配列番号：３９由来のヌクレオチド９６６７−９６４９の逆向き相補鎖である。前向きプライマーは配列番号：３９由来のヌクレオチド２８４２−２８６２である。その結果得られる７ｋｂ断片をＸｈｏＩ（部位は前向きプライマー中に存在する）及びＳａｌＩ（部位は逆向きプライマー中に存在する）で切断し、標的に向かうベクターのＳａｌＩ部位中に連結する。
【０１６６】
工程３．導入遺伝子ベクターの組立て
工程１及び工程２で得られた成分をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）のようなプラスミド内で次の順序で組み立てる。即ち（５’マウス隣接）→（ヒトＡＬＢ）→（ｎｅｏ）→（３’マウス隣接）。ＴＫプロモーターにより駆動されるネオマイシン耐性遺伝子を平滑末端化してＢａｍＨＩ部位の近くの遺伝子の３’末端を持つｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳｍａＩ部位中に連結する。ヒトアルブミンｃＤＮＡを使用する場合、得られるプラスミドを次にＮｏｔＩ／ＳｐｅＩで切断し、マウスプロモーター（５’−ＮｏｔＩ−ＢｓｔＥII−３’）、ヒト遺伝子の５’部分（ＢｓｔＥII・・・Ｂｓｕ３６Ｉ）、及びヒト遺伝子の３’部分（５’Ｂｓｕ３６Ｉ・・・ＳｐｅＩ）を含む５’腕と連結する。次いで、正確な配列を含むクローンをＳａｌＩで切断し、３’腕をその中に連結する。
【０１６７】
３’隣接配列の３’末端にＨＳＶ−ｔｋのような負の選択マーカーを挿入する選択枝があるが、これは相同組換え体（ＨＳＶ−ｔｋを欠失する）を無差別組み込み体（ＨＳＶ−ｔｋを維持しており従ってガンシクロヴィルに感受性である）と識別するのに助けとなる。
【０１６８】
工程４．ＥＳ細胞中への導入遺伝子の挿入
３’腕断片を正しい向きで挿入すると、ユニークなＳａｌＩ部位がこの構築物の３’末端で保存され、ＥＳ細胞に電気穿孔する前に標的に向かう構築物を線状化するために使用できる。次いで、それをマウス胚性幹（ＥＳ）細胞中にトランスフェクトする。これを後に外来性ＤＮＡをその核物質中に組み込んだ細胞を単離するためＧ４１８を含む増殖培地中で選択する（計画の詳細については実施例６及び実施例７を参照）。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を使用する場合も、相同組換えによるのではなく無差別に導入遺伝子を組み込んだ細胞を除去するためガンシクロヴィル中で細胞をさらに選択する。次に個々のクローンを増殖させ、クローンそれぞれを複数のプレート中に分ける。相同組換え体はサザーンブロット又はＰＣＲで確認する。これは該構築物が両端に正確に標的化されることを確実にするため該構築物の両端の外側のサザーンブロットプローブ又は外側のＰＣＲプライマーを用いてスクリーニングすることによりなされる。
【０１６９】
代わりの戦略では、ｎｅｏカセットをｌｏｘＰ部位で挟む。これはＣｒｅ−発現プラスミドを持つＥＳ細胞の一時的トランスフェクションによって除去でき、又はＣｒｅを発現するトランスジェニックマウスと異種交配させることによりマウスの後の世代から除去できる。別の代替的戦略では、ｎｅｏカセットをＦＲＴ部位で挟む。これはＦＬＰ発現プラスミドを持つＥＳ細胞の一時的トランスフェクションにより除去でき、又はＦＬＰを発現するトランスジェニックマウスと異種交配させることによりマウスの後の世代から除去できる。
【０１７０】
工程５．胚盤胞の注入
一つ以上の正確なクローン由来のＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中に注射し、これを次いで擬妊娠マウス中に移植する。移植は解剖顕微鏡を用い麻酔を掛けたマウスに対して行う。擬妊娠雌マウスを 0.017 - 0.020ｍＬ /g 体重のアバーティンの腹腔内注射で麻酔をかける。このマウスを解剖顕微鏡の下に置き、切開部分を７０％エタノールで殺菌する。卵巣を体外に出し、卵巣の周りの滑液包嚢及び輸卵管を注意深く手前に引いて開ける。輸卵管の開口部を露出させるため卵巣と輸卵管を分離する。マウスの胚盤胞を再移植用ピペットの上に載せ、ピペットの先をロート中に数ミリメータ挿入し、輸卵管の中に注ぐ。次いで、この卵巣を腹膜中に戻し、体壁及び皮膚を縫合する。
【０１７１】
工程６．トランスジェニックマウスの選択
ＥＳ細胞と胚盤胞は、キメラ創始（Ｆ0 ) マウスが被毛色で識別できるように、異なるマウス血統から得ることが好ましい。成熟した場合、Ｆ0 マウスを野性型マウスと交配させて標的対立遺伝子の生殖系伝達を取得し、そして所望の遺伝的改変を含むＦ1 マウスが色によって同定され、サザーンブロット及び／又はＰＣＲ及び／又はＤＮＡ配列決定によって確認される。ヘテロ接合体のＦ1 マウスはこれらのマウスの肝臓からＲＮＡを抽出することによりヒトアルブミン遺伝子の発現についてこの段階で検定でき、そしてヒト遺伝子特異的プローブを用いてＲＴ−ＰＣＲ又はノーザンブロット分析により発現を検定することができる。
【０１７２】
トランスジェニックマウスの後の世代はホモ接合性を維持するように育種してヒト血清アルブミンを発現し且つマウス血清アルブミンを発現しないマウスを提供することが好ましい。
【０１７３】
代替的戦略は、マウス５’ＵＴＲを欠くマウスプロモーターをヒト５’ＵＴＲ及びヒト３’ＵＴＲを含むヒトアルブミンｃＤＮＡ全体と融合させる工程を含むであろう。別の代替的戦略はヒトのコード配列をマウスアルブミン遺伝子の５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲと融合させる工程を含むであろう。
【０１７４】
代わりの戦略では、標的に向かうベクターはヒトアルブミンｃＤＮＡ配列なしで構築される。この構築物はマウスアルブミン遺伝子を標的に向かわせ、その遺伝子の発現をできなくする（knock out)ために使用される。マウスアルブミンをもはや発現しない標的化された細胞が一旦同定されれば、アルブミン遺伝子座ＲＰ１１−５８０Ｐ２１（配列ＩＤ：ＡＣ１０８１５７）を覆うヒトＢＡＣ（これはチルドレンズ・ホスピタル・オークランド・リサーチ・インスティチュート（ＣＨＯＲＩ）から入手可能である）、はピューロマイシン耐性遺伝子又はハイグロマイシン耐性遺伝子などの選択可能マーカーの５０分の１の量と共にトランスフェクトされる。この細胞を選択し、個々のコロニーを釣り上げ、増殖させ、試料を凍結する。ＤＮＡは個々のクローンから調製し、導入遺伝子の存在及びコピー数についてスクリーニングする。１個のコピーが好ましい。必要ならば、導入遺伝子の組み込み位置を確定し、この組み込みが別の遺伝子を破壊しなかったことを確実にするため標準的手法により逆ＰＣＲを行なうことができる。
【０１７５】
代わりの戦略では、ヒトアルブミン遺伝子座全体を覆う上記のＢＡＣから断片を消化して取り出すことができる。使える酵素は、この遺伝子の最初の上流約８ｋｂ及びこの遺伝子の下流約２ｋｂでＢＡＣを消化するＥｃｏ４７III であろう。この断片はパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により単離でき、選択マーカーと共に適当なベクター中にクローニングし、次いでマウスアルブミン遺伝子が欠失したＥＳ細胞中にトランスフェクトするために使用できるであろう。代わりの方法は、胚注入によるヒトアルブミン遺伝子の無差別組み込みを含み、そして内因性のマウス血清アルブミン遺伝子の破壊とは結びついても結びつかなくてもよい。
-１
【実施例２】
【０１７６】
ヒトＡＧＰが内因性マウスＡＧＰに置き代わっているマウスを取得する工程
相同組換えによるノックアウトマウス遺伝子、次いでヒト遺伝子を無差別に組み込む。
【０１７７】
工程１．マウスＡＧＰ遺伝子座全体をノックアウトするための標的に向かう構築物の設計
マウスにおけるＡＧＰ遺伝子座を覆うＢＡＣ配列を同定した。このＢＡＣはマウスの第４染色体のＢＡＣ２７９（ジェンバンク寄託番号：ＡＦ３３６３７９）である。この領域は位置が決定され４個の遺伝子（又は擬遺伝子）が同定された。これらはこの配列の約９８８８０から１２０９９１まで伸びる領域を覆う。位置８８６８１から位置１３００８０までを覆う４１４００ｂｐの領域はこのＢＡＣ配列から取ることができ、標的に向かう構築物の調製に使用できる。この領域の線状地図は図３に示し、それに関する配列は配列番号：４２に記載する。
【０１７８】
標的に向かうベクターのためのマウスの５’腕及び３’腕はそれぞれその４遺伝子座の５’側領域及びその３’側領域から得られる。これらの配列は鋳型としてＢＡＣ２７９又はマウスゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲにより得られる。有用なプライマーの例を以下に要約する。
（外１）
2004533826.tif 000007
プライマーＡＧＰ５’ＥＸＦ及びＡＧＰ５’ＥＸＲは標的化されたクローンをスクリーニングするための８７７ｂｐの５’外側プローブを増幅する。プライマーＡＧＰ３’ＥＸＦ及びＡＧＰ３’ＥＸＲは標的化されたクローンをスクリーニングするための６１７ｂｐの３’外側プローブを増幅する。
【０１７９】
５’腕の場合には、３．７ｋｂ断片を得るためプライマーＡＧＰ１２Ｆ及びＡＧＰ４９Ｒを用い、そして５．４ｋｂ断片を得るためプライマーＡＧＰ４５Ｆ及びＡＧＰ９９Ｒを用いて、二つの別々のＰＣＲ反応が行なわれる。それぞれの断片をＳｐｅＩ及びＨｉｎｄIII で消化する。ＳｐｅＩ部位はこれらのオリゴヌクレオチドの末端に位置しそしてＨｉｎｄIII 部位は約位置４７００に位置する。これらの二つのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄIII 断片を正しい向きに連結し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＳｐｅＩ部位中にクローニングする。このｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにはｎｅｏ遺伝子がＳｍａＩ部位に平滑末端連結されており、ＢａｍＨＩ部位の近くにｎｅｏ遺伝子の３’末端を有する。この５’腕は８．７ｋｂの長さである。
【０１８０】
３’腕をプライマーＡＧＰ３３９及びＡＧＰ４０３を用いて増幅して各末端にＳａｌＩ部位を持つ６．４ｋｂ断片を得る。この断片を消化し上記のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＳａｌＩ部位中にクローニングする。得られる構築物の線状地図は図４に示す。
【０１８１】
工程２．マウスのＡＧＰ遺伝子座を標的とする
実施例１の工程４のように行なう。
【０１８２】
工程３．ヒトをコードする配列を導入する
選択枝  Ａ  ＢＡＣクローン全体を導入する
ヒトＡＧＰ遺伝子（ＯＲＭ１及びＯＲＭ２）はＢＡＣクローンＲＰ１１−８２Ｉ１の上に位置し、これはカルテク・ヒューマン・ＢＡＣライブラリーＢ・サンガーシーケンシング・センター，ケンブリッジ，ＵＫから入手可能である〔ｂＡ８２Ｉ１，ジェンバンク寄託番号ＡＬ３５６７９６も参照〕。一つの戦略では、ＢＡＣクローン全体又はヒトＡＧＰ遺伝子を含むその大きな断片を、マウスＡＧＰ遺伝子座が上記の構築物の相同組換えにより破壊されているＥＳ細胞のゲノム中に無差別に組み込む（標的に向かうベクター中のヒト配列は含まない）。このＢＡＣを５０分の１の量のピューロマイシン又はハイグロマイシンのような選択可能なマーカーと共にトランスフェクトし、細胞を選択し、個々のコロニーを釣り上げ、増殖させそして凍結する。ＤＮＡは個々のクローンから調製し、導入遺伝子の存在及びコピー数についてスクリーニングする。必要であれば、導入遺伝子の組み込み部位を同定し、この組み込みが別の遺伝子を破壊しなかったことを確実にするため標準的手法で逆ＰＣＲを行なうことができる。
【０１８３】
選択枝Ｂ  ヒトＡＧＰ遺伝子を含むＢＡＣクローンの一部を導入する
代わりの戦略では、ヒトＡＧＰ遺伝子及びこれを挟む配列を含むＢＡＣの領域を、ｎｅｏ以外の選択可能マーカーを含むベクター中にサブクローニングする。ＰＲ１１−８２Ｉ１の一部（ヌクレオチド４８０００−７８０００）はヒトＡＧＰ遺伝子座を含み、その配列は配列番号：１９に記載されている。
【０１８４】
これらの二つの遺伝子の領域の位置は次の通りである。
（外２）
2004533826.tif 000008
所望の断片を増幅するためのＰＣＲプライマーはこのコンティグ（配列番号：１９）から同定することができる。または、関連する断片を切り出すために有用なＲＥ部位はこのコンティグの制限地図から得ることができる。例えば、ＸｂａＩは３０６０、９８８３、１６６００、２９３６８の位置で切断する。
【０１８５】
ＢＡＣクローンＲＰ１１−８２Ｉ１をＸｂａＩで消化すると多数の断片を生ずるが、これらの中には６８２３ｂｐと他方の６７１７ｂｐの二つの断片が存在し、これらは上流の配列の約３ｋｂと共にそれぞれＡＧＰ−１遺伝子及びＡＧＰ−２遺伝子である。この二つの断片をｎｅｏに代わる選択可能マーカーを含む適当なベクターのＸｂａＩ、ＳｐｅＩ又はＮｈｅＩ部位で正しい向きに組み立てる。これらのクローニング部位（及び選択可能マーカー遺伝子）の両脇には、組立てられた（１３．５ｋｂの）ヒトの配列（ＡＧＰ−１遺伝子に対し５’側の配列の約３ｋｂを含む）の除去を容易にする唯一のＲＥ部位（例えば、ＳｇｒＡＩ）がある。
【０１８６】
代わりの戦略では、転写調節因子がさらに上流に伸びる場合にはより多くの５’配列を含むより大きな断片をＢＡＣからサブクローニングすることができる。例えば、配列番号：１９に記載したように、ＸｈｏＩは位置３０７で切断し、ＳｐｅＩは位置１０１２８及び１６９０５で切断する。ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩで消化すると、二つの断片を生じ、これらは適当なベクター中に逐次クローニングでき、従ってＡＧＰ−１遺伝子の５’側の配列の約６ｋｂを含む１６．６ｋｂのゲノム断片が得られる。
【実施例３】
【０１８７】
ノック−アウトマウス遺伝子及び相同組換えによる同じ遺伝子座へのヒト遺伝子の挿入−手順１
好ましい戦略はヒトＡＧＰ配列を標的に向かうマウスＡＧＰベクター中の５’腕とｎｅｏ遺伝子の間に組み込む工程を含む。換言すれば、相同組換えの際、マウスＡＧＰ遺伝子の発現の破壊と同じ遺伝子座にヒトＡＧＰ遺伝子の挿入の両方を行なうノック−インベクターを作成する。この戦略は大きなベクターの構築を必要とする。ｐＢＲ３２２のような低コピー数ベクターは２０ｋｂを越える大きな断片のクローニングをより受け易いという証拠が文献にある。低コピー数は比較的大きなプラスミドの安定性を助ける。連結によらないクローニング手順では、ＣｏｌＥ１由来のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのような高コピーベクターが２５ｋｂまでクローニングでき、一方ｐＢＲ３２２は８０ｋｂまでクローニングできる（リーら 2001, Genomics 73: 56-65)。
【０１８８】
５’及び３’腕を、ｎｅｏ遺伝子及びヒトゲノム断片と共に、ｐＢＲ３２２のような１個のベクター中に正しい向きでクローニングする。クローニングを容易にするため、実施例２Ａに記載したものと比べ上記の腕の大きさを小さくすることが好ましい。
【０１８９】
工程１．ヒトをコードする配列の取得
ＡＧＰ−１及びＡＧＰ−２及び両方のプロモーター領域を含むヒトＡＧＰ遺伝子クラスターを、ヒトゲノムＤＮＡか又は配列番号：１９を含むＢＡＣクローンのいずれかのＰＣＲにより取得する。これはカルテック・ヒューマン・ＢＡＣライブラリーＢ・アンド・サンガー・センター，ケンブリッジ，ＵＫから入手可能であり、クローンＲＰ１１−８２Ｉ１（ｂＡ８２Ｉ１）として同定される。ＰＣＲプライマーは配列番号：１９（ジェンバンク寄託番号：ＡＬ３５６７９６由来の完全なヒトＡＧＰ遺伝子クラスター）からこれに基づいて設計される。実施例１と同様に、所望のヒト配列の５’半分及び３’半分を形成し、次いでこの二つの断片を結合するための好ましい方法は、二つの別々のＰＣＲ反応を含む。適当なプライマーには以下のものが含まれる。
【０１９０】
５’半分（ＡＧＰ１）：前向きプライマー（ＡＧＰ−１翻訳開始コドンの上流の約６ｋｂ）＝配列番号：１９[ ＡＬ３５６７９６] のヌクレオチド４７２８３−４７３１４。即ち、 (5') ＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＣＴＧＧＧＡＴＣＴＣＴＡＣＡＣＴＣＧＡＧＣＡ (3') [ 配列番号：５３ ]。逆向きプライマー（ＡＧＰ−１ポリアデニル化シグナルの３’＝配列番号：１９[ ＡＬ３５６７９６ ]のヌクレオチド５８１１２−５８１４２の逆向き相補鎖）。即ち、 (5') ＣＴＧＣＡＣＡＴＡＣＧＧＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＴＣＡＧ (3') [ 配列番号：５４ ]。
【０１９１】
３’半分（ＡＧＰ２）：前向きプライマー＝配列番号：１９[ ＡＬ３５６７９６ ]のヌクレオチド５８１１２−５８１４２。即ち、 (5') ＣＴＧＡＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＣＣＧＴＡＴＧＴＧＣＡＧ (3') [ 配列番号：５５ ]。（ＡＧＰ−２の翻訳開始コドンの上流約２ｋｂ）。逆向きプライマー（ＡＧＰ−２のポリアデニル化シグナルの３’＝配列番号：１９[ ＡＬ３５６７９６ ]のヌクレオチド６６１３１−６６１５７の逆向き相補鎖。即ち (5') ＣＣＴＴＴＧＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＡＡＣＣＡＴＡＡＡＴＣ (3') [ 配列番号：５６ ]。
【０１９２】
ＰＣＲにより得られた５’側半分及び３’側半分を一緒にスプライスして、マウスゲノムに「ノック−イン」するためのヒトＡＧＰ−１−ＡＧＰ−２導入遺伝子（配列番号：２０）を形成することができる。
【０１９３】
代わりの戦略はＢＡＣクローンであるＲＰ１１−８２Ｉ１（ｂＡ８２Ｉ１）の制限酵素消化によりヒトＡＧＰ遺伝子を取得し、そして以下の工程にそれを用いる工程を含む。または、ＢＡＣクローン全体をマウスの胚にミクロインジェクション（無差別組み込み）し、得られるトランスジェニックマウスを相同組換えを経て形成されたＡＧＰノック−アウトマウスと後に交配させる。このタイプの２工程手順のより詳細については実施例３を参照せよ。
【０１９４】
工程２．両側を挟むマウスゲノム配列を取得する
この実施例では、導入遺伝子はヒトＡＧＰの発現を駆動するヒトプロモーターを含む。従って、ヒトのポリヌクレオチド配列は実施例１の場合のように、マウスプロモーターと機能しうるように結合される必要はない。しかしながら、このマウスＡＧＰ遺伝子を機能的に不活性化させることがさらに好ましい。従って、相同組換えがＡＧＰ−２遺伝子全体、マウスＡＧＰ−１の３’部分、及びマウスＡＧＰ−３の５’部分の欠失を生じさせるように、マウスの５’側隣接配列はマウスＡＧＰ−１の５’部分から構成され、マウスの３’側隣接配列はマウスＡＧＰ−３の３’部分から構成される。このプロモーター及び／又はマウスＡＧＰ１の第一のエキソンの中に小さな突然変異を導入すれば、この遺伝子の機能的破壊が確実になる。
【０１９５】
マウスの５’側隣接配列は、前向きプライマーとして、配列番号：９のヌクレオチド８４−１１１（Ｍ１７３７６，ＡＧＰ−１の５’側隣接配列）、即ち（5') ＣＴＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡＣＴＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＣ（3') [ 配列番号：５７ ]を用いるマウスゲノムＤＮＡのＰＣＲにより得ることができる。逆向きプライマーは配列番号：９のヌクレオチド２９９１−３０２０（Ｍ１７３７６，ＡＧＰ−１のイントロン５）、即ち（5') ＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＧＴＣＴＧＴＡＴＧＧＣＡＧＧＣＣ（3') [ 配列番号：５８ ]の逆向き相補鎖である。得られるＰＣＲ産物は、これは配列番号：９のヌクレオチド８４−３０２０を表すが、次に機能を有するが先端が欠失したマウスのＡＧＰ−１タンパク質が生産されないことを確実にするため標準的手法を用いて重要な部位で突然変異させてもよい。この突然変異は下記のいずれか又は全てを含む。即ち、ａ）ＧＣボックス（配列番号：９のヌクレオチド５４６−５５４）及びＴＡＴＡボックス（配列番号：９のヌクレオチド５６２−５６７）の破壊、ｂ）翻訳開始コドン（配列番号：９のヌクレオチド６３４−６３６）の点突然変異及び好ましくは配列番号：９のヌクレオチド６５８−６６０のＡＴＧの点突然変異も、ｃ）配列番号：９のヌクレオチド６８０をＴからＡへ変化させることによるなどの第一エキソンに停止コドンの導入、である。突然変異を導入する方法の一例は「融合ＰＣＲ」である。これは所望のヌクレオチド不適合を有するプライマー又は突然変異をコードする５’尾部を有するプライマーを利用する。突然変異を含む相補的な前向き及び逆向きプライマーを形成し、別々のＰＣＲ反応で使用する。一方の反応は５’前向きプライマー（この例では、配列番号：９のヌクレオチド８４−１１１）及び突然変異逆向きプライマーを含みその５’側配列のみでなく該突然変異をも形成する。他方の反応は突然変異前向きプライマー及び３’逆向きプライマー（この例では、配列番号：９のヌクレオチド２９９１−３０２０）を含み、その３’側配列のみでなく該突然変異をも形成する。次いで、これら二つのＰＣＲ産物を、５’前向きプライマー及び３’逆向きプライマーを用いる第三の反応で結合させる。アニーリングの途中で、これら二つの異なるＰＣＲ産物は該突然変異を含むそれらの相補的末端で相互にアニーリングし、一方、前向きプライマーと逆向きプライマーは同じハイブリッドの外側の末端を結び付けて所望の突然変異を含む全長のポリヌクレオチドが合成されそしてその後増幅される。
【０１９６】
マウスの３’側隣接配列もマウスゲノムＤＮＡのＰＣＲにより形成される。その前向きプライマーは配列番号：１１のヌクレオチド８９８−９２４（[ Ｓ３８２１９ ]マウスＡＧＰ−３のイントロン１）から誘導される、即ち（5') ＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＴＧＡＡＴＧＣＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣ（3') [ 配列番号：５９ ]である。逆向きプライマーは配列番号：１１のヌクレオチド３４９２−３５２３（[ Ｓ３８２１９ ]マウスＡＧＰ−３のイントロン５）の逆向き相補鎖である、即ち（5') ＣＡＡＧＧＴＡＧＧＴＡＡＧＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＡＧ（3') [ 配列番号：６０ ]である。
【０１９７】
工程３．導入遺伝子の組立て
工程１及び工程２で得られた成分をｐＢＲ３２２のようなプラスミドの中で次の順序で組み立てる。即ち、（マウスの５’側隣接）−（ヒトのＡＧＰ−１）−（ヒトのＡＧＰ−２）−（ｎｅｏ）−（マウスの３’側隣接）である。使用する手法は当業者に周知であり、制限酵素消化、連結及びクローニングが含まれる。上記のプライマーの５’末端に加えられるユニークな制限酵素認識部位はこの手順を促進するのに有用である。
【０１９８】
ＨＳＶ−ｔｋのような負の選択マーカーを５’側隣接配列の５’末端又は３’側隣接配列の３’末端に挿入するのは任意であるが、無差別組み込み体（ＨＳＶ−ｔｋを維持し、従ってガンシクロヴィルに感受性である）と相同組換え体（ＨＳＶ−ｔｋを失っている）を識別するのに助けになる。
【０１９９】
工程４−６
実施例１の通りである。
【実施例４】
【０２００】
ヒトＡＧＰが内因性のマウスＡＧＰを置き代わっているノック−インマウスを取得する
マウス遺伝子をノック−アウトし次いで相同組換えにより同じ遺伝子座にヒト遺伝子を挿入する−手順２。
【０２０１】
工程１．マウスの隣接ゲノム配列を取得し組み立てる
８．７ｋｂの５’腕（上の実施例２Ａで記載）をＳｐｅＩ−ＸｂａＩで消化して５．９ｋｂ断片を得る。この断片はＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含み又は欠いているｐＢＲ３２２又は何らかの他のベクターのＮｈｅＩ部位にクローニングできる。５’側隣接配列の５’末端又は３’側隣接配列の３’末端にＨＳＶ−ｔｋのような負の選択マーカーを挿入することは任意であるが、無差別組み込み体（これはＨＳＶ−ｔｋを維持しており従ってガンシクロヴィルに感受性である）と相同組換え体（ＨＳＶ−ｔｋを失っている）を識別する場合に助けとなる。
【０２０２】
その３’腕（上の実施例２Ａに記載）はＸｈｏＩ−ＳａｌＩで切断すると５０７２ｂｐ断片を生ずる。これをｐＢＲ３２２のＳａｌＩ部位にクローニングする。相同な腕の全長はほぼ１１ｋｂである。これらの二つの腕の間にユニークなＳｇｒＡ１部位がある。これはヒトの配列（以下を参照）にクローニングするために使用できる。または、同じ目的で、人工的プライマーを設計し、ＳｇｒＡ１部位内に挿入してユニークなＮｏｔＩ部位又は何らかの他のユニークなＲＥ部位（単数又は複数）を作成することができる。
【０２０３】
工程２．ヒトのゲノム配列を取得し組み立てる
上記の１３．５ｋｂ又は１６．６ｋｂのヒト配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中に改変された多クローニング部位（ＭＣＳ）と共に連結する。有用なＭＣＳの例には、
ＳａｃＩ−ＳｇｒＡＩ−ＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ−ＸｂａＩ−ＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ−ＳｇｒＡＩ−ＫｐｎＩ、又は
ＳａｃＩ−ＳｇｒＡＩ−ＮｈｅＩ−ＸｂａＩ−ＳｐｅＩ−ｎｅｏ−ＳｇｒＡＩ−ＫｐｎＩが含まれる。
【０２０４】
このようなＭＣＳは合成プライマーをハイブリッド形成させ連結させることにより、又は適当なＲＥ部位を含む伸長プライマーでＰＣＲすることにより形成できる。ＳａｃＩとＫｐｎＩはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにＭＣＳを挿入することを可能とする。ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩはｎｅｏ遺伝子の挿入を可能とする。ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ及び／又はＮｈｅＩは上の実施例２Ａで記載したＲＰ１１−８２Ｉ１（ヒトＡＧＰ遺伝子を含む）のヒト６８２３ｂｐ及び６７１７ｂｐのＸｂａＩ断片の挿入を可能とする。例えば、５’断片をＮｈｅＩ／ＸｂａＩ切断ベクター中に連結し、ＮｈｅＩに５’末端を持つクローンを同定し、ＸｂａＩ／ＳｐｅＩで切断し、次いでその中に３’断片を連結する。ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩは実施例２Ａで記載した１６．６ｋｂのヒト断片の挿入を可能とする。例えば、ＰＲ１１−８２Ｉ１の９８２１ｂｐのＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ断片を同じ酵素で切断したベクター中に連結する。得られるベクターを次にＳｐｅＩで切断し、ＲＰ１１−８２Ｉ１の６７７７ｂｐのＳｐｅＩ断片を挿入して完全な１６．６ｋｂのヒトＡＧＰ配列を組み立てる。ＳｇｒＡＩはヒト配列（ｎｅｏを含む又は含まない）の除去を可能としそしてその後で上記のｐＢＲ３２２系の標的に向かうベクター中への挿入を可能とする。
【０２０５】
ＥＳ細胞でＧ４１８耐性を与えるための真核性プロモーターを有するだけでなく大腸菌でカナマイシン耐性を付与する原核性プロモーターをも含むｎｅｏ遺伝子を利用することも可能である。最後の連結工程が行なわれると、アンピシリン耐性を付与するプラスミド及びカナマイシン耐性を付与する挿入体の両方について選択することはこのような大きなクローンを選択する場合に助けとなる。３０ｋｂの大きさに近いプラスミドの構築を助けるかも知れない他のパラメータはＤＨ１０Ｂのような大きなプラスミドの安定な増殖を支持し低減した抗生物質濃度で又はより低い温度で該クローンを増殖させる高効率エレクトロコンピテント（electrocompetent) 細胞の使用である。
【０２０６】
代わりの戦略は、相同組換えの二つの工程を含む。例えば、最初の標的に向かうベクターはヒトＡＧＰ−１遺伝子を含む６．８ｋｂのヒト断片を含み、次いで標的化の第二ラウンドはハイグロマイシン又はピューロマイシンなどの異なる選択可能マーカーを使用して行なうことができるであろう。上記５’腕は最初の標的化事象の間にノック−インされた６．８ｋｂのヒトＡＧＰ−１遺伝子の全て又は一部となるであろう。そして３’腕は最初の標的に向かう構築物中で使用される同じ３’腕となるであろう。５’腕と抗生物質耐性遺伝子の間に６．７ｋｂのヒトＡＧＰ−２断片が挿入されるであろう。このようにして、二つの遺伝子が標的化の二つのラウンドの間に逐次ノック−インされるであろう。
【０２０７】
他の代替的クローニング戦略は、より大きなヒト配列のクローニングを容易にするためＥＴクローニング（コープランドら，2001，Nature Reviews Genetics 2: 769-779) 又はコスミドベクター若しくはバクミド（bacmid) ベクターの使用を含む。
【０２０８】
工程３．マウスのＡＧＰ遺伝子座を標的化する
実施例１の工程４の通りである。
【０２０９】
工程４．胚盤胞の注入
実施例１の工程５の通りである。
【０２１０】
工程５．トランスジェニックマウスの選択
実施例１の工程６の通りである。
【実施例５】
【０２１１】
ヒトＡＧＰが内因性のマウスＡＧＰに置き代わっているノック−インマウスを取得する
マウス遺伝子をノック−アウトし次いで相同技術を用いて同じ遺伝子座にヒト遺伝子を挿入する。
【０２１２】
工程１．マウスの全ＡＧＰ遺伝子座をノック−アウトするための標的に向かう構築物の設計
標的に向かうベクターは実施例２Ａに記載したものと同じ方法で構築する。ただし、ネオマイシン耐性遺伝子は野性型ｌｏｘＰ部位を持つ一方の端及び突然変異ｌｏｘＰ５１１部位を持つ他方の端で挟まれる点を除く。
【０２１３】
工程２．ヒトゲノム配列を取得し組み立てる
ヒトの遺伝子断片（１６．６ｋｂ又は１３．５ｋｂ）を実施例２Ｃに記載したように別のベクターにクローニングする。ただし、二つの異なるｌｏｘＰ部位が、改変されたＭＣＳ中に、これらがヒト配列を挟むように、ＳｇｒＡＩ部位に直ぐ隣接して且つＳｇｒＡＩ部位（複数）の間に正しい向きで組み込まれる点を除く。この断片の一方の端には野性型ｌｏｘＰ組換え部位がそして他方の端には突然変異ｌｏｘＰ組換え部位（ｌｏｘＰ５１１）が存在するであろう。これらの二つのｌｏｘＰ部位は一緒に組み換えることができないが、ｌｏｘＰ５１１突然変異部位は別のｌｏｘＰ５１１部位と組み換えることができる。
【０２１４】
工程３．マウスのＡＧＰ遺伝子座を標的化する
実施例１のとおり、マウスのＡＧＰ遺伝子座を破壊しそしてｌｏｘＰ部位を挿入するため工程１（上記）に記載された標的に向かうベクターを用いる。標的化されたＥＳ細胞が一旦同定されれば、ヒト断片はＣｒｅリコンビナーゼを用いて極めて効率的な組換え反応で共トランスフェクトでき、ｎｅｏ遺伝子は組換えにより媒介されたＣｒｅ切断（ＲＭＣＥ）を経てヒト遺伝子により置換される。このようにして、ヒト遺伝子の１個のコピーをマウスのＡＧＰ遺伝子座に特異的に効果的に標的化し、コピー数及び組み込み部位の両方について制御することが可能である。この手法を用いれば他の遺伝子は破壊されずそしてＡＧＰ遺伝子はその「天然の遺伝子座」に存在し、位置効果の問題を消滅させることになる。
【０２１５】
代わりの戦略はＣｒｅリコンビナーゼではなくＦＬＰリコンビナーゼを利用する。その手順は上記のものと同じである。ただし、
−工程１及び工程２では、野性型ＦＲＴ部位と突然変異のＦＲＴ部位がｌｏｘＰの代わりに用いられる（1998，Biochemistry 37(18): 6229-34) 、そして
−工程３では、Ｃｒｅ−発現プラスミドの代わりにＦＬＰ−発現プラスミドが用いられる、
点を除く。
【実施例６】
【０２１６】
ヒトＣＹＰ４５０イソ型を発現するトランスジェニックマウスを取得する
これらのトランスジェニックマウスを作成するために様々なアプローチを用いることができる。ＣＹＰ１、ＣＹＰ２及びＣＹＰ３のファミリーから選択される一つ以上のヒトＣＹＰイソ型をコードするポリヌクレオチドを用いることが好ましい。例えば、下記のリストからのＣＹＰイソ型を導入遺伝子の成分として使用する。即ち、１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、２Ｅ１、３Ａ４、３Ａ５、４Ａ９、４Ａ１１である。このトランスジェニックマウスはＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ２Ｄ６を発現することが望ましく、特にこのトランスジェニックマウスはＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｃ１９を含むこのリスト由来の他のものを発現することもある。これは同じトランスジェニックベクター中に複数のＣＹＰ遺伝子を組み込むことにより、又は二重、三重、四重などのトランスジェニック動物を作成するため、それぞれが異なるヒトＣＹＰイソ型を含む異なるトランスジェニックマウスを交配させることにより達成しうる。このようなトランスジェニック動物は導入遺伝子の無差別組み込みにより又は特定の部位への相同組み込みにより作成しうるし、そして内因性マウスＣＹＰイソ型の破壊と関連することもあり又はしないこともある。
【０２１７】
工程１．ＣＹＰ３Ａ４をコードするポリヌクレオチドを取得する
好ましい手法は、ＢＡＣ又はＹＡＣクローンを取得する工程、ヒトＣＹＰ３Ａ４を含ませる工程、及び該クローンを直接使用するか又は胚に注入する前にそれを線状化するいずれかの工程を含む。この手法は同一ベクター内に配置された複数のＣＹＰ３Ａ遺伝子が同時に導入されるという利点を有する。クローンＲＰ１１−３１６Ａ２４及びＲＰ１１−７５７Ａ１３（ゲノム配列決定センター，ワシントン、Ｕ．Ｓ．Ａ．）は適切なクローンである。他の適当なＢＡＣ又はＹＡＣクローンは、ＢＡＣクローンＲＰ１１−７５７Ａ１３（ジェンバンク寄託番号ＡＣ０６９２９４）に関する配列番号：２３から設計されたプローブを用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。ジェンバンク寄託番号ＡＦ２０９３８９に記載された配列にも言及しうる。これはヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子のエキソン１〜１３を含む２６５０２ヌクレオチドのポリヌクレオチドを規定する。ＡＱ５３９６６０及びＡＱ５３９６５９はＲＰ１１−３１６Ａ２４のＢＡＣ末端を規定し、ＮＧ−０００００４は関連コンティグを規定する。
【０２１８】
代替的戦略は下記のプライマーの合成を含み、適当な場合はその５’末端に制限酵素認識部位をも含む。
【０２１９】
プライマー１：(5')ＧＴＣＣＡＡＡＣＡＣＴＴＣＴＣＴＡＴＧＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＣＡＧＴＣＡＣ(3')[ 配列番号：６１ ]、即ち配列番号：２３（ＡＣ０６９２９４）のヌクレオチド２６９３０−２６９６５であり、これは開始コドンの上流約８．４ｋｂである。
【０２２０】
プライマー２：(5')ＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＴＧＴＧＣＡＴＧＧ(3')[ 配列番号：６２ ]、即ち配列番号：２３（ＡＣ０６９２９４）のヌクレオチド３５２２７−３５２５４及びジェンバンク寄託番号ＮＭ−０１７４６０に関する配列番号：２４のヌクレオチド２６−５３（これはＣＹＰ３Ａ４の５’ＵＴＲの中にある。）の逆向き相補鎖である。
【０２２１】
プライマー３：(5')ＡＣＡＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＧＡ(3')[ 配列番号：６３ ]、即ち配列番号：２３（ＡＣ０６９２９４）のヌクレオチド３５２５５−３５２８１及び配列番号：２４（ＮＭ−０１７４６０）のヌクレオチド５４−８０（これは５’ＵＴＲの中にあり、プライマー２遺伝子座の直ぐ下流にある。）である。
【０２２２】
プライマー４：(5')ＧＡＣＣＡＡＴＣＧＡＣＴＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＧＴＧ(3')[ 配列番号：６４ ]、即ち配列番号：２３（ＡＣ０６９２９４）のヌクレオチド６２３８０−６２４０６及び配列番号：２４（ＮＭ−０１７４６０）のヌクレオチド２７３８−２７６４（これは３’ＵＴＲの中にありポリアデニル化部位を含む）の逆向き相補鎖である。または、ポリＡ尾部に結合するオリゴｄＴプライマーをプライマー４の代わりに使用することができる。
【０２２３】
次いで、下記のＰＣＲ反応を行なう。
【０２２４】
ＰＣＲ反応Ａ：プライマー１及びプライマー２を用いて、ＢＡＣクローンＲＰ１１−７５７Ａ１３又はヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用いて長領域ＰＣＲを行なう。その産物は５’ＵＴＲの一部だけでなく５’側隣接配列の約８．４ｋｂ（ヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーター及びエンハンサーを含む）に相当する。
【０２２５】
ＰＣＲ反応Ｂ：プライマー３及びプライマー４を用い鋳型としてヒト肝臓ｃＤＮＡを用いるＰＣＲ。その産物は全タンパク質コード配列並びに３’ＵＴＲ（ポリアデニル化シグナルを含む）及び反応Ａで増幅されなかった５’ＵＴＲの一部に相当する。
【０２２６】
工程２．導入遺伝子ベクターを組み立てる
上記二つのＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）などの適当なベクター中で組み立てる。該プライマーの５’末端に適当な制限酵素部位を含めることでこのプロセスは容易になる。
ＢＡＣクローン又はＹＡＣクローンを用いた場合には、組立ては必要でない。
【０２２７】
工程３．マウスの胚内に導入遺伝子を挿入する
ＢＡＣクローンを直接精製するか、又は線状化した後精製する。該ＰＣＲにより形成された構築物をプラスミドベクターから切断し、プラスミドＤＮＡから単離する。精製した導入遺伝子を次いで単離されたマウス胚の雄性前核の中にミクロインジェクションを行なう。次いでその胚を無差別組み込みによりトランスジェニックマウスを形成させる標準的手法に従って偽妊娠の代理宿主マウスの輸卵管中に移植する。さらなる詳細は本明細書の別の場所に記載する。または、導入遺伝子ＤＮＡを（ｎｅｏのような選択マーカーを共トランスフェクトさせ又はさせないで）ＥＳ細胞中にトランスフェクトさせる。サザンブロット及び／又はＰＣＲにより組み込み及びコピー数についてクローンをスクリーニングする。
【０２２８】
工程４．トランスジェニックマウスを選択する
トランスジェニックマウスはＰＣＲ及び／又はサザンブロットにより同定し、導入遺伝子の発現は、肝臓のような適当な組織試料を用いてウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、又は他の免疫学的検定法により確認する。または、肝ＲＮＡをノーザンブロットにより分析する。
【０２２９】
別の戦略では、導入遺伝子の相同組換えを用いてマウスゲノムの所望の部位に導入遺伝子の１個のコピーを挿入する。その部位はヒト導入遺伝子に類似の内因性のマウスＣＹＰ遺伝子の部位の近くか又はその部位であることが好ましい。例えば、ヒト導入遺伝子がＣＹＰ３Ａ４のようなＣＹＰ３Ａファミリーの一員でもある場合、マウスのＣＹＰ３Ａ１１、３Ａ１３、ＣＹＰ３Ａ２５、又は３Ａ１６である。両側に隣接するマウス配列は実施例１及び実施例２に記載したように、相同組換えを実行するために導入遺伝子構築物の中に組み込まれる。これらの両側に隣接する配列は、例えば、マウスタンパク質の発現を破壊するのが好ましい場合には、マウスのＣＹＰ遺伝子内の又はそれの両側に隣接するマウスのゲノム配列から誘導する。ＢＡＣクローン又はＹＡＣクローンのミクロインジェクションで形成されたトランスジェニックマウスの場合には、マウスＣＹＰイソ型の破壊は別のマウスで行なわれ、それらのマウスを続いてヒトＣＹＰを発現する上記のマウスと交配させる。同様な手法を用いてヒト様のしかしマウスには似ない免疫グロブリンを発現するマウスを形成させた（グリーン，Ｌ．Ｌ．1999，J. Immunol. Methods 231: 11-23) 。
【０２３０】
ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子に対するマウスの相同染色体は染色体５に局在する。この染色体の上に幾つかのＣＹＰ３Ａ遺伝子が存在し、
ａ）ＣＰ３Ｇ  ＣＹＰ３Ａ１６（ensembl ID：ＥＮＳＭＵＳＧ00000029628)
ｂ）ＣＰ３Ｂ  ＣＹＰ３Ａ１１（ensembl ID: ＥＮＳＭＵＳＧ00000029630)
ｃ）ＣＰ３Ｐ  ＣＹＰ３Ａ２５（ensembl ID: ＥＮＳＭＵＳＧ00000029631)
ｄ）ＣＰ３Ｄ  ＣＹＰ３Ａ１３（ensembl ID: ＥＮＳＭＵＳＧ00000029727)
その順序は、ＣＹＰ３Ａ１３−約８Ｍｂ−ＣＹＰ３Ａ１６−約３００ｋｂ−ＣＹＰ３Ａ１１−約４００ｋｂ−ＣＹＰ３Ａ２５である。
【０２３１】
各遺伝子を個々にノック−アウトすることは可能である。１６、１１及び２５の場合には野性型ｌｏｘＰ部位を５’側隣接領域に標的化し且つ突然変異ｌｏｘＰ５１１を３’側隣接領域に標的化するという二つのの標的化事象を行なうことも可能である。次いで、いずれかの端に野性型ｌｏｘＰ部位及び突然変異ｌｏｘＰ部位を含み且つこの染色体領域にそれを（Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて）標的化するＲＰ１１−３１６Ａ２４などのヒトＢＡＣを取り、こうして３個のマウス遺伝子の全てを欠失させ、このＢＡＣに含まれるヒトＣＹＰ３Ａ４、３Ａ５、３Ａ７及び３Ａ３を挿入することができよう。
【実施例７】
【０２３２】
ヒトＵＧＴ（ＵＤＰＧＴ）イソ型を発現するトランスジェニックマウスを取得する
ＵＧＴ遺伝子ファミリーにはＵＧＴ１及びＵＧＴ２亜型が含まれる。ヒトでは、９個のＵＧＴ１遺伝子（プラス４個の擬似遺伝子）が知られており、これら全てが７ｑ２２の同じ遺伝子座に位置付けられている（ゴングら，2001, Pharmacogenetics 11: 357-368) 。これらの遺伝子はそれぞれユニークなプロモーター及び基質を特異的にコードするエキソン１を利用する一方、これらの遺伝子は全てＵＤＰグルクロン酸との相互作用に必要な同一のカルボキシル末端をコードする同じエキソン２−５を共有する。
【０２３３】
マウスでは、マウス染色体１に位置付けられるＵＧＴ１ファミリーの少なくとも３個の遺伝子が存在する。これらはＵＤ１６、ＵＤ１２及びＵＤ１７であり、それぞれゲノムＤＮＡの８６．１７ｋｂ、１６．６５ｋｂ及び５．１９ｋｂを覆うものである。他の遺伝子もこの領域（ＵＤ１１を含む）にある可能性はある。個々の遺伝子は異なるプロモーター及びエキソン１を有するが、これらは全て最後の３個のエキソンを共有する。これらのマウスＵＧＴ遺伝子は配列番号：６５に記載された７５ｋｂコンティグに位置付けられた。最後の３個のエキソンは全て５ｋｂ領域に位置付けられる。
【０２３４】
７５ｋｂコンティグの上の各遺伝子の種々のエキソンの位置は次のようになる。
（外３）
2004533826.tif 000009
（外４）
2004533826.tif 000010
【０２３５】
このコンティグの上にはさらなる遺伝子もある。
（外５）
2004533826.tif 000011
【０２３６】
相同組換えの際、以下に述べる標的に向かう構築物はこれらの遺伝子の中の最後の３個のエキソンを欠失する（及びＵＤ１７のエキソン１及びＵＤ１６のエキソン４をも欠失する）。遺伝子が発現されないことを確実にするため３個の読み取り枠の全てに停止コドンを挿入する。３’腕はマウスのゲノムＤＮＡ及び下記のプライマーを用いて増幅できる。ｕｇｔ２３２７５Ｆ  (5')ＧＡＡＧＴＣＧＡＣＧＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＧＧ(3') [配列番号：６６] （配列番号：６５のヌクレオチド２３２７５からヌクレオチド２３２９６まで）、及び
ｕｇｔ２７５０１Ｒ  (5')ＧＡＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＴＴＡＣＡＣＡＧＧＴＣＣＣＡＡＡＧＣ(3') [配列番号：６７] （配列番号：６５のヌクレオチド２７５０１からヌクレオチド２７４８１まで）。
【０２３７】
これらは末端で人工的ＳａｌＩ部位を有する。ＰＣＲ断片をＳａｌＩで消化し、標的に向かうベクター（前の実施例で記載したようにｎｅｏ遺伝子を持つｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）のＳａｌＩ部位にクローニングする。
【０２３８】
マウスのゲノムＤＮＡ及び下記のプライマー
ｕｇｔ３５９６７Ｒ  (5')ＣＴＡＡＧＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＴＧＴＣＣ(3') [配列番号：６８] （配列番号：６５のヌクレオチド３５９６７からヌクレオチド３５９４７まで）、及び
ｕｇｔ３１１７０Ｆ  (5')ＧＣＡＡＴＡＣＴＡＧＣＴＡＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧ(3') [配列番号：６９] （配列番号：６５のヌクレオチド３１１７０からヌクレオチド３１１９３まで）
を用いて５’腕を増幅できる。
【０２３９】
ＰＣＲ断片をｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター中にクローニングし、ＮｏｔＩで消化し、ｎｅｏ遺伝子の３’末端のＮｏｔＩ部位中にクローニングする。このｎｅｏ遺伝子はＵＧＴの反対向きに転写される。この腕の３’末端は最後の第三のエキソンの最初の７ｂｐを含む（ＵＤ１２及びＵＤ１７の場合はエキソン３）。ネオマイシン耐性遺伝子は、先端を欠失したマウスＵＧＴｍＲＮＡのナンセンス媒介崩壊を誘導するためそして考えられる任意の突然変異ＵＧＴタンパク質の翻訳を終結させるため３個の（アンチセンス）枠全てに停止コドンを含む。如何なる先端を欠失したマウスＵＧＴｍＲＮＡでも急速に分解されることをさらに確実にするためＲＮＡ不安定化因子を含む断片を標的に向かうベクター中に工学処理することも可能である。
【０２４０】
この標的に向かうベクターを実施例６に記載されたように電気穿孔法によりＥＳ細胞中に導入し、実施例７に従って該領域が正確に標的化されたＥＳ細胞のクローンを釣り上げ、Ｇ４１８耐性クローンのサザンブロットにより同定する。標的化されたＥＳ細胞を次にチルドレンズ・ホスピタル・オークランド・リサーチ・インスティチュート（ＣＨＯＲＩ）から入手可能なヒトＢＡＣクローンＲＰ１１−９４３Ｂ１０でトランスフェクトする。（ＢＡＣの末端はＡＱ５６４９３８及びＡＱ７１１０９３と同定され、位置はＡＦ２９７０９３で規定されている）。このＢＡＣを陽性クローンの選択を助けるハイグロマイシン耐性又はピューロマイシン耐性を付与するプラスミドと共に共トランスフェクトしてもよい。次いで、選択されたクローンを増殖させ、上記のようにコピー数及び組み込み部位についてスクリーニングする。このＢＡＣは以下のヒトＵＧＴ１遺伝子を含む。即ち、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ２ｐ、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ５、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ９、ＵＧＴ１Ａ１０、ＵＧＴ１Ａ１３ｐ。（ｐは擬似遺伝子を示す）。
【０２４１】
代わりのアプローチは、野性型ｌｏｘＰ部位と突然変異ｌｏｘＰ部位（ｌｏｘＰ５１１）に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子を持つ標的に向かうベクターの使用を含む。このベクターで標的化された細胞は、ＣＲＥリコンビナーゼを発現するプラスミドと共にそのベクター骨格中に野性型ｌｏｘＰ部位と突然変異ｌｏｘＰ部位を有するＢＡＣでトランスフェクトできる。組換えにより媒介されたＣｒｅ削除（ＲＭＣＥ）を受けたコロニーを選択する。このようなコロニーでは、ｎｅｏ遺伝子（マウスＵＧＴ遺伝子座にある）はヒトＵＧＴ遺伝子で置換される。または、野性型ＦＲＴ部位と突然変異ＦＲＴ部位はＦＬＰリコンビナーゼと組み合わせて用いることができる。
【実施例８】
【０２４２】
ヒトＭＤＲ−１を発現するトランスジェニックマウスを取得する
ヒトＭＤＲ−１遺伝子は肝臓、腎臓及び腸上皮などの種々の組織で発現する大きな膜貫通タンパク質（Ｐ−糖タンパク質又はＰ−ｇｐ）をコードする。Ｐ−ｇｐは血液脳関門の不可欠の部分であり、様々な薬を脳から血液へ輸送する薬−輸送ポンプとして機能する。実際、ＭＤＲ−１のＰ−糖タンパク質は多くの細胞型の原形質膜を通して様々な薬を押し出す。
【０２４３】
ヒトは一つのＭＤＲ−１遺伝子のみを持つが、マウスは二つ持つ。Ｍｄｒ−１ａは腸上皮で高度に発現し、ここでそれは腸腔からそして血液脳関門で吸収した生体異物を能動的に排出する。血液脳関門は血液中の生体異物から脳を保護する。Ｍｄｒ−１ｂは副腎、妊娠した子宮及び卵巣で高度に発現する。マウスの両遺伝子は多数の他の組織で実質的に発現する。
【０２４４】
Ｍｄｒ−１ａのＰ糖タンパク質を欠失している天然に生ずるＭｄｒ−１ａ突然変異マウス（ＣＦ−１異系交配マウス系統の）が記載された（ウンベンハウエルら，1997, Toxicol. Appl. Pharmacol. 146 (1): 88-94) 。ノック−アウトマウスは個々のマウスｍｄｒ１遺伝子単独に対してもまた組み合わせでも形成された（シンケルら，1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4028-4033) 。ヒトＭＤＲ−１を発現するトランスジェニックマウスは従って上記のマウスのいずれかと交配して、これらの遺伝子のマウス型ではなくヒト型を発現するマウスを形成させることができる。
【０２４５】
以下の例はヒトＭＤＲ−１を発現するトランスジェニックマウスを構築する方法を記載する。ヒトＭＤＲ−１のｃＤＮＡ（ジェンバンク寄託番号ＮＭ−０００９２７）[ 配列番号：７０ ]はヒト肝臓ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより得られ、ヒト５’及び（好ましくは）３’隣接調節配列及び選択可能マーカー遺伝子と一緒にベクター中で組立てられる。両側の隣接配列は５’側隣接配列についてはヒトゲノムＤＮＡ又はＢＡＣクローンのＣＴＢ６０Ｐ１２（ジェンバンク寄託番号ＡＣ００２４５７）のＰＣＲにより、３’側隣接配列についてはＢＡＣクローンのＣＴＢ１３７Ｎ１３（ジェンバンク寄託番号ＡＣ００５０６８）のＰＣＲにより得られる。これらはそれぞれカルテック・ヒューマンＢＡＣライブラりーＢから入手可能である。組立てられた導入遺伝子は、次に実施例６及び先の実施例で記載したように無差別組み込みにより導入される。
【０２４６】
下記のプライマーはこの目的に有用である。５’末端には添加された酵素部位が必要であり、効率的な消化を可能とするのに十分なヌクレオチドでその部位の両側を挟むべきである。
【０２４７】
プライマーＭＤＲ１（前向き）(5') SalI-ＧＡＡＡＣＣＣＴＡＧＧＣＡＣＴＡＡＡＴＣＣＣ(3')[ 配列番号：７１ ]、これはプロモーターのＡｖｒII部位と重なる。配列番号：７２に記載された５’側隣接ヒトＭＤＲコンティグのヌクレオチド４９３０−４９５１。
【０２４８】
プライマーＭＤＲ２（逆向き）(5') ClaI-ＧＧＧＡＴＴＴＡＧＴＧＣＣＴＡＧＧＧＴＴＴＣ(3')[ 配列番号：７３ ]、これはプロモーターのＡｖｒII部位と重なる。５’側隣接ヒトＭＤＲコンティグ[ 配列番号：７２ ]のヌクレオチド４９３０−４９５１の逆向き相補鎖。
【０２４９】
プライマーＭＤＲ３（前向き）(5')ＣＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＡＧＧＡＧＴＡＣＴＣＡＣ(3')[ 配列番号：７４ ]、これはエキソン１のＡｖｒII部位と重なる。５’側隣接ＭＤＲコンティグ[ 配列番号：７２ ]のヌクレオチド１００４９−１００７１及びＭＤＲ−１ｃＤＮＡ[ 配列番号：７０ ]のヌクレオチド５６−７２。
【０２５０】
プライマーＭＤＲ４（逆向き）(5')ＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＣＴＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＧ(3')[ 配列番号：７５ ]、これはエキソン１のＡｖｒII部位と重なる。配列番号：７２に記載された５’側隣接ＭＤＲコンティグのヌクレオチド１００４９−１００７１及びＭＤＲ−１ｃＤＮＡ[ 配列番号：７０ ]のヌクレオチド５６−７２の逆向き相補鎖。
【０２５１】
プライマーＭＤＲ５（前向き）(5')  SalI- ＡＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＡＧＡＴＧＣＧ(3')[ 配列番号：７６ ]、５’側隣接ＭＤＲコンティグ[ 配列番号：７２ ]のヌクレオチド２９２−３１３。
【０２５２】
プライマーＭＤＲ６（逆向き）(5')  ClaI- ＣＡＣＡＴＧＡＡＡＧＴＴＴＡＧＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＧＡＣＡＣ(3')[ 配列番号：７７ ]、ＭＤＲ−１ｃＤＮＡ[ 配列番号：７０ ]のヌクレオチド４６１４−４６４３の逆向き相補鎖（３’ＵＴＲ中でＰｍｅＩ部位の下流）。
【０２５３】
プライマーＭＤＲ７（逆向き）(5')  XbaI- ＴＧＧＴＣＡＡＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣＧＣＴＴＣ(3')[ 配列番号：７８ ]、これはＭＤＲ１ポリアデニル化シグナルの下流約１７３０ｂｐに位置し、ジェンバンク寄託番号ＡＣ００５０６８（カルテック・ヒューマンＢＡＣライブラリーＢから入手可能なＢＡＣクローンＣＴＢ１３７Ｎ１３）のヌクレオチド３６０７５−３６１００。ジェンバンク寄託番号ＡＣ００５０６８のヌクレオチド３６０６１−３８００１の逆向き相補鎖に相当する１９４０ヌクレオチド配列は配列番号：７９で提示される。プライマーＭＤＲ７はこの配列のヌクレオチド１９００−１９２６の逆向き相補鎖である。
【０２５４】
プライマーＭＤＲ８（前向き）(5')  ＧＣＧＣＣＡＧＴＧＡＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＴＧ(3')[ 配列番号：８０ ]、ヒトＭＤＲ−１ｃＤＮＡ[ 配列番号：７０ ]のヌクレオチド４２５５−４２８３。これは３’ＵＴＲ中でＰｍｅＩ部位の下流に位置する。
【０２５５】
プロモーター因子を持つヒト５’側隣接配列を取得する
ＰＣＲ反応１：転写開始部位の上流約５ｋｂから１０ｋｂまで延びるＳａｌＩ／ＣｌａＩ断片の生産
ＰＣＲは、プライマーＭＤＲ５及びＭＤＲ２を用い、ヒトゲノムＤＮＡ又はより好ましくは適当な配列を含むＣＴＢ−６０Ｐ１２（カルテック・ヒューマンＢＡＣライブラリーＢから入手可能。ジェンバンク寄託番号ＡＣ００２４５７）のようなＢＡＣクローン由来のＤＮＡを鋳型として用いて行なう。
【０２５６】
ＰＣＲ反応２：エキソン１内から転写開始部位の上流約５ｋｂまで延びるＡｖｒII断片の生産
ＰＣＲは、プライマーＭＤＲ１及びＭＤＲ４を用い、ヒトゲノムＤＮＡ又はより好ましくは適当な配列を含むＣＴＢ−６０Ｐ１２（カルテック・ヒューマンＢＡＣライブラリーＢから入手可能。ジェンバンク寄託番号ＡＣ００２４５７）のようなＢＡＣクローン由来のＤＮＡを鋳型として用いて行なう。
【０２５７】
ヒトＭＤＲ−１をコードする配列を取得する
ＰＣＲ反応３：ヒトｃＤＮＡの５’ＵＴＲ内から３’ＵＴＲ内までを含むＡｖｒII／ＣｌａＩ断片の生産
ヒトＭＤＲ−１ｃＤＮＡ（ジェンバンク寄託番号ＮＭ−０００９２７）は、プライマーＭＤＲ３及びＭＤＲ６を用いて、ヒト肝ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより取得する。
【０２５８】
ヒト３’側隣接配列を取得する
ＰＣＲ反応４：最後のエキソンからポリアデニル化シグナルの約１．７ｋｂ下流まで延びるＰｍｅＩ−ＸｂａＩ断片の生産
ＰＣＲは、プライマーＭＤＲ７及びＭＤＲ８を用い、ヒトゲノムＤＮＡ又はより好ましくは適当な配列を含むＣＴＢ−１３７Ｎ１３（カルテック・ヒューマンＢＡＣライブラリーＢから入手可能。ジェンバンク寄託番号ＡＣ００５０６８）のようなＢＡＣクローン由来のＤＮＡを鋳型として用いて行なう。
【０２５９】
ベクターを組立てる
工程１：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターの適当な部位（例えば、ＳａｃII) にネオマイシン耐性遺伝子を連結し、
工程２：反応１で得られたＰＣＲ産物をＳａｌＩ／ＣｌａＩで消化し、工程１で得られたベクターのＳａｌＩ／ＣｌａＩ部位に連結し（こうして〔ＣｌａＩ〕部位の近く及びその上流にＡｖｒII部位をも挿入し) 、
工程３：反応３で得られたＰＣＲ産物をＡｖｒII／ＣｌａＩで消化し、工程２で得られたベクターのＡｖｒII／ＣｌａＩ部位に連結し（こうして〔ＣｌａＩ〕部位の近く及びその上流にＰｍｅＩ部位をも挿入し) 、
工程４：反応２で得られたＰＣＲ産物をＡｖｒIIで消化し、工程３で得られたベクターのＡｖｒII部位中に連結し、
工程５：反応４で得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩ／ＸｂａＩで消化し、工程４で得られたベクターのＰｍｅＩ／ＸｂａＩ部位中に連結する。
【０２６０】
マウスを形成する
上記構築物をＮｏｔＩで線状化し、無差別組み込みのためにＥＳ細胞中にトランスフェクトする（実施例６を参照）。または、トランスフェクトの前にＢｓｓＨII又はＳａｌＩ／ＸｂａＩで消化してベクター骨格からこの導入遺伝子を切り出すことができる。クローンをＧ４１８で選択し、コピー数を決定するためサザンブロットで分析する。適当なクローン（好ましくは１個の遺伝子コピー）を先の実施例で記載したように胚盤胞に移植し、得られたキメラを繁殖させてヒトＭＤＲ−１を発現するホモ接合体マウスを形成させる。このようなマウスはジャーマンタウン，ニューヨーク，米国のタコニック社から入手可能なｍｄｒ１ａ／１ｂ二重ノック−アウトマウス（シンケルら，1997，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4028-4033) と交配育種することができる。得られる三重トランスジェニックマウスはマウスＭｄｒ−１遺伝子両方の発現を欠いているが相同的なヒトＭＤＲ−１遺伝子を発現する。
【実施例９】
【０２６１】
ＥＳ細胞の電気穿孔
電気穿孔の日の前に以下のものを用意すべきである。
（ｉ）１２×１０ｃｍのプレート、及び分裂が不活性化されたネオマイシン耐性の繊維芽細胞（又は適当な場合はハイグロマイシン耐性又はピューロマイシン耐性の繊維芽細胞）のフィーダー層を含む４×６ｃｍのプレート。
【０２６２】
（ii) ＥＳ細胞は、電気穿孔の日に少なくとも３×１０7 細胞が入手できるように、ほぼ８０％コンフルーエンシーまで増殖させるべきである。
１．細胞を収穫する２〜４時間前にＥＳ細胞の上の培地を交換する。通常３×１０ｃｍプレートのＥＳ細胞が入手可能である。これは少なくとも４×１０7 個の細胞を提供する。２×１０7 細胞が一回の電気穿孔に必要なので、これで十分である。
２．先に述べたように０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて細胞を収穫し、３７℃で５分間インキュベートする。
３．５０ｍＬの管に細胞を集める。ＥＢ培地で細胞を洗浄する。
４．ペレットを１０ｍＬの電気穿孔用緩衝液（ＥＢ；１×ハンクス溶液（ギブコ−ＢＲＬ）、２０ｍＭのヘペス、２８ｍＭの２−ベータメルカプトエタノール、１ｍＭのＮａＯＨ）に再懸濁する。
５．トリパンブルー排除を用いて生細胞密度を測定する。
６．細胞を１５００ｒｐｍで５分間回転させる。
７．細胞密度がほぼ３×１０7 細胞／ｍＬとなるように細胞をＥＢ中に再懸濁する。
８．０．４ｃｍの電気穿孔用キューベット２個を次のように標識する。即ち（ｉ）「＋ＤＮＡ」そして８００μＬの最終容量に２×１０7 細胞及び３３μｇＤＮＡを添加する。（ii) 「ＤＮＡ対照」そして８００μＬの最終容量に１．１×１０6 細胞を添加する。
９．室温に１０分間放置する。
１０．無菌移送用ピペットで温和に上下に混合する。
１１．０．４Ｋボルト、２５μＦＤ（時定数は０．４秒又は０．５秒であるべきである）の設定で遺伝子パルサーを用いて電気穿孔を行なう。
１２．室温に１０分間放置する。
１３．＋ＤＮＡキューベットから得た細胞を１２×１０ｃｍプレートの上に播種すると同時に２×６ｃｍの対照プレートの上に比例した量の細胞を播種する。
１４．−ＤＮＡキューベットから得た細胞を２×１０ｃｍプレートの上に播種する。
１５．ゲネティシン（Ｇ４１８）単独又はガンシクロヴィルを添加したもので２４時間後に選択を開始する。
１６．二重選択の場合は、通常Ｇ４１８を３００μｇ／ｍＬの濃度、ガンシクロヴィルを２μＭ用いる。
１７．培地を毎日交換する。
１８．１０日目又は１１日目に生存するクローンを釣り上げる。
【実施例１０】
【０２６３】
コロニーを釣り上げる
材料：
ａ）解剖顕微鏡、マウスピペット、多チャンネルピペット、９６穴Ｕ底プレート
ｂ）釣り上げの前日に分裂的に不活性なネオマイシン耐性胚繊維芽細胞を含む１５又は３０個の２４穴プレートを用意する。これらの細胞は、下記の日に使用するために備えて、ＥＳ細胞増殖培地中に置かれる。
【０２６４】
調製：
ａ）多チャンネルピペットを用いて３０μＬの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを９６穴Ｕ底プレートに添加する。釣り上げるべき細胞の数にとって十分なプレートを用意する。即ち、３６０のコロニーを釣り上げる場合は４×９６穴プレートであり、７２０コロニーを釣り上げる場合は８×９６穴プレートである。
ｂ）６穴プレート中の２穴にハンクス／ヘペス緩衝液を添加する。これはコロニーの間で釣り上げピペットを洗浄するために使用できる。０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを６穴プレート中の一つの穴に添加する。コロニーをトリプシン中に維持できるように、この少量を釣り上げピペット中に集める。
【０２６５】
手順：
１．釣り上げるべきコロニーを含む１０ｃｍプレートの２又は３個を５〜１０ｍＬのハンクス／ヘペス緩衝液（Ｈ／Ｈ）で洗浄する。
２．５ｍＬのＨ／Ｈを添加しプレートの上に放置する。
３．７０％エタノールを用いて多数回パストゥールピペットで引っ張り洗浄する。
４．Ｈ／Ｈで反復洗浄し、次いで釣り上げピペットで少量のトリプシン溶液を採取する。
５．層流室中に設置された解剖顕微鏡を用いて、釣り上げようと思うコロニーを同定する。
６．フィーダー細胞の層の周りを釣り上げ用ピペットで温和に切断する。口で吸ってＥＳ細胞コロニーをピペット中に吸引し、そのコロニーをトリプシン溶液を含む９６穴プレートの穴の一つに移す。
７．２４個のコロニーを集める（即ち、９６穴プレートの３列分）。
８．該９６穴プレートを３７℃の孵卵器に５分間移し細胞の分散を促進する。
９．多チャンネルピペットで激しく２〜３回かき回して該コロニーを分散させる。
１０．該２４穴プレートから採取した５０μＬの培地を該９６穴プレートに添加し、再び激しく分散させる。
１１．全ての細胞を２４穴プレートに移し、各コロニーを分離させたままに保つ。
１２．全ての２４穴プレートがその中にＥＳ細胞を含むまで続ける。
１３．翌日培地を交換する。
【実施例１１】
【０２６６】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・ｎｅｏ・ｔｋベクターの構築
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・ｎｅｏ・ｔｋベクターは次のようにして構築した。ネオマイシン耐性遺伝子はｔｋプロモーターを持っている。それをＳａｌＩ及びＸｈｏＩでｐＭＣ１ｎｅｏ（ジェンバンク寄託番号Ｕ４３６１２）から切り出し、ついでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII KS のＳｍａＩ部位に挿入した。チミジンキナーゼ遺伝子は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）から誘導され、ＥＳ細胞（ジェンバンク寄託番号ＡＦ０９０４５１）中で発現するように工学処理した。その両側を突然変異ポリオーマウイルスのエンハンサーの重複で挟む。このチミジンキナーゼ遺伝子をＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIII でｐＩＣ１９Ｒ／ＭＣ１−ｔｋから切り出し、。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・ｎｅｏベクターのＡｐａＩ部位にクローニングした。ｎｅｏ遺伝子とｔｋ遺伝子及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＴ３プロモーターは両方とも同じ向きで転写される。
【０２６７】
本明細書で引用した全ての特許、特許出願、及び出版物はその全体が参照により本明細書にインコーポレートされる。
【０２６８】
本明細書での如何なる参考文献の引用もかかる参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることを認めるものと解すべきではない。
【０２６９】
本明細書を通じてその目的は如何なる一つの実施態様又は特定の特徴の集合に本発明を限定することなく本発明の好ましい実施態様を記述することであった。従って、当業者は、本開示に照らして本発明の範囲を逸脱することなく例示された特定の実施態様に様々な修正や変更を加え得ることを認めるはずである。このような修正や変更は全て添付された請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０２７０】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０２７１】
【図１】図１は、マウスＡＬＢ遺伝子の線状地図を示す図式的表示である。
【図２】図２は、ヒトＡＬＢｃＤＮＡでマウスＡＬＢ遺伝子を置換するためのマウスＡＬＢを標的とする構築物の一つの実施態様の線状地図を示す図式的表示である。
【図３】図３は、マウスＡＧＰ遺伝子座の線状地図を示す図式的表示である。
【図４】図４は、マウスＡＧＰ遺伝子座をノックアウトさせるためのマウスＡＧＰを標的とする構築物の一つの実施態様の線状地図を示す図式的表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月18日(2002.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的にトランスジェニック動物を作成するためにその中に外来性核酸が導入された非ヒト動物に関する。より具体的には、本発明はマウスなどの非ヒトトランスジェニック動物の生産、育種及び使用に関する。このトランスジェニック動物では、特定の遺伝子又は遺伝子の部分が別の動物由来の相同染色体で置換され、薬物の薬物動態学や薬物の代謝に関して該動物の生理学をこの他の動物の生理学に似るように改変されている。本発明は薬力学的及び／又は毒物学的な研究のために本発明の遺伝的に改変された非ヒト動物の利用にも拡大される。
【背景技術】
【０００２】
新薬を市場に出すまでの費用は極端に高い。通常、製薬会社は、市販するための１個の薬を選択するために、数百から数十万の化合物をスクリーニングする。最初のスクリーニングは最も有望な化合物についてイン・ビトロで行い、動物研究に進む。さらなる開発や臨床試験のために最良の薬（単数又は複数）が選択されるのは、これらの動物研究に基づく。薬品開発に伴う費用のかなりの量はこの動物研究の後に生ずるから、薬物のヒトにおける挙動を予測する際の動物モデルの精度が重要であることは明らかである。
【０００３】
薬の発見及び開発の過程で、動物モデルは薬の候補の特性決定をするという繰り返し行なわれるプロセスにおいて使用される。初期の動物研究は薬物動態学（薬の吸収、体内分布及び体内からのその最終的排出の力学）を決定する。それに続く動物研究は薬力学（薬の作用機作、及び薬の濃度と薬の効果の間の関係）を測定する。通常、これらの研究は効力（例えば、その化合物が腫瘍の増殖を阻止するか、又はこの化合物が神経学的障害を回復するのに有効であるか）、短期毒性、最適投与方法及び投与計画、などをも調べる。これらの動物研究に基づいて、最も有望な化合物（単数又は複数）がさらに開発される。この段階は、継続動物研究（例えば、より長期の毒性研究、徹底的な代謝研究、複数投与の薬物動態学的研究、薬の組み合わせ研究をしばしば含む拡大された効力研究）、化学的開発（例えば、生産）及び薬剤開発（例えば、薬の製剤及び送達）を含む。これらの段階の全てを首尾よく完了した化合物は次にヒト患者でテストされる（フェーズＩ〜III 臨床試験) 。フェーズＩ試験の成功は良好な許容性、適当な薬物動態そして場合によってはヒトにおける意図された薬力学的性質を証明することになろう。このような薬は最適な投与計画並びに病気の治療における効力を試験するためフェーズII及びフェーズIII 臨床試験に進むことになろう。
【０００４】
１個の薬の開発はしばしばマウス又は他の動物種における多数の異なる化合物の試験を必要とする。これらの動物研究はさらなる開発及びさらなる臨床試験のための化合物の選択を決定する。臨床試験段階での薬の脱落の主な理由は、不適当な薬物動態学的及び毒性学的効果（両者ともしばしば薬の代謝に関係する）であり、そしてより程度は小さいが、誤ったコンセプトによる効果の欠如又は薬力学的効果の欠如である。臨床試験へ化合物が進んだ後この後期の段階で不合格となるのは、通常、現存する動物モデルの予想可能性が貧弱だからである。
【０００５】
ヒトにおける薬の挙動を正確に反映しなかった動物モデルからのデータに基づいてなされた不正確な決定は貴重な資源、数百万ドルそして何年もの労働を浪費し得る。さらに、他の候補化合物を追求しないことによって失われる機会は、収益損失として潜在的に数十億ドルに達するであろう。例えば、現在のマウスモデルはしばしば（そして予測不可能なしかたで）ヒトにおける薬物動態学、代謝及び毒性学を正確に反映しない。多数の薬がマウスで有望な結果を示すが、ヒトでは効果的に働くことに失敗する。同様に、マウスで失敗し従って拒絶された他の薬がヒトで良く機能することがある。こうして、さらなる開発及び臨床試験のために薬の候補を選択するというプロセスは現在欠陥のある動物モデルから得られたデータに基づいている。この結果は、ａ）ヒトで働かない薬を追求して貴重な資源を浪費すること、ｂ）ヒトで働くであろうくろたを追求しないことにより機会損失、そしてｃ）フェーズＩ臨床試験で未知の危険に患者を曝すことを含むことになる。
【０００６】
目的の動物（例えば、ヒトや家畜動物、愛玩動物を含む他の哺乳動物）における薬の挙動（例えば、分布、代謝、効力及び毒性）をより正確に予測する改良された動物モデルは、薬品産業及び／又は畜産業にそしてこれらの動物に悪影響を与える疾病の治療に共に極めて大きな利益を与えるであろう。
【特許文献１】
記載なし。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は改良された動物モデルを開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
従って、本発明の一つの側面では、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドを発現するものであり、該外来性ポリペプチドが該他の動物で本来発現されるものであるトランスジェニック動物が提供される。この外来性ポリペプチドは薬と結合するポリペプチド、薬を代謝するポリペプチド又は薬と結合し且つ薬を代謝するポリペプチドから選択されることが好ましい。
【０００９】
トランスジェニック動物は該外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをさらに発現してもよい。しかしながら、このトランスジェニック動物は機能を有する内因性ポリペプチド又は検出可能なレベルの該内因性ポリペプチドを生産する能力を欠如していることが好ましい。この外来性ポリペプチドは好ましくは該内因性ポリペプチドの機能を有する相同体である。このタイプの実施態様では、外来性ポリペプチドは該内因性ポリペプチドのオルソログ（orthologue) である。このタイプの別の実施態様では、外来性ポリペプチドは該内因性ポリペプチドのパラログ（paralogue)である。
【００１０】
トランスジェニック動物はそのゲノムの改変を含んでもよい。その改変は外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子（transgene)による内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の置換を含んでいる。または、その改変は該内因性遺伝子の破壊を含むことがある。該破壊は内因性ポリペプチドの発現レベルを結果として低減させるものであることが好ましい。好ましい実施態様では、該破壊は内因性ポリペプチドの発現レベルの排除を結果として生ずる。別の好ましい実施態様では、該動物は機能的な内因性ポリペプチドを生産する能力を欠いている。別の実施態様では、該破壊は内因性遺伝子の欠失を含む。該欠失は内因性ポリペプチドの領域若しくはドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失を含むことが好ましい。または、該欠失は内因性遺伝子の発現を少なくとも部分的に制御する調節ポリヌクレオチドの欠失を含む。好ましい実施態様では、該欠失は該内因性ポリペプチドをコードする全オープンリーディングフレームの欠失を含む。
【００１１】
外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は調節ポリヌクレオチドに機能しうにように連結していることが好ましい。この調節ポリヌクレオチドは１〜１０ｋｂのヌクレオチド配列を含んでもよい。該調節ポリヌクレオチドは該トランスジェニック動物又は該他の動物に天然で存在するポリヌクレオチドであることが好ましい。一つの実施態様では、調節ポリヌクレオチドはトランスジェニック動物又はその先祖の内因性ポリヌクレオチドである。別の実施態様では、調節ポリヌクレオチドは他の動物の内因性ポリヌクレオチドである。好ましい実施態様では、調節ポリヌクレオチドは該内因性遺伝子のコード配列の上流に天然で位置するヌクレオチド配列を含む。別の好ましい実施態様では、調節ポリヌクレオチドは外来性ポリペプチドをコードする遺伝子のコード配列の上流に天然で位置するヌクレオチド配列を含む。代わりの実施態様では、調節ポリヌクレオチドは該トランスジェニック動物、該トランスジェニック動物の先祖、又は該他の動物から選択された動物以外の動物又は資源に由来する。別の実施態様では、調節ポリヌクレオチドは誘導プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）を含む。
【００１２】
該改変は、構築物が該動物のゲノム中に安定に組み込まれるように胚性幹細胞中で、導入遺伝子を含む核酸構築物との相同組換え、無作為組み込み又はリコンビナーゼ系（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ又はＦＬＰ−ＦＲＴ系）の使用によりトランスジェニック動物のゲノム中に導入されたものであることが好ましい。
【００１３】
トランスジェニック動物は、該導入遺伝子に関してヘテロ接合体であってもよいが、ホモ接合体であることが好ましい。
【００１４】
一つの実施態様では、トランスジェニック動物は哺乳動物である。好ましい実施態様では、このトランスジェニック動物はネズミ目から選択される。特に好ましい実施態様では、このトランスジェニック動物はマウスである。
【００１５】
好ましい実施態様では、該他の動物は霊長類から選択される。特に好ましい実施態様では、この他の動物はヒトである。
【００１６】
該外来性ポリペプチドは該他の動物又はその等価物により発現される、薬の挙動及び／又は代謝と関連するポリペプチドの少なくとも一部に対応しうる。この外来性ポリペプチドは、血清アルブミン、α−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、チトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）、ウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰｓ）を含む多剤耐性（ＭＤＲ）タンパク質、アセチルトランスフェラーゼ、プレニルタンパク質トランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、アセチラーゼ、グルクロニダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、又は酸化反応、共役反応（conjugation reaction) 、加水分解反応、還元的代謝又は生体異物を含む他の異化的若しくは同化的反応から選択される反応を促進又は触媒するポリペプチドから選択してもよい。一つの実施態様では、外来性ポリペプチドは血清アルブミンであり、好ましくはヒト血清アルブミンであるが、これに限られるわけではない。ヒト血清アルブミンは配列番号：２に記載された配列を含むことが好ましい。好ましい実施態様では、ヒト血清アルブミンをコードするヌクレオチド配列は配列番号：１及び配列番号：３のいずれか一つに記載された配列を含む。別の好ましい実施態様では、内因性血清アルブミンの発現が改変される。この内因性血清アルブミンは配列番号：６に記載された配列を含むマウス血清アルブミンであることが好ましい。マウス血清アルブミンの内因性遺伝子は配列番号：５に記載された配列を含む転写物をコードすることが好ましい。該調節ポリヌクレオチドはこの内因性遺伝子に関するコード配列の上流に本来位置しているヌクレオチド配列を含むことが好ましい。該調節ポリヌクレオチドは配列番号：７に記載されたような配列を含むことが好ましい。
【００１７】
別の実施態様では、外来性ポリペプチドはα酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）である。このタイプの好ましい実施態様では、外来性ポリペプチドはＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３から選択されるヒトＡＧＰである。ヒトＡＧＰ−１（オロソムコイド（ＯＲＭ）−１としても知られている）は配列番号：１４に記載された配列を含むことが好ましい。ヒトＡＧＰ−１をコードするヌクレオチド配列は配列番号：１３に記載された配列を含むことが好ましい。ヒトＡＧＰ−２（ＯＲＭ−２としても知られる）は配列番号：１６に記載された配列を含むことが好ましい。ヒトＡＧＰ−２をコードするヌクレオチド配列は配列番号：１５に記載された配列を含むことが好ましい。別の好ましい実施態様では、内因性ＡＧＰの発現は改変されている。この内因性ＡＧＰはＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３から選択されるマウスＡＧＰであることが好ましい。このマウスＡＧＰ−１は配列番号：１０に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−１をコードする内因性遺伝子は配列番号：９に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−３は配列番号：１２に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−３をコードする内因性遺伝子は配列番号：１１に記載された配列を含むことが好ましい。この例では、調節ポリヌクレオチドは外来性ポリペプチドをコードする遺伝子に関するコード配列の上流に本来位置しているヌクレオチド配列を含むことが好ましい。この調節ポリヌクレオチドは、それぞれがヒトＡＧＰ−１遺伝子及びヒトＡＧＰ−２遺伝子の上流に本来位置している調節ポリヌクレオチドに対応する配列番号：２１及び／又は配列番号：２２に記載された配列を含むことが好ましい。
【００１８】
別の側面では、本発明は別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する一つ以上の外来性ポリペプチドを発現するものであり、その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが該他の動物において本来発現されるものであるトランスジェニック動物を意図する。
【００１９】
さらに別の側面では、本発明は別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する一つ以上の外来性ポリペプチドを発現するものであり、その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが該他の動物において本来発現されるものであり、且つ、血清アルブミン、α酸性糖タンパク質、チトクロームＰ４５０、ウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ、及び多剤耐性タンパク質から成る群より選択されるものである非ヒトトランスジェニック動物を包含する。
【００２０】
別の一側面では、本発明は別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する一つ以上の外来性ポリペプチドを発現するものであり、その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが該他の動物において本来発現されるものであり、且つ、血清アルブミン、α酸性糖タンパク質、下位群３Ａから選択されるチトクロームＰ４５０、下位群１Ａから選択されるウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ、及びＰ糖タンパク質から成る群より選択されるものである非ヒトトランスジェニック動物を意図する。
【００２１】
さらに別の一側面において、本発明は別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する一つ以上の外来性ポリペプチドを発現するものであり、その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが該他の動物において本来発現されるものであり、且つ、該外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子が胚性幹細胞中で相同組換え又はリコンビナーゼ系（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ又はＦＬＰ−ＦＲＴ系）を経て該非ヒト動物又は該非ヒト動物の先祖に導入されたものである非ヒトトランスジェニック動物を特徴とする。
【００２２】
別の一側面では、本発明は別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する一つ以上の外来性ポリペプチドを発現するものであり、その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが該他の動物において本来発現されるものであり、且つ、該外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子が胚又は胚性幹細胞中で無差別組み込み（random integration) を経て該非ヒト動物又は該非ヒト動物の先祖に導入されたものである非ヒトトランスジェニック動物を提供する。
【００２３】
さらに別の一側面では、本発明は別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する際に使用するための、好ましくはしかしそれに限らないが標的に向かう構築物である核酸構築物であって、該構築物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むものであり、外来性ポリペプチドが該他の動物において本来発現されるものである核酸構築物を包含する。一つの実施態様では、この核酸構築物は該導入遺伝子の両側の二つの領域を含む標的に向かう構築物であって、該領域（複数）が該非ヒト動物のゲノムの部分（複数）と相同組換えを受ける程に十分に該部分と相同である構築物である。この種の好ましい実施態様では、該部分は該外来性ポリペプチドの相同体である非ヒト動物のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の両側にある又は内因性遺伝子に含まれる配列を含む。導入遺伝子は外来性ポリペプチドをコードする該配列に機能しうるように連結された調節ポリヌクレオチドを含むことが好ましい。この核酸構築物は選択可能マーカー遺伝子を含むことが好ましい。
【００２４】
さらなる側面において、本発明は、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物において本来発現される外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を提供する工程、及び
−  この導入遺伝子を非ヒト動物のゲノム中に導入する工程、
を含む方法に存する。
【００２５】
この導入遺伝子のゲノム中への導入には、上に概述したような核酸構築物を作成する工程が含まれることが好ましい。
【００２６】
ゲノムへの導入遺伝子の導入は内因性遺伝子を機能的に破壊する工程を含むことが好ましく、これは該内因性遺伝子の構造を破壊することにより達成することが好ましい。または、ゲノムへの導入遺伝子の導入は該内因性遺伝子の部位以外の部位への導入遺伝子の挿入を含んでもよい。一つの実施態様では、ゲノムへの導入遺伝子の導入は内因性遺伝子又はその部分を導入遺伝子で置換する工程を含む。好ましい実施態様では、内因性遺伝子の機能は、例えば適当な標的に向かう構築物を用いて破壊される。
【００２７】
この方法は、非ヒト動物のゲノム中に選択可能マーカー遺伝子を導入する工程をさらに含むことが好ましい。この種の好ましい実施態様では、該選択可能マーカー遺伝子は、例えば、上述した標的に向かう構築物の中に組み込まれる。
【００２８】
さらなら側面では、本発明は、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物において本来発現される外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子、及び該導入遺伝子の両側にあり、該非ヒト動物のゲノムの部分と相同組換えを受ける程に十分相同性を有する領域、を含む標的に向かう構築物を提供する工程、及び
−  該導入遺伝子が該部分（複数）の間に挟まれたゲノムの領域中に相同的に組み換わるのに十分な条件の下で、非ヒト細胞のゲノム中に該標的に向かう構築物を導入する工程を含む方法に存する。
【００２９】
別の側面によれば、本発明は、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物において本来発現される外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む核酸構築物を提供する工程、及び
−  該導入遺伝子が非ヒト細胞のゲノム中に無差別に組み込まれるような条件の下で、該ゲノム中に該構築物を導入する工程、
を含む方法を提供する。
【００３０】
さらなる側面では、本発明は、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物において本来発現される外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子、及び該外来性ポリペプチドの相同体である非ヒト動物のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の両側にあるか又は内因性遺伝子の内部に含まれる該非ヒト動物のゲノムの部分（複数）との相同組換えを受けるのに十分な該部分との相同性を有し且つ該導入遺伝子の両側にある領域（複数）、とを含む、標的に向かう構築物を提供する工程、及び
−  非ヒト細胞のゲノム中の内因性遺伝子の少なくとも一つに該導入遺伝子が相同組換えを起こすのに十分な条件の下で該細胞のゲノム中に該標的に向かう構築物を導入し、それにより該導入遺伝子で置換され又は破壊された内因性遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子を含む細胞を作成する工程、
を含む方法に存する。
【００３１】
本発明はさらに、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物で本来発現される外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み且つ非ヒト細胞のゲノムの部分により両側を挟まれている導入遺伝子を含む第一の標的に向かう構築物を提供する工程、及び
−  ｉ）該外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の少なくとも一部分、及びii）該内因性遺伝子を破壊できるポリヌクレオチド、を含む第二の標的に向かう構築物を提供する工程、
−  該部分に対応する、該細胞のゲノムの領域に導入遺伝子が相同組換えを起こすのに十分な条件の下で該非ヒト細胞中に第一の標的に向かう構築物を導入する工程、
−  該細胞のゲノム中の内因性遺伝子の少なくとも一つの中に該ポリヌクレオチドが相同組換えを起こすのに十分な条件の下で該細胞の中に第二の標的に向かう構築物を導入し、それにより該内因性遺伝子の少なくとも一つの破壊された対立遺伝子を含む細胞を作成する工程、
を含む方法に存する。
【００３２】
本発明は、別の動物における薬の挙動及び／又は代謝を評価するための非ヒトトランスジェニック動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該他の動物で本来発現される外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む核酸構築物を提供する工程、
−  ｉ）該外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の少なくとも一部分、及びii）該内因性遺伝子を破壊できるポリヌクレオチド、を含む標的に向かう構築物を提供する工程、
−  該細胞のゲノムの領域中に導入遺伝子が無差別に組み込まれるのに十分な条件の下で該非ヒト細胞の中に該核酸構築物を導入する工程、及び
−  該細胞のゲノム内の内因性遺伝子の少なくとも一つの中に該ポリヌクレオチドを相同組換えするのに十分な条件の下で該細胞中に該標的に向かう構築物を導入し、それによって該内因性遺伝子の少なくとも一つの破壊された対立遺伝子を含む細胞を作成する工程、
を含む方法にさらに及ぶ。
【００３３】
上記の作成方法で用いられた細胞は胚性幹細胞であることが好ましく、ネズミ目内の哺乳動物由来の胚性幹細胞であることが好ましく、マウスの胚性幹細胞であることが最も好ましい。
【００３４】
好ましい実施態様では、この方法は、非ヒト動物の胚盤胞又は他の発生初期段階中に少なくとも一つの導入遺伝子を含む胚性幹細胞を注入する工程をさらに含む。
【００３５】
別の好ましい実施態様では、この方法は注入された胚盤胞を偽妊娠非ヒト動物中に導入し、偽妊娠動物に少なくとも一つの相同組換えされた導入遺伝子を含む子孫に送達させる工程をさらに含む。
【００３６】
別の好ましい実施態様では、少なくとも一つの相同組換えされた導入遺伝子を含む該子孫は該外来性ポリペプチドを検出可能なレベルで発現することによりさらに特徴付けられる。
【００３７】
別の好ましい実施態様では、少なくとも一つの相同組換えされた導入遺伝子を含む子孫は、該内因性ポリペプチドの発現レベルの低下又は検出不可能によりさらに特徴付けられる。
【００３８】
代替的な好ましい実施態様では、この子孫は機能的な内因性ポリペプチドを生産する能力を欠如する。
【００３９】
この方法は、上に概述した方法により作成された非ヒトトランスジェニック動物を育種し、この動物の子孫を生産する工程をさらに含んでもよい。例えば、同一の導入遺伝子を含む動物を該導入遺伝子に関してホモ接合である動物を生産するため同系交配することができる。代替的に若しくは追加的に、本発明で記述された異なる導入遺伝子を含むトランスジェニック動物は二つ以上の異なる導入遺伝子を含む動物を作成するため交配することができる。代替的に又は追加的に、これらのトランスジェニック動物のいずれかを、本発明に記載された導入遺伝子（単数又は複数）のみでなく交雑戦略で使用される他の動物の望ましい遺伝的特性をも含む動物を得るために、同種の動物の任意の他の遺伝的に改変された、野性型の、又は突然変異型の動物と交配することができる。トランスジェニック動物がマウスの場合、交雑戦略はトランスジェニックマウスと、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、ＢＡＬＢ／ｃなどの同系交配マウス系統、ヒトの特定の疾病を模倣するように設計されたマウス又は有用なレポーター構築物有するマウスを含むがこれらに限定されない別のマウスとの交雑を含んでもよい。
【００４０】
トランスジェニック動物及びそれに由来する細胞は、薬を含む生物活性物質をスクリーニングするためにそして該物質の分布、効力、代謝及び／又は毒性を研究するために有用である。これらのスクリーニング法は、目的の動物における薬の挙動及び／又は代謝を改良された予測可能性を以て評価するためにとりわけ有用である。従って、さらなる側面において本発明は、目的の動物における薬の代謝及び／又は挙動を評価する方法であって、薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ目的の該動物で本来発現される外来性ポリペプチドを発現する非ヒトトランスジェニック動物にテストされる物質を投与する工程、及び薬の代謝及び／又は挙動を決定するため分析試験を行なう工程を含む方法を特徴とする。
【００４１】
一つの実施態様では、この分析試験は薬が投与されたトランスジェニック動物における該薬の濃度及び／又は分布を直接的又は間接的に評価する工程を含む。別の実施態様では、該分析試験は薬が投与されたトランスジェニック動物における該薬の効力を直接的又は間接的に評価する工程を含む。さらに別の実施態様では、該分析試験は薬が投与されたトランスジェニック動物における該薬の毒性を直接的又は間接的に評価する工程を含む。さらなる実施態様では、該分析試験は薬が投与されたトランスジェニック動物における該薬の半減期を直接的又は間接的に評価する工程を含む。なおさらなる実施態様では、該分析試験は薬が投与されたトランスジェニック動物における該薬の薬力学を直接的又は間接的に評価する工程を含む。なお別の実施態様では、該分析試験は薬が投与されたトランスジェニック動物における該薬の薬物動態学を直接的又は間接的に評価する工程を含む。
【００４２】
本発明は薬の代謝及び／又は挙動の研究における上に概説したようなトランスジェニック動物の使用をも包含する。
【００４３】
【表Ａ】
2004533826.tif 000423
【００４４】
【表Ａ−１】
2004533826.tif 000424
【００４５】
【表Ａ−２】
2004533826.tif 000425
【００４６】
【表Ａ−３】
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【００４７】
【表Ａ−４】
2004533826.tif 000427
発明の詳細な説明
１．定義
特に断らない限り、本明細書で用いられる技術的及び科学的用語は全て本発明が属する技術分野における当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載されたものと同じ又は等価の全ての方法及び材料は本発明の実施又は試験において使用できるが、好ましい方法及び材料が記載されている。本発明の目的のために、下記の用語を以下に定義する。
【００４８】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は一つ又は冠詞の文法上の一つよりも大きな数（即ち、少なくとも一つ）を指すために用いられる。例を挙げれば、「an element」は１要素又は１より大の要素を意味する。
【００４９】
「物質」とは、そのレベル及び／又は機能的活性が改変されるべき標的と直接的又は間接的のいずれかで相互作用する、天然に生ずる又は合成的に生産される分子を意味する。
【００５０】
「ＡＧＰ」とは、α酸性糖タンパク質ファミリーを意味する（ＡＡＧとも略する）。
【００５１】
「抗原結合分子」とは標的抗原に対する結合親和性を有する分子を意味する。この用語は免疫グロブリン、免疫グロブリン断片及び抗原結合活性を示す非免疫グロブリン由来のタンパク質骨格にまで及ぶものと理解される。
【００５２】
「オートロガス」とは同一生物に由来するもの（例えば、細胞、組織など）を意味する。
【００５３】
本明細書で用いるとき、用語「挙動」とは、薬に関して使用される場合、薬の分布、半減期、効力及び毒性及び薬の代謝物並びに該薬／化合物の投与の生理学的又は病理学的如何なる他の結果をも含むが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書で用いるとき、用語「シスで作用する配列」又は「シスで調節する領域」又は「調節領域」又は同様な用語は、発現しうる遺伝子配列に関して適当に配置された場合その遺伝子配列の発現を少なくとも一部調節することができる任意のヌクレオチド配列を意味すると解すべきである。当業者は、シスで調節する領域が、転写レベル又は転写後のレベルで遺伝子配列の発現及び／又は細胞型特異性及び／又は発生特異性のレベルを活性化し、沈黙化（silencing)し、強化し、抑制し又は他の方法で改変することができることに気付くはずである。
【００５５】
本明細書を通じて、論旨が他の意味を要求しない限り、「含む（comprise, comprises, comprising)」という用語は述べられた工程又は要素或いは工程又は要素の群を含むことを意味するが、他の如何なる工程又は要素或いは工程又は要素の群を排除することを意味しないと解すべきである。
【００５６】
「に対応する（corresponds to, corresponding to) 」とは、（ａ）参照されたポリヌクレオチド配列の全て又は一部と実質的に同一又は相補的であるヌクレオチド配列、又は（ｂ）ぺプチド又はタンパク質中のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチドを意味する。この言葉はその範囲内に参照されたぺプチド又はタンパク質中のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するぺプチド又はポリペプチドをも含んでいる。
【００５７】
「誘導体」とは、改変により、例えば、他の化学的部分との結合若しくは複合体形成により又は当分野で理解されるような翻訳後修飾により、基本配列から誘導されたポリペプチドを意味する。この用語「誘導体」はその範囲内に機能的に等価な分子を生ずる付加、又は欠失を含む親配列に加えられた改変をも含む。従って、用語誘導体は機能及び／又は免疫反応を調節する分子を包含する。
【００５８】
「薬」とは、生物、器官、組織又は細胞の生理学又は病理学を改変する又は改変することを意図する任意の化合物、ぺプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、又は他の分子若しくは部分を指す。
【００５９】
「エキソン」とは、成熟ｍＲＮＡ分子中に存在するＤＮＡセグメント又はそれがコードするｍＲＮＡセグメントの領域を意味する。
【００６０】
用語「外来性ポリヌクレオチド」又は「外因性ポリヌクレオチド」又は「異質ポリヌクレオチド」とは、実験操作により動物のゲノム中に導入される任意の核酸（例えば、遺伝子配列）を指し、該導入された遺伝子が天然に生ずる遺伝子に関して何らかの改変（例えば、点突然変異、選択可能マーカー遺伝子の存在、ｌｏｘＰ部位の存在など）を含む限りその動物中で見出される遺伝子配列を含んでもよい。
【００６１】
用語「遺伝子」とは、本明細書で用いられるとき、細胞のゲノムの考えられる全ての分離したコード領域並びに関連する非コード領域及び調節領域を指す。遺伝子は発現の調節に関与する特定のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、イントロン、及び隣接する５’及び３’非コードヌクレオチド配列をも意味すると意図される。この点で、遺伝子は、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル及び／又はポリアデニル化シグナルなどの内因性の（即ち、本来所与の遺伝子と関連している）又は異質の制御シグナルをさらに含んでもよい。ＤＮＡ配列はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ又はそれらの断片であってよい。遺伝子は染色体外で維持するため又は宿主中に組み込むため適当なベクター中に導入してもよい。
【００６２】
用語「相同体」とは、ポリペプチドとの文脈では、異なる動物のポリペプチドのコードされたアミノ酸配列に類似する配列を有する、参照動物のポリペプチドを指す。二つのポリペプチドは「相同である」と言われるが、これは該タンパク質の間で進化上の関係が必ずあることを意味するものではない。そうではなく、用語「相同である」とは該二つのポリペプチドが類似のアミノ酸配列を有することを意味すると定義される。さらに、多くの場合、類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドは類似の機能を有することになるが、用語「相同である」とは該ポリペプチドが機能的に相互に類似せねばならないことを意味するものではない。「相同である」がポリぺプチド又はぺプチドを指して用いられる場合、同一でない残りの位置はしばしば同類アミノ酸置換しか異ならないことが認識される。「同類アミノ酸置換」はアミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を持つ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されている場合の置換である。一般に、同類アミノ酸置換はタンパク質の機能的性質を実質的に変化させない。二つ以上のアミノ酸配列が同類置換だけ相互に異なる場合には、配列同一性パーセント又は相同性の程度は該置換の同類性を修正するため上方に補正してもよい。この補正をする手段は当業者に良く知られている（例えば、ピアソンら（1949）Method in Molecular Biology 24: 307-31) 。次の６個の群は、それぞれが相互に同類置換であるアミノ酸を含んでいる。（１）アラニン（Ａ），セリン（Ｓ），スレオニン（Ｔ）、（２）アスパラギン酸（Ｄ），グルタミン酸（Ｅ）、（３）アスパラギン（Ｎ），グルタミン（Ｑ）、（４）アルギニン（Ｒ），リジン（Ｋ）、（５）イソロイシン（Ｉ），ロイシン（Ｌ），メチオニン（Ｍ），バリン（Ｖ）、及び（６）フェニルアラニン（Ｆ），チロシン（Ｙ），トリプトファン（Ｗ）。
【００６３】
ポリペプチドの配列相同性は、配列同一性とも呼ばれるが、通常、配列分析ソフトウェアを用いて求められる。例えば、ウィスコンシン州５３７０５，マジソン，ユニバーシティ  アベニュー  ９１０のユニバーシティ・オブ・ウィスコンシン・バイオテクノロジー・センターのシーケンス・アナリシス・ソフトウェア・バッケージ・オブ・ザ・ジェネティクス・コンピュータ・グループ（ＧＣＧ）を参照せよ。タンパク質分析ソフトウェアは種々の置換、欠失及び同類アミノ酸置換を含む他の修飾に割当られた相同性の尺度を用いて類似の配列を適合させる。例えば、ＧＣＧは、例えば異なる種の生物由来の又は野性型タンパク質とその突然変異タンパク質の間の相同的なポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチドの間の配列相同性又は配列同一性を決定するためデフォルト・パラメータで使用できる「Ｇａｐ」や「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含む。異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと参照配列を比較する場合に好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴであり、とりわけｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ（アルチュールら，1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) である。ｂｌａｓｔｐの好ましいパラメータは、
予想値                          １０              （デフォルト）
フィルター                      ｓｅｇ            （デフォルト）
ギャップを開くための費用        １１              （デフォルト）
ギャップを拡大するための費用    １                （デフォルト）
最大整列                        １００            （デフォルト）
ワードサイズ                    １１              （デフォルト）
記載（descriptions) の数        １００            （デフォルト）
ペナルティマトリックス          ＢＬＯＷＳＵＭ６２
である。
【００６４】
相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは、一般に少なくとも約１６アミノ酸残基、通常少なくとも約２０アミノ酸残基、より普通には少なくとも約２４アミノ酸残基、典型的には少なくとも約２８残基、そして好ましくは約３５残基より多い。アミノ酸配列を用いるデータベース調査は当分野で知られたｂｌａｓｔ以外のアルゴリズムにより求めることができる。例えば、ポリペプチド配列はＧＣＧ６．１版におけるプログラムであるＦａｓｔａを用いて比較できる。Ｆａｓｔａは質問配列と調査配列の間の最良の重なりの領域の整列と配列同一性パーセントを与える（ピアソン（1990) Methods in Enzymology 183: 63-98))。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性パーセントは、ＧＣＧ６．１版で提供される、Ｆａｓｔａとそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ２、ＰＡＭ250 評点マトリックス）を用いて決定できる。本発明は、ポリペプチド「相同体」の二つの一般型を意図する。タイプ１相同体は強い相同体である。タイプ１相同体である二つのポリペプチドの比較は、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムと上に列挙したパラメータを用いて１×１０-40 より小さいｂｌａｓｔｐ評点を結果として生ずるであろう。ｂｌａｓｔｐ評点が低い程、即ちそれがゼロに近づく程、両ポリペプチド配列の間の適合は良くなる。タイプ２相同体はより弱い相同体である。タイプ２相同体である二つのポリペプチドの比較は、Ｂｌａｓｔアルゴリズムと上に列挙したパラメータを用いて、１×１０-40 と１×１０-10 の間のｂｌａｓｔｐ評点を結果として生ずるであろう。当業者は他のアルゴリズムが弱い相同性又は強い相同性を決定するために使用できることを認めるはずである。
【００６５】
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は二つのぺプチド又はポリペプチドの間又は二つの核酸分子の間の配列類似性を指す。相同性は、比較のために整列させた各配列における一つの位置を比較することにより決定できる。比較された配列の一つの位置が同じ塩基又はアミノ酸により占められる場合は、該分子（複数）はその位置において相同である。配列間の相同性の程度は該配列により共有される適合位置又は相同位置の数の関数である。「無関係な」又は「非相同な」配列は、参照配列と４０％未満の同一性、好ましくは２５％未満の同一性であるが、を共有する。
【００６６】
「ヒト化」とは、必ずしもヒトの等価物と同一ではないが、機能及び／又は構造においてヒトにより似せることを意味する。ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に関して本明細書で用いるとき、用語「ヒト」は、機能においてヒトに似ている全ての配列を含んでもよい。
【００６７】
「イントロン」とは一般に一次ｍＲＮＡからスプライスにより除かれるＤＮＡの領域又はそれがコードするｍＲＮＡセグメントであり、成熟ｍＲＮＡ分子には存在しないものである。
【００６８】
「分離された」とは、その本来の状態でそれに通常伴う成分を実質的に又は本質的に含まない物質を意味する。
【００６９】
「ノックイン」動物とは、本明細書で用いるとき、特定の遺伝子又はその部分が外来性遺伝子又は外来性ＤＮＡ配列により置き換えられている遺伝子的に改変された動物を指す。
【００７０】
「ノックアウト」動物とは、遺伝子が除去され又は機能できなくされている遺伝的に改変された動物を意味する。
【００７１】
用語「哺乳動物」は、本明細書では最も広い意味で用いられ、ゲッ歯類、霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ（caprices) 、ウマ、イヌ、及びネコを含む。好ましい非ヒト哺乳動物はねずみ（例えば、ラットやマウス）を含むネズミ目から選択され、最も好ましいのはマウスである。
【００７２】
「ｍＲＮＡ（Messenger RNA 又は mRNA)」とは、鋳型としてのＤＮＡを用いて細胞中で生産される「転写物」であって、それ自体タンパク質をコードするものである。
【００７３】
薬又はそれが相互作用するポリペプチドに関して用いられる場合、用語「代謝（metabolism又はmetabolising) 」などは、外因性物質の吸収、結合、摂取、分泌、分布、輸送、処理、変換又は分解を含む、これらに限定されないが、化合物の生変換並びに該薬の投与から直接的又は間接的に結果として生ずる病理学的反応の全ての側面を指す。
【００７４】
用語「５’非コード領域」は、該遺伝子のポリペプチド産物を含むアミノ酸残基をコードする配列以外の、発現可能な遺伝子の上流領域から誘導される全てのヌクレオチド配列を含めるためその最も広い意味で本明細書中で用いられる。この場合、５’非コード領域は該遺伝子を少なくとも一部発現させ、発現を活性化し、又は他の方法で発現を容易にする。
【００７５】
「ヌードマウス」は、ヒト腫瘍細胞を増殖させるための宿主としてしばしば使用される胸腺欠損マウスとしても知られる免疫不全マウスの一血統である。
【００７６】
本明細書で用いられるとき用語「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合（又は関連する構造変異型又はそれらの合成類似体）を介して連結されている多数のヌクレオチド単位（デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又は関連する構造変異型又はそれらの合成類似体）からなるポリマーを指す。従って、用語「オリゴヌクレオチド」は通常ヌクレオチド及びそれらの間の連結が天然に生ずるものであるヌクレオチドポリマーを指すが、この用語はその範囲内にぺプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ホスホン酸メチル、リボ核酸２−Ｏ−メチルなど、これらに限定されないが、を含む様々な類似体をも含むものと理解される。これらの分子の正確な大きさは特定の適用に応じて変化しうる。オリゴヌクレオチドは通常長さがかなり短く、一般に約１０から３０ヌクレオチドまでであるが、この用語は任意の長さの分子を指すことができる、ただし用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は通常大きなオリゴヌクレオチドに対して用いられる。
【００７７】
「機能しうるように連結した（operably linked 又は operably connected など) 」とは、機能的な関係でポリヌクレオチド要素を連結することを意味する。核酸配列はそれが別の核酸配列と機能的な関係で配置される場合「機能しうるように連結されて」いる。例えば、プロモーター又はエンハンサーはそれがコード配列の転写に影響を与える場合、該コード配列に機能しうるように連結されている。機能しうるように連結されるとは、連結されている核酸配列が通常隣接しており、二つのタンパク質コード領域を結合させる必要がある場合は隣接し且つリーディングフレーム内にあることを意味する。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼが二つのコード配列を１個のｍＲＮＡに転写でき、次いでそれが両方のコード配列から誘導されるアミノ酸を有する１個のポリペプチドに翻訳される場合に、別のコード配列に「機能しうるように連結され」ている。これらのコード配列は、発現された配列が最終的に所望のタンパク質を生産するようにプロセスされる限り、相互に隣接している必要はない。転写可能なポリヌクレオチドにプロモーターを「機能しうるように連結する」とは、該転写可能なポリヌクレオチド（例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は他の転写物）をプロモーターの調節的制御の下に置くことを意味する。このプロモーターは次いで該ポリヌクレオチドの転写及びときには翻訳を制御する。異質のプロモーター／構造遺伝子の組み合わせを構築する際には、転写可能なポリヌクレオチドの転写開始部位からある距離を置いてプロモーター又はその変異型を配置することが一般に好ましい。その距離はプロモーターとその本来の構成においてこのプロモーターが制御する遺伝子、即ち、該プロモーターがそれから誘導された遺伝子との間の距離とほぼ同じである。当分野で知られているように、この距離には幾らかの変動が機能の損失なしに許容される。同様に、その制御の下に置こうとする転写可能なポリヌクレオチドとの関係で調節配列要素（例えば、オペレーター、エンハンサーなど）の好ましい配置は、その天然の構成における該要素、即ち、それがそこから誘導された遺伝子の配置によって規定される。
【００７８】
用語「オルソログ（orthologue) 」とは、種分化を介する相同体、例えば、構造的及び機能的考察に基づいて密接に関係しておりそして共通の一定水準を持つと仮定される相同体である遺伝子又はタンパク質を意味する。オルソログのタンパク質は異なる種において同じ活性又は類似の活性を認識しうるように働く。用語「パラローグ（paralogue)」とは、遺伝子重複を介して、即ちゲノム内の一つの遺伝子の重複した変異型を介して相同である遺伝子又はタンパク質を意味する。フリッチ，ダブリューエム（1970) Syst Zool 19: 99-113を参照。
【００７９】
「ＰＣＲ」とは、ＤＮＡを増幅するための方法であるポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【００８０】
本明細書で用いられるとき用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とはｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを指し示す。この用語は通常長さが３０ヌクレオチドより大きなオリゴヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド配列は相補鎖並びに本明細書で記載された代替的骨格を包含するものと理解される。
【００８１】
用語「ポリヌクレオチド変異型」及び「変異型」とは、参照配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド又は以下に定義されるストリンジェント条件下で参照配列とハイブリッドを形成するポリヌクレオチドを意味する。これらの用語は、一つ以上のヌクレオチドが付加され若しくは欠失し若しくは異なるヌクレオチドで置換されたポリヌクレオチドをも包含する。この点で、突然変異、付加、欠失及び置換を含む一定の変更が、参照ポリヌクレオチドに施され、それにより改変されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物機能若しくは生物活性を保持し得ることは当分野で良く知られている。用語「ポリヌクレオチド変異型」及び「変異型」は天然に生ずる対立遺伝子変異型をも含む。
【００８２】
「ポリペプチド」、「ぺプチド」及び「タンパク質」は本明細書では、アミノ酸残基のポリマー及びその変異型及びその合成類似対立遺伝子を指すために互換的に使用される。従って、これらの用語は、天然に生ずるアミノ酸ポリマーのみでなく、一つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に生ずるアミノ酸の化学類似体などの天然に生じない合成アミノ酸であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００８３】
用語「ポリペプチド変異型」とは、参照ポリペプチドのそれと比べそのアミノ酸配列において何らかの相違を有するポリペプチドを意味する。従って、ポリペプチド変異型は、少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失又は置換により参照ポリペプチドから識別される。
【００８４】
「プライマー」とは、ＤＮＡ鎖と対合された場合、適当な重合物質の存在下でプライマー伸長生産物の合成を開始できるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは増幅の最大効率のためには一本鎖であることが好ましいが、代替的に二本鎖であってもよい。プライマーは重合物質の存在下で伸長生産物の合成を開始するのに十分な程長くなければならない。プライマーの長さは、適用、用いられる温度、鋳型反応条件、他の試薬、及びプライマーの起源などの多数の因子に依存する。例えば、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは通常１５〜３５又はそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含んでいてもよい。プライマーは、約２００ヌクレオチドから数千塩基又はそれ以上までの大きなポリヌクレオチドであることもできる。プライマーは、それがハイブリッドを形成しそして合成の開始部位として役立つように設計される鋳型の配列に「実質的に相補的」であるように選択されうる。「実質的に相補的」とは、このプライマーが標的ヌクレオチド配列とハイブリッドを形成するのに十分な程相補的であることを意味する。プライマーはそれがハイブリッドを形成するように設計される鋳型との不適合を含まないことが好ましいが、これは必須ではない。例えば、プライマー配列の残りが該鋳型に相補的であれば、非相補的ヌクレオチドがプライマーの５’末端に付着しうる。または、プライマー配列が鋳型配列とハイブリッドを形成するのに十分な程相補的でありそれにより該プライマーの伸長生産物を合成するための鋳型を形成するとするならば、非相補的ヌクレオチド又は非相補的ヌクレオチドのストレッチがプライマー中に散在できる。
【００８５】
「プローブ」は、特定の配列又は部分配列又は別の分子の他の部分に結合する分子を指す。特に断らない限り、用語「プローブ」は通常相補的塩基対合を介して「標的核酸」としばしば呼ばれる別の核酸に結合するポリヌクレオチドプローブを指す。プローブはハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブとの完全な配列相補性を持たない標的核酸に結合しうる。プローブは直接的又は間接的に標識できる。
【００８６】
「プロモーター」とは転写の開始及び転写レベルを制御する、ｍＲＮＡをコードする領域の一般に上流（５’）のＤＮＡ領域を意味する。本明細書での「プロモーター」への言及はその最も広い意味にとられるべきであり、ＴＡＴＡボックス配列やＣＣＡＡＴボックス配列などの古典的ゲノム遺伝子の転写調節配列を含み、並びに発生的及び／又は環境からの刺激への応答として遺伝子発現を改変する、又は組織特異的若しくは細胞型特異的な方式で遺伝子発現を改変する付加的調節因子（即ち、上流の活性化配列、エンハンサー及びサイレンサー）を含む。プロモーターは通常、しかし必ずしも常にではなく、それがその発現を調節する構造遺伝子の上流即ち５’に配置される。さらに、プロモーターを含む調節因子は通常該遺伝子の転写の開始部位の２ｋｂ以内に配置される。本発明のプロモーターは細胞中での発現をさらに強化するため、及び／又はそれが機能しうるように連結される構造遺伝子の発現のタイミング又は誘導可能性を改変するため、開始部位からさらに遠位に配置された付加的な特異的調節因子を含んでもよい。
【００８７】
用語「組換えポリヌクレオチド」は、本明細書で用いられるとき、核酸の操作により天然で普通には発見されない形態にイン・ビトロで形成されたポリヌクレオチドを指す。例えば、組換えポリヌクレオチドは発現ベクターの形態であってもよい。一般に、このような発現ベクターはヌクレオチド配列に機能しうるように連結された転写調節核酸及び翻訳調節核酸を含む。
【００８８】
「組換えポリペプチド」とは、組換え技法を用いて、即ち組換えポリヌクレオチドの発現により、作成されたポリペプチドを意味する。
【００８９】
本明細書で用いられるとき「レポーター分子」とは、その化学的性質により、分析的に同定可能なシグナルを提供する分子を意味する。例えば、抗原結合分子及びその標的抗原を含む複合体の検出である。用語「レポーター分子」は細胞凝集の使用又はラテックスビーズ上の赤血球などの凝集の阻害の使用にも及ぶ。
【００９０】
「ＳＣＩＤマウス」とは重症複合免疫不全症を持つ免疫不全マウスの一血統を意味する。
【００９１】
本明細書で用いるとき用語「配列同一性」は、比較窓の上でヌクレオチドごと又はアミノ酸ごとに配列が同一であるというその程度を指す。従って、「配列同一性パーセンテージ」とは、比較窓の上で最適に整列させた二つの配列を比較し、両配列において同一核酸塩基（例えば、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｉ）又は同一アミノ酸残基（例えば、Ａｌａ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が生ずる位置の数を決定して適合位置の数を求め、該適合位置の数を比較窓中の位置の総数（即ち、窓のサイズ）で割り、そしてその結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることにより計算される。本発明の目的では、「配列同一性」は、ＤＡＮＳＩＳコンピュータプログラム（ウィンドウズ（登録商標）用２．５版，米国，カリフォルニア，サウスサンフランシスコのヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング・コウ．リミティッド）により、このソフトウェアに添付された参照マニュアルで使用されているような標準的デフォルトを用いて計算された「適合パーセンテージ」を意味するものと理解すべきである。
【００９２】
「サザンブロット」は、特異的ＤＮＡ配列を検出するための方法である。簡単に述べれば、ＤＮＡ試料を制限酵素で切断し、電気泳動にかけ、膜に移転させ、ついで目的の標識化ＤＮＡ断片で精査する。
【００９３】
「標準的マウス」とは、本発明の遺伝子改変を保持しないマウスの任意の血統を意味する。
【００９４】
本明細書で用いるとき「ストリンジェンシー」とは、ハイブリダイゼーション手順及び洗浄手順の間の温度とイオン強度、及び一定の有機溶媒の存在又は非存在を意味する。ストリンジェンシーが高い程、固定化された標的ヌクレオチド配列と洗浄後に該標的とハイブリッド形成をしたまま残っている標識化プローブポリヌクレオチド配列との間の相補性の程度は高くなる。
【００９５】
「ストリンジェント条件」は、高頻度の相補塩基を有するヌクレオチド配列のみがハイブリッドを形成する、温度及びイオンの条件を指す。要求されるストリンジェンシーはヌクレオチド配列に依存し、且つ、ハイブリダイゼーション及びその後の洗浄の間存在する種々の成分に依存し、そしてこれらの処理の時間に依存する。一般に、ハイブリダイゼーションの割合を最大にするため、非ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択され、熱融点（Ｔm ）よりも約２０〜２５℃低い温度が選択される。このＴm は、規定されたイオン強度及びｐＨで溶液中の完全に相補的なプローブに特定の標的配列の５０％がハイブリッドを形成する温度である。一般に、ハイブリッドを形成した配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を要求するためには、高ストリンジェント洗浄条件はＴm よりも約５〜１５℃低い温度が選択される。ハイブリッドを形成した配列の少なくとも約７０％ヌクレオチド相補性を要求するためには、中ストリンジェント洗浄条件はＴm よりも約１５〜３０℃低い温度が選択される。高度に許容性の（低ストリンジェンシー）洗浄条件は、ハイブリッドを形成した配列の間の高レベルの不適合を許容する、Ｔm より５０℃も低い温度である。当業者は、ハイブリダイゼーション及び洗浄段階で他の物理的及び化学的パラメータが標的配列及びプローブ配列の間の相同性の特定のレベルからの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響するように改変することもできることを認めるはずである。ストリンジェンシー条件の他の例はセクション３．３に記載される。
【００９６】
本明細書で用いられるとき、用語「実質的に精製された」とは、天然の環境から分離され、単離又は分別され、自然界で結合している他の成分を少なくとも６０％、好ましくは７５％、最も好ましくは９０％含まない、核酸配列又はアミノ酸配列のいずれかである分子を意味する。従って、「単離されたポリヌクレオチド」は実質的に精製されたポリヌクレオチドである。
【００９７】
「ｔ1/2 」とは、薬がその濃度を１／２まで低減するために必要な時間（半減期としても知られる）を意味する。
【００９８】
「トランスフェクション」とは、核酸分子（例えば、プラスミド又はＤＮＡ断片）が真核細胞中に挿入される過程のプロセスを意味する。通常、２〜５０％の細胞が該プラスミドを取込み、該プラスミドＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ断片を細胞の染色体に組み込むことなく約３日間タンパク質生産物を発現する（＝一過性のトランスフェクション）。これらの細胞の小さな割合が最終的にプラスミドＤＮＡを細胞の染色体に組み込み、永久にタンパク質生産物を発現する（＝安定なトランスフェクション）。
【００９９】
用語「導入遺伝子（transgene)」とは、生きている動物の細胞、とりわけ哺乳動物細胞のゲノム中に人工的に挿入された又はされる予定の遺伝子物質を記述するために本明細書で用いられる。該導入遺伝子は細胞を形質転換するために用いられ、永久的又は一過性の遺伝子変化、好ましくは永久的遺伝子変化が、外因性の核酸（通常ＤＮＡ）の組み込みの後に細胞内で誘導されることを意味する。永久的遺伝子変化は一般に細胞のゲノム中へのＤＮＡの導入により達成される。安定な組み込みのためのベクターには、プラスミド、レトロウイルス、及び他の動物ウイルス、ＹＡＣｓ（酵母人工染色体）、ＢＡＣｓ（細菌人工染色体）などが含まれる。導入遺伝子は、脊椎動物、好ましくはゲッ歯類、ヒト、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ目の動物、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、エイブ（aves) などの哺乳動物を含む、これらに限定されないが、動物に由来するものが好ましい。
【０１００】
本明細書で用いるとき用語「トランスジェニック」とは、内因性ゲノムが外来性遺伝子又は外来性配列の無差別組み込み又は部位特異的組み込みにより補充され又は改変されている遺伝子的に改変された動物を意味する。
【０１０１】
本発明の「トランスジェニック動物」は、好ましくは動物の生殖細胞系列のゲノムの実験的操作により生産される。これらの遺伝子工学処理された動物は、核酸（通常ＤＮＡ）を含む「導入遺伝子」の胚の標的細胞中への導入、又は本明細書で記載された方法によるなどのヒトの介入により動物の体細胞及び／又は生殖系列細胞の染色体中への「導入遺伝子」の組み込みを含む幾つかの方法により作成される。導入遺伝子を含む動物は「トランスジェニック動物」と呼ばれる。トランスジェニック動物はそのゲノムが導入遺伝子の導入により改変された動物である。
【０１０２】
「ＵＧＴｓ」又は「ＵＤＰＧＴｓ」とは、ウリジン・グルクロノシルトランスフェラーゼ又はウリジン・ジホスホグルクロノシルトランスフェラーゼを意味する。
【０１０３】
「ベクター」とは、核酸配列が挿入され又はクローニングされうる、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、又は植物ウイルスに由来する核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子を意味する。ベクターは一つ以上のユニークな制限部位を含み、そして標的細胞若しくは組織又はその先祖の細胞若しくはその組織を含む一定の宿主細胞中で自律複製でき、又は該クローニングされた配列が再生できるように一定の宿主のゲノムと一体化しうるものであることが好ましい。従って、ベクターは、自律複製可能ベクター、即ち、その複製が染色体の複製と無関係な染色体外実体、例えば、線状プラスミド若しくは閉環状プラスミド、染色体外因子、ミニクロモソーム、又は人工染色体、として存在するベクターでありうる。ベクターは自己複製を確実にするための任意の手段を含んでもよい。または、ベクターは宿主細胞に導入された場合、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（単数又は複数）と一緒に複製するものであってもよい。ベクター系は１個のベクター又はプラスミドを含んでもよく、宿主細胞のゲノム中に導入されるべき総ＤＮＡを共に含む二つ以上のベクター又はプラスミドを含んでもよく、トランスポゾンを含んでもよい。ベクターの選択は通常該ベクターが導入される宿主細胞と該ベクターの適合性に左右される。ベクターは適当な形質転換体を選択するために用いることができる抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含んでもよい。このような耐性遺伝子の例は当業者に良く知られている。
【０１０４】
用語「野性型」とは、天然資源から単離されたときの遺伝子又は遺伝子産物の特徴を持っているその遺伝子又は遺伝子産物を意味する。野性型遺伝子は集団において最も頻繁に観察され、従って該遺伝子の「正常」型又は「野性」型と恣意的に命名される。対照的に、用語「改変された」、「変異型」又は「突然変異型」は、野性型の遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合配列の特性又は機能的特性における改変（即ち、改変された特徴）を示す遺伝子又は遺伝子産物を指す。天然に生ずる突然変異体を単離することができることに注意すべきである。これらは野性型遺伝子又は野性型遺伝子産物と比較した場合改変された特徴を有するという事実により確認される。
【０１０５】
本明細書で用いるとき、遺伝子の名前に下線を引いたもの又はイタリックにしたものは遺伝子を示すと解すべきである。これは下線を引いたりイタリックにしたりしないで示された該遺伝子のタンパク質生産物と対照的である。例えば、「ＡＧＰ−１」はＡＧＰ−１遺伝子を意味するが、「ＡＧＰ−１」は「ＡＧＰ−１」遺伝子のタンパク質生産物を示す。
【０１０６】
２．本発明のトランスジェニック哺乳動物
本発明は選択された霊長類種の薬の代謝により近似する薬の代謝を示す非霊長類トランスジェニック哺乳動物を提供する。とりわけ好ましい実施態様では、該選択された霊長類種はヒトであり、従って、このトランスジェニック哺乳動物は、その野性型動物の薬の代謝よりももっとヒトに近似しした薬の代謝を示す。このようなトランスジェニック動物は、薬のスクリーニング、薬の前臨床的評価及び種々の毒性学的及び薬理学的研究を含む適用を有するが、これらに限定されない。
【０１０７】
本発明はとりわけ、薬の挙動及び／又は薬の代謝と関連したポリペプチドの発現のための非霊長類トランスジェニックモデルに向けられている。より具体的には、本発明は選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物であって、該トランスジェニック哺乳動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドの少なくとも一部を発現するものであり、該外来性ポリペプチドが該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種内で本来発現されるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当するものである非霊長類トランスジェニック哺乳動物を提供する。一つの実施態様では、外来性ポリペプチドは、導入遺伝子内に含まれるヌクレオチド配列によりコードされ、該ヌクレオチド配列が該選択された霊長類種の野性型遺伝子又は野性型様遺伝子物質に相当するものである。この野性型様遺伝子物質は一遺伝子全体から成るものでも、遺伝子群の塊又はその部分から成るものであってもよい。それは野性型遺伝子の生物活性断片から成るものでもよい。導入遺伝子はゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを含んでもよい。好ましい実施態様では、該トランスジェニック哺乳動物は、そのゲノムに挿入された、薬と結合するポリペプチド及び／又は薬を代謝するポリペプチドをコードする少なくとも一つのヒト遺伝子又はヒト様遺伝子を持つという特徴を有する。このトランスジェニック哺乳動物は、その細胞の全体又は一部への導入遺伝子の安定な組み込みにより、その生殖細胞系配列に安定な変化を含むことが好ましい。
【０１０８】
薬の効力は標的組織に到達する薬の量及び該標的に対しその化合物が持つ親和性に依存する。同様に、薬の毒性は攻撃されやすい組織に到達する薬又はその代謝物の量に依存する。薬は、身体組織に薬を送達するため通常、血液、血清、脳脊髄液及びリンパ液などの、これらに限定されないが、循環液を用いる種々の技法（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、経口、皮下）により投与できる。幾つかの薬を代謝するポリペプチドは循環液内に存在し、この循環液は薬及びその代謝物の両者の半減期に影響を与えることができる。毒性を決定しそして効力に寄与できるのは該薬それ自体ではなく二次代謝物であることがしばしばある。一般に、代謝には二つのタイプが起こり得る。フェーズＩ代謝は通常酸化、還元又は加水分解によりこの分子の極性を増加させる。そしてフェーズII反応は該薬への内因性基質の何らかの結合が起こるという点で合成的である（例えば、アセチル化については、表１及びギルマンら（編），1985，The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan Publishing Co., New York を参照）。しかしながら、薬代謝における種差が起こり得る。例えば、フェーズII反応では、ラットでグルクロニド形成が硫酸化よりも優先しており、一方イヌ及びヒトでは、例外も起こるが硫酸化が優先する（リン及びルー，1997,Pharmacol. Rev. 49: 403-449) 。薬の代謝における周知の差は、アモバルビタールのヒドロキシル化がヒト、イヌ、モルモット、ラット、ハムスター、及びマウスの間で一貫した特徴であるにもかかわらず、Ｎ−グルクロニド形成はヒト特異的であり、一方ジオール誘導体の形成は研究されたヒト以外の種でのみ起こるようにみえるということである（タングら，1980，Canadian J. Physiol. Pharmacol. 58: 1167-1169)。薬の代謝には無数の酵素が関与し、これらには幾つかのチトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）イソ型、エステラーゼ、アセチル−トランスフェラーゼ、アセチラーゼ、グルクロノシル−トランスフェラーゼグルクロニダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ及びさらに多く（例えば、表１を参照）が含まれる。通常、異なる種由来の薬を代謝するポリペプチド同族体の間には構造的相違があり、これはそれらの基質特異性を含むそれらの薬代謝能力に影響し得る。こうして、一つの実施態様では、外来性ポリペプチドは薬を代謝するポリペプチドである。このタイプの好ましい外来性ポリペプチドには、脱アルキル化反応（Ｏ−又はＮ−結合）、脱アミノ化反応、デスルフレーション（desulphuration) 、ヒドロキシル化（脂肪族又は芳香族側鎖）、ヒドロキシル化（Ｎ−結合）及びスルホキシド誘導体化を含むがこれらに限定されない酸化反応、アセチル化、グルクロニド形成、グリシン・コンジュゲーション、メチル化（Ｏ−，Ｎ−，又はＳ−結合の）、及び硫酸コンジュゲーションを含むがこれらに限定されないコンジュゲーション反応、エステル又はアミドのの加水分解を含むがこれらに限定されない加水分解反応、並びにアゾ基又はニトロ基の還元的代謝を含むがこれらに限定されない還元的代謝から選択される反応を促進し又は触媒するポリペプチドが含まれる。とりわけ好ましい実施態様では、薬物を代謝するポリペプチドはチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）である。これは、ＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３及びＣＹＰ４を含むがこれらに限定されないＣＹＰ群から適切に選択される。このタイプの好ましい実施態様では、外来性ポリペプチドはヒト又はヒト様のＣＹＰ亜群又はハロタイプである。これはＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ４Ａ９又はＣＹＰ４Ａ１１から選択されることが好ましいが、常にそうとは限らない。内因性ＣＹＰ群の発現は変化せず又は破壊されずに残る。このタイプの特に好ましい実施態様では、ＣＹＰはＣＹＰ３Ａ４である。別の好ましい実施態様では、該薬物を代謝するポリペプチドはウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である。
【０１０９】
薬物を代謝するタンパク質及び遺伝子の他の例には、多剤耐性（ＭＤＲ）群及び多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）群が含まれる。例えば、ヒトのＭＤＲ−１遺伝子は、本来細胞内に蓄積する薬物の量を制限する薬物流出ポンプとして働くＰ−糖タンパク質をコードする。ＭＲＰ−１は識別可能ではあるが類似の効果を有する。
【０１１０】
循環液も一定の薬物に対し結合親和性を有し、それによりこれらの薬物又はその代謝物の分布、効力及び／又は毒性に影響を与える幾つかのタンパク質（及び他の因子）を含んでいる。典型的には、異なる種から得られるそのような薬物結合ポリペプチドは構造上の差異を有し、それがこれらの薬物結合能力に影響を与え得る。従って、代わりの実施態様では、外来性ポリペプチドは薬物結合ポリペプチドである。このタイプの好ましい実施態様では、該薬物結合ポリペプチドは、通常酸性の薬物若しくは薬物代謝物に結合する血清アルブミンである。この外来性ポリペプチドは、配列番号：２に記載された配列を適切に含むヒトの血清アルブミンであることが好ましい。このタイプの好ましい実施態様では、ヒトの血清アルブミンをコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号：１及び配列番号：３のいずれか一つに記載された配列を含む。このトランスジェニックマウス又はその先祖の内因性血清アルブミンは配列番号：６に記載の配列を含むマウスの血清アルブミンであることが好ましい。マウス血清アルブミンに対する内因性遺伝子は配列番号：５に記載された配列を含む転写物をコードすることが好ましい。その調節ポリヌクレオチドはその内因性遺伝子に関するコード配列の上流に本来配置されるヌクレオチド配列を含むことが好ましい。その調節ポリヌクレオチドは配列番号：７に記載された配列を含むことが好ましい。
【０１１１】
別の薬物結合ポリペプチドはα酸性糖タンパク質（ＡＡＧ，ＡＧＰ又はオロソムコイド，ＯＲＭとしても知られる）であり、これは以下ＡＧＰと呼ばれる。ＡＧＰの血漿濃度は健常個人では０．０２８から０．０９２ｇ／１００ｍＬに及び、炎症、感染又は癌への応答として増加する（ドゥチェＪＣら，1998, J Chromatogr. B Biomed Sci Appl 715: 103-109; ドゥチェＪＣら，2000, Clin Biochem 33: 197-202; ナカムラ H  ら，2000 Biochem Biophys Res Commun 276: 779-784) 。ＡＧＰのレベルはこれらの疾病状態で大きく変化できる、従ってＡＧＰに強く結合する薬物の薬物動態学に大きな影響を与えることができる。ＡＧＰの幾つかの亜群が記述されており、以下ＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３と呼ばれる、２〜３の縦列に配列した遺伝子によりコードされる。一般に、ＡＧＰは中性及び塩基性の化合物と結合するが、その例外も生ずる（リン及びルー，1997，Pharmacol. Rev. 49: 403-449)。従って、別の実施態様では、該薬物結合ポリペプチドはＡＧＰである。このタイプの好ましい実施態様では、外来性ポリペプチドは、ＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３から選択されるヒトＡＧＰである。このヒトＡＧＰ−１（オロソムコイド（ＯＲＭ）−１としても知られる）は配列番号：１４に記載された配列を含むことが好ましい。一つの実施態様では、ヒトＡＧＰ−１をコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号：１３に記載された配列を含む。ヒトＡＧＰ−２（ＯＲＭ−２としても知られる）は配列番号：１６に記載された配列を含むことが好ましい。一つの実施態様では、ヒトＡＧＰ−２をコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号：１５に記載された配列を含む。別の好ましい実施態様では、内因性ＡＧＰの発現は改変される。この内因性ＡＧＰはＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２、ＡＧＰ−３及びＡＧＰ−４から選択されるマウスのＡＧＰであることが好ましい。マウスＡＧＰ−１は配列番号：１０に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−１をコードする内因性遺伝子は配列番号：９に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−３は配列番号：１２に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−３をコードする内因性遺伝子は配列番号：１１に記載された配列を含むことが好ましい。この例では、調節ポリヌクレオチドは該外来性ポリペプチドをコードする遺伝子に関するコード配列の上流に本来位置するヌクレオチド配列を含むことが好ましい。この調節ポリヌクレオチドはそれぞれヒトＡＧＰ−１及びＡＧＰ−２の上流に本来位置する調節ポリヌクレオチドに相当する配列番号：２１及び／又は配列番号：２２に記載された配列を含むことが好ましい。
【０１１２】
薬物結合タンパク質も特定の薬物の標的を含みうる。例えば、薬物ヘルセプチン（Herceptin)はヒト（マウスではなく）のＥｒｂＢ２の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、ＥｒｂＢ２を過剰発現する腫瘍の増殖を低減する効果を有する。多くのｍＡｂは最初にマウスで形成されるから、ヘルセプチンやその前駆体である４Ｄ５などの多くのｍＡｂ類が相同的なマウスタンパク質を認識しないのは驚くべきことではない。ヘルセプチンの前臨床試験はヒト腫瘍を持ったヌードマウスの治療を含むものであった。このような研究はヘルセプチンの潜在的心臓毒性を明らかにしない。何故ならマウス組織が発現するＥｒｂＢ２はヘルセプチンにより認識されなかったからである。この薬との関係では、ＥｒｂＢ２は薬物結合タンパク質と考えられ、従ってこの発明はこのような如何なる薬物標的をもこの発明の外来性ポリペプチドだと考える。好ましい実施態様では、本発明はトランスジェニック哺乳動物でＥｒｂＢ２のような薬物標的のヒト化を意図する。
【０１１３】
トランスジェニック哺乳動物は、標準的トランスジェニック（無差別組み込み）法又は「ノックイン」（部位特異的）法により作成してもよく、そして宿主の細胞遺伝子、とりわけ導入遺伝子と相同な、類似する、又はそうでなければ導入遺伝子の少なくとも一部に相当する宿主遺伝子の破壊と関連しうる。好ましい実施態様では、非ヒト起源、例えば非ヒト霊長類などのヒトに似た動物から一つ以上の遺伝子又はその部分を誘導することが好ましいが、この導入遺伝子の核酸配列は通常ヒト起源からのものである。または、この導入遺伝子は合成ポリヌクレオチド及び／又はヒトのポリヌクレオチド及び／又は他の起源由来のポリヌクレオチド配列のハイブリッド／キメラであってもよい。
【０１１４】
目的の導入遺伝子は薬物結合及び／又は薬物代謝と関連するポリペプチドをコードするその能力について選択される。１個の胚に挿入するため一つ以上の導入遺伝子を同時に使用することは本発明の範囲内にはいる。
【０１１５】
トランスジェニック動物はネズミ目の動物から選択することが好ましい。好ましいトランスジェニック哺乳動物はマウスであるが、ラットもとりわけ有用である。しかしながら、本発明はこれらの種には限定されないことが理解されるであろう。例えば、トランスジェニック動物はヒト化されたイヌ若しくはモルモットであってもよい。
【０１１６】
本発明のトランスジェニック哺乳動物を作成するために有用な配列には、発現の調節に関与する特定のポリペプチド又はドメイン、イントロン、及び隣接する５’及び３’非コードヌクレオチド配列をコードするオープンリーディングフレームが含まれるが、これらに限定されない。目的のポリペプチドをコードする核酸配列はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ又はそれらの断片であってもよい。
【０１１７】
目的のゲノム配列はタンパク質をコードする領域、例えばリストされた配列で規定されたような領域を含み、そして本来の染色体に正常では存在するイントロンのいずれか若しくは全てを含んでもよい。成熟ｍＲＮＡで見出される３’及び５’非翻訳領域をさらに含んでもよい。
【０１１８】
プロモーター及び他の調節因子を含む調節ポリヌクレオチドも本発明を実施する際に使用される。一部の適用では、受容する哺乳動物と同じ種に由来する調節因子を使用することが好ましい。別の適用、とりわけ、トランスジェニック哺乳動物における遺伝子発現のパターンが選択された霊長類種のそれとより類似することが要求される場合では、その種の調節因子、又はその種に似ている調節因子、又はこのような調節因子とトランスジェニック哺乳動物の調節因子の混合物を使用することが好ましいことがある。従って、ヒトに一層似た遺伝子発現のパターンが要求される好ましい実施態様では、ヒト調節因子又はヒトに似た調節因子又はヒト調節因子と宿主の調節因子の混合物を使用することが好ましいことがある。この調節因子は、約１〜約１０ｋｂの長さの、受容するゲノムに挿入されるべき宿主哺乳動物遺伝子又は対応するヒト遺伝子の領域をコードするｍＲＮＡの５’の上流の配列及びおそらくは３’の下流の配列に相当するゲノム配列を必ずではないが典型的には含むことが好ましい。遺伝子の５’非翻訳配列、３’−非翻訳配列及びタンパク質をコードする配列を含む他の調節因子は、イントロン又はエキソン中に配置されてもよい。こうして、調節ポリヌクレオチドは、転写制御配列及び／又は翻訳制御配列及び／又は他の転写後制御配列を含むことが好ましい。この調節ポリヌクレオチドには、プロモーター配列、５’非コード領域、転写調節タンパク質又は翻訳調節タンパク質に対する機能的結合部位などのシス調節領域、上流のオープンリーディングフレーム、転写開始部位、翻訳開始部位、及び／又はリーダー配列、終止コドン、翻訳停止部位及び３’非翻訳領域をコードするヌクレオチド配列が含まれるがこれらに限定されない。３’非翻訳配列は、ポリアデニル化シグナル及びｍＲＮＡのプロセシング又は遺伝子発現を行なうことができる任意の他の調節シグナルを含むＤＮＡセグメントを含む遺伝子の部分を指す。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端にポリアデニル酸部分の付加を行なうことを特徴とする。ポリアデニル化シグナルは、標準的な形である５’ＡＡＴＡＡＡ−３’への相同性の存在により通常認識され、極めて近く（一般にＡＡＴＡＡＡから２０〜６０ヌクレオチド）にＴ豊富又はＧＴ豊富な配列を含むが、変異は稀ではない。この３’非翻訳調節ＤＮＡ配列は約５０から１０００ヌクレオチド塩基対までを含むことが好ましく、ｍＲＮＡ切断シグナル又は転写終結配列、並びにポリアデニル化シグナルに加えた翻訳終結配列及びｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現を行なうことができる任意の他の調節シグナルを含んでもよい。当分野で知られている構成プロモーター又は誘導プロモーターは本発明で意図される。これらのプロモーターは天然に生じるプロモーター、又は一つ以上のプロモーターの要素を結合するハイブリッドプロモーターのいずれでもよい。本発明により意図されるプロモーター配列は導入される宿主細胞にとって天然のものであってもよく、又はその領域が宿主細胞内で機能する場合は代替的起源から誘導してもよい。本発明で使用されるポリヌクレオチドは目的のポリペプチド又は適当な場合はそのドメインの全部又は一部をコードすることがある。ＤＮＡ配列の断片は従来法に従ってオリゴヌクレオチドを化学的に合成することにより、制限酵素消化により、ＰＣＲ増幅（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，９６５，１８８号、及びアウスベルら（「分子生物学の現代のプロトコール」，John Wiley & Sons Inc, 1994-1998) 又はロング・テンプレートＰＣＲシステム（ベーリンガー・マンハイム，インディアナポリス，インディアナ州、スキアダス J. ら 1999, Mammalian Genome 10: 1005-1009)及び「インバースＰＣＲ」（例えば、アキヤマ K. ら 2000, Nucleic Acids Research 28(16)e77 i-viにより記載されたもの) などの長距離ＰＣＲ技術を含むそれらの改良法により、又は例えば米国特許第５，４２２，２５２号に記載されたような鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、例えばリューら（1996，J. Am. Chem. Soc. 118: 1587-1594及び国際出願 WO 92/01813) 及びリザルディら（国際出願 WO 97/19193) に記載されたようなローリング・サークル複製（ＲＣＲ）、例えばスークナナンら（1994, Biotechniques 17: 1077-1080)  により記載されたような核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び例えばタイアギら（1996, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 93: 5395-5400) に記載されたようなＱ−βレプリカーゼ増幅法などの任意の他の核酸増幅法により得てもよいが、これらに限定されない。大部分については、ＤＮＡ断片は少なくとも１０ヌクレオチド、通常は少なくとも１８ヌクレオチドである。このような小さなＤＮＡ断片はＰＣＲ又は他の核酸増幅法、ハイブリダイゼーションスクリーニングなどのためのプライマーとして有用である。より大きなＤＮＡ断片、即ち１００ヌクレオチドより大きな断片はコードされたポリペプチド又はその部分の生産に有用である。ＰＣＲなどの増幅反応に使用するためには、一対のプライマーが使用される。一例として、目的のＤＮＡセグメントの５’末端及び３’末端の領域に相当するプライマーが化学的に合成され、目的のセグメントを形成させ且つ増幅させるために、鋳型としてのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡと共にＰＣＲ反応で使用される。
【０１１９】
３．核酸構築物
本発明は、選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物を作成するための核酸構築物又はベクターを提供する。有利なことに、この構築物は薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むものであり、この外来性ポリペプチドは該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種で本来発現されるものであるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当するものである。特に好ましい実施態様では、この導入遺伝子はヒト起源のポリヌクレオチド又はヒト様ポリヌクレオチド（例えば、異なる霊長類種由来の）又は他の等価物を含む。
【０１２０】
一つの実施態様では、上記核酸構築物は該導入遺伝子を挟む二つの領域であって、該非霊長類哺乳動物のゲノムの部分と十分に相同的であるため該部分と相同組換えを受ける領域を含む標的に向かうベクターである。このタイプの好ましい実施態様では、該部分は非霊長類種哺乳動物のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の両側の配列又は内因性遺伝子に含まれる配列を含み、そのポリペプチドは該外来性ポリペプチドの対応する相同体である。この導入遺伝子は外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードする該配列に機能しうるように連結した調節ポリヌクレオチドを含むことが好ましい。上記標的に向かうベクターは選択可能なマーカー遺伝子を含むことが好ましい。
【０１２１】
こうして、相同組換えのための標的に向かうベクターは目的の外来性遺伝子又は異種の遺伝子の少なくとも一部を含み、そして標的遺伝子座に相同な領域を含む。無差別組み込みのためのＤＮＡベクターは、組換えを媒介するための相同な領域を含む必要はない。正の選択及び負の選択のためのマーカーを含めるのが便利である。標的化された遺伝子の相同組換えによる改変を受けた細胞を形成させる方法は当分野で知られている。哺乳動物細胞をトランスフェクトする種々の方法についてはケオウンら（1990, Methods in Enzymology 185: 527-537) を参照せよ。
【０１２２】
標的非霊長類細胞又は受容体非霊長類細胞（例えば、ＥＳ細胞）の染色体に存在する内因性遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子の中に導入遺伝子を相同組換えさせるために、領域は十分な長さをもち該ゲノムの部分と十分な相同性をもつように選択されることが好ましい。この領域は、挿入が意図された宿主ゲノムの部位に相同なＤＮＡの約１〜１５ｋｂを含むことが好ましい（用いられる量が内因性遺伝子中への相同組換えを可能とするのに十分である限り、１５ｋｂを越えるか又はその１ｋｂ未満の内因性遺伝子配列も使用されうる）。
【０１２３】
この核酸構築物は選択可能なマーカー遺伝子を含むことが好ましい。好ましい実施態様では、該核酸構築物は、非霊長類哺乳動物のゲノムの部分との相同組換えを受けるのに十分に該部分と相同な領域により両側を挟まれた選択可能なマーカー遺伝子を含む標的に向かうベクターである。一つの実施態様では、このゲノムの部分は非霊長類哺乳動物のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の両側の配列又は内因性遺伝子の内部の配列に相当し、そのポリペプチドは該外来性ポリペプチドの対応する相同体である。この例では、標的に向かうベクターは内因性遺伝子を破壊するように改変される。
【０１２４】
この核酸構築物は二つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含んでもよい。この選択可能なマーカーは、該選択可能なマーカーを発現する細胞に抗生物質又は薬に対する耐性を与える酵素活性をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。選択可能なマーカーは「正」であってもよい。正の選択可能なマーカーは通常優性な選択可能マーカーであり、即ち、全ての動物、好ましくは哺乳動物の細胞又は細胞系統（ＥＳ細胞を含む）中で検出できる酵素活性をコードする遺伝子である。優性な選択可能マーカーの例としては、薬Ｇ４１８に対する耐性を動物細胞に与える細菌のアミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ハイグロマイシンへの耐性を与える細菌のハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子、及びミコフェノール酸の存在下で増殖する能力を与える細菌のキサンチン−グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子とも呼ばれる）が挙げられる。選択可能なマーカーは「負」であってもよい。負の選択可能マーカーは適当な選択性培地中で増殖される場合その発現が細胞に毒性となる酵素活性をコードする。例えば、単純ヘルペスウイルスｔｋ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子は負の選択可能マーカーとして普通に使用される。ガンシクロヴィル（gancyclovir)又はアシクロヴィル（acyclovir)の存在下で増殖した細胞中でのＨＳＶ−ｔｋの発現は毒性であり、従って、ガンシクロヴィル又はアシクロヴィルを含む選択培地中での細胞の増殖は機能的なＨＳＶ・ＴＫ酵素を発現できる細胞を選択的に排除する。
【０１２５】
二つ以上の選択可能マーカー遺伝子を標的に向かうベクターと共に用いてもよい。この場合、標的に向かうベクターは、導入遺伝子内に正の選択可能マーカー（例えば、ｎｅｏ遺伝子）を、そしてこの導入遺伝子を挟む外側の領域の一つ以上に負の選択可能マーカー（例えば、ＨＳＶ−ｔｋ）を含むことが好ましい。正の選択可能マーカーの存在は、該標的に向かうベクターの組み込まれたコピーを含む受容細胞の選択を、この組み込みが標的部位で起ころうと無作為部位で起ころうと、可能とする。負の選択可能マーカーの存在は標的化された部位（即ち、該標的部位中への相同組換えにより組み込まれた部位）に標的に向かうベクターを含む受容細胞の同定を可能とする。負の選択可能マーカーの発現を選択的に排除する培地で増殖した場合に生き残る細胞は負の選択可能マーカーのコピーを含まない。
【０１２６】
本発明の標的に向かうベクターは「置換型」であることが好ましい。置換型ベクターの組み込みは標的遺伝子中への選択可能マーカーの挿入を結果として生ずる。本明細書で証明するように、標的に向かう置換型ベクターは無効な対立遺伝子（即ち、機能的なタンパク質を発現することができない対立遺伝子、無効な対立遺伝子はコード領域の一部の欠失、遺伝子全体の欠失、挿入の導入、及び／又はフレームシフト突然変異などにより形成されうる）の形成を結果として生ずる遺伝子の破壊のために用いられ、又は遺伝子に変更を加えるため又は遺伝子の一部又は全部を置換するために用いられうる。この方法は動物の内因性遺伝子又は野性型遺伝子を破壊したい場合に使用してもよい。
【０１２７】
または、標的に向かうベクターはリコンビナーゼ系を含んでもよい。この系は導入遺伝子の遺伝子組換えを触媒するリコンビナーゼの発現を可能とする。この導入遺伝子はリコンビナーゼの認識配列により両側を挟まれており、一般にリコンビナーゼ活性を発現する細胞中で切断されるか又は逆転される。例示的な実施態様では、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ−ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（ラスコら，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236、オーバンら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6861-6865）又はサッカロミセス・セレビシエのＦＬＰリコンビナーゼ系（オ' ゴルマンら，1991，Science 251: 1351-1355、国際公開 WO 92/15694）のいずれかがイン・ビボ部位特異的遺伝子組換え系を形成するために用いることができる。ＣｒｅリコンビナーゼはｌｏｘＰ配列の間に配置された介在する標的配列又は導入遺伝子の部位特異的組換えを触媒する。ｌｏｘＰ配列はＣｒｅリコンビナーゼが結合する３４塩基対のヌクレオチド反復配列であり、Ｃｒｅリコンビナーゼにより媒介される遺伝子組換えに必要である。ｌｏｘＰ配列の向きはＣｒｅリコンビナーゼが存在する場合に介在する導入遺伝子が切断されるか逆転されるかを決定する（アブレムスキーら，1984, J. Biol. Chem. 259: 1509-1514)。ｌｏｘＰ配列が直接反復として方向付けされている場合は導入遺伝子の切断を触媒し、ｌｏｘＰ配列が逆の反復として方向付けされている場合は導入遺伝子の逆転を触媒する。
【０１２８】
本明細書の非霊長類トランスジェニック哺乳動物を作成する際に使用されるベクターは、受容体の非霊長類哺乳動物細胞中へのその挿入の前又は後に該ベクターの最適機能化に有用な他の因子を含んでもよい。これらの因子は当業者に良く知られており、例えば、サムブルックら，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，1989に記載されている。該ベクターの導入遺伝子成分は、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）などのプラスミドベクター内で組み込まれ、標的細胞の形質転換の前に、このプラスミドＤＮＡから単離されることが好ましい。
【０１２９】
哺乳動物胚を形質転換するために使用されるベクターは当分野で良く知られた方法を用いて構築される。これらの方法には、例えば、サムブルック，フリッチュ及びマニアティス編，Molecular: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]) に記載されたような制限エンドヌクレアーゼ消化、連結、プラスミド、ＤＮＡ及びＲＮＡ精製、ＤＮＡの配列決定などの標準的手法が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３０】
４．本発明のトランスジェニック哺乳動物を作成する方法
本発明のトランスジェニック哺乳動物は胚幹（ＥＳ）細胞中に標的に向かうベクターを導入することにより形成することが好ましい。ＥＳ細胞は適当な条件（エバンスら，1981，Nature 292: 154-156 、ブラドレーら, 1984, Nature 309: 255-258 、ゴスラーら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065-9069、及びロバートソンら, 1986，Nature 322: 445-448 ）の下でイン・ビトロで移植前の胚を培養することにより得ることができる。  導入遺伝子は、電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈殿法、プロトプラスト融合又はスフェロプラスト融合、リポフェクション、及びＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションを含む当分野で知られた様々な方法を用いたＤＮＡトランスフェクションによりＥＳ細胞中に効率的に導入することができる。導入遺伝子はレトロウイルスにより媒介される形質導入又はミクロインジェクションによりＥＳ細胞中に導入してもよい。このようなトランスフェクトされたＥＳ細胞はその後胚盤胞期の胚の胞胚腔中にそれらが導入された後胚をコロニー形成して、生ずるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する。総説としては、ジェニッシュ（1988, Science 240: 1468-1474）を参照せよ。トランスフェクトされたＥＳ細胞を胞胚腔中に導入する前に、トランスフェクトされたＥＳ細胞を種々の選択計画に付して、導入遺伝子がこのような選択手段を持つことを前提に該導入遺伝子を組み込んだＥＳ細胞を濃縮してもよい。または、該導入遺伝子を組み込んだＥＳ細胞をスクリーニングするためにポリメラーゼ連鎖反応を使用してもよい。この手法により、胞胚腔中に移送する前に適当な選択条件の下でトランスフェクトされたＥＳ細胞を増殖させる必要性がなくなる。
【０１３１】
トランスジェニック哺乳動物を形成する代替的方法は当業者に知られている。例えば、トランスジェニック哺乳動物を作成するため、導入遺伝子を導入するのに種々の発生段階の胚細胞を用いることができる。胚細胞の発生の段階に応じて異なる方法が使用される。接合体、とりわけ前核段階の接合体（即ち、雄性前核及び雌性前核の融合の前）は、ミクロインジェクションの好ましい標的である。マウスでは、雄性前核は直径約２０マイクロメータの大きさに達する。これは１〜２ピコリットル（ｐｌ）のＤＮＡ溶液の再現可能な注射を可能とする。遺伝子移送の標的として接合体を使用することは、多くの場合注入されたＤＮＡが最初の切断の前に宿主ゲノムの中に組み込まれる点で大きな利点を有する（ブリンスターら，1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442) 。その結果、非霊長類トランスジェニック哺乳動物の細胞は全て組み込まれた導入遺伝子を保持することになる。これは一般に創始細胞の子孫への導入遺伝子の効率的移送にも反映される、というのは生殖細胞の５０％が導入遺伝子を保持するからである。接合体のミクロ−インジェクションは導入遺伝子の無差別組み込みにとって好ましい方法である。米国特許第４，８７３１９１号は接合体のミクロ−インジェクションの方法を記載する。
【０１３２】
レトロウイルス感染も非霊長類哺乳動物に導入遺伝子を導入するために使用できる。発生中の非霊長類胚は、胚盤胞期までイン・ビトロで培養できる。この期間に、分割球はレトロウイルス感染の標的となることができる（ヤネニッヒら，1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 1260-1264) 。分割球の効率的な感染は酵素処理して透明帯を除去することにより得られる（ホーガンら，1986，マウス胚の操作, Cold Spring Harbor Laboratory Press ，プレインビュー, N.Y.) 。導入遺伝子を導入するために使用されるウイルスベクター系は通常導入遺伝子を保持する複製に欠陥のあるレトロウイルスである（ヤーネル，D.ら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6927-6931、バンデアプッテンら, 1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152) 。レトロウイルス感染はウイルス生産細胞の単層の上で分割球を培養することにより容易且つ効率的に得られる（バンデアプッテン，上掲、スチュワートら，1987，EMBO J. 6: 383-388) 。または、感染は後期で行なうことができる。ウイルス又はウイルス生産細胞を胞胚腔中に注入できる（ヤーネル，D.ら, 1982, Nature 298: 623-628)。創始細胞の大部分はその導入遺伝子についてモザイクとなる。何故なら組み込みはトランスジェニック哺乳動物を形成する細胞の部分集合でのみ起こるからである。さらに、創始細胞は子孫で一般にセグリゲートすることになるゲノム中の異なる位置において該導入遺伝子の種々のレトロウイルスの挿入を含むことがある。さらに、妊娠中期（midgestation) の胚の子宮内レトロウイルス感染により生殖系中に導入遺伝子を導入することも可能であるが、効率は低い（ヤーネル，D.ら, 1982, 上掲）。当分野で知られた、レトロウイルス又はレトロウイルスベクターを用いてトランスジェニック哺乳動物を作成するさらなる手段には、受精卵又は初期胚の卵黄周囲腔中にレトロウイルス粒子又はレトロウイルスを生産するマイトマイシンＣ処理細胞をミクロ−インジェクションする方法が含まれる（国際公開 WO90/08832 及びハスケルとバウエン, 1995, Mol. Reprod. Dev. 40: 386)。
【０１３３】
本発明を実施するため任意の哺乳動物種の系統を選択する際、これらは胚の収率、胚中での前核の見易さ、生殖適合性、トランスジェニック子孫の色選択性又はＥＳ細胞クローンの利用可能性などの基準により選択しうる。例えば、もしトランスジェニックマウスを作成したい場合、Ｃ５７／Ｂ１６又は１２９が使用しうる。
【０１３４】
胚を得るためそして代理宿主として働くために用いられる哺乳動物の年齢は使用する種の関数である。例えば、マウスを使用する場合、思春期前の雌が好ましい、何故ならこれらはより多くの胚を作りそしてホルモン注射により良く反応するからである。
【０１３５】
ホルモン又は他の化合物の投与は卵生産、交配及び／又は胚の移植に適する雌を準備するために必要であることがある。通常、欲情した雌（即ち、受精しうる卵を生産している雌）を種畜の雄と交配させ、その結果受精した胚を導入遺伝子（単数又は複数）を導入するため取り出す。または、卵と精子を適当な雌及び雄から取得し、イン・ビトロ受精のために使用して導入遺伝子の導入に適する胚を作成してもよい。
【０１３６】
通常、受精した胚は、前核が現れるまで適当な培地中でインキュベートする。ほぼこの時期に、目的の導入遺伝子を含む外因性の核酸配列が雄性前核又は雌性前核の中に導入される。マウスのような一部の種では、雄性前核が好ましい。
【０１３７】
核酸の導入は、例えばミクロインジェクションなどの当分野で知られた任意の手段により達成しうる。胚への核酸の導入の後、その胚は代理宿主に再移植する前に種々の長さの時間イン・ビトロでインキュベートしてもよい。一つの普通の方法はイン・ビトロで１〜７日間上記の胚をインキュベートし、次いでそれを代理宿主中に再移植することである。
【０１３８】
再移植は標準的方法を用いて実施される。通常、代理宿主には麻酔をかけ、上記の胚を輸卵管中に挿入する。特定の宿主中に移植される胚の数は異なることになり、通常該種が天然で生産する子孫の数に匹敵するか又はそれより高くなる。代理宿主のトランスジェニック子孫は任意の適当な方法で導入遺伝子の存在についてスクリーニングしうる。スクリーニングは、該導入遺伝子の少なくとも一部（及び／又は導入遺伝子の両側の領域）に相補的なプローブを用いたサザン分析又はノーザン分析により、又は導入遺伝子の部分（及び／又は導入遺伝子の両側の領域）に相補的なプライマーを用いるＰＣＲにより実施してもよい。該導入遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体を用いるウェスタンブロット分析をスクリーニングのための代替的又は付加的な方法として用いてもよい。
【０１３９】
導入遺伝子の存在を評価する代替的又は付加的な方法には、酵素検定法及び／又は免疫学的検定法、特定のマーカー又は酵素活性のための組織学的染色などの適当な生化学的検定法が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４０】
トランスジェニック哺乳動物の子孫は、トランスジェニック哺乳動物を適当な相手と交配させることにより、又はトランスジェニック哺乳動物から得た卵子及び／又は精子を用いてイン・ビトロ受精を行なうことにより得てもよい。イン・ビトロ受精を用いる場合、受精した胚は代理宿主中に再移植するか、又はイン・ビトロでインキュベートするか又はその両方を行なう。トランスジェニック子孫を作成するために交配が用いられる場合、このトランスジェニック哺乳動物は親の系統へ戻し交雑することがあり、そうでなければ純粋種となり又は他の所望の遺伝的特性を有する哺乳動物との交雑種となることがある。これらの子孫は上述の方法又は他の適当な方法を用いて該導入遺伝子の存在について評価されうる。
【０１４１】
前記の議論はトランスジェニック哺乳動物を作成するための幾つかの方法を参照してなされたが、本発明はこれらの方法のいずれか一つに基礎を置くものでもそれに限定されるものでもない。そうではなくて、上に広く述べたようにその生殖細胞又は体細胞が導入遺伝子を含む遺伝的に改変された哺乳動物を作成するための適当な手段をすべて意図することが理解されるべきである。
【０１４２】
５．遺伝的に改変された哺乳動物の使用
本発明のトランスジェニック哺乳動物は、それが誘導された標準的哺乳動物の代わりに、又はそれに加えて用いられる。例となる手法のリストを以下に示すが、それは本発明のトランスジェニック哺乳動物の様々な利用を記述する。これらの手法には、薬物動態学的検定法、薬力学的検定法（効力の測定を含む）、毒性学的検定法、並びに吸収、分布、分泌及び代謝の研究が含まれる。標準的哺乳動物の代わりに使用される場合、トランスジェニック哺乳動物は選択された霊長類種、とりわけヒトにおける薬の挙動をより正確に予想するデータを提供する。標準的哺乳動物に加えて用いられる場合、トランスジェニック哺乳動物と標準的哺乳動物の間の薬の挙動に関する差異は研究している特定の薬の代謝における導入遺伝子の潜在的役割を示す。
【０１４３】
本発明で記載されたトランスジェニック哺乳動物は、正常な哺乳動物又は他の遺伝的な改変を有する哺乳動物の利用に類似した方法で幾つかの標準的適用に使用できる。以下の一般的な記述は本発明のトランスジェニック哺乳動物の可能な利用を例示することを意図するものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。この記述は当業者に知られた一般的検定法の幾つかの可能な修飾を網羅することが意図される。
【０１４４】
例えば、トランスジェニック哺乳動物には、種々の可能な経路（静脈内 (iv) 、皮下(sc)、腹腔内(ip)、経口（po) 、筋肉内(im)、鞘内(intrathecially)又は他の非経口経路、又は皮膚、粘膜に適用することにより、又は食餌若しくは飲料水に該物質を入れることにより）により、ある化合物（おそらく放射性同位元素又は蛍光基などの標識を保持する化合物）の種々の用量を投与しうる。通常１群当たりのマウスの数は１〜２０の範囲であるが、実験者が実際の数を決定する。化合物は１回又は多数回投与でき、化合物の混合物は同時又は逐次のいずれかで投与してもよい。記述した分析法は制限することを意図するものではなく、単なる例示である。
【０１４５】
５．１  薬物動態学的検定法
このような検定法はある時間経過にわたって哺乳動物の体内での化合物の消失及び代謝を決定する。例えば、本発明のトランスジェニック哺乳動物に化合物を投与し、次いで血液、又は他の体液又は組織又は排泄物（尿又は糞）を投与後の異なる時点で集める。化合物（単数又は複数）又はその代謝物の濃度は適当な分析法（例えば、ＨＰＬＣを用いる被験体の分光学的測定）により決定する。次いで、動力学的データは通常グラフやコンピュータ手法により分析される。
【０１４６】
５．２  薬力学的検定法
この検定法は通常ある時間経過にわたって哺乳動物の体内における化合物の活性を測定する。投与後、標的に対する化合物（単数又は複数）の活性は「全身」検定（例えば、血圧、呼吸速度、心電図、筋電図、電磁パルスを測定することによる神経活性）を用いるか、又はイメージング技法（例えば、ボジトロン放射分光法、核磁気共鳴イメージング、超音波検査、など）により行なうことができる。該化合物の活性は生化学的手段によっても測定できる。これは該化合物と標的との相互作用の直接測定か又は薬力学的活性の指標となる上流又は下流のマーカーの測定のいずれかを含む。例えば、本発明のトランスジェニック哺乳動物に化合物を投与し、次いで血液、又は他の体液若しくは組織、又は排泄物（尿又は糞）を投与後の異なる時点で集める。生体試料中の標的の活性又はマーカーの活性の直接測定は種々の手段（例えば、標的又はマーカーの活性を測定するための酵素検定、標的の豊富さ及び／又は活性のいずれかを測定するためのウェスタンブロット法又はＥＬＩＳＡ法、標的又はマーカーのｍＲＮＡレベルを測定するためのノーザンブロット分析など）により行なうことができる。標的又はマーカーの間接的測定には、種々の分析法（例えば、ＨＰＬＣを用いる被験体の分光学的測定）による基質又は生産物のレベルの測定を含めることができる。薬力学的活性の試験は哺乳動物へのチャレンジ（例えば、化学的手段又は機械的手段による人為的血圧の上昇、生理学的変化を促進するため食餌の変化、疾病状態を作成するため外科的介入、感染因子の注入など）をも含めることができる。次いで薬力学的データをグラフ的手段及びコンピュータ手法により通常分析し、しばしば組織中の化合物のレベルに相関させる。薬力学的研究には、疾病の治療における薬の効力の測定が含まれる。例えば、腫瘍増殖を阻害するために又は感染因子を消失させるために必要な用量。
【０１４７】
５．３  吸収、分布、代謝及び排泄（ＡＤＭＥ）の研究
このような研究では、通常哺乳動物に放射活性化合物（単数又は複数）を投与する。この化合物の体内への吸収の程度の測定には、薬物動態学的検定法について記述した取り組みを用いることができる。化合物の分布の研究は該化合物の体組織中への分布を決定し、通常全身の組織学的グレードの切片のオートラジオグラフィを使用する。排泄の研究は、薬物動態学的検定法で記述したように、糞又は尿（ただし、胆汁などの抽出された体液を含めることができる）の中の化合物又は代謝物のレベルを測定することにより身体からの化合物の消失の経路を解明する。代謝の研究は哺乳動物によって生産される親化合物の代謝物の性質及び量を決定する。それは身体から排泄された代謝物又は体内に残存する代謝物を含む。代謝物の量及び同定には種々の分析法（例えば、質量分析法）を用いることができる。
【０１４８】
５．４  毒性学的検定法
このような検定法はある時間経過にわたって哺乳動物の体内の化合物の毒性活性を決定する。これらの検定は通常毒性効果が観察され得ない用量を決定するためマウスの群に同時か逐次のいずれかで段階的に増加する用量を使用する。これらの検定は化合物（単数又は複数）の一回投与又は多数回投与を用いることができ、長期間（通常２週間から２年）続けることができる。投与の後、化合物（単数又は複数）の毒性活性を、病的状態の程度（例えば、該哺乳動物の臨床的外観）の肉眼観察によるモニターにより、又は現れる死亡率、体重減少又は一般的活動力（例えば、運動、探索的活動、睡眠時間など）の測定、食物や水の消費量、尿及び／又は糞の外観により決定することができる。化合物（単数又は複数）の毒性活性の測定は「全身」検定を使用することもでき或いはイメージング法（薬力学的検定法について上述した）によることもできる。化合物の毒性活性は生化学的手段（例えば、一般的毒物反応と関連する遺伝子誘導又は遺伝子の生産物の測定、毒物の障害への反応と関連する生体代謝の測定）によっても測定することができる。哺乳動物の死又は犠牲の際に分離された体組織の組織学的検討も、循環細胞の数及び特性における血液学的変化と同様に、毒性効果をモニターするために使用することができる。発癌性の研究は化合物処置の間の腫瘍の形成又は癌に移行し易い遺伝的損傷の形成をモニターする。奇形発生の研究は胎児の発生に対する化合物投与の効果を決定する。
【０１４９】
本発明が容易に理解されそして実施されるように、特に好ましい実施態様が非限定的な実施例を用いて以下に記述される。
【実施例１】
【０１５０】
ヒト血清アルブミンが内因性のマウス血清アルブミンに置き代わっているノック−インマウスの取得。
【０１５１】
工程１．ヒトをコードする配列の取得
ヒトアルブミンｃＤＮＡ配列（ＸＭ−０３１３２０）は、ジェンバンク寄託番号ＸＭ−０３１３２０[ 配列番号：３ ]に記載された配列から及びそれに基づいて設計されたプライマーを用いたヒト胎児肝臓のｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲによって得られる。例えば、以下に述べる二つの別々のＰＣＲ反応はＢｓｕ３６Ｉ部位を横切って重なる遺伝子の５’及び３’部分を形成する。Ｂｓｕ３６Ｉで消化した後、この二つの半分を酵素連結によってｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）のような適当なベクター中に結合し、ｎｅｏ遺伝子の平滑末端をＳｍａＩ部位に連結し、ＢａｍＨＩ部位を該遺伝子の３’末端でポリリンカーに連結する。該ＰＣＲ反応の実施には以下のプライマーを使用することができる。
【０１５２】
ヒトＡＬＢｃＤＮＡの５’部分：
前向きプライマー（開始コドンから、重なっているＢｓｔＥII部位＝配列番号：３のヌクレオチド３９−６３）、ＨＡＬＢ１Ｆ＝（5') ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＣ (3') [ 配列番号：２６] 。
【０１５３】
逆向きプライマー（コード領域の末端から、停止コドン及びＢｓｕ３６Ｉ部位と重なる部分を含む、＝配列番号：３のヌクレオチド１８４３−１８６９の逆向き相補鎖）、ＨＡＬＢ３Ｒ＝（5') ＴＴＡＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＣＴＴＧＣ (3') [ 配列番号：２７] 。この断片をＢｓｔＥII（５’マウス隣接配列の３’末端への結合）及びＢｓｕ３６Ｉ（ヒトＡＬＢ遺伝子の３’部分への結合）で切断する。
【０１５４】
ヒトＡＬＢ遺伝子の３’部分：
前向きプライマー（停止コドンと重なる、Ｂｓｕ３６Ｉ部位及びＨＡＬＢ３Ｒ＝配列番号：３のヌクレオチド１８５５−１８８５）、ＨＡＬＢ５Ｆ＝（5') ＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡＣＡＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＧＣ (3') [ 配列番号：２８] 。
【０１５５】
逆向きプライマー（第二のポリアデニル化シグナルの３’＝配列番号：３のヌクレオチド２１９７−２２１６の逆向き相補鎖）、ＨＡＬＢ４Ｒ＝（5') ＡＡＣＴＴＡＧＡＡＧＡＧＴＡＴＴＡＡＴＧ (3') ）[ 配列番号：２９ ]。この断片は適当な向き（該ベクターの３’末端に最も近いＳｐｅＩ部位）でｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結し、クローニングし、ＳｐｅＩ及びＢｓｕ３６Ｉで切り出す。ＳｐｅＩ部位はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づく標的に向かうベクターのＳｐｅＩ部位中にクローニングすること、そして５’ＢｓｔＥII部位は上述のヒトｃＤＮＡの５’部分の３’末端に連結することを可能とする。
【０１５６】
ｍＲＮＡをコードする領域（及び効率的なポリアデニル化を促進しうる）を越えて伸びる追加の３’配列は、追加の下流の（ゲノム）配列を含むＨＡＬＢ４Ｒの伸長版を使用することにより得ることができる。例えば、（5') ＴＣＡＴＡＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＴＴＴＡＴＡＡＴＣＣＡＴＡＡＣＴＴＡＧＡＡＧＡＧＴＡＴＴＡＡＴＧ (3') 、即ち配列番号：１のヌクレオチド１８８８９−１８８３０の逆向き相補鎖である。
【０１５７】
代わりのアプローチはヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを配列番号：３内のコード配列に基づいたプローブを用いてスクリーニングすることである。次に、全長アルブミンをコードする配列を標準的分子生物学的手法（例えば、制限酵素消化及び／又はＰＣＲ）を用いて正のクローンから誘導することができる。全長ｃＤＮＡは配列番号：３に記載されたようなヒトＡＬＢｍＲＮＡに相当する。
【０１５８】
工程２．両側に接するマウスゲノム配列の取得
選択枝  Ａ
５’側のマウス隣接配列は、配列番号：７に示され、導入遺伝子の発現を駆動するマウスアルブミンプロモーターを含む。この配列は下記のプロモーターを用いるマウスゲノムＤＮＡのＰＣＲにより得られる。即ち、前向きプライマーとして、配列番号：７（Ｊ０４７３８）のヌクレオチド１−３２、即ち（5') ＡＡＧＣＴＴＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＣＴＧＣＣＴＴＡＧＡＡＧＴＡＡＣ (3') [ 配列番号：３０ ]を用い、逆向きプライマーとして配列番号：７（Ｊ０４７３８）からのヌクレオチド２０３５−２０６５の逆向き相補鎖、即ち（5') ＧＴＧＧＧＧＴＴＧＡＴＡＧＧＡＡＡＧＧＴＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＣ (3') [ 配列番号：３１ ]（マウスアルブミン遺伝子の５’−ＵＴＲ内の）を用いる。
【０１５９】
３’側のマウス隣接配列も、マウスゲノムＤＮＡのＰＣＲにより作成される。前向きプライマーは配列番号：５（ＡＪ０１１４１３）のヌクレオチド１９７３−２００２から誘導される、即ち（5') ＴＴＴＡＡＡＣＡＴＴＴＧＡＣＴＴＣＴＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＣ (3') [ 配列番号：３２ ]（マウスアルブミンｍＲＮＡの３’−ＵＴＲに相当する）である。逆向きプライマーは配列番号：８（Ｊ０５２４６）のヌクレオチド１−２９の逆向き相補鎖である、即ち（5') ＧＴＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＴＴＧＣＴＡＡ (3') [ 配列番号：３３ ]（マウスαフェトプロテイン[ ＡＦＰ ]５’プロモーター領域）である。これはマウスＡＬＢ遺伝子の下流約１２．６ｋｂにある領域に相当する。こうして、記述されたＰＣＲ反応はマウスＡＬＢ遺伝子の３’側に直ちに続く領域に相当する約１２．６ｋｂの増幅体を形成する。この増幅体は標的に向かうベクターの構築に直接使用することができる。または、この増幅体はより小さな３’側隣接配列（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）のようなベクター中にサブクローニングし、制限酵素消化を行なうことにより）を誘導するために使用できる。より小さな隣接領域は、大きなゲノムコード配列を利用する場合、しばしば好ましい。
【０１６０】
選択枝  Ｂ
マウスアルブミン遺伝子（配列ＩＤ c077802366)の最初の１１エキソンを覆う１５２９５ｂｐのコンティグ（contig) は図１に図式的に例示してあり、その配列は配列番号：３４に記載されている。このコンティグには、プロモーター配列の大部分を含むこの遺伝子の上流約２ｋｂも含まれる。マウスのプロモーター領域とこのコンティグの位置３５３−２３８２からのマウスアルブミン遺伝子の５’ＵＴＲを覆う５’腕は、下記のプライマー及び鋳型としてマウスゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲにより形成される。この断片は適当な向き（ベクターの５’末端に最も近いＳａｃII部位）でｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ中に連結され、クローニングされ、ＮｏｔＩ及びＢｓｔＥIIで切り出される。そのＮｏｔＩ部位はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づく標的に向かうベクターのＮｏｔＩ部位にクローニングすることを可能とし、３’ＢｓｔＥII部位は上述のヒトアルブミンｃＤＮＡの５’末端に連結することを可能とする。この５’横腹はｃＤＮＡの両半分と共に、ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩで切断された標的に向かうベクター中に連結される。得られる構築物はマウスプロモーター及びヒトコード領域に連結した５’ＵＴＲ及びヒト３’ＵＴＲを含む。最初の３−６コドンはマウス起源のものであるが、これらのコドンはヒト及びマウスのアルブミンｍＲＮＡと１００％同一である。
【０１６１】
上のＰＣＲ増幅のために有用なプロモーターの例には以下のものが含まれる。即ち
Malb353F (5') ＣＡＴＡＴＡＧＧＡＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧ (3') ( 開始コドンの上流約２ｋｂ＝配列番号：３４のヌクレオチド３５３−３７５）[ 配列番号：３５] 、及び Malb2382R (5') ＧＧＴＴＡＣＣＣＡＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＡＴＡＧＧ (3') [ 配列番号：３６] （これはＢｓｔＥII部位、開始コドン及び５’ＵＴＲの一部と重なる、即ち配列番号：３のヒト配列ヌクレオチド７８−９３の逆向き相補鎖を含むオリゴの５’末端を持つ配列番号：３４のヌクレオチド２３５４−２３９７の逆向き相補鎖）。
【０１６２】
３’腕（該コンティグ中の位置６３１０から位置１３３８２まで）はプライマーとして下記のオリゴを用いてマウスのゲノムＤＮＡのＰＣＲにより形成される。即ち
Malb6310F  (5') ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣ (3') [ 配列番号：３７] 、及び Malb13382R  (5') ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＡＴＴＣＡＣＣＣＡＡＣＣ (3') [ 配列番号：３８] 。
【０１６３】
その結果得られる７ｋｂ断片は、エキソン５の中央から下流にイントロン１０の末端近くまで伸びるが、これをＸｈｏＩ（部位は前向きプライマー中に存在する）及びＳａｌＩ（部位は逆向きプライマー中に存在する）で切断して標的に向かうベクターのＳａｌＩ部位中に連結する。
【０１６４】
相同組換えの後、この標的に向かうベクターはマウスＡＬＢエキソン１〜４をヒトＡＬＢｃＤＮＡで置き換えることができる。これはマウスＡＬＢ遺伝子の残りの欠失していない部分の発現を阻止するポリアデニル化シグナルを含む（図２）。
【０１６５】
代わりの戦略は、マウスアルブミン遺伝子の全体の下流の断片を増幅しこうして全遺伝子座を欠失させる工程を含む。２７７８１ｂｐのマウスコンティグ（配列番号：３９に記載されたようなサンガー・アセンブリＮｏ．F105491 ）を用いて、約７ｋｂの３’腕を増幅するようにプライマーを設計できる。例えば、次のようである。逆向きプライマー、albt9649R  (5') ＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＴＴＣＣＴＣＣ (3') [ 配列番号：４０] 、そして前向きプライマー albt2842F (5') ＡＧＴＡＧＴＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＴＧＡＴＣＣ (3') [ 配列番号：４１] 。
【０１６６】
この逆向きプライマーは配列番号：３９由来のヌクレオチド９６６７−９６４９の逆向き相補鎖である。前向きプライマーは配列番号：３９由来のヌクレオチド２８４２−２８６２である。その結果得られる７ｋｂ断片をＸｈｏＩ（部位は前向きプライマー中に存在する）及びＳａｌＩ（部位は逆向きプライマー中に存在する）で切断し、標的に向かうベクターのＳａｌＩ部位中に連結する。
【０１６７】
工程３．導入遺伝子ベクターの組立て
工程１及び工程２で得られた成分をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）のようなプラスミド内で次の順序で組み立てる。即ち（５’マウス隣接）→（ヒトＡＬＢ）→（ｎｅｏ）→（３’マウス隣接）。ＴＫプロモーターにより駆動されるネオマイシン耐性遺伝子を平滑末端化してＢａｍＨＩ部位の近くの遺伝子の３’末端を持つｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳｍａＩ部位中に連結する。ヒトアルブミンｃＤＮＡを使用する場合、得られるプラスミドを次にＮｏｔＩ／ＳｐｅＩで切断し、マウスプロモーター（５’−ＮｏｔＩ−ＢｓｔＥII−３’）、ヒト遺伝子の５’部分（ＢｓｔＥII・・・Ｂｓｕ３６Ｉ）、及びヒト遺伝子の３’部分（５’Ｂｓｕ３６Ｉ・・・ＳｐｅＩ）を含む５’腕と連結する。次いで、正確な配列を含むクローンをＳａｌＩで切断し、３’腕をその中に連結する。
【０１６８】
３’隣接配列の３’末端にＨＳＶ−ｔｋのような負の選択マーカーを挿入する選択枝があるが、これは相同組換え体（ＨＳＶ−ｔｋを欠失する）を無差別組み込み体（ＨＳＶ−ｔｋを維持しており従ってガンシクロヴィルに感受性である）と識別するのに助けとなる。
【０１６９】
工程４．ＥＳ細胞中への導入遺伝子の挿入
３’腕断片を正しい向きで挿入すると、ユニークなＳａｌＩ部位がこの構築物の３’末端で保存され、ＥＳ細胞に電気穿孔する前に標的に向かう構築物を線状化するために使用できる。次いで、それをマウス胚性幹（ＥＳ）細胞中にトランスフェクトする。これを後に外来性ＤＮＡをその核物質中に組み込んだ細胞を単離するためＧ４１８を含む増殖培地中で選択する（計画の詳細については実施例６及び実施例７を参照）。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を使用する場合も、相同組換えによるのではなく無差別に導入遺伝子を組み込んだ細胞を除去するためガンシクロヴィル中で細胞をさらに選択する。次に個々のクローンを増殖させ、クローンそれぞれを複数のプレート中に分ける。相同組換え体はサザーンブロット又はＰＣＲで確認する。これは該構築物が両端に正確に標的化されることを確実にするため該構築物の両端の外側のサザーンブロットプローブ又は外側のＰＣＲプライマーを用いてスクリーニングすることによりなされる。
【０１７０】
代わりの戦略では、ｎｅｏカセットをｌｏｘＰ部位で挟む。これはＣｒｅ−発現プラスミドを持つＥＳ細胞の一時的トランスフェクションによって除去でき、又はＣｒｅを発現するトランスジェニックマウスと異種交配させることによりマウスの後の世代から除去できる。別の代替的戦略では、ｎｅｏカセットをＦＲＴ部位で挟む。これはＦＬＰ発現プラスミドを持つＥＳ細胞の一時的トランスフェクションにより除去でき、又はＦＬＰを発現するトランスジェニックマウスと異種交配させることによりマウスの後の世代から除去できる。
【０１７１】
工程５．胚盤胞の注入
一つ以上の正確なクローン由来のＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中に注射し、これを次いで擬妊娠マウス中に移植する。移植は解剖顕微鏡を用い麻酔を掛けたマウスに対して行う。擬妊娠雌マウスを 0.017 - 0.020ｍＬ /g 体重のアバーティンの腹腔内注射で麻酔をかける。このマウスを解剖顕微鏡の下に置き、切開部分を７０％エタノールで殺菌する。卵巣を体外に出し、卵巣の周りの滑液包嚢及び輸卵管を注意深く手前に引いて開ける。輸卵管の開口部を露出させるため卵巣と輸卵管を分離する。マウスの胚盤胞を再移植用ピペットの上に載せ、ピペットの先をロート中に数ミリメータ挿入し、輸卵管の中に注ぐ。次いで、この卵巣を腹膜中に戻し、体壁及び皮膚を縫合する。
【０１７２】
工程６．トランスジェニックマウスの選択
ＥＳ細胞と胚盤胞は、キメラ創始（Ｆ0 ) マウスが被毛色で識別できるように、異なるマウス血統から得ることが好ましい。成熟した場合、Ｆ0 マウスを野性型マウスと交配させて標的対立遺伝子の生殖系伝達を取得し、そして所望の遺伝的改変を含むＦ1 マウスが色によって同定され、サザーンブロット及び／又はＰＣＲ及び／又はＤＮＡ配列決定によって確認される。ヘテロ接合体のＦ1 マウスはこれらのマウスの肝臓からＲＮＡを抽出することによりヒトアルブミン遺伝子の発現についてこの段階で検定でき、そしてヒト遺伝子特異的プローブを用いてＲＴ−ＰＣＲ又はノーザンブロット分析により発現を検定することができる。
【０１７３】
トランスジェニックマウスの後の世代はホモ接合性を維持するように育種してヒト血清アルブミンを発現し且つマウス血清アルブミンを発現しないマウスを提供することが好ましい。
【０１７４】
代替的戦略は、マウス５’ＵＴＲを欠くマウスプロモーターをヒト５’ＵＴＲ及びヒト３’ＵＴＲを含むヒトアルブミンｃＤＮＡ全体と融合させる工程を含むであろう。別の代替的戦略はヒトのコード配列をマウスアルブミン遺伝子の５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲと融合させる工程を含むであろう。
【０１７５】
代わりの戦略では、標的に向かうベクターはヒトアルブミンｃＤＮＡ配列なしで構築される。この構築物はマウスアルブミン遺伝子を標的に向かわせ、その遺伝子の発現をできなくする（knock out)ために使用される。マウスアルブミンをもはや発現しない標的化された細胞が一旦同定されれば、アルブミン遺伝子座ＲＰ１１−５８０Ｐ２１（配列ＩＤ：ＡＣ１０８１５７）を覆うヒトＢＡＣ（これはチルドレンズ・ホスピタル・オークランド・リサーチ・インスティチュート（ＣＨＯＲＩ）から入手可能である）、はピューロマイシン耐性遺伝子又はハイグロマイシン耐性遺伝子などの選択可能マーカーの５０分の１の量と共にトランスフェクトされる。この細胞を選択し、個々のコロニーを釣り上げ、増殖させ、試料を凍結する。ＤＮＡは個々のクローンから調製し、導入遺伝子の存在及びコピー数についてスクリーニングする。１個のコピーが好ましい。必要ならば、導入遺伝子の組み込み位置を確定し、この組み込みが別の遺伝子を破壊しなかったことを確実にするため標準的手法により逆ＰＣＲを行なうことができる。
【０１７６】
代わりの戦略では、ヒトアルブミン遺伝子座全体を覆う上記のＢＡＣから断片を消化して取り出すことができる。使える酵素は、この遺伝子の最初の上流約８ｋｂ及びこの遺伝子の下流約２ｋｂでＢＡＣを消化するＥｃｏ４７III であろう。この断片はパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により単離でき、選択マーカーと共に適当なベクター中にクローニングし、次いでマウスアルブミン遺伝子が欠失したＥＳ細胞中にトランスフェクトするために使用できるであろう。代わりの方法は、胚注入によるヒトアルブミン遺伝子の無差別組み込みを含み、そして内因性のマウス血清アルブミン遺伝子の破壊とは結びついても結びつかなくてもよい。
【実施例２】
【０１７７】
ヒトＡＧＰが内因性マウスＡＧＰに置き代わっているマウスを取得する工程
相同組換えによるノックアウトマウス遺伝子、次いでヒト遺伝子を無差別に組み込む。
【０１７８】
工程１．マウスＡＧＰ遺伝子座全体をノックアウトするための標的に向かう構築物の設計
マウスにおけるＡＧＰ遺伝子座を覆うＢＡＣ配列を同定した。このＢＡＣはマウスの第４染色体のＢＡＣ２７９（ジェンバンク寄託番号：ＡＦ３３６３７９）である。この領域は位置が決定され４個の遺伝子（又は擬遺伝子）が同定された。これらはこの配列の約９８８８０から１２０９９１まで伸びる領域を覆う。位置８８６８１から位置１３００８０までを覆う４１４００ｂｐの領域はこのＢＡＣ配列から取ることができ、標的に向かう構築物の調製に使用できる。この領域の線状地図は図３に示し、それに関する配列は配列番号：４２に記載する。
【０１７９】
標的に向かうベクターのためのマウスの５’腕及び３’腕はそれぞれその４遺伝子座の５’側領域及びその３’側領域から得られる。これらの配列は鋳型としてＢＡＣ２７９又はマウスゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲにより得られる。有用なプライマーの例を以下に要約する。
（外１）
2004533826.tif 000428
プライマーＡＧＰ５’ＥＸＦ及びＡＧＰ５’ＥＸＲは標的化されたクローンをスクリーニングするための８７７ｂｐの５’外側プローブを増幅する。プライマーＡＧＰ３’ＥＸＦ及びＡＧＰ３’ＥＸＲは標的化されたクローンをスクリーニングするための６１７ｂｐの３’外側プローブを増幅する。
【０１８０】
５’腕の場合には、３．７ｋｂ断片を得るためプライマーＡＧＰ１２Ｆ及びＡＧＰ４９Ｒを用い、そして５．４ｋｂ断片を得るためプライマーＡＧＰ４５Ｆ及びＡＧＰ９９Ｒを用いて、二つの別々のＰＣＲ反応が行なわれる。それぞれの断片をＳｐｅＩ及びＨｉｎｄIII で消化する。ＳｐｅＩ部位はこれらのオリゴヌクレオチドの末端に位置しそしてＨｉｎｄIII 部位は約位置４７００に位置する。これらの二つのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄIII 断片を正しい向きに連結し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＳｐｅＩ部位中にクローニングする。このｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにはｎｅｏ遺伝子がＳｍａＩ部位に平滑末端連結されており、ＢａｍＨＩ部位の近くにｎｅｏ遺伝子の３’末端を有する。この５’腕は８．７ｋｂの長さである。
【０１８１】
３’腕をプライマーＡＧＰ３３９及びＡＧＰ４０３を用いて増幅して各末端にＳａｌＩ部位を持つ６．４ｋｂ断片を得る。この断片を消化し上記のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＳａｌＩ部位中にクローニングする。得られる構築物の線状地図は図４に示す。
【０１８２】
工程２．マウスのＡＧＰ遺伝子座を標的とする
実施例１の工程４のように行なう。
【０１８３】
工程３．ヒトをコードする配列を導入する
選択枝  Ａ  ＢＡＣクローン全体を導入する
ヒトＡＧＰ遺伝子（ＯＲＭ１及びＯＲＭ２）はＢＡＣクローンＲＰ１１−８２Ｉ１の上に位置し、これはカルテク・ヒューマン・ＢＡＣライブラリーＢ・サンガーシーケンシング・センター，ケンブリッジ，ＵＫから入手可能である〔ｂＡ８２Ｉ１，ジェンバンク寄託番号ＡＬ３５６７９６も参照〕。一つの戦略では、ＢＡＣクローン全体又はヒトＡＧＰ遺伝子を含むその大きな断片を、マウスＡＧＰ遺伝子座が上記の構築物の相同組換えにより破壊されているＥＳ細胞のゲノム中に無差別に組み込む（標的に向かうベクター中のヒト配列は含まない）。このＢＡＣを５０分の１の量のピューロマイシン又はハイグロマイシンのような選択可能なマーカーと共にトランスフェクトし、細胞を選択し、個々のコロニーを釣り上げ、増殖させそして凍結する。ＤＮＡは個々のクローンから調製し、導入遺伝子の存在及びコピー数についてスクリーニングする。必要であれば、導入遺伝子の組み込み部位を同定し、この組み込みが別の遺伝子を破壊しなかったことを確実にするため標準的手法で逆ＰＣＲを行なうことができる。
【０１８４】
選択枝  Ｂ  ヒトＡＧＰ遺伝子を含むＢＡＣクローンの一部を導入する
代わりの戦略では、ヒトＡＧＰ遺伝子及びこれを挟む配列を含むＢＡＣの領域を、ｎｅｏ以外の選択可能マーカーを含むベクター中にサブクローニングする。ＰＲ１１−８２Ｉ１の一部（ヌクレオチド４８０００−７８０００）はヒトＡＧＰ遺伝子座を含み、その配列は配列番号：１９に記載されている。
【０１８５】
これらの二つの遺伝子の領域の位置は次の通りである。
（外２）
2004533826.tif 000429
所望の断片を増幅するためのＰＣＲプライマーはこのコンティグ（配列番号：１９）から同定することができる。または、関連する断片を切り出すために有用なＲＥ部位はこのコンティグの制限地図から得ることができる。例えば、ＸｂａＩは３０６０、９８８３、１６６００、２９３６８の位置で切断する。
【０１８６】
ＢＡＣクローンＲＰ１１−８２Ｉ１をＸｂａＩで消化すると多数の断片を生ずるが、これらの中には６８２３ｂｐと他方の６７１７ｂｐの二つの断片が存在し、これらは上流の配列の約３ｋｂと共にそれぞれＡＧＰ−１遺伝子及びＡＧＰ−２遺伝子である。この二つの断片をｎｅｏに代わる選択可能マーカーを含む適当なベクターのＸｂａＩ、ＳｐｅＩ又はＮｈｅＩ部位で正しい向きに組み立てる。これらのクローニング部位（及び選択可能マーカー遺伝子）の両脇には、組立てられた（１３．５ｋｂの）ヒトの配列（ＡＧＰ−１遺伝子に対し５’側の配列の約３ｋｂを含む）の除去を容易にする唯一のＲＥ部位（例えば、ＳｇｒＡＩ）がある。
【０１８７】
代わりの戦略では、転写調節因子がさらに上流に伸びる場合にはより多くの５’配列を含むより大きな断片をＢＡＣからサブクローニングすることができる。例えば、配列番号：１９に記載したように、ＸｈｏＩは位置３０７で切断し、ＳｐｅＩは位置１０１２８及び１６９０５で切断する。ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩで消化すると、二つの断片を生じ、これらは適当なベクター中に逐次クローニングでき、従ってＡＧＰ−１遺伝子の５’側の配列の約６ｋｂを含む１６．６ｋｂのゲノム断片が得られる。
【実施例３】
【０１８８】
ノック−アウトマウス遺伝子及び相同組換えによる同じ遺伝子座へのヒト遺伝子の挿入−手順１
好ましい戦略はヒトＡＧＰ配列を標的に向かうマウスＡＧＰベクター中の５’腕とｎｅｏ遺伝子の間に組み込む工程を含む。換言すれば、相同組換えの際、マウスＡＧＰ遺伝子の発現の破壊と同じ遺伝子座にヒトＡＧＰ遺伝子の挿入の両方を行なうノック−インベクターを作成する。この戦略は大きなベクターの構築を必要とする。ｐＢＲ３２２のような低コピー数ベクターは２０ｋｂを越える大きな断片のクローニングをより受け易いという証拠が文献にある。低コピー数は比較的大きなプラスミドの安定性を助ける。連結によらないクローニング手順では、ＣｏｌＥ１由来のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのような高コピーベクターが２５ｋｂまでクローニングでき、一方ｐＢＲ３２２は８０ｋｂまでクローニングできる（リーら 2001, Genomics 73: 56-65)。
【０１８９】
５’及び３’腕を、ｎｅｏ遺伝子及びヒトゲノム断片と共に、ｐＢＲ３２２のような１個のベクター中に正しい向きでクローニングする。クローニングを容易にするため、実施例２Ａに記載したものと比べ上記の腕の大きさを小さくすることが好ましい。
【０１９０】
工程１．ヒトをコードする配列の取得
ＡＧＰ−１及びＡＧＰ−２及び両方のプロモーター領域を含むヒトＡＧＰ遺伝子クラスターを、ヒトゲノムＤＮＡか又は配列番号：１９を含むＢＡＣクローンのいずれかのＰＣＲにより取得する。これはカルテック・ヒューマン・ＢＡＣライブラリーＢ・アンド・サンガー・センター，ケンブリッジ，ＵＫから入手可能であり、クローンＲＰ１１−８２Ｉ１（ｂＡ８２Ｉ１）として同定される。ＰＣＲプライマーは配列番号：１９（ジェンバンク寄託番号：ＡＬ３５６７９６由来の完全なヒトＡＧＰ遺伝子クラスター）からこれに基づいて設計される。実施例１と同様に、所望のヒト配列の５’半分及び３’半分を形成し、次いでこの二つの断片を結合するための好ましい方法は、二つの別々のＰＣＲ反応を含む。適当なプライマーには以下のものが含まれる。
【０１９１】
５’半分（ＡＧＰ１）：前向きプライマー（ＡＧＰ−１翻訳開始コドンの上流の約６ｋｂ）＝配列番号：１９[ ＡＬ３５６７９６] のヌクレオチド４７２８３−４７３１４。即ち、 (5') ＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＣＴＧＧＧＡＴＣＴＣＴＡＣＡＣＴＣＧＡＧＣＡ (3') [ 配列番号：５３ ]。逆向きプライマー（ＡＧＰ−１ポリアデニル化シグナルの３’＝配列番号：１９[ ＡＬ３５６７９６ ]のヌクレオチド５８１１２−５８１４２の逆向き相補鎖）。即ち、 (5') ＣＴＧＣＡＣＡＴＡＣＧＧＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＴＣＡＧ (3') [ 配列番号：５４ ]。
【０１９２】
３’半分（ＡＧＰ２）：前向きプライマー＝配列番号：１９[ ＡＬ３５６７９６ ]のヌクレオチド５８１１２−５８１４２。即ち、 (5') ＣＴＧＡＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＣＣＧＴＡＴＧＴＧＣＡＧ (3') [ 配列番号：５５ ]。（ＡＧＰ−２の翻訳開始コドンの上流約２ｋｂ）。逆向きプライマー（ＡＧＰ−２のポリアデニル化シグナルの３’＝配列番号：１９[ ＡＬ３５６７９６ ]のヌクレオチド６６１３１−６６１５７の逆向き相補鎖。即ち (5') ＣＣＴＴＴＧＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＡＡＣＣＡＴＡＡＡＴＣ (3') [ 配列番号：５６ ]。
【０１９３】
ＰＣＲにより得られた５’側半分及び３’側半分を一緒にスプライスして、マウスゲノムに「ノック−イン」するためのヒトＡＧＰ−１−ＡＧＰ−２導入遺伝子（配列番号：２０）を形成することができる。
【０１９４】
代わりの戦略はＢＡＣクローンであるＲＰ１１−８２Ｉ１（ｂＡ８２Ｉ１）の制限酵素消化によりヒトＡＧＰ遺伝子を取得し、そして以下の工程にそれを用いる工程を含む。または、ＢＡＣクローン全体をマウスの胚にミクロインジェクション（無差別組み込み）し、得られるトランスジェニックマウスを相同組換えを経て形成されたＡＧＰノック−アウトマウスと後に交配させる。このタイプの２工程手順のより詳細については実施例３を参照せよ。
【０１９５】
工程２．両側を挟むマウスゲノム配列を取得する
この実施例では、導入遺伝子はヒトＡＧＰの発現を駆動するヒトプロモーターを含む。従って、ヒトのポリヌクレオチド配列は実施例１の場合のように、マウスプロモーターと機能しうるように結合される必要はない。しかしながら、このマウスＡＧＰ遺伝子を機能的に不活性化させることがさらに好ましい。従って、相同組換えがＡＧＰ−２遺伝子全体、マウスＡＧＰ−１の３’部分、及びマウスＡＧＰ−３の５’部分の欠失を生じさせるように、マウスの５’側隣接配列はマウスＡＧＰ−１の５’部分から構成され、マウスの３’側隣接配列はマウスＡＧＰ−３の３’部分から構成される。このプロモーター及び／又はマウスＡＧＰ１の第一のエキソンの中に小さな突然変異を導入すれば、この遺伝子の機能的破壊が確実になる。
【０１９６】
マウスの５’側隣接配列は、前向きプライマーとして、配列番号：９のヌクレオチド８４−１１１（Ｍ１７３７６，ＡＧＰ−１の５’側隣接配列）、即ち（5') ＣＴＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡＣＴＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＣ（3') [ 配列番号：５７ ]を用いるマウスゲノムＤＮＡのＰＣＲにより得ることができる。逆向きプライマーは配列番号：９のヌクレオチド２９９１−３０２０（Ｍ１７３７６，ＡＧＰ−１のイントロン５）、即ち（5') ＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＧＴＣＴＧＴＡＴＧＧＣＡＧＧＣＣ（3') [ 配列番号：５８ ]の逆向き相補鎖である。得られるＰＣＲ産物は、これは配列番号：９のヌクレオチド８４−３０２０を表すが、次に機能を有するが先端が欠失したマウスのＡＧＰ−１タンパク質が生産されないことを確実にするため標準的手法を用いて重要な部位で突然変異させてもよい。この突然変異は下記のいずれか又は全てを含む。即ち、ａ）ＧＣボックス（配列番号：９のヌクレオチド５４６−５５４）及びＴＡＴＡボックス（配列番号：９のヌクレオチド５６２−５６７）の破壊、ｂ）翻訳開始コドン（配列番号：９のヌクレオチド６３４−６３６）の点突然変異及び好ましくは配列番号：９のヌクレオチド６５８−６６０のＡＴＧの点突然変異も、ｃ）配列番号：９のヌクレオチド６８０をＴからＡへ変化させることによるなどの第一エキソンに停止コドンの導入、である。突然変異を導入する方法の一例は「融合ＰＣＲ」である。これは所望のヌクレオチド不適合を有するプライマー又は突然変異をコードする５’尾部を有するプライマーを利用する。突然変異を含む相補的な前向き及び逆向きプライマーを形成し、別々のＰＣＲ反応で使用する。一方の反応は５’前向きプライマー（この例では、配列番号：９のヌクレオチド８４−１１１）及び突然変異逆向きプライマーを含みその５’側配列のみでなく該突然変異をも形成する。他方の反応は突然変異前向きプライマー及び３’逆向きプライマー（この例では、配列番号：９のヌクレオチド２９９１−３０２０）を含み、その３’側配列のみでなく該突然変異をも形成する。次いで、これら二つのＰＣＲ産物を、５’前向きプライマー及び３’逆向きプライマーを用いる第三の反応で結合させる。アニーリングの途中で、これら二つの異なるＰＣＲ産物は該突然変異を含むそれらの相補的末端で相互にアニーリングし、一方、前向きプライマーと逆向きプライマーは同じハイブリッドの外側の末端を結び付けて所望の突然変異を含む全長のポリヌクレオチドが合成されそしてその後増幅される。
【０１９７】
マウスの３’側隣接配列もマウスゲノムＤＮＡのＰＣＲにより形成される。その前向きプライマーは配列番号：１１のヌクレオチド８９８−９２４（[ Ｓ３８２１９ ]マウスＡＧＰ−３のイントロン１）から誘導される、即ち（5') ＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＴＧＡＡＴＧＣＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣ（3') [ 配列番号：５９ ]である。逆向きプライマーは配列番号：１１のヌクレオチド３４９２−３５２３（[ Ｓ３８２１９ ]マウスＡＧＰ−３のイントロン５）の逆向き相補鎖である、即ち（5') ＣＡＡＧＧＴＡＧＧＴＡＡＧＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＡＧ（3') [ 配列番号：６０ ]である。
【０１９８】
工程３．導入遺伝子の組立て
工程１及び工程２で得られた成分をｐＢＲ３２２のようなプラスミドの中で次の順序で組み立てる。即ち、（マウスの５’側隣接）−（ヒトのＡＧＰ−１）−（ヒトのＡＧＰ−２）−（ｎｅｏ）−（マウスの３’側隣接）である。使用する手法は当業者に周知であり、制限酵素消化、連結及びクローニングが含まれる。上記のプライマーの５’末端に加えられるユニークな制限酵素認識部位はこの手順を促進するのに有用である。
【０１９９】
ＨＳＶ−ｔｋのような負の選択マーカーを５’側隣接配列の５’末端又は３’側隣接配列の３’末端に挿入するのは任意であるが、無差別組み込み体（ＨＳＶ−ｔｋを維持し、従ってガンシクロヴィルに感受性である）と相同組換え体（ＨＳＶ−ｔｋを失っている）を識別するのに助けになる。
【０２００】
工程４−６
実施例１の通りである。
【実施例４】
【０２０１】
ヒトＡＧＰが内因性のマウスＡＧＰを置き代わっているノック−インマウスを取得する
マウス遺伝子をノック−アウトし次いで相同組換えにより同じ遺伝子座にヒト遺伝子を挿入する−手順２。
【０２０２】
工程１．マウスの隣接ゲノム配列を取得し組み立てる
８．７ｋｂの５’腕（上の実施例２Ａで記載）をＳｐｅＩ−ＸｂａＩで消化して５．９ｋｂ断片を得る。この断片はＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含み又は欠いているｐＢＲ３２２又は何らかの他のベクターのＮｈｅＩ部位にクローニングできる。５’側隣接配列の５’末端又は３’側隣接配列の３’末端にＨＳＶ−ｔｋのような負の選択マーカーを挿入することは任意であるが、無差別組み込み体（これはＨＳＶ−ｔｋを維持しており従ってガンシクロヴィルに感受性である）と相同組換え体（ＨＳＶ−ｔｋを失っている）を識別する場合に助けとなる。
【０２０３】
その３’腕（上の実施例２Ａに記載）はＸｈｏＩ−ＳａｌＩで切断すると５０７２ｂｐ断片を生ずる。これをｐＢＲ３２２のＳａｌＩ部位にクローニングする。相同な腕の全長はほぼ１１ｋｂである。これらの二つの腕の間にユニークなＳｇｒＡ１部位がある。これはヒトの配列（以下を参照）にクローニングするために使用できる。または、同じ目的で、人工的プライマーを設計し、ＳｇｒＡ１部位内に挿入してユニークなＮｏｔＩ部位又は何らかの他のユニークなＲＥ部位（単数又は複数）を作成することができる。
【０２０４】
工程２．ヒトのゲノム配列を取得し組み立てる
上記の１３．５ｋｂ又は１６．６ｋｂのヒト配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中に改変された多クローニング部位（ＭＣＳ）と共に連結する。有用なＭＣＳの例には、
ＳａｃＩ−ＳｇｒＡＩ−ＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ−ＸｂａＩ−ＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ−ＳｇｒＡＩ−ＫｐｎＩ、又は
ＳａｃＩ−ＳｇｒＡＩ−ＮｈｅＩ−ＸｂａＩ−ＳｐｅＩ−ｎｅｏ−ＳｇｒＡＩ−ＫｐｎＩが含まれる。
【０２０５】
このようなＭＣＳは合成プライマーをハイブリッド形成させ連結させることにより、又は適当なＲＥ部位を含む伸長プライマーでＰＣＲすることにより形成できる。ＳａｃＩとＫｐｎＩはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにＭＣＳを挿入することを可能とする。ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩはｎｅｏ遺伝子の挿入を可能とする。ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ及び／又はＮｈｅＩは上の実施例２Ａで記載したＲＰ１１−８２Ｉ１（ヒトＡＧＰ遺伝子を含む）のヒト６８２３ｂｐ及び６７１７ｂｐのＸｂａＩ断片の挿入を可能とする。例えば、５’断片をＮｈｅＩ／ＸｂａＩ切断ベクター中に連結し、ＮｈｅＩに５’末端を持つクローンを同定し、ＸｂａＩ／ＳｐｅＩで切断し、次いでその中に３’断片を連結する。ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩは実施例２Ａで記載した１６．６ｋｂのヒト断片の挿入を可能とする。例えば、ＰＲ１１−８２Ｉ１の９８２１ｂｐのＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ断片を同じ酵素で切断したベクター中に連結する。得られるベクターを次にＳｐｅＩで切断し、ＲＰ１１−８２Ｉ１の６７７７ｂｐのＳｐｅＩ断片を挿入して完全な１６．６ｋｂのヒトＡＧＰ配列を組み立てる。ＳｇｒＡＩはヒト配列（ｎｅｏを含む又は含まない）の除去を可能としそしてその後で上記のｐＢＲ３２２系の標的に向かうベクター中への挿入を可能とする。
【０２０６】
ＥＳ細胞でＧ４１８耐性を与えるための真核性プロモーターを有するだけでなく大腸菌でカナマイシン耐性を付与する原核性プロモーターをも含むｎｅｏ遺伝子を利用することも可能である。最後の連結工程が行なわれると、アンピシリン耐性を付与するプラスミド及びカナマイシン耐性を付与する挿入体の両方について選択することはこのような大きなクローンを選択する場合に助けとなる。３０ｋｂの大きさに近いプラスミドの構築を助けるかも知れない他のパラメータはＤＨ１０Ｂのような大きなプラスミドの安定な増殖を支持し低減した抗生物質濃度で又はより低い温度で該クローンを増殖させる高効率エレクトロコンピテント（electrocompetent) 細胞の使用である。
【０２０７】
代わりの戦略は、相同組換えの二つの工程を含む。例えば、最初の標的に向かうベクターはヒトＡＧＰ−１遺伝子を含む６．８ｋｂのヒト断片を含み、次いで標的化の第二ラウンドはハイグロマイシン又はピューロマイシンなどの異なる選択可能マーカーを使用して行なうことができるであろう。上記５’腕は最初の標的化事象の間にノック−インされた６．８ｋｂのヒトＡＧＰ−１遺伝子の全て又は一部となるであろう。そして３’腕は最初の標的に向かう構築物中で使用される同じ３’腕となるであろう。５’腕と抗生物質耐性遺伝子の間に６．７ｋｂのヒトＡＧＰ−２断片が挿入されるであろう。このようにして、二つの遺伝子が標的化の二つのラウンドの間に逐次ノック−インされるであろう。
【０２０８】
他の代替的クローニング戦略は、より大きなヒト配列のクローニングを容易にするためＥＴクローニング（コープランドら，2001，Nature Reviews Genetics 2: 769-779) 又はコスミドベクター若しくはバクミド（bacmid) ベクターの使用を含む。
【０２０９】
工程３．マウスのＡＧＰ遺伝子座を標的化する
実施例１の工程４の通りである。
【０２１０】
工程４．胚盤胞の注入
実施例１の工程５の通りである。
【０２１１】
工程５．トランスジェニックマウスの選択
実施例１の工程６の通りである。
【実施例５】
【０２１２】
ヒトＡＧＰが内因性のマウスＡＧＰに置き代わっているノック−インマウスを取得する
マウス遺伝子をノック−アウトし次いで相同技術を用いて同じ遺伝子座にヒト遺伝子を挿入する。
【０２１３】
工程１．マウスの全ＡＧＰ遺伝子座をノック−アウトするための標的に向かう構築物の設計
標的に向かうベクターは実施例２Ａに記載したものと同じ方法で構築する。ただし、ネオマイシン耐性遺伝子は野性型ｌｏｘＰ部位を持つ一方の端及び突然変異ｌｏｘＰ５１１部位を持つ他方の端で挟まれる点を除く。
【０２１４】
工程２．ヒトゲノム配列を取得し組み立てる
ヒトの遺伝子断片（１６．６ｋｂ又は１３．５ｋｂ）を実施例２Ｃに記載したように別のベクターにクローニングする。ただし、二つの異なるｌｏｘＰ部位が、改変されたＭＣＳ中に、これらがヒト配列を挟むように、ＳｇｒＡＩ部位に直ぐ隣接して且つＳｇｒＡＩ部位（複数）の間に正しい向きで組み込まれる点を除く。この断片の一方の端には野性型ｌｏｘＰ組換え部位がそして他方の端には突然変異ｌｏｘＰ組換え部位（ｌｏｘＰ５１１）が存在するであろう。これらの二つのｌｏｘＰ部位は一緒に組み換えることができないが、ｌｏｘＰ５１１突然変異部位は別のｌｏｘＰ５１１部位と組み換えることができる。
【０２１５】
工程３．マウスのＡＧＰ遺伝子座を標的化する
実施例１のとおり、マウスのＡＧＰ遺伝子座を破壊しそしてｌｏｘＰ部位を挿入するため工程１（上記）に記載された標的に向かうベクターを用いる。標的化されたＥＳ細胞が一旦同定されれば、ヒト断片はＣｒｅリコンビナーゼを用いて極めて効率的な組換え反応で共トランスフェクトでき、ｎｅｏ遺伝子は組換えにより媒介されたＣｒｅ切断（ＲＭＣＥ）を経てヒト遺伝子により置換される。このようにして、ヒト遺伝子の１個のコピーをマウスのＡＧＰ遺伝子座に特異的に効果的に標的化し、コピー数及び組み込み部位の両方について制御することが可能である。この手法を用いれば他の遺伝子は破壊されずそしてＡＧＰ遺伝子はその「天然の遺伝子座」に存在し、位置効果の問題を消滅させることになる。
【０２１６】
代わりの戦略はＣｒｅリコンビナーゼではなくＦＬＰリコンビナーゼを利用する。その手順は上記のものと同じである。ただし、
−工程１及び工程２では、野性型ＦＲＴ部位と突然変異のＦＲＴ部位がｌｏｘＰの代わりに用いられる（1998，Biochemistry 37(18): 6229-34) 、そして
−工程３では、Ｃｒｅ−発現プラスミドの代わりにＦＬＰ−発現プラスミドが用いられる、
点を除く。
【実施例６】
【０２１７】
ヒトＣＹＰ４５０イソ型を発現するトランスジェニックマウスを取得する
これらのトランスジェニックマウスを作成するために様々なアプローチを用いることができる。ＣＹＰ１、ＣＹＰ２及びＣＹＰ３のファミリーから選択される一つ以上のヒトＣＹＰイソ型をコードするポリヌクレオチドを用いることが好ましい。例えば、下記のリストからのＣＹＰイソ型を導入遺伝子の成分として使用する。即ち、１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、２Ｅ１、３Ａ４、３Ａ５、４Ａ９、４Ａ１１である。このトランスジェニックマウスはＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ２Ｄ６を発現することが望ましく、特にこのトランスジェニックマウスはＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｃ１９を含むこのリスト由来の他のものを発現することもある。これは同じトランスジェニックベクター中に複数のＣＹＰ遺伝子を組み込むことにより、又は二重、三重、四重などのトランスジェニック動物を作成するため、それぞれが異なるヒトＣＹＰイソ型を含む異なるトランスジェニックマウスを交配させることにより達成しうる。このようなトランスジェニック動物は導入遺伝子の無差別組み込みにより又は特定の部位への相同組み込みにより作成しうるし、そして内因性マウスＣＹＰイソ型の破壊と関連することもあり又はしないこともある。
【０２１８】
工程１．ＣＹＰ３Ａ４をコードするポリヌクレオチドを取得する
好ましい手法は、ＢＡＣ又はＹＡＣクローンを取得する工程、ヒトＣＹＰ３Ａ４を含ませる工程、及び該クローンを直接使用するか又は胚に注入する前にそれを線状化するいずれかの工程を含む。この手法は同一ベクター内に配置された複数のＣＹＰ３Ａ遺伝子が同時に導入されるという利点を有する。クローンＲＰ１１−３１６Ａ２４及びＲＰ１１−７５７Ａ１３（ゲノム配列決定センター，ワシントン、Ｕ．Ｓ．Ａ．）は適切なクローンである。他の適当なＢＡＣ又はＹＡＣクローンは、ＢＡＣクローンＲＰ１１−７５７Ａ１３（ジェンバンク寄託番号ＡＣ０６９２９４）に関する配列番号：２３から設計されたプローブを用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。ジェンバンク寄託番号ＡＦ２０９３８９に記載された配列にも言及しうる。これはヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子のエキソン１〜１３を含む２６５０２ヌクレオチドのポリヌクレオチドを規定する。ＡＱ５３９６６０及びＡＱ５３９６５９はＲＰ１１−３１６Ａ２４のＢＡＣ末端を規定し、ＮＧ−０００００４は関連コンティグを規定する。
【０２１９】
代替的戦略は下記のプライマーの合成を含み、適当な場合はその５’末端に制限酵素認識部位をも含む。
【０２２０】
プライマー１：(5')ＧＴＣＣＡＡＡＣＡＣＴＴＣＴＣＴＡＴＧＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＣＡＧＴＣＡＣ(3')[ 配列番号：６１ ]、即ち配列番号：２３（ＡＣ０６９２９４）のヌクレオチド２６９３０−２６９６５であり、これは開始コドンの上流約８．４ｋｂである。
【０２２１】
プライマー２：(5')ＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＴＧＴＧＣＡＴＧＧ(3')[ 配列番号：６２ ]、即ち配列番号：２３（ＡＣ０６９２９４）のヌクレオチド３５２２７−３５２５４及びジェンバンク寄託番号ＮＭ−０１７４６０に関する配列番号：２４のヌクレオチド２６−５３（これはＣＹＰ３Ａ４の５’ＵＴＲの中にある。）の逆向き相補鎖である。
【０２２２】
プライマー３：(5')ＡＣＡＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＧＡ(3')[ 配列番号：６３ ]、即ち配列番号：２３（ＡＣ０６９２９４）のヌクレオチド３５２５５−３５２８１及び配列番号：２４（ＮＭ−０１７４６０）のヌクレオチド５４−８０（これは５’ＵＴＲの中にあり、プライマー２遺伝子座の直ぐ下流にある。）である。
【０２２３】
プライマー４：(5')ＧＡＣＣＡＡＴＣＧＡＣＴＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＧＴＧ(3')[ 配列番号：６４ ]、即ち配列番号：２３（ＡＣ０６９２９４）のヌクレオチド６２３８０−６２４０６及び配列番号：２４（ＮＭ−０１７４６０）のヌクレオチド２７３８−２７６４（これは３’ＵＴＲの中にありポリアデニル化部位を含む）の逆向き相補鎖である。または、ポリＡ尾部に結合するオリゴｄＴプライマーをプライマー４の代わりに使用することができる。
【０２２４】
次いで、下記のＰＣＲ反応を行なう。
【０２２５】
ＰＣＲ反応Ａ：プライマー１及びプライマー２を用いて、ＢＡＣクローンＲＰ１１−７５７Ａ１３又はヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用いて長領域ＰＣＲを行なう。その産物は５’ＵＴＲの一部だけでなく５’側隣接配列の約８．４ｋｂ（ヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーター及びエンハンサーを含む）に相当する。
【０２２６】
ＰＣＲ反応Ｂ：プライマー３及びプライマー４を用い鋳型としてヒト肝臓ｃＤＮＡを用いるＰＣＲ。その産物は全タンパク質コード配列並びに３’ＵＴＲ（ポリアデニル化シグナルを含む）及び反応Ａで増幅されなかった５’ＵＴＲの一部に相当する。
【０２２７】
工程２．導入遺伝子ベクターを組み立てる
上記二つのＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）などの適当なベクター中で組み立てる。該プライマーの５’末端に適当な制限酵素部位を含めることでこのプロセスは容易になる。
ＢＡＣクローン又はＹＡＣクローンを用いた場合には、組立ては必要でない。
【０２２８】
工程３．マウスの胚内に導入遺伝子を挿入する
ＢＡＣクローンを直接精製するか、又は線状化した後精製する。該ＰＣＲにより形成された構築物をプラスミドベクターから切断し、プラスミドＤＮＡから単離する。精製した導入遺伝子を次いで単離されたマウス胚の雄性前核の中にミクロインジェクションを行なう。次いでその胚を無差別組み込みによりトランスジェニックマウスを形成させる標準的手法に従って偽妊娠の代理宿主マウスの輸卵管中に移植する。さらなる詳細は本明細書の別の場所に記載する。または、導入遺伝子ＤＮＡを（ｎｅｏのような選択マーカーを共トランスフェクトさせ又はさせないで）ＥＳ細胞中にトランスフェクトさせる。サザンブロット及び／又はＰＣＲにより組み込み及びコピー数についてクローンをスクリーニングする。
【０２２９】
工程４．トランスジェニックマウスを選択する
トランスジェニックマウスはＰＣＲ及び／又はサザンブロットにより同定し、導入遺伝子の発現は、肝臓のような適当な組織試料を用いてウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、又は他の免疫学的検定法により確認する。または、肝ＲＮＡをノーザンブロットにより分析する。
【０２３０】
別の戦略では、導入遺伝子の相同組換えを用いてマウスゲノムの所望の部位に導入遺伝子の１個のコピーを挿入する。その部位はヒト導入遺伝子に類似の内因性のマウスＣＹＰ遺伝子の部位の近くか又はその部位であることが好ましい。例えば、ヒト導入遺伝子がＣＹＰ３Ａ４のようなＣＹＰ３Ａファミリーの一員でもある場合、マウスのＣＹＰ３Ａ１１、３Ａ１３、ＣＹＰ３Ａ２５、又は３Ａ１６である。両側に隣接するマウス配列は実施例１及び実施例２に記載したように、相同組換えを実行するために導入遺伝子構築物の中に組み込まれる。これらの両側に隣接する配列は、例えば、マウスタンパク質の発現を破壊するのが好ましい場合には、マウスのＣＹＰ遺伝子内の又はそれの両側に隣接するマウスのゲノム配列から誘導する。ＢＡＣクローン又はＹＡＣクローンのミクロインジェクションで形成されたトランスジェニックマウスの場合には、マウスＣＹＰイソ型の破壊は別のマウスで行なわれ、それらのマウスを続いてヒトＣＹＰを発現する上記のマウスと交配させる。同様な手法を用いてヒト様のしかしマウスには似ない免疫グロブリンを発現するマウスを形成させた（グリーン，Ｌ．Ｌ．1999，J. Immunol. Methods 231: 11-23) 。
【０２３１】
ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子に対するマウスの相同染色体は染色体５に局在する。この染色体の上に幾つかのＣＹＰ３Ａ遺伝子が存在し、
ａ）ＣＰ３Ｇ  ＣＹＰ３Ａ１６（ensembl ID：ＥＮＳＭＵＳＧ00000029628)
ｂ）ＣＰ３Ｂ  ＣＹＰ３Ａ１１（ensembl ID: ＥＮＳＭＵＳＧ00000029630)
ｃ）ＣＰ３Ｐ  ＣＹＰ３Ａ２５（ensembl ID: ＥＮＳＭＵＳＧ00000029631)
ｄ）ＣＰ３Ｄ  ＣＹＰ３Ａ１３（ensembl ID: ＥＮＳＭＵＳＧ00000029727)
その順序は、ＣＹＰ３Ａ１３−約８Ｍｂ−ＣＹＰ３Ａ１６−約３００ｋｂ−ＣＹＰ３Ａ１１−約４００ｋｂ−ＣＹＰ３Ａ２５である。
【０２３２】
各遺伝子を個々にノック−アウトすることは可能である。１６、１１及び２５の場合には野性型ｌｏｘＰ部位を５’側隣接領域に標的化し且つ突然変異ｌｏｘＰ５１１を３’側隣接領域に標的化するという二つのの標的化事象を行なうことも可能である。次いで、いずれかの端に野性型ｌｏｘＰ部位及び突然変異ｌｏｘＰ部位を含み且つこの染色体領域にそれを（Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて）標的化するＲＰ１１−３１６Ａ２４などのヒトＢＡＣを取り、こうして３個のマウス遺伝子の全てを欠失させ、このＢＡＣに含まれるヒトＣＹＰ３Ａ４、３Ａ５、３Ａ７及び３Ａ３を挿入することができよう。
【実施例７】
【０２３３】
ヒトＵＧＴ（ＵＤＰＧＴ）イソ型を発現するトランスジェニックマウスを取得する
ＵＧＴ遺伝子ファミリーにはＵＧＴ１及びＵＧＴ２亜型が含まれる。ヒトでは、９個のＵＧＴ１遺伝子（プラス４個の擬似遺伝子）が知られており、これら全てが７ｑ２２の同じ遺伝子座に位置付けられている（ゴングら，2001, Pharmacogenetics 11: 357-368) 。これらの遺伝子はそれぞれユニークなプロモーター及び基質を特異的にコードするエキソン１を利用する一方、これらの遺伝子は全てＵＤＰグルクロン酸との相互作用に必要な同一のカルボキシル末端をコードする同じエキソン２−５を共有する。
【０２３４】
マウスでは、マウス染色体１に位置付けられるＵＧＴ１ファミリーの少なくとも３個の遺伝子が存在する。これらはＵＤ１６、ＵＤ１２及びＵＤ１７であり、それぞれゲノムＤＮＡの８６．１７ｋｂ、１６．６５ｋｂ及び５．１９ｋｂを覆うものである。他の遺伝子もこの領域（ＵＤ１１を含む）にある可能性はある。個々の遺伝子は異なるプロモーター及びエキソン１を有するが、これらは全て最後の３個のエキソンを共有する。これらのマウスＵＧＴ遺伝子は配列番号：６５に記載された７５ｋｂコンティグに位置付けられた。最後の３個のエキソンは全て５ｋｂ領域に位置付けられる。
【０２３５】
７５ｋｂコンティグの上の各遺伝子の種々のエキソンの位置は次のようになる。
（外３）
2004533826.tif 000430
（外４）
2004533826.tif 000431
このコンティグの上にはさらなる遺伝子もある。
（外５）
2004533826.tif 000432
相同組換えの際、以下に述べる標的に向かう構築物はこれらの遺伝子の中の最後の３個のエキソンを欠失する（及びＵＤ１７のエキソン１及びＵＤ１６のエキソン４をも欠失する）。遺伝子が発現されないことを確実にするため３個の読み取り枠の全てに停止コドンを挿入する。３’腕はマウスのゲノムＤＮＡ及び下記のプライマーを用いて増幅できる。ｕｇｔ２３２７５Ｆ  (5')ＧＡＡＧＴＣＧＡＣＧＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＧＧ(3') [配列番号：６６] （配列番号：６５のヌクレオチド２３２７５からヌクレオチド２３２９６まで）、及び
ｕｇｔ２７５０１Ｒ  (5')ＧＡＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＴＴＡＣＡＣＡＧＧＴＣＣＣＡＡＡＧＣ(3') [配列番号：６７] （配列番号：６５のヌクレオチド２７５０１からヌクレオチド２７４８１まで）。
【０２３６】
これらは末端で人工的ＳａｌＩ部位を有する。ＰＣＲ断片をＳａｌＩで消化し、標的に向かうベクター（前の実施例で記載したようにｎｅｏ遺伝子を持つｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）のＳａｌＩ部位にクローニングする。
【０２３７】
マウスのゲノムＤＮＡ及び下記のプライマー
ｕｇｔ３５９６７Ｒ  (5')ＣＴＡＡＧＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＴＧＴＣＣ(3') [配列番号：６８] （配列番号：６５のヌクレオチド３５９６７からヌクレオチド３５９４７まで）、及び
ｕｇｔ３１１７０Ｆ  (5')ＧＣＡＡＴＡＣＴＡＧＣＴＡＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧ(3') [配列番号：６９] （配列番号：６５のヌクレオチド３１１７０からヌクレオチド３１１９３まで）
を用いて５’腕を増幅できる。
【０２３８】
ＰＣＲ断片をｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター中にクローニングし、ＮｏｔＩで消化し、ｎｅｏ遺伝子の３’末端のＮｏｔＩ部位中にクローニングする。このｎｅｏ遺伝子はＵＧＴの反対向きに転写される。この腕の３’末端は最後の第三のエキソンの最初の７ｂｐを含む（ＵＤ１２及びＵＤ１７の場合はエキソン３）。ネオマイシン耐性遺伝子は、先端を欠失したマウスＵＧＴｍＲＮＡのナンセンス媒介崩壊を誘導するためそして考えられる任意の突然変異ＵＧＴタンパク質の翻訳を終結させるため３個の（アンチセンス）枠全てに停止コドンを含む。如何なる先端を欠失したマウスＵＧＴｍＲＮＡでも急速に分解されることをさらに確実にするためＲＮＡ不安定化因子を含む断片を標的に向かうベクター中に工学処理することも可能である。
【０２３９】
この標的に向かうベクターを実施例６に記載されたように電気穿孔法によりＥＳ細胞中に導入し、実施例７に従って該領域が正確に標的化されたＥＳ細胞のクローンを釣り上げ、Ｇ４１８耐性クローンのサザンブロットにより同定する。標的化されたＥＳ細胞を次にチルドレンズ・ホスピタル・オークランド・リサーチ・インスティチュート（ＣＨＯＲＩ）から入手可能なヒトＢＡＣクローンＲＰ１１−９４３Ｂ１０でトランスフェクトする。（ＢＡＣの末端はＡＱ５６４９３８及びＡＱ７１１０９３と同定され、位置はＡＦ２９７０９３で規定されている）。このＢＡＣを陽性クローンの選択を助けるハイグロマイシン耐性又はピューロマイシン耐性を付与するプラスミドと共に共トランスフェクトしてもよい。次いで、選択されたクローンを増殖させ、上記のようにコピー数及び組み込み部位についてスクリーニングする。このＢＡＣは以下のヒトＵＧＴ１遺伝子を含む。即ち、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ２ｐ、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ５、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ９、ＵＧＴ１Ａ１０、ＵＧＴ１Ａ１３ｐ。（ｐは擬似遺伝子を示す）。
【０２４０】
代わりのアプローチは、野性型ｌｏｘＰ部位と突然変異ｌｏｘＰ部位（ｌｏｘＰ５１１）に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子を持つ標的に向かうベクターの使用を含む。このベクターで標的化された細胞は、ＣＲＥリコンビナーゼを発現するプラスミドと共にそのベクター骨格中に野性型ｌｏｘＰ部位と突然変異ｌｏｘＰ部位を有するＢＡＣでトランスフェクトできる。組換えにより媒介されたＣｒｅ削除（ＲＭＣＥ）を受けたコロニーを選択する。このようなコロニーでは、ｎｅｏ遺伝子（マウスＵＧＴ遺伝子座にある）はヒトＵＧＴ遺伝子で置換される。または、野性型ＦＲＴ部位と突然変異ＦＲＴ部位はＦＬＰリコンビナーゼと組み合わせて用いることができる。
【実施例８】
【０２４１】
ヒトＭＤＲ−１を発現するトランスジェニックマウスを取得する
ヒトＭＤＲ−１遺伝子は肝臓、腎臓及び腸上皮などの種々の組織で発現する大きな膜貫通タンパク質（Ｐ−糖タンパク質又はＰ−ｇｐ）をコードする。Ｐ−ｇｐは血液脳関門の不可欠の部分であり、様々な薬を脳から血液へ輸送する薬−輸送ポンプとして機能する。実際、ＭＤＲ−１のＰ−糖タンパク質は多くの細胞型の原形質膜を通して様々な薬を押し出す。
【０２４２】
ヒトは一つのＭＤＲ−１遺伝子のみを持つが、マウスは二つ持つ。Ｍｄｒ−１ａは腸上皮で高度に発現し、ここでそれは腸腔からそして血液脳関門で吸収した生体異物を能動的に排出する。血液脳関門は血液中の生体異物から脳を保護する。Ｍｄｒ−１ｂは副腎、妊娠した子宮及び卵巣で高度に発現する。マウスの両遺伝子は多数の他の組織で実質的に発現する。
【０２４３】
Ｍｄｒ−１ａのＰ糖タンパク質を欠失している天然に生ずるＭｄｒ−１ａ突然変異マウス（ＣＦ−１異系交配マウス系統の）が記載された（ウンベンハウエルら，1997, Toxicol. Appl. Pharmacol. 146 (1): 88-94) 。ノック−アウトマウスは個々のマウスｍｄｒ１遺伝子単独に対してもまた組み合わせでも形成された（シンケルら，1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4028-4033) 。ヒトＭＤＲ−１を発現するトランスジェニックマウスは従って上記のマウスのいずれかと交配して、これらの遺伝子のマウス型ではなくヒト型を発現するマウスを形成させることができる。
【０２４４】
以下の例はヒトＭＤＲ−１を発現するトランスジェニックマウスを構築する方法を記載する。ヒトＭＤＲ−１のｃＤＮＡ（ジェンバンク寄託番号ＮＭ−０００９２７）[ 配列番号：７０ ]はヒト肝臓ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより得られ、ヒト５’及び（好ましくは）３’隣接調節配列及び選択可能マーカー遺伝子と一緒にベクター中で組立てられる。両側の隣接配列は５’側隣接配列についてはヒトゲノムＤＮＡ又はＢＡＣクローンのＣＴＢ６０Ｐ１２（ジェンバンク寄託番号ＡＣ００２４５７）のＰＣＲにより、３’側隣接配列についてはＢＡＣクローンのＣＴＢ１３７Ｎ１３（ジェンバンク寄託番号ＡＣ００５０６８）のＰＣＲにより得られる。これらはそれぞれカルテック・ヒューマンＢＡＣライブラりーＢから入手可能である。組立てられた導入遺伝子は、次に実施例６及び先の実施例で記載したように無差別組み込みにより導入される。
【０２４５】
下記のプライマーはこの目的に有用である。５’末端には添加された酵素部位が必要であり、効率的な消化を可能とするのに十分なヌクレオチドでその部位の両側を挟むべきである。
【０２４６】
プライマーＭＤＲ１（前向き）(5') SalI-ＧＡＡＡＣＣＣＴＡＧＧＣＡＣＴＡＡＡＴＣＣＣ(3')[ 配列番号：７１ ]、これはプロモーターのＡｖｒII部位と重なる。配列番号：７２に記載された５’側隣接ヒトＭＤＲコンティグのヌクレオチド４９３０−４９５１。
【０２４７】
プライマーＭＤＲ２（逆向き）(5') ClaI-ＧＧＧＡＴＴＴＡＧＴＧＣＣＴＡＧＧＧＴＴＴＣ(3')[ 配列番号：７３ ]、これはプロモーターのＡｖｒII部位と重なる。５’側隣接ヒトＭＤＲコンティグ[ 配列番号：７２ ]のヌクレオチド４９３０−４９５１の逆向き相補鎖。
【０２４８】
プライマーＭＤＲ３（前向き）(5')ＣＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＡＧＧＡＧＴＡＣＴＣＡＣ(3')[ 配列番号：７４ ]、これはエキソン１のＡｖｒII部位と重なる。５’側隣接ＭＤＲコンティグ[ 配列番号：７２ ]のヌクレオチド１００４９−１００７１及びＭＤＲ−１ｃＤＮＡ[ 配列番号：７０ ]のヌクレオチド５６−７２。
【０２４９】
プライマーＭＤＲ４（逆向き）(5')ＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＣＴＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＧ(3')[ 配列番号：７５ ]、これはエキソン１のＡｖｒII部位と重なる。配列番号：７２に記載された５’側隣接ＭＤＲコンティグのヌクレオチド１００４９−１００７１及びＭＤＲ−１ｃＤＮＡ[ 配列番号：７０ ]のヌクレオチド５６−７２の逆向き相補鎖。
【０２５０】
プライマーＭＤＲ５（前向き）(5')  SalI- ＡＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＡＧＡＴＧＣＧ(3')[ 配列番号：７６ ]、５’側隣接ＭＤＲコンティグ[ 配列番号：７２ ]のヌクレオチド２９２−３１３。
【０２５１】
プライマーＭＤＲ６（逆向き）(5')  ClaI- ＣＡＣＡＴＧＡＡＡＧＴＴＴＡＧＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＧＡＣＡＣ(3')[ 配列番号：７７ ]、ＭＤＲ−１ｃＤＮＡ[ 配列番号：７０ ]のヌクレオチド４６１４−４６４３の逆向き相補鎖（３’ＵＴＲ中でＰｍｅＩ部位の下流）。
【０２５２】
プライマーＭＤＲ７（逆向き）(5')  XbaI- ＴＧＧＴＣＡＡＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣＧＣＴＴＣ(3')[ 配列番号：７８ ]、これはＭＤＲ１ポリアデニル化シグナルの下流約１７３０ｂｐに位置し、ジェンバンク寄託番号ＡＣ００５０６８（カルテック・ヒューマンＢＡＣライブラリーＢから入手可能なＢＡＣクローンＣＴＢ１３７Ｎ１３）のヌクレオチド３６０７５−３６１００。ジェンバンク寄託番号ＡＣ００５０６８のヌクレオチド３６０６１−３８００１の逆向き相補鎖に相当する１９４０ヌクレオチド配列は配列番号：７９で提示される。プライマーＭＤＲ７はこの配列のヌクレオチド１９００−１９２６の逆向き相補鎖である。
【０２５３】
プライマーＭＤＲ８（前向き）(5')  ＧＣＧＣＣＡＧＴＧＡＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＴＧ(3')[ 配列番号：８０ ]、ヒトＭＤＲ−１ｃＤＮＡ[ 配列番号：７０ ]のヌクレオチド４２５５−４２８３。これは３’ＵＴＲ中でＰｍｅＩ部位の下流に位置する。
【０２５４】
プロモーター因子を持つヒト５’側隣接配列を取得する
ＰＣＲ反応１：転写開始部位の上流約５ｋｂから１０ｋｂまで延びるＳａｌＩ／ＣｌａＩ断片の生産
ＰＣＲは、プライマーＭＤＲ５及びＭＤＲ２を用い、ヒトゲノムＤＮＡ又はより好ましくは適当な配列を含むＣＴＢ−６０Ｐ１２（カルテック・ヒューマンＢＡＣライブラリーＢから入手可能。ジェンバンク寄託番号ＡＣ００２４５７）のようなＢＡＣクローン由来のＤＮＡを鋳型として用いて行なう。
【０２５５】
ＰＣＲ反応２：エキソン１内から転写開始部位の上流約５ｋｂまで延びるＡｖｒII断片の生産
ＰＣＲは、プライマーＭＤＲ１及びＭＤＲ４を用い、ヒトゲノムＤＮＡ又はより好ましくは適当な配列を含むＣＴＢ−６０Ｐ１２（カルテック・ヒューマンＢＡＣライブラリーＢから入手可能。ジェンバンク寄託番号ＡＣ００２４５７）のようなＢＡＣクローン由来のＤＮＡを鋳型として用いて行なう。
【０２５６】
ヒトＭＤＲ−１をコードする配列を取得する
ＰＣＲ反応３：ヒトｃＤＮＡの５’ＵＴＲ内から３’ＵＴＲ内までを含むＡｖｒII／ＣｌａＩ断片の生産
ヒトＭＤＲ−１ｃＤＮＡ（ジェンバンク寄託番号ＮＭ−０００９２７）は、プライマーＭＤＲ３及びＭＤＲ６を用いて、ヒト肝ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより取得する。
【０２５７】
ヒト３’側隣接配列を取得する
ＰＣＲ反応４：最後のエキソンからポリアデニル化シグナルの約１．７ｋｂ下流まで延びるＰｍｅＩ−ＸｂａＩ断片の生産
ＰＣＲは、プライマーＭＤＲ７及びＭＤＲ８を用い、ヒトゲノムＤＮＡ又はより好ましくは適当な配列を含むＣＴＢ−１３７Ｎ１３（カルテック・ヒューマンＢＡＣライブラリーＢから入手可能。ジェンバンク寄託番号ＡＣ００５０６８）のようなＢＡＣクローン由来のＤＮＡを鋳型として用いて行なう。
【０２５８】
ベクターを組立てる
工程１：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターの適当な部位（例えば、ＳａｃII) にネオマイシン耐性遺伝子を連結し、
工程２：反応１で得られたＰＣＲ産物をＳａｌＩ／ＣｌａＩで消化し、工程１で得られたベクターのＳａｌＩ／ＣｌａＩ部位に連結し（こうして〔ＣｌａＩ〕部位の近く及びその上流にＡｖｒII部位をも挿入し) 、
工程３：反応３で得られたＰＣＲ産物をＡｖｒII／ＣｌａＩで消化し、工程２で得られたベクターのＡｖｒII／ＣｌａＩ部位に連結し（こうして〔ＣｌａＩ〕部位の近く及びその上流にＰｍｅＩ部位をも挿入し) 、
工程４：反応２で得られたＰＣＲ産物をＡｖｒIIで消化し、工程３で得られたベクターのＡｖｒII部位中に連結し、
工程５：反応４で得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩ／ＸｂａＩで消化し、工程４で得られたベクターのＰｍｅＩ／ＸｂａＩ部位中に連結する。
【０２５９】
マウスを形成する
上記構築物をＮｏｔＩで線状化し、無差別組み込みのためにＥＳ細胞中にトランスフェクトする（実施例６を参照）。または、トランスフェクトの前にＢｓｓＨII又はＳａｌＩ／ＸｂａＩで消化してベクター骨格からこの導入遺伝子を切り出すことができる。クローンをＧ４１８で選択し、コピー数を決定するためサザンブロットで分析する。適当なクローン（好ましくは１個の遺伝子コピー）を先の実施例で記載したように胚盤胞に移植し、得られたキメラを繁殖させてヒトＭＤＲ−１を発現するホモ接合体マウスを形成させる。このようなマウスはジャーマンタウン，ニューヨーク，米国のタコニック社から入手可能なｍｄｒ１ａ／１ｂ二重ノック−アウトマウス（シンケルら，1997，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4028-4033) と交配育種することができる。得られる三重トランスジェニックマウスはマウスＭｄｒ−１遺伝子両方の発現を欠いているが相同的なヒトＭＤＲ−１遺伝子を発現する。
【実施例９】
【０２６０】
ＥＳ細胞の電気穿孔
電気穿孔の日の前に以下のものを用意すべきである。
（ｉ）１２×１０ｃｍのプレート、及び分裂が不活性化されたネオマイシン耐性の繊維芽細胞（又は適当な場合はハイグロマイシン耐性又はピューロマイシン耐性の繊維芽細胞）のフィーダー層を含む４×６ｃｍのプレート。
【０２６１】
（ii) ＥＳ細胞は、電気穿孔の日に少なくとも３×１０7 細胞が入手できるように、ほぼ８０％コンフルーエンシーまで増殖させるべきである。
１．細胞を収穫する２〜４時間前にＥＳ細胞の上の培地を交換する。通常３×１０ｃｍプレートのＥＳ細胞が入手可能である。これは少なくとも４×１０7 個の細胞を提供する。２×１０7 細胞が一回の電気穿孔に必要なので、これで十分である。
２．先に述べたように０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて細胞を収穫し、３７℃で５分間インキュベートする。
３．５０ｍＬの管に細胞を集める。ＥＢ培地で細胞を洗浄する。
４．ペレットを１０ｍＬの電気穿孔用緩衝液（ＥＢ；１×ハンクス溶液（ギブコ−ＢＲＬ）、２０ｍＭのヘペス、２８ｍＭの２−ベータメルカプトエタノール、１ｍＭのＮａＯＨ）に再懸濁する。
５．トリパンブルー排除を用いて生細胞密度を測定する。
６．細胞を１５００ｒｐｍで５分間回転させる。
７．細胞密度がほぼ３×１０7 細胞／ｍＬとなるように細胞をＥＢ中に再懸濁する。
８．０．４ｃｍの電気穿孔用キューベット２個を次のように標識する。即ち（ｉ）「＋ＤＮＡ」そして８００μＬの最終容量に２×１０7 細胞及び３３μｇＤＮＡを添加する。（ii) 「ＤＮＡ対照」そして８００μＬの最終容量に１．１×１０6 細胞を添加する。
９．室温に１０分間放置する。
１０．無菌移送用ピペットで温和に上下に混合する。
１１．０．４Ｋボルト、２５μＦＤ（時定数は０．４秒又は０．５秒であるべきである）の設定で遺伝子パルサーを用いて電気穿孔を行なう。
１２．室温に１０分間放置する。
１３．＋ＤＮＡキューベットから得た細胞を１２×１０ｃｍプレートの上に播種すると同時に２×６ｃｍの対照プレートの上に比例した量の細胞を播種する。
１４．−ＤＮＡキューベットから得た細胞を２×１０ｃｍプレートの上に播種する。
１５．ゲネティシン（Ｇ４１８）単独又はガンシクロヴィルを添加したもので２４時間後に選択を開始する。
１６．二重選択の場合は、通常Ｇ４１８を３００μｇ／ｍＬの濃度、ガンシクロヴィルを２μＭ用いる。
１７．培地を毎日交換する。
１８．１０日目又は１１日目に生存するクローンを釣り上げる。
【実施例１０】
【０２６２】
コロニーを釣り上げる
材料：
ａ）解剖顕微鏡、マウスピペット、多チャンネルピペット、９６穴Ｕ底プレート
ｂ）釣り上げの前日に分裂的に不活性なネオマイシン耐性胚繊維芽細胞を含む１５又は３０個の２４穴プレートを用意する。これらの細胞は、下記の日に使用するために備えて、ＥＳ細胞増殖培地中に置かれる。
【０２６３】
調製：
ａ）多チャンネルピペットを用いて３０μＬの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを９６穴Ｕ底プレートに添加する。釣り上げるべき細胞の数にとって十分なプレートを用意する。即ち、３６０のコロニーを釣り上げる場合は４×９６穴プレートであり、７２０コロニーを釣り上げる場合は８×９６穴プレートである。
ｂ）６穴プレート中の２穴にハンクス／ヘペス緩衝液を添加する。これはコロニーの間で釣り上げピペットを洗浄するために使用できる。０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを６穴プレート中の一つの穴に添加する。コロニーをトリプシン中に維持できるように、この少量を釣り上げピペット中に集める。
【０２６４】
手順：
１．釣り上げるべきコロニーを含む１０ｃｍプレートの２又は３個を５〜１０ｍＬのハンクス／ヘペス緩衝液（Ｈ／Ｈ）で洗浄する。
２．５ｍＬのＨ／Ｈを添加しプレートの上に放置する。
３．７０％エタノールを用いて多数回パストゥールピペットで引っ張り洗浄する。
４．Ｈ／Ｈで反復洗浄し、次いで釣り上げピペットで少量のトリプシン溶液を採取する。
５．層流室中に設置された解剖顕微鏡を用いて、釣り上げようと思うコロニーを同定する。
６．フィーダー細胞の層の周りを釣り上げ用ピペットで温和に切断する。口で吸ってＥＳ細胞コロニーをピペット中に吸引し、そのコロニーをトリプシン溶液を含む９６穴プレートの穴の一つに移す。
７．２４個のコロニーを集める（即ち、９６穴プレートの３列分）。
８．該９６穴プレートを３７℃の孵卵器に５分間移し細胞の分散を促進する。
９．多チャンネルピペットで激しく２〜３回かき回して該コロニーを分散させる。
１０．該２４穴プレートから採取した５０μＬの培地を該９６穴プレートに添加し、再び激しく分散させる。
１１．全ての細胞を２４穴プレートに移し、各コロニーを分離させたままに保つ。
１２．全ての２４穴プレートがその中にＥＳ細胞を含むまで続ける。
１３．翌日培地を交換する。
【実施例１１】
【０２６５】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・ｎｅｏ・ｔｋベクターの構築
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・ｎｅｏ・ｔｋベクターは次のようにして構築した。ネオマイシン耐性遺伝子はｔｋプロモーターを持っている。それをＳａｌＩ及びＸｈｏＩでｐＭＣ１ｎｅｏ（ジェンバンク寄託番号Ｕ４３６１２）から切り出し、ついでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII KS のＳｍａＩ部位に挿入した。チミジンキナーゼ遺伝子は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）から誘導され、ＥＳ細胞（ジェンバンク寄託番号ＡＦ０９０４５１）中で発現するように工学処理した。その両側を突然変異ポリオーマウイルスのエンハンサーの重複で挟む。このチミジンキナーゼ遺伝子をＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIII でｐＩＣ１９Ｒ／ＭＣ１−ｔｋから切り出し、。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・ｎｅｏベクターのＡｐａＩ部位にクローニングした。ｎｅｏ遺伝子とｔｋ遺伝子及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＴ３プロモーターは両方とも同じ向きで転写される。
【０２６６】
本明細書で引用した全ての特許、特許出願、及び出版物はその全体が参照により本明細書にインコーポレートされる。
【０２６７】
本明細書での如何なる参考文献の引用もかかる参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることを認めるものと解すべきではない。
【０２６８】
本明細書を通じてその目的は如何なる一つの実施態様又は特定の特徴の集合に本発明を限定することなく本発明の好ましい実施態様を記述することであった。従って、当業者は、本開示に照らして本発明の範囲を逸脱することなく例示された特定の実施態様に様々な修正や変更を加え得ることを認めるはずである。このような修正や変更は全て添付された請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０２６９】
【表１】
2004533826.tif 000433
【図面の簡単な説明】
【０２７０】
【図１】図１は、マウスＡＬＢ遺伝子の線状地図を示す図式的表示である。
【図２】図２は、ヒトＡＬＢｃＤＮＡでマウスＡＬＢ遺伝子を置換するためのマウスＡＬＢを標的とする構築物の一つの実施態様の線状地図を示す図式的表示である。
【図３】図３は、マウスＡＧＰ遺伝子座の線状地図を示す図式的表示である。
【図４】図４は、マウスＡＧＰ遺伝子座をノックアウトさせるためのマウスＡＧＰを標的とする構築物の一つの実施態様の線状地図を示す図式的表示である。




【手続補正書】
【提出日】平成15年3月25日(2003.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬をスクリーニングし又は評価するプロセスの一部として、選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物の使用であって、該トランスジェニック哺乳動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドの少なくとも一部を発現するものであり、この外来性ポリペプチドが選択された霊長類種で若しくは霊長類の異なる種で本来発現されるものであるか又は本来発現されるポリペプチドに相当するものであり、且つこの外来性ポリペプチドの内因性相同体の該トランスジェニック哺乳動物における発現が無くなるかそうでなければ低減するものであり、且つ、該外来性ポリペプチドがこの薬の意図された標的以外のものである使用。
【請求項２】
この外来性ポリペプチドが薬−結合ポリペプチドである、請求項１記載の使用。
【請求項３】
この薬−結合ポリペプチドが血清アルブミン及びα−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）から選択されるものである、請求項２記載の使用。
【請求項４】
この選択された霊長類種がヒトであり、且つ薬−結合ポリペプチドがヒト血清アルブミンである、請求項２記載の使用。
【請求項５】
この選択された霊長類種がヒトであり、且つ薬−結合ポリペプチドがＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３から選択されるヒトα−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）である、請求項３記載の使用。
【請求項６】
この外来性ポリペプチドが血清アルブミン及びα−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）から選択されるものであり、このトランスジェニック哺乳動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する少なくとも一つの他の外来性ポリペプチドの少なくとも一部をさらに発現するものであり、且つこの少なくとも一つの他の外来性ポリペプチドが選択された霊長類種で若しくは霊長類の異なる種で本来発現されるものであるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当するものであり、そしてこの相当する他の外来性ポリペプチドのそれぞれの内因性相同体の該トランスジェニック哺乳動物における発現が無くなり若しくはそうでなければ低減するものである使用。
【請求項７】
この若しくはそれぞれの他の外来性ポリペプチドが別の薬−結合ポリペプチド、薬−代謝ポリペプチド、薬−結合及び薬−代謝ポリペプチド又は薬−移送ポリペプチドから選択されるものである、請求項６記載の使用。
【請求項８】
この若しくはそれぞれの他の外来性ポリペプチドが血清アルブミン、α−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、チトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）、ウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）を含む多剤耐性（ＭＤＲ）タンパク質、アセチル−トランスフェラーゼ、プレニルタンパク質トランスフェラーゼ、ぺプチダーゼ、エステラーゼ、アセチラーゼ、グルクロニダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、又は酸化反応、抱合反応（conjugation reaction) 、加水分解反応、還元的代謝又は生体異物に関する他の異化的若しくは同化的反応から選択される反応を促進若しくは触媒するポリペプチドから選択されるものである、請求項６記載の使用。
【請求項９】
この外来性ポリペプチドが薬−結合ポリペプチドであり、このトランスジェニック哺乳動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する少なくとも一つの他の外来性ポリペプチドの少なくとも一部をさらに発現するものであり、この少なくとも一つのの他の外来性ポリペプチドが選択された霊長類種で若しくは霊長類の異なる種で本来発現されるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当するものであり、且つチトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）、ウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）又は多剤耐性タンパク質から選択されるものであり、この相当する他の外来性ポリペプチドのトランスジェニック哺乳動物におけるそれぞれの内因性相同体の発現が無くなるか又はそうでなければ低減するものである、請求項１記載の使用。
【請求項１０】
この選択された霊長類種がヒトであり且つ薬−結合ポリペプチドがヒト血清アルブミンである、請求項９記載の使用。
【請求項１１】
この選択された霊長類種がヒトであり且つ薬−結合ポリペプチドがＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３から選択されるヒトα−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）である、請求項９記載の使用。
【請求項１２】
この選択された霊長類種がヒトであり且つ少なくとも一つの他の外来性ポリペプチドがＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３又はＣＹＰ４から選択されるヒトチトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）である、請求項９記載の使用。
【請求項１３】
この選択された霊長類種がヒトであり且つ少なくとも一つの他の外来性ポリペプチドがＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ４Ａ９又はＣＹＰ４Ａ１１から選択されるヒトチトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）である、請求項９記載の使用。
【請求項１４】
選択された霊長類種がヒトであり且つ少なくとも一つの外来性ポリペプチドがヒトウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である、請求項９記載の使用。
【請求項１５】
選択された霊長類種がヒトであり且つ少なくとも一つの外来性ポリペプチドがヒトＭＤＲ１（Ｐ−糖タンパク質）又はＭＲＰ１である、請求項９記載の使用。
【請求項１６】
この外来性ポリペプチドが内因性ポリペプチドの機能性の相同体である、請求項１記載の使用。
【請求項１７】
この相同体がオルソログ（orthologue) である、請求項１記載の使用。
【請求項１８】
この相同体がパラログ（paralogue)である、請求項１記載の使用。
【請求項１９】
このトランスジェニック哺乳動物がそのゲノムにおける改変を含むものである、請求項１記載の使用。
【請求項２０】
この改変が、内因性相同体をコードする内因性遺伝子の少なくとも一部を該外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子で置き換えることを含むものである、請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
この改変が内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊と、外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子のゲノム中への挿入とを含むものである、請求項１９記載の使用。
【請求項２２】
この改変が内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊であって、この内因性相同体の発現レベルの低下をもたらす破壊を含むものである、請求項１９記載の使用。
【請求項２３】
この改変が内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊であって、内因性相同体の発現レベルをゼロにする破壊を含むものである、請求項１９記載の使用。
【請求項２４】
この改変が内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊であって、この哺乳動物が機能性の内因性相同体を生産する能力を失う破壊を含むものである、請求項１９記載の使用。
【請求項２５】
この改変が内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊であって、この内因性遺伝子の少なくとも一部の欠失を含む破壊を含むものである、請求項１９記載の使用。
【請求項２６】
この改変が内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊であって、この内因性相同体の領域若しくはドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失を含む破壊を含むものである、請求項１９記載の使用。
【請求項２７】
この改変が内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊であって、この内因性遺伝子の発現を少なくとも一部制御する調節ポリヌクレオチドの欠失を含む破壊を含むものである、請求項１９記載の使用。
【請求項２８】
この改変が内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊であって、この内因性相同体をコードするオープンリーディングフレーム全体の欠失を含む破壊を含むものである、請求項１９記載の使用。
【請求項２９】
このトランスジェニック哺乳動物のゲノムが、調節ポリヌクレオチドに機能しうるように連結した外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むものである、請求項１記載の使用。
【請求項３０】
この調節ポリヌクレオチドがトランスジェニック哺乳動物に又は選択された霊長類種に本来存在するポリヌクレオチドである、請求項２９記載の使用。
【請求項３１】
この調節ポリヌクレオチドがトランスジェニック哺乳動物又はその先祖の内因性ポリヌクレオチドである、請求項２９記載の使用。
【請求項３２】
この調節ポリヌクレオチドが選択された霊長類種の内因性ポリヌクレオチドである、請求項２９記載の使用。
【請求項３３】
この調節ポリヌクレオチドが、この外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子のコード配列に本来機能しうるように連結されているヌクレオチド配列を含むものである、請求項２９記載の使用。
【請求項３４】
この調節ポリヌクレオチドがこの外来性ポリペプチドをコードする遺伝子のコード配列に本来機能しうるように連結されているヌクレオチド配列を含むものである、請求項２９記載の使用。
【請求項３５】
この調節ポリヌクレオチドが、トランスジェニック哺乳動物，トランスジェニック哺乳動物の先祖又は選択された霊長類種から選択される動物以外の動物若しくは出所から誘導されるものである、請求項２９記載の使用。
【請求項３６】
この調節ポリヌクレオチドが誘導プロモーターを含むものである、請求項２９記載の使用。
【請求項３７】
この改変が、核酸構築物が該哺乳動物のゲノムに安定に組み込まれるように、該外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、胚性幹細胞中の該核酸構築物と一緒に、相同組換え、無差別組み込み又はリコンビナーゼ系（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ又はＦＬＰ−ＦＲＴ系）の使用によりトランスジェニック哺乳動物のゲノム中に導入されたものである、請求項１９記載の使用。
【請求項３８】
このトランスジェニック哺乳動物が該外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子についてのヘテロ接合体である、請求項１９記載の使用。
【請求項３９】
このトランスジェニック哺乳動物が該外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子についてのホモ接合体である、請求項１９記載の使用。
【請求項４０】
このトランスジェニック哺乳動物がネズミ目の動物から選択されるものである、請求項１記載の使用。
【請求項４１】
このトランスジェニック哺乳動物がマウスである、請求項１記載の使用。
【請求項４２】
この選択された霊長類種がヒトである、請求項１記載の使用。
【請求項４３】
このトランスジェニック哺乳動物がマウスであり且つ選択された霊長類種がヒトである、請求項１記載の使用。
【請求項４４】
選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物であって、該トランスジェニック哺乳動物が薬と結合する外来性ポリペプチドの少なくとも一部を発現するものであり、この外来性ポリペプチドが該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種で本来発現されるものであるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当するものであり、且つ、該トランスジェニック哺乳動物におけるこの外来性ポリペプチドの内因性相同体の発現が無くなるか若しくはそうでなければ低減するものであるトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４５】
該薬と結合するポリペプチドが、血清アルブミン及びα−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）から選択されるものである、請求項４４記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４６】
該選択された霊長類種がヒトであり且つ薬と結合するポリペプチドがヒト血清アルブミンである、請求項４５記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４７】
該選択された霊長類種がヒトであり且つ薬と結合するポリペプチドがＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３から選択されるヒトα−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）である、請求項４５記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４８】
該トランスジェニック哺乳動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種で本来発現される又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当する、少なくとも一つの他の外来性ポリペプチドの少なくとも一部をさらに発現するものであり、該トランスジェニック哺乳動物におけるこの相当する他の外来性ポリペプチドのそれぞれの内因性相同体の発現が無くなり若しくはそうでなければ低減するものである、請求項４４記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項４９】
該その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが、薬と結合するポリペプチド、薬を代謝するポリペプチド、薬と結合し且つ薬を代謝するポリペプチド又は薬を移送するポリペプチドから選択されるものである、請求項４８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５０】
該その又はそれぞれの外来性ポリペプチドが、血清アルブミン、α−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、チトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）、ウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰｓ）を含む多剤耐性（ＭＤＲ）タンパク質、アセチル−トランスフェラーゼ、プレニルタンパク質トランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、アセチラーゼ、グルクロニダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、又は酸化反応、抱合反応（conjugation reaction) 、加水分解反応、還元的代謝又は生体異物を含む他の異化的若しくは同化的反応から選択される反応を促進又は触媒するポリペプチドから選択されるものである、請求項４８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５１】
該薬と結合するポリペプチドが血清アルブミン及びα−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）から選択されるものであり、該トランスジェニック哺乳動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する他の外来性ポリペプチドの少なくとも一つの少なくとも一部をさらに発現するものであり、この他の外来性ポリペプチドが該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種で本来発現され又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当するものであり、且つチトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）、ウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）又は多剤耐性タンパク質から選択されるものであり、該トランスジェニック哺乳動物におけるこの相当する他の外来性ポリペプチドのそれぞれの内因性相同体の発現が無くなり若しくはそうでなければ低減するものである、請求項４４記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５２】
該選択された霊長類種がヒトであり且つ該他の外来性ポリペプチドの少なくとも一つがＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３又はＣＹＰ４ファミリーから選択されるヒトチトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）である、請求項５１記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５３】
該選択された霊長類種がヒトであり且つ該他の該外来性ポリペプチドの少なくとも一つがＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ４Ａ９又はＣＹＰ４Ａ１１から選択されるヒトチトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）である、請求項５１記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５４】
該選択された霊長類種がヒトであり且つ該他の該外来性ポリペプチドの少なくとも一つがヒトウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である、請求項５１記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５５】
該選択された霊長類種がヒトであり且つ該他の該外来性ポリペプチドの少なくとも一つがヒトＭＤＲ１（Ｐ−糖タンパク質）又はＭＲＰ１である、請求項５１記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５６】
該相同体がオルソログ（orthologue) である、請求項４４記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５７】
該相同体がパラログ（paralogue)である、請求項４４記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５８】
改変がそのゲノムに対するものである、請求項４４記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項５９】
該改変が、内因性相同体をコードする内因性遺伝子の少なくとも一部をこの外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子で置き換えることを含むものである、請求項５８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項６０】
該改変が、上記内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊と上記外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子の該ゲノム中への挿入を含むものである、請求項５８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項６１】
該改変が上記内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊であり、この破壊が結果として内因性相同体の発現レベルを低減させるものである、請求項５８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項６２】
該改変が上記内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊であり、この破壊が結果として内因性相同体の発現レベルをゼロとするものである、請求項５８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項６３】
該改変が上記内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊を含む、請求項５８記載のトランスジェニック哺乳動物であって、機能を有する内因性相同体を生産する能力を失っている哺乳動物。
【請求項６４】
該改変が上記内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊であり、この破壊がその内因性遺伝子の少なくとも一部の欠失を含むものである、請求項５８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項６５】
該改変が上記内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊であり、この破壊がその内因性相同体の領域若しくはドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失を含むものである、請求項５８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項６６】
該改変が上記内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊であり、この破壊がその内因性遺伝子の発現を少なくとも部分的に制御する調節ポリヌクレオチドの欠失を含むものである、請求項５８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項６７】
該改変が上記内因性相同体をコードする内因性遺伝子の破壊であり、この破壊がその内因性相同体をコードするオープンリーディングフレーム全体の欠失を含むものである、請求項５８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項６８】
そのゲノムが、調節ポリヌクレオチドに機能しうるように連結されている上記外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むものである、請求項４４記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項６９】
該調節ポリヌクレオチドがこのトランスジェニック哺乳動物又は該選択された霊長類種に本来存在するポリヌクレオチドである、請求項６８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７０】
該調節ポリヌクレオチドが該トランスジェニック哺乳動物又はその先祖の内因性ポリヌクレオチドである、請求項６８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７１】
該調節ポリヌクレオチドが上記選択された霊長類種の内因性ポリヌクレオチドである、請求項６８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７２】
該調節ポリヌクレオチドが上記外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子のコード配列に本来機能しうるように連結されているヌクレオチド配列を含むものである、請求項６８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７３】
該調節ポリヌクレオチドが上記外来性ポリペプチドをコードする遺伝子のコード配列に本来機能しうるように連結されているヌクレオチド配列を含むものである、請求項６８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７４】
該調節ポリヌクレオチドが、該トランスジェニック哺乳動物、該トランスジェニック哺乳動物の先祖又は該選択された霊長類種から選択される動物以外の動物又は起源に由来するものである、請求項６８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７５】
該調節ポリヌクレオチドが誘導プロモーターを含むものである、請求項６８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７６】
該改変が、核酸構築物が該哺乳動物のゲノムに安定に組み込まれるように、外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む、胚性幹細胞中の該構築物と一緒に、相同組換え、無差別組み込み又はリコンビナーゼ系（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ又はＦＬＰ−ＦＲＴ系）の使用によりトランスジェニック哺乳動物のゲノム中に導入されたものである、請求項５８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７７】
該外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子についてヘテロ接合体である、請求項５８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７８】
該外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子についてホモ接合体である、請求項５８記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項７９】
該トランスジェニック哺乳動物がネズミ目の動物から選択されるものである、請求項４４載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項８０】
該トランスジェニック哺乳動物がマウスである、請求項４４記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項８１】
該選択された霊長類種がヒトである、請求項４４記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項８２】
該トランスジェニック哺乳動物がマウスであり、且つ該選択された霊長類種がヒトである、請求項４４記載のトランスジェニック哺乳動物。
【請求項８３】
薬のスクリーニング又は評価プロセスの一部として選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測する方法であって、薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ選択された霊長類種で若しくは異なる霊長類種で本来発現され又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当する外来性ポリペプチドの少なくとも一部を発現する非霊長類トランスジェニック哺乳動物にこの薬を投与する工程であり、このトランスジェニック哺乳動物における該外来性ポリペプチドの内因性相同体の発現がゼロとされ若しくはそうでなければ低減され、この外来性ポリペプチドが該薬の意図された標的以外のものである工程、及び該トランスジェニック哺乳動物におけるこの薬の挙動を決定するため分析試験を行なう工程であり、その結果が内因性相同体を発現するが該外来性ポリペプチド若しくはその部分を発現しない該トランスジェニック哺乳動物と同じ種の哺乳動物から得られた結果よりも選択された霊長類種における該薬の挙動により高い相関性を有するものである工程を含む方法。
【請求項８４】
該分析試験がそれが投与されたトランスジェニック哺乳動物における薬の濃度及び／又は分布を直接的又は間接的に評価する工程を含むものである、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
該分析試験がそれが投与されたトランスジェニック哺乳動物における薬の効力を直接的又は間接的に評価する工程を含むものである、請求項８３記載の方法。
【請求項８６】
該分析試験がそれが投与されたトランスジェニック哺乳動物における薬の毒性を直接的又は間接的に評価する工程を含むものである、請求項８３記載の方法。
【請求項８７】
該分析試験がそれが投与されたトランスジェニック哺乳動物における薬の半減期を直接的又は間接的に評価する工程を含むものである、請求項８３記載の方法。
【請求項８８】
該分析試験がそれが投与されたトランスジェニック哺乳動物における薬の薬力学を直接的又は間接的に評価する工程を含むものである、請求項８３記載の方法。
【請求項８９】
該分析試験がそれが投与されたトランスジェニック哺乳動物における薬の薬物動態学を直接的又は間接的に評価する工程を含むものである、請求項８３記載の方法。
【請求項９０】
該分析試験が薬−スクリーニングプロセスの少なくとも一部である、請求項８３記載の方法。
【請求項９１】
該分析試験が薬の前臨床評価の少なくとも一部である、請求項８３記載の方法。
【請求項９２】
該分析試験が薬−選別プロセスの少なくとも一部である、請求項８３記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的にトランスジェニック動物を作成するためにその中に外来性核酸が導入された非ヒト動物に関する。より具体的には、本発明はマウスなどの非ヒトトランスジェニック動物の生産、育種及び使用に関する。このトランスジェニック動物では、特定の遺伝子又は遺伝子の部分が別の動物由来の相同染色体で置換され、薬物の薬物動態学や薬物の代謝に関して該動物の生理学をこの他の動物の生理学に似るように改変されている。本発明は薬力学的及び／又は毒物学的な研究のために本発明の遺伝的に改変された非ヒト動物の利用にも拡大される。
【背景技術】
【０００２】
新薬を市場に出すまでの費用は極端に高い。通常、製薬会社は、市販するための１個の薬を選択するために、数百から数十万の化合物をスクリーニングする。最初のスクリーニングは最も有望な化合物についてイン・ビトロで行い、動物研究に進む。さらなる開発や臨床試験のために最良の薬（単数又は複数）が選択されるのは、これらの動物研究に基づく。薬品開発に伴う費用のかなりの量はこの動物研究の後に生ずるから、薬物のヒトにおける挙動を予測する際の動物モデルの精度が重要であることは明らかである。
【０００３】
薬の発見及び開発の過程で、動物モデルは薬の候補の特性決定をするという繰り返し行なわれるプロセスにおいて使用される。初期の動物研究は薬物動態学（薬の吸収、体内分布及び体内からのその最終的排出の力学）を決定する。それに続く動物研究は薬力学（薬の作用機作、及び薬の濃度と薬の効果の間の関係）を測定する。通常、これらの研究は効力（例えば、その化合物が腫瘍の増殖を阻止するか、又はこの化合物が神経学的障害を回復するのに有効であるか）、短期毒性、最適投与方法及び投与計画、などをも調べる。これらの動物研究に基づいて、最も有望な化合物（単数又は複数）がさらに開発される。この段階は、継続動物研究（例えば、より長期の毒性研究、徹底的な代謝研究、複数投与の薬物動態学的研究、薬の組み合わせ研究をしばしば含む拡大された効力研究）、化学的開発（例えば、生産）及び薬剤開発（例えば、薬の製剤及び送達）を含む。これらの段階の全てを首尾よく完了した化合物は次にヒト患者でテストされる（フェーズＩ〜III 臨床試験) 。フェーズＩ試験の成功は良好な許容性、適当な薬物動態そして場合によってはヒトにおける意図された薬力学的性質を証明することになろう。このような薬は最適な投与計画並びに病気の治療における効力を試験するためフェーズII及びフェーズIII 臨床試験に進むことになろう。
【０００４】
１個の薬の開発はしばしばマウス又は他の動物種における多数の異なる化合物の試験を必要とする。これらの動物研究はさらなる開発及びさらなる臨床試験のための化合物の選択を決定する。臨床試験段階での薬の脱落の主な理由は、不適当な薬物動態学的及び毒性学的効果（両者ともしばしば薬の代謝に関係する）であり、そしてより程度は小さいが、誤ったコンセプトによる効果の欠如又は薬力学的効果の欠如である。臨床試験へ化合物が進んだ後この後期の段階で不合格となるのは、通常、現存する動物モデルの予想可能性が貧弱だからである。
【０００５】
ヒトにおける薬の挙動を正確に反映しなかった動物モデルからのデータに基づいてなされた不正確な決定は貴重な資源、数百万ドルそして何年もの労働を浪費し得る。さらに、他の候補化合物を追求しないことによって失われる機会は、収益損失として潜在的に数十億ドルに達するであろう。例えば、現在のマウスモデルはしばしば（そして予測不可能なしかたで）ヒトにおける薬物動態学、代謝及び毒性学を正確に反映しない。多数の薬がマウスで有望な結果を示すが、ヒトでは効果的に働くことに失敗する。同様に、マウスで失敗し従って拒絶された他の薬がヒトで良く機能することがある。こうして、さらなる開発及び臨床試験のために薬の候補を選択するというプロセスは現在欠陥のある動物モデルから得られたデータに基づいている。この結果は、ａ）ヒトで働かない薬を追求して貴重な資源を浪費すること、ｂ）ヒトで働くであろうくろたを追求しないことにより機会損失、そしてｃ）フェーズＩ臨床試験で未知の危険に患者を曝すことを含むことになる。
【０００６】
目的の動物（例えば、ヒトや家畜動物、愛玩動物を含む他の哺乳動物）における薬の挙動（例えば、分布、代謝、効力及び毒性）をより正確に予測する改良された動物モデルは、薬品産業及び／又は畜産業にそしてこれらの動物に悪影響を与える疾病の治療に共に極めて大きな利益を与えるであろう。
【特許文献１】
記載なし。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は改良された動物モデルを開発することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
従って、本発明の一つの側面では、薬のスクリーニング又は薬の評価のプロセスの一部として、選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物の使用であって、該トランスジェニック哺乳動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドの少なくとも一部を発現するものであり、該外来性ポリペプチドが該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種で本来発現されるものであるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当するものであり、該トランスジェニック哺乳動物におけるこの外来性ポリペプチドの内因性相同体の発現がゼロとされ又はそうでなければ低減されるものであり、且つ、該外来性ポリペプチドがこの薬の意図された標的以外のものであるトランスジェニック哺乳動物が提供される。この外来性ポリペプチドは薬と結合するポリペプチド、薬を代謝するポリペプチド、薬と結合し且つ薬を代謝するポリペプチド又は薬を移送するポリペプチドから選択されることが好ましい。
【０００９】
トランスジェニック哺乳動物は機能を有する内因性ポリペプチド又は検出可能なレベルの内因性ポリペプチドを生産する能力を欠如していることが好ましい。この外来性ポリペプチドは好ましくは該内因性ポリペプチドの機能を有する相同体である。このタイプの一つの実施態様では、この外来性ポリペプチドは該内因性ポリペプチドのオルソログ（orthologue) である。このタイプの別の実施態様では、外来性ポリペプチドは該内因性ポリペプチドのパラログ（paralogue)である。
【００１０】
トランスジェニック哺乳動物はそのゲノムの改変を含んでもよい。その改変は外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子（transgene)による内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の置換を含んでいる。または、その改変は該内因性遺伝子の破壊を含むことがある。該破壊は内因性ポリペプチドの発現レベルを結果として低減させるものであることが好ましい。好ましい実施態様では、該破壊は内因性ポリペプチドの発現レベルの排除を結果として生ずる。別の好ましい実施態様では、該哺乳動物は機能的な内因性ポリペプチドを生産する能力を欠いている。別の実施態様では、該破壊は内因性遺伝子の少なくとも一部の欠失を含む。該欠失は内因性ポリペプチドの領域若しくはドメインをコードするヌクレオチド配列の欠失を含むことが好ましい。または、該欠失は内因性遺伝子の発現を少なくとも部分的に制御する調節ポリヌクレオチドの欠失を含む。好ましい実施態様では、該欠失は該内因性ポリペプチドをコードする全オープンリーディングフレームの欠失を含む。
【００１１】
外来性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は調節ポリヌクレオチドに機能しうにように連結していることが好ましい。この調節ポリヌクレオチドは１〜１０ｋｂのヌクレオチド配列を含んでもよい。該調節ポリヌクレオチドは該トランスジェニック哺乳動物又は該選択された霊長類種に天然で存在するポリヌクレオチドであることが好ましい。一つの実施態様では、調節ポリヌクレオチドはトランスジェニック哺乳動物又はその先祖の内因性ポリヌクレオチドである。別の実施態様では、調節ポリヌクレオチドは選択された霊長類種の内因性ポリヌクレオチドである。好ましい実施態様では、調節ポリヌクレオチドは該内因性遺伝子のコード配列の上流に天然で位置するヌクレオチド配列を含む。別の好ましい実施態様では、調節ポリヌクレオチドは外来性ポリペプチドをコードする遺伝子のコード配列の上流に天然で位置するヌクレオチド配列を含む。代わりの実施態様では、調節ポリヌクレオチドは該トランスジェニック哺乳動物、該トランスジェニック哺乳動物の先祖、又は該選択された霊長類種から選択された動物以外の動物又は資源に由来する。別の実施態様では、調節ポリヌクレオチドは誘導プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）を含む。
【００１２】
該改変は、構築物が該哺乳動物のゲノム中に安定に組み込まれるように胚性幹細胞中で、導入遺伝子を含む核酸構築物との相同組換え、無作為組み込み又はリコンビナーゼ系（例えば、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ又はＦＬＰ−ＦＲＴ系）の使用によりトランスジェニック哺乳動物のゲノム中に導入されたものであることが好ましい。
【００１３】
トランスジェニック動物は、該導入遺伝子に関してヘテロ接合体であってもよいが、ホモ接合体であることが好ましい。
【００１４】
一つの実施態様では、このトランスジェニック動物はネズミ目から選択される。特に好ましい実施態様では、このトランスジェニック動物はマウスである。
【００１５】
好ましい実施態様では、該選択された霊長類種はヒトである。
【００１６】
この外来性ポリペプチドは、血清アルブミン、α−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、チトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）、ウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰｓ）を含む多剤耐性（ＭＤＲ）タンパク質、アセチルトランスフェラーゼ、プレニルタンパク質トランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、エステラーゼ、アセチラーゼ、グルクロニダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、又は酸化反応、共役反応（conjugation reaction) 、加水分解反応、還元的代謝又は生体異物を含む他の異化的若しくは同化的反応から選択される反応を促進又は触媒するポリペプチドから選択してもよい。一つの実施態様では、外来性ポリペプチドは血清アルブミンであり、好ましくはヒト血清アルブミンであるが、これに限られるわけではない。ヒト血清アルブミンは配列番号：２に記載された配列を含むことが好ましい。好ましい実施態様では、ヒト血清アルブミンをコードするヌクレオチド配列は配列番号：１及び配列番号：３のいずれか一つに記載された配列を含む。別の好ましい実施態様では、内因性血清アルブミンの発現が改変される。この内因性血清アルブミンは配列番号：６に記載された配列を含むマウス血清アルブミンであることが好ましい。マウス血清アルブミンの内因性遺伝子は配列番号：５に記載された配列を含む転写物をコードすることが好ましい。該調節ポリヌクレオチドはこの内因性遺伝子に関するコード配列の上流に本来位置しているヌクレオチド配列を含むことが好ましい。該調節ポリヌクレオチドは配列番号：７に記載されたような配列を含むことが好ましい。
【００１７】
別の実施態様では、外来性ポリペプチドはα酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）である。このタイプの好ましい実施態様では、外来性ポリペプチドはＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３から選択されるヒトＡＧＰである。ヒトＡＧＰ−１（オロソムコイド（ＯＲＭ）−１としても知られている）は配列番号：１４に記載された配列を含むことが好ましい。ヒトＡＧＰ−１をコードするヌクレオチド配列は配列番号：１３に記載された配列を含むことが好ましい。ヒトＡＧＰ−２（ＯＲＭ−２としても知られる）は配列番号：１６に記載された配列を含むことが好ましい。ヒトＡＧＰ−２をコードするヌクレオチド配列は配列番号：１５に記載された配列を含むことが好ましい。別の好ましい実施態様では、内因性ＡＧＰの発現は改変されている。この内因性ＡＧＰはＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３から選択されるマウスＡＧＰであることが好ましい。このマウスＡＧＰ−１は配列番号：１０に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−１をコードする内因性遺伝子は配列番号：９に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−３は配列番号：１２に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−３をコードする内因性遺伝子は配列番号：１１に記載された配列を含むことが好ましい。この例では、調節ポリヌクレオチドは外来性ポリペプチドをコードする遺伝子に関するコード配列の上流に本来位置しているヌクレオチド配列を含むことが好ましい。この調節ポリヌクレオチドは、それぞれがヒトＡＧＰ−１遺伝子及びヒトＡＧＰ−２遺伝子の上流に本来位置している調節ポリヌクレオチドに対応する配列番号：２１及び／又は配列番号：２２に記載された配列を含むことが好ましい。
【００１８】
別の側面では、本発明は選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が薬と結合する外来性のポリペプチドの少なくとも一部を発現するものであり、その外来性ポリペプチドが該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種において本来発現されるものであるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当するものであり、トランスジェニック哺乳動物におけるこの外来性ポリペプチドの内因性相同体の発現がゼロとされ又はそうでなければ低減されるものであるトランスジェニック哺乳動物を意図する。
【００１９】
さらに別の側面では、本発明は選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物又はその子孫であって、該トランスジェニック動物が血清アルブミン及びアルファ酸性糖タンパク質からなる群より選択される薬と結合する外来性ポリペプチドの少なくとも一部を発現するものであり、その薬と結合するポリペプチドが該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種において本来発現されるものであるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当するものであり、該トランスジェニック哺乳動物におけるこの外来性ポリペプチドの内因性相同体の発現がゼロとされ又はそうでなければ低減されるものである非霊長類トランスジェニック哺乳動物を包含する。
【００２０】
このトランスジェニック哺乳動物は、薬の挙動及び／又は代謝と関連する少なくとも一つの他の外来性ポリペプチドの少なくとも一部をさらに発現することが好ましい。この外来性ポリペプチドは、選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種で本来発現されるものであるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当するものであり、この相当する他の外来性ポリペプチドのそれぞれの内因性相同体の該トランスジェニック哺乳動物における発現がゼロとされ若しくはそうでなければ低減されるものである。この又はそれぞれの他の外来性ポリペプチドは薬と結合するポリペプチド、薬を代謝するポリペプチド、薬と結合し且つ薬を代謝するポリペプチド又は薬を移送するポリペプチドから選択されることが好ましい。このタイプの好ましい実施態様では、その又はそれぞれの他の外来性ポリペプチドは血清アルブミン、アルファ酸性糖タンパク質、好ましくは３Ａ下位群から選択されるチトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）、下位群１Ａから選択されるウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）、ウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ及びＰ−糖タンパク質及び多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）を含む多剤耐性タンパク質（ＭＤＲ）からなる群より選択される。
【００２１】
さらに別の一側面では、本発明は選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物を作成する際に使用するための、好ましくはしかしそれに限らないが標的に向かう構築物である核酸構築物であって、該構築物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むものであり、この外来性ポリペプチドが該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種において本来発現されるものであるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当するものである核酸構築物を包含する。一つの実施態様では、この核酸構築物は該導入遺伝子の両側の二つの領域を含む標的に向かう構築物であって、該領域（複数）が該非霊長類哺乳動物のゲノムの部分（複数）と相同組換えを受ける程に十分に該部分と相同である構築物である。この種の好ましい実施態様では、該部分は該外来性ポリペプチドの相同体である非霊長類哺乳動物のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の両側にある又は内因性遺伝子に含まれる配列を含む。導入遺伝子は外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードする該配列に機能しうるように連結された調節ポリヌクレオチドを含むことが好ましい。この核酸構築物は選択可能マーカー遺伝子を含むことが好ましい。
【００２２】
さらなる側面において、本発明は、選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種において本来発現されるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当する外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を提供する工程、及び
−  この導入遺伝子を非霊長類哺乳動物のゲノム中に導入する工程、
を含む方法に存する。
【００２３】
この導入遺伝子のゲノム中への導入には、上に概述したような核酸構築物を作成する工程が含まれることが好ましい。
【００２４】
ゲノムへの導入遺伝子の導入は内因性遺伝子を機能的に破壊する工程を含むことが好ましく、これは該内因性遺伝子の構造を破壊することにより達成することが好ましい。または、ゲノムへの導入遺伝子の導入は該内因性遺伝子の部位以外の部位への導入遺伝子の挿入を含んでもよい。一つの実施態様では、ゲノムへの導入遺伝子の導入は内因性遺伝子又はその部分を導入遺伝子で置換する工程を含む。好ましい実施態様では、内因性遺伝子の機能は、例えば適当な標的に向かう構築物を用いて破壊される。
【００２５】
この方法は、非霊長類哺乳動物のゲノム中に選択可能マーカー遺伝子を導入する工程をさらに含むことが好ましい。この種の好ましい実施態様では、該選択可能マーカー遺伝子は、例えば、上述した標的に向かう構築物の中に組み込まれる。
【００２６】
さらなら側面では、本発明は、選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種において本来発現されるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当する外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子、及び該導入遺伝子の両側にあって、該非霊長類哺乳動物のゲノムの部分と相同組換えを受ける程に十分相同性を有する領域、を含む標的に向かう構築物を提供する工程、及び
−  該導入遺伝子が該部分（複数）の間に挟まれたゲノムの領域中に相同的に組み換わるのに十分な条件の下で、非霊長類細胞のゲノム中に該標的に向かう構築物を導入する工程、
を含む方法に存する。
【００２７】
別の側面によれば、本発明は、選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種において本来発現されるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当する外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む核酸構築物を提供する工程、及び
−  該導入遺伝子が非霊長類細胞のゲノム中に無差別に組み込まれるような条件の下で、該ゲノム中に該構築物を導入する工程、
を含む方法を提供する。
【００２８】
さらなる側面では、本発明は、選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種において本来発現されるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当する外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子、及び該導入遺伝子の両側にある領域で、該非霊長類哺乳動物のゲノムの部分（複数）との相同組換えを受けるのに十分な該部分との相同性を有する領域であり、該部分が該外来性ポリペプチドの相同体である非霊長類哺乳動物のポリペプチドの少なくとも一部をコードする内因性遺伝子の両側にあるか又はその内部に含まれるものである領域、とを含む標的に向かう構築物を提供する工程、及び
−  非霊長類細胞のゲノム中の内因性遺伝子の少なくとも一つに該導入遺伝子が相同組換えを起こすのに十分な条件の下で該細胞のゲノム中に該標的に向かう構築物を導入し、それにより細胞内の内因性遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子が該導入遺伝子で置換され又は破壊された細胞を作成する工程、
を含む方法に存する。
【００２９】
本発明はさらに、選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種で本来発現されるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当する外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含み且つ非霊長類細胞のゲノムの部分により両側を挟まれている導入遺伝子を含む第一の標的に向かう構築物を提供する工程、及び
−  ｉ）該外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の少なくとも一部分、及びii）該内因性遺伝子を破壊できるポリヌクレオチド、を含む第二の標的に向かう構築物を提供する工程、
−  該部分に対応する、該細胞のゲノムの領域に導入遺伝子が相同組換えを起こすのに十分な条件の下で該非霊長類細胞中に第一の標的に向かう構築物を導入する工程、
−  該細胞のゲノム中の内因性遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子中に該ポリヌクレオチドが相同組換えを起こすのに十分な条件の下で該細胞の中に第二の標的に向かう構築物を導入し、それにより該内因性遺伝子の少なくとも一つの破壊された対立遺伝子を含む細胞を作成する工程、
を含む方法に存する。
【００３０】
本発明は、選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物を作成する方法であって、
−  薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種で本来発現されるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当する外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含む核酸構築物を提供する工程、
−  ｉ）該外来性ポリペプチドの相同体である内因性ポリペプチドをコードする内因性遺伝子の少なくとも一部分、及びii）該内因性遺伝子を破壊できるポリヌクレオチド、を含む標的に向かう構築物を提供する工程、
−  該細胞のゲノムの領域中に導入遺伝子が無差別に組み込まれるのに十分な条件の下で該非霊長類細胞の中に該核酸構築物を導入する工程、及び
−  該細胞のゲノム内の内因性遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子の中に該ポリヌクレオチドを相同組換えするのに十分な条件の下で該細胞中に該標的に向かう構築物を導入し、それによって細胞内の該内因性遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子が破壊された細胞を作成する工程、
を含む方法にさらに及ぶ。
【００３１】
上記の作成方法で用いられた細胞は胚性幹細胞であることが好ましく、ネズミ目内の哺乳動物由来の胚性幹細胞であることが好ましく、マウスの胚性幹細胞であることが最も好ましい。
【００３２】
好ましい実施態様では、この方法は、非ヒト動物の胚盤胞又は他の発生初期段階中に少なくとも一つの導入遺伝子を含む胚性幹細胞を注入する工程をさらに含む。
【００３３】
別の好ましい実施態様では、この方法は注入された胚盤胞を偽妊娠非ヒト動物中に導入し、偽妊娠動物に少なくとも一つの相同組換えされた導入遺伝子を含む子孫に送達させる工程をさらに含む。
【００３４】
別の好ましい実施態様では、少なくとも一つの相同組換えされた導入遺伝子を含む該子孫は該外来性ポリペプチドの少なくとも一部を検出可能なレベルで発現することによりさらに特徴付けられる。
【００３５】
別の好ましい実施態様では、少なくとも一つの相同組換えされた導入遺伝子を含む子孫は、該内因性ポリペプチドの発現レベルの低下又は検出不可能によりさらに特徴付けられる。
【００３６】
代替的な好ましい実施態様では、この子孫は機能的な内因性ポリペプチドを生産する能力を欠如する。
【００３７】
この方法は、上に概述した方法により作成された非霊長類トランスジェニック哺乳動物を育種し、この動物の子孫を生産する工程をさらに含んでもよい。例えば、同一の導入遺伝子を含む哺乳動物を該導入遺伝子に関してホモ接合である哺乳動物を生産するため同系交配することができる。代替的に若しくは追加的に、本発明で記述された異なる導入遺伝子を含むトランスジェニック哺乳動物は二つ以上の異なる導入遺伝子を含む哺乳動物を作成するため交配することができる。代替的に又は追加的に、これらのトランスジェニック哺乳動物のいずれかを、本発明に記載された導入遺伝子（単数又は複数）のみでなく交雑戦略で使用される他の哺乳動物の望ましい遺伝的特性をも含む哺乳動物を得るために、同種の哺乳動物の、他の遺伝的に改変された、野性型の、又は突然変異型の任意の哺乳動物と交配することができる。トランスジェニック哺乳動物がマウスの場合、交雑戦略はトランスジェニックマウスと、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、ＢＡＬＢ／ｃなどの同系交配マウス系統、ヒトの特定の疾病を模倣するように設計されたマウス又は有用なレポーター構築物有するマウスを含むがこれらに限定されない別のマウスとの交雑を含んでもよい。
【００３８】
トランスジェニック哺乳動物及びそれに由来する細胞は、薬を含む生物活性物質をスクリーニングするためにそして該物質の分布、効力、代謝及び／又は毒性を研究するために有用である。これらのスクリーニング法は、目的の霊長類種における薬の挙動を改良された予測可能性を以て評価するためにとりわけ有用である。従って、さらなる側面において本発明は、薬のスクリーニング又は評価のプロセスの一部として、選択された霊長類種における薬の挙動を評価する方法であって、薬の挙動及び／又は代謝と関連し且つ選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種で本来発現されるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当する外来性ポリペプチドであり、且つ該薬の意図された標的以外のものである外来性ポリペプチドの少なくとも一部を発現する非霊長類トランスジェニック哺乳動物に薬を投与する工程、及びトランスジェニック哺乳動物における薬の挙動を決定するため分析試験を行ない、その結果が内因性ポリペプチドを発現するが外来性ポリペプチド又はその部分を発現しないトランスジェニック哺乳動物と同一種の哺乳動物から得られる結果よりも選択された霊長類種における該薬の挙動とより高い相関性を有するものである工程を含む方法を特徴とする。
【００３９】
一つの実施態様では、この分析試験は薬が投与されたトランスジェニック哺乳動物における該薬の濃度及び／又は分布を直接的又は間接的に評価する工程を含む。別の実施態様では、該分析試験は薬が投与されたトランスジェニック哺乳動物における該薬の効力を直接的又は間接的に評価する工程を含む。さらに別の実施態様では、該分析試験は薬が投与されたトランスジェニック哺乳動物における該薬の毒性を直接的又は間接的に評価する工程を含む。さらなる実施態様では、該分析試験は薬が投与されたトランスジェニック哺乳動物における該薬の半減期を直接的又は間接的に評価する工程を含む。なおさらなる実施態様では、該分析試験は薬が投与されたトランスジェニック哺乳動物における該薬の薬力学を直接的又は間接的に評価する工程を含む。なお別の実施態様では、該分析試験は薬が投与されたトランスジェニック哺乳動物における該薬の薬物動態学を直接的又は間接的に評価する工程を含む。
【００４０】
本発明は薬の挙動の研究における上に概説したようなトランスジェニック哺乳動物の使用をも包含する。
【００４１】
【表Ａ】
2004533826.tif 000434
【００４２】
【表Ａ−１】
2004533826.tif 000435
【００４３】
【表Ａ−２】
2004533826.tif 000436
【００４４】
【表Ａ−３】
2004533826.tif 000437
【００４５】
【表Ａ−４】
2004533826.tif 000438
発明の詳細な説明
１．定義
特に断らない限り、本明細書で用いられる技術的及び科学的用語は全て本発明が属する技術分野における当業者により通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載されたものと同じ又は等価の全ての方法及び材料は本発明の実施又は試験において使用できるが、好ましい方法及び材料が記載されている。本発明の目的のために、下記の用語を以下に定義する。
【００４６】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は一つ又は冠詞の文法上の一つよりも大きな数（即ち、少なくとも一つ）を指すために用いられる。例を挙げれば、「an element」は１要素又は１より大の要素を意味する。
【００４７】
「物質」とは、そのレベル及び／又は機能的活性が改変されるべき標的と直接的又は間接的のいずれかで相互作用する、天然に生ずる又は合成的に生産される分子を意味する。
【００４８】
「ＡＧＰ」とは、α酸性糖タンパク質ファミリーを意味する（ＡＡＧとも略する）。
【００４９】
「抗原結合分子」とは標的抗原に対する結合親和性を有する分子を意味する。この用語は免疫グロブリン、免疫グロブリン断片及び抗原結合活性を示す非免疫グロブリン由来のタンパク質骨格にまで及ぶものと理解される。
【００５０】
「オートロガス」とは同一生物に由来するもの（例えば、細胞、組織など）を意味する。
【００５１】
本明細書で用いるとき、用語「挙動」とは、薬に関して使用される場合、薬の分布、半減期、効力及び毒性及び薬の代謝物並びに該薬／化合物の投与の生理学的又は病理学的如何なる他の結果をも含むが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書で用いるとき、用語「シスで作用する配列」又は「シスで調節する領域」又は「調節領域」又は同様な用語は、発現しうる遺伝子配列に関して適当に配置された場合その遺伝子配列の発現を少なくとも一部調節することができる任意のヌクレオチド配列を意味すると解すべきである。当業者は、シスで調節する領域が、転写レベル又は転写後のレベルで遺伝子配列の発現及び／又は細胞型特異性及び／又は発生特異性のレベルを活性化し、沈黙化（silencing)し、強化し、抑制し又は他の方法で改変することができることに気付くはずである。
【００５３】
本明細書を通じて、論旨が他の意味を要求しない限り、「含む（comprise, comprises, comprising)」という用語は述べられた工程又は要素或いは工程又は要素の群を含むことを意味するが、他の如何なる工程又は要素或いは工程又は要素の群を排除することを意味しないと解すべきである。
【００５４】
「に対応する（corresponds to, corresponding to) 」とは、（ａ）参照されたポリヌクレオチド配列の全て又は一部と実質的に同一又は相補的であるヌクレオチド配列、又は（ｂ）ぺプチド又はタンパク質中のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチドを意味する。この言葉はその範囲内に参照されたぺプチド又はタンパク質中のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するぺプチド又はポリペプチドをも含んでいる。
【００５５】
「誘導体」とは、改変により、例えば、他の化学的部分との結合若しくは複合体形成により又は当分野で理解されるような翻訳後修飾により、基本配列から誘導されたポリペプチドを意味する。この用語「誘導体」はその範囲内に機能的に等価な分子を生ずる付加、又は欠失を含む親配列に加えられた改変をも含む。従って、用語誘導体は機能及び／又は免疫反応を調節する分子を包含する。
【００５６】
「薬」とは、生物、器官、組織又は細胞の生理学又は病理学を改変する又は改変することを意図する任意の化合物、ぺプチド、タンパク質、脂質、炭水化物、又は他の分子若しくは部分を指す。
【００５７】
「エキソン」とは、成熟ｍＲＮＡ分子中に存在するＤＮＡセグメント又はそれがコードするｍＲＮＡセグメントの領域を意味する。
【００５８】
用語「外来性ポリヌクレオチド」又は「外因性ポリヌクレオチド」又は「異質ポリヌクレオチド」とは、実験操作により動物のゲノム中に導入される任意の核酸（例えば、遺伝子配列）を指し、該導入された遺伝子が天然に生ずる遺伝子に関して何らかの改変（例えば、点突然変異、選択可能マーカー遺伝子の存在、ｌｏｘＰ部位の存在など）を含む限りその動物中で見出される遺伝子配列を含んでもよい。
【００５９】
用語「遺伝子」とは、本明細書で用いられるとき、細胞のゲノムの考えられる全ての分離したコード領域並びに関連する非コード領域及び調節領域を指す。遺伝子は発現の調節に関与する特定のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、イントロン、及び隣接する５’及び３’非コードヌクレオチド配列をも意味すると意図される。この点で、遺伝子は、プロモーター、エンハンサー、終結シグナル及び／又はポリアデニル化シグナルなどの内因性の（即ち、本来所与の遺伝子と関連している）又は異質の制御シグナルをさらに含んでもよい。ＤＮＡ配列はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ又はそれらの断片であってよい。遺伝子は染色体外で維持するため又は宿主中に組み込むため適当なベクター中に導入してもよい。
【００６０】
用語「相同体」とは、ポリペプチドとの文脈では、異なる動物のポリペプチドのコードされたアミノ酸配列に類似する配列を有する、参照動物のポリペプチドを指す。二つのポリペプチドは「相同である」と言われるが、これは該タンパク質の間で進化上の関係が必ずあることを意味するものではない。そうではなく、用語「相同である」とは該二つのポリペプチドが類似のアミノ酸配列を有することを意味すると定義される。さらに、多くの場合、類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドは類似の機能を有することになるが、用語「相同である」とは該ポリペプチドが機能的に相互に類似せねばならないことを意味するものではない。「相同である」がポリぺプチド又はぺプチドを指して用いられる場合、同一でない残りの位置はしばしば同類アミノ酸置換しか異ならないことが認識される。「同類アミノ酸置換」はアミノ酸残基が類似の化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を持つ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基により置換されている場合の置換である。一般に、同類アミノ酸置換はタンパク質の機能的性質を実質的に変化させない。二つ以上のアミノ酸配列が同類置換だけ相互に異なる場合には、配列同一性パーセント又は相同性の程度は該置換の同類性を修正するため上方に補正してもよい。この補正をする手段は当業者に良く知られている（例えば、ピアソンら（1949）Method in Molecular Biology 24: 307-31) 。次の６個の群は、それぞれが相互に同類置換であるアミノ酸を含んでいる。（１）アラニン（Ａ），セリン（Ｓ），スレオニン（Ｔ）、（２）アスパラギン酸（Ｄ），グルタミン酸（Ｅ）、（３）アスパラギン（Ｎ），グルタミン（Ｑ）、（４）アルギニン（Ｒ），リジン（Ｋ）、（５）イソロイシン（Ｉ），ロイシン（Ｌ），メチオニン（Ｍ），バリン（Ｖ）、及び（６）フェニルアラニン（Ｆ），チロシン（Ｙ），トリプトファン（Ｗ）。
【００６１】
ポリペプチドの配列相同性は、配列同一性とも呼ばれるが、通常、配列分析ソフトウェアを用いて求められる。例えば、ウィスコンシン州５３７０５，マジソン，ユニバーシティ  アベニュー  ９１０のユニバーシティ・オブ・ウィスコンシン・バイオテクノロジー・センターのシーケンス・アナリシス・ソフトウェア・バッケージ・オブ・ザ・ジェネティクス・コンピュータ・グループ（ＧＣＧ）を参照せよ。タンパク質分析ソフトウェアは種々の置換、欠失及び同類アミノ酸置換を含む他の修飾に割当られた相同性の尺度を用いて類似の配列を適合させる。例えば、ＧＣＧは、例えば異なる種の生物由来の又は野性型タンパク質とその突然変異タンパク質の間の相同的なポリペプチドなどの密接に関連するポリペプチドの間の配列相同性又は配列同一性を決定するためデフォルト・パラメータで使用できる「Ｇａｐ」や「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムを含む。異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと参照配列を比較する場合に好ましいアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴであり、とりわけｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ（アルチュールら，1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402) である。ｂｌａｓｔｐの好ましいパラメータは、
予想値                          １０              （デフォルト）
フィルター                      ｓｅｇ            （デフォルト）
ギャップを開くための費用        １１              （デフォルト）
ギャップを拡大するための費用    １                （デフォルト）
最大整列                        １００            （デフォルト）
ワードサイズ                    １１              （デフォルト）
記載（descriptions) の数        １００            （デフォルト）
ペナルティマトリックス          ＢＬＯＷＳＵＭ６２
である。
【００６２】
相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは、一般に少なくとも約１６アミノ酸残基、通常少なくとも約２０アミノ酸残基、より普通には少なくとも約２４アミノ酸残基、典型的には少なくとも約２８残基、そして好ましくは約３５残基より多い。アミノ酸配列を用いるデータベース調査は当分野で知られたｂｌａｓｔ以外のアルゴリズムにより求めることができる。例えば、ポリペプチド配列はＧＣＧ６．１版におけるプログラムであるＦａｓｔａを用いて比較できる。Ｆａｓｔａは質問配列と調査配列の間の最良の重なりの領域の整列と配列同一性パーセントを与える（ピアソン（1990) Methods in Enzymology 183: 63-98))。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性パーセントは、ＧＣＧ６．１版で提供される、Ｆａｓｔａとそのデフォルトパラメータ（ワードサイズ２、ＰＡＭ250 評点マトリックス）を用いて決定できる。本発明は、ポリペプチド「相同体」の二つの一般型を意図する。タイプ１相同体は強い相同体である。タイプ１相同体である二つのポリペプチドの比較は、ｂｌａｓｔｐアルゴリズムと上に列挙したパラメータを用いて１×１０-40 より小さいｂｌａｓｔｐ評点を結果として生ずるであろう。ｂｌａｓｔｐ評点が低い程、即ちそれがゼロに近づく程、両ポリペプチド配列の間の適合は良くなる。タイプ２相同体はより弱い相同体である。タイプ２相同体である二つのポリペプチドの比較は、Ｂｌａｓｔアルゴリズムと上に列挙したパラメータを用いて、１×１０-40 と１×１０-10 の間のｂｌａｓｔｐ評点を結果として生ずるであろう。当業者は他のアルゴリズムが弱い相同性又は強い相同性を決定するために使用できることを認めるはずである。
【００６３】
「相同性」又は「同一性」又は「類似性」は二つのぺプチド又はポリペプチドの間又は二つの核酸分子の間の配列類似性を指す。相同性は、比較のために整列させた各配列における一つの位置を比較することにより決定できる。比較された配列の一つの位置が同じ塩基又はアミノ酸により占められる場合は、該分子（複数）はその位置において相同である。配列間の相同性の程度は該配列により共有される適合位置又は相同位置の数の関数である。「無関係な」又は「非相同な」配列は、参照配列と４０％未満の同一性、好ましくは２５％未満の同一性であるが、を共有する。
【００６４】
「ヒト化」とは、必ずしもヒトの等価物と同一ではないが、機能及び／又は構造においてヒトにより似せることを意味する。ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列に関して本明細書で用いるとき、用語「ヒト」は、機能においてヒトに似ている全ての配列を含んでもよい。
【００６５】
「イントロン」とは一般に一次ｍＲＮＡからスプライスにより除かれるＤＮＡの領域又はそれがコードするｍＲＮＡセグメントであり、成熟ｍＲＮＡ分子には存在しないものである。
【００６６】
「分離された」とは、その本来の状態でそれに通常伴う成分を実質的に又は本質的に含まない物質を意味する。
【００６７】
「ノックイン」動物とは、本明細書で用いるとき、特定の遺伝子又はその部分が外来性遺伝子又は外来性ＤＮＡ配列により置き換えられている遺伝子的に改変された動物を指す。
【００６８】
「ノックアウト」動物とは、遺伝子が除去され又は機能できなくされている遺伝的に改変された動物を意味する。
【００６９】
用語「哺乳動物」は、本明細書では最も広い意味で用いられ、ゲッ歯類、霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ（caprices) 、ウマ、イヌ、及びネコを含む。好ましい非ヒト哺乳動物はねずみ（例えば、ラットやマウス）を含むネズミ目から選択され、最も好ましいのはマウスである。
【００７０】
「ｍＲＮＡ（Messenger RNA 又は mRNA)」とは、鋳型としてのＤＮＡを用いて細胞中で生産される「転写物」であって、それ自体タンパク質をコードするものである。
【００７１】
薬又はそれが相互作用するポリペプチドに関して用いられる場合、用語「代謝（metabolism又はmetabolising) 」などは、外因性物質の吸収、結合、摂取、分泌、分布、輸送、処理、変換又は分解を含む、これらに限定されないが、化合物の生変換並びに該薬の投与から直接的又は間接的に結果として生ずる病理学的反応の全ての側面を指す。
【００７２】
用語「５’非コード領域」は、該遺伝子のポリペプチド産物を含むアミノ酸残基をコードする配列以外の、発現可能な遺伝子の上流領域から誘導される全てのヌクレオチド配列を含めるためその最も広い意味で本明細書中で用いられる。この場合、５’非コード領域は該遺伝子を少なくとも一部発現させ、発現を活性化し、又は他の方法で発現を容易にする。
【００７３】
「ヌードマウス」は、ヒト腫瘍細胞を増殖させるための宿主としてしばしば使用される胸腺欠損マウスとしても知られる免疫不全マウスの一血統である。
【００７４】
本明細書で用いられるとき用語「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合（又は関連する構造変異型又はそれらの合成類似体）を介して連結されている多数のヌクレオチド単位（デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又は関連する構造変異型又はそれらの合成類似体）からなるポリマーを指す。従って、用語「オリゴヌクレオチド」は通常ヌクレオチド及びそれらの間の連結が天然に生ずるものであるヌクレオチドポリマーを指すが、この用語はその範囲内にぺプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホルアミデート、ホスホロチオエート、ホスホン酸メチル、リボ核酸２−Ｏ−メチルなど、これらに限定されないが、を含む様々な類似体をも含むものと理解される。これらの分子の正確な大きさは特定の適用に応じて変化しうる。オリゴヌクレオチドは通常長さがかなり短く、一般に約１０から３０ヌクレオチドまでであるが、この用語は任意の長さの分子を指すことができる、ただし用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は通常大きなオリゴヌクレオチドに対して用いられる。
【００７５】
「機能しうるように連結した（operably linked 又は operably connected など) 」とは、機能的な関係でポリヌクレオチド要素を連結することを意味する。核酸配列はそれが別の核酸配列と機能的な関係で配置される場合「機能しうるように連結されて」いる。例えば、プロモーター又はエンハンサーはそれがコード配列の転写に影響を与える場合、該コード配列に機能しうるように連結されている。機能しうるように連結されるとは、連結されている核酸配列が通常隣接しており、二つのタンパク質コード領域を結合させる必要がある場合は隣接し且つリーディングフレーム内にあることを意味する。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼが二つのコード配列を１個のｍＲＮＡに転写でき、次いでそれが両方のコード配列から誘導されるアミノ酸を有する１個のポリペプチドに翻訳される場合に、別のコード配列に「機能しうるように連結され」ている。これらのコード配列は、発現された配列が最終的に所望のタンパク質を生産するようにプロセスされる限り、相互に隣接している必要はない。転写可能なポリヌクレオチドにプロモーターを「機能しうるように連結する」とは、該転写可能なポリヌクレオチド（例えば、タンパク質をコードするポリヌクレオチド又は他の転写物）をプロモーターの調節的制御の下に置くことを意味する。このプロモーターは次いで該ポリヌクレオチドの転写及びときには翻訳を制御する。異質のプロモーター／構造遺伝子の組み合わせを構築する際には、転写可能なポリヌクレオチドの転写開始部位からある距離を置いてプロモーター又はその変異型を配置することが一般に好ましい。その距離はプロモーターとその本来の構成においてこのプロモーターが制御する遺伝子、即ち、該プロモーターがそれから誘導された遺伝子との間の距離とほぼ同じである。当分野で知られているように、この距離には幾らかの変動が機能の損失なしに許容される。同様に、その制御の下に置こうとする転写可能なポリヌクレオチドとの関係で調節配列要素（例えば、オペレーター、エンハンサーなど）の好ましい配置は、その天然の構成における該要素、即ち、それがそこから誘導された遺伝子の配置によって規定される。
【００７６】
用語「オルソログ（orthologue) 」とは、種分化を介する相同体、例えば、構造的及び機能的考察に基づいて密接に関係しておりそして共通の一定水準を持つと仮定される相同体である遺伝子又はタンパク質を意味する。オルソログのタンパク質は異なる種において同じ活性又は類似の活性を認識しうるように働く。用語「パラローグ（paralogue)」とは、遺伝子重複を介して、即ちゲノム内の一つの遺伝子の重複した変異型を介して相同である遺伝子又はタンパク質を意味する。フリッチ，ダブリューエム（1970) Syst Zool 19: 99-113を参照。
【００７７】
「ＰＣＲ」とは、ＤＮＡを増幅するための方法であるポリメラーゼ連鎖反応を意味する。
【００７８】
本明細書で用いられるとき用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とはｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを指し示す。この用語は通常長さが３０ヌクレオチドより大きなオリゴヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド配列は相補鎖並びに本明細書で記載された代替的骨格を包含するものと理解される。
【００７９】
用語「ポリヌクレオチド変異型」及び「変異型」とは、参照配列と実質的な配列同一性を示すポリヌクレオチド又は以下に定義されるストリンジェント条件下で参照配列とハイブリッドを形成するポリヌクレオチドを意味する。これらの用語は、一つ以上のヌクレオチドが付加され若しくは欠失し若しくは異なるヌクレオチドで置換されたポリヌクレオチドをも包含する。この点で、突然変異、付加、欠失及び置換を含む一定の変更が、参照ポリヌクレオチドに施され、それにより改変されたポリヌクレオチドが参照ポリヌクレオチドの生物機能若しくは生物活性を保持し得ることは当分野で良く知られている。用語「ポリヌクレオチド変異型」及び「変異型」は天然に生ずる対立遺伝子変異型をも含む。
【００８０】
「ポリペプチド」、「ぺプチド」及び「タンパク質」は本明細書では、アミノ酸残基のポリマー及びその変異型及びその合成類似対立遺伝子を指すために互換的に使用される。従って、これらの用語は、天然に生ずるアミノ酸ポリマーのみでなく、一つ以上のアミノ酸残基が対応する天然に生ずるアミノ酸の化学類似体などの天然に生じない合成アミノ酸であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００８１】
用語「ポリペプチド変異型」とは、参照ポリペプチドのそれと比べそのアミノ酸配列において何らかの相違を有するポリペプチドを意味する。従って、ポリペプチド変異型は、少なくとも一つのアミノ酸の付加、欠失又は置換により参照ポリペプチドから識別される。
【００８２】
「プライマー」とは、ＤＮＡ鎖と対合された場合、適当な重合物質の存在下でプライマー伸長生産物の合成を開始できるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは増幅の最大効率のためには一本鎖であることが好ましいが、代替的に二本鎖であってもよい。プライマーは重合物質の存在下で伸長生産物の合成を開始するのに十分な程長くなければならない。プライマーの長さは、適用、用いられる温度、鋳型反応条件、他の試薬、及びプライマーの起源などの多数の因子に依存する。例えば、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは通常１５〜３５又はそれ以上のヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含んでいてもよい。プライマーは、約２００ヌクレオチドから数千塩基又はそれ以上までの大きなポリヌクレオチドであることもできる。プライマーは、それがハイブリッドを形成しそして合成の開始部位として役立つように設計される鋳型の配列に「実質的に相補的」であるように選択されうる。「実質的に相補的」とは、このプライマーが標的ヌクレオチド配列とハイブリッドを形成するのに十分な程相補的であることを意味する。プライマーはそれがハイブリッドを形成するように設計される鋳型との不適合を含まないことが好ましいが、これは必須ではない。例えば、プライマー配列の残りが該鋳型に相補的であれば、非相補的ヌクレオチドがプライマーの５’末端に付着しうる。または、プライマー配列が鋳型配列とハイブリッドを形成するのに十分な程相補的でありそれにより該プライマーの伸長生産物を合成するための鋳型を形成するとするならば、非相補的ヌクレオチド又は非相補的ヌクレオチドのストレッチがプライマー中に散在できる。
【００８３】
「プローブ」は、特定の配列又は部分配列又は別の分子の他の部分に結合する分子を指す。特に断らない限り、用語「プローブ」は通常相補的塩基対合を介して「標的核酸」としばしば呼ばれる別の核酸に結合するポリヌクレオチドプローブを指す。プローブはハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに応じて、プローブとの完全な配列相補性を持たない標的核酸に結合しうる。プローブは直接的又は間接的に標識できる。
【００８４】
「プロモーター」とは転写の開始及び転写レベルを制御する、ｍＲＮＡをコードする領域の一般に上流（５’）のＤＮＡ領域を意味する。本明細書での「プロモーター」への言及はその最も広い意味にとられるべきであり、ＴＡＴＡボックス配列やＣＣＡＡＴボックス配列などの古典的ゲノム遺伝子の転写調節配列を含み、並びに発生的及び／又は環境からの刺激への応答として遺伝子発現を改変する、又は組織特異的若しくは細胞型特異的な方式で遺伝子発現を改変する付加的調節因子（即ち、上流の活性化配列、エンハンサー及びサイレンサー）を含む。プロモーターは通常、しかし必ずしも常にではなく、それがその発現を調節する構造遺伝子の上流即ち５’に配置される。さらに、プロモーターを含む調節因子は通常該遺伝子の転写の開始部位の２ｋｂ以内に配置される。本発明のプロモーターは細胞中での発現をさらに強化するため、及び／又はそれが機能しうるように連結される構造遺伝子の発現のタイミング又は誘導可能性を改変するため、開始部位からさらに遠位に配置された付加的な特異的調節因子を含んでもよい。
【００８５】
用語「組換えポリヌクレオチド」は、本明細書で用いられるとき、核酸の操作により天然で普通には発見されない形態にイン・ビトロで形成されたポリヌクレオチドを指す。例えば、組換えポリヌクレオチドは発現ベクターの形態であってもよい。一般に、このような発現ベクターはヌクレオチド配列に機能しうるように連結された転写調節核酸及び翻訳調節核酸を含む。
【００８６】
「組換えポリペプチド」とは、組換え技法を用いて、即ち組換えポリヌクレオチドの発現により、作成されたポリペプチドを意味する。
【００８７】
本明細書で用いられるとき「レポーター分子」とは、その化学的性質により、分析的に同定可能なシグナルを提供する分子を意味する。例えば、抗原結合分子及びその標的抗原を含む複合体の検出である。用語「レポーター分子」は細胞凝集の使用又はラテックスビーズ上の赤血球などの凝集の阻害の使用にも及ぶ。
【００８８】
「ＳＣＩＤマウス」とは重症複合免疫不全症を持つ免疫不全マウスの一血統を意味する。
【００８９】
本明細書で用いるとき用語「配列同一性」は、比較窓の上でヌクレオチドごと又はアミノ酸ごとに配列が同一であるというその程度を指す。従って、「配列同一性パーセンテージ」とは、比較窓の上で最適に整列させた二つの配列を比較し、両配列において同一核酸塩基（例えば、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｉ）又は同一アミノ酸残基（例えば、Ａｌａ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｇｌｙ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ，Ｈｉｓ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｃｙｓ及びＭｅｔ）が生ずる位置の数を決定して適合位置の数を求め、該適合位置の数を比較窓中の位置の総数（即ち、窓のサイズ）で割り、そしてその結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを求めることにより計算される。本発明の目的では、「配列同一性」は、ＤＡＮＳＩＳコンピュータプログラム（ウィンドウズ（登録商標）用２．５版，米国，カリフォルニア，サウスサンフランシスコのヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング・コウ．リミティッド）により、このソフトウェアに添付された参照マニュアルで使用されているような標準的デフォルトを用いて計算された「適合パーセンテージ」を意味するものと理解すべきである。
【００９０】
「サザンブロット」は、特異的ＤＮＡ配列を検出するための方法である。簡単に述べれば、ＤＮＡ試料を制限酵素で切断し、電気泳動にかけ、膜に移転させ、ついで目的の標識化ＤＮＡ断片で精査する。
【００９１】
「標準的マウス」とは、本発明の遺伝子改変を保持しないマウスの任意の血統を意味する。
【００９２】
本明細書で用いるとき「ストリンジェンシー」とは、ハイブリダイゼーション手順及び洗浄手順の間の温度とイオン強度、及び一定の有機溶媒の存在又は非存在を意味する。ストリンジェンシーが高い程、固定化された標的ヌクレオチド配列と洗浄後に該標的とハイブリッド形成をしたまま残っている標識化プローブポリヌクレオチド配列との間の相補性の程度は高くなる。
【００９３】
「ストリンジェント条件」は、高頻度の相補塩基を有するヌクレオチド配列のみがハイブリッドを形成する、温度及びイオンの条件を指す。要求されるストリンジェンシーはヌクレオチド配列に依存し、且つ、ハイブリダイゼーション及びその後の洗浄の間存在する種々の成分に依存し、そしてこれらの処理の時間に依存する。一般に、ハイブリダイゼーションの割合を最大にするため、非ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択され、熱融点（Ｔm ）よりも約２０〜２５℃低い温度が選択される。このＴm は、規定されたイオン強度及びｐＨで溶液中の完全に相補的なプローブに特定の標的配列の５０％がハイブリッドを形成する温度である。一般に、ハイブリッドを形成した配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を要求するためには、高ストリンジェント洗浄条件はＴm よりも約５〜１５℃低い温度が選択される。ハイブリッドを形成した配列の少なくとも約７０％ヌクレオチド相補性を要求するためには、中ストリンジェント洗浄条件はＴm よりも約１５〜３０℃低い温度が選択される。高度に許容性の（低ストリンジェンシー）洗浄条件は、ハイブリッドを形成した配列の間の高レベルの不適合を許容する、Ｔm より５０℃も低い温度である。当業者は、ハイブリダイゼーション及び洗浄段階で他の物理的及び化学的パラメータが標的配列及びプローブ配列の間の相同性の特定のレベルからの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響するように改変することもできることを認めるはずである。ストリンジェンシー条件の他の例はセクション３．３に記載される。
【００９４】
本明細書で用いられるとき、用語「実質的に精製された」とは、天然の環境から分離され、単離又は分別され、自然界で結合している他の成分を少なくとも６０％、好ましくは７５％、最も好ましくは９０％含まない、核酸配列又はアミノ酸配列のいずれかである分子を意味する。従って、「単離されたポリヌクレオチド」は実質的に精製されたポリヌクレオチドである。
【００９５】
「ｔ1/2 」とは、薬がその濃度を１／２まで低減するために必要な時間（半減期としても知られる）を意味する。
【００９６】
「トランスフェクション」とは、核酸分子（例えば、プラスミド又はＤＮＡ断片）が真核細胞中に挿入される過程のプロセスを意味する。通常、２〜５０％の細胞が該プラスミドを取込み、該プラスミドＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ断片を細胞の染色体に組み込むことなく約３日間タンパク質生産物を発現する（＝一過性のトランスフェクション）。これらの細胞の小さな割合が最終的にプラスミドＤＮＡを細胞の染色体に組み込み、永久にタンパク質生産物を発現する（＝安定なトランスフェクション）。
【００９７】
用語「導入遺伝子（transgene)」とは、生きている動物の細胞、とりわけ哺乳動物細胞のゲノム中に人工的に挿入された又はされる予定の遺伝子物質を記述するために本明細書で用いられる。該導入遺伝子は細胞を形質転換するために用いられ、永久的又は一過性の遺伝子変化、好ましくは永久的遺伝子変化が、外因性の核酸（通常ＤＮＡ）の組み込みの後に細胞内で誘導されることを意味する。永久的遺伝子変化は一般に細胞のゲノム中へのＤＮＡの導入により達成される。安定な組み込みのためのベクターには、プラスミド、レトロウイルス、及び他の動物ウイルス、ＹＡＣｓ（酵母人工染色体）、ＢＡＣｓ（細菌人工染色体）などが含まれる。導入遺伝子は、脊椎動物、好ましくはゲッ歯類、ヒト、非ヒト霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ目の動物、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、エイブ（aves) などの哺乳動物を含む、これらに限定されないが、動物に由来するものが好ましい。
【００９８】
本明細書で用いるとき用語「トランスジェニック」とは、内因性ゲノムが外来性遺伝子又は外来性配列の無差別組み込み又は部位特異的組み込みにより補充され又は改変されている遺伝子的に改変された動物を意味する。
【００９９】
本発明の「トランスジェニック動物」は、好ましくは動物の生殖細胞系列のゲノムの実験的操作により生産される。これらの遺伝子工学処理された動物は、核酸（通常ＤＮＡ）を含む「導入遺伝子」の胚の標的細胞中への導入、又は本明細書で記載された方法によるなどのヒトの介入により動物の体細胞及び／又は生殖系列細胞の染色体中への「導入遺伝子」の組み込みを含む幾つかの方法により作成される。導入遺伝子を含む動物は「トランスジェニック動物」と呼ばれる。トランスジェニック動物はそのゲノムが導入遺伝子の導入により改変された動物である。
【０１００】
「ＵＧＴｓ」又は「ＵＤＰＧＴｓ」とは、ウリジン・グルクロノシルトランスフェラーゼ又はウリジン・ジホスホグルクロノシルトランスフェラーゼを意味する。
【０１０１】
「ベクター」とは、核酸配列が挿入され又はクローニングされうる、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、又は植物ウイルスに由来する核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子を意味する。ベクターは一つ以上のユニークな制限部位を含み、そして標的細胞若しくは組織又はその先祖の細胞若しくはその組織を含む一定の宿主細胞中で自律複製でき、又は該クローニングされた配列が再生できるように一定の宿主のゲノムと一体化しうるものであることが好ましい。従って、ベクターは、自律複製可能ベクター、即ち、その複製が染色体の複製と無関係な染色体外実体、例えば、線状プラスミド若しくは閉環状プラスミド、染色体外因子、ミニクロモソーム、又は人工染色体、として存在するベクターでありうる。ベクターは自己複製を確実にするための任意の手段を含んでもよい。または、ベクターは宿主細胞に導入された場合、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（単数又は複数）と一緒に複製するものであってもよい。ベクター系は１個のベクター又はプラスミドを含んでもよく、宿主細胞のゲノム中に導入されるべき総ＤＮＡを共に含む二つ以上のベクター又はプラスミドを含んでもよく、トランスポゾンを含んでもよい。ベクターの選択は通常該ベクターが導入される宿主細胞と該ベクターの適合性に左右される。ベクターは適当な形質転換体を選択するために用いることができる抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含んでもよい。このような耐性遺伝子の例は当業者に良く知られている。
【０１０２】
用語「野性型」とは、天然資源から単離されたときの遺伝子又は遺伝子産物の特徴を持っているその遺伝子又は遺伝子産物を意味する。野性型遺伝子は集団において最も頻繁に観察され、従って該遺伝子の「正常」型又は「野性」型と恣意的に命名される。対照的に、用語「改変された」、「変異型」又は「突然変異型」は、野性型の遺伝子又は遺伝子産物と比較した場合配列の特性又は機能的特性における改変（即ち、改変された特徴）を示す遺伝子又は遺伝子産物を指す。天然に生ずる突然変異体を単離することができることに注意すべきである。これらは野性型遺伝子又は野性型遺伝子産物と比較した場合改変された特徴を有するという事実により確認される。
【０１０３】
本明細書で用いるとき、遺伝子の名前に下線を引いたもの又はイタリックにしたものは遺伝子を示すと解すべきである。これは下線を引いたりイタリックにしたりしないで示された該遺伝子のタンパク質生産物と対照的である。例えば、「ＡＧＰ−１」はＡＧＰ−１遺伝子を意味するが、「ＡＧＰ−１」は「ＡＧＰ−１」遺伝子のタンパク質生産物を示す。
【０１０４】
２．本発明のトランスジェニック哺乳動物
本発明は選択された霊長類種の薬の代謝により近似する薬の代謝を示す非霊長類トランスジェニック哺乳動物を提供する。とりわけ好ましい実施態様では、該選択された霊長類種はヒトであり、従って、このトランスジェニック哺乳動物は、その野性型動物の薬の代謝よりももっとヒトに近似しした薬の代謝を示す。このようなトランスジェニック動物は、薬のスクリーニング、薬の前臨床的評価及び種々の毒性学的及び薬理学的研究を含む適用を有するが、これらに限定されない。
【０１０５】
本発明はとりわけ、薬の挙動及び／又は薬の代謝と関連したポリペプチドの発現のための非霊長類トランスジェニックモデルに向けられている。より具体的には、本発明は選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物であって、該トランスジェニック哺乳動物が薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドの少なくとも一部を発現するものであり、該外来性ポリペプチドが該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種内で本来発現されるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当するものである非霊長類トランスジェニック哺乳動物を提供する。一つの実施態様では、外来性ポリペプチドは、導入遺伝子内に含まれるヌクレオチド配列によりコードされ、該ヌクレオチド配列が該選択された霊長類種の野性型遺伝子又は野性型様遺伝子物質に相当するものである。この野性型様遺伝子物質は一遺伝子全体から成るものでも、遺伝子群の塊又はその部分から成るものであってもよい。それは野性型遺伝子の生物活性断片から成るものでもよい。導入遺伝子はゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡを含んでもよい。好ましい実施態様では、該トランスジェニック哺乳動物は、そのゲノムに挿入された、薬と結合するポリペプチド及び／又は薬を代謝するポリペプチドをコードする少なくとも一つのヒト遺伝子又はヒト様遺伝子を持つという特徴を有する。このトランスジェニック哺乳動物は、その細胞の全体又は一部への導入遺伝子の安定な組み込みにより、その生殖細胞系配列に安定な変化を含むことが好ましい。
【０１０６】
薬の効力は標的組織に到達する薬の量及び該標的に対しその化合物が持つ親和性に依存する。同様に、薬の毒性は攻撃されやすい組織に到達する薬又はその代謝物の量に依存する。薬は、身体組織に薬を送達するため通常、血液、血清、脳脊髄液及びリンパ液などの、これらに限定されないが、循環液を用いる種々の技法（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、経口、皮下）により投与できる。幾つかの薬を代謝するポリペプチドは循環液内に存在し、この循環液は薬及びその代謝物の両者の半減期に影響を与えることができる。毒性を決定しそして効力に寄与できるのは該薬それ自体ではなく二次代謝物であることがしばしばある。一般に、代謝には二つのタイプが起こり得る。フェーズＩ代謝は通常酸化、還元又は加水分解によりこの分子の極性を増加させる。そしてフェーズII反応は該薬への内因性基質の何らかの結合が起こるという点で合成的である（例えば、アセチル化については、表１及びギルマンら（編），1985，The Pharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan Publishing Co., New York を参照）。しかしながら、薬代謝における種差が起こり得る。例えば、フェーズII反応では、ラットでグルクロニド形成が硫酸化よりも優先しており、一方イヌ及びヒトでは、例外も起こるが硫酸化が優先する（リン及びルー，1997,Pharmacol. Rev. 49: 403-449) 。薬の代謝における周知の差は、アモバルビタールのヒドロキシル化がヒト、イヌ、モルモット、ラット、ハムスター、及びマウスの間で一貫した特徴であるにもかかわらず、Ｎ−グルクロニド形成はヒト特異的であり、一方ジオール誘導体の形成は研究されたヒト以外の種でのみ起こるようにみえるということである（タングら，1980，Canadian J. Physiol. Pharmacol. 58: 1167-1169)。薬の代謝には無数の酵素が関与し、これらには幾つかのチトクロームｐ４５０（ＣＹＰ）イソ型、エステラーゼ、アセチル−トランスフェラーゼ、アセチラーゼ、グルクロノシル−トランスフェラーゼグルクロニダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ及びさらに多く（例えば、表１を参照）が含まれる。通常、異なる種由来の薬を代謝するポリペプチド同族体の間には構造的相違があり、これはそれらの基質特異性を含むそれらの薬代謝能力に影響し得る。こうして、一つの実施態様では、外来性ポリペプチドは薬を代謝するポリペプチドである。このタイプの好ましい外来性ポリペプチドには、脱アルキル化反応（Ｏ−又はＮ−結合）、脱アミノ化反応、デスルフレーション（desulphuration) 、ヒドロキシル化（脂肪族又は芳香族側鎖）、ヒドロキシル化（Ｎ−結合）及びスルホキシド誘導体化を含むがこれらに限定されない酸化反応、アセチル化、グルクロニド形成、グリシン・コンジュゲーション、メチル化（Ｏ−，Ｎ−，又はＳ−結合の）、及び硫酸コンジュゲーションを含むがこれらに限定されないコンジュゲーション反応、エステル又はアミドのの加水分解を含むがこれらに限定されない加水分解反応、並びにアゾ基又はニトロ基の還元的代謝を含むがこれらに限定されない還元的代謝から選択される反応を促進し又は触媒するポリペプチドが含まれる。とりわけ好ましい実施態様では、薬物を代謝するポリペプチドはチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）である。これは、ＣＹＰ１、ＣＹＰ２、ＣＹＰ３及びＣＹＰ４を含むがこれらに限定されないＣＹＰ群から適切に選択される。このタイプの好ましい実施態様では、外来性ポリペプチドはヒト又はヒト様のＣＹＰ亜群又はハロタイプである。これはＣＹＰ１Ａ２、ＣＹＰ２Ａ６、ＣＹＰ２Ｂ６、ＣＹＰ２Ｃ９、ＣＹＰ２Ｃ１９、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ２Ｅ１、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ４Ａ９又はＣＹＰ４Ａ１１から選択されることが好ましいが、常にそうとは限らない。内因性ＣＹＰ群の発現は変化せず又は破壊されずに残る。このタイプの特に好ましい実施態様では、ＣＹＰはＣＹＰ３Ａ４である。別の好ましい実施態様では、該薬物を代謝するポリペプチドはウリジン・ジホスホグルクロノシル・トランスフェラーゼ（ＵＧＴ）である。
【０１０７】
薬物を代謝するタンパク質及び遺伝子の他の例には、多剤耐性（ＭＤＲ）群及び多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ）群が含まれる。例えば、ヒトのＭＤＲ−１遺伝子は、本来細胞内に蓄積する薬物の量を制限する薬物流出ポンプとして働くＰ−糖タンパク質をコードする。ＭＲＰ−１は識別可能ではあるが類似の効果を有する。
【０１０８】
循環液も一定の薬物に対し結合親和性を有し、それによりこれらの薬物又はその代謝物の分布、効力及び／又は毒性に影響を与える幾つかのタンパク質（及び他の因子）を含んでいる。典型的には、異なる種から得られるそのような薬物結合ポリペプチドは構造上の差異を有し、それがこれらの薬物結合能力に影響を与え得る。従って、代わりの実施態様では、外来性ポリペプチドは薬物結合ポリペプチドである。このタイプの好ましい実施態様では、該薬物結合ポリペプチドは、通常酸性の薬物若しくは薬物代謝物に結合する血清アルブミンである。この外来性ポリペプチドは、配列番号：２に記載された配列を適切に含むヒトの血清アルブミンであることが好ましい。このタイプの好ましい実施態様では、ヒトの血清アルブミンをコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号：１及び配列番号：３のいずれか一つに記載された配列を含む。このトランスジェニックマウス又はその先祖の内因性血清アルブミンは配列番号：６に記載の配列を含むマウスの血清アルブミンであることが好ましい。マウス血清アルブミンに対する内因性遺伝子は配列番号：５に記載された配列を含む転写物をコードすることが好ましい。その調節ポリヌクレオチドはその内因性遺伝子に関するコード配列の上流に本来配置されるヌクレオチド配列を含むことが好ましい。その調節ポリヌクレオチドは配列番号：７に記載された配列を含むことが好ましい。
【０１０９】
別の薬物結合ポリペプチドはα酸性糖タンパク質（ＡＡＧ，ＡＧＰ又はオロソムコイド，ＯＲＭとしても知られる）であり、これは以下ＡＧＰと呼ばれる。ＡＧＰの血漿濃度は健常個人では０．０２８から０．０９２ｇ／１００ｍＬに及び、炎症、感染又は癌への応答として増加する（ドゥチェＪＣら，1998, J Chromatogr. B Biomed Sci Appl 715: 103-109; ドゥチェＪＣら，2000, Clin Biochem 33: 197-202; ナカムラ H  ら，2000 Biochem Biophys Res Commun 276: 779-784) 。ＡＧＰのレベルはこれらの疾病状態で大きく変化できる、従ってＡＧＰに強く結合する薬物の薬物動態学に大きな影響を与えることができる。ＡＧＰの幾つかの亜群が記述されており、以下ＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３と呼ばれる、２〜３の縦列に配列した遺伝子によりコードされる。一般に、ＡＧＰは中性及び塩基性の化合物と結合するが、その例外も生ずる（リン及びルー，1997，Pharmacol. Rev. 49: 403-449)。従って、別の実施態様では、該薬物結合ポリペプチドはＡＧＰである。このタイプの好ましい実施態様では、外来性ポリペプチドは、ＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２及びＡＧＰ−３から選択されるヒトＡＧＰである。このヒトＡＧＰ−１（オロソムコイド（ＯＲＭ）−１としても知られる）は配列番号：１４に記載された配列を含むことが好ましい。一つの実施態様では、ヒトＡＧＰ−１をコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号：１３に記載された配列を含む。ヒトＡＧＰ−２（ＯＲＭ−２としても知られる）は配列番号：１６に記載された配列を含むことが好ましい。一つの実施態様では、ヒトＡＧＰ−２をコードする導入遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号：１５に記載された配列を含む。別の好ましい実施態様では、内因性ＡＧＰの発現は改変される。この内因性ＡＧＰはＡＧＰ−１、ＡＧＰ−２、ＡＧＰ−３及びＡＧＰ−４から選択されるマウスのＡＧＰであることが好ましい。マウスＡＧＰ−１は配列番号：１０に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−１をコードする内因性遺伝子は配列番号：９に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−３は配列番号：１２に記載された配列を含むことが好ましい。マウスＡＧＰ−３をコードする内因性遺伝子は配列番号：１１に記載された配列を含むことが好ましい。この例では、調節ポリヌクレオチドは該外来性ポリペプチドをコードする遺伝子に関するコード配列の上流に本来位置するヌクレオチド配列を含むことが好ましい。この調節ポリヌクレオチドはそれぞれヒトＡＧＰ−１及びＡＧＰ−２の上流に本来位置する調節ポリヌクレオチドに相当する配列番号：２１及び／又は配列番号：２２に記載された配列を含むことが好ましい。
【０１１０】
薬物結合タンパク質も特定の薬物の標的を含みうる。例えば、薬物ヘルセプチン（Herceptin)はヒト（マウスではなく）のＥｒｂＢ２の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）であり、ＥｒｂＢ２を過剰発現する腫瘍の増殖を低減する効果を有する。多くのｍＡｂは最初にマウスで形成されるから、ヘルセプチンやその前駆体である４Ｄ５などの多くのｍＡｂ類が相同的なマウスタンパク質を認識しないのは驚くべきことではない。ヘルセプチンの前臨床試験はヒト腫瘍を持ったヌードマウスの治療を含むものであった。このような研究はヘルセプチンの潜在的心臓毒性を明らかにしない。何故ならマウス組織が発現するＥｒｂＢ２はヘルセプチンにより認識されなかったからである。この薬との関係では、ＥｒｂＢ２は薬物結合タンパク質と考えられ、従ってこの発明はこのような如何なる薬物標的をもこの発明の外来性ポリペプチドだと考える。好ましい実施態様では、本発明はトランスジェニック哺乳動物でＥｒｂＢ２のような薬物標的のヒト化を意図する。
【０１１１】
トランスジェニック哺乳動物は、標準的トランスジェニック（無差別組み込み）法又は「ノックイン」（部位特異的）法により作成してもよく、そして宿主の細胞遺伝子、とりわけ導入遺伝子と相同な、類似する、又はそうでなければ導入遺伝子の少なくとも一部に相当する宿主遺伝子の破壊と関連しうる。好ましい実施態様では、非ヒト起源、例えば非ヒト霊長類などのヒトに似た動物から一つ以上の遺伝子又はその部分を誘導することが好ましいが、この導入遺伝子の核酸配列は通常ヒト起源からのものである。または、この導入遺伝子は合成ポリヌクレオチド及び／又はヒトのポリヌクレオチド及び／又は他の起源由来のポリヌクレオチド配列のハイブリッド／キメラであってもよい。
【０１１２】
目的の導入遺伝子は薬物結合及び／又は薬物代謝と関連するポリペプチドをコードするその能力について選択される。１個の胚に挿入するため一つ以上の導入遺伝子を同時に使用することは本発明の範囲内にはいる。
【０１１３】
トランスジェニック動物はネズミ目の動物から選択することが好ましい。好ましいトランスジェニック哺乳動物はマウスであるが、ラットもとりわけ有用である。しかしながら、本発明はこれらの種には限定されないことが理解されるであろう。例えば、トランスジェニック動物はヒト化されたイヌ若しくはモルモットであってもよい。
【０１１４】
本発明のトランスジェニック哺乳動物を作成するために有用な配列には、発現の調節に関与する特定のポリペプチド又はドメイン、イントロン、及び隣接する５’及び３’非コードヌクレオチド配列をコードするオープンリーディングフレームが含まれるが、これらに限定されない。目的のポリペプチドをコードする核酸配列はｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ又はそれらの断片であってもよい。
【０１１５】
目的のゲノム配列はタンパク質をコードする領域、例えばリストされた配列で規定されたような領域を含み、そして本来の染色体に正常では存在するイントロンのいずれか若しくは全てを含んでもよい。成熟ｍＲＮＡで見出される３’及び５’非翻訳領域をさらに含んでもよい。
【０１１６】
プロモーター及び他の調節因子を含む調節ポリヌクレオチドも本発明を実施する際に使用される。一部の適用では、受容する哺乳動物と同じ種に由来する調節因子を使用することが好ましい。別の適用、とりわけ、トランスジェニック哺乳動物における遺伝子発現のパターンが選択された霊長類種のそれとより類似することが要求される場合では、その種の調節因子、又はその種に似ている調節因子、又はこのような調節因子とトランスジェニック哺乳動物の調節因子の混合物を使用することが好ましいことがある。従って、ヒトに一層似た遺伝子発現のパターンが要求される好ましい実施態様では、ヒト調節因子又はヒトに似た調節因子又はヒト調節因子と宿主の調節因子の混合物を使用することが好ましいことがある。この調節因子は、約１〜約１０ｋｂの長さの、受容するゲノムに挿入されるべき宿主哺乳動物遺伝子又は対応するヒト遺伝子の領域をコードするｍＲＮＡの５’の上流の配列及びおそらくは３’の下流の配列に相当するゲノム配列を必ずではないが典型的には含むことが好ましい。遺伝子の５’非翻訳配列、３’−非翻訳配列及びタンパク質をコードする配列を含む他の調節因子は、イントロン又はエキソン中に配置されてもよい。こうして、調節ポリヌクレオチドは、転写制御配列及び／又は翻訳制御配列及び／又は他の転写後制御配列を含むことが好ましい。この調節ポリヌクレオチドには、プロモーター配列、５’非コード領域、転写調節タンパク質又は翻訳調節タンパク質に対する機能的結合部位などのシス調節領域、上流のオープンリーディングフレーム、転写開始部位、翻訳開始部位、及び／又はリーダー配列、終止コドン、翻訳停止部位及び３’非翻訳領域をコードするヌクレオチド配列が含まれるがこれらに限定されない。３’非翻訳配列は、ポリアデニル化シグナル及びｍＲＮＡのプロセシング又は遺伝子発現を行なうことができる任意の他の調節シグナルを含むＤＮＡセグメントを含む遺伝子の部分を指す。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端にポリアデニル酸部分の付加を行なうことを特徴とする。ポリアデニル化シグナルは、標準的な形である５’ＡＡＴＡＡＡ−３’への相同性の存在により通常認識され、極めて近く（一般にＡＡＴＡＡＡから２０〜６０ヌクレオチド）にＴ豊富又はＧＴ豊富な配列を含むが、変異は稀ではない。この３’非翻訳調節ＤＮＡ配列は約５０から１０００ヌクレオチド塩基対までを含むことが好ましく、ｍＲＮＡ切断シグナル又は転写終結配列、並びにポリアデニル化シグナルに加えた翻訳終結配列及びｍＲＮＡプロセシング又は遺伝子発現を行なうことができる任意の他の調節シグナルを含んでもよい。当分野で知られている構成プロモーター又は誘導プロモーターは本発明で意図される。これらのプロモーターは天然に生じるプロモーター、又は一つ以上のプロモーターの要素を結合するハイブリッドプロモーターのいずれでもよい。本発明により意図されるプロモーター配列は導入される宿主細胞にとって天然のものであってもよく、又はその領域が宿主細胞内で機能する場合は代替的起源から誘導してもよい。本発明で使用されるポリヌクレオチドは目的のポリペプチド又は適当な場合はそのドメインの全部又は一部をコードすることがある。ＤＮＡ配列の断片は従来法に従ってオリゴヌクレオチドを化学的に合成することにより、制限酵素消化により、ＰＣＲ増幅（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，９６５，１８８号、及びアウスベルら（「分子生物学の現代のプロトコール」，John Wiley & Sons Inc, 1994-1998) 又はロング・テンプレートＰＣＲシステム（ベーリンガー・マンハイム，インディアナポリス，インディアナ州、スキアダス J. ら 1999, Mammalian Genome 10: 1005-1009)及び「インバースＰＣＲ」（例えば、アキヤマ K. ら 2000, Nucleic Acids Research 28(16)e77 i-viにより記載されたもの) などの長距離ＰＣＲ技術を含むそれらの改良法により、又は例えば米国特許第５，４２２，２５２号に記載されたような鎖置換増幅法（ＳＤＡ）、例えばリューら（1996，J. Am. Chem. Soc. 118: 1587-1594及び国際出願 WO 92/01813) 及びリザルディら（国際出願 WO 97/19193) に記載されたようなローリング・サークル複製（ＲＣＲ）、例えばスークナナンら（1994, Biotechniques 17: 1077-1080)  により記載されたような核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、及び例えばタイアギら（1996, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 93: 5395-5400) に記載されたようなＱ−βレプリカーゼ増幅法などの任意の他の核酸増幅法により得てもよいが、これらに限定されない。大部分については、ＤＮＡ断片は少なくとも１０ヌクレオチド、通常は少なくとも１８ヌクレオチドである。このような小さなＤＮＡ断片はＰＣＲ又は他の核酸増幅法、ハイブリダイゼーションスクリーニングなどのためのプライマーとして有用である。より大きなＤＮＡ断片、即ち１００ヌクレオチドより大きな断片はコードされたポリペプチド又はその部分の生産に有用である。ＰＣＲなどの増幅反応に使用するためには、一対のプライマーが使用される。一例として、目的のＤＮＡセグメントの５’末端及び３’末端の領域に相当するプライマーが化学的に合成され、目的のセグメントを形成させ且つ増幅させるために、鋳型としてのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡと共にＰＣＲ反応で使用される。
【０１１７】
３．核酸構築物
本発明は、選択された霊長類種における薬の類似の挙動を予測するための非霊長類トランスジェニック哺乳動物を作成するための核酸構築物又はベクターを提供する。有利なことに、この構築物は薬の挙動及び／又は代謝と関連する外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードするヌクレオチド配列を含む導入遺伝子を含むものであり、この外来性ポリペプチドは該選択された霊長類種若しくは異なる霊長類種で本来発現されるものであるか又はそうでなければ本来発現されるポリペプチドに相当するものである。特に好ましい実施態様では、この導入遺伝子はヒト起源のポリヌクレオチド又はヒト様ポリヌクレオチド（例えば、異なる霊長類種由来の）又は他の等価物を含む。
【０１１８】
一つの実施態様では、上記核酸構築物は該導入遺伝子を挟む二つの領域であって、該非霊長類哺乳動物のゲノムの部分と十分に相同的であるため該部分と相同組換えを受ける領域を含む標的に向かうベクターである。このタイプの好ましい実施態様では、該部分は非霊長類種哺乳動物のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の両側の配列又は内因性遺伝子に含まれる配列を含み、そのポリペプチドは該外来性ポリペプチドの対応する相同体である。この導入遺伝子は外来性ポリペプチドの少なくとも一部をコードする該配列に機能しうるように連結した調節ポリヌクレオチドを含むことが好ましい。上記標的に向かうベクターは選択可能なマーカー遺伝子を含むことが好ましい。
【０１１９】
こうして、相同組換えのための標的に向かうベクターは目的の外来性遺伝子又は異種の遺伝子の少なくとも一部を含み、そして標的遺伝子座に相同な領域を含む。無差別組み込みのためのＤＮＡベクターは、組換えを媒介するための相同な領域を含む必要はない。正の選択及び負の選択のためのマーカーを含めるのが便利である。標的化された遺伝子の相同組換えによる改変を受けた細胞を形成させる方法は当分野で知られている。哺乳動物細胞をトランスフェクトする種々の方法についてはケオウンら（1990, Methods in Enzymology 185: 527-537) を参照せよ。
【０１２０】
標的非霊長類細胞又は受容体非霊長類細胞（例えば、ＥＳ細胞）の染色体に存在する内因性遺伝子の少なくとも一つの対立遺伝子の中に導入遺伝子を相同組換えさせるために、領域は十分な長さをもち該ゲノムの部分と十分な相同性をもつように選択されることが好ましい。この領域は、挿入が意図された宿主ゲノムの部位に相同なＤＮＡの約１〜１５ｋｂを含むことが好ましい（用いられる量が内因性遺伝子中への相同組換えを可能とするのに十分である限り、１５ｋｂを越えるか又はその１ｋｂ未満の内因性遺伝子配列も使用されうる）。
【０１２１】
この核酸構築物は選択可能なマーカー遺伝子を含むことが好ましい。好ましい実施態様では、該核酸構築物は、非霊長類哺乳動物のゲノムの部分との相同組換えを受けるのに十分に該部分と相同な領域により両側を挟まれた選択可能なマーカー遺伝子を含む標的に向かうベクターである。一つの実施態様では、このゲノムの部分は非霊長類哺乳動物のポリペプチドをコードする内因性遺伝子の両側の配列又は内因性遺伝子の内部の配列に相当し、そのポリペプチドは該外来性ポリペプチドの対応する相同体である。この例では、標的に向かうベクターは内因性遺伝子を破壊するように改変される。
【０１２２】
この核酸構築物は二つ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含んでもよい。この選択可能なマーカーは、該選択可能なマーカーを発現する細胞に抗生物質又は薬に対する耐性を与える酵素活性をコードするポリヌクレオチドであることが好ましい。選択可能なマーカーは「正」であってもよい。正の選択可能なマーカーは通常優性な選択可能マーカーであり、即ち、全ての動物、好ましくは哺乳動物の細胞又は細胞系統（ＥＳ細胞を含む）中で検出できる酵素活性をコードする遺伝子である。優性な選択可能マーカーの例としては、薬Ｇ４１８に対する耐性を動物細胞に与える細菌のアミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ遺伝子とも呼ばれる）、抗生物質ハイグロマイシンへの耐性を与える細菌のハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子、及びミコフェノール酸の存在下で増殖する能力を与える細菌のキサンチン−グアニン・ホスホリボシル・トランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子とも呼ばれる）が挙げられる。選択可能なマーカーは「負」であってもよい。負の選択可能マーカーは適当な選択性培地中で増殖される場合その発現が細胞に毒性となる酵素活性をコードする。例えば、単純ヘルペスウイルスｔｋ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子は負の選択可能マーカーとして普通に使用される。ガンシクロヴィル（gancyclovir)又はアシクロヴィル（acyclovir)の存在下で増殖した細胞中でのＨＳＶ−ｔｋの発現は毒性であり、従って、ガンシクロヴィル又はアシクロヴィルを含む選択培地中での細胞の増殖は機能的なＨＳＶ・ＴＫ酵素を発現できる細胞を選択的に排除する。
【０１２３】
二つ以上の選択可能マーカー遺伝子を標的に向かうベクターと共に用いてもよい。この場合、標的に向かうベクターは、導入遺伝子内に正の選択可能マーカー（例えば、ｎｅｏ遺伝子）を、そしてこの導入遺伝子を挟む外側の領域の一つ以上に負の選択可能マーカー（例えば、ＨＳＶ−ｔｋ）を含むことが好ましい。正の選択可能マーカーの存在は、該標的に向かうベクターの組み込まれたコピーを含む受容細胞の選択を、この組み込みが標的部位で起ころうと無作為部位で起ころうと、可能とする。負の選択可能マーカーの存在は標的化された部位（即ち、該標的部位中への相同組換えにより組み込まれた部位）に標的に向かうベクターを含む受容細胞の同定を可能とする。負の選択可能マーカーの発現を選択的に排除する培地で増殖した場合に生き残る細胞は負の選択可能マーカーのコピーを含まない。
【０１２４】
本発明の標的に向かうベクターは「置換型」であることが好ましい。置換型ベクターの組み込みは標的遺伝子中への選択可能マーカーの挿入を結果として生ずる。本明細書で証明するように、標的に向かう置換型ベクターは無効な対立遺伝子（即ち、機能的なタンパク質を発現することができない対立遺伝子、無効な対立遺伝子はコード領域の一部の欠失、遺伝子全体の欠失、挿入の導入、及び／又はフレームシフト突然変異などにより形成されうる）の形成を結果として生ずる遺伝子の破壊のために用いられ、又は遺伝子に変更を加えるため又は遺伝子の一部又は全部を置換するために用いられうる。この方法は動物の内因性遺伝子又は野性型遺伝子を破壊したい場合に使用してもよい。
【０１２５】
または、標的に向かうベクターはリコンビナーゼ系を含んでもよい。この系は導入遺伝子の遺伝子組換えを触媒するリコンビナーゼの発現を可能とする。この導入遺伝子はリコンビナーゼの認識配列により両側を挟まれており、一般にリコンビナーゼ活性を発現する細胞中で切断されるか又は逆転される。例示的な実施態様では、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ−ｌｏｘＰリコンビナーゼ系（ラスコら，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6232-6236、オーバンら, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6861-6865）又はサッカロミセス・セレビシエのＦＬＰリコンビナーゼ系（オ' ゴルマンら，1991，Science 251: 1351-1355、国際公開 WO 92/15694）のいずれかがイン・ビボ部位特異的遺伝子組換え系を形成するために用いることができる。ＣｒｅリコンビナーゼはｌｏｘＰ配列の間に配置された介在する標的配列又は導入遺伝子の部位特異的組換えを触媒する。ｌｏｘＰ配列はＣｒｅリコンビナーゼが結合する３４塩基対のヌクレオチド反復配列であり、Ｃｒｅリコンビナーゼにより媒介される遺伝子組換えに必要である。ｌｏｘＰ配列の向きはＣｒｅリコンビナーゼが存在する場合に介在する導入遺伝子が切断されるか逆転されるかを決定する（アブレムスキーら，1984, J. Biol. Chem. 259: 1509-1514)。ｌｏｘＰ配列が直接反復として方向付けされている場合は導入遺伝子の切断を触媒し、ｌｏｘＰ配列が逆の反復として方向付けされている場合は導入遺伝子の逆転を触媒する。
【０１２６】
本明細書の非霊長類トランスジェニック哺乳動物を作成する際に使用されるベクターは、受容体の非霊長類哺乳動物細胞中へのその挿入の前又は後に該ベクターの最適機能化に有用な他の因子を含んでもよい。これらの因子は当業者に良く知られており、例えば、サムブルックら，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，1989に記載されている。該ベクターの導入遺伝子成分は、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）などのプラスミドベクター内で組み込まれ、標的細胞の形質転換の前に、このプラスミドＤＮＡから単離されることが好ましい。
【０１２７】
哺乳動物胚を形質転換するために使用されるベクターは当分野で良く知られた方法を用いて構築される。これらの方法には、例えば、サムブルック，フリッチュ及びマニアティス編，Molecular: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]) に記載されたような制限エンドヌクレアーゼ消化、連結、プラスミド、ＤＮＡ及びＲＮＡ精製、ＤＮＡの配列決定などの標準的手法が含まれるがこれらに限定されない。
【０１２８】
４．本発明のトランスジェニック哺乳動物を作成する方法
本発明のトランスジェニック哺乳動物は胚幹（ＥＳ）細胞中に標的に向かうベクターを導入することにより形成することが好ましい。ＥＳ細胞は適当な条件（エバンスら，1981，Nature 292: 154-156 、ブラドレーら, 1984, Nature 309: 255-258 、ゴスラーら, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9065-9069、及びロバートソンら, 1986，Nature 322: 445-448 ）の下でイン・ビトロで移植前の胚を培養することにより得ることができる。  導入遺伝子は、電気穿孔法、リン酸カルシウム共沈殿法、プロトプラスト融合又はスフェロプラスト融合、リポフェクション、及びＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションを含む当分野で知られた様々な方法を用いたＤＮＡトランスフェクションによりＥＳ細胞中に効率的に導入することができる。導入遺伝子はレトロウイルスにより媒介される形質導入又はミクロインジェクションによりＥＳ細胞中に導入してもよい。このようなトランスフェクトされたＥＳ細胞はその後胚盤胞期の胚の胞胚腔中にそれらが導入された後胚をコロニー形成して、生ずるキメラ動物の生殖細胞系に寄与する。総説としては、ジェニッシュ（1988, Science 240: 1468-1474）を参照せよ。トランスフェクトされたＥＳ細胞を胞胚腔中に導入する前に、トランスフェクトされたＥＳ細胞を種々の選択計画に付して、導入遺伝子がこのような選択手段を持つことを前提に該導入遺伝子を組み込んだＥＳ細胞を濃縮してもよい。または、該導入遺伝子を組み込んだＥＳ細胞をスクリーニングするためにポリメラーゼ連鎖反応を使用してもよい。この手法により、胞胚腔中に移送する前に適当な選択条件の下でトランスフェクトされたＥＳ細胞を増殖させる必要性がなくなる。
【０１２９】
トランスジェニック哺乳動物を形成する代替的方法は当業者に知られている。例えば、トランスジェニック哺乳動物を作成するため、導入遺伝子を導入するのに種々の発生段階の胚細胞を用いることができる。胚細胞の発生の段階に応じて異なる方法が使用される。接合体、とりわけ前核段階の接合体（即ち、雄性前核及び雌性前核の融合の前）は、ミクロインジェクションの好ましい標的である。マウスでは、雄性前核は直径約２０マイクロメータの大きさに達する。これは１〜２ピコリットル（ｐｌ）のＤＮＡ溶液の再現可能な注射を可能とする。遺伝子移送の標的として接合体を使用することは、多くの場合注入されたＤＮＡが最初の切断の前に宿主ゲノムの中に組み込まれる点で大きな利点を有する（ブリンスターら，1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442) 。その結果、非霊長類トランスジェニック哺乳動物の細胞は全て組み込まれた導入遺伝子を保持することになる。これは一般に創始細胞の子孫への導入遺伝子の効率的移送にも反映される、というのは生殖細胞の５０％が導入遺伝子を保持するからである。接合体のミクロ−インジェクションは導入遺伝子の無差別組み込みにとって好ましい方法である。米国特許第４，８７３１９１号は接合体のミクロ−インジェクションの方法を記載する。
【０１３０】
レトロウイルス感染も非霊長類哺乳動物に導入遺伝子を導入するために使用できる。発生中の非霊長類胚は、胚盤胞期までイン・ビトロで培養できる。この期間に、分割球はレトロウイルス感染の標的となることができる（ヤネニッヒら，1976, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73: 1260-1264) 。分割球の効率的な感染は酵素処理して透明帯を除去することにより得られる（ホーガンら，1986，マウス胚の操作, Cold Spring Harbor Laboratory Press ，プレインビュー, N.Y.) 。導入遺伝子を導入するために使用されるウイルスベクター系は通常導入遺伝子を保持する複製に欠陥のあるレトロウイルスである（ヤーネル，D.ら, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6927-6931、バンデアプッテンら, 1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 6148-6152) 。レトロウイルス感染はウイルス生産細胞の単層の上で分割球を培養することにより容易且つ効率的に得られる（バンデアプッテン，上掲、スチュワートら，1987，EMBO J. 6: 383-388) 。または、感染は後期で行なうことができる。ウイルス又はウイルス生産細胞を胞胚腔中に注入できる（ヤーネル，D.ら, 1982, Nature 298: 623-628)。創始細胞の大部分はその導入遺伝子についてモザイクとなる。何故なら組み込みはトランスジェニック哺乳動物を形成する細胞の部分集合でのみ起こるからである。さらに、創始細胞は子孫で一般にセグリゲートすることになるゲノム中の異なる位置において該導入遺伝子の種々のレトロウイルスの挿入を含むことがある。さらに、妊娠中期（midgestation) の胚の子宮内レトロウイルス感染により生殖系中に導入遺伝子を導入することも可能であるが、効率は低い（ヤーネル，D.ら, 1982, 上掲）。当分野で知られた、レトロウイルス又はレトロウイルスベクターを用いてトランスジェニック哺乳動物を作成するさらなる手段には、受精卵又は初期胚の卵黄周囲腔中にレトロウイルス粒子又はレトロウイルスを生産するマイトマイシンＣ処理細胞をミクロ−インジェクションする方法が含まれる（国際公開 WO90/08832 及びハスケルとバウエン, 1995, Mol. Reprod. Dev. 40: 386)。
【０１３１】
本発明を実施するため任意の哺乳動物種の系統を選択する際、これらは胚の収率、胚中での前核の見易さ、生殖適合性、トランスジェニック子孫の色選択性又はＥＳ細胞クローンの利用可能性などの基準により選択しうる。例えば、もしトランスジェニックマウスを作成したい場合、Ｃ５７／Ｂ１６又は１２９が使用しうる。
【０１３２】
胚を得るためそして代理宿主として働くために用いられる哺乳動物の年齢は使用する種の関数である。例えば、マウスを使用する場合、思春期前の雌が好ましい、何故ならこれらはより多くの胚を作りそしてホルモン注射により良く反応するからである。
【０１３３】
ホルモン又は他の化合物の投与は卵生産、交配及び／又は胚の移植に適する雌を準備するために必要であることがある。通常、欲情した雌（即ち、受精しうる卵を生産している雌）を種畜の雄と交配させ、その結果受精した胚を導入遺伝子（単数又は複数）を導入するため取り出す。または、卵と精子を適当な雌及び雄から取得し、イン・ビトロ受精のために使用して導入遺伝子の導入に適する胚を作成してもよい。
【０１３４】
通常、受精した胚は、前核が現れるまで適当な培地中でインキュベートする。ほぼこの時期に、目的の導入遺伝子を含む外因性の核酸配列が雄性前核又は雌性前核の中に導入される。マウスのような一部の種では、雄性前核が好ましい。
【０１３５】
核酸の導入は、例えばミクロインジェクションなどの当分野で知られた任意の手段により達成しうる。胚への核酸の導入の後、その胚は代理宿主に再移植する前に種々の長さの時間イン・ビトロでインキュベートしてもよい。一つの普通の方法はイン・ビトロで１〜７日間上記の胚をインキュベートし、次いでそれを代理宿主中に再移植することである。
【０１３６】
再移植は標準的方法を用いて実施される。通常、代理宿主には麻酔をかけ、上記の胚を輸卵管中に挿入する。特定の宿主中に移植される胚の数は異なることになり、通常該種が天然で生産する子孫の数に匹敵するか又はそれより高くなる。代理宿主のトランスジェニック子孫は任意の適当な方法で導入遺伝子の存在についてスクリーニングしうる。スクリーニングは、該導入遺伝子の少なくとも一部（及び／又は導入遺伝子の両側の領域）に相補的なプローブを用いたサザン分析又はノーザン分析により、又は導入遺伝子の部分（及び／又は導入遺伝子の両側の領域）に相補的なプライマーを用いるＰＣＲにより実施してもよい。該導入遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体を用いるウェスタンブロット分析をスクリーニングのための代替的又は付加的な方法として用いてもよい。
【０１３７】
導入遺伝子の存在を評価する代替的又は付加的な方法には、酵素検定法及び／又は免疫学的検定法、特定のマーカー又は酵素活性のための組織学的染色などの適当な生化学的検定法が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３８】
トランスジェニック哺乳動物の子孫は、トランスジェニック哺乳動物を適当な相手と交配させることにより、又はトランスジェニック哺乳動物から得た卵子及び／又は精子を用いてイン・ビトロ受精を行なうことにより得てもよい。イン・ビトロ受精を用いる場合、受精した胚は代理宿主中に再移植するか、又はイン・ビトロでインキュベートするか又はその両方を行なう。トランスジェニック子孫を作成するために交配が用いられる場合、このトランスジェニック哺乳動物は親の系統へ戻し交雑することがあり、そうでなければ純粋種となり又は他の所望の遺伝的特性を有する哺乳動物との交雑種となることがある。これらの子孫は上述の方法又は他の適当な方法を用いて該導入遺伝子の存在について評価されうる。
【０１３９】
前記の議論はトランスジェニック哺乳動物を作成するための幾つかの方法を参照してなされたが、本発明はこれらの方法のいずれか一つに基礎を置くものでもそれに限定されるものでもない。そうではなくて、上に広く述べたようにその生殖細胞又は体細胞が導入遺伝子を含む遺伝的に改変された哺乳動物を作成するための適当な手段をすべて意図することが理解されるべきである。
【０１４０】
５．遺伝的に改変された哺乳動物の使用
本発明のトランスジェニック哺乳動物は、それが誘導された標準的哺乳動物の代わりに、又はそれに加えて用いられる。例となる手法のリストを以下に示すが、それは本発明のトランスジェニック哺乳動物の様々な利用を記述する。これらの手法には、薬物動態学的検定法、薬力学的検定法（効力の測定を含む）、毒性学的検定法、並びに吸収、分布、分泌及び代謝の研究が含まれる。標準的哺乳動物の代わりに使用される場合、トランスジェニック哺乳動物は選択された霊長類種、とりわけヒトにおける薬の挙動をより正確に予想するデータを提供する。標準的哺乳動物に加えて用いられる場合、トランスジェニック哺乳動物と標準的哺乳動物の間の薬の挙動に関する差異は研究している特定の薬の代謝における導入遺伝子の潜在的役割を示す。
【０１４１】
本発明で記載されたトランスジェニック哺乳動物は、正常な哺乳動物又は他の遺伝的な改変を有する哺乳動物の利用に類似した方法で幾つかの標準的適用に使用できる。以下の一般的な記述は本発明のトランスジェニック哺乳動物の可能な利用を例示することを意図するものであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。この記述は当業者に知られた一般的検定法の幾つかの可能な修飾を網羅することが意図される。
【０１４２】
例えば、トランスジェニック哺乳動物には、種々の可能な経路（静脈内 (iv) 、皮下(sc)、腹腔内(ip)、経口（po) 、筋肉内(im)、鞘内(intrathecially)又は他の非経口経路、又は皮膚、粘膜に適用することにより、又は食餌若しくは飲料水に該物質を入れることにより）により、ある化合物（おそらく放射性同位元素又は蛍光基などの標識を保持する化合物）の種々の用量を投与しうる。通常１群当たりのマウスの数は１〜２０の範囲であるが、実験者が実際の数を決定する。化合物は１回又は多数回投与でき、化合物の混合物は同時又は逐次のいずれかで投与してもよい。記述した分析法は制限することを意図するものではなく、単なる例示である。
【０１４３】
５．１  薬物動態学的検定法
このような検定法はある時間経過にわたって哺乳動物の体内での化合物の消失及び代謝を決定する。例えば、本発明のトランスジェニック哺乳動物に化合物を投与し、次いで血液、又は他の体液又は組織又は排泄物（尿又は糞）を投与後の異なる時点で集める。化合物（単数又は複数）又はその代謝物の濃度は適当な分析法（例えば、ＨＰＬＣを用いる被験体の分光学的測定）により決定する。次いで、動力学的データは通常グラフやコンピュータ手法により分析される。
【０１４４】
５．２  薬力学的検定法
この検定法は通常ある時間経過にわたって哺乳動物の体内における化合物の活性を測定する。投与後、標的に対する化合物（単数又は複数）の活性は「全身」検定（例えば、血圧、呼吸速度、心電図、筋電図、電磁パルスを測定することによる神経活性）を用いるか、又はイメージング技法（例えば、ボジトロン放射分光法、核磁気共鳴イメージング、超音波検査、など）により行なうことができる。該化合物の活性は生化学的手段によっても測定できる。これは該化合物と標的との相互作用の直接測定か又は薬力学的活性の指標となる上流又は下流のマーカーの測定のいずれかを含む。例えば、本発明のトランスジェニック哺乳動物に化合物を投与し、次いで血液、又は他の体液若しくは組織、又は排泄物（尿又は糞）を投与後の異なる時点で集める。生体試料中の標的の活性又はマーカーの活性の直接測定は種々の手段（例えば、標的又はマーカーの活性を測定するための酵素検定、標的の豊富さ及び／又は活性のいずれかを測定するためのウェスタンブロット法又はＥＬＩＳＡ法、標的又はマーカーのｍＲＮＡレベルを測定するためのノーザンブロット分析など）により行なうことができる。標的又はマーカーの間接的測定には、種々の分析法（例えば、ＨＰＬＣを用いる被験体の分光学的測定）による基質又は生産物のレベルの測定を含めることができる。薬力学的活性の試験は哺乳動物へのチャレンジ（例えば、化学的手段又は機械的手段による人為的血圧の上昇、生理学的変化を促進するため食餌の変化、疾病状態を作成するため外科的介入、感染因子の注入など）をも含めることができる。次いで薬力学的データをグラフ的手段及びコンピュータ手法により通常分析し、しばしば組織中の化合物のレベルに相関させる。薬力学的研究には、疾病の治療における薬の効力の測定が含まれる。例えば、腫瘍増殖を阻害するために又は感染因子を消失させるために必要な用量。
【０１４５】
５．３  吸収、分布、代謝及び排泄（ＡＤＭＥ）の研究
このような研究では、通常哺乳動物に放射活性化合物（単数又は複数）を投与する。この化合物の体内への吸収の程度の測定には、薬物動態学的検定法について記述した取り組みを用いることができる。化合物の分布の研究は該化合物の体組織中への分布を決定し、通常全身の組織学的グレードの切片のオートラジオグラフィを使用する。排泄の研究は、薬物動態学的検定法で記述したように、糞又は尿（ただし、胆汁などの抽出された体液を含めることができる）の中の化合物又は代謝物のレベルを測定することにより身体からの化合物の消失の経路を解明する。代謝の研究は哺乳動物によって生産される親化合物の代謝物の性質及び量を決定する。それは身体から排泄された代謝物又は体内に残存する代謝物を含む。代謝物の量及び同定には種々の分析法（例えば、質量分析法）を用いることができる。
【０１４６】
５．４  毒性学的検定法
このような検定法はある時間経過にわたって哺乳動物の体内の化合物の毒性活性を決定する。これらの検定は通常毒性効果が観察され得ない用量を決定するためマウスの群に同時か逐次のいずれかで段階的に増加する用量を使用する。これらの検定は化合物（単数又は複数）の一回投与又は多数回投与を用いることができ、長期間（通常２週間から２年）続けることができる。投与の後、化合物（単数又は複数）の毒性活性を、病的状態の程度（例えば、該哺乳動物の臨床的外観）の肉眼観察によるモニターにより、又は現れる死亡率、体重減少又は一般的活動力（例えば、運動、探索的活動、睡眠時間など）の測定、食物や水の消費量、尿及び／又は糞の外観により決定することができる。化合物（単数又は複数）の毒性活性の測定は「全身」検定を使用することもでき或いはイメージング法（薬力学的検定法について上述した）によることもできる。化合物の毒性活性は生化学的手段（例えば、一般的毒物反応と関連する遺伝子誘導又は遺伝子の生産物の測定、毒物の障害への反応と関連する生体代謝の測定）によっても測定することができる。哺乳動物の死又は犠牲の際に分離された体組織の組織学的検討も、循環細胞の数及び特性における血液学的変化と同様に、毒性効果をモニターするために使用することができる。発癌性の研究は化合物処置の間の腫瘍の形成又は癌に移行し易い遺伝的損傷の形成をモニターする。奇形発生の研究は胎児の発生に対する化合物投与の効果を決定する。
【０１４７】
本発明が容易に理解されそして実施されるように、特に好ましい実施態様が非限定的な実施例を用いて以下に記述される。
【実施例１】
【０１４８】
ヒト血清アルブミンが内因性のマウス血清アルブミンに置き代わっているノック−インマウスの取得。
【０１４９】
工程１．ヒトをコードする配列の取得
ヒトアルブミンｃＤＮＡ配列（ＸＭ−０３１３２０）は、ジェンバンク寄託番号ＸＭ−０３１３２０[ 配列番号：３ ]に記載された配列から及びそれに基づいて設計されたプライマーを用いたヒト胎児肝臓のｃＤＮＡライブラリーのＰＣＲによって得られる。例えば、以下に述べる二つの別々のＰＣＲ反応はＢｓｕ３６Ｉ部位を横切って重なる遺伝子の５’及び３’部分を形成する。Ｂｓｕ３６Ｉで消化した後、この二つの半分を酵素連結によってｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）のような適当なベクター中に結合し、ｎｅｏ遺伝子の平滑末端をＳｍａＩ部位に連結し、ＢａｍＨＩ部位を該遺伝子の３’末端でポリリンカーに連結する。該ＰＣＲ反応の実施には以下のプライマーを使用することができる。
【０１５０】
ヒトＡＬＢｃＤＮＡの５’部分：
前向きプライマー（開始コドンから、重なっているＢｓｔＥII部位＝配列番号：３のヌクレオチド３９−６３）、ＨＡＬＢ１Ｆ＝（5') ＡＴＧＡＡＧＴＧＧＧＴＡＡＣＣＴＴＴＡＴＴＴＣＣ (3') [ 配列番号：２６] 。
【０１５１】
逆向きプライマー（コード領域の末端から、停止コドン及びＢｓｕ３６Ｉ部位と重なる部分を含む、＝配列番号：３のヌクレオチド１８４３−１８６９の逆向き相補鎖）、ＨＡＬＢ３Ｒ＝（5') ＴＴＡＴＡＡＧＣＣＴＡＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＣＴＴＧＣ (3') [ 配列番号：２７] 。この断片をＢｓｔＥII（５’マウス隣接配列の３’末端への結合）及びＢｓｕ３６Ｉ（ヒトＡＬＢ遺伝子の３’部分への結合）で切断する。
【０１５２】
ヒトＡＬＢ遺伝子の３’部分：
前向きプライマー（停止コドンと重なる、Ｂｓｕ３６Ｉ部位及びＨＡＬＢ３Ｒ＝配列番号：３のヌクレオチド１８５５−１８８５）、ＨＡＬＢ５Ｆ＝（5') ＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡＴＡＡＣＡＴＣＡＣＡＴＴＴＡＡＡＡＧＣ (3') [ 配列番号：２８] 。
【０１５３】
逆向きプライマー（第二のポリアデニル化シグナルの３’＝配列番号：３のヌクレオチド２１９７−２２１６の逆向き相補鎖）、ＨＡＬＢ４Ｒ＝（5') ＡＡＣＴＴＡＧＡＡＧＡＧＴＡＴＴＡＡＴＧ (3') ）[ 配列番号：２９ ]。この断片は適当な向き（該ベクターの３’末端に最も近いＳｐｅＩ部位）でｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター中に連結し、クローニングし、ＳｐｅＩ及びＢｓｕ３６Ｉで切り出す。ＳｐｅＩ部位はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づく標的に向かうベクターのＳｐｅＩ部位中にクローニングすること、そして５’ＢｓｔＥII部位は上述のヒトｃＤＮＡの５’部分の３’末端に連結することを可能とする。
【０１５４】
ｍＲＮＡをコードする領域（及び効率的なポリアデニル化を促進しうる）を越えて伸びる追加の３’配列は、追加の下流の（ゲノム）配列を含むＨＡＬＢ４Ｒの伸長版を使用することにより得ることができる。例えば、（5') ＴＣＡＴＡＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＴＴＧＡＡＴＧＴＴＴＡＴＡＡＴＣＣＡＴＡＡＣＴＴＡＧＡＡＧＡＧＴＡＴＴＡＡＴＧ (3') 、即ち配列番号：１のヌクレオチド１８８８９−１８８３０の逆向き相補鎖である。
【０１５５】
代わりのアプローチはヒト肝臓ｃＤＮＡライブラリーを配列番号：３内のコード配列に基づいたプローブを用いてスクリーニングすることである。次に、全長アルブミンをコードする配列を標準的分子生物学的手法（例えば、制限酵素消化及び／又はＰＣＲ）を用いて正のクローンから誘導することができる。全長ｃＤＮＡは配列番号：３に記載されたようなヒトＡＬＢｍＲＮＡに相当する。
【０１５６】
工程２．両側に接するマウスゲノム配列の取得
選択枝  Ａ
５’側のマウス隣接配列は、配列番号：７に示され、導入遺伝子の発現を駆動するマウスアルブミンプロモーターを含む。この配列は下記のプロモーターを用いるマウスゲノムＤＮＡのＰＣＲにより得られる。即ち、前向きプライマーとして、配列番号：７（Ｊ０４７３８）のヌクレオチド１−３２、即ち（5') ＡＡＧＣＴＴＧＡＡＡＡＣＡＧＧＡＣＴＧＣＣＴＴＡＧＡＡＧＴＡＡＣ (3') [ 配列番号：３０ ]を用い、逆向きプライマーとして配列番号：７（Ｊ０４７３８）からのヌクレオチド２０３５−２０６５の逆向き相補鎖、即ち（5') ＧＴＧＧＧＧＴＴＧＡＴＡＧＧＡＡＡＧＧＴＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＣ (3') [ 配列番号：３１ ]（マウスアルブミン遺伝子の５’−ＵＴＲ内の）を用いる。
【０１５７】
３’側のマウス隣接配列も、マウスゲノムＤＮＡのＰＣＲにより作成される。前向きプライマーは配列番号：５（ＡＪ０１１４１３）のヌクレオチド１９７３−２００２から誘導される、即ち（5') ＴＴＴＡＡＡＣＡＴＴＴＧＡＣＴＴＣＴＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＣ (3') [ 配列番号：３２ ]（マウスアルブミンｍＲＮＡの３’−ＵＴＲに相当する）である。逆向きプライマーは配列番号：８（Ｊ０５２４６）のヌクレオチド１−２９の逆向き相補鎖である、即ち（5') ＧＴＧＴＣＴＡＧＡＧＧＴＣＣＡＧＡＣＡＴＧＴＴＴＧＣＴＡＡ (3') [ 配列番号：３３ ]（マウスαフェトプロテイン[ ＡＦＰ ]５’プロモーター領域）である。これはマウスＡＬＢ遺伝子の下流約１２．６ｋｂにある領域に相当する。こうして、記述されたＰＣＲ反応はマウスＡＬＢ遺伝子の３’側に直ちに続く領域に相当する約１２．６ｋｂの増幅体を形成する。この増幅体は標的に向かうベクターの構築に直接使用することができる。または、この増幅体はより小さな３’側隣接配列（例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）のようなベクター中にサブクローニングし、制限酵素消化を行なうことにより）を誘導するために使用できる。より小さな隣接領域は、大きなゲノムコード配列を利用する場合、しばしば好ましい。
【０１５８】
選択枝  Ｂ
マウスアルブミン遺伝子（配列ＩＤ c077802366)の最初の１１エキソンを覆う１５２９５ｂｐのコンティグ（contig) は図１に図式的に例示してあり、その配列は配列番号：３４に記載されている。このコンティグには、プロモーター配列の大部分を含むこの遺伝子の上流約２ｋｂも含まれる。マウスのプロモーター領域とこのコンティグの位置３５３−２３８２からのマウスアルブミン遺伝子の５’ＵＴＲを覆う５’腕は、下記のプライマー及び鋳型としてマウスゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲにより形成される。この断片は適当な向き（ベクターの５’末端に最も近いＳａｃII部位）でｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ中に連結され、クローニングされ、ＮｏｔＩ及びＢｓｔＥIIで切り出される。そのＮｏｔＩ部位はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに基づく標的に向かうベクターのＮｏｔＩ部位にクローニングすることを可能とし、３’ＢｓｔＥII部位は上述のヒトアルブミンｃＤＮＡの５’末端に連結することを可能とする。この５’横腹はｃＤＮＡの両半分と共に、ＮｏｔＩ及びＳｐｅＩで切断された標的に向かうベクター中に連結される。得られる構築物はマウスプロモーター及びヒトコード領域に連結した５’ＵＴＲ及びヒト３’ＵＴＲを含む。最初の３−６コドンはマウス起源のものであるが、これらのコドンはヒト及びマウスのアルブミンｍＲＮＡと１００％同一である。
【０１５９】
上のＰＣＲ増幅のために有用なプロモーターの例には以下のものが含まれる。即ち
Malb353F (5') ＣＡＴＡＴＡＧＧＡＣＧＡＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧ (3') ( 開始コドンの上流約２ｋｂ＝配列番号：３４のヌクレオチド３５３−３７５）[ 配列番号：３５] 、及び Malb2382R (5') ＧＧＴＴＡＣＣＣＡＣＴＴＣＡＴＴＴＴＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＡＧＴＧＧＧＧＴＴＧＡＴＡＧＧ (3') [ 配列番号：３６] （これはＢｓｔＥII部位、開始コドン及び５’ＵＴＲの一部と重なる、即ち配列番号：３のヒト配列ヌクレオチド７８−９３の逆向き相補鎖を含むオリゴの５’末端を持つ配列番号：３４のヌクレオチド２３５４−２３９７の逆向き相補鎖）。
【０１６０】
３’腕（該コンティグ中の位置６３１０から位置１３３８２まで）はプライマーとして下記のオリゴを用いてマウスのゲノムＤＮＡのＰＣＲにより形成される。即ち
Malb6310F  (5') ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＡＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣ (3') [ 配列番号：３７] 、及び Malb13382R  (5') ＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＡＴＴＣＡＣＣＣＡＡＣＣ (3') [ 配列番号：３８] 。
【０１６１】
その結果得られる７ｋｂ断片は、エキソン５の中央から下流にイントロン１０の末端近くまで伸びるが、これをＸｈｏＩ（部位は前向きプライマー中に存在する）及びＳａｌＩ（部位は逆向きプライマー中に存在する）で切断して標的に向かうベクターのＳａｌＩ部位中に連結する。
【０１６２】
相同組換えの後、この標的に向かうベクターはマウスＡＬＢエキソン１〜４をヒトＡＬＢｃＤＮＡで置き換えることができる。これはマウスＡＬＢ遺伝子の残りの欠失していない部分の発現を阻止するポリアデニル化シグナルを含む（図２）。
【０１６３】
代わりの戦略は、マウスアルブミン遺伝子の全体の下流の断片を増幅しこうして全遺伝子座を欠失させる工程を含む。２７７８１ｂｐのマウスコンティグ（配列番号：３９に記載されたようなサンガー・アセンブリＮｏ．F105491 ）を用いて、約７ｋｂの３’腕を増幅するようにプライマーを設計できる。例えば、次のようである。逆向きプライマー、albt9649R  (5') ＡＧＣＴＣＴＣＧＡＧＡＡＴＣＣＣＴＧＣＣＴＴＴＣＣＴＣＣ (3') [ 配列番号：４０] 、そして前向きプライマー albt2842F (5') ＡＧＴＡＧＴＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＧＡＴＧＣＣＴＧＴＧＡＴＣＣ (3') [ 配列番号：４１] 。
【０１６４】
この逆向きプライマーは配列番号：３９由来のヌクレオチド９６６７−９６４９の逆向き相補鎖である。前向きプライマーは配列番号：３９由来のヌクレオチド２８４２−２８６２である。その結果得られる７ｋｂ断片をＸｈｏＩ（部位は前向きプライマー中に存在する）及びＳａｌＩ（部位は逆向きプライマー中に存在する）で切断し、標的に向かうベクターのＳａｌＩ部位中に連結する。
【０１６５】
工程３．導入遺伝子ベクターの組立て
工程１及び工程２で得られた成分をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）のようなプラスミド内で次の順序で組み立てる。即ち（５’マウス隣接）→（ヒトＡＬＢ）→（ｎｅｏ）→（３’マウス隣接）。ＴＫプロモーターにより駆動されるネオマイシン耐性遺伝子を平滑末端化してＢａｍＨＩ部位の近くの遺伝子の３’末端を持つｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＳｍａＩ部位中に連結する。ヒトアルブミンｃＤＮＡを使用する場合、得られるプラスミドを次にＮｏｔＩ／ＳｐｅＩで切断し、マウスプロモーター（５’−ＮｏｔＩ−ＢｓｔＥII−３’）、ヒト遺伝子の５’部分（ＢｓｔＥII・・・Ｂｓｕ３６Ｉ）、及びヒト遺伝子の３’部分（５’Ｂｓｕ３６Ｉ・・・ＳｐｅＩ）を含む５’腕と連結する。次いで、正確な配列を含むクローンをＳａｌＩで切断し、３’腕をその中に連結する。
【０１６６】
３’隣接配列の３’末端にＨＳＶ−ｔｋのような負の選択マーカーを挿入する選択枝があるが、これは相同組換え体（ＨＳＶ−ｔｋを欠失する）を無差別組み込み体（ＨＳＶ−ｔｋを維持しており従ってガンシクロヴィルに感受性である）と識別するのに助けとなる。
【０１６７】
工程４．ＥＳ細胞中への導入遺伝子の挿入
３’腕断片を正しい向きで挿入すると、ユニークなＳａｌＩ部位がこの構築物の３’末端で保存され、ＥＳ細胞に電気穿孔する前に標的に向かう構築物を線状化するために使用できる。次いで、それをマウス胚性幹（ＥＳ）細胞中にトランスフェクトする。これを後に外来性ＤＮＡをその核物質中に組み込んだ細胞を単離するためＧ４１８を含む増殖培地中で選択する（計画の詳細については実施例６及び実施例７を参照）。ＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を使用する場合も、相同組換えによるのではなく無差別に導入遺伝子を組み込んだ細胞を除去するためガンシクロヴィル中で細胞をさらに選択する。次に個々のクローンを増殖させ、クローンそれぞれを複数のプレート中に分ける。相同組換え体はサザーンブロット又はＰＣＲで確認する。これは該構築物が両端に正確に標的化されることを確実にするため該構築物の両端の外側のサザーンブロットプローブ又は外側のＰＣＲプライマーを用いてスクリーニングすることによりなされる。
【０１６８】
代わりの戦略では、ｎｅｏカセットをｌｏｘＰ部位で挟む。これはＣｒｅ−発現プラスミドを持つＥＳ細胞の一時的トランスフェクションによって除去でき、又はＣｒｅを発現するトランスジェニックマウスと異種交配させることによりマウスの後の世代から除去できる。別の代替的戦略では、ｎｅｏカセットをＦＲＴ部位で挟む。これはＦＬＰ発現プラスミドを持つＥＳ細胞の一時的トランスフェクションにより除去でき、又はＦＬＰを発現するトランスジェニックマウスと異種交配させることによりマウスの後の世代から除去できる。
【０１６９】
工程５．胚盤胞の注入
一つ以上の正確なクローン由来のＥＳ細胞をマウスの胚盤胞中に注射し、これを次いで擬妊娠マウス中に移植する。移植は解剖顕微鏡を用い麻酔を掛けたマウスに対して行う。擬妊娠雌マウスを 0.017 - 0.020ｍＬ /g 体重のアバーティンの腹腔内注射で麻酔をかける。このマウスを解剖顕微鏡の下に置き、切開部分を７０％エタノールで殺菌する。卵巣を体外に出し、卵巣の周りの滑液包嚢及び輸卵管を注意深く手前に引いて開ける。輸卵管の開口部を露出させるため卵巣と輸卵管を分離する。マウスの胚盤胞を再移植用ピペットの上に載せ、ピペットの先をロート中に数ミリメータ挿入し、輸卵管の中に注ぐ。次いで、この卵巣を腹膜中に戻し、体壁及び皮膚を縫合する。
【０１７０】
工程６．トランスジェニックマウスの選択
ＥＳ細胞と胚盤胞は、キメラ創始（Ｆ0 ) マウスが被毛色で識別できるように、異なるマウス血統から得ることが好ましい。成熟した場合、Ｆ0 マウスを野性型マウスと交配させて標的対立遺伝子の生殖系伝達を取得し、そして所望の遺伝的改変を含むＦ1 マウスが色によって同定され、サザーンブロット及び／又はＰＣＲ及び／又はＤＮＡ配列決定によって確認される。ヘテロ接合体のＦ1 マウスはこれらのマウスの肝臓からＲＮＡを抽出することによりヒトアルブミン遺伝子の発現についてこの段階で検定でき、そしてヒト遺伝子特異的プローブを用いてＲＴ−ＰＣＲ又はノーザンブロット分析により発現を検定することができる。
【０１７１】
トランスジェニックマウスの後の世代はホモ接合性を維持するように育種してヒト血清アルブミンを発現し且つマウス血清アルブミンを発現しないマウスを提供することが好ましい。
【０１７２】
代替的戦略は、マウス５’ＵＴＲを欠くマウスプロモーターをヒト５’ＵＴＲ及びヒト３’ＵＴＲを含むヒトアルブミンｃＤＮＡ全体と融合させる工程を含むであろう。別の代替的戦略はヒトのコード配列をマウスアルブミン遺伝子の５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲと融合させる工程を含むであろう。
【０１７３】
代わりの戦略では、標的に向かうベクターはヒトアルブミンｃＤＮＡ配列なしで構築される。この構築物はマウスアルブミン遺伝子を標的に向かわせ、その遺伝子の発現をできなくする（knock out)ために使用される。マウスアルブミンをもはや発現しない標的化された細胞が一旦同定されれば、アルブミン遺伝子座ＲＰ１１−５８０Ｐ２１（配列ＩＤ：ＡＣ１０８１５７）を覆うヒトＢＡＣ（これはチルドレンズ・ホスピタル・オークランド・リサーチ・インスティチュート（ＣＨＯＲＩ）から入手可能である）、はピューロマイシン耐性遺伝子又はハイグロマイシン耐性遺伝子などの選択可能マーカーの５０分の１の量と共にトランスフェクトされる。この細胞を選択し、個々のコロニーを釣り上げ、増殖させ、試料を凍結する。ＤＮＡは個々のクローンから調製し、導入遺伝子の存在及びコピー数についてスクリーニングする。１個のコピーが好ましい。必要ならば、導入遺伝子の組み込み位置を確定し、この組み込みが別の遺伝子を破壊しなかったことを確実にするため標準的手法により逆ＰＣＲを行なうことができる。
【０１７４】
代わりの戦略では、ヒトアルブミン遺伝子座全体を覆う上記のＢＡＣから断片を消化して取り出すことができる。使える酵素は、この遺伝子の最初の上流約８ｋｂ及びこの遺伝子の下流約２ｋｂでＢＡＣを消化するＥｃｏ４７III であろう。この断片はパルスフィールドゲル電気泳動（ＰＦＧＥ）により単離でき、選択マーカーと共に適当なベクター中にクローニングし、次いでマウスアルブミン遺伝子が欠失したＥＳ細胞中にトランスフェクトするために使用できるであろう。代わりの方法は、胚注入によるヒトアルブミン遺伝子の無差別組み込みを含み、そして内因性のマウス血清アルブミン遺伝子の破壊とは結びついても結びつかなくてもよい。
【実施例２】
【０１７５】
ヒトＡＧＰが内因性マウスＡＧＰに置き代わっているマウスを取得する工程
相同組換えによるノックアウトマウス遺伝子、次いでヒト遺伝子を無差別に組み込む。
【０１７６】
工程１．マウスＡＧＰ遺伝子座全体をノックアウトするための標的に向かう構築物の設計
マウスにおけるＡＧＰ遺伝子座を覆うＢＡＣ配列を同定した。このＢＡＣはマウスの第４染色体のＢＡＣ２７９（ジェンバンク寄託番号：ＡＦ３３６３７９）である。この領域は位置が決定され４個の遺伝子（又は擬遺伝子）が同定された。これらはこの配列の約９８８８０から１２０９９１まで伸びる領域を覆う。位置８８６８１から位置１３００８０までを覆う４１４００ｂｐの領域はこのＢＡＣ配列から取ることができ、標的に向かう構築物の調製に使用できる。この領域の線状地図は図３に示し、それに関する配列は配列番号：４２に記載する。
【０１７７】
標的に向かうベクターのためのマウスの５’腕及び３’腕はそれぞれその４遺伝子座の５’側領域及びその３’側領域から得られる。これらの配列は鋳型としてＢＡＣ２７９又はマウスゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲにより得られる。有用なプライマーの例を以下に要約する。
（外１）
2004533826.tif 000439
プライマーＡＧＰ５’ＥＸＦ及びＡＧＰ５’ＥＸＲは標的化されたクローンをスクリーニングするための８７７ｂｐの５’外側プローブを増幅する。プライマーＡＧＰ３’ＥＸＦ及びＡＧＰ３’ＥＸＲは標的化されたクローンをスクリーニングするための６１７ｂｐの３’外側プローブを増幅する。
【０１７８】
５’腕の場合には、３．７ｋｂ断片を得るためプライマーＡＧＰ１２Ｆ及びＡＧＰ４９Ｒを用い、そして５．４ｋｂ断片を得るためプライマーＡＧＰ４５Ｆ及びＡＧＰ９９Ｒを用いて、二つの別々のＰＣＲ反応が行なわれる。それぞれの断片をＳｐｅＩ及びＨｉｎｄIII で消化する。ＳｐｅＩ部位はこれらのオリゴヌクレオチドの末端に位置しそしてＨｉｎｄIII 部位は約位置４７００に位置する。これらの二つのＳｐｅＩ−ＨｉｎｄIII 断片を正しい向きに連結し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＳｐｅＩ部位中にクローニングする。このｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにはｎｅｏ遺伝子がＳｍａＩ部位に平滑末端連結されており、ＢａｍＨＩ部位の近くにｎｅｏ遺伝子の３’末端を有する。この５’腕は８．７ｋｂの長さである。
【０１７９】
３’腕をプライマーＡＧＰ３３９及びＡＧＰ４０３を用いて増幅して各末端にＳａｌＩ部位を持つ６．４ｋｂ断片を得る。この断片を消化し上記のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターのＳａｌＩ部位中にクローニングする。得られる構築物の線状地図は図４に示す。
【０１８０】
工程２．マウスのＡＧＰ遺伝子座を標的とする
実施例１の工程４のように行なう。
【０１８１】
工程３．ヒトをコードする配列を導入する
選択枝  Ａ  ＢＡＣクローン全体を導入する
ヒトＡＧＰ遺伝子（ＯＲＭ１及びＯＲＭ２）はＢＡＣクローンＲＰ１１−８２Ｉ１の上に位置し、これはカルテク・ヒューマン・ＢＡＣライブラリーＢ・サンガーシーケンシング・センター，ケンブリッジ，ＵＫから入手可能である〔ｂＡ８２Ｉ１，ジェンバンク寄託番号ＡＬ３５６７９６も参照〕。一つの戦略では、ＢＡＣクローン全体又はヒトＡＧＰ遺伝子を含むその大きな断片を、マウスＡＧＰ遺伝子座が上記の構築物の相同組換えにより破壊されているＥＳ細胞のゲノム中に無差別に組み込む（標的に向かうベクター中のヒト配列は含まない）。このＢＡＣを５０分の１の量のピューロマイシン又はハイグロマイシンのような選択可能なマーカーと共にトランスフェクトし、細胞を選択し、個々のコロニーを釣り上げ、増殖させそして凍結する。ＤＮＡは個々のクローンから調製し、導入遺伝子の存在及びコピー数についてスクリーニングする。必要であれば、導入遺伝子の組み込み部位を同定し、この組み込みが別の遺伝子を破壊しなかったことを確実にするため標準的手法で逆ＰＣＲを行なうことができる。
【０１８２】
選択枝  Ｂ  ヒトＡＧＰ遺伝子を含むＢＡＣクローンの一部を導入する
代わりの戦略では、ヒトＡＧＰ遺伝子及びこれを挟む配列を含むＢＡＣの領域を、ｎｅｏ以外の選択可能マーカーを含むベクター中にサブクローニングする。ＰＲ１１−８２Ｉ１の一部（ヌクレオチド４８０００−７８０００）はヒトＡＧＰ遺伝子座を含み、その配列は配列番号：１９に記載されている。
【０１８３】
これらの二つの遺伝子の領域の位置は次の通りである。
（外２）
2004533826.tif 000440
所望の断片を増幅するためのＰＣＲプライマーはこのコンティグ（配列番号：１９）から同定することができる。または、関連する断片を切り出すために有用なＲＥ部位はこのコンティグの制限地図から得ることができる。例えば、ＸｂａＩは３０６０、９８８３、１６６００、２９３６８の位置で切断する。
【０１８４】
ＢＡＣクローンＲＰ１１−８２Ｉ１をＸｂａＩで消化すると多数の断片を生ずるが、これらの中には６８２３ｂｐと他方の６７１７ｂｐの二つの断片が存在し、これらは上流の配列の約３ｋｂと共にそれぞれＡＧＰ−１遺伝子及びＡＧＰ−２遺伝子である。この二つの断片をｎｅｏに代わる選択可能マーカーを含む適当なベクターのＸｂａＩ、ＳｐｅＩ又はＮｈｅＩ部位で正しい向きに組み立てる。これらのクローニング部位（及び選択可能マーカー遺伝子）の両脇には、組立てられた（１３．５ｋｂの）ヒトの配列（ＡＧＰ−１遺伝子に対し５’側の配列の約３ｋｂを含む）の除去を容易にする唯一のＲＥ部位（例えば、ＳｇｒＡＩ）がある。
【０１８５】
代わりの戦略では、転写調節因子がさらに上流に伸びる場合にはより多くの５’配列を含むより大きな断片をＢＡＣからサブクローニングすることができる。例えば、配列番号：１９に記載したように、ＸｈｏＩは位置３０７で切断し、ＳｐｅＩは位置１０１２８及び１６９０５で切断する。ＸｈｏＩ及びＳｐｅＩで消化すると、二つの断片を生じ、これらは適当なベクター中に逐次クローニングでき、従ってＡＧＰ−１遺伝子の５’側の配列の約６ｋｂを含む１６．６ｋｂのゲノム断片が得られる。
【実施例３】
【０１８６】
ノック−アウトマウス遺伝子及び相同組換えによる同じ遺伝子座へのヒト遺伝子の挿入−手順１
好ましい戦略はヒトＡＧＰ配列を標的に向かうマウスＡＧＰベクター中の５’腕とｎｅｏ遺伝子の間に組み込む工程を含む。換言すれば、相同組換えの際、マウスＡＧＰ遺伝子の発現の破壊と同じ遺伝子座にヒトＡＧＰ遺伝子の挿入の両方を行なうノック−インベクターを作成する。この戦略は大きなベクターの構築を必要とする。ｐＢＲ３２２のような低コピー数ベクターは２０ｋｂを越える大きな断片のクローニングをより受け易いという証拠が文献にある。低コピー数は比較的大きなプラスミドの安定性を助ける。連結によらないクローニング手順では、ＣｏｌＥ１由来のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのような高コピーベクターが２５ｋｂまでクローニングでき、一方ｐＢＲ３２２は８０ｋｂまでクローニングできる（リーら 2001, Genomics 73: 56-65)。
【０１８７】
５’及び３’腕を、ｎｅｏ遺伝子及びヒトゲノム断片と共に、ｐＢＲ３２２のような１個のベクター中に正しい向きでクローニングする。クローニングを容易にするため、実施例２Ａに記載したものと比べ上記の腕の大きさを小さくすることが好ましい。
【０１８８】
工程１．ヒトをコードする配列の取得
ＡＧＰ−１及びＡＧＰ−２及び両方のプロモーター領域を含むヒトＡＧＰ遺伝子クラスターを、ヒトゲノムＤＮＡか又は配列番号：１９を含むＢＡＣクローンのいずれかのＰＣＲにより取得する。これはカルテック・ヒューマン・ＢＡＣライブラリーＢ・アンド・サンガー・センター，ケンブリッジ，ＵＫから入手可能であり、クローンＲＰ１１−８２Ｉ１（ｂＡ８２Ｉ１）として同定される。ＰＣＲプライマーは配列番号：１９（ジェンバンク寄託番号：ＡＬ３５６７９６由来の完全なヒトＡＧＰ遺伝子クラスター）からこれに基づいて設計される。実施例１と同様に、所望のヒト配列の５’半分及び３’半分を形成し、次いでこの二つの断片を結合するための好ましい方法は、二つの別々のＰＣＲ反応を含む。適当なプライマーには以下のものが含まれる。
【０１８９】
５’半分（ＡＧＰ１）：前向きプライマー（ＡＧＰ−１翻訳開始コドンの上流の約６ｋｂ）＝配列番号：１９[ ＡＬ３５６７９６] のヌクレオチド４７２８３−４７３１４。即ち、 (5') ＣＡＧＧＣＴＧＣＧＣＣＴＧＧＧＡＴＣＴＣＴＡＣＡＣＴＣＧＡＧＣＡ (3') [ 配列番号：５３ ]。逆向きプライマー（ＡＧＰ−１ポリアデニル化シグナルの３’＝配列番号：１９[ ＡＬ３５６７９６ ]のヌクレオチド５８１１２−５８１４２の逆向き相補鎖）。即ち、 (5') ＣＴＧＣＡＣＡＴＡＣＧＧＡＡＴＡＧＡＴＧＧＡＡＣＡＡＣＴＣＡＧ (3') [ 配列番号：５４ ]。
【０１９０】
３’半分（ＡＧＰ２）：前向きプライマー＝配列番号：１９[ ＡＬ３５６７９６ ]のヌクレオチド５８１１２−５８１４２。即ち、 (5') ＣＴＧＡＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＣＣＧＴＡＴＧＴＧＣＡＧ (3') [ 配列番号：５５ ]。（ＡＧＰ−２の翻訳開始コドンの上流約２ｋｂ）。逆向きプライマー（ＡＧＰ−２のポリアデニル化シグナルの３’＝配列番号：１９[ ＡＬ３５６７９６ ]のヌクレオチド６６１３１−６６１５７の逆向き相補鎖。即ち (5') ＣＣＴＴＴＧＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＡＡＣＣＡＴＡＡＡＴＣ (3') [ 配列番号：５６ ]。
【０１９１】
ＰＣＲにより得られた５’側半分及び３’側半分を一緒にスプライスして、マウスゲノムに「ノック−イン」するためのヒトＡＧＰ−１−ＡＧＰ−２導入遺伝子（配列番号：２０）を形成することができる。
【０１９２】
代わりの戦略はＢＡＣクローンであるＲＰ１１−８２Ｉ１（ｂＡ８２Ｉ１）の制限酵素消化によりヒトＡＧＰ遺伝子を取得し、そして以下の工程にそれを用いる工程を含む。または、ＢＡＣクローン全体をマウスの胚にミクロインジェクション（無差別組み込み）し、得られるトランスジェニックマウスを相同組換えを経て形成されたＡＧＰノック−アウトマウスと後に交配させる。このタイプの２工程手順のより詳細については実施例３を参照せよ。
【０１９３】
工程２．両側を挟むマウスゲノム配列を取得する
この実施例では、導入遺伝子はヒトＡＧＰの発現を駆動するヒトプロモーターを含む。従って、ヒトのポリヌクレオチド配列は実施例１の場合のように、マウスプロモーターと機能しうるように結合される必要はない。しかしながら、このマウスＡＧＰ遺伝子を機能的に不活性化させることがさらに好ましい。従って、相同組換えがＡＧＰ−２遺伝子全体、マウスＡＧＰ−１の３’部分、及びマウスＡＧＰ−３の５’部分の欠失を生じさせるように、マウスの５’側隣接配列はマウスＡＧＰ−１の５’部分から構成され、マウスの３’側隣接配列はマウスＡＧＰ−３の３’部分から構成される。このプロモーター及び／又はマウスＡＧＰ１の第一のエキソンの中に小さな突然変異を導入すれば、この遺伝子の機能的破壊が確実になる。
【０１９４】
マウスの５’側隣接配列は、前向きプライマーとして、配列番号：９のヌクレオチド８４−１１１（Ｍ１７３７６，ＡＧＰ−１の５’側隣接配列）、即ち（5') ＣＴＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡＣＴＣＡＧＡＴＴＣＡＣＣＣＣＴＣ（3') [ 配列番号：５７ ]を用いるマウスゲノムＤＮＡのＰＣＲにより得ることができる。逆向きプライマーは配列番号：９のヌクレオチド２９９１−３０２０（Ｍ１７３７６，ＡＧＰ−１のイントロン５）、即ち（5') ＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＧＣＡＴＧＴＣＴＧＴＡＴＧＧＣＡＧＧＣＣ（3') [ 配列番号：５８ ]の逆向き相補鎖である。得られるＰＣＲ産物は、これは配列番号：９のヌクレオチド８４−３０２０を表すが、次に機能を有するが先端が欠失したマウスのＡＧＰ−１タンパク質が生産されないことを確実にするため標準的手法を用いて重要な部位で突然変異させてもよい。この突然変異は下記のいずれか又は全てを含む。即ち、ａ）ＧＣボックス（配列番号：９のヌクレオチド５４６−５５４）及びＴＡＴＡボックス（配列番号：９のヌクレオチド５６２−５６７）の破壊、ｂ）翻訳開始コドン（配列番号：９のヌクレオチド６３４−６３６）の点突然変異及び好ましくは配列番号：９のヌクレオチド６５８−６６０のＡＴＧの点突然変異も、ｃ）配列番号：９のヌクレオチド６８０をＴからＡへ変化させることによるなどの第一エキソンに停止コドンの導入、である。突然変異を導入する方法の一例は「融合ＰＣＲ」である。これは所望のヌクレオチド不適合を有するプライマー又は突然変異をコードする５’尾部を有するプライマーを利用する。突然変異を含む相補的な前向き及び逆向きプライマーを形成し、別々のＰＣＲ反応で使用する。一方の反応は５’前向きプライマー（この例では、配列番号：９のヌクレオチド８４−１１１）及び突然変異逆向きプライマーを含みその５’側配列のみでなく該突然変異をも形成する。他方の反応は突然変異前向きプライマー及び３’逆向きプライマー（この例では、配列番号：９のヌクレオチド２９９１−３０２０）を含み、その３’側配列のみでなく該突然変異をも形成する。次いで、これら二つのＰＣＲ産物を、５’前向きプライマー及び３’逆向きプライマーを用いる第三の反応で結合させる。アニーリングの途中で、これら二つの異なるＰＣＲ産物は該突然変異を含むそれらの相補的末端で相互にアニーリングし、一方、前向きプライマーと逆向きプライマーは同じハイブリッドの外側の末端を結び付けて所望の突然変異を含む全長のポリヌクレオチドが合成されそしてその後増幅される。
【０１９５】
マウスの３’側隣接配列もマウスゲノムＤＮＡのＰＣＲにより形成される。その前向きプライマーは配列番号：１１のヌクレオチド８９８−９２４（[ Ｓ３８２１９ ]マウスＡＧＰ−３のイントロン１）から誘導される、即ち（5') ＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＴＧＡＡＴＧＣＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣ（3') [ 配列番号：５９ ]である。逆向きプライマーは配列番号：１１のヌクレオチド３４９２−３５２３（[ Ｓ３８２１９ ]マウスＡＧＰ−３のイントロン５）の逆向き相補鎖である、即ち（5') ＣＡＡＧＧＴＡＧＧＴＡＡＧＣＣＴＧＴＧＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＡＡＧ（3') [ 配列番号：６０ ]である。
【０１９６】
工程３．導入遺伝子の組立て
工程１及び工程２で得られた成分をｐＢＲ３２２のようなプラスミドの中で次の順序で組み立てる。即ち、（マウスの５’側隣接）−（ヒトのＡＧＰ−１）−（ヒトのＡＧＰ−２）−（ｎｅｏ）−（マウスの３’側隣接）である。使用する手法は当業者に周知であり、制限酵素消化、連結及びクローニングが含まれる。上記のプライマーの５’末端に加えられるユニークな制限酵素認識部位はこの手順を促進するのに有用である。
【０１９７】
ＨＳＶ−ｔｋのような負の選択マーカーを５’側隣接配列の５’末端又は３’側隣接配列の３’末端に挿入するのは任意であるが、無差別組み込み体（ＨＳＶ−ｔｋを維持し、従ってガンシクロヴィルに感受性である）と相同組換え体（ＨＳＶ−ｔｋを失っている）を識別するのに助けになる。
【０１９８】
工程４−６
実施例１の通りである。
【実施例４】
【０１９９】
ヒトＡＧＰが内因性のマウスＡＧＰを置き代わっているノック−インマウスを取得する
マウス遺伝子をノック−アウトし次いで相同組換えにより同じ遺伝子座にヒト遺伝子を挿入する−手順２。
【０２００】
工程１．マウスの隣接ゲノム配列を取得し組み立てる
８．７ｋｂの５’腕（上の実施例２Ａで記載）をＳｐｅＩ−ＸｂａＩで消化して５．９ｋｂ断片を得る。この断片はＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を含み又は欠いているｐＢＲ３２２又は何らかの他のベクターのＮｈｅＩ部位にクローニングできる。５’側隣接配列の５’末端又は３’側隣接配列の３’末端にＨＳＶ−ｔｋのような負の選択マーカーを挿入することは任意であるが、無差別組み込み体（これはＨＳＶ−ｔｋを維持しており従ってガンシクロヴィルに感受性である）と相同組換え体（ＨＳＶ−ｔｋを失っている）を識別する場合に助けとなる。
【０２０１】
その３’腕（上の実施例２Ａに記載）はＸｈｏＩ−ＳａｌＩで切断すると５０７２ｂｐ断片を生ずる。これをｐＢＲ３２２のＳａｌＩ部位にクローニングする。相同な腕の全長はほぼ１１ｋｂである。これらの二つの腕の間にユニークなＳｇｒＡ１部位がある。これはヒトの配列（以下を参照）にクローニングするために使用できる。または、同じ目的で、人工的プライマーを設計し、ＳｇｒＡ１部位内に挿入してユニークなＮｏｔＩ部位又は何らかの他のユニークなＲＥ部位（単数又は複数）を作成することができる。
【０２０２】
工程２．ヒトのゲノム配列を取得し組み立てる
上記の１３．５ｋｂ又は１６．６ｋｂのヒト配列をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター中に改変された多クローニング部位（ＭＣＳ）と共に連結する。有用なＭＣＳの例には、
ＳａｃＩ−ＳｇｒＡＩ−ＸｈｏＩ−ＮｈｅＩ−ＸｂａＩ−ＳｐｅＩ−ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ−ＳｇｒＡＩ−ＫｐｎＩ、又は
ＳａｃＩ−ＳｇｒＡＩ−ＮｈｅＩ−ＸｂａＩ−ＳｐｅＩ−ｎｅｏ−ＳｇｒＡＩ−ＫｐｎＩが含まれる。
【０２０３】
このようなＭＣＳは合成プライマーをハイブリッド形成させ連結させることにより、又は適当なＲＥ部位を含む伸長プライマーでＰＣＲすることにより形成できる。ＳａｃＩとＫｐｎＩはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにＭＣＳを挿入することを可能とする。ＢａｍＨＩ／ＰｓｔＩはｎｅｏ遺伝子の挿入を可能とする。ＳｐｅＩ、ＸｂａＩ及び／又はＮｈｅＩは上の実施例２Ａで記載したＲＰ１１−８２Ｉ１（ヒトＡＧＰ遺伝子を含む）のヒト６８２３ｂｐ及び６７１７ｂｐのＸｂａＩ断片の挿入を可能とする。例えば、５’断片をＮｈｅＩ／ＸｂａＩ切断ベクター中に連結し、ＮｈｅＩに５’末端を持つクローンを同定し、ＸｂａＩ／ＳｐｅＩで切断し、次いでその中に３’断片を連結する。ＸｈｏＩ／ＳｐｅＩは実施例２Ａで記載した１６．６ｋｂのヒト断片の挿入を可能とする。例えば、ＰＲ１１−８２Ｉ１の９８２１ｂｐのＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ断片を同じ酵素で切断したベクター中に連結する。得られるベクターを次にＳｐｅＩで切断し、ＲＰ１１−８２Ｉ１の６７７７ｂｐのＳｐｅＩ断片を挿入して完全な１６．６ｋｂのヒトＡＧＰ配列を組み立てる。ＳｇｒＡＩはヒト配列（ｎｅｏを含む又は含まない）の除去を可能としそしてその後で上記のｐＢＲ３２２系の標的に向かうベクター中への挿入を可能とする。
【０２０４】
ＥＳ細胞でＧ４１８耐性を与えるための真核性プロモーターを有するだけでなく大腸菌でカナマイシン耐性を付与する原核性プロモーターをも含むｎｅｏ遺伝子を利用することも可能である。最後の連結工程が行なわれると、アンピシリン耐性を付与するプラスミド及びカナマイシン耐性を付与する挿入体の両方について選択することはこのような大きなクローンを選択する場合に助けとなる。３０ｋｂの大きさに近いプラスミドの構築を助けるかも知れない他のパラメータはＤＨ１０Ｂのような大きなプラスミドの安定な増殖を支持し低減した抗生物質濃度で又はより低い温度で該クローンを増殖させる高効率エレクトロコンピテント（electrocompetent) 細胞の使用である。
【０２０５】
代わりの戦略は、相同組換えの二つの工程を含む。例えば、最初の標的に向かうベクターはヒトＡＧＰ−１遺伝子を含む６．８ｋｂのヒト断片を含み、次いで標的化の第二ラウンドはハイグロマイシン又はピューロマイシンなどの異なる選択可能マーカーを使用して行なうことができるであろう。上記５’腕は最初の標的化事象の間にノック−インされた６．８ｋｂのヒトＡＧＰ−１遺伝子の全て又は一部となるであろう。そして３’腕は最初の標的に向かう構築物中で使用される同じ３’腕となるであろう。５’腕と抗生物質耐性遺伝子の間に６．７ｋｂのヒトＡＧＰ−２断片が挿入されるであろう。このようにして、二つの遺伝子が標的化の二つのラウンドの間に逐次ノック−インされるであろう。
【０２０６】
他の代替的クローニング戦略は、より大きなヒト配列のクローニングを容易にするためＥＴクローニング（コープランドら，2001，Nature Reviews Genetics 2: 769-779) 又はコスミドベクター若しくはバクミド（bacmid) ベクターの使用を含む。
【０２０７】
工程３．マウスのＡＧＰ遺伝子座を標的化する
実施例１の工程４の通りである。
【０２０８】
工程４．胚盤胞の注入
実施例１の工程５の通りである。
【０２０９】
工程５．トランスジェニックマウスの選択
実施例１の工程６の通りである。
【実施例５】
【０２１０】
ヒトＡＧＰが内因性のマウスＡＧＰに置き代わっているノック−インマウスを取得する
マウス遺伝子をノック−アウトし次いで相同技術を用いて同じ遺伝子座にヒト遺伝子を挿入する。
【０２１１】
工程１．マウスの全ＡＧＰ遺伝子座をノック−アウトするための標的に向かう構築物の設計
標的に向かうベクターは実施例２Ａに記載したものと同じ方法で構築する。ただし、ネオマイシン耐性遺伝子は野性型ｌｏｘＰ部位を持つ一方の端及び突然変異ｌｏｘＰ５１１部位を持つ他方の端で挟まれる点を除く。
【０２１２】
工程２．ヒトゲノム配列を取得し組み立てる
ヒトの遺伝子断片（１６．６ｋｂ又は１３．５ｋｂ）を実施例２Ｃに記載したように別のベクターにクローニングする。ただし、二つの異なるｌｏｘＰ部位が、改変されたＭＣＳ中に、これらがヒト配列を挟むように、ＳｇｒＡＩ部位に直ぐ隣接して且つＳｇｒＡＩ部位（複数）の間に正しい向きで組み込まれる点を除く。この断片の一方の端には野性型ｌｏｘＰ組換え部位がそして他方の端には突然変異ｌｏｘＰ組換え部位（ｌｏｘＰ５１１）が存在するであろう。これらの二つのｌｏｘＰ部位は一緒に組み換えることができないが、ｌｏｘＰ５１１突然変異部位は別のｌｏｘＰ５１１部位と組み換えることができる。
【０２１３】
工程３．マウスのＡＧＰ遺伝子座を標的化する
実施例１のとおり、マウスのＡＧＰ遺伝子座を破壊しそしてｌｏｘＰ部位を挿入するため工程１（上記）に記載された標的に向かうベクターを用いる。標的化されたＥＳ細胞が一旦同定されれば、ヒト断片はＣｒｅリコンビナーゼを用いて極めて効率的な組換え反応で共トランスフェクトでき、ｎｅｏ遺伝子は組換えにより媒介されたＣｒｅ切断（ＲＭＣＥ）を経てヒト遺伝子により置換される。このようにして、ヒト遺伝子の１個のコピーをマウスのＡＧＰ遺伝子座に特異的に効果的に標的化し、コピー数及び組み込み部位の両方について制御することが可能である。この手法を用いれば他の遺伝子は破壊されずそしてＡＧＰ遺伝子はその「天然の遺伝子座」に存在し、位置効果の問題を消滅させることになる。
【０２１４】
代わりの戦略はＣｒｅリコンビナーゼではなくＦＬＰリコンビナーゼを利用する。その手順は上記のものと同じである。ただし、
−工程１及び工程２では、野性型ＦＲＴ部位と突然変異のＦＲＴ部位がｌｏｘＰの代わりに用いられる（1998，Biochemistry 37(18): 6229-34) 、そして
−工程３では、Ｃｒｅ−発現プラスミドの代わりにＦＬＰ−発現プラスミドが用いられる、
点を除く。
【実施例６】
【０２１５】
ヒトＣＹＰ４５０イソ型を発現するトランスジェニックマウスを取得する
これらのトランスジェニックマウスを作成するために様々なアプローチを用いることができる。ＣＹＰ１、ＣＹＰ２及びＣＹＰ３のファミリーから選択される一つ以上のヒトＣＹＰイソ型をコードするポリヌクレオチドを用いることが好ましい。例えば、下記のリストからのＣＹＰイソ型を導入遺伝子の成分として使用する。即ち、１Ａ２、２Ａ６、２Ｂ６、２Ｃ９、２Ｃ１９、２Ｄ６、２Ｅ１、３Ａ４、３Ａ５、４Ａ９、４Ａ１１である。このトランスジェニックマウスはＣＹＰ３Ａ４及びＣＹＰ２Ｄ６を発現することが望ましく、特にこのトランスジェニックマウスはＣＹＰ２Ｃ９及びＣＹＰ２Ｃ１９を含むこのリスト由来の他のものを発現することもある。これは同じトランスジェニックベクター中に複数のＣＹＰ遺伝子を組み込むことにより、又は二重、三重、四重などのトランスジェニック動物を作成するため、それぞれが異なるヒトＣＹＰイソ型を含む異なるトランスジェニックマウスを交配させることにより達成しうる。このようなトランスジェニック動物は導入遺伝子の無差別組み込みにより又は特定の部位への相同組み込みにより作成しうるし、そして内因性マウスＣＹＰイソ型の破壊と関連することもあり又はしないこともある。
【０２１６】
工程１．ＣＹＰ３Ａ４をコードするポリヌクレオチドを取得する
好ましい手法は、ＢＡＣ又はＹＡＣクローンを取得する工程、ヒトＣＹＰ３Ａ４を含ませる工程、及び該クローンを直接使用するか又は胚に注入する前にそれを線状化するいずれかの工程を含む。この手法は同一ベクター内に配置された複数のＣＹＰ３Ａ遺伝子が同時に導入されるという利点を有する。クローンＲＰ１１−３１６Ａ２４及びＲＰ１１−７５７Ａ１３（ゲノム配列決定センター，ワシントン、Ｕ．Ｓ．Ａ．）は適切なクローンである。他の適当なＢＡＣ又はＹＡＣクローンは、ＢＡＣクローンＲＰ１１−７５７Ａ１３（ジェンバンク寄託番号ＡＣ０６９２９４）に関する配列番号：２３から設計されたプローブを用いてヒトゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。ジェンバンク寄託番号ＡＦ２０９３８９に記載された配列にも言及しうる。これはヒトＣＹＰ３Ａ４遺伝子のエキソン１〜１３を含む２６５０２ヌクレオチドのポリヌクレオチドを規定する。ＡＱ５３９６６０及びＡＱ５３９６５９はＲＰ１１−３１６Ａ２４のＢＡＣ末端を規定し、ＮＧ−０００００４は関連コンティグを規定する。
【０２１７】
代替的戦略は下記のプライマーの合成を含み、適当な場合はその５’末端に制限酵素認識部位をも含む。
【０２１８】
プライマー１：(5')ＧＴＣＣＡＡＡＣＡＣＴＴＣＴＣＴＡＴＧＡＴＡＡＴＧＣＡＡＡＣＡＧＴＣＡＣ(3')[ 配列番号：６１ ]、即ち配列番号：２３（ＡＣ０６９２９４）のヌクレオチド２６９３０−２６９６５であり、これは開始コドンの上流約８．４ｋｂである。
【０２１９】
プライマー２：(5')ＧＴＴＧＣＴＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＣＴＡＴＧＴＧＣＡＴＧＧ(3')[ 配列番号：６２ ]、即ち配列番号：２３（ＡＣ０６９２９４）のヌクレオチド３５２２７−３５２５４及びジェンバンク寄託番号ＮＭ−０１７４６０に関する配列番号：２４のヌクレオチド２６−５３（これはＣＹＰ３Ａ４の５’ＵＴＲの中にある。）の逆向き相補鎖である。
【０２２０】
プライマー３：(5')ＡＣＡＧＡＧＣＴＧＡＡＡＧＧＡＡＧＡＣＴＣＡＧＡＧＧＡ(3')[ 配列番号：６３ ]、即ち配列番号：２３（ＡＣ０６９２９４）のヌクレオチド３５２５５−３５２８１及び配列番号：２４（ＮＭ−０１７４６０）のヌクレオチド５４−８０（これは５’ＵＴＲの中にあり、プライマー２遺伝子座の直ぐ下流にある。）である。
【０２２１】
プライマー４：(5')ＧＡＣＣＡＡＴＣＧＡＣＴＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＧＴＧ(3')[ 配列番号：６４ ]、即ち配列番号：２３（ＡＣ０６９２９４）のヌクレオチド６２３８０−６２４０６及び配列番号：２４（ＮＭ−０１７４６０）のヌクレオチド２７３８−２７６４（これは３’ＵＴＲの中にありポリアデニル化部位を含む）の逆向き相補鎖である。または、ポリＡ尾部に結合するオリゴｄＴプライマーをプライマー４の代わりに使用することができる。
【０２２２】
次いで、下記のＰＣＲ反応を行なう。
【０２２３】
ＰＣＲ反応Ａ：プライマー１及びプライマー２を用いて、ＢＡＣクローンＲＰ１１−７５７Ａ１３又はヒトゲノムＤＮＡを鋳型として用いて長領域ＰＣＲを行なう。その産物は５’ＵＴＲの一部だけでなく５’側隣接配列の約８．４ｋｂ（ヒトＣＹＰ３Ａ４プロモーター及びエンハンサーを含む）に相当する。
【０２２４】
ＰＣＲ反応Ｂ：プライマー３及びプライマー４を用い鋳型としてヒト肝臓ｃＤＮＡを用いるＰＣＲ。その産物は全タンパク質コード配列並びに３’ＵＴＲ（ポリアデニル化シグナルを含む）及び反応Ａで増幅されなかった５’ＵＴＲの一部に相当する。
【０２２５】
工程２．導入遺伝子ベクターを組み立てる
上記二つのＰＣＲ産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ストラタジーン）などの適当なベクター中で組み立てる。該プライマーの５’末端に適当な制限酵素部位を含めることでこのプロセスは容易になる。
ＢＡＣクローン又はＹＡＣクローンを用いた場合には、組立ては必要でない。
【０２２６】
工程３．マウスの胚内に導入遺伝子を挿入する
ＢＡＣクローンを直接精製するか、又は線状化した後精製する。該ＰＣＲにより形成された構築物をプラスミドベクターから切断し、プラスミドＤＮＡから単離する。精製した導入遺伝子を次いで単離されたマウス胚の雄性前核の中にミクロインジェクションを行なう。次いでその胚を無差別組み込みによりトランスジェニックマウスを形成させる標準的手法に従って偽妊娠の代理宿主マウスの輸卵管中に移植する。さらなる詳細は本明細書の別の場所に記載する。または、導入遺伝子ＤＮＡを（ｎｅｏのような選択マーカーを共トランスフェクトさせ又はさせないで）ＥＳ細胞中にトランスフェクトさせる。サザンブロット及び／又はＰＣＲにより組み込み及びコピー数についてクローンをスクリーニングする。
【０２２７】
工程４．トランスジェニックマウスを選択する
トランスジェニックマウスはＰＣＲ及び／又はサザンブロットにより同定し、導入遺伝子の発現は、肝臓のような適当な組織試料を用いてウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、又は他の免疫学的検定法により確認する。または、肝ＲＮＡをノーザンブロットにより分析する。
【０２２８】
別の戦略では、導入遺伝子の相同組換えを用いてマウスゲノムの所望の部位に導入遺伝子の１個のコピーを挿入する。その部位はヒト導入遺伝子に類似の内因性のマウスＣＹＰ遺伝子の部位の近くか又はその部位であることが好ましい。例えば、ヒト導入遺伝子がＣＹＰ３Ａ４のようなＣＹＰ３Ａファミリーの一員でもある場合、マウスのＣＹＰ３Ａ１１、３Ａ１３、ＣＹＰ３Ａ２５、又は３Ａ１６である。両側に隣接するマウス配列は実施例１及び実施例２に記載したように、相同組換えを実行するために導入遺伝子構築物の中に組み込まれる。これらの両側に隣接する配列は、例えば、マウスタンパク質の発現を破壊するのが好ましい場合には、マウスのＣＹＰ遺伝子内の又はそれの両側に隣接するマウスのゲノム配列から誘導する。ＢＡＣクローン又はＹＡＣクローンのミクロインジェクションで形成されたトランスジェニックマウスの場合には、マウスＣＹＰイソ型の破壊は別のマウスで行なわれ、それらのマウスを続いてヒトＣＹＰを発現する上記のマウスと交配させる。同様な手法を用いてヒト様のしかしマウスには似ない免疫グロブリンを発現するマウスを形成させた（グリーン，Ｌ．Ｌ．1999，J. Immunol. Methods 231: 11-23) 。
【０２２９】
ヒトＣＹＰ３Ａ遺伝子に対するマウスの相同染色体は染色体５に局在する。この染色体の上に幾つかのＣＹＰ３Ａ遺伝子が存在し、
ａ）ＣＰ３Ｇ  ＣＹＰ３Ａ１６（ensembl ID：ＥＮＳＭＵＳＧ00000029628)
ｂ）ＣＰ３Ｂ  ＣＹＰ３Ａ１１（ensembl ID: ＥＮＳＭＵＳＧ00000029630)
ｃ）ＣＰ３Ｐ  ＣＹＰ３Ａ２５（ensembl ID: ＥＮＳＭＵＳＧ00000029631)
ｄ）ＣＰ３Ｄ  ＣＹＰ３Ａ１３（ensembl ID: ＥＮＳＭＵＳＧ00000029727)
その順序は、ＣＹＰ３Ａ１３−約８Ｍｂ−ＣＹＰ３Ａ１６−約３００ｋｂ−ＣＹＰ３Ａ１１−約４００ｋｂ−ＣＹＰ３Ａ２５である。
【０２３０】
各遺伝子を個々にノック−アウトすることは可能である。１６、１１及び２５の場合には野性型ｌｏｘＰ部位を５’側隣接領域に標的化し且つ突然変異ｌｏｘＰ５１１を３’側隣接領域に標的化するという二つのの標的化事象を行なうことも可能である。次いで、いずれかの端に野性型ｌｏｘＰ部位及び突然変異ｌｏｘＰ部位を含み且つこの染色体領域にそれを（Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて）標的化するＲＰ１１−３１６Ａ２４などのヒトＢＡＣを取り、こうして３個のマウス遺伝子の全てを欠失させ、このＢＡＣに含まれるヒトＣＹＰ３Ａ４、３Ａ５、３Ａ７及び３Ａ３を挿入することができよう。
【実施例７】
【０２３１】
ヒトＵＧＴ（ＵＤＰＧＴ）イソ型を発現するトランスジェニックマウスを取得する
ＵＧＴ遺伝子ファミリーにはＵＧＴ１及びＵＧＴ２亜型が含まれる。ヒトでは、９個のＵＧＴ１遺伝子（プラス４個の擬似遺伝子）が知られており、これら全てが７ｑ２２の同じ遺伝子座に位置付けられている（ゴングら，2001, Pharmacogenetics 11: 357-368) 。これらの遺伝子はそれぞれユニークなプロモーター及び基質を特異的にコードするエキソン１を利用する一方、これらの遺伝子は全てＵＤＰグルクロン酸との相互作用に必要な同一のカルボキシル末端をコードする同じエキソン２−５を共有する。
【０２３２】
マウスでは、マウス染色体１に位置付けられるＵＧＴ１ファミリーの少なくとも３個の遺伝子が存在する。これらはＵＤ１６、ＵＤ１２及びＵＤ１７であり、それぞれゲノムＤＮＡの８６．１７ｋｂ、１６．６５ｋｂ及び５．１９ｋｂを覆うものである。他の遺伝子もこの領域（ＵＤ１１を含む）にある可能性はある。個々の遺伝子は異なるプロモーター及びエキソン１を有するが、これらは全て最後の３個のエキソンを共有する。これらのマウスＵＧＴ遺伝子は配列番号：６５に記載された７５ｋｂコンティグに位置付けられた。最後の３個のエキソンは全て５ｋｂ領域に位置付けられる。
【０２３３】
７５ｋｂコンティグの上の各遺伝子の種々のエキソンの位置は次のようになる。
（外３）
2004533826.tif 000441
（外４）
2004533826.tif 000442
このコンティグの上にはさらなる遺伝子もある。
（外５）
2004533826.tif 000443
相同組換えの際、以下に述べる標的に向かう構築物はこれらの遺伝子の中の最後の３個のエキソンを欠失する（及びＵＤ１７のエキソン１及びＵＤ１６のエキソン４をも欠失する）。遺伝子が発現されないことを確実にするため３個の読み取り枠の全てに停止コドンを挿入する。３’腕はマウスのゲノムＤＮＡ及び下記のプライマーを用いて増幅できる。ｕｇｔ２３２７５Ｆ  (5')ＧＡＡＧＴＣＧＡＣＧＴＴＴＣＡＧＡＧＴＣＡＴＡＣＣＡＡＡＡＧＧ(3') [配列番号：６６] （配列番号：６５のヌクレオチド２３２７５からヌクレオチド２３２９６まで）、及び
ｕｇｔ２７５０１Ｒ  (5')ＧＡＡＧＴＣＧＡＣＡＴＣＴＴＡＣＡＣＡＧＧＴＣＣＣＡＡＡＧＣ(3') [配列番号：６７] （配列番号：６５のヌクレオチド２７５０１からヌクレオチド２７４８１まで）。
【０２３４】
これらは末端で人工的ＳａｌＩ部位を有する。ＰＣＲ断片をＳａｌＩで消化し、標的に向かうベクター（前の実施例で記載したようにｎｅｏ遺伝子を持つｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）のＳａｌＩ部位にクローニングする。
【０２３５】
マウスのゲノムＤＮＡ及び下記のプライマー
ｕｇｔ３５９６７Ｒ  (5')ＣＴＡＡＧＡＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧＴＧＴＣＣ(3') [配列番号：６８] （配列番号：６５のヌクレオチド３５９６７からヌクレオチド３５９４７まで）、及び
ｕｇｔ３１１７０Ｆ  (5')ＧＣＡＡＴＡＣＴＡＧＣＴＡＧＡＡＡＧＧＣＣＡＧ(3') [配列番号：６９] （配列番号：６５のヌクレオチド３１１７０からヌクレオチド３１１９３まで）
を用いて５’腕を増幅できる。
【０２３６】
ＰＣＲ断片をｐＧＥＭＴｅａｓｙベクター中にクローニングし、ＮｏｔＩで消化し、ｎｅｏ遺伝子の３’末端のＮｏｔＩ部位中にクローニングする。このｎｅｏ遺伝子はＵＧＴの反対向きに転写される。この腕の３’末端は最後の第三のエキソンの最初の７ｂｐを含む（ＵＤ１２及びＵＤ１７の場合はエキソン３）。ネオマイシン耐性遺伝子は、先端を欠失したマウスＵＧＴｍＲＮＡのナンセンス媒介崩壊を誘導するためそして考えられる任意の突然変異ＵＧＴタンパク質の翻訳を終結させるため３個の（アンチセンス）枠全てに停止コドンを含む。如何なる先端を欠失したマウスＵＧＴｍＲＮＡでも急速に分解されることをさらに確実にするためＲＮＡ不安定化因子を含む断片を標的に向かうベクター中に工学処理することも可能である。
【０２３７】
この標的に向かうベクターを実施例６に記載されたように電気穿孔法によりＥＳ細胞中に導入し、実施例７に従って該領域が正確に標的化されたＥＳ細胞のクローンを釣り上げ、Ｇ４１８耐性クローンのサザンブロットにより同定する。標的化されたＥＳ細胞を次にチルドレンズ・ホスピタル・オークランド・リサーチ・インスティチュート（ＣＨＯＲＩ）から入手可能なヒトＢＡＣクローンＲＰ１１−９４３Ｂ１０でトランスフェクトする。（ＢＡＣの末端はＡＱ５６４９３８及びＡＱ７１１０９３と同定され、位置はＡＦ２９７０９３で規定されている）。このＢＡＣを陽性クローンの選択を助けるハイグロマイシン耐性又はピューロマイシン耐性を付与するプラスミドと共に共トランスフェクトしてもよい。次いで、選択されたクローンを増殖させ、上記のようにコピー数及び組み込み部位についてスクリーニングする。このＢＡＣは以下のヒトＵＧＴ１遺伝子を含む。即ち、ＵＧＴ１Ａ１、ＵＧＴ１Ａ２ｐ、ＵＧＴ１Ａ３、ＵＧＴ１Ａ４、ＵＧＴ１Ａ５、ＵＧＴ１Ａ６、ＵＧＴ１Ａ７、ＵＧＴ１Ａ９、ＵＧＴ１Ａ１０、ＵＧＴ１Ａ１３ｐ。（ｐは擬似遺伝子を示す）。
【０２３８】
代わりのアプローチは、野性型ｌｏｘＰ部位と突然変異ｌｏｘＰ部位（ｌｏｘＰ５１１）に挟まれたネオマイシン耐性遺伝子を持つ標的に向かうベクターの使用を含む。このベクターで標的化された細胞は、ＣＲＥリコンビナーゼを発現するプラスミドと共にそのベクター骨格中に野性型ｌｏｘＰ部位と突然変異ｌｏｘＰ部位を有するＢＡＣでトランスフェクトできる。組換えにより媒介されたＣｒｅ削除（ＲＭＣＥ）を受けたコロニーを選択する。このようなコロニーでは、ｎｅｏ遺伝子（マウスＵＧＴ遺伝子座にある）はヒトＵＧＴ遺伝子で置換される。または、野性型ＦＲＴ部位と突然変異ＦＲＴ部位はＦＬＰリコンビナーゼと組み合わせて用いることができる。
【実施例８】
【０２３９】
ヒトＭＤＲ−１を発現するトランスジェニックマウスを取得する
ヒトＭＤＲ−１遺伝子は肝臓、腎臓及び腸上皮などの種々の組織で発現する大きな膜貫通タンパク質（Ｐ−糖タンパク質又はＰ−ｇｐ）をコードする。Ｐ−ｇｐは血液脳関門の不可欠の部分であり、様々な薬を脳から血液へ輸送する薬−輸送ポンプとして機能する。実際、ＭＤＲ−１のＰ−糖タンパク質は多くの細胞型の原形質膜を通して様々な薬を押し出す。
【０２４０】
ヒトは一つのＭＤＲ−１遺伝子のみを持つが、マウスは二つ持つ。Ｍｄｒ−１ａは腸上皮で高度に発現し、ここでそれは腸腔からそして血液脳関門で吸収した生体異物を能動的に排出する。血液脳関門は血液中の生体異物から脳を保護する。Ｍｄｒ−１ｂは副腎、妊娠した子宮及び卵巣で高度に発現する。マウスの両遺伝子は多数の他の組織で実質的に発現する。
【０２４１】
Ｍｄｒ−１ａのＰ糖タンパク質を欠失している天然に生ずるＭｄｒ−１ａ突然変異マウス（ＣＦ−１異系交配マウス系統の）が記載された（ウンベンハウエルら，1997, Toxicol. Appl. Pharmacol. 146 (1): 88-94) 。ノック−アウトマウスは個々のマウスｍｄｒ１遺伝子単独に対してもまた組み合わせでも形成された（シンケルら，1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4028-4033) 。ヒトＭＤＲ−１を発現するトランスジェニックマウスは従って上記のマウスのいずれかと交配して、これらの遺伝子のマウス型ではなくヒト型を発現するマウスを形成させることができる。
【０２４２】
以下の例はヒトＭＤＲ−１を発現するトランスジェニックマウスを構築する方法を記載する。ヒトＭＤＲ−１のｃＤＮＡ（ジェンバンク寄託番号ＮＭ−０００９２７）[ 配列番号：７０ ]はヒト肝臓ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより得られ、ヒト５’及び（好ましくは）３’隣接調節配列及び選択可能マーカー遺伝子と一緒にベクター中で組立てられる。両側の隣接配列は５’側隣接配列についてはヒトゲノムＤＮＡ又はＢＡＣクローンのＣＴＢ６０Ｐ１２（ジェンバンク寄託番号ＡＣ００２４５７）のＰＣＲにより、３’側隣接配列についてはＢＡＣクローンのＣＴＢ１３７Ｎ１３（ジェンバンク寄託番号ＡＣ００５０６８）のＰＣＲにより得られる。これらはそれぞれカルテック・ヒューマンＢＡＣライブラりーＢから入手可能である。組立てられた導入遺伝子は、次に実施例６及び先の実施例で記載したように無差別組み込みにより導入される。
【０２４３】
下記のプライマーはこの目的に有用である。５’末端には添加された酵素部位が必要であり、効率的な消化を可能とするのに十分なヌクレオチドでその部位の両側を挟むべきである。
【０２４４】
プライマーＭＤＲ１（前向き）(5') SalI-ＧＡＡＡＣＣＣＴＡＧＧＣＡＣＴＡＡＡＴＣＣＣ(3')[ 配列番号：７１ ]、これはプロモーターのＡｖｒII部位と重なる。配列番号：７２に記載された５’側隣接ヒトＭＤＲコンティグのヌクレオチド４９３０−４９５１。
【０２４５】
プライマーＭＤＲ２（逆向き）(5') ClaI-ＧＧＧＡＴＴＴＡＧＴＧＣＣＴＡＧＧＧＴＴＴＣ(3')[ 配列番号：７３ ]、これはプロモーターのＡｖｒII部位と重なる。５’側隣接ヒトＭＤＲコンティグ[ 配列番号：７２ ]のヌクレオチド４９３０−４９５１の逆向き相補鎖。
【０２４６】
プライマーＭＤＲ３（前向き）(5')ＣＴＣＡＴＴＣＴＣＣＴＡＧＧＡＧＴＡＣＴＣＡＣ(3')[ 配列番号：７４ ]、これはエキソン１のＡｖｒII部位と重なる。５’側隣接ＭＤＲコンティグ[ 配列番号：７２ ]のヌクレオチド１００４９−１００７１及びＭＤＲ−１ｃＤＮＡ[ 配列番号：７０ ]のヌクレオチド５６−７２。
【０２４７】
プライマーＭＤＲ４（逆向き）(5')ＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＣＴＡＧＧＡＧＡＡＴＧＡＧ(3')[ 配列番号：７５ ]、これはエキソン１のＡｖｒII部位と重なる。配列番号：７２に記載された５’側隣接ＭＤＲコンティグのヌクレオチド１００４９−１００７１及びＭＤＲ−１ｃＤＮＡ[ 配列番号：７０ ]のヌクレオチド５６−７２の逆向き相補鎖。
【０２４８】
プライマーＭＤＲ５（前向き）(5')  SalI- ＡＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＴＧＴＡＡＧＡＴＧＣＧ(3')[ 配列番号：７６ ]、５’側隣接ＭＤＲコンティグ[ 配列番号：７２ ]のヌクレオチド２９２−３１３。
【０２４９】
プライマーＭＤＲ６（逆向き）(5')  ClaI- ＣＡＣＡＴＧＡＡＡＧＴＴＴＡＧＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＧＡＣＡＣ(3')[ 配列番号：７７ ]、ＭＤＲ−１ｃＤＮＡ[ 配列番号：７０ ]のヌクレオチド４６１４−４６４３の逆向き相補鎖（３’ＵＴＲ中でＰｍｅＩ部位の下流）。
【０２５０】
プライマーＭＤＲ７（逆向き）(5')  XbaI- ＴＧＧＴＣＡＡＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＣＴＣＣＧＣＴＴＣ(3')[ 配列番号：７８ ]、これはＭＤＲ１ポリアデニル化シグナルの下流約１７３０ｂｐに位置し、ジェンバンク寄託番号ＡＣ００５０６８（カルテック・ヒューマンＢＡＣライブラリーＢから入手可能なＢＡＣクローンＣＴＢ１３７Ｎ１３）のヌクレオチド３６０７５−３６１００。ジェンバンク寄託番号ＡＣ００５０６８のヌクレオチド３６０６１−３８００１の逆向き相補鎖に相当する１９４０ヌクレオチド配列は配列番号：７９で提示される。プライマーＭＤＲ７はこの配列のヌクレオチド１９００−１９２６の逆向き相補鎖である。
【０２５１】
プライマーＭＤＲ８（前向き）(5')  ＧＣＧＣＣＡＧＴＧＡＡＣＴＣＴＧＡＣＴＧＴＡＴＧＡＧＡＴＧ(3')[ 配列番号：８０ ]、ヒトＭＤＲ−１ｃＤＮＡ[ 配列番号：７０ ]のヌクレオチド４２５５−４２８３。これは３’ＵＴＲ中でＰｍｅＩ部位の下流に位置する。
【０２５２】
プロモーター因子を持つヒト５’側隣接配列を取得する
ＰＣＲ反応１：転写開始部位の上流約５ｋｂから１０ｋｂまで延びるＳａｌＩ／ＣｌａＩ断片の生産
ＰＣＲは、プライマーＭＤＲ５及びＭＤＲ２を用い、ヒトゲノムＤＮＡ又はより好ましくは適当な配列を含むＣＴＢ−６０Ｐ１２（カルテック・ヒューマンＢＡＣライブラリーＢから入手可能。ジェンバンク寄託番号ＡＣ００２４５７）のようなＢＡＣクローン由来のＤＮＡを鋳型として用いて行なう。
【０２５３】
ＰＣＲ反応２：エキソン１内から転写開始部位の上流約５ｋｂまで延びるＡｖｒII断片の生産
ＰＣＲは、プライマーＭＤＲ１及びＭＤＲ４を用い、ヒトゲノムＤＮＡ又はより好ましくは適当な配列を含むＣＴＢ−６０Ｐ１２（カルテック・ヒューマンＢＡＣライブラリーＢから入手可能。ジェンバンク寄託番号ＡＣ００２４５７）のようなＢＡＣクローン由来のＤＮＡを鋳型として用いて行なう。
【０２５４】
ヒトＭＤＲ−１をコードする配列を取得する
ＰＣＲ反応３：ヒトｃＤＮＡの５’ＵＴＲ内から３’ＵＴＲ内までを含むＡｖｒII／ＣｌａＩ断片の生産
ヒトＭＤＲ−１ｃＤＮＡ（ジェンバンク寄託番号ＮＭ−０００９２７）は、プライマーＭＤＲ３及びＭＤＲ６を用いて、ヒト肝ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲにより取得する。
【０２５５】
ヒト３’側隣接配列を取得する
ＰＣＲ反応４：最後のエキソンからポリアデニル化シグナルの約１．７ｋｂ下流まで延びるＰｍｅＩ−ＸｂａＩ断片の生産
ＰＣＲは、プライマーＭＤＲ７及びＭＤＲ８を用い、ヒトゲノムＤＮＡ又はより好ましくは適当な配列を含むＣＴＢ−１３７Ｎ１３（カルテック・ヒューマンＢＡＣライブラリーＢから入手可能。ジェンバンク寄託番号ＡＣ００５０６８）のようなＢＡＣクローン由来のＤＮＡを鋳型として用いて行なう。
【０２５６】
ベクターを組立てる
工程１：ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターの適当な部位（例えば、ＳａｃII) にネオマイシン耐性遺伝子を連結し、
工程２：反応１で得られたＰＣＲ産物をＳａｌＩ／ＣｌａＩで消化し、工程１で得られたベクターのＳａｌＩ／ＣｌａＩ部位に連結し（こうして〔ＣｌａＩ〕部位の近く及びその上流にＡｖｒII部位をも挿入し) 、
工程３：反応３で得られたＰＣＲ産物をＡｖｒII／ＣｌａＩで消化し、工程２で得られたベクターのＡｖｒII／ＣｌａＩ部位に連結し（こうして〔ＣｌａＩ〕部位の近く及びその上流にＰｍｅＩ部位をも挿入し) 、
工程４：反応２で得られたＰＣＲ産物をＡｖｒIIで消化し、工程３で得られたベクターのＡｖｒII部位中に連結し、
工程５：反応４で得られたＰＣＲ産物をＰｍｅＩ／ＸｂａＩで消化し、工程４で得られたベクターのＰｍｅＩ／ＸｂａＩ部位中に連結する。
【０２５７】
マウスを形成する
上記構築物をＮｏｔＩで線状化し、無差別組み込みのためにＥＳ細胞中にトランスフェクトする（実施例６を参照）。または、トランスフェクトの前にＢｓｓＨII又はＳａｌＩ／ＸｂａＩで消化してベクター骨格からこの導入遺伝子を切り出すことができる。クローンをＧ４１８で選択し、コピー数を決定するためサザンブロットで分析する。適当なクローン（好ましくは１個の遺伝子コピー）を先の実施例で記載したように胚盤胞に移植し、得られたキメラを繁殖させてヒトＭＤＲ−１を発現するホモ接合体マウスを形成させる。このようなマウスはジャーマンタウン，ニューヨーク，米国のタコニック社から入手可能なｍｄｒ１ａ／１ｂ二重ノック−アウトマウス（シンケルら，1997，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4028-4033) と交配育種することができる。得られる三重トランスジェニックマウスはマウスＭｄｒ−１遺伝子両方の発現を欠いているが相同的なヒトＭＤＲ−１遺伝子を発現する。
【実施例９】
【０２５８】
ＥＳ細胞の電気穿孔
電気穿孔の日の前に以下のものを用意すべきである。
（ｉ）１２×１０ｃｍのプレート、及び分裂が不活性化されたネオマイシン耐性の繊維芽細胞（又は適当な場合はハイグロマイシン耐性又はピューロマイシン耐性の繊維芽細胞）のフィーダー層を含む４×６ｃｍのプレート。
【０２５９】
（ii) ＥＳ細胞は、電気穿孔の日に少なくとも３×１０7 細胞が入手できるように、ほぼ８０％コンフルーエンシーまで増殖させるべきである。
１．細胞を収穫する２〜４時間前にＥＳ細胞の上の培地を交換する。通常３×１０ｃｍプレートのＥＳ細胞が入手可能である。これは少なくとも４×１０7 個の細胞を提供する。２×１０7 細胞が一回の電気穿孔に必要なので、これで十分である。
２．先に述べたように０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを用いて細胞を収穫し、３７℃で５分間インキュベートする。
３．５０ｍＬの管に細胞を集める。ＥＢ培地で細胞を洗浄する。
４．ペレットを１０ｍＬの電気穿孔用緩衝液（ＥＢ；１×ハンクス溶液（ギブコ−ＢＲＬ）、２０ｍＭのヘペス、２８ｍＭの２−ベータメルカプトエタノール、１ｍＭのＮａＯＨ）に再懸濁する。
５．トリパンブルー排除を用いて生細胞密度を測定する。
６．細胞を１５００ｒｐｍで５分間回転させる。
７．細胞密度がほぼ３×１０7 細胞／ｍＬとなるように細胞をＥＢ中に再懸濁する。
８．０．４ｃｍの電気穿孔用キューベット２個を次のように標識する。即ち（ｉ）「＋ＤＮＡ」そして８００μＬの最終容量に２×１０7 細胞及び３３μｇＤＮＡを添加する。（ii) 「ＤＮＡ対照」そして８００μＬの最終容量に１．１×１０6 細胞を添加する。
９．室温に１０分間放置する。
１０．無菌移送用ピペットで温和に上下に混合する。
１１．０．４Ｋボルト、２５μＦＤ（時定数は０．４秒又は０．５秒であるべきである）の設定で遺伝子パルサーを用いて電気穿孔を行なう。
１２．室温に１０分間放置する。
１３．＋ＤＮＡキューベットから得た細胞を１２×１０ｃｍプレートの上に播種すると同時に２×６ｃｍの対照プレートの上に比例した量の細胞を播種する。
１４．−ＤＮＡキューベットから得た細胞を２×１０ｃｍプレートの上に播種する。
１５．ゲネティシン（Ｇ４１８）単独又はガンシクロヴィルを添加したもので２４時間後に選択を開始する。
１６．二重選択の場合は、通常Ｇ４１８を３００μｇ／ｍＬの濃度、ガンシクロヴィルを２μＭ用いる。
１７．培地を毎日交換する。
１８．１０日目又は１１日目に生存するクローンを釣り上げる。
【実施例１０】
【０２６０】
コロニーを釣り上げる
材料：
ａ）解剖顕微鏡、マウスピペット、多チャンネルピペット、９６穴Ｕ底プレート
ｂ）釣り上げの前日に分裂的に不活性なネオマイシン耐性胚繊維芽細胞を含む１５又は３０個の２４穴プレートを用意する。これらの細胞は、下記の日に使用するために備えて、ＥＳ細胞増殖培地中に置かれる。
【０２６１】
調製：
ａ）多チャンネルピペットを用いて３０μＬの０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡを９６穴Ｕ底プレートに添加する。釣り上げるべき細胞の数にとって十分なプレートを用意する。即ち、３６０のコロニーを釣り上げる場合は４×９６穴プレートであり、７２０コロニーを釣り上げる場合は８×９６穴プレートである。
ｂ）６穴プレート中の２穴にハンクス／ヘペス緩衝液を添加する。これはコロニーの間で釣り上げピペットを洗浄するために使用できる。０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡを６穴プレート中の一つの穴に添加する。コロニーをトリプシン中に維持できるように、この少量を釣り上げピペット中に集める。
【０２６２】
手順：
１．釣り上げるべきコロニーを含む１０ｃｍプレートの２又は３個を５〜１０ｍＬのハンクス／ヘペス緩衝液（Ｈ／Ｈ）で洗浄する。
２．５ｍＬのＨ／Ｈを添加しプレートの上に放置する。
３．７０％エタノールを用いて多数回パストゥールピペットで引っ張り洗浄する。
４．Ｈ／Ｈで反復洗浄し、次いで釣り上げピペットで少量のトリプシン溶液を採取する。
５．層流室中に設置された解剖顕微鏡を用いて、釣り上げようと思うコロニーを同定する。
６．フィーダー細胞の層の周りを釣り上げ用ピペットで温和に切断する。口で吸ってＥＳ細胞コロニーをピペット中に吸引し、そのコロニーをトリプシン溶液を含む９６穴プレートの穴の一つに移す。
７．２４個のコロニーを集める（即ち、９６穴プレートの３列分）。
８．該９６穴プレートを３７℃の孵卵器に５分間移し細胞の分散を促進する。
９．多チャンネルピペットで激しく２〜３回かき回して該コロニーを分散させる。
１０．該２４穴プレートから採取した５０μＬの培地を該９６穴プレートに添加し、再び激しく分散させる。
１１．全ての細胞を２４穴プレートに移し、各コロニーを分離させたままに保つ。
１２．全ての２４穴プレートがその中にＥＳ細胞を含むまで続ける。
１３．翌日培地を交換する。
【実施例１１】
【０２６３】
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・ｎｅｏ・ｔｋベクターの構築
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・ｎｅｏ・ｔｋベクターは次のようにして構築した。ネオマイシン耐性遺伝子はｔｋプロモーターを持っている。それをＳａｌＩ及びＸｈｏＩでｐＭＣ１ｎｅｏ（ジェンバンク寄託番号Ｕ４３６１２）から切り出し、ついでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII KS のＳｍａＩ部位に挿入した。チミジンキナーゼ遺伝子は単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）から誘導され、ＥＳ細胞（ジェンバンク寄託番号ＡＦ０９０４５１）中で発現するように工学処理した。その両側を突然変異ポリオーマウイルスのエンハンサーの重複で挟む。このチミジンキナーゼ遺伝子をＸｈｏＩ及びＨｉｎｄIII でｐＩＣ１９Ｒ／ＭＣ１−ｔｋから切り出し、。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ・ｎｅｏベクターのＡｐａＩ部位にクローニングした。ｎｅｏ遺伝子とｔｋ遺伝子及びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＴ３プロモーターは両方とも同じ向きで転写される。
【０２６４】
本明細書で引用した全ての特許、特許出願、及び出版物はその全体が参照により本明細書にインコーポレートされる。
【０２６５】
本明細書での如何なる参考文献の引用もかかる参考文献が本出願に対する「先行技術」として利用可能であることを認めるものと解すべきではない。
【０２６６】
本明細書を通じてその目的は如何なる一つの実施態様又は特定の特徴の集合に本発明を限定することなく本発明の好ましい実施態様を記述することであった。従って、当業者は、本開示に照らして本発明の範囲を逸脱することなく例示された特定の実施態様に様々な修正や変更を加え得ることを認めるはずである。このような修正や変更は全て添付された請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０２６７】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【０２６８】
【図１】図１は、マウスＡＬＢ遺伝子の線状地図を示す図式的表示である。
【図２】図２は、ヒトＡＬＢｃＤＮＡでマウスＡＬＢ遺伝子を置換するためのマウスＡＬＢを標的とする構築物の一つの実施態様の線状地図を示す図式的表示である。
【図３】図３は、マウスＡＧＰ遺伝子座の線状地図を示す図式的表示である。
【図４】図４は、マウスＡＧＰ遺伝子座をノックアウトさせるためのマウスＡＧＰを標的とする構築物の一つの実施態様の線状地図を示す図式的表示である。




【国際調査報告】
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