(57)【要約】ゼロ死亡率を有する熱ウイルスの接種および患者から誘導された照射された腫瘍細胞の引き続いての注射によって全身高熱（ｗｈｏｌｅ−ｂｏｄｙ ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）および増強された抗腫瘍免疫応答を誘発させる改善方法。この治療は、２５０倍ベースライン超までインターフェロンレベルを上昇させる前に、安全に、身体的手段（熱）によって９０〜９９．９％だけ腫瘍量（ｔｕｍｏｒ ｂｕｒｄｅｎ）を減少させる。これらの高インターフェロンレベルによって産生された活性化リンフォカインキラー細胞は、ウイルスまたは腫瘍抗原を発現するいずれの細胞をも、免疫監視を予め回避したものでさえ、殺し得る。該方法におけるフィン最終工程（ｆｉｎ ｆｉｎａｌ ｓｔｅｐ）の際、患者自身の癌細胞を破壊するようにプログラムされた細胞障害性Ｔリンパ球の特異的クラスは、患者から採取された樹状細胞の反復接種によって産生される。３つの方法の組み合わせが単一のレジメン（ｒｅｇｉｍｅｎ）に予め統合されないが、この治療は患者から癌細胞を完全に全滅させる高い見込みを有すると述べることは論理的である。さらに、この治療は、疾患の再発に対する生涯の免疫を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガン患者における非特異的免疫応答誘導用薬物を調製するための、腫瘍ペプチドでパルスされた同種異系樹状細胞のデングウイルスと組み合わせた使用。
【請求項２】
該ガン患者が白血病、リンパ腫又は充実性腫瘍を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
該ウイルスがデング１型、デング２型、デング３型、又はデング４型である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
該デングウイルスが、類人猿を通過させることにより精製され、ニューロビルレンスの除去を確認する請求項１に記載の使用。
【請求項５】
該ウイルスがアフリカミドリザルの腎臓細胞を通過する、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
該薬物の単位投与量が５ｐｆｕ／ｍｌより少ない、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
該ガン患者が黒色腫を有し、該腫瘍ペプチドがＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ｐｍｅｌ７、及びＭＡＧＥ群抗原からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
該ガン患者が胸部腺ガンを有し、該腫瘍ペプチドがガン胎児性抗原（ＣＥＡ）又はＨＥＲ−２／ｎｅｕである、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
該ガン患者が子宮頚ガンを有し、該腫瘍ペプチドがヒトパピロマウイルス１７型又は１９型の全てのタンパクからなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
該ガン患者が結腸ガンを有し、該腫瘍ペプチドがガン胎児性抗原（ＣＥＡ）又はＨＥＲ−２／ｎｅｕである、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
該ガン患者が胃ガンを有し、該腫瘍ペプチドがＨＥＲ−２／ｎｅｕである、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
該ガン患者が頭部又は頚部ガンを有し、該腫瘍ペプチドがＭＡＧＥ−１又はＭＡＧＥ−３タンパク質である、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
該ガン患者が肺ガンを有し、該腫瘍ペプチドがＡｗ６８、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ、及びＢＡＧＥタンパク質からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項１４】
該ガン患者が前立腺ガンを有し、該腫瘍ペプチドがＨＬＡ−Ａ２、ＰＳＡ−１、及びＰＳＡ−３からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項１５】
該ガン患者が卵巣ガンを有し、該腫瘍ペプチドがガン胎児性抗原（ＣＥＡ）又はＨＥＲ−２／ｎｅｕである、請求項１に記載の使用。
【請求項１６】
該ガン患者が膵臓ガンを有し、該腫瘍ペプチドがガン胎児性抗原（ＣＥＡ）又はＨＥＲ−２／ｎｅｕである、請求項１に記載の使用。
【請求項１７】
該ガン患者が腎細胞ガンを有し、該腫瘍ペプチドがＭＡＧＥ又はＧＡＧＥタンパク質である、請求項１に記載の使用。
【請求項１８】
該ガン患者が子宮ガンを有し、該腫瘍ペプチドがガン胎児性抗原（ＣＥＡ）又はＨＥＲ−２／ｎｅｕである、請求項１に記載の使用。
【請求項１９】
該腫瘍ペプチドがｐ５３又はテロメラーゼである、請求項１に記載の使用。
【請求項２０】
該ガン患者が鼻咽頭ガンを有し、該腫瘍ペプチドがＥＢＶ由来ペプチドである、請求項１に記載の使用。
【請求項２１】
該ガン患者が白血病又はリンパ腫を有し、該腫瘍ペプチドがＮ−ｒａｓ、Ｋ−ｒａｓ、ＨＴＬＶ−１タンパク質、ＨＴＬＶ−２タンパク質、及びＥＢＶウイルス性タンパク質からなる群より選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項２２】
該ガン患者が慢性骨髄性白血病又は急性骨髄芽球性白血病細胞を有し、該腫瘍ペプチドがＮ−ｒａｓ又はＫ−ｒａｓである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
該ガン患者がＴ細胞白血病を有し、該腫瘍ペプチドがＨＴＬＶ−Ｉ又はＨＴＬＶ−ＩＩ由来ペプチドである、請求項２１に記載の使用。
【請求項２４】
該ガン患者が非ホジキンリンパ腫を有し、該腫瘍ペプチドがＥＢＶ由来ペプチドである、請求項２１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
背景−発明の分野
本発明は、ガン処置のための温熱療法及び免疫療法に関する。
【０００２】
背景−従来技術の説明
温熱療法（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）によりガンを治療する最古の例は、遡って紀元前３０００年の日付のあるエジプトのパピルスの巻物に見られ得、温水浴による治療を受ける乳ガンの患者が描かれている。超高熱（発熱）での全身温熱療法は、発熱性バクテリアの感染後の劇的な腫瘍の退縮さらに治癒でさえ実現してきた。１９世紀末期および２０世紀初期には、ウィリアム・コーリー（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｃｏｌｅｙ）博士が自然発生腫瘍退縮の症例を調査し、その共通要因が摂氏３９．５度または華氏１０３．５度以上の持続性の発熱であることを発見した。
【０００３】
コーリー博士は、発熱物質であるリポ多糖（ＬＰＳ）を含む化膿連鎖球菌（ストレプトコッカス・ピオゲネス：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の細菌ライゼートによって発熱の再現を試みた。コーリーは、多種にわたる癌腫及び肉腫を彼の混合細菌毒素（ＭＢＴ）で治療し、手術不可能な悪性黒色腫の症例について６０％の５年生存率を成し遂げた。この割合は、手術、放射線、及び化学療法プログラムで得られるものに比べて著しく高い。問題は、より多量のＭＢＴを必要とする中和抗体を、患者が大量に生産し始めたときに生じた。また、コーリーは毒素の発熱性を標準化するのに苦労していた。自分の治療の成功の鍵は、腫瘍に対してどういう訳か交差反応性である、毒素への免疫応答が増強されたことに基づくと、コーリーは依然確信していた。現在の免疫学の知識でコーリーの仮説は確認されるが、抗菌応答の機構より抗ウイルス免疫のほうが、はるかに密接に抗腫瘍免疫に関係していることが今や明らかである。
【０００４】
これは、細菌感染が、主に免疫系の体液性または抗体＋補体アームを刺激するという事実による。バクテリアや原生動物などの細胞外寄生体については、このことは、血流内における排出の効率良い手段を提供する。しかしながら、ウイルスは細胞内寄生体であり、ウイルス感染した宿主細胞は、通常の細胞タンパクと共に細胞表面にウイルス抗原を発現する。それゆえ、ウイルス感染細胞を認識して殺す能力を持つキラーリンパ球は、ウイルスを根絶するために必要とされる。ガン細胞もまた、「自己（ｓｅｌｆ）」または正常な宿主抗原を「変化した自己（ａｌｔｅｒｅｄ−ｓｅｌｆ）」または突然変異腫瘍抗原と共に細胞表面に発現するため、同じエフェクター細胞が必要である。ナチュラルキラー（ＮＫ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）、及び抗原特異的細胞障害性Ｔリンパ球には、抗腫瘍および抗ウイルスを監視して根絶する主要な義務がある。今までのところ、発熱性ウイルスを用いて全身の高体温を誘発する例は科学文献にみられない。
【０００５】
高熱を誘発する別の技術が試みられてきた；温液浴、四肢灌流、さらにマイクロ波の放射である。これらの方法の主な不利点は、大抵のガンは組織層内部の奥深くにあり、外部からの加熱では腫瘍細胞を殺すのに十分な温度を発生させることができないという点である。こうした従来技術のアプローチのもう１つの問題は、転移したガンでは腫瘍細胞が体中に広がっており、治癒を意図した治療では、体全体もまた加熱しなければならないという点である。安全かつ発熱性のウイルスを利用した全身発熱方法が、これら２つの問題を解決する。
【０００６】
ガン治療においては、事実上特異的なものも非特異的なものも、おびただしい種類の免疫療法が試されてきた。ガン治療における主要な非特異的免疫調節物質は、バチルスカルメット−ゲラン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、つまりＢＣＧである。ＢＣＧは遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を引き起こすが、これによって局在性マクロファージが活性化され、場合によっては殺腫瘍性となる。しかしながら、これは弱い発熱因子であり、したがって体温上昇によるメリットは実現できない。また、前に詳しく述べた通り、主に免疫系の体液性アームを刺激するため、インターフェロンの産生およびＮＫの活性化が概して低い。
【０００７】
外因性インターフェロン療法が試みられてきたが、精製と毒性の問題に悩まされている。研究者たちは、通常より１０倍高いアルファ−インターフェロン濃度を達成できているが、外来性インターフェロンが強い細胞応答を誘導し得る前にこれを中和する血清遮断因子（ＳＢＦ）によって、その応答は妨げられている。免疫学者の間では、内因性インターフェロンの産生を刺激する治療法のほうが組換えインターフェロン及びインターロイキンの注射に頼る方法より好ましいという点で、一般に意見が一致している。前述の免疫療法は内因性インターフェロンＡの濃度を通常濃度のおよそ２６０倍に刺激する。
【０００８】
測定可能な応答を引き起こす、サブユニットペプチド或いは細胞全体が放射線照射された製剤の両方を用いた、ガンワクチンへのアプローチが非常に多く試されてきた。悪性黒色腫の場合、一般的な黒色腫抗原であるｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、及びＴＲＰ−１（チロシナーゼ関連タンパク）を含むポリペプチドワクチンが臨床的に試験されてきた。こうした方法の主な欠点は、ポリペプチドであることであり、それらはキラー細胞応答を誘導するよりむしろ寛容化できる。さらに、全ての黒色腫細胞がこれらの抗原をインビボで発現して同定及びエフェクター細胞による溶解のためにラベルするわけではない。
【０００９】
もう１つの抗原特異的方法は、抗原構造が原型を保つように殺された（通常は照射）ガン細胞全体を用いることである。これらの細胞は次に注射により体に戻され、免疫応答を誘導する。このアプローチの問題は、特異的細胞障害性Ｔリンパ球が誘導される前に、腫瘍の負荷量を物理的手段により減らしておかなければならないことである。３つの主要な抗ガン療法がある。手術、放射線照射、及び化学療法が腫瘍負荷量を減らすが、同時に免疫系に打撃を与える。前述の療法はこうした障壁を乗り越えるよう設計されている。
【００１０】
目的および利点
従って、ウイルス剤応答性の発熱に基づく全身温熱療法の目的および利点に加えて、本発明の目的および利点が幾つかある。
【００１１】
（ａ）免疫機能を損なわない華氏１０３．５度以上の物理的手段（発熱）を通じて腫瘍負荷量を減らす方法を提供すること。
【００１２】
（ｂ）非特異的殺腫瘍活性のあるリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞となるナチュラルキラーリンパ球を、無数に誘導すること。
【００１３】
（ｃ）患者の生命のために、特異的腫瘍抗原を有する腫瘍細胞を認識し殺すことができる、細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のクローンを誘導すること。
【００１４】
（ｄ）患者に深刻な害を与える危険性なく前述の活性を達成すること。
【００１５】
他の目的および利点は、以下の本発明及びその実施の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【００１６】
発明の概要
デングウイルスは、サブファミリーがフラビウイルスであるトガウイルスファミリーのＲＮＡウイルスである。直径約４０−４５ナノメーターで２つのエンベロープタンパク質をもつ正二十面体の構成をしている。Ｅ１タンパク又はへマグルチンはアミノ酸グリシンが非常に豊富であり、分子量は約４５，０００ダルトンである。Ｅ２タンパク又はノイラミニダーゼはアミノ酸アラニン、セリン及びバリンに富み、分子量は約５０，０００ダルトンである。Ｅ３タンパクは膜貫通構造を持ち、これがＥ１及びＥ２タンパクをウイルスのコアタンパクに固定する。中和抗体は主にＥ１タンパクに向けられる。
【００１７】
材料および方法
患者の基準
ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶのガン、白血病あるいはリンパ腫の男性または女性被験者。
【００１８】
ウイルス
デングウイルス（ワシントンＤＣ、ウォルター・リード陸軍病院（Ｗａｌｔｅｒ Ｒｅｅｄ Ａｒｍｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）で入手可能）は、アフリカミドリザルの腎臓細胞中１ｍｌ当たり５より少ないプラーク形成単位まで継代したもの。ＤＢＳ−ＦＲｈＬ−２ローラーフラスコに最小限感染またはＭＯＩ ０．０００５で種ウイルスを接種する。１．５時間、３５℃での吸着の後、種菌を除去してフラスコを１００ｍｌのハンクス平衡塩類溶液で３回洗浄する。維持培地（ローラー当たり２００ｍｌ）は、０．２５％のヒト血清アルブミン、０．２２％のＮａＨＣＯ３、ストレプトマイシン（５０マイクログラム／ｍｌ）、及びネオマイシン（１００マイクログラム／ｍｌ）を含むイーグル最小必須培地からなる。全てのフラスコの培地は４日目までに取り換えられ、上澄み液を６日目に収集する。１，０５０×ｇで２０分間遠心分離する前に、最終濃度２．７５％になるまでヒト血清アルブミンを加える。アルブミンのｐＨはウイルス液への添加前に調整される。清澄の最終工程として、液体を０．４５マイクロメーターのメンブランフィルター（Ｎａｌｇｅ、ロチェスター、ＮＹ）でろ過する。次に、実施許諾された弱毒化生菌ウイルス性ワクチンのための公共保健サービス規則（連邦規定規範、第２１章、Ｆ節、生物製剤）に説明されているように、試料を外来性微生物剤試験する。
【００１９】
試験及びプラークアッセイのために試料を除いた後、残存分量を氷浴中４℃の冷蔵室で７日間、安全性試験およびプラークアッセイの結果が出るまで放置する。ウイルスの最終プールは、３９．３℃で１ｍｌ当たり５より少ないプラーク形成単位を含むフラスコの液体から得られ、検出可能な大型プラークウイルスは存在しない。バイアルの平均力価は８５０，０００ＰＦＵ／ｍｌであり、神経毒性試験後の使用のために凍結乾燥する。雄アカゲザルにウイルス液０．５ｍｌを脊髄内および大脳半球内に接種し、２体のコントロールはウイルスフリーの培養液を受ける。サルたちを、ＣＮＳ関与または他の身体的異常の徴候について毎日２０日間観察する。犠牲に引き続き、腰椎および頚椎（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃｏｒｄ）、下部および上部延髄、中脳、及び運動皮質をウイルス性病理学のため組織検査した。
【００２０】
患者への接種
患者に、各肢（ｌｉｍｂ）において一回、そして一次（ｐｒｉｍａｒｙ）黒色腫腫瘍部位で一回、２ｍｌのウイルスサンプル液を皮下注射する。接種後３〜５日後、患者に、患者のクラスＩ ＨＬＡ型に適合された腫瘍−ペプチドでパルスされた樹状細胞を、リンパ内マイクロカテーテル（ｉｎｔｒａｌｙｍｐｈａｔｉｃ ｍｉｃｒｏｃａｔｈｅｔｅｒ）によって注入する。連続注射を、患者がＣＡＴ、ＰＥＴ、またはＭＲＩスキャン、または免疫組織化学技術によって検出可能な腫瘍細胞をもはや示さなくなるまで、２週間毎に行う。
【００２１】
患者マネージメント
患者は、生物医学的に完全にモニターされる：（パルス、血圧、呼吸、尿量（ｕｒｉｎａｒｙ ｏｕｔｐｕｔ）、および特に体温）。患者は、発熱期間の間、十分に水を与えられた状態（ｗｅｌｌ−ｈｙｄｒａｔｅｄ）および軟らかいまたは液体の（高蛋白質）制限食（ｄｉｅｔ）に保たれる。黒色腫の場合、外部熱（電気パッド）が、発熱期間の間、可視の腫瘍に直接適用される。本発明の初期目標として与えられる解熱鎮痛剤（ａｎｔｉｐｙｒｅｔｉｃ ａｎａｌｇｅｓｉｃｓ）無しは、３９．５℃を超える持続された発熱（ｐｙｒｅｍｉａ）を達成する。正常体温への回復後、患者は、外来患者基準（ｏｕｔｐａｔｉｅｎｔ ｂａｓｉｓ）に基づいて退院およびモニターされる。
【００２２】
患者の注射
患者に、各肢（ｌｉｍｂ）において一回２ｍｌのウイルスサンプル液を真皮中へ皮下針によって注射する。２〜３日後、患者に、パルスされた樹状細胞（ｐｕｌｓｅｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｓ）をリンパ内マイクロカテーテルによって注入し、患者が疾患に対して陰性となるまで注射を反復する。
【００２３】
ペプチド合成手順
短鎖のアミノ酸を合成する多くの方法が使用され得るが、以下の方法が記載される。
【００２４】
工程１（合成）
試薬グレード（ｒｅａｇｅｎｔ ｇｒａｄｅ）塩化メチレンを無水炭酸カリウムから蒸留し、試薬グレードジメチルホルムアミドを、使用の４８時間前に、０．４ｎｍモレキュラーシーブで処理する。追加の材料および供給源：（全ての材料は、特記しない限り試薬グレード）。
【００２５】
2004507445.tif 000002
【００２６】
トレオニンおよびグルタミン酸の側鎖をＯ−ベンジル基で、チロシンをオルト−ブロモベンジル−オキシカルボニルで、およびシステインをＳ−パラ−メトキシベンジルで保護する。開始アミノ酸（ｉｎｉｔａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）（例えば、アスパラギン酸）をブトキシカルボニル−Ｂ−ベンジルアスパラギン酸に変換し、そしてベンズヒドラルアミン（ｂｅｚｈｙｄｒａｌａｍｉｎｅ）樹脂へカップリングさせる。カップリング反応を、サイクルの終わりにニンヒドリンおよび／またはピクリン酸を使用して各工程でチェックする。ダブルカップリング（ｄｏｕｂｌｅ−ｃｏｕｐｌｉｎｇ）は、アスパラギン酸、システイン、プロリン、チロシン、およびフェニルアラニンの残基に必要である。等モル量のブトキシカルボニルアスパラギニンが、シアノアラニンの形成を防止するために含まれる。
【００２７】
最終アミノ酸カップリングに続いて、Ｎ−末端ブトキシカルボニル基が除去され、そして樹脂は一晩真空乾燥されて、ペプチド樹脂を生成する（９５〜９７％純粋）。ペプチドは、樹脂から切断され得、そして側鎖保護基は、４℃で１．０時間の２０ｍｌ液体ＨＦでの１．０ｇの樹脂および１．０ｍｌアニソールの処理によって除去される。窒素流で４℃でのＨＦの除去後、過剰のアニソールが、無水エーテル（１００）ｍｌでの抽出によって除去され得、得られる混合物は、揮発性ＨＦを除去するためにＮａＯＨペレットの存在下で高真空にさらされる。粗ペプチド樹脂が、窒素−脱気した（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ−ｄｅ−ａｅｒａｔｅｄ）５％ＨＯＡｃ（１００ｍｌ）で抽出され得、残存する試薬を除去する。得られる混合物を、水で２０％ＨＯＡｃまで希釈し、そして２０％ＨＯＡｃで平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１０カラムを通過させる。最終生成物を凍結乾燥し、最終ペプチドを得る。
【００２８】
樹状細胞の調製
骨髄細胞を、ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ８についてのモノクローナル抗体を用いる蛍光活性化細胞選別（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）によって、リンパ球およびＭＨＣクラスポジティブ細胞について枯渇させる。残存する細胞を、一晩、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２−ＭＥ、および１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０μＭ非必須アミノ酸を補足したＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）（ＩＭＤＭ）中で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中、１ｍｌ培養培地／ウェルで約百万個の細胞を有する２４ウエルプレート中、培養させる。２４時間後、細胞を再プレートし（ｒｅｐｌａｔｅｄ）、そして顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、および９００Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−４の存在下で、培養する。３〜４日後、培地を、新鮮なサイトカイン培地に交換する。
【００２９】
あるいは、真皮樹状細胞（ｄｅｒｍａｌ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ）（ＤＤＣ）は、以下の方法を使用して調製され得る：健康なヒトボランティアからの角膜切開刀（ｋｅｒａｔｏｍｅｓ）を、ＲＰＭＩ １６４０中最終濃度１．２Ｕ／ｍｌの細菌プロテアーゼ・ディスパーゼ２型の溶液中で、１時間、３７℃でインキュベートする。インキュベーション期間後、上皮および真皮は、容易に分離され得る。上皮および真皮シートは、次いで、ＰＢＳでの数回の洗浄後に小さな（１〜１０ｍｍ）断片に切断され、そして１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補足されたＲＰＭＩ １６４０中に配置され、そして１０−ｃｍ組織培養プレートに配置される。２〜３日後、組織断片を取り出し、そして培地を回収する。組織切片から培地への細胞移動（ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｎｇ）は、スピンダウンされ（ｓｐｕｎ ｄｏｗｎ）、１〜２ｍｌの新鮮な培地に再懸濁され、そしてトリパンブルーで染色される。更なる富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）が、メトリザミド勾配における分離によって達成され得る。細胞が、高張１４．５％メトリザミドの３−ｍｌカラム上に層にされ、そして室温で１０分間６５０ｇで沈降される（ｓｅｄｉｍｅｎｔｅｄ）。低密度インターフェース細胞（ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ ｃｅｌｌｓ）を回収し、そして２回連続してより低い高張の洗浄物（１０％ＦＢＳおよび４０ｍＭ ＮａＣｌを有するＲＰＭＩ １６４０）において洗浄し、細胞を等張に戻す。
【００３０】
樹状細胞のペプチドパルシング
遺伝子産物の予め記載した免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）ペプチドは、種々の方法を使用して構築され得るが、１つをここで記載する。１０マイクロモルスケールのＡｂｉｍｅｄ４２２マルチプルペプチドシンセサイザーが、必要とされるペプチドを構築するために使用され得る。あるいは、ミリグラム量の所望のペプチドを生成するためにクローニングおよび発現ベクターを使用する遺伝子工学技術が使用され得る。
【００３１】
所望のペプチドが十分な量で単離された後、それらを樹状細胞上にロードしなければならない。第８日目、樹状細胞が、０．５％ＢＳＡおよび１０マイクログラムのペプチドで補足されたＩＭＤＭ培地１ｍｌ中３７℃で２時間パルスされ得る。数回の等張洗浄後、ペプチドはヒトにおける使用のための準備が出来ている。パルスされた樹状細胞は、使用のための準備が出来るまで、液体窒素中−５０℃で２年間まで保存され得る。
【００３２】
発明の操作
ａ．癌細胞の温熱療法（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）および熱感受性（ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）
癌細胞は、多数の因子に起因して正常な組織細胞よりも熱に敏感である：
１．腫瘍タイプ
２．腫瘍部位
３．血液供給
４．増殖速度
５．細胞内ｐＨ
６．細胞代謝レベル。
【００３３】
一般的に、肉腫（ｓａｒｃｏｍａｓ）と呼ばれる結合組織（骨、軟骨、筋肉）から生じる腫瘍は、癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）と呼ばれる裏打ち（ｌｉｎｉｎｇ）または上皮組織から生じる腫瘍よりも、温熱療法に対して敏感である。これは、組織タイプの相対的血液供給（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｂｌｏｏｄ ｓｕｐｐｌｉｅｓ）に主として起因する。上皮組織は、結合組織よりも遥かに豊富な血液供給を有し、従って癌腫はより熱耐性（ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ）である。白血病およびリンパ腫のような血液癌は、熱損傷（ｄａｍａｇｅ）に敏感でない。悪性黒色腫は、それが裏打ち（ｌｉｎｉｎｇ）組織から生じるが乏しい血液供給を有するので、両方の特徴を共有する。
【００３４】
位置もまた、四肢腫瘍はボディコア（ｂｏｄｙ ｃｏｒｅ）におけるものよりも選択的加熱（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｈｅａｔｉｎｇ）に供され易いので、重要である。大抵の先行技術の温熱療法成功（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉｃ ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ）は、肉腫の四肢灌流を伴う。小動脈の広範な網目構造附近の腫瘍は、これらの主な血管から遥かに離れたものよりもより感受性でない。
【００３５】
腫瘍の相対的増殖速度もまた、重要である。攻撃的な速く増殖する（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ｆａｓｔ−ｇｒｏｗｉｎｇ）腫瘍は、不活発なものよりも豊富な血液供給を必要とする。速く増殖する腫瘍はまた、酸性代謝物の多量なプール（ｐｏｏｌｓ）を構築し、そしてこの因子は、温熱療法の間重要となる。高温で、それらの複製の間に染色体を安定化させる紡錘体器官が、変性および崩壊に供され、細胞死に至る。
【００３６】
デング熱によって誘発されるような高熱の穏やかなレベル（１０３．５〜１０６ｏＦ）、または（３９．５〜４１℃）で、熱感受性（ｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）は、血液供給、細胞内ｐＨ、および細胞内代謝速度のような間接的因子に主に起因する。腫瘍は、単一細胞から生じるので、一般的に乏しい血液供給を有し、そして直ぐに局所血液供給（ｌｏｃａｌ ｂｌｏｏｄ ｓｕｐｐｌｙ）を追い越す。アンギオテンシノゲン（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎｏｇｅｎ）と呼ばれるホルモンの分泌は、局所血管増殖を助長し、しかし要求は灌流速度を凌ぐ。中等度から大きな腫瘍において、内部コア（ｉｎｔｅｒｉｏｒ ｃｏｒｅ）は、酸素、グルコース、および他の栄養を得ることが出来ないことに起因して死滅する。外部腫瘍細胞のみが、生存のために十分なガスおよび栄養交換を行い得る。
【００３７】
腫瘍はまた、毒性、酸性の代謝副産物を取り除くための低い灌流に起因して、健康な組織よりも低い細胞内ｐＨを有する。細胞は、機能的反応（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）を行うために、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）通用分子（ｃｕｒｒｅｎｃｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）を産生するための２つの経路を有する：好気的代謝および解糖。好気的代謝は酸素を使用し、そして少量の酸性廃棄産物を伴って１グルコース分子当たり３６ＡＴＰ分子を生成する。他方、解糖は、遥かに迅速であり、しかし１グルコース当たり２ＡＴＰのみを生成し、そして乳酸を生成し、これは細胞内ｐＨを低下させる。
【００３８】
腫瘍は、それらの過剰増殖のために、健康な細胞よりも高い解糖速度を有する。従って、腫瘍微小環境（ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）は、低酸素症（低い酸素）、アシドーシス、および栄養欠乏（ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）によって特徴付けられる。ステージは、温熱療法を通してこれらの弱さを利用するために設定される。
【００３９】
体温が上昇すると、細胞代謝率も上昇する。温度の関数として、酵素反応は増加するので、細胞はより多くの栄養分を取り入れ、それらの有毒廃棄物を洗い流さなければならない。正常な灌流速度を有する健全な細胞は、容易に４１℃以下の温度に耐えることができる。一方、腫瘍細胞には、どちらの側にも不利なシナリオが与えられる。もし、それらがそれらの解糖速度を増加させないならば、飢えるであろう。もし、それらがそれらの解糖速度を増加させれば、それらの細胞内ｐＨは６．７、つまり血流ｐＨ下のほぼフル対数点（ｆｕｌｌ ｌｏｇａｒｉｔｈｍｉｃ ｐｏｉｎｔ）に達するまで下がるであろう。６．０において、重要な細胞反応を担う酵素、特にＮａ−Ｋ ＡＴＰａｓｅポンプシステムは機能しなくなり始める。この酵素は、細胞膜を通したナトリウム及びカリウムイオンの相対勾配を維持することを担っている。それが機能しない時、ナトリウムイオンが流れ込み、その細胞は死ぬ。リソソーム及びペルオキシソームは、プロテアーゼを含む細胞質膜結合ボディーである。６．０以下のｐＨにおいて、これらのボディーは破裂し、細胞を消化する。
【００４０】
腫瘍感受性は、該反応によると、時間及び温度の両方に依存する：
ｓ ＝ Ｓ０ｅ−ｋｔ
ここで、ｓはあらゆる所定時間ｔにおける生存であり、Ｓ０は最初の時間における生存であり、ｋは所定温度での不活性化速度を表す定数であり、ｔはインキュベーションの所要時間である。
【００４１】
上記式から分かるように、細胞生存は対数的に減少する。簡単に言うと、温度が高ければ高いほど、１ ｌｏｇつまり９０％腫瘍殺傷率、２ ｌｏｇつまり９９％殺傷率、又は３ ｌｏｇつまり９９．９％殺傷率に必要な時間が短くなる。
【００４２】
デング熱は、生腫瘍細胞における１−２ ｌｏｇ減少を作り出すのに充分な熱を作り出すが、もしそれらが高灌流血管付近に置かれるなら、比較的少数が生存するだろう。今、該細胞を同定し、除去するのは、免疫反応次第である。
【００４３】
ｂ．発明の活性な非特異的免疫療法操作
デング熱ウイルスは感染し、次の２種の白血球中で複製する：（マクロファージに成熟する）未熟単球、及び抗体産生血漿細胞に成熟するＢ−リンパ球。感染での最初の三日で、デングは６０％の循環白血球を殺し、ＷＢＣ数値は５３００／ｍｌから２２００／ｍｌに低下する。破裂の際、これらの細胞は莫大な量のインターフェロン、インターロイキン、及びリンパ球構造タンパク質を血流中に放つ。これらのリンフォカインは、ＮＫ細胞を刺激し、ＬＡＫ細胞になり、これは、特異性に関係なく、ウイルス及び腫瘍抗原発現細胞を殺すことができる。前のインヴィトロ実験において、デング活性化ＬＡＫ細胞は、高度にヒト腫瘍株Ｋ５６２の細胞を殺した。ＬＡＫ細胞は、ＮＫ細胞に抵抗力のある腫瘍細胞を殺すことができ、これは、本発明の操作において重要な要因である。
【００４４】
デングはまた、ＭＡＦつまりマクロファージ活性化因子と呼ばれるリンフォカインを通して、殺腫瘍性（ｔｕｍｏｒｃｉｄａｌ）になるように、成熟マクロファージを誘発する。この状態で、マクロファージは、癌性細胞を殺すことのできる腫瘍浸透性白血球になる。温熱療法を通した１−２ ｌｏｇ死に続くこの反応は、患者から十分に腫瘍細胞を全滅させ得、治癒を生じたとしても、それは結局、治まるだろう。癌細胞は全く熱及びＬＡＫ／ＴＩＬ反応を生き残らないということを完全に確信するためには、第３の成分、つまり一生の抗腫瘍監視及び殺傷能力を提供する成分が必要である。
【００４５】
ｃ．発明の特異的抗腫瘍反応
ＬＡＫ細胞は、圧倒的な殺腫瘍特性を有する一方で、免疫学的記憶を有さない。インターフェロンレベルが正常に戻った後、これらの非特性キラー細胞は、細胞を壊すようにそれらを仕向けた抗原構造を“記憶する”能力を有さない。該免疫系のその機能は、体液性免疫の抗体アームに、及び細胞障害性Ｔリンパ球に任せられている。
【００４６】
細胞障害性Ｔリンパ球は胸腺に由来し、リンパ組織に移動する。Ｔ４ヘルパーリンパ球は、腫瘍細胞に対し細胞障害性であることができるが、これらは、限られた数の細胞タイプ上のクラスＩＩ ＭＨＣにより提示されたより長いペプチドを認識する。Ｔ８ ＣＴＬは、“特権”部位：ＣＮＳ、網膜、及び生殖腺において以外、すべての細胞タイプ上に存在する、クラスＩ ＭＨＣにより提示されたより短い（８−１１ ｍｅｒ）ペプチドを認識する。Ｔ８ ＣＴＬはそれらのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を使用し、ＨＬＡによりＡ及びＢ対立遺伝子にコードされたＭＨＣタンパク質により提示されるペプチドを評価する。小胞体中で産生されるタンパク質は、周期的にプロテアーゼにより切断され、ＨＬＡ結合モチーフを適合させるペプチドは、該ＭＨＣ鎖間にロードされている。このように安定化され、該三量体複合体は、最終的に細胞膜にはめ込まれ、ここで該ペプチドはＴＣＲにより“読み取られる”ことができる。もし充分な数のＣＴＬが生成されることができるなら、ウイルス性タンパク質を製造する細胞、つまり腫瘍関連ペプチドは、このように除去されることができる。これらのＣＴＬは記憶受容能力があり（ｍｅｍｏｒｙ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）、該患者の一生の間、それらのターゲット抗原を発現する細胞を同定し、殺すことができる。
【００４７】
多くの癌研究者らは、大した成果もなく、腫瘍特異的ＣＴＬを作り出そうと試みてきた。その主な困難は、前もってのディバルキング（ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ）の欠如、その７つの腫瘍免疫回避法、及び自己ペプチドに対するＴ細胞寛容性から生じる。
【００４８】
腫瘍ディバルキング
存在する腫瘍細胞の９９％（２−ｌｏｇｓ）の除去は、免疫療法からの最適の結果のための必須条件である。細胞障害性薬剤を用いる化学療法、ガンマ照射及び大手術は、腫瘍を小さくすることはできるが、細胞免疫を低下させる。患者は、時々、これらの方法により彼らの癌を“治す”が、彼らの低下した免疫系のため、感染により死んでしまうだけである。温熱療法（ｈｙｐｅｒｔｈｅｍｉａ）は、細胞性免疫反応を抑制しない、唯一、信頼できるディバルキング方法である。
【００４９】
７つの腫瘍免疫回避法
もし、ある治療が２−ｌｏｇディバルキングを達成するなら、ＣＴＬ及びＬＡＫ細胞はしばしば、７つの該腫瘍免疫回避法により、腫瘍細胞を除去するのに成功しない。
１．クラスＩ ＭＨＣ発現のダウンレギュレーション。
２．ＣＴＬにより認識される腫瘍エピトープにおける点突然変異。
３．ＮＫ認識を避けるための、胎児の栄養芽層ＨＬＡ−Ｇタンパク質の発現。
４．腫瘍微細血管はＬＡＫ及びＣＴＬ移動に対し阻害性である。
５．腫瘍細胞は、ＩＬ−１０を分泌するように単球を誘導し、それはＣＴＬをアネルギー性にする。
６．腫瘍細胞はＦａｓリガンド（ＦａｓＬ）を発現し、それはＦａｓ ＋ ＣＴＬを殺すことができる。
７．腫瘍細胞は繊維状間質性バリアーを組み立て、ＣＴＬの動きを妨害する。
【００５０】
記載されている本発明は、デングウイルスにより誘発されるサイトカインの放出を通し、これらの７つ全ての機構を打ち負かすように設計されている。
【００５１】
腫瘍細胞はしばしば、ＭＨＣ三量体のフロアを形成するベータ−２−ミクログロビンを制限することにより、クラスＩ ＭＨＣ発現を低下又は除去する。Ｂ−２ｍがなければ、ＭＨＣは不安定であり、ペプチドを結合させることはできない。腫瘍細胞もまた、ＭＨＣ複合体を膜に運ぶ輸送体タンパク質ＴＡＰ−１及びＴＡＰ−２を減少させる。これらのタンパク質の機能障害は、クラスＩ発現の不在につながり、ＣＴＬのＴ細胞レセプターに対し腫瘍細胞を見えなくする。
【００５２】
デングウイルス感染は、大量のインターフェロンアルファ、ベータ及びガンマを誘発する。ＩＦＮ−ガンマは、Ｂ−２ｍ及びＴＡＰ遺伝子のプロモーター領域に結合することにより、腫瘍細胞中にクラスＩ発現を再構築することができる。ＩＦＮ−アルファもまた、クラスＩ発現を増加させ、クラスＩレベルを正常値まで上げるように、ＩＦＮ−ガンマとの相乗的に作用する。
【００５３】
腫瘍細胞はしばしば、欠陥遺伝子調節の結果として、高い突然変異率に苦しみ、腫瘍特異的ＣＴＬにより認識されるターゲットペプチドにおける突然変異は、腫瘍細胞が溶解を避けるのを助けることができる。もし突然変異が、ペプチドをＭＨＣ鎖にアンカーリングするために必要なアミノ酸中で起こるなら、そのペプチドはもはやＨＬＡ分子に結合できない。もし突然変異が、ＴＣＲ認識に必要な残基中で起こるなら、該ペプチドはまだＭＨＣと結合し、もはや該ＣＴＬにより認識されないであろう。
【００５４】
デング感染は、結果として、高レベルの２つの重要なサイトカイン：ＩＦＮ−ベータ、及びＩＬ−２を生じる。ＣＴＬがこれらのサイトカインに一緒にさらされた時、それらはターゲット特異性を失い、ＬＡＫ様の溶解能力を得る。これらの非選好性ＣＴＬは、ＨＬＡ制限なしで、多くの細胞株からの腫瘍タイプを溶解することができるので、腫瘍関連ペプチドにおける突然変異は回避できないはずである。
【００５５】
ＭＨＣ発現を減少させてしまっている腫瘍細胞は、ＮＫ溶解を受けやすい。ナチュラルキラーは、クラスＩ ＭＨＣにより架橋された時、ネガティブシグナルを伝達するレセプターを使用する。もし該細胞がそのＨＬＡ発現を低下させるならば、それはＮＫ細胞に殺されることができる。胎児栄養芽層細胞はＨＬＡ−Ｇと称されるタンパク質を発現し、それは母のＮＫ溶解から保護する。クラスＩ ＭＨＣレベルを減少させる間、ＨＬＡ−Ｇ遺伝子を活性化する腫瘍細胞は、細胞免疫系のアーム両方を避けることができる。
【００５６】
デング熱感染はとても高レベルのＬＫ−２を誘発し、それはＣＴＬ増殖を促進する。ＩＬ−２もまたＮＫ細胞をＬＡＫに変換させ、これは腎細胞癌株ＣｕｒのようなＮＫ耐性腫瘍株を殺すことができる。
【００５７】
腫瘍血管、特に高内皮小静脈（ＨＥＶ）は、しばしばＰ及びＥセレクチンを欠いており、これらは活性化キラー細胞上に見出されるＣＤ１１インテグリンに結合する。高い流体力学ずれ率と共に、これは、ＬＡＫ及びＣＴＬが腫瘍細胞ターゲットとかみ合うために血流から出でいくことを防ぐ。
【００５８】
デング感染は、高レベルの２つの炎症誘発性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）サイトカイン、つまりＩＬ−１及び腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−ａ）を誘発する。ＩＬ−１及びＴＮＦ−ａは腫瘍血管上のセレクチンをアップレギュレートし、血管内皮細胞間のギャップジャンクションを広げる。これは、治療により作り出されたキラー細胞がＨＥＶから出て、腫瘍細胞を破壊することを可能にする。
【００５９】
腫瘍細胞は、しばしばトランスフォーミング成長因子−ベータ（ＴＧＦ−ｂ）を分泌し、これは付近の単球にＩＬ−１０を分泌させる。ＩＬ−１０はＣＴＬをアネルギー性にするので、それらはもはや腫瘍細胞とかみ合う能力はない。デングウイルスは、選択的に単球中で複製し、単球を殺し、誘発された高レベルのＩＬ−２は、腫瘍浸透性リンパ球（ＴＩＬ）のアネルギー状態を反対にするだろう。
【００６０】
病原体に対する反応でクローン化されたＣＴＬは、しばしばＦａｓ、またはＣＤ９５を発現する。Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）により架橋された時、ＤＮＡ分解（アポトーシス）により該ＣＴＬは死ぬ。“特権”部位の細胞は、しばしばＦａｓＬを発現し、感応性の領域に侵入するあらゆるＣＴＬを殺す。ＦａｓＬを発現する腫瘍細胞は、反応性ＣＴＬを殺すことができ、抑制されない腫瘍成長を可能にする。
【００６１】
デング感染は、高量のＩＬ−６を誘発し、これはＦＬＩＰ（Ｆａｓ−リガンド抑制タンパク質）の発現を促進する。ＦＬＩＰは、ＣＴＬ上のＦａｓ自己破壊トリガーを覆う“安全スイッチ”として働く。ＩＬ−２レベルが高い限り、ＦＬＩＰはＣＴＬをＦａｓＬから保護するだろう。デング感染におけるＩＬ−２レベルは、３０日以上の間、高かった。
【００６２】
腫瘍細胞は、ストローマと呼ばれる血管結合組織の束（ｆｉｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ｂｕｎｄｌｅ）の成長を促進する因子を分泌する。このコラーゲン束の密な網状組織は、ＣＴＬ移動性を妨げることができる。デング感染により誘発される高レベルのＩＦＮ−ガンマは、ＣＤ４４を発現するマクロファージを活性化し、これはヒアルロニダーゼ酵素でストローマのバリアを消化する。活性化マクロファージは、腫瘍特異性Ｔ４及びＴ８ ＣＴＬにより放出される走化性シグナルにより腫瘍領域に引かれるだろう。
【００６３】
腫瘍関連ペプチドに対するＴ−細胞耐性の克服
ここで述べられる治療は、個々の腫瘍免疫回避手段を無効にする設計により、独特である。最初の２つの目的、腫瘍免疫回避メカニズムのデバルキングと破壊を達成する治療は、克服すべき１つの他の障壁：Ｔ−細胞耐性を有する。
【００６４】
子宮内の最後の月において、及び、生命体の最初の１８月の間、Ｔ−細胞免疫システムはクローンの選別と削除のサイクルを受ける。胸腺上皮組織によって示される自己ペプチドに対して高い親和性を有するレセプターを伴ったＴ４及びＴ８細胞は除去（削除）される。自己ペプチドに低い親和性を有するＴ−細胞のみが選別され、周辺リンパ組織に在住するため胸腺を離れる。これは自己免疫に対する重要なセーフガードであるが、腫瘍細胞はこの仕組みを利用する。もし腫瘍が免疫反応を起こすと、ひき起こされたＣＴＬはペプチドに対し低い親和性を有し、そのため腫瘍細胞に対しては、低い細胞毒性を示すだろう。免疫回避手段と兼ね合って、このことは、腫瘍免疫療法における成功の低い割合を説明する。
【００６５】
クローンの削除は完全なプロセスではなく、さもなければ自己免疫疾患は知られていないであろう。適当な条件において、耐性は克服し得ることを示唆する、一連の増大する証拠がある。最初の要件はＴ−細胞に対する抗原の効率のよい提示である。マクロファージは抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能し得るが、最も効率の良いＡＰＣは骨髄由来の樹状細胞（ＤＣ）である。ＤＣは抗原を捕捉し、標的ペプチドへ加工し、次いで、Ｔ−細胞にそのペプチドを提示する。ＣＴＬは次いでペプチドを認識するためにそれらのＴＣＲを形作り、抗原特異的となる。
【００６６】
ＤＣは１：１０００の割合でＣＴＬをプライムすることができ、従って、腫瘍ペプチドでパルスされた１０００万のＤＣは１００億のＣＴＬを生じ得る。１００億の細胞の初期の腫瘍の負担から温熱療法を通して２−ｌｏｇ縮小した後で、これは個々の残存する腫瘍細胞に１００ＣＴＬという結果となろう。
【００６７】
Ｔ−細胞耐性を克服するための２番目の要件は、Ｔｈ−１タイプサイトカイン、即ちＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１２の高レベルである。ＣＴＬの増大は２つの因子：ＡＰＣとＴｈ１サイトカインレベルによって制限される。デング感染は必要とされる高レベルを誘発する。
【００６８】
腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）
腫瘍免疫療法の成功に対する別の主要な障害は、ＣＴＬの標的として役立つＴＡＡの不足である。ウィルス感染細胞においてＨＬＡによって捕捉されるペプチドと違って、ＴＡＡはより少ない量で一般に製造される。それぞれの細胞は、特異的なＨＬＡタイプ、例えば、ＨＬＡ−Ａ２のおよそ２００，０００のコピーを有する。それぞれのペプチドのフラグメントはＨＬＡ結合のために１０，０００の他のものと競合しなければならず、ペプチドを提示する最低２００のＭＨＣ複合体がＣＴＬ分解のために必要とされる。
【００６９】
黒色腫は最も特徴的なＴＡＡ、即ち、他の腫瘍タイプに発現するＭｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００、ｐｍｅｌ７及びＭＡＧＥグループ抗原を有する。以下の腫瘍タイプが、腫瘍特異的ＣＴＬをプライムする同種異系のＤＣの上にロードされ得る特異的ＴＡＡと共に、列挙される。
【００７０】
胸部アデノカルシノーマ（Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）
乳ガンで最も頻繁に表れるＴＡＡは、ガン胎児性抗原（ＣａｒｃｉｎｏＥｍｂｒｙｏｎｉｃＡｎｔｉｇｅｎ（ＣＥＡ））と、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、プロトオンコジーンである。ＣＥＡは、様々なアデノカルシノーマにおいて多量に発現される大きな胎児性腫瘍蛋白であるが、ほんのわずかな量で通常の小腸上皮組織に発現される。標的ペプチドの例はＹＬＳＧＡＮＬＮＬで、ＨＬＡ−Ａ２によって制限される。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは多くの腫瘍タイプに過剰に発現し、ＣＴＬに対する多くの好適な標的を有する大きい蛋白（１２５５アミノ酸）である。標的ペプチドの例は、残基３６９−３７７に、ＫＩＦＧＳＬＡＦＬを含むＥ７５である。ＨＥＲ−２／ｎｅｕは、乳房、卵巣、及び肺組織からの腫瘍細胞において２００倍まで発現する。
【００７１】
頸ガン
頸ガンはヒトパピローマウィルス（ＨＰＶ）１７型及び１９型と関連する。これらのＤＮＡウィルスは、ＲＮＡウィルス・インフルエンザＡ及びＨＩＶ−１と違って遺伝子的に安定である。ＨＬＡ制限ＨＰＶペプチドはＣＴＬの標的として確認されていた。
【００７２】
結腸ガン
結腸ガンは、乳ガンと同種の標的、即ち、ＣＥＡとＨＥＲ−２−ｎｅｕを共有する。
【００７３】
胃ガン
胃ガン細胞はＨＥＲ−２／ｎｅｕを過剰発現することが知られている。
【００７４】
頭及び首のガン
頭及び首の扁平上皮ガンはＭＡＧＥ−１及びＭＡＧＥ−３遺伝子から黒色腫関連ペプチドを過剰発現することが知られている。
【００７５】
白血病及びリンパ腫
温熱療法による影響は受けないが、酸素に富んだ媒体に浮遊しているので、白血病及びリンパ腫の細胞はＬＡＫ細胞の攻撃を受けやすい。それらはまたオンコジーンＮ−ｒａｓとＫ−ｒａｓからのペプチドを発現し、慢性骨髄腫白血病と急性骨随白血病に関連する。Ｔ−細胞白血病はヒトＴ−リンパ腫白血病ウィルスＨＴＬＶ−１とＩＩによって頻繁に引き起こされる。白血病細胞のＨＬＡによって提示されるウィルス蛋白はＣＴＬの標的として役立ち得る。
【００７６】
エプステイン−バーウィルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ）は、鼻咽頭ガンと非ホジキンリンパ腫（Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ　Ｌｙｍｐｈｏｍａ）に関連した大きいＤＮＡウィルスである。このウィルスからのペプチドはガン細胞によって発現され、ＣＴＬの標的として役立ち得る。
【００７７】
肺ガン
肺ガンは、扁平上皮乳頭腫とアデノカルシノーマに分割される。Ａｗ６８によって制限される標的ペプチドは、扁平上皮肺ガンから単離され、アデノカルシノーマはＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ及び関連ＢＡＧＥ遺伝子からの蛋白を共有する。
【００７８】
前立腺ガン
前立腺−特異的抗原は、前立腺ガンに対する診断マーカーとして使用し得るが、それはまたＣＴＬエピトープも含有する。ＨＬＡ−Ａ２によって制限された例は、ＰＳＡ−１、ＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶと、ＰＳＡ−３、ＶＩＳＮＤＶＣＡＱＶである。
【００７９】
卵巣ガン
卵巣ガン細胞は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕとＣＥＡを発現することが知られている。
【００８０】
膵臓ガン
膵臓ガン細胞は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕとＣＥＡを発現することが知られている。
【００８１】
腎細胞ガン
腎細胞ガンは、ＭＡＧＥ及びＧＡＧＥを含む、多くの黒色腫関連ペプチドを共有する。
【００８２】
子宮ガン
子宮ガン細胞は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕとＣＥＡを発現することが知られている。
【００８３】
発ガンプロセスの一部として発現する腫瘍関連ペプチドｐ５３腫瘍抑制蛋白
ｐ５３遺伝子の産物は発ガンプロセスの礎石である。その産物はＤＮＡに結合する四量体蛋白である。これは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合のバリアーとして機能し、オンコジーンの転写を妨げる。ＵＶ照射によって生じる突然変異、化学発ガン物質、ＳＶ４０のような腫瘍原因ウィルスの感染はｐ５３を不活性化し得る。不活性化されたｐ５３はもはや転写を妨げず、オンコジーンが活性化され、細胞を不死で、急速に増殖する腫瘍細胞に変換する。
【００８４】
突然変異したｐ５３遺伝子は全てのガンの５０％以上にみられ、これらの遺伝子からのペプチドはＨＬＡで制限される。突然変異されたｐ５３、又は正常ｐ５３を過剰発現している腫瘍細胞にさえ特異的なＣＴＬは、ネズミの腫瘍を根絶することができる。ガン患者に使用されるこのタイプのペプチドのため、クラスＩＭＨＣタイプはｐ５３のｃＤＮＡライブラリーと比較され、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が、ガン組織サンプルにおける突然変異ｐ５３の存在を確認するために使用し得る。
【００８５】
テロメラーゼ（Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）
２番目の一般的なＴＡＡは酵素テロメラーゼである。クロモソームの末端はテロメリックＤＮＡの繰り返し単位でキャップされている。これはクロモソームの分解を妨げ、同様に、クロモソーム相互間の結合を妨げる。テロメリックＤＮＡは細胞分割の度に失われ、ＤＮＡ複製の半保存的性質のために、それらはＤＮＡポリメラーゼＩによってもとに戻されることはできない。これは細胞時計として作用し、細胞が分割できる回数を制限しているようである。テロメアが終点に到ると、細胞は拘束され、それ以上、分割できない。
【００８６】
定義によると、ガン細胞は、そのような活性に対する制限を無視して急速に増殖する。テロメアを加えると、それらは、酵素テロメアーゼを大量に合成する。腫瘍細胞株の９０％近くが高いテロメラーゼ発現を示し、そして触媒サブユニット（ｈＴＥＲＴ）はＣＴＬに対する標的として作用し得るＨＬＡ−制限蛋白である。テロメラーゼは通常正常な細胞では合成されないので、それは免疫療法における広く発現されたＴＡＡを示す。
【００８７】
ほとんどのＴＡＡが、幾つかの正常組織タイプ、特に急速に増殖するものに存在するけれども、それらは微少な量で作られる。ＴＡＡは正常蛋白に由来する１０，０００のペプチドと競合しなければならないので、これらのＨＬＡ提示は低い。
【００８８】
結論、効果及び見通し
従って、読者は、前述した組合せ療法が、人体からガン細胞を消去するのに、安全で効果的な方法を提供することがわかるだろう。ガン患者に有効として医学で知られた３つの療法を組み合わせることによって、その療法は、現行の化学療法、放射線、及び外科手術によって提示されるジレンマを解決する。全盛で野生型のデングウィルスが様々な熱帯医学のテキストで、無、非存在、及び６１，０００の１という死亡率を有するように、本発明における上述の及び様々な他の目的及び利点は、患者に対する過度の危険なく達成される。どんな他の全盛のウィルスにおいてもボランティアに注射する他の例はどの文献にも見られない。
【００８９】
上述の記述は多くの具体的事項を含むけれども、これらは、発明の範囲を制限するものとして解釈すべきものではなく、単に、この発明における現在の好ましい具体化の幾つかの例を提供するものである。
【００９０】
従って、本発明の範囲は、提示した具体例によるよりもむしろ、添付のクレームとそれらの法的均等物によって決定されるべきである。
【００９１】
別に規定していない限り、ここで用いられている全ての技術的及び科学的用語は、この発明の属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。ここで述べたものと類似又は均等なあらゆる材料及び方法が、本発明の実施、インビトロ及びインビボテストにおいて使用し得るけれども、好ましい方法と材料を述べている。ここで述べた全ての刊行物がここに参照として援用される。別に規定していない限り、ここで用いた技術は、当該分野の当業者によく知られた標準の技術である。
【００９２】
ここで用いられた「実質的に純粋（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｐｕｒｅ）」という用語は、標準の精製技術によって取得し得る程度に純粋という意味である。
【００９３】
発明の概要
本発明に従い、体全体の温熱療法並びに特異的及び非特異的免疫活性化を通じて人体内のガン細胞を破壊する方法は、患者の生命のため、ガン細胞を認識し殺すことのできる特異的な細胞傷害性Ｔリンパ細胞株のクローンを作り出すデング熱ウィルス及びペプチド−パルスされた樹状細胞を、注射することによってもたらされる。
【００９４】
ここで述べられた実施例及び具体例は、単に例示目的のものであって、それに照らして種々の変更や修正が当業者に示唆され、この出願の精神と範囲および添付のクレームの範囲内において含まれると理解される。
【国際公開パンフレット】
2004507445.tif 000003
2004507445.tif 000004
2004507445.tif 000005
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2004507445.tif 000019
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004507445.tif 000020
【国際調査報告】
2004507445.tif 000021
2004507445.tif 000022
2004507445.tif 000023