(57)【要約】本発明は、ヒトの起源、医学及び進化生物学の分野に入る。より正確には、本発明はミトコンドリアＤＮＡ配列に基づくヒトの地理的及び集団的起源の決定のための方法及びキット、特に全長ヒトミトコンドリアゲノム由来のＤＮＡ変種（多型）の使用に関する。この情報が、生物学的試料と、既知起源の試料あるいはミトコンドリアゲノム配列のデータベースとの比較に使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含んでなるヒトの起源又はアイデンティティを決定する方法：
ａ）その起源又はアイデンティティが研究されるヒト被検者由来の試料中のミトコンドリアゲノムの全核酸配列内の多型部位を決定すること；そして
ｂ）工程ａ）からの情報を既知起源のミトコンドリア核酸配列情報と関連付けること。
【請求項２】
工程ｂ）の既知情報が多様な起源のヒトからの核酸配列情報のデータベース由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ミトコンドリアの核酸配列が、Ｄループを除いたｍｔＤＮＡゲノムの全核酸配列である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ミトコンドリアの核酸配列が表１に示された多型部位を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ヒトのミトコンドリアの核酸配列の決定が、ＤＮＡシークエンス法、あるいは遺伝子マーカーの場合には、ＤＮＡハイブリダイゼーション法（ＡＳＯ、ＳＳＯハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロチップ、ｐａｄｌｏｃｋ）、酵素的連結法（ＯＬＡ、ｐａｄｌｏｃｋ）、酵素的切断法（Ｔａｑｍａｎ）、酵素的伸長法（ミニシークエンス法、ピロシークエンス法）のような方法又は他の遺伝子多型タイピング法によって行われる、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ミトコンドリアの核酸配列がピロシークエンス法によって決定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
分析の手段が本特許出願の表２に記載された反応物から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
ミトコンドリアの全長ゲノム内の有用な部位を対象として含む分析の手段を含んでなる、ヒトの起源又はアイデンティティを決定するためのキット。
【請求項９】
有用な部位がＤループ外である、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
分析の手段が本特許出願の表２に記載された反応物から選択される、請求項８又は９に記載のキット。
【請求項１１】
分析の手段が増幅用プライマー、シークエンス用プライマー、及び多型検出の手段である、請求項８〜１０のいずれかに記載のキット。
【請求項１２】
分析の手段が、ＤＮＡシークエンスの手段である、あるいは遺伝子マーカーの場合には、ＤＮＡハイブリダイゼーション法（ＡＳＯ、ＳＳＯハイブリダイゼーション法、ＤＮＡマイクロチップ、ｐａｄｌｏｃｋ）、酵素的連結法（ＯＬＡ、ｐａｄｌｏｃｋ）、酵素的切断法（Ｔａｑｍａｎ）、酵素的伸長法（ミニシークエンス法、ピロシークエンス法）のような方法又は他の遺伝子多型タイピング法による、請求項８〜１１のいずれかに記載のキット。
【請求項１３】
分析の手段がピロシークエンスの手段である、請求項８〜１２のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明はヒトの起源、医学および進化生物学の分野に属する。さらに正確には、本発明はミトコンドリアＤＮＡ配列に基づいてヒトの地理的あるいは集団的起源を決定するための方法およびキットに関し、特に完全なヒトミトコンドリアゲノムからのミトコンドリアＤＮＡ変種（多型）の使用に関する。既知の起源の試料あるいはミトコンドリアゲノム配列のデータベースと生物学試料との比較に、この情報が用いられる。
【０００２】
発明の背景
各個人は、一卵性双生児は例外として、それぞれ特有の遺伝子構成を有している。それゆえに遺伝的起源の同定は原則として遺伝学的材料、例えば未知のヒト起源試料と既知の起源の比較試料の間の比較に基づくことができる。このような分析は、母子および父子鑑定において、家族関係に論争がある移民事件において、医学および進化生物学上の研究において関連を有する。
【０００３】
ヒトの遺伝学的材料（ＤＮＡ）は細胞核（材料の９９％以上が含まれる）およびミトコンドリア（１％未満）に見出される。核内のＤＮＡは５０％ずつをそれぞれの親から受け継ぐが、ミトコンドリア内のＤＮＡ（ｍｔＤＮＡと呼ばれる）は完全に母親由来である（母系遺伝と称される過程）。ミトコンドリアゲノムは核とは異なるさまざまな特徴を有する。ｍｔＤＮＡの細胞当たりの高いコピー数（１，０００−１０，０００コピー／細胞）により、限られた量のあるいは部分的に分解したＤＮＡでも分析が可能となる（Ｂｏｄｅｎｈａｇｅｎ と Ｃｌａｙｔｏｎ， １９７４）。大部分の核遺伝子に比較して高いヌクレオチド置換率により、個人の同定の可能性が増す（Ｂｒｏｗｎら、１９８２）。最後に、ｍｔＤＮＡは母系の親を介した片親由来である（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． １９７４）。兄弟や近縁の母方の親戚のｍｔＤＮＡは同一であると思われるので（新規の突然変異という例外は除くが）、個体は母方の系統に割り当てることができる。半数性である、あるいは栄養系であるというｍｔＤＮＡの性質から、通常分解されたＤＮＡが生じるジャンピングＰＣＲ（Ｐａａｂｏ ｅｔ ａｌ． １９８９）によっても誤った結果は生じない。対照的に、核の遺伝子座の分析においては、ジャンピングＰＣＲはキメラ配列の存在を引起して、多型の対立相の解釈を複雑化させる。
【０００４】
ヒトの起源についての研究は核あるいはｍｔＤＮＡのどちらかの小セグメントの分析に基づいて行われてきた。ｍｔＤＮＡの研究は、Ｄ−ループを表すｍｔＤＮＡゲノムの小セグメント（Ｈｉｇｕｃｈｉら １９８８、 Ｗｉｌｓｏｎら １９９３、 Ｇｉｎｔｈｅｒら　　１９９２、 Ｈａｇｅｒｂｅｒｇ ａｎｄ Ｓｙｋｅｓ １９８９、 Ｓｔｏｎｅｋｉｎｇら　１９９１， Ｈｏｌｌａｎｄ ら １９９３、 Ｈａｎｄｔ ら １９９４、 Ｇｉｌｌ ら １９９４、 Ａｌｌｅｎ ら １９９８）に限定されてきた。母方の系統を決定し、地理的あるいは集団的起源を推定するという目的のための、全ｍｔＤＮＡを含む研究はこれまで記載されていない。異なるヌクレオチドの部位間の置換率が非常にばらついていること（分析から除外しなければならない部位もある）及び比較的高率の新規突然変異（誤った包含／除外の生じる可能性がある）のため、Ｄループ部位の分析は複雑であった。一つの個体の異なる組織でＤループｍｔＤＮＡの相違を示すこともありえるので、母方の親戚由来の試料同士でも異なる組織タイプのものの比較は不明瞭なものとなる。
【０００５】
Ｄループ配列を基にして個体の主要な人種（又は地理的地域）が推定可能である確率を推定する研究が行われてきた（Ａｌｌｅｎ ら １９９８）。Ｄループ配列のみを用いては、ある個体の地理的あるいは集団的起源を同定することは不可能である。
【０００６】
ＲＦＬＰ分析を用いたヒトのミトコンドリア分子の研究も行われており、Ｄループ外のいくつかのＤＮＡ変種に関するデータが得られている。これらの分析は、種としてのヒトの進化学的歴史を研究し、あるいはミトコンドリアの疾患を引き起こす突然変異を特定するために行われたもので、個体の地理的及び集団的起源をたどって決定する目的で行われたのではない。
【０００７】
発明の概要
本発明は、生物学的試料の分析を基にして個体の地理的及び集団的起源を決定する方法を提供する。本発明によれば、分析は全ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の分析、及び調査対象の試料と既知起源の試料又は全長ミトコンドリアゲノムのデータベースとの比較に基づく。
【０００８】
第一の側面において、本発明はヒトの地理的あるいは集団的起源を決定する、以下の工程を含む方法に関する：
ａ）その起源あるいはアイデンティティを研究するヒト被検者由来の試料中の多型部位を含むミトコンドリアゲノムの全核酸配列を決定すること；そして
ｂ）工程ａ）からの情報を既知起源のミトコンドリア核酸配列情報と関連付けること。
【０００９】
上記で言及される身体試料は体液あるいは組織由来であってよい。
工程ｂ）の既知情報は既知アイデンティティのヒト被検者（対照被検者）から由来してよい。あるいは、工程ｂ）の既知情報は多様な起源のヒトの全ミトコンドリアゲノム核酸配列情報のデータベースに由来する。これは、母方の親戚からの試料が入手できない場合、又は別の点で有益である場合にも適切であるかもしれない。
【００１０】
ミトコンドリアＤＮＡ配列情報は、全ｍｔＤＮＡ分子（約１６．５００ヌクレオチド）からのものである。あるいは、この情報はＤループを含まないこの断片から得られる。全ｍｔＤＮＡ配列又はその断片の分析は、ＤＮＡ核酸配列決定のための既存技術を用いて行うことができる。遺伝マーカの分析は、ＤＮＡハイブリダイゼーション法（例えばＡＳＯハイブリダイゼーション、ＤＮＡマイクロチップ、ｐａｄｌｏｃｋなど）、酵素的切断法（ＯＬＡ、Ｔａｑｍａｎ）、酵素的伸長法（ミニシークエンス法、ピロシークエンス法）、又は他の適当なＤＮＡタイピング技術に基づくことができる。
【００１１】
第二の側面において、本発明はヒトの地理的及び集団的起源を決定するための、未知起源のヒトの全ミトコンドリアＤＮＡ及び既知起源のミトコンドリアＤＮＡ配列情報の配列分析の手段を含んでなるキットを提供する。当該配列情報は、印刷された配列情報として又はデータベースの印刷された出典を記載したリーフレットとして提供可能である。当該配列分析の手段は、上記の公知のＤＮＡ配列決定法において使用されるいかなる手段であってもよい。未知起源の配列は、既知配列又は全ミトコンドリアゲノムのデータベースと比較され、そして地理的及び集団的起源についての結論を出すことができる。
【００１２】
別の態様において、前記キットは、好ましくはＤループ外に位置する多型部位の分析のための手段を含む。本発明の目的に有用な多型部位を表１に列挙する。Ｄループには１６０２８から５７７（すなわち、１６０２８から１６５６９及び１〜５７７）の番号が付けられている。
【００１３】
他の態様において、本発明は、ピロシークエンス法の使用に基づく、ミトコンドリアゲノム中の多型部位の選択されたセットでのヌクレオチドの型を決定するための、研究室用反応物（ｒｅａｇｅｎｔ）及び条件（プロトコール）の専用のセットを提供する。
【００１４】
発明の詳細な説明
ヒトミトコンドリアゲノム中の遺伝的変異の特定
ヒトｍｔＤＮＡにおける世界的な遺伝的多様性を調査するために、発明者らは合計１２４人の個体の全長ｍｔＤＮＡゲノムを決定した。個体は、種としてのヒトの遺伝的多様性の大部分に及ぶように選択された。
【００１５】
ＰＣＲを用いて全長ｍｔＤＮＡゲノムをセグメント内で増幅し、断片をシークエンスした。ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーは、Ｒｅｉｄｅｒ ら（１９９８）によって記載された通りであった。シークエンスは、ＰＣＲ産物で直接、ＢｉｇＤｙｅ（（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）化学を用いて行った。シークエンスラダーの分離は、ＡＢＩ３７７機上の自動化断片分析で行った。フォワード及びリバース鎖の両方をシークエンスした。配列分析はＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３．３ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行い、配列アライメントはＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ３．１．１ （Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ）で作成された。
【００１６】
１２４の全長ｍｔＤＮＡ配列の全ては特有であった。合計１１２２の多型がこれら１２４人の個体から同定された。当該部位のリスト、これらの各部位で見られた変化したヌクレオチドの型、及びこれらの相違するヌクレオチドの頻度を表１に示す。
【００１７】
本発明者らの、ミトコンドリアゲノム全体のこの研究は、これまでのＤループの研究とは顕著な差異を有している。大変重要なことに、Ｄループ外の配列はほぼ「時計のような」方式で進化しており、突然変異発生率のより正確な測定を可能とし、したがって時間と進化上の事象との推定の改良を可能とする（Ｉｎｇｍａｎ ら ２０００）。Ｄループと残りの分子との間の差は、Ｄループ内の多型部位のごちゃ混ぜの配置（ｊｕｍｂｌｅｄ ａｒａｎｇｅｍｅｎｔ）と分子中の残りの部位で定められるクリアなハプロタイプの間の対照において、視覚的に明らかである（図１）。本発明者らのｍｔＤＮＡ配列から構築された近隣結合（ＮＪ）法の系統樹は、強く支持された根元の分岐パターンを有する（図２）。最も深い３つの分岐は、排他的にサブサハラのｍｔＤＮＡに至り、４本目の分岐はアフリカ系及びアフリカ系以外の両方を含んでいる。最深の、統計学的に裏付けられた分岐（ＮＪブートストラップ＝１００）はヒトｍｔＤＮＡの起源がアフリカであることの説得力のある証拠を提供する。本発明者らのデータにより、Ｄループ外のｍｔＤＮＡゲノムにおける遺伝的変異（多型）がほとんど並列化（ｐａｒａｌｌｅｌｌｉｓｍ）の対象とならない（すなわち同じ部位での複数のｍｔＤＮＡ系列における独立した置換がほとんどない）ということ、これにより母方の系統を決定する能力を増大し、この情報に基いて地理的及び集団的起源が推論されること、一方、Ｄループはこの目的に有用であるには多すぎる並列な置換を数多くの部位に有することが示される。
【００１８】
ヒト起源の研究のための全長ｍｔＤＮＡゲノム変異の有用性
本発明者らによる全長ミトコンドリアＤＮＡゲノム（Ｄループ以外）の分析は以下の結果をもたらした：
１）Ｄループ外で非常に多数の新規な多型が検出され、その多くは強い集団特異的な分布を示した。これにより、生物学的試料に基づいて個体の特有の母方の系統を決定し、個体の地理的及び集団的起源を定める能力が増大する。
２）それに対して個体の遺伝情報が比較可能で、地理的及び集団的起源を評価可能であるような全長ミトコンドリアゲノムの大きなデータベース。例えば、本発明者らのデータベースは、試料がアフリカか白人起源の個体のどちらから得られたものであるかを非常に高い確率で同定する能力を与える。
【００１９】
検出されたｍｔＤＮＡ多型の部分セットの分析のためのキット
個体間のｍｔＤＮＡにおける変異は、主にサンガー法によって検討されてきた。ピロシークエンス法は、遺伝子タイピングのための他の多くの方法と比較して、非常に速く、丈夫で簡便である（Ｒｏｎａｇｈｉ ら １９９６）。
【００２０】
本発明においてｍｔＤＮＡ決定のために開発されたキットは、ミトコンドリアゲノム全体中で高度に有用な（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｖｅ）部位を対象として含む１０のＰＣＲ断片の分析に基づく（表２）。本システムは４のＨＶＩ、４のＨＶＩＩ及び１１のコーディング領域の反応を含む、１９のピロシークエンス反応の分析に基づく。これにより、ｍｔＤＮＡ全長の中で最も有用な部位のいくつかの分析が可能となる。本方法は、Ｄループ及びｍｔＤＮＡのコーディング領域の分析を可能とし、広範な生物学的材料について使用できる。
【００２１】
ミトコンドリアのＤループの分析は、２つの別々のＰＣＲ断片から行われる。一つの超可変領域Ｉ（ＨＶＩ）断片、これは４つの別々のピロシークエンス反応で分析される。同様に、超可変領域ＩＩ（ＨＶＩＩ）断片は４つの別々のピロシークエンス反応で分析される。本方法を評価するために、多数の対照試料からのミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）を分析した。合計１９０試料をＨＶＩＩについて分析し、１２０試料をＨＶＩについて分析し、そして最終的に５０の法医学的証拠材料を検討した。結果は、同一個体についてのＤループの配列決定データと一致した。
【００２２】
さらにピロシークエンス法を使用して、３６の以前に配列決定された対照試料中で、１１のｍｔＤＮＡコーディング領域を配列決定した。この１１の領域は、以前に作成された全長ｍｔＤＮＡゲノム配列を用いて、ミトコンドリアゲノム全体を通じて最も有用な部位を含むように選択された。ピロシークエンス法を用いて得られた結果は、サンガー配列決定法によって得られた結果と１００％一致した。
【００２３】
限られた量のＤＮＡで本システムを評価するため、少量のＤＮＡの５０の生物学的試料をＨＶＩ及びＨＶＩＩについてピロシークエンス法で分析した。分析された材料の中には、泥棒の頭巾（ｒｏｂｂｅｒ ｈｏｏｄｓ）、かつら、口ひげ、靴、携帯電話、腕時計、ナイフ及び銃からの試料があった。ピロシークエンス法の結果は、試験された全試料について、サンガー法を使用して得られた結果と一致した。
【００２４】
８つのＨＶＩ及びＨＶＩＩピロシークエンス反応の結果を合わせると、Ｄループ配列のマニュアル編集後、全部でヌクレオチドの約８８％（３９６／４４８）に及んだ。Ｄループの全長サンガー配列決定法により、プライマー対 Ｌ０４８／Ｈ４０８ 及び Ｌ１５９９７／Ｒ１６４０１を用いて、３５９ヌクレオチドのＨＶＩＩ断片及び４０３ヌクレオチドのＨＶＩ断片が与えられる（Ｗｉｌｓｏｎ ら １９９５）。ピロシークエンス法は、サンガー配列決定法で決定されたＨＶＩＩ断片のヌクレオチドの６２％ （２２２／３５９）及びサンガー配列決定法で決定されたＨＶＩ断片のヌクレオチドの５６％ （２２６／４０３）をカバーした。これは合計すると、サンガー法で決定されたＤループの５９％（４４８／７６２）のカバー率を与える。
【００２５】
【実施例】
全長ｍｔＤＮＡゲノムを決定するための方法論
ＰＣＲ法
ミトコンドリアのゲノムを、Ｒｅｉｄｅｒら（１９９８）が記載したように、ＰＣＲ法により２４の一部重なりのある断片中で、２４のプライマー対を用いて増幅した。ＤＮＡ塩基配列決定のための確立された技術を用いて、これら２４のＤＮＡ鋳型のフォワードとリバースの鎖の両方を配列決定し、例えばＢｉｇＤｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）キットを１倍シークエンス用緩衝液で１：１希釈し、以下の組成を使用した。
ＤＮＡ鋳型　ｌｕＬ
反応混合液　４ｕＬ （キット　２ｕＬ　及び１倍シークエンス用緩衝液　２ｕＬ）
ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅｔｒａｄサーモサイクラー中で以下のプログラムでの伸長反応：
フォワード反応
（温度変化１度／秒）
９６度　１０秒間
５５度　５秒間
７０度　１分間
＜１４サイクル＞
９６度　１０秒間
７０度　１分間
＜１４サイクル＞
４度でホールド
リバース反応
（温度変化１度／秒）
９６度　１０秒間
４８度　５秒間
７０度　１分間
＜１９サイクル＞
９６度　１０秒間
７０度　１分間
＜１４サイクル＞
４度でホールド
これらの反応の伸長産物を９５％エタノール中で沈殿し、最高速度で２５分間遠心して当該産物を集め、エタノールを除いてペレットを風乾する。
【００２６】
ペレットをブロモチモールローディング緩衝液中に再水和し、シークエンスラダーの分離のためにＡＢＩ３７７機上に載せる。９６穴フォーマットを用いて２つのゲノムの全てのフォワード及びリバース鎖を同時に泳動できるようにした。シークエンス用ゲルの分析は、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３．３ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して行い、シーケンサー３．１．１ （Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ）によりコンティグを完全な二重鎖ゲノムへと集合させた。次いで、エラーのチェックを補助するため、これらの完成したゲノムを、過去に配列決定された全てのｍｔＤＮＡのコンセンサスゲノム配列とアライニングし、全ての相違をこの新しい配列に関するクロマトグラムに対してチェックした。次に、この新しいゲノム配列を分析のためのシークエンスデータベースへとエクスポートすることができた。
【００２７】
配列の分析
この新しい全長ｍｔＤＮＡゲノム配列を参照用データベース内の別の配列とアライニングする。例えばＰＡＵＰ＊のようなコンピュータプログラムを用いて、相違のペアの数をデータベース内の全配列に対して計算することができる。その結果である距離行列（ｄｉｓｔａｎｃｅ ｍａｔｒｉｘ）は、分析中の配列と各参照用配列との間の相違の数のリストである。この情報から、各配列とデータベース内の配列との間の差が０、１及び２であるマッチの数（ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｍａｔｃｈｅｓ）を計算することができる。本発明者らの１２４の全長ｍｔＤＮＡ配列のデータベース中では、Ｄループ配列のみを考慮した時の変異部位の数は、全長配列についてのものよりもかなり低くなる。
【００２８】
検出されたｍｔＤＮＡ多型を分析するキットについての方法論及び試薬
ＤＮＡの調製
対照として用いるために、１９０人のスェーデン人血液提供者のＰＢＬからヒトＤＮＡを抽出した。この法医学的証拠材料を３つの方法の一つによって精製した。綿棒によって及び血液から採取された証拠材料の大部分からのＤＮＡを抽出するために、ウィザードゲノムＤＮＡ抽出キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）が使用された。血痕からのＤＮＡを抽出するには、Ｃｈｅｌｅｘ １００ （Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いた。 この方法は、法医学的試料からのＤＮＡを抽出してＰＣＲに使用するために開発されてきたものである（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ． １９９１）。毛髪試料は、プロテイネースＫとＤＴＴを使用する抽出法により抽出された（Ｖｉｇｉｌａｎｔ １９９９）。
【００２９】
プライマーの設計とＰＣＲ
ＰＣＲ及びシークエンス用プライマーの設計のために、ソフトウェアであるＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。Ｄループ内の有用な多型をほとんど全て含むように最適の選択が行われており、超可変領域Ｉ及びＩＩ（ＨＶＩ及びＨＶＩＩ）が２つの異なるＰＣＲ産物へとＰＣＲ増幅される（表２）。コード領域多型は１１の別々の反応で増幅され、フォワードＰＣＲプライマーをシークエンス用プライマーとして用いて、１１のピロシークエンス反応で分析される。対照試料のＰＣＲ増幅は、１．５μｌのＤＮＡ、２００ｎＭの通常及びビオチン化プライマー（表２）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ゴールドＤＮＡポリメレース及び１ｘＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ用緩衝液ＩＩを含む７０μｌで開始された。当該法医学材料のＰＣＲ増幅は、１０μｌのＤＮＡ、２００ｎＭの通常及びビオチン化プライマー、２００ｎＭの各ｄＮＴＰ、２．４ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ゴールドＤＮＡポリメレース、１．２ｘＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ用緩衝液ＩＩ、０．１６ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ及び１０％グリセロールの１００μｌ中で開始された。増幅は、ＡＢＩ ９６００機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行われた。試料は９５℃で１０分間で保たれ、続いて９５℃で３０秒間、６０℃（コード領域プライマーについては５３℃）で４５秒間、そして７２℃で６０秒間を４５サイクル行った。最後の伸長は７分間に延長された。鋳型（ＮＴＣ）以外の全てのＰＣＲ成分を含むチューブを使用し、試薬が汚染されていないことを確認した。
【００３０】
鋳型の調製とピロシークエンス反応
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＡＢに記載されるように、固相支持体としてストレプトアビジンコートされたビーズを用いて、一本鎖のビオチン化ＰＣＲ産物を得た。ピロシークエンスの前に、４４０ｎｇのシングルストランデッドＤＮＡバインディングプロテイン（ＳＳＢ） （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を前処理された（ｐｒｉｍｅｄ）鋳型ＤＮＡに加えておく必要がある反応もあった（Ｒｏｎａｇｈｉ ２０００）。シークエンスは室温で行い、７０μｌのＰＣＲ反応の１５μｌを４００ｎＭのシースエンス用プライマーと共に使用した。酵素と基質の混合物（ＰＳＱ（登録商標）９６ ＳＱＡ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔのプロトタイプ）を、ＰＳＱ（登録商標）９６ＳＱＡソフトウェア（試料導入、機器の制御及び評価）のプロトタイプを使用したＰＳＱ（登録商標）９６ システム（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＡＢ）中の全試料に加えた。異なるｄＮＴＰ（ＡαＳ、Ｃ、Ｇ及びＴ）の順次供給の間のプライマー鎖の段階的伸長、その後のヌクレオチドの分解、によりこの方法を実施した。最適な反復分配順序は各断片に応じて選択した。配列を編集し、Ａｎｄｅｒｓｏｎらの参照用標準と比較した（Ａｎｄｅｒｓｏｎら １９８１）。対照用試料は、ＡＢＩ ３７７機 ＢｉｇＤｙｅ ターミネーター化学を使用してシークエンスされた。
【００３１】
表１：１２４人のヒトミトコンドリアゲノム中で多型であるヌクレオチド部位のリストであり、各部位で見られた別のヌクレオチド及び１２４人の個体におけるこの多型の頻度と共に検討されたもの。アステリスク（＊）で示された部位は、過去にミトコンドリア疾患に関する研究に関連して記載されていたもの。番号はＡｎｄｅｒｓｓｏｎ ら （１９８１）による。
【００３２】
【表１】
2004508836.tif 000002
【表２】
2004508836.tif 000003
【表３】
2004508836.tif 000004
【表４】
2004508836.tif 000005
【表５】
2004508836.tif 000006
【表６】
2004508836.tif 000007
【表７】
2004508836.tif 000008
【００３３】
ｂｐ：塩基対　ｄｅｌ：削除　　ｉｎｓ：挿入
【００３４】
【表８】
2004508836.tif 000009
【００３５】
参考文献
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Ｃｒｉｍｅ Ｌａｂ Ｄｉｇ １９９３ ； ２０： ６８−７７．
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、全長ミトコンドリアゲノムの決定された１２４人の個体の５３人における全ての有用なヌクレオチド部位を示すデータ行列を頻度が減少する順に表したもの：ａ）Ｄループを除く全ｍｔＤＮＡゲノム及び；ｂ）Ｄループ。左の系統樹は、図２のものと同様のトポロジーと個体番号での分岐図である。アフリカ系の個体のみが点線より下、アフリカ系以外が上に見られる。４つの主要な配列の群が線で囲まれたブロックとなっている。これらのブロックはいくつかの配列が一致しているヌクレオチドの群を示す。
【図２】図２は、検討された１２４人の内の５３人の個体の全長ｍｔＤＮＡゲノム配列（Ｄループを除く）に基づく、ＰＡＵＰ＊４．０ Ｂｅｔａ （Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）の使用により構築され、１０００回の複製でブートストラップを行った（分岐点（ｎｏｄｅ）にブートストラップ値を示す）近隣結合系統図を示す。個体の集団的起源は小枝で与えられる。分岐は図１においてブッロク状に示される。アフリカ系の個体のみが点線より下、アフリカ系以外が上に見られる。‡の印がつけられた分岐点はアフリカ系と非アフリカ系の両方を含む、最も若い分岐群（ｃｌａｄｅ）のＭＲＣＡを指す。
【図３】図３は、５３のｍｔＤＮＡゲノム（Ｄループを除く）間におけるペアワイズのヌクレオチドの相違ミスマッチ分布を示す：ａ）アフリカ系；及びｂ）非アフリカ系の個体。
【図４】図４は、Ｄループのみについて及び全長ｍｔＤＮＡ配列についての５３の配列のペアワイズの比較における相違の数の分布を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年11月28日(2002.11.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含んでなるヒトの起源又はアイデンティティを決定する方法：
ａ）その起源又はアイデンティティが研究されるヒト被検者由来の試料中のミトコンドリアゲノムの全核酸配列内の多型部位を決定すること［ここで当該ヒトミトコンドリア核酸配列はＤＮＡシークエンス法により決定され、あるいは遺伝子マーカーの場合には、酵素的連結法（ＯＬＡ、ｐａｄｌｏｃｋ）、酵素的切断法（Ｔａｑｍａｎ）、酵素的伸長法（ミニシークエンス法、ピロシークエンス法）のような方法又は他の遺伝子多型タイピング法によって行われる］；そして
ｂ）工程ａ）からの情報を既知起源のミトコンドリア核酸配列情報と関連付けること。
【請求項２】
工程ｂ）の既知情報が多様な起源のヒトからの核酸配列情報のデータベース由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ミトコンドリアの核酸配列が、Ｄループを除いたｍｔＤＮＡゲノムの全核酸配列である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ミトコンドリアの核酸配列が表１に示された多型部位を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
ミトコンドリアの核酸配列がピロシークエンス法によって決定される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
分析の手段が本特許出願の表２に記載された反応物から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ミトコンドリアの全長ゲノム内の有用な部位を対象として含む分析の手段を含んでなる、ヒトの起源又はアイデンティティを決定するためのキット。
【請求項８】
有用な部位がＤループ外である、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
分析の手段が本特許出願の表２に記載された反応物から選択される、請求項７又は８に記載のキット。
【請求項１０】
分析の手段が増幅用プライマー、シークエンス用プライマー、及び多型検出の手段である、請求項７〜９のいずれかに記載のキット。
【請求項１１】
分析の手段が、ＤＮＡシークエンスの手段である、あるいは遺伝子マーカーの場合には、酵素的連結法（ＯＬＡ、ｐａｄｌｏｃｋ）、酵素的切断法（Ｔａｑｍａｎ）、酵素的伸長法（ミニシークエンス法、ピロシークエンス法）のような方法又は他の遺伝子多型タイピング法による、請求項７〜１０のいずれかに記載のキット。
【請求項１２】
分析の手段がピロシークエンスの手段である、請求項７〜１１のいずれかに記載のキット。
【国際調査報告】
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