(57)【要約】予防用または治療用ワクチン及び／または遺伝子治療を主体とする用途に有効な改良されたポリヌクレオチドワクチンアジュバント及び類縁のポリヌクレオチドワクチン製剤が開示されている。これらのアジュバントは、ブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤成分とを含む。カチオン性界面活性剤が混在すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアジュバントに物理的に会合するポリヌクレオチドの割合が増加し、その結果としてポリヌクレオチドワクチンに対するｉｎ  ｖｉｖｏ免疫応答が増強される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）一般式：
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ；
〔式中、（ｂ）は疎水性ＰＯＰ部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約２０，０００ダルトン以下であるような数を表し、（ａ）は親水性ＰＯＥ部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約１重量％乃至４０重量％の範囲であるような数を表す〕のブロックコポリマーと、
（ｂ）カチオン性界面活性剤と
から成るアジュバント。
【請求項２】
ブロックコポリマーの一般式の下付き文字（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約９，０００ダルトン乃至１５，０００ダルトンの範囲であるような数を表し、一般式の下付き文字（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約３％乃至３５％の範囲、好ましくは１０％以下であるような数を表すことを特徴とする請求項１に記載のアジュバント。
【請求項３】
ブロックコポリマーの一般式の下付き文字（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約９，０００ダルトンであるような数を表し、一般式の下付き文字（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）が約３％乃至５％の範囲であるような数を表すことを特徴とする請求項１に記載のアジュバント。
【請求項４】
ブロックコポリマーの一般式の下付き文字（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約１２，０００ダルトンであるような数を表し、一般式の下付き文字（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）が約５％であるような数を表すことを特徴とする請求項１に記載のアジュバント。
【請求項５】
ブロックコポリマーがＣＲＬ−１００５であることを特徴とする請求項１に記載のアジュバント。
【請求項６】
カチオン性界面活性剤が、ベンズアルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド、セトラミド、セチルピリジニウムクロリド及びセチルトリメチルアンモニウムクロリドから成るグループから選択されることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載のアジュバント。
【請求項７】
（ａ）ポリヌクレオチド分子群と、
（ｂ）一般式：
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ；
〔式中、（ｂ）は疎水性ＰＯＰ部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約２０，０００ダルトン以下であるような数を表し、（ａ）は親水性ＰＯＥ部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）が約１重量％乃至４０重量％の範囲であるような数を表す〕のブロックコポリマー、及び、
（ｃ）カチオン性界面活性剤
から成るアジュバントとを含み、
ポリヌクレオチドワクチン分子群の一部分がアジュバントと会合し、ポリヌクレオチドワクチン分子群の残りの部分が医薬として許容される緩衝溶液中に遊離していることを特徴とするポリヌクレオチドワクチン製剤。
【請求項８】
ブロックコポリマーの一般式の下付き文字（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約９，０００ダルトン乃至１５，０００ダルトンの範囲であるような数を表し、一般式の下付き文字（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約３％乃至３５％の範囲、好ましくは１０％以下であるような数を表すことを特徴とする請求項７に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤。
【請求項９】
ブロックコポリマーの一般式の下付き文字（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約９，０００ダルトンであるような数を表し、一般式の下付き文字（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約３％乃至５％の範囲であるような数を表すことを特徴とする請求項７に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤。
【請求項１０】
ブロックコポリマーの一般式の下付き文字（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約１２，０００ダルトンであるような数を表し、一般式の下付き文字（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約５％であるような数を表すことを特徴とする請求項７に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤。
【請求項１１】
ブロックコポリマーがＣＲＬ−１００５であることを特徴とする請求項７に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤。
【請求項１２】
カチオン性界面活性剤が、ベンズアルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド、セトラミド、セチルピリジニウムクロリド及びセチルトリメチルアンモニウムクロリドから成るグループから選択されることを特徴とする請求項７から１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤。
【請求項１３】
Ｄ１１８、Ｄ１１８ａ及びＤ１２１から成るグループから選択されることを特徴とする請求項１１に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤。
【請求項１４】
請求項７に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤を哺乳類宿主に導入する段階から成る哺乳類宿主の体内で免疫応答を誘発する方法。
【請求項１５】
請求項８に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤を哺乳類宿主に導入する段階から成る哺乳類宿主の体内で免疫応答を誘発する方法。
【請求項１６】
請求項９に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤を哺乳類宿主に導入する段階から成る哺乳類宿主の体内で免疫応答を誘発する方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤を哺乳類宿主に導入する段階から成る哺乳類宿主の体内で免疫応答を誘発する方法。
【請求項１８】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤を哺乳類宿主に導入する段階から成る哺乳類宿主の体内で免疫応答を誘発する方法。
【請求項１９】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤を哺乳類宿主に導入する段階から成る哺乳類宿主の体内で免疫応答を誘発する方法。
【請求項２０】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤を哺乳類宿主に導入する段階から成る哺乳類宿主の体内で免疫応答を誘発する方法。
【請求項２１】
（ａ）ポリヌクレオチド分子群と、
（ｂ）一般式：
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ；
〔式中、（ｂ）は疎水性ＰＯＰ部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約２０，０００ダルトン以下であるような数を表し、（ａ）は親水性ＰＯＥ部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約１重量％乃至４０重量％の範囲であるような数を表す〕のブロックコポリマー、
（ｃ）カチオン性界面活性剤、及び、
（ｄ）非イオン性界面活性剤
から成るアジュバントとを含み、
ポリヌクレオチドワクチン分子群の一部分がアジュバントと会合し、ポリヌクレオチドワクチン分子群の残りの部分が医薬として許容される緩衝溶液中に遊離していることを特徴とするポリヌクレオチドワクチン製剤。
【請求項２２】
ブロックコポリマーの一般式の下付き文字（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約９，０００ダルトン乃至１５，０００ダルトンの範囲であるような数を表し、ブロックコポリマーの一般式の下付き文字（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約３％乃至３５％の範囲、好ましくは１０％以下であるような数を表すことを特徴とする請求項２１に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤。
【請求項２３】
ブロックコポリマーの一般式の下付き文字（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約９，０００ダルトンであるような数を表し、ブロックコポリマーの一般式の下付き文字（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約３％乃至５％の範囲であるような数を表すことを特徴とする請求項２１に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤。
【請求項２４】
ブロックコポリマーの一般式の下付き文字（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約１２，０００ダルトンであるような数を表し、ブロックコポリマーの一般式の下付き文字（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約５％であるような数を表すことを特徴とする請求項２１に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤。
【請求項２５】
ブロックコポリマーがＣＲＬ−１００５であることを特徴とする請求項２１に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤。
【請求項２６】
カチオン性界面活性剤が、ベンズアルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド、セトラミド、セチルピリジニウムクロリド及びセチルトリメチルアンモニウムクロリドから成るグループから選択されることを特徴とする請求項２１から２５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドワクチン製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ポリヌクレオチドワクチンのアジュバント、ポリヌクレオチドとアジュバントとから成る製剤、類縁の医薬品、並びに、予防用または治療用のワクチン及び／または遺伝子治療を主体とする用途でこれらの製剤及び医薬品を使用する方法に関する。本文中に開示された好ましい製剤は、ポリヌクレオチド成分とアジュバント成分とから成り、アジュバント成分が非イオン性ブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成るアジュバント添加ポリヌクレオチドワクチン製剤である。カチオン性界面活性剤を混在させる結果として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアジュバントに物理的に会合するポリヌクレオチドの割合が増加する。このために、これらのアジュバント添加製剤では、ポリヌクレオチドワクチン及び／または遺伝子治療の主体となるトランスジーンに対するｉｎ  ｖｉｖｏの免疫応答が既知のポリヌクレオチドワクチンアジュバントに比較して有意に増強される。
【０００２】
（発明の背景）
ＤＮＡワクチンによる免疫感作方法についてはＤＮＡにコードされた抗原の免疫原性を増進させるために選択可能な種々の形態が報告されている。これらの方法は当業界で公知であり、例えば、ＤＮＡをコートした金ビーズを使用する分子衝撃、ＤＮＡワクチンとサイトカイン、ケモカインまたは同時刺激性（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）分子を発現するプラスミドＤＮＡとの同時投与、ＤＮＡとカチオン性脂質または実験用アジュバント例えばモノホスホリル脂質Ａとの製剤化、ＤＮＡワクチンとある種の無機塩、例えばアルミニウムまたはカルシウムを基剤とするアジュバントとの同時投与がある。、ＤＮＡがアルミニウムアジュバントに物理的に結合するならばＤＮＡワクチンの効果増強は妨害されるが、これはタンパク質抗原が“ミョウバン”にほぼ結合している従来のワクチンとの明らかな相違である（ＰＣＴ／ＵＳ９８／０２４１４，ＷＯ９８／３５５６２参照）。Ｎｅｗｍａｎら（１９９８，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５（２）：８９−１４２）は、アジュバント活性を示す非イオン性ブロックコポリマーのクラスについて考察している。基本構造は、ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーのようにポリオキシエチレン（ＰＯＥ）とポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）とのブロックからる。Ｎｅｗｍａｎら、同上は、ある種のＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマー、即ち、約９，０００ダルトンから約２０，０００ダルトンの範囲の分子量をもつ中央のＰＯＰブロックと、コポリマーの全分子量の約２０％以下を占める両側のＰＯＥブロックとを含有する高分子量ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーが、インフルエンザタンパク質を基剤とするワクチンに対するアジュバントとして有効であると開示している（例えば、米国再発行特許第３６，６６５号、米国特許第５，５６７，８５９号、第５，６９１，３８７号、第５，６９６，２９８号及び第５，９９０，２４１号参照。これらの特許はすべてＥｍａｎｕｅｌｅらに許諾され、上記のようなＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーに関するものである）。更にＷＯ９６／０４９３２は、界面活性剤の特性を有しておりワクチンアジュバントとして生物学的有効性を示す高分子量ＰＯＥ／ＰＯＰブロックコポリマーを開示している。
【０００３】
１９９７年８月１２日に許諾された米国特許第５，６５６，６１１号及びＷＯ９９／０６０５５は、ポリヌクレオチドと、非イオン性部分及びポリカチオン性部分を含有するブロックコポリマーとから成る組成物を開示している。界面活性剤が溶解度を向上させるために添加されていること、最終目的がミセルの形成であることは明白である。
【０００４】
ＷＯ９９／２１５９１は、ポリヌクレオチドとベンジルアンモニウム基含有界面活性剤との水性混合物から成る可溶性のイオン複合体を開示している。
【０００５】
これらの報告にもかかわらず、プラスミドＤＮＡとアジュバントとのｉｎ  ｖｉｔｒｏ物理的会合を増強し、それに付随してｉｎ  ｖｉｖｏ免疫応答の増強を促進するようなＤＮＡワクチンアジュバント及び類縁のポリヌクレオチドワクチン製剤の開発が依然として要望されている。本発明は、（１）ポリヌクレオチドとのｉｎ  ｖｉｔｒｏ会合の増進を示すアジュバント、及び、（２）これらのアジュバントを含有しておりそれぞれのポリヌクレオチドに関して予測されるｉｎ  ｖｉｖｏ免疫応答の付随的な増加を示すポリヌクレオチドワクチン製剤、を開示することによってこれらの要望に対処しこれらの要望を充足させる。
【０００６】
（発明の概要）
本発明の一部は、ブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成るポリヌクレオチドワクチンのアジュバントに関する。カチオン性界面活性剤を混在させる結果として、混合及び／またはブロックコポリマーの曇り点を経由する温度サイクルの処理中にブロックコポリマー／カチオン性界面活性剤と物理的に会合するポリヌクレオチドの割合が増加する。その結果として、ポリヌクレオチドワクチン及び／または遺伝子治療の主体となるトランスジーンに対するｉｎ  ｖｉｖｏ免疫応答が増強される。このために、本発明の一部は、ポリヌクレオチドワクチン及び遺伝子治療を主体とする用途におけるアジュバントの使用に関する。このような用途ではアジュバントと負電荷をもつポリヌクレオチドワクチン成分との会合特性が増強され、その結果として、宿主に投与する前のワクチン製剤中でアジュバントと会合しているポリヌクレオチドの割合が増加する。
【０００７】
本発明はまた、医薬として許容されるポリヌクレオチドワクチン製剤に関する。本発明の製剤はポリヌクレオチド成分とアジュバント成分とから成り、アジュバント成分はブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成る。これらの製剤は、アジュバントと会合したポリヌクレオチドをある程度の割合で含有し、かつ、遊離ポリヌクレオチド（即ち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアジュバントと会合していないポリヌクレオチド）をある程度の割合で含有するであろう。本発明の製剤では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアジュバントと会合したポリヌクレオチドの割合が増加しており、その結果としてｉｎ  ｖｉｖｏの免疫応答の付随的な増強が得られる。
【０００８】
従って本発明は、非イオン性ブロックコポリマーを含んでおり、この非イオン性ブロックコポリマーが、（１）約１００ｎｍ乃至約２，０００ｎｍのサイズ範囲の微粒子を形成し、（２）室温以下の温度の曇り点を有し、及び、（３）核酸分子に対するブロックコポリマー微粒子の会合を増強し得るカチオン性界面活性剤に結合しているようなアジュバント及びポリヌクレオチドワクチンに関する。これらを考慮すれば、本発明は、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）／ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）ブロックコポリマーのような非イオン性ブロックコポリマー、特に、一般式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨで表され、式中の、（ｂ）は疎水性ＰＯＰ部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約２０，０００ダルトン未満であるような数を表し、（ａ）は親水性ＰＯＥ部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約１重量％乃至４０重量％の範囲であるような数を表す高分子量ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーと、カチオン性界面活性剤とから成るアジュバント及びポリヌクレオチドワクチンに関する。好ましい製剤は本文中に詳細に記載されている。
【０００９】
本発明はまた、ブロックコポリマーと本明細書に記載したようなカチオン性界面活性剤とポリヌクレオチドのような抗原の存在下で粒子凝集をコントロールするために有効な賦形剤となるポリソルベート−８０のような非イオン性界面活性剤とから成るアジュバントに関する。従って本発明は、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）／ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）ブロックコポリマーのような非イオン性ブロックコポリマー、特に、一般式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨで表され、式中の、（ｂ）は疎水性ＰＯＰ部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約２０，０００ダルトン未満であるような数を表し、（ａ）は親水性ＰＯＥ部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約１重量％乃至４０重量％の範囲であるような数を表す高分子量ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーと、カチオン性界面活性剤と、ポリヌクレオチド分子群の存在下で粒子凝集を阻害する非イオン性界面活性剤または別の賦形剤とから成るアジュバントに関する。
【００１０】
本発明はまた、ポリヌクレオチドワクチン製剤に関する。該製剤は、第一に、ポリヌクレオチドと、本明細書に記載したようなブロックコポリマーと界面活性剤とから成るアジュバント成分とを含み、第二に、ポリカチオンの存在下で粒子凝集をコントロールするために有効な賦形剤となるポリソルベート−８０のような非イオン性界面活性剤またはグリセロールのような別の賦形剤を含む。従って本発明は、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）／ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）ブロックコポリマーのような非イオン性ブロックコポリマー、特に、一般式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨで表され、式中の、（ｂ）は疎水性ＰＯＰ部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約２０，０００ダルトン未満であるような数を表し、（ａ）は親水性ＰＯＥ部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約１重量％乃至４０重量％の範囲であるような数を表す高分子量ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーと、カチオン性界面活性剤と、ポリカチオン分子群の存在下で粒子凝集を阻害するため有効な非イオン性界面活性剤または別の賦形剤とから成るポリヌクレオチドワクチンに関する。
【００１１】
本発明はまた、本発明のアジュバント添加ポリヌクレオチドワクチン製剤を脊椎動物宿主に投与することによって脊椎動物宿主の体内で免疫応答を誘発するかまたは治療用タンパク質の発現を促進する方法に関する。好ましい宿主は、哺乳類宿主、好ましくはヒトまたはヒト以外の外国産または国内産の獣医学上重要な哺乳類である。
【００１２】
従って本発明は、ヒトまたはヒト以外の哺乳類のような標的宿主の体内に投与されると有効な免疫応答を促進するために有効なアジュバント、ポリヌクレオチドワクチン組成物／製剤、及び、それぞれの使用方法に関する。本文中で使用された“アジュバント”という用語は、開示された本発明のアジュバント組成物及び製剤に関して使用されるので特定の作用モードには限定されない。本文中で使用された“アジュバント”という用語は、ポリヌクレオチドから抗原が発現したときのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫応答が増進されるように、抗原、例えば送達されたポリヌクレオチドから発現された抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する物質または物質の組合せを意味する。また、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞への遺伝子送達の促進剤として作用し、これによって所期の抗原を発現できる細胞に送達されたプラスミドＤＮＡの量を増加させる物質もこの定義に含意される。プラスミドＤＮＡの送達を増強し得る物質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、製剤中のプラスミドと実質的に相互作用しない物質、及び、プラスミドＤＮＡと相互作用し、アジュバントとプラスミドＤＮＡとの強固に結合した複合体または弱く結合した複合体を形成する物質を包含する。
【００１３】
本発明の１つの目的は、非イオン性ブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成る改良されたアジュバントを提供することである。該アジュバントは、特にポリヌクレオチドワクチンまたは疾患もしくは異常の部分的もしくは全面的改善に貢献する治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドとの同時投与を介してワクチンに対するｉｎ  ｖｉｖｏ免疫応答の増強を促進する。
【００１４】
また、直前の文節に記載したようなポリヌクレオチドとアジュバント成分との双方を含むポリヌクレオチドを基剤とする製剤を提供することも本発明の１つの目的である。
【００１５】
従って本発明の別の目的は、本発明のポリヌクレオチドワクチン製剤を標的宿主に投与し、標的宿主の体内で免疫応答または治療用タンパク質の発現を促進する方法を提供することである。
【００１６】
従って本発明の１つの目的は、ヒト及びヒト以外の哺乳類のような脊椎動物宿主系の体内のｉｎ  ｖｉｖｏ免疫応答を促進すべく作用するアジュバント及びこのようなアジュバントを含有するポリヌクレオチドワクチン製剤を提供することである。本文中で指摘したように、アジュバントという用語は、抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する任意の物質または物質の組合せを含意するであろう。この開示は理論によって限定されていないので、細胞内部への遺伝子送達の促進剤として作用し、これによって所期の抗原を発現できる標的細胞に送達されたプラスミドＤＮＡの量を増加させる物質は、アジュバントとして作用する物質の定義に包含されるであろう。
【００１７】
本文中で使用された“ＰＢＳ”は、リン酸塩緩衝生理食塩水を意味する。
【００１８】
本文中で使用された“ＢＡＫ”は、ベンジルアルコニウムクロリドを意味する。
【００１９】
本文中で使用された“ＢＥＣ”は、ベンズエトニウムクロリドを意味する。
【００２０】
本文中で使用された“ＣＰＣ”は、セチルピリジニウムクロリドを意味する。
【００２１】
本文中で使用された“ＣＴＡＣ”は、セチルトリメチルアンモニウムクロリドを意味する。
【００２２】
本文中で使用された“Ｄｈ”は、流体力学的直径を意味する。
【００２３】
本文中で使用された“ＰＳ−８０”はポリソルベート８０を意味する。
【００２４】
本文中で“粒子”及び“微粒子”という用語は互換的に使用されている。
【００２５】
本文中で使用された“アジュバント”という用語は、抗原に対する免疫応答を非特異的に増強する任意の物質または物質の組合せを意味する。この用語はまた、本文中に更に示されているように、脊椎動物または哺乳類宿主例えばヒトまたはヒト以外の哺乳類宿主体内のポリヌクレオチドの送達に直接的に関係して免疫応答を増進し、ポリヌクレオチドと組合せたアジュバントの投与がポリヌクレオチドにコードされた１以上の所期の抗原の発現に対するｉｎ  ｖｉｖｏ免疫応答を増進するような任意の物質を意味する。また、遺伝子送達促進剤として作用し、これにより所期の抗原を発現できる細胞に送達されたプラスミドＤＮＡの量を増加させる物質もこの定義に包含される。プラスミドＤＮＡの送達を増進し得る物質としては、製剤中のプラスミドＤＮＡと実質的に相互作用しない物質、及び、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでプラスミドＤＮＡと相互作用してアジュバントとプラスミドＤＮＡとの結合が強固な複合体または結合が弱い複合体を形成する物質がある。
【００２６】
本文中で使用された“ポリヌクレオチド”という用語は、生きた脊椎動物細胞に導入された核酸分子が細胞機構を指令して該核酸分子を含む遺伝子にコードされた翻訳産物を産生するための必須調節要素を含有する核酸分子を意味する。
【００２７】
本文中で使用された“ポリヌクレオチドワクチン”、“ポリヌクレオチドワクチン製剤”、“医薬”及び“ワクチン”という用語は、予防的または治療的な免疫応答を誘発するために有効なポロキサマーと本文中に開示されたカチオン性界面活性剤とを含む組成物のようなポリヌクレオチドを基剤とする組成物を示すために互換的に使用されている。このような組成物は、有益なトランスジーンをヒトまたはヒト以外の哺乳類宿主のような脊椎動物宿主に送達するビヒクルであってもよく、特定生物に対するトランスジーンワクチンの治療用発現レベルを促進するビヒクルであってもよく、または、免疫応答及び治療用発現レベルの双方を生じさせるビヒクルであってもよい。
【００２８】
本文中で使用された“ベクター”という用語は、大抵は抗原または抗原性エピトープを発現するトランスジーンまたはその一部分から成るＤＮＡフラグメントを宿主生物または宿主組織に導入し得るビヒクルを意味する。多様な種類のベクターが存在しており、その非限定例は、ＤＮＡプラスミドベクターのような組換えベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターのような組換えウイルスベクター、バクテリオファージベクター並びにコスミドベクターである。
【００２９】
“生物学的有効量”という用語は、適正なレベルのポリペプチドを生じさせ、必要な体液性免疫応答及び／または細胞性免疫応答を生じさせるために十分量のポリヌクレオチドワクチンまたはアジュバント添加ポリヌクレオチドワクチンが注入されることを意味する。適正なポリペプチドレベルが一定の値でないことは当業者の認めるところであろう。
【００３０】
“遺伝子”または“トランスジーン”という用語は、個別タンパク質またはその一部分、例えば、宿主の体内で適正な免疫応答を誘発する全長タンパク質の一部分をコードする核酸分子のセグメントを意味する。
【００３１】
（図面の簡単な説明）
図１は、ＰＢＳ中のＣＲＬ−１００５の粒度に対するベンズアルコニウムクロリド及びベンズエトニウムクロリドの効果を示す。
【００３２】
図２Ａ及び２Ｂは２乃至１３％のショ糖勾配を使用し８０，０００ｒｐｍ（３４８，０００×ｇ）で１．５時間処理したときのプラスミドＤＮＡの沈降を示す。図２Ｂはｙ軸を拡大して示す図である。図２Ａでは画分１５−１６に回収されたＤＮＡの量が示されているが、図２Ｂは拡大されているのでこの量が示されていない。図中にポリマーに会合したＤＮＡの％が示されているとき、どの場合にもこれらはＤＮＡの総回収率を示す。
【００３３】
図３Ａ及び３Ｂは、ＣＲＬ−１００５の非存在下で０．８５ｍＭのＢＡＫ、５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡをショ糖勾配によって処理したときのプラスミドＤＮＡの沈降（図３Ａ）及びＢＡＫの沈降（図３Ｂ）を示す。ＤＮＡ回収率は９３％であった。
【００３４】
図４Ａ及び４Ｂは、７．５ｍｇ／ｍｌのＣＲＬ−１００５の存在下で０．８５ｍＭのＢＡＫ、５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを含むサンプルをショ糖勾配によって処理したときのプラスミドＤＮＡの沈降（図３Ａ）及びＢＡＫの沈降（図３Ｂ）を示す。ＤＮＡ回収率は９７％であった。
【００３５】
図５は、ＰＢＳ中で調製した２乃至１３％のショ糖勾配で処理したときの０．８５ｍＭのＢＡＫ、７．５ｍＭのＣＲＬ−１００５、５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを含むサンプル及び０．８５ｍＭのＢＡＫ単独のＢＡＫ沈降プロフィルを示す。
【００３６】
図６はＣＲＬ−１００５に会合したプラスミドＤＮＡの％に対するＢＡＫ濃度の効果を示す。
【００３７】
図７は表２に記述したような製剤Ｄ１１８及びＤ１２１の製剤の再現性及び短期安定性を示す。
【００３８】
図８は、２２．５ｍｇ／ｍｌのＣＲＬ−１００５を含有する製剤の粒度に対するＢＡＫ濃度の効果を示す。製剤Ｄ１２１、Ｄ１２９、Ｄ１３０及びＤ１３１は表２に記述されている。
【００３９】
図９は、表２に記述したような製剤Ｄ１１８及びＤ１２１中のＣＲＬ−１００５の粒度に対する３０℃インキュベーションの効果を示す。
【００４０】
図１０は、ＣＲＬ−１００５粒子に対するＢＡＫの結合を示す。
【００４１】
図１１は、ＣＲＬ−１００５の曇り点よりも高い温度の製剤Ｄ１１８中のＤＮＡ／ＢＡＫ沈降物の溶解を示す。製剤Ｄ１１８は表７に記述されている。
【００４２】
図１２は、ＣＲＬ−１００５を含有する場合と非含有の場合について５．０ｍｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡと０．６ｍＭのＢＡＫとを含有する製剤の粒度分布（単位は容量％）を示す。
【００４３】
図１３は、ＣＲＬ−１００５を含有する場合と非含有の場合について５．０ｍｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡと０．６ｍＭのＢＡＫとを含有する製剤の粒度分布（単位は数％）を示す。
【００４４】
図１４は、表７に記述されている製剤Ｄ１１３及びＤ１１８中のＣＲＬ−１００５の粒度分布を示す。
【００４５】
図１５は、表７に記述されている製剤Ｄ１１８ａ中のＣＲＬ−１００５の粒度分布を示す。
【００４６】
図１６は、表７に記述されている製剤Ｄ１４５中のＣＲＬ−１００５の粒度分布を示す。
【００４７】
図１７は、製剤Ｄ１１８ａ中のＣＲＬ−１００５の粒度分布の２５℃における安定度を示す。製剤Ｄ１１８ａは表７に記述されている。
【００４８】
（詳細な説明）
本発明は、遺伝子治療及び／またはワクチンの用途に使用するためのアジュバント及びそれぞれのアジュバント添加ポリヌクレオチドワクチン製剤及び類縁の医薬品に関する。これらの製剤及び医薬品は、ポリヌクレオチド分子とブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成る。これらのアジュバント添加核酸製剤及び医薬品は、核酸を主体とする遺伝子治療及び／またはワクチン接種の用途で免疫応答を現在入手可能な製剤に比較して顕著に増強する。本文中に記載のＤＮＡワクチン製剤に有用なブロックコポリマーは、室温（ブロックコポリマーの曇り点よりも高い温度）で微粒子を形成し、プラスミドＤＮＡ分子群のような核酸分子の群と会合する機能を有しているようなブロックコポリマーであり、また、得られた会合はカチオン性界面活性剤の添加によって増強される。本発明の核酸分子としては、ゲノムＤＮＡ及び相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）のようなデオキシリボ核酸分子（ＤＮＡ）、並びに、リボ核酸分子（ＲＮＡ）がある。ブロックコポリマーに関しては、このようなブロックコポリマーは、広範囲のヒト及び／またはヒト以外の動物に投与することを標的とするＤＮＡワクチン製剤中でアジュバント機能を有しているブロックコポリマーが好ましい。このために、本発明のＤＮＡ製剤に有用なコポリマーの好ましいグループは、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）とポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）とのブロックから成る非イオン性ブロックコポリマーである。本文中に使用された典型的なＰＯＥ／ＰＯＰブロックコポリマーは、Ｎｅｗｍａｎら（１９９８，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５（２）：８９−１４２）によって考察されているように構造ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥを有しているであろう。本発明のＤＮＡワクチン製剤中で使用するための好ましいブロックコポリマーは、ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥの構造をもち、中央のＰＯＰブロックが分子量１，０００乃至約２０，０００ダルトンの範囲であり、両側に隣接のＰＯＥブロックがコポリマーの全分子量の約４０％以下であるようなブロックコポリマーである。初期に開示されたプルロニック主体のＰＯＥ／ＰＯＰブロックコポリマーよりもはるかに大きいこのようなブロックコポリマーは米国再発行特許第３６，６５５号に詳細に記載されている。本発明のＤＮＡ製剤を例示するために使用された代表的なＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーはＷＯ９６／０４３９２に開示されており、またＮｅｗｍａｎら（前出）に詳細に記載されており、ＣＲＬ  １００５（ＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐ）と呼ばれている。本発明の非イオン性コポリマーの合成は公知であり、例えば米国特許第２，６７４，６１９号に記載されている。該特許の記載内容全体が参照によって本発明に含まれるものとする。またＮｅｗｍａｎら（１９９８，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５（２）：８９−４２）にも記載されており、該文献の記載内容全体も参照によって本発明に含まれるものとする。
【００４９】
本文中に提示したデータは、少量のプラスミドＤＮＡがＣＲＬ−１００５単独のようなＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥコポリマーに弱く会合することを示す。本発明の目的は、例えばＣＲＬ−１００５に比べて物理的に異なる粒子を形成することであり、該粒子中で３つの成分全部が会合しており、本発明のブロックコポリマーに対するプラスミドＤＮＡの会合がより促進され、その結果として細胞性免疫応答が顕著に増強される。従って、本発明の目的は、ポリヌクレオチドとブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とを組合せることによって、コポリマー／カチオン性界面活性剤を基剤とするアジュバントに対するポリヌクレオチドの会合の実質的な増進、及びその結果として細胞性免疫応答の有効な増強が可能であると開示することである。実施例の項に示したデータは、プラスミドＤＮＡをＣＲＬ−１００５粒子に会合させると免疫応答が改善されることを示唆しているが、免疫応答を増強するメカニズムは現時点では未解明である。理論的に確定されてはいないが、ＣＲＬ−１００５粒子に会合したＤＮＡが細胞によって摂取され易くかつ発現され易くなるという可能性が考えられる。また、プラスミドＤＮＡがＣＲＬ−１００５／ＢＡＫ粒子に会合することによって生じたＣＲＬ−１００５粒子の表面の負電荷がＣＲＬ−１００５のアジュバント特性を増強するために重要であるという可能性も考えられる。実施例の項に提示したデータからは、免疫応答増強メカニズムとして考えられるこれらの２つのメカニズムを見分けることはできない。実施例の項の表面電荷（ゼータ電位）の測定値及びＣＲＬ−１００５粒子に会合したＤＮＡの量は、プラスミドＤＮＡ／ブロックコポリマー（ＣＲＬ−１００５）とカチオン性界面活性剤（例えば、ＢＡＫ）との相互作用モデルに一致する。該モデルは、疎水性相互作用を介してＣＲＬ−１００５の粒子にＢＡＫが結合すると、その結果としてＣＲＬ−１００５の粒度が縮小し、正電荷をもつＣＲＬ−１００５粒子が形成されることを示唆する。ポリヌクレオチド（ＨＩＶ  ｇａｇをコードするプラスミドＤＮＡ）の結合は、カチオン性界面活性剤（ＢＡＫ）の頭部の正帯電基とＤＮＡリン酸基との間の静電相互作用を介して生じると考えられている。カチオン性界面活性剤の疎水性尾部はブロックコポリマー（ＣＲＬ−１００５）粒子に埋め込まれている。本文中の開示によれば、ポリヌクレオチドと高分子量ポロキサマーのようなブロックコポリマーとＢＡＫのようなカチオン性界面活性剤とから成る溶液を室温に加温することで、カチオン性界面活性剤が欠如した組成物に比較してポリヌクレオチド分子とアジュバント（即ちポロキサマー主体の粒子）との会合が増進していることを示唆する表面電荷及び直径をもつ微粒子群が形成される。このようなポリヌクレオチドの会合の増進（例えば実施例１−５、表１及び表３参照）は、ポリヌクレオチドがＨＩＶ  ｇａｇを発現するようなポリヌクレオチド／ポロキサマー／ＢＡＫを含有する微粒子を接種したアカゲザルのｉｎ  ｖｉｖｏ免疫応答の増進につながる（例えば、実施例７、１２、１３及び１４参照）。
【００５０】
上記に指摘したように、本文中に例示したポリヌクレオチドワクチンはＨＩＶ  ｇａｇである。しかしながら、ヒトまたはヒト以外の哺乳類のような脊椎動物宿主用、特にヒト用及び動物薬学用の本文中に開示したアジュバント添加ポリヌクレオチドワクチン及び使用方法に使用するために多数のポリヌクレオチドワクチン構築物を考察できることは平均的な当業者に明らかであろう。例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）を発現するＤＮＡプラスミドベクター、インフルエンザＡの表面糖タンパク質、インフルエンザＡの核タンパク質、肝炎Ｂ型ウイルスのＨＢｓＡｇ表面抗原があり、また、ｐｏｌ、ｎｅｆ、ｅｎｖ（例えばｇｐ１２０、ｇｐ４１または完全ｇｐ１６０構築物など）、ｔａｔ及びｒｅｖなどを非限定例とする他のＨＩＶの構築物がある。従って本明細書が、実施例の項に明記されていない他の構造をもつ本発明の核酸製剤を使用するための優れた指針を当業者に与えることは明らかである。従って、種々のＤＮＡ構築物、送達モード、疾患及び抗原標的を表す多数の別の構築物を本発明のワクチン製剤に使用できる。予防的または治療的な処置として使用できるウイルス性または細菌性の抗原投与の非限定例は、インフルエンザ、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、結核、ヒトパピローマウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎である。また、癌、自己免疫疾患のような非感染性疾患及び種々のアレルギーの予防的またはより頻繁には治療的な処置を与えることも本発明の範囲内であろう。更に、狂犬病、ジステンパー、口蹄疫、炭疽病、ウシ単純疱疹及びウシ結核を非限定例とする幾つかの動物薬に本発明の製剤を使用することは当業者の視野の範囲内であろう。
【００５１】
本発明は、一部が非イオン性ブロックコポリマーから成るアジュバント添加ポリヌクレオチドワクチン製剤に関する。本発明によれば、本文中に記載したような粒度及び表面電荷の発生を促進する任意のブロックコポリマーの使用が考えられるが、好ましい非イオン性ブロックコポリマーは、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）／ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）ブロックコポリマー、特に、高分子量のＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーである。発明の背景の項で指摘したように、これらの化合物は米国再発行特許第３６，６６５号、米国特許第５，５６７，８５９号、第５，６９１，３８７号、第５，６９６，２９８号及び第５，９９０，２４１号、並びにＷＯ９６／０４３９２に記載されている。これらの全部の特許が参照によって本発明に含まれるものとする。簡単に説明すると、これらの非イオン性ブロックコポリマーは以下の一般式：
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ
を有しており、式中の、（ｂ）は疎水性ＰＯＰ部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約２０，０００ダルトン以下であるような数を表し、（ａ）は親水性ＰＯＥ部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約１重量％乃至４０重量％の範囲であるような数を表す。
【００５２】
ワクチンアジュバントとして使用できる好ましいＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーは以下の一般式：
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ
を有しており、式中の、（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約９，０００ダルトン乃至１５，０００ダルトンの範囲であるような数を表し、（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約３％乃至３５％の範囲であるような数を表す。
【００５３】
ワクチンアジュバントとして使用できる別の好ましいＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーは以下の一般式：
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ
を有しており、式中の、（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約９，０００ダルトン乃至１５，０００ダルトンの範囲であるような数を表し、（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約３％乃至１０％の範囲であるような数を表す。
【００５４】
ワクチンアジュバントとして使用できる好ましい界面活性コポリマーは以下の一般式：
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ
を有しており、式中の、（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約９，０００ダルトンであるような数を表し、（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約３％であるような数を表す。
【００５５】
ワクチンアジュバントとして使用できる別の好ましい界面活性コポリマーは以下の一般式：
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ
を有しており、式中の、（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約１２，０００ダルトンであるような数を表し、（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約５％であるような数を表す。これは、（ａ）が約７＋／−１で、（ｂ）が約１２，０００ダルトンで約２０７単位＋／−７であるＣＲＬ−１００５の構造を表す。
【００５６】
本発明のアジュバント添加ポリヌクレオチドワクチン製剤はまたカチオン性界面活性剤を含んでいる。これらの製剤に使用できる候補となり得る多くのカチオン性界面活性剤が存在することは当業者に明らかであろう。従って本発明は、ブロックコポリマーと共に本文中に記載のような粒度及び表面電荷の発生を促進する任意のカチオン性界面活性剤の使用を考察している。使用され得るカチオン性界面活性剤の非限定例は、ベンズアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）、ベンズエトニウムクロリド、セトラミド（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド及び場合によっては少量のデデシルトリメチルアンモニウムブロミド及びヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有している）、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）及びセチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、第一級アミン、第二級アミン、Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−タロウ−１，３−ジアミノプロパンを非限定例とする第三級アミン、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミドを非限定例とする別の第四級アミン塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、混合アルキル−トリメチル−アンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジル−ジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、メチルベンズエトニウムクロリド、デカメトニウムクロリド、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２（２−メチル−４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ）エチル］−ベンゼンメタンアミニウムクロリド（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ジアシル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジアシル−３−（ジメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジオレオイル−３−（４′−トリメチル−アンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル−３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル、コレステリル（４′−トリメチルアンモニオ）ブタノエート）、Ｎ−アルキルピリジニウム塩（例えば、セチルピリジニウムブロミド及びセチルピリジニウムクロリド）、Ｎ−アルキルピペリジニウム塩、ジカチオニックボラフォーム電解質（Ｃ１２Ｍｅ６；Ｃ１２Ｂｕ６）、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リゾレシチン、Ｌ−αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、コレステロールヘミスクシネートコリンエステル、リポポリアミン類、コレステロールのカチオン性誘導体、である。リポポリアミン類の非限定例は、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノール−アミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリ−Ｌ（ま���はＤ）−リシン（ＬＰＬＬ，ＬＰＤＬ）、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンに共役したポリ（Ｌ（またはＤ）−リシン、アミノ側基をもつジドデシルグルタメートエステル（Ｃ１２ＧｌｕＰｈＣｎＮ＋）、アミノ側基をもつジテトラデシルグルタメートエステル（Ｃ１４ＧｌｕＣｎＮ＋）である。コレステロールのカチオン性誘導体の非限定例は、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンジチメルアミン及び３β［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン−カルボモイル］コレステロール）である。
【００５７】
本発明の好ましい特徴によれば、カチオン性界面活性剤が、ベンズアルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド、セトラミド、セチルピリジニウムクロリド及びセチルトリメチルアンモニウムクロリドから成るグループから選択される。ベンズアルコニウムクロリドは市販されており、一般式：
［Ｃ６Ｈ５ＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２Ｒ］Ｃｌ
のアルキルベンジルジメチルアンモニウムクロリドの混合物として存在することが知られている。式中の、Ｒはｎ−Ｃ８Ｈ１７からｎ−Ｃ１６Ｈ３３で始まる基の全部または幾つかを含むアルキルの混合物を表す。ＢＡＫの平均ＭＷは３６０である（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｅｄ．Ｗａｄｅ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ，１９９４，２ｎｄ  Ｅｄ．ｐｐ．２７−２９参照）。ベンズエトニウムクロリドはＮ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２−［２−［４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェノキシ］エトキシ］エチル］ベンゼン−メタンアミニウムクロリド（Ｃ２７Ｈ４２ＣｌＮＯ２）であり、これは分子量４４８．１０を有している（同上、ｐｐ．３０−３１）。セトラミドは主として、トリメチルテトラデシルアンモニウムブロミド（Ｃ１７Ｈ３８ＢｒＮ）から成り、少量のドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ１５Ｈ３４ＢｒＮ）及びヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド（Ｃ１９Ｈ４２ＢｒＮ）を含有してもよく、分子量３３６．４０を有している（同上、ｐｐ．９６−９８）。
【００５８】
本発明の本質は、ポリヌクレオチド分子に接触したブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成る微粒子を（ＣＲＬ−１００５または別の代表的なブロックコポリマーの曇り点よりも高温で）発生させることである。粒子に対するポリヌクレオチド分子の会合の増強を促進し次いでこの微粒子のアジュバント特性を増強するのは加温中にコポリマー／界面活性剤アジュバント粒子が形成されるからである。実施例の項には、カチオン性界面活性剤であるベンズアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）、ベンズエトニウムクロリド、セチルピリジニウムクロリド及びセチルトリメチルアンモニウムクロリドがＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーであるＣＲＬ−１００５の粒子に対するプラスミドＤＮＡの会合を有意に増強することが開示されている。アカゲザルの免疫原性結果は（実施例７）、ＨＩＶ−ＦＬｇａｇプラスミドＤＮＡとＣＲＬ−１００５とを含有する製剤にＢＡＫのようなカチオン性界面活性剤を添加すると、ＨＩＶ−ｇａｇに対する細胞性免疫応答がＢＡＫ非含有の製剤に比べて増強されることを示す。５ｍｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡと７．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５と０．７５ｍＭのＢＡＫとを含有する製剤（製剤Ｄ１２１）中では約３％のプラスミドＤＮＡがアジュバントと会合している。
【００５９】
従って、本発明の目的は、プラスミドＤＮＡのようなポリヌクレオチドとの会合が増強された微粒子を発生させる機能である。上記に指摘したように、実施例の項のデータは、ＣＲＬ−１００５粒子に対するプラスミドＤＮＡの会合が免疫応答の改善に導くことを示唆しているが、免疫応答を増強するメカニズムは未解明である。ＣＲＬ−１００５粒子に会合したＤＮＡが細胞によって摂取及び発現され易くなるのかも知れない。また、ＣＲＬ−１００５／ＢＡＫ粒子とプラスミドＤＮＡとの会合によって生じたＣＲＬ−１００５粒子表面の負電荷がＣＲＬ−１００５のアジュバント特性を増強するために重要であるのかも知れない。免疫応答の増強について推測されるこれらの２つのメカニズムを実施例の項に提示したデータによって見分けることはできない。本発明の１つの実施態様では、形成された粒子の粒径が約１００ｎｍから約２，０００ｎｍの範囲である。カチオン性界面活性剤の存在下の非イオン性ブロックコポリマー粒子は正の表面電荷を有しているが、カチオン性界面活性剤とＤＮＡとの存在下のポリマー粒子はポリマー粒子単独よりも有意に負の表面電荷を有するであろう。実施例の項に記載した代表的な微粒子（例えば表３）は約２００−６００ｎｍの粒径を有しており、ＢＡＫの存在下のゼータ電位の測定値は、ポリヌクレオチド不添加の場合には僅かに正の値であり（ＣＲＬ−１００５及び０．７１ｍＭのＢＡＫの場合に約２．５ｍＶ）、ポリヌクレオチド（５ｍｇ／ｍｌ）が存在するときは負の値である（ＣＲＬ−１００５及び０．７１ｍＭのＢＡＫ及び５ｍｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡの場合は約−４６．６ｍＶ）。これらの値は参考になる数値であるが、限定的な数値ではない。表３に記載の量的な測定値は、アジュバント及びポリヌクレオチドワクチン製剤の構造的特徴を示すために有効な。しかしながら、カチオン性界面活性剤の添加が粒子の立体配置または構造保全性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を変化させ、変化した構造とポリヌクレオチド分子との相互作用機能が増進されるという質的な変化を考えることが重要である。コポリマー／界面活性剤を基剤とする粒子に対するポリヌクレオチド分子の会合機能は向上しており、これがＤＮＡ／ポロキサマーだけを用いた接種に比べたｉｎ  ｖｉｖｏの細胞性免疫応答の増強につながることが本文中で証明された。従って、種々の粒子の表面電荷及びサイズの測定値は参考になるが、必ずしも限定的な数値ではない。むしろこれらの測定値は、当業者が特許請求の範囲に記載の本発明を実施するとき、１つのタイプのブロックコポリマーを１つのタイプのカチオン性界面活性剤と共に使用して別の微粒子、即ち、特定のポリヌクレオチド分子群との会合機能が向上したことを最終的な特徴とする微粒子が得られたことを実証するために有効な数値である。例えば、表３は、プラスミドＤＮＡが単独では約−４８．５ｍＶの表面電荷及び約６６ｎｍの流体力学的直径を有しており、ＣＲＬ−１００５と共存するプラスミドＤＮＡは約−５．１ｍＶの表面電荷及び約１３８７ｎｍの直径を有するアジュバント材料となり、ＣＲＬ−１００５と０．７１ｍＭのＢＡＫと共存するときは、約２．５ｍＶの表面電荷及び約２２６ｎｍの��径をもつまた別の構造的に異なる粒子を生じることを示している。最後に、３つの成分全部を混合し、曇り点よりも高温の溶液にすると、約−４６．６ｍＶの表面電荷及び約６７４ｎｍの直径をもつまた別の異なる粒子が生じる。また、上記に指摘したように、このＤＮＡ／ポロキサマー／カチオン性界面活性剤粒子が大量の会合ポリヌクレオチド（約３％）を含有していることが本文中に示されており、これがｉｎ  ｖｉｖｏ細胞性免疫応答を増強することも示されている。従って、これらのデータは、種々の成分の混合が実際に、異なる表面電荷特性をもつ異なる粒子を生じること、及び、ＤＮＡ／ポロキサマー／カチオン性界面活性剤がアジュバント活性を増強するようにワクチン部分とアジュバント部分との会合を増進させることを示すために役立つ。従ってこれらのまたは同様の測定値は、１つの特定ブロックコポリマーアジュバントと別の特定カチオン性界面活性剤との適正な組合せを当業者が決定するときの参考となる。
【００６０】
以上の記載を考察し、本発明の一部は、ブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成るアジュバント及び該アジュバントを含む類縁のポリヌクレオチドワクチン製剤に関する。カチオン性界面活性剤が混在する結果、混合によってブロックコポリマー／カチオン性界面活性剤と物理的に会合するポリヌクレオチドの割合が増加し、その結果としてポリヌクレオチドワクチン及び／または遺伝子治療の主体となるトランスジーンに対するｉｎ  ｖｉｖｏの免疫応答が増強される。このために、本発明は部分的には、ポリヌクレオチドワクチン及び遺伝子治療を主体とする用途に使用するためのアジュバントに関する。該アジュバントは、負電荷をもつポリヌクレオチドワクチン成分との会合特性が増強され、その結果として宿主に投与する前にワクチン製剤中でアジュバントと会合しているポリヌクレオチドの割合が増加する。
【００６１】
本発明はまた、ブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成るポリヌクレオチドワクチンのアジュバントに関する。ブロックコポリマーはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）／ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）ブロックコポリマー、特に、一般式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨを有しており、式中の、（ｂ）は疎水性ＰＯＰ部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約２０，０００ダルトン以下であるような数を表し、（ａ）は親水性ＰＯＥ部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約１重量％乃至４０重量％の範囲であるような数を表す高分子量ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーである。
【００６２】
本発明の１つの実施態様は、ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成り、ブロックコポリマーが一般式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨを有しており、式中の、（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約９，０００ダルトン乃至１５，０００ダルトンの範囲であるような数を表し、（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約３％乃至３５％の範囲、好ましくは１０％以下であるような数を表すことを特徴とするアジュバントである。
【００６３】
本発明の別の実施態様は、ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成り、ブロックコポリマーが一般式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨを有しており、式中の、（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約９，０００ダルトンであるような数を表し、（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約３％乃至５％の範囲であるような数を表すことを特徴とするアジュバントである。
【００６４】
本発明のまた別の実施態様は、ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成り、ブロックコポリマーが一般式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨを有しており、式中の、（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約１２，０００ダルトンであるような数を表し、（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約５％であるような数を表すことを特徴とするアジュバントであ。このようなブロックコポリマーとしては例えば、（ａ）が約７単位＋／−１で、（ｂ）が約１２，０００ダルトンで約２０７単位＋／−７であるＣＲＬ−１００５がある。
【００６５】
本発明は更に、上記及び本文中に記載の１種または複数のブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とを含有するアジュバントに関する。カチオン性界面活性剤の非限定例は、ベンズアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）、ベンズエトニウムクロリド、セトラミド、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）及びセチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）から成るグループから選択されたカチオン性界面活性剤である。当業界で公知の別のカチオン性界面活性剤及び特に本明細書中で言及したカチオン性界面活性剤を上記に列挙した１つまたは複数の界面活性剤に代替し得る。
【００６６】
本発明の特定実施態様は、式：
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ
を有しており、式中の、（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約９，０００ダルトンであるような数を表し、（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約３％乃至５％の範囲であるような数を表すＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーと、カチオン性界面活性剤とから成り、ヒトに投与するために特に適当なアジュバントに関する。このようなカチオン性界面活性剤は、ベンズアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）、ベンズエトニウムクロリド、セトラミド、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）及びセチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）から成るグループから選択される。
【００６７】
本発明の別の実施態様は、式：
ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨ
を有しており、式中の、（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約１２，０００ダルトンであるような数を表し、（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約５％であるような数を表すＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーと、上記に列挙したようなカチオン性界面活性剤とから成り、ヒトに投与するために特に適当なアジュバントに関する。このようなカチオン性界面活性剤は、ベンズアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）、ベンズエトニウムクロリド、セトラミド、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）及びセチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）から成るグループから選択される。
【００６８】
本発明の特定実施態様は、ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーとしてＣＲＬ−１００５と、ベンズアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）、ベンズエトニウムクロリド、セトラミド、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）及びセチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）から成るグループから選択されたカチオン性界面活性剤とから成るアジュバントである。
【００６９】
本発明の特定実施態様は、ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーとしてＣＲＬ−１００５とカチオン性界面活性剤としてベンズアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）とから成るアジュバントである。
【００７０】
上記及び本文中に記載のアジュバントに加えて本発明は更に、ポリヌクレオチド成分とアジュバント成分とから成り、該アジュバント成分がブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成るポリヌクレオチドワクチン製剤に関する。これらの製剤は、アジュバントと会合したポリヌクレオチドをある割合で含み、遊離ポリヌクレオチド（即ち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアジュバントと会合しないポリヌクレオチド）をある割合で含む。本発明の製剤では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアジュバントと会合したポリヌクレオチドの割合が増加しており、それに付随してｉｎ  ｖｉｖｏの免疫応答が増強される。
【００７１】
このために、本発明のポリヌクレオチドワクチン製剤は、ポリヌクレオチド成分とブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成るポリヌクレオチドワクチン製剤に関する。ここでブロックコポリマーはポリオキシエチレン（ＰＯＥ）／ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）ブロックコポリマーのような非イオン性ブロックコポリマー、特に、一般式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨを有する高分子量ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーであり、式中の、（ｂ）は疎水性ＰＯＰ部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約２０，０００ダルトン以下であるような数を表し、（ａ）は親水性ＰＯＥ部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約１重量％乃至４０重量％の範囲であるような数を表す。
【００７２】
本発明の１つの実施態様は、ポリヌクレオチド成分とＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成り、該ブロックコポリマーが式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨを有しており、式中の、（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約９，０００乃至１５，０００ダルトンであるような数を表し、（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約３％乃至３５％の範囲、好ましくは１０％以下であるような数を表すことを特徴とするアジュバント添加ポリヌクレオチド製剤である。
【００７３】
本発明の別の実施態様は、ポリヌクレオチド成分とＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成り、該ブロックコポリマーが式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨを有しており、式中の、（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約９，０００ダルトンであるような数を表し、（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約３％乃至５％の範囲であるような数を表すことを特徴とするアジュバント添加ポリヌクレオチドワクチン製剤である。
【００７４】
本発明のまた別の実施態様は、ポリヌクレオチド成分とＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成り、該ブロックコポリマーが式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨを有しており、式中の、（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約１２，０００ダルトンであるような数を表し、（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約５％であるような数を表すことを特徴とするアジュバント添加ポリヌクレオチドワクチン製剤である。
【００７５】
本発明の他の実施態様は、ポリヌクレオチド成分とＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成り、ブロックコポリマーがＣＲＬ−１００５であるようなアジュバント添加ポリヌクレオチドワクチン製剤である。
【００７６】
カチオン性界面活性剤を含むアジュバントに関して、本発明はより特定的に、ポリヌクレオチド成分と、式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨを有しており、式中の、（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約９，０００ダルトンであるような数を表し、（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約３％乃至５％であるような数を表すＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーと、ヒトに投与するために特に適当なカチオン性界面活性剤とから成り、カチオン性界面活性剤がベンズアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）、ベンズエトニウムクロリド（ＢＥＣ）、セトラミド、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）及びセチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）から成るグループから選択されるポリヌクレオチドワクチン製剤に関する。
【００７７】
本発明の別の実施態様は、ポリヌクレオチド成分と、式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨを有しており、式中の、（ｂ）は疎水性部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約１２，０００ダルトンであるような数を表し、（ａ）は親水性部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約５％であるような数を表すＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマー（例えば本文中に記載のＣＲＬ−１００５）と、上記に記載したようなヒトに投与するために特に適当なカチオン性界面活性剤とから成り、カチオン性界面活性剤がベンズアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）、ベンズエトニウムクロリド（ＢＥＣ）、セトラミド、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）及びセチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）から成るグループから選択されるポリヌクレオチドワクチン製剤に関する。。
【００７８】
本発明の特定実施態様は、ポリヌクレオチド成分と、ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーとしてＣＲＬ−１００５及びベンズアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）、ベンズエトニウムクロリド（ＢＥＣ）、セトラミド、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）及びセチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）から成るグループから選択されるカチオン性界面活性剤を含むアジュバントとから成るポリヌクレオチドワクチン製剤である。
【００７９】
本発明の別の特定実施態様は、ポリヌクレオチド成分と、ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーとしてＣＲＬ−１００５及びカチオン性界面活性剤としてベンズアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）を含むアジュバントとから成るポリヌクレオチドワクチン製剤である。
【００８０】
本明細書を検討することによって当業者は、種々のポリカチオン、ポロキサマー、カチオン性界面活性剤、賦形剤を混合及び組合せることができ、また、これらの成分を種々の濃度で使用することができるであろう。当業者は、本文中に示したアジュバントまたはワクチン製剤の構造的特徴をｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定し、これらの成分をｉｎ  ｖｉｖｏ投与するための参考とすることができよう。核酸は各々が約０．５ｍｇ／ｍｌから約７．５ｍｇ／ｍｌの濃度範囲であり、ポロキサマーは約１乃至約７０ｍｇ／ｍｌの範囲であり、（１種または複数の）カチオン性界面活性剤は約０．１乃至１０ｍＭの濃度で存在するであろう。これらの成分のもっと好ましい範囲は、核酸が約１ｍｇ／ｍｌ乃至約７ｍｇ／ｍｌ、特に好ましくは５乃至６ｍｇ／ｍｌ、ポロキサマーが約５乃至約５０ｍｇ／ｍｌの濃度であり、（１種または複数の）カチオン性界面活性剤は約０．２乃至約２ｍＭの濃度で存在する。幾つかの好ましい製剤、例えば、製剤＃Ｄ１１８（ＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ、７．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５、０．４５ｍＭのＢＡＫ）及びＤ１２１（ＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ、７．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５、０．７５ｍＭのＢＡＫ）を表２に示し、開示されたＤ１１８ａを表７に示す。
【００８１】
本発明はまた、ブロックコポリマーと、本明細書に記載したようなカチオン性界面活性剤と、ポリソルベート−８０のような非イオン性界面活性剤とから成り、ポリヌクレオチドのような抗原の存在下で粒子凝集をコントロールする賦形剤として有用なアジュバントに関する。その他の非イオン性界面活性剤は当業界で公知であり、本発明のこの部分を実施するために使用され得る。これらの他の非イオン性界面活性剤の非限定例は、別のポリソルベート類、ｎ−アルキルフェニルポリオキシエチレンエーテル、ｎ−アルキルポリオキシエチレンエーテル類（例えば、ＴｒｉｔｏｎｓＴＭ）、ソルビタンエステル類（例えば、ＳｐａｎＴＭ）、ポリグリコールエーテル界面活性剤（ＴｅｒｇｉｔｏｌＴＭ）、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、ＴｗｅｅｎＴＭ）、ポリ−オキシエチル化グリコールモノエーテル類（例えば、ＢｒｉｊＴＭ、ポリオキシエチレン９ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン１０エーテル、ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル）、ルブロール、エチレンオキシドとプロピレンオキシドとのコポリマー（例えば、ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ＲＴＭ、ＴｅｔｒｏｎｉｃＴＭ、ＰｌｕｒａｄｏｔＴＭ）、アルキルアリールポリエーテルアルコール（ＴｙｌｏｘａｐｏｌＴＭ）、ペルフルオロアルキルポリオキシ化アミド類、Ｎ，Ｎ−ビス［３−Ｄ−グルコンアミドプロピル］コラミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−デシルβ−Ｄ−グルコピラノジド、ｎ−デシルβ−Ｄ−グルコピラノジド、ｎ−デシルβ−Ｄ−マルトピラノジド、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−グルコピラノジド、ｎ−ウンデシルβ−Ｄ−グルコピラノジド、ｎ−ヘプチルβ−Ｄ−グルコピラノジド、ｎ−ヘプチルβ−Ｄ−チオグルコピラノジド、ｎ−ヘキシルβ−ｄ−グルコピラノジド、ｎ−ノナノイルβ−グルコピラノジド、１−モノオレイル−ｒａｃ−グリセロール、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、Ｎ，Ｎ−ビス［３−グルコンアミドプロピル］デオキシコラミド、ジエチレングリコールモノペンチルエーテル、ジギトニン、ヘプタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ヘペノイル−Ｎ−メチルグルカミド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎ−オクチルβＤ−グルコピラノジド、ｎ−オクチルβＤ−グルコピラノジド、ｎ−オクチルβ−Ｄ−チオガラクトピラノジド、ｎ−オクチル−ｄ−チオグルコピラノジドである。従って本発明は、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）／ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）ブロックコポリマーのような非イオン性ブロックコポリマー、特に、一般式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨを有しており、式中の（ｂ）が疎水性ＰＯＰ部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約２０，０００ダルトン未満となるような数を表し、（ａ）が親水性ＰＯＥ部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約１重量％乃至４０重量％の範囲であるような数を表す高分子量ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーと、カチオン性界面活性剤と、ポリヌクレオチド分子の群の存在下で粒子凝集を阻害するために有用な非イオン性界面活性剤とから成るアジュバントに関する。
【００８２】
このために、本発明はまた、本明細書に記載したようなポリヌクレオチドとブロックコポリマーとカチオン性界面活性剤とから成るアジュバントを第一成分として含み、ポリソルベート−８０のような非イオン性界面活性剤またはその他の賦形剤を第二成分として含むポリヌクレオチドワクチン製剤に関する。その他の賦形剤の非限定例はグリセロールまたはプロピレングリコールのような当業界で公知の賦形剤または本文中に列挙したような非イオン性界面活性剤であり、これらは粒子凝集をコントロールするために有用な賦形剤である。従って本発明は、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）／ポリオキシプロピレン（ＰＯＰ）ブロックコポリマーのような非イオン性ブロックコポリマー、特に、一般式ＨＯ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａ（Ｃ３Ｈ６Ｏ）ｂ（Ｃ２Ｈ４Ｏ）ａＨを有しており、式中の（ｂ）は疎水性ＰＯＰ部分（Ｃ３Ｈ６Ｏ）の分子量が約２０，０００ダルトン未満となるような数を表し、（ａ）は親水性ＰＯＥ部分（Ｃ２Ｈ４Ｏ）の割合が約１重量％乃至４０重量％の範囲であるような数を表す高分子量ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーと、カチオン性界面活性剤と、粒子凝集を阻害するために有用な非イオン性界面活性剤例えばグリセロール及びプロピレングリコールまたはその他の賦形剤とを含むポリヌクレオチドワクチンに関する。
【００８３】
発明の概要の項で指摘したように、本発明はこのようにヒトまたはヒト以外の哺乳類のような標的宿主の体内に投与されて有効な免疫応答を促進するために有用なアジュバント、ポリヌクレオチドワクチン組成物／製剤、及びそれぞれの使用方法に関する。本文中で使用された“アジュバント”という用語は、開示された本発明のアジュバント組成物及び製剤に関して使用されているので特定の作用モードに限定されない。後述するように本文中で使用された“アジュバント”という用語は、抗原例えば送達されたポリヌクレオチドから発現された抗原に対する免疫応答を非特異的に増強し、ポリヌクレオチドから抗原が発現された結果としてｉｎ  ｖｉｖｏ免疫応答が増進するような任意の物質または物質の組合せを意味する。遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏ細胞送達の促進剤として作用し、これによって所期の抗原を発現できる細胞に送達されたプラスミドＤＮＡの量を増加させる物質はこの定義に包含される。プラスミドＤＮＡの送達を増強し得る物質としては、製剤中のプラスミドＤＮＡと実質的に相互作用しない物質、及び、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでプラスミドＤＮＡと相互作用し、アジュバントとプラスミドＤＮＡとの強固に結合した複合体または弱く結合した複合体を形成する物質がある。
【００８４】
本発明に開示されたアジュバント、アジュバント添加ポリヌクレオチド製剤及び類縁の医薬として許容される製品について考察すると、本発明はまた、本発明のアジュバント添加ポリヌクレオチドワクチン製剤を宿主に投与することによって脊椎動物宿主体内で免疫応答及び／またはそれぞれの遺伝子治療物質の発現を増強する方法に関する。好ましい宿主は哺乳類宿主、好ましくはヒトまたはヒト以外の獣医学的に重要な外国産または国内産の哺乳類である。これらのワクチンまたは遺伝子治療用製剤は、腸内経路または非経口経路のようなＤＮＡワクチンの分野で公知の任意の手段によって宿主に投与される。これらの送達経路の非限定例は、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射、吸入または鼻腔内送達、経口送達、舌下投与、皮下投与、経皮投与、または任意の形態の粒子衝撃である。好ましい送達方法は、筋肉内注射、皮下、鼻腔内または経口主体の送達である。特に好ましい方法は筋肉内送達である。本文中に記載したアジュバント添加ポリヌクレオチド製剤は、腸内経路及び非経口経路のような当業界で公知の任意の手段によって宿主に投与される。これらの送達経路の非限定例は、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射、吸入または鼻腔内送達、経口送達、舌下投与、皮下投与、経皮投与、または、“遺伝子ガン”などの生体起源の（ｂｉｏｌｏｓｔｉｃ）デバイスもしくは利用可能なニードルフリー注入デバイスなどによる任意の形態の粒子衝撃である。本文中に記載の製剤の好ましい送達方法は筋肉内注射、皮下注射及びニードルフリー注入である。特に好ましい方法は筋肉内送達である。
【００８５】
本発明の組成物は、利用可能な任意のやり方、戦略及び／または組合せによって宿主に投与され得る。例えば、遺伝子ワクチンによる免疫計画において抗原の発現及びこれに付随する細胞性免疫応答及び／または体液性免疫応答を最適に生じさせるために、本発明の組成物を、一価もしくは多価の組成物の投与、多様な組合せ形態の投与、及び／または、プライム（初回抗原刺激）／ブースター（追加抗原刺激）などの投与計画で使用し得る。従って本発明は、アジュバント添加プラスミドＤＮＡ製剤を使用するプライム／ブースター投与と哺乳類組織に導入するためのアデノウイルスベクターのようなウイルスベクターの投与とを含む投与方法を提案する（例えば、実施例１４に提示したデータ参照）。投与間隔は所定の最小時間でよい。従って、個体に第一用量のプラスミドワクチンを投与し、次いで第二用量のプラスミドワクチンを投与し得る。代替的には、個体に、第一用量の組換えウイルスワクチン例えばアデノウイルスワクチンを投与し、次いで第二用量の別のウイルスベクターワクチンを投与してもよい。別の実施態様では、プラスミドワクチンを先ず投与し、次いで時間間隔をおいてアデノウイルスワクチンを投与する。逆に、アデノウイルスワクチンを先ず投与し、次いで時間間隔をおいてプラスミドワクチンを投与してもよい。これらの実施態様では、ウイルスベクターまたはプラスミドの形態の同じアデノウイルス血清型を個体に多回投与してもよく、または、異なる血清型を使用してもよい。これらの投与計画は遺伝子ワクチン接種及び遺伝子治療の用途のようなすべての遺伝子投与テクノロジーに適するであろう。従って、本発明のアジュバント添加プラスミドＤＮＡワクチンは単独で投与されてもよく、または、プライム／ブースター投与計画の一部を構成してもよい。混合形態のプライム／ブースター接種計画は免疫応答を増強し、特に抗ベクター免疫応答が予め存在するときには免疫応答を増強する。この観点から本発明の１つの目的は、プラスミドワクチンを少なくとも１回投与することによってプラスミドワクチンで患者を初回行路減刺激し、所定の時間を経過させた後、アデノウイルスワクチンを投与することによって追加抗原刺激する方法である。通常は複数回のプライム投与が使用され、典型的には１乃至４回であるが、もっと多い回数でもよい。プライム投与とブースター投与との間の時間間隔は典型的には約４カ月から１年の範囲であるが、別の時間枠も使用し得る。
【００８６】
実施例の項に特定的に例示されていない任意の追加ポリヌクレオチド構造をもつ本発明のアジュバント及びアジュバント添加ポリヌクレオチド製剤の利用指針が当業者に与えられていることは本明細書を検討すれば明らかであろう。例示されたポリヌクレオチドはＨＩＶからｐ５５  ｇａｇタンパク質を発現する。しかしながら、開示された本発明のアジュバント及びアジュバント添加ポリヌクレオチド製剤を使用し得る無数の別のワクチン及び遺伝子治療の構造が存在しており、それらの多くは現時点で当業者に公知である。この方法は、治療される（１つまたは複数の）疾患または障害次第で予防的または治療的に有効であろう。従って、種々のポリヌクレオチドワクチン、送達モード、疾患及び抗原の標的に対応する多数の別の構築物を本発明のワクチン製剤に使用できると考えてよい。予防的または治療的な処置に使用し得るウイルス性または細菌性の抗原投与の非限定例は、インフルエンザ、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、結核、ヒトパピローマウイルス、肝炎Ａ型、肝炎Ｂ型、肝炎Ｃ型、エプスタイン・バールウイルス、水痘、麻疹、ロタウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、百日咳菌、大腸菌、サルモネラ菌、結核である。癌、自己免疫疾患のような非感染性疾患及び種々のアレルギーの予防的処置またはより頻繁には治療的処置として本発明のアジュバント及びアジュバント添加ポリヌクレオチドワクチンを使用することも本発明の範囲内であろう。更に、狂犬病、ジステンパー、口蹄疫、炭疽病、ウシ単純疱疹及びウシ結核を非限定例とする任意の数の獣医学的用途に本発明のアジュバント及びポリヌクレオチド製剤を使用することは当業者の領分であろう。言い換えると、本発明のアジュバントは、例示していない別のワクチンまたは遺伝子治療の主体となる構築物に容易に使用され得る。本発明の本質は、ポリヌクレオチドワクチンまたは遺伝子治療ビヒクルの製剤化に使用するための改良されたアジュバントである。本発明の利用によって宿主体内で免疫応答または標的されたトランスジーンの発現がそれぞれ、本発明のブロックコポリマー／カチオン性界面活性剤を基剤とする本発明のアジュバントを利用しない投与に比べて大いに改善されると考えられる。それぞれポリヌクレオチドワクチンまたは遺伝子治療の構造の有効性の改善を試験及び測定するために本文中の教示を採用することは当業者の領分であろう。
【００８７】
ＨＩＶ−１の予防的または治療的な処置に関して考察すると、このウイルスはヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）及び類縁疾患の病因物質である。ＨＩＶ−１はレトロウイルス科のＲＮＡウイルスであり、すべてのレトロウイルスの５′ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−ＬＴＲ３′編成を示す。プロウイルスとして知られる組込まれた形態のＨＩＶ−１はほぼ９．８Ｋｂの長さを有している。ウイルスゲノムの各末端が末端反復配列（ＬＴＲ）として公知のフランキング配列を有している。ＨＩＶ遺伝子は少なくとも９個のタンパク質をコードしており、３つのクラス、即ち、主要構造タンパク質（Ｇａｇ、Ｐｏｌ及びＥｎｖ）、調節タンパク質（Ｔａｔ及びＲｅｖ）、補助タンパク質（Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｖｉｆ及びＮｅｆ）に分類される。
【００８８】
ｇａｇ遺伝子は５５キロダルトン（ｋＤａ）の前駆体タンパク質（ｐ５５）をコードしており、該タンパク質は未スプライスのウイルスｍＲＮＡから発現され、ｐｏｌ遺伝子の産物であるＨＩＶプロテアーゼによってタンパク質分解的にプロセシングされる。成熟Ｐ５５タンパク質産物はｐ１７（マトリックス）、ｐ２４（キャプシド）、ｐ９（ヌクレオキャプシド）及びｐ６である。
【００８９】
ｐｏｌ遺伝子はウイルス複製に必要なタンパク質類、即ち、逆転写酵素、プロテアーゼ、インテグラーゼ及びＲＮアーゼＨをコードしている。これらのウイルスタンパク質はＧａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質として発現される。これはリボソームフレームシフト（読取り枠変異）を介して産生される１６０ｋＤａの前駆体タンパク質である。ウイルスにコードされたプロテアーゼはＧａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質からＰｏｌポリペプチドをタンパク質分解的に分割し、Ｐｏｌポリペプチドを更に、プロテアーゼ（Ｐｒｏ、Ｐ１０）、逆転写酵素（ＲＴ、Ｐ５０）、インテグラーゼ（ＩＮ、ｐ３１）及びＲＮアーゼＨ（ＲＮアーゼ、ｐ１５）の活性をそれぞれ与える成熟タンパク質に分割する。
【００９０】
ｎｅｆ遺伝子は、ＣＤ４発現の下方調節、Ｔ−細胞活性化の撹乱及びＨＩＶ感染力の刺激のような幾つかの活性をもつことが判明した初期補助ＨＩＶタンパク質（Ｎｅｆ）をコードしている。
【００９１】
ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスのエンベロープ糖タンパク質をコードしている。該タンパク質は１６０キロダルトン（ｋＤａ）の前駆体（ｇｐ１６０）として翻訳され、次いで細胞性プロテアーゼによって分割されて、１２０ｋＤａの外側エンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）と４１ｋＤａの膜貫通エンベロープ糖タンパク質（ｇｐ４１）とを生じる。ｇｐ１２０とｇｐ４１とは会合しており、ウイルス粒子及びＨＩＶ感染細胞の表面に展示される。
【００９２】
ｔａｔ遺伝子は長い形態及び短い形態のＴａｔタンパク質をコードしている。該タンパク質は、ＨＩＶ−１複製に必須の転写トランスアクチベーターとなるＲＮＡ結合性タンパク質である。
【００９３】
ｒｅｖ遺伝子はＲＮＡ結合性タンパク質である１３ｋＤａのＲｅｖタンパク質をコードしている。Ｒｅｖタンパク質はＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）と呼ばれるウイルスＲＮＡの領域に結合する。Ｒｅｖタンパク質は未スプライスのウイルスＤＮＡが核から細胞質に転移することを促進する。Ｒｅｖタンパク質はＨＩＶ後期遺伝子の発現、従ってＨＩＶ複製に必要である。
【００９４】
ｇｐ１２０は、別のコレセプター分子に加えて、ヘルパーＴリンパ球、マクロファージ及びその他の標的細胞の表面に存在するＣＤ４／ケモカイン受容体に結合する。Ｘ４ウイルス（マクロファージ親和性）ウイルスは、ＣＤ４／ＣＸＣＲ４複合体に親和性を示すが、Ｒ５（Ｔ細胞系親和性）ウイルスはＣＤ４／ＣＣＲ５受容体複合体と相互作用する。ｇｐ１２０がＣＤ４に結合した後、ｇｐ４１はウイルス侵入を生じさせる融合イベントに介在する。ウイルスは標的細胞に融合して該細胞に侵入し、次いでその一本鎖ＲＮＡゲノムがＲＮＡ依存性ポリメラーゼを介して二重鎖ＤＮＡに逆転写される。プロウイルスとして知られたウイルスＤＮＡが細胞核に侵入し、ここでウイルスＤＮＡが、核内部の新しいウイルスＲＮＡの産生、初期及び後期ＨＩＶウイルスタンパク質の発現を指令し、次いで新しいウイルス粒子の産生及び細胞内放出を指令する。最近の技術では宿主内部のウイルス負荷を検出する性能が進歩しており、このような技術によれば、一次感染の結果として極めて高いウイルスの産生及び組織分布が生じ、次いでウイルスの定常状態レベルが生じ（この時期には連続的なウイルス産生及び代謝回転が存在する）、最終的にもう一度ウイルス負荷のバーストが生じ、これが臨床的なＡＩＤＳの発症につながることが判明した。増殖性感染細胞は７日間の半減期を有しているが、慢性または潜伏感染細胞は３週間の半減期を有しており、次いで、非増殖性感染細胞は長い半減期（１００日間以上）を有しているが、疾患の進行中に観察される日々のウイルス負荷を有意に増加させない。
【００９５】
免疫防御に極めて重要なＣＤ４ヘルパーＴリンパ球の破壊がＨＩＶ感染の特徴である進行性免疫不全の主因である。ＣＤ４  Ｔ細胞の減少は大抵の侵略物に対する身体の抵抗力を低下させるが、特にウイルス、真菌類、寄生生物及びマイクバクテリアを含むある種の細菌に対する防御機能が深刻な打撃を受ける。
【００９６】
ＨＩＶ−１感染個体の有効な治療計画が最近になって使用可能になった。しかしながらこれらの薬物は世界の多くの地域でこの病気に対して有意な打撃を与えることができない。またこれらの薬物はヒトの内部で感染の蔓延を抑止するために最小の打撃を与えるだけであろう。多くの別の感染性疾患と同様に、ＨＩＶ−１感染の蔓延に対する有意な疫学的効果は有効なワクチンの開発及び導入後に初めて可能になるであろう。有効なワクチンの開発が今日まで妨げられた原因として多くの要因がある。上述したように、慢性感染患者の体内では体液性及び細胞性の抗ＨＩＶ−１免疫応答が存在しウイルス感染細胞が破壊されるにもかかわらずウイルス産生が絶えず生じていることが明らかになった。他の感染性疾患の場合と同様に、病気の経過は、免疫応答の速度及び大きさと病原体の複製速度及び免疫応答感受性とのバランスの結果である。予め存在する免疫が急性感染に与える効果は誘発させた免疫応答が慢性感染症に与える効果よりも大きい。第二の要因はウイルスがかなりの遺伝的多様性を有していることである。細胞培養物中のＨＩＶ−１の感染力を中和できる抗ＨＩＶ−１抗体は存在しているが、これらの抗体の活性は一般にウイルス単離物特異的である。従来方法を使用してＨＩＶ−１の血清学的グループを定義することはできないことが判明した。それどころか、ウイルスは血清学的“群集連続（ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）”を形成すると考えられるので、個々の中和抗体応答はせいぜい一握りのウイルス変異体にしか有効でない。このような観察を前提とすれば、抗ＨＩＶ−１細胞性免疫応答を誘発し易い免疫原及び関連送達技術を同定することが有効であろう。ＣＴＬ応答を生じさせるためには。抗原が細胞内部で合成されるかまたは細胞内部に導入され、次いでプロテアソーム複合体によって小ペプチドにプロセシングされ、小胞体／ゴルジ複合体分泌経路に転位され、最終的に主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質と会合しなければならないことは公知である。ＣＤ８＋  Ｔリンパ球は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びＣＤ８細胞表面タンパク質を介してクラスＩ  ＭＨＣと会合した抗原を認識する。無垢のＣＤ８＋  Ｔ細胞を活性化エフェクターまたは記憶細胞として活性化するためには一般に、上述のような抗原のＴＣＲ関与と同時刺激性タンパク質の関与との双方が必要である。ＣＴＬ応答の最適な誘発には通常は、ＴＣＲ及びＣＤ４の関与を介してＭＨＣクラスＩＩ分子と会合した抗原を認識するＣＤ４＋  Ｔリンパ球からサイトカイン形態で与えられる“ヘルプ”が必要である。本発明のアジュバント及び製剤は、宿主細胞中で標的された抗原の発現を増進させれば、標的宿主体内のＨＩＶ−１またはその他の疾患もしくは障害に対する細胞性免疫応答の増進に有効であろう。
【００９７】
本文中に記載のアジュバント添加ポリヌクレオチドワクチン製剤を使用する投薬計画は、発現された抗原に対して予め存在する免疫のタイプ、レベル、患者の種、年齢、体重、性別及び病態、治療すべき病態の重篤度、投与経路、患者の腎機能、肝機能及び心血管機能、使用される特定化合物のような多くの要因に従って選択され得る。平均的な医師または獣医師は、病気の進行を防止、対抗または阻止するために必要な薬物の有効量を容易に決定及び処方できる。毒性を伴うことなく有効性を生じる範囲内の薬物濃度を与える最適処方には、標的部位で薬物が有効利用できるまでの速度に基づく投与計画が必要である。このためには、薬物の分布、平衡及び排出も考慮される。今日まで、ヒト宿主に一回接種するプラスミドＤＮＡの最適量は約１μｇ乃至約１０ｍｇのＤＮＡの範囲、好ましくは約１００μｇ乃至約６ｍｇ、特に約１ｍｇ乃至約５ｍｇのＤＮＡの範囲である。勿論、本発明の目的は、本文中に記載のポリヌクレオチドワクチンアジュバントを作製することによって免疫応答を増進し、その結果として患者に投与されるポリヌクレオチドの必要量を削減することである。このために、本発明はまた、有益なトランスジーンまたは抗原を発現する少なくとも１つのポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡプラスミドと、本文中に記載のポロキサマーと、カチオン性界面活性剤として作用する第四級アンモニウム化合物を含有するカチオン性界面活性剤とを含む本文中に記載のアジュバント添加製剤の投与から成る、ポリヌクレオチドワクチンに対する免疫応答の増強方法に関する。
【００９８】
本発明のＤＮＡベクターワクチンは宿主に投与される医薬として有効な任意の製剤の形態に製剤化され得る。このような製剤は例えば、リン酸塩緩衝生理的塩類溶液（ＰＢＳ）のような生理食塩水溶液でもよい。このような溶液は、本発明のＤＮＡベクターワクチンに長期安定性を付与する医薬として許容される製剤を得るために有効なであろう。完成医薬品として保存中に、ＤＮＡプラスミドワクチンに物理化学的変化が生じ、スーパーコイル形プラスミドが開いた環状及び直鎖状の形態に変形する。様々な保存条件（低ｐＨ、高温、低イオン強度）がこのプロセスを促進する。従って、ＤＮＡプラスミド溶液、製剤緩衝溶液または容器及び蓋から微量金属イオンを（コハク酸もしくはリンゴ酸、または、複数のリン酸塩リガンドを含有するキレート化剤、または、ＥＤＴＡのようなキレート化剤によって）除去及び／またはキレート化することによってこの保存中の劣化経路からＤＮＡプラスミドを安定させる。更に、エタノールまたはグリセロールのような非還元性遊離ラジカルスカベンジャーを混在させることは、見掛けは脱金属化した溶液中であっても依然として生じ得る遊離ラジカル産生からＤＮＡプラスミドの損傷を防止するために有効である。更に、ＤＮＡワクチンの安定度を最適にするために、製剤化中に緩衝溶液のタイプ、ｐＨ、塩濃度、露光、容器の準備に使用した滅菌工程のタイプをコントロールし得る。従って、ＤＮＡワクチンに最高の安定度を与える製剤は、７−８の範囲のｐＨをもつ緩衝溶液（リン酸塩または炭酸水素塩）と、１００乃至２００ｍＭの範囲の塩（ＮａＣｌ、ＫＣｌまたはＬｉＣｌ）と、金属イオンキレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、リンゴ酸塩、ヘキサリン酸イノシトール、トリポリリン酸塩またはポリリン酸）と、非還元性遊離ラジカルスカベンジャー（例えば、エタノール、グリセロール、メチオニンまたはジメチルスルホキシド）と、、最も高い適正濃度のＤＮＡとを含有する脱金属化溶液から成り、該溶液が滅菌ガラス容器に収容され、高度に精製されたヌクレアーゼ非含有ＤＮＡを光から保護するようにパッケージされている。本発明のＤＮＡベクターワクチンの長期安定性を増強する特に好ましい製剤は、約８．０乃至約９．０のｐＨをもつトリス−ＨＣｌ緩衝溶液と、約０．５乃至３％ｗ／ｖのエタノールまたはグリセロールと、約５ｍＭ以下の濃度範囲のＥＤＴＡまたはＤＴＰＡと、約５０ｍＭ乃至約５００ｍＭの濃度のＮａＣｌとを含むであろう。このような安定化ＤＮＡベクターワクチン及びこの好ましい範囲の製剤に代替し得る種々の製剤の使用はＰＣＴ国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９７／０６６５５、ＰＣＴ国際公開Ｎｏ．ＷＯ９７／４０８３９に詳細に記載されている。これらの特許の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。
【００９９】
本発明をより十分に定義するために以下に実施例を示すが、本発明は実施例の記載には限定されない。
【０１００】
実施例
材料及び方法
本発明のアジュバント及び製剤の一部分を構成する医薬銘柄の非イオン性ブロックコポリマーは、米国特許第５，５６７，８５９号及び米国再発行特許３６，６６５のような先行文献に記載の方法によって合成され得る。双方の文献は参照によって本発明に含まれるものとする。更に、Ｎｅｗｍａｎら（１９９８，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  １５（２）：８９−１４２）は、これらの医薬用非イオン性ブロックコポリマーの合成を記載している。該文献も参照によって本発明に含まれるものとする。Ｎｅｗｍａｎら（同上）、米国特許第５，５６７，８５９号及び米国再発行特許３６，６６５は、これらの高分子量ポロキサマーを製造し、得られた生成物から不要な副生物及び不純物を除去して精製する方法を記載している。本文中で使用された医薬銘柄のカチオン性界面活性剤は市販されており、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａ．Ｗａｄｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｊ．Ｗｅｌｌｅｒ，１９９４，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ；Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）に明記され詳細に記述されている。
【０１０１】
非イオン性ブロックコポリマーＣＲＬ−１００５はＣｙｔＲｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡから得られた。ベンズアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）、ベンズエトニウムクロリド（ＢＥＣ）、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）及びセチルトリメチルアンモニウムクロリドはＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。ポリソルベート−８０はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏから購入した。
【０１０２】
溶液中のＣＲＬ−１００５粒子の流体力学的直径（Ｄｈ）及び表面電荷（ゼータ電位）はＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  ３０００，モデルＤＴＳ５３００を使用して測定した。サイズ測定に先立って、製剤をＰＢＳ，ｐＨ７．２で１０乃至５０倍に希釈した。製剤を２０ｍＭのトリス−酢酸塩，ｐＨ７．２に５０倍まで希釈した後でゼータ電位を測定した。
【０１０３】
ＣＲＬ−１００５粒子に会合したＤＮＡの量を測定するために、２００マイクロリットルの被験製剤サンプルを３．０ｍＬの２乃至１３％ショ糖勾配の頂部に加えた。８０，０００ＲＰＭ（３４８，０００×ｇ）で１．５時間遠心した後、勾配の頂部から始まる各２００マイクロリットルの１６の画分が得られた。次に、ＵＶ分光光度法によって各画分中のＤＮＡ及びＢＡＫの濃度を測定した。次いで、以下に示す関係式を使用して会合ＤＮＡの％を計算した。
会合ＤＮＡの％
＝（画分１−６中のＤＮＡの量／全画分中のＤＮＡの量）×１００
ＤＮＡ及びＢＡＫを含有するＣＲＬ−１００５製剤の製造：
本文中に記載の製剤は、容量形ピペットを使用してＰＢＳ中のプラスミドＤＮＡの低温（＜５℃）溶液に純粋なポリマーを添加することによって調製した。次に溶液を渦流させてポリマーを可溶化した。ポリマーの完全な可溶化後、ポリマーの曇り点（６−７℃以下）よりも低温で透明溶液が得られる。次いで、ＰＢＳに溶解したＢＡＫの希釈溶液をゆっくりと添加することによってＰＢＳ中のＤＮＡ／ＣＲＬ−１００５溶液にＢＡＫを添加した。ＤＮＡ／ＣＲＬ−１００５溶液に添加したＢＡＫ溶液の濃度は典型的には約４ｍＭであった。ポリマー及びＢＡＫを添加する前のＤＮＡの初期濃度は典型的には約６ｍｇ／ｍＬであった。各製剤中のＤＮＡの最終濃度は５ｍｇ／ｍＬであった。ＢＡＫの添加後、温度上昇が曇り点から２℃以内である間は製剤を十分に渦流させた。次いで製剤を氷に載せ、曇り点よりも低温にした。再度、温度上昇が曇り点から２℃以内である間は製剤を渦流させた。動的光散乱によって測定した製剤の粒度が２００乃至５００ｎｍの範囲になるまでこの工程（温度上昇を曇り点から２℃以内に維持する冷却及び撹拌）を数回繰り返した。次に、溶液が透明になるまで製剤を氷上に保存し、−７０℃の貯蔵庫に入れた。使用前に−７０℃の貯蔵庫から製剤を取出し室温で解凍した。
【０１０４】
Ｖ１Ｊｎｓ−ＦＬｇａｇ：
本文中に示したポリヌクレオチドの非限定的代表例であるＶ１Ｊｎｓ−Ｆｌｇａｇ（本文中ではまたＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇと記述）は、１９９８年８月１３日出願のＰＣＴ国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９８／０２２９３、公開Ｎｏ．ＷＯ９８／３４６４０に開示されている。ヒトの体内発現に最適化されたコドンをもつＨＩＶ−１  ｐ５５  ｇａｇの読取り枠を以下に示し、配列：２７として表す。開始コドン（ＡＴＧコドン）はヌクレオチド１０−１２によって表され、“ＴＡＡ”終結コドンは、代表的なＨＩＶ−１  ｐ５５  ｇａｇ抗原をコードする配列：２７のヌクレオチド１５１０−１５１２である。ｇａｇ遺伝子の発現を増進させる合成遺伝子セグメントは、同一翻訳配列を有しているが、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．１８３，ｐｐ．１−１２（１９８５）に所収のＲ．Ｌａｔｈｅの研究論文“アミノ酸配列データから推定された合成オリゴヌクレオチドプローブ：理論的及び実際的考察（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｄｅｄｕｃｅｄ  ｆｒｏｍ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ：  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ）”に定義されたような代替コドンを使用する配列に変換された。ＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子セグメントの発現を増進させるために以下に記載した方法は、哺乳類細胞中でこの遺伝子が有効に発現できないという既知の現象が転写物の全体組成の結果であるという発明者らの仮説に基づいて計画された。従って、同じタンパク質配列をコードする代替コドンを使用することによってｇａｇの発現に対する制約が除去されるかもしれない。特定コドンを置換するために使用した方法は以下のように記述し得る：（１）適正な読取り枠のコドンの位置を同定する；（２）野生型コドンについて観察されたヒト遺伝子による使用頻度を比較する；（３）コドンの使用頻度が最も少ないときは、該コドンをヒト細胞中で高度な発現を得るために最適なコドンによって置換する；（４）遺伝子セグメント全体が置換されるまでこの手順を繰り返す；（５）新しい遺伝子配列について、これらのコドン置換によって望ましくない配列（例えば“ＡＴＴＴＡ”配列、意図しないイントロンスプライス認識部位の形成、不要な制限酵素部位、など）が生じているか否かを点検し、これらの配列を除去するようにコドンを置換する；（６）合成遺伝子セグメントの組立を行って、発現の改善を試験する。
【０１０５】
これらの方法を使用してＨＩＶ  ｇａｇを構成する以下の合成遺伝子セグメントを作製し、完全に発現最適コドン使用から成る遺伝子が得られた。上記の手順はＤＮＡワクチン用のコドン最適化遺伝子を設計するための我々の方法の概要を示したものであるが、手順の副次的な変更または配列の副次的な変異によって同様のワクチン有効性または遺伝子発現の増進が得られることは当業者に理解されよう。
【０１０６】
実施例１
ＣＲＬ−１００５の粒度に対するベンズアルコニウムクロリド（ＢＡＫ）及びベンズエトニウムクロリド（ＢＥＣ）の効果
ＰＯＥ−ＰＯＰ−ＰＯＥブロックコポリマーＣＲＬ−１００５に対するＢＡＫ及びＢＥＣの効果を測定するために、ＰＢＳ中に７．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５を含有する製剤に漸増量のＢＡＫ及びＢＥＣを添加した。サンプルを十分に混合し、次いで−７０℃で凍結した。粒度を測定する前に、室温の解凍用ラブベンチに容器を載せるかまたは容器を手で温めることによってサンプルを解凍した。次に動的光散乱によってＣＲＬ−１００５の粒度を測定した。図１の結果は、０．０１％という低濃度のＢＡＫ及びＢＥＣがＣＲＬ−１００５の粒度を２００ｎｍ以下に縮小したことを示す。これらの結果はまた、０．０％乃至０．０５％の界面活性剤の存在下ではＢＡＫまたはＢＥＣの濃度が粒度に対して有意な効果を全く有していなかったことを示す。これらの結果は更に、ＢＡＫまたはＢＥＣを含有する製剤中の粒度に対して加温速度の影響は殆どなかったことを示す。これらの結果は、ＢＡＫ及びＢＥＣの双方が曇り点を経由する加温速度によって有意な影響を受けない小さい粒度のＣＲＬ−１００５を安定させることを示唆する。
【０１０７】
実施例２
プラスミドＤＮＡとＣＲＬ−１００５粒子との会合に対するＢＡＫの効果
ＢＡＫがプラスミドＤＮＡとＣＲＬ−１００５との会合を増強するか否かを判断するために、ＣＲＬ−１００５に会合したＤＮＡを未会合のＤＮＡから分離するようにアッセイを設計した。該方法は、ショ糖勾配上の高速遠心を使用する会合ＤＮＡと未会合ＤＮＡとの分離に基づく。遠心中に、ＣＲＬ−１００５及びＢＡＫに会合したプラスミドＤＮＡはショ糖勾配の上方の画分１−６に残存し、未会合のＤＮＡは殆どがペレット化される。このアッセイを使用し、７．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５と０．８５ｍＭのＢＡＫと５．０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳ中に含有するサンプルを２乃至１３％のショ糖勾配の頂部に載せ、８０，０００ｒｐｍで１．５時間遠心した。次に、勾配を１６の画分に分画し、ポリマーを含有していた各画分中のＤＮＡ濃度を直接ＵＶ吸光度の測定によって測定した。ポリマーを含有する画分（１−６）を目視観察によって同定した。図２Ａ及び２Ｂの結果は、ポリマー含有画分（１−６）がまた、ＤＮＡ単独、ＤＮＡ＋ＣＲＬ−１００５またはＤＮＡ＋ＢＡＫをそれぞれ含有する画分に比べて有意な量のプラスミドＤＮＡを含有していることを示す。ＣＲＬ−１００５の非存在下またはＢＡＫの非存在下の上方画分中にはプラスミドＤＮＡが保留されていなかったので、プラスミドＤＮＡがＣＲＬ−１００５に会合するためにはＢＡＫとＣＲＬ−１００５との双方が必要なことは明らかである。例えば、サンプル４では、１６の画分全部のＤＮＡ総量の２．５％が上方の６画分に局在していた。ＣＲＬ−１００５とＤＮＡとを含有するサンプル（サンプル３）では、上方の６画分中には総ＤＮＡの０．３５％以下しか存在しなかった。これは、ＢＡＫの非存在下でＣＲＬ−１００５に会合するプラスミドＤＮＡが極めて少量であったことを示唆する。
【０１０８】
プラスミドＤＮＡとＢＡＫとだけを含有するサンプルについて勾配の各画分中のＢＡＫ濃度の分析を行った。図３Ａ及び３Ｂに示す結果は、ＢＡＫが遊離ＤＮＡと共にペレットを形成しないで（図３Ａ）、勾配中にほぼ均一に分布していた（図３Ｂ）ことを示す。これらの結果は、ＣＲＬ−１００５ポリマーの非存在下ではＢＡＫがＤＮＡに結合しないこと、または、結合が弱くＢＡＫが遠心処理中に解離することを示唆する。
【０１０９】
別の実験では、ＢＡＫとＣＲＬ−１００５とだけを含有するサンプルをショ糖勾配上で遠心し、次いで画分中のＢＡＫを分析した。結果は、画分１−６中にポリマーと共に局在するＢＡＫが検出されたことを示す。これらの結果を図３Ａ及び３Ｂの結果に比較すると、ＰＢＳ中でＢＡＫがプラスミドＤＮＡに結合するよりも強力にＣＲＬ−１００５に結合することが明らかである。
【０１１０】
また、勾配の各画分中のＢＡＫ濃度の分析を、５．０ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ／０．８５ｍＭのＢＡＫ／７．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５を含有するサンプルについて行った。図４Ａ及び４Ｂに示す結果は、ＢＡＫ（図４Ｂ）が勾配の上方の６画分中にＤＮＡ（図４Ａ）及びＣＲＬ−１００５と共に検出されたことを示す。結果はまた、未会合のＤＮＡを含む管の底部の画分１５−１６中にＢＡＫが全く検出されなかったことを示す。総合的にこれらの結果は、ＢＡＫがＤＮＡ親和性よりも高いＣＲＬ−１００５親和性を有していること、及び、ＢＡＫがプラスミドＤＮＡとＣＲＬ−１００５との相互作用に介在することを示す。
【０１１１】
ＢＡＫがＤＮＡに弱く結合するか否かを判断するべく、ＰＢＳ中にＡＫだけを含有するサンプルを遠心し、画分中のＢＡＫを検定した。この実験で得られたＢＡＫプロフィル（図５）を図３Ａ−Ｂ及び図４Ａ−Ｂの結果に比較すると、ＢＡＫがＣＲＬ−１００５の非存在下でＤＮＡに弱く結合することが明らかである。
【０１１２】
図３Ａ−Ｂ中のデータはまた、ＢＡＫの有意な部分が画分８−１６中に検出されたことを示し、図４Ａ−Ｂのデータは画分８−１６中に有意なＢＡＫが存在しないことを示す。これらのデータは、ＣＲＬ−１００５の曇り点よりも高い温度では遊離ＤＮＡ−ＢＡＫ複合体（ＣＲＬ−１００５粒子に会合していない）が製剤中に存在しなかったことを示す。Ｄ１１８及びＤ１２１製剤はＣＲＬ−１００５の曇り点よりも高温で投与されるので、これらのデータは、製剤Ｄ１１８によって誘発された免疫応答の増強は、遊離ＤＮＡ−ＢＡＫ複合体の存在に起因するものでなく、ＢＡＫ及びＤＮＡに会合したＣＲＬ−１００５粒子に起因するものであることを示す。
【０１１３】
実施例３
プラスミドＤＮＡとＣＲＬ−１００５との会合に対するＢＡＫ濃度の効果
ＣＲＬ−１００５ポリマーに会合したプラスミドＤＮＡの量に対するＢＡＫ濃度の効果を測定するために、７．５ｍＭのＣＲＬ−１００５を含有する製剤中のベンズアルコニウムクロリドの濃度を０乃至１．５ｍＭまで変化させた。図６に示す結果は、会合ＤＮＡの量が少なくとも１．２５ｍＭまではＢＡＫ濃度に伴ってほぼ直線状に増加することを示す。０．７５ｍＭのＢＡＫと５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡと７．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５とを含有する製剤Ｄ１２１中でＣＲＬ−１００５に会合したＤＮＡの量は典型的には３．０乃至３．５％である。
【０１１４】
実施例４
ＣＲＬ−１００５に会合したプラスミドＤＮＡの％の再現性及び安定性
ＣＲＬ−１００５に会合したＤＮＡの量を上述のショ糖濃度勾配法を使用する複数の個別実験で測定した。結果を表１にまとめる。該結果は、製剤Ｄ１２１（ｐＨ７．２のＰＢＳ中に５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ、７．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５、０．８５ｍＭのＢＡＫ含有）中でＣＲＬ−１００５に会合したＤＮＡの％を示す。しかしながら、少数のサンプル中では予想よりも低い値及び高い値が得られた。例えば、サンプル１２では室温で２４時間後の会合ＤＮＡは僅か１．６％であり、これは、会合ＤＮＡの％が経時的に減少したことを示唆する。しかしながら、この実験の繰り返し（サンプル１５＆１６）は、室温で２４時間後の会合ＤＮＡの％が安定していたことを示す。これらのデータはまた、会合ＤＮＡの％が少なくとも４回の凍結／解凍サイクル中に安定であったことを示す（サイクル１７＆１８参照）。回収されたＤＮＡの％は典型的には７０乃至８５％であり、回収率は会合ＤＮＡの％に相関関係を有するとは考えられなかった。
【０１１５】
【表１】
2004536017.tif 000002
１制限された混合  ２Ｔｗｅｅｎで遠心管を洗浄  ３十分な混合
【０１１６】
実施例５
熱誘発凝集に対するＢＡＫ濃度の効果
３７℃で１時間インキュベーションの前後のＣＲＬ−１００５粒子のサイズを測定することによって熱誘発凝集に対するＢＡＫ濃度の効果を測定した。試験した製剤を以下の表２に示す。
【０１１７】
【表２】
2004536017.tif 000003
ＡＢＡＫ＝ベンズアルコニウムクロリド
ＢＰＳ−８０＝ポリソルベート−８０
【０１１８】
図７の結果は、製剤Ｄ１１８中のＣＲＬ−１００５粒子は３７℃で１時間インキュベートしたときに凝集することを示す。しかしながら、より高い濃度のＢＡＫを含有する製剤Ｄ１２１中のポリマー粒子は同じ条件下で凝集しなかった。
【０１１９】
また、２２．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５を含有する製剤を使用してＣＲＬ−１００５の熱誘発凝集に対するＢＡＫ濃度の効果を測定した。図８のデータは、２２．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５を含有する製剤中のＣＲＬ−１００５粒子の凝集を防止するために２．４ｍＭのＢＡＫが必要であることを示す。これらの結果は、３７℃で凝集を防止するためにはＢＡＫ対ＣＲＬ−１００５の最小比が必要であることを示す。
【０１２０】
ＣＲＬ−１００５粒子に会合したＤＮＡの量は室温で少なくとも２４時間は安定であると考えられ、多数の凍結／解凍サイクル回数の影響を受けなかった。製剤Ｄ１２１中のＣＲＬ−１００５の粒度は典型的には３００乃至５００ｎｍの範囲であり、調製物毎に再現可能であった。３７℃で１時間加熱後の凝集を排除するためにはＢＡＫ対ＣＲＬ−１００５ポリマーの最小比が必要であった。
【０１２１】
製剤Ｄ１１８にポリソルベート−８０を添加するとＣＲＬ−１００５の凝集が阻害されるか否かを判断するために、ｔｐａ−ｇａｇプラスミドＤＮＡまたはｓｉｖ−ｇａｇプラスミドＤＮＡを含有するＤ１１８製剤に０．０１％のポリソルベート−８０を添加した。該製剤を凍結し、３０℃で解凍し、次いで３０℃で２時間まで保存した。時点０並びにインキュベーションの０．５、１及び２時間後の時点に動的光散乱によって粒度測定を行った。図９に示す結果は、０．０１％のポリソルベート−８０の添加がいずれかの形態のプラスミドＤＮＡを含有する製剤Ｄ１１８中のＣＲＬ−１００５の凝集を防止したことを示す。更に、対照製剤（Ｄ１２１）はポリソルベート−８０の存在下でも非存在下でも凝集しなかった。これらのデータは、ポリソルベート−８０がＢＡＫを含有する製剤中のＣＲＬ−１００５の凝集を有効にコントロールすることを示す。
【０１２２】
実施例６
ＣＲＬ−１００５粒子の表面電荷に対するＢＡＫ及びプラスミドＤＮＡの効果  ＣＲＬ−１００５粒子の表面電荷に対するＢＡＫ及びＤＮＡの効果を測定するために、複数の製剤に対してゼータ電位の測定を行った。使用したＣＲＬ−１００５及びＤＮＡの濃度はそれぞれ７．５ｍｇ／ｍＬ及び５．０ｍｇ／ｍＬであった。表３に示す結果は、ＢＡＫ及びＤＮＡの非存在下でＣＲＬ−１００５は１５００ｎｍ以下のサイズであり、−４．４ｍＶのゼータ電位を有していることを示す。ＤＮＡ単独は７０ｎｍ以下のサイズであり、−４８．５ｍＶのゼータ電位を有している。ＤＮＡとＣＲＬ−１００５とを含有している製剤の場合、ＣＲＬ−１００５のゼータ電位はＤＮＡ非存在下のポリマーよりもやや負に傾いた−５．１ｍＶである。ＤＮＡの存在下及び非存在下のＣＲＬ−１００５粒子のゼータ電位の差は小さいが、この差は必ず存在しており、ＢＡＫの非存在下で少量のＤＮＡがＣＲＬ−１００５粒子に会合することを示唆する。図２のデータもまたこの仮説に符合する。
【０１２３】
０．７１ｍＭのＢＡＫの存在下（ＤＮＡ非存在）のＣＲＬ−１００５粒子のゼータ電位は２．５ｍＶであった。この結果は、ＢＡＫがＣＲＬ−１００５粒子に結合し、該粒子の電位を負から正に少し変化させることを示唆する。ＣＲＬ−１００５とＢＡＫとを含有する製剤中にプラスミドＤＮＡが存在したときは、ゼータ電位が正から負に大きく変化した。これらのデータは、プラスミドＤＮＡがＢＡＫ含有ＣＲＬ−１００５に結合するとその結果としてＢＡＫとＤＮＡとの双方を含有している負帯電ＣＲＬ−１００５粒子が形成されることを示す。
【０１２４】
プラスミドＤＮＡとＣＲＬ−１００５粒子との結合に対するポリソルベート−８０の効果を測定するために、０．７１ｍＭのＢＡＫと０．０１％のＰＳ−８０との存在下のＣＲＬ−１００５粒子のゼータ電位を先ず測定し、−４．９ｍＶであることを知見した。ＣＲＬ−１００５とＢＡＫと０．０１％のＰＳ−８０とを含有する製剤中にプラスミドＤＮＡが含まれているとき、ゼータ電位が正（ＤＮＡの非存在下）から負（ＤＮＡの存在下）に大きく変化した。これらの結果は、ＰＳ−８０がプラスミドＤＮＡとＣＲＬ−１００５との結合を大して阻害しなかったことを示唆する。しかしながら、ＤＮＡとＢＡＫと０．０１％のＰＳ−８０との存在下のＣＲＬ−１００５粒子のゼータ電位はＰＳ−８０が存在しない同じ製剤よりもやや負に傾いており、これは、ＰＳ−８０の存在下ではＤＮＡの結合がやや少ないことを示唆する。ＤＮＡとＣＲＬ−１００５と０．７１ｍＭのＢＡＫと０．０１％のＰＳ−８０とを含有する製剤中のＣＲＬ−１００５粒子のサイズはまた、ＰＳ−８０非含有の同じ製剤よりも小さく、これはＰＳ−８０がＤＮＡに結合したＣＲＬ−１００５の凝集を阻害することを示唆する。
【０１２５】
【表３】
2004536017.tif 000004
【０１２６】
実施例７
アカゲザルの体内におけるプラスミドＤＮＡ／ＣＲＬ−１００５製剤の免疫原性
実験の設計：
各６匹のグループに分けたサルに以下のワクチンを接種した：（１）ＰＢＳ中の５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ  ＤＮＡ；（２）５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ＋７．５ｍｇのＣＲＬ−１００５；（３）５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ＋２２．５ｍｇのＣＲＬ−１００５。また、各３匹のグループに分けたサルには以下のワクチンを接種した：（４）５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ＋２２．５ｍｇのＣＲＬ−１００５＋０．０１％のポリソルベート−８０（ＰＳ−８０）；及び（５）５ｍｇｋＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ＋７．５ｍｇのＣＲＬ−１００５＋０．５ｍＭのベンズアルコニウムクロリド。全部のワクチンをガラス容器及びプラスチック二次コンテナに入れて凍結保存し、注射の直前に容器を室温までゆっくりと加温した。０週及び４週目に免疫感作した。筋肉内（ＩＭ）投与経路を使用し、各動物の三角筋に０．５ｍＬのワクチンを接種した。
【０１２７】
結果：
ワクチン接種した動物の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、複数の時点でｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって、または、投与２の４週後のバルクＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）の傷害アッセイによって検定した。抗原特異的Ｔ細胞の総体頻度は、ＤＮＡを７．５ｍｇのＣＲＬ−１００５と共に製剤化することによって合格最低ライン（５０％）まで改善された（以下の表Ａ、グループ１＆２参照）。しかしながら、ＤＮＡを２２．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５と共に製剤化すると、抗原特異的Ｔ細胞の総体頻度は２倍近くに増強された（グループ１及び３の比較）。更に、ＣＲＬ−１００５をカチオン性界面活性剤ＢＡＫと混合すると、３匹中の２匹のサルでＩＦＮ−ガンマを分泌するｇａｇ特異的Ｔ細胞が４倍以上に増加した（それぞれ表４Ａ及び４Ｂ中のグループ１及び５の比較）。このポロキサマー／界面活性剤／ＤＮＡ製剤はまた、ＣＤ８＋成分を全面的Ｔ細胞応答まで増加させ、これに付随してバルクＣＴＬの傷害活性もポロキサマー／ＤＮＡまたはＤＮＡ対照グループに比べて増強されていた。
【０１２８】
表４Ａ
アカゲザルの体内におけるＨＩＶ−１  ｇａｇ免疫原性に対する種々のＣＲＬ−１００５含有プラスミドＤＮＡ製剤の評価
【０１２９】
１００万個のＰＢＭＣあたりのＳＦＣの数
【０１３０】
【表４】
2004536017.tif 000005
ａグループ１−３にはアジュバント添加または不添加でＰＢＳ中で製剤化した５ｍｇのＦＬ−ｇａｇプラスミドＤＮＡを投与した。
【０１３１】
表４Ｂ
アカゲザルの体内におけるＨＩＶ−１  ｇａｇ免疫原性に対する種々のＣＲＬ−１００５含有プラスミドＤＮＡ製剤の評価
【０１３２】
１００万個のＰＢＭＣあたりのＳＦＣの数
【０１３３】
【表５】
2004536017.tif 000006
ａグループ４−５にはアジュバント添加または不添加でＰＢＳ中で製剤化した５ｍｇのＦＬ−ｇａｇプラスミドＤＮＡを投与した。
【０１３４】
実施例８
別のカチオン性界面活性剤を使用したＣＲＬ−１００５とＤＮＡとの会合の増強
別の２つのカチオン性界面活性剤、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）及びセチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）を５ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ及び７．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５と共に製剤化した。サンプルを凍結し解凍した後、ＣＲＬ−１００５ポリマーに会合したＤＮＡの％を測定した。結果は、ＣＰＣでは４．７％の会合、ＣＴＡＣでは４．８％の会合が生じたことを示す。先行実験では、ベンズエトニウムクロリドを使用した同じ製剤中で３．２％のＤＮＡ会合が観察された。これらの結果は、別のカチオン性界面活性剤がＤＮＡとＣＲＬ−１００５粒子との会合を増強できることを示す。
【０１３５】
有効なワクチンは１つまたは複数の正しい抗原に対する適切な応答を誘発しなければならない。複数の異なるタイプの免疫応答が存在し、これらの免疫応答が特定の疾患を防御できる機能は一様でない。例えば、抗体は細菌感染を防御し得るであろうが、多くのウイルス感染症及び腫瘍を身体から除去するためには細胞性免疫が必要である。異なるタイプの多くの抗体及び細胞性免疫応答が存在する。細胞性免疫応答は２つの基本グループ、即ち、（１）遅延型過敏症、及び、（２）細胞傷害性、に分類される。（１）では、Ｔ細胞がマクロファージ及び別の細胞または細胞産物を介して、また、サイトカインのようなＴ細胞から分泌された産物との間接相互作用を介して、間接的にヘルパーまたはサプレッサーとして作用し、（２）では、特定機能をもつＴ細胞が特異的及び直接的に感染細胞を攻撃し殺傷する。
【０１３６】
実施例９
ＢＡＫはＣＲＬ１００５粒子に結合する
実施例２及び６に示すデータは、ＢＡＫがＣＲＬ−１００５粒子に結合することを示す。結合の程度を測定するために、ＢＡＫを曇り点よりも高温及び低温で７．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５に混合した。該混合物を次に室温で３０−６０分間インキュベートし、４４０，０００×ｇで２５℃で３０分間遠心して、溶液中のＣＲＬ−１００５に結合したＢＡＫを遊離ＢＡＫから分離した。沈降物を２％のＳＤＳに再懸濁させ（ＣＲＬ−１００５を溶解させるため）、ＢＡＫ濃度をＵＶ分光光度法によって測定した。結果は、図１０に示すＢＡＫ濃度範囲で５０％以下のＢＡＫがＣＲＬ−１００５粒子に吸着されたことを示した。これらのデータはまた、ＢＡＫ添加時点がＢＡＫの吸着量に影響しなかったことを示す。これらの結果は、ＢＡＫがＣＲＬ−１００５粒子に結合することを明らかに示し、プラスミドＤＮＡとＣＲＬ−１００５粒子との結合にＢＡＫが介在するという仮説を裏付ける。
【０１３７】
この試験に使用したＢＡＫは１２、１４及び１６炭素の鎖長をもつＢＡＫ同族体の混合物である。これらの実験に使用したＢＡＫを逆相ＨＰＬＣによって分析すると、ＢＡＫ予製液が６８％のＢＡＫ−１２と２４％のＢＡＫ−１４と８％のＢＡＫ−１６とから構成されていることが判明した。ＢＡＫとＣＲＬ−１００５との結合はＢＡＫの鎖長に依存するので、ＣＲＬ−１００５粒子に結合したＢＡＫ−１２、ＢＡＫ−１４及びＢＡＫ−１６の割合を測定した。この試験のために、各々がＰＢＳ中に７．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５と５．０ｍｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡを含有する２つの製剤を調製した。一方の製剤は０．４５ｍＭのＢＡＫを含有し、第二の製剤に０．８５ｍＭのＢＡＫを含有した。製剤を調製し、上述のように遠心してＣＲＬ−１００５粒子に結合したＢＡＫを沈降させた。ペレットを２％のＳＤＳで再度溶解し、ＢＡＫの存在量をＵＶ分光光度法によって定量した。上清中のＢＡＫ−１２、ＢＡＫ−１４及びＢＡＫ−１６の量を逆相ＨＰＬＣによって測定した。表５に示す結果は、ＢＡＫ−１４及びＢＡＫ−１６の全部がＣＲＬ−１００５粒子に結合したが、ＢＡＫ−１２は約１８乃至２５％しか結合しなかったことを示す。これらの結果は、ＢＡＫがＣＲＬ−１００５粒子に結合することを示し、ＢＡＫ−１２との結合よりもＢＡＫ−１４及びＢＡＫ−１６との結合のほうが強いことを示唆する。これらの結果はまた、プラスミドＤＮＡがＢＡＫとＣＲＬ−１００５粒子との結合を阻害しなかったことを示す。
【０１３８】
【表６】
2004536017.tif 000007
【０１３９】
実施例１０
ＣＲＬ−１００５含有及び非含有のＤＮＡ／ＢＡＫ製剤の比較
ＢＡＫがプラスミドＤＮＡにコードされた抗原に対する免疫応答を増強することはＷＯ９９／２１５９１で既に報告されていた。更に、免疫応答の増強がプラスミドＤＮＡとＢＡＫによって形成された可溶性イオン複合体の存在に起因することも特許請求の範囲に記載されていた。実施例９に提示したデータは、ＢＡＫがＣＲＬ−１００５粒子に結合するが、ＢＡＫ−１２の殆どは遊離状態でありＣＲＬ−１００５粒子に吸着されなかったことを示す。これらの結果は、ＢＡＫ−１２はプラスミドＤＮＡに結合する機能を潜在させていること、ＤＮＡ／ＢＡＫ／ＣＲＬ−１００５製剤によって誘発された細胞性免疫応答の増強の原因はＤＮＡ／ＢＡＫ複合体（ＣＲＬ−１００５には会合していない）にあるらしいことを示唆する。しかしながら、実施例２に提示したデータは、遊離ＤＮＡ／ＢＡＫ複合体がＣＲＬ−１００５の曇り点よりも高温のＤＮＡ／ＢＡＫ／ＣＲＬ−１００５中に存在しないことを示唆する。これらの結果を更に確認するために、７．５ｍＭのＣＲＬ−１００５と５．０ｍｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡと０．４５ｍＭのＢＡＫとを含有する製剤（Ｄ１１８）の０．４ｍＬのサンプルを曇り点よりも高温で複数の異なる速度（５，０００から４０，０００ｒｐｍ）で２５℃で３０分間遠心した。遠心速度の範囲は、ＢＡＫ／ＤＮＡ複合体がペレット化すべく十分に高速であるが、ＣＲＬ−１００５／ＢＡＫ粒子と会合したＤＮＡがペレット化するほど高速にはならないように選択した。各サンプルから得られたペレットを２％ＳＤＳを含む０．４ｍｌのＰＢＳに溶解し、ペレット中のＤＮＡをＵＶ分光光度法を使用して定量した。製剤Ｄ１１８と別の２つの対照との遠心段階から得られた結果を図１１に示す。
【０１４０】
結果は、ＤＮＡ対照（ＰＢＳ中に５．０ｍｇ／ｍＬのＤＮＡ）の場合、＜２５，０００ｒｐｍの速度で３０分間遠心してもＤＮＡはペレット化しなかった。遠心管から回収されたＤＮＡの基底レベルは、サンプルの除去後に管に残存するＤＮＡの残留量に起因する。対比的に、５．０ｍｇ／ｍＬのＤＮＡと０．４５ｍＭのＢＡＫとを含有する対照サンプルでは、最低遠心速度（５，０００ｒｐｍ）で有意量（３．３％）のＤＮＡがペレット化した。ペレット化したＤＮＡの量は１５，０００ｒｐｍでプラトー（総ＤＮＡの約４％）に達し、このことは、このサンプル中にＤＮＡ／ＢＡＫ沈降物が存在することを明白に表す。Ｄ１１８製剤中でペレット化したＤＮＡの量は、ＤＮＡ対照中の該当する量とほぼ同様であった。Ｄ１１８から生じたペレット中に有意量のＤＮＡが存在しないことは、この製剤中にＤＮＡ／ＢＡＫ複合体が存在しなかったことを明白に表す。
【０１４１】
これらのデータは、曇り点よりも低温で形成されたＤ１１８中のＤＮＡ／ＢＡＫ沈降物がＣＲＬ−１００５粒子の形成後に完全に溶解したことを示す。発明者らはこのイベントが以下のメカニズムによると推測する：ＢＡＫがＣＲＬ−１００５粒子に吸着されて、遊離ＢＡＫ濃度が臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）よりも低いレベルに達し、その結果としてＢＡＫミセルの溶解が生じ、その結果としてＢＡＫミセル介在性ＤＮＡ沈降物が溶解する。従って、ＤＮＡ／ＢＡＫ／ＣＲＬ−１００５製剤による免疫応答増強手段はＤＮＡ／ＢＡＫ複合体の存在を必要としない。
【０１４２】
ＤＮＡとＢＡＫとを含有する製剤に対するＣＲＬ−１００５の効果を更に検討するために、静止レーザー回折光散乱を使用して、ＰＢＳ中に５．０ｍｇ／ｍＬのＤＮＡと０．６ｍＭのＢＡＫとを含有する未希釈製剤中のＤＮＡ／ＢＡＫ粒子のサイズ分布を測定した。図１２の結果は、粒子の容量（または質量）のかなりの部分が１００乃至２，０００ミクロンの範囲のサイズをもつ粒子として存在するという極めて広い粒度分布を示す。対比的に、Ｄ１１８ａの粒度分布（容量）は、ほぼ３００ｎｍを平均サイズとするはるかに狭い分布を示す。Ｄ１１８ａ及びＤＮＡ／ＢＡＫ製剤の粒度分布を数によってプロットすると、結果は、ＤＮＡ／ＢＡＫ混合物中の最大多数の粒子がほぼ４ミクロンの粒度を有していることを明白に表す（図１３参照）。対比的に、Ｄ１１８ａ中の粒子の分析は、数による分布が量による分布と有意にオーバーラップすることを示す。これらの結果は、ＣＲＬ−１００５がＤＮＡとＢＡＫとを含有する製剤の平均粒度及びサイズ分布を有意に縮減することを明白に表す。
【０１４３】
実施例１１
ＤＮＡ／ＣＲＬ−１００５製剤の粒度分布に対するＢＡＫの効果
動物試験に使用した複数のＤＮＡ／ＣＲＬ−１００５製剤の粒度分布（表６）を静止レーザー回折光散乱によって測定した。
【０１４４】
【表７】
2004536017.tif 000008
【０１４５】
図１４のデータは、ＢＡＫがＣＲＬ−１００５の粒度分布に有意な効果を有しており、平均粒度を１５００ｎｍ以下から３００ｎｍ以下に縮小させることを示す。ＢＡＫはまた、大きい（＞１０ミクロン）粒子の量を減少させると考えられる。図１４の結果を図１２の結果に比較すると、ＰＢＳ中にＤＮＡを含有する製剤にＢＡＫを添加したときには大きい（１０００ミクロン以下）粒子が形成されるが、ＰＢＳ中にＤＮＡ／ＣＲＬ−１００５を含有する製剤にＢＡＫを添加したときにははるかに小さい（３００ｎｍ以下）粒子が形成されることが判明する。従って、ＢＡＫは、ＣＲＬ−１００５が存在するか否かに従って、プラスミドＤＮＡ製剤の粒度分布に対して顕著に異なる効果を示す。図１５は、Ｄ１１８に類似であるがより高いＢＡＫ濃度を有しておりかつＤ１１８中に使用されたＢＡＫとは有意に異なる鎖組成をもつＢＡＫを含有しているＤ１１８ａの粒度分布を示す。結果は、Ｄ１１８ａの粒度分布がＤ１１８の粒度分布と有意な違いがないことを示し、これはＢＡＫ組成の変化が粒度分布に殆ど影響しないことを表す。Ｄ１４５（図１６）の分析は、ＢＡＫ−１２を使用すると１乃至２ミクロンのサイズ範囲の狭いサイズ分布をもつ粒子が生じたことを示す。
【０１４６】
実施例１２
アカゲザルの体内におけるプラスミドＤＮＡ／ＣＲＬ１００５／ＢＡＫ製剤の免疫原性
実験の設計：
３乃至５匹ずつのグループに分けたサルに以下のワクチンを接種した：（１）ＰＢＳ中の５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ  ＤＮＡ（Ｄ１０１）；（２）Ｄ１１８中の５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ；（３）Ｄ１１８ａ中の５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ；（４）Ｄ１４５中の５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ。アジュバントは、使用したＢＡＫの濃度（０．４５対０．６ｍＭ）及びＢＡＫのタイプ（ＢＡＫ混合物対単一鎖長のＢＡＫ−１２）に関連して変える。全部のワクチンをガラス容器及びプラスチック二次コンテナに凍結保存し、注射直前に容器をゆっくりと室温に加温した。０、４、８週目に免疫感作した。ＩＭ投与経路を使用して各動物の各三角筋に０．５ｍＬのワクチンを接種した。ワクチン接種した動物の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を複数の時点でＨＩＶ−１  ｇａｇペプチドプールに対するｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって検定した（表７）。
【０１４７】
表７
アカゲザルの体内におけるプラスミドＤＮＡ／ＣＲＬ１００５製剤の免疫原性に対するＢＡＫのタイプ及び組成の効果
【０１４８】
１００万個のＰＢＭＣあたりのＳＦＣの数
【０１４９】
【表８】
2004536017.tif 000009
【０１５０】
ＤＮＡをＣＲＬ−１００５／ＢＡＫアジュバントのいずれかと共に製剤化したとき、１０週目の抗原特異的Ｔ細胞の総体頻度は２乃至４倍に増加していた。これらの結果は、種々の濃度のＢＡＫ（０．４５ｍＭから０．６ｍＭまで）を用いてまたは単一鎖長のＢＡＫ（ＢＡＫ−１２）を用いて調製したＤＮＡ／ＢＡＫ／ＣＲＬ−１００５製剤は、ＰＢＳ中のプラスミドＤＮＡによって誘発されるよりも高い免疫応答増強機能を有していたことを示す。
【０１５１】
全部の製剤がＰＢＳ中に５．０ｍｇ／ｍＬのＨＩＶ−ＦＬｇａｇプラスミドＤＮＡと７．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５とを含有していた。製剤Ｄ１１８に使用したＢＡＫは６８％のＢＡＫ−１２と２４％のＢＡＫ−１４と８％のＢＡＫ−１６とから構成され、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手した。製剤Ｄ１１８ａ及びＤ１２１（実施例１３に後述）に使用したＢＡＫは５０％のＢＡＫ−１２と３０％のＢＡＫ−１４と１７％のＢＡＫ−１６と３％のＢＡＫ−１８とから構成され、Ｒｕｇｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．から入手した。
【０１５２】
表７の免疫原性結果と図１４−１６の粒度分布データとの比較は、３００ｎｍ以下から２ミクロン以下のサイズ範囲をもつＣＲＬ−１００５粒子は免疫応答の増強に同等に有効であったことを示唆する。
【０１５３】
実施例１３
ＣＲＬ−１００５及び／またはＢＡＫを含有するプラスミドＤＮＡ製剤の免疫原性
実験の設計：
各４匹のグループに分けたサルに以下のワクチンを接種した：（１）ＰＢＳ中の５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ  ＤＮＡ（Ｄ１０１）；（２）５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ＋７．５ｍｇのＣＲＬ−１００５（Ｄ１１３）；（３）５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ＋７．５ｍｇのＣＲＬ−１００５＋０．４５ｍＭのＢＡＫ（Ｄ１１８）；（４）５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ＋７．５ｍｇのＣＲＬ−１００５＋０．６ｍＭのＢＡＫ（Ｄ１２１）；及び（５）５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ＋０．４５ｍＭのＢＡＫ（Ｄ１４９）。全部のワクチンをガラス容器及びプラスチック二次コンテナに凍結保存し、注射直前に容器をゆっくりと室温に加温した。０、４、８週目に免疫感作した。ＩＭ投与経路を使用して各動物の各三角筋に０．５ｍＬのワクチンを接種した。ワクチン接種した動物の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を複数の時点でＨＩＶ−１  ｇａｇペプチドプールに対するｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって検定した（表８Ａ）。
【０１５４】
表８Ａ
アカゲザルの体内のプラスミドＤＮＡ／ＣＲＬ１００５製剤の免疫原性に対するＢＡＫの効果
【０１５５】
１００万個のＰＢＭＣあたりのＳＦＣの数
【０１５６】
【表９】
2004536017.tif 000010
【０１５７】
ＤＮＡ単独（Ｄ１０１）とＤＮＡ／アジュバント製剤のいずれかとを比較すると、１２週目のｇａｇ特異的Ｔ細胞の総体頻度は２乃至５倍に改善されていた。Ｄ１１８製剤に対する応答はＤ１１３に対する応答のほぼ２倍に改善され、Ｄ１１８では一回だけの注射後に増強された応答が観察された（４週目のデータ参照）。１２週目にＤ１１８中のＤＮＡに対する応答はＤ１４９中のＤＮＡに対する応答を漸く上回る程度であった。しかしながら、該データはまた、Ｄ１１８中のＤＮＡによって誘発された免疫応答は一回だけの注射後に観察されたが（４週目のデータ参照）、Ｄ１４９中のＤＮＡに対する応答は２回の注射後まで観察されなかった（６週目のデータ参照）ことを示す。更に、２回の注射後にはＤ１１８中のＤＮＡによって誘発された免疫応答がＤ１４９中のＤＮＡの免疫応答を上回っていた。
【０１５８】
第二の実験では、各３匹のグループに分けたサルに以下のワクチンを接種した：（１）５ｍｇのＳＩＶ  ｇａｇ  ＤＮＡとＤ１２１（７．５ｍｇのＣＲＬ−１００５＋０．７５ｍＭのＢＡＫ）；（２）５ｍｇのＳＩＶ  ｇａｇ  ＤＮＡと７．５ｍｇのＢＡＫ（Ｄ１５０）。全部のワクチンをガラス容器及びプラスチック二次コンテナに凍結保存し、注射直前に容器をゆっくりと室温に加温した。０、４、８週目に免疫感作した。ＩＭ投与経路を使用して各動物の各三角筋に０．５ｍＬのワクチンを接種した。ワクチン接種した動物の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を複数の時点でＭａｍｕ−Ａ０１＊特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞ペプチドエピトープ，ｐ１１ｃに対するｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって検定した（表８Ｂ）。
【０１５９】
表８Ｂ
プラスミドＤＮＡ／ＣＲＬ１００５製剤の免疫原性に対するＢＡＫの効果
【０１６０】
１００万個のＰＢＭＣあたりのＳＦＣの数
【０１６１】
【表１０】
2004536017.tif 000011
【０１６２】
１５週目に（３回の注射後）、Ｄ１２１グループのｐ１１ｃ特異的Ｔ細胞のレベルはＤ１５０グループに比較して上昇していた。更に、２回の注射後のＤ１２１中のＤＮＡに対する免疫応答はＤ１５０中のＤＮＡに対する免疫応答よりも上昇していた（６週目のデータ参照）。
【０１６３】
要約すると、表８Ａ及び表８Ｂの結果は、ＣＲＬ−１００５を含有するＤＮＡ／ＢＡＫ製剤（製剤Ｄ１１８、Ｄ１１８ａ及びＤ１２１）によって誘発された免疫応答がＣＲＬ−１００５の欠如したＤＮＡ／ＢＡＫ製剤（Ｄ１４９、Ｄ１５０）またはＢＡＫの欠如したＤＮＡ／ＣＲＬ−１００５製剤（Ｄ１１３）によって誘発された免疫応答よりも強力でありかつ速やかに現れることを示す。
【０１６４】
実施例１４
ＤＮＡ／ＢＡＫ／ＣＲＬ−１００５プライムはアデノウイルスブースターに有効である
実験の設計
３乃至５匹ずつのグループに分けたサルに以下のワクチンを接種した：（１）ＰＢＳ中の５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ  ＤＮＡ（Ｄ１０１）及び（２）５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−ｇａｇ＋Ｄ１１８ａ（７．５ｍｇのＣＲＬ−１００５＋０．６ｍＭのＢＡＫ）。全部のワクチンをガラス容器及びプラスチック二次コンテナに凍結保存し、注射直前に容器をゆっくりと室温に加温した。０、４、８週目に免疫感作した。２６週目に同じＨＩＶ−１ｇａｇ遺伝子を発現する複製欠陥アデノウイルス５型（Ａｄ５）ベクターの１０７のウイルス粒子をブースターとして動物に投与した。ワクチン接種した動物の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を複数の時点でＨＩＶ−１  ｇａｇペプチドプール（ｇａｇ  Ｈ）に対するｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって検定した。
【０１６５】
ブースターの４週及び８週後に（表９）、ＤＮＡ／Ｄ１１８ａでプライムした動物の体内のｇａｇ特異的Ｔ細胞の頻度は対照グループの２倍であった。これらの結果は、アデノウイルスブースターによる免疫応答に対するプライムとしてはＤＮＡ／ＢＡＫ／ＣＲＬ−１００５製剤がＰＢＳ中のＤＮＡよりも有効であることを示す。
【０１６６】
表９
Ｄ１１８ａプライムによるアデノウイルスブースターの増強
【０１６７】
１００万個のＰＢＭＣあたりのＳＦＣの数
【０１６８】
【表１１】
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【０１６９】
実施例１５
プラスミドＤＮＡ／ＣＲＬ１００５製剤の安定度
５．０ｍｇ／ｍＬのＤＮＡと１２ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５と０．５ｍＭのＢＡＫとを含有する製剤中の超らせんプラスミドＤＮＡの安定度を評価した。２乃至８℃で９カ月間保存後のＤＮＡのアガロースゲル電気泳動は、ＣＲＬ−１００５製剤中のＤＮＡでは初期超らせん含量の９９％が残存していることを示した。ＰＢＳ中の５．０ｍｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡから成る対照サンプルでは初期超らせん含量の９８％が残存していた（双方のサンプルの初期超らせん含量は９１乃至９２％であった）。これらのデータは、１２ｍｇ／ｍＬまでの濃度のＣＲＬ−１００５がＰＢＳ中のプラスミドＤＮＡの貯蔵安定度に有意に影響しないことを示す。
【０１７０】
また、同じ実験でＣＲＬ−１００５ポリマーの安定度を試験した。分子量７，０００ダルトン未満のポリマーの割合を測定するＨＰＬＣゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を使用してポリマーの安定度を評価した。保存中の低分子量ポリマーの割合の経時的増加はポリマーの分解を表すであろう。ＧＰＣの結果は、低ＭＷポリマー（＜７，０００ダルトン）の割合が０時点で１６．７３％であり、２−８℃で６カ月間保存後に１６．１％であったことを示した（これらの結果はアッセイ変動の範囲内である；％ＲＳＤ＝５−６％）。これらの結果は、５．０ｍｇ／ｍＬのＤＮＡと０．４５ｍＭのＢＡＫとを含有する製剤中のＣＲＬ−１００５は２−８℃で少なくとも６カ月間安定であることを表す。
【０１７１】
製剤の安定度に関する別の重要な観点は粒度分布の安定度である。ＣＲＬ−１００５は５℃で保存中に安定なので、使用直前に保存製剤を取り出して室温で曇り点より高い温度に加温するまでＣＲＬ−１００５粒子が形成されない。ワクチンまたは遺伝子治療に使用するための有効な製剤は、投与まで安定な粒度分布を有していなければならない。室温で少なくとも８時間は安定な粒度分布をもつ製剤がワクチンまたは遺伝子治療に特に有用であろう。粒度分布の安定度を測定するために、５．０ｍｇ／ｍＬのＤＮＡと７．５ｍｇ／ｍＬのＣＲＬ−１００５と０．６ｍＭのＢＡＫとを含有する製剤（Ｄ１１８ａ）を調製した。時点０及び２５℃で１８時間インキュベーション後に静止レーザー回折光散乱によって粒度分布を測定した。図１７に示す結果は、Ｄ１１８ａ中のＣＲＬ−１００５の粒度分布は、曇り点よりも高温に加温した後で少なくとも１８時間は室温で安定であることを表す。
【０１７２】
本発明の範囲は本文中に記載の特定実施態様によって限定されない。実際、本文中に記載の形態以外の本発明の種々の変形が上記の記載から当業者に明らかであろう。このような変形は特許請求の範囲に包含される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＰＢＳ中のＣＲＬ−１００５の粒度に対するベンズアルコニウムクロリド及びベンズエトニウムクロリドの効果を示す。
【図２Ａ】
Ａ及びＢは２乃至１３％のショ糖勾配を使用し８０，０００ｒｐｍ（３４８，０００×ｇ）で１．５時間処理したときのプラスミドＤＮＡの沈降を示す。図２Ｂはｙ軸を拡大して示す図である。図２Ａでは画分１５−１６に回収されたＤＮＡの量が示されているが、図２Ｂは拡大されているのでこの量が示されていない。図中にポリマーに会合したＤＮＡの％が示されているとき、どの場合にもこれらはＤＮＡの総回収率を示す。
【図２Ｂ】
Ａ及びＢは２乃至１３％のショ糖勾配を使用し８０，０００ｒｐｍ（３４８，０００×ｇ）で１．５時間処理したときのプラスミドＤＮＡの沈降を示す。図２Ｂはｙ軸を拡大して示す図である。図２Ａでは画分１５−１６に回収されたＤＮＡの量が示されているが、図２Ｂは拡大されているのでこの量が示されていない。図中にポリマーに会合したＤＮＡの％が示されているとき、どの場合にもこれらはＤＮＡの総回収率を示す。
【図３Ａ】
Ａ及びＢは、ＣＲＬ−１００５の非存在下で０．８５ｍＭのＢＡＫ、５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡをショ糖勾配によって処理したときのプラスミドＤＮＡの沈降（図３Ａ）及びＢＡＫの沈降（図３Ｂ）を示す。ＤＮＡ回収率は９３％であった。
【図３Ｂ】
Ａ及びＢは、ＣＲＬ−１００５の非存在下で０．８５ｍＭのＢＡＫ、５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡをショ糖勾配によって処理したときのプラスミドＤＮＡの沈降（図３Ａ）及びＢＡＫの沈降（図３Ｂ）を示す。ＤＮＡ回収率は９３％であった。
【図４Ａ】
Ａ及びＢは、７．５ｍｇ／ｍｌのＣＲＬ−１００５の存在下で０．８５ｍＭのＢＡＫ、５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを含むサンプルをショ糖勾配によって処理したときのプラスミドＤＮＡの沈降（図３Ａ）及びＢＡＫの沈降（図３Ｂ）を示す。ＤＮＡ回収率は９７％であった。
【図４Ｂ】
Ａ及びＢは、７．５ｍｇ／ｍｌのＣＲＬ−１００５の存在下で０．８５ｍＭのＢＡＫ、５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを含むサンプルをショ糖勾配によって処理したときのプラスミドＤＮＡの沈降（図３Ａ）及びＢＡＫの沈降（図３Ｂ）を示す。ＤＮＡ回収率は９７％であった。
【図５】
ＰＢＳ中で調製した２乃至１３％のショ糖勾配で処理したときの０．８５ｍＭのＢＡＫ、７．５ｍＭのＣＲＬ−１００５、５ｍｇ／ｍｌのＤＮＡを含むサンプル及び０．８５ｍＭのＢＡＫ単独のＢＡＫ沈降プロフィルを示す。
【図６】
ＣＲＬ−１００５に会合したプラスミドＤＮＡの％に対するＢＡＫ濃度の効果を示す。
【図７】
表２に記述したような製剤Ｄ１１８及びＤ１２１の製剤の再現性及び短期安定性を示す。
【図８】
２２．５ｍｇ／ｍｌのＣＲＬ−１００５を含有する製剤の粒度に対するＢＡＫ濃度の効果を示す。製剤Ｄ１２１、Ｄ１２９、Ｄ１３０及びＤ１３１は表２に記述されている。
【図９】
表２に記述したような製剤Ｄ１１８及びＤ１２１中のＣＲＬ−１００５の粒度に対する３０℃インキュベーションの効果を示す。
【図１０】
ＣＲＬ−１００５粒子に対するＢＡＫの結合を示す。
【図１１】
ＣＲＬ−１００５の曇り点よりも高い温度の製剤Ｄ１１８中のＤＮＡ／ＢＡＫ沈降物の溶解を示す。製剤Ｄ１１８は表７に記述されている。
【図１２】
ＣＲＬ−１００５を含有する場合と非含有の場合について５．０ｍｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡと０．６ｍＭのＢＡＫとを含有する製剤の粒度分布（単位は容量％）を示す。
【図１３】
ＣＲＬ−１００５を含有する場合と非含有の場合について５．０ｍｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡと０．６ｍＭのＢＡＫとを含有する製剤の粒度分布（単位は数％）を示す。
【図１４】
表７に記述されている製剤Ｄ１１３及びＤ１１８中のＣＲＬ−１００５の粒度分布を示す。
【図１５】
表７に記述されている製剤Ｄ１１８ａ中のＣＲＬ−１００５の粒度分布を示す。
【図１６】
表７に記述されている製剤Ｄ１４５中のＣＲＬ−１００５の粒度分布を示す。
【図１７】
製剤Ｄ１１８ａ中のＣＲＬ−１００５の粒度分布の２５℃における安定度を示す。製剤Ｄ１１８ａは表７に記述されている。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004536017.tif 000118
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