(57)【要約】本発明は、インターフェロンβポリペプチドと共有結合している少なくとも１つの第１の非ポリペプチド部分を含有する、インターフェロンβ活性を示す結合体に関し、そのアミノ酸配列は野生型ヒトインターフェロンβと比較して、その第１の非ポリペプチド部分との連結基を含む少なくとも１つのアミノ酸残基が導入され除去されている点で相違している。第１の非ポリペプチド部分は例えばポリマー分子または糖部分である。結合体は治療上特定の用途が見出されている。本発明はさらに、少なくとも１つのインビボグリコシル化部位を含む親インターフェロンβ（IFNB）ポリペプチドのグリコシル化変異体に関し、グリコシル化部位に近接するその親ポリペプチドのアミノ酸残基は、親ポリペプチドのグリコシル化と比較して増大しているグリコシル化を有する変異型ポリペプチドが得られるように修飾されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのインビボグリコシル化部位を含む親インターフェロンβ（IFNB）ポリペプチドのグリコシル化変異体であって、親ポリペプチドのグリコシル化と比較してグリコシル化が増大している変異ポリペプチドを与えるように該親ポリペプチドにおける該グリコシル化部位に近接しているアミノ酸残基が修飾されているグリコシル化変異体。
【請求項２】
グリコシル化部位がＮ−グリコシル化部位である、請求項１記載の変異体。
【請求項３】
親IFNBポリペプチドが野生型インターフェロンβ、例えば野生型ヒトIFNBである、請求項１または２記載の変異体。
【請求項４】
親IFNBが、IFNB活性を示す野生型インターフェロンβの変異体または断片である、請求項１または２記載の変異体。
【請求項５】
親IFNBが、野生型IFNBと比較して非ポリペプチド部分との連結基が少なくとも１つ導入されているおよび／または少なくとも１つ除去されている、野生型IFNBの変異体である、請求項１から４までのいずれか記載の変異体。
【請求項６】
親IFNBが、野生型IFNBと比較してグリコシル化部位、具体的にはＮ−グリコシル化部位が少なくとも１つ導入されている、請求項５記載の変異体。
【請求項７】
配列番号：２に示すアミノ酸配列に対して突然変異C17Sをさらに含有している、請求項１から６までのいずれか記載の変異体。
【請求項８】
第２の非ポリペプチド部分との連結基を含むアミノ酸残基が少なくとも１つさらに、導入および／または除去されている、請求項１から７までのいずれか記載のグリコシル化変異体。
【請求項９】
少なくとも１つのリジン残基が導入および／または除去されている、請求項８記載の変異体。
【請求項１０】
K19R, K33R, K45RおよびK123Rからなる群のなかから選ばれる少なくとも１つの突然変異を含有する、請求項９記載の変異体。
【請求項１１】
突然変異の以下の組合わせ：
C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T;
C17S+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T;
C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T;
S2N+N4T+C17S+Q51N+E53T;
C17S+K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R;
C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R;
S2N+N4T+C17S+K19R+K45R+Q51N+E53T+K123R;
S2N+N4T+C17S+K19R+K33R+K45R+Q51N+E53T+K123R;
S2N+N4T+C17S+K19R+K45R+Q51N+E53T+F111N+R113T+K123R; または
S2N+N4T+C17S+K19R+K33R+K45R+Q51N+E53T+F111N+R113T+K123R
のうちの１つを含有する、請求項１から１０までのいずれか記載の変異体。
【請求項１２】
グリコシル化され、かつ糖部分とは異なる第２の非ポリペプチド部分と結合している、請求項１から１１までのいずれか記載の変異体。
【請求項１３】
第２の非ポリペプチド部分がポリマー、例えばPEG、特に12kDaまたは20kDa PEG、例えば単一PEG 20kDaである、請求項１２記載のグリコシル化変異体。
【請求項１４】
少なくとも１つのインビボグリコシル化部位を含む親IFNB分子のインビボグリコシル化を増大させる方法であって、
i)  親IFNB分子のインビボグリコシル化部位に近接している第１の位置を占めるアミノ酸残基を第２のアミノ酸残基と置換し、変異型IFNB分子を調製し、
ii)  得られた変異体のグリコシル化の程度を、グリコシル化可能宿主細胞により発現させることで得られた親IFNB分子のグリコシル化と同等の条件下で比較して測定し、
iii)  要すれば工程（i）を繰返して第２のアミノ酸残基を第３のアミノ酸残基と置換し、および／またはグリコシル化部位に近接している第２の位置に位置するアミノ酸残基を第２のアミノ酸残基と置換し、次いで親分子または工程（i）にて得られた変異型分子いずれかに対して工程（ii）を繰返し、
工程（i）から（iii）をインビボグリコシル化が増大されるまで繰り返す方法。
【請求項１５】
グリコシル化部位が天然に存在しないグリコシル化部位である、請求項１４記載の方法方法。
【請求項１６】
調製される変異体が請求項１から１３までのいずれか記載のものである、請求項１４または１５記載の方法。
【請求項１７】
a)  IFNBポリペプチドおよびb)  ヒト血清アルブミンポリペプチドを含有する融合タンパク質である変異型IFNB分子。
【請求項１８】
請求項１から１７までのいずれか記載の変異体をコードするヌクレオチド配列。
【請求項１９】
請求項１８記載のヌクレオチド配列を含有する発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１８記載のヌクレオチド配列または請求項１９記載の発現ベクターを含有するグリコシル化可能宿主細胞。
【請求項２１】
CHO細胞である、請求項２０記載の宿主細胞。
【請求項２２】
グリコシル化IFNB分子を調製する方法であって、
i)  請求項２０または２１記載の形質転換されたグリコシル化可能宿主細胞をグリコシル化分子を調製するための条件下に培養し、そして
ii)  得られたグリコシル化分子を単離する方法。
【請求項２３】
請求項１から１３までのいずれか記載の結合変異体を調製する方法であって、IFNBポリペプチド変異体を、結合が起こる条件下に結合できる分子と反応させ、得られた結合体を回収する方法。
【請求項２４】
請求項１から１３までのいずれか記載の結合変異体、およびb)製薬的に許容される希釈剤、担体またはアジュバントを含有する医薬組成物。
【請求項２５】
C17を含有するIFNBポリペプチドを含有する医薬組成物を調製するのに要する安定化剤の量と比較して少ない量の安定化剤を含有している、（配列番号：２に対して）C17S置換を含むIFNBポリペプチドを含有する医薬組成物。
【請求項２６】
安定化剤を含有していない、（配列番号：２に対して）C17S置換を含むIFNBポリペプチドを含有する医薬組成物。
【請求項２７】
疾患、特に多発性硬化症を処置するための、請求項１から１３までのいずれか記載の結合体または請求項２４から２６までのいずれか記載の組成物。
【請求項２８】
疾患、特に多発性硬化症を処置するために使用される、請求項１から１３までのいずれか記載の結合変異体、請求項２４から２６までのいずれか記載の組成物。
【請求項２９】
疾患、特に多発性硬化症を処置する医薬を製造するための、請求項１から１３までのいずれか記載の結合変異体または請求項２４から２６までのいずれか記載の組成物の使用。
【請求項３０】
多発性硬化症を処置するための方法であって、有効量の請求項１から１３までのいずれか記載の結合変異体または請求項２４から２６までのいずれか記載の医薬組成物を投与する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
インターフェロンは抗ウィルス、増殖抑制、および免疫調節活性を特徴とする重要なサイトカインである。これらの活性は肝炎、種々の癌および多発性硬化症を含む多数の疾患においてみられる臨床上の有用性の基盤となる。インターフェロンはタイプIおよびタイプIIクラスに分けられる。IFNBはタイプIインターフェロンのクラスに属しており、タイプIクラスにはインターフェロンα、τ、およびωも含まれ、他方インターフェロンγは異なるタイプIIクラスの唯一の既知のメンバーである。
【０００２】
ヒトIFNBは１６６アミノ酸残基からなる分子量２２kDaの調節ポリペプチドである。ヒトIFNBは体内のほとんどの細胞、特に繊維芽細胞から、ウィルス感染またはその他の生物学的物質の暴露に応答して産生される。これは多量体細胞表面受容体に結合し、生産的受容体結合はIFNB誘導遺伝子の発現をもたらす一連の細胞内事象を引き起こし、これは続いて抗ウィルス、増殖抑制、および免疫調節活性に分類できる効果を生じさせる。
【０００３】
ヒトIFNBのアミノ酸配列はTaniguchiらによって、Gene 10:11-15, 1980, and in EP 83069, EP 41313 and US 4686191.において報告されている。
結晶構造はヒトおよびマウスIFNBについてそれぞれ報告されている（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:11813-11818, 1997. J. Mol. Biol. 253:187-207, 1995）。それらはCell Mol. Life Sci. 54:1203-1206, 1998において概説されている。
IFNBのタンパク質操作変異体は比較的少数しか報告されていない（WO 9525170, WO 9848018, US 5545723, US 4914033, EP 260350, US 4588585, US 4769233, Stewart et al, DNA Vol 6 no2 1987 pp. 119-128, Runkel et al, 1998, Jour. Biol. Chem. 273, No. 14, pp. 8003-8008）。
CHO細胞におけるIFNBの発現が報告されている（US 4966843, US 5376567 and US 5795779）。
Redlich et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, Vol. 88, pp. 4040-4044, 1991は、突然変異C17Sを有する組換えヒトIFNBのペプチド鎖に相当する合成ペプチドに対する抗体の免疫活性を開示している。
特定のグリコシル化を受けたIFNB分子およびそれらの調製方法が報告されている（EP 287075 and EP 529300）。
【０００４】
様々な参考文献がポリマー結合またはグリコシル化によるポリペプチドの修飾を開示している。未変性IFNBのポリマー修飾またはそのC17S突然変異体が報告されている（EP 229108, US 5382657, EP 593868, US 4917888 and WO 99/55377）。 US 4,904,584は、PEG化され、かつリジン残基を欠失するポリペプチドを開示しており、そこでは少なくとも一つのリジン残基が、除去されているか他のいずれかのアミノ酸残基に置換されている。WO 99/67291はタンパク質をPEGと結合させる方法を開示しており、そこではそのタンパク質上の少なくとも一つのアミノ酸残基が除去され、そのタンパク質はPEGと、タンパク質への結合を行うのに十分な条件下で接触される。WO 99/03887は成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドのPEG化変異体を開示しており、そこではシステイン残基がそのポリペプチドのある特定の領域に位置する非必須アミノ酸残基と置換されている。IFNBは成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドの一例として示されている。WO 00/23114はグリコシル化およびPEG化されたIFNBを開示している。WO 00/23472はIFNB融合タンパク質を開示している。WO 00/26354は、アレルゲン性の低いグリコシル化ポリペプチド変異体の生産方法を開示しており、その変異体は対応する親ポリペプチドと比較して少なくとも１つの付加的なグリコシル化部位を含有するものである。US 5,218,092は、未変性のポリペプチドと比較して少なくとも一つの付加的な炭水化物鎖を導入するための、顆粒球刺激因子（G-CSF)および他のポリペプチドの修飾を開示する。IFNBはUS 5,218,092に記載されている技術により修飾され得るといわれる多くのポリペプチドの中の一例として示されている。
【０００５】
IFNBの市販製剤はBetaseron（登録商標）（インターフェロンβ1bとも呼ばれ、グリコシル化を受けておらず、組換え細菌細胞により産生されており、N末メチオニン残基欠失およびC17S突然変異を含む）、Avonex(登録商標)およびRebif（登録商標）（インターフェロンβ1aともよばれ、グリコシル化を受けており組換え哺乳動物細胞により産生されている）の名称のもと、多発性硬化症患者の治療を目的として販売され、悪化を遅らせるのに有効であることが示されており、より多くの患者でプラセボ投与された患者と比較し長期間悪化を起こさない。さらに能力障害の蓄積速度が減少する（Neurol. 51:682-689, 1998）。
構造および機能に関するインターフェロンβ1aおよびβ1bの比較はPharmaceut. Res. 15:641-649, 1998に示されている。
【０００６】
IFNBは、再発性さらには進行性の中枢神経系炎症変性疾患である多発性硬化症の進行を遅らせることが最初に示された治療である。しかしながら、その作用機序はほとんど解明されていない。IFNBはリンパ球の増殖および抗原提示に対し阻害作用を示すようである。さらに、IFNBはサイトカイン産生プロファイルを抗炎症性の表現型へと調節しているのかもしれない。最後に、IFNBはT細胞マトリックスメタロプロテアーゼの活性を阻害することにより、T細胞遊走を減少させることができる。これらの活性が協調して働き、多発性硬化症におけるIFNBの作用機序が説明される（Neurol. 51:682-689, 1998）。
さらに、IFNBは骨肉腫、基底細胞癌、子宮頚異形、神経膠腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、乳癌、黒色腫、ならびにパピローマウィルス、ウィルス性肝炎、陰部ヘルペス、帯状疱疹、疱疹性角膜炎、単純疱疹、ウィルス性脳炎、サイトメガロウィルス肺炎、およびライノウィルスのようなウィルス感染の治療に使用され得る。現在のIFNB製剤の使用は、注射部位での反応、発熱、寒気、筋肉痛、関節痛、およびその他のインフルエンザ様症状を含む様々な副作用を伴う（Clin. Therapeutics, 19:883-893, 1997）。
さらに、6-40%の患者がIFNBに対する中和抗体を産生するようになる（Int. Arch. Allergy Immunol. 118:368-371, 1999）。抗IFNB中和抗体が産生されるとIFNBに対する生物反応が減少し、治療効果を下げる傾向をもたらす（Neurol. 50:1266-1272, 1998）。中和抗体はまた、他の疾患の処置との関連でIFNBの治療上の有用性を妨げるであろうと思われる。
現在のIFNB製品の副作用の大きさ、それらと頻回投与との関連、IFNBの望ましい治療効果の妨げとなる中和抗体産生の危険性、およびより強い治療効果と同時に治療上より適したIFNBレベルが得られる可能性を考慮すれば、改良されたIFNB様分子の要望は明らかである。
【０００７】
PCT/DK00/00471は、PEGのような非ポリペプチド部分に対する連結部位やグリコシル化部位を導入および/または欠失することにより修飾されたIFNBポリペプチドに非ポリペプチド部分が結合した、新規なIFNB結合体を開示している。この分子は半減期の改善および/または現在のIFNB製品に対して生成される中和抗体に対する反応性の減少等、性質が改善されている。
【０００８】
（発明の簡単な説明）
本出願は望ましい性質をもった改良型IFNB分子を開示する。
すなわち、第一の態様として、本発明は少なくとも一つのインビボグリコシル化部位を含有する親IFNBポリペプチドのグリコシル化変異体に関し。ここで該変異体は親IFNBポリペプチドのグリコシル化と比較してグリコシル化が増大された変異型ポリペプチドが得られるように、該グリコシル化部位に近接する該親ポリペプチドのアミノ酸残基が修飾されている。
別の態様として、本発明は少なくとも一つのインビボグリコシル化部位を持つ親IFNBのインビボグリコシル化を増大させる方法に関し。その方法は以下の工程を含む：
i)  親IFNB分子のインビボグリコシル化部位に近接している第１の位置を占めるアミノ酸残基を第２のアミノ酸残基と置換し、変異型IFNB分子を調製し、
ii)  得られた変異体のグリコシル化の程度を、グリコシル化可能宿主細胞により発現させることで得られた親IFNB分子のグリコシル化と同等の条件下で比較して測定し、
iii)  要すれば工程（i）を繰返して第２のアミノ酸残基を第３のアミノ酸残基と置換し、および／またはグリコシル化部位に近接している第２の位置に位置するアミノ酸残基を第２のアミノ酸残基と置換し、次いで親分子または工程（i）にて得られた変異型分子のいずれかに対して工程（ii）を繰返し、工程（i）から（iii）をインビボグリコシル化が増大されるまで繰り返す。
【０００９】
さらなる態様として、本発明は、配列番号：２に示される野生型ヒトインターフェロンβとは異なるアミノ酸配列を有し、かつ任意で一つもしくはそれ以上のポリマー、例えば一つもしくはそれ以上のPEG分子、を含有することがある、以下の突然変異の組のうち一つを含有するインターフェロンβポリペプチドに関する：
D110F;
C17S+D110F;
C17S+Q49N+Q51T;
C17S+F111N+R113T;
C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T;
D110F+ F111N+ R113T;
C17S+D110F+ F111N+ R113T;
C17S+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T;
C17S+K19R;
C17S+K33R;
C17S+K45R;
C17S+K19R+K33R+K45R;または
C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T。
【００１０】
具体的態様として、本発明は、任意で一つもしくはそれ以上のポリマー、例えば一つもしくはそれ以上のPEG分子、を含有することがある、以下のアミノ酸配列を有するインターフェロンβポリペプチドに関する：
MSYNLLGFLQ RSSNFQSQKL LWQLNGRLEY CLKDRMNFDI PEEIKQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN。
任意で一つもしくはそれ以上のポリマー、例えば一つもしくはそれ以上のPEG分子を含有する。
別の具体的態様として、この発明は、任意で一つもしくはそれ以上のポリマー、例えば一つもしくはそれ以上のPEG分子、を含有することがある、以下のアミノ酸配列を有するインターフェロンβポリペプチドに関する：
MSYNLLGFLQ RSSNFQSQRL LWQLNGRLEY CLRDRMNFDI PEEIRQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN。
さらなる態様として、本発明は、配列番号：２に示される野生型ヒトインターフェロンβとは異なるアミノ酸配列を有し、かつ任意で一つもしくはそれ以上のポリマー、例えば一つもしくはそれ以上のPEG分子、を含有することがある以下の突然変異のうち一つを含有するグリコシル化された変異型インターフェロンβポリペプチドに関する：
D110F;
C17S+D110F;
C17S+Q49N+Q51T;
C17S+F111N+R113T;
C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T;
D110F+ F111N+ R113T;
C17S+D110F+ F111N+ R113T;
C17S+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T;
C17S+K19R;
C17S+K33R;
C17S+K45R;
C17S+K19R+K33R+K45R;または
C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T。
【００１１】
具体的態様として、本発明は、以下のアミノ酸配列を有し、かつ任意で一つもしくはそれ以上のポリマー、例えば一つもしくはそれ以上のPEG分子、を含有することがある、グリコシル化された変異型インターフェロンβポリペプチドに関する：
MSYNLLGFLQ  RSSNFQSQKL LWQLNGRLEY CLKDRMNFDI PEEIKQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL  HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN。
別の具体的態様として、この発明は、以下のアミノ酸配列を有し、かつグリコシル化された変異型インターフェロンβポリペプチドに関する：
MSYNLLGFLQ RSSNFQSQRL LWQLNGRLEY CLRDRMNFDI PEEIRQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN。
さらなる態様として、本発明は、本発明の変異型ポリペプチドの調製手段および方法に関し、本ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、発現ベクター、および本ポリペプチドの調製方法を含む。
最後に、本発明は、本発明の変異体を含有する治療用組成物、治療に使用される本発明の組成物、治療における組成物の使用または疾患治療の医薬を製造するための組成物の使用に関する。
【００１２】
（発明の詳しい説明）
本出願においては数々の参考文献が参照される。それらはすべて引用により本明細書に含まれる。
同時係属中のPCT/DK00/00471のいくつかの部分は本発明を十分に説明するのに必須であり、本明細書に包含される。これらの部分はPCT/DK00/00471を引用することで示される。それらの部分は、例えばPCT/DK00/00471に記載されるポリペプチド変異体がここに記載される修飾のための親IFNBポリペプチドとして使用され得る、という範囲で、本発明の一部を構成すると理解される。また、PCT/DK00/00471に開示される結合体またはポリペプチドに基づいた新規な発明概念が本出願において開示される。
【００１３】
定義
本出願および発明に関して（および、関連する場合、PCT/DK00/00471による発明について）、以下の定義が適用される。
”結合体”（もしくは互換的に結合型ポリペプチド）とは、一つまたはそれ以上の非ポリペプチド部分が、一つまたはそれ以上のポリペプチドと共有結合して生成される異種性（複合性もしくはキメラという意味において）の分子を意味するものである。共有結合とは、ポリペプチドと非ポリペプチド部分がお互い直接に共有結合により結合している、または架橋、スペーサー、もしくはそのポリペプチドに存在する連結基を利用した連結部分群等の介在性部分群を介して間接的に共有結合的に結合していることを意味する。その結合体は適当な濃度および条件下で可溶性であること、すなわち血液のような生理的体液中で可溶性であることが好ましい。本発明の結合型ポリペプチドとしては、グリコシル化および/またはPEG化ポリペプチドが例示される。「非結合型ポリペプチド」とはその結合体のポリペプチド部分について使用される。
「非ポリペプチド部分」なる用語は本発明のポリペプチドの連結基に結合可能な分子を意味するものとする。そのような分子の適当な例として、ポリマー分子、糖部分、親油性化合物または有機誘導化剤が含まれる。ここに記される結合体に関して使用される時は、非ポリペプチド部分は、結合変異体のポリペプチドの連結基を介してそのポリペプチド部分に結合すると解されるであろう。
【００１４】
「ポリマー分子」なる用語は二つもしくはそれ以上の単量体の共有結合によって形成される分子と定義され、ここに、ポリマーがヒトアルブミンまたは血漿中に豊富に存在する別のタンパク質である場合を除き、いずれの単量体もアミノ酸残基ではない。「ポリマー」は「ポリマー分子」と互換的に使われ得る。この用語はインビトログリコシル化、すなわち、通常ポリペプチドの連結基に対して炭水化物分子を共有結合させることを伴い、選択的に架橋剤が使用されるインビトロで行われる人工的グリコシル化、によって結合された炭水化物分子を包含するものてある。N-またはO-グリコシル化（後にさらに説明）のようなインビボグリコシル化によって付加された炭水化物分子は、本明細書では「糖部分」と称する。結合体中の、ポリマー分子または糖部分のような非ポリペプチド部分の数が表現上示されている場合を除き、結合体またはここで使用されるその他のものの中に含まれる「非ポリペプチド部分」の引用は常に、結合体中、一つまたはそれ以上の非ポリペプチド部分、例えばポリマー分子もしくは糖部分、を意味する。
【００１５】
「連結基」とは、適当な非ポリペプチド部分に結合可能なポリペプチドのアミノ酸残基の基を意味する。たとえば、ポリマーに対して、特にPEG結合に対して頻繁に使われる連結基はリジンのε-アミノ基またはN末アミノ基である。その他のポリマー連結基には遊離型カルボン酸基（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基の、またはC末アミノ酸残基のそれ）、適切に活性化されたカルボニル基、メルカプト基（例えばシステイン残基のそれ）、芳香族アミノ酸残基（例えばPhe、Tyr、Trp）、ヒドロキシ基（例えば、Ser、Thr、もしくはOH-Lysのそれ）、グアニジン（例えばArg）、イミダゾール（例えば、His）、および酸化型炭水化物部分が含まれる。
インビボN-グリコシル化において、「連結基」はN-グリコシル化部位を構成する複数のアミノ酸残基を示すという、特別な意味で用いられる（このN-グリコシル化部位はN-X'-S/T/C-X''の配列を持ち、X'はプロリン以外のアミノ酸残基であり、X''はX'と同一または同一でなくてもよいアミノ酸残基で、好ましくはプロリンとは異なるものであり、Nはアスパラギンであり、S/T/Cはセリン、スレオニンまたはシステインであり、好ましくはセリンまたはスレオニン、より好ましくはスレオニンである）。N-グリコシル化部位のアスパラギン残基はグリコシル化において糖部分が結合する部分であるが、そのような結合はN-グリコシル化部位のその他のアミノ酸残基が存在しなければ起こり得ない。つまり、非ポリペプチド部分がN-結合型糖部分である場合、親ポリペプチドのアミノ酸配列の変化に関連して使用される「非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基」なる用語は、機能的なN-グリコシル化部位がそのアミノ酸配列に導入されるか、または該アミノ酸配列から除去されるかたちで、N-グリコシル化部位を構成するアミノ酸残基が変化を受けていると解されるべきである。”O-グリコシル化部位”については連結基は、セリンまたはスレオニンのOH基である。
【００１６】
”一つの相違”または”〜と相違する”とは具体的な突然変異と関連して使用されるとき、その具体的なアミノ酸変の相違とは別の、更なる相違の存在を許容することを意味する。例えば、非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基の除去および/または導入に加えて、そのIFNBポリペプチドは、そのようなアミノ酸残基の導入および/または除去に関連しない他の置換を包含し得る。「少なくとも一つ」なる用語は、非ポリペプチド部分、アミノ酸残基、置換などについて使用されるときには、一つまたはそれ以上を意味する。「突然変異」および「置換」とはここでは互換的に使用される。
【００１７】
本出願においてアミノ酸名および原子名（例えばCA、CB、CD、CG、SG、NZ、N、O、Cなど）はthe Protein DataBank (PDB) (www.pdb.org)に明示されるとおり使用される。それはIUPAC nomenclature (IUPAC Nomenclature and Symbolism for Amino Acids and Peptides (残基名、原子名など), Eur. J. Biochem., 138, 9-37 (1984)（Eur. J. Biochem., 152, 1 (1985)において訂正）)に基づいている。CAは時折Cαと、CBはCβと呼ばれる。「アミノ酸残基」とは、アラニン（AlaまたはA）、システイン（CysまたはC）、アスパラギン酸（AspまたはD）、グルタミン酸（GluまたはE）、フェニルアラニン（PheまたはF）、グリシン（GlyまたはG）、ヒスチジン（HisまたはH）、イソロイシン（IleまたはI）、リジン（LysまたはK）、ロイシン（LeuまたはL）、メチオニン（MetまたはM）、アスパラギン（AsnまたはN）、プロリン（ProまたはP）、グルタミン（GlnまたはQ）、アルギニン（ArgまたはR）、セリン（SerまたはS）、スレオニン（ThrまたはT）、バリン（ValまたはV）、トリプトファン（TrpまたはW）、およびチロシン（TyrまたはY）残基からなる群のうちに含まれるアミノ酸残基を意味する。アミノ酸の位置/置換を同定するために使用される用語は以下のように示される：C17 (配列番号：２に示されるアミノ酸配列における17位のアミノ酸残基がシステイン残基であることを意味する）、C17S（17位におけるシステイン残基がセリンに置換されていることを意味する）。ここに示されるアミノ酸残基の番号付けは配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対してされている。「M1del」とは１位のメチオニン残基の欠失に対して使用される。複数の置換は「+」で示され、例えばR71N+D73T/Sは、71位のアルギニン残基のアスパラギンとの置換、および73位のアスパラギン酸残基のスレオニン残基またはセリン残基との置換で、好ましくはスレオニン残基との置換であること、を意味する。T/Sはここに示された置換について使用されるときはTもしくはSのいずれかを意味し、好ましくはTであることを意味する。
「ヌクレオチド配列」なる用語は二つまたはそれ以上の核酸分子の連続したひと続きを意味する。ヌクレオチド配列はゲノム、cDNA、ＲＮＡ、半合成、合成由来のもの、またはそれらの組み合わせのものがあり得る。
【００１８】
「IFNBタンパク質配列ファミリー」なる用語は、その配列と、例えばCLUSTALWプログラムを用いて配列比較可能な程十分に相同性のあるアミノ酸配列をもつポリペプチドの集まりを示す、慣習的な意味で使用される。IFNB配列ファミリーは、例えばthe PFAM families, version 4.0より入手可能であり、もしくは、CLUSTALW version 1.74のような適したコンピュータープログラムの標準パラメーターを使用することによって作成され得る。（Thompson et al., 1994, CLUSTAL W：Thompson et al., 1994, CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research, 22:4673-4680)。
「細胞」、「宿主細胞」、「株化細胞」、および「細胞培養物」はここでは互換的に使用され、それらすべての語句は、一つの細胞の成長もしくは培養により得られる子孫を含むと解されなければならない。「形質転換」および「トランスフェクション」は、DNAを細胞に導入する工程を呼ぶために互換的に使用される。
”作動可能に結合された”とは、酵素的ライゲーションもしくはその他の手段により、その配列の正常な機能が発揮されるように互いに関連ある立体配置でなされた二つまたはそれ以上のヌクレオチド配列の共有結合を指す。例えばシグナルペプチドまたは分泌リーダーをコードする配列は、ポリペプチドに対するヌクレオチド配列と結合した場合に分泌可能なタンパク質前駆体が発現されるならば、そのポリペプチドに対するヌクレオチド配列に作動可能に結合されている。プロモーターもしくはエンハンサーは、あるコード配列の転写に影響する場合には作動可能に結合されている。リボソーム結合部位は、トランスロケーションを促進するような位置にある場合、あるコード配列に作動可能に結合している。一般に、「 作動可能に結合された」とは結合されたヌクレオチド配列が連続していることを意味し、分泌リーダーの場合には、連続しかつ読み枠内にあること意味する。結合は適切な制限酵素部位におけるライゲーションによってなされる。そのようは部位が存在しない場合には、標準的なDNA組換技術と組み合わせて、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【００１９】
「導入する」なる用語は本来、既存のアミノ酸残基を置換することを意味するが、アミノ酸残基の付加的な挿入をも意味し得る。「除去する」とは本来、別のアミノ酸残基による除去されるべきアミノ酸残基の置換を意味するが、（置換を伴わずに）除去されるべきアミノ酸残基を欠失することをも意味する。
「免疫原性」とは、ある示された物質と関連して使用されるときは、その物質が免疫系の反応を引き起こす能力を意味するものとする。その免疫反応は細胞性または抗体性応答である（さらなる免疫原性についての解説はRoitt: Essential Immunology (8th Edition, Blackwell)参照）。免疫原性は、インビボもしくはインビトロのような当業界にて既知の適切な方法、例えば、以下の材料および方法に概説されるインビトロ免疫原性テストにより測定され得る。「減少した免疫原性」とは、ポリペプチドもしくは結合体について使用されるときには、同等の条件下で測定された場合にその結合変異体もしくポリペプチドが引き起こす免疫反応が、例えばRebifもしくはAvonexのような野生型ヒトIFNB、またはBetaseronのような野生型ヒトIFNB変異体のような参考分子より、測定可能なほど低いことを意味するものである。ここに市販のIFNB製品（すなわちBetaseron、AvonexおよびRebif）について述べるときは、製剤化された製品もしくは（適当なときは）製品中のIFNBポリペプチドの部分のいずれかを意味すると解されなければならない。通常、抗体反応性（例えば市販のIFNBを処置された患者由来の血清中に存在する抗体に対する反応性）が減少している場合には免疫原性が減少していることを示唆する。
【００２０】
「機能的インビボ半減期」なる用語は通常の意味で用いられ、すなわち、ポリペプチドまたは結合体の所定の機能の５０％が保持されている時点（ポリペプチドまたは結合体の生物学的活性の５０％が体内もしくは対象臓器に残存する時点、またはポリペプチドもしくは結合体の活性が最初の値の５０％である時点、など）をいう。機能的インビボ半減期を測定する代わりに「血清半減期」を測定してもよく、これはポリペプチドもしくは結合体分子の５０％が血漿もしくは血流中をクリアランスされずに循環している時点である。血清半減期の測定は機能的インビボ半減期を測定するよりも単純であり、血清半減期の大きさは大抵の場合機能的インビボ半減期の適当な指標である。血清半減期に代わる語句には、「血漿半減期」、「循環半減期」、「血清クリアランス」、「血漿クリアランス」および「クリアランス半減期」が含まれる。残存する機能は、通常、抗ウィルス、抗増殖、免疫調節もしくは受容体結合活性から選択される。機能的インビボ半減期および血清半減期は以下の材料および方法の節においてさらに論じているように当業界にて既知の適切な方法で測定することができる。
【００２１】
ポリペプチドもまたは結合体は通常、細網内皮系、腎臓、脾臓もしくは肝臓のうち一つもしくはそれ以上の機能、もしくは特異的または非特異的な蛋白分解によりクリアランスされる。腎臓により行われるクリアランスはまた”腎クリアランス”とも呼ばれる場合があり、それは例えば、糸球体濾過、尿細管排泄もしくは尿細管除去によりなされる。通常、クリアランスは、分子量、大きさ（直径）（糸球体濾過のカットオフに関連する）、電荷、対称性、形状/硬性、付加された糖鎖、およびそのタンパク質に対する細胞受容体の存在を含む、そのポリペプチドまたは結合体の物理学的性質に依存する。約６７kDaの分子量は腎クリアランスの重要なカットオフ値であると考えられる。
腎クリアランスの減少は適当なアッセイ、例えば確立されたインビボアッセイにより確認できる。通常腎クリアランスは、標識（例えば放射性標識もしくは蛍光標識）されたポリペプチドもしくはポリペプチド結合変異体を患者に投与し、その患者から採取された尿における標識活性を測ることにより測定する。腎クリアランスの減少は、同等の条件下で相当の非結合型ポリペプチドもしくは相当の非結合型野生型ポリペプチド、または市販のIFNB製品と比較して定められる。
【００２２】
機能的インビボ半減期または血清半減期について使用されるとき「増加した」なる用語は、結合体もしくはポリペプチドの相当な半減期が、同等の条件下で測定した場合に非結合型野生型ポリペプチド（例えばAvonexもしくはRebif）または非結合型変異型ヒトIFNB（例えばBetaseron）のような参考分子のそれと比較して、統計学上有意に増加していることを意味するため用いられる。
「減少した免疫原性、および/または増加した機能的インビボ半減期、および/もしくは血清半減期」とは、これらのうちいずれか一つ、二つもしくはすべての性質を包含するものと解されねばならない。好ましくは、ここに記載される結合体またはポリペプチドは、これらの性質のうち少なくとも二つ、すなわち減少した免疫原性および増加した機能的インビボ半減期、減少した免疫原性および増加した血清半減期、または増加したインビボにおける機能的半減期および増加した血清半減期を備えている。より好ましくはその結合変異体もしくはポリペプチドはすべての性質を備える。
「同等の条件下で」とは、本発明の分子および参考分子の（絶対的よりもむしろ）相対的な性質の測定について使用される場合には、それら二つの分子の相対的性質が同一のアッセイ（すなわち、同一の内部基準を含む同一の条件下で行われているアッセイ）で、適当な場合には同一種の動物を用いて、測定されていることを意味するものである。
【００２３】
「IFNB活性を示す」なる用語は、ポリペプチドもしくは結合体が未変性IFNB、特に配列番号：２に示されるアミノ酸配列（成熟配列）をもつヒト野生型IFNBであって、任意でグリコシル化可能宿主細胞において発現されたものもしくは市販のIFNB製品のうちいずれかのもの、の機能のうち一つまたはそれ以上を備えていることを意味する。そのような機能には、IFNBと結合可能でかつ細胞内シグナルを開始可能であるインターフェロン受容体、特にIFNAR-2およびIFNAR-1の受容体サブユニットから構成されるタイプＩインターフェロン受容体（Domanski et al., The Journal of Biological Chemistry, Vol. 273, No. 6, pp3144-3147, 1998, Mogensen et al., Journal of Interferon and Cytokine Research, 19: 1069-1098, 1999）に対する結合能、および抗ウィルス、抗増殖もしくは免疫調節活性（既知のアッセイ（例えば以下の開示に引用されているアッセイ）を用いて測定可能）が含まれる。IFNB活性は以下の材料および方法の節に例示されるように、当業界にて既知の方法にて測定するものとする。
「IFNB活性を示す」または「IFNB活性をもつ」ポリペプチドまたは結合体は、それが測定可能な機能を示すとき、例えば、測定可能な受容体結合および刺激活性を示すとき（例えば実施例の節に記載されている一次アッセイもしくは二次アッセイによって測定されるように）、そのような活性を持つと考えられる。IFNB活性をもつポリペプチドは、ここではまた”IFNB分子”、”IFNB変異体”、”IFNBポリペプチド”とも呼ばれ得る。”IFNBポリペプチド”、IFNB変異体”、”変異型ポリペプチド”は、本明細書では基本的に本発明の修飾されたポリペプチドについて使用される。
【００２４】
「親IFNBポリペプチド」なる用語は、本発明またはは適切な場合にはPCT/DK00/00471により改良されるべき出発分子を意味するものとする。親IFNBはIFNB配列ファミリーに属することが好ましい。親IFNBが脊椎動物もしくは哺乳動物由来のようないずれかの由来（例えばWO 00/23472において明示されている由来のいずれか）のものでありうるが、親IFNBは配列番号：２に示されるアミノ酸配列をもつ野生型ヒトIFNBまたはその変異体であることが好ましい。親IFNBポリペプチドに関して、”変異体”とは、一つまたはそれ以上のアミノ酸残基、通常は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15アミノ酸残基、が親ポリペプチドと異なるポリペプチドである。野生型ヒトIFNBの例にはAvonexもしくはRebifのポリペプチド部分が含まれる。親ポリペプチド変異体の一例はBetaseronである。あるいは、親IFNBポリペプチドは、IFNBとインターフェロンαのような別の相同ポリペプチドとの間の雑種分子であるアミノ酸配列を含むことができ、一つまたはそれ以上の付加置換がその雑種分子に導入されていることがある。そのような雑種分子は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と１０アミノ酸残基以上が異なるアミノ酸配列を含む場合がある。親ポリペプチドとして有用であるためには、雑種分子はIFNB活性を示す（例えば本明細書の材料および方法の節に記載される二次アッセイにより測定される活性）。本発明における親IFNB分子として働き得る野生型ヒトIFNBの変異体の他の例は、非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基が導入および/もしくは除去されているPCT/DK00/00471に記載されている変異体、WO 00/23114、WO 00/23472、WO 99/3887に記載されている、または当業界にて利用可能な他のIFNB分子である。
「機能的部位」とは、PCT/DK00/00471または本発明に従って本発明のポリペプチドもしくは結合変異体について使用されるときには、IFNBの機能、または性能に必須、またはそうでなければ関与する、一つまたはそれ以上のアミノ酸残基、すなわち機能的部位に「位置する」ものを意味する。機能的部位は例えば受容体結合部位であり、それは当業界にて既知の方法、好ましくはIFNAR-1およびIFNAR-2より構成されるタイプＩインターフェロン受容体のような適切な受容体と複合体を形成したポリペプチドの構造解析によって決定できる。
【００２５】
本発明のポリペプチド変異体
グリコシル化が増大した変異体
驚くことに、IFNB分子のある特定のグリコシル化部位におけるグリコシル化は、それが導入された部位であるか天然の部位であるかにかかわらず、該グリコシル化部位に近接する一つまたはそれ以上のアミノ酸残基を修飾することによって増大し得ることが明らかになった。
従って、ある態様として本発明は、少なくとも一つのインビボグリコシル化部位を有する親IFNBポリペプチドのグリコシル化変異体てあって、該グリコシル化部位に近接する該親ポリペプチドのアミノ酸残基が、親ポリペプチドのグリコシル化と比較してグリコシル化の増大した変異体ポリペプチドを得るために修飾されている変異体に関する。
「変異体」なる用語はその親ポリペプチドのアミノ酸残基が変化していることを意味するため用いられている。グリコシル化変異体はまたIFNB結合体とも呼ばれる（その結合体は、そのポリペプチド部分に結合している糖部分である非ポリペプチド部分を含む）。
通常、インビボグリコシル化部位はN-グリコシル化部位であるが、O-グリコシル化部位もまた本発明については適切と考えられる。
本明細書において「グリコシル化の増大」なる用語は、結合している糖分子のレベルの増大を意味し、通常、グリコシル化部位をより多く（もしくはより適切に）利用することで得られる。グリコシル化の増大は、結合した炭水化物構造を解析するのに適した当業界にて既知の方法によって測定され得る。結合した炭水化物構造の測定に都合のよいアッセイのひとつが以下の実施例７及び実施例８に記載される方法である。
【００２６】
グリコシル化部位に「近接する」アミノ酸残基は、大抵グリコシル化部位中の炭水化物の結合したアミノ酸残基に対して4、-3、-2、-1、+1、+2、+3、もしくは+4の位置に存在し、特に、1または+1の位置のように、-2、-1、+1、または+2の位置に存在する。従って、（配列N-X'-S/T/C-X''をもつ）N-グリコシル化部位に近接するアミノ酸残基はそのN-残基に対して4、-3、-2、-1の位置、X'もしくはX''の位置（その場合導入されるアミノ酸はプロリンとは異なることが望ましい）、またはX''残基に対して+1の位置である場合がある。
アミノ酸修飾は通常置換であり、それは親ポリペプチドと比較してIFNB変異体のグリコシル化を増大させるような、他のいずれかのアミノ酸残基との置換である。そのような他のアミノ酸残基は試行錯誤的な実験によって（すなわち適当な位置のアミノ酸残基を他のいずれかのアミノ酸残基に置換し、得られた変異体のグリコシル化を測定することによって）決めることができる。
原則として、本発明に従って修飾される親IFNBポリペプチドは、IFNB活性を示し少なくとも一つのグリコシル化部位、特にN-グリコシル化部位、をもつポリペプチドである。適切な親ポリペプチドは前方の「定義」の節に示されており、それには野生型IFNB（例えば野生型ヒトIFNB）または非天然のIFNBポリペプチド（例えば野生型ヒトIFNBの変異体または断片）が含まれる。
【００２７】
親INFBポリペプチドは一つ以上、例えば2から7または2から5のグリコシル化部位、のように2から10のグリコシル化部位を含むことができる。そのグリコシル化部位は天然のグリコシル化部位または導入されたグリコシル化部位であってよく、N-グリコシル化部位であることが好ましい。野生型ヒトIFNBのN80およびT82により定められるN-グリコシル化部位は天然のグリコシル化部位の一例である。
親IFNBポリペプチドが少なくとも一つの導入されたN-グリコシル化部位を含むとき、該部位は「PCT/DK00/00471に係る発明の結合体」または「PCT/DK00/00471に係る発明の結合体であって非ポリペプチド部分が糖部分であるもの」と題される節に記載されたもののうち、いずれかまたはそれと同等の位置に存在することが望ましい。
「同等の位置」とは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列における相当の位置と相同の（すなわち一次または三次構造において位置的に対応する）、ある特定のIFNBポリペプチドのアミノ酸配列中の位置を意味する。その「同等の位置」はIFNBタンパク配列ファミリーのメンバーの配列比較に基づいて適宜決定され、それは例えばCLUSTALW version 1.74の標準パラメーターを使用することによって（Thompson et al., 1994, CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice, Nucleic Acids Research, 22:4673-4680）または公開されている配列から決定される。
【００２８】
ある具体的な態様では、親IFNBポリペプチドは一つまたはそれ以上のグリコシル化部位が導入された野生型ヒトIFNBであり、そのグリコシル化部位は「PCT/DK00/00471に係る発明の結合体であって非ポリペプチド部分が糖部分であるもの」の節に明示される置換によって導入されている。親IFNBポリペプチドが野生型ヒトIFNBに由来する場合、通常N80の位置に天然のグリコシル化部位も含んでいる。
例えば、その親IFNBポリペプチドは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を持つ野生型ヒトIFNBのアミノ酸配列の2、49、51、または111の位置のアミノ酸のうち少なくとも一つと同等の位置にグリコシル化部位が導入されており（それぞれアミノ酸置換S2N+N4T/S、Q49N+Q51T/S、Q51N+E53T/SまたはF111N+R113T/Sと規定される）、さらに/またはN80+T82によって規定される野生型ヒトIFNBの配列のそれと相当する位置にグリコシル化部位を含む。そのような親IFNBポリペプチドから調製される本発明の変異体はさらに、そのN-グリコシル化部位に近接する位置、例えば配列番号：２の1、48、50、79、または110の位置もしくはそれに相当する位置、におけるアミノ酸置換を含み、その置換は親ポリペプチドの相当する位置におけるアミノ酸残基とは異なるアミノ酸残基との置換であり、親IFNBポリペプチドと比較して適切なグリコシル化部位におけるグリコシル化を増大することができるものである。
より具体的には、本発明の一つの態様として、その変異体は、配列番号：２におけるQ49N+Q51T/Sで示される置換またはそれと同等の置換によりグリコシル化部位を導入された親IFNBポリペプチドから調製され、その変異体はさらに配列番号：２のK45、Q46、L47、Q48、F50もしくはK52の位置またはそれと同等の位置におけるアミノ酸残基の置換を含み、その置換は親IFNBポリペプチドと比較して導入された該ポリペプチド部位におけるグリコシル化が増大するようにアミノ酸残基に対して行われている。置換されるアミノ酸残基はQ48の位置またはそれと同等の位置に存在することが好ましい。
【００２９】
別の態様において、その変異体は配列番号：２のおけるF111N+R113T/Sの置換またはそれと同等の置換により導入されたグリコシル化部位を含む親IFNBポリペプチドから調製され、その変異体はさらに配列番号：２のE107、K108、E109、D110、T112もしくはG114の位置またはそれと同等の位置におけるアミノ酸残基の置換を含み、その置換は親IFNBポリペプチドと比較して導入された該ポリペプチド部位におけるグリコシル化が増大するようにアミノ酸残基に対して行われている。置換されるアミノ酸残基はD110の位置もしくはそれと同等の位置に存在することが好ましい。
さらに別の態様において、その変異体は配列番号：２のおけるQ51N+E53T/Sの置換またはそれと同等の置換により導入されたグリコシル化部位を含む親IFNBポリペプチドから調製され、その変異体はさらに配列番号：２のL47、Q48、Q49、F50、K52もしくはD54の位置またはそれと同等の位置におけるアミノ酸残基の置換を含み、その置換は親IFNBポリペプチドと比較して導入された該ポリペプチド部位におけるグリコシル化が増大するようにアミノ酸残基に対して行われている。好ましくは、置換されるアミノ酸残基はQ49の位置またはそれと同等の位置に存在する。
さらに別の態様において、その変異体は配列番号：２のおけるS2N+N4T/Sの置換またはそれと同等の置換により導入されたグリコシル化部位を含む親IFNBポリペプチドから調製され、その変異体はさらに配列番号：２のM1、Y3もしくはL5の位置またはそれと同等の位置におけるアミノ酸残基の置換を含み、その置換は親IFNBポリペプチドと比較して導入された該ポリペプチド部位におけるグリコシル化が増大するようにアミノ酸残基に対して行われている。置換されるアミノ酸残基はM1の位置またはそれと同等の位置に存在することが好ましい。http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/を用いて、すべてのアミノ酸置換が配列番号：２の１の位置において可能であることが証明されている（すなわち正しいシグナルペプチドの分裂が可能である）。
さらに別の態様において、その変異体は配列番号：２のおけるN80およびT82の位置もしくはそれと同等の位置に天然のグリコシル化部位をもつ親IFNBポリペプチドから調製され、その変異体はさらに配列番号：２のS76、T77、E78、W79、E81もしくはI83の位置またはそれと同等の位置におけるアミノ酸残基の置換を含み、その置換は親IFNBポリペプチドと比較して導入された該ポリペプチド部位におけるグリコシル化が増大するようにアミノ酸残基に対して行われている。置換されるアミノ酸残基はW79の位置またはそれと同等の位置に存在することが好ましい。
例えば、この局面における変異体は以下の突然変異の組のうち少なくとも一つを含有するものであり、示されている突然変異はすべて配列番号：２に記載されるアミノ酸配列に相当する：
Q48F,V,W,Y + Q49N+Q51T/S;
D110F,V,Y + F111N+R113T/S。
以上に具体的に示した以外の他の部位（例えばPCT/DK00/00471に規定される表面露出アミノ酸残基が存在する位置）に導入されたグリコシル化部位でのグリコシル化は上記と同様にして修飾され得る。
さらに、この局面により修飾を受ける親IFNBポリペプチドは、遊離型システイン残基、例えば配列番号：２の１７の位置におけるシステイン残基を含まないことが本発明では好ましい。好ましくは、親ポリペプチドが野生型ヒトIFNB由来である場合、その親ポリペプチドは配列番号：２に示されるアミノ酸配列に対して17の位置に非システインアミノ酸残基、例えば突然変異C17S、を含む。
【００３０】
別の態様においては、この局面により修飾をうける親IFNBポリペプチドは第二の非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基が少なくとも一つ導入および/または除去されている。例えば、導入および/または除去されているアミノ酸残基は「 PCT/DK00/00471に係る発明の結合体」、「PCT/DK00/00471に係る発明の結合体であって非ポリペプチド部分が連結基としてリジン残基を有する分子であるもの」、「PCT/DK00/00471に係る発明の結合体であって非ポリペプチド部分がシステイン残基に結合しているもの」、または「PCT/DK00/00471に係る発明の結合体であって非ポリペプチド部分が酸性基に結合しているもの」と題される節に示されているとおりであり、従ってこれらの節のいずれかに記載されているように親IFNBポリペプチドは結合体のポリペプチド部分である。
非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基は例えばリジン残基である。ある具体的な態様においては親IFNBポリペプチドは少なくとも一つのアミノ酸残基の置換を含み、そのアミノ酸はK19、K33、K45およびK123の位置またはそれと同等の位置に存在し、そのリジン残基はR残基に置換されていることが好ましい。
【００３１】
より具体的には、親IFNBポリペプチドは以下の突然変異（配列番号：２に対して示されている）の組のうち一つを含むことができる：
C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T;
S2N+N4T+C17S+Q51N+E53T;
C17S+K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R;
C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R;
S2N+N4T+C17S+K19R+K45R+Q51N+E53T+K123R;
S2N+N4T+C17S+K19R+K33R+K45R+Q51N+E53T+K123R;
S2N+N4T+C17S+K19R+K45R+Q51N+E53T+F111N+R113T+K123R;または
S2N+N4T+C17S+K19R+K33R+K45R+Q51N+E53T+F111N+R113T+K123R。
親IFNBポリペプチドが突然変異Q49N+Q51T/Sを含む場合、この態様による変異体はさらに置換Q48F,V,W,Yを含むことが好ましい。親IFNBポリペプチドが突然変異F111N+R113T/Sを含む場合、その変異体はさらに置換D110F,V,Yを含むことが好ましい。
親IFNBポリペプチド、即ち変異体において第二の非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基が導入および/または除去されているとき、その変異体はグリコシル化されているだけでなく、少なくとも一つの導入および/または除去された連結基を介して第二の非ポリペプチド部分と結合していることが好ましい、と理解される。第二のポリペプチド部分は大抵糖部分とは異なり、通常はPEGのようなポリマーである。「本発明の結合体の非ポリペプチド部分」の節には、この態様に従う変異体に結合する第二のポリペプチド部分として使用可能な適したポリマーおよびその他のタイプの非ポリペプチド部分が記載されている。
【００３２】
さらなる態様として、本発明は配列番号：２に示されるアミノ酸配列をもつ野生型ヒトインターフェロンβとは異なる配列を有し、かつ任意で一つまたはそれ以上のポリマー、例えば一つまたはそれ以上のPEG分子を含有することがある、以下の突然変異の組のうち一つを含むインターフェロンβポリペプチドに関する：
D110F;
C17S+D110F;
C17S+Q49N+Q51T;
C17S+F111N+R113T;
C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T;
D110F+ F111N+ R113T;
C17S+D110F+ F111N+ R113T;
C17S+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T;
C17S+K19R;
C17S+K33R;
C17S+K45R;
C17S+K19R+K33R+K45R;または
C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T。
これらの突然変異の組のそれぞれは個々の具体例とみなされ、特許請求の範囲の対象と成り得る。
具体的な態様において本発明は、以下のアミノ酸配列をもち、任意で一つまたはそれ以上のポリマー、例えば一つまたはそれ以上のPEG分子を含むことがある、インターフェロンβポリペプチドに関する：
MSYNLLGFLQ RSSNFQSQKL LWQLNGRLEY CLKDRMNFDI PEEIKQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN。
別の具体的な態様として、本発明は、以下のアミノ酸配列をもち、任意で一つまたはそれ以上のポリマー、例えば一つまたはそれ以上のPEG分子を含むことがある、インターフェロンβポリペプチドに関する：
MSYNLLGFLQ RSSNFQSQRL LWQLNGRLEY CLRDRMNFDI PEEIRQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN。
【００３３】
さらなる態様においては、インターフェロンβポリペプチドはさらに、PEG分子、特に12kDaまたは20kDaのPEG分子（例えば20kDaの単量体PEG）を含む。インターフェロンβ分子がPEG化されるとき、それは大抵1から5のポリエチレングリコール（PEG）分子を含む。さらなる態様においては、インターフェロン分子は例えば1、2、または3のPEG分子のように1から5のPEG分子を含む。さらなる態様においては、各PEG分子の分子量は約5kDa（キロダルトン）から100kDaである。さらなる態様においては、各PEG分子の分子量は約10kDaから40kDaである。さらなる態様においては、各PEG分子の分子量は約12kDaである。さらなる態様においては、各PEG分子の分子量は約20kDaである。好ましくは、インターフェロン分子は、分子量が各々約12kDaである1から3のPEG分子か、または、分子量約20kDaの1のPEG分子を含む。適したPEG分子はShearwater Polymers, Inc. and Enzon, Inc.より入手可能であり、SS-PEG、NPC-PEG、アルデヒド-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC、SC-PEG、トレシル化mPEG（US 5,880,255）、またはオキシカルボニル-オキシ-N-ジカルボキシミド-PEG（US 5,122,614）から選択することができる。
【００３４】
さらなる態様として、本発明は少なくとも一つのインビボグリコシル化部位を含む親IFNBポリペプチドのインビボグリコシル化を増大する方法に関し、その方法は以下の工程を含む：
i)  親IFNB分子のインビボグリコシル化部位に近接している第１の位置を占めるアミノ酸残基を第２のアミノ酸残基と置換し、変異型IFNB分子を調製し、
ii)  得られた変異体のグリコシル化の程度を、グリコシル化可能宿主細胞により発現させることで得られた親IFNB分子のグリコシル化と同等の条件下で比較して測定し、
iii)  要すれば工程（i）を繰返して第２のアミノ酸残基を第３のアミノ酸残基と置換し、および／またはグリコシル化部位に近接している第２の位置に位置するアミノ酸残基を第２のアミノ酸残基と置換し、次いで親分子または工程（i）にて得られた変異型分子のいずれかに対して工程（ii）を繰返し、工程（i）から（iii）をインビボグリコシル化が増大されるまで繰り返す。
親ポリペプチドは天然または非天然のグリコシル化部位を含み、それは例えば本発明において上記に記載される親ポリペプチドである。グリコシル化部位に近接するアミノ酸残基は例えば本節において特定されるそれらのうちのいずれかである。
【００３５】
さらなる態様として、本発明は配列番号：２に記載されるアミノ酸配列をもつ野生型ヒトインターフェロンβとは異なるアミノ酸配列をもち、かつ任意で一つまたはそれ以上のポリマー、例えば一つまたはそれ以上のPEG分子を含有することがある、以下の突然変異の組のうち一つを含むインターフェロンβポリペプチドのグリコシル化変異体に関する：
D110F;
C17S+D110F;
C17S+Q49N+Q51T;
C17S+F111N+R113T;
C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T;
D110F+ F111N+ R113T;
C17S+D110F+ F111N+ R113T;
C17S+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T;
C17S+K19R;
C17S+K33R;
C17S+K45R;
C17S+K19R+K33R+K45R;または
C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T。
これらの突然変異の組のそれぞれは個々の具体例とみなされ、請求の範囲の対象と成り得る。
特定の態様において本発明は、以下のアミノ酸配列をもち、任意で一つまたはそれ以上のポリマー、例えば一つまたはそれ以上のPEG分子を含むことがある、インターフェロンβポリペプチドのグリコシル化変異体に関する：
MSYNLLGFLQ RSSNFQSQKL LWQLNGRLEY CLKDRMNFDI PEEIKQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN。
別の態様として、本発明は、以下のアミノ酸配列をもち、任意で一つまたはそれ以上のポリマー、例えば一つまたはそれ以上のPEG分子を含むことがある、インターフェロンβポリペプチドのグリコシル化変異体に関する：
MSYNLLGFLQ RSSNFQSQRL LWQLNGRLEY CLRDRMNFDI PEEIRQLQNF TKEDAALTIY EMLQNIFAIF RQDSSSTGWN ETIVENLLAN VYHQINHLKT VLEEKLEKEF NTTGKLMSSL HLKRYYGRIL HYLKAKEYSH CAWTIVRVEI LRNFYFINRL TGYLRN。
ある実施例においてはインターフェロン分子はグリコシル化およびPEG化されている。さらなる態様では、インターフェロン分子はグリコシル化されている。
【００３６】
さらなる態様においては、グリコシル化されたインターフェロンβポリペプチドは、1から3の糖部分のような1から5の糖部分を含む。インターフェロン分子がグリコシル化されるとき、それはN-グリコシル化であることが好ましい。インターフェロン分子がグリコシル化されるとき、それは大抵1から3の糖部分のような1から5の糖部分を含む。さらなる態様において、インターフェロン分子はN-グリコシル化されており、かつ1から3の糖部分のような1から5の糖部分を含む。さらなる態様において、インターフェロン分子はN-グリコシル化されており、かつ3つの糖部分を含む。上記の具体的態様については、そのインターフェロンβポリペプチドは3つの糖部分をもち、それはN49、N80およびN111の位置である。
【００３７】
別の態様においては、グリコシル化されたインターフェロンβポリペプチドはさらにPEG分子、特に12kDaまたは20kDaのPEG分子（例えば20kDaの単量体PEG）を含む。インターフェロン分子がPEG化されるとき、それは大抵1から5のポリエチレングリコール（PEG）分子を含む。さらなる実施例においては、インターフェロン分子は例えば1、2、または3のPEG分子のように1から5のPEG分子を含む。さらなる実施例においては、各PEG分子の分子量は約5kDa（キロダルトン）から100kDaである。さらなる実施例においては、各PEG分子の分子量は約10kDaから40kDaである。さらなる実施例においては、各PEG分子の分子量は約12kDaである。さらなる実施例においては、各PEG分子の分子量は約20kDaである。好ましくは、インターフェロン分子は、分子量が各々約12kDaである1から3のPEG分子か、または、分子量約20kDaの1のPEG分子を含む。上記の具体的な局面について、特定の態様においては、インターフェロンβポリペプチドは1から3の12kDaのPEG分子を含む。上記の具体的態様について、特定の実施例においては、インターフェロンβポリペプチドは1つの20kDaのPEG分子を含む。適したPEG分子はShearwater Polymers, Inc. and Enzon, Incより入手可能であり、SS-PEG、NPC-PEG、アルデヒド-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC、SC-PEG、トレシル化mPEG（US 5,880,255）、またはオキシカルボニル-オキシ-N-ジカルボキシミド-PEG（US 5,122,614）から選択することができる。
【００３８】
この態様に従うグリコシル化変異体はグリコシル化可能宿主細胞、好ましくは「糖部分との結合」と題される節に示されるそれらのうちいずれか、のような哺乳類宿主細胞において組換え手法により発現される。
この態様に従う変異体は、親IFNBポリペプチドのほとんどまたはすべてのIFNB発現レベル（IU/ml）を保持していることが好ましい。しかしながら、グリコシル化部位に近接するアミノ酸残基の置換により非常に高いグリコシル化が得られる時、変異体の全体的な性能が親IFNBポリペプチドと比較して改善されている限り発現レベルの減少は許容される。
この態様に従う変異体は、通常PCT/DK00/00471に基づく結合体について記載されているいずれかの改善された性質、例えば、「PCT/DK00/00471に係る発明の結合体」と題される節においてさらに記載されているいずれかの改善された性質、を有すると解される。
【００３９】
特定のアミノ酸置換をうけた変異体
本発明のさらなる具体的な態様では、変異体は親IFNB分子、特に配列番号：１に示されるアミノ酸配列を有する野生型ヒトIFNBに対して突然変異L98Pを含むものである。その変異体はL98Pを唯一の突然変異をして含むか、または、さらなる突然変異、例えば本明細書のいずれかの節（その題が「PCT/DK00/00471に発明の結合体...」ではじまる節か、または「グリコシル化の増大した変異体」と題される節）に記載される突然変異のうちいずれか、を含むことができる。例えば、変異体は以下の突然変異を含む場合がある：
Q49N+Q51T+L98P+F111N+R113T
C17S+Q49N+Q51T+L98P+F111N+R113T。
本発明のさらに特定のグリコシル化変異体は以下のアミノ酸置換（配列番号：２に関して）を含む：
C17S+Q49N+Q51T+F111N+R113T
S2N+N4T+C17S+Q51N+E53T
S2N+N4T+C17S+Q51N+E53T+F111N+R113T。
本発明のさらに特定のグリコシル化変異体は以下のアミノ酸置換（配列番号：２に関して）を含む：
S2N+N4T+C17S+K19R+Q51N+E53T+K123R
S2N+N4T+C17S+K19R+Q51N+E53T+F111N+R113T+K123R
S2N+N4T+C17S+K19R+K45R+Q51N+E53T+F111N+R113T+K123R。
これらの変異体は、ポリマー、例えばPEG、のような、第二の非ポリペプチド部分と通常は結合している。
この態様による変異体は、通常PCT/DK00/00471に基づく結合体について記載されているいずれかの改善された性質、例えば、「PCT/DK00/00471に係る発明の結合体」と題される節においてさらに記載されているいずれかの改善された性質、を有すると解される。
【００４０】
融合タンパク質である変異体
さらなる態様として、本発明は、a）IFNBポリペプチドおよびb）ヒト血清アルブミンポリペプチド（HSA）を含む融合タンパク質である変異体IFNBポリペプチドに関する。変異体IFNBポリペプチドは、例えば、PCT/DK00/00471に記載される結合体または本発明に基づくグリコシル化変異体のポリペプチド部分である。HSAは、例えば野生型ヒト血清アルブミン、またはその断片もしくは変異体（例えばWO 97/24445に開示されるヒト血清アルブミン断片のいずれか）である。ヒト血清アルブミンに対する融合はWO 93/15199、WO 93/15200およびEP 413 622にもまた記載されている。
融合タンパク質のIFNBポリペプチドおよびヒト血清アルブミンの部分は直接結合しているか、または（例えばWO 97/24445に開示される）リンカーペプチドを介して結合し得る。HSAはIFNBポリペプチドのC末端またはN末端に結合し、任意でリンカーペプチドを介する場合がある。IFNBポリペプチドのヒト血清アルブミンまたはその変異体もしくは断片との結合の結果、生じる融合タンパク質の安定性が全体的に増大する。
この態様に従う変異体は、通常PCT/DK00/00471に基づく結合体について記載されているいずれかの改善された性質、例えば、「PCT/DK00/00471に係る発明の結合体」と題される節においてさらに記載されているいずれかの改善された性質、を有すると解される。
【００４１】
Pct/dk00/00471の開示の部分
PCT/DK00/00471に係る発明の結合体
PCT/DK00/00471に係る発明の第一の態様は、IFNB活性を示し、少なくとも一つ第一の非ポリペプチド部分（IFNBポリペプチドに共有結合している）を含む結合体に関するものであり、そのIFNBポリペプチドのアミノ酸配列は、前述の第一の非ポリペプチド部分に対する連結基を含有するアミノ酸残基が少なくとも一つ導入および少なくとも一つ除去されている点で野生型ヒトIFNBと相違する。
非ポリペプチド部分に対する連結基を含有するアミノ酸残基を除去および/または導入することにより、そのポリペプチドを、選択した非ポリペプチド部分とより結合しやすくするように特別に改造することが可能であり、それは結合パターンを最適化するため（例えば、IFNB分子表面の非ポリペプチド部分を確実に最適に配置させるため、およびそれにより例えばその機能を著しく弱めることなく効果的にエピトープおよびポリペプチドの他の表面部分を保護するため）に行われる。例えば、連結基を導入することにより、IFNBポリペプチドにおいて適切な非ポリペプチド部分が結合する特定のアミノ酸残基の量がふえ、またはそうでなければ変化し、それによってより効果的で、特定性が高く、かつ/または大量の結合が達成される。一つまたはそれ以上の連結基を除去することにより、結合がおこると不都合なポリペプチドの部分、例えばポリペプチドの機能的部位に位置するまたはその近くのアミノ酸残基における非ポリペプチド部分との結合を回避することができる（なぜならそのような部位における結合は受容体による認識を損なうため、得られる結合体の不活性化またはIFNB活性の減少をもたらすため）。さらに、別の連結基に近接する連結基を除去すると、そのような基に対する異種の結合が回避されるため、好都合である。
【００４２】
非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基は、それは除去されているかまたは導入されているかいずれかであるが、非ポリペプチド部分の性質、およびほとんどの場合、使用される結合方法に基づいて選択される。例えば、非ポリペプチド部分がポリエチレングリコールまたはポリアルキレンオキサイド誘導分子のようなポリマー分子であるときは、連結基として機能し得るアミノ酸残基は、リジン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびアルギニンからなる群のうちから選ぶことができる。非ポリペプチド部分が糖部分であるときは、連結基はインビボグリコシル化部位であり、N-グリコシル化部位であることが好ましい。
非ポリペプチド部分に対する連結基が、PCT/DK00/00471に記載される発明に従いIFNBポリペプチドに導入されまたはIFNBポリペプチドから除去されているときは必ず、修飾されるべきIFNBポリペプチドの位置は適宜以下のように選択される：
その位置はIFNBポリペプチドの表面に存在することが好ましく、かつその側鎖の25％以上、好ましくは50％以上、が溶媒に露出しているアミノ酸残基であることがより好ましい。そのような位置は本明細書の方法の節に記載されるヒトIFNB分子の三次元構造解析に基づき同定される。
あるいはまたはさらに、修飾されるべき位置はIFNBタンパク配列ファミリーの解析に基づいて同定される。さらに詳細には、修飾されるべき位置は、親IFNB以外の一つまたはそれ以上のファミリーのメンバーにおいて適切な連結基を含むアミノ酸残基で占められている位置（そのようなアミノ酸残基が導入されるべきとき）であり、または他の一つまたはそれ以上のファミリーのメンバーではなく親ポリペプチドにおいて適切な連結基を含むアミノ酸残基で占められている位置（そのようなアミノ酸残基が除去されるべきとき）、であり得る。
【００４３】
連結基の最適な分布を決定するため、IFNBポリペプチドの三次元構造解析に基づいてIFNB分子の表面に位置するアミノ酸残基間の距離を計算する。詳細には、そのような連結基を含むアミノ酸残基のCB間の距離、または一アミノ酸残基の機能的部位（リジンについてNZ、アスパラギン酸についてCG、グルタミン酸についてCD、システインについてSG）と連結基を含む別のアミノ酸残基のCBの間の距離を測定する。グリシンの場合、CBの代わりにCAが用いられる。PCT/DK00/00471に係る発明の結合体のIFNBポリペプチド部分において該距離のいずれかは8Å以上、特に異種性の結合を避けるまたは減らすため、１０Å以上であることが好ましい。
さらに、PCT/DK00/00471に係る発明の結合体中のIFNBポリペプチド部分において、IFNBの受容体結合部位に存在する連結基は除去されていることが好ましく、それはそのような基を含むアミノ酸残基の置換によりなされていることが好ましい。
【００４４】
IFNBポリペプチドを修飾するのに一般的により適切な方法は、非ポリペプチド部分の結合により親IFNBに存在するエピトープを保護し、かつそれにより破壊またはそうでなければ不活性化することである。ヒトIFNBのエピトープは当業界にて既知の方法、それはまたエピトープマッピングとして知られるが（例えばRomagnoli et al., J. Biol Chem, 1999, 380(5):553-9、DeLisser HM, Methods Mol Biol, 1999, 96:11-20、Van de Water et al., Clin Immunol Immunopathol, 1997, 85(3):229-35、Saint-Remy JM, Toxicology, 1997, 119(1):77-81、およびLane DP and Stephen CW, Curr Opin Immunol, 1993, 5(2):268-71参照）、を使用して特定できる。ある方法では、ランダムなオリゴペプチド、例えば9アミノ酸残基の、を発現するファージディスプレイライブラリーを構築するものである。特定の抗血清から得られるヒトIFNBに対するIgG1抗体は免疫沈降により精製され、反応性のあるファージはイムノブロッティングにより特定される。精製された反応性のあるファージのDNAをシークエンスすることにより、そのオリゴペプチドの配列を決定し、続いてIFNBの三次元構造におけるその配列の位置を決定することができる。あるいは、エピトープはUS 5,041,376に記載される方法により特定することができる。それにより特定されたその構造上の領域は、非ポリペプチド部分に対する連結基の導入のための対象領域として選択することができるエピトープの構成要素となる。好ましくは、二つ、三つ、または四つのように、少なくとも一つの（任意でC17S突然変異を含むことがある）ヒト組換えIFNBのエピトープを、PCT/DK00/00471に記載される発明に従い非ポリペプチド部分によって保護する。つまり、ある態様においては、PCT/DK00/00471に係る発明の結合体は、市販のIFNBを含む任意でC17S突然変異を含むことのある野生型ヒトIFNBと比較して、少なくともひとつの保護されたエピトープをもつ。好ましくは、PCT/DK00/00471に係る発明の結合体は、Q49および/またはF111のアミノ酸残基の付近に位置するエピトープを保護するように修飾されたポリペプチドを含む。これはQ49および/またはF111の付近（すなわち一次配列において4アミノ酸残基以内または三次配列において約10Å以内）の位置に非ポリペプチド部分に対する連結基を導入することによってなされ得る。10Åの距離はCB（グリシンの場合はCA）の間で測定される。そのような特定の導入は以下の節に記載される。
【００４５】
連結基の除去の場合は、そのような基を含み上記のように定められた位置を占める適当なアミノ酸残基は、問題の非ポリペプチド部分に対する連結基を含まない異なるアミノ酸残基と置換されていることが好ましい。
連結基の導入の場合は、そのような基を含むアミノ酸残基がその位置に導入され、それはそのような位置を占めるアミノ酸残基を置換することによりなされることが好ましい。
結合に利用可能でかつそのIFNBポリペプチドに存在する連結基の正確な数は、結合によって達成されることが期待される効果に依存する。得られるべき効果は、例えば結合の性質および程度（例えば、非ポリペプチド部分自身、ポリペプチドに結合していることが望ましいもしくは結合可能な非ポリペプチド部分の数、それらが結合されるべき場所、または結合が回避されるべき場所など）に依存する。例えば免疫原性が減少することが望まれる場合、連結基の数（および位置）は、ほとんどまたはすべてのエピトープを保護するのに十分であるべきである。これは通常、より高い割合のIFNBポリペプチドが保護されるときに得られる。エピトープの効果的な保護は通常、結合に利用可能な連結基の総数が1から10連結基の範囲内、特に3から7のように2から8の範囲内、であるときに達成される。
機能的インビボ半減期は特に結合体の分子量に依存し、半減期を増大させるのに必要な連結基の数は従って問題の非ポリペプチド部分の分子量に依存する。ある実施例においては、PCT/DK00/00471に係る発明の結合体の分子量は少なくとも67kDaであり、特にLaemmli, U.K., Nature Vol 227 (1970), p680-85に従いSDS-PAGEにより測定した場合は少なくとも70kDaである。IFNBの分子量は約20kDaであり、それゆえ望ましい効果を得るのにさらに50kDaが必要である。これは例えば5、10、12もしくは20kDaのPEG分子または本明細書に記載されるその他のものにより与えられる。
【００４６】
ヒトIFNB分子の構造および機能が過剰に失われるのを避けるため、PCT/DK00/00471に係る発明により変化をうけるべきアミノ酸残基の総数は一般に、（配列番号：２に示されるアミノ酸配列と比較して）15を超えない。好ましくはIFNBポリペプチドは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と1から15アミノ酸残基において相違するアミノ酸配列を含み、それは配列番号：２に示されるアミノ酸配列と1から8または2から8アミノ酸残基において、例えば1から5または2から5アミノ酸残基において、相違するアミノ酸配列を含むようなものである。従って、通常IFNBポリペプチドは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列と1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15アミノ酸残基において異なるアミノ酸配列を含む。好ましくは、上記の数は、適切な非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基で導入されたものの総数またはそのようなアミノ酸残基で除去されたものの総数のいずれかをあらわすか、または、導入および除去されたそのような基を含むアミノ酸残基の総数をあらわす。
PCT/DK00/00471に係る発明の結合体において、すべての結合可能な連結基の少なくとも約50％（少なくとも約80％および好ましくはそのような基のすべて、のように）が適切な非ポリペプチド部分で占められていることが好ましい。つまり、より好ましい実施例においては、PCT/DK00/00471に係る発明の結合体は、例えば2から8または3から6のように1から10の非ポリペプチド部分を含む。
【００４７】
PCT/DK00/00471に係る発明の結合体は、以下の改善された性質（それは同等の条件下で測定されている）のうち一つもしくはそれ以上を含む：
野生型ヒトIFNB（例えばRebifもしくはAvonex）またはBetaseronとの比較における免疫原性の減少、例えば少なくとも50％かつ好ましくは少なくとも75％、のように少なくとも25％の減少；
野生型ヒトIFNB（例えばRebifもしくはAvonex）またはBetaseronとの比較における機能的インビボ半減期の増大および/または血清半減期の増大；
野生型ヒトIFNB（例えばRebifもしくはAvonex）またはBetaseronを処置された患者由来の中和抗体との反応の減少または消失、例えば野生型ヒトIFNBと比較して、少なくとも50％かつ好ましくは少なくとも75％、のように少なくとも25％の中和反応の減少；
PCT/DK00/00471に係る発明の結合体の抗ウィルス活性の大きさは重要ではなく、従って同等の条件下で測定した場合（例えば最大75％まで）減少しているかもしくは（例えば少なくとも5％まで）増大しているか、または野生型ヒトIFNB（例えばRebifもしくはAvonex）またはBetaseronの活性と等しい場合がある。
さらに、PCT/DK00/00471に係る発明の結合体の抗増殖活性と比較して抗ウィルス活性の程度はさまざまであり、従って、野生型ヒトIFNBの活性より高いか、より低いか、またはそれと等しい場合がある。
【００４８】
PCT/DK00/00471に係る発明の結合体であって非ポリペプチド部分が連結基としてリジン残基を有する分子であるもの
PCT/DK00/00471に係る発明の好ましい態様において、第一の非ポリペプチド部分は連結基としてリジン残基をもち、従ってそのIFNBポリペプチドは、リジン残基が少なくとも一つ導入および/または少なくとも一つ除去されている点で野生型ヒトIFNBと相違するアミノ酸配列を含む。非ポリペプチド部分は、ポリマー分子、親油基、有機誘導剤または炭水化物部分のように、リジン残基、例えばそのε-アミノ基、に結合するもののいずれかであるところ、それは「ポリマー分子との結合」と題される節に示されるポリマー分子、特に分岐したもしくは直鎖のPEGまたはポリアルキレンオキサイド、のいずれかであることが好ましい。より好ましくはポリマー分子はPEGであり、かつ結合に用いられる活性化された分子は、SS-PEG、NPC-PEG、アルデヒド-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC（Shearwater Polymers, Incより）、SC-PEG（よりEnzon, Inc）、 トレシル化mPEG（US 5,880,255に記載）またはオキシカルボニル-オキシ-N-ジカルボキシミド-PEG（US 5,122,614）である。通常、リジン残基に対する結合のためには、非ポリペプチド部分の分子量は約5、10、12または20kDaである。
【００４９】
PCT/DK00/00471に係る発明のある態様において、IFNBポリペプチドのアミノ酸配列は、（1から5、特に1から4または1から3のように）少なくとも1リジン残基が除去されている点でヒト野生型IFNBと相違する。（好ましくは交換によって）除去されるべきリジン残基は、K19、K33、K45、K52、K99、K105、K108、 K115、K123、K134、およびK136より成る群のうちから選択される。そのリジン残基は他のいずれのアミノ酸残基に交換してもよいが、構造的変化を最小限にするためにアルギニンまたはグルタミン残基と交換されることが好ましい。特にポリペプチド部分は一つであり、そこではK19、K45、K52および/またはK123、好ましくはK19、K45および/またはK123、が別のアミノ酸残基、好ましくはアルギニンまたはグルタミン、と交換されている。例えば、PCT/DK00/00471に係る発明の結合体のIFNBポリペプチド部分は、以下の一覧から選択されるアミノ酸置換の組み合わせを含む：
K19R+K45R+K123R;
K19Q+K45R+K123R;
K19R+K45Q+K123R;
K19R+K45R+K123Q;
K19Q+K45Q+K123R;
K19R+K45Q+K123Q;
K19Q+K45R+K123Q;
K19Q+K45Q+K123Q;
K45R+K123R;
K45Q+K123R;
K45Q+K123Q;
K45R+K123Q;
K19R+K123R;
K19Q+K123R;
K19R+K123Q;
K19Q+K123Q;
K19R+K45R;
K19Q+K45R;
K19R+K45Q;または
K19Q+K45Q。
【００５０】
上記一覧に示されるアミノ酸置換に加えてまたはそのかわりに、ポリペプチド部分はK33R、K33Q、K52R、K52Q、K99R、K99Q、K105R、K105Q、K108R、K108Q、K115R、K115Q、K134R、K134Q、K136RおよびK136Qから成る群から選ばれる置換を少なくとも一つ含み、それは例えば以下の置換のうち少なくとも一つである：
K52R+K134R;
K99R+K136R;
K33R+K105R+K136R;
K52R+K108R+K134R;
K99R+K115R+K136R;
K19R+K33R+K45R+K123R;
K19R+K45R+K52R+K123R;
K19R+K33R+K45R+K52R+K123Rまたは
K19R+K45R+K52R+K99R+K123R。
PCT/DK00/00471に係る発明のさらなる態様において、IFNBポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号：２に示されるものとリジン残基が置換により導入されている点において相違し、その置換は親IFNBポリペプチドにおいては表面露出アミノ酸残基（好ましくはその側鎖の少なくとも25％以上（少なくとも50％以上、のように）がその表面に露出している）により占められている位置を占めるアミノ酸残基の少なくとも一つとの置換である。
好ましくは置換されるべきアミノ酸残基は、配列番号：２の、N4、F8、L9、R11、S12、F15、Q16、Q18、L20、W22、Q23、G26、R27、L28、E29、Y30、L32、R35、M36、N37、D39、P41、E42、E43、L47、Q48、Q49、T58、Q64、N65、F67、A68、R71、Q72、D73、S75、S76、G78、N80、E81、I83、E85、N86、A89、N90、Y92、H93、H97、T100、L102、E103、L106、E107、E109、D110、F111、R113、G114、L116、M117、L120、H121、R124、G127、R128、L130、H131、E137、Y138、H140、I145、R147、V148、E149、R152、Y155、F156、N158、R159、G162、Y163、R165およびN166からなる群のうちから選ばれる。
【００５１】
より好ましくは、IFNBポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号：２に示されるアミノ酸配列とリジン残基が導入されている点で相違し、それは、N4、F8、L9、R11、S12、G26、R27、E29、R35、N37、D39、E42、L47、Q48、Q49、A68、R71、Q72、D73、S75、G78、N80、E85、N86、A89、Y92、H93、D110、F111、R113、L116、H121、R124、G127、R128、R147、V148、Y155、N158、R159、G162およびR165から成る群より選ばれる位置、より好ましくはN4、R11、G26、R27、Q48、Q49、R71、D73、S75、N80、E85、A89、Y92、H93、F111、R113、L116、R124、G127、R128、Y155、N158およびG162から成る群より選ばれる位置、および非常に好ましくはR11、Q49、R71、S75、N80、E85、A89、H93、F111、R113、L116およびY155、大変好ましくはQ49およびF111、から成る群より選ばれる位置を占める少なくとも一つのアミノ酸残基との置換によりなされる。
PCT/DK00/00471に係る発明この態様と一致して、IFNBポリペプチドは上記の位置のうち1またはそれ以上、特に1から8または1から5のように1から15の位置、かつ好ましくは2から8または2から5のように少なくとも二つの位置、におけるリジン残基への置換を含む。
PCT/DK00/00471に係る発明のさらなる態様において、結合体のIFNBポリペプチド部分のアミノ酸配列は、1から5または2から5のリジン残基の除去および1から5または2から5のリジン残基の導入のように、リジン残基が少なくとも一つ除去または少なくとも一つ導入されている点で相違する。除去または導入されるべきリジン残基は本節に記載されるもののうちより選択されるのが好ましいと解される。PCT/DK00/00471に係る発明のこの実施例と一致して、結合可能なリジン残基の総数は、2から8または3から7のように1から10の範囲内であることが好ましい。
【００５２】
例えば、PCT/DK00/00471に係る発明のこの態様による結合体のIFNBポリペプチド部分は以下の置換のうち少なくとも一つを含む場合がある：R11K、Q48K、Q49K、R71K、S75K、N80K、E85K、A89K、H93K、F111K、R113K、L116KおよびY155K、より好ましくはR11K、Q49K、R71K、S75K、N80K、E85K、A89K、H93K、F111K、R113K、L116KおよびY155Kであって、K19R/Q K33R/Q K45R/Q、K52R/Q、K99R/Q、K105R/Q、K108R/Q、K115R/Q、K123R/Q、K134R/QおよびK136R/Q（ここでR/QはRまたはQ残基、好ましくはR残基への置換を意味する）の置換うち少なくとも一つと同時であるもの。より好ましくは、IFNBポリペプチド以下の置換のうち少なくとも一つを含み、それはR11K、Q49K、R71K、S75K、N80K、E85K、A89K、H93K、F111K、R113K、L116KおよびY155K、特にQ49K、F111Kおよび/またはN80Kであって、K19、K45、K52および/またはK123の好ましくはRまたはQ残基への置換うち少なくとも一つと同時であるものを含む。特に、IFNBポリペプチドは、リジン残基除去のための上記の置換のうち少なくとも一つと同時に、Q49K、F111KおよびN80Kの置換のうち少なくとも一つを含む。例えばIFNBポリペプチドは以下の置換を含む場合があり、ここでYは、Q49K、F111K、N80K、Q49K+F111K、Q49K+N80K、F111K+N80KおよびQ49K+F111K+N80Kの群から選択され、かつZは、存在しないかまたはK33R、K33Q、K52R、K52Q、K99R、K99Q、K105R、K105Q、K108R、K108Q、K115R、K115Q、K134R、K134Q、K136RおよびK136Qからなる群から選択される置換のうち少なくとも一つを含む：
Y+Z+K19R+K45R+K123R;
Y+Z+K19Q+K45R+K123R;
Y+Z+K19R+K45Q+K123R;
Y+Z+K19R+K45R+K123Q;
Y+Z+K19Q+K45Q+K123R;
Y+Z+K19R+K45Q+K123Q;
Y+Z+K19Q+K45R+K123Q;
Y+Z+K19Q+K45Q+K123Q;
Y+Z+K45R+K123R;
Y+Z+K45Q+K123R;
Y+Z+K45Q+K123Q;
Y+Z+K45R+K123Q;
Y+Z+K19R+K123R;
Y+Z+K19Q+K123R;
Y+Z+K19R+K123Q;
Y+Z+K19Q+K123Q;
Y+Z+K19R+K45R;
Y+Z+K19Q+K45R;
Y+Z+K19R+K45Q;または
Y+Z+K19Q+K45Q。
【００５３】
詳細には、PCT/DK00/00471に係る発明のこの実施例により、IFNBポリペプチドは以下の置換のうち一つを含むことができる：
K19R+K45R+F111K+K123R;
K19R+K45R+Q49K+F111K+K123R;
K19R+K45R+Q49K+K123R;
K19R+K45R+ F111K;
K19R+K45R+Q49K+F111K;
K19R+Q49K+K123R;
K19R+Q49K+F111K+K123R;
K45Q+F111K+K123Q;
K45R+Q49K+K123R;または
K45R+Q49K+F111K+K123R。
特に大腸菌のような不グリコシル化宿主における発現のため、IFNBポリペプチドは、置換N80KまたはC17S+N80Kを含み、それは任意で一つもしくはそれ以上のK19R/Q、K45R/Q、K52R/QまたはK123R/Qと同時である場合がある。置換N80Kは、IFNBポリペプチドが不グリコシル化宿主細胞において発現されるとき特に重要であり、なぜならN80はヒトIFNBの本来のグリコシル化部位の一部の構成要素であり、そのような位置における結合は天然のグリコシル化によく似る可能性があるからである。
さらに、PCT/DK00/00471に係る発明のこの態様による結合体は、2から8の部分、のように、少なくとも二つの第一のポリペプチド部分を含む。
【００５４】
PCT/DK00/00471に係る発明の結合体であって非ポリペプチド部分がシステイン残基に結合しているもの
さらなる態様として、PCT/DK00/00471に係る発明は、IFNB活性を示しかつIFNBポリペプチドの少なくとも一つのシステイン残基に結合した少なくとも一つの第一の非ポリペプチド部分を含む結合体に関し、そのアミノ酸配列は、少なくとも一つのシステイン残基が親IFNB分子においては分子表面に露出しているアミノ酸残基により占められている位置に好ましくは置換によって導入されている点で野生型ヒトIFNBと相違し、その表面露出アミノ酸は少なくとも50％、のように少なくとも25％の側鎖が表面に露出していることが好ましい。例えば、そのアミノ酸残基は配列番号：２のF8、L9、R11、S12、F15、Q16、Q18、L20、W22、L28、L32、M36、P41、T58、Q64、N65、F67、I83、E85、N86、A89、N90、Y92、H93、H97、T100、L102、E103、L106、M117、L120、H121、R124、G127、R128、L130、H131、H140、I145、R147、V148、E149、R152、Y155およびF156からなる群より選択される。
加えてまたはあるいは、その置換はスレオニンまたはセリン残基により占められている位置において行われるのが好ましい。例えば、そのような位置は以下より成る群から選択される：S2、S12、S13、T58、S74、S75、S76、T77、T82、T100、T112、S118、S119、S139、T144およびT161、より好ましくはS2、S12、S13、S74、S75、S76、T77、T82、T100、T112、S118、S119、S139およびT144（側鎖が表面に露出)、さらに好ましくはS2、S12、S75、S76、T82、T100、S119およびS139（その側鎖の少なくとも25%が露出)、並びにさらに一層好ましくはS12、S75、T82およびT100（その側鎖の少なくとも50%が露出）。
上記のスレオニンまたはセリン置換のうち、セリン置換が好ましい。つまり、PCT/DK00/00471に係る発明のより好ましい態様においては、その位置はS2、S12、S13、S74、S75、S76、S118、S119およびS139、より好ましくはS2、S12、S13、S74、S75、S76、S118、S119およびS139、さらに好ましくはS2、S12、S75、S76、S119およびS139、並びにさらに一層好ましくはS12およびS75、よりなる成る群から選択される。
【００５５】
ある態様においては、二つまたはそれ以上の導入されたシステイン残基間のジスルフィド架橋の形成を回避するため、システイン残基はIFNBポリペプチドにただ一つだけ導入される。これに関して、野生型ヒトIFNBに存在するC17は、好ましくは置換、特にSまたはAとの置換、によって除去すればよい。別の態様においては、2から6または2から4のシステイン残基、のように、2もしくはそれ以上のシステイン残基が導入される。好ましくは、PCT/DK00/00471に係る発明のこの態様による結合体のIFNBポリペプチド部分は、突然変異L47C、Q48C、Q49C、D110C、F111CまたはR113C、特にこれらの突然変異のうちだた一つ、を含み、任意で突然変異C17Sを含むことがある。また、IFNBポリペプチドは置換C17S+N80Cを含むことがある。
PCT/DK00/00471に係る発明のこの局面による第一の非ポリペプチド部分は、特定の結合方法を使用するとき、（炭水化物部分、親油基または有機誘導剤のような）連結基としてシステインをもついずれの分子であってもよいが、その非ポリペプチド部分はポリマー分子であることが好ましい。ポリマー分子は「ポリマー分子との結合」と題される節に示されるいずれの分子であってもよいが、直鎖のもしくは分岐したポリエチレングリコールまたはポリアルキレンオキサイドから成る群より選択されることが好ましい。より好ましくは、ポリマー分子はVS-PEGである。ポリペプチドとポリマーの間の結合はいずれかの適した方法で、例えば「ポリマー分子との結合」と題される節に示される方法で成され、それは例えば、該節に引用される一段階方法または段階的方法を用いるものである。IFNBポリペプチドがただ一つしか結合可能なシステイン残基を含まないとき、これは、分子量が少なくとも20kDaである第一の非ポリペプチド部分と、直接にまたは（WO 99/55377に開示されるように）低分子量ポリマーを介して間接的に結合することが好ましい。その結合体が二つまたはそれ以上の第一の非ポリペプチド部分を含む場合、通常これらそれぞれの分子量は5または10kDaである。
【００５６】
PCT/DK00/00471に係る発明の結合体であって非ポリペプチド部分が酸性基に結合しているもの
さらなる局面において、PCT/DK00/00471に係る発明は、IFNB活性を示しかつ少なくとも一つの第一の非ポリペプチド部分であって酸性基を連結基として有するものを含む結合体に関し、その部分はIFNBポリペプチドの少なくとも一つのアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基と結合しており、そのアミノ酸配列は、IFNBポリペプチドのアスパラギン酸またはグルタミン酸残基がそれぞれ少なくとも一つ導入および/または除去されている点で野生型ヒトIFNBと相違する。適切なアミノ酸残基は、表面露出アミノ酸残基、好ましくはその側鎖の25％以上が表面に露出しているアミノ酸残基、に占められているいずれかの位置に導入できる。好ましくは、N4、L5、L6、F8、L9、Q10、R11、S12、S13、F15、Q16、Q18、K19、L20、W22、Q23、L24、N25、G26、R27、Y30、M36、Q46、Q48、Q49、I66、F67、A68、I69、F70、R71、S75、T82、I83、L87、A89、N90、V91、Y92、H93、Q94、I95、N96、H97、K108、F111、L116、L120、K123、R124、Y126、G127、R128、L130、H131、Y132、K134、A135、H140、T144、R147、Y155、F156、N158、R159、G162、Y163およびR165から成る群より選択された位置を占めるアミノ酸残基が少なくとも一つアスパラギン酸残基またはグルタミン酸残基と置換されている。
より好ましくは、その位置はN4、L5、F8、L9、R11、S12、F15、Q16、Q18、K19、W22、Q23、G26、R27、Y30、M36、Q46、Q48、Q49、A68、R71、S75、T82、A89、N90、Y92、H93、N96、H97、K108、F111、L116、L120、K123、R124、G127、R128、L130、H131、K134、A135、H140、Y155、N158、R159、G162、Y163およびR165より成る群から選択され、それは例えばN4、L5、F8、S12、F15、Q16、K19、W22、Q23、R27、Y30、M36、Q46、Q48、Q49、R71、S75、T82、A89、Y92、H93、K108、F111、L116、K123、R124、G127、H131、K134、A135、Y155およびR165より成る群から選択され、より好ましくはN4、L5、F8、S12、F15、Q16、K19、W22、Q23、R27、Y30、Q46、Q48、Q49、S75、T82、A89、Y92、H93、K108、F111、L116、R124、G127、H131、K134、Y155およびR165より成る群から選択され、例えばL5、F8、S12、F15、Q16、K19、W22、Q23、Q48、Q49、Y92、H93、R124、G127、H131およびY155から成る群から選択され、さらに好ましくはS12、Q16、K19、Q23、Q48、Q49、Y92、H93、R124、G127、H131 and Y155から成る群から、例えばS12、Q16、K19、Q23、Q48、Y92、H93、R124、G127、H131およびY155から成る群、特に S12、Q16、K19、Q23、Q48、H93およびH131から成る群から選択され、さらに一層好ましくはS12、Q16、K19、Q48、H93およびH131から成る群から選択され、最も好ましくはQ16およびQ48より成る群から選択される。
【００５７】
さらに、十分な数の非ポリペプチド部分を得るために、少なくとも二つのアスパラギン酸残基または少なくとも二つのグルタミン酸残基が導入されることが好ましく、それは上記一覧のいずれかから選択された二つの位置におけることが好ましい。また、PCT/DK00/00471に係る発明のこの局面による結合体は、少なくとも二つの第一の非ポリペプチド部分を含むことが好ましい。
アミノ酸の除去の場合には、IFNBポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも一つのアスパラギン酸またはグルタミン酸残基が除去されている点で、例えば1から5の残基、特に1から4または1から3のアスパラギン酸またはグルタミン酸残基が除去されている点で、ヒト野生型IFNBの配列と相違する。（好ましくは交換により）除去されるべき残基は、D34、D39、D54、D73、D110、E29、E42、E43、E53、E61、E81、E85、E103、E104、E107、E109、E137およびE149から成る群より選択される。アスパラギン酸またはグルタミン酸残基は、他のいずれのアミノ酸残基とも交換され得るが、アルギニンまたはグルタミン残基と交換されるのが好ましい。第一の非ポリペプチド部分はそのような性質を有するいずれの非ポリペプチド部分でもあり得るが、その非ポリペプチド部分は、酸性基を連結基として有するポリマー分子または有機誘導剤、特にPEGのようなポリマー分子であることが本発明では好ましく、その結合体は、例えばSakane and Pardridge, Pharmceutical Research, Vol. 14, No. 8, 1997, pp 1085-1091に記載されるように調製される。通常、酸性基に対する結合のためには、非ポリペプチド部分の分子量は約5または10kDaである。
【００５８】
PCT/DK00/00471に係る発明の結合体であって第二のポリペプチド部分を含むもの
（前節に記載される）第一の非ポリペプチド部分に加えて、PCT/DK00/00471に係る発明の結合体は第一の非ポリペプチド部分と比較して異なるタイプの第二の非ポリペプチド部分を含むことができる。好ましくは、第一の非ポリペプチド部分が例えばPEGのようなポリマーである上記記載の結合体のいずれかにおいて、第二の非ポリペプチド部分は糖部分、特にN-結合型糖部分である。第二の非ポリペプチド部分は、ヒトIFNBの天然のグリコシル化部位、例えばN80で示されるN-結合型グリコシル化部位に結合し得るが、通常はIFNBポリペプチドにおいて少なくとも一つのさらなるグリコシル化部位を導入するのが都合がよい。そのような部位は、例えば「PCT/DK00/00471に係る発明の結合体であって非ポリペプチド部分が糖部分であるもの」と題されるすぐ後の節に記載されるそれらのうちいずれかである。さらに、少なくとも一つのさらなるグリコシル化部位が導入されている場合、これは以下に記載されるように既存のグリコシル化部位の除去を伴う場合がある。
【００５９】
結合した第一および第二の非ポリペプチド部分の最適な分布を得るため、IFNBポリペプチドは、第二と同様に第一の非ポリペプチド部分に対する連結基の数および配置を修飾することができ、それは例えば第一の非ポリペプチド部分に対する連結基を少なくとも一つ除去しかつ第二の非ポリペプチド部分に対する連結基を少なくとも一つ導入するように、またはその逆も同様に行われることは理解されよう。例えば、IFNBポリペプチドは少なくとも2つ（例えば2から5）の第一のポリペプチド部分に対する連結基が除去され、少なくとも１つ（例えば1から5）の第二のポリペプチド部分に対する連結基が導入されているか、またはその逆である。
特に重要なのは、第一の非ポリペプチド部分がリジンを連結基としてもつPEGのようなポリマーで、かつ第二の非ポリペプチド部分がN-結合型糖部分である結合体である。
より具体的には、PCT/DK00/00471に係る発明の結合体は、IFNB活性を示しかつ少なくとも一つのポリマー分子、好ましくはPEG、および少なくとも一つのIFNBポリペプチドに共有結合した糖部分を含み、そのアミノ酸配列は野生型ヒトIFNBの配列と以下の点において相違する：
a）ポリマー分子に対する連結基を含むアミノ酸残基が少なくとも一つ導入および/または少なくとも一つ除去されている；および
b）インビボグリコシル化部位、特にN-グリコシル化部位が少なくとも一つ導入および/または少なくとも一つ除去されている。
ある具体的な態様においては、IFNBポリペプチドは以下の突然変異の組のうち一つを含む：
K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T+K123R;
K19R+K45R+Q49N+Q51T+F111N+R113T; または
K19R+K45R+Q49N+Q51T+ K123R。
【００６０】
PCT/DK00/00471に係る発明の結合体であって非ポリペプチド部分が糖部分であるもの
PCT/DK00/00471に係る発明の結合体が、インビボグリコシル化部位、特にN-グリコシル化部位に結合した糖部分を少なくとも一つ含むとき、これは、N80の位置における、すなわちアミノ酸残基N80、E81、T82およびI83で規定される野生型ヒトIFNBの天然のN-グリコシル化部位、またはIFNBポリペプチドに導入された新しいインビボグリコシル化部位である。そのインビボグリコシル化部位はO-グリコシル化部位である場合もあるが、好ましくはN-グリコシル化部位である。
より具体的には、PCT/DK00/00471に係る発明のある局面は、IFNB活性を示しかつアミノ酸配列が野生型ヒトIFNBの配列とグリコシル化部位が少なくとも一つ導入されている点で相違するIFNBポリペプチドを含む結合体に関し、その結合体はさらに、導入されたグリコシル化部位に結合した非PEG化糖部分を少なくとも一つ含む。
別の局面においてPCT/DK00/00471に係る発明は、IFNB活性を示しかつアミノ酸配列が野生型ヒトIFNBの配列とグリコシル化部位が導入または除去されている点で相違するIFNBポリペプチド部分を含む結合体に関する。
例えば、インビボグリコシル化部位は、その分子の表面に露出する、好ましくはその側鎖の25％以上、特に50％以上が溶媒中に露出しているアミノ酸残基により占められている親IFNB分子の位置（これらの位置は本明細書の方法の節において同定される）に導入される。N-グリコシル化部位は該部位のN-残基が該位置に存在するように導入される。同様に、O-グリコシル化はそのような部位を作り出すSまたはTが該位置に位置するように導入される。さらに、確実に有効にグリコシル化するため、インビボグリコシル化部位、特にN-グリコシル化部位のN残基またはO-グリコシル化部位のSまたはT残基は、IFNBポリペプチドのはじめの141アミノ酸残基中、より好ましくははじめの116アミノ酸残基中、に位置することが好ましい。さらにより好ましくは、インビボグリコシル化部位は、その部位を創るのに一つの突然変異しか必要でない位置（すなわち機能的グリコシル化部位を創るのに必要とされる他のアミノ酸残基がすでにその分子に存在していること）に導入される。
【００６１】
IFNB分子の表面に露出しかつその側鎖の25％以上が表面に露出しているアミノ酸残基に占められている位置におけるさらなるN-グリコシル化部位の導入をもたらす置換は以下のものを含む：
S2N+N4S/T、L6S/T、L5N+G7S/T、F8N+Q10S/T、L9N+R11S/T、R11N、R11N+S13T、S12N+N14S/T、F15N+C17S/T、Q16N+Q18S/T、Q18N+L20S/T、K19N+L21S/T、W22N+L24S/T、Q23N+H25S/T、G26N+L28S/T、R27N+E29S/T、L28S+Y30S/T、Y30N+L32S/T、L32N+D34S/T、K33N+R35S/T、R35N+N37S/T、M36N+F38S/T、D39S/T、D39N+P41S/T、E42N+I44S/T、Q43N+K45S/T、K45N+L47S/T、Q46N+Q48S/T、L47N+Q49T/S、Q48N+F50S/T、Q49N+Q51S/T、Q51N+E53S/T、K52N+D54S/T、L57N+I59S/T、Q64N+I66S/T、A68N+F70S/T、R71N+D73S/T、Q72N、Q72N+S74T、D73N、D73N+S75T、S75N+T77S、S75N、S76N+G78S/T、E81N+I83S/T、T82N+V84S/T、 E85N+L87S/T、L88S/T、A89N+V91S/T、Y92S/T、Y92N+Q94S/T、H93N+I95S/T、L98S/T、H97N+K99S/T、K99N+V101S/T、T100N+L102S/T、E103N+K105S/T、E104N+L106S/T、K105N+E107S/T、E107N+E109S/T、K108N+D110S/T、E109N+F111S/T、D110N+T112S、D110N、F111N+R113S/T、R113N+K115S/T、G114N+L116S/T、K115N+M117S/T、L116N、L116N+S118T、S119N+H212S/T、L120N+L122S/T、H121N+K123S/T、K123N+Y125S/T、R124N+Y126S/T、G127N+I129S/T、R128N+L130S/T、L130N+Y132S/T、 H131N+L133S/T、K134N+K136S/T、A135N+E137S/T、K136N+Y138S/T、E137N、Y138N+H140S/T、H140N+A142S/T、V148N+I150S/T、R152N+F154S/T、Y155N+I157S/T、L160S/T、R159N+T161S、R159N、G162N+L164S/TおよびY163N+R165S/T。
IFNB分子の表面に露出し、その側鎖の50％以上が表面に露出している位置におけるさらなるN-グリコシル化部位の導入をもたらす置換は以下のものを含む：
L6S/T、L5N+G7S/T、F8N+Q10S/T、L9N+R11S/T、S12N+N14S/T、F15N+C17S/T、Q16N+Q18S/T、K19N+L21S/T、W22N+L24S/T、Q23N+H25S/T、G26N+L28S/T、R27N+E29S/T、Y30N+L32S/T、K33N+R35S/T、R35N+N37S/T、M36N+F38S/T、D39S/T、D39N+P41S/T、E42N+I44S/T、Q46N+Q48S/T、Q48N+F50S/T、Q49N+Q51S/T、Q51N+E53S/T、K52N+D54S/T、L57N+I59S/T、R71N+D73S/T、D73N、D73N+S75T、S75N+T77S、S75N、S76N+G78S/T、E81N+I83S/T、T82N+V84S/T、E85N+L87S/T、A89N+V91S/T、Y92S/T、Y92N+Q94S/T、H93N+I95S/T、T100N+L102S/T、E103N+K105S/T、E104N+L106S/T、E107N+E109S/T、K108N+D110S/T、D110N+T112S、D110N、F111N+R113S/T、R113N+K115S/T、L116N、L116N+S118T、K123N+Y125S/T、R124N+Y126S/T、G127N+I129S/T、H131N+L133S/T、K134N+K136S/T、A135N+E137S/T、E137N、V148N+I150S/T、およびY155N+I157S/T。
上記一覧に示された置換のなかで、N残基が141N-末アミノ酸残基、特に116N-末アミノ酸残基の中に導入されているものが好ましい。
【００６２】
ただ一つのアミノ酸置換によってN-グリコシル化部位を導入する置換は以下のものを含む：L6S/T, R11N, D39S/T, Q72N, D73N, S75N, L88S/T, Y92S/T, L98S/T, D110N, L116N, E137N, R159NおよびL160S/T。これらのなかで、L6S/T、R11N、D39S/T、Q72N、D73N、S75N、L88S/T、Y92S/T、L98S/T、D110NおよびL116Nより成る群から、より好ましくはL6S/T、D39S/T、D73N、S75N、L88S/T、D110N、L116NおよびE137Nより成る群から選択される置換が好ましく、かつさらに好ましくはL6S/T、D39S/T、D73N、S75N、L88S/T、D110NおよびL116Nより成る群から選択される置換が好ましい。
PCT/DK00/00471に係る発明のこの態様による最も好ましいIFNBポリペプチドは、本発明では、以下の置換、S2N+N4T/S、L9N+R11T/S、R11N、S12N+N14T/S、F15N+C17S/T、Q16N+Q18T/S、K19N+L21T/S、Q23N+H25T/S、G26N+L28T/S、R27N+E29T/S、L28N+Y30T/S、D39T/S、K45N+L47T/S、Q46N+Q48T/S、Q48N+F50T/S、Q49N+Q51T/S、Q51N+E53T/S、R71N+D73T/S、Q72N、D73N、S75N、S76N+G78T/S、L88T/S、Y92T/S、N93N+I95T/S、L98T/S、E103N+K105T/S、E104N+L106T/S、E107N+E109T/S、K108N+D110T/S、D110N、F111N+R113T/SまたはL116Nのうち少なくとも一つ含み、より好ましくは以下の置換、S2N+N4T、L9N+R11T、49N+Q51またはF111N+R113TまたはR71N+D73T、特に49N+Q51TまたはF111N+R113TまたはR71N+D73Tのうち少なくとも一つ含む。例えば、IFNBポリペプチドは以下の置換の組のうち一つを含む：
Q49N+Q51T+F111N+R113T;
Q49N+Q51T+R71N+D73T+ F111N+ R113T;
S2N+N4T+ F111N+R113T;
S2N+N4T+Q49N+Q51T;
S2N+N4T+Q49N+Q51T+F111N+R113T;
S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51T;
S2N+N4T+L9N+R11T+F111N+R113T;
S2N+N4T+L9N+R11T+Q49N+Q51T+F111N+R113T;
L9N+R11T+Q49N+Q51T;
L9N+R11T+Q49N+Q51T+F111N+R113T;または
L9N+R11T+F111N+R113T。
機能的インビボグリコシル化部位を導入するため、N残基とS/T残基の間におけるアミノ酸残基はプロリンとは異なると解される。通常、間のアミノ酸残基は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列における適切な位置を占めるものであろう。例えば、置換Q49N+Q51Sを含むポリペプチドにおいて、50の位置が間のその位置である。
【００６３】
PCT/DK00/00471に係る発明の結合体のIFNBポリペプチド部分はただ一つのインビボグリコシル化を含む場合がある。しかしながら、親ポリペプチドの表面に存在するエピトープを有効に保護するために、ポリペプチドは一つ以上のインビボグリコシル化部位、特に2から7のインビボグリコシル化部位、例えば2、3、4、5、6、または7のインビボグリコシル化部位、を含むことが大抵望ましい。従ってIFNBポリペプチドは、さらなるグリコシル化部位を一つ含むか、または好ましくは一つもしくはそれ以上の上記一覧のいずれかに記載される置換によってインビボグリコシル化部位が二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つまたはそれ以上導入される場合がある。
上記に示されるように、一つまたはそれ以上のグリコシル化部位が導入されるのに加えて、既存のグリコシル化部位がIFNBポリペプチドから除去されている場合がある。例えば上記にあげられたグリコシル化部位を導入するためのいずれかの置換は、ヒト野生型IFNBの天然のN-グリコシル化部位を除去するための置換と同時になされる場合がある。例えば、そのIFNBポリペプチドはN80の置換、例えば第一の非ポリペプチド部分が連結基としてK、C、D、Eのうち一つを含むものであるとき置換N80K/C/D/Eのうち一つ、を含む場合がある。例えば、IFNBポリペプチドは置換N80K/C/D/Eとともに以下の置換のうち少なくとも一つを含み得る：
S2N+N4T/S、L9N+R11T/S、R11N、S12N+N14T/S、F15N+C17S/T、Q16N+Q18T/S、K19N+L21T/S、Q23N+H25T/S、G26N+L28T/S、R27N+E29T/S、L28N+Y30T/S、D39T/S、K45N+L47T/S、Q46N+Q48T/S、Q48N+F50T/S、Q49N+Q51T/S、Q51N+E53T/S、R71N+D73T/S、Q72N、D73N、S75N、S76N+G78T/S、L88T/S、Y92T/S、N93N+I95T/S、L98T/S、E103N+K105T/S、E104N+L106T/S、E107N+E109T/S、K108N+D110T/S、D110N、F111N+R113T/S、またはL116N。より具体的には、IFNBポリペプチドは置換N80K/C/D/Eとともに置換Q49N+Q51TまたはF111N+R113TまたはR71N+D73T、特にQ49N+Q51T+F111N+R113TまたはQ49N+Q51T+R71N+D73T+ F111N+ R113Tを含む。
【００６４】
グリコシル化部位が少なくとも一つ導入または除去されている本節に開示されるグリコシル化変異体のいずれか、例えば置換Q48N+F50T/S、Q48N+F50T/S+F111N+R113T/S、Q49N+Q51T/S、F111N+R113T/SまたはQ49N+Q51T/S+F111N+R113T/Sを含む変異体、のいずれかはさらに、PEGのようなポリマー分子または他の非ポリペプチド部分と結合することができる。この目的のための結合は、IFNBポリペプチドに既に存在する連結基か、または特に1から6、特に3から4または1、2、3、4、5もしくは6の連結基のすべてが結合に利用できるように導入もしくは除去されている連結基を使用してなされる。好ましくは、IFNBポリペプチドが二つのグリコシル化部位含むPCT/DK00/00471に係る発明の結合体においては、非ポリペプチド部分の数および分子量は、非ポリペプチド部分により付加された全体の分子量が20から40kDaの範囲内で、特に約20kDaまたは30kDaであるように選ばれる。
【００６５】
特にそのグリコシル化変異体は、リジン連結基を介して非ポリペプチド部分と結合し、かつ親ポリペプチドの一つまたはそれ以上のリジン残基が例えば「本発明の結合体であって非ポリペプチド部分がリジンを連結基としてもつ分子であるもの」と題される節に示される置換のいずれか、特に置換K19R+K45R+K123R、によって除去されている場合がある。かわりにまたはさらに、リジン残基を例えば該節に示される置換のいずれか、特に置換R71K、により導入することができる。つまり、ある具体的なPCT/DK00/00471に係る発明の結合体は、突然変異Q49N + Q51T + F111N + R113T + K19R + K45R + K123RまたはQ49N + Q51T + F111N + R113T + K19R + K45R + K123R + R71Kを含有しさらにPEGに結合しているグリコシル化IFNBポリペプチドを含むものである。該結合体のグリコシル化ポリペプチド部分は好ましくはCHO細胞により産生され、精製された後例えばSS-PEG、NPC-PEG、アルデヒド-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC（Shearwater Polymers, Inc.より)、SC-PEG（Enzon、Inc.より）、トレシル化mPEG（US 5,880,255に記載）、またはオキシカルボニル-オキシ-N-ジカルボキシミド-PEG（US 5,122,614）を用いてPEG化される。
リジン残基を介するPEG化のかわりに、PCT/DK00/00471に係る発明の結合体のこの態様によるグリコシル化結合体は、「PCT/DK00/00471に係る発明の結合体であって非ポリペプチド部分がシステインを連結基としてもつ分子であるもの」と題される節に記載されるようにシステイン基を介して、「PCT/DK00/00471に係る発明の結合体であって非ポリペプチド部分が酸性基に結合するもの」と題される節に記載されるように酸性基を介して、または他の適切な基を介してPEG化され得る。
【００６６】
PCT/DK00/00471に係る発明の他の結合体
（「PCT/DK00/00471に係る発明の結合体...」と題される上記の節のいずれかに記載されるような）選択された非ポリペプチド部分に対する連結基を含むアミノ酸残基の導入および/または除去に加えて、結合体のIFNBポリペプチド部分はさらなる置換を含むことができる。好ましい例は、残基M1、C17、N80またはV101のうちいずれかの置換であり、それは例えば一つまたはそれ以上の以下の置換である：C17S；N80K/C/D/E；V101Y/W/F/,H；M1の欠失；またはM1K。置換M1Kは、IFNBポリペプチドがタグ、例えばHis-14タグとともに発現されるとき特に重要であり、その場合そのようなタグは精製および/または結合の後DAP（ジアミノペプチダーゼ）により除去されるべきである。
PCT/DK00/00471に係る発明の結合体の非ポリペプチド部分
上記にさらに記載されるように、本発明およびPCT/DK00/00471に係る発明の結合体の非ポリペプチド部分は、ポリマー分子、親油基、糖部分（インビボグリコシル化による）および有機誘導剤から成る群より選択されることが好ましい。これらの試薬はすべて、結合体のポリペプチド部分に望ましい性質を与えることができ、それは特に免疫原性の減少および/または機能的インビボ半減期の増加および/または血清半減期の増加である。結合体のポリペプチド部分はただ一つのタイプの非ポリペプチド部分に結合する場合があるが、しかしまた二つまたはそれ以上の相違するタイプの非ポリペプチド部分に結合する場合もあり、例えばポリマー分子と糖分子、親油基と糖部分、有機誘導剤と糖部分、などである。二つまたはそれ以上の相違する非ポリペプチド部分との結合は同時にまたは連続してなされ得る。非ポリペプチド部分の選択は、例えば結合により達成されることが望まれる効果に依存する。例えば糖部分は免疫原性を減少させるのに特に有用であることがわかっており、一方PEGのようなポリマー分子は機能的インビボ半減期および/または血清半減期を増加させるのに特に役立つ。第一の非ポリペプチド部分としてポリマー分子を、かつ第二の非ポリペプチド部分として糖部分を使用することで、免疫原性が減少しかつ機能的インビボ半減期または血清半減期が増加し得る。
【００６７】
本発明およびPCT/DK00/00471に係る発明の結合体の調整方法
以下の節「親油基性化合物との結合」、「ポリマー分子との結合」、「糖部分との結合」および「有機誘導剤との結合」においては、特定のタイプの非ポリペプチド部分との結合が記載される。これらの節の内容はPCT/DK00/00471に係る発明と同時に本発明に関する（本明細書中に記載されるように）。
親油性化合物との結合
親油性化合物との結合のため、以下のポリペプチド基が連結基として機能し得る：ポリペプチドのN末またはC末、アミノ酸残基Ser、ThrまたはTyrのヒドロキシ基、Lysのε-アミノ基、CysのSH基またはAspもしくはGluのカルボキシル基。ポリペプチドおよび親油性化合物は、直接にまたはリンカーを用いて互いに結合する。親油性化合物は、飽和もしくは不飽和脂肪酸、脂肪酸ジケトン、テルペン、プロスタグランジン、ビタミンまたはカロテノイドのような天然の化合物か、または一つまたはそれ以上のアルキル、アリル、アルケニルまたは他の複数の不飽和組成物を伴う炭素酸、アルコール、アミンおよびスルホン酸のような合成化合物であり得る。ポリペプチドと親油組成物の間の結合は、任意でリンカーを介して、当業界にて既知の方法、例えばBodanszky in Peptide Synthesis, John Wiley, New York, 1976によりまたはWO 96/12505において記載される方法、によりなされ得る。
ポリマー分子との結合
【００６８】
ポリペプチドに結合すべきポリマー分子はいずれの適したポリマー分子であってもよく、それは例えば天然または合成のホモポリマーまたはヘテロポリマーで、典型的には分子量が300から20,000 Daのように300から100,000 Daの範囲内, より好ましくは500から10,000 Daの範囲内、さらにより好ましくは500から5000 Daの範囲内のものである。
ホモポリマーの例には、ポリオール（すなわちポリ-OH）、ポリアミン（すなわちポリ-NH2）およびポリカルボキシル酸（すなわちポリ-COOH）が含まれる。ヘテロポリマーは、例えばヒドロキシル基およびアミン基のような、一つまたはそれ以上の相違する結合基を含むポリマーである。
適したポリマー分子の例には、ポリエチレングリコール（PEG）およびポリプロピレングリコール（PPG）のようなポリアルキレングリコール（PAG）を含むポリアルキレンオキサイド（PAO）、分岐PEG、ポリ-ビニルアルコール（PVA）、ポリ-カルボキシレート、ポリ-（ビニルピロリドン）、ポリエチレン-コ-マレイン酸アンヒドライド、ポリスチレン-コ-マレイン酸アンヒドライド、カルボキシメチル-デキストランを含むデキストラン、または免疫原性を減少させ、かつ/または機能的インビボ半減期および/または血清半減期を増加させるのに適した他のバイオポリマー、より成る群から選択されたポリマー分子が含まれる。ポリマー分子の別の例は、ヒトアルブミンまたは血漿中に豊富に存在する別のタンパク質である。一般的にポリアルキレン-グリコール由来ポリマーは、生物学的適合性があり、毒性、抗原性、免疫原性がなく、様々な水溶性の性質を有し、かつ生体より容易に排泄される。
【００６９】
PEGは、例えばデキストランのようなポリサッカライドや同類のものと比較して架橋結合可能な反応基がほんの少ししかないため、好んで用いられるポリマー分子である。特に、単機能的PEG、例えばモノメトキシポリエチレングリコール（mPEG）は、その結合化学が比較的単純（ただ一つの反応基しかポリペプチド上の連結基と結合するのに利用可能でない）であるため重要である。結果的に、架橋結合の危険性が排除され、生成するポリペプチド結合体はより均一であり、かつポリマー分子のポリペプチドとの反応はより容易に制御できる。インターフェロン分子がPEG化される場合、それは大抵1から5のポリエチレングリコール（PEG）分子を含む。さらなる態様において、インターフェロン分子は1から5のPEG分子、例えば1、2または3のPEG分子を含む。さらなる態様においては、各PEG分子の分子量は約5kDa（キロダルトン）から100kDaである。さらなる態様においては、各PEG分子の分子量は約10kDaから40kDaである。さらなる態様においては、各PEG分子の分子量は約12kDaである。さらなる態様においては、各PEG分子の分子量は約20kDaである。好ましくはインターフェロン分子が各々分子量約12kDaの1から3のPEG分子か、または分子量約20kDaのPEG分子を1つ含む。適したPEG分子はShearwater Polymers, Inc.およびEnzon, Inc.より入手可能であり、 かつのSS-PEG、NPC-PEG、アルデヒド-PEG、mPEG-SPA、mPEG-SCM、mPEG-BTC、SC-PEG、トレシルmPEG (US 5,880,255)、またはオキシカルボニル-オキシ-N-ジカルボキシミド-PEG (US 5,122,614)の中から選択することができる。
【００７０】
ポリペプチドに対しポリマー分子を共有結合させるため、ポリマー分子のヒドロキシル末端基は活性化型、すなわち反応性官能基（それらの例には一次アミノ基、ヒドラジド（HZ）、チオール、コハク酸（SUC）、スクシニミジルコハク酸（SS）、スクシニミジルスクシナミド(SSA), スクシニミジルプロプリオネート（SPA）、スクシニミジルカルボキシメチレート（SCM）、ベンゾトリアゾールカルボネート（BTC）、N-ヒドロキシスクシニミド（NHS）、アルデヒド、 ニトロフェニルカルボネート（NPC）、およびトレシレート（TRES）が含まれる）と共に与えられなければならない。適切に活性化されたポリマー分子は、例えばShearwater Polymers, Inc., Huntsville, AL, USAまたはPolyMasc, UKから市販されている。あるいは、ポリマー分子は当業界にて既知の常套的方法にて、例えばWO90/13540に開示されるように活性化され得る。本発明において使用する活性化直鎖または分岐ポリマーの具体的な例は、Shearwater Polymers, Inc. 1997および2000カタログ(Functionalized Biocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals, Polyethylene Glycol and Derivatives、引用により本明細書に含まれる) に記載されている。活性化PEGポリマーの特定の例には、以下の直鎖PEGが含まれる：NHS-PEG（例えばSPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-PEG、SG-PEG、およびSCM-PEG)、ならびにNOR-PEG)、BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO-PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS-PEG、IODO-PEG、およびMAL-PEG、ならびにPEG2-NHSのような分岐PEGおよびUS 5,932,462およびUS 5,643,575（どちらも引用により本明細書に含まれる）に開示されるそれらのもの。さらに引用により本明細書に含まれる以下の出版物は、有用なポリマー分子および/またはPEG化化学を開示する：US 5,824,778、US 5,476,653、WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、US 4,902,502、US 5,281,698、US 5,122,614、US 5,219,564、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO95/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439 508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921 131、US 5,736,625、WO 98/05363、EP 809 996、US 5,629,384、WO 96/41813、WO 96/07670、US 5,473,034、US 5,516,673、EP 605 963、 US 5,382,657、EP 510 356、EP 400 472、EP 183 503およびEP 154 316。
【００７１】
ポリペプチドと活性型ポリマー分子との結合は常套的方法を使用することにより、例えば以下の引用（ポリマー分子の活性化に適した方法も記載している）に記載されるように、実施される：Harris and Zalipsky, eds., Poly(ethylene glycol) Chemistry and Biological Applications, AZC, Washington;  R.F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S.S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G.T. Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.)。使用される活性化方法および/または結合化学は、ポリマーの官能基（例えば、アミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、アルデヒドまたはスルフヒドリル）と同様にIFNBポリペプチドの連結基に依存することは当業者は認識しているであろう。PEG化は、ポリペプチド上のすべての利用可能な連結基（すなわちポリペプチド表面に露出しているそのような連結基）と結合するようなされる場合、または特定の連結基、例えばN末アミノ基（US 5,985,265）に対してなされる場合がある。
さらに、結合は一段階または段階的方法（例えばWO 99/55377に記載されるように）により達成され得る。
【００７２】
PEG化は、結合するPEG分子の数、そのような分子の大きさおよび形（例えばそれらが直鎖であるか分岐しているか）、ならびにそのような分子が結合するポリペプチド中の場所、に関して最適な分子を生成するように設計されると解される。例えば、使用されるポリマーの分子量は、達成されるべき望ましい効果に基づいて選択することができる。例えば、結合の第一の目的が高分子量の結合体を生成すること（例えば腎クリアランスを減少させるため）ならば、望ましい分子量を得るたのにできるだけ少ない数の高分子量ポリマー分子を結合することが大抵望ましい。高程度のエピトープ保護が望ましいときは、これは、効果的にポリペプチドのすべてまたはほとんどのエピトープを保護するのに十分な程多数の低分子量ポリマー（例えば分子量約5,000Daの）を用いることにより得られる。例えば3から6のように2から8のそのようなポリマーを使用することができる。
タンパク質上のただ一つの連結基との結合に関して（US 5,985,265に記載されるように）、ポリマー分子は、直鎖でも分岐していてもよいが、例えば約20kDaの高分子量を有する。
通常、ポリマー結合は、すべての利用可能なポリマー連結基がポリマー分子と反応するような条件下で行われる。典型的には、最適な反応を得るための活性化ポリマー分子のポリペプチドに対するモル比は、1000対1、特に200対1、好ましくは10対1または5対1のような100対1である。しかしながら等モル比もまた用いることができる。
本発明およびPCT/DK00/00471に係る発明に従い、ポリマー分子をリンカーを介してポリペプチドに結合させることも考えられる。適したリンカーは当業者にはよく知られている。好ましい例はシアヌリッククロライドである（Abuchowski et al., (1977), J. Biol. Chem., 252, 3578-3581; US 4,179,337; Shafer et al., (1986), J. Polym. Sci. Polym. Chem. Ed., 24, 375-378.）。
結合に続いて、残りの活性化ポリマー分子は当業界にて既知の方法に従い、例えば第一アミンを反応混合物中に加えることにより、ブロックされ、生成する不活性化ポリマー分子は適した方法により除去される。
【００７３】
IFNBのアミノ酸残基に対する炭水化物部分のインビトロ共有結合は、炭水化物置換基の数または特徴を、調整しまたは増加させるのに用いることができる。用いられる結合様式に依存して、炭水化物は、a）アルギニンおよびヒスチジン(Lundblad and Noyes, Chemical Reagents for Protein Modification, CRC Press Inc. Boca Raton, FI)、b）遊離型カルボキシル基（例えばC末アミノ酸残基、アスパラギンまたはグルタミンの）、c）システインのそれのような遊離型スルフィドリル基、d）セリン、スレオニン、チロシンまたはヒドロキシチロシンのそれらのような遊離型ヒドロキシル基、e）フェニルアラニンまたはトリプトファンのそれらのような芳香族残基、またはf）グルタミンのアミノ基に結合することができる。これらのアミノ酸残基は炭水化物部分に対する連結基の例を構成し、IFNBポリペプチドにおいて導入および/または除去されている場合がある。インビトロ結合の適した方法は、WO 87/05330およびAplin etl al., CRC Crit Rev. Biochem., pp. 259-306, 1981に記載されている。炭水化物部分またはPEGはまた、例えばSato et al., 1996 Biochemistry 35, 13072-13080 or in EP 725145似記載されるように、トランスグルタミナーゼ（TGases）によりタンパク質-およびペプチド-結合Gln残基にインビトロ結合させることができる。
【００７４】
糖部分との結合
本明細書に記載されるようにIFNBポリペプチドをインビボグリコシル化するため、例えばそれは一つもしくはそれ以上のグリコシル化部位を導入（「PCT/DK00/00471に係る発明の結合体であって非ポリペプチド部分が糖部分であるもの」の節参照）またはグリコシル化部位に近接するアミノ酸残基の修飾（「グリコシル化の増大した変異体」と題される節に記載されるように）により修飾されたものであるが、結合体のポリペプチド部分をコードするヌクレオチド配列がグリコシル化可能真核生物発現宿主に挿入されなければならない。発現宿主細胞は、真菌（糸状菌または酵母）、昆虫、哺乳動物、動物および遺伝子組換え植物細胞から、または遺伝子組換え動物から選択することができる。さらにグリコシル化は、本明細書に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を遺伝子治療において使用するとき、ヒトの体内においてなされ得る。ある態様においては、宿主細胞はCHO細胞、BHKまたはHEK細胞、例えばHEK293細胞、のような哺乳細胞、またはSF9細胞のような昆虫細胞、または酵母細胞、例えばSaccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris、または例えば以下にさらに記載されるような他の適したグリコシル化可能宿主、である。任意で、インビボグリコシル化によりIFNBポリペプチドに結合した糖部分は、さらにグリコシルトランスフェラーゼを使用して、例えばNeose, Horsham, PA, USAにより市販されるglycoAdvanceTM technologyを使用して、修飾される。それにより例えば、CHO細胞による発現およびインビボグリコシル化に続きグリコシル化IFNBポリペプチドのシアリル化を増大することができる。
【００７５】
有機誘導剤との結合
IFNBポリペプチドの共有結合修飾はポリペプチドの連結基を有機誘導剤と反応させることにより行うことができる。適した誘導剤および方法は当業界にて周知である。例えば、システイニル残基は最も一般的にはα-ハロアセテート（および対応アミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応してカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生成する。システイル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α-ブロモ-β-(4-イミドゾイル)プロピオン酸、燐酸クロロアセチル、N-アルキルマレイミド、3-ニトロ-2-ピリジルジスルフィド、メチル2-ピリジルジスルフィド、p-クロロ水銀安息香酸、2-クロロ水銀-4-ニトロフェノール、またはクロロ-7-ニトロベンゾ-2-オキサ-1,3-ジアゾールとの反応により誘導体化される。ヒスチジル残基はpH5.5-7.0でジエチルピロカルボナートとの反応により誘導体化されるが、これは、この剤がヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるためである。p-ブロモフェナシルブロミドもまた有用である。この反応は好ましくは0.1Mカコジル酸ナトリウム中pH6.0で行う。リジルおよびアミノ末端残基は琥珀酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの物質による誘導体化はリジン残基の電荷を逆転させる効果を持つ。α-アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬は、イミドエステル類、例えばメチル ピコリンイミダート、燐酸ピリドキサル、ピリドキサル、水素化クロロ硼素、トリニトロベンゼンスルホン酸、O-メチルイソ尿素、2,4-ペンタンジオンおよびグリオキシラートを用いたトランスアミナーゼ触媒反応を包含する。アルギニル残基は1または幾つかの常套的試薬、なかでもフェニルグリオキサル、2,3-ブタンジオン、1,2-シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いpKaのため、アルカリ条件下で反応を行う必要がある。さらに、これらの試薬はリジンの基およびアルギニングアニジノ基と反応することができる。カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミルまたはC末アミノ酸残基）は、カルボジイミド（R-N=C=N-R'）（ここでRおよびR'は異なるアルキル基である）、例えば1-シクロヘキシル-3-(2-モルホリニル-4-エチル)カルボジイミドまたは1-エチル-3-(4-アゾニア-4,4-ジメチルペンチル)カルボジイミドとの反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【００７６】
本発明（またはPCT/DK00/00471に記載される）IFNBポリペプチドの調整方法
任意でグリコシル化型であることがある本発明のまたはPCT/DK00/00471に記載されるポリペプチドは、当業界で既知の適した方法により製造できる。そのような方法は、そのポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を作成し、適した形質転換またはトランスフェクトされた宿主でこの配列を発現することを含む。しかしながら、本発明に係るポリペプチドは、効率は低いものの、化学合成または化学合成の組み合わせまたは化学合成と組換えDNA技術の組み合わせによって製造することができる。
IFNBポリペプチドをコードする本発明のヌクレオチド配列は、例えば配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する親IFNBをコードするヌクレオチド配列を単離または合成し、その後このヌクレオチド配列を適当なアミノ酸残基の導入（即ち挿入または置換）または除去（即ち除去または置換）を惹起するように変化させることにより作成することができる。
そのヌクレオチド配列は、周知の方法により位置指定突然変異誘発によって都合よく修飾される（例えばMark et al., ″Site-specific Mutagenesis of the Human Fibroblast Interferon Gene″, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 5662-66 (1984);およびUS 4,588,585参照）。
あるいは、そのヌクレオチド配列は化学合成によって調整され、それは例えばオリゴヌクレオチド合成機を使用し（ここでオリゴヌクレオチドは所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づき設計される）、そして好ましくはその組換えポリペプチドが産生されるであろう宿主細胞において好都合なコドンを選択することによる。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードしている幾つかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、PCR、ライゲーションまたはライゲーション連鎖反応（LCR）によって組み立てることができる。個々のオリゴヌクレオチドは典型的には相補的組み立てのための5'または3'突出部を含んでいる。
【００７７】
（合成、位置指定突然変異または別の方法により）いったん組み立てられると、IFNBポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、組換えベクターに挿入され、かつ望ましい形質転換宿主細胞におけるIFNBの発現に必要な調節配列に作動可能に結合される。
全てのベクターおよび発現調節配列が等しく良好に機能し、本明細書に記載されるポリペプチド変異体をコードしているヌクレオチド配列を発現する訳ではないことは無論理解されるべきである。全ての宿主が同じ発現系で等しく良好に機能する訳でもない。しかしながら当業者は、これらのベクター、発現調節配列および宿主から、不必要な実験を行うことなく選択を行うことができる。例えばベクターの選択において、そのベクターは宿主中で複製しまた染色体中に組み込まれ得なければならないので、宿主を考慮せねばならない。ベクターのコピー数、そのコピー数を調節する能力、および抗生物質マーカーのようなそのベクターによりコードされている他のタンパク質の発現もまた考慮すべきである。発現調節配列の選択にあたり、様々な因子もまた考慮すべきである。これらは、例えば配列の相対的強さ、その被調節可能性、および、特に可能性ある二次構造に関するポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列との適合性を含む。宿主は、選択したベクターとの適合性、該ヌクレオチド配列がコードしている生成物の毒性、それらの分泌特性、該ポリペプチドを正しく折り畳む能力、発酵または培養要件、および該ヌクレオチド配列がコードしている生成物の精製し易さを考慮して選択すべきである。
【００７８】
この組換えベクターは、自律複製ベクター、即ち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体の複製とは独立しているベクター、例えばプラスミドであってよい。これに代わり該ベクターは、宿主細胞中に導入された時にその宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、それが組み込まれた染色体と共に複製されるベクターである。
ベクターは好ましくは、本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列が該ヌクレオチド配列の転写に必要なさらなるセグメントに作動可能に連結している発現ベクターである。このベクターは典型的にはプラスミドまたはウィルスDNAに由来する。本明細書に記載の宿主細胞での発現にとって適した多くの発現ベクターが市販されており、または文献に記載されている。真核生物宿主のための有用な発現ベクターは、例えば、SV40、牛乳頭腫ウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルス由来の発現調節配列を含有するベクターを含む。具体的なベクターは、例えばpCDNA3.1(+)＼Hyg（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）およびpCI-neo（Stratagene, LaJola, CA, USA）である。細菌宿主のための有用な発現ベクターは、既知の細菌プラスミド、例えばpBR322、pET3aおよびpET12a（いずれもNovagen Inc., WI, USAより）を含むE.coli由来のプラスミド、より広い宿主範囲のプラスミド、例えばRP4、ファージDNA、例えばファージλの多数の誘導体、例えばNM989、ならびに他のDNAファージ、例えばM13および繊維状一本鎖DNAファージを含む。酵母細胞のための有用な発現ベクターは、2μプラスミドおよびその誘導体、POT1ベクター（US4,931,373）、Okkels, Ann.New York Acad.Sci. 782, 202-207, 1996に記載されるpJSO37ベクター、およびpPICZ A、BまたはC（Invitrogen）を含む。昆虫細胞のための有用なベクターは、pVL941、pBG311 (Cate et al., “Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance And Expression of the Human Gene In Animal Cells”, Cell, 45, pp. 685-98 (1986)）、pBluebac 4.5およびpMelbac（いずれもInvitrogenより入手可能）を含む。
【００７９】
本発明で使用するための他のベクターは、該ポリペプチド変異体をコードしているヌクレオチド配列のコピー数を増幅させるものを含む。このような増幅可能なベクターは当業界において周知である。それらは、例えば、DHFR増幅（例えば、Kaufman、米国特許第4470461号、Kaufman and Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)参照) およびグルタミンシンセターゼ (「GS」) 増幅(例えばUS5122464およびEP338841を参照）によって増幅させることのできるベクターを含む。
この組換えベクターはさらに、該ベクターを問題の宿主細胞中で複製することのできるDNA配列を含む。このような配列の例は（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合）、SV40複製開始点である。宿主細胞が酵母細胞である場合、ベクターを複製することのできる適切な配列は、酵母プラスミド2μ複製遺伝子REP1-3および複製開始点である。
このベクターはまた、選択マーカー、例えばその生成物が宿主細胞の欠陥を補完する遺伝子、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）またはSchizosaccharomyces pombe TPI遺伝子（P.R.Russell, Gene 40, 1985, pp.125-130に記載）、または、薬物、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシンもしくはメトトレキサートに対する耐性を付与する遺伝子を含み得る。糸状菌のためには、選択マーカーはamdS、pyrG、arcB、niaDおよびsCを含む
。
【００８０】
「調節配列」なる用語は本明細書では、IFNBポリペプチドの発現にとって必要または有利な全ての成分を包含すると規定される。各調節配列は、該ポリペプチドをコードしている核酸配列に対して本来のまたは外来のものであってよい。そのような調節配列は、これらに限定される訳ではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、エンハンサーまたは上流活性化配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを含む。最低でも調節配列はプロモーターを含む。
本発明には多岐にわたる発現調節配列を使用できる。このような有用な発現調節配列は、前記発現ベクターの構造遺伝子に付随する発現調節配列、および、原核生物もしくは真核生物細胞またはそれらのウィルスの遺伝子の発現を調節することが知られている任意の配列、ならびにそれらの様々な組み合わせを含む。
哺乳動物細胞における転写を指令するのに適した調節配列の例は、SV40およびアデノウィルスの初期および後期プロモーター、例えばアデノウィルス2主要後期プロモーター、MT-1（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトサイトメガロウィルス即時初期プロモーター（CMV）、ヒト延長因子1α（EF-1α）プロモーター、ショウジョウバエ最小熱ショック蛋白70プロモーター、ラウス肉腫ウィルス（RSV）プロモーター、ヒトユビキチンC（UbC）プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター、SV40またはアデノウィルスE1b領域ポリアデニル化シグナルおよびKozakコンセンサス配列（Kozak,M. J Mol Biol 1987 Aug 20;196(4):947-50）を含む。
【００８１】
哺乳動物細胞における発現を改善するため、当該ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の5'非翻訳領域に合成イントロンを挿入することができる。合成イントロンの一例は、プラスミドpCI-Neo（Promega Corporation, WI, USAより入手可能）由来の合成イントロンである。
昆虫細胞における転写を指令するのに適した調節配列の例は、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーター、Autographa californica多角体病ウィルス塩基性蛋白プロモーター、バキュロウイルス即時初期遺伝子1プロモーターおよびバキュロウィルス39K遅延初期遺伝子プロモーター、ならびにSV40ポリアデニル化配列を含む。
酵母宿主細胞における使用に適した調節配列の例は、酵母α接合系のプロモーター、酵母燐酸トリオースイソメラーゼ（TPI）プロモーター、酵母解糖遺伝子またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のプロモーター、ADH2-4cプロモーター、および誘導性GALプロモーターを含む。
糸状菌宿主細胞における使用に適した調節配列の例は、ADH3プロモーターおよびターミネーター、Aspergillus oryzae TAKAアミラーゼ燐酸トリオースイソメラーゼもしくはアルカリ性プロテアーゼ、A.niger α-アミラーゼ、A.nigerもしくはA.nidulansグルコアミラーゼ、A.nidulansアセトアミダーゼ、Rhizomucor mieheiアスパラギン酸プロテイナーゼまたはリパーゼをコードしている遺伝子に由来するプロモーター、TPI1ターミネーターおよびADH3ターミネーターを含む。
細菌宿主細胞での使用のための適した調節配列の例は、lac系、trp系、TACまたはTRC系のプロモーター、およびファージλの主要プロモーター領域を含む。
【００８２】
位置指定突然変異誘発、合成または他の方法による調整の如何に拘わらず、IFNBポリペプチドをコードしている本発明のヌクレオチド配列は、シグナルペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含んでも、また含まなくてもよい。シグナルペプチドは、該ポリペプチドをそれが発現される細胞から分泌させようとする場合に存在する。このようなシグナルペプチドは、存在するとすれば、該ポリペプチドの発現のために選択した細胞によって認識されるものであるべきである。シグナルペプチドは、該ポリペプチドにとって同種（例えば、ヒトIFNBに通常付随するもの）または異種（即ち、ヒトIFNB以外の供給源に起源を持つもの）であってよく、または宿主細胞にとって同種または異種、即ち、その宿主細胞から通常発現されるシグナルペプチドであるか、または宿主細胞から通常発現されないものであってよい。したがって、シグナルペプチドは原核生物性、例えばE.coliのような細菌由来のもの、または真核生物性、例えば哺乳動物または昆虫もしくは酵母細胞由来のものであってよい。
シグナルペプチドの存在または不在は、例えば、ポリペプチドの産生に使用する発現宿主細胞、発現させるべきタンパク質（それが細胞内タンパク質であるか細胞外タンパク質であるか）、および分泌を得ることが望ましいかどうかに依存するであろう。糸状菌において使用するためには、シグナルペプチドは都合にあわせ、Aspergillus種のアミラーゼもしくはグルコアミラーゼをコードしている遺伝子、Rhizomucor mieheiのリパーゼもしくはプロテアーゼ、またはHumicola lanuginosaのリパーゼをコードしている遺伝子由来のものであってよい。シグナルペプチドは好ましくはA.oryzae TAKAアミラーゼ、A.niger中性α-アミラーゼ、A.niger酸安定性アミラーゼ、またはA.nigerグルコアミラーゼをコードしている遺伝子由来のものである。昆虫細胞において使用するためには、シグナルペプチドは都合により、昆虫遺伝子（WO90/05783参照）、例えばlepidopteran Manduca sexta脂肪動員ホルモン前駆体（US5023328参照）、ミツバチのメリチン（Invitrogen）、エクジステロイドUDPグリコシルトランスフェラーゼ（egt）(Murphy et al., Protein Expression and Purification 4, 349-357(1993)）またはヒト膵臓リパーゼ（hp1)(Methods in Enzymology 284, pp.262-272, 1997）由来のものであってよい。哺乳動物細胞において使用するための好ましいシグナルペプチドは、本明細書中以下に記載の例より明らかなヒトIFNBのそれまたはマウスIgκ軽鎖シグナルペプチド（Coloma,J(1992) J.Imm.Methods 152:89-104）である。酵母細胞において使用するための適したシグナルペプチドは、S.cereviciae由来のα因子シグナルペプチド（US4,870,008参照）、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド（O. Hagenbuchle et al.,Nature 289, 1981, pp. 643-646参照）、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド（L.A.Valls et al., Cell 48, 1987, pp.887-897参照）、酵母BAR1シグナルペプチド（WO87/02670参照）および酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3（YAP3）シグナルペプチド（M.Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp.127-137参照）であることが見出されている。
【００８３】
細菌、真菌（酵母を含む）、植物、昆虫、哺乳動物、または他の適当な動物細胞もしくは株化細胞、ならびに遺伝子組換え動物もしくは植物を含む、任意の適した宿主を使用してIFNBポリペプチドを産生できる。細菌宿主細胞の例は、Bacillusの菌株、例えばB.brevisまたはB.subtilis、PseudomonasまたはStreptomyces、のようなグラム陽性細菌、またはE.coliの菌株のようなグラム陰性細菌を含む。細菌宿主細胞へのベクターの導入は、例えばプロトプラスト形質転換（例えばChang and Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168:111-115参照）、コンピテント細胞の使用（例えばYoung and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81:823-829、またはDubnau and Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:209-221参照）、電気穿孔（例えばShigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6:742-751参照）、またはコンジュゲーション（例えばKoehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169:5771-5278参照）によって実施できる。
適した糸状菌宿主細胞の例は、Aspergillusの菌株、例えばA.oryzae、A.nigerもしくはA.nidulans、FusariumまたはTrichodermaを含む。真菌細胞は、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を含むプロセスにより、自体既知の方法で形質転換できる。Aspergillus宿主細胞の形質転換に適した方法がEP238023およびUS5,679,543に記載されている。Fusarium種を形質転換させるのに適した方法はMalardier et al., 1989, Gene 78:147-156およびWO96/00787に記載されている。酵母は、Becker and Guarenteによる、Abelson,J.N.およびSimon,M.I. Ed.、Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp182-187, Academic Press,Inc., New York；Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153:163；Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920に記載の方法を用いて形質転換できる。
【００８４】
適した酵母宿主細胞の例は、例えばS.cerevisiaeのようなSaccharomycesの菌株、Schizosaccharomyces、Klyveromyces、Pichiaの菌株、例えばP.pastorisもしくはP.methanolica、H.Polymorpha のようなHansenulaの菌株、またはYarrowiaの菌株を含む。酵母細胞を異種性DNAで形質転換しそこから異種性ポリペプチドを産生する方法はClontech Laboratories,Inc., Palo Alto, CA, USA（YeastmakerTM酵母形質転換系キットのための製品プロトコル中）により、およびReeves et al., FEMS Microbiology Letters 99 (1992) 193-198、Manivasakam and Schiestl, Nucleic Acids Research, 1993, Vol. 21, No. 18, pp. 4414-4415並びにGaneva et al., FEMS Microbiology Letters 121 (1994) 159-164.により開示される。
適した昆虫宿主細胞の例は、Lepidoptora株化細胞、例えばSpodoptera frugiperda（Sf9またはSf21）またはTrichoplusioa ni細胞（High Five）(US5,077,214）を含む。昆虫細胞の形質転換およびそこでの異種性ポリペプチドの産生はInvitrogenにより記載されるように実施できる。
適した哺乳動物宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）株化細胞（例えばCHO-K1; ATCC CCL-61）、ミドリザルセルライン（COS)(例えばCOS1（ATCC CRL-1650）、COS7（ATCC CRL-1651)); マウス細胞（例えばNS/O）、新生児ハムスター腎（BHK）株化細胞（例えばATCC CRL-1632またはATCC CCL-10）、およびヒト細胞（例えばHEK293（ATCC CRL-1573）ならびに組織培養の植物細胞を包含する。さらなる適した株化細胞が当業界で知られており、American Type Culture Collection, Rockville, Marylandのような公的寄託機関から入手できる。また、CHO細胞のような哺乳動物細胞は、IFNBポリペプチドのグリコシル化を改善するために、US5,047,335に記載のようにシアリルトランスフェラーゼ、例えば1,6-シアリルトランスフェラーゼを発現するよう改変することができる。
【００８５】
外因性DNAを哺乳動物宿主細胞中に導入する方法は、燐酸カルシウム仲介トランスフェクション、電気穿孔、DEAE-デキストラン仲介トランスフェクション、リポソーム仲介トランスフェクション、ウィルスベクター、およびLipofectamin 2000を用いるLife Technologies Ltd, Paisley, UKにより記載されるトランスフェクション法並びにFuGENE 6を用いるRoche Diagnostics Corporation, Indianapolis, USA より記載されるトランスフェクション法を含む。これらの方法は当業界にて周知であり、例えばAusbel et al.(eds.), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USAに記載されている。哺乳動物細胞の培養は、例えば(Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Nigel Jenkins Ed., 1999, Human Press Inc, Totowa, New Jersey, USAおよびHarrison MA and Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997)に開示されている、確立された方法に従って実施する。
本発明の製造方法では、当業界で既知の方法を用いて該ポリペプチドの産生に適した栄養培地で細胞を培養する。例えば、該ポリペプチドが発現されそして/または単離され得る条件下で、適した培地中で実施される実験室または工業的発酵槽内での振盪フラスコ培養、小規模または大規模発酵（連続、バッチ、給餌バッチ、または固体状態発酵を含む）により、細胞を培養できる。この培養は、炭素並びに窒素源および無機塩類を含む適した栄養培地中で、当業界で既知の方法を用いて実施する。適した培地は商業的供給者から入手でき、または公開されている組成（例えばAmerican Type Culture Collectionのカタログにおいて）に従って調整できる。該ポリペプチドが栄養培地中に分泌されるならば、このポリペプチドを培地から直接回収することができる。該ポリペプチドが分泌されない場合は細胞可溶化物から回収できる。
得られるポリペプチドは当業界にて既知の方法によって回収できる。例えば、該ポリペプチドは、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発または沈殿を含む（但しこれらに限定されない）常套的方法によって栄養培地から回収できる。
【００８６】
該ポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動法（例えば調製用等電点電気泳動）、差別的溶解度（例えば硫酸アンモニウム沈殿）、SDS-PAGEまたは抽出（例えばProtein Purification, J.-C.Janson and Lars Ryden Ed., VCH Publishers, New York, 1989参照）を含む（但しこれらに限定されない）当業界で既知の様々な方法によって精製できる。IFNB活性を示すポリペプチドを精製する具体的な方法は、US 4,289,689、US 4,359,389、US 4,172,071、US 4,551,271、US 5,244,655、US 4,485,017、US 4,257,938およびUS 4,541,952.に開示される。ある具体的な精製方法はイムノアフィニティー精製である（例えばOkamura et al., "Human Fibroblastoid Interferon: Immunosorbent Column Chromatography And N-Terminal Amino Acid Sequence", Biochem., 19, pp. 3831-35 (1980)参照）。またヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーも使用できる。さらに、精製はIFNAR 1および/またはIFNAR 2、特にIFNAR 2の使用に基づくことができる。
IFNBポリペプチドの生物学的活性は当業界にて既知の適した方法により測定できる。そのようなアッセイは、EP 41313 B1に記載されるように、抗ウィルス活性、タンパクキナーゼの誘導、オリゴアデニレート2,5-A合成酵素またはホスホジエステラーゼ活性の抗体中和を含む。そのようなアッセイはまた免疫調節アッセイ（US 4,753,795参照）、成長阻害アッセイ、およびインターフェロン受容体発現細胞に対する結合測定を含む。本発明のポリペプチドまたは結合体の生物学的活性を決定する具体的なアッセイは本明細書後方の材料と方法の節に開示される。
【００８７】
本発明の結合体の医薬組成物および使用
本発明のIFNB分子は、Avonex、RebifおよびBetaseronヒトIFNBでの治療において用いられる量におおよそ匹敵する投与量、またはより高い投与量で投与される。投与されるべき正確な量はその環境に依存する。通常、投与量は、処置の対象である状態または適応症の重症度または拡散を防ぐかまたは減少させることができなければならない。効果的なIFNB分子の量は、特に、疾患、投与量、投与計画、その分子が単独でまたは他の治療薬と一緒に投与されるか、組成物の血清半減期、および患者の全体的健康状態に依存することは当業者には明らかであろう。
本発明のIFNB分子は「現状のままで」および/またはその塩の形態で使用できる。適した塩は、アルカリ金属またはアルカリ土類金属、例えばナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウムおよびマグネシウムとの塩、ならびに例えば亜鉛塩を含むが、これらに限定される訳ではない。これらの塩または錯体は結晶および/またはアモルファス構造として存在できる。
本発明の分子は、さらに製薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物として投与されるのが好ましい。「製薬的に許容される」なる用語は、担体または賦形剤が、それらが投与される患者において有害な作用を惹起しないことを意味する。このような製薬的に許容される担体および賦形剤は当業界ではよく知られている
【００８８】
本発明の分子は、周知の方法により医薬組成物へと製剤化できる。適した製剤はUS5,183,746、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R.Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S.Frokjaer and L.Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]；およびHandbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A.Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]に記載される。
本発明の分子は、液体、ゲル、凍結乾燥、肺分散、または圧縮固体のような他の適した形態を含む様々な形態で医薬組成物へと製剤化できる。好ましい形態は治療される特定の適応症に依存し、かつ当業者には明らかであろう。
本発明の医薬組成物は、非経口（例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下）、経口、脳内、皮内、鼻腔内、肺内、吸入または他の許容される方法、例えばPowderJect or ProLease technologyを使用する方法、にて投与され得る。好ましい投与の様式は処置される特定の適応症に依存しかつそれは当業者には明らかであろう。
【００８９】
遊離型システインを有さないIFNBポリペプチドを含む医薬組成物
驚くべきことに、遊離型システイン、例えばヒトIFNB由来ポリペプチドのC17、を有さないIFNBポリペプチドは、遊離型システインを含むIFNBポリペプチドと比較して顕著に凝集しにくいことが明らかになった。この知見は、IFNBポリペプチドの生産（複雑さが減少する）だけでなく、治療製品へと製剤化するときのIFNBポリペプチドの凝集を最小限にする安定剤の使用の必要性に関しても重要な意味をもつ。
従って、さらなる態様において本発明は、置換C17S（配列番号：２に対して）を含むグリコシル化IFNBポリペプチドを含む医薬組成物に関し、この組成物は、C17を含む以外は同じアミノ酸配列を有するグリコシル化IFNBポリペプチドを含む医薬組成物を調製するのに必要な量と比較して、少ない量の安定剤を含む。例えば、安定剤の量は少なくとも50％まで、例えば少なくとも75％またはさらに高い割合まで減らすことができる。置換C17S（配列番号：２に対して）を含むグリコシル化IFNBポリペプチドを含む医薬組成物であって、実質的に安定剤を含まないものは特に重要である。
この局面に従うIFNBポリペプチドは、遊離型システインを有さないグリコシル化IFNBのいずれでもよく、例えば、親IFNB分子のいずれか、（グリコシル化されかつ任意で第二の非ポリペプチド部分と結合することがある）結合体のポリペプチド部分、または本明細書に記載される（すなわち「PCT/DK00/00471に係る発明の結合体であって非ポリペプチド部分が糖部分であるもの」または「グリコシル化の増大した変異体」の節に記載される）グリコシル化変異体であってよい。IFNBポリペプチドがヒトIFNB由来である場合、そのアミノ酸配列は17の位置のシステインが相違し、かつ例えば突然変異C17Sを含む。
減ったかまたは存在しなくなった安定剤は、以下の節に示される安定剤のうちのいずれかである。例えば安定剤は、HAS、またはTweenのような非イオン界面活性剤、例えばTween 20もしくはTween80、である。
【００９０】
非経口組成物
医薬組成物の一例は非経口投与用に設計した溶液である。多くの場合、医薬溶液製剤は即時使用に適した液体形態で提供されるが、係る非経口製剤は凍結または凍結乾燥形態でも提供され得る。前者の場合、使用前にこの組成物を融解せねばならない。凍結乾燥調製物は一般に液体調合物より安定であるという事が当業者に認識されているため、より多岐にわたる貯蔵条件の下で該組成物中に含まれる活性化合物の安定性を増強するため、凍結乾燥形態がしばしば利用される。このような凍結乾燥調製物は、注射用滅菌水または滅菌生理食塩水のような一つまたはそれ以上の適当な製薬的に許容される希釈剤の添加により、使用前に再構成される。
非経口投与の場合、これらは、所望の純度を持つ該ポリペプチドを一つまたはそれ以上の当業界で典型的に使用される製薬的に許容される担体、賦形剤または安定剤（これらは全て「賦形剤」と称する）、例えば緩衝液、安定剤、保存剤、等張化剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤および／または他の様々な添加剤と適宜混合することにより、凍結乾燥製剤または水溶液として保存用に調製される。
【００９１】
緩衝液は生理的条件に近似する範囲のpHを維持する助けとなる。これらは典型的には約2mMから約50mMの範囲の濃度で存在する。本発明に使用するのに適した緩衝液は、有機および無機酸ならびにその塩、例えばクエン酸緩衝液（例えばクエン酸一ナトリウム-クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸-クエン酸一ナトリウム混合物など）、コハク酸緩衝液（例えばコハク酸-コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸-水酸化ナトリウム混合物、コハク酸-コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝液（例えば酒石酸-酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸-酒石酸カリウム混合物、酒石酸-水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝液（例えばフマル酸-フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸-フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム-フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝液（例えばグルコン酸-グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸-水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸-グルコン酸カリウム混合物など）、蓚酸緩衝液（例えば蓚酸-蓚酸ナトリウム混合物、蓚酸-水酸化ナトリウム混合物、蓚酸-蓚酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝液（例えば乳酸-乳酸ナトリウム混合物、乳酸-水酸化ナトリウム混合物、乳酸-乳酸カリウム混合物など）および酢酸緩衝液（例えば酢酸-酢酸ナトリウム混合物、酢酸-水酸化ナトリウム混合物など）を包含する。さらなる可能性は燐酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液およびTrisのようなトリメチルアミン塩である。保存剤は微生物の増殖を遅延させるために添加し、典型的には約0.2%から1%(w/v)の量を添加する。本発明での使用に適した保存剤は、フェノール、ベンジルアルコール、メタ-クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ハロゲン化ベンザルコニウム（例えば塩化、臭化またはヨウ化ベンザルコニウム）、塩化ヘキサメトニウム、メチルまたはプロピルパラベンといったアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノールおよび3-ペンタノールを包含する。
【００９２】
等張化剤は液体組成物の等張性を確保するために添加し、多価糖アルコール、好ましくは三価またはそれ以上の糖アルコール、例えばグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールを含む。多価アルコールは他の成分の相対量を考慮に入れて0.1%および25%（重量）の間、典型的には1%から5%の量で存在できる。
安定剤とは、機能の上で、増量剤から、治療剤を可溶化しまたは変性や容器壁への付着の防止を助ける添加物までの範囲の広い範疇の賦形剤を指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上に列挙）；アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、L-ロイシン、2-フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど、有機糖または糖アルコール、例えば乳糖、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールおよび同様のもの（イノシトールのようなシクリトールを含む）；ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；硫黄含有還元剤、例えば尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α-モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウム；低分子量ポリペプチド（即ち＜10残基）；タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、牛血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；単糖類、例えばキシロース、マンノース、フルクトースおよびグルコース；二糖類、例えば乳糖、マルトースおよび蔗糖；三糖類、例えばラフィノース、ならびに多糖類、例えばデキストランであってよい。非イオン性界面活性剤またはデタージェント（「湿潤化剤」としても知られる）は、治療剤の可溶化を助けるため、そして治療用ポリペプチドを振動誘発凝集から保護するために存在させることができ、さらにこれは、該ポリペプチドの変成をもたらすことなく製剤を剪断表面応力にさらすことを可能にする。適した非イオン性界面活性剤は、ポリソルベート（20、80など）、ポリオキサマー（184、188など）、Pluronic（登録商標）ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（Tween（登録商標）-20、Tween（登録商標）-80など）を含む。
【００９３】
安定剤は、典型的には活性タンパク質重量を基準として0.1から10,000重量部の範囲で存在するが、「遊離型システインを有さないIFNBポリペプチドを含む医薬組成物」と題される節に規定されるような本発明の医薬組成物の場合、減らされているか存在しないことも可能である。さらなるその他の賦形剤は、充填剤または増量剤（例えば澱粉）、キレート化剤（例えばEDTA）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンE）および補助溶媒を包含する。活性成分はまた、例えばコアセルベート化技術または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース、ゼラチンまたはポリ-(メチルメタキレート)マイクロカプセル中に、またはコロイドドラッグデリバリーシステム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に捕捉できる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences、上記、に開示されている。
インビボ投与に使用する非経口製剤は無菌でなければならない。これは例えば滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成できる。
【００９４】
持続放出調製物
持続放出調製物の適当な例は、本発明の分子を含有する疎水性固体ポリマーの半透性マトリックスを含み、そのマトリックスはフィルムまたはマイクロカプセルのような適した形態を有する。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えばポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)）、ポリ乳酸、L-グルタミン酸とエチル-L-グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレンビニルアセタート、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばProLease（登録商標）技術またはLupron Depot（登録商標）（乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドより成る注射可能なミクロスフェア）、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸を包含する。エチレン-ビニルアセタートおよび乳酸-グリコール酸といったポリマーは、100日間またはそれ以上の長期間の分子の放出を可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短期間放出する。カプセル化したポリペプチドが体内に長時間とどまる場合、37℃で水分にさらされる結果これらは変性または凝集し、生物学的活性の喪失およびことによると免疫原性の変化を招く場合がある。関与している機構に応じて、安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間S-S結合の形成であることが判明しているならば、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分量の調節、適当な添加剤の使用、そして特別なポリマーマトリックス組成物の開発により、安定化を達成できる。
【００９５】
肺送達
ジェットまたは超音波のいずれかの噴霧器での使用に適した結合体またはポリペプチド製剤は、典型的には、例えば溶液1 mLに対し結合体約0.01-25mgの濃度、好ましくは0.1-10ng/mL、で水に溶解した分子を含むであろう。その製剤はまた緩衝液並びに単糖（例えばタンパク質安定化および浸透圧調節のため）、および/または濃度0.1-10 mg/mlの範囲のヒト血清アルブミンを含む。使用可能な緩衝液の例は酢酸ナトリウム、クエン酸およびグリシンである。好ましくはその緩衝液は、溶液のpHを3から9の範囲に調節するのに適した組成およびモル濃度を有する。一般的に、1 mMから50 mMの緩衝液モル濃度がこの目的に適している。利用可能な糖の例は、乳糖、麦芽糖、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、およびキシロースであり、通常製剤の重量の1%から10%の範囲の量である。
エアロゾル形成における溶液の噴霧化により引き起こされる表面誘導タンパク質凝集を減少させるため、または防ぐため、噴霧製剤はまた界面活性剤を含むことができる。ポリオキシエチレン脂肪酸エステル並びにアルコール、およびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルのような、様々な常套的な界面活性剤が使用可能である。量は一般的に製剤の重量の0.001％から4％の間の範囲である。本発明の目的のため特に好ましい界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである。
本発明の液体粒子を適切に分散させる具体的な製剤および方法は、引用により本明細書に含まれるWO 9420069、US 5915378、US 5960792、US 5957124、US 5934272、US 5915378、US 5855564、US 5826570、およびUS 5522385に記載される。
【００９６】
本発明の実施に適した市販の噴霧器の三つの具体的な例は、Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Mo.製造のUltravent nebulizer、Marquest Medical Products, Englewood, Colorado製造のAcorn II nebulizer、 およびAradigm Corporation, Hayward, California製造のAERx pulmonary drug delivery systemである。
定量吸入装置で使用するための本発明の製剤は、一般的に微細粉末を含む。この粉末は、液体製剤を凍結乾燥しその後製粉することで生産することができ、またヒト血清アルブミン（HSA）のような安定剤を含むことができる。典型的には0.5％(w/w)以上のHSAが添加される。さらに、要すれば一つまたはそれ以上の糖または糖アルコールをその調製物に添加できる。例としては、乳糖、麦芽糖、マンニトール、ソルビトール、ソルビトース、トレハロース、キシリトール、およびキシロースが含まれる。存在する結合体の約0.01から200% (w/w)、好ましくはおよそ1から50%、の範囲の量で製剤に添加できる。そのような製剤はその後凍結乾燥され所望の粒子サイズに製粉される。
【００９７】
適切なサイズになった粒子はその後、界面活性剤に助けられ噴霧剤中に懸濁される。噴霧剤は本目的に用いられる常套的な物質のいずれでもよく、例えば、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および1,1,1,2-テトラフルオロエタンなど、クロロフッ化炭素、ヒドロクロロフッ化炭素、ヒドロフッ化炭素または炭化水素、またはそれらの組み合わせである。適した界面活性剤はソルビタントリオレートおよび大豆レシチンを含む。オレイン酸もまた界面活性剤として有用である。この混合物はその後到送達装置に充填される。本発明における使用に適した市販の定量吸入器の例は、Glaxo Inc., Research Triangle Park, N.C.製造のVentolin metered dose inhalerである。
このような粉末吸入器のための製剤は、IFNB分子を含有する微細乾燥粉末を含むであろうし、また、乳糖、ソルビトール、ショ糖またはマンニトールのような充填剤を、その装置からの粉末の散布を促進する量で、例えば製剤の重量の50％から90％で、含むことができる。粉末の粒子は、平均直径が10マイクロメーター以下、好ましくは0.5-5マイクロメーターの間、より好ましくは1.5-3.5マイクロメーターの間でかつ密度約1 g/cm2の粒子に相当する空気力学的性質を肺中で有するであろう。
ここに示される教示に従う使用に適した粉末吸入器の一例は、Fisons Corp., Bedford, Mass製造のSpinhaler powder inhalerである。
これらの装置のための粉末は、US 5997848、US 5993783、US 5985248、US 5976574、US 5922354、US 5785049、US 6,123,936およびUS 55654007に開示される方法により生成し、送達することができる。
【００９８】
本発明の分子を含む医薬組成物は、噴霧器、定量吸入器、および粉末吸入器（但しこれらに限定されない）を含む、治療用製品の肺送達のために設計された広範な機械的装置によって投与することができ、それらはすべて当業者には周知である。
本発明の実施に適した市販の装置のいくつかの具体例は、Ultravent nebulizer（ Mallinckrodt, Inc., St. Louis, Missouri製造）、 Acorn II nebulizer（Marquest Medical Products, Englewood, Colorado製造）、Ventolin metered dose inhaler（Glaxo Inc., Research Triangle Park, North Carolina製造）、Spinhaler powder inhaler（Fisons Corp., Bedford, Massachusetts製造）、 Inhale Therapeutic Systems, Inc., San Carlos, Californiaの「スタンディングクラウド」 装置、AIR inhaler（Alkermes, Cambridge, Massachusetts製造）および AERx pulmonary drug delivery system（Aradigm Corporation, Hayward, California製造）である。
【００９９】
本発明およびPCT/DK00/00471に係る発明の医薬組成物は、他の治療剤と共に投与できる。これらの剤は、同じ医薬組成物の一部として含まれることができ、または、本発明のIFNB分子とは別に、同時にまたは他の許容される処置計画に従って、投与することもできる。さらに、本発明の分子または医薬組成物は、他の治療の補助剤（アドジャンクト）として使用することができる。
従って本発明は、ほとんどのタイプのウィルス感染、癌または腫瘍または腫瘍性血管新生、クローン病、潰瘍性大腸炎、ギランバレー症候群、神経膠腫、特発性肺繊維症、細胞増殖異常、を治療するための、または適した動物、好ましくは哺乳類、特にヒト、における免疫調節のための、方法および組成物を提供する。例えば、本発明またはPCT/DK00/00471に係る発明の分子または組成物は、骨肉腫、基底細胞癌、卵巣癌、子宮頚部異形成、子宮癌、喉頭乳頭腫症、菌状息肉腫、神経膠腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、ホジキン病、黒色腫、肺癌、非小細胞肺癌、悪性黒色腫（免疫賦活、後期、および予防的）、カルチノイド腫瘍、B細胞リンパ腫、T細胞リンパ腫、濾胞リンパ腫、カポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、再発性表在性膀胱癌、直腸癌、有毛細胞白血病、およびパピローマウィルス、ウィルス性肝炎、陰部ヘルペス、帯状疱疹、疱疹性角膜炎、単純疱疹、ウィルス性脳炎、サイトメガロウィルス肺炎、ライノウィルス慢性持続性肝炎、慢性活動性HCV（タイプI）、慢性活動性HCV（タイプII並びに慢性B型肝炎、のようなウィルス感染の処置に使用され得る。
【０１００】
これに関係して、PCT/DK00/00471による結合体または本発明の変異体は、単剤治療でまたはシラタビンと組み合わせてCMLに、単剤治療でまたはドキソルビシンに基づく治療法と組み合わせてB細胞リンパ腫に、CHOP様治療法の添加剤として濾胞リンパ腫治療に、単剤治療でまたはリバビリンと組み合わせてC型肝炎に、単剤治療でまたはVBMCP、BCNU、もしくはVBMCP + HiCyと組み合わせて多発性骨髄腫に、または単剤治療でまたはビンブラスチン、フロクスリジン、5-フルオルウラシルまたはIL-10と組み合わせて腎臓癌に、使用され得る。
特に、本発明の分子または組成物は多発性硬化症（MS）、例えば一般的に認識される4つのタイプのMSのいずれか（良性、再発寛解型MS（RRMS）、一次進行型MS（PPMS）および二次進行型MS （SPMS）、および単一症候性MS）、癌または腫瘍、肝炎、例えばB型肝炎およびC型肝炎、またはヘルペス感染に使用され得る（後者の処置は任意にIL-10処置と組み合わせることができる）。
【０１０１】
さらなる局面において本発明は、AvonexTMまたはRebif（登録商標）のようなIFNB1aまたはBetaseron（登録商標）のような1bに対する循環抗体を有する哺乳類を処置する方法に関し、その方法は、該抗体との反応が減少しているかまたは反応しない本発明の変異体の投与を含む。その化合物は効果的な量で投与される。哺乳類は好ましくはヒトである。処置される哺乳類は、インターフェロンβが有用な処置である上記の疾患のいずれかに苦しむものであろう。特に、本発明のこの局面は、多発性硬化症（上記のタイプのいずれか）、肝炎または癌の処置に重要である。さらに、本発明は、AvonexTMまたはRebif（登録商標）のようなIFNB1aまたはBetaseron（登録商標）のような1bに対する循環抗体を有する哺乳類を処置するのに使用される医薬製品を製造する方法に関し、そこでは、そのような循環抗体との反応が減少しているかまたは反応しない（例えば反応が少なくとも25%まで、例えば50%まで、かつ好ましくは75%まで、例えば約100%（即ち反応しない）減少している）本発明の変異体は、注射可能なまたは他の適した製剤へと上記記載のように製剤化される。「循環抗体」なる用語は、抗体、特に市販のIFNB調製物のいずれか（Rebif、Betaseron、Avonex）を処置されたことに反応して哺乳類中で生成する中和抗体、を意味する。
【０１０２】
さらなる局面において本発明は、IFNBの治療上有益な性質の少なくともいくつかを有する医薬組成物を処置する必要のある患者（例えばIFNBにより処置可能な本明細書記載の疾患のいずれかに苦しむ患者）を処置する方法に関し、該処置は本発明の変異体を含有する組成物の投与を含み、かつ現在の市販のIFNB製品による処置と比較して有害な心理的効果が減少しているかまたは除去されている。さらなる局面において、本発明はこのような処置に有用な医薬組成物に関する。
本発明のポリペプチド変異体をコードするヌクレオチド配列の、遺伝子治療適用での使用もまた考えられる。特に、「グリコシル化の増大した変異体」または「特定のアミノ酸置換をうけた変異体」または「融合タンパク質である変異体」と題される上記の節に記載されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を使用することは重要であろう。ポリペプチドのグリコシル化は従って遺伝子治療の経過中、すなわちヒト体内でのヌクレオチド配列の発現の後、になされる。
【０１０３】
考えられる遺伝子治療適用には、その抗ウィスル活性のためポリペプチドが効果的な治療を提供することが期待されるそれらの疾患、例えばC型肝炎のような肝炎および特にHPVを含むウィルス性疾患、または他のIFNB応答性感染性疾患またはIFNB感受性のある感染性病原体、の処置が含まれる。さらに、本発明の結合体またはポリペプチドは、慢性炎症性脱髄性多発根神経炎および重症壊死性皮膚障害の処置に使用され得る。また、いずれのタイプのMSの処置と関係する遺伝子治療も考えられる。同様に、本発明は、免疫調節のため、およびその抗増殖活性のためIFNBが効果的な治療を提供することが期待されるそれらの疾患、例えば腫瘍および癌、または再狭窄のように望ましくない細胞増殖に特徴づけられる他の状態、の治療における遺伝子治療適用を意図する。このような遺伝子治療はWO 95/25170にさらに記載されている。
遺伝子治療を用いるIFNBの局所送達は、非特異的投与に関して可能性のある毒性問題を回避しつつ、目標領域に治療剤を提供できる。
インビトロおよびインビボの両者の遺伝子治療方法論が考えられる。
【０１０４】
治療上利用可能な遺伝子を規定された細胞集団に移入するいくつかの方法が知られている。さらなる参考として、例えばMulligan, ″The Basic Science Of Gene Therapy″, Science, 260, pp. 926-31 (1993)を参照されたい。これらの方法は以下のものを含む：
直接的遺伝子移入（例えばWolff et al., ″Direct Gene transfer Into Mouse Muscle In vivo″, Science 247, pp. 1465-68 (1990)により開示されている）；
リポソーム仲介DNA移入（例えばCaplen et al., ″Liposome-mediated CFTR Gene Transfer to the Nasal Epithelium Of Patients With Cystic Fibrosis″ Nature Med., 3, pp. 39-46 (1995)、Crystal, ″The Gene As A Drug″, Nature Med., 1, pp.- 15-17 (1995)、Gao and Huang, ″A Novel Cationic Liposome Reagent For Efficient Transfection of Mammalian Cells″, Biochem.Biophys Res. Comm., 179, pp. 280-85 (1991)により開示されている）；
レトロウィルス仲介DNA移入（例えばKay et al., ″In vivo Gene Therapy of Hemophilia B: Sustained Partial Correction In Factor IX-Deficient Dogs″, Science, 262, pp. 117-19 (1993)、Anderson, ″Human Gene Therapy″, Science, 256, pp.808-13(1992)により開示されている）；
DNAウィスル仲介DNA移入。このようなDNAウィルスには、アデノウィルス（好ましくはAd-2またはAd-5に基づくベクター）、ヘルペスウィルス（好ましくは単純疱疹ウイルスに基づくベクター）、およびパルボウィルス（好ましくは「欠陥」または非自律性パルボウィルスに基づくベクター、より好ましくはアデノ関連ウィルスに基づくベクター、さらに好ましくはAAV-2に基づくベクター）。例えばAli et al., ″The Use Of DNA Viruses as Vectors for Gene Therapy″, Gene Therapy, 1, pp. 367-84 (1994)、US 4,797,368、およびUS 5,139,941を参照されたい。
本発明はさらに以下の例に記載される。この例は、いかなる方法によっても、本明細書および特許請求の範囲の一般性を限定するように解されるべきではない。
【実施例】
【０１０５】
この項は、PCT/DK00/00471に関連する記載事項の一部、および本発明に関連する記載事項に相当する。
材料
HeLa 細胞  (American Type Culture Collection (ATCC)から入手）
ISRE-Luc (Stratagene, La Jolla USA)
pCDNA 3.1/hygro (Invitrogen, Carlsbad USA)
pGL3基本ベクター (Promega)
ヒトゲノムDNA (CloneTech, USA)
DMEM培地：Dulbecco's 改変イーグル培地 (DMEM), 10% ウシ胎児血清 (Life Technologies A/S, Copenhagen, Denmarkから入手)
【０１０６】
アッセイ
インターフェロンアッセイの概略
IFNBはHeLa細胞上のI型インターフェロン受容体と相互作用しそれを活性化することが報告されている。従って、インターフェロン刺激応答要素（ISRE）を含むプロモーターにおいてその転写は活性化される。よって、HeLa細胞に位置するISREカップリングルシフェラーゼ受容体遺伝子（ISRE-luc）を使用することで、インターフェロン受容体のアゴニストをスクリーニングすることができる。
【０１０７】
一次アッセイ
HeLa細胞をISRE-LucおよびpCDNA 3.1/hygroで同時トランスフェクトし、ハイグロマイシンBを含有するDMEM培地にて選択することで点（細胞クローン）が作成される。IFNBの存在または不存在下に細胞クローンをルシフェラーゼ活性についてスクリーニングする。ルシフェラーゼ刺激活性の非刺激活性に対する比率が最も高い細胞クローンを以後のアッセイに使用する。
ムテインをスクリーニングするため、96ウエル培養プレートに15,000細胞/ウエルを播種し、DEME培地にて一晩インキュベートする。その翌日、細胞に種々の濃度のムテインおよび既知標品を加える。プレートを5% CO2雰囲気下に37℃にて6時間インキュベートし、次いでLucLite基質 (Packard Bioscience, Groningen The Netherlands )を各ウエルに加える。プレートをシールし、SPC（単一光子計数）モードにてTopCount照度計(Packard)で蛍光を測定する。個々のプレートには、刺激対照としてIFNBとともにインキュベートされるウエル、および非刺激対照として通常培地を含有する他のウエルを含んでいる。刺激および非刺激ルシフェラーゼ活性間の比率は、ムテイン活性および実験間変動の両者についての内部基準として役立つ。
【０１０８】
二次アッセイ
現在、18個の非アレルインターフェロンα遺伝子と1個のIFNB遺伝子が存在する。これらのタンパク質は重複した活性を有し、よってムテインがIFNBの選択性と特異性とを保持していることを確認することが重要である。
β-R1遺伝子はIFNBによって活性化されるが、他のインターフェロンによっては活性化されない。従って、β-R1の転写はIFNB活性の第２のマーカーとして役立ち、ムテインがIFNB活性を保持していることを確認するのに使用される。インターフェロン感受性転写を行うことが示されているβ-R1の300bpプロモーター断片(Rani. M.R. et al (1996) JBC 271 22878-22884 )がヒトゲノムDNAからPCRにより単離され、それはpGL3基本ベクター(Promega)に挿入されている。得られたβ-R1:ルシフェラーゼ遺伝子を、上記の一次アッセイに類似したアッセイに使用する。星細胞腫において、得られたβ-R1:ルシフェラーゼ遺伝子は、IFNBに対する感受性がインターフェロンαに対するよりも250倍高いことが記載されている(Rani et al.前掲)。
【０１０９】
ELISAアッセイ
IFNBの濃度は市販のサンドイッチ免疫検定(PBL Biomedical Laboratories, New Brunswick, NJ, USA)を使用して計量される。このキットは、被検試料中のIFN-βを補足し検出するためのモノクローナルマウス抗-IFN-β抗体を使用するELISAを基本としている。この検出抗体はビオチンと結合されている。
被検試料および組換えヒトIFN-β標品0.1 mLを10-0.25 ng/mLの濃度でマイクロタイタープレートに加え、補足抗体で前コートする。プレートを室温で1時間インキュベートする。試料および標品をキットの希釈緩衝液で希釈する。
平板をキット緩衝液で洗浄し、ビオチン化検出抗体0.1 mLとともに室温で1時間インキュベートする。さらに洗浄した後、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体0.1 mLを加え、室温で1時間インキュベートする。
0.1 mLテトラメチルベンジジン（TMB）基質色素原を加え、反応を視覚化する。プレートを室温暗所にて15分間インキュベートし、停止溶液を加えて反応を停止させる。ELISAリーダーにより450nmの吸光度を読む。
【０１１０】
受容体結合アッセイ
本発明のポリペプチドまたは結合体の受容体結合能は、「受容体結合に関するIFN-β(Phe101)の分析」と題するWO 95/25170（ここではDaudiまたはA549細胞を基本）に記載されているアッセイによって測定できる。IFNAR1およびIFNAR2の可溶性ドメインは、Arduini et al, Protein Science, 1999, vol. 8, 1867-1877または本明細書の実施例９に本質的に記載されているようにして得ることができる。
あるいは、受容体結合能は、Pierce, Rockford, IL, USAから市販されているジスクシンイミジル基質（DSS）のような架橋剤を使用することにより以下のようにして測定される：
製造元の教示に従い、DSSの存在または不存在下に、ポリペプチドまたは結合体を可溶性IFNAR-2受容体とともにインキュベートする。SDS-PAGEによって試料を分離し、抗-IFNBまたは抗-IFNAR2抗体を使用するウエスターンブロットを行う。機能的IFNBポリペプチド/結合体：受容体の相互作用の存在は、DSS存在下の受容体およびIFNBの分子サイズの増大により明らかになる。
だらに、本発明のポリペプチドまたは結合体と両受容体サブユニット（IFNAR-1およびIFNAR-2）を使用する架橋アッセイにより、インターフェロン受容体１結合能を確立できる。これに関連し、インターフェロンβ：IFNAR-2複合体が形成された後でのみ、IFNAR-1は結合することが記載されている(Mogensen et al., Journal of Interferon and Cytokine Research, 19:1069-1098, 1999)。
【０１１１】
インターフェロンβ結合体のインビトロ免疫原性試験
本発明の結合体またはポリペプチドの免疫原性の減少は、ELISA法により対照分子または調製物に対する結合体またはポリペプチドの免疫反応を測定することにより測定される。対照分子または調製物は通常、組換えヒトIFNB調製物、例えばAvonex、RebifもしくはBetaseron、またはこれらの産物の作成法と同じ方法によって調製される別の組換えヒトIFNB調製物である。ELISA法は、これら組換えIFNB調製物のうちの１つで処置された患者由来の抗体を基本とする。免疫原性は、本発明の結合体またはポリペプチドが、対照分子または調製物よりも本アッセイにおいて統計的に有意に低下して応答する場合、減少していると考える。
免疫原性を測定する別の方法は、Ross et al. J. Clin Invest. 95, 1974-78, 1995に記載されているのと同様の方法にIFNB（即ち市販されているIFNB製品）で処置された患者由来の血清を使用することに基づく。抗ウイルス中和バイオアッセイでは、免疫原性の減少により、患者血清による本発明結合体の阻害が野生型IFNB対照分子と比較して減少される。さらに、生物化学IFN結合アッセイでは、免疫原性が低下している結合体は、対照IFNB分子よりも低い程度でしか患者IgGと結合しないと期待される。
中和アッセイでは、抗ウイルス中和バイオアッセイにおいて約80%のウイルス防護を与える濃度の対照および結合体分子を加える。IFNBタンパク質は種々の希釈度の患者血清（1：20から開始）と混合する。
【０１１２】
抗ウイルス活性
抗ウイルスバイオアッセイは、A549細胞 (CCL 185, American tissue culture collection)および脳心筋炎(EMC)ウイルス (VR-129B, American tissue culture collection)を使用して行う。
濃度10,000細胞/ウエルにて細胞を９６ウエル組織培養プレートに播種し、5% CO2雰囲気下、37℃にてインキュベートする。ウシ胎児血清および抗生物質を含有するDMEM培地全100μl中、100-0.0001 IU/mLの濃度の本発明ポリペプチドまたは結合体を加える。
24時間後、培地を除去し、EMCウイルスを含有する新鮮な培地0.1 mLを各ウエルに加える。EMCウイルスは、IFN-β不含細胞培地において100％細胞死を24時間後にもたらす濃度で加える。
さらに24時間後、ポリペプチドまたは結合体の抗ウイルス効果をWST-1アッセイにより測定する。0.01 mL WST-1 (WST-1細胞増殖剤, Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany)を0.1 mL培地に加え、5% CO2雰囲気下、37℃にて0.5-2時間インキュベートする。生細胞においてミトコンドリア・デヒドロゲナーゼによりテトラゾリウム塩WST-1が開裂され、ホルマゾンが形成され、これは450 nmにおける吸光度を測定することにより定量される。
【０１１３】
インターフェロン刺激応答要素（ISRE）における活性の中和アッセイ
抗-IFNB血清のIFNB中和効果はISRE-ルシフェラーゼ活性アッセイにより分析される。
IFNB処置患者または免疫動物由来の血清を使用する。血清は、固定濃度(希釈率 1:20-1:500 (患者血清)もしくは20-600 ng/mL (動物血清))、または1/20 (患者血清)もしくは600 ng/mL (動物血清)から開始する血清の5倍連続希釈のいずれかで加える。IFNBは、DMEM培地 + 10% FCSの総容量80μl中、25.000 IU/mL から開始する5倍希釈または固定濃度 (0.1-10 IU/mL)のいずれかで加える。血清をIFN-βとともに37℃にて1時間インキュベートする。
次いで、ISRE-LucでトランスフェクトしたHeLa細胞をDMEM培地にて24時間前から増殖させ（15,000細胞/ウエル）、それを含む97ウエル組織培養プレートに試料を移す。培養物を5% CO2雰囲気下、37℃にて6時間インキュベートする。次に、LucLite基質 (Packard Bioscience, Groningen, The Netherlands)を各ウエルに加える。プレートをシールし、SPC（単一光子計数）モードにてTopCount照度計(Packard)で蛍光を測定する。
固定容量の血清存在下にIFNB試料を滴定する場合、中和効果は、EC50(w. 血清)/EC50 (w/o 血清)として数量化されるフォールド阻害（FI）と規定されている。IFNB変異型タンパク質の抗体中和の減少は次のように規定される：
【数１】
2004534523.tif 000002
【０１１４】
PEG-IFNB結合体またはグリコシル化IFNB変異体の生物学的半減期測定
生物学的半減期の測定は、文献記載の多くの手法により行うことができる。１つの方法は、Munafo et al (European Journal of Neurology 1998, vol 5 No2 p 187-193)に記載され、彼らはELISA法を使用して、IFNBの皮下および筋肉内投与後のIFNB血清レベルを検出した。
静脈内投与後にIFNB血清濃度が迅速に減少することは、IFNB処置に対する生物学的応答の評価が重要であることを示している。しかし、本発明の結合体は、静脈内投与後であっても血清半減期が長期化すると考えられ、それにより例えばELISA法または一次スクリーニングアッセイによって測定可能となっている。
種々の薬物動態学マーカー、例えば血清ニュープテリン（neupterin）およびβ２ミクログロブリンも研究されている(Clin Drug Invest (1999) 18(1):27-34)。これらは同様に、長期化した生物効果を評価するのに使用できるであろう。これらの実験はまた、適当な動物種、例えばラットにおいて実施できる。
抗ウイルス、抗増殖および免疫調整効果などのIFNBの生物効果を評価するアッセイ（例えばAnnals of Neurology 1995 vol 37 No 1 p 7-15に記載されているような）は、本明細書に記載している一次および二次スクリーニングアッセイとともに、野生型IFNBと比較した本発明結合体の生物効果の評価に使用できる。
【０１１５】
最後に、広く使用されている自己免疫脳脊髄炎（EAE）実験モデルのような動物モデルは、本発明の結合体またはポリペプチドの効能を確立するのに使用できる。EAEモデルでは、ミエリンまたはミエリン誘導化タンパク質による免疫により、ヒトにおける多発性硬化症の炎症および神経性の多くの特徴を模擬する疾患が誘発される。EAEは、マウス、ラット、ウサギおよびマモセットにおいて使用されている（Cannella et al. PNAS, 95, 10100-5, 1998; Zaprianova. et al. Morfologiia, 112, 25-8, 1997; Hassouna al. J.Urology, 130, 806-10, 1983; Genain & Hauser J. Mol. Med. 75, 187-97,1997）。他のモデルには、Theilerマウス脳脊髄炎ウイルス（TMEV）モデルがあり（Murray et al. J.Neurosci. 18, 7306-14, 1998）、これもIFNB結合体の効能確立に使用されよう。
【０１１６】
接触可能表面積（ASA）
コンピューター・プログラム・アクセス(B. Lee and F.M.Richards,  J. Mol.Biol. 55: 379-400 (1971))バージョン２(Copyright (c) 1983 Yale University)を使用し、構造物内の個々の原子の接触可能表面積（accessible surface area）が計算される。この方法は通常、プローブサイズ1.4Å（オングストローム）を使用し、接触可能表面積（ASA）をプローブ中心から形成される領域として規定する。この計算の前に、この座標の組からすべての水分子とすべての水素原子を、これら他の分子はタンパク質に直接関連していないので、除去する。ASAの計算には他のプログラムも利用でき、例えばWWW interface on http://swift.embl-heidelberg.de/servers2/ (R.Rodriguez et.al. CABIOS (1998) 14, 523-528.)から電子情報として利用可能な、接触分子表面を形成するためのアクセスオプションを使用するプログラムWhatIf G.Vriend, J. Mol. Graph. (1990) 8, 52-56がある。
【０１１７】
側鎖の分画ASA
側鎖原子の分画ASAは、側鎖内原子のASAの総和を、伸張ALA-x-ALAトリペプチドにおける残基タイプの側鎖原子のASA値で割ることにより計算される。Hubbard, Campbell & Thornton (1991) J.Mol.Biol.220,507-530を参照。この例としては、CA原子はグリシン残基の側鎖の一部と見なされるが、残りの残基でない。次の表に、側鎖の100％ASA標準を示す。
【０１１８】
【表１】
2004534523.tif 000003
【０１１９】
表面露出しているアミノ酸残基の決定
2.2Å解像度のヒトIFNBIの三次元結晶構造(Karpusas et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA (1997) 94:11813-11818)は、Protein Data Bank (PDB) (Bernstein et.al. J. Mol. Biol. (1977) 112 pp. 535)から利用可能であり、受託コード1AU1のもとThe Research Collaboratory for Structural Bioinformatics PDB（http://www.pdb.org/）を介して電子情報が入手できる。この結晶構造には２つの別個のヒトIFNB分子が含まれており、ここでの例では分子Aを使用している。
【０１２０】
表面暴露：
上記WhatIfプログラムを使用し、以下の残基を見つけだし、側鎖原子に対する表面アクセスは「０」とした：  G7, N14, C17, L21, I44, A55, A56, T58, I59, M62, L63, L98, L122, Y125, I129, L133, A142, W143, V146, I150, N153, I157, L160, T161, および L164。
【０１２１】
分画表面暴露：
さらに分析を行うには、立体的障害のため、残基：R71, R113, K115, L116, M117の側鎖をリモデリング（remodelling）しなければならなかった。このリモデリングはModeler 98, MSI INCを用いて行った。レモデリングされたIFNB分子に対してアクセス・コンピューター・プログラムを使用し、分画ASAを計算すると（アミノ酸残基のみであり、N-連結糖部分を排除）、25%以上の側鎖が表面に暴露されている以下の残基が得られた：S2, N4, L5, F8, L9, R11, S12, F15, Q16 Q18, K19, W22, Q23, G26, R27, L28, E29, Y30, L32, K33, R35, M36, N37, D39, E42, K45, Q46, L47, Q48, Q49, Q51, K52, Q64, A68, R71, Q72, D73, S75, S76, G78, N80, E81, T82, E85, N86, A89, Y92, H93, N96, H97, K99, T100, E103, E104, K105, E107, K108, E109, D110, F111, R113, G114, K115, L116, S119, L120, H121, K123, R124, G127, R128, L130, H131, K134, A135, K136, E137, Y138, S139, H140, V148, R152, Y155, N158, G162, Y163, R165,およびN166、また50%以上の側鎖が表面に暴露されている以下の残基が得られた：N4, L5, F8, S12, F15, Q16, K19, W22, G26, R27, E29, Y30, K33, R35, N37, D39, E42, Q46, Q48, Q49, Q51, K52, R71, D73, S75, G78, N80, E81, T82, E85, N86, A89, Y92, H93, K99, T100, E103, E104, E107, K108, D110, F111, L116, K123, R124, G127, H131, K134, E137, V148, Y155, R165, およびN166。
【０１２２】
実施例１（= PCT/DK00/00471の実施例１）
哺乳動物および昆虫細胞におけるIFNB発現のための発現カセットの構築
天然のシグナルペプチドを伴うヒトIFNBをコードする全長ｃDNAを含むDNA配列（GenBank受託番号M28622；配列番号：１に記載）を、哺乳動物細胞において高発現するよう修飾した。まず、Kozak保存配列（Kozak, M. J Mol Biol 1987 Aug 20;196(4):947-50）に従い、ATG開始コドンコンテキストを修飾し、ATG開始コドンの上流にある保存配列に完全に適合するようにした。次いで、天然のヒトIFNBのコドンを修飾し、高度に発現されるヒト遺伝子に頻繁に使用されるコドンに適合するコドン使用頻度に偏向させた。次に、配列中の特定のヌクレオチドを他のものと置換し、DNA制限エンドヌクレアーゼの認識部位を導入した（これにより、以後のDNA配列の修飾が容易になる）。遺伝子を合成するようにしてプライマーを構築した：
【０１２３】
2004534523.tif 000004
【０１２４】
Platinum Pfx-ポリメラーゼキット（Life Technologies）を使用するワンステップPCRおよび標準的な三工程PCRサイクリングパラメーターにより、プライマーを組合せて合成遺伝子とした。同じ条件のPCRにより、組立てた遺伝子を増幅した。
CBProFpr1から14プライマーを以下のプライマーに置き換える以外は上記のPCR条件と同じ条件により、ヒトIFNBのN-末端延長型をコードするcDNAを合成し、IFNB分子に精製TAGを導入した：
2004534523.tif 000005
【０１２５】
合成遺伝子をpcDNA3.1/Hygro (Invitrogen)の5'末端のHindIII部位と3'末端のBamHIとの間にクローニングし、pCBProF1およびpCBProF2を得た。
上記の標準的なPCR条件と以下のプライマー：
2004534523.tif 000006
を使用して、pCI-Neo (Promega)由来の合成イントロンを増幅し、332 bp PCR断片を得、これをNheI および HindIIIで切断してプラスミドpCBProF1 and pCBProF2の5'UTRに挿入し、pCBProF4 および pCBProF5を調製した。
【０１２６】
典型的なクローニング手法により配列中のPCR導入改変は発現プラスミドに導入できるので、コード領域の適当な領域をPCRにより増幅し、個々のアミノ酸のコドンを改変した。例えば、プライマー：
2004534523.tif 000007
を使用し、pCBProF1の1055から1243位の領域をまたぐPCR断片にK45R置換を導入した。PCR断片およびpCBProF1の両者を、NarI および BsiWI（ともに唯一である）で切断した。PCR断片およびpCBProF1のベクター骨格を精製し、連結し、pCBProF1中、Lys45 コドン AAGをArg コドン CGCと置換した。
さらに、SOE（配列オーバーハング伸張）PCRを使用し、アミノ酸置換を導入した。SOE-PCRでは、INFB分子のN-末端およびC-末端の両部分をまず、個々に一次PCRによって増幅した。
【０１２７】
これらの一次PCRでは、中央相補的プライマーを合成し、置換するべきアミノ酸のコドンを所望のコドンに改変する。末端プライマーはそれぞれ、INFβ分子のN-およびC-末端を規定する標準的なプライマーであった。末端プライマーはさらに、全長PCR産物を以後にクローニングできる制限酵素部位を与えるものであった。従って、これらの中央（ナンセンス）プライマーおよびN-末端（センス）プライマーを使用することにより、一次PCRの一方においてINFβコード領域のN-末端部分が、そして同じくC-末端部分が増幅された。増幅されれば、N-およびC-末端部分は二次PCRにて全長産物にまで組立てられ、それは上記のようにしてpCDNA3.1/Hygroの修飾型にクローニングされる。例えば、以下のプライマーを使用し、F111N および R113T置換の突然変異を導入した：
2004534523.tif 000008
また、導入した突然変異が、発現プラスミドの唯一の制限エンドヌクレアーゼ部位に十分に近接している場合は、変異型遺伝子は、単一PCR工程と以後のクローニングを包含する構築操作により構築される。例えば、K19R置換は、PCR primer:
CBProFpr58:
GAGGAGTTCGAACTTCCAGTGCCAGCGCCTCCTGTGGCAGCTGAACG, および CBProFprimer9:を使用することにより導入された。
次いで、PCR産物を制限エンドヌクレアーゼ部位BsiWI および BstBIを使用してクローニングした。
【０１２８】
実施例２（= PCT/DK00/00471の実施例５）
１つのグリコシル化部位が導入されたIFNB変異体の構築と発現
hINF-βの111位に過剰のN-連結グリコシル化部位を挿入するため、hINF-βをコードする合成遺伝子（hinf-β）（実施例１に記載）を部位特異的PCR突然変異によって改変した。BIO-X-ACT (Bioline, UK) およびプラスミドPF050 [hinf-β)/pcDNA3.1(-)Hygro/Intron (ベクターのMCS内のBamHIおよびNheI部位間にpCI-neo (Promega, USA) から得られるキメライントロンが挿入されているpcDNA3.1(-)Hygroの誘導体(Invitrogen, USA)]を鋳型として使用し、以下の２つの重複プライマーの組を使用して２つのPCR反応を行い：CB41 (5'-TTTAAACTGGATCCAGCCACCATGACCAACAAG-3')
/CB55 (5'-CGGCCATAGTAGCGCTTCAGGTGCAGGGAGCTCATCAGCTTGCCGGTGGTGTTGTCCTCCTTC-3') および CB42 / CB86 (5'-GAAGGAGGACAACACCACCGGCAAGCTGATGAGCTCCCTGCACCTGAAGCGCTACTATGGCC G-3')、それぞれ446および184塩基対の２つの断片を得た。これら２つの断片をフランキングプライマーCB41 および CB42を用いて第３のPCRにて結合した。得られた遺伝子を哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(-)Hygro/Intronに挿入し、DNA配列決定により、hINF-β内のF111N および R113T置換を導く正しい塩基改変を有していることを確認した（PF085と称されるプラスミド）。
【０１２９】
[F111N+ R113T]hINF-β変異体の活性を試験するため、トランスフェクション剤としてリポフェクタミン2000（Life Technologies, USA）を使用してPF085をCHO K1 細胞系統 (ATCC #CCL-61)にトランスフェクトした。24時間後、培養培地を収獲し、INF-β活性/濃度について検定した：
2004534523.tif 000009
このように、[F111N+ R113T]hINF-β変異体は、野生型hINF-βの比活性のおよそ2倍という、非常に高い比活性を有している。
【０１３０】
実施例３（= PCT/DK00/00471の実施例６）
別のグリコシル化部位が導入されているIFNBの構築と発現 [Q49N+Q51T]
実施例５において記載しているのと同様にして、Q49N および Q51T置換によって過剰N-連結グリコシル化部位を49位に挿入した。PF043 (hinf-β/pcDNA3.1 (Invitrogen, USA))を鋳型として使用し、以下の２つの重複プライマーの組を使用して２つのPCR反応を行い：[PBR7] /PBR78 (5'- GGCGTCCTCCTTGGTGAAGTTCTGCAGCTG-3') および PBR8 (5'- ATATATCCCAAGCTTTTATCAGTTGCGCAGGTAGCCGGT-3') /PBR77 (5'- CAGCTGCAGAACTTCACCAAGGAGGACGCC-3')、それぞれ228および369塩基対の２つの断片を得た。これら２つの断片をフランキングプライマーPBR7 および PBR8を用いて第３のPCRにて結合した。得られた遺伝子を哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(-)Hygro/Intronに挿入し、DNA配列決定により、[Q49N,Q51T]hINF-βを導く正しい塩基改変を有していることを確認した（PF104と称されるプラスミド）。
【０１３１】
[Q49N+Q51T]hINF-β変異体の活性を試験するため、トランスフェクション剤としてリポフェクタミン2000（Life Technologies, USA）を使用してPF104をCHO K1 細胞系統にトランスフェクトした。24時間後、培養培地を収獲し、INF-β活性/濃度について検定した：
2004534523.tif 000010
このように、[Q49N+Q51T]hINF -β変異体は高い比活性を有している。これは、ELISAに使用したモノクローナル抗体の１つが低く認識したことによるのかもしれない。
【０１３２】
実施例４（= PCT/DK00/00471の実施例７）
２つのグリコシル化部位が導入されているIFNBの構築と発現
実施例５および６に記載している付加的なグリコシル化部位をQ49N, Q51T, F111N, および R113T置換によってヒトIFNBに導入した。
PF085 (実施例５に記載を鋳型として使用し、以下の２つの重複プライマーの組を使用して２つのPCR反応を行い：PBR89 (5'CGCGGATCCAGCCACCATGACCAACAAGTGCCTG)/ PBR78 および PBR8/PBR77、それぞれ228および369塩基対の２つの断片を得た。
これら２つの断片をフランキングプライマーPBR89 および PBR8を用いて第３のPCRにて結合した。得られた遺伝子を哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(-)Hygro/Intronに挿入し、配列決定により、[Q49N, Q51T, F111N, R113T] hINF-βを導く正しい塩基改変を有していることを確認した（PF123と称されるプラスミド）。
【０１３３】
トランスフェクション剤としてFugene 6 (Roche)を使用してPF123をCHO K1 細胞にトランスフェクトした。24時間後、培養培地を収獲し、INF-β活性/濃度について検定した：
2004534523.tif 000011
このように、[Q49N+Q51T+ F111N+ R113T]hINF-β変異体も高い比活性を有している。
この変異体は、材料および方法の項に記載している受容体結合アッセイ（架橋剤DSSの使用に基づく）において受容体結合活性を有していることが見出された。
【０１３４】
実施例５（PCT/DK00/00471の実施例８を基本）
[Q49N+ Q51T+ F111N+ R113T]IFNBグリコシル化変異体の回転容器における調製
1700 cm2の拡張表面を有する２つの回転容器(Corning, USA)中、10% FBS およびペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を添加したDMEM/F-12 培地 (LifeTechnologies; Cat. # 31330) 200 mlに [Q49N+Q51T+F111N+R113T]グリコシル化変異体を産生するCHO K1サブクローン(5/G-10)を播種した。2日後、培地を交換した。さらに2日後では、２つの回転容器ともに100％近くの全面成長を示し、そこで培地を変更し、1/500 EX-CYTE (Serologicals Proteins; Cat. # 81129N) およびP/Sを添加した血清不含のUltraCHO培地(BioWhittaker; Cat. # 12-724) 300 mlとした。この培地で細胞を発育させると、血清を含有する培地での発育で得られるものより細胞塊が高度に促進され、高度になる。2日後、培地を新しくした。さらに2日後、培地を変更し、1/100 ITSA (Life Technologies; Cat. # 51300-044) [ITSAはインスリン (1.0 g/L)  トランスフェリン (0.55 g/L)  セレニウム (0.67 mg/L)が添加された接着培養を意味する], 1/500 EC-CYTE およびP/Sが添加された生産培地：DMEM/F-12培地(Life Technologies; Cat. # 21041)とした。２つの回転容器から収獲した培地をプールし、次いでIFNB活性の測定の際に培地試料を採取した。
【０１３５】
実施例６（PCT/DK00/00471の実施例９）
IFNB変異体K19R+ K45R+ K123Rの調製、精製とPEG化
IFNB変異体K19R+ K45R+ K123Rを含有する血清不含培地100mlを最終的に得るため、３つのT-175フラスコに10% FBS +グルタミンおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM 培地 (Life technologies; Cat. # 21969-035)のCOS-7細胞を播種した。トランスフェクション当日（100％近くの全面成長）、トランスフェクションの4-5時間前に培地を新鮮な培地30mlに新しくした。トランスフェクションの準備のため、添加剤を加えていないDMEM培地1890μlを14mlポリプロピレンチューブ(Corning)に等分した。この培地にFugene 6 (Roche) 210μlを直接加え、室温にて5分間インキュベートした。別に、プラスミドDNA([K19R, K45R, K123R]INF-β/pcDNA3.1(-)Hygro; PF #161)168μgを別の14mlポリプロピレンチューブ(Corning)に等分した。インキュベートの5分後、Fugene 6ミックスをDNA溶液に直接加え、室温にて15分間インキュベートした。インキュベート後、その約700μlを３つの細胞培地にそれぞれ滴加した。
翌日、トランスフェクション培地を血清不含の生産培地35mlと置き換えた。この血清不含培地は、グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン/ストレプトマイシン、1% ITSA (Life Technologies; Cat. # 51300-044), および0.2% Ex-Cyte (Serologicals Proteins; Cat. # 81-129)を添加したDMEM 培地medium (Life Technologies; Cat. # 31053-028)を基本としている。生産培地を加える前に、細胞層を、添加剤を含まないDMEM培地で2回洗浄した。
【０１３６】
IFNB変異体の精製とPEG化のため、トランスフェクションの3日後、血清不含培地100mlを収獲した。
pHを6.8に調整し、Milli Q水を用いて伝導率を＜ 10 mS/cmに調節した。次いで、得られたブロスを、緩衝液A(20 mM リン酸, 100 mM NaCl, pH 7)で前もって平衡化しておいたSP 550陽イオン交換樹脂(TosoHaas)１mlにバッチ吸着させた。2時間後逆さまにひっくり返し、樹脂を沈降させ、カラムに移した。樹脂を5カラム容量の緩衝液Aで洗浄し、緩衝液B(20 mM リン酸, 800 mM NaCl, pH 7) 2mlで溶出した。溶出液に5％エチレングリコールを加えた後、VivaSpin  (カットオフ 10 kDa)で500μlにまで濃縮した。濃縮物を最終容量2mlとして50 mM リン酸, 0.3 M NaCl, 20 % エチレングリコール, pH 8に調整し、さらに0.5mlに濃縮した。
最終濃縮物のPEG化は次のようにして行った：  最終濃縮物100μlに、リン酸緩衝液pH 8にて調製したばかりの活性化mPEG-SPA (5000 kDa, Shearwater, Alabama)25μlを加え、活性化PEGの終濃度を0, 5, 10, 25 または 50 mg/mlに調整した。室温にて30分間反応させた後、50mMグリシン緩衝液を添加して反応を停止させた。即座に試料を-80℃に冷凍し、記載のようにして生物活性を測定した（一次アッセイ）。各試料のウエスターンブロティングを行い、PEG化試料中に存在する非反応IFNB変異体の量を評価した。
得られた結果は、25mg活性化PEG/mlにて非PEG化IFNB変異体は存在していないことがウエスターンブロティングから判断され、対照試料（0 mg/ml活性化PEGで処理する以外は同じ処理）と比較して変異体はその生物活性の50％を保持していることを示している。
【０１３７】
実施例７
49位に炭水化物が多く付加している変異体
PCT/DK00/00471の実施例６に記載されているINFB変異体[Q49N, Q51T]の49位における挿入N-連結グリコシル化部位は約60％しか使用されていない。付加する炭水化物量を増大させるため、48位のグルタミン残基を部位特異的PCR突然変異法によってフェニルアラニン（Q48F）、バリン（Q48V）およびトリプトファン（Q48W）に改変した。BIO-X-ACT (Bioline, UK) および PF185（PF185はPF104と同じcDNA配列を含み、実施例６に記載されえちるが、Kozak配列が開始コドンATGの前に挿入されている）を鋳型として使用し、PCR反応を以下の重複プライマーの組を用いて行った：
2004534523.tif 000012
【０１３８】
断片をフランキングプライマーPBR89 および PBR8を用いてPCR反応にて組合わせた。得られた遺伝子を哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(-)Hygro/Intronに挿入し、配列決定により、それぞれ[Q48F, Q49N, Q51T]hINF-β（PF305と称されるプラスミド）、[Q48V, Q49N, Q51T]hINF-β(PF306と称されるプラスミド)、および[Q48W, Q49N, Q51T]hINF-β(PF307と称されるプラスミド)を導く正しい塩基改変を有していることを確認した。
PF305, PF306, PF307およびPF185（[Q49N, Q51T]hINF-βをコード）を、トランスフェクション剤としてFugene 6 (Roche)を使用してCHO K1 細胞にトランスフェクトした。24時間後、培養培地を収獲し、INF-β活性について検定した：
2004534523.tif 000013
【０１３９】
得られた３つの新しいグリコシル化変異体の炭水化物の付加量を評価するため、各レーンについて等量の活性とともにウエスターンブロティッングを行った（図１：レーン2, 3, 4, および 5）。図から分かるように、グリコシル化導入部位(Q49N, Q51T)の前にアミノ酸改変（Q48F, Q48V, Q48W）を導入するとすべて、完全グリコシル化物質の量を増大させている。
別の実験では、48位に特にチロシンを挿入すると、49位の挿入N-連結グリコシル化部位に付加する炭水化物の量が増大することが示された。
【０１４０】
実施例８
111位に炭水化物が多く付加している変異体
PCT/DK00/00471の実施例５に記載されているINFB変異体variant [F111N, R113T]の111位における挿入N-連結グリコシル化部位は約50％しか使用されていない。付加する炭水化物量を増大させるため、110位のアスパラギン酸残基を部位特異的PCR突然変異法によってフェニルアラニン（D110F）およびバリン（D110V）に改変した。BIO-X-ACT (Bioline, UK) および PF085（PCT/DK00/00471の実施例５に記載）を鋳型として使用し、PCR反応を以下の重複プライマーの組を用いて行った：
2004534523.tif 000014
【０１４１】
断片をフランキングプライマーPBR89 および PBR8を用いてPCR反応にて組合わせた。得られた遺伝子を哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1(-)Hygro/Intronに挿入し、配列決定により、それぞれ[D110F, F111N, R113T]hINF-β (PF308と称されるプラスミド)および[D110V, F111N, R113T]hINF-β (PF309と称されるプラスミド)を導く正しい塩基改変を有していることを確認した。
PF308, PF309 および PF085（[F111N, R113T]hINF-βをコード）を、トランスフェクション剤としてFugene 6 (Roche)を使用してCHO K1 細胞にトランスフェクトした。24時間後、培養培地を収獲し、INF-β活性について検定した：
2004534523.tif 000015
【０１４２】
得られた２つの新しいグリコシル化変異体の炭水化物の付加量を評価するため、各レーンについて等量の活性とともにウエスターンブロティッングを行った（図１：レーン7, 8, 9）。図から分かるように、グリコシル化導入部位(F111N, R113T)の前にアミノ酸改変（D110F および D110V）を導入するとともに、完全グリコシル化物質の量を増大させている。
別の実験では、110位に特にチロシンを挿入すると、111位の挿入N-連結グリコシル化部位に付加する炭水化物の量が増大することが示された。
【０１４３】
実施例９
IFNBポリペプチドグリコ型の分離
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、IFNBグリコ型（IFNB glycoforms）を分離するための、例えばグリコシル化部位が完全に利用されているグリコ型を得るための効率的な手段である。本実施例はこれを説明する。
PCT/D00/00471の実施例８に記載しているようにして調製したIFNB変異体[Q49N+ Q51T+F111N+R113T]を3工程手法により精製した：
回転容器から回収した培地を遠心し、0.22umフィルター(PVDF)で濾過した。濾過した培地を、カットオフ10000のポリエーテルスルフォン膜を備えたVivaflow 200システムで透析し、50 mM酢酸ナトリウム、50 mM塩化ナトリウム, pH 5.5で平衡化したS-セファロースカラム (Pharmacia)に適用した。カラムに結合したインターフェロン変異体を50 mM酢酸ナトリウム、0.5 M塩化ナトリウム, pH 5.5で溶出した。S-セファロースカラムから溶出した溶出液中の塩化ナトリウムの濃度を1.0 Mに調節し、得られた試料を、50 mM酢酸ナトリウム、1.0 M塩化ナトリウム, pH 5.5で平衡化したフェニル-セファロースHigh Performanceカラム(Pharmacia)に適用した。適用後、カラムをMilli Q水で洗浄した。30カラム容量にて、Milli Q水から60% エチレングリコール、50 mM 酢酸ナトリウム, pH 5.5の勾配溶液でIFNB変異体を溶出した。完全にグリコシル化されたIFNB変異体を含む画分を集め、溶離剤の緩衝液を15 mM リン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.2に変更した。試料を、15 mMリン酸ナトリウムで平衡化したヒドロキシアパタイトカラム(CHT II , Ceramic hydroxyapatite, Type II, Biorad)に適用した。完全にグリコシル化された型はこのカラムを通過し、他方、余分な部位を有するグリコシル化不充分な型はカラムに結合し、これは15 mM から200 ｍMの直線リン酸ナトリウム勾配溶液20カラム容量で溶出された。
完全グリコシル化[Q49N+ Q51T+F111N+R113T] IFNBは、SDS-PAGEに基づき95％以上の純度であると判定された。
【０１４４】
実施例１０
グリコシル化部位が導入されたIFNBのPEG化
各実験の前に、SCM-PEG (Shearwater, Alabamaのカルボキシメチル化PEGのスクシンイミジルエステル, 5 kD または 12 kD)の新鮮なストック溶液をメタノール中にて調製した。
50 mMリン酸ナトリウム、100 mM塩化ナトリウム, pH 7.0中、グリコ変異型[Q49N+ Q51T+F111N+R113T] IFNBの0.3 mg/ml 溶液100マイクロリットルを、PEG化可能な部位、即ちリジンおよびN-末端に対して2倍モル濃度過剰のPEGであるSCM-PEG, 5 kD または 12 kDでPEG化した。室温にて30分間インキュベートした後、20 mM グリシン, pH 8.0（5μl）を添加して反応を停止させた。この時点で、反応混合物は少量の非修飾タンパク質を含有していることがSDS-PAGEにより判明した。
一次スクリーニングアッセイによるインビトロ試験により、12kD PEGが結合した1-3 グループを有するPEG化物質は40％活性を保持していることが証明された。5kD PEGが結合した1-3 グループでは、保持した生物活性は２５％であった。
別の実験では、50 mMリン酸ナトリウム、100 mM塩化ナトリウム, pH 8.0中、精製した[Q49N+ Q51T+F111N+R113T+K19R+K45R+K123R] IFNBのタンパク質濃度0.1 mg/ml 溶液50μlを、PEG化可能な部位、即ちリジンおよびN-末端に対して20倍モル濃度過剰のSCM-PEG, 5 kDでPEG化した。室温にて30分間インキュベートした後、20 mM グリシン, pH 8.0（5μl）を添加して反応を停止させた。この時点で、反応混合物は少量の非修飾タンパク質を含有していることがSDS-PAGEにより判明した。
一次スクリーニングアッセイによるインビトロ試験により、5kD PEGが結合した1-3 グループを有するPEG化物質は45％活性を保持していることが証明された。１つまたは数個のリジンが他のアミノ酸残基と置換されている変異体をPEG化するには、より高いモル濃度過剰のPEGが必要であった。
サイズ排除クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれか、またはこれらの組合わせて、PEG化物質を非PEG化物質および過剰のPEGと分離した。サイズ排除クロマトグラフィーは、PBS緩衝液, pH 7.2で平衡化したSuperose 12 または Superdex 75 カラム（Pharmacia）を用いて行った。陽イオン交換クロマトグラフィーは、20 mM クエン酸塩, pH 2.7で平衡化したSP-セファロース HP (Pharmacia)により行った。SP-セファロース HPカラムからの溶出は、塩濃度（例えば、塩化ナトリウム）を増大させるか、あるいは緩衝液（例えば酢酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウム）のpHを増大させるかのいずれかで行った。
【０１４５】
実施例１１
17位のシステインをセリンに置換することによる高度グリコシル化INF-β変異体の安定化
２つの高度グリコシル化INF-β変異体：[S2N, N4T, Q51N, E53T]INF-β(PF276) および [S2N, N4T, C17S, Q51N, E53T]INF-β（PF279）をコードするプラスミドでCHO K1細胞をトランスフェクトした。全面成長した安定な一次トランスフェクションプールをそれぞれT-175フラスコに拡大させた。全面成長すると、フラスコの培地を、血清含有培地から、1/100 ITSA (Life Technologies #51300-044) および 1/1000 Ex-Cyte (Serologicals Corp. #81-129)を添加したDMEM/F-12 培地 (Lifetecnologies #21045-025)を基本とする血清不含培地に変更した。毎日、15日間、各変異体120ml を収獲し、-80℃にて凍結した。
毎日収獲した収獲物から上清を採取し、0.22 um フィルター (PVDF基本)で濾過した。得られた上清を、カットオフ10000のポリエーテルスルフォン膜を備えたVivaflow 200システムで約15倍に濃縮し、濃縮した試料を50 mM酢酸ナトリウム、50 mM塩化ナトリウム, pH 5.5で平衡化したS-セファロースカラムに適用した。IFNB変異体は、50 mM酢酸ナトリウム、0.5 M塩化ナトリウム, pH 5.5を用いた工程にて溶出された。
S-セファロースカラムからの溶出液の塩化ナトリウム濃度を1.0M に調節し、試料を、50 mM酢酸ナトリウム, 1.0 M塩化ナトリウム, pH 5.5で平衡化したフェニル-セファロースカラムに適用した。平衡化緩衝液で十分に洗浄し、次いでIFNB変異体を、50 mM酢酸ナトリウム, pH 5.5中、60％エチレングリコールで溶出した。
非還元SDS-PAGE、次いで精製を行い、[S2N, N4T, Q51N, E53T]INF-βとのダイマー形成が明らかに証明され、他方[S2N, N4T, C17S, Q51N, E53T]INF-βとではダイマーは存在しなかった。
【０１４６】
実施例１２
[C17S+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T]IFNBグリコシル化変異体の調製、精製およびPEG化
10% FBS およびペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を添加したDMEM/F-12 培地 (LifeTechnologies; Cat. # 31330) 200 ml中、1700 cm2 の拡大表面をそれぞれ有する6個の回転容器(Corning, USA)に、[C17S+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T]IFNBグリコシル化変異体を産生するCHO K1サブクローン(5/G-10)を播種した。2日後、培地を交換した。さらに2日後、２つの回転容器を100％全面成長近くとし、培地を、1/500 EX-CYTE (Serologicals Proteins; Cat. # 81129N) および P/Sを添加した血清不含UltraCHO 培地 (BioWhittaker; Cat. # 12-724) 300 mlに変換した。この培地で細胞を発育させると、血清を含有する培地での発育で得られるものより細胞塊が高度に促進され、高度になる。2日後、培地を新しくした。さらに2日後、培地を変更し、1/100 ITSA (Life Technologies; Cat. # 51300-044) [ITSAはインスリン (1.0 g/L)  トランスフェリン (0.55 g/L)  セレニウム (0.67 mg/L)が添加された接着培養を意味する], 1/500 EC-CYTE およびP/Sが添加された生産培地：DMEM/F-12培地(Life Technologies; Cat. # 21041)とした。回転容器から収獲した培地をプールし、次いでIFNB活性の測定の際に培地試料を採取した。毎日、21日間、培地1.8l を収獲し、-80℃にて凍結した。
回転容器から収獲した培地を遠心し、0.22 μm フィルター (PVDF)で濾過した。濾過培地を、カットオフ10000のポリエーテルスルフォン膜を備えたVivaflow 200システムで透析し、これをS-セファロースカラム(Pharmacia)に適用した。
【０１４７】
S-セファロースカラムは、50 mM酢酸ナトリウム、50 mM塩化ナトリウム, pH 5.5で平衡化し、インターフェロン変異体は50 mM酢酸ナトリウム、0.5 M塩化ナトリウム, pH 5.5により溶出された。溶出液中の塩化ナトリウム濃度を1.0M に調節した。
S-セファロースカラムからの溶出液を、50 mM酢酸ナトリウム, 1.0 M塩化ナトリウム, pH 5.5で平衡化したフェニル-セファロースHigh Performance カラム (Pharmacia)に適用した。適用後、カラムを、50 mM酢酸ナトリウム, 1.0 M塩化ナトリウム, pH 5.5で洗浄した。IFNB変異体を、50 mM酢酸ナトリウム, 50 mM塩化ナトリウム, pH 5.5から、50 mM酢酸ナトリウム中60％エチレングリコール, pH 5.5の勾配溶液30カラム容量で溶出した。完全にグリコシル化されたIFNB変異体を含有する画分を集め、プールした。
フェニル-セファロースからの溶出液を、50 mM酢酸ナトリウム, 1.0 M塩化ナトリウム, pH 5.5で平衡化したS-セファロースカラムに通し、溶出液中のエチレングリコールを除去した。エチレングリコールは流出中に存在し、他方インターフェロン変異体はカラムに結合した。適用後、カラムを20 mM酢酸ナトリウム, pH 5.5で洗浄し、インターフェロン変異体を100mMリン酸ナトリウム, pH 7.5で溶出した。
【０１４８】
溶出液中のリン酸濃度を15 mMリン酸ナトリウム緩衝液, pH 7.2に調節し、これを、15 mM リン酸ナトリウム, pH 7.2で平衡化したヒドロキシアパタイトカラム(CHT I , Ceramic hydroxyapatite, Type I, Biorad)に適用した。完全にグリコシル化された型はこのカラムを通過し、他方、余分な部位を有するグリコシル化不充分な型はカラムに結合し、これは15 mM から200 ｍMの直線リン酸ナトリウム勾配溶液20カラム容量で溶出された。
完全グリコシル化変異型[C17S+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T] IFNBは、SDS-PAGEに基づき95％以上の純度であると判定された。
【０１４９】
精製した後、変異体をPEG化した。各実験の前に、10 mg/ml SCM-PEG (Shearwater, Alabamaのカルボキシメチル化PEGのスクシンイミジルエステル, 12 K または 20 K)の新鮮なストック溶液を96％エタノール中にて調製した。
20 mMリン酸ナトリウム, pH 7.0中、0.1 mg/ml タンパク質溶液を、PEG化可能な部位、即ちリジンおよびN-末端に対して0.75倍モル濃度過剰のPEGであるSCM-PEG, 20KでPEG化した。室温にて30分間インキュベートした後、20 mM グリシン, pH 8.0の過剰量を添加して反応を停止させた。得られた反応混合物はモノ-、ジ-および非PEG化物質の混合物を含有していた。サイズ排除クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれか、またはこれらの組合わせにより、モノ-PEG化物質を他の種から分離した。PEG化溶液のpHを pH 2.7に調節し、試料を、20 mMクエン酸ナトリウム, pH 2.7で平衡化したSP-セファロース HR (Pharmacia)カラムに適用した。PEG化タンパク質を1 M塩化ナトリウムを含有する50 mM酢酸ナトリウムでカラムから溶出させ、これを、100 mM酢酸ナトリウム、200 mM塩化ナトリウム, pH 5.5で平衡化したサイズ排除カラムのセファクリルS-100, ((16/60) Pharmacia)に適用した。モノ-PEG化物質を含有する画分をプールし、さらに特性化した。
別の実験において、20 mMリン酸ナトリウム, pH 7.0中、0.16 mg/ml タンパク質溶液を、PEG化可能な部位、即ちリジンおよびN-末端に対して2倍モル濃度過剰のPEGであるSCM-PEG, 12KでPEG化した。室温にて30分間インキュベートした後、20 mM グリシン, pH 8.0の過剰量を添加して反応を停止させた。得られた反応混合物はモノ-、ジ-、トリ-PEG化物質の混合物とともに非誘導化物質を含有していた。サイズ排除クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれか、またはこれらの組合わせにより、PEG化物質を非修飾タンパク質から分離した。PEG化溶液のpHを pH 2.7に調節し、試料を、20 mMクエン酸ナトリウム, pH 2.7で平衡化したSP-セファロース HR (Pharmacia)カラムに適用した。PEG化タンパク質を1 M塩化ナトリウムを含有する50 mM酢酸ナトリウムによってカラムから溶出させ、これを、100 mM酢酸ナトリウム、200 mM塩化ナトリウム, pH 5.5で平衡化したサイズ排除カラムのセファクリルS-100, ((16/60) Pharmacia)に適用した。モノ-、ジーおよびトリ-PEG化タンパク質を含有する画分をプールし、さらに特性化した。
【０１５０】
実施例１３
[C17S+K19R+K33R+K45R+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T]IFNBグリコシル化変異体の回転容器における調製、精製およびPEG化
実施例１２記載のようにして6つの回転容器において、[C17S+K19R+ K33R+K45R+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T]IFNBグリコシル化変異体を産生するCHO K1サブクローン(5/G-10)を調製し、次いで実施例１２にて使用したプロトコールにより精製した。完全グリコシル化変異型[C17S+K19R+ K33R+K45R+Q49N+ Q51T+D110F+ F111N+ R113T] IFNBは、SDS-PAGEに基づき95％以上の純度であると判定された。
精製した後、変異体をPEG化した。各実験の前に、SCM-PEG (Shearwater, Alabamaのカルボキシメチル化PEGのスクシンイミジルエステル, 12 kD または 20 kD)の新鮮なストック溶液をエタノール中にて調製した。
20 mMリン酸ナトリウム, pH 7.0中、0.1 mg/ml タンパク質溶液を、PEG化可能な部位、即ちリジンおよびN-末端に対して3倍モル濃度過剰のPEGであるSCM-PEG, 20KでPEG化した。室温にて30分間インキュベートした後、20 mM グリシン, pH 8.0の過剰量を添加して反応を停止させた。得られた反応混合物はモノ-、ジ-および非PEG化物質の混合物を含有していた。サイズ排除クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれか、またはこれらの組合わせにより、モノ-PEG化物質を他の種から分離した。PEG化溶液のpHを pH 2.7に調節し、試料を、20 mMクエン酸ナトリウム, pH 2.7で平衡化したSP-セファロース HR (Pharmacia)カラムに適用した。PEG化タンパク質を1 M塩化ナトリウムを含有する50 mM酢酸ナトリウムによってカラムから溶出させ、これを、100 mM酢酸ナトリウム、200 mM塩化ナトリウム, pH 5.5で平衡化したサイズ排除カラムのセファクリルS-100, ((16/60) Pharmacia)に適用した。モノ-PEG化物質を含有する画分をプールし、さらに特性化した。
【０１５１】
別の実験において、20 mMリン酸ナトリウム, pH 7.0中、0.1 mg/ml タンパク質溶液を、PEG化可能な部位、即ちリジンおよびN-末端に対して5倍モル濃度過剰のPEGであるSCM-PEG, 12K（10 mg/ml）でPEG化した。室温にて30分間インキュベートした後、20 mM グリシン, pH 8.0の過剰量を添加して反応を停止させた。得られた反応混合物はモノ-、ジ-、トリ-PEG化物質の混合物とともに非誘導化物質を含有していた。サイズ排除クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーのいずれか、またはこれらの組合わせにより、PEG化物質を非修飾タンパク質から分離した。PEG化溶液のpHを pH 2.7に調節し、試料を、20 mMクエン酸ナトリウム, pH 2.7で平衡化したSP-セファロース HR (Pharmacia)カラムに適用した。PEG化タンパク質を1 M塩化ナトリウムを含有する50 mM酢酸ナトリウムによってカラムから溶出させ、これを、100 mM酢酸ナトリウム、200 mM塩化ナトリウム, pH 5.5で平衡化したサイズ排除カラムのセファクリルS-100, ((16/60) Pharmacia)に適用した。モノ-、ジーおよびトリ-PEG化タンパク質を含有する画分をプールし、さらに特性化した。
【図面の簡単な説明】
【０１５２】
【図１】hIFNBの最適なグリコシル化変異体のウエスターンブロット（実施例７および８に記載）である；レーン１, 野生型hIFNB, レーン２, [Q49N, Q51T]hIFNB, レーン３, [Q48F, Q49N, Q51T]hIFNB, レーン４, [Q48V, Q49N, Q51T]hIFNB, レーン５, [Q48W, Q49N, Q51T]hIFNB, レーン６, マーカー, レーン７, [F111N, R113T]hIFNB, レーン８, [D110F, F111N, R113T]hIFNB, およびレーン９, [D110V, F111N, R113T]hIFNB。
【国際公開パンフレット】
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2004534523.tif 000115
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004534523.tif 000118
2004534523.tif 000119
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