(57)【要約】本発明は主要関連抗原、それらに由来する免疫原性ペプチド、前記ペプチドをコードするＤＮＡ分子およびそれらの癌免疫療法における使用に関する。
2004500024.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号４または配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群より選ばれる、腫瘍関連抗原Ｂ９９。
【請求項２】
請求項１に記載の腫瘍関連抗原に由来する、免疫原性タンパク質断片またはペプチド。
【請求項３】
液性免疫応答を引き起こす、請求項１または２に記載の免疫原性（ポリ）ペプチド。
【請求項４】
ＭＨＣ分子によって提示され細胞性免疫応答を引き起こす、請求項１または２に記載の免疫原性（ポリ）ペプチドまたはその分解産物。
【請求項５】
配列番号２２〜５５に記載のペプチドからなる群より選ばれる請求項４に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項６】
配列番号３１、配列番号５７および配列番号５９に記載のペプチドからなる群より選ばれる請求項５に記載の免疫原性ペプチド。
【請求項７】
ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおける癌疾病の免疫療法用の、Ｂ９９を発現する患者の腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導する請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性（ポリ）ペプチド。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性（ポリ）ペプチドの１以上を活性成分として含むことを特徴とする、非経口投与、局所投与、経口投与または部分的投与用医薬組成物。
【請求項９】
Ｂ９９由来の種々の免疫原性ペプチドを含む請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
他の腫瘍関連抗原に由来するペプチドと混合されたＢ９９由来の１以上のペプチドを含むことを特徴とする請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
少なくとも２種の異なるＨＬＡ型に結合することを特徴とする請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の腫瘍関連抗原の免疫原性特性を有するタンパク質またはその断片をコードする単離ＤＮＡ分子。
【請求項１３】
配列番号２、配列番号４または配列番号６に記載のアミノ酸配列を有する免疫原性ポリペプチドＢ９９または前記Ｂ９９に由来するタンパク質断片若しくはペプチドをコードする請求項１２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１４】
配列番号１、配列番号３または配列番号５に記載の配列を有するポリヌクレオチドであること、または、ストリンジェントな条件下で配列番号１、配列番号３または配列番号５に記載の配列を有するポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子を含む、組換えＤＮＡ分子。
【請求項１６】
癌疾病の免疫療法用の請求項１２〜１５のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子であって、前記ＤＮＡ分子によって発現されるＢ９９（ポリ）ペプチドがＢ９９を発現する患者腫瘍細胞に対する免疫応答を引き起こす、前記ＤＮＡ分子。
【請求項１７】
請求項１２〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子の１以上を活性成分として含む医薬組成物。
【請求項１８】
請求項１に記載の腫瘍関連抗原を発現する細胞の癌ワクチン製造のための使用。
【請求項１９】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の（ポリ）ペプチドに対する抗体。
【請求項２０】
モノクローナルであることを特徴とする請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
Ｂ９９の発現と関連した癌疾病の治療および診断用の請求項１９または２０に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は腫瘍疾病の免疫療法に関する。
免疫系は身体を種々の微生物から守り、積極的にこれらの微生物と戦う働きをする。無傷の免疫系の重要性は先天性または後天性免疫不全の場合に特に顕著である。予防ワクチンプログラムの使用は、ウイルスまたはバクテリア感染疾病に対する戦いにおいて多くの場合に極めて効果的で好結果の免疫学的干渉であることが証明されている。また免疫系は腫瘍細胞の除去にも大きく関与していることも見いだされている。免疫系の構成成分による腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の認識は重要な役割を果す。最も広義には、免疫系の要素によって認識される、および、免疫応答の刺激につながる腫瘍細胞のいかなる（ペプチド性または非ペプチド性）構成成分も免疫原性腫瘍抗原として働き得る。免疫学的反応を引き起こすだけでなく腫瘍の拒絶を引き起こす腫瘍抗原は特に重要である。この種の免疫学的反応を刺激することのできる特異的な抗原を同定することは分子的に明らかにされた腫瘍ワクチンの開発における主要な工程を構成する。
【０００２】
腫瘍の拒絶に免疫系のどの要素が関与しているかはいまだ明確ではないが、ＣＤ８−発現細胞障害性Ｔ−リンパ細胞（ＣＴＬ）が主要な役割を果す（Ｃｏｕｌｉｅ、１９９７）というのが大多数の意見である。特に、（メラノーマや腎臓癌のような）自発的緩解率の比較的高い型の腫瘍において臨床学的進行度とＣＤ８＋−およびＣＤ４＋−Ｔ−細胞の出現の増加とに相関が見いだされている（Ｓｃｈｅｎｄｅｌら、１９９３；Ｍａｃｋｅｎｓｅｎら、１９９３；Ｈａｌｌｉｄａｙら、１９９５；Ｋａｗａｋａｍｉら、１９９５；Ｋａｗａｋａｍｉら、１９９６；Ｗａｎｇ、１９９７；ＣｅｌｌｕｚｚｉとＦａｌｏ、１９９８）。特異的ＣＴＬクローンは腫瘍浸潤性リンパ細胞（ＴＩＬ）または末梢単球血液細胞（ＰＢＭＣ）から、一般にｉｎ ｖｉｔｒｏにおける自家腫瘍細胞との共培養およびサイトカイン刺激の後に得られている。動物モデルおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたヒト細胞培養系のいずれにおいても腫瘍細胞に対するＴ−細胞応答は腫瘍細胞をサイトカインでトランスフェクションすることによって増加した（ｖａｎ Ｅｌｓａｓら、１９９７；Ｇａｎｓｂａｃｈｅｒら、１９９０；Ｔｅｐｐｅｒら、１９８９；Ｆｅａｒｏｎら、１９９０；Ｄｒａｎｏｆｆら、１９９３）。
緩解性とＣＤ８＋−Ｔ細胞の関与との相関という観点から、ＣＤ８陽性ＣＴＬによって認識される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の同定は腫瘍ワクチンの開発へ向けての具体的な第１の目標である（Ｐａｒｄｏｌｌ、１９９８；ＲｏｂｂｉｎｓとＫａｗａｋａｍｉ、１９９６）。免疫系の他の型の細胞、例えばＣＤ４＋−Ｔヘルパー細胞のような細胞型が重要な役割を果たすかどうかは未だ明確でない；メラノーマ患者におけるＭＡＧＥ−３／ＨＬＡ−Ａ１ペプチドにによる多数の研究がこのことを示した（Ｍａｒｃｈａｎｄら、１９９５；Ｂｏｏｎら、１９９８）。近年、ＣＴＬによって認識される多数のＴＡＡが同定されてきている（Ｂｏｏｎら、１９９４；ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅとｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ， １９９７）。
【０００３】
Ｔ細胞は、細胞表面のＭＨＣ分子（「主要組織適合性複合体」、ヒトではＨＬＡ＝ヒト白血球抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ））上に提示されるペプチド断片として抗原を認識する。２つの型のＭＨＣ分子がある：ＭＨＣ−Ｉ分子は有核の大部分の細胞に存在し、内在性タンパク質のタンパク質分解性分解（いわゆる「抗原プロセッシング」）によって生成されるペプチド（通常８〜１０ｍｅｒ）を提示する。ペプチド：ＭＨＣ−Ｉ複合体はＣＤ８−陽性ＣＴＬによって認識される。ＭＨＣ−ＩＩ分子はいわゆる「専門的抗原−提示細胞」（ＡＰＣ）上にのみ現れ、ＡＰＣによるエンドサイトーシスの過程で吸収され、プロセッシングされる外来性タンパク質のペプチドを提示する。ペプチド：ＭＨＣ−ＩＩ複合体はＣＤ４−ヘルパーＴ細胞によって認識される。Ｔ細胞レセプターとペプチド：ＭＨＣ複合体との相互作用により、種々のエフェクター機構が引き起こされることがあり、ＣＴＬの場合は標的細胞のアポトーシスを引き起こすことがある。ＭＨＣ（例えば、移植拒絶の場合）またはペプチド（例えば、細胞内病原体の場合）が外来性であるとして認識される場合にこれが起こる。いずれにしろ、提示されたペプチドの全てがＴ細胞との効果的相互作用のための構造的および機能的要求を満たすわけではない（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、１９９５に記載および後述するように）。
【０００４】
原理的には、腫瘍ワクチンにおいてＴＡＡを使用するために多数の投与方法が可能である：抗原は適切なアジュバント若しくは担体系と共に組換えタンパク質として投与することもでき、抗原をコードするプラスミド（ＤＮＡワクチン；Ｔｉｇｈｅら、１９９８）若しくはウイルスベクター中（Ｒｅｓｔｉｆｏ、１９９７）のｃＤＮＡとして与えることもできる。他の可能性はヒト抗原を組換え的に発現し、それらの追加的成分の結果としてアジュバント効果を有する組換えバクテリア（例えば、リステリア、サルモネラ）を使用することである（Ｐａｔｅｒｓｏｎ、１９９６；Ｐａｒｄｏｌｌ、１９９８）。これらの全ての場合において、抗原はいわゆる「専門的抗原提示細胞（ＡＰＣ）」によってプロセッシングされて提示されなければならない。他の可能性は、抗原のＴ細胞エピトープ等価物に対応し、外部からＡＰＣに装荷され（Ｂｕｓｃｈｌｅら、１９９７；Ｓｃｈｍｉｄｔら、１９９７）、またはＡＰＣによって吸収されＭＨＣ Ｉ分子に細胞内移送される、合成ペプチド（Ｍｅｌｉｅｆら、１９９６）を使用することである。特定の抗原を投与する最も治療的に効果的な方法は一般には臨床試験によって決定される。
【０００５】
腫瘍特異的ＣＴＬによって認識される抗原またはそのエピトープには、いかなるタンパク質クラス（例えば、転写因子、レセプター、酵素；総説についてはＲａｍｍｅｎｓｅｅら、１９９５；ＲｏｂｂｉｎｓとＫａｗａｋａｍｉ、１９９６を参照せよ）に由来し得る分子も含まれる。抗体による認識の場合に必要であるようにこれらのタンパク質は必ずしも細胞表面上に位置する必要はない。ＣＴＬによる認識のための腫瘍特異的抗原として働くためには、あるいは、治療に使用するためには、そのタンパク質はある条件を満たさなければならない：まず第一に、その抗原は腫瘍細胞によって排他的に発現されなければならない、または、いわゆる「決定的」正常組織においては腫瘍におけるよりも低い濃度でのみ生じなければならない。決定的正常組織とは必須の組織である；それらに向けられた免疫反応は重大な結果、ある場合には致死的な結果を引き起こすであろう。
【０００６】
第２に、この抗原は一次腫瘍においてのみならず転移においても発現されなければならない。更に、抗原の広範な臨床的利用という観点から、その抗原は幾つかのタイプの腫瘍において高濃度で存在することが望ましい。ワクチンの効果的な成分としてのＴＡＡの適切性に関する更なる前提条件はその抗原のアミノ酸配列中のＴ細胞エピトープの存在である；ＴＡＡ由来のペプチドはｉｎ ｖｉｔｒｏ／ｉｎ ｖｉｖｏ でＴ細胞応答を生じさせなければならない（「免疫原性」ペプチド）。臨床的に広範に適用できる免疫原性ペプチドを選択するための別の基準は、その抗原が任意の患者集団において出現する頻度である。
免疫原性腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、既にＴ細胞エピトープを有することが広く示されているが、多数のカテゴリーに分けることができ、それらには、ウイルスタンパク質、変異タンパク質、過剰発現タンパク質、染色体転座によって形成される融合タンパク質、分化抗原、癌胎児性抗原が含まれる（Ｖａｎ ｄｅｎ ＥｙｎｄｅとＢｒｉｃｈａｒｄ、１９９５；ｖａｎ ｄｅｎ Ｅｙｎｄｅとｖａｎ ｄｅｒ Ｂｒｕｇｇｅｎ， １９９７）。
【０００７】
腫瘍ワクチンの開発のための出発点となる、ＴＡＡを同定し解析する方法は、ひとつには患者において既に誘導されている（細胞性免疫応答）ＣＴＬの使用または抗体（液性免疫応答）に基づくか、または腫瘍と正常組織の間の示差的転写プロフィールを描き出すことに基づいている。前者の例、免疫学的アプローチでは、ＭＨＣ−Ｉ分子によってＣＴＬエピトープを提示する真核性腫瘍ｃＤＮＡ発現ライブラリー（Ｂｏｏｎら、１９９４）のスクリーニングに患者のＣＴＬが使用され、一方、高アフィニティー患者抗血清真核性ｃＤＮＡ発現ライブラリーを使用することによって、ＴＡＡの存在は個々のプラークのイムノブロット解析によって直接に探索することができる（Ｓａｈｉｎら、１９９５）。ＣＴＬ反応性とタンパク質−化学的工程の組合せは、患者ＣＴＬとの反応性によって予備選択した腫瘍細胞のＭＨＣ−Ｉから分離されるペプチドの単離を生じさせる。このペプチドはＭＨＣ−Ｉ複合体から洗い出され、質量分光器によって同定される（Ｆａｌｋら、１９９１；Ｗｏｅｌｆｅｌら、１９９４；Ｃｏｘら、１９９４）。抗原の特性解析のためにＣＴＬを使用するアプローチは、ＣＴＬの培養と活性化を必要とするために、かなりの費用がかかり、または、必ずしも成功するものではない。
【０００８】
正常組織と腫瘍組織の転写プロフィールの比較に基づくＴＡＡの同定方法は多数あり多様である；それらには、ディファレンシャルハイブリダイゼーション、サブトラクションｃＤＮＡバンクの確立（「提示的差異解析」（”ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ”）；ＨｕｂａｎｋとＳｃｈａｔｚ、１９９４；Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏら、１９９６）およびＤＮＡチップ技術の使用またはＳＡＧＥ法（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら１９９５）が含まれる。患者ＣＴＬを使用する上述した免疫学的方法と対照的に、分子生物学的方法を使用する場合は、この方法によって発見される潜在的抗原候補が腫瘍特異的（腫瘍関連）であって細胞障害性Ｔ細胞応答を引き起こすことができるＴ細胞エピトープを確かに有することを示す必要がある。少なくとも一つの例では（ＮＹ−ＥＳＯ／ＬＡＧＥ−１）、抗原は患者血清およびＲＤＡの両方によって同定され（Ｃｈｅｎら、１９９７；Ｌｅｔｈｅら、１９９８）、さらに、この抗原のＣＴＬエピトープおよび同時自発性液性およびＴ細胞応答が一人の患者について述べられている（Ｊａｇｅｒら、１９９８）。
【０００９】
本発明の目的は、新規な腫瘍−関連抗原（ＴＡＡ）を提供することである。
この目的は、最初に、肺腺癌細胞株（Ａ５４９）と正常肺組織間のＲＤＡ（提示的差異解析）によるｃＤＮＡサブトラクションライブラリーを樹立することによって達成した。腫瘍中で過剰発現されている抗原を選択するため、得られたｃＤＮＡクローンをシーケンシングしデータバンクで入手可能な配列と比較した。同定された遺伝子のうちデータバンク中に３２１個の未知の遺伝子があり、データバンク中にその大部分がＥＳＴ（発現配列タグ）であるエントリーが存在した。更に決定的正常組織および免疫特権的組織のｃＤＮＡライブラリーにおける定性的ＰＣＲ解析、および詳細なデータバンク検索の後、候補クローンの数は５６に限定され、それらのＥＳＴは決定的正常組織には由来しないものであった。ＲＴ−ＰＣＲによって、調べた５６個のクローンのうち３つが主として種々の腫瘍組織における発現を示し、正常組織では殆どまたは全く発現を示さないことが明らかにされた。クローンの一つ（Ｂ９９）の腫瘍組織と正常組織との発現の（ＰＣＲを用いた）定量的比較は、種々の腫瘍におけるＢ９９の過剰発現を明らかにした。ノーザンブロットによって解析した発現プロフィールは、調べた正常組織ではＢ９９は全くまたはわずかな転写しかないことを明らかにした。
【００１０】
ヒトＢ９９ ｃＤＮＡはクローン化された；得られた配列は配列番号１に示されている。クローン化されたヒトＢ９９ ｃＤＮＡの配列解析により、位置４２７から位置１７４３には、β−１，３−ガラクトシル−Ｏ−グリコシル−グリコプロテインβ−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼのオープンリーディングフレームとヌクレオチドレベルおよびタンパク質レベルで非常に類似した連続オープンリーディングフレームが存在することが示された。ノーザンブロット実験から得られたデータにより、Ｂ９９転写物は約３．０ｋｂの長さを有していると結論付けられた。Ｂ９９ ｃＤＮＡのクローン化された領域は２２１６ｂｐであるが、配列の３’末端にポリＡ尾部が存在することはこの領域のｃＤＮＡが完全であることの証拠である。ノーザンブロット解析から導き出された大きさとクローン化されたＢ９９−ｃＤＮＡの大きさの相違は、未知の長さのポリＡ尾部の存在およびＢ９９の５’−非翻訳領域中の追加的配列によって説明することができる。このクローン化ｃＤＮＡの５’領域中の位置０から４２７には連続したリーディングフレームがないという事実から、位置４２７のＡＴＧがＢ９９の開始コドンであると結論づけることができる。
【００１１】
更に上流に位置するＢ９９の配列に関する情報は分子生物学の標準的な方法、例えば、５’−ＲＡＣＥ（ＤＮＡ末端迅速増幅）によって得ることができる。この方法では、ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡが、Ｂ９９が転写されている細胞または組織（例えば大腸癌組織またはＡ５４９のような肺腺癌に由来する細胞株）から逆転写され、次に、既知の配列のアダプターとライゲーションされる。アダプタープライマー（ｃＤＮＡの５’末端にあるアダプターに特異的に結合する）およびＢ９９特異的プライマー（例えば配列番号８、１０、１１）を用いたＰＣＲにより対応するＢ９９断片の増幅が可能となる。これらのＰＣＲ産物は実施例１に記載したような標準的な方法によりクローン化することができ、特にＤＮＡシーケンシングにより特徴付けができる。
【００１２】
５’末端解析の他の方法はＢ９９に特異的なＤＮＡプローブによるハイブリダイセーションまたは抗血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによるものである。
ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングが、例えばＲＮＡの顕著な２次構造のための効率の良くない逆転写のようなその手順の限界のために所望の結果を達成しない場合は、例えば、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにおけるように、Ｂ９９に特異的なＤＮＡプローブとハイブリダイズさせることによりゲノムライブラリーを調べ、得られたｃＤＮＡの５’末端の上流に位置する配列（例えばＢ９９のプロモーター領域）情報を含むクローンを単離することもできる。
【００１３】
この単離ｃＤＮＡは、Ｂ９９と名付けた配列番号２に記載のアミノ酸配列（Ｂ９９−１）を有する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）をコードする。この配列は単離Ｂ９９−ｃＤＮＡの位置４２７の開始コドンによって規定されている。
肺腺癌細胞株Ａ５４９からのｃＤＮＡを使用したＢ９９のコード領域をクローニングする別の試みにおいて、配列番号１に示す配列に比較してヌクレオチドの位置９２３における挿入を有する配列が決定された（配列番号３または配列番号５）。この挿入はＢ９９のオープンリーディングフレームに変化を生じさせ、Ｂ９９タンパク質のＣ−末端領域に改変されたアミノ酸配列を生じさせる；このリーディングフレームに由来するＢ９９抗原（Ｂ９９−２）の配列は配列番号４に示してある。この挿入とは別に、Ａ５４９細胞から単離したｃＤＮＡは配列番号１の配列と比較して位置６２２にヌクレオチド置換を有している。このヌクレオチド置換は位置６６におけるアルギニン（配列番号２、Ｂ９９−１）のトリプトファン（配列番号４、Ｂ９９−２）による置換を生じさせる。このアミノ酸置換を別にすれば、Ｂ９９−２のアミノ酸配列の位置１６６（これを含む）までの配列はＢ９９−１と同一である。
位置９２３のヌクレオチド挿入は配列番号３（または配列番号５）に示した配列の位置８４５から１７４４の第２の潜在的リーディングフレームを作り出す。このリーディングフレームを有するｃＤＮＡによって発現されるタンパク質は配列番号６に示されたアミノ酸配列を有する（Ｂ９９−３）。Ｂ９９−３の配列はＢ９９−１と位置１から２７が異なり、位置２８以降はＢ９９−１と同一である。
【００１４】
従って、第１の側面によれば、本発明は配列番号２、配列番号４または配列番号６に記載したアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選ばれる、Ｂ９９と命名された腫瘍関連抗原に関する。
配列番号２（Ｂ９９−１）、配列番号４（Ｂ９９−２）および配列番号６（Ｂ９９−３）に示したアミノ酸配列は、Ｂ９９誘導体が腫瘍ワクチンとしての使用のために望まれる免疫原性特性を有する場合には、ある程度の相違、例えば、アミノ酸置換による相違を有してもよい（この種のＢ９９多型性の例は、点変異によって生じたＢ９９−１とＢ９９−２の位置６６における相違である）。
特に断らない限り、用語「Ｂ９９」は本明細書ではＢ９９−１、Ｂ９９−２およびＢ９９−３を意味するために使用される。
【００１５】
Ｂ９９の天然のアミノ酸配列（従って、対応するＢ９９−ｃＤＮＡの配列）は場合により、Ｂ９９ ＣＴＬ−エピトープ中の個々のアミノ酸を置換することにより改変され、天然のＢ９９ ＣＴＬエピトープと比較してＭＨＣ−Ｉ分子に対するＢ９９ペプチドの親和性の増加を達成し、それにより、増加した免疫原性を生じさせ、最終的に腫瘍に対するより大きな反応性を生じさせてもよい。Ｂ９９エピトープ領域における改変はＢ９９タンパク質全体において行なってもよく（これはＡＰＣによりプロセッシングされて対応するペプチドを形成する）、あるいは、大きなＢ９９タンパク質断片またはＢ９９ペプチドに対して行なってもよい（以下を参照せよ）。
他の側面によれば、本発明はＢ９９に由来する免疫原性断片およびペプチドに関する。後者は以下ではＢ９９ペプチドと称する。最初のグループは液性免疫応答を起動する（抗体の誘導）Ｂ９９ペプチドである。そのようなペプチドは、例えば表面可能性ブロット（Ｅｍｉｎｉら、１９８５）、疎水性ブロット（ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）および抗原性インデックス（ＪａｍｅｓｏｎとＷｏｌｆ、１９８８）のようないわゆる予測アルゴリズムによって決定できるＢ９９の選択した部分（少なくとも１２〜１５アミノ酸）である。
【００１６】
腫瘍関連抗原は腫瘍特異的変異を有することがあり、それが腫瘍組織と正常組織との免疫学的識別に寄与することが知られている（Ｍａｎｄｒｕｚｚａｔｏら、１９９７、Ｈｏｇａｎら、１９９８、Ｇａｕｄｉら、１９９９、Ｗｏｌｆｅｌら、１９９５）。腫瘍特異的Ｂ９９変異の存在を決定するために、Ｂ９９ ｃＤＮＡを１以上の異なる腫瘍から、好ましくは本発明の単離Ｂ９９ ｃＤＮＡからのプローブでクローン化し、得られた配列を正常組織のＢ９９ ｃＤＮＡと比較してもよい。正常組織に対して変異した配列部分からの腫瘍Ｂ９９ペプチドは正常組織からの対応する配列部分のＢ９９ペプチドと比較して増加した免疫原性を有していることが期待されるであろう。
従って、本発明は、更なる側面において、腫瘍特異的変異を有する、腫瘍−発現Ｂ９９由来のＢ９９ペプチドに関する。
Ｂ９９ペプチド候補を選ぶとき、Ｂ９９−１と異なるＢ９９−２およびＢ９９−３の領域は特に関心に値する。アミノ酸配列に相違をもたらすＢ９９ ＤＮＡの挿入が腫瘍特異的変異であると理解すると、この領域からのペプチドはＢ９９−１のペプチドよりも大きな抗原性を示すと期待することができる。この挿入が腫瘍特異的であることを確認するために、この領域に対する抗体を作製し、腫瘍細胞をＢ９９−２およびＢ９９−３の発現について調べてもよい。
【００１７】
Ｂ９９ペプチドは直接投与、または、改変された形態（例えば、ＫＬＨ＝キーホールリンペットヘモシアニンに結合して）で投与され、抗体の形成は通常の免疫学的アッセイ、例えばＥＬＩＳＡによって決定される。
本発明の範囲内で好ましい他のＢ９９ペプチドは、ＭＨＣ分子によって提示され、細胞性免疫応答を生み出すものである。２つの型のＭＨＣ分子、すなわちＣＤ８陽性ＣＴＬによって認識されるＭＨＣ−Ｉ分子およびＣＤ４陽性Ｔヘルパー細胞によって認識されるＭＨＣ−ＩＩ分子がある。
ペプチドが細胞性免疫応答を起動するためには、そのペプチドはＭＨＣ分子に結合しなければならず、一方治療される患者はその分子を彼または彼女のレパトワール中に有していなければならない。従って、患者のＭＨＣ−サブタイプを決定することは、細胞性免疫応答の起動という観点から、その患者におけるペプチドの効果的な使用のために最も重要な欠くことのできないことを構成する。
治療的に使用すべきＢ９９ペプチドの配列は、アンカーアミノ酸および長さの観点から問題としているＭＨＣ−分子によって決定される。明らかにしたアンカー位置と長さは、そのペプチドが問題にしている患者のＭＨＣ−分子のペプチド結合溝に適合することを保証する。この結果は、免疫系が刺激され、腫瘍抗原に由来するペプチドが使用された場合は、患者の腫瘍細胞に対して向けられた細胞性免疫反応が生成されるというものである。
【００１８】
免疫原性Ｂ９９ペプチドは既知の方法によって同定することができる；基本的条件の一つはＭＨＣ−結合性とＣＴＬ−誘導性の間の相関である。
従って、免疫原性ペプチドの配列はそのペプチド結合モチーフに基づいて予測することができるため、Ｂ９９タンパク質配列に基づいてＣＴＬエピトープを構成するＢ９９ペプチドを同定すること、および合成することができる。これを行なうため、既知のタンパク質抗原のＣＴＬエピトープを同定するために使用される種々の方法が利用できる；例えば、ヒトパピローマウイルスにおけるＴ細胞エピトープを同定するためにＳｔａｕｓｓら、１９９２によって記載された方法。
【００１９】
ＭＨＣ分子に結合し、それによって提示されるペプチドに関する各ＭＨＣ−Ｉアレル産物のアレル特異的要求はモチーフとして集められている（例えば、Ｆａｌｋら、１９９１）。これまでに、多数のＭＨＣ−ペプチドモチーフおよびＭＨＣ−リガンドが両方とも知られるようになった。本発明の範囲内にある、特定のＭＨＣ−Ｉ分子に適合する既知のタンパク質のエピトープを捜すための適切な方法はＲａｍｍｅｎｓｅｅら（１９９５）の総説によって記載されている。この方法は以下の工程を含む：第１に、アンカーモチーフに対応する断片についてタンパク質配列が検索され、一方、ペプチド長およびアンカー占有率についてはある種の変動が可能である。例えば、モチーフが末端にＩｌｅまたはＬｅｕを有する９ｍｅｒを規定している場合、対応するＣ末端を有する１０ｍｅｒも考慮することができ、ＶａｌまたはＭｅｔのような他の脂肪族残基を有するペプチドも考慮することができる。
【００２０】
このようにして、多数のペプチド候補が得られる。これらは既知のリガンドと共通する可能な限り多数のアンカーグループの存在に関して検索され、および／または、それらが種々のＭＨＣ分子に対して「好ましい」残基を有しているか否かが（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、１９９５の表に従って）検索される。弱く結合するペプチドを排除するために、好ましくは結合アッセイが行なわれる。特定のＭＨＣ分子に対するペプチド結合に対する要求が既知であれば、ペプチド候補は結合に負の影響または正の影響を有する非アンカー残基について検索され、または、そもそも確かに結合を可能にする非アンカー残基について検索される（Ｒｕｐｐｅｒｔら、１９９３）。しかしながら、この方法では、ペプチド結合モチーフは天然のリガンドを捜す場合の唯一の決定因子ではないことを心に止めておかなければならない；他の側面、例えば抗原プロセッシングの過程での酵素特異性もＭＨＣ結合の特異性に加えてリガンドの正体に寄与する。これらの側面を考慮し、本発明の範囲内の免疫原性Ｂ９９ペプチドを同定するために適した一つの方法は、特にＫａｗａｋａｍｉら（１９９５）において既知のＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチーフに基づいてｇｐ１００エピトープを同定するために使用された。
【００２１】
ペプチドはまたＭＣＨ−ＩＩ分子への結合能について選択してもよい。９アミノ酸を超えるＭＨＣ−ＩＩ結合モチーフはＭＨＣ−Ｉ結合モチーフよりもアンカー位置についてより高度の縮退を有する。ＭＨＣ−ＩＩ分子のＸ−線構造解析、および、ペプチド配列における変異に基づいてＭＨＣ−ＩＩ結合モチーフの正確な解析を可能とする方法が開発されている（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら（１９９５）、およびそれに引用された原論文）。ＭＨＣ−ＩＩ分子に結合するペプチドは典型的には樹状細胞、マクロファージまたはＢ細胞によってＣＤ４−Ｔ細胞に提示される。ＣＤ４−Ｔ細胞は、次に例えばサイトカインの放出によって次々とＣＴＬを直接的に活性化し、ＡＰＣ（樹状細胞、マクロファージおよびＢ細胞）による抗原提示の効率を増大させる。
【００２２】
最近、データバンクおよび特定のＭＨＣ分子に結合するペプチドエピトープのより信頼性のある予測を可能とする予測アルゴリズムが利用できるようになった。
本発明の範囲内において、Ｐａｒｋｅｒら（１９９４）によって記載されたアルゴリズムを用いて、最も重要なＨＬＡ−型、特にＨＬＡ−Ａ１、−Ａ＊０２０１、−Ａ３、−Ｂ７、−Ｂ１４および−Ｂ＊４４０３に対する候補ペプチドが同定され、これらは対応するＨＬＡ分子に結合することが期待され、従って、免疫原性ＣＴＬ−エピトープを構成することが期待される；発見されたペプチドは表２に列挙されている。同様に、ペプチドの他の種々の特徴（疎水性、電荷、大きさ）、または、ＨＬＡ分子の３Ｄ構造のようなペプチドによる要求を考慮した他のアルゴリズムを用いることによって潜在的ペプチドエピトープを発見することが可能である；これは他のＨＬＡ型のペプチドエピトープにも適用できる。
【００２３】
記載した方法によってＢ９９ペプチド候補を選択した後は、そのＭＨＣ結合性がペプチド結合アッセイによってテストされる。第１に、良好な結合特性を有するペプチドの免疫原性が決定される（ペプチド−ＭＨＣ相互作用の安定性は多くの場合免疫原性と相関する；ｖａｎ ｄｅｒ Ｂｕｒｇら、１９９６）。選択したペプチドまたはペプチド等価物の免疫原性を決定するために、例えば、Ｓｅｔｔｅら（１９９４）によって記載された方法を定量的ＭＨＣ結合アッセイと組み合せて使用することができる。あるいは、選択したペプチドの免疫原性は既知の方法を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ ＣＴＬ誘導によってテストしてよい（ｅｘ ｖｉｖｏ ＣＴＬ誘導について以下に記載したように）。細胞性免疫応答を起動することのできるペプチドを選択するための、いくつかの工程で行なわれる方法の原理は、ＷＯ ９７／３０７２１に記載されている。この文献の内容は引用により本明細書に含まれるものとする。本発明の範囲内にある効率的な免疫原性ペプチドを得るための一般的なストラテジーはＳｃｈｗｅｉｇｈｏｆｆｅｒ，１９９７によっても記載されている。
【００２４】
ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩ分子の結合溝に適合する元々のペプチド、すなわち、未改変Ｂ９９に由来するペプチドを使用する代わりに、元のペプチド配列に基づいて特定されるアンカー位置および長さに関する最小限の要求に従って、変異を行なってもよい。ただし、それらの変異が、ＭＨＣ分子への結合アフィニティーによって形成されるペプチドの効果的な免疫原性およびＴ細胞レセプター活性化能力を損なわないだけでなく、それを増強することが好ましい。この場合、ＭＨＣ分子への結合能に関する要求に合致するように設計された人工的ペプチドまたはペプチド等価物が使用される。
【００２５】
このようにして改変したペプチドは「ヘテロクリティックペプチド」と称される。それらは以下の方法によって得ることができる：
まず最初に、例えば、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら（１９９５）によって記載された原理を用いてＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩリガンドのエピトープまたはそれらの変異体を得る。このペプチドの長さは、それがＭＨＣ−Ｉ分子に適合すべきであるならば、必要なアンカーアミノ酸を有する８〜１０個のアミノ酸という最小配列に対応するものが好ましい。
所望であれば、ペプチドはＣ末端および／またはＮ末端において伸長させてもよいが、但しその伸長がＭＨＣ分子への結合能に影響せず、伸長させたペプチドが最小配列へ細胞性プロセッシングを受け得ることを条件とする。
次に改変ペプチドは、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら（１９９６）およびＢｅｃｋｅｒら（１９９７）に記載されたように、ＴＩＬ（腫瘍浸潤性リンパ細胞） による認識、ＣＴＬ誘導および増加したＭＨＣ結合性および免疫原性について調べられる。
【００２６】
天然のＢ９９ペプチドの免疫原性よりも大きな免疫原性を有する、本発明の目的に適したペプチドを見出す他の方法は、Ｂｌａｋｅら（１９９６）に記載されているように、天然に腫瘍上に見出されるＢ９９ペプチドを認識するＣＴＬでペプチドライブラリーをスクリーニングすることを基礎とする；これとの関係で、ＭＨＣ−Ｉ拘束ＣＴＬによって認識される腫瘍エピトープを模倣する分子を設計するためにコンビナトリアルペプチドライブラリーを使用することが提案される。
本発明のＢ９９ポリペプチドまたはそれらに由来する免疫原性断片若しくはペプチドはＷＯ ９６／１０４１３に記載されたように組換え的に作製してもよく、ペプチド合成によって産生してもよい。この文献の開示は引用により本明細書に含まれるものとする。組換え産生のために、対応するＤＮＡ分子が標準的な方法で発現ベクターに挿入され、適切な宿主細胞にトランスフェクションされ、この宿主が適切な発現条件下で培養され、タンパク質が精製される。慣習的な方法をＢ９９ペプチドの化学合成に使用してよく、例えば商業的に入手可能な自動ペプチド合成機をすることができる。
【００２７】
天然のＢ９９ペプチドまたはヘテロクリティックペプチドの代わりにその様なペプチドを模倣する物質、例えば、「ペプチド擬似物」または「レトロインバースペプチド」を使用することもできる。腫瘍ワクチンにおける治療的用途という観点からこれらの分子をテストするために、天然のＢ９９ペプチドまたはＢ９９ペプチド等価物について上述したのと同じ方法を使用することができる。
本発明のＢ９９と命名されたＴＡＡおよび、それに由来するタンパク質断片、ペプチドまたはペプチド等価物は癌治療のために、例えば、対応する抗原決定基を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するために使用することができる。それらはＢ９９陽性の腫瘍、特に腎臓細胞癌、肺癌、大腸癌、膵臓癌、乳癌および胃癌における腫瘍の治療に使用されることが好ましい。
ＣＴＬ誘導という形の免疫応答はｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで達成することができる。
【００２８】
ｉｎ ｖｉｖｏでＣＴＬを誘導するために、ＴＡＡ Ｂ９９またはそれに由来する断片若しくはペプチドを活性成分として含む医薬組成物がそのＴＡＡと関連した癌性疾病に苦しむ患者に投与されるが、ＴＡＡ（ペプチド）の量は抗原保持腫瘍に対する効果的なＣＴＬ応答を得るために充分でなければならない。
従って、別の側面によれば、本発明は非経口投与、局所的投与、経口投与または部分投与のための医薬組成物に関する。好ましくは、本組成物は非経口的に使用され、例えば皮下、皮内または筋肉内適用のために使用される。Ｂ９９−ＴＡＡ／ペプチドは医薬的に許容できる担体、好ましくは水性担体に溶解又は懸濁される。この組成物はバッファー等の慣用されるアジュバントを含んでいてもよい。ＴＡＡ／ペプチドはそれ単独でまたはアジュバント、例えば、フロイントの不完全アジュバント、サポニン、アルミニウム塩、あるいは、好ましい実施態様ではポリアルギニンまたはポリリジンのようなポリカチオンと組み合せて使用することができる。このペプチドはＣＴＬ誘導またはＣＴＬ活性化を助ける成分、例えばＴヘルパーペプチド、脂質若しくはリポソームに結合させてもよく、これらの物質および／または免疫刺激物質、例えばサイトカイン（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ）とともに投与してもよい。本発明の医薬組成物の調製および投与のための適切な方法はＷＯ ９５／０４５４２およびＷＯ ９７／３０７２１に記載されており、これらの開示は本明細書に含まれるものとする。
【００２９】
Ｂ９９（断片）またはＢ９９ペプチドはｅｘ ｖｉｖｏでＣＴＬ応答を起動するために使用することができる。Ｂ９９を発現する腫瘍に対するｅｘ ｖｉｖｏ ＣＴＬ応答はＣＴＬ前駆細胞をＡＰＣおよびＢ９９ペプチドまたはＢ９９タンパク質と共にインキュベーションすることによって誘導される。活性化されたＣＴＬは次に増殖させられ、その後患者に再投与される。あるいは、ＡＰＣにＢ９９ペプチドを装荷してもよい。それにより、Ｂ９９陽性腫瘍に対する細胞性免疫応答の効率的な活性化が起こり得る（Ｍａｙｏｒｄｏｍｏら、１９９５；Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、１９９６）。細胞、例えば樹状細胞上へのペプチド装荷の適切な方法の一つはＷＯ ９７／１９１６９に開示されている。
本発明の一つの実施態様においては、異なるいくつかのＢ９９ペプチドまたはＢ９９ペプチド等価物の組み合わせが使用される。他の実施態様では、Ｂ９９ペプチドは他のＴＡＡに由来するペプチドと合わされる。その様な組み合わせのためのペプチドの選択は、種々の異なる腫瘍抗原由来のペプチドを合わせることにより、最も広範囲の患者集団をカバーするために種々のＭＨＣ型を検出するという観点から行われ、および／または可能な最も広範な症例スペクトルを目的として行われる。医薬組成物中のペプチドの数は広範囲に変動し得るものであるが、典型的には臨床的に有用なワクチンは１〜１５好ましくは３〜１０の異なるペプチドを含む。
【００３０】
本発明のペプチドはまた診断試薬として使用することもできる。例えば、本ペプチドは、免疫原性ペプチドによって引き起こされる液性または細胞性免疫応答に対する患者の応答性をテストするために使用することができる。これは治療手順を改善する可能性を提供するものである。例えば、ＴＡＡの投与形態（ペプチド、総タンパク質またはＤＮＡワクチン）に依存して、同定したペプチドエピトープに対する反応性を示すＰＢＬ中のＴ細胞前駆体の増加を調べることができる（ＲｏｂｂｉｎｓとＫａｗａｋａｍｉ、１９９６および、これに引用される文献）。更に、ペプチドまたは総タンパク質またはＴＡＡに向けられた抗体はＢ９９陽性腫瘍の進行を特性付けるために使用できる（例えば１次腫瘍および転移の免疫組織化学的解析による）。この種のストラテジーは多くの場合に成功することが証明されている；例えば乳癌における内分泌療法を行う判断の基礎としてのエストロゲンレセプターの検出；乳癌における予後および治療過程における関連マーカーとしてのｃ−ｅｒｂＢ−２（Ｒａｖｉａｉｏｌｉら、１９９８；Ｒｅｖｉｌｌｉｏｎら、１９９８）；前立腺癌の上皮細胞に対する血清中マーカーとしてのＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、または前立腺癌に対する免疫シンチグラフィーにおけるＰＳＭＡに対する１１１Ｉｎ標識モノクローナル抗体の使用によるもの（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９８およびそれに含まれる文献）；大腸癌にかかった患者における予後および進行に関する血清学的マーカーとしてのＣＥＡ（癌胎児性抗原）（ＪｅｓｓｕｐとＬｏｄａ、１９９８）。
【００３１】
他の側面により、本発明はＢ９９の免疫原性特性を有するタンパク質またはその断片をコードする単離ＤＮＡ分子に関する。
一つの側面において、本発明は配列番号１に示した配列を有するポリヌクレオチドを含む、または、ストリンジェントな条件下で配列番号１に示した配列のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離ＤＮＡ分子である。
本発明において「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、５０％ホルムアミド、５ｘ ＳＳＣ（１ｘ ＳＳＣ＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩インキュベーションし、続いてフィルターを０．１ｘ ＳＳＣで約６５℃にて洗浄する条件、またはこれと等価な条件を言う。
他の側面において、本発明は配列番号３（または配列番号５）に示した配列を有するポリヌクレオチドを含む、または、ストリンジェントな条件下で配列番号３（または配列番号５）に示した配列のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離ＤＮＡ分子である。
【００３２】
本発明のＤＮＡ分子またはその断片は、配列番号２、配列番号４または配列番号６に示したアミノ酸配列を有するＢ９９と命名された（ポリ）ペプチド（Ｂ９９−１、Ｂ９９−２またはＢ９９−３）またはそれに由来するタンパク質断片若しくはペプチドをコードする；これには、遺伝子コードの縮退の結果として配列番号１、配列番号３または配列番号５に示した配列からの変異を示すＤＮＡ分子が含まれる。
本発明はまた、腫瘍ワクチンとしての使用に関して望ましい免疫原性特性を有するＢ９９誘導体または断片又はペプチドをコードするならば、アミノ酸の保存的置換によって生じる配列番号１または配列番号３（または配列番号５）に示した配列からの逸脱を有するＤＮＡ分子に関する。
上で定義した、Ｂ９９−１、Ｂ９９−２またはＢ９９−３またはそれらの断片をコードする、場合により改変されていてもよいＤＮＡ分子は、以下では特に断らない限り「Ｂ９９−ＤＮＡ分子」という。
本発明のＢ９９−ＤＮＡ分子または、これも本発明の主題である対応するＲＮＡは、それらによってコードされる（ポリ）ペプチドと同様に、癌疾病の免疫療法のために使用される。
【００３３】
本発明の一つの実施態様では天然のＢ９９ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子が使用される。天然のＢ９９ ｃＤＮＡまたはその断片の代わりに、改変した誘導体を使用することもできる。これらには、より大きな免疫原性を有するタンパク質（断片）またはペプチドをコードする改変を有する配列が含まれ、一方、上述したペプチドに適用されるのと同じ考察がＤＮＡレベルの改変に適用される。他の型の改変は、数珠のように免疫的に関連のあるペプチドをコードする多数の配列を並べることである（Ｔｏｅｓら、１９９７）。配列はまた、免疫原のより効率的な放出とプロセッシングを保証する補助的要素を追加することによって改変してもよい（Ｗｕら、１９９５）。例えば、抗原のプロセッシングおよび、従って抗原の提示および最終的な免疫原性はエンドプラズミックレティキュラムへの局在配列（「ＥＲ標的化配列」）を追加することにより増大させることができる。
【００３４】
他の側面では、本発明はＢ９９−ＤＮＡを含む組換えＤＮＡ分子に関する。
本発明のＢ９９−ＤＮＡ分子は、好ましくはプラスミドとして組換え形態で直接、または組換えウイルス若しくはバクテリアの一部として投与してよい。理論的には、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏのどちらのいても、どんな遺伝子治療方法もＤＮＡ（ＤＮＡワクチン）、Ｂ９９−ＤＮＡに基づく癌免疫療法のためにも使用し得る。
Ｉｎ ｖｉｖｏ投与の例は、筋肉内経路による、あるいは遺伝子銃を用いた「裸の」ＤＮＡの直接注入であり、これは腫瘍抗原に対するＣＴＬの形成をもたらすことが示されている。組換え体生物の例はワクシニアウイルス、アデノウイルス又はリステリア単球遺伝子（ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅ）である（概説がＣｏｕｌｉｅ（１９９７）によって与えられている）。さらに、カチオン性脂質、微小球体、微小ペレットまたはリポソームのような核酸用の合成担体をＢ９９ペプチドをコードする核酸分子のｉｎ ｖｉｖｏ投与のために使用してもよい。ペプチドの場合のように、免疫応答を増強する、サイトカインのような種々のアジュバントを投与してもよく、アジュバントはタンパク質の形であってもそれをコードするプラスミドの形であってもよい。この適用は場合により物理的な方法、例えばエレクトロポレーションと組み合わせてもよい。
【００３５】
ｅｘ ｖｉｖｏ投与の例は、Ｔｕｔｉｎｇ（１９９７）によって記載されたような樹状細胞のトランスフェクション、または細胞性癌ワクチンとして使用される他のＡＰＣのトランスフェクションである。
従って、他の側面によれば、本発明は癌ワクチン製造のための、対応するコード配列でトランスフェクション後、Ｂ９９自体または場合によりその改変された形態を発現する細胞の使用に関する。
他の側面では、本発明はＢ９９又はその断片に対する抗体に関する。ポリクローナル抗体は動物、特にウサギを免疫することによって、抗原又はその断片を注射し、続いて免疫グロブリンを精製することによって慣用的に得られる。
モノクローナル抗Ｂ９９抗体はＫｏｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）によって記載された原理に従った標準的な方法により、動物特にマウスを免疫し、免疫動物の抗体産生細胞を、例えばミエローマ細胞と融合させることにより不死化し、得られたハイブリドーマの上清を免疫学的に標準的なアッセイにより抗Ｂ９９抗体についてスクリーニングすることによって得ることができる。ヒトにおける治療的又は診断適使用のために、これらの動物抗体は場合により通常のやり方でキメラ化（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４， Ｂｏｕｌｉａｎｎｅら、１９８４）しても、ヒト化（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８、Ｇｒａｚｉａｎｏら、１９９５）してもよい。
【００３６】
ヒトモノクローナル抗Ｂ９９抗体（またはその断片）はいわゆるファージディスプレイライブラリー（Ｗｉｎｔｅｒら、１９９４、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、１９９４、Ｋｒｕｉｆら、１９９５、Ｍｃ Ｇｕｉｎｅｓｓら、１９９６）から、およびトランスジェニック動物（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、１９９６、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９９５）によっても得ることができる。
本発明の抗Ｂ９９抗体は診断目的の免疫組織学的分析に使用することができる。
他の側面において、本発明は、Ｂ９９を発現する腫瘍に対してまたはその中へ所望の物質を選択的に与えるためのＢ９９特異的抗体の使用に関する。そのような物質の例は、細胞障害性試薬または放射活性原子核であり、その活性がｉｎ ｓｉｔｕで腫瘍を損傷することにある物質である。Ｂ９９の腫瘍特異的発現のために、副作用は全くまたはほとんど予想しえない。他の側面によれば、Ｂ９９を発現する細胞を顕在化させるための物質をＢ９９抗体の助けと共に使用してもよい。これは診断および治療の評価のために有用である。抗Ｂ９９抗体に応用できる治療的および診断的な抗体の使用はＷＯ ９５／３３７７に記載されている。
【００３７】
Ｂ９９と命名された本発明のＴＡＡおよびそれに由来するタンパク質断片、ペプチドまたはペプチド等価物またはペプチド擬似物は癌治療、例えば、対応する抗原決定基を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導するために使用することができる。これらは、好ましくは、Ｂ９９−陽性腫瘍、特に、腎臓細胞、肺、大腸、膵臓、乳および胃の癌の治療のために使用される。
腫瘍細胞におけるＢ９９の優先的発現のために、このタンパク質は腫瘍にとって重要な機能、例えば、腫瘍形成、浸潤及び増殖などの機能を有することが仮定される。従って、Ｂ９９（ＤＮＡ）はこのタンパク質の活性を調節、特に阻害する物質を同定するためのスクリーニングアッセイに使用することができる。ある実施態様では、そのようなアッセイは、Ｂ９９タンパク質またはその活性な断片を細胞に導入すること、または、Ｂ９９−ＤＮＡを細胞中で発現させること、およびテスト物質の存在下または非存在下における細胞の増殖を測定することを含む。増殖阻害性効果を有する物質はＢ９９の強い発現を有する腫瘍、特に、肺癌、大腸癌、乳癌、腎臓細胞癌およびホジキンリンパ腫の治療に使用することができる。
【００３８】
（実施例）
実施例１．ヒト肺腺癌細胞株（Ａ５４９）と正常肺組織のＲＤＡ（提示的差異解析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ））
ＡＴＣＣより入手したヒト肺腺癌細胞株Ａ５４９（ＣＣＬ１８５）をＴ１５０細胞培養フラスコで培養した。使用した培地は、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清および２ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加したＭＥＭである。細胞を増殖させるため、３〜４日ごとに細胞をトリプシン処理によって１：５〜１：１０に分けた。約８０％コンフルエントになった後、４ｍｌのトリプシン溶液（１Ｌあたり、８ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＫＣｌ、１．１３ｇの無水Ｎａ２ＨＰＯ４、０．２ｇのＫＨ２ＰＯ４、１００ｍｌの２．５％トリプシン溶液および１ｇのＥＤＴＡ−Ｎａ塩；ｐＨ７．２〜７．４）を各Ｔ１５０細胞培養フラスコに加えて、細胞を収集した。４ｍｌを１５ｍｌ Ｆａｌｃｏｎ試験管に移し、８ｍｌのＰＢＳを添加し、この混合物をＨａｅｒｅｕｓ卓上遠心機（Ｍｅｇａｆｕｇｅ ２．０Ｒ）にて１２００ｒｐｍで４℃にて５分間遠心し、細胞ペレットを１ｍｌの溶解バッファー（１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ ｐＨ８、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５％ ＮＰ４０）と混合し、激しく撹拌し、２ｍｌエッペンドルフ容器内で１２００ｒｐｍで４℃にて５分間Ｓｉｇｍａ卓上遠心機（Ｓｉｇｍａ、２０２ ＭＫ）で遠心した。
【００３９】
上清を別のエッペンドルフ容器に移し５５μｌの２０％ＳＤＳ溶液を加えた後、２倍体積のＣＨＣｌ３／フェノール（１：１ ｖ／ｖ）混合物で抽出し、同じ体積のＣＨＣｌ３で抽出した。ＲＮＡを含む水性相を１／１０体積の３Ｍ ＮａＡｃ（ｐＨ５）および２倍体積の９６％エタノールと混合し、ＲＮＡを−２０℃にて一晩沈殿させた。１ｍｇの全ＲＮＡから出発して、業者の指示に従い、ＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてポリＡ（＋）ＲＮＡを単離した。Ａ５４９ポリＡ（＋）ＲＮＡの保存は、ＤＥＰＣ−処理水中１ｍｇ／ｍｌの濃度で、小分けして−８０℃で行った。
提示的差異解析（ＲＤＡ；ＨｕｂａｎｋとＳｃｈａｔｚ、１９９４；Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏら、１９９６）を行うため、肺腺癌細胞株Ａ５４９のポリＡ（＋）ＲＮＡをテスターとして用い、一方、正常肺組織のポリＡ（＋）ＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ；＃６５２４−１）をドライバーとして使用した。ＲＤＡはＰＣＲ−ｓｅｌｅｃｔＴＭキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）を用いて、以下の配列を有する改変プライマー／アダプター−２−オリゴヌクレオチド系を使用したことを除いて業者の指示に従って行った：
５’− ＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧ −３’（アダプター−２−ａｌｔ−１；配列番号１９）、５’− ＡＧＧＧＣＧＴＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＧ −３’ （入れ子ＰＣＲプライマー−２−ａｌｔ；配列番号２０）、および、５’− ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＴＣ −３’（アダプター−２−ａｌｔ−２；配列番号２１）。新たに作製したプライマー／アダプター配列は、入れ子ＰＣＲプライマー−２−ａｌｔの配列中の３つの制限酵素切断部位（ＫｐｎＩ、ＳａｃＩおよびＸｈｏＩ）の存在により、サブトラクションしたｃＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩベクターにクローニングした後に関連するｃＤＮＡ断片を切り出すことを可能にする。従って、多数の利用可能な制限酵素切断部位を有するプライマー／アダプター配列を設計することが必要である。なぜなら、ＰＣＲ−増幅工程によって点変異がしばしば観察され、特にプライマー配列中に観察されるからである。
【００４０】
オリゴｄＴを用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成した後、テスターおよびドライバーから得られたｃＤＮＡをＲｓａＩで消化した（ＲｓａＩは４塩基認識制限酵素であり、統計学的平均として２５６ｂｐ長の断片を生じさせる）。テスターｃＤＮＡの等価部分をアダプター１または２とライゲーションし、別個に過剰量のドライバーｃＤＮＡと６５℃でハイブリダイズさせた。次にこの２つの混合物を合わせ、新たに変性させたドライバーＤＮＡと第２のハイブリダイゼーションにかけた。濃縮されたテスター特異的ｃＤＮＡを次にアダプター１または２に特異的なプライマーを用いてＰＣＲによって指数関数的に増幅した。更なる濃縮のため、この反応からのアリコートを特異的な内部シフト（入れ子）プライマーで第２のＰＣＲにかけた。この反応によって指数関数的に増幅されたｃＤＮＡ断片をｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；「ＴＡクローニングベクター」）に直接ライゲーションし、次に、ライゲーション混合物の１／３をコンピテント大腸菌（ＯｎｅＳｈｏｔＴＭ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションした。
【００４１】
７１２個の陽性形質転換体（青−白選抜）が得られ、９６ウェルブロック中、ＬＢ−Ａｍｐ培地（ウェルあたり１．３ｍｌ）で３７℃にて４８時間培養した。プラスミドＤＮＡ調製のため（業者の指示に従った、ＱＩＡｇｅｎの９６−ウェル微量調製法）ウェルあたり７５０μｌの大腸菌懸濁液を使用した。残りのバクテリア培養物はグリセリン保存培養物として−８０℃に保存した。
７１２の個々のクローンからなるｃＤＮＡサブトラクションライブラリーが得られ、それぞれ大腸菌グリセリン保存培養物および精製プラスミドの両方の形態で存在させた。
【００４２】
実施例２．ＴＡＡ候補のＤＮＡ配列およびアノテーション
７１２個の全てのクローン（実施例１参照）から単離したプラスミドＤＮＡをサンガー法により、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ装置を用いてシーケンシングした。得られた配列をＢｉｏＳｃｏｕｔソフトウエア（ＬＩＯＮ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を用いてアノテーションし、データバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）比較にかけた。７１２個のクローンのうち、６７８個をシーケンシングし注釈をつけることができた。残り（３４）はポリＡのみを挿入として含むか、再結合したベクターに対応するものか、またはシーケンシングできなかった。アノテーションできた６７８個の配列のうち、３５７は既知の機能を有する遺伝子であることが分かった。残りの３２１個は未知の機能の遺伝子をコードするクローンを表していた；これらのうちの５９個はヒトＥＳＴデータバンクにエントリーすら無かった。既知の遺伝子はそれ以上処理しなかった。
【００４３】
ＥＳＴエントリーが入手可能な未知の遺伝子については、発現プロファイルを評価した：実験的に決定された対応するサブトラクションライブラリーの配列に属する、９５％より大きな同一性を有するＥＳＴ（ＢＬＡＳＴ）を調べた。アノテーションにおいて、ｉ）決定的正常組織、ｉｉ）胎児性、「使い捨て可能」な、および、免疫特権的組織およびｉｉｉ）腫瘍および腫瘍細胞株、に細分化した。この「仮想的ｍＲＮＡプロフィール」に基づいて、ＥＳＴがグループｉ）に見出されなかった２００個のクローンを更なる実験的解析のための選抜した（ＥＳＴエントリーがなかった５９クローンを含む）。更に候補クローンを絞り込むために、２００個の選抜クローンから決定された配列からオリゴヌクレオチドプライマー対を設計して合成した。まず初めに、ｐＣＭＶ ＳＰＯＲＴ中に方向付けてクローニングされている、ヒト組織から由来する８種の異なるｃＤＮＡライブラリー（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ）を、問題にしている候補クローンの存在について定性的ＰＣＲによってテストした。用いたｃＤＮＡライブラリーは、心臓組織（＃１０４１９−０１８）、肝臓（＃１０４２２−０１２）、白血球（＃１０４２１−０２２）、腎臓（＃１０４２０−０１６）、肺（＃１０４２４−０１８）、精巣（＃１０４２６−０１３）、脳（＃１０４１８−０１０）および胎児脳（＃１０６６２−０１３）に由来するものであった。
【００４４】
ＰＣＲ条件は以下の通りである：総量２０μｌの各ＰＣＲ混合物中、１ｘＴａｑＰｏｌバッファー（５０ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ　ｐＨ９、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、０．０２５Ｕ／μｌ Ｔａｑ−ＤＮＡ−ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５ｐＭの特異的オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号７および配列番号８）および調べるべき１００ｎｇのプラスミドＤＮＡを含む。対照として、ＧＡＰＤＨに特異的なプライマー（配列番号１４および１５）を使用した。選択性の証拠を検査するため、このプライマー対は単離プラスミドについても並行してテストした。これらのＰＣＲ条件（１サイクル：３’　９４℃；３５サイクル：１’ ９４℃−１’ ５５℃−１’ ２２℃；１サイクル：７’ ７２℃）において、正常な決定的組織（心臓、肝臓、肺、腎臓および白血球）のひとつにおいて予想された長さの断片が検出されるが、免疫特権的組織（脳、胎児脳および精巣）において検出されないことを選抜基準として定義した。この定性的ＰＣＲ解析を用いて、多数の候補を５６にまで絞ることができた。
【００４５】
実施例３．種々の腫瘍および正常組織における候補クローンの転写解析
ＲＴ−ＰＣＲ解析のために、同型の３種の異なる組織からの３μｇの全ＲＮＡから調製したｃＤＮＡプールを使用した。腫瘍または正常組織プールあたり９μｇの全ＲＮＡをＡＭＶ−ＲＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって業者の推奨に従って逆転写した。ゲノムＤＮＡの混入を防ぐため、ＲＮＡは前もってＤＮＡｓｅ Ｉ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とインキュベーションした。ｃＤＮＡの質および量はＧＡＰＤＨ特異的プライマー（配列番号１４および１５）を用いたＰＣＲによる２０サイクル後（３０”、９５℃、９０” ６０℃）にテストした。Ｂ９９−ｃＤＮＡは配列番号７および８に記載のＢ９９−特異的プライマーで、１’ ９５℃、１’ ５５℃、１’ ７２℃のプログラムの２５、３０および３５サイクルによって増幅した。他の５５の候補クローンを特異的プライマーを用いて同様に調べた。
【００４６】
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色によって検出した。調べた５６個のクローンの３つについて、ＲＴ−ＰＣＲは正常組織に比較して種々の腫瘍組織において発現が増大していることを明らかにした。候補の例、Ｂ９９を図１に示した：種々のヒト腫瘍および正常組織のｃＤＮＡプールのＢ９９特異的プライマーによる解析は、大腸癌および肺腺癌細胞株Ａ５４９において強いシグナルを生成し、乳癌および腎臓細胞癌において弱いシグナルを生成した。調べた全ての正常組織について、弱いシグナルが大腸組織に見られただけであった。候補Ｂ９９を以後更に詳細に評価した。
【００４７】
実施例４．腫瘍及び正常組織におけるＢ９９の発現プロファイル
５６個の候補の一つ（Ｂ９９と命名）はＲＴ−ＰＣＲ転写により、調べた５つの腫瘍組織プールの３つにおいてシグナルを示した。一方、調べた正常組織の大部分では、転写を検出することはできなかった。Ｂ９９発現のより詳細な研究のため、個々の腫瘍および正常組織サンプルのｃＤＮＡを以下のようにＰＣＲによって解析した。調べた全ての大腸癌の大部分（１７／２３）、全ての膵臓癌（３／３）および全ての胃癌（４／４）がＢ９９を発現していることが見いだされた。対応する正常組織では、それぞれ事例の１／４、０／３および２／４で発現が検出された。全ての結果は表１に示してあり、一方図２には膵臓および大腸癌における結果例を示した：種々のヒト腫瘍および正常組織の個々のｃＤＮＡのＢ９９特異的プライマーによるＲＴ−ＰＣＲ解析によって、Ｂ９９−ｃＤＮＡを７つの腫瘍サンプルのうち６つで検出することができたが、調べた正常組織のうち１つだけ（１／６）がＢ９９の弱いシグナルを示した。
【００４８】
【表１】
表１．
2004500024.tif 000003
【００４９】
ノーザンブロット解析のため、ヒト複数組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）を６５℃にて１６時間、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（ＮＥＮ、Ｂｏｓｔｏｎ）で標識した２７１ｂｐ Ｂ９９ ＰＣＲ産物とハイブリダイズさせた。視覚化は標準的なオートラジオグラフィー（Ｘｍｏｔ ＡＲフィルム、Ｋｏｄａｋ）およびホスフォ画像解析装置（Ｍｏｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）への曝露によって行った。図３は、１６の正常組織の解析結果を示す。〜３．０ｋｂの大きさの転写物が大腸、および、ずっと弱いが十二指腸においてのみ見られた。シグナルの強度が弱いことは、免疫学的に関連する発現はありそうにないという結論を導く。
Ｂ９９のｍＲＮＡプロファイルに関する全てのテスト（ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロット解析を合わせたもの）を表１にまとめた。実施例４は、種々の指標の腫瘍の高いパーセンテージにおいてＢ９９は明瞭に発現されているが、調べた全ての正常組織において転写は全くまたは限られた事例にしか見られないことを示すものである。
【００５０】
実施例５．ヒト腫瘍におけるＢ９９タンパク質発現の検出
Ｂ９９タンパク質発現を検出するため、Ｂ９９特異的抗体をウサギで作製した。免疫のため、バクテリア融合タンパク質ｐＧＥＸ−ＯＲＦ−１／１（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼがＢ９９ ＯＲＦの一部（配列番号１の位置１２７８〜１７４０）に融合している）を使用した。得られた血清をペプチドＢ９９−ＫＭＬ（配列番号６１）でアフィニティー精製した。この血清の特異的反応性を調べるために、完全なＢ９９オープンリーディングフレームをＣＯＳ細胞中でＧＦＰ融合タンパク質として一過性に発現させ、トランスフェクションした細胞をウエスタンブロットでこの血清を用いてテストした。この血清は発現されたＢ９９融合タンパク質と明瞭に反応することが示された。続いて、種々の腫瘍型からの５６個のサンプルをＢ９９発現についてＢ９９血清を用いた免疫組織化学により調べた（表２）。
【００５１】
５３例でＢ９９の発現が腫瘍細胞中において示された。その例は図４に見ることができる。図４は、腺癌の４つの異なる症例（ａ．大腸、ｂ．乳、ｃ．膵臓、ｄ．胃）の免疫組織化学解析を示している。全ての症例において腫瘍細胞の明瞭な染色を見ることができ、一方、腫瘍ストロマおよび血管は染色されなかった。図４ａからは、残存する正常大腸粘膜はこの抗体と反応性を示さないことも見ることができる。切片をヘマトキシリンで対比染色した。選択した症例において、免疫組織化学における陽性反応性はＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＡレベルで確認した。この実験では、乳癌も陽性ＰＣＲシグナルを発生させた。実施例４とこの結果との相違は、実施例４におけるのと異なるＰＣＲプライマ−の使用によって説明することができる。
【００５２】
【表２】
表２．
2004500024.tif 000004
【００５３】
実施例６．Ｂ９９のクローニング
クローンＢ９９はＲＤＡによって導入されたアダプター間に２７１ｂｐ長の未知のヒト遺伝子の挿入を有している。ヒト配列を完全にクローニングするために、以下の手順を用いた：ＵｎｉＧｅｎｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ（国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））はＢ９９に相同な以下のＥＳＴを生成した：ＡＡ３１５４６９、ＡＡ３４５７８０、ＡＡ２９５５２０。これらのＥＳＴを用いて、Ｂ９９の配列を４３９ヌクレオチドまで拡張することができた。この配列内の新たなプライマーを合成した（配列番号９から１２）。これらのプライマーの種々の組み合わせを用いたＰＣＲにより、Ａ５４９ ｃＤＮＡから理論的断片長を増幅することができた。
【００５４】
３’末端のクローニング：腎臓細胞癌細胞株７８６−０からの１０μｇの全ＲＮＡをオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写し、このｃＤＮＡのアリコートをＰＣＲにかけた。ＰＣＲのプログラムは、遺伝子特異的プライマーのみがｃＤＮＡに結合するように（プライマー、配列番号７または９）高いアニーリング温度で開始し、、一方第２のプライマー（Ｔｍ〜５３℃、配列番号１３）が低い温度で新たに合成されたＤＮＡ基質にのみ結合するようなものである。このいわゆる「タッチダウンＰＣＲ」（Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ Ｇｒａｄｉｅｎｔ， Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を以下の条件で行った：２０サイクルの｛１５” ９５℃、３０” ７５℃（サイクルごとに０．７℃低下）｝、１サイクルの７’ ７２℃および２０サイクルの（１５” ９５℃、３０” ５０℃）、１サイクルの７’ ７２℃。
【００５５】
上記混合物のアリコートを第２のプライマーの組み合わせ（配列番号７および１３、または配列番号１２および１３）を用いて前と同じ条件でもう一度ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ混合物のアリコートをｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ−ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に直接ライゲーションし、続いてこれでコンピテント大腸菌Ｊ１０９（Ｐｒｏｍｅｇａ）を形質転換した。ＰＣＲ選抜後、陽性クローンをシーケンシングした。シーケンシングはＰＣＲ増幅に用いたプライマーから得られる前の配列と矛盾せず、加えてこの配列の３’−領域のポリＡの開始部位に至る１７７７の追加のヌクレオチド配列をもたらした。腫瘍細胞株（７８６−０、Ａ５４９）および大腸癌からの組織サンプルのｃＤＮＡの、配列番号１６〜１８記載のプライマーを用いたＰＣＲは、最初のプライマーと共に、クローニング後に予想される断片を作り出した。ここで２２１６ｂｐとなったｃＤＮＡ断片中、位置４２７から１７４３に連続したリーディングフレームを同定することができた。この配列の５’−領域中に更なるリーディングフレームを同定することができなかったので、０〜４２７の領域がＢ９９ ｍＲＮＡの５’−非翻訳領域に属すると結論される。
【００５６】
配列番号１２および配列番号１７のプライマーを用いて、Ａ５４９−ｃＤＮＡからＢ９９の全コード領域を増幅し、クローニングし、およびシーケンシングした。シーケンシングにおいて、配列番号１（Ｂ９９−１をコードする）と比較して位置９２３にヌクレオチドの挿入を有する多数のクローンが得られた（配列番号３または配列番号５）。
この挿入はＢ９９のオープンリーディングフレームに変化を生じさせ、その結果としてＢ９９タンパク質のＣ−末端領域中のアミノ酸配列変化を生じさせる；このリーディングフレームに由来するＢ９９抗原（Ｂ９９−２）の配列を配列番号４に示した。
Ａ５４９細胞から単離したクローンの一つは、上述した挿入に加えて、配列番号１に比較して位置６２２にヌクレオチド置換を示した。このヌクレオチド置換は、アミノ酸配列の位置６６番において、アルギニン（配列番号２，Ｂ９９−１）のトリプトファン（配列番号４、Ｂ９９−２）による置換を生じさせる。このアミノ酸置換を別にすれば、Ｂ９９−２のアミノ酸配列はＢ９９−１と位置１６６まで同一である。
更に、上述した挿入は配列番号３（または配列番号５）に示した配列において位置８４５〜１７４４の第２の潜在的リーディングフレームを生じさせる。このリーディングフレームを有するｃＤＮＡによって発現されるタンパク質は配列番号６に示したアミノ酸配列を有する（Ｂ９９−３）。Ｂ９９−３の配列は、Ｂ９９−１と位置１〜２７が異なっており、位置２８以降はＢ９９−１と同一である。
【００５７】
実施例７．Ｂ９９のコード領域中の潜在的ＭＨＣ−結合ペプチド
配列番号２に記載のＢ９９−１のコード領域（アミノ酸位置：１−４３８；表３Ａ）、配列番号４に記載のＢ９９−２のコード領域（アミノ酸位置：１５０−１９０；表３Ｂ）および、配列番号６に記載のＢ９９−３のコード領域（アミノ酸位置：１−４０、表３Ｃ）内の可能性のあるペプチドエピトープを、Ｐａｒｋｅｒら、１９９４によって記載されたアルゴリズムを用いて既知のモチーフ（Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、１９９５）に基づいて処理した。最も重要なＨＬＡ型、特にＨＬＡ−Ａ１、−Ａ＊０２０１、−Ａ３、−Ｂ７、−Ｂ１４および−Ｂ＊４４０３について、９ｍｅｒ候補ペプチドを同定した。これらは対応するＨＬＡ分子に結合することが期待され、従って、免疫原性ＣＴＬ−エピトープを構成することが期待される；発見されたペプチドは表３に列挙した。他のＨＬＡ型に関する他の可能性のあるペプチドエピトープまたは、８ｍｅｒおよび１０ｍｅｒペプチドを同様な手順で決定することができる。
【００５８】
【表３】
表３Ａ．免疫原性Ｂ９９ペプチド候補（Ｂ９９−１）
2004500024.tif 000005
【００５９】
【表４】
表３Ａ続き
2004500024.tif 000006
【００６０】
【表５】
表３Ｂ．免疫原性Ｂ９９ペプチド候補（Ｂ９９−２）
2004500024.tif 000007
【００６１】
【表６】
表３Ｃ．免疫原性Ｂ９９ペプチド候補（Ｂ９９−３）
2004500024.tif 000008
【００６２】
実施例８．可能性のあるＢ９９特異的ＭＨＣ結合ペプチドによるＭＨＣ安定化アッセイ
Ｔ２ペプチド装荷アッセイにおいて、ＨＬＡ−Ａ２分子を安定化させる能力について潜在的Ｂ９９ ＭＨＣ結合ペプチドをテストした。これはペプチドのＭＨＣ結合能のヒントとなる。このアッセイは、Ｂｏｈｍら（１９９８）によって記載されたように行った。ＨＬＡ−Ａ２特異的抗体（ＢＢ７．２）を用いてＦＡＣＳ解析によって安定化を測定した。５つのペプチドが、ペプチドを含まないかまたは結合しないＭＡＧＥ−３ Ａ１対照ペプチドを含む対照と比較して平均蛍光強度が増加したことによって示される、安定化効果を示した。
【００６３】
【表７】
表４．
2004500024.tif 000009
【００６４】
更なる解析のため、これらの結合が濃度依存性であるかどうかを調べるためペプチドを系列希釈し、同じ試験系でテストした。図５は、種々のＢ９９ペプチド濃度におけるＴ２細胞上のＭＨＣ安定化を示す。チロシナーゼを陽性対照として使用し、ＨＬＡ−Ａ１−特異的ＭＡＧＥ−３ペプチドを陰性対照として使用した。特に、ペプチドＢ９９−１９、Ｂ９９−１８７およびＢ９９−２０９はＭＨＣ安定化について明瞭な濃度依存性を示した。このことは、それらのペプチドを免疫ストラテジーのための好ましい候補とするものである。
【００６５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
Ｂ９９特異的プライマーを用いた種々のヒト腫瘍組織および正常組織ｃＤＮＡプールのＲＴ−ＰＣＲ解析。
【図２】
Ｂ９９特異的プライマーを用いた種々のヒト腫瘍組織および正常組織の個々のｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析。
【図３】
正常組織におけるＢ９９の転写：１６の正常組織からのｍＲＮＡのノーザンブロット解析。
【図４】
Ｂ９９血清による、４つの異なる腺癌症例の免疫組織化学解析。
【図５】
種々の濃度のＢ９９ペプチドによるＴ２細胞上のＭＨＣ安定化。
【図１】
2004500024.tif 000010
【図２】
2004500024.tif 000011
【図３】
2004500024.tif 000012
【図５】
2004500024.tif 000013
【国際公開パンフレット】
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2004500024.tif 000015
2004500024.tif 000016
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004500024.tif 000082
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【国際調査報告】
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