(57)【要約】本発明は以下の工程を含む抗原提示細胞の作成方法を開示する：ａ．対象から該細胞を収集する工程、ｂ．該収集した細胞を活性化する工程；ｃ．該活性化された細胞を生体外で培養し、所望により増加させる工程；ｄ．該培養し、所望により増加させた細胞を、ＤＮＡ低メチル化剤で処理して該細胞に同時に複数の腫瘍関連抗原を発現させる工程。本発明の方法により入手可能な細胞、およびその細胞成分は、単独であるいは該細胞と組合せて、該細胞に発現している複数の腫瘍関連抗原の１または複数を構成的に発現する様々なヒストタイプの悪性腫瘍の予防および治療に有用である。便宜に、該細胞および／または細胞成分をワクチンの形態にすることができる。該ワクチンは、同時に複数の／すべてのメチル化−制御された腫瘍関連抗原を発現する点で従来技術のものより有用である。
2004536615.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む抗原提示細胞の作成方法：
ａ）対象から該細胞を収集する工程、
ｂ）該収集した細胞を活性化する工程、
ｃ）生体外で該活性化した細胞を培養および所望により増加させる工程、
ｄ）該培養および所望により増加させた細胞をＤＮＡ低メチル化剤で処理して該細胞から同時に複数の腫瘍関連抗原を発現させる工程。
【請求項２】
該対象が哺乳類である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該対象がヒトである請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該対象が癌患者である請求項２に記載の方法。
【請求項５】
該細胞が免疫細胞である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
該細胞が非免疫細胞である請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
該細胞が共有免疫優性癌抗原を発現する請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該細胞が共有非免疫優性癌抗原を発現する請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
該細胞がエプスタイン・バーウイルス−不死化Ｂ−リンパ芽球腫細胞系である、請求項１から５、７、８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
該細胞がヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）−活性化Ｂ−リンパ球である、請求項１から５、７、８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
該細胞がＣＤ４０活性化Ｂ−リンパ球である、請求項１から５、７、８のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
該細胞がフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）＋組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２）−活性化ＰＢＭＣである、請求項１から５、７、８のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
該細胞がフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）＋組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２）＋ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）−活性化ＰＢＭＣである、請求項１から５、７、８のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
該細胞が樹状細胞、単球、マクロファージである、請求項１から４、６から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
該細胞がＣＤ３４＋細胞、線維芽細胞、幹細胞、線維芽細胞および角化細胞である、請求項１から４、６から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
工程ｄ）においてヒストン脱アセチル酵素阻害剤を使用する、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡ低メチル化剤が５−アザ−シチジンまたは５−アザ−２’−デオキシシチジンから選択される、請求項１から１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれかに記載の方法によって得られる細胞。
【請求項１９】
１または複数の癌抗原を構成的に発現する様々なヒストタイプの悪性腫瘍の予防および治療のための、請求項１８に記載の細胞および／またはその細胞成分の使用。
【請求項２０】
該共有癌抗原が免疫優性癌抗原である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
該共有癌抗原が非免疫優性である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２２】
該癌抗原が癌精巣抗原である、請求項１８に記載の使用。
【請求項２３】
該細胞がプールされた抗原の貯蔵所として保存される、請求項１９から２２のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
癌ワクチン用の請求項２３に記載のプールされた抗原。
【請求項２５】
請求項１８に記載の細胞を含む癌ワクチン。
【請求項２６】
該ワクチンが自己由来である請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２７】
該ワクチンが同種由来である請求項２５に記載のワクチン。
【請求項２８】
細胞が請求項２３に記載のように使用される、請求項２７に記載のワクチン。
【請求項２９】
請求項１９に記載の細胞成分が使用される、請求項２７または２８に記載のワクチン。
【請求項３０】
エフェクター免疫細胞の作成方法における請求項１８に記載の細胞および／またはその細胞成分の使用であって、該エフェクター免疫細胞が養子免疫治療に有用な産物の調製のために用いられる使用。
【請求項３１】
請求項２５から２９のいずれかに記載のワクチンおよび低メチル化剤の全身的投与に好適な医薬組成物を含む製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医学分野、特にヒトまたは動物の対象の治療方法に有用な製品、物質および組成物に関し、より具体的には癌の診断、治療、および予防に関する。本発明は、癌ワクチンおよびその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々のヒストタイプ(histotype)の形質転換細胞によって構成的に発現される数々の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が近年同定されている(Renkvist N. et al. Cancer Immunol. Immunother. 50: 3-15、2001)。
【０００３】
これらＴＡＡの多くは、特定のＨＬＡクラスＩ同種特異体(allospecifities)に関してＣＤ８＋細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識される複数の免疫優性抗原ペプチドを提供し得る(Renkvist N. et al. Cancer Immunol. Immunother. 50: 3-15、2001);さらに選択されたＴＡＡ、例えば、ＭＡＧＥ(Jager E. et al.、J. Exp. Med. 、187 :265-270、1998)、ＮＹ−ＥＳＯ−１（Jager E. et al.、J. Exp. Med. 、187 : 265- 270、1998）、ＳＳＸ(Tureci O, et al. Cancer Res; 56 (20) : 4766-72 1996）、チロシナーゼ(Topalian S. L. et al.、J. Exp. Med. 、183 : 1965-1971、1996.)、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１(Zarour H. M. et al. Proc. Natl. Acad. Ssi. USA、97 : 400-405,2000)は、特定のＨＬＡクラスＩＩ同種特異体に関して同時にＣＤ４＋Ｔリンパ球によって認識されるエピトープを含み、したがって、ＴＡＡ−特異的(directed)体液性免疫応答を誘導することができる(Wang R. F. 、Trends Immunol.、22 : 269-276、2001)。
【０００４】
治療標的として主要な役割を果たす様々なクラスのＴＡＡが同定されている：
ｉ）癌−精巣抗原（ＣＴＡ）、これは様々な組織の腫瘍で発現するが、精巣および胎盤を除く正常組織では発現せず、例えば、ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＳＳＸ  ＳＡＲＴ−１、ＢＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＸＡＧＥ−１、ＴＲＡＧ−３およびＳＡＧＥが挙げられ、これらのなかには複数のファミリーを表すものもある(Traversari C. 、Minerva Biotech.、11 : 243-253、1999)；
ｉｉ）分化−特異的抗原、これは正常および腫瘍性メラニン細胞で発現し、例えば、チロシナーゼ、Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００／Ｐｍｅｌｌ７、ＴＲＰ−１／ｇｐ７５、ＴＲＰ−２が挙げられる(Traversari C.、Minerva Biotech.、11 : 243-253、1999)；
ｉｉｉ）様々な組織の悪性腫瘍組織に過剰発現するが、その良性の対応物にも存在する抗原、例えば、ＰＲＡＭＥ(Ikeda H. et al., Immunity、6 : 199-208, 1997)、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（Traversari C. 、Minerva Biotech.、11 : 243-253、1999）、ＣＥＡ、ＭＵＣ−１(Monges G. M. et al., Am. J. Clin Pathol.、112 : 635-640、1999)、アルファ−フェトプロテイン(Meng W. S. et al., Mol. Immunol.、37 : 943-950、2001)が挙げられる；
ｉｖ）偏在的に発現するタンパク質をコードする遺伝子の点突然変異に由来する抗原、例えば、ＭＵＭ−１、β−カテニン、ＨＬＡ−Ａ２、ＣＤＫ４およびカスパーゼ８が挙げられる(Traversati C. 、Minerva Biotech.、11 : 243-253、1999)；
ｖ）ウイルス抗原（Traversari C. 、Minerva Biotech.、11 : 243-253、 1999）。
【０００５】
ＴＡＡに加えて、有効な免疫原性および効率的な宿主Ｔリンパ球による認識に重要な細胞要素には、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ抗原、および同時刺激／アクセサリー分子が含まれる（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０、ＣＤ８１）(Fleuren G. J. et al.、Immunol. Rev.、145 : 91-122、1995)。
【０００６】
既知のクラスのＴＡＡのなかで、ＣＴＡは、癌患者の特に好適な有効な特異的免疫療法の治療標的である。というのはそれらの正常組織における発現は限られており、それらの生体対象、特にヒトを含む哺乳類におけるインビボ免疫原性が知られているからである（Jager E. et al., J. Exp. Med., 187: 265- 270、1998 ; Rejnolds S. R. et al., Int. J. Cancer、72 : 972-976、1997)。
【０００７】
しかし、異なる患者の腫瘍性病変での特異的ＣＴＡの不均一な発現により、その生物学的適格性は、ＣＴＡ−特異的治療用ワクチン接種に制限される。実際、特定の癌患者の悪性腫瘍病変はしばしば選択されたＣＴＡのみ発現することがあり得(Sahin U. et al., Clin. Cancer Res. 、6 : 3916-3922、2000)、さらに下方制御された(Lethz B. et al., Melanoma Res., 7 : S83- S88、1997)および／または不均一な(dos Santos N. R. et al., Cancer Res., 60 : 1654-1662、2000)特異的ＣＴＡの個々の腫瘍性病変における発現も報告されている(Jungbluth A. A. et al., Br. J. Cancer、83 : 493-497、2000)。これらの現象はインビボで別々にまたは同時に起こりうるが、おそらく疾患が進行しやすい悪性腫瘍細胞の免疫原性が構成的に乏しいことに寄与している可能性があり（Speiser D. E et al., J. Exp. Med. 、186 : 645-653、1997)、また、特異的ＣＴＡに対する免疫療法の過程におけるＣＴＡ−陰性クローンの出現により、腫瘍性細胞のインビボ免疫選択が起こりうる。したがって、単一のＣＴＡの特定の免疫原性エピトープを免疫学的標的とする免疫療法アプローチは、標的ＣＴＡのその腫瘍性病変における発現が無いことまたは下方制御されていることにより、多くの癌患者には適用することができない；さらに、インビボで単一のＣＴＡを免疫学的標的とすることは、治療により誘導／増幅されたＣＴＡ−特異的免疫応答を効率的に回避するＣＴＡ−欠損腫瘍変異体を生み出す可能性がある。単一のＣＴＡを標的とする治療アプローチのさらなる限界は、その不均一な病変内での発現に由来し( Schultz-Thater E. et al., Br. J. Cancer、83 : 204-208,2000)、さらに、特異的ＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩ同種特異体による単一のＣＴＡの特定の免疫原性エピトープの提示により、特定の規定されたＨＬＡ表現型を有する患者の治療のみしか可能とならない。
【０００８】
こういった限界を部分的に避けるため、最近の治療戦略では１まはた複数のＣＴＡの２以上の免疫原性エピトープか、またはＣＴＡタンパク質全体をワクチン接種剤として利用する(Conference on Cancer Vaccines、Eds. Ferrantini M.and Belardelli F. 、Rome-Italy、November 15-16、1999 ; http://www. cancerresearch.org)。
【０００９】
したがって、当該技術分野の現状の欠点、特に免疫原性が弱いことおよびインビボ免疫選択を克服できる癌ワクチンが強く求められており、多数の癌患者に対する癌ワクチンであって、特定の単一の標的とされたＣＴＡまたはＴＡＡに制限されないものの実用可能性が望まれている。この点で、求められる癌ワクチンは、選択されたＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ抗原に「拘束」されないのもである。
【００１０】
最近のインビトロでの証拠により、今までに知られているもののなかで調査されたすべてのＣＴＡ遺伝子の発現が、ＤＮＡ低メチル化剤に曝された後、様々な組織の腫瘍性細胞において誘導または上方制御されることが示された(dos Santos N. R. et al., Cancer Res., 60: 1654-1662、2000 ; Weber J. et al, Cancer Res.、54 : 1766-1771、1994)。ＣＴＡ誘導は持続的であり、治療後数週間検出可能であることが見出された。これらの知見は、ＣＴＡが総合的にＤＮＡメチル化により制御されるＴＡＡのクラスに属することを支持する。さらに、ＤＮＡ低メチル化剤による腫瘍性細胞の処理は、そのＨＬＡクラスＩ抗原の発現および調査したＨＬＡクラスＩ同種特異体の同時かつ持続的な上方制御を誘導し、そして同時刺激／アクセサリー分子であるＣＤ５４およびＣＤ５８の発現を上方制御した(Coral S. et al., J. Immunother.、22: 16-24、1999）。
【００１１】
有望な治療的側面であるにもかかわらず、ＣＴＡは多くの欠点を示す。例えば、今までに調査された特定のＣＴＡは特定の腫瘍性病変の間で不均一な発現を示し、ＣＴＡ−陽性悪性腫瘍細胞とＣＴＡ−陰性悪性腫瘍細胞が共存する；また、今までに同定されたもののなかで選択されたＣＴＡのみが、特定の腫瘍性病変において、その組織学的起源とは独立に発現し得る；腫瘍性細胞上の特異的ＣＴＡの発現の閾値が、ＣＴＡ−特異的ＣＴＬによる認識のために必要とされ、特異的ＣＴＡに対するワクチン接種には、患者の適当なＨＬＡクラスＩ表現型が要求され、選択されたＣＴＡにはまた、患者の適当なＨＬＡクラスＩＩ表現型が要求される。
【００１２】
その特有の生物学的特徴のために、選択されたＣＴＡは、様々な組織の悪性腫瘍疾患を患う患者におけるＣＴＡ−特異的免疫応答を誘導または増強する目的の様々な臨床的試みに用いられている。臨床での治療的ＣＴＡのインビボ投与のため、あるいは前臨床段階でのより強力なワクチン接種手段を作成するために、現在、当業者に知られている様々な戦略が用いられている（dos Santos N. R. et al., Cancer Res.、60: 1654-1662、2000; Weber J. et al.、Cancer Res. 、54 : 1766-1771、1994）。注目すべきことに、主に数々の技術的および実践的制限により、限られた数の特異的ＣＴＡの免疫原性エピトープのみ、あるいは単一の全ＣＴＡタンパク質のみが現在治療目的で臨床で利用されているにすぎない。
【００１３】
以下は、すでに利用されているかあるいは今までに提案されている、ＣＴＡを癌患者に投与するための主な戦略を含むリストである；いままでに知られているＴＡＡのその他のクラスに属するＴＡＡを患者に投与するのにも同一の戦略が利用されており、また、様々なアジュバントおよび／またはキャリアを用いて治療薬の免疫原性を増強させることがあることに注意されたい。
【００１４】
ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される単一または複数のＣＴＡの１または複数の免疫原性エピトープを提示する、合成ペプチド(Conference on Cancer Vaccines、Eds. Ferrantini M. and Belardelli F.、Rome- Italy、November 15-16、1999 ; http ://www. cancerresearch. org)。
単一または複数のＣＴＡの１または複数の免疫原性エピトープを提示する、リポソームに封入された合成ペプチド(Steller M. A. et al., Clin. Cancer Res.、4: 2103-2109、1998)。
単一のＣＴＡの全体の合成タンパク質（Conference on Cancer Vaccines、Eds. Ferrantini M. and Belardelli F. 、Rome-Italy、November 15-16、1999; http ://www. cancerresearch. org）。
ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される単一または複数のＣＴＡのエピトープを発現する組換えウイルスベクター（Jenne L. et al.、Trends Immunol.、22 : 102-107、2001）。
裸の（Naked）ＤＮＡシューティング（Park J. H. et al., Mol. Cells、9 : 384-391、 1999）。
ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される単一または複数のＣＴＡのエピトープを提示する合成ペプチドを生体外で与えられた自己ＰＢＭＣ／マクロファージ(Conference on Cancer Vaccines、Eds. Ferrantini M. and Belardelzi F.、Rome-Italy、November 15-16,  1999 ; http ://www. cancerresearch. org)。
ＣＤ８＋Ｔ細胞によって認識される単一または複数のＣＴＡのエピトープを提示する合成ペプチドまたは単一のＣＴＡの全合成タンパク質または全腫瘍細胞調製物を生体外で与えられた自己樹状細胞（Conference on Cancer Vaccines、Eds. Ferrantini M. And Belardelli F. 、Rome- Italy、November 15-16、1999 ; http ://www. cancerresearch. org;  Jenne L. et al.、Trends Immunol.、22 : 102-107、2001）。
全長ＣＴＡを発現するようにＤＮＡ／ＲＮＡを生体外で形質移入または形質導入されたか、あるいは全腫瘍細胞に融合された自己樹状細胞（Jenne L. et al.、Trends Immunol.、22: 102-107、2001）；
全長ＣＴＡを発現するようにＤＮＡ／ＲＮＡを生体外で形質移入または形質導入された自己Ｔリンパ球。
【００１５】
本発明の主な目的である自己癌ワクチンに関しては、数多くの特許文献が引用される。国際特許出願第ＷＯ９９／４２１２８号には、適切な治療の選択および／または腫瘍の進行のモニタリングのための、固形腫瘍のＨＬＡ転写または発現プロフィールの測定方法が開示されている。この文献の目的はＨＬＡ−Ｇのいくつかのアイソフォームを阻害して自然の抗腫瘍応答を増加させることである。該方法は腫瘍サンプルから細胞を抽出し、それを溶解し、溶解物をＨＬＡクラスＩ抗原に対する抗体と反応させることを含む。
【００１６】
ドイツ国特許第２９９１３５２２号には、腫瘍細胞の表面をそのままにしたまま腫瘍細胞を殺すか損傷を与えるために、患者から抽出した腫瘍細胞を２００−９０００バールの圧力にかけ、そして細胞を患者に再注入することによる癌ワクチンの調製装置が提供されている。
【００１７】
国際特許出願第ＷＯ００／０２５８１号には、発癌遺伝子または突然変異腫瘍抑制タンパク質あるいはペプチドに対するＴ細胞応答を誘導することができるテロメラーゼタンパク質またはペプチドが開示されている。該ペプチドは癌ワクチンに有用である。
【００１８】
国際特許出願第ＷＯ００／１８９３３号には、機能的に不活性な、改変された抗原の発現を引き起こすＤＮＡコンストラクトが開示されており、該抗原はＤＮＡ、ＲＮＡの転写および翻訳の効率または抗原ペプチドの生成に関しては変化していないものである。癌を患う患者は改変されたヒト癌関連抗原、特にＰＳＭＡ抗原をコードするＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡの投与によって治療される。別の態様において、インビトロで該ＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡに曝された自己樹状細胞がワクチンとして用いられる。
【００１９】
国際特許出願第ＷＯ００／２０５８１号には、新たに単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩＩ−結合ペプチドを含む癌ワクチンが開示されている。該ペプチドを用いてＴリンパ球の集団を選択的に濃縮して該ペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔリンパ球を得ることができる。該濃縮されたリンパ球は癌ワクチンとしても利用できる。
【００２０】
国際特許出願第ＷＯ００／２５８１３号には、主要組織適合遺伝子複合体分子に結合する普遍的な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が開示されている。治療方法は、該ＴＡＡをコードする核酸分子を投与する工程を含み、ＴＡＡは抗原提示細胞によってプロセシングされ、抗原提示細胞は細胞障害性リンパ球を活性化し、ＴＡＡを発現する細胞は殺される。特異的ｈＴＥＲＴペプチド以外に、様々なＴＡＡの同定が複雑なコンピュータ化された方法により可能となり、コンピュータにより設計されたペプチドの合成および該ペプチドの有効性の確認のための生物学的アッセイが可能となる。
【００２１】
国際特許出願第ＷＯ００／２６２４９号には、ヒトＷＴ−１タンパク質またはヒトｇａｔａ−１タンパク質の断片が開示されている。これらのペプチド断片は細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化を介して癌ワクチンとして用いられる。
【００２２】
米国特許第６０７７５１９号には、腫瘍組織からの酸によるエピトープの溶出により回収されたＴ細胞エピトープの組成物を含む癌ワクチンが提供されている。
【００２３】
国際特許出願第ＷＯ００／４６３５２号には、機能性のＣＤ８６分子を発現するヒトＴリンパ球を含む癌ワクチンが提供されている。Ｔリンパ球はＴ細胞を少なくとも２回の連続刺激に曝すことによって得られ、各刺激は少なくとも１つのアクチベーター（抗体、抗ＣＤ２、３または２８）およびＴ細胞増殖を刺激するサイトカイン（インターロイキン）を含む。
【００２４】
Coral S. et al. Journal of Immunotherapy 22 (1) : 16-24,1999には、黒色腫細胞の免疫原性能力およびその宿主細胞障害性細胞による認識が、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ抗原、同時刺激分子および腫瘍性細胞上の黒色腫関連抗原（ＭＡＡ）の発現の存否とレベルに依存することが教示されている。５−ＡＺＡ−ＣｄＲの活動性および／または受動性のヒト黒色腫のためのその全身投与による特異的免疫療法における使用が、細胞障害性細胞による黒色腫細胞認識を促進することが示唆される。
【００２５】
Momparler、Anticancer Drugs Apr ; 8 (4) : 358-68、1997は、化学療法剤としての５−ＡＺＡ−ＣｄＲについて言及している。
【００２６】
Shichijo S. et al Jpn. J. Cancer Res. 87、751-756、July 1996は、脱メチル剤５−ＡＺＡ−ＣｄＲが正常および悪性腫瘍リンパ球においてＭＡＧＥ１、２、３および６を誘導するか否かを調査し、細胞におけるそれらの発現機構をより明かにした。著者らは試験した選択されたサンプルにおける調査したＣＴＡの誘導を示し、すべての場合において脱メチル反応がＭＡＧＥ遺伝子の誘導のために十分な刺激であるわけではないと論じ、その結果細胞におけるＭＡＧＥ遺伝子の発現機構がより明らかになった。治療上の見通しに付いての示唆は無かった。
（発明の概要）
【００２７】
このたび新たに抗原提示細胞の作成方法が見出された。該方法は以下の工程を含む。
ａ）該細胞を対象から収集する工程、
ｂ）該収集した細胞を活性化させる工程；
ｃ）該活性化した細胞を生体外で培養および所望により増加させる工程；
ｄ）該培養および所望により増加させた細胞をＤＮＡ低メチル化剤で処理して該細胞から同時に複数の腫瘍関連抗原を発現させる工程。
【００２８】
本発明の方法によって得られる細胞およびその細胞成分は、単独でまたは該細胞と組合せて、該細胞において発現される複数の腫瘍関連抗原の１または複数を構成的に発現する様々なヒストタイプの悪性腫瘍の予防および治療、特に哺乳類、ヒトの予防および治療に有用である。
【００２９】
本発明の以下の記載において、該細胞をＡＤＨＡＰＩ−細胞と略称する。
もっとも便宜的には、本方法により得られる細胞は癌ワクチンの形態で用いられる。
以下の記載において、本発明を実施例と図面によってより詳細に開示する。図面において：
【００３０】
図１は、ＡＤＨＡＰＩ−細胞／Ｂ−ＥＢＶまたは対照Ｂ−ＥＢＶ細胞（Ｓ）によって刺激された自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖を示す。
図２は、ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−Ｂまたは対照ＰＷＭ−Ｂ細胞（Ｓ）によって刺激された自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖を示す。
図３は、ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＣＤ４０Ｌ−Ｂまたは対照ＣＤ４０Ｌ−Ｂ細胞（Ｓ）によって刺激された自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖を示す。
図４は、ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−ＰＢＭＣまたは対照ＰＷＭ−ＰＢＭＣ細胞（Ｓ）によって刺激された自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖を示す。
図５は、ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＨＡ−ＰＢＭＣによって刺激された自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖を示す。
図６は、ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣまたは対照ＰＨＡ−＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣ（Ｓ）によって刺激された自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖を示す。
（発明の詳細な開示）
【００３１】
本発明によると、抗原提示細胞を作成するために処理される細胞のタイプに実質的に制限はないが、ただし、低メチル化剤によって好適に活性化および処理されるものである。
【００３２】
本発明によると、対象から収集される細胞は、具体的には哺乳類、より好ましくはヒトである。本発明の可能な態様において、該ヒトは癌患者である。
【００３３】
本発明の第１の好適な態様によると、本方法により得られる抗原提示細胞は免疫細胞である。
【００３４】
本発明の第２の好適な態様において、本方法により得られる抗原提示細胞は非免疫細胞である。
【００３５】
本発明により得られる細胞は共有（shared）免疫優性癌抗原を発現してもよく、共有非免疫優性癌抗原を発現してもよい。
【００３６】
本発明の特定の態様において、本方法に好適な細胞は以下のものである：
エプスタイン・バーウイルスで不死化され、ＤＮＡ低メチル化剤で処理されたＢ−リンパ芽球腫細胞系。これは疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から作成したものである（ＡＤＨＡＰＩ−細胞／Ｂ−ＥＢＶ）。
ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）で活性化され、ＤＮＡ低メチル化剤で処理されたＢ−リンパ球。これは、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のＰＢＭＣから精製したＢ−リンパ球から作成したものである（ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−Ｂ）。
ＣＤ４０で活性化され、ＤＮＡ低メチル化剤で処理されたＢ−リンパ球。これは、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のＰＢＭＣから精製したＢ−リンパ球から作成したものである（ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＣＤ４０−Ｂ）。
ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）で活性化され、ＤＮＡ低メチル化剤で処理されたＰＢＭＣ。これは、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象の精製ＰＢＭＣから作成した（ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−ＰＢＭＣ）。
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）＋組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２）で活性化され、ＤＮＡ低メチル化剤で処理されたＰＢＭＣ。これは、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象の精製ＰＢＭＣから作成した（ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ｒｈＩＬ２−ＰＢＭＣ）。
フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）＋組換えヒトインターロイキン−２（ｒｈＩＬ−２）＋ヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）で活性化され、ＤＮＡ低メチル化剤で処理されたＰＢＭＣ。これは、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象の精製ＰＢＭＣから作成した（ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ｒｈＩＬ２−ＰＷＭ−ＰＢＭＣ）。
樹状細胞、単球、マクロファージ。
ＣＤ３４＋細胞、線維芽細胞、幹細胞、線維芽細胞および角化細胞。
【００３７】
本発明の方法によって得られる細胞は、免疫優性であれ非免疫優性であれ、１または複数の癌抗原を構成的に発現する様々なヒストタイプの悪性腫瘍の予防薬および治療薬としての使用に好適である。
【００３８】
本発明の別の可能な態様は、ワクチン接種する細胞の直接の抗原提示能力の利用が望ましくないか必要でない場合に適用できる。この場合、本発明の方法により得られるワクチン接種する細胞またはその細胞成分はワクチン接種される患者に対してプールされた癌抗原の「貯蔵所」として利用できる。
【００３９】
本発明の好適な態様において、選択されたＴＡＡはＣＴＡである。
【００４０】
本発明のこの態様は当業者に以下の利点を提供する。
ＣＴＡは免疫原性である。というのはそれらはＨＬＡクラスＩ−拘束ＣＴＡ−特異的ＣＤ８＋ＣＴＬによって認識されるエピトープを含むからである。
ＣＴＡは免疫原性である。というのはそれらはＨＬＡクラスＩＩ−拘束ＣＴＡ−特異的ＣＤ４＋Ｔリンパ球によって認識されるエピトープを含むからである。
選択されたＣＴＡは同時にＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ抗原によって提示されるエピトープを含む。したがって、選択されたＣＴＡはＣＤ８＋ＣＴＬおよびＣＤ４＋Ｔリンパ球反応を同時に誘導できる。
ＣＴＡは精巣と胎盤を除き、良性の組織では発現しない。
異なるＣＴＡが固形および造血性悪性腫瘍の腫瘍性細胞に同時に発現し得、形質転換細胞に同時発現している複数の治療標的を提供し得る。
特定のＣＴＡは、所与の患者の同時のおよび逐次の転移性病変に均一に発現する。
特定のＣＴＡは、異なる組織起源の悪性腫瘍組織に発現し得、その特異的ヒストタイプに関わらずヒト腫瘍症に共有される共通の治療標的を提供する。
特定のＣＴＡは、様々なＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ同種特異体において提示される複数の免疫原性ペプチドをコードし得る。
【００４１】
本発明のさらなる態様において、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤がＤＮＡ低メチル化剤と協同してＣＴＡ、ＨＬＡ抗原、および様々な組織の腫瘍性細胞の同時刺激／アクセサリー分子の発現を誘導／上方制御し得る。実際、ＤＮＡメチル化およびヒストン脱アセチル化は、癌における後成的なジーンサイレンシングの相乗作用の層として作用し(Fuks F. et al., Nat. Genet.、24 : 88-91、2000)、腫瘍抑制機能を有する選択された過剰メチル化遺伝子の強い再活性化が、ヒストン脱アセチル酵素阻害剤での処理後、最初の最小限のＤＮＡ脱メチル反応に続いて結腸直腸癌細胞において観察された（Cameron E. E. et al., Nat. Genet.、21 : 103-107、1999）。
【００４２】
本発明による方法における活性化工程は、一般的知識にしたがって行われ、いかなる場合もCurrent Protocols in Immunology、Coligan J. E. et al Eds、Wileyを参照すればよい。
【００４３】
本発明による方法における脱メチル反応処理は、一般的に周知であり、文献に一般的手順が記載されている。さらなる詳細な情報についてはSantini V. et al., Ann. Intern. Med. 、134 : 573-586, 2001を参照されたい。
【００４４】
本発明の目的に有用な当該技術分野で脱メチル剤としても知られている低メチル化剤は、当該技術分野で周知である。ＤＮＡ脱メチル剤は文献に広く開示されている。例えば、国際特許出願第ＷＯ０１／２９２３５号、米国特許第５８５１７７３号を参照されたい。好適なＤＮＡ脱メチル剤は５−アザ−シチジンであり、より好適には、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−ＡＺＡ−ＣｄＲ）である。
【００４５】
本発明による抗原提示細胞は癌ワクチンの調製に好適である。本発明の好適な態様において、該ワクチンは自己ワクチンである。
【００４６】
本発明の別の好適な態様において、該ワクチンは同種(allogeneic)ワクチンである。この態様において、本発明の方法により得られる細胞は、それが細胞であれ、その細胞成分であれ、抗原提示細胞として、そして、プールされた癌抗原の「貯蔵所」の形態として利用できる。
【００４７】
本発明のさらに好適な別の態様において、細胞および／または細胞成分は、エフェクター免疫細胞の作成方法に利用できる。該エフェクター免疫細胞は周知の養子免疫治療において有用な産物の調製に利用される。本発明のさらなる態様において、ここに記載するワクチンは、例えばデシタビンなどの低メチル化剤による癌患者の全身的前処理と組合せて用いることができる。この態様は例えば、本発明のワクチンと例えばデシタビンなどの低メチル化剤の全身投与に好適な医薬組成物とを含むキットなどの製品を用いて行なうことができる。
【００４８】
ワクチンは当業者に周知の技術によって、一般的知識によって調製することができる。例えば、本明細書において言及した特許文献は癌ワクチンの調製について十分開示している。例えば、国際特許出願第ＷＯ００／２５８１３号または第ＷＯ００／４６３５２号を参照されたい。
【００４９】
当業者であれば、特に投与プロトコールに関して、本発明によるワクチンを使用するための好適な方法を簡単に確立できるであろう。
【００５０】
以下の実施例において本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００５１】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／Ｂ−ＥＢＶ
ＰＢＭＣ精製
ＰＢＭＣは、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のヘパリン処置した末梢血から標準的フィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque）密度勾配遠心分離によって精製した。
【００５２】
エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）によるＰＢＭＣの不死化による自己Ｂ−リンパ芽球腫細胞系の作成
Ｂ−ＥＢＶ＋リンパ芽球腫細胞系は、Ｂ９５．８マーモセット細胞系からの上清とともに、ＰＢＭＣを、３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気で、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（またはヒトＡＢ血清）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを追加したＲＰＭＩ１６４０培地中でインキュベートすることによって作成した。
【００５３】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／Ｂ−ＥＢＶおよび対照Ｂ−ＥＢＶ細胞の作成
Ｂ−ＥＢＶ＋リンパ芽球腫細胞系（７．５ｘ１０５細胞／ｍｌ）を１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（または１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを追加したＲＰＭＩ１６４０培地中で３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気で培養し、１２時間ごとに４回、１μＭの５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−ＡＺＡ−ＣｄＲ）によるパルス刺激を与えた；次いで培地の半分を新鮮な培地で交換し、培養をさらに４８時間続けた。次いで細胞を実験手順に使用および／または生存条件下で凍結した。対照細胞（Ｂ−ＥＢＶ細胞）を同様の実験条件下で培養したが、５−ＡＺＡ−ＣｄＲによるパルス刺激は与えなかった。
【００５４】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／Ｂ−ＥＢＶおよび対照Ｂ−ＥＢＶ−細胞の最終的な収集
この結果に付いては表１を参照されたい。
【００５５】
自己混合リンパ球反応（ａＭＬＲ）およびＭＬＲ
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／Ｂ−ＥＢＶおよび対照Ｂ−ＥＢＶ細胞（刺激細胞＝Ｓ）を収集し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、ｘ−線で処理した（７５Ｇｙ）。ａＭＬＲおよびＭＬＲのために、スカラー濃度（１ｘ１０６細胞／ｍｌから６ｘ１０４細胞／ｍｌ）のＡＤＨＡＰＩ−細胞／Ｂ−ＥＢＶまたは対照Ｂ−ＥＢＶ細胞を、熱不活性化ヒトＡＢ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Ｉｓｃｏｖｅ培地中の自己または同種ＰＢＭＣ（１ｘ１０６細胞／ｍｌ）（反応細胞＝Ｒ）に添加した。そして９６ウェルＵ底プレートに最終容積が２００μｌ／ウェルとなるように播いた。３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気での２４時間のインキュベーションの後、１００μｌの培養上清を収集し、すぐに−８０℃でサイトカインアッセイに使用するまで保存した。次いで１００μｌの新鮮な培地を各ウェルに添加し、培養をさらに５日間続けた後、培養物に３Ｈ−ＴＤＲ（１μＬＣｉ／ウェル）でＯ／Ｎパルス刺激を与えた。次いでプレートを回収しＲ細胞による３Ｈ−ＴＤＲ取りこみをβ−カウンターによって測定した。
【００５６】
ａＭＬＲにおいてＡＤＨＡＰＩ−細胞／Ｂ−ＥＢＶまたは対照Ｂ−ＥＢＶ細胞（Ｓ）によって刺激された自己ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖
図１を参照されたい。
【００５７】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／Ｂ−ＥＢＶおよび対照Ｂ−ＥＢＶ細胞の表現型の特性
結果については表２を参照されたい。
【００５８】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／Ｂ−ＥＢＶおよび対照Ｂ−ＥＢＶ細胞によって発現されるＣＴＡのＲＴ−ＰＣＲ分析
調査する細胞上のＣＴＡ発現を評価するために用いた実験条件およびプライマーは以下の通りである：
ＭＡＧＥ−１、−２、−３、−４については、Brasseur、F. 、et al. Int. J. Cancer 63: 375- 380、1995 ；ＧＡＧＥ１−６については、Van den Eynde、B. 、et al. J. Exp. Med. 182 : 689-698、1995 ; ＮＹ−ＥＳＯ−１については、 Stockert、E. et al. J. Exp. Med． 187 : 265- 270、1998 ；ＳＳＸ−２については； Sahin、U. 、et al. Clin. Cancer Res. 6 : 3916- 3922、2000。
【００５９】
【化１】
2004536615.tif 000003
【００６０】
ａ陽性／被験；ＮＴ、試験せず。
【００６１】
ａＭＬＲにおいてＡＤＨＡＰＩ−細胞／Ｂ−ＥＢＶまたは対照Ｂ−ＥＢＶ細胞（Ｓ）によって刺激されたＰＢＭＣ（Ｒ）によって放出されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ評価
結果については表３を参照されたい。
【実施例２】
【００６２】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−Ｂ
Ｂ−リンパ球精製
ＰＢＭＣを疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のヘパリン処置した末梢血から標準的フィコール−ハイパック密度勾配遠心分離によって精製し、精製したＢリンパ球をノイラミニダーゼ処理したヒツジ赤血球を用いた常套のＥロゼット形成技術によって得た。
【００６３】
ＰＷＭ−活性化Ｂ細胞の作成
精製Ｂ−リンパ球（１．５ｘ１０６細胞／ｍｌ）にＰＷＭ（３μｇ／ｍｌ）を添加し、３７℃で４８時間、５％ＣＯ２加湿雰囲気下で、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μＧ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Ｉｓｃｏｖｅ培地で培養した。
【００６４】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−Ｂおよび対照ＰＷＭ−Ｂ細胞の作成
ＰＷＭ−活性化Ｂ−リンパ球に１２時間ごとに１μＭの５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−ＡＺＡ−ＣｄＲ）で４回パルス刺激を与えた；次いで培地の半分を新鮮な培地で交換し、さらに４８時間培養を続けた。次に細胞を実験手順に使用および／または生存条件下で凍結した。対照細胞（ＰＷＭ−Ｂ）を同様の実験条件下で培養したが５−ＡＺＡ−ＣｄＲでのパルス刺激は与えなかった。
【００６５】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−Ｂおよび対照ＰＷＭ−Ｂ細胞の最終的な収集
結果については表１を参照されたい。
【００６６】
自己混合リンパ球反応（ａＭＬＲ）およびＭＬＲ
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−Ｂおよび対照ＰＷＭ−Ｂ細胞（刺激細胞＝Ｓ）を収集し、０．５％α−メチルマンノピラノシドを追加したハンクス平衡塩類溶液で３回洗浄し、ｘ−線処理した（３０Ｇｙ）。ａＭＬＲおよびＭＬＲのためにスカラー濃度（１ｘ１０６細胞／ｍｌから６ｘ１０４細胞／ｍｌ）のＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−Ｂまたは対照ＰＷＭ−Ｂ細胞を、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Ｉｓｃｏｖｅ培地中の自己または同種ＰＢＭＣ（１ｘ１０６細胞／ｍｌ）（反応細胞＝Ｒ）に添加し、９６ウェルＵ−底プレートに最終容積が２００μｌ／ウェルとなるように播いた。３７℃で５％ＣＯ２加湿雰囲気下での６日間のインキュベーションの後、１００μｌの培養上清を各ウェルから収集し、すぐにサイトカインアッセイに使用するまで−８０℃で保存した。
【００６７】
次いで、１００μｌの新鮮な培地を各ウェルに添加し、培養に３Ｈ−ＴｄＲ（１μＣｉ／ウェル）でＯ／Ｎパルス刺激を与えた；そして、プレートを収集しＲ細胞による３Ｈ−ＴｄＲ取りこみをβ−カウンターで測定した。
【００６８】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−Ｂおよび対照ＰＷＭ−Ｂ細胞の表現型の特性
結果については表２を参照されたい。
【００６９】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−Ｂおよび対照ＰＷＭ−Ｂ細胞によって発現されるＣＴＡのＲＴ−ＰＣＲ分析
【化２】
2004536615.tif 000004
【００７０】
ａ陽性／被験；ＮＴ、試験せず。
【００７１】
ａＭＬＲにおいてＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−Ｂまたは対照ＰＷＭ−Ｂ細胞（Ｓ）によって刺激された自己ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖
結果については図２を参照されたい。
【００７２】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−Ｂまたは対照ＰＷＭ−Ｂ細胞（Ｓ）によって刺激された同種（ＭＬＲ）および自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）により放出されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ評価
結果については表３を参照されたい。
【実施例３】
【００７３】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＣＤ４０Ｌ−Ｂ
ＰＢＭＣ精製
ＰＢＭＣを、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のヘパリン処置または酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）−抗凝固処理した末梢血から、標準的なフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離によって精製した。
【００７４】
ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＤ４０Ｌ−活性化ＰＢＭＣの作成
ＰＢＭＣ（２ｘ１０６細胞／ｍｌ）を、半集密的な、ｘ−線処理した（７５Ｇｙ）ＮＩＨ３Ｔ３−ＣＤ４０Ｌと、３７℃で５％ＣＯ２加湿雰囲気下で、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２ｎｇ／ｍｌ組換えヒト（ｒｈ）インターロイキン４（ｒｈＩＬ−４）、５０μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン、５μｇ／ｍｌ  ｒｈインスリン、５．５ｘ１０−７ＭシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Ｉｓｃｏｖｅ培地（完全培地）中で共培養した。インキュベーションの６日後、ＰＢＭＣを収集し、ＨＢＳＳで２回洗浄し、完全培地に１ｘ１０６細胞／ｍｌとなるように再懸濁し、上記のようにして新たに調製したＮＩＨ３Ｔ３−ＣＤ４０Ｌと、さらに３日間３７℃で５％ＣＯ２加湿雰囲気下で共培養した。この手順を２−３日毎に繰り返し、最大培養時間を１６−１８日とした。
【００７５】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＣＤ４０Ｌ−Ｂおよび対照ＣＤ４０Ｌ−Ｂ細胞の作成
１６−１８日間の培養後、活性化ＰＢＭＣを収集し、上記のようにしてＮＩＨ３Ｔ３−ＣＤ４０Ｌで再刺激した；３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気でのＯ／Ｎインキュベーションの後、培養に１２時間ごとに１μＭ  ５−アザ−デオキシシチジン（５−ＡＺＡ−ＣｄＲ）で４回パルス刺激を与えた；次いで、細胞を収集し、上記のようにＮＩＨ３Ｔ３−ＣＤ４０Ｌで再刺激し、さらに４８時間培養を続けた。次いで細胞を実験手順に使用および／または生存条件下で凍結した。対照細胞（ＣＤ４０Ｌ−Ｂ細胞）を同様の実験条件で培養したが、５−ＡＺＡ−ＣｄＲによるパルス刺激は与えなかった。
【００７６】
最終的なＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＣＤ４０Ｌ−Ｂおよび対照ＣＤ４０Ｌ−Ｂ細胞の収集
結果については表１を参照されたい。
【００７７】
自己混合リンパ球反応（ａＭＬＲ）およびＭＬＲ
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＣＤ４０Ｌ−Ｂおよび対照ＣＤ４０Ｌ−Ｂ細胞（刺激細胞＝Ｓ）を収集し、ハンクス平衡塩類溶液で３回洗浄し、ｘ−線処理した（５０Ｇｙ）。ａＭＬＲおよびＭＬＲのために、スカラー濃度（１ｘ１０６細胞／ｍｌから６ｘ１０４細胞／ｍｌ）のＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＣＤ４０Ｌ−Ｂまたは対照ＣＤ４０Ｌ−Ｂ細胞を、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Ｉｓｃｏｖｅ培地中で、自己または同種ＰＢＭＣ（１ｘ１０６細胞／ｍｌ）（反応細胞＝Ｒ）に添加し、９６ウェルＵ−底プレートに最終容積が２００μｌ／ウェルとなるように播いた。３７℃でのＣＯ２加湿雰囲気下での２４時間のインキュベーション後、１００μｌの培養上清を収集し、すぐにサイトカインアッセイに使用するまで−８０℃で保存した。次いで、１００μｌの新鮮な培地を各ウェルに添加し、培養をさらに５日間続け、そして培養に３Ｈ−ＴｄＲ（１μＣｉ／ウェル）でＯ／Ｎパルス刺激を与えた；次いでプレートを収集し、Ｒ細胞による３Ｈ−ＴｄＲ取りこみをβ−カウンターで測定した。
【００７８】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＣＤ４０Ｌ−Ｂおよび対照ＣＤ４０Ｌ−Ｂ細胞の表現型の特性
結果については表２を参照されたい。
【００７９】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＣＤ４０Ｌ−Ｂおよび対照ＣＤ４０Ｌ−Ｂ細胞によって発現されるＣＴＡのＲＴ−ＰＣＲ分析
【００８０】
【化３】
2004536615.tif 000005
【００８１】
ａ陽性／被験
【００８２】
ａＭＬＲにおいてＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＣＤ４０Ｌ−Ｂまたは対照ＣＤ４０Ｌ−Ｂ細胞（Ｓ）によって刺激された自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖
結果については図３を参照されたい。
【００８３】
ａＭＬＲにおいてＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＣＤ４０Ｌ−Ｂまたは対照ＣＤ４０Ｌ−Ｂ細胞Ｓ（Ｓ）によって刺激されたＰＢＭＣ（Ｒ）によって放出されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ評価
結果については表３を参照されたい。
【実施例４】
【００８４】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−ＰＢＭＣ
ＰＢＭＣ精製
ＰＢＭＣを、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のヘパリン処置した末梢血から標準的なフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離によって精製した。
【００８５】
ＰＷＭ−活性化ＰＢＭＣの作成
ＰＢＭＣ（１．５ｘ１０６細胞／ｍｌ）にＰＷＭ（３μｇ／ｍｌ）を添加し、４８時間３７℃で５％ＣＯ２加湿雰囲気で、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Ｉｓｃｏｖｅ培地中で培養した。
【００８６】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＷＭ−ＰＢＭＣ細胞の作成
ＰＷＭ−活性化ＰＢＭＣに、１２時間ごとに４回、１μＭの５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−ＡＺＡ−ＣｄＲ）でパルス刺激を与えた；次いで、培地の半分を新鮮な培地で交換し、培養をさらに４８時間続けた。次いで細胞を実験手順に使用および／または生存条件下で凍結した。対照細胞（ＰＷＭ−ＰＢＭＣ）を同様の実験条件下で培養したが、５−ＡＺＡ−ＣｄＲによる刺激は与えなかった。
【００８７】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＷＭ−ＰＢＭＣ細胞の最終的な収集
結果については表１を参照されたい。
【００８８】
自己混合リンパ球反応（ａＭＬＲ）およびＭＬＲ
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＷＭ−ＰＢＭＣ細胞（刺激細胞＝Ｓ）を収集し、０．５％α−メチルマンノピラノシドを追加したハンクス平衡塩類溶液で３回洗浄し、ｘ−線処理した（３０Ｇｙ）。ａＭＬＲおよびＭＬＲのために、スカラー濃度（１ｘ１０６細胞／ｍｌから６ｘ１０４細胞／ｍｌ）のＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−ＰＢＭＣまたは対照ＰＷＭ−ＰＢＭＣ細胞を、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Ｉｓｃｏｖｅ培地中で、自己または同種ＰＢＭＣ（１ｘ１０６細胞／ｍｌ）（反応細胞＝Ｒ）に追加し、９６ウェルＵ−底プレートに最終容積が２００μｌ／ウェルとなるように播いた。３７℃で５％ＣＯ２加湿雰囲気下での６日間のインキュベーションの後、１００μｌの培養上清を各ウェルから収集し、すぐにサイトカインのために使用するまで−８０℃で保存した。１００μｌの新鮮な培地を各ウェルに添加し、３Ｈ−ＴｄＲ（１μＣｉ／ウェル）でＮ／Ｏパルス刺激を与えた；次いで収集し、Ｒ細胞による３Ｈ−ＴｄＲ取りこみをβ−カウンターにより測定した。
【００８９】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＷＭ−ＰＢＭＣ細胞の表現型の特性
結果については表２を参照されたい。
【００９０】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＷＭ−ＰＢＭＣ細胞によって発現するＣＴＡのＲＴ−ＰＣＲ分析
【００９１】
【化４】
2004536615.tif 000006
【００９２】
ａ陽性／被験；ＮＴ、試験せず。
【００９３】
ａＭＬＲにおいてＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−ＰＢＭＣまたは対照ＰＷＭ−ＰＢＭＣ細胞によって刺激された自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖
結果については図４を参照されたい。
【００９４】
ａＭＬＲにおいてＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−ＰＢＭＣまたは対照ＰＷＭ−ＰＢＭＣ細胞（Ｓ）によって刺激された自己ＰＢＭＣ−（Ｒ）によって放出されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ評価
結果については表３を参照されたい。
【実施例５】
【００９５】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ＰＢＭＣ
ＰＢＭＣ精製
ＰＢＭＣを、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のヘパリン処置した末梢血から、標準的なフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離によって精製した。
【００９６】
ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣの作成
ＰＢＭＣ（１．５ｘ１０６細胞／ｍｌ）にＰＨＡ−Ｍ（１０μｇ／ｍｌ）および１００ＵＩ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を添加し、４８時間３７℃で５％ＣＯ２加湿雰囲気下で、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清を追加したＲＰＭＩ１６４０培地（または１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清を追加した基本Ｉｓｃｏｖｅ培地）（これらには、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩が追加されている（完全培地））中で培養した。
【００９７】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＨＡ−ＰＢＭＣの作成
ＰＨＡ−活性化ＰＢＭＣに、１２時間ごとに４回、１μＭの５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−ＡＺＡ−ＣｄＲ）によってパルス刺激を与えた；次いで培地の半分を新鮮なＰＨＡ−Ｍを含有しない完全培地と交換し、さらに４８時間培養を続けた。次いで細胞を実験手順に使用および／または生存条件下で凍結した。対照細胞（ＰＨＡ−ＰＢＭＣ）を同様の実験条件下で培養したが、５−ＡＺＡ−ＣｄＲによるパルス刺激は与えなかった。
【００９８】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＨＡ−ＰＢＭＣの最終的な収集
結果については表１を参照されたい。
【００９９】
自己混合リンパ球反応（ａＭＬＲ）およびＭＬＲ
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＨＡ−ＰＢＭＣ（刺激細胞＝Ｓ）を収集し、０．５％α−メチルマンノピラノシドを追加したハンクス平衡塩類溶液で３回洗浄し、ｘ−線処理した（５０Ｇｙ）。ａＭＬＲおよびＭＬＲのために、スカラー濃度（１ｘ１０６細胞／ｍｌから６ｘ１０４細胞／ｍｌ）のＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ＰＢＭＣまたは対照ＰＨＡ−ＰＢＭＣを、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Ｉｓｃｏｖｅ培地中、自己または同種ＰＢＭＣ（１ｘ１０６細胞／ｍｌ）（反応細胞＝Ｒ）に添加し、９６ウェルＵ−底プレートに最終容量が２００μｌ／ウェルとなるように播いた。３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気下での２４時間のインキュベーション後、１００μｌの培養上清を各ウェルから収集し、すぐにサイトカインアッセイでの使用まで−８０℃で保存した。次いで、１００μｌの新鮮な培地を各ウェルに添加し、培養をさらに５日間続け、そして培養に３Ｈ−ＴｄＲ（１μＣｉ／ウェル）によってＯ／Ｎパルス刺激を与えた；次いでプレートを収集し、Ｒ細胞による３Ｈ−ＴｄＲ取りこみをβ−カウンターによって測定した。
【０１００】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＨＡ−ＰＢＭＣの表現型の特性
結果については表２を参照されたい。
【０１０１】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＨＡ−ＰＢＭＣにより発現するＣＴＡのＲＴ−ＰＣＲ分析
【０１０２】
【化５】
2004536615.tif 000007
【０１０３】
ａ陽性／被験；ＮＴ、試験せず。
【０１０４】
ａＭＬＲにおいてＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＨＡ−ＰＢＭＣによって刺激された自己ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖
結果については図５を参照されたい。
【０１０５】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ＰＢＭＣまたは対照ＰＨＡ−ＰＢＭＣ（Ｓ）によって刺激された同種（ＭＬＲ）および自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）によって放出されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ評価
結果については表３を参照されたい。
【実施例６】
【０１０６】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣ
ＰＢＭＣ精製
ＰＢＭＣを、疾患の進行状態にある癌患者または健康な対象のヘパリン処置またはＡＣＤ−抗凝固処理した末梢血から、標準的なフィコール−ハイパック密度勾配遠心分離によって精製した。
【０１０７】
ＰＨＡ＋ＰＷＭ−活性化ＰＢＭＣの作成
ＰＢＭＣ（１．５ｘ１０６細胞／ｍｌ）に、ＰＨＡ−Ｍ（１０μｇ／ｍｌ）、ＰＷＭ（３μｇ／ｍｌ）、１００ＵＩ／ｍｌのｒｈＩＬ−２を添加し、３７℃で４８時間５％ＣＯ２加湿雰囲気下で、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（または１０％熱不活性化自己血清）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Ｉｓｃｏｖｅ培地（完全培地）中で培養した。
【０１０８】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣの作成
ＰＨＡ＋ＰＷＭ−活性化ＰＢＭＣに、１２時間ごとに４回、１μＭの５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−ＡＺＡ−ＣｄＲ）によりパルス刺激を与えた；次いで培地の半分をＰＨＡまたはＰＷＭを含有しない新鮮な完全培地と交換し、培養をさらに４８時間続けた。次いで細胞を実験手順に使用および／または生存条件下で凍結した。対照細胞（ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣ）を同様の実験条件下で培養したが、５−ＡＺＡ−ＣｄＲでのパルス刺激は与えなかった。
【０１０９】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣの最終的な収集
結果については表１を参照されたい。
【０１１０】
自己混合リンパ球反応（ａＭＬＲ）およびＭＬＲ
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣ（刺激細胞＝Ｓ）を収集し、０．５％α−メチルマンノピラノシドを追加したハンクス平衡塩類溶液で３回洗浄し、ｘ−線処理した（５０Ｇｙ）。ａＭＬＲおよびＭＬＲのためにスカラー濃度（１ｘ１０６細胞／ｍｌから６ｘ１０４細胞／ｍｌ）のＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ｒｈＩＬ２−＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣまたは対照ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣを、１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン硫酸塩を追加した基本Ｉｓｃｏｖｅ培地中で、自己または同種ＰＢＭＣ（１ｘ１０６細胞／ｍｌ）（反応細胞＝Ｒ）に添加し、９６ウェルＵ−底プレートに最終容積が２００μｌ／ウェルとなるように播いた。３７℃で５％ＣＯ２加湿雰囲気下での６日間のインキュベーション後、１００μｌの培養上清を各ウェルから収集し、すぐにサイトカインアッセイに使用するまで−８０℃で保存した。次いで、１００μｌの新鮮な培地を各ウェルに添加し、培養に３Ｈ−ＴｄＲ（１μＣｉ／ウェル）でＯ／Ｎパルス刺激を与えた；次いでプレートを収集し、Ｒ細胞による３Ｈ−ＴｄＲ取りこみをβ−カウンターにより測定した。
【０１１１】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣの表現型の特性
結果については表２を参照されたい。
【０１１２】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣによって発現されるＣＴＡのＲＴ−ＰＣＲ分析
【０１１３】
【化６】
2004536615.tif 000008
【０１１４】
ａ陽性／被験
【０１１５】
ａＭＬＲにおいてＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣまたは対照ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣによって刺激された自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖
結果については図６を参照されたい。
【０１１６】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣまたは対照ＰＨＡ＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣ（Ｓ）によって刺激された同種（ＭＬＲ）および自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）によって放出されたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ評価
結果については表３を参照されたい。
【０１１７】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞のインビボ腫瘍形成能
生ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ｒｈＩＬ２−ＰＷＭ−ＰＢＭＣ（１２ｘ１０６）およびその対照細胞（１４ｘ１０６）、ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＣＤ４０Ｌ−Ｂ（８ｘ１０６）およびその対照細胞（８ｘ１０６）またはｘ−線処理した（３０Ｇｙ）ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ｒｈＩＬ２−ＰＷＭ−ＰＢＭＣ（１２ｘ１０６）およびその対照細胞（１４ｘ１０６）、ｘ−線処理した（５０Ｇｙ）ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＣＤ４０Ｌ−Ｂ（１５ｘ１０６）およびその対照細胞（１８ｘ１０６）の単一の皮下異種移植は、注入部位でも離れた（臨床調査可能な）部位でも腫瘍形成を誘導せず、ＡＤＨＡＰＩ−細胞投与後１８０日のＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの総合的な健康状態および体重に影響を与えなかった。
【０１１８】
生ＡＤＨＡＰＩ−細胞／Ｂ−ＥＢＶ（５ｘ１０６／第１回注入；ｌｘ１０７／第２回およびその後の注入）および対照Ｂ−ＥＢＶ細胞（５ｘ１０６／第１回注入；ｌｘ１０７／第２回およびその後の注入）またはｘ−線処理したＡＤＨＡＰＩ−細胞／Ｂ−ＥＢＶ（７５Ｇｙ）（５ｘ１０６／第１回注入；ｌｘ１０７／第２回およびその後の注入）およびｘ−線処理した（７５Ｇｙ）対照Ｂ−ＥＢＶ細胞（５ｘ１０６／第１回注入；ｌｘ１０７／第２回およびその後の注入）の０、３３、６３および９６日目の繰り返し皮下異種移植は、注入部位でも離れた（臨床調査可能な）部位でも腫瘍形成を誘導せず、第１回投与後１８０日のＢＡＬＢ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスの総合的な健康状態および体重に影響を与えなかった。ＡＤＨＡＰＩ−細胞で処理された動物の総合的な健康状態および体重は、未処理またはＢ−ＥＢＶ細胞を移植された対照動物と同等であった。
【０１１９】
多価細胞ＣＴＡワクチンとしてのＡＤＨＡＰＩ−細胞の利点
公知のＣＴＡを癌患者にもっとも効率的に投与するための既に利用あるいは提案されている主な戦略と比較して、ＡＤＨＡＰＩ−細胞は全体として新規で革新的なアプローチであり、数多くの顕著な注目すべき利点を含む。これらのなかには以下のものがある：
【０１２０】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞対遺伝的に未改変の細胞ＣＴＡワクチン
ＡＤＨＡＰＩ−細胞は、同時に複数の／すべてのメチル化−制御されたＣＴＡを発現することから新規で独特のＡＰＣワクチンである；内因的に合成されるため、ＣＴＡは直接および同時にＡＤＨＡＰＩ−細胞中のＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの両方の抗原プロセシング経路にアクセスすることができる（Jenne L. et al., Trends Immunol.、22: 102-107、2001）。
【０１２１】
したがって、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ抗原の両方が細胞膜に構成的に発現することから、ＡＤＨＡＰＩ−細胞は、内因的に合成されたＣＴＡの免疫原性エピトープを同時にＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ自己リンパ球の両方に提示することができる；それゆえ、ＡＤＨＡＰＩ−細胞は同時にＣＴＡ−特異的ＣＴＬおよび体液性免疫応答を誘導／増幅させることができる。さらに、ＡＤＨＡＰＩ−細胞は、今までに同定、特徴づけがされていないメチル化−制御されたＣＴＡを発現し、宿主Ｔ細胞に提示することができる（既知または未知のＣＴＡの非免疫優性エピトープと同様である）。
【０１２２】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞とは反対に、合成ＣＴＡペプチドによりパルス刺激を与えた、合成ＣＴＡ全タンパク質によりパルス刺激を与えた、または全腫瘍細胞調製物によりパルス刺激を与えた自己ＡＰＣワクチン（例えば、樹状細胞、ＰＢＭＣ）、および電気融合で作成した腫瘍細胞樹状細胞ハイブリッド（Kugler A. et al., Nat. Med., 6: 332-336、2000. Tureci O. et al., Cancer Res.、56 : 4766-4772、1996. Eds）はともに以下の主要な制限を有する：
ｉ）生体外で与えられた合成ＣＴＡペプチド、全合成ＣＴＡタンパク質または腫瘍由来ＣＴＡは、インビボでの振る舞いが知られていないために、宿主免疫系の抗原提示の寿命に重大な影響を与える可能性がある；
ｉｉ）細胞ワクチンのＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ抗原に生体外で与えられる合成ＣＴＡペプチド、全合成ＣＴＡタンパク質または腫瘍由来ＣＴＡの量が制限されているため、投与したＣＴＡの免疫原性をひどく妨害してしまう可能性がある；
ｉｉｉ）患者のＨＬＡ表現型による拘束があり、いまだに比較的既知のＨＬＡクラスＩ抗原の数が少なく、今までに同定されたＣＴＡのＨＬＡクラスＩＩ抗原に拘束される免疫原性エピトープの数が少ない；
ｉｖ）十分な量の新鮮な腫瘍組織が入手しにくく、その腫瘍組織は腫瘍性病変において発現される様々なＣＴＡを十分に代表するものでなければならない（Jenne L. et al., Trends Immunol.、22: 102-107、2001）。
【０１２３】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞によって内因的に合成されたＣＴＡの発現は長期間持続する；したがって、生体外で合成されたＣＴＡペプチドによりパルス刺激を与えたか、合成ＣＴＡ全タンパク質によりパルス刺激を与えたか、または全腫瘍細胞調製物によりパルス刺激を与えた自己ＡＰＣワクチンと異なり、ＡＤＨＡＰＩ−細胞によると宿主免疫応答のインビボでの刺激を長期にすることができ、患者への投与回数を少なくすることができる。
【０１２４】
この仮説はＡＤＨＡＰＩ−細胞はインビボでの長期腫瘍形成能が無いことによりＡＤＨＡＰＩ−細胞を生きた、ｘ−線処理されていない細胞ワクチンとして投与することが可能であろうということにより支持される。
【０１２５】
さらに、ＡＤＨＡＰＩ−細胞は一旦インビボで生理的な死を経ると、それらは内因的に合成されるＣＴＡペプチドおよびタンパク質の「貯蔵所」として機能し、これによってさらにクロスプライミングの免疫機構を介して患者の樹状細胞によるＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＣＴＡのＨＬＡクラスＩ−拘束エピトープの効率的な追加的提示が可能となり、また、周知の抗原プロセシングの外来経路を介してＣＤ４＋Ｔ細胞に対するＣＴＡのＨＬＡクラスＩＩ−拘束エピトープの提示も可能となる。
【０１２６】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞はそのＡＰＣ機能を保持している；実際、それは効率的に自己および同種ＰＢＭＣの増殖およびＩＦＮ−γ放出を刺激する；さらに、ＡＤＨＡＰＩ−細胞は多くの場合、それらに対応する対照細胞と比較してより強力な刺激細胞である。この点に関して、ＣＴＡに加えて、ＡＤＨＡＰＩ−細胞はＨＬＡクラスＩ抗原および／または様々な同時刺激細胞／アクセサリー分子を、対応する対照細胞と比較してより高レベルに同時に発現することができる。これらの証拠により免疫原性が低く、いくつかの同時刺激／アクセサリー分子を構成的に発現しない自己腫瘍細胞と比べて、ＡＤＨＡＰＩ−細胞は自己細胞ワクチンとして明かに大きな利点を有する。さらに、生体外で作成して増加させた自己樹状細胞と比較して、ＡＤＨＡＰＩ−細胞ワクチンは完全に成熟した免疫適格性のＡＰＣにより作成される；この側面により細胞ワクチンの作成に利用されてきた樹状細胞の成熟段階によって表れる、免疫原性能力よりも寛容に対して影響を与える可能性のある潜在的な制限が克服される。
【０１２７】
その他の細胞ワクチンと比較して、複数の／全てのメチル化−制御されたＣＴＡを同時に発現するＡＤＨＡＰＩ−細胞ワクチンの生体外での作成は、簡単であり多くの場合迅速に行なえ、困難なインビトロの細胞操作を必要とせず、遺伝子操作を伴わず、自己腫瘍組織を必要とせず、健康な個人および癌患者のＰＢＭＣの両方から高い再現性をもって行なうことができる。
【０１２８】
さらに、１００％に近いＡＤＨＡＰＩ−細胞調製物がＡＰＣにおいて脱メチル反応が誘導できるすべての調査したＣＴＡを発現する。これらの特徴により、ＡＤＨＡＰＩ−細胞ワクチンの作成は標準化しやすく質（例えば選択された細胞表面分子のためのフローサイトメトリーや選択されたＣＴＡのためのＲＴ−ＰＣＲによる）および効力（例えば選択されたＣＴＡのための定量的ＲＴ−ＰＣＲによる）を制御しやすい。さらに、その他の今日までの細胞ワクチンは患者に投与するたびに新たに調製しなければならず、明かに調製物の間に変動があったのに対し（例えば細胞生存度、ワクチン接種する細胞の表現型の特性、与える合成ＣＴＡペプチドまたは合成ＣＴＡ全タンパク質または全腫瘍細胞調製物の量、電気融合による腫瘍細胞−樹状細胞ハイブリッドの作成効率など）、ＡＤＨＡＰＩ−細胞ワクチンは、一旦調製して生存度、質および効力について確認したら、アリコットに保存し、適宜凍結し、生存条件下で治療用に用いるまで保存することができる。さらに、自己細胞ワクチンにパルス刺激を与えるため、または生体外で腫瘍細胞−樹状細胞ハイブリッドを作成するために自己腫瘍組織の生存度が必要とされないため、また繰り返し白血球血漿交換(leukaphereses)を行なうことによって大量に迅速に調製することができるため、ＡＤＨＡＰＩ−細胞ワクチンは各患者のための治療薬の実践的な無制限のソースである。
【０１２９】
内因的に合成され、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ抗原プロセシング経路に直接かつ同時にアクセスすることができる複数の／すべてがメチル化−制御されたＣＴＡの同時発現を鑑みると、それらがいまだに同定および特徴づけされていないメチル化制御されたＣＴＡ（および既知および未知のＣＴＡの非免疫優性エピトープ）を発現して宿主Ｔ細胞に提示する能力により、また、患者のＨＬＡ表現型に応じた治療用途にしか用いることができなかった今までに同定されたＣＴＡの、ＨＬＡクラスＩ抗原−およびＨＬＡクラスＩＩ抗原−拘束免疫原性エピトープは限られた数しか知られていないため、ＡＤＨＡＰＩ−細胞のさらなる利点はあらゆる複数のＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ同種特異体に関する様々なＣＴＡの既知のおよび未知の免疫原性エピトープを同時に提示することができるであろうということである。したがって、合成ＣＴＡペプチドによりパルス刺激を与えた、または合成ＣＴＡ全タンパク質によりパルス刺激を与えた細胞ワクチンと比較して、ＡＤＨＡＰＩ−細胞ワクチンによる治療は特定のＨＬＡ表現型の患者に制限されない；したがってその腫瘍性病変が１または複数のＣＴＡを発現するすべての癌患者が、そのＨＬＡ表現型にかかわらずＡＤＨＡＰＩ−細胞ワクチンによる治療の候補となりうる。この点で、今までに知られているＣＴＡのなかの１または複数は、様々なヒストタイプの調査した悪性腫瘍のほとんどにおいて一般的に発現している；それゆえ、ＡＤＨＡＰＩ−細胞によるワクチン接種は癌患者の大多数において好適である。ＭＡＧＥ、ＧＡＧＥまたはＮＹ−ＥＳＯ−１がヒト腫瘍の９６％において発現しているということは重要な情報である（Cancer Immunol. Immunother.50 : 3-15、2001）。
【０１３０】
合成ＣＴＡペプチドによりパルス刺激を与えた細胞ワクチンおよび合成ＣＴＡ全タンパク質によりパルス刺激を与えた細胞ワクチンは、細胞ワクチンのＨＬＡクラスＩおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ抗原に対して生体外で限られた量のタンパク質しか与えることができず、投与されたＣＴＡの免疫原性が大幅に低減されるのに対して、複数のすべてのメチル化−制御されたＣＴＡが同時発現することにより、ＡＤＨＡＰＩ−細胞ワクチンは、１または数個のＣＴＡに対する治療過程に生じるＣＴＡ−陰性腫瘍変異体の免疫選択という欠点を克服し、また、特定の腫瘍性病変においておこる特定のＣＴＡの構成的に不均一な、またときには下方制御された発現という欠点を克服することができる。
【０１３１】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞ワクチンは、同時に複数の／すべての既知のメチル化−制御されたＣＴＡを発現し、その発現がＤＮＡメチル化によって制御されるいまだに同定されていないＣＴＡを発現する自己の機能的なＡＰＣによって構成される；さらに、ＡＤＨＡＰＩ−細胞ワクチンは様々なヒストタイプのＣＴＡ−陽性腫瘍を患う患者に利用できる。これらの機能的および表現型の特性は、現在まで用いられてきた同種腫瘍細胞ワクチン（例えば、全プール(pooled)腫瘍性細胞系の溶解液またはその非精製抽出物、プール腫瘍性細胞系からの脱落(shed)抗原）と比べて明かに有利である。実際、これらの腫瘍細胞ワクチンは既知のおよびいまだに未知の免疫学的に関連するＣＴＡを含まないか、含むとしても不充分な量であり、免疫応答に関してＣＴＡと競合する不適切な細胞性分を含み、毒性が強いであろう。また同種であるため、患者の免疫系による効率的なプロセシングが要求され、同じ組織タイプの悪性腫瘍を患う患者においてのみしか利用できない。
【０１３２】
ＡＤＨＡＰＩ−細胞対遺伝的に改変された細胞ＣＴＡワクチン
ＡＤＨＡＰＩ−細胞の作成は生体外での自己樹状細胞またはその他の自己ＡＰＣの遺伝子操作を伴わず、一方、遺伝的に改変されたワクチンの作成には遺伝子操作が要求され、これは形質移入または形質導入の後に選択されたＣＴＡを発現させるものである。さらにＡＤＨＡＰＩ−細胞と比較して、遺伝的に改変された細胞ワクチンには数々の問題点がある；それらには以下のものが挙げられる：
ｉ）利用可能な形質移入方法の効率が比較的低い。
ｉｉ）細胞形質導入に利用されるウィルスベクターの抗原に対する細胞の免疫応答が誘導され、遺伝的に改変されたワクチン細胞の破壊が起こる。
ｉｉｉ）ワクチン投与を妨害する、既存のまたはワクチン接種により誘導される中和抗体が存在する。
ｉｖ）形質導入細胞の生存、成熟および抗原提示能力に対してウイルスベクターが直接影響を与える（Jenne L. et al.、Trends Immuno Z.、22 : 102-107、2001）。
【０１３３】
【表１】
2004536615.tif 000009
【０１３４】
ａデータは収集した細胞の、３回の（ａ）、４回の（ｂ）、４回の（ｃ）、４回の（ｄ）、７回の（ｅ）および５回の（ｆ）の独立した実験においてその作成に用いた細胞数（１００％）に対する平均％±ＳＤである。
【０１３５】
【表２】
2004536615.tif 000010
【０１３６】
＊データは、６回の（ａ）、６回の（ｂ）、４回の（ｃ）、４回の（ｄ）、６回の（ｅ）、および２回の（ｆ）の独立の実験においてフローサイトメトリーによって得た平均蛍光強度の平均値の対応スチューデントｔ−検定による比較によって得た。統計的有意差は、自己対照細胞と比較してＡＤＨＡＰＩ−細胞上の調査した抗原の発現が常に上方制御されていることを示した。
ｆ有意差無し
ｇｐ値
ｈ試験せず；
＋ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＣＤ４０Ｌ−Ｂ＝８２−１００％  ＣＤ２０＋；対照ＣＤ４０Ｌ−Ｂ細胞＝８７−９９％  ＣＤ２０＋。
【０１３７】
【表３】
2004536615.tif 000011
【０１３８】
＊データは２回の（ａ）、４回の（ｂ）、４回の（ｃ）、４回の（ｄ）、３回の（ｅ）および４回の（ｆ）の独立した実験において放出されたＩＦＮ−γ（ｐｇ／ｍｌ）の平均値±ＳＤを表す。Ｓ／Ｒ比は、以下の通り：３：１（ａ）、１：１（ｂ）、１：２（ｅ）、１：１（ｄ）、１：１（ｅ）、１：２（ｆ）。ＩＦＮ−γ放出は培養開始から２４時間後（ａ）、６日間後（ｂ）、２４時間後（ｃ）、６日間後（ｄ）、２４時間後（ｅ）および６日間後（ｆ）にアッセイした。
ｇ対応スチューデントｔ−検定によって得た対照細胞に対するｐ値。
ｈ試験せず。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】図１は、ＡＤＨＡＰＩ−細胞／Ｂ−ＥＢＶまたは対照Ｂ−ＥＢＶ細胞（Ｓ）によって刺激された自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖を示す。
【図２】図２は、ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−Ｂまたは対照ＰＷＭ−Ｂ細胞（Ｓ）によって刺激された自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖を示す。
【図３】図３は、ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＣＤ４０Ｌ−Ｂまたは対照ＣＤ４０Ｌ−Ｂ細胞（Ｓ）によって刺激された自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖を示す。
【図４】図４は、ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＷＭ−ＰＢＭＣまたは対照ＰＷＭ−ＰＢＭＣ細胞（Ｓ）によって刺激された自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖を示す。
【図５】図５は、ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−ＰＢＭＣおよび対照ＰＨＡ−ＰＢＭＣによって刺激された自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖を示す。
【図６】図６は、ＡＤＨＡＰＩ−細胞／ＰＨＡ−＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣまたは対照ＰＨＡ−＋ＰＷＭ−ＰＢＭＣ（Ｓ）によって刺激された自己（ａＭＬＲ）ＰＢＭＣ（Ｒ）の増殖を示す。
【図１】
2004536615.tif 000012
【図２】
2004536615.tif 000013
【図３】
2004536615.tif 000014
【図４】
2004536615.tif 000015
【図５】
2004536615.tif 000016
【図６】
2004536615.tif 000017
【国際公開パンフレット】
2004536615.tif 000018
2004536615.tif 000019
2004536615.tif 000020
2004536615.tif 000021
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2004536615.tif 000026
2004536615.tif 000027
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2004536615.tif 000030
2004536615.tif 000031
2004536615.tif 000032
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2004536615.tif 000036
2004536615.tif 000037
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【国際調査報告】
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