(57)【要約】【化１】2004525138.tif 000008リポソームに内包された薬剤の細胞内送達を達成するためのリポソーム組成物および同組成物の使用方法が記述される。リポソームはＰＨ感受性脂質からなり、そしてリポソームを標的細胞に対向させるためのターゲティング・リガンドを含有する。またリポソームは、安定化成分、例えばポリマー誘導の脂質を含有し、この場合ポリマーは遊離可能な結合によって脂質に結合される。リポソームの投与は、内包された薬剤の細胞内送達のためにリポソームの細胞インターナリゼーションおよび不安定化をもたらす。
2004525138.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ｐＨ−感受性脂質；（ｉｉ）親水性ポリマーであって、実在するかまたは誘発される生理学的状態に応じて親水性ポリマー鎖を遊離するのに効果的な結合によって該脂質に結合された該ポリマーを用いて誘導された脂質１−２０モル％；（ｉｉｉ）ターゲティングリガンド；および（ｉｖ）内包された治療剤、から形成されるリポソームを含んでなる、治療剤の細胞内送達のためのリポソーム組成物であって、標的細胞に結合し、そして該内包された薬剤を放出して、該遊離可能な結合および／または該ターゲティングリガンドを欠如する類似のリポソームによって送達される薬剤の細胞内濃度に比較した場合、薬剤の細胞内濃度において少なくとも２倍の増加を達成するように適合化された該組成物。
【請求項２】
該ｐＨ−感受性脂質がジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である、請求項１の組成物。
【請求項３】
該リポソームが安定化成分をさらに含む、請求項１の組成物。
【請求項４】
該安定化成分がコレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）である、請求項３の組成物。
【請求項５】
該脂質誘導のポリマーが、ポリエチレングリコールを用いて誘導されるホスファチジルエタノールアミンである、請求項１の組成物。
【請求項６】
該ターゲティングリガンドが抗体もしくは抗体フラグメントである、請求項１の組成物。
【請求項７】
該抗体フラグメントが、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２からなる群から選ばれる、請求項６の組成物。
【請求項８】
該遊離可能な結合がジスルフィド結合を含有する、請求項１の組成物。
【請求項９】
該ジスルフィド結合がジチオベンジル結合である、請求項８の組成物。
【請求項１０】
請求項２−８のいずれか１つに記載のリポソームであって、投与された場合、（ｉ）遊離可能な結合を開裂し、それによって該親水性ポリマー鎖を放出すること；（ｉｉ）該開裂の前またはその後に起きる標的細胞に対する該リガンドの該結合；および（ｉｉｉ）該標的細胞による該リポソームのインターナリゼーション、を達成し、それによって、該遊離可能な結合および／または該ターゲティングリガンドを欠如する類似のリポソームによって送達される薬剤の細胞内濃度に比較して、少なくとも２倍高い該薬剤の細胞内細胞毒性を達成するために効果的な該リポソームを含んでなる、リポソームに内包された薬剤の細胞内細胞毒性を増強するための組成物。
【請求項１１】
遊離可能な結合の該開裂が、天然に存在する血液成分によって達成される、請求項１０記載の組成物。
【請求項１２】
投与された場合の該リポソームが（ｉ）遊離可能な結合を開裂し、それによって該親水性ポリマー鎖を放出すること；（ｉｉ）該開裂の前またはその後に起きる標的細胞に対する該リガンドの該結合；および（ｉｉｉ）該標的細胞による該リポソームのインターナリゼーションを達成して、該遊離可能な結合および／または該ターゲティングリガンドを欠如する類似のリポソームによって送達される薬剤の細胞内濃度に比較した場合、該標的細胞の核において少なくとも２倍高い該薬剤の蓄積を達成するために効果的である、請求項２−８のいずれか１つに記載の、細胞核中への治療剤の蓄積を増大するための組成物。
【請求項１３】
遊離可能な結合の該開裂が、天然に存在する血液成分によって達成される、請求項１２記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内包された（ｅｎｔｒａｐｐｅｄ）薬剤の改良された細胞内送達のために設計されたリポソーム組成物に関する。より具体的には、本発明は、リポソームに内包された薬剤の細胞内の細胞毒性を増強するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームは、長い間、治療剤の細胞内への送達のために可能な担体（ｖｅｈｉｃｌｅ）と考えられてきた。しかしながら、今日まで、リポソームに内包された薬剤の細胞内送達の達成における成功は種々の理由のために限定されている。１つの理由は、血流への全身的投与後にリポソームが細網内皮細胞系によって循環から急速に除去されることである。その他の理由は、分子、特に大きい分子または電荷をもつ分子を細胞の細胞質および／または核に送達する際の固有の困難性にある。
【０００３】
リポソームに内包された薬剤の細胞内送達を改良するための１つのアプローチは、リポソーム二分子膜にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）誘導の脂質を包含させることによってリポソームの血液循環の寿命を延ばすことである（参照、例えば特許文献１）。リポソームが血流中に留まる時間の長さを延長することによって、細胞によって取り込まれる機会が改善される。
【０００４】
リポソームに内包された薬剤の細胞内送達を改良するためのその他のアプローチは、リポソーム上にターゲティング分子もしくはリガンドを提供することである（非特許文献１）。標的細胞上のレセプターへのターゲティング分子の結合は、リポソームおよびその内包された薬剤の細胞内取り込みの機会を改善する。
【０００５】
また、標的細胞と融合することができるリポソームも当該技術分野において記述されている（特許文献２）。融合誘導性リポソームは、典型的には、標的細胞膜中に侵入するためにリポソームの外部表面から伸びる疎水性セグメントを含む。
【０００６】
弱酸性条件下で不安定化するリポソーム、いわゆる「ｐＨ−感受性」リポソームは、また、内包された薬剤の細胞内送達へのアプローチとして記述されている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。これらのリポソームは、一定のｐＨ範囲で脂質二重層を形成する脂質、例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から主としてなる。このｐＨ範囲外では脂質二重層は不安定化する。そのようなリポソームがエンドサイトーシスを介して細胞に入った後、エンドソーム内の酸性ｐＨがｐＨ−感受性リポソームを不安定化させ、そして内包された薬剤を放出する。
【０００７】
ｐＨ−感受性リポソームは、「通常の」、「非ｐＨ−感受性リポソーム」のように、短い循環寿命を有しているので、血液循環時間を延ばすためのＰＥＧ−誘導の脂質の添加が提案されていた（非特許文献２）。しかしながら、ＰＥＧ−誘導のリポソームの添加は、リポソームのｐＨ−感受性を弱めて、所望されるリポソーム二重層の急速な不安定化および付随する内包された薬剤の細胞内への急速な放出の欠如をもたらす。
【０００８】
長い血液循環寿命を有し、かつ急速に不安定化するリポソームの機能を保持するｐＨ−感受性リポソームを提供する１つのアプローチは、ＰＥＧが、化学的に開裂可能な結合、例えばジスルフィドによって脂質に結合しているＰＥＧ−誘導の脂質を使用することである（非特許文献５）。しかしながら、不安定化は、リポソームに内包された薬剤の高い細胞内濃度を達成するためには細胞内で起きることが望ましい。Ｋｉｒｐｏｔｉｎら（前出）によって記述されている長い間循環するｐＨ−感受性リポソームは、ＰＥＧ鎖の遊離によって細胞外で不安定化するよう設計された。このアプローチは内包された内容物を細胞外で放出するという短所を負っている。
【０００９】
したがって、内包された薬剤の急速な細胞内放出を伴う標的細胞に特異的に結合することが可能なリポソーム組成物への技術上のニーズが残されている。
【特許文献１】
米国特許第５，０１３，５５６号
【特許文献２】
米国特許第５，８９１，４６８号
【非特許文献１】
Ｋｌｉｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２（３）：３２１（１９９２）
【非特許文献２】
Ｓｌｅｐｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（４）：２３８２（１９９７）
【非特許文献３】
Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８４：７８５１（１９８７）
【非特許文献４】
Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，９８１：２５４（１９８９）
【非特許文献５】
Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８８：１１５（１９９６）
【発明の開示】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、リポソームに内包された薬剤の細胞内送達が可能なリポソーム組成物を提供することである。
【００１１】
さらなる本発明の目的は、リポソーム組成物ならびに種々の疾患を治療するため、特に血液学的悪性疾患を治療するために同組成物の使用方法を提供することである。
【００１２】
したがって、１つの態様では、本発明は、治療剤の細胞内送達のためのリポソーム組成物を含む。本組成物は、（ｉ）ｐＨ−感受性脂質；（ｉｉ）親水性ポリマーであって、実在するかまたは誘発される生理学的状態に応じて親水性ポリマー鎖を遊離するのに効果的な結合によって脂質に結合されたポリマーを用いて誘導された脂質１−２０モル％；（ｉｉｉ）ターゲティングリガンド；および（ｉｖ）内包された治療剤、から形成されるリポソームからなる。組成物は標的細胞に結合し、そして内包された薬剤を放出して、遊離可能な結合および／またはターゲティングリガンドを欠如する類似のリポソームによって送達される薬物の細胞内濃度に比較した場合、薬物の細胞内濃度において少なくとも２倍の増加を達成するのに効果的である。
【００１３】
１つの実施態様では、ｐＨ−感受性脂質はジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）である。その他の実施態様では、リポソームは、安定化成分、例えばコレステリルヘミスクシネート（ｈｅｍｉｓｕｃｃｉｎａｔｅ）（ＣＨＥＭＳ）をさらに含む。
【００１４】
１つの実施態様では、脂質誘導のポリマーは、ポリエチレングリコールを用いて誘導されるホスファチジルエタノールアミンである。ターゲティングリガンドは抗体もしくは抗体フラグメントであってもよく、そしてある種の疾患の治療のためには、抗体抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ２２からの抗体もしくはフラグメントが好適である。
【００１５】
１つの実施態様では、脂質に親水性ポリマー鎖を結合する遊離可能な結合はジスルフィド結合を含有する。１つの好適な実施態様では、ジスルフィド結合はジチオベンジル結合の１部である。
【００１６】
その他の態様では、本発明は、リポソームに内包された薬剤の細胞内細胞毒性を増強する方法を含む。本方法は、上記組成を有するリポソームを提供すること、ならびにリポソームを投与して、（ｉ）遊離可能な結合を開裂し、それによって親水性ポリマー鎖を放出すること；（ｉｉ）結合が開裂の前またはその後に起きる標的細胞に対するリガンドの結合；および（ｉｉｉ）標的細胞によるリポソームのインターナリゼーション、を達成することを含む。そのような投与は、遊離可能な結合および／またはターゲティングリガンドを欠如する類似のリポソームによって送達される薬物の細胞内濃度に比較して、少なくとも２倍高い薬剤の細胞内細胞毒性を達成するのに効果的である。
【００１７】
１つの実施態様では、組成物を投与した後の遊離可能な結合の開裂は、１種以上の内因性作用物、例えば血液中もしくは細胞中に天然に存在している成分によって達成される。
【００１８】
その他の態様では、本発明は、上記のようなリポソームを提供すること、ならびにリポソームを投与して、（ｉ）遊離可能な結合を開裂し、それによって親水性ポリマー鎖の全部もしくは１部分を放出すること；（ｉｉ）結合が開裂の前またはその後に起きる標的細胞に対するリガンドの結合；および（ｉｉｉ）標的細胞によるリポソームのインターナリゼーションを達成することによって、細胞核における治療剤の蓄積を増大する方法に関する。そのような投与は、遊離可能な結合および／またはターゲティングリガンドを欠如する類似のリポソームによって送達される薬物の細胞内濃度に比較した場合、標的細胞の核において少なくとも２倍高い薬剤の蓄積を達成するために効果的である。
【００１９】
本発明のこれらおよび他の目的および特徴は、次に示す本発明の詳細な記述が添付する図面と併せて読まれる場合、より完全に理解できるであろう。
【００２０】
本発明は、リポソーム組成物、ならびにリポソームに内包された薬剤の細胞内送達のために同組成物を使用する方法を提供する。リポソームは、標的部位、例えば細胞の内部領域もしくは細胞内オルガネラにおける生理学的ｐＨ以下の環境に応じて内包された薬剤を急速に放出するよう適合される。以下、リポソーム組成物が記述され、そしてリポソーム内容物の細胞内送達が示される。
【００２１】
Ｉ．定義および略語
「誘発される生理学的状態」は、作用物もしくは状態が不安定な結合の開裂を惹起するのに効果的である本明細書で記述されるリポソームにより処置される被験者に投与される、外因性作用物もしくは状態、例えば熱、光、化学的作用物もしくは生物学的作用物を指す。
【００２２】
「実在する生理学的状態」は、不安定な結合の開裂を惹起するのに効果的な、内因性作用物もしくは状態、例えば化学的作用物、生物学的作用物、ｐＨレベルもしくは温度を指す。
【００２３】
句「親水性ポリマー鎖を遊離するのに効果的な」は、ポリマー鎖の全部もしくは少なくとも１部の遊離を意図する。
【００２４】
「ｐＨ−感受性」脂質は、脂質二重層の形態を形成するかまたは維持する能力が、周囲の環境のｐＨに少なくとも部分的に依存する脂質を指す。
【００２５】
ＤＯＰＥは、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを指す。
【００２６】
ＤＳＰＥは、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミンを指す。
【００２７】
ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥは、ＤＳＰＥに共有結合したメトキシポリ（エチレングリコール）を指す。
【００２８】
ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥは、Ｎ−［２−ω−メトキシポリ（エチレングリコール）−α−アミノカルボニルエチル−ジチオプロピオニル］−ＤＳＰＥを指す。
【００２９】
Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥは、ＤＳＰＥに共有結合したマレイミド末端のポリエチレングリコールを指す。
【００３０】
ＣＨＥＭＳは、コレステリルヘミスクシネートを指す。
【００３１】
ＣＦＥは、無細胞抽出液を指す。
【００３２】
ｍＡｂは、モノクローナル抗体を指す。
【００３３】
ＤＸＲは、ドキソルビシンを指す。
【００３４】
ＨＰＴＳは、８−ヒドロキシピレントリスルホン酸３ナトリウムを指す。
【００３５】
ＨＳＣＰは、水素化した大豆ホスファチジルコリンを指す。
【００３６】
ＴＩは、チラミニルイヌリンを指す。
【００３７】
ＤＰＸは、臭化ｐ−キシレン−ビス−ピリジニウムを指す。
【００３８】
ＩＩ．リポソーム組成物
本発明の方法における使用のためのリポソームは、ｐＨ−感受性脂質および親水性ポリマーを用いて誘導された脂質からなり、この場合ポリマーおよび脂質は開裂可能な結合によって結合される。また、リポソームは、リポソームが特定の細胞を標的とするのに効果的なリガンドもしくは部分を含む。細胞内送達のための治療剤はリポソーム内に内包される。これらの成分の各々がここに記述される。
【００３９】
ｐＨ−感受性脂質成分
リポソームは、特定のｐＨ範囲においてのみ安定化成分の不在下で二重層小胞（ｖｅｓｉｃｌｅ）を形成する脂質であるｐＨ−感受性脂質を含む。これらの脂質は、典型的には、疎水性および極性のヘッドグループ（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）部分を有する両親媒性脂質であり、そして二重層に配列される場合、疎水性部分が二分子膜の内部の疎水性領域に接し、そして極性ヘッドグループ部分が膜の外部の極性表面に向くように方向付けられる。ｐＨ−感受性の両親媒性脂質は、好ましくは、２種の炭化水素鎖、典型的には炭素原子約８−２２個の長さのアシル鎖をもち、そして種々の不飽和度を有する。
【００４０】
好適なｐＨ−感受性脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジアシル鎖を有するリン脂質である。生理的なｐＨおよびイオン強度において、ＤＯＰＥは二重層を形成することが不可能な逆ヘキサゴナル（ＨＩＩ）フェース（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｈｅｘａｇｏｎａｌ  ｐｈａｓｅ）において存在する。ＤＯＰＥの二重層リポソームは、アミン基についてのｐＫａ以上のｐＨ、すなわちｐＨ約８．５において作成することができる（Ａｌｌｅｎ  Ｔ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３：２９７６（１９９０））。しかしながら、酸が負に荷電されるｐＨでは、ＤＯＰＥは、電荷排斥性（ｃｈａｒｇｅ−ｒｅｐｕｌｓｉｎｇ）親水性部分を有する両親媒性物質の存在下で二重層状態において安定化することができる（Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒ，Ｌ．Ｈ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１１３１：２０１（１９９２）；Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８８：１１５（１９９６））。両親媒性物質のｐＫａにおける両親媒性物質のプロトン付加は、ヘキサゴナルフェース（ＨＩＩ）への逆行を促進することによってＤＯＰＥ小胞の不安定化を加速する（Ｌａｉ，Ｍ．Ｚ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４：１６５４（１９８５）；Ｅｌｌｅｎｓ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２３：１５３２（１９８４））。かくして、リポソームがその内容物を放出できるｐＨは、安定化する両親媒性物質の選択によって制御することができる。
【００４１】
本発明の一つの態様では、ＤＯＰＥは、大きいコレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）によって二重層状態で安定化される。ＣＨＥＭＳはｐＨ７．４において純粋に負に荷電され、そして中性ｐＨでは二重層状態でＤＯＰＥを安定化する。ｐＨレベル約６．０およびそれ以下では、ＣＨＥＭＳはプロトン付加し、ＤＯＰＥ小胞の不安定化をもたらす。
【００４２】
ＤＯＰＥはまた、以下に記述するように、大きい親水性部分を有する両親媒性脂質、例えばＰＥＧ−脂質誘導体の少モル％の混在によってｐＨ範囲５．５−７．４において二重層状態で安定化することができる。
【００４３】
ポリマーで誘導される脂質成分
またリポソームは、親水性ポリマーを用いて誘導された脂質を含有する。ポリマーで誘導される脂質は、ｐＨ感受性脂質を安定化して二重層およびリポソーム形成を容易にし、そしてリポソーム表面上にポリマー鎖のコーティングを形成してリポソームの血液循環の寿命を延ばすのに役立つ。すなわち、親水性ポリマーコーティングはコロイドの安定性を与え、そして単核食細胞系による取り込みからリポソームを保護するよう働いて、生物体に分布するリポソームのためのより長い血液循環寿命を提供する。下記のようにリポソームのｐＨ感受性を回復させるためには、ポリマー鎖は遊離可能な結合によって脂質に結合されてポリマー鎖を開裂および遊離させる。
【００４４】
好ましくは、誘導体化可能な脂質は、ｐＨ非感受性小胞を形成する両親媒性脂質であり、これは水中で自然に二重層小胞を形成できる。この種の小胞形成性脂質は、好ましくは、いずれか極性もしくは非極性の２種の炭化水素鎖、典型的にはアシル鎖およびヘッドグループを有する脂質である。２種の炭化水素鎖が、典型的には、炭素原子約１４−２２個の長さであり、そして種々の不飽和度を有する、合成および天然に存在する小胞形成性の両親媒性脂質が存在し、そして限定されるものではないがリン脂質、例えばホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトールおよびスフィンゴミエリンを含む。そのアシル鎖が種々の不飽和度を有する上記脂質およびリン脂質は、市販品を得ることもできるし、また公知の方法にしたがって製造することもできる。本発明における使用のための好適なジアシル鎖両親媒性脂質は、ジアシルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）およびホスファチジルグリセロール（ＰＧ）を含み、ホスファチジルエタノールアミンがもっとも好適である。本発明の１つの好適な実施態様では、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）が使用される。
【００４５】
両親媒性脂質を誘導するために適当な親水性ポリマーは、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメチルエーテル、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、ポリヒドロキシプロピルメタクリレート、ポリヒドロキシエチルアクリレート、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリエチレングリコールおよびポリアスパルタミドを含む。
【００４６】
好適な実施態様では、親水性ポリマーは、好ましくは分子量５００−１０，０００ダルトン、より好ましくは２，０００−１０，０００ダルトン、もっとも好ましくは１，０００−５，０００ダルトンを有するＰＥＧ鎖としてのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００４７】
遊離可能な結合
前記のように、親水性ポリマーは、特定の刺激、例えば熱、ｐＨにおける変化または外因性の投与された化学的もしくは生物学的作用物への曝露により開裂する結合である遊離可能な結合を介して小胞形成性脂質に結合される。好適な実施態様では、本結合は、限定されるものではないが、細胞、血液（血漿）中の、または標的細胞表面の近傍における化学的もしくは生物学的作用物を含む、内因性のイン・ビボ刺激に応答する結合である。
【００４８】
適当な遊離可能な結合は、例えば、ペプチド、エステルもしくはジスルフィド結合を含む。エステルおよびペプチド結合は、内因性もしくは外因性のエステラーゼもしくはペプチダーゼ酵素によって開裂することができる。ジスルフィド結合は、還元剤、例えばジチオトレイトール（ＤＴＴ）、グルタチオンもしくはアスコルビン酸塩の投与によって、あるいはイン・ビボで還元剤、例えばシステインによるか、または血漿中および細胞内に存在する還元酵素によって開裂できる。
【００４９】
好適な実施態様では、遊離可能な結合は、ジスルフィド結合であり、広くは、本明細書では硫黄含有結合を指すことを意図している。硫黄含有結合は、当該技術分野において既知であり、そして例えば米国特許第６，０４３，０９４号において記述されているように、選択される不安定度を達成するよう合成することができる。不安定度の可変性は、リポソーム表面から親水性ポリマーコーティングを遊離する割合の調整を可能にする。一般に、より長い循環寿命が必要である場合は、より少ない不安定結合が使用される。
【００５０】
代表的なジスルフィド結合は、当該技術分野において記述されているようなジチオプロピオニル（ＤＴＰ）である（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８８：１１５（１９９６））。ＤＴＰによって脂質ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）に結合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の合成は、過剰のｍＰＥＧ−ＮＨ２とジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のスクシンイミジルエステルの反応によって達成されて、Ｎ−スクシンイミジル−［２−（メトキシポリ（オキシエチレン）−α−アミノカルボニル）エチル−ジチオプロピオネート、ｍＰＥＧ−ＤＴＰ−ＯＳｕを生成する。これはＤＳＰＥと反応して、所望の複合体、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（前出）を形成する。
【００５１】
その他の好適な遊離可能な結合は、同時係属出願番号０９／５５６，０５６および０９／５５６，６１０に記述されたようなジチオベンジル（ＤＴＢ）結合（Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０（５）：７０３（１９９９）；ＷＯ００／６４４８３およびＷＯ００／６４４８４）であり、両者とも本明細書に引用によって組み入れられている。この結合は、一般構造：
【００５２】
【化１】
2004525138.tif 000003
【００５３】
［式中、Ｒ１は、ジチオベンジル部分への結合のための結合を含んでなる親水性ポリマーであり；Ｒ２は、Ｈ，アルキルおよびアリールからなる群から選ばれ；Ｒ３は、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ４，Ｓ（Ｃ＝Ｏ）Ｒ４およびＯ（Ｃ＝Ｓ）Ｒ４からなる群から選ばれ；Ｒ４は、アミン含有の脂質、例えば前記の小胞形成性脂質を含有し；そしてＲ５は、Ｈ，アルキルおよびアリールからなる群から選ばれ；そしてＣＨ２−Ｒ３の配向はオルト位およびパラ位から選ばれる］によって表される。
【００５４】
図１Ａは、本発明による代表的化合物の構造を示し、この場合、Ｒ１は親水性ポリマーメトキシ−ポリエチレングリコール、ｍＰＥＧ＝ＣＨ３Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ［式中、ｎは約１０〜約２３００である］であって、分子量約４４０ダルトン〜約１００，０００ダルトンに対応する。ポリマーの分子量は、ある程度まではＲ３の選択に依存する。Ｒ３がリポソームにおける使用のためのアミン含有脂質である実施態様では、ＰＥＧ分子量の好適な範囲は、約７５０〜約１０，０００ダルトン、より好ましくは約２，０００〜約５，０００ダルトンである。この実施態様におけるｍＰＥＧはウレタン結合部分を含む。Ｒ１が種々の親水性ポリマーから選ばれ、そして代表的なポリマーが先に列挙されていることは評価できる。また、ポリマーの分子量が、リポソーム組成物中に含有されるポリマー−ＤＴＢ−脂質複合体の量に依存し、ここで、より大きい分子量ポリマーが、しばしば組成物中のポリマー−ＤＴＢ−脂質が少量である場合に選ばれて、少数のリポソームに結合されたポリマー鎖を生じることは評価される。
【００５５】
図１Ａへの参照を続ければ、この代表的な化合物におけるＲ２およびＲ５は水素（Ｈ）であるが、Ｒ２およびＲ５のいずれかまたは両方は、また直鎖もしくは分枝アルキルもしくはアリール基であってもよい。好適な実施態様では、Ｒ５はＨであり、そしてＲ２はアルキルであり、そして数例が以下に示される。図１Ａに示される化合物において、Ｒ３はＯ（Ｃ＝Ｏ）−（ＮＨ２−リガンド）の一般式をとるが、この場合ＮＨ２−リガンドはいかなるアミン含有脂質であってもよい。また、Ｒ３は式Ｏ（Ｃ＝Ｓ）−（ＮＨ２−リガンド）もしくはＳ（Ｃ＝Ｏ）−（ＮＨ２−リガンド）であってもよい。
【００５６】
図１Ｂは、図１ＡのｍＰＥＧ−ＤＴＢ−（ＮＨ２−脂質）化合物のチオール開裂のメカニズムを示す。カルバミン酸オルト−もしくはパラ−ジチオベンジル部分が、弱いチオール開裂条件下、例えばシステインもしくは他の天然に存在する還元剤の存在下で開裂される。開裂により、アミン含有脂質がその天然の未改変形態で再生される。下記の本発明を支持する研究は、イン・ビボでの天然の生理学的条件がＤＴＢ結合の開裂を開始し、そして達成するのに十分であることを示している。還元剤が化合物の開裂および分解のために十分なチオール開裂条件を人為的に誘導するよう投与されてもよいことは評価できる。
【００５７】
ポリマー−ＤＴＢ−脂質複合体における使用のために適当な脂質は、好ましくは、炭素原子を少なくとも約８個含有する少なくとも１個のアシル鎖、より好ましくは炭素原子約８−２４個を含有するアシル鎖を有する水に不溶の分子である。好適な脂質は、アミン含有の極性ヘッドグループおよびアシル鎖を有する脂質である。代表的な脂質は、１本のアシル鎖、例えばステアロイルアミン、または２本のアシル鎖を有するリン脂質である。アミン含有ヘッドグループを有する好適なリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルセリンを含む。脂質テール（ｔａｉｌ）は、炭素原子約１２〜約２４個を有し、そして完全に飽和されていても、または不飽和であってもよい。１種の好適な脂質は、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）であるが、当業者はこの記述内にはいる広範な脂質を評価できる。また、脂質が天然にアミン基を含有するか、またはアミン基を含有するよう誘導できることも評価できる。アシルテール、例えばコレステロールアシルをもたない他の脂質部分もまた適当である。
【００５８】
ポリマー−ＤＴＢ−脂質化合物の合成は各所に記述されている（（Ｚａｌｉｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１０（５）：７０３（１９９９）；ＷＯ００／６４４８３およびＷＯ００／６４４８４）および代表的な合成経路は図２において図によって示される。メトキシカルボニルジチオアルキル末端基を有するｍＰＥＧ誘導体（ＭＷ２０００および５０００ダルトン）は、２−（メトキシカルボニルジチオ）エタンアミンをｍＰＥＧ−クロロホルメートと反応させることによって製造され、これは、乾燥ｍＰＥＧ−ＯＨ溶液のホスゲネーションによって容易に製造される（Ｚａｌｉｓｋｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５：１００−１１４（１９９２））。前者の化合物は、公表されている操作にしたがって当量の塩化メトキシカルボニルスルフェニルとの塩酸２−アミノエタンチオール反応をとおして得られる（Ｂｒｏｉｓ，Ｓ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９２：７６２９−７６３１（１９７０）；Ｋｏｎｅｋｏ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２：１３３−１４１（１９９１））。メルカプトベンジルアルコールの両パラおよびオルト異性体（Ｇｒｉｃｅ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９４７−１９５４（１９６３））は、得られるＰＥＧ結合したアシルジスルフィドと完全にカップリングして、ジチオベンジルアルコール末端基を担持するｍＰＥＧを生じる。活性カーボネート導入は未誘導のｍＰＥＧ−ＯＨを用いて進行して、炭酸パラ−ニトロフェニルを生成する。エタノールアミンにおけるＤＳＰＥの付加は所望のｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＤＳＰＥ生成物を形成する。両オルト−およびパラ−ＤＴＢ−脂質化合物はこの方法によって製造され、次いで、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製され、そしてＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳによって特性決定できる。
【００５９】
図３は、ｍＰＥＧ−ＤＴＢ−ＤＳＰＥ複合体のチオール開裂のメカニズムを示す。開裂により、ホスファチジルエタノールアミン脂質（ＤＳＰＥ）がその天然の未改変形態で再生される。
【００６０】
末端官能化されたポリマー−脂質複合体
本発明のリポソーム組成物はターゲティング部分をさらに含む。好適な実施態様では、ターゲティングリガンドは、リポソームに固定される親水性ポリマー鎖の末端に共有結合される。例えば、前述の脂質−ＤＴＢ−ポリマーにおけるポリマーの遊離末端は、末端の反応性基（末端官能化された）を含むように改変されて、ターゲティング部分分子内の官能基とカップリングされる。そのようなポリマー末端の反応性基は当該技術分野において既知であり、そして結合されるターゲティングリガンドにしたがって選択される。例えば、ターゲティング部分が抗体もしくは抗体フラグメントである場合、ポリマー鎖は、例えば、抗体に存在するスルフヒドリル、アミノ基、およびアルデヒドもしくはケトン（典型的には、抗体の炭水化物部分の弱い酸化より得られる）とのカップリングに適する反応性基を含有するよう官能化される。そのようなＰＥＧ−末端の反応性基の例は、マレイミド（スルフヒドリル基との反応のため）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）もしくはＮＨＳ−炭酸エステル（１級アミンとの反応のため）、ヒドラジドもしくはヒドラジン（アルデヒドもしくはケトンとの反応のため）、ヨードアセチル（スルフヒドリル基と優先して反応性）およびジチオピリジン（チオール−反応性）を含む。
【００６１】
他の適当な反応性末端基は、マレイミドおよびヒドラジンを含む。マレイミドは広く使用されるタンパク質改変試薬であり、そしてマレイミドがヘテロ−二官能性架橋試薬における２つの官能基の１つである場合に特に有用である。マレイミドのスルフヒドリル基との反応は、活性化された二重結合へのメルカプタン基のマイケル（Ｍｉｃｈａｅｌ）付加を含む。アミノ基との反応は同じメカニズムによるが、はるかに遅い速度で生じる。メルカプタンは、特に中性ｐＨではもっとも反応性の種であるので、マレイミド基は、ターゲティング部分におけるスルフヒドリル基を標的とするために使用でき、そして良好な選択性が通常達成される。
【００６２】
ヒドラジドもしくはヒドラジン基はアルデヒド基に対して反応性である。また、ヒドラジドは活性エステルもしくはカルボジイミド−活性化カルボキシル基によってアシル化することができる。アシル化種として反応性であるアシルアジド基はヒドラジドから容易に得ることができ、そしてアミノ含有分子の結合を可能にする。
【００６３】
末端を官能化されたポリマー−脂質複合体の製造方法は当該技術分野において一般に周知である。例えば、同時共有権のある米国特許第５，６２０，６８９号は、抗体もしくは抗体フラグメントのポリマー鎖への結合のためのマレイミド、ヒドラジドおよび２−ピリジルジチオプロピオンアミド末端基の製造および使用方法を開示している；この開示は引用によって本明細書に組み入れられている。
【００６４】
ターゲティングリガンドがまた、脂質およびポリマーを結合している遊離不可能な結合をもつ脂質−ポリマー複合体を用いてリポソーム中に包含されてもよいことは評価できる。また、前記リポソームの親水性ポリマーコーティングを形成するのに適当ないかなる脂質も、改変されたポリマー−脂質複合体を形成するために使用されてもよく、そして前記親水性ポリマーのいかなるものも適当であることは評価である。好ましくは、ターゲティング部分のＰＥＧ−官能化脂質への結合では、ターゲティング部分はいかなる活性の損失をも受けない。
【００６５】
ターゲティング部分は、リポソーム中に末端を官能化されたポリマー−脂質複合体を含有させ、次いでリポソームの形成後に、予め形成されたリポソームにおいて所望のリガンドを反応性ポリマー末端と反応させることによってリポソーム表面に結合されてもよい。あるいはまた、リガンド−ポリマー−脂質は、リポソーム形成時に脂質組成物中に含有されてもよい。リガンド−ポリマー−脂質複合体を予め形成されたリポソーム中に挿入によって組み入れることもまた可能であり、この場合、リガンド−ポリマー−脂質複合体は、リポソーム脂質二重層中に複合体を組み入れさせるのに適当な条件下で、予め形成されたリポソームとインキュベートされる。挿入技術は、当該技術分野において、例えば米国特許第６，０５６，９７３号に記述されている。
【００６６】
ターゲティング部分
広範なターゲティング部分が使用のために企図され、そして代表的な部分は、例えば、米国特許第５，８９１，４６８号に記述されている部分を含み、そしてリガンドを記述しているこの特許の一部は引用によって本明細書に組み入れられている。一般に、ターゲティング部分は、標的細胞上の細胞表面レセプターと特異的に結合するのに効果的なリガンドである。
【００６７】
好適な実施態様では、リガンドは、標的細胞上のレセプターに特異的な抗原を標的にする抗体もしくは抗体フラグメントである。抗体はモノクローナル抗体もしくは抗体フラグメントであってもよく、これは標的に特異的である。好適な実施態様では、リポソームに結合された抗体は、Ｂ細胞抗原決定基に特異的に結合するための抗ＣＤ１９、抗ＣＤ２０もしくは抗ＣＤ２２である。これらの抗体もしくは抗体フラグメントは、典型的には、影響を受けるＢ細胞に対してポジティブな反応性を示すハイブリドーマから得られる。体内のすべての他の細胞をも標的とする他の抗体もしくは抗体フラグメントが同様に使用できることが考えられる。
【００６８】
本発明を支持するために実施された研究において、抗ＣＤ１９抗体は、内包された薬剤を含有するリポソームが悪性Ｂ細胞を標的とするために使用された。抗体はＢ細胞上の独特な抗原決定基、ＣＤ１９表面抗原を認識する。以下に記述されるように、ターゲティング部分を有するｐＨ−感受性リポソームは、内包された薬剤を細胞内に送達するために効果的であった。
【００６９】
リポソームに内包された治療剤
標的細胞へ細胞内送達するための治療剤はリポソームに内包される。小胞の水性コンパートメント（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）中に安定に被包化できる水溶性薬剤、小胞の脂質相に安定に分配する親水性化合物、または例えば、外部小胞表面への静電接着によって安定に結合できる薬剤を含む、種々の治療剤が脂質小胞中に内包することができる。代表的な水溶性化合物は、低分子の水溶性有機化合物、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡプラスミド、オリゴヌクレオチドおよび遺伝子フラグメントを含む。
【００７０】
リポソームに内包される化合物はまた疾病の進行をたどるための造影（ｉｍａｇｉｎｇ）剤であってもよい。造影剤は、放射性核種、例えばテクネチウム９９、インジウム１１１およびヨウ素１２５のキレートを含む。
【００７１】
また、内包される作用物は、イン・ビトロの診断アッセイに使用するためのレポーター分子、例えば酵素もしくは蛍光団であってもよい。そのような内包されたレポーター分子を有するリポソームは、いずれか標的細胞もしくはレセプターを含有するリポソームに融合することによって送達されてもよい。
【００７２】
一つの態様では、化合物は、Ｂリンパ球系統細胞の新生物を特徴とする血漿細胞疾患、例えば多発性骨髄腫の治療のために有用である。多発性骨髄腫の治療のために好適な治療剤は、メルファラン、シクロホスファミド、プレドニソン、クロラムブシル、カルムスチン、デキサメタソン、ドキソルビシン、シスプラチン、パクリタキセル、ビンクリスチン、ロムスチンおよびインターフェロンを含む。これらの若干の薬物の標準化学療法処置について典型的な用量は次のとおりである：メルファラン，１日当たり８ｍｇ／ｍ２体表面積；シクロホスファミド，１日当たり２００ｍｇ／ｍ２；クロラムブシル，１日当たり８ｍｇ／ｍ２；プレドニソン，１日当たり２５−６０ｍｇ／ｍ２；ビンクリスチン，（１．４ｍｇ／ｍ２）およびドキソルビシン（６０−７５ｍｇ／ｍ２）。
【００７３】
がんおよびウイルス感染症の治療のためにプラスミド、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの細胞質内送達もまた考えられる。
【００７４】
本発明において、治療剤は、被験者への非経口的投与のために以下に議論される方法によってリポソーム中に内包される。リポソーム投与に使用される用量は、最初は標準化学療法での用量に基づき、そして疾病の進行を監視することによって治療コースにわたって逐次調節される。
【００７５】
ＩＩＩ．ｐＨ感受性のターゲティングリポソームの製造
内包された作用物を含有しているリポソームは、周知の方法、例えば脂質膜の水和、逆相蒸発および溶媒注入により製造することができる。送達される化合物は、親油性化合物の場合に脂質膜に包含されるか、または水溶性治療剤の場合に水和媒質に包含されるかいずれかである。あるいはまた、治療剤は、例えば、イオン勾配に対してイオン化可能な化合物を充填することによって、予め形成された小胞中に充填されてもよい。
【００７６】
多重膜小胞（ＭＬＶ）の形成のための１つの周知の操作は単一脂質膜水和技術である。この操作では、リポソーム形成脂質の混合物が適当な有機溶媒に溶解され、次いでこれが蒸発されて薄い脂質膜を形成する。脂質膜は、次に水性媒質により水和されて、典型的にはサイズ約０．１〜１０ミクロンをもつＭＬＶを形成する。
【００７７】
送達される治療化合物は、形成されたリポソームに薬物を内包するために、リポソーム形成前に小胞形成脂質に薬物を添加することによってリポソーム中に組み入れられてもよい。薬物が疎水性である場合、それは疎水性混合物に直接添加されてもよく、一方、親水性薬物は乾燥脂質の薄膜を覆う水性媒質に添加されてもよい。あるいはまた、薬物は、能動輸送機構によって、例えば、化合物が硫酸アンモニウム勾配のような勾配（米国特許第５，１９２，５４９号明細書、Ｂｏｌｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ.，４：４５５（１９９４））またはカリウムもしくは水素イオン濃度に応じてリポソームに取り込まれる遠隔（ｒｅｍｏｔｅ）充填によって、予め形成されたリポソーム中に組み入れられてもよい。
【００７８】
形成後、リポソームは大きさを整えられる。ＭＬＶのための１つの効果的なサイズを整える方法は、範囲０．０３〜０．２ミクロン、典型的には０．０５，０．０８，０．１もしくは０．２ミクロンの選ばれた均一な孔径を有する一連のポリカーボネートメンブランをとおしてリポソームの水性懸濁液を押し出すことを含む。メンブランの孔径は、特に同じメンブランをとおして調製物が２回以上押し出される、メンブランをとおしての押し出しによって製造されたリポソームの最大サイズにほぼ対応する。またホモジナイゼーション法は大きさ１００ｎｍ以下にリポソームのサイズを小さく整えるためにも有用である。本発明の好適な実施態様では、リポソームは、範囲０．２〜０．０８μｍの孔径を有する一連のポリカーボネートフィルターをとおして押し出されて、範囲ほぼ１２０±１０ｎｍの直径を有するリポソームをもたらす。
【００７９】
本発明のリポソームは、典型的には、小胞形成脂質約７０−９０％、遊離可能なポリマー鎖の表面コーティングを形成するためのポリマー−脂質複合体１−２０％、およびターゲティング部分のカップリングのための末端官能化されたポリマー脂質複合体０．１−５％のモル比において存在する脂質成分を用いて製造される。遊離可能な結合を含有するポリマー−脂質複合体が末端を官能化されてターゲティングリガンドを結合してもよく、あるいはリポソームが２種の異なるポリマー−脂質種、遊離可能な結合を有する１つのポリマー−脂質複合体および遊離可能な結合を含有しないが結合されたターゲティング部分を有するその他のポリマー−脂質複合体を含んでもよいことが評価できる。
【００８０】
本発明の支持に際して実施された研究では、両ｐＨ−感受性およびｐＨ−非感受性リポソームは実施例１において記述されるように製造された。いずれか標的指向化または標的非指向化の、そしていずれか遊離可能または遊離不可能なコーティングを有する、ｐＨ−感受性の、立体的に安定化されたリポソームが、ＤＯＰＥもしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭ（モル比６：４）の混合物から、そしていずれかｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（遊離不可能な）またはｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（遊離可能なコーティング）およびある場合には、ターゲティングリガンドの結合が可能な、ＤＳＰＥにカップリングされたマレイミド−末端のポリエチレングリコール、Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥを含んで製造された。種々の製剤の脂質モル比は、各実験についての図の説明および記述において指示される。
【００８１】
ｐＨ−非感受性リポソームは、水素化した大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、コレステロール（ＣＨＯＬ）、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥおよびいずれかマレイミド−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（標的指向化）または不在（標的非指向化）から、モル比それぞれ２：１：０．０８：０．０２のＨＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／マレイミド−ＰＥＧ−ＤＳＰＥまたは２：１：０．０８のＨＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを含有して製造された。リポソームは、脂質成分をクロロホルム中に溶解することによって水和技術により形成された。成分の混合後、クロロホルムが除去され、そして乾燥脂質フィルムが適当なバッファーで水和され、連続して孔径範囲０．２〜０．０８μｍの一連のポリカーボネートフィルターをとおして押し出された。
【００８２】
治療薬ドキソルビシン（ＤＸＲ）は、実施例１において記述されるように、硫酸アンモニウム勾配にしたがう遠隔充填によって予め形成されたリポソーム中に被包化された。若干の研究では、ＰＨ−感受性リポソームはまた、リポソーム二重層の安定性を調査するために、８−ヒドロキシピレントリスルホン酸３ナトリウム−ｐ−キシレン−ビス−ピリジニウム（ＨＰＴＳ−ＤＰＸ）、蛍光染料を充填されるか、または放射能標識されたチラミニルイヌリン（［１２５Ｉ］ＴＩ）を充填された。ＨＰＴＳ−ＤＰＸもしくは［１２５Ｉ］ＴＩの被包化は、実施例１において記述されるように、所望の化合物の溶液（ｐＨ９．０）を用いて薄い脂質膜を水和することによって達成された。
【００８３】
以下に記述される若干の研究では、Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥのマレイミド−末端にカップリングされたＣＤ１９抗体を有する標的指向化リポソームが、実施例２に記される操作にしたがって製造された。
【００８４】
ＩＶ．リポソーム組成物のイン・ビトロの安定性
本明細書において記述されるｐＨ−感受性リポソームは、遊離可能なポリマーコーティングによって安定化され、その結果、リポソームは酸性ｐＨにおいてさえ被包化された化合物を保持することを可能にする。リポソームのｐＨ感受性、したがって酸性ｐＨにおける不安定化は、ポリマーコーティングの全部もしくは一部を開裂することによって回復されて、リポソームの不安定化と同時にリポソーム内容物の放出を惹起する。リポソーム組成物のこの特徴は実施例３−５において記述されるイン・ビトロの漏出実験によって例証された。ｐＨ−感受性リポソームの安定性が、無細胞抽出液（ＣＦＥ）、ヒト血漿中および１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有する細胞培養液において、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含有するかまたは含有しない、ｐＨ７．４もしくは５．５のバッファー中で、ｐＨ−非感受性リポソームの安定性と比較された。リポソームからの、内包された溶質、いずれか８−ヒドロキシピレントリスルホン酸３ナトリウム−臭化ｐ−キシレン−ビス−ピリジニウム（ＨＰＴＳ−ＤＰＸ，蛍光染料）またはドキソルビシン（ＤＸＲ）の放出もしくは漏出が、蛍光−デクェンチング（ｄｅｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）アッセイを用いて測定された。
【００８５】
バッファー中のｐＨ−感受性リポソームの安定性
ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（図４Ａおよび５Ａ）もしくはｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（図４Ｂおよび５Ｂ）により安定化され、そして３７℃においてｐＨ７．５およびｐＨ５．５のバッファー中でインキュベートされたＤＯＰＥ（図４Ａ−４Ｂ）およびＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ（図５Ａ−５Ｂ）リポソームからのＨＰＴＳの漏出が、実施例３に記述される操作によって評価された。さらに、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）（１００ｎＭ）の存在下、ｐＨ７．４およびｐＨ５．５によってインキュベートされたｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを含有するリポソームからのＨＰＴＳの漏出が評価された（図５Ｂ）。ＤＴＴはジスルフィド結合の開裂を誘導し、そして安定化するポリマーコーティングの遊離を惹起する。
【００８６】
図４Ａおよび４Ｂにおいて示されるように、ｐＨ−感受性リポソームは、少モル％の大きいヘッドグループを有する分子の包含によって二重層状態で安定化することができる。すなわち、ＰＥＧ−脂質誘導体は、ｐＨ５．５−７．４の範囲で二重層状態においてＤＯＰＥもしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳを安定化でき、そしてリポソームのｐＨ感受性はコーティングが遊離される場合に回復される。ＤＯＰＥのみから形成されたリポソームは、ｐＨ７．４バッファー（●）またはｐＨ５．５バッファー（○）においてインキュベートされた場合それらの内容物を放出する（図４Ａ）。ＤＯＰＥ製剤中への５モル％ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（図４Ａ）またはｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（図４Ｂ）の組み入れは、ｐＨ７．４バッファー（▲，５モル％のｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（図４Ａ）および■，５モル％のｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（図４Ｂ））において，またはｐＨ５．５バッファー（△，５モル％のｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（図４Ａ）および▼，５モル％のｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（図４Ｂ））において、２４時間にわたってインキュベートされた場合に漏出しなかったリポソームの形成をもたらした。
【００８７】
ジチオトレイトール（ＤＴＴ）によるリポソームの処理は、脂質膜アンカー（ＤＳＰＥ）からのｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥのチオール開裂を誘導する。５モル％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを含有するＤＯＰＥリポソームは、ｐＨ７．４ではＤＴＴの存在下で２４時間にわたってほとんど内容物を放出しなかった（■，図４Ｂ）が；ｐＨ５．５では、ＤＴＴによる処理が、約１０時間内に約５０％のＨＰＴＳの段階的放出をもたらした（▽，図４Ｂ）。ｐＨ５．５において、３モル％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを含有するＤＯＰＥ製剤は、より一層急速な内容物の放出をもたらした（２時間で１００％放出、データ未掲載）。
【００８８】
図５Ａ−５Ｂに図示されるように、ＤＯＰＥリポソームはまた、大きい、そして／または電荷を拒絶する親水性部分を有する両親媒性物質によって二重層状態で安定化することができる。ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを含有しないＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ製剤は、ｐＨ７．４ではほとんど漏出しなかった（●，図５Ａ）が、ｐＨ５．５では被包化された染料を急速に放出した（○，図５Ａ）。ｐＨ５．５もしくは７．４において、これらのリポソームが、いずれか５モル％ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（図５Ａ：△，ｐＨ５．５および▲，ｐＨ７．４において）、または５モル％のｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（図５Ｂ：▼，ｐＨ５．５および■，ｐＨ７．４において）で安定化された場合には２４時間にわたって１０％未満の漏出が起きた。ＤＴＴの存在下では、５モル％のｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを含有するＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳは、ｐＨ５．５では約８時間の放出半減期を有した（▽，図５Ｂ）が、一方ｐＨ７．４ではほとんど放出は起きなかった（□，図５Ｂ）。３モル％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥで安定化されたＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソームのＤＴＴ処理は、中間的な漏出速度をもたらした（データ未掲載）。
【００８９】
図４Ｂおよび５Ｂにおいて見られるように、ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを含有するｐＨ−感受性リポソーム（▼，両図４Ｂおよび５Ｂにおいて）は、ｐＨ５．５では内容物放出速度を増大したが、内容物放出は類似のＰＥＧを欠如するリポソームについて見られたものよりも急速ではなかった（○，図４Ａおよび５Ａ）。この比較的遅い放出は、一部は、ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥの不完全な開裂によるようであり、内包された作用物の放出速度を変えたり調整するのに有利に利用できる特徴である。例えば、完全な放出を受けることができない遊離可能な結合の選択は、内容物放出速度を遅くするために使用できるが、これに対して、選ばれた刺激に応じて容易に開裂する結合の選択は、内包された作用物の総体的に急速な放出を達成するために使用することができる。
【００９０】
無細胞抽出液（ＣＦＥ）中のｐＨ感受性リポソームの安定性
無細胞抽出液（ＣＦＥ）は、ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥの開裂においてジチオトレイトール（ＤＴＴ）の作用を模倣できる細胞質およびリソソーム酵素を含有している。したがって、ＣＦＥに接触した製剤からの、親水性の膜不透過性染料８−ヒドロキシピレントリスルホン酸３ナトリウム（ＨＰＴＳ）の漏出は、いずれかｍＰＥＧ−ＤＳＰＥもしくはｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥにより安定化されたｐＨ−感受性リポソームの細胞内環境における不安定化の過程を示している。
【００９１】
図６Ａ−６Ｂは、３７℃においてｐＨ５．５（ほぼリポソームのｐＨ５〜６．５）に調節された無細胞抽出液中でインキュベートされた脂質混合物において、種々の割合のｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを用いて安定化されたＤＯＰＥもしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソームからの時間の関数としての被包化されたＨＰＴＳの漏出を示す。研究は、実施例４に記述された操作にしたがって実施された。漏出は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理されたプレインキュベーションサンプルの蛍光（１００％放出）をおおうサンプルの蛍光における増加パーセントとして決定された；結果は、代表的な実験からのものであり、そして３並列分析の平均値±Ｓ．Ｄ．である。
【００９２】
図６Ａは、ＤＯＰＥ（●）、３モル％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（▲）および５モル％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（■）で安定化されたＤＯＰＥからなるリポソームについての時間の関数としてのＨＰＴＳ染料の放出％を示す。ＤＯＰＥ単独または３モル％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥで安定化されたＤＯＰＥから作成されたリポソームは、半減期１．７時間をもつそれらの内容物の急速な放出を受けた。５モル％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（■）を含有するＤＯＰＥ製剤のＣＦＥにおける放出速度は、２４時間にわたって被包化染料の４０％を放出する遅いものであった。
【００９３】
図６Ｂは、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ（○）、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／１．８モル％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（△）；およびＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／３モル％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（□）から作成されたリポソーム中に被包化されたＨＰＴＳの放出％を示す。３種の製剤は、ｐＨ５．５のＣＦＥ中でそれらの内容物を急速に放出し、８時間でほぼ完全に放出した。ｐＨ７．４に調整されたＣＦＥ中でインキュベートされたＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳおよびＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ製剤は、はるかに遅い速度でＨＰＴＳを放出した（データ未掲載）。
【００９４】
ヒト血漿中のｐＨ−感受性リポソームの安定性
実施例５に記述されるその他の研究では、種々のリポソーム製剤からの親水性染料の漏出速度が、３７℃での９０％ヒト血漿（ｐＨ７．４）中および３７℃での１０％ＦＢＳを含有する細胞培養培地中で評価された。ＨＰＴＳは、水溶性（しかし蛍光−消光された）複合体、ＨＰＴＳ−ＤＰＸとしてリポソーム中に受動的に充填された。ＨＰＴＳ−ＤＰＸがリポソームから漏出する場合、それは遊離ＨＰＴＳとＤＰＸに解離し、４１３ｎｍで励起されるとＨＰＴＳ蛍光を増強する。被包化されたＨＰＴＳの２０％が、ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥもしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ製剤からヒト血漿中で２４時間にわたって漏出した（未掲載）。
【００９５】
ドキソルビシン（ＤＸＲ）は、リポソーム内部で沈殿（（ＤＸＲ−ＮＨ３）２ＳＯ４）を形成する硫酸アンモニウム勾配を用いて、ｐＨ約５．５においてリポソーム中に普通は能動的に充填される（Ｂｏｌｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，４：４５５（１９９４））。このリポソームのドキソルビシン製剤は、遅い速度の薬物放出をもち非常に安定である。しかしながら、リポソーム中にＤＯＰＥもしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ脂質を集中させるのに必要な一層高いｐＨでは、ＤＸＲが、能動的な充填の間にリポソーム内部で沈殿を形成するか否か、そしてｐＨ−感受性リポソームからのＤＸＲの放出速度が如何なるものであるかは、これまで知られていなかった。図７Ａ−７Ｂに見られるように、ヒト血漿中でのＤＸＲの漏出が、ＤＯＰＥ／４モル％ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ，（●）；ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／２モル％ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ，（▲）、ＤＯＰＥ／４モル％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（■）およびＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／２モル％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（▼）からなる抗ＣＤ１９で標的指向化されたｐＨ−感受性リポソームについて試験された。ＤＸＲは、若干遅いが、なお速い放出速度を有するＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（▲，図７Ａ）を除いて、すべての製剤から急速に放出された。ヒト血漿の存在下では抗ＣＤ１９で標的指向化された製剤と類似の標的非指向化製剤（５モル％ｍＰＥＧ含有）との間にＤＸＲ放出の速度において有意な差はなかった（データ未掲載）。
【００９６】
１０％ＦＢＳを含有する細胞培養培地における種々のｐＨ−感受性リポソーム組成物の安定性もまた評価された。試験されたすべてのリポソームが抗ＣＤ１９ターゲティングリガンドを含み、そして内部コンパートメント中に内包されたＤＸＲを含有した。リポソーム脂質組成物は、ＤＯＰＥ／４モル％ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／２モル％ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ，ＤＯＰＥ／４モル％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥおよびＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／２モル％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥからなった。リポソーム組成物のすべては安定しており、３７℃で２４時間にわたるインキュベーションで１０％未満の漏出があった（データ未掲載）。
【００９７】
Ｖ．リポソーム組成物の薬物送達効力
本発明にしたがって、前記リポソームは、標的細胞の中もしくはすぐ外側の低いｐＨ条件に応じてその内容物を急速に放出することができ、その結果、ｐＨ非感受性の標的指向化リポソームまたはｐＨ非感受性の標的非指向化リポソームに比較した場合、薬物の細胞内濃度の増大を達成する。この増大した細胞内濃度は、以下のＡ部に記述される本発明を支持するために実施された研究において例証された。これらの研究では、標的指向化リポソームのインターナリゼーションに続いてリソソーム装置から細胞核へのリポソームに被包化されたドキソルビシンの放出速度が、リポソームに封入されたドキソルビシンの細胞毒性についての決定因子であるので、細胞核中のドキソルビシンの蓄積速度が決定された。ドキソルビシンの核蓄積アッセイの結果は、Ｂ部に記述される。Ｃ部は、マウスモデルにおけるリポソームの血液排除の研究を記述し、そしてＤ部は、本発明の処置方法によって達成できる改善された治療効果をイン・ビボ研究により具体的に示す。
【００９８】
標的指向化され、安定化されたｐＨ−感受性リポソームのイン・ビトロの細胞毒性
遊離ＤＸＲおよび種々のリポソーム製剤のイン・ビトロ細胞毒性が、実施例６に記述されるようにイン・ビトロの増殖アッセイによりＮａｍａｌｗａ細胞を用いて評価された。評価されるリポソーム製剤は表１に列挙される。標的指向化されたｐＨ−感受性リポソームに加えて、慣用のｐＨ−非感受性の立体的に安定なリポソーム（ＤＸＲ−ＳＬ）および遊離形態のドキソルビシンもまた評価された。試験製剤の各々が制御条件下で４８時間Ｎａｍａｌｗａ細胞とともに培養された。培養時間の終了時に、細胞毒性が、細胞増殖の５０％阻害（ＩＣ５０）のために要求される濃度である阻害濃度として表された。結果は表１に示される。
【００９９】
【表１】
2004525138.tif 000004
【０１００】
表１に示されるように、すべてのＤＯＰＥもしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ製剤は、標的指向化でも非指向化でも、ＤＸＲ−ＳＬ（ＨＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ）またはＤＸＲ−ＳＩＬ［抗ＣＤ１９］（ＨＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ［抗ＣＤ１９］製剤よりも有意に低いＩＣ５０を有した（Ｐ＜０．００１）。有意に低いＩＣ５０は、かなり低い薬物の遊離速度を有するＤＸＲ−ＳＬもしくはＤＸＲ−ＳＩＬ［抗ＣＤ１９］からのドキソルビシンの遊離（Ｌｏｐｅｓ  ｄｅ  Ｍｅｎｅｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：３３２０（１９９８））に較べてＤＯＰＥもしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ製剤からのドキソルビシンの急速な遊離速度によるものと考えられる。標的指向化ＤＯＰＥおよびＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ製剤は、大部分の例において遊離ドキソルビシンに匹敵するＩＣ５０を有した（表１）。いずれかＤＯＰＥもしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ（ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥもしくはｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥで安定化された）のドキソルビシンを充填され標的指向化された製剤のＩＣ５０は、標的指向化されてない製剤のＩＣ５０よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０５〜Ｐ＜０．００１）。注目すべきは、ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを含有する製剤では、標的指向化でも非指向化でもｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを含有する製剤よりもやや高い細胞毒性がある傾向であった。被包化されたドキソルビシンを含有しない標的指向化製剤は、０．０６μＭＤＯＰＥ以下の濃度では毒性はなく、製剤がドキソルビシンを含有しなかった場合の３４．５μＭのドキソルビシン濃度に対応する（未掲載）。
【０１０１】
ｐＨ−感受性リポソームは、標的指向化でも非指向化でも、ｐＨ−非感受性リポソーム（例えば、ＨＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥから製造されたリポソーム）よりも有意に低いＩＣ５０を有することが表１のデータから明らかである。ｐＨ−非感受性リポソームのＩＣ５０は、標的非指向化および標的指向化製剤について、それぞれ２００μＭドキソルビシンおよび３５μＭドキソルビシンであった。ＨＰＳＣ／ＣＨＯＬよりむしろｐＨ−感受性脂質ＤＯＰＥもしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳの使用が、ＩＣ５０における２２−４８倍の低下をもたらした。細胞毒性におけるこの大幅な増強は予期されず、したがって本発明は、ｐＨ−感受性リポソーム中に内包することによって、リポソームに内包された薬物の細胞毒性を少なくとも約１０倍、より好ましくは約２０倍、もっとも好ましくは約４０倍増強する方法を意図する。また表１のデータから、ｐＨ−感受性リポソームへのターゲティングリガンドを含有することによって達成される細胞毒性の増強が理解される。かくして、本発明は、リポソーム上にターゲティングリガンドを含有することによって、ｐＨ−感受性リポソーム中に内包された薬物の細胞毒性を増強することを意図する。ターゲティングリガンドは、ターゲティングリガンドを欠如しているｐＨ−感受性リポソームに較べたＩＣ５０の低下によって測定されるように、細胞毒性において少なくとも２倍、好ましくは４倍、より好ましくは６倍、そしてもっとも好ましくは１０倍の増強を達成するために効果的である。
【０１０２】
核蓄積アッセイ
ドキソルビシンの核蓄積が実施例７の記述のように決定された。簡単に言えば、対数増殖条件下で維持されたＮａｍａｌｗａ細胞が、ドキソルビシン濃度８μＭにおけるドキソルビシン内包リポソーム製剤により処理された。種々の時点（０，２，４，８，１２時間）で、一定分量の処理された細胞が破壊されて核を回収した。核内のＤＮＡが酵素により消化され、そしてドキソルビシンの蛍光が測定された。結果が図８Ａ−８Ｃに示される。
【０１０３】
図８Ａは、遊離のドキソルビシン（●）；ドキソルビシン封入、標的非指向化、ｐＨ−非感受性リポソーム（■）（ＨＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ，２：１：０．１モル比）；およびドキソルビシン封入、標的指向化、ｐＨ−非感受性リポソーム（▲）（ＨＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ，２：１：０．０８：０．０２モル比）により処理されたＮａｍａｌｗａ細胞における、ドキソルビシン蛍光によって測定されたドキソルビシンの核蓄積を比較している。見られるように、ほとんど測定不可能なドキソルビシンがｐＨ−非感受性リポソームからの投与後の核内に見いだされる。
【０１０４】
図８Ｂは、ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ，１：０．０４：０．０１モル比からなるドキソルビシン内包の抗ＣＤ１９ターゲティング部分をもつリポソーム（●）；ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ，６：４：０．２４：０．０６モル比からなるドキソルビシン内包の抗ＣＤ１９ターゲティング部分をもつリポソーム（▲）；ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ，１：０．０５モル比からなるドキソルビシン内包のリポソーム（○）；ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ，６：４：０．３モル比からなるドキソルビシン内包のリポソーム（□）により処理されたＮａｍａｌｗａ細胞におけるドキソルビシンの核蓄積を比較している。見られるように、ｐＨ−感受性リポソームは、より高い蓄積レベルを達成するのに効果的なターゲティングリガンドの付加による核内の薬物の蓄積（図８Ａに示されるｐＨ−非感受性リポソームと比較して）をもたらす。
【０１０５】
図８Ｃは、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ，６：４：０．１２：０．０６モル比からなるドキソルビシン内包の抗ＣＤ１９ターゲティング部分をもつリポソーム（▼）；ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ，１：０．０２：０．０１モル比からなる抗ＣＤ１９ターゲティング部分をもつリポソーム（■）；ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ，１：０．０３モル比からなるターゲティング部分をもたないリポソーム（□）；ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ，６：４：０．１８モル比からなるターゲティング部分をもたないリポソーム（▽）により処理されたＮａｍａｌｗａ細胞におけるドキソルビシンの核蓄積を示す。見られるように、遊離可能なＰＥＧ鎖とターゲティングリガンドを有するｐＨ−感受性リポソームは、細胞核内のリポソーム内包薬物の蓄積を達成する。
【０１０６】
図８Ａ−８Ｃに提示されるデータは、遊離ドキソルビシンがもっとも速い速度で核内に蓄積したことを示す（図８Ａ）。標的指向化されｍＰＥＧ−ＤＳＰＥで安定化される（図８Ｂ）か、またはｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥで安定化される（図８Ｃ）ＤＯＰＥ又はＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ製剤についてのドキソルビシン放出速度は、標的指向化されたｐＨ−非感受性リポソーム（図８Ａ）よりもさらに速かった。リポソーム製剤からのドキソルビシンの核蓄積の順序は、遊離薬物＞標的指向化ｐＨ−感受性ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ＞標的指向化ｐＨ−感受性ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ＞標的非指向化ｐＨ−感受性ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ＞標的非指向化ｐＨ−感受性ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ＞標的指向化ｐＨ−非感受性＞ｐＨ−非感受性であった。興味あることは、ｍＰＥＧ−含有製剤よりも細胞毒性は高くはない（表１）が、ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを含有する製剤は、これらの実験の時間経過にわたってドキソルビシンの比較的速い核蓄積をもたらすと考えられる。
【０１０７】
表１において報告された細胞毒性（ＩＣ５０）値は核蓄積データと並行しており、このことは、リポソーム薬物の取り込みの総量ならびに封入された薬物の放出速度がリポソーム薬物の細胞毒性を支配することを示している。リポソーム薬物の細胞取り込み総量はレセプター媒介のインターナリゼーションのメカニズムを介して増強でき、そして細胞内薬物の放出は、ここに記述されたｐＨ−感受性の引き金をもつ放出メカニズムのようなメカニズムをとおして増強できる。かくして、本データは、ｐＨ−感受性脂質、遊離可能なポリマー鎖のコーティングおよびターゲティング部分からなる本明細書に記述されるリポソームを提供し、そして本リポソームを投与することによって細胞核内への治療剤の蓄積を増強する方法を支持する。本投与は、（ｉ）親水性ポリマー鎖の全部もしくは１部分を放出するための遊離可能な結合の開裂；（ｉｉ）結合がポリマー鎖の開裂の前またはその後に起きる、リポソームに結合されたリガンドと標的細胞間の結合；および（ｉｉｉ）標的細胞中へのリポソームのインターナリゼーション、を達成するのに効果的である。リポソームのインターナリゼーションはリポソームの不安定化を惹起するのに効果的な条件へのｐＨ−感受性脂質の曝露を惹起できる。本投与は、ｐＨ−感受性脂質、遊離可能な結合および／またはターゲティングリガンドを欠如するリポソームによって達成される細胞核におけるリポソームに内包された薬剤の少なくとも２倍高い薬剤の蓄積を効果的に達成する。
【０１０８】
血液薬動学
マウスにおけるリポソーム調製物の薬動学が、本発明にしたがって製造され、そして放射能標識された［１２５Ｉ］ＴＩを含有するリポソームを用いて評価された。実施例８に記述されるように、マウスは、種々のリポソーム製剤中に被包化された［１２５Ｉ］ＴＩ０．２ｍｌの単一用量を尾静脈をとおしてｉ．ｖ．注射された（０．５μｍｏｌＰＬ／マウス）。選ばれた時間に、注射後の血液サンプルが採取され、そして１２５I標識について分析された。血液からのリポソームのクリアランス／排除は放射能の減少によって測定された。結果は図９Ａ−９Ｄに示される。
【０１０９】
図９Ａは、種々の含有量のｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを有する４種のリポソーム組成物について、時間（ｈｒ）の関数として１分当たりのイン・ビボのカウント（ｃｐｍ）のパーセントとして表されるＤＯＰＥリポソームの排除を示す。リポソーム組成物は：ＤＯＰＥのみ（◆）；ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、１．０：０．０３モル比（■）；ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、１．０：０．０５モル比（▲）；ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、１．０：０．１モル比（●）であった。血液排除プロフィルは、リポソーム中のｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ量が変化するにつれて変化し、より高いｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ含量は血流からのリポソーム排除の遅延をもたらす。
【０１１０】
図９Ｂは、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳから製造され、そして種々の含有量のｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを有するリポソームについての類似プロットである。リポソーム製剤は：ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ６：４モル比（□）；ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６：４：０．１８モル比（◇）；ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６：４：０．３モル比（△）；ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６：４：０．６モル比（○）であった。血液排除プロフィルは、リポソーム中のｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ量が変化するにつれて変化し、より高いｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ含量は血流からのリポソーム排除の遅延をもたらす。
【０１１１】
図９Ｃは、時間の関数として種々の含有量のｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを有するＤＯＰＥリポソームについての排除プロフィルである。ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、１．０：０．０２：０．０１モル比（■）；ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、１．０：０．０４：０．０１モル比（▲）；ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、１．０：０．０９：０．０１モル比（●）からなるリポソームが実施例８記述のようにマウスに投与された。ここでは、ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥの量の増加とともに循環寿命への依存性が低下し、製剤は本質的に同じ排除プロフィルを有した。
【０１１２】
同様の観察が、時間の関数として種々の含有量のｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを有するＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソームの排除を示す図９Ｄにおいてもまた見られる。ここでは、製剤は、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６：４：０．０１２：０．０６モル比（□）；ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６：４：０．０２４：０．０６モル比（△）；ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６：４：０．０５４：０．０６モル比（○）からなった。再び、すべての製剤は、本質的に同じ排除プロフィルを有し、遊離可能なＰＥＧ（ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ）量の増加は、循環時間には測定しうる効果を示さなかった。
【０１１３】
総括すると、循環時間は、いずれかＤＯＰＥもしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソーム製剤においてｍＰＥＧ−ＤＳＰＥの濃度増加とともに増加した（図９Ａ−９Ｂ）。１０モル％ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを含有するリポソームの注射後２４時間には、注射されたリポソームの約５−１０％が、なお血液中に残留した。ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥにより安定化されなかったＤＯＰＥもしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソームの注射はリポソームの急速なクリアランスをもたらした。２〜９モル％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥの含有は、ＤＯＰＥ（図９Ｃ）もしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ（図９Ｄ）製剤のいずれについても循環時間を増加しなかった。すべてのｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ製剤は、ターゲティング実験において製剤に１モル％カップリング脂質を付加する効果を模倣するために１モル％ｍＰＥＧ／ＤＳＰＥを含有した。製剤におけるｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ量の増加は、いかなる有意な程度にも製剤の循環半減期を増加しなかった（図９Ａ−９Ｂ）。
【０１１４】
ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを含有するリポソームは、開裂不能なｍＰＥＧ−ＤＳＰＥからなるリポソームに比較して短い血液循環寿命を有し、これは、イン・ビボで血液成分、例えばシステインによるジスルフィド結合の急速な開裂による。リポソームからのＰＥＧの欠如による立体障害の喪失は、血液中でのそれらの安定性を低下し、ＭＰＳによるリポソームの取り込みを増加するであろう。抗体で標的指向化されたリポソームは、標的細胞に急速に結合し、それによってインターナリゼーションを受ける（Ｌｏｐｅｓ  ｄｅ  Ｍｅｎｅｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，９：１９９（１９９９）；Ｌｏｐｅｓ  ｄｅ  Ｍｅｎｅｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：３３２０（１９９８））。かくして、本発明は、開裂可能なポリマー鎖を含有する標的指向化されたｐＨ−感受性リポソームを投与して、ターゲティングリガンドと標的細胞間の結合、リポソームのインターナリゼーション、ポリマー鎖の開裂、続いて、細胞内でリポソームの内容物を放出するための脂質二重層の崩壊を達成することを意図する。
【０１１５】
イン・ビボの治療処置
本発明の支持において実施されたその他の研究では、マウスが開裂可能なＰＥＧ鎖を有する標的指向化されたｐＨ−感受性リポソームにより処置された。治療剤ドキソルビシン（ＤＸＲ）がリポソーム中に内包された。実施例９に記述されるように、マウスは、遊離形態か、またはリポソーム中に内包された３ｍｇＤＸＲ／ｋｇの単一用量により処理された。リポソーム製剤は表２において総括され、そして実施例８において詳述される。
【０１１６】
【表２】
2004525138.tif 000005
【０１１７】
表２は、各処理群についての平均生存時間および対照動物の平均生存時間（ＭＳＴ）に基づいて算出された寿命の増加を示す。薬物毒性の証拠は試験動物のいずれにおいても明らかではなかった。標的非指向化リポソーム製剤により処理された動物（群（３）−（５））は、対照群以上の改善された治療効能をほとんど示さなかった（Ｐ＞０．０５）。しかしながら、標的指向化リポソーム製剤により処理された試験群（群（６）−（８））は、対照群または標的非指向化製剤により処理された群より有意に増加した寿命（＞１００％ＩＬＳ）を有した（Ｐ＞０．００１）。ＤＸＲ−ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ［抗ＣＤ１９］により処理された群（７）は、他の標的指向化処理群、群６および群８に較べて有意に増加した％ＩＬＳを有した。
【０１１８】
表２および図において提示されるデータは、開裂可能なＰＥＧを有する標的指向化されたｐＨ−感受性リポソームが標的非指向性またはｐＨ−非感受性リポソームよりも高い治療効能を有することを示している。すなわち、ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥで安定化された標的指向化ｐＨ−感受性製剤は、封入されたドキソルビシンを標的細胞の細胞質中に有効に送達し、そして引き金放出特性を欠如した標的指向化製剤、すなわちＤＸＲ−ＨＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ［抗ＣＤ１９］に較べて、イン・ビトロで被包化されたドキソルビシンの細胞毒性を改善した。標的指向化、ｐＨ−感受性、開裂可能なポリマー鎖の製剤は、リポソームに内包された薬剤の細胞内送達の増大を達成する。
【０１１９】
ＶＩ．実施例
次の実施例は本明細書に記述される本発明をさらに具体的説明するものであり、本発明の範囲をいかなる点でも限定することを意図しない。
【０１２０】
材料
水素化した大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）はＬｉｐｏｉｄ  ＫＧ（Ｌｕｄｗｉｇｓｈａｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得られ、ｍＰＥＧ２０００−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ｍＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ、またｍＰＥＧ−ＤＳＰＥと略記される）は標準的な方法により合成することができる（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ，Ｅｄ．）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．３４７−３７０（１９９２））。ドキソルビシン（ＤＸＲ）はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから購入した。マレイミドを誘導したＰＥＧ２０００−ＤＳＰＥ（Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ，Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：６６（１９９７））はＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）によって注文合成された。コレステロール（ＣＨＯＬ）およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ）から購入した。Ｎ−［２−ω−メトキシポリ（エチレングリコール）−α−アミノカルボニルエチル−ジチオプロピオニル］−ＤＳＰＥ（ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ，ジスルフィド−リンカー）は前述のように合成された。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０およびＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４ＢはＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入した。Ｎａ１２５Ｉおよびコレステリルー［１，２−［３Ｈ］（Ｎ）］−ヘキサデシルエーテル（［３Ｈ］ＣＨＥ）はＭａｎｄｅｌ  Ｓｃｉｎｔｉｆｉｃ（Ｇｕｅｌｐｈ，ＯＮ）から購入した。コレステリルヘミスクシネート（ＣＨＥＭＳ）、臭化３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）およびイミノチオランはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｏａｋｖｉｌｌｅ，ＯＮ）から購入した。臭化ｐ−キシレン−ビス−ピリジニウム（ＤＰＸ）および８−ヒドロキシピレントリスルホン酸３ナトリウム（ＨＰＴＳ）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入した。ＩｇＧのヨウ素化は各所に記述される方法にしたがって合成した（Ｌｏｐｅｓ  ｄｅ  Ｍｅｎｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：３３２０（１９９８））。チラミニルイヌリン（ＴＩ）合成および［１２５Ｉ］ＴＩの製造は既に記述されている（Ｓｏｍｍｅｒｍａｎ，Ｅ．Ｆ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２２：３１９（１９８４））。マウス・モノクローナル抗体（ｍＡｂ）抗−ＣＤ１９は、Ｄｒ．Ｈ．Ｚｏｌａ（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から得られたＦＭＣ−６３マウス・抗−ＣＤ１９ハイブリドーマ細胞系から調製された。ヒトＢリンパ腫細胞系Ｎａｍａｌｗａ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４３２）はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＭＤ，ＵＳＡ）から得られた。ヒ��血漿は、アルバータ大学薬理学部の健康なボランティアから得られた。Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅポリカーボネートメンブラン（０．０８，０．１および０．２μｍ孔径）はＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）から購入した。すべての他の化学薬品は分析級のものであった。
【実施例１】
【０１２１】
ｐＨ−感受性およびｐＨ−非感受性リポソームの製造
立体的に安定化したｐＨ−感受性リポソームは、所望の製剤の脂質モル比にしたがってジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）もしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ（コレステリルヘミスクシネート）およびいずれかｍＰＥＧ−ＤＳＰＥもしくはｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．に記述されるように製造）およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ−マレイミド（Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ；米国特許第６，３２６，３５３号に記述されるように製造）の混合物から製造された。所望の脂質混合物がクロロホルム中に溶解され、そしてロータリーエバポレーターを用いて減圧下の回転によって薄膜として乾燥された。乾燥した脂質膜を水性バッファーの添加によって水和してリポソームを形成させた。リポソームは、Ｌｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｌｉｐｅｘ  Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を使用して、孔径範囲０．２〜０．０８μｍをもつ一連のＮｕｃｌｅｏｐｏｒｅポリカーボネートフィルターを通す連続押し出しによってサイズを調整した。リポソームの平均直径はＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＢＩ−９０  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｈｏｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を用いる動的光散乱によって決定した。押し出したリポソームの直径は１２０±１０ｎｍの範囲内にあった。
【０１２２】
いずれかＨＰＴＳ−ＤＰＸもしくは［１２５Ｉ］ＴＩを充填されるリポソームでは、脂質膜はＨＰＴＳ−ＤＰＸ溶液（３０ｍＭ  ＨＰＴＳ，３０ｍＭ  ＤＰＸ，ｐＨ９．０，ＮａＣｌで２９０ｍｏｓｍｏｌに調節される）もしくは［１２５Ｉ］ＴＩ溶液（ｐＨ９．０，）により水和された。押し出し後、内包された染料もしくは［１２５Ｉ］ＴＩを、ＨＥＰＥＳバッファー，ｐＨ７．４（２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１４０ｍＭＮａＣｌ）で溶出するＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０もしくはＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂカラムにおけるクロマトグラフィーによってそれぞれ除去した。
【０１２３】
治療剤、ドキソルビシン（ＤＸＲ）は、小改変をしたＢｏｌｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，４：４５５（１９９４））に記述されたような硫酸アンモニウム勾配を用いて遠隔充填によって充填された。簡単に言えば、脂質膜を、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳをコーティングする製剤ではｐＨ８．５において、またはＤＯＰＥをコーティングする製剤ではｐＨ９．０において２５０ｍＭ硫酸アンモニウム中で水和した。ある場合には、少量のＮａＯＨを添加して脂質膜の完全な水和を得た。押し出し後、外部のバッファーを、二重層形成を達成するために適当なｐＨ８．５もしくはｐＨ９．０における１０％スクロース、２５ｍＭＴｒｉｚｍａ塩基で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムをとおして溶出することによって交換した。ＤＸＲは、ＤＸＲ／脂質比０．２：１（ｗ／ｗ）において予め形成されたリポソームに添加され、そしてリポソームが２２℃で１５分間インキュベートされた。リポソームに封入されたＤＸＲは、脱気したＨＥＰＥＳバッファーで溶出されるＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムでのクロマトグラフィーによって遊離ＤＸＲと分離された。リポソームに内包されたＤＸＲの濃度はメタノール抽出後の分光測定（λ＝４９０ｎｍ）によって決定された。リン脂質濃度はＦｉｓｋｅ−Ｓｕｂｂａｒｏｗ比色アッセイ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｇ．Ｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３４：４６６（１９５９））を用いて決定された。
【実施例２】
【０１２４】
予め形成されたリポソームへの抗体カップリング
リポソーム上のマレイミド（Ｍａｌ）−ＰＥＧ−ＤＳＰＥへの抗ＣＤ１９ｍＡｂのカップリングは、既に記述された方法（Ｌｏｐｅｓ  ｄｅ  Ｍｅｎｅｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，９：１９９（１９９９））にしたがって、１２５Ｉ標識した抗ＣＤ１９ｍＡｂをトレーサーとして用いて実施された。
【０１２５】
抗体は、最初に、ＨＥＰＥＳバッファー，ｐＨ８．０（２５ｍＭＨＥＰＥＳ，１４０ｍＭＮａＣｌ）中で１時間２５℃において濃度１０ｍｇＩｇＧ／ｍｌバッファーにおいて、モル比２０：１（Ｔｒａｕｔ’ｓ：ＩｇＧ）でＴｒａｕｔ’ｓ試薬を用いて活性化された。未反応のＴｒａｕｔ’ｓ試薬をＧ−５０カラムを用いて除去した。カップリング反応は、２５℃で１８時間アルゴン雰囲気下で、ＩｇＧ対リン脂質モル比１：２０００において実施した。カップリングしなかったＡｂは、カップリング混合液をＨＥＰＥＳバッファー，ｐＨ７．４においてＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂカラムを通過させることによってリポソームから除去した。カップリング効率は平均８０％であった。
【０１２６】
全ｍＡｂ密度は、日常的には、イン・ビボ実験ではリン脂質１μｍｏｌ当たり抗ＣＤ１９  ３０−６０μｇの範囲、およびイン・ビトロ実験ではＰＬ１μｍｏｌ当たり抗ＣＤ１９  ６５−８０μｇの範囲であった。
【実施例３】
【０１２７】
バッファー中でのリポソームに内包された蛍光染料またはリポソームに内包されたドキソルビシンの漏出
ＤＯＰＥもしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソームの種々の製剤からの内包されたＨＰＴＳ−ＤＰＸの漏出が、蛍光−デクェンチングアッセイを用いて内包溶質の漏出をモニターすることによって評価された。ＨＰＴＳは、水溶性（しかし、蛍光−消光された）複合体、ＨＰＴＳ−ＤＰＸとしてリポソーム中に受動的に充填された。ＨＰＴＳ−ＤＰＸがリポソームから漏出する場合；それは遊離ＨＰＴＳとＤＰＸに解離し、４１３ｎｍで励起されるとＨＰＴＳ蛍光を増加する。試験されたＤＯＰＥおよびＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ製剤は次のとおりであった。
【０１２８】
【表３】
2004525138.tif 000006
【０１２９】
内包されたＨＰＴＳ−ＤＰＸを含有するリポソームは、使用する直前にＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムを通過させて、すべての残留遊離染料もしくは薬物を除去した。内包された染料（ＨＰＴＳ−ＤＰＸ）もしくはドキソルビシンを含有するリポソーム５０μｌをいずれかｐＨ５．５もしくはｐＨ７．４バッファー４５０μｌ中３７℃で０．５ｍＭ最終ＰＬ濃度においてインキュベートした。またｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを含有するｐＨ感受性リポソームは、両ｐＨ５．５もしくはｐＨ７．４バッファー中でジチオトレイトール（ＤＴＴ）（１００ｎＭ）とともにインキュベートした。種々の時点で、放出されたＨＰＴＳのパーセントを、インキュベーション混合液の一定分量において、ＳＬＭ−Ａｍｉｎｃｏ  Ｍｏｄｅｌ８１００蛍光測定計（Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を用いて、発光波長５１２ｎｍおよび励起波長４１３ｎｍにおけるサンプル発光（Ｄａｌｅｋｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１０２４：３５２（１９９０））における増大をプレインキュベーションサンプルの発光と比較して測定することによって決定した；値は、１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００によるプレインキュベーションサンプルの溶解後に得られる蛍光（１００％放出）（Ｋｉｒｐｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８８：１１５（１９９６））における増大に対して基準化された。
【０１３０】
いずれかｐＨ５．５もしくはｐＨ７．４のバッファー中で、いずれかｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥもしくはｍＰＥＧ−ＤＳＰＥで安定化されたＤＯＰＥおよびＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソームからの封入ＨＰＴＳの漏出は、図４Ａ−４Ｂおよび図５Ａ−５Ｂにおいて時間の関数としてプロットされている。結果は、代表的な実験からのものであり、３並列の分析の平均値±Ｓ．Ｄ．である。
【実施例４】
【０１３１】
リポソームに内包された蛍光染料の無細胞抽出液中への放出
Ａ．無細胞抽出液の調製
Ｎａｍａｌｗａ細胞は、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中、３７℃で１０％ＦＢＳを補足されたＲＰＭＩ  １６４０において対数増殖条件下で維持された。細胞（１．０ｘ１０８）は遠心（１０分間１０００ｒｐｍ）によって回収し、そしてＴＥＡバッファー（１０ｍＭトリエタノールアミン，０．２５Ｍスクロース，１０ｍＭ酢酸および１ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ７．４）２０ｍｌで洗浄した。洗浄細胞は、ＴＥＡバッファー４ｍｌ中に再懸濁され、そして哺乳細胞抽出液用に製剤化されたプロテアーゼ阻害剤カクテル（フッ化４−（２−アミノ−エチル）−ベンゼンスルホニル、ペプスタチンＡ、トランス−エポキシスクシニル−Ｌ−ロイシルアミノ（４−グアニジノ）ブタン、ベスタチン、ロイペプチンおよびアプロチニン；Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，ＵＳＡ）が細胞１ｇ当たり１００μｌで添加された。細胞をタイト・フィッティング（ｔｉｇｈｔ−ｆｉｔｔｉｎｇ）Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーにより４０ｆｉｒｍストロークを用いて４℃で破壊した。未破壊細胞は４℃で１０００ｒｐｍ１０分間の遠心によって沈殿させた。ＣＦＥは細胞沈殿物から注意して除去し、次いでＴＥＡバッファーの添加により６ｍｌに希釈した。ＣＦＥをｐＨ５．５、ほぼリソソームのｐＨ５〜６．５に調節した（Ｔｙｃｋｏ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２８：６４３（１９８２）；Ｔｙｃｋｏ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，９７：１７６２（１９８３））。
【０１３２】
ＨＰＴＳ−ＤＰＸを含有するリポソームを使用する直前にＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０カラムを通過させて、すべての残留遊離染料を除去した。内包された溶質の放出が蛍光−デクェンチングアッセイを用いて研究された。
【０１３３】
内包された染料（ＨＰＴＳ−ＤＰＸ）を含有するリポソーム５０ｍｌを無細胞抽出液４５０ｍｌ中３７℃で０．５ｍＭ最終リン脂質濃度においてインキュベートした。リポソーム製剤は、脂質混合物において、安定化されないか、または３％もしくは５％のｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥにより安定化されるかいずれかのＤＯＰＥリポソーム、および安定化されないか、または１．８モル％もしくは３モル％のｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥにより安定化されるかいずれかのＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソームからなった。漏出は、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００により処理されたプレインキュベーションサンプルの蛍光（１００％放出）をおおうサンプルの蛍光における増大％として決定された。時間の関数としてプロットされた代表的な実験からの結果が図６Ａ−６Ｂにおいて示されている。各データポイントは３並列の分析の平均値±Ｓ．Ｄ．である。
【実施例５】
【０１３４】
ヒト血漿においてインキュベートされたｐＨ−感受性リポソームからのドキソルビシンの漏出
ヒト血漿におけるドキソルビシン（ＤＸＲ）の漏出が、ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（１：０．０４：０．０１）、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（６：４：０．２：０１）、ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（１：０．０４：０．０１）もしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（６：４：０２：０．１）の抗ＣＤ１９で標的指向化されたリポソームについて試験された。
【０１３５】
内包されたＤＸＲを含有するリポソーム５０μｌを、ヒト血漿４５０μｌ中３７℃で０．０５ｍＭ最終リン脂質濃度においてインキュベートした。種々の時点で、インキュベーション混合液の一定分量を採取し、ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）において希釈した。リポソーム中に含有されるドキソルビシンの蛍光は、硫酸アンモニウム法によって、充填された場合のその自己会合により消光された。ドキソルビシンの漏出は、励起および発光波長それぞれ４８５および５９０ｎｍにおける蛍光デクェンチングによって決定された。放出されたＤＸＲは、１０％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００により処理されたプレインキュベーションサンプルの蛍光（１００％放出）をおおうサンプルの蛍光における増大％として決定された。代表的な実験の結果は時間の関数としてプロットされ、図７Ａ−７Ｂにおいて示されている。各データポイントは３並列の分析の平均値である。
【実施例６】
【０１３６】
標的指向化され、ＰＥＧ−ＤＳＰＥで安定化されたｐＨ−感受性リポソームのイン・ビトロ細胞毒性
遊離ドキソルビシンおよび種々のリポソーム製剤のイン・ビトロ細胞毒性の比較（表１）が、Ｌｏｐｅｓ  ｄｅ  Ｍｅｎｅｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：３３２０（１９９８）に記述されるように，テトラゾリウム染料（ＭＴＴ，臭化３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム；Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｊ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：５５（１９８３））を用いて、イン・ビトロの増殖アッセイによりＮａｍａｌｗａ細胞において実施された。
【０１３７】
簡単に言えば、５ｘ１０５Ｎａｍａｌｗａ細胞が９６穴プレートに塗布され、そしていずれか遊離ＤＸＲまたは抗ＣＤ１９ｍＡｂを含有または不含のリポソームに内包されたドキソルビシンの種々の製剤とともに培養された。モノクローナル抗体はマレイミド−末端のＰＥＧ−ＤＳＰＥにカップリングされて６５−８０μｇｍＡｂ／μｍｏｌリン脂質を有するリポソームを形成した。リポソームは、１４０−１６０μｇドキソルビシン／μｍｏｌリン脂質（０．２４−０．２８μｍｏｌドキソルビシン／μｍｏｌリン脂質）の充填レベルにおいてドキソルビシンを遠隔充填された。細胞は、９８％湿度および５％ＣＯ２の雰囲気中３７℃で１，２４，４８時間培養された。１時間および２４時間の培養時間に、細胞は、新しい培地により置換前に２回洗浄し、そしてさらに４７時間および２４時間それぞれ培養した。全プレートが総計４８時間培養された。培養時間の終了時に、テトラゾリウム染料を添加し、そしてプレートを５７０と６５０ｎｍの２波長においてＴｉｔｅｒｔｅｋ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  Ｐｌｕｓ（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて読み取った。種々のリポソーム製剤の細胞毒性は、細胞増殖を５０％阻害するのに有効な平均濃度（ＩＣ５０，μＭＤＸＲ）±Ｓ．Ｄ．（ｎ＝３−６）として表され、そして表１に列挙される。
【実施例７】
【０１３８】
核蓄積アッセイ
ドキソルビシンの核蓄積が，Ｋｉｒｃｈｍｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１１：１５（２００１））の方法にしたがって決定された。簡単に言えば、１０％ＦＢＳを補足されたＲＰＭＩ  １６４０において対数増殖条件下で維持されたＮａｍａｌｗａ細胞４．５ｘ１０８／５００ｍｌが、ＤＸＲ濃度８μＭにおいていずれか遊離ＤＸＲもしくは種々のリポソームＤＸＲ製剤により処理された。
【０１３９】
種々の時点（０，２，４，８，１２時間）で、細胞１００ｍｌを１０分間１０００ｒｐｍの遠心によって沈殿させ、そしてＴＥＡバッファー２０ｍｌで洗浄した。洗浄細胞は、ＴＥＡバッファー３ｍｌ中に再懸濁され、そしてタイト・フィッティングＤｏｕｎｃｅホモジナイザーにより４０ｆｉｒｍストロークを用いて４℃で破壊した。未破壊細胞を沈殿させ、そして核を含有するＣＦＥを細胞ペレットから注意して除去した。より完全なホモジネーションを得るために、未破壊のペレットをＴＥＡバッファー（３ｍｌ）に懸濁し、そして第２回の破壊を実施し、その後再び未破壊細胞を除去した。合わせた上澄液を１０分間１０００ｒｐｍで遠心してすべての残っている未破壊細胞を除去した。この遠心段階からの上澄液を４℃で２．５分間２０００ｒｐｍで回転させて核を沈殿させた。上澄液の除去後、ペレットをＴＥＡバッファーで１ｍｌに希釈し、次いで回転させ、そして肉眼観察によって決定されるように、核が均一に分散するまで音波処理した。
【０１４０】
各時点で、核画分の一定量３つ（各０．２ｍｌ）をＴＥＡ１．３ｍｌに入れた。ＤＮＡは、ジギトニン溶液（無菌ＰＢＳ中２５ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１０μｌ、ＭｇＣｌ２溶液（無菌ＰＢＳ中５７ｍｇ／ｍｌ）１０μｌおよびＤＮアーゼ１溶液（無菌ＰＢＳ中３ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）５０μｌの添加によって酵素的に消化した。２２℃で２時間消化後、ドキソルビシン蛍光を記録した（４８０ｎｍで励起および５９５ｎｍで発光）。核画分の純度は種々の細胞オルガネラに関する酵素マーカーのレベルを決定することによってチェックした（Ｌｏｐｅｓ  ｄｅ  Ｍｅｎｅｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｒｅｓ．，９：１９９（１９９９））。
【０１４１】
結果が図８Ａ−８Ｃにおいて示されている。
【実施例８】
【０１４２】
ＢＡＬＢ／ｃ（近交系）マウスにおけるリポソームの血液排除
メスのＢＡＬＢ／ｃ  Ｃｒ  Ａｌｔ  Ｂ／Ｍマウス、体重範囲１７−２２ｇは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌｂｅｒｔａ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓから得られ、そして封入された［１２５Ｉ］ＴＩを含有する種々の製剤のリポソーム０．２ｍｌの単一大用量を尾静脈をとおして注射された（０．５μｍｏｌＰＬ／マウス）。リポソーム製剤は、ＤＯＰＥのみ、いずれか３ｍｏｌ％、５ｍｏｌ％もしくは１０ｍｏｌ％ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを含有するＤＯＰＥ、ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳのみ、およびいずれか１．８ｍｏｌ％、３ｍｏｌ％もしくは６ｍｏｌ％ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥを含有するＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ；いずれか２ｍｏｌ％、４ｍｏｌ％もしくは９ｍｏｌ％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを含有するＤＯＰＥ／１ｍｏｌ％ＰＥＧ−ＤＳＰＥ、およびいずれか１ｍｏｌ％、２ｍｏｌ％もしくは５ｍｏｌ％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを含有するＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ（６：４：０．０６）からなった。
【０１４３】
注射後選ばれた時間に、マウスはハロタンで麻酔され、そして頸部脱臼によって犠牲にされた。血液サンプル（１００μｌ）が心臓穿刺によって採取された。血液サンプル、種々の臓器および死体が、Ｂｅｃｋｍａｎ  ８０００ガンマ計数器において１２５I標識についてカウントされた。データはＰＫＡｎａｌｙｓｔ（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて解析された。
【０１４４】
代表的実験からの結果は図９Ａ−９Ｄに示される。データポイントは３並列分析の平均値±Ｓ．Ｄ．である。
【実施例９】
【０１４５】
Ｎａｍａｌｗａ細胞をＣＢ−１７／ＩＣＲ  Ｔａｃ  ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）においてｉ．ｐ．継代して、再生可能な腫瘍生着を有するさらに強力な株を開発した（Ｌｏｐｅｓ  ｄｅ  Ｍｅｎｅｚｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８：３３２０（１９９８））。Ｎａｍａｌｗａ細胞を無菌ＰＢＳ中に収穫し、そしてＳＣＩＤマウス中に移植した。細胞の生存率は、移植過程の前後にＴｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ染料を用いる染料排除によって調査された。
【０１４６】
ＳＣＩＤマウス（５マウス／群）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、６−８週齢はＮａｍａｌｗａ細胞（５ｘ１０６）をｉ．ｖ．移植され、そして移植後２４時間に、いずれか遊離ドキソルビシン、いずれかｍＰＥＧ−ＤＳＰＥもしくはｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥにより安定化されたドキソルビシン−ＳＩＬ［抗ＣＤ１９］もしくは標的指向化されたＤＸＲを充填したＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ製剤として、ドキソルビシン３ｍｇ／ｋｇの単一用量を用いてｉ．ｖ．治療された。治療プログラムは次のとおりであった；
2004525138.tif 000007
１  全リポソーム製剤がドキソルビシンを含有した。
【０１４７】
全治療群がドキソルビシン３ｍｇを受けた。マウスは、日常的に体重損失についてモニターされ、そしてそれらが瀕死状態になった時点で安楽死させられた；生存時間が記録された。薬物毒性の証拠はいかなる実験群においても観察されなかった。全動物実験がｔｈｅ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｏｌｉｃｙ  ａｎｄ  Ｗｅｌｆａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌｂｅｒｔａ（Ｅｄｍｏｎｔｏｎ，Ａｌｂｅｒｔａ，Ｃａｎａｄａ）によって承認された。平均生存時間（ＭＳＴ）および対照マウスのＭＳＴ以上の寿命の増加％（ＩＬＳ）が決定され、そして表２に示されている。
【０１４８】
本発明は、特定の実施態様に関して記述されているけれども、種々の変更および改変が本発明から逸脱することなく作成できることは当業者には明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１Ａ】ジチオベンジル（ＤＴＢ）がメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）部分とアミン含有リガンドを結合する場合の本発明の実施態様を示す。
【図１Ｂ】図１Ａにおける化合物のチオール開裂後の生成物を示す。
【図２】アミン−脂質が脂質ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）である場合のｍＰＥＧ−ＤＴＢ−アミン−脂質の合成のための合成反応スキームを具体的に説明する。
【図３】パラ−ジチオベンジルウレタン（ＤＴＢ）−結合ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ複合体のチオール開裂機構を具体的に説明する。
【図４Ａ−４Ｂ】ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在または不在下３７℃において、ｐＨ７．４もしくはｐＨ５．５のいずれかのバッファー中種々のＰＥＧ−ＤＳＰＥ複合体（開裂可能もしくは開裂不可能）を用いて安定化されたジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）リポソームからの、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理されたプレインキュベーションサンプルの蛍光（１００％放出）をおおうサンプルの蛍光における増加パーセントとして決定された時間（ｈｒ）の関数としての被包化された蛍光染料の漏出を具体的に説明する；結果は、代表的な実験からのものであり、そして３並列分析の平均値±Ｓ．Ｄ．（誤差バーは多くの場合マーカーより小さい）である；（Ａ）では、●，ＤＯＰＥ、ＰＥＧ−ＤＳＰＥなし，ｐＨ７．４；○，ＤＯＰＥ、ＰＥＧ−ＤＳＰＥなし，ｐＨ５．５；▲，ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ，ｐＨ７．４；△，ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ，ｐＨ５．５；（Ｂ）では、■，ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ，ｐＨ７．４；▼，ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ，ｐＨ５．５；□，ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ＋ＤＴＴ，ｐＨ７．４；▽，ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ＋ＤＴＴ，ｐＨ５．５。
【図５Ａ−５Ｂ】ジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在または不在下３７℃において、ｐＨ７．４もしくはｐＨ５．５のいずれかのバッファー中５ｍｏｌ％ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥもしくは５ｍｏｌ％ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ複合体（開裂可能もしくは開裂不可能）を用いて安定化されたＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソームからの、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理されたプレインキュベーションサンプルの蛍光（１００％放出）をおおうサンプルの蛍光における増加パーセントとして決定された時間（ｈｒ）の関数としての被包化された蛍光染料の漏出を具体的に説明する；結果は、代表的な実験からのものであり、そして３並列分析の平均値±Ｓ．Ｄ．（誤差バーは多くの場合マーカーより小さい）である；（Ａ）では、●，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳのみ，ｐＨ７．４；○，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳのみ，ｐＨ５．５；▲，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ，ｐＨ７．４；△，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ，ｐＨ５．５；（Ｂ）では、■，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ，ｐＨ７．４；▼，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ，ｐＨ５．５；□，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ＋ＤＴＴ，ｐＨ７．４；▽，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ＋ＤＴＴ，ｐＨ５．５。
【図６Ａ−６Ｂ】３７℃においてｐＨ５．５に調節された無細胞抽出液中でインキュベートされた、脂質混合物において安定化されないか、または種々の割合のｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを用いて安定化されたいずれかのＤＯＰＥリポソーム（Ａ）もしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソーム（Ｂ）からの、時間（ｈｒ）の関数としての被包化された蛍光染料の漏出を具体的に説明する；漏出はＴｒｉｔｏｎＸ−１００で処理されたプレインキュベーションサンプルの蛍光（１００％放出）をおおうサンプルの蛍光における増加パーセントとして決定される；結果は、代表的な実験からのものであり、そして３並列分析の平均値±Ｓ．Ｄ．である；（Ａ）では、●，ＤＯＰＥ単独；▲，ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（１：０．０３）；■，ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（１：０．０５）；（Ｂ）では、○，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ（６：４）；△，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（６：４：０．１８）；□，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ（６：４：０．３）。
【図７Ａ−７Ｂ】ターゲティング部分としての抗ＣＤ１９およびいずれかｍＰＥＧ−ＤＳＰＥもしくはｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥを含有するＤＯＰＥもしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソームからの被包化されたドキソルビシンの、３７℃においてヒト血漿（ｐＨ７．４）中でインキュベートされ後の、時間（ｈｒ）の関数としての漏出を具体的に説明する；放出されるＤＸＲはＴｒｉｔｏｎＸ−１００とともにプレインキュベートされたサンプルの蛍光をおおうサンプルの蛍光における増加パーセントとして決定された；結果は、代表的な実験からのものであり、そして３並列分析の平均値±Ｓ．Ｄ．である；（Ａ）、●，抗ＣＤ１９ターゲティング部分をもつＤＸＲ充填されたＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（１：０．０４：０．０１）；▲，抗ＣＤ１９ターゲティング部分をもつＤＸＲ充填されたＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（６：４：０．２：０．１）；（Ｂ）、■，抗ＣＤ１９ターゲティング部分をもつＤＸＲ充填されたＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（１：０．０４：０．０１）；▼，抗ＣＤ１９ターゲティング部分をもつＤＸＲ充填されたＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ（６：４：０．２：０．１）。
【図８Ａ−８Ｃ】リポソーム中に被包化されたドキソルビシンによる処理の後、時間とともにＮａｍａｌｗａ細胞におけるドキソルビシンのイン・ビトロ核蓄積を具体的に説明する；結果は、代表的な実験からのものであり、そして３並列分析の平均値±Ｓ．Ｄ．である；（Ａ）では、●，ドキソルビシン不含；■，ＨＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ，２：１：０．１のドキソルビシン含有リポソーム；▲，抗ＣＤ１９ターゲティング部分をもつＨＳＰＣ／ＣＨＯＬ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ，２：１：０．０８：０．０２のドキソルビシン含有リポソーム；（Ｂ）では、●，抗ＣＤ１９ターゲティング部分をもつＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ，１：０．０４：０．０１のドキソルビシン含有リポソーム；▲，抗ＣＤ１９ターゲティング部分をもつＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ，６：４：０．２４：０．０６のドキソルビシン含有リポソーム；○，ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ，１：０．０５のドキソルビシン含有リポソーム；△，ＤＸＲ−ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ，６：４：０．３のドキソルビシン含有リポソーム；（Ｃ）では、▼，抗ＣＤ１９ターゲティング部分をもつＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ，６：４：０．１２：０．０６のドキソルビシン含有リポソーム；■，抗ＣＤ１９ターゲティング部分をもつＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／Ｍａｌ−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ，１：０．０２：０．０１のドキソルビシン含有リポソーム；□，ターゲティング部分をもたないＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ，１：０．０３のドキソルビシン含有リポソーム；▽，ターゲティング部分をもたないＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ，６：４：０．１８のドキソルビシン含有リポソーム。
【図９Ａ−９Ｄ】種々のリポソーム製剤中に被包化された［１２５Ｉ］ＴＩの取り込みによって測定されるような、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＤＯＰＥもしくはＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳリポソームの薬動学を具体的に説明する；結果は、代表的な実験からのものであり、そして３並列分析の平均値±Ｓ．Ｄ．である；（Ａ）では、◆，ＤＯＰＥ；■，ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、１．０：０．０３；▲，ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、１．０：０．０５；●，ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、１．０：０．１；（Ｂ）では、◇，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ；□，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６：４：０．１８；△，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６：４：０．３；○，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６：４：０．６；（Ｃ）では、■，ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、１．０：０．０２：０．０１；▲，ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、１．０：０．０４：０．０１；●，ＤＯＰＥ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、１．０：０．０９：０．０１；（Ｄ）では、□，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６：４：０．０１２：０．０６；△，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６：４：０．０２４：０．０６；○，ＤＯＰＥ／ＣＨＥＭＳ／ｍＰＥＧ−Ｓ−Ｓ−ＤＳＰＥ／ｍＰＥＧ−ＤＳＰＥ、６：４：０．０５４：０．０６。
【図１Ａ−１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ−８Ｃ】
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【図９Ａ−９Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004525138.tif 000071