(57)【要約】神経系の新しいタイプのカルシウム結合タンパク質、特にカルシンテニン１〜３について記述されている。カルシンテニンタンパク質は、特に中枢神経系といった神経系の疾患の治療において価値ある作用物質である。これらは、神経系の疾患の治療のための薬物の開発のために非常に有用である。
2004508827.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシウム結合活性及びＡｒｐ２／３複合体に結合する能力を有し、かつ：
ａ）配列番号２、配列番号４及び配列番号６から成るグループの中から選択された全長アミノ酸配列、
ｂ）配列番号２の残基約４６から約１６５までの配列、残基約１６６から約２５７までの配列、残基約７７４から約８６１までの配列及び残基約８８１から約９８１までの配列から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つを含むポリペプチド、
ｃ）配列番号４の残基約６６から約１５８までの配列、残基約１８２から約２５９までの配列、残基約７５１から約８３４までの配列及び残基約８５４から約９５５までの配列から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つを含むポリペプチド、
ｄ）配列番号６の残基約５１から約１４２までの配列、残基約１６７から約２４４までの配列、残基約７５９から約８４５までの配列及び残基約８６９から約９５６までの配列から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つを含むポリペプチド、
ｅ）配列番号２の残基約８８１から約９８１までの配列、配列番号４の残基約８５４から約９５５までの配列及び配列番号６の残基約８６９から約９５６までの配列から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つを含むポリペプチド、
から成るグループの中から選択された配列に対する少なくとも５０％の同一性をもつアミノ酸配列を含んで成る、医薬品として使用するための単離されたポリペプチド。
【請求項２】
カルシウム結合活性及びＡｒｐ２／３複合体に結合する能力を有し、かつ：
ａ）配列番号２、配列番号４及び配列番号６から成るグループの中から選択された全長アミノ酸配列、
ｂ）配列番号２の残基約４６から約１６５までの配列、残基約１６６から約２５７までの配列、残基約７７４から約８６１までの配列及び残基約８８１から約９８１までの配列から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つを含むポリペプチド、
ｃ）配列番号４の残基約６６から約１５８までの配列、残基約１８２から約２５９までの配列、残基約７５１から約８３４までの配列及び残基約８５４から約９５５までの配列から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つを含むポリペプチド、
ｄ）配列番号６の残基約５１から約１４２までの配列、残基約１６７から約２４４までの配列、残基約７５９から約８４５までの配列及び残基約８６９から約９５６までの配列から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つを含むポリペプチド、
ｅ）配列番号２の残基約８８１から約９８１までの配列、配列番号４の残基約８５４から約９５５までの配列及び配列番号６の残基約８６９から約９５６までの配列から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つを含むポリペプチド、
から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列に対しポリペプチド配列が少なくとも６０％の、より好ましくは６５％を上回る同一性をもつ請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
カルシウム結合活性及び／又はＡｒｐ２／３複合体に結合する能力を有しかつ配列番号２、配列番号４及び配列番号６から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列に対する５０％、好ましくは５５％そしてより好ましくは６０％という最小同一性百分率をもつ少なくとも１００個のアミノ酸の広がりを含む配列、の中から選択されたアミノ酸配列を含んで成る医薬品として使用するための単離されたポリペプチド。
【請求項４】
−　トランスメンブランタンパク質でありかつ：
−　神経系の細胞内で主に発現される、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
ニューロン内で発現される、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
シナプスのシナプス後膜に局在化されている請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
棘シナプスの棘器官の膜内及び幹シナプスのシナプス下小胞体の膜内に局在化されている請求項６に記載のポリペプチド。
【請求項８】
腫瘍細胞内で発現される、請求項４〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
細胞質区画内にその主要カルシウム結合ドメインをもつ請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
Ａｒｐ２／３複合体のための少なくとも１つの結合部位を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
医薬品として使用するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１２】
少なくとも１つの点突然変異、挿入又は欠失に起因してその機能を喪失した請求項１〜１１のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド配列。
【請求項１３】
診断用手段として使用するための請求項１２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを含んで成る、医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド及び／又は請求項１１に記載のヌクレオチド配列を含んで成る医薬組成物。
【請求項１６】
医薬品の開発のための手段としての用途を目的とした請求項１〜１５のいずれか１項に記載のポリペプチド又はその部分配列の使用。
【請求項１７】
疾患、特に神経系、より特定的には中枢神経系、最も好ましくは脳の疾患のスクリーニング及び治療用の薬剤の調製を目的とした、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のタンパク質又はＤＮＡ配列の使用。
【請求項１８】
前記疾患、特に神経系の、より特定的には脳の疾患が、少なくとも１つのプロテアーゼにより誘発された請求項１〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質の分割の欠如又は誤分割又は過剰分割に起因する疾患であることを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
プロテアーゼが、ｔＰＡと略される組織型プラスミノーゲン活性化因子、ｕＰＡと略されるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子又はプラスミン、又はニューロトリプシン又はトロンビン又はニューロプシンであることを特徴とする請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記疾患、特に神経系の疾患が、細胞内カルシウムシグナルの処理の混乱に起因することを特徴とする請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２１】
前記疾患、特に神経系の疾患が、Ａｒｐ２／３複合体の活性を調節することにより細胞運動性プロセスを調節する細胞外シグナルの処理の混乱に起因することを特徴とする請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
薬剤が、脳卒中の間及び／又はその後の組織破壊を最小限におさえるための薬剤であることを特徴とする請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２３】
薬剤が神経系の細胞の細胞死を予防することを特徴とする請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
原発性腫瘍及び転移性腫瘍、特に脳腫瘍又は網膜腫瘍の成長、膨張、浸潤及び転移の予防又は低減を含む腫瘍の治療のための薬剤の調製を目的とした、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列又はタンパク質の使用。
【請求項２５】
前記腫瘍の成長、膨張、浸潤、転移及び血管又は新生血管形成の促進には、Ａｒｐ２／３複合体の活性増強が関与していることを特徴とする請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
Ａｒｐ２／３複合体の前記活性増強が、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の配列の１つの異常又は過剰又は低減した調節機能によって媒介されることを特徴とする請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
前記腫瘍の成長、膨張、浸潤、転移及び血管又は新生血管形成の促進には、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドと機能的に関連する少なくとも１つのプロテアーゼが関与していることを特徴とする請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
プロテアーゼが、
−　組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、プラスミン、トロンビン、ニューロトリプシン、ニューロプシン、エラスターゼ、カテプシンＧといったセリンプロテアーゼ系統群、
−　コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシン、マトリリシンといったような、マトリックスメタロプロテイナーゼ系統群、
−　カテプシンＢ及びカテプシンＤといったようなシステインプロテアーゼ系統群、
といったプロテアーゼ系統群の１つの成員であることを特徴とする請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
適切な宿主細胞内での請求項１２に記載のＤＮＡ配列の発現を確保するベクター内で前記宿主細胞が該ＤＮＡでのトランスフェクションを受けること、及び前記トランスフェクションを受けた細胞が、前記発現を可能にする適切な条件下で培養されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド又はかかるポリペプチドを発現する細胞の産生方法。
【請求項３０】
カルシンテニンの生物活性特にカルシウム結合活性をそれぞれ模倣又は遮断する能力を有し、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の配列の少なくとも一部分を表わすポリペプチド、ペプチド又は核酸配列の産生のための合成又は化学的方法。
【請求項３１】
医薬品のスクリーニングにおけるツールとしての、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列及び／又はポリペプチドの使用。
【請求項３２】
抗原を産生するための手段としてか又は抗体の産生用の抗原としての、請求項１１に記載の配列の使用。
【請求項３３】
タンパク質の発現を可能にする環境の中で、請求項１２に記載の外因性ＤＮＡ配列を含むことを特徴とする、ヒト以外の遺伝子導入動物。
【請求項３４】
請求項１１に記載のＤＮＡ配列を含むゲノム配列内の欠陥に起因する疾患の診断のための診断用調製物の調製を目的とした、請求項１２又は１３に記載のＤＮＡ配列又はそのフラグメントの使用。
【請求項３５】
ヒト及び動物における遺伝子療法の利用分野で使用するための、請求項１２に記載のＤＮＡ配列を含んで成るベクター又は人工染色体。
【請求項３６】
配列番号４のアミノ酸配列に対し少なくとも６０％の同一性をもつアミノ酸配列を含んで成る、単離されたポリペプチド。
【請求項３７】
アミノ酸配列が配列番号４と同一である、請求項３６に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
配列番号６のアミノ酸配列に対し少なくとも９８．５％の同一性をもつアミノ酸配列を含んで成る単離されたポリペプチド。
【請求項３９】
配列番号６と同一である、請求項３７に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
請求項３６〜３９のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項４１】
その細胞外部分内で請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを分割するプロテアーゼ。
【請求項４２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドを分割するプロテアーゼを含む細胞抽出物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術的分野
本発明は、神経系で主に発現される新規のタイプのカルシウム結合タンパク質に関する。
【０００２】
背景技術
神経系関連疾患、特に中枢神経関連疾患は、人々の平均年令の上昇に起因するものであれ、潜在的危険性の発生の増加に起因するものであれ、又ストレス関連その他の精神的疾患の発生の増加に起因するものであれ、増々重大なものとなってきている。
【０００３】
神経系及び神経系が関与する疾患、例えば精神的疾患、例えば苦痛の発生、損傷した神経の再生などについて、そして特にかかる疾患又は損傷の治癒又は少なくともかかる疾患又は損傷を患う患者の状態の改善についてのより多くの知識を得ることに対する関心が高まっており、又この分野における医薬品及び診断用調製物に対する多大なニーズも存在している。神経系関連疾患についてさらに学習するための１つのアプローチは、神経系の生化学経路に関与するタンパク質の同定及び特徴づけである。カルシウムは、神経系のシグナリング経路において重要な役割を果たしている。神経系活性タンパク質の多くのＤＮＡ配列が公表されているものの、なおかかるタンパク質の多くがいまだに検出されていない。その上、既知の配列の大部分についても、それらの活性はなお未知のままである。
【０００４】
上述の理由から、神経系内で発現されカルシウムのシグナリング又は貯蔵において１つの役割を果たすタンパク質を同定しかつ特徴づけすることに多大な関心が寄せられている。
【０００５】
発明の開示
神経系由来のｃＤＮＡライブラリにおいて、近年、それまで未知であった活性をもつタンパク質をコードするＤＮＡ配列が公表されてきた。本発明の範囲内で、今や、前記タンパク質が、カルシウムのシグナリング経路内で重要な役割を果たし、類似の活性をもつ化合物のクラス全体のたった１つの成員であるということが発見された。本発明の範囲内ではカルシンテニン−１と呼ばれてきた前記神経系活性タンパク質は、酸性アミノ酸残基が高度に富化された小さい（アミノ酸約１００個）の細胞質セグメント及び大きい細胞外セグメントを伴うシングルパスのトランスメンブランセグメントを含むことが発見された。
【０００６】
本発明の前には、カルシンテニン遺伝子発現の細胞パターン、カルシンテニンタンパク質の細胞及び細胞下の局在化及び機能的役割及びカルシンテニン関連疾患については全く何も知られていなかった。
【０００７】
従って、本発明の目的は、カルシウム結合活性及びＡｒｐ２／３複合体に結合する能力を有し、かつ：
ａ）配列番号２（カルシンテニン−１）、配列番号４（カルシンテニン−２）及び配列番号６（カルシンテニン−３）から成るグループの中から選択された全長アミノ酸配列、
ｂ）配列番号２の残基約４６から約１６５までの配列、残基約１６６から約２５７までの配列、残基約７７４から約８６１までの配列及び残基約８８１から約９８１までの配列から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つを含むポリペプチド、
ｃ）配列番号４の残基約６６から約１５８までの配列、残基約１８２から約２５９までの配列、残基約７５１から約８３４までの配列及び残基約８５４から約９５５までの配列から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つを含むポリペプチド、
ｄ）配列番号６の残基約５１から約１４２までの配列、残基約１６７から約２４４までの配列、残基約７５９から約８４５までの配列及び残基約８６９から約９５６までの配列から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つを含むポリペプチド、
ｅ）配列番号２の残基約８８１から約９８１までの配列、配列番号４の残基約８５４から約９５５までの配列及び配列番号６の残基約８６９から約９５６までの配列から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列のうちの少なくとも１つ、好ましくは２つ、最も好ましくは３つを含むポリペプチド、
から成るグループの中から選択された配列に対する少なくとも５０％の同一性をもつアミノ酸配列を含んで成る、医薬品として使用するための単離されたポリペプチドを提供することにある。
【０００８】
リガンド結合機能を含む上述のグループのポリペプチド、特に配列番号２のアミノ酸残基４６〜１６５、残基約１６６から約２５７までを含むポリペプチド；特に配列番号４の約６６から約１５８までのアミノ酸残基、残基約１８２から約２５９までを含むポリペプチド；特に配列番号６の約５１から１４２までのアミノ酸残基、残基約１６７から約２４４までを含むポリペプチドが特に有利である。
【０００９】
タンパク質分解性分割部位を含む上述のとおりのポリペプチド、特に配列番号２の約７７４から約８６１までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；特に配列番号４の約７５１から約８３４までのアミノ酸残基を含むポリペプチド；特に配列番号６の約７５９から約８４５までのアミノ酸残基を含むポリペプチドが好まれる。
【００１０】
カルシンテニン−１及び／又はカルシンテニン−２及び／又はカルシンテニン−３のカルシウム結合ドメインを含む上述の通りのポリペプチド、すなわち配列番号２の約８８１から約９８１までのアミノ酸残基を含むポリペプチド及び／又は配列番号４の約８５４から約９５５までのアミノ酸残基を含むポリペプチド及び／又は配列番号６の約８６９から約９５６までのアミノ酸残基を含むポリペプチドが好まれる。
【００１１】
好まれるのは、上述のグループの中から選択されたアミノ酸配列に対し少なくとも６０％、より好ましくは７０％以上の同一性をもつポリペプチド配列である。
本発明のもう１つの目的は、カルシウム結合活性及び／又はＡｒｐ２／３複合体に結合する能力を有しかつ配列番号２、配列番号４及び配列番号６から成るグループの中から選択されたアミノ酸配列に対する５０％、好ましくは５５％そしてより好ましくは６０％という最小同一性百分率をもつ少なくとも１００個のアミノ酸の広がりを含む配列、の中から選択されたアミノ酸配列を含んで成る医薬品として使用するための単離されたポリペプチドにある。
【００１２】
本発明のポリペプチドは好ましくは、神経系の細胞内で主に発現され、より好ましくはニューロン内で発現されるトランスメンブランタンパク質である。
本発明のポリペプチドは、シナプスのシナプス後膜内に局在化され、より好ましくは棘シナプスの棘器官の膜内及び／又は幹シナプスのシナプス下小胞体の膜内に局在化されている。特に有利であるのは、細胞質区画内にその主要カルシウム結合ドメインをもつタンパク質である。
【００１３】
好ましいのは、腫瘍内で発現されるポリペプチドであり、その他の好ましいポリペプチドは、Ａｒｐ２／３複合体のための少なくとも１つの結合部位を有する。前記Ａｒｐ２／３結合部位は、保存されたトリプトファンを含む保存された酸性アミノ酸配列モチーフであり、例えば、配列モチーフＭＤＷＤＤＳ及びＬＥＷＤＤＳ（１文字コードで与えられるアミノ酸配列）を包含するがこれに制限されるわけではない。
【００１４】
約５０個のアミノ酸という最小長さをもつ本発明のポリペプチド又はそのフラグメントは、医薬品の開発のための一手段として使用するのに適している。
本発明のもう１つの目的は、医薬品として使用するための本発明のポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド配列又はその部分配列である。
本発明のもう１つの目的は、少なくとも１つの点突然変異、挿入又は欠失に起因してその機能を喪失した本発明のポリペプチド又はそのフラグメントをコードする単離されたヌクレオチド配列である。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、診断手段として使用するための、少なくとも１つの点突然変異、挿入又は欠失に起因してその機能を喪失した本発明のポリペプチド又はそのフラグメントをコードする単離されたヌクレオチド配列である。かかる配列は、通常はカルシウム結合細胞内領域内部の活性セグメント及び／又はプロテアーゼ認識部位を含む細胞外セグメントに対し２５以下の差異を有する。
【００１６】
例えば本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異を受けた領域又はそれにフランキングする領域が、ヒトの組織などから単離された突然変異を受けたＤＮＡを検出するために診断試験において使用することのできるプライマ又はヌクレオチドプローブの設計にとって有用である。かかる試験は、例えば、細胞がガンの発生を導く形質転換を受ける確率が高いか否かを予測するのに適している。本書で使用するプライマ又はヌクレオチドプローブという語は、１０個以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチド配列を内含している。
【００１７】
本発明のＤＮＡ配列は、緊縮性条件下で、配列番号１（カルシンテニン−１）、配列番号３（カルシンテニン−２）及び配列番号５（カルシンテニン−３）から成るグループの中から選択された配列に対しハイブリッド形成するスプライス変異体及びＤＮＡ配列をも内含すると理解されるものとする。緊縮性条件下で、ハイブリッド形成配列全般は、少なくとも約８０％、好ましくは約９０％、最も好ましくは９８％の同一性を伴う配列である。かかる配列は、カルシウム結合活性をもつアミノ酸配列をコードする配列ならびに、カルシウム結合活性の無いアミノ酸配列をコードするような配列、特に小さな欠陥のために前記活性を喪失したような配列を含んで成る。小さな欠陥というのは通常、前記配列内の点突然変異、挿入又は欠失を意味する。本発明の配列は同様に、コードされたタンパク質の細胞外セグメント内でタンパク質分解性分割部位（単複）全体にまたがるアミノ酸配列をコードする配列、ならびにタンパク質分解性分割部位（単複）の無いアミノ酸配列をコードするような配列、特に小さな欠陥のために前記分割部位（単複）を喪失したような配列をも含んで成る。本発明の配列は同様に、タンパク質分解により放出されたフラグメントのアミノ酸配列をコードする配列、ならびに、タンパク質分解により放出されたフラグメント内の突然変異を伴うアミノ酸配列をコードするような配列をも含んで成る。本書で使用される対立遺伝子という語は、活性提供領域内で通常多くとも２０の差異である、単数又は複数のヌクレオチド置換、付加又は欠失だけの差異をもつ配列を内含するように意図されている。
【００１８】
本発明のもう１つの目的は、医薬品の開発用のツールとして及び医薬作用物質のスクリーニング用のツールとしての本発明のポリペプチド又はヌクレオチド配列又はそのフラグメントの使用にある。
本発明はさらに、上述の通りのＤＮＡ配列及び／又はポリペプチド又はそのフラグメントを含む医薬組成物にも関する。
【００１９】
本発明の医薬組成物は同様に、少なくとも１つの活性物質（成分）として上述の通りのタンパク質を含むこともできる。
医薬組成物はさらに、少なくとも１つのさらなる活性化合物、例えば、上述のタンパク質のカルシウム結合活性を増加又は減少させる化合物、又は体内でのその作用場所におけるかかるタンパク質の量を増加又は減少させる化合物、又は、体内でのその作用場所におけるかかるタンパク質の存在時間を延長又は短縮する化合物を含むことができる。
【００２０】
本発明はさらに、少なくとも１つの活性化合物として、上述のようなＤＮＡから誘導されたｍＲＮＡの転写を増強又は抑制する物質を含む医薬組成物、又はそれがかかるＤＮＡの翻訳を増強又は抑制させることをも包含している。
本発明は又、上述のようなタンパク質のカルシウム結合活性を減少又は増加させる化合物又は、体内でのその作用場所におけるかかるタンパク質の量を増加又は減少させる化合物、又は体内のその作用場所におけるかかるタンパク質の存在時間を短縮又は延長する化合物を、少なくとも１つの活性化合物として含む医薬組成物にも関する。
【００２１】
本発明のもう１つの目的は、配列番号４に規定されている通りの配列及び該配列と少なくとも６０％の同一性をもつタンパク質を含む該配列の相同体を有するタンパク質にある。
本発明のもう１つの目的は、配列番号６に規定されている通りの配列及び該配列と少なくとも９８．５％の同一性をもつタンパク質を含む該配列の相同体を有するタンパク質にある。
【００２２】
本発明のもう１つの目的は、配列番号４及び配列番号６に規定されている通りのタンパク質をコードするヌクレオチド配列にある。該ヌクレオチド配列のコーディング配列は、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列をコードする全ての配列又はその相同体を含んで成る。同様に内含されているのは、上述のヌクレオチド配列の部分配列である。例えば、カルシンテニンコーディング配列は好ましくは、配列番号４又は配列番号６のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の類似性をもつ配列を有する。
【００２３】
上述のＤＮＡ配列及び／又はタンパク質は、特に、少なくとも１つのプロテアーゼ特にｔＰＡと略される組織型プラスミノーゲン活性化因子、ｕＰＡと略されるウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子又はプラスミン、又はニューロトリプシン又はニューロセルピンから成るグループの中から選択されたプロテアーゼによって誘発された本発明のタンパク質の分割の欠如又は誤分割又は過剰分割に起因してひき起こされた神経系の疾患を防止、改善又は治癒させるために、例えばカルシウム結合活性の欠如又は過剰なカルシウム結合活性又は細胞内カルシウムシグナルの処理の混乱に起因する疾患、好ましくは神経系疾患、より好ましくは中枢神経系、最も好ましくは脳の疾患のスクリーニング検定及び／又は治療において使用するのに適している。細胞間カルシウムシグナルの処理の混乱に起因する前記疾患は、好ましくは、Ａｒｐ２／３複合体の活性を調節することによって細胞運動性プロセスを調節する細胞外シグナルの処理の混乱によってひき起こされる。かくして、本発明のタンパク質又はヌクレオチド配列を使用することによりかかる疾患を治療するための方法も同様に包含されている。
【００２４】
最も好ましくは、本発明は、脳卒中における組織破壊を最小限におさえるためのＤＮＡ配列又はタンパク質に関する。
かかるＤＮＡ配列又はタンパク質を含む調製物により、例えば壊死性組織の周囲のいわゆる半影ゾーンの細胞に対する保護効果を及ぼすことなどによって脳梗塞及び脳虚血、脳内出血、及びクモ膜下出血を含めた脳卒中における組織破壊を、最小限におさえることができる。
【００２５】
それが医薬品であれ診断用作用物質であれ、本発明の有効な物質又は調製物を使用できるその他の疾患には、適切な選択として、以下のものが含まれる：
−　例えば、壊死組織の周囲のいわゆる半影ゾーンの細胞に対する保護効果を及ぼすことなどによる、外傷性脳損傷の治療；
−　例えば多発性硬化症といったような、神経変性疾病又は神経炎症性疾病によりひき起こされるマイナス効果の予防、改善又は治癒；
−　てんかん性発作によってひき起こされる脳細胞に対するマイナス効果の削減又は予防；
−　低酸素症及び虚血、興奮毒性、神経炎症性疾病及びプロセス、てんかん性発作、及びガン性新生物形成により危険にさらされたニューロンといったような、危機に瀕したニューロンの救済；
−　シナプス無欠性及び機能の軸索再生及び／又は回復；
−　例えば、網膜変性及び網膜新生血管形成といったような網膜疾患の予防、改善又は治癒、
−　特に例えば脳の梗塞及び虚血性脳卒中又は脳の出血又は外傷といった神経組織の損傷に関連した細胞死、及び／又は、酸素又はグルコースの欠如又は中毒に起因して発生する神経組織の損傷に関連した細胞死、及び／又はてんかん性発作に関連した細胞死及び／又は、神経変性疾病及び神経系の遺伝性遺伝子欠如に関連した細胞死などの、神経系の細胞の細胞死；
−　外傷、損傷を受けた、発育不全の、又は形成異常の脳組織及び／又は神経組織の再生、
−　脳及び／又は神経の外傷の後又は脚部域の破壊又は損傷の後の無傷の状態にとどまった脳又は神経部域の再組織、
−　病的疼痛症候群の予防、改善又は治癒、
−　例えば神経質又は「内的不安」といったような精神的健康又は心身健康状態の障害の分野における障害、例えば不安状態といった情緒機能の分野での障害の改善又は治癒；
−　精神医学的障害、特に慢性精神分裂症、慢性分裂情動性障害、非特異的障害；
例えば重症又は非緩解性「クレペリン」精神分裂症又は例えば精神分裂症様障害のＤＳＭ−ＩＩＩ−Ｒ−プロトタイプといったようなさまざまな総体的症状の急性及び慢性精神分裂症；偶発性精神分裂症障害；妄想性精神分裂症様障害；例えば穏やかな総体的症状の精神分裂症様人格障害といったような精神分裂症様人格障害；精神分裂症性人格障害、最近の形態の精神分裂症又は精神分裂症様障害、非有機的精神障害を含めた精神分裂症及び精神分裂症様障害の分野、及び／又は内因性うつ病の分野又はそう病又はそううつ障害の分野における精神医学的障害の予防、改善又は治癒；
−　原発性腫瘍及び転移性腫瘍の成長、膨張、湿潤及び転移の予防又は低減、新しい血管の形成又は新生血管形成の抑制といったような腫瘍の治療、特に脳腫瘍又は網膜の腫瘍の治療。前記腫瘍の成長、膨張、浸潤、転移及び血管又は新生血管形成の促進には、Ａｒｐ２／３複合体の活性増強が関与している。Ａｒｐ２／３複合体の前記活性増強は、好ましくは、本発明のタンパク質のうちの１つの異常又は過剰又は低減した調節機能によって媒介される。
【００２６】
前記腫瘍の成長、膨張、浸潤、転移及び血管又は新生血管形成の促進には、本発明のポリペプチドと機能的に関連する少なくとも１つのプロテアーゼが関与している。前記プロテアーゼは、好ましくは以下の系統群のうちの１つの成員である：
−　組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、プラスミン、トロンビン、ニューロトリプシン、ニューロプシン、エラスターゼ、カテプシンＧといったセリンプロテアーゼ系統群、
−　コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシン、マトリリシンといったような、マトリックスメタロプロテイナーゼ系統群、
−　カテプシンＢ及びカテプシンＤといったようなシステインプロテアーゼ系統群。
【００２７】
本発明は、同様に、健康なヒトならびに学習及び記憶機能が低減した人物における学習及び記憶機能に改善にも関する。
１つの付加的な態様においては、本発明は、適切な宿主原核細胞及び真核細胞特に哺乳動物細胞が、前記ＤＮＡ配列内の発現を確保するベクター内で前述のとおりのＤＮＡ配列でのトランスフェクションを受けること、及び前記トランスフェクションを受けた細胞が、前記タンパク質の発現を可能にする適切な条件下で培養されることを特徴とする、上述のタンパク質の産生方法に関する。
【００２８】
もう１つの目的においては、本発明は、カルシンテニンの生物活性特にカルシウム結合活性をそれぞれ模倣又は遮断する能力を有し、本発明の配列の少なくとも一部分を表わすポリペプチド、ペプチド又は核酸の配列の産生のための合成又は化学的方法に関する。
上述のＤＮＡ配列及び／又はタンパク質は、さらに、カルシンテニンタンパク質が関与する疾患に対する薬物のみならず、転写増強又は低減物質及び翻訳増強又は低減物質及び活性増強又は低減物質といったような活性成分のスクリーニングのための手段としても使用することができる。
【００２９】
本発明のもう１つの目的は、その細胞外セグメントにおいて、本発明のタンパク質を分割する単数又は複数のプロテアーゼにある。
さらに、本発明は、本発明のタンパク質を分割するプロテアーゼを含む細胞抽出物にも関する。
本発明のもう１つの目的は、前記プロテアーゼの活性を変調させる化合物又は作用物質の同定方法にある。前記方法は、テスト化合物と活性プロテアーゼを産生する細胞を接触させる段階及びプロテアーゼ活性の変化を測定する段階を含んで成る。好ましい実施形態においては、前記細胞は、哺乳動物細胞であり、プロテアーゼは非相同遺伝子構成体から発現される。
【００３０】
さらに、本発明は同様に、抗原を産生する手段として又は抗体産生用抗原としての上述の配列使用をも含んで成る。
かかる抗体は例えば、カルシウム結合機能を抑制又は促進する抗体又は、上述の通りのタンパク質のタンパク質分解性分割を抑制又は促進する抗体、又は免疫組織学的研究又は診断検定のために用いることのできる抗体でありうる。
【００３１】
本発明は又、上述の通りの外因性ＤＮＡ配列を含む遺伝子導入動物にも関する。かかる動物は、上述のような疾病の研究及び活性物質のテストに適している。
かかる動物は特に、マウスといったようなヒト以外の哺乳動物である。
本発明のさらなる態様は、遺伝子　ターゲティング技術を用いた対応する内因性遺伝子の不活性化又は突然変異のための上述の通りのＤＮＡ配列の使用に関する。
【００３２】
かかる遺伝子ターゲティング技術は、例えば、その突然変異形態による遺伝子の相同組換え又は置換を通した、マウス内の遺伝子の除去である。
上述の通りのＤＮＡ配列は、本発明の範囲内で、上述のコーディング配列のうちの１つに類似しているものの同一ではないコーディング配列を含むゲノム配列内の欠陥又は改変に起因する疾患の診断のための診断用調製物の調製にも使用することができる。
【００３３】
本発明の核酸配列は、例えば、生物学的ベクター及び合成ベクターといったような遺伝子療法ベクターの一部として又は人工染色体の一部としての人間及び動物における遺伝子療法の利用分野においてきわめて有利なものである。
本発明についての以下の詳細な説明を考慮することにより、本発明をより良く理解することができ、又、上述のもの以外の目的が明白になることだろう。かかる説明では、添付の図面が参考にされている。
発明の実施形態
カルシンテニンタンパク質は、脳内で主に発現されるものとして知られている。脳内の遺伝子発現は、ほぼ排他的にニューロン内で起こる。
【００３４】
新規のクラスのカルシウム結合タンパク質の代表として、カルシンテニン−１、２及び３の単離及び特徴づけについてさらに記述する。
カルシンテニン−１のコードされたペプチドは、１００９個のアミノ酸という長さをもち、２８のアミノ酸のシグナルペプチドを含有する。成熟タンパク質は、９８１個のアミノ酸から成る。細胞外セグメントは８６０個のアミノ酸を含み、トランスメンブランセグメントは、２１個のアミノ酸を有し、細胞質セグメントは９９個のアミノ酸をもつ。
【００３５】
カルシンテニン−１の特に興味深い機能が、カルシウム結合細胞質領域を形成するセグメント内に見られる。
カルシンテニン−１は、酸性アミノ酸残基が高度に富化されカルシウムイオンを結合する能力をもつ細胞質セグメントを有する。カルシンテニン−１の細胞質セグメントは、高い能力をもつ低親和性のカルシウム結合構造として機能し、カルシウムのための高親和性結合部位をも含有している。
【００３６】
この機能により、カルシンテニン−１は、中枢神経系及び末梢神経系の励起性及び抑制性シナプスのサブシナプスゾーン内にカルシウムを保持する。この特長により、カルシンテニン−１は、シナプス後膜の下のゾーン内でのカルシウムの蓄積を媒介し、かくしてカルシウム媒介シナプス機能を変調させる。これらの機能により、カルシンテニン−１は、シナプス後膜の下のゾーン内に高いカルシウム濃度を維持し、かくしてシナプス後膜の下のゾーン内のカルシウムシグナルを延長させる。カルシンテニン−１の興味深い一面は、細胞外セグメント内のタンパク質分解性分割の後に続くエンドサイトーシスプロセスによるシナプス後膜からのその除去にある。従って、カルシンテニン−１は、少なくとも１つのシナプスプロテアーゼによるタンパク質分解性分割による動的調節を受ける。
【００３７】
本発明の範囲内で、現在、カルシンテニン−１が同様にｉｎ ｖｉｖｏ活性をも有し、そのためプロテアーゼが関与する疾患特に神経系、より特定的には中枢神経系の疾患の診断及び療法のためのひじょうに有用な手段となるということを示すことができるだろう。
神経発達中のカルシンテニン−１の発現がシナプスの再組織化プロセスが観察される時間的範囲の始めにおいて開始すること、成体の神経系において、それらの発現は、シナプスの可塑性が発生する脳の領域内で卓越していること、そして、大脳皮質、海馬及びマウスの小脳扁桃において、特に高いカルシンテニン−１の発現が見い出されることがわかっている。
【００３８】
成体のマウスの脳のさらに深い構造の中、脳幹内、そして脊髄内では、カルシンテニン−１のさらに弱い発現が見い出される。
成体の末梢神経系では、カルシンテニン−１は同じく、例えば知覚神経節ニューロン内でも発現される。脳内のカルシンテニン−１の遺伝子発現パターンは、これらの分子が、成体の神経系内で学習及び記憶機能において重要な役割を果たすと考えられているような領域のニューロン内で卓越して発現されることから、極めて興味深いものである。
【００３９】
大脳皮質内のカルシンテニン−１の遺伝子発現パターンは、大脳皮質内の細胞分化の減少が、精神分裂症と結びつけられることがわかっていることから、極めて興味深いものである。
ここで、カルシンテニン−１のもう１つの顕著な特徴は、それがニューロンにより分泌されるということから成る。
【００４０】
この事実は、カルシウム結合タンパク質としての機能及び発達中の及び成体の脳における発現パターンと共に、カルシンテニン−１が、学習された行動、学習された情動又は記憶内容の処理及び保存に関与する脳の部域内のカルシウム媒介シグナルの調節において１つの役割を果たすということを示唆している。
神経可塑性における細胞外プロテアーゼ、特に組織型プラスミノーゲン活性化因子の役割について近年発見された証拠と合わせて（Ｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １６，２０５７−２０６３ページ、１９９６；Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ９３、６９９−７０４ページ、１９９６参照）、発現パターンは、カルシンテニンのカルシウム結合活性が、学習及び記憶作業、例えば学習された行動、学習された情動又は記憶内容の処理又は保存に関与する作業において１つの役割を果たすと仮定することを可能にする。
【００４１】
カルシンテニン−１がプロテアーゼの基質であるという事実は、例えばプロテアーゼ組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）が興奮毒系誘発性てんかん発作という情況下でのニューロン細胞損傷又はニューロン細胞死の病因において１つの役割を果たすことがわかっていることから、特に興味深いものである（Ｔｓｉｒｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ３７７，３４０−３４４ページ、１９９５参照）。
【００４２】
脊髄及び知覚神経節におけるカルシンテニン−１の遺伝子発現パターンは、これらの分子が、成体の神経系内で、苦痛の処理ならびに病的苦痛の病因において１つの役割を果たすと考えられているような脳の領域のニューロン内で発現されることから、興味深いものである。
カルシンテニン−１は、ニューロンの軸索から分泌されるタンパク質を発現することを目的とする研究に関連して発見された（Ｓｔｏｅｃｋｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ１８０，２４９−２５９ページ、１９８９を参照のこと）。それらの調製については現在、本書に参考として含まれている複数の論文中で記述されてきている（Ｏｓｔｅｒｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １５，ｐａｇｅｓ ２９４４，１９９６；Ｓｃｈｒｉｍｐｆ ｅｔ ａｌ． ヒトニューロセルピン（Ｐ１１２）：「ｃＤＮＡクローニング及び３ｑ２６に対する染色体局在化」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， 第３９巻、１〜８ページ、（１９９７）を参照のこと）。
【００４３】
クローニングについてのこの手順は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、乳牛、羊、豚、霊長類、鳥類、ゼブラフィッシュ（Ｂｒａｎｃｈｙｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ）などといったその他の種の相同配列の単離のためにも使用可能である。かかる配列は、不適合性反応を回避するために獣医学用途のために好まれる。
【００４４】
例えば、上述の方法によって得られたコーディングヌクレオチド配列は、上述のようなコードされたアミノ酸配列を伴うタンパク質の産生のために使用することができる。
カルシンテニン遺伝子のコーディング配列は同様に対立遺伝子の単離のための出発配列としても使用でき、スプライス変異体又はその一部分は、前記配列に対応する遺伝子の単離のためのプローブとして使用可能である。例えば、この目的でポリメラーゼ連鎖反応及び核酸ハイブリダイゼーション技術を使用することができる。
【００４５】
カルシンテニン遺伝子のコーディング配列は、代替的コドンの使用に起因して配列番号１、３及び５に示された配列との関係において変性されたヌクレオチド配列をもつ、上述の通りの特に配列番号１、３及び５に示されたタンパク質又はその一部分をコードするヌクレオチド配列を生成する目的で、いわゆる「部位特異的突然変異誘発」のための出発配列として使用することができる。かかる突然変異誘発は、問題のタンパク質の発現のために使用される宿主細胞に依存して望まれる可能性がある。
【００４６】
本発明において開示されているコーディング配列は、いわゆる部異特異的突然変異誘発を用いて、改変された機能を示す配列変異体の産生のための出発配列として使用可能である。かかる改変された機能は、例えば、より長い寿命、すなわちより緩慢な劣化、増強された活性などを有するタンパク質を提供することができる。
【００４７】
該コーディング配列は、遺伝子療法及び細胞工学において使用するためのベクターの産生を目的として使用することができる。
コーディング配列は、本発明のコーディング配列及びコードされた配列を過剰発現する遺伝子導入動物の生成のために使用することができる。
コーディング配列は、本発明の配列に対応する遺伝子内の疾患の診断のために使用することができる。
【００４８】
上述の核酸配列によりコードされたアミノ酸配列は、活性物質として、抗体の産生のための抗原として、及び薬物開発のための標的として使用することができる。
さらなる態様では、本発明は、医薬品の開発のための手段として、及び医薬作用物質のスクリーニング、特に本発明のタンパク質を結合する化合物用のスクリーニング検定のための手段としての、本発明のポリペプチド又はヌクレオチド配列又はそのフラグメントの使用に関する。かかる分子の結合のための本発明のタンパク質の好ましい標的配列は、本発明のタンパク質の細胞外部分、特に青色セファロース結合能力を示すドメイン／部位である。かかる分子の結合のためのもう１つの標的配列は、細胞内Ａｒｐ２／３複合体結合ドメイン、特に本発明のタンパク質のモチーフＭＤＷＤＤＳ‥及び‥ＬＥＷＤＤＳ（１文字コードで与えられたアミノ酸配列）を含む配列である。
【００４９】
本発明のタンパク質の活性及び／又は安定性及び／又は発現に対する効果をもつ化合物の同定のための適切なｉｎ ｖｉｔｒｏ検定は、例えば、特異的タンパク質／リガンド相互作用を検出できる生化学又は生物物理学試験を利用したｉｎ ｖｉｔｒｏ検定であり、これには例えば、その全体が本書に参考として内含されているＭｏｙ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７３（３）：５７１−８１，２００１中に記述されているＭＳ／ＮＭＲ、Ｈａｊｄｕｋ ＰＪ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ４２（１３）：２３１５−７，１９９９に記述されているようなハイスループット核磁気共鳴ベースのスクリーニング又はＫａｕｒ ｓ．， Ｊ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ．， １６（５）：５０５−１１，１９９７に記述されているような質量分析法ベースの戦略が含まれる。
【００５０】
本発明の前記態様は、カルシンテニン−１そして最も高い確率で系統群成員カルシンテニン−２及びカルシンテニン−３も同様に、Ａｒｐ２／３複合体を結合する能力をもつという発見に基づいている。Ａｒｐ２／３複合体に対するカルシンテニン−１の細胞質ゾルセグメントの結合は、細胞運動性の調節におけるカルシンテニンタンパク質系統群の役割を表わしている。細胞表面タンパク質と細胞骨格の間の相互作用を扱かった科学的文献を研究している間に、我々は、カルシンテニン系統群の全てのタンパク質（すなわち、カルシンテニン−１、カルシンテニン−２及びカルシンテニン−３）の細胞質部分が保存されたトリプトファンを含有する保存されたアミノ酸配列の少なくとも１つの興味深いモチーフを含むということを発見した。このモチーフは、ＡＲＰ２／３複合体の現在既知の活性化因子の全てとは言わないまでも大部分のＡｒｐ２／３結合ドメインの中に見い出される保存されたトリプトファンを伴う保存された酸性アミノ酸モチーフに対する高い類似性をもつ。カルシンテニン−１の細胞質セグメント内では、このモチーフは２回、すなわちアミノ酸配列‥ＭＤＷＤＤＳ‥で一回、そして‥ＬＥＷＤＤＳ‥（１文字コードで与えられたアミノ酸配列）で一回見い出される。カルシンテニン−２の細胞質配列は、１つの‥ＭＤＷＤＤＳ‥と１つの‥ＬＥＷＤＤＳを含有する。カルシンテニン−３の細胞質セグメントは、この種の単一モチーフ、すなわち‥ＬＦＷＤＤＳを含有している。ＡＲＰ２／３複合体はアクチンフィラメントの成長及び分枝を調節することによりアクチンベースの細胞運動性の調節において中心的な役割を果たす（再考のためにはＢｏｒｉｓｙ ａｎｄ Ｓｖｉｔｋｉｎａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：１０４−１１２，２０００；Ｐａｎｔａｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１５０２−１５０６；Ｈｉｇｇｓ ａｎｄ Ｐｏｌｌａｒｄ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７０：６４９−６７６，２００１及びその中の参考文献を参照のこと）。保存された酸性のアミノ酸及びトリプトファンを伴う類似のモチーフを含有するＡｒｐ２／３活性化因子としては、ヒト ＷＡＳＰ（Ｗｉｓｃｏｔｔ Ａｌｄｒｉｋ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎの略）、関連ヒトＮ−ＷＡＳＰ、ヒトＳｃａｒ／ＷＡＶＥ１タンパク質及び、それぞれ配列‥ＤＤＥＷＤＤ、‥ＤＤＥＷＥＤ及び‥ＥＶＤＷＬＥ及び‥ＡＤＤＷＥＴ‥を示すコルタクチンがある（ＷＡＳＰ、Ｎ−ＷＡＳＴ及びＳｃａｒ／ＷＡＶＥ１についてはＨｉｇｇｓ及びＰｏｌｌａｒｄ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７０：６４９−６７６，２００１を、そしてコルタクチンについては、Ｕｒｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２５９−２６６，２００１を参照のこと）。アクチン重合化におけるＡｒｐ２／３結合及びＡｒｐ２／３機能にとっての保存されたトリプトファン及び隣接する酸性アミノ酸の重要性は、コルタクチンの部位特異的突然変異誘発により実証されてきた（Ｕｒｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２５９−２６６，２００１）。トリプトファン及びコルタクチンの配列‥ＡＤＤＷＥＴ‥内でトリプトファンに先行す��２つのアミノ酸残基の両方の部位特異的突然変異誘発の結果、Ａｒｐ２／３結合及びＡｒｐ２／３媒介アクチン重合が喪失した。これら全てのＡｒｐ２／３活性化因子タンパク質は、細胞質内に常在している。これらは、成長因子サイトカインなどといったその細胞外調節遺伝子とトランスメンブランレセプタの相互作用から誘導された細胞内シグナルをＡＲＰ２／３複合体の活性化にリンクさせる。活性化されたトランスメンブランレセプタからＡｒｐ２／３活性化因子の活性化までのシグナリングカスケード内の極めて重要な中間段階は、Ｒｈｏ系統群の小型ＧＴＰ−結合タンパク質のせいであるとされてきて（再考のためには、Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ８１：１５３−２０７，２００１を参照のこと）。活性化されたＡＲＰ２／３複合体は、新しいアクチンフィラメントの生成及び既存のアクチンフィラメントの分枝を開始させる（再考のためにはＢｏｒｉｓｙ及びＳｖｉｔｋｉｎａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ， １２：１０４−１１２，２０００；Ｐａｎｔａｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１５０２−１５０６；Ｈｉｇｇｓ及びＰｏｌｌａｒｄ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７０：６４９−６７６，２００１を参照のこと）。細胞骨格ダイナミクスが増強された結果として、細胞は、糸状仮足及び葉状仮足といったような原形質膜の突出部分を生成しかつ／又は後退させることができる（Ｂｏｒｉｓｙ及びＳｖｉｔｋｉｎａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：１０４−１１２，２０００）この増強された活性は、成長円錐の探査活性の増強、ニューロンから延びる軸索の先端部の成長ならびに軸索成長及び開通活性の増強の形で現われる（Ｈｕ及びＲｅｉｃｈａｒｄｔ， Ｎｅｕｒｏｎ２２，４１９−４２２，１９９９；Ｓｕｔｅｒ ａｎｄ Ｆｏｒｓｃｈｅｒ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ８：１０６−１１６，１９９８；Ｄｉｃｋｓｏｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． １１：１０３−１１０，２００１）。中枢神経系のニューロンの樹状突起棘においては、アクチンフィラメントダイナミクスが増強された結果、運動性が増大し、このことはそれ自体、この突起の形態学的形状及び電気特性を調節することができる。その結果として、シナプス前シグナルに対するシナプス後応答は改変される可能性がある（Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２３：５３−５７，２０００；Ｈａｌｐａｉｎ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２３：１４１−１４６，２０００，Ｍａｔｕｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ２９０：７５４−７５８，２０００；Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｌｕｏ， Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ４：３５９−３６５，２００１）。非ニューロン細胞においては、Ａｒｐ２／３の活性化を介して誘発されたアクチンフィラメントダイナミクスの強化は、結果として、葉状仮足といったような膜突出部分の形成の増強を伴う細胞運動性の増強及び移動活性の増強をもたらす（Ｈｏｌｔ及びＫｏｆｆｅｒ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：３８−４７，２００１；Ｍｕｌｌｉｎｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：９１−９６，２０００；Ｐｒｏｋｏｐｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４８：８４３−８４８，２０００）。細胞表面から細胞骨格へのシグナリングの調節不全は、腫瘍細胞の侵襲性成長及び転移能力の増強とリンクされるその移動活性を変化させる（Ｒａｄｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ． ， Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． １１：８７−９５，２００１；Ｋａｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． １１：１０５−１１９，２００１；Ｃｏｎｄｅｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． １１：１１９−１２８，２００１；Ｐｒｉｃｅ ａｎｄ Ｃｏｌｌａｒｄ， Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１１：１６７−１７３，２００１）。
【００５１】
本発明は、シナプスカルシウム信号を選択的に調節する１つの化合物の活性を評価するための方法を提供する。ここで提示されているスクリーニングアプローチの原理は、本書に提示されている免疫電子顕微鏡研究に基づいている。これらの研究の中で我々は、全長カルシンテニン−１がほぼ排他的に、シナプス後膜の中及びその下にあり、一方タンパク質分解性分割により生成されたトランスメンブランフラグメントは、いわゆる棘器官の膜内に転座させられるということを発見した。棘器官からの全長カルシンテニン−１が全く存在しないということは、タンパク質分解により分割されたカルシンテニン−１のみが内在化させられるということを表わしている。明らかにタンパク質分解性分割は、カルシンテニン−１のトランスメンブランセグメントの内在化にとっての１つの前提条件である。カルシンテニン−１のタンパク質分解性分割及びその後のそのトランスメンブランフラグメントの内在化の結果として、シナプス後膜内のカルシンテニン−１の量は減少させられる。その結果、シナプスカルシウムシグナリングに対するカルシンテニン−１の細胞質セグメントの調節上の影響は減少する。
【００５２】
これらの特徴に基づくと、カルシンテニン−１のその細胞外セグメント内のタンパク質分解性分割は、シナプス後膜の下のカルシンテニン−１で媒介されるカルシウム結合能力の低下と相関関係をもつ。従って、カルシンテニン−１のタンパク質分解性分割の程度は、シナプス後カルシウムシグナルのＫＮＴ−１媒介調節のための相関物を提供する。カルシンテニン−１のタンパク質分解性分割とシナプスカルシウムシグナルのＫＮＴ−１媒介調節の間のこのリンクは、シナプスカルシウムシグナリングのモジュレータとしてのその潜在的な活性について１つの化合物をテストするための比較的単純な検定を確立するために開発利用可能である。この検定は、適切な培地又は緩衝液中の予め選択された量の化合物と、ＫＮＴタンパク質を発現しシナプスを形成するニューロン細胞培養又はシナプトソーム又はシナプトニューロソーム調製物を接触させる段階を含んで成る。適当なインキュベーション時間の後、全長カルシンテニンタンパク質のタンパク質分解性分割反応の進捗度を、全長形状のカルシンテニンの減少及び２つの分割産物の増大を測定することによって査定する。全長カルシンテニンタンパク質の分解及び／又は前記ニューロン細胞培養又は前記シナプトソーム又はシナプトニューロソームによるカルシンテニンタンパク質の分割産物の生成を１つの対照に比較して測定することは、カルシンテニンタンパク質のエンドサイト−シスを変調させる上での１つの化合物の効率、ひいては棘器官のシナプス後膜下のゾーンからのカルシンテニン結合ドメインの転座、さらにはシナプス後カルシウムシグナルの変調についての尺度を提供することになる。
【００５３】
より特定的には、本発明は、１つの化合物の、細胞外部分におけるカルシンテニンタンパク質の分割に影響を及ぼす能力を決定する方法を提供する。標準的な実験は以下の作業から成る：
ａ）　シナプス形成ニューロン細胞培養（例えば、マウス又はラットの脳からの解離した海馬培養：Ｇｏｓｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８，神経細胞の培養第２版、ＭＩＴ Ｐｒｅｓｓ Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）の調製、又は代替的には実証済みプロトコルを用いた、げっ歯類（マウス又はラット）又は鳥類（ニワトリ又はハト）の脳からのシナプトソーム又はシナプトニューロソームの調製（シナプトソームについては、Ｐｈｅｌａｎ及びＧｏｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋｓ， １９９７、神経化学、その実践的アプローチ、第２版：シナプトニューロソームについては、Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９８５，Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ５，２２４０−２２５３）
ｂ）　シナプス形成ニューロン細胞培養の培地又は懸濁したシナプトソーム又はシナプトニューロソームを含有する緩衝液に対する化合物の添加、
ｃ）　ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動による細胞又はシナプトソーム又はシナプトニューロソームタンパク質の分離、
ｄ）　ウェスタンブロット分析による全長カルシンテニン及びそのフラグメントの視覚化、
ｅ）　全長及び分割カルシンテニンの相対的量の測定、
ｆ）　制御された条件下で得られた分割及び未分割カルシンテニンの相対的量と、分割及び未分割カルシンテニンの相対的量の比較。
【００５４】
本発明は、非シナプスカルシウムシグナルに起因する副作用を生成することなく、シナプスカルシウムシグナルを選択的に変調させる薬物の開発にとって有用となる、シナプスカルシウムシグナリングに対する薬物の作用のスクリーニングのための単純なｉｎ ｖｉｔｒｏシステムを提供する。それぞれ比較的容易に培養又は調製可能な、哺乳動物又は鳥類のニューロンの生きたシナプス形成培養又は単離された哺乳動物又は鳥類のシナプス（いわゆるシナプスソーム又はシナプトニューロソーム）について検定を実施することができる。ウェスタンブロット分析によるカルシンテニンのタンパク質分解性分割の査定は、同様に比較的単純な手順である。かくして、該検定は、多数の化合物のハイスループットスクリーニングに適している。
【００５５】
本発明は同様に、カルシンテニン遺伝子産物又はそこから延びる生化学経路に結びつけられる「経路遺伝子」と呼ばれる遺伝子の同定のための方法にも関する。本書で使用されている「経路遺伝子」は、その遺伝子産物がカルシンテニン遺伝子産物と相互作用する能力を示す遺伝子を意味している。
遺伝子産物とカルシンテニン遺伝子産物の間の相互作用を同定することにより経路遺伝子産物を同定するためには、タンパク質同士の相互作用を検出するのに適したあらゆる方法を利用することができる。このような既知の遺伝子産物は、細胞内、トランスメンブラン又は細胞外タンパク質であり得る。かかる既知の遺伝子産物と相互作用するような遺伝子産物が、経路遺伝子産物を表わし、これらのコードする遺伝子が、経路遺伝子を表わす。
【００５６】
利用可能な従来の方法としては、勾配又はクロマトグラフィカラムを通した同時精製、架橋及び同時免疫沈降法がある。これらのような手順を利用することで、経路遺伝子産物の同定が可能となる。ひとたび同定されたならば、経路遺伝子産物を標準的な技術と合わせて使用して、その対応する経路遺伝子を同定することができる。例えば、Ｅｄｍａｎ分解技術を介してといったように、当業者にとっては周知の技術を用いて、経路遺伝子産物のアミノ酸配列の少なくとも一部分を確認することが可能である（例えばＣｒｅｉｇｈｔｏｎ， １９８３，「タンパク質：その構造及び分子原理」Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．３４−４９を参照のこと）。得られたアミノ酸配列は、経路遺伝子配列についてスクリーニングするのに使用され得るオリゴヌクレオチド混合物の生成のための指針として使用可能である。スクリーニングは、例えば、標準的ハイブリダイゼーション又はＰＣＲ技術などにより達成できる。オリゴヌクレオチド混合物の生成及びスクリーニングのための技術は周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８７−２０００，「分子生物学における現行プロトコル」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， 及び「ＰＣＲプロトコル：方法及び利用分野に対する指針」１９９０，Ｉｎｎｉｓ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００５７】
さらに、カルシンテニン遺伝子産物と相互作用するタンパク質をコードする経路遺伝子の同時同定を結果としてもたらす方法を利用することが可能である。これらの方法には、例えば標識付けされたカルシンテニンタンパク質をラムダｇｔ１１ライブラリの抗体プローブ探査の周知の技術と類似の要領で使用して、このタンパク質で発現ライブラリをプローブ探査することが含まれる。
【００５８】
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質相互作用を検出する１つのこのような方法である２−ハイブリッドシステムは、制限的な意味のない単なる例示を目的として詳述される。このシステムの１つの態様がすでに記述されてきており、（Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：９５７８−９５８２）（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。
【００５９】
簡単に言うと、かかるシステムを利用して、既知のタンパク質に融合した転写活性化因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメインから成るもの及びｃＤＮＡライブラリの一部としてその中に組換えされたｃＤＮＡによってコードされる未知のタンパク質に融合された活性化因子タンパク質の活性化ドメインから成るものという２つのハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドが構築される。プラスミドは、活性化因子の結合部位を含有する調節領域をもつリポータ遺伝子（例えばＬａｃＺ）を含有する酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１菌株の中に形質転換される。いずれのハイブリッドタンパク質も単独ではリポータ遺伝子の転写を活性化できない：ＤＮＡ結合ドメインは、活性化機能を提供しないことを理由とし、活性化ドメインは、活性化因子の結合部位に対し局在化できないことを理由としている。２つのタンパク質の相互作用が機能的活性化因子タンパク質を再構成し、リポータ遺伝子の発現を結果としてもたらし、これは、リポータ遺伝子産物についての検定によって検出される。
【００６０】
２ハイブリッドシステム又は関連する方法論は、本書では既知の「ベイト、遺伝子タンパク質とも呼ばれているカルシンテニン遺伝子産物と相互作用するタンパク質について活性化ドメインライブラリをスクリーニングするために用いることができる。全ゲノム又はｃＤＮＡ配列は、活性化ドメインをコードするＤＮＡに融合され得る。かかるライブラリ及びＤＮＡ結合ドメインに融合されたベイト遺伝子タンパク質のハイブリッドをコードするプラスミドは、酵母リポータ菌株内に同時形質転換され得、結果として得られた形質転換体を、リポータ遺伝子に発現するものについてスクリーニングすることが可能である。これらのコロニーを精製し、リポータ遺伝子の発現を担当するライブラリプラスミドを単離することができる。次に、ＤＮＡ配列決定を用いて、ライブラリプラスミドによりコードされたタンパク質を同定することが可能である。
【００６１】
例えば、制限的意味はないが、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡに翻訳融合されるような形で、ベイト遺伝子をベクター内にクローニングすることができる。
ベイト遺伝子と相互作用するタンパク質がそこから検出されることになる細胞系統のｃＤＮＡライブラリを、当該技術分野において日常的に実践されている方法を用いて作ることができる。本書に記述されている特定のシステムに従うと、例えば、ＧＡＬ４の活性化ドメインに翻訳融合されるような形でｃＤＮＡフラグメントをベクター内に挿入することができる。このライブラリは、ベイト遺伝子−ＧＡＬ４融合プラスミドと共に、ＧＡＬ４活性化配列を含有するプロモータによって駆動されたｌａｃＺ 遺伝子を含有する酵母菌株内に同時形質転換され得る。ベイト遺伝子と相互作用するＧＡＬ４活性化ドメインに融合されたｃＤＮＡコード化ＰＮは、活性ＧＡＬ４タンパク質を再構成しかくしてｌａｃＺ 遺伝子の発現を駆動することになる。ｌａｃＺを発現するコロニーは、Ｘ−ｇａｌの存在下でのその青い色によって検出可能である。ｃＤＮＡは、このときこれらの菌株から精製され得、当該技術分野において日常的に実践されている技術を用いてベイト遺伝子相互作用タンパク質を産生し単離するために使用可能である。
【００６２】
経路遺伝子を発見するためのもう１つの方法は、真核性発現クローニングである。この発現クローニング方法は、真核性発現ベクター内に含まれているｃＤＮＡライブラリから、問題のタンパク質と物理的に相互作用する分子をコードするｃＤＮＡを単離することを可能にする。過去数年にわたり、それは、数多くの異なるタンパク質及びその他の分子の結合をパートナーを同定するための強力な方法として出現した（Ｓｉｍｍｏｎｓ， １９９３，哺乳動物の細胞内での過渡的発現による細胞表面分子のクローニング、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２０００，Ｃｕｒｒ． Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ参照）。２−ハイブリッドシステム技術とは異なり、それは、細胞外区画内のタンパク質−タンパク質相互作用を検出するための好ましい技術である。この方法の１つの態様は、ここで、制限的意味のない例示のみを目的として詳述されている。
【００６３】
発現クローニングアプローチには、以下の作業が関与する：
−　スクリーニングのための使用されるプローブの構築及び／又は精製、
−　適切なｍＲＮＡ供給源からのｃＤＮＡ発現ライブラリの作製、
−　発現ライブラリのスクリーニング及びプローブと相互作用するリガンドを発現する陽性プールの決定、
−　リガンドのｃＤＮＡを担持する単一クローンが見い出されるまでのサブクローニング。
【００６４】
培養された哺乳動物細胞内のｃＤＮＡ発現ライブラリのスクリーニングは、細菌培養内のファージ又はプラスミドライブラリのスクリーニングよりもさらに骨の折れるものである。それは、細菌内のｃＤＮＡライブラリクローンのプラスミドＤＮＡの増幅、その単離及び発現のための哺乳動物細胞内へのその後のトランスフェクションを必要とする。それでも、ＣＯＳ細胞といった哺乳動物細胞は、なお前記目的のための理想的宿主である。これらの細胞は、ｃＤＮＡ鋳型から正しく長い翻訳産物を合成し、細胞外区画内で正しくタンパク質の折り畳み及びその翻訳後修飾を実施することができる。ｃＤＮＡ発現ライブラリのスクリーニングのためのプローブを設計するための１つの可能性は、アルカリホスファターゼでの問題のタンパク質の融合である（Ｆｌａｎａｇａｎ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ， １９９０，Ｃｅｌｌ６３，１８５−１９４）。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）は、高い感度で融合タンパク質を追跡するのに使用できる固有の酵素活性を有する。ＡＰのための多様な基質が、溶液中の定量検定又はｉｎ ｓｉｔｕ検出を可能にしている。ＡＰに対する抗体が利用可能であるため、ＡＰ融合タンパク質の免疫学的検出も同様に可能である。
【００６５】
ＡＰでタグ付けされた融合タンパク質の産生のためには、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）といった真核性発現ベクターが適当である。カルシンテニンとそのリガンドの相互作用が混乱を受ける可能性があることから、ＡＰタグが融合される領域近くに結合部位がある場合、スクリーニングプログラムに内含されるカルシンテニンの各フラグメントについて、３′未満に融合されたＡＰタグを伴うものと５′末端に融合されたＡＰタグを伴うものといった２つの構成体を生成することが必要である。融合タンパク質は、ＨＥＫ２９３Ｔ又はＣＯＳといった適当な真核細胞系統の中での過渡的な発現により産生可能である。充分に発現されたタンパク質は、例えばウェスタンブロット分析によってテストされ、ＡＰ検定により定量化される。カルシンテニンタンパク質は、海馬を含めた脳全体を通してニューロン内で発現されることから、解離された海馬ニューロンの培養に対する結合について、プローブをテストすることができる。その他の脳領域又は組織切片からの培養されたニューロンでのプローブのテストも可能である。
【００６６】
発現及び結合実験のための対照を得るためには、分泌されたＡＰの配列を同じ発現ベクター内に挿入することができる。内因性分泌シグナル及びカルシンテニン又はＡＰのコザック配列をＣＭＶプロモータと共に使用することにより、融合タンパク質の効率の良い翻訳及び培地内へのその分泌が保証される。
かくして生成されたベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション方法又は電気穿孔法又はリポフェクションといったその他のトランスフェクション方法を用いて、ヒト胚性腎細胞系統ＨＥＫ２９３Ｔ内に形質移入される。ならし培地は、トランスフェクションから３〜４日後に収集される。発現されたタンパク質の量は、ならし培地内のＡＰ活性を測定することによって推定される。ならし培地の標本が、ＡＰの可溶性基質を含有する緩衝液の中で希釈される。ＡＰによる基質の転換速度は、この酵素の活性に正比例する。ＡＰは、基質をカラー産物に転換することから、それを分光光度計で測定することが可能である。発現されたタンパク質は同様に、ＡＰに対するポリクローナル抗体を用いたウェスタンブロット分析によってもテストされる。かくして、融合タンパク質の見かけの分子量を、その無欠性についての対照として決定することができる。
【００６７】
真核性発現クローニングは、ｃＤＮＡライブラリを生成するために適切なＲＮＡ供給源を必要とする。カルシンテニンタンパク質をコードするｍＲＮＡは、海馬のニューロンを含めた中枢神経系のニューロン内で卓越して発現される。マウス脳切片の免疫組織化学染色により、タンパク質レベルでもこれらの脳領域内のカルシンテニン−１の発現が確認された。従って、推定上のリガンドが、カルシンテニンタンパク質があるのと同じ領域内で発現されると仮定することが理にかなっていると思われる。この仮説をテストするため、解離された海馬細胞培養を調製し、プローブの結合についてテストした。結合検定は、以下のプロトコルに従って実施される。解離された海馬ニューロンに、直ちに予備固定に付し、これを適切なプローブを含有する緩衝ならし培地で９０分間インキュベートする。その後、細胞を洗浄し、短かい予備固定付加に付す。内因性感熱ＡＰを次に、２時間６５℃での細胞インキュベーションにより不活性化する。融合タンパク質内に挿入されたＡＰは熱安定性を有し、この段階の後も活性であり続けている。最後に、ＡＰにより有色沈殿物へと転換されうる基質を含有する染色用緩衝液を用いて細胞をインキュベートする。従って、プローブを結合させる分子を発現する細胞は、青色に染色される。
【００６８】
発現ライブラリ生成のためのｃＤＮＡは、標準的な技術（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， ２０００参照）により、成体のマウス又はラット又はヒトの脳から得られたｍＲＮＡから生成することができる。ＣＯＳ細胞内へのライブラリのトランスフェクションのための真核性発現ベクターとしては、例えばｐＣＤＭ８（Ａｒｕｆｆｏ及びＳｅｅｄ， １９８７，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ８４，８５７３−８５７７）又はより最近ではｐｃＤＮＡ３１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が内含される。ライブラリの生成のためには、さまざまなプロトコルが使用され成功を収めている（例えば、Ｓｉｍｍｏｎｓ， １９９３を参照のこと）。生成の直後に、ｃＤＮＡ発現ライブラリを、１プールあたり１０００〜１５００の複雑さコロニー形成単位（ｃｆｕ）の割合で約２００個のプールに分割することができる。各プールは、例えば全く同じ条件で３回平板固定する。各平板上で５００〜１，０００ｃｆｕを成長させる。３６時間後、コロニーが２〜３ｍｍの直径に達した時点で、培地を用いて平板から細菌を洗浄する。細菌懸濁液の一部分をグリセロールと混合し、その後のサブプール作業のためのバックアップとして凍結保存することができる。懸濁液の残りの部分は、プラスミドＤＮＡの単離のために使用することができる。例えばＣＯＳ細胞に、個々のｃＤＮＡライブラリプールのプラスミドＤＮＡを形質移入し、４８時間後に、ｃＤＮＡフラグメントが発現された時点で、プローブ結合についてこれらをテストする。トランスフェクションの効率及び染色反応の質はつねに、ニューロピリン−１のｃＤＮＡでの細胞のトランスフェクション及びＡＰに融合されたその既知の結合パートナーであるセマフォリン−ＩＩＩでのこれらの対照細胞の染色によって制御された。負の対照として、模擬トランスフェクションを受けた細胞を、カルシンテニン−ＡＰ及びセマフォリン−ＡＰの両方で染色した。全てのｃＤＮＡライブラリプールを、全く同じ条件で３回スクリーニングできる。
【００６９】
全ての陽性プールを、サブプール作業手順に付すことができる。各々の陽性プールのバックアップから、各平板に約１００ｃｆｕが存在するような形で、５０枚の平板に平板固定する。コロニーが目に見えるようになった時点で、複製を作る。複製及びオリジナルの平板を両方共、コロニーが約２〜３ｍｍの直径に達するまでさらにインキュベートさせる。その後、複製平板から細菌を洗浄し、プラスミドＤＮＡを単離させる。次回のサブプール作業のために４℃でオリジナル平板を保存する。次にＣＯＳ細胞に、単離されたＤＮＡを形質移入し、２日後、同じプローブでテストする。
【００７０】
経路遺伝子がひとたび同定され単離された時点で、これを、例えば本書で論述されている通りに特徴づけすることができる。
本書で定義されているカルシンテニンの遺伝子発現を変調させるために、経路遺伝子の産物として同定されたタンパク質を使用することができる。代替的には、経路遺伝子の産物として同定されたタンパク質は、カルシンテニンのタンパク質分解性分割及び結果としての、カルシンテニンのトランスメンブランフラグメントのそのカルシウム結合細胞質ドメインでの内在化を変調させるために使用することができる。代替的には、経路遺伝子の産物として同定されたタンパク質を、シナプスカルシウムシグナリングにおけるカルシンテニンのカルシウム結合ドメインの影響を変調させるために使用することができる。経路遺伝子は、それ自体、カルシンテニンタンパク質機能を変調させるための変調標的であってよい。
【００７１】
スクリーン内で同定された化合物は、シナプスカルシウムシグナリングのモジュレータとしてのカルシンテニン タンパク質の活性を選択的に変調させる能力を実証することになる。これらの化合物としては、細胞外部分内でカルシンテニンタンパク質を分割するプロテアーゼ（単複）のタンパク質分解活性を調節する小型有機分子、カルシンテニンタンパク質の細胞外部分を結合させかくして、タンパク質分解性分割及び／又は内在化に対するカルシンテニンタンパク質の感受性を変調させる分子、カルシンテニン タンパク質のトランスメンブラン又は細胞質ドメインに結合しカルシウムに対するその親和性又はそのカルシウム結合能力を変調させる分子、及びカルシンテニンタンパク質の任意の部分に結合し本書で経路タンパク質又は経路遺伝子として定義づけされているものといった、巨大分子リガンドとのその相互作用を変調させる分子が含まれるが、これらに制限されるわけではない。これらの化合物は同様に、カルシンテニン タンパク質及びその相同体、類似体及び欠失をコードする核酸、ならびにアンチセンス、リボザイム、３重らせん、２本鎖ＲＮＡ、抗体、及びポリペプチド分子及び小型無機又は有機分子をも内含するが、これらに制限されるわけではない。
【００７２】
同定された化合物のいずれでも、不充分な、異常な又は過剰なカルシンテニン活性を特徴とするものを含めた、さまざまな疾患を治療又は改善するため治療上有効な用量で適切な担体又は賦形剤（単複）と混合される医薬組成物の形で、或いは単独で、人間の患者を含めた動物宿主に投与することが可能である。治療上有効な用量というのはさらに、かかる疾患に付随する症候の改善を結果としてもたらすのに充分な化合物の量を意味する。本出願の化合物の処方及び投与の技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの薬学」Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ． Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ，．最新版の中に見い出すことができる。
【００７３】
数多くの疾患が、不充分な、異常な又は過剰なカルシンテニンタンパク質活性の結果としてもたらされ得る。さらに、時として望ましくないものとみなされうる複数の生理学的状態も、カルシンテニン活性に結びつけることができる。制限的な意味のない一例として、本発明の化合物で治療可能なかかる疾患及び生理学的状態としては、精神分裂症またはうつ病、アルツハイマー病、卒中、及び急性頭部外傷といったような神経学的疾患、急性又は慢性頭痛、高血圧及び心筋梗塞があるが、これらに制限されるわけではない。
【００７４】
その他のオプションとしては、クローニングされた遺伝子を用いた遺伝的手段により産生され精製された酵素の直接的送達が内含されうる。その他のイソ型も存在する可能性があり、カルシンテニン配列を利用してクローニングされ得る。本発明の化合物は、組織特異性のために設計又は投与され得る。該化合物が発現ベクタを含むものを含めた核酸分子を含んで成る場合、Ｈａｒｔ， １９９４，Ａｎｎ． Ｏｎｃｏｌ．， ５．Ｓｕｐｐｌ ４：５９−６５；Ｄａｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４，Ｇｅｎｅ， １４５：３０５−３１０；ＤｉＭａｉｏ ｅｔ ａｌ．， １９９４，Ｓｕｒｇｅｒｙ， １１６：２０５−２１３；Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５４：４２６６−４２６９；Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４，Ｃａｎｃｅｒ， ７４（Ｓｕｐｐｌ． ３）：１０２１−１０２５；Ｒｅｔｔｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’１． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９１：１４６０−１４６４；ａｎｄ Ｘｕ ｅｔ ａｌ， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．， ２２：２２３−２３０；Ｂｒｉｇｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９４，Ｐｒｏｇ． Ｃｌｉｎ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｓ．， ３８８：３６１−３６５で記述されているものを含めた当該技術分野で既知である方法により、脳、腎臓、心臓などといった標的組織について特異的な調節配列にこれをリンクさせることができる。本発明の化合物は、特異的部位への直接的注射によりこれらの部位にターゲティングすることができる。中枢神経系で使用するように設計された化合物は、血液脳関門を横断できなくてはならず、そうでなければ、局在化された注入による投与に適していなければならない。さらに、脈管系内部にとどまる本発明の化合物は、動脈硬化症、バルーン式血管形成術、カテーテル法、心筋梗塞、血管閉塞及び血管外科手術の結果として発生しうる血管の炎症の治療において有用であり得る。血流内にとどまるかかる化合物は、ＭｃＩｎｔｉｒｅ， １９９４，Ａｎｎａｌｓ Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２２：２−１３の中でより詳しく記述されているものを含めた当該技術分野において周知の方法によって、調製可能である。
【００７５】
本発明で使用するのに適した医薬組成物としては、その意図された目的を達成するために有効量で活性成分が含有されている組成物が含まれる。より特定的には、治療上有効な量というのは、治療対象の被験者の既存の症候の発達で防止するか又はかかる症候を軽減させるのに有効な量を意味している。有効量の決定は、特に本書で提供されている詳細な開示に照らして当業者の能力の範囲内に充分入るものである。
【００７６】
本発明の方法において使用されるあらゆる化合物について、治療上有効な用量は、当初細胞培養検定から推定できる。例えば、細胞培養内で決定されるようなＩＣ５０（細胞の５０％が所望の効果を示す用量）を含む循環濃度範囲を達成するための用量を、動物モデルにおいて処方することができる。かかる情報を用いて、人間における有用な用量をより正確に決定することが可能である。
【００７７】
治療上有効な用量というのは、１人の患者における症候の改善又は延命を結果としてもたらす化合物の量を意味する。かかる化合物の毒性及び治療上の効力は、例えばＬＤ５０（個体群の５０％に対する致死用量）及びＥＤ５０（個体群の５０％において治療上有効な用量）を決定するための細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順によって決定可能である。毒性効果と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、これはＬＤ５０とＥＤ５０の間の比率として表わすことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養検定及び動物研究から得られたデータは、ヒトにおいて使用するための用量範囲を処方する上で使用可能である。かかる化合物の用量は、好ましくは、ほとんど又は全く毒性の無いＥＤ５０を内含する循環濃度範囲内にある。用量は、利用される剤形及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。正確な処方、投与経路及び用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る（例えばＦｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．， １９７５、「治療学の薬理学的基礎」Ｃｈ１ ｐｌを参照のこと）。投与量及びその間隔は、所望の効果を維持するのに充分なものである活性部分の血漿レベルを提供するために個別に調整可能である。
【００７８】
局所的投与又は選択的摂取の場合、薬物の有効な局所的濃度は、血漿濃度に関係づけできない。
投与された組成物の量は、当然のことながら、治療対象の被験者、被験者の体重、苦痛の重症度、投与方法及び指示する医師の判断によっても左右されることになる。
【００７９】
本発明の医薬組成物は、従来の混合、溶解、造粒、打錠、研和、乳化、カプセル封入、閉じ込め又は凍結乾燥プロセスを用いて、それ自体既知である要領で製造可能であり得る。
本発明に従って使用するための医薬組成物はかくして、薬学的に使用可能な調製物への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び添加剤を含む単数又は複数の生理学的に受容可能な担体を用いて従来の方法で処方され得る。適切な製剤形態は、選択された投与経路によって左右される。注射のためには、本発明の作用物質は、水溶液、好ましくはハンクス溶液、リンゲル溶液又は生理食塩緩衝液といったような生理学的に相容性ある緩衝液の中で処方され得る。経粘膜投与のためには、製剤中に、浸透すべき障壁に適した浸透剤が使用される。かかる浸透剤は、一般に、当該技術分野において既知のものである。
【００８０】
経口投与のためには、化合物は、当該技術分野において周知の薬学的に受容可能な担体と活性化合物を組合わせることによって容易に処方できる。かかる担体は、治療すべき患者による経口摂取のため、錠剤、丸薬、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして本発明の化合物を処方できるようにする。経口用途のための薬学調製物は、固体賦形剤＜原文抜けあり？＞、結果として得られた混合物を粉砕し、望まれる場合には錠剤又は糖衣錠コアを得るべく適切な添加剤を添加した後、顆粒混合物を処理することによって得ることができる。適切な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトール又はソルビトールを含めた糖などの充てん剤；例えばトウモロコシデンプン、小麦デンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トウガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及び／又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）といったようなセルロース調製物である。望ましい場合、架橋ポリビニルピロリドン、寒天又はアルギン酸又はアルギン酸ナトリウムといったようなその塩などの崩壊剤を添加することができる。
【００８１】
糖衣錠コアには適切なコーティングが施される。この目的で、任意にはアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール及び／又は二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤又は溶剤混合物を含有しうる濃縮糖溶液を使用することができる。同定のため又は活性化合物用量の異なる組合せを特徴づけするために、錠剤又は糖衣錠コーティングに対して染料又は色素を添加することもできる。
【００８２】
経口的に使用可能な薬学調製物には、ゼラチンで作られたハードカプセル、ならびにゼチラン及びグリセロール又はソルビトールといった可塑化剤で作られた密封ソフトカプセルが含まれる。ハードカプセルは、ラクトースといった充てん材、でんぷんといった結合材及び／又は、タルク又はステアリン酸マグネシウムといった潤滑剤そして場合によっては安定剤との混和物の形で活性成分を含有することができる。ソフトカプセルでは、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン又は液体ポリエチレングリコールといったような適当な液体の中に溶解又は懸濁していてよい。さらに、安定剤を添加することもできる。経口投与のための全ての製剤形態は、かかる投与に適した用量のものでなくてはならない。舌下投与のためには、組成物は、従来の要領で処方された錠剤又はトローチ剤の形をとり得る。吸入による投与のためには、本発明に従って使用するための化合物は、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又はその他の適当な気体などの適当な推進薬を使用して、圧縮パック又はネブライザからエアゾルスプレーの体裁といった形で適切に送達される。加圧されたエアゾルの場合、用量単位は、計量された量を送達するためのバルブを具備することにより決定される。吸入器又は吹込み器で使用するための例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジを、ラクトース又はでんぷんといったような適当な粉末ベースと化合物の粉末ミックスが入った形で処方することができる。
【００８３】
化合物は、例えば、静脈内ボーラスによる注入又は連続輸液による非経口投与のために処方することができる。注入のための製剤形態は、例えば、防腐剤が添加された多用量コンテナ又はアンプルといった単位剤形の体裁をとることができる。組成物は、油性又は水性ビヒクル内の懸濁液、溶液又は乳剤といった形をとることができ、懸濁剤、安定剤及び／又は分散剤といった製剤作用物質を含有できる。
【００８４】
非経口投与のための薬学的製剤形態には、水溶形態での活性化合物の水溶液が内含される。さらに、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注入懸濁液として調製可能である。適切な親油性溶剤又はビヒクルには、ゴマ油といった脂肪油、又はオレイン酸エチル又はトリグリセリドといった合成脂肪酸エステル又はリポソームが含まれる。水性注入用懸濁液には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール又はデキストランといったような懸濁液の粘度を増大させる物質が含まれていてよい。任意には、懸濁液は同様に、濃度の高い溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を増大させる適当な作用物質又は適当な安定剤も含有することができる。代替的には、活性成分は、使用前に例えば無菌で発熱物質を含まない水といった適当なビヒクルを用いた構成のため粉末形態をしていてもよい。化合物は同様に、ココアバター又はその他のグリセリドといったような従来の座薬基剤を含有する、座薬又は保持浣腸剤といったような、直腸組成物の形でも処方され得る。前述の製剤形態に加えて、化合物は同様に、デポ製剤としても処方可能である。かかる長時間作用型製剤形態は、移植（例えば皮下又は筋内）によってか又は筋内注射により投与され得る。かくして、例えば化合物を、適当な重合体又は疎水性材料（例えば受容可能な油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂と共に、又は可溶性の低い誘導体として、例えば可溶性の低い塩として、処方可能である。
【００８５】
本発明の疎水性化合物のための薬学的担体は、ベンジルアルコール、無極性界面活性剤、水混和性有機重合体及び水相を含む助溶剤系である。当然のことながら、助溶剤系の割合は、その溶解度及び毒性特性を壊すことなく著しく変動させることができる。さらに、助溶剤成分のアイデンティティーを変動させることもできる。
【００８６】
代替的には、疎水性薬学化合物のためのその他の送達系を利用することもできる。リポソーム及びエマルジョンが、疎水性薬剤のための送達ビヒクル又は担体の周知の例である。ジメチルスルフォキシドといったいくつかの有機溶剤も利用することができるが、通常毒性が増大するという代償が伴う。さらに、化合物は、治療用作用物質を含有する固体疎水性重合体の半浸透性マトリックスといった持続放出型系を用いて送達することもできる。さまざまな持続放出型材料が実証されてきており、当業者には周知である。持続放出型カプセルは、その化学的性質に応じて、数週間から最高１００日以上まで化合物を放出することができる。治療用作用物質の化学的性質及び生物学的安定性に応じて、タンパク質安定化のための付加的な戦略を利用することができる。
【００８７】
医薬組成物は同様に、適当な固体又はゲル相の担体又は賦形剤を含むことができる。かかる担体は賦形剤の例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、さまざまな糖、でんぷん、セルロース誘導体、ゼラチン及び重合体、例えばポリエチレングリコールが含まれるが、これらに制限されるわけではない。
本発明の化合物の多くは、薬学的に相容性ある対立イオンを伴う塩として提供されうる。薬学的に相容性ある塩は、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などを含む（ただしこれらに制限されるわけではない）数多くの酸で形成されうる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性又はその他のプロトン性溶剤の中でさらに高い溶解度をもつ傾向がある。
【００８８】
適当な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経皮又は腸内投与；　筋内、皮下、髄内注入ならびに鞘内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内又は眼内注入を含む非経口送達が内含され得る。
代替的には、全身的にではなく局所的に、例えば、往々にしてデポ製剤又は持続放出型製剤の形での患部への化合物の直接注入を介して、化合物を投与することもできる。さらに、例えば、冒された細胞に特異的な抗体でコーティングされたリポソームの中でターゲティングされた薬物送達系内で薬物を投与することができる。リポソームは細胞にターゲティングされ、細胞により選択的に取り上げられることになる。
【００８９】
組成物は、望まれる場合、活性成分を含有する単数又は複数の単位剤形を含有しうるパック又はディスペンサ装置の形で提示され得る。パックには、例えばブリスターパックといったような金属又はプラスチック製ホイルが含まれ得る。パック又はディスペンサ装置には投与のための説明書が伴われている可能性がある。相容性ある薬学的担体の形で処方された本発明の化合物を含む組成物を、調製し、適切なコンテナ内に入れ、指示された身体状況の治療についてのラベルを貼ることができる。ラベル上に指示された適当な身体状況には、不充分な、異常な又は過剰なカルシンテニン−１活性によって特徴づけされるものといったような疾病の治療が含まれ得る。
【００９０】
上述のような核酸配列及びアミノ酸配列の以上に概略的に説明した用途は、本発明の範囲内で、プロテアーゼが関与する疾患、特にｔＰＡが関与する疾患にきわめて適しており、脳卒中の治療に特に適している。例えば、脳卒中の治療においては、カルシンテニン又は、カルシンテニン由来のタンパク質が、緊急治療ならびに長時間治療において適切な医薬品である。
【００９１】
急性状態ですなわち卒中後最初の数時間以内で、現在好まれている適用様式は、大量のカルシンテニンタンパク質の直接的適用、好ましくは鞘内適用、すなわち、脳脊髄液内への直接注入である。
脳卒中の長期療法すなわち損傷の復旧のためには、好ましい方法は、細胞療法である。
【００９２】
遺伝子療法及び／又は細胞療法のためには、処置対象の神経細胞又は特異的療法細胞内でのカルシンテニン遺伝子の発現を可能にする適当なベクタ内に、カルシンテニンタンパク質についてコードする核酸配列（カルシンテニンタンパク質という表現は、プロテアーゼ抑制物質少なくともｔＰＡ抑制物質活性をもつ突然変異体及び対立遺伝子を内含するものとして考慮される）が導入される。遺伝子療法に適しかつカルシンテニンの発現を可能にするこのようなベクターには、神経細胞特異的プロモータの制御下で遺伝子をコードするカルシンテニン−１が含まれる。
【００９３】
遺伝子療法にとっての適当なベクターは、直接的にか又は輸送細胞内で適用可能な神経栄養性ウイルスである。
カルシンテニン発現細胞は同様に、不適合反応のリスクをはるかに低下させながら外科手術治療により所望の作用の中心までもっていくことができるような形でカプセル封入することもできる。かかる細胞は、それらがもはや必要でなくなった時点で又はそれらが活性を失ないかくして交換が必要となった時点で直ちに除去できる。
【００９４】
脳卒中の治療のための上述の方法は全て、プロテアーゼ特にｔＰＡによって誘発されるその他の疾患にも同様に適用可能である。かかる疾患には、細胞移動に対するその効果に起因してｔＰＡにより誘発されるものといったような腫瘍のみならず、その成長、膨張、湿潤、転移及び血管又は新生血管形成の促進において一般に少なくとも１つのプロテアーゼが関与する腫瘍も含まれる。かかるプロテアーゼは、好ましくは、以下のプロテアーゼ系統群のうちの少なくとも１つの成員である：
−　組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、プラスミン、トロンビン、エラスターゼ、カテスピンＧ、ニューロプシン、ニューロトリプシンといったようなセリンプロテアーゼ系統群、
−　コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロームリシン、マトリリシンといったようなマトリックスメタロプロテイナーゼ系統群、
−　カテプシンＢ及びカテプシンＤといったようなシステインプロテアーゼ系統群。
【００９５】
以上で詳述した治療以外に、本発明は同様に、非常に有用な診断手段をも提供する。すでに上述した通りのＰＣＲ及びハイブリダイゼーション方法により、カルシンテニンコーディングタンパク質内の遺伝的欠陥を決定することができる。かかる決定は、すでにその症候が顕著である疾患を診断する上でならびにかかる疾患を発生させるリスクの高い人物又は家族といったその一群を見極める上で一助となる。
【００９６】
同様に、当然のことながら、合成又は化学的方法により、上述の配列の少なくとも一部分を表わし、それぞれカルシンテニンの生物活性特にカルシウム結合活性を模倣又は遮断する能力をもつタンパク質、ペプチド又は核酸配列を産生することも可能である。
さらに、欠陥遺伝子又はかかる遺伝子によりコードされる欠陥タンパク質の特徴づけ及び単離は、かかる欠陥に起因する疾患に悩まされている患者の健康を改善すると考えられる薬物をスクリーニングするための効率の良い手段を提供する。
【００９７】
特にさらなる疾患及び薬物を探索するために、遺伝子導入動物も、非常に価値がある。
本発明のこの態様及びさらなる態様について、ここで以下の例によってさらに説明する。ただしこれらは、本発明の範囲を縮小させることを意図したものでは全くないということを理解すべきである。これらは、単なる例示を目的としたものにすぎない。
【００９８】
実施例：
胚性ニワトリ脊髄ニューロンの神経突起から放出されたタンパク質についてのスクリーニングにより、カルシンテニン−１のタンパク質分解性フラグメントとして１１５ＫＤのタンパク質が同定される。
神経突起から放出されたタンパク質を探索するにあたり、我々は、ニューロン細胞及び神経突起に対する別々のアクセスを提供する区画式細胞培養システムの中で、解離した脊髄ニューロンを培養した（図１Ｃ）。区画式細胞培養システムは、Ｃａｍｐｅｎｏｔ（１９７９），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ， ５８，３０２−７によって記述された通りにセットアップした。Ｅ６杯性ニワトリの脊髄の腹側半分からの解離細胞を、以前記述された通りに区画培養システムの中央区画の中で培養した（Ｓｏｎｄｅｒｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ． １９８４，Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ９８（１）：３６４−８）。平板固定から６日後、側方区画を神経突起が密に占有した状態になった時点で（図１Ｂ），中央区画に〔３５Ｓ〕メチオニンを含有する新鮮な培地を添加することによって、新たに合成されたタンパク質を代謝により標識づけした（Ｓｔｏｅｃｋｌｉ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８０（２）：２４９−５８）。４０時間後、中央及び側方の両方の区画のならし培地を収獲し、２次元ゲル電気泳動（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９７５ Ｍａｙ ２５；２５０（１０）：４００７−２１．）に付し、その後、新たに合成されたタンパク質をフルオログラフィで検出した（Ｂｏｎｎｅｒ及びＬａｓｋｅｙ， Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９７４ Ｊｕｌ １；４６（１）：８３−８．）（図１Ｄ及びＥ）。図１Ｄに示されているように、中央区画の上清は、比較的多数のタンパク質を含有し、一方側方区画の中にはわずか４つの強いタンパク質スポットしか発見されなかった（図１Ｅ）。中央から側方区画まで拡散するタンパク質は、中央区画内でのその濃度の１０％以上に達していなかったことから、我々は、これら４つのタンパク質が側方区画の神経突起から誘導されたに違いないという結論を下した（同じシステムでの定量的研究についてはＳｔｏｅｃｋｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １８０（２）：２４９−５８を参照のこと）。それらのうちの１つ（図１Ｅ、矢印１）は、軸索分泌されたセリンプロテアーゼ抑制物質であるニューロセルピンとして以前に同定されたものである（Ｏｓｔｅｒｗａｌｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １９９６；１５（１２）：２９４４−５３．）。
【００９９】
分子量及びｐＩに基づくと、その他のタンパク質は未知のものであった。１１５ＫＤの見かけの分子量と５．９〜６．３のｐＩをもつタンパク質（図１Ｅの矢印２）を単離し、以下の例で報告されているように特徴づけした。精製、アミノ酸配列決定、及びｃＤＮＡクローニング（例えば例２及び３参照）が、胚性ニワトリ脊髄ニューロンの神経突起から放出された１１５ＫＤのタンパク質が、トランスメンブランタンパク質のタンパク質分解フラグメントであることを明らかにした。そのシナプス局在化（例１０及び１１参照）及びその細胞質ドメインでカルシウムを結合させるその能力（例６）のため、我々はこれをカルシンテニン−１と称した。簡略さ及び明確さを期して、我々は例全体を通して、カルシンテニン−１という語を使用することにする。
【０１００】
例２：
トランスメンブラン定着済みカルシンテニン−１タンパク質から放出された１１５ＫＤのフラグメントの精製及びマイクロ配列：決定。
区画式培養システム（例１参照）内での脊髄ニューロンの神経突起から放出される１１５ＫＤのカルシンテニン−１フラグメントの精製のため、我々は、Ｅ６ニワトリからの脊髄の腹側半分の解離された培養のならし培地を用いた。Ｅ６ニワトリの脊髄の腹側半分からの６×１０６個の細胞を、６０ｍｍのコラーゲンコーティングされた培養皿（ブタコラーゲン、２５０１０ＣＯＬ１，Ｃｏｒｎｉｎｇ， ＮＹ）で培養し、一回培地を交換して７日間成長させた。放出されたタンパク質を収獲するために、細胞を、追加無しの予め暖めたＭＥＭで２度洗浄し、ＢＳＡ及びトランスフェリンが欠如した栄養物混合物Ｎ３（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｓａｔｏ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １９７９，７６（１）：５１４−７）を用い無血清培地内で２〜３日間成長させた。ならし培地を収獲し、０．２２μｍのフィルタを通してろ過し、−２０℃で保存した。
【０１０１】
カルシンテニン−１の精製のために、ならし培地を緩衝液Ａ（２０ｍＭ　トリス−Ｃｌ、ｐＨ８．０）に対し透析し、脱ガスし、再び０．２２μｍのフィルタを通してろ過し、その後、１ｍｌ／分の流速で１ｍｌのＭｏｎｏＱアニオン交換カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に投入した。１０体積の緩衝液Ａでカラムを洗浄した後、タンパク質を２０ｍｌ内で０％〜５０％の緩衝液Ｂ（２０ｍＭのトリス−Ｃｌ中の１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）の勾配で、タンパク質を溶出させた。３ｍｌの分画を収集し、２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９７５ Ｍａｙ２５；２５０（１０）：４００７−２１．）、その後銀染色を行なった（Ｈｅｕｋｅｓｈｏｖｅｎ ａｎｄ Ｄｅｒｎｉｃｋ， Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ． １９８８；９（１）：２８−３２．）。カルシンテニン−１を３００〜４５０ｍＭのＮａＣｌで溶出させた。
【０１０２】
２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる準備分離のため、分画をプールし、Ｗｅｓｓｅｌ及びＦｌｕｅｇｇｅ， （Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４）、１３８：１４１−３）に従ってか又は、多孔質膜を通した遠心分離（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−２０，Ｍｉｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）により濃縮した。Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ（１９７５）に従って２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施し、アニオン交換カラムから１つのゲル上に３〜４の濃縮分画を投入した。等電点電気泳動段階のためのアンフォリン溶液は、１．６％のファルマライト５／８、０．４％のファルマライト３／１０及び０．８％のファルマライト４／６（全てＰｈａｒｍａｃｉａから）で構成されていた。等電点電気泳動中のゲルのｐＨ範囲は、ｐＨ４．９から６．８までであった。第２の次元は、７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｌａｍｍｌｉ， １９７０）で行なわれた。
【０１０３】
クーマシーブルー染色の後、カルシンテニン−１のゲル座標を伴うタンパク質スポットを切除し、ファンネル−ウェル濃縮システムを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより処理した（Ｌｏｍｂａｒｄ−Ｐｌａｔｅｔ及びＪａｌｉｎｏｔ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９９３， ２１（１７）：３９３５−４２）。Ｌｏｍｂａｒｄ−Ｐｌａｔｅｔ 及びＪａｌｉｎｏｔ（１９９３）により考案されたファンネル−ウェルゲル電気泳動システムは、複数のゲル片由来のタンパク質の濃縮のための方法である。ファンネルを形成する２つのスペーサを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ−Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）のミニゲルシステムに適合させた。２０％のアクリルアミドで密封を行なった。１０％のアクリルアミドから成るランニングゲルの長さは１ｃｍであり、４％のアクリルアミドから成るスタッキングゲルの長さは４〜５ｃｍであった。
【０１０４】
ファンネル−ウェル内への投入に先立ち、カルシンテニン−１を含むゲル片を、２０％のエタノール／５％の酢酸中でクーマシーブルーを脱色し、標本緩衝液（２５ｍＭのトリス−Ｃｌ中４％のグリセロール、２．５％のＳＤＳ、２．５％のβ−メルカプトエタノール、ｐＨ６．８）中で室温で３時間平衡化した。カルシンテニン−１を含有する最高８個のゲル片を入念にファンネル−ウェル内に移し、ランニング緩衝液を重ね、５０Ｖで２時間ゲル内で濃縮させた。濃縮中、電流は１０ｍＡから４ｍＡまで変化した。シュリーレン効果に起因するゲル内のタンパク質前線を目視することによって、濃縮の進捗度を追跡することができた。ランニングゲルの中央でタンパク質が濃縮した時点で、ゲル内の消化のため又は直接的アミノ酸配列決定用にＰＶＤＦ膜上に移すため、ランを停止させた。標準的な実験においては、約２０μｇのカルシンテニン−１を含有するタンパク質バンドを得た。切除及び４０％のｎ−プロパノール（ＬｉｃｈｒｏＳｏｌｖ グレード、Ｍｅｒｃｋ）での脱色の後、カルシンテニン−１を０．２ＭのＮＨ４ＨＣＯ３、５０％のアセトニトリルで抽出し、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ．内で乾燥させた。Ｎ−末端を配列決定するため、濃縮カルシンテニン−１をゲルからＰＶＤＦ膜までエレクトロトランスファした（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ ＰＳＱ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。ＰＶＤＦ膜上のカルシンテニン−１含有部域をオートラジオグラフィで位置特定し、切除した。配列は、タンパク質シーケンサ（４７７Ａ型、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．）上でＥｄｍａｎ分解により決定された。
【０１０５】
内部ペプチドの配列決定のため、トリプシン消化を、ファンネル−ウェルシステムで得たゲル片内で実施した（Ｊｅｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９９５；２２４（１）：７５−８２）。２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより上述の通りカルシンテニン−１を処理し、クーマシーブルーで染色し、切除し、ファンネル−ウェルシステム内で濃縮した。約２０μｇのカルシンテニン−１のタンパク質バンドを小片にカットした。ゲル片を４０％のｎ−プロパノール（Ｌｉｃｈｒｏ Ｓｏｌｖグレード、Ｍｅｒｃｋ）で脱色し、０．２ＭのＮＨ４ＨＣＯ３、５０％のアセトニトリルで抽出し、３０分間Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃ内で完全に乾燥させた。１μｇのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ：１ｍＭ ＨＣｌ中０．５μｇ／μｌ）を含有する消化緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ中５％のアセトニトリル、ｐＨ８．０）内でトリプシン消化を実施し、１８時間３７℃でインキュベートした。ペプチドを、消化緩衝液そして８０％のアセトニトリル、０．１％のトリフルオロ酢酸で抽出した。プールした抽出物を蒸発させて、逆相ＨＰＬＣカラムの注入容積（３０−５０μｌ）を得た。質量分析計（ＡＰＩ−ＩＩＩ、ＰＥＳｃｉｅｘ， Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ， Ｏｎｔａｒｉｏ）に連結された逆相ＨＰＬＣカラム（Ｖｙｄａｃ Ｃ８、５μｍ粒度、１ｍｍ（内径）×２５０ｍｍ；Ｖｙｄａｃ， Ｈｅｓｐｅｒｉａ，（Ａ）内で、ペプチドを分離した。溶剤Ａは、０．１％のトリフルオロ酢酸であり、溶剤Ｂは、０．０９％のトリフルオロ酢酸を含有する８０％のアセトニトリルであった。使用された溶出プログラムは、５０μｌ／分の流速で、５分間５％の溶剤Ｂ；６０分間５％〜６０％の溶剤Ｂであった。２１５ｎｍで廃液を監視した。溶出した体積の９０％を収集し、１０％をオンラインで質量分析計（ＡＰＩ−ＩＩＩ、ＰＥＳｃｉｅｘ， Ｔｈｏｒｎｈｉｌｌ， Ｏｎｔａｒｉｏ）内に注入した。クロマトグラムを分析し、配列決定のため単一ペプチド分画を選択した。メーカーのプロトコルに従い、Ｇ１００５型タンパク質シーケンサー（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｈａｒｄ， Ｃａｍａｓ， ＷＡ）上で配列分析を実施した。
【０１０６】
この方法により、脊髄ニューロンの培養から放出されたカルシンテニン−１の１１５ＫＤのフラグメントのＮ末端及び７つの内部ペプチドのアミノ酸配列を決定した。以下の配列が発見された。
Ｎ末端配列（アミノ酸Ｋのための１文字コード）：
ＡＲＶＮＫＨＫＰＷＩＥＴＴＹ（配列番号７）
内部ペプチド
ペプチド番号アミノ酸配列
【化１】
2004508827.tif 000003
【０１０７】
１つの内部ペプチド（ペプチド番号１）の配列は、Ｎ末端配列とオーバーラップし、かくして、
【化２】
2004508827.tif 000004
という配列をもつ、アミノ酸２９個の長さまでのＮ末端配列の拡張を生成した。
【０１０８】
例３：
ニワトリのカルシンテニン−１ｃＤＮＡのクローニングと配列決定
Ｅ１４ニワトリの脳からの全ＲＮＡを鋳型として用いたＲＴ−ＰＣＲのための変性されたプライマを設計するために、Ｎ末端及び内部ペプチドのアミノ酸配列を使用した。Ｅ１４ニワトリの脳及びＰ１０マウスの小脳から、全ＲＮＡを調製した（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉ， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８７；１６２（１）：１５６−９．）。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、オリゴ（ｄＴ）−及びランダム−プライムドｃＤＮＡを産生した。ＰＣＲのために、アミノ末端及び４つの内部ペプチドに対応する変性プライマを合成した（センスプライマ：５′−ＧＴＩＡＡＭＡＡＧＣＡＹＡＡＧＣＣＩＴＧＧＡＴ−３′（配列番号１５）及び５′−ＣＡＴＧＧＩＡＴＨＧＴＩＡＣＩＧＡＧＡＡＴＧＡＴＡＡ−３′（配列番号１６）；アンチセンスプライマ：５′−ＣＣＩＧＴＩＣＣＩＧＧＣＴＣＡＴＡＣＴＣＤＡＴ−３′（配列番号１７）、５′−ＧＴＡＴＣＩＡＣＩＣＣＩＴＡＤＡＴＤＡＴＣＡＴＩＣＣ−３′（配列番号１８）、５′−ＡＣＩＣＣＡＴＣＩＧＣＤＡＴＣＴＧＩＡＡＡＴＣ−３′（配列番号１９）及び５′−ＧＣＡＴＣＡＡＡＣＴＣＩＧＣＣＴＣＣＴＴＡＴＡＡＡＡ−３′（配列番号２０）。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲフラグメントを配列決定し、ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために使用した。それぞれ約２．５×１０６平板のオリゴ（ｄＴ）−プライムドＥ１４ニワトリの脳ｃＤＮＡライブラリ（Ｚｕｅｌｌｉｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ２０４（２）：４５３−６３）オリゴ（ｄＴ）−プライムドＰ２０マウスの脳ｃＤＮＡライブラリ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、オリゴ（ｄＴ）−及びランダムプライムドＥ１５マウスの脳ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及びオリゴ（ｄＴ）−及びランダムプライムドヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を高緊縮性条件下で対応する放射性標識付けされたＰＣＲフラグメントとのハイブリダイゼーションによりスクリーニングした（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９；分子クローニング：実験室マニュアル）。陽性クローンをさらに特徴づけした。
【０１０９】
最長のＰＣＲ産物の長さは２．２ｋｂであった。それは、以前に決定されたアミノ酸配列全てをコードする単一の読取り枠（ＯＲＦ）を含んでいた（図２）。プローブとしてこのフラグメントを用いてオリゴ（ｄＴ）プライムドＥ１４ニワトリの脳ｃＤＮＡ−ライブラリをスクリーニングすると、（Ｚｕｅｌｌｉｇ ｅｔ ａｌ．， １９９２；Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ２０４（２）：４５３−６３）ＯＲＦの付加的な３′配列及び３′未翻訳領域を含有するクローンが生成された。複合ｃＤＮＡは、（精製されたタンパク質のアミノ末端から出発して）２８５０ｎｔのＯＲＦを含んでいた。水治療法プロットは、Ｃ末端に近い１９個のアミノ酸の単一トランスメンブランセグメントについての証拠を提供した（図２）。従って、我々は、成熟タンパク質が、８１３個のアミノ酸の細胞外Ｎ末端部分、１９個のアミノ酸のトランスメンブランセグメント及び１００個のアミノ酸の細胞質部分で構成されているという結論を下した。Ｉ型トランスメンブランタンパク質としての推定的構造に基づき、Ｅ６脊髄培養の上清から単離された１１５ＫＤのタンパク質は、全長トランスメンブランタンパク質のタンパク質分解により分割されたＮ末端フラグメントを表わす。全長カルシンテニン−１の配列内の分割部位の正確な場所は、なお今後決定すべきものである。トリプシンペプチドの場所（図２中灰色の囲み）に基づき、培養上清から単離された放出済みフラグメントは、（成熟タンパク質のＮ末端から計数されるように）少なくとも７５０個のアミノ酸の長さを有していなければならない。
【０１１０】
カルシンテニン−１の細胞質セグメントの１００個のアミノ酸のうちの３８個は、酸性である（表１を参照のこと）。大部分の酸性中央部分において、２０個のうちの１８の残基が酸性であり、フランキング配列には酸性残基も富化されている。同様にして、酸性セグメントは、カルセケストリン、カルレティキュリン、及びタンパク質ジスルフィドイソメラレーゼの特徴である（Ｆｌｉｅｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９８９；２６４（３６）：２１５２２−２８）。これらのタンパク質は、低い親和性をもつ多数のＣａ２＋イオンと結合するその能力に起因して、骨格筋細胞の筋小胞体及び非筋肉細胞の小胞体内のＣａ２＋の貯蔵にとって不可欠なものである（Ｂａｋｓｈ及びＭｉｃｈａｌａｋ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． １９９１；２６６（３２）：２１４５８−６５；Ｏｈｎｉｓｈｉ及びＲｅｉｔｈｍｅｉｅｒ， ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． １９８７；２６（２３）：７４５８−６５．）。
【０１１１】
例４：
ヒト及びマウスのカルシンテニン−１ｃＤＮＡのクローニング及び配列決定：脊椎動物内のカルシンテニン−１の種相同体は、高度の構造的保存を示す。
ヒトカルシンテニン−１のｃＤＮＡの大部分は、ＴＨＣＢｌａｓｔプログラムでＴＨＣ（試行的ヒトコンセンサス配列）データベースを探索することによって発見された。ニワトリカルシンテニン−１のｃＤＮＡに対する相同性をもつ７つのＴＨＣ（ＴＨＣ１７６４３８、ＴＨＣ１７８８２５、ＴＨＣ１９５８４３、ＴＨＣ２００４２４、ＴＨＣ１９２３２５、ＴＨＣ２１１１１４、及びＴＨＣ２１１１１５）を同定し、５′末端及び２つの内部セグメントのうちの１つのセグメントが欠如したヒトｃＤＮＡの部分配列を構成するためにこれを使用した。空隙はＲＴ−ＰＣＲによって閉鎖した。推定的翻訳開始コドン及び５′ＵＴＲ配列のセグメントを、ヒトの脳ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって発見した。かくして我々は、さらに特徴づけされない脳特異的タンパク質のためのスクリーンの結果としてもたらされるｃＤＮＡであるＫＩＡＡＯ９１１と１００％同一の２９４３ｂｐのＯＲＦをもつヒトｃＤＮＡ配列を得た。（Ｎａｇａｓｅ ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ Ｒｅｓ． １９９８；５（６）、３５５−３６４）。
【０１１２】
ＲＴ−ＰＣＲ及びその後の脳ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングにより、マウスカルシンテニン−１のｃＤＮＡを得た。オーバラップクローンの配列に基づき、９７９個のアミノ酸をコードする２９３７ｎｔの単一ＯＲＦを画定した（図２）。
アミノ酸２９から始まるヒト及びマウスのカルシンテニン−１の配列は、ニワトリカルシンテニン−１のＮ末端ペプチドの配列に対応する（図２）。ヒト及びマウスのオルソログの演繹されたアミノ酸配列は、ニワトリカルシンテニン−１に対しそれぞれ８６．４％及び８４．７％の同一性をもっていた（表Ｉ）。ヒト及びマウスカルシンテニン−１のアミノ酸配列の同一性は９２％であった。
【０１１３】
これらの結果は、３つの脊椎動物種つまりヒト、マウス及びニワトリにおけるカルシンテニン−１の種相同体が、高い構造保存度を示すことを明らかにした。高度の構造保存に基づき、ヒト、マウス、ラット及びニワトリといったような異なる脊椎動物種のカルシンテニン−１の種オルソログの間での高い機能的保存度を予測することができる。
【０１１４】
例５：
カルシンテニン−１関連遺伝子についてのデータベース
探索：データベース内に見い出される関連配列が、Ｄ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ及びＣ． ｅｌｅｇａｎｓ内のカルシンテニン様遺伝子の存在を示唆する。
Ｄ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ及びＣ． ｅｌｅｇａｎｓのためのデータベース内には、脊椎動物カルシンテニン−１に対する構造的関係をもつ遺伝子も発見された。ショウジョウバエ（Ｇａｄ Ｆｌｙ）のゲノムアノテーションデータベースの中には、単一のカルシンテニン−１−様遺伝子が発見された（受入れ番号．ＧＣ１１０５９）。６つのオーバラップＥＳＴ（ＧＭ０９２９３、ＨＬ０３９１４、ＬＤ０７４０８、ＬＤ１１６８９、ＧＭ１０４６５、ＬＤ０６２１６）に基づいて、我々は、対応するｃＤＮＡの配列を決定した（受入れ番号ＡＪ２８９０１８）。演繹されたタンパク質は、脊椎動物のカルシンテニン−１と約３５％のアミノ酸配列同一性を示す。受入れ番号アミノ酸Ｃ３８８１６のさらなるカルシンテニン−１関連遺伝子　Ｂ００３４．３が、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓの中に発見された（表Ｉ参照）。
【０１１５】
これらの結果は、カルシンテニン−１−様の遺伝子が無脊椎動物の中にも見られるということを示している。かくして、カルシンテニン−１は、進化全体を通してうまく保存されてきた進化上古い遺伝子を表わしている。
【０１１６】
例６
カルシンテニン−１の細胞質セグメントでのカルシウム結合研究：カルシンテニン−１の細胞質セグメントは、カルシウムイオンを結合する。
【０１１７】
酸性アミノ酸のクラスタ化した出現は、カルセケストリン（Ｙａｎｏ及びＺａｒａｉｎ−Ｈｅｒｚｂｅｒｇ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４；１３５（１）：６１−７０．）及びカルレティキュリン（Ｋｒａｕｓｅ 及びＭｉｃｈａｌａｋ， Ｃｅｌｌ．１９９７；８８（４）：４３９−４３）といったような小嚢状Ｃａ２＋貯蔵の中に見い出される高能力、低親和力のＣａ２＋−結合タンパク質の標準的特徴である。カルシンテニン−１のＣａ２＋−結合能力についてテストするため、我々は、その細胞質セグメントと細菌タンパク質インテインの融合タンパク質を生成した。マウスのカルシンテニン−１の細胞質セグメントとＮ末端インテインタグの融合タンパク質を、Ｉｍｐａｃｔ−ＣＮシステム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ Ｉｎｃ．）を用いて細菌内で発現させた。
【０１１８】
カルシンテニン−１の細胞質セグメントのｃＤＮＡを、ｐＴＹＢ１１ベクターの多重クローニング領域（ＭＣＳ）内に同一枠内で挿入する前に、ＰＣＲで増幅させた（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｉｎｃ．）。ＰＣＲは、校正ポリメラーゼＰｗｏ（Ｒｏｃｈｅ）、鋳型としてのカルシンテニン−１の完全マウスｃＤＮＡプライマＬＶ３８Ｆｍａｘ３（５′ＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＣＡＣＡＴＣＡＧＣＧＡＡＣＧ−３′）（配列番号２１）及びＬＶ３９Ｂｍａｘ３（５′−ＣＣＣＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＴＡＧＣＴＧＡＧＴＧＴＧＧＡＧ−３′）（配列番号２２）を用いて実施した。ＰＣＲフラグメントを、制限部位ＳａｐＩ及びＸｈｏＩを用いてｐＴＹＢ１１のＭＣＳ内にクローニングさせた。連結の後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１ＤＥを形質転換するためにプラスミドを使用した。タンパク質発現のために、適正なプラスミドを含む単一コロニーを使用した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１リットルのＬＢ培地に、新鮮なコロニーを接種した。空気振とう機内で、ＯＤ２６０が０．６に達するまで３７℃で培養をインキュベートした。その後、培養を２２℃の振とう機に移した。０．５ｍＭのイソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、タンパク質発現を誘発した。６時間後、細胞を４℃で１０分間５０００×ｇでスピンダウンさせた。２０ｍｌの細胞溶解緩衝液（２０ｍＭのトリス；５００ｍＭのＮａＣｌ；ｐＨ８．０）の中で細胞ペレットを再懸濁させ、細胞を音波処理により破壊した。清澄した細胞抽出物を得るため、３０分間１２０００×ｇで粗製細胞抽出物を遠心分離した。カルシンテニン−１／インテイン融合タンパク質を精製するため、清澄した細胞抽出物をキチンカラム上に投入し、高い流速（２ｍｌ／分）及び緊縮洗浄条件（１ＭのＮａＣｌ）で洗浄した。３×ＳＤＳ−ＰＡＧＥ標本緩衝液（１８７．５ｍＭのトリス−ＨＣｌ ｐＨ６．８；６％ＳＤＳ；３０％グリセロール及び０．０３％のブロムフェノールブルー）と３分間９９℃のインキュベーションで融合タンパク質を溶出した。
【０１１９】
対照としては、インテインタグに融合させたマルトース結合タンパク質（ｐＭＹＢ５対照プラスミド；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）を使用した。
以前に記述された通りに（Ｍａｒｕｙａｍａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９８４；９５（２）：５１１−９．）Ｃａ２＋結合検定を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥのためには、５μｇの精製された融合タンパク質を、１０％のポリアクリルアミドゲル上への投入に先立ち５分間１００℃で加熱した。電極緩衝液として２０％のメタノール、０．０２５Ｍのトリス−Ｃｌ及び０．１２９Ｍのグリシン（ｐＨ８．５）を含有する溶液を用いて、４℃で１時間１００Ｖの定電圧で、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｄａｓｓｅｌ， Ｇｅｒｍａｎｙ）上へのエレクトロトランスファを実施した。トランスファの後、６０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２及び１０ｍＭのイミダゾール−ＨＣｌ、ｐＨ６．８を含有する溶液内に膜を浸漬し、１時間以内で数回緩衝液を交換した。次に、１０分間、それぞれ０．５μＭ又は１μＭ又は５μＭの４５Ｃａ２＋（２８ｍＣｉ／ｍｇのカルシウム、Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ， ＵＫ）を含有する同じ緩衝液の中で、膜をインキュベートした。膜を２分間、精製水で洗い流した。Ｗｈａｔｍａｎの１番ろ紙で水を吸収し、膜を室温で乾燥させた。オートラジオグラフィのためには、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， ＣＡ）を用いてブロットを分析した。
【０１２０】
図３に示されているように、ニトロセルロースフィルターを０．５μＭ、１μＭ及び５μＭのＣａ２＋濃度でインキュベートした時点で、カルシンテニン−１／インテイン融合タンパク質とオーバラップする用量依存性４５Ｃａ２＋シグナルが発見された。細菌マルトース結合タンパク質及びインテインから成る融合タンパク質では、いかなるＣａ２＋結合も観察されなかった（図３中のＭＢＰ／インテイン）。
【０１２１】
カルシンテニン−１／インテイン融合タンパク質では、ＣａＣｌ２が添加された時点で、広範な沈殿が見られた。５０ｍＭ以上のＣａ２＋の添加は、可溶性カルシンテニン−１／インテインの沈殿をひき起こしたもののＭＢＰ／インテインの沈殿は引き起こさなかった。等モル濃度のＥＤＴＡの添加により、、カルシンテニン−１／インテインのＣａ２＋により誘発される沈殿は防止された。５０ｍＭ未満のＣａ２＋濃度では沈殿が観察されなかったことから、我々は、カルシンテニン−１の細胞質ドメイン間の架橋には、ニトロセルロース膜上の４５Ｃａ２＋結合により検出された高い親和力の部位とは明らかに異なる部位に対するＣａ２＋の低親和力結合が関与しているという結論を下した。Ｃａ２＋についての低親和力結合能力に関しては、カルシンテニン−１の細胞質ドメインが、横紋筋細胞の筋小胞体の主要カルシウム結合タンパク質であるカルセケストリンとの衝撃的な類似性を示している。カルセケストリンは、１４個の酸性残基の隣接する広がり内に蓄積する酸性残基の類似のクラスタ化を示す。隣接する酸性残基をもつペプチドのＣａ２＋結合能力は、特異的Ｃａ２＋部位ではなくむしろ一般的カチオン結合能力とリンクされてきた。かかる酸性の広がりを伴うタンパク質を比較することによって、Ｃａ２＋結合能力が酸性残基の含有量に正比例することが示唆された（Ｌｕｃｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．１９９４；２６９（３７）：２３１１２−９）。Ｘ線結晶構造解析は、Ｃａ２＋の低親和力結合がカルセケストリン２量体の酸性Ｃ末端セグメント間へのＣａ２＋の挿入を介して発生することを示唆した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．１９９８；５（６）：４７６−８３）。同様にして、カルシンテニン−１は、トランスメンブラン定着により秩序立った平行な配向に保たれているその細胞質部分の間への挿入により、Ｃａ２＋を結合させることができる。
【０１２２】
要約すると、これらの結果は、カルシンテニン−１の細胞質ドメインが、Ｃａ２＋の高親和力及び低親和力の両方の結合を示すということを表わしている。
【０１２３】
例７：
カルシンテニン−１ｍＲＮＡの組織分布のノーザンブロット分析；脳は、カルシンテニン−１ｍＲＮＡの最高の発現レベルを有する組織である。
【０１２４】
異なるヒト組織内のカルシンテニン−１の発現パターンについての情報を得るために、Ｐｒｉｍｅ−ｉｔ ＩＩランダムプライマ標識づけキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識づけされたヒトカルシンテニン−１の２．８ｋｂのｃＤＮＡフラグメントで、ヒト多重組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をハイブリッド形成した。ハイブリダイゼーションは、４２℃で一晩行ない、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いてハイブリダイゼーションシグナルを分析した。成体のヒト組織からのポリ（Ａ）で富化されたＲＮＡのノーザンブロット分析は、約５ｋｂのカルシンテニン−１ｍＲＮＡの単一の種を明らかにした（図４Ｃ）。カルシンテニン−１ｍＲＮＡの最高の発現は、脳内で観察された。心臓、胎盤、骨格筋及び腎臓の中では、低いシグナルが検出された。肺及び肝臓では、写しは全く発見されなかった。
【０１２５】
従って、これらの結果は、脳内にカルシンテニン−１ｍＲＮＡの最高の発現レベルが見い出されることを、明確に実証している。
【０１２６】
例８：
カルシンテニン−１ｍＲＮＡの組織分布のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析：カルシンテニン−１はニューロン内で主に発現される。
【０１２７】
細胞分解能での脳内のカルシンテニン−１の発現を決定するため、以前に記述された通りに、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施した。（Ｓｃｈａｅｒｅｎ−Ｗｉｅｍｅｒｓ及びＧｅｒｆｉｎ−Ｍｏｓｅｒ， Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９３；１００（６）：４３１−４０）。Ｅ１８マウスからの凍結切片についてのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、中枢及び末梢神経系（図４Ａ）の灰白質内のカルシンテニン−１ｍＲＮＡの強い細胞発現を明らかにした。Ｅ１８マウスの矢状断面内で、以下の領域を標識付けした（図４Ａ）；新皮質（ｎｃ）、海馬形成（ｈｉ）、尾状被殻（ｃｐｕ）、視床（ｔｈ）、視床下部（ｈｙｔｈ）、小脳（ｃｅ）、橋（ｐ）、三叉神経節（ｔｇ）、後根神経節（ｄｒｇ）、嗅上皮（ｏｅ）、顎下腺（セグメント）及び腸（ｉｎ）。非神経組織内には、顎下腺を除き、いかなるカルシンテニン−１ｍＲＮＡも検出されなかった。センスプローブで処理した対照切片は、いかなる染色も示さなかった。成体のマウスにおいては、灰白質の全ての部域内で、カルシンテニン−１ｍＲＮＡが豊富であった（図４Ｂ）。脳梁（ｃｃ）といったような白質内では、いかなるカルシンテニン−１発現も見い出されなかった。より高い倍率での検査は、ＣＮＳ及びＰＮＳの全ての部域内でニューロン発現パターンを示した。全てとは言わないまでも大部分のニューロンが、カルシンテニン−１ｍＲＮＡを発現したが、それでも発現レベルの多大な差異が見られた。成体のヒト組織内のカルシンテニン−１ｍＲＮＡのノーザンブロット分析が、図４Ｃに示されている。心臓（Ｈｅ）、脳（Ｂｒ）、胎盤（Ｐｌ）、肺（Ｌｕ）、肝臓（Ｌｉ）、骨格筋（Ｓｍ）、及び腎臓（Ｋｉ）からの１レーンあたり２μｇの精製済みｐｏｌｙＡ＋ＲＮＡを、ヒトカルシンテニン−１の放射性標識付けされたｃＤＮＡフラグメントで分析した。分子サイズ目盛はｋｂ単位である。図４Ｄには、ニワトリのカルシンテニン−１タンパク質のウェスタンブロット分析が示されている。成体のニワトリの脳（Ｂｒ）、心臓（Ｈｅ）、肝臓（Ｌｉ）、こう丸（Ｔｅ）、ニワトリの脳脊髄液（ＣＳＦ）及びヒトの脳脊髄液（ｈＣＳＦ）からの１５０μｇの組織抽出物を、カルシンテニン−１に対するポリクローナル抗体Ｒ６３（左図版）及びＲ７１（右図版）を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロット法に付した。分子量目盛は懸濁単位である。図４Ｅは、成熟カルシンテニン−１の完全配列内でＲ６３（影付き）及びＲ７１（斜線入り）抗体を発生させるために用いられた組換え型ペプチドセグメントの場所及びカルシンテニン−１タンパク質上のタンパク質分解性分割部位（矢印）を表わす概略図を示している。抗体Ｒ６３が、全長形態のカルシンテニン−１及びＮ末端分割産物の両方を認識するという点に留意されたい。これとは対照的に、抗体Ｒ７１は、カルシンテニン−１のタンパク質分解性分割によって生成される膜貫通断端を認識する。トランスメンブランドメイン（ＴＭ）は、黒色でマーキングされている。スケールバー：（Ａ）、２．５ｍｍ；（Ｂ）、１．０ｍｍ
【０１２８】
例９：
カルシンテニン−１タンパク質及びその分割産物の特徴づけ：カルシンテニン−１タンパク質は、全長トランスメンブランタンパク質、膜結合Ｃ末端分割産物及び可溶性Ｎ末端分割産物として発生する。
【０１２９】
全長カルシンテニン−１及びその分割産物の組織分布を分析するために、それぞれ抗体Ｒ６３及びＲ７１と呼ばれる２つの抗体をウサギの体内で発生させた。Ｒ６３抗血清についての免疫原は、ニワトリカルシンテニン−１のＮ末端で始まる２６７個のアミノ酸ペプチドから成っていた。Ｒ７１抗血清のための免疫原は、ニワトリカルシンテニン−１のトランスメンブランセグメントのすぐ外側にある８７個のアミノ酸ペプチドで構成されていた。両方のフラグメント共、細菌内でＨｉｓ−タグと共に発現され、ＮｉＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製された。
【０１３０】
Ｒ６３抗原の産生：
ニワトリカルシンテニン−１のＮ末端にある２６７個のアミノ酸という長さのｃＤＮＡフラグメントを、ｐＴＦＴ７４ベクター内に同一枠内で挿入する前にＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲは、校正ポリメラーゼｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、鋳型としてのニワトリカルシンテニン−１のｃＤＮＡ及びプライマＬＶ３１Ｆｃｈａｘ３（５′−ＧＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＣＧＴＧＴＴＡＡＣＡＡＧＣＡＴＡＡＧＣＣＣＴＧＧＡＴＴＧ−３′）（配列番号２３）及びＬＶ３２Ｂｃｈａｘ３（５′−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＣＡＴＣＡＣＡＴＧＴＧＴＣＣ−３′）（配列番号２４）を用いて実施した。ＰＣＲフラグメントを、制限部位ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＴＦＴ７４ベクター内にクローニングさせた。連結の後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１ＤＥ内該プラスミドを形質転換させた。タンパク質発現のために、適正なプラスミドを含む単一コロニーを使用した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１リットルのＬＢ培地に、新鮮なコロニーを接種した。空気振とう機内で、ＯＤ２６０が０．６に達するまで３７℃で培養をインキュベートした。その後、培養を２２℃の振とう機に移した。０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加することにより、タンパク質発現を誘発した。６時間後、細胞を４℃で１０分間５０００×ｇでスピンダウンさせた。２０ｍｌの細胞溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス；ｐＨ８．０）の中で細胞ペレットを再懸濁させ、細胞を音波処理により破壊した。清澄した細胞抽出物を得るため、３０分間１２０００×ｇで粗製細胞抽出物を遠心分離した。ＮｉＮＴＡカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用い、説明書に従って融合タンパク質を精製した。このようにして生成されたＲ６３抗原は、以下に示されている（アミノ酸のための１文字コード；大文字は、カルシンテニン−１内で発現されたアミノ酸を示す；小文字は、それぞれ初期メチオニン及びヒスチジン−タグを表わす）。
【０１３１】
Ｒ６３抗原のタンパク質配列（配列番号２５）
【化３】
2004508827.tif 000005
【０１３２】
Ｒ７１抗原の産生：
Ｒ７１抗体の産生のために抗原として用いられた８７個のアミノ酸という長さのｃＤＮＡフラグメントを、ｐＴＦＴ７４ベクター内に同一枠内で挿入する前にＰＣＲで増幅させた。ＰＣＲは、校正ポリメラーゼｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、鋳型としてのニワトリカルシンテニン−１のｃＤＮＡ及びプライマＭＳ３１Ｆｃｈａｘ３（５′−ＧＧＧＣＣＡＴＧＡＴＡＣＧＣＴＡＣＡＧＡＡＡＣＴＧＧＣＡＣ−３′）（配列番号２６）及びＭＳ２Ｂｃｈａｘ３（５′−ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＧＴＧＧＣＴＧＴＡＣＴＴＧＧＡＡＣＡＡＣ−３′）（配列番号２７）を用いて実施した。ＰＣＲフラグメントを、制限部位ＮｃｏＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いてｐＴＦＴ７４ベクター内にクローニングさせた。連結の後、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１ＤＥ内該プラスミドを形質転換させた。タンパク質発現のために、適正なプラスミドを含む単一コロニーを使用した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１リットルのＬＢ培地に、新鮮なコロニーを接種した。空気振とう機内で、ＯＤ２６０が０．６に達するまで３７℃で培養をインキュベートした。その後、培養を２２℃の振とう機に移した。０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加することにより、タンパク質発現を誘発した。６時間後、細胞を４℃で１０分間５０００×ｇでスピンダウンさせた。２０ｍｌの細胞溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス；ｐＨ８．０）の中で細胞ペレットを再懸濁させ、細胞を音波処理により破壊した。清澄した細胞抽出物を得るため、３０分間１２０００×ｇで粗製細胞抽出物を遠心分離した。ＮｉＮＴＡカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用い、説明書に従って融合タンパク質を精製した。このようにして生成されたＲ７１抗原は、以下に示されている（アミノ酸のための１文字コード；大文字は、カルシンテニン−１内で発現されたアミノ酸を示す；小文字は、それぞれ初期メチオニン及びヒスチジン−タグを表わす）。
【０１３３】
Ｒ７１抗原のタンパク質配列（配列番号２５）
【化４】
2004508827.tif 000006
【０１３４】
第１の注射については完全フロインドアジュバント、又追加抗原注射については不完全フロインドアジュバントを用いてリン酸緩衝溶液中の５０μｇのタンパク質を注射することによって、ウサギの体内でタンパク質（抗原Ｒ６３及び抗原Ｒ７１）に対する抗血清を、発生させた。タンパク質−Ｇカラムとそれに続く抗原接合カラム上を通過させることによって、免疫血清から抗−カルシンテニン−１抗体を親和力精製した。
【０１３５】
成熟タンパク質のＮ末端の２６７個のアミノ酸に対して発生させた抗体Ｒ６３は、全長カルシンテニン−１ならびにタンパク質分解性分割の結果として得られるＮ末端部分の両方を検出する（図４Ｅ）。トランスメンブランドメインに隣接して存在する８７個のアミノ酸のセグメントに対して発生させた抗体Ｒ７１は、タンパク質分解性分割によって生成された膜貫通断端を検出する。ウェスタンブロットでは、カルシンテニン免疫反応性バンドが、脳抽出物内及び脳脊髄液（ＣＳＦ：図４Ｄ）内で排他的に発見された。心臓、肝臓、こう丸（図４Ｄ）ならびに腎臓、肺及び脾臓（図示せず）を含めた、テストされたその他の組織全ての抽出物が、カルシンテニン−１免疫反応性を示さなかった。成体のニワトリの脳抽出物においては、１５０及び１１５ＫＤという見かけのＭＷ（分子量）をもつ２つのバンドが抗体Ｒ６３で見られ、一方抗体Ｒ７１では、３３ＫＤで単一バンドが検出された（図４Ｄ）。１１５ＫＤのバンドは、精髄ニューロンの軸索樹状突起間区画の放出されたタンパク質として区画式培養システムを用いて最初に同定されたタンパク質と同時移動した。１５０ＫＤのバンドは、放出されたフラグメントの推定上のサイズ及びトランスメンブラン及び細胞質セグメントの長さに基づいて、全長形態のカルシンテニン−１を表わしている可能性が最も高い。脳脊髄液中、抗体Ｒ６３は、カルシンテニン−１の可溶性Ｎ末端分割産物に対応する１１５ＫＤの単一バンドのみを認識した。脳抽出物とは対照的に、ＣＳＦは、全長カルシンテニン−１又は膜貫通断端を含んでいなかった。これらの結果を合わせて考慮すると、全長カルシンテニン−１及びその分割産物は、脳組織内に同時に存在することが示されている。タンパク質分解性分割の後に可溶化されるカルシンテニン−１のＮ末端１１５ＫＤフラグメントは、ＣＳＦ中にも同様に発見させる。
【０１３６】
ヒトＣＳＦを調査すると、ヒトカルシンテニン−１が、その他の脊椎動物のカルシンテニン−１と同じ形で細胞外部分の中で分割されることがわかった。図４Ｅに実証されているように、マウス及びニワトリにおいて発見されたカルシンテニン−１のＮ末端分割フラグメントと同じ分子量をもつ卓越したカルシンテニン−１−免疫反応性バンド（原文不明）。これらの結果は、細胞外ドメイン内のカルシンテニン−１のタンパク質分解性分割が、進化の間に保存された１つの特徴であることを示している。
【０１３７】
例１０：
光学顕微鏡レベルでのカルシンテニン−１タンパク質の亜細胞局在化の研究：
細胞表面で結合したカルシンテニン−１が、立証済みのシナプスマーカータンパク質と同時局在化されている。
海馬（図５Ａ）及び大脳皮質（図示せず）の組織切片の酵素免疫染色は、カルシンテニン−１がシナプス富有領域内で豊富であることを明らかにした。より高い倍率では、神経網（図５Ａのインサート）内の免疫染色の点状の外観が見られ、これは、カルシンテニン−１のシナプス局在化を示唆していた。
【０１３８】
細胞表面関連カルシンテニン−１の亜細胞局在化の詳細な研究を、解離された海馬ニューロンの培養中の免疫螢光による同時局在化によって実施した。Ｅ１７マウスの脳から切開された海馬の細胞懸濁液を、トリプシンでの消化（３７℃で１０分間０．２５％）及び青色Ｇｉｌｓｏｎチップを用いた研和によって調製した。その後、Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．２５ｍｇ／ｍｌのＡｌｂｕｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２ｍＭのグルタミン、及び０．１Ｍのピルビン酸ナトリウムで補足されたＤＭＥＭ中で、酸洗いされたポリ−Ｌ−リシン処理済みカバーガラス又はポリ−Ｌ−リシン処理済みプラスチック皿の上に、細胞を平板固定した。培養を最高４週間、３７℃で５％のＣＯ２を伴う加湿されたインキュベータ内に維持した。
【０１３９】
ＰＢＳ中の４％のパラホルムアルデヒド及び４％のスクロースの中で、３７℃で３０分間細胞を固定した。ＰＢＳで洗い流した後、細胞を、ＰＢＳ中の１０％のウシ胎児血清及び０．１％のグリシンの中で１時間室温で予めインキュベートさせてから、２４〜４８時間４℃でＰＢＳ中の３％のウシ胎児血清内で一次抗体と共にインキュベートさせた。２重標識付け実験のために、一次抗体を合わせてインキュベートした。３回交換したＰＢＳの中で少なくとも３０分ずつ細胞を洗浄した。２次抗原のためには、ＦＩＴＣ接合されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃａｐｐｅｌ）及びＣｙ３接合されたロバ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ）を使用した。抗−Ｇｌｕ Ｒ２での染色のためには、細胞に０．１％のサポニンで浸透性を付与した。
【０１４０】
シナプトフィシン、ＧＡＢＡＡレセプタのα２サブユニット及びＡＭＰＡレセプタのＧｌｕ Ｒ２サブユニットといったような立証済みのシナプスマーカーを、それぞれ、シナプス前末端及びシナプス後膜のためのマーカーとして使用した。ＧＡＢＡＡレセプタサブユニットα２に対する抗体は、Ｊｅａｎ−Ｍａｒｃ Ｆｒｉｔｓｃｈｙによって提供された。シナプトフィシン、ＰＳＤ９５、ＧｌｕＲ１及びＧｌｕＲ２に対する抗原は、それぞれＲｏｃｈｅ， Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ及びＣｈｅｍｉｃｏｎからのものであった。図５、Ｂ−Ｄで実証されているように、カルシンテニン−１免疫反応性は、神経突起束に沿ってパッチ状のパターンを示した。シナプトフィシン（図５Ｂ）及びＧＡＢＡＡレセプタ（図５Ｃ）に対する抗体で、非常に類似した染色パターンが見られた。オーバーレイ内では、シナプトフィシン及びＧＡＢＡＡレセプタに対する抗体で標識された大きい部域の大部分に、少なくとも部分的にカルシンテニン−１免疫反応性が重畳していた。細胞に浸透性を付与することが必要とされ従って、表面露出した及び内部のＡＭＰＡレセプタの両方を染色した、ＧｌｕＲ２の細胞質エピトープに対する市販の抗体を用いて、（図５Ｄ）、カルシンテニン−１免疫反応性のパッチの近くに、そして時としてこれらのパッチを部分的にオーバラップしている大きな免疫反応性パッチが発見された。これらの結果を合わせて考慮すると、カルシンテニン−１のシナプス局在化が実証される。
【０１４１】
例１１：
免疫電子顕微鏡検査によるカルシンテニン−１タンパク質の亜細胞局在化の研究：全長カルシンテニン−１は、シナプス後膜の１成分である。
ＣＮＳニューロン内のカルシンテニン−１の亜細胞局在化を顕示するため、我々は、前包埋及び後包埋免疫電子顕微鏡法を使用した。免疫ＥＭ用の脳組織を調製するために、両性別の８匹のＷｉｓｔａｒ及びＯＦＡ系統の成体ラット（２００〜２５０ｇ）を、メチオファン（メトキシフルラン、Ｐｉｔｍａｎ−Ｍｏｏｒｅ Ｉｎｃ．， ＵＳＡ）で深く麻酔し、まず第１に０．９％の食塩水で１分間、そしてその後ｐＨ７．４の０．１Ｍのリン酸緩衝液中で作り上げられた３．５〜４％のパラホルムアルデヒド、０．０１５〜０．０５％のグルタルアルデヒド及び０．２％のピクリン酸を含む固定剤で、１５〜２５分間上行大動脈を通して灌流させた。その後、頭蓋骨から低温ＰＢ内に脳を取り出し、ビブラトーム上で７０μｍ（前包埋免疫細胞化学で使用される６匹のラット）又は５００μｍの厚みの冠状切片（凍結置換のために使用される２匹のラット）のいずれかをカットした。
【０１４２】
前包埋免疫細胞化学のために、切片を３０％のスクロース中で凍結保護し、液体窒素中で急速に凍結させ、ＰＢ中で解凍した。２０％の正規ヤギ血清（ＮＧＳ：Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ， ＵＳＡ）内での予備インキュベーションの後、２日間４℃で２％のＢＳＡ及び２％のＮＧＳを含有する０．０５ｍＭのトリス緩衝液食塩水ｐＨ７．４（ＴＢＳ）内で作り上げられた一次抗体の中で切片をインキュベートした。免疫金方法のためには、１．４ｎｍの金にカップリングされた１：４０のヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ． Ｓｔｏｎｙ Ｂｒｏｏｋ， ＮＹ）内で一晩、切片をインキュベートさせ、ＰＢＳ中の１％のグルタルアルデヒド中で後固定し、それに続いて、ＨＱＳｉｌｖｅｒキット（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ）で金粒子を銀増強した。ペルオキシダーゼ反応のためには、１％のＮＧＳを含むＴＢＳ中で１：２００に希釈されたビオチニル化されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）中にＲＴで４時間切片をインキュベートし、その後、ＴＢＳ中に１：１００に希釈させたアビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣキット；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）の中で２時間インキュベートした。標準的な３，３′−ジアミノベンチジン四塩酸塩組織染色手順（ＴＢ中０．０５％のＤＡＢ及び０．０１％のＨ２Ｏ２、ｐＨ７．６）を用いて、抗原部位を顕示させた。金−銀及びペルオキシダーゼ反応させた切片を、ＰＢ中の１％の四酸化オスミウム中で後固定し、２％の酢酸ウラニルで染色し、エタノール中で段階的に脱水し、電子顕微鏡のためＤｕｒｃｕｐａｎ ＡＣＭ樹脂（Ｆｌｕｋａ）内でスライドグラス上に平坦包埋させた。
【０１４３】
超薄型切片上での後包埋免疫細胞化学のために、我々は、先に記述された通り（Ｂａｎｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ． １９９３；１１（４）：７７１−８７）、凍結置換及び低温包埋手順を使用した。ビブラトーム切片を、１Ｍのスクロース中で凍結保護し、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ ＭＭ８０Ｅ装置上で凍結させ、−８０℃でメタノール中で脱水し、ＬｅｉｃａＣＳ自動装置を用いてＬｏｗｉｃｒｙｌ ＨＭ２０（Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ Ｗｅｒｋｅ Ｌｏｗｉ ＧｍＢＨ， ドイツ）内に包埋させた。ニッケル格子上に、Ｌｏｗｉｃｒｙｌ 包埋ブロックから厚み８０ｎｍの超薄型切片８０ｎｍを取り上げ、０．１％のＴｒｉｔｏｘ Ｘ−１００を含有するＴＢＳ中の１％のＢＳＡ、０．１％の冷水魚皮ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）及び５％のＮＧＳから成るブロッキング溶液の液滴上で３０分間インキュベートさせた。ブロッキング溶液は又、一次及び二次抗体を希釈させるためにも使用した。一次抗体（１６〜２４μｇ／ｍｌ）の中で一晩格子をインキュベートさせ、その後続いて、１：８０に希釈された１．４ｎｍの金（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）にカップリングされたヤギ抗ウサギＩｇＧの液滴上で２４時間インキュベートさせた。３〜５分間のＨＱキット（Ｎａｎｏｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）での銀増強に先立ち４分間２％のグルタルアルデヒドで抗体を固定させた。その後、切片をまずは飽和した水性酢酸ウラニルで次にクエン酸鉛で電子顕微鏡検査のために対比させた。両面免疫反応のためには、切片を免疫インキュベーションに先立ち２〜３秒エタン酸ナトリウムでエッチングした（Ｍａｔｓｕｂａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １９９６；１８０（２）：４９９−５１０）。
【０１４４】
前包埋及び後包埋免疫−ＥＭは両方共、明確に、カルシンテニン−１が、興奮性及び抑制性シナプスの両方のシナプス後膜内に位置づけされていることを実証した。ペルオキシダーゼで標準付けされた抗体を伴う前包埋免疫ＥＭにより、樹状突起棘、樹状突起幹上及びニューロン細胞体上にあるシナプスのシナプス後膜の中にカルシンテニン−１が位置特定された（図６Ａ−Ｃ）。一部のシナプスにおいては、隣接するシナプス周囲膜の一部分全体にわたっても、カルシンテニン−１免疫反応性が発見された。まれには、樹状突起棘内に綿状の免疫反応性が見い出された。低温で包埋されたラットの海馬の包埋後免疫金染色は、シナプス後膜内のカルシンテニン−１の局在化を確認した（図６、Ｄ−Ｇ）。丸い小嚢及び厚いＰＳＤをもつ非対称シナプス（Ｇｒａｙ， １９５９に従ったＩ型）及び多形性小嚢及び薄いＰＳＤをもつ対称シナプス（２型）は共に、カルシンテニン−１免疫反応性を示し、興奮性及び抑制性シナプスの両方におけるシナプス後膜の成分としてのカルシンテニン−１を確認した。
【０１４５】
（当該例において示されているような）カルシンテニン−１のシナプス後の局在化を考慮すると、カルシンテニン−１の細胞質セグメントのカルシウム結合能力は特に興味深いものとなる。我々の研究は、高親和力及び低親和力のＣａ２＋結合部位の存在についての証拠を提供している。我々は、０．５μＭという低い濃度で、カルシンテニン−１の細胞質ドメインに対するＣａ２＋結合を発見した。従って、カルシンテニン−１の細胞質ドメインは、シナプス後のＣａ２＋の内向きフラックス中に発生する濃度でＣａ２＋を結合させ、このことは、シナプス後のＣａ２＋シグナルのモジュレータとしてのカルシンテニン−１を示唆している。１４の酸性残基の隣接する広がりの中で累積する酸性残基の類似のクラスタ化を示すカルセケストリンの高能力、低親和力Ｃａ２＋結合機能と並行して、カルシンテニン−１の細胞質ドメインは同様に、低親和力Ｃａ２＋結合に関する能力も有する可能性がある。隣接する酸性残基を伴うペプチドのＣａ２＋結合能力は、特異的Ｃａ２＋部位より一般的なカチオン結合能力とリンクされてきた。かかる酸性の広がりをもつタンパク質を比較することにより、ＣＡ２＋結合能力が酸性残基の含有量に正比例することが示唆された（Ｌｕｃｅｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．１９９４；２６９（３７）：２３１１２−９）。Ｘ腺結晶構造解析は、ＣＡ２＋の低親和力結合が、カルセケストリン２量体の酸性Ｃ末端セグメント間へのＣａ２＋の挿入を介して発生することを示唆した（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ． １９９８；５（６）：４７６−８３）。同様にして、カルシンテニン−１は、トランスメンブラン定着により秩序立った平行な配向に保持されるその細胞質部分の間への挿入によりＣＡ２＋を結合することができる。シナプス後膜内のその定着のため、カルシンテニン−１の細胞質ドメインは、シナプス後膜の下に固定されたＣＡ２＋緩衝液を確立する。可動緩衝液とは対照的に、固定緩衝液は、ＣＡ２＋の拡散を制限する（Ｋａｓａｉ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒｓｅｎ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １９９４；１７（３）：９５−１０１）。これらの緩衝液は又、遊離ＣＡ２＋のピーク値を低減させ、ＣＡ２＋の遅延放出により、ＣＡ２＋の上昇を延長させる。固定ＣＡ２＋緩衝液として、カルシンテニン−１は、シナプス下ゾーン内に、ＣＡ２＋を一時的に保持し、その散逸を遅延させることができる。この役割の中で、カルシンテニン−１は、潜在的に、細胞内ＣＡ２＋の過渡的増大がきわめて重要であるシナプスプロセス、例えばＬＴＰ（Ｂｌｉｓｓ及びＣｏｌｌｉｎｇｒｉｄｇｅ， Ｎａｔｕｒｅ． １９９３；３６１（６４０７）：３１−９），ＬＴＤ（Ｌｉｎｄｅｎ及びＣｏｎｎｏｒ， Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９９５；１８：３１９−５７）ならびに樹状突起棘内での同時性検出（Ｚｕｃｋｅｒ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． １９９９；９（３）：３０５−１３）においてモジュレータ要素でありうる。シナプス後ＣＡ２＋過渡現象は、ＣＡ２＋変化の持続時間及び濃度に応じてＬＴＤかＬＴＰのいずれかをひき起こすものと報告されてきた。数秒間のＣＡ２＋の高い上昇は、ＬＴＰを誘発し、��方、約１分というさらに長いタイムスパンの間持続するより低いＣＡ２＋の上昇は、ＬＴＤを誘発することが発見された（Ｍａｌｅｎｋａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ． １９９２；９（１）：１２１−８）。従ってシナプス下空間内のＣＡ２＋緩衝液の有無は、ＣＡ２＋過渡現象の結果がＬＴＰであるかＬＴＤであるかを決定するメカニズムの中で重要な要素でありうる。皮質又は海馬錐体状ニューロンの樹状突起棘内の最近報告された同時性検出メカニズム（Ｋｏｅｓｔｅｒ及びＳａｋｍａｎｎ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ． １９９８；９５（１６）：９５９６−６０１）は、２００ｍｓというタイムウィンドウ内で求心性入力及び逆誤差伝播作用ポテンシャル（ＡＰ）がシナプスに到達した場合、ＣＡ２＋シグナルの非線形和を生成する。求心性入力の後に逆誤差伝播樹状突起ＡＰが続く場合、ＣＡ２＋シグナルの超線形和が見い出される。これとは対照的に、逆誤差伝播ＡＰが求心性入力に先行する場合、ＣＡ２＋の内向きフラックスの減少という結果がもたらされる。ＡＰがＥＰＳＰに後続する場合に起こるＣＡ２＋シグナルの増強は、ＮＭＤＡレセプタのＭｇ２＋ブロックの電圧依存性緩和のせいであるとされてきたが、一方、ＡＰが最初にシナプスに到着した場合のＣＡ２＋の内向きフラックスの減少の根底にあるメカニズムとしてはＣＡ２＋依存性のＮＭＤＡレセプタの不活性化が提案されてきた。（再考のためには、（Ｚｕｃｋｅｒ， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． １９９９；９（３）：３０５−１３）を参照のこと）。両方のプロセスにおいて、シナプス後膜の下の固定緩衝液が、１つの役割を果たすことができた。その高い親和力ＣＡ２＋結合により、カルシンテニン−１は、超線形ＣＡ２＋シグナリングに貢献する可能性があった。緩衝液の飽和が、ＣＡ２＋シグナルの超線形加成性を生成するメカニズムにおける重要な「目に見えない」構成要素であるかもしれないということが示唆されてきた（Ｎｅｈｅｒ， Ｃｅｌｌ Ｃａｌｃｉｕｍ１９９８；２４（５−６）：３４５−５７）。ＮＭＤＡ及び電位依存性ＣＡ２＋チャンネルを通るＣＡ２＋内向きフラックスが一致する場合、ＣＡ２＋緩衝液が第１タイプの内向きフラックスによって飽和されるため、より多くの遊離ＣＡ２＋が生成され得る。シナプス後膜の下のＣＡ２＋の低親和力結合により、カルシンテニン−１はＣＡ２＋過渡現象を延長させることができ、その結果、ＣＡ２＋−依存性ＮＭＤＡ−レセプタ不活性化の増強ひいては、亜線形ＣＡ２＋シグナリングのウィンドウの延長がもたらされた。小脳プルキンエ細胞を用いた最近の研究では、超線形ＣＡ２＋シグナリングは、可動高親和力ＣＡ２＋緩衝液の飽和（解離定数０．３７μＭ）及び不動低親和力緩衝液の貢献のせいであるとされてきた（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ．１９９９；２４（４）：９８９−１００２）。その研究において、内部貯蔵からのＣＡ２＋の内向きフラックス又はＣＡ２＋放出の変調は、プルキンエ細胞のＣＡ２＋応答における超線形性についての主要源としては除外され、むしろ超線形応答は、主として可動高親和力緩衝液の飽和のせいであるとされた。不動低親和力緩衝液は、ＣＡ２＋の存在を延長することにより貢��し、かくして超線形和のタイムウィンドウを広げるものであると示唆された（Ｍａｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ．１９９９；２４（４）：９８９−１００２）。固定されたシナプス位置で１つの分子内で高親和力及び低親和力両方のＣＡ２＋緩衝を組合わせることによって、カルシンテニンは、シナプスの同時性検出メカニズムに対し重要な要素を貢献する可能性があった。
【０１４６】
例１２：
シナプトソームの亜細胞分画及び単離によるカルシンテニン−１の亜細胞局在化の研究：カルシンテニン−１は、シナプス後膜内に位置特定されるが、シナプス後膜肥厚内に定着されていない。
カルシンテニン−１がいわゆるシナプス後膜肥厚（ＰＳＤ）にしっかりと付着させられていたか否かの問題に対処するため、我々は、亜細胞分画を用いてシナプトソームを単離した。亜細胞分画のためには、Ｐｈｅｌａｎ及びＧｏｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋｓのプロトコルを使用した（Ｐｈｅｌａｎ ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋｓ， １９９７）。２００匹の成体のマウス及び２０羽の成体のニワトリの脳をそれぞれ、Ｍｉｎｉ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ抑制物質ミックス（Ｒｏｃｈｅ）で補足された０．３２Ｍのスクロース、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ５体積内で、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを用いて均質化した。Ｐｈｅｌａｎ ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋｓ １９９７によって記述されている通りに細胞下分画を実施した。「神経化学−その実践的アプローチ」第２版（ｅｄｓ． Ｔｕｒｎｅｒ ＡＪ， Ｂａｃｈｅｌａｒｄ ＨＳ）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ １−３８）中。抗体Ｒ６３及びＲ７１でのウェスタンブロット分析のために、１レーンあたり１００μｇの合計タンパク質を投入した。正しい分画を制御するために、我々は、ＡＭＰＡレセプタのＧｌｕＲ１サブユニットのための市販の抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎから）を用いた。ＰＳＤ−９５は、シナプス後膜肥厚の標準的構成要素であり、一方ＧｌｕＲ１は、そのＣ末端上の高親和力部位によるＰＳＤへのしっかりした付着を示すことが実証されてきたＡＭＰＡ型のグルタミン酸塩レセプタの１構成要素である（再考のためにはＯ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８を参照のこと）。ＧｌｕＲ１及びＰＳＤ９５の免疫検出のためには、１レーンあたり５０μｇの合計タンパク質を投入した。
【０１４７】
この分析で、我々は、カルシンテニン−１がシナプス後膜のタンパク質であるものの、ＰＳＤに対する密な結合をもたないということを発見した。図７に示されているように、シナプトソームは、全長カルシンテニン−１及びその分割産物について富化された。シナプトソームの低張性分断及び穏やかな洗剤での処理の結果、カルシンテニン−１の３つの形態全ての可溶化がもたらされた。これとは対照的に、シナプス後膜肥厚の標準的マーカーすなわちＰＳＤ−９５及びＧｌｕＲ１（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏｎ．１９９８；２１（５）：１０６７−７８）は、Ｐｈｅｌａｎ ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ−Ｗｅｅｋｓ １９９７に従うと、粒状画分（Ｐ４及びＰＳＤの中にとどまった（「シナプトソーム、成長円錐及びその亜細胞成分の単離、神経化学−その実践的アプローチ」第２版（ｅｄｓ Ｔｕｒｎｅｒ ＡＪ， Ｂａｃｈｅｌａｒｄ ＨＳ）ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， ｐｐ１−３８中）。ＰＳＤ画分からのカルシンテニン−１の浄化値は、その細胞質セグメントが、ＥＭ内に見られるＰＳＤに対応し、シナプトソームの洗剤−処理の後結果として得られる粒状物質として作業上定義づけされているシナプス下分子足場をしっかり会合されていないことを示している。
【０１４８】
例１３：
免疫電子顕微鏡検査によるカルシンテニン−１の膜内多分割産物の局在化の研究：タンパク質分解性分割を受けたカルシンテニン−１のトランスメンブランフラグメントは、棘シナプスの棘器官及び幹シナプスのシナプス下膜の中に蓄積される。
タンパク質分解性分割の後のカルシンテニン−１のトランスメンブランセグメントの運命を識別するため、我々は、ペルオキシダーゼ及び全接合された２次抗体と共に免疫ＥＭのための膜近接セグメントに対する抗体であるＲ７１を使用した。ペルオキシダーゼでは、棘シナプス内の棘器官の膜を標識づけした（図８，Ａ及びＢ）。一部のシナプスにおいては、シナプス後膜全体にわたってもさらに弱い免疫反応性が見られた（図８Ａ）。同様にして、樹状突起幹及びニューロン細胞体内のシナプスの１画分の下に見られる層状膜の中に、強いシグナルが見られた（図示せず）。比較的感度が低いものとして知られている免疫金では、排他的に棘器官（図８，Ｃ−Ｅ）及び幹シナプスのシナプス下膜に会合した状態でのみ標識付けが見られた。Ｎ末端抗体では、シナプス下膜オルガネラの標識付けは全くみられなかったこと（図６）から、我々は、棘器官が全長カルシンテニン−１もＮ末端分割産物も含有していなかったという結論を下した。従って、シナプトソームのウェスタンブロット（図７）内に見られるカルシンテニン−１の全長ならびに１１５懸濁形態は、シナプス後膜からしか誘導され得ない。これらの結果は、タンパク質分解性分割が細胞表面ですなわちシナプス間隙内で発生しなければならないこと、及び膜貫通断端がその後で内在化されることを示している。
【０１４９】
細胞外セグメント内のタンパク質分解性分割は、カルシンテニン−１の主要細胞外部分の放出を結果としてもたらす。カルシンテニン−１のこの可溶性フラグメントは、脳脊髄液及び眼球の硝子液内でのその蓄積によって実証されるように、細胞外流体の中で展延する。残りの膜貫通断端は、棘器官内に内在化される。その膜トポロジーに起因して、内在化された膜貫通断端のＣＡ２＋結合ドメインは、棘器官の細胞質表面をカバーする。かくして、内在化はシナプス後膜から棘器官の表面まで、カルシンテニン−１で媒介されたＣＡ２＋緩衝液を転座させることができる。
【０１５０】
近年、細胞内貯蔵すなわちＥＲ及び棘器官からのＩＰ３レセプタの活性化を介したＣＡ２＋の放出は、樹状突起棘に対する重要な貢献として識別された（Ｆｉｎｃｈ及びＡｕｇｕｓｔｉｎｅ， Ｎａｔｕｒｅ １９９８；３９６（６７１３）：７５３−６）。ＩＰ３−媒介ＣＡ２＋放出は、２相モードで細胞質ＣＡ２＋により調節される（Ｔａｙｌｏｒ， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ．１９９８；１４３６（１−２）：１９−３３）。放出は、低及び高の両方のＣＡ２＋濃度で低いが、２００〜３００ｎＭの中間濃度では有利な作用を受ける。ＣＡ２＋の上昇を延長させるその能力により、カルシンテニン−１の細胞質ドメインは、ＩＰ３媒介ＣＡ２＋放出に対するＣＡ２＋効果を変調させることができる。
【０１５１】
免疫ＥＭ分析及び亜細胞分画の結果を比較することにより、カルシンテニン−１の全長形態及び両方の分割産物がシナプス後膜内で発生することがわかる（例示については、図９を参照のこと）。これとは対照的に、全長カルシンテニン−１もＮ末端分割産物も、内部膜内に発見されず、膜貫通断端のみが排他的に見い出された。それぞれ間質液及び内部膜に対するＮ末端及びＣ末端分割産物のこの完全な分離は、シナプス間隙内にあるプロテアーゼによるカルシンテニン−１の細胞外分割によってのみ説明がつく。カルシンテニン−１の膜貫通断端についての内在化プロセスの選択性は当然、シナプス後膜から棘器官の表面までのカルシンテニン−１のＣＡ２＋結合ドメインの転座のためのシナプス間隙内のタンパク質分解性分割のレギュレータとしての役割を意味している。
【０１５２】
例１４：
タンパク質分解性分割部位を担持するカルシンテニン−１の領域の決定。
全長カルシンテニン−１の配列内のタンパク質分解性分割部位の場所は、なお今後決定されるべきものである。放出された１１５ｋＤのフラグメント（図２内で灰色でマークされているもの）のトリプシン分割の後に配列決定されたトリプティックペプチドの場所に基づくと、放出されたフラグメントは、少なくとも７４７個のアミノ酸という長さを有するはずである（成熟タンパク質のＮ末端から計数された場合）。その上、分割は、細胞外部分内、すなわちトランスメンブランセグメントのＮ末端側で発生する。かくして、分割部位は、アミノ酸７４６（配列決定されたペプチド番号７の最後のアミノ酸）より後で、アミノ酸８３４（トランスメンブランセグメントの最初のアミノ酸）の前に位置特定されなくてはならない。タンパク質分解性分割部位を担持するペプチドとしてこの要領で定義づけされたカルシンテニン−１の細胞外部分のセグメントは、以下に示されている。
【０１５３】
ニワトリカルシンテニン−１の分割された配列（配列番号２９）；
【化５】
2004508827.tif 000007
ヒトカルシンテニン−１の分割された配列（配列番号３０）；
【化６】
2004508827.tif 000008
【０１５４】
第１のアミノ酸は、カルシンテニン−１の１１５懸濁のフラグメントの配列決定されたペプチド番号７の最後のアミノ酸である（例２及び図２を参照のこと）。最後のアミノ酸は、トランスメンブランセグメントの第１のアミノ酸である（図２参照）。
【０１５５】
カルシンテニン−１を分割するプロテアーゼの性質もカルシンテニン−１の膜貫通断端の選択的内在化を付与するメカニズムも、現在のところわかっていない。神経系の中で、組織プラスミノーゲン活性化因子，トロンビン、ニュートリプシン及びニューロプシンを含めたいくつかの細胞外プロテアーゼが発現されることが報告されてきた。これらのうちの２つ、すなわちｔＰＡ及びニューロプシンについては、ニューロン活性により転写が調節されることが報告された（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｅｕｒｏ−ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ．１９９５；２６（５）：４５５−６４）。これらは、カルシンテニン−１内在化のレギュレータのための興味深い候補である。
【０１５６】
例１５：
成長するニューロン内のカルシンテニン−１の亜細胞局在化の研究：
カルシンテニン−１は、神経発達中の成長する軸索の成長円錐内に見い出される。
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、発達中の神経系の胚芽層のニューロン前駆体細胞内及び発達中の神経系の全ての領域内のニューロンの早期分裂終了段階におけるカルシンテニン−１ ｍＲＮＡの発現が示された。従って我々は、細胞移動及び神経突起成長の期間中のニューロン内でも、カルシンテニン−１の亜細胞局在化を調査した。この例では、Ｅ１８マウス海馬のニューロンを前述の通りに培養した。Ｅ１８マウスの海馬からの解離細胞が低密度で平板固定された場合、その成長プロセスは、最初の１０日の培養中その他の細胞と接触しなかった。従って、これらの培養は、成長する軸索の先行先端部である成長円錐の顕微鏡検査を可能にした。図１０で実証されているように、ニューロン細胞体の表面上そして両方のタイプのプロセスすなわち樹状突起及び軸索上で、カルシンテニン−１免疫反応性が発見された。抗体Ｒ６３（図１０Ａ）及び軸索マーカータンパク質　Ｔａｕ１に対する抗体（図１０Ｂ）との比較によって証明されるように、成長円錐全体にわたり、特に強いカルシンテニン−１免疫反応性が発見された。さらに大きい倍率では、成長円錐内のカルシンテニン−１の免疫反応性は、パッチ様のパターンを示し、成長円錐内のカルシンテニン−１が多数のクラスタ内で発生することを表わしていた。
【０１５７】
この例で提示されている結果は、カルシンテニン−１が、成長するニューロンの表面上で豊富に発現され、かくして、ニューロン移動及び軸索及び樹状突起の形成といったような発達プロセス及び神経組織の外傷の後の神経再生機能において１つの役割を果たす可能性があるということを示している。成長円錐全体にわたって見られる特に強いカルシンテニン−１シグナルは、軸索成長及び誘導といった成長円錐機能にカルシンテニン−１を関与させている。
【０１５８】
例１６：
遺伝子導入マウス技術を用いたＣＮＳニューロン内のカルシンテニン−１の過剰発現
遺伝子導入マウスにおける遺伝子の過剰発現は、ｉｎ ｖｉｖｏでの１つのタンパク質の機能を研究するための比較的直接的な方法である。最初の１連の実験については、Ｔｈｙ−１遺伝子のプロモータの制御下で、ニワトリのカルシンテニン−１を発現させた。Ｔｈｙ−１遺伝子は、神経系内で比較的遅く（その場所に応じて生後４〜１０日）発現される。Ｔｈｙ−１プロモータの制御下でのカルシンテニン−１の発現（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７，Ｃｅｌｌ ５０（３），４４５−５２）は、早期発達段階が影響を受けない、ということを保証している。この点は不可欠である。カルシンテニン−１は、発達中の神経系のいくつかの領域内で比較的早く発見され、かくして、それは細胞移動及び軸索経路探索といった早期発達機能において１つの役割を果たすことができた。晩期開始プロモータを使用することにより、遺伝子導入動物における神経発生の早期段階の混乱を防止することが意図された。しかしながら、調査の目的に応じて、その他のプロモータも同様に使用することができる。
【０１５９】
第１の遺伝子導入マウスについては、我々は、種特異的モノクローナル抗体で選択的に検出される潜在性をもつことを理由として、細胞質セグメント無しでニワトリのカルシンテニン−１に過剰な圧力を加えることを選択した。ニワトリカルシンテニン−１は、マウスのその対応物と８４．７％というアミノ酸配列同一性を示す。かくして、きわめて保存された機能を仮定することができる。
【０１６０】
トランスジーンの構成体は、Ｔｈｙ−１の翻訳された領域がＸｈｏ−Ｉリンカーによって置換された、Ｔｈｙ−１のための発現ベクタに基づいている（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８７，Ｃｅｌｌ５０（３），４４５〜５２）。過剰発現のために使用されるニワトリカルシンテニン−１の長さ２６８２ｂｐの長いＤＮＡフラグメントは、Ａｆｌ ＩＩＩ（開始ＡＴＧの上流側３ｂｐのところ）及びＣａｃ８Ｉ（ＴＡＡ停止コドンの下流側９ｂｐのところ）で消化されたニワトリのｃＤＮＡから誘導される。このフラグメントは、平滑末端連結及びＨｉｎｄ ＩＩＩ消化物で制御された配向によりＸｈｏ−Ｉリンカー部位でＴｈｙ−１発現ベクター内に挿入される。プラスミドは救済され、受精マウス卵母細胞の前核内への注入のために使用されるべきフラグメントは、２つのフランキングＰｖｕ１部位における消化によって切り取られる。９ｋｂの長さの注入フラグメントを１％のアガロースゲル上で分離し、バンドをＱＩＡＥＸＩＩ−キットで精製し、ＤＮＡを注入緩衝液でＱＩＡＥＸ粒子から溶出させる。遺伝子導入マウスの生成は、標準的プロトコルに従って前核注入により達成した。ＰＣＲ及びサザンブロット法によって、トランスジーンの存在について同腹子をスクリーニングした。
【０１６１】
この手順により、ニワトリカルシンテニン−１を過剰発現する３つのマウス系統及びマウスカルシンテニン−１を過剰発現する２系統を発生させた。トランスジーンの発現について、ｍＲＮＡレベルではノーザンブロット法及びｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションにより、又、ＲＰレベルではウェスタンブロット法により確認した。標準的な過剰発現は、およそ６〜１２倍であった。
【０１６２】
同じ方法により、全長カルシンテニン−１を発現する遺伝子導入動物ならびに、カルシンテニン−１のその他の切形形態又はカルシンテニン−１の突然変異を受けた形態（点突然変異又は欠失突然変異）を生成させることができる。Ｔｈｙ−１プロモータの代りに、プルキンエ細胞特異的Ｌ７タンパク質のプロモータ又は大脳辺縁系特異的プロテアーゼニューロプシンといったようなニューロンの特定の亜集団内でのトランスジーン発現を駆動するプロモータを含めたその他のプロモータを使用することも可能である。代替的には、トランスジーン発現を誘発可能なプロモータの制御下に置くこともできる。
【０１６３】
例１７：
真核性（ＨＥＫ２９３）細胞内でのヒトカルシンテニン−１の発現。
ヒトカルシンテニン−１の真核性発現のためには、ヒトカルシンテニン−１の完全ｃＤＮＡを、制限部位Ｈｉｎｄ ＩＩＩ及びＸｂａＩを用いて、ｐｃＤＮＡ３．１Ａ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に連結させた。標準的なリン酸カルシウムトランスフェクション技術を用いて、ＨＥＫ２９３細胞を形質移入するために、プラスミドを使用した。３日後に、細胞上清及び細胞リゼイトを収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、Ｒ６３抗体又はＲ７１抗体を用いてウェスタンブロット法によりこれを分析した。ＨＥＫ２９３細胞の細胞リゼイトの中では、全長ヒトカルシンテニン−１（１５０懸濁）が富化され、一方ＨＥＫ２９３細胞の上清中では、放出されたヒトカルシンテニン−１（１１６懸濁）のみが発見された（図１１）。
【０１６４】
真核細胞内での発現は、代替的に、さまざまな真核性発現ベクター（市販のもの又は自作のもの）で達成することができる。頻繁に使用される真核性発現系は、バキュロウイルスに由来するベクターを使用する。真核性発現のためには、さまざまな真核細胞系統を使用することができる（例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｈ９細胞、ジャーカット細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＶ１細胞又はＳｆ細胞）。ＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞又はバキュロウイルスベースの発現系の使用についての詳細な説明に関しては、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１６４８４号又は国際公報ＷＯ９８／１６６４３号を参照のこと。
【０１６５】
例１８：
真核（ＨＥＫ２９３）細胞におけるカルシンテニン−１の細胞質セグメントの発現
カルシンテニン−１の真核性発現のために、ニワトリカルシンテニン−１の細胞質セグメントのＣ末端にＣ−カッパ軽鎖を含む融合タンパク質を生成した。融合タンパク質がＨＥＫ２９３細胞内で放出タンパク質として発現されるにつれて、ＮｇＣＡＭのシグナルペプチドをニワトリカルシンテニン−１のＮ末端でクローニングさせた。融合タンパク質，シグナルペプチド、細胞質セグメント及びＣ−カッパ軽鎖の３つのＤＮＡフラグメントを、制限部位ＡｐａＬ１及びＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて同一枠内で連結した。その後、制限部位ＸｂＩ及びＢａｍＨＩを用いて、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内に融合タンパク質のｃＤＮＡを連結した。プラスミドを、標準リン酸カルシウムトランスフェクション技術を用いてＨＥＫ２９３細胞内に形質移入した。４日後に、細胞上清を収獲し、１８９．１抗体をカップリングさせたアフニティカラムで融合タンパク質を精製した。
【０１６６】
真核細胞内での発現は、代替的に、さまざまな真核性発現ベクター（市販のもの又は自作のもの）で達成することができる。頻繁に使用される真核性発現系は、バキュロウイルスに由来するベクターを使用する。真核性発現のためには、さまざまな真核細胞系統を使用することができる（例えばＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｈ９細胞、ジャーカット細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＶ１細胞又はＳｆ細胞）。ＣＯＳ細胞又はＣＨＯ細胞又はバキュロウイルスベースの発現系の使用についての詳細な説明に関しては、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／１６４８４号又は国際公報ＷＯ９８／１６６４３号を参照のこと。
【０１６７】
例１９：
ヒトカルシンテニン−２のｃＤＮＡのクローニング。
ヒトカルシンテニン−１のタンパク質配列を用いてプログラムｔｂｌａｓｔｎでＮＣＢＩにおけるハイスループットゲノム配列データベースをサーチした。カルシンテニン系統群の新しい成員の１２の推定的エキソンを、ヒトカルシンテニン−１のＣ末端の７１３個のアミノ酸に相同なペプチドをコードする受入れ番号ＡＣ０１０１８１の配列の中に発見した。
【０１６８】
これらの推定的エキソンが転写された遺伝子に属しているか否かを決定するため、第２の推定的エキソン（Ｓ３ｅＢｆｗｄ：５′−ＣＴＣＣＴＣＴＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＡＣＣＴＣ−３′）（配列番号３１）及び最後の推定的エキソン（Ｓ３ｒｅｖ：５′−ＣＡＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＧＧＣＴＴＣＴＴＣＣ−３′）（配列番号３２）の配列に基づいて、ＰＣＲプライマを設計した。第１鎖ｃＤＮＡを、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ からのＴｈｅｒｍｏ ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲＳｙｓｔｅｍを用いてランダムヘキサマープライマでヒト海馬由来のｐｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， カタログ＃６５７８−１）から合成し、プライマＳ３ｅＢｆｗｄ及びＳ３ｒｅｖでのＰＣＲ反応において鋳型としてこれを使用した。予想した長さのフラグメントが得られ、それをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋内にサブクローニングし、完全に配列決定した。大きなセグメント上で、得られた配列はゲノム配列からの予測されたｃＤＮＡと同一であった。しかしながら、ゲノム配列から予測されなかった付加的なエキソンが発見された。この１７６２塩基対のフラグメントを放射線標識付けし、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリ（λｇｔ１０中のＣｌｏｎｔｅｃｈ ５′ＳＴＲＥＴＣＨ　ＰＬＵＳ，カタログ＃ＨＬ３００３ａ）をスクリーニングするためのプローブとしてこれを使用した。１０個のクローンを単離し、そのインサートをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ＋内にサブクローニングし、完全に配列決定した。クローンを隣接ｃＤＮＡ内に組立てた。Ｎ末端の１１６個のアミノ酸（カルシンテニン−１に対する相同性により）はなお欠落していた。従って、同じｃＤＮＡライブラリを再度スクリーニングするため、カルシンテニン−２の最もＮ末端の４００個の塩基対を表わすＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＮＩフラグメントを使用した。１つのクローンは、１０９個の付加的なＮ末端アミノ酸を含み、もう１つのＨＴＧＳクローン、ＡＣ００９６７１と１００％の同一性を示した。このゲノミッククローンと一緒に、我々は、ヒトカルシンテニン−２の全長ｃＤＮＡを組立てることができた。プライマｈｓＣｓｔ２ａｔｇｆｗｄ（ＡＴＧ開始コドンを含む５′−ＴＧＣＴＧＣＧＡＧＧＡＴＧＣＴＧＣ−３′（配列番号３３））及びｈＣｓ２ｓｅｑ４ｒ（５′−ＡＴＧＡＴＧＣＣＡＧＡＧＧＡＧＧＣ−３′）（配列番号３４）を用いてＰＣＲでＮ末端配列を確認した。
【０１６９】
要約すると、我々は、９５５個のアミノ酸のタンパク質をコードする２８６５ヌクレオチドの単一の長いＯＲＦを発見した。このｃＤＮＡは、カルシンテニン−２の名称でＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＤＤＢＪデータベースに提出され、受入れ番号ＡＪ２７８０１８を受けた。ヒトカルシンテニン−２のタンパク質翻訳は、ヒトカルシンテニン−１に対する５％の同一性と６７％の類似性、そしてヒトカルシンテニン−３に対する５１％の同一性と５９％の類似性を示している。カルシンテニン−１ときわめてよく似た形で、カルシンテニン−２は１９個のアミノ酸の単一のトランスメンブランセグメントをもつＩ型トランスメンブランタンパク質である。カルシンテニン−２の大きなＮ末端部分は、８３４個のアミノ酸で構成され、細胞外空間内にある。Ｃ末端セグメントは、１０２個のアミノ酸という長さをもち、酸性残基がきわめて富化されている。細胞質セグメントの１０２個の残基のうち３３個が酸性である。
【０１７０】
カルシンテニン−１との高度の配列同一性は、カルシンテニン−１内にタンパク質分解性分割部位をも担持するトランスメンブランセグメントに近位の領域内にも同様に見られた。このことは、カルシンテニン−２が同様にこのセグメント内にタンパク質分解性分割部位を担持することを示唆している。
カルシンテニン−１の分割されたセグメントに対応するカルシンテニン−２のセグメントは、以下のアミノ酸配列を有する。
【０１７１】
ヒトカルシンテニン−２の推定的分割済み配列（配列番号３５）：
【化７】
2004508827.tif 000009
【０１７２】
異なるヒト組織内のカルシンテニン−２の発現パターンについての情報を得るために、成体のヒト組織（Ｃａｔ． Ｎｒ． ７７６０−１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡのノーザンブロットを、Ｐｒｉｍｅ−ｉｔ ＩＩランダムプライマ標識づけキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識づけされたヒトカルシンテニン−２の１７６２ｂｐのｃＤＮＡフラグメントでハイブリッド形成させた。５５℃で２時間ハイブリダイゼーションを実施し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で、ハイブリダイゼーションシグナルを分析した。約５．５ｋｂのカルシンテニン−２ｍＲＮＡの単一種が発見された。脳、心臓及び腎臓内に最高のカルシンテニン−２ ｍＲＮＡの発現が観察された。骨格筋の中で低いシグナルが検出された。胎盤、肺及び肝臓には、いかなる写しも発見されなかった。
【０１７３】
例２０：
ヒトカルシンテニン−３のｃＤＮＡのクローニング。
データベース探索において、我々は、ヒト、マウス及びニワトリのカルシンテニン−１とそれぞれ５３．０％，５２．３％及び５４．５％の配列同一性をもつ（表Ｉ）未分類のヒトｃＤＮＡ，ＫＩＡＡ０７２６を発見した。以下の段階で記述するように、我々はＲＴ−ＰＣＲによりこの配列に整合するオーバラップフラグメントを単離した。我々は、ＯＲＦの大部分にわたりＫＩＡＡ０７２６の配列と同一であるもののＮ末端セグメントが異なるｃＤＮＡを発見した。我々はこれをｃＤＮＡカルシンテニン−３と呼び、それをＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＤＤＢＪデータベースに提出し、そこでそれを受入れ番号ＡＪ２７７４６０として登録した。
【０１７４】
ヒトカルシンテニン−３のｃＤＮＡのクローニングは、ＲＴ−ＰＣＲ戦略に基づいていた。第１ラウンドでは、ＫＩＡＡ０７２６のマウスオルソログのｃＤＮＡをクローニングした。成体のマウスのＢＡＬＢ／Ｃ ５′ストレッチプラス全脳ｃＤＮＡライブラリ（ＭＬ３０００ａ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｓ， ＣＡ）の約２×１０６枚の平板をスクリーニングした。ＫＩＡＡ０７２６に対する相同性をもつ２つの独立したクローンを単離した。これらのクローンを詳しく分析したところ、ＯＲＦの５′末端にＫＩＡＡ０７２６との顕著な差異が明らかになった。両クローン共、１２０ｂｐの５′ＵＴＲ，翻訳開始コドン（ＡＴＧ）及びＫＩＡＡ０７２６に対する相同性が全く無いＯＲＦの最初の部分で構成されている。しかしながら、さらに下流側では、クローンの配列は、ＫＩＡＡ０７２６に対する相同性を有している。翻訳コドン（ＡＴＧ）に隣接するヌクレオチドは、Ｋｏｚａｋにより決定されるように、コンセンサス配列ときわめて密に一致している。カルシンテニン−１に対するその相同性のため、マウスゲノムの新規遺伝子は、カルシンテニン−３と呼ばれた。
【０１７５】
シグナルペプチド分析プログラムは、マウスカルシンテニン−３が１９ａａのシグナルペプチドを含有することを予測した。これに対し、同じ分析プログラムで、ＫＩＡＡ０７２６についていかなるシグナルペプチドも予測されなかった。
ヒトＥＳＴデータベースを通してのスクリーンは、マウスカルシンテニン−３と７９．４％のヌクレオチド配列同一性をもつヒトＥＳＴ（発現済み配列タグ：受入れ番号ＡＬ１３３６７７）を明らかにした。ＥＳＴ　ＡＬ１３３６７７の３′領域は、ＫＩＡＡ０７２６のセグメントと同一であり、マウスカルシンテニン−３と高度の類似性を示した。しかしながら、５′領域は、マウスカルシンテニン−３のＯＲＦの５′末端との類似性を示したものの、ＫＩＡＡ０７２６のいずれの配列とも全く無関係であった。ＥＳＴＡＬ１３３６７７の翻訳済みヌクレオチド配列は、マウスカルシンテニン−３と同様、１９ａａの長さのシグナルペプチドを含んでいる。ＥＳＴＡＴ１３３６７７のＯＲＦのシグナルペプチドの同一性は、マウスカルシンテニン−３のシグナルペプチドと６８．４％のアミノ酸配列同一性を示した。これらの特徴に基づき、我々は、ＲＴ−ＰＣＲの産物及びＥＳＴＡＬ１３３６７７から得られた新規の配列がヒトカルシンテニン−３であるという結論を下した。
【０１７６】
ヒトカルシンテニン−３のｍＲＮＡの５′領域についての直接的情報を得るため、ＲＴ−ＰＣＲアプローチが着手されてきた。成体の海馬からのＰｏｌｙ（Ａ）＋で選択されたＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を、逆転写のための鋳型として選択した。オリゴ（ｄＴ）−プライミング法で第１鎖ｃＤＮＡを得た（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ ＲＴ−ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， バーゼル、スイス）。Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）及び以下のプライマを、ＰＣＲ反応を実施するために使用した：
順方向：ｈＳｙｎ２ＵＴＲｆｏｒｌ（ＥＳＴ　ＡＬ１３３６７７の５′末端から開始）（配列番号３６）
【０１７７】
【化８】
2004508827.tif 000010
逆方向：ＲＦＫＩＡ０２Ｂ（ＫＩＡＡ０７２６のＴＡＡ停止コドンの下流側５８ｎｔのところで終結する）
【化９】
2004508827.tif 000011
【０１７８】
このようにして、ヒトカルシンテニン−３の５′ＵＴＲの付加的な２７５ｂｐが加わった完全コーディング配列を得た。ＲＴ−ＰＣＲフラグメントの両方のストランドのＤＮＡ配列決定により、ヒトカルシンテニン−３の５′部分及びＫＩＡＡ０７２６の差異が確認された。ヒトカルシンテニン−３の新規ｃＤＮＡは、１９個のアミノ酸のシグナルペプチド及び２３個のアミノ酸のトランスメンブランドメインから成る９５６個のアミノ酸のタンパク質をコードする２８６８ｂｐのＯＲＦを含有している。カルシンテニン−３のＮ末端細胞外部分は、８４５個のアミノ酸及びＣ末端で構成されており、細胞質部分は８８個のアミノ酸を有する。カルシンテニン−３の細胞質セグメントの８８個のアミノ酸の中でも、１６個は酸性側鎖を有する。
【０１７９】
カルシンテニン−１との高度の配列同一性は、カルシンテニン−１内にタンパク質分解性分割部位を担持するトランスメンブランセグメントに近位の領域内にも同様に見られた。このことは、ＫＴＳ−３が同様にこのセグメント内にタンパク質分解性分割部位を担持することを示唆している。
カルシンテニン−１の分割されたセグメントに対応するカルシンテニン−３のセグメントは、以下のアミノ酸配列を有する：
ヒトカルシンテニン−３の推定的分割済み配列（配列番号３８）：
【０１８０】
【化１０】
2004508827.tif 000012
異なるヒト組織内のカルシンテニン−３ ｍＲＮＡの発現パターンは、市販のヒト多重組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で決定された。プローブとして、Ｐｒｉｍｅ−ｉｔ ＩＩランダムプライマ標識づけキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識づけされたヒトカルシンテニン−３の１．１５ｋｂのｃＤＮＡフラグメントを用いた。４２℃で２時間ハイブリダイゼーションを実施し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で、ハイブリダイゼーションシグナルを分析した。約４ｋｂのカルシンテニン−３ ｍＲＮＡの単一種が明らかにされた（図１２）。カルシンテニン−３ ｍＲＮＡの最高の発現は、脳内に観察された。中庸な強度のシグナルが、腎臓からのｍＲＮＡで発見された。膵臓、肝臓、心臓、胎盤、骨格筋及び肺の中では、低レベルのシグナルが検出された。
【０１８１】
カルシンテニン−３の発現の細胞分解能を、以前に記述された通りに実施したｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションによって決定した（Ｓｃｈａｅｒｅｎ−Ｗｉｅｍｅｒｓ ａｎｄ Ｇｅｒｆｉｎ−Ｍｏｓｅｒ， Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． １９９３；１００（６）：４３１−４）。成体のマウスの脳からの凍結切片上では、灰白質の全部域内で、カルシンテニン−３ ｍＲＮＡが豊富であった。より高い倍率での検査は、ＣＮＳ及びＰＮＳの全ての部域内でニューロン発現パターンを表示した。しかしながら、全てのニューロンがカルシンテニン−３ ｍＲＮＡを発現したわけではなく、発現レベルの著しい差が見られた。カルシンテニン−３の細胞型特異的発現の非常に突出した例が、小脳の中に見られる。図１２に示されているように、小脳プルキンエ細胞は、カルシンテニン−３について非常に強いｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションシグナルを示し、一方、小脳のその他の全ての細胞は、検出可能なレベルのカルシンテニン−３ ｍＲＮＡを発現していない。
【０１８２】
例２１：
カルシンテニン−１の細胞質ゾルセグメントとＡｒｐ２／３複合体の結合
細胞表面タンパク質と細胞骨格の相互作用を扱った科学文献を研究している間に、我々は、全てのカルシンテニン系統群タンパク質（すなわちカルシンテニン−１、カルシンテニン−２及びカルシンテニン−３）の細胞質部分が、少なくとも１つの興味深い保存されたアミノ酸配列モチーフを含有することを発見した。このモチーフは、Ａｒｐ２／３複合体の現在知られている活性化因子の全てとは言わないまでも大部分のＡｒｐ２／３結合ドメイン内に保存されたトリプトファンを含有する酸性アミノ酸モチーフと高い類似性度を示す保存されたトリプトファンを含む酸性アミノ酸配列から成る。保存されたトリプトファンを含有する酸性アミノ酸配列は、カルシンテニン−１の細胞質セグメントの中で２度、すなわち一度はアミノ酸配列‥ＭＤＷＤＤＳ‥、一度は‥ＬＥＷＤＤＳ‥（１文字コードで与えられたアミノ酸配列）で見い出される。カルシンテニン−２の細胞質配列は、１つの‥ＭＤＷＤＤＳ‥と１つの‥ＬＥＷＤＤＳ‥を含み、カルシンテニン−３の細胞質セグメントは、この種の単一モチーフすなわち‥ＬＦＷＤＤＳを含有する。Ａｒｐ２／３複合体は、アクチンフィラメントの成長及び分枝を調節することによりアクチンベースの細胞運動性の調節において中心的役割を果たしている（再考のためには、Ｂｏｒｉｓｙ及びＳｖｉｔｋｉｎａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：１０４−１１２，２０００；Ｐａｎｔａｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１５０２−１５０６；Ｈｉｇｇｓ及びＰｏｌｌａｒｄ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７０：６４９−６７６，２００１；をその中の参考文献を参照のこと）。
【０１８３】
保存されたトリプトファンを伴う類似の酸性モチーフを含有するＡｒｐ２／３活性化因子としては、ヒトＷＡＳＰ（Ｗｉｓｃｏｔｔ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ Ｐｒｏｔｅｉｎの略）、関連ヒトＮ−ＷＡＳＰ，ヒトＳｃａｒ／ＷＡＶＥ１タンパク質及び、それぞれ配列‥ＤＤＥＷＤＤ，‥ＤＤＥＷＥＤ及び‥ＥＶＤＷＥＬ及び‥ＡＤＤＷＥＴ‥を示すコルタクチンがある（ＷＡＳＰ，Ｎ−ＷＡＳＰ及びＳｃａｒ／ＷＡＶＥ１についてはＨｉｇｇｓ及びＰｏｌｌａｒｄ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７０：６４９−６７６，２００１を、そしてコルタクチンについてはＵｒｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２５９−２６６，２００１を参照のこと）。アクチン重合化におけるＡｒｐ２／３結合及びＡｒｐ２／３機能にとっての保存されたトリプトファン及び隣接する酸性アミノ酸の重要性は、コルタクチンの部位特異的突然変異誘発により実証されてきた。（Ｕｒｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２５９−２６６， ２００１）。トリプトファンそして配列‥ＡＤＤＷＥＴ‥内でトリプトファンに先行する２つのアミノ酸残基の両方の部位特異的突然変異誘発の結果、Ａｒｐ２／３結合及びＡｒｐ２／３媒介アクチン重合が喪失した。これら全てのＡｒｐ２／３活性化因子タンパク質は、細胞質内に常在しており、成長因子サイトカインなどといった細胞外調節遺伝子のためのレセプタのトランスメンブランシグナリングによって生成された細胞内シグナルをＡｒｐ２／３複合体の活性化へとリンクさせることが報告されてきた。活性化されたトランスメンブランレセプタからＡｒｐ２／３活性化因子の活性化までのシグナリングカスケード内の極めて重要な中間段階は、Ｒｈｏ系統群の小型ＧＴＰ−結合タンパク質のせいであるとされてきた（再考のためには、Ｔａｋａｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ８１：１５３−２０７，２００１を参照のこと）。活性化されたＡｒｐ２／３複合体はそれ自体、新しいアクチンフィラメントの生成及び既存のアクチンフィラメントの分枝を開始させる（再考のためにはＢｏｒｉｓｙ及びＳｖｉｔｋｉｎａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：１０４−１１２，２０００；Ｐａｎｔａｌｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１５０２−１５０６；Ｈｉｇｇｓ及びｐｏｌｌａｒｄ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７０：６４９−６７６，２００１を参照のこと）。細胞骨格ダイナミクスが増強された結果として、細胞は、糸状仮足及び葉状仮足といったような原形質膜の突出部分を生成しかつ／又は後退させることができる（Ｂｏｒｉｓｙ及びＳｖｉｔｋｉｎａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：１０４−１１２，２０００）成長円錐と呼ばれるニューロンから成長する軸索の成長中の先端部において、こうして生成された増強された活性は、探査活性の増強ならびに軸索成長及び開通活性の増強の形で現われる（Ｈｕ及びＲｅｉｃｈａｒｄｔ， Ｎｅｕｒｏｎ２２，４１９−４２２，１９９９；Ｓｕｔｅｒ及びＦｏｒｓｃｈｅｒ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ８：１０６−１１６，１９９８；Ｄｉｃｋｓｏｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． １１：１０３−１１０，２００１）。中枢神経系のニューロンの樹状突起棘においてアクチンフィラメントのダイナミクスが増強された結果、運動性が増大し、このことはそれ自体、この突起の形態学的形状及び電気特性を調節することができる。その結果として、シナプス前シグナルに対するシナプス後応答は改変される可能性がある（Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２３：５３−５７，２０００；Ｈａｌｐａｉｎ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ２３：１４１−１４６，２０００，Ｍａｔｕｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ２９０：７５４−７５８，２０００；Ｓｃｏｔｔ ａｎｄ Ｌｕｏ， Ｎａｔｕｒｅ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ４：３５９−３６５，２００１）。非ニューロン細胞においては、Ａｒｐ２／３の活性化を介して誘発されたアクチンフィラメントダイナミクスの増強は、結果として、葉状仮足といったような膜突出部分の形成の増大を伴う細胞運動性の増加及び移動活性の増強をもたらす（Ｈｏｌｔ及びＫｏｆｆｅｒ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１：３８−４７，２００１；Ｍｕｌｌｉｎｓ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １２：９１−９６，２０００；Ｐｒｏｋｏｐｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４８：８４３−８４８，２０００）。細胞運動性の改変、葉状仮足の形成及び移動運動の増強を結果としてもたらす細胞表面から細胞骨格へのシグナリングの調節不全は、腫瘍細胞の中で見られる場合、侵襲性成長及び転移能力についての腫瘍細胞の能力を強化する。（Ｒａｄｉｓｋｙ ｅｔ ａｌ． ， Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． １１：８７−９５，２００１；Ｋａｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． １１：１０５−１１９，２００１；Ｃｏｎｄｅｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． １１：１１９−１２８，２００１；Ｐｒｉｃｅ及びＣｏｌｌａｒｄ， Ｓｅｍｉｎａｒｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．１１：１６７−１７３，２００１）。
【０１８４】
トリプトファン残基を含む酸性配列も同様に、リステリアモノサイトゲネスによって生成されるアクチンフィラメントの誘発及び分枝のためにきわめて重大であることが発見された（Ｈｉｇｇｓ及びＰｏｌｌａｒｄ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ７０：６４９−６７６，２００１；Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．１１：１３０−１３５，２００１）。宿主細胞の細胞質ゾルに侵入した後、これらの細菌は、自らの移動運動のために細胞アクチンのメカニズムを使用する。細胞表面タンパク質 ＡｃｔＡは、リステリアモノサイトゲネスの表面上でのアクチンフィラメントの形成を開始させる。細胞自体のＡｒｐ２／３活性化因子ときわめて類似して、リステリアモノサイトゲネスのＡｃｔＡは、酸性残基によりフランキングされたトリプトファンを含有する。それは、アミノ酸配列‥ＤＥＷＥＥ‥を有する（再考のためにはＨｉｇｇｓ及びＰｏｌｌａｒｄ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：６４９−６７６，２００１を参照のこと）。
【０１８５】
現在公表されているＡｒｐ２／３活性化因子のＡｒｐ２／３結合及びＡｒｐ２／３活性化モチーフとの高度の類似性に基づき、我々は、カルシンテニン系統群のタンパク質がＡｒｐ２／３複合体に対する結合及びその機能の調節を介してアクチン細胞骨格ダイナミクスを調節することができるということを推測した。この仮説をテストするため、我々は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）及びカルシンテニン−１の細胞質セグメント（ＧＳＴ−Ｃｓｔｃ）から成る融合タンパク質を生成した。ヒトカルシンテニン−１のＣＯＯＨ−末端ドメイン（Ｃｓｔｃ）を発現させ、Ｅ． ｃｏｌｉ内のＧＳＴ融合タンパク質として精製した。それぞれ順方向及び逆方向プライマとしてオリゴヌクレオチドｈｓＣｓｔ１−８８１ｆ（５′−ＣＧＧＧＡＴＣＣＣＧＣＡＴＣＣＧＧＧＣＣＧＣＡＣＡＴ−３′）（配列番号３９）及びｈｓＣｓｔ１−９８１ｒ（５′ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＡＧＴＡＧＣＴＧＡＧＧＧＴＧＧＡＧ−３′）（配列番号４０）を用いてヒトの脳ｃＤＮＡからのＰＣＲにより、ヒトカルシンテニン−１の細胞質セグメントをコードする領域（Ｃｓｔｃ：残基８８１−９８１）を増強させた。Ｃｓｔｃ ＰＣＲフラグメントをｐＧＥＸ６Ｐ−１プラスミドのＢａｍ Ｈ１／ＥｃｏＲ１部位内にクローニングさせた。結果としてもたらされたｐＧＥＸ−ＧＳＴ−Ｃｓｔｃプラスミドを、Ｅ． ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１内に形質移入し、標準的手順に従って、ＧＳＴ−Ｃｓｔｃタンパク質の発現を誘発した。ＧＳＴ−Ｃｓｔｃ融合タンパク質を、グルタチオン−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて標準的手順に従って精製し、使用するまで４℃に保った。アフニティカラムを生成するため、３．５ｍｇのＧＳＴ−Ｃｓｔｃをバッチインキュベーションにより０．７５ｍｌのグルタチオン−セファロースに結合させた。その後、カラム内にＧＳＴ−Ｃｓｔｃ接合されたグルタチオン−セファロースを詰め、緩衝液Ｂ（以下参照）で平衡化した。以前に記述された手順に従って、ウシの脳抽出物を調製した（Ｕｒｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２５９−２６６，２００１）。簡単に言うと、５０μｇ／ｍｌのフェニルメチルスルフォニルフッ化物、５μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１μｇ／ｍｌのアプロチニンで補足された１００ｍｌの緩衝液Ｑ（２０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ，５ｍＭのＭｇＣｌ２，５ｍＭのＥＧＴＡ及び１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ、ｐＨ８．０）中でＷａｒｉｎｇブレンダを用いて、１００ｇのウシの脳をみじん切りにした。みじん切りにした組織を、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザを用いてさらに均質化し、４℃で６０分間１０，０００ｇでの遠心分離により清澄させた。上清を、緩衝液Ｑで平衡化された１００ｍｌのＱセファロース高速流カラム中のクロマトグラフィに付した。フロースルーを収集し、０．１ｍＭのＡＴＰを補充し、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのトリス、２５ｍＭのＫＣｌ，１ｍＭのＭｇＣｌ２，０．５ｍＭのＥＤＴＡ，１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．５）で平衡化されたＧＳＴ−Ｃｓｔｃグルタチオン−セファロースカラム上に投入した。緩衝液Ｂで洗浄した後、緩衝液Ｂ内で０．２ＭのＫＣｌで溶出を開始し、その後、０．２ＭのＭｇＣｌ２を含有する緩衝液Ｂで第２の溶出を行なった。溶出されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、その後、Ａｒｐ２／３複合体のＡｒｐ３サブユニットに対する市販の抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いてウェスタンブロット法を行なった。図１３に実証されているように、ウシの脳から抽出されたタンパク質の複合混合物の中に含有されたＡｒｐ２／３複合体は、不動化されたＧＳＴ−Ｃｓｔｃ融合タンパク質に結合し、溶出条件を適用した時点で（図１３中の溶出Ａ．）初めて放出された。ＧＳＴ部分のみを含有するカラム上にウシの脳抽出物を通過させた場合、Ａｒｐ２／３の結合は全く観察されなかった。このことはすなわち、観察されたＧＳＴ−Ｃｓｔｃ融合タンパク質に対するＡｒｐ２／３の結合がカルシンテニン−１の細胞質セグメントにより媒介されるということを示している。カルシンテニン−２及びカルシンテニン−３の細胞質部分の中の酸性アミノ酸によりフランキングされた保存されたトリプトファンを含有する類似性の高いセグメントの存在に基づくと、カルシンテニン系統群の全ての成員は結合して、Ａｒｐ２／３活性を調節する。
【０１８６】
カルシンテニン−１の細胞質セグメントとＡｒｐ２／３複合体の間の直接的結合を実証するために、Ａｒｐ２／３複合体を公表済みのプロトコル（Ｅｇｉｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４６：１３１９−１３３２，１９９９）に従って精製した。Ａｒｐ２／３複合体のための親和力リガンドを調製するため、Ｅ． ｃｏｌｉ内でＧＳＴ融合タンパク質としてヒトＮ−ＷＡＳＰのＣＯＯＨ−末端ドメイン（ＶＣＡ）を発現させ、グルタチオン−セファロースカラムを用いて精製した。以前に記述された通りに（Ｅｇｉｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４６：１３１９−１３３２，１９９９），それぞれ順方向及び逆方向プライマとしてオリゴヌクレオチドｐｈＮＷ３９２（５′−ｃｃｇｇａａｔｔｃＣＣＴＴＣＴＧＡＴＧＧＧＧＡＣＣＡＴＣＡＧ−３′）（配列番号４１）及びｐｈＮＷ５０５（５′−ｃｃｇｃｔｃｇａｇＴＣＡＧＴＣＴＴＣＣＣＡＣＴＣＡＴ　ＣＡＴＣ−３′）（配列番号４２）を用いてヒトの脳ｃＤＮＡからＰＣＲにより、ヒトＮ−ＷＡＳＰのＶＣＡセグメントをコードする領域（残基３９２−５０５）を増幅した。Ｎ−ＷＡＳＰＶＣＡをコードするＰＣＲフラグメントをｐＧＥＸ６Ｐ−１プラスミドのＸｈｏＩ部位内にクローニングして、ＰＧＥＸ−ＶＣＡプラスミドを生成した。標準的な誘発及び精製手順に従って、Ｅ． ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１内でＧＳＴ−ＶＣＡタンパク質を発現させた。ＧＳＴ−ＶＣＡ融合タンパク質を、グルタチオン−セファロースカラム上で精製し、供給業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）により推奨されているプロトコルに従って溶出させた。アフニティカラムを生成するために、精製されたＧＳＴ−ＶＣＡを、バッチインキュベーションによりグルタチオン−セファロースビーズに結合させた。ＧＳＴ−ＶＣＡグルタチオンセファロースビーズを、使用するまで４℃で貯蔵した。
【０１８７】
以前に記述された手順の通り、（Ｕｒｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２５９−２６６、２００１）、Ａｒｐ２／３複合体を精製するために親和力マトリクスとして、ＧＳＴ−ＶＣＡグルタチオン−セファロースを使用した。簡単に言うと、５０μｇ／ｍｌのフェニルメチルスルフォニルフッ化物、５μｇ／ｍｌのロイペプチン及び１μｇ／ｍｌのアプロチニンで補足された１００ｍｌの緩衝液Ｑ（２０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＥＧＴＡ及び１ｍＭのジチオトレイトール（ｐＨ８．０）中でＷａｒｉｎｇブレンダを用いて、１００ｇのウシの脳をみじん切りにした。みじん切りにした組織を、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザを用いてさらに均質化し、４℃で６０分間１０，０００ｇでの遠心分離により清澄させた。上清を、緩衝液Ｑで平衡化された１００ｍｌのＱセファロース高速流カラム中のクロマトグラフィに付した。Ａｒｐ２／３複合体を含有するフロースルーを収集し、０．１ｍＭのＡＴＰを補充し、緩衝液Ｂ（５０ｍＭのトリス、２５ｍＭのＫＣｌ，１ｍＭのＭｇＣｌ２，０．５ｍＭのＥＤＴＡ，１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．５）で平衡化されたＧＳＴ−ＶＣＡグルタチオン−セファロースカラム上で分画した。緩衝液Ｂ中の０．２ＫＣｌで洗浄した後、０．２ＭのＭｇＣｌ２を含有する緩衝液ＢでＡｒｐ２／３複合体を溶出させた。次に、タンパク質を緩衝液Ｂに対し透析し、Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ１０カートリッジで濃縮した。濃縮したＡｒｐ２／３複合体を−８０℃で、３０％のグリセロールを含有する緩衝液Ｂ中で貯蔵した。タンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを用いたＢＣＡ方法（Ｐｉｅｒｃｅ タンパク質検定）により決定した。
【０１８８】
カルシンテニン−１の細胞質セグメントがＡｒｐ２／３複合体に結合する能力をもつか否かを調査するため、ＧＳＴ−Ｃｓｔｃ融合タンパク質を、バッチインキュベーションによりグルタチオン−セファロースビーズに結合させた。対照として、Ａｒｐ２／３複合体の立証済みのリガンドである（Ｕｒｕｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ３：２５９−２６６，２００１）ＧＳＴ−ＶＣＡ融合タンパク質及びＧＳＴ単独を、グルタチオン−セファロースに結合させた。グルタチオンセファロースビーズ上に不動化されたＧＳＴ−Ｃｓｔｃ，ＧＳＴ−ＶＣＡ又はＧＳＴ（５μｇ）を緩衝液Ａ（１００μｌの５０ｍＭトリス、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）内の１０ｐｍｏｌの精製済みＡｒｐ２／３複合体と混合させ、回転するホイール上で４℃で２時間インキュベートした。ビーズを３回緩衝液Ａで洗い流し、次にＳＤＳ標本緩衝液内で煮沸した。結果として得た標本緩衝液をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に投入した。電気泳動によって分離したタンパク質を、標準的プロトコルを用いてニトロセルロース上にエレクトロトランスファした。Ａｒｐ２／３複合体を、標準的免疫ブロット法の手順に従ってポリクローナル抗−Ａｒｐ３抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚより購入）で視覚化した。ＧＳＴ−Ｃｓｔｃ及びＧＳＴ−ＶＣＡに対するＡｒｐ２／３の直接的結合については明確な証拠が発見されたが、ＧＳＴ単独については発見されなかった。これらの結果は、カルシンテニン−１の細胞質セグメントとＡｒｐ２／３複合体の間の直接結合相互作用を実証している。
【０１８９】
要約すると、細胞質配列 ．．ＭＤＷＤＤＳ．．及び ．．ＬＥＷＤＤＳ．．はＡｒｐ２／３複合体を結合する能力をもつ。このことはすなわち保存されたトリプトファンを含む部位が配列 ．．ＤＥＷＤＤ、．．ＤＥＷＥＤ、 ．．ＶＤＷＬＥ、．．ＡＤＤＷＥＴ．．、及び ．．ＤＥＷＥＥをそれぞれ内含しているヒトＷＡＳＰ、ヒトＮ−ＷＡＳＰ、ヒトＳｃａｒ／ＷＡＶＥ１タンパク質、コルタクチン及びリステリアモノサイトゲネスのＡｃｔＡタンパク質を含めた現在既知のＡｒｐ２／３活性レギュレータと同じ部位をカルシンテニン−１がＡｒｐ２／３複合体との相互作用のために使用するということを示している（概覧するためには、Ｈｉｇｇｓ及びｐｏｌｌａｒｄ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７０：６４９−６７６，２００１及びその中の参考文献を参照のこと）。かくしてカルシンテニン−１はその細胞質部分を用いてＡｒｐ２／３活性の立証済みレギュレータと競合し、そうすることでＡｒｐ２／３活性の調節に参加する。カルシンテニン−１は、トランスメンブランタンパク質であるＡｒｐ２／３複合体の最初のレギュレータである。これとは対照的に、ＷＡＳＰ、Ｎ−ＷＡＳＰ、Ｓｃａｒ／ＷＡＶＥ１系統群及びコルタクチンを含めた現在既知のＡｒｐ２／３レギュレータは、細胞質タンパク質であり、細胞外シグナルのその他の細胞内媒介物質に依存している。カルシンテニン−１は、その細胞外部分により受取った細胞外シグナルを直接Ａｒｐ２／３複合体に対する活性調節シグナルへと変換することができる。カルシンテニン−２及びカルシンテニン−３の細胞質部分の中に、保存されたトリプトファンを含有するきわめて類似した保存された酸性セグメントが存在することは、カルシンテニン系統群成員の全ての成員が結合し、かくしてＡｒｐ２／３活性を調節するということを表わしている。
【０１９０】
本発明の現在好まれている実施形態を示し記述してきたが、本発明がそれに制限されず、以下のクレームの範囲内で他のさまざまな形で実施され実践され得るものであることをはっきりと理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａは、細胞培養システムの中央区画内に播種されたＥ６ニワトリ脊髄の腹側半分からの解離されたニューロンを示す。
図１Ｂは、６日間の培養後に側方区画内に延びるＥ６ニワトリ脊髄の腹側半分からのニューロンの神経突起を示している。
図１Ｃは、細胞培養表面がテフロン分割装置により３つの区画に細分されている、区画式細胞培養システムを示す。
図１Ｄは、中央及び側方区画の両方の培地の中に放出された３５Ｓ−メチオニンで標識付けされたタンパク質の２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのフルオログラフィを示す。
図１Ｅは、中央及び側方区画の両方の培地の中に放出された３５Ｓ−メチオニンで標識付けされたタンパク質の２次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのフルオログラフィを示す。
【図２】
図２は、カルシンテニン−１のヒト（ｈｓ）、マウス（ｍｍ）及びニワトリ（ｇｇ）ｃＤＮＡ内の単一のＯＲＦから演繹されたアミノ酸配列の整列を示す。
【図３】
図３は、カルシンテニン−１の細胞質部分のカルシウム結合能力の実証を示す。
【図４】
図４Ａは、Ｅ１８マウスの矢状断面内でのカルシンテニン−１ｍＲＮＡの発現パターンを示す。
図４Ｂは、成体のマウスの脳の冠状断面でのカルシンテニン−１ｍＲＮＡの発現パターンを示す。
図４Ｃは、成体のヒト組織内のカルシンテニン−１ｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。
図４Ｄは、ヒト及びニワトリカルシンテニン−１タンパク質のウェスタンブロット分析を示す。
図４Ｅは、カルシンテニン−１タンパク質の概略図を示す。
【図５】
図５Ａは、成体のラットの海馬の断面における免疫組織化学染色によるカルシンテニン−１のシナプス局在化を示す。
図５Ｂは、シナプスマーカーシナプトフィシンとのカルシンテニン−１の同時局在化を示す。
図５Ｃは、シナプスマーカーＧＡＢＡＡレセプタのα２サブユニットとのカルシンテニン−１の同時局在化を示す。
図５Ｄは、ＡＭＰＡレセプタのＧｌｕＲ２サブユニットとのカルシンテニン−１の同時局在化を示す。
【図６】
図６Ａは、棘シナプスのシナプス後膜内のカルシンテニン−１の超微構造局在化を示す。
図６Ｂは、棘シナプスのシナプス後膜内のカルシンテニン−１の超微構造局在化を示す。
図６Ｃは、棘シナプスのシナプス後膜内のカルシンテニン−１の超微構造局在化を示す。
図６Ｄは、棘シナプスのシナプス後膜内のカルシンテニン−１の超微構造局在化を示す。
図６Ｅは、棘シナプスのシナプス後膜内のカルシンテニン−１の超微構造局在化を示す。
図６Ｆは、棘シナプスのシナプス後膜内のカルシンテニン−１の超微構造局在化を示す。
図６Ｇは、棘シナプスのシナプス後膜内のカルシンテニン−１の超微構造局在化を示す。
【図７】
図７は、シナプス後密度内ではなくシナプトソーム内のカルシンテニン−１の局在化を示す。
【図８】
図８Ａは、棘シナプスの棘器官全体にわたるタンパク質分解により分割されたカルシンテニン−１のトランスメンブランフラグメントの超微構造局在化を示す。
図８Ｂは、棘シナプスの棘器官全体にわたるタンパク質分解により分割されたカルシンテニン−１のトランスメンブランフラグメントの超微構造局在化を示す。
図８Ｃは、棘シナプスの棘器官全体にわたるタンパク質分解により分割されたカルシンテニン−１のトランスメンブランフラグメントの超微構造局在化を示す。
図８Ｄは、棘シナプスの棘器官全体にわたるタンパク質分解により分割されたカルシンテニン−１のトランスメンブランフラグメントの超微構造局在化を示す。
図８Ｅは、棘シナプスの棘器官全体にわたるタンパク質分解により分割されたカルシンテニン−１のトランスメンブランフラグメントの超微構造局在化を示す。
【図９】
図９は、カルシンテニン−１のシナプス後Ｃａ２＋結合のプロテアーゼ依存性転座のダイヤグラムを示す。
【図１０】
図１０Ａは、間接的免疫螢光染色による培養された海馬ニューロンの成長円錐内のカルシンテニン−１の局在化を示す。
図１０Ｂは、軸索マーカータンパク質 Ｔａｕ１に対する抗体での間接的免疫螢光染色により、軸索としての図１０Ａに示されたニューロンプロセスの１つを識別している。
図１０Ｃは、さらに高い倍率で、間接的免疫螢光による培養された海馬ニューロンの成長円錐内のカルシンテニン−１の局在化を示す。
【図１１】
図１１は、カルシンテニン−１に対する抗体を用いたウェスタンブロット法による、分割されたカルシンテニンのＮ末端分泌フラグメント及びカルシンテニンの全長形態の産生を示す（Ｒ７１及びＲ６３）。
【図１２】
図１２Ａは、ノーザンブロット法による異なるヒトの器官内のカルシンテニン−３ｍＲＮＡの発現を示す。
図１２Ｂは、成体のマウスの脳を通る水平断面内の細胞解像でのカルシンテニン−３ｍＲＮＡの発現を示す。
図１２Ｃは、成体のマウスの脳を通る側矢状断面内の細胞解像でのカルシンテニン−３ｍＲＮＡの発現を示す。
【図１３】
図１３は、カルシンテニン−１の細胞質部分に対するＡｒｐ２／３複合体の結合を実証している。ウシの脳抽出物を、結合したＧＳＴ−Ｃｓｔ融合タンパク質の入ったカラム上に通過させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、フロースルー分画内、洗浄分画内及び溶出分画内で収集されたタンパク質を分離させ、銀染色（上部図版）で染色した。同じタンパク質分画を同様に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後にニトロセルロース紙へとエレクトロトランスファし、Ａｒｐ２／３複合体のＡｒｐ３サブユニットに対し向けられた市販の抗体を第１の抗体として用いた免疫検出により、Ａｒｐ２／３複合体の存在を視覚化した（下部図版）。
【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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