(57)【要約】本発明は、免疫学およびタンパク質治療薬の分野に関する。この治療用タンパク質は、特にヒトに投与するためのポリペプチドである。このポリペプチドは修飾されており、その結果としてポリペプチドのヒト対象への投与後の免疫応答誘発性が低減されている。したがって、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用した場合にどんな非修飾相当物よりも免疫原性の低い治療用ポリペプチドを開発する方法を提供する。本発明に従って使用される修飾は、たとえば、プロテアーゼ切断部位の導入、異なる分子の結合、または非天然アミノ酸の挿入に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
特定の生物活性を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用した場合に実質的に非免疫原性であるか、または同じ生物活性を有する修飾されていないどんな標的タンパク質またはポリペプチドよりも免疫原性の低い標的タンパク質または標的ポリペプチドを修飾する方法であって、前記方法が、
（ｉ）前記標的タンパク質またはその部分のアミノ酸配列を決定するステップ、
（ｉｉ）標準の方法を使用して、ＭＨＣクラスＩＩ複合体のＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＨＬＡ−ＤＰ分子に結合する潜在能力を備えた、前記配列上の潜在的なＴ細胞エピトープを同定するステップ、
（ｉｉｉ）ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力をもたない、またはそれが低下しているエピトープを有する修飾タンパク質またはポリペプチドを得るために、分子生物学技術による１個または複数のアミノ酸の置換、挿入、もしくは除去、または分子の結合によって、前記Ｔ細胞エピトープ内またはその外側で標的タンパク質を修飾するステップ、および
（ｉｖ）任意選択で、Ｔ細胞エピトープの数が減少しているタンパク質を得るために、ステップ（ｉ）から（ｉｉｉ）を繰り返すステップを含み、
修飾ステップ（ｉｉｉ）が以下の選択肢、すなわち、
（ａ）Ｔ細胞エピトープ領域内に１個または複数の非天然アミノ酸残基を導入するもの、
（ｂ）潜在的なＴ細胞エピトープ内の１箇所または複数の部位に高分子量の分子を共有結合させるもの、
（ｃ）Ｔ細胞エピトープ内でアミノ酸残基を修飾して、Ｔ細胞エピトープペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する原因である、ＨＬＡ−ＤＭ／ＨＬＡ−ＤＯを触媒とする交換反応を予防または縮小するもの、
（ｄ）前記Ｔ細胞エピトープの外側の側方領域中にあるタンパク質を、プロテアーゼによって認識され得るモチーフが存在するか分析し、前記プロテアーゼプロセシング部位を除去するために１個または複数の前記モチーフを修飾するもの、
（ｅ）Ｔ細胞エピトープ領域内の前記Ｔ細胞エピトープの最初と最後のアンカー残基の間に１箇所または複数のプロテアーゼプロセシング部位を導入するもの、
（ｆ）Ｔ細胞エピトープ内もしくはその外側に、ＭＨＣクラスＩＩ分子上に効率よく提示されることのできるペプチド配列の１個または複数のコピーを導入するもの、のうちの少なくとも１つから選択されている方法。
【請求項２】
（ｉｉｉａ）の前記非天然アミノ酸残基が、対応する天然のＬ異性体のＤ異性体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ｉｉｉｂ）の前記高分子量の分子が、炭水化物、脂質、糖脂質、ＰＥＧ、およびこれらの誘導体からなる群から選択されている請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｔ細胞エピトープがグリコシル化されている請求項３に記載の方法。
【請求項５】
グリコシル化が、単一アミノ酸置換によって導入されたＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏを除く任意の天然アミノ酸である）モチーフを介して実現される請求項４に記載の方法。
【請求項６】
選択肢（ｉｉｉｄ）または（ｉｉｉｅ）が選択された請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼがＭＨＣクラスＩＩプロセシング経路に関与している請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記プロテアーゼが表１に規定した群から選択されている請求項７に記載の方法。
【請求項９】
選択肢（ｉｉｉｆ）が選択された請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチド配列の多数のコピーが、各ペプチド単位がプロテアーゼ切断部位の側方に位置している連続した列になって連結されている請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが自己ペプチドである請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記自己ペプチドが、前記標的タンパク質またはポリペプチドのＣおよび／もしくはＮ末端で結合されている請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記自己ペプチド単位が、配列ＡＩＬＥＦＲＡＭＡＱＦＳＲＫＴＤを含む請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
表１のカテプシンのいずれかのプロテアーゼ切断部位を使用する請求項１０から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記標的タンパク質またはポリペプチドが治療用タンパク質またはペプチドである前記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力をもたない、またはそれが低下しているＴ細胞エピトープを有し、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用した場合に実質的に非免疫原性であるか、または同じ生物活性を有する修飾されていないどんな標的タンパク質もしくはポリペプチドよりも免疫原性の低い、特定の生物活性の修飾標的タンパク質もしくはポリペプチドであって、前記修飾が、１個または複数のアミノ酸の置換、挿入、もしくは除去、または分子の結合によって実現され、前記修飾によって、
（ａ）前記Ｔ細胞エピトープ内の１個または複数の非天然アミノ酸残基、および／または
（ｂ）前記の潜在的なＴ細胞エピトープ内の１箇所または複数の部位に結合した１個または複数の高分子量の分子、および／または
（ｃ）Ｔ細胞エピトープペプチドがＣＬＩＰペプチドに代わってＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する原因である、ＨＬＡ−ＤＭ／ＨＬＡ−ＤＯを触媒とする交換反応を予防または縮小するＴ細胞エピトープ内の特定のアミノ酸残基、および／または
（ｄ）前記Ｔ細胞エピトープの外側の側方領域中にある１箇所または複数のプロテアーゼプロセシング部位、および／または
（ｅ）Ｔ細胞エピトープ領域内の前記Ｔ細胞エピトープの最初と最後のアンカー残基間の１箇所または複数のプロテアーゼプロセシング部位、および／または
（ｆ）ＭＨＣクラスＩＩ分子上に効率よく提示されることができる、Ｔ細胞エピトープ内またはその外側のペプチド配列の１個または複数のコピーを有する修飾された分子が生じる修飾標的タンパク質。
【請求項１７】
（ａ）の前記非天然アミノ酸残基が、対応する天然のＬ異性体のＤ異性体である請求項１６に記載の修飾標的タンパク質。
【請求項１８】
（ｂ）の前記高分子量の分子が、炭水化物、脂質、糖脂質、ＰＥＧ、およびこれらの誘導体からなる群から選択されている請求項１６に記載の修飾標的タンパク質。
【請求項１９】
前記Ｔ細胞エピトープが、炭水化物残基に結合した部位を有する請求項１６に記載の修飾標的タンパク質。
【請求項２０】
炭水化物分子が、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏを除く任意の天然アミノ酸である）モチーフを介してＴ細胞エピトープ部位に結合している請求項１９に記載の修飾標的タンパク質。
【請求項２１】
前記Ｔ細胞エピトープ内またはその外側に１箇所または複数のプロテアーゼ部位を有する請求項１６に記載の修飾標的タンパク質。
【請求項２２】
前記プロテアーゼがＭＨＣクラスＩＩプロセシング経路に関与している請求項２１に記載の修飾標的タンパク質。
【請求項２３】
前記プロテアーゼが表１に規定した群から選択されている請求項２２に記載の修飾標的タンパク質。
【請求項２４】
前記ペプチド配列の多数のコピーが、各ペプチド単位がプロテアーゼ切断部位の側方に位置している連続した列になって連結されている請求項１６に記載の修飾標的タンパク質。
【請求項２５】
前記ペプチドが自己ペプチドである請求項２４に記載の修飾標的タンパク質。
【請求項２６】
前記自己ペプチドが、前記標的タンパク質またはポリペプチドのＣおよび／もしくはＮ末端で結合されている請求項２５に記載の修飾標的タンパク質。
【請求項２７】
前記自己ペプチド単位が、配列ＡＩＬＥＦＲＡＭＡＱＦＳＲＫＴＤを含む請求項２５または２６に記載の修飾標的タンパク質。
【請求項２８】
表１のカテプシンのいずれかのプロテアーゼ切断部位を使用する請求項２４から２７のいずれかに記載の修飾標的タンパク質。
【請求項２９】
前記標的タンパク質またはポリペプチドが治療用タンパク質またはペプチドである請求項１６から２８のいずれかに記載の修飾標的タンパク質。
【請求項３０】
任意選択の薬剤として許容される担体、賦形剤、または希釈剤と共に請求項２９に記載のタンパク質を含む薬剤組成物。
【請求項３１】
医薬を製造するための請求項２９に記載のタンパク質の使用。
【請求項３２】
請求項１６から２９のいずれかに記載の標的タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学およびタンパク質治療の分野に関する。その治療用タンパク質は、特にヒトに投与するためのポリペプチドである。このポリペプチドは、修飾されており、この修飾の結果として、ポリペプチドのヒト対象への投与における免疫応答誘発性が低減される。したがって、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用した場合にどんな非修飾相当物よりも免疫原性の低い治療用ポリペプチドを開発する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
治療用タンパク質に対する不必要な免疫反応によって治療用タンパク質の効果が制限される例は数多い。数種のマウスモノクローナル抗体は、いくつかのヒトの疾患の状況で治療法としての見込みを示したが、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答がかなりの度合で誘発されたために失敗した症例もある［Ｓｃｈｒｏｆｆ，Ｒ．Ｗ．他（１９８５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５：８７９−８８５；Ｓｈａｗｌｅｒ，Ｄ．Ｌ．他（１９８５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：１５３０−１５３５］。モノクローナル抗体については、ＨＡＭＡ応答を低減させようと、いくつかの技術が開発されている［ＷＯ  ８９／０９６２２；ＥＰ  ０２３９４００；ＥＰ  ０４３８３１０；ＷＯ  ９１／０６６６７］。これらの組換えＤＮＡ手法では、一般に、最終的な抗体構築物中のマウスの遺伝情報を低減する一方で、その最終構築物中のヒトの遺伝情報を増加させている。それにもかかわらず、得られた「ヒト化」抗体が依然として患者に免疫応答を誘発した症例もある［Ｉｓｓａｃｓ  Ｊ．Ｄ．（１９９０）Ｓｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４９、４５６；Ｒｅｂｅｌｌｏ，Ｐ．Ｒ．他（１９９９）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６８：１４１７−１４２０］。
【０００３】
免疫応答を発動し得る治療剤として投与されるポリペプチド分子のクラスは、抗体だけではない。ヒトに由来し、しかもヒト体内に存在するのと同じアミノ酸配列を有するタンパク質でさえ、ヒトにおいて免疫応答を引き起こしかねない。顕著な例としては、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子［Ｗａｄｈｗａ，Ｍ．他（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５：１３５３−１３６１］やインターフェロンα２［Ｒｕｓｓｏ，Ｄ．他（１９９６）Ｂｒｉ．Ｊ．Ｈａｅｍ．９４：３００−３０５；Ｓｔｅｉｎ，Ｒ．他（１９８８）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１８：１４０９−１４１３］の治療上の使用が挙げられる。
【０００４】
治療用タンパク質に対する免疫応答は、ＭＨＣクラスＩＩペプチド提示経路を経て進行する。この経路では、外来タンパク質が取り込まれ、プロセシングを受けて、ＤＲ、ＤＱ、またはＤＰ型のＭＨＣクラスＩＩ分子と共同して提示される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、特にマクロファージや樹状細胞など、専門の抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって発現される。Ｔ細胞表面上の同族のＴ細胞レセプターがＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体を結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）し、ならびにＣＤ４分子など、ある種の他の補助レセプターが交差結合することによって、Ｔ細胞内の活性化状態が引き起こされる。活性化によってサイトカインが放出されて、Ｂ細胞などの他のリンパ球が抗体を産生するようにさらに活性化され、または完全な細胞免疫応答としてキラーＴ細胞が活性化される。
【０００５】
したがって、免疫応答誘導の主たる要因は、タンパク質内に、ＭＨＣクラスＩＩ分子上での提示を介してＴ細胞の活性を刺激し得るペプチド（いわゆる「Ｔ細胞エピトープ」）が存在することである。このような潜在するＴ細胞エピトープは、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力を備えた任意のアミノ酸残基配列であると一般に定義される。このようなＴ細胞エピトープを測定すると、ＭＨＣ結合を確立することができる。暗黙にではあるが、「Ｔ細胞エピトープ」は、ＭＨＣ分子に結合する際にＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）によって認識され、かつ少なくとも原理としては、ＴＣＲに結合してこれらＴ細胞の活性化を引き起こし、Ｔ細胞応答を促進し得るエピトープを意味する。しかし、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することがわかっているある種のペプチドは、最終タンパク質を投与した生物体内で「自己」であると認識されるので、タンパク質配列中に保持されていてもよいと通常は理解されている。
【０００６】
前述のことから、治療用タンパク質の免疫原性が、免疫系がこの治療用タンパク質に由来するペプチドに特異的なＴ細胞クローンを選択し増殖させる能力に強く左右されることは明らかである。特異的なＴ細胞クローンの活性化は複雑な事象ではあるが、複雑な諸事象からなる経路の終わりに起こる一事象である。この経路は、次のいくつかの鍵となるステップ、すなわち、
１）抗原提示細胞によってタンパク質が取り込まれるステップ、
２）抗原提示細胞中のプロテアーゼによるタンパク質分解によってタンパク質がプロセシングを受けるステップ、
３）タンパク質から切除されたペプチドが、細胞表面上にこれらを提示することのできるＭＨＣ分子に結合するステップ、
４）ペプチドＭＨＣ複合体が細胞表面に移送されるステップによって特徴付けることができる。
【０００７】
本発明は、治療用タンパク質内に免疫原性のあるＭＨＣクラスＩＩエピトープが必然的に存在することによって浮上する問題の解決策に関する。全体的な側面では、本発明は、ペプチド配列が上述の経路から出現し得る能力を妨害することに関するものであり、特に、免疫原性プロフィールの改善された治療用タンパク質の開発において上述のステップ２〜４を操作することのできる方法を提供するものである。
【０００８】
当技術分野では、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することのできる合成ペプチドを同定する操作手順がある。そのようなペプチドは、すべての状況下で（特に、プロセシング経路または他の現象のためにｉｎ  ｖｉｖｏでは）Ｔ細胞エピトープとして機能するとはいえない。Ｔ細胞エピトープを同定することは、エピトープを除去する最初のステップであるとみなすことができる。実験によって決定されたＴ細胞エピトープの中に認識された配列モチーフがないか走査するなどのコンピュータ技術、またはコンピュータ技術を使用してＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドを予測することが発表されている。ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７は、ヒトＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのサブセットを結合する可能性を秘めたポリペプチド配列を同定するためのコンピュータによるスレッディング手法（computational threading approaches）を教示している。これらの教示では、ヒト由来および非ヒト由来の治療用抗体タンパク質または非抗体タンパク質の一次配列内での妥当なアミノ酸置換を用いることによって、予測されるＴ細胞エピトープが除去される。このような手順は、アミノ酸置換によって修飾ポリペプチド配列を得るものであり、エピトープを除去する他の修飾様式の使用を見越して述べていない。
【０００９】
合成ペプチドと組み合わせた、ヒトまたは実験動物の末梢血試料から得られたＴ細胞クローンと結合し得る組換えＭＨＣ分子の可溶性複合体を活用する他の技術も当技術分野で使用されており［Ｋｅｒｎ，Ｆ．他（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：９７５−９７８；Ｋｗｏｋ，Ｗ．Ｗ．他（２００１）ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：５８３−５８８］、エピトープ同定戦略にも同等に活用することができるが、これらもエピトープを除去する手段を提供するものでない。
【００１０】
米国特許第５，８３３，９９１号（Ｍａｓｕｃｃｉ）は、グリシン含有配列区域を活用して組換えタンパク質に対する望ましくない免疫応答を妨げる方法を提供しているが、この手法は、免疫学的に不活性（ｉｎｈｅｒｔ）な種を治療用タンパク質、たとえばＰＥＧなどの重合体分子に付加する広く実施されている方法に類似しており、当技術分野で集約的に記載されている［たとえば、米国特許第５，３４９，００１号およびＷＯ９０／１３５９０の概要を参照されたい］。
【００１１】
本発明の理解の過程が明瞭になるよう、本明細書で「免疫プロセシング経路」と称するものの主要な構成成分をここで述べる。
【００１２】
ＭＨＣクラスＩＩ系
ＭＨＣクラスＩＩ分子は、ヘルパーＴ細胞の選択および活性化に中心的な役割を果たす高多型性タンパク質グループである。ヒト白血球抗原グループのＤＲ（ＨＬＡ−ＤＲ）は、このタンパク質グループの優勢なアイソタイプであるが、アイソタイプのＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＰも同様の機能を果たし、これらは生物学的に関連性がある。ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲ分子は、α鎖とβ鎖でできており、これらのＣ末端が細胞膜を貫通している。各ヘテロ二量体がアミノ酸９〜２０個の間の様々な長さのペプチドに結合するリガンド結合領域を有するが、結合溝に収容できるのは最高１１個のアミノ酸である。リガンド結合領域は、α鎖の１〜８５個のアミノ酸およびβ鎖の１〜９４個のアミノ酸で構成される。ＤＱ分子は、相同構造を有することが最近示されており、ＤＰファミリーのタンパク質も非常に類似していると予想される。ヒトでは、およそ７０種類の異なるＤＲのアイソタイプのアロタイプが知られており、ＤＱについては３０種類の異なるアロタイプが、またＤＰについては４７種類の異なるアロタイプが知られている。各個人は、２〜４個のＤＲ対立遺伝子、２個のＤＱ対立遺伝子、および２個のＤＰ対立遺伝子を有する。いくつかのＤＲ分子の構造が解明されており、その構造は、ペプチドの疎水性残基（ポケット残基）を結合するいくつかの疎水性ポケットを有する、末端の開いたペプチド結合溝である［Ｂｒｏｗｎ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９９３）３６４：３３；Ｓｔｅｒｎ他（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：２１５］。クラスＩＩ分子の様々なアロタイプの識別手段になる（ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ）多型は、ペプチド結合溝内のペプチド結合表面の多様性が高いことの一因であり、これによって、集団レベルでは、外来タンパク質を認識し、病原生物体に対する免疫応答を発動する能力に関して最大限の柔軟性が保証される。
【００１３】
タンパク質分解処理
タンパク質抗原は、様々な哺乳動物細胞によって取り込まれ、プロセシングを受けるが、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現しているＡＰＣは、これを特に効率よく行うことができる。抗原は、レセプター介在性のエンドサイトーシス、食作用、大食作用（ｍａｃｒｏｐｉｎｏｃｙｔｏｓｉｓ）、自食作用など、様々な機序によるエンドサイトーシス経路に入り得る。そうした抗原が、酸性でタンパク分解活性のあるエンドサイトーシス小胞中で分解される。この経路には異なる多数のプロテアーゼが関与しており、これらの多くはまだ特徴付けられていない。エンドサイトーシス小胞は、徐々に特性が変化し、より酸性になり、より高いタンパク分解活性をもつようになる。抗原は、段階を踏んで分解され、最も敏感な、または最も露出された区域が最初に攻撃される。
【００１４】
多くの異なるプロテアーゼが抗原提示細胞中のエンドサイトーシス小胞中で同定されている。これらのタンパク質の大部分は、哺乳動物の他のタンパク分解過程でも見られるので、十分に特徴付けられているものもある。Ｂ細胞および樹状細胞（dentritic cells）では、カテプシンＳが重要な役割を担っており、胸腺内皮細胞ではそれがカテプシンＬであり、マクロファージではカテプシンＦである。
【００１５】
カテプシンは、抗原提示に加えて種々の生理学的過程に関与しているパパインファミリーのシステインプロテアーゼである。カテプシンは、糖タンパク質であり、活性部位中に不可欠なシステイン残基を含んでいるが、基質特異性およびｐＨの安定性を含むいくつかの酵素特性に違いがある。同定されているカテプシンには、発現が遍在しており、「ハウスキーピング」の役割を負っているかもしれないものがある一方で、カテプシンＳのように、発現する組織が限られており、より特異な機能を備えているかもしれないものもある。
【００１６】
カテプシンＳ、Ｌ、およびＦに加え、抗原の分解に関与している他のいくつかのカテプシンが同定されている。これらは、カテプシンＢ、カテプシンＨ、カテプシンＤ、およびカテプシンＥであり、潜在的にカテプシンＺ、Ｖ、およびＫもある。種々のカテプシンにとっての最適ｐＨは異なるので、初期エンドソーム中でより活性がありそうなものもあれば、抗原プロセシングのより後の時期に役割を担うものもある。結果として、タンパク質断片の集団は、プロセシング経路を通して様々に変化するが、個々の異なるＡＰＣ中にも異なる範囲のペプチドが存在しているかもしれない。カテプシンに加え、Ｂ細胞によって取り込まれた抗原がプロセシングされる際に決定的な役割を担う、アスパラギンエンドペプチダーゼなどの他のプロテアーゼが抗原の分解に関与し得る場合もある。
【００１７】
ＭＨＣペプチド複合体の形成
抗原分解経路を経て、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＨＬＡ−ＤＰ分子の結合溝の中にはまり込む潜在能力を有するペプチドが出現する。ペプチドをＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＨＬＡ−ＤＰ分子に結合させる目的で、結合溝からＣＬＩＰ（クラスＩＩ結合Ｉｉペプチド）と呼ばれるペプチドを除去する必要がある。ＣＬＩＰは、標的としてＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、およびＤＰを小胞体からエンドサイトーシス小胞に送り込む、分子シャペロンのＩｉタンパク質に由来するペプチドである。Ｉｉは、（Ｃ末端）三量体形成ドメインを含んでいるので、九量体の複合体が形成される。Ｉｉの細胞質ドメインは、この複合体を、標的としてゴルジ体を通してエンドサイトーシス経路に送り込むシグナル配列を含む。ここで、Ｉｉ分子が数段階で分解される。まず、三量体形成ドメインが非システインプロテアーゼによって切り離されると、九量体が解離してＤＲα−ＤＲβ−ＩｉＰ２２複合体が遊離する。Ｃｙｓプロテアーゼは、ＣＬＩＰ領域のＣ末端を切断し、それによって２個の嵩高な炭水化物が除去され、ＤＲα−ＤＲβ−ＩｉＰ１０が遊離する。最後に、ＩｉがＣＬＩＰペプチドのＮ末端で切断されて、ＤＲα−ＤＲβ−ＣＬＩＰが遊離する。このＣＬＩＰペプチドは、エンドソーム中に存在する他のペプチドと交換することができる。
【００１８】
ＨＬＡ−ＤＲに結合しているペプチドの交換反応では、ＭＨＣクラスＩＩによってコードされている酵素であるＨＬＡ−ＤＭと名付けられた分子が、ＣＬＩＰペプチドおよびＤＲα−ＤＲβに低い親和性で結合している他のペプチドを、プロセシングを受けた抗原由来のより安定に結合するペプチドと交換するのを触媒することにより重要な役割を担っている［Ｂｕｓｃｈ他、（２０００）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２、９９−１０６で総説されている］。ＨＬＡ−ＤＭは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのペプチドの精製ＨＬＡ−ＤＲへの交換反応の動力学に大きな影響を及ぼすものであり、ある特定のペプチドの放出を効率よく刺激する。エンドソーム中のＨＬＡ−ＤＭおよびＨＬＡ−ＤＲの化学量論は、１：５〜１：１２であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＤＭのターンオーバーは、約３〜１２／分である。ＨＬＡ−ＤＭは、露出した疎水性領域および電荷残基を介してＨＬＡ−ＤＲ分子と相互に作用する。相互作用の最も起こりやすい部位が、ＨＬＡ−ＤＭの結晶構造モデル上で提示されている［Ｍｏｓｙａｋ他、（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９：３７７−３８３］。ＨＬＡ−ＤＭは、ペプチドが低い融和性で結合しているＨＬＡ−ＤＲ複合体に優先的に結合する。ＨＬＡ−ＤＭは、これに加えて、不安定であり、ＨＬＡ−ＤＭなしでは凝集しそうな空のＨＬＡ−ＤＲ二量体にも結合することができる。ＨＬＡ−ＤＭが結合することによって、ペプチドが緩く結合しているか、またはペプチドが少しも結合していないＨＬＡ−ＤＲ二量体の「空の状態」が安定になる。この方法でＨＬＡ−ＤＲの結合溝を開けておくと、この溝の中で結合をかけてペプチドを競合させることができる。ペプチドの交換は、効率は有意に低下するものの、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＨＬＡ−ＤＭなしで行うこともできる。ＣＬＩＰペプチドのＮ末端ドメインは、結合溝の外側で、ある種のＨＬＡ−ＤＲアロタイプと相互に作用し合うことができ、それによってＣＬＩＰペプチドが放出される可能性のより高い高次構造が安定になる。ＨＬＡ−ＤＭの作用は、ＨＬＡ−ＤＲ複合体を原形質膜に輸送する絶対的な必要条件がないことにもある。ＨＬＡ−ＤＭなしでは、そのまま結合している自己ペプチドのＣＬＩＰペプチドを有するクラスＩＩ分子によって、細胞表面への進路がつくられる。
【００１９】
ＨＬＡ−ＤＭは、酸性のｐＨでの活性が最大であり、したがって主にタンパク分解性エンドソーム（ＭＩＩＣと呼ばれる）中で活性である。酸性のＭＩＩＣ中では、ＨＬＡ−ＤＭは、ＨＬＡ−ＤＲの抗原結合溝中でペプチドが安定に結合した後に放出されることになる。あるいは、ＨＬＡ−ＤＭは、ＨＬＡ−ＤＲ複合体と共に細胞表面に同時輸送（ｃｏ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）され、細胞表面で中性のｐＨにより急速な放出がもたらされる。実際、細胞表面では少量のＨＬＡ−ＤＭを検出することができ、そこでＨＬＡ−ＤＭが機能的な役割を負っているかもしれない［Ａｒｎｄｔ他（２０００）、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９：６、１２４１−１２５１］。その後、リソソームターゲッティングシグナルを含むＨＬＡ−ＤＭは、直ちに内部移行し、ＭＩＩＣに送り込まれる。
【００２０】
ＨＬＡ−ＤＯと名付けられた、ＭＨＣクラスＩＩにコードされているタンパク質は、調節機能を備えており［ｖａｎ  Ｈａｍ他、（２０００）、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ．５１、７６５−７７０で総説されている］、ＨＬＡ−ＤＭ活性をｐＨ依存的に阻害する［ｖａｎ  Ｈａｍ他（１９９７）、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７、９５０−９５７］。ＨＬＡ−ＤＭは、ｐＨ５で至適活性があるが、ｐＨ６でも活性である。ｐＨ６でＨＬＡ−ＤＯが結合すると、ＨＬＡ−ＤＭの活性が無効になる。すなわち、ＨＬＡ−ＤＯは、ＨＬＡ−ＤＭ活性のためのｐＨセンサーとして働き、初期エンドソーム中ではＨＬＡ−ＤＭ活性を阻害するが、リソソームのｐＨでは活性になるようにする。実際、ＨＬＡ−ＤＯ-細胞中では、その時点では完全にプロセシングを受けていない長いペプチドを載せたＨＬＡ−ＤＲを見ることができ、ＨＬＡ−ＤＯ+細胞中では、このようなペプチドはＨＬＡ−ＤＲに結合していない。
【００２１】
ＨＬＡ−ＤＭは、すべてのＡＰＣ中で発現され、ＨＬＡ−ＤＯは、主にＢ細胞中に見られる。このことにより、Ｂ細胞レセプターを介する取り込みを通じて内部移行した抗原に由来するエピトープの提示を特異的に刺激する手段であることが提示されている。抗体によって結合された抗原は、Ｂ細胞によるエンドサイトーシスを受けるとき、直ちにＭＩＩＣ、すなわち後期タンパク質プロセシング小胞に輸送される。ｐＨが酸性であるためにＨＬＡ−ＤＯがこのような区画の中で機能していないので、こうした抗原から切り出されたペプチドは、直ちにＨＬＡ−ＤＲに結合する。初期エンドソーム、すなわちｐＨのせいでＨＬＡ−ＤＯによってＨＬＡ−ＤＭ機能が抑制されるエンドソーム中で、レセプター非介在性エンドサイトーシスによって取り込まれた抗原から生成されたペプチドは、ＨＬＡ−ＤＲに結合しないように妨げられる。［ｖａｎ  Ｈａｍ他（２０００）、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １９１：７、１１２７−１１３６］。
【００２２】
ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、およびＤＰ二量体の結合溝は、抗原性ペプチドのアミノ酸がその中に拘束され得るいくつかのポケットを含む。そのようなポケットの中に拘束され得るいわゆるペプチドアンカー残基は、ペプチドがＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、およびＤＰに結合するための主な決定基である。ＭＨＣへの結合は、競合的な過程であり、親和性の高いペプチドは、低親和性ペプチドと競合してＡＰＣ表面での提示を勝ち取ることが知られている。［Ａｄｏｒｎｉ  Ｌ．他（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １６８：２０９１；Ｉｉ．Ｗ．他（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：９４３］。いくつかのペプチドについては、有効に不可逆的結合反応を構成するほど親和性が高い［Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ａ．他（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：２４９］。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
上で示したように、またその結果として、治療上価値があるが元来免疫原性のある任意のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質から、任意の所与のＴ細胞エピトープを同定し、かつその有効性を除去もしくは少なくとも低減することが望ましいとされてきた。本発明の目的は、タンパク質が治療用の分子として投与された際に必然的なＴ細胞エピトープの存在によってそれに対する免疫原性の応答がもたらされずに済む方式を提供することである。したがって、ここでは、治療用タンパク質の潜在的な免疫原性を除去または改良しようとする主題の範囲内で方法の選択肢が多数提供される。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
要約すると、本発明は以下の点に関する。
・ペプチドのＭＨＣクラスＩＩリガンドとして働くことのできる能力が修飾によって無効になった修飾ポリペプチド。
・ＭＨＣクラスＩＩ経路によって免疫系に提示される能力が低減された修飾ポリペプチド。
・ｉｎ  ｖｉｖｏで使用する場合に実質的に非免疫原性であるか、または同じ生物活性を有する任意の非修飾ポリペプチドよりも免疫原性が低い修飾ポリペプチド。
・修飾が、ポリペプチド鎖内の特定のアミノ酸残基をそれぞれのＤ異性体に置換するものである、そのように修飾されたポリペプチド。
・修飾が化学基を共有結合させるものである、そのように修飾されたポリペプチド。
・修飾が、ポリペプチドの翻訳後修飾を指示することのできるシグナル配列を適切な宿主に導入し、翻訳後修飾によってポリペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子に関連して提示されないようにするものである、そのように修飾されたポリペプチド。
・修飾が、ポリペプチドの翻訳後修飾を指示することのできるシグナル配列を適切な宿主に導入し、翻訳後修飾によってポリペプチドがＭＨＣクラスＩＩ分子と関連して提示されないようにするものである、そのように修飾されたポリペプチド。
・前記の免疫原性の喪失が、アミノ酸の置換、付加、または除去によって実現され、そのアミノ酸配列の変更が、非修飾ポリペプチド中のＨＭＣクラスＩＩタンパク分解性経路のプロテアーゼによる切断を受けやすい位置で行われる、そのように規定されたポリペプチド。
・前記の免疫原性の喪失が、アミノ酸の置換、付加、または除去によって実現され、そのアミノ酸配列の変更が、非修飾ポリペプチドがＭＨＣクラスＩＩタンパク分解性経路のプロテアーゼによって切断されないままになる位置で行われる、そのように規定されたポリペプチド。
・前記の免疫原性の喪失が、アミノ酸の置換、付加、または除去によって実現され、そのアミノ酸配列の変更が行われると、ＭＨＣクラスＩＩタンパク分解性経路のプロテアーゼに対する新しい切断部位が導入される、そのように規定されたポリペプチド。
・前記の免疫原性の喪失が、アミノ酸の置換、付加、または除去によって実現され、そのアミノ酸配列の変更が、非修飾ポリペプチド中のＴ細胞エピトープの位置で行われ、またこの変更によって、Ｔ細胞エピトープが、ペプチドが切断されるために、ＭＨＣクラスＩＩによる提示に向けたプロセシング経路を経て生存できなくなる、そのように規定されたポリペプチド。
・前記の免疫原性の喪失が、アミノ酸の置換、付加、または除去によって実現され、そのアミノ酸配列の変更が、非修飾ポリペプチド中のＴ細胞エピトープの位置で行われ、またこの変更によって、Ｔ細胞エピトープが、Ｉｉとの相互作用が損なわれるために、ＭＨＣクラスＩＩによる提示に向けたプロセシング経路を経て生存できなくなる、そのように規定されたポリペプチド。
・前記の免疫原性の喪失が、アミノ酸の置換、付加、または除去によって実現され、そのアミノ酸配列の変更によって、ポリペプチドのＨＬＡ−ＤＭを触媒とするペプチド交換反応に関与する能力（容量）が低下する、そのように規定されたポリペプチド。
【００２５】
・ＨＬＡ−ＤＭを触媒とするペプチド交換を抑制するためにＨＬＡ−ＤＯの類似体または誘導体を使用すること。
・ＨＬＡ−ＤＭを触媒とするペプチド交換を抑制するためにＨＬＡ−ＤＭの類似体または誘導体を使用すること。
・変更が、Ｔ細胞エピトープであると認識された配列内で行われ、前記の免疫原性の喪失が、アミノ酸の置換、付加、または除去によって実現され、そのアミノ酸配列の変更が、非修飾ポリペプチド中のＴ細胞エピトープの位置で行われ、またこの変更によって、Ｔ細胞エピトープが、ペプチドが切断されるために、ＭＨＣクラスＩＩによる提示に向けたプロセシング経路を経て生存できなくなる、そのように変更されたポリペプチド。
・問題のタンパク質から、どの潜在的Ｔ細胞エピトープを除去しなければならないかの決断を下す際に、そのタンパク質のプロテアーゼ認識部位についての知識を利用する方法。
・１個または複数のプロテアーゼ認識部位がそうしたプロテアーゼに対して抵抗性になるように、Ｔ細胞エピトープのＮ末端および／またはＣ末端フランキング領域中で１または複数のアミノ酸の変更がなされている前記エピトープを含むポリペプチド。
・エピトープに新規なプロテアーゼ部位が導入されるように１または複数のアミノ酸の変更がなされているＴ細胞エピトープを含むポリペプチド。
・Ｂ細胞アスパラギニルエンドペプチダーゼ切断部位を生じるように１または複数のアミノ酸の変更がなされているポリペプチド。
・カテプシン部位が生じるように１または複数のアミノ酸の変更がなされているポリペプチド。
・表面に露出された１個または複数のアスパラギン残基が代替アミノ酸に置換されているポリペプチド。
・１個または複数の表面に露出したアスパラギン残基がグルタミン残基に置換されているポリペプチド。
・表面に露出したアスパラギン残基がすべて代替アミノ酸に置換されているポリペプチド。
【００２６】
・ポリペプチドの潜在的免疫原性を低減する方法であって、任意の手段によってポリペプチドのプロテアーゼ切断パターンを解析するステップを含む方法。
・ポリペプチドの潜在的免疫原性を低減する方法であって、コンピュータによる技術（in silico technique）を使用してポリペプチドのプロテアーゼ切断パターンを解析するステップを含む方法。
・ポリペプチドの潜在的免疫原性を低減する方法であって、ポリペプチドのプロテアーゼ切断パターンを変更することを含む方法。
・ポリペプチドの潜在的免疫原性を低減する方法であって、ポリペプチド配列に１個または複数の追加の切断部位を導入することによりポリペプチドのプロテアーゼ切断パターンを変更することを含む方法。
・ポリペプチドの潜在的免疫原性を低減する方法であって、ポリペプチド中の１個または複数の切断部位を除去することによりポリペプチドのプロテアーゼ切断パターンを変更することを含む方法。
・上記または下記の型のいずれかである修飾が、ポリペプチドがＡＰＣ内で提示に向けてプロセシングされた後にＭＨＣクラスＩＩペプチド結合溝との結合能力（容量）が喪失するように特異的に作用するものである修飾ポリペプチド。
・タンパク質に、ＭＨＣクラスＩＩ上で効率よく提示されることのできるペプチド配列の１個または複数のコピーを導入することにより、治療用タンパク質の免疫原性を低減する方法。
・タンパク質に、ＭＨＣクラスＩＩ上で効率よく提示されることのできるペプチド配列の１個または複数のコピーを導入し、そこで多数のコピーを連結して、各ペプチド単位がプロテアーゼ切断部位の側方に位置している連続した列にすることにより治療用タンパク質の免疫原性を低減する方法。
・付加されたペプチド配列が自己ペプチドであるそのように規定された方法。
・付加されたペプチド配列が配列ＡＩＬＥＦＲＡＭＡＱＦＳＲＫＴＤである自己ペプチドであるそのように規定された方法。
・構造［Ｘ］ｎＹ（Ｘ＝多数のＭＨＣアロタイプに結合するｐａｎ反応性自己ペプチド、ｎ＝１を含む任意の整数、Ｙ＝治療タンパク質）の修飾ポリペプチド。
・Ｘ＝ＡＩＬＥＦＲＡＭＡＱＦＳＲＫＴＤであるそのように規定されたポリペプチド構造。
・Ｘが特に表１のカテプシンのいずれかに対するＣ末端プロテイナーゼ切断部位を含んでいる規定されたポリペプチド構造。
・構造Ｙ−［Ｘ］ｎ（Ｘ＝多数のＭＨＣアロタイプに結合するｐａｎ反応性自己ペプチド、ｎ＝１を含む任意の整数、Ｙ＝治療用タンパク質）の修飾ポリペプチド。
・Ｘが特に表１のカテプシンのいずれかに対するＮ末端プロテイナーゼ切断部位を含んでいるそのように規定されたポリペプチド構造。
・構造［Ｘ’］ｎ−Ｙ−［Ｘ”］ｎ（Ｘ＝多数のＭＨＣアロタイプに結合するｐａｎ反応性自己ペプチド、ｎ＝１を含む任意の整数、Ｙ＝治療用タンパク質）の修飾ポリペプチド構造。
・Ｘ’＝Ｘ”であるそのように修飾されたポリペプチド構造。
・Ｘ’がＣ末端プロテアーゼ切断部位を含み、Ｘ”がＮ末端切断部位を含んでいるそのように修飾されたポリペプチド構造。
・構造［Ｘ］ｎＹ（式中、Ｘ＝多数のＭＨＣアロタイプに結合するｐａｎ反応性自己ペプチド、ｎ＝１を含む任意の整数、Ｙ＝治療用タンパク質）の修飾ポリペプチド。
【００２７】
本明細書および添付の特許請求の範囲では、用語「ペプチド」は、２個以上のアミノ酸を含む化合物である。アミノ酸は、ペプチド結合（以下で定義する）によって互いに結合している。生物によるペプチド産生に関与する２０個の異なる天然アミノ酸が存在しており、これらが任意の数、任意の順序で結合して、ペプチドの鎖または環を形成する。生物によるペプチド産生に使用される天然アミノ酸はすべてＬ−配置である。合成ペプチドは、従来の合成方法を用い、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、またはこれら２種の異なる配置のアミノ酸の様々な組合せを利用して調製することができる。あるペプチドは、数個のアミノ酸単位しか含まない。短いペプチド、たとえば、１０アミノ酸単位未満のペプチドは、時に「オリゴペプチド」と呼ばれる。他のペプチドは、多数のアミノ酸残基、たとえば、最高で１００個以上のアミノ酸残基を含み、「ポリペプチド」と呼ばれる。慣例によって、「ポリペプチド」が３個以上のアミノ酸を含む任意のペプチド鎖であるとみなされることもあるが、「オリゴペプチド」は、通常は特定の型の「短い」ポリペプチドであるとみなされる。したがって、ここでは、「ポリペプチド」への言及には、オリゴペプチドも含まれると理解される。さらに、「ペプチド」への言及には、ポリペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質が含まれる。異なるアミノ酸配置はそれぞれ、異なるポリペプチドまたはタンパク質を形成する。形成され得るポリペプチドの数、したがって異なるタンパク質の数は、事実上無制限である。
【００２８】
ＡＰＣ表面上のＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体は、ペプチドの露出した残基とＭＨＣクラスＩＩ分子の両方によってもたらされた決定基を認識することのできる特定のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）に対する結合面を提示する。ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合し、ＴＣＲを結合して、免疫応答を促進するペプチドは、一般にエピトープ、特に機能性Ｔ細胞エピトープであると定義される。
（発明の詳細な説明）
本発明の特定の目的は、ＭＨＣクラスＩＩ経路によって免疫系に提示される能力（容量）の低下した修飾ポリペプチドを提供することである。第１の実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸置換によって修飾され、問題の置換は、そのポリペプチド鎖内の１個または複数の特定のアミノ酸残基をそのそれぞれのＤ異性体に替えるものである。
【００２９】
ポリペプチド内に単一のＤ−アミノ酸を含めると、ＭＨＣクラスＩＩ結合溝への結合が妨害されることが知られている。米国特許第５，６７９，６４０号は、Ｄ−アミノ酸への置換は、ペプチドＭＨＣ複合体に対するクリティカルな接触部位で行われる必要があり、クリティカルでない部位でのＤ−アミノ酸への置換は、ＭＨＣ／ペプチド複合体内で許容されることを示している。本発明の目的は、ペプチドがＴＣＲに提示されないように、Ｄ−アミノ酸への置換を利用して、ＭＨＣクラスＩＩ結合ポケット内での結合を妨害することである。これは、自己抗原のペプチドを、ＭＨＣに対する高い親和性を保持しているが、ＴＣＲを認識し、それと結合することのできない代替自己抗原で置き換えることを試みる戦略において、クリティカルでない結合残基で置換を起こすとしている米国特許第５，６７９，６４０号が教示している方法とは異なる。
【００３０】
当技術分野では、ポリペプチド治療薬が記載されており、それが一次構造内の１個または複数のＤ−アミノ酸残基を特徴としている例がいくつか存在する。そうした例には、米国特許第５，１８２，２６１号、米国特許第５，６６８，１０９号、米国特許第４，７６４，５０４号、米国特許第５，９４８，７６４号、米国特許第５，５４５，６１８号、米国特許第５，８７７，１５６号、米国特許第５，９３２，５４５号、および米国特許第６，０８７，４４１号他が含まれるはずであり、１個または複数のＤ−アミノ酸残基を含む完全に合成のペプチド該当物が生成されている。通常、このような置換は、ペプチダーゼによる分解を受ける傾向を低減することによりｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性を付与する目的で、Ｎおよび／またはＣ末端残基に対する追加の修飾と組み合わせて行う。Ｄ−アミノ酸は、それ自体酵素の攻撃を受ける傾向が低下しており、それによってｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性に寄与するが、上で引用した例においては、潜在的または実際の治療利益のために、通常は、生物標的への結合を強化し、若干の生物活性を遮断することによって、その構成成分の合成ペプチドに対する拮抗活性が付与されるようにＤ−アミノ酸が特定の位置に含まれている。
【００３１】
たとえば、米国特許第５，９８５，２４２号は、Ｄ−アミノ酸を特徴とする合成βアミロイドペプチド類似体を開示し、アルツハイマー病などのアミロイド形成疾患で見られる新生の神経原線維変化の天然のβアミロイドペプチド成分を結合することを提示している。そのような結合によって、ペプチド類似体が更なる凝集を抑制する。同様に、Ｄ−アミノ酸を含有するヒトミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のペプチド類似体も記載されている。米国特許第５，９４８，７６４号の一実施形態には、少なくとも７個のアミノ酸からなり、好ましくはヒトＭＢＰの残基８６〜９９を包含するペプチドが記載されている。そうでなければＬ−バリンであるはずの残基８７を含むペプチドが、修飾されてこの位置にＤ−アミノ酸を含み、そのペプチド類似体のＭＨＣへの結合が自然のＭＢＰ８７−９９よりも強化されるようになっている。典型的な修飾としては、Ｌ−バリンをＤ−バリンもしくは別のＤ−アミノ酸とするものが挙げられよう。
【００３２】
当技術分野、特に合成ペプチド治療薬の分野では、ペプチドのＮおよび／またはＣ末端に「キャッピング」構造を含め、ペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が延長するようにすることが一般に実施されている。したがって、上の例の米国特許第５，９８５，２４２号では、末端の修飾は、配列の区域内にＤ−アミノ酸を含めることに加え、Ｃ末端でのアミド化、アルキル化、またはアリールアミドもしくはヒドロキシル基の付加を含む。Ｎ末端に対する修飾も記載されており、それには、環状、複素環式、多環式、および／または分枝鎖アルキル基の付加が含まれ、当技術分野では、ｉｎ  ｖｉｖｏの環境内でポリペプチドの各末端を安定にする目的で、非常に多くの他の化学基または化学結合が企図されている。
【００３３】
Ｄ−アミノ酸など、アミノ酸の天然でない鏡像異性体を活用することは、化学合成によって生成される治療薬に利用できる戦略である。組換え発現系を使用して生成されたもののような分子質量の大きいポリペプチド治療薬にＤ−アミノ酸を導入することは実現不可能である。いくつかの微生物発酵系、および微生物、真菌、および他の生物供給源から精製した酵素によって、遊離アミノ酸のラセミ体を相互に変換することができるが、発明者らの知識でポリペプチド鎖内のアミノ酸残基のラセミ化を可能にする酵素学は、当技術分野で知られていない。そのような酵素の能力が発見されれば、本発明の策略のもとで明らかに有用であるはずである。
【００３４】
本発明の第２の態様は、ポリペプチドの治療用タンパク質に化学基を共有結合させることを含む。追加の結合物によって、本明細書で上に概略を示した１段階または複数の抗原プロセシングステップが妨げられ、その結合物が結合するポリペプチド配列のセグメントが、ＡＰＣ表面上でＭＨＣ／ペプチドレパートリーを代表するようになる傾向が最も低減される。取り込まれる化学基は、ポリペプチド鎖の所望の単一部位に結合することが最も好ましい。共有結合による修飾が、所望のいくつかの部位、および／またはポリペプチドの特定の一次構造状態によって規定される部位で起こる代替の立体配置も企図している。
【００３５】
当技術分野では、グリカン誘導体、ポリエチレングリコール誘導体の脂質部分など、大きな化学基または付加物で、共有結合によってポリペプチドを修飾する方法がある。［たとえば、米国特許第５，８８５５７０、ＷＯ００２６２３０、およびＷＯ９０／１３５９０他］。単一炭素のアセチル基の結合など、他の修飾も開示されており［ＷＯ００３５４２７］、分子上の特定のレセプター部位を立体的に封鎖することにより、かつ／または免疫による監視から逃れる一般化した機構を介して治療薬の生物学的利用能を向上させる目的で実施されている。
【００３６】
本発明の目的に特に適すると考えられる１つの化学修飾の具体的な例は、ポリペプチド鎖にＡｓｎ結合型糖鎖を付加するものである。Ａｓｎ結合型糖鎖（グリコシル化）をもたらす共通シグナル配列は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏを除く任意のアミノ酸（３文字表記））であると明確に規定される。任意の規定されたエピトープ内で単一のアミノ酸置換によってＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフを生成することは、そのコア配列としての大抵のエピトープがこのモチーフとは大きく異なるために、実施できる可能性がありそうにないことは当然うなずける。これに関して、このシグナル配列を得るための多発アミノ酸置換が提示されており、これを本発明の範囲に含める。
【００３７】
単純な糖鎖またはグルコサミノグリカン鎖が関与するＯ−結合グリコシル化など、他のグリコシル化結合が当技術分野でわかっており［Ａｌｂｅｒｔｓ．Ｂ．他（１９９０）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ｐｐ  ４３３−４７５］、これを本発明の範囲に含める。
【００３８】
グリコシル化されたペプチド（たとえば、Ａｓｎ結合型グリカン）は安定であり、ＭＨＣクラスＩプロセシング経路のクリティカルな構成要素であるＴＡＰ［Ｍｏｍｂｕｒｇ  Ｆ．Ｍ．他（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：５３３］によってサイトゾルからＥＲルーメンに移出できないことがわかっている。さらに、自然にプロセシングを受けた大抵のペプチドは、Ｎ−結合型グリカン共通配列を含まず、ＭＨＣクラスＩＩ経路内でのグリカンペプチドのプロセシングおよび輸送は、グリコース（ｇｌｙｃｏｓｅ）決定基の存在による影響を受けると予想するのが妥当であり、さらにペプチドはＭＨＣクラスＩＩ結合溝にますます結合できなくなる。
【００３９】
したがって、ポリペプチドのグリコシル化によって、他の点では同一の構造のグリコシル化されていない種よりも免疫原性の低い種が得られることが理解されている。本発明の実施形態は、得られるポリペプチド種の免疫原性がその非グリコシル化相当物よりも高くなるように、グリコシル化シグナルまたはグリコシル化部位が除去されているポリペプチドを提供するものである。この状況は、たとえば、目的を特定の分子種に対する免疫応答に絞ったワクチン分子の場合には望ましいといえる。
【００４０】
本発明を使用するポリペプチドの共有結合修飾は、最低限の数の部位で起こすことが好ましい。共有結合修飾は、ポリペプチドの一次構造内の規定された残基を対象とすることが特に好ましい。化学結合物を、ポリペプチド分子内の特定の残基または特定のクラスのアミノ酸残基に向けて送り込む方法は、よく知られており、本発明の範囲のもとで活用して、好ましい実施形態に従う修飾を実現することができる。たとえば、Ｌｙｓ残基上の利用可能なアミド基、またはＡｓｐもしくはＧｌｕ残基に載ったカルボキシル基を狙って結合させ、またはＣｙｓ残基上のスルフヒドリル基を活性化することのできる化学修飾スキームは、かなり文書化されており［たとえば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、（１９９６）Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  Ｇ．Ｔ．Ａｃｅｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ；Ａｓｌａｍ  Ｍ．＆  Ｄｅｎｔ  Ａ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ（１９９８）Ｍａｃｍｉｌｌａｎ、Ｌｏｎｄｏｎを参照されたい］、本発明の策略のもとで活用することができる。同様に、ＰＥＧなどの重合体分子によって活性化し、それを結合させる方法は、当技術分野で遍く記載されており［たとえば、米国特許第５，３４９，００１およびＷＯ９０／１３５９０のスキームを参照されたい］、他の脂質部分、アミド、もしくはグリコースを結合させるための類似の策略、または他の化学的特徴は、当技術分野の中で本発明の策略のもとでの使用に適するものであるか確認することができる。
【００４１】
本発明が、治療用タンパク質の潜在的免疫原性を低減する方法に関するものである場合、これを実現する第４の方法は、治療用タンパク質が、そのアミノ酸残基配列内の１箇所または複数の特定の領域で修飾される実施形態を含む。その修飾は、アミノ酸残基の置換、除去、または付加でよく、このような修飾の結果として、プロセシングを受けたペプチドエピトープがそれによって最終的にＭＨＣクラスＩＩ結合溝と結合するようになるペプチド分解に関与する１種または複数のクリティカルなプロテアーゼによるポリペプチドの認識が変更される。
【００４２】
本発明の具体的な実施形態は、ＭＨＣクラスＩＩ分子のＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、およびＤＰに結合する潜在能力（容量）が証明されたかまたは予測される部分を有するフランキングペプチドの残基を変異させ、または修飾して、そのようなペプチドが、ＭＨＣクラスＩＩ経路のタンパク質プロセシングに関与するプロテアーゼによって抗原タンパク質から切除され得なくなるようにするものである。
【００４３】
別の実施形態は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、およびＤＰ分子に結合する潜在能力が証明されたかまたは予測されているタンパク質配列を、そのような配列が、ＭＨＣクラスＩＩプロセシング経路に関与するプロテアーゼの作用を受けやすくなるように修飾するものである。これも、ＭＨＣクラスＩＩ経路に関与するプロテアーゼによって認識され切断され得るモチーフが生じるようにアミノ酸を取り替えることによって実現される。
【００４４】
さらに別の実施形態では、問題のタンパク質のタンパク分解性プロセシング部位についての情報自体が、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、もしくはＤＰに結合する潜在能力があり、したがってＡＰＣ表面上で見出される見込みのあるペプチドを同定するのに、予測するような形で使用することのできる価値あるデータとなる。
【００４５】
プロテアーゼのアスパラギンエンドペプチダーゼは、Ｂ細胞によって取り込まれた抗原がプロセシングされる際に決定的な役割を担う。この酵素は、ヒトＢ細胞由来の不能になったリソソーム中での破傷風毒素ドメインの分解において決定的な役割を担うことが示されている［Ｍａｎｏｕｒｉ他、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ３９６：６９５−６９９］。Ｂ細胞アスパラギニルエンドペプチダーゼの切断部位は、標的タンパク質の配列および構造の両方に応じて決まる。ポリペプチド抗原をまずこのプロテアーゼで消化して、さらなるプロセシングに必要な、カテプシンのような他のプロテアーゼに敏感な部位を露出させるという適用例がある。アスパラギニルエンドペプチダーゼによる破傷風毒素Ｃ断片のプロセシングは、抗原のＡｓｎ残基をＮ−グリコシル化することによって阻害できた。この酵素は、胸腺ＡＰＣ中でのタンパク質プロセシングでも役割も担っており［Ｍａｎｎｏｕｒｙ他、（２００２）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ３：１６９−１７４；Ａｎｄｅｒｔｏｎ他、（２００２）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．,３：１７５−１８１］、そこで、中心にアスパラギンを含む、ミエリン塩基性タンパク質の隠れたエピトープを除去することが示されている。
【００４６】
したがって、本発明の策略のもとでは、表面に露出したアスパラギン残基を除去することによって、ポリペプチドの免疫原性を低くすることができる。除去は、アミノ酸置換によって、また最も好都合なようには組換えＤＮＡ操作の技術を使用して実現されるが、他の策略、たとえば化学的脱アミドや化学合成を考えてもよい。最初の例では、特に好適な置換はアスパラギンをグルタミンで置換するものであるが、アスパラギン酸やグルタミン酸など、他の置換基も同等にみなしてよい。
【００４７】
もう１つのプロテアーゼは、胸腺中で単独に発見された、胸腺に特異的なセリンプロテアーゼである。このタンパク質をコードしている遺伝子は、ＭＨＣクラスＩ領域中に配置されている。このタンパク質の発現は、他のＡＰＣ中では観察されなかった。この酵素がこのように限定的に発現すること、およびカテプシンＬが胸腺細胞中で特異的に役割を担っていること（上記を参照のこと）から、胸腺中のタンパク分解性の環境がやや独特であることが示唆される。
【００４８】
上述のプロテアーゼの数種は、他の生理的プロセスにも関与しているので、いくつかのそうしたプロテアーゼの機構および特異性は、分析がなされている。表１に、いくつかの重要なカテプシンの特異性をまとめて示す。
【００４９】
【表１】
2004533845.tif 000002
本発明の一目的が、抗原タンパク質を修飾して、ＭＨＣクラスＩＩ提示のタンパク分解経路に関与するプロテアーゼによるプロセシングを受けた部位が、そのようなプロテアーゼに敏感でなくなって、抗原提示細胞表面上での抗原ペプチドの提示が縮小されるようにすることである場合、もう１つの目的は、抗原タンパク質のＴ細胞エピトープに追加のプロテアーゼ部位を導入して、Ｔ細胞エピトープがエンドサイトーシス小胞中でさらにプロセシングを受け、免疫系に提示され得なくなるようにすることである。このような変異は、エピトープ自体の除去または破壊を対象とするものとは異なるが、潜在的なＭＨＣクラスＩＩリガンドがプロセシング経路から出現し、ＡＰＣの表面上に提示されるようになる見込みはそれよりもむしろ低減される。したがって、本発明の策略のもとでは、抗原ペプチドのＭＨＣアンカー残基を変異させることを必ずしも目的としないが、本発明による変異をそのような戦略と組み合わせて実施してもよい。
【００５０】
本明細書で概略を示したＭＨＣクラスＩＩ系を経てＡＰＣ表面上に提示されたペプチドの性質を同定するためにいくつかの手法が採用されている。例として、抗原を含んだＡＰＣの表面から抗原ペプチドを精製し、抽出されたペプチドにタンパク質の配列決定技術を適用することが可能になった。あるいは、ある問題のタンパク質を構成する合成（重複）ペプチドのライブラリーを、抗原提示細胞、または精製されたＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、もしくはＤＰ分子に結合させ、その後、これらのタンパク質と相互に作用するペプチドの溶出および配列解析が行われている。別の手法は、共通結合モチーフを基にして、あるいはＨＬＡ−ＤＲ分子のＸ線回折／構造モデリング、またはペプチドドッキングなど、コンピュータに基づく他の技術によって、ある問題のタンパク質のどのペプチドがＨＬＡ−ＤＲ分子に結合しそうであるか予測するものである。
【００５１】
原則として、これらの手法のどれよっても、ＭＨＣ分子に結合する可能性のあるペプチドの配列についての情報を得ることができ、そのようなデータを使用して、ＭＨＣ分子との相互作用が極度に妨げられるようにペプチドまたはそのペプチドが得られるタンパク質に変異を起こすことができる。タンパク質中で行ってこれを実現することのできる変異は、通常は、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、もしくはＤＰのペプチド結合溝中にきつく拘束される抗原ペプチド残基、すなわちいわゆるアンカー残基に限られる。このような変異は、大抵のエピトープの免疫原性を低減するのに十分であるが、このような位置での変異は、タンパク質の機能上の活性に甚大な影響を及ぼすので、除去するのがより難しいエピトープもある。本発明は、この制限を克服することを考えるものである。
【００５２】
ＤＲ結合ペプチドを選択するのにペプチドライブラリーを使用する場合には、ＤＲ分子に結合する潜在能力を有するペプチドを見つけ出すことができるが、抗原提示細胞中では、この細胞のタンパク分解経路によって、そのペプチドが抗原タンパク質から出現できないようになるので、それがあり得ない。コンピュータのアルゴリズムによってＤＲまたはＤＱ分子に結合すると予想されたペプチドについても同じことがいえる。その結果として、どちらの方法でも、タンパク質に対する免疫応答で役割を担うかもしれないペプチドの数が過大に予測されかねない。これら予測された潜在的Ｔ細胞エピトープのどれが抗原提示細胞上に提示されやすいかを決定できるようになるには、タンパク質中のプロテアーゼ部位についての追加の情報が必要である。
【００５３】
本発明によれば、プロテアーゼプロセシング部位を除去する好ましい方法は、以下のとおりである。
【００５４】
１．所与の問題のタンパク質について配列（の部分）を決定する。
【００５５】
２．ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＨＬＡ−ＤＰ分子に結合する潜在能力を有するペプチドを同定する。
【００５６】
３．それらのエピトープの側方に位置する配列状アミノ酸を、ＭＨＣクラスＩＩプロセシング経路に関与するプロテアーゼ、特に表１に詳述したプロテアーゼによって認識されるモチーフが存在するか分析する。
【００５７】
４．タンパク質のそうした位置が認識され、切断され得ないように変異を設計する。
【００５８】
５．現在の標準的な分子生物学技術のいずれかによって問題のタンパク質に変異を導入する。
【００５９】
６．任意選択で、修飾された分子を再度分析して、所望の領域でプロテアーゼ敏感性が喪失し、ペプチドがＭＨＣクラスＩＩと共に細胞表面に提示されるその能力が低下したことを確認する。
【００６０】
上の方法を実施するに際して、ステップ３は、任意選択で、抗原提示細胞に由来するタンパク分解性タンパク抽出物を利用して行ってもよい。問題のタンパク質をその抽出物と共にインキュベートするが、これはある範囲の条件下（たとえば、いくつものｐＨ）で行うことができる。問題のタンパク質の消化産物は、たとえば様々な断片のＨＰＬＣによる精製を利用して分析した後、エドマン分解および／または質量分析を利用してその配列を同定することができる。このスキームによれば、見つけ出された断片の配列を問題のタンパク質の配列と整列させると、プロテアーゼによって切断された位置が示されて、プロテアーゼがその位置を認識し切断できなくなるような合理的な変異を設計できる。
【００６１】
本発明によれば、追加のプロセシング部位を導入することによって免疫原性を低減する好ましい方法は、以下のとおりである。
【００６２】
１．所与の問題のタンパク質について配列（の部分）を決定する。
【００６３】
２．ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＨＬＡ−ＤＰ分子に結合する潜在能力を有するペプチドを同定する。
【００６４】
３．Ｔ細胞エピトープであると同定されたペプチドにおいて、プロテアーゼ認識モチーフを、そのプロテアーゼによる消化がそのＴ細胞エピトープの最初と最後のアンカー残基の間で起こり得るように導入する変異を設計する。
【００６５】
４．現在の標準的な分子生物学技術のいずれかによって問題のタンパク質に変異を導入する。
【００６６】
５．任意選択で、修飾された分子を再度分析して、所望の領域でプロテアーゼ敏感性が喪失し、ペプチドがＭＨＣクラスＩＩと共に細胞表面に提示されるその能力が低下したことを確認する。
【００６７】
多数の重複するＴ細胞エピトープを検出する状況では、上の方法を実施することが好ましいといえる。新たな（de novo）プロセシング部位を画定されたエピトープの最初と最後のアンカー残基の間に導入する、上の方法のステップ３に従う要件は、クリティカルな九量体ペプチドが同定される程度に詳細なエピトープ地図が作成されない限り、実際に規定することはできない。実際的には、多数のＭＨＣクラスＩＩアロタイプ（特にＨＬＡ−ＤＲ）を考える場合、あるアロタイプの九量体配列が同様のアロタイプ特異性に対する九量体配列と一部が合致して「スリップ」し、同じエピトープを結合し得ること、ならびに長さが９残基を超える配列内で一連の重複する九量体を規定できることがわかっている。そのような状況では、ステップ３でそう規定された新たな切断部位は、エピトープの最初と最後のアンカー残基間の領域外にできてもよく、それでも切断によってＭＨＣクラスＩＩを介するペプチドの提示が行われなくなる。変異によるこのような変更は、本発明の範囲のもとに行われるとみなされよう。
【００６８】
さらに別の実施形態では、問題のタンパク質のタンパク分解性プロセシング部位についての情報自体が、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、もしくはＤＰに結合する潜在能力があるペプチドを同定するのに、予測するような形で使用することのできる価値あるデータとなる。上述のように、Ｔ細胞エピトープの予測アルゴリズム、およびＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、もしくはＤＰ分子に結合できるペプチドの重複ペプチドライブラリーからの選択では、ほとんど必然的にＴ細胞エピトープ数が過剰に予測されることになる。ＭＨＣクラスＩＩプロセシング経路に関与するプロテアーゼによって切断される認識部位を含む潜在的なＴ細胞エピトープを予測する場合では、そのエピトープが実際に見つかる機会は減り、したがって問題のタンパク質からそのエピトープを除去することが必ずしも必要でない。また、プロテアーゼ認識部位の側方に位置しない潜在的なＴ細胞エピトープを予測する場合では、そのようなエピトープがタンパク質から切除され、抗原提示細胞の表面上で提示される機会は減り、したがって問題のタンパク質からそのエピトープを除去することが必ずしも必要でない。
【００６９】
本発明のこの別の実施形態によれば、クリティカルなＴ細胞エピトープを除去の目標とする好ましい方法は、以下のとおりである。
【００７０】
１．所与の問題のタンパク質について配列を決定する。
【００７１】
２．その配列中の潜在的なＴ細胞エピトープを予測する。
【００７２】
３．結合領域内にＭＨＣクラスＩＩタンパク分解経路に関与するプロテアーゼによって認識されそうなモチーフが存在するか、すべての潜在的なＴ細胞エピトープを精査する。
【００７３】
４．その潜在的なＴ細胞エピトープのＣ末端側またはＮ末端側への１０個のアミノ酸の範囲内にプロテアーゼ切断部位を含むことが判明したすべての潜在的なＴ細胞エピトープを、エピトープの除去にとってクリティカルであるとみなす。そのようなモチーフを欠いている潜在的なエピトープはすべて、それほどクリティカルでなく、問題のタンパク質から除去する必要のあるエピトープの集合から除外してよい。
【００７４】
本発明が治療用タンパク質の潜在的免疫原性を低減する方法に関するものである場合において、それを実現する第４の全般的な方法は、治療用ポリペプチドをそのアミノ酸残基配列内の１箇所または複数の特定の領域で修飾する実施形態を含む。その修飾は、アミノ酸残基の置換、除去、または付加でよく、このような修飾の結果として、プロセシングを受けたペプチドエピトープがＭＨＣクラスＩＩ結合溝と結合するようになる、ＨＬＡ−ＤＭを触媒とするクリティカルな反応の効率が変更される。
【００７５】
ＨＬＡ−ＤＭによってエピトープのペプチドが交換される主な決定要因は、ペプチドのＨＬＡ−ＤＲに対する親和性であるが、ＨＬＡ−ＤＲに対する結合親和性を決定しないアミノ酸残基も交換反応に影響を及ぼし得ることが徐々に明らかになってきている。合成ペプチドを使用するＨＬＡ−ＤＲ−ＣＬＩＰとのｉｎ  ｖｉｔｒｏペプチド交換反応において、ＨＬＡ−ＤＭの存在が、ＣＬＩＰペプチドに取って代わるペプチドの選択に大きな影響を及ぼし得ることが示されている。Ｌｉｇｈｔｓｔｏｎｅら［Ｌｉｇｈｔｓｔｏｎｅ他（１９９７）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：９２５５−９２６０］は、正常なＩｉ-、ＨＬＡ−ＤＭ-、およびＨＬＡ−ＤＭ／Ｉｉ-抗原提示細胞表面上での自己ペプチドの発現を比較し、ＨＬＡ−ＤＭ発現のあるまたはない細胞上に提示されたペプチド整列物の根深い相違を認めた。Ｋｒｏｐｓｈｏｆｅｒら［Ｋｒｏｐｓｈｏｆｅｒ他（１９９６）；ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：６１４４−６１５４］は、アフィニティー精製法を使用して、ＥＢＶで形質転換したリンパ芽球腫細胞からＨＬＡ−ＤＲ分子（ＤＲ２およびＤＲ３アロタイプ）を得、それらをＨＬＡ−ＤＭの存在下または非存在下で１６時間、ｐＨ５でインキュベートした。複合体のまま保たれたペプチドを溶出し、質量分析によって分析した。スペクトルを比較すると、若干のペプチドはＨＬＡ−ＤＭによって効率よく除去されたが、他のペプチドは影響を受けなかったことが明らかであった。別の実験では、前もってＨＬＡ−ＤＲ１から溶出した６種の異なる自己エピトープの混合物を結合アッセイで試験すると、ＤＭの存在下ではそのうちの５種がＤＲ１に効率よく結合し、ＤＭなしでは、そのうちの２種が結合を維持したにすぎなかった。これらや他の実験によって、ＨＬＡ−ＤＭは、細胞表面で提示すべくあるペプチド亜集団を選択するペプチド編集機として機能する潜在能力を備えているという考えに至った。ＨＬＡ−ＤＲに対するこうしたペプチドの親和性以外の要因、すなわち複合体の動力学的安定性も役割を果たしていることが明らかになってきている。安定性と親和性は関連があるが（ＫD＝ｋoff／ｋon）、ＨＬＡ−ＤＭを触媒とする交換反応の効率に対しては、ｋoffが深遠な影響を及ぼす。このことは、ｋonが例外的に高く、ｋoffも高いＣＬＩＰペプチドによって例証される。重要なのは、親和性は比較的高いが、（ＤＭ存在下での）安定性が低いことである。したがって、ＨＬＡ−ＤＭの役割は、動力学的校正であると述べることができる。
【００７６】
潜在的なＴ細胞エピトープの特定の位置にあるどのアミノ酸がＨＬＡ−ＤＭを触媒とする交換反応の効率に影響を及ぼすのかを分析することは何回か試みられている。Ｋｒｏｐｓｈｏｆｅｒら［Ｋｒｏｐｓｈｏｆｅｒ他（１９９６）；ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：６１４４−６１５４］は、ＨＡ（３０７〜３１９）ペプチドのアンカー位の変異がｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＬＡ−ＤＲ１への結合に及ぼす影響を分析した。アンカー残基１のチロシンは、結合溝の最初のポケットに非常によく適合する。これをアスパラギン酸で置き換えると、完全に結合されなくなる。この位置がメチオニンまたはバリンでも良好な結合が生じるが、ＨＬＡ存在下では結合が弱まる。したがって、ＨＬＡ−ＤＭは、アンカー位の（副）最適残基を除外して選択することができる。ポケット残基９についても同様の観察が行われた。ポケット６では、それほどでないが逆の作用が認められた。ＨＬＡ−ＤＭによって、それなしでは疎まれた残基の結合が可能になったのである。ＨＬＡ−ＤＭはまた、１１アミノ酸よりも短いエピトープを除外して選択しており、ＤＲによって結合された実際に見られるペプチドの大きさを反映している。
【００７７】
Ｒａｄｄｒｉｚｚａｎｉら［Ｒａｄｄｒｉｚｚａｎｉ他（１９９９）；Ｅｕｒ．Ｊ．ｌｍｉｎｕｎｏｌ．２９、６６０−６６８］は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＬＡ−ＤＭによってＨＬＡ−ＤＲから最も放出されそうな、グリシンおよびプロリン残基に富む（合成）ペプチドを示している。考えられる説明は、グリシンおよびプロリンが、ペプチドの二次構造に対して比較的大きな影響を及ぼし得るということであろう。実際、ＨＬＡ−ＤＲ１に対する親和性の高いペプチドを、グリシンまたはプロリンのどちらかが導入または除去された変異体ペプチドと比較すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＨＬＡ−ＤＭを触媒とする交換反応に対する有意な影響が認められた。
【００７８】
前述の事項は、本発明のさらに別の重要な実施形態への序文であるとみなされるものであり、その実施形態での方法は、ポリペプチド抗原に由来する、プロセシングを受けた１種または複数のエピトープが妨害されるか、または少なくともＨＬＡ−ＤＭを触媒とするペプチド交換反応に関与できる能力が低下するようにポリペプチドを修飾することに関する。これは、ＨＬＡ−ＤＲ、ＤＱ、およびＤＰに結合できる能力を備えたあるペプチドがその交換反応で不利になるようにして問題のタンパク質を変異させることにより実現する。
【００７９】
本発明のこの実施形態に従う全般的な方法は、以下のとおりである。
【００８０】
１．所与の問題のタンパク質について配列（の部分）を決定する。
【００８１】
２．ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＨＬＡ−ＤＰ分子を結合する潜在能力を備えたペプチドを同定する。
【００８２】
３．ＨＬＡ−ＤＭを触媒とするＨＬＡ−ＤＲ−ＣＬＩＰ複合体との交換反応の効率を低下させる、それら（潜在的な）Ｔ細胞エピトープの変異を設計する。
【００８３】
４．現在の標準的な分子生物学技術のいずれかによって、問題のタンパク質に変異を導入する。
【００８４】
ＨＬＡ−ＤＲを触媒とする、ＨＬＡ−ＤＲ複合体に結合したＣＬＩＰペプチドとの交換反応の効率が低下するように設計された変異は、（潜在的な）Ｔ細胞エピトープ中のどの位置で起こしてもよい。そうした位置には、ＨＬＡ−ＤＲの抗原結合溝中のポケット中に結合されるような位置が含まれる。このような位置でのいくつかの変異は、ペプチドのＨＬＡ−ＤＲに対する親和性には影響を及ぼし得ないが、ＨＬＡ−ＤＲを触媒とする交換反応の効率を低減し得る。さらに、そのような変異を非アンカー位で起こすこともできる。
【００８５】
本発明のさらに別の実施形態において、またペプチド配列を操作してＨＬＡ−ＤＭを触媒とする交換に影響を及ぼすものに代わる代替法として、ＨＬＡ−ＤＭまたはＨＬＡ−ＤＯ分子自体の操作または模倣によってそのような交換を変更できるはずである。たとえば、外から供給されたＨＬＡ−ＤＯ（またはその模倣物）のエンドサイトーシス、またはＨＬＡ−ＤＯをコードしている遺伝子の導入、または内在するＨＬＡ−ＤＯ遺伝子の活性化のいずれかによって、ＨＬＡ−ＤＯ分子またはＨＬＡ−ＤＯの作用を模倣する他の分子を（それらが存在する）Ｂ細胞以外のＡＰＣに導入し得る。このようなＨＬＡ−ＤＯ分子は、実際には、たとえばその分子によってｐＨ５以下でのＨＬＡ−ＤＭ活性が阻害され、そうしてＨＬＡ−ＤＭを触媒とするペプチド交換がブロックされるようにＨＬＡ−ＤＯのｐＨ依存的な挙動を変更する（アミノ酸置換などによる）修飾を受けることもある。同様に、ＨＬＡ−ＤＭ分子またはＨＬＡ−ＤＭの作用を模倣する他の分子をＡＰＣに導入すると、ペプチド交換の効率を向上させることができ、あるいはそれと共にＨＬＡ−ＤＭに適切な修飾を施せば、ＨＬＡ−ＤＯ阻害作用を阻止し、またはＨＬＡ−ＤＭによって結合されるペプチドに対する特異性を変更し、またはＨＬＡ−ＤＭのｐＨ敏感性を変更し得る。したがって、ＨＬＡ−ＤＯまたはＨＬＡ−ＤＭの操作または模倣によって、ＨＬＡ−ＤＰ、ＤＱ、もしくはＤＲ上での特定のペプチドの提示を増強することも、またはそのような提示を縮小／排除することも可能であった。
【００８６】
本発明のさらに別の実施形態では、特定のプロテアーゼ認識部位を、種々のＡＰＣ’中でのそのプロテアーゼ部位の切断されやすさに差が出るように、特定のＨＬＡ結合ペプチドのすぐ隣またはその範囲内に含めることができる。この方法により、特定のＡＰＣ’によってタンパク質配列内からペプチドを優先的に放出させて、その後ＡＦＣ’上でペプチドが提示されて起こるＴ型細胞応答に影響を及ぼすこともできる。たとえば、（たとえば側方のカテプシンＳ部位を優先的に含めることにより）樹状細胞からペプチドを優先的に放出させると、次いで、マクロファージ中で同じタンパク質がプロセシングを受けて誘発されたものと異なる型の細胞性応答（たとえばＴＨ１に偏ったもの）が誘発されるかもしれない。したがって、側方または内部プロテアーゼ部位を合理的に含めることにより、同じタンパク質によって誘発されるＴＨ０、ＴＨ１、およびＴＨ２応答のバランスに影響を及ぼすことが可能になるはずである。同様に、異なるＡＰＣ’内のプロテアーゼのパターンに差があることを利用して、ＡＰＣ’内でのペプチド輸送に影響を及ぼすこともできよう。ＡＰＣ表面上でのペプチド提示の動態を乱す特に好都合な策略は、治療用ペプチド抗原と共に、その配列および存在量によって、ＭＨＣ系を経て外側の表面への提示に優先的に達することのできるペプチド配列を提供するものである。それを行う場合では、このような優先的に提示されるペプチドが、抗原タンパク質中に存在する他のペプチドとの競合に勝つので、そうした他のペプチドは、免疫応答を開始するために利用できなくなる。このような手法が有用であるためには、当然、優先的に提示されるペプチド自体は、免疫応答を惹起できないことがクリティカルである。したがって、そのような策略の設計には、自己ペプチド抗原、すなわちその生物体がそれに対して高度の免疫寛容を確立している、宿主の生物体由来のペプチドを使用するという意味が暗に含まれている。
【００８７】
こうした策略では、自己寛容配列が必要であることに加え、「免疫消滅（ｉｍｍｕｎｅ  ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）」と呼ぶことのできる効力を備えたペプチドが、広範なＭＨＣ、好ましくはＨＬＡ−ＤＲアロタイプに対する高い親和性という特性、またＨＬＡ−ＤＭ存在下での高い動力学的安定性も備えているべきである。上述の特性を有するペプチドは、自己ペプチドＳＰ３と称し、３文字表記の配列がＡＩＬＥＦＲＡＭＡＱＦＳＲＫＴＤである。
【００８８】
本発明の策略では、ＳＰ３または機能が同等のペプチド配列を、問題の治療用タンパク質のＣ末端および／またはＮ末端に連結する。そのペプチドは、表１に示したもののいずれかまたは複数のものなど、ＭＨＣクラスＩＩプロセシング経路に関与するプロテアーゼに対する認識モチーフ寄りのどちらかの側方に配置されることが好ましい。ペプチドは、治療用タンパク質のＮおよび／もしくはＣ末端に向けて直列に反復させて連結することもできる。このような構築物を操作する手段は、当技術分野で容易に利用でき、また任意の数の反復単位を特徴とする構造が考えられるが、これを本発明の範囲に含める。
【国際公開パンフレット】
2004533845.tif 000003
2004533845.tif 000004
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2004533845.tif 000035
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533845.tif 000036
【国際調査報告】
2004533845.tif 000037
2004533845.tif 000038
2004533845.tif 000039
2004533845.tif 000040