(57)【要約】哺乳動物における癌の処理に有用な医薬組成物であって、有効成分として、治療的に有効な量のジャスモネート化合物を含む。ジャスモネート化合物は、あらゆる悪性腫瘍の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における癌の治療に有用な医薬組成物であって、有効成分として、治療的に有効な量の、式Ｉ：
【化１】
2004525163.tif 000005
［前記式中、ｎは０、１、または２；
Ｒ1はＯＨ、アルコキシ、Ｏ−グルコシル、もしくはイミノ、
Ｒ2はＯＨ、Ｏ、アルコキシもしくはＯ−グルコシル、
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、Ｈ、ＯＨ、アルコキシもしくはＯ−グルコシル、
ならびに／またはＲ1及びＲ2、もしくはＲ1及びＲ4は一緒になってラクトンを形成し、及び更にＣ3：Ｃ7、Ｃ4：Ｃ5及びＣ9：Ｃ10間は二重結合もしくは単結合であってもよい］
で表されるジャスモネート化合物または、
前記式で表される誘導体を含み、前記誘導体は、Ｃ3に低級アシル側鎖（遊離酸またはエステルまたは複合体）、Ｃ6炭素にケトもしくはヒドロキシ（遊離ヒドロキシまたはエステル）部分、またはＣ7にｎ−ペンテニルもしくはｎ−ペンチル側鎖のうち少なくとも１つを有する医薬組成物。
【請求項２】
前記ジャスモネートが、ジャスモン酸メチルエステル、ジャスモン酸、ジャスモン、７−イソ−ジャスモン酸、９，１０−ジヒドロジャスモン酸、２，３−ジデヒドロジャスモン酸、３，４−ジデヒドロジャスモン酸、３，７−ジデヒドロジャスモン酸、４，５−ジデヒドロジャスモン酸、４，５−ジデヒドロ−７−イソ−ジャスモン酸、ククルビン酸、６−エピ−ククルビン酸、６−エピ−ククルビン酸−ラクトン、１２−ヒドロキシ−ジャスモン酸、１２−ヒドロキシ−ジャスモン酸−ラクトン、１１−ヒドロキシ−ジャスモン酸、８-ヒドロキシ−ジャスモン酸、ホモ−ジャスモン酸、ジホモ−ジャスモン酸、１１−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、８−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、ツベロン酸、ツベロン酸−Ｏ-β−グルコピラノシド、ククルビン酸−Ｏ−β−グルコピラノシド、５，６−ジデヒドロジャスモン酸、６，７−ジデヒドロジャスモン酸、７，８−ジデヒドロジャスモン酸、シス−ジャスモン、メチルジヒドロイソジャスモネート, ジヒドロジャスモン, ジャスモン酸のアミノ酸複合体、及びそれらの低級アルキルエステル類、キャリアリガンド複合体及び立体異性体から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記有効成分が、許容されうる脂質キャリアに溶解されている請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
更に、少なくとも１種類の他の化学治療剤を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、経口投与用に調製された請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、乳剤、液剤、カプセル剤、錠剤から選択される形態である請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、注射による投与用に調製された請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、局部投与用に調製された請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、軟膏、ゲル、またはクリームから選択される形態である請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、吸入による投与用に調製された請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、坐剤を介する投与用に調製された請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
治療的に有効な量の、式Ｉ：
【化２】
2004525163.tif 000006
［前記式中、ｎは０、１、または２；
Ｒ1はＯＨ、アルコキシ、Ｏ−グルコシル、もしくはイミノ、
Ｒ2はＯＨ、Ｏ、アルコキシもしくはＯ−グルコシル、
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、Ｈ、ＯＨ、アルコキシもしくはＯ−グルコシル、
ならびに／またはＲ1及びＲ2、もしくはＲ1及びＲ4は一緒になってラクトンを形成し、及び更にＣ3：Ｃ7、Ｃ4：Ｃ5及びＣ9：Ｃ10間は二重結合もしくは単結合であってもよい］
で表されるジャスモネート化合物もしくは前記式で表される誘導体
［前記誘導体は、Ｃ3に低級アシル側鎖（遊離酸またはエステルまたは複合体）、Ｃ6炭素にケトもしくはヒドロキシ（遊離ヒドロキシまたはエステル）部分、またはＣ7にｎ−ペンテニルもしくはｎ−ペンチル側鎖のうち少なくとも１つを有する］
またはその医薬的に許容される塩の、
哺乳動物における前立腺癌、乳癌、皮膚癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、リンパ腫、白血病、頭頚部癌、腎臓癌、卵巣癌、骨癌、肝臓癌または甲状腺癌の治療に有用な医薬組成物の調製における使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物におけるあらゆる悪性腫瘍の治療に用いられる医薬組成物に関するものである。本発明の組成物は、無害であり、その対象を、健康な末梢細胞と相対する癌細胞に絞ったものである。
【０００２】
植物は、様々なストレスを受ける場合があり、それによって、ストレス源に対応した生理学的反応を引き起こす複雑な遺伝経路が活性化される。植物がさらされる一般的なストレスとしては、極度の紫外線放射、浸透圧ショック、熱ショック及び病原体攻撃が挙げられる。植物において、ストレスホルモン類が放出される。そのストレスホルモン類は、そのようなストレスを受けた時に放出され、対応した反応のもとである様々なカスケードの引き金となる。ジャスモン酸（ＪＡ）及びジャスモン酸メチルエステル（ＭＪ）は、「ジャスモネート類」と呼ばれる１群の天然植物ストレスホルモン類に属する（Sembdner及びParthier、Annu. Rev. Physiol. Plant Mol. Biol.、44、569-589、1993）。ジャスモン酸は、創傷に対する応答である細胞間のシグナリングに非常に重要であり、ジャスモン酸メチルエステルは、傷または病原体攻撃に応答して低濃度で蓄積するプロテイナーゼ阻害剤を誘導する（Farmer及びRyan、Proc. Natl. Acad. Sci.、87、7713-7716、1990）。ジャスモネート類は、植物の成長及び穀物の改良における様々な使用について特許権化されている。ジャスモネート類を適用することにより、事実上すべての植物に広範囲な相反する作用を及ぼす可能性がある。これらの作用は植物の発達を阻害することから植物のプロセスを促進することまで多岐に渡っている。米国特許第６，１１４，２８４号には、植物の成長及び発達を相乗的に増進することを目的としたジャスモン酸エステル及びジベレリン（giberellin）の使用が開示されている。米国特許第５，４３６，２２６号には、収穫後の塊茎における発芽及び黒ずみの阻害を目的としたジャスモネートの使用が開示されており、米国特許第５，１１８，７１１号には、防虫を目的としたジャスモン酸メチルエステルの使用が開示されている。
【０００３】
サリチル酸ナトリウム（ＳＡ）は、別のファミリーの植物ストレスホルモンであり、病原体や創傷に対する植物の防衛反応の中心的媒介物質である（Ryalsら、Plant Cell.、8、1809-1819、1996）。
【０００４】
微生物病原体に攻撃された場合の植物の典型的な反応の一つとしては、例えば、過敏感反応（ＨＲ）と呼ばれる先天的に植物内にプログラムされた細胞死を挙げることができる。過敏感反応によって、感染部位の周囲には死細胞の領域が形成される。病原体の侵入部位を囲む死細胞の層は、病原体の更なる増殖及び拡散を阻害する物理的なバリアとして機能すると考えられている。そのプロセスの次の段階には、植物ストレスホルモンであるサリチル酸ナトリウムの合成、及び感染特異的タンパク質類、フィトアレキシン類などの抗菌剤の蓄積が含まれる（Danglら、Plant Cell、8、1793-1807、1996;Mitler及びLam、Trends. Microbiol.、4、10-15 1996）。
【０００５】
病原体攻撃に対する応答であるこのプログラムされた細胞死は、哺乳動物細胞において起こることが知られているプログラムされた細胞死とよく似ている。哺乳動物細胞は、外部の損傷によって引き起こされ、細胞破裂をもたらす「予定外の」壊死、または同様に「プログラムされた細胞死」あるいは「細胞自殺」と呼ばれている、より系統立てられたアポトーシスにおいて死ぬ可能性がある（Willingham, J. Histochem. Cytochem.、47、1101-1109、1999）。アポトーシスにおいて、生化学的及び形態学的事象は、通常、非常に特異で制御された工程（核の断片化や細胞収縮を含む）のカスケードにおいて系統立てられおり、細胞構成要素が完全にアポトーシス小体に分離されて終了する（Stwart, J. Cancer Inst.、86、1286-1295、1994）。
【０００６】
アポトーシスのプロセスは壊死より遅く、誘導物質によって異なるが、２、３時間または２、３日間の内に発生する。この種の死は「細胞自殺」と見なされる場合がある（Willingham, J. Histochem. Cytochem.、47、1101-1109、1999）。
【０００７】
驚いたことに、植物ストレスホルモンＳＡは、哺乳動物細胞におけるストレス応答に特有の細胞間の生化学的事象を誘導することができ（Schwengerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、4、2869-2873、1997;Schwengerら、J. Cell. Physiol.、179、109-114、1999）、カスパーゼ−３（アポトーシスの最終段階に不可欠な哺乳動物細胞質性プロテアーゼ）の活性化を通して、ヒト骨髄性白血病の細胞株においてアポトーシス（プログラムされた細胞死）を誘導することができた（Klampferら、Blood.、93、2386-2394、1999;Willingham, J. Histochem. Cytochem.、47、1101-1109、1999;Porter及びJanicke、Cell Death Differ.、6、99-104 1999）。ＳＡはまた、哺乳動物ＦＳ−４繊維芽細胞（Schwengerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、4、2869-2873、1997）及びヒト膵臓癌腫（McDadeら、J. Surg. Res.、83、56-61 1999）においてアポトーシスを誘導することができた。サリチル酸をメンバーとする薬剤ファミリー、非ステロイド性抗炎症薬類（ＮＳＡＩＤ）は、強力な化学的予防活性を有する（Morgan、Gut.、38、646-648 1996;Pelegら、Dig. Dis. Sci.、41、1319-1326 1996;Vainioら、Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.、6、749-753、1997）。
【０００８】
環境上及び発達上の変化に応答する多くの植物遺伝子は、オクタデカノイド経路によりリノレン酸から派生するジャスモン酸によって調整される。特定の波長の紫外線放射に対する植物の防衛反応には、オクタデカノイド防衛シグナル経路を活性化する必要がある（Conconiら、 Nature、 383、826-829、1996）。細胞膜から細胞内へのリノレン酸の放出、及びそれに続くリノレン酸のＪＡへの転化は、哺乳動物細胞におけるシグナル経路に類似する。シグナル経路においては、細胞膜からのアラキドン酸の放出によって、プロスタグランジン類などのエイコサノイド類の合成が起こる（Needlemanら、Ann. Rev. Biochem.、 55、69-102 1986）。シクロペンタノン環状構造を含むＡ型及びＪ型のプロスタグランジン類は、試験管内での細胞増殖を阻害する強力な阻害剤であり、生体内での腫瘍発生能を抑制することができる（D'Onofrioら、Int. J. Cancer.、51、481-488、 1992; Gorospeら、 Mol. Cell. Biol.、 16、 762-770、 1996）。その多種多様な範囲の腫瘍細胞株において成長を阻止する能力により、プロスタグランジン類は、ヒト癌治療に有用である可能性が高まっていた（Sasaki及びFukushima、 Anti-Cancer Drugs、 5、 131-138、 1994）。ジャスモネート類とプロスタグランジン類は、共にシクロペンタノン類（cyclopentanons）であることから構造上類似しており、このことは、ＪＡ及びＭＪが癌細胞に対して強力である可能性を示唆している。
【０００９】
本発明は、主要なタイプのヒト悪性腫瘍を代表する哺乳動物癌細胞を抑制し殺生するための、「ジャスモネート類」と呼ばれる植物ストレスホルモンファミリーのメンバーの使用を開示している。出願人が知る限りでは、ジャスモネート類はこれまで、制癌剤としては検討されなかった。哺乳動物の身体に使用される化学療法薬は、通常、癌細胞におけるアポトーシスの誘導によって効き目を表し（Baillyら、 Leukemia.、 11、 1523-1532、 1997）、ジャスモネート類は、植物ストレスに対するアポトーシス反応に関係するものであると考えられている。そこで、出願人は、ジャスモネート類の、臨床的に重要な哺乳動物の癌細胞株の複製を抑制する能力を検査した。ジャスモネート類の細胞毒性は、哺乳動物の癌細胞に対して細胞毒性があることが知られている、植物ストレスホルモン、サリチル酸ナトリウムのそれと比較された。
【００１０】
化学療法薬は非常に毒性が強いため、患者の生活の質を著しく低下させ、その機能を損なわせる多くの副作用をもたらすことが多い。化学療法養生法は数ヶ月間続き、再発した場合には繰り返し行われる可能性があり、寝たきりでない患者にまで、部分的に機能が損なわれる期間を繰り返しもたらす。従って、その効能を低下させずに、悪性腫瘍細胞に対する高い特異性を有し、副作用が少ない化学療法薬が必要である。本発明は、悪性腫瘍治療を目的とするジャスモネート化合物の使用を開示している。ジャスモネート類は、一般に、トマト、ジャガイモ、カボチャの種等の多くの食用植物に微量に含まれており（Sembdner及びParthier、 Annu. Rev. Physiol. Plant Mol. Biol.、 44、 569-589 1993）、従って無害である。出願人は、ジャスモネート類が、臨床的に重要なタイプの癌細胞においてアポトーシスを誘導し、しかも健康なリンパ球等の正常なヒト細胞の増殖を引き起こさないことから、非常に特異であるということを示した。更に出願人は、ジャスモネート類が、マウスの癌モデルにおけるリンパ腫の治療に有効であることを示した。
【００１１】
本発明は、悪性腫瘍細胞に対する高い特異性を有する、強力な化学療法薬としてのジャスモネート化合物を提案することを目的とする。以下に、これらを含む本発明の他の目的を、好ましい実施形態の詳細な説明からより明らかにする。
【００１２】
本発明において、「ジャスモネート類」という語は、ジャスモン酸及びジャスモンの全ての天然または合成の誘導体及び異性体に加え、天然植物ホルモン類であるジャスモン酸及びジャスモン酸メチルエステルを含むことを意図している。これらの誘導体は：
１）Ｃ3に低級アシル側鎖（遊離酸またはエステルまたは複合体（conjugate））、
２）Ｃ6炭素にケトまたはヒドロキシ（遊離ヒドロキシまたはエステル）部分、
３）Ｃ7にｎ−ペンテニルまたはｎ−ペンチル側鎖を有する。
【００１３】
様々なジャスモネート類を使用することができ、そのようなジャスモネート類は、以下の式：
【００１４】
【化３】
2004525163.tif 000002
を有するものを含むが、それらに限定されない。
【００１５】
前記式中、ｎは０、１、または２；
Ｒ1はＯＨ、アルコキシ、Ｏ−グルコシルもしくはイミノ、
Ｒ2はＯＨ、Ｏ、アルコキシもしくはＯ−グルコシル、
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、Ｈ、ＯＨ、アルコキシもしくはＯ−グルコシル、
ならびに／またはＲ1及びＲ2、もしくはＲ1及びＲ4は一緒になってラクトンを形成し、及び更にＣ3：Ｃ7、Ｃ4：Ｃ5及びＣ9：Ｃ10間は二重結合もしくは単結合であってもよい。
【００１６】
（本発明の要旨）
本発明は、哺乳動物における癌の治療に有用な医薬組成物に関し、前記医薬組成物は、有効成分として、治療的に有効な量の、式Ｉ：
【００１７】
【化４】
2004525163.tif 000003
［前記式中、ｎは０、１、または２；
Ｒ1は、ＯＨ、アルコキシ、Ｏ−グルコシルもしくはイミノ、
Ｒ2は、ＯＨ、Ｏ、アルコキシもしくはＯ−グルコシル、
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、Ｈ、ＯＨ、アルコキシもしくはＯ−グルコシル、
ならびに／またはＲ1及びＲ2、もしくはＲ1及びＲ4は一緒になってラクトンを形成し、及び更にＣ3：Ｃ7、Ｃ4：Ｃ5及びＣ9：Ｃ10間は二重結合または単結合であってもよい］
で表されるジャスモネート化合物または前記式で表される誘導体を含み、前記誘導体は、Ｃ3に低級アシル側鎖（遊離酸またはエステルまたは複合体）、Ｃ6炭素にケトもしくはヒドロキシ（遊離ヒドロキシまたはエステル）部分またはＣ7にｎ−ペンテニルもしくはｎ−ペンチル側鎖のうち少なくとも１つを有する。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記ジャスモネートは、ジャスモン酸メチルエステル、ジャスモン酸、ジャスモン、７−イソ−ジャスモン酸、９，１０−ジヒドロジャスモン酸、２，３−ジデヒドロジャスモン酸、３，４−ジデヒドロジャスモン酸、３，７−ジデヒドロジャスモン酸、４，５−ジデヒドロジャスモン酸、４，５−ジデヒドロ−７−イソ−ジャスモン酸、ククルビン酸、６−エピ−ククルビン酸、６−エピ−ククルビン酸−ラクトン、１２−ヒドロキシ−ジャスモン酸、１２−ヒドロキシ−ジャスモン酸−ラクトン、１１−ヒドロキシ−ジャスモン酸、８-ヒドロキシ−ジャスモン酸、ホモ−ジャスモン酸、ジホモ−ジャスモン酸、１１−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、８−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、ツベロン酸、ツベロン酸−Ｏ-β−グルコピラノシド、ククルビン酸−Ｏ−β−グルコピラノシド、５，６−ジデヒドロジャスモン酸、６，７−ジデヒドロジャスモン酸、７，８−ジデヒドロジャスモン酸、シス−ジャスモン、メチルジヒドロイソジャスモネート、ジヒドロジャスモン, ジャスモン酸のアミノ酸複合体、及びそれらの低級アルキルエステル類、キャリアリガンド複合体及び立体異性体（sterioisomers）から選択される。
【００１９】
また、本発明の好ましい実施形態によれば、治療対象である前記癌は、前立腺癌、乳癌、皮膚癌、 結腸癌、肺癌、膵臓癌、リンパ腫、白血病、頭頚部癌、腎臓癌、卵巣癌、骨癌、肝臓癌または甲状腺癌から選択される。
【００２０】
更に、本発明の好ましい実施形態によれば、前記有効成分は、許容されうる任意の脂質キャリアに溶解されている。
【００２１】
更にまた、本発明の好ましい実施形態によれば、前記組成物は更に、少なくとも１種類の他の化学治療剤を含む。
【００２２】
更に、本発明の好ましい実施形態によれば、前記組成物は、経口投与用に調製される。このような実施形態において、前記組成物は、乳剤、液剤、カプセル剤、錠剤から選択される形態である。
【００２３】
本発明の別の実施形態において、前記組成物は、注射による投与用に調製される。前記組成物は、筋内、腹膜内、または静脈注射に適するように調製される。
【００２４】
更にまた、特定の実施形態において、前記組成物は、局部投与用に調製される。これらの実施形態によれば、前記組成物は、軟膏、ゲル、またはクリームから選択される形態である。
【００２５】
更に、本発明の一部の実施形態において、前記組成物は、吸入による投与用に調製される。他の実施形態において、前記組成物は、坐剤を介する投与用に調製される。
【００２６】
本発明には更に、治療的に有効な量の、式Ｉ：
【００２７】
【化５】
2004525163.tif 000004
［前記式中、ｎは０、１、または２；
Ｒ1は、ＯＨ、アルコキシ、Ｏ−グルコシルもしくはイミノ、
Ｒ2は、ＯＨ、Ｏ、アルコキシもしくはＯ−グルコシル、
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、Ｈ、ＯＨ、アルコキシもしくはＯ−グルコシル、
及び／またはＲ1及びＲ2、もしくはＲ1及びＲ4は一緒になってラクトンを形成し、及び更にＣ3：Ｃ7、Ｃ4：Ｃ5及びＣ9：Ｃ10間は二重結合もしくは単結合であってもよい］
で表されるジャスモネート化合物もしくは前記式で表される誘導体
［前記誘導体は、Ｃ3に低級アシル側鎖（遊離酸またはエステルまたは複合体）、Ｃ6炭素にケトまたはヒドロキシ（遊離ヒドロキシまたはエステル）部分またはＣ7にｎ−ペンテニルまたはｎ−ペンチル側鎖のうち少なくとも１つを有する。］
【００２８】
またはその医薬的に許容される塩の、哺乳動物における前立腺癌、乳癌、皮膚癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、リンパ腫、白血病、頭頚部癌、腎臓癌、卵巣癌、骨癌、肝臓癌または甲状腺癌の治療に有用な医薬組成物の調製における使用が開示されている。
【００２９】
本発明を、単に例示として、添付の図面を参照して説明する。表１は、４タイプの悪性腫瘍細胞株について、ジャスモン酸、ジャスモン酸メチルエステル及びサリチル酸によってもたらされた毒性レベルを比較したものである。
【００３０】
（発明の詳細な説明）
以下の詳細な説明は、特定の本発明の好ましい実施形態を説明することのみを意図していることを確認する。決して、クレームに記載されている、本発明の範囲を制限することを意図するものではない。
【００３１】
本発明は、悪性腫瘍細胞の増殖防止及び死誘導を目的とするジャスモネート類の使用を説明するものである。
【００３２】
特に好ましいジャスモネート類としては、ジャスモン酸［（−）−ＪＡ及び／または（＋）−７−イソ−ＪＡ］、ジャスモン酸メチルエステル、ジャスモン、及び９，１０−ジヒドロジャスモン酸及びその低級アルキルエステルが挙げられる。他の好ましいジャスモネート類としては、４，５−ジデヒドロ−７−イソ−ＪＡ、３，７−ジデヒドロ−ＪＡ、ククルビン酸（ＣＡ）、６−エピ−ＣＡ、６−エピ−ＣＡ−ラクトン、１２−ヒドロキシ−ＪＡ、１２−ヒドロキシ−ＪＡ−ラクトン、１１−ヒドロキシ−ＪＡ、８−ヒドロキシ−ＪＡ、ホモ−ＪＡ、ジホモ−ＪＡ、１１−ヒドロキシ−ジホモ−ＪＡ、８−ヒドロキシ−ジホモ−ＪＡ、ツベロン酸（ＴＡ）、ＴＡ−Ｏ−β−グルコピラノシド、ＣＡ−Ｏ−β−グルコピラノシド、ＪＡのアミノ酸複合体、加えて、これらの酸それぞれに対応する低級アルキルエステル類が挙げられる。
【００３３】
出願人は以下に、２種類のジャスモネート類、ジャスモン酸メチルエステル及びジャスモン酸が、正常な循環系リンパ球等の正常な細胞には無害であり、しかも悪性腫瘍細胞に対して積極的な治療作用を有することを立証した。以下の実施例は、ジャスモネート類が、哺乳動物において安全で達成可能であると考えられるであろう用量において、培養された異なる４タイプの悪性腫瘍細胞に細胞毒性を有し、健康なリンパ球の成長を阻害しないことを実証するものである。更に出願人は、実施例７において、ジャスモネート類が、リンパ腫細胞を注射されたマウスの寿命を延ばすのに有効であり、それによって、未処理のマウスよりも著しく高い生存率がもたらされることを立証した（生存したマウスの数は、未処理グループの２．２５倍）。
【００３４】
実施例１−植物ストレスホルモン類は４タイプのヒト形質転換細胞株に対して細胞毒性を有する。
【００３５】
組織構造系統が異なる４タイプの形質転換細胞株に、３種類の植物ストレスホルモン類の１つを適用した。選ばれた細胞株は、臨床学的重要性を有する一般的な４タイプの癌を代表するものである。Ｍｏｌｔ−４は、ヒト急性Ｔリンパ球性白血病細胞株であり、ＳＫ−２８は、ヒト黒色腫細胞である。ＬＮＣａＰは、アンドロゲン応答型ヒト前立腺癌細胞株であり、ＭＣＦ７は、ヒト乳癌細胞株である。細胞株は全て、ＡＴＣＣ（Rockville、 MD）から購入した。試薬は全て、特に断らない限り、シグマケミカルズ（Sigma Chemicals）（St. Luise、 MO）から購入した。ＪＡ及びＭＪは、エタノールに溶解させた。細胞培養は全て、１０％ウシ胎仔血清（Biological Industries、 Beit-Haemek、 Israel）を含有するＲＰＭＩ−１６４０内で行い、細胞（末梢血液からのＭｏｌｔ−４及びリンパ球を除く）は、下記のそれぞれの治療に先立って付着させた。
【００３６】
ＬＮＣａＰ、ＭＣＦ７及びＳＫ−２８細胞（４×１０3個／ウェルにて）及びＭｏｌｔ−４細胞（１．５×１０4個／ウェルにて）は、９６−ウェルプレートに播種し、一晩培養した。以下に示すように、植物ストレスホルモンを濃度を上げながら加え、２４時間後、セルタイター水溶性非放射性細胞増殖アッセイ（CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay）（Promega、 Madison、 WI）；生存可能な細胞が着色生成物を生成するアッセイ（このアッセイのプロトコルについての詳細は以下を参照）を用いて毒性を計測した。生成された色素の量をＥＬＩＳＡリーダーを用いて読み取るため、このアッセイは定量的である。
【００３７】
非ステロイド性抗炎症薬ＳＡの、ヒトに使用される、非毒性薬理学的最高濃度は、およそ３ｍＭである（Katzung、Lange Medical Book、 Stamford、 1998）。添加された植物ストレスホルモン類ＪＡ（ジャスモン酸）及びＭＪ（ジャスモン酸メチルエステル）とＳＡとを比較するため、同じ濃度範囲（０．５〜３ｍＭ）が選ばれた。上記濃度におけるこれらの化合物は、マウスに対して毒性を有しない。それぞれの細胞株を、０．５〜３ｍＭの範囲の濃度におけるこれらホルモンのそれぞれを用いて２４時間培養し、その後、細胞毒性を計測した。各結果の統計的重要性を、両側スチューデントのｔ検定、ｎ＝３により（適宜）測定した。各結果を±標準偏差で表す。
【００３８】
図１に関し、３種類の植物ホルモンのそれぞれについての細胞毒性を、その濃度を基準としてプロットしている。
【００３９】
菱形  ＝  Ｍｏｌｔ−４急性リンパ球性白血病細胞；
正方形  ＝  ＳＫ２８黒色腫細胞；
三角形  ＝  ＬＮＣａＰアンドロゲン反応型前立腺癌細胞、
丸  ＝  ＭＣＦ７乳癌細胞。
【００４０】
図１Ａに関し、全ての細胞株が、ＳＡに対し、投与量依存的に反応した。ＳＡの細胞毒性は、Ｐ＜０．０５の場合、Ｍｏｌｔ−４急性リンパ球性白血病細胞、ＳＫ２８黒色腫細胞及びＭＣＦ７乳癌細胞では全ての濃度において、ＬＮＣａＰヒト前立腺癌細胞では１ｍＭ以上で著しいものであった。ここで、ＳＡは、細胞株に依存して、異なる癌細胞の細胞増殖を２０から４０％阻害することが分かった。このことは、ＳＡが、乳癌細胞株、ラット肝癌及びヒト繊維芽細胞培養菌の成長を阻害したという、同様の報告観察記録（Sotiriouら、 Anticancer Res.、 19、 2997-3006 1999; Hialら、 J. Pharmacol. Exp. Ther.、 202、 446-454 1977）と一致している。このデータは、ＳＡが癌細胞内にストレスを引き起こし、それによって、それらの細胞における増殖が抑制されると解釈することができる。
【００４１】
癌細胞に対するＳＡの作用が植物ストレスホルモン類に共通のものなのかどうか、及びジャスモネート類が、悪性腫瘍細胞の成長を対象とし、阻害することにおいて、サリチル酸よりもより有効であると考えられるのかどうかを確認するため、ＳＡと比較してＪＡ及びＭＪを検討した。
【００４２】
図１Ｂに関し、ＪＡに対する反応性は投与量依存的であった。ＪＡの細胞毒性は、Ｐ＜０．０５の場合、Ｍｏｌｔ−４細胞では１ｍＭ以上、ＬＮＣａＰ及びＳＫ２８細胞では２ｍＭ以上、ＭＣＦ７細胞では３ｍＭで著しいものであった。感度は、Ｍｏｌｔ−４＞ＳＫ−２８＞ＬＮＣａＰ＞ＭＣＦ７の順であった。
【００４３】
図１Ｃに関し、ＭＪの細胞毒性は、Ｐ＜０．０１の場合、Ｍｏｌｔ−４細胞では全ての濃度において、ＭＣＦ７細胞では３ｍＭにおいて著しく；そしてＰ＜０．０５の場合、ＬＮＣａＰ及びＳＫ２８細胞では２ｍＭ以上で著しいものであった。
【００４４】
ここに示された結果により、ＭＪが最高レベルの細胞毒性をもたらしたことが分かった。例えば０．５ｍＭにおけるＭＪは、Ｍｏｌｔ−４細胞において８７．５２％の細胞毒性を誘導した。他の細胞株は、投与量依存的にＭＪに反応した。感度は、Ｍｏｌｔ−４＞ＬＮＣａＰ＞ＳＫ２８＞ＭＣＦ７の順であった。
【００４５】
（ＪＡ及びＭＪが溶解されている）エタノール自体が細胞毒性を誘導することがないよう、適切な制御が行われた。
【００４６】
実施例１は、由来の異なる癌細胞が、植物ストレスホルモン類に応答したが、その反応に差異があったことを実証している。検討した細胞株の内、Ｍｏｌｔ−４は、ＪＡ（３ｍＭにおいて９０％の細胞毒性）及びＭＪ（０．５ｍＭにおいて９０％の細胞毒性）に対して強い反応を示した。
【００４７】
実施例において用いられた細胞毒性アッセイ
セルタイター水溶性非放射性細胞増殖アッセイ（Promega、 Madison、 WI）により、細胞増殖の阻害性が測定された：所定の実験終了と同時に、ＭＴＳ（テトラゾリウム化合物）３３３μｇ／ｍｌ＋フェナジンメト硫酸（methosulfate）塩（２５μＭ）を、３７℃で１時間、９６−ウェルプレートの各ウェルに加えた。これによって、デヒドロゲナーゼ類が代謝活性細胞内のＭＴＳを減少させる呈色反応を顕出できた。ＭＴＳの添加前に細胞を洗浄しなかったため、問題となる可能性があった、潜在的に疎結合である付着性細胞または非付着性細胞はなかった。ＣＥＲＥＳ  ９００  ＨＤＩ  ＥＬＩＳＡリーダー（Bio-Tek Instruments, Inc、 Highland Park、 VT）を用い、波長４９０ｎｍにおいて、可溶性ＭＴＳホルマザン生成物を計測した。光学密度は、培養内の生細胞の数に正比例する。細胞毒性（％）の計算は以下のように行った：［（対照細胞のＯＤ−薬剤処理細胞のＯＤ）／対照細胞のＯＤ］×１００。
【００４８】
実施例２−更なるジャスモネート化合物であるシス−ジャスモンは３タイプのヒト形質転換細胞株に対して細胞毒性を有する。
【００４９】
実施例１において説明した細胞株の内、３タイプの形質転換細胞株に、（ＪＡ及びＭＪに加えて）更なるジャスモネート化合物であるシス−ジャスモンを適用し、その癌細胞株に対する細胞毒性を検討した。実験は、実施例１に説明したように行った。
【００５０】
図２に関し、シス−ジャスモンは、投与量依存的に細胞に影響を及ぼす強力な細胞毒性剤である。用いられた全ての濃度において（ｔ検定によって求められた統計学的重要性をＰ＜０．０１とした場合）、シス−ジャスモンの各細胞株に対する作用は著しいものであった。唯一、重要でないと考えられたのは、シス−ジャスモンを、用いられた最小用量である０．５ｍＭでＬＰＣａＰ細胞に加えた場合の計測結果であった。シス−ジャスモンを２ｍＭ以上の濃度で加えた場合、検討された全ての細胞株において、細胞毒性は細胞の５０％を超えた。用いられた最高濃度において、シス−ジャスモンは、各プレート内の７５〜８５％の形質転換細胞に対して細胞毒性を示した。
【００５１】
実施例３−ジャスモネート類によって誘導される損傷の特徴について
最初に細胞を各ウェルに同数ずつ等分したので、処理細胞（上記）を含むウェルにおいて計測される光学密度の低下が、細胞死及び／または増殖率の低下を反映する。これらの２つの可能性を区別するため、トリパンブルー色素排除を行わないことから細胞死であることを検知する更なる細胞毒性アッセイを用いた。細胞を、０．１％のトリパンブルーを用いて２〜５分間培養し、死細胞（色素を排除しなかったもの）の比率を顕微鏡を用いて測定した。
【００５２】
表１に関し、検査された植物ホルモン類の内、ＭＪは、各細胞株において最も効果的に死を誘導した。ＭＪは、その非メチル化形態であるＪＡよりも、ヒト形質転換細胞株を殺すのにより効果的である（図１Ｂ、１Ｃ及び表１）。ＳＡは全ての細胞株において増殖を抑制し、一方、ＪＡは急性リンパ球性白血病細胞において死を誘導し、他の細胞においては増殖抑制を誘導した。相対感度については、Ｍｏｌｔ−４細胞の次にＳＫ２８、ＬＮＣａＰ及びＭＣＦ７細胞がその順に続く。細胞株の違いにより、植物ストレスホルモンに対する感度に差異があることは、それらの化合物の各細胞に対する影響の特異性を示唆している。
【００５３】
ＳＡとジャスモネート類との間の、癌細胞株に対する影響の違いに注目することは重要である。ＳＡは、検査された各細胞株において細胞増殖抑制を引き起こし、ＪＡは、Ｍｏｌｔ−４細胞において細胞死、及びＳＫ２８、ＬＮＣａＰ及びＭＣＦ７細胞において細胞増殖抑制を引き起こし、一方、ＭＪは全ての細胞株において死を引き起こす。これらの違いは、植物ストレスホルモン類の構造の相違及び／またはそれらの化合物が細胞において誘導する生化学的事象の違いによって説明がつくであろう。
【００５４】
実施例４−ジャスモネート類はＭｏｌｔ−４細胞においてアポトーシスを誘導する。
【００５５】
高レベルのカスパーゼ−３は、アポトーシスプロセスの特異なマーカーである（Porter及びJanicke、 Cell Death Differ.、 6、 99-104、 1999）。細胞死の原因がアポトーシスであったことを明確に確認するために、ＪＡ及びＭＪで処理後の細胞において、カスパーゼ−３の活性レベルを計測した。
【００５６】
Ｍｏｌｔ−４細胞を、ＪＡ及びＭＪを用いて２、４及び１４時間培養し、アポトーシスを介するプロテアーゼであるカスパーゼ−３の活性レベルを、メーカーの提案に従い、カスパーゼ−３（ＣＰＰ３２）プロテアーゼアッセイキット（PharMingen、San Diego、CA）を用いて測定した。簡潔に述べると、２×１０6個の細胞を、蛍光原カスパーゼ−３（ＣＰＰ３２）基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣを含有する１００μＬの反応バッファー中で溶解させ、再浮遊させた。反応は、３７℃で２時間培養し、試料は３６０ｎｍの励磁波長及び４６０ｎｍの発光波長において、ＦＬ６００蛍光マイクロプレートリーダー（Bio-Tek Instruments、 Winooski、 Vermont、 USA）内でアッセイした。
【００５７】
図３に関し、カスパーゼ−３活性の投与量依存性の向上が観察された：
（菱形  ＝  ２時間、
正方形  ＝  ４時間、
三角形  ＝  １４時間。）
図３において分かるように、ＪＡ及びＭＪは、Ｐ＜０．０５の場合、全ての濃度及び時間において著しいカスパーゼ−３活性の増加を示した。
【００５８】
図３Ａに関し、ＪＡを用いた２時間の培養によっては、カスパーゼ−３のレベル向上は誘導されなかった。
【００５９】
図３Ｂに関し、ＭＪを１４時間適用後、１ｍＭ以上における死は、カスパーゼ−３活性の測定が不可能である程度のものであった。
【００６０】
これらの結果から、ＪＡ及びＭＪがＭｏｌｔ−４細胞においてアポトーシス死を誘導したことが示唆された。この事実を確証するため、Ｍｏｌｔ−４細胞を、ＪＡ（２ｍＭ）及びＭＪ（０．５ｍＭ）で１４時間処理し、クロマチンの凝集及び断片化のような、アポトーシスの極めて重要な形態学的特徴を検知するために、蛍光顕微鏡により分析した。
【００６１】
図４に関し、植物ストレスホルモンであるＪＡまたはＭＪで処理後、Ｍｏｌｔ−４細胞の核内の細胞形態学的変化を表す蛍光顕微鏡像が示されている。５×１０5個／試料の細胞を採取し、その後１時間、［３％パラホルムアルデヒド及び０．１％トリトンＸ−１００］を含有する燐酸緩衝塩水（ＰＢＳ）を加えることにより固定した。細胞はＤＡＰＩ（１μｇ／ｍｌ）で１０分間染色した。核を、蛍光顕微鏡により（日本国、オリンパス光学工業株式会社製、Ａ×７０  ＴＲＦ型の蛍光顕微鏡を用いて）１：４００の倍率で分析した。特徴的なアポトーシス核を矢印で示している。
【００６２】
図４Ａに関し、未処理Ｍｏｌｔ−４細胞が示されている。
【００６３】
図４Ｂに関し、Ｍｏｌｔ−４細胞を、２ｍＭのＪＡで１４時間処理した。ＪＡを用いた処理により、クロマチンの凝集及び断片化が誘導された。
【００６４】
図４Ｃに関し、Ｍｏｌｔ−４細胞を、０．５ｍＭのＭＪで１４時間処理した。ＭＪを用いた処理により、略全ての細胞内の核形態構造が完全に破壊された。
【００６５】
これらの結果は、アポトーシスの特徴の１つであるカスパーゼ−３活性の上昇、及び特徴的な形態学的変化に基づいて、ＪＡ及びＭＪが、Ｍｏｌｔ−４細胞においてアポトーシス死を引き起こしたことを確証するものである。
【００６６】
ＳＡは、骨髄性白血病細胞株及びＢ細胞性慢性リンパ球性白血病細胞においてアポトーシス及びカスパーゼの活性化を誘導すると報告された。また、ＳＡがアポトーシスを増進し、ＦＳ−４細胞においてｐ３８を介してアポトーシスを引き起こすという事実がある（Schwengerら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、 4、 2869-2873、 1997）。それらの検討においては、炎症性疾患で処理されている患者の血漿において得られるよりも高い濃度のサリチル酸塩類を用いた培養によって、異なった細胞株にアポトーシスが起こる。本発明では、血漿において得られる濃度に匹敵するサリチル酸塩類の濃度を用いた。このことにより、ＳＡがアポトーシスを誘導した検討と我々の結果との間の相違を説明することができる。
【００６７】
実施例５−ジャスモネート類は正常なリンパ球には無害である
上記の結果により、植物ストレスホルモンが、癌細胞を脅かす能力を有することが立証される。ジャスモネート類が非癌細胞に対してもそれを脅かす細胞毒性を有しているのかどうかを確認するために、これらの植物生成物の作用を正常な細胞について検査した。
【００６８】
正常なリンパ球を、以下のように末梢血液から分離した：健康なドナーの静脈血から単核細胞（ＭＮＣ）をフィコール−ハイパック（Ficoll-Hypaque）（Phamacia Fine Chemicals、 Uppsala、 Sweden）密度勾配遠心により採取した。得られた単核細胞調製物を、汚染物質であるマクロファージを取り除くためにプラスチック皿に付着させた。その非付着性末梢血液リンパ球を用いた。
【００６９】
ＪＡ及びＭＪでの処理に先立ち、リンパ球の増殖を引き起こすために（そしてそれにより悪性腫瘍不死化細胞と比較できるように）、正常なリンパ球にＴＰＡ（５ｎｇ／ｍｌ）及びＰＨＡ（０．８μｇ／ｍｌ）により４８時間、刺激を与えた。正常なリンパ球及びＭｏｌｔ−４細胞を、（１．５×１０4個／ウェルにて）９６−ウェルプレート内に播種した。
【００７０】
ジャスモネート類またはサリチル酸を１ｍＭまたは３ｍＭの濃度で加え、細胞を２４時間培養した。生存可能な細胞に対応する光学密度を、セルタイター水溶性非放射性細胞増殖アッセイにより測定した。
【００７１】
各植物ストレスホルモンは、Ｐ＜０．０５の場合、Ｍｏｌｔ−４細胞において著しい細胞毒性を誘導したが、一方、正常なリンパ球において著しい細胞毒性を誘導したホルモンはなかった。
【００７２】
図５に関し、Ｍｏｌｔ−４形質転換急性リンパ球性白血病細胞（白抜きの棒で表されている）とは対照的に、正常な血液リンパ球（塗りつぶされた棒で表されている）は実質的に植物ストレスホルモンの影響を受けなかった。
【００７３】
図５Ａは、１ｍＭ及び３ｍＭの濃度のＳＡでの処理を表している。
【００７４】
図５Ｂは、１ｍＭ及び３ｍＭの濃度のＪＡでの処理を表しており、図５Ｃは、１ｍＭ及び３ｍＭの濃度のＭＪでの処理を表している。
【００７５】
表１も、健康な細胞ではなく、悪性腫瘍細胞に対して示されるジャスモネート類の選択性を表している。
【００７６】
この実施例において、植物ストレスホルモンの形質転換リンパ球（Ｍｏｌｔ−４細胞）へ影響を、末梢血液から抽出された正常なリンパ球へ影響に対して比較した。（増殖を誘導するためＴＰＡ／ＰＨＡによって刺激を受けている）正常なリンパ球は、形質転換リンパ球とは対照的に、ＳＡ及びジャスモネート類によって影響を受けなかった。このデータは、選択性のある制癌剤としての植物ストレスホルモンの使用の可能性を裏付けるものである。
【００７７】
実施例６−ジャスモネート類は正常な赤血球には無害である
ジャスモン酸、ジャスモン酸メチルエステル及びシス−ジャスモンの作用を、正常なヒト赤血球について検討した。その目的のため、ヘモグロビンの放出により赤血球への損傷を評価するアッセイが確立された。後者を、４１２ｎｍにおいて分光測定法により計測した。完全溶血を誘導し、ヘモグロビンの放出を引き起こすために、実際の対照として蒸留水を用いた。ジャスモネート類は何れも、異なる３人のドナーの正常なヒト赤血球からのヘモグロビン放出を引き起こさなかった。これは、ジャスモネート類が、癌細胞において細胞毒性作用を引き起こす濃度（０．５〜３ｍＭ）で加えられた場合の結果であった。従って、ジャスモネート類は、正常なヒトリンパ球に（実施例５に示したように）無害であることに加え、赤血球に対しても無害であり、癌細胞に対する選択的作用を更に示している。
【００７８】
実施例７−マウスにおける生体内実験
同質遺伝子のリンパ腫細胞を、マウス（Ｃ５７ＢＬ系）の検査グループ及び対照グループに注射した。注射は皮下注射または腹膜内注射の何れかにより行われた。ジャスモン酸メチルエステルを経口投与、得られた腫瘍内または腹膜内に直接注射し、腫瘍の進行及び生存率に対する作用を分析した。
【００７９】
４００，０００個のＥＬ−４リンパ腫細胞を、Ｃ５７ＢＬ株の、２０個体の検査マウス、または１９個体の対照マウスに腹膜内注射した。
【００８０】
予備実験の結果、体重に対して２３６〜４７２ｍｇ／ｋｇの用量のジャスモン酸メチルエステルであれば、腫瘍の成長を防止するのに適当であることが分かっている。そこで、ジャスモン酸メチルエステルを脂質キャリア（ドイツ国、B. Brown、 Melsunger製、０．４％リポフンディン）中に溶解し、体重に対して２３６ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与した。投与は、リンパ腫細胞を注射した日から始まって毎日、水を飲むことによって行われた。
【００８１】
１９個体の対照マウスには、ジャスモン酸メチルエステルを溶解していない脂質キャリア（０．４％リポフンディン）のみを与えた。
【００８２】
各グループのマウスの生存時間（日）を計測し、分析した。
【００８３】
図６に関し、実験の進行に応じた各グループにおける生存累積比率を示すカプラン−マイヤー生存関数グラフが示されている。対照グループ（丸及び文字「Ｃ」で表されている）に対して、処理グループ（十字及び文字「Ｔ」で表されている）は著しく高い生存率を示した；これは例えば、対照グループが達成した生存率２０％のプラトー部に対して、第３３日目に処理グループが達成した生存率５０％のプラトー部において見られる。
【００８４】
これらの結果の重要性を、ログ−ランク検定（Log-Rank Test）及びコックス−マンテル検定（Cox-Mantel Test）の２つの非常に厳密な統計分析手段を用いて、統計的に分析した。これらの検定はそれぞれ、所定の日に、生存マウスの全体的な数と比較して、２つのマウスグループの内の１つについて死の重要性の数値的な比較検討を行うものである。
【００８５】
ログ−ランク検定についてはＰ＝０．０１４９２の場合、コックス−マンテル検定についてはＰ＝０．００９５３の場合（Ｐ＜０．０５の場合に結果が重要であると見なされる時）に結果の重要性が高いと考えられた。
【００８６】
結論として、実施例１〜７は、構造が異なる植物ストレスホルモン類である、ジャスモネート類及びサリチル酸塩の、数タイプの異なる癌細胞株における細胞増殖及び生存能力に対する作用を説明するものである。主に４つの発見があった。第１に、検査された全てのストレスホルモンが、癌細胞の増殖を脅かす能力を共通に有していることである。ジャスモン酸（ＪＡ）は、急性リンパ球性白血病細胞に死を誘導し、他の上記のヒト癌細胞において細胞増殖の抑制を引き起こした。ジャスモン酸メチルエステル（ＭＪ）は、各細胞株において死を誘導した。植物ホルモン類は、投与量依存的に以下の順の感度で作用した：急性リンパ球性白血病＞前立腺癌＞黒色腫＞乳癌。第２に、ジャスモネート類がＭｏｌｔ−４細胞に引き起こした死は、ほとんどの化学療法薬が細胞レベルで用いるメカニズムと同様の、アポトーシスとして確認されたことである。第３に、ジャスモネート類は、正常のリンパ球または赤血球に対しては損傷を引き起こさないことである。第４に、ジャスモネート類は、試験管内においてのみならず、リンパ腫の動物モデルにおいても、マウスにおいて安全であると考えられる用量を用いて、著しく生存率を延ばし（２．２５倍）、有効であるということである。
【００８７】
これらの発見は、植物ストレスホルモン類の、新規なクラスの制癌薬剤としての使用の可能性を示唆している。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１は、濃度を基準として、サリチル酸と比較した、植物ホルモンであるジャスモン酸メチルエステル及びジャスモン酸の細胞毒性を表すグラフである。
【図２】図２は、濃度を基準として、植物ホルモンであるシス−ジャスモンの細胞毒性を表すグラフである。
【図３】図３は、ジャスモン酸及びジャスモン酸メチルエステルで処理されたＭｏｌｔ−４細胞における、アポトーシスマーカータンパク質カスパーゼ−３の活性レベルを表すグラフである。
【図４】図４は、ジャスモン酸及びジャスモン酸メチルエステルで処理後の、Ｍｏｌｔ−４細胞の形態構造におけるアポトーシス変化を表す蛍光顕微鏡像を表す。
【図５】図５は、ジャスモネート類の細胞毒性作用が、健康なドナーからの正常なリンパ球には及ぼされないのに対して、悪性腫瘍細胞には及ぼされるという特異性を表すグラフである。
【図６】図６は、未処理マウスに対して、リンパ腫形成防止を目的としてジャスモネート類で処理したマウスの生存累計比率を表すグラフである。
【図１】
2004525163.tif 000007
【図２】
2004525163.tif 000008
【図３】
2004525163.tif 000009
【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年3月26日(2003.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における癌の治療に有用な医薬組成物であって、有効成分として、治療的に有効な量の、式Ｉ：
【化１】
2004525163.tif 000043
［前記式中、ｎは０、１、または２；
Ｒ1はＯＨ、アルコキシ、Ｏ−グルコシル、もしくはイミノ、
Ｒ2はＯＨ、Ｏ、アルコキシもしくはＯ−グルコシル、
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、Ｈ、ＯＨ、アルコキシもしくはＯ−グルコシル、
ならびに／またはＲ1及びＲ2、もしくはＲ1及びＲ4は一緒になってラクトンを形成し、及び更にＣ3：Ｃ7、Ｃ4：Ｃ5及びＣ9：Ｃ10間は二重結合もしくは単結合であってもよい］
で表されるジャスモネート化合物または、
前記式で表される誘導体を含み、前記誘導体は、Ｃ3に低級アシル側鎖（遊離酸またはエステルまたは複合体）、Ｃ6炭素にケトもしくはヒドロキシ（遊離ヒドロキシまたはエステル）部分、またはＣ7にｎ−ペンテニルもしくはｎ−ペンチル側鎖のうち少なくとも１つを有する医薬組成物。
【請求項２】
前記ジャスモネートが、ジャスモン酸メチルエステル、ジャスモン酸、ジャスモン、７−イソ−ジャスモン酸、９，１０−ジヒドロジャスモン酸、２，３−ジデヒドロジャスモン酸、３，４−ジデヒドロジャスモン酸、３，７−ジデヒドロジャスモン酸、４，５−ジデヒドロジャスモン酸、４，５−ジデヒドロ−７−イソ−ジャスモン酸、ククルビン酸、６−エピ−ククルビン酸、６−エピ−ククルビン酸−ラクトン、１２−ヒドロキシ−ジャスモン酸、１２−ヒドロキシ−ジャスモン酸−ラクトン、１１−ヒドロキシ−ジャスモン酸、８-ヒドロキシ−ジャスモン酸、ホモ−ジャスモン酸、ジホモ−ジャスモン酸、１１−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、８−ヒドロキシ−ジホモ−ジャスモン酸、ツベロン酸、ツベロン酸−Ｏ-β−グルコピラノシド、ククルビン酸−Ｏ−β−グルコピラノシド、５，６−ジデヒドロジャスモン酸、６，７−ジデヒドロジャスモン酸、７，８−ジデヒドロジャスモン酸、シス−ジャスモン、メチルジヒドロイソジャスモネート, ジヒドロジャスモン, ジャスモン酸のアミノ酸複合体、及びそれらの低級アルキルエステル類、キャリアリガンド複合体及び立体異性体から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記有効成分が、許容されうる脂質キャリアに溶解されている請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
更に、少なくとも１種類の他の化学治療剤を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が、経口投与用に調製された請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、乳剤、液剤、カプセル剤、錠剤から選択される形態である請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が、注射による投与用に調製された請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、局部投与用に調製された請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、軟膏、ゲル、またはクリームから選択される形態である請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、吸入による投与用に調製された請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、坐剤を介する投与用に調製された請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
治療的に有効な量の、式Ｉ：
【化２】
2004525163.tif 000044
［前記式中、ｎは０、１、または２；
Ｒ1はＯＨ、アルコキシ、Ｏ−グルコシル、もしくはイミノ、
Ｒ2はＯＨ、Ｏ、アルコキシもしくはＯ−グルコシル、
Ｒ3、Ｒ4及びＲ5は、Ｈ、ＯＨ、アルコキシもしくはＯ−グルコシル、
ならびに／またはＲ1及びＲ2、もしくはＲ1及びＲ4は一緒になってラクトンを形成し、及び更にＣ3：Ｃ7、Ｃ4：Ｃ5及びＣ9：Ｃ10間は二重結合もしくは単結合であってもよい］
で表されるジャスモネート化合物もしくは前記式で表される誘導体
［前記誘導体は、Ｃ3に低級アシル側鎖（遊離酸またはエステルまたは複合体）、Ｃ6炭素にケトもしくはヒドロキシ（遊離ヒドロキシまたはエステル）部分、またはＣ7にｎ−ペンテニルもしくはｎ−ペンチル側鎖のうち少なくとも１つを有する］
またはその医薬的に許容される塩の、
哺乳動物における乳癌、皮膚癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、リンパ腫、白血病、頭頚部癌、腎臓癌、卵巣癌、骨癌、肝臓癌または甲状腺癌の治療に有用な医薬組成物の調製における使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
また、本発明の好ましい実施形態によれば、治療対象である前記癌は、乳癌、皮膚癌、 結腸癌、肺癌、膵臓癌、リンパ腫、白血病、頭頚部癌、腎臓癌、卵巣癌、骨癌、肝臓癌または甲状腺癌から選択される。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
またはその医薬的に許容される塩の、哺乳動物における乳癌、皮膚癌、結腸癌、肺癌、膵臓癌、リンパ腫、白血病、頭頚部癌、腎臓癌、卵巣癌、骨癌、肝臓癌または甲状腺癌の治療に有用な医薬組成物の調製における使用が開示されている。




【国際調査報告】
2004525163.tif 000045
2004525163.tif 000046
2004525163.tif 000047