(57)【要約】本発明は動物細胞用発現ベクターに関する。具体的には本発明は、発現ベクター、ｐＭＳベクター、ｐＳＧベクター及びｐＭＳＧ、ヒトβグロビン５’ＭＡＲ相補性配列または／及びガストリン遺伝子の転写終止部位を含む、ベクターに関する。本発明の発現ベクターを用いる発現系は、種々の動物細胞における組換えタンパク質及び独特の構造及び機能を有する組換えタンパク質の製造に成功する。
2004506428.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
βグロビンＭＡＲ配列またはその相補性配列をプロモーターの５’末端に含んでなる動物細胞用発現ベクター。
【請求項２】
動物細胞用発現ベクターが配列番号１のｐＭＳ　ＫＣＣＭ　１０２０３である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
動物細胞用発現ベクターがｐＭＣである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
ＳＶ４０ウイルスポリＡ（ポリアデニル化）シグナル及びガストリン遺伝子の転写終止部位からなる構築物を含んでなる動物細胞用発現ベクターであって、構築物が配列番号３の配列を有する発現ベクター。
【請求項５】
発現ベクターが配列番号７のｐＳＧである請求項４に記載の発現ベクター。
【請求項６】
ヒトβグロビン５’ＭＡＲ（核マトリックス結合領域）相補性配列、およびＳＶ４０ウイルスポリＡシグナルとガストリン遺伝子の転写終止部位とからなる構築物を含んでなる、配列番号８のｐＭＳＧ　ＫＣＣＭ　１０２０２ベクター。
【請求項７】
請求項１、請求項４及び請求項６に記載の発現ベクターからなる群から選択される発現ベクターから、生理活性物質を動物細胞において調製する方法。
【請求項８】
生理活性物質が請求項６に記載の発現ベクターから調製されるＴＧＦ−β　ＳＲＩＩである、請求項７に記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（ａ）発明の分野
本発明は動物細胞用発現ベクター、より具体的には核マトリックス結合領域因子（本明細書では「ＭＡＲ因子」と称する）及びガストリン遺伝子の転写終止部位を含む発現ベクターに関する。
【０００２】
（ｂ）関連技術の記載
多くの種類の発現ベクター、例えば微生物、植物、酵母、昆虫細胞、及び動物細胞が、現在、大量の望ましいタンパク質の発現による医学的処置に使用されている。多くの種類の発現系の中で、微生物は発現系として最も容易に使用され、多くの種類の微生物系が研究され、発現系として利用されている。
【０００３】
しかしながら、微生物発現系の使用はいくつかの点において限定的である。まず、遺伝子は微生物において発現されるが、微生物はタンパク質発現や、例えばグリコシル化、リン酸化及びアミジル化のようなタンパク質の修飾機序に関して、異なる機序を有するので、発現されたタンパク質の構造及び特性は動物タンパク質の構造及び特性とは類似していない。従って、微生物から製造した組換えタンパク質はほとんど修飾されないか、または機能がタンパク質の修飾及び構造の差異にそれほど影響されないタンパク質の生成に限定される。加えて、微生物により発現される組換えタンパク質を用いる場合、微生物または毒素の夾雑を排除する方法が必要とされる。
【０００４】
動物のタンパク質発現には動物細胞が適しているが、動物細胞を用いる発現系は、微生物及び動物細胞の組換えタンパク質の発現効率と比較して効率が低いために生産コストがより高くなり、動物細胞を用いる発現系は一般に使用されない。
【０００５】
現在発現系に用いられている工業用の動物細胞にはＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）及び骨髄腫などがあり、発現ベクターは動物細胞に導入され、微生物の場合と同様望ましい外来性タンパク質を生成する。
【０００６】
従って、一般に少量の外来性遺伝子が発現されるので、遺伝子発現系は種々の方法により修飾される。例えば、ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸リダクターゼ）に対する阻害剤であるメトトレキセート（本明細書では以後「ＭＴＸ」と称する）を含有する培地でＣＨＯの細胞株を培養し、ＭＴＸ濃度に依存して生存し、遺伝子のコピー数の増加によりタンパク質を高度に発現するＣＨＯ株を得る。
【０００７】
一般に、外来性遺伝子が動物細胞で発現される場合、外来性遺伝子は選抜マーカーを有するベクターと同時トランスフェクトされ、形質転換された細胞は長時間選択培地で培養することにより選別する。しかしながら高度に発現する細胞クローンの達成頻度は低い。外来性遺伝子発現の低頻度は、微生物とは異なり、動物系における外来遺伝子の染色体挿入による。加えて、外来遺伝子の挿入方法は成功するが、各遺伝子の挿入部位は異なり、遺伝子の発現は挿入部位に依存するので、外来遺伝子の発現が予測できない（Ｇｒｉｎｄｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．３：１６−２２（１９８７）；Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６：３４９−３８１（１９８４）；Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０：４６５−４９９（１９８６））。従って、外来性遺伝子は安定して挿入されるが、動物細胞におけるたいていの遺伝子発現は近隣の核酸により阻止されるので、少量しか発現できない（Ｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．７：３３５−３４０（１９９１）；Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２０：４６５−４９９（１９８６））。
【０００８】
位置効果から外来性遺伝子の発現を保護するために、いくつかの系で核マトリックス因子を使用する可能性が報告されている。核因子の実例としては絶縁体因子、核マトリックス結合領域（本明細書では「ＭＡＲ」と称する）及び骨格結合領域（本明細書では「ＳＡＲ」と称する）などがある。
【０００９】
Ｋａｌｏｓ（Ｋａｌｏｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５：１９８−２０７（１９９５））は、アポリポタンパク質Ｂ　ＭＡＲを最小プロモーター導入遺伝子構築物と組み合わせた場合、外来性遺伝子が宿主染色体に安定して導入され、発現された転写体の量が約２００倍増加することを示唆した。前記の方法に類似して、ニワトリリゾチームＡ　ＭＡＲ及びβインターフェロンＳＡＲが染色体挿入部位にかかわらず、脊椎動物細胞における外来性遺伝子の発現レベルを増加させることができることが報告された（Ｅｉｓｓｅｎｂｅｒｇら、Ｔｒｅｎｄ　Ｇｅｎｅｔ．７：３３５−３４０（１９９１）；Ｋｌｅｈｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０：１２６４−１２７０（１９９１））。しかしながら、ＭＡＲ及びＳＡＲがＣＨＯ細胞株においてタンパク質生成を増加させることができること、またはＭＡＲ及びＳＡＲが一般的な使用に適することは証明されていない。
【００１０】
動物細胞遺伝子が発現される場合、ｍＲＮＡ合成はプロモーターから生じ、終止部位で停止する。発現されたタンパク質のレベルはしばしば、合成されたｍＲＮＡの安定性によってのみならず、転写終止の効率によっても影響を受ける。
【００１１】
発現ベクターに含まれる転写終止部位はポリアデニル化を調節し、ｍＲＮＡ安定性に影響を有する。終止部位はポリＡシグナル、切断部位、終止部位を含み、ポリアデニル化シグナルはＡＡＴＡＡＡであり、十分に研究されている。しかしながらポリアデニル化を生じる切断部位、及びＲＮＡ重合化酵素ＩＩにより遺伝子転写が完了される終止部位についてはよく解っていない。加えて、３種の重要な領域以外のＧＵ／Ｕに富む領域がｍＲＮＡのポリアデニル化を調節することが報告されているが、詳細な機序は解っていない。
【００１２】
動物細胞において一般に使用される発現ベクターはＳＶ４０ウイルス及びＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）のポリＡシグナルを含有し、動物細胞の発現ベクターを使用するためにｍＲＮＡの安定性及び発現レベルを改善する特異的転写終結区は示唆されていない。
【００１３】
（発明の要約）
本発明の目的は、動物細胞株において用いられる外来性タンパク質の発現において外来性遺伝子の発現効率及びレベルが上昇されている発現ベクターを提供することである。
【００１４】
これらの目的を達成するために、本発明はＭＡＲ（核マトリックス結合領域）因子またはその相補性配列をプロモーターの５’末端に含んでなる発現ベクターを提供する。
【００１５】
また本発明は、配列番号３の配列を有する、ＳＶ４０ウイルスポリＡ（ポリアデニル化）シグナル及びガストリン遺伝子の転写終止部位からなる構築物を含んでなる動物細胞のため発現ベクターを提供する。
【００１６】
また、本発明はヒトβグロビン５’ＭＡＲ（核マトリックス結合領域）の相補性配列、並びにＳＶ４０ウイルスポリＡシグナル及びガストリン遺伝子の転写終止部位からなる構築物を含んでなる、配列番号８のｐＭＳＧ　ＫＣＣＭ　１０２０２ベクターを提供する。
【００１７】
また、本発明はβグロビンＭＡＲ因子、またはβグロビンＭＡＲ相補性配列をプロモーター５’末端で含んでなる動物細胞用発現ベクター、配列番号３のＳＶ４０ウイルスポリＡ（ポリアデニル化）シグナル及びガストリン遺伝子の転写終止部位を含んでなるベクター、並びにｐＭＳＧベクターを使用することによる、生理活性物質の調製方法を提供する。
【００１８】
（発明の詳細な説明）
本明細書では以後、本発明を詳細に説明する。
【００１９】
本願発明者は、外来性遺伝子を動物細胞株で発現させる場合に位置特異的効果から生じる問題を打破し、遺伝子の発現量を増加させる最適な発現ベクターを設計した。
【００２０】
本発明の動物細胞用発現ベクターは、慣用される発現ベクターにさらに加えられる適当な塩基配列を含んでなる。適当な塩基配列は核酸マトリックス結合領域（本明細書以後「ＭＡＲ」と称する）及び骨格結合領域（本明細書以後「ＳＡＲ」と称する）を含み、これらは挿入部位の位置効果から宿主例えばＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞）及びＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）の外来性遺伝子発現を刺激し、外来性遺伝子の発現量を増加させる。
【００２１】
プロモーター５’末端にＭＡＲまたはＳＡＲ因子を加えて本明細書の発現ベクターの効率を分析する。染色体ＤＮＡを細胞から単離し、次いで染色体ＤＮＡをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）及びサブクローニングによりＥ．ｃｏｌｉにクローン化し、ＭＡＲ及びＳＡＲ因子のＤＮＡが得られるようにする。
【００２２】
好ましくは、ＭＡＲまたはＳＡＲ因子をニワトリリゾチーム５’ＭＡＲ（Ｐｈｉ−Ｖａｎ，Ｌ．及びＳｔｒａｔｌｉｎｇ，Ｗ．Ｈ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３５：１０７３５−１０７４２（１９９６）、ジーンバンク番号：Ｘ９８４０８）、ニワトリｐｉαグロビン５’ＭＡＲ（Ｋｒｅｖｓｋｉｉ，Ｖ．Ａ．、Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ，Ｖ．Ｓ．及びＲａｚｉｎ，Ｓ．Ｖ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：６７２−６７８（１９９２）、ジーンバンク番号：Ｘ６４１１３）、ヒトβグロビン５’ＭＡＲ（Ｙｕ，Ｊ．、Ｂｏｃｋ，Ｊ．Ｈ．、Ｓｌｉｇｈｔｏｍ，Ｊ．Ｌ．及びＶｉｌｌｅｐｏｎｔｅａｕ，Ｂ．、Ｇｅｎｅ　１３９（２）：１３９−１４５（１９９４）、ジーンバンク番号：Ｌ２２７５４）、ＣＨＯ　ＤＨＦＲイントロンＭＡＲ（Ｋａｓ，Ｅ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８（４）：６７７−６９２（１９８７）、ジーンバンク番号：Ｘ０６６５４）、ヒトＨＰＲＴイントロンＭＡＲ（Ｓｙｋｅｓ，Ｒ．Ｃ．、Ｌｉｎ，Ｄ．、Ｈｗａｎｇ，Ｓ．Ｊ．、Ｆｒａｍｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．及びＣｈｉｎａｕｌｔ，Ａ．Ｃ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１２：３０１−３０９（１９８８）、ジーンバンク番号：Ｘ０７６９０）、ヒトＣＳＰ−Ｂ遺伝子隣接ＳＡＲ（Ｈａｎｄｓｏｎ，Ｒ．Ｄ．及びＬｅｙ，Ｔ．Ｊ．、ジーンバンク番号：Ｍ６２７１６）、及びヒトインターフェロンβ遺伝子隣接ＳＡＲ（Ｍｉｅｌｋｅ，Ｃ．、Ｋｏｈｗｉ，Ｙ．、Ｋｏｈｗｉ−Ｓｈｉｇｅｍａｔｓｕ，Ｔ．及びＧｏｄｅ，Ｊ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２９：７４７５−７４８５（１９９０）、ジーンバンク番号：Ｍ８３１３７）からなる群から選択する。
【００２３】
ＭＡＲ及びＳＡＲを動物細胞用発現ベクターに組み込み、ＭＡＲ／ＳＡＲ及び発現力価の間の関係を確認するためにベクターのβ−Ｇａｌ発現を誘導した。
【００２４】
インビトロＰＣＲ変異誘発によりｐＳＶ−β−ｇａｌプロモーターの５’末端をマルチクローニング部位（本明細書では以後「ＭＣＳ」と称する）に連結させ、次いで図１に示す組換えベクター（バージョンＩ及びバージョンＩＩベクター）を得た。ＭＡＲまたはＳＡＲを組換えベクターｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩまたはＩＩのＳＶプロモーターの５’末端の前に挿入し、被験ベクターを調製し、被験ベクターをＣＨＯ　ＤＧ４４に形質転換した。形質転換されたＣＨＯ　ＤＧ　４４をＧ４１８（ネオマイシン）含有培地で選別し、β−Ｇａｌ染色することにより（ＩＰＴＧ及びＸ−Ｇａｌでの青色染色）発現力価を測定した。発現力価を測定するために、発現頻度、発現細胞数、及びβ−Ｇａｌ発現の量を測定した。
【００２５】
図２は本発明で使用される種々ＭＡＲ及びＳＡＲ因子により誘導されたβ−Ｇａｌの発現頻度を示す。ｐＳＶ−β−ｇａｌベクターは約２０から３０％のβ−Ｇａｌ発現頻度を示したが、βグロビンＭＡＲ、ＣＳＰ−Ｂ　ＳＡＲまたはインターフェロンβＳＡＲを含んでなる被験ベクターは陽性細胞株において発現頻度を増加させ、さらに具体的にはβグロビンＭＡＲを含んでなる被験ベクターは約７０から８０％のβ−Ｇａｌ発現頻度を示した。
【００２６】
加えて、種々のＭＡＲ因子及びＳＶ４０プロモーターの組み合わせに従って構築物を調製し、組換えタンパク質発現の頻度をＳＶ４０ウイルスプロモーターと比較した。β−Ｇａｌ生成の量を比較するために、β−Ｇａｌ染色法及びβ−Ｇａｌ酵素の測定法を運用し、発現頻度は各ＭＡＲ因子によって異なるので、同一数の陽性細胞株においてβ−Ｇａｌの活性を分析した。
【００２７】
図３は、βグロビンＭＡＲ、ＣＳＰ−Ｂ、ＳＡＲ、及びインターフェロンβ−ＳＡＲ因子を使用し、ｐＳＶ−β−ｇａｌと比較した場合の種々ＭＡＲ及びＳＡＲ因子の影響によって発現されたβ−Ｇａｌの活性、及び陽性細胞あたりのβ−Ｇａｌ量または増加したβ−Ｇａｌ活性を示す。βグロビンＭＡＲ因子を含んでなるベクターの発現量が７倍またはそれ以上に増加したことが観察される。
【００２８】
従って、ＭＡＲ因子の中でβグロビンＭＡＲ因子が本発明ではより好ましい。
【００２９】
βグロビンＭＡＲ因子の効果及び効率を調べるためにＭＡＲ因子のＤＮＡ配列を分析した。
【００３０】
βグロビンＭＡＲ因子は２９９９個の塩基を含有し、その機能は詳細には解っていない。βグロビンＭＡＲ因子は一致配列及び８００ｂｐ領域の３’に位置する２４４ｂｐのａｌｕ因子を含んで成り、ここにはＡ＋Ｔ（アデニン、チミジン）に富む配列が存在する。ａｌｕ部位は３００ｂｐの２つの直接反復単量体ユニットを含んで成り、真核生物の染色体には数千の相同性部位が存在するので、この部位でその組換えがしばしば生じる（Ｊａｇａｄｅｅｓｗａｒａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　２９６：４６９−４７０（１９８２）；Ｒｏｇｅｒｓ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｃｙｔｏｌ．９３：１８７−２７９（１９８５））。βグロビンＭＡＲのａｌｕはＳＶ４０プロモーターの上流に位置し、細胞が長時間培養される場合、組換えを生じ得る。
【００３１】
従って、本願発明者は前記の悪影響を有さないβグロビンＭＡＲ変異体を設計した。
【００３２】
図４はＭＡＲ相補性配列ｂ、欠失変異体ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ及びｉを調製し、これをｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩに組み込むことにより生成したβグロビンＭＡＲ変異体を示す。
【００３３】
βグロビンＭＡＲ変異体を含んでなるベクターをＣＨＯ細胞に導入した後、β−Ｇａｌ発現細胞数及びβ−Ｇａｌ量を測定し、その結果を図５に表す。たいていのβグロビンＭＡＲ変異体のβ−Ｇａｌ発現力価は低下した；対照的にβグロビンＭＡＲ相補性配列を含んでなるｐＭＳ−β−ｇａｌベクターで形質転換された細胞株の力価は高かった。図６及び図７は、組換えタンパク質の発現量及び組み込まれた遺伝子のコピー数、並びにｐＳＶ−β−Ｇａｌの発現量の間の関係は組み込まれた遺伝子のコピー数に依存せず、ｐＭＳ−β−Ｇａｌで形質転換されたベクターの発現量は組み込まれた遺伝子のコピー数に比例することを示している。βグロビンＭＡＲ相補性配列によりａｌｕがプロモーターの別の側に存在できるので、ベクターの組換えの可能性が低減し、挿入位置特異的効果の防御により発現量が増加する。従ってβグロビンＭＡＲ相補性配列は本発明において好ましい。
【００３４】
ＭＡＲまたはＳＡＲ因子が慣用される発現ベクタープロモーターの５’部位に位置し、ＭＡＲもしくはＳＡＲ変異体または相補性配列が慣用される発現ベクターに組み込まれ、そのため外来性タンパク質の発現力価が増加することが証明される。従って、本発明はＭＡＲまたはＳＡＲ因子を含む発現ベクターを提供し、その発現ベクターにはＭＡＲもしくはＳＡＲ変異体、またはその相補性配列が含まれる。ＭＡＲまたはＳＡＲはｐｉ−ａ　ＭＡＲ（ニワトリｐｉ　αグロビン５’ＭＡＲ）、βグロビンＭＡＲ（ヒトβグロビン５’ＭＡＲ）、ＤＨＦＲ　ＭＡＲ（ＣＨＯ　ＤＨＦＲイントロンＭＡＲ）、ＨＰＲＴ　ＭＡＲ（ヒトＨＰＲＴイントロンＭＡＲ）、ＣＳＰ−Ｂ　ＳＡＲ（ヒトＣＳＰ−Ｂ遺伝子隣接ＳＡＲ因子）、インターフェロンβＳＡＲ因子（ヒトインターフェロン−β遺伝子隣接ＳＡＲ因子）、及びリゾＭＡＲ（ニワトリリゾチーム５’ＭＡＲ）からなる群からから選択されるのが好ましい。
【００３５】
これらの中で本発明のｐＭＳベクター（ＫＣＣＭ１０２０３）はＳＶ４０ウイルスプロモーターの５’末端でヒトβグロビンＭＡＲ相補性配列を含んでなる６２８７ｂｐ及びマルチクローニング部位からなり、マルチクローニング部位に遺伝子を組み込むことにより組換えタンパク質を発現できる。ｐＭＳ塩基配列をシークエンス・リスティング・ソフトウェアで配列番号１として編成した。
【００３６】
βグロビンＭＡＲ相補性配列を用いる場合、外来性遺伝子の発現頻度及び発現量は、ＳＶ４０プロモーターのみを用いる場合の外来性遺伝子のそれと比較して各々３から４倍、及び７から１０倍増加する。加えて、ｐＭＳ−β−ｇａｌベクターを図８に示す種々の動物細胞に適用でき、ｐＭＳ−β−ｇａｌベクター系が好ましくＢＨＫ、ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３及びＨＥＫ２９３に適用できる。図９は外来性遺伝子がｐＭＳ−β−ｇａｌベクター系において発現される場合、ＭＴＸ（メトトレキセート）を添加することにより発現力価が上昇することを示している。
【００３７】
ＭＡＲまたはＳＡＲによる外来性タンパク質の発現力価を測定するために、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターを使用する。外来性遺伝子の発現力価はプロモーターの種類及び種々の細胞株に依存して変化するので、ＣＭＶプロモーターをも試験する。ＣＭＶプロモーターの機能に及ぼすβグロビンＭＡＲ相補性配列を確認するために、ｐＭＳ調製に類似の手順によりｐＭＣベクターを調製し、Ｓｃｕ−ＰＡ遺伝子をｐＭＳ、ｐＭＣ及び調節ベクターに組み込む。
【００３８】
図１０は、ｓｃｕ−ＰＡのｐＭＳ、ｐＭＣ、ｐＳＶ及びｐＣＭＶへの組み込みにより調製されるｐＭＳＰＵＫ、ｐＭＣＰＵＫ、ｐＳＰＵＫ及びｐＭＣＰＵＫベクターで形質転換したＣＨＯにおけるｓｃｕ−ＰＡの発現力価、並びにｐＭＳ及びｐＭＣの遺伝子発現はｐＳＶ及びｐＣＭＶの発現の４倍増加することを示す。従って、本発明のβグロビンＭＡＲ相補性配列を望ましいプロモーターとの適当な組み合わせにより動物細胞のタンパク質発現に使用することができる。
【００３９】
βグロビンＭＡＲ相補性配列などの本発明のベクターは宿主細胞である外来性の遺伝子に組み込まれるので、慣用される方法で動物細胞株から有用なタンパク質を得ることができる。
【００４０】
本発明ではヒトガストリン遺伝子転写ポリＡシグナル、切断部位及びヒトガストリン終止部位を調製し、ｍＲＮＡ安定性を増し、それにより発現ベクターの効率を増すためにこれらを本発明の発現ベクターに適用した。
【００４１】
ヒトガストリン遺伝子３’転写制御領域はポリＡシグナル、切断部位、終止部位を含む６０５ｂｐを含んで成り、ヒトガストリン遺伝子３’転写制御領域に塩基配列を配列番号２として提示する。切断部位はポリＡシグナルの下流１５ｂｐに位置し、終止部位はポリＡシグナルの下流２２０ｂｐに位置する。ガストリンの転写は終止部位で完了し、ｍＲＮＡの切断及びポリアデニル化は切断部位で生じる。
【００４２】
本発明者が設計した、遺伝子の発現力価を増加させることができるＳＶ４０ポリＡ及びガストリン遺伝子の転写終止部位からなる構築物を、図１１に示す。
【００４３】
図１１はガストリン遺伝子の転写終止部位及びＳＶ４０ポリＡからなる構築物を示し、構築物は好ましくは「ａ」のｐＳＶ−ＳＰＡ（ＳＰＡ；ＳＶ４０ポリアデニル化のシグナル）、「ｂ」のｐＳＶ−ＳＰＡ−ＧＴＦ（ＧＴＦ；ガストリン遺伝子の転写終止部位）、「ｃ」のｐＳＶ−ＳＰＡ−ＧＴＲ（ＧＴＲ；ＧＴＦ相補性配列）、「ｄ」のｐＳＶ−ＧＰＡ（ＧＰＡ；ガストリンポリアデニル化シグナル）、「ｅ」のｐＳＶ−ＧＰＡ−ＧＴＦ、「ｆ」のｐＳＶ−ＧＰＡ−ＧＴＲ、「ｇ」のｐＳＶ−ＧＭＰＡ（ＧＭＰＡ；ＧＰＡ変異体）、「ｈ」のｐＳＶ−ＧＭＰＡ―ＧＴＦ、「ｉ」のｐＳＶ−ＧＭＰＡ―ＧＴＲから選択される。ＳＰＡ−ＧＴＦ、ＳＰＡ−ＧＴＲ、ＳＰＡ−ＧＰＡ、ＳＰＡ−ＧＰＭＡの塩基配列は各々配列番号３、４、５及び６に列挙する。全ての構築物はおのおのｐＳＶ−β−ｇａｌに組み込まれ、β−Ｇａｌの発現力価を測定するためにＣＯＳ−７細胞株にさらに導入した。発現力価はβ−Ｇａｌの発現量であり、これを図１２に示す。ＳＶ４０ポリＡからなる構築物及びガストリン遺伝子の転写終止部位からなる構築物を含んでなるｐＳＧベクターはタンパク質の発現量を４倍に増加させる効果を有する。従って発現力価を上昇させるために終止部位はＳＰＡ−ＧＴＦ（ＳＶ４０ポリＡシグナル及びガストリン遺伝子の転写終止部位）であるのが好ましい。本発明では、慣用される発現ベクターの終止部位として構築物を用い、そして外来性タンパク質の発現量を増加させる。本発明の発現ベクターの例としてはｐＳＧなどがある。
【００４４】
ｐＳＧベクターはその終止部位でＳＰＡ−ＧＴＦに組み込まれ、３３０９ｂｐである。ｐＳＧベクターの塩基配列を配列番号７に列挙する。ｐＳＧベクターを、その発現力価を測定するためにβ−Ｇａｌに挿入し、ｐＳＧの発現力価はｐＳＶベクターよりも４倍多くなり、これはガストリン遺伝子の転写終止部位及びＳＶ４０ウイルスポリＡシグナルからなる構築物によりｍＲＮＡが安定化された結果である。
【００４５】
従って、ＳＰＡ−ＧＲＦからなるベクターは従来の方法で動物宿主において外来性遺伝子を発現でき、有用なタンパク質、例えば生理活性物質を得ることができる。
【００４６】
加えて、本発明は外来性遺伝子の発現力価を増加させることができる２つの部位を含む発現ベクターを提供する。２つの部位は、ＳＶ４０ポリＡを伴うガストリン遺伝子の転写終止部位と連結した転写終止部位、及びβグロビンＭＡＲ相補性配列である。
【００４７】
図１３は本発明のｐＭＳＧ構造を示し、全塩基配列の６３４７ｂｐを配列番号８として列挙し、ｐＭＳＧを韓国微生物培養センターにＫＣＣＭ１０２０２の下に寄託した。以下の表はｐＭＳＧの詳細なマップを示す。
【００４８】
【表１】
2004506428.tif 000003
【００４９】
ＴＧＦ−β　ＳＲＩＩ遺伝子のタンパク質は、活性なヒトタンパク質であるＴＧＦ−βとの選択的結合によりＴＧＦ−βの副作用を防御できる。本発明のｐＭＳＧの効果及び効率を分析するためにＴＧＦ−β　ＳＲＩＩを発現させた。結果は図１４に示すように、ＴＧＦ−β　ＳＲＩＩタンパク質はグリコシル化構造を有するので、タンパク質は典型的な動物細胞が有するような元来のタンパク質の分子量よりも大きな分子量を有する。ＴＧＦ−β　ＳＲＩＩの最初の発現量は約１００ｎｇ／１０６細胞／日であり、たいていの細胞は同等に発現する。加えて、図１５に示すように、ＭＴＸ　１μＭをＴＧＦ−β　ＳＲＩＩ細胞に添加した場合、最大１０μｇ／１０６細胞／日が得られた。ＴＧＦ−βはヒト体内で種々の機能を有し、とりわけ、例えば腎臓の糸球体硬化体、肝硬変、表皮細胞の角質化、及び軟骨咬合のごとき炎症に至る因子として見出され、ＴＧＦ−β　ＳＲＩＩはＴＧＦ−β過剰発現された疾患の処置に用いることができる。
【００５０】
本発明のｐＭＳＧベクターは、一般的な問題、すなわち発現収量が低く及び形質転換体の入手が困難であるという問題を打破しており、種々の組換えタンパク質、例えば生理活性物質の大量生産が可能である。
【００５１】
加えて、ｐＭＳベクター（ＫＣＣＭ−１０２０３）が開発され、これは挿入部位の近隣塩基によるその発現が阻止されず、ｐＭＳは慣用されるＳＶ４０プロモーターよりも約８倍の組換えタンパク質を生成する。
【００５２】
また、転写体の特定の部位で転写終止を誘導することができる転写終止部位を含んでなるｐＳＧベクターを調製し、慣用されるポリＡ部位の３倍まで増加した。
【００５３】
機能的ＤＮＡフラグメント及び外来性遺伝子に適用できるマルチクローニング部位を連結することにより本発明のｐＭＳＧベクター（ＫＣＣＭ−１０２０２）を調製し、動物細胞においてＴＧＦ−βを発現させる場合、その発現量は１０μｇ／１０６細胞／日である。従って、本発明の発現ベクターは組換えタンパク質の発現に適し、本発明によれば、原核細胞において発現される、真核細胞に由来するタンパク質を、野生型タンパク質に比較して同一の構造及び機能を有する組換えタンパク質として動物細胞において生成することができる。
【００５４】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、その範囲を限定することを意図するものではない。
【００５５】
実施例１：ｐＭＳ−β−ｇａｌベクターの調製
（１）ｐＭＳ−β−ｇａｌベクターの調製
ｐＭＳ−β−ｇａｌベクターを以下のように調製した
１） ヒトβグロビンＭＢＲの塩基配列を得るための、Ｇ−２細胞からのゲノムＤＮＡ単離
ウィザード・ゲノミックＤＮＡ精製キット（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社による製品）を使用してヒト宿主においてＧ−２細胞からゲノムＤＮＡを単離し、精製手順は製造会社により供給された実験手順に従った。
【００５６】
２） ゲノムＰＣＲ及びサブクローニングの実施
ヒトβグロビン５’ＭＡＲのフラグメントを得るために、鋳型として精製されたゲノムＤＮＡを用い、ゲノムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてβグロビンＭＡＲのセンスプライマーＢＭＬ１及びアンチセンスプライマーＢＭＲ１を使用した。ＢＭＬ１及びＢＭＲ１は各々配列番号９及び配列番号１０として列挙した。ＰＣＲは３２サイクルで実施した。表２はサイクル数を示す。
【００５７】
【表２】
2004506428.tif 000004
【００５８】
ＰＣＲの後、ＰＣＲ産物をノヴァゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社のｐＴ７ｂｌｕｅベクターに挿入し、ｐＴ７ｂｌｕｅ／βグロビンＭＡＲベクターを調製した。ｐＴ７ｂｌｕｅベクターはＰＣＲ産物を直接クローニングできるＴＡクローニングベクターである。
【００５９】
３） 組換えベクターｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩ及びバージョンＩＩマルチクローニング部位（ＭＣＳ）の調製
ｐＴ７ｂｌｕｅベクターのβグロビンＭＡＲをｐＳＶ−β−ｇａｌベクターのプロモーターの上流に挿入するために、ｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩとｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩＩを調製した。
【００６０】
まずｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩを調製するために、ｐＳＶ−β−ｇａｌをＳｐｅ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩで処理した後、ＳＶ４０プロモーターを含むＳｐｅ　Ｉ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントの４４３ｂｐをＢＩＯ　１０１社のジーン・クリーンＩＩＩキットでアガロースゲルから精製した。フラグメントをＳｐｅ　Ｉ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ消化により直線化したストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（＋）にライゲートし、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＳＶ４０　Ｉプロモーターベクターを調製した。
【００６１】
次いで、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＳＶ４０　ＩプロモーターベクターをＳｃａ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩと反応させ、前記と同一の方法でＳＶ４０プロモーターを含むフラグメントをアガロースゲルから精製し、フラグメントをＳｃａ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩ消化により直線化したｐＳＶ−β−ｇａｌベクターと共にライゲートし、バージョンＩベクターを調製した。
【００６２】
加えて、ｐＳＶ−β−ｇａｌをＥｃｏＲ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩと反応させた後、ｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩＩベクターを生成するために、前記と同一の方法でＳＶ４０プロモーターを含むＥｃｏＲ　Ｉ／Ｈｉｎｄ　ＩＩＩフラグメントの４２０ｂｐをアガロースゲルから精製し、ＥｃｏＲ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩ消化により直線化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ（＋）と共にフラグメントをライゲートして、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＳＶ４０　ＩＩプロモーターベクターを生成した。
【００６３】
前記と同一の方法でＳＶ４０を含むフラグメントをアガロースゲルから精製するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ／ＳＶ４０　ＩＩプロモーターベクターをＳｃａ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩで処理し、フラグメントをＳｃｅ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩ消化により直線化したｐＳＶ−β−ｇａｌベクターと共にライゲートし、ｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩＩベクターを調製した。
【００６４】
４） ｐＭＳ−β−ｇａｌベクターの調製
ｐＴ７ｂｌｕｅ／βグロビンＭＡＲベクターをＳｐｅ　Ｉ及びＳｍａ　Ｉで処理して、βグロビンＭＡＲを含む３ｋｂの大きさのＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから精製し、フラグメントをＳｐｅ　Ｉ及びＳｍａ　Ｉにより直線化した組換えｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩとライゲートし、βグロビンＭＡＲをクローン化した。βグロビンＭＡＲの配向を確認するために、ｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩに存在する制限酵素Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ及びβグロビンＭＡＲを反応させ、βグロビンＭＡＲがｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩベクターに対して逆の配向でクローン化されたことを確認した。
【００６５】
（２）ｐＭＳ−β−ｇａｌベクターの発現力価
ｐＭＳ−β−ｇａｌベクターを含む被験ベクター２μｇをＤＯＳＰＥＲ（ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）による製品）を用いてｐＳＶ２ｎｅｏベクターでＣＨＯ　ＤＧ４４に同時トランスフェクトし、対照ベクターとしてｐＳＶ−β−ｇａｌベクターを同一の方法で同時トランスフェクトした。トランスフェクトされたＣＨＯ　ＤＧ４４細胞をヌクレオシド補充した１０％加熱不活性化したＦＢＳ及び８５０μｇ／ｍｌ　Ｇ４１８硫酸塩（カルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）社による製品）を含むＭＥＭ−α培地である選択培地中で培養した。約２週後、安定してトランスフェクトされたＧ４１８抵抗性トランスフェクト体を生じ、Ｇ４１８抵抗性トランスフェクト体において対照ベクター及びｐＭＳ−β−ｇａｌベクターに関してβ−Ｇａｌを発現する２０個の安定したクローンを単離した。β−Ｇａｌ及びｎｅｏ遺伝子のコピー数及びｐＳＶ−β−ｇａｌ及びｐＭＳ−β−ｇａｌからの転写されるβ−Ｇａｌ　ＲＮＡの量を測定するために、４０個の陽性クローンをサザン及びノザンブロッティングにより分析した。
【００６６】
図６はｐＳＶ−β−ｇａｌまたはｐＭＳ−β−ｇａｌベクターに関する、β−Ｇａｌ遺伝子コピー数（ａ：対照群、ｂ：本発明）、ＲＮＡ数（ｃ：対照群、ｄ：本発明）、及びβ−Ｇａｌを発現する陽性クローン（本明細書において以後「陽性クローン」と称する）における選抜マーカーとしてのｎｅｏ遺伝子のコピー数（ｅ：対照群、ｆ：本発明）を確認するためのサザン及びノザンブロットを示し、図７はｐＳＶ−β−ｇａｌまたはｐＭＳ−β−ｇａｌベクターに関する、陽性クローンにおけるβ−Ｇａｌ遺伝子のコピー数及びβ−Ｇａｌの発現収量間の関係を示すグラフである。各陽性クローン中のβ−Ｇａｌ遺伝子のコピー数は図６ａ及び６ｂで示されるように変化するので、各陽性クローンを２群に分類し、ここで一方はβ−Ｇａｌ遺伝子の高コピー数を有し、他方はβ−Ｇａｌ遺伝子の比較的低コピー数を有し、互いの群を分析した。β−Ｇａｌ遺伝子の高コピー数を有する群では、「ａ」で示すように対照群はβ−Ｇａｌ遺伝子の高コピー数を有するが、これらのクローンにおけるβ−Ｇａｌ遺伝子のＲＮＡ量は「ｃ」で示すようにＤＮＡコピー数に相対して低かった。しかしながら、「ｄ」で示す、本発明のｐＭＳ−β−ｇａｌの陽性クローンにおけるＲＮＡ量は高かった。加えて、図６で示すように、β−Ｇａｌ遺伝子の低コピー数を有する群では、ｐＭＳ−β−ｇａｌベクターに関する陽性クローンにおけるβ−Ｇａｌのコピー数及びＲＮＡ量は対照ベクターに関する陽性クローンよりも非常に高かった。図７は遺伝子のコピー数及び発現量間の関係を示す。図７ではｐＭＳ−β−ｇａｌベクタークローンにおけるβ−Ｇａｌ遺伝子の平均コピー数及び発現レベル（●）は対照ベクタークローン（○）の約１０倍に相当する。加えて、β−Ｇａｌ遺伝子の高コピー群の場合、対照ベクタークローンにおけるβ−ｇａｌ遺伝子の発現は遺伝子のコピー数に依存せず、ｐＭＳ−β−ｇａｌの場合を図７に示す。
【００６７】
（３）種々細胞株におけるｐＭＳ−β−ｇａｌベクターの発現パターン
動物細胞における外来性遺伝子の発現では、種々の細胞及びＣＨＯもまた用いられ、外来性遺伝子の発現量は種々の細胞で多様であった。本発明では、ＣＨＯ細胞宿主でｐＭＳ−β−ｇａｌベクターを用いる場合、トランスフェクトされたＣＨＯにおける外来性遺伝子の発現力価及び発現頻度が増加した事が明らかにされた。従って、本発明のベクターを、起源及び形態がＣＨＯ細胞とは類似しない動物細胞に適用できるかどうかを試験した。
【００６８】
ｐＳＶ−β−ｇａｌベクター及びｐＭＳ−β−ｇａｌベクターを各々ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ）、マウス繊維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）、及びヒト胚腎細胞（ＨＥＫ２９３）にｐＳＶ２ｎｅｏベクターと同時トランスフェクトした後、Ｇ４１８を含む培地中で１４日間培養し、各ベクターに関して安定したトランスフェクト体においてβ−Ｇａｌを発現する陽性細胞の頻度及び発現力価を（２）と同一の方法で測定した。
【００６９】
図８は種々細胞株におけるｐＭＳ−β−ｇａｌの発現力価を示す。宿主細胞株にＢＨＫを用いる場合、遺伝子発現はＣＨＯ細胞株の場合に類似する。宿主細胞株にＮＩＨ３Ｔ３を用いる場合、発現量の増加に及ぼす影響は低かった。宿主細胞株にＨＥＫ２９３を用いる場合、効果及び発現量は対照に類似した。陽性クローンの頻度は前記に類似した。従って、本発明の発現ベクターの効果は細胞の種類で異なり、とりわけ動物細胞の発現において一般的に用いられるＣＨＯ、ＢＨＫ、及びＮＩＨ３Ｔ３細胞に関して有用である。
【００７０】
（４）ｐＭＳ−β−ｇａｌベクターの発現系の確立
慣用される発現ベクター系では、プールされた１次トランスフェクト体のできるだけ多くを単離し、外来性遺伝子の発現レベルを高めるために長時間これらのクローンを培養する冗長な方法で高度に発現するクローンを選別しなければならない。これらの問題を打破し、外来性遺伝子の発現レベルを最大にするために、ＣＨＯ　ＤＧ４４細胞株を用いるＤＨＦＲ／ＭＴＸ増幅系を発現系において確立した。
【００７１】
ｐＭＳ−β−ｇａｌベクターをＤＨＦＲ−ＣＨＯ　ＤＧ４４（本明細書では以後「ＣＨＯ　ＤＧ４４」と称する）細胞株にトランスフェクトし、ｐＭＳ−β−ｇａｌベクターをＭＴＸに適合させ、次いでタンパク質の発現量を測定した。ｐＭＳ−β−ｇａｌベクター及び対照（ｐＳＶ−β−ｇａｌベクター）を、各々ＤＨＦＲ遺伝子を欠いているＣＨＯ　ＤＧ４４に、ＤＨＦＲ遺伝子を有しているｐＤＣＨ１Ｐベクターと共に同時トランスフェクトした。ＤＨＦＲトランスフェクトされた細胞株を選択培地、ヌクレオシド補充した１０％加熱不活性化透析ＦＢＳを欠いたＭＥＭ−α培地で培養した。２週後に安定したＤＨＦＲ＋トランスフェクト体を生じ、安定したＤＨＦＲ＋トランスフェクト体においてβ−Ｇａｌを発現する陽性クローンをβ−Ｇａｌ染色により単離した。ＤＨＦＲ＋トランスフェクト体においてβ−Ｇａｌを発現する陽性クローンをスクリーニングするためのβ−Ｇａｌ染色に関しては、細胞を２％ホルムアルデヒド、及び０．２％グルタルアルデヒドを含有するＰＢＳ中４℃で１０分間インキュベートすることにより固定し、ＰＢＳで二回洗浄し、Ｘ−Ｇａｌで処理した。β−Ｇａｌを発現する場合、β−Ｇａｌタンパク質によるＸ−Ｇａｌの分解のため、青色生成物が作製されるので、細胞は青色に見える。選択されたクローンを、ＭＴＸ濃度を多段階的に増加させて、例えば１０ｎＭ、２０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、４００ｎＭ、及び１μＭで処理した。クローンを各々のＭＴＸ濃度の培養に適合させるのに約２から３週間かかった。ＭＴＸ適合による遺伝子増幅の間のβ−Ｇａｌの発現量を、慣用されるＥＬＩＳＡで分析した。
【００７２】
図９は、１μＭ　ＭＴＸ濃度に適合させた、ｐＭＳ−β−ｇａｌ及び対照各々でトランスフェクトした細胞における組換えタンパク質の発現量を示す。組換えタンパク質の発現がＣＨＯ細胞株においてＤＨＦＲ．ＭＴＸ増幅系により増幅された場合、発現レベルは約１０μｇ／１０６細胞／日までになり、これは全タンパク質の２．５％に相当する（Ｋａｕｆｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６２：２８７−３００（１９９７））。本発明では漸増量のＭＴＸにより約１００から１０００までのコピー数が増幅されることが観察される。対照のｐＭＳ−β−ｇａｌベクターのクローンにおけるβ−Ｇａｌの発現量が測定された。対照クローンにおけるβ−Ｇａｌの発現量は各クローンで変化する。動物細胞における組換えタンパク質生成では、２０μｇ／１０６細胞は工業的に貴重であることを鑑みて、対照ベクターの２５％がそれに属し、本発明のｐＭＳ−β−ｇａｌベクタークローンの８８％が２０μｇ／１０６細胞以上の組換えタンパク質を生成した。最大発現量を有する細胞株に比較した、本発明のｐＭＳ−β−ｇａｌベクターは多量の発現タンパク質を有し、外来性遺伝子をｐＭＳ（ＫＣＣＭ−１０２０３）に挿入することにより多量のタンパク質を生成できる。従って、本発明の発現ベクターを外来性遺伝子の発現に使用する場合、高度な発現収量及び効率に至る。
【００７３】
実施例２：ｐＳＰＵＫ、ｐＭＳＰＵＫ、ｐＣＰＵＫ、及びｐＭＣＰＵＫの調製
（１）ｐＣＭＶベクターの調製
ＣＭＶプロモーター及びＳＶ４０プロモーターのｓｃｕ−ＰＡ遺伝子へのクローニングを容易にするために、ｐＣＭＶベクターを調製した。ＣＭＶプロモーター、ＭＣＳ部位、及びｐｃＣＤＮＡ３．１（＋）（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社による製品）の転写終止部位を得るためのＰＣＲを実施した。ＰＣＲセンスプライマーはＣＭＶＬ１（配列番号１１）であり、アンチセンスプライマーはＰＡＲ１（配列番号１２）である。ＣＭＶＬ１プライマーはＳａｃ　ＩＩ、Ｃｌａ　Ｉ、Ｎｒｕ　Ｉ部位を有し、ＰＡＲ１プライマーはＢｓｍｌ部位を有する。１．４ｋｂのＰＣＲ産物をＳａｃ　ＩＩ及びＢｓｍ　Ｉで消化した後、ｐＣＭＶを調製するためにこれを直線化した組換えｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩでライゲートした。
【００７４】
（２）ｐＳＰＵＫ、ｐＭＳＰＵＫ、ｐＣＰＵＫ、及びｐＭＣＰＵＫの調製
動物細胞におけるｓｃｕ−ＰＡ発現のための組換え発現ベクターを調製するために、鋳型としてヒトＴＣＬ−５９８細胞株に由来するｓｃｕ−ＰＡ遺伝子を有するＣＨＯ細胞株から分離したゲノムＤＮＡに関するＰＣＲにより、ｓｃｕ−ＰＡ遺伝子を得た。センスプライマーＰＫＬ１は配列番号１３として提示し、アンチセンスプライマーＰＫＲ１は配列番号１４として提示する。ＰＫＬ１プライマーはＨｉｎｄ　ＩＩＩ制限部位を有し、ＰＫＲ１プライマーはＳｍａ　Ｉ制限部位を有する。
【００７５】
プライマーから生成した約１．３ｋｂのｓｃｕ−ＰＡ　ＰＣＲ産物（ヒトｓｃｕ−ＰＡの第６から第１２９３塩基を有するＤＮＡフラグメント）をＳｍａ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩにより切断し、ｐＣＰＵＫ発現ベクターの調製のため、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ及びＥｃｏＲ　Ｖにより切断したプラスミド、ｐＣＭＶに挿入した。
【００７６】
加えて、組換えｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩベクターをＳｍａ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩで処理し、そこからＳＶ４０プロモーターを有するフラグメントを分離する。このフラグメントをＮｒｕ　Ｉ及びＨｉｎｄ　ＩＩＩにより直線化した対照のｐＣＰＵＫに挿入し、結合させ、ｐＳＰＵＫ発現ベクターを調製した。
【００７７】
ｐＣＰＵＫをＳａｃ　ＩＩ及びＮｒｕ　Ｉで処理して、ＭＡＲ因子をそこに挿入した。直線化したｐＣＰＵＫを、ｐＭＳ−β−ｇａｌベクターをＳｍａ　Ｉ及びＳａｃ　ＩＩで処理することにより調製したβグロビンＭＡＲ因子に挿入し結合させ、ｐＭＣＰＵＫベクターを調製した。
【００７８】
ｐＳＰＵＫベクターをＳｔｕ　Ｉ及びＳａｃ　ＩＩで処理して、そこにβグロビンＭＡＲ因子を挿入した。ｐＭＳ−β−ｇａｌベクターをＳｕ　Ｉ及びＳａｃ　ＩＩで処理することにより生成したβグロビンＭＡＲ因子を、ｐＳＰＵＫベクターに挿入し、ｐＭＳＰＵＫベクターを調製した。
【００７９】
簡単には、ｐＳＰＵＫベクター構築物はｓｃｕ−ＰＡ遺伝子を組換えベクターである、β−Ｇａｌ遺伝子を除去したｐＳＶ−β−ｇａｌバージョンＩに挿入することにより生成された形態であり、βグロビンＭＡＲ相補性配列をｐＳＰＵＫベクターに挿入してｐＭＳＰＵＫベクターを調製した。ｐＣＰＵＫベクター構築物はｓｃｕ−ＰＡをｐＣＭＶベクターに挿入することにより生成された形態であり、βグロビンＭＡＲ相補性配列をｐＣＰＵＫに挿入してｐＭＣＰＵＫベクターを調製した。
【００８０】
（３）ｐＳＰＵＫ、ｐＭＳＰＵＫ、ｐＣＰＵＫ及びｐＭＣＰＵＫベクターの効率の試験
１） 組換えｓｃｕ−ＰＡ遺伝子の細胞へのトランスフェクション、形質転換体の選別及び遺伝子の増幅
４種の組換え発現プラスミド、すなわちｐＳＰＵＫ、ｐＭＳＰＵＫ、ｐＣＰＵＫ及びｐＭＣＰＵＫを各々ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ　ＤＧ４４）に導入してｓｃｕ−ＰＡを発現するのに十分安定な細胞株を得た。ＣＨＯ細胞２ｘ１０５を６ウェルプレートに載せ、５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で２４時間インキュベートした。ｐＳＰＵＫ、ｐＭＳＰＵＫ、ｐＣＰＵＫ及びｐＭＣＰＵＫのプラスミド１μｇ及びＤＨＦＲミニ遺伝子１０ｎｇを各々１００：１の比率で混合し、リポフェクトアミン（ＧｉｂｏＢＲＬ）またはロッシュ（Ｌｏｃｈｅ）によるＤＯＳＰＥＲの方法で混合物をＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。６時間後、培地を新鮮培養培地で置換し、細胞をさらに４８時間インキュベートした。細胞を培地上で選択培地に１０：１の比率で約２週またはそれ以上継代培養し、培地を約４または５日毎に交換して細胞コロニーを形成させた。細胞コロニーを別個にまたは一緒に培養した。
【００８１】
２） 細胞の培養溶液に分泌されたｓｃｕ−ＰＡの活性測定
細胞の培養培地のアミド溶解活性は基質としてＳ−２４４４を用いて測定し、その結果を標準ウロキナーゼ活性と比較した。１×１０６細胞を培養溶液２ｍｌと一緒の６ウェルプレートに載せ、５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で１７時間インキュベートした。上澄の活性を測定するために、連続希釈した上澄５０μｌを９６ウェルプレートに載せ、バッファー溶液（５０ｍＭトリス／Ｈｃｌ（ｐＨ８．８）、８０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０２％トゥイン８０）３０μｌと混合した。プラスミン（０．５Ｕ／ｍｌ）１０μｌをさらに混合物に混合し、混合物を３７℃で２０分間反応させて組換えｓｃｕ−ＰＡを活性化させた。アプロチニン（１００ＫＩＵ／ｍｌ）１０μｌを混合物に加えてプラスミン活性を阻止し、色素基質溶液（バッファー溶液及び６ｍＭ　Ｓ−２４４４の混合物）１００μｌをさらに混合物に加え、３７℃で１時間反応させた。マイクロプレートリーダーで得られた溶液の４０５ｎｍでの吸収（光学密度）を測定することにより、培養培地中のｓｃｕ−ＰＡの活性及び濃度を測定し、結果を標準であるウロキナーゼと比較した。
【００８２】
図１０はｐＭＳＰＵＫ、ｐＭＣＰＵＫ、ｐＳＰＵＫ及びｐＣＰＵＫのＣＨＯ細胞へのトランスフェクションによるｓｃｕ−ＰＡの発現力価を示す。ｐＭＳ及びｐＭＣベクターからの発現レベルは対照であるｐＳＶ及びｐＣＭＶからの発現レベルよりも４倍増加する。
【００８３】
実施例３：ｐＳＧ−β−ｇａｌベクターの調製
（１）ガストリン遺伝子の転写終止部位及びｐＳＧ−β−ｇａｌベクターの調製
配列番号１５のガストリン遺伝子の転写終止部位のセンス鎖を合成した後、配列番号１６のアンチセンス鎖を合成し、２つをアニーリングさせた。アニーリングフラグメントをＢａｍＨ　Ｉ及びＰｓｔ　Ｉで処理して、ＳＶ４０ｐ（Ａ）転写週末区の３’でＢａｍＨ　Ｉ及びＰｓｔ　Ｉ消化により直線化されたｐＳＶ−β−ｇａｌベクター（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社により製造されたベクター）に組み込んで結合させ、ｐＳＧ−β−ｇａｌを調製した。
【００８４】
（２）ｐＳＧベクター効率の測定
ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）によるＤＯＳＰＥＲを用いて、ｐＳＧ−β−ｇａｌベクターをＣｏｓ−７細胞にｐＳＶ２ｎｅｏベクターと共に同時トランスフェクトし、β−Ｇａｌの発現力価を測定した。
【００８５】
図１２はｐＳＧ−β−ｇａｌベクター中のβ−Ｇａｌの発現力価を示し、ＳＶ４０ポリＡ及びガストリン遺伝子の転写終止部位からなる構築物を含んでなるｐＳＧ−β−ｇａｌベクターは、ＳＶ４０ポリＡを含んでなる慣用されるベクターよりも４倍多いβ−Ｇａｌを生成した。従って、ｐＳＧベクターにクローン化された外来性遺伝子のトランスフェクションにより大量の組換えタンパク質を生成することができる。
【００８６】
実施例４
（１）ｐＭＳＧベクターの調製
図１３に示すように、βグロビンＭＡＲ相補性配列及びＳＰＡ−ＧＴＦを含有するベクターをＰＣＲにより調製した。ｐＭＳＧベクターを調製するために、ｐＭＳ−β−ｇａｌ及びｐＳＧ−β−ｇａｌを鋳型として用い、ＰＣＲを３回実施し、ＰＣＲプロデューサーを特異的制限酵素と反応させ、一緒に結合させた。
【００８７】
１） βグロビンＭＡＲ因子のＰＣＲ
センスプライマーＭＬ１（配列番号１７）及びアンチセンスプライマーＭＲ１（配列番号１８）をＰＣＲに用いた。ＰＣＲ産物をＳａｃ　ＩＩ及びＣｌａ　Ｉで処理した後、Ｓａｃ　ＩＩ及びＣｌａ　Ｉ消化により直線化されたｐＭＳ−β−ｇａｌベクターに組み込み、ｐＭＳ−β−ｇａｌ／ｓｃベクターを調製した。
【００８８】
２） マルチクローニング部位及び転写終止部位を得るためのＰＣＲ
センスプライマーＴＬ１（配列番号１９）及びアンチセンスプライマーＴＲ１（配列番号２０）をｐＳＧベクターのガストリン遺伝子の転写終止部位のＰＣＲに用いた。ＰＣＲ産物を直接クローニングできる一種のＴＡクローニングベクターであるｐＧＥＭ−Ｔ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社による製品）でＰＣＲ産物をサブクローニングし、ｐＧＥＭ−Ｔ／ＭＣＳｐ（Ａ）を調製した。
【００８９】
３） ＳＶ４０プロモーター及びマルチクローニング部位を得るためのＰＣＲ
センスプライマーＰＬ１（配列番号２１）及びアンチセンスプライマーＰＲ１（配列番号２２）をＳＶ４０プロモーター及び図１のバージョン１のマルチクローニング部位に関するＰＣＲに用いた。ＰＣＲ生成物をＡｐａ　Ｉ及びＢｇｌ　ＩＩで処理し、次いでＡｐａ　Ｉ及びＢｇｌ　ＩＩ消化により直線化されたｐＧＥＭ−Ｔ／ＭＣＳｐ（Ａ）ベクターにこれを組み込み、ｐＧＥＭ−Ｔ／ＳＶＭＣＳｐ（Ａ）ベクターを調製した。
【００９０】
４） ｐＭＳベクター及びｐＭＳＧベクターの調製
実施例４のｐＧＥＭ−Ｔ／ＳＶＭＣＳｐ（Ａ）をＡｐａ　Ｉ及びＢａｍＨ　Ｉで処理し、ＳＶ４０プロモーター、マルチクローニング部位及びＳＶ４０終止部位からなるＤＮＡフラグメントを精製し、精製したフラグメントを実施例４の１）のＡｐａ　Ｉ及びＢａｍＨ　Ｉ消化により直線化されたｐＭＳ−β−ｇａｌ／ｓｃベクターに組み込み、ｐＭＳベクターを調製した。ｐＳＧベクターをＢａｍＨ　Ｉ及びＳｃａ　Ｉで処理して、ＧＴＦ塩基配列を有する９５０ｂｐのＤＮＡフラグメントを分離し、ＢａｍＨ　Ｉ及びＳｃａ　Ｉ消化により直線化したｐＭＳベクターと結合させ、ｐＭＳＧベクターを調製した。
【００９１】
（２）ｐＭＳＧベクターにおける発現力価の測定
ＴＦＧ−β　ＳＲＩＩ（ＴＧＦ−β可溶性レセプターＩＩ、グリコシル化タンパク質）遺伝子に関するＰＣＲをセンスプライマーＴＲＩ（配列番号２３）及びアンチセンスプライマーＴＲＲ１（配列番号２４）で実施し、ＣＨＯ宿主細胞株におけるｐＭＳＧベクターの発現効率及びｐＭＳＧベクターの工業用適用を確認した。ＰＣＲ産物である増幅されたＴＧＦ−β　ＳＲＩＩをｐＭＳＧ及びｐＳＶベクターにＮｈｅ　Ｉ及びＸｈｏ　Ｉ部位で挿入し、得られた各々のベクターを、ＤＨＦＲ遺伝子を有するｐＤＣＨ１Ｐと共にＣＨＯ　ＤＧ４４細胞に同時トランスフェクトした。これらを、ＤＨＦＲ遺伝子を有する細胞株のみが成長できる選択培地で培養した。２週後、安定したＤＨＦＲ＋トランスフェクト体を生じ、２０個のＤＨＦＲ＋クローンを単離し、これらのクローンをウェスタンブロットにより分析し、ＴＧＦ−β　ＳＲＩＩの量を測定して、その特性を見出した。
【００９２】
図１４はＴＧＦ−β　ＳＲＩＩ発現を示すウェスタンブロットを示し、ここで「ａ」はｐＳＶベクタークローンから発現されたＴＧＦ−β　ＳＲＩＩであり、「ｂ」はｐＭＳＧベクタークローンから発現されたＴＧＦ−β　ＳＲＩＩである。対照ベクタークローンの場合、２５個のクローン中１個のクローンでＴＧＦ−β　ＳＲＩＩ発現が検出された。２７個のクローン中２３個のクローンでＴＧＦ−β　ＳＲＩＩの発現が検出されたが、さらに多くのクローンでＴＧＦ−βが高レベルで発現された。加えて、ＴＧＦ−β　ＳＲＩＩがｐＭＳＧ発現ベクターにより発現された場合、これはグリコシル構造を有し、典型的な動物細胞の糖タンパク質のようにその分子量が増加した。ｐＭＳＧベクターに関するこれらの１次クローンの平均発現レベルは約１００ｎｇ／１０６細胞／日である。
【００９３】
本発明のｐＭＳＧ／ＴＧＦ−β　ＳＲＩＩベクターに関する安定した１次クローンを、１０ｎＭ、４０ｎＭ、２００ｎＭ及び１μＭのような多段階で増加させたＭＴＸ量で処置することによりＤＨＦＲ／ＭＴＸ増幅系に適合させ、ＴＧＦ−β　ＳＲＩＩの発現量を増加させた。
【００９４】
図１５はＴＧＦ−β　ＳＲＩＩをｐＭＳＧベクターにクローニングし、これらをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、そして１μＭ　ＭＴＸ濃度に適合させることにより生成される、ＴＧＦ−β　ＳＲＩＩの発現量を示す。対照ベクタークローンでは、多くのクローンはＭＴＸ処理による遺伝子増幅過程中に各ＭＴＸ濃度で適合しないが、ｐＭＳＧ／ＴＧＦ−β　ＳＲＩＩベクタークローンは対照ベクタークローンに比較して良好に適合する。ｐＭＳＧ発現ベクターのＭＡＲ因子は、外来性遺伝子のみならずＤＨＦＲ遺伝子も同様に発現量を増加すること考えられる。図１５に示すように、１μＭ　ＭＴＸ濃度に適合させる場合、約１０μｇ／１０６細胞／日でＴＧＦ−βを生成するＭＳＧベクターに対する多くのクローンが得られた。
【００９５】
細胞成長及び分化の強力なタンパク質レギュレーターであるＴＧＦ−βは損傷応答の中心であることが報告されている。多くの上皮では反復された、または延長された損傷が進行性繊維症及び最終的には望ましくない過剰な瘢痕の発達に至る。加えて、ＴＦＧ−βは糸球体、腎硬化症、肝硬変、表皮細胞の角質化、及び炎症性軟骨のごとき疾患に至る。ＴＦＧ−β　ＳＲＩＩはＴＦＧ−βのアンタゴニストとして機能する。従って、本発明のＣＨＯ細胞株から発現されるＴＧＦ−β　ＳＲＩＩは、例えばＥ．ｃｏｌｉまたはＰｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓのような原核生物から発現されるタンパク質に比較して優れた処置効果を有し、外来性遺伝子の発現力価が改善されている本発明の発現ベクターを動物細胞において用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＳＶ４０プロモーターと、遺伝子発現のレポーターのためのβ−ｇａｌ遺伝子とを組み合わせることにより調製される、発現ベクターの構造を示す。
【図２】図２は本発明で用いられる種々のＭＡＲ及びＳＡＲ因子により誘導される、β−Ｇａｌの発現頻度を示す。
【図３】図３は本発明のＭＡＲ及びＳＡＲ因子によるβ−Ｇａｌ発現に及ぼす影響を示す、発現されたβ−Ｇａｌの活性を示す。
【図４】図４は本発明のβグロビンＭＡＲ　ＤＮＡ配列に基づく、ＭＡＲ因子の種々の変異体構築物形態を示す。
【図５】図５はＭＡＲ因子と共にＣＨＯ細胞に導入されたベクターのトランスフェクション後の、β−Ｇａｌタンパク質の発現頻度及び発現量を示す。
【図６】図６は、ｐＭＳ−β−ｇａｌまたは対照としてｐＳＶ−β−ｇａｌベクターで形質転換された動物細胞における、β−Ｇａｌ遺伝子コピー数（ａ：対照群、ｂ：本発明）、ＲＮＡ数（ｃ：対照群、ｄ：本発明）、及び選抜マーカーとしてのｎｅｏ遺伝子のコピー数（ｅ：対照群、ｆ：本発明）を確認するための、サザン及びノザンブロットを示す。
【図７】図７は、ｐＭＳ−β−ｇａｌまたは対照としてｐＳＶ−β−ｇａｌベクターで形質転換された動物細胞における、β−Ｇａｌ遺伝子のコピー数とβ−Ｇａｌの発現収量との間の関係を示すグラフである。
【図８】図８は種々の細胞株におけるｐＭＳ−β−ｇａｌベクターの発現力価を示す。
【図９】図９はｐＭＳ−β−ｇａｌベクターまたは対照ベクターで形質転換された細胞における、ＭＴＸ濃度に依存する外来性タンパク質の発現量を示す。
【図１０】図１０はｓｃｕ−ＰＡ（一本鎖プロウロキナーゼ）をｐＭＳベクター及びｐＭＳベクターに挿入した後のｓｃｕ−ＰＡの発現力価を、対照と比較して示す。
【図１１】図１１はガストリン遺伝子の転写終止部位及びＳＶ４０ポリＡシグナルを含む構築物を示す。
【図１２】図１２はガストリン遺伝子の転写終止部位及びＳＶ４０ポリＡシグナルを含む構築物を含んでなる発現ベクターにおけるβ−Ｇａｌの発現量を示す。
【図１３】図１３は本発明のｐＭＳＧ構造を示す。
【図１４】図１４は抗原抗体反応により確認されたｐＭＳＧベクターにおけるＴＧＦ−β　ＳＲＩＩの発現を示す。
【図１５】図１５はＴＧＦ−β　ＳＲＩＩ遺伝子をｐＭＳＧベクターにクローニングし、これらをＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、及びＭＴＸの添加条件において培養することにより生成される、ＴＧＦ−β　ＳＲＩＩの発現量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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