(57)【要約】本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原のヒト化抗体及びその製造方法に関する。特に、ＨＢＶ表面抗原Ｓに対するヒト化抗体の重鎖及び軽鎖可変領域内の各ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３部分のアミノ酸残基をヒト抗体の重鎖及び軽鎖由来アミノ酸残基に置換させたヒト化重鎖及びヒト化軽鎖を含むＨＢＶ表面抗原Ｓに対するヒト化抗体、上記ヒト化抗体の重鎖または軽鎖遺伝子各々を含む発現ベクター、上記重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターによって形質転換され、上記ヒト化抗体を生産できる形質転換体、及び上記形質転換体を培養してヒト化抗体を大量に製造する方法に関する。本発明のヒト化抗体は、既存のヒト化抗体よりさらにヒト化された。したがって、人体内での免疫誘発反応性は顕著に減少され、かつ、優秀な抗原結合能を示すため、Ｂ型肝炎ウイルスの予防及び治療に有用である。
2004517636.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マウス由来重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３からなる群から選択されたアミノ酸配列の一部または全体がヒト由来重鎖ＨＣＤＲのアミノ酸配列の一部または全体と置換されていることを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原Ｓに選択的に結合するヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項２】
ＨＣＤＲ１のアミノ酸残基３４番イソロイシンがバリンに置換されたことを特徴とする請求項１に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項３】
ＨＣＤＲ２のアミノ酸残基５４番スレオニンがセリンに置換されたことを特徴とする請求項１に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項４】
ＨＣＤＲ２のアミノ酸残基６５番セリンがグリシンに置換されたことを特徴とする請求項１に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項５】
ＨＣＤＲ３のアミノ酸残基１００番グルタミン酸がセリンに置換されたことを特徴とする請求項１に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項６】
請求項２ないし請求項５の遺伝子変異を全て含むことを特徴とする請求項１に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項７】
請求項６のヒト化重鎖遺伝子変異体を含むｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ発現ベクター（寄託番号：ＫＣＴＣ  １００８３ＢＰ）。
【請求項８】
マウス由来重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３からなる群から選択されたアミノ酸配列の一部または全体がヒト由来重鎖ＨＣＤＲ部位のアミノ酸配列の一部または全体と置換され、かつ、ヒトＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩに結合するペプチド配列が除去されたことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原Ｓに選択的に結合するヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項９】
ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩに結合するペプチド配列は、配列番号４４または配列番号４５で表わされることを特徴とする請求項８に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項１０】
配列番号４４で表わされる配列のＰ９位置セリンがスレオニンに置換されたことを特徴とする請求項８に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項１１】
配列番号４５で表わされる配列のＰ６位置スレオニンがアスパラギン酸に置換されたことを特徴とする請求項８に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項１２】
請求項１０ないし請求項１１の遺伝子変異を全て含むことを特徴とする請求項８に記載のヒト化重鎖遺伝子変異体。
【請求項１３】
請求項１２のヒト化重鎖遺伝子変異体を含むｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＶｈ発現ベクター（寄託番号：ＫＣＴＣ  １００８０ＢＰ）。
【請求項１４】
マウス由来軽鎖ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３で構成された群から選択されたアミノ酸配列の一部または全体が、ヒト由来軽鎖ＬＣＤＲ部位アミノ酸配列の一部または全体と置換されたＢ型肝炎ウイルスの表面抗原Ｓに選択的に結合するヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項１５】
ＬＣＤＲ１のアミノ酸残基２７ｃ番アスパラギン酸がセリンに置換されたことを特徴とする請求項１４に記載のヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項１６】
ＬＣＤＲ１のアミノ酸残基３１番セリンがアスパラギンに置換されたことを特徴とする請求項１４に記載のヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項１７】
ＬＣＤＲ１のアミノ酸残基３３番メチオニンがイソロイシンに置換されたことを特徴とする請求項１４に記載のヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項１８】
ＬＣＤＲ２のアミノ酸残基５４番グルタミンがリジンに置換されたことを特徴とする請求項１４に記載のヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項１９】
ＬＣＤＲ２のアミノ酸残基５６番セリンがスレオニンに置換されたことを特徴とする請求項１４に記載のヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項２０】
マウス由来軽鎖ＬＣＤＲ３アミノ酸残基９１番スレオニンがセリンに置換されたことを特徴とする請求項１４に記載のヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項２１】
請求項１５ないし請求項２０の遺伝子変異を全て含むことを特徴とする請求項１４に記載のヒト化軽鎖遺伝子変異体。
【請求項２２】
請求項２１のヒト化軽鎖遺伝子変異体を含むｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋ発現ベクター（寄託番号：ＫＣＴＣ  １００８４ＢＰ）。
【請求項２３】
請求項７または請求項１３のヒト化重鎖発現ベクター及び請求項２２のヒト化軽鎖発現ベクターが同時に形質転換された形質転換体。
【請求項２４】
請求項２３の形質転換体から発現される、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原Ｓに対するヒト化抗体。
【請求項２５】
マウスとヒトの抗体のＣＤＲ配列を比較し、マウスＣＤＲと最も類似なヒトＣＤＲ配列を選択し、抗原結合に直接的に関与しないマウス抗体のＣＤＲ中のアミノ酸残基をヒト抗体のＣＤＲ中のヒト由来アミノ酸残基に置換してヒト化抗体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の表面抗原Ｓに対するヒト化抗体及びその製造方法に関するものである。より詳しくは、ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖可変領域内の各ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３領域にヒト抗体由来のアミノ酸配列を有し、上記ヒト化重鎖からＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩと結合するペプチド配列を除去してＨＡＭＡ（ヒト抗マウス抗体）反応を最小化させたヒト化抗体、上記ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子を含む発現ベクター、上記重鎖発現ベクター及び軽鎖発現ベクターによって形質転換することにより上記ヒト化抗体を生産できる形質転換体、及び上記形質転換体の培養によってヒト化抗体を大量製造する方法に関するものである。
【０００２】
（発明の背景）
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ヒトに侵入して慢性及び急性肝炎を誘発させ、容態が悪化した場合、肝硬化と肝癌の原因になる病原体であり、全世界的に３億人におよぶ患者がＨＢＶに感染しているものと推定されている（Ｔｉｏｌｌａｉｓ  ＆  Ｂｕｅｎｄｉａ，Ｓｃｉ．  Ａｍ．，２６４，４８，１９９１）。ＨＢＶの皮膜は、３個の蛋白質で構成されているが、具体的にＳ抗原を含む主（ｍａｊｏｒ）蛋白質、Ｓ抗原とプリＳ２抗原を含む中（ｍｉｄｄｌｅ）蛋白質、及びＳ抗原、プリＳ２抗原及びプリＳ１抗原を含む大（ｌａｒｇｅ）蛋白質で構成されている（Ｎｅｕｒａｔｈ，Ａ．Ｒ． ａｎｄ Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．，Ａｄｖ．Ｖｉｒ．Ｒｅｓ．，３４：６５−１４２，１９８８）。上記した全てのＨＢＶ表面抗原蛋白質は、ＨＢＶを中和させて無力化する抗体を誘導する。その中のＳ抗原は、全体皮膜蛋白質の約８０％を占め、亜型のＨＢＶ全てに共通に存在する「Ｃｏｍｍｏｎ  ａ」と呼ばれる中和エピトープ（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ）を持っている。
【０００３】
ＨＢＶに感染した場合、例えばＨＢＶ陽性の母親から生まれる新生児やＨＢＶに露出した医療機関従事者達またはＨＢＶ関連肝疾患患者からの肝移植手術時に手術を受ける患者のＨＢＶ感染を防止する為にＨＢ免疫グロブリン（ＨＢＩＧ）が使用されてきた（Ｂｅａｓｌｅｙ等、Ｌａｎｃｅｔ，２，１０９９，１９８３；Ｔｏｄｏ等、Ｈｅｐａｔｏｌ．，１３，６１９，１９９１）。しかし、現在使用されているＨＢＩＧは、ヒトの血漿から抽出されるため抗原に対する選択性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）が低く、汚染される可能性が比較的高く、またヒトの血液を継続的に供給しなければならないという短所がある。
【０００４】
このような問題点を解決するために、マウスのＨＢＶ表面抗原に対する単クローン抗体を使用する方法が開発された。一般的にマウスの単クローン抗体は、抗原に対する親和度が高く大量生産が可能であるという長所を持っているが、ヒトに投与された場合に人体内でのヒト抗マウス抗体反応（以下。「ＨＡＭＡ反応」と略称する）を誘発する短所がある（Ｓｈａｗｌｅｒ等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５，１５３０，１９８５）。
【０００５】
このような問題点を克服する方法として、マウス由来単クローン抗体の高い親和度と選択性を維持しながらもＨＡＭＡ反応を最小化できる「ヒト化抗体」が開発された。ヒト化抗体は、遺伝子工学技術を用い、マウス単クローン抗体の相補性決定部位（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ，以下「ＣＤＲｓ」と略称する）をヒト抗体の骨格構造部位（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）に移植（ｇｒａｆｔｉｎｇ）することによって製造される。このようなヒト化抗体は、人体内での免疫反応を顕著に減少させられる長所を持っている（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等、Ｎａｔｕｒｅ，３３２，３２３，１９８８；Ｎａｋａｔａｎｉ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７，４３５，１９９４）。
【０００６】
しかし、このように製造されたヒト化抗体もまた抗体内に存在するマウス由来のＣＤＲｓが人体に反復投与された場合、ＨＡＭＡ反応を誘発しうる問題点を持っていることが報告された（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８５，６６８−６７４，１９９５；Ｓｈａｒｋｅｙ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５，５９３５ｓ−５９４５ｓ，１９９５）。したがって、上記ヒト化抗体内マウス抗体由来のＣＤＲｓアミノ酸残基をヒト抗体の残基に置換できれば，ＨＡＭＡ反応を減少させられるものと期待されている。
【０００７】
抗体分子の可変領域には、３個の重鎖ＣＤＲループ、すなわち、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と、３個の軽鎖ＣＤＲループ、すなわち、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３が存在するが、従来の方法でヒト化抗体を製造する為には、上記６個のＣＤＲループ全てを移植しなければならない。しかし、ＣＤＲ内の全ての残基は抗原と直接結合しない（Ｐａｄｌａｎ等、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，９，１３３，１９９５）ので、抗原結合に直接的に関与する、マウス単クローン抗体の選択決定残基（以下「ＳＤＲｓ」と略称する）をヒト抗体の骨格構造部位に移植することによって構成されたヒト化抗体は、既存の公知のヒト化抗体よりもＨＡＭＡ反応の誘発を低く押さえるであろう。
【０００８】
一方、ヘルパーＴ細胞は、免疫反応初期に必須的に作用し、ＭＨＣ（Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）ｃｌａｓｓＩＩ分子は、Ｔ細胞の選別と活性化に中心的な役割をする。ＭＨＣｃｌａｓｓＩＩ蛋白は、蛋白質抗原から切断された９個のアミノ酸で構成されるペプチドに結合して抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）の表面に送られる。ＭＨＣｃｌａｓｓＩＩ分子を認識したＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）と複合体を形成することによりＴ細胞が活性化されて、免疫反応が始まる（Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．Ｃｅｌｌ  ７６，２８７−２９９，１９９４）。したがって、ＭＨＣ分子に結合するそのようなペプチドを有さないヒト化抗体は人体の免疫反応を起きないであろう。
【０００９】
かつて、本発明者らは、ＨＢＶの表面抗原Ｓに対するマウス単一クローン抗体Ｈ６７の遺伝子等を用いたＣＤＲ−移植方法により製造したヒト化抗体を、大韓民国特許登録第１６３１６３号（１９９８．９．３）に開示し、この抗体に基づいて、より免疫誘発性を減少させたヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７を開発して特許出願した（大韓民国特許出願第９８−３２６４４号）。
【００１０】
本発明者らは、上記ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７をさらにヒト化させることによってＨＡＭＡ反応を最小化する為に、可変領域内の各ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、及び、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３に、ヒト抗体由来のアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖を備えたヒト化抗体を開発し、上記ヒト化抗体の重鎖からＭＨＣｃｌａｓｓＩＩと結合するペプチド配列を除去してさらにＨＡＭＡ反応を最小化させたヒト化抗体を製造した。人体内での免疫誘発反応の可能性を減少させ、Ｂ型肝炎ウイルス感染の予防及び治療の優れた候補となることを明らかにして本発明を完成した。
【００１１】
（発明の要旨）
本発明の目的は、Ｂ型肝炎ウイルスの感染を効果的に予防及び治療する為に、人体内での免疫反応誘発性を最小限に押さえながら優秀な抗原結合能を持ったＨＢＶ表面抗原Ｓに対するヒト化抗体及びその製造方法を提供することである。
【００１２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＨＢＶの表面抗原Ｓに対するヒト化抗体の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子内マウス由来ＣＤＲｓアミノ酸残基がヒト抗体由来アミノ酸残基に置換された重鎖及び軽鎖遺伝子を含むヒト化抗体、上記ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖遺伝子各々を含む発現ベクター、上記発現ベクターが形質転換された形質転換体を提供する。
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、ＨＢＶの表面抗原Ｓに対するヒト化抗体の重鎖可変領域内の各ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３部分のアミノ酸残基をヒト抗体の重鎖由来アミノ酸に置換させたヒト化重鎖遺伝子変異体及びそれを含む発現ベクターを提供する。
【００１４】
本発明のヒト化抗体は、ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７の重鎖可変領域に存在するマウス抗体由来のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３部分のアミノ酸残基を各々ヒト抗体由来の重鎖ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と比較して最も類似のＣＤＲ配列を選定して各ＣＤＲ内で抗原結合に影響を及ぼさないアミノ酸残基をヒト抗体由来のアミノ酸配列に置換させて製造する。
【００１５】
本発明者らは、ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７に存在する配列番号１で表わされるマウスＨＣＤＲ１由来アミノ酸残基Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎをヒト抗体のものに交換するためにマウスＨＣＤＲ１をヒト抗体ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列と比較し、その結果、マウスＨＣＤＲ１が、Ｋａｂａｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ＩＤ  Ｎｕｍｂｅｒ  ３５９２０の配列番号２で表わされるヒト抗体のＨＣＤＲ１由来アミノ酸残基Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐと高い相同性を持っていることを確認して、上記の二つの配列間の差を示す４番目及び５番目残基を置換させてＨＣＤＲ１遺伝子変異体を製造した。
【００１６】
これを行う為に、まず、マウスＨＣＤＲ１とヒト抗体のＨＣＤＲ１アミノ酸配列間の差を示す、３４番イソロイシンと３５番グルタミンをバリンとアスパラギンにそれぞれ置換させて遺伝子変異体Ｉ３４Ｖ、Ｑ３５Ｎを製造する。
【００１７】
これらの遺伝子変異体は、ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７の重鎖遺伝子発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＣ−ＨＺＩＩＳ（ＫＣＴＣ  ０４８９ＢＰ）を鋳型に利用するＰＣＲと組み換えＰＣＲを行うことによって製造される（図１及び図２参照）。
【００１８】
その結果、配列番号３及び配列番号４で表わされるＨＬとＰ１プライマーの組を使用したＰＣＲから得たＤＮＡ断片及び配列番号５及び配列番号６で表わされるＰ２とＨＣプライマーの組を使用したＰＣＲから得たＤＮＡ断片を鋳型にして、ＨＬとＨＣプライマーの組に組み換えＰＣＲを行なうことによってヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｉ３４Ｖを得る。上記遺伝子変異体Ｉ３４Ｖをヒト化重鎖発現ベクターとしてヒト化重鎖を暗号するｃＤＮＡ遺伝子がクローニングされている発現ベクターにクローニングして組み換え発現ベクターを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｉ３４Ｖと命名した（図３参照）。ヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｉ３４Ｖのヌクレオチド配列を分析して上記組み換え発現ベクター内にヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体のＩ３４Ｖが挿入されたことを確認した。
【００１９】
マウスＨＣＤＲ１とヒト抗体のＨＣＤＲ１配列間にお互いに差を示す残基中で５番目残基のグルタミン（Ｇｌｎ）をヒト抗体重鎖由来ＤＰ−１５のアスパラギン（Ａｓｎ）に置換させた遺伝子変異体Ｑ３５Ｎは、配列番号３、配列番号７、配列番号８及び配列番号６で表わされるプライマーの組を使用して上記と同一の方法でＰＣＲ及び組み換えＰＣＲを行なって得られた。その後、これを発現ベクターにクローニングして組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｑ３５Ｎを製造した。
【００２０】
また、ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７に存在するマウスＨＣＤＲ２由来アミノ酸残基をヒト抗体のアミノ酸残基に置換した本発明のヒト化抗体において、マウス由来のＨＣＤＲ２由来アミノ酸配列が全てヒト抗体由来のＨＣＤＲ２アミノ酸配列に置換されることが望ましいが、抗原結合に直接関与するアミノ酸残基は、置換しないことが望ましい。本発明者らは、ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７に存在するマウスＨＣＤＲ２由来アミノ酸残基をヒト抗体のものと換えるために、マウスのＨＣＤＲ２をヒト抗体ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列と比較してマウスＨＣＤＲ２と、ヒト抗体重鎖ＤＰ−１５のＨＣＤＲ２領域との相同性を確認し、上記二配列間で差を現わす残基中で抗原結合に直接関与しないものと考えられる残基を置換してＨＣＤＲ２遺伝子変異体を上記と同一の方法で製造した。
【００２１】
その結果、ＨＣＤＲ２由来アミノ酸残基５１番イソロイシンがメチオニンに置換された遺伝子変異体Ｉ５１Ｍ（配列番号９及び配列番号１０のプライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｉ５１Ｍ、アミノ酸残基５４番スレオニンがセリンに置換された遺伝子変異体Ｔ５４Ｓ（配列番号１１及び配列番号１２のプライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｔ５４Ｓ、アミノ酸残基６５番セリンがグリシンに置換された遺伝子変異体Ｓ６５Ｇ（配列番号１３及び配列番号１４のプライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｓ６５Ｇを製造した。
【００２２】
合わせて、ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７に存在するマウスＨＣＤＲ３由来アミノ酸残基をヒト抗体のアミノ酸残基に置換した本発明のヒト化抗体において、マウス由来のＨＣＤＲ３由来アミノ酸配列が全てヒト抗体由来のＨＣＤＲ３アミノ酸配列に置換されることが望ましいが、抗原結合に直接関与するアミノ酸残基は置換しないことが望ましい。本発明者らは、ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７に存在するマウスＨＣＤＲ３配列由来アミノ酸残基をヒト抗体のものと換えるために、抗原結合に直接的に関与するアミノ酸残基を同定するために、アラニンに置換さマウスＨＣＤＲ３の遺伝子変異生成を行った。
【００２３】
その結果、ＨＣＤＲ３由来アミノ酸残基９５番アスパラギンがアラニンに置換された遺伝子変異体Ｎ９５Ａ（配列番号１５及び配列番号１６のプライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｎ９５Ａ、アミノ酸残基９６番チロシンがアラニンに置換された遺伝子変異体Ｙ９６Ａ（配列番号１７及び配列番号１８のプライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｙ９６Ａ、アミノ酸残基９７番グリシンがアラニンに置換された遺伝子変異体Ｇ９７Ａ（配列番号１９及び配列番号２０のプライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｇ９７Ａ、アミノ酸残基９８番チロシンがアラニンに置換された遺伝子変異体Ｙ９８Ａ（配列番号２１及び配列番号２２のプライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｙ９８Ａ、アミノ酸残基９９番アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）がアラニンに置換された遺伝子変異体Ｄ９９Ａ（配列番号２３及び配列番号２４のプライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｄ９９Ａ、アミノ酸残基１００番グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）がアラニンに置換された遺伝子変異体Ｅ１００Ａ（配列番号２５及び配列番号２６のプライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクター  ｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｅ１００Ａ、アミノ酸残基１００ａ番セリンがアラニンに置換された遺伝子変異体Ｓ１００ａＡ（配列番号２７及び配列番号２８のプライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｓ１００ａＡを製造した。
【００２４】
上述したように、本発明のヒト化抗体は、既存のヒト化抗体に存在するマウス由来ＣＤＲ部位のアミノ酸残基の中で抗原との結合に直接的に参与せず抗原結合親和度に影響を及ぼさないと予想されるいくつかのアミノ酸残基をヒト抗体のアミノ酸残基に置換させて、さらにヒト化されている。特に、本発明では、マウス抗体のＣＤＲｓ全体アミノ酸残基をこれと相同性を持ったヒト抗体に移植させる従来の方法とは異なり、ＣＤＲｓ内においても特にＨＢＶ  Ｓ表面抗原との結合に直接的に関与するＳＤＲｓ部位だけをヒト抗体に移植させるＳＤＲ−移植方法を利用して既存のヒト化抗体よりＨＡＭＡ反応の誘発をより少なくおさえながら治療効果が改善されたヒト化抗体を開発した。
【００２５】
本発明者らは、上記のように製造された本発明のヒト化重鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体の発現程度を確認する為に、動物セルラインに各々のヒト化重鎖遺伝子変異体を含む各々の組み換え発現ベクターを形質転換させ、これから発現されたヒト化抗体の濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ法で測定して、ヒト化重鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体の表面抗原Ｓに対する抗原結合能を間接ＥＬＩＳＡにより測定した。その結果、ＨＣＤＲ１遺伝子変異体の中では、Ｉ３４ＶのＨＢＶ表面抗原Ｓに対する結合能が野生型ヒト化抗体ＨＺＳ−Ｈ６７の重鎖とほとんど同じであり、ＨＣＤＲ２遺伝子変異体の場合には、Ｔ５４ＳとＳ６５Ｇが野生型とほとんど同一水準の抗原結合能を示した（図４参照）。反面、ＨＣＤＲ３遺伝子変異体の場合には、Ｅ１００Ａが野生型より若干落ちた抗原結合能を示したが、これは、上記ＨＣＤＲ３遺伝子変異体のグルタミン酸残基（Ｅ１００）がＨＢＶ表面抗原Ｓとの結合に重要に作用しないことを示唆するものである。
【００２６】
上記のように本発明者らは、マウスＨＣＤＲ３配列由来１００番目アミノ酸残基のグルタミン酸（Ｅ１００）がＨＢＶ表面抗原Ｓとの結合に重要に作用しないことを確認して上記アミノ酸残基を異なるヒト抗体のものに置換させるためにヒト抗体ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列データベースと比較した結果、マウスＨＣＤＲ３配列に高い相同性を示すヒト抗体配列（Ｋａｂａｔ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ  ＩＤ  Ｎｏ  ２４５６２，３９６６９，４４７６０）でＨＣＤＲ３の１００番残基のサリンと１０１番残基のグリシンが共通的であることを確認し、マウス由来ＨＣＤＲ３の１００番目グルタミン酸をセリンまたは１０１番目アラニンをグリシンに置換させた遺伝子変異体を製造してこれらの抗原結合能を測定した。
【００２７】
前述したのと同一の方法でアミノ酸残基１００番グルタミン酸がセリンに置換された遺伝子変異体Ｅ１００Ｓ（配列番号２９及び配列番号３０のプライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｅ１００Ｓ、アミノ酸１０１番アラニンがグリシンに置換された遺伝子変異体Ａ１０１Ｇ（配列番号３１及び配列番号３２のプライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ａ１０１Ｇを製造した。ヒト化重鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体の表面抗原Ｓに対する抗原結合能を測定した結果、Ｅ１００Ｓの抗原結合能は野生型と類似な反面、Ａ１０１Ｇは抗原結合能が多少減少したことが分かった。
【００２８】
本発明者らは、上記結果を基に本発明で製造したヒト化重鎖の変異体の中でＩ３４Ｖ、Ｔ５４Ｓ、Ｓ６５Ｇ及びＥ１００Ｓの抗原結合能が野生型と類似であることを確認して、上記４個の遺伝子変異体を同時に含む組み換え変異体を製造した。
【００２９】
まず、Ｔ５４ＳとＩ３４Ｖ遺伝子変異体を含む組み換え遺伝子変異体を製造する為に、Ｔ５４Ｓの重鎖遺伝子発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｔ５４Ｓを鋳型にして上記と同一の方法でＰＣＲとサブクローニングを行ない、これから得た組み換え発現ベクターをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｔ５４Ｓ＋Ｉ３４Ｖと命名した。
【００３０】
また、Ｔ５４Ｓ、Ｉ３４Ｖ及びＥ１００Ｓ遺伝子変異体を含む組み換え遺伝子変異体を製造する為に、Ｉ３４Ｖの重鎖遺伝子発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｉ３４Ｖを鋳型にして上記と同一の方法でＰＣＲとサブクローニングを行ない、これから得た組み換え発現ベクターをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｔ５４Ｓ＋Ｉ３４Ｖ＋Ｅ１００Ｓと命名した。
【００３１】
あわせて、Ｔ５４Ｓ、Ｉ３４Ｖ、Ｅ１００Ｓ及びＳ６５Ｇ遺伝子変異体を含む組み換え遺伝子変異体を製造する為に、Ｅ１００Ｓの重鎖遺伝子発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｅ１００Ｓを鋳型にして上記と同一の方法でＰＣＲとサブクローニングを行なった。これからＴ５４Ｓ、Ｉ３４Ｖ、Ｅ１００Ｓ及びＳ６５Ｇ遺伝子変異体を全て含む組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｔ５４Ｓ＋Ｉ３４Ｖ＋Ｅ１００Ｓ＋Ｓ６５Ｇを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈと命名した。
【００３２】
このように製造されたヒト化重鎖組み換え遺伝子変異体を持つヒト化抗体の抗原結合能を測定する為に、これらを含む組み換え発現ベクターを動物セルラインに形質転換させてこれから発現されるヒト化抗体の表面抗原Ｓに対する抗原結合能を間接ＥＬＩＳＡにより測定した。
【００３３】
その結果、本発明の遺伝子変異体をいくつか含むＩ３４Ｖ＋Ｔ５４Ｓ、Ｉ３４Ｖ＋Ｔ５４Ｓ＋Ｅ１００Ｓ及びＩ３４Ｖ＋Ｔ５４Ｓ＋Ｅ１００Ｓ＋Ｓ６５Ｇの組み換え遺伝子変異体を持つ各々のヒト化重鎖は、表面抗原Ｓに対して野生型のヒト化抗体ＨＺＳ−Ｈ６７の重鎖とほとんど同一水準の結合能を示した（図５参照）。このようにＨＢＶ表面抗原Ｓに対する抗原結合能が確認された重鎖組み換え遺伝子変異体を発現する発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈを韓国生命工学研究院遺伝子銀行（ＫＲＩＢＢ）に２０００年９月２２日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ  １００８３ＢＰ）。上記発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈから発現されるヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの重鎖アミノ酸配列を分析した結果、配列番号４３で表わされるアミノ酸配列の可変領域を含むヒト化重鎖ＨｚＳ−ＩＩＩ−ＶＨで成ることを確認した。
【００３４】
また、本発明は、ＳＤＲ−移植方法によって、ＨＢＶの表面抗原Ｓに対するヒト化抗体の軽鎖可変領域内ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３部分のアミノ酸残基をヒト抗体の軽鎖由来アミノ酸に置換させて製造されたヒト化軽鎖遺伝子変異体及びそれを含む発現ベクターを提供する。
【００３５】
本発明のヒト化抗体は、ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７の軽鎖可変領域に存在するＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３部分のアミノ酸残基をヒト抗体由来の軽鎖アミノ酸配列に置換させて製造される。ヒト化軽鎖の場合には、ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７のＬＣＤＲ１とＬＣＤＲ２がすでにヒト抗体のアミノ酸残基を含んでいるため（ＬＣＤＲ１の場合Ｄ２７ｃＳ、Ｓ３１Ｎ、Ｍ３３Ｉ；ＬＣＤＲ２の場合Ｑ５４Ｋ、Ｓ５６Ｔ）、本発明者らは、ＬＣＤＲ３のアミノ酸残基を変更した。詳しくは、本発明者らは、ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７に存在するマウス由来ＬＣＤＲ３のアミノ酸残基をヒト抗体のものと換えるために、上記ＬＣＤＲ３と高い相同性を持つヒト軽鎖Ｂ１のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と比較した（図６参照）。これからマウス由来ＬＣＤＲ３配列の８９番グルタミンと９１番スレオニン残基が抗原結合に直接的に関与しないものと判断してこれらをヒト抗体の残基のロイシンとセリンに置換させた。
【００３６】
その結果、アミノ酸残基８９番グルタミンがロイシンに置換された遺伝子変異体Ｑ８９Ｌ（配列番号３３ないし配列番号３６のプライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクターｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋ−Ｑ８９Ｌ（図７及び図８参照）、アミノ酸９１番スレオニンがセリンに置換された遺伝子変異体Ｔ９１Ｓ（配列番号３３及び配列番号３６ないし配列番号３８プライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクターｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋ−Ｔ９１Ｓを製造した。
【００３７】
ヒト化軽鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体のＨＢＶ表面抗原Ｓに対する結合能を測定する為に、遺伝子変異体各々を含む組み換え発現ベクターを動物セルラインに形質転換させ、これから発現されるヒト化抗体の結合能を間接ＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【００３８】
その結果、上記遺伝子変異体中９１番スレオニンがセリンに置換されたＴ９１Ｓの変異を持つヒト化軽鎖が野生型ヒト化抗体ＨＺＳ−Ｈ６７の軽鎖と同一の水準の表面抗原Ｓに対する結合能を示すことを確認してＴ９１Ｓ遺伝子変異体を発現する発現ベクターｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋ−Ｔ９１ＳをｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋと命名した。このようにＨＢＶ表面抗原Ｓに対する結合能が確認された遺伝子変異体Ｔ９１Ｓを発現する組み換え発現ベクターｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋを生命工学研究所遺伝子銀行（ＫＲＩＢＢ）に２０００年９月２２日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ  １００８４ＢＰ）。上記発現ベクターｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋから発現されるヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの軽鎖アミノ酸配列を分析した結果、配列番号４２で表わされるアミノ酸配列の可変領域を含むヒト化軽鎖ＨｚＳ−ＩＩＩ−ＶＬで成り立っていることを確認した。
【００３９】
あわせて、本発明は、ＨＢＶの表面抗原Ｓに対するマウス単クローン抗体Ｈ６７の重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子内マウス由来アミノ酸残基がヒト由来アミノ酸残基に置換された重鎖及び軽鎖遺伝子を含むヒト化抗体を提供する。
【００４０】
組み換え重鎖組及び軽鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体を製造する為に、本発明者らは、ヒト化重鎖発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈとヒト化軽鎖発現ベクターｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋを動物セルに形質転換させた後、４８時間培養して形質転換体から組み換えヒト化重鎖及び組軽鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩを発現させた。これから得た培養上澄み液内に存在するヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ方法で測定した後、前述したのと同一の方法で間接ＥＬＩＳＡ方法を利用して抗原結合能を測定した。
【００４１】
その結果、組ヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩは、野生型ヒト化抗体ＨＺＳ−Ｈ６７（Ｈ／Ｋ）と同一の水準で表面抗原Ｓに対する結合能を示した（図１１参照）。
また、ヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの抗原結合親和度を競合ＥＬＩＳＡ方法（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ，Ｒｙｕ等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．，５２，２２６，１９９７）を利用して測定した。その結果、本発明のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩは、マウス由来のいくつかのアミノ酸残基がヒトのものに置換されたが、抗原結合親和度には特別な影響を及ぼさず対照群に使用されたＨＺＩＩ−Ｈ６７の親和度と大きな差を示さないことを確認した（図１２参照）。
【００４２】
また、本発明では、上記のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの重鎖配列内でＭＨＣｃｌａｓｓ  ＩＩに結合するペプチド配列が存在するかどうかをスタニオロ（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ）等の方法（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，５５５−５６１，１９９９）でスクリーニングし、ＭＨＣＩＩに結合しないと推定される残基を置換したヒト化重鎖を製造し、その抗原結合能を測定した。上記のようなヒト化重鎖を製造する為に、アミノ酸残基４４番セリンがスレオニンに置換された遺伝子変異Ｓ４４Ｔ（配列番号４６及び配列番号４７のプライマーの組を利用）とアミノ酸残基６８番スレオニンがアスパラギン酸に置換された遺伝子変異Ｔ６８Ｄ（配列番号４８及び配列番号４９のプライマーの組を利用）及びこれを含む組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＶｈを製造し、これを２００１年９月２６日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行（ＫＲＩＢＢ）に寄託した（寄託番号；ＫＣＴＣ１００８０ＢＰ）。上記ヒト化重鎖発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＶｈとヒト化軽鎖発現ベクターｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋを動物セルラインに形質転換させた後、４８時間培養して形質転換体からヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＶを発現させた。これから得た培養上澄み液内に存在するヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＶの抗原結合能を測定した結果、本発明のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＶは、ヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩとほとんど類似した抗原結合親和度を示した（図１２参照）。
【００４３】
このようにＨＢＶ表面抗原Ｓに対して優秀な結合能及び抗原結合親和度を示した本発明のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩ及びＨｚＳ−ＩＶの重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を野生型のマウス単クローン抗体Ｈ６７及びヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７のアミノ酸配列と比較した。その結果、本発明のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、マウス単クローン抗体Ｈ６７とヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７に比べてマウス由来アミノ酸残基が少なかった。これは、重鎖遺伝子のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３と軽鎖遺伝子のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３内のいくつかのマウス由来アミノ酸残基がヒト由来アミノ酸残基に置換されたためである。また、本発明のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＶの重鎖可変領域のアミノ酸配列の内、ヒトＭＨＣＩＩに結合して免疫反応を誘発するものと考えられる骨格領域の二つのアミノ酸残基が置換されており、このため免疫反応が最小化される（図１３及び図１４参照）。
【００４４】
したがって、本発明のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩ及びＨｚＳ−ＩＶは、既存のヒト化抗体よりＨＡＭＡ反応の誘発を少なく押さえ、なおかつ優秀な治療効果を示すので、Ｂ型肝炎ウイルスの治療に有用である。
【００４５】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのもであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるものではない。
【００４６】
＜実施例１＞ヒト化重鎖抗体をコードする遺伝子の変異
＜１−１＞ＨＣＤＲ１遺伝子変異体の製造
ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７（大韓民国特許第９８−３２６４４号）に存在する配列番号１で表わされるマウスＨＣＤＲ１由来アミノ酸残基Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎをヒト抗体のものと換えるために、マウスＨＣＤＲ１をヒト抗体ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列と比較した。その結果、マウスＨＣＤＲ１がＫａｂａｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ＩＤ  Ｎｕｍｂｅｒ  ３５９２０の配列番号２で表わされるヒト抗体のＨＣＤＲ１由来アミノ酸残基Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐと高い相同性を持っていることが確認された。そこで、上記の二配列間に差が見られる４番目及び５番目残基を置換させてＨＣＤＲ１遺伝子変異体を製造した。
【００４７】
＜１−１−１＞アミノ酸残基３４番イソロイシンがバリンに置換された遺伝子変異体の製造
マウスＨＣＤＲ１とヒト抗体のＨＣＤＲ１アミノ酸配列間にお互いに差を示す残基中で抗原のエピトープ領域と直接結合しないものと考えられる４番目３４番イソロイシンをバリンに置換させた遺伝子変異体Ｉ３４Ｖを製造する為に、ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７の重鎖遺伝子発現ベクターｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＣ−ＨＺＩＩＳ（ＫＣＴＣ  ０４８９ＢＰ）を鋳型にして配列番号３ないし配列番号６で表わされるプライマーを利用してＰＣＲと組み換えＰＣＲを行なった（図１及び図２）。詳しくは、ＰＣＲはＴａｑＤＮＡ重合酵素（Ｔａｋａｒａ社）を使用して９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の反応を３０回行なった。
【００４８】
その結果、配列番号３及び配列番号４で表わされるＨＬとＰ１プライマーの組を使用したＰＣＲから１８１ｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅され、配列番号５及び配列番号６で表わされるＰ２とＨＣプライマーの組を使用したＰＣＲから２８４ｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した。上記二ＤＮＡ断片を鋳型にしてＨＬとＨＣプライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって４４８ｂｐの大きさのヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｉ３４Ｖを得た。上記遺伝子変異体Ｉ３４Ｖの可変領域両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、制限酵素ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩ位置にヒト化重鎖を暗号するｃＤＮＡ遺伝子がクローニングされているヒト化重鎖発現ベクターのｐｃＤｄＡ−ＨＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐｃＤＮＡ３のＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ位置の間にＨＢＶのｐｒｅＳ１抗原に対するヒト化抗体の重鎖遺伝子［大韓民国特許出願第１９９８−４９６６３号］がクローニングされている発現ベクター）の制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｉ３４Ｖと命名した（図３）。ヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｉ３４Ｖの塩基配列をＤＮＡ配列分析機で分析して上記組み換え発現ベクター内にヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体のＩ３４Ｖが挿入されたことを確認した。
【００４９】
＜１−１−２＞アミノ酸残基３５番グルタミンがアスパラギンに置換された遺伝子変異体の製造
マウスＨＣＤＲ１とヒト抗体のＨＣＤＲ１配列間にお互いに差を示す残基中で５番目残基のグルタミンをヒト抗体重鎖由来ＤＰ−１５のアスパラギン（Ａｓｎ）に置換させた遺伝子変異体Ｑ３５Ｎを製造する為に、上記実施例＜１−１−１＞と同一の条件でＰＣＲを行なった。
【００５０】
詳しくは、配列番号３で表わされるＨＬと配列番号７で表わされるＰ３プライマーの組を使用して１８７ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅して、配列番号６で表わされるＨＣと配列番号８で表わされるＰ４プライマーの組を使用して２７８ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅した後、これらを鋳型にしてＨＬとＨＣプライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって４４８ｂｐの大きさのヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｑ３５Ｎを得た。上記遺伝子変異体Ｑ３５Ｎの可変領域両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨＣの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｑ３５Ｎと命名した。ヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｑ３５Ｎの塩基配列をＤＮＡ配列分析機で分析して上記組み換え発現ベクター内にヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体のＱ３５Ｎが挿入されたことを確認した。
【００５１】
＜１−２＞ＨＣＤＲ２遺伝子変異体の製造
ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７に存在する配列番号３９で表わされるマウスＨＣＤＲ２由来アミノ酸残基をヒト抗体のものと換えるために、マウスＨＣＤＲ２をヒト抗体ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列と比較した。その結果、マウスＨＣＤＲ２は生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）ヒト抗体重鎖の切片のＤＰ−１５の配列番号４０で表わされるＨＣＤＲ２の配列と高い相同性を示した。上記二配列間で差が見られる残基中で抗原結合に直接関与しないものと考えられる残基を置換してＨＣＤＲ２遺伝子変異体を製造した。
【００５２】
＜１−２−１＞アミノ酸残基５１番イソロイシンがメチオニンに置換された遺伝子変異体の製造
ＨＣＤＲ２遺伝子変異体を製造する為に、上記実施例＜１−１−１＞と同一の方法でＰ１とＰ２プライマーの組の代りに配列番号９と配列番号１０で表わされるＰ５とＰ６プライマーの組を使用してＰＣＲを行なった。ＨＬとＰ５プライマーの組を使用して２３６ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅して、ＨＣとＰ４プライマーの組を使用して２３０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅した後、これから得た上記二ＤＮＡ断片を鋳型にしてＨＬとＨＣプライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって４４８ｂｐの大きさのヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｉ５１Ｍを得た。上記遺伝子変異体Ｉ５１Ｍの可変領域両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨＣの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｉ５１Ｍと命名した。ヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｉ５１Ｍの塩基配列をＤＮＡ配列分析機で分析して上記組み換え発現ベクター内にヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体のＩ５１Ｍが挿入されたことを確認した。
【００５３】
＜１−２−２＞アミノ酸残基５４番スレオニンがセリンに置換された遺伝子変異体の製造
上記実施例＜１−１−１＞と同一の方法でＰ１とＰ２プライマーの組の代りに配列番号１１と配列番号１２で表わされるＰ７とＰ８プライマーの組を使用してＰＣＲを行なった。ＨＬとＰ７プライマーの組を使用して２４９ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅して、ＨＣとＰ８プライマーの組を使用して２１８ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅した後、これから得た上記二ＤＮＡ断片を鋳型にしてＨＬとＨＣプライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって４４８ｂｐの大きさのヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｔ５４Ｓを得た。上記遺伝子変異体Ｔ５４Ｓの可変領域両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨＣの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｔ５４Ｓと命名した。ヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｔ５４Ｓの塩基配列をＤＮＡ配列分析機で分析して上記組み換え発現ベクター内にヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体のＴ５４Ｓが挿入されたことを確認した。
【００５４】
＜１−２−３＞アミノ酸残基６５番セリンがグリシンに置換された遺伝子変異体の製造
上記実施例＜１−１−１＞と同一の方法でＰ１とＰ２プライマーの組の代りに配列番号１３と配列番号１４で表わされるＰ９とＰ１０プライマーの組を使用してＰＣＲを行なった。ＨＬとＰ９プライマーの組を使用して２７８ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅して、ＨＣとＰ１０プライマーの組を使用して１８５ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅した後、これから得た上記二ＤＮＡ断片を鋳型にしてＨＬとＨＣプライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって４４８ｂｐの大きさのヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｓ６５Ｇを得た。上記遺伝子変異体Ｓ６５Ｇの可変領域両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨＣの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｓ６５Ｇと命名した。ヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｓ６５Ｇの塩基配列をＤＮＡ配列分析機で分析して上記組み換え発現ベクター内にヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体のＳ６５Ｇが挿入されたことを確認した。
【００５５】
＜１−３＞ＨＣＤＲ３遺伝子変異体の製造
ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７に存在する配列番号４１で表わされるマウスＨＣＤＲ３配列由来アミノ酸残基をヒト抗体のものと換えるために、マウスＨＣＤＲ３をヒト抗体ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と比較してマウスＨＣＤＲ３配列のアミノ酸残基中で抗原結合に直接的に作用しない残基を置換させてＨＣＤＲ３遺伝子変異体を製造した。
【００５６】
＜１−３−１＞アミノ酸残基９５番アスパラギンがアラニンに置換された遺伝子変異体の製造
上記実施例＜１−１−１＞と同一の方法でＰ１とＰ２プライマーの組の代りに配列番号１５と配列番号１６で表わされるＰ１１とＰ１２プライマーの組を使用してＰＣＲを行なった。ＨＬとＰ１１プライマーの組を使用して３８１ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅して、ＨＣとＰ１２プライマーの組を使用して８８ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅した後、これから得た上記二ＤＮＡ断片を鋳型にしてＨＬとＨＣプライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって４４８ｂｐの大きさのヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｎ９５Ａを得た。上記遺伝子変異体Ｎ９５Ａの可変領域両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨＣの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｎ９５Ａと命名した。ヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｎ９５Ａの塩基配列をＤＮＡ配列分析機で分析して上記組み換え発現ベクター内にヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体のＮ９５Ａが挿入されたことを確認した。
【００５７】
＜１−３−２＞アミノ酸残基９６番チロシンがアラニンに置換された遺伝子変異体の製造
上記実施例＜１−１−１＞と同一の方法でＰ１とＰ２プライマーの組の代りに配列番号１７と配列番号１８で表わされるＰ１３とＰ１４プライマーの組を使用してＰＣＲを行なった。ＨＬとＰ１３プライマーの組を使用して３８０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅して、ＨＣとＰ１４プライマーの組を使用して８５ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅した後、これから得た上記二ＤＮＡ断片を鋳型にしてＨＬとＨＣプライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって４４８ｂｐの大きさのヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｙ９６Ａを得た。上記遺伝子変異体Ｙ９６Ａの可変領域両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨＣの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｙ９６Ａと命名した。ヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｙ９６Ａの塩基配列をＤＮＡ配列分析機で分析して上記組み換え発現ベクター内にヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｙ９６Ａが挿入されたことを確認した。
【００５８】
＜１−３−３＞アミノ酸残基９７番グリシンがアラニンに置換された遺伝子変異体の製造
上記実施例＜１−１−１＞と同一の方法でＰ１とＰ２プライマーの組の代りに配列番号１９と配列番号２０で表わされるＰ１５とＰ１６プライマーの組を使用してＰＣＲを行なった。ＨＬとＰ１５プライマーの組を使用して３８３ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅して、ＨＣとＰ１４プライマーの組を使用して８２ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅した後これから得た上記二ＤＮＡ断片を鋳型にしてＨＬとＨＣプライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって４４８ｂｐの大きさのヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｇ９７Ａを得た。上記遺伝子変異体Ｇ９７Ａの可変領域両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨＣの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｇ９７Ａと命名した。ヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｙ９６Ａの塩基配列をＤＮＡ配列分析機で分析して上記組み換え発現ベクター内にヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体のＧ９７Ａが挿入されたことを確認した。
【００５９】
＜１−３−４＞アミノ酸残基９８番チロシンがアラニンに置換された遺伝子変異体の製造
上記実施例＜１−１−１＞と同一の方法でＰ１とＰ２プライマーの組の代りに配列番号２１と配列番号２２で表わされるＰ１７とＰ１８プライマーの組を使用してＰＣＲを行なった。ＨＬとＰ１７プライマーの組を使用して３８６ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅して、ＨＣとＰ１８プライマーの組を使用して７８ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅した後これから得た上記二ＤＮＡ断片を鋳型にしてＨＬとＨＣプライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって４４８ｂｐの大きさのヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｙ９８Ａを得た。上記遺伝子変異体Ｙ９８Ａの可変領域両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨＣの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造した。これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｙ９８Ａと命名した。ヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｙ９８Ａの塩基配列をＤＮＡ配列分析機で分析して上記組み換え発現ベクター内にヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体のＹ９８Ａが挿入されたことを確認した。
【００６０】
＜１−３−５＞アミノ酸残基９９番アスパラギン酸がアラニンに置換された遺伝子変異体の製造
上記実施例＜１−１−１＞と同一の方法でＰ１とＰ２プライマーの組の代りに配列番号２３と配列番号２４で表わされるＰ１９とＰ２０プライマーの組を使用してＰＣＲを行なった。ＨＬとＰ１９プライマーの組を使用して３９０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅して、ＨＣとＰ２０プライマーの組を使用して７３ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅した後これから得た上記二ＤＮＡ断片を鋳型にしてＨＬとＨＣプライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって４４８ｂｐの大きさのヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｄ９９Ａを得た。上記遺伝子変異体Ｄ９９Ａの可変領域両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨＣの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｄ９９Ａと命名した。ヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｙ９８Ａの塩基配列をＤＮＡ配列分析機で分析して上記組み換え発現ベクター内にヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体のＤ９９Ａが挿入されたことを確認した。
【００６１】
＜１−３−６＞アミノ酸残基１００番グルタミン酸がアラニンに置換された遺伝子変異体の製造
上記実施例＜１−１−１＞と同一の方法でＰ１とＰ２プライマーの組の代りに配列番号２５と配列番号２６で表わされるＰ２１とＰ２２プライマーの組を使用してＰＣＲを行なった。ＨＬとＰ２１プライマーの組を使用して３９０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅して、ＨＣとＰ２２プライマーの組を使用して７３ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅した後これから得た上記二ＤＮＡ断片を鋳型にしてＨＬとＨＣプライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって４４８ｂｐの大きさのヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｅ１００Ａを得た。上記遺伝子変異体Ｅ１００Ａの可変領域両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨＣの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｅ１００Ａと命名した。ヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｙ９８Ａの塩基配列をＤＮＡ配列分析機で分析して上記組み換え発現ベクター内にヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｅ１００Ａが挿入されたことを確認した。
【００６２】
＜１−３−７＞アミノ酸残基１００ａ番セリンがアラニンに置換された遺伝子変異体の製造
上記実施例＜１−１−１＞と同一の方法でＰ１とＰ２プライマーの組の代りに配列番号２７と配列番号２８で表わされるＰ２３とＰ２４プライマーの組を使用してＰＣＲを行なった。ＨＬとＰ２３プライマーの組を使用して３９５ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅して、ＨＣとＰ２４プライマーの組を使用して６７ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅した後これから得た上記二ＤＮＡ断片を鋳型にしてＨＬとＨＣプライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって４４８ｂｐの大きさのヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｓ１００ａＡを得た。上記遺伝子変異体Ｓ１００ａＡの可変領域両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨＣの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｓ１００ａＡと命名した。ヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｙ９８Ａの塩基配列をＤＮＡ配列分析機で分析して上記組み換え発現ベクター内にヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体のＳ１００ａＡが挿入されたことを確認した。
【００６３】
＜実施例２＞ヒト化重鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体の発現
ヒト化重鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体を細胞で直接発現させるために上記発現ベクターを動物セルラインに形質転換させた。
【００６４】
詳しくは、ＣＯＳ７細胞を牛胎児血清が１０％添加されたＤＭＥＭ培養培地（ＧＩＢＣＯ）に接種して、これを３７℃、５％ＣＯ２恒温器で継代培養した。上記細胞を１００ｍｍ培養皿に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ濃度で接種して、３７℃で夜通し培養した後ＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ（ＧＩＢＣＯ）で３回洗浄した。一方、上記実施例１で製造されたＩ３４Ｖ、Ｑ３５Ｎ、Ｉ５１Ｍ、Ｔ５４Ｓ、Ｓ６５Ｇ、Ｎ９５Ａ、Ｙ９６Ａ、Ｇ９７Ａ、Ｙ９８Ａ、Ｄ９９Ａ、Ｅ１００ＡまたはＳ１００ａＡのヒト化重鎖遺伝子変異体を含む各々の組み換え発現ベクターとヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７の軽鎖発現ベクターｐＫＣ−ｄｈｆｒ−ＨＺＩＩＳ（ＫＣＴＣ  ０４９０ＢＰ）を５μｇずつ取って８００μｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉで稀釈して、５０μｌのリポフェクトアミン（ＧＩＢＣＯ）もＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉ  ８００μｌで稀釈した。上記稀釈液を１５μｌチューブに入れて混合してＤＮＡ−リポフェクトアミン混合物を製造した後、これを１５分以上室温に放置した。上記各々のＤＮＡ−リポフェクトアミン混合物に６．４ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ  Ｉを添加し、これをきれいに洗浄されたＣＯＳ７細胞に一様に混合して細胞内を形質転換（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた。形質転換は、ＤＮＡ−リポフェクトアミン混合物が添加された上記細胞培養液を３７℃、５％ＣＯ２恒温器で４８時間培養して行ない、これから培養上澄み液を回収してサンドイッチＥＬＩＳＡ法で抗体の濃度を測定した。サンドイッチＥＬＩＳＡを行なう為に、抗ヒト抗体（ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ，Ｓｉｇｍａ社製品）を捕獲抗体（ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）に使用し、抗ヒト抗体（Ｆｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，Ｓｉｇｍａ社製品）が結合された抗体を２次抗体に使用した。
【００６５】
＜実施例３＞ヒト化重鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体の表面抗原Ｓに対する抗原結合能測定
ＨＢＶの表面抗原Ｓ（緑十字社）をマイクロプレートの各ウェルに２５０ｎｇずつ添加してコーティングした後、ここに上記実施例２から得た各々のＤＮＡ−リポフェクトアミン混合物が形質転換された細胞培養液を実施例２で測定された抗体濃度を基準にして、抗体の濃度が各々０、０．２、０．４、０．８、１．８、３．５及び７ｎｇになるように添加した。上記ウェルプレートに抗ヒト抗体に西洋ワサビペルオキシダーゼが結合された抗体を２次抗体に使用して、間接ＥＬＩＳＡを行なった後４９２ｎｍで吸光度を測定した。対照群には、ＨＺＩＩ−Ｈ６７の重鎖及び軽鎖発現ベクターのｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＣ−ＨＺＩＩＳ  （ＫＣＴＣ  ０４８９ＢＰ）とｐＫＣ−ｄｈｆｒ−ＨＺＩＩＳを使用して上記と同一の実験を行ない、その結果を図４に示した。
【００６６】
図４に示したように、ＨＣＤＲ１遺伝子変異体中では、Ｉ３４ＶのＨＢＶ表面抗原Ｓに対する結合能が野生型ヒト化抗体ＨＺＳ−Ｈ６７の重鎖とほとんど同じであった。そして、ＨＣＤＲ２遺伝子変異体の場合には、Ｔ５４ＳとＳ６５Ｇが野生型とほとんど同一水準の抗原結合能を示した。反面、ＨＣＤＲ３遺伝子変異体の場合には、Ｅ１００Ａが野生型より若干落ちた抗原結合能を示したが、これは上記ＨＣＤＲ３遺伝子変異体のグルタミン酸残基（Ｅ１００）がＨＢＶ表面抗原Ｓとの結合に重要に作用しないことを示唆するものである。
【００６７】
＜実施例４＞ＨＣＤＲ３遺伝子変異体の製造
本発明者らは、上記実施例３の結果からマウスＨＣＤＲ３配列由来１００番目アミノ酸残基のグルタミン酸（Ｅ１００）がＨＢＶ表面抗原Ｓとの結合に重要に作用しないことを確認し、上記アミノ酸残基を他のヒト抗体のものと置換させるためにヒト抗体ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列データベースと比較した。
【００６８】
その結果、マウスＨＣＤＲ３配列に高い相同性を示すヒト抗体配列の中でＨＣＤＲ３の１００番残基のセリンと１０１番残基のグリシンが共通的であることを確認し、マウス由来ＨＣＤＲ３の１００番残基のグルタミン酸をセリンにまたは１０１番残基のアラニンをグリシンに置換させた遺伝子変異体を製造しこれらの抗原結合能を測定した。
【００６９】
＜４−１＞アミノ酸残基１００番グルタミン酸がセリンに置換された遺伝子変異体の製造
上記実施例＜１−１−１＞と同一の方法でＰ１とＰ２プライマーの組の代りに配列番号２９と配列番号３０で表わされるＰ２５とＰ２６プライマーの組を使用してＰＣＲを行なった。ＨＬとＰ２５プライマーの組を使用して３９０ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅して、ＨＣとＰ２６プライマーの組を使用して７３ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅した後、これから得た上記二ＤＮＡ断片を鋳型にしてＨＬとＨＣプライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって４４８ｂｐの大きさのヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｅ１００Ｓを得た。上記遺伝子変異体Ｅ１００Ｓの可変領域両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨＣの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｅ１００Ｓと命名した。ヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ｅ１００Ｓの塩基配列をＤＮＡ配列分析機で分析して上記組み換え発現ベクター内にヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体のＥ１００Ｓが挿入されたことを確認した。
【００７０】
＜４−２＞アミノ酸１０１番アラニンがグリシンに置換された遺伝子変異体の製造
上記実施例＜１−１−１＞と同一の方法でＰ１とＰ２プライマーの組の代りに配列番号３１と配列番号３２で表わされるＰ２７とＰ２８プライマーの組を使用してＰＣＲを行なった。ＨＬとＰ２７プライマーの組を使用して３９６ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅して、ＨＣとＰ２８プライマーの組を使用して６８ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅した後これから得た上記二ＤＮＡ断片を鋳型にしてＨＬとＨＣプライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって４４８ｂｐの大きさのヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ａ１０１Ｇを得た。上記遺伝子変異体Ａ１０１Ｇの可変領域両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨＣの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ａ１０１Ｇと命名した。ヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体Ａ１０１Ｇの塩基配列をＤＮＡ配列分析機で分析して上記組み換え発現ベクター内にヒト化抗体重鎖可変領域遺伝子変異体のＡ１０１Ｇが挿入されたことを確認した。
【００７１】
＜４−３＞表面抗原Ｓに対する抗原結合能測定
上記実施例＜４−１＞及び＜４−２＞で製造された二個の組み換え発現ベクターを上記実施例２及び３と同一の方法でＣＯＳ細胞に形質転換させた後、これから選別された形質感染体の抗原結合能を間接ＥＬＩＳＡ方法で測定した。その結果、Ｅ１００Ｓの抗原結合能は、野生型と類似な反面、Ａ１０１Ｇは抗原結合能が多少減少したことを確認した。
【００７２】
本発明者らは、上記実施例３ないし＜４−３＞の結果を通じてヒト化重鎖の変異体中でＩ３４Ｖ、Ｔ５４Ｓ、Ｓ６５Ｇ及びＥ１００Ｓの抗原結合能が野生型と類似であることを確認し、上記四個の遺伝子変異体を同時に含む組み換え変異体を製造した。
【００７３】
＜実施例５＞ヒト化重鎖遺伝子の組み換え変異体
＜５−１＞Ｔ５４Ｓ＋Ｉ３４Ｖ組み換え遺伝子変異体の製造
Ｔ５４ＳとＩ３４Ｖ遺伝子変異体を含む組み換え遺伝子変異体を製造する為に、上記実施例＜１−２−１＞の重鎖遺伝子発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｔ５４Ｓを鋳型にして実施例＜１−１−１＞と同一の方法でＰＣＲとサブクローニングを行ない、これから得た組み換え発現ベクターをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｔ５４Ｓ＋Ｉ３４Ｖと命名した。
【００７４】
＜５−２＞Ｔ５４Ｓ＋Ｉ３４Ｖ＋Ｅ１００Ｓ組み換え遺伝子変異体の製造
Ｔ５４Ｓ、Ｉ３４Ｖ及びＥ１００Ｓ遺伝子変異体を含む組み換え遺伝子変異体を製造する為に、上記実施例＜５−１＞の重鎖遺伝子発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｉ３４Ｖを鋳型にして実施例＜１−１−１＞と同一の方法でＰＣＲとサブクローニングを行ない、これから得た組み換え発現ベクターをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｔ５４Ｓ＋Ｉ３４Ｖ＋Ｅ１００Ｓと命名した。
【００７５】
＜５−３＞Ｔ５４Ｓ＋Ｉ３４Ｖ＋Ｅ１００Ｓ＋Ｓ６５Ｇ組み換え遺伝子変異体の製造
Ｔ５４Ｓ、Ｉ３４Ｖ、Ｅ１００Ｓ及びＳ６５Ｇ遺伝子変異体を含む組み換え遺伝子変異体を製造する為に、上記実施例＜５−２＞の重鎖遺伝子発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｅ１００Ｓを鋳型にして実施例＜１−１−１＞と同一の方法でＰＣＲとサブクローニングを行なってＴ５４Ｓ、Ｉ３４Ｖ、Ｅ１００Ｓ及びＳ６５Ｇ遺伝子変異体を全て含む組み換え発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｔ５４Ｓ＋Ｉ３４Ｖ＋Ｅ１００Ｓ＋Ｓ６５Ｇを製造し、これをｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈと命名した。
【００７６】
＜実施例６＞ヒト化重鎖組み換え遺伝子変異体を持つヒト化抗体の抗原結合能測定
ＨＢＶの表面抗原Ｓ（緑十字社）をマイクロプレートの各ウェルに２５０ｎｇずつ添加してコーティングした後ここに上記実施例＜４−１＞ないし＜４−３＞で製造された各々の組み換え発現ベクターとＨＺＩＩ−Ｈ６７の軽鎖発現ベクターのｐＫＣ−ｄｈｆｒ−ＨＺＩＩＳを実施例２と同一の方法でＣＯＳ７細胞に形質転換させ、これから得た形質転換体の細胞培養液を抗体の濃度が各々０．６２５、１．２５、２．５、５、１０及び２０ｎｇになるように上記ウェルプレートに添加した。これを上記実施例２と同一の方法でＥＬＩＳＡを行なって吸光度を測定した。この時、対照群にはＨＺＩＩ−Ｈ６７の重鎖及び軽鎖発現ベクターのｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＣ−ＨＺＩＩＳとｐＫＣ−ｄｈｆｒ−ＨＺＩＩＳを使用して上記と同一の実験を行ない、このようにして測定された吸光度を図５に示した。
【００７７】
図５に示したように、本発明の遺伝子変異体をいくつか含むＩ３４Ｖ＋Ｔ５４Ｓ、Ｉ３４Ｖ＋Ｔ５４Ｓ＋Ｅ１００Ｓ及びＩ３４Ｖ＋Ｔ５４Ｓ＋Ｅ１００Ｓ＋Ｓ６５Ｇの組み換え遺伝子変異体を持つ各々のヒト化重鎖は、野生型のヒト化抗体ＨＺＳ−Ｈ６７の重鎖とほとんど同一水準の表面抗原Ｓに対する結合能を示した。このようにＨＢＶ表面抗原Ｓに対する抗原結合能が確認された重鎖組み換え遺伝子変異体を発現する発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈを生命工学研究所遺伝子銀行に２０００年９月２２日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ  １００８３ＢＰ）。上記発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈから発現されるヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの重鎖アミノ酸配列を分析した結果、配列番号４３で表わされるアミノ酸配列の可変領域を含むヒト化重鎖ＨｚＳ−ＩＩＩ−ＶＨで成り立っていることを確認した。
【００７８】
＜実施例７＞ヒト化軽鎖遺伝子の変異
ヒト化軽鎖の場合には、ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７のＬＣＤＲ１とＬＣＤＲ２がヒト抗体由来のアミノ酸残基を持っているため、本発明者らは、ＬＣＤＲ３のアミノ酸残基を変更した。詳しくは、本発明者らは、ヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７に存在するマウス由来ＬＣＤＲ３のアミノ酸残基をヒト抗体のものと換えるために、上記ヒト化軽鎖のアミノ酸配列と高い相同性を持ったヒト軽鎖Ｂ１のＬＣＤＲ３アミノ酸配列と比較し、これからマウス由来ＬＣＤＲ３配列の８９番グルタミンと９１番スレオニン残基が抗原結合に直接的に関与しないものと判断してこれらをヒトＢ１軽鎖の残基のロイシンとセリンに置換させた。
【００７９】
＜７−１＞アミノ酸残基８９番グルタミンがロイシンに置換された遺伝子変異体の製造
マウス由来ＬＣＤＲ３の８９番グルタミン残基がヒト抗体のロイシンに置換された遺伝子変異体を製造する為に、既存のヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７の軽鎖発現ベクターのｐＫＣ−ｄｈｆｒ−ＨｚＩＩＳを鋳型にして配列番号３３ないし配列番号３６で表わされるプライマーを利用してＰＣＲと組み換えＰＣＲを行なった（図６及び図７）。
【００８０】
詳しくは、ＰＣＲはＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素を使用して９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分の反応を２５回行なった。配列番号３３及び配列番号３４で表わされるＬＬとＰ２９プライマーの組を使用したＰＣＲから３３６ｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅され、配列番号３５及び配列番号３６で表わされるＰ３０とＬＣプライマーの組を使用したＰＣＲから２７３ｂｐの大きさのＤＮＡ断片が増幅されたことを確認した。これから確保した上記二ＤＮＡ断片を鋳型にしてＬＬとＰ２９プライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって７４３ｂｐの大きさのヒト化抗体軽鎖可変領域遺伝子変異体Ｑ８９Ｌを得た。上記遺伝子変異体Ｑ８９Ｌの可変領域両端を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで切断してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋（ＳｔｒａｔａＧｅｎ）にクローニングして組み換えプラスミドのｐＢｌｕｅ−ＨｚＳＩＩＩｋ−Ｑ８９Ｌを製造した。上記ヒト化抗体軽鎖可変領域遺伝子変異体Ｇ８９Ｌの塩基配列を分析して発現ベクター内にＱ８９Ｌが正しく挿入されたことを確認した。上記ｐＢｌｕｅ−ＨｚＳＩＩＩｋ−Ｑ８９Ｌ  ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＡｐａＩで切断してヒト化軽鎖遺伝子変異体断片を切り取った後これを発現ベクターのｐＣＭＶ−ｄｈｆｒのＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩ位置に再びクローニングして組み換え発現ベクターを製造し（図７）これをｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋ−Ｑ８９Ｌと命名した（図８）。
【００８１】
＜７−２＞アミノ酸９１番スレオニンがセリンに置換された遺伝子変異体の製造
上記実施例＜７−１＞と同一の反応条件で配列番号３３及び配列番号３６ないし配列番号３８のプライマーを使用してＰＣＲを行なった。ＬＬとＰ３１プライマーの組を使用して３６９ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅して、Ｐ３２とＬＣプライマーの組を使用して３９１ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を増幅した後これから得た上記二ＤＮＡ断片を鋳型にしてＬＬとＬＣプライマーの組で組み換えＰＣＲを行なってこれらをお互いに連結することによって７４３ｂｐの大きさのヒト化抗体軽鎖可変領域遺伝子変異体Ｔ９１Ｓを得た。上記遺伝子変異体Ｔ９１Ｓの可変領域両端を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｌＩで切断してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋にクローニングして組み換えプラスミドのｐＢｌｕｅ−ＨｚＳＩＩＩｋ−Ｔ９１Ｓを製造した。上記ヒト化抗体軽鎖可変領域遺伝子変異体Ｔ９１Ｓの塩基配列を分析して発現ベクター内にＴ９１Ｓが正しく挿入されたことを確認した。上記ｐＢｌｕｅ−ＨｚＳＩＩＩｋ−Ｔ９１Ｓ  ＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＡｐａＩで切断してヒト化軽鎖遺伝子変異体断片を切り取った後、発現ベクターｐＣＭＶ−ｄｈｆｒのＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩ位置に再びクローニングして組み換え発現ベクターｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋ−Ｔ９１Ｓを製造し、これをｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋと命名した。
【００８２】
＜実施例８＞ヒト化軽鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体のＨＢＶ表面抗原Ｓに対する結合能測定
上記実施例＜７−１＞及び＜７−２＞から得た発現ベクターｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋ−Ｑ８９ＬまたはｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋ−Ｔ９１Ｓとヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７の重鎖発現ベクターのｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＣ−ＨＺＩＩＳを実施例２と同一の方法でＣＯＳ７細胞に形質転換させた後、選別された形質転換体を４８時間培養した。これから得た培養上澄み液内に存在するヒト化抗体の濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ方法で測定した後、実施例３と同一の方法で抗体の濃度が各々０、０．２、０．４、０．８、１．８、３．５及び７ｎｇになるようにＨＢＶ表面抗原Ｓがコーティングされたウェルプレートに添加して間接ＥＬＩＳＡ方法で抗原結合能を測定した。この時、対照群にＨＺＩＩ−Ｈ６７の重鎖及び軽鎖発現ベクターのｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＣ−ＨＺＩＩＳとｐＫＣ−ｄｈｆｒ−ＨＺＩＩＳを使用して上記と同一の実験を行ない、その結果を図９に示した。
【００８３】
図９に示したように、上記遺伝子変異体中９１番スレオニンがセリンに置換されたＴ９１Ｓの変異を持つヒト化軽鎖が野生型ヒト化抗体ＨＺＳ−Ｈ６７の軽鎖と同一の水準の表面抗原Ｓに対する結合能を示した。このようにＨＢＶ表面抗原Ｓに対する結合能が確認された遺伝子変異体Ｔ９１Ｓを発現する組み換え発現ベクターｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋを生命工学研究所遺伝子銀行に２０００年９月２２日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＴＣ  １００８４ＢＰ）。上記発現ベクターｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋから発現されるヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの軽鎖アミノ酸配列を分析した結果、配列番号４２で表わされるアミノ酸配列の可変領域を含むヒト化軽鎖ＨｚＳ−ＩＩＩ−ＶＬで成り立っていることを確認した。
【００８４】
＜実施例９＞ヒト化重鎖組み換え遺伝子変異体／ヒト化軽鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体（ＨｚＳ−ＩＩＩ）の抗原結合能測定
上記実施例＜５−２＞から得たヒト化重鎖発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈと実施例＜７−２＞から得たヒト化軽鎖発現ベクターｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋを実施例２と同一の方法でＣＯＳ７細胞に形質転換させた後、４８時間培養して形質転換体からヒト化重鎖組み換え遺伝子変異体／ヒト化軽鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩを発現させた。これから得た培養上澄み液内に存在するヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩを確認する為に、抗ヒト抗体（Ｆｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）に西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ社製品）が結合された抗体を２次抗体に使用してウエスタンブロット分析を行った。その結果、図１０に示したように、約５５ｋＤａのヒト化重鎖と約２７ｋＤａのヒト化軽鎖が検出され、本発明のヒト化抗体が形質転換体から正しく発現及び分泌されたことを確認した。
【００８５】
上記培養液に分泌されたヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの濃度をサンドイッチＥＬＩＳＡ方法で測定した後、実施例３と同一の方法で抗体の濃度が各々０．６２５、１．２５、２．５、５、１０及び２０ｎｇになるようにＨＢＶに対する表面抗原Ｓがコーティングされたウェルプレートに添加して間接ＥＬＩＳＡ方法で抗原結合能を測定した。この時、対照群にＨＺＩＩ−Ｈ６７の重鎖及び軽鎖発現ベクターのｐＲｃ／ＣＭＶ−ＨＣ−ＨＺＩＩＳとｐＫＣ−ｄｈｆｒ−ＨＺＩＩＳを使用して上記と同一の実験を行ない、その結果を図１１に示した。
【００８６】
図１１に示したように、本発明のヒト化重鎖組み換え遺伝子変異体及びヒト化軽鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩは、野生型ヒト化抗体ＨＺＳ−Ｈ６７（Ｈ／Ｋ）と同一水準の表面抗原Ｓに対する結合能を示した。
【００８７】
＜実施例１０＞ヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの抗原結合親和度決定
ヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの抗原結合親和度を決定する為に、競合ＥＬＩＳＡ方法（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ，Ｒｙｕ等、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｖｉｒｏｌ．，５２，２２６，１９９７）を利用した。上記実施例８でＣＯＳ７細胞から生産されたヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩ  ５ｎｇと表面抗原Ｓ（１×１０−７Ｍないし１×１０−１２Ｍ）をあらかじめ３７℃で３時間反応させた後、この反応混合物を表面抗原Ｓであらかじめコーティングしておいた９６ウェルプレートに添加した。上記ウェルプレートを３７℃で３０分間反応させた後、実施例３と同一の方法でＥＬＩＳＡを行なって吸光度を測定した（図１２）。この時、対照群にはヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７を使用した。
【００８８】
その結果、本発明のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの抗原結合親和度は、約４×１０９Ｍ−１であり、対照群に使用されたＨＺＩＩ−Ｈ６７の親和度（３．２×１０９Ｍ−１）と大差を示さないことを確認した。
【００８９】
＜実施例１１＞ヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩからＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩに結合するペプチド配列を除去したヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＶの製造
本発明者らは、上記ヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩにＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩと結合するペプチド配列が存在するかをスタニオロ（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ）等の方法（ＴＥＰＩＴＯＰＥ）を利用して分析した（Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏ等、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，５５５−５６１，１９９９）。また、上記ヒト化抗体と類似性が高いヒト生殖系列（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）ＤＰ−２５の配列を分析して同一のペプチド配列を考慮の対象から除外した。
【００９０】
その結果、ヒト化重鎖で２種類のペプチドがＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩに結合するものと分析された。１番目ペプチドは、配列番号４４で表わされるアミノ酸配列を持ち、５１種類のＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩ分子中で２２種類のＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩ分子に結合するものと分析され、２番目ペプチドは、配列番号４５で表わされるアミノ酸配列を持ち、１４種類のＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩ分子に結合するものと分析された（表１）。
【００９１】
【表１】
2004517636.tif 000003
上記ペプチドのＭＨＣＩＩに対する結合力を弱化させる為に、本発明者らは、配列番号４４で表わされるアミノ酸配列のＰ９位置にあるセリンをスレオニンに置換した結果、結合可能なＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩ分子が１１個（５０％）に減少し、配列番号４５で表わされるアミノ酸配列のＰ６に存在するスレオニン残基をアスパラギン酸に置換した時には、５１種類のＭＨＣＩＩ分子中でただ１種類にだけ結合可能であると分析された。
【００９２】
したがって、本発明者らは、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩに対する結合程度が弱化されたヒト化重鎖を製造する為に、ヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの重鎖配列４４番セリンがスレオニンに置換された遺伝子変異Ｓ４４Ｔ（配列番号４６及び配列番号４７のプライマーの組を利用）とアミノ酸残基６８番スレオニンがアスパラギン酸に置換された遺伝子変異Ｔ６８Ｄ（配列番号４８及び配列番号４９のプライマーの組を利用）を含む遺伝子変異体Ｓ４４Ｔ／Ｔ６８Ｄを得た。上記遺伝子変異体Ｓ４４Ｔ／Ｔ６８Ｄの可変領域の両端を制限酵素ＥｃｏＲＩとＡｐａＩで切断した後、発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨＣの制限酵素ＥｃｏＲＩ−ＡｐａＩ位置にクローニングして組み換え発現ベクターを製造して、ｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＶｈと命名し、これを２００１年９月２６日付で韓国生命工学研究院遺伝子銀行に寄託した（寄託番号；ＫＣＴＣ  １００８０ＢＰ）。
【００９３】
上記ヒト化重鎖発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＶｈとヒト化軽鎖発現ベクターｐＣＭＶ−ｄｈｆｒ−ＨｚＳＩＩＩｋを動物セルラインに形質転換させた後、４８時間培養して形質転換体からヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＶを発現させ、これから得た培養上澄み液内に存在するヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＶの抗原結合能を測定した結果、本発明のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＶはヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩとほとんど類似な抗原結合親和度を示した（図１２参照）。
【００９４】
＜実施例１２＞ヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩ及びＨｚＳ−ＩＶのアミノ酸配列比較
本発明のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩ及びＨｚＳ−ＩＶの重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列を野生型のマウス単クローン抗体Ｈ６７及びヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７のアミノ酸配列と比較した。
【００９５】
その結果図１３及び図１４に示したように、本発明のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩ及びＨｚＳ−ＩＶの重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、マウス単クローン抗体Ｈ６７とヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７に比べて重鎖遺伝子のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３または軽鎖遺伝子のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３がマウス由来のアミノ酸残基の含有がより少なく、ＨｚＳ−ＩＶはＨｚＳ−ＩＩＩの重鎖よりＭＨＣｃｌａｓｓ結合配列がさらに少なくＨＡＭＡ反応がさらに低いものと予想される。したがって、本発明のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩ及びＨｚＳ−ＩＶは、既存のヒト化抗体よりＨＡＭＡ反応の誘発をより少なくおさえ、なおかつ優秀な治療効果を示すためＢ型肝炎ウイルスの治療に有用である。
【００９６】
（産業上の利用可能性）
上記で詳しく見たように、本発明のＨＢＶ表面抗原Ｓに対するヒト化抗体は、重鎖遺伝子のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３及び軽鎖遺伝子のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３でマウス由来アミノ酸残基がヒト由来アミノ酸に置換され既存のヒト化抗体よりさらにヒト化されたアミノ酸残基を含み、またＦＲ内でＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩＩに結合する配列を減らすことによって、人体内での免疫誘発反応性は顕著に減少された反面、優秀な抗原結合能を示すためＢ型肝炎ウイルスの治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＨＢＶの表面抗原Ｓに対するヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７の重鎖可変領域と本発明のヒト化重鎖可変領域遺伝子変異体のヌクレオチド及びアミノ酸配列との比較結果を示す。
【図２】マウスＨＣＤＲ１の３４番イソロイシンがバリンに置換されたヒト化重鎖遺伝子変異体Ｉ３４Ｖの製作方法を示した模式図である。
【図３】図２の方法で製作された遺伝子変異体Ｉ３４Ｖを含む発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｉ３４Ｖの制限酵素地図を示したものである。
【図４】本発明のヒト化重鎖遺伝子変異体をもつヒト化抗体の表面抗原Ｓに対する抗原結合能をＥＬＩＳＡ測定の結果であり、Ａ；ＨＣＤＲ１遺伝子変異体、Ｂ；ＨＣＤＲ２遺伝子変異体、Ｃ；ＨＣＤＲ３遺伝子変異体であり、Ｈ／Ｋ；ＨＺＩＩ−Ｈ６７の重鎖及び軽鎖で成り立ったヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７である。
【図５】本発明のヒト化重鎖遺伝子変異体を２個以上含む組み換え遺伝子変異体を持つヒト化抗体の表面抗原Ｓに対する抗原結合能をＥＬＩＳＡで測定した結果である。
【図６】ＨＢＶの表面抗原Ｓに対するヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７の軽鎖可変領域と本発明のヒト化軽鎖可変領域遺伝子変異体のヌクレオチド及びアミノ酸配列を比較したものである。
【図７】マウスＬＣＤＲ１の８９番グルタミンがロイシンに置換されたヒト化軽鎖遺伝子変異体Ｑ８９Ｌの製作方法を示した模式図である。
【図８】図７と同じく製作された遺伝子変異体Ｑ８９Ｌを含む発現ベクターｐｃＤｄＡ−ＨｚＳＩＩＩｈ−Ｑ８９Ｌの開列地図を示したものである。
【図９】本発明のヒト化軽鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体の表面抗原Ｓに対する抗原結合能をＥＬＩＳＡで測定した結果である。Ｈ／Ｋ；ＨＺＩＩ−Ｈ６７の重鎖及び軽鎖で成り立ったヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７
【図１０】本発明のヒト化重鎖組み換え遺伝子変異体及びヒト化軽鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩをウェスタンブロット分析で確認した結果である。Ａ；ＨｚＳ−ＩＩＩ    Ｂ；ＨＺＩＩ−Ｈ６７
【図１１】本発明のヒト化重鎖組み換え遺伝子変異体及びヒト化軽鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩのＨＢＶ表面抗原Ｓに対する抗原結合能をＥＬＩＳＡ方法で測定した結果である。
【図１２】本発明のヒト化重鎖組み換え遺伝子変異体及びヒト化軽鎖遺伝子変異体を持つヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩ及びＨｚＳ−ＩＶのＨＢＶ表面抗原Ｓに対する抗原結合親和度を競合ＥＬＩＳＡ方法で測定した結果である。
【図１３】本発明のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩ及びＨｚＳ−ＩＶの重鎖可変領域のアミノ酸配列を野生型のマウス単クローン抗体Ｈ６７及びヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７のアミノ酸配列と比較した結果を示す。
【図１４】本発明のヒト化抗体ＨｚＳ−ＩＩＩの軽鎖可変領域のアミノ酸配列を野生型のマウス単クローン抗体Ｈ６７及びヒト化抗体ＨＺＩＩ−Ｈ６７のアミノ酸配列と比較した結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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