(57)【要約】本発明は、ホスホロアミダイト化合物、特に、三価のリン多量体；オリゴヌクレオチドを製造するために三価のリン多量体を利用する方法；および三価のリン多量体を製造する方法に関する。更に、本発明は、三価のリン多量で誘導される固体支持体およびそれを製造する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個またはそれを超えるヌクレオシド間リン原子によって連結した２個またはそれを超えるヌクレオシド部分を含むホスホロアミダイト化合物であって、該ヌクレオシド間リン原子がリン（ＩＩＩ）原子であるホスホロアミダイト化合物。
【請求項２】
ホスホロアミダイト部分を有するヌクレオシド部分の３’位に結合したホスホロアミダイト部分を含む請求項１に記載のホスホロアミダイト化合物。
【請求項３】
ホスホロアミダイト部分が、式−Ｘ１−ＰＲ３ＮＲ４Ｒ５（式中、Ｒ３は、β−シアノエチルオキシ基またはβ−シアノエチルチオ基であり、Ｒ４およびＲ５は、イソプロピル基である）を有する基である請求項１および請求項２のどちらかに記載のホスホロアミダイト化合物。
【請求項４】
ヌクレオシド間リン（ＩＩＩ）原子が亜リン酸トリエステル基を含む請求項１〜３のいずれかに記載のホスホロアミダイト化合物。
【請求項５】
前記亜リン酸トリエステル基が、ホスホロアミダイト部分を有するヌクレオシド部分の５’位と、次のヌクレオシド部分の３’位とを連結する請求項４に記載のホスホロアミダイト化合物。
【請求項６】
次の構造式
【化１】
2004508379.tif 000018
（式中、Ｘ１は、各々独立して、−Ｏ−または−Ｓ−であり；
Ｘ２は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ−であり；
Ｘ３は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−であり；
Ｒ１は保護基であり；
Ｒ２は、各々独立して、−Ｈ、−Ｆ、−ＮＨＲ６、−ＣＨ２Ｒ６または−ＯＲ６であり；
Ｒ３は、各々独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、−ＯＲ７または−ＳＲ７であり；
Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基であり；または
Ｒ４およびＲ５は、それらが結合している窒素と一緒になって、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基を形成し；
Ｒは、−Ｈ、置換された若しくは未置換のアルキル基、置換された若しくは未置換の芳香族基、またはアミン保護基であり；
Ｒ６は、−Ｈ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基、または保護基であり；
Ｒ７は、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、または置換された若しくは未置換のアルアルキル基であり；
Ｂは、各々独立して、Ｈ、または保護された若しくは未保護のヌクレオシド塩基であり；そして
ｎは０または正の整数である）
によって表される三価のリン多量体またはその立体異性体。
【請求項７】
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３が各々−Ｏ−である請求項６に記載の三価のリン多量体。
【請求項８】
Ｒ３が−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮまたは−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮである請求項６または請求項７に記載の三価のリン多量体。
【請求項９】
Ｒ１が酸に不安定な保護基である請求項６、７または８に記載の三価のリン多量体。
【請求項１０】
Ｒ２が−Ｈである請求項６、７、８または９に記載の三価のリン多量体。
【請求項１１】
Ｒ２が−ＯＲ６であり、Ｒ６が、Ｍｅ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＭｅまたはヒドロキシ保護基である請求項６、７、８または９に記載の三価のリン多量体。
【請求項１２】
次の構造式
【化２】
2004508379.tif 000019
（式中、Ｒ２は、−Ｈまたは−ＯＲ６であり；
Ｒ６は、−Ｈ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基、またはアルコール保護基であり；
Ｒ８は、置換された若しくは未置換のトリチルであり；
Ｒ１０およびＲ１１は、各々独立して、置換された若しくは未置換の脂肪族基であり；
Ｂは、各々独立して、Ｈ、または保護された若しくは未保護のヌクレオシド塩基であり；そして
ｍは０または１である）
によって表される三価のリン多量体またはその立体異性体。
【請求項１３】
Ｒ８が４，４’−ジメトキシトリチルであり；
Ｒ２が−Ｈであり；そして
Ｒ１０およびＲ１１がイソプロピルである請求項１２に記載の多量体。
【請求項１４】
Ｒ８が４，４’−ジメトキシトリチルであり；
Ｒ２が−ＯＲ６であり；
Ｒ１０およびＲ１１がイソプロピルであり；そして
Ｒ６が、Ｍｅ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＭｅ、ｔ−ブチルジメチルシリル、テトラヒドロピラニル、４−メトキシテトラヒドロピラニルまたはＦｐｍｐである請求項１２に記載の多量体。
【請求項１５】
次の構造式
【化３】
2004508379.tif 000020
（式中、Ｘ１は、各々独立して、−Ｏ−または−Ｓ−であり；
Ｘ２は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ−であり；
Ｘ３は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−であり；
Ｘ４は、各々独立して、＝Ｏまたは＝Ｓであり；
Ｒは、−Ｈ、置換された若しくは未置換のアルキル基、置換された若しくは未置換の芳香族基、またはアミン保護基であり；
Ｒ２は、各々独立して、−Ｈ、−Ｆ、−ＮＨＲ６、−ＣＨ２Ｒ６または−ＯＲ６であり；
Ｒ６は、−Ｈ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基、または保護基であり；
Ｒ３は、各々独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、−ＯＲ７または−ＳＲ７であり；
Ｒ７は、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、または置換された若しくは未置換のアルアルキル基であり；
Ｒ１３は、アルコール保護基、アミン保護基、チオール保護基、式−Ｙ２−Ｌ−Ｙ１の基、式−Ｙ２−Ｌ−Ｙ２−Ｒ１５の基または固体支持体であり；
Ｒ１４は、−Ｈまたは保護基であり；
Ｂは、各々独立して、Ｈ、または保護された若しくは未保護のヌクレオシド塩基であり；
ｐは正の整数であり；
Ｙ１は、エステル基またはカルボン酸基であり；
Ｙ２は、単結合、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１７−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ１７−または−Ｏ−であり；
Ｌは、置換された若しくは未置換の脂肪族基、または置換された若しくは未置換の芳香族基であり；そして
Ｒ１７は、−Ｈ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、または置換された若しくは未置換の芳香族基である）
によって表されるオリゴヌクレオチドまたはその立体異性体を製造する方法であって、
（ａ）次の構造式
【化４】
2004508379.tif 000021
（式中、Ｒ１は保護基であり；
Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基であり；または
Ｒ４およびＲ５は、それらが結合している窒素と一緒になって、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基を形成し；そして
ｎは０または正の整数である）
によって表される三価のリン多量体またはその立体異性体と、次の構造式
【化５】
2004508379.tif 000022
（式中、Ｘ５は−ＯＨまたは−ＳＨであり；そして
ｑは０または正の整数である）
によって表される５’−脱保護ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド、またはその立体異性体とをカップリングさせて、次の構造式
【化６】
2004508379.tif 000023
によって表される第一中間体またはその立体異性体を生じ；
（ｂ）第一中間体中の三価のリン基を酸化してまたは硫化して、次の構造式
【化７】
2004508379.tif 000024
によって表される第二中間体またはその立体異性体を形成し；
（ｃ）場合により、工程（ａ）において該三価のリン多量体と反応しなかった基Ｘ５にキャッピングし；
（ｄ）該第二中間体を処理してＲ１を除去して、５’−脱保護オリゴヌクレオチドを形成し；そして
（ｅ）場合により、工程（ａ）〜（ｄ）を１回またはそれを超えた回数繰り返すが、ここにおいて、その最終工程は工程（ｃ）または工程（ｄ）であり、それによって、オリゴヌクレオチドを製造する工程を含む方法。
【請求項１６】
Ｒ１３が固体支持体である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチド生成物を前記固体支持体から切断する工程を更に含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド塩基を脱保護することを更に含む請求項１５、１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｘ２が−Ｏ−であり、Ｒ１３がアルコール保護基である請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記保護基Ｒ１３をオリゴヌクレオチド生成物から除去する工程を更に含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
Ｒ１が、未置換のトリチル基、モノアルコキシトリチル基、ジアルコキシトリチル基、トリアルコキシトリチル基、テトラヒドロピラニル基またはピキシル基である請求項１５、１６、１７、１８、１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｒ１を、ジクロロメタン中のジクロロ酢酸溶液およびジクロロメタン中のトリクロロ酢酸溶液より選択される酸で除去する請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ｒ３が各々、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮまたは−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮである請求項１５〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
オリゴヌクレオチドを塩基で処理することによって、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮまたは−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮから−ＣＨ２ＣＨ２ＣＮを除去することを更に含む請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
オリゴヌクレオチドを塩基で処理中に、ヌクレオチド塩基を脱保護する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
Ｉ２および水を含有する溶液で第一中間体を処理することによって前記三価のリン基を酸化する請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
３−アミノ−［１，２，４］−ジチアゾール−５−チオンまたは３Ｈ−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドで第一中間体を処理することによって前記三価のリン基を硫化する請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）および（ｄ）の１サイクルより多いサイクルを行い、生じたオリゴヌクレオチドがキメラオリゴヌクレオチドである請求項１５〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記生じたオリゴヌクレオチドがリン酸エステルである請求項１５〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記生じたオリゴヌクレオチドがホスホロチオエートである請求項１５〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記製造されたオリゴヌクレオチドが５０個までのヌクレオチド塩基を有する請求項１５〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
次の構造式
【化８】
2004508379.tif 000025
（式中、Ｘ１は、各々独立して、−Ｏ−または−Ｓ−であり；
Ｘ２は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ−であり；
Ｘ３は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−であり；
Ｒ１は保護基であり；
Ｒ２は、各々独立して、−Ｈ、−Ｆ、−ＮＨＲ６、−ＣＨ２Ｒ６または−ＯＲ６であり；
Ｒ３は、各々独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、−ＯＲ７または−ＳＲ７であり；
Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基であり；または
Ｒ４およびＲ５は、それらが結合している窒素と一緒になって、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基を形成し；
Ｒは、−Ｈ、置換された若しくは未置換のアルキル基、置換された若しくは未置換の芳香族基、またはアミン保護基であり；
Ｒ６は、−Ｈ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基、または保護基であり；
Ｒ７は、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、または置換された若しくは未置換のアルアルキル基であり；
Ｂは、各々独立して、Ｈ、または保護された若しくは未保護のヌクレオシド塩基であり；そして
ｎは０または正の整数である）
によって表される三価のリン多量体またはその立体異性体を製造する方法であって、
（ａ）次の構造式
【化９】
2004508379.tif 000026
によって表されるヌクレオシドまたはその立体異性体の３’−置換基を保護し、それによって、次の構造式
【化１０】
2004508379.tif 000027
（式中、Ｒ１６は、Ｒ１に直交する保護基である）
によって表される第一中間体またはその立体異性体を形成し；
（ｂ）該第一中間体を処理してＲ１を除去し、それによって、５’−脱保護ヌクレオシドを形成し；
（ｃ）該５’−脱保護ヌクレオシドを、カップリング触媒の存在下において、次の構造式
【化１１】
2004508379.tif 000028
によって表される化合物またはその立体異性体と反応させ、それによって、次の構造式
【化１２】
2004508379.tif 000029
によって表される二量体またはその立体異性体を形成し；
（ｄ）３’，５’−保護多量体を処理してＲ１６を除去し、それによって、３’−脱保護二量体を形成し；
（ｅ）場合により、カップリング触媒の存在下において、該３’−脱保護二量体と、次の構造式
【化１３】
2004508379.tif 000030
によって表される化合物またはその立体異性体とを反応させ、それによって、次の構造式
【化１４】
2004508379.tif 000031
によって表される３’，５’−保護三量体またはその立体異性体を形成し；
（ｆ）場合により、工程（ｅ）および（ｆ）を１回またはそれを超えた回数繰り返し、それによって、３’，５’−保護多量体を形成し；
（ｇ）該３’，５’−保護多量体を処理してＲ１６を除去し、それによって、３’−脱保護多量体を形成し；
（ｈ）該３’−脱保護多量体と、次の構造式
【化１５】
2004508379.tif 000032
（式中、Ｘ６はハロゲンである）
の一つによって表される三価のリン化合物とを反応させ、それによって、三価のリン多量体を形成する工程を含む方法。
【請求項３３】
カップリング触媒が、テトラゾールまたはＳ−エチルチオテトラゾールである請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
Ｒ１６がレヴリノイルであり、それを、ピリジン／酢酸中においてヒドラジン水和物で３’，５’−保護多量体を処理することによって除去する請求項３２または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
次の構造式
【化１６】
2004508379.tif 000033
（式中、Ｘ１は、各々独立して、−Ｏ−または−Ｓ−であり；
Ｘ２は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ−であり；
Ｘ３は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−であり；
Ｒ１は保護基であり；
Ｒ２は、各々独立して、−Ｈ、−Ｆ、−ＮＨＲ６、−ＣＨ２Ｒ６または−ＯＲ６であり；
Ｒ３は、各々独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、−ＯＲ７または−ＳＲ７であり；
Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基であり；または
Ｒ４およびＲ５は、それらが結合している窒素と一緒になって、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基を形成し；
Ｒは、−Ｈ、置換された若しくは未置換のアルキル基、置換された若しくは未置換の芳香族基、またはアミン保護基であり；
Ｒ６は、−Ｈ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基、または保護基であり；
Ｒ７は、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、または置換された若しくは未置換のアルアルキル基であり；
Ｂは、各々独立して、Ｈ、または保護された若しくは未保護のヌクレオシド塩基であり；そして
ｎは０または正の整数である）
によって表される三価のリン多量体またはその立体異性体を製造する方法であって、
（ａ）次の構造式
【化１７】
2004508379.tif 000034
によって表されるヌクレオシドまたはその立体異性体の３’−置換基を保護し、それによって、次の構造式
【化１８】
2004508379.tif 000035
（式中、Ｒ１６は、Ｒ１に直交する保護基である）
によって表される第一中間体またはその立体異性体を形成し；
（ｂ）該第一中間体を処理してＲ１を除去し、それによって、５’−脱保護ヌクレオシドを形成し；
（ｃ）該５’−脱保護ヌクレオシドと、次の構造式
【化１９】
2004508379.tif 000036
（式中、Ｘ６はハロゲンである）
の一つによって表される三価のリン化合物とを反応させ、それによって、５’−ホスホロアミダイトを形成し；
（ｄ）該５’−ホスホロアミダイトを、カップリング触媒の存在下において、次の構造式
【化２０】
2004508379.tif 000037
によって表される化合物またはその立体異性体と反応させ、それによって、次の構造式
【化２１】
2004508379.tif 000038
によって表される３’，５’−保護二量体またはその立体異性体を形成し；
（ｅ）該３’，５’−保護二量体を処理してＲ１６を除去し、それによって、３’−脱保護二量体を形成し；
（ｆ）場合により、カップリング触媒の存在下において、該３’−脱保護二量体と、次の構造式
【化２２】
2004508379.tif 000039
によって表される化合物またはその立体異性体とを反応させ、それによって、次の構造式
【化２３】
2004508379.tif 000040
によって表される３’，５’−保護三量体またはその立体異性体を形成し；
（ｇ）場合により、工程（ｅ）および（ｆ）を１回またはそれを超えた回数繰り返し、それによって、３’，５’−保護多量体を形成し；
（ｈ）該３’，５’−保護多量体を処理してＲ１６を除去し、それによって、３’−脱保護多量体を形成し；
（ｉ）該３’−脱保護多量体と、次の構造式
【化２４】
2004508379.tif 000041
（式中、Ｘ６はハロゲンである）
の一つによって表される三価のリン化合物とを反応させ、それによって、三価のリン多量体を形成する工程を含む方法。
【請求項３６】
カップリング触媒が、テトラゾールまたはＳ−エチルチオテトラゾールである請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
Ｒ１６がレヴリノイルであり、それを、ピリジン／酢酸中においてヒドラジン水和物で３’，５’−保護多量体を処理することによって除去する請求項３０または請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
次の構造式
【化２５】
2004508379.tif 000042
（式中、Ｘ１は、各々独立して、−Ｏ−または−Ｓ−であり；
Ｘ２は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ−であり；
Ｘ３は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−であり；
Ｒ１は保護基であり；
Ｒ２は、各々独立して、−Ｈ、−Ｆ、−ＮＨＲ６、−ＣＨ２Ｒ６または−ＯＲ６であり；
Ｒ３は、各々独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、−ＯＲ７または−ＳＲ７であり；
Ｒは、−Ｈ、置換された若しくは未置換のアルキル基、置換された若しくは未置換の芳香族基、またはアミン保護基であり；
Ｒ６は、−Ｈ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基、または保護基であり；
Ｒ７は、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、または置換された若しくは未置換のアルアルキル基であり；
Ｂは、各々独立して、Ｈ、または保護された若しくは未保護のヌクレオシド塩基であり；
Ｌは、置換された若しくは未置換の脂肪族基、または置換された若しくは未置換の芳香族基であり；
ｎは０または正の整数であり；そして
Ｒ１５は固体支持体である）
によって表される、三価のリン多量体で誘導される固体支持体またはその立体異性体。
【請求項３９】
Ｘ１、Ｘ２およびＸ３が各々−Ｏ−である請求項３８に記載の固体支持体。
【請求項４０】
Ｒ３が−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮである請求項３８または請求項３９に記載の固体支持体。
【請求項４１】
Ｒ１が酸に不安定な保護基である請求項３８、３９または４０に記載の固体支持体。
【請求項４２】
Ｒ１が４，４’−ジメトキシトリチルである請求項４１に記載の固体支持体。
【請求項４３】
Ｒ２が−Ｈである請求項３８、３９、４０、４１または４２に記載の固体支持体。
【請求項４４】
Ｒ２が−ＯＲ６であり、Ｒ６がヒドロキシ保護基である請求項３８、３９、４０、４１または４２に記載の固体支持体。
【請求項４５】
Ｌが−ＣＨ２ＣＨ２−である請求項３８〜４４のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項４６】
Ｒ１５が、制御細孔ガラス、ポリスチレンまたは微孔性ポリアミドを含む請求項３８〜４５のいずれか１項に記載の固体支持体。
【請求項４７】
次の構造式
【化２６】
2004508379.tif 000043
（式中、Ｘ１は、各々独立して、−Ｏ−または−Ｓ−であり；
Ｘ２は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ−であり；
Ｘ３は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−であり；
Ｒ１は保護基であり；
Ｒ２は、各々独立して、−Ｈ、−Ｆ、−ＮＨＲ６、−ＣＨ２Ｒ６または−ＯＲ６であり；
Ｒ３は、各々独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、−ＯＲ７または−ＳＲ７であり；
Ｒは、−Ｈ、置換された若しくは未置換のアルキル基、置換された若しくは未置換の芳香族基、またはアミン保護基であり；
Ｒ６は、−Ｈ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基、または保護基であり；
Ｒ７は、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、または置換された若しくは未置換のアルアルキル基であり；
Ｂは、各々独立して、Ｈ、または保護された若しくは未保護のヌクレオシド塩基であり；
Ｌは、置換された若しくは未置換の脂肪族基、または置換された若しくは未置換の芳香族基であり；
ｎは０または正の整数であり；そして
Ｒ１５は固体支持体である）
によって表される、多量体で誘導される固体支持体またはその立体異性体を製造する方法であって、
（ａ）次の構造式
【化２７】
2004508379.tif 000044
によって表されるヌクレオシドまたはその立体異性体の３’−置換基を保護し、それによって、次の構造式
【化２８】
2004508379.tif 000045
（式中、Ｒ１６は、Ｒ１に直交する保護基である）
によって表される第一中間体またはその立体異性体を形成し；
（ｂ）該第一中間体を処理してＲ１を除去し、それによって、５’−脱保護ヌクレオシドを形成し；
（ｃ）該５’−脱保護ヌクレオシドを、カップリング触媒の存在下において、次の構造式
【化２９】
2004508379.tif 000046
（式中、Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基であり；または
Ｒ４およびＲ５は、それらが結合している窒素と一緒になって、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基を形成する）
によって表される化合物またはその立体異性体と反応させ；それによって、次の構造式
【化３０】
2004508379.tif 000047
によって表される二量体またはその立体異性体を形成し；
（ｄ）３’，５’−保護二量体を処理してＲ１６を除去し、それによって、３’−脱保護二量体を形成し；
（ｅ）場合により、カップリング触媒の存在下において、該３’−脱保護二量体と、次の構造式
【化３１】
2004508379.tif 000048
によって表される化合物またはその立体異性体とを反応させ、それによって、次の構造式
【化３２】
2004508379.tif 000049
によって表される３’，５’−保護三量体またはその立体異性体を形成し；
（ｆ）場合により、工程（ｅ）および（ｆ）を１回またはそれを超えた回数繰り返し、それによって、３’，５’−保護多量体を形成し；
（ｇ）該３’，５’−保護多量体を処理してＲ１６を除去し、それによって、３’−脱保護多量体を形成し；
（ｈ）該３’−脱保護多量体を、塩基の存在下において、
【化３３】
2004508379.tif 000050
から成る群より選択される化合物と反応させ、それによって、次の構造式
【化３４】
2004508379.tif 000051
によって表される固体支持体充填用試薬またはその立体異性体を形成し；そして
（ｉ）該固体支持体充填用試薬と、第一級または第二級アミン基で官能化された固体支持体とを、塩基および置換された若しくは未置換の二脂肪族カルボジイミドの存在下で反応させ、それによって、前記多量体で誘導される固体支持体を製造する工程を含む方法。
【請求項４８】
工程（ｆ）で形成される固体支持体充填用試薬と、ｐ−ニトロフェノールとを、塩基および置換された若しくは未置換の二脂肪族カルボジイミドの存在下で反応させ、それによって、活性固体支持体充填用試薬を形成する工程を更に含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記置換された若しくは未置換の二脂肪族カルボジイミドが、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドである請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
次の構造式
【化３５】
2004508379.tif 000052
（式中、Ｘ１は、各々独立して、−Ｏ−または−Ｓ−であり；
Ｘ２は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ−であり；
Ｘ３は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−であり；
Ｒ１は保護基であり；
Ｒ２は、各々独立して、−Ｈ、−Ｆ、−ＮＨＲ６、−ＣＨ２Ｒ６または−ＯＲ６であり；
Ｒ３は、各々独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、−ＯＲ７または−ＳＲ７であり；
Ｒは、−Ｈ、置換された若しくは未置換のアルキル基、置換された若しくは未置換の芳香族基、またはアミン保護基であり；
Ｒ６は、−Ｈ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基、または保護基であり；
Ｒ７は、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、または置換された若しくは未置換のアルアルキル基であり；
Ｂは、各々独立して、Ｈ、または保護された若しくは未保護のヌクレオシド塩基であり；
Ｌは、置換された若しくは未置換の脂肪族基、または置換された若しくは未置換の芳香族基であり；
ｎは０または正の整数であり；そして
Ｒ１５は固体支持体である）
によって表される、多量体で誘導される固体支持体またはその立体異性体を製造する方法であって、
（ａ）次の構造式
【化３６】
2004508379.tif 000053
によって表されるヌクレオシドまたはその立体異性体の３’−置換基を保護し、それによって、次の構造式
【化３７】
2004508379.tif 000054
（式中、Ｒ１６は、Ｒ１に直交する保護基である）
によって表される第一中間体またはその立体異性体を形成し；
（ｂ）該第一中間体を処理してＲ１を除去し、それによって、５’−脱保護ヌクレオシドを形成し；
（ｃ）該５’−脱保護ヌクレオシドと、次の構造式
【化３８】
2004508379.tif 000055
（式中、Ｘ６はハロゲンであり；そして
Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基であり；または
Ｒ４およびＲ５は、それらが結合している窒素と一緒になって、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基を形成する）
の一つによって表される三価のリン化合物とを反応させ、それによって、５’−ホスホロアミダイトを形成し；
（ｄ）該５’−ホスホロアミダイトを、カップリング触媒の存在下で、次の構造式
【化３９】
2004508379.tif 000056
によって表される化合物またはその立体異性体と反応させ、それによって、次の構造式
【化４０】
2004508379.tif 000057
によって表される３’，５’−保護二量体またはその立体異性体を形成し；
（ｅ）該３’，５’−保護二量体を処理してＲ１６を除去し、それによって、３’−脱保護二量体を形成し；
（ｆ）場合により、カップリング触媒の存在下において、該３’−脱保護二量体と、次の構造式
【化４１】
2004508379.tif 000058
によって表される化合物またはその立体異性体とを反応させ、それによって、次の構造式
【化４２】
2004508379.tif 000059
によって表される３’，５’−保護三量体またはその立体異性体を形成し；
（ｇ）場合により、工程（ｅ）および（ｆ）を１回またはそれを超えた回数繰り返し、それによって、３’，５’−保護多量体を形成し；
（ｈ）該３’，５’−保護多量体を処理してＲ１６を除去し、それによって、３’−脱保護多量体を形成し；
（ｉ）該３’−脱保護多量体を、塩基の存在下において、
【化４３】
2004508379.tif 000060
から成る群より選択される化合物と反応させ、それによって、次の構造式
【化４４】
2004508379.tif 000061
によって表される固体支持体充填用試薬またはその立体異性体を形成し；そして
（ｊ）該固体支持体充填用試薬と、第一級または第二級アミン官能基で官能化された固体支持体とを、塩基および置換された若しくは未置換の二脂肪族カルボジイミドの存在下で反応させ、それによって、前記多量体で誘導される固体支持体を製造する工程を含む方法。
【請求項５１】
工程（ｈ）で形成される固体支持体充填用試薬と、ｐ−ニトロフェノールとを、塩基および置換された若しくは未置換の二脂肪族カルボジイミドの存在下で反応させ、それによって、活性固体支持体充填用試薬を形成する工程を更に含む請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記置換された若しくは未置換の二脂肪族カルボジイミドが、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはジイソプロピルカルボジイミドである請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
オリゴヌクレオチドの合成のための、請求項１〜５のいずれか１項に記載のホスホロアミダイト化合物の使用。
【請求項５４】
オリゴヌクレオチドの合成のための、請求項６〜１４のいずれか１項に記載の三価のリン多量体の使用。
【請求項５５】
オリゴヌクレオチドの合成のための、請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の三価のリン多量体で誘導される固体支持体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
合成オリゴヌクレオチドは、遺伝的疾患およびウイルス性疾患の検出ための診断の分野において重要である。更に、アンチセンスおよび関連の療法において用いるためのオリゴヌクレオチドの大規模合成は、現在、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の処置用のオリゴヌクレオチド類似体、および数種類の他のオリゴヌクレオチド類似体のＦＤＡ承認が臨床試験中であるので、ますます重要になってきている。各々の臨床試験には、キログラム量の精製オリゴヌクレオチド類似体が必要である。
【０００２】
オリゴヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート結合、またはホスホロチオエート結合とリン酸ジエステル結合の組合せ（キメラオリゴヌクレオチド）のような、修飾されたヌクレオチド間結合を含有し、体内での分解にそれらがより耐性であるので、アンチセンス用途において、リン酸ジエステル結合だけを有するオリゴヌクレオチドより有用であることが判明している。典型的には、オリゴヌクレオチド類似体は、各ヌクレオチドモノマーを、所望の配列が完成するまで一度に１個加えることによって合成される。各ヌクレオチドの付加は、最低３回の反応工程、すなわち、カップリング工程、酸化または硫化工程、および５’−脱保護工程を有するサイクルを必要とする。典型的には、酸化または硫化工程の後に、キャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）工程も行う。したがって、２１個の塩基を有するオリゴヌクレオチドの合成は、２０サイクルまたは（キャッピング工程を各サイクルで行うかどうかに依って）６０〜８０の反応を必要とする。各々の反応工程での収率は、概して、１００％未満であるので、長いオリゴヌクレオチドを十分な収率で合成することは難しく、そして不可能ではないとしても、約１５０を超えるヌクレオチド塩基を有するオリゴヌクレオチドを現行の技術で合成することは極めて難しい。更に、多数の反応工程には多量の試薬を使用するので、その合成を一層高価にしている。より長いオリゴヌクレオチドを十分な収率で得るためにおよび／またはオリゴヌクレオチドを合成するのに用いられる試薬の費用を低減させるためには、オリゴヌクレオチドを合成するのに必要な反応工程の数を減少させることが望ましいと考えられる。
【０００３】
二量体または三量体の使用は、より長い合成オリゴヌクレオチドの収率および入手可能性を増加させると示唆されている。しかしながら、現在利用されている二量体および三量体は、酸化されてリン酸ジエステルを形成したかまたは硫化されてホスホロチオエートを形成したリン結合を有する。したがって、これら構成単位は、同じモノマー構成単位が用いられて、リン酸ジエステルか、ホスホロチオエート主鎖かまたは、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート主鎖の組合せでオリゴヌクレオチドを形成することができるモノマー構成単位ほど多用性ではない。
【０００４】
合成後、オリゴヌクレオチドは、通常、合成中に生じた不純物から分離される。典型的には、これら不純物は、試薬、反応副生成物および失敗配列（ｆａｉｌｕｒｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）から成る。失敗配列とは、１回またはそれを超えるカップリング工程が失敗した場合のオリゴヌクレオチドであるので、その失敗配列は、所望の長さより１個またはそれを超えるヌクレオチドだけ短い。失敗配列は、概して、イオン交換クロマトグラフィーによって除去される。しかしながら、所望の長さより１ヌクレオチドだけ短い失敗配列（すなわち、Ｎ−１種）は、所望の生成物へのそれらの構造類似性が、生成物オリゴヌクレオチドに類似したクロマトグラフィー移動度をそれらにもたらすので、除去するのが難しい。Ｎ−２およびＮ−３の失敗配列は、生成物オリゴヌクレオチドとは実質的に異なったクロマトグラフィー移動度をもたらすように十分に構造が異なっているので、所望の生成物から一層容易に分離される。したがって、所望のオリゴヌクレオチドの収率および純度を改善するためには、Ｎ−１失敗配列を生じない合成法が望まれる。
【０００５】
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体の合成の改善は、治療的使用に必要な量および品質でこれら化合物を製造するために必要である。更に、より長いオリゴヌクレオチドを有用な収率で合成する能力は、治療的および組換えの用途におけるそれらの使用を拡大しうると考えられる。
【０００６】
発明の要旨
本発明は、三価のリン多量体、オリゴヌクレオチドを製造するために三価のリン多量体を利用する方法、および三価のリン多量体を製造する方法に関する。更に、本発明は、三価のリン多量体で誘導される固体支持体、およびその製造方法に関する。
【０００７】
本発明の一つの側面において、１個またはそれを超えるヌクレオシド間リン原子によって連結した２個またはそれを超えるヌクレオシド部分を含むホスホロアミダイト化合物であって、これらヌクレオシド間リン原子がリン（ＩＩＩ）原子であるホスホロアミダイト化合物を提供する。
【０００８】
これらホスホロアミダイト化合物は、ホスホロアミダイト部分を有するヌクレオシド部分の５’位、または好ましくは、３’位に結合していてよいホスホロアミダイト部分を含む。このホスホロアミダイト部分は、好ましくは、式−Ｘ１−ＰＲ３ＮＲ４Ｒ５（式中、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、下に記載の通りである）を有する基である。
【０００９】
ヌクレオシド部分は、ｄ−またはｌ−ヌクレオシドであってよいが、多くの態様において、ｄ−ヌクレオシドである。これらヌクレオシドは、非塩基性であってよいが、多くの態様において、核酸塩基を含む。普通は、これら核酸塩基は、当該技術分野において知られている適当な保護基で保護されている。
【００１０】
ヌクレオシド間リン（ＩＩＩ）原子は、好ましくは、亜リン酸トリエステル基を含む。多くの態様において、この亜リン酸トリエステル基は、ホスホロアミダイト部分を有するヌクレオシド部分の５’位と、次のヌクレオシド部分の３’位とを連結する。最も好ましくは、この亜リン酸トリエステル基は、β−シアノエチルオキシ部分またはβ−シアノエチルチオ部分を含む。
【００１１】
もう一つの側面において、構造式Ｉ
【００１２】
【化４５】
2004508379.tif 000002
【００１３】
によって表される三価のリン多量体またはその立体異性体を提供する。
構造式Ｉにおいて、Ｘ１は、各々独立して、−Ｏ−または−Ｓ−である。Ｘ２は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−または−ＮＲ−である。Ｘ３は、各々独立して、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＨ２−または−（ＣＨ２）２−である。好ましい態様において、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３は各々−Ｏ−である。Ｒ１は、保護基、好ましくは、酸に不安定な保護基、またはｔ−ブチルジメチルシリルまたはトリイソプロピルシリルのようなトリアルキルシリル基である。より好ましい態様において、Ｒ１は、置換された若しくは未置換のトリチル、９−（フェニル−）キサンテニル（以下、「ピキシル（ｐｉｘｙｌ）」）またはテトラヒドロピラニル（以下、「ＴＨＰ」）である。なお一層好ましい態様において、Ｒ１は、未置換のトリチル、モノアルコキシトリチル、ジアルコキシトリチル、トリアルコキシトリチル、ＴＨＰまたはピキシルである。最も好ましくは、Ｒ１は４，４’−ジメトキシトリチルである。Ｒ２は、各々独立して、−Ｈ、−Ｆ、−ＮＨＲ６、−ＣＨ２Ｒ６または−ＯＲ６である。Ｒ３は、各々独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、または式−ＯＲ７または−ＳＲ７の基である。好ましくは、Ｒ３は、各々独立して、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−ＳＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、４−シアノブト−２−エニルチオ、４−シアノブト−２−エニルオキシ、アリルチオ、アリルオキシ、クロチルチオまたはクロチルオキシである。Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基であり；またはＲ４およびＲ５は、それらが結合している窒素と一緒になって、ヘテロシクロアルキル基またはヘテロ芳香族基を形成するが、ここにおいて、このヘテロシクロアルキル環またはヘテロ芳香環は、好ましくは、５員環または６員環である。好ましくは、Ｒ４およびＲ５は各々イソプロピル基である。Ｒは、−Ｈ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、またはアミン保護基である。Ｒ６は、−Ｈ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基、またはアルコール保護基、例えば、ｔ−ブチルジメチルシリルまたはアミン保護基のような保護基である。Ｒ７は、置換された若しくは未置換の脂肪族基、置換された若しくは未置換の芳香族基、置換された若しくは未置換のアルアルキル基、ＴＨＰ、４−メトキシテトラヒドロピラニルまたは２−フルオロフェニルメトキシピペリジン−４−イルである。具体的な態様において、Ｒ７は、ｏ−クロロフェニルまたはｐ−クロロフェニルである。Ｂは、各々独立して、保護された若しくは未保護のヌクレオシド塩基であり、または１個またはそれを超える非塩基性部分が存在する場合、Ｈであってよい。ｎは０または正の整数である。本発明の三価のリン多量体を用いて、固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成する場合、好ましくは、ｎは０〜２である。三価のリン多量体を用いて、溶液中でオリゴヌクレオチドを合成する場合、好ましくは、ｎは０〜１０である。若干の態様において、Ｒ２はＣ−アリル基である。最も好ましくは、Ｒ２は、Ｈ、ＯまたはＯＣＨ２ＣＨ２ＯＭｅである。
【００１４】
一つの態様において、三価のリン多量体は、構造式ＩＩ
【００１５】
【化４６】
2004508379.tif 000003
【００１６】
またはその立体異性体によって表すことができる。
構造式ＩＩにおいて、ＢおよびＲ２は、構造式Ｉについて定義の通りである。Ｒ８は、４，４’−ジメトキシトリチルのような、置換された若しくは未置換のトリチルである。Ｒ１０およびＲ１１は、各々独立して、置換された若しくは未置換の脂肪族基である。好ましくは、Ｒ１０およびＲ１１は各々イソプロピル基である。ｍは０または１である。
【００１７】
構造式Ｉによって表される三価のリン多量体は、構造式ＩＩＩ
【００１８】
【化４７】
2004508379.tif 000004
【００１９】
によって表されるオリゴヌクレオチドまたはその立体異性体を製造するのに用いることができる。
【００２０】
構造式ＩＩＩにおいて、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、構造式Ｉについて定義の通りである。Ｘ４は、各々独立して、＝Ｏまたは＝Ｓである。Ｒ１３は、ヒドロキシル保護基、チオール保護基、アミン保護基、式−Ｙ２−Ｌ−Ｙ１の基、固体支持体または式−Ｙ２−Ｌ−Ｙ２−Ｒ１５の基である。Ｙ１は、アミン基、チオール基またはヒドロキシル基と反応することができる官能基である。好ましくは、Ｙ１は、エステル基またはカルボン酸基である。Ｙ２は、各々独立して、単結合、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ１７−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＲ１７−または−Ｏ−である。Ｌはリンカーであり、好ましくは、置換された若しくは未置換の脂肪族基、または置換された若しくは未置換の芳香族基である。より好ましくは、Ｌはエチレン基である。Ｒ１７は、−Ｈ、置換された若しくは未置換の脂肪族基、または置換された若しくは未置換の芳香族基である。Ｒ１５は、制御細孔ガラス、ポリスチレン、ポリジメチルアクリルアミドのような微孔性ポリアミド、ポリエチレングリコールで被覆されたポリスチレン、および Ｔｅｎｔａｇｅｌ という商品名で商業的に入手可能な固体支持体のようなポリスチレン上に支持されたポリエチレングリコールなどの、固相オリゴヌクレオチド合成に適した固体支持体である。Ｒ１４は、−Ｈまたは保護基である。好ましくは、Ｒ１４が保護基である場合、それは、酸に不安定な保護基、ｔ−ブチルジメチルシリルまたはトリイソプロピルシリルである。ｐは正の整数である。一つの態様において、三価のリン多量体で合成されるオリゴヌクレオチドは、リン酸エステル（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）であり、したがって、リン酸エステル結合だけを有する（すなわち、各々のヌクレオチド間リンは、酸素にだけ結合している）。もう一つの態様において、合成されるオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートであり、したがって、ホスホロチオエート結合だけを有する（各々のヌクレオチド間リンは、少なくとも１個のＳに、好ましくは、１個のＳだけに結合している）。なおもう一つの態様において、合成されるオリゴヌクレオチドは、リン酸エステルおよびホスホロチオエート両方のヌクレオチド間結合を含むキメラオリゴヌクレオチドである。
【００２１】
構造式ＩＩＩによって表されるオリゴヌクレオチドを製造する方法では、構造式Ｉによって表される三価のリン多量体を、構造式ＩＶ
【００２２】
【化４８】
2004508379.tif 000005
【００２３】
によって表される５’−脱保護ヌクレオチドまたはヌクレオシド、またはその立体異性体にカップリングさせる。
【００２４】
構造式ＩＶにおいて、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１３およびＢは、上に定義の通りである。Ｘ５は−ＯＨまたは−ＳＨである。ｑは０または正の整数である。このカップリング反応は、構造式Ｖ
【００２５】
【化４９】
2004508379.tif 000006
【００２６】
によって表される第一中間体またはその立体異性体を形成する。
構造式Ｖにおいて、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１３、ｎおよびｑは、上に定義の通りである。次に、この第一中間体の三価のリン基を酸化してまたは硫化して、構造式ＶＩ
【００２７】
【化５０】
2004508379.tif 000007
【００２８】
によって表される第二中間体またはその立体異性体を形成する。
構造式ＶＩにおいて、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１３、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｂおよびｑは、上に定義の通りである。反応混合物中に残っている、構造式ＩＶによって表される５’−脱保護ヌクレオシドまたはヌクレオチドはいずれも、場合により、未反応の基Ｘ５にキャッピングする試薬で処理することができる。次に、この第二中間体を処理して、Ｒ１を除去する。Ｒ１が酸に不安定な保護基である場合、この第二中間体を酸で処理してＲ１を除去する。Ｒ１が、ｔ−ブチルジメチルシリル基またはトリイソプロピルシリル基のようなトリアルキルシリル基である場合、この第二中間体をフッ化物イオンで処理して、Ｒ１を除去することができる。典型的には、ｔ−ブチルジメチルシリルおよびトリイソプロピルシリルは、ＴＨＦ中のフッ化テトラブチルアンモニウム溶液での処理によって除去される。ｔ−ブチルジメチルシリルを除去する方法は、その内容が本明細書中にそのまま援用される、Ｇｒｅｅｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （１９９１）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ｐａｇｅｓ ７７−８３ に見出されうる。上の反応工程または反応サイクルは、１回またはそれを超えた回数繰り返して、所望の長さのオリゴヌクレオチドを形成することができる。５’末端が保護されているオリゴヌクレオチド生成物を得ることが望まれる場合、反応サイクルの最終工程は、キャッピング工程が行われる場合はキャッピング工程でありうるし、またはキャッピング工程が行われない場合、その反応の最終工程は、酸化または硫化工程でありうる。或いは、５’保護基を有していないオリゴヌクレオチドを得ることが望まれる場合、この反応サイクルの最終工程は、Ｒ１の除去でありうる。
【００２９】
本発明は、更に、構造式Ｉによって表される三価のリン多量体またはその立体異性体を製造する方法に関する。この方法は、構造式ＶＩＩ
【００３０】
【化５１】
2004508379.tif 000008
【００３１】
によって表されるヌクレオシドまたはその立体異性体の３’−置換基を保護して、構造式ＶＩＩＩ
【００３２】
【化５２】
2004508379.tif 000009
【００３３】
によって表される第一中間体またはその立体異性体を形成することを行う。
構造式ＶＩＩおよびＶＩＩＩにおいて、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ１およびＢは、上に定義の通りである。構造式ＶＩＩＩにおいて、Ｒ１６は、Ｒ１に直交する（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｏ　Ｒ１）保護基である。したがって、Ｒ１は、Ｒ１６の存在下において、Ｒ１６で反応を生じることなく除去することができる保護基であり、そしてＲ１６は、Ｒ１の存在下において、Ｒ１で反応を生じることなく除去することができる保護基である。好ましくは、Ｒ１６は、レヴリノイル（ｌｅｖｕｌｙｎｏｙｌ）基または３−ベンゾイルプロピオニル基である。次に、構造式ＶＩＩＩによって表される第一中間体を処理してＲ１を除去して、５’−脱保護ヌクレオシドを形成する。Ｒ１が酸に不安定な保護基である場合、この第一中間体を酸で処理して、酸に不安定な保護基を除去する。Ｒ１がトリアルキルシリル保護基である場合、典型的には、この第一中間体をフッ化物イオンで処理して、Ｒ１を除去する。この５’−脱保護ヌクレオシドを、カップリング触媒の存在下において、次の構造式ＩＸ
【００３４】
【化５３】
2004508379.tif 000010
【００３５】
によって表される化合物またはその立体異性体と反応させる。
構造式ＩＸにおいて、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＢは、上に定義の通りである。この反応より形成される３’，５’−保護二量体（３’，５’−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ　ｄｉｍｅｒ）は、構造式Ｘ
【００３６】
【化５４】
2004508379.tif 000011
【００３７】
またはその立体異性体によって表すことができる。
構造式Ｘにおいて、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１６およびＢは、上に定義の通りである。この３’，５’−保護二量体を処理してＲ１６を除去して、３’−脱保護二量体を形成する。この３’−脱保護二量体を、場合により、カップリング触媒の存在下において、構造式ＸＩ
【００３８】
【化５５】
2004508379.tif 000012
【００３９】
によって表される化合物またはその立体異性体と反応させる。
構造式ＸＩにおいて、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ１６およびＢは、前に定義の通りである。この反応の生成物は、構造式ＸＩＩ
【００４０】
【化５６】
2004508379.tif 000013
【００４１】
によって表される３’，５’−保護三量体またはその立体異性体である。
構造式ＸＩＩにおいて、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１６およびＢは、前に定義の通りである。
【００４２】
場合により、この３’，５’−保護三量体を処理してＲ１６を除去して、３’−脱保護三量体を形成することができ、これを、カップリング触媒の存在下において、構造式ＸＩによって表される化合物と、１回またはそれを超えた回数反応させて、３’，５’−保護多量体を形成することができる。次に、この３’，５’−保護多量体を処理してＲ１６を除去して、３’−脱保護多量体を形成する。この３’−脱保護多量体を、ＸＩＩＩａかまたはＸＩＩＩｂ
【００４３】
【化５７】
2004508379.tif 000014
【００４４】
によって表される三価のリン化合物と反応させて、構造式Ｉによって表される三価のリン多量体を形成する。構造式ＸＩＩＩａおよびＸＩＩＩｂにおいて、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、上に定義の通りである。Ｘ６はハロゲン、好ましくは、クロロまたはブロモである。
【００４５】
或いは、構造式Ｉによって表される三価のリン多量体またはその立体異性体は、構造式ＶＩＩによって表されるヌクレオシドまたはその立体異性体の３’−置換基を保護して、構造式ＶＩＩＩによって表される第一中間体またはその立体異性体を形成することによって製造することができる。この第一中間体を処理してＲ１を除去し、それによって、５’−脱保護ヌクレオシドを形成する。この５’−脱保護ヌクレオシドを、ＸＩＩＩａかまたはＸＩＩＩｂによって表される三価のリン化合物と反応させて、構造式ＸＩによって表される５’−ホスホロアミダイトまたはその立体異性体を形成する。この５’−ホスホロアミダイトを、カップリング触媒の存在下において、構造式ＶＩＩによって表される化合物またはその立体異性体と反応させて、構造式Ｘによって表される３’，５’−保護二量体またはその立体異性体を形成する。この３’，５’−保護二量体を処理してＲ１６を除去して、３’−脱保護二量体を形成する。場合により、この３’−脱保護二量体を、カップリング触媒の存在下において、構造式ＸＩによって表される化合物またはその立体異性体と反応させて、構造式ＸＩＩによって表される３’，５’−保護三量体またはその立体異性体を形成する。場合により、Ｒ１６の除去およびカップリング工程をもう１回繰り返して、３’，５’−保護多量体を形成することができる。この３’，５’−保護多量体からＲ１６を除去して、３’−脱保護多量体を形成し、これを、構造式ＸＩＩＩａまたはＸＩＩＩｂの一つによって表される三価のリン化合物と反応させて、構造式Ｉによって表される三価のリン多量体またはその立体異性体を形成する。
【００４６】
本発明のもう一つの態様は、三価のリン多量体で誘導される固体支持体およびそれを製造する方法である。この三価のリン多量体で誘導される固体支持体は、構造式ＸＩＶ
【００４７】
【化５８】
2004508379.tif 000015
【００４８】
またはその立体異性体によって表すことができる。
構造式ＸＩＶにおいて、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１５、Ｂ、Ｌおよびｎは、上に定義の通りである。
【００４９】
構造式ＸＩＶによって表される、三価のリン多量体で誘導される固体支持体を製造する方法は、上記の方法の一つによって３’−脱保護多量体を製造することを含む。この３’−脱保護多量体を、塩基の存在下において、構造式ＸＶａまたはＸＶｂ
【００５０】
【化５９】
2004508379.tif 000016
【００５１】
によって表される化合物と反応させて、構造式ＸＶＩ
【００５２】
【化６０】
2004508379.tif 000017
【００５３】
によって表される固体支持体充填用試薬（ｓｏｌｉｄ　ｓｕｐｐｏｒｔ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｒｅａｇｅｎｔ）またはその立体異性体を形成する。
【００５４】
構造式ＸＶａ、ＸＶｂおよびＸＶＩにおいて、Ｌは上に定義の通りである。構造式ＸＶＩにおいて、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＢは、上に定義の通りである。この固体支持体充填用試薬と、第一級または第二級アミン基で誘導された固体支持体とを、塩基および置換された若しくは未置換の二脂肪族カルボジイミドの存在下で反応させて、構造式ＸＩＶによって表される、三価のリン多量体で誘導される固体支持体を形成する。
【００５５】
若干の態様において、構造式Ｉ〜ＸＩＩ、ＸＩＶおよびＸＶＩの化合物の立体異性体は、それらの糖部分が、図示されているｄ−立体異性体とは反対のｌ−立体異性体である該当する構造式である。
【００５６】
本発明の多量体は、三価のリン結合を有するので、キメラオリゴヌクレオチド（すなわち、ホスホジエステル結合およびホスホロチオエート結合両方を有するオリゴヌクレオチド）は、これら三価のリン多量体から合成することができる。三価のリン多量体を用いたオリゴヌクレオチドの合成は、モノマーを用いてオリゴヌクレオチドを合成する場合よりも少ない反応工程しか必要としないので、所望の生成物の収率を改善すると考えられる。したがって、本発明の三価のリン多量体の使用は、利用可能な技術で現在可能であるよりも長いオリゴヌクレオチドの合成を容易にすると考えられる。更に、本発明の多量体の使用は、ある与えられた長さのオリゴヌクレオチドを合成するのに、モノマーを用いて合成を行う場合よりも少ないまたは半分程度の反応工程しか必要としないので、試薬を節約するであろう。最後に、多量体を用いてオリゴヌクレオチドを合成する場合、Ｎ−１副生成物を生じることはないと考えられるので、所望のオリゴヌクレオチドは、失敗配列から一層容易に分離されるであろう。したがって、所望の生成物は、精製中の生成物の損失が少ないために、より高純度および高収率で製造することができる。
【００５７】
発明の詳細な記述
本明細書中で用いられる脂肪族基には、完全に飽和しているまたは１個若しくはそれを超える非芳香族二重結合を含有する直鎖または分岐状のＣ１−Ｃ１８炭化水素、または完全に飽和しているまたは１個若しくはそれを超える非共役二重結合を含有する環状Ｃ３−Ｃ１８炭化水素が含まれる。低級アルキル基は、完全に飽和している直鎖または分岐状のＣ１−Ｃ８炭化水素またはＣ３−Ｃ８環状炭化水素である。脂肪族基は、好ましくは、低級アルキル基である。
【００５８】
芳香族基には、炭素環式芳香環系（例えば、フェニル）、および１個またはそれを超える炭素環式芳香環または非芳香環に縮合した炭素環式芳香環系（例えば、ナフチル、アントラセニルおよび１，２，３，４−テトラヒドロナフチル）が含まれる。
【００５９】
本明細書中で用いられるヘテロ芳香族基には、ヘテロアリール環系（例えば、チエニル、ピリジル、ピラゾール、イソオキサゾリル、チアジアゾリル、オキサジアゾリル、インダゾリル、フラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、トリアゾール、ピリミジン、ピラジン、チアゾール、イソオキサゾール、イソチアゾール、テトラゾールまたはオキサジアゾール）；および炭素環式芳香環、炭素環式非芳香環、ヘテロアリール環またはヘテロシクロアルキル環が、１個またはそれを超える他のヘテロアリール環に縮合しているヘテロアリール環系（例えば、ベンゾ（ｂ）チエニル、ベンゾイミダゾール、インドール、テトラヒドロインドール、アザインドール、インダゾール、キノリン、イミダゾピリジン、プリン、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジンおよびピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン）が含まれる。
【００６０】
本明細書中で用いられるアルアルキル基は、好ましくは、１〜約６個の炭素原子を有する脂肪族基によってある部分に連結している芳香族置換基である。
【００６１】
本明細書中で用いられるヘテロシクロアルキル基は、好ましくは、５〜６個の原子を有し且つ窒素、酸素または硫黄のような少なくとも１個のヘテロ原子を含む非芳香環系である。
【００６２】
脂肪族基、芳香族基、アルアルキル基、ヘテロ芳香族基およびヘテロシクロアルキル基に適当な置換基には、芳香族基、ハロゲン化芳香族基、低級アルキル基、ハロゲン化低級アルキル基（例えば、トリフルオロメチルおよびトリクロロメチル）、−Ｏ−（脂肪族基または置換脂肪族基）、−Ｏ−（芳香族基または置換芳香族基）、ベンジル、置換ベンジル、ハロゲン、シアノ、ニトロ、−Ｓ−（脂肪族または置換脂肪族基）、および−Ｓ−（芳香族または置換芳香族）が含まれる。
【００６３】
アミン、アルコールおよびチオールの保護基は、当業者に知られている。アミン保護基の例については、その内容が本明細書中にそのまま援用される、Ｇｒｅｅｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （１９９１）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ３０９−４０５頁を参照されたい。好ましくは、アミンは、アミドまたはカルバメートとして保護される。アルコール保護基の例については、その内容が本明細書中にそのまま援用される同上、１０−１４２頁を参照されたい。好ましいアルコール保護基はｔ−ブチルジメチルシリル基である。チオール保護基の例については、その内容が本明細書中にそのまま援用される同上、２７７−３０８頁を参照されたい。
【００６４】
酸に不安定な保護基は、ブレーンステッド酸またはルイス酸とその基を接触させることによって除去することができる保護基である。酸に不安定な保護基は、当業者に知られている。一般的な酸に不安定な保護基の例には、置換された若しくは未置換のトリチル基（同上、６０−６２頁）、置換された若しくは未置換のテトラヒドロピラニル基（同上、３１−３４頁）、置換された若しくは未置換のテトラヒドロフラニル基（同上、３６−３７頁）またはピキシル基（同上、６５頁）である。好ましい酸に不安定な保護基は、置換された若しくは未置換のトリチル、例えば、４，４’−ジメトキシトリチル（以下、「ＤＭＴ」）である。トリチル基は、好ましくは、アルコキシ基のような電子供与性置換基で置換されている。
【００６５】
ヌクレオシド塩基には、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシルのような天然に存在する塩基、および７−デアザグアニン、７−デアザ−８−アザグアニン、５−プロピニルシトシン、５−プロピニルウリシル、７−デアザアデニン、７−デアザ−８−アザアデニン、７−デアザ−６−オキソプリン、６−オキソプリン、３−デアザアデノシン、２−オキソ−５−メチルピリミジン、２−オキソ−４−メチルチオ−５−メチルピリミジン、２−チオカルボニル−４−オキソ−５−メチルピリミジン、４−オキソ−５−メチルピリミジン、２−アミノプリン、５−フルオロウリシル、２，６−ジアミノプリン、８−アミノプリン、４−トリアゾロ−５−メチルチミンおよび４−トリアゾロ−５−メチルウリシルのような修飾塩基が含まれる。
【００６６】
保護されたヌクレオシド塩基は、その塩基の反応性官能基が保護されているヌクレオシド塩基である。典型的には、ヌクレオシド塩基は、アミド基またはカルバメート基の形成によるような、アミン保護基で保護されうるアミン基を有する。例えば、アデニンおよびシトシンのアミン基は、典型的には、ベンゾイル保護基で保護され、グアニンのアミン基は、典型的には、イソブチリル基、アセチル基またはｔ−ブチルフェノキシアセチル基で保護される。しかしながら、他の保護スキームを用いることができる。例えば、迅速な脱保護のためには、アデニンおよびグアニンのアミン基を、フェノキシアセチル基で保護し、シトシンのアミン基を、イソブチリル基で保護する。オリゴヌクレオチドを、保護されたヌクレオチド塩基を有する本発明の多量体から合成する場合、保護基の除去のための条件は、用いられる保護基に依るであろう。アミド基として保護されたアミノ基を用いる場合、それは、そのオリゴヌクレオチドを、濃水酸化アンモニウム溶液、ｎ−メチルアミン溶液または水酸化アンモニウム中のｔ−ブチルアミン溶液のような塩基溶液で処理することによって除去することができる。
【００６７】
この項での構造式の意味には、適宜、該当する立体異性体が含まれると理解されるであろう。
【００６８】
構造式ＩまたはＩＩによって表される三価のリン多量体は、構造式ＩＩＩによって表されるオリゴヌクレオチドを製造するのに用いることができる。三価のリン多量体を用いることの、モノマーを用いることに勝る利点は、より少ない反応工程しか必要としないということである。したがって、より長いオリゴヌクレオチドを合成することができる。１５０ヌクレオチド塩基より長いオリゴヌクレオチドは、三価のリン多量体を用いて合成することができると考えられる。本発明の多量体は、約５０個までの塩基、例えば、８〜３５個の塩基を含むものような、より短いオリゴヌクレオチドを合成するのに用いることもできる。
【００６９】
オリゴヌクレオチドの合成は、溶液中でまたは固体支持体上で行うことができる。合成が溶液中である場合、Ｒ１３は、アルコール、アミンまたはチオールの保護基である。オリゴヌクレオチドの合成後、そのアルコール、アミンまたはチオール保護基を除去することができる。オリゴヌクレオチドを固体支持体上で合成する場合、Ｒ１３は、固体支持体または−Ｙ２−Ｌ−Ｙ２−Ｒ１５である。概して、三価のリン多量体を用いたオリゴヌクレオチドの液相合成または固相合成は、多量体が用いられる場合に、カップリング工程が、しばしば、モノマーを用いる場合のカップリング工程よりも約２５％〜約７５％長く要することを除き、モノマーからのオリゴヌクレオチド合成用に開発された方法と同様に行われる。三価のリン多量体を用いた液相合成および固相合成オリゴヌクレオチドに典型的な条件の例は、下に記載される。
【００７０】
オリゴヌクレオチドを製造する第一工程は、三価のリン多量体を、構造式ＩＶによって表される５’−脱保護ヌクレオシドまたはヌクレオチドとカップリングさせることを行う。このカップリング反応中に、このヌクレオシドまたはヌクレオチドの５’−脱保護基は、基−ＮＲ４Ｒ５を置換することによって多量体と反応する。合成を溶液中で行う場合、この５’−脱保護ヌクレオチドは、しばしば、約０．０２Ｍ〜約２Ｍの濃度で存在し、そして多量体は、好ましくは、約１．１当量〜約２当量の５’−脱保護ヌクレオシドまたはヌクレオチドの濃度で存在する。５’−脱保護ヌクレオシドに関して、約２．５当量〜約５．０当量のテトラゾール、Ｓ−エチルチオテトラゾール、ジシアノイミダゾールのような求核性カップリング触媒または塩化ピリジニウムのようなピリジニウム塩を、通常、カップリング反応を促進するために加える。この反応時間は、一般的には、約２０分〜約６０分である。
【００７１】
オリゴヌクレオチドを製造する第二工程は、オリゴヌクレオチドの三価のリン基を酸化することまたは硫化することを行う。この工程では、５’−脱保護ヌクレオシドにカップリングした多量体の三価のリン基、更には、５’−脱保護ヌクレオシドまたはヌクレオチドと多量体との間に新たに形成される三価のリン結合を、酸化するまたは硫化する。
【００７２】
液相合成において、この酸化反応は、しばしば、酸化剤、例えば、水の存在下のＩ２または有機溶媒中のｔ−ブチル過酸化水素のような過酸化物でオリゴヌクレオチドを処理することによって行われる。Ｉ２および水を用いる場合、この酸化溶液は、典型的には、塩基および微量の水の存在下において約１．１〜約１．８当量のＩ２を含有する。この反応は、第三級アルキルアミンのような塩基および約１％の水と混合される、ＴＨＦのような非プロトン性極性溶媒中で行われる。非プロトン性溶媒対塩基の比率は、約４：１（容量／容量）〜約１：４（容量／容量）である。約５分〜約２０分後、反応混合物を、重亜硫酸ナトリウムの水溶液中に注いで、過剰のヨウ素を急冷した後、有機溶媒中に抽出する。
【００７３】
或いは、三価のリン基は、オリゴヌクレオチド合成での使用について当業者に知られているいずれの硫黄転移試薬（ｓｕｌｆｕｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｒｅａｇｅｎｔ）を用いても、硫化することができる。硫黄転移試薬の例には、３Ｈ−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド（「Ｂｅａｕｃａｇｅ 試薬」とも称される）、四硫化ジベンゾイル、二硫化フェニルアセチル、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラエチルチウラムジスルフィド、３−アミノ−［１，２，４］−ジチアゾール−５−チオン（その内容が本明細書中にそのまま援用される米国特許第６，０９６，８８１号を参照されたい）または元素硫黄が含まれる。上の試薬を用いたオリゴヌクレオチドの硫化の反応条件の例は、その内容が本明細書中にそのまま援用される、Ｂｅａｕｃａｇｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ （１９９３）， ４９：６１２３ に見出されうる。３−アミノ−［１，２，４］−ジチアゾール−５−チオンは、好ましい硫黄転移試薬である。概して、オリゴヌクレオチドを、ピリジン／アセトニトリル（１：９ｗ／ｗ）のような有機溶媒中で約０．０４Ｍ〜約０．２Ｍの濃度を有する３−アミノ−［１，２，４］−ジチアゾール−５−チオンの溶液と接触させる。この硫化反応は、約３０秒〜約２分で完了する。
【００７４】
オリゴヌクレオチドの酸化または硫化後、未反応の５’−脱保護ヌクレオシドはいずれも、しばしば、キャッピングされるので、それは、引き続きのカップリング工程で反応し得ない。キャッピング失敗配列は、完全長さオリゴヌクレオチド生成物から一層容易に分離されることが可能になる。求核性５’末端基（すなわち、−ＯＨ、−ＳＨまたは−ＮＨ２）と反応し且つそれが三価のリン多量体と反応するのを妨げるであろう試薬はいずれも、キャッピング用試薬として用いることができる。典型的には、無水酢酸または無水イソ酪酸のような無水物、または塩化アセチルまたは塩化イソブチリルのような酸塩化物を、塩基の存在下において、キャッピング用試薬として用いる。
【００７５】
キャッピング反応が完了後、Ｒ１によって表される５’保護基を除去する。Ｒ１が、酸に不安定な保護基である場合、Ｒ１は、オリゴヌクレオチドを酸で処理することによって除去される。好ましくは、５’保護基は、４，４’−ジメトキシトリチルのようなトリチル基である。５’保護基がトリチル基である場合、それは、ジクロロメタンのような有機溶媒中のジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸の溶液でオリゴヌクレオチドを処理することによって除去することができる。５’保護基がいったん除去されたら、その反応サイクル（すなわち、カップリング工程、酸化または硫化工程、キャッピング工程（任意）および脱保護工程）を、場合により、１回またはそれを超えた回数繰り返して、所望の長さのオリゴヌクレオチドを得ることができる。
【００７６】
リン酸エステルオリゴヌクレオチドは、三価のリン基を酸化することによって、およびヌクレオチド間基が脱保護された場合にリン酸基が形成されるようなヌクレオチド間リン保護基（Ｒ３によってあらわされるような）の選択によって製造することができる。例えば、β−シアノエチルオキシで保護された三価のリンの酸化後、塩基性脱保護は、リン酸基を形成すると考えられる。
【００７７】
ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、三価のリン基を硫化することによってまたは三価のリン基を酸化することによって、およびヌクレオチド間基が脱保護された場合にホスホロチオエート基が形成されるようなヌクレオチド間リン保護基（Ｒ３によってあらわされるような）の選択によって製造することができる。例えば、β−シアノエチルチオで保護された三価のリンの酸化後、無水塩基性脱保護は、ホスホロチオエート基を形成すると考えられる。
【００７８】
キメラオリゴヌクレオチドは、三価のリン基を１回またはそれを超える反応サイクルで酸化し且つ三価のリン基を１回またはそれを超える異なった反応サイクルで硫化することにより、所望のリン酸エステル結合またはホスホロチオエート結合を形成するためのヌクレオチド間リン保護基（Ｒ３によってあらわされるような）の適当な選択と組み合わせて製造することができる。或いは、キメラオリゴヌクレオチドは、β−シアノエチルチオ保護基のような、ヌクレオチド間保護基のいくつかが、脱保護でホスホロチオエート結合を形成し、そしてβ−シアノエチルオキシ保護基のような、ヌクレオチド間保護基のいくつかが、脱保護でリン酸エステル結合を形成している多量体を選択することによって製造することができる。この方法では、各反応サイクル中のカップリング工程後に、オリゴヌクレオチドを酸化する。
【００７９】
５’末端基が保護されているオリゴヌクレオチド生成物を得ることが望まれる場合、反応サイクルの最終工程は、キャッピング工程が行われる場合はキャッピング工程でありうるし、またはキャッピング工程が行われない場合、その反応の最終工程は、酸化または硫化工程でありうる。５’−脱保護オリゴヌクレオチドが望まれる場合、この反応サイクルは、脱保護工程で終わることができる。通常は、５’に保護されたオリゴヌクレオチドは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってそのオリゴヌクレオチドを精製することになっている場合、所望の生成物である。オリゴヌクレオチドをイオン交換クロマトグラフィーによって精製することになっている場合、通常は、５’−脱保護オリゴヌクレオチドが所望の生成物である。
【００８０】
三価のリン多量体を用いたオリゴヌクレオチドの固相合成は、概して、液相合成と同様の反応サイクルおよび試薬を利用する。しかしながら、５’−脱保護ヌクレオシドまたはヌクレオチドを固体支持体上に充填するが、この場合の充填量は、しばしば、支持体１グラムにつき約５００μモル〜約１００μモルである。カップリング工程では、アセトニトリルのような有機溶媒中に、典型的には、約０．０１Ｍ〜約１Ｍ、好ましくは、約０．１Ｍの濃度を有する三価のリン多量体の溶液を、固体支持体に加える。約１．５ｍｍｏｌ〜約１．５Ｍの濃度を有する求核性カップリング触媒の溶液を、通常、カップリング反応中にまたは直前に、多量体を含有する溶液と混合する。次に、支持体に結合した５’−脱保護ヌクレオシドまたはヌクレオチドとその混合物とを、約２分間〜約１０分間、好ましくは、約５分間接触させる。
【００８１】
三価のリン結合を、カップリング反応が完了した後に酸化することになっている場合、固体支持体を、ＴＨＦ、アセトニトリルまたはトルエンのような有機溶媒中のｔ−ブチルヒドロペルオキシドのような過酸化物、またはＩ２および水の混合物などの酸化剤と接触させる。Ｉ２およびＨ２Ｏの混合物は、好ましい酸化試薬である。Ｉ２および水の混合物を用いる場合、他の水混和性有機溶媒も存在しうる。典型的には、固体支持体に結合した、三価のリンヌクレオチド間結合を含有するオリゴヌクレオチドを、水、非プロトン性の水混和性溶媒および塩基の溶媒混合物中のＩ２溶液と接触させることができる。典型的な酸化溶液の例は、（２：８０：２０）水／テトラヒドロフラン／ルチジン（容量／容量／容量）の溶液中に約０．０５Ｍ〜約１．５ＭのＩ２である。固体支持体は、典型的に、このＩ２溶液で約３０秒間〜約１．５分間処理される。
【００８２】
或いは、固体支持体を、有機溶媒中の硫黄転移試薬溶液と接触させて、三価のリン基を硫化することができる。例えば、固体支持体は、アセトニトリルのような有機溶媒中の３Ｈ−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（約０．０５Ｍ〜０．２Ｍ）溶液と約３０秒間〜約１分間接触させることができる。
【００８３】
固相オリゴヌクレオチド合成において、固体支持体は、場合により、キャッピング試薬の溶液と約３０秒間〜約１分間接触させることができる。キャッピング工程後、固体支持体と酸溶液とを約１分間〜約３分間接触させることによって、脱保護工程を行う。この反応サイクルは、場合により、所望の長さのオリゴヌクレオチドが合成されるまで、１回またはそれを超えた回数繰り返すことができる。液相合成の場合と同様、５’に保護されたオリゴヌクレオチドは、反応サイクルが、キャッピング工程でかまたは酸化または硫化工程で終わる場合に得られる。５’−脱保護オリゴヌクレオチドは、反応サイクルが脱保護工程で終わる場合に得られる。
【００８４】
固相合成が完了した時点で、オリゴヌクレオチドは、標準法によって固体支持体から取り出すことができる。概して、固体支持体を、濃水酸化アンモニウム溶液で、オリゴヌクレオチド配列に依っておよびこの工程中に核酸塩基保護基を除去することが望まれるがどうかに依って、２５℃〜６０℃において約０．５時間〜約１６時間またはそれを越えて処理する。
【００８５】
三価のリン多量体は、二つの異なった方法によって製造することができる。第一の方法（この方法の例については、図１を参照されたい）では、構造式ＶＩＩによって表されるヌクレオシドを保護して、構造式ＶＩＩＩによって表される第一中間体を形成する。好ましくは、保護基は、レヴリノイル保護基または３−ベンゾイルプロピオニル保護基である。レヴリノイル保護基は、いくつか異なった方法でヌクレオシドに加えることができる（その内容が本明細書中にそのまま援用される、Ｇｒｅｅｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （１９９１）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ｐａｇｅ ９７ を参照されたい）。レヴリノイル保護基または３−ベンゾイルプロピオニル保護基でヌクレオシドを保護する好ましい方法は、ピリジン中の無水レヴリン酸または無水３−ベンゾイルプロピオン酸でそれを約１６〜２４時間処理することによる。或いは、レヴリノイル保護基または３−ベンゾイルプロピオニル保護基は、ジクロロメタンおよびピリジンの溶液中においてレヴリン酸または３−ベンゾイルプロピオン酸およびジシクロヘキシルカルボジイミドでヌクレオシドを処理することによって加えることができる。
【００８６】
次に、この第一中間体を処理してＲ１を除去して、５’−脱保護ヌクレオシドを形成する。トリチル基を除去する方法は、その内容が本明細書中にそのまま援用される、Ｇｒｅｅｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （１９９１）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ｐａｇｅｓ ６０−６２ に挙げられている。テトラヒドロピラニル保護基（３１−３４頁）およびテトラヒドロフラニル保護基（３６−３７頁）を除去する方法は、その内容が本明細書中にそのまま援用される、Ｇｒｅｅｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （１９９１）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． に見出されうる。トリチル基は、好ましくは、この第一中間体を、水中８０％（容量／容量）酢酸水溶液で約７時間処理することによって、またはジクロロメタン中の約２％トリフルオロ酢酸またはジクロロ酢酸での約１５分間の処理によって除去される。
【００８７】
次に、この５’−脱保護ヌクレオシドを、構造式ＩＸによって表されるホスホロアミダイトとカップリングさせて、構造式Ｘによって表される二量体を形成することができる。このカップリング反応は、典型的には、乾燥反応条件下の有機溶媒中で行われる。反応物の濃度は、約０．０５Ｍ〜約０．５Ｍである。Ｈ−テトラゾールまたはＳ−エチルチオテトラゾールのようなカップリング触媒も、反応混合物中に、しばしば、５’−脱保護ヌクレオシドに関して約２当量〜約６当量で存在する。このカップリング反応は、典型的には、約２時間〜約１６時間を要する。
【００８８】
次に、３’，５’−保護二量体を処理してＲ１６を除去して、３’−脱保護二量体を形成する。Ｒ１６がレヴリノイル保護基である場合、それは、その内容が本明細書中にそのまま援用される、Ｇｒｅｅｎｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ （１９９１）， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ｐ． ９７ に示される方法によって除去することができる。好ましくは、レヴリノイル保護基または３−ベンゾイルプロピオニル保護基は、この３’，５’−保護二量体と、約４：１（容量／容量）〜約１：４（容量／容量）の比率のピリジン／酢酸中の約０．０５Ｍ〜約１Ｍヒドラジン溶液とを、約１５分間〜約１時間接触させることによって除去される。
【００８９】
この３’−脱保護二量体を、場合により、カップリング触媒の存在下において、構造式ＸＩによって表される化合物と反応させる。このカップリング反応は、乾燥反応条件下の有機溶媒中で行われる。この３’−脱保護二量体および構造式ＸＩによって表される化合物の濃度は、約０．０５Ｍ〜約０．５Ｍである。Ｈ−テトラゾールまたはＳ−エチルチオテトラゾールのようなカップリング触媒は、３’−脱保護二量体に関して約２当量〜約６当量で存在する。構造式ＸＩＩによって表される３’，５’−保護三量体は、この反応によって形成される生成物である。
【００９０】
このＲ１６脱保護反応およびカップリング反応を、場合により、３’，５’−保護三量体を出発物質として用いて１回またはそれを越えて繰り返して、３’，５’−保護多量体を形成することができる。
【００９１】
次に、この３’，５’−保護多量体を処理してＲ１６を除去して、３’−脱保護多量体を形成する。
【００９２】
この３’−脱保護多量体を、リン酸化試薬と反応させて、構造式Ｉによって表される三価のリン多量体を形成する。構造式ＸＩＩＩａおよびＸＩＩＩｂによって表されるリン酸化試薬を、ジクロロメタン、アセトニトリルまたはＴＨＦのような有機溶媒中の３’−脱保護多量体の乾燥溶液に徐々に加える。リン酸化試薬が、構造式ＸＩＩＩｂによって表される化合物である場合、トリエチルアミンまたはジイソプロピルエチルアミンのような非プロトン性有機塩基も、この反応混合物に加える。リン酸化試薬は、しばしば、多量体に関して過剰の約１．１当量〜約１．５当量で存在する。この反応を約４時間〜約２４時間進行させる。反応が完了後、場合により、ｎ−オクタノールを反応混合物に加えて、いずれか残っているリン酸化試薬と反応させることができる。好ましくは、多量体は二量体（２個のヌクレオチド塩基）または三量体（３個のヌクレオチド塩基）である。
【００９３】
三価のリン多量体を製造する第二の方法（例については、図２を参照されたい）では、構造式ＶＩＩによって表されるヌクレオシド塩基を、Ｒ１に直交する保護基Ｒ１６で保護して、構造式ＶＩＩＩによって表される第一中間体を形成する。好ましくは、Ｒ１６は、レヴリノイル保護基または３−ベンゾイルプロピオニル保護基である。この第一中間体を、三価のリン多量体を製造する第一の方法の場合と同様に処理して、Ｒ１を除去する。この反応配列によって形成される５’−脱保護ヌクレオシドを、構造式ＸＩＩＩａまたはＸＩＩＩｂによって表されるリン酸化試薬で処理して、構造式ＸＩによって表される５’−ホスホロアミダイトヌクレオシドを形成する。この５’リン酸化条件は、三価のリン多量体を形成する第一方法の３’リン酸化条件について記載されたのと同様である。次に、この５’−ホスホロアミダイトを、カップリング触媒の存在下において、構造式ＶＩＩによって表される化合物とカップリングさせて、構造式Ｘによって表される３’，５’−保護二量体を形成する。このカップリング反応の反応条件は、多量体を形成する第一方法でのカップリング反応の場合と同様である。この３’，５’−保護二量体を、上記のように処理してＲ１６を除去して、３’−脱保護二量体を形成する。更に、上記のように、この３’−脱保護二量体を、場合により、カップリング触媒の存在下において、構造式ＸＩによって表される化合物と反応させて、構造式ＸＩＩによって表される３’，５’−保護三量体を形成する。この３’−脱保護反応およびカップリング反応を、場合により、１回またはそれを超えた回数繰り返して、３’，５’−保護多量体を形成することができる。この３’，５’−保護多量体からＲ１６を除去して、３’−脱保護多量体を形成し、そしてこの３’−脱保護多量体を、上記のようにリン酸化して、構造式Ｉによって表される三価のリン多量体を形成する。
【００９４】
構造式ＸＩＩによって表される三価のリン多量体で誘導される固体支持体は、上記の方法によって形成される３’−脱保護多量体を、構造式ＸＶａまたはＸＶｂによって表される化合物と反応させて、固体支持体充填用試薬を形成することによって製造することができる。３’−脱保護多量体を、構造式ＸＶａによって表される化合物と反応させる場合、この反応は、ピリジンのような塩基の存在下で行われる。３’−脱保護多量体を、構造式ＸＶｂによって表される化合物と反応させる場合、構造式ＸＶｂによって表される化合物に関して、少なくとも約１当量の二脂肪族カルボジイミドも、この反応混合物中に存在すべきである。この固体支持体充填用試薬は、場合により、末端カルボン酸を活性エステルに変換する化合物とそれを反応させることによって活性化させることができる。末端カルボン酸と反応して活性エステルを形成するであろう化合物の例には、ｐ−ニトロフェノール、ｏ，ｐ−ジニトロフェノール、イミダゾールおよびＮ−ヒドロキシスクシンアミドが含まれる。活性エステルを形成するｐ−ニトロフェノールまたはｏ，ｐ−ジニトロフェノールとの反応では、脂肪族カルボジイミドも、反応混合物中に存在すべきである。
【００９５】
固体支持体充填用試薬または活性（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）固体支持体充填用試薬は、アミンで官能化された固体支持体を誘導するのに利用することができる。固体支持体上のアミン官能基は、第一級または第二級アミンでありうる。このアミンで官能化された支持体を、塩基性溶液中において活性固体支持体充填用試薬と接触させて、誘導固体支持体を形成する。反応条件の例については、その内容が本明細書中にそのまま援用される米国特許第５，６６８，２６８号を参照されたい。或いは、アミンで官能化された固体支持体を、二脂肪族カルボジイミドの存在下の塩基性溶液中で、未反応の充填用試薬と接触させて、固体支持体を誘導する。反応条件の例については、その内容が本明細書中にそのまま援用される米国特許第５，６６８，２６８号および米国特許第４，８１２，５１２号を参照されたい。好ましい二脂肪族カルボジイミドは、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびジイソプロピルカルボジイミドである。
【００９６】
実施例
ホスホロアミダイト二量体を、実施例１および２に示される手順を用いて製造した。ホスホロアミダイト三量体を製造する手順を、実施例３に示す。ホスホジエステル結合および／またはホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチドを、実施例４に詳述される方法を用いて製造した。実施例１〜４において、特に断らない限り、部および百分率は全て重量による。
【００９７】
実施例１（図１を参照されたい）：
Ａ．　２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−３’−Ｏ−レヴリノイルシチジンの合成：
標題化合物を、商業的に入手可能な２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−シチジンから製造した。２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−シチジンを、乾燥ピリジン中のレヴリン酸無水物（１．５当量）で室温において５時間処理して、２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−３’−Ｏ−レヴリノイル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−シチジンを生じた。２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−３’−Ｏ−レヴリノイル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−シチジンを、水中８０％（容量／容量）酢酸に室温で１．５時間委ねることによって、５’−Ｏ−ＤＭＴ保護基を除去して、２’−デオキシ−Ｎ４−ベンゾイル−３’−Ｏ−レヴリノイルシチジンを生じた。このようにして得られた生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製した。
【００９８】
Ｂ．　２’−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ２−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−Ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）−５’−Ｏ−Ｎ４−ベンゾイル−２’デオキシシチジン−３’−Ｏ−レヴリネート（ｌｅｖｕｌｉｎａｔｅ）の合成：
工程Ａで合成されたＮ４−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン−３’−Ｏ−レヴリネート（８．５８ｇ，２０ｍｍｏｌ）およびテトラゾール（０．５６ｇ，８０ｍｍｏｌ）を、減圧下における乾燥トルエンとの共蒸発によって乾燥させた後、乾燥アセトニトリル（１００ｍＬ）中に溶解させた。商業的に入手可能なＮ２−イソブチリル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’デオキシグアノシン−３’−Ｏ−ホスホロアミダイト（１６．０ｇ，１９ｍｍｏｌ）を、この溶液に加え、溶液をアルゴン下において室温で４時間撹拌させた。その溶液を濃縮して粘稠塊とした後、アルゴンガスを飽和した酢酸エチル中に入れた。この溶液を、冷重炭酸ナトリウム溶液で、次に冷水で洗浄した。無水硫酸ナトリウム上で乾燥後、その溶液を減圧下で濃縮して、淡黄色泡状物にした。この生成物をカラムクロマトグラフィーによって精製して、十分に保護された二量体ヌクレオシド亜リン酸トリエステル（１９．５ｇ）を生じ、これをＮＭＲによって特性決定した。
【００９９】
Ｃ．　２’−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ２−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−Ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）−５’−Ｏ−Ｎ４−ベンゾイル−２’デオキシシチジン−３’−ＯＨの合成：
工程Ｂで合成された十分に保護されたジヌクレオシド亜リン酸トリエステル（１７．５ｇ，１５ｍｍｏｌ）を、ピリジン／酢酸（４：１容量／容量）中のヒドラジン溶液（０．５Ｍ，１００ｍｌ）で室温において３０分間処理した。ピリジン（１００ｍｌ）をその溶液に加え、混合物を減圧下で濃縮した。生成物をジクロロメタン（５００ｍｌ）中に入れた後、重炭酸ナトリウム溶液（２ｘ３００ｍｌ）で、次に水（３００ｍｌ）で注意深く洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶液を濾過し、減圧下で濃縮して、固体泡状物にした。次に、この固体泡状物を、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、所望の生成物（１３．４ｇ，８３．４％）を生じた。
【０１００】
Ｄ．　２’−デオキシ−５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ２−イソブチリルグアノシン−３’−Ｏ−Ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）−５’−Ｏ−Ｎ４−ベンゾイル−２’デオキシシチジン−３’−Ｏ−β−シアノエチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−ホスホロアミダイトの合成：
工程Ｃで合成された５’−Ｏ−ＤＭＴ−Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシグアノシン−３’−Ｏ−Ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）−５’−Ｏ−Ｎ４−ベンゾイル−２’デオキシシチジン−３−ＯＨ（１２．５ｇ，１１．７ｍｍｏｌ）を、減圧下においてアセトニトリルと共蒸発することによって乾燥させた。この乾燥物質を蒸留ジクロロメタン中に溶解させた。ビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−β−シアノエトキシホスフィン（４．５ｇ，１５ｍｍｏｌ）を、シリンジを用いてその溶液に加え、Ｓ−エチルチオテトラゾール（１．６ｇ，１２．５ｍｍｏｌ）を固体として加えた。室温で１６時間撹拌後、ｎ−オクタノール（５００ｌ）を加え、その溶液を更に２時間撹拌した。反応混合物を濃縮して粘稠な液体にし、これを酢酸エチル（５００ｍｌ）中に溶解させた後、重炭酸ナトリウム溶液で、次に塩化ナトリウム溶液で洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、濃縮して固体にした。粗生成物の精製は、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって行ったが、これは、所望の二量体ホスホロアミダイト（１２．８ｇ，８６．２％）を与えた。
【０１０１】
実施例２：
Ａ．　２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−レヴリノイルウリジンの合成：
２’−Ｄｅｏｘｙ−２’−Ｏ−メチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチルウリジン（１１．２ｇ，２０ｍｍｏｌ）を、ピリジン（３ｘ１００ｍｌ）との共蒸発によって乾燥させた後、乾燥ピリジン（１５０ｍｌ）中に溶解させた。レヴリン酸無水物（６．５ｇ，３０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．１ｇ，触媒量）を加え、その溶液を室温で５時間撹拌させた。ｔｌｃによって評価したところ、溶液中に出発物質が残っていない場合、その溶液を濃縮減少させて粘稠塊とした後、酢酸エチル中に入れた。この酢酸エチル溶液を、重炭酸ナトリウム溶液で、次に塩化ナトリウム溶液で洗浄した。酢酸エチル層を硫酸ナトリウム上で乾燥後、濃縮して泡状物にして、２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−レヴリノイル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチルウリジンを生じ、これをプロトンＮＭＲによって特性決定した。この物質を、精製することなく次の工程で用いた。
【０１０２】
次に、２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−レヴリノイル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチルウリジン（１４．０ｇ）を、水（５００ｍｌ）中８０％（容量／容量）酢酸溶液で室温において１．５時間処理した。ピリジン（４００ｍＬ）をこの溶液に加え、その混合物を減圧下で濃縮して粘稠な液体にした。この粘稠塊をエーテルで研和して、ゴム状固体を与え、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、増加する百分率のメタノールを含む酢酸エチルを用いて精製した。所望の画分をプールし、濃縮して固体にした。２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−レヴリノイルウリジンは、塩化メチレンおよびエーテル混合物から晶出した。この生成物をプロトンＮＭＲによって特性決定した。
【０１０３】
Ｂ．　２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）−５’−Ｏ−ウリジン−２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−レヴリネートの合成（カップリング反応）：
工程Ａで合成された２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−レヴリノイルウリジン（５．０ｇ，１４．０ｍｍｏｌ）およびテトラゾールを、乾燥アセトニトリル中に溶解させ、減圧下で共蒸発させた。この乾燥物質を、高真空ポンプで１時間ポンプ吸引後、アセトニトリル（７０ｍｌ）中に溶解させた。２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−ウリジン−３’−ホスホロアミダイト（９．５ｇ，１２．５ｍｍｏｌ）をその溶液に加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌させた。有機溶媒を減圧下で除去し、残留物を、アルゴンを飽和した酢酸エチル中に入れた。その溶液を、重炭酸ナトリウム溶液で、次に塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥後、減圧下後に濃縮した。粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーによって、酢酸エチルおよび増加する百分率のメタノールを用いて精製した。所望のプールされた画分を一緒にし、濃縮して、９．５ｇの十分に保護された二量体を生じた。最後に、この生成物を、プロトンおよびリンＮＭＲによって特性決定した。
【０１０４】
Ｃ．　２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）−５’−Ｏ−ウリジン−２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチルの合成（３’−Ｏ−レヴリノイル基の除去）：
工程Ｂで合成された十分に保護されたジヌクレオチド亜リン酸トリエステル（８．０ｇ，８．７５ｍｍｏｌ）を、ピリジン：酢酸（４：１）中のヒドラジン水和物溶液（０．５Ｍ，５０ｍｌ）で室温において３０分間処理した。ピリジン（５０ｍｌ）をその溶液に加えた後、混合物を濃縮して粘稠な液体にした。次に、この物質をクロロホルム中に入れた後、重炭酸ナトリウム溶液および水で洗浄した。クロロホルム抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、蒸発乾固させた。このようにして得られた粗製物質を、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して、３’−脱保護二量体（６．５ｇ，８．０ｍｍｏｌ）を生じた。これを、プロトンおよびリンＮＭＲによって特性決定した。
【０１０５】
Ｄ．　２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−ウリジン−３’−Ｏ−Ｐ−（ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ）−５’−Ｏ−ウリジン−２’−デオキシ−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−β−シアノエチル−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−ホスホロアミダイトの合成（二量体ヌクレオシドホスホロアミダイトシントン）：
工程Ｃで合成された３’−脱保護ジヌクレオシド亜リン酸トリエステル（６．１ｇ，７．４６ｍｍｏｌ）を、減圧下において乾燥アセトニトリルと共蒸発することによって乾燥させた。この乾燥物質を、新たに蒸留された乾燥塩化メチレン（５０ｍｌ）中に溶解させた。リン酸化試薬ビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−β−シアノエトキシホスフィン（３．４ｍｌ，１１．２ｍｍｏｌ）を、その溶液に加え、次にＳ−エチルチオテトラゾール（０．７５ｇ，６．０ｍｍｏｌ）を加え、その反応混合物を室温で１６時間撹拌した。ｎ−オクタノール（０．１３ｍｌ）を反応混合物に加えて、過剰のリン酸化試薬と反応させ、その反応を更に２時間撹拌した。最後に、反応混合物を、クロロホルム中の５％ジイソプロピルエチルアミン（容量／容量）（３５０ｍｌ）で希釈し、重炭酸ナトリウム溶液（２ｘ１５０ｍｌ）および塩化ナトリウム溶液（１５０ｍｌ）で速やかに洗浄した。クロロホルム層を硫酸ナトリウム上で乾燥させた後、濃縮して固体にした。二量体ホスホロアミダイト生成物（図３を参照されたい）を、シリカゲルクロマトグラフィーによって、酢酸エチル中０．１％（容量／容量）ジイソプロピルエチルアミンを用いて精製した。６．５ｇの所望のプールされた画分を、Ｐ−ＮＭＲによる９８％純度で得た。
【０１０６】
実施例３：三量体ホスホロアミダイトの合成：
三量体ホスホロアミダイトは、ホスホロアミダイト二量体ヌクレオシド（例えば、実施例１Ｄまたは２Ｄで形成される化合物）と、５’−ヒドロキシ−２’−デオキシ−３’−Ｏ−レヴリノイルヌクレオシドまたは５’−ヒドロキシ−２’−Ｏ−保護−３’−Ｏ−レヴリノイルヌクレオシドとを、４．０当量のテトラゾールの存在下のアセトニトリル中において、実施例１Ｂまたは２Ｂに与えられたのと同様の反応条件を用いて反応させることによって製造することができる。三量体ヌクレオシドの３’末端からのレヴリノイルは、実施例１Ｃまたは２Ｃに与えられたのと同様の反応条件を用いて、ピリジンおよび酢酸中のヒドラジン溶液を用いることによって除去することができる。精製後、２個の亜リン酸トリエステル結合を含む３’−脱保護三量体ヌクレオシドは、実施例１Ｄまたは２Ｄに与えられたのと同様の反応条件を用いて、ビス−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）−β−シアノエトキシホスフィンおよびＳ−エチルチオテトラゾールで亜リン酸化して、２個の亜リン酸トリエステル結合を含む三量体ヌクレオシドのホスホロアミダイトを生じることができる。
【０１０７】
実施例４：リン酸ジエステル結合およびホスホロチオエートジエステル結合両方を有するオリゴヌクレオチドの合成（図５を参照されたい）：
オリゴヌクレオチドの合成は、ＤＮＡ合成機８９０９ Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。標準的なホスホロアミダイト化学プロトコールを、僅かな修飾を含む合成について行った。亜リン酸トリエステル結合を有するホスホロアミダイト二量体ヌクレオシドの濃度は、アセトニトリル中０．１Ｍであった。合成に用いられる二量体を図４に示す。二量体ホスホロアミダイトを用いた鎖伸長に用いられるカップリング時間は、モノマーホスホロアミダイトと比較して５０％長かった。カップリング後、亜リン酸トリエステル結合を、ヨウ素溶液で安定なリン酸トリエステルにかまたは Ｂｅａｕｃａｇｅ 試薬で安定なホスホロチオエートに変換した。各々の合成で１０回の反応サイクルを行って、２１個のヌクレオチド塩基を含むオリゴヌクレオチドを形成した。配列ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴ（配列番号１）を有するリン酸エステル２１マー、および配列ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＴ（配列番号１）およびＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＴ（配列番号２）を有する二つのホスホロチオエート２１マーを製造した。合成の最後に、鎖を解放し且つβ−シアノエチル保護基およびヌクレオシド塩基保護を除去するために、十分に保護されたオリゴヌクレオチド鎖と連結した固体支持体を、濃水酸化アンモニウムで５０℃において１６時間処理した。粗製オリゴヌクレオチドを、イオン交換ＨＰＬＣによって分析した。クロマトグラム中の主要ピークは、所望の生成物であった。ホスホロチオエート化ジエステル結合を含むオリゴヌクレオチドの場合、その粗製生成物を、リンＮＭＲによっても分析した。これらスペクトルは、ホスホロチオエートジエステルに特徴的な化学シフトを生じ、リン酸ジエステル結合についての化学シフトを認めることはできなかった。
【０１０８】
均等物（ＥＱＵＩＶＡＬＥＮＴＳ）
本発明を、その好ましい態様に関して、具体的に示し且つ記載してきたが、そこにおいて、請求の範囲によって包含される発明の範囲内から逸脱することなく、形態および詳細のいろいろな変更が行われてよい。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、三価のリン多量体の合成についての合成スキームである。
【図２】
図２は、三価のリン多量体の合成についての別の合成スキームである。
【図３】
図３は、実施例２で製造される２’−Ｏ−メチル二量体を表わす。
【図４】
図４は、実施例４で合成されるホスホジエステルおよび２種類のホスホロチオエートを製造するのに用いられる２種類の二量体を表わす。
【図５】
図５は、三価のリン二量体を用いて実施例４で合成されるオリゴヌクレオチドの合成についての合成スキームである。固体支持体に結合した状態で示されるチミジン部分は、所望の配列を製造するために適宜、別のヌクレオシド部分で置き換えられてよいということは理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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