(57)【要約】本発明は、目的とするポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも一種類の核酸と、目的とする少なくとも一種類のリン脂質とを含んでなり、同時、連続的または経時的に使用するための組合せ生成物であって、目的とする前記ポリペプチドおよびリン脂質が細胞毒性活性を有することを特徴とする、組合せ生成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ） 目的とするポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも一種類の核酸と、
（ｉｉ） 目的とする少なくとも一種類のリン脂質と
を含んでなり、同時、連続的または経時的に使用するための組合せ生成物であって、
目的とする前記ポリペプチドおよびリン脂質が細胞毒性活性を有することを特徴とする、組合せ生成物。
【請求項２】
目的とする前記リン脂質が、下記式を有する、請求項１に記載の組合せ生成物：
【化１】
2004506617.tif 000009
［式中、
Ｒ１は
（ａ） ６〜３０個の炭素原子を含んでなる直鎖状または分岐状の炭素主鎖、または
（ｂ）　下式のモティーフであり：
【化２】
2004506617.tif 000010
（式中、
Ｒ５は、−Ａ−Ｒ基であって、ここでＡは−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、または−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−から選択され、Ｒは６〜３０個の炭素原子を含んでなる直鎖状または分岐状の炭素主鎖であり、
Ｒ６は、水素原子であるか、またはＲ５と同じ意味を有し、Ｒ５とＲ６は同一でもまたは異なることもできる）、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素原子であるか、または１〜５個の炭素原子を含むアルキル残基であり、または
【化３】
2004506617.tif 000011
は環状アミンであり、
ｍは１〜６の正の整数であり、
ｎは０〜１の正の整数である］。
【請求項３】
Ｒ１が１２〜２２個の炭素原子を含んでなる直鎖状または分岐状の炭素主鎖である、請求項２に記載の組合せ生成物。
【請求項４】
Ｒ１が１６個の炭素原子を含んでなる直鎖状または分岐状の炭素主鎖である、請求項３に記載の組合せ生成物。
【請求項５】
Ｒ１がアルキル、アルケニル、アルキニル、またはアラールキル残基である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の組合せ生成物。
【請求項６】
ｎ＝１、ｍ＝２であり、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がメチル残基である、請求項２〜５のいずれか一項に記載の組合せ生成物。
【請求項７】
Ｒ１が１６個の炭素原子を含んでなるアルキル残基である、請求項２〜６のいずれか一項に記載の組合せ生成物。
【請求項８】
目的とする前記ポリペプチドが、サイトカイン、自殺遺伝子によってコードされるタンパク質、抗血管新生促進因子、化学誘因物質活性を有するポリペプチド、および、細胞アポトーシスを活性化する活性を有するポリペプチドから選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組合せ生成物。
【請求項９】
目的とする前記ポリペプチドが、α、βおよびγ−インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、およびコロニー刺激因子から選択されるサイトカインである、請求項８に記載の組合せ生成物。
【請求項１０】
前記サイトカインが、インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはγ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）である、請求項９に記載の組合せ生成物。
【請求項１１】
（ｉｉｉ） 核酸と会合している物質、および／または
（ｉｖ） 目的とするリン脂質と会合している物質
をさらに含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組合せ生成物。
【請求項１２】
前記物質（ｉｉｉ）が、カチオン性脂質またはカチオン性ポリマーである、請求項１１に記載の組合せ生成物。
【請求項１３】
前記物質（ｉｖ）が、リポソームに組込むことができる脂質である、請求項１１に記載の組合せ生成物。
【請求項１４】
中性、双性イオン性または負に帯電した脂質から選択されるアジュバント（ｖ）をさらに含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の組合せ生成物。
【請求項１５】
前記アジュバント（ｖ）が、コレステロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、およびそれらの誘導体から選択される、請求項１４に記載の組合せ生成物。
【請求項１６】
核酸（ｉ）、物質（ｉｉｉ）、リン脂質（ｉｉ）、および、必要に応じてアジュバント（ｖ）が複合体を形成する、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の組合せ生成物。
【請求項１７】
複合体を形成する要素の正電荷の数と負電荷の数との比が０．０５〜２０である、請求項１６に記載の組合せ生成物。
【請求項１８】
複合体の直径が２０〜８００ｎｍである、請求項１６または１７に記載の組合せ生成物。
【請求項１９】
核酸（ｉ）が、プラスミドまたはウイルス起源の組換えベクターである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組合せ生成物。
【請求項２０】
薬学的観点から許容可能なビヒクル中で処方される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組合せ生成物。
【請求項２１】
目的とするポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも一種類の核酸（ｉ）、目的とする少なくとも一種類のリン脂質（ｉｉ）、核酸と会合している物質（ｉｉｉ）、および必要に応じてアジュバント（ｖ）を含んでなる複合体であって、
目的とする前記リン脂質（ｉｉ）が請求項１〜７のいずれか一項に記載のものであることを特徴とする、複合体。
【請求項２２】
ヒトまたは動物体の治療を目的とする医薬生成物を調製するための、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組合せ生成物、または請求項２１に記載の複合体の使用。
【請求項２３】
治療が抗腫瘍および／または抗転移治療である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
目的とする前記リン脂質（ｉｉ）を核酸（ｉ）と同時に投与する、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
前記組合せ生成物または前記複合体を腫瘍内または腫瘍周囲に投与する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
核酸配列（ｉ）およびリン脂質（ｉｉ）を同時に細胞中に導入するための、請求項２１に記載の複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、（ｉ）ポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも一種類の核酸と、（ｉｉ）少なくとも一種類のリン脂質とを含んでなる組合せ生成物であって、前記ポリペプチドとリン脂質が細胞毒性活性、特に抗腫瘍活性を有するものに関する。本発明は、増殖性疾患の治療に関連して、例えば癌の治療に関連して特に有用である。
【０００２】
背景技術
今日までのところ、癌治療に関連して得られた最も有望な結果は、化学的化合物に基づく治療（化学療法）と放射線の使用に基づく治療（放射線治療）を組合せる組合せ治療に関するものである。この種の治療が患者に引き起こすかなりの不都合の他に、多くの場合に、腫瘍細胞は転移型のものもあればそうでないものもあるが、治療を受けた個体に残り続けて再発することがあるので、完全には緩解しないことが注目されている
【０００３】
更に最近になり、癌の分野で行われた研究では、抗腫瘍治療に遺伝子治療のプロトコールを適合させることが提案されている。これに関して、例えば、Ｍｅｎｅｇｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ． （１９９１， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １８１， ６１−６９） による、１６型ヒトパピローマウイルスのＥ６およびＥ７遺伝子を発現する組換えワクシニアベクターを用いる腫瘍細胞に対する免疫化に関する研究（米国特許第５，７４４，１３３号明細書および第６，００７，８０６号明細書も参照されたい）、または、Ｌｅｒｏｙ ｅｔ ａｌ． （１９９８， Ｒｅｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９，６８１−６８４）による、組換えウイルスベクターの腫瘍内投与後の腫瘍部位におけるサイトカイン産生によって腫瘍成長の抑制と組み合わせた免疫応答を誘発することができることを示した研究を挙げることができる。ＩＬ２を発現できる遺伝子修飾した細胞（Ｒｏｓｃｈｌｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ６，２７１−２８１）または腫瘍抗原およびインターロイキンを発現するウイルスベクター（Ｂｉｚｏｕａｒｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６， 「乳癌、生物学および治療学の進歩（Ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」， Ｆ． Ｃａｌｖｏ， Ｍ． ＣｒｅｐｉｎおよびＨ． Ｍａｇｄａｌｅｎａｔ監修， ３０３−３０８： 総説についてＺｈａｎｇ， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ６，１１３−１３８を参照されたい）を用いて得た結果を挙げることもできる。
【０００４】
１９９７年に、Ｓｏｎ（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， ４，３９１−３９６）は、別の抗腫瘍治療法であって、白金を基剤とする第一の治療（シスジアミンジクロロ白金 ＩＩ）と、γ−インターフェロンをコードする遺伝子を伝達するカチオン性リポプレックス（すなわち、核酸とカチオン性脂質とからなる複合体）を投与することからなる遺伝子治療による第二の治療とを組合せた方法を提案した。
【０００５】
しかしながら、これら様々な治療法に関連して見られる抗腫瘍応答は、有望ではあるが、腫瘍細胞を明確に消失させ且つ同時に望ましくない副作用（例えば、白金の場合における、腎臓、聴覚、血液学的、または神経学的毒性）を回避する満足な抗腫瘍治療とはならない。従って、効果的であり且つ調整が容易な、すなわち腫瘍体積を持続的に制御し且つ治療を受けた患者の生存率を増加することができ、所望な細胞毒性活性意外には副作用をほとんどまたは全く持たない抗腫瘍治療を行うことができる新規生成物および／または新規方法を有することが望ましい。
【０００６】
アルキルリゾリン脂質はある種の抗腫瘍薬であり（米国特許第４，９３５，５２０号明細書）、腫瘍細胞系のアポトーシスに対するその効果、更に詳細には放射線照射（γ線）による治療と組合せた効果はイン・ビトロで示されている（Ｒｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５９， ２４５７−２４６３）。
【０００７】
【発明の概要】
本発明者らは、今般、新規な組合せ生成物であって、それらの様々な成分がそれらのそれぞれの細胞毒性活性および／または前記成分の改良された特性の相乗効果が得られるように選択されるものを同定した。更に詳細には、このような組合せ生成物は、細胞、特に腫瘍細胞腫瘍細胞の特異的死、一層良好な抗原提供、および／または宿主生物の免疫細胞の刺激を誘発することによって細胞増殖を抑制しおよび／または遅延させることができる。本発明は、従来技術の手法、特にヒトまたは動物の癌の治療のための有利で効果的な代替法を提供する。
【０００８】
最初に、本発明の主題は、
（ｉ） 目的とするポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも一種類の核酸と、
（ｉｉ） 目的とする少なくとも一種類のリン脂質と
を含んでなる組合せ生成物であって、目的とする前記ポリペプチドおよびリン脂質が細胞毒性活性を有することを特徴とする、組合せ生成物である。
【０００９】
このような組合せ生成物は、更に具体的には、哺乳類において細胞毒性治療、例えば抗腫瘍治療の実施に関連して、または例えば、アテローム発生または血管形成術後の再狭窄の場合における細胞死または細胞増殖の現象の制御を要する任意の用途において、同時、連続的または経時的に投与する使用を意図している。
【００１０】
【発明の具体的説明】
「核酸」という用語は、二本鎖または一本鎖の直鎖状または環状の、天然に単離されたまたは合成のＤＮＡ、および／またはＲＮＡ断片であって、修飾されていることもまたは修飾されていないこともあるヌクレオチドの正確な鎖を表すものであり、あらゆる大きさの制限なしに核酸の断片または領域を定義することができる。好ましい態様によれば、この核酸は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡメッセンジャーＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボチーム、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、またはこれらのＲＮＡをコードするＤＮＡ、細胞中への導入を促進する化合物を全く持たないポリヌクレオチド、少なくとも一種類のポリペプチド、特にウイルス起源、更に具体的にはアデノウイルスまたはレトロウイルス起源のポリペプチド、または合成ポリペプチドと会合した核酸、およびリガンドと会合した核酸からなる群から選択される。
【００１１】
好ましくは、本発明によれば、「核酸」という用語はプラスミドまたはウイルス起源の組換えベクターを表す。本発明に関連して用いることができるプラスミドは、広汎なものから選択される。それらは、クローニングおよび／または 発現ベクターであることができる。一般に、それらは当業者に知られており、それらの多数のものが市販されているが、遺伝子操作技術を用いてそれらを構築しまたはそれらを修飾することもできる。例えば、ｐＢＲ３２２ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＵＣ （Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）、またはｐＰｏｌｙ （Ｌａｔｈｅ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｇｅｎｅ ５７，１９３−２０１）由来のプラスミドを挙げることができる。好ましくは、本発明に関連して用いられるプラスミドは、プロデューサー細胞および／または宿主細胞における複製開始を確保する複製起源を含む（例えば、ｔｈｅ Ｅ． ｃｏｌｉで産生しようとするプラスミドについてはＣｏｌＥ１起源のものが選択され、哺乳類宿主細胞でのプラスミドの自己複製が所望なときには、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１系が選択される（ＬｕｐｔｏｎおよびＬｅｖｉｎｅ， １９８５， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５， ２５３３−２５４２； Ｙａｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１３， ８１２−８１５））。これは、トランスフェクションされた細胞を選択または同定することができる選択遺伝子を含むこともできる（例えば、栄養要求性突然変異の相補性、抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子）。勿論、これは、所定の細胞におけるその持続性および／またはその安定性を向上させる追加要素（プラスミドのモノマー形態での持続性を促進するｃｅｒ配列（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｈｅｒｒａｔ， １９８４， Ｃｅｌｌ ３６， １０９７−１１０３））、細胞性ゲノムへ組込むための配列を含んでなることができる。
【００１２】
ウイルスベクターに関しては、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、特にＭＶＡ、カナリポックス）由来、アデノウイルス由来、レトロウイルス由来、ヘルペスウイルス由来、アルファウイルス由来、フォーミーウイルス由来、またはアデノ随伴ウイルス由来のベクターを考えることができる。非複製および非組込みベクターを用いるのが好ましい。これに関しては、アデノウイルスベクターが本発明の実施に特に適している。しかしながら、ここで、本発明の実施に関しては、ベクターの性状は比較的重要ではないことに留意すべきである。
【００１３】
レトロウイルスは主として分割細胞に感染し、組込む特性を有し、癌への応用に特に適している。本発明による組換えレトロウイルスは、一般に以下に記載されるようなＬＴＲ配列、キャプシド化領域、およびレトロウイルスＬＴＲまたは内部プロモーターの制御下に置かれた本発明によるヌクレオチド配列を含んでなる。これは、任意の起源（ネズミ、霊長類、ネコ、ヒトなど）のレトロウイルス、特にＭｏＭｕＬＶ（Ｍｏｌｏｎｅｙネズミ白血病ウイルス）、ＭＳＶ（ネズミ肉腫ウイルス）、またはＦｒｉｅｎｄネズミレトロウイルス（Ｆｂ２９）由来のものでよい。これは、ウイルス粒子を構築するのに要するｇａｇ、ｐｏｌ、および／またはｅｎｖウイルスポリペプチドを途中で提供することができるキャプシド化系で増殖される。このような系は、文献に記載されている（ＰＡ３１７、Ｐｓｉ ＣＲＩＰ ＧＰ ＋ Ａｍ−１２、など）。本発明によるレトロウイルスベクターは、特にＬＴＲ（真核生物プロモーターによるプロモーター領域の置換）またはキャプシド化領域（例えば、ＶＬ３０型の非相同性キャプシド化領域による置換）における修飾を含んでなることができる（フランス国特許出願第９４／０８３００号明細書および第９７／０５２０３号明細書）。
【００１４】
複製欠損である、すなわちＥ１、Ｅ２、Ｅ４および／またはＬ１〜Ｌ５領域から選択される複製に本質的な少なくとも一種類の領域の全部または一部を欠いているアデノウイルスベクターを用いることもできる。Ｅ１領域の欠失が好ましい。しかしながら、これは、欠陥に本質的な機能が相補性系および／または補助ウイルスによって途中で補足され、目的とするウイルス粒子を確実に産生する範囲では、特にＥ２、Ｅ４および／またはＬ１〜Ｌ５領域の全部または一部に影響を与える他の（複数の）修飾／（複数の）欠失と組合せてもよい。これに関して、従来技術のベクター、例えば、国際出願ＷＯ９４／２８１５２号明細書およびＷＯ９７／０４１１９号明細書に記載されているものを用いることができる。例えば、Ｅ１領域およびＥ４転写単位の大部分の欠失が、極めて有利である。クローニング用量を増加するには、アデノウイルスベクターは、非本質的Ｅ３領域の全部または一部を欠くこともできる。もう一つの代替法によれば、キャプシド化に本質的な配列、すなわち５′および３′ＩＴＲ（逆方向末端反復配列）およびキャプシド化領域のみを保持する最小アデノウイルスベクターを用いることができる。更に、本発明によるアデノウイルスベクターの起源は、種および血清型の療法の観点から変化することができる。これは、ヒトまたは動物（例えば、イヌ、トリ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、サル）起源、または少なくとも二種類の起源のアデノウイルスゲノムの断片を含んでなる雑種のゲノムに由来することができる。更に具体的には、イヌ起源のＣＡＶ−１またはＣＡＶ−２アデノウイルス、トリ起源のＤＡＶアデノウイルス、またはウシ起源の３型Ｂａｄアデノウイルスを挙げることができる（Ｚａｋｈａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．， Ａｒｃｈ． Ｖｉｒｏｌ．， １９９３，１７１−１７６； ＳｐｉｂｅｙおよびＣａｖａｎａｇｈ，　Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， １９８９，７０： １６５−１７２ ； Ｊｏｕｖｅｎｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １９８７，６０： ２１−２８； Ｍｉｔｔａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．， １９９５， ７６： ９３−１０２）。しかしながら、ヒト起源であって、好ましくは血清型Ｃアデノウイルス、特に２または５型アデノウイルスに由来するアデノウイルスベクターが好ましい。本発明によるアデノウイルスベクターは、連結または相同組換えにより（例えば、国際出願ＷＯ９６／１７０７０号明細書を参照されたい）または相補系における組換えによって大腸菌 （Ｅ． Ｃｏｌｉ） でイン・ビトロで生成させることができる。様々なアデノウイルスベクターおよびそれらの調製技術も知られている（例えば、ＧｒａｈａｍおよびＰｒｅｖｅｃｔ， １９９１， 分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）， 第７巻， ｐ． １０９−１２８ ； Ｅ． Ｊ． Ｍｕｒｅｙ監修， Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．を参照されたい）。
【００１５】
「目的とするポリペプチドをコードする配列を含む核酸」という表現は、前記核酸が目的とするポリペプチドをコードする遺伝子とこの遺伝子を発現するための要素とを含んでなることを示唆しようとするものである。「ポリペプチド」という用語は、その大きさまたはそのグリコシル化度に関して何の制限もないことを意味するものと見なされる。
【００１６】
核酸が目的とするポリペプチドを含んでなる配列を含んでなるときには、前記核酸は、前記配列をターゲット細胞に導入した後に確実に発現させるのに要する要素の他に、特に前記細胞で有効なプロモーター配列および／または調節配列、および必要に応じて前記ポリペプチドのターゲット細胞の表面における分泌または発現に必要な配列を含んでなる。発現に要する要素は、ヌクレオチド配列をＲＮＡへ転写させおよびｍＲＮＡをポリペプチドへ転写させる総ての要素、特に前記細胞中で有効なプロモーター配列および／または調節配列、および必要に応じて前記ポリペプチドのターゲット細胞での分泌または発現に要する配列からなっている。これらの要素は、調節可能または構成的であることができる。勿論、プロモーターは選択されたベクターおよび宿主細胞に適している。例えば、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）、ＭＴ（メタロチオネイン； Ｍｃ Ｉｖｏｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ７， ８３８−８４８）、α−１アンチトリプシンおよびＣＦＴＲ遺伝子のプロモーター、筋クレアチンキナーゼ、アクチン、肺界面活性剤、免疫グロブリン、β−アクチン（Ｔａｂｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２， ４２６４３６）およびＳＲα（Ｔａｋｅｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ８， ４６６−４７２）をコードする遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０ウイルス（サルウイルス）初期プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｏｕｓｅ肉腫ウイルス）ＬＴＲ、ＭＰＳＶプロモーター、ＨＳＶ−１ＴＫプロモーター、ＣＭＶウイルス（サイトメガロウイルス）初期プロモーター、ワクシニアウイルスプロモーターｐ７．５Ｋ、ｐＨ５Ｒ、ｐＫ１Ｌ、ｐ２８およびｐ１ｌ、およびＥ１ＡおよびＭＬＰアデノウイルスプロモーター、または前記プロモーターの組合せを挙げることができる。これは、腫瘍細胞において遺伝子の発現を刺激するプロモーターであってもよい。特に、乳癌および前立腺癌で過剰発現したＭＵＣ−１遺伝子 （Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９６， ２７７５−２７８２）、結腸癌で過剰発現したＣＥＡ（癌胎児性抗原）（Ｓｃｈｒｅｗｅ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １０， ２７３８−２７４８）、黒色腫で過剰発現したチロシナーゼ遺伝子（Ｖｉｌｅ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３， ３８６０−３８６４）、乳癌および膵臓癌で過剰発現したＥＲＢ−２遺伝子 （Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， １， １７０−１７５） 、および肝臓癌で過剰発現したα−フェトプロテイン遺伝子 （Ｋａｎａｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５７， ４６１−４６５）のプロモーターを挙げることができる。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターが、極めて好ましい。組織特異的、特に治療を行う腫瘍が特定の細胞型に由来するとき、または画定条件下で活性化することができるプロモーター領域を用いることもできる。文献は、このようなプロモーター配列に関する多量の情報を提供する。更に、前記核酸は、同一でもまたは異なっていてもよく、転写プロモーター活性を有する少なくとも２つの配列、および／または同一でもまたは異なっていてもよく、互いに隣接しまたは遠く離れており、同一方向または逆方向に配置されている目的とするポリペプチドをコードする少なくとも２つの配列であって、これらの配列の転写プロモーターまたは転写の機能が影響されないものを含むことができる。核酸がポリペプチドをコードする少なくとも２つの配列を含むときには、それらの少なくとも一方は本発明によって定義される（すなわち、少なくとも細胞毒性活性を有する）目的とするポリペプチドをコードし、他方の配列に関しては、このようなポリペプチド、または当業者が本発明の技術に関連して発現が有用であると判定する任意の他のポリペプチド（例えば、抗原、特に腫瘍抗原、抗体の全部または一部、特に腫瘍抗原に特異的な抗体）をコードすることもできる。同様に、この種の核酸構築物中に「中性の」核酸配列またはイントロンであって、転写を損なわず且つ転写段階前にはスプライシングされないものを導入することができる。このような配列およびそれらの使用は、文献に記載されている（ＷＯ９４／２９４７１号明細書）。前記核酸は、細胞内輸送、複製および／または組込み、分泌、または転写または翻訳に必要な配列を有することもできる。このような配列は、当業者には周知である。更に、本発明により用いることができる核酸は、それらをターゲット細胞のゲノムに組込むことができないように修飾されている核酸、または例えば、スペルミンのようなそれ自身ではトランスフェクションの効率に全く影響を持たない薬剤を用いて安定化した核酸であることができる。本発明に関連して、目的とするポリペプチドの機能および細胞毒性特性が保存される場合には、このポリペプチドをコードする核酸配列の全部または一部のみ、または誘導したまたは突然変異ポリペプチドを用いることができる。本発明の目的のために、「突然変異」という用語は、１個以上のヌクレオチドの欠失および／または置換および／または付加を意味することを意図する。同様に、本発明による目的とするポリペプチドをコードする配列と、別の型のポリペプチド（例えば、細胞毒性ポリペプチド、膜固定ポリペプチド、分泌ポリペプチド）をコードする配列との融合から生じるハイブリッドポリペプチドをコードする配列を使用することが考えられる。
【００１７】
「リン脂質」という用語は、少なくとも一種類の極性ドメインと少なくとも一種類のリン原子を含んでなる分子または分子の組合せを表そうとするものである。これらの分子は、当業者には周知である（例えば、Ｓｉｌｖｉｕｓ， １９９３， 構造と命名法（ＳｔｒｕｃｔｕｒｅおよびＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ） 。リン脂質ハンドブック（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ）， Ｇ． Ｃｅｖｃ監修， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｂａｓｌｅ， Ｈｏｎｇ Ｋｏｎｇ， ｐｐ． １−２２を参照されたい）。極性ドメインとしては、例えば、コリン、エタノールアミン、セリン、イノシトール、グリセロール、またはホスファチジルグリセロールから誘導されるドメインが挙げられる。リン脂質は、無極性ドメイン、特に脂肪酸、グリセロールまたはステロイド、およびそれらの類似物から誘導されるドメインを含んでなることもある。リン脂質は、合成または天然物であり、且つ動物または植物性のものであることができる。
【００１８】
「少なくとも細胞毒性活性を有する化合物（すなわち、リン脂質またはポリペプチド）」という表現は、考察中の化合物（すなわち、リン脂質またはポリペプチド）が特異的にターゲット細胞に対する免疫応答を誘導または活性化し、またはこのような細胞の成長および／または分割を阻害することができることを示そうとするものである。好ましい例によれば、この細胞毒性活性により、前記細胞が死滅する。本発明の好ましい態様では、前記ターゲット細胞は腫瘍細胞である（細胞毒性活性は、従って、抗腫瘍活性と呼ばれる）。しかしながら、このような細胞毒性活性は、例えば、再狭窄またはアテローム性動脈硬化症の現象における場合などのように、細胞増殖と関連した正に病理学的状況を意図した治療に関連しても所望なことがある （Ｒｏｓｓ， １９９０， Ｎａｔｕｒｅ， ３６２，８０１−８０９； Ｌａｎｄａｕ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３０， ９８１−９９３）。本発明は、このような応用にも関する。
【００１９】
所定のポリペプチドの細胞毒性活性、特に抗腫瘍活性は、短期生育力分析法（例えば、トリパンブルーまたはＭＴＴ分析法）を用いてまたはクローン生成（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ）生存分析法（コロニーの形成）（ＢｒｏｗｎおよびＷｏｕｔｅｒｓ， １９９９， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ５９， １３９１−１３９９）を用いて細胞の製造数を測定することによってイン・ビトロで、または動物モデルでの腫瘍成長（大きさ、および／または体積）を測定することによってイン・ビボで評価することができる（ＯｖｅｊｅｒａおよびＨｏｕｃｈｅｎｓ， １９８１， Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．， ８， ３８６−３９３）。
【００２０】
特に有利な態様によれば、本発明の組合せ生成物に含まれるリン脂質は、下記式を有する：
【化４】
2004506617.tif 000002
［式中、
Ｒ１は
（ａ） ６〜３０個の炭素原子を含んでなる直鎖状または分岐状の炭素主鎖、または
（ｂ）　下式のモティーフであり：
【化５】
2004506617.tif 000003
（式中、
Ｒ５は、−Ａ−Ｒ基であって、ここでＡは−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、または−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−から選択され、Ｒは８〜３０個の炭素原子を含んでなる直鎖状または分岐状の炭素主鎖であり、
Ｒ６は水素原子であるか、またはＲ５と同じ意味を有し、但し、Ｒ５とＲ６は同一でもまたは異なることもできる）、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素原子であるか、または１〜５個の炭素原子を含むアルキル残基であり、または
【化６】
2004506617.tif 000004
は環状アミンであり、
ｍは１〜６の正の整数であり、
ｎは０〜１の正の整数である］。
【００２１】
特定の態様によれば、Ｒ１は１２〜２２個の炭素原子を含む、好ましくは１６個の炭素原子を含む炭素主鎖である。
【００２２】
Ｒ１がによって表される６〜３０個の炭素原子を含んでなる炭素主鎖は飽和または不飽和（例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアラールキルなど）であり、且つ直鎖状または分岐状であってもよい。アルケニル基は、ＺまたはＥ異性体であることができる。Ｒ１、およびＲ５、および／またはＲ６基は、更に１個以上のアルキル（特に、Ｃ１〜Ｃ５）、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、オキソ、カルバモイル、カルボキシ、ハロゲン、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルケニル、アリール（例えば、フェノキシ、トリル、フェニルなど）、フッ素などの基で置換されていてもよい。
【００２３】
Ｒ１の例としては、Ｃ６〜Ｃ３０アルキル基（例えば、ｎ−ドデシル、ｎ−トリデシル、ｎ−テトラデシル、３，７，１１−トリメチルドデシル、ｎ−ペンタデシル、ｎ−ヘプタデシル、ｎ−オクタデシル、ｎ−エイコシル、ｎ−ドコシル、３，７−ジメチルオクチル （１−オクチル）ノニル、および３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデシル）、Ｃ６〜Ｃ３０アルケニル基（８−トリデセニル（δ８）、３，７，１１−トリメチル−２，６，１０−ドデカトリエニル、８−テトラデセニル（δ８）、８，１１−テトラデカジエニル（δ８，１１）、８−ヘプタデセニル（δ８）、２−オクタデセニル、９−オクタデセニル（オレイル）、９，１５−オクタデカジエニル、９，１２，１５−オクタデカトリエニル、８，１１，１４−ヘプタデカトリエニル（δ８，１１，１４）、８，１１−オクタデカジエニル（δ８，１１）、４，７，１０，１３−ノナデカテトラエニル（δ４，７，１０，１３）、フェチル、３，７，１１，１５−テトラメチル−２，６，１０，１４−ヘキサデカテトラエニル、３，７，１１，１５−テトラメチル−２，４，６，１０，１４−ヘキサデカペンタエニル、１２−（２，３−シクロペンテニル）ドデシル、１２−（２，３−シクロペンテニル）−５−ドデセニル、１１−ヒドロキシ−８−ヘプタデセニル、３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセン−１−イル）−２，４，６，８−ノナテトラエニルおよび４，７，１０，１３−ノナデカテトラエニル）、Ｃ６〜Ｃ３０アルキニル基（例えば、９−オクタデシニル、９，１５−オクタデカジイニル、ヘプタデカン−８−イニルおよび４−デシニル）、Ｃ６〜Ｃ３０アラールキル基（例えば、１５−（４−ｎ−ブチルフェニル）ペンタデシル、ω−（ｐ−トリル）ヘプタデシル、６−（４−ｎ−ペンチルフェニル）ヘキサデシルおよび１５−フェニルペンタデシル）、および１５− （４−ｎ−ブチルフェノキシ）ペンタデシルまたは６−（４−ｎ−ペンチルフェノキシ）ヘキサデシルが挙げられる。本発明の有利な例によれば、Ｒ１はＣ１０〜Ｃ３０アルキル基である。
【００２４】
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４基は、Ｒ１について前記したものなど１個以上の基によって置換されていてもよい。例えば、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がヒドロキシカルボニル、Ｃ１〜Ｃ３アルコキシカルボニル、ヒドロキシル、シアノ基またはＣ１〜Ｃ３アルコキシで置換されている例が挙げられる。
【００２５】
Ｎと結合した基が環状アミンであるときには、例えば、ピリジノ、オキサゾロ、チアゾロ、ピリダジノ、キノリノまたはイソキノリノ基を表す例が挙げられる。これらの基は、Ｃ１〜Ｃ５アルキル（例えば、メチル、エチルなど）、ヒドロキシル、ヒドロキシエチル、アミノエチル、アミノ（イミノ）、カルバモイルまたはウレイド基などの基で置換されていてもよい。前記の環状アミンとしては、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４基のいずれかが第四アミンと環を形成し、残りの基がＣ１〜Ｃ４アルキル基（例えば、メチル、エチル）、例えば、Ｎ−エチルモルホリノまたはＮ−メチルピペリジノである例が挙げられる。
【００２６】
有利な態様によれば、本発明は、ｎ＝１、ｍ＝２およびＲ２、Ｒ３およびＲ４がメチル基であるものに関し、極めて好ましい例では、Ｒ１が１６個の炭素原子を含んでなる未分岐アルキル基であるものに関する。
【００２７】
更に、反応性官能基（例えば、アミノ、ヒドロキシなどの官能基）が存在するため、このような化学分子は直接、または例えば、ヘテロ二感応価試薬（例えば、 ＳＰＤＰまたはＳＭＣＣ）または感応性にした試薬（例えば、ＰＥＧ）のようなアームを介して置換されていてもよい。このような試薬は、文献に詳細に報告されている（Ｍａｔｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｏｒｔｓ， １７， １６７−１８３）。置換の要素は、文献に広汎に記載されているものの一つ、例えば、イン・ビトロまたはイン・ビボで投与した後に前記脂質の分布を明視化することができる標識分子（例えば、米国特許第４，７１１，９５５号明細書を参照されたい）、細胞（リガンド）のターゲッティングまたは細胞固定をできる分子、または細胞への浸透、エンドソームの還元（ＪＴＳ１ペプチド、例えば、Ｇｏｔｔｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ３， ４４８−４５７）または細胞内輸送を促進する要素であることができる。これらの分子は、全体がまたは一部が糖、グリコール、ペプチド（例えば、ＧＲＰ、ガストリン放出ペプチド）、オリゴヌクレオチド、脂質（特に、Ｃ２〜Ｃ２２脂質）、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体（またはその断片）、特異的膜結合受容体、細胞性抗リガンドと反応することができるリガンド、フソゲニックペプチド（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ）、核局在化（ＮＬＳ）ペプチド、またはこのような分子の組合せ、例えば、肝細胞の表面でアシアログリコプロテインをターゲッティングするガラクトシル残基、インフルエンザウイルスＨＡ−２サブユニット由来のＩＮＦ−７フソゲニックペプチド（Ｐｌａｎｋ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６９， １２９１８−１２９２４）、またはＳＶ４０ウイルス（ＬａｎｆｏｒｄおよびＢｕｔｅｌ， １９８４， Ｃｅｌｌ， ３７， ８０１−８１３）またはＥｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス（Ａｍｂｉｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６５， １４６６−１４７８）のＴ抗原のＮＬＳシグナルからなることができる。特にファージディスプレー法を用いる幾つかの研究により、本発明による置換基として用いることができ且つある種の細胞、例えば、脳または腎臓細胞（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｎａｔｕｒｅ ３８０， ３６４−３６６）、肺細胞（Ｒｏｍａｎｃｚｕｋ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， １０， ２６１５−２６２６）、皮膚細胞、または膵臓細胞（Ｒａｊｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９９８， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １０２， ４３０−４３７）、またはある種の腫瘍由来の細胞（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １５， ５４２−５４６； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ３， ４−１０； Ｃｒｏｃｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， １７， ４２８７−４２９２； Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．， １， １８５−１９１ ； Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ａｄｖ． Ｐｈａｒｍ���ｃｏｌ．， ４０， ３９９−４３５）を特異的にターゲッティングできるペプチド配列を同定することができた。これらの文献の全内容は、本発明の応用の一部を形成している。例えば、ＨＷＧＦモティーフが挙げられ、これは腫瘍増殖、脈管形成および転移の形成に関与するメタロプロテイナーゼのリガンドである（Ｋｏｉｖｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １７， ７６８−７７４）。
【００２８】
本発明の置換リン脂質は、当業者の範囲内にある手法により、更に具体的には、化学カップリング基、例えば、アミン上でのトリフルオロアセチル、Ｆｍｏｃ（９−フルオロエニルメトキシカルボニル）、またはＢＯＣ（第三ブチルオキシカルボニル）のような化学基を用いて容易に得ることができる（Ｇｒｅｅｎｅ Ｔ． Ｗ．およびＷｕｔｓ Ｐ． Ｇ． Ｍ．， １９９１， 有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
【００２９】
本発明の具体例によれば、本発明のリン脂質は、塩素、臭素またはヨウ素イオンのようなアニオン、アルカリ金属（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋）のイオン、またはアルカリ土類金属（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋）のイオンと結合した塩の形態である。
【００３０】
式Ａのリン脂質およびその誘導体は、任意の適当な方法によってまたは米国特許第４，９３５，５２０号明細書に示されている方法によって調製することができ、前記特許明細書の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。式Ａで表され且つ本発明に関連して用いることもできるリン脂質のある種の誘導体は、ＷＯ９０／１５８０７号明細書にも記載されている。
【００３１】
本発明の好ましい例では、組合せ生成物に含まれるリン脂質は双性イオン性の形態であり、すなわち、その正／負の電荷比は０である。
【００３２】
本発明の一態様によれば、前記核酸に含まれる配列によってコードされる目的とするポリペプチドは、サイトカイン、化学誘因物質活性を有するポリペプチド（すなわち、ケモカイン）、「自殺遺伝子」と呼ばれる遺伝子によってコードされるタンパク質、抗血管新生促進因子、および細胞アポトーシスを活性化する活性を有するポリペプチドから選択される。
【００３３】
サイトカインは、抗原刺激または炎症反応の後に自然に産生される分子であり（ＧｉｌｌｉｓおよびＷｉｌｌｉａｍｓ， １９９８， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １０，５０１−５０３）、ある種の癌治療に関するその有用性は特にＯｅｔｔｇｅｒによって示されている（Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９１， ３， ６９９−７０５）。本発明のこの第一の変異体によれば、目的とするポリペプチドは、好ましくはα−、β−およびγ−インターフェロン、インターロイキン、特にＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＩＬ−１２、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、およびコロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦ）から選択されるサイトカインを表す。
【００３４】
好ましい態様によれば、前記サイトカインは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）およびγ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）から選択される。インターロイキン−２は、特に活性化したＴリンパ球の増殖および免疫系の細胞の増殖および活性化に関与している（核酸配列については、特にＦＲ　８５　０９４８０号明細書を参照されたい）。γ−ＩＦＮは食細胞細胞を活性化し、クラスＩおよびクラスＩＩの主要組織適合遺伝子複合体表面抗原の発現を増加する（核酸配列については、特にＦＲ　８５　０９２２５号明細書を参照されたい）。これらの核酸配列は、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【００３５】
具体的態様によれば、本発明による組合せ生成物は、１種類以上の性質が異なる核酸によって支持され、インターロイキン−２（ＩＬ−２）の全部または一部およびγ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）の全部または一部をコードする少なくとも２個の配列を含んでなることを特徴とする。
【００３６】
本発明の第二の変異体によれば、目的とするポリペプチドは化学誘因物質活性を有するポリペプチド（すなわち、ケモカイン）である。ケモカインは、サイトカインファミリーのサブクラスを構成している。それらは、その化学誘因物質特性、特に天然の走化性工程、具体的には炎症または感染が見られる組織への免疫系の細胞の天然の誘因工程中の特性、およびそれらの抗血管新生特性が他のサイトカインと異なる。
【００３７】
ケモカインは、大きさの小さな（７０〜８０アミノ酸）の低分子量（８〜１０ｋｄ）タンパク質であり、そのアミノ酸配列は相同性の程度が低い（考察したケモカインの１０〜７０％の範囲）ので、これまでに約５０種類のケモカインが明らかになっている。しかしながら、これらのケモカインは、それらが含むシステイン残基の位置に関して４つの主要なファミリーに再分することができる。Ｎ−末端が単一アミノ酸によって分離されている２個のシステインを含んでなるαファミリー（ＩＬ−８、ＮＡＰ−２、ＧＣＰ−２型のケモカイン）、およびＮ−末端が２個の隣接システインを含んでなるβファミリー（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１、ＭＣＰ１型のケモカイン）が最も詳細に特性決定されている（Ｈｏｒｕｋ， Ｒ．， １９９４， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ．， １５， １５９−１６５； Ｍｕｒｐｈｙ， Ｐ． Ｍ．， １９９４， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２， ５９３−６３３）。
【００３８】
本発明に関して、好ましいケモカインはＭＩＰ１型のケモカインであり、更に具体的にはＭＩＰ１αおよびＭＩＰ１βケモカインからなる群から選択され、それらの特性はＷｏｌｐｅ ｅｔ ａｌ．によって明らかにされている（１９８８， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６７， ５７０−５８１）。
【００３９】
核酸およびペプチド配列がＯｂａｒｕ ｅｔ ａｌ． （１９８６， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ９９， ８８５−８９４）によって記載されて折り、前記文献の内容がその開示の一部として本明細書に引用されているＭＩＰ１αは、Ｔリンパ球および単球によって産生される。これは、気道感染症の際に好酸球とＴリンパ球を、また慢性関節リウマチ、消化管炎または細菌性髄膜炎の際に単球および好中球を化学誘引することができる。更に、これは、造血前駆体の増殖を阻害する。
【００４０】
核酸およびペプチド配列がＢｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４２， ６７９−６８ ）によって記載されて折り、前記文献の内容がその開示の一部として本明細書に引用されているＭＩＰ１βも、Ｔリンパ球および単球によって産生される。これは、変形性関節症および細菌性髄膜炎の場合に単球および好中球に対する化学誘引物質特性を働かせる。ＭＩＰ１αと同様に、これは造血前駆体の増殖を阻害する。
【００４１】
前記ＭＩＰ１αおよびＭＩＰ１βタンパク質の天然の変異体があり、これらは当業者に知られており、且つＭＩＰ１αについては、例えば、ＧＯＳ１９、ＬＤ７８、ｐＡＴ４６４、ＴＹ５（マウス）、またはＳＩＳα（マウス）という名称が、またはＭＩＰ１βについては、ｐＡＴ７４４、Ａｃｔ−２、Ｇ−２６、Ｈ−４００（マウス）またはｈＳＩＳγ（マウス）という名称が付けられている。ＭＩＰ１βの特定の場合には、例えば、Ａｃｔ−２に相当する配列（Ｌｉｐｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８８， ＰＮＡＳ， ８５， ９７０４−９７０８、前記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている）が選択される。
【００４２】
本発明の第三の変異体によれば、目的とするポリペプチドは、「自殺遺伝子」と呼ばれる遺伝子によってコードされるポリペプチドである。幾つかの研究により、それ自体は毒性を持たないが、不活性物質（プロドラッグ）、例えば、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を、細胞にとって毒性の高い物質、例えば、伸長を受けるＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖に組込むことができる修飾ヌクレオシドに形質転換することができる触媒的酵素特性を有し、結果として特に細胞分割の阻害または細胞機能障害の結果、これらのポリペプチドを含む細胞を死滅させるポリペプチドを同定することができた。このようなポリペプチドをコードする遺伝子は、「自殺遺伝子」と呼ばれる。多くの自殺遺伝子／プロドラッグ対が、現在利用可能である。更に詳細には、下記の対が挙げられる：
−　単純ヘルペスウイルス１型チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−１　ＴＫ）と、アシクロビールまたはガンシクロビール（ＧＣＶ）（Ｃａｒｕｓｏ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ７０２４−７０２８； Ｃｕｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６， １５５０−１５５２ ； Ｒａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ３， １３５４−１３６１）、
−　ラットシトクロムｐ４５０と、シクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈｏｐｈａｍｉｄｅ）（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５， ９６９−９７８）、
−　大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）プリンヌクレオシドホスホリラーゼと、６−メチルプリンデオキシリボヌクレオシド（Ｓｏｒｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １， ２３３−２３８）、
−　大腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼと、６−チオキサンチン（ＭｚｏｚおよびＭｏｌｔｅｎ， １９９３， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４， ５８９−５９５）、および
−　シトシンデアミナーゼ（ＣＤａｓｅ）と、５−フルオロ−シトシン（５ＦＣ）。
【００４３】
有利な例によれば、本発明は、目的とする前記ポリペプチドがチミジンキナーゼ活性、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ活性、グアニン、ウラシルまたはオロテートホスホリボシルトランスフェラーゼ活性、およびシトシンデアミナーゼ活性から選択される少なくとも１個の酵素活性を有する例に関する。
【００４４】
更に具体的には、ＣＤａｓｅはピリミジンの代謝経路に関与する酵素であり、これを通って外来性シトシンが加水分解的脱アミノ化によりウラシルに形質転換される。ＣＤａｓｅ活性は原核生物および下等真核生物で明らかにされているが（ＪｕｎｄおよびＬａｃｒｏｕｔｅ， １９７０， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １０２， ６０７−６１５； Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９７２， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １１０， ２１９−２２８； Ｄｅ Ｈａａｎ ｅｔ ａｌ．， １９７２， Ａｎｔｏｉｎｅ ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ ３８， ２５７−２６３ ； Ｈｏｅｐｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９７４， Ｊ． Ｉｎｆ． Ｄｉｓ． １３０， １１２−１１８ ； ＥｓｄｅｒｓおよびＬｙｎｎ， １９８５， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０， ３９１５−３９２２）、哺乳類では欠けている（Ｋｏｅｃｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９６６， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １５， ４３５−４４６ ； Ｐｏｌａｋ ｅｔ ａｌ．， １９７６， Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ２２， １３７−１５３）。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ （Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦＣＹ１遺伝子およびＥ． ｃｏｌｉのｃｏｄＡ遺伝子であって、それぞれそれら２種類の生物のＣＤａｓｅをコードするものが知られており、それらの肺連れが公表されている（欧州特許第４０２　１０８号明細書； Ｅｒｂｓ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． ３１， １−６； ＷＯ９３／０１２８１号明細書）。ＣＤａｓｅはまた、シトシン類似体である５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を脱アミノ化して５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）とするが、これは細胞毒性が高い化合物であり、特に５−フルオロ−ＵＭＰ（５−ＦＵＭＰ）に転換されるときには細胞毒性が極めて高い。ＣＤａｓｅ活性を欠いている細胞は、酵素をコードする遺伝子の不活性化突然変異によりまたはこの酵素が天然で欠失しているため（例えば、哺乳類細胞）、５−ＦＣに耐性である（ＪｕｎｄおよびＬａｃｒｏｕｔｅ， １９７０， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １０２， ６０７−６１５； Ｋｉｌｓｔｒｕｐ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７１， ２１２４−２１２７）。一方、ＣＤａｓｅ活性をコードする配列が導入されている哺乳類細胞に５−ＦＣ感受性を伝達することができることが明らかにされている（Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３， ４６１９−４６２６； Ｍｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， ３３−３７； ＷＯ９３／０１２８１号明細書）。更に、この場合には、隣接する形質転換していない細胞も５−ＦＣに感受性となる（Ｈｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ８３０２−８３０６）。バイスタンダー効果と呼ばれるこの現象は、単に細胞膜を通る拡散により隣接細胞を中毒させる５−ＦＣのＣＤａｓｅ活性を発現する細胞による排泄によるためである。この５−ＦＣの受動的拡散特性は、バイスタンダー効果にはｔｋを発現する細胞との接触が必要であるｔｋ／ＧＣＶリファレンス系に関して有利となる（Ｍｅｓｎｉｌ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｐ��ｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３， １８３１−１８３５）。従って、この効果は、遺伝子治療、特に抗癌遺伝子治療に関連してＣＤａｓｅを用いることのもう一つの長所となる。
【００４５】
しかしながら、５−ＦＣ感受性は細胞系によって大きく変化する。例えば、Ｅ． ｃｏｌｉのｃｏｄＡ遺伝子を発現するレトロウイルスを形質導入したＰＡＮＣ−１（膵臓癌）およびＳＫ−ＢＲ−３（乳腺癌）ヒト腫瘍系では、感受性が低い。（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １， １７０−１７５）。この望ましくない現象は、ＣＤａｓｅの酵素作用によって形成された５−ＦＣの細胞毒性５−ＦＵＭＰへの内因性転換が全くないかまたは僅かであることによって説明することができる。この工程は、通常は哺乳類細胞でオロテートホスホリボシルトランスフェラーゼによって行われるが（Ｐｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｃａｎｃｅｒ ６８， １９０３−１９０９）、ある種の腫瘍では見られず、従って、ＣＤａｓｅに基づく遺伝子治療が無効となることがある。原核生物および下等真核生物では、ウラシルはウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼの作用によってＵＭＰに変換される（従って、ＵＰＲＴａｓｅ活性を示す）。この酵素はまた、５−ＦＵを５−ＦＵＭＰへ転換する。従って、ＵＰＲＴａｓｅ活性がない場合には、ＣＤａｓｅによる５−ＦＣの脱アミノ化によって生じる５−ＦＵは細胞毒性を有する５−ＦＵＭＰ （ＪｕｎｄおよびＬａｃｒｏｕｔｅ， １９７０， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １０２， ６０７−６１５）に変換されないので、酵母Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｆｕｒ１突然変異体は高濃度の５−ＦＵ（１０ｍＭ）および５−ＦＣ（１０ｍＭ）に耐性である。それぞれＥ． ｃｏｌｉおよびＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＵＰＲＴａｓｅをコードするｕｐｐおよびＦＵＲ１遺伝子は、クローニングされ、配列決定されている（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２０４， ５１−５６； Ｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｇｅｎｅ ８８， １４９−１５７）。
【００４６】
本発明の一態様によれば、目的とするポリペプチドはＵＰＲＴａｓｅ活性を有するが、これは、前記ポリペプチドがウラシルまたはその誘導体をモノホスフェート類似体へ、具体的には、５−ＦＵを５−ＦＵＭＰへ転換することができることを意味する。
【００４７】
本発明で言及するＵＰＲＴａｓｅは任意の起源のものでよく、特に原核生物、真菌または酵母起源のものでよい。例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ （Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０４， ５１−５６）、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ （ＭａｒｔｉｎｕｓｓｅｎおよびＨａｍｍｅｒ， １９９４， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７６， ６４５７−６４６３）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ （Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｉｎｔ ４１， １１１７−１１２４）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ （Ｍａｒｔｉｎｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７７， ２７１−２７４）のＵＰＲＴａｓｅをコードする核酸配列を、本発明に関連して用いることができる。しかしながら、酵母ＵＰＲＴａｓｅ、特にＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＵＲ１遺伝子によってコードされるものであって、Ｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０， Ｇｅｎｅ ８８， １４９−１５７）に開示されているその配列が、その開示の一部として本明細書に引用されているものが、極めて好ましい。例えば、遺伝子の配列および相当するＵＰＲＴａｓｅの配列は文献や専門のデーターバンク（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ、ＥＭＢＬ、Ｇｅｎｂａｎｋ Ｍｅｄｌｉｎｅなど）で見出すことができる。
【００４８】
更に、特許出願ＰＣＴ／ＦＲ９９／００９０４号明細書には、ＦＵＲ１遺伝子がコード部分の５′側の１０５個のヌクレオチドを欠いており、Ｎ−末端位置の最初の３５個の残基を欠失したＵＰＲＴａｓｅを合成することができ、元のタンパク質の３６位におけるメチオニンで出発することが記載されている。ＦＵＲ１） １０５と表される突然変異体遺伝子の発現生成物は、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのｆｕｒ１突然変異体を補足することができる。更に、切断型突然変異体は、元の酵素より大きいＵＰＲＴａｓｅ活性を有する。従って、特に有利な態様によれば、本発明によりコードされたポリペプチドは元のＵＰＲＴａｓｅの欠失突然変異体である。欠失は、好ましくは元のＵＰＲＴａｓｅのＮ−末端領域に配置される。これは、全体的（前記Ｎ−末端領域の総ての残基に関する））または部分的（一次構造における連続または不連続であってもよい１個以上の残基に関する）であってもよい。一般に、ポリペプチドはＮ−末端、中心およびＣ−末端部分からなり、それぞれが分子の約１／３である。例えば、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＵＰＲＴａｓｅは２５１個のアミノ酸を有するので、そのＮ−末端は元の形態の最初の位置にある開始メチオニンと呼ばれるメチオニンで出発する最初の８３個の残基からなる。Ｅ． ｃｏｌｉのＵＰＲＴａｓｅについては、そのＮ−末端部分は１〜６９位を包含する。
【００４９】
更に、特許出願ＷＯ９６／１６１８３号明細書およびＰＣＴ／ＦＲ９９／００９０４号明細書には、ＣＤａｓｅ活性およびＵＰＲＴａｓｅ活性を有する２個のドメインを有する酵素をコードする融合タンパク質の使用が記載されており、発現プラスミドによって支持された ｃｏｄＡ：：ｕｐｐまたはＦＣＹ１：：ＦＵＲ１またはＦＣＹ１：：ＦＵＲ１Δ１０５ハイブリッド遺伝子の導入によりトランスフェクションしたＢ１６細胞の５−ＦＣ感受性が増加することが示されている。これら２つの出願明細書に記載されているタンパク質および核酸配列は、本出願の説明に組込まれる。この態様によれば、ポリペプチドは、少なくとも第二のポリペプチドとフレームが融合したポリペプチドである。融合は第一のポリペプチドの任意の部位に起こり得るが、Ｎ−またはＣ−末端が好ましく、特にＮ−末端が好ましい。ＣＤａｓｅおよびＵＰＲＴａｓｅ活性の融合により、ターゲット細胞の５−ＦＣおよび５−ＦＵに対する感受性を向上させることができる。
【００５０】
当業者であれば、公表されたデーターを用いてＣＤａｓｅまたはＵＰＲＴａｓｅ配列をクローニングし、可能な突然変異を行い、当該技術分野の手法に準じてまたは特許出願ＰＣＴ／ＦＲ９９／００９０４号明細書に示されたプロトコールに従って非細胞または細胞系における突然変異体の形態の酵素活性を分析し、特にフレームで、ＣＤａｓｅおよびＵＰＲＴａｓｅ活性を有するポリペプチド、従って、相当する遺伝子の全部または一部を融合することができる。特許出願ＷＯ９６／１６１８３号明細書およびＰＣＴ／ＦＲ９９／００９０４号明細書に記載されているハイブリッドポリペプチドは、その開示の一部として本明細書に引用されている。
【００５１】
もう一つの変異体によれば、目的とするポリペプチドは抗血管新生促進因子である。血管新生は、既に存在している脈管組織から新たな毛細血管を形成することに関与する工程である。この複雑な工程は、健常組織では多くの血管新生および抗血管新生因子の効果のバランスによって精巧に制御されている。しかしながら、ある種の病理学的条件、特に腫瘍の形成において、この工程は妨げられ、血管新生因子が抗血管新生因子に優先し、腫瘍にかなり血管が新生し、結果として腫瘍が速やかに成長し、および／または転移が出現する。このため、本発明に関連して、抗血管新生因子は細胞毒性薬剤、特に細胞毒性を有する抗腫瘍薬であると考えられる。現在知られている様々な抗血管新生因子としては、特にアンギオスタチン、エンドスタチン、血小板因子ＰＦ４、トロンボスポンジン−１、ＰＲＰ（プロリフエリン関連タンパク質）、ＶＥＧＩ（血管内皮増殖阻害因子）、メタロプロテアーゼおよびウロキナーゼが挙げられる。
【００５２】
最後に、目的とするポリペプチドは、細胞アポトーシスを活性化する活性を有するポリペプチド、更に具体的には、ｐ５３タンパク質であることができる。ｐ５３は、細胞サイクルに関与するタンパク質の発現の制御に関与し（Ｏｚｂｕｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６６， ７１−１４１； Ｓｅｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２６， １４５−１５４）、ゲノムの安定性および細胞アポトーシスに関連した多くの細胞工程に寄与する（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８８， １４４２−１４４５； Ｋａｓｔａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１， ６３０４−６３１１； Ｋｕｅｒｂｉｔｚ ｅｔ ａｌ．， １９９２， ＰＮＡＳ， ８９， ７４９１−７４９５）核ホスホプロテインである。ｐ５３遺伝子は、同定され、配列決定されている。ｃＤＮＡの配列はＭａｔｌａｓｈｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８４， ＥＭＢＯ Ｊ．， ３， ３２５７−３２６２）に記載されており、タンパク質の配列はＬａｍｐ （１９８６， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ６， １３７９−１３８５）に記載されている。同様に、天然および機能性の多形突然変異体であって、ｐ５３の機能に影響することなくある種のアミノ酸が他のものに置換されているものも、同定されている。更に、このタンパク質の機能を喪失する可能性がある多くの突然変異体は、癌に関する文献に記載されている（Ｈｏｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３， ４９−５３； Ｌｅｖｉｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ｎａｔｕｒｅ， ３５１， ４５３−４５６）。例えば、Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９８９， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４， ２１７）は、７０％を上回る結直腸腫瘍において、このｐ５３遺伝子の機能が喪失していることに注目している。本発明に関連して、ｐ５３ポリペプチドまたはこのポリペプチドの一部のみ、または誘導体形成したまたは突然変異したポリペプチドは、ｐ５３の機能が保存されるという条件で用いることができる。このような配列は当業者に周知であり、例えば、Ｍａｔｌａｓｈｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ． （１９８４， ＥＭＢＯ Ｊ．， ３， ３２５７−３２６２）、Ｐｒｉｖｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９４， Ｃｅｌｌ， ７８， ５４３−５４６）またはＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９６， Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｄｅｖｅ．， １０， ２４３８−２４５１）を参照することができ、前記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている。転写トランスアクチベーター（Ｆａｒｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ， ３５８， ８３−８６）または他のタンパク質と相互作用できるポリペプチド（Ｈａｒｒｉｓ， １９９６， Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ， １７， １１８７−１１９８）としてのｐ５３ポリペプチドの特性を考慮すれば、ｐ５３活性は、 ｃａｎ ｂｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ａｎａｌｙｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ｉｎ ｔｈｅＧ１／ＳおよびＧ２／Ｍ相での細胞サイクル阻止、アポトーシスの誘導、腫瘍遺伝子によって誘導される細胞形質転換の抑制、または血管形成の抑制を分析することによって測定することができ��。
【００５３】
本発明の目的とするポリペプチドをコードする配列は、クローニング、ＰＣＲ、または使用されている通常の手法による合成によって容易に得ることができる。それらは本来の遺伝子でよく、または１個以上のヌクレオチドの突然変異、欠失、置換、および／または付加によって本来の遺伝子から誘導された遺伝子であってもよい。更に、それらの配列は、当業者が検索することができる文献に詳細に記載されている。
【００５４】
本発明の特定の態様によれば、組合せ生成物は、
（ｉｉｉ） 核酸と会合している物質、および／または
（ｉｖ） 目的とするリン脂質と会合している物質
をさらに含んでなることを特徴とする。
【００５５】
「核酸と会合している物質」という表現は、特にトランスフェクション効率および／またはベクター、特にプラスミド起源のベクターの安定性、および／または宿主生物の免疫系に対してイン・ビボでの前記ベクターの保護を向上させることができる物質、または幾つかの物質の組合せを表そうとするものである（Ｒｏｌｌａｎｄ Ａ， Ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ， １５， （１９９８）， １４３−１９８）。これらの物質は、静電的、疎水的、カチオン性、共有的または好ましくは非共有的相互作用によって核酸と会合している。このような物質は、当業者が入手可能な文献に詳細に報告されている（例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｐｒｏｃ． Ｗｅｓｔ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｏｃ． ３２， １１５−１２１； Ｈｏｄｇｓｏｎ ａｎｄ Ｓｏｌａｉｍａｎ， １９９６， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４， ３３９−３４２； Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５， ６４７−６５４を参照されたい）。例えば、それらはカチオン性ポリマーまたはカチオン性脂質であることができ、リポソーム、核またはウイルスタンパク質、または中性脂質であることができるが、これらに限定されない。これらの物質は、単独でまたは組合せて用いることができる。このような化合物、およびトランスフェクション効率および／または所定のベクターの安定性を向上させるためのそれらの能力を測定する方法の例は、特に特許出願ＷＯ９８／０８４８９号明細書、ＷＯ９８／１７６９３号明細書、ＷＯ９８／３４９１０号明細書、ＷＯ９８／３７９１６号明細書、ＷＯ９８／５３８５３号明細書、欧州特許第８９０３６２号明細書、またはＷＯ９９／０５１８３号明細書で入手可能である。それらは、詳細には、ＤＯＴＭＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７， ＰＮＡＳ， ８４， ７４１３−７４１７）、ＤＯＧＳまたはＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商品名）（Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．， １９８９， ＰＮＡＳ， ８６， ６９８２−６９８６）、ＤＭＲＩＥまたはＤＯＲＩＥ（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｍｅｔｈｏｄｓ， ５， ６７−７５）、ＤＣ−ＣＨＯＬ（Ｇａｏ ａｎｄ Ｈｕａｎｇ， １９９１， ＢＢＲＣ， １７９， ２８０−２８５）、ＤＯＴＡＰ（商品名）（ＭｃＬａｃｈｌａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ２， ６１４−６２２）、またはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商品名）のような脂質物質でよい。
【００５６】
有利には、これらのカチオン性脂質は、下式のカチオン性脂質から選択される（ＥＰ ９０１ ４６３参照）：
【化７】
2004506617.tif 000005
（式中、
Ｒ１およびＲ２は、同一でもまたは異なっていてもよく、直鎖状もしくは分岐状のＣ６〜Ｃ２３アルキルまたはＣ６〜Ｃ２３アルケニル、または、直鎖状もしくは分岐状のＣ６〜Ｃ２３アルキルカルボニルまたはＣ６〜Ｃ２３アルケニルカルボニルであり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）または−ＮＲ３であり、
Ｒ３は水素原子またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり、
ｎは１〜６の正の整数であり、
ｍは１〜６の正の整数であり、
ｎ＞１であるときには、ｍは同一分子内で変化することができる）。
【００５７】
物質（ｉｉｉ）は、例えば、ポリアミドアミン（Ｈａｅｎｓｌｅｒ ａｎｄ Ｓｚｏｋａ， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ４ （１９９３）， ３７２−３７９）、「デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）」ポリマー（ＷＯ９５／２４２２１号明細書）、ポリエチレンイミンまたはポリプロピレンイミン（ＷＯ９６／０２６５５号明細書）、キトサン、ポリリシンのようなポリアミノ酸（米国特許第５，５９５，８９７号明細書またはフランス国特許第２　７１９　３１６号明細書）などのカチオン性ポリマー、ポリ第四化合物、プロタミン、ポリイミン、ポリビニルアミン、プルーランまたはセルロースのようなＤＥＡＥで置換したポリカチオン性ポリマー、ポリビニルピリジン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリオキセタン、ポリ（チオジエチルアミノメチルエチレン）（Ｐ（ＴＤＡＥ））、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリ−ｐ−アミノスチレン、コポリメタクリレート（例えば、ＨＰＭＡのコポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド）、ＵＳ−Ａ−３，９１０，８６２号明細書に記載の化合物、ＤＥＡＥポリビニルピロリドとメタクリレート、デキストラン、アクリルアミド、ポリイミン、アルブミン、１−ジメチルアミノメチルメタクリレートおよびポリビニルピロリドンメチルアクリルアミノプロピルトリメチルアンモニウムクロリドとの複合体、テロマー化合物（特許出願ＥＰ９８４０１４７１．２号明細書）であることもできる。しかしながら、このリストは総てを網羅しているものではなく、他の既知のカチオン性ポリマーを用いて本発明の核酸複合体を得ることができる。更に、これらのカチオン性ポリマーおよび脂質は、フッ素化されていることがある（例えば、ＷＯ９８／３４９１０号明細書を参照されたい）。
【００５８】
「リン脂質と会合している物質（ｉｖ）」という表現は、特に目的とするリン脂質伝達する構造に組込むことができる分子または分子の組合せを表そうとするものである。これらの構造としては、例えば、リポソーム、ミセルまたはナノ粒子が挙げられる。目的とするリン脂質と会合している物質（ｉｖ）としては、リポソームに組込むことができる分子、特に脂質（例えば、Ｐａｔｅｒｎｏｓｔｒｅ ｅｔ ａｌ．， １９９６， 「リポソーム：調製および膜タンパク質の再構成」、膜脂質便覧（Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ： ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ． Ｉｎ Ｍａｎｕａｌ ｏｎ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｌｉｐｉｄｓ）、Ｒ． Ｐｒａｓａｄ監修、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， ｐｐ． ２０２−２４７を参照されたい）、およびタンパク質が挙げられる。脂質に関しては、極性脂質、無極性脂質（例えば、カロテノイドまたはステリルエステル）、ステロールなどのある種のステロイド、リン脂質、または糖脂質などが考えられる。タンパク質に関しては、例えば、膜結合タンパク質、膜貫通タンパク質、またはホスファチジルイノシトール型アンカーリングを有するタンパク質が挙げられ、これらのタンパク質はグリコシル化されていることがある。本発明の有利な態様によれば、物質（ｉｖ）は、目的とするリン脂質を伝達する構造の標識、細胞または細胞アンカーリングのターゲッティングを可能とし、細胞中への浸透、エンドソームの還元または細胞輸送を促進し、リポソームの血漿中半減期を増加させることができる（例えば、Ｃｈｏｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ６， ６９８−７０８を参照されたい）。
【００５９】
本発明は、前記組合せ生成物が中性、双性イオン性または負に帯電した脂質から選択されるアジュバント（ｖ）も含む。これらの中性、双性イオン性または負に帯電した脂質は、例えば、動物または植物性の天然リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスホコリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、セラミドまたはセレブロシド、およびそれらの類似体、独占的にではないが一般的に２個の同一脂肪酸鎖を含んでなるジミリストイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、およびホスファチジルグリセロール、およびそれらの類似体のような合成リン脂質；ホスファチジルコリン、カルディオリピン、ホスファチジルエタノールアミン、モノ−、ジ−またはトリアシルグリセロール、およびα−トコフェロール、およびそれらの類似体；ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、または類似のリン脂質類似体；コレステロール、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、プロスタグランジン、ガングリオシド、ニオソーム（ｎｉｏｓｏｍｅｓ）、または任意の他の天然または合成両親媒性化合物を含んでなる群から選択することができる。
【００６０】
好ましい態様によれば、前記アジュバントは、コレステロール、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびそれらの誘導体から選択される。
【００６１】
本発明の有利な態様によれば、前記核酸（ｉ）、前記物質（ｉｉｉ）、前記リン脂質（ｉｉ）、および必要に応じて前記アジュバント（ｖ）は複合体を形成する。このような複合体は、様々な化合物が、例えば、静電、疎水性、カチオン性、共有的または好ましくは非共有的相互作用によって互いに会合することによって生じる。
【００６２】
このような複合体は、様々な特徴に関して定義することができる。例えば、下記のものが挙げられる。
−　前記複合体の総ての成分によって提供される正電荷の数と負電荷の数との比を表す理論電荷比（＋／−またはＰ／Ｎ）。この理論電荷比の計算では、総てのカチオン性基と総てのアニオン性基はイオン化していると仮定される。一般に、複合体の過剰の正電荷は、負に帯電している細胞表面への前記複合体の結合を促進する。所定の複合体の成分の量および濃度は、それらのそれぞれの分子質量と正／負電荷の数の関数として調節される。好ましい態様によれば、組合せ生成物中にある複合体の理論電荷比（＋／−またはＰ／Ｎ）は０．０５〜２０、好ましくは０．１〜１５の範囲であり、更に具体的には０．５〜１０の範囲である。
−　核酸（ｉ） 濃度。好ましくは、この濃度は１０μｇ／ｍｌ〜５０００μｇ／ｍｌの範囲であり、更に具体的には１００μｇ／ｍｌ〜２０００μｇ／ｍｌの範囲である。
−　核酸の構造。これは、好ましい態様によれば、超へリックス形態での核酸（ｉ）の少なくとも８０％、好ましくは９０％，、更に好ましくは９５％を有する。
−　複合体が物質（ｉｉｉ）およびアジュバント（ｖ）を含むとき、前記複合体はこれらの要素のモル比によって定義することもできる。有利には、（ｉｉｉ）と（ｖ）の比は０．１〜１０の範囲であり、好ましくは２〜３の範囲である。
−　複合体はその平均直径によって特性決定することもでき、好ましくは２μｍ未満であり、２０〜８００ｎｍの範囲であり、更に詳細には５０〜５００ｎｍ、有利には７５〜２００ｎｍの範囲であり、極めて好ましくは約１００ｎｍである。複合体の平均直径は、ある応用においては最適使用のために選択することができる。この直径は、「動的レーザー光散乱」（光子相関スペクトル分析法、ＰＣＳ）という名称で知られる手法、および当業者に知られている他の手法（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， 薬学および他の産業における粒度分析（Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）， Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９２， １３５−１６９を参照されたい）など多数の手法を用いて測定することができるが、これらに限定されない。ここで、本発明の複合体をそれらの粒どの関数として分離する方法があり、且つ特定の直径を有する複合体を選択するのに用いることができる点に留意すべきである。例えば、押出、超音波処理、マイクロ流動化、排除／拡散クロマトグラフィー、グラディエント分離、電気泳動、および特に画定された細孔を有する膜による超遠心などの方法が挙げられる。
【００６３】
有利な態様によれば、リン脂質（ｉｉ）は、核酸（ｉ）と物質（ｉｉｉ）との間で形成され、必要に応じてアジュバント（ｖ）と結合することがある前記複合体に組込まれる。この正確な場合には、リン脂質（ｉｉ）と物質（ｉｉｉ）あるいはアジュバント（ｖ）とのモル比は０．１％〜６０％、有利には１０％〜５０％、好ましくは２０％〜４０％の範囲である。
【００６４】
しかしながら、本発明は、前記リン脂質が前記核酸（ｉ）との複合体にはない組合せ生成物にも関する。この特定の場合には、目的とする前記リン脂質（ｉｉ）は、好ましくは物質（ｉｖ）と会合している。好ましくは、物質（ｉｖ）とのこの会合は、目的とするリン脂質を運ぶことができるようにするリポソームからなっている。この種のリポソームは、当業者に知られている。
【００６５】
特に、コレステロール、アルキルリゾリン脂質およびリン酸ジアセチルから調製されるリポソームを挙げることができる（Ｚｅｉｓｉｇ ｅｔ ａｌ． １９９４， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ， １４， １７８５−１７９０）。本発明の好ましい態様によれば、これらのリポソームは、特にコレステロールからなっている。目的とするリン脂質を運ぶリポソームは、目的とする他の物質を運ぶこともできる（例えば、Ｃｈｏｎｎ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ６， ６９８−７０８を参照されたい。前記文献の内容は、その開示の一部として本明細書に引用されている）。目的とするこれら他の物質の中では、特に細胞毒性活性を有する薬剤（例えば、アンホテリシンＢ、または全トランス−レチン酸）、組換えタンパク質、特に細胞毒性活性を有するもの、または核酸が挙げられる。
【００６６】
本発明は、薬学的観点から許容可能なビヒクルで処方されることを特徴とする前記の組合せ生成物にも関する。このような支持体は好ましくは等張性、低張性または弱高張性であり、例えば、スクロース溶液のようにイオン強度は比較的低い。更に、このような支持体は任意の溶媒、または水性または部分的に水性の液体、例えば、発熱性物質不含滅菌水を含むことができる。更に、処方物のｐＨを調節および緩衝し、イン・ビボでの使用条件を満足させる。処方物は、薬学上の観点から許容可能な希釈剤、アジュバントまたは賦形剤、および可溶化剤、安定剤および／または防腐剤を含むこともできる。注射可能な投与用には、水性、非水性または等張溶液での処方物が好ましい。これは、単回用量または複数回用量で、液体または乾燥（粉末、凍結乾燥生成物など）形態であって、必要に応じて適当な希釈剤で再構成することができるもので提供することができる。
【００６７】
本発明の特定の態様によれば、前記組合せ生成物は、少なくとも細胞毒性活性を有するポリペプチドによって細胞毒性分子に形質転換することができるプロドラッグの薬学上の観点から許容可能な量をも含んでなる。このようなプロドラッグは、詳細にはアシクロビールまたはガンシクロビール（ＧＣＶ）、シクロホスホファミド、６−メチルプリンデオキシリボヌクレオシド、６−チオキサンチン、シトシンまたはその誘導体、またはウラシルまたはその誘導体からなる群から選択される。更に、前記プロドラッグが５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）または５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）であるときには、前記組合せ生成物は５−ＦＵの細胞毒性効果を増強する１種類以上の物質を含んでなることもできる。特に、ピリミジンのデ・ノボでの生合成の経路の酵素を阻害する薬剤（例えば、以下に引用するもの）、複製に要するｄＴＭＰのプールを減少させるチミジレートシンターゼの阻害を５−ＦＵ代謝生成物（５−ＦｄＵＭＰ）の存在下で増加させるＬｅｕｃｏｖｏｒｉｎのような薬剤（Ｗａｘｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １８， ６８５−６９２）、および最後にメトトレキセートのような薬剤（Ｃａｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９７９， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０， １１３５−１１３７）であって、ジヒドロホレートレダクターゼを阻害し、ＰＲＰＰ（ホスホリボシルピロホスフェート）の組込みのためのプールを増加することによって、細胞性ＲＮＡにおける５−ＦＵを増加させるものが挙げられる。
【００６８】
本発明の組合せ生成物は、例えば、クロロキン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノール、１−メチル＝ Ｌ−２−ピロリドンおよびそれらの誘導体のようなプロトン性化合物、非プロトン性化合物、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセタミド、 テトラメチル尿素、アセトニトリル、またはそれらの誘導体（欧州特許第８９０　３６２号明細書を参照されたい）、サイトカイン、特にインターロイキン−１０（ＩＬ−１０）（ＷＯ９９／５６７８４号明細書）、ヒアルロニダーゼ（ＷＯ９８／５２８５３号明細書）、およびヌクレアーゼ阻害薬（ＷＯ９９／５６７８４号明細書）、例えば、アクチンＧを含んでなる群から選択された物質を含むこともできる。本発明のもう一つの態様では、この物質は塩、好ましくはカチオン性塩、例えば、マグネシウム（Ｍｇ２＋）（欧州特許第９９８９４５号明細書）および／またはリチウム（Ｌｉ＋）であることができる。この場合には、本発明の核酸の複合体におけるイオン性物質の量は、有利には０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲であり、好ましくは０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲である。
【００６９】
本発明によるもう一つの主題は、
（ｉ） 目的とするポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも一種類の核酸、
（ｉｉ） 目的とする少なくとも一種類のリン脂質、
（ｉｉｉ） 核酸と会合している物質、
（ｖ） 必要に応じて、アジュバント
を含んでなり、
目的とする前記リン脂質（ｉｉ）が前記の特徴および特性を有し、更に具体的には、下記式を有する複合体からなっている：
【化８】
2004506617.tif 000006
［式中、
Ｒ１は
（ａ） ６〜３０個の炭素原子を含んでなる直鎖状または分岐状の炭素主鎖、または
（ｂ）　下式の基であり：
【化９】
2004506617.tif 000007
（式中、
Ｒ５は、−Ａ−Ｒ基であって、ここでＡは−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｏ）−Ｓ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、または−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−から選択され、Ｒは６〜３０個の炭素原子を含んでなる直鎖状または分岐状の炭素主鎖であり、
Ｒ６は、水素原子であるか、またはＲ５と同じ意味を有し、Ｒ５とＲ６は同一でもまたは異なることもできる）、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は水素原子であるか、または１〜５個の炭素原子を含むアルキル残基であり、または
【化１０】
2004506617.tif 000008
は環状アミンであり、
ｍは１〜６の正の整数であり、
ｎは０〜１の正の整数である］。
【００７０】
核酸（ｉ）、リン脂質（ｉｉ）、核酸と会合している物質（ｉｉｉ）、およびアジュバントも、このような複合体の特性決定に応用される。
【００７１】
有利なことには、用いられるベクターの性質によっては、本発明の組合せ生成物は、
ベクターがプラスミド性のものであるときには、０．０１〜１００ｍｇ、好ましくは０．０５〜１０ｍｇ、特に好ましくは０．５〜５ｍｇのＤＮＡ、
ベクターがウイルス性のものであるときには、１０４〜１０１４ｐｆｕ（プラーク形成単位）、有利には１０５〜１０１３ｐｆｕ、好ましくは１０６〜１０１２ｐｆｕを投与準備のできた形態で含んでなる。
【００７２】
本発明によるもう一つの主題は、ヒトまたは動物体の治療を行い、更に詳細には抗腫瘍および／または抗転移治療を目的とし、具体的には、腫瘍の成長を阻害しまたは拒絶を引き起こし、感染細胞の死滅を目的とする医薬生成物を調製するための前記の組合せ生成物または複合体の使用からなる。もう一つの例によれば、行われる治療はアテローム性動脈硬化症または再狭窄による損傷の例で見られる細胞増殖の制御にある。
【００７３】
前記のように、目的とするポリペプチドをコードする配列を含む少なくとも一種類の核酸（ｉ）と少なくとも一種類の目的とするリン脂質（ｉｉ）とを含んでなる本発明の組合せ生成物は、同時、連続的または経時的に投与に使用することができる。「同時」という用語は、同時投与を表す。この場合に、２つの成分（ｉ）および（ｉｉ）は投与前に混合することができ、または宿主生物または細胞に同時に投与することができる。それらを連続的に投与することもでき、すなわち本発明による組合せ生成物のいずれの成分を最初に投与するかについては関係なく順次に投与することもできる。最後に、２成分の一方および／または他方について、経時的にまたは断続的に投与され、且つ規則的であることもまたはないこともある間隔で停止し且つ再開始する投与法を用いることができる。２成分の投与経路および部位は異なっていてもよいことが、示唆される。特に好ましい態様によれば、目的とする核酸（ｉ）およびリン脂質（ｉｉ）は、前記の一つの同じ複合体に含まれている。
【００７４】
必要に応じて物質（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、および／またはアジュバント（ｖ）と混合した成分（ｉ）および（ｉｉ）の一方および／または他方の反復投与の場合には、投与の間の時間間隔は重要ではなく、当業者であれば容易に定義することができる。１０分〜７２時間、有利には３０分〜４８時間、好ましくは１〜２４時間、特に好ましくは１〜６時間の間隔が推奨される。
【００７５】
本発明によれば、多くの投与経路を考えることができる。例えば、全身的、胃内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、腹腔内、腫瘍内、鼻内、肺内、または気管内経路が挙げられる。後の３つの態様については、エアゾールまたは吸入による投与が有利である。特に好ましくは、本発明の組合せ生成物または複合体は、腫瘍内または腫瘍周囲に投与され、すなわち、接近可能な腫瘍中、その縁の周囲、または冒された器官または腫瘍に連結した血管中に投与される。
【００７６】
考えられる応用の中では、乳癌、子宮癌（特に、パピローマウイルスによって誘導された癌）、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、肝臓癌、結腸癌、および膵臓、胃、食道、喉頭、中枢神経系、および血液（リンパ腫、白血病など）の癌が挙げられる。循環器疾患に関連しても、例えば、血管壁の平滑筋細胞の増殖（再狭窄）を阻止しまたは遅延させる目的で用いられる。
【００７７】
本発明は、遺伝子治療であって、本発明による組合せ生成物または複合体を治療を必要とする宿主細胞または生体に投与することを特徴とする方法にも敷衍される。一つの具体例によれば、この治療は、最初にヌクレオチド配列（ｉ）を、二番目に本発明による目的とするリン脂質を別個に投与することからなっている。この具体例では、前記リン脂質は好ましくは前記のような物質（ｉｖ）と会合している。しかしながら、特に有利な態様によれば、核酸配列（ｉ）および目的とする前記リン脂質（ｉｉ）は、好ましくは少なくとも核酸（ｉ）および前記リン脂質（ｉｉ）を含んでなる複合体の形態で同時に投与される。
【００７８】
前記治療でＵＰＲＴａｓｅ活性を有するポリペプチドをコードする配列を用いるときには、ＣＤａｓｅ活性を有する第二のポリペプチドを発現することができる第二の配列を投与することも有利なことがある。後者の場合には、ＵＰＲＴａｓｅおよびＣＤａｓｅ配列は同時または連続的に投与することができ、投与順序は重要ではない。このような態様によれば、この治療法は、プロドラッグ、有利にはシトシン類似体、詳細には５−ＦＣの薬学上の観点から許容可能な量が宿主細胞または生体に投与される追加工程をも含んでなる。例えば、５０〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは２００ｍｇ／ｋｇ／日の用量が用いられる。このプロドラッグは標準的実施法に準じて投与することができ、これは、本発明の組合せ生成物の投与の前に、と同時に、の後に投与される。経口投与が好ましい。プロドラッグの単回用量、または宿主細胞または生体で毒性代謝物が産生されるのに十分な長さの時間で反復される用量を投与することもできる。
【００７９】
本発明の有利な態様によれば、本発明の使用または治療方法を、外科手術（特に、腫瘍の部分的または全部切除）、放射線治療、または化学療法による患者の第二の治療と組み合わせる。この特定の例では、本発明による治療は、前記の第二の治療の前に、と同時に、またはの後に行う。好ましくは、この治療は、前記の第二の治療の後に行う。
【００８０】
同様に、核酸（ｉ）の細胞内導入の効率を、例えば、電気穿孔治療（Ｖｉｃａｔ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， １１， ９０９−９１６）、または投与を行う血管の透過性を変更するための治療（ＷＯ９８／５８５４２号明細書）と組合せることによって、または文献記載の任意の他の手段によって有利に促進させることができる。
【００８１】
本発明は、本発明に記載の複合体を調製する目的で、特に遺伝子治療へ応用する目的で、目的とするリン脂質またはその誘導体の使用にも関する。
【００８２】
最後に、本発明は、例えば、前記ターゲット細胞の死亡を誘発する目的で、核酸配列（ｉ）および目的とするリン脂質（ｉｉ）を前記の複合体同時に導入するための、前記複合体、特に目的とするリン脂質を含む複合体の使用に関する。
【００８３】
下記の実施例の目的は、本発明の様々な主題を例示することであり、従って、制限しようとするものではない。
【００８４】
【実施例】
例１： ＨＰＣを含む複合体の細胞毒性の検討
サイトメガロウイルス初期プロモーター配列の下流におかれたルシフェラーゼをコードする配列を含むプラスミドｐＴＧ１１２３６（５７３９塩基対）、カチオン性脂質（ｐｃＴＧ２０１， Ｎａｚｉｈ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｓｙｎｌｅｔｔ．， ５， ６３５−６３６）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ）、および必要に応じてヘキサデシルホスホコリン（ＨＰＣ， Ｓｉｇｍａ）を含む複合体を、超音波処理の後に押出によって調製した（特許出願ＦＲ９７／０２４２０号明細書を参照されたい）。この例で用いられる複合体は、ＨＰＣを含まない複合体については直径が２００〜４００ｎｍ、Ｎ／Ｐ比＝５、ｐｃＴＧ２０１／コレステロールモル比＝１／１であり、またはＨＰＣを含む複合体についてはｐｃＴＧ２０１／ＨＰＣ／コレステロールモル比＝１／２／２であることを特徴とする。
【００８５】
ＲＥＮＣＡ腎臓癌細胞を、１０％子牛血清（Ｇｉｂｃｏ）の存在下にて改良Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）を含むウェル（９６／プレート）で培養した。様々な量の複合体（プラスミド量ｐｇ〜６．６ｐｇに相当する）を細胞（集密度７０〜８０％）上に４８時間置いた。その後、培地を取り出し、細胞をＰＢＳ緩衝液で数回洗浄した。細胞毒性分析は、ＭＴＴ テトラゾリウム［臭素＝３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム］（Ｔｗｅｎｔｙｍａｎ ａｎｄ Ｌｕｓｃｏｍｂｅ， １９８７， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ５６， ２７９−２８５）を用いる分析法によって行った。得られた結果を、図１に示す。付着した複合体の量は、それぞれのウェルに導入されたｐＴＧ１１２３６の量に比例している。これらの結果は、ＨＰＣを含まない複合体とは異なり、ＨＰＣを含む複合体がＲＥＮＣＡ腫瘍細胞を死亡させることができることを示唆している。
【００８６】
例２： マウス腫瘍細胞のイン・ビボでのトランスフェクション
ＲＥＮＣＡ細胞を、８週齢のＢ６Ｄ２雌マウスの皮膚に投与した（５×１０４個／動物）。細胞を投与してから１１日後、蝕知可能な腫瘍が出現した。次に、プラスミドｐＴＧ１１２３６、脂質ｐｃＴＧ２０１、およびＨＰＣまたはＤＯＰＥを含む複合体を含む組成物（Ｎ／Ｐ＝０．５、ｐｃＴＧ２０１／ＤＯＰＥまたはｐｃＴＧ２０１／ＨＰＣモル比＝１／１）を直接腫瘍に投与した（腫瘍当たり投与したｐＴＧ１１２３６ ６０μｇ）。複合体の投与から２４時間後にマウスを屠殺し、腫瘍をルシフェラーゼ活性（ルシフェラーゼ測定法、Ｐｒｏｍｅｇａ）の分析に適する緩衝液で抽出して摩砕する。タンパク質分析（ＢＣＡ分析法、Ｐｉｅｒｃｅ）を平行して行い、腫瘍中のタンパク質１ｍｇ当たりの相対光単位（ＲＬＵ）の値を標準化する。得られた結果を、図２に示す。これらの結果は、ＨＰＣを含む複合体を投与した腫瘍細胞がＨＰＣを含まない複合体を投与した腫瘍細胞と同程度のルシフェラーゼを発現することを示唆し、従って、複合体にＨＰＣが含まれていてもそれらのトランスフェクション特性を阻害しないことを示している。
【００８７】
例３：ＨＰＣを含んでなる複合体のイン・ビボでの腫瘍成長に対する効果
例２に記載の方法で調製した担腫瘍マウスの腫瘍内に、
ｐｃＴＧ２０１、コレステロールおよびプラスミドｐＴＧ１４８３７（４５５７ｂｐ、細胞毒性ポリペプチドをコードする配列を含んでなる：ＩＬ２）、または
ｐｃＴＧ２０１、コレステロール、ＨＰＣおよび空プラスミド、または
ｐｃＴＧ２０１、コレステロール、ＨＰＣおよびｐＴＧ１４８３７
から作製した複合体を含んでなる組成物５０μｌを５回（次の投与の間に３日間の間隔を置く）投与する。２４μｇＤＮＡを、毎回投与する（Ｎ／Ｐ＝０．５，ｐｃＴＧ２０１／コレステロール／ＨＰ＝１／１／２、またはｐｃＴＧ２０１／コレステロール＝１／１）。腫瘍体積は、腫瘍の２つの直角をなしている直径と深さを測定することによってカリパスで測定する（群当たり、１４匹のマウスに投与する）。
【００８８】
結果を、図３および４に示す。それらは、ＨＰＣまたはｐＴＧ１４３８７のみを含んでなる複合体の投与と比較して、ＨＰＣおよびｐＴＧ１４３８７の組合せを含んでなる複合体を投与した後には、腫瘍成長が遅くなることを示している。
【００８９】
これらの結果は、ＨＰＣと、細胞毒性ポリペプチド（すなわち、ＩＬ２）をコードする配列を含んでなる核酸の腫瘍成長に対する相乗効果を明らかに示している。
【００９０】
例４：ＨＰＣおよびＩＬ２をコードする配列を含んでなる核酸を含んでなる組成物のマウス生存率および腫瘍成長に対する効果
Ｂ６Ｄ２雌マウスの側腹部中央に３・１０５個のＲＥＮＣＡ細胞を皮下接種する。１１〜１２日後に、ｐＴＧ１４３８７プラスミド１０μｇ、または０．２％ＨＰＣ、または両者の組合せを５％グルコース溶液に溶解したものを含んでなる組成物５０μｌを、腫瘍内に投与する（群当たり、９匹のマウスに投与）。腫瘍体積を、前記と同様にして測定する。
【００９１】
結果を、図５および６に示す。それらは、ｐＴＧ１４３８７またはＨＰＣを単独で投与した場合と比較して、ｐＴＧ１４３８７およびＨＰＣの組合せを投与した場合には腫瘍成長が遅くなることを示している。この腫瘍成長の減少は、マウスの２２％での長期間生存とも相関している。これらの結果から、ＨＰＣと細胞毒性ポリペプチド（ここでは、ＩＬ２）をコードする配列を含んでなる核酸との相乗効果が明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＰＣの存在または非存在下での、プラスミドｐＴＧ１１２３６、カチオン性脂質ｐｃＴＧ２０１、およびコレステロールを含む複合体のＲＥＮＣＡ腎臓癌細胞に対する細胞毒性の検討。
【図２】
プラスミドｐＴＧ１１２３６、カチオン性脂質ｐｃＴＧ２０１、ＨＰＣまたはＤＯＰＥを含む複合体でトランスフェクションしたマウス腫瘍におけるルシフェラーゼ活性のイン・ビボでの測定。
【図３】
プラスミドｐＴＧ１４３８７の存在または非存在下において、ｐｃＴＧ２０１、コレステロール、ＨＰＣを含んでなる複合体を腫瘍内投与した後のイン・ビボでの腫瘍成長。
【図４】
ｐｃＴＧ２０１、コレステロールおよびプラスミドｐＴＧ１４３８７を、ＨＰＣと共にまたはなしで含んでなる複合体を腫瘍内投与した後のイン・ビボでの腫瘍成長。
【図５】
プラスミドｐＴＧ１４３８７またはＨＰＣ、またはＨＰＣとプラスミドｐＴＧ１４３８７との組合せを腫瘍内投与した後のイン・ビボでの腫瘍成長。
【図６】
プラスミドｐＴＧ１４３８７またはＨＰＣ、またはＨＰＣとプラスミドｐＴＧ１４３８７との組合せを腫瘍内投与した後のマウスの生存率。
【図１】
2004506617.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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