(57)【要約】新規アグレカナーゼタンパク質およびそれらをコードしているヌクレオチド配列ならびにそれらを調製する方法を開示する。アグレカンのデグラデーションにより特徴づけられる疾患の治療のための、アグレカナーゼ酵素のインビターおよび該酵素に対する抗体を開発するための方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）  配列番号５のヌクレオチド＃１−＃２２７０の配列；
ｂ）  配列番号７のヌクレオチド＃１−＃２３３９の配列；
ｃ）  配列番号３のヌクレオチド＃１−＃３８９９の配列；および、
ｄ）  配列番号９のヌクレオチド＃１−＃５００１の配列；
ｅ）  配列番号１１のヌクレオチド＃１−＃３３６９の配列；および
ｆ）  （ａ）〜（ｅ）の天然に生じるヒト対立遺伝子配列および同等の縮重コドン配列：
から選択されるＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子。
【請求項２】
請求項１記載のＤＮＡ分子をその発現コントロール配列と作動可能に連結して含むベクター。
【請求項３】
請求項１のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞。
【請求項４】
請求項２のＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞。
【請求項５】
精製ヒトアグリカナーゼタンパク質を産生する方法であって、
ａ）請求項１記載のＤＮＡ分子で形質転換した宿主細胞を培養すること、および
ｂ）培地から該アグリカナーゼタンパク質を回収および精製すること
を含む方法。
【請求項６】
宿主細胞が昆虫細胞である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ａ）配列番号６のアミノ酸＃１−＃７５６に示すアミノ酸配列；
ｂ）配列番号８のアミノ酸＃１−＃７７９に示すアミノ酸配列；
ｃ）配列番号１０のアミノ酸＃１−＃１０５７に示すアミノ酸配列；
ｄ）配列番号１３のアミノ酸＃１−＃１１２２に示すアミノ酸配列；
ｅ）（ａ）〜（ｄ）の配列の付加、置換、および欠失変異体から成る相同アグリカナーゼタンパク質
から選択されるアミノ酸配列を含む精製アグレカナーゼタンパク質。
【請求項８】
ａ）請求項１記載のＤＮＡ分子で形質転換した細胞を培養すること；および、
ｂ）配列番号６、８、１０、および１３から選択されるアミノ酸配列を含んでいるタンパク質を、該培地から回収および精製すること、
の工程により産生される精製アグレカナーゼタンパク質。
【請求項９】
請求項７記載の精製アグレカナーゼタンパク質に結合する抗体。
【請求項１０】
抗体がアグレカナーゼ活性を阻害する、請求項９記載の抗体。
【請求項１１】
ａ）ｉ）配列番号６またはそのフラグメント；
ｉｉ）配列番号８またはそのフラグメント；
ｉｉｉ）配列番号１０またはそのフラグメント；および、
ｉｖ）配列番号１３またはそのフラグメント
から選択されるアグレカナーゼタンパク質を得ること；
ｂ）アグレカナーゼを潜在的なインヒビターと合わせること；および、
ｃ）潜在的なインヒビターがアグレカナーゼ活性を阻害するかどうかを評価すること、
を含む、アグレカナーゼのインヒビターを同定する方法。
【請求項１２】
潜在的なインヒビターと合わせる前に、三次元構造分析においてアグレカナーゼタンパク質を用いて評価することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
潜在的なインヒビターと合わせる前に、コンピューターに基く薬物設計においてアグレカナーゼタンパク質を用いて評価することを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
請求項９記載の抗体および医薬キャリアを含む、アグレカナーゼのタンパク質分解活性を阻害するための医薬組成物。
【請求項１５】
哺乳動物に、請求項１４記載の組成物の有効量を投与すること、および組成物にアグレカナーゼ活性を阻害せしめることを含む、哺乳動物においてアグレカナーゼを阻害するための方法。
【請求項１６】
組成物を、静脈内、皮下、または筋肉内に投与する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの投与量にて組成物を投与する、請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００１年７月５日に出願された米国仮特許出願第６０／３０３，０５１号および２００２年１月１６日に出願された第６０／３４９，１３３号の優先権の利益による。
【０００２】
発明の分野
本発明は、新規アグレカナーゼ(aggrecanase)分子をコードしているヌクレオチド配列、アグレカナーゼタンパク質、およびそれらを産生する方法の発見に関する。本発明はさらに、アグレカナーゼ酵素のインヒビターならびにその抗体の開発に関する。これらのインヒビターおよび抗体は、骨関節症を含む種々のアグレカナーゼ関連疾患の治療に有用であり得る。
【０００３】
発明の背景
アグレカンは、関節軟骨の主要な細胞外成分である。それは、軟骨に圧縮性および弾力性というその機能特性を付与する原因たるプロテオグリカンである。アグレカンの喪失は、関節疾患における関節軟骨の崩壊に関与している。骨関節症は、少なくとも三千万人のアメリカ人に影響を及ぼしている衰弱性の疾患である(MacLean et al., J Rheumatol 25:2213-8 (1998))。骨関節症は、関節軟骨の崩壊および結果的に生じる慢性痛のために生活の質をかなり低下させ得る。骨関節症のプロセスの初期の、そして重要な特徴は、細胞外マトリックスからのアグレカンの喪失である（Brandt and Mankin, 骨関節炎の病因(Pathogenesis of Osteoarthritis), in Textbook of Rheumatology, WB Saunders Company, Philadelphia, PA, at 1355-1373 (1993)）。アグレカンの大部分のシュガー含有部分がそれにより細胞外マトリックスから喪失され、軟骨の生物力学な特徴の欠損を生じる。
【０００４】
「アグレカナーゼ」と呼ばれるタンパク質分解活性は、骨関節症および炎症性関節疾患に伴う軟骨崩壊において役割を有するアグレカンの切断の原因であると考えられている。ヒト骨関節症軟骨におけるアグレカンのデグラデーションの原因である酵素を同定するための研究が行われてきた。２つの酵素切断部位が、アグレカンの球内ドメイン内に同定されている。１つ（Ａｓｎ３４１−Ｐｈｅ３４２）が、いくつかの公知のメタロプロテアーゼにより切断されることが認められている。Flannery et al., J Biol Chem 267:1008-14 (1992); Fosang et al., Biochemical J. 304:347-351 (1994)。ヒト滑液に見出され、ＩＬ−１誘導性の軟骨アグレカン切断により生じるアグレカンフラグメントは、Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４結合におけるものであり(Sandy et al., J Clin Invest 69:1512-1516 (1992); Lohmander et al., Arthritis Rheum 36: 1214-1222 (1993); Sandy et al., J Biol Chem 266: 8683-8685 (1991))、公知の酵素のいずれもインビボでのアグレカン切断において役割を果たしていないことが示唆される。
【０００５】
近年、ＩＬ−１により刺激された軟骨により合成され、適当な部位でアグレカンを切断する「トロンボスポンジンタイプ１モチーフを有するディスインテグリン−様およびメタロプロテアーゼ」（ＡＤＡＭ−ＴＳ）ファミリー内の２つの酵素、アグレカナーゼ−１（ＡＤＡＭＴＳ４）およびアグレカナーゼ−２（ＡＤＡＭＴＳ−１１）の同一性が同定された(Tortorella et al., Science 284:1664-6 (1999); Abbaszade et al., J Biol Chem 274: 23443-23450 (1999))。これらの酵素は骨関節症のヒト関節軟骨により合成され得る可能性がある。Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４結合にてアグレカンを切断することができ、骨関節症におけるアグレカン切断に寄与し得るＡＤＡＭ−ＴＳファミリーの他の関連する酵素が存在することも予想される。他のアグレカナーゼ酵素を同定し、そしてその活性を遮断する方法を決定する必要がある。
【０００６】
発明の概要
本発明は、アグレカンを切断することができる新規アグレカナーゼタンパク質分子、アグレカナーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列、およびアグレカナーゼの産生のためのプロセスを指向する。これらの酵素は、タンパク質分解性アグレカナーゼ活性を有するとして特徴付けられるものとする。本発明は、これらの酵素を含む組成物をさらに含む。
【０００７】
本発明はさらに、これらの酵素に対する抗体、一態様においては、例えば、アグレカナーゼ活性を遮断する抗体を含む。加えて、本発明は、酵素のタンパク質分解活性を遮断するアグレカナーゼのインヒビターを開発するための方法を含む。これらのインヒビターおよび抗体は、種々のアッセイおよび関節軟骨の崩壊により特徴づけられる疾患の治療のための処置に用いてよい。
【０００８】
本発明により、配列番号５のヌクレオチド＃１〜＃２２７０の配列；配列番号７のヌクレオチド＃１〜＃２３３９；配列番号３のヌクレオチド＃１〜＃３８９９；配列番号９のヌクレオチド＃１〜＃５００４；配列番号１１のヌクレオチド＃１〜＃３３６９；および天然に生じるヒト対立変種配列およびその等価の縮重コドン配列から選択されるＤＮＡ配列を含む単離ＤＮＡ分子が提供される。
【０００９】
本発明はさらに、配列番号６アミノ酸＃１〜＃７５６に示すアミノ酸配列；配列番号８のアミノ酸＃１〜＃７７９；図２（配列番号１０）のアミノ酸＃１〜＃１０５７；図５（配列番号１３）のアミノ酸＃１−＃１１２２から選択されるアミノ酸配列を含む精製アグレカナーゼタンパク質；および配列の付加、置換、および欠失変異体からなる相同アグレカナーゼタンパク質をさらに含む。
【００１０】
本発明により、本発明によるＤＮＡ分子で形質転換された宿主細胞を培養し、次いで該細胞培地から、配列番号６、８、１０、および１３の１つの記載するアミノ酸配列を含むタンパク質を回収および精製するステップにより産生される精製アグレカナーゼタンパク質を産生する方法も提供される。
【００１１】
本発明によりさらに、本発明の精製アグレカナーゼタンパク質に結合する抗体を提供する。配列番号６、８、１０、１３、およびそのフラグメントから選択されるアグレカナーゼタンパク質の使用を含むアグレカナーゼのインヒビターを開発する方法も提供される。
【００１２】
さらに、アグレカナーゼのタンパク質分解活性を阻害するための医薬組成物であって、組成物が、本発明による少なくとも１つの抗体および少なくとも１つの医薬キャリアを含む組成物が提供される。哺乳動物においてアグレカナーゼを阻害する方法であって、哺乳動物に医薬組成物の有効量を投与し、組成物にアグレカナーゼ活性を阻害せしめることを含む方法も提供される。
【００１３】
図面の簡単な記載
図１は、配列番号９に示すアグレカナーゼタンパク質のヌクレオチド配列である。
図２は、配列番号９に示すヌクレオチド配列からコードされるアグレカナーゼタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０）である。
図３は、ＥＳＴ１４の拡張されたヌクレオチド配列（配列番号１１）である。
図４は、配列番号１１のヌクレオチド＃２１３８（７）〜＃２２０６（７）の６９塩基のエキソンインサート（配列番号１２）である。
図５は、配列番号１１の予測されるタンパク質翻訳物（配列番号１３）である。
図６は、配列番号５および追加のエキソンの結果としての２４個のエキストラインフレームアミノ酸を含んでいるアミノ酸配列（配列番号１４）である。
【００１４】
配列の簡単な記載
【表１】
2004533841.tif 000002
【００１５】
【表２】
2004533841.tif 000003
【００１６】
発明の詳細な記載
１．新規アグレカナーゼタンパク質
１つの具体例では、本発明のアグレカナーゼ分子のヌクレオチド配列を配列番号３に、ヌクレオチド＃１〜＃３８９９として示す。ヌクレオチド＃８０−１３４はプロドメインを示すものとする。メタロプロテアーゼドメインは、ヌクレオチド＃１３５−＃２５４；イントロンヌクレオチド＃２５５−＃３１７、ヌクレオチド＃３１８−＃５６０、イントロンヌクレオチド＃５６１−＃１２６４、ヌクレオチド＃１２６５−１３７２、イントロンヌクレオチド＃１３７３−１８０１、およびヌクレオチド＃１８０２−＃１９７６を含む。ディスインテグリンドメインは、ヌクレオチド＃１９７７−＃２２３６を含む。トロンボスポンジンタイプＩドメインは、アミノ酸＃２２３７−＃２４９２を含む。スぺーサー領域は、アミノ酸＃２４９３−＃２６３６、イントロンヌクレオチド＃２６３７−＃２７５９、およびヌクレオチド＃２７６０−＃３２３３を含む。トロンボスポンジンタイプＩサブモチーフは、ヌクレオチド＃３２３４−＃３４１６を含む。本発明はさらに、配列番号３に示す配列の同等の縮重コドン配列ならびにアグレカナーゼ活性を示すそのフラグメントをさらに含む。本発明のアグレカナーゼの全長配列を配列番号３の配列を用いて得て、常套の方法を用いる全配列のスクリーニングのためのプローブを設計してよい。
【００１７】
単離されたアグレカナーゼ様分子のアミノ酸配列を配列番号４にヌクレオチド＃１〜＃８０７として示す。部分的なプロドメインは、アミノ酸＃１−＃１８を含む。推定のＰＡＣＥプロセシング部位は、アミノ酸＃１５−＃１８を含む。推定のメタロプロテアーゼドメインは、アミノ酸＃１９−＃２０９を含む。部分的触媒Ｚｎ結合ドメインは、アミノ酸＃１４５−＃１５５を含む。Ｍｅｔターンはアミノ酸＃１６８である。推定ディスインテグリンドメインは、アミノ酸＃２１０−＃２９８を含む。推定トロンボスポンジンタイプＩドメインは、アミノ酸＃２９９−＃３７７を含む。推定のシステインに富むおよびシステインに乏しいスぺーサードメインは、アミノ酸＃３７８−＃５８６を含む。推定のトロンボスポンジンタイプＩサブモチーフは、アミノ酸＃５８７−＃６４４を含む。アミノ酸＃６４８−＃８０７はイントロン配列である。
本発明はさらに、アグレカナーゼ活性を示している分子をコードするアミノ酸配列のフラグメントを含む。
【００１８】
他の具体例において、胸腺ＤＮＡから誘導される本発明のアグレカナーゼ分子のヌクレオチド配列を、配列番号５のヌクレオチド＃１−＃２２７０に示す。本発明には、スクリーニングのためのプローブを設計するための配列番号５の配列を用いて得られるより長いアグレカナーゼ配列が含まれる。本発明にはさらに、配列番号５に示す配列の等価の縮重コドン配列ならびにアグレカナーゼ活性を示すそのフラグメントが含まれる。
【００１９】
配列番号５に示す胸腺クローンのヌクレオチド配列は、配列番号６のアミノ酸＃１−＃７５６に示すアミノ酸配列をコードする。配列番号６に関してドメインは以下のものとする。プロドメインはアミノ酸＃１−＃８８を含む。推定のＰＡＣＥ部位はアミノ酸ＲＥＲＲ、アミノ酸＃８５−＃８８により示される。メタロプロテイナーゼドメインは、触媒Ｚｎ結合ドメインを＃２６４−２６５に、およびＭｅｔターンを＃２７８に有するアミノ酸＃８９−＃３１７を含む。ディスインテグリンドメインは、アミノ酸＃３１８−＃４０８を含む。トロンボスポンジンタイプＩドメインは、アミノ酸＃４０９−＃４８７を含む。システインに富むおよびシステインが乏しいスペーサードメインは、アミノ酸＃４８８−＃６９５を含む。推定トロンボスポンジンタイプＩサブモチーフは、アミノ酸＃６９６−＃７５２を含む。本発明はさらに、アグレカナーゼ活性を示す分子をコードする配列番号６に示すアミノ酸配列のフラグメントを含む。
【００２０】
さらなる具体例において、肝臓ＤＮＡから誘導された本発明のアグレカナーゼ分子のヌクレオチド配列を配列番号７のヌクレオチド＃１−＃２３３９に示す。本発明は、スクリーニングのためのプローブを設計するための配列番号７の配列を用いて得られるより長いアグレカナーゼ配列を含む。本発明はさらに、配列番号７に示す配列の等価の縮重コドン配列ならびにアグレカナーゼ活性を示すそのフラグメントを含む。本発明はさらに、アグレカナーゼ活性を示している分子をコードする配列番号８に示すアミノ酸配列のフラグメントを含む。
【００２１】
配列番号７に示すヌクレオチド配列は、配列番号８のアミノ酸＃１−＃７７９に示すアミノ酸配列をコードする。この配列は、スペーサードメイン中に見出されるアミノ酸＃５７８−＃６０１をコードしている６９塩基の挿入を含む。ドメインは以下のようであるとする。プロドメインは、アミノ酸＃１−＃８８を含む。推定ＰＡＣＥ部位はアミノ酸ＲＥＲＲ、アミノ酸＃８５−＃８８により示される。メタロプロテイナーゼドメインは、触媒Ｚｎ結合ドメインを＃２６４−２６５に、およびＭｅｔターンを＃２７８に有するアミノ酸＃８９−＃３１７を含む。ディスインテグリンドメインは、アミノ酸＃３１８−＃４０８を含む。トロンボスポンジンタイプＩドメインは、アミノ酸＃４０９−＃４８７を含む。システインに富むおよびシステインが乏しいスペーサードメインは、アミノ酸＃４８８−＃５７７および＃６０２−＃７１８を含む。推定トロンボスポンジンタイプＩサブモチーフは、アミノ酸＃７１９−＃７７６を含む。
【００２２】
さらなる具体例において、本発明のアプリカナーゼ分子のヌクレオチド配列を、配列番号９のヌクレオチド＃１−＃５００４に示す。本発明はさらに、配列番号９に示す配列の等価の縮重コドン配列ならびにアグレカナーゼ活性を示すそのフラグメントを含む。
【００２３】
配列番号９に示すヌクレオチド配列は、配列番号１０のアミノ酸＃１−＃１０５７に示すアミノ酸配列をコードする。プロドメインは、アミノ酸＃１（Ｒ）〜＃１５８（Ｒ）を含むものとする（図２において推定ＰＡＣＥプロセシング部位に下線を引く）。推定のメタロプロテアーゼドメインは、触媒Ｚｎ結合ドメインを＃３２４−３３５に、Ｍｅｔターンを＃３４７に有するアミノ酸１５９（Ｎ）〜３７８（Ｋ）を含む。推定ディスインテグリンドメインは、アミノ酸＃３７９（Ｖ）〜＃４７８（Ｄ）を含む。推定トロンボスポンジンタイプＩドメインは、アミノ酸＃４７９（Ｇ）〜＃５５７（Ｌ）を含む。推定のシステインに富むおよびシステインに乏しいスペーサードメインは、アミノ酸＃５５８（Ｌ）〜＃７６０（Ｑ）を含む。推定のトロンボスポンジンタイプＩサブモチーフ（４）は、アミノ酸＃７６１（Ｄ）〜＃９９０（Ｃ）を含む。推定のＰＬＡＣドメインは、（パピリン、ラクニン、ＰＡＣＥ４、およびＰＣ５／６プロテアーゼならびにＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ３、ＡＤＡＭＴＳ１０、ＡＤＡＭＴＳ１２、およびＡＤＡＭＴＳ１６のＣ末端に見出される）アミノ酸＃９９１（Ｎ）〜＃１０５７（Ｓ）を含む。本発明はさらに、アグレカナーゼ活性を示している分子をコードする配列番号１０に示すアミノ酸配列のフラグメントを含む。
【００２４】
さらなる具体例において、本発明のアグレカナーゼ分子のヌクレオチド配列を、配列番号１１のヌクレオチド＃１−＃３３６９に示す。本発明はさらに、配列番号１１に示す配列の等価の縮重コドン配列ならびにアグレカナーゼ活性を示すそのフラグメントを含む。
【００２５】
配列番号１１に示すヌクレオチド配列は、配列番号１３のアミノ酸＃１−＃１１２２に示すアミノ酸配列をコードする。推定リーダー配列は、アミノ酸＃１（Ｍ）〜＃２１（Ｇ）を含む。推定プロドメインは、アミノ酸＃２２（Ｌ）〜＃２２３（Ｒ）を含む（図５において、推定ＰＡＣＥプロセシング部位を下線で示す）。アミノ酸＃２４４（Ｍ）は、Ｎ末端代替スプライス変種の推定第一ｍｅｔである。推定メタロプロテイナーゼドメインは、触媒Ｚｎ結合ドメインを＃３８９−４００に、Ｍｅｔターンを＃４１３に有するアミノ酸＃２２４（Ｎ）〜＃４４３（Ｋ）を含む。推定ディスインテグリンドメインは、アミノ酸＃４４４（Ｖ）〜＃５４３（Ｄ）を含む。推定トロンボスポンジンタイプＩドメインは、アミノ酸＃５４４（Ｇ）〜＃５２２を含む。推定のシステインに富むおよびシステインの乏しいスペーサドメインは、アミノ酸＃５２３（Ｌ）〜＃８３０（Ｉ）を含む。推定トロンボスポンジンタイプＩサブモチーフ（４）は、アミノ酸＃８３１（Ｗ）〜＃１０５５（Ｃ）を含む。推定ＰＬＡＣドメインは、アミノ酸＃１０５６（Ｎ）〜＃１０２２（Ｓ）を含む。ＮｘＳ／Ｔｘ推定Ｎ結合グリコシル化は、アミノ酸＃１６７−１６９（ＮＮＳ）、＃８１２−８１４（ＮＲＴ）、＃８１７−８１９（ＮＱＳ）、アミノ酸＃８５９−８６１（ＮＫＴ）、アミノ酸＃８６６−８６８（ＮＤＳ）、およびアミノ酸＃９２１−９２３（ＮＧＴ）を含む。本発明は、さらに、アグレカナーゼ活性を示している分子をコードする配列番号１３に示すアミノ酸配列のフラグメントを含む。
【００２６】
本発明は、全長のアグレカナーゼ分子を得るための方法、この方法により得られるＤＮＡ配列、およびそれによりコードされるタンパク質を含む。全長配列の単離のための方法は、配列番号３、５、７、９、および１１に示すアグレカナーゼ配列を用いて、スクリーニングのためのプローブを設計すること、またはそれ以外には、当業者に公知の標準的な方法を用いてスクリーニングすることに関する。プローブを設計するために好ましい配列は、配列番号５または７のより長い配列である。
【００２７】
ヒトのアグレカナーゼタンパク質またはそのフラグメントは、配列番号３、５、７、９、および１１から選択されるＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養し、次いで培地から、同時に産生される他のタンパク質物質を実質上含まない、配列番号４、６、８、１０、および１３の少なくとも１つに示すアミノ酸配列により特徴付けられるタンパク質を回収および精製することにより製造されてよい。哺乳動物細胞における製造のために、ＤＮＡ配列はさらに、アグレカナーゼ酵素をコードしているヌクレオチド配列にインフレーム結合した適当なペプチド５’をコードしているＤＮＡ配列を含む。
【００２８】
前記の方法により産生されたヒトアグレカナーゼタンパク質は、アグレカンを切断する能力を有すること、および天然に生じる対立変種、および他の変種を含む、配列番号４、６、８、１０、または１３のアミノ酸配列の配列番号４、６、８、１０、または１３の変種（ここで、タンパク質は、アグレカナーゼタンパク質に特徴的なアグレカン切断能力を保持する）から選択されるアミノ酸配列を有することにより特徴づけられる。好ましいタンパク質は、配列番号４、６、８、１０、または１３に示すアミノ酸配列に少なくとも約８０％相同な、およびより好ましくは少なくとも約９０％相同なタンパク質を含む。最終的に、アミノ酸の変化が変異形成、化学的変異により、またはタンパク質を産生するために用いられるＤＮＡ配列の変更により（ここで、ペプチド配列はアグレカナーゼ活性を依然として有する）誘導される、配列番号４、６、８、１０、または１３の配列の対立変種または他の変種も本発明に含まれる。本発明は、アグレカナーゼタンパク質の活性を保持する配列番号４、６、８、１０、または１３のアミノ酸配列のフラグメントも含む。
【００２９】
ＩＩ．相同アグレカナーゼタンパク質およびそれをコードしているＤＮＡの同定
さらなるヒト配列および他の種がヒトアグレカナーゼ酵素に相同なＤＮＡ配列を有することが期待される。本発明はそれゆえ、他のアグレカナーゼタンパク質をコードしているＤＮＡ配列を得るための方法、これらの方法により得られるＤＮＡ配列、およびこれらのＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質を含む。この方法は、本発明のヌクレオチド配列またはその部分を用いて、他の種からの対応する遺伝子、またはそのコーディング配列またはフラグメントに関するライブラリーを標準的な方法を用いてスクリーニングするためのプローブを設計することを包含する。つまり、本発明は、ヒトアグレカナーゼタンパク質に対して相同な、そしてヒト配列を用いて得ることができる他の種からのＤＮＡ配列を含んでよい。本発明はさらに、アグレカナーゼタンパク質の機能フラグメント、およびそのような機能フラグメントをコードしているＤＮＡ配列、ならびに他の関連するタンパク質の機能フラグメントを含んでよい。そのようなフラグメントが機能する能力は、アグレカナーゼタンパク質のアッセイに関して記載する生物学的アッセイに関するタンパク質のアッセイにより測定する。
【００３０】
例えば、配列番号２０のアミノ酸の翻訳を、データベースＴＲＥＭＢＬ、スイスプロット、ＮＣＢＩ ＮＲ、ＰＩＲ、およびＢＬＡＳＴＰ２．２．２サーチにおけるｇｅｎｅｓｅｑｐに対する質問に用いた。いくつかの配列が配列番号２０と類似し、スプライシングまたはインコンプリート配列によってのみ異なることが同定された。これらの配列は、以下の受入番号により同定した：ＡＡＥ１０３５０、ＡＡＥ１０３４７、ＡＡＵ７２８９４、ＡＡＥ１０３４９、ＡＡＥ１０３４８。これらの配列は、ＡＤＡＭＴＳの同じファミリーの全部分であると考えられる。このファミリーの１つのメンバーは、その最も近いファミリーメンバーとしてＡＤＡＭＴＳ１９を有すると考えられるＡＤＡＭＴＳ１７として公開されている。ＡＤＡＭＴＳ１７のクローニングは、Cal, S., et al., Gene, 283 (1-2), 49-62 (2002)に記載されている。
【００３１】
配列番号１１を、ＢＬＡＳＴＮ２．２．２を用いるｇｅｎｅｓｑｎデータベースに対する質問として用いた。配列番号１１がいくつかの公開された配列と（可変スプライシングまたはインコンプリート配列を有して）同一性を有すると決定された。例えば、公開された配列は、ＥＰ−Ａ２−１１３４２８６（ＡＡＤ１７４９８、ＡＡＤ１７４９９、ＡＡＤ１７５００、ＡＡＤ１７５０１、およびＡＡＤ１７５０２）およびＷＯ２０／０１８３７８２（ＡＡＳ９７１７７）に例証した。
【００３２】
相同の、非ヒト配列のいくつかの例には、マウス配列２０８３４２０６（ＮＣＢＩ ＮＲデータベースに見出された）、ラットの配列１３２４２３１６（ＮＣＢＩ ＮＲデータベースに見出された）、虫の配列ＡＡＹ５３８９８（ｇｅｎｅｗｅｑｐ１データベースに見出された）、およびウシの配列１１１３１２７２（ＮＣＢＩ ＮＲデータベースに見出された）が含まれる。非ヒト種からのこれらの配列は、ヒトのアグレカナーゼ酵素に相同であると予想される。
【００３３】
本明細書中に提供されるアグレカナーゼタンパク質には、配列番号３、５、７、９、または１１の配列と同様の配列であるが、変更または欠失が天然に提供されたまたは伝達によりそれらを操作した配列（例えば、タンパク質にアミノ酸変化を生じ得るヌクレオチド配列の対立変種など）によりコードされるファクターも含まれる。例えば、合成タンパク質は、配列番号４、６、８、１０、または１３のアミノ酸残基の完全または部分的に重複する連続配列であってよい。これらの配列は、一次、二次、または三次構造および配置特性がアグレカナーゼタンパク質と共通しているので、それと共通の生物学的特徴を有し得る。例えば、多くの保存的アミノ酸置換が、タンパク質の構造および配置を有意に変更することなく可能であり、こうして生物学的特性も維持されることが公知である。例えば、保存的アミノ酸置換は、リジン（LysまたはK)、アルギニン(ArgまたはR)、およびヒスチジン(HisまたはH)などの塩基性側鎖を有するアミノ酸の間で、アスパラギン酸(AspまたはD)およびグルタミン酸(GluまたはE)などの酸性側鎖を有するアミノ酸；アスパラギン(AsnまたはN)、グルタミン(GlnまたはQ)、セリン(SerまたはS)、トレオニン(ThrまたはT)、およびチロシン(TyrまたはY)などの非荷電極性側鎖を有するアミノ酸；およびアラニン(AlaまたはA)、グリシン(GlyまたはG)、バリン(ValまたはV)、ロイシン(LeuまたはL)、イソロイシン(IleまたはI)、プロリン(ProまたはP)、フェニルアラニン(PheまたはF)、メチオニン(MetまたはM)、トリプトファン(TrpまたはW)、およびシステイン(CysまたはC)などの無極性側鎖を有するアミノ酸の間でなされてよい。つまり、ネイティブのアグレカナーゼのこれらの変更および欠失を、天然に生じるアグレカナーゼの生物学的活性置換として、および治療プロセスにおけるインヒビターまたは他のタンパク質の開発に用いてよい。アグレカナーゼの所定の変種がアグレカナーゼの生物活性を維持するかどうかは、アグレカナーゼとアグレカナーゼ変種ならびにそのインヒビターを、実施例に記載するアッセイに供することにより容易に決定することができる。
【００３４】
本明細書中に記載するアグレカナーゼタンパク質の配列の他の特定の変異には、グリコシル化部位の変更が含まれる。これらの変更には、Ｏ−結合またはＮ−結合グリコシル化部位が関与し得る。例えば、グリコシル化または部分的なグリコシル化の不在が、アスパラギン−結合グリコシル化認識部位のアミノ酸置換または欠失から生じる。アスパラギン結合グリコシル化認識部位は、適当な細胞グリコシル化酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列を含む。これらのトリペプチド配列は、アスパラギン−Ｘ−トレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリンのいずれかであり、ここで、Ｘは通常いずれかのアミノ酸である。グリコシル化認識部位の第一または第三アミノ酸位の１つまたは両方における多様なアミノ酸置換または欠失（および／または第二位でのアミノ酸欠失）により、変更されたトリペプチド配列における非グリコシル化を生じる。加えて、アグレカナーゼ関連タンパク質の細菌における発現によっても、例えばグリコシル化部位は変化しないままであっても、非グリコシル化タンパク質が産生される。
【００３５】
ＩＩＩ．新規アグレカナーゼヌクレオチド配列
本発明のさらなる態様は、アグレカナーゼタンパク質分解活性またはアグレカナーゼの他の開示される活性を有するアグレカナーゼタンパク質の発現をコードしているＤＮＡ配列である。そのような配列には、配列番号３、５、７、９、および１１に示す５’から３’方向のヌクレオチド配列および、遺伝子コードの縮重を除いて、配列番号３、５、７、９、および１１のＤＮＡ配列と同一であり、そしてアグレカナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列が含まれる。
【００３６】
配列番号１、３、５、７、９、および１１のＤＮＡ配列とストリンジェント条件下にハイブリダイズし、アグレカンを切断する能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、さらに本発明に含まれる。好ましいＤＮＡ配列には、ストリンジェント条件下にハイブリダイズするものが含まれる（Maniatisら、分子クローニング（研究室マニュアル）、Cold Spring Harbor Laboratory, at 387-389 (1982)）。そのようなストリンジェント条件には、例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃が含まれる。そのようなＤＮＡ配列は、配列番号３、５、７、９、または１１に示す配列と少なくとも約８０％相同である、およびより好ましくは少なくとも約９０％相同であるタンパク質をコードすることが一般に好ましい。最終的に、配列番号１、３、５、７、９、または１１の配列の対立変種または他の変種も、そのようなヌクレオチドの変化がペプチド配列に変化を生じようと生じまいと、ペプチド配列がアグレカナーゼ活性を依然として有している場合には、本発明に含まれる。本発明には、アグレカナーゼの活性を保持するタンパク質をコードする配列番号１、３、５、７、９、または１１に示すＤＮＡ配列のフラグメントも含まれる。
【００３７】
同様に、配列番号３、５、７、９、または１１の配列によりコードされるアグレカナーゼタンパク質、または配列番号４、６、８、１０、または１３のアミノ酸配列を含むが、遺伝子コードの縮重または対立変種（アミノ酸変化を生じ得るまたは生じ得ない、種において天然に生じる塩基変化）のためにコドン配列が異なるアグレカナーゼタンパク質をコードするＤＮＡ配列も、本明細書中に記載される新規ファクターをコードする。点突然変異により、またはコードされるタンパク質の活性、半減期、または産生を高めるための誘導性変更（挿入、欠失、および置換を含む）により引き起こされる配列番号３、５、７、９、または１１のＤＮＡ配列の変化も、本発明に包含される。
【００３８】
本発明のＤＮＡ配列は、例えば、所定の細胞集団におけるアグレカナーゼをコードしているｍＲＮＡの検出のためのプローブとして有用である。つまり、本発明には、アグレカナーゼが関与する遺伝子疾患、またはアグレカナーゼが異常に転写または発現された細胞性、器官性、または組織性疾患を含む疾患を検出または診断する方法が含まれる。アンチセンスＤＮＡ配列も、遺伝子治療における適用のためのベクターを調製するのに有用であり得る。アンチセンスＤＮＡ配列は、細胞へアンチセンスＤＮＡを誘導するためのインビボ法、ネイティブな配列とのアンチセンスＤＮＡの相互作用を研究するためのインビボ法、およびどれだけのアンチセンスＤＮＡが産生されたかの指標として細胞におけるアンチセンスＤＮＡの相互作用を研究することにより、ベクターにおいてアンチセンスＤＮＡに作用的に結合したプロモーターの能力を試験するためのインビボ法においても有用である。
【００３９】
本発明のさらなる態様には、そのための発現コントロール配列と作用的に結合した前記のＤＮＡ配列を含むベクターが含まれる。これらのベクターは、アグレカナーゼタンパク質をそのための発現コントロール配列と作用的に結合したＤＮＡ配列で形質転換した細胞を、適当な細胞培地中で培養し、次いでアグレカナーゼタンパク質をそれから回収および精製する、本発明のアグレカナーゼタンパク質を産生するための新規方法に用いてよい。このプロセスは、タンパク質発現のための宿主細胞として、原核細胞および真核細胞両方の多数の公知細胞を用いてよい。ベクターは、遺伝子治療における適用に用いてよい。そのような使用では、ベクターをエキソビボにて患者の細胞へとトランスフェクトしてよく、および細胞を患者へと再導入してよい。別法として、ベクターは患者に、ターゲットトランスフェクションによりインビボで導入してよい。
【００４０】
ＩＶ．アグレカナーゼタンパク質の産生
本発明の他の態様により、新規アグレカナーゼタンパク質を産生するための方法が提供される。本発明の方法は、公知の調節配列のコントロール下に本発明のアグレカナーゼタンパク質をコードしているＤＮＡ配列で形質転換した適当な細胞株を、培養することを含む。形質転換した宿主細胞を培養し、アグレカナーゼタンパク質を培地から回収および精製する。精製タンパク質は、同時産生される他のタンパク質ならびに他の混入物質から実質上分離している。回収した精製タンパク質は、タンパク質分解アグレカナーゼ活性を示し、アグレカンを切断すると考えられる。つまり、本発明のタンパク質は、アグレカン変性分子の存在を測定するアッセイにおけるアグレカナーゼタンパク質分解活性を示す能力により、さらに特徴づけ得る。これらのアッセイおよびその開発は、当業者の知識の範囲内にある。そのようなアッセイは、アグレカン基質をアグレカナーゼ分子と接触させること、次いでアグレカンフラグメントの産出をモニターすることを含んでよい（例えば、Hughes et al., Biochem J 305: 799-804 (1995); Mercuri et al, J Bio Chem 274:32387-32395 (1999)を参照されたい）。
【００４１】
適当な細胞または細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞であってよい。適当な哺乳動物宿主細胞の選択、および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、生成物の産生および精製のための方法は、当該分野で公知である。（例えば、Gething and Sambrook, Nature, 293:620-625 (1981); Kaufman et al, Mol Cell Biol, 5(7):1750-1759 (1985); Howley et al, U.S. Patent 4,419,446.を参照されたい。）本明細書中の実施例に記載する他の適当な哺乳動物細胞株は、サルのＣＯＳ−１細胞株である。哺乳動物細胞ＣＶ−１が適当であり得る。
【００４２】
細菌細胞も適当な宿主であり得る。例えば、イー．コリの種々の株（例えば、ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１）がバイオテクノロジーの分野において宿主細胞として周知である。ビー．サブチリス、シュードモナス、他のバシリ(bacilli)などの種々の株も、本方法に用いてよい。細菌細胞におけるタンパク質の発現のためには、アグレカナーゼのプロペプチドをコードしているＤＮＡは、一般的に必要でない。
【００４３】
当業者に公知の多くの酵母細胞株を、本発明のタンパク質の発現のための宿主細胞として用い得る。さらに、所望のように、昆虫細胞を本発明の方法において、宿主細胞として用いてよい。例えば、Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298 (Plenum Press 1986)を参照されたい。
【００４４】
本発明の他の態様により、これら新規アグレカナーゼタンパク質の発現の方法における使用のためのベクターが提供される。好ましくは、ベクターは、本発明の新規ファクターをコードする前記の完全な新規ＤＮＡ配列を含む。さらに、ベクターは、アグレカナーゼタンパク質配列の発現を可能とする適当な発現コントロール配列を含む。別法として、前記のごとく変更された配列を組み込んでいるベクターも本発明の態様である。加えて、配列番号３、５、７、９、または１１の配列、またはアグレカナーゼタンパク質をコードしている他の配列を操作して、合成のアグレカナーゼタンパク質を発現させることができる。つまり、本発明には、他のアグレカナーゼタンパク質をコードしているＤＮＡ配列に対して正確なリーディングフレームにて結合した配列番号３、５、７、９、または１１からのフラグメントを含んでいるアグレカナーゼタンパク質をコードしているキメラＤＮＡ分子が含まれる。
【００４５】
ベクターは、細胞株を形質転換させる方法に用いてよく、および選択される宿主細胞においてその複製および発現を指向することができる、本発明のＤＮＡコーディング配列と作用的に結合した選択調節配列を含んでよい。そのようなベクターのための調節配列は当該分野の専門家に公知であり、宿主細胞に依存して選択されてよい。そのような選択はルーチンであり、本発明の部分を形成しない。
【００４６】
Ｖ．抗体の産生
本発明の精製タンパク質を用いて、アグレカナーゼおよび／または他のアグレカナーゼ関連タンパク質に対するモノクローナルまたはポリクローナルいずれかの抗体を、抗体産生のための当該分野で公知の方法を用いて産生してよい。つまり、本発明には、アグレカナーゼまたは他の関連タンパク質に対する抗体も含まれる。抗体には、アグレカナーゼ活性を遮断するものおよび遮断しないものの両方が含まれる。抗体は、アグレカナーゼまたは関連タンパク質の検出および／または精製に有用であり、またはアグレカナーゼの作用を阻害または予防するのに有用であり得る。本発明のアグレカナーゼまたはその部分を用いて、アグレカナーゼに特異的に結合する抗体を調製してよい。
【００４７】
本発明に用いる「抗体」なる用語は、免疫グロブリンまたはその部分を意味し、源、製造法、および特徴に関わらず、抗原結合部位を含んでいるあらゆるタンパク質を包含する。該用語には、制限されるものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、モノ特異的、ポリ特異的、非特異的、ヒト化、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異、ＤＣＲ−移殖抗体が含まれる。他を記載しない限り、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、および抗原結合機能を保持する他の抗体フラグメントなどの抗体フラグメントも含まれる。
【００４８】
抗体は、例えば、常套のハイブリドーマ法（Kohler and Milstein, Nature 256:495-499 (1975)）、組換えＤＮＡ法（米国特許第4,816,567号）、または抗体ライブラリーを用いるファージディスプレイ法(Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991))により産生することができる。種々の他の抗体産生法に関しては、抗体：研究室マニュアル、eds. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1988)を参照されたい。
【００４９】
抗体は、抗体が少なくとも１つの新規アグレカナーゼ分子以外の分子に対して有意な結合を全く示さない場合、本発明の少なくとも１つの新規アグレカナーゼ分子に「特異的に」結合する。該用語は、抗原結合ドメインが、多くの抗原が有する特定のエピトープに特異的である場合にも適用可能であり、この場合、抗原結合ドメインを有する特異的結合メンバー（抗体）は、エピトープを有する種々の抗原に結合することができる。この様式で、本発明の抗体は、複数の新規なアグレカナーゼタンパク質に結合することができる。典型的には、結合は、アフィニティ定数Ｋａが１０８Ｍ−１よりも高い場合に特異的であると考えられる。抗体は、適当に選択された条件下で、そのような結合が実質上阻害されず、一方では同時に非特異的結合が阻害されるならば、抗原に対して「特異的に結合する」または「特異的に反応する」と言う。そのような条件は当該分野で周知であり、当業者は通常の方法を用いて適当な条件を選択することができる。条件は、抗体の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合を可能とする時間、非関連分子（例えば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）の濃度などに関して通常規定される。
【００５０】
タンパク質は、疎水性であるセクションおよび親水性であるセクションを含む所定の生化学的特性を有することが公知である。疎水性セクションは、タンパク質の構造の内部に位置していることが最も多いが、親水性セクションは、タンパク質の構造の外部に位置していることが最も多い。タンパク質の親水性領域は従って、タンパク質における抗原領域に対応すると考えられる。配列番号１１の疎水性は、ＧＣＧ ＰｅｐＰｌｏｔを用いて決定した。結果は、ｎ−末端がおそらくはシグナル配列のために疎水性であることを示した。
【００５１】
ＶＩ．インヒビターの開発
骨関節症などの種々の疾患がアグレカンのデグラデーションにより特徴づけられることが公知である。それゆえ、アグレカンを切断する本発明のアグレカナーゼタンパク質は、アグレカナーゼのインヒビターの開発に有用であり得る。本発明によりそれゆえ、アグレカナーゼインヒビターを含んでいる組成物が提供される。インヒビターは、後でアグレカンに暴露する、アグレカン基質とインヒビターを含む混合物が関与するスクリーニングアッセイにおいて、アグレカナーゼを用いて開発し得る。インヒビターは、インヒビターのライブラリーをスクリーニングすることによるなどの、高処理量のプロセスを用いてスクリーニングすることができる。インヒビターは、三次元の構造分析および／またはコンピューターに基く薬物設計を用いて作製することもできる。組成物は、骨関節症およびアグレカンのデグラデーションを示している他の疾患の治療に用いてよい。
【００５２】
本方法は、アグレカナーゼおよびアグレカンの三次元構造に基き結合部位を決定することおよび結合部位と反応する分子を開発することを包含し得る。候補分子を阻害活性に関してアッセイする。アグレカナーゼ分子のインヒビターを開発するためのさらなる標準的な方法は、当該分野の専門家に公知である。インヒビターに関するアッセイには、アグレカンおよびインヒビターの混合物をアグレカナーゼ分子と接触させた後、例えば、アグレカナーゼ感受性部位における切断により作製されるアグレカンフラグメントを検出および測定することにより、アグレカナーゼ阻害の測定を行うことを含む。インヒビターは、タンパク質または小分子であってよい。
【００５３】
ＶＩＩ．投与
本発明の他の態様により、それゆえ、アグレカナーゼ抗体および／またはインヒビターの治療有効量を医薬上許容されるビヒクル中に含んでいる医薬組成物が提供される。アグレカナーゼにより媒介される軟骨細胞におけるアグレカンのデグラデーションは、骨関節症および他の炎症疾患に関与している。それゆえ、本発明のこれらの組成物を、アグレカンのデグラデーションおよび／またはアグレカナーゼのアップレギュレーションにより特徴づけられる疾患の治療に用いてよい。組成物は、これらの疾患の治療に、またはその予防に用いてよい。
【００５４】
本発明には、アグレカンのデグラデーションにより特徴づけられる疾患に罹患している患者を治療する、またはそのような疾患を予防するための方法を含む。本発明によるこれらの方法には、そのような治療を必要としている患者へ、アグレカナーゼ抗体またはアグレカナーゼ酵素のタンパク質分解活性を阻害するインヒビターを含む組成物の有効量を投与することを含む。
【００５５】
本発明の抗体およびインヒビターは、ヒトまたは動物における種々の医学的疾患を予防、診断、または治療するのに有用である。一つの具体例において、抗体は、同じ抗体が結合していないアグレカナーゼタンパク質と比較して、アグレカナーゼタンパク質に伴う１つまたはそれ以上の活性を阻害または低下させるのに用いることができる。最も好ましくは、抗体およびインヒビターは、抗体が結合していないアグレカナーゼと比較して、アグレカナーゼの活性の１つまたはそれ以上を阻害または低下させる。所定の具体例において、アグレカナーゼの活性は、ここに開示する抗体の１つまたはそれ以上が結合する場合、ここに開示する抗体の１つまたはそれ以上が結合していないアグレカナーゼタンパク質に対して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７６、７８、８０、８２、８４、８６、または８８％、より好ましくは少なくとも９０、９１、９２、９３、または９４％、およびいっそうより好ましくは少なくとも９５％〜１００％を阻害する。
【００５６】
一般に、組成物は、抗体/その結合フラグメントが、１μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ/ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１０μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、および５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲の投与量にて投与されるように投与する。好ましくは、抗体はボーラス投与にて投与して、投与後最大限の時間に関して、循環している抗体のレベルを最大にする。継続注入も、ボーラス投与後に用いてよい。
【００５７】
他の具体例にて、およびタンパク質および小分子などのインヒビターの投与に関して、インヒビターの有効量は、アグレカナーゼの活性を低下させて所望の生物学的成果を得るのに有効な投与量である。一般に、インヒビターを投与するための適当な治療的投与量は、５ｍｇ〜１００ｍｇ、１５ｍｇ〜８５ｍｇ、３０ｍｇ〜７０ｍｇ、または４０ｍｇ〜６０ｍｇの範囲であってよい。インヒビターは、１回投与にて、または１日１回、週１回、および月１回といった間隔にて投与することができる。投与スケジュールは、アグレカナーゼターゲットに対するインヒビターのアフィニティ、インヒビターの半減期、および患者の症状の重篤度によって調整することができる。一般に、インヒビターは、ボーラス投与として投与して、インヒビターの循環レベルを最大にする。継続注入もボーラス投与後に用いてよい。
【００５８】
そのような化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致命的な投与量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療上有効な投与量）を決定するための、細胞培養物または実験動物において標準的な医薬的方法により、決定することができる。毒性および治療効果の間の投与比が治療指数であり、それは比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表現することができる。大きな治療指数を示す抗体およびインヒビターが好ましい。
【００５９】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータを、ヒトにおける使用のための一連の投与量を処方するのに用いることができる。そのような化合物の投与量は、好ましくはほとんどまたは全く毒性を持たないＥＤ５０を含む循環濃度内である。投与量は、用いられる投与形態および用いられる投与経路に依存してこの範囲内で変化してよい。本発明に用いるあらゆる抗体およびインヒビターに関して、治療的有効投与量は、細胞培養アッセイからまず見積もることができる。投与量を動物モデルにおいて処方して、細胞培養物にて決定されるＩＣ５０（即ち、症状の半−最大阻害を達成する試験抗体の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成してよい。血漿におけるレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーなどにより測定してよい。いずれかの特定の投与量の効果は、適当な生物アッセイによりモニターすることができる。適当なバイオアッセイの例には、ＤＮＡ複製アッセイ、転写に基くアッセイ、ＧＤＦタンパク質／レセプター結合アッセイ、クレアチンキナーゼアッセイ、前肥満細胞の分化に基くアッセイ、肥満細胞におけるグルコースの取り込みに基くアッセイ、および免疫学的アッセイが含まれる。
【００６０】
本発明の治療法には、アグレカナーゼインヒビター組成物を、局所、全身、またはインプラントまたはディバイスのような局所にて、投与することが含まれる。投与管理は、アグレカナーゼタンパク質の活性を変更する種々のファクターを考慮する主治医、病理部位、疾患の重篤度、患者の年齢、性、および食事、あらゆる炎症の重篤度、投与の時間、および他の臨床ファクターにより決定する。一般に、全身または注射可能な投与は、最低限有効である投与量にて開始し、投与量は、ポジティブな効果が認められるまで、予め選択した時間経過に渡って増す。従って、投与量のインクレメンタルな増加は、そのようなインクレメンタルな増加を対応する効果の増加を生じるようなレベルへと制限する一方で、生じ得るあらゆる副作用を考慮に入れて為す。他の公知のファクターを最終組成物へ加えることで、投与に影響を与えてよい。
【００６１】
進行は、疾患の進行の定期的な評価によりモニターすることができる。進行は、例えば、ｘ−線、ＭＲＩ、または他の画像化モダリティ、滑液分析、患者の認知、および／または臨床試験によりモニターすることができる。
【００６２】
ＶＩＩＩ．検出のアッセイおよび方法
本発明のインヒビターおよび抗体は、サンプル中のアグレカナーゼの存在または不在を測定するための、またはそれを定量するためのアッセイおよび検出法に用いることができる。本発明のインヒビターおよび抗体を用いて、インビボまたはインビトロでアグレカナーゼタンパク質を検出してよい。これらのタンパク質の存在またはレベルを医学的疾患と関連づけることにより、当業者は、関連する医学的疾患を診断し、またはその重篤度を決定することができる。ここに開示するインヒビターおよび抗体により診断し得る医学的症状は、前記のごとくである。
【００６３】
抗体を用いる使用のためのそのような検出法は、当該分野で周知であり、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、免疫ブロット、ウェスタンブロット、免疫蛍光法、免疫沈降法、および他の匹敵する方法が含まれる。抗体は、タンパク質（例えば、アグレカナーゼタンパク質）を検出するためのこれらの方法の１つまたはそれ以上を導入する診断キットに、さらに提供してよい。そのようなキットは、タンパク質の検出におよびキットの使用に役立つ他の成分、パッケージング、説明書、または他の物質を含んでよい。タンパク質インヒビターをそのようなアッセイに用いる場合、タンパク質−タンパク質相互作用アッセイを用いることができる。
【００６４】
抗体およびインヒビターが診断のために意図される場合、例えば、リガンド群（ビオチンなど）または検出可能なマーカー群（蛍光群、放射性同位元素群、または酵素など）でそれらを修飾することが望まれてよい。所望により、抗体（ポリクローナルまたはモノクローナルいずれか）は、常套法を用いて標識してよい。適当な標識には、フルオロフォア、クロモフォア、放射能活性原子、電子密度試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドが含まれる。酵素は、典型的にはその活性により検出する。例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼは、スペクトロフォトメーターにて検出可能な、テトラメチルベンズイジン（ＴＭＢ）を青色色素に変換するその能力により検出することができる。他の適当な結合パートナーには、ビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジン、ＩｇＧおよびタンパク質Ａ、および当該分野で公知の多くのレセプター−リガンド結合体が含まれる。
【００６５】
実施例
実施例１：ＤＮＡの単離
潜在的な新規アグレカナーゼファミリーのメンバーを、データベーススクリーニングアプローチを用いて同定した。アグレカナーゼ−１（Science 284:1664-1666 (1999))）は少なくとも６つのドメイン：シグナル、プロペプチド、触媒ドメイン、ディスインテグリン、ｔｓｐ、およびｃ−末端を有する。触媒ドメインは亜鉛結合特性領域、TAAHELGHVKF（配列番号１５）および「ＭＥＴターン」を含み、これらがプロテアーゼ活性の原因である。ポジションの番号における亜鉛結合領域内での置換によっては、プロテアーゼ活性が許容されるが、ヒスチジン（Ｈ）およびグルタミン酸（Ｅ）残基は存在しなければならない。アグレカナーゼ−１のトロンボスポンジンドメインも、基質の認識および切断に重要なドメインである。これら２つのドメインにより、発明者らは新規アグレカナーゼファミリーのメンバーの分類を決定する。アグレカナーゼ−１ＤＮＡ配列のタンパク質配列を用いて、ヒトＥＳＴに焦点を合わせているGeneBank ESTに対し、TBLASTNを用いて質問した。生じた配列は、潜在的なファミリーメンバーの全長の配列を同定するための試みにおける開始点であった。本発明のアグレカナーゼのヌクレオチド配列は、アグレカナーゼ−１の触媒ドメインおよび亜鉛結合モチーフに対するホモロジーを含むＥＳＴから成る。３つのＥＳＴ（GenBank受託番号AW575922、AW501874、AW341169）の寄せ集めであるＥＳＴ１４（配列番号１）を用いて、ＡＤＡＭＴＳ４のＰｒｏおよび触媒ドメインの部分に対して相同性を有する配列番号２のペプチドを予測した。配列番号１において、塩基＃２０−＃５８１がＡＤＡＭＴＳ７に対して、３７％の同一性にて最も相同である。ヌクレオチド＃２１−＃５８１の予測される翻訳物は、Ｐｒｏドメインの部分（塩基＃２１−＃３１７）；ＰＡＣＥプロセッシング部位；および部分的なメタロプロテアーゼドメイン（塩基＃３１８−＃５８１）をコードする。ＥＳＴ１４は、ヒトゲノム上に位置づけられ（セレラ ディスカバリー システム(Celera Discovery System) (Rockville, MD, USA)およびセレラの関連するデータベース(Celera's associated databases)）、予めコンピュータ化されている遺伝子予測（FgenesH）を用いて、配列番号３に示すごとく、ＥＳＴ１４配列を拡張した。それは６００−７００塩基まで切除されると考えられ、Ｃ末端は切除されることが予想される。
【００６６】
ＥＳＴ１４に関する遺伝子を、予備ＰＣＲにより最初に決定しておいた組織源を用いてＰＣＲ法を用いて単離した。５’プライマー配列CCGGCTCCCTCGTCTCGCTCAG（配列番号２１）および３’プライマー配列AGCAGAAGGGCTGGGGGTCAAGGAC（配列番号２２）を、Clontech(Palo Alto, CA, USA)からの９つの異なるMarathon-Ready ｃＤＮＡに関して用いて、配列番号１のヌクレオチド＃５２−２２４に対応する１７２ｂｐのフラグメントを、ClontechからのAdvantage-GC2 PCRキットを用いて作製した。反応条件は、ユーザーマニュアルにて推奨されているものであり、５０μｌの反応物当たり０．５ｎｇのｃＤＮＡおよび２０ｐモルの各プライマーを含んだ。サイクリング条件は次のようであった：９４℃にて１分間、１サイクル；次いで９４℃にて３０秒／６８℃にて３分間から成る３５サイクル；次いで６８℃にて３分間の１サイクル。
【００６７】
ＥＳＴ１４のクローニングを開始するために、配列番号３のＥＳＴの寄せ集めのヌクレオチド＃５２から始まり、配列番号３のＥＳＴ１４FgenesH予測のヌクレオチド＃３４１６までの、ＥＳＴ１４の中間の部分をコードしている２２７０ｂｐのフラグメント（配列番号５）または２３３９ｂｐのフラグメント（配列番号７）を、ヒト胸腺（４人の白人男性および１人の白人女性からプールした）（配列番号５）、またはヒト肝臓（１人の白人男性）（配列番号７）のMarathon-Ready(Clontechから）のｃＤＮＡ基質からの５’プライマー配列CCGGCTCCCTCGTCTCGCTCAG（配列番号２１）および３’プライマー配列ACGTGACTGGCAGGGGTGCAAGTT（配列番号２３）を用いて作製した。Epicentre Technologies (Madison, WI, USA)からのMasterAmp ハイ ファイデリティ イクストラ−ロング(Fidelity Extra-Long)ＰＣＲキットを、ＰＣＲ反応のために用いた。５０μｌの反応物当たり０．５ｎｇのｃＤＮＡおよび２０ｐモルの各プライマーを用いてユーザーマニュアルに記載のごとく、Ｐｒｅｍｉｘ４または８を用いた。サイクリング条件は、次のようであった：９４℃にて３分間、１サイクル；次いで９４℃にて３０秒／６８℃にて４分間から成る３５サイクル；次いで６８℃にて６分間の１サイクル。これらの増幅から生じたＰＣＲ産物をAdvanTAge PCRクローニングキットを製造業者の指示（Clontech）に従い用いてｐＴ−Ａｄｖベクターへとライゲートした。ライゲートされた産物を、Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)からのElectroMAX DH5α-Ｅ細胞へと形質転換した。両ライブラリーから生じたクローンを配列決定し、忠実度を決定した。全長クローン（配列番号１１）におけるこのフラグメントの位置は、ヌクレオチド＃４０４および２６７４の間である。（肝臓組織由来の）配列番号７における６９塩基の挿入も、膵臓、腎臓、および肝臓にも存在するが、胸腺、精巣、または白血病ＭＯＬＴ４ｃＤＮＡには存在しない。
【００６８】
ＥＳＴ１４の組織分布の全決定を、Clontech ヒト マルチプル組織発現アレイ（ＭＴＥ）をプローブすることにより達成した。ＭＴＥのためのプローブは、５’プライマー配列CGGAGCATGTGGACGGAGACTGGA（配列番号２４）および３’プライマー配列ACGTGACTGGCAGGGGTGCAAGTT（配列番号２３）（配列番号３におけるＥＳＴ１４FgenesH予測のヌクレオチド＃２２３６〜＃３４１６）をヒト胸腺Marathon-Ready cDNAに関して用いて、ＥＳＴ１４の末端を増幅しているＰＣＲ産物から作製した。Epicentre TechnologiesからのMasterAmp ハイ ファイデリティ エクストラ−ロング(MasterAmp High Fidelity Extra-Long)ＰＣＲキットをＰＣＲ反応のために、前記のpremix 4および標準的な条件を用いて用いた。
【００６９】
この増幅から生じたＰＣＲ産物をＰＴ−Ａｄｖベクターへと、AdvanTAge PCRクローニングキット（Clontech由来）を用いてライゲートし、次いで配列決定した。スぺーサードメインのみをコードしているプローブを、制限エンドヌクレアーゼＢＩｐＩおよびＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ）での、ＰＣＲ産物を含んでいるプラスミドの、New England Biolabs (Beverly, MA, USA) により推奨されている条件を用いる消化後に得た（図３のヌクレオチド＃１８４２〜＃２４１０）。５６８ｂｐのフラグメントを５％の非変性ポリアクリルアミドゲルをマニアティスの分子クローニング 研究室マニュアル(Maniatis's Molecular Cloning A Laboratory Manual)に見出される標準的な分子生物学的方法を用いて単離した。フラグメントをゲルからIsco (Little Blue Tank)からのサンプル コンセントレーション カップス（Sample Concentration Cups）を用いてエレクトロエルートして取り出した。精製したスぺーサードメインプローブを、Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ, USA)からのレディ−トゥ−ゴウＤＮＡラベリングビーズ(Ready-To-Go DNA Labelling Beads)（ｄＣＴＰ）を製造業者の指示に従い用いて放射能標識した。放射能標識したフラグメントを、プライマーおよび導入されていない放射性ヌクレオチドから、Amersham Pharmacia Biotechからのニックカラムを製造業者の指示に従い用いて精製し、次いでＭＴＥをプローブするのに用いた。放射能標識されたｃＤＮＡプローブを用いるＭＴＥのハイブリダイゼーションのための製造業者の条件に従った。ＥＳＴ１４は、以下の組織および細胞株にて発現されることが認められた：胸腺、白血球ＭＯＬＴ４細胞株、膵臓、腎臓、胎児胸腺、および肝臓。EST14の残る部分をクローニングするために、以下の細胞株または組織のClontech Marathon-Ready cDNAを用いた：４人の白人男性および１人の白人女性からプールしたヒトの胸腺、６人の白人男性からプールしたヒトの膵臓、およびヒト白血病、リンパ球芽ＭＯＬＴ−４細胞株ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１５８２。
【００７０】
ＥＳＴ１４のＣ末端配列を、Clontech Marathon cDNA 増幅(Amplification)キットおよびヒト胸腺および白血病、リンパ球芽ＭＯＬＴ−４細胞株Marathon-ready cDNAsを基質として用いる３’ＲＡＣＥにより決定した。用いた３’ＲＡＣＥプライマーは、次のようであった：GSP1- TCTGGCTCTCAAAGACTCGGGTAA（配列番号２５（配列番号５のヌクレオチド＃１８１１〜１８３４）およびGSP2- GCAGGCACAACTGTTCGCTATGT（配列番号２６）（配列番号５のヌクレオチド＃１８８７〜１９０９）。ClontechからのAdvantage-GC2ＰＣＲキットを用いて、Marathon cDNA増幅キットのためのユーザーマニュアルにおける指示に従いネスティッドＲＡＣＥ反応を設定した：用いたＧＣ−meltの量は、５μｌ／５０μｌ反応液であり、用いたＧＳＰオリゴの量は０．２ｐモル／μｌであった。ＧＳＰ１プライマーをＰＣＲの第一ラウンドに用い、ＧＳＰ２プライマーをネスティッド反応のために用いた。３’ＲＡＣＥからの情報は、配列番号９／図１のヌクレオチド＃２０９５および５００４の間に見出され、ヌクレオチド＃３１７２〜３１７４にてフレームターミネーションコドン（ＴＧＡ）を含む。
【００７１】
ストップコドンを含んでいるＥＳＴ１４のＣ−末端１0７９ｂｐのフラグメントを、５’プライマー配列 GCAGGCACAACTGTTCGCTATGT(配列番号２６）（配列番号９のヌクレオチド＃２０９５〜２１１７）および３’プライマー配列TCACGAGCTCGGCGGTGGC（配列番号２７）（配列番号９のヌクレオチド＃３１５６〜３１７４、相補物）をRACE反応に用いたヒト胸腺、膵臓、および白血病、リンパ球芽ＭＯＬＴ−４細胞株Marathon-Ready cDNAにおいて用いて作製した。Epicentre Technologies由来のMasterAmp ハイ ファイデリティ エクストラ-ロング(High Fidelity Extra-Long)PCRキットを、前記のPremix 4および標準的な条件を用いて、PCR反応のために用いた。これらの増幅から生じたＰＣＲ産物を、AdvanTAge PCRクローニングキットを製造業者の指示(Clontech)の指示に従い用いて、pT1-Advベクターへとライゲートした。ライゲート産物を、InvitrogenからのElectroMAX DH5α-E細胞へと形質転換した。全３つのライブラリーから生じたクローンを配列決定し、忠実度を決定した。全長クローン（図３）におけるフラグメントの位置は、ヌクレオチド＃２２９０と３３６９の間である。
【００７２】
ＥＳＴ１４のＮ−末端配列を、Clontech Marathon cDNA Amplificationキットおよびヒト胸腺および白血病、リンパ球芽ＭＯＬＴ−４細胞株Marathon-ready cDNAを基質として用いて５’ＲＡＣＥにより決定した。用いた５’ＲＡＣＥプライマーは次のようであった；GSP1- TCGGCCACCACCAGGGTCTCCAC（配列番号２８）（配列番号５のヌクレオチド＃２９７〜３１９、相補物）およびGSP2- GTTCCTCCGCTCCCGCCAGTCCC（配列番号２９）（配列番号５のヌクレオチド＃２４７〜２６９、相補物）。ClontechからのAdvantage-GC2 PCRキットを、Marathon cDNA 増幅キットのためのユーザーマニュアルにおける指示に従い用いて、ネスティドＲＡＣＥ反応を設定した：用いたGC meltの量は５μl/50μl反応液であり、および用いたＧＳＰオリゴの量は０．２ｐモル/μｌであった。ＧＳＰ１プライマーをＰＣＲの第一ラウンドのために用い、ＧＳＰ２プライマーをネスティド反応のために用いた。イニシエーターメチオニン(ATG)を含む５’ＲＡＣＥからの情報は、図３のヌクレオチド＃１と６７２の間に見出される。
【００７３】
イニシエーターメチオニンを含むＥＳＴ１４のＮ-末端６８５ｂｐフラグメントを、５’プライマー配列GGTCCCGGGTACCATGTGTGAC（配列番号３０）（図３のヌクレオチド＃１〜９）および３’プライマー配列GTTCCTCCGCTCCCGCCAGTCCC（配列番号２９）（図３のヌクレオチド＃６５０〜６７２、相補物）を、RACE反応に用いたヒト胸腺Marathon-Ready cDNAに用いて、作製した。ClontechからのAdvantage-GC2 PCRキットを、ＰＣＲ反応のために用いた。反応条件は、ユーザーマニュアルに推奨されているものであり、５０μｌの反応液当たり０．５ｎｇのｃＤＮＡおよび２０ｐモルの各プライマーを含んだ。サイクリング条件は、次のようである；９４℃にて２分間、１サイクル；次いで９４℃にて２０秒間／６８℃にて３分間から成る３５サイクル；次いで６８℃にて３分間の１サイクル。
【００７４】
これらの増幅から生じるＰＣＲ産物を、PCR-Script AMPクローニングキットを製造業者の指示（Stratagene, La Jolla, CA, USA）に従い用いて、pPCR-Script AMPベクターへとライゲートした。ライゲート産物を、InvitrogenからのElectroMAZ DH5α−E細胞へと、形質転換した。クローンを配列決定して、忠実度を決定した。
【００７５】
ＥＳＴ１４のクローン化ＰＣＲフラグメントを配列決定して、忠実度を決定した。ＥＳＴ１４の全長配列は、ＥＳＴ１４FgenesH配列（配列番号３）から誘導された共通配列および３つのClontech Marathon cDNA（配列番号５、９、および図３）からのＥＳＴ１４に関して作製されたＰＣＲ産物であった。ＥＳＴ１４の全長バージョンを、ｐＴ-ＡｄｖまたはpPCR-Script AMPベクターからの正しい配列を有する３つのフラグメントのＰＣＲ産物を、以下のようにＣｏｓ発現ベクターｐＥＤａｓｃ１へと移動させることにより構築した。５’末端にベクターＸｂａＩ部位（TCTAGA）、ＥＳＴ１４のＮ末端ＡｐａＬ部位（GTGCAC）に対する、イニシエーターＭｅｔ（ATG）の上流の最適化されたKozac配列（GCCGCCACC）をコードしている２つの二本鎖を、以下のオリゴヌクレオチドにおいて合成した。：5'- CTAGAGCCGCCACCATGTGTGACGGCGCCCTGCTGCCTCCGCTCGTCCTGCCCGTGCTGCTGCTGCTGGT（配列番号３１）および相補オリゴ5'-GTCCCCAAACCAGCAGCAGCAGCACGGGCAGGACGAGCGGAGGCAGCAGGGCGCCGTCACACATGGTGGCGGCT（配列番号３２）、5'-TTGGGGACTGGACCCGGGCACAGCTGTCGGCGACGCGGCGGCCGACGTGGAGGTGGTGCTCCCGTGGCGGGTGCGCCCCGACGACG（配列番号３３）相補オリゴ5'- TGCACGTCGTCGGGGCGCACCCGCCACGGGAGCACCACCTCCACGTCGGCCGCCGCGTCGCCGACAGCTGTGCCCGGGTCCA（配列番号３４）。これらの二本鎖を、ＥＳＴ１４のＮ末端のＡｐａＬ １-ＳｇｒＡ １フラグメント、ＥＳＴ１４のＳｇｒＡ-ＢｇＩ ＩＩフラグメント、およびＥＳＴ１４のＣ末端および停止コドン（ＴＧＡ）を含んでいるＢｇＩ２-ＳｐｅＩフラグメントと結合させた。
【００７６】
本発明のアグレカナーゼヌクレオチド配列を用いて、単離された配列を含んでいる全長クローンをさらにスクリーニングするためのプローブを設計することができる。例えば、ＥＳＴ１４を用いて、種々のｃＤＮＡライブラリーから単離したより小さいＥＳＴを位置づけてよい。genbank受託番号およびそのライブラリー源を含むそのようなＥＳＴの例は次のようである：AA884550-- Soares_精巣_NHT; AI808729-- Soares_NFL_T_GBC_S1 (胎児肺NbHL19W, 精巣NHT、およびB-細胞 NCI_CGAP_GCB1からプールしたもの); AI871510-- NCI_CGAP_Brn25 (脳からの脱分化乏突起神経膠細胞); AI937739-- NCI_CGAP_Brn25 (脳からの脱分化乏突起神経膠細胞); AW293573-- NCI_CGAP_Sub4 (結腸); AW341169-- NCI_CGAP_Lu24 (カルチノイド肺); AW501874-- NIH_MGC_52 (リンパジャーミナルセンター B 細胞); AW575922-- NIH_MGC_52 (リンパジャーミナルセンター B 細胞); BF529318--NCI_CGAP_Brn67(1p/19q の欠損を有する脱分化乏突起神経膠細胞); BI828046-- NIH_MGC_119 (脊髄脳); およびBQ053458-- NIH_MGC_106 (ナチュラルキラー細胞、細胞株)。
【００７７】
Metからストップコドンまでの、ＥＳＴ１４の目的のヌクレオチド配列を、配列番号１１に示す。別のスプライス変種では、エキソン２は、配列番号１１に記載するヌクレオチド #79 〜 #449から371ヌクレオチドを喪失しており(イニシエーターMetを有するエキソンをエキソン1として数える)、これはＮ−末端にてフレームを切除し、その結果、イニシエーターMetは、タンパク質の残りとインフレームにはない。Mは、この別のスプライス変種の配列に見出される最初のmetである。前で認めるように、リーダー配列およびプロドメインは、この切除形態から失われている。さらなるエキソンを、肝臓ではシステインリッチなスぺーサードメインが後に続く、配列番号１４のアミノ酸＃１１３（Ｖ）〜＃１３６（Ｃ）に記載する２４個の追加のインフレームアミノ酸をコードする所定のcDNAs (肝臓、膵臓、腎臓)に見出すことができるが、４つの追加のシステインを含む胸腺ｃＤＮＡには見出すことができない。これらの追加のシステインはＡＤＡＭＴＳファミリーメンバーのいずれにも見出されない。
【００７８】
ヒトマルチプル組織発現アレイからの発現特性およびClontechからのマルチプル組織ノーザンは、以下のようである：中程度の発現がリンパ芽白血病molt4細胞株および胸腺に見出される；より低い発現が、膵臓、腎臓、および胎児胸腺に見出される；弱いが検出可能な発現が、肝臓、唾液腺、胎児脳、リンパ節、結腸腺癌SW480細胞株、胎児肺、気管、胎児脾臓、および精巣に見出される。
【００７９】
実施例２：アグレカナーゼの発現
ネズミ、ヒト、または他の哺乳動物のアグレカナーゼ関連タンパク質を産生するために、それをコードしているＤＮＡを適当な発現ベクターに移入し、次いで常套の遺伝子操作法により、哺乳動物細胞、または昆虫の宿主細胞培養系を含む他の好ましい真核細胞または原核細胞宿主に導入する。生物学的に活性のある組換えヒトアグレカナーゼのための発現系は、安定に形質転換された哺乳動物細胞、昆虫、酵母、または細菌細胞であるとする。
【００８０】
当業者は、配列番号３、５、７、９、１１、またはアグレカナーゼ関連タンパク質をコードしている他のＤＮＡ配列または他の変更された配列、およびｐＣＤ（Okayama et al., Mol Cell Biol, 2:161-170 (1982)）、ｐＪＬ３、ｐＪＬ４（Gough et al., EMBO J, 4:645-653 (1985)）、およびｐＭＴ２ ＣＸＭなどの公知のベクターを含んでいる配列を用いることにより、哺乳動物発現ベクターを構築することができる。
【００８１】
哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２ ＣＸＭは、テトラサイクリン耐性遺伝子の代わりにアンピシリン耐性遺伝子を含み、かつさらにｃＤＮＡクローンの挿入のためのＸｈｏＩ部位を含む点で後者と異なるｐ９１０２３（ｂ）の誘導体（Wong et al., Science 228:810-815 (1985)）である。ｐＭＴ２ ＣＸＭの機能エレメントが開示されており（Kaufman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:689-693 (1985)）、アデノウイルスＶＡ遺伝子、７２ｂｐのエンハンサーを含んでいる複製のＳＶ４０起源、５’スプライス部位およびアデノウイルス後期ｍＲＮＡ上に存在するアデノウイルス三つ組リーダー配列の大部分を含んでいるアデノウイルス主要後期プロモーター、３’スプライスアクセプター部位、ＤＨＦＲインサート、ＳＶ４０初期ポリアデニル化部位（ＳＶ４０）、およびイー．コリの増殖に必要なｐＢＲ３２２配列が含まれる。
【００８２】
プラスミドｐＭＴ２ ＣＸＭは、アメリカン タイプ カルチャー コレクション（ＡＴＣＣ）、Rockville, MD (USA)に受託番号67122の下で寄託されているｐＭＴ２−ＶＷＦのＥｃｏＲＩ消化により得られる。ＥｃｏＲＩ消化により、ｐＭＴ２−ＶＷＦに存在するｃＤＮＡインサートが切り出され、線状のｐＭＴ２が得られ、これをライゲートし、次いで用いて、イー．コリＨＢ１０１またはＤＨ−５を形質転換し、アンピシリン耐性とすることができる。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡは、常套法により調製することができる。ｐＭＴ２ ＣＸＭを次いで、ループアウト／イン変異形成を用いて構築する（Morinaga, et al., Biotechnology 84: 636 (1984)）。これにより、複製のＳＶ４０起源近くのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびｐｍＴ２のエンハンサー配列に関連する塩基１０７５〜１１４５が除去される。加えて、これにより、以下の配列：5' PO-CATGGGCAGCTCGAG-3' (配列番号１６)がヌクレオチド１１４５に挿入される。この配列は、制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩの認識部位を含む。ｐＭＴ２３と名づけられるｐＭＴ２ ＣＸＭの誘導体は、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、およびＸｈｏＩの認識部位を含む。プラスミドｐＭＴ２ ＣＸＭおよびｐＭＴ２３ＤＮＡは、常套法により調製してよい。
【００８３】
ｐＭＴ２１から誘導されるｐＥＭＣ２β１も本発明の実施に適当であり得る。ｐＭＴ２１は、ｐＭＴ２−ＶＷＦから誘導されるｐＭＴ２から誘導される。前記のように、ＥｃｏＲＩ消化により、ｐＭＴ−ＶＷＦに存在するｃＤＮＡインサートが切り出され、鎖状形態のｐＭＴ２が得られ、これをライゲートおよび用いて、イー．コリＨＢ１０１またはＤＨ−５を形質転換し、アンピシリン耐性とすることができる。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡは、常套法により調製することができる。
【００８４】
ｐＭＴ２１は、以下の変更によりｐＭＴ２から誘導する。まず、Ｇ／Ｃテイリングから１９Ｇ残基のストレッチを含んでいる７６ｂｐのＤＨＦＲｃＤＮＡの５’非翻訳領域を削除する。この操作において、ＸｈｏＩ部位を挿入して、ＤＨＦＲからすぐ上流に以下の配列を得る。
【００８５】
【化１】
2004533841.tif 000004
【００８６】
第二に、ユニークなＣｌａＩ部位をＥｃｏＲＶおよびＸｂａｌでの消化、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントでの処置、およびＣｌａＩリンカー（CATCGATG）へのライゲーションにより導入する。これにより、アデノウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡＩ）領域から２５０ｂｐのセグメントが削除されるが、ＶＡＩ ＲＮＡ遺伝子の発現または機能は干渉しない。ｐＭＴ２１をＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化し、ベクターｐＥＭＣ２Ｂ１を誘導するのに用いる。
【００８７】
ＥＭＣＶリーダーの部分を、ＰＭＴ２−ＥＣＡＴ１（S.K. Jung, et al, J. Virol 63:1651-1660 (1989)）から、ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩでの消化により得、２７５２ｂｐのフラグメントを得た。このフラグメントをＴａｑＩで消化し、５０８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメントを得、これを低融点アガロースゲル上での電気泳動により精製する。６８ｂｐのアダプターおよびその相補鎖を、以下の配列：
【００８８】
【化２】
2004533841.tif 000005
【００８９】
を有する５’ＴａｑＩ突出末端および３’ＸｈｏＩ突出末端を用いて合成する。
【００９０】
この配列は、ヌクレオチド７６３〜８２７のＥＭＣウイルスリーダー配列にマッチする。ＥＭＣウイルスリーダー内のポジション１０ではＡＴＧがＡＴＴにさらに変化しており、次いでＸｈｏＩ部位が続く。ｐＭＴ２１ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメント、ＥＭＣウイルスＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩフラグメント、および６８ｂｐのオリゴヌクレオチドアダプターＴａｑＩ−ＸｈｏＩアダプターの３工程のライゲーション(a three way ligation)により、ベクターｐＥＭＣ２β１が得られる。
【００９１】
このベクターは、複製のＳＶ４０起源およびエンハンサー、アデノウイルス主要後期プロモーター、アデノウイルス三つ組リーダー配列の大部分のｃＤＮＡコピー、小ハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびアデノウイルスＶＡＩ遺伝子、ＤＨＦＲおよびβ−ラクタマーゼマーカーおよびＥＭＣ配列を、哺乳動物細胞における所望のｃＤＮＡの高レベルの発現を指向するために、適当に関連して含む。
【００９２】
ベクターの構築は、アグレカナーゼ関連ＤＮＡ配列の変更を含んでよい。例えば、アグレカナーゼｃＤＮＡは、コーディング領域の５’および３’末端における非−コーディングヌクレオチドを除去することにより変更し得る。欠失した非コーディングヌクレオチドを、発現に有益であることが公知の他の配列により置き換えてもよいし、置き換えなくてもよい。これらのベクターを、アグレカナーゼ関連タンパク質の発現のために、適当な宿主細胞へと形質転換する。加えて、配列番号３、５、７、９、１１の配列、またはアグレカナーゼ関連タンパク質をコードしている他の配列を操作して、アグレカナーゼをコードしているプロペプチド配列を削除し、およびそれらを他のアグレカナーゼタンパク質の完全なプロペプチドをコードしている配列と置換することにより、成熟アグレカナーゼ−関連タンパク質を発現させることができる。
【００９３】
当業者は、コーディング配列に隣接している哺乳動物調節配列を排除すること、またはそれを細菌配列と置換することにより、配列番号３、５、７、９、または１１の配列を操作して、細菌細胞による細胞内または細胞外発現のための細菌ベクターを作製することができる。例えば、コーディング配列をさらに操作する（例えば、他の公知のリンカーにライゲートする、またはそれから非−コーディング配列を削除すること、またはその中のヌクレオチドを他の公知の方法により変化させることにより変更する）ことができる。変更されたアグレカナーゼ関連コーディング配列を次いで公知の細菌ベクターへと、Taniguchi et al., Proc Natl Acad Sci USA, 77:5230-5233 (1980)に開示されているような方法を用いて挿入することができる。この典型的な細菌ベクターを次いで細菌宿主細胞へと形質転換して、それによりアグレカナーゼ関連タンパク質を発現させることができる。アグレカナーゼ関連タンパク質の細菌細胞中での細胞外発現を生じさせるための方法に関しては、ヨーロッパ特許出願ＥＰＡ177,343号を参照されたい。
【００９４】
同様の操作を次いで昆虫ベクターの構築のために行うことができる（例えば、公開欧州特許出願ＥＰＡ155,476号を参照されたい）。酵母ベクターをさらに、本発明のファクターの酵母細胞による細胞内または細胞外発現のための酵母調節配列を用いて構築することもできる。（例えば、公開ＰＣＴ出願WO86/00639号および欧州特許出願EPA 123,289号を参照されたい。）
【００９５】
哺乳動物、細菌、酵母または昆虫宿主細胞系において高レベルの本発明のアグレカナーゼ関連タンパク質を製造する方法には、異種構造アグレカナーゼ関連遺伝子の多コピーを含んでいる細胞の構築が含まれ得る。異種構造遺伝子を、Kaufman and Sharp, J Mol Biol, 159:601-629 (1982)の方法に従い、メトトレキサート(MTX)の濃度を増した場合に、増加した遺伝子のコピーを含んでいる細胞を増殖に関して選択することができる増幅可能なマーカー、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子に結合する。本手段は、多くの異なる細胞タイプを用いて行うことができる。
【００９６】
例えば、その発現を可能にする他のプラスミド配列と作用的に結合して本発明のアグレカナーゼ関連タンパク質に関するＤＮＡ配列を含んでいるプラスミドおよびＤＨＦＲ発現プラスミドｐＡｄＡ２６ＳＶ（Ａ）３（Kaufman and Sharp, Mol Cell Biol 2:1304 (1982)）をＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−ＢＩＩへ、リン酸カルシウム共沈法およびトランスフェクション、エレクトロポーレーションまたはプロトプラスト融合を含む種々の方法により同時導入することができる。ＤＨＦＲを発現している形質転換体を、透析した子牛血清を含むアルファ培地中での増殖に関して選択し、次いでKaufman et al., Mol Cell Biol., 5:1750 (1983)に記載されているようにＭＴＸの濃度を増す場合の（例えば、０．０２、０．２、１．０、および５μＭ ＭＴＸの連続工程）増殖による増幅に関して次いで選択する。形質転換体をクローン化し、生物学的に活性なアグレカナーゼの発現を前記のアッセイによりモニターする。アグレカナーゼタンパク質の発現は、ＭＴＸ抵抗性のレベルの上昇と共に増すはずである。アグレカナーゼタンパク質は、３５Ｓメチオニンまたはシステインでのパルスラベリングおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動などの当該分野で公知の標準的な方法を用いて特定する。同様の方法を、他の関連するアグレカナーゼ関連タンパク質を製造するために行うことができる。
【００９７】
一実施例において、配列番号１１に示す本発明のアグレカナーゼ遺伝子を、発現ベクターｐＥＤ６（Kaufman et al., Nucleic Acid Res 19:44885-4490 (1991)）にクローン化してよい。ＣＯＳおよびＣＨＯ ＤＵＫＸ Ｂ１１細胞をリポフェクション（LF2000, Invitrogen）により本発明のアグレカナーゼ配列でトランジェントにトランスフェクトする（別個のｐＥＤ６プラスミドにおけるＰＡＣＥの＋／−同時−トランスフェクション）。２倍のトランスフェクション：（ａ）活性アッセイのために、条件付けた培地を回収するための一つと（ｂ）３５−Ｓ−メチオニン／システイン代謝標識化のための一つを、目的の各遺伝子に関して行う。
【００９８】
１日目に培地を、（ａ）活性アッセイのために回収するための、ＤＭＥ（ＣＯＳ）またはアルファ（ＣＨＯ）培地＋１％熱不活性化子牛血清＋／−１００μｇ／ｍｌへパリンに、ウェルにおいて変更する。４８時間（４日）後、条件付けた培地を活性アッセイのために回収する。
【００９９】
３日目に、対のウェル（ｂ）をＭＥＭ（メチオニン−不含／システイン不含）培地＋１％熱不活性化子牛血清＋１００μｇ／ｍｌへパリン＋１００μＣｉ／ｍｌ ３５Ｓ−メチオニン／システイン（Redivue Pro mix, Amersham）に変更する。３７℃にて６時間インキュベーション後、条件付けた培地を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上還元条件下に流す。タンパク質をオートラジオグラフィーにより視覚化する。
【０１００】
実施例３：発現されたアグレカナーゼの生物学的活性
前記実施例２で得た、発現されたアグレカナーゼ関連タンパク質の生物学的活性を測定するために、タンパク質を細胞培養物から回収し、次いでアグレカナーゼ関連タンパク質を、同時産生される他のタンパク質物質ならびに他の混入物質から単離することにより、精製する。精製は、当該分野で公知の標準的な方法を用いて行う。精製されるタンパク質は、以下のアッセイに従ってアッセイしてよい。
【０１０１】
タンパク質が、アグレカナーゼ切断部位にてアグレカンを切断することができる酵素であるかどうかを特異的に決定するためのアッセイ：
１．蛍光ペプチドアッセイ：発現されたタンパク質を、アグレカンのアグレカナーゼ切断部位のアミノ酸を含む合成ペプチドと共にインキュベートする。合成ペプチドの１つの端はフルオロフォアを有し、他方はクエンチャーを有する。ペプチドの切断により、フルオロフォアとクエンチャーが分かれ、蛍光が顕現化する。このアッセイから、発現されたタンパク質が、アグレカナーゼ部位にてアグレカンを切断することができることを決定することができ、相対的蛍光が、発現されたタンパク質の相対的活性を示す。
【０１０２】
２．ネオエピトープ ウェスタン：発現されたタンパク質を完全なアグレカンと共にインキュベートする。生じたサンプルをいくつかの生化学的操作（透析、コンドロイチナーゼ処理、凍結乾燥、および再構築）に供した後、サンプルをＳＤＳ ＰＡＧＥゲルに流す。ゲルを、アグレカナーゼ切断後に露出するアグレカン上における部位のみを認識する抗体と共に、インキュベートする。ゲルをニトロセルロースに移し、二次抗体で展開し（ウェスタンアッセイと呼ばれる）、アグレカンのアグレカナーゼにより作製される切断産物と一致する分子量のところに走っているバンドを得る。このアッセイは、発現されたタンパク質がアグレカナーゼ切断部位にてネイティブのアグレカンを切断したことを示し、およびさらに、切断産物の分子量をも示す。バンドの相対密度により、相対アグレカナーゼ活性に関するいくつかの見解を得ることができる。
【０１０３】
発現されたタンパク質が、タンパク質のどこかでアグレカンを切断することができるかどうかを決定するためのアッセイ（アグレカナーゼ部位に特異的でない）：
【０１０４】
３．アグレカンＥＬＩＳＡ：発現されたタンパク質をプラスチックのウェルに予め固着させた完全なアグレカンと共にインキュベートする。ウェルを洗浄し、次いで、アグレカンを検出する抗体と共にインキュベートする。ウェルを、二次抗体を用いて展開する。アグレカンの当初の量がウェルに残っている場合、抗体はウェルを濃厚に染色する。アグレカンが発現されたタンパク質によりプレートから消化除去されたら、抗体は、低下したアグレカン濃度のために低下した染色を示す。このアッセイは、発現されたタンパク質がアグレカンを（アグレカナーゼ部位のみならず、タンパク質中のどこかで）切断することができるかどうかを示し、相対的なアグレカンの切断を測定することができる。
【０１０５】
精製されたタンパク質のタンパク質分析を、銀で染色した（Oakley, et al., Anal Biochem. 105:361 (1980)）ＳＤＳ−ＰＡＧＥアクリルアミド(Laemmli, Nature 227:680 (1970))、および免疫ブロット（Towbin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350 (1979)）によるなどの標準的な方法を用いて行う。前記アッセイを用いて、発現されたアグレカナーゼ関連タンパク質をその活性に関して評価し、有用なアグレカナーゼ関連分子を同定する。
【０１０６】
実施例４：抗体の調製
新規アグレカナーゼ分子に対する抗体を調製する。アグレカナーゼ活性を阻害することができる抗体を開発するために、マウスの１群を、最初の２回の免疫化のためにはフロイント完全アジュバントに、およびその後は不完全フロイントアジュバントにて混合した新規アグリカナーゼタンパク質で、２週間ごとに免疫化する。免疫期間を通じて、血液をサンプル化し、循環抗体の存在に関して試験する。９週にて、循環抗体を有する動物を選択し、続く３日間免疫化し、次いで屠殺する。脾臓を取り出し、細胞へとホモジェナイズする。脾臓細胞を骨髄腫融合パートナー（株Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３）と、５０％ＰＥＧ１５００を確立された方法により用いて(Oi & Herzenberg, 細胞免疫学における選択された方法(Selected Methods in Cellular Immunology), W. J. Freeman Co., San Francisco, CA, at 351 (1980))、融合する。融合細胞を９６−ウェルのマイクロタイタープレートに２×１０５細胞／ウェルの密度で蒔く。２４時間後、細胞をＨＡＴ選択に供し（Littlefield, サイエンス(Science), 145: 709 (1964)）、効果的にあらゆる非融合性および非増殖性融合骨髄腫細胞を殺滅する。
【０１０７】
抗−アグレカナーゼ抗体を分泌している首尾よく融合したハイブリドーマ細胞を、固相および液相ＥＬＩＳＡにより同定する。新規なアグレカナーゼタンパク質を、前記のごとくＣＨＯ細胞から調製し、（固相アッセイのために）ポリスチレン上にコートし、または（液相アッセイのために）ビオチン化する。中和アッセイをさらに用いるが、この場合は、アグレカンをポリスチレンプレート上にコートし、ビオチンアグレカナーゼ活性をハイブリドーマ上清の添加により阻害する。結果から、アグレカナーゼ抗体を発現しているハイブリドーマが同定される。これらのポジティブクローンを培養し、次いでさらなる研究のために増殖させる。これらの培養物は、増殖させる場合安定を維持し、細胞株を、ディリューションを制限することによりクローン化し、次いで低温保存する。
【０１０８】
これらの細胞培養物から、アグレカナーゼタンパク質を特異的に認識する抗体のパネルを開発する。抗体のアイソタイプを、マウス免疫グロブリンアイソタイピングキット(ザイムド(登録商標)ラボラトリーズ(ZymedTM Laboratories), Inc., サンフランシスコ, CA))を用いて、決定する。
【０１０９】
実施例５：アグレカナーゼのレベルを検出する方法
実施例４に従い調製される抗−アグレカナーゼ抗体を用いて、サンプル中のアグレカナーゼのレベルを検出することができる。抗体をＥＬＩＳＡに用いて、例えば、サンプル中のアグレカナーゼの存在または不在を同定すること、またはその量を定量することができる。抗体は、蛍光タグで標識する。一般に、サンプル中のアグレカナーゼのレベルは、実施例３に開示するアッセイのいずれかを用いて決定することができる。
【０１１０】
実施例６：患者を治療する方法
実施例４に従い開発した抗体は、アグレカンの欠損または過剰なアグレカナーゼ活性に関連する病気または疾患に罹患している患者に投与することができる。患者は、一度、または一日一回というように間隔をあけて組成物を摂取し、その病気または疾患の症状および徴候が改善する。例えば、アグレカンの欠損が減少するかまたはなくなり、関節軟骨の崩壊が減少するかまたはなくなる。骨関節症の症状が低下するかまたは排除される。これにより、本発明の組成物が、アグレカンの欠損または過剰なアグレカナーゼ活性に関連する病気または疾患の治療に有用であることが示される。抗体は、該疾患のファミリーヒストリーまたはマーカーを有するが、その作用は未だ被り始めていない人など、骨関節症に感受性のある患者に用いることもできる。
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
前記記載は、本発明の目下好ましい具体例を詳述したものである。その実施における多くの変更およびバリエーションが、これらの記載を考慮して、当該分野の専門家に思いつくことが予想される。これらの変更およびバリエーションは、本明細書に添付する請求の範囲内に包含されるものと信じる。本出願に記載する文献の全ては、その全容を出典明示により組み込む。さらに、データベースおよび全引用文献に記載される全配列は、その全容を出典明示により組み込む。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、配列番号９に示すアグレカナーゼタンパク質のヌクレオチド配列である。
【図２】図２は、配列番号９に示すヌクレオチド配列からコードされるアグレカナーゼタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０）である。
【図３】図３は、ＥＳＴ１４の拡張されたヌクレオチド配列（配列番号１１）である。
【図４】図４は、配列番号１１のヌクレオチド＃２１３８（７）〜＃２２０６（７）の６９塩基のエキソンインサート（配列番号１２）である。
【図５】図５は、配列番号１１の予測されるタンパク質翻訳物（配列番号１３）である。
【図６】図６は、配列番号５および追加のエキソンの結果としての２４個のエキストラインフレームアミノ酸を含んでいるアミノ酸配列（配列番号１４）である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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