(57)【要約】タンパク質を含む溶液のｐＨを約７〜約１０のｐＨに調整し、ｐＨ調整した溶液を低濃度イオンを有する水溶液でダイアフィルトレーションすることによって、シトレート、アルミニウム、及びその他の多価イオン及び汚染物質をタンパク質から除去する方法が提供される。
2004521099.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質から多価イオンを除去する方法であって、
タンパク質及び多価イオンを含む水溶液を用意する工程と、
前記水溶液を約７〜約１０のｐＨに調整する工程と、
前記水溶液を純水でダイアフィルトレーションし、それによって多価イオンを含む濾液及びタンパク質を含む保持液を得る工程とを含む前記方法。
【請求項２】
多価イオンがアルミニウム及びシトレートからなる群の少なくとも１つである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質がアルブミン、免疫グロブリン、第VIII因子、第IX因子、アルファ−１−プロテイナーゼインヒビター、及びプロトロンビン複合体からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項４】
水溶液の体積の少なくとも約３倍の量の純水で水溶液をダイアフィルトレーションする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
水溶液の体積の少なくとも約５倍の量の純水で水溶液をダイアフィルトレーションする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
水溶液の重量の少なくとも約３倍の量の純水で水溶液をダイアフィルトレーションする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
水溶液の重量の少なくとも約５倍の量の純水で水溶液をダイアフィルトレーションする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
水溶液を約８．５〜約９．５のｐＨに調整する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
水溶液を約８．８〜約９．２のｐＨに調整する請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
水溶液が可溶性コーンフラクションＶである請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
タンパク質から多価イオンを除去する方法であって、
タンパク質及び多価イオンを含む水溶液を原料タンクに入れて水溶液を約７〜約１０のｐＨに調整する工程と、
水溶液を原料タンクからダイアフィルトレーション装置に供給し、それによってタンパク質を含む保持液及び多価イオンを含む濾液を生成し、濾液を流量Ｆ1でダイアフィルトレーション装置から除去する工程と、
保持液を原料タンクに移す工程と、
純水を原料タンク中の保持液に加え、それによって希釈した保持液を得る工程とを含み、
多価イオンがタンパク質から除去されるまで、希釈した保持液を原料タンクからダイアフィルトレーション装置に供給し、原料タンクに戻し、純水を加える工程を繰り返す前記方法。
【請求項１２】
多価イオンがアルミニウム、シトレート、及びそれらの混合物からなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質がアルブミン、免疫グロブリン、第VIII因子、第IX因子、アルファ−１−プロテイナーゼインヒビター、及びプロトロンビン複合体からなる群から選択される請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
タンパク質がアルブミンであり、多価イオンがシトレートである請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
タンパク質がアルブミンであり、多価イオンがアルミニウムである請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
純水を水溶液の体積の少なくとも３倍の量で加える請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
純水を水溶液の体積の少なくとも約５倍の量で加える請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
純水を水溶液の重量の少なくとも３倍の量で加える請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
純水を水溶液の重量の少なくとも約５倍の量で加える請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
純水を約Ｆ1の流量で加える請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
純水を約８．８〜約９．２のｐＨに調整する請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
アルブミンからシトレートイオンを除去する方法であって、
アルブミン及びシトレートイオンを含む水溶液を用意する工程と、
水溶液のｐＨを約７．０〜約１０．０のｐＨに調整する工程と、
ｐＨ調整した水溶液を純水でダイアフィルトレーションし、それによってアルブミンを含む保持液及びシトレートイオンを含む濾液を得る工程とを含む前記方法。
【請求項２３】
水溶液が可溶性コーンフラクションＶである請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
水溶液を約８．５〜約９．５のｐＨに調整する請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
水溶液を約８．８〜約９．２のｐＨに調整する請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｐＨ調整した水溶液を水溶液の重量の少なくとも約５倍の量の純水でダイアフィルトレーションする請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
ｐＨ調整した水溶液を水溶液の体積の少なくとも約５倍の量の純水でダイアフィルトレーションする請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
アルブミンからアルミニウムイオンを除去する方法であって、
アルブミン及びアルミニウムイオンを含む水溶液を用意する工程と、
水溶液を約７．０〜約１０．０のｐＨに調整する工程と、
ｐＨ調整した水溶液を純水でダイアフィルトレーションし、それによってアルブミンを含む保持液及びアルミニウムイオンを含む濾液を得る工程とを含む前記方法。
【請求項２９】
水溶液が可溶性コーンフラクションＶである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
水溶液を約８．５〜約９．５のｐＨに調整する請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
水溶液を約８．８〜約９．２のｐＨに調整する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ｐＨ調整した水溶液を水溶液の重量の少なくとも約５倍の量の純水でダイアフィルトレーションする請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
ｐＨ調整した水溶液を水溶液の体積の少なくとも約５倍の量の純水でダイアフィルトレーションする請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は生理活性タンパク質からシトレート、アルミニウム及びその他の多価イオンを除去するのに有用な方法に関する。この方法はアルブミンを含む溶液からアルミニウム及びシトレートイオンを除去するのに特に有用である。
【０００２】
（発明の背景）
生理活性タンパク質は治療薬としてヒトに頻繁に投与される。そのようなタンパク質が副作用を生じるかもしれない汚染物質を含まないことは重要である。例えば、静脈内投与を意図し、血漿増量剤として溶液において広く使用されている精製したヒト血清アルブミン（アルブミン）がヒトへの使用が容認されない濃度のアルミニウムを含んでいるかもしれないことが知られている。
ヒト中のアルミニウムの存在はアルツハイマータイプの老人性痴呆症及び神経原線維変性と関係がある。静脈内に投与されたアルミニウムは組織及び器官、例えば脳に蓄積する可能性があり、体内からアルミニウムを十分に排泄できない腎機能が低下した患者に特定の脅威をもたらす。そのような患者において、透析液のアルミニウム汚染物質は骨軟化症、小球性貧血及び透析性脳症と関係がある。結果として、静脈内投与用として欧州で販売されているアルブミンは、５、２０又は２５％のタンパク質濃度を有する溶液において２００ｐｐｂ以下のアルミニウム濃度を有することが必要とされ、その濃度はアルブミン製品の日付を入れた期間にわたって維持されなければならない。その他の金属、例えば鉄、鉛、水銀、クロム、銅及びニッケルの副作用も記録されている。
アルブミンに、アルブミン処理の際に使用する珪藻土、ガラス製の容器、粘度の詰まったエラストマー封入物、及び珪藻土を含むデプスフィルター等を含むいくつかのソースからアルミニウムが混入することが分かっている（Quagliaro, D. A. et al., Aluminum in Albumin for Injection, Journal of Parenteral Science & Technology, 42(6), 187-190 (1988)）。
いくつかの溶液は、ガラス製の容器からアルミニウムが抽出されることによって、貯蔵の際にアルミニウムの濃度が増加することを示す。ガラス製の容器は、多くのそのような容器が１〜５％のアルミニウムを含むために、アルミニウム汚染の重要なソースであるように見える。タンパク質溶液中のアルミニウムの濃度に寄与する因子は、ガラス製の容器中の溶液の貯蔵状態及びタンパク質溶液中に存在する溶質の性質である。例えば、アルファヒドロキシ基、例えばシトレートアニオンを有するカルボン酸は、金属イオンの良いキレート化剤であり、アルミニウム含有物質へのその可溶化作用として知られている。
【０００３】
シトレートイオンは、抗凝血性クエン酸ナトリウム中の血漿の収集を含む通常の血漿交換法の際に血漿誘導タンパク質に導入される。例えば、可溶化コーンフラクションＶ粉末（アセトン法によるアルブミン溶液の調製の出発物質）は、約７．６ｍＭ〜約９．７ｍＭ（約２２３５ｐｐｍ〜約２８５３ｐｐｍ）のシトレート含量を有する。このように、ヒトに投与されるべきアルブミン及びその他のタンパク質溶液中のアルミニウムの低濃度を保証することに加えて、貯蔵の際のシトレートイオンによるガラス製の容器からのアルミニウムの浸出の可能性を回避するためにシトレートの低濃度を保証することも重要である。
多価アルミニウムイオンは、その他の多価イオンと同様に、タンパク質と結合し、ＥＤＴＡのようなキレート剤によってこれらのイオンを除去する試みはほとんど成功していない。限外濾過透析法は、アルブミンのようなタンパク質から多価イオンを除去するために使用されている。このプロトコールは、透析の際に一価イオンによってタンパク質と結合した多価イオンを置き換えることに依存している。例えば、米国特許第Ｒｅ．３６，２５９号には、アルブミンからアルミニウムイオンを除くためにダイアフィルトレーションシステムにおいて３％の塩水溶液、例えば塩化ナトリウム又は酢酸ナトリウムを使用することが開示されている。同様に、米国特許第５，２２９，４９８号には、約０．１５Ｍから飽和するまでの濃度の一価アルカリ金属イオン又はアンモニウムイオンを含む水溶液でのダイアフィルトレーションによってタンパク質からの多価イオンの置換及び除去が開示されている。
しかしながら、上記の場合には、ダイアフィルトレーションされたタンパク質は結合した一価イオンを含む。結果として、そのタンパク質を、通常は脱イオン水でさらに一連のダイアフィルトレーションに供して一価イオンを除去することが必要である。従って、シトレートイオン及びアルミニウムイオンの両方、同様にその他の多価イオンを、一価イオンを除去するために第２の方法を必要としないで、タンパク質から除去する方法が望まれている。
【０００４】
（発明の概要）
本発明は、タンパク質を含む溶液のｐＨを約７〜約１０のｐＨに調整し、ｐＨ調整した溶液を純水でダイアフィルトレーションすることによって、シトレート、アルミニウム、及びその他の多価イオン及び汚染物質をタンパク質から除去する方法に関する。
本発明のこれら及びその他の特徴、解釈、及び利点は、以下の詳細な説明、特許請求の範囲、及び添付図面を考慮することにより、より完全に理解されるであろう。
【０００５】
（詳細な説明）
本発明の方法は、タンパク質からシトレート、アルミニウム、及びその他の多価イオン及び汚染物質を除去する、簡便で、コストパフォーマンスがよく、効率的な方法を提供する。本発明の方法は、アルブミンからシトレート及びアルミニウムイオンを除去するのに特に有用である。
本発明の方法の出発物質は、シトレート及び／又はアルミニウムイオンをも含む任意のタンパク質含有水溶液であってもよい。例えば、出発物質は、工業的に調製されたアルブミン、CohnらによるJ. Amer. Chem. Soc., 68: 459-475 (1946)に記載される（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）コーン法から得られる可溶化フラクションＶ粉末又はフラクションＶペースト、その他の血漿誘導フラクション、又はアルブミン又はその他の血漿タンパク質を含む任意のその他の水溶液であってもよい。米国特許第５，２５０，６６２号（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）には、出発物質として好適なアルブミンを精製する方法が開示されている。
本発明の実施に適した出発物質のその他の例としては、これに限定されないが、免疫グロブリン、第VIII因子、第IX因子、アルファ−１−プロテイナーゼインヒビター及び／又はプロトロンビン複合体を含む水溶液が挙げられる。
初期のタンパク質含有溶液は、１ＮのNaOHのような塩基によって約７〜約１０のｐＨ値に最初に調整される。一の実施態様において、アルブミンを含む溶液は約８．８〜約９．２のｐＨに調整される。タンパク質溶液は、好ましくは予め濾過されて沈殿したタンパク質又はその他の粒状物質が取り除かれる。
次いで、タンパク質含有溶液はダイアフィルトレーションシステムに適用される。ダイアフィルトレーションシステムはタンパク質の分子量よりも小さい細孔サイズを有するダイアフィルター膜を含むように選択されて、アルミニウムイオン及びシトレートイオンのような多価イオン、同様に塩、溶媒、及びその他の小さな分子がダイアフィルター膜を通過できるようにし、タンパク質を保持する。アルブミン溶液からシトレート及びアルミニウムを除去するための使用に適したダイアフィルター膜としては、例えばMillipore UF-10 KDフィルター膜及びMillipore UF-30 KDフィルター膜（ミリポアコーポレイション、ベッドフォード、マサチューセッツ）が挙げられる。
タンパク質含有溶液はダイアフィルター膜に平行な方向にダイアフィルトレーションシステムを通過する。圧力勾配はフィルターにわたって適用される。タンパク質含有溶液がダイアフィルトレーション膜を横切って移動するため、汚染物質は濾液としてダイアフィルトレーション膜を通過し、タンパク質は保持液として保持される。純水が保持液に加えられ、得られた希釈保持液はさらにダイアフィルトレーションで循環処理される。このプロセスは汚染物質の所望の低減が達成されるまで繰り返される。
【０００６】
本明細書で使用される“純水”は、脱イオン水及び蒸留水等の低濃度のイオンを有する任意の水溶液を意味する。また、純水としては、１９９５年米国薬局方、国民医薬品集１８に記載されるように、注射用蒸留水、注射用静菌水、吸入用滅菌水、注射用滅菌水、潅漑用水、及び精製水が挙げられる（その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）。
次に、図１に本発明の実施に有用なシステム１０を示す。ｐＨ調整されたタンパク質溶液が原料タンク１２に入れられる。ポンプ１４は、溶液がホース１６を通ってダイアフィルター膜（図示しない）を含むダイアフィルトレーション装置１８に流れるようにする。濾液はパイプ２０を通ってダイアフィルトレーション装置から除去され、保持液はパイプ２２を通って原料タンクに戻されて再循環される。
水タンク２４に含まれる純水、例えば脱イオン水は、ポンプ２８によってホース２６を通って原料タンクに供給される。撹拌装置３０は純水を原料タンク中で保持液と混合する。
一の好ましい実施態様において、純水は、濾液がダイアフィルトレーション装置から除去される流量と同じ流量で原料タンク１２に連続的に加えられる。この実施態様において、タンパク質溶液／保持液の体積は一定に保たれる（“定容量洗浄ダイアフィルトレーション”）。保持液は、保持液に加えられた純水の量が初期のタンパク質溶液の体積又は重量の少なくとも約３倍と等しくなるまで、又は汚染物質の所定の低減が達成されるまで、ダイアフィルトレーション装置及び原料タンクを通って連続的に再循環される。
第２の好ましい実施態様において、純水は連続的ではなくバッチで保持液に加えられる。この“回分式ダイアフィルトレーション”実施態様において、保持液の体積は濾液が除去されるために減少し、保持液中のタンパク質の濃度は増加する。保持液中のタンパク質濃度が２倍から１０倍に増加したときに、保持液の体積をタンパク質溶液の初期体積に戻すのに十分な純水の量が原料タンクに加えられる。ダイアフィルトレーション装置及び原料タンクを通して保持液を再循環する方法及び原料タンクへの純水の回分式添加は、多価イオンが所望の濃度になるまで続けられる。
本発明の方法の実施例を以下に記載する。
【０００７】
実施例１：脱イオン水でのアルブミンの定容量洗浄ダイアフィルトレーション
ｐＨ７．２の工業的に製造されている２５％アルブミン溶液約４０ｍＬを本発明の手順に従ってダイアフィルトレーションした。10KD Millipore（登録商標）UF膜フィルターを含むダイアフィルトレーション装置を通してアルブミン溶液を循環することによって、濾液を除去し、濾液が除去される流量と同じ流量で脱イオン水を保持液に連続的に加えた。約２８０ｍＬの体積の脱イオン水が加えられるまで、ダイアフィルトレーションを繰り返した。次いで、ダイアフィルトレーションしたアルブミン溶液について、アルミニウム及びシトレートの試験をした。
試料について、ウエストコーストアナリティカルサービス（ＷＣＡＳ、サンタフェスプリングズ、ＣＡ）でシトレートイオンの試験をした。ＷＣＡＳによって使用されたイオンクロマトグラフィー方法において、抑制した伝導性（suppressed conductivity）によってシトレートイオンを検出し、外部標準を参照して定量化した。
また、アルミニウム試験も、誘導結合プラズマ質量分光法（ＩＣＰＭＳ）を用いて、ＷＣＡＳで行った。この方法において、プラズマによって発生した陽イオンは真空界面に導入される。この界面は四重極質量分析計であり、試料導入後元素状態で存在する同位体の質量の範囲のデータを得る。データを多チャンネル分析装置で記録及び収集し、さらに標準と比較することによってアルミニウムの濃度を計算するために使用する。
結果を表１に示す。
【０００８】
【表１】
2004521099.tif 000003
【０００９】
表１に示すように、工業的に製造された２５％アルブミン溶液（ｐＨ７．２）中の９７％のシトレートは脱イオン水でのダイアフィルトレーションの際に除去され、８１％のアルミニウムが除去される。
【００１０】
実施例２：アルブミンの定容量洗浄ダイアフィルトレーションによるアルミニウム及びシトレートの除去に対するｐＨの影響
工業的に製造された２５％アルブミン溶液を脱イオン水で３倍に希釈した。希釈したアルブミン溶液を３つの試料に分けた。１ＮのNaOHを用いて、第１試料のｐＨを８．１に調整し、第２試料のｐＨを９．１に調整し、さらに第３試料のｐＨを９．９に調整した。
約５０ｍＬの各試料を、10KD Millipore UF膜フィルターを用いて、脱イオン水での定容量洗浄ダイアフィルトレーションに別々に供した。ダイアフィルトレーションは、約３５０ｍＬの脱イオン水が加えられるまで継続した。ダイアフィルトレーション前後の希釈したアルブミン溶液中のシトレート及びアルミニウム濃度を上述のように測定した。結果を表２に示す。
【００１１】
【表２】
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【００１２】
表２に示すように、市販のアルブミンのシトレート濃度はすべての試験したｐＨ条件で５０ｐｐｍ未満に減少した。アルミニウム濃度は、ｐＨ８．１で７４ｐｐｂから１０ｐｐｂに減少し、ｐＨ９．１及び９．９では、１０ｐｐｂ未満に減少した。
【００１３】
実施例３：コーンフラクションＶペースト−脱イオン水での定容量洗浄ダイアフィルトレーション後のアルブミン及びシトレートイオン濃度に対するｐＨの影響
脱イオン水にコーンフラクションＶペーストを懸濁することによって、約７％のタンパク質を含むアルブミン溶液を調製した。ｐＨを４．６に調整した後、アルブミン溶液を予め平衡にしたDEAE Sephadex A-50樹脂で処理した。予め濾過したパススルーアルブミン溶液の一部を取り、５つの５０ｍＬアリコットをこの溶液から調製した。第１アリコットをｐＨ５．０に調整し、第２アリコットをｐＨ７．０に調整し、第３アリコットをｐＨ８．０に調整し、第４アリコットをｐＨ９．０に調整し、第５アリコットをｐＨ１０．０に調整した。
10KD Millipore（登録商標）UF膜フィルターを用いて、各アリコットを一つずつ脱イオン水に対する定容量洗浄ダイアフィルトレーションに供した。約３５０ｍＬの脱イオン水が加えられるまで、ダイアフィルトレーションを継続した。アルブミン溶液中のシトレート及びアルミニウム濃度をダイアフィルトレーション前後で測定した。結果を表３に示す。
【００１４】
【表３】
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【００１５】
表３に示した結果は、増加するｐＨ条件下でのアルブミン溶液のダイアフィルトレーションによるシトレート及びアルミニウム濃度の減少傾向を示す。一般に、アルミニウム及びシトレートの両方の濃度は増加するｐＨによって減少するが、ｐＨ１０のアルミニウム濃度はｐＨ９．０及びｐＨ８．０の濃度よりもわずかに上がっている。
【００１６】
実施例４：コーンフラクションＶ粉末−アルミニウム及びシトレート濃度に対するｐＨ１０で脱イオン水でのダイアフィルトレーションの影響
アセトン処理したコーンフラクションＶペーストから得られるコーンフラクションＶ粉末から約７％のタンパク質を含むアルブミン溶液を調製した。アルブミン溶液のｐＨを約１０に調整した。
30KD Millipore（登録商標）UF膜フィルターを含むダイアフィルトレーション装置を用いて、ｐＨ調整したアルブミン溶液を脱イオン水でダイアフィルトレーションした。原料タンクからのアルブミン溶液をダイアフィルトレーション装置に供給した。保持液を原料タンクに戻して再循環し、濾液を除去した。脱イオン水を濾液の除去とほぼ同じ流量で原料タンクに連続的に加えた。タンパク質溶液の原重量の約７倍の量の脱イオン水を加えたときに、ダイアフィルトレーションプロセスを停止した。タンパク質溶液の試料を回収し、シトレート及びアルミニウムについて試験した。試験結果を表４に示す。
【００１７】
【表４】
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【００１８】
表４に示すように、タンパク質溶液のｐＨを約１０に調整し、その溶液を脱イオン水でダイアフィルトレーションした後、シトレート濃度は１７００ｐｐｍの初期値から２ｐｐｍ未満に減少し、アルミニウム濃度は４９ｐｐｂから２ｐｐｂに減少した。
【００１９】
実施例５：ｐＨ６．２、８．８、９．０、又は９．２に調整した可溶性コーンフラクションＶ粉末からの２０％アルブミンの調製
アセトン処理したコーンフラクションＶペーストから得られる約１．５ＫｇのフラクションＶ粉末を冷脱イオン水中に０〜１０℃で懸濁して約８％のタンパク質を含む溶液を得た。温度を０〜１０℃に保ちながらｐＨを約６．５±０．５に調整した。濾過助剤を有するCUNO CPX90SPデプスフィルターを通して濾過することにより、ｐＨ調整したアルブミン溶液を浄化した。
浄化した溶液をそれぞれ４Ｋｇの４つのサブロットに分け、各サブロットのｐＨを６．２（コントロール）、８．８、９．０、又は９．２に１ＮのNaOHで調整した。ｐＨ調整した各サブロットを、出発可溶性フラクションＶ溶液の重量の５倍（“５×体積”）の冷（約２℃〜約８℃）脱イオン水の合計量で２回ダイアフィルトレーションした。ダイアフィルトレーションの完了時のタンパク質濃度は１３±３％であった。ダイアフィルトレーションしたアルブミン溶液のｐＨをｐＨ６．７０〜６．８５に０．５ＮのHCl（ｐＨ６．２のコントロールについて）又は１．０ＮのHCl（ｐＨ８．８、９．０及び９．２のサブロットについて）で調整した。
ダイアフィルトレーションしたアルブミン溶液をカプリル酸ナトリウム及びアセチルトリプトファンナトリウム（sodium acetyl tryptophan）で安定化して、それぞれ１グラム当たり０．０８ミリモルのタンパク質の最終濃度とした。濾過による浄化後、溶液を６０±０．５℃で２時間加熱した。加熱したアルブミン溶液を５〜１０℃の温度に急激に冷却し、濾過により浄化し、２３〜２６％のタンパク質溶液に濃縮した。
溶液をカプリル酸ナトリウム及びアセチルトリプトファンナトリウムで再度安定化し、それぞれ１グラム当たり０．０８ミリモルのアルブミンの濃度とした。ｐＨを６．９±０．５に調整し、ナトリウムを１リットル当たり１４５±１５ｍＥｑに調整し、タンパク質を約２０％に調整した。
無菌バクテリア保持フィルターを通して溶液を無菌濾過し、無菌ボトル（タイプIIガラス）に入れ、塩化ゴム止め具で栓をした。密封したボトルを１０時間以上又は１１時間よりも長く６０±０．５℃で加熱処理した。
【００２０】
実施例６：ｐＨ６．２、９．０、又は９．２に調整した可溶性コーンフラクションＶ粉末からの２５％アルブミンの調整
２５％アルブミンの２つの別個のロット（ロット１及びロット２）を可溶性コーンフラクションＶ粉末から実施例５に記載されるように調製した（各ロットの浄化した溶液をそれぞれ４Ｋｇの３つのサブロットに分け（各サブロットのｐＨを６．２（コントロール）、９．０又は９．２に調整した）、各サブロットからの最終加熱アルブミン溶液を約２５％のタンパク質溶液に濃縮することを除いて）。
２０％及び２５％アルブミン（実施例５及び６）を調製する方法の３つのステージ：ダイアフィルトレーション前（出発物質又は“ＳＭ”）、ダイアフィルトレーション後（６．７０〜６．８５へのｐＨ調製後；ダイアフィルトレーションした試料又は“ＤＳ”）、及び最終無菌ガラス容器での低温殺菌後（最終容器試料又は“ＦＳ”）で試験する試料を得た。アルブミンを調製する方法の概要を３つのサンプリングポイントと共に図２に示す。
【００２１】
実施例７：フラクションＶ溶液の異なるｐＨ及び異なるダイアフィルトレーション洗浄体積でのダイアフィルトレーション
シトレートの低減に対するダイアフィルトレーションの際の浄化したフラクションＶ溶液のｐＨの増加（ｐＨ８．８、９．０、又は９．２）の影響を決定した。また、ダイアフィルトレーションをｐＨ６．２で行い、これをコントロールとした。実施例５のダイアフィルトレーションしたフラクションＶ溶液の試料（“ＤＳ”）をシトレートについてウエストコーストアナリティカルサービス（ＷＣＡＳ、サンタフェスプリングズ、ＣＡ）及びアルファセラピューティックコーポレイション（ＡＴＣ、ロサンジェルス、ＣＡ）の両方で試験した。
上述のシトレート濃度を測定するためのＷＣＡＳによって使用されたイオンクロマトグラフィー方法は、２ｐｐｍの最小検出限界を有する。ＡＴＣで使用した比色法において、標準シトレート溶液及びタンパク質を除去した試料を混合し、ピリジン及び無水酢酸と反応させた。約４５分間後、これらの溶液の４２５ｎｍでの光学密度（ＯＤ425）を測定した。次いで、各試料のシトレートイオン含有量を計算し、標準曲線から決定した。この方法は０．１ｍＭ（２９ｐｐｍ）の最小検出限界を有する。検出限界未満のすべてのシトレートの値は、以下に述べられるように、図３〜５において検出限界値として得られた。
ダイアフィルトレーション定容量洗浄が４×体積又は６×体積であること以外は実施例５のようにして調製したダイアフィルトレーションしたフラクションＶ溶液から追加の試料を得た。図３に示すように、冷（約２℃〜約８℃）脱イオン水に対するｐＨ８．８、９．０及び９．２のダイアフィルトレーションにより、ｐＨ６．２のダイアフィルトレーション（３８３ｐｐｍ）と比較してシトレートの量が少ない（約３８〜５ｐｐｍ）溶液を得た。
また、低濃度のシトレート（５０ｐｐｍ未満）は、洗浄体積が４×体積又は６×体積である試料においても、ｐＨ８．８、９．０又は９．２のダイアフィルトレーションの場合にも見られた。図３及び４を参照のこと。図４に示すように、使用した各ｐＨで、浄化したフラクションＶ溶液をダイアフィルトレーションするために使用した脱イオン水の体積を大きくすればするほど、シトレートはより低減される。
同じ結果は、多くの２５％アルブミンが実施例６のようにして調製され、４×体積又は５×体積の脱イオン水でｐＨ６．２（コントロール）、ｐＨ９．０及び９．２の浄化したフラクションＶ溶液をダイアフィルトレーションした場合に見られた。図５に示すように、ｐＨ９．０及び９．２の両方で、各洗浄体積でのダイアフィルトレーション後のシトレートの量は、コントロールで得られた２６４ｐｐｍ（ｐＨ６．２、５×体積）と比較して、２ｐｐｍの検出限界未満であった。
【００２２】
実施例８：２０％及び２５％アルブミンの浄化したフラクションＶのダイアフィルトレーション前後及び最終容器溶液のシトレート及びアルミニウム濃度
シトレート及びアルミニウム濃度を、実施例５における２０％アルブミンの調製及び実施例６における２５％アルブミンのロット１及び２の調製からのそれぞれ３つの試料（ＳＭ、ＤＳ及びＦＳ）について測定した。結果を表５、６及び７及び図６〜１１に示す。
アルミニウム試験は、電熱黒鉛炉アトマイザによる原子の発生を含む黒鉛炉原子吸光分析（ＧＦＡＡＳ）を用いてＡＴＣで行った。溶媒（有機分子及び／又は無機物質）を除去するための乾燥及び灰化後、試料を原子化して狭い領域に遊離原子を生成する。ＧＦＡＡＳによって生成した吸収シグナルは鋭いピークであり、その領域は試料中に存在する検体成分の量に関係している。バリアン黒鉛炉モデルGTA96Z及びプログラム制御サンプリング可能なバリアンオートサンプラーPSD96を備えるバリアンSpectrAA-400ゼーマン原子吸光分光計をアルミニウム定量に用いた。２．５％タンパク質に希釈した試料を熱分解性被覆プラトーチューブ内の熱分解性黒鉛プラットフォームに導入した。原子吸光測定は３０９．３ｎｍで行った。
３つのサンプリングポイント（ＳＭ、ＤＳ及びＦＳ）から回収した試料のタンパク質濃度は異なるために、表５及び図６〜１１に示したアルミニウム値は一貫性を維持するために２．５％タンパク質で規格化した。
シトレート試験は上述のようにＡＴＣ及びＷＣＡＳの両方で行った。表５、６及び７に示すように、検出限界未満であるすべてのシトレート及びアルミニウムの結果は、それぞれその検出限界値で示し、図６〜１１に示すようにグラフ化した。
【００２３】
【表５】
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【００２４】
【表６】
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【００２５】
【表７】
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【００２６】
表５に示すように、ｐＨ６．２、８．８又は９．０でのダイアフィルトレーション後のアルミニウムの濃度は浄化したフラクションＶ溶液の６ｐｐｂからダイアフィルトレーションした試料（実施例５）の５ｐｐｂ未満に減少した。しかしながら、いくらか驚いたことに、アルミニウムの濃度は、ｐＨ９．２でダイアフィルトレーションした場合に、ＳＭの６ｐｐｂからＤＳの約２４ｐｐｂに明らかに増加した。この結果はアルミニウムアッセイの汚染物質によるものであるかもしれない。注目すべきは、ｐＨ９．２でダイアフィルトレーションしたアルブミン溶液の最終容器（ＦＳ）が５ｐｐｂ未満のアルミニウム濃度を有するように見える（表５）ことである。ｐＨ８．８でダイアフィルトレーションした試料を除いては、ダイアフィルトレーションｐＨが増加すると、最終容器のアルミニウム濃度は減少傾向を示した。
同様に、実施例６のようにして調製した２５％アルブミン溶液の結果は、ダイアフィルトレーションｐＨが増加すると、アルミニウム濃度の減少を示した。例えば、ｐＨ６．２でのダイアフィルトレーション後、アルブミン溶液のアルミニウム濃度は４４ｐｐｂであり、ｐＨ９．０及び９．２では、それぞれ３７ｐｐｂ及び７ｐｐｂ又は１８ｐｐｂに減少し（実施例６、ロット１）、又はｐＨ９．０及び９．２では、それぞれ９ｐｐｂ及び５ｐｐｂ未満に減少した（実施例６、ロット２）。
表６に示すように、同様の結果が脱イオン水での高いｐＨ値のダイアフィルトレーション後のアルブミン溶液中のシトレート濃度で見られた。浄化したフラクションＶ溶液（ＳＭ）のｐＨ６．２でのダイアフィルトレーションにより、シトレート量は３３７０ｐｐｍから約６２４ｐｐｍ（２．１２ｍＭ）に減少した（実施例５）。ダイアフィルトレーションｐＨを８．８、９．０又は９．２に増加することにより、ダイアフィルトレーションした試料（ＤＳ）のシトレート量は４１ｐｐｍ（０．１４ｍＭ）から２９ｐｐｍ未満（０．１０ｍＭ未満）の間に減少した。同様の結果は実施例６のようにして調製した２５％アルブミンの溶液で見られ、ｐＨ６．２でのダイアフィルトレーション後のシトレート濃度は６１８ｐｐｍ（ロット１）及び５９７（ロット２）であるが、ｐＨ９．０又は９．２でのダイアフィルトレーション後には検出限界未満（２９ｐｐｍ又は０．１０ｍＭ未満）に低下した（表６）。同様の結果は試験のためにウエストコーストアナリティカルサービスに送られた試料でも見られた（表７）。
出発物質（ＳＭ）及びダイアフィルトレーションした溶液（ＤＳ）のアルミニウム及びシトレートアッセイの結果を図６（２０％アルブミン、実施例５）、７（２５％アルブミン、ロット１、実施例６）及び８（２５％アルブミン、ロット２、実施例６）にグラフで示す。２０％及び２５％アルブミン溶液の調製の際の浄化したフラクションＶ溶液のダイアフィルトレーション前後で得られる結果に基づいて、溶液のシトレート及びアルミニウム含有量が、ダイアフィルトレーションｐＨが８．８、９．０又は９．２に増加した場合に減少することは明らかである。
また、最終容器試料のシトレート及びアルミニウム結果は、ダイアフィルトレーションｐＨの増加がシトレート及びアルミニウム濃度を減少させることを示す。最終容器試料のシトレート濃度は、ダイアフィルトレーションｐＨがｐＨ６．２からｐＨ８．８、９．０又は９．２に増加した場合に２９ｐｐｍ未満に減少した（表６）。また、ｐＨ９．０又は９．２でダイアフィルトレーションした最終容器溶液のアルミニウム濃度は、各アルブミン製剤について、対応するコントロール（ｐＨ６．２でのダイアフィルトレーション）と比較して低くなった（表５）。すべての場合に、２０％又は２５％のタンパク質に標準化した後の最終容器のアルミニウム濃度は、２００ｐｐｂ以下のアルミニウムのスペックの範囲内であった。最終容器溶液（ＦＳ）のアルミニウム及びシトレートアッセイの結果を図９（２０％アルブミン、実施例５）、１０（２５％アルブミン、ロット１、実施例６）及び１１（２５％アルブミン、ロット２、実施例６）にグラフで示す。
これらの結果は、より高いｐＨで、アルミニウム又はタンパク質又はその両方と結合するシトレートが薄まり、ダイアフィルトレーションによって容易に除去されることを示唆する。これは、より高いｐＨ（塩基性ｐＨ）で、シトレートとアルミニウムとの間の静電気引力がその２つの種のクーロン反発力によって弱められることを示したRabinow, B.E., Ericson, S., and Shelbourne, T.M. (1989) J. Parenter. Sci. Technol. 43: 132-139と一致している。
【００２７】
実施例９：２０％及び２５％アルブミンの浄化したフラクションＶのダイアフィルトレーション前後及び最終容器溶液の純度、透明度、アセトン含有量及びＨＰＳＥＣ結果
ダイアフィルトレーションｐＨの増加は低濃度のシトレート及びアルミニウムを生じるが、より高いダイアフィルトレーションｐＨがアルブミン溶液のその他の物理特性に悪影響を与えないことを保証することは重要である。たいていの市販のアルブミン溶液は、例えば種々の物理特性について所定のスペックに適合しなければならない。例えば、市販のアルブミン溶液の典型的なスペックとしては、次のような要求が挙げられる：２００ｐｐｂ以下のアルミニウム含有量、９６％以上のアルブミンの純度、０．０２ｇ／１００ｍＬ以下のアセトン含有量、及び８０％以上のモノマー及びダイマー、ポリマー、及びフラグメントについて、それぞれ９％、１５％及び６％以下である分子サイズ分布。従って、これらの物理特性を、実施例５及び６に記載される３つのすべてのアルブミン製剤からのＳＭ、ＤＳ、及びＦＳ試料で測定した。
異なるｐＨ値でのダイアフィルトレーション前後及び最終容器溶液の浄化したフラクションＶ溶液の純度をセルロースアセテート膜電気泳動法（ＣＡＭＥ）により決定した。結果を表８に示す。
【００２８】
【表８】
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【００２９】
表８に示すように、３つのすべての製剤のアルブミン溶液の純度は、ダイアフィルトレーション前で９９．０％〜９９．２％の範囲であり、ダイアフィルトレーション後で９９．０％〜９９．８％の範囲であった。すべての最終容器溶液の純度は９８．９％〜９９．９％アルブミンの範囲であり、９６％以上のアルブミンであるスペックの範囲内である。
１２×７５ｍｍチューブを用いて、ダイアフィルトレーション前後及び最終容器溶液のアルブミン溶液の透明度を比濁分析によって測定した。結果を表９に示す。
【００３０】
【表９】
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【００３１】
ダイアフィルトレーション前の浄化したフラクションＶ溶液の透明度は、３つのすべての製剤で２．０ＮＴＵ〜２．２ＮＴＵの範囲であった。ｐＨ６．２でのダイアフィルトレーション後の濁度を表示する比濁分析記録は増加した。ダイアフィルトレーションｐＨをｐＨ８．８、９．０又は９．２に増加させた場合、透明度はわずかに改善し、又はほとんど変化しなかった。すべての最終容器溶液の透明度は１．６ＮＴＵ〜２．６ＮＴＵの範囲内であった。
ダイアフィルトレーション前後及び最終容器溶液におけるアルブミン溶液のアセトン含有量を表１０に示す。
【００３２】
【表１０】
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【００３３】
ダイアフィルトレーション前のアセトン含有量は、３つのすべてのアルブミン製剤について０．００３〜０．０１０ｇ／１００ｍＬの範囲であった。アセトン濃度はダイアフィルトレーション後、０．００１〜０．００４ｇ／１００ｍＬの範囲に減少し、ダイアフィルトレーションｐＨの影響を受けないようであった。アセトンの出発濃度は低いが、ダイアフィルトレーション後のアセトンの量の減少は、アセトンが本発明の方法によりさらに除去されることを示す。すべての最終容器溶液のアセトン含有量は０．００１〜０．００２ｇ／１００ｍＬの範囲であり、０．０２ｇ／１００ｍＬ以下であるスペックの十分範囲内である。
高性能サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）によって決定した、ダイアフィルトレーション前後及び最終容器溶液中のアルブミンの分子分布を実施例５及び６に記載される３つのアルブミン製剤について表１１、１２及び１３に示す。
【００３４】
【表１１】
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【００３５】
【表１２】
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【００３６】
【表１３】
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【００３７】
表１１、１２及び１３に示すように、ダイアフィルトレーション前のモノマーの量は８８．１％〜９４．３％の範囲であり、ダイマーの量は４．０％〜８．８％の範囲であり、ポリマーの量は０．６％〜０．９％の範囲であり、フラグメントの量は０．８％〜２．２％の範囲である。ダイアフィルトレーション後、モノマーの量は９２．２％〜９４．９％の範囲であり、ダイマーの量は３．４％〜６．０％の範囲であり、ポリマーの量は０．６％〜１．３％の範囲であり、フラグメントの量は０．４％未満〜１．２％の範囲である。最終容器溶液のモノマーの量は８７．２％〜８９．３％の範囲であり、すべて８０％以上のスペックの範囲内である。同様に、ダイマー、ポリマー及びフラグメントの量は、すべてスペックの範囲内である（それぞれ、９％以下、１５％以下、及び６％以下）。
３つの製剤間でモノマー、ダイマー、ポリマー及びフラグメントの相対量において大きな変化があるが、各製剤内では変化は有意ではなかった。
【００３８】
実施例１０：２０％及び２５％アルブミンの最終容器溶液におけるタンパク質の二次構造
すべての最終容器のアルブミン溶液の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルのオーバーレイプロット（図１２）は、試料に含まれるタンパク質の構造が定性的に非常に似ていることを示す。ＣＤ試験はコモンウェルスバイオテクノロジーズ  インコーポレイテッド（リッチモンド、ＶＡ）により行われた。
【００３９】
実施例１１：２０％及び２５％アルブミンの最終容器溶液の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）結果
アルブミン最終容器溶液のＤＳＣ結果を表１４にまとめる。コントロール（ダイアフィルトレーションｐＨ６．２）及び試料（ダイアフィルトレーションｐＨ８．８、９．０及び９．２）の融解温度、モル熱（Ｈ）及びファントホッフ熱変化（Ｈｖ）は、平均の±２ＳＤの範囲内であった。これらのデータは、実施例５及び６のように調製された３つのロットすべてからの最終容器試料間で二次タンパク質構造に有意な差がないことを示す。ＤＳＣ試験もコモンウェルスバイオテクノロジーズ  インコーポレイテッド（リッチモンド、ＶＡ）により行われた。
【００４０】
【表１４】
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【００４１】
実施例１２：２０％及び２５％アルブミンの最終容器溶液の全タンパク質、熱安定性及び外観
実施例５及び６に記載されるように調製した２０％及び２５％アルブミンの最終容器溶液（ＦＳ）の全タンパク質濃度を表１５に示す。市販のアルブミン溶液の典型的なスペックは、以下の濃度要求を有する：１８．８〜２１．２ｇ／１００ｍＬ（２０％アルブミンについて）又は２３．５〜２６．５ｇ／１００ｍＬ（２５％アルブミンについて）の全タンパク質濃度。
【００４２】
【表１５】
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【００４３】
表１５に示すように、２０％アルブミンの最終容器のタンパク質濃度は１９．０〜２０．５ｇ／１００ｍＬの範囲であり、１８．８〜２１．２ｇ／１００ｍＬのスペックの十分範囲内であった。同様に、２５％アルブミン（ロット１）の最終容器のタンパク質濃度は２３．５〜２４．１ｇ／１００ｍＬの範囲であり、すべて２３．５〜２６．５ｇ／１００ｍＬのスペックの範囲内であった。ロット２（２５％アルブミン）の３つの最終容器のうち１つは２７．３ｇ／１００ｍＬのタンパク質濃度を有し、スペックよりも約０．８ｇ／１００ｍＬ高い。しかしながら、タンパク質濃度の小さな差は、最終容器アルブミン生成物の品質又は生成物のアルミニウム濃度に悪影響を与えないであろう。
熱安定性研究の結果（表１６に示す）は、種々のダイアフィルトレーションｐＨ値で実施例５及び６のように調製した２０％及び２５％アルブミンがすべてスペック濃度の範囲内（加熱の前後で外観上透き通っている、コントロールにおいて１６ＮＴＵ以下又は試料において２１ＮＴＵ以下）であることを示す。
【００４４】
【表１６】
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【００４５】
最終的に、最終容器溶液のすべては、より高いｐＨ値でダイアフィルトレーションしたアルブミン生成物の外観が市販スペック、透明性の要求、わずかな粘性、緑色又は琥珀色から淡黄色への溶液の変化する強度の範囲内であるかどうかを決定するために外観上調べられた。最終容器試料のすべては、透明性、琥珀色及びわずかな粘性であることが分かり、スペックパラメータの十分範囲内であった。
浄化したフラクションＶ溶液の８．８〜９．２の範囲のｐＨ値でのダイアフィルトレーションは、最終アルブミン溶液のシトレート濃度を検出限界（２９ｐｐｍ又は０．１０ｍＭ）未満に減少させ、アルミニウム濃度を最終アルブミン溶液の重要な特性を有意に変化させることなしに減少させる。
上記の実施例を見ても分かるように、ｐＨ調整したタンパク質溶液の純水でのダイアフィルトレーションは、シトレート及びアルミニウムイオンを除去する簡単かつ効果的な方法である。タンパク質溶液のｐＨを約７よりも大きく調整し、純水でダイアフィルトレーションすることによって、多価イオン、同様に一価イオン、塩、溶媒及びその他の低分子量分子が同時にタンパク質から除去される。
汚染物質をタンパク質溶液から除去する方法の例示的な実施態様の上記記述は本発明の実例である。しかしながら、当業者にとって明らかである変更のために、本発明が上記特定の実施態様に限定されることを意図しない。本発明の範囲は特許請求の範囲に定義される。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】本発明の実施に従って純水でタンパク質溶液をダイアフィルトレーションするシステムの概略図である。
【図２】本発明の実施に従ってコーンフラクションＶ粉末からのダイアフィルトレーションしたアルブミン溶液の調製を示すフローチャートであり、ｐＨ６．２、８．８、９．０、又は９．２の純水でダイアフィルトレーションした場合のアルブミン溶液のシトレート及びアルミニウム濃度を試験するサンプリングポイントを示す。
【図３】異なる体積の脱イオン水でダイアフィルトレーションした浄化フラクションＶ溶液中のシトレートの低減に対するｐＨ（６．２、８．８、９．０、又は９．２）の影響を示すグラフである。
【図４】ｐＨ８．８、９．０又は９．２での浄化フラクションＶ溶液中のシトレートの低減に対するダイアフィルトレーション体積の影響を示すグラフである。
【図５】異なる体積の脱イオン水でダイアフィルトレーションした浄化フラクションＶ溶液中のシトレートの低減に対するｐＨ（６．２、９．０、又は９．２）の影響を示す。
【図６】実施例５のように調製した、脱イオン水でのダイアフィルトレーション前後の浄化フラクションＶ溶液中のシトレート及びアルミニウムイオンの低減に対するダイアフィルトレーションｐＨの影響を示すグラフである。
【図７】実施例６のように調製した、脱イオン水でのダイアフィルトレーション前後の浄化フラクションＶ溶液ロット１中のシトレート及びアルミニウムイオンの低減に対するダイアフィルトレーションｐＨの影響を示すグラフである。
【図８】実施例６のように調製した、脱イオン水でのダイアフィルトレーション前後の浄化フラクションＶ溶液ロット２中のシトレート及びアルミニウムイオンの低減に対するダイアフィルトレーションｐＨの影響を示すグラフである。
【図９】実施例５のように調製した２０％アルブミン溶液（最終容器試料）中のシトレート及びアルミニウムイオンの低減に対するダイアフィルトレーションｐＨの影響を示すグラフである。
【図１０】実施例６のように調製した２５％アルブミン溶液（最終容器試料）ロット１中のシトレート及びアルミニウムイオンの低減に対するダイアフィルトレーションｐＨの影響を示すグラフである。
【図１１】実施例６のように調製した２５％アルブミン溶液（最終容器試料）ロット２中のシトレート及びアルミニウムイオンの低減に対するダイアフィルトレーションｐＨの影響を示すグラフである。
【図１２】２０％及び２５％アルブミン溶液の調製の際に得られる試料の円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルのオーバーレイプロットである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004521099.tif 000076
2004521099.tif 000077
【国際調査報告】
2004521099.tif 000078
2004521099.tif 000079