(57)【要約】本発明は、ＣａｎＩｏｎのゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびポリペプチド配列、新規な電位作動性イオンチャネルタンパク質に関する。本発明は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の２対立遺伝子マーカーにも関する。ＣａｎＩｏｎ遺伝子は、精神分裂病、双極性障害、および他の疾患および症状の治療および診断に生物学的標的として使用することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜４または配列番号６で示されるヌクレオチド配列のいずれか、もしくはこれらの配列のいずれかに相補的な配列を含む、単離、精製された、または組換えポリヌクレオチド。
【請求項２】
配列番号４の少なくとも５０ヌクレオチドの隣接スパンを含有する、単離、精製された、または組換えポリヌクレオチドであって、生物活性ＣａｎＩｏｎポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号５のアミノ酸配列を含有するヒトＣａｎＩｏｎポリペプチド、またはその生物活性断片をコードする、単離、精製された、または組換えポリヌクレオチド。
【請求項４】
固体支持体に付着される、請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項４に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドのアレイ。
【請求項６】
アドレス指定可能である、請求項５に記載のアレイ。
【請求項７】
さらに標識を含む、請求項１から４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１から３のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項９】
プロモーターに作動可能に連結する、請求項２または３に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の組換えベクターを含有する宿主細胞。
【請求項１１】
請求項８または９に記載の組換えベクターを含有する非ヒト宿主動物または哺乳類。
【請求項１２】
ノックアウトベクターとの相同的組換えによって破壊されたＣａｎＩｏｎ遺伝子を含有する、哺乳類宿主細胞または非ヒト宿主哺乳類。
【請求項１３】
配列番号５で示されるアミノ酸配列、またはその生物活性断片を含有する、単離、精製された、または組換えポリペプチド。
【請求項１４】
ａ）プロモーターに作動可能に連結する、請求項１３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞集団を提供する段階；
ｂ）前記細胞内の前記ポリペプチドを生成する助けとなる条件下にて、前記細胞集団を培養する段階；
ｃ）前記細胞集団から前記ポリペプチドを精製する段階；を含む、ポリペプチドを作製する方法。
【請求項１５】
請求項１に記載のポリペプチドに抗ＣａｎＩｏｎ抗体を結合させる方法であって、前記抗体が前記ポリペプチドに特異的に結合することができる条件下にて、前記抗体を前記ポリペプチドと接触させることを含む方法。
【請求項１６】
細胞内のＣａｎＩｏｎ遺伝子の発現を検出する方法であって、
ａ）前記細胞または前記細胞からの抽出物を、
ｉ）厳密な条件下にて、請求項１、２、もしくは３に記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチド；
ｉｉ）請求項１３に記載のポリペプチドに特異的に結合するポリペプチド；のいずれかと接触させる段階と、
ｂ）前記ポリヌクレオチドと前記細胞もしくは抽出物内のＲＮＡ種との間のハイブリダイゼーションの存在または非存在、あるいは前記細胞もしくは抽出物内のタンパク質への前記ポリペプチドの結合の存在または非存在を検出する段階と、
を含み、前記ハイブリダイゼーションまたは前記結合の存在の検出によって、前記ＣａｎＩｏｎ遺伝子が前記細胞内で発現することが示される方法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドプライマーであり、かつ前記ハイブリダイゼーションが、前記プライマーの配列を含有する増幅産物の存在を検出することによって検出される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが抗ＣａｎＩｏｎ抗体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ａ）請求項１３に記載のポリペプチドを試験化合物と接触させる段階；
ｂ）前記化合物が、前記ポリペプチドに特異的に結合するかどうかを決定する段階；を含む、ＣａｎＩｏｎポリペプチドの候補修飾物質を同定する方法であって、
前記化合物が前記ポリペプチドに特異的に結合することの検出によって、前記化合物が前記ＣａｎＩｏｎポリペプチドの候補修飾物質であることが示される方法。
【請求項２０】
前記候補修飾物質の存在下にて、前記ＣａｎＩｏｎポリペプチドの活性を試験することをさらに含む、請求項１９に記載の方法であって、前記候補修飾物質の非存在下での活性と比較した、前記候補修飾物質の存在下における前記ＣａｎＩｏｎポリペプチドの活性の差によって、その候補修飾物質が前記ＣａｎＩｏｎポリペプチドの修飾物質であることが示される方法。
【請求項２１】
ａ）請求項１３に記載のポリペプチドを試験化合物と接触させる段階；
ｂ）前記化合物の存在下または非存在下における前記ポリペプチドの活性を検出する段階；を含む、ＣａｎＩｏｎポリペプチドの修飾物質を同定する方法であって、
前記化合物の非存在下での活性と比較した、前記化合物の存在下における前記活性の差を検出することによって、前記化合物が前記ＣａｎＩｏｎポリペプチドの修飾物質であることが示される方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが細胞または細胞膜中に存在し、かつ前記活性が電位作動性イオンチャネル活性を含む、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
ａ）請求項１９から２２のいずれか一項に記載の方法を用いて、ＣａｎＩｏｎポリペプチドの修飾物質を同定する段階；
ｂ）前記修飾物質を生理学的に許容可能な担体と組み合わせる段階；を含む、薬剤組成物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電位作動性イオンチャンネル遺伝子およびタンパク質と、疾患におけるその役割に関する。本発明は、ＣａｎＩｏｎポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびに前記コード領域の５’−および３’−末端に位置する調節領域に関する。本発明はまた、ＣａｎＩｏｎ遺伝子によってコードされるポリペプチドにも関係する。本発明は、ＣａｎＩｏｎチャンネルの修飾物質、例えば、拮抗薬をスクリーニングする方法、および種々の疾患または症状の治療または予防にかかる修飾物質を使用する方法もまた提供する。本発明はまた、診断用試薬として有用な、かかるポリペプチドに対して特異的に作られる抗体を論じる。本発明はさらに、遺伝分析で有用なＣａｎＩｏｎ遺伝子の２対立遺伝子マーカーを包含する。
【背景技術】
【０００２】
基礎および臨床の研究者にとって利用可能な技術的設備の進歩によって、健康状態および疾患状態における脳および神経系機能をますます精密に研究することが可能となっている。神経生物学的および薬理学的両方の多数の仮説が、精神障害および神経変性疾患を含む、中枢神経系（ＣＮＳ）障害に関与する神経化学的および遺伝的メカニズムに関して提起されている。しかしながら、ＣＮＳ障害は原因が複雑であり、よく理解されていないばかりでなく、症状が重複しており、よく特徴付けられておらず測定するのが難しい。結果としては、今後の治療法および薬剤開発努力を、さらに精巧にし、複遺伝子性の原因に焦点を当てることが必要とされ、疾患集団をセグメントに分けて、ＣＮＡ障害を患う患者に関する、より正確な診断および予後情報を得るために、新規なアッセイが必要とされると思われる。
【０００３】
ＣＮＳ障害は、広範囲の障害、およびそれに対応した広範囲の遺伝子因子もまた包含し得る。ＣＮＳ障害の例には、神経変性疾患、精神病疾患、気分障害、自閉症、物質依存およびアルコール中毒、疼痛性障害、てんかん、精神遅滞、および認知障害、不安障害、摂食障害、衝動調節障害、および人格障害を含む他の精神疾患が含まれる。障害は、精神障害の診断・統計便覧第４版（Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders fourth edition ）（ＤＳＭ−ＩＶ）の分類を用いて定義することができる。
【０００４】
ＣＮＳ障害の単なる小さなサブセットを考察した場合でさえ、治療的発明のための新しい標的および改良された治療方法が必要であることは、精神分裂病および双極性障害の適切な治療および分子機序の理解の欠如から明らかである。精神分裂病および双極性障害のどちらの場合についても、それらの治療に使用されている現在既知の分子すべてが副作用を有し、その疾患症状に対してのみ作用する。したがって、付随する副作用を持たず、精神分裂病および双極性障害の原因となるメカニズムに関与する標的に対して作られる新規な分子が強く必要とされている。したがって、これらの標的の発見および特徴付けを容易にするツールが必要であり、有用である。
【０００５】
［電位作動性イオンチャンネル］
電位作動性イオンチャンネルは巨大分子の大きなファミリーの一部であり、その機能は、膜間の電位の調節および維持、分泌およびシグナル伝達を含む。これらのチャンネルタンパク質は、ニューロンからの神経伝達物質放出の調節に関与し、膜興奮性、筋収縮およびシナプス伝達を含む様々な細胞機能の調節において重要な役割を果たす。Ｎａ+チャンネルの主なα−サブユニットおよびＣａ+チャンネルのα−１サブユニットは、約２０００個のアミノ酸からなり、イオン伝導経路を含有する。生化学分析によって、生理活性イオンチャンネルが、いくつかの異なるサブユニットで構成されていることが明らかとなっている。Ｎａ+チャンネルのαサブユニット、β−１およびβ−２サブユニットと同時精製する２つの補助サブユニットが存在する。Ｃａ+チャンネルについては、その他のサブユニット（α−２、β、γおよびσ）が修飾作用で同定されている。α−２およびβ−サブユニットは、Ｃａ+チャンネルのα−１サブユニットの機能活性を高めると思われる。Ｋ+チャンネルのα−サブユニットは、１：１様式でβサブユニットと会合し、結果として（α）4（β）4化学量論を示すＫ+チャンネル複合体を生じる（Terlau 等, Naturwissenschaften 85:437-444 (1998)）。カルシウムおよびナトリウムイオンチャンネルの基本構造および例は、例えばWilliams等 Science 257:389-395 (1992); Mori等, Nature 350:398-402 (1991); および Koch 等, J.Biol.Chem. 265 (29):17786-17791 (1990)にさらに記述されている。ＣａｎＩｏｎチャンネルと高レベルの配列相同性を共有するラット由来のＣａ+およびＮａ+イオンチャンネルの核酸配列が、Lee 等, FEBS Lett. 445 231:236 (1999)にさらに記述されている。
【０００６】
αサブユニットは、すべての電位依存性カチオンチャンネルと配列特性を共有し、潜在的な膜貫通ドメインの６本ヘリックスバンドルを含む同一の構造モチーフを利用する。ナトリウムチャンネルおよびカルシウムチャンネルのどちらにおいても、このモチーフは、配列中で４回反復され、２４−ヘリックスバンドルが得られる。そのアミノ酸配列は、種（例えば、ヒトおよびショウジョウバエ）の間で、かつ異なるイオンチャンネル間で高度に保存される。
【０００７】
多重遺伝子族における個々の遺伝子によってコードされる、カルシウムチャンネルの組織特異的な、薬理学的かつ電気生理学的に異なるアイソフォームが存在する。骨格筋において、α、βおよびγサブユニットの密に結合した各集合は、他の４つと会合して、五量体巨大分子を形成する。例えば、ニューロンのカルシウムチャンネルα−１サブユニットは、α−１Ａ〜Ｈと呼ばれる少なくとも７つの異なる遺伝子の産物である。免疫細胞化学的な研究から、α−１カルシウムチャンネルサブユニットの差次的分布が示されている。α−１Ａおよびα−１Ｂは主に、樹状突起およびシナプス前終末で発現し、α−１Ａは一般に、α−１Ｂよりも多数の神経終末に集中する。ラットおよびヒト神経筋接合部において、α−１Ａはシナプス前性に局在化し、α−１Ｂおよびα−１Ａはどちらも、軸索−会合したシュワン細胞に存在する。α−１Ｅは主に細胞体に局在化し、場合によっては、近位樹状突起、ならびにプルキンエ細胞の遠位分枝に局在化する。α−１Ｃおよびα−１Ｄは、細胞体に、および中枢ニューロンの近位樹状突起に局在化する。
【０００８】
天然のカルシウムチャンネルは、それらの薬理学的かつ／または電気生理学的特性に基づいて分類されている。電位依存性カルシウムチャンネルの分類は、Ｌ−、Ｎ−、Ｐ−およびＱ−型を含む高電位活性化型（ＨＶＡ）：中間（ＩＶＡ、Ｒ型）；低電位活性化型（ＬＶＡ、Ｔ型）に分けられる。（Morena 等, Annals NY Acad. Sci. 102-117 (1999))。
【０００９】
主要なサブユニット（α−１）は、異種発現系で発現した場合にそのメンバーが単独で機能的なチャンネルを形成することができる遺伝子族に属する。（参照により本明細書に組み込まれる、Zhang 等, Neuropharmacology 32 (11): 1075-1088 (1993))。天然の細胞において、α−１サブユニットは、α−１サブユニットの機能特性を変更する補助サブユニットとの多サブユニット複合体として発現する。多くの場合、補助サブユニットの同時発現は、チャンネルの生物物理学的性質に影響を及ぼす。特にβユニットは、α−１サブユニットに重要な影響を及ぼす傾向があり；βサブユニットは、活性化特性、定常状態の不活性化、不活性化の速度論およびピーク電流を変化させることが示されている。
【００１０】
チャンネルの分子多様性の多くは、α−１サブユニットの複数の形態が存在することによって生じる。例えば、カルシウムチャンネルの選択的にスプライスされた形態が、選択的に発現し、セリン−トレオニンキナーゼによってリン酸に対して異なる感受性を有することが示されている(Hell 等, Annals N.Y. Acad. Sci. 747:282-293 (1994))。イオンチャンネル遺伝子における変異は、いくつかの中枢神経系疾患を含む広範な疾患に関与することが示されている。周期性麻痺、偶発性運動失調、片頭痛、遺伝性ＱＴ延長症候群および発作性ジスキネジアを含む、多数の偶発性疾患の原因となるイオンチャンネル変異の例が、Bulman 等, Hum. Mol. Gen. 6(10) 1679-1685 (1997) に記述されている。例えば、いくつかのＣａ+チャンネル変異の疾患を表Ａ（Moreno、上記文献）に示す。
【００１１】
【表１】
2004525614.tif 000002
カルシウムおよびナトリウムチャンネルの修飾物質も、一般に種々の疾患および症状の治療に使用される。例えば、カルシウムおよび／またはナトリウムチャンネル遮断薬は、様々な心臓疾患および症状（例えば、アンギナ、不整脈）、高血圧、片頭痛、発作の神経作用、躁病、神経弛緩薬性晩期ジスキネジー、双極性障害、疼痛、てんかん等の種種の疾患または状態に関連する１つまたは複数の症状を治療または予防するのに有用であることが示されている。
【００１２】
異なるイオンチャンネル間に神経系の著しい機能上の違いが存在することが示されている。さらに、機能上の違いは、同一イオンチャンネル遺伝子における異なる変異の間に、ならびに同一イオンチャンネルのスプライス変異体の間に存在する。このように、ＣＮＳ疾患におけるイオンチャンネルの影響にもかかわらず、どのイオンチャンネルが特定の疾患の治療的介入に対して有効な標的であるかを予測するのは困難である。１つの問題は、精神分裂病、双極性障害またはそれに関連する疾患に関係するイオンチャンネル遺伝子を提供することである。
【００１３】
本発明は、これらの必要性および他の必要性に取り組む。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は、ＣａｎＩｏｎと呼ばれる電位作動性イオンチャンネルタンパク質をコードする、新規なヒト遺伝子のゲノム配列を含む核酸分子に関する。ＣａｎＩｏｎのゲノム配列はまた、前記遺伝子の転写部分の上流（５’末端）および下流（３’末端）に位置する制御配列を含み、これらの制御配列もまた本発明の一部である。
【００１５】
本発明は、ＣａｎＩｏｎタンパク質をコードする完全なｃＤＮＡ配列、ならびにそれに対応する翻訳産物も提供する。
【００１６】
ＣａｎＩｏｎゲノムまたはｃＤＮＡ配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマー、ならびに前記プライマーおよびプローブを用いたＤＮＡ増幅および検出方法もまた、本発明の一部である。
【００１７】
本発明の更なる目的は、上記の核酸配列のいずれかを含む組換えベクターからなり、特にＣａｎＩｏｎ制御配列もしくはＣａｎＩｏｎタンパク質をコードする配列を含む組換えベクターからなり、ならびに前記核酸配列もしくは組換えベクターを含む細胞宿主およびトランスジェニック非ヒト動物からなる。
【００１８】
本発明は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の２対立遺伝子マーカーおよびその使用にもまた関係する。
【００１９】
最終的に、本発明は、ＣａｎＩｏｎの発現または活性を調節する物質または分子をスクリーニングする方法、ならびにＣａｎＩｏｎポリペプチドと相互作用する物質または分子をスクリーニングする方法に関する。これらの方法において同定された物質を使用する方法もまた提供する。例えば、ＣａｎＩｏｎチャンネル拮抗薬を用いて、精神分裂病もしくは双極性障害を含む疾患または症状を治療または予防する方法を提供する。
【００２０】
それに応じて、一態様において、本発明は、配列番号１〜４または６で示されるヌクレオチド配列のいずれか、またはこれらの配列のいずれかに相補的な配列を含む、単離、精製されたポリヌクレオチド、または組換えポリヌクレオチドを提供する。
【００２１】
他の態様では、本発明は、配列番号４の少なくとも５０ヌクレオチドの隣接スパンを含む、単離、精製されたポリヌクレオチド、または組換えポリヌクレオチドを提供し、前記ポリヌクレオチドは、生物活性ＣａｎＩｏｎポリペプチドをコードする。
【００２２】
他の態様において、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列を含むヒトＣａｎＩｏｎポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする、単離、精製されたポリヌクレオチド、または組換えポリヌクレオチドを提供する。
【００２３】
一実施形態において、本明細書に記述されるポリヌクレオチドのいずれかを固体支持体に付着させる。他の実施形態では、そのポリヌクレオチドは標識を含む。
【００２４】
他の態様において、本発明は、本明細書に記述されるポリヌクレオチドの少なくとも１種類を含むポリヌクレオチドのアレイを提供する。一実施形態において、そのアレイはアドレス指定可能である。
【００２５】
他の態様では、本発明は、作動可能にプロモーターに連結される、本発明に記述されるポリヌクレオチドのいずれかを含む組換えベクターを提供する。
【００２６】
他の態様では、本発明は、細胞中にそのポリヌクレオチドが存在することによって、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の発現レベルの変化が生じるポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、そのポリヌクレオチドは、ＣａｎＩｏｎ遺伝子に、またはＣａｎＩｏｎゲノム領域に挿入される。一実施形態において、そのポリヌクレオチドは、ＣａｎＩｏｎ遺伝子プロモーターに挿入される。一実施形態において、そのポリヌクレオチドは、相同的組換えによって、例えば内因性ＣａｎＩｏｎプロモーターまたはエンハンサー領域の１つまたは複数のエレメントを置換することによって挿入される。
【００２７】
他の態様において、本発明は、本明細書に記述される組換えベクターまたはポリヌクレオチドのいずれかを含む、宿主細胞または非ヒト宿主動物を提供する。
【００２８】
他の態様において、本発明は、ノックアウトベクターとの相同的組換えによって破壊されたＣａｎＩｏｎ遺伝子を含む、哺乳類の宿主細胞または非ヒト宿主哺乳類を提供する。一実施形態において、宿主細胞は、本明細書に記述されるポリヌクレオチドのいずれかを含む。
【００２９】
他の態様において、本発明は、配列番号５で示されるアミノ酸配列またはその生物活性断片を含む、単離、精製されたポリヌクレオチド、または組換えポリヌクレオチドを提供する。
【００３０】
他の態様において、本発明は、ａ）作動可能にプロモーターに連結される、請求項１３に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞集団を提供する段階；ｂ）前記細胞中の前記ポリペプチドを生成する助けとなる条件下で前記細胞集団を培養する段階；ｃ）前記細胞集団から前記ポリペプチドを精製する段階；を含む、ポリペプチドを生成する方法を提供する。
【００３１】
他の態様において、本発明は、ＣａｎＩｏｎポリペプチドに抗ＣａｎＩｏｎ抗体を結合させる方法であって、その抗体が前記ポリペプチドに特異的に結合することができる条件下にて、本明細書に記述されるＣａｎＩｏｎポリペプチドのいずれかと、前記抗体とを接触させることを含む方法を提供する。他の態様において、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはエピトープを特異的に認識する、抗体またはその免疫活性断片もまた提供する。
【００３２】
他の態様において、本発明は、細胞中のＣａｎＩｏｎ遺伝子の発現を検出する方法を提供し、前記方法は、ａ）前記細胞または前記細胞の抽出物を、ｉ）厳密な条件下にて、本明細書に記述されるＣａｎＩｏｎポリペプチドのいずれかにハイブリダイズするポリヌクレオチド；またはｉｉ）本明細書に記述されるＣａｎＩｏｎポリペプチドのいずれかに特異的に結合するポリペプチド；のいずれかと接触させる段階と、ｂ）前記細胞もしくは抽出物中の前記ポリヌクレオチドとＲＮＡ種との間のハイブリダイゼーションの存在または非存在、あるいは前記細胞もしくは抽出物中のタンパク質への前記ポリペプチドの結合の存在または非存在を検出する段階とを含み、前記ハイブリダイゼーションまたは前記結合の存在の検出によって、前記ＣａｎＩｏｎ遺伝子が前記細胞中で発現することが示される。一実施形態において、前記ポリヌクレオチドはプライマーであり、前記ハイブリダイゼーションは、前記プライマーの配列を含有する増幅産物の存在を検出することによって検出される。他の実施形態において、前記ポリペプチドは、抗体、例えば、抗ＣａｎＩｏｎ抗体である。
【００３３】
他の態様において、本発明は、ａ）本明細書に記述されるＣａｎＩｏｎポリペプチドのいずれかと試験化合物とを接触させる段階；ｂ）前記化合物が前記ポリペプチドに特異的に結合するかどうかを決定する段階；を含む、ＣａｎＩｏｎポリペプチドの候補修飾物質を同定する方法であって、前記化合物が前記ポリペプチドに特異的に結合することの検出によって、前記化合物が前記ＣａｎＩｏｎポリペプチドの候補修飾物質であることが示される方法を提供する。
【００３４】
一実施形態において、その方法はさらに、前記候補修飾物質の存在下にて、前記ＣａｎＩｏｎポリペプチドの生物活性を試験することを含み、前記候補修飾物質の非存在下での活性と比較して、前記候補修飾物質存在下での前記ＣａｎＩｏｎポリペプチドの生物活性の変化から、その候補修飾物質が前記ＣａｎＩｏｎポリペプチドの修飾物質であることが示される。
【００３５】
他の態様において、本発明は、ａ）本明細書に記述されるＣａｎＩｏｎポリペプチドのいずれかと試験化合物とを接触させる段階；ｂ）前記化合物の存在下および非存在下における前記ポリペプチドの活性を検出する段階；を含む、ＣａｎＩｏｎポリペプチドの修飾物質を同定する方法であって、前記化合物の非存在下での活性と比較した、前記化合物の存在下での前記活性の差を検出することによって、前記化合物が前記ＣａｎＩｏｎポリペプチドの修飾物質であることが示される方法を提供する。
【００３６】
本発明の一実施形態において、前記ポリペプチドは、細胞または細胞膜に存在し、前記生物活性は、電位作動性イオンチャンネル活性を含む。
【００３７】
他の態様では、本発明は、ａ）本明細書に記述される方法のいずれかを使用して、ＣａｎＩｏｎポリペプチドの修飾物質を同定する段階；ｂ）前記修飾物質を生理学的に許容可能な担体と組み合わせる段階；を含む薬剤組成物の調製方法を提供する。薬剤組成物を使用する方法もまた提供する。
【００３８】
例えばヒトの体を治療するための、または本明細書に記述される疾患もしくは状態のいずれかを治療するための薬物の製造における、本明細書に記述されるＣａｎＩｏｎ修飾物質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体のいずれかの使用もまた提供する。
【００３９】
インビトロもしくはインビボでＣａｎＩｏｎポリヌクレオチドおよびポリペプチドの存在を検出するために使用するキットもまた提供する。
[配列表に提供される配列の簡単な説明]
配列番号１は、５’調節領域（上流の未転写領域）およびエクソン１〜７を含む、ＣａｎＩｏｎのゲノム配列を含有する。
【００４０】
配列番号２は、エクソン８〜２７を含む、ＣａｎＩｏｎのゲノム配列を含有する。
【００４１】
配列番号３は、エクソン２８〜４４および３’調節領域（下流の未転写領域）を含む、ＣａｎＩｏｎのゲノム配列を含有する。
【００４２】
配列番号４は、ＣａｎＩｏｎのｃＤＮＡ配列を含有する。
【００４３】
配列番号５は、配列番号４のｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を含有する。
【００４４】
配列番号６は、２対立遺伝子マーカーＡ１８を含む、アンプリコンのヌクレオチド配列を含有する。
【００４５】
配列番号７は、実施例２にさらに記述される追加のＰＵ５’配列を含むプライマーを含有する。
【００４６】
配列番号８は、実施例２にさらに記述される追加のＲＰ５’配列を含むプライマーを含有する。
【００４７】
配列表に関する規則に従って、以下のコードが、配列中の２対立遺伝子マーカーの位置を示し、かつ多型塩基に存在する対立遺伝子それぞれを同定するために使用されている。配列においてコード「ｒ」は、多型塩基の一方の対立遺伝子がグアニンであり、他方の対立遺伝子がアデニンであることを示す。配列におけるコード「ｙ」は、多型塩基の一方の対立遺伝子がチミンであり、他方の対立遺伝子がシトシンであることを示す。配列におけるコード「ｍ」は、多型塩基の一方の対立遺伝子がアデニンであり、他方の対立遺伝子がシトシンであることを示す。配列におけるコード「ｋ」は、多型塩基の一方の対立遺伝子がグアニンであり、他方の対立遺伝子がチミンであることを示す。配列におけるコード「ｓ」は、多型塩基の一方の対立遺伝子がグアニンであり、他方の対立遺伝子がシトシンであることを示す。配列におけるコード「ｗ」は、多型塩基の一方の対立遺伝子がアデニンであり、他方の対立遺伝子がチミンであることを示す。各２対立遺伝子マーカーの元の対立遺伝子のヌクレオチドコードは以下の通りである：
２対立遺伝子マーカー            元の対立遺伝子
５−１２４−２７３               Ａ（例）
場合によっては、２対立遺伝子マーカーの多型塩基は、コードされたポリペプチドにおけるアミノ酸の同一性を変化させる。これは、変異体（ＶＡＲＩＡＮＴ）という特徴の使用、多型アミノ酸の位置でのＸａａの配置、および２つの選択的アミノ酸としてのＸａａの定義によって添付の配列表に示される。例えば、２対立遺伝子マーカーの一方が、ヒスチジンをコードするコドンＣＡＣであり、２対立遺伝子マーカーの他方が、グルタミンをコードするＣＡＡであり、コードされるポリペプチドの配列表は、多型アミノ酸の位置にＸａａを含有するだろう。この場合には、Ｘａａは、ヒスチジンまたはグルタミンとして定義されると考えられる。
【００４８】
他の場合、ヌクレオチド配列が曖昧であるため、Ｘａａは、その同一性が未知のアミノ酸を示す場合がある。この場合には、不確か（ＵＮＳＵＲＥ）という特徴を使用し、未知のアミノ酸の位置でのＸａａの配置およびＸａａの定義は、２０個のアミノ酸のいずれかまたは遺伝コードによって示唆される限定数のアミノ酸である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
家系における精神分裂病および双極性障害の集合、双生児および養子研究からの証拠、および世界中の発生頻度の変動が無いことから、環境的な危険因子もまた、必要な、十分な、または相互作用的な原因としてあるレベルで関与するが、精神分裂病および双極性障害は主に遺伝的条件によるものである。例えば、精神分裂病は、一般人口の１％で発生する。しかし、祖父（祖母）１人が精神分裂病である場合には、その病気になる危険性は約３％に上昇する；両親のうち１人が精神分裂病である場合、病気になる危険性は約１０％に上昇する。両親共に精神分裂病であれば、その危険性は約４０％に上昇する。
【００５０】
精神分裂病のような特定の中枢神経系障害など、特定の形質に関与に関与する遺伝子の同定を、遺伝子地図作成に現在使用されている主な２つの方策：連鎖解析および関連研究によって行うことができる。連鎖解析には、多くの罹患者を有する家系の研究が必要であり、現在、一遺伝子性または主働遺伝子性の遺伝形質の検出に有用である。逆に、関連研究では、形質のネガティブ（Ｔ−）コントロールと比較して、関係のない形質（Ｔ+）の個体でのマーカー対立遺伝子の頻度が調べられ、ポリジーン遺伝の検出に一般に用いられている。
【００５１】
遺伝的連鎖または「連鎖」は、染色体上の隣接する２つの配列のどちらが、減数分裂中の交叉による最小の組換えを含有するかについての分析に基づくものである。これを行うために、マイクロサテライトマーカーなどの染色体マーカーを、ゲノム上に正確に局在化させる。遺伝的連鎖解析では、系統樹、疾患の伝染、およびマーカーの伝達に従って、標的遺伝子上で使用される染色体マーカーとの組換えの確率を計算する。このように、所定のマーカーの特定の対立遺伝子が、考えられる確率よりも多く疾患を伝達する場合（組換えレベル０〜０．５）、問題の標的遺伝子がマーカー付近で見つけられると推論することが可能である。この技術を用いて、家系性癌の遺伝的素因を示す、いくつかの遺伝子を局在化することが可能である。遺伝的連鎖研究に包含できるようにするために、遺伝性の疾患にかかっている家系は、「情報価値のある」判定基準：世代当たりに数名の患者対象（およびその体質的なＤＮＡが利用可能である）、最高でも多数の姉妹（兄弟）を満たさなければならない。
【００５２】
連鎖研究の結果から、１３番染色体は、精神分裂病羅病性遺伝子座を３ｑ３２上に有するらしいという仮説が支持された（Blouin JL 等, 1998, Nature Genetics, 20:70-73; Lin MW 等, Hum. Genet., 99(3) (1997):417-420; Brzustowicz 等, Am. J. Hum. Genet. 65:1096-1103 (1999))。しかしながら、連鎖解析は、形質に関与する遺伝子を検出する強力な方法である一方、分解能がメガベースレベルを超えることが不可能である場合が多く、この方法によって最初に同定された領域の分析を改良するには、相補的な研究が必要な場合が多い。
【００５３】
染色体１３ｑ−３１−ｑ３３遺伝子座の候補ゲノム領域をカバーするＢＡＣコンティグを、染色体１３ｑ３１−ｑ３３領域に局在化された公知のＳＴＳを用いて作成し、７個のゲノムに相当する、知的所有権下にあるＢＡＣライブラリーをスクリーニングした。これらの材料から、新たなＳＴＳが生成され、その領域の高密度な物理的地図を作成することが可能となった。ＢＡＣはあらゆる大きさであり、検証のためにｉｎ  ｓｉｔｕ染色体ハイブリダイゼーションによってマッピングされる。最小限のセットのＢＡＣを同定し、完全にシークエンスし、その結果として、最終的に４Ｍｂを超えるコンティグの作成につながる、いくつかのコンティグが得られた。この地図の作成によって、精神分裂病に有意な連関を示す、ゲノム領域内に位置するＣａｎＩｏｎ遺伝子が同定される。
【００５４】
ＣａｎＩｏｎアミノ酸配列は、Ｃａチャンネル（ＣＡＣＨＡＮＮＥＬ）、カルシウムチャンネルのα−１サブユニットのサインを提供する７要素のフィンガープリントに特有である（Ｒ００１６７、ＢＬＯＣＫｓ+データベース参照）。フィンガープリントは、６配列の最初のアラインメントから得られた：そのモチーフは、これらのチャンネルと他のカチオンチャンネルを区別することができる保存ループ領域から引き出された；モチーフ１および２は、膜貫通セグメント４および５と、セグメント５および６との間のセグメントをコードし（第１内部反復）；モチーフ３は、反復１のセグメント６と反復２のセグメント１の間のセグメントに対応し；モチーフ４は、反復２のセグメント５と６の間のセグメントをコードし、モチーフ５は、反復３のセグメント６と反復４のセグメント１との間のセグメントに対応し；モチーフ６および７は、反復４のセグメント４および５と、セグメント５および６との間のセグメントをコードする。
【００５５】
図１は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子を含む対象の１３番染色体領域をカバーするＢＡＣコンティグを示し、連鎖研究において最も高い有意性を示す遺伝子マーカーに対するＣａｎＩｏｎ遺伝子のゲノム位置を示す。特に、Blouin 等 (1998)は、５４の複合系図上で４５２個のマイクロサテライトマーカーを使用して、精神分裂病罹病性についてのゲノムワイドスキャンを実施した。家系における精神分裂病の間の最も有意な関連性が、マーカーＤ１３Ｓ１７４付近の染色体１３ｑ３２で見出された。Brzustowics 等 (1999)は、２１の広範囲なカナダ人家系において、８番染色体および１３番染色体におよぶマイクロサテライトマーカーを評価した。染色体の１３ｑ領域におけるマーカーは、使用される各分析モデルにおいてポジティブなＬＯＤスコアを得た：精神分裂病の狭いまたは広い定義での常染色体優性および常染色体劣性。最大３ポイントのＬＯＤスコアが、劣性の広範なモデル下にてマーカーＤ１３Ｓ７９３を用いて得られた：組換え率（θ）にて３．９２。均一下では１、不均一下ではα＝０．６５およびθ＝０の場合に４．４２である。図１を参照すると、ＣａｎＩｏｎ遺伝子は、コンティグ標識「領域Ｅ」上に一部位置し、コンティグ標識Ｃ０００１Ａ１０上に一部位置する。ＣａｎＩｏｎ遺伝子は、連鎖研究に最も高い有意性を示す２つのマーカーによってフランキングされる。マーカーＤ１３Ｓ１７４もコンティグＣ０００１Ａ１０上にあり、マーカーＤ１３Ｓ７９３は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子にセントロメア（centromeric)な約３．５Ｍｂに位置する。
【００５６】
精神分裂病、双極性障害および他のＣＮＳおよび心臓血管性疾患および症状に関与する遺伝子を同定することが強く必要とされている。疾患に関与する新規なイオンチャンネルを同定することも必要とされている。これらの遺伝子およびタンパク質は、精神分裂病、双極性障害、または他のＣＮＳ状態、ならびに心臓の異常および高血圧などの他の症状の治療において新たな介入ポイントを提供することが可能であり、ＣａｎＩｏｎ遺伝子およびそれに関連する生物学的経路をさらに研究および特徴付けすることが可能となる。これらの疾患および症状に関与する、これらの遺伝子およびそれに関連する生物学的経路の知識によって、例えば精神分裂病および双極性障害の原因を研究者らが理解でき、疾患の原因に対して薬物および医薬品が導かれるだろう。例えば、ＣａｎＩｏｎチャンネルを遮断する化合物を使用して、多数の疾患または症状のいずれか、好ましくは精神分裂病または双極性障害を治療することができる。疼痛性障害、てんかん、および不整脈、アンギナ、高血圧などの種々の心臓血管性疾患もまた含まれる。精神分裂病、双極性障害および他の症状に対する罹病性を検出する新規な方法、ならびにこれらの疾患のいずれかの発症を予防または経過観察することも、非常に必要とされている。診断ツールも非常に有用であることを証明することができる。実際に、一例を挙げると、精神分裂病を発症する危険性について対象を早期に同定することによって、早期および／または予防的な治療を施すことが可能となるだろう。さらに、薬物の有効性ならびにそれに対する患者の耐性を正確に評価することによって、臨床医は精神分裂病および双極性障害の治療法の利点／危険性の比を高めることが可能となる。
【００５７】
本発明は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子に関連するポリヌクレオチドおよびポリペプチドに関する。ＣａｎＩｏｎのゲノム配列またはｃＤＮＡ配列と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーもまた、本発明の一部である。本発明の更なる目的は、本発明に記述される核酸配列のいずれかを含む組換えベクター、特にＣａｎＩｏｎの調節領域またはＣａｎＩｏｎタンパク質をコードする配列を含む組換えベクター、ならびに前記核酸配列もしくは組換えベクターを含む細胞宿主からなる。本発明は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子またはタンパク質の発現または活性を調節する能力に関して分子をスクリーニングする方法、ならびに精神分裂病、双極性障害、または多数の他の疾患もしくは症状のいずれかを治療または予防するために、かかる分子を使用する方法もまた包含する。本発明は、診断用試薬として有用なかかるポリペプチドに対して特異的に作られる抗体も取り扱う。
【００５８】
本発明は、ＣａｎＩｏｎ−関連２対立遺伝子マーカー、および家系における連鎖研究、集団における連鎖不平衡研究および症例対照集団における関連研究を含む、遺伝分析方法でのそれらの使用にも関する。本発明の重要な態様は、２対立遺伝子マーカーによって、関連研究を行い、複合形質に関与する遺伝子の役割を同定することが可能となることである。
【００５９】
定義
本発明をさらに詳細に説明する前に、以下の定義を示し、本明細書において本発明を説明するために使用される用語の意味および範囲を説明かつ定義する。
【００６０】
本明細書で使用される「ＣａｎＩｏｎ遺伝子」という用語は、ゲノムＤＮＡの非翻訳調節領域を含む、ＣａｎＩｏｎタンパク質をコードする、ゲノム、ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列を包含する。
【００６１】
本明細書で使用される「異種タンパク質」という用語は、ＣａｎＩｏｎタンパク質以外のいずれかのタンパク質またはポリペプチドを示すことを意図するものである。例えば、異種タンパク質は、ＣａｎＩｏｎ調節領域を用いた更なる実験において、マーカーとして使用することができる化合物である。
【００６２】
「単離（された）」という用語は、その元の環境（例えば、それが天然に存在する場合、自然環境）から物質が取り出されることを必要とする。例えば、生体動物に存在する天然ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、自然体系において共存する物質の一部またはすべてから分離されたポリヌクレオチドまたはＤＮＡまたはポリペプチドは単離される。かかるポリヌクレオチドは、ベクターおよび／またはかかるポリヌクレオチドの一部であることが可能であり、あるいはポリペプチドは、組成物の一部であることが可能であり、さらに、ベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではない点から単離することができる。
【００６３】
例えば、生体動物に存在する天然ポリヌクレオチドは単離されないが、自然体系において共存する物質の一部またはすべてから分けられる同一ポリヌクレオチドは単離される。具体的には、「単離（された）」の定義から：天然の染色体（染色体拡散など）、人工的な染色体ライブラリー、ゲノムライブラリー、および核酸のインビトロ標本として、あるいはその宿主細胞が異質インビトロ標本であるか、または単一コロニーの異質集団としてプレーティングされる、移入／形質転換された宿主細胞標本として存在するｃＤＮＡライブラリーは除外される。具体的には、指定のポリヌクレオチドがベクター分子中の核酸インサート数の５％未満を占める、上記のライブラリーもまた除外される。さらに具体的には、全細胞のゲノムＤＮＡまたは全細胞のＲＮＡ標本（機械的に切断または酵素で消化される前記全細胞標本を含む）は除外される。さらに具体的には、上記の全細胞標本は除外される。インビトロ標本としての、または電気泳動（それのブロットトランスファーを含む）によって分離された異質混合物としての上記全細胞標本は除外される。その電気泳動において、本発明のポリヌクレオチドは、電気泳動媒体中の異種ポリヌクレオチドからさらに分離されていない（例えば、アガロースゲルまたはナイロンブロットにおいて異質バンドから単一バンド集合を切り出すことによる更なる分離）。
【００６４】
「精製（された）」」という用語は、完全な精製を必要とするわけではなく；むしろ、それらは相対的な定義として意図される。少なくとも１桁、好ましくは２桁または３桁、さらに好ましくは４桁または５桁のオーダーに、出発物質または天然物質を精製することが特に企図される。例として、濃度０．１％から濃度１０％への精製は２桁のオーダーである。説明すると、ｃＤＮＡライブラリーから単離された個々のｃＤＮＡクローンは従来法で、電気泳動的な均一性に精製されている。これらのクローンから得られる配列は、ライブラリーまたはヒト全ＤＮＡから直接得ることはできなかった。ｃＤＮＡクローンはそれ自体、天然に存在しないが、むしろ一部精製された天然物質（メッセンジャーＲＮＡ）の操作によって得られる。ｍＲＮＡのｃＤＮＡライブラリーへの変換は、合成物質（ｃＤＮＡ）の生成を伴い、個々の純粋なｃＤＮＡクローンを、クローン選択によって合成ライブラリーから単離することができる。このように、メッセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡライブラリーを作成し、続いてそのライブラリーから個々のクローンを単離することによって、結果として、天然のメッセージが約１０4〜１０6倍精製される。
【００６５】
さらに、本明細書において「精製（された）」という用語は、限定されないが、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、炭水化物、脂質等を含む他の化合物から分離された本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを説明するために使用される。「精製（された）」という用語は、ホモもしくはヘテロ−二量体、三量体等のオリゴマーからの本発明の単一ポリペプチドの分離を示すのに使用する場合がある。「精製（された）」という用語はまた、共有結合により閉環状のポリヌクレオチドの線状ポリヌクレオチドからの分離を説明するために使用される場合がある。サンプルの少なくとも約５０％、好ましくは６０〜７５％が単一ポリヌクレオチド配列および配座（線状に対して共有結合による閉環状）を示す場合、ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。実質的に純粋なポリペプチドまたはポリヌクレオチドは通常、それぞれポリペプチドまたはポリヌクレオチドサンプルの約５０％（重量／重量）、好ましくは６０〜９０％、さらに通常約９５％を占め、約９９％を超える純度であることが好ましい。ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの純度、または均一性は、サンプルのアガロースゲルまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動などの当技術分野で公知の多数の手段によって、続いてゲルを染色して単一バンドを可視化することによって示される。特定の目的のために、ＨＰＬＣまたは当技術分野で公知の他の手段を用いて、より高い分解能を提供することができる。代替の実施形態として、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの精製は、異質ポリペプチドおよびポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ、または両方）に対する「最低」純度％として表される。好ましい実施形態として、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、異質ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに対してそれぞれ、少なくとも；純度１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、または１００％である。さらに好ましい実施形態として、本発明のポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、異質ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドに対して、または担体に存在するもの以外のすべての化合物および分子に対する重量／重量比として、任意の位〜小数点以下第３位の範囲、９０％〜１００％（例えば、少なくとも純度９９．９９５％）のポリペプチドまたはポリヌクレオチド）の純度を有する。小数点以下第３位までの純度％を表す各数字は、純度の個々の種類として主張することが可能である。
【００６６】
「ポリペプチド」という用語は、ポリマーの長さに無関係に、アミノ酸のポリマーを意味し；このため、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、ポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後の修飾を指定しないか、または除外する。例えばグリコシル基、アセチル基、リン酸基、脂質基等の共有結合を含有するポリペプチドは、「ポリペプチド」という用語によって明確に包含される。アミノ酸（例えば、非天然のアミノ酸、無関係の生体系において天然にのみ存在するアミノ酸、哺乳類系からの修飾アミノ酸等を含む）の１つまたは複数の類似体を含有するポリペプチド、置換される結合ならびに当技術分野で公知の他の修飾を有する、天然および非天然両方のポリペプチドもまた定義内に含まれる。
【００６７】
本明細書において「組換えポリペプチド」という用語は、人工的に設計されたポリペプチド、およびそれらの元の自然環境において隣接するポリペプチド配列として見出されない少なくとも２つのポリペプチド配列を含むポリペプチドを指すか、または組換えポリヌクレオチドから発現したポリペプチドを指すために使用される。
【００６８】
本明細書において使用される「非ヒト動物」とは、非ヒトの脊椎動物、鳥類およびさらに一般的には動物、好ましくは霊長類、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、およびウマ、ウサギもしくは齧歯類などの家畜、さらに好ましくはラットまたはマウスを意味する。本明細書において使用される「動物」という用語は、脊椎動物、好ましくは哺乳類を指すために使用される。「動物」および「哺乳類」というどちらの用語も、「非ヒト」という用語で前述されていないかぎり、ヒトの対象を明確に含む。
【００６９】
本明細書において使用される「抗体」という用語は、少なくとも１つの結合ドメインから構成されるポリペプチドまたはポリペプチドのグループを意味し、抗体結合ドメインは抗体分子の可変ドメインの折り畳みから形成され、抗原の抗原決定基の特徴に相補的な内面形状および電荷分布を有する三次元結合空間が形成されて、抗原との免疫学的反応が可能となる。抗体には、結合ドメインならびにＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）2およびＦ（ａｂ’）2断片を含む断片を含有する組換えタンパク質が含まれる。
【００７０】
本明細書において使用される「抗原決定基」は、抗原分子の一部であり、この場合には、抗原−抗体反応の特異性を決定するＣａｎＩｏｎポリペプチドである。「エピトープ」とは、ポリペプチドの抗原決定基を意味する。エピトープは、エピトープに固有な空間構造にわずか３個のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、かかるアミノ酸を少なくとも６個、さらに一般的にはかかるアミノ酸を少なくとも８個〜１０個含む。エピトープを構成するアミノ酸を決定する方法には、例えばＸ線結晶構造解析、２次元核磁気共鳴、およびエピトープマッピング、例えばGeysen 等 1984；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８４／０３５６４；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８４／０３５０６に記載のペプスキャン（Pepscan）法が含まれる。
【００７１】
本明細書全体を通して、「ヌクレオチド配列」という表現は、ポリヌクレオチドまたは核酸を示すために同義で使用される。さらに正確には、「ヌクレオチド配列」はそれ自体、核の物質を包含し、したがって特定のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を生物化学的に特徴付ける配列情報（つまり、４つの塩基文字の中で選択されるひと続きの文字）に制限されない。
【００７２】
本明細書において同義で使用される「核酸」、「オリゴヌクレオチド」、および「ポリヌクレオチド」には、単鎖または二重鎖状のＲＮＡ，ＤＮＡ、または複数のヌクレオチドのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列が含まれる。本明細書において形容詞として使用される「ヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二重鎖状の任意の長さのＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む分子を意味する。本明細書において、「ヌクレオチド」という用語は、プリンまたはピリミジン、リボースまたはデオキシリボースの糖部位、およびリン酸基、あるいはオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド中のヌクレオチドの場合にはリン酸ジエステル結合を含む、分子または大きな核酸分子における個々のユニットを意味する、個々のヌクレオチドまたは種々のヌクレオチドを示すために名詞としても使用される。本明細書において「ヌクレオチド」という用語はまた、少なくとも１つの修飾：（ａ）選択的（alternative)結合基、（ｂ）プリンの類似体、（ｃ）ピリミジンの類似体、または（ｄ）例えば類似結合基、プリン、ピリミジンの類似糖および糖を含む「修飾ヌクレオチド」を包含するために使用される。例えば、ＰＣＴ公開番号：ＷＯ９５／０４０６４を参照のこと。本発明のポリヌクレオチド配列は、合成、組み換え、エクスビボでの生成、またはそれらの組み合わせを含む公知の方法によって、ならびに当技術分野で公知の精製方法を用いて作製することが可能である。
【００７３】
プロモーターなどの制御配列に「作動可能に連結される」配列は、ＲＮＡポリメラーゼ開始および対象の核酸の発現を調節するために、前記調節エレメントが核酸に対して正しい位置および向きにあることを意味する。本明細書において使用される「作動可能に連結される」という用語は、機能上の関係におけるポリヌクレオチドエレメントの結合を意味する。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがコード配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作動可能に連結する。
【００７４】
「形質」および「表現型」という用語は、本明細書では同義で使用され、可視の、検出可能な、または測定可能な生体の性質、例えば疾患の症状または疾患に対する感受性を意味する。通常、本明細書において「形質」および「表現型」という用語は、疾患の症状または疾患に対する感受性、治療に対して有利な反応、または治療に関連する副作用を意味する。好ましくは、前記形質は、制限されることなく、精神分裂病または双極性障害、他のＣＮＳ障害または神経性障害、例えば、てんかんもしくは疼痛性障害、ならびにアンギナ、高血圧、および不整脈などの心臓血管性疾患、ならびにいずれかの側面、特徴、またはこれらの疾患または症状のいずれかの特性である。
【００７５】
本明細書において「対立遺伝子」という用語は、ヌクレオチド配列の変異体を示すために使用される。２対立遺伝子多型は２つの形を有する。二倍体生物は対立遺伝子型にホモ接合性またはヘテロ接合性である。
【００７６】
本明細書において「ヘテロ接合率」という用語は、特定の対立遺伝子においてヘテロ接合性である集団における個々の出現率を示すために使用される。２対立遺伝子系において、ヘテロ接合率は、平均で２Ｐa（１−Ｐa）（Ｐaは、頻度の最も低い対立遺伝子の頻度）に等しい。遺伝子研究において有用であるためには、遺伝子マーカーは、ランダムに選択された人がヘテロ接合性であるという妥当な確率を可能にするのに適切なレベルのヘテロ接合性を有するべきである。
【００７７】
本明細書において使用される「遺伝子型」という用語は、個体またはサンプルに存在する対立遺伝子の同一性を意味する。本明細書のコンテクストにおいて、遺伝子型は、個体またはサンプル中に存在する２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子、例えばＣａｎＩｏｎ遺伝子またはゲノム領域内の２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の詳細を意味することが好ましい。２対立遺伝子マーカーに対して、サンプルまたは個体の「ゲノタイピング」という用語は、２対立遺伝子マーカーにて個体によって保有される特異的な対立遺伝子または特異的なヌクレオチドを決定することを含む。
【００７８】
本明細書における「変異」という用語は、１％未満の頻度を有する、異なるゲノムまたは個体間の、または異なるゲノムまたは個体中のＤＮＡ配列の差異を意味する。
【００７９】
「ハプロタイプ」という用語は、個体またはサンプル中に存在する対立遺伝子の組み合わせを意味する。本発明のコンテクストにおいて、ハプロタイプは好ましくは、所定の個体で見出される、かつ表現型と関連する２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の組み合わせを意味する。
【００８０】
本明細書において使用される「多型」という用語は、異なるゲノムまたは個体間または中の２つ以上の選択的なゲノム配列または対立遺伝子の出現を意味する。「多型性」とは、特異的なゲノム配列の２種類以上の変異体が集団において見つけられる条件を意味する。「多型部位」は、変異体が発生する遺伝子座である。単一ヌクレオチド多型は、多型部位での他のヌクレオチドによる１つのヌクレオチドの置換である。単一ヌクレオチドの欠失または単一ヌクレオチドの挿入もまた、単一ヌクレオチド多型を引き起こす。本発明のコンテクストにおいて、「単一ヌクレオチド多型」は好ましくは、単一ヌクレオチドの置換を意味する。通常、異なる個体間では、多型部位は、異なる２つのヌクレオチドによって占有される。
【００８１】
本明細書において「２対立遺伝子多型」および「２対立遺伝子マーカー」という用語は、集団においてかなり高い頻度で２つの対立遺伝子を有する単一ヌクレオチド多型を示すために同義で用いられる。「２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子」とは、２対立遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチド変異体を意味する。通常、本発明の２対立遺伝子マーカーの頻度の低い対立遺伝子の頻度は、１％を超えると確認されており、好ましくはその頻度は１０％を超え、さらに好ましくは少なくとも２０％であり（つまり、少なくとも０．３２のヘテロ接合率）、さらに好ましくは少なくとも３０％である（つまり、少なくとも０．４２のヘテロ接合率）。頻度の低い対立遺伝子の頻度が３０％以上である２対立遺伝子マーカーは、「高品質の２対立遺伝子マーカー」と呼ばれる。
【００８２】
ポリヌクレオチドの中心に対する、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの位置は、本明細書において以下のように記述される。ポリヌクレオチドが奇数個のヌクレオチドを有する場合、ポリヌクレオチドの３’末端から５’末端の等しい距離にあるヌクレオチドは、「ポリヌクレオチドの中心にある」と見なされ、中心にあるヌクレオチドにすぐ横に隣接するヌクレオチド、またはそれ自体が中心のヌクレオチドは、「中心から１ヌクレオチド以内」であると見なされる。ポリヌクレオチド中のヌクレオチドが奇数である場合、ポリヌクレオチド中央の５個のヌクレオチド位置のいずれも、「中心から２ヌクレオチド以内」であるなどと見なされるだろう。ポリヌクレオチドが偶数個のヌクレオチドを有する場合、結合があり、ポリヌクレオチドの中心にヌクレオチドは存在しないだろう。したがって、２個の中心ヌクレオチドのいずれかが、「中心から１ヌクレオチド以内」であると見なされ、ポリヌクレオチド中央の４個のヌクレオチドのいずれも、「中心から２ヌクレオチド以内」であるなどと見なされる。１つまたは複数のヌクレオチドの置換、挿入または欠失を含む多型については、多型の置換、挿入または欠失ポリヌクレオチドからポリヌクレオチドの３’末端までの距離と、多型の置換、挿入または欠失ポリヌクレオチドからポリヌクレオチドの５’末端までの距離と、の差が０または１ヌクレオチドである場合には、多型、対立遺伝子または２対立遺伝子マーカーは、ポリヌクレオチドの「中心」にある。この差が０〜３である場合、次いで多型は、「中心から１ヌクレオチド以内」であると見なされる。その差が０〜５である場合、多型は、「中心から２ヌクレオチド以内」であると見なされる。その差が０〜７である場合、多型は「中心から３ヌクレオチド以内」であるなどと見なされる。
【００８３】
本明細書において「上流」という用語は、特定の基準点からポリヌクレオチドの５’末端方向である位置、遺伝子の場合、コード配列からプロモーターに伸びる方向にある位置を示すために使用される。
【００８４】
本明細書において「塩基対」および「ワトソン−クリック型塩基対」という用語は、２つの水素結合によってアデニン残基に結合されるチミンまたはウラシル残基、および３つの水素結合によって結合されるシトシンおよびグアニン残基を有する二重らせんＤＮＡにおいて見出されるように、それらの配列同一性によって互いに水素結合することができるヌクレオチドを示すために同義で使用される（Stryer, L., Biochemistry,  4th edition, 1995を参照のこと）。
【００８５】
本明細書において「相補的」または「その補体」という用語は、相補領域全体を通して指定の他のポリヌクレオチドとワトソン−クリック型塩基対を形成することができる、ポリヌクレオチドの配列を示すために使用される。本発明の目的のために、第１ポリヌクレオチド中の各塩基がその相補的塩基と対を形成する場合、第１ポリヌクレオチドは第２ポリヌクレオチドに相補的であると考えられる。相補的塩基は一般に、ＡおよびＴ（またはＡおよびＵ）、またはＣおよびＧである。本明細書において「補体」は、「相補的ポリヌクレオチド」、「相補的核酸」および「相補的ヌクレオチド配列」からの同義語として使用される。これらの用語は、単にそれらの配列に基づくポリヌクレオチドの対に適用され、２つのポリヌクレオチドが実際に結合すると考えられる条件の特定のセットには適用されない。
［変異体および断片］
１−ポリヌクレオチド
本発明は、本明細書に記述されるポリヌクレオチド、特に本発明による１つまたは複数の２対立遺伝子マーカーを含有するＣａｎＩｏｎ遺伝子の変異体および断片にも関する。
【００８６】
本明細書において使用される用語としてのポリヌクレオチドの変異体は、参照ポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの変異体は、自然発生の突然変異体などの自然発生の変異体であるか、または自然に発生することが知られていない変異体であることが可能である。かかる非自然発生のポリヌクレオチド変異体は、ポリヌクレオチド、細胞または生体に適用される技術を含む、突然変異誘発技術によって生成することが可能である。一般に差異は限られており、その結果、参照および変異体のヌクレオチドは配列が全体的に密接に類似しており、多くの領域において同一である。
【００８７】
本発明によるポリヌクレオチドの変異体には、制限されないが、配列番号１〜４のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドと、または配列番号１〜４のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドの少なくとも１２個の連続するヌクレオチドのポリヌクレオチド断片と、少なくとも９５％同一である、好ましくは配列番号１〜４のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドと、または配列番号１〜４のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチドの少なくとも１２個の連続するヌクレオチドのポリヌクレオチド断片と、少なくとも９９％同一である、さらに好ましくは少なくとも９９．５％同一である、最も好ましくは少なくとも９９．８％同一であるヌクレオチド配列が含まれる。
【００８８】
変異体ポリヌクレオチドに存在するヌクレオチドの変化はサイレントである場合があり、それらがポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を変化させないことを意味する。しかしながら、ヌクレオチドの変化によって、参照配列によってコードされるポリペプチドにおいて、アミノ酸が置換、付加、欠失、融合および切断される結果にもなる。置換、欠失または付加には、１つまたは複数のヌクレオチドを要する。変異体は、コード領域または非コード領域またはその両方において変化する。コード領域における変化によって、保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失または付加が生じる。
【００８９】
本発明のコンテクストにおいて、特に好ましい実施形態は、そのポリヌクレオチドが、成熟ＣａｎＩｏｎタンパク質と実質的に同じ生物学的機能または生物活性を保持するポリペプチドをコードする実施形態、あるいはポリヌクレオチドが、特定の生物活性を保持または増大する一方、第２の生物活性を低減するポリペプチドをコードする実施形態である。
【００９０】
ポリヌクレオチド断片は、所定のヌクレオチド配列、好ましくはＣａｎＩｏｎ遺伝子のヌクレオチド配列のすべてとではないが一部と完全に同一である配列を有するポリヌクレオチド、およびその変異体である。その断片は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子のイントロンまたはエクソンの一部であり得る。それはまた、ＣａｎＩｏｎの調節領域の一部であり得る。かかる断片は、２対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ１７の少なくとも１つまたはそれに対する補体、または２対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ１７の１つまたは複数と連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーを含むことが好ましい。
【００９１】
かかる断片は「自立型」であり、つまり他のポリヌクレオチドの一部ではない、または他のポリヌクレオチドに融合しないか、あるいはそれらがその一部または領域を形成する、大きな単一ポリヌクレオチド内に含まれる。実際には、これらの断片のいくつかが、大きな単一ポリヌクレオチド内に存在する場合がある。
【００９２】
任意に、かかる断片は、長さが少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、５０、７０、８０、１００、２５０、５００または１０００ヌクレオチドの隣接スパンからなる、またはから本質的になる。１セットの好ましい断片は、本明細書において記述されるＣａｎＩｏｎ遺伝子の２対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ１７の少なくとも１つまたはそれに対する補体を含有する。
２−ポリペプチド
本発明は、変異したＣａｎＩｏｎタンパク質を含む、本明細書に記載のポリペプチドの変異体、断片、類似体および誘導体にもまた関する。
【００９３】
その変異体は、１）アミノ酸残基の１つまたは複数が、保存または非保存アミノ酸残基で置換され、かかる置換されたアミノ酸残基が遺伝コードによってコードされたものである、またはそうでない変異体、または２）アミノ酸残基の１つまたは複数が置換基を含む変異体、または３）変異したＣａｎＩｏｎが、例えばポリペプチドの半減期を増大する化合物（例えば、ポリエチレングリコール）などの他の化合物と融合する変異体、または４）追加のアミノ酸が、リーダー配列または分泌配列、または変異したＣａｎＩｏｎの精製に使用される配列またはプレタンパク質配列などの、変異したＣａｎＩｏｎに融合する変異体である。かかる変異体は、当業者の範囲内であると考えられる。
【００９４】
ポリペプチド断片は、所定のポリペプチド配列のすべてではないが一部と完全に同一である配列を有するポリペプチド、好ましくは、ＣａｎＩｏｎ遺伝子によってコードされるポリペプチドおよびその変異体である。
【００９５】
本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸の置換の場合には、１つまたはいくつかのアミノ酸を、「同等の」アミノ酸によって置換することができる。本明細書において「同等の」アミノ酸という表現は、ペプチド化学分野の当業者であれば、ペプチドの第２構造およびハイドロパシー性質が実質的に変化しないと考えるような、同様な特性を有するアミノ酸の１つに対して置換することが可能ないずれかのアミノ酸を示すために用いられる。一般に、アミノ酸の以下の群：（１）Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；（２）Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；（３）Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；（４）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；（５）Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓは、同等の変化を表す。
本発明による対象の修飾ＣａｎＩｏｎペプチド分子の特定の実施形態には、制限されないが、タンパク質分解に対して耐性であるペプチドが含まれ、その−ＣＯＮＨ−ペプチド結合が、（ＣＨ2ＮＨ）還元結合、（ＮＨＣＯ）逆結合（retro inverso bond）、（ＣＨ2−Ｏ）メチレン−オキシ結合、（ＣＨ2−Ｓ）チオメチレン結合、（ＣＨ2ＣＨ2）カルバ結合、（ＣＯ−ＣＨ2）セトメチレン結合、（ＣＨＯＨ−ＣＨ2）ヒドロキシエチレン結合、（Ｎ−Ｎ）結合、Ｅ−アルケン結合、または−ＣＨ＝ＣＨ−結合によっても修飾かつ置換されるペプチドである。本発明は、少なくとも１つのペプチド結合が上述のように修飾される、ヒトＣａｎＩｏｎポリペプチドまたは断片またはその変異体もまた包含する。
【００９６】
かかる断片は「自立形」であり、つまり他のポリヌクレオチドの一部ではない、または他のポリヌクレオチドに融合しないか、あるいはそれらがその一部または領域を形成する、大きな単一ポリヌクレオチド内に含まれる。しかしながら、いくつかの断片が大きな単一ポリヌクレオチド内に含まれる場合がある。
【００９７】
本発明のポリペプチド断片の代表的な例として、長さ約５、６、７、８、９または１０〜１５、１０〜２０、１５〜４０、または３０〜５５個のアミノ酸を有するアミノ酸が挙げられる。ＣａｎＩｏｎタンパク質中に少なくとも１つのアミノ酸変異を含有する断片が好ましい。
［核酸またはポリペプチド間の同一性］
本明細書において「配列同一性のパーセンテージ」および「同一性パーセンテージ」という用語は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド間の比較を示すために同義で用いられ、比較ウィンドウ上に最適にアラインメントされた２つの配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントに対して参照配列（付加または欠失を含まない）と比較すると、付加または欠失（つまり、ギャップ）を含む。そのパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で生じる位置の数を決定して、マッチ位置の数を得て、比較ウィンドウにおける位置の総数でマッチ位置数を割り、その結果を１００倍することによって計算され、配列同一性のパーセンテージが得られる。相同性は、当技術分野で公知の様々な配列比較アルゴリズムのいずれかを用いて評価される。かかるアルゴリズムおよびプログラムには、限定されないが、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、およびＣＬＵＳＴＡＬＷが含まれる（PearsonおよびLipman, 1988;  Altschul 等, 1990; Thompson 等, 1994; Higgins 等, 1996; Altschul 等, 1990; Altschul 等, 1993)。特に好ましい実施形態において、当技術分野で公知のBasic Local Alignment Search Tool(「ＢＬＡＳＴ」)を用いて、タンパク質および核酸配列相同性を評価する(KarlinおよびAltschul, 1990;  Altschul等, 1990, 1993,1997を参照のこと）。特に以下のタスクを実行するために、特定の５つのプログラムを使用する：
（１）アミノ酸問い合わせ配列をタンパク質配列データベースと比較するＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３；
（２）ヌクレオチド問い合わせ配列をヌクレオチド配列データベースと比較するＢＬＡＳＴＮ；
（３）問い合わせヌクレオチド配列（両方の鎖）の６つの枠の概念上の翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較するＢＬＡＳＴＸ；
（４）問い合わせタンパク質配列を、６つすべての読み枠において翻訳されたヌクレオチド配列（両方の鎖）データベースと比較するＴＢＬＡＳＴＮ；
（５）ヌクレオチド問い合わせ配列の６つの枠の翻訳を、ヌクレオチド配列データベースの６つの枠の翻訳と比較するＴＢＬＡＳＴＸ。
【００９８】
ＢＬＡＳＴプログラムは、問い合わせアミノ酸もしくは核酸配列と、タンパク質もしくは核酸配列データベースから得られることが好ましい試験配列との間の、本明細書において「スコアの高いセグメント対」と呼ばれる類似セグメントを同定することによって相同配列を同定する。その多くが当技術分野で公知であるスコアリングマトリックスを用いることによって、スコアの高いセグメント対を同定（つまり、アラインメント）することが好ましい。使用するスコアマトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Gonnet 等, 1992;  Henikoff and Henikoff, 1993)であることが好ましい。好ましさは低いが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用することができる（例えば、SchwartzおよびDayhoff, eds., 1978参照)。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定された高スコアのすべてのセグメント対の統計的有意性を評価し、好ましくはユーザーによって指定された相同性％など、ユーザーによって指定された有意性の閾値を満たすそれらのセグメントを選択する。高スコアのセグメント対の統計的有意性は、カーリンの統計的有意性の式（例えば、Karlin and Altschul, 1990参照）を用いて評価することが好ましい。ＢＬＡＳＴプログラムは、ユーザーによって提供されるデフォルトパラメーターを用いて、または変更されたパラメーターを用いて使用することが可能である。
［厳密なハイブリダイゼーション条件］
本発明によるかかるハイブリダイズ核酸を定義する目的のために、厳密なハイブリダイゼーション条件は以下の通りである：
６×ＳＣＣバッファー、５×デンハルト液、０、５％ＳＤＳおよびサケ精子ＤＮＡ１００μｇ／ｍｌの存在下にて、ハイブリダイゼーション段階を６５℃で行う。
【００９９】
そのハイブリダイゼーション段階は、４つの洗浄段階：
２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳバッファー中で好ましくは６５℃で５分間、２回洗浄；
２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳバッファー中で好ましくは６５℃で３０分間、１回洗浄；
０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳバッファー中で好ましくは６５℃で１０分間、１回洗浄；を伴い、これらのハイブリダイゼーション条件は、長さ約２０ヌクレオチドの核酸分子に適している。上述のハイブリダイゼーション条件は、所望の核酸の長さ、当業者に公知の以下の技術に応じて、適応させるべきである。適切なハイブリダイゼーション条件は例えば、HamesおよびHiggins (1985)の書物に開示されている技術に応じて適応させることが可能である。
［ＣａｎＩｏｎ遺伝子のゲノム配列］
本発明は、ＣａｎＩｏｎのゲノム配列に関する。本発明は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子、または配列番号１〜３の配列からなる、から本質的になる、またはをその配列を含むＣａｎＩｏｎゲノム配列、それに相補的な配列、ならびにその断片および変異体を包含する。これらのポリヌクレオチドは精製、単離ポリヌクレオチド、または組換えポリヌクレオチドである。
【０１００】
本発明は、配列番号１〜３のヌクレオチド配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、または９５％のヌクレオチド同一性を有するヌクレオチド配列、またはそれに相補的な配列またはその断片を含む、精製、単離、または組換えポリヌクレオチドもまた包含する。配列番号１〜３のヌクレオチド配列に関して、ヌクレオチド差異は一般に、核酸全体にわたってランダムに分布する。それにもかかわらず、好ましい核酸は、配列番号１〜３のヌクレオチド配列に関して、ヌクレオチド差異が主に、エクソン中に含まれるコード配列の外部に位置する核酸である。試験サンプルにおけるＣａｎＩｏｎ遺伝子のコピーの存在を検出するため、あるいは一方、ＣａｎＩｏｎ配列内の標的ヌクレオチド配列を増幅するために、これらの核酸ならびにそれらの断片および変異体を、オリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブとして使用することができる。
【０１０１】
本発明の他の目的は、上記に定義される厳密なハイブリダイゼーション条件下にて、配列番号１〜３のヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列またはその変異体とハイブリダイズする精製、単離、または組換え核酸からなる。好ましい実施形態において、前記精製、単離、または組換え核酸は、ヒトＣａｎＩｏｎ遺伝子のポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、さらに好ましくは、前記核酸はヒトＣａｎＩｏｎ遺伝子のヌクレオチドとハイブリダイズすることができるが、ラットＣａｎＩｏｎ遺伝子のヌクレオチド配列と実質上ハイブリダイズすることができない。
【０１０２】
本発明の特に好ましい核酸には、配列番号１〜３の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００または１００００ヌクレオチドの隣接スパンまたはその補体を含む精製、単離、または組換えポリヌクレオチドが含まれる。任意のサイズおよび配列の核酸断片もまた、このセクションで記述されるポリヌクレオチドによって含まれることを留意されたい。
【０１０３】
ＣａｎＩｏｎゲノム核酸は４４個のエクソンを含む。配列番号１〜３におけるエクソン位置を以下の表Ｂに列挙する。
【０１０４】
【表２】
2004525614.tif 000003
このように、本発明は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の４４個の各エクソンからなる群から選択されるヌクレオチド配列およびそれに相補的な各配列を含む、精製、単離、または組換えポリヌクレオチドを具体化する。本発明は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の少なくとも２つのエクソンの組み合わせを含む、精製、単離、または組換え核酸もまた提供し、そのポリヌクレオチドは、配列番号１〜３と同じ順序で前記核酸の５’末端から３’末端の核酸内に配列されている。
【０１０５】
イントロン１は、エクソン１とエクソン２との間に位置するヌクレオチド配列等を指す。イントロンの位置を表Ａに列挙する。このように、本発明は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の４３個のイントロンからなる群から選択されるヌクレオチド配列、またはそれに相補的な配列を含む、精製、単離、または組換えポリヌクレオチドを具体化する。
【０１０６】
このセクションは「ＣａｎＩｏｎのゲノム配列」というタイトルがつけられているが、任意のサイズおよび配列の核酸断片もまた、２つ以上のかかるゲノム配列のどちらかの側またはそれらの間のＣａｎＩｏｎのゲノム配列をフランキングする、このセクションに記述されるポリヌクレオチドによって含まれることを留意されたい。
［ＣａｎＩｏｎのｃＤＮＡ配列］
ＣａｎＩｏｎ遺伝子の発現は、少なくとも１つのｍＲＮＡ種の産生を引き起こすことが示されており、その核酸配列は配列番号４で示される。
【０１０７】
本発明の他の目的は、配列番号４のヌクレオチド配列、それに相補的な配列、ならびに対立遺伝子の変異体、およびその断片を含む、精製、単離、または組換え核酸である。さらに、本発明の好ましいポリヌクレオチドには、配列番号４の配列からなる、から本質的になる、またはそれを含む精製、単離、または組換えＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡが含まれる。本発明の特に好ましい核酸には、配列番号４の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００または６０００ヌクレオチドの隣接スパン、またはその補体を含む精製、単離、または組換えポリヌクレオチドが含まれる。好ましい実施形態において、前記隣接スパンは、好ましくはＡ１２〜Ａ１６からなる群から選択されるＣａｎＩｏｎ−関連２対立遺伝子マーカーを含む。
【０１０８】
本発明はまた、配列番号４のポリヌクレオチドと少なくとも９５％のヌクレオチド同一性、有利には、配列番号４のポリヌクレオチドと９９％のヌクレオチド同一性、好ましくは９９．５％のヌクレオチド同一性、最も好ましくは９９．８％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれに相補的な配列またはその生物活性断片を含む、精製または単離された核酸に関する。
【０１０９】
本発明の他の目的は、本明細書で定義される厳密なハイブリダイゼーション条件下にて、配列番号４のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはそれに相補的な配列またはその変異体またはその生物活性断片を含む、精製、単離または組換え核酸に関する。
【０１１０】
本発明の更なる目的は、配列番号５の少なくとも６個のアミノ酸の隣接スパンを含むＣａｎＩｏｎポリペプチドをコードする、単離、精製、または組換えポリヌクレオチドに関するものであり、前記隣接スパンは、配列番号５のアミノ酸位置２７７、３３８、５７４、６７８、６８０、６８３、６９１、６９２、６９５、６９６、６９７、８９４、１４８０、１４８１、１４８３、１４８４、１４８５、１６３０、１６３１、１６３２、１６３６、１６６０、１６６７、１７０７、１７０９の少なくとも１、２、３、５または１０を含む。配列番号５のアミノ酸配列を含むＣａｎＩｏｎポリペプチド、またはその誘導体または生物活性断片をコードする、単離、精製、または組換えポリヌクレオチド、ならびに配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも０、８５、９０、９５、９８、９９、９９．５または９９．８％同一なＣａｎＩｏｎポリペプチドをコードする、単離、精製、または組換えポリヌクレオチドもまた包含される。
【０１１１】
配列番号４のｃＤＮＡは、位置１のヌクレオチドから開始し、配列番号４の位置６５におけるヌクレオチドで終了する５’−ＵＴＲ領域を含む。配列番号ｃＤＮＡのｃＤＮＡは、位置５２８３のヌクレオチドから開始し、配列番号４の位置６７９９のヌクレオチドで終了する３’−ＵＴＲ領域を含む。
【０１１２】
結果として、本発明は、ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲのヌクレオチド配列、それに相補的な配列、またはその突然変異体を含む単離、精製、または組換え核酸に関する。本発明は、ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡの３’ＵＴＲのヌクレオチド配列、それに相補的な配列、またはその突然変異体を含む単離、精製、または組換え核酸にも関するものである。
【０１１３】
このセクションは「ＣａｎＩｏｎのｃＤＮＡ配列」というタイトルがつけられているが、２つ以上のかかるゲノム配列のどちらかの側またはそれらの間のＣａｎＩｏｎゲノム配列をフランキングする、このセクションに記載のポリヌクレオチドによって、任意のサイズおよび配列の核酸断片もまた含まれることを留意されたい。
［コード領域］
ＣａｎＩｏｎオープンリーディングフレームは、配列番号ｃＤＮＡの対応するｍＲＮＡに含まれる。さらに正確には、有効なＣａｎＩｏｎコード配列（ＣＤＳ）は、ヌクレオチド位置６６（ＡＴＧコドンの第１ヌクレオチド）と配列番号４のヌクレオチド位置５２８２（ＴＧＡコドンの末端ヌクレオチド）との間の領域を含む。本発明はまた、配列番号５の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８または１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、７００または１０００個のアミノ酸の隣接スパンを含むポリペプチドをコードする、単離、精製、かつ組換えポリヌクレオチドを具体化する。
【０１１４】
ＣａｎＩｏｎ遺伝子のコード配列を含有する、上記で開示したポリヌクレオチドは、このポリヌクレオチドが適切な発現シグナルの調節下におかれた場合には、所望の宿主細胞または所望の宿主生体において発現することが可能である。発現シグナルは本発明のＣａｎＩｏｎ遺伝子における調節領域中に含まれる発現シグナルであるか、またはそれと対照的に、そのシグナルは外因性核酸制御配列である。適切な発現シグナル下に置かれた場合、かかるポリヌクレオチドは、その発現および／または増幅のためにベクター中に挿入することも可能である。
［ＣａｎＩｏｎの制御配列］
上述のように、ＣａｎＩｏｎ遺伝子のゲノム配列は、非コード５’−フランキング領域、およびこの遺伝子の４４個のエクソンを含有するＣａｎＩｏｎコード領域と境をなす非コード３’−フランキング領域の両方において制御配列を含有する。
【０１１５】
５’および３’調節領域から誘導されるポリヌクレオチドは、試験サンプル中のＣａｎＩｏｎヌクレオチド配列の少なくともコピーまたはその断片の存在を検出するのに有用である。
【０１１６】
ＣａｎＩｏｎに含まれる５’調節領域のプロモーター活性を以下に記述するように評価することができる。配列番号１の関連する生物活性ポリヌクレオチド断片または変異体を同定するために、当業者は、マーカー遺伝子（つまり、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ等）を保有する組換えベクターの使用が記述されているSambrook 等(1989)を参照することが可能であり、その発現は、配列番号１の生物活性ポリヌクレオチド断片または変異体の調節下に置いた場合に、検出することができる。ＣａｎＩｏｎ遺伝子の第１エクソンの上流に位置するゲノム配列を、適切なプロモーターレポーターベクター、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社から入手可能なｐＳＥＡＰ−Ｂａｓｉｃ、ｐＳＥＡＰ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、ｐβｇａｌ−Ｂａｓｉｃ、ｐβｇａｌ−Ｅｎｈａｎｃｅｒ、もしくはｐＥＧＦＰ−１プロモーターレポーターベクター、またはＰｒｏｍｅｇａ社から入手可能なｐＧＬ２−ｂａｓｉｃもしくはｐＧＬ３−ｂａｓｉｃのプロモーターレスルシフェラーゼレポーター遺伝子ベクター中にクローン化する。簡単に言えば、これらのプロモーターレポーターベクターそれぞれは、分泌性アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、もしくは緑色蛍光タンパク質などの容易にアッセイできるタンパク質をコードするレポーター遺伝子の上流に位置する複数のクローニング部位を含む。ＣａｎＩｏｎコード領域の上流の配列は、両方向でレポーター遺伝子の上流のクローニング部位中に挿入され、適切な宿主細胞に導入される。レポータータンパク質のレベルをアッセイし、クローニング部位においてインサートを欠くベクターから得られたレベルを比較する。対照ベクターにおけるレベルと比較して、インサートを含有するベクターにおいて高い発現レベルが存在することから、インサート中にプロモーターが存在することが示されている。必要な場合には、上流配列を、弱いプロモーター配列からの転写レベルを高めるエンハンサーを含有するベクター中にクローン化することができる。インサートを欠いているベクターで観察された上記の有意な発現のレベルから、プロモーター配列が挿入された上流配列中に存在することが示されている。
【０１１７】
上流のゲノムＤＮＡ内のプロモーター配列は、エキソヌクレアーゼＩＩＩまたは適切な制限エンドヌクレアーゼ消化などの従来の技術を用いて、上流のＤＮＡ中の重複した５’および／または３’欠失を構成することによってさらに定義することができる。その結果得られた欠失断片をプロモーターレポーターベクター中に挿入して、例えばその開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるColes 等 (1998)により記述されているように、その欠失がプロモーター活性を低減または消失しているかどうかを決定することができる。このように、プロモーターの境界を定義することができる。所望の場合には、部位特異的突然変異誘発またはリンカースキャンを用いて、プロモーター内の潜在的な個々の調節部位を同定して、プロモーター個々内、またはプロモーターの組み合わせ内の潜在的な転写因子結合部位を除去することが可能である。転写レベルに対するこれらの変異の影響は、プロモーターレポーターベクターにおけるクローニング部位中に変異を挿入することによって決定される。この種類のアッセイは、当業者にはよく知られており、ＷＯ９７／１７３５９、米国特許第５，３７４，５４４号；欧州特許第５８２  ７９６号；米国特許第５，６９８，３８９号；米国特許第５，６４３，７４６号；米国特許第５，５０２，１７６号；および米国特許第５，２６６，４８８号に記述されており；それらの開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１８】
異なる種類の細胞および組織中でＣａｎＩｏｎプロモーターに作動可能に（operably)連結される検出可能なポリヌクレオチドの発現レベルによって、ＣａｎＩｏｎ遺伝子のプロモーターの強さおよび特異性を評価することができる。検出可能なポリヌクレオチドは、予め定義されたオリゴヌクレオチドプローブと特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド、またはＣａｎＩｏｎポリペプチドもしくはその断片もしくはその変異体を含む検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドのいずれかである。この種類のアッセイは当業者にはよく知られており、米国特許第５，５０２，１７６号；米国特許第５，２６６，４８８号に記述されている；それらの開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。その方法の一部を以下にさらに詳細に述べる。
【０１１９】
ＣａｎＩｏｎコード領域の５’末端および３’末端に位置する調節エレメントを保有するポリヌクレオチドは、対象の異種ポリヌクレオチドの転写および翻訳活性を調節するのに有利に使用することが可能である。
【０１２０】
このように、本発明は、５’および３’調節領域からなる群から選択されるポリヌクレオチド、またはそれに相補的な配列またはその生物活性断片もしくは変異体を含む、精製または単離された核酸にもまた関する。好ましい実施形態において、「５’調節領域」は、配列番号１の位置１〜２０００の間に位置するヌクレオチド配列中に位置する。「３’調節領域」は、配列番号３の位置４５８４２〜４７８４１の間に位置するヌクレオチド配列中に位置する。
【０１２１】
本発明はまた、５’および３’調節領域からなる群から選択されるポリヌクレオチドと少なくとも９５％のヌクレオチド同一性、有利には５’および３’調節領域からなる群から選択されるポリヌクレオチドと９９％のヌクレオチド同一性、好ましくは９９．５％のヌクレオチド同一性、最も好ましくは９９．８％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれに相補的な配列またはその変異体またはその生物活性断片を含む、精製または単離された核酸に関する。
【０１２２】
本発明の他の目的は、本明細書で定義される厳密なハイブリダイゼーション条件下にて、５’および３’調節領域のヌクレオチド配列からなる群から選択されるポリヌクレオチド、またはそれに相補的な配列またはその変異体またはその生物活性断片とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む、精製、単離または組換え核酸からなる。
【０１２３】
５’調節領域の好ましい断片は、約１５００または１０００ヌクレオチド、好ましくは約５００ヌクレオチド、さらに好ましくは約４００ヌクレオチド、またさらに好ましくは３００ヌクレオチド、最も好ましくは約２００ヌクレオチドの長さを有する。
【０１２４】
３’調節領域の好ましい断片は、少なくとも５０、１００、１５０、２００、３００または４００塩基の長さである。
【０１２５】
配列番号１および３の「生物活性」ポリヌクレオチド誘導体は、組換え細胞宿主において組換えポリペプチドもしくは組換えポリヌクレオチドを発現するための調節領域として機能的である、前記ポリヌクレオチドの断片を含む、あるいはその断片にあるポリヌクレオチドである。それは、エンハンサーとして、またはリプレッサーとして働くことができる。
【０１２６】
本発明の目的のために、核酸またはポリヌクレオチドは、前記調節ポリヌクレオチドが転写および翻訳調節情報を含有するヌクレオチド配列を含有する場合、組換えポリペプチドもしくは組換えポリヌクレオチドを発現するための調節領域として「機能的」であり、かかる配列は、所望のポリペプチドまたは所望のポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列に「作動可能に連結」される。
【０１２７】
本発明の調節ポリヌクレオチドは、例えばSambrook 等(1989)の書籍に記述されているように、適切な制限酵素を使用して切断することによって配列番号１および３のヌクレオチド配列から作製することができる。Ｂａｌ３１（Wabiko 等, 1986)などのエキソヌクレアーゼ酵素により、配列番号１および３を消化することによって、調節ポリヌクレオチドを作製することもできる。これらの調節ポリヌクレオチドは、本明細書の他に記述される核酸化学合成によっても作製することができる。
【０１２８】
本発明による調節ポリヌクレオチドは、所望の宿主細胞または宿主生体においてコード配列を発現させるのに使用することができる組換え発現ベクターの一部である。本発明による組換え発現ベクターは、本明細書の他に記述されている。
【０１２９】
本発明の好ましい５’調節ポリヌクレオチドには、ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡの５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、またはその生物活性断片もしくは変異体が含まれる。
【０１３０】
本発明の好ましい３’調節ポリヌクレオチドには、ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）、またはその生物活性断片もしくは変異体が含まれる。
【０１３１】
本発明の更なる目的は：
ａ）ｉ）５’調節領域のポリヌクレオチドまたはそれに相補的な配列を含むヌクレオチド配列；
ｉｉ）５’調節領域のヌクレオチド配列と少なくとも９５％のヌクレオチド同一性を有するポリヌクレオチドまたはそれに相補的な配列を含むヌクレオチド配列；
ｉｉｉ）５’調節領域のヌクレオチド配列と厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドまたはそれに相補的な配列を含むヌクレオチド配列；
ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）におけるポリヌクレオチドの生物活性断片または変異体；からなる群から選択される調節ヌクレオチド配列を含む核酸と、
ｂ）上記（ａ）で定義される核酸に作動可能に連結される、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたは対象の核酸と、
ｃ）任意に、３’調節ポリヌクレオチド、好ましくはＣａｎＩｏｎ遺伝子の３’調節ポリヌクレオチドを含む核酸と、を含む精製または単離された核酸からなる。
【０１３２】
上記で定義された核酸の特定の実施形態において、前記核酸は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の５’非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）、またはその生物活性断片もしくは変異体を含む。
【０１３３】
上記で定義された核酸の特定の第２実施形態において、前記核酸は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）、またはその生物活性断片もしくは変異体を含む。
【０１３４】
５’調節領域の調節ポリヌクレオチド、またはその生物活性断片もしくは変異体は、所望のポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端で作動可能に結合する。
【０１３５】
３’調節領域の調節ポリヌクレオチド、またはその生物活性断片もしくは変異体は、所望のポリペプチドまたはポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの３’末端で有利に、作動可能に結合する。
【０１３６】
上述の核酸によってコードされる所望のポリペプチドは、原核または真核起源のタンパク質を包含する、種々の性質または起源のポリペプチドである。ＣａｎＩｏｎ調節領域の制御下で発現するポリペプチドの中では、細菌性、真菌性またはウイルス性抗原が含まれる。真核性タンパク質、例えば細胞内タンパク質、「ハウスキーピング」タンパク質など、膜結合タンパク質、受容体など、サイトカインなどの内因性メディエーターのような分泌タンパク質もまた包含される。所望のポリペプチドは、ＣａｎＩｏｎタンパク質、特に配列番号５のアミノ酸配列のタンパク質、またはその断片もしくは変異体であってもよい。
【０１３７】
上述のポリヌクレオチドによってコードされる所望の核酸、通常ＲＮＡ分子は、所望のコードポリヌクレオチド、例えばＣａｎＩｏｎコード配列に相補的であり、したがってアンチセンスポリヌクレオチドとして有用である。
【０１３８】
宿主細胞または宿主生体において所望のポリペプチドまたは所望の核酸を発現させるために、かかるポリヌクレオチドは組換え発現ベクターに含まれることが可能である。本明細書に記述されるようなポリヌクレオチドを含有する適切な組換えベクターは、本明細書の他に開示される。
［ポリヌクレオチド構築物］
「ポリヌクレオチド構築物」および「組換えポリヌクレオチド」という用語は、人工的にデザインされ、かつそれらの最初の自然環境において隣接ヌクレオチド配列として見出されない少なくとも２つのヌクレオチド配列を含有する、直鎖または環状の、精製または単離ポリヌクレオチドを指すために本明細書において同義で用いられる。
［組換え細胞宿主において、およびトランスジェニック動物において時間的かつ空間的なＣａｎＩｏｎ遺伝子発現を検出することを可能にするＤＮＡ構築物］
ＣａｎＩｏｎタンパク質合成の欠失の生理学的結果および表現型の結果を研究するために、細胞レベルおよび多細胞生物レベルの両方で、本発明は、ＤＮＡ構築物および組換えベクターもまた包含する。ＣａｎＩｏｎゲノム配列もしくはｃＤＮＡの特定の対立遺伝子の条件発現、および配列番号１〜４のＣａｎＩｏｎヌクレオチド配列もしくはその断片に関して１つまたは複数の塩基の置換、欠失、または付加を有するこのゲノム配列もしくはｃＤＮＡのコピーの条件発現もまた可能にするＤＮＡ構築物および組換えベクターもまた包含し、これらの塩基置換、欠失または付加は、エクソン、イントロンまたは制御配列のいずれかに位置するが、好ましくは５’制御配列またはＣａｎＩｏｎゲノム配列のエクソンにおいて、または配列番号４のＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡ内に位置する。好ましい実施形態では、ＣａｎＩｏｎ配列は、本発明の２対立遺伝子マーカーを含む。好ましい実施形態では、ＣａｎＩｏｎ配列は、本発明の２対立遺伝子マーカー、好ましくは２対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ１７の１つを含む。
【０１３９】
本発明は、本発明に記述されるポリヌクレオチドのいずれか１つを含む組換えベクターを具体化する。特に、本発明によるポリヌクレオチド構築物は、「ＣａｎＩｏｎ遺伝子のゲノム配列」のセクション、「ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡ配列」のセクション、「コード領域」のセクション、および「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」のセクションに記述されるポリヌクレオチドのいずれかを含むことができる。
【０１４０】
好ましいＤＮＡ構築物は、Gossen 等 (1992, 1995)およびFurth 等 (1994)により記述されているようにＣａｎＩｏｎ遺伝子発現を制御する大腸菌トランスポゾンＴｎ１０からのテトラサイクリン耐性オペロンｔｅｔに基づく。かかるＤＮＡ構築物は、最小プロモーターまたはＣａｎＩｏｎ遺伝子の５’制御配列のいずれかに融合するＴｎ１０（ｔｅｔオペロン）からの７つのｔｅｔオペレーター配列を含有し、前記最小プロモーターまたは前記ＣａｎＩｏｎ制御配列は、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＣａｎＩｏｎポリペプチドもしくはそのペプチド断片を含むポリペプチドをコードする対象のポリヌクレオチドに作動可能に連結する。同じ細胞が、ＨＣＭＶＩＥ１エンハンサー／プロモーターもしくはＭＭＴＶ−ＬＴＲなどのプロモーターの制御下に置かれた、単純疱疹ウイルスのウイルス性タンパク質ＶＰ１６の活性化ドメインに融合した野型（ｔＴＡ）または突然変異体（ｒＴＡ）リプレッサーをコードするヌクレオチド配列も含有する場合、対象のヌクレオチド配列に対する条件発現系としてこのＤＮＡ構築物は機能的である。実際に、本発明の好ましいＤＮＡ構築物は、オペレーター配列を含有するポリヌクレオチドと、ｔＴＡもしくはｒＴＡリプレッサーをコードする配列を含有するポリヌクレオチドのどちらも含む。
【０１４１】
特定の実施形態において、条件発現ＤＮＡ構築物は、突然変異体テトラサイクリンリプレッサーｒＴＡをコードする配列を含有し、対象のポリヌクレオチドの発現はテトラサイクリンの非存在下では無変化であり、その存在下では誘導される。
［相同的組換え：置換ベクターを可能にするＤＮＡ構築物］
好ましい第２ＤＮＡ構築物は、５’末端から３’末端に：（ａ）ＣａｎＩｏｎゲノム配列中に含まれる第１ヌクレオチド配列；（ｂ）ネオマイシン耐性（ｎｅｏ）に対するマーカーなど、正の選択マーカーを含むヌクレオチド配列；（ｃ）ＣａｎＩｏｎゲノム配列中に含まれる第２ヌクレオチド配列；を含み、第１ＣａｎＩｏｎヌクレオチド配列（ａ）の下流のゲノム上に位置する。
【０１４２】
好ましい実施形態において、このＤＮＡ構築物は、ヌクレオチド配列（ａ）の上流またはヌクレオチド配列（ｃ）の下流に位置する負の選択マーカーもまた含む。その負の選択マーカーは、チミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子(Thomas 等, 1986)、ハイグロマイシンβ遺伝子(Te Riele 等, 1990)、ｈｐｒｔ遺伝子（Van der Lugt 等, 1991; Reid 等, 1990)またはジフテリア毒素Ａ断片（Ｄｔ−Ａ）遺伝子を含むことが好ましい。正の選択マーカーは、ＣａｎＩｏｎタンパク質をコードする配列を中断するようにＣａｎＩｏｎエクソン配列内に位置することが好ましい。これらの置換ベクターは、例えばThomas 等 (1986; 1987)、Mansour 等 (1988) およびKoller 等 (1992)によって記述されている。
【０１４３】
第１および第２ヌクレオチド配列（ａ）および（ｃ）は、ＣａｎＩｏｎ制御配列、イントロン配列、エクソン配列または制御および／またはイントロンおよび／またはエクソン配列のどちらも含有する配列内に無関係に位置することが可能である。ヌクレオチド配列（ａ）および（ｃ）のサイズは、１〜５０ｋｂ、好ましくは１〜１０ｋｂ、さらに好ましくは２〜６ｋｂ、最も好ましくは２〜４ｋｂの範囲である。
［相同的組換えを可能にするＤＮＡ構築物：Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ系］
これらの新規なＤＮＡ構築物は、Ｐ１ファージの部位特異的組換え系を利用する。Ｐ１ファージは、３４塩基対のｌｏｘＰ部位と特異的に相互作用する、Ｃｒｅと呼ばれるリコンビナーゼを有する。そのｌｏｘＰ部位は、８ｂｐ保存配列によって分離される１３ｂｐの２つのパリンドローム配列で構成される(Hoess 等, 1986)。同一の向きを有する２つのｌｏｘＰ部位間のＣｒｅ酵素による組換えによって、ＤＮＡ断片の欠失が生じる。
【０１４４】
相同的組換えと組み合わせて使用されるＣｒｅ−ｌｏｘＰ系はGu 等 (1993, 1994)によって最初に記述されている。簡単に言えば、ゲノムの標的位置に挿入される対象のヌクレオチド配列は、同じ向きに少なくとも２つのｌｏｘＰ部位を有し、組換えゲノムから切り出されるべきヌクレオチド配列のそれぞれの末端に位置する。切り出し事象には、組換え細胞宿主の核内にリコンビナーゼ（Ｃｒｅ）酵素が存在することが必要である。リコンビナーゼ酵素は、（ａ）組換え細胞宿主をこの酵素を含有する培地中でインキュベートすることによって、Araki 等 (1995)により記述されているように所望の細胞中にＣｒｅ酵素を直接注入することによって、またはBaubonis 等 (1993)によって記述されているように、細胞中に酵素をリポフェクションすることによって；（ｂ）組換え細胞宿主において機能的なプロモーターに作動可能に連結するＣｒｅコード配列を含むベクターを細胞宿主に移入することによって（プロモーターが任意に誘導性であり、前記ベクターがGu 等 (1993)およびSauer 等 (1988)によって記述されるように組換え細胞宿主に導入される）；（ｃ）組換え細胞宿主において機能的なプロモーターに作動可能に連結するＣｒｅコード配列を含むポリヌクレオチドを細胞宿主のゲノムに移入することによって（プロモーターが任意に誘導性であり、前記ポリヌクレオチドがGu 等 (1993)よって記述されるように、ランダムな挿入事象または相同的組換え事象によって細胞宿主のゲノムに挿入される）；所望の時点で導くことが可能である。
【０１４５】
特定の実施形態において、相同的組換えによってＣａｎＩｏｎ遺伝子に挿入されるべき配列を含有するベクターは、選択可能なマーカーが同じ向きのｌｏｘＰ部位によってフランクされるように構成され、Ｃｒｅ酵素による処理によって、相同的組換え事象により挿入されている対象のＣａｎＩｏｎ配列を残すと同時に選択可能なマーカーを除去することが可能である。再度、２つの選択可能なマーカー：組換え事象を選択するための正の選択マーカーおよび相同的組換え事象を選択するための負の選択マーカーが必要とされる。Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ系を用いたベクターおよび方法は、Zou 等 (1994)によって記述されている。
【０１４６】
したがって、本発明の第３の好ましいＤＮＡ構築物は、５’末端から３’末端に：（ａ）ＣａｎＩｏｎゲノム配列に含まれる第１ヌクレオチド配列；（ｂ）正の選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを含むヌクレオチド配列であって、ｌｏｘＰ部位などのリコンビナーゼによって認識される部位を定義する２つの配列をさらに含み、その２つの部位が同じ向きに配置されているヌクレオチド配列；（ｃ）ＣａｎＩｏｎゲノム配列に含まれ、かつ第１ＣａｎＩｏｎヌクレオチド配列（ａ）の下流にあるゲノム上に位置する第２ヌクレオチド配列；を含む。
【０１４７】
ｌｏｘＰ部位などのリコンビナーゼによって認識される部位を定義する配列は、条件切り出しが求められるヌクレオチド配列を有する適切な位置でヌクレオチド配列（ｂ）内に位置することが好ましい。特定の一実施形態において、相同的組換え事象の出現後の所望の時点でその切り出しを可能にするために、２つのｌｏｘＰ部位は正の選択マーカー配列の各側に位置する。
【０１４８】
上術の第３ＤＮＡ構築物を用いた方法の好ましい実施形態において、リコンビナーゼによって認識される２つの部位、好ましくは２つのｌｏｘＰ部位によって境を接するポリヌクレオチド断片の切り出しは、プロモーター配列、好ましくは誘導性プロモーター、さらに好ましくは組織特異的プロモーター配列、最も好ましくは、Gu 等 (1994)によって記述されているような誘導性かつ組織特異的であるプロモーター配列に作動可能に連結するＣｒｅ酵素をコードする配列の組換え宿主細胞のゲノム内に存在するために、所望の時点で行われる。
【０１４９】
組換え細胞宿主のゲノム内でのＣｒｅ酵素の存在は、２種類のトランスジェニック動物、上述のようにｌｏｘｐ部位を含有する対象のＣａｎＩｏｎ誘導配列を有する第１トランスジェニック動物およびGu 等 (1994)によって記述されているように、適切なプロモーター配列に作動可能に連結するＣｒｅコード配列を有する第２トランスジェニックの繁殖に起因する。
【０１５０】
従ってAntonおよびGraham (1995)および Kanegae 等 (1995)によって記述されているように、Ｃｒｅ酵素発現の空間時間的制御もまた、Ｃｒｅ遺伝子を含有するアデノウイルスをベースとするベクターで達成することが可能であり、Ｃｒｅ酵素を送達するための、細胞の感染または臓器のインビトロでの感染が可能となる。
【０１５１】
上述のＤＮＡ構築物を使用して、本発明の所望のヌクレオチド配列、好ましくはＣａｎＩｏｎゲノム配列またはＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡ配列、最も好ましくはＣａｎＩｏｎゲノム配列またはｃＤＮＡ配列の変更されたコピーを、標的ゲノムの所定の位置に導入し、標的遺伝子の変更されたコピーが産生されるか（ノックアウトの相同的組換え）、または相同的組換え事象を起こすのに十分に相同性の他のコピーによって標的遺伝子のコピーが置換される（ノックインの相同的組換え）。特定の実施形態において、上述のＤＮＡ構築物を使用して、ＣａｎＩｏｎゲノム配列、または本発明の少なくとも１つの２対立遺伝子マーカー、好ましくはＡ１〜Ａ１７からなる群から選択される少なくとも１つの２対立遺伝子マーカーを含むＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡ配列を導入することが可能である。
［核のアンチセンスＤＮＡ構築物］
配列番号４の核配列のオリゴヌクレオチド断片、好ましくはＣａｎＩｏｎ遺伝子の開始コドンを含む断片を、対応するＣａｎＩｏｎ遺伝子の発現を抑制するアンチセンスツールとして含有する、本発明のベクターを含有する他の組成物。本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドを用いた好ましい方法は、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Sczakiel 等 (1995)により記述されている手順またはＰＣＴ出願番号：ＷＯ９５／２４２２３に記述されている手順である。
【０１５２】
アンチセンスツールは、ＣａｎＩｏｎ  ｍＲＮＡの５’末端に相補的なポリヌクレオチド（長さ１５〜２００ｂｐ）の中で選択することが好ましい。一実施形態では、所望の標的遺伝子の異なる部分に相補的な異なるアンチセンスポリヌクレオチドの組み合わせが使用される。
【０１５３】
本発明による好ましいアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンＡＴＧまたはスプライシング部位を含有するＣａｎＩｏｎのｍＲＮＡの配列に相補的である。本発明によるさらに好ましいアンチセンスポリヌクレオチドは、ＣａｎＩｏｎ  ｍＲＮＡのスプライシング部位に相補的である。
【０１５４】
好ましくは、Liu 等 (1994)に記述されるように、本発明のアンチセンスポリヌクレオチドは、自己切断リボザイムと置換されている３’ポリアデニル化シグナルを有し、その結果ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写物はそれらの３’末端でポリ（Ａ）なしに生成され、これらのアンチセンスポリヌクレオチドは核から移出することができない。好ましい実施形態において、これらのＣａｎＩｏｎアンチセンスポリヌクレオチドはまた、Eckner 等 (1991)に記述される構造など、３’〜５’ヌクレオチド鎖分解性（exonucleolytic)の分解に対して切断された転写物を安定化するヒストンのステムループ構造をリボザイムカセット内に含有する。
［オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー］
ＣａｎＩｏｎ遺伝子に由来するポリヌクレオチドは、試験サンプルにおける配列番号１〜４のヌクレオチド配列の少なくともコピー、またはその断片、補体、または変異体の存在を検出するのに有用である。
【０１５５】
本発明の特に好ましいプローブおよびプライマーには、配列番号１〜３の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００または２００００ヌクレオチドの隣接スパン、またはその補体を含有する単離、精製、または組換えポリヌクレオチドが含まれる。本発明のさらに好ましいプローブおよびプライマーには、前記隣接スパンがＡ１〜Ａ１７からなる群から選択される２対立遺伝子マーカーを含む、単離、精製、または組換えポリヌクレオチドが含まれる。
【０１５６】
本発明の他の目的は、配列番号４のヌクレオチド配列、それに相補的な配列、ならびにその突然変異体および断片を含む精製、単離、または組換え核酸である。さらに、本発明の好ましいプローブおよびプライマーには、配列番号４の配列からなる、その配列から本質的になる、またはその配列を含む、精製、単離、または組換えＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡが含まれる。本発明の特に好ましいプローブおよびプライマーには、配列番号４の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００または６０００ヌクレオチドの隣接スパン、またはその補体を含有する、単離、精製、または組換えヌクレオチドが含まれる。本発明のさらに好ましいプローブおよびプライマーには、配列番号４の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００または６０００ヌクレオチドの隣接スパン、またはその補体を含有する、単離、精製、または組換えヌクレオチドが含まれ、前記隣接スパンは、Ａ１２〜Ａ１６からなる群から選択される２対立遺伝子マーカーを含む。
【０１５７】
更なる実施形態において、本発明のプローブおよびプライマーには、配列番号６の少なくとも２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００または４００ヌクレオチドの隣接スパン、またはその補体を含有する、単離、精製、または組換えヌクレオチドが含まれる。好ましい実施形態において、配列番号６の前記隣接スパンは２対立遺伝子マーカーＡ１８を含む。
【０１５８】
このように、本発明は、上記で定義された厳密なハイブリダイゼーション条件下にて、配列番号１〜３のヒトＣａｎＩｏｎヌクレオチド配列、またはそれの変異体またはそれに相補的な配列からなる群から選択される核酸と、それらが特異的にハイブリダイズすることを特徴とする核酸プローブにも関する。
【０１５９】
一実施形態において、本発明は、配列番号１〜４および配列番号６のいずれか１つの８〜５０ヌクレオチドの隣接スパン、およびその補体からなる、またはその隣接スパンから本質的になる、単離、精製、および組換えポリヌクレオチドを包含し、前記スパンは、前記配列においてＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーを含み；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１８、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択される。任意に、前記隣接スパンは、長さ１８〜３５ヌクレオチドであり、前記２対立遺伝子マーカーは、前記ポリヌクレオチドの中心から４ヌクレオチド以内であり；任意に、前記ポリヌクレオチドは前記隣接スパンからなり、前記隣接スパンは長さ２５ヌクレオチドであり、前記２対立遺伝子マーカーは前記ポリヌクレオチドの中心にあり；任意に、前記隣接スパンの３’末端は、前記ポリヌクレオチドの３’末端に存在し；任意に、前記隣接スパンの３’末端は、前記ポリヌクレオチドの３’末端に位置し、前記前記２対立遺伝子マーカーは、前記ポリヌクレオチドの３’末端に存在する。好ましい実施形態において、前記プローブは、以下の配列：Ｐ１〜Ｐ１８から選択される配列およびそれに相補的な配列を含む、からなる、またはから本質的になる。
【０１６０】
他の実施形態において、本発明は、配列番号１〜４の８〜５０ヌクレオチドの隣接スパン、またはその補体を含む、からなる、またはから本質的になる、単離、精製および組換えポリヌクレオチドを包含し、前記隣接スパンの３’末端は、前記ポリヌクレオチドの３’末端に位置し、かつ前記ポリヌクレオチドの３’末端は、前記配列においてＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーの上流にある２０ヌクレオチド内に位置し；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１８、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ポリヌクレオチドの３’末端は、前記配列において前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーの上流にある１ヌクレオチドに位置し；任意に、前記ポリヌクレオチドは、以下の配列：Ｄ１〜Ｄ１８およびＥ１〜Ｅ１８から選択される配列から本質的になる。
【０１６１】
更なる実施形態において、本発明は、以下の配列：Ｂ１〜Ｂ１７およびＣ１〜Ｃ１７から選択される配列を含む、からなる、またはから本質的になる、単離、精製、または組換えポリヌクレオチドを包含する。
【０１６２】
追加の実施形態では、本発明は、配列番号１〜４および配列番号６におけるＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカー、またはその補体でのヌクレオチドの同一性を決定するために、ハイブリダイゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイ、酵素ベースのミスマッチ検出アッセイに使用されるポリヌクレオチド、ならびに配列番号１〜４および配列番号６におけるＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカー、またはその補体を含むヌクレオチドのセグメントを増幅するのに使用されるポリヌクレオチドを包含し；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１８、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択される。
【０１６３】
本発明は、ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーでヌクレオチドの同一性を決定するための、好ましくはハイブリダイゼーションアッセイ、シークエンシングアッセイ、マイクロシークエンシングアッセイ、または酵素ベースのミスマッチ検出アッセイにおける、およびＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチドセグメントの増幅における、本発明によるポリヌクレオチドの使用に関する。
【０１６４】
本発明によるプローブまたはプライマーは、８〜１０００ヌクレオチドの長さを有するか、または少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、５０、６０、７０、８０、１００、２５０、５００もしくは１０００ヌクレオチドの長さであると指定される。さらに詳細には、これらのプローブおよびプライマーの長さは、８、１０、１５、２０、または３０〜１００ヌクレオチド、好ましくは１０〜５０、さらに好ましくは１５〜３０ヌクレオチドの範囲である。より短いプローブおよびプライマーは、標的の核酸配列に対する特異性を欠く傾向があり、一般に、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためには、より低い温度が必要とされる。より長いプローブおよびプライマーは、作製するのにコストが高くつき、時として自己（self）ハイブリダイズして、ヘアピン構造を形成し得る。特定のセットのアッセイ条件下でのプライマーおよびプローブの適切な長さは、当業者によって経験的に決定される。好ましいプローブまたはプライマーは、Ｐ１〜Ｐ１８、それに相補的な配列、Ｂ１〜Ｂ１７、Ｃ１〜Ｃ１７、Ｄ１〜Ｃ１８、Ｅ１〜Ｅ１８のヌクレオチド配列の群から選択されるポリヌクレオチドを含む核酸からなり、配列表におけるそれぞれの位置を表１、２、および３に示す。
【０１６５】
安定なハイブリッドの形成は、ＤＮＡの融解温度（Ｔｍ）に依存する。Ｔｍは、プライマーもしくはプローブの長さ、溶液のイオン強度およびＧ＋Ｃ含有率に応じて異なる。プライマーまたはプローブのＧ＋Ｃ含有率が高いほど、融解温度は高くなる。Ｇ：Ｃ対は３つのＨ結合によって保持されるが、Ａ：Ｔ対は２つのみ有するためである。本発明のプローブ中のＧＣ含有率は通常、１０〜７５％、好ましくは３５〜６０％、さらに好ましくは４０〜５５％の範囲である。
【０１６６】
プライマーおよびプローブは、例えば適切な配列のクローニングおよび制限およびNarang 等 (1979)のリン酸ジエステル法、Beaucage 等 (1981)のジエチルホスホラミダイト法およびＥＰ  ０  ７０７  ５９２に記載の固体支持体法などの方法による直接的な化学合成を含む適切な方法によって作製することができる。
【０１６７】
検出用プローブは一般に、核酸配列または無電荷核酸類似体、例えば国際特許出願番号ＷＯ９２／２０７０２に開示のペプチド核酸、米国特許第５，１８５，４４４号；同第５，０３４，５０６号および同第５，１４２，０４７号に記載のモルホリノ類似体である。プローブは、追加のｄＮＴＰをプローブに添加することができないという点で「伸長不可能」にしなければならない。それら自体において、およびそれら自体の中で、類似体は通常、伸長不可能であり、ヒドロキシル基がもはや伸長に関与することができないように、プローブの３’末端を修飾することによって核酸プローブを伸長不可能にすることができる。例えば、プローブの３’末端を捕獲もしくは検出標識で官能性を付与して、それによってヒドロキシル基を消費するか、またはそうでなければヒドロキシル基をブロックすることができる。代替方法としては、３’ヒドロキシル基を単に、切断、置換または修正することが可能であり、１９９３年４月１９日出願の米国特許出願第０７／０４９，０６１号には、プローブを伸長不可能にするために用いることができる修正形態が記述されている。
【０１６８】
本発明のポリヌクレオチドのいずれも、所望の場合には、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、もしくは化学的手段によって検出可能なことが当技術分野で知られているいずれかの標識を組み込むことによって標識化することができる。例えば、有用な標識には、放射性物質（32Ｐ、35Ｓ、3Ｈ、125Ｉを含む）、蛍光染料（５−ブロモデスオキシウリジン、フルオレセイン、アセチルアミノフルオレン、ジゴキシゲニン）またはビオチンが含まれる。ポリヌクレオチドはそれらの３’および５’末端で標識化されることが好ましい。核酸断片の非放射性標識化の例が、フランス特許番号ＦＲ−７８１０９７５に、またはUrdea 等 (1988)もしくはSanchez-Pescador 等 (1988）によって記述されている。さらに、本発明によるプローブは、それらがシグナル増幅を可能にするような構造特性を有する場合があり、かかる構造特性は、例えばUrdea 等 (1991)によって記述されている、または欧州特許番号ＥＰ  ０  ２２５  ８０７（Chiron）に記載のような分岐ＤＮＡプローブである。
【０１６９】
修飾ＤＮＡなどのプライマーまたはプライマー伸長産物のいずれかの固体支持体上への固定化を促進するために、標識を使用して、プライマーを捕獲することもできる。捕獲標識は、プライマーおよびプローブに取り付けられ、固相の試薬の特異的結合メンバー（例えば、ビオチンおよびストレプトアビジン）と結合対を形成する特異的結合メンバーであることが可能である。したがって、ポリヌクレオチドまたはプローブによって保有される標識の種類に応じて、捕獲するため、または標識ＤＮＡを検出するために、それを用いることができる。さらに、本明細書において提供されるポリヌクレオチド、プライマーまたはプローブはそれ自体が捕獲標識としての役割を果たすことを理解されよう。例えば、固相試薬の結合メンバーが核酸配列である場合には、プライマーもしくはプローブの相補的な部分を結合させて、それによってプライマーもしくはプローブが固相に固定化されるように、それが選択される。ポリヌクレオチドプローブ自体が結合メンバーとしての役割を果たす場合には、プローブが、標識に相補的でない配列または「テール（tail）」を含有するであろうことは当業者であれば認識されよう。ポリヌクレオチドプライマー自体が捕獲標識としての役割を果たす場合には、プライマーの少なくとも一部は、固相上で核酸と自由にハイブリダイズするだろう。ＤＮＡ標識技術は当業者にはよく知られている。
【０１７０】
本発明のプローブは、多数の目的に有用である。それらは特に、ゲノムＤＮＡとのサザンハイブリダイゼーションに使用することができる。プローブを使用して、ＰＣＲ増幅産物を検出することもできる。他の技術を用いて、ＣａｎＩｏｎ遺伝子またはｍＲＮＡにおけるミスマッチを検出するためにそれらを使用することもできる。例えば、ノーザンブロットにおいてＣａｎＩｏｎ遺伝子の発現を検出するために、それらを使用することもできる。
【０１７１】
本発明のポリヌクレオチド、プライマーおよびプローブのいずれも、固体支持体上に便利に固定化することができる。固体支持体は当業者には公知であり、反応トレイのウェルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁気ビーズ、ニトロセルロース片、膜、ラテックス粒子などの微粒子、ヒツジ（または他の動物）の赤血球、duracytesなどが含まれる。固体支持体は重要ではなく、当業者によって選択することができる。このように、ラテックス粒子、微粒子、磁気もしくは非磁気ビーズ、膜、プラスチックチューブ、マイクロタイターウェルの壁、ガラスもしくはシリコンチップ、ヒツジ（または他の適切な動物）の赤血球およびduracytesはすべて適切な例である。固相上に核酸を固定化する適切な方法には、イオン性、疎水性、共有結合性相互作用等が含まれる。本明細書において使用されるような固体支持体は、不溶性のいずれかの材料を指すか、またはその後の反応によって不溶性にすることができる。固体支持体は、捕獲試薬を引き付け、固定化するその固有の能力に対して選択することができる。代わりに、固相は、捕獲試薬を引き付け、固定化する能力を有する追加の受容体を保持することができる。その追加の受容体は、捕獲試薬自体に対して、または捕獲試薬に結合した荷電物質に対して逆に帯電した荷電物質を含むことができる。さらに他の代替として、受容体分子は、固体支持体上に固定化され（付着され）、かつ特異的結合反応によって捕獲試薬を固定化する能力を有する特異的結合メンバーであり得る。受容体分子によって、アッセイを実施する前またはアッセイの実施中に、固体支持体材料の捕獲試薬を間接的に結合させることが可能となる。このように、固相は、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁気もしくは非磁気金属、試験管、マイクロタイターウェルのガラスもしくはシリコン表面、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ（または他の適切な動物）の赤血球およびduracytes（登録商標）および当業者に公知の他の構造である。本発明のポリヌクレオチドは、個々に、あるいは単一固体支持体に対して少なくとも２、５、８、１０、１２、１５、２０、または２５個の本発明の別個のポリヌクレオチドのグループで、固体支持体に付けるかまたは固体支持体上に固定化することができる。さらに、本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドと同じ固体支持体に付けることができる。
【０１７２】
結果として、本発明は、サンプルにおける配列番号１〜４および配列番号６からなる群から選択されるヌクレオチド配列、その断片または変異体およびそれに相補的な配列を含む、核酸の存在を検出する方法もまた含み、前記方法は、以下の段階：
ａ）配列番号１〜４および配列番号６のヌクレオチド配列、その断片または変異体およびそれに相補的な配列からなる群から選択される核酸中に含まれるヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる１つの核酸プローブまたは複数の核酸プローブと、アッセイするサンプルとを接触させる段階；
ｂ）サンプルにおいてプローブと核酸との間で形成されるハイブリッド複合体を検出する段階；を含む。
【０１７３】
本発明はさらに、サンプルにおける配列番号１〜４および配列番号６からなる群から選択されるヌクレオチド配列、その断片または変異体およびそれに相補的な配列を含む核酸の存在を検出するためのキットに関し、前記キットは：
ａ）配列番号１〜４および配列番号６のヌクレオチド配列、その断片または変異体およびそれに相補的な配列からなる群から選択される核酸中に含まれるヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる１種類の核酸プローブまたは複数の核酸プローブ；
ｂ）任意に、ハイブリダイゼーション反応を実施するために必要な試薬；を備える。
【０１７４】
この検出方法およびキットの第１の好ましい実施形態において、前記核酸プローブまたは複数種の核酸プローブは検出可能な分子で標識化される。前記方法およびキットの第２の好ましい実施形態では、前記核酸プローブまたは複数の核酸プローブは基体上に固定化されている。第３の好ましい実施形態では、核酸プローブまたは複数の核酸プローブは、Ｐ１〜Ｐ１８のヌクレオチド配列、それに相補的な配列、Ｂ１〜Ｂ１７、Ｃ１〜Ｃ１７、Ｄ１〜Ｄ１８、Ｅ１〜Ｅ１８からなる群から選択される配列、またはＡ１〜Ａ１８およびそれに相補的な配列からなる群から選択される２対立遺伝子マーカーのいずれかを含む。
［オリゴヌクレオチドアレイ］
本発明の複数のオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブを含む基体は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子における標的配列を検出または増幅するのに使用することが可能であり、ＣａｎＩｏｎ遺伝子のコード配列もしくは非コード配列における変異を検出するのにもまた使用することができる。
【０１７５】
本明細書で提供される任意のポリヌクレオチドは、固体支持体上の重なり領域に、またはランダムな位置に付着することが可能である。代替方法として、本発明のポリヌクレオチドは、他のいずれかのポリヌクレオチドの付着部位と重ならない固体支持体の別の領域に各ポリヌクレオチドが付着される、順序付きアレイ中に付着させることが可能である。かかるポリヌクレオチドの順序付きアレイは、「アドレス指定可能」であるように設計されて、異なる位置が記録され、アッセイ手順の一部としてアクセスすることができることが好ましい。アドレス指定可能なポリヌクレオチドアレイは通常、異なる公知の位置で基体表面に結合する複数の異なるオリゴヌクレオチドプローブを含む。各ポリヌクレオチドの正確な位置の情報によって、これらは、ハイブリダイゼーションアッセイに特に有用な「アドレス指定可能な」アレイとなる。当技術分野で公知のいずれかのアドレス指定可能なアレイ技術を、本発明のポリヌクレオチドと共に用いることができる。これらのポリヌクレオチドアレイのある特定の実施形態は、Ｇｅｎｅｃｈｉｐｓ（商標）として知られており、一般に米国特許第，１４３，８５４号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１５０７０および９２／１００９２に記述されている。これらのアレイは一般に、機械的合成方法またはフォトリソグラフィ法と固相オリゴヌクレオチド合成との組み合わせを組み込んだ光直接的（light-directed）合成方法を用いて製造される(Fodor 等, 1991)。固体支持体上へのオリゴヌクレオチドアレイの固定化は、「非常に大きなスケールの固定化ポリマー合成」（ＶＬＳＩＰＳ（商標））と特定される技術の開発によって可能となっている。その技術では、通常、高密度アレイにおいてプローブをチップの固体表面上に固定化する。ＶＬＳＩＰＳ（商標）技術の例は、米国特許第５，１４３，８５４号；同第５，４１２，０８７号およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１５０７０、ＷＯ９２／１００９２、ＷＯ９５／１１９９５に挙げられており、光直接的合成技術などの技術によってオリゴヌクレオチドアレイを形成する方法が記述されている。固体支持体上に固定化されたヌクレオチドのアレイの提供を目的とする方策の設計では、ハイブリダイゼーションパターンおよび配列情報を最大限にする試みで、チップ上にオリゴヌクレオチドアレイを配列し表示するために、更なる提示方策が開発された。かかる提示方策の例は、それらの開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１２３０５、ＷＯ９４／１１５３０、ＷＯ９７／２９２１２およびＷＯ９７／３１２５６に開示されている。
【０１７６】
本発明のオリゴヌクレオチドアレイの他の実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのマトリックスを有利に使用して、ＣａｎＩｏｎ遺伝子において、好ましくはその調節領域で起こる変異を検出することができる。この特定の目的のために、公知の変異（１つまたはいくつかのヌクレオチドの欠失、挿入または置換による）を保有する遺伝子とのそれらのハイブリダイゼーションを可能にするヌクレオチド配列を有するように、プローブが特異的に設計される。公知の変異というのは、例えば、Huang 等 (1996)またはSamson 等 (1996)により使用されている技術に従って同定されたＣａｎＩｏｎ遺伝子上の変異を意味する。
【０１７７】
ＣａｎＩｏｎ遺伝子における変異を検出するのに使用される他の技術は、高密度ＤＮＡアレイの使用である。高密度ＤＮＡアレイの単位要素を構成する各オリゴヌクレオチドプローブは、ＣａｎＩｏｎゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡの特定の配列にマッチするように設計される。このように、標的の遺伝子配列のサブ配列に相補的なオリゴヌクレオチドからなるアレイを使用して、標的配列と野生型遺伝子との同一性を決定し、その量を測定し、標的配列とＣａｎＩｏｎ遺伝子の参照野生型配列との間の差異を検出する。かかる設計において、４Ｌタイルアレイと呼ばれる、４つのプローブのセット（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）、好ましくは１５ヌクレオチドオリゴマーが実行される。４つのプローブの各セットにおいて、完全な補体は、ミスマッチのプローブよりも強くハイブリダイズするだろう。結果として、４Ｌプローブを含有するタイルアレイ、公知の野生型参照配列において可能性のあるすべての変異を含有するプローブセット全部を用いて、長さＬの核酸標的を変異についてスキャンする。１５ｍｅｒプローブセットのタイルアレイのハイブリダイゼーションシグナルは、標的配列における一塩基変化によって乱される。結果として、変異位置をフランキングするプローブに対して、シグナルの特有の減少または「フットプリント」が存在する。この技術はChee 等 (1996)によって記述されている。
【０１７８】
結果的に、プローブおよびプライマーとして上述の少なくとも１種類のポリヌクレオチドを含む核酸分子のアレイに関係する。好ましくは、本発明は、プローブおよびプライマーとして上述の少なくとも２種類のポリヌクレオチドを含む核酸のアレイに関する。
【０１７９】
本発明の更なる目的は、Ｐ１〜Ｐ１８、Ｂ１〜Ｂ１７、Ｃ１〜Ｃ１７、Ｄ１〜Ｄ１８、Ｅ１〜Ｅ１８、それに相補的な配列、その少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３０、もしくは４０連続ヌクレオチドのその断片からなる群から選択される配列の少なくとも１つ、およびＡ１〜Ａ１８からなる群から選択される２対立遺伝子マーカーおよびそれに対する補体を含む少なくとも１つの配列を含む、核酸配列のアレイからなる。
【０１８０】
本発明は、Ｐ１〜Ｐ１８、Ｂ１〜Ｂ１７、Ｃ１〜Ｃ１７、Ｄ１〜Ｄ１８、Ｅ１〜Ｅ１８、それに相補的な配列、その少なくとも８連続ヌクレオチドのその断片からなる群から選択される配列の少なくとも２つ；およびＡ１〜Ａ１８からなる群から選択される２対立遺伝子マーカーおよびそれの補体を含む少なくとも２つの配列を含む、核酸配列のアレイに関係する。
［ＣａｎＩｏｎタンパク質およびポリペプチド断片：］
「ＣａｎＩｏｎポリペプチド」という用語は、本発明のタンパク質およびポリペプチドのすべてを包含するために本明細書において用いられる。本発明のポリペプチド、ならびにかかるポリペプチドを含む融合ポリペプチドによってコードされるポリペプチドもまた、本発明の一部を形成する。本発明は、配列番号５の配列からなる、から本質的になる、またはその配列を含む、単離または精製されたＣａｎＩｏｎタンパク質を含む、ヒトからのＣａｎＩｏｎタンパク質を具体化する。
【０１８１】
本発明は、配列番号１〜４および配列番号からなる群から選択されるヌクレオチド配列、それに相補的な配列またはその断片から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに関する。本発明は、配列番号５の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、７００、１０００、１２００、１４００、１６００または１７００個のアミノ酸の隣接スパンを含む、単離、精製、および組換えポリペプチドを具体化する。他の好ましい実施形態において、アミノ酸の隣接配列は、ＣａｎＩｏｎタンパク質配列におけるアミノ酸の欠失、付加、交換または切断を含む、変異または機能上の変異の部位を含む。
【０１８２】
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号５の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、７００、１０００、１２００、１４００、１６００または１７００個のアミノ酸の隣接スパンを含有する、単離、精製、および組換えポリペプチドを具体化し、前記隣接スパンは、配列番号５のアミノ酸位置２７７、３３８、５７４、６７８、６８０、６８３、６９１、６９２、６９５、６９６、６９７、８９４、１４８０、１４８１、１４８３、１４８４、１４８５、１６３０、１６３１、１６３２、１６３６、１６６０、１６６７、１７０７、１７０９の少なくとも１、２、３、５または１０を含む。配列番号５の前記隣接スパンは、位置２７７にアラニン残基；位置３３８にセリン；位置５７４にバリン；位置６７８にロイシン；位置６８０にセリン；位置６８３にトレオニン；位置６９１にヒスチジン；位置６９２にセリン；位置６９５にセリン；位置６９６にアラニン；位置６９７にイソロイシン；位置８９４にイソロイシン；位置１４８０にリジン；位置１４８１にアルギニン；位置１４８３にグリシン；位置１４８４にバリン；位置１４８５にイソロイシン；位置１６３０にアスパラギン；位置１６３１にセリン；位置１６３２にメチオニン；位置１６３６にトレオニン；位置１６６０にアラニン；位置１６６７にフェニルアラニン；位置１７０７にトレオニン；および／または１７０９位置にアラニンを含むことが好ましい。
【０１８３】
本発明は、配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８または９９％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列またはその断片を含む、精製、単離または組換えポリペプチドもまた包含する。
【０１８４】
ＣａｎＩｏｎタンパク質は、ヒトまたは哺乳類の組織サンプルから単離されるか、あるいはヒトまたは哺乳類の遺伝子から発現することが好ましい。本発明のＣａｎＩｏｎポリペプチドは、当技術分野で公知の通常の発現方法を用いて作製することができる。所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、いずれかの簡便な宿主に適した発現ベクター中にライゲートする。真核性および原核性両方の宿主系を組換えポリペプチドの形成に使用する。より一般的な系のいくつかの概要。次いで、溶解された細胞または培地から、そのポリペプチドを単離し、意図する用途に必要な程度まで精製する。精製は、当技術分野で公知のいずれかの技術、例えば選択的抽出、塩析分画、クロマトグラフィー、遠心分離等による。例えば、Methods in Enzymology for a variety of methods for purifying Proteins（「タンパク質を精製する様々な方法のための酵素学における方法」）を参照のこと。
【０１８５】
さらに、短いタンパク質断片は、化学合成によって生成される。代替方法としては、本発明のタンパク質は、ヒトまたは非ヒトの動物の細胞または組織から抽出される。タンパク質を精製する方法は当技術分野で公知であり、粒子を破壊するための洗剤またはカオトロピック剤の使用、続いてイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーによるポリペプチドの選択的抽出および分離、密度による沈降、およびゲル電気泳動を含む。
【０１８６】
配列番号４を含むいずれかのＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡを使用して、ＣａｎＩｏｎタンパク質およびポリペプチドを発現させることができる。発現するはずのＣａｎＩｏｎタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸は、従来のクローニング技術を用いて発現ベクターにおいてプロモーターに作動可能に連結する。発現ベクターにおけるＣａｎＩｏｎインサートは、ＣａｎＩｏｎタンパク質の完全なコード配列またはその一部を含む。
【０１８７】
発現ベクターは、当技術分野で知られている哺乳類、酵母、昆虫または細菌の発現系のいずれかである。市販のベクターおよび発現系は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ社（マサチューセッツ州ケンブリッジ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（カリフォルニア州ラ・ホーヤ）、Ｐｒｏｍｅｇａ社（ウィスコンシン州マディソン）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（カリフォルニア州サンディエゴ）を含む、様々な供給元から入手可能である。所望の場合には、発現を高め、適切なタンパク質を促進するために、その開示内容全体が本明細書に組み込まれる、Hatfield, 等による米国特許第５，０８２，７６７号に説明されているように、配列のコドンコンテクストおよびコドン対を、発現ベクターが導入される特定の発現生物体に対して最適化する。
【０１８８】
一実施形態において、ｃＤＮＡのポリＡシグナルによるＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡのコード配列全体は、発現ベクターにおけるプロモーターに作動可能に連結する。一方、ＣａｎＩｏｎタンパク質の一部をコードする核酸が開始部位として働くためのメチオニンを欠く場合、従来の技術を用いて、核酸の最初のコドンに隣接して開始メチオニンを導入することができる。同様に、ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡからのインサートがポリＡシグナルを欠く、例えばＢｇｌＩおよびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いてｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）からポリＡシグナルをスプライスし、哺乳類の発現ベクターｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にそれを組み込むことによって、この配列を構築物に付加することができる。ｐＸＴ１は、ＬＴＲおよびモロニーマウス白血病ウイルスからのｇａｇ遺伝子の一部を含有する。構築物中のＬＴＲのその位置は、効率的な安定なトランスフェクションを可能にする。そのベクターは、単純疱疹チミジンキナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイシン遺伝子を含む。ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部をコードする核酸は、ＣａｎＩｏｎｃＤＮＡもしくはその一部に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、配列番号５のＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡを含有する細菌ベクターからＰＣＲによって得られ、５’プライマーに組み込まれたＰｓｔ  Ｉおよび対応するｃＤＮＡ３’プライマーの５’末端のＢｇｌＩＩに対して制限エンドヌクレアーゼ配列を含有し、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部をコードする配列が確実にポリＡシグナルに対して適切に位置するように注意を払う。その結果得られたＰＣＲ反応物から得られる精製された断片をＰｓｔＩで消化し、エキソヌクレアーゼで平滑末端化し、ＢｇｌＩＩで消化し、精製し、ここでポリＡシグナルを含有するｐＸＴ１にライゲートし、ＢｇｌＩＩで消化する。
【０１８９】
ライゲートされた生成物を、製品の仕様書に記載の条件下でリポフェクチン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、ニューヨーク州グランドアイランド）を用いて、マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞に移入する。正のトランスフェクタントが、移入された細胞をＧ４１８（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）６００ｕｇ／ｍｌ中で成長させた後に選択される。
【０１９０】
上記の手順を用いて、検出可能な表現型の要因である変異体ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部を発現させることができる。
【０１９１】
硫酸アンモニウム沈殿またはサイズもしくは電荷に基づくクロマトグラフィー分離など、従来の精製技術を用いて、発現したタンパク質を精製することが可能である。核酸インサートによってコードされるタンパク質もまた、標準免疫クロマトグラフィー技術を用いて精製することが可能である。かかる手順において、細胞抽出物など、発現したＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部を含有する溶液を、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部に対する抗体を有するカラムに適用し、クロマトグラフィーマトリックスに付着させる。発現したタンパク質を免疫クロマトグラフィーカラムに結合させる。その後、そのカラムを洗浄して、非特異的に結合したタンパク質を除去する。次いで、特異的に結合した発現タンパク質をカラムから放出し、標準技術を用いて回収する。
【０１９２】
ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部の発現を確認するために、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部をコードするインサートを含有する発現ベクターを含有する宿主細胞から発現したタンパク質を、インサートを含まない発現ベクターを含有する宿主細胞で発現したタンパク質と比較することができる。インサートを含まない発現ベクターを含有する細胞からのサンプルに存在しない、インサートを有する発現ベクターを含有する細胞からのサンプルにおけるバンドの存在は、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部が発現していることを示している。一般に、バンドは、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部に対して考えられる移動性を有するだろう。しかしながら、バンドは、グリコシル化、ユビキチン結合、または酵素切断などの修飾の結果として考えられる移動性と異なる移動性を有する場合がある。
【０１９３】
発現したＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部を特異的に認識することができる抗体を以下に説明する。
【０１９４】
抗体作製が不可能な場合には、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部をコードする核酸を、キメラポリペプチドを用いた精製スキームで使用するために設計された発現ベクターに組み込む。かかる方策において、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部をコードする核酸は、キメラのもう半分をコードする遺伝子を有するフレームに挿入される。キメラのもう半分は、β−グロブリンまたはニッケル結合ポリペプチドコード配列である。次いで、β−グロブリンに対する抗体またはそれに付着するニッケルを有するクロマトグラフィーマトリックスを使用して、キメラタンパク質を精製する。プロテアーゼ切断部位は、β−グロブリンまたはニッケル結合ポリペプチドとＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部との間で操作される。したがって、キメラの２種類のポリペプチドは、プロテアーゼ消化によって互いに分離される。
【０１９５】
β−グロブリンキメラタンパク質を産生する有用な発現ベクターは、ウサギβ−グロブリンをコードするｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）である。ウサギβ−グロブリン遺伝子のイントロンＩＩは、発現した転写物のスプライシングを促進し、構築物に組み込まれたポリアデニル化シグナルは発現のレベルを高める。これらの技術は、分子生物学の当業者には良く知られている。標準法は、Davis 等 (1986)などの方法テキストに公開されており、その方法の多くをＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、またはＰｒｏｍｅｇａ社から入手することができる。さらにポリペプチドは、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（商標）Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）などのインビトロの翻訳システムを用いて構築物から生成することが可能である。
〈本発明のＣａｎＩｏｎポリペプチドに結合する抗体〉
いずれかのＣａｎＩｏｎポリペプチドまたは全タンパク質を使用して、記述される発現したＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片に特異的に結合することができる抗体を産生することが可能である。
【０１９６】
本発明の抗体組成物は、配列番号５のＣａｎＩｏｎタンパク質の変異体に特異的または選択的に結合することができる。ＣａｎＩｏｎの第１変異体に特異的に結合する抗体組成物に関しては、それは、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、または他の抗体に基づく結合アッセイにおいて、ＣａｎＩｏｎタンパク質の全長第２変異体に対してよりもＣａｎＩｏｎタンパク質の全長第１変異体に対する結合親和性のほうが少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、または１００％高いことを示さなければならない。好ましい実施形態において、抗体組成物は、ヒトＣａｎＩｏｎタンパク質に特異的に結合することができる。
【０１９７】
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号５の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、７００または１０００個のアミノ酸の隣接スパンを含む、エピトープ含有ポリペプチドに選択的に結合することができる、または選択的に結合するポリクローナルまたはモノクローナルの抗体組成物に関する。好ましい実施形態において、前記スパンは、配列番号５のアミノ酸位置の７７、３３８、５７４、６７８、６８０、６８３、６９１、６９２、６９５、６９６、６９７、８９４、１４８０、１４８１、１４８３、１４８４、１４８５、１６３０、１６３１、１６３２、１６３６、１６６０、１６６７、１７０７、１７０９の少なくとも１、２、３、５または１０を含む。
【０１９８】
いずれかのＣａｎＩｏｎポリペプチドまたは全タンパク質を使用して、記述される発現したＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片に特異的に結合することができる抗体を産生することが可能である。
【０１９９】
エピトープは、エピトープに固有の空間構造に３個と少ないアミノ酸を含む。一般に、エピトープは、少なくとも６個のかかるアミノ酸、およびさらに多くの場合少なくとも８〜１０個のかかるアミノ酸からなる。好ましい実施形態において、抗原エピトープは、３〜５０個の任意の整数である多数のアミノ酸を含有する。エピトープとして機能する断片を従来のいずれかの手段によって作製することが可能である。ジェームソン−ウルフの抗原分析によって決定することが可能であり、例えばデフォルトパラメーターを用いたコンピュータープログラムＰＲＯＴＥＡＮを使用して実施することができる（Windows4.0、DNASTAR社、ウィスコンシン州マディソン、1228 South Park)。
【０２００】
本発明は、変異したＣａｎＩｏｎタンパク質に、または変異したＣａｎＩｏｎタンパク質のエピトープを含むその断片もしくは変異体に特異的に結合することができる、精製または単離された抗体にもまた関する。他の好ましい実施形態では、本発明は、ＣａｎＩｏｎタンパク質の少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含み、変異を生じる形質によってコードされ得るアミノ酸の少なくとも１つを含むポリペプチドに結合することができる抗体に関する。
【０２０１】
野生型またはトランスジェニックであろうとなかろうと、それへの抗体結合が望まれる種と異なるＣａｎＩｏｎの種を発現する非ヒト動物または哺乳類、およびＣａｎＩｏｎを発現しない動物（つまり、本明細書で記述されるＣａｎＩｏｎノックアウト動物）が、抗体を作製するのに特に有用である。ＣａｎＩｏｎノックアウト動物は、外来抗原としてＣａｎＩｏｎタンパク質の露出領域のすべてまたは大部分を認識し、したがって、ＣａｎＩｏｎエピトープのより野生のアレイで抗体を産生するだろう。さらに、アミノ酸を１０〜３０個のみ有する小さなポリペプチドが、ＣａｎＩｏｎタンパク質のいずれか１つへの特異的な結合を得るのに有用である。さらに、抗原配列に類似しているＣａｎＩｏｎの種を産生する動物の液性免疫系は、動物の天然ＣａｎＩｏｎ種と抗原配列との差異を選択的に認識し、抗原配列におけるこれらの固有の部位に対する抗体を産生するだろう。かかる技術は特に、ＣａｎＩｏｎタンパク質のいずれか１つに特異的に結合する抗体を得るのに有用であるだろう。
【０２０２】
いずれかのプロトコルに従って作製した抗体標本は、生体サンプル中の抗原を有する物質の濃度を決定する定量的イムノアッセイで有用である；それらはまた、生体サンプル中の抗原の存在を同定するために半定量的または定量的に使用される。その抗体は、タンパク質を発現する細胞を殺すため、または体内のタンパク質のレベルを低減するために、治療用組成物においてもまた使用することができる。
【０２０３】
本発明の抗体は、当技術分野で公知の放射性、蛍光性、または酵素標識のいずれか１つによって標識化することが可能である。
【０２０４】
結果として、本発明は、生体サンプル中の本発明によるＣａｎＩｏｎポリペプチドの存在を特異的に検出する方法にもまた関するものであり；前記方法は以下の段階：
ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含有するＣａｎＩｏｎポリペプチドに、またはそのペプチド断片もしくは変異体に特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体と生体サンプルとを接触させる段階；
ｂ）形成された抗原−抗体複合体を検出する段階；を含む。
【０２０５】
本発明はまた、生体サンプル中の本発明によるＣａｎＩｏｎポリペプチドの存在をインビトロで検出する診断用キットに関し；前記キットは：
ａ）配列番号５のアミノ酸配列を含有するＣａｎＩｏｎポリペプチドに、またはそのペプチド断片もしくは変異体に特異的に結合する、任意に標識化されるポリクローナルまたはモノクローナル抗体；
ｂ）形成された抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬であって、任意に標識を保有するか、または特に上記のモノクローナルまたはポリクローナル抗体が単独で標識化されていない場合に、標識試薬によってそれ自体を認識することができる試薬；を備える。
【０２０６】
したがって、本発明は、ポリペプチドに特異的に結合する、さらに詳細には、制限されないがＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡを含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、およびＩｇＹを含む、本発明のポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に関する。好ましい実施形態において、抗体は、制限されないが本発明のヒト抗原結合抗体断片であり、制限されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）およびＶＬもしくはＶＨドメインのいずれかを含有する断片が含まれる。その抗体は、鳥類および哺乳類を含むいずれかの動物の起源に由来する。抗体は、ヒト、マウス、ウサギ、ヒツジ、モルモット、ウマまたはトリであることが好ましい。
【０２０７】
単鎖抗体を含む、抗原結合抗体断片は単独で、または以下の：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインの全体または一部との組み合わせで、可変領域（１つまたは複数）を含む。可変領域（１つまたは複数）とヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインのいずれかの組み合わせもまた、本発明に含まれる。本発明はさらに、本発明のポリペプチドに特異的に結合する、キメラ、ヒト化、およびヒトモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。本発明はさらに、本発明の抗体に抗イディオタイプである抗体を含む。
【０２０８】
本発明の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性であるか、またはより大きな多特異性を有することが可能である。多特異性抗体は、本発明のポリペプチドの異なるエピトープに特異的であるか、または本発明のポリペプチドの両方に対して、ならびに異種組成物、例えば異種ポリペプチドまたは固体支持体材料に特異的である。ＷＯ９３／１７７１５；ＷＯ９２／０８８０２；ＷＯ９１／００３６０；ＷＯ９２／０５７９３；Tutt等 (1991) J. Immunol. 147:60-69；米国特許第５，５７３，９２０号、同第４，４７４，８９３号、同第５，６０１，８１９号、同第４，７１４，６８１号、同第４，９２５，６４８号；Kostelny等 (1992) J. Immunol. 148:1547-1553を参照のこと。
【０２０９】
本発明の抗体は、抗体によって認識または特異的に結合される、本発明のポリペプチドのエピトープ（１つまたは複数）またはエピトープを有する部分（１つまたは複数）の面から説明または指定される。本発明のタンパク質の場合には、分泌タンパク質、抗体が、本発明の核酸によってコードされる完全長タンパク質、本発明の核酸によってコードされる成熟タンパク質（つまり、シグナルペプチドの切断によって生成されるタンパク質）、本発明の核酸によってコードされるシグナルペプチド、または本発明の他のいずれかのポリペプチドに特異的に結合する。したがって、エピトープ（１つまたは複数）またはエピトープを有するポリペプチド部分（１つまたは複数）は、本明細書で記述されるように、例えばＮ末端およびＣ末端位置によって、隣接アミノ酸残基におけるサイズによって指定されるか、または別の方法で本明細書において説明される（配列表を含む）。本発明のいずれかのエピトープまたはポリペプチドに特異的に結合する抗体はまた、個々の種としては除外される。したがって、本発明は、本発明の指定のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含み、それの除外を考慮に入れる。
【０２１０】
本発明の抗体は、それらの交差反応性の面からも説明または指定される。本発明のポリペプチドの他のいずれかの類似体、オルソログ、または相同体に特異的に結合しない抗体が含まれる。本発明のポリペプチドに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同一性（当技術分野で公知であり、かつ本明細書に記述されている方法を用いて計算された）を有するポリペプチドに結合しない抗体もまた、本発明に含まれる。厳密なハイブリダイゼーション条件下にて（本明細書で記述される）、本発明のポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのみに結合する抗体がさらに本発明に含まれる。本発明の抗体は、結合親和性の面からも説明または指定される。好ましい結合親和性には、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍ未満の乖離定数またはＫｄを有する結合親和性が含まれる。
【０２１１】
本発明の抗体は、制限されないが、インビトロおよびインビボでの診断方法および治療方法のどちらも含む、本発明のポリペプチドを生成、検出、および標的化するための当技術分野で公知の方法を含む用途を有する。例えば、抗体は、生体サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルを定性的かつ定量的に測定するための免疫アッセイでの用途を有する。例えば、Harlow 等, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988)（その全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
【０２１２】
本発明の抗体は、単独でまたは他の組成物と組み合わせて使用してもよい。抗体はさらに、Ｎ末端もしくはＣ末端で異種ポリペプチドに組換えにより融合するか、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結合することが可能である（共有および非共有結合を含む）。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイで標識として有用な分子および異種ポリペプチド、薬物、もしくは毒素などのエフェクター分子に組換えにより融合するか、または結合することが可能である。例えば、ＷＯ９２／０８４９５；ＷＯ９１／１４４３８；ＷＯ８９／１２６２４；米国特許第５，３１４，９９５号；およびＥＰ  ０  ３９６  ３８７を参照のこと。
【０２１３】
本発明の抗体は、当技術分野で公知の適切な方法によって作製することができる。例えば、本発明のポリペプチドまたはその抗原断片を、ポリクローナル抗体を含有する血清の生成を誘導するために動物に投与することができる。「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって作製された抗体に限定されない。「抗体」という用語は、少なくとも１つの結合ドメインで構成されるポリペプチドまたはポリペプチドのグループを意味し、結合ドメインは、抗体分子の可変ドメインの折り畳みから形成されて、内部表面形状および抗原の抗原決定基の特徴に相補的な電荷分布を有する三次元結合空間を形成し、それによって、抗原との免疫反応が可能となる。「モノクローナル抗体」という用語は、真核、原核、もしくはファージクローンを含む単一クローンから誘導される抗体を意味するものであり、それが作製される方法を意味するものではない。ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術を含む、当技術分野で公知の多種多様な技術を用いて作製することができる。
【０２１４】
ハイブリドーマ技術には、当技術分野で公知の技術が含まれる（例えば、その開示内容全体が参照により組み込まれる、Harlow 等 (1998); Hammerling等 (1981))。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は例えば、パパイン（Ｆａｂ断片を作製するための）もしくはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を作製するための）などの酵素を用いて、タンパク分解性切断によってハイブリドーマにより作製された抗体から作製することが可能である。
【０２１５】
代替方法としては、本発明の抗体は、組換えＤＮＡ技術の適用によって、または当技術分野で公知の方法を用いた合成化学によって作製することができる。例えば、本発明の抗体は、当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ法を用いて作製することができる。ファージディスプレイ法では、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有する、ファージ粒子の表面上に機能抗体ドメインを提示する。抗原、通常固体表面もしくはビーズに結合または捕獲される抗原を用いて直接選択することによって、所望の結合特性を有するファージが、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から選択される。これらの方法で使用されるファージは通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質に組換えによって融合する、Ｆａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するｆｄおよびＭ１３を含む繊維状ファージである。本発明の抗体を作製するのに使用することができるファージディスプレイ法の例には、Brinkman等 (1995); Ames等(1995); Kettleborough, 等 (1994); Persic等(1997); Burton等 (1994)；ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；および米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号および同第５，７３３，７４３号に開示の方法が含まれる（前記参考文献全体が参照により組み込まれる）。
【０２１６】
上記の参考文献に記述されているように、ファージ選択後、ファージから抗体コード領域を単離し、ヒト抗体、もしくは他のいずれかの所望の抗原結合断片を含む全抗体を作製するのに使用することが可能であり、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む所望の宿主で発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２断片を組換えにより作製する技術もまた、ＷＯ９２／２２３２４；Mullinax等 (1992);Sawai等 (1995); Better等 (1988)（前記参考文献はその全体が参照により組み込まれる）に開示の方法など、当技術分野で公知の方法を用いて使用することができる。
【０２１７】
単鎖Ｆｖｓおよび抗体を作製するのに使用することができる技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Huston 等 (1991); Shu等 (1993);Skerra等 (1988)に記載の技術が含まれる。ヒトにおける抗体のインビボでの使用およびインビトロでの検出アッセイを含む一部の使用については、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を使用することが好ましい場合がある。キメラ抗体を作製する方法は当技術分野で公知である。Morrison (1985); Oi 等, (1986); Gillies, S.D. 等 (1989); および米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと。ＣＤＲグラフティング（ＥＰ  ０  ２３９  ４００；ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，５３０，１０１号；同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（veneering）またはリサーフェシング（resurfacing）（ＥＰ  ０  ５９２  １０６；ＥＰ  ０  ５１９  ５９６；Padlan E.A., (1991); Studnicka G.M. 等 (1994)；Roguska M.A. 等 (1994))、チェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む様々な技術を用いて、抗体をヒト化することができる。ヒト抗体は、上述のファージディスプレイ法を含む、当技術分野で公知の様々な方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号；ＷＯ９８／４６６４５；ＷＯ９８／５０４３３；ＷＯ９８／２４８９３；ＷＯ９６／３４０９６；ＷＯ９６／３３７３５；ＷＯ９１／１０７４１を参照のこと（前記参考文献はその全体が参照により組み込まれる）。
【０２１８】
本発明のポリペプチドに組換え融合される、または化学結合（共有および非共有結合のどちらも含む）される抗体がさらに、本発明に含まれる。その抗体は、本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的である。例えば、抗体を使用して、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合または結合させることによって、インビトロまたはインビボの特定の細胞型に対して本発明のポリペプチドを標的化することが可能である。本発明のポリペプチドに融合または結合した抗体は、インビトロ免疫アッセイおよび当技術分野で公知の方法を用いた精製法において使用することも可能である。例えば、上記のHarbor 等およびＷＯ９３／２１２３２；ＥＰ  ０  ４３９  ０９５； Naramura, M. 等 (1994)；米国特許第５，４７４，９８１号； Gillies, S.O. 等 (1992); Fell, H.P. 等 (1991)を参照のこと（前記参考文献はそれらの全体が参照により組み込まれる）。
【０２１９】
本発明はさらに、可変領域以外の抗体ドメインに融合または結合した本発明のポリペプチドを含有する組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体のＦｃ領域、またはその一部に融合または結合することが可能である。本発明のポリペプチドに融合した抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、または全ドメインのいずれかの組み合わせまたはその一部を含む。本発明のポリペプチドは上記の抗体部分に融合または結合して、ポリペプチドのインビボでの半減期を増大するか、あるいは当技術分野で公知の方法を用いた免疫アッセイで使用することができる。そのポリペプチドを上記の抗体部分に融合または結合させて、多量体を形成することも可能である。例えば、本発明のポリペプチドに融合したＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合によって二量体を形成することができる。三量体以上の多量体形は、ＩｇＡおよびＩｇＭの部分にポリペプチドを融合させることによって生成することができる。本発明のポリペプチドを抗体に融合または結合させる方法は、当技術分野では公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、同第５，１１２，９４６号；ＥＰ  ０  ３０７  ４３４、ＥＰ  ０  ３６７  １６６；ＷＯ９６／０４３８８、ＷＯ９１／０６５７０； Ashkenazi, A. 等 (1991); Zheng, X.X. 等 (1995);Vil, H. 等 (1992)（前記参考文献はそれらの全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
【０２２０】
本発明は、本発明のポリペプチドの作動薬または拮抗薬として働く抗体に関する。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとの受容体／リガンド相互作用を一部または完全に阻害する抗体を含む。受容体特異的抗体およびリガンド特異的抗体のどちらも含まれる。リガンド結合を妨げないが、受容体活性化を妨げる受容体特異的抗体が含まれる。受容体活性化（つまり、シグナル伝達）は、本明細書に記述されるか、または当技術分野で公知の技術によって決定することができる。リガンド結合および受容体活性化のどちらも妨げる受容体特異的抗体もまた含まれる。同様に、リガンドに結合し、リガンドの受容体への結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合し、それによって受容体活性化を妨げるが、リガンドが受容体に結合するのを妨げない抗体が含まれる。受容体を活性化する抗体がさらに含まれる。これらの抗体は、リガンドによって仲介される受容体活性化によって影響を受ける、すべてのまたはすべてとは限らない生物活性に対して作動薬として作用する。その抗体は、本明細書で開示される特異的活性を含む生物活性に対して作動薬または拮抗薬として指定される。上記の抗体作動薬は当技術分野で公知の方法を用いて作製することができる。例えば、ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７；Deng, B. 等 (1998); Chen, Z. 等 (1998); Harrop, J.A. 等 (1998); Zhu, Z. 等 (1998); Yoon, D.Y. 等 (1998); Prat, M. 等 (1998); Pitard, V. 等 (1997); Liautard, J. 等 (1997); Carlson, N.G. 等 (1997); Taryman, R.E. 等 (1995); Muller, Y.A. 等 (1998); Bartunek, P. 等 (1996)を参照のこと(前記参考文献はそれらの全体が参照により組み込まれる）。
【０２２１】
上述のように、本発明のポリペプチドの抗体は次に、当業者によく知られている技術を用いて本発明のポリペプチドを「模倣」する、抗イディオタイプ抗体を作製するのに使用することができる。例えば、GreenspanおよびBona, (1989); Nissinoff, (1991)を参照のこと。例えば、本発明のポリペプチドに結合し、かつポリペプチド多重体化または本発明のポリペプチドのリガンドへの結合を競合的に抑制する抗体を使用して、ポリペプチド多重体化または結合ドメインを模倣し、結果として、ポリペプチドもしくはそのリガンドを中和する抗イディオタイプを産生することができる。かかる中和抗イディオタイプ抗体を使用して、本発明のポリペプチドに結合させるか、またはそのリガンド／受容体に結合させて、それによってその生物活性をブロックすることができる。
〈ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカー〉
［本発明の２対立遺伝子マーカーの利点］
本発明のＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、ＲＦＬＰ（制限断片長多型）およびＶＮＴＲ（可変数の直列型反復）マーカーなどの他の遺伝子マーカーと比較して、多数の重要な利点を提供する。
【０２２２】
マーカーの第１の生成は、制限断片の長さを変更する変異である、ＲＦＬＰであった。しかしながら、ＲＦＬＰを同定し、かつ分類するのに使用される方法は相対的に、材料、労力、および時間の無駄である。遺伝子マーカーの第２の生成は、ミニサテライトまたはマイクロサテライトとして分類することができるＶＮＴＲであった。ミニサテライトは、長さ０．１〜２０キロ塩基の範囲のヒト染色体の領域に沿って分布する、５〜５０反復の単位に存在する直列型反復のＤＮＡ配列である。それらは多くの可能性のある対立遺伝子を表すため、それらの情報含有量は非常に高い。ミニサテライトはサザンブロットを実施することによってスコアリングされて、試験される個体からの核酸サンプル中に存在する直列型反復の数が同定される。しかしながら、サザンブロットによって分類することができる、可能性のあるＶＮＴＲはわずか１０4種である。さらに、ＲＦＬＰおよびＶＮＴＲマーカーのどちらも、多数を発生させ、かつアッセイするのはコストと時間がかかる。
【０２２３】
単一ヌクレオチド多型または２対立遺伝子マーカーをＲＦＬＰおよびＶＮＴＲと同一の手法で使用することができるが、いくつかの利点が得られる。ＳＮＰはヒトゲノムにおいて密な間隔であり、最も高い頻度の変異のタイプを表す。１０7を超える推定数の部位が、ヒトゲノムの３×１０9塩基対に沿って点在する。したがって、ＳＮＰはＲＦＬＰまたはＶＮＴＲマーカーよりも高い頻度で、かつ高い均一性で生じ、それは、かかるマーカーが対象の遺伝子座の近傍で見出される高い可能性があることを意味している。ＳＮＰはＶＮＴＲマーカーよりも可変性が低いが、変異的には安定性が高い。
【０２２４】
また、本発明の２対立遺伝子マーカーなど、特徴付けられた単一ヌクレオチド多型の異なる形は、区別するのが容易である場合が多く、したがって日常的に容易に分類することができる。２対立遺伝子マーカーは単一ヌクレオチドをベースとする対立遺伝子を有し、それらはわずか２つの共通の対立遺伝子を有し、それによって、高度に並行して検出し、自動スコアリングすることが可能となる。本発明の２対立遺伝子マーカーは、多数の個体の迅速な、高いハイスループットのゲノタイピングの可能性を提供する。
【０２２５】
２対立遺伝子マーカーはゲノムにおいて密な間隔であり、十分に情報価値があり、多数でアッセイすることができる。これらの利点を兼ね備えた効果によって、遺伝子研究において２対立遺伝子マーカーが非常に価値あるものとなる。２対立遺伝子マーカーは、家系における連鎖研究、対立遺伝子共有法において、集団における連鎖不平衡の研究において、症例対照集団の、または形質ポジティブおよび形質ネガティブの集団の関連研究において使用することができる。本発明の重要な態様は、２対立遺伝子マーカーによって、関連研究を行い、複合形質に関与する遺伝子を同定することが可能となることである。関連研究では、血縁関係のないケース集団およびコントロール集団におけるマーカー対立遺伝子の頻度を調べ、一般に、多遺伝子性もしくは散発性形質の検出に用いられる。関連研究は一般的な集団内で行うことが可能であり、罹患家系における関連する個体について行われる研究（連鎖研究）に限定されない。疾患との直接的な関連または治療に対する反応に対して、異なる遺伝子における２対立遺伝子マーカーを並行してスクリーニングすることができる。この同義遺伝子の手法は、特定の表現型に対する同義遺伝子因子の相乗効果、薬物反応、散発性形質、または複合遺伝子病因を調べるのに必要な統計能力を提供するため、様々なヒト遺伝学の研究の強力なツールである。
［本発明の候補遺伝子］
異なる手法を用いて、関連研究：ゲノムワイドな関連研究、候補領域の関連研究および候補遺伝子の関連研究を行うことができる。ゲノムワイドな関連研究は、均等に配置された遺伝子マーカーのスクリーニングおよび全ゲノムを網羅することに依拠する。候補遺伝子のアプローチは、対象の形質に関連する生物学的経路に潜在的に関与する遺伝子において特異的に位置する遺伝子マーカーの研究に基づく。本発明において、ＣａｎＩｏｎは候補遺伝子である。形質の生物学と関係する一部の情報が利用可能である場合には、候補遺伝子解析は明らかに、特定の形質に関連する遺伝子および遺伝子多型の同定への近道のアプローチを提供する。しかしながら、本出願で開示される２対立遺伝子マーカーのすべてを、ゲノムワイドな関連研究の一部として、または候補領域の関連研究の一部として使用することが可能であり、かかる使用は、本発明および特許請求の範囲に明確に企図されることを留意されたい。
［ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーおよびそれに関連するポリヌクレオチド］
本発明は、ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーにも関連する。本明細書で使用される「ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカー」という用語は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子と連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーのセットに関する。ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーという用語は、Ａ１〜Ａ１７と表される２対立遺伝子マーカーを含む。
【０２２６】
本発明の２対立遺伝子マーカーの一部を表２に開示する。それらは、関連する配列番号１〜４および配列番号６の特徴において一塩基多型としても記述される。１つのＣａｎＩｏｎ２対立遺伝子マーカーの多型塩基を含有する核酸を増幅させるプライマー対を実施例２の表１に列挙する。１７個のＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカー、Ａ１〜Ａ１７は、ＣａｎＩｏｎのゲノム配列に位置する。２対立遺伝子マーカーＡ１２およびＡ１６は、ＣａｎＩｏｎのエクソンに位置する。２対立遺伝子マーカーＡ１８は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子をフランキングする。
【０２２７】
本発明は、ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーの多型塩基を含む、精製かつ／または単離されたヌクレオチド配列にも関する。好ましい実施形態において、２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１８およびその補体からなる群から選択される。その配列は、８〜１０００ヌクレオチドの長さを有し、好ましくは、配列番号１〜４および配列番号６からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその変異体またはそれに相補的な配列の少なくとも８，１０，１２，１５，１８，２０，２５，３５，４０，５０，６０，７０，８０，１００，２５０，５００または１０００個の隣接ヌクレオチドを含む。これらのヌクレオチド配列は、考えられる２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子１または対立遺伝子２のいずれかの多型塩基を含む。任意に、前記２対立遺伝子マーカーは、前記ポリヌクレオチドの中心から６、５、４、３、２、もしくは１ヌクレオチド内、または前記ポリヌクレオチドの中心にある。任意に、前記隣接スパンの３’末端は、前記ポリヌクレオチドの３’末端に存在する。任意に、２対立遺伝子マーカーは、前記ポリヌクレオチドの３’末端に存在する。任意に、前記ポリヌクレオチドはさらに、標識を含む。任意に、前記ポリヌクレオチドを固体支持体に付着させることができる。更なる実施形態において、上記で定義されるポリヌクレオチドは単独で、またはいずれかの組み合わせで使用することができる。
【０２２８】
本発明は、８〜１０００個の隣接ヌクレオチド、および／または好ましくは、配列番号１〜４および配列番号６からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはその変異体またはそれに相補的な配列の少なくとも８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、３５、４０、５０、６０、７０、８０、１００、２５０、５００または１０００個の隣接ヌクレオチドを含む、精製かつ／または単離されたヌクレオチド配列にも関する。任意に、前記ポリヌクレオチドは、前記配列におけるＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーの上流にある少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、１００、２５０、５００、もしくは１０００ヌクレオチド内または２、４、６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、１００、２５０、５００、もしくは１０００ヌクレオチドに位置する。任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１７からなる群から選択され；任意に、ポリヌクレオチドの３’末端は、前記配列におけるＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーの上流にある少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、１００、２５０、５００、もしくは１０００ヌクレオチド内または２、４、６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、１００、２５０、５００、もしくは１０００ヌクレオチドに位置する。任意に、前記ポリヌクレオチドの３’末端は、前記配列におけるＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーの上流の１ヌクレオチドに位置する。任意に、前記ポリヌクレオチドはさらに、標識を含む。任意に、前記ポリヌクレオチドを固体支持体に付着させることができる。更なる実施形態において、上記で定義されたポリヌクレオチドを単独、またはいずれかの組み合わせで使用することができる。
【０２２９】
好ましい実施形態において、表２に示す２対立遺伝子マーカーの１つの多型塩基を含む配列は、表１に列挙されるアンプリコンとして示される配列またはその変異体またはそれに相補的な配列の核酸からなる群から選択されるポリヌクレオチドの隣接スパンを有する、そのポリヌクレオチドからなる、において構成される、またはそのポリヌクレオチドを含むヌクレオチド配列からなる群から選択される。
【０２３０】
本発明はさらに、ＣａｎＩｏｎタンパク質をコードする核酸に関係し、前記核酸は、Ａ１２およびＡ１６およびその補体からなる群から選択される２対立遺伝子マーカーの多型塩基を含む。
【０２３１】
本発明は、ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーにおける１つまたは複数のヌクレオチドの同一性を決定するのに使用される、いずれかのポリヌクレオチドの使用、またはいずれかのポリヌクレオチドもまた包含する。さらに、ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーでの１つまたは複数のヌクレオチドの同一性を決定するのに使用される本発明のポリヌクレオチドは、この開示に、または以下に記述される、単独または組み合わせて指定される更なる制限を有するポリヌクレオチドを包含する。任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１８およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１７およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１２およびＡ１６およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に前記ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される配列を含み；任意に、前記ポリヌクレオチドは、本明細書に記述されるいずれかのポリヌクレオチドからなる、またはから本質的になり；任意に、前記決定は、ハイブリダイゼーションアッセイ、シーケンシングアッセイ、マイクロシーケンシングアッセイ、または酵素に基づくミスマッチ検出アッセイにおいて行われ；任意に、前記ポリヌクレオチドは、固体支持体、アレイまたはアドレス指定可能なアレイに付着され；任意に、前記ポリヌクレオチドは標識化される。好ましいポリヌクレオチドは、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性を検出するためにハイブリダイゼーションアッセイに使用することが可能である。ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性を決定するために、シークエンシングまたはマイクロシークエンシングアッセイに、他の好ましいポリヌクレオチドを使用することが可能である。第３の好ましいポリヌクレオチドは、ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性を決定するために、酵素に基づくミスマッチ検出アッセイに使用することが可能である。第４の好ましいポリヌクレオチドは、ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーを含むポリヌクレオチドのセグメントを増幅するのに使用することができる。任意に、上述のポリヌクレオチドのいずれも、固体支持体、アレイ、またはアドレス指定可能なアレイに付着させることが可能であり；任意に、前記ポリヌクレオチドを標識化することができる。
【０２３２】
さらに、本発明は、ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチドのセグメントを増幅するためのいずれかのポリヌクレオチド、またはそのセグメントを増幅する際に使用されるいずれかのポリヌクレオチドを包含する。さらに、ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーを含むヌクレオチドのセグメントを増幅する際に使用される本発明のポリヌクレオチドは、この開示に、または以下に記述される、単独または組み合わせて指定される更なる制限を有するポリヌクレオチドを包含し；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１８およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１７およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１２およびＡ１６およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される配列を含み；任意に、前記ポリヌクレオチドは、本明細書に記述されるいずれかのポリヌクレオチドからなる、またはから本質的になり；任意に、前記増幅は、ＰＣＲまたはＬＣＲによって行われる。任意に、前記ポリヌクレオチドは、固体支持体、アレイ、またはアドレス指定可能なアレイに付着される。任意に、前記ポリヌクレオチドを標識化することが可能である。
【０２３３】
本発明の２対立遺伝子マーカーを含むポリヌクレオチドの増幅またはシークエンシング反応用のプライマーは、当技術分野で公知のいずれかの方法によって開示された配列から設計することができる。プライマーの好ましいセットは、配列番号１〜４および配列番号６からなる群から選択される配列またはそれに相補的は配列またはその変異体と同一性の隣接スパンの３’末端が、プライマーの３’末端に存在するように作製される。かかる構造は、プライマーの３’末端の選択された核酸配列とハイブリダイズすることを可能にし、増幅またはシークエンシング反応に対するプライマーの効率を劇的に増大する。対立遺伝子特異的プライマーは、２対立遺伝子マーカーの多型塩基が隣接スパンの３’末端に位置し、かつ隣接スパンがプライマーの３’末端に存在するように設計される。かかる対立遺伝子特異的プライマーは、２対立遺伝子マーカーに存在する２つの対立遺伝子の１つを含有する核酸と共にそれらが使用される限り、増幅またはシーケンシング反応を選択的にプライミングする傾向がある。本発明のプライマーの３’末端は、前記配列におけるＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーの上流にある少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、１００、２５０、５００、もしくは１０００ヌクレオチド内または少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１５、１８、２０、２５、５０、１００、２５０、５００、もしくは１０００ヌクレオチドに、またはシーケンシング、増幅での使用目的に適切である他のいずれかの位置、または新規な配列もしくはマーカーの位置に位置する。このように、好ましい増幅用プライマーの別のセットは、配列番号１〜４および配列番号６からなる群から選択される配列またはそれに相補的は配列またはそれの変異体における８〜５０ヌクレオチドの隣接スパンから本質的になる単離されたポリヌクレオチドを含み、前記スパンの３’末端は、前記ポリヌクレオチドの３’末端に位置し、かつ前記ポリヌクレオチドの３’末端は、前記配列におけるＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーの上流に位置する。好ましくは、それらの増幅用プライマーは、配列Ｂ１〜Ｂ１７およびＣ１〜Ｃ１７からなる群から選択される配列を含む。ＣａｎａＩｏｎの２対立遺伝子マーカーの上流１ヌクレオチドに位置するそれらの３’末端を有するプライマーは、マイクロシーケンシングアッセイで特別な有用性を有する。好ましいマイクロシーケンシングプライマーを表４に示す。任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１８およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１７、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１６、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、マイクロシーケンシングプライマーは、ヌクレオチド配列Ｄ１〜Ｄ１８およびＥ１〜Ｅ１８からなる群から選択される。
【０２３４】
本発明のプローブは、当技術分野で公知のいずれかの方法、特に本明細書で開示されているマーカーが存在する場合に、試験することを可能にする方法に対して、開示されている配列から設計することが可能である。プローブの好ましいセットは、それらが２対立遺伝子マーカーの一方の対立遺伝子に特異的に結合するが、いずれかの特定のセットのアッセイ条件下では他方の対立遺伝子に特異的に結合しないように、当技術分野で公知のいずれかの手法において本発明のハイブリダイゼーションアッセイで使用するために設計される。好ましいハイブリダイゼーションプローブは、考えられる２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子１または対立遺伝子２の多型塩基を含む。任意に、前記２対立遺伝子のマーカーは、ハイブリダイゼーションプローブの中心から６、５、４、３、２、もしくは１ヌクレオチド内に、または前記プローブの中心に位置する。好ましい実施形態では、プローブは、配列Ｐ１〜Ｐ１８のそれぞれおよびそれに相補的な配列のそれぞれからなる群から選択される。
【０２３５】
本発明のポリヌクレオチドは、配列表に列挙されている多型塩基を取り囲む正確なフランキング配列を有することに限定されないことに留意されたい。むしろ、２対立遺伝子マーカーを取り囲むフランキング配列は、意図される用途と適合する程度に延長するか、短縮することが可能であり、本発明はかかる配列を特に企図することを理解されよう。隣接スパンの外側のフランキング領域は、ヒト対象で実際に生じる天然のフランキング配列に相同的である必要はない。ヌクレオチドの意図する用途と適合する、いずれかのヌクレオチド配列を付加することが特に企図される。
【０２３６】
プライマーおよびプローブを標識化するか、または「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」に記述されているように固体支持体上に固定化することが可能である。
【０２３７】
固体支持体に付着される本発明のポリヌクレオチドは、この開示に、または以下に記述される、単独またはいずれかの組み合わせで指定される更なる制限を有するポリヌクレオチドを包含し；任意に、前記ポリヌクレオチドは、個々に、または本発明の少なくとも２、５、８、１０、１２、１５、２０、もしくは２５個の別個のポリヌクレオチドのグループで、単一固体支持体に付着されるように指定することが可能である。任意に、本発明のポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドを、本発明のポリヌクレオチドと同じ固体支持体に付着させてもよい。任意に、複数のポリヌクレオチドが固体支持体に付着される場合、それらは、ランダムな位置に、または順序付きアレイで付着される。任意に、前記順序付きアレイはアドレス指定可能である。
【０２３８】
本発明は、ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性を決定することにより試験対象をゲノタイピングするために必要な試薬および説明書の一部またはすべてと共に、本発明の１つまたは複数種のポリヌクレオチドを備える、診断キットもまた包含する。そのキットは、限定されないが、シーケンシングアッセイ法、マイクロシーケンシングアッセイ法、ハイブリダイゼーションアッセイ法、または酵素に基づくミスマッチ検出アッセイ法を含む当業者に公知のいずれかの方法による、マーカー位置におけるヌクレオチドの同一性の決定を提供する。
［２対立遺伝子マーカーを新規に同定する方法］
ポリヌクレオチドプローブとのディファレンシャルハイブリダイゼーション、ゲル電気泳動により測定される移動度の変化の検出または増幅された核酸の直接シーケンシングなど、様々な方法のいずれかを使用して、単一ヌクレオチド多型に対してゲノム断片をスクリーニングすることができる。２対立遺伝子マーカーを同定するための好ましい方法は、適切な数の血縁関係のない個体からのゲノムＤＮＡ断片を比較によりシーケンシングすることを含む。
【０２３９】
第１の実施形態において、血縁関係のない個体からのＤＮＡサンプルを共にプールし、それに続いて、対象のゲノムＤＮＡを増幅し、シーケンスする。このようにして得られたヌクレオチド配列を次に分析して、有意な多型を同定する。この方法の主な利点の１つは、ＤＮＡサンプルのプールによって、行わなければならないＤＮＡ増幅反応およびシーケンシング反応の回数が実質的に減少するという事実にある。さらに、この方法は十分高感度であり、そのため、それによって得られた２対立遺伝子マーカーは通常、その頻度の低い対立遺伝子の十分な頻度が、関連研究を行うのに有用であることを実証する。
【０２４０】
第２の実施形態では、ＤＮＡサンプルをプールせず、このため個々に増幅かつシークエンスする。この方法は通常、候補遺伝子内で関連研究を実施するために２対立遺伝子マーカーを同定する必要がある場合に好ましい。プロモーター領域もしくはエクソン領域などの高い関連性の遺伝子領域を２対立遺伝子マーカーに対してスクリーニングすることが好ましい。この方法を用いて得られた２対立遺伝子マーカーは、例えば、その頻度の低い対立遺伝子の頻度が約１０％未満である場合には、関連研究を実施するには情報価値の程度が低い。しかしながら、かかる２対立遺伝子マーカーは、関連研究を行うのに十分に情報価値があると考えられ、さらに、本発明の遺伝分析研究において低い情報価値の２対立遺伝子マーカーを含むことによって、場合によっては、それらの浸透度に応じて、稀な変異である偶然の変異を直接同定することが可能となるということがさらに理解されよう。
【０２４１】
本発明の２対立遺伝子マーカーを同定するために、本発明によって使用される好ましい方法の種々のパラメーターを以下に説明する。
［ゲノムＤＮＡサンプル］
本発明の２対立遺伝子マーカーが産生されるゲノムＤＮＡサンプルは、公知の民族的背景の異質集団に相当する血縁関係のない個体から得ることが好ましい。ＤＮＡサンプルを得る個体の数は、好ましくは約１０〜約１０００、好ましくは約５０〜約２００個体と実質的に変動する。通常、できる限り多くのマーカーを同定し、かつ統計学的に有意な結果を得るために、所定の集団において十分な多型多様性を有するように、少なくとも１００個体からＤＮＡサンプルを回収することが好ましい。
【０２４２】
解析にかけられるゲノムＤＮＡのソースに関しては、特定の制限無く、いずれかの試験サンプルを予測することができる。これらの試験サンプルには、本明細書に記述される本発明の方法によって試験することができる生体材料が含まれ、ヒトおよび動物の体液、例えば全血、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液および呼吸器、腸管および尿生殖路の種々の外分泌、涙、唾液、乳汁、白血球、骨髄腫等；細胞培養液の上清などの生物体液；腫瘍および非腫瘍組織およびリンパ節組織を含む固定組織標本；骨髄穿刺および固定細胞標本が含まれる。本発明で使用されるゲノムＤＮＡの好ましいソースは、各ドナーの末梢静脈血に由来する。
生体サンプルからゲノムＤＮＡを作製する技術は、当業者にはよく知られている。好ましい実施形態の詳細を実施例１に示す。当業者であれば、プールされた、またはプールされていないＤＮＡサンプルを増幅することを選択できる。
［ＤＮＡ増幅］
ゲノムＤＮＡのサンプルにおける２対立遺伝子マーカーの同定は、ＤＮＡ増幅方法を使用することによって容易になる。増幅段階のために、ＤＮＡサンプルをプールすることができるし、またはしなくてもよい。ＤＮＡ増幅技術は当業者にはよく知られている。
【０２４３】
本発明のコンテクストで使用できる増幅技術には、限定されないが、ＥＰ−Ａ−３２０  ３０８、ＷＯ９３２０２２７およびＥＰ−Ａ−４３９  １８２に記載のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ，ＲＴ−ＰＣＲ）、Guatelli J.C., 等 (1990)およびCompton J. (1991)に記載の核酸配列に基づく核酸配列ベース増幅（ＮＡＢＳＡ）などの技術、欧州特許出願第５４４６１０号に記載のＱ−β増幅、Walker 等 (1996)およびＥＰ  Ａ  ６８４  ３１５に記載の鎖置換増幅および、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９３２２４６１に記載の標的仲介増幅が含まれる。
【０２４４】
ＬＣＲおよびギャップＬＣＲは指数関数的増幅技術であり、どちらも、ＤＮＡ分子にアニールした隣接プライマーを結合させるＤＮＡリガーゼに依存する。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）では、２つの一次（第１および第２）プローブおよび２つの二次（第３および第４）プローブを含むプローブ対が使用され、それらすべてがモル過剰量で標的に使用される。第１プローブは、標的の鎖の第１セグメントとハイブリダイズし、第２プローブは、標的の鎖の第２セグメントとハイブリダイズし、第１および第２セグメントは、一次プローブが５’リン酸エステル−３’ヒドロキシル関係において互いに隣接するように、かつリガーゼが２つのプローブを共有結的に融合させるか、または２つのプローブを融合産物にライゲートすることができるように隣接している。さらに、第３（二次）プローブは、第１プローブの一部とハイブリダイズすることができ、第４（二次）プローブは、同様の隣接形式で第２プローブの一部とハイブリダイズすることができる。当然、標的が最初に二本鎖である場合には、二次プローブは、最初の場合には標的補体ともまたハイブリダイズするだろう。一次プローブのライゲーションした鎖が標的の鎖から分離されると、ライゲーションして相補的な二次ライゲーション産物を形成することができる、第３および第４プローブとハイブリダイズするだろう。ライゲーション産物が標的またはその補体に対して機能的に同等であることを理解することは重要である。ハイブリダイゼーションおよびライゲーションの反復サイクルによって、標的配列の増幅が達成される。多重ＬＣＲの方法もまた記述されている（ＷＯ９３２０２２７）。ギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）は、プローブが隣接せず、２塩基ないし３塩基ごとに離れているＬＣＲの種類である。
【０２４５】
ｍＲＮＡの増幅の場合、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いてポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うこと；または米国特許第５，３２２，７７０号に記述されているように両方の段階に単一の酵素を使用すること、またはMarshall 等(1994)によって記述されるように非対称性ギャップＬＣＲ（ＲＴ−ＡＧＬＣＲ）を使用することは本発明の範囲内である。ＡＧＬＣＲは、ＲＮＡの増幅を可能にするＧＬＣＲの改良である。
【０２４６】
ＰＣＲ技術は、本発明で使用するのに好ましい増幅技術である。様々なＰＣＲ技術が当業者には知られている。ＰＣＲ技術を調べるために、White (1997) および「PCR Methods and Applications」という題名の出版物(1991, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照のこと。これらのＰＣＲ方法のそれぞれにおいて、増幅すべき核酸配列のいずれかの側のＰＣＲプライマーを、ｄＮＴＰおよびＴａｑポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、もしくはＶｅｎｔポリメラーゼなどの耐熱性ポリメラーゼと共に、適切に作製された核酸サンプルに添加する。サンプル中の核酸が変性し、ＰＣＲプライマーは、サンプル中の相補的な核酸配列に特異的にハイブリダイズする。そのハイブリダイズしたプライマーは伸長する。その後、変性、ハイブリダイゼーション、および伸長の別のサイクルが開始される。そのサイクルを複数回繰り返して、プライマー部位間の核酸配列を含有する増幅断片を作製する。ＰＣＲはさらに、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，６８３，２０２号；同第４，９６５，１８８号を含むいくつかの特許に記述されており、それらの開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４７】
ＰＣＲ技術は、新規な２対立遺伝子マーカーを同定するために使用されるに好ましい増幅技術である。本発明の目的に適したＰＣＲ反応の一般的な例を実施例２に示す。
【０２４８】
本発明の態様の１つは、好ましくはＰＣＲを用いた、試験サンプルにおけるヒトＣａｎＩｏｎ遺伝子、特に配列番号１〜３のゲノム配列の断片、または配列番号４のｃＤＮＡ配列、またはその断片もしくは変異体の増幅方法である。
【０２４９】
この方法は以下の段階：
ａ）上述されており、かつ増幅するべきポリヌクレオチド領域のいずれかの側に位置する、１対の増幅用プライマーを含む増幅反応試薬と、試験サンプルとを接触させる段階；
ｂ）任意に、増幅産物を検出する段階；を含む。
【０２５０】
本発明は、試験サンプルにおけるＣａｎＩｏｎ遺伝子配列、特に配列番号１〜３のゲノム配列の一部または配列番号４のｃＤＮＡ配列の一部、またはその変異体を増幅するためのキットにもまた関係し、前記キットは：
ａ）増幅すべきＣａｎＩｏｎ遺伝子のいずれかの側に位置する１対のポリヌクレオチドプライマー；
ｂ）任意に、増幅反応を行うのに必要な試薬；を備える。
【０２５１】
上記の増幅方法およびキットの一実施形態において、増幅産物は、増幅された領域に相補的な配列を有する標識プローブとのハイブリダイゼーションによって検出される。上記の増幅方法およびキットの他の実施形態において、プライマーは、Ｂ１〜Ｂ１７、Ｃ１〜Ｃ１７、Ｄ１〜Ｄ１８、およびＥ１〜Ｅ１８のヌクレオチド配列からなる群から選択される配列を含む。
【０２５２】
本発明の第１の実施形態において、２対立遺伝子マーカーは、本発明者らによって産生されたゲノム配列情報を用いて同定される。シーケンスされたゲノムＤＮＡ断片を使用して、５００ｂｐ断片を増幅するためにプライマーを設計する。これらの５００ｂｐ断片をゲノムＤＮＡから増幅し、２対立遺伝子マーカーについて調査する。ＯＳＰソフトウェアを用いて、プライマーを設計することが可能である（Hillier L. および Green P., 1991)。すべてのプライマーが、特定の標的塩基の上流に、シーケンシングプライマーとしての役割を果たす共通のオリゴヌクレオチド末端（tale）を含有する。これらの目的に使用することができるプライマー伸長法は、当業者にはよく知られている。
【０２５３】
ＣａｎＩｏｎ遺伝子をコードするゲノム配列の増幅に有用な好ましいプライマーは、遺伝子のプロモーター、エクソンおよびスプライス部位に焦点を合わせる。２対立遺伝子マーカーは、遺伝子のこれらの機能領域に位置する場合、最終的な偶然の変異である高い可能性を表す。本発明の好ましい増幅用プライマーには、実施例２、表１にさらに詳述されるＢ１〜Ｂ１７、Ｃ１〜Ｃ１７のヌクレオチド配列が含まれる。
［増幅されたゲノムＤＮＡのシーケンシングおよび単一ヌクレオチド多型の同定］
次いで、当業者に公知であり、かつ利用可能ないずれかの方法を用いて、上述のように産生された増幅産物をシーケンスする。ジデオキシ仲介法（サンガー法）またはマクサム・ギルバート法を用いてＤＮＡをシーケンスする方法は、当業者には広く知られている。かかる方法は、例えばSambrook 等 (1989)に開示されている。代替のアプローチは、Chee 等 (1996)に記述されているように、高密度ＤＮＡプローブアレイとのハイブリダイゼーションを含む。
【０２５４】
増幅されたＤＮＡは、ダイプライマー・サイクルシーケンシングプロトコルを用いて、自動化ジデオキシターミネーター・シーケンシング反応にかけることが好ましい。シーケンシング反応の産物はシーケンシング用ゲル上に流され、ゲル画像解析を用いて、その配列が決定される。多型検索は、同じ位置で生じる、異なる塩基から得られる電気泳動パターンの重なり合ったピークの存在に基づく。各ジデオキシターミネーターは異なる蛍光分子で標識されるため、２対立遺伝子部位に相当する２つのピークは、配列上の同じ位置における２つの異なるヌクレオチドに相当する、異なる色を表す。しかしながら、２つのピークの存在は、背景のノイズのために人為的結果であり得る。かかる人為的結果を排除するために、２つのＤＮＡ鎖をシーケンスし、そのピーク間の比較を行う。多型配列として記録するために、その多型は、両方の鎖で検出されなければならない。
【０２５５】
上記の手順によって、２対立遺伝子マーカーを含有するそれらの増幅産物を同定することができる。１００個体のシーケンシングプールによって検出される２対立遺伝子多型の頻度の検出限界は、公知の２対立遺伝子頻度のシーケンシングプールによって検証されるように、マイナーな対立遺伝子に対して約０．１である。しかしながら、プーリング法（pooling method)によって検出される９０％を超える２対立遺伝子多型は、マイナーな対立遺伝子に対して０．２５よりも高い頻度を有する。したがって、この方法によって選択された２対立遺伝子マーカーは、マイナー対立遺伝子に対して少なくとも０．１の頻度を有し、メジャーな対立遺伝子に対して０．９未満の頻度を有する。好ましくはマイナー対立遺伝子に対して少なくとも０．２、メジャー対立遺伝子に対して０．８未満、さらに好ましくはマイナー対立遺伝子に対して少なくとも０．３、メジャー対立遺伝子に対して０．７未満、このため、０．１８よりも高いヘテロ接合率、好ましくは０．３２よりも高い、さらに好ましくは０．４２よりも高い接合率である。
【０２５６】
他の実施形態において、２対立遺伝子マーカーは、個々のＤＮＡサンプルをシーケンスすることによって検出され、かかる２対立遺伝子マーカーのマイナー対立遺伝子の頻度は０．１未満である。
［本発明の２対立遺伝子マーカーの確認］
両方の対立遺伝子が集団に存在することを確認することによって、遺伝子マーカーとしてのそれらの有用性について、多型を評価する。２対立遺伝子マーカーの確認は、本発明の方法により個体のグループをゲノタイピングし、両方の対立遺伝子が存在することを実証することによって達成される。マイクロシーケンシングが、対立遺伝子をゲノタイピングするのに好ましい方法である。ゲノタイピング段階による確認は、グループにおける各個体に由来する個々のサンプルで、または複数の個体に由来するプールされたサンプルをゲノタイピングすることによって行われる。その個体が問題の対立遺伝子に対してヘテロ接合性である場合には、そのグループは１個体と同程度に小さい場合がある。好ましくは、そのグループは、少なくとも３個体を含有し、さらに好ましくはそのグループは５個体または６個体を含有し、その結果単一確認試験では、試験される２対立遺伝子マーカーがさらに多く確認される結果となる可能性が高いだろう。しかしながら、確認試験が小さなグループで行われる場合、サンプリング誤差として、試験された個体のいずれも２つの対立遺伝子の一方を保有していない場合には、偽陰性の結果を生じる可能性があることに留意されたい。このように、その確認プロセスは、配列における特定の位置に本当の２対立遺伝子マーカーが存在することを実証するのに比べて、特定の最初の結果が人為的結果であることを実証するのには有用性が低い。本発明のゲノタイピング、ハプロタイピング、関連研究、および相互作用研究法のすべては任意に、確認された２対立遺伝子マーカーを用いて単独で行われる。
［本発明の２対立遺伝子マーカーの頻度の評価］
確認された２対立遺伝子マーカーをさらに、２対立遺伝子マーカー部位における頻度の最も低い対立遺伝子の頻度を決定することによって、遺伝子マーカーとしてのそれらの有用性について評価する。頻度の最も低い対立遺伝子の頻度が高いほど、２対立遺伝子マーカーの関連および相互作用研究での有用性は高くなる。頻度の最も低い対立遺伝子の決定は、本発明の方法によって個体のグループをゲノタイピングし、どちらの対立遺伝子も存在することを実証することによって行われる。ゲノタイピング段階の頻度の決定は、グループ中の各個体から得られる個々のサンプル上で、または複数の個体から得られるプールされたサンプルをゲノタイピングすることによって行うこともできる。そのグループは、全体として集団を代表するのに十分に大きくなければならない。好ましくは、そのグループは少なくとも２０個体を含有し、さらに好ましくは、そのグループは少なくとも５０個体を含有し、最も好ましくは、そのグループは少なくとも１００個体を含有する。当然グループが大きいほど、サンプリング誤差が減るため、頻度決定の精度が高くなる。頻度の最も低い対立遺伝子の頻度が３０％以上である２対立遺伝子マーカーは、「高品質の２対立遺伝子マーカー」と呼ばれる。本発明のゲノタイピング、ハプロタイピング、関連研究、および相互作用研究法のすべては任意に、高品質の２対立遺伝子マーカーを用いて単独で行われる。
〈２対立遺伝子マーカーに対して個体をゲノタイピングする方法〉
本発明の１つまたは複数の２対立遺伝子マーカーに対して生体サンプルをゲノタイピングする方法が提供され、それらすべてはインビトロで行われる。ゲノタイピングのかかる方法は、当技術分野で公知のいずれかの方法によってＣａｎＩｏｎ２対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性を決定することを含む。これらの方法は、関連研究における症例対照集団、ならびに所定の形質と関連することが知られている２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子検出のコンテクストにおいて個体をゲノタイピングする際に使用されることが見出されており、そのケースでは、個体のゲノムに存在する２対立遺伝子マーカーの両方のコピーが決定され、その結果、特定の対立遺伝子に対してホモ接合性もしくはヘテロ接合性として分類される。
【０２５７】
これらのゲノタイピング法は、単一個体から得られた核酸サンプルまたはプールされたＤＮＡサンプルで行うことができる。
【０２５８】
２対立遺伝子マーカーを同定するために、上述の方法と同様な方法を用いて、または以下にさらに記述する方法などの他のゲノタイピング法を用いて、ゲノタイピングを行うことができる。好ましい実施形態では、異なる個体から増幅されたゲノム断片の配列の比較を用いて、新規な２対立遺伝子マーカーを同定し、診断および関連研究用途において公知の２対立遺伝子マーカーをゲノタイピングするために、マイクロシーケンシングを用いる。
【０２５９】
一実施形態において、本発明は、生体サンプル中のＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーまたはその補体におけるヌクレオチドの同一性を決定することを含むゲノタイピングの方法を包含し；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１８、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１２およびＡ１６、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記生体サンプルは、単一対象に由来するものであり；任意に、前記２対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性が、個体のゲノムに存在する前記２対立遺伝子マーカーの両方のコピーに対して決定され；任意に、前記生体サンプルが、複数の対象に由来するものであり；任意に、本発明のゲノタイピング法は、この開示に、または以下に記述される、単独またはいずれかの組み合わせで指定される更なる制限を有する方法を包含し；任意に、前記方法はインビトロで行われ；任意に、前記決定段階前に、２対立遺伝子マーカーを含む前記配列の一部を増幅することをさらに含み；任意に、前記増幅が、ＰＣＲ、ＬＣＲ、または複製開始点含有する組換えベクターおよび宿主細胞中の前記断片の複製によって行われ；任意に、前記決定が、ハイブリダイゼーションアッセイ、シーケンシングアッセイ、マイクロシーケンシングアッセイ、または酵素に基づくミスマッチ検出アッセイによって行われる。
［ゲノタイピングに使用される核酸のソース］
精製または未精製状態の核酸のいずれかのソースを、所望の特定の核酸配列を含有するか、または含有すると考えられるという条件で、開始核酸として用いることができる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、上述のように細胞、組織、体液等から抽出することができる。本発明のゲノタイピング法で使用される核酸は、いずれかの哺乳類のソースから得ることができるが、核酸サンプルが採取される試験対象および個体は一般にヒトであると理解される。
［２対立遺伝子マーカーを含有するＤＮＡ断片の増幅］
本発明の１つまたは複数の２対立遺伝子マーカーを含有するヌクレオチドのセグメントを増幅するための方法およびポリヌクレオチドを提供する。２対立遺伝子マーカーを含有するＤＮＡ断片の増幅は、様々な方法において、および様々な目的で用いられ、ゲノタイピングに制限されないことは理解されよう。それにもかかわらず、すべてではないが、多くのゲノタイピング法では、対象の２対立遺伝子マーカーを保有するＤＮＡ領域を先に増幅する必要がある。かかる方法は、２対立遺伝子マーカーに及ぶ、またはそれの遠位もしくは近位に位置する部位および配列を含む配列の濃度または総数を特異的に増大する。診断アッセイは、本発明の２対立遺伝子マーカーを保有するＤＮＡセグメントの増幅にも依拠する。ＤＮＡの増幅は、当技術分野で公知のいずれかの方法によって達成される。増幅技術は、「ＤＮＡ増幅」という題名のセクションに記述されている。
【０２６０】
これらの増幅法の一部は特に、単一ヌクレオチド多型の検出に適しており、以下にさらに記述されているように、標的配列の同時増幅および多型ヌクレオチドの同定が可能となる。
【０２６１】
上述の２対立遺伝子マーカーの同定によって、本発明の２対立遺伝子マーカーを含有するＤＮＡ断片を増幅するためにプライマーとして使用することができる、適切なポリヌクレオチドを設計することが可能となる。本明細書で記述される新規な２対立遺伝子マーカーを発見するために最初に使用されるプライマー、または本発明の２対立遺伝子マーカーを含有するＤＮＡ断片の増幅を可能にするプライマーの任意のセットを用いて、増幅を行うことができる。
【０２６２】
一部の実施形態において、本発明は、本発明の１つまたは複数の２対立遺伝子マーカーを含有するＤＮＡ断片を増幅するためのプライマーを提供する。好ましい増幅用プライマーを実施例２に列挙する。列挙するプライマーは単に例示的なものであり、本発明の１つまたは複数の２対立遺伝子マーカーを含有する増幅産物を産生する他のセットもまた有用であることは理解されよう。
【０２６３】
プライマーの間隔によって、増幅すべきセグメントの長さが決定される。本発明のコンテクストにおいて、２対立遺伝子マーカーを保有する増幅されたセグメントは、少なくとも約２５ｂｐ〜３５ｋｂｐの範囲のサイズである。２５〜３０００ｂｐの増幅断片が一般的であり、５０〜１０００ｂｐの断片が好ましく、１００〜６００ｂｐの断片が非常に好ましい。２対立遺伝子マーカーの増幅用プライマーは、マーカーを保有するいずれかのＤＮＡ断片の特異的な増幅を可能にする、いずれかの配列であることは理解されよう。増幅用プライマーは、「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」に記述するように、標識化するか、または固体支持体上に固定化することが可能である。
［２対立遺伝子マーカーに対してＤＮＡサンプルをゲノタイピングする方法］
当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて、２対立遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチドを同定することができる。検出すべき２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子が本発明において同定かつ指定されているため、多数の技術のいずれかを使用することによって、当業者には検出が簡単であることが分かるだろう。多くのゲノタイピング法では、対象の２対立遺伝子マーカーを保有するＤＮＡ領域を予め増幅する必要がある。標的またはシグナルの増幅は、現在のところ好ましい場合が多いが、増幅を必要としない超高感度検出法もまた、本発明のゲノタイピング法によって包含される。２対立遺伝子多型を検出するのに使用できる、当業者にはよく知られている方法には、従来のドットブロット分析、Orita 等 (1989)により記述されている１本鎖高次構造多型解析、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、ヘテロ二本鎖分析、ミスマッチ切断検出、およびSheffield 等 (1991), White 等 (1992), Grompe 等 (1989および1993)に記述されている従来の他の技術などの方法が含まれる。特定の多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定する別の方法では、米国特許第４，６５６，１２７号に記載されている、特定化されたエキソヌクレアーゼ耐性ヌクレオチド誘導体が用いられる。
【０２６４】
好ましい方法は、シーケンシングアッセイ、酵素に基づくミスマッチ検出アッセイ、またはハイブリダイゼーションアッセイによって、２対立遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチドの同一性を直接決定することを含む。一部の好ましい方法の詳細を以下に示す。非常に好ましい方法は、マイクロシーケンシング技術である。「シーケンシング」という用語は、二重鎖のプライマー／鋳型複合体のポリメラーゼ伸長を指すために本明細書中で一般に使用され、従来のシーケンシングおよびマイクロシーケンシングのどちらも含む。
（１）シーケンシングアッセイ
多型部位に存在するヌクレオチドは、シーケンシング法によって決定することができる。好ましい実施形態において、ＤＮＡサンプルは、上述のシーケンシング前にＰＣＲ増幅にかけられる。ＤＮＡシーケンシング法は、「増幅されたゲノムＤＮＡのシーケンシングおよび単一ヌクレオチド多型の同定」に記述されている。増幅されたＤＮＡは、ダイプライマー・サイクルシーケンシングプロトコルを用いて、自動化ジデオキシターミネーター・シーケンシング反応にかけることが好ましい。配列解析によって、２対立遺伝子マーカー部位に存在する塩基を同定することができる。
（２）マイクロシーケンシングアッセイ
マイクロシーケンシング法では、標的ＤＮＡ中の多型部位におけるヌクレオチドを、単一ヌクレオチドプライマー伸長反応によって検出する。この方法は、標的の核酸における対象の多型塩基のすぐ上流でハイブリダイズする適切なマイクロシーケンシングプライマーを要する。ポリメラーゼを使用して、多型部位におけるヌクレオチドに相補的な１つの単一ｄｄＮＴＰ（チェーンターミネーター）でプライマーの３’末端を特異的に伸長する。次に、取り込まれたヌクレオチドの同一性をいずれかの適切な方法で決定する。
【０２６５】
通常、マイクロシーケンシング反応は、蛍光ｄｄＮＴＰを用いて行われ、ＡＢＩ３７７シーケンシング機器で電気泳動によって、伸長されたマイクロシーケンシングプライマーを分析して、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＥＰ  ４１２  ８８３に記述されているように、取り込まれたヌクレオチドの同一性を決定する。代替方法としては、より多くのアッセイを同時に処理するために、キャピラリー電気泳動を用いることができる。本発明のコンテクストで使用することができる、通常のマイクロシーケンシング手順の例を実施例４に示す。
【０２６６】
異なるアプローチをｄｄＮＴＰの標識化および検出に用いることができる。蛍光共鳴エネルギー移動に基づく均一相検出法が、ChenおよびKwok (1997) およびChen 等 (1997)によって記述されている。この方法では、多型部位を含有する増幅されたゲノムＤＮＡ断片を、対立遺伝子の染料標識化ジデオキシリボヌクレオチド三リン酸および修飾Ｔａｑポリメラーゼの存在下にて、５’−蛍光標識されたプライマーと共にインキュベートする。その染料標識されたプライマーは、鋳型上に存在する対立遺伝子に特異的なダイターミネーターによって１塩基伸長される。ゲノタイピング反応の終わりに、反応混合物中の２種類の染料の強度を、分離または精製することなく直接的に分析する。これらのすべての段階は、同一チューブにおいて行うことが可能であり、蛍光の変化をリアルタイムでモニターすることができる。代替方法として、その伸長されたプライマーを、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法によって分析することができる。多型部位における塩基は、マイクロシーケンシングプライマー上に加えられた質量によって同定される(HaffおよびSmirnov, 1997を参照のこと)。
【０２６７】
確立されたマイクロシーケンシング法によって、またはその発達もしくは派生物によって、マイクロシーケンシングを達成することが可能である。代替方法には、いくつかの固相マイクロシーケンシング技術が含まれる。その方法が、プライマーもしくは標的分子が固体支持体上に固定化または捕獲される、不均一相アッセイとして行われることを除いては、基本的なマイクロシーケンシングプロトコルは上述と同じである。プライマーの分離または末端ヌクレオチドの付加を単純化するために、オリゴヌクレオチドを固体支持体に付着させるか、またはアフィニティー分離ならびにポリメラーゼ伸長を可能にするように修飾する。合成オリゴヌクレオチドの５’末端および内部ヌクレオチドを、異なるアフィニティー分離アプローチを可能にするような多数の異なる方法、例えばビオチン化で修飾することができる。単一の親和性基がオリゴヌクレオチド上に用いられた場合、そのオリゴヌクレオチドは、取り込まれたターミネーター試薬から分離することができる。これによって、物理的分離またはサイズ分離の必要がなくなる。複数の親和性基が使用された場合には、複数のオリゴヌクレオチドをターミネーター試薬から分離し、同時に分析することができる。これによって、伸長反応につき、いくつかの核酸種またはより多くの核酸配列情報を解析することが可能となる。その親和性基はプライミングオリゴヌクレオチド上にある必要はないが、代わりに、鋳型上に存在することが可能である。例えば、ビオチン化ＤＮＡおよびストレプトアビジン−コートミクロ滴定ウェルもしくはアビジン−コートポリスチレン粒子との間の相互作用を介して、固定化を行うことができる。同じ手法で、オリゴヌクレオチドまたは鋳型を高密度フォーマットで固体支持体に付着させることが可能である。かかる固相マイクロシーケンシング反応では、取り込まれたｄｄＮＴＰを標識化するか(Syvanen, 1994)、またはフルオレセインに連結させることができる(Livakおよび Hainer, 1994)。放射標識されたｄｄＮＴＰの検出は、シンチレーションに基づく技術によって達成することができる。フルオレセイン連結ｄｄＮＴＰの検出は、アルカリホスファターゼと結合した抗フルオレセイン抗体の結合、それに続く、発色性基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェートなど）とのインキュベーションに基づく。可能性のある他のレポーター−検出対には：基質としてのｏ−フェニレンジアミンと共に、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）に連結するｄｄＮＴＰおよび抗ＤＮＰアルカリホスファターゼ複合体(Harju 等, 1993)またはビオチン化ｄｄＮＴＰおよびホースラディッシュペルオキシダーゼ−結合ストレプトアビジンが含まれる（その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ９２／１５７１２参照）。さらに他の代替の固相マイクロシーケンシング手順としては、Nyren 等 (1993)が、酵素的光度測定無機ピロリン酸検出アッセイ（enzymatic luminometric inorganic pyrophosphate detection assay)（ＥＬＩＤＡ）によるＤＮＡポリメラーゼ活性の検出に依拠する方法を記述している。
【０２６８】
固相ミニシーケンシング原理がオリゴヌクレオチドアレイフォーマットに適用される、単一ヌクレオチド多型の多重検出の方法がPastinen 等 (1997)により、記述されている。固体支持体（ＤＮＡチップ）に付着されるＤＮＡプローブの高密度アレイを以下でさらに説明する。
【０２６９】
一態様において、本発明は、マイクロシーケンシングアッセイを実施することによって、本発明の１つまたは複数の２対立遺伝子マーカーをゲノタイピングするためのポリヌクレオチドおよび方法を提供する。好ましいマイクロシーケンシングプライマーは、ヌクレオチド配列Ｄ１〜Ｄ１８およびＥ１〜Ｅ１８を含む。実施例４に列挙するマイクロシーケンシングプライマーは単に例示的なものであり、多型性ヌクレオチドのすぐ横に隣接する３’末端を有するいずれかのプライマーを使用してもよいことは理解されよう。同様に、マイクロシーケンシング解析は、本発明のいずれかの２対立遺伝子マーカーまたは本発明の２対立遺伝子マーカーのいずれかの組み合わせについて行うことが可能であることは理解されよう。本発明の一態様は、２対立遺伝子マーカー部位におけるヌクレオチドの同一性を決定するための、実施例４に列挙する１つまたは複数のマイクロシーケンシングプライマー、またはかかる長さが記載のプライマーと一致する範囲で、少なくとも８、１２、１５、２０、２５、３０、４０、または５０個のその連続ヌクレオチドを含有し、対応する２対立遺伝子マーカーのすぐ上流の３’末端を有する断片を含む固体支持体である。
（３）ポリメラーゼおよびリガーゼに基づくミスマッチ検出アッセイ
一態様において、本発明は、ポリメラーゼおよび／またはリガーゼに基づくミスマッチ検出アッセイによって、生体サンプルにおける本発明の１つまたは複数の２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子を決定するためのポリヌクレオチドおよび方法を提供する。これらのアッセイは、ポリメラーゼおよびリガーゼの特異性に基づく。重合反応は、増幅用プライマーの３’末端の正確な塩基対上で特に厳密な必定条件で起こり、標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズした２つのオリゴヌクレオチドの結合は、ライゲーション部位、特に３’末端に近いミスマッチに対してかなり感受性が高い。本発明の２対立遺伝子マーカーを含有するＤＮＡ断片を増幅するための方法、プライマーおよび様々なパラメーターは、上記の「２対立遺伝子マーカーを含むＤＮＡ断片の増幅」でさらに説明される。
［対立遺伝子特異的な増幅用プライマー］
２対立遺伝子マーカーの２つの対立遺伝子間の識別もまた、対立遺伝子特異的な増幅、選択的方策によって達成することが可能であり、それによって対立遺伝子の一方が、他方の対立遺伝子の増幅をすることなく増幅される。対立遺伝子特異的な増幅については、プライマー対の少なくとも一方のメンバーが、それとハイブリダイズし、かつ増幅を開始させるのに、本発明の２対立遺伝子マーカーの多型塩基を含むＣａｎＩｏｎ遺伝子の領域と十分に相補的である。かかるプライマーは、２対立遺伝子マーカーの２つの対立遺伝子を識別することができる。
【０２７０】
これは、増幅用プライマーの一方の３’末端に多型塩基を配置することによって達成される。伸長はプライマーの３’末端から形成するため、この位置におけるミスマッチまたはこの位置付近のミスマッチは増幅に抑制作用を及ぼす。したがって、適切な増幅条件下にて、これらのプライマーは単に、それらの相補的対立遺伝子対して増幅を向ける。ミスマッチの正確な位置および対応するアッセイ条件の決定は、当業者には良く知られている。
［ライゲーション／増幅に基づく方法］
「オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ」（ＯＬＡ）では、標的分子の一本鎖の隣接配列とハイブリダイズすることができるように設計される２つのオリゴヌクレオチドを使用する。そのオリゴヌクレオチドの一方をビオチン化し、他方を検出可能に標識する。正確な相補的配列が標的分子で見つけられる場合、そのオリゴヌクレオチドは、それらの末端が隣接するようにハイブリダイズし、捕獲かつ検出できるライゲーション基質を生じるだろう。ＯＬＡは、単一ヌクレオチド多型を検出することができ、Nickerson 等 (1990)によって記述されているように、ＰＣＲと有利に組み合わせることが可能である。この方法において、ＰＣＲを使用して、標的ＤＮＡの指数関数的増幅が達成され、次いで、ＯＬＡを用いて検出される。
【０２７１】
単一ヌクレオチド多型の検出に特に適している他の増幅方法には、「ＤＮＡの増幅」で上述のＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、ギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）が含まれる。ＬＣＲでは、特定の標的を指数関数的に増幅するために２対のプローブを使用する。オリゴヌクレオチドの各対の配列は、標的の同じ鎖の隣接配列とその対がハイブリダイズするのが可能なように選択される。かかるハイブリダイゼーションによって、鋳型依存性リガーゼに対して基質が形成される。本発明に従って、ＬＣＲは、２対立遺伝子マーカー部位の同じ鎖の近位および遠位配列を有するオリゴヌクレオチドで行うことができる。一実施形態において、いずれかのオリゴヌクレオチドが、２対立遺伝子マーカー部位を含むように設計されるだろう。かかる実施形態では、標的がオリゴヌクレオチド上の２対立遺伝子マーカーに相補的な特定のヌクレオチドを含有するか、または欠いている場合のみ、オリゴヌクレオチドが共にライゲートすることができるように、反応条件が選択される。代替の実施形態では、オリゴヌクレオチドは２対立遺伝子マーカーを含まず、そのため、それらが標的分子とハイブリダイズした場合、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ９０／０１０６９に記載のように「ギャップ」が生じる。次いで、このギャップは、相補的なｄＮＴＰ（ＤＮＡポリメラーゼによって仲介される）で、またはオリゴヌクレオチドの追加の対によって「充填」される。したがって、各サイクルの終わりでは、各一本鎖は、次のサイクル中に標的としての働きをすることができる補体を有し、所望の配列の指数関数的な対立遺伝子特異的な増幅が得られる。
【０２７２】
リガーゼ／ポリメラーゼ仲介遺伝子ビット解析(Ligase/Polymerase-mediated Genetic Bit Analysis)（商標）は、核酸分子中の予め選択された部位におけるヌクレオチドの同一性を決定するもう１つの方法である（ＷＯ９５／２１２７１）。この方法は、プライマー分子の末端上の予め選択された部位に存在するヌクレオチドに相補的なヌクレオシド三リン酸の取り込み、その後のそれらの第２オリゴヌクレオチドへのライゲーションを含む。その反応は、反応の固相に付けられた特異的標識を検出することによって、または溶液中での検出によってモニターされる。
（４）ハイブリダイゼーションアッセイの方法
２対立遺伝子マーカー部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定する好ましい方法は、核酸のハイブリダイゼーションを含む。かかる反応に便利に使用することができるハイブリダイゼーションプローブには、好ましくは本明細書で定義されるプローブが含まれる。サザンハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーションおよび固相ハイブリダイゼーションを含む、いずれかのハイブリダイゼーションアッセイを用いることが可能である(Sambrook 等, 1989を参照のこと)。ハイブリダイゼーションは、相補的塩基対が原因の２本の一本鎖核酸による二重鎖構造の形成を意味する。ハイブリダイゼーションは、正確に相補的な核酸鎖間またはミスマッチのマイナー領域を含有する核酸鎖間で起こり得る。２対立遺伝子マーカーの一方の形とハイブリダイズし、他方とはハイブリダイズしない特異的プローブを設計することが可能であり、したがって、異なる対立形質間で識別することができる。対立遺伝子特異的なプローブは、対で使用される場合が多く、１対の一方のメンバーは、元の対立遺伝子を含有する標的配列に対して完全な一致を示し、他方のメンバーは、代替の対立遺伝子を含有する標的配列に対して完全な一致を示す。ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間でのハイブリダイゼーション強度の有意な差異が存在し、好ましくは本質的に２つの応答が存在し、それによってプローブ対立遺伝子の一方のみとハイブリダイズするように十分厳密であるべきである。プローブが正確に相補的な標的配列とのみハイブリダイズするであろう、厳密な、配列特異的なハイブリダイゼーション条件は、当技術分野ではよく知られている(Sambrook 等, 1989)。厳密な条件は配列依存的であり、異なる環境では違いがあるだろう。一般に、厳密な条件は、定義されたイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列に対する融点（Ｔｍ）よりも約５℃低い温度であるように選択される。かかるハイブリダイゼーションは溶液中で行うことができるが、固相ハイブリダイゼーションアッセイを用いることが好ましい。本発明の２対立遺伝子マーカーを含有する標的ＤＮＡは、ハイブリダイゼーション反応前に増幅してもよい。サンプル中の特定の対立遺伝子の存在は、プローブと標的ＤＮＡとの間で形成される安定なハイブリッド二重鎖の存在または非存在を検出することによって決定される。ハイブリッド二重鎖の検出は、多数の方法によって行うことができる。標的またはプローブに結合する検出可能な標識を用いて、ハイブリッド二重鎖の検出を可能にする、種々の検出アッセイ方式がよく知られている。通常、ハイブリダイゼーション二重鎖は、ハイブリダイズしていない核酸から分離され、次いで、二重鎖に結合した標識が検出される。当業者であれば、洗浄段階を用いて、余分な標的ＤＮＡまたはプローブならびに未結合の複合体を洗い流すことができることは認識されよう。さらに、標準不均一アッセイ方式は、プライマーおよびプローブ上に存在する標識を用いてハイブリッドを検出するのに適している。
【０２７３】
最近開発された２種類のアッセイは、分離または洗浄の必要なく、ハイブリダイゼーションに基づいて対立遺伝子の識別をすることができる（Landegren U.  等, 1998参照)。ＴａｑＭａｎアッセイは、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を利用して、蓄積する増幅産物に特異的にアニールするＤＮＡプローブを消化する。ＴａｑＭａｎプローブは、蛍光エネルギー移動を介して相互作用するドナー−アクセプター染料対で標識化される。増幅中に進むポリメラーゼによるＴａｑＭａｎプローブの切断は、消光しているドナー染料からアクセプター染料を解離し、ドナーの蛍光が大幅に増大される。２つの突然変異体を検出するのに必要なすべての試薬を、反応の最初に評価することが可能であり、その結果はリアルタイムでモニターされる(Livak 等, 1995参照)。選択的な（alternative)均一ハイブリダイゼーションに基づく手順において、分子ビーコンが対立遺伝子の識別に使用される。分子ビーコンは、均一溶液中で特定の核酸の存在を報告するヘアピン形のオリゴヌクレオチドプローブである。それらがそれらの標的に結合した場合、内部で消光されたフルオロフォアの蛍光を戻す高次構造再構築を受ける(Tyagi 等, 1998)。
【０２７４】
本明細書で提供されるポリヌクレオチドを使用して、生体サンプル中の２対立遺伝子マーカーを検出するためのハイブリダイゼーションアッセイで使用できるプローブを作製することができる。これらのプローブは、それらが好ましくは８〜５０ヌクレオチドを含有し、かつそれにハイブリダイズするのに本発明の２対立遺伝子マーカーを含む配列に十分相補的であり、好ましくは、ただ１つのヌクレオチド変異に対して標的化された配列を識別することができるのに十分に特異的であることを特徴とする。特に好ましいプローブは、長さが２５ヌクレオチドである。２対立遺伝子マーカーは、ポリヌクレオチドプローブの中心から４ヌクレオチド以内であることが好ましい。特に好ましいプローブにおいて、２対立遺伝子マーカーは、前記ポリヌクレオチドの中心にある。好ましいプローブは、表１に列挙するアンプリコンからなる群から選択されるヌクレオチド配列およびそれに相補的な配列またはその断片を含み、前記断片は、少なくとも約８個の連続ヌクレオチド、好ましくは１０、１５、２０個、さらに好ましくは２５、３０、４０、４７、または５０個の連続ヌクレオチドを含み、多型塩基を含有する。好ましいプローブは、Ｐ１〜Ｐ１８からなる群から選択されるヌクレオチド配列およびそれに相補的な配列を含む。好ましい実施形態において、多型塩基（１つまたは複数）は、前記ポリヌクレオチドの中心から５、４、３、２、１ヌクレオチド以内、さらに好ましくは前記ポリヌクレオチドの中心にある。
【０２７５】
本発明のプローブは標識化するか、または固体支持体上に固定化することが好ましい。標識および固体支持体については、「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」でさらに説明される。プローブは、「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」で記述されているように伸長不可能であることが可能である。
【０２７６】
対立遺伝子特異的なプローブとのハイブリダイゼーションをアッセイすることによって、所定のサンプルにおける２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の存在または非存在を検出することができる。アレイ方式におけるハイスループットの並行ハイブリダイゼーションは特に、「ハイブリダイゼーションアッセイ」内に包含され、以下に説明される。
（５）オリゴヌクレオチドのアドレス指定可能なアレイとのハイブリダイゼーション
オリゴヌクレオチドアレイに基づくハイブリダイゼーションアッセイは、完全にマッチする、かつミスマッチの標的配列変異体に対する、短いオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション安定性の差異に依拠する。多型情報への効率的なアクセスが、選択された位置で固体支持体（例えば、チップ）へ付着されたオリゴヌクレオチドプローブの高密度アレイを含む基本構造によって得られる。各ＤＮＡチップは、格子状に配列され、１０セントサイズに小型化された何千から何百万の個々の合成ＤＮＡプローブを含有する。
【０２７７】
チップ技術は既に、多数のケースで適用されて成果をおさめている。例えば、変異のスクリーニングは、ＢＲＣＡ１遺伝子において、酵母変異株において、およびＨＩＶ−１ウイルスのプロテアーゼ遺伝子において着手されている(Hacia 等, 1996; Shoemaker 等, 1996; Kozal 等, 1996)。２対立遺伝子多型を検出するのに使用される様々な形式のチップは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社（ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標））、Ｈｙｓｅｑ社（ＨｙＣｈｉｐおよびＨｙＧｎｏｓｔｉｃｓ）、およびＰｒｏｔｏｇｅｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社によって受託で製造することができる。
【０２７８】
一般に、これらの方法では、個体からの標的核酸配列セグメントに相補的なオリゴヌクレオチドプローブのアレイを用い、標的配列は多型性マーカーを含む。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれるＥＰ  ７８５２８０には、単一ヌクレオチド多型を検出するためのタイリング方法が記述されている。簡単に言えば、アレイは一般に、多数の特定の多型に対して「タイリング」される（タイルのように並べられる）。「タイリング」とは通常、対象の標的配列に相補的な配列、ならびにその配列の予め選択された変異、例えば、ヌクレオチドの基本セットの１つまたは複数のメンバーでの１つまたは複数の所定の位置の置換で構成される、定義されたセットのオリゴヌクレオチドプローブの合成を意味する。タイリング法はさらに、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／１１９９５に記述されている。特定の態様において、アレイは、多数の特定の、同定された２対立遺伝子マーカー配列に対してタイリングされる。特に、アレイは多数の検出ブロックを含むようにタイリングされ、各検出ブロックは、特定の２対立遺伝子マーカーまたは一組の２対立遺伝子マーカーに特異的である。例えば、検出ブロックは、特定の多型を含む配列セグメントに及ぶ、多数のプローブを含むようにタイリングされる。各対立遺伝子に相補的なプローブを確実にするために、プローブは、２対立遺伝子マーカーにおいて異なる対で合成される。多型塩基において異なるプローブに加えて、一置換プローブもまた一般に、検出ブロック内でタイリングされる。これらの一置換プローブは、多型からいずれかの方向に、一定数の塩基以下の塩基を有し、残存するヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｇ、ＣおよびＵから選択される）で置換される。通常、タイリングされた検出ブロックにおけるプローブは、２対立遺伝子マーカーから５塩基離れた位置までの、およびその位置を含む配列位置の置換を含むだろう。一置換プローブは、タイリングされたアレイに対して内部標準を提供し、実際のハイブリダイゼーションと人為結果のクロスハイブリダイゼーションを区別する。標的配列とのハイブリダイゼーションおよびアレイの洗浄が完了したら、アレイをスキャンして、標的配列がハイブリダイズするアレイ上の位置を決定する。次いで、スキャンしたアレイからのハイブリダイゼーションデータを解析し、２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子（１つまたは複数）がサンプル中に存在するかどうかを同定する。ハイブリダイゼーションおよびスキャンは、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９２／１００９２およびＷＯ９５／１１９９５および米国特許第５，４２４，１８６号に記述されているように行われる。
【０２７９】
このように一部の実施形態では、チップは、長さ約１５ヌクレオチドの断片の核酸配列アレイを含む。更なる実施形態では、チップは、表１に列挙されるアンプリコンからなる群から選択される配列およびそれに相補的な配列、またはその断片の少なくとも１つを含むアレイを含み、前記断片は、少なくとも約８個の連続ヌクレオチド、好ましくは１０、１５、２０個、さらに好ましくは２５、３０、４０、４７、もしくは５０個の連続ヌクレオチドを含み、多型塩基を含有する。好ましい実施形態において、多型塩基は、前記ポリヌクレオチドの中心から５、４、３、２、１ヌクレオチド以内、さらに好ましくは前記ポリヌクレオチドの中心にある。一部の実施形態では、チップは、本発明のこれらのポリヌクレオチドの少なくとも２、３、４、５、６、７、８個以上のアレイを含む。固体支持体および固体支持体に付着される本発明のポリヌクレオチドについては、「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」にさらに記述される。
（６）集積システム
多型を解析するのに使用される他の技術には、単機能デバイスにおける、ＰＣＲおよびキャピラリー電気泳動反応などのプロセスを縮小化し、区分化するマルチコンポーネント集積システムが含まれる。その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５８９，１３６号に、かかる技術の例が開示されており、そこには、チップにおけるＰＣＲ増幅とキャピラリー電気泳動の集積化が記述されている。
【０２８０】
集積システムは、マイクロ流体システムが使用される場合に主に考えることができる。これらのシステムは、マイクロチップ上に含まれるガラス、シリコン、石英、またはプラスチック製のウエハ上に設計されたマイクロチャンネルのパターンを含む。サンプルの移動は、マイクロチップの異なる領域にわたってかけられる電気的、電気浸透の、または静水学的力によって制御され、可動部を有さない機能的な微小バルブおよびポンプが作製される。
【０２８１】
２対立遺伝子マーカーをゲノタイピングするために、マイクロ流体システムによって、核酸増幅、マイクロシークエンシング、キャピラリー電気泳動およびレーザー誘導蛍光検出などの検出方法を集積化することが可能である。
〈本発明の２対立遺伝子マーカーを用いた遺伝分析の方法〉
異なる方法を、複合形質の遺伝分析に利用することができる(LanderおよびSchork, 1994参照)。罹病性遺伝子の検索は、２つの主要な方法；家系研究を用いた、遺伝子座と推定上の形質遺伝子座との間の同時分離に対して証拠が求められる連鎖アプローチ；および対立遺伝子と形質もしくは対立遺伝子を生じる形質との間の統計的に有意な関連に対して証拠が求められる関連アプローチ；を用いて行われる(Khoury 等, 1993)。一般に、本発明の２対立遺伝子マーカーは、当技術分野で公知のいずれかの方法における使用が見出され、遺伝子型と表現型との間の統計学的に有意な相関性が実証される。２対立遺伝子マーカーは、パラメトリックおよびノンパラメトリックな連鎖解析法に使用することが可能である。好ましくは、本発明の２対立遺伝子マーカーを使用して、罹患家系を用いる必要なく、かつ複合および散発性形質と関連する遺伝子の同定を可能にする、関連研究、アプローチを用いて、検出可能な形質に関連する遺伝子を同定する。
【０２８２】
本発明の２対立遺伝子マーカーを用いた遺伝分析は、任意のスケールで行うことが可能である。本発明の２対立遺伝子マーカーの全セット、または候補遺伝子に対応する、本発明の２対立遺伝子の任意のサブセットが使用される。さらに、本発明の２対立遺伝子マーカーを含む任意のセットの遺伝子マーカーが使用される。本発明の２対立遺伝子マーカーと組み合わせて、遺伝子マーカーとして使用できる１セットの２対立遺伝子多型が、ＷＯ９８／２０１６５に記述されている。上述のように、本発明の２対立遺伝子マーカーは、ヒトゲノムの完全なまたは部分的な遺伝子地図に含まれる。これらの異なる使用は、本発明および特許請求の範囲において具体的に企図される。
［連鎖解析］
連鎖解析は、家系内の世代を通じて遺伝子マーカーの伝達と特定の形質の伝達との間の相関性を確立することに基づく。したがって、連鎖解析の目的は、系統における対象の形質で同時分離を示すマーカー遺伝子座を検出することである。
【０２８３】
パラメトリックな方法
データが連続世代から入手可能な場合、遺伝子座対間の連鎖の程度を研究する機会がある。組換え画分を推定することによって、遺伝子座を遺伝子地図上に順序付けて、配置することができる。遺伝子マーカーである遺伝子座位を用いて、遺伝子マップを確立することができ、マーカーと形質との間の連鎖の強さを計算し、それを使用して、それらの形質に影響を及ぼすマーカーおよび遺伝子の相対位置を示すことができる(Weir, 1996)。連鎖解析の古典的な方法は、オッズ（ロッド）スコア法の対数である(Morton, 1955; Ott, 1991参照)。ロッドスコアの計算には、疾患の遺伝様式の特定化が必要である（パラメトリックな方法）。一般に、連鎖解析を用いて同定された候補領域の長さは２〜２０Ｍｂである。候補領域を上述のように同定したら、更なるマーカーを用いて組換え個体の解析を行うことによって、候補領域をさらに描写することが可能となる。連鎖解析の研究は一般的に、最高で５，０００個のマイクロサテライトマーカーの使用に依拠しており、したがって、連鎖解析の理論的に達成可能な最大限の解明は平均で約６００ｋＢに制限される。
【０２８４】
連鎖解析は、明らかなメンデル遺伝パターンを示し、かつ高い浸透度を有する単純な遺伝形質をマッピングするためにうまく適用されている（つまり、対立遺伝子の形質ポジティブなキャリアの数と、集団におけるキャリアの総数との比）。しかしながら、パラメトリックな連鎖解析には様々な欠点がある。第一に、研究された各形質に適切な遺伝モデルの選択へのそれらの依存によって制限される。さらに、既に言及されているように、連鎖解析を用いて達成可能な解明は制限され、連鎖解析によって最初に同定される通常２Ｍｂ〜２０Ｍｂの領域の解析を改良するために、補足的な研究が必要とされる。さらに、パラメトリックな連鎖解析のアプローチは、同義遺伝子および／または環境因子を合わせた作用が原因の形質など、複合遺伝形質に適用される場合には、難しいことが分かっている。ロッドスコア解析でこれらの因子を適切にモデリングするのは非常に困難である。かかる場合では、RischおよびMerikangas (1996)によって最近論述されているように、これらの状況に連鎖解析を適用するのに必要な、適切な数の罹患家族を集めるのに、多大な労力および費用が必要である。
【０２８５】
ノンパラメトリックな方法
連鎖解析に対する、いわゆるノンパラメトリックな方法の利点は、疾患の遺伝様式の特定化が必要なく、複合形質の解析にさらに有用である傾向があることである。ノンパラメトリックな方法では、罹患した親族が期せずして予想よりも多くの場合に領域の同一コピーを受け継ぐことを示すことによって、染色体領域の遺伝パターンがランダムなメンデル分離と一致しないことを証明しようと試みている。罹患親族は、不完全な浸透度およびポリジーン遺伝子の存在下においてでさえ、過剰な「対立遺伝子共有」を示すはずである。ノンパラメトリックな連鎖解析において、２個体でのマーカー遺伝子座における一致の程度は、状態同一（ＩＢＳ）の対立遺伝子数によって、または同祖同一（ＩＢＤ）の対立遺伝子数によって測定することができる。罹患同胞対解析はよく知られている特別のケースであり、これらの方法の中で最も単純な形式である。
【０２８６】
本発明の２対立遺伝子マーカーは、パラメトリックな連鎖解析とノンパラメトリックな連鎖解析のどちらでも使用することができる。２対立遺伝子マーカーは、複合形質に関与する遺伝子のマッピングを可能にするノンパラメトリックな方法で使用することが好ましい。本発明の２対立遺伝子マーカーは、複合形質に影響を及ぼす遺伝子をマッピングするのためのＩＢＤ−およびＩＢＳ−法のどちらでも使用することができる。かかる研究において、２対立遺伝子マーカーの高密度を利用して、隣接するいくつかの２対立遺伝子マーカー座位をプールし、多数の対立遺伝子マーカーによって得られる効率を達成することが可能である(Zhao 等, 1998)。
［集団の関連研究］
本発明は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子が検出可能な形質と関連するかどうかを同定するための、本発明の２対立遺伝子マーカーを用いた方法を含む。一実施形態において、本発明は、２対立マーカー対立遺伝子もしくは２対立遺伝子マーカーハプロタイプと形質との間の関連性を検出する方法を含む。さらに、本発明は、本発明のいずれかの２対立遺伝子マーカー対立遺伝子と連鎖不平衡にある対立遺伝子を生じる形質を同定する方法を含む。
【０２８７】
上述のように、代替のアプローチを用いて、関連研究；ゲノムワイドな関連研究、候補領域関連研究および候補遺伝子関連研究を行うことができる。好ましい実施形態において、本発明の２対立遺伝子マーカーを使用して、候補遺伝子関連研究が行われる。候補遺伝子解析は明らかに、形質の生物学に関する一部の情報が入手可能である場合、特定の形質に関連する遺伝子および遺伝子多型の同定への近道のアプローチを提供する。さらに、本発明の２対立遺伝子マーカーは、ゲノムワイドな関連研究を実施するために、ヒトゲノムの遺伝子マーカーのいずれかの地図に組み込むことが可能である。２対立遺伝子マーカーの高密度地図を作製する方法は、米国特許仮出願第６０／０８２，６１４号に記述されている。本発明の２対立遺伝子マーカーはさらに、ゲノムの特定の候補領域（例えば、特定の染色体または特定の染色体セグメント）のいずれかの地図に組み込むことが可能である。
【０２８８】
上述のように、関連研究は一般集団内で行うことが可能であり、罹患家系の関連個体で行われる研究に限定されない。関連研究は、散発性または多因子形質の解析を可能にすることから、非常に価値がある。さらに、関連研究は、連鎖研究よりも対立遺伝子を生じる形質をかなり精密にマッピングすることを可能にする、精密スケールのマッピングの強力な方法である。系統に基づく研究は単に、対立遺伝子を生じる形質の位置をしぼるだけである場合が多い。したがって、本発明の２対立遺伝子マーカーを用いた関連研究を用いて、連鎖解析法により同定された候補領域における対立遺伝子を生じる形質の位置をリファインすることができる。さらに、対象の染色体セグメントが同定されていれば、対象の領域における本発明の候補遺伝子などの候補遺伝子の存在によって、対立遺伝子を生じる形質の同定への近道が得られる。本発明の２対立遺伝子マーカーを使用して、候補遺伝子が形質に関連することを実証することができる。かかる使用は本発明において具体的に企図される。
［集団における２対立遺伝子マーカー対立遺伝子または２対立遺伝子マーカーハプロタイプの頻度の決定］
関連研究は、遺伝子座間の対立遺伝子のセットに対する頻度間の関係を探索する。
【０２８９】
集団における対立遺伝子の頻度の決定
集団での２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子頻度を、「２対立遺伝子マーカーに対して個体をゲノタイピングする方法」という表題で上述されている方法の１つ、またはこの意図される目的に適したいずれかのゲノタイピング手順を用いて決定することができる。プールされた、または個々のゲノタイピングサンプルによって、集団における２対立遺伝子マーカー対立遺伝子の頻度を決定することができる。必要とされるゲノタイピングの回数を減らす１つの方法は、プールしたサンプルを使用することである。プールしたサンプルを使用することでの主な障害は、プールをセットアップする際に正確なＤＮＡ濃度を決定する精度および再現性の点である。個々のサンプルをゲノタイピングすることによって、より高い感度、再現性および精度が得られ；それが本発明で使用するのに好ましい方法である。各個体は別々にゲノタイピングし、単一遺伝子の計数を適用して、所定の集団における遺伝子型の、または２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の頻度を決定することが好ましい。
【０２９０】
本発明は、集団における対立遺伝子の頻度を推定する方法であって：
ａ）本発明による前記２対立遺伝子マーカーに対して前記集団からの個体をゲノタイピングする段階；ｂ）前記集団における前記２対立遺伝子マーカーの比例的表現（representation)を決定する段階；を含む方法にもまた関する。さらに、本発明の集団における対立遺伝子の頻度を推定する方法は、この開示に、または以下に記述される、単独またはいずれかの組み合わせで指定される更なる制限を有する方法を包含し；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１８、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１７、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１２およびＡ１６、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、集団における２対立遺伝子マーカー対立遺伝子の頻度の決定は、前記集団における各個体のゲノムに存在する前記２対立遺伝子マーカーの両方のコピーに対してヌクレオチドの同一性を決定し、集団に対して前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーにおける前記ヌクレオチドの比例的表現を計算することによって達成され；任意に、比例的表現の決定は、前記集団における、代表数の個体または各個体から得たプールされた生体サンプルで本発明のゲノタイピング法を実施し、全体と比較した前記ヌクレオチドの比例的な量を計算することによって達成される。
集団におけるハプロタイプの頻度の決定
２倍体個体が複数の遺伝子座においてヘテロ接合性である場合、ハプロタイプの配偶子相は不明である。家系における系統情報を用いて、時として配偶子相を推論することができる(Perlin 等, 1994)。系統情報が入手可能でない場合、異なる方策を使用してもよい。ある可能性は、複数部位のヘテロ接合性２倍体を分析から排除し、ホモ接合体および単一部位のヘテロ接合体のみを保持することができることであるが、このアプローチは、起こり得るサンプルの偏り、低頻度のハプロタイプの過小評価につながる場合がある。他の可能性は、例えば、非対称ＰＣＲ増幅によって(Newton等1989; Wu 等, 1989参照)、または限界希釈による単一染色体の単離によって、続いてＰＣＲ増幅(Ruano 等, 1990参照)によって、単一染色体を別々に研究することができることである。さらに、特定の対立遺伝子を二重ＰＣＲ増幅することによって、十分に近い２対立遺伝子マーカーに対して、サンプルをハプロタイピングすることが可能である(Sarkar, G.およびSommer S.  S., 1991)。これらのアプローチは、技術的に複雑であり、追加の費用がかかり、大きなスケールでの一般化を欠いており、または偏りを生じる可能性があることから、完全に満足のいくものではない。これらの困難を克服するために、Clark, A.G. (1990)により紹介されているＰＣＲ増幅されたＤＮＡ遺伝子型の相を推定するアルゴリズムを使用することが可能である。簡単に言えば、その原則は、明瞭な個体、つまり完全なホモ接合体および単一部位のヘテロ接合体を調べることによって、サンプルに存在するハプロタイプの予備リストを埋めることを開始することである。次いで、同一サンプルにおける他の個体を、先に認識されたハプロタイプの可能性のある出現に対してスクリーニングする。それぞれのポジティブの同定のために、すべての個体の相情報が解決されるか、または未解決として識別されるまで、認識されたハプロタイプのリストに、相補的なハプロタイプを加える。この方法では、各マルチヘテロ接合性個体に単一ハプロタイプを割り当て、いくつかのハプロタイプは、複数のヘテロ接合性部位がある場合には可能である。代替方法として、各個体にハプロタイプを割り当てることなく、集団におけるハプロタイプ頻度を推定する方法を使用することができる。ハーディ・ワインベルグ平衡（任意交配）の仮定の下でハプロタイプ頻度の最尤推定値を導く、期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムに基づく方法(pster 等, 1977)を使用することが好ましい。ＥＭアルゴリズムは、データが不明瞭および／または不完全である場合に有用である推定への、一般化された反復最尤法アプローチである。ＥＭアルゴリズムを用いて、ヘテロ接合体をハプロタイプに分ける。ハプロタイプの推定は、「統計学的方法」という表題で以下にさらに記述される。集団におけるハプロタイプの頻度を決定または推定するための当技術分野で公知の他のいずれかの方法を使用することができる。
【０２９１】
本発明は、集団において１セットの２対立遺伝子マーカーに対してハプロタイプの頻度を推定する方法であって、ａ）前記集団における各個体に対して、本発明による少なくとも１つのＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーをゲノタイピングする段階；ｂ）前記集団における各個体のゲノムに存在する第２の２対立遺伝子マーカーの両方のコピーに対して、前記第２の２対立遺伝子マーカーにおけるヌクレオチドの同一性を決定することによって、第２の２対立遺伝子マーカーをゲノタイピングする段階；ｃ）段階ａ）およびｂ）で決定されたヌクレオチドの同一性にハプロタイプ決定方法を適用し、前記頻度の推定値を得る段階；を含む方法もまた包含する。さらに、本発明のハプロタイプの頻度を推定する方法は、この開示に、または以下に記述される、単独またはいずれかの組み合わせで指定される制限を有する方法を包含し；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１８、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１７、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１２およびＡ１６、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ハプロタイプ決定法は、特定の対立遺伝子の非対称ＰＣＲ増幅、二重ＰＣＲ増幅、クラーク（Clark）アルゴリズム、または期待値最大化アルゴリズムによって行われる。
［連鎖不平衡解析］
連鎖不平衡は、２つ以上の座位における対立遺伝子の非ランダムな関係であり、疾患形質に関与する遺伝子をマッピングする強力なツールである(Ajioka R.S. 等, 1997参照)。２対立遺伝子マーカーは、ヒトゲノムで密な間隔であり、かつ遺伝子マーカーの他の種類（ＲＦＬＰまたはＶＮＴＲマーカーなどの）よりも多数でゲノタイピングすることができるため、連鎖不平衡に基づく遺伝分析で特に有用である。
【０２９２】
疾患変異が最初に（新たな変異または変異キャリアの移動によって）集団に導入された場合、それは必然的に、単一染色体上に、したがって連結したマーカーの単一「背景」または「祖先」のハプロタイプ上に存在する。結果として、これらのマーカーと疾患変異との間には完全な不平衡が存在し：特定のセットのマーカー対立遺伝子の存在下でのみ疾患変異が見つけられる。続く世代を通して、組換え事象が疾患変異とこれらのマーカーの多型との間に起こり、不平衡は次第に散逸する。この散逸のペースは、組換え頻度の関数であり、そのため、疾患遺伝子に最も近いマーカーは、さらに離れているマーカーよりも高いレベルの不平衡を表すだろう。組換えによって破壊されていない場合、「祖先」のハプロタイプおよび異なる遺伝子座におけるマーカー対立遺伝子間の連鎖不平衡を、系統のみならず、集団によってもまた追跡することができる。連鎖不平衡は通常、１つの遺伝子座における１つの特定の対立遺伝子と、第２遺伝座におけるもう１つの特定の対立遺伝子との間の関連性として見なされる。
【０２９３】
疾患とマーカー遺伝子座との間のパターンまたは曲線は、疾患遺伝子座で起こる最大を示すと考えられる。結果として、疾患対立遺伝子と、密に連結した遺伝子マーカーとの間の連鎖不平衡の量から、疾患遺伝子の位置に関する価値ある情報が得られる。疾患遺伝子座の精密スケールのマッピングには、研究領域におけるマーカー間に存在する連鎖不平衡パターンのいくつかの知識を有することが有用である。上述のように、連鎖不平衡解析によって達成されたマッピングの分解能は、連鎖研究よりもはるかに高い。連鎖不平衡解析と組み合わせた２対立遺伝子マーカーの密度が高いことによって、精密スケールのマッピングに強力なツールが得られる。連鎖不平衡を計算するための異なる方法は、「統計学的方法」という表題の下で以下に記述される。
［形質−マーカー関連の集団に基づく症例対照研究］
上述のように、同一染色体上の異なる遺伝子座における特定の対立遺伝子対の出現はランダムではなく、ランダムからのずれは連鎖不平衡と呼ばれる。関連研究は集団頻度に焦点を合わせており、連鎖不平衡の現象に依拠している。所定の遺伝子における特定の対立遺伝子が、特定の形質を生じることに直接関与している場合、その頻度は統計的に、形質ネガティブな集団またはランダムな対照集団における頻度と比較して、罹患した（形質ポジティブ）集団では増大するだろう。連鎖不平衡が存在する結果として、形質の原因となる対立遺伝子を保有するハプロタイプに存在する他のすべての対立遺伝子の頻度もまた、形質ネガティブな個体またはランダム対照と比較して、形質ポジティブな個体において増大するだろう。したがって、形質と、形質の原因となる対立遺伝子と連鎖不平衡にある対立遺伝子（特に、２対立遺伝子マーカー対立遺伝子）との間の関連は、その特定領域における形質関連遺伝子の存在を示唆するのに十分であるだろう。２対立遺伝子マーカーに対して、症例対照集団をゲノタイピングして、形質の原因となる対立遺伝子を厳密に位置付ける関連性を同定することができる。形質と関連する所定の１つのマーカーと連鎖不平衡にある任意のマーカーは形質と関連するだろう。限定数の遺伝子多型（特に、２対立遺伝子マーカー）の症例対照集団における相対頻度を、形質の原因となる対立遺伝子を見つけるために、すべての可能性のある機能的多型をスクリーニングする代替として解析することが、連鎖不平衡によって可能となる。関連研究では、血縁関係のない症例対照集団においてマーカー対立遺伝子の頻度を比較し、関連研究は、複合形質を検出するための強力なツールである。
症例対照集団（選択基準）
集団に基づく関連研究は、家族性遺伝に関係せず、症例対照集団において特定の遺伝子マーカーまたは１セットのマーカーの罹患率を比較する。それらは、血縁関係のないケース（罹患した、または形質ポジティブな）個体および血縁関係のない対照（罹患していない、形質ネガティブまたはランダムな）個体の比較に基づく症例対照研究である。対照群は、罹患していない、または形質ネガティブな個体で構成されることが好ましい。さらに、対照群は、ケース集団と民族的に一致する。さらに、対照群は、研究中の形質の主要な公知の混乱因子に関してケース集団と一致することが好ましい（例えば、年齢依存性形質に対しては年齢一致）。理想的には、２つのサンプルにおける個体が、それらの疾患症状でのみ異なると考えられるように対をなす。「形質ポジティブな集団」、「ケース集団」および「罹患した集団」という用語は、本明細書において同義で用いられる。
【０２９４】
関連研究を用いた複合形質の解析における重要な段階は、症例対照集団の選択である(LanderおよびSchork, 1994参照)。症例対照集団の選択での主要な段階は、所定の形質または表現型の臨床的定義である。本明細書で提案された関連研究によって、形質ポジティブおよび形質ネガティブな表現型群に含まれる個体を注意深く選択することによって、いずれの遺伝形質も解析することができる。４つの基準：臨床的表現型、発病年齢、家族歴および重症度が有用である場合が多い。連続的または量的形質（例えば、血圧など）の選択手順は、非重複の表現型を有するこれらの形質ポジティブおよび形質ネガティブな集団の個体に含めるために、研究中の形質の表現型分布の反対端における個体を選択することを含む。症例対照集団は、表現型的に均一な集団を含むことが好ましい。形質ポジティブおよび形質ネガティブな集団は、それぞれ、研究中の全集団の１〜９８％、好ましくは１〜８０％、さらに好ましくは１〜５０％、さらに好ましくは１〜３０％、最も好ましくは１〜２０％に相当し、かつ、好ましくは非重複の表現型を示す個体の中で選択される、個体の表現型的に均一な集団を含む。２つの形質表現型間の差異が明らかであるほど、２対立遺伝子マーカーとの関連性を検出する確率も高くなる。これらの劇的に異なるが、比較的均一な表現型の選択により、研究中の集団のサンプルサイズが十分有意であるという条件で、関連研究での効率的な比較および遺伝子レベルでの著しい差異の可能性のある検出が可能となる。
【０２９５】
好ましい実施形態では、５０〜３００の形質ポジティブな個体、好ましくは約１００個体の第１群が、それらの表現型に従って集められる。同様な数の対照個体もかかる研究に含まれる。
関連解析
本発明は、以下の段階：ａ）本発明のゲノタイピング法に従って、形質ポジティブな集団において少なくとも１つのＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーの頻度を決定する段階；ｂ）本発明のゲノタイピング法に従って、対照集団において前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーの頻度を決定する段階；ｃ）統計的に有意な関連性が前記遺伝子型と前記表現型との間に存在するかどうかを決定する段階；を含む、遺伝子型と表現型との関連性を検出する方法もまた包含する。さらに、遺伝子型と表現型との関連性を検出する本発明の方法は、この開示に、または以下に記述される、単独またはいずれかの組み合わせで指定される制限を有する方法を包含し：任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１８、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１７、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１２およびＡ１６、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記対照集団は、形質ネガティブな集団、またはランダムな集団であり；任意に、前記ゲノタイピング段階ａ）およびｂ）それぞれは、前記集団それぞれに由来のプールされた生体サンプルで行われ；任意に、前記ゲノタイピング段階ａ）およびｂ）それぞれは、前記集団における各個体に由来する生体サンプルまたはそのサブサンプルで別々に行われる。
【０２９６】
候補遺伝子を保有する領域に由来する２対立遺伝子マーカーを用いて、関連研究を実施する一般的な方策は、両方の群において本発明の２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子頻度を測定し、かつ統計的に比較するために、個体の２つの群（症例対照集団）をスキャンすることである。
【０２９７】
統計的に有意な形質との関連性が、解析された２対立遺伝子マーカーの少なくとも１つまたは複数に関して同定された場合、どちらかの関連する対立遺伝子が形質を生じる直接的な原因であるか（つまり、関連性のある対立遺伝子が形質の原因となる対立遺伝子）、あるいは関連する対立遺伝子が形質の原因となる対立遺伝子と連鎖不平衡である可能性が高いと仮定することができる。候補遺伝子の機能に関して、関連する対立遺伝子の特異性は通常、関連する対立遺伝子と形質との間の関係（因果的または連鎖不平衡）への更なる洞察を与える。証拠から、候補遺伝子内の関連する対立遺伝子が最もおそらく、形質の原因となる対立遺伝子ではなく、実際の形質の原因となる対立遺伝子と連鎖不平衡である場合、次いで、関連マーカーの近傍をシーケンシングし、反復法で明らかにされる多型で更なる関連研究を行うことによって、形質の原因となる対立遺伝子を見つけることができる。
【０２９８】
関連研究は通常、２つの連続段階で行われる。第１段階では、候補遺伝子からの減少した数の２対立遺伝子マーカーの頻度が、形質ポジティブおよび対照集団で決定される。解析の第２段階では、所定の形質の原因となる遺伝子座の位置が、関連領域からの高密度マーカーを用いてさらにリファインされる。しかしながら、研究中の候補遺伝子の長さが比較的短い場合には、ＣａｎＩｏｎの場合と同様に、単一段階は有意な関連性を確立するのに十分である。
ハプロタイプ解析
上述のように、疾患対立遺伝子を保有する染色体が最初に、変異または移入の結果として集団において現れる場合、変異体対立遺伝子は必然的に、１セットの連結したマーカーを有する染色体：祖先ハプロタイプ上に存在する。このハプロタイプを集団によって追跡することが可能であり、所定の形質とのその統計学的関連性を解析することができる。ハプロタイプ研究とも呼ばれる多点関連研究で単一ポイント（対立遺伝子）関連研究を補足することによって、関連研究の統計学的能力が向上する。このように、ハプロタイプの関連研究によって、祖先キャリアのハプロタイプの頻度および種類を定義することが可能となる。ハプロタイプ解析は、それによって個々のマーカーを要する解析の統計学的能力が向上するという点で重要である。
【０２９９】
ハプロタイプ頻度解析の第１段階において、本発明の同定された２対立遺伝子マーカーの種々の組み合わせに基づく、可能性のあるハプロタイプの頻度が決定される。次いで、ハプロタイプ頻度を、形質ポジティブな個体および対照個体の異なる集団に関して比較する。統計的に有意な結果を得るためにこの解析にかけられるべき形質ポジティブな個体の数は、通常３０〜３００の範囲であり、個体の好ましい数は５０〜１５０の範囲である。同じ考慮事項が、研究に使用される、罹患していない個体（またはランダム対照）の数に当てはまる。第１の解析の結果から、症例対照集団におけるハプロタイプ頻度が得られ、値が求められた各ハプロタイプ頻度に対して、ｐ値およびオッズ比が計算される。統計学的に有意な関連性が見出された場合、研究中の形質で影響を受ける所定のハプロタイプを保有する個体に対して、相対危険を近似することができる。
【０３００】
本発明のその他の実施形態は、以下の段階：ａ）ハプロタイプの頻度を推定するために、本発明の方法に従って、形質ポジティブな集団において少なくとも１つのハプロタイプの頻度を推定する段階；ｂ）ハプロタイプの頻度を推定するために、本発明の方法に従って、対照集団において前記ハプロタイプの頻度を推定する段階；ｃ）統計的に有意な関連性が前記ハプロタイプと前記表現型との間に存在するかどうかを決定する段階；を含む、ハプロタイプと表現型との間の関連性を検出する方法を包含する。さらに、ハプロタイプと表現型との関連性を検出する本発明の方法は、この開示に、または以下に記述される制限を有する方法を包含し：任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１８、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１７、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーは、Ａ１２およびＡ１６、およびその補体、または任意にそれと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーからなる群から選択され；任意に、前記対照集団は、形質ネガティブな集団、またはランダムな集団である。任意に、前記方法は、段階ｃ）の前に前記形質ポジティブな集団および前記対照集団において表現型を決定する追加の段階を含む。
相互作用解析
本発明の２対立遺伝子マーカーは、ポリジーンの相互作用から生じる検出可能な形質と関連する２対立遺伝子マーカーのパターンを同定するのにも使用することができる。連鎖していない遺伝子座における対立遺伝子間の遺伝的相互作用の解析には、本明細書で記述される技術を用いた個々のゲノタイピングが必要である。適切なレベルの統計的有意性を有する２対立遺伝子マーカーの選択されたセット間での対立遺伝子相互作用の解析は、ハプロタイプ解析と見なすことができる。相互作用解析は、第１遺伝子座に対する所定のハプロタイプに関して症例対照集団を層別化し、各分集団において第２遺伝子座についてハプロタイプ解析を実施することを含む。
【０３０１】
関連研究で使用される統計学的方法をさらに以下に記述する。
［関連性の存在下での連鎖の試験］
本発明の２対立遺伝子マーカーはさらに、ＴＤＴ（伝達／不平衡試験）で使用することが可能である。ＴＤＴでは、連鎖および関連性の両方について試験し、ＴＤＴは集団の層別化によって影響を受けない。ＴＤＴには、罹患した個体およびそれらの親のデータまたは親の代わりに、罹患していない兄弟姉妹からのデータが必要である(Spielmann S. 等, 1993; Schaid D.J. 等, 1996, Spielmann S. および Ewens W.J., 1998を参照のこと)。一般に、このように組み合わされた試験によって、別々の解析によって生じる偽陽性のエラーが低減される。
〈統計学的方法〉
一般に、形質および遺伝子型が統計学的に有意な相関性を示すかどうかを試験するための当技術分野で公知の方法を使用することが可能である。
【０３０２】
（１）連鎖解析における方法
連鎖解析に有用な統計学的方法およびコンピュータープログラムは、当業者にはよく知られている(Terwilliger J.D. and Ott J., 1994; Ott J., 1991参照)
（２）集団におけるハプロタイプ頻度を推定する方法
上述のように、遺伝子型をスコアリングする場合、ヘテロ接合体を区別することが可能でないことが多く、そのため、ハプロタイプ頻度を容易に推測することができない。配偶子相が未知の場合には、ハプロタイプ頻度を多遺伝子座の遺伝子型データから推定することができる。当業者に公知のいずれかの方法を用いて、ハプロタイプ頻度を推定することができる(Lange K., 1997; Weir, B.S., 1996参照)。好ましくは、最尤ハプロタイプ頻度を期待値最大化（ＥＭ）アルゴリズムを用いてコンピューターで計算する(Dempster 等, 1977; Excoffier L. およびSlatkin M., 1995参照)。この手順は、配偶子相が未知の場合に、多遺伝子座の遺伝子型データからハプロタイプ頻度の最尤推定値を得ることを目的とする反復プロセスである。ハプロタイプの推定は通常、例えばＥＭ−ＨＡＰＬＯプログラム(Hawley M.  E.  等, 1994)またはＡｒｌｅｑｕｉｎプログラム（Schneider 等, 1997)を用いたＥＭアルゴリズムを適用することによって実施される。ＥＭアルゴリズムは、推定への、一般化された反復最尤法アプローチであり、それを以下に簡潔に説明する。
【０３０３】
「集団におけるハプロタイプ頻度を推定する方法」という本発明のセクションで、表現型とは、未知のハプロタイプ相を有する多遺伝子座の遺伝子型を意味すると考えられることを留意されたい。遺伝子型とは、公知のハプロタイプ相を有する多遺伝子座の遺伝子型を意味すると考えられる。
【０３０４】
Ｋマーカーに対して分類されるＮ個の血縁関係のない個体のサンプルを有すると仮定する。観察されたデータは、Ｆの異なる表現型で分類することができる未知相のＫ個の遺伝子座の表現型である。さらに、Ｈ個の可能性のあるハプロタイプを有すると仮定する（Ｋ個の２対立遺伝子マーカーの場合には、可能性のあるハプロタイプの最大数Ｈ＝２Kを有する）。
【０３０５】
ｃj個の可能性のある遺伝子型を有する表現型ｊについては：
【０３０６】
【数１】
2004525614.tif 000004
（式中、Ｐjは、ｊth表現型の確率であり、Ｐ（ｈk、ｈl）は、ハプロタイプｈkおよびｈlで構成されるｉth遺伝子型の確率である）を有する。任意交配（ハーディ−ワインベルク平衡）下では、Ｐ（ｈkｈl）は：
【０３０７】
【数２】
2004525614.tif 000005
と表される。
【０３０８】
Ｅ−Ｍアルゴリズムは以下の段階で構成される：最初に、ハプロタイプ頻度の１セットの初期値から遺伝子型頻度を推定する。これらのハプロタイプ頻度は、Ｐ1(0)、Ｐ2(0)、Ｐ3(0)、…、ＰH(0)で示される。ハプロタイプ頻度の初期値は、乱数発生から、または当技術分野でよく知られている他のいくつかの方法で得られる。この段階を期待値段階と呼ぶ。最大化段階と呼ばれる、この方法での次の段階は、遺伝子型頻度の測定値を用いて、ハプロタイプ頻度を再計算することからなる。最初の反復ハプロタイプ頻度推定値は、Ｐ1(1)、Ｐ2(1)、Ｐ3(1)、…、ＰH(1)によって示される。一般に、ｓth反復での期待値段階は、前の反復のハプロタイプ頻度に基づいて、可能性のある異なる遺伝子型に各表現型を配置する確率を計算することからなる：
【０３０９】
【数３】
2004525614.tif 000006
式中、ｎjは、ｊth表現型を有する個体の数であり、Ｐj（ｈk、ｈl）は、表現型ｊにおける遺伝子型ｈk、ｈlの確率である。遺伝子計数法(Smith, Ann. Hum. Genet., 21:254-276, 1957)に等しい最大化段階では、遺伝子型推定値に基づいて、ハプロタイプ頻度を再推定する：
【０３１０】
【数４】
2004525614.tif 000007
式中、δitは、ｉth遺伝子型に存在するハプロタイプｔの出現数を計数する、可変の指標であり；それは、０、１、および２の値をとる。
【０３１１】
Ｅ−Ｍ反復は、以下の判定基準に達している場合に停止する。最尤推定（ＭＬＥ）理論を用いて、表現型ｊは多項分布であると仮定する。各反復にて、尤度関数Ｌをコンピューターで計算することができる。２つの連続した反復間の対数尤度の差が、いくつかの小さい数よりも小さい場合、好ましくは１０-7である場合に収束が達成される。
（３）マーカー間の連鎖不平衡を計算する方法
多数の方法を用いて、２つの遺伝子位置間の連鎖不平衡を計算することが可能であり、実際には、集団から採取したハプロタイプのデータに統計学的関連試験を適用することによって、連鎖不平衡が測定される。
【０３１２】
マーカーＭiにおける対立遺伝子（ａi／ｂi）およびマーカーＭjにおける対立遺伝子（ａj／ｂj）を有する、本発明の２対立遺伝子マーカー（Ｍi、Ｍj）の少なくとも１つを含む２対立遺伝子マーカーの任意の対間の連鎖不平衡を、ピアッツァの式：
【０３１３】
【数５】
2004525614.tif 000008
（式中、(４＝  −  −  ＝Ｍiで対立遺伝子ａiを有さない、かつＭjで対立遺伝子ａjを有さない遺伝子型の頻度
(３＝  −  ＋  ＝Ｍiで対立遺伝子ａiを有さない、かつＭjで対立遺伝子ａjを有する遺伝子型の頻度
(２＝  ＋  −  ＝Ｍiで対立遺伝子ａiを有する、かつＭjで対立遺伝子ａjを有さない遺伝子型の頻度）
に従って、対立遺伝子のすべての組み合わせ（ａi、ａj；ａi、ｂj；ｂi、ｂjおよびｂi、ｂj）について計算することができる。
【０３１４】
２対立遺伝子マーカー（Ｍi、Ｍj）対間の連鎖不平衡（ＬＤ）も、Weir (Weir B.  S., 1996) によって記述されているようにデルタの最尤推定値（ＭＬＥ）（複合遺伝子型不平衡係数）に従って、対立遺伝子のすべての組み合わせ（ａi、ａj；ａi、ｂj；ｂi、ｂjおよびｂi、ｂj）に対して計算することができる。複合連鎖不平衡のＭＬＥは：
【０３１５】
【数６】
2004525614.tif 000009
式中、ｎ1＝Σ表現型（ａi／ａi、ａj／ａj）、ｎ2＝Σ表現型（ａi／ａi、ａj／ｂj）、ｎ3＝Σ表現型（ａi／ｂi、ａj／ａj）、ｎ4＝Σ表現型（ａi／ｂi、ａj／ｂj）であり、Ｎはサンプル中の個体数である。
【０３１６】
この式によって、ハプロタイプではなく、遺伝子型のデータのみが入手可能であれば、対立遺伝子間の連鎖不平衡を推定することが可能となる。
【０３１７】
マーカー間の連鎖不平衡を計算する他の方法は以下のとおりである。１組の２対立遺伝子マーカーＭi（ａi／ｂi）およびＭj（ａj／ｂj）に対して、ハーディ・ワインベルク平衡をあてはめると、上述の手法に従って、所定の集団における可能性のある４つのハプロタイプの頻度を推定することができる。
【０３１８】
ａiおよびａj間の配偶子不平衡の推定は単に：
【０３１９】
【数７】
2004525614.tif 000010
であり、
式中、ｐｒ（ａi）は対立遺伝子ａiの確率であり、ｐｒ（ａj）は対立遺伝子ａjの確率であり、ｐｒ（ハプロタイプ（ａi、ａj））は上記の式３と同様に推定される。
【０３２０】
１組の２対立遺伝子マーカーに関しては、ＭiとＭjとの間の関連性を説明するのに必要な不平衡の測定は、１回のみである。
【０３２１】
次いで、上記の正規化値は以下のように計算される：
【０３２２】
【数８】
2004525614.tif 000011
当業者であれば、他の連鎖不平衡の計算法を使用することができることは容易に理解されよう。
【０３２３】
適切なヘテロ接合率を有する１組の２対立遺伝子マーカーの間の連鎖不平衡は、５０〜１０００の血縁関係のない個体、好ましくは７５〜２００、さらに好ましくは約１００の血縁関係のない個体間でゲノタイピングすることによって決定することができる。
（４）関連性についての試験
２対立遺伝子マーカーにおける対立遺伝子またはかかる対立遺伝子で構成されるハプロタイプの場合には、表現型と遺伝子型との間の相関性の統計的有意性を決定する方法は、当技術分野で公知の統計学的試験および必要とされる統計的有意性の許容閾値で決定される。特定の方法の適用および有意性の閾値は、当業者にはよく知られている。
【０３２４】
ケースおよび対照集団において２対立遺伝子マーカー対立遺伝子の頻度を決定し、研究中の形質および２対立遺伝子マーカー対立遺伝子との間の相関性を示すと考えられる、統計学的に有意な頻度の差が存在するかどうかを決定するために統計学的試験でこれらの頻度を比較することによって、関連性についての試験が行われる。同様に、ケースおよび対照集団において、所定の組の２対立遺伝子マーカーの可能性のあるすべてのハプロタイプの頻度を推定し、研究中のハプロタイプと表現型（形質）との間の統計学的に有意な相関性が存在するかどうかを決定するために統計学的試験でこれらの頻度を比較することによって、ハプロタイプ解析を行う。遺伝子型と表現型との間の統計学的に有意な関連性について試験するのに有用な統計学的ツールを使用することができる。用いられる統計学的試験は、１つの自由度を有するカイ２乗検定であることが好ましい。Ｐ値は計算される（Ｐ値は、観測値以上の統計値が偶然生じる確率である）。
【０３２５】
統計学的有意性
好ましい実施形態において、更なる診断試験の正の基準としての、または早期の予防的治療の先行開始点としての診断目的のための有意性、２対立遺伝子マーカーの関連性に関するｐ値は、単一２対立遺伝子マーカー解析に関しては、好ましくは約１×１０-2以下、さらに好ましくは約１×１０-4以下であり、２種類以上のマーカーを要するハプロタイプ解析に関しては、約１×１０-3以下、さらに好ましくは１×１０-6以下、最も好ましくは約１×１０-8以下である。これらの値は、単一マーカーまたは複数のマーカーの組み合わせを要するいずれの関連研究にも適用可能であると考えられる。
【０３２６】
当業者は、本発明の２対立遺伝子マーカーで関連研究を行うために、開始点として上記に示す値の範囲を用いることができる。そうすることで、本発明の２対立遺伝子マーカーと形質との間の有意な関連性を明らかにし、診断および薬物スクリーニングの目的に使用することができる。
表現型順列
上述の第１段階のハプロタイプ解析の統計学的有意性を確認するために、症例対照個体からのゲノタイピングデータをプールし、形質表現型に対してランダム化する、更なる解析を行うことが適切である可能性がある。第１段階で得られたデータをコンパイルするのに使用される症例対照集団として同数の個体を含む２つの群に各個体のゲノタイピングデータをランダムに割り当てる。第２段階のハプロタイプ解析は、好ましくは、最も高い相対危険係数を示す第一段階の解析のハプロタイプに含まれるマーカーに対して、これらの人為的な群で行われることが好ましい。この実験は、少なくとも１００〜１０００回繰り返し行うことが好ましい。その繰り返される反復法によって、試験されたハプロタイプを偶然に得る確率を決定することが可能となる。
【０３２７】
統計学的関連性の評価
偽陽性の問題に取り組むために、ランダムなゲノム領域における同じ症例対照集団で同様な解析が行われる。ランダム領域および候補領域における結果は、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、「Methods, Software And Apparati For Identifying Genomic Regions Harboring A Gene Associated With A Dtectable Trait」という名称の係属中の米国特許仮出願、１９９８年１１月１０日出願の米国特許第６０／１０７，９８６号に記載のように比較される。
（５）危険因子の評価
危険因子（遺伝子疫学において、危険因子は、マーカー遺伝子座における特定の対立遺伝子またはハプロタイプの存在または非存在である）と、疾患との関連性は、オッズ比（ＯＲ）および相対危険（ＲＲ）によって測定される。Ｐ（Ｒ+）が個体に対する疾患を発生する確率であり、ＲおよびＰ（Ｒ+）が危険因子に暴露されない個体に対する疾患を発生する確率であるとすると、次いで、相対危険は単に２つの確率の比であり、つまり：
【０３２８】
【数９】
2004525614.tif 000012
である。
【０３２９】
症例対照研究では、相対危険の直接的な測定値は、サンプリングデザインのために得ることができない。しかしながら、オッズ比によって、低発生率の相対危険をうまく近似することが可能となり、オッズ比を計算することができる：
【０３３０】
【数１０】
2004525614.tif 000013
Ｆ+は、症例群における危険因子への暴露の頻度であり、Ｆ-は、対照群における危険因子への暴露の頻度である。Ｆ+およびＦ-は、研究の対立遺伝子頻度またはハプロタイプ頻度を用いて計算され、さらに根底にある遺伝モデル（優性、劣性、付加的・・・）によって異なる。所定の危険因子が原因の形質を示す集団における個体の比率を表す寄与危険（ＡＲ）をさらに推定することができる。この測定値は、疾患病因における特定の因子の役割を定量化する点で、かつ危険因子の公衆衛生上の影響の面で重要である。この測定値の公衆衛生上の関連性は、対象の暴露が存在しない場合に防ぐことができる、集団における疾患の症例の比率を推定することにある。ＡＲは以下のとおり決定される：
【０３３１】
【数１１】
2004525614.tif 000014
ＡＲは、２対立遺伝子マーカー対立遺伝子または２対立遺伝子マーカーハプロタイプに起因し得る危険である。ＰEは、一般の集団内の対立遺伝子またはハプロタイプへの暴露の頻度であり；ＲＲは、研究中の形質が一般集団において比較的低い発生率を有する場合、オッズ比で近似される相対危険である。
〈本発明の２対立遺伝子マーカーと連鎖不平衡にある２対立遺伝子マーカーの同定〉
第１の２対立遺伝子マーカーが対象のゲノム領域で同定されていれば、本発明の教示を用いて、当業者はこの第１マーカーと連鎖不平衡にあるその他の２対立遺伝子マーカーを容易に同定することができる。上述のように、形質に関連する第１マーカーと連鎖不平衡にあるマーカーは形質と関連するだろう。したがって、所定の遺伝子マーカーと形質との間の関連性が実証されれば、この特定の領域における２対立遺伝子マーカーの密度を高めるために、この形質に関連するその他の２対立遺伝子マーカーの発見は大いに興味深い。原因の遺伝子または変異が、形質との最も高い相関性を示すマーカーまたはマーカーのセットの付近で見つけられるだろう。所定のマーカーと連鎖不平衡にあるその他のマーカーの同定は：（ａ）複数の個体からの第１の２対立遺伝子マーカーを含むゲノム断片を増幅する段階；（ｂ）前記第１の２対立遺伝子マーカーを有するゲノム領域における第２の２対立遺伝子マーカーを同定する段階；（ｃ）前記第１の２対立遺伝子マーカーおよび第２の２対立遺伝子マーカーとの間の連鎖不平衡解析を行う段階；（ｄ）前記第１マーカーとの連鎖不平衡にある前記第２の２対立遺伝子マーカーを選択する段階；を含む。段階（ｂ）および（ｃ）を含むサブコンビネーションもまた企図される。
【０３３２】
２対立遺伝子マーカーを同定し、連鎖不平衡解析を行う方法は本明細書に記述されており、不当な実験を行うことなく当業者によって実施することができる。次いで、本発明は、２対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ１８と連鎖不平衡にあり、かつ所定の形質とのそれらのそれぞれの関連の面から同様の特性を示すと考えられる２対立遺伝子マーカーにも関する。
〈機能変異の同定〉
検出可能な表現型または形質の原因であるＣａｎＩｏｎ遺伝子における変異は、形質ポジティブな個体および対照個体からのＣａｎＩｏｎ遺伝子の配列と比較することによって同定することができる。正の関連性が本発明の２対立遺伝子マーカーで確認されれば、同定された遺伝子座を変異についてスキャンすることができる。好ましい実施形態において、ＣａｎＩｏｎ遺伝子のエクソンおよびスプライス部位などの機能領域、プロモーターおよび他の調節領域を、変異についてスキャンする。好ましい実施形態では、形質ポジティブな個体および対照個体において、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の配列を比較する。形質ポジティブな個体は、形質と関連すると示されるハプロタイプを保有し、形質ネガティブな個体は、形質と関連するハプロタイプまたは対立遺伝子を保有しないことが好ましい。検出可能な形質または表現型は、変更されたＣａｎＩｏｎ機能の様々な発現を含む場合がある。
【０３３３】
変異の検出手順は、２対立遺伝子マーカーの同定に使用される手順と本質的に同様である。かかる変異を検出するのに使用される方法は一般に、以下の段階：
−形質ポジティブな患者および形質ネガティブな対照のＤＮＡサンプルからの形質と関連する２対立遺伝子マーカーまたは２対立遺伝子マーカーの群を含むＣａｎＩｏｎ遺伝子の領域の増幅；
−その増幅された領域のシーケンシング；
−形質ポジティブな個体および対照個体に由来するＤＮＡ配列の比較；
−形質ポジティブな患者に特異的な変異の決定；
を含む。
【０３３４】
一実施形態において、前記２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１８、およびその補体からなる群から選択される。次いで、本明細書に記載の手順などのゲノタイピング手順を用いて、好ましくは個々の試験形式でマイクロシーケンシング技術を用いて、症例および対照のより大きな集団をスクリーニングすることによって、候補多型を検証することが好ましい。多型は、予想される関連性の結果と適合する頻度で症例および対照において存在する場合には、候補変異と見なされる。多型は、検出可能な表現型との統計学的に有意な相関性を示す場合には、候補「形質の原因となる」変異と見なされる。
〈遺伝子診断の方法における本発明の２対立遺伝子マーカー〉
本発明のＣａｎＩｏｎ核酸配列および２対立遺伝子マーカーを使用して、特定の遺伝子型の結果として検出可能な形質を表す個体、またはその遺伝子型がその後の時点で検出可能な形質を発生する危険にそれらをさらす個体を同定することができる診断試験を開発することもできる。かかる診断は、精神分裂病、双極性障害、および他のＣＮＳ障害、例えばてんかんおよび疼痛性障害、心疾患、高血圧、不整脈などの心臓血管性疾患、および多数の他の疾患および症状を含む、多数の疾患または症状の段階的、モニタリング、予後および／または予防的または治療的な療法に有用であり得る。
【０３３５】
本発明の診断技術には、試験対象が検出可能な形質を発生する増大した危険性と関連する２対立遺伝子マーカーパターンを有するかどうか、あるいはその個体が特定の変異の結果としての検出可能な形質を有するかどうかを決定するために、家系研究、単一精子ＤＮＡ解析もしくは体細胞雑種などのハプロタイピングのための個々の染色体の解析を可能にする方法を含む、様々な方法論を用いることが可能である。
【０３３６】
本発明は、個体が、ＣａｎＩｏｎ遺伝子における変異または多型から生じる疾患を発生する危険性があるかどうか、またはその疾患を患っているかどうかを決定する診断方法を提供する。本発明は、個体が、精神分裂病および双極性障害に対する、あるいは当技術分野で公知の、または本明細書に記述される他のカルシウムチャンネルに関連する症状のいずれかに対する罹病性を有するかどうかを決定する方法も提供する。
【０３３７】
これらの方法は、個体から核酸サンプルを採取することと、その核酸サンプルが、特定のＣａｎＩｏｎ多型または変異（形質の原因となる対立遺伝子）を有する結果として、個体が形質を表現することを示す、または形質を発生する危険性を示す、少なくとも１つの対立遺伝子または少なくとも１つの２対立遺伝子マーカーハプロタイプを含有するかどうかを決定することを含む。
【０３３８】
かかる診断法において、核酸サンプルを個体から採取し、「２対立遺伝子マーカーに対してＤＮＡサンプルをゲノタイピングする方法」に上述されている方法を用いて、このサンプルをゲノタイピングすることが好ましい。その診断法は、単一の２対立遺伝子マーカーまたは２対立遺伝子マーカーのグループに基づく。
【０３３９】
これらの方法それぞれにおいて、核酸サンプルは試験対象から採取され、２対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ１８のうち１つまたは複数の２対立遺伝子マーカーパターンが決定される。
【０３４０】
一実施形態において、ＰＣＲ増幅を核酸サンプルで行い、検出可能な表現型に関連する多型が同定されている領域を増幅する。増幅産物をシークエンスして、個体が検出可能な表現型に関連する１種または複数種のＣａｎＩｏｎ多型を保持するかどうかを決定する。増幅産物を産生するのに使用されるプライマーは、表１に列挙するプライマーを含む。代替方法として、核酸サンプルを上述のようにマイクロシーケンシング反応にかけて、ＣａｎＩｏｎ遺伝子における変異または多型から生じる検出可能な表現型と関連する１種または複数種のＣａｎＩｏｎ多型を、個体が保持するかどうかを決定する。マイクロシーケンシング反応に使用されるプライマーは、表４に列挙するプライマーを含む。他の実施形態では、検出可能な表現型に関連する１種または複数種のＣａｎＩｏｎ対立遺伝子と特異的にハイブリダイズする、１つまたは複数の対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドプローブと、核酸サンプルとを接触させる。ハイブリダイゼーションアッセイに使用されるプローブには、表３に列挙されるプローブが含まれる。他の実施形態において、増幅反応において対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドと共に使用される場合に、増幅産物を生成することができる第２ＣａｎＩｏｎオリゴヌクレオチドと、核酸サンプルとを接触させる。増幅反応において増幅産物が存在することから、個体が検出可能な表現型と関連する１つまたは複数のＣａｎＩｏｎ対立遺伝子を保持することが示される。
【０３４１】
好ましい実施形態において、Ａ１〜Ａ１８およびその補体からなる群から選択される少なくとも１つの２対立遺伝子マーカーに存在するヌクレオチドの同一性を決定し、その検出可能な形質は精神分裂病および双極性障害である。診断用キットは、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを備える。
【０３４２】
これらの診断方法は、特定の状況において使用して、予防治療を開始、または有意なハプロタイプを保持する個体が軽微な症状などの危険信号を予見することができるため、非常に価値がある。
【０３４３】
薬物に対する反応または薬物に対する副作用を分析かつ予測する診断は、個体を特定の薬物で治療すべきかどうかを決定するのに使用することも可能である。例えば、個体が特定の薬物を用いた治療にポジティブに反応する見込みが診断から示される場合、その薬物を個体に投与することが可能である。逆に言えば、個体が特定の薬物を用いた治療にネガティブに反応する可能性があることが、診断により示された場合には、治療の代わりの過程が指示される。ネガティブな反応は、有効な反応の非存在または有毒な副作用の存在として定義される。
【０３４４】
臨床薬物試験によって、本発明のマーカーの別の用途が表される。精神分裂病または双極性障害または他のカルシウムチャンネルに関連する症状に対して作用する作用薬に対する反応、あるいは精神分裂病または双極性障害または他のカルシウムチャンネルに関連する症状に対して作用する作用薬に対する副作用を示す、１種または複数種のマーカーを上述の方法を用いて同定することが可能である。その後、かかる作用薬の臨床試験における潜在的な参加者をスクリーニングして、薬物に有利に反応する可能性の高い個体を同定し、副作用を経験する可能性のある個体を排除する。そのように、研究においてポジティブに反応する見込みのない個体を包含した結果として、測定を低下させることなく、かつ望ましくない安全上問題の危険を冒すことなく、薬物にポジティブに反応する個体において薬物治療の有効性が測定される。
【０３４５】
特に好ましい実施形態において、本発明の診断法を用いて解析した形質は、精神分裂病または双極性障害である。しかしながら、本発明はまた、関連する障害、特に関連するＣＮＳ障害を予防、診断、管理および治療する方法において、本発明の２対立遺伝子マーカーを使用して、本明細書に記述される予防、診断、予後および治療のいずれも含む。例としては、関連する障害は、精神障害の診断・統計便覧第４版(Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders fourth edition )（ＤＳＭ−ＩＶ）の分類を用いて定義される、精神異常、気分障害、自閉症、物質依存およびアルコール中毒、疼痛性障害、てんかん、精神遅滞、および認知障害、不安障害、摂食障害、衝動調節障害、および人格障害を含む他の精神障害を含む。他の疾患には、アンギナ、高血圧、または不整脈などの心臓血管性疾患が含まれる。
【０３４６】
〈組換えベクター〉
本明細書において「ベクター」という用語は、二本鎖または一本鎖のいずれかであり、かつ細胞宿主または単細胞もしくは多細胞宿主生物に導入されることが求められる対象の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、環状もしくは直鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指すために使用される。
【０３４７】
本発明は、ＣａｎＩｏｎゲノム配列に由来する調節ポリヌクレオチド、および／またはＣａｎＩｏｎゲノム配列もしくはｃＤＮＡ配列に由来するコードポリヌクレオチドを含む組換えベクターのファミリーを包含する。
【０３４８】
一般に、本発明の組換えベクターは、制御配列、コード配列およびポリヌクレオチド構築物を含む、本明細書で記述されるポリヌクレオチドのいずれか、ならびに上記で定義される任意のＣａｎＩｏｎプライマーもしくはプローブを含む。特に、本発明の組換えベクターは、「ＣａｎＩｏｎ遺伝子のゲノム配列」のセクション、「ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡ配列」のセクション、「コード領域」のセクション、「ポリヌクレオチド構築物」のセクション、および「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」のセクションに記述されるポリヌクレオチドのいずれかを含み得る。
【０３４９】
第１の好ましい実施形態において、本発明の組換えベクターを使用して、配列番号１〜３または配列番号６のゲノム配列に由来する、挿入されたポリヌクレオチド、またはＣａｎＩｏｎｃＤＮＡ、例えば適切な細胞宿主中で配列番号４のｃＤＮＡを増幅する。このポリヌクレオチドは組換えベクターが複製する毎に増幅される。
【０３５０】
本発明による組換えベクターの好ましい実施形態は、本発明の調節ポリヌクレオチドまたはコード核酸のいずれか、またはどちらも含む発現ベクターを含む。特定の実施形態内で、ＣａｎＩｏｎタンパク質に対して作られる特異的抗体を産生するために、次いで精製され、リガンドスクリーニングアッセイにおいて、または免疫原として使用することができるＣａｎＩｏｎポリペプチドを発現させるために、発現ベクターが用いられる。他の実施形態では、その発現ベクターは、トランスジェニック動物を作製するために使用され、また遺伝子治療にも使用される。発現には、適切なシグナルがベクターにおいて提供されることが必要であり、前記シグナルは、宿主細胞中で対照の遺伝子の発現を操作する、ウイルスおよび哺乳類ソース両方からのエンハンサー／プロモーターなどの種々の調節エレメントを含む。産物を発現する永続的な、安定な細胞クローンを確立するための優性（dominant）薬物選択マーカーは、ポリペプチドの発現に薬物選択マーカーの発現を結びつけるエレメントであることから、一般に本発明の発現ベクターに含まれる。
【０３５１】
特に、本発明は、ＣａｎＩｏｎタンパク質、好ましくは配列番号５のアミノ酸配列のＣａｎＩｏｎタンパク質またはその変異体もしくは断片をコードする核酸を含む発現ベクターに関する。
【０３５２】
本発明は、ＣａｎＩｏｎコード配列の発現に有用な組換えベクターに関し、前記ベクターは配列番号４の核酸を含む。
【０３５３】
ＣａｎＩｏｎ関連２対立遺伝子マーカーを含有する核酸を含む組換えベクターもまた、本発明の一部である。好ましい実施形態では、前記２対立遺伝子マーカーは、Ａ１〜Ａ１８、およびその補体からなる群から選択される。
【０３５４】
本発明のベクターにおいて見出すことができるエレメントの一部を以下のセクションでさらに詳細に説明する。
【０３５５】
本発明は、ａ）標的にされた遺伝子の内在性染色体ＤＮＡ中に外来性（異種）ポリヌクレオチドを挿入し、ｂ）内在性染色体ＤＮＡを除去し、かつ／またはｃ）内在性染色体ＤＮＡを外来性ポリヌクレオチドと置き換えるために操作されている、脊椎動物起源、好ましくは哺乳類起源および特にヒト起源の一次、二次、および不死化された相同的組換え宿主細胞もまた包含する。ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失、および／または置換は、標的遺伝子と作動可能に関連する、標的遺伝子のコード配列および／または調節領域、例えばプロモーターおよびエンハンサー配列に対するものである。
【０３５６】
本発明はさらに、細胞中で正常に発現しない標的遺伝子の発現を変化させる、インビトロまたはインビボで相同的組換え宿主細胞を作製する方法に関する。その変化によって、正常な成長条件下または標的遺伝子によってコードされるポリペプチドを生成するのに適切な条件下にて、標的遺伝子の発現が起こることが好ましい。その方法は、以下の段階：（ａ）ポリヌクレオチド構築物をインビボまたはインビトロで細胞に移入する段階であって、そのポリヌクレオチド構築物が：（ｉ）ターゲティング配列；（ｉｉ）制御配列および／またはコード配列；および（ｉｉｉ）必要な場合には、不対のスプライスドナー部位を含み、それによって移入細胞が生成される段階と、（ｂ）相同的組換えに適切な条件下にて、インビトロまたはインビボで移入細胞を保持する段階と、を含む。
【０３５７】
本発明はさらに、細胞中で正常に発現しない標的遺伝子の発現をインビボまたはインビトロにて細胞中で変化させる方法であって、以下の段階：（ａ）ポリヌクレオチド構築物をインビボまたはインビトロで細胞に移入する段階であって、そのポリヌクレオチド構築物が：（ｉ）ターゲティング配列；（ｉｉ）制御配列および／またはコード配列；および（ｉｉｉ）必要な場合には、不対のスプライスドナー部位を含み、それによって移入細胞が生成される段階と、（ｂ）相同的組換えに適切な条件下にて、インビトロまたはインビボで移入細胞を保持し、それによって相同的組換え細胞が生成される段階と、（ｃ）遺伝子の発現に適切な条件下にて、インビボまたはインビトロで相同的組換え細胞を保持する段階と、を含む方法に関する。
【０３５８】
本発明はさらに、細胞中で正常に発現しない標的内在性遺伝子の発現をインビボまたはインビトロにて細胞中で変化させることによって本発明のポリペプチドを生成する方法であって、以下の段階：（ａ）ポリヌクレオチド構築物をインビボまたはインビトロで細胞に移入する段階であって、そのポリヌクレオチド構築物が：（ｉ）ターゲティング配列；（ｉｉ）制御配列および／またはコード配列；および（ｉｉｉ）必要な場合には、不対のスプライスドナー部位を含み、それによって移入細胞が生成される段階と、（ｂ）相同的組換えに適切な条件下にて、インビトロまたはインビボで移入細胞を保持し、それによって相同的組換え細胞が生成される段階と、（ｃ）遺伝子の発現に適切な条件下にて、インビボまたはインビトロで相同的組換え細胞を保持し、それによってポリペプチドが生成される段階と、を含む方法に関する。
【０３５９】
本発明はさらに、遺伝子が正常に発現しない細胞型において標的遺伝子の発現を変化させるポリヌクレオチド構築物に関する。これは、ポリヌクレオチド構築物が標的細胞の染色体ＤＮＡに挿入された場合に起こり、そのポリヌクレオチド構築物は：（ａ）ターゲティング配列；（ｂ）制御配列および／またはコード配列；および（ｃ）必要な場合には、不対のスプライスドナー部位；を含む。上述のようなポリヌクレオチド構築物がさらに含まれ、その構築物はさらに、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、染色体ＤＮＡとの相同的組換え後、標的内在性遺伝子とインフレームである。
【０３６０】
その組成物は、米国特許第６，０５４，２８８号；同第６，０４８，７２９号；同第６，０４８，７２４号；同第６，０４８，５２４号；同第５，９９４，１２７号；同第５，９６８，５０２号；同第５，９６５，１２５号；同第  ５，８６９，２３９号；同第５，８１７，７８９号；同第５，７８３，３８５号；同第  ５，７３３，７６１号；同第５，６４１，６７０号；同第５，５８０，７３４号；国際特許公開番号：ＷＯ９６／２９４１１、ＷＯ９４／１２６５０；およびKoller 等, PNAS 86:8932-8935 (1989)を含む化学論文に記載ような、当技術分野での技術によって行われる方法によって生成される。
１．本発明の発現ベクターの一般的な特徴
本発明による組換えベクターは、制限されないが、ＹＡＣ  （酵母人工染色体）、  ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ファージ、ファージミド、コスミド、プラスミドまたは染色体、非染色体を含み、半合成ＤＮＡおよび合成ＤＮＡを含む直鎖ＤＮＡ分子でさえ含む。かかる組換えベクターは：
（１）遺伝子発現において調節の役割を有する１つまたは複数の遺伝子エレメント、例えばプロモーターまたはエンハンサー（エンハンサーは、転写を高めるプロモーターに作用する、ＤＮＡのシス作用エレメントであり、通常約１０〜３００ｂｐの長さである）；
（２）ｍＲＮＡに転写され、最終的にポリペプチドに翻訳される構造またはコード配列であって、前記構造またはコード配列が（１）に記載の調節エレメントに作動可能に連結される配列；
（３）適切な転写開始および終止配列；
の集合を含む転写ユニットを含み得る。酵母または真核発現系での使用が意図される構造ユニットは、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含むことが好ましい。一方、組換えタンパク質がリーダー配列または輸送（transport)配列なしで表現する場合、Ｎ末端残基を含む。最終産物を得るために、この残基は、発現された組換えタンパク質から実質的に切断してもよいし、しなくてもよい。
【０３６１】
一般に、組換え発現ベクターは、複製開始点、宿主細胞の形質転換を可能にする選択可能なマーカー、および下流の構造配列の直接転写を指示する、高度に発現した遺伝子に由来するプロモーターを含むだろう。その異種構造配列は、翻訳開始および終止配列、および好ましくは、翻訳されたタンパク質の分泌を細胞膜周辺腔または細胞外媒体に指示することができるリーダー配列で適切な相において組み立てられる。ベクターが哺乳類宿主細胞において所望の配列を移入し、発現させるために適応される特定の実施形態において、好ましいベクターは、所望の宿主において複製開始点、適切なプロモーターおよびエンハンサー、また必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、スプライスドナーおよびアクセプター部位、転写終止配列、および５’フランキング非転写配列を含むだろう。ＳＶ４０ウイルスゲノム、例えばＳＶ４０起源に由来するＤＮＡ配列、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化シグナルを用いて、必要とされる非転写遺伝子エレメントを提供することが可能である。
【０３６２】
配列番号５のＣａｎＩｏｎポリペプチドまたはその断片もしくは変異体のインビトロでの発現は、宿主生物における天然遺伝子の発現に、または生物学的に不活性なＣａｎＩｏｎタンパク質の生成に関連する遺伝的欠陥を正すために有用である。結果として、本発明は、治療すべき患者の生物体中の適切な遺伝物質を導入することにより、配列番号５のＣａｎＩｏｎポリペプチドまたはその断片もしくは変異体をインビトロで産生するために主に設計された組換え発現ベクターもまた含む。生物体から予め抽出された遺伝物質は、細胞中にインビトロで導入し、その修飾された細胞は続いて、前記生物体における適切な組織中にインビボで直接再導入される。
２．調節エレメント
プロモーター
本発明による発現ベクターで使用される適切なプロモーター領域は、異種遺伝子が発現されなければならない細胞宿主を考慮に入れて選択される。対象の核酸配列の発現を調節するのに用いられる特定のプロモーターは、標的にされた細胞中での核酸の発現を検出することができる限り、重要であるとは考えられない。したがって、ヒト細胞が標的にされる場合、例えばヒトもしくはウイルスプロモーターなどの、ヒト細胞中で発現させることができるプロモーターに隣接し、そのプロモーターの制御下に核酸コード領域を位置付けることが好ましい。
【０３６３】
適切なプロモーターは、それが発現を調節する核酸に対して異種であるか、またはその代わりに、発現されるコード配列を含有する天然ポリヌクレオチドに内在性であり得る。さらに、プロモーターは、その中に構築物プロモーター／コード配列が挿入されている組換えベクターに対しては一般に異種である。
【０３６４】
プロモーター領域は、例えばＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター、さらに好ましくはｐＫＫ２３２−８およびｂｐＣＭ７を用いて、望ましい遺伝子から選択することができる。
【０３６５】
好ましい細菌プロモーターは、ＬａｃＩ、ＬａｃＺ、Ｔ３〜Ｔ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐプロモーター（ＥＰ００３６７７６）、ポリヘドリンプロモーター、またはバキュロウイルスからのｐ１０タンパク質プロモーター（Ｋｉｔ  Ｎｏｖａｇｅｎ）  (Smith 等, 1983; O'Reilly 等, 1992)、ラムダＰＲプロモーター、またはさらにｔｒｃプロモーターである。
【０３６６】
真核性プロモーターには、ＣＭＶ前初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期および後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ、およびマウスのメタロチオネイン−Ｌが含まれる。便利なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベル内で十分である。
【０３６７】
プロモーターの選択は、遺伝子工学分野の業者の能力内で十分である。例えば、Sambrook 等 (1989)またはFuller 等 (1996)により記述されている手順もまた参照のこと。
他の調節エレメント
ｃＤＮＡインサートが使用される場合、通常、遺伝子転写物の適切なポリアデニル化をもたらすための、ポリアデニル化シグナルを含むことが望まれるだろう。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施の成功には重要でないと考えられ、ヒト成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルなど、かかる配列が使用される。発現カセットのエレメントとして、ターミネーターもまた企図される。これらのエレメントは、メッセージレベルを高め、かつカセットから他の配列への読み過し(read through)を最小限にする役割を果たし得る。
３．選択可能なマーカー
かかるマーカーは細胞に同定可能な変化を与え、それによって発現構築物を含有する細胞を容易に同定することが可能となるだろう。形質転換された宿主細胞を選択するための選択可能なマーカー遺伝子は、真核細胞培養にはジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、酵母にはＴＰＲ１、または大腸菌においてテトラサイクリン、リファマイシンもしくはアンピシリン耐性、またはマイクバクテリアにはレバンスクラーゼであることが好ましく、後者のマーカーは、ネガティブ選択用マーカーである。
４．好ましいベクター
細菌ベクター
非制限的ではあるが代表的な例として、細菌使用に有用な発現ベクターは、選択可能なマーカーと、ｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミドに由来する細菌複製開始点とを含み得る。かかる市販のベクターには、例えばｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、スウェーデン、Ｕｐｐｓａｌａ）およびＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ社、米国、ウィスコンシン州マディソン）が含まれる。
【０３６８】
多数の他の適切なベクターは、当業者には公知であり、以下の細菌ベクター：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ社）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）；ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）；ｐＱＥ−３０（ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ社）などの市販されているベクターである。
バクテリオファージベクター
Ｐ１バクテリオファージベクターは、範囲約８０〜約１００ｋｂの大きなインサートを含有する。ｐ１５８またはｐ１５８／ｎｅｏ８などのＰ１バクテリオファージベクターの作製は、とりわけSternberg (1992, 1994)によって記述されている。ＣａｎＩｏｎヌクレオチド配列を含む組換えＰ１クローンが、４０ｋｂを超える大きさのポリヌクレオチドを挿入するために設計される(Linton 等, 1993)。トランスジェニックの実験でＰ１  ＤＮＡを産生するために、好ましいプロトコルは、McCormick 等 (1994)によって記述されているプロトコルである。簡単には、Ｐ１プラスミドを有する大腸菌（好ましくは株ＮＳ３５２９）は、カナマイシン２５μｇ／ｍｌを含有する適切な肉汁培地中で一晩成長させる。製造元の説明書に従って、Ｑｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社、米国カリフォルニア州チャッツワース）を用いてアルカリ溶解によって、Ｐ１  ＤＮＡを大腸菌から作製する。キットに含まれる洗浄および溶出バッファーを使用して、２つのＱｉａｇｅｎ−ｔｉｐ  ５００カラム上で、そのＰ１  ＤＮＡを細菌ライセートから精製する。次いで、７０％エタノールでＤＮＡを沈殿させる前に、フェノール／クロロホルム抽出を行う。ＴＥ（１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中でＤＮＡを可溶化した後、そのＤＮＡ濃度を分光測定法によって評価する。
【０３６９】
目標が、トランスジェニック動物、通常トランスジェニックマウスにおいてＣａｎＩｏｎヌクレオチド配列を含むＰ１クローンを発現することである場合、例えば、Ｐ１ポリリンカー内のレアカット（rare-cutting）部位でＰ１  ＤＮＡを切断することによって（ＳｆｉＩ、ＮｏｔＩまたはＳａｌＩ）、Ｐ１  ＤＮＡ断片からベクター配列を除去することが望ましい。次いで、ＹＡＣからのＤＮＡの単離のための、元々報告されている方法と同様な方法を用いて、パルスフィールドアガロースゲル上でベクター配列からＰ１インサートを精製する(Schedl 等, 1993a; Peterson 等, 1993)。この段階で、必要な場合には、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−ＭＣフィルターユニット（分子量限界３０，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国、マサチューセッツ州ベッドフォード）上で得られた精製インサートＤＮＡを濃縮し、次いで、微小透析膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ＶＳ型、０．０２５μＭ）上で１００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０μＭスペルミン、７０  μＭスペルミジンを含有する微量注入バッファー（１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ  ７．４；２５０μＭ  ＥＤＴＡ）に対して透析することができる。１％アガロース（Ｓｅａ  Ｋｅｍ  ＧＴＧ；ＦＭＣ  Ｂｉｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）パルスフィールドゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムで染色することによって、精製したＰ１  ＤＮＡの完全性を評価する。
バキュロウイルスベクター
配列番号５のＣａｎＩｏｎポリペプチドまたはその断片もしくは変異体の発現に適切なベクターは、昆虫細胞および昆虫細胞系において増殖することができるバキュロウイルスベクターである。特定の適切な宿主ベクター系は、Spodoptera frugiperdaに由来するＳＦ９細胞系（ＡＴＣＣ  Ｎ°ＣＲＬ  １７１１）を移入するのに使用される、ｐＶＬ１３９２／１３９３バキュロウイルストランスファーベクター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）である。
【０３７０】
バキュロウイルス発現系における、配列番号５のＣａｎＩｏｎポリペプチドまたはその断片もしくは変異体の発現に適切な他のベクターには、Chai 等 (1993), Vlasak 等 (1983) and Lenhard 等 (1996)によって記述されているベクターが含まれる。
ウイルスベクター
特定の一実施形態において、ベクターはアデノウイルスに由来する。本発明による好ましいアデノウイルスベクターは、FeldmanおよびSteg (1996)またはOhno 等 (1994)によって記述されているベクターである。本発明のこの特定の実施形態による、他の好ましい組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス２型または５型（Ａｄ２またはＡｄ５）または動物起源のアデノウイルス（フランス特許出願Ｎ°ＦＲ−９３．０５９５４参照）である。
【０３７１】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、外来性ポリヌクレオチドをインビトロで、特にヒトを含む哺乳類に導入するために選択される組換え遺伝子送達システムであると一般に理解される。これらのベクターによって、細胞中に遺伝子が効率的に送達され、導入された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡに安定に組み込まれる。
【０３７２】
本発明のレトロウイルスのインビトロまたはインビボ遺伝子送達媒体の調製または作製に、特に好ましいレトロウイルスには、ミンク細胞増殖巣誘導ウイルス、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスからなる群から選択されるレトロウイルスが含まれる。特に好ましいマウス白血病ウイルスには、４０７０Ａおよび１５０４Ａウイルス、アベルソン（ＡＴＣＣ番号  ＶＲ−９９９）、フレンド（ＡＴＣＣ番号  ＶＲ−２４５）、グロス（ＡＴＣＣ番号  ＶＲ−５９０）、ラウシャー（ＡＴＣＣ番号  ＶＲ−９９８）およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ番号  ＶＲ−１９０；ＰＣＴ出願番号ＷＯ９４／２４２９８）が含まれる。特に好ましいラウス肉腫ウイルスには、ブライアン高力価（ＡＴＣＣ番号  ＶＲ−３３４、ＶＲ−６５７、ＶＲ−７２６、ＶＲ−６５９およびＶＲ−７２８）が含まれる。他の好ましいレトロウイルスベクターは、Roth 等 (1996)、ＰＣＴ出願第ＷＯ９３／２５２３４、ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０６９２０、Roux 等, 1989, Julan 等, 1992およびNeda 等, 1991に記述されているベクターである。
【０３７３】
本発明によって企図される、さらに他のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を含む。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および生産的な生活環のためにヘルパーウイルスとしてアデノウイルスもしくはヘルペスウイルスなどの他のウイルスを必要とする、天然に存在する欠陥ウイルスである(Muzyczka 等, 1992)。それは、非分裂細胞中にそのＤＮＡを組み込むことが可能であり、かつ高頻度の安定な組み込みを示す、わずかなウイルスのうちの１つでもある（Flotte 等, 1992; Samulski 等, 1989; McLaughlin 等, 1989)。ＡＡＶの１つの有利な特徴は、形質転換された細胞に対して一次細胞を形質導入する有効性が低下していることに由来する。
ＢＡＣベクター
細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローニングシステム(Shizuya 等, 1992)は、大腸菌中でゲノムＤＮＡの大きな断片（１００〜３００ｋｂ）を安定に維持するように開発されている。好ましいＢＡＣベクターは、Kim 等 (1996)によって記述されているｐＢｅｌｏＢＡＣ１１ベクターを含む。ＢＡＣライブラリーは、ベクターにおいてＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ部位にライゲーションすることを可能にする酵素を用いて一部消化されているサイズ選択されたゲノムＤＮＡを使用して、このベクターで作製される。フランキングするこれらのクローニング部位は、ＲＮＡ転写またはＰＣＲ法によって末端のプローブを産生するために使用することができる、Ｔ７およびＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ転写開始部位である。大腸菌におけるＢＡＣライブラリーの構築後、ＢＡＣ  ＤＮＡを宿主細胞から超らせんサークルとして精製する。これらの環状分子の直線状への変換は、サイズ決定およびＢＡＣの受容細胞への導入のどちらよりも前に起こる。クローニング部位は、２つのＮｏｔＩ部位によってフランキングされ、クローン化されたセグメントをＮｏｔＩ消化によってベクターから切り出すことが可能となる。代替方法としては、ｐＢｅｌｏＢＡＣ１１ベクター中に含まれるＤＮＡインサートは、固有のｃｏｓＮ部位で切断を導く市販の酵素ラムダターミナーゼ（terminase）でＢＡＣベクターを処理することによって直鎖化することが可能であるが、この切断方法によって、インサートＤＮＡおよびＢＡＣ配列のどちらも含有する完全長ＢＡＣクローンが生じる結果となる。
５．組換えベクターの送達
本発明のポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド構築物の発現を起こすために、これらの構築物を細胞中に送達しなければならない。この送達は、細胞系を形質転換するための実験手順と同様にインビボで、または特定の疾患状態の治療と同様にインビトロもしくはエクスビボで達成される。
【０３７４】
１つのメカニズムは、発現構築物が感染性ウイルス粒子中にカプセル化されるウイルス感染である。
【０３７５】
培養された哺乳類細胞にポリヌクレオチドを導入する、いくつかの非ウイルス的な方法もまた本発明によって企図され、限定されないが、リン酸カルシウム沈殿（Graham 等, 1973; Chen 等, 1987)、ＤＥＡＥ−デキストラン(Gopal, 1985)、電気穿孔法(Tur-Kaspa 等, 1986; Potter 等, 1984)、  直接微量注入(Harland 等, 1985)、ＤＮＡ−添加リポソーム（Nicolau 等, 1982; Fraley 等, 1979)、および受容体−仲介移入(Wu および Wu, 1987; 1988)が含まれる。これらの技術の一部は、インビボまたはエクスビボでの用途に上手く適応させることができる。
【０３７６】
発現ポリヌクレオチドが細胞中に送達されたら、それは、受容細胞のゲノムに安定に組み込まれる。この組み込みは、相同的組換えによって同族（cognate)位置および向きにあるか（遺伝子置換）、またはランダム、非特異的な位置に組み込まれる（遺伝子増強）。更なる実施形態において、ＤＮＡの別々のエピソームセグメントとして、核酸を細胞中に安定に維持する。かかる核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞サイクルと無関係に、または宿主細胞サイクルと同期して、維持および複製することを可能にするのに十分な配列をコードする。
【０３７７】
脊椎動物の細胞内部にインビボでタンパク質またはペプチドを送達するための方法についての特定の実施形態は、生理学的に許容可能な担体と、対象のポリペプチドを操作的にコードする裸のポリヌクレオチドとを含む標本を、細胞を含有する組織の間質空間に導入する段階を含み、それによって、裸のポリヌクレオチドは細胞内部に取り込まれ、生理的効果を有する。これは特に、インビトロでの伝達に適用可能であるが、インビボでも適用することができる。
【０３７８】
「裸の」ポリヌクレオチドを含むインビトロおよびインビボで使用される組成物は、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９０／１１０９２（Ｖｉｃａｌ社）およびＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／１１３０７（Institut Pasteur, INSERM, Universite d'Ottawa)ならびにTacson 等 (1996)およびHuygen 等 (1996)の文献にも記述されている。
【０３７９】
本発明のさらに他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチド構築物を含む、本発明の裸のポリヌクレオチドの細胞中への伝達は、粒子照射（微粒子発射物）で進められ、Klein 等 (1987)に記述されているように、前記粒子は、細胞膜を貫通し、それらを殺すことなく細胞に入ることが可能となる高速に加速されたＤＮＡコーティング微粒子発射物である。
【０３８０】
更なる実施形態において、本発明のポリヌクレオチドはリポソーム中に閉じ込められる(GhoshおよびBacchawat, 1991; Wong 等, 1980; Nicolau 等, 1987)。
【０３８１】
特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記述されるＣａｎＩｏｎタンパク質またはポリペプチドをインビボで生成するための組成物を提供する。その組成物は、生理学的に許容可能な担体中に溶液中に、かつ組織細胞に前記タンパク質またはポリペプチドを発現させるために組織中に導入するのに適している、このポリペプチドを操作的にコードする裸のポリヌクレオチドを含有する。
【０３８２】
所望の宿主生物に注入されるベクターの量は、注入部位に応じて異なる。指示用量として、動物体内、好ましくは哺乳類体内、例えばマウス体内に、ベクター０．１〜１００μｇが注入されるだろう。本発明によるベクターの他の実施形態では、それは、宿主細胞中にインビトロで、処理される動物から予め収集された宿主細胞中に、さらに好ましくは筋細胞などの体細胞中に導入される。続く段階では、体内に組換えタンパク質を局所的または全身的に送達するために、所望のＣａｎＩｏｎポリペプチドまたは所望のその断片をコードするベクターで形質転換された細胞を動物体内に再導入する。
〈細胞宿主〉
本発明の別の目的は、本明細書に記述されるポリヌクレオチドの１つ、特にＣａｎＩｏｎ調節ポリヌクレオチドまたは配列番号１〜４からなる群から選択されるＣａｎＩｏｎポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を形質転換または移入した宿主細胞を含む。上述のベクターの１つなどの組換えベクターを、形質転換した宿主細胞（原核細胞）または移入した宿主細胞（真核細胞）もまた含まれる。特に、本発明の細胞宿主は、「ＣａｎＩｏｎ遺伝子のゲノム配列」のセクション、「ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡ配列」のセクション、「コード領域」のセクション、「ポリヌクレオチド構築物」のセクション、および「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」のセクションに記述されるポリヌクレオチドのいずれかを含み得る。
【０３８３】
本発明による更なる組換え細胞宿主は、Ａ１〜Ａ１８およびその補体からなる群から選択される２対立遺伝子マーカーを含有するポリヌクレオチドを含む。
【０３８４】
本発明によるその他の組換え細胞宿主は、本明細書に記述されるベクターのいずれか、特に「組換えベクター」セクションで記述されるベクターのいずれかを含む。
【０３８５】
本発明の発現ベクターのレシピエントとして使用される好ましい宿主細胞は以下のとおりである：
ａ）原核宿主細胞：大腸菌株（Ｉ．Ｅ．ＤＨ５−α株）、枯草菌、ネズミチフス菌、およびシュードモナス属、ストレプトマイセス属およびブドウ球菌などの種からの株。
【０３８６】
ｂ）真核宿主細胞：ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎ°ＣＣＬ２；Ｎ°ＣＣＬ２．１；Ｎ°ＣＣＬ２．２）、Ｃｖ１細胞（ＡＴＣＣ  Ｎ°ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ細胞  （ＡＴＣＣ  Ｎ°ＣＲＬ１６５０；Ｎ°ＣＲＬ１６５１）、Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣ  Ｎ°ＣＲＬ１７１１）、Ｃ１２７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎ°  ＣＲＬ−１８０４）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎ°  ＣＲＬ−６３６１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ  Ｎ°ＣＣＬ−６１）、ヒト腎２９３（ＡＴＣＣ  Ｎ°４５５０４；Ｎ°ＣＲＬ−１５７３）およびＢＨＫ（ＥＣＡＣＣ  Ｎ°８４１００５０１；Ｎ°８４１１１３０１）。
【０３８７】
ｃ）他の哺乳類宿主細胞。
【０３８８】
哺乳類、および通常ヒトの細胞におけるＣａｎＩｏｎ遺伝子発現は欠陥のある状態にするか、またはその代わりに、本発明によるＣａｎＩｏｎポリヌクレオチドによって動物細胞のゲノム中のＣａｎＩｏｎ遺伝子対応物が置換された、ＣａｎＩｏｎゲノムまたはｃＤＮＡ配列の挿入で進行させることが可能である。これらの遺伝子の変化は、上述されている特定のＤＮＡ構築物を用いた相同的組換え事象によって引き起こされる。
【０３８９】
使用することができる細胞宿主の種類は、マウス接合体などの哺乳類接合体である。例えば、マウス接合体に、例えば１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、  １００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する２５０μＭ  ＥＤＴＡ、３０μＭ  スペルミン、  ７０μＭスペルミジン中で、ＢＡＣインサートに対しては１ｎｇ／ｍｌ、Ｐ１バクテリオファージインサートに対しては３ｎｇ／μｌの濃度範囲に予め調節された対象の精製ＤＮＡ分子を微量注入する。微量注入するＤＮＡのサイズが大きい場合、Schedl 等 (1993b)よって記述されているように、このＤＮＡの機械的な破損を避けるために、ポリアミドおよび高い塩濃度を使用することができる。
【０３９０】
本明細書に記述されるＤＮＡ構築物を含む本発明のポリヌクレオチドのいずれか１つは、胚幹（ＥＳ）細胞系、好ましくはマウスＥＳ細胞系に導入することが可能である。ＥＳ細胞系は、着床前胚盤胞の内部細胞塊の多能性の、未委任（uncommitted）細胞に由来する。好ましいＥＳ細胞系は、以下の：ＥＳ−Ｅ１４ＴＧ２ａ（ＡＴＣＣ  ｎ°ＣＲＬ−１８２１）、ＥＳ−Ｄ３（ＡＴＣＣ  ｎ°ＣＲＬ１９３４およびｎ°ＣＲＬ−１１６３２）、ＹＳ００１（ＡＴＣＣ  ｎ°ＣＲＬ−１１７７６）、３６．５（ＡＴＣＣ  ｎ°ＣＲＬ−１１１１６）である。未委託状態でＥＳ細胞を維持するために、この胚の表現型を保存する適切なシグナルを提供し、かつＥＳ細胞接着のための基質としての役割を果たす成長抑制されたフィーダー細胞の存在下で、それらは培養される。好ましいフィーダー細胞は、実質的に任意のマウス細胞株の１３日目から１４日目の胚の組織から樹立され、Abbondanzo 等(1993)によって記述されているように培養液中で維持され、Robertson (1987)により記述のように照射によって、またはPease and Williams (1990)によって記述されているように抑制濃度のＬＩＦの存在によって成長を抑制された胚線維芽細胞である。
【０３９１】
宿主細胞中の構築物を従来の手法で使用して、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を産生することができる。
【０３９２】
適切な宿主を形質転換し、その宿主を適切な細胞密度に成長させた後に、温度変化または化学誘導などの適切な手段によって、選択されたプロモーターを誘導し、細胞を更なる期間培養する。
【０３９３】
細胞は通常、遠心分離によって収集され、物理的または化学的手段によって破壊され、その結果得られた粗抽出物をさらに精製するために保持する。
【０３９４】
タンパク質の発現に用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクリング、音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む、いずれかの簡便な方法によって破壊することができる。かかる方法は、当技術者にはよく知られている。
〈トランスジェニック動物〉
本明細書において「トランスジェニック動物」または「宿主動物」という用語は、本発明による核酸のうちの１つを含ませるために遺伝子的または人工的に操作されたそれらのゲノムを有する動物を指すために使用される。好ましい動物は非ヒト動物であり、本発明による核酸の挿入によって人工的かつ遺伝子的に改変されたそれらのゲノムを有するＭｕｓ（例えば、マウス）、クマネズミ属（例えば、ラット）およびＯｒｙｃｔｏｇａｌｕｓ（例えば、ウサギ）から選択される属に属する動物が含まれる。一実施形態において、本発明は、非ヒト宿主動物と、本発明の組換えベクターまたはノックアウトベクターを用いた相同的組換えによって破壊されたＣａｎＩｏｎ遺伝子を含む動物とを包含する。
【０３９５】
本発明のトランスジェニック動物はすべて、複数のそれらの細胞内に、クローン化された組換えまたは合成ＤＮＡ配列、さらに詳細には、ＣａｎＩｏｎコード配列、ＣａｎＩｏｎ調節ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド構築物、または本明細書に記述されるようなアンチセンスポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を含む、精製または単離された核酸の１つを含む。
【０３９６】
一般に、本発明によるトランスジェニック動物は、本発明に記述されるポリヌクレオチド、組換えベクターおよび細胞宿主のいずれか１つを含む。特に、本発明のトランスジェニック動物は、「ＣａｎＩｏｎ遺伝子のゲノム配列」のセクション、「ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡ配列」のセクション、「コード領域」のセクション、「ポリヌクレオチド構築物」のセクション、および「オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマー」のセクション、「組換えベクター」のセクションおよび「細胞宿主」のセクションに記述されるポリヌクレオチドのいずれかを含み得る。
【０３９７】
本発明の更なるトランスジェニック動物は、それらの体細胞および／またはそれらの生殖系列細胞中に、Ａ１〜Ａ１８、およびその補体からなる群から選択される２対立遺伝子マーカーを含むポリヌクレオチドを含有する。
【０３９８】
第１の好ましい実施形態において、トランスジェニック動物は、特に天然ＣａｎＩｏｎタンパク質、もしくはその代わりとして変異体ＣａｎＩｏｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドの１つまたはいくつかのコピーが挿入されたゲノム内のトランスジェニック動物に関して、細胞分化に関連する多様な病理を研究するのに良い実験モデルである。
【０３９９】
第２の好ましい実施形態において、これらのトランスジェニック動物は、対象のこのタンパク質の合成で良好な収量を導き、最終的に対象のこのタンパク質の組織特異的な発現を導く、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の調節ポリヌクレオチドの制御下にて対象の所望のポリペプチドを発現する。
【０４００】
本発明のトランスジェニック動物の設計は、当業者によく知られている従来の技術に従って行われる。トランスジェニック動物、および特にトランスジェニックマウスの作製に関するその他の詳細は、例えば、それが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第４，８７３，１９１号；同第５，４６４，７６４号；  および同第５，７８９，２１５号で見つけることができる。本発明のトランスジェニック動物は、外来性遺伝物質を組み込んだゲノムを有する動物をもたらす手順を適用することによって作製される。その手順は、ＣａｎＩｏｎコード配列、ＣａｎＩｏｎ調節ポリヌクレオチドまたは本明細書に記述するようにアンチセンスポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列をコードする、遺伝物質、またはその一部を得ることを含む。
【０４０１】
本発明のポリヌクレオチドは、胚またはＥＳ幹細胞系に挿入される。その挿入は、Thomas 等 (1987)によって記述されるように、電気穿孔法を用いて行うことが好ましい。電気穿孔法にかけられた細胞をスクリーニングして（例えば選択可能なマーカーによる選択によって、ＰＣＲによって、またはサザンブロット分析によって）、好ましくは相同的組換え事象を介して、外来性組換えポリヌクレオチドがそれらのゲノムに組み込まれたポジティブな細胞を見つける。本発明に従って使用することが可能な、実例となるポジティブ−ネガティブ選択手順は、Mansour 等 (1988)によって記述されている。
【０４０２】
次いで、Bradley (1987)によって記述されているように、ポジティブな細胞を単離し、クローン化し、マウス由来の３．５日目の胚盤胞に注入する。次いで、その胚盤胞を雌の宿主動物に挿入し、期間まで成長させる。
【０４０３】
代替方法として、Wood 等 (1993) またはNagy 等 (1993)によって記述されているように、ポジティブなＥＳ細胞を２．５日目の８〜１６細胞期（桑実胚）における胚と接触させる。そのＥＳ細胞は内部に取り入れられて、生殖系列を生じるであろう細胞を含む胚盤胞を広範囲にコロニー形成する。
【０４０４】
雌の宿主の子を試験して、どの動物が、例えば挿入された外来性ＤＮＡ配列を含むトランスジェニックであるか、どれが野生型であるかを決定する。
【０４０５】
このように、本発明は、核酸、組換え発現ベクターまたは本発明による組換え宿主細胞にも関係する。
［本発明のトランスジェニック動物に由来する組換え細胞系］
本発明の更なる目的は、本明細書に記述されるトランスジェニック動物から得られる組換え宿主細胞を含む。一実施形態では、本発明は、本発明の組換えベクターまたはノックアウトベクターでの相同的組換えによって破壊されたＣａｎＩｏｎ遺伝子を含む非ヒト宿主動物および動物に由来する細胞を包含する。
【０４０６】
組換え細胞系は、例えばChou (1989) およびShay 等 (1991)によって記述されているように、ＳＶ４０ラージＴ抗原などのオンコジーンを発現するベクターを初代細胞培養に移入することによって、本発明によるトランスジェニック動物のいずれかの組織から得られる細胞からインビトロで樹立される。
ＣａｎＩｏｎ修飾物質および相互作用物質のスクリーニング方法
多数の実施形態において、本発明は、ＣａｎＩｏｎポリペプチド、チャンネル、およびポリヌクレオチドの発現と相互作用する、その発現に結合する、またはその発現を活性化または抑制する化合物を提供する。かかる化合物は有機または無機化合物であることが可能であり、制限されないが、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、ヌクレオチド、アミノ酸、または小分子抑制剤または活性化剤が含まれる。本出願において他で記述されているように、かかる化合物は、多数の疾患または症状のいずれかを治療または予防するのに有用である。ＣａｎＩｏｎ活性または発現の抑制剤は、精神分裂病または双極性障害などの精神障害の治療または予防に使用することが好ましい。
〈ＣａｎＩｏｎチャンネル修飾物質のスクリーニング方法〉
ＣａｎＩｏｎに結合することができる化合物およびＣａｎＩｏｎ機能を調節することができる化合物は、疾患の治療において重要な用途を有する。電位作動性イオンチャンネルは一般的に、薬理学的に到達可能であり、様々な遺伝子によってコードされ、通常多量体タンパク質集合として作動し、結果として機能的かつ解剖学的な高い程度の特異性を生じることから、薬物標的として十分に確立されている。さらに、荷電電位感受性アミノ酸の移動を含むイオンチャンネルの開閉によって、コンフォメーションに変化が生じるため、イオンチャンネルによって、例えば伝導（活性化）または非伝導（不活性化）状態にあるチャンネルのみに結合する状態依存性分子を設計することが可能となる。
【０４０７】
さらに、多数のカルシウムチャンネル修飾物質が、多数の疾患または症状の治療または予防に有効であると実証されている。さらに、カルシウムチャンネル抑制剤は、種々の心臓血管疾患および症状（例えば、アンギナ、不整脈、高血圧）ならびにＣＮＡおよび神経細胞障害（例えば、片頭痛、脳卒中、神経遮断薬により誘導される遅発性ジスキネジア、精神分裂病、双極性障害、疼痛、てんかん等）に対して効果的であることが示されている。さらに、カルシウムチャンネル作動薬は、局所麻酔の持続時間を短くする場合、また他の点では局所麻酔の効果を減弱する場合など、種々の用途に有効であることが示されている。ＣａｎＩｏｎチャンネルの拮抗薬および作動薬は、これらの疾患および他の疾患および症状の治療または予防に同様に有用である。例えば、ＣａｎＩｏｎ拮抗薬は、精神分裂病および双極性障害の治療または予防に有用である。
【０４０８】
電位作動性イオンチャンネルは活性化するために作動薬の結合が必要でないため、機能ＣａｎＩｏｎチャンネルに対して化合物をスクリーニングすることが好ましい。アッセイには、天然のもしくはクローン化されたチャンネルを発現する細胞（小胞または膜）に、または全細胞アッセイに適用される機能および放射リガンド結合アプローチが含まれる。全細胞の機能アッセイでは、パッチクランプ法などの電気生理学的技術が使用される。アッセイは、いずれかの電位作動性チャンネル型、好ましくはＬ、Ｎ、およびＴ型チャンネルを含む。チャンネルを介した運動論的イオンフラックスもまた、蛍光、終点放射性トレーサーまたは細胞生死判別技術を用いて測定される。
【０４０９】
アッセイには、チャンネルに結合し、チャンネルを開口または閉口させる、種々の毒素、毒液または化合物（その開示内容全が参照により本明細書に組み込まれる、Denyer 等, Drug Disc. Today 3(7): 323-332 (1998))を利用することが可能である。一実施形態において、本発明のアッセイは、例えばポジティブまたはネガティブコントロールとしての、多数の公知のカルシウムチャンネル作動薬および拮抗薬のいずれかの使用を含む。適切な公知のカルシウムチャンネル拮抗薬の例には、フェニルアルキルアミン（例えば、ベラパミル）、ベンゾチアゼピン（例えば、ジルチアゼム）、およびジヒドロピリジン（例えば、ニフェジピン）が含まれ；カルシウムチャンネル作動薬には、ＦＰＬ−６４１７６およびＢＡＹ  Ｋ８６４４が含まれ；ナトリウムチャンネル作動薬には、バトラコトキシンが含まれ；ナトリウムチャンネル拮抗薬には、スピラドリン（spiradoline）、メキシレチン、Ｕ−５４４９４Ａ（＋／−）−シス−３，４−ジクロロ−Ｎ−メチル−Ｎ−［２−（１−ピロリジニル）−シクロヘキシル］−ベンズアミド）が含まれる。かかる化合物は、「リード」化合物として、つまりＣａｎＩｏｎチャンネルに特異的に結合する、またはＣａｎＩｏｎチャンネルを調節する誘導体分子を設計または発見するための出発分子としての役割を果たす化合物としても使用される。
【０４１０】
好ましい実施形態において、本発明のアッセイは、以下の段階：
ａ）（ｉ）ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片を含む、から本質的になる、またはからなるポリペプチドを含有するサンプルまたは宿主細胞、または（ｉｉ）ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片を含む、から本質的になる、またはからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する組換え宿主細胞を提供する段階；
ｂ）候補物質を得る段階；
ｃ）前記宿主細胞を前記候補物質と接触させる段階；
ｄ）ＣａｎＩｏｎ活性への前記候補物質の効果を決定する段階；
を含む、候補物質をスクリーニングする方法を含む。
【０４１１】
ＣａｎＩｏｎ活性への候補物質の効果の決定は、よく知られている方法に従って達成することができる。ＣａｎＩｏｎ活性への候補物質の効果は、作動薬または拮抗薬の効果であることが好ましい。一般に、イオン（例えば、Ｃａ２+または  Ｎａ+）を輸送する能力が減少した場合、化合物はＣａｎＩｏｎを抑制する。イオンを輸送する能力が増大した場合には、化合物はＣａｎＩｏｎを刺激する。
【０４１２】
ＣａｎＩｏｎ活性は、いずれかの適切な手段を用いて検出することができる。好ましい例では、ＣａｎＩｏｎ活性は、シグナル伝達事象を測定することによって検出される。シグナル伝達事象が、細胞に特有の分子または細胞のパラメーターの適切な変化を含むと同時に、シグナル伝達事象の非制限的な例には、イオンフラックスの変化、例えばＣａ２＋もしくはＮａ＋の変化または生成、あるいはＫ＋フラックスまたは酵素活性化が含まれる。
【０４１３】
一態様において、例えば、単一細胞からの、または膜パッチにおける細胞全体の電流を測定する技術を用いて、ＣａｎＩｏｎチャンネルの電気生理学的性質を測定することによって、イオンフラックスをモニターすることができる。他の実施例では、蛍光または放射標識を使用して、公知のＣａｎＩｏｎ結合化合物の置換を検出するか、または細胞全体にわたるイオンフラックスを検出することができる（例えば、標識されたＣａ２＋またはＮａ＋）。細胞生死判別のための蛍光指示薬など、細胞の生理学的パラメーターに対する指示薬を使用することができる。他の実施例において、蛍光活性化細胞選別の使用などで、指示薬の物理的位置の変化を検出して、生理学的指示薬の排除または取込みを同定することができる。
【０４１４】
本発明のアッセイで使用されるサンプルは、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片を含む、から本質的になる、またはからなるポリペプチドまたはポリペプチドを発現する宿主細胞、または（ｉｉ）ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片を含む、から本質的になる、またはからなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する組換え宿主細胞を含有する。本発明のＣａｎＩｏｎアッセイは、機能ＣａｎＩｏｎポリペプチドを発現する組換え宿主細胞の使用を含むことが好ましい。宿主細胞は、ＣａｎＩｏｎチャンネルの機能αサブユニットを発現するか、または含むか、あるいは１つまたは複数のその他のイオンチャンネルサブユニット、もしくはＣａｎＩｏｎを含むイオンチャンネル複合体を発現するか、または含むことが可能である。低い内因性イオンチャンネル発現または低い背景イオン、特にＣａ２＋および／またはＮａ＋伝導度を有する、宿主細胞を使用することが好ましい。
〔放射リガンド結合〕
一態様において、ＣａｎＩｏｎの対象の部位に結合し、かつ好ましくは所望の修飾作用を有する高親和性リガンドを同定し、前記の標識されたリガンドを置換する試験化合物の能力を検出することによって、ＣａｎＩｏｎチャンネルがスクリーニングされる。電位作動性（Ｃａ２＋、Ｎａ＋およびＫ＋）チャンネルアッセイで使用される毒物学的／薬理学的作用薬のリストは、Denyer 等 (上記)に示されている。この方法は一般に、標識化リガンドとして、同一部位に結合するか、またはその部位とアロステリックに結合する化合物を検出するのに適しているが、化合物の作動薬または拮抗薬の性質に関する情報は得られない。
〔細胞に基づく蛍光および放射性トレーサーアッセイ〕
他のアッセイにおいて、蛍光イオン試薬または放射標識されたイオンを用いて、浸透イオンの細胞内濃度の変化を測定することによって、ＣａｎＩｏｎ機能をモニターすることができる。
【０４１５】
通常、Ｎａ＋チャンネルなどのイオンチャンネルは、電位刺激後にミリ秒で不活性化する。Ｃａ２＋チャンネルは、不活性化を全く示さないか、または低い程度の不活性化を示し、高いＫ＋脱分極によって開口することができる。細胞に基づく蛍光および放射性トレーサーアッセイにおいて、ＣａｎＩｏｎチャンネルは一般に、毒素もしくはいずれかの試験化合物、または高いＫ＋脱分極によって活性化することが可能であり、その結果、そのチャンネルは長時間（何分かまで）開口する。
【０４１６】
蛍光に基づくアッセイにおいて、蛍光Ｃａ２＋染料を使用することができる（例えば、フルオ−３、カルシウムグリーン−１、分子プローブ、ＯＲ、米国）。Ｃａ２＋チャンネルは、等張液で膜を脱分極することによって、または毒素もしくは他の化合物でＮａ＋チャンネルを脱分極することによって活性化することが可能であり、その結果として生じる細胞中の蛍光の過渡的な移動を２０〜６０秒にわたって測定することができる。蛍光測定システムおよび装置については、Denyer 等 (上記)にさらに記述されている。一般的に、放射性トレーサー２２Ｎａ＋および１４Ｃ−グアニジンがＮａ＋チャンネル分析に使用され、Ｃａ２＋チャンネル分析には４５Ｃａ２＋が使用される。Denyer 等 (上記)に記載の好ましい実施形態において、Ｃｙｔｏｓｔａｒ−Ｔシンチレーションマイクロプレート（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社、英国）を使用して、ＣａｎＩｏｎ細胞に基づくハイスループットアッセイを実施する。
【０４１７】
更なるアッセイにおいて、イオンチャンネルのＣａ２＋機能を、膜電位指示薬を用いて膜電位を測定することによってモニターする。生体膜の電気抵抗が高いと、原形質膜全体にわたるわずかなイオン電流によって、膜電位の大きな変化が生じる。したがって、電位アッセイを便利に用いて、膜全体にわたる一般的なイオンフラックスを検出することができる。細胞系は一般に、内因性イオンチャンネルからの影響を最小限に抑えるように選択される。ある範囲の染料が、膜電位指示薬染料として利用可能であり、反応の速い染料と反応の遅い染料、ならびにＦＲＥＴに基づく電位センサー染料に分けられる。(Aurora Biosciences, CA, USA; Gonzalez 等, Drug Disc. Today 4(9): 431:439 (1999)に概説されている)
〔細胞生死判別〕
細胞生死判別アッセイにおいて、イオンチャンネル活性およびイオンフラックスは、細胞生死判別に直接関係する。酵母および哺乳類細胞系のどちらも、イオンチャンネル標的を試験するのに利用可能である。例えば、イオン特異的なＫ＋取込みが欠乏しているサッカロミセス−セレビジエ細胞系を用いた酵母系を使用しなければならず、その系では、対象の機能Ｋ＋チャンネルが細胞系において発現し、それによってＫ＋取り込みが回復し、細胞生存が促進される（Anderson 等, Symp. Soc. Exp. Biol. 48: 85-97 (1994))。Ｃａ２＋またはＮａ＋チャンネルのかかるアッセイを用いて、ＣａｎＩｏｎ機能をブロックすることができる化合物を同定することが可能である。比色細胞生死判別読出しに、哺乳類神経芽細胞腫細胞を使用するＮａ＋チャンネルアッセイなど、哺乳類細胞系もまた利用可能である。致死的な細胞内Ｎａ＋過負荷を促進するために、Ｎａ＋チャンネルオープナーおよびＮａ＋／Ｋ＋ポンプ阻害剤で細胞を処理する。チャンネルをブロックすることができる試験化合物での処理によって、細胞生存度が向上し、チャンネル開口を高めるその化合物はさらに、細胞死を促進するだろう(Manger 等, Anal. Biochem. 214: 190-194 (1993)。
〔電気生理学〕
電気生理学的な電位固定技術は、１つまたは多数のチャンネルを通って流れるイオン電流の測定を含む。単一微小電極が膜電位を調節し、単一細胞または膜パッチを通る電流の流れを測定する(Hamill, Pfugers Arch. 391, 85-100 (1981)。このように、対象の試験化合物の存在下または非存在下にて、イオン電流を測定することができる。大きなスケールの化合物スクリーニングシステムが設計されている（Neurosearch A/S, Glostrup, Denmark; Olesen 等, Voltage gated channel modulators, 7-8 December , Philadelphia PA, USA (1995); Denyer 等,上記文献)。
〈ＣａｎＩｏｎポリペプチドと相互作用する物質をスクリーニングする方法〉
本発明の目的では、リガンドは、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片もしくは変異体の１つに結合することができる、あるいはＣａｎＩｏｎまたはその断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドの発現を調節する、タンパク質、ペプチド、抗体、またはいずれかの合成的な化学化合物などの分子を意味する。
【０４１８】
本発明によるリガンドのスクリーニング法では、生体サンプルまたはＣａｎＩｏｎタンパク質の推定上のリガンドとして試験すべき定義された分子を、このタンパク質と試験すべき推定上のリガンド分子との間に複合体を形成するために、対応する精製ＣａｎＩｏｎタンパク質、例えば上述の組換え細胞宿主によって生成された、対応する精製組換えＣａｎＩｏｎタンパク質と接触させる。
【０４１９】
説明となる例として、ＣａｎＩｏｎタンパク質、または配列番号５の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００または１０００個のアミノ酸の隣接スパンを含む断片と、コンビナトリアル化学アプローチによって生成された分子などの薬物または小分子との相互作用を研究するために、Wang 等 (1997)によって記述されているＨＰＬＣ法と対となる微小透析またはBush 等 (1997)により記述されているアフィニティーキャピラリー電気泳動法を使用することが可能である。上記文献の開示内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０４２０】
更なる方法では、ＣａｎＩｏｎタンパク質、または配列番号５の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００個のアミノ酸の隣接スパンを含む断片と相互作用する、ペプチド、薬物、脂肪酸、リポタンパク質、または小分子は、以下のようなアッセイを用いて同定される。結合について試験すべき分子は、蛍光、放射性、もしくは酵素タグなどの酵素検出可能な標識で標識され、特異的結合を生じさせる条件下にて固定化されたＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片と接触して置かれる。非特異的に結合した分子を除去した後、適切な手段を用いて、結合分子を検出する。
【０４２１】
本発明の他の目的は、ＣａｎＩｏｎポリペプチドと相互作用する候補物質をスクリーニングする方法およびキットを含む。
【０４２２】
本発明は、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその１つの断片もしくは変異体と相互作用する対象の物質をスクリーニングする方法に関係する。ＣａｎＩｏｎタンパク質に、またはその断片もしくは変異体に共有結合または非共有結合するそれらの能力によって、これらの物質または分子は、インビトロおよびインビボのどちらでも有利に使用することができる。
【０４２３】
インビトロでは、前記相互作用分子は、サンプル中、好ましくは生体サンプル中のＣａｎＩｏｎタンパク質の存在を同定するために検出手段として使用することができる。
【０４２４】
候補物質をスクリーニングする方法は、以下の段階：
ａ）ＣａｎＩｏｎタンパク質または配列番号５の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸の隣接スパンを含む断片を含む、から本質的になる、またはからなるポリペプチドを提供する段階；
ｂ）候補物質を得る段階；
ｃ）前記ポリペプチドと前記候補物質を接触させる段階；
ｄ）前記ポリペプチドと前記候補物質との間に形成された複合体を検出する段階；を含む。
【０４２５】
本発明はさらに、ＣａｎＩｏｎポリペプチドと相互作用する候補物質のスクリーニング用のキットに関し、前記キットは：
ａ）配列番号５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＣａｎＩｏｎタンパク質、または配列番号５の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸の隣接スパンを含むペプチド断片；
ｂ）任意に、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはそのペプチド断片もしくは変異体と、候補物質との間に形成された複合体を検出するのに有用な手段；を含む。
【０４２６】
上述のキットの好ましい実施形態において、検出手段は、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはそのペプチド断片もしくは変異体に対して作られるモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む。
【０４２７】
ＣａｎＩｏｎポリペプチドとの相互作用について、種々の候補物質または分子をアッセイすることができる。これらの物質または分子には、限定されないが、ポリペプチドなどの生物起源の天然もしくは合成有機化合物または分子が含まれる。候補物質または分子がポリペプチドを含む場合、このポリペプチドは、ファージに基づくランダムペプチドライブラリーに属するファージクローンの結果としての発現産物であるか、あるいは代わりに、そのポリペプチドは、２ハイブリッドスクリーニングアッセイを実施するのに適したベクター中でクローン化されたｃＤＮＡライブラリーの結果として得られた発現産物である。
【０４２８】
本発明は、上述のスクリーニング法を実施するのに有用なキットにも関係する。かかるキットは、ＣａｎＩｏｎポリペプチドまたはその断片もしくは変異体と、任意にＣａｎＩｏｎポリペプチドまたはその断片もしくは変異体と候補物質との間に形成された複合体を検出するのに有用な手段と、を備えることが好ましい。好ましい実施形態において、検出手段は、相当するＣａｎＩｏｎポリペプチドまたはその断片もしくは変異体に対して作られるモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む。
Ａ．ランダムペプチドライブラリーから得られる候補リガンド
スクリーニング方法の特定の実施形態において、推定上のリガンドは、ファージベクターに含まれるＤＮＡインサートの発現産物である(ParmleyおよびSmith, 1988)。特に、ランダムペプチドファージライブラリーが使用される。そのランダムＤＮＡインサートは、アミノ酸８〜２０個の長さのペプチドをコードする(Oldenburg K.R. 等, 1992; Valadon P., 等, 1996; Lucas A.H., 1994; Westerink M.A.J., 1995; Felici F. 等, 1991)。この特定の実施形態に従って、固定化ＣａｎＩｏｎタンパク質に結合する、タンパク質を発現する組換えファージを保持し、続いて、ＣａｎＩｏｎタンパク質と組換えファージとの間に形成された複合体を、ＣａｎＩｏｎタンパク質に対して作られるポリクローナルまたはモノクローナル抗体によって免疫沈降させる。
【０４２９】
組換えファージにおけるリガンドライブラリーが構築されたら、ファージ集団を固定化ＣａｎＩｏｎタンパク質と接触させる。次いで、非特異的に結合した組換えファージを除去するために、複合体標本を洗浄する。次いで、ＣａｎＩｏｎ  タンパク質に特異的に結合するファージをバッファー（酸性ｐＨ）によって溶出するか、ハイブリドーマ抗ＣａｎＩｏｎによって作製されたモノクローナル抗体によって免疫沈降させ、続いてこのファージ集団を、細菌（例えば、大腸菌）の過剰感染によって増幅する。さらに特異的な組換えファージクローンを選択するために、選択段階は、数回、好ましくは２〜４回繰り返し行われる。最後の段階は、感染細菌中での発現および単離によって、選択された組換えファージクローンによって生成されたペプチドを特徴付けることと、別の宿主ベクター系においてファージインサートを発現させること、または選択された組換えファージに含まれるインサートをシーケンスすることを含む。
Ｂ．競合実験によって得られる候補リガンド
代替方法としては、ＣａｎＩｏｎタンパク質、または配列番号５の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸の隣接スパンを含む断片に結合するペプチド、薬物または小分子を、競合実験で同定することが可能である。かかるアッセイにおいて、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片を、プラスチックプレートなどの表面に固定化する。検出可能な標識された公知のＣａｎＩｏｎタンパク質リガンドの存在下にて、増加量のペプチド、薬物または小分子を、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片と接触して置く。例えば、ＣａｎＩｏｎリガンドは、蛍光、放射性、または酵素タグで検出可能に標識される。ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片に結合する試験分子の能力は、試験分子の存在下で結合した、検出可能に標識された公知のリガンドの量を測定することによって決定される。試験分子が存在する場合、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片に結合した公知のリガンドの量の減少から、試験分子がＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片に結合することができることが示される。
Ｃ．アフィニティークロマトグラフィーによって得られる候補リガンド
ＣａｎＩｏｎタンパク質、または配列番号５の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸の隣接スパンを含むその断片と相互作用するタンパク質または他の分子。アガロース、Ａｆｆｉ  Ｇｅｌ（登録商標）、もしくは当技術者に公知の他のマトリックスなど適切なカラムマトリックスへの化学結合を含む従来の技術を用いて、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片をカラムに付着させる。この方法の一部の実施形態では、アフィニティーカラムはキメラタンパク質を含有し、そこでＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片はグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合する。上述のような細胞タンパク質の混合物または発現タンパク質のプールをアフィニティーカラムに適用する。次いで、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ramunsen 等 (1997)で記述されているように、カラムに付着されたＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片と相互作用するタンパク質または他の分子を単離し、２−Ｄ電気泳動ゲル上で分析することができる。代替方法として、アフィニティーカラム上に保持されたタンパク質を、電気泳動に基づく方法によって精製し、シーケンスすることができる。同じ方法を用いて、個体を単離し、ファージディスプレイ産物をスクリーニングし、またはファージディスプレイのヒト抗体をスクリーニングすることができる。
Ｄ．光学バイオセンサー法により得られる候補リガンド
その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、EdwardsおよびLeatherbarrow (1997) 、 Szabo 等 (1995)にもまた記載の光学バイオセンサーを使用することによっても、ＣａｎＩｏｎタンパク質、または配列番号５の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸の隣接スパンを含むその断片と相互作用するタンパク質をスクリーニングすることができる。この技術によって、標識された分子を必要とすることなく、リアルタイムで分子間の相互作用を検出することが可能となる。この技術は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象に基づく。簡単に言えば、試験すべき候補リガンド分子を表面（カルボキシメチルデキストランマトリックス）に付着させる。光線は、試験するサンプルを含有しない表面側に向けられ、前記表面によって反射される。ＳＰＲ現象は、角度および波長と特定の関連を有する、反射光の強度の減少をもたらす。候補リガンド分子の結合によって、表面上の屈折率の変化が生じ、その変化はＳＰＲシグナルの変化として検出される。ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片と相互作用することができる候補リガンド分子または物質をスクリーニングするために、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片を表面上に固定化する。この表面は、アッセイすべき候補分子が流れる細胞の一方の側を含む。ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片上への候補分子の結合は、ＳＰＲシグナルの変化として検出される。試験される候補分子は、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、またはコンビナトリアル化学によって生成された小分子であることが可能である。この技術は、それらの表面に内因性または組換え発現ＣａｎＩｏｎタンパク質を示す真核もしくは原核細胞または脂質小胞を固定化することによっても実施することができる。
【０４３０】
その方法の主な利点は、ＣａｎＩｏｎタンパク質と、ＣａｎＩｏｎタンパク質と相互作用する分子との間の会合速度を決定することが可能となることである。したがって、強いまたは逆に弱い会合定数によって、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片と相互作用するリガンド分子を特異的に選択することが可能である。
Ｅ．２ハイブリッドスクリーニングアッセイにより得られる候補リガンド
酵母２ハイブリッド系は、インビボでのタンパク質−タンパク質相互作用を研究するために設計され(Fieldsおよび Song, 1989)、酵母Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインへのベイトタンパク質の融合に依拠する。この技術は、米国特許第５，６６７，９７３号および同第５，２８３，１７３号（Fields 等）にもまた記述されており、どちらの特許の技術的教示も参照により本明細書に組み込まれる。
【０４３１】
Harper 等 (1993), Cho 等 (1998), またはFromont-Racine 等 (1997)によって記述されているように、２ハイブリッドアッセイによるライブラリースクリーニングの一般手順を行うことが可能である。
【０４３２】
ベイト（bait)タンパク質またはポリペプチドは、ＣａｎＩｏｎポリペプチド,
または配列番号５の少なくとも６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、または１００個のアミノ酸の隣接スパンを含む断片を含む、から本質的になる、またはからなる。
【０４３３】
さらに正確には、ＣａｎＩｏｎポリペプチドまたはその断片もしくは変異体をコードするヌクレオチド配列が、ＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合し、その融合したヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター、例えばｐＡＳ２またはｐＭ３中に挿入される。
【０４３４】
次いで、ヒトｃＤＮＡライブラリーは、ヒトｃＤＮＡインサートがＧＡＬ４タンパク質の転写ドメインをコードするベクター中でヌクレオチド配列に融合するように特別に設計されたベクターにおいて構築される。使用するベクターはｐＡＣＴベクターであることが好ましい。ヒトｃＤＮＡライブラリーのヌクレオチドインサートによってコードされるポリペプチドは、「プレイ（prey）」ポリペプチドと呼ばれる。
【０４３５】
第３ベクターは、転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインのどちらも含有する完全なＧａｌ４タンパク質の結合に反応性である制御配列の制御下に置かれる、βガラクトシダーゼまたはＣＡＴ遺伝子などの検出可能なマーカー遺伝子を含有する。例えば、ベクターｐＧ５ＥＣを使用することが可能である。
【０４３６】
２種類の異なる酵母株もまた使用される。説明のためであり非制限的な例として、２種類の異なる酵母株は、以下の：
−その表現型が（ＭＡＴａ、Ｌｅｕ２−３、１１２ｕｒａ３−１２、ｔｒｐ１−９０１、ｈｉｓ３−Ｄ２００、ａｄｅ２−１０１、ｇａｌ４Ｄｇａｌ１８０Ｄ  ＵＲＡ３  ＧＡＬ−ＬａｃＺ、ＬＹＳ  ＧＡＬ−ＨＩＳ３、ｃｙｈｒ）である、Ｙ１９０；
−その表現型が（ＭＡＴａ  ｇａｌ４  ｇａｌ８０  ｈｉｓ３  ｔｒｐ１−９０１  ａｄｅ２−１０１  ｕｒａ３−５２  ｌｅｕ２−３、−１１２  ＵＲＡ３  ＧＡＬ−ｌａｃＺｍｅｔ−）であり、Ｙ１９０の逆の交配型である、Ｙ１８７；
であることが可能である。
【０４３７】
簡単に言えば、ｐＡＳ２／ＣａｎＩｏｎ２０μｇおよびｐＡＣＴ−ｃＤＮＡ  ライブラリー２０μｇを、酵母株Ｙ１９０中に同時形質転換する。その形質転換体は、ヒスチジン、ロイシンおよびトリプトファンを欠くが、ヒスチジン合成阻害剤３−ＡＴ（５０ｍＭ）を含有する最少培地上で成長させるために選択される。フィルターリフトアッセイによって、βガラクトシダーゼに対してポジティブコロニーをスクリーニングする。次いで、ダブルポジティブコロニー（Ｈｉｓ+、β−ｇａｌ+）を、ヒスチジン、ロイシンを欠くが、トリプトファンおよびシクロヘキシミド（１０  ｍｇ／ｍｌ）を含有するプレート上で成長させて、ｐＡＳ２／ＣａｎＩｏｎプラスミドの損失およびｐＡＣＴ−ｃＤＮＡライブラリープラスミドの保持率に対して選択する。得られたＹ１９０株は、Harper 等 (1993) および Bram 等 (Bram RJ 等, 1993)に記述されているようにＧａｌ４融合として、ＣａｎＩｏｎタンパク質または関連しない対照タンパク質；例えばサイクロフィリンＢ、ラミン、またはＳＮＦ１などを発現するＹ１８７株と交配し、フィルターリフトアッセイによって、βガラクトシダーゼに対してスクリーニングする。対照Ｇａｌ４融合と交配した後、βｇａｌ−である酵母クローンは、偽陽性と見なされる。
【０４３８】
本発明による２ハイブリッド法の他の実施形態において、ＣａｎＩｏｎまたはその断片もしくは変異体との細胞タンパク質との相互作用を、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２（カタログ晩番号Ｋ１６０４−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を使用して評価することが可能である。その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｔｗｏ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２（カタログ晩番号Ｋ１６０４−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）に添付されるマニュアルに記載のように、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部をコードする核酸は、それらが酵母転写活性化因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡとインフレームであるように、発現ベクター中に挿入する。所望のｃＤＮＡ、好ましくはヒトｃＤＮＡを、それらがＧＡＬ４の活性化ドメインをコードするＤＮＡとインフレームであるように、第２発現ベクター中に挿入する。２つの発現プラスミドを酵母に形質転換し、その酵母を、ＨＩＳ３遺伝子の発現ベクターならびにＧＡＬ４依存性発現のそれぞれに対して選択可能なマーカーの発現を選択する選択培地上にプレーティングする。ヒスチジンを欠く培地で成長させることができる形質転換体を、ＧＡＬ４依存性ｌａｃＺ発現についてスクリーニングする。ヒスチジン選択およびｌａｃＺアッセイの両方でポジティブである細胞は、ＣａｎＩｏｎと、最初に選択されたｃＤＮＡインサートによってコードされるタンパク質またはペプチドとの間の相互作用を含有する。
〈ＣａｎＩｏｎ遺伝子の制御配列と相互作用する物質をスクリーニングする方法〉
本発明は、例えばプロモーターもしくはエンハンサー配列などのＣａｎＩｏｎ遺伝子の制御配列と相互作用することができる物質または分子をスクリーニングする方法にも関する。
【０４３９】
ＣａｎＩｏｎ遺伝子の制御配列、特に５’および３’調節領域のポリヌクレオチドまたはその断片もしくは変異体、好ましくは本発明の２対立遺伝子マーカーの１つを含む変異体からなる群から選択されるヌクレオチド配列と相互作用することができるタンパク質をコードする核酸は、その技術的な教示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＭａｔｃｈｍａｋｅｒ  Ｏｎｅ−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｋｉｔに同封されている冊子（カタログ参照ｎ°  Ｋ１６０３−１）に記述されているように、１−ハイブリッド系を使用することによって同定することが可能である。簡単に言えば、標的ヌクレオチド配列を選択可能なレポーター配列の上流でクローン化し、その結果得られたＤＮＡ構築物を酵母ゲノム（サッカロミセス−セレビジエ）中に組み込む。次いで、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の制御配列上に結合する候補タンパク質をコードするｃＤＮＡと、ＧＡＬ４などの酵母転写因子の活性化因子ドメインをコードする配列との間に融合分子を含むライブラリーで、それらのゲノム中にレポーター配列を含有する酵母細胞を形質転換する。レポーター配列を発現する細胞を選択するために、その組換え酵母細胞を肉汁培養中にプレーティングする。このように選択された組換え酵母細胞は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の標的配列上に結合することができる融合タンパク質を含有する。次いで、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡをシーケンスし、インビトロで発現するか、または転写ベクター中にクローン化することが可能である。コードされたポリペプチドのＣａｎＩｏｎ遺伝子の標的制御配列への結合は、ゲル遅延アッセイまたはＤＮＡｓｅ保護アッセイなどの当業者に公知の技術によって確認することができる。
【０４４０】
これらの出版物の教示内容が参照により本明細書に組み込まれる、FriedおよびCrothers (1981)、Garnerおよび Revzin (1981) 、 DentおよびbLatchman (1993)によって記述されているように、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の制御配列と相互作用することができる候補分子をスクリーニングするために、ゲル遅延アッセイを別々に実施してもよい。これらの技術は、タンパク質に結合するＤＮＡ断片が、未結合の同じＤＮＡ断片よりもゆっくりと移動することによる原理に基づく。簡単には、標的ヌクレオチド配列を標識する。次いで、標識された標的ヌクレオチド配列を、転写因子を含有する細胞に由来する全核抽出物、または試験すべき異なる候補分子と接触させる。ＣａｎＩｏｎ遺伝子の標的制御配列と、候補分子または転写因子との間の相互作用は、移動の遅延によりゲルもしくはキャピラリー電気泳動後に検出される。
〈ＣａｎＩｏｎ遺伝子の発現を調節するリガンドをスクリーニングする方法〉
本発明の別の目的は、ＣａｎＩｏｎタンパク質の発現を調節する分子をスクリーニングする方法である。かかるスクリーニング方法は、以下の段階：
ａ）ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその変異体もしくは断片をコードするヌクレオチド配列を形質移入された原核細胞または真核細胞を培養し、それ自体のプロモーターの制御下に配置する段階；
ｂ）培養した細胞を試験すべき分子と接触させる段階；
ｃ）ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその変異体もしくは断片の発現を定量化する段階；を含む。
【０４４１】
実施形態において、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその変異体もしくは断片をコードするヌクレオチド配列は、２対立遺伝子マーカーＡ１２またはＡ１６の少なくとも１つの対立遺伝子、およびその補体を含む。
【０４４２】
当業者によく知られているＤＮＡ組換え技術を用いて、ＣａｎＩｏｎタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、そのプロモーター配列の下流で発現ベクター中に挿入する。実例として、ＣａｎＩｏｎ遺伝子のプロモーター配列は、５’調節領域の核酸中に含まれる。ＣａｎＩｏｎタンパク質の発現の定量化は、ｍＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルで実現される。後者の場合には、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用して、例えばＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイにおいて、生成されたＣａｎＩｏｎタンパク質の量を定量化することが可能である。
【０４４３】
好ましい実施形態では、ＣａｎＩｏｎのｍＲＮＡの定量化は、ＣａｎＩｏｎに特異的な１組のプライマーを用いて、培養されたＣａｎＩｏｎ形質移入宿主細胞の全ｍＲＮＡの逆転写によって得られたｃＤＮＡを定量的ＰＣＲ増幅することによって実現される。
【０４４４】
本発明は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の発現レベルを増大または減少することができる物質または分子をスクリーニングする方法にも関する。かかる方法によって、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の発現レベルに制御効果を及ぼし、かつ本明細書に記述する疾患のいずれかを患う患者を治療するための薬剤組成物に含まれる活性成分として有用である可能性のある物質を当業者が選択することが可能となる。
【０４４５】
したがって、本発明は、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の発現を調節する候補物質または分子をスクリーニングする方法もまた提供し、この方法は以下の段階：
−核酸を含有する組換え細胞宿主を提供する段階であって、前記核酸が、検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの上流に位置する、５’調節領域またはその生物活性断片もしくはその変異体のヌクレオチド配列を含む段階；
−候補物質を得る段階；
−検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現レベルを調節する候補物質の能力を決定する段階；を含む。
【０４４６】
更なる実施形態において、５’調節領域またはその生物活性断片もしくはその変異体のヌクレオチド配列を含む核酸はまた、配列番号４のＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ領域、またはその生物活性断片もしくはその変異体の１つを含む。
【０４４７】
検出可能なタンパク質をコードする好ましいポリヌクレオチドの中でも、βガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。
【０４４８】
本発明は、本明細書に記述されるスクリーニング法を実施するのに有用なキットにも関係する。かかるキットは、検出可能なタンパク質またはＣａｎＩｏｎタンパク質またはその断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドの上流に位置し、作動可能に連結する５’調節領域またはその生物活性断片もしくはその変異体のヌクレオチド配列の発現を可能にする組換えベクターを備えることが好ましい。
【０４４９】
ＣａｎＩｏｎ遺伝子の発現を調節する候補物質または分子をスクリーニングする他の方法において、その方法は以下の段階：
ａ）核酸を含有する組換え宿主細胞を提供する段階であって、前記核酸が、配列番号４のＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ配列、またはその生物活性断片もしくはその変異体の１つを含み、５’ＵＴＲ配列またはその生物活性断片もしくはその変異体が、検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結される段階；
ｂ）候補物質を得る段階；
ｃ）検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現レベルを調節する候補物質の能力を決定する段階；を含む。
【０４５０】
上記のスクリーニング法の特定の実施形態において、配列番号４のＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ配列またはその生物活性断片もしくはその変異体の１つからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸は、ＣａｎＩｏｎ５’ＵＴＲ配列に関して内因性であるプロモーター配列を含む。
【０４５１】
上記のスクリーニング法の別の特定の実施形態において、配列番号４のＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡの５’ＵＴＲ配列またはその生物活性断片もしくはその変異体の１つからなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸は、そこで定義されるＣａｎＩｏｎ５’ＵＴＲ配列に関して外因性であるプロモーター配列を含む。
【０４５２】
さらに好ましい実施形態では、ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡもしくは配列番号４の５’−ＵＴＲ配列またはその生物活性断片を含む核酸は、Ａ１２またはＡ１６またはその補体からなる群から選択される２対立遺伝子マーカーを含む。
【０４５３】
本発明はさらに、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の発現を調節する候補物質をスクリーニングするためのキットを含み、前記キットは、配列番号４のＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡの５’−ＵＴＲ配列、またはその生物活性断片もしくは変異体を含む核酸を含有する組換えベクターを備え、５’ＵＴＲ配列またはその生物活性断片もしくは変異体は、検出可能なタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結する。
【０４５４】
ＣａｎＩｏｎの発現レベルおよび発現パターンは、その開示内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開番号ＷＯ９７／０５２７７に記載の長いプローブとの溶液ハイブリダイゼーションによって解析される。簡単に言えば、ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡまたは上述のＣａｎＩｏｎゲノムＤＮＡ、またはその断片を、バクテリオファージ（Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６）ＲＮＡポリメラーゼプロモーターのすぐ上流のクローニング部位で挿入して、アンチセンスＲＮＡを生成する。ＣａｎＩｏｎインサートは、ゲノムＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ配列の少なくとも１００個以上の連続したヌクレオチドを含むことが好ましい。プラスミドは、修飾リボヌクレオチド（つまり、ビオチン−ＵＴＰおよびＤＩＧ−ＵＴＰ）を含むリボヌクレオチドの存在下にて直鎖化され、転写される。二重標識された過剰量のＲＮＡを、対象の細胞または組織から単離されたｍＲＮＡと溶液中でハイブリダイズさせる。そのハイブリダイゼーションは、厳密な標準条件下（８０％ホルムアミド、０．４Ｍ  ＮａＣｌバッファー、ｐＨ７〜８中、４０〜５０℃で１６時間）にて行われる。一本鎖ＲＮＡに特異的なリボヌクレアーゼ（つまり、ＲＮａｓｅ  ＣＬ３、Ｔ１、Ｐｈｙ  Ｍ、Ｕ２またはＡ）で消化することによって、ハイブリダイズしていないプローブを除去する。ビオチン−ＵＴＰ修飾の存在によって、ストレプトアビジンでコートされたミクロ滴定プレート上でハイブリッドを捕獲することが可能となる。ＤＩＧ修飾が存在することによって、アルカリホスファターゼに結合する抗ＤＩＧ抗体を用いたＥＬＩＳＡでハイブリッドを検出かつ定量化することが可能となる。
【０４５５】
ＣａｎＩｏｎ遺伝子発現の定量分析も、アレイを使用して実施することが可能である。本明細書で使用される「アレイ」という用語は、それにハイブリダイズすることができるｍＲＮＡの発現の特異的な検出を可能にするのに十分な長さがある複数の核酸の一次元、二次元、または多次元の配列を意味する。例えば、アレイは、その発現レベルが評価される遺伝子に由来する複数の核酸を含有する。アレイは、ＣａｎＩｏｎゲノムＤＮＡ、ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡ配列またはそれに相補的な配列またはその断片、特に本発明による２対立遺伝子マーカーの少なくとも１つ、好ましくは２対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ１７の少なくとも１つを含む配列を含む。その断片は、少なくとも１５ヌクレオチドの長さであることが好ましい。他の実施形態において、その断片の長さは、少なくとも２５ヌクレオチドである。一部の実施形態では、その断片の長さは、少なくとも５０ヌクレオチドである。その断片の長さは、少なくとも１００ヌクレオチドであることがさらに好ましい。他の好ましい実施形態では、その断片は、１００ヌクレオチドを超える長さである。一部の実施形態では、その断片は、５００ヌクレオチドを超える長さである。
【０４５６】
例えば、ＣａｎＩｏｎ遺伝子発現の定量分析は、Schena 等 (1995および1996)によって記述されているように相補ＤＮＡマイクロアレイで実施することが可能である。完全長ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡまたはその断片をＰＣＲによって増幅し、高速ロボティクスを用いて、シリル化された（silylated）顕微鏡スライド上に９６穴マイクロタイタープレートから配列する。加湿チャンバー内でプリントされたアレイをインキュベートし、アレイエレメントを再水和させ、０．２％ＳＤＳ中で１分間１回、水中で１分間２回、水素化ホウ素ナトリウム溶液中で５分間１回すすぐ。そのアレイを水に９５℃で２分間浸し、０．２％ＳＤＳに１分間移し、水で２回すすぎ、空気乾燥させ、２５℃にて暗所で保存する。
【０４５７】
細胞または組織のｍＲＮＡを単離するか、または市販のものを入手し、１回の逆転写によってプローブを作製する。プローブは、１４×１４ｍｍカバーガラス下の１ｃｍ2マイクロアレイに６０℃で６〜１２時間ハイブリダイズさせる。厳密性の低い洗浄バッファー（１×ＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ）中、２５℃で５分間アレイを洗浄し、次いで厳密性の高い洗浄バッファー（０．１×ＳＳＣ／０．２％  ＳＤＳ）中で室温にて１０分間洗浄する。カスタムフィルターセットを備えた蛍光レーザースキャン装置を使用して、アレイを０．１×ＳＳＣ中でスキャンする。正確な差次的発現測定値が、２つの独立したハイブリダイゼーションの比の平均を取ることによって得られる。
【０４５８】
Pietu 等 (1996)によって記述されているように、ＣａｎＩｏｎ遺伝子発現の定量分析は、相補ＤＮＡアレイにおいて、完全長ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡまたはその断片を用いて実施することも可能である。完全長ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡまたはその断片をＰＣＲ増幅し、膜上にスポットする。次いで、種々の組織または細胞から生じるｍＲＮＡを放射性ヌクレオチドで標識する。制御条件でハイブリダイゼーションおよび洗浄した後、ハイブリダイズしたｍＲＮＡは、ホスホ−イメージングまたはオートラジオグラフィーによって検出される。重複実験を行い、次いで、差次的に発現したｍＲＮＡの定量分析を行う。
【０４５９】
代替方法としては、Lockhart 等 (1996) およびSosnowsky 等 (1997)によって記述されているように、ＣａｎＩｏｎゲノムＤＮＡ、ＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡ、またはその断片を使用した発現分析を高密度ヌクレオチドアレイによって行うことができる。ＣａｎＩｏｎゲノムＤＮＡの配列またはＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡ配列、特に本発明による２対立遺伝子マーカーの少なくとも１つ、好ましくはＡ１〜Ａ１７、またはそれに相補的な配列からなる群から選択される少なくとも１つの２対立遺伝子マーカー、からの１５〜５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドをチップ上に直接合成するか(Lockhart 等, 上記)、あるいは合成し、次いでチップにアドレスする (Sosnowski 等, 上記)。そのオリゴヌクレオチドの長さは約２０ヌクレオチドであることが好ましい。
【０４６０】
ビオチン、ジゴキシゲニンもしくは蛍光染料などの適切な化合物で標識されたＣａｎＩｏｎ  ｃＤＮＡプローブを適切なｍＲＮＡ集団から合成し、次いで平均５０〜１００ヌクレオチドにランダムに断片化する。次いで、そのプローブをチップにハイブリダイズする。上記のLockhart等に記載のように洗浄し、異なる電界をかけた(Sosnowsky 等, 1997)後、染料または標識化化合物を検出し、定量化する。重複ハイブリダイゼーションを行う。異なるｃＤＮＡサンプル中の同じ標的オリゴヌクレオチド上のｃＤＮＡプローブから生じるシグナル強度の比較分析によって、ＣａｎＩｏｎ  ｍＲＮＡの差次的発現発現が示される。
〈ＣａｎＩｏｎ遺伝子の発現を抑制する方法〉
本発明による他の治療用組成物は有利に、アンチセンスツールまたは対応するＣａｎＩｏｎ遺伝子の発現を抑制する三重らせんツールとして、ＣａｎＩｏｎの核配列のオリゴヌクレオチド断片を含む。ＣａｎＩｏｎの核配列の好ましい断片は、２対立遺伝子マーカーＡ１〜Ａ１７の少なくとも１つの対立遺伝子を含む。
［アンチセンスアプローチ］
本発明によるアンチセンスポリヌクレオチドを使用する好ましい方法は、Sczakiel 等 (1995)によって記述されている手順である。
【０４６１】
アンチセンスツールは、ＣａｎＩｏｎ  ｍＲＮＡの５’末端に相補的なポリヌクレオチド（長さ１５〜２００ｂｐ）の中で選択されることが好ましい。他の実施形態では、所望の標的遺伝子の異なる部分に相補的な異なるアンチセンスポリヌクレオチドの組み合わせが使用される。
【０４６２】
本発明による好ましいアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳開始コドンＡＴＧまたはスプラスドナーもしくはアクセプター部位を含有するＣａｎＩｏｎのｍＲＮＡの配列に相補的である。
【０４６３】
そのアンチセンス核酸は、二重鎖におけるＣａｎＩｏｎ  ｍＲＮＡの発現を抑制するのに十分な安定性を有する細胞内二重鎖の形成を可能にするのに十分な長さおよび融解温度を有するはずである。遺伝子治療で使用するのに適したアンチセンス核酸を設計する方策は、その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、Green 等 (1986) 、IzantおよびWeintraub (1984)に開示されている。
【０４６４】
一部の方策において、アンチセンス分子は、細胞で正常に転写された鎖と逆の鎖を転写するために、プロモーターに対してＣａｎＩｏｎコード領域の向きを逆にすることによって得られる。そのアンチセンス分子は、Ｔ７もしくはＳＰ６ポリメラーゼを用いた転写系など、インビトロ転写系を使用して転写され、転写物が産生される。他のアプローチは、適切な発現ベクターにおけるプロモーターに、アンチセンス配列を含有するＤＮＡを作動可能に連結することによって、インビボでＣａｎＩｏｎアンチセンス核酸を転写することを含む。
【０４６５】
代替方法として、適切なアンチセンス方法は、Rossi 等 (1991)によって記述されている方法、国際特許出願番号ＷＯ９４／２３０２６、ＷＯ９５／０４１４１、ＷＯ９２／１８５２２および欧州特許出願番号ＥＰ０  ５７２  ２８７  Ａ２に記述されている方法である。
【０４６６】
本発明に従って使用されるアンチセンス技術の代替方法は、それらの相補的なポリヌクレオチド末端（tail）を介して標的配列に結合し、かつその標的部位をハイブリダイズすることによって対応するＲＮＡを切断するであろうリボザイム（つまり、「ハンマーヘッド型リボザイム」）を使用することを含む。簡単に言えば、ハンマーヘッド型リボザイムの単純化されたサイクルは、（１）相補的なアンチセンス配列を介した標的ＲＮＡへの配列特異的な結合；（２）標的鎖の切断可能なモチーフの部位特異的な加水分解；および（３）別の触媒サイクルを生じさせる、切断産物の放出；を含む。実際に、長鎖アンチセンスポリヌクレオチド（少なくとも３０塩基の長さ）または長いアンチセンスアームを有するリボザイムの使用が有利である。アンチセンスリボザイムの好ましい送達システムは、これらのリボザイムを親油基に共有結合することによって、または簡便なベクターとしてリポソームを使用することによって達成される。本発明による好ましいアンチセンスリボザイムは、Sczakiel 等(1995)によって記述されているように作製され、特定の作製手順が、参照により本明細書に組み込まれる前記論文に参照される。
［三重らせんアプローチ］
ＣａｎＩｏｎゲノムＤＮＡを使用して、細胞内三重らせん形成に基づくＣａｎＩｏｎ遺伝子の発現を抑制することも可能である。
【０４６７】
三重らせんオリゴヌクレオチドを使用して、ゲノムからの転写が抑制される。細胞活性の変化が特定の遺伝子に関連する場合に、その変化を研究するのに特に有用である。
【０４６８】
同様に、ＣａｎＩｏｎゲノムＤＮＡの一部を使用して、細胞内のＣａｎＩｏｎ転写を抑制する効果を研究することができる。従来から、ホモプリン配列は、三重らせんに最も有用であると見なされていた。しかしながら、ホモピリミジン配列もまた、遺伝子発現を抑制することができる。かかるホモピリミジンオリゴヌクレオチドは、ホモプリン：ホモピリミジン配列中の主溝に結合する。したがって、ＣａｎＩｏｎゲノムＤＮＡからの配列のどちらのタイプも、本発明の範囲内で企図される。
【０４６９】
三重らせんアプローチを用いた遺伝子治療法を実施するために、ＣａｎＩｏｎゲノムＤＡＮの配列を最初にスキャンして、ＣａｎＩｏｎ発現を抑制するための三重らせんに基づく方法で使用することが可能な１０ｍｅｒ〜２０ｍｅｒのホモピリミジンまたはホモプリンの伸びを同定する。候補ホモピリミジンまたはホモプリン伸びの同定後、ＣａｎＩｏｎ遺伝子を発現する組織培養細胞中に、候補配列を含有する様々な量のオリゴヌクレオチドを導入することによって、ＣａｎＩｏｎ発現の抑制におけるそれらの効率を評価する。
【０４７０】
そのオリゴヌクレオチドは、制限されないが、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、電気穿孔法、リポソーム仲介移入または天然取り込み（native uptake）を含む、当業者に公知のさまざまな方法を用いて細胞中に導入することができる。
【０４７１】
ノーザンブロット、ＲＮアーゼ保護アッセイ、もしくはＰＣＲに基づく方法などの技術を用いて、変化した細胞機能または低減したＣａｎＩｏｎ発現について、処理した細胞をモニターし、オリゴヌクレオチドで処理してある細胞中のＣａｎＩｏｎ遺伝子の転写レベルをモニターする。
【０４７２】
次いで、アンチセンスアプローチで記述されているようにインビトロでの結果に基づいて計算された用量で、組織細胞培養細胞中の遺伝子の発現を抑制するのに有効なオリゴヌクレオチドを、アンチセンスアプローチにおいて上述の技術を用いてインビボで導入することが可能である。
【０４７３】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドユニットの天然（β）アノマーをαアノマーと置換して、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに対してさらに耐性にする。さらに、臭化エチジウム等の介入性作用薬をαオリゴヌクレオチドの３’末端に付着して、三重らせんを安定化することができる。三重らせんの形成に適したオリゴヌクレオチドの産生の情報については、参照により本明細書に組み込まれるGriffin 等 (1989)を参照のこと。
〈薬剤組成物および製剤〉
ＣａｎＩｏｎ調節化合物
本明細書に開示の方法を用いて、インビトロおよびインビボでＣａｎＩｏｎ活性を選択的に調節するＣａｎＩｏｎ作動薬または拮抗薬化合物を同定することが可能である。したがって、本発明は、患者における精神分裂病、双極性障害、または本明細書に記述される他の疾患または症状のいずれかを治療する方法であって、有効量のＣａｎＩｏｎ調節化合物を投与することを含む方法を包含する。前記化合物は、選択的なＣａｎＩｏｎ調節化合物であることが好ましい。本発明の方法によって同定される化合物には、例えばヒトＣａｎＩｏｎポリペプチドに対する結合特性を有する抗体が含まれる。ＣａｎＩｏｎの相同体は、ＣａｎＩｏｎ仲介活性および精神分裂病または双極性障害に付随する関連のある生理的症状を調節するのに有用であることもまた期待される。一般に、中枢神経系障害でのＣａｎＩｏｎの役割に基づく本発明のアッセイ法を使用して、本発明のアッセイカスケードにおいて介入することができる化合物を同定することがさらに期待されている。好ましい実施形態において、治療有効量のＣａｎＩｏｎ拮抗薬を含む薬剤組成物を患者に投与することによって、精神分裂病または双極性障害を患う患者を治療する。
適応
ＣａｎＩｏｎは精神分裂病および双極性障害に関連するゲノム領域に連結し、ＣａｎＩｏｎを含む適応症は、種々の中枢神経系疾患を含む。神経系障害は、複合遺伝子塩基を有し、特定の症状を共有する場合が多いと期待される。特に本明細書に記述されるように、適応症は、精神障害の診断・統計便覧第４版(Diagnosis and Statistical Manual of Mental Disorders fourth edition )（ＤＳＭ−ＩＶ）の分類を用いて定義される、精神分裂病  および他の精神異常、気分障害、自閉症、物質依存およびアルコール中毒、てんかん、疼痛性障害、精神遅滞、および認知障害、不安障害、摂食障害、衝動調節障害、および人格障害を含む他の精神障害を含む。さらに、アンギナ、高血圧、または不整脈を含む多数の心臓血管性疾患もまた、ＣａｎＩｏｎ修飾物質、好ましくは拮抗薬を使用して治療することが可能である。
医薬製剤および投与経路
本発明の方法を用いて同定された化合物を、単独で、または治療有効用量で適切な担体または賦形剤（１つまたは複数）と混合された薬剤組成物の状態で、ヒト患者を含む哺乳類に投与して、精神分裂病または双極性障害に関連する障害を治療または回復することができる。治療有効用量はさらに、本明細書で記載の方法によって決定されるように、症状を回復させるのに十分な化合物の量を意味する。治療有効用量は、連続する定期的な使用または投与に適していることが好ましい。本出願の化合物の配合および投与に関する技術は、「Remington's Pharmaceutaical Sciences」Mack Publishing Co., Easton, PA, latest editionに記載されている。
投与経路
適切な投与経路には、経口、直腸、経粘膜、または腸内投与、筋肉内注入、皮下注入、髄内注入ならびにくも膜下注入、直接脳室内注入、静脈内注入、腹腔内注入、鼻腔内もしくは眼内注入を含む非経口的送達が含まれる。中枢神経系疾患を治療する化合物を投与する特に有用な方法は、長時間にわたって化合物を送達する装置の外科的な埋め込みを要する。発明された薬物の徐放性製剤が企図される。
組成物／製剤
本発明に従って使用される薬剤組成物および薬物は、賦形剤および添加剤を含む１種または複数種の生理学的に許容可能な担体を用いて従来の手法で配合することが可能である。適切な処方は、選択される投与経路によって異なる。
【０４７４】
注入のために、本発明の作用薬は、水溶液、好ましくはハンクス液、リンゲル液などの生理学的に適合性のバッファー、またはリン酸もしくは重炭酸バッファーなどの生理食塩水中で配合することが可能である。経粘膜投与のために、透過すべきバリヤに適した浸透剤を製剤に使用する。かかる浸透剤は一般に、当技術分野で公知である。経口的に使用できる医薬製剤には、ゼラチンで作られた押込み嵌め（push-fit）カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤、例えばグリセロールもしくはソルビトールで作られた密封カプセルが含まれる。押込み嵌めカプセルは、ラクトースなどの賦形剤、デンプンなどの結合剤、および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤との混合物中に活性成分を含有し得る。ソフトカプセル中では、活性化合物は、脂肪油、液体パラフィン、もしくは液体ポリエチレングリコールなどの適切な液体中に溶解または懸濁される。さらに、安定剤を添加してもよい。経口投与のためのすべての製剤は、かかる投与に適した用量であるべきである。
【０４７５】
口腔投与用に、組成物は、従来の手法で配合された錠剤またはトローチ剤の形を取ることが可能である。
【０４７６】
吸入による投与のために、本発明に従って使用される化合物は、適切な気体噴射剤、つまり二酸化炭素を使用して加圧したパックまたは噴霧器からエアゾールスプレー状で便利に送達される。加圧されたエアゾールの場合には、用量単位は、計量された量を送達する値を求めることによって決定される。化合物の粉末混合物およびラクトースもしくはデンプンなどの適切な粉末ベースを含有する、吸入器または注入器で使用される、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジが配合される。
【０４７７】
その化合物は、注入、例えば静脈内ボーラスもしくは持続注入による非経口投与のために配合することが可能である。注入用の製剤は、添加された保存剤と共に、単位用量の形で、例えばアンプルまたは容器の形で提供される。その組成物は、水性媒体中の懸濁液、溶液または乳濁液としてのかかる形状を取り、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの配合剤を含有することが可能である。
【０４７８】
非経口投与に用いられる医薬製剤には、水溶性の活性化合物の水溶液が含まれる。水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランなどの懸濁液の粘度を高める物質を含有してもよい。任意に、その懸濁液は、高濃度溶液の調製を可能とする、化合物の溶解性を増大する適切な安定剤または物質を含有することも可能である。
【０４７９】
代替方法としては、活性成分は、使用前に発熱物質を含有しない滅菌水などの適切な媒体と構成するために粉末状または親液性であることが可能である。
【０４８０】
前述の製剤の他に、その化合物はデポ製剤として配合することも可能である。かかる長時間作用性製剤は、埋め込み（例えば、皮下または筋肉内に）によって、または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えばその化合物は、適切な高分子もしくは疎水性材料（例えば、許容可能なオイル中の乳濁液として）またはイオン交換樹脂と、またはやや可溶性の誘導体、例えばやや可溶性の塩として配合することが可能である。
【０４８１】
さらに、その化合物は、治療薬を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性システムを用いて送達することが可能である。種々の徐放性材料が確立されており、当業者にはよく知られている。徐放性カプセルは、それらの化学的性質に応じて、数週間から１００日を超える期間まで化合物を放出することができる。
【０４８２】
治療薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質を安定化するためのその他の方法を用いることも可能である。
【０４８３】
その薬剤組成物は、適切な固体もしくはゲル相の担体または賦形剤を含有してもよい。かかる担体または賦形剤の例には、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリエチレングリコールなどのポリマーが含まれる。
有効用量
本発明で使用するのに適した薬剤組成物には、活性成分が意図する目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物が含まれる。さらに詳細には、治療有効量とは、治療される対象の発症を予防する、または現在の症状を軽減するのに有効な量を意味する。有効量の決定は、特に本明細書に提供される詳細な開示内容に照らして、当業者の能力内で十分である。
【０４８４】
本発明の方法で使用されるいずれかの化合物について、治療有効用量は、細胞培養アッセイから最初に推定し、用量は動物モデルで処方することができる。かかる情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定することができる。
【０４８５】
治療有効用量とは、患者において症状の改善をもたらす化合物の量を意味する。かかる化合物の毒性および治療有効性は、例えばＬＤ５０（試験集団の５０％致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準薬剤手順によって決定することができる。毒性作用と治療効果との用量比は治療指数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０との比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
【０４８６】
これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトで使用される範囲の薬用量を処方するのに使用することができる。かかる化合物の薬用量は、ほとんどまたは全く毒性を有さず、ＥＤ５０を含む濃度を循環する範囲内にあることが好ましい。薬用量は、用いられる剤形および用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変動する。正確な配合、投与経路および薬用量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択することができる（例えば、Fingl 等, 1975,「The Pharmacological Basis of Therapeutics」, Ch. 1参照)。
〈コンピューターに関連する実施形態〉
本発明で使用される「本発明の核酸コード」という用語は、以下の：ａ）配列番号１〜３の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００または１００００個のヌクレオチドの隣接スパン；ｂ）配列番号４の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００または６０００個のヌクレオチドの隣接スパンまたはその補体；ｃ）配列番号１〜３の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００または１００００個のヌクレオチドの隣接スパンであって、Ａ１〜Ａ１７からなる群から選択される２対立遺伝子マーカーを含む隣接スパン；ｄ）配列番号６の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００または４００個のヌクレオチドの隣接スパン；ｅ）配列番号６の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、３００または４００個のヌクレオチドの隣接スパンであって、２対立遺伝子マーカーＡ１８を含む隣接スパン；ｆ）上記のヌクレオチド配列のいずれか１つの相補的なヌクレオチド配列；のいずれか１つを含む、から本質的になる、またはからなるヌクレオチド配列を包含する。
【０４８７】
「本発明の核酸コード」はさらに、ａ）配列番号１〜３の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００または１００００個のヌクレオチドの隣接スパン；ｂ）配列番号４の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００または６０００個のヌクレオチドの隣接スパン；ｃ）配列番号６の少なくとも１２、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００，３００または４００個のヌクレオチドの隣接スパン；およびｄ）上記の配列のいずれか１つに相補的な配列；に相同的なヌクレオチド配列を包含する。相同配列は、これらの隣接スパンに少なくとも９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％の相同性を有する配列を意味する。相同性は、デフォルトパラメーターまたはいずれかの変更された（modified)パラメーターを用いたＢＬＡＳＴ２Ｎを含む、本明細書に記載のいずれかの方法を使用して決定することが可能である。相同的配列は、ウリジンが本発明の核酸コードにおけるチミンと置き換わるＲＮＡ配列も含む。本発明の核酸コードは、従来の１文字形式(the inside back cover of Stryer, Lubert. Biochemistry, 3rd edition. W. H Freeman & Co., New York参照)、または配列におけるヌクレオチドの同一性を記録する他の形式またはコードで表すことができることを理解されよう。
【０４８８】
本明細書で使用される「本発明のポリペプチドコード」という用語は、配列番号５の少なくとも６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、７００、１０００、１２００、１４００、１６００または１７００個のアミノ酸の隣接スパンを含有するポリペプチド配列を包含する。好ましい実施形態において、前記隣接スパンは、配列番号５のアミノ酸位置２７７、３３８、５７４、６７８、６８０、６８３、６９１、６９２、６９５、６９６、６９７、８９４、１４８０、１４８１、１４８３、１４８４、１４８５、１６３０、１６３１、１６３２、１６３６、１６６０、１６６７、１７０７、１７０９のうちの少なくとも１、２、３、５  または１０を含む。本発明のポリペプチドコードは、従来の１文字形式または３文字形式(the inside back cover of Stryer, Lubert. Biochemistry, 3rd edition. W. H Freeman & Co., New York参照)、または配列におけるヌクレオチドの同一性を記録する他の形式またはコードで表すことができることを理解されよう。
【０４８９】
本発明の核酸コードおよび本発明のポリペプチドコードは、コンピューターによって読み取り、アクセスすることができるいずれかの媒体上に保存、記録し、処理することができることは理解されよう。本明細書で使用される「記録された」および「保存された」という言葉は、コンピューター媒体上に情報を保存するプロセスを意味する。当業者であれば、コンピューターで読み取り可能な媒体上の情報を記録する、現在公知の方法のいずれかを容易に採り入れて、本発明の核酸コードの１つまたは複数、あるいは本発明のポリペプチドコードの１つまたは複数を含む製品を作製することができる。本発明の他の態様は、本発明の少なくとも  ２、５、１０、１５、２０、２５、３０、または５０個の核酸コードをその上に記録してあるコンピューターで読み取り可能な媒体である。本発明の他の態様は、本発明の少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、または５０個のポリペプチドコードをその上に記録してあるコンピューターで読み取り可能な媒体である。
【０４９０】
コンピューターで読み取り可能な媒体には、磁気的に読み取り可能な媒体、光学的に読み取り可能な媒体、電子的に読み取り可能な媒体および磁気／光学媒体が含まれる。例えば、コンピューターで読み取り可能な媒体は、ハードディスク、フロッピーディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル・バーサタイル・ディスク（ＤＶＤ）、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、または読み出し専用メモリー（ＲＯＭ）ならびに当業者に公知の他の種類の媒体である。
【０４９１】
本発明の実施形態は、システム、特に本明細書に記載の配列情報を保存かつ処理するコンピューターシステムを含む。コンピューターシステム１００の一例を、図２においてロック線図で図示する。本明細書で使用される「コンピューターシステム」とは、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列を解析するのに使用される、ハードウェア構成要素、ソフトウェア構成要素、およびデータ記憶構成要素を意味する。一実施形態において、コンピューターシステム１００は、Ｓｕｎ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ１０００サーバー（Ｓｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社、カリフォルニア州  パロアルト）である。コンピューターシステム１００は、配列データを処理し、そのデータにアクセスし、データを操作するプロセッサーを備える。プロセッサー１０５は、Ｉｎｔｅｌ社から市販のＰｅｎｔｉｕｍＩＩＩまたはＭｏｔｏｒｏｌａ社、Ｃｏｍｐａｑ社もしくはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ社から市販の同様のプロセッサーなど、よく知られている種類の中央処理装置であることが可能である。
【０４９２】
コンピューターシステム１００は、プロセッサー１０５と、データを保存するための１つまたは複数の内部データ記憶構成要素１１０と、データ記憶構成要素上に保存されたデータを検索するための１つまたは複数のデータ検索素子を備える汎用システムであることが好ましい。当業者ならば、現在市販されているコンピューターシステムのいずれかが適していることは容易に理解することができるだろう。
【０４９３】
特定の一実施形態において、コンピューターシステム１００は、メインメモリー１１５（好ましくは、ＲＡＭとして実装される）に接続されるバスに接続されたプロセッサー１０５、およびハードドライブなどの１つまたは複数の内部データ記憶素子１１０、および／またはその上に記録されたデータを有するコンピューターで読み取り可能な他の媒体を備える。一部の実施形態では、コンピューターシステム１００はさらに、内部データ記憶素子１１０上に保存されたデータを読み取る、１つまたは複数のデータ検索素子１１８を備える。
【０４９４】
そのデータ検索素子１１８は、例えばフロッピーディスクドライブ、コンパクトディスクドライブ、磁気テープドライブ等である。一部の実施形態において、内部データ記憶素子１１０は、制御論理および／またはその上に記録されたデータを含む、フロッピーディスク、コンパクトディスク、磁気テープ等の、取り外し可能であり、コンピューターで読み取り可能な媒体である。コンピューターシステム１００は有利なことに、データ検索素子に挿入したら、制御論理および／またはデータ記憶構成要素からのデータを読み取る適切なソフトウェアを備えるか、あるいはそのソフトウェアによってプログラムされる。
【０４９５】
コンピューターシステム１００は、コンピューターユーザーにアウトプットを表示するために使用されるディスプレイ１２０を備える。コンピューターシステム１００を、ネットワークまたはワイドエリアネットワークにおける他のコンピューターシステム１２５ａ〜ｃにリンクして、コンピューターシステム１００への集中アクセスを提供することができることにも留意されたい。
【０４９６】
本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列にアクセスかつ処理するソフトウェア（検索ツール、比較ツール、およびモデリングツール等）は、実行中にメインメモリー１１５に常駐する。
【０４９７】
一部の実施形態では、コンピューターシステム１００はさらに、コンピューターで読み取り可能な媒体上に保存された本発明の上述の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードをコンピューターで読み取り可能な媒体上に保存された参照ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と比較するための配列コンペアラ（comparer）を備える。「配列コンペアラ」とは、ヌクレオチド配列またはポリペプチド配列を、他のヌクレオチドまたはポリペプチド配列および／または制限されないが、データ記憶手段内に保存されたペプチド、ペプチド擬態化合物、および化学物質を含む化合物と比較するために、コンピューターシステム１００上に実装される１つまたは複数のプログラムを意味する。例えば、配列コンペアラは、コンピューターで読み取り可能な媒体上に保存された本発明の核酸コードのヌクレオチド配列および本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列を、コンピューターで読み取り可能な媒体上に保存された参照配列と比較して、相同性、生物学的機能に間係するモチーフ、または構造モチーフを同定することが可能である。この特許明細書の他で同定される種々の配列コンペアラのプログラムは特に、本発明のこの態様での使用に企図される。
【０４９８】
図３は、新規な配列とデータベースにおける配列との間の相同性レベルを決定するために、新規なヌクレオチド配列またはタンパク質配列を配列のデータベースと比較するプロセス２００の一実施形態を図示するフローチャートである。配列のそのデータベースは、コンピューターシステム１００内に保存された個人のデータベース、またはインターネットを通じて入手可能なＧＥＮＢＡＮＫ、ＰＩＲ  ＯＲ  ＳＷＩＳＳＰＲＯＴなどの公開データベースである。
【０４９９】
プロセス２００は開始状態２０１で開始し、次いで状態２０２に移動し、そこで比較すべき新規な配列がコンピューターシステム１００におけるメモリーに保存される。上述のように、そのメモリーは、ＲＡＭもしくは内部記憶素子を含むいずれかの種類のメモリーであることが可能である。
【０５００】
次いで、プロセス２００は、配列のデータベースが解析および比較のために開かれている状態２０４に移動する。次いで、プロセス２００は、データベースに保存された第１配列がコンピューター上のメモリーに読み込まれる状態２０６に移動する。次いで、第１配列が第２配列と同じであるかどうかを決定するために、状態２１０で比較を行う。この段階は、新規な配列とデータベースにおける第１配列との間の正確な比較を実施することに限定されないことを留意することは重要である。たとえ同一ではないとしても、２つのヌクレオチドまたはタンパク質配列を比較するための公知の方法は、当業者には公知である。例えば、試験すべき２つの配列間の相同性レベルを上げるために、一方の配列にギャップを導入することができる。比較中、配列にギャップまたは他の特徴が導入されるかどうかを制御するパラメーターは通常、コンピューターシステムのユーザーによって入力される。
【０５０１】
２つの配列の比較が状態２１０で実施されたら、２つの配列が同じかどうかの決定が決定状態でなされる。当然、「同じ」という用語は、完全に同一である配列に限定されない。ユーザーによって入力された相同性パラメーター内にある配列は、プロセス２００において「同じ」と記録されるだろう。
【０５０２】
２つの配列が同じであることの決定がなされた場合、プロセス２００は、データベースからの配列の名称がユーザーに表示される状態２１４に移る。この状態では、表示された名称を有する配列が入力された相同性の制約を満たすかどうかをユーザーに知らせる。保存された配列の名称がユーザーに表示されたら、プロセス２００は、更なる配列がデータベースに存在するかどうかの決定をなす決定状態２１９に移る。更なる配列がデータベースに存在しない場合には、次いで、プロセス２００は、最終状態２２０で終了する。しかしながら、更なる配列がデータベースに存在する場合、次いでプロセス２００は、ポインタがデータベース中の次の配列に移動する状態２２４に移り、その結果、それを新規な配列と比較することができる。この手法において、新規な配列は整列され、データベース中のすべての配列と比較される。
【０５０３】
その配列が相同ではない決定が決定状態２１２でなされた場合、次いで、他のいずれかの配列が比較のためにデータベースで利用可能であるかどうかを決定するために、プロセス２００は、決定状態２１８に即座に移るであろうことを留意されたい。
【０５０４】
したがって、本発明の一態様は、プロセッサー、本発明の核酸コードもしくは本発明のポリペプチドコードをその上に保存してあるデータ記憶素子、本発明の核酸コードもしくは本発明のポリペプチドコードと比較すべき、参照核酸配列もしくはポリペプチド配列をその上に検索可能に保存してあるデータ記憶素子、および比較を行うための配列コンペアラを備えるコンピューターシステムである。その配列コンペアラは、比較される配列間の相同性レベルを示すこと、または本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードおいて生物学的機能に関係するモチーフおよび構造モチーフを同定することが可能であり、あるいはこれらの核酸コードおよびポリペプチドコードと比較される配列において構造モチーフを同定することが可能である。一部の実施形態において、データ記憶素子は、本発明の核酸コードもしくは本発明のポリペプチドコードの少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、または５０の配列をその上に保存してある。
【０５０５】
本発明の他の態様は、本発明の核酸コードと参照ヌクレオチド配列との間の相同性のレベルを決定する方法であって、相同性レベルを決定するコンピュータープログラムを使用することによって、核酸コードおよび参照ヌクレオチド配列を読み取る段階と、そのコンピュータープログラムで核酸コードと参照ヌクレオチド配列との間の相同性を決定する段階とを含む方法である。そのコンピュータープログラムは、デフォルトパラメーターまたはいずれかの変更されたパラメーターを用いたＢＬＡＳＴ２Ｎが含まれる、本明細書に具体的に列挙されているプログラムを含む、相同性レベルを決定するための多数のコンピュータープログラムのいずれかであることが可能である。その方法は、上述のコンピューターシステムを用いて実行することができる。その方法はまた、コンピュータープログラムを使用して、本発明の上述の核酸コードの２、５、１０、１５、２０、２５、３０、または５０を読み取り、かつ核酸コードと参照ヌクレオチド配列との間の相同性を決定することによって実施される。
【０５０６】
図４は、２つの配列が相同であるかどうかを決定するための、コンピューターにおけるプロセス２５０の一実施形態を図示するフローチャートである。プロセス２５０は開始状態２５２で開始し、次いで、比較すべき第１配列がメモリーに保存される状態２５４に移る。次いで、比較すべき第２配列が状態２５６でメモリーに保存される。次いで、プロセス２５０は、第１配列における第１文字が読み取られる状態２６０に移り、次いで、第２配列の第１文字が読み取られる状態２６２に移る。その配列がヌクレオチド配列である場合には、次いでその文字は通常、Ａ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵであると考えられることを理解されたい。その配列がタンパク質配列である場合には、次いでそれは１文字アミノ酸コードであるはずであり、そのため第１および第２配列が容易に比較できる。
【０５０７】
次いで、２つの文字が同じであるかどうかの決定が、決定状態２６４でなされる。それらが同じ場合には、次いでプロセス２５０は、第１および第２配列における次の文字が読み取られる状態２６８に移る。次いで、その次の文字が同じであるかどうかの決定がなされる。それらが同じである場合には、次いでプロセス２５０は、２つの文字が同じでなくなるまでこのループを続ける。その次の２つの文字が同じでないという決定がなされた場合、プロセス２５０は決定状態２７４に移り、読み取るべきいずれかの配列の更なる文字が存在するかどうかを決定する。
【０５０８】
読み取るべき、更なる文字が全く存在しない場合、次いでプロセス２５０は、第１配列と第２配列との間の相同性レベルがユーザーに表示される状態２７６に移る。相同性のレベルは、第１配列における配列の総数の中から、同じであった配列間の文字の比率を計算することによって決定される。したがって、第１の１００ヌクレオチド配列におけるすべての文字が第２配列におけるすべての文字と整列した場合には、相同性レベルは１００％であると考えられる。
【０５０９】
代替方法として、そのコンピュータープログラムは、本発明の核酸コードが１つまたは複数の位置で参照核酸配列と異なるかどうかを決定するために、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列を参照ヌクレオチド配列と比較するコンピュータープログラムであることが可能である。任意に、かかるプログラムは、参照ポリヌクレオチドまたは本発明の核酸コードのいずれかの配列に対して、挿入、欠失、または置換されたヌクレオチドの長さおよび同一性を記録する。一実施形態において、コンピュータープログラムは、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列に対して、１つまたは複数の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含有するかどうかを決定するプログラムであることが可能である。これらの単一ヌクレオチド多型はそれぞれ、一塩基の置換、挿入、または欠失を含む場合がある。
【０５１０】
本発明の別の態様は、本発明のポリペプチドコード配列と参照ポリペプチド配列との間の相同性レベルを決定する方法であって、相同性レベルを決定するコンピュータープログラムを使用することによって、本発明のポリペプチドコード配列および参照ポリペプチド配列を読み取る段階と、そのコンピュータープログラムを使用してポリペプチドコード配列と参照ポリペプチド配列との間の相同性を決定する段階と、を含む方法である。
【０５１１】
したがって、本発明の別の態様は、本発明の核酸コードが参照ヌクレオチド配列と１つまたは複数のヌクレオチドにおいて異なるかどうかを決定する方法であって、核酸配列間の差異を同定するコンピュータープログラムを使用することによって、核酸コード配列および参照ヌクレオチド配列を読み取る段階と、そのコンピュータープログラムを使用して核酸コード配列と参照ヌクレオチド配列との間の差異を同定する段階と、を含む方法である。一部の実施形態において、そのコンピュータープログラムは、単一ヌクレオチド多型を同定するプログラムである。その方法は、上述のコンピューターシステムおよび図４に示す方法によって実行される。その方法は、コンピュータープログラムを使用することによって、本発明の核酸コードの少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、または５０および参照ヌクレオチド配列を読み取り、その核酸コードと参照ヌクレオチド配列との差異をコンピューターシステムで同定することによってもまた行われる。
【０５１２】
他の実施形態では、コンピューターに基づくシステムはさらに、本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列内の特徴を同定するための識別子を含む。
【０５１３】
「識別子」とは、上述の本発明の核酸コードのヌクレオチド配列または本発明のポリペプチドコードのアミノ酸配列内の特定の特徴を同定する１つまたは複数のプログラムを意味する。一実施形態において、その識別子は、本発明のｃＤＮＡコードにおけるオープンリーディングフレームを同定するプログラムを含む。
【０５１４】
図５は、配列における特徴の存在を検出する識別子プロセス３００の一実施形態を図示するフローチャートである。プロセス３００は開始状態３０２で開始し、次いで、特徴についてチェックすべき第１配列がコンピューターシステム１００におけるメモリー１１５に保存される状態３０４に移る。次いで、プロセス３００は、配列特徴のデータベースが開かれている状態３０６に移る。かかるデータベースは、特徴の名称と共に各特徴の属性のリストを含むであろう。例えば、特徴の名称が「開始コドン」であり、属性が「ＡＴＧ］であり得る。別の例は、特徴の名称が「ＴＡＡＴＡＡ  ボックス」である場合、特徴の属性は「ＴＡＡＴＡＡ」と考えられる。かかるデータベースの例は、University of Wisconsin Genetics Computer Group (www.gcg.com)によって作られている。
【０５１５】
特徴のデータベースが状態３０６で開かれたら、プロセス３００は、第１の特徴がデータベースから読み取られる状態３０８に移る。第１特長の属性と第１配列との比較は、状態３１０で行われる。次いで、特徴の属性が第１配列で見出されるかどうかの決定が、決定状態３１６でなされる。その属性が見出された場合、プロセス３００は、その見出された特徴の名称がユーザーに表示される状態３１８に移る。
【０５１６】
次いで、プロセス３００は、特徴がデータベースに存在するかどうかの決定がなされる決定状態３２０に移る。更なる特徴が存在しない場合、次いでプロセス３００は、最終状態３２４で終了する。しかしながら、更なる特徴がデータベースに存在する場合には、次いでプロセス３００は、状態３２６で次の配列特徴を読み取り、次の特徴の属性が第１配列に対して比較される状態３１０にループバックする。
【０５１７】
特徴の属性が、決定状態３１６にて第１配列において見出されない場合、プロセス３００は、さらなる特徴がデータベースに存在するかどうかを決定するために決定状態３２０に直接移動することを留意されたい。
【０５１８】
他の実施形態では、識別子は、本発明のポリペプチドコードの３次元構造を決定する分子モデリングプログラムを含む。一部の実施形態では、その分子モデリングプログラムは、公知の３次元タンパク質における残基の構造環境を表すプロファイルと最も適合性のある標的配列を同定する。（例えば、米国特許第５，４３６，８５０号参照）。他の技術では、所定のファミリーにおけるタンパク質の公知の３次元構造を重ね合わせて、そのファミリーにおける構造的に保存された領域を定義する。このタンパク質モデリング技術では、本発明のポリペプチドコードの構造に近づけるために相同的タンパク質の公知の３次元構造も使用する。（例えば、米国特許第５，５５７，５３５号参照）。従来の相同性モデリング技術は、プロテアーゼおよび抗体のモデルを構築するために日常的に用いられている。(Sowdhamini 等, (1997))。対照のタンパク質が鋳型タンパク質に対して不十分な配列同一性を有する場合、３次元タンパク質モデルを作るために、比較アプローチもまた用いることができる。場合によっては、非常に弱い配列同一性を有するにもかかわらず、タンパク質は同様な３次元構造に折り畳む。例えば、多数のらせん状サイトカインの３次元構造は、配列相同性が弱いにもかかわらず、同様な３次元トポロジーに折り畳む。
【０５１９】
現在、スレッディング法の最近の発達によって、標的と鋳型（１つまたは複数）との間の構造的関連性が配列レベルで検出可能ではない多数の状況において、有望な折り畳みパターンの同定が可能である。多重配列スレッディング（ＭＳＴ）、構造同値(structural equivalencies)を用いて、折り畳みの認識が実行されるハイブリッド法は、ディスタンスジオメトリーのプログラムＤＲＡＧＯＮを用いてスレッディングの結果から推論されて、低解像度のモデルが構築され、ＱＵＡＮＴＡなどの分子モデリングパッケージを使用して、全原子の画像が作られる。
【０５２０】
この３段階のアプローチに従って、最初に、１つまたは複数の３Ｄ構造上に複数の整列配列を同時にスレッディングすることができる、新規な折り畳み認識アルゴリズムＭＳＴを用いることによって、候補鋳型を同定する。第２段階において、ＭＳＴの結果から得られた構造同値を、残基間距離拘束に転換し、二次構造予測から得られた補助的情報と共に、ディスタンスジオメトリープログラムＤＲＡＧＯＮに入力する。そのプログラムは不偏手法で拘束を組み合わせ、多数の低解像度モデルのコンフォメーションを迅速に形成する。第３段階において、これらの低解像度モデルのコンフォメーションは、全原子モデルに変換され、分子モデリングパッケージＱＵＡＮＴＡを使用したエネルギーの最小化にかけられる(例えば、Aszodi 等, (1997)参照)。
【０５２１】
次いで、分子モデリング解析の結果を薬物設計技術に用いて、本発明のポリペプチドコードの活性を調節する作用薬を同定することが可能である。
【０５２２】
したがって、本発明の他の態様は、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコード内の特徴を同定する方法であって、その中の特徴を同定するコンピュータープログラムを使用することによって、核酸コード（１つまたは複数）またはポリペプチドコード（１つまたは複数）を読み込み、その核酸コード（１つまたは複数）またはポリペプチドコード（１つまたは複数）内の特徴をコンピュータープログラムで同定することを含む方法である。一実施形態では、コンピュータープログラムは、オープンリーディングフレームを同定するコンピュータープログラムを含む。更なる実施形態において、コンピュータープログラムは、ポリペプチド配列における構造モチーフを同定する。他の実施形態では、コンピュータープログラムは、分子モデリングプログラムを含む。その方法は、コンピュータープログラムを使用することによって、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドの単一配列または少なくとも、５、１０、１５、２０、２５、３０，もしくは５０を読み込み、コンピュータープログラムでその核酸コードまたはポリペプチド内の特徴を同定することによって行われる。
【０５２３】
本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドを保存して、様々な形式で様様なデータ処理装置を用いて処理することが可能である。例えば、それらは、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ＷＯＲＤもしくはＷＯＲＤＰＥＲＦＥＣＴなどの文書作成ファイルに、またはＤＢ２、ＳＹＢＡＳＥ、もしくはＯＲＡＣＬＥなどの当業者に公知の様々なデータベースプログラムにＡＳＣＩＩファイルとして保存することが可能である。さらに、多くのコンピュータープログラムおよびデータベースは、配列コンペアラ、識別子、または参照ヌクレオチドもしくはポリペプチド配列のソースとして使用され、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードと比較される。以下のリストは、本発明を制限するものではないが、本発明の核酸コードまたは本発明のポリペプチドコードに関して有用なプログラムおよびデータベースへのガイダンスを提供する。使用することが可能なプログラムおよびデータベースには、制限されないが、ＭａｃＰａｔｔｅｒｎ（ＥＭＢＬ）、ＤｉｓｃｏｖｅｒｙＢａｓｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ）、ＧｅｎｅＭｉｎｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ）、Ｌｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ）、ＭａｃＬｏｏｋ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｇｒｏｕｐ）、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２（ＮＣＢＩ）、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸ(Altschul等1990)、ＦＡＳＴＡ(Pearson および Lipman, 1988)、ＦＡＳＴＤＢ(Brutlag 等, 1990)、Ｃａｔａｌｙｓｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、Ｃａｔａｌｙｓｔ／ＳＨＡＰＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、Ｃｅｒｉｕｓ２．ＤＢＡｃｃｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、ＨｙｐｏＧｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、ＩｎｓｉｇｈｔＩＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、ＣＨＡＲＭｍ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、Ｆｅｌｉｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、ＤｅｌＰｈｉ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、ＱｕａｎｔｅＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、Ｈｏｍｏｌｏｇｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、Ｍｏｄｅｌｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、ＩＳＩＳ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、Ｑｕａｎｔａ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、ＷｅｂＬａｂ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、ＷｅｂＬａｂ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、ＳｅｑＦｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社）、ＥＭＢＬ／Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔｅｉｎデータベース、ＭＤＬ  Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙデータベース、ＭＤＬ  Ｄｒｕｇ  Ｄａｔａ  Ｒｅｐｏｒｔデータベース��Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙデータベース、Ｄｅｒｗｅｎｔｓ’ｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｄｒｕｇ  Ｉｎｄｅｘ  データベース、ＢｉｏＢｙｔｅＭａｓｔｅｒＦｉｌｅデータベース、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース、およびＧｅｎｓｅｑｎデータベースが含まれる。他の多くのプログラムおよびデータベースも、示された本発明の開示内容において当業者には明らかであるだろう。
【０５２４】
上記のプログラムを使用して検出することができるモチーフは、ロイシンジッパー、ヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン結合、αヘリックス、およびβシートをコードする配列、ホメオボックス、酸性ストレッチ（stretch）、酵素活性部位、基質結合部位、および酵素切断部位などの転写調節に関係するコードされたタンパク質、配列の分泌を方向付ける単一ペプチドをコードする単一配列を含む。
【０５２５】
本出願全体にわたり、様々な出版物、特許および公開特許出願が記載されている。本出願に参照されているこれらの出版物、特許および公開特許明細書の開示内容は、本発明の開示内容に参照として組み込まれ、本発明が関係する現況技術がより完全に説明される。
《実施例》
【実施例１】
【０５２６】
〈２対立遺伝子マーカーの同定−ＤＮＡ抽出〉
ドナーは血縁関係がなく健康であった。それらは、フランス人異質集団を表す十分な多様性を示した。１００個体からのＤＮＡを抽出し、２対立遺伝子マーカーを検出するために試験した。
【０５２７】
ＥＤＴＡの存在下にて、末梢静脈血３０ｍｌを各ドナーから採取した。細胞（ペレット）を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、回収した。溶解溶液（最終体積５０ｍｌ：１０ｍＭトリス、ｐＨ７．６；５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；１０ｍＭ  ＮａＣｌ）によって、赤血球を溶解した。溶解溶液中にペレットを再懸濁した後、上清中に存在する残留赤血球を除去するのに必要な回数、その溶液を遠心分離した（１０分、２０００ｒｐｍ）。
【０５２８】
−３ｍｌのＴＥ１０−２（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）／０４Ｍ  ＮａＣｌ
−２００μｌの１０％ＳＤＳ
−５００μｌのＫ−プロテイナーゼ（ＴＥ１０−２／０．４Ｍ  ＮａＣｌ中にＫ−プロテイナーゼ２ｍｇ）から構成される溶解溶液３．７ｍｌで、白血球のペレットを４２℃で一晩溶解した。
【０５２９】
タンパク質を抽出するために、飽和ＮａＣｌ（６Ｍ）（１／３．５ｖ／ｖ）１ｍｌを添加した。激しく攪拌した後、その溶液を１００００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。
【０５３０】
ＤＮＡを沈殿させるために、１００％エタノール２〜３容積を前の上清に添加し、その溶液を２０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。そのＤＮＡ溶液を７０％エタノールで３回すすぎ、塩を除去し、２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。そのペレットを３７℃で乾燥させて、ＴＥ１０−１  １ｍｌまたは水１ｍｌ中で再懸濁した。２６０ｎｍにてＯＤを測定することによって、ＤＮＡ濃度を評価した（１単位ＯＤ＝５０μｇ／ｍｌＤＮＡ）。
【０５３１】
ＤＮＡ溶液中のタンパク質の存在を決定するために、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０比を決定した。１．８〜２のＯＤ２６０／ＯＤ２８０比を有するＤＮＡ標本のみを、以下に記述するその後の実施例で使用した。各個人からの等量のＤＮＡを混合することによって、そのプールを構成した。
【実施例２】
【０５３２】
〈２対立遺伝子のマーカーの同定：ＰＣＲによるゲノムＤＮＡの増幅〉
実施例１のＤＮＡサンプルの特定のゲノム配列の増幅を、予め得られたＤＮＡのプール上で行った。さらに、５０個体のサンプルを同様に増幅した。
ＣＲアッセイを以下のプロトコルを用いて行った：
2004525614.tif 000015
第１プライマーの各対を、本明細書に開示されるＣａｎＩｏｎ遺伝子の配列情報およびＯＳＰソフトウェア(Hillier & Green, 1991)を用いて設計した。この第１プライマー対は長さ約２０ヌクレオチドであり、標識されたＰＵおよびＲＰカラムにおいて、以下の表に開示される配列を有した。
【０５３３】
【表３】
2004525614.tif 000016
好ましくは、プライマーは、シーケンシングに有用である増幅に対して標的化された特定の塩基の上流にある共通のオリゴヌクレオチド末端を含有した。
【０５３４】
プライマーＰＵは、以下の更なるＰＵ５’配列：ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴを含有し、プライマーＲＰは、以下のＲＰ５’配列：ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣを含有する。追加のＰＵ５’配列を含有するプライマーは配列番号７に示される。追加のＲＰ５’配列を含有するプライマーは配列番号８に示される。
【０５３５】
これらのプライマーの合成は、ホスホラミダイト法に従ってＧＥＮＳＥＴ  ＵＦＰＳ２４．１シンセサイザーで実施した。
【０５３６】
ＤＮＡの増幅は、Ｇｅｎｉｕｓ  ＩＩサーモサイクラーで行った。９５℃で１０分間加熱した後、４０サイクルを実施した。各サイクルは：９５℃で３０秒間、５４℃で１分間、７２℃で３０秒間を含む。最終の伸長に関しては、７２℃で１０分間により、増幅を終了した。得られた増幅産物の量を、挿入原子剤（分子プローブ）として蛍光光度計およびピコグリーンを用いて、９６穴マイクロタイタープレート上で決定した。
【実施例３】
【０５３７】
〈２対立遺伝子マーカーの同定−増幅されたゲノムＤＮＡのシーケンシングおよび多型の同定〉
実施例２で得られた増幅されたＤＮＡのシーケンシングをＡＢＩ３７７シーケンサーで行った。増幅産物の配列は、染料ターミネーターサイクルシーケンシングプロトコルと共に自動ジデオキシターミネーターシーケンシング反応を用いて決定した。シーケンシング反応の産物をシーケンシングゲル上に流し、ゲル画像解析（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＤＮＡシーケンシング解析ソフトウェア（２．１．２バージョン））を使用して、その配列を決定した。
【０５３８】
その配列データをさらに評価して、増幅断片内の２対立遺伝子マーカーの存在を検出した。多型検索は、上述の同一位置で生じる、異なる塩基から生じる電気泳動パターンの重なり合ったピークの存在に基づいた。
【０５３９】
増幅の１７個の断片において、１８個の２対立遺伝子マーカーが検出された。これらの２対立遺伝子マーカーの局在は、以下の表に示すとおりである。
【０５４０】
【表４】
2004525614.tif 000017
ＢＭとは、「２対立遺伝子マーカー」を指す。Ａｌｌ１およびａｌｌ２はそれぞれ、２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子１および対立遺伝子２を意味する。
【０５４１】
【表５】
2004525614.tif 000018
【実施例４】
【０５４２】
〈マイクロシーケンシングによる多型のバリデーション〉
実施例３において同定された２対立遺伝子マーカーをさらに確認し、それらのそれぞれの頻度をマイクロシーケンシングによって決定した。マイクロシーケンシングは、実施例１に記載の個々のＤＮＡサンプルについて行った。
【０５４３】
ＰＣＲプライマーの同じセット（表１）を用いた２対立遺伝子マーカーの検出のために、上述のようにＰＣＲによって、個体のゲノムＤＮＡからの増幅を実施した。
【０５４４】
マイクロシーケンシングで使用される好ましいプライマーは、長さ約１９ヌクレオチドであり、考えられる多型塩基のすぐ上流でハイブリダイズした。本発明に従って、マイクロシーケンシングに使用されるプライマーを以下の表に列挙する。
【０５４５】
【表６】
2004525614.tif 000019
Ｍｉｓ１およびＭｉｓ２はそれぞれ、ＣａｎＩｏｎ遺伝子の非コード鎖と、またはＣａｎＩｏｎ遺伝子のコード鎖と、ハイブリダイズするマイクロシーケンシング用プライマーを意味する。
【０５４６】
そのマイクロシーケンシング反応を以下の通り実施した：
増幅産物の精製後、製造元の助言に従って、１０ｐｍｏｌマイクロシーケンシングオリゴヌクレオチド、１Ｕ  Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｅ７９０００Ｇ）、Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅバッファー１．２５μｌ（２６０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ９．５、６５ｍＭ  ＭｇＣｌ2）、および試験される各２対立遺伝子マーカーの多型部位におけるヌクレオチドに相補的な２つの適切な蛍光ｄｄＮＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｓｅｔ  ４０１０９５）を最終体積２０μｌで添加することによって、マイクロシーケンシング反応混合物を調製した。９４℃で４分後、５５℃で１５秒、７２℃で５秒、９４℃で１０秒のＰＣＲの２０サイクルを、Ｔｅｔｒａｄ  ＰＴＣ−２２５サーモサイクラー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）において行った。次いで、取り込まれなかった染料ターミネーターをエタノール沈殿によって除去した。サンプルを最終的に、ホルムアミド−ＥＤＴＡローディングバッファー中に再懸濁し、ポリアクリルアミドシーケンシングゲル上にローディングする前に９５℃で２分間加熱した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡシーケンサーによって、データを回収し、ＣａｎＩｏｎＳＣＡＮソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を使用して処理した。
【０５４７】
ゲル解析に続いて、増幅された各断片に存在する２対立遺伝子マーカーの対立遺伝子の決定を可能にするソフトウェアで、データを自動的に処理した。
【０５４８】
そのソフトウェアによって、上記のマイクロシーケンシング手順から得られるシグナルの強度が弱い、正常、または飽和しているかどうか、またはシグナルが不明瞭であるかどうかなどの因子が評価される。さらに、ソフトウェアによって、有意なピークが同定される（形状および高さの基準に従って）。有意なピークの中で、標的にされた部位に相当するピークが、それらの位置に基づいて同定される。２つの有意なピークが同じ位置に対して検出された場合、各サンプルは、高さの比に基づくホモ接合型またはヘテロ接合型として分類される。
【実施例５】
【０５４９】
〈ＣａｎＩｏｎタンパク質に対する抗体組成物の調製〉
実質的に純粋なタンパク質またはポリペプチドを、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部をコードする発現ベクターを含有する形質移入または形質転換された細胞から単離する。最終標本におけるタンパク質の濃度を、Ａｍｉｃｏｎフィルターデバイス上で数マイクログラム／ｍｌのレベルまで濃縮することによって調整する。次いで、そのタンパク質に対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を以下のように作製することができる：
Ａ．ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体の作製
ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部におけるエピトープに対するモノクローナル抗体を、Kohler, G. および Milstein, C., (1975)の伝統的方法またはその派生的方法に従って、マウスハイブリドーマから作製することができる。Harlow, E., および D. Lane. 1988もまた参照のこと。
【０５５０】
簡潔には、数週間にわたって、数マイクログラムのＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部をマウスに繰り返し接種する。次いで、そのマウスを屠殺し、抗体を生成する脾臓細胞を単離する。ポリエチレングリコールを使用して、その脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させ、融合していない余分な細胞を、アミノプテリンを含有する選択培地（ＨＡＴ培地）上でその系の成長によって破壊する。うまく融合された細胞を希釈し、その希釈液のアリコートを、培養物の成長が続けられるマイクロタイタープレートのウェル中に入れる。抗体生成クローンは、最初Engvall (1980)によって記述されているようにＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイ、およびその派生的方法によって、ウェルの上清液中の抗体を検出することによって同定される。選択されたポジティブなクローンを拡大し、それらのモノクローナル抗体産物を使用するために収集することができる。モノクローナル抗体作製の詳細な手順は、L. 等 Basic Methods in Molecular Biology Elsevier, New York. Section 21-2に記述されている。
Ｂ．免疫化によるポリクローナル抗体の作製
未修飾であるか、または修飾して免疫原性を高めることができる、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部で適切な非ヒト動物を免疫化することによって、ＣａｎＩｏｎタンパク質またはその一部における異質エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗血清を作製することができる。適切な非ヒト動物は、好ましくは非ヒト哺乳類であることが好ましい。通常マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、またはウマである。代わりに、ＣａｎＩｏｎ濃度に対して濃縮された未精製標本を使用して、抗体を生成することができる。当技術分野で公知の適切なアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム、ＲＩＢＩ等）の存在下にて、かかるタンパク質、断片または標本を非ヒト哺乳類に導入する。さらに、そのタンパク質、断片または標本を、免疫原性を高めるであろう薬剤で前処理することが可能であり、かかる薬剤は、例えばメチル化ウシ血清アルブミン（ｍＢＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｂ型肝炎表面抗原、およびキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）を含む当技術分野で公知の薬剤である。免疫化された動物からの血清を回収し、処理し、公知の手順に従って試験する。その血清が不要なエピトープに対するポリクローナル抗体を含有する場合、そのポリクローナル抗体をイムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
【０５５１】
有効なポリクローナル抗体生成は、抗原および宿主種の両方に関係する多くの因子によって影響を受ける。また、宿主動物は、接種部位および用量に応じて異なり、不適切な用量または過剰用量の抗原によって、血清の力価が低くなる。複数の皮内部位に投与された少用量（ｎｇレベル）の抗原が、最も信頼性が高いと思われる。ポリクローナル抗血清を生成かつ処理する技術は当技術分野で公知であり、例えばMayerおよびWalker (1987)を参照のこと。ウサギに対する有効な免疫化プロトコルが、Vaitukaitis, J. 等 (1971)で見出すことができる。
【０５５２】
一定間隔を空けて追加抗原注射をし、例えば抗原の公知の濃度に対する寒天中での二重免疫拡散によって半定量的に決定される、その抗体力価が下がり始めた時に、抗血清を収集することができる。例えば、Ouchterlony, O. 等 (1973)を参照のこと。抗体のプラトー濃度は通常、血清の０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌの範囲にある（約１２μＭ）。抗原に対する抗血清の親和性は、例えばFisher, D. (1980)によって記述されているように競合結合曲線を作成することによって決定される。
【０５５３】
モノクローナルまたはポリクローナルプロトコルのいずれかに従って作製された抗体標本は、生体における抗原を有する物質の濃度を決定する定量的イムノアッセイにおいて有用であり；それらはまた、生体サンプルにおける抗原の存在を同定するために半定量的または定性的に使用される。その抗体は、タンパク質を発現する細胞を殺すため、または体内のタンパク質レベルを低減するために治療用組成物において使用することも可能である。
【０５５４】
本発明の好ましい実施形態が例証かつ説明されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者によって様々な変更を加えることができることは理解されよう。
【０５５５】
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【図面の簡単な説明】
【０５５６】
【図１】Ｃａｎｌｏｎ遺伝子を含有する染色体１３ｑのＢＡＣマップを示す図である。
【図２】例示的なコンピューターシステムのブロック図である。
【図３】新規な配列とデータベースの配列との間の相同性レベルを決定するための、新規なヌクレオチド配列またはタンパク質配列を配列のデータベースと比較する、プロセス２００の一実施形態を示すフローチャートである。
【図４】２つの配列が相同的であるかどうかを決定するための、コンピューターにおけるプロセス２５０の一実施形態を示すフローチャートである。
【図５】配列中の特徴の存在を検出するための、識別子プロセス３００の一実施形態を示すフローチャートである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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