(57)【要約】【解決手段】本発明は、組換えアデノウイルスベクタの提供によって、目的とする異質な核酸を間充織幹細胞に送達さるための新規な方法及び手段を提供する。この組換えアデノウイルスベクタは、間充織細胞幹細胞のための自然な親和性を、代表的には他の種類の細胞、特に肝細胞のための減少している親和性との組合せで備えるか、又は有する。また、本発明は、本発明に従う組換えアデノウイルスベクタの使用による異質の核酸を備える間充織幹細胞を提供し、及び多発性硬化症、リウマチ様関節炎、血管形成及び骨関連疾患の処置のための、例えば、骨の形成（再生）を含む処置において、薬を調製するためのかかる間充織幹細胞の使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異質の核酸を間充織幹細胞に送達するための組換えアデノウイルスベクタの使用であって、前記組換えアデノウイルスベクタが間充織幹細胞のための親和性を備えることを特徴とする使用。
【請求項２】
前記組換えアデノウイルスベクタが、肝細胞のための少なくとも部分的に減少している親和性を有することを特徴とする請求項１記載の使用。
【請求項３】
間充織幹細胞のための前記親和性が、ウイルスカプシド又はその機能的誘導体及び／又は類似体の少なくとも１部分によって提供されることを特徴とする請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
前記ウイルスカプシドが、少なくとも２種の異なるアデノウイルスからのタンパク質、又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体を含むことを特徴とする請求項３記載の使用。
【請求項５】
少なくとも１種の前記アデノウイルスが亜群Bのアデノウイルスであることを特徴とする請求項４記載の使用。
【請求項６】
亜群Bの前記アデノウイルスが、アデノウイルス１１、−１６、−３５及び−５１：からなる群より選ばれることを特徴とする請求項５記載の使用。
【請求項７】
前記亜群Bのアデノウイルスがアデノウイルス１６であることを特徴とする請求項６記載の使用。
【請求項８】
前記ウイルスカプシドが、亜群Bに属さないアデノウイルスから導かれる少なくとも１種の他のタンパク質、又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体を更に含むことを特徴とする請求項５乃至７のいずれか一項記載の使用。
【請求項９】
前記他のタンパク質が亜群Cのアデノウイルスから導かれることを特徴とする請求項８記載の使用。
【請求項１０】
前記他のタンパク質がアデノウイルス５から導かれることを特徴とする請求項９記載の使用。
【請求項１１】
前記組換えアデノウイルスベクタが、少なくとも２種の異なるアデノウイルスからのタンパク質をコード化する核酸を含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか一項記載の使用。
【請求項１２】
前記核酸が、亜群Ｂアデノウイルス線維タンパク質の親和性決定部分をコード化することを特徴とする請求項１１記載の使用。
【請求項１３】
前記アデノウイルス線維タンパク質が、アデノウイルス１１、−１６、−３５及び−５１：からなる群より選ばれるアデノウイルスのものであることを特徴とする請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
前記核酸が修飾された核酸であり、前記核酸の標的細胞内で複製する能力が、好ましくは、Ｅ１−領域の少なくとも１部分の欠失を介して、減少するか又は不活化されることを特徴とする請求項１１乃至１３のいずれか一項記載の使用。
【請求項１５】
前記核酸が修飾された核酸であり、前記核酸によってコード化されるアデノウイルスタンパク質に対する免疫反応を行う宿主免疫系の能力が、好ましくは、Ｅ２Ａ及び／又はＥ４−領域の少なくとも１部分の欠失を介して、減少するか又は不活化されることを特徴とする請求項１１乃至１４のいずれか一項記載の使用。
【請求項１６】
前記組換えアデノウイルスベクタが少なくとも１種の異質な核酸を更に含む請求項１乃至１５のいずれか一項記載の使用。
【請求項１７】
前記組換えアデノウイルスベクタが、亜群Ｂアデノウイルスカプシド及び少なくとも１種の異質な核酸を含むことを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか一項記載の使用。
【請求項１８】
前記亜群Ｂアデノウイルスが、アデノウイルス１１、−１６、−３５又は−５１であることを特徴とする請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
異質な核酸を間充織幹細胞に送達するための組換えアデノウイルスベクタの使用であって、前記組換えアデノウイルスベクタが亜群Ｂアデノウイルスから導かれることを特徴とする使用。
【請求項２０】
前記組換えアデノウイルスベクタが、アデノウイルス１１、−１６、−３５及び−５１：からなる群より選ばれるアデノウイルスから導かれることを特徴とする請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
異質な核酸を間充織幹細胞に送達するためであることを特徴とする請求項１乃至２０のいずれか一項記載の使用。
【請求項２２】
組織工学で用いることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれか一項記載の使用。
【請求項２３】
疾病の処置のためであり、治療用タンパク質又はその機能的等価物、又はＲＮＡをコード化する異質な核酸を間充織幹細胞に移動させることによって治療可能であることを特徴とする請求項１乃至２１のいずれか一項記載の使用。
【請求項２４】
前記疾病が変形関節炎又は多発性硬化症であることを特徴とする請求項２３記載の使用。
【請求項２５】
前記異質な核酸がＩＬ−１０をコード化することを特徴とする請求項２４記載の使用。
【請求項２６】
間充織幹細胞であって、請求項１乃至２５のいずれか一項記載の組換えアデノウイルスベクタの使用を介する異質な核酸を備えることを特徴とする間充織幹細胞。
【請求項２７】
請求項２６記載の間充織幹細胞の使用であって、骨関連疾患の処置用の薬を調製するためであることを特徴とする使用。
【請求項２８】
前記異質な核酸が骨形態形成タンパク質−２をコード化することを特徴とする請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
前記異質な核酸が骨ＬＩＭ鉱質形成タンパク質−１をコード化することを特徴とする請求項２７又は２８記載の使用。
【請求項３０】
請求項２６記載の間充織幹細胞の使用であって、多発性硬化症の処置用の薬を調製するためであることを特徴とする使用。
【請求項３１】
請求項２６記載の間充織幹細胞の使用であって、脈管形成を促進するための薬の調製で用いることを特徴とする使用。
【請求項３２】
請求項２６記載の間充織幹細胞の使用であって、変形関節炎を処置するための薬の調製で用いることを特徴とする使用。
【請求項３３】
前記異質な核酸がＩＬ−１０をコード化することを特徴とする請求項３２記載の使用。
【請求項３４】
亜群Ｂのアデノウイルスから導かれる線維タンパク質、又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体の使用であって、異質な核酸を間充織幹細胞に送達するためであることを特徴とする使用。
【請求項３５】
前記線維タンパク質が、アデノウイルス１１、−１６、−３５及び−５１：からなる群より選ばれるアデノウイルスから導かれることを特徴とする請求項３４記載の使用。
【請求項３６】
間充織幹細胞の形質導入のための方法であって、次の工程：
−間充織幹細胞を培養すること；及び
−前記間充織幹細胞を、異質な核酸を含む組換えアデノウイルスベクタと接触させること；
を含み、
前記組換えアデノウイルスベクタが間充織幹細胞のための親和性を備えることを特徴とする方法。
【請求項３７】
間充織幹細胞の形質導入のための方法であって、次の工程：
−間充織幹細胞を培養すること；及び
−前記間充織幹細胞を、異質な核酸を含む組換えアデノウイルスベクタと接触させること；
を含み、
前記組換えアデノウイルスベクタが亜群Ｂアデノウイルスから導かれることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、遺伝子治療の分野に関し、更に特に、間充織幹細胞(mesenchymal stem cell間葉性幹細胞)のための自然な親和性(tropism向性)を備えるか又は有するアデノウイルスを用いる遺伝子治療に関する。さらに、本発明は、所望の核酸での間充織幹細胞の形質導入のための方法及び手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
遺伝子治療では、遺伝情報が、宿主細胞中の遺伝的欠損の修正（補充）、宿主細胞での不必要な機能の抑制又は宿主細胞の除去のいずれかのために、宿主細胞に送達される。もちろん、遺伝情報はまた、所望の機能を有する宿主細胞を、例えば、分泌タンパク質を供給して宿主の他の細胞を処置するために提供することを目的とすることができる。したがって、遺伝子治療において、基本的に３つの異なるアプローチがあり、第１のアプローチは（ほ乳類）宿主に存在する欠損の補償に対して行われ；第２のアプローチは不必要な物質（生物又は細胞）の除去又は排除に対して行われ及び第３のアプローチは必要な機能を有する細胞の提供に対して行われる。上記に示す目的のいずれかのための対象の遺伝子（核酸）を有する細胞を提供するために、前記遺伝子を機能的な形式で宿主細胞に送達することができる媒体（ビヒクル）が必要である。ある例では、一時的な発現（数週間又はそれよりも若干長い期間まで）が求められ、他の例では、宿主細胞の永久的な形質導入が必要と思われる。これらの目的を達成するために、種々の媒体が利用可能である。アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）はそれらの例であり、それらのゲノム（対象の遺伝子を含む）を宿主細胞のゲノムに組み込むことができる一方でアデノウイルスはエピソームのままである。しかし、アデノウイルスは、多くの種類の細胞により一層良好に感染することができる一方、レトロウイルスはある種の特定の細胞のみに感染することができる。異なるウイルスの組合せ（キメラウイルス）が提案され、異なる種類のウイルスの利点が用いられている。もちろん、非ウイルス性の送達系も利用でき、合成ウイルスでは、それらのすべてがまた、目前にある特定の標的にも適する場合がある。これらのすべての系を本発明に適用することができる。
【０００３】
遺伝子治療の目的のために、アデノウイルスが、遺伝子の宿主細胞への搬送に適した媒体として提案されてきた。アデノウイルス由来の遺伝子−移動ベクタ（いわゆるアデノウイルスベクタ）は、それらを遺伝子の移動のために特に有用にする下記の多くの特徴を有する。１）アデノウイルスの生物学が詳細に特徴づけられており、２）アデノウイルスはヒトの重篤な症状と関連しておらず、３）このウイルスはそのＤＮＡを宿主細胞中に導入する際に極めて効率的であり、４）このウイルスは多種多様な細胞に感染することができ、広い宿主域を有し、５）このウイルスは高ウイルス力価で大量に生産することができ、及び６）このウイルスはウイルスゲノムの初期領域(early-region)１（Ｅ１）の欠失により複製不全にすることができる〔Ｂｒｏｄｙ（ブロディ）等、１９９４〕。しかし、アデノウイルスベクタ、特に、よく研究された血清型の亜群Ｃアデノウイルスの使用に関連する欠点がある。これらの血清型は、感染を成功させるために、細胞上にコクサッキーアデノウイルス受容体（CAR）の存在を必要とする。このタンパク質は多くの細胞及び樹立細胞系によって発現されるが、このタンパク質は多くの他の一次細胞及び細胞系上には存在せず、後者の細胞が血清型１、２、５、及び６に感染するのを困難にする。
【０００４】
アデノウイルスゲノムは、約３６０００の塩基対の線状二本鎖ＤＮＡ分子である。アデノウイルスＤＮＡは、血清型に依存する正確な長さを有する約９０〜１４０の塩基対の同一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。ウイルスの複製起点は、ゲノム端で正確にITRsの範囲内にある。現在、遺伝子治療において用いられているほとんどのアデノウイルスベクタは、Ｅ１領域での欠失を有し、そこで新しい遺伝情報を導入することができる。E1欠失はその組換えウイルスを複製不全にする〔Ｌｅｖｒｅｒｏ（レヴレノ）等、１９９１〕〕。組換えアデノウイルス、特に、血清型５が、肝臓、気道上皮及び動物モデルにおける充実性腫瘍並びに免疫不全マウスにおけるヒト異種移植片へのインビボでの効率的な遺伝子の移動に適切であることが、広く示された〔Ｂｏｕｔ（ボウト）１９９６；Ｂｌａｅｓｅ（ブラーゼ）等１９９５〕。このように、インビボでの標的細胞への遺伝子移動のための好ましい方法では、アデノウイルスベクタを遺伝子送達媒体として利用する。
【０００５】
現在、ヒトアデノウイルスの６つの異なる亜群が提案されており、それらは全体で５１種の異なったアデノウイルス血清型を包含する。これらのヒトアデノウイルスの他に、多数の動物アデノウイルスが確認されている（イシバシ等１９８３）。血清型は、動物の抗血清（ウマ、ウサギ）を用いる定量的な中和によって決定されるようなその免疫学的特殊性に基づいて定義される。中和がある程度の交差反応を２種のウイルス間で示す場合、血清型の特殊性は、Ａ）血球凝集阻止反応上の交差反応の欠如により示されるように、血球凝集素と無関係か、又はＢ）ＤＮＡにおける十分な生物物理学的／生化学的な違いが存在するかどうかで仮定される〔Ｆｒａｎｃｋｉ（フランキー）等１９９１〕。最後に確認される９種の血清型（４２〜５１）は、ＨＩＶ感染した患者から初めて単離された〔Ｈｉｅｒｈｏｌｚｅｒ（ハイエールホルザー）等１９８８；Ｓｃｈｎｕｒｒ（シュナー）等１９９３；  Ｄｅ  Ｊｏｎｇ（デ・ジョング）等１９９９〕。十分理解されなかった理由により、かかる免疫不全の大部分の患者は、免疫適格個体から希にしか単離されないか又は全く単離されないアデノウイルスを放出した〔Hierholzer等１９８８及び１９９２；Ｋｈｏｏ（クー）等１９９５；De Jong等１９９９〕。アデノウイルス血清型５（Ad5）は遺伝子治療の目的のために広く使用されている。血清型２、４及び７と同様に、Ａｄ５は肺上皮及び他の呼吸器組織への自然な認定(affiliation)（親和性:tropism）を有する。対照的に、例えば、血清型４０及び４１が消化管に対して自然な認定を有するのが知られている。異なるアデノウイルス血清型の疾病関連性の詳細については表１を参照。この表には文献からの逸脱が１つある。異なる種からの赤血球を使用して行った配列分析及び血球凝集アッセイは、文献（De Jong等１９９９）と対照的に、アデノウイルス５０がD群ベクタであるのに対し、アデノウイルス５１がＢ群ベクタであるのが分かったことを示す。
【０００６】
特定の器官又は細胞種類への所定の血清型の自然な認定は、感染経路、異なる受容体分子の使用における違いによるか、又は異なる内在化経路による。しかしながら、それは、血清型が多くの組織／器官に感染することができるという事実による場合もあるが、複製のための何らかの細胞因子の要求及びそれゆえの臨床疾病のため、１つの器官においてのみ複製することができる。現在、上述の機構がヒト疾病関連性において観察された違いに原因があるかは知られていない。しかし、異なるアデノウイルス血清型が、カプシドタンパク質、ヘキソン、ペントン、及び線維の配列の相違により、異なる受容体に結合可能であることは知られている。例えば、Ａｄ２及びＡｄ５のような亜群Ｃのアデノウイルスが、Ａｄ３のような亜群Ｂからのアデノウイルスと比較して異なる受容体に結合することが示されている〔Ｄｅｆｅｒ（デファー）等１９９０〕。同様に、受容体特異性が、Ａｄ３をＡｄ５瘤(knob)タンパク質に変換することにより、及びその逆も同様に、変化可能であることが示された〔Ｋｒａｓｎｙｋｈ（クラスニク）等１９９６；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ（スティーヴンソン）等１９９５及び１９９７〕。
【０００７】
ヒトの体内で、循環血液細胞は予め定められた期間生存し；その長さは、細胞種類によって数時間から数ヶ月までさまざまであり得る。したがって、赤血球、血小板、リンパ球、単球、及び顆粒球は絶え間なく必要とされる。これらの細胞プールは、骨髄から導かれる造血性幹細胞（ＨＳＣ’ｓ）の分裂及び分化を通じて、一定の程度に保たれる。ＨＳＣ’ｓの特徴の１つは、それらがエキソビボの培養条件下でプラスチック培養皿に付着しないことである。ＨＳＣ以外に、近年、別の幹細胞様細胞が骨髄において確認されており、これは、非造血性起源のものでかつプラスチック支持体に付着する。この幹細胞様細胞は、間充織起源のものであることから、‘間充織幹細胞’（ＭＳＣ’ｓ）と表される。また、ＭＳＣ’ｓは、骨髄間質細胞、髄間質細胞、又は骨髄間充織前駆細胞とも称される。ＭＳＣ’ｓの多くの属性は今だ決定されていないが、それらの多重の潜在性(multi-potentiality)は、ＭＳＣ’ｓが破骨細胞、軟骨芽細胞、線維芽細胞、含脂肪細胞及び筋芽細胞に分化することができるという知見〔Ｐｒｏｃｋｏｐ（プロコップ）等１９９７〕によって立証されている。ＨＳＣ’ｓ及びＭＳＣ’ｓは骨髄から単離することができるが、後者だけが骨格筋〔Ｊａｃｋｓｏｎ（ジャクソン）等１９９９〕、肝臓〔Ｃｒｏｓｂｉｅ（クロスビー）等１９９９〕〕、及び脳〔Ｂｊｏｒｎｓｏｎ（ビョルソン）等１９９９〕〕のような他の組織から導くことができる。ＭＳＣ’ｓの多分化能(pluripotency)は、脳から導かれるＭＳＣ’ｓが骨髄系細胞及びリンパ系細胞を含む種々の血液細胞種類を産生することができるという知見によって更に強調された（Bjornson等１９９９）。ＨＳＣ’ｓと同様に、ＭＳＣ’ｓも、細胞−療法、及び遺伝子療法のための媒体として探求されている。ＭＳＣ’ｓは、局部麻酔下での小量の骨髄穿刺液から比較的容易に得ることができ、それらの幹細胞としての特性を失うことなくエキソビボでの条件下で容易に培養することができる。ＭＳＣ’ｓは、エキソビボで、組織工学の分野において、並びに後天性又は先天性疾病のインビボでの処置の双方で治療行為のために適用されている。ＭＳＣ’ｓの使用で考えられる例の一つは、例えば、変性性関節炎で苦しむ患者の骨髄からＭＳＣ’ｓを単離し、これらの細胞を培養中で増やし、例えば、滑膜細胞の増殖又は炎症を妨げる因子を発現するように、これらを遺伝学的に修飾し、更にその後に、患っている関節に直接これらの細胞を移植することである。滑膜細胞の増殖又は炎症のどちらかを妨げる遺伝子の例は、限定されないが、ＩＬ−１０〔Ｄｅｃｈａｎｅｔ（デチャネット）等１９９５〕及び可溶性ＶＣＡＭ−１〔Ｃｈｅｎ（チェン）１９９５〕である。別の適用は、ＭＳＣ’ｓの内移植(implantation)であり、これらが、骨関連障害を処置するために、例えば、骨再生の刺激物質(stimulator)を発現させるために、遺伝学的に修飾される。かかる遺伝子の例は、限定されないが、骨形態形成タンパク質(bone morphogenesis protein)−２（ＢＭＰ−２）、及びＬＩＭ鉱質形成タンパク質(mineralisation protein)（ＬＭＰ−１）〔Ｌｏｕ（ルー）等１９９９，Ｂｏｄｅｎ（ボーデン）等２０００〕である。これら遺伝子的に修飾されたＭＳＣ’ｓは、その後、骨形成を誘発するために局所的に移植される。
【０００８】
あるいは、これらの細胞は、生物反応器中のコラーゲン骨格(collagen scaffold)上においてエキソビボで培養され、外科的に移植可能な人工骨を形成する。局所的に注入されたＭＳＣ’ｓは、ウサギの膝軟骨における外科的切開の修復を促進することが明らかとなり、また、セラミックビーズにおけるＭＳＣ’ｓは動物モデルで骨折治癒を促進することが明らかとなった〔Ｇｏｌｄｂｅｒｇ（ゴールドバーグ）等１９９４，Ｂｒｕｄｅｒ（ブルーダー）等１９９４，ワキタニ等１９９４〕。同じ戦略は、例えば、多発性硬化症の処置に適用することができる。ここでは、自己由来のＭＳＣ’ｓを遺伝子的に修飾して、横紋筋への移植前にジストロフィンを発現させる。もう１つの例は、心不全の処置であり、脈管形成誘発因子を発現しているＭＳＣ’ｓを、罹患心臓の虚血領域に移植する。後者の場合、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ１−３）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、又はＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）のような遺伝子を用いることができる。
【０００９】
ＭＳＣ’ｓの適用に関する他の非限定例は、分泌タンパク質を発現するように細胞を遺伝子的に修飾した後、ＭＳＣ’ｓを全身的に注入することである。ＭＳＣ’ｓは、体のさまざまな場所を拠点として、治療上のタンパク質を分泌し、特異的（遠位）部位でそれぞれの機能を発揮する。かかる設定において用いることができる興味深い遺伝子の非限定例は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、β−グルコセレブロシダーゼ（の突然変異遺伝子）、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、新しい赤血球形成刺激タンパク質（ＮＥＳＰ）、α−Ｌ−イズロニダーゼ、イズロン酸塩スルファターゼ、Ｎ−スルファターゼ、Ｎ−アセチルα−Ｄ−グルコサミニダーゼ、α−グルコサミン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミナイド−６−サルファターゼ、ガラクトサミン−６−硫酸塩スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチル−アラクトサミン−４−スルファターゼ、酸セラミニダーゼ、酸スフィンゴミエリナーゼ、ガラクトセレブロシド−β−ガラクトシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、アデノシンデアミナーゼ、α−Ｌ−フコシダーゼ、サイトカイン、インターロイキン群やＧ−ＣＳＦやインシュリン及びヒト成長ホルモンのような成長因子、一酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ１−３）や血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、及びアンジオスタチン１−７のような脈管形成刺激又は抑制因子をコード化する核酸である。遺伝子的に修飾されたＭＳＣ’ｓの直接注入の他に、細胞ではないが、タンパク質の拡散を可能にする不活性物質内に細胞を封入できる。少なくとも第ＩＸ因子によるこの手法の実行可能性は、ヒトＭＳＣ’ｓを移植された免疫不全マウスで明らかとなった。これらのマウスは全身注入後少なくとも８ヶ月間第ＩＸ因子を発現した。
【００１０】
ＨＳＣ’ｓに勝るＭＳＣ’ｓの主な利点の１つは、ＭＳＣ’ｓがエキソビボの条件下で多能性(multipotency)の損失なしに多数に培養することができることである。後者は、先に述べた戦略を、単に多数の遺伝子的に修飾された細胞が注入できるという理由で、骨髄切除による処理の必要なく患者に適用することができることを示している。ここでは、ＭＳＣ’ｓが多くの異なった治療的戦略の興味の対象であり、従ってこの細胞種類の遺伝子的修飾はかなりの重要性を持つことが示される。多くの適用にとって、外因性遺伝子の一時的な発現は、ＭＳＣ’ｓが分化するか又は周期的に分泌されるタンパク質を発現させるのを誘発するのに十分である。プロセスが誘発される必要がある場合、すなわち、脈管形成、軟骨形成、骨形成のプロセスの場合、一時的発現で十分である。他の適用では、持続的発現、すなわち、タンパク質の欠乏を上昇させるタンパク質の分泌（第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、糖レベルを減少させる酵素、等）が必要である。すべての適用のために、遺伝子送達媒体としてのアデノウイルスを用いることができ、その理由は、アデノウイルスを宿主細胞ゲノムに組み込むか又は組み込まないように設計することができるからである〔Ｃｏｎｃａｌｖｅｓ（コンカーブス）等２０００〕。組込み及び従って長期発現を得るための代替戦略が発表されている〔Ｆｅｎｇ（フェン）等１９９７、Ｚｈｅｎｇ（チェン）等２０００〕。これらの研究では、アデノウイルスが用いられ、アデノウイルスゲノム内にレトロウイルスゲノムをクローン化することによって、組込みベクタ（レトロウイルス）が送達される。レトロウイルスを用いてＭＳＣ’ｓを伝達した例は、Ｍａｒｘ（マークス）等によって提供された（１９９９）。レトロウイルスによる形質導入の増強は、レトロウイルスによって認識されるレセプターをコード化する遺伝子を持つアデノウイルスベクタの感染の後に観察された。ＭＳＣ’ｓを効果的に伝達すると思われるアデノウイルスは、上述の任意の戦略の臨床適用を提供すると思われる。したがって、アデノウイルスの結合及び内在化の分子的機序を理解することは重要である。この理由から、アデノウイルス血清型５について現時点で明らかになっているアデノウイルスの結合に関与する工程について、ここで説明する。
【００１１】
感染を成功させるための最初の工程は、アデノウイルスによるその標的細胞への結合であり、線維タンパク質を介して媒介される工程である。線維タンパク質は、ウイルス血清型によって異なる長さを有する〔Ｓｉｇｎａｓ（シグナス）等１９８５；Ｋｉｄｄ（キッド）等１９９３〕三量体構造を持つ〔Ｓｔｏｕｔｅｎ（ストウテン）等１９９２〕。異なる血清型は、構造的に似たＮ及びＣ末端を持つポリペプチドを有するが、中間幹領域(middle stem regions)は異なっている。Ｎ末端で、最初の３０個のアミノ酸、特に、テール部分で保存されたＦＮＰＶＹＰ領域〔Ａｒｎｂｅｒｇ（アーンバーグ）等１９９７〕が、ペントン塩基への線維の固定に関与している〔Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋ（クロボシェック）等１９９５〕。Ｃ末端、又は瘤は、細胞のアデノウイルス受容体との最初の相互作用を担う。この最初の結合の後、カプシドペントン塩基と細胞表面インテグリンとの間の第２の結合が提案され、被覆小窩及びエンドサイトーシスにおけるウイルス粒子の内在化をもたらす〔Ｍｏｒｇａｎ（モーガン）等１９６９；Ｓｖｅｎｓｓｏｎ（スベソン）等１９８４；Ｖａｒｇａ（バーガ）等１９９２；Ｇｒｅｂｅｒ（グレバー）等１９９３；Ｗｉｃｋｈａｍ（ウィクハム）等１９９５〕。インテグリンはαβ−ヘテロ二量体であり、その少なくとも１４個のα−サブユニット及び８個のβ−サブユニットが同定されている〔Ｈｙｎｅｓ（ハイネス）等１９９２〕。細胞で発現されるインテグリンの配置は複雑で、細胞種類及び細胞環境によって変化する。瘤はいくらかの保存された領域を含むが、血清型間で、瘤タンパク質が高度な変動性を示し、このことは異なるアデノウイルス受容体が存在するかもしれないことを示唆する。例えば、亜群Ｃのアデノウイルス（Ａｄ２、Ａｄ５）及び亜群Ｂのアデノウイルス（Ａｄ３）が異なる受容体と結合することが証明された（Defer１９９０）。アデノウイルスに産生された可溶性ＣＡＲ及びアデノウイルス血清型５の瘤タンパク質を用いることによって、Ｒｏｅｌｖｉｎｋ（ロエルビンク）等は、干渉に関する研究を通して亜群Ｂの血清型を除くすべてのアデノウイルス血清型はＣＡＲを通して細胞に入ると結論を下した（１９９８）。
【００１２】
細胞結合への関与以外に、線維タンパク質は、また、種類特異的γ−抗原をも含み、これはヘキソンのε−抗原と共に血清型特異性を決定する。γ−抗原は、線維上で局在し、１７個のアミノ酸からなることが知られている。したがって、宿主の抗−線維抗体は、瘤の三量体構造へと導かれる。組換えアデノウイルス血清型５の向け直された感染を得るために、いくつかの手法が研究されているか、又は依然研究中である。Wickham等は、αＶβ３及び／又はαＶβ５インテグリンのペントン塩基への結合の原因になっていると考えられるペントン塩基中のＲＧＤ（Ａｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、）モチーフに変更を加えた（１９９３及び１９９５）。彼らは、このＲＧＤモチーフを、α４β１受容体に特異的な別のペプチドモチーフで置換した。この方法で、アデノウイルスの特異的標的細胞への標的化が成し遂げられる。Krasnykh等は、瘤内で利用可能なＨＩループを用いている。このループは、Ｘ線結晶学によれば、瘤の三量体構造の外側に位置するために、瘤での分子内相互作用には貢献しないと考えられる。ＦＬＡＧコード配列のＨＩループへの挿入は、ＦＬＡＧエピトープ及び細胞受容体の双方を認識する抗体を用いることによって、アデノウルスの標的細胞への標的化を招いた（Krasnykh等１９９８）。しかし、ＣＡＲから独立した完全な感染は観察されなかった。
【００１３】
結論として、一般に、アデノウイルスが遺伝子治療の目的のための適切なプラットフォームを提供すると思われる。それにもかかわらず、また、アデノウイルスを用いることの不利な点の１つが、Ａｄ５のような一般的に用いられるアデノウイルスの制限された向性であるということも認識されていた。インビトロでの研究は、ある種の細胞がＡｄ５に効果的に感染される一方、他の細胞は不十分にしか伝達されないことを示した。明らかに、Ａｄ５は間充織幹細胞に不十分にしか感染しない。何人かの研究者達は、アデノウイルスがＭＳＣ’ｓを感染させ得るが、低い形質導入効率しか得られないことを示し〔Ｃｏｎｇｅｔ（コンジェット）等２０００；Ｔｕｒｇｅｍａｎ（タージェマン）等２０００〕、ヒト及び／又は動物の体内に存在する特異的細胞種類に感染し、及び異質な核酸（非アデノウイルス性のタンパク質及び／又は治療上のタンパク質をコード化する）を送達することができるアデノウイルスベクタのような遺伝子送達の媒体（例えば、ＭＳＣ’ｓ）がこの技術分野で明らかに必要であることを支持している。既に述べたように、幹細胞には、代表的に、この技術分野の遺伝子送達の媒体を十分な範囲に感染させることは困難である。感染が成功した場合、特に、十分な量の時間に及ぶ機能的な発現を達成することは困難である。幹細胞の感染は遺伝子治療のより一層失望的な側面の１つであると考えられており、その一方、かかる遺伝子的に修飾されたＭＳＣ’ｓを用いることの可能な治療上の恩恵は大きい。Ａｄ２、Ａｄ５又はＡＡＶ’ｓのような、遺伝子治療に一般的に用いられる代表的な遺伝子送達媒体は、本明細書で開示するように、間充織幹細胞に対する特定の向性を持たない。この技術分野における遺伝子治療の明らかな必要性は、効果的でかつ適当な方法によって間充織幹細胞の認識及び感染のために適用できる遺伝子送達媒体について存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
図面及び表の簡単な説明
図１は：一次ヒト間充織幹細胞の形質導入により一層良好に適したウイルスの存在のための線維キメラウイルスをスクリーニングすることを示す。用いる投与量は、細胞につき１０００のウイルス粒子である。ルシフェラーゼ活性を相対的光量（RLU）で表わす（ｙ軸）。
図２は：Ａｄ５Ｆｉｂｌ６を有するヒト骨髄ストローマ（間質）細胞（ＨＢＳＣ’ｓ又はＭＳＣ’ｓ）の形質導入を示す。（Ａ）：ＨＢＳＣ’ｓを１００、５００、又は１０００ｖｐ／細胞のＡｄ５又はＡｄ５．Ｆｉｂ１６に１時間曝した。４８時間後、細胞を、ＧＦＰの発現に関して流動細胞計測機を用いてスクリーニングした。ＧＦＰが陽性である細胞の平均±標準偏差率（Ｎ＝３）を示す。（Ｂ）：ＨＢＳＣ’ｓを、５０００ｖｐ／細胞に曝露し、高分子骨格中に播種した。ウイルスの露出の４８時間後に、細胞をＬａｃＺ発現に関し染色した。ＬａｃＺ着色反応の対照として、非形質導入細胞（ウイルスなし）を一緒にした。
図３は：間充織幹細胞上のＡｄ５Ｆｉｂｌ６のマーカ遺伝子発現の持続時間及び毒性を示す。（Ａ）は、１０００又は５０００ｖｐ／細胞のＡｄ５Ｆｉｂｌ６ｌａｃＺに１時間曝露したものである。ＬａｃＺ発現についてウイルスの曝露後の異なる時間点で細胞を着色した。（Ｂ）細胞への感染を１０００又は５０００ｖｐ／細胞で１時間行った。Ａｄ５Ｆｉｂｌ６細胞への曝露後の異なる時間点で細胞を収集し、細胞集団の生存度を測定した。ウイルスに曝露されない対照細胞（０）を一緒にした。
表１は：異なるヒトアデノウイルス血清型のヒト疾病との関連性を示す。
表２は：組換え線維キメラアデノウイルスの産生結果を示す。ＨＰＬＣによって測定される１ｍｌ毎のウイルス粒子での結果である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の要約
本発明は、間充織幹細胞のための親和性を、代表的には他の種類の細胞、特に肝細胞のための減少している親和性との組合せで有する組換えアデノウイルスベクタのような遺伝子送達媒体を提供することによって、対象となる異質な核酸を間充織幹細胞に送達するための方法及び手段を提供する。本発明によって、かかる遺伝子送達媒体の使用が間充織幹細胞への異質な核酸の送達のために提供され、ここで、前記組換えアデノウイルスベクタは、間充織幹細胞のための自然な親和性を備えるか、又は有している。
【００１６】
本発明は、本発明に従う組換えアデノウイルスベクタのような媒体を生産するための細胞を提供すると共に、本発明に従う媒体を製造するための方法を提供し、これらは、細胞に前記媒体の構築のための手段を提供することを含み、ここで、前記手段はアデノウイルス線維タンパク質を生産するための手段を含み、ここで、前記線維タンパク質は、亜群Ｂのアデノウイルス、特にアデノウイルス血清型１１、−１６、−３５及び／又は−５１のアデノウイルス線維タンパク質又はその機能的誘導体及び／又は類似体の少なくとも組織親和性決定部分を含む。
【００１７】
本発明はまた、治療上のタンパク質又はその機能的な等価物、又はＲＮＡをコード化する異質な核酸の間充織幹細胞への移動によって処置可能な疾病の処置のために、本発明に従う遺伝子送達媒体の使用をも提供する。本発明の手段及び方法で処置することができる疾病の例には、多発性硬化症及び変形関節炎(rheumatoid arthritis)があるが、その方法及び手段は、また、骨再生を必要とするような骨関連疾患の処置、脈管形成を刺激する目的及び組織工学に適用することもできる。
【００１８】
本発明は、また、本発明に従う組換えアデノウイルスベクタの使用を介して、異質な核酸を備える間充織幹細胞を提供するが、本発明は更に間充織幹細胞に形質導入をするための方法を提供し、これは、次の工程：間充織幹細胞を培養すること；及び前記間充織幹細胞を、異質な核酸を含む組換えアデノウイルスベクタと接触させることを含み、ここで、前記組換えアデノウイルスベクタは間充織幹細胞のための親和性を備えるか、又は前記組換えアデノウイルスベクタは亜群Ｂアデノウイルスから導かれている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
詳細な説明
本発明は、遺伝子送達媒体に間充織幹細胞のための親和性を、代表的には他の種類の細胞、特に肝細胞のための減少した親和性との組合せで提供することによって、間充織幹細胞に遺伝子（対象の核酸）を送達するための方法及び手段を提供する。したがって、本発明は、間充織幹細胞のための組織親和性を少なくとも持っており、好ましくは、少なくとも遺伝子送達媒体が宿主内で接触し得る肝細胞及び他の細胞に対する組織親和性を部分的に減少させた核酸送達媒体を提供する。代表的には、本発明に従う前記送達媒体は、少なくともウイルスのカプシド（又はエンベロープ）の一部又はその機能的誘導体及び／又は類似体によって、前記組織親和性が提供される。カプシドは、同じ種ではあるが異なったサブタイプの１種又はそれより多い種類のウイルス又は異なったウイルスからのタンパク質、又はその機能的な部分、誘導体及び／又は類似体を含むことができる。前記ウイルスのうち少なくとも１種は、アデノウイルス、代表的には亜群Ｂのアデノウイルスであることが好ましい。代表的には、前記カプシドから導かれる前記タンパク質のうち少なくとも１種は、亜群Ｂアデノウイルスから、特に、血清型１１、１６、３５及び／又は５１のアデノウイルス又はその機能的誘導体及び／又は類似体から導かれる線維タンパク質の組織親和性決定部分を含む。本発明は、アデノウイルスＢ型線維の組織親和性決定部分を備えた本発明に従った遺伝子送達媒体が、間充織幹細胞のための増大した親和性を有することを示す。特定の適切な親和性決定部分は、アデノウイルス１６の線維タンパク質に由来することもある。好ましくは、アデノウイルス１６の線維のかかる部分を含むアデノウイルスの線維タンパク質全体を用いる。
【００２０】
キメラアデノウイルスは間充織幹細胞を標的とするのに特に適していることが見出された。したがって、本発明は、亜群Ｂに属さないアデノウイルス、又はその機能的な部分、誘導体及び／又は類似体から導かれる、少なくとも１種のタンパク質を更に含む本発明に従う遺伝子送達媒体を更に提供する。好ましくは、亜群Ｂのアデノウイルス由来ではない前記タンパク質又はその機能的な部分、誘導体及び／又は類似体は、亜群Ｃのアデノウイルスから導かれ、以下に述べる理由によって、好ましくは、アデノウイルス５のものである。また、送達されるべき対象の核酸（遺伝子）を含む核酸は、好ましくは、アデノウイルス起源のものであり、それは１種又はそれより多い種類の異なったアデノウイルスのものである。代表的に、アデノウイルス由来の核酸は、亜群Ｂアデノウイルスの線維タンパク質、特に、血清型１１、１６、３５及び／又は５１の、好ましくは、アデノウイルス１６のもの又はその機能的誘導体及び／又は類似体の少なくとも組織親和性決定部分を含む線維タンパク質をコード化する。機能的誘導体及び類似体は、本明細書で用いる際、それが化学的に導かれるか、理論的に導かれるか又は実験的に設計され、同じ機能（同種であって、同量である必要はない）を持つようにされたものであれ、本明細書に開示された分子に基づいて分子を解釈することを意図している。これには、核酸及び／又はタンパク様分子に関しては、開示した特定の分子（断片及び誘導体の双方）に高い相同性を有しており、かつ類似の機能を提供する分子が含まれる。いくつかの実施形態において、核酸送達媒体は、標的細胞内で複製してはならない。かかる例では、好ましくは、前記アデノウイルスの核酸は、修飾された核酸であり、前記アデノウイルスの核酸が標的細胞内で複製する能力が、好ましくは、少なくとも１部分のアデノウイルスのＥ１−領域の欠失によって減少するか、又は不活化される。対象とする遺伝子の発現を十分な量の時間にわたり達成するには、好ましくは、ある程度の範囲に対して免疫反応を回避することができる遺伝子送達媒体を提供する。したがって、本発明は、本発明に従う媒体を提供し、ここで、前記アデノウイルス核酸は、前記アデノウイルス核酸によってコード化されるアデノウイルスタンパク質に対する免疫反応を行う宿主免疫系の能力が、好ましくは、アデノウイルスＥ２Ａ及び／又は少なくとも１部分のＥ４−領域の欠失を介して、減少するか、又は不活性にされるように修飾された核酸である。本発明はまた、最小のアデノウイルスベクタ又はＡｄ／ＡＡＶキメラベクタを含む本発明に従う媒体をも提供する。
【００２１】
本発明は更に、本発明に従う媒体を製造する方法も提供し、これは、細胞に媒体の構築のための手段を提供することを含み、ここで、前記手段は、アデノウイルス線維タンパク質の生産のための手段を含み、ここで、前記線維タンパク質は、亜群Ｂアデノウイルス、特に、血清型１１、−１６、−３５及び／又は−５１アデノウイルスの線維タンパク質又はその機能的誘導体及び／又は類似体の少なくとも１種の組織親和性決定部分を含む。
【００２２】
本発明は更に、本発明に従う媒体の生産のための細胞を提供し、これは、前記媒体の構築のための手段を含み、ここで、前記手段はアデノウイルス線維タンパク質の製造のための手段を含み、ここで、前記線維タンパク質は、亜群Ｂアデノウイルスの線維タンパク質、特に、血清型１１、−１６、−３５及び／又は−５１アデノウイルスのもの又はその機能的誘導体及び／又は類似体の少なくとも１種の組織親和性決定部分を含み、好ましくは、前記細胞は、ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ（商標）細胞（ＥＣＡＣＣ受託番号９６０２２９４０）であるか、又はこれから導かれる。本発明は、異なったアデノウイルスの血清型がヒトの異なった疾病関連性を有するという知見を用い、異なった疾病関連性は、細胞宿主範囲における差異の結果かもしれず、同様に、その差異は、カプシドタンパク質、特に線維タンパク質における差異の結果かもしれない。本発明はまた、アデノウイルスのライブラリを提供し、ここでは、別の血清型からの線維タンパク質をコード化する配列が、アデノウイルス血清型５幹(backbone)の中にクローン化されており、それによってキメラアデノウイルスを生成する。したがって、このキメラアデノウイルスは、線維配列がクローン化されたアデノウイルス血清型の宿主範囲を有するものであるが、一方、他の全ての側面はアデノウイルス血清型５から導かれる。
【００２３】
もちろん、また、対象の遺伝子は、例えば、元のアデノウイルスのＥ１の部位に挿入することもでき、これからベクタが導かれる。この対象の遺伝子は、治療上のタンパク質のように、異質な核酸であることもある。本明細書で用いる‘異質な’は、概して、非アデノウイルスを意味する。このようにして、製造すべきキメラアデノウイルスは、ある種の疾患のための遺伝子治療の必要から、ある種の宿主の要求及び必要に適合することができる。必然的に、キメラアデノウイルスの生産を可能にするには、概して、十分な量の安全なキメラアデノウイルスを生産するために、パッケージング細胞が必要となる。
【００２４】
本発明の重要な特徴は、キメラウイルスを生産するための手段である。代表的には、人は、これがいつも正しいとは限らないが、複製能力のあるアデノウイルスを含有する宿主細胞にアデノウイルスのバッチを投与させたがらない。したがって、概して、キメラウイルスをコード化するベクタ上のアデノウイルスゲノムから、多くの遺伝子（少なくとも１個であるが）を除去し、そして、これらの遺伝子を細胞のゲノム内に供給し、そこで、ベクタを持ち込み、キメラアデノウイルスを生産するのが望ましい。かかる細胞は、通常、パッケージング細胞と呼ばれる。したがって、本発明はまた、本発明に従うキメラアデノウイルスを製造するためのパッケージング細胞を提供し、これは、本発明に従うアデノウイルスベクタ上に存在しないアデノウイルスの生産に必要なすべての要素を途中（in trans）に含む。代表的には、ベクタ及びパッケージング細胞は、互いに適合しなければならず、それらはすべての必要要素を持っているが、それらは組み換えにより複製能力のあるウイルスになるよう導く重複要素を持っていない。
【００２５】
本発明の１種の目的は、アデノウイルスが初期のヒト間充織幹細胞に感染する方法及び手段を提供することである。したがって、１実施形態において、修飾された線維遺伝子を有するアデノウイルス血清型５に基づくキメラアデノウイルスの生成を説明する。この目的のために、２又は３種のプラスミドで、共に完全なアデノウイルス血清型５ゲノムを有するものを構成した。これらのプラスミドの１種から、アデノウイルス血清型５線維タンパク質をコード化するＤＮＡを除去し、容易なクローン化を促進するリンカＤＮＡ配列により置換した。天然のアデノウイルス血清型５線維配列が部分的に除去されたプラスミドは、続いて、異なるアデノウイルス血清型（ヒト又は動物）から導かれる線維タンパク質をコード化するＤＮＡの挿入のための鋳型として使われた。異なる血清型から導かれるＤＮＡは、〔縮重(degenerate)〕オリゴ−ヌクレオチドと組合せて、ポリメラーゼ連鎖反応技術を用いて得られた。アデノウイルス血清型５のゲノム内における以前のＥ１の位置で、対象とする任意の遺伝子をクローン化することができる。２又は３種のプラスミドの単一のトランスフェクション方法は、共に、組換えの、線維キメラアデノウイルスの形成を招く。アデノウイルス血清型５線維及びペントン塩基における変化の、好首尾の導入が他の者によって報告されているが、瘤の複雑な構造及びＣＡＲと相互作用する正確なアミノ酸の知識が限られていることによって、かかる標的化手法は骨の折れる、困難なものになっている。
【００２６】
上述した限界を克服するため、既存のアデノウイルス線維を用い、組換えアデノウイルスを得る機会を最大にするのが好ましく、この組換えアデノウイルスは、通常、産生細胞の核内で構築され、また、既存のパッケージング細胞上で生産することができる。他のすべてのヒトアデノウイルス血清型の線維タンパク質を含む、キメラアデノウイルス血清型５に基づく線維ライブラリを生成することによって、初期のヒト間充織幹細胞に対する好ましい感染特徴を有する組換えアデノウイルスベクタのための迅速なスクリーニングを可能にする技術が開発された。
【００２７】
１側面において、本発明は、アデノウイルス血清型５の特異な部分からなるプラスミドの構成及び使用を説明し、ここでは、線維タンパク質をコード化する遺伝子が別のヒト又は動物血清型から導かれるＤＮＡに置換されている。この組合せの構成体は、全体で、完全なアデノウイルスゲノムを含み、特定の細胞種類又は器官（諸器官）の形質導入のために特注で製作される独特なキメラアデノウイルスの構成を可能にする。また、本発明の手段及び方法のこの部分で、線維キメラアデノウイルスを増殖させ、生産し、及び精製することを説明する。本発明の他の側面において、ヒト間充織幹細胞における好ましい感染特徴を有するキメラウイルスを説明する。アデノウイルスベクタは、亜群Ｂアデノウイルスから導かれるか、又は少なくとも線維タンパク質の結合成分(moiety)を含む亜群Ｂからのアデノウイルス由来の線維タンパク質の少なくとも機能的部分を含むのが好ましい。更に好ましい実施形態において、アデノウイルスベクタは、アデノウイルス血清型５に基づくキメラベクタであり、及び少なくともアデノウイルスの種類１６、３５、又は５１からの線維タンパク質の機能的部分を含む。すべての実施形態において、アデノウイルスベクタを望ましい特性を有する血清型から導いてよいこと、又はアデノウイルスベクタが１種の血清型からのアデノウイルスに基づき、及び別の血清型の望ましい機能を含む配列で、前記血清型内で天然配列と入れ替わるこれらの配列を含むことを理解すべきである。
【００２８】
本発明の別の側面において、キメラアデノウイルスは、Ｅ１領域における欠失、及びプロモータに結び付いているか又は結び付いていない異質な遺伝子の挿入を含んでよいし、又は含まなくてもいい。さらに、キメラアデノウイルスは、Ｅ３領域における欠失、及びプロモータに結び付いている異質な遺伝子の挿入を含んでよいし、又は含まなくてもいい。さらに、キメラアデノウイルスは、Ｅ２及び／又はＥ４領域における欠失、及びプロモータに結び付いている異質な遺伝子の挿入を含んでよいし、又は含まなくてもいい。後者の場合、Ｅ２及び／又はＥ４を補う細胞系は、組換えアデノウイルスを生成する必要がある。
【００２９】
本発明は、間充織幹細胞へ異質な核酸を送達するための組換えアデノウイルスベクタの使用を提供し、ここでは、前記組換えアデノウイルスベクタは間充織幹細胞のための親和性が備わっている。前記組換えアデノウイルスベクタは、肝細胞に対する少なくとも部分的に減少した親和性を有しているのが好ましい。好ましい実施形態において、間充織幹細胞に対する前記親和性は、少なくともウイルスカプシドの一部分、又はその機能的誘導体及び／又は類似体によってもたらされ、ここで、前記ウイルスカプシドは、少なくとも２種の異なるアデノウイルスからのタンパク質、又はその機能的誘導体及び／又は類似体を含むのが好ましい。更に好ましいのは、前記アデノウイルスのうち少なくとも１種が亜群Ｂのアデノウイルスである組換えアデノウイルスベクタである。好ましくは、亜群Ｂからの前記アデノウイルスは、アデノウイルス１１、−１６、−３５及び−５１：からなる群より選ばれる。高度に好ましいのは、前記亜群Ｂアデノウイルスがアデノウイルス１６である本発明に従う組換えアデノウイルスベクタである。Ａｄ１６はある種類の細胞のための自然な親和性を有する。Ａｄ１６（及び／又はＡｄ１１、Ａｄ３５又はＡｄ５１）が、間充織幹細胞に異質な核酸を送達する遺伝子送達媒体として利用できることは、本発明の重要な側面である。これは、亜群Ｂアデノウイルスを組換えアデノウイルスベクタの幹として使うことによるか、又は１種又はそれより多い種類のこれらのアデノウイルスの親和性決定要素（又はその部分）を特定の親和性を持たない他のアデノウイルス内で使うことによって、達成することができる。かかる組換えアデノウイルスベクタの非限定的な例は、Ａｄ５アデノウイルスであり、Ａｄ５線維（その部分）は、Ａｄ１６線維（その部分）と入れ替わっている（Ａｄ５ｆｉｂ１６）。他の非限定的な例は、 Ａｄ５ｆｉｂ３５、 Ａｄ５ｆｉｂｌｌ、 Ａｄ３５ｆｉｂｌｌ、 Ａｄｌｌｆｉｂ３５、 Ａｄｌｌｆｉｂｌ６、 Ａｄ３５ｆｉｂｌ６、 Ａｄｌ６ｆｉｂ３５、等のような組合せである。亜群Ｂウイルスの間充織幹細胞のための自然な親和性が、かかる亜群Ｂウイルスを、非複製ウイルスにするために、分子生物学の技術によって処置することができるといった意味で利用することができ、ここでは、例えば、Ａｄ３５、Ａｄｌｌ、Ａｄｌ６、又はＡｄ５１のＥ１領域は、削除され、及び間充織幹細胞に送達されるべきである治療上の非アデノウイルス（異質）の対象の遺伝子に置換されている。したがって、本発明は、キメラウイルス（少なくとも２種のアデノウイルスからの要素を含む）並びに亜群Ｂアデノウイルスに基づくか、又はこれから導かれる組換え（非複製）アデノウイルスベクタの使用を提供する。分子生物学の技術が、核酸配列の無限の組合せを構成することを可能にした。異なった配列の組合せが、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）並びに直接サブクローン化のような異なった分子技術を実行されることは、分子生物学の当業者には明らかである。本発明において用いられる配列の多くは、この技術分野で知られている配列及びキメラ構成体と同様、異なったアデノウイルス血清型から導かれる。本明細書で用いる‘から導く’は、従って、かかる配列��組合せが、野生型ウイルスから得られた野生型配列からの直接クローン化を介して得ることができることを意味し、一方、それらはまた、例えば、ＤＮＡの異なった小片を鋳型として用いることによるＰＣＲを介して得ることもできる。これはまた、かかる配列が野生型の形態並びに変形した形態においてでもよいことを意味する。同じ結果に到達するもう１つの選択肢は、合成ＤＮＡを結合することである。‘から導く’が必ずしも野生型ＤＮＡの直接クローン化を意味するのではないということを理解すべきである。当業者はまた、核酸のある種の小片の変異体の形態を得るための分子生物学の可能性に気付くであろう。これらの変異は異なる機能性を与えるが、それらはまた、ある種の変異がそのＤＮＡの特定の小片及びそのコード化したタンパク質の機能性を変えないような方法で沈黙していることもある。したがって、‘その機能的な部分、誘導体及び／又は類似体’の用語は、それらが関係する核酸の等価物として理解されなければならない。当業者は、ある欠失、交換、（点）変異、付加、等が、元の核酸と類似の機能を有する核酸にもまだ生じることもあるという事実を認めるであろう。したがって、かかる変形が、本発明にかかるカプシドタンパク質のようなタンパク質の機能性をそれほど変えるものではないことを理解すべきである。
【００３０】
本明細書で用いられる‘自然の親和性’は、ただ単に、現実生活において、アデノウイルスによって自然に見られるような組織又は細胞の認識を単に意味するのではない。この用語にはまた、哺乳類の体内のどこにあろうと、対象のアデノウイルスベクタによって結合される受容体を持ち運ぶすべての組織及び細胞の認識、認定及び感染が含まれる。
【００３１】
上述のように、本発明は、キメラウイルスと同様に亜群Ｂウイルスの使用を提供する。したがって、本発明は、また、組換えアデノウイルスの使用を提供し、ここでは、前記ウイルスカプシドは、更に、亜群Ｂ、又はその機能的な部分、誘導体及び／又は類似体に属さない、アデノウイルスから導かれる少なくとも１種の他のタンパク質を含む。前記他のタンパク質は亜群Ｃのアデノウイルスから導かれるのが好ましく、前記他のタンパク質はアデノウイルス５から導かれるのが更に好ましい。
【００３２】
本発明の１側面において、本発明の方法で用いる組換えアデノウイルスベクタは、少なくとも２種の異なるアデノウイルスからのタンパク質をコード化する核酸を含み、ここでは、前記核酸は亜群Ｂアデノウイルス線維タンパク質の親和性決定部分をコード化するのが好ましい。更に好ましい実施形態は、前記アデノウイルス線維タンパク質が、アデノウイルス１１、−１６、−３５及び−５１：からなる群より選ばれるアデノウイルスのものである。
【００３３】
本発明の重要な側面において、本発明の方法で用いる組換えアデノウイルスベクタよりなる核酸は、好ましくは、少なくともＥ１−領域の１部分の欠失を介して、前記核酸の標的細胞内における複製能力が減少するか、又は無能になるように修飾されている核酸である。別の側面において、前記核酸は、好ましくは、Ｅ２Ａ及び／又は少なくともＥ４−領域の１部分の欠失を介して、前記核酸によってコード化されるアデノウイルスタンパク質に対する免疫応答を始める宿主免疫系の能力が減少するか、又は無能になるように修飾されている核酸である。
【００３４】
重要なことであるが、組換えアデノウイルスベクタは、間充織幹細胞に遺伝子を送達するのに用いることができる。したがって、本発明は、本発明に従う使用を提供し、ここでは、前記組換えアデノウイルスベクタが更に、少なくとも１種の異質な核酸を有する。前記組換えアデノウイルスベクタは、亜群Ｂアデノウイルスカプシド及び少なくとも１種の異質な核酸を有することが好ましい。更に好ましい実施形態は、前記亜群Ｂアデノウイルスが、アデノウイルス１１、−１６、−３５又は−５１のものである。
【００３５】
本発明は、間充織幹細胞へ異質な核酸を送達するための組換えアデノウイルスベクタの使用を提供する。前記組換えアデノウイルスベクタは、間充織幹細胞に対する自然な親和性を有するアデノウイルスから導く。間充織幹細胞に対する自然な親和性を有するアデノウイルスは、本明細書で開示するように、亜群Ｂのアデノウイルスであるのが好ましい。更に好ましいかかる使用は、前記組換えアデノウイルスベクタが、１１、−１６、−３５及び−５１：からなる群より選ばれるアデノウイルスから導かれる。本発明は、間充織幹細胞への異質な核酸の送達のために、本発明に従う組換えアデノウイルスベクタの使用を提供する。間充織幹細胞は、多重の潜在性を有し、及び明らかに成長して異なった種類の細胞になることができるので、かかる細胞を用いる遺伝子治療のための多くの様々な応用方法が、本発明を用いることによって、いまや可能である。本発明を適用できる応用方法の１つが、組織工学である。本発明は、治療用タンパク質又はその機能的等価物、又はＲＮＡをコード化する異質な核酸を間充織幹細胞に移動させることによって治療できる疾病の処置のための使用を提供する。好ましくは、変形関節炎又は多発性硬化症が、本発明のこれらの側面を用いて処置することができる疾病である。更に好ましい側面においては、送達すべき前記異質な核酸は、ＩＬ−１０タンパク質をコード化する。
【００３６】
本発明の側面を用いて、遺伝子組換え間充織幹細胞が得られる。本発明の特定の実施様態において、本発明はまた、本発明の提供された方法及び手段に従う組換えアデノウイルスベクタの使用を介し、異質な核酸を具備した間充織幹細胞を提供する。かかる間充織幹細胞は、多くの異なった治療上の設定において適用可能であることを理解すべきである。本発明の別の実施形態において、本発明は、例えば、骨形成（再生）の提供のために、骨に関連した疾患の処置用の薬を調製するために、本発明に従って得られる間充織幹細胞の使用を提供する。本明細書において、好ましくは、前記異質な核酸は骨形態形成タンパク質−２及び／又は骨ＬＩＭ鉱質形成タンパク質−１をコード化する。得られる前記間充織幹細胞はまた、多発性硬化症の処置のための、脈管形成促進のための、又は変形関節炎の処置のための薬の調製にも適用することができる。
【００３７】
上述のように、カプシドタンパク質はアデノウイルスの親和性を決定するのに重要な役割を果たす。特に、線維タンパク質は、宿主細胞の表面に提示された細胞受容体（群）の認識において必須である。別の実施形態において、本発明は、間充織幹細胞に異質な核酸を送達するために、亜群Ｂのアデノウイルスから導かれる、線維タンパク質、又はその機能的部分、誘導体及び／又は類似体の使用を提供する。好ましくは、前記線維タンパク質を、アデノウイルス１１、−１６、−３５及び−５１：からなる群より選ばれるアデノウイルスから導く。
【００３８】
本発明は更に、間充織幹細胞に形質導入をするための方法を提供し、この方法は、以下の工程：間充織幹細胞を培養すること；及び前記間充織幹細胞を、異質な核酸を含む組換えアデノウイルスベクタと接触させることを含み、ここで、前記組換えアデノウイルスベクタは間充織幹細胞に対する親和性を具備する。本発明はまた、次の工程：間充織幹細胞を培養すること；及び前記間充織幹細胞を、異質な核酸を含む組換えアデノウイルスベクタと接触させることを含む間充織幹細胞に形質導入する方法を提供し、ここでは、前記組換えアデノウイルスベクタを亜群Ｂアデノウイルスから導く。本発明の方法において用いる好ましいアデノウイルスは、組換えＡｄｌｌ、Ａｄｌ６、Ａｄ３５及びＡｄ５１であるか、又は亜群Ｂ由来ではない組換えアデノウイルスベクタであるが、それらのカプシド内で間充織幹細胞の親和性決定要素を発現するものである。
【実施例】
【００３９】
例１：アデノウイルス血清型５ゲノムプラスミドクローンの産生
アデノウイルス血清型５の完全ゲノムを、種々のプラスミド又はコスミドにクローン化し、アデノウイルス血清型５ゲノムの部分が容易に修飾されるようにする一方で、組換えウイルスを生産する能力が依然として保たれるようにした。この目的のため、以下のプラスミドを産生させた：
【００４０】
１．ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１２２）
ＩＴＲ配列の平滑端クローン化を容易にするために、野生型ヒトアデノウイルス５型（Ａｄ５）ＤＮＡを、過剰のｄＮＴＰ存在下にクレノ酵素で処理した。クレノ酵素の不活性化及びフェノール／クロロホルム抽出とそれに次ぐエタノール沈殿とによる精製の後、ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化した。このＤＮＡ調製物を、更に精製することなく、以下のようにして調製したｐＢｒ３２２由来ベクタＤＮＡとの連結反応に用いた：ｐＢｒ３２２ＤＮＡをＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩで消化し、ＴＳＡＰ酵素〔Life Technologies（ライフ・テクノロジー社）〕処理によって脱リン酸化し、更にＬＭＰアガロースゲル〔SeaPlaque（シープラーク）ＧＴＧ社〕で精製した。受容性Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ〔Life Tech.（ライフ・テック社）〕への形質転換及びアンピシリン耐性コロニの分析の後、Ａｄ５中のＢａｍＨＩ部位から右側ＩＴＲへ伸びる挿入断片について予想通りに消化パターンを示す１種のクローンを選定した。右側ＩＴＲでのクローン化辺縁(cloning border)の配列分析によって、ＩＴＲの最も３´側のＧ残基が失われて、ＩＴＲの残りの部分が正しいことを明らかにした。前記欠損Ｇ残基は、複製の間に他のＩＴＲにより補完される。
【００４１】
２．ｐＢｒ／Ａｄ．Ｓａｌ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１１９）
ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲをＢａｍＨＩ及びＳａｌＩで消化した。アデノウイルス挿入断片を含むベクタ断片をＬＭＰアガロース(SeaPlaque GTG)において分離し、ｗｔＡｄ５ＤＮＡから得た４．８ｋｂのＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片に連結し、更にＧｅｎｅｃｌｅａｎ（ジーンクリーン）ＩＩキット〔Bio101, Inc.（バイオ１０１社）〕により精製した。１種のクローンを選び、Ａｄ５配列の完全性を制限酵素分析によって決定した。クローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｓａｌ−ｒＩＴＲは、１６７４６番目の塩基対にあるＳａｌＩ部位からｒＩＴＲ（最も３´側のＧ残基を欠損）までの、及びこれを含むアデノ５型配列を含む。
【００４２】
３．ｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−Ｂａｍ（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１１７）
野生型Ａｄ５ＤＮＡをＣｌａＩ及びＢａｍＨＩで消化し、２０．６ｋｂの断片を電気泳動溶出(electro-elution)によってゲルから単離した。ｐＢｒ３２２を同じ酵素で消化し、Genecleanによってアガロースゲルから精製した。両断片を連結し、及び受容性ＤＨ５ａへの形質転換をさせた。得られるクローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−Ｂａｍを制限酵素消化よって分析し、塩基対９１９から２１５６６番目までのアデノウイルス配列所有の挿入断片が含まれることを示した。
【００４３】
４．ｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−Ｂａｍ（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１１４）
クローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−ＢａｍをＥｃｏＲＩ（ｐＢｒ３２２内）で直線状にし、更にＡｆｌＩＩで部分的に消化した。ＡｆｌＩＩを２０分間６５℃の加熱により不活性化した後、断片の末端をクレノ酵素を用い充填した。次いで、前記ＤＮＡをＰａｃＩ部位（５´−ＡＡＴＴＧＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＧＣＴＴＡＡ−３´）含有の平滑端化二重鎖オリゴリンカに連結させた。このリンカは、次の２本のオリゴヌクレオチド：５´−ＡＡＴＴＧＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＧＣ−３´及び５´−ＡＡＴＴＧＣＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＣ−３´をアニーリングすること、次いでクレノ酵素よる平滑端化によって作製された。連結されたＤＮＡを沈殿させて緩衝液を変えた後、過剰のＰａｃＩ酵素を用い連結物を消化し、オリゴの鎖状体(concatamere)を除去した。塩基対が３５３４番目から２１５６６番目までのＡｄ５配列及びベクタ配列を含む２２０１６塩基対の部分断片をＬＭＰアガロース(SeaPlaque GTG)において単離し、再連結し、更に受容性ＤＨ５ａへの形質転換をさせた。ＰａｃＩ部位を含むことが見出され、及び大きなアデノ断片を保持していた１種のクローンを選定し、５´端の配列を決定して、（喪失した）ＡｆｌＩＩ部位へのＰａｃＩリンカの正しい挿入を確認した。
【００４４】
５．ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲｐａｃ＃２（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１２０）及びｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ＃８（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１２１）
Ａｄ５のＩＴＲ近傍にあるＰａｃＩ部位をクローンｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲに挿入可能とするために、約１９０個のヌクレオチドを、ｐＢｒ３２２幹中のＣｌａＩ部位とＩＴＲ配列の開始部位との間で除去した。これは、以下のようにして行った：ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲをＣｌａＩで消化し、時間の長さを変えて（２分、５分、１０分及び１５分）、核酸分解酵素Ｂａｌ３１で処理した。ヌクレオチド除去の範囲は、同一の緩衝液及び条件を用いるｐＢｒ３２２ＤＮＡでの分離反応に従った（ＣｌａＩ部位でも消化）。７５℃１０分間でのインキュベーション（温置）によりＢａｌ３１酵素を不活性化させ、ＤＮＡを沈殿させ、及び小容量のＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。平滑端を確保するために、更にＤＮＡを過剰のｄＮＴＰ存在下にＴ４ＤＮＡ重合酵素で処理した。（対照）ｐＢｒ３２２ＤＮＡのＳａｌＩを用いる消化後、１０分又は１５分間処理した試料において申し分のない分解（〜１５０塩基対）が観察された。次に、１０分又は１５分処理したｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ試料を上述の平滑端化ＰａｃＩリンカ（ｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−Ｂａｍ参照）に連結した。連結物を沈殿によって精製し、過剰のＰａｃＩで消化し、更にＬＭＰアガロースゲル上でリンカから分離した。再連結後、ＤＮＡを受容性ＤＨ５ａへ形質転換させ、コロニを分析した。１０種のコロニはおよそ所望の長さの欠失が観察されたものを選定し、更にこれらをＴ−トラック配列決定〔Ｔ７配列決定キット、Pharmacia Biotech（ファーマシア・バイオテック社）〕により分析した。２種のクローンがｒＩＴＲの直下流に挿入されたＰａｃＩリンカを有することが見出された。ＰａｃＩによる消化後、クローン＃２は、ＩＴＲに付着した２８塩基対を有し、更にクローン＃８は２７塩基対を有する。
【００４５】
ｐＷＥ／Ａｄ．Ａｆ１ＩＩ−ｒＩＴＲ（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１１６）
コスミドベクタｐＷＥ１５〔Clontech（クローンテック社）〕を用いて、より一層大きいＡｄ５挿入断片をクローン化した。最初に、特有のＰａｃＩ部位を含むリンカをｐＷＥ１５のＥｃｏＲＩ部位に挿入してｐＷＥ．ｐａｃを作り出した。この目的のため、ｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩについて説明したような二重鎖ＰａｃＩオリゴを用いたが、ここではそのＥｃｏＲＩ突出末端による。次に、電気泳動溶出によりアガロースゲルから以下の断片を単離した：ＰａｃＩによって消化されたｐＷＥ．ｐａｃ、ＰａｃＩ及びＢａｍＨＩにより消化されたｐＢｒ／ＡｆｌＩＩ−Ｂａｍ及びＢａｍＨＩ及びＰａｃＩにより消化されたｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ＃２。これらの断片を一緒に連結し、１ファージパッケージング抽出〔Stratagene（ストラタジーン社）〕を製造元のプロトコルに従って用いパッケージングした。宿主細菌への感染後、コロニをプレート上で増殖させ、完全挿入断片の存在について分析した。ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲは、３５３４番目の塩基対（ＡｆｌＩＩ部位）から右側ＩＴＲ（最も３´側のＧ残基を欠損）に至るとともに該ｒＩＴＲを含むすべてのアデノウイルス５型配列を含む。
【００４６】
ｐＢｒ／Ａｄ．ｌＩＴＲ−Ｓａｌ（９．４）（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１１５）
Ａｄ５野生型ＤＮＡを過剰なｄＮＴＰ存在下でクレノ酵素と反応させた後、ＳａｌＩで消化した。得られた断片のうち２種を、それぞれ左側ＩＴＲ−Ｓａｌ（９．４）及びＳａｌ（１６．７）−右側ＩＴＲと表し、これらをＬＭＰアガロース（Seaplaque GTG）において単離した。ｐＢｒ３２２ＤＮＡをＥｃｏＲＶ及びＳａｌＩで消化し、更に脱リン酸酵素（Life Technologies）で処理した。ベクタ断片を、Geneclean法（BIO 101, Inc.）を用い単離し、Ａｄ５ＳａｌＩ断片に連結させた。９．４ｋｂ断片による連結物のみが挿入断片を有するコロニを与えた。クローン化辺縁の分析及び配列決定後、十分なＩＴＲ配列を有し、及び９４６２番目の塩基対にあるＳａｌＩ部位へ伸びるクローンを選定した。
【００４７】
ｐＢｒ／Ａｄ．１ＩＴＲ−Ｓａｌ（１６．７）（ＥＣＡＣＣ受託番号Ｐ９７０８２１１８）
ｐＢｒ／Ａｄ．ｌＩＴＲ−Ｓａｌ（９．４）をＳａｌＩで消化し、更に脱リン酸化した（ＴＳＡＰ、Life Technologies）。このクローンをＡｄ５中の第３ＳａｌＩ部位まで伸張させるために、ｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−ＢａｍをＢａｍＨＩにより直線状にし、更にＳａｌＩで部分的に消化した。９４６２〜１６７４６からのアデノウイルス配列を含む７．３ｋｂのＳａｌＩ断片をＬＭＰアガロースゲルにおいて単離し、ＳａｌＩ−消化ｐＢｒ／Ａｄ．ｌＩＴＲ−Ｓａｌ（９．４）ベクタ断片に連結した。
【００４８】
ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ
ｐＷＥ．ｐａｃをＣｌａＩで消化し、５´突出末端をクレノ酵素を用いて充填した。次に、ＤＮＡをＰａｃＩで消化して、アガロースゲルから単離した。ｐＷＥ／ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲをＥｃｏＲＩで消化し、クレノ酵素による処理の後ＰａｃＩで消化した。アデノウイルス配列を含む大きな２４ｋｂ断片をアガロースゲルから単離し、ＣｌａＩ−消化し及び平滑端化されたｐＷＥ．ｐａｃベクタに、ClontechからのLigation ExpressTM（リゲーション・エクスプレス、商標）キットを用いて連結した。StratageneからのUltracompetent XL10-Gold（ウルトラコンピテントＸＬ１０−ゴールド）細胞を形質転換した後、予測した挿入断片を含むクローンを同定した。ｐＷＥ／ＡｆｌＩＩ−ＥｃｏＲＩは、３５３４から２７３３６番目までの塩基対からなるＡｄ５配列を含む。
【００４９】
新規アダプタプラスミドの構築
パッケージング細胞系で組換え体のアデノウイルスとＥ１配列との間の配列重複が存在しないことは、新しい組換え体ウイルスの生成及び増殖を安全で、ＲＣＡ無しで行う上で必須である。アダプタプラスミドｐＭＬＰＩ．ＴＫは、本発明の改良されたパッケージング細胞系と組み合わせて本発明に従う使用のために設計されたアダプタプラスミドの１例である。このプラスミドを出発材料として用い、特定のプロモータ及び遺伝子配列を含む核酸分子が容易に交換される新しいベクタを作製した。最初に、以下のプライマを用いてｐＺｉｐΔＭｏ＋ＰｙＦ１０１（Ｎ−）鋳型ＤＮＡ（ＰＣＴ／ＮＬ９６／００１９５）からＰＣＲ断片を生成させた：ＬＴＲ−１：５´−ＣＴＧ  ＴＡＣ  ＧＴＡ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＣＣＴ  ＡＧＧ  ＣＡＴ  ＧＧＡ  ＡＡＡ  ＡＴＡ  ＣＡＴ  ＡＡＣ  ＴＧ−３´及びＬＴＲ−２：５´−ＧＣＧ  ＧＡＴ  ＣＣＴ  ＴＣＧ  ＡＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＡＣＣ  ＧＣＴ  ＡＧＣ  ＧＴＴ  ＡＡＣ  ＣＧＧ  ＧＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＴＣＡ  ＡＴＣ  Ｇ−３´。ＰｗｏＤＮＡ重合酵素〔Boehringer Mannheim（ベーリンガー・マンハイム社）〕を、製造元のプロトコルに従い以下の温度サイクルで用いた：９５℃で５分間；５５℃で３分間；及び７２℃で１分間を１回、及び９５℃で１分間、６０℃で１分間、７２℃で１分間の３０回のサイクル、その後７２℃で１０分間を１回。次に、ＰＣＲ生産物をＢａｍＨＩで消化し、ＰｖｕＩＩ及びＢａｍＨＩにより消化したｐＭＬＰ１０（Levrero等１９９１）ベクタに連結し、それによって、ベクタｐＬＴＲ１０を生成した。このベクタは、１番目の塩基対から４５４番目の塩基対に至るまでのアデニノウイルス配列と、それに続き、Ｍｏ−ＭｕＬＶ  ＬＴＲであって、変異体ポリオーマウイルス（ＰｙＦ１０１）からのエンハンサによって置換されたその野生型エンハンサ配列を持つものの１部からなるプロモータとを含む。プロモータ断片をＬ４２０で表す。次に、ネズミＨＳＡ遺伝子の翻訳領域を挿入した。ｐＬＴＲ１０をＢｓｔＢＩで消化し、続いてクレノ処理及びＮｃｏＩによる消化を行った。ＨＳＡ遺伝子は、以下のプライマを用いてｐＵＣ１８−ＨＳＡ〔Kay（カイ）等１９９０〕上のＰＣＲ増幅により得た：ＨＳＡ１、５´−ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＣＧＡ  ＴＧＧ  ＴＧＧ  Ｃ−３´及びＨＳＡ２、５´−ＧＴＴ  ＡＧＡ  ＴＣＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＧＴＣ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＧＡＴ  ＣＴＡ  ＣＴＡ  ＡＣＡ  ＧＴＡ  ＧＡＧ  ＡＴＧ  ＴＡＧ  ＡＡ−３´。２６９塩基対増幅断片を、ＮｃｏＩ及びＢｇｌＩＩ部位を用いて、シャトルベクタ中にサブクローン化した。配列決定によってＨＳＡ遺伝子の正しいコード配列の取り込みが確認されたが、付加的なＴＡＧ挿入断片によりＴＡＧ停止コドンが直後に続いた。次に、ＨＳＡ遺伝子の翻訳領域は、ＴＡＧの重複を含み、ＮｃｏＩ（粘着性）−ＳａｌＩ（平滑性）断片として切除され、ｐｌＴＲ１０からの３．５ｋｂＮｃｏＩ（粘着性）／ＢａｔＢＩ（平滑性）断片にクローン化され、ｐＬＴＲ−ＨＳＡ１０が得られた。
【００５０】
最後に、ｐＬＴＲ−ＨＳＡ１０をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化し、しかる後、左側ＩＴＲ、パッケージング信号、Ｌ４２０プロモータ及びＨＳＡ遺伝子を含む断片を、同じ酵素で消化したベクタｐＭＬＰＩ．ＴＫに挿入し、それによって、プロモータ及び遺伝子配列を置換した。これにより、種々の制限酵素のための好都合な認識部位をプロモータ及び遺伝子配列の周囲に含む新しいアダプタプラスミドｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡが得られた。ＳｎａＢＩ及びＡｖｒＩＩを、ＨｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄＩＩＩと合わせて、プロモータ配列を交換することができ、一方、後者の部位をＨＳＡ翻訳領域から３´側のＣｌａＩ又はＢａｍＨＩ部位と合わせることで、この構成体内で遺伝子を置き換えることができる。核酸分子の交換を容易にするように設計された他のアダプタプラスミドは、ｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡ中のプロモータ、遺伝子、及びポリ（Ａ）配列を、ＣＭＶプロモータ、多重クローン化部位、イントロン及びポリ（Ａ）信号と置換することにより作製した。この目的のため、ｐＡｄ／Ｌ４２０−ＨＳＡをＡｖｒＩＩ及びＢｇｌＩＩで消化した後にクレノで処理することで、平滑端が得られた。ｐＢｒ３２２ベクタ及びアデノウイルス配列を有する５．１ｋｂ断片を単離し、ＨｈａＩ及びＡｖｒＩＩにより消化した後にＴ４ＤＮＡ重合酵素により処理することで得られたｐｃＤＮＡ１／ａｍｐ〔Invitrogen（インビトロゲン社）〕からの平滑端化１５７０塩基対断片に連結した。このアダプタプラスミドをｐＣＬＩＰと命名した。
【００５１】
組換え体アデノウイルスの生成
新しいプラスミドを基とする系によるＥ１欠失組換えアデノウイルスを生成するために、以下の構成体を調製する：
（ａ）重複アデノウイルスゲノム断片の３´側で切断する制限酵素によって直線状になった対象の遺伝子を有する発現カセットを含み、好ましくは任意のｐＢｒ３２２ベクタ配列を含まないアダプタ構成体、及び
（ｂ）ＰａｃＩによって消化された補完的(complementing)アデノウイルスゲノム構成体ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ。
【００５２】
これらの２種のＤＮＡ分子を、更にフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール（ＥｔＯＨ）沈殿によって精製する。これらのプラスミドのアデノウイルスパッケージング細胞系、好ましくは本発明にかかる細胞系への同時形質移入は、アダプタと補完的構成体との間の１工程相同組換えによって、組換え複製欠失アデノウイルスを生成する。
【００５３】
あるいはまた、ｐＢＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩＩ−ｒＩＴＲの代わりに、他の断片を使用することができる。例えば、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＢｒ／Ａｄ．Ｃｌａ−Ｂａｍ又はＰａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＢａｍＨＩを、ＳａｌＩで消化したｐＢｒ／Ａｄ．Ｓａｌ−ｒＩＴＲと合わせることができる。この場合、３種類のプラスミドが合わされ、組換えアデノウイルスを得るために２種の相同組換えが必要となる。本発明から逸脱することなく、当業者であれば、アダプタ及び補完的プラスミドの他の組合せを用いることができることを理解すべきである。以下に本発明の非限定的な例として概略し、意味される一般的なプロトコルを実行することで、種々のアダプタプラスミド及びＡｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ断片を用いる組換えアデノウイルスが生産される。アデノウイルスパッケージング細胞（ＰＥＲ．Ｃ６）を、２５ｃｍ２のフラスコに播種し、集密度(confluency)が〜８０％となった翌日に、ＤＮＡとリポフェクタミン剤（Life Techn.）との混合物で製造元の記載通りに形質移入した。日常的に、４０μｌのリポフェクタミン、４μｇのアダプタプラスミド、及び４μｇの補完的アデノウイルスゲノム断片ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ（又は二重相同組換えに対して２μｇのすべての３類のプラスミド）を用いる。これらの条件下で、ｐＡｄ／ＣＭＶ−ＬａｃＺアダプタを用いた対照形質移入により決定されるように、〜５０％（形質移入後４８時間）の一時的な形質移入効率が得られる。２日後、細胞を８０ｃｍ２のフラスコに継代し更に培養した。約５日（単一の相同組換えに対して）乃至１１日（二重の相同組換えに対して）後、細胞変性効果（ＣＰＥ）が見られ、機能性アデノウイルスが形成されたことを示す。十分なＣＰＥ状態で細胞及び培地を収集し、組換えウイルスを凍結／解凍によって放出させる。日常的に、８０ｃｍ２のフラスコでの付加的増幅工程を実行し、収量を高める。なぜなら、初期段階では、十分なＣＰＥが生じたにもかかわらず力価が変わり易いためである。増幅後、ウイルスを収集し、ＰＥＲ．Ｃ６細胞上でプラークを精製する。活性な導入遺伝子を有するウイルスについて、個々のプラークを試験する。
【００５４】
Ｅ１領域での置換に加え、アデノウイルスでのＥ３領域（の部分）を欠失又は置換することができる。なぜなら、Ｅ３は、（組換え体）ウイルスの複製、パッケージング及び感染にとって不要だからである。これによって、最大パッケージ寸法（ｗｔゲノム長さの約１０５％）を超えないで、より一層大きな挿入断片を用いるか、又は１種よりも多い遺伝子を挿入する機会が作り出される。このことは、例えば、ＸｂａＩによる消化及び再連結によってｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲクローン中のＥ３領域の部分を欠失させることによって行うことができる。これによって、既知のＥ３翻訳領域のすべてを含むＡｄ５ｗｔ配列２８５９２〜３０４７０が除去される。別の例は、Ｅ３領域内のｇｐｌ９Ｋの翻訳領域をポリリンカによって正確に置換することであり、新たな配列の挿入を可能にする。これは、（１）他の翻訳領域すべてを損なわずに残し、及び（２）異質なプロモータの必要性を取り除く。なぜなら、導入遺伝子がＥ３プロモータ及びｐＡ配列によって駆動され、コード配列のための空間が残るからである。
【００５５】
この目的のため、Ｅ３領域の５´部分を含むｗｔＡｄ５からの２．７ｋｂＥｃｏＲＩ断片を、pBluescript（ブルースクリプト）（ＫＳ−）（Stratagene）のＥｃｏＲＩ部位にクローン化した。次いで、ポリリンカ中のＨｉｎｄＩＩＩ部位を、ＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｃＩＩによる消化及びそれに続く再連結によって除去した。得られたクローンｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ＤＨＩＩＩを用い、ｇｐ１９Ｋ翻訳領域を削除した。プライマ１（５´−ＧＧＧ  ＴＡＴ  ＴＡＧ  ＧＣＣ  ＡＡ  ＡＧＧ  ＣＧＣ  Ａ３´）及びプライマ２（５´−ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＧ  ＧＴＧ  ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＣＣＡ  ＧＣＧ−３´）を用い、ｗｔＡｄ５ＤＮＡ中の配列２８５１１〜２８７３４に相当するｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／Ａｄ５ＤＨＩＩＩからの配列を増幅させた。プライマ３（５´−ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＣＴＴ  ＴＡＣ  ＴＡＡ  ＧＴＴ  ＡＣＡ  ＡＡＧ  ＣＴＡ−３´）及びプライマ４（５´−ＧＴＣ  ＧＣＴ  ＧＴＡ  ＧＴＴ  ＧＧＡ  ＣＴＧ  Ｇ−３´）を同じＤＮＡ上で用い、２９２１７から２９４７６までのＡｄ５配列を増幅させた。得られた２種類のＰＣＲ断片を新しい導入されたＮｃｏＩ部位によって互いに連結し、次いでＸｂａＩ及びＭｕｎＩで消化した。次に、この断片を、ＸｂａＩ（部分的）及びＭｕｎＩで消化したｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ΔＨＩＩＩベクタに連結し、ｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ΔＨＩＩＩ．Δｇｐ１９Ｋを生成させた。ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ部位への外来遺伝子導入を可能とするために、ｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ΔＨＩＩＩ．Δｇｐ１９Ｋ中にＸｂａＩ欠失を生じさせ、Bluescriptポリリンカ中のＢａｍＨＩ部位を除去した。得られるプラスミドｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ΔＨＩＩＩΔｇｐ１９ＫΔＸｂａＩは、Ａｄ５中の配列２８７３３（ＨｉｎｄＩＩＩ）及び２９２１８（ＢａｍＨＩ）に相当する独特なＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ部位を含む。外来遺伝子をこれらの部位に導入した後に、欠失ＸｂａＩ断片を再び導入するか、又は挿入断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及び例えばＭｕｎＩを用いて、ｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ΔＨＩＩＩ．Δｇｐ１９Ｋ中に再クローン化した。この方法を用いることにより、本発明者等は、ＨＳＶ−ＴＫ、ｈＩＬ−１ａ、ラットＩＬ−３、ルシフェラーゼ又はＬａｃＺを発現するプラスミドを生成した。ｐＢＳ．Ｅｃｏ−Ｅｃｏ／ａｄ５ΔＨＩＩＩ．Δｇｐ１９Ｋプラスミド（対象の挿入された遺伝子の有無にかかわりなく）中の独特なＳｒｆＩ及びＮｏｔＩ部位を用いて、対象の遺伝子を含む領域をｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲの相当する領域に移すことで、構成体ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲΔｇｐ１９Ｋ（対象の挿入された遺伝子の有無にかかわりなく）が得られる。この構成体を前記のように用いて組換えアデノウイルスを生産する。このウイルスの状況では、挿入遺伝子の発現はアデノウイルスＥ３プロモータによって駆動される。
【００５６】
Ｅ１及びＥ３の双方が欠失している組換えウイルスを、以下のプラスミドを基とする系を用いて、Ｅ１−置換ベクタのための上述したような二重相同組換え方法によって生成させる：（ａ）対象の第１の遺伝子の挿入の有無にかかわらず、本発明に従うＥ１置換のためのアダプタプラスミド；（ｂ）ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片；及び（ｃ）対象の第２の遺伝子の挿入の有無にかかわらず、ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲΔｇｐ１９Ｋプラスミド。Ｅ３領域での操作に加え、Ｅ４領域（の部分）の変化は、ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲで容易に遂行し得る。しかし、かかるウイルスの生成及び増殖は、場合によっては途中で相補性を要求する。
【００５７】
例２：キメラ線維タンパク質を有するアデノウイルス血清型５系ウイルスの生成
以下に説明する方法によって、２種又はそれより多い種類の別々のクローン化アデノウイルス配列を同時形質移入することにより、組換えアデノウイルスを生成する。これらのクローン化アデノウイルス配列の１種を、アデノウイルス血清型５線維ＤＮＡを欠失させ独特な制限部位と置換されるように修飾し、それによって、他のアデノウイルス血清型から導かれる線維タンパク質をコード化するＤＮＡ配列の導入を容易にする‘鋳型クローン’を生成した。
【００５８】
線維をコード化するＤＮＡを欠くアデノウイルス鋳型クローンの生成
アデノウイルス血清型５の線維コード配列は、ヌクレオチド３１０４２と３２７８７との間に位置している。線維をコード化しているアデノウイルス血清型５ＤＮＡを除去するために、本発明者等は構成体ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲから始めた。最初に、この構成体からＮｄｅＩ部位を除去した。この目的のために、ｐＢｒ３２２プラスミドＤＮＡ配列をＮｄｅＩで消化し、しかる後突出末端を、クレノ酵素を用いて充填した。次に、このｐＢｒ３２２プラスミドを再連結し、ＮｄｅＩで消化し、及びＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに形質転換させた。得られたｐＢｒ／ΔＮｄｅＩプラスミドをＳｃａＩ及びＳａｌＩで消化し、結果として生じた３１９８ｂｐベクタ断片をｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍｒＩＴＲから導く１５３４９ｂｐのＳｃａＩ−ＳａｌＩ断片に連結することで、独特なＮｄｅＩ部位が含まれるプラスミドｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲΔＮｄｅＩを生じさせた。次に、オリゴヌクレオチドＮＹ−ｕｐ：５´−ＣＧＡ  ＣＡＴ  ＡＴＧ  ＴＡＧ  ＡＴＧ  ＣＡＴ  ＴＡＧ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＴＴＡ  ＴＧＴ  ＴＴＣ  ＡＡＣ  ＧＴＧ−３´及びＮＹ−ｄｏｗｎ：５´−ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＣＡＴ  ＧＴＴ−３´を用いてＰＣＲを実行した。増幅の間、ＮｄｅＩ制限部位（太文字、上記「ＮＹ−ｕｐ：５´−・・・ＣＡＴ  ＡＴＧ  ・・・−３´」）及びＮｓｉＩ制限部位（下線）を導入して、増幅する線維ＤＮＡのクローン化を容易にした。増幅は、それぞれが９４℃で４５秒間、６０℃で１分間、及び７２℃で４５秒間の２５サイクルからなった。ＰＣＲ反応は、２５ピコモルのオリゴヌクレオチドＮＹ−ｕｐ又はＮＹ−ｄｏｗｎ、２ｍＭのｄＮＴＰ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含むＰＣＲ緩衝液、及び１単位のElongase（エロンガーゼ）熱安定性ポリメラーゼ〔Gibco（ギブコ社）、オランダ国〕を含むものであった。ＰＣＲ産物の１０分の１をアガロースゲル上で泳動させることで、±２２００ｂｐからなる予測したＤＮＡ断片が増幅した。次いで、このＰＣＲ断片をGeneclean kit system（Bio101 Inc.）を用いて精製した。次に、構成体ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲΔＮｄｅＩ及びＰＣＲ産物の双方を制限酵素ＮｄｅＩ及びＳｂｆＩで消化した。その後、Ｔ４リガーゼ酵素を用いて、ＰＣＲ断片をＮｄｅＩ及びＳｂｆＩ消化ｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲΔＮｄｅＩ中にクローン化することで、ｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂを生成した。このプラスミドは、除去された線維配列の代わりに挿入される独特なＮｄｅＩ及びＮｓｉＩ部位を介して、任意のＰＣＲ増幅された線維配列の挿入を可能とする。ウイルスは、後述するパッケージング細胞において、アダプタプラスミド、ＰａｃＩ及びＥｃｏＲＩにより消化された構成体ｐＢｒ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ及び異質な線維配列が挿入されているｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂ構成体を用いる二重相同組換えによって生成することができる。ウイルスの生成効率を高めるために、構成体ｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂを修飾して、ＰａｃＩ部位を生成し、右側ＩＴＲに隣接させた。これに関して、ｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂをＡｖｒＩＩで消化し、５ｋｂアデノ断片を単離し、及びベクタｐＢｒ／Ａｄ．Ｂａｍ−ｒＩＴＲ．ｐａｃ＃８に導入することで、相当する���ｖｒＩＩ断片を置換した。結果として生じる構成体をｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂ．ｐａｃと命名した。ひとたび異質な線維配列がｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂ．ｐａｃに導入されれば、線維修飾右側アデノウイルスクローンを、例１においてｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲについて説明したように、大きなコスミドクローンに導入することができる。かかる大きなコスミドクローンは、１回の相同組換えのみによってアデノウイルスの生成を可能とし、プロセスを非常に効率的なものにする。
【００５９】
アデノウイルス血清型由来の線維配列の増幅
選択可能な複数の血清型から導かれる線維タンパク質をコード化するＤＮＡの増幅を可能とするために、縮重オリゴヌクレオチドを合成した。この目的のために、選択可能な複数の血清型の線維タンパク質をコード化する最初の複数の既知ＤＮＡ配列を整列させて、線維タンパク質の瘤−領域及び尾(tail)−領域の双方に保存領域を同定した。６種の亜群すべてを現す１９種の異なる血清型のヌクレオチド配列を含む配列比較(alignment)から、（縮重）オリゴヌクレオチドを合成した。増幅反応（５０μｌ）は、２ｍＭのｄＮＴＰ、２５ピコモルの各オリゴヌクレオチド、標準１ｘＰＣＲ緩衝液、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び１反応あたり１単位のＰｗｏ(1 Unit Pwo)熱安定性ポリメラーゼ（Boehringer）を含んだ。サイクラープログラムは２０サイクルを含んでおり、各々のサイクルは、９４℃３０秒間、６０〜６４℃６０秒間、及び７２℃１２０秒間からなった。ＰＣＲ産物の１／１０をアガロースゲル上で泳動したところ、ＤＮＡ断片が増幅したことが示された。各々の異なる鋳型のうち、ＰＣＲ反応をそれぞれ別個に２回実施し、しかる後、得られた個々のＰＣＲ断片の塩基配列を決定して、ヌクレオチド配列を確定した。１１種の異なる血清型から、ヌクレオチド配列をｇｅｎｂａｎｋ（ジーンバンク）にある配列と比較することができた。他のすべての血清型のうち、線維タンパク質をコード化するＤＮＡは今まで知られておらず、従って他の亜群の一員からの既知配列と配列比較することで、相同性、すなわち配列分散を決定した。現在まで知られている５１種のヒト血清型のうち、血清型１、６、１８、及び２６を除くすべての線維配列が増幅され、及び配列決定された。
【００６０】
線維キメラアデノウイルスＤＮＡ構成体の生成
ベクタ（ｐＢｒ／Ａｄ．ＢａｍＲΔＦｉｂ）と同様にすべての増幅した線維ＤＮＡをＮｄｅＩ及びＮｓｉＩで消化した。次いで、消化ＤＮＡをアガロースゲル上で泳動し、しかる後、ゲルから断片を単離し、及びGeneclean kit (Bio101 Inc.)を用いて精製した。次に、ＰＣＲ断片をｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲΔＦｉｂのＮｄｅＩ及びＮｓｉＩ部位中にクローン化し、このようにしてｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲＦｉｂＸＸ（式中、ＸＸは、線維ＤＮＡが単離された血清型数を表す）を生成させた。これまでに、血清型５／７／８／９／１０／１１／１２／１３／１４／１６／１７／１９／２１／２４／２７／２８／２９／３０／３２／３３／３４／３５／３６／３７／３８／４０−Ｓ／４０−Ｌ／４１−Ｓ／４２／４５／４７／４９／５１の線維配列をｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲＦｉｂＸＸ中にクローン化した。ｐＢｒ／ＡｄＢａｍＲＦｉｂＸＸ（式中、ＸＸは、５／８／９／１０／１ｌ／１３／１６／１７／２４／２７／３０／３２／３３／３４／３５／３８／４０−Ｓ／４０−Ｌ／４５／４７／４９／５１である）から、ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ中のコスミドクローン（例１参照）を生成し、効率的なウイルス生成を促進した。このコスミドクローン化によって、構成体ｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ／ＦｉｂＸＸ（式中、ＸＸは、線維ＤＮＡが単離された血清型数を表す）が形成された。
【００６１】
線維タンパク質に対してキメラである組換え体アデノウイルスの生成
血清型１２、１６、２８、４０−Ｌ、５１、及び５を所有する組換えＡｄ５ウイルスを生成するために、３種の構成体、ｐＣＬＩＰ／ルシフェラーゼ、ｐＷＥ／ＡｄＡｆｌＩＩ−Ｅｃｏ及びｐＢｒ／ＡｄＢａｍｒＩＴＲ．ｐａｃ／ｆｉｂＸＸ（ＸＸ＝１２、１６、２８、４０−Ｌ、５１、及び５）をアデノウイルス生産細胞中に形質移入させた。線維の５／７／８／９／１０／１１／１２／１３／１４／１６／１７／１９／２１／２４／２７／２８／２９／３０／３２／３３／３４／３５／３６／３７／３８／４０−Ｓ／４０−Ｌ／４１−Ｓ／４２／４５／４７／４９／５１を所有する組換えＡｄ５ウイルスを生成するために、２種類の構成体ｐＣＬＩＰ／ルシフェラーゼ及びｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ／ＦｉｂＸＸをアデノウイルス生産細胞中に形質移入させた。形質移入のために、２μｇのｐＣＬＩＰ／ルシフェラーゼ、及びｐＷＥ／ＡｄＡｆｌＩＩ−Ｅｃｏ及びｐＢｒ／ＡｄＢａｍｒＩＴＲ．ｐａｃ／ｆｉｂＸＸの双方の４μｇ（又はコスミドの場合、４μｇのｐＣＬＩＰ／ルシフェラーゼに加え４μｇのｐＷＥ／Ａｄ．ＡｆｌＩＩ−ｒＩＴＲ／ＦｉｂＸＸ）を、無血清のＤＭＥＭ中で希釈して全体の容量を１００μｌにした。このＤＮＡ懸濁液１００μｌに対して、１倍希釈したリポフェクタミン（Gibco）を添加した。室温で３０分置いた後、ＤＮＡ−リポフェクタミン複合体溶液を、後にＴ２５ｃｍ２組織培養フラスコに加えられる２．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭに添加した。このフラスコは、形質移入の２４時間前に播種された２×１０６個のＰＥＲ．Ｃ６細胞を含んだ。２時間後、ＤＮＡ−リポフェクタミン複合体含有培地を、２０％ウシ胎児血清が補充された２．５ｍｌのＤＭＥＭを加えることによって１回希釈した。再び２４時間後、培地を１０％ウシ胎児血清が補充された新鮮なＤＭＥＭと交換した。細胞を６〜８日間培養した後に収集し、凍結／解凍を３回行った。５分間、３０００ｒｐｍ室温の遠心分離によって、細胞破片を除去した。上清（１２．５ｍｌ）のうち、３〜５ｍｌを用いて、感染ＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ｔ８０ｃｍ２組織培養フラスコ）を再び感染させた。この再感染によって、５〜６日後に十分な細胞変性効果（ＣＰＥ）が得られ、しかる後アデノウイルスを上記のようにして収集した。
【００６２】
例３：線維キメラアデノウイルスの生産、精製、及び滴定
形質移入したＰＥＲ．Ｃ６細胞から得た上清のうち、１０ｍｌを使用して、懸濁液中の増殖に特に適応させた１〜１．５×１０６個細胞／ｍｌのＲＥＲ．Ｃ６を含む１リットルの発酵槽に接種した。接種後３日目、室温で１０分間、１７５０ｒｐｍで遠心分離することにより、細胞を収集し及び沈殿化(pellet)させた。次いで、沈殿化させた細胞に存在するキメラアデノウイルスを、以下のような下流処理(downstream processing)プロトコルを用いて抽出及び精製した。沈殿物を５０ｍｌの１０ｍＭのＮａＰ０４−中に溶解し、しかる後、−２０℃で凍結させた。３７℃で解凍した後、５．６ｍｌのデオキシコレート（５％ｗ／ｖ）を添加し、しかる後、溶液をホモゲナイズ（均質化）した。次いで、溶液を３７℃で１５分間インキュベートして細胞を完全に分解した。溶液をホモゲナイズした後、１８７５μｌ（１Ｍ）のＭｇＣｌ２−を添加し、及び１００％のグリセロール５ｍｌを加えた。ＤＮＡ分解酵素（１０ｍｇ／ｍｌ）３７５μｌを加えた後、溶液を３７℃で３０分間インキュベートした。室温で３０分間、制動をかけることなく１８８０×ｇで遠心分離して細胞破片を除去した。その後、１０ｍｌのフレオン上にロードすることにより、上清をタンパク質から精製した。室温で１５分間、制動をかけることなく２０００ｒｐｍで遠心分離することで、上側バンドがアデノウイルスを示す３種のバンドが見えるようになる。このバンドをピペットで取ることで分離し、しかる後、それを、Ｔｒｉｓ／ＨＣ１（１Ｍ）緩衝化塩化セシウムの段階勾配(blockgradient)（範囲：１．２乃至１．４ｇ／ｍｌ）上に装填した。他の成分とは対照的に、ウイルスは１．４ｇ／ｍｌのＣｓＣｌ溶液中に移らないことから、１０℃で２．５時間、２１０００ｒｐｍで遠心分離する際、ウイルスを残留タンパク質及び細胞破片から精製した。ウイルスのバンドを単離し、しかる後、２回目の精製を１．３３ｇ／ｍｌのＣｓＣｌのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（１Ｍ）緩衝化連続勾配を用いて実行する。この勾配の頂上でのウイルスの負荷の後、ウイルスを１０℃、５５０００ｒｐｍで１７時間遠心分離する。次いで、ウイルスバンドを単離し、ショ糖（５０ｗ／ｖ）３０μｌを加えた後、１ラウンド１時間を含む透析を３ラウンド行うことによって、余分なＣｓＣｌを除去する。透析のため、ウイルスを透析スライド〔Slide-a-lizer、カットオフ１００００ｋＤ、Pierce（ピアス社）、米国〕に移動させる。透析に使用する緩衝液は、ＰＢＳであり、このＰＢＳにショ糖が濃度を増加させながら補充される（１〜３ラウンド：３０ｍｌ、６０ｍｌ、及び１５０ｍｌのショ糖（５０％ｗ／ｖ）／１．５リットルＰＢＳ、すべて７．５ｍｌの２％（ｗ／ｖ）ＣａＭｇＣ１２を補充）。透析後、Slide-a-lizerからウイルスを除去し、しかる後、それを分けて２５μｌ及び１００μｌの部分とし、ウイルスを−８５℃で貯蔵する。１ｍｌ当たりのウイルス粒子数を決定するために、ウイルスバッチ１００μｌを高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）にかける。アデノウイルスをカラム（アニオン交換）に結合させ、しかる後、それをＮａＣｌ勾配（範囲３００〜６００ｍＭ）を用いて溶出させる。ウイルスのピーク下面積の決定によって、ウイルス粒子の数を計算することができる。１つのウ��ルスのバッチに存在する１ｍｌ当たりの感染単位（ＩＵ）の数を決定するために、９１１細胞に対して滴定を実行した。この目的のために、９６穴プレートの１穴当たりに、４×１０４個の９１１細胞を、１穴あたり１００μｌを全量として列Ｂ、Ｄ、及びＦに播種する。播種後３時間で、細胞がプラスチック支持体に付着するので、その後に培地を除去することができる。細胞に対して、繰り返して、２００μｌの容量を添加し、異なる希釈のウイルスを含有させる（範囲：２×１０９まで１０２倍希釈）。ＣＰＥについてのスクリーニングによって、１４日後でもＣＰＥを与える最も高いウイルス希釈が少なくとも１感染単位を含むと考えられる。この観察を用いることは、これらの穴に存在するウイルス容量の計算値と共に、所定のウイルスバッチ１ｍｌ当たりの感染単位の数を表す。生産結果、すなわち、１ｍｌ当たりのウイルス粒子及び１ｍｌ当たりのＩＵ、又は生産されたそれらのキメラアデノウイルスは、すべてがマーカとしてのルシフェラーゼｃＤＮＡを有し、それらを表２に示す。
【００６３】
例４：ヒト間充織幹細胞の形質導入
健康なドナーから得られる骨髄穿刺液から導かれる付着画分を、Ｄ−グルコース（１ｇ／ｌ）、ピルビン酸ナトリウム及び炭酸水素ナトリウム（４．４ｇ／ｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、及び１０％熱不活化ウシ胎児血清を補足したDulbecco’s modified（ダルベッコ変法）イーグル培地（DMEM）中で培養した。細胞を１：２の割合で培養飽和密度に達するまで継代した。形質導入のために、２４穴プレートの１穴あたり５×１０４細胞の濃度で、細胞を播種し、２４時間付着させた。その後、１細胞当たり１０００ウイルス粒子のＡｄ５又は線維キメラウイルスＡｄ５．Ｆｉｂ１２、Ａｄ５．Ｆｉｂ１６、Ａｄ５．Ｆｉｂ３２、Ａｄ５．Ｆｉｂ３５、Ａｄ５．Ｆｉｂ４０−Ｓ、Ａｄ５．Ｆｉｂ４０−Ｌ，Ａｄ５．Ｆｉｂ４５、又はＡｄ５．Ｆｉｂ５１に曝した。線維４０−Ｓ及び４０−Ｌは、血清型４０の短線維及び長線維をそれぞれ示している。ウイルス添加後４８時間で、細胞を収集し、１００μｌの細胞−溶解緩衝液（ＰＢＳ／１％トリトン−Ｘ１００）の添加によって溶解した。ルシフェラーゼ活性の測定は、生物発光装置、Ｐｒｏｍｅｇａ（プロメガ社）（カタログ番号Ｅ−１５０１）からのルシフェラーゼアッセイキット及び製造元から提供される使用説明書を用いて行った。線維キメラウイルスのパネルで形質移入後に間充織幹細胞において測定されたルシフェラーゼ導入遺伝子発現の結果を、図１に示す。結果は、いくつかの線維キメラウイルスが親ベクタ（Ａｄ５）と比較して線維芽細胞に対して良好に作用することを示している。これらのウイルスは、亜群Ｂウイルス、すなわち１６、３５、及び５１からの線維を運ぶ。また、１種の亜群Ｄウイルス（Ａｄ５．Ｆｉｂ３２）は、より良く間充織幹細胞を形質導入するための用意があるようである。Ａｄ５．Ｆｉｂ４０−Ｓ及びＡｄ５．Ｆｉｂ４０−Ｌ（亜群Ｆ）の双方は、Ａｄ５と比べて類似か、又は若干良好に機能する。次の実験では、本発明者等は他のマーカ遺伝子を運んで間充織幹細胞を感染させるＡｄ５Ｆｉｂ１６の能力を試験した。これに関して、細胞を２時間にわたり、マーカとしての緑色蛍光タンパク質を所有するＡ５又はＡｄ５Ｆｉｂ１６の増大するベクタ用量に曝した（図２ａ）。４８時間後、細胞を収集し、細胞を、フォローサイトメータを用いて、ＧＦＰ発現について調べた。得られた結果は、マーカ遺伝子に対して陽性の細胞の比率に基づいて、間充織幹細胞の遺伝的修飾に関して、Ａｄ５．Ｆｉｂ１６がＡｄ５に比べ、はるかに強力であることを示した。また、間充織幹細胞は生分解性の高分子骨格中に播種され、及びマーカ遺伝子としてのＬａｃＺを所有するＡｄ５．Ｆｉｂ１６に曝される。再び４８時間後に、ＬａｃＺ発現について細胞を染色した（図２ｂ）。明らかに、細胞は、Ａｄ５．Ｆｉｂ１６による形質導入後に青く染まり、再び効率を示し、それによって、Ａｄ５．Ｆｉｂ１６が間充織幹細胞に感染する。最後に、時間の経過に伴うマーカ遺伝子の発現を試験し、発現の継続について調べた。これに関して、ＬａｃＺを所有するＡｄ５．Ｆｉｂ１６の細胞当たり１０００まで又は５００のウイルス粒子にＨＢＳＣ’ｓを１時間にわたって曝し��。ＬａｃＺに関して陽性と記録された細胞の数は、１時間ウイルスに曝露後、２４、４８、７２，１２０、１４４、及び１６８時間で監視した。１細胞当たりのウイルス用量が５０００で、すべての細胞が感染した。なぜなら、ウイルス曝露後４８時間の時点で１００％の細胞がＬａｃＺについて陽性に染色されたからである（図３ａ）。概して、感染後に最適な発現を得るのに必要な時間は、４８時間である。試験した時点のすべてにおいて、すなわち、感染後１６８時間まで、ＬａｃＺ陽性細胞の数が１００％のままであったことから、各細胞の核にＡｄ５Ｆｉｂ１６ゲノムが少なくとも４コピー含まれると結論することができる。なぜなら、４回の細胞倍加ではウイルスが希釈されなかったからである。後者の実験では、本発明者等は、１０００又は５０００Ｖｐ／細胞のいずれかにより感染した形質導入細胞の生存度も監視した。対照として、非形質導入細胞を分析した。Ａｄ５Ｆｉｂ１６による形質導入後の生存細胞の割合に基づいて、１細胞当たり５０００ウイルス粒子の用量であっても細胞の生存力を著しく変えることはないと結論することができる。同時に、これらの結果は、同定された改良型ベクタが細胞生存力を損なうことなくヒト骨髄間質細胞又は間充織幹細胞に対して非常に高い感染力があることを示す。したがって、これらの結果は、生物人工的な改変骨(bio-artificial engineered bone)の量及び質の最適化を目的とした研究を開始するための道を開く。
【００６４】
【表１】
2004533268.tif 000002
【００６５】
【表２】
2004533268.tif 000003
【００６６】
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【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】線維キメラウイルスのスクリーニングを示す図である。
【図２】（Ａ）はＧＦＰの発現に関するスクリーニングを示す図であり、（Ｂ）はＬａｃＺ発現に関し染色した図である。
【図３】（Ａ）はＬａｃＺ発現の持続時間を示す図であり、（Ｂ）は細胞集団の生存度を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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