(57)【要約】本発明は、調節遺伝子に関連する遺伝子の化学的に修飾されたゲノム配列と、この配列に向けられた遺伝子調節に関連する遺伝子のシトシンメチル化状態を検出するオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマーと、遺伝子調節に関連する遺伝子の遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータを確認する方法とに関する。さらに、本発明は、シトシンメチル化パターンが遺伝子調節に関連する疾患の診断及び／又は治療に特に適していることを見出したことによるものである。【選択図】図１
2004508807.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号２２４のグループから選択した配列の一つ及びこれの相補配列に従った、遺伝子調節に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡのセグメントの少なくとも１８塩基の長さである配列を含む核酸。
【請求項２】
遺伝子ＣＢＦＢ（Ｌ２０２９８）、ＥＬＦ１（Ｍ８２８８２）、ＥＴＶ３（Ｌ１６４６４）、ＥＴＶ４（Ｄ１２７６５）、ＬＹＬ１（Ｍ２２６３７）、ＲＥＮＢＰ（Ｕ５２１１２）、ＴＡＦ２Ｃ２（Ｙ０９３２１）、ＴＣＦ３（Ｍ３１２２２）、Ｈ４ＦＩ（ＮＭ＿００３５４４）、ＡＤＡ（ＮＭ＿００００２２）、ＡＴＦ３（ＮＭ＿００１６７４）、ＣＥＢＰＤ（ＮＭ＿００５１９５）、ＣＨＤ１Ｌ（ＮＭ＿００４２８４）、ＣＴＰＳ（ＮＭ＿００１９０５）、ＤＣＴＤ（ＮＭ＿００１９２１）、ＥＩＦ２Ｂ１（ＮＭ＿００１４１４）、ＥＬＦ３（ＮＭ＿００４４３３）、ＥＬＫ４（ＮＭ＿０２１７９５）、ＥＴＶ５（ＮＭ＿００４４５４）、ＦＯＸＯ１Ａ（ＮＭ＿００２０１５）、ＨＩＶＥＰ１（ＮＭ＿００２１１４）、ＨＭＧ２（ＮＭ＿００２１２９）、ＩＤ１（ＮＭ＿００２１６５）、ＩＤ３（ＮＭ＿００２１６７）、ＩＤ４（ＮＭ＿００１５４６）、ＬＡＦ４（ＮＭ＿００２２８５９）、ＭＡＦＧ（ＮＭ＿００２３５９）、ＭＨＣ２ＴＡ（ＮＭ＿０００２４６）、ＯＤＣ１（ＮＭ＿００２５３９）、ＰＢＸ３（ＮＭ＿００６１９５）、ＰＣＮＡ（ＮＭ＿００２５９２）、ＰＯＵ２ＡＦ１（ＮＭ＿００６２３５）、ＰＲＰＳ１（ＮＭ＿００２７６４）、ＲＡＲＧ（ＮＭ＿０００９６６）、ＲＥＣＱＬ（ＮＭ＿００２９０７）、ＲＸＲＡ（ＮＭ＿００２９５７）、ＴＩＡＬ１（ＮＭ＿００３２５２）、ＺＮＦ１７３（ＮＭ＿００３４４９）、ＡＴＢＦ１（ＮＭ＿００６８８５）、ＦＬＩ１（ＮＭ＿００２０１７）、ＮＵＭＡ１（ＮＭ＿００６１８５）、ＰＯＵ２Ｆ２（ＮＭ＿００２６９８）、ＳＰ１００（ＮＭ＿００３１１３）のいずれか一つの遺伝子に従った配列の一つ及びこれの相補配列に従った、調節遺伝子に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡのセグメントの少なくとも１８塩基対の長さである配列を含む核酸。
【請求項３】
オリゴマー、特にオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマーであって、請求項１に記載の配列ＩＤ番号１乃至２２４の一つによる遺伝子制御に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡ、又は請求項２に記載の遺伝子の化学的前処理されＤＮＡ、及びこれの相補配列とハイブリッド形成する又は同一である、少なくとも九個のヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列をいずれの場合でも含むオリゴマー。
【請求項４】
塩基配列が少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチドを含む、請求項３記載のオリゴマー。
【請求項５】
ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが、オリゴマーの三分の一のほぼ中央に位置することを特徴とする、請求項３記載のオリゴマー。
【請求項６】
請求項３乃至５のいずれか一項に記載の少なくとも二つのオリゴマーを含む、オリゴマーのセット（ｓｅｔ）。
【請求項７】
請求項１に記載された配列ＩＤ番号１乃至２２４に従った配列の一つと、又は請求項２に記載の遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡ、及びこれらの相補配列内のすべてのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を検出するオリゴマーを含む、請求項６記載のオリゴマーのセット（ｓｅｔ）。
【請求項８】
配列ＩＤ１乃至配列ＩＤ２２４の一つのＤＮＡ配列及びこれの相補配列、請求項２に記載の遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡの配列及びこれの相補配列、又はそのセグメントの増殖のためのプライマーオリゴヌクレオチドとして使用することが可能な、請求項３記載の少なくとも二つのオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）。
【請求項９】
少なくとも一つのオリゴヌクレオチドが固相に固定されていることを特徴とする、請求項８記載のオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）。
【請求項１０】
請求項１記載の化学的前処理されたゲノムＤＮＡ又は請求項２に記載の遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡにおけるシトシンメチル化状態及び／又は単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出する請求項６乃至９のいずれか一項記載の少なくとも十個のオリゴマーを含む、オリゴマープローブのセット（ｓｅｔ）の使用。
【請求項１１】
配列ＩＤ１乃至配列ＩＤ２２４の一つ及びこれの相補配列及び／又は請求項２記載の遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態に関連する疾患を分析する、キャリヤー材料に固定された様々なオリゴマーの配置（アレイ）を製造する方法であって、請求項３乃至５のいずれか一項に記載の少なくとも一つのオリゴマーが固相に結合されている方法。
【請求項１２】
請求項１１により得ることが可能な、様々なオリゴマーの配置（アレイ）。
【請求項１３】
長方格子又は六方格子の形態で平坦な固相上に配置されることを特徴とする、請求項１２記載の様々なオリゴヌクレオチド−及び／又はＰＮＡ−オリゴマーのアレイ。
【請求項１４】
固相表面が、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成されることを特徴とする、請求項１２又は１３記載のアレイ。
【請求項１５】
前記請求項のいずれか一項に記載の少なくとも一つの核酸を含む、遺伝子のメチル化状態に関連する疾患を分析するＤＮＡ−及び／又はＰＮＡ−アレイ。
【請求項１６】
シトシンメチル化を分析することで、既存の疾患或いは特定の疾患の素因に関する診断及び／又は治療のための遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメーターを確認する方法であって、
ａ）ゲノムＤＮＡ試料において、５位置においてメチル化されていないシトシン塩基を、化学処理によって、ウラシル又はハイブリッド形成行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換するステップと、
ｂ）化学的前処理されたゲノムＤＮＡの断片が、請求項８又は９記載のプライマーオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）及びポリメラーゼを使用して増幅され、増幅物が検出可能な標識を運ぶステップと、
ｃ）増幅物が、請求項６又は７記載のオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡプローブのセット（ｓｅｔ）、或いは請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載のアレイとハイブリッド形成するステップと、
ｄ）ハイブリッド形成された増幅物が、その後、検出されるステップと、
が実行されることを特徴とする方法。
【請求項１７】
化学的処理が、重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、又は二亜流酸塩の水溶液を用いて実行されることを特徴とする、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
１００乃至２０００塩基対の長さを有する１０より多くのの異なる断片が増幅されることを特徴とする、請求項１６又は１７の一方に記載の方法。
【請求項１９】
いくつかのＤＮＡセグメントの増幅が、一つの反応槽において実行されることを特徴とする、請求項１６乃至１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ポリメラーゼが、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする、請求項１６乃至１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を用いて実行されることを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
増幅の標識が、蛍光標識であることを特徴とする、請求項１６乃至２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
増幅の標識が、放射性核種であることを特徴とする、請求項１６乃至２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
増幅の標識が、質量分析計において検出される通常の質量を有する分離可能な分子断片であることを特徴とする、請求項１６乃至２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
増幅物又は増幅物の断片が、質量分析計において検出されることを特徴とする、請求項１６乃至２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
生成された断片が、質量分析計での検出可能性を高めるために、単一の正又は負の実効電荷を有することを特徴とする、請求項２４又は２５の一方に記載の方法。
【請求項２７】
検出が、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）を用いて、或いは電子スプレ質量分析法（ＥＳＩ）を使用して、実行及び視覚化されることを特徴とする、請求項２４乃至２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ゲノムＤＮＡが、ＤＮＡを含む細胞又は細胞構成要素から得られ、ＤＮＡのソースが例えば、細胞系と、バイオプシーと、血液と、唾液と、大便と、尿と、脳脊髄液と、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房、又は肝臓からの組織等のパラフィンに埋め込まれた組織と、ヒストロジックオブジェクトスライド（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ　ｏｂｊｅｃｔ　ｓｌｉｄｅｓ）と、又はこれらにおいて可能なあらゆる組み合わせとを含むことを特徴とする、請求項１６乃至２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）（＝二亜流酸塩、亜硫酸水素塩）試薬と、請求項３乃至５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマーを含むキット。
【請求項３０】
重症複合型免疫不全症と、心臓障害と、炎症反応と、血友病と、ウェルナ症候群と、喘息と、ＨＤＲ症候群と、Ｓａｅｔｈｒｅ−Ｃｈｏｔｚｅｎ症候群と、腎臓病と、子癇前症と、移植片対宿主疾患と、充実性腫瘍と、癌との診断のための、請求項１又は２に記載の核酸と、請求項３乃至５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はＰＮＡ−オリゴマーと、請求項２９に記載のキットと、請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載のアレイと、請求項６乃至９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）との使用。
【請求項３１】
重症複合型免疫不全症と、心臓障害と、炎症反応と、血友病と、ウェルナ症候群と、喘息と、ＨＤＲ症候群と、Ｓａｅｔｈｒｅ−Ｃｈｏｔｚｅｎ症候群と、腎臓病と、子癇前症と、移植片対宿主疾患と、充実性腫瘍と、癌との治療のための、請求項１又は２に記載の核酸と、請求項３乃至５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又はＰＮＡ−オリゴマーと、請求項２９に記載のキットと、請求項１２乃至１５のいずれか一項に記載のアレイと、請求項６乃至９のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）との使用。
【請求項３２】
重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）（＝二亜流酸塩、亜硫酸水素塩）試薬と、請求項３乃至５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマーを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の属する技術分野】
【０００１】
分子生物学における近年の方法論の発展を受けて、遺伝子自体と、こうした遺伝子のＲＮＡへの転換と、結果として生じるタンパク質との観察（治療）レベルにおいて広く研究が行われてきた。個体の成長過程のどの時点においてどの遺伝子のスイッチが入るかという問題、及び特定の細胞及び組織内の特定の遺伝子の活性化及び抑制がどのように制御されるかという問題は、遺伝子又はゲノムのメチル化の程度及び特徴と相関させることができる。この点において、発病条件は、個別の遺伝子又はゲノムの変化したメチル化パターンに現れる可能性がある。
本発明は、核酸と、オリゴヌクレオチドと、ＰＮＡオリゴマーとに関し、遺伝子調節及び特にそのメチル化状態に関連する遺伝子の遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータとのつながりを有する疾患の診断及び／又は治療のための方法に関する。
【従来の技術】
【０００２】
ヒトゲノムの配列決定の完了により、遺伝子の調節及び制御を更に理解する必要性が強調されている。細胞は多数のレベルで遺伝子を制御するが、しかしながら、大多数の遺伝子に関して、最も重要な調節メカニズムは、転写調節である。
【０００３】
様々なタンパク質群、遺伝子、及び調節配列に関与する多数の遺伝子調節メカニズムが存在している。ポリメラーゼによる真核遺伝子の転写では、遺伝子のプロモータ領域で転写因子が事前に構築する必要がある。こうした因子は、特定の順序で結合し、これはＴＦＩＩＤのＴＡＴＡボックスへの結合により開始される。これは、遺伝子調節が行われる可能性のあるいくつか段階を提供し、多くの真核遺伝子調節メカニズムは、こうしたプロセスに対して正又は負の制御を行うことで機能すると考えられている。
【０００４】
遺伝子調節タンパク質は、二本鎖ＤＮＡの短い部分（ｓｈｏｒｔ ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ）を認識する。こうした配列は、ゲノム全体で何百種類も確認されており、例えば、配列ＧＧＧＣＧＧ（二本鎖形状内）を認識するＳｐ１と、配列ＴＧＡＴＡＧ（二本鎖形状内）を認識するＧＡＴＡ−１と、ＡＴＧＣＡＡＡＴ（二本鎖形状内）を認識するＯｃｔ−１とがある。遺伝子調節タンパク質は、ＤＮＡの主溝及び副溝中において、水素結合供与体と、水素結合受容体と、及び疎水性パッチ（ｐａｔｃｈｅｓ）の独自のパターンを利用して、調節配列を認識することが可能な構造モチーフを含む。数種の構造モチーフ群が知られており、これには、アミノ酸を含むヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフと、構造要素として一つ以上の亜鉛分子を利用するジンクフィンガーモチーフと、ロイシンジッパーと、ヘリックス・ループ・ヘリックスモチーフとが含まれる。
【０００５】
他の遺伝子調節メカニズムには、クロマチンパッケージングが含まれる。高凝縮したクロマチンは、転写することが不可能であり、凝縮の少ない形態においても、ＤＮＡは依然としてヌクレオソーム中にパッケージされている。転写部位の開始地点に位置するヌクレオソームは、転写因子の構築を阻害する、そのため、これらは除去されなければいけない。加えて、遺伝子転写には、スーパーコイルＤＮＡの広範な巻き取り及び巻き戻しが必要である。ＤＮＡパッケージングの正確なメカニズムは完全に理解されていないが、これには、さまざまなＤＮＡヘリカーゼ、ジャイレース、及びトポイソメラーゼの使用が含まれる。更に、遺伝子調節の更に詳しい解説は、例えば、アルバートらの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ」Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇといった標準的な分子生物学の教科書で見つけることができる。
【０００６】
遺伝子調節経路の崩壊は、広範な疾患に関係しているとされ、例えば、こうした疾患の一部には、以下が含まれる。しかし、限定はされない。
【０００７】
重症複合型免疫不全症。Ｍｉｓａｋｉ ｅｔ．ａｌ． ’Ｇｅｎｅ−Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ Ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ
Ｐｅｒｓｉｓｔ ｉｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ ｆｒｏｍ ａｎ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｐａｔｉｅｎｔ
ｄｕｒｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．’ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００１ Ｊａｎ；３（１）：２４−２７．
心臓損傷。Ｐｉｅｐｅｒ ｅｒ ａｌ． ’Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｐｏｓｔｉｓｃｈｅｍｉｃ ｉｎｊｕｒｙ ｉｓ ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｙ ｐｏｌｙＡＤＰｒｉｐｏｓｅ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−１ ｇｅｎｅ ｄｕｓｒｕｐｔｉｏｎ．’ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０００ Ａｐｒ，６（４）：２７１−８２．
炎症反応。Ｌｅｋｓｔｒｏｍ−Ｈｉｍｅｓ Ｊ， Ｘａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓ ＫＧ． ’ＣＣＡＡＴ／ｅｎｈａｎｃｅｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｅｐｓｉｌｏｎ ｉｓ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｆｏｒ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
ｃｈａｌｌｅｎｇｅ’ Ｂｌｏｏｄ １９９９ Ｍａｙ １；９３（９）：３０９６−１０５．
血友病Ｂ。Ｃｒｏｓｓｌｅｙ Ｍ， Ｂｒｏｗｎｌｅｅ ＧＧ． ’Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃ／ＥＢＰ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ ｉｎ ｔｈｅ
ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ’ Ｎａｔｕｒｅ １９９０ Ｍａｙ
３１；３４５（６２７４）：４４４−６．
ウェルナ症候群。Ｌｉ Ｂ， Ｃｏｍａｉ Ｌ． ’Ｒｅｑｕｉｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｙｔｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｅｎｄｓ
ｂｙ ｔｈｅ Ｗｅｒｎｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｋｕ７０／８０ ｃｏｍｐｌｅｘ．’ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２００１ Ｊａｎ ４．　喘息。Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ． ａｌ． ’Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＧＡＴＡ−３ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ
ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ａｔｏｐｉｃ ａｓｔｈｍａ．’ Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９９ Ｆｅｂ；１０３（２ Ｐｔ
１）：２１５−２２．
ＨＤＲ症候群。Ｖａｎ Ｅｓｃｈ ｅｔ． ａｌ． ’ＧＡＴＡ３ ｈａｐｌｏ−ｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃａｕｓｅ ｈｕｍａｎ ＨＤＲ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．’
Ｎａｔｕｒｅ ２０００ Ｊｕｌ ２７； ４０６（６７９４）：４１９−２２．
先天的心臓欠陥。Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ Ｄ． ’ＨＡＮＤ ｐｒｏｔｅｉｎｓ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ｃａｒｄｉａｃ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ ｈｅａｒｔ ｄｉｓｅａｓｅ．’ Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｍｅｄ １９９９
Ｊａｎ−Ｆｅｂ；９（１−２）：１１−８．
Ｓａｅｔｈｒｅ−Ｃｈｏｔｚｅｎ症候群。Ｅｌ Ｇｈｏｕｚｚｉ ｅｔ． ａｌ． ’Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈｉｎ ｏｒ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｏｆ ｔｈｅ
ｂａｓｉｃ ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ＴＷＩＳＴ ｇｅｎｅ ａｒｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ Ｓａｅｔｈｒｅ−Ｃｈｏｔｚｅｎ
ｓｙｎｄｒｏｍｅ．’ Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９９ Ｊａｎ；７（１）：２７−３３．
腎臓病。Ｍｏｒｅｌｌｏ ｅｔ． ａｌ． ’Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ ｂａｓｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｌｌａｇｅｎ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ＬＭＸＩＢ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ ｔｏ ｒｅｎａｌ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｎａｉｌ ｐａｔｅｌｌａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．’ Ｎａｔ
Ｇｅｎｅｔ ２００１ Ｆｅｂ；２７（２）：２０５−２０８．
子癇前症。Ｒａｊａｋｕｍａｒ ｅｔ． ａｌ． ’Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｙｐｏｘｉａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ， ＨＩＦ−２ａｌｐｈａ， ｉｎ Ｐｌａｃｅｎｔａｓ ｆｒｏｍ Ｗｏｍａｎ ｗｉｔｈ ｐｒｅｅｃｌａｍｐｓｉａ．’
Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ． ２００１ Ｆｅｂ；６４（２）：４９９−５０６．
Ｏｇａｔａ ｅｔ． ａｌ． ’Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ
ｐｒｏｔｅｉｎ ２（ＢＴＥＢ２）， ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ， ｉｎ
ｃａｒｄｉａｃ ａｌｌｏｇｒａｆｔ ｖａｓｃｕｌａｒ ｄｉｓｅａｓｅ．’ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ． ２０００ Ｄｅｃ
１５；７０（１１）：１６５３−６．
結腸直腸癌。Ｒａｓｋ ｅｔ． ａｌ． ’Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ ＣＣＡＡＴ−ｅｎｈａｎｃｅｒ
ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂｅｔａ （Ｃ／ＥＢＢｅｔａ） ａｎｄ Ｃ／ＥＢｚｅｔａ （ＣＨＯＰ） ｃｏｒｒｅｌａｔｅ ｗｉｔｈ ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ
ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ．’ Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ． ２０００ Ｍａｙ １；８６（３）：３３７−４３．
甲状腺癌。Ｋｅｂｅｂｅｗ ｅｔ． ａｌ． ’Ｔｈｅ ｈｅｌｉｘ−ｌｏｏｐ−ｈｅｌｉｘ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ， Ｉｄ−１， ｉｓ
ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｔｈｙｒｏｉｄ ｃａｎｃｅｒ．’ Ｓｕｒｇｅｒｙ． ２０００ Ｄｅｃ；１２８（６）：９５２−７．
食道癌。Ｓａｅｋｉ ｅｔ． ａｌ． ’Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｔｓ−１ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｉｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ
ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ
ｅｓｏｐｈａｇｕｓ’ Ｃａｎｃｅｒ． ２０００ Ｏｃｔ １５；８９（８）：１６７０−６．
【０００８】
遺伝子の調節に関与するメカニズムの多様性は、別のレベルでの疾患の治療法及び診断の対象を提供する。特に、これは、現在の治療法によって好ましくない副作用がともなう、又は効果的な治療が提供できない疾患に適用させることができる。癌患者にとって、こうした方法は、強い副作用をともなう化学療法、すなわち、時には受け入れがたい病態、又は患者の死につながる結果を導くといった従来の方法に比べ、大きな利点となる。実際に、こうした癌治療に伴う好ましくない副作用が、癌患者を救う治療の制限になることが多々ある。
【０００９】
遺伝子調節メカニズムの状態の大域的分析は、遺伝子調節に関連する多くの疾患に適しそして特定の治療法を開発する基盤となる。こうした分析は、例えば、ｍＲＮＡ発現のＤＮＡマイクロアレイ分析又はプロテオーム分析等の遺伝子発現の結果に基づいて、遺伝子特有の方法で実行することができる。次のステップは、調節メカニズムの早期段階に関与する原因の要素（ｃａｕｓａｌ
ｆａｃｔｏｒｓ）に注目することである。ＤＮＡメチル化は、ゲノムを分析する上での新しいレベルの情報を提供する。
【００１０】
５−メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡにおいて最も多い共有塩基修飾である。これは、例えば、転写の調整と、遺伝子の刷り込みと、腫瘍形成とにおいて役割を果たす。そのため、遺伝情報の構成要素として５−メチルシトシンを特定することは、大きな関心に値する。しかしながら、５−メチルシトシンはシトシンと同じ塩基対合行動を有するため、５−メチルシトシンの位置は、配列決定では特定不可能である。更に、５−メチルシトシンが運ぶはエピジェネティク情報は、ＰＣＲ増幅中に完全に失われる。
【００１１】
５−メチルシトシンに関してＤＮＡを分析するために、比較的新しく、現在最も頻繁に使用される方法は、重亜硫酸塩のシトシンとの特定の反応に基づいており、結果として生じるアルカリ加水分解により、シトシンは塩基対合行動においてチミジンに対応するウラシルに転換される。しかしながら、５−メチルシトシンは、こうした条件下では修飾されないまま残る。
【００１２】
その結果、元のＤＮＡは、ハイブリッド形成行動によって当初識別できなかったメチルシトシンを、例えば増幅及びハイブリッド形成又は配列決定等、「通常」の分子生物学的手法を使用して唯一残存するシトシンとして検出できる。こうしたすべての手法は、十分に利用することが可能となっている塩基対合に基づいている。感度の点において、従来技術は、分析されるＤＮＡをアガロースマトリックスで囲み、ＤＮＡの拡散及び復元を防ぎ（重亜硫酸塩は一本鎖ＤＮＡとのみ反応する）、すべての沈殿及び浄化ステップを高速透析に置き換える方法によって定められる（Ｏｌｅｋ　Ａ，　Ｏｓｗａｒｄ　Ｊ，Ｗａｌｔｅｒ　Ｊ．　Ａ
ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｂｉｓｕｌｐｈａｔｅ ｂａｓｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９９６ Ｄｅｃ １５； ２４（２４）： ５０６４−６）。この方法を使用することで、個々の細胞を分析することが可能となり、これらの方法のすなわち意義を示すものである。しかしながら、現在、約３０００塩基対までの長さの個別領域のみが分析されており、数千のメチル化事象の可能性に関する細胞の広範囲分析は不可能である。また、しかしながら、この方法は、小さな量の試料からの非常に小さな断片を高い信頼性で分析することはできない。これらは、拡散防止措置にもかかわらず、マトリックスを通じて失われてしまう。
【００１３】
５−メチルシトシンを検出する更なる既知の方法の概要は、次の総論から得ることができる。Ｔ．，　ＤｅＰａｍｐｈｉｌｉｓ，　Ｍ．Ｌ．，　Ｚｏｒｂａｓ，　Ｈ．，　Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９８， ２６， ２２５５。
【００１４】
現在まで、僅かな例外を除き（例えば、Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ　Ｍ，　Ｌｉｃｈ　Ｃ，　Ｂｕｉｔｉｎｇ　Ｋ，　Ｄｏｅｒｆｌｅｒ　Ｗ，　Ｈｏｒｓｔｈｅｍｋｅ　Ｂ．　Ａ
ｓｉｎｇｌｅ−ｔｕｂｅ ＰＣＲ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ　ｉｓ ｏｆ Ａｎｇｅｌｍａｎ ａｎｄ Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ
ｂａｓｅｄ ｏｎ ａｌｌｅｌｉｃ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｔ ｔｈｅ ＳＮＲＰＮ ｌｏｃｕｓ． Ｅｕｒ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．
１９９７ Ｍａｒ−Ａｐｒ； ５（２）：９４−８）、重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）手法は調査のみに使用されている。しかしながら、常に、既知である短い特定の断片は、重亜硫酸塩処理の後で増幅され、完全に配列決定されるか（Ｏｌｅｋ　Ａ，　Ｗａｌｔｅｒ　Ｊ．　Ｔｈｅ
ｐｒｅ−ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｏｎｔｏｇｅｎｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｈ１９ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｍｐｒｉｎｔ． Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ． １９９７ Ｎｏｖ；
１７（３）：２７５−６）、或いは、プライマ延長反応によって（Ｇｏｎｚａｌｇｏ　ＭＬ，　Ｊｏｎｅｓ　ＰＡ．　Ｒａｐｉｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ
ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｓｉｎｇｌｅ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ （Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ）． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９７ Ｊｕｎ １５； ２５（１２）：
２５２９−３１， ＷＯ出願９５／００６６９）又は酵素的な消化によって（Ｘｉｏｎｇ　Ｚ，　Ｌａｉｒｄ　ＰＷ．　ＣＯＢＲＡ： ａ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｒｅｓ． １９９７ Ｊｕｎ １５； ２５（１２）：
２５３２−４）、個々のシトシン位置が検出される。加えて、ハイブリッド形成による検出も述べられている（Ｏｌｅｋら、ＷＯ９９／２８４９８）。
【００１５】
個々の遺伝子でのメチル化検出に関する重亜硫酸塩手法の使用を扱っているその他の出版物は、次の通りである。Ｇｒｉｇｇ　Ｇ，　Ｃｌａｒｋ　Ｓ．　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ． Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ． １９９４ Ｊｕｎ； １６（６）： ４３１−６，
４３１。Ｚｅｓｃｈｎｉｇｋ　Ｍ，　Ｓｃｈｍｉｔｚ　Ｂ，　Ｄｉｔｔｒｉｃｈ　Ｂ，　Ｂｕｉｔｉｎｇ　Ｋ，　Ｈｏｒｓｔｈｅｍｋｅ　Ｂ，Ｄｏｅｒｆｌｅｒ　Ｗ．　Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ
ｓｅｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ： ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｔｈｅＰｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ／Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｒｅｇｉｏｎ ａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ｍｅｔｈｏｄ． Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ． １９９７ Ｍａｒ； ６（３）： ３８７−９５。Ｆｅｉｌ　Ｒ，　Ｃｈａｒｌｔｏｎ　Ｊ，　Ｂｉｒｄ　ＡＰ，　Ｗａｌｔｅｒ　Ｊ，　Ｒｅｉｋ　Ｗ．　Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ： ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｂｉｓｕｌｐｈａｔｅ ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９４ Ｆｅｂ ２５； ２２（４）： ６９５−６。Ｍａｒｔｉｎ　Ｖ，　Ｒｉｂｉｅｒａｓ　Ｓ，　Ｓｏｎｇ−Ｗａｎｇ　Ｘ，　Ｒｉｏ　ＭＣ，　Ｄａｎｔｅ　Ｒ．　Ｇｅｎｏｍｉｃ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎｄｉｃａｔｅｓ ａ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＤＮＡ ｈｙｐｏｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ５’ ｒｅｇｉｏｎ
ｏｆ ｔｈｅ ｐＳ２ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｇｅｎｅ．
１９９５ Ｍａｙ １９； １５７（１−２）： ２６１−４。ＷＯ　９７　４６７０５、ＷＯ　９５１５３７３、及びＷＯ　９７　４５５６０。
【００１６】
オリゴマーアレイ製造における従来技術の概要は、１９９９年１月に刊行されたＮａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓの特別版（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ， Ｖｏｌｕｍｅ ２１， Ｊａｎｕａｒｙ １９９９）と、そこに引用された文献とから得ることができる。
【００１７】
蛍光標識プローブは、固定化ＤＮＡアレイのスキャニングに使用される場合が多い。特定のプローブの５’−ＯＨに対するＣｙ３及びＣｙ５色素の添加は、蛍光標識に特に適している。ハイブリッド形成されたプローブの蛍光の検出は、例えば、共焦点顕微鏡を介して実行することができる。Ｃｙ３及びＣｙ５色素は、他の多くの色素同様、市販されている。
【００１８】
マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、生体分子の分析に関する非常に効率的な成果である（Ｋａｒａｓ　Ｍ，　Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ　Ｆ．　Ｌａｓｅｒ
ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｓｓｅｓ ｅｘｃｅｅｄｉｎｇ １０，０００ｄａｌｔｏｎｓ． Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ． １９８８ Ｏｃｔ １５； ６０（２０）： ２２９９−３０１）。検体は、ライト（ｌｉｇｈｔ）マトリックスに埋め込まれる。このマトリックスは、短レーザパルスによって蒸発するため、検体分子を断片化せずに気相へと移行させる。検体は、マトリックス分子との衝突によってイオン化する。給与電圧により、このイオンは、フィールドフリー飛行管へ加速される。質量の違いにより、このイオンは、異なる速度で加速される。小さなイオンは、大きなイオンよりも早く検出器に到達する。
【００１９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析法は、ペプチド及びタンパク質の分析に非常に適している。核酸の分析は、多少困難である（Ｇｕｔ　Ｉ　Ｇ，　Ｂｅｃｋ　Ｓ．　ＤＮＡ ａｎｄ
Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｔｒｅｎｄｓ． １９９５， １： １４７−５７）。核酸に対する感度は、ペプチドに対する感度よりも約１００倍劣っており、断片のサイズの増加とは反比例して感度は減少する。多重負電荷バックボーンを有する核酸では、マトリックスを介したイオン化プロセスの効率は、大幅に低下する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析法において、マトリックスの選択は、非常に重要な役割を果たす。ペプチドの脱離に関しては、非常に微細な結晶体を生成する極めて効率的なマトリックスがいくつか発見されている。現在では、ＤＮＡに関する反応性マトリックスがいくつか存在するが、しかしながら、感度の格差は低減されていない。感度の格差は、ＤＮＡがペプチドに類似するような形でＤＮＡを化学的に修飾することで低減させることができる。バックボーンの通常のリン酸塩がチオリン酸塩に置換したホスホロチオエート核酸は、単純なアルキル化化学反応を使用して電荷中立ＤＮＡに転換することができる（Ｇｕｔ　Ｉ　Ｇ，　Ｂｅｃｋ　Ｓ．　Ａ
ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＤＮＡ ａｌｋｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９９５ Ａｐｒ ２５； ２３（８）： １３６７−７３）。この修飾済みＤＮＡに電荷タグを結合させることで、ペプチドに関してみられるものと同じレベルまで感度が増加する。電荷タグ付加の更なる利点は、未修飾の基質の検出を非常に困難にする不純物に対する分析の安定性を増加させることである。
【００２０】
ゲノムＤＮＡは、標準的な方法を使用して、細胞、組織、又はその他の試験試料のＤＮＡから取得される。この標準的な方法は、Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＭａｎｉａｔｉｓ編のＭｏｌｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，１９８９といった参考文献に記載されている。
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の目的は、遺伝子調節に関連する遺伝子の化学的に修飾されたＤＮＡと、シトシンメチル化を検出するためのオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡオリゴマーと、遺伝子調節に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの診断及び／又は治療に特に適した方法とを提供することである。本発明は、遺伝子調節に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータを見出したことに基づいている、特にそのシトシンメチル化パターンが遺伝子調節に関連する疾患の診断及び／又は治療に特に適している点である
【００２２】
本発明による目的は、ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号２２４のうち一つ及びこれと相補配列に従った遺伝子調節に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡ及び／又は表１記載の遺伝子に従った化学的前処理されたＤＮＡの配列及びその相補配列の少なくとも１８塩基の長さの配列を含む核酸を使用することで、達成される。この表において、列挙された遺伝子の記号表示の後には、付随する遺伝子配列を固有のものとして定めるそれぞれのデータバンク番号（アクセッション番号）が指定されている。基盤となるデータバンクとして、国立保健研究所のＧｅｎＢａｎｋを使用しており、インターネットアドレスはｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖである。
【００２３】
化学的に修飾された核酸は、これまで、遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの確認とは関連付けられていない。
【００２４】
本発明の目的は、配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号２２４及びこれの相補配列に従った遺伝子調節に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡ及び／又は表１記載の遺伝子に従ったの化学的前処理されたＤＮＡの配列とその相補配列とハイブリッド形成する少なくとも１３ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含む、化学的前処理されたＤＮＡにおけるシトシンメチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチド又はオリゴマーによって、更に達成される。本発明によるオリゴマープローブは、遺伝子調節に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータを確認することを初めて可能にする重要かつ効果的なツールを構成する。オリゴマーの塩基配列は、好ましくは、少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。このプローブは、特に好適な対合特性を有するＰＮＡ（ペプチド核酸）の形態で存在することもできる。本発明によるオリゴヌクレオチドで特に好適なものは、１３−ｍｅｒの５’末端からの五番目乃至九番目のＣｐＧジヌクレオチドであり、ＰＮＡ−オリゴマーの場合は、ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンが９−ｍｅｒの５’末端からの四番目及び六番目のヌクレオチドとなるのが好適である。
【００２５】
本発明によるオリゴマーは、配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号２２４の配列及びこれの相補配列及び／又は表１記載の遺伝子に従った化学的前処理したＤＮＡの配列及び相補配列のＣｐＧジヌクレオチドのそれぞれに関して少なくとも一つのオリゴマーを含むいわゆるセット（ｓｅｔ）において通常使用される。好適なものは、配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号２２４のうち一つ及びこれの相補配列及び／又は表１記載の遺伝子の化学的前処理したＤＮＡの配列及びこれらの相補配列からのＣｐＧジヌクレオチドのそれぞれに関して少なくとも一つのオリゴマーを含むセット（ｓｅｔ）である。
【００２６】
更に、本発明は、配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号２２４の及びこれの相補配列、表１の遺伝子の化学的前処理したＤＮＡの配列及びこれらの相補配列、又はそのセグメントの配列を増幅するいわゆる「プライマーオリゴヌクレオチド」として使用可能な少なくとも二つのオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）を利用可能にする。
【００２７】
本発明によるオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）の場合、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドが固相に固定されることが好適である。
【００２８】
本発明は、化学的前処理されたゲノムＤＮＡ（配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号２２４及びこれの相補配列及び／又は表１の遺伝子に従った化学的前処理されたＤＮＡ及びこれらの相補配列）におけるシトシンメチル化状態を検出するために使用される少なくとも１０ｎのセット（ｓｅｔ）（オリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマー）に更に関する。こうしたプローブにより、遺伝子調節に関連する遺伝子の遺伝的及びエピジェネティクスパラメータの診断及び／又は治療が可能となる。このオリゴマーのセット（ｓｅｔ）は、配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号２２４のうち一つ及びこれの相補配列に従った遺伝子調節に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡ及び／又は表１の遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡの配列及びこれらの相補配列において単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出するために使用することもできる。
【００２９】
本発明によれば、本発明によって利用可能となる、異なるオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマの配置（いわゆる「アレイ」）は、同様に固相に固定される形で存在することが好適である。この異なるオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマー配列のアレイは、長方格子又は六方格子の形態で固相上に配置されることによって特徴付けることができる。固相表面は、好ましくは、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成される。しかしながら、ニトロセルロースと、ペレットの形態又は樹脂基質として存在することが可能なナイロン等のプラスチックとも利用可能である。
【００３０】
そのため、本発明の主題は、遺伝子調節に関連する疾患と関係する分析のためのキャリヤー材料に固定されたアレイを製造する方法であり、この方法においては、本発明に従った少なくとも一つのオリゴマーが固相に結合される。こうしたアレイを製造する方法は、例えば、固相化学反応及び光変性保護基を用いる米国特許第５，７４４，３０５号により知られている。
【００３１】
本発明の更なる主題は、本発明に従った少なくとも一つの核酸を含む遺伝子調節に関連する疾患の分析のためのＤＮＡチップに関する。ＤＮＡチップは、米国特許第５，８３７，８３２号により知られている。
【００３２】
更に、本発明の主題は、例えば、重亜硫酸塩（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）含有試薬と、いずれの場合にも、付録で指定する塩基配列（配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号２２４及びこれの相補配列及び／又は表１の遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡの配列及びその相補配列）の１８塩基の長さのセグメントに対応する配列又はこのセグメントの相補配列を有する少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）と、オリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマーと、説明された方法を実行及び評価するための指示書とによって構成されるキットである。しかしながら、本発明に沿ったキットは、上で述べた構成要素の一部のみを含むこともできる。
【００３３】
本発明により、シトシンメチル化及び単一ヌクレオチド多型を分析することで、細胞周期に関連する遺伝子の遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータを確認する方法も利用可能となり、これは以下のステップを含む。
【００３４】
この方法の第一のステップにおいて、ゲノムＤＮＡ試料は、５’−位置においてメチル化していないシトシン塩基がウラシル、チミン、又はハイブリッド形成行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換される形で、化学的に処理される。これは、以下において「化学的前処理」として理解されるものとする。
【００３５】
分析されるゲノムＤＮＡは、好ましくは、細胞又は細胞構成要素といったＤＮＡの通常のソースから取得され、これは例えば、細胞株と、バイオプシーと、血液と、唾液と、大便と、尿と、脳脊髄液と、眼、腸、腎臓、脳、心臓、前立腺、肺、乳房、又は肝臓からの組織等のパラフィンに埋め込まれた組織と、ヒストロジックオブジェクトスライド（ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ　ｏｂｊｅｃｔ　ｓｌｉｄｅｓ）と、又はその組み合わせとである。
【００３６】
上で説明したゲノムＤＮＡの処置は、好ましくは、重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）（亜硫酸水素塩、二亜流酸塩）と、続いてアルカリ加水分解によって実行され、このアルカリ加水分解によって、非メチル化シトシンはウラシル、或いは塩基対合行動に関してシトシンと類似しない別の塩基に転換される。
【００３７】
化学的前処理されたＤＮＡの断片は、本発明に従ったプライマーオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔｓ）と、好ましくは、熱安定性ポリメラーゼとを使用して、増幅される。統計的及び実際的な考慮から、好ましくは、１００乃至２０００塩基対の長さを有する１０より多くの異なる断片を増幅する。いくつかのＤＮＡセグメントの増幅は、一つの同じ反応槽において、同時に実行することができる。通常、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を用いて実行される。
【００３８】
この方法の好適な実施形態において、プライマオリゴヌクレオチドのセット（ｓｅｔ）は、付録において指定された塩基配列（配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号２２４及びこれの相補配列及び／又は表１の遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡの配列及びそれらの相補配列）の少なくとも１８塩基対の長さのセグメントをそれぞれ逆相補配列又はこれと同一の配列を有する少なくとも二つのオリゴヌクレオチドを含む。このプライマオリゴヌクレオチドは、好ましくは、ＣｐＧジヌクレオチドをまったく含まない点で特徴付けられる。
【００３９】
本発明によれば、少なくとも一つのプライマオリゴヌクレオチドは、増幅中に固相に接合されている。様々なオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマー配列を、長方格子又は六方格子の形態で、平坦な固相上に配置することが可能であり、固相表面は、好ましくは、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金によって構成され、ニトロセルロース又はプラスチック等の他の材料を使用することも可能である。
【００４０】
増幅を用いて得られる断片は、検出可能な標識を直接的又は間接的に伴なうことができる。好適なものは、蛍光標識、放射性核種、又は質量分析計において検出できる通常の質量を有する分離可能な分子断片の形態の標識であり、質量分析計での検出可能性を高めるために、生成される断片は単一の正又は負の実効電荷を有することが好適である。この検出は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）を用いて、或いは電子スプレ質量分析法（ＥＳＩ）を使用して、実行及び視覚化することができる。
【００４１】
この方法の第二のステップで得られた増幅物は、その後、オリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡプローブのアレイ又はセット（ｓｅｔ）とハイブリッド形成する。この状況において、ハイブリッド形成は、以下の説明の形で行われる。ハイブリッド形成中に使用されるプローブのセット（ｓｅｔ）は、好ましくは、少なくとも十個のオリゴヌクレオチド又はＰＮＡ−オリゴマーで構成される。このプロセスにおいて、増幅物は、既に固相と接合しているオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するプローブの役割を果たす。ハイブリッド形成しない断片は、その後、除去される。前記オリゴヌクレオチドは、付録において指定された塩基配列のセグメントを逆相補する又はこれと同一である１３ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含み、このセグメントは少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンは、１３−ｍｅｒの５’末端からの五番目乃至九番目のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドにはそれぞれＣｐＧジヌクレオチドが存在する。前記ＰＮＡ−オリゴマーは、付録において指定された塩基配列のセグメントを逆相補する又はこれと同一である９ヌクレオチドの長さを有する少なくとも一つの塩基配列を含み、このセグメントは少なくとも一つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。ＣｐＧジヌクレオチドのシトシンは、９−ｍｅｒの５’末端から見て四番目乃至六番目のヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドにはそれぞれＣｐＧジヌクレオチドが存在する。
【００４２】
この方法の第四のステップにおいて、ハイブリッド形成されない増幅物は除去される。
【００４３】
この方法の最終ステップにおいて、ハイブリッド形成した増幅物が検出される。この状況において、増幅物に添加された標識は、各オリゴヌクレオチド配列が位置する固相の各位値を特定可能できることが好適である。
【００４４】
本発明によれば、増幅物の標識は、蛍光標識、放射性核種、又は質量分析計において検出できる通常の質量を有する分離可能な分子断片であることが好適である。質量分析計は、増幅物、増幅物の断片、又は増幅物を相補するプローブの検出に好適であり、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ）を用いて、或いは電子スプレ質量分析法（ＥＳＩ）を使用して、検出を実行及び視覚化することができる。
【００４５】
生成た断片は、質量分析計での検出可能性を高めるために、単一の正又は負の実効電荷を有することができる。上述の方法は、好ましくは、遺伝子調節に関連する遺伝子の遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータを確認するために使用される。
【００４６】
本発明によるオリゴマー又はそのアレイと、本発明によるキットとは、遺伝子調節に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析することで、遺伝子調節に関連する疾患の診断及び／又は治療に使用される。本発明によれば、この方法は、好ましくは、遺伝子調節に関連する遺伝子内の重要な遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータの診断及び／又は治療に使用される。
【００４７】
本発明による方法は、例えば、重症複合型免疫不全症と、心臓障害と、炎症反応と、血友病と、ウェルナ症候群と、喘息と、ＨＤＲ症候群と、Ｓａｅｔｈｒｅ−Ｃｈｏｔｚｅｎ症候群と、腎臓病と、子癇前症と、移植片対宿主疾患と、充実性腫瘍と、癌との診断及び／又は治療に使用される。
【００４８】
配列ＩＤ番号１乃至配列ＩＤ番号２２４及びこれの相補配列及び／又は表１の遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡ及びその相補配列の本発明による核酸は、遺伝子調節に関連する遺伝子の遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータの診断及び／又は治療に使用することができる。
【００４９】
本発明は、更に、遺伝子調節に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析することで遺伝子調節に関連する疾患の診断及び／又は治療を行うための診断剤及び／又は治療剤を製造する方法に関し、この診断剤及び／又は治療剤は、その製造において、おそらくは適切な添加剤及び助剤と共に、本発明による少なくとも一つの核酸が使用される点によって特徴付けられる。
【００５０】
本発明の更なる主題は、遺伝子調節に関連する遺伝子のメチル化パターンを分析する遺伝子調節に関連する疾患の診断剤及び／又は治療剤に関し、この診断剤及び／又は治療剤は、おそらくは適切な添加剤及び助剤と共に、本発明による少なくとも一つの核酸が含まれる。
【００５１】
本発明は、更に、患者又は個人にとって不利な事象の診断及び／又は予後診断に関し、これにおいて、遺伝子調節に関連する遺伝子内の重要な遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータは、本発明を用いて取得されるパラメータであり、遺伝的及び／又はエピジェネティクスパラメータの他のセット（ｓｅｔ）と比較することが可能であり、その格差は患者又は個人にとって不利な事象の診断及び／又は予後診断の根拠の役割を果たす。
【００５２】
本発明における、「ハイブリッド形成」という用語は、オリゴヌクレオチドを、試料ＤＮＡにおいて、ワトソン・クリック塩基対合のラインに沿って、完全に相補配列に接合し、二重構造を形成することと理解される。「厳密なハイブリッド形成条件」は、６０℃の２．５×ＳＳＣ緩衝液でハイブリッド形成が実行され、その後、３７℃の低緩衝液濃度でのいくつかの洗浄ステップが行われ、安定状態が維持されるとして理解される。
【００５３】
「機能変異体」という用語は、ＤＮＡ配列を相補し、厳密な条件下で基準配列とハイブリッド形成を行い、本発明に従った対応するポリペプチドと類似する活動を有する、すべてのＤＮＡ配列を意味する。
【００５４】
本発明における、「遺伝的パラメータ」は、遺伝子調節及びその調節に更に必要な配列に関連する遺伝子の変異及び多型現象である。変異として指定されるものは、特に、挿入と、欠失と、点変異と、反転及び多型現象と、特に好適なものとしてＳＮＰ（単一ヌクレオチド多型）とである。
【００５５】
本発明における、「エピジェネティクスパラメータ」は、遺伝子調節及びその調節に更に必要な配列に関連する遺伝子のＤＮＡ塩基におけるシトシンメチル化及びその他の化学的修飾である。その他のエピジェネティクスパラメータには、例えば、ヒストンのアセチル化が含まれ、しかしながら、これは説明した方法を使用して直接的に分析することはできないが、同様に、ＤＮＡメチル化と相関する。
【発明の実施の形態】
【００５６】
以下では、本発明について、配列及び例と、添付の図とに基づいて参照し、これに限定されることなく、詳細に説明する。
【実施例１】
【００５７】
遺伝子調節に関連するｐ５３遺伝子におけるメチル化分析
この実施例は、遺伝子調節に関連する遺伝子の断片に関係し、この場合はｐ５３遺伝子上の特定のＣＧ位置でのメチル化状態が分析される。
【００５８】
第一のステップにおいて、ゲノム配列は、塩基の５位置においてメチル化していないすべてのシトシンが修飾され、それは５位置においてメチル化しているシトシンが変化しないまま、異なる塩基が塩基対合行動に関して置換されるように、重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）（亜硫酸水素塩、二亜流酸塩）を使用して処理される。
【００５９】
重亜硫酸（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）溶液が反応に使用される場合、非メチル化シトシン塩基において付加が発生する。更に、変性剤又は溶剤と、ラジカルインタセプターとが存在しなければいけない。その後のアルカリ加水分解により、非メチル化シトシン核酸塩基のウラシルへの転換が生じる。化学的に転換されたＤＮＡ（配列ＩＤ番号２２１）は、次に、メチル化シトシンの検出に使用される。第二の方法ステップにおいて、処理されたＤＮＡ試料は、水又は水溶液により希釈される。好ましくは、このＤＮＡは、その後、アルカリ性ｐＨ値で脱スルホン化される（１０乃至３０分、９０乃至１００℃）。この方法の第三のステップにおいて、このＤＮＡ試料は、好ましくは耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応において増幅される。この例では、ｐ５３遺伝子のシトシンが分析される。このため、５９５ｂｐの長さを有する定められた断片は、特定のプライマーオリゴヌクレオチド　ＧＴＧＡＴＡＡＧＧＧＴＴＧＴＧＡＡＧＧＡ（配列ＩＤ番号２２５）及び　ＣＡＡＡＡＡＣＴＴＡＣＣＣＡＡＴＣＣＡＡ（配列ＩＤ番号２２６）により増幅される。この増幅物は、既に固相に接合されているオリゴヌクレオチドと（これは例えば　ＡＡＣＣＣＣＴＡＣＧＡＡＡＣＴＣＣＴ（配列ＩＤ番号２２７））、ハイブリッド形成し、二重構造を形成し、増幅物の位置４０１に位置するシトシンを検出する試料としての役割を果たす。ハイブリッド形成物の検出は、増幅に使用されたＣｙ３及びＣｙ５蛍光標識プライマーオリゴヌクレオチドに基づく。増幅ＤＮＡのオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成反応は、重亜硫酸塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）処理されたＤＮＡのこの位置にメチル化シトシンが存在している場合のみ発生する。したがって、分析される特定のシトシンのメチル化状態は、ハイブリッド形成物から推測できる。
【００６０】
特定の位置のメチル化状態を検証するために、増幅物の試料は、既に固相に接合された別のオリゴヌクレオチドと更にハイブリッド形成される。前記オリゴヌクレオチドは、焦点となる位置を除き、試料のメチル化状態を分析するのに以前使用されたオリゴヌクレオチドと同一である。分析される位置において、前記オリゴヌクレオチドは、シトシン塩基ではなくチミン塩基を含み、これは例えば　ＡＡＣＣＣＣＴＡＣＡＡＡＡＣＴＣＣＴ（配列ＩＤ番号２２８）である。そのため、ハイブリッド形成反応は、分析される位置に非メチル化シトシンが存在する場合のみ発生する。
【００６１】
分析は、二種類の組織試料に関して実行され、試料１は毛様細胞性星状細胞腫（脳腫瘍）組織からであり、試料２は毛様細胞性星細胞種悪性度ＩＩ（脳腫瘍）組織からのものである。結果（図１）から、試料２は増幅物の位置４０１においてメチル化しているのに対して、一方試料１は同じ位置にメチル化した細胞又は非メチル化細胞の両方の混合物を有することが確認できる。
【実施例２】
【００６２】
遺伝子調節に関連する疾患の診断
メチル化パターンを遺伝子調節に関連する疾患の一つに関係付けるために、最初に、疾患のある患者グループと健康な患者グループのＤＮＡメチル化パターンを分析する必要がある。こうした分析は、例えば、実施例１と同じように実行される。このようにして得られた結果は、データベースに保存され、二グループ間でメチル化が異なるＣｐＧジヌクレオチドが特定される。これは、個別のＣｐＧメチル化割合を決定することで実行可能であり、こうした決定は、例えば、配列決定による比較的不正確な方法、或いは、メチル化感受性「プライマー延長反応」による非常に正確な方法で行うことができる。更に、例えば、コンピュータ等により実行することが可能なクラスター分析により、全体のメチル化状態を同時に分析すること、及びパターンを比較することも可能である。
【００６３】
その後、検査した患者を特定の治療グループに割り当て、こうした患者を個別化した治療により選択的に治療することが可能である。
【００６４】
実施例２は、例えば、以下の疾患に関して実行することができる。
重症複合型免疫不全症と、心臓障害と、炎症反応と、血友病と、ウェルナ症候群と、喘息と、ＨＤＲ症候群と、Ｓａｅｔｈｒｅ−Ｃｈｏｔｚｅｎ症候群と、腎臓病と、子癇前症と、移植片対宿主疾患と、充実性腫瘍と、癌。
【００６５】
表１　本発明の遺伝子調節に関する好適な遺伝子の一覧
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【００６６】
【配列表】
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【配列の説明】
配列ＩＤ番号１乃至２２４
配列ＩＤ番号１乃至２２４は、本発明による遺伝子調節に関連する遺伝子の化学的前処理されたＤＮＡの配列を示している。特に、奇数の配列番号（配列ＩＤ番号１、３、５、．．．）を有する配列は、いずれの場合にも、遺伝子調節に関連する様々な遺伝子の化学的前処理されたゲノムＤＮＡの配列を示す。偶数の配列番号（配列ＩＤ番号２、４、６、．．．）を有する配列は、いずれの場合にも、先行する配列の相補する遺伝子調節に関連する様々な遺伝子の化学的前処理されたゲノムＤＮＡの配列を示す（例えば、配列ＩＤ番号１に対する相補配列は配列ＩＤ番号２であり、配列ＩＤ番号３に対する補完配列は配列ＩＤ番号４である）。
配列ＩＤ番号２２５乃至配列ＩＤ番号２２８は、実施例１において使用されるオリゴヌクレオチド配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、蛍光標識増幅物による表面固定オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を示している。試料Ｉは、毛様細胞性星状細胞腫（脳腫瘍）組織からのものであり、試料ＩＩは、毛様細胞性星細胞種悪性度ＩＩ（脳腫瘍）組織からのものである。点の蛍光は、増幅物によるオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成を示している。ＣＧオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、分析されるシトシン位置でのメチル化を意味し、ＴＧオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成は、分析されるシトシン位置での非メチル化を意味する。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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