(57)【要約】非毒性、非抗原性のエキソ多糖を産生する新規な微生物を教示する。このエキソ多糖は、マンノース、フコース、フルクトース及びガラクトースと同じ速度で移動する中性糖と、フコースと同じ速度で移動する酸性糖と、グルコース及びフコースと同じ速度で移動するアミン糖とを有し、ガラクトース：フコース：グルコース：マンノースの比率は約１：２：３：６である。該微生物と該エキソ多糖とは、地質学的用途にバイオフィルムとして用いられ、食品及び薬物ポリマーとしての消費者用途と、血漿増量剤として用途を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＰＴＡ−２５００として寄託された単離細菌。
【請求項２】
次の特徴：グラム陰性、 杆状、約０．２ｘ０．８μｍ、通性嫌気性菌、１５℃〜４５℃において、最適温度３７℃で増殖、ｐＨ４〜１１において増殖するが、ｐＨ２では増殖なし、ＡＢ１３培地又は最少培地中で増殖、自動力あり、莢膜なし、胞子なし、約１：２：３：６の比率でガラクトース、フコース、グルコース、マンノースの糖含量を有する弾性エキソ多糖を産生、を含む単離細菌。
【請求項３】
表２におけるような抗生物質感受性プロフィル、表３におけるような生化学プロフィル、及び表４におけるような炭素利用プロフィルの特徴をさらに含む、請求項２記載の単離細菌。
【請求項４】
図２及び図３のＬＡＢ−１菌株の総タンパク質ＳＤＳ−ＰＡＧＥプロフィルをさらに含む、請求項３記載の単離細菌。
【請求項５】
配列番号：１の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の特徴をさらに含む、請求項４記載の単離細菌。
【請求項６】
配列番号：１の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子を含む単離細菌。
【請求項７】
マンノース、フコース、フルクトース及びガラクトースと同じ速度で移動する中性糖と、フコースと同じ速度で移動する酸性糖と、グルコース及びフコースと同じ速度で移動するアミン糖とから本質的に成り、ガラクトース：フコース：グルコース：マンノースの糖比率が約１：２：３：６であるエキソ多糖を産生する単離細菌。
【請求項８】
配列番号：１の１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子をさらに含む、請求項７記載の単離細菌。
【請求項９】
マンノース、フコース、フルクトース及びガラクトースと同じ速度で移動する中性糖と、フコースと同じ速度で移動する酸性糖と、グルコース及びフコースと同じ速度で移動するアミン糖とから本質的に成り、ガラクトース：フコース：グルコース：マンノースの糖比率が約１：２：３：６であるエキソ多糖。
【請求項１０】
ＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＰＴＡ−２５００のＬＡＢ−１菌株によって産生されるエキソ多糖。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載の細菌によって産生されるエキソ多糖。
【請求項１２】
植物又は動物の生長のための栄養供給として用いるための請求項１１記載のエキソ多糖。
【請求項１３】
エキソ多糖が精製されて、食品又は薬物の添加剤として用いられる、請求項１１記載のエキソ多糖。
【請求項１４】
エキソ多糖が精製されて、血漿増量剤として用いられる、請求項１１記載のエキソ多糖。
【請求項１５】
粘性調節剤、接着剤、充填剤、エキステンダー、増量剤、及び生物生長防止剤から成る群から選択された使用のための請求項１１記載のエキソ多糖。
【請求項１６】
マンノース、フコース、フルクトース及びガラクトースと同じ速度で移動する中性糖と、フコースと同じ速度で移動する酸性糖と、グルコース及びフコースと同じ速度で移動するアミン糖とから本質的に成り、ガラクトース：フコース：グルコース：マンノースの糖比率が約１：２：３：６であるエキソ多糖を含むバイオフィルム。
【請求項１７】
請求項１〜８のいずれかに記載の細菌によって産生される、請求項１６記載のバイオフィルム。
【請求項１８】
マンノース、フコース、フルクトース及びガラクトースと同じ速度で移動する中性糖と、フコースと同じ速度で移動する酸性糖と、グルコース及びフコースと同じ速度で移動するアミン糖とから本質的に成り、ガラクトース：フコース：グルコース：マンノースが約１：２：３：６の比率で存在する精製エキソ多糖を含む血漿増量剤。
【請求項１９】
エキソ多糖がＡＴＣＣ　Ｎｏ．ＰＴＡ−２５００のＬＡＢ−１によって産生される、請求項１８記載の血漿増量剤。
【請求項２０】
エキソ多糖が請求項１〜８のいずれかに記載の細菌によって産生される、請求項１８記載の血漿増量剤。
【請求項２１】
下記濃度のカチオン：１１０〜１２０ｍＥｑ／ｌのナトリウム、約５ｍＥｑ／ｌのカルシウム、０〜３ｍＥｑ／ｌのカリウム及び０〜０．９ｍＥｑ／ｌのマグネシウムをさらに含む、請求項１８記載の血漿増量剤。
【請求項２２】
少なくとも１種類の緩衝剤及び栄養と、任意にビタミンＫと、任意にヒト血清アルブミンとをさらに含む、請求項１８記載の血漿増量剤。
【請求項２３】
請求項１〜８のいずれかに記載の細菌の増殖と発生を阻害する組成物。
【請求項２４】
プロピオン酸を含む、請求項２３記載の組成物。
【請求項２５】
プロピオン酸の誘導体を含む、請求項２３記載の組成物。
【請求項２６】
プロピオン酸に関連する化学構造又はバックボーンを有する化合物を含む、請求項２３記載の組成物。
【請求項２７】
２−（４−イソブチルフェニル）−プロピオン酸を含む、請求項２３記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１〜８のいずれかに記載の細菌のバイオフィルム産生を阻害する組成物。
【請求項２９】
プロピオン酸を含む、請求項２８記載の組成物。
【請求項３０】
プロピオン酸の誘導体を含む、請求項２８記載の組成物。
【請求項３１】
プロピオン酸に関連する化学構造又はバックボーンを有する化合物を含む、請求項２８記載の組成物。
【請求項３２】
２−（４−イソブチルフェニル）−プロピオン酸を含む、請求項２８記載の組成物。
【請求項３３】
ムコイド微生物の増殖と発生を阻害する組成物。
【請求項３４】
プロピオン酸を含む、請求項３３記載の組成物。
【請求項３５】
プロピオン酸の誘導体を含む、請求項３３記載の組成物。
【請求項３６】
プロピオン酸に関連する化学構造又はバックボーンを有する化合物を含む、請求項３３記載の組成物。
【請求項３７】
２−（４−イソブチルフェニル）−プロピオン酸を含む、請求項３３記載の組成物。
【請求項３８】
ムコイド生物のバイオフィルム産生を阻害する組成物。
【請求項３９】
プロピオン酸を含む、請求項３８記載の組成物。
【請求項４０】
プロピオン酸の誘導体を含む、請求項３８記載の組成物。
【請求項４１】
プロピオン酸に関連する化学構造又はバックボーンを有する化合物を含む、請求項３８記載の組成物。
【請求項４２】
２−（４−イソブチルフェニル）−プロピオン酸を含む、請求項３８記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願のクロス・リファレンス
本特許出願は、１９９９年１０月２６日出願の同時係属米国予備特許出願第６０／１６１，５８８号からの優先権の恩典を主張し、その開示をそのまま援用する。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、概して、無毒性の非抗原性エキソ多糖を産生する新規な非病原性微生物に関する。環境工学、農学、地質学、消費者および医学的用途におけるこの微生物およびエキソ多糖の使用を記載する。ムコイドエキソ多糖の阻害および制御も記載する。
【０００３】
発明の背景
本発明は、無毒性の非抗原性エキソ多糖を産生する新規な非病原性微生物に関する。このエキソ多糖は、環境工学および農学的用途においてバイオフィルムとして、および消費者および医学的用途において充填剤またはポリマーとして用いることができる。バイオフィルム用途が最初に記載され、次に、具体的な医学的用途が記載されている。
【０００４】
“バイオフィルム”という用語は、微生物が、それら自体が作るポリマーマトリックス中に埋封されたものを含む有機物質を記載するのに用いられる。このマトリックスは、主に、エキソ多糖から成り、土壌粒子に強く付着する強靱で弾性の粘液状物質である。砂土中のバイオフィルムの成長は、土壌検体中に細菌および栄養素溶液を注入することによって達せられる。得られたバイオフィルム処理を用いて土壌細孔をふさぎ、それによって、流体を透過する土壌の能力を低下させる。
【０００５】
バイオフィルムの例は、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種の若干の菌株によって産生される。Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ の使用についての問題は、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）が、多数のヒト病原体を含む属であるということである。更に、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ 自体の病原性は、付着に用いられる粘液状エキソ多糖を生じるその能力、およびその病原体が非特異的および特異的両方の免疫清澄化防御機構を免れるのを助ける集落形成と関連している。
【０００６】
バイオフィルムのもう一つの例は、Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ によって米国特許第４，８００，９５９号に記載されているが、これは、地中形成を選択的にふさぐ微生物処理の使用を開示している。示される処理では、地中レザバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）中の極めて透過性の層または区画を、サイズを減少させるために餓死させた後に標的区画中に注入される Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ または Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 細菌を用いてふさぐ。この細菌は、最少栄養素含有培地への暴露で、完全な細胞サイズを回復し、増殖し、そしてバイオフィルム形成性エキソ多糖の産生を開始する。これら細菌によって生じるバイオフィルムは、高透過性形成区画を選択的に封鎖し、その区画を介する水性流を減少させる。
【０００７】
上記のバイオフィルム使用の他に、灌流液および代用血液への要求が存在している。しかしながら、現在利用可能な且つ承認されている化合物は、これまで、本発明者の血液供給システムへの増加する需要を満たすことができなかった。血液、代用血液および血漿増量剤への増加する需要を満たすことを試みるのに、多数の代用血液がこの数年にわたって開発されている。残念ながら、現在利用されている血漿増量剤の多くは、浸透圧を与えるのにそれらが依存する低分子量分子として、動脈後方毛細血管床で見出される負の浸透圧の結果として毛細血管床を容易に移動することができない。起こりうる浸透圧の減少は、哺乳動物対象における適当なイオンまたは流動平衡または血漿容量を維持する現行の血漿増量剤の長期使用を不充分にさせる。
【０００８】
容量を維持するために不透過性物質を有するそれら代用血液は、ヒト血清アルブミンまたは血漿タンパク質混合物を膨張剤として用いている。これら代用血漿タンパク質は、本発明者の現行の血液供給システムと同様の血液および血漿供給に依存しているので、これら製品への増加した需要を満たすことができない。
【０００９】
代用血液および代用血漿に関する多数の特許は、Ｓｅｇａｌｌ によって発行されている。米国特許第４，９２３，４４２号およびその再発行は、生きている対象の代用血液中で用いられる多数の溶液を開示しているが、それらのいずれもが、少なくとも若干の濃度の心停止薬、通常はカリウムイオンを含む。米国特許第４，９２３，４４２号は、特に器械配置に関する外科的方法、および対象の灌流に一般的に応用できる肺動脈楔入圧のまたは制御を開示している。米国特許第５，１３０，２３０号は、生きている対象の血液を完全に交換するのに多数の溶液が連続的に用いられる溶液システムとして用いることができる代用血液を開示している。米国特許第５，１３０，２３０号は、この代用血液が、“生理学的濃度の電解質水溶液、巨大分子膨張剤、生理学的ｐＨの範囲内で緩衝能を有する生物緩衝剤、１種類または複数の単純な栄養糖、および細胞膜を越えるカルシウムの流出に代用するのに充分な濃度のマグネシウムイオン”を含むということを開示している。
【００１０】
上記の特許発明に加えて、多数の商業的に入手可能な製品が、循環血液量減少患者の処置に用いられている。これらには、ＨＥＳＰＡＮＴＭ（０．９％塩化ナトリウム中６％ヘタスターチ（ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ）注入、ＰＥＮＴＡＳＰＡＮＴＭ（０．９％塩化ナトリウム中１０％ペンタスターチ（ｐｅｎｔａｓｔａｒｃｈ）注入［両方ともＤＵＰＯＮＴ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳＴＭ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ Ｄｅｌ． による］）、ＭＡＣＲＯＤＥＸＴＭ（５％デキストロース中６％デキストラン７０注入または０．９％塩化ナトリウム中６％デキストラン７０注入［ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ，ＩＮＣ．ＴＭ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．］）およびＲＨＥＯＭＡＣＲＯＤＥＸＴＭ（５％デキストロース中１０％デキストラン４０注入または０．９％塩化ナトリウム中１０％デキストラン４０注入［ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ，ＩＮＣ．ＴＭ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， Ｎ．Ｊ．］）が含まれる。しかしながら、これら製品はいずれも、ポリマー性であり、しかもしばしば、時が経つにつれて解離するまたは天然の生理学的酵素によって分解する化合物に依存している。或いは、細菌は、これら新たに供給される栄養源を利用して、傷害時に病原体に感染する患者において重症の敗血症を引き起こすことがありうる。したがって、よりよい膨張剤がなお必要とされている。
【００１１】
医学的に重要な細菌中で粘液状エキソ多糖を生じる能力は、表面への付着に臨界的であり、薬物処置への増加した耐性を生じる。化学的処置も物理的処置も、バイオフィルム形成を抑制するために開発されている。Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．３１０， Ｂｉｏｆｉｌｍｓ， Ｅｄ． Ｒｏｎ Ｊ．Ｄｏｙｌｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， １９９９。しかしながら、バイオフィルムは、病原性、永続型および耐性型の細菌感染、および産業構造物の生物腐蝕と関連しているので、バイオフィルムを抑制する更に別の簡単且つ有効な方法が必要とされている。
【００１２】
発明の要旨
新たに発見され、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−２５００として寄託された細菌ＬＡＢ−１は、多数の可能性のある商業的バイオフィルム用途を有する。これらには、（１）表面下バイオフィルム遮断壁形成；（２）圧縮されたバイオフィルム処理土壌を含む表面下ライナー；（３）現場バイオフィルムライナー；（４）バイオフィルム物質を用いてジオテキスタイルを処理することによって作られるバリヤー；（５）湿分を保持する改善された砂の能力；（６）不毛土の開墾および農耕土への転換；（７）植物成長への栄養供給として機能するおよび／または栄養素および水を保持するのに役立つポリマーの形の有意に増加した土壌バイオマス；および（８）それ以外の点で非凝集性の土壌（砂丘など）に凝集性を与え、それによって、土壌を風および／または水による浸食に一層耐性にすることが含まれるが、これに制限されるわけではない。
【００１３】
先行技術の方法およびバイオフィルムは、生物学的におよび環境的に安全且つ有効な水、土壌および廃棄物保持特性を与えることはできないということが判っている。既存の技術についての有意の問題は、バイオフィルムを生じるのに用いられる細菌の病原性である。本発明は、したがって、マンノース、フコース、フルクトースおよびガラクトースと同じ速度で移動する中性糖、フコースと同じ速度で移動する酸性糖、およびグルコースおよびフコースと同じ速度で移動するアミン糖から本質的に成るエキソ多糖から成るバイオフィルムを生じる非病原性細菌に関する。
【００１４】
より詳しくは、この細菌はＬＡＢ−１菌株である。バイオフィルム生産性細菌は、約ｐＨ４〜１１および約１５℃〜４５℃で成長可能であると更に定義することができる。ＬＡＢ−１菌株は、最少成長培地中で成長可能であり、または酵母、ペプトンおよび無機塩成分を含む水性栄養培地中で成長させることができる。ＬＡＢ−１は、本明細書中に記載のエキソ多糖を分泌する約０．２Ｘ０．８μｍのグラム陰性桿状細菌である。
【００１５】
本発明の一つの態様において、ＬＡＢ−１菌株は、透過性地中層をふさぐ場合、栄養素含有溶液中のＬＡＢ−１細菌を標的層中に与えることによって用いられる。栄養素含有溶液は、概して、ＬＡＢ−１の実質的且つ均一な成長条件を与えるように適合される。充分なバイオフィルムをこれら条件下で生じて、層を有効にふさぐ。例えば、現場の細菌は、１．５ｘ１０−５ｃｍ／秒に等しいまたはそれ未満、１．０ｘ１０−７ｃｍ／秒に等しいまたはそれ未満、または１．５ｘ１０−８ｃｍ／秒に等しいまたはそれ未満の飽和透水係数（ｓａｔｕｒａｔｅｄ ｈｙｄｒａｕｌｉｃ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）を生じることがありうる。
【００１６】
或いは、この細菌を、層に注入する前に、水性懸濁培地中の培養で撹拌しながら、細菌エキソ多糖産生を開始するのに充分なインキュベーション時間プレインキュベートしてよい。地中層をふさぐ方法には、レザバーから栄養素不足懸濁培地を排水すること、および規定の飽和透水係数を有するバイオフィルムを樹立するのに充分な一定の経過時間細菌成長を維持するために、そのレザバーに水性栄養培地を再補充することも含まれうる。水性栄養培地を用いた排水および再補充工程は、４８時間の経過時間毎に少なくとも１回行われてよい。細菌をプレインキュベートする工程は、例えば、少なくとも約７２時間であってよい。これら成長条件は、スライド表面上に約１０５〜１０１５個／平方センチメートルのコロニー形成単位の細菌集団を有するバイオフィルムを樹立させる。
【００１７】
このバイオフィルムは、表面下バイオフィルムカットオフ壁中に置かれる開放導管をふさぐのに、表面下ライナーの水分保持能力を強化するのに、または圧縮された、半圧縮されたまたはゆるめられたバイオフィルム処理土壌の水分保持能力を改良するためにも用いることができる。ライナー中で用いられる場合、バイオフィルムは現場に置かれてよい。バイオフィルムは、バイオフィルムを用いてジオテキスタイルを処理することによって環境バリヤーと一緒におよび／またはそれを強化するのに用いることができる。
【００１８】
本ポリマーのもう一つ重要な側面は、動物系において抗原性および毒性がないことである。これは、（１）食品添加物または食品用増粘剤または充填剤としての使用；（２）血漿増量剤としての使用；（３）ポリマー産業における使用；（４）化学薬品の精製用のクロマトグラフィーマトリックス支持体としての使用；（５）科学的研究におけるフィコール等の代わりの懸濁液としての使用；（６）生物の遺伝子内容、特に、エキソ多糖ポリマーの生合成をコードするものを決定する場合の使用；（７）化粧品分野におけるポリマー物質の使用；（８）昆虫または動物用餌を増加させるための使用；（９）組織培養培地中添加剤としての使用；（１０）半固体〜固体マトリックスとしての使用、例えば、ゲル電気泳動用；（１１）練り歯磨き、軟膏剤、クリーム剤およびローション剤中の添加剤としての使用；（１２）色素、染料、ペイントおよびワニスとの混合用；（１３）透析における封入用；（１４）複合材料、例えば、煉瓦、タイル、モルタル中での使用；（１５）シーラントの一部分としての使用；（１６）油、ロウおよびグリース用の粘度調整剤；（１７）医薬製剤中の充填剤、粘稠化剤またはエキステンダーとしての使用；（１８）創傷治癒用途を含めたバイオスカッフォルディング（ｂｉｏｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｇ）用途におけるポリマーの使用；および（１９）細菌成長を阻害する、または少なくとも支持することができない静菌（生物生長防止）剤としての、なお可能ならば殺生物剤としての使用を含めたいくつかの消費者／医学的用途を示唆する。
【００１９】
具体的には、血液容量を増加させるのに役立ち且つ毛細血管で不透過性である血漿増量剤として用いるための化合物が必要とされる。この化合物は、時が経つにつれて容易に解離してはならないし、または天然の生理学的酵素によって容易に分解されてはならない。更に、化合物およびその血漿増量剤としての使用は、細菌に外因性栄養源を与えてはならないが、これは、循環血液量減少を引き起こしている傷害時に病原体に感染する患者において、既に悪化している重症の敗血症をもたらすことがありうる。
【００２０】
より詳しくは、本発明は、ＬＡＢ−１細菌菌株によって産生されるエキソ多糖である。このエキソ多糖は、細菌成長を容易に支持するとは考えられない。これは、エキソ多糖上で成長する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＢ．ｉｎｄｉｃａ の能力を調べることによって決定されたが、成長は認められなかった。更に、エキソ多糖は、マウスへの注射によって調べたところ、抗原性ではない。したがって、この生成物は、血漿増量剤に必要な基本的なパラメーターのいくつかを満足させると考えられる。
【００２１】
エキソ多糖は、細胞培地中に分泌され、そして例えば、血漿増量剤中で用いるために集められる。血漿増量剤として単独でまたは他の要素と組み合わせて用いられる場合、エキソ多糖は等張液中で与えられるであろう。一つの態様において、それを必要としている対象において用いるための血液不含血漿増量剤および代用血液には、少なくとも２種類の水溶性膨張剤、すなわち、水溶性多糖膨張剤であるものおよび血清アルブミンであるものを含む単一溶液が含まれるが、この場合、エキソ多糖は、マンノース、フコース、フルクトースおよびガラクトース、酸性フコース、およびグルコースおよびフコースを含有するアミンから本質的に成る。
【００２２】
血漿増量剤および代用血液は、１：１〜１：２重量−重量の水溶性エキソ多糖膨張剤対血清アルブミンの比率を有してよい。血漿増量剤および代用血液の溶液中の水溶性エキソ多糖膨張剤および血清アルブミンの組合せ百分率は、約４％〜６％重量−容量の範囲内であってよい。
【００２３】
血漿増量剤および代用血液には、多数の陽イオンも単独でまたは組合せで含まれうる。例えば、陽イオンは、次の濃度、すなわち、１１０〜１２０ｍＥｑ／ｌのＮａ＋、約５ｍＥｑ／ｌのＣａ＋＋、０〜３ｍＥｑ／ｌのＫ＋および０〜０．９ｍＥｑ／ｌのＭｇ＋＋で与えられてよい。これら陽イオンは、溶解した塩化物塩として供給されてよい。血漿増量剤および代用血液には、少なくとも１種類の緩衝剤、例えば、乳酸および／または重炭酸緩衝剤も含まれてよい。緩衝化される場合、血漿増量剤は、概して、約６．８〜７．８のｐＨ範囲で緩衝能を有する生物緩衝剤であろう。
【００２４】
循環血液量減少患者、例えば、外傷のために多量の血液を失っている患者で用いられる場合、追加の薬剤は、回復を助けるように血漿増量剤中に含まれてよい。このような薬剤には、約１〜４ｍｇ／ｌの濃度のビタミンＫ、アミラーゼ、凝固因子、ｔ−ＰＡ、またはエリトロポエチンさえも含まれてよい。
【００２５】
非医学的用途において、本発明のエキソ多糖は、化学薬品の精製用のクロマトグラフィーマトリックス支持体として用いることができる。一つのこのような使用は、遠心分離で用いるための懸濁液としてであろう。エキソ多糖は、サイズ分離で用いるための懸濁液として溶液中で用いることさえできる。
【００２６】
本発明は、多数の生物学的および分析的用途のコーティングプレート中で用いるための生物学的に安定な無毒性物質として用いることもできる。このような用途に例には、細胞の ｉｎ ｖｉｔｒｏ の成長を維持するための組織培養プレートのコーティングが含まれる。エキソ多糖の表面上で成長させうる細胞には、原核細胞および真核細胞が含まれる。分析用設定において、本明細書中に開示されるエキソ多糖は、バイオセンサーのような、生物学的に適合しうる環境の維持を必要とする計測用コーティングとして用いることができる。
【００２７】
プロピオン酸およびイブプロフェンを含有する組成物は、ＬＡＢ−１菌株の液体または固形成長培地中に０．１〜１．０％（ｗ／ｖ）の濃度範囲で包含された場合、その成長、発育、細胞付着およびバイオフィルム産生を示差的に阻害する。新たに発見されたＬＡＢ−１菌株の成長、更には、その粘液状エキソ多糖およびバイオフィルムの産生は、プロピオン酸、プロピオン酸誘導体、それ以外にはイブプロフェンとして知られる２−（４−イソブチルフェニル）−プロピオン酸のような関連の化学構造または主鎖を有する化合物、およびこのような化合物を単独でまたは他の物質または化合物との組合せで含む製剤の溶液、混合物、懸濁液および他の種類によって阻害されうるしまたは制御されうる。任意のムコイド生物におけるムコイド化合物およびバイオフィルムの産生を阻害するのに上の方法を利用することは、当業者に明らかであると考えられる。
【００２８】
本発明およびその範囲の一層完全な理解は、下に簡単に要約される添付図面、本発明の現在好ましい態様についての次の詳細な記述、およびクレイムから得ることができる。
【００２９】
本発明の方法および装置の一層完全な理解は、添付図面と一緒にされた場合の次の詳細な記述の参照によって得ることができる。
現在好ましい典型的な実施態様の詳細な説明
次に、本明細書の以下では、本発明の好ましい実施態様を示す添付図面を参照して、本発明をより詳しく説明する。しかし、本発明は多くの異なる形態で具体化されうるので、本明細書に示した実施態様に限定されるものと解釈されるべきではなく；むしろ、これらの実施態様は、この開示が完璧かつ完全であり、当業者に本発明の範囲を詳しく伝えるように、提供される。
【００３０】
実施例１．ＬＡＢ−１微生物の特徴付けとエキソ多糖
ＬＡＢ−１のサンプルはＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−２５００として寄託されている。ＬＡＢ−１は本発明者によってＷｙｏｍｉｎｇ州における構成土壌（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｏｉｌ）サンプルから単離された、グラム陰性、 杆状細菌である。この土壌サンプルはＷｙｏｍｉｎｇ大学においてＪ．Ｔｕｒｎｅｒによって構成されたものであり、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａをバックグラウンドとして汚染物を含有した。汚染物のＬＡＢ−１は、その過度のスライム産生のために、単離され、研究された。
【００３１】
微生物の種と属を同定するために、多様な生化学的試験が行なわれた。これらの試験は、増殖条件、培養外観、細胞外観及び染色特徴（ｓｔａｉｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）、最適温度とｐＨの増殖範囲、酸素必要量、抗生物質感受性試験、カタラーゼとオキシダーゼに対する試験（Ｔａｘｏｓ  ＮＴＭディスク使用）、炭素源としてのアミノ酸利用、窒素固定、運動性試験、並びにＭｉｃｒｏ−ＩＤＴＭ、ＯｘｙＦｅｒｍＴＭ、ＥｎｔｅｒｏｔｕｂｅＴＭ及びＢｉｏＬｏｇ  ＧＮ  ＭｉｃｒｏＰｌａｔｅＴＭから商業的に入手可能な、多様な試験の評価を包含した。
【００３２】
この微生物は、Ｂ．ｉｎｄｉｃａ培養物によって改良された土壌中の汚染物であったので、Ｂ．ｉｎｄｉｃａとＬＡＢ−１微生物とをプレート上で増殖させ、総タンパク質プロフィルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって比較した。脂肪酸分析はＮｅｗａｒｋ、ＤＥの微生物ＩＤ（ＭＩＤＩ）によって行なったＮｅｗａｒｋ、ＤＥは高分解能ＭＩＤＩ  Ｓｈｅｒｌｏｃｋ  ＳｙｓｔｅｍＴＭを用いて、高分解能ガスクロマトグラフィーによって脂肪酸を同定した。同実験室はさらに、１６Ｓ遺伝子を配列決定して、それを登録された（ｐｒｏｐｒｉｅｔａｒｙ）ＭＩＣＲＯＳＥＱＴＭデータベース（ＰＥ  ＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＴＭ）と比較した。
【００３３】
エキソ多糖を、ＧＬＹＫＯＴＭ（ＮＯＶＡＴＯＴＭＣＡ）発蛍光団介助炭水化物電気泳動（ＦＡＣＥ）とマトリックス介助レーザーデソープション／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）とによってさらに分析した。エキソ多糖の免疫原性もマウスにおいて試験した。
【００３４】
固体培地上のＬＡＢ−１のコロニーは波状縁を有し不規則であった。これらは凸状の高まり、滑らかな光沢ある表面を示し、白色の色を有し、半透明から不透明であった。コロニーのコンシステンシーは非常に粘着力の強い、弾性のスライムのコンシステンシーであった。ＬＡＢ−１エキソ多糖は非常に大きな靭性を示し、ガラスロッドで引っ張ったときに破断せずに１フィート以上伸長した。このエキソ多糖の産生のために、コロニーを寒天プレートから引き上げることは困難であると分かった。
【００３５】
ＡＢ１３培地はＬＡＢ−１菌株を増殖させるために用いることができ、次のように製造する：水  １リットルにつきグルコース  ２０ｇ、ＮａＣｌ  １ｇ、酵母エキス  １ｇ又はＮａＮＯ３２ｇ、Ｋ２ＨＰＯ４８ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０．２ｇ、ＭｇＳＯ４０．５ｇ及び５％ＦｅＣｌ２１５０μｌを加える。固体培地を製造するためには、この培地に１５ｇの寒天を加える。この簡易化した最終培地は多糖ポリマーの大規模産生を実現可能にする。
【００３６】
液体ＡＢ１３培地における増殖は一面に広がり、濁度は濃密であり、均一であった。ＬＡＢ−１細菌が液体培地で増殖するときに、溶液全体は非常に粘性になり、コンシステンシーは、増殖のステージに依存して、重質コーンシロップのコンシステンシーから卵白のコンシステンシーまでの範囲である。振とうなしに増殖した培養物は平滑な表面増殖と共に綿毛様沈積（ｆｌｏｃｃｕｌｅｎｔ ｄｅｐｏｓｉｔ）を示した。この培養物は、幾らか甘い香りがするが、心地よくはない、非常に独特な匂いを有した。
【００３７】
この細菌は、丸い両端部と、平行な側面とを有する 杆状（ｂａｃｉｌｌｉａｒｙ）であり、グラム陰性であることが分かった。細胞集団には、主として長さの相違のために、細胞サイズに多少不規則性が見られたが、平均サイズは約０．２ｘ０．８μｍであった。細胞パケットの配置は不規則であるように思われたが、細胞の大きな割合は側面を接して整列していた。細胞の凝集（ｃｌｕｍｐｉｎｇ）は粘性のスライム層のためであると考えられた。このエキソ多糖はグラム染色において細胞周囲の軽度の曇りとして見ることができた。図１はグラム染色された細胞を１００ｘで示す。胞子染色は赤色の栄養細胞のみを示し、胞子は観察されなかった。莢膜染色は莢膜を示さず、むしろ、細胞周囲のぼんやりしたエキソ多糖を示した。穿刺培養の観察は微生物が運動性であることを示した。
【００３８】
２６°、３０°、３７℃及び４５℃において増殖したプレート上のコロニーの形態学は同じであったが、増殖は３７℃において最適であった。スライム層の弾性も変化しなかった。ｐＨ４、９及び１１の範囲の液体ＡＢ１３培養における増殖は変化しなかった。増殖はｐＨ２では観察されなかった。このｐＨ範囲にわたってプレート上のコロニー形態学も変化しなかった。ＬＡＢ−１微生物は通性嫌気性菌であることが判明した。
【００３９】
種々な生化学的試験結果を以下の表に要約する。
【００４０】
【表１】
2004500806.tif 000002
【００４１】
【表２】
2004500806.tif 000003
【００４２】
【表３】
2004500806.tif 000004
【００４３】
【表４】
2004500806.tif 000005
【００４４】
【表５】
2004500806.tif 000006
【００４５】
細菌学的情報を表１〜４に示したチャートにコンパイルした。この情報を用いて、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙの第９版（１９９４）を研究した。可能なマッチ（ｍａｔｃｈｅｓ）を発見しようと試みて、全てのグラム陰性の通性嫌気性 杆菌のＢｅｒｇｅｙ’ｓプロフィルを研究した。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属はＢＩＯＬＯＧＴＭによって提供された最も密接なマッチであるので、この属のメンバーと、ＬＡＢ−１はＢｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａコロニーのローン（ｌａｗｎ）中の汚染物として単離されたので、Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ属とに特別の注意を払った。
【００４６】
表１〜４中に含有される情報は有益であると考えられたが、この特定の探査方法は説得的でないと迅速に実証された。正確なマッチが同定されず、発見された部分的なマッチはあまりにも多すぎて、それらを全て考慮することはできなかった。それ故、他のより具体的な同定方法が用いられた。
【００４７】
ＬＡＢ−１がＢｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ種であると考えられたことは全く可能であったので、各微生物のタンパク質プロフィルを比較した。図２のゲルに関しては、各微生物のコロニーをＡＢ１３プレートから回収して、ガラスビーズと共に５分間渦流させることによって剪断した。溶菌物（ｌｙｓａｔｅ）に１倍量の流体バッファー（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）と１倍量のブロモフェノールブルー追跡染料（ｔｒａｃｋｉｎｇ ｄｙｅ）とを加え、この結果を５分間沸騰させた。短時間回転させた後に、サンプルに粉状スクロースを２回オーバーレイして、細胞破片を除去し、１００μｌを４．５％スタッキング、１０％分解能ポリアクリルアミドゲル上に負荷させて、３０〜３５ｍＡｍｐにおいてランした。
【００４８】
図３のために用いたサンプルを液体ＡＢ１３培地中で増殖させた。５分間ペレット化することによって１ｍｌを回収し、１％ＮａＣｌによって洗浄し、ｄＨ２Ｏによって再度洗浄した。ペレットを１８０μｌの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓと１０ｍＭ  ＥＤＴＡ，ｐＨ８．０中に再懸濁させた。６０μｌのＰＳＳ（４ｘＰＳＳは７００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８、４．３ｇのスクロース、４ｍｇのブロモフェノールブルー、１．４５μｌの２０％ＳＤＳ、４４μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ，１０ｍｇのＤＴＴ及び１０ｍｌになるまでのｄＨ２Ｏである）を細胞に加えて、この混合物を５分間沸騰させた。サンプルに粉状スクロースをオーバーレイして、細胞破片を除去し、上記のようにランした。
【００４９】
図２と図３に示したＣｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、これら２種類の微生物間に相違点が有ることを実証する。未知微生物ＬＡＢ−１はＢｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ種ではないことが結論された。
【００５０】
ＭＩＤＩ  ＬＡＢＳＴＭ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥによるガスクロマトグラフィーによる脂肪酸分析を用いて、この微生物を同定した。増殖条件を標準化して、ＭＩＤＩ  ＳＨＥＲＬＯＣＫ  ＳＹＳＴＥＭＴＭを完全に自動化して、データを、１９００種類を超える細菌の脂肪酸プロフィルを含有する、登録されたデータベースと比較した。結果は図４に示す。最良のマッチであるＫｌｕｙｖｅｒａ  ｃｒｙｏｃｒｅｓｃｅｎｓは０．８３５の類似性を有した。第１選択と，０．７５３の類似性を有する第２選択、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｔａｙｌｏｒａｅとの間に少なくとも０．１００の分離が存在したならば、このマッチは非常に良好と見なされたと考えられる。
【００５１】
これらの２つの種を用いて、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙの第９版（１９９４）を参照して、これらの特徴を表１〜４にリストした特徴と比較した。第３選択、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ａｓｃｏｒｂａｔａも比較した。ＬＡＢ−１とこれら３種類のマッチとの生化学的プロフィルには多くの重要な相違が存在した。これらの４種類の微生物間で異なることが発見された性質を表５に示す。この情報は、脂肪酸分析の結果と共に、この微生物がＫｌｕｙｖｅｒａ属のメンバーでないという結論をもたらした。
【００５２】
【表６】
2004500806.tif 000007
【００５３】
次の論理的段階は１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子の配列を決定することであった。この手法は、現在、同定の目的のために選択すべき方法である。遺伝子配列は配列番号：１に示される。１６Ｓ　ｒＲＮＡ遺伝子配列に基づく同定は、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ　ａｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔａであると判明した。ＬＡＢ−１とＬ．ａｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔａとの間の配列相同性の相違は僅か０．５９％であった。Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ　＆　Ｇｏｅｂｅｌ，ＩＮＴ’Ｌ　Ｊ．ＳＹＳＴＥＭ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．４４：８４６（１９９４）は、これを種レベルマッチと見なすが、ＭＩＤＩ　ＬＡＢＳＴＭによって得られたデータの信頼限界は、属レベルのみにおける同定を可能にした。ＬＡＢ−１とＬ．ａｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔａ（第９版  Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １９９４）との生化学的特徴を比較すると、さらに再び、非常に多くの相違が存在する。これらの相違がこの方法に関する疑問を生じた。
【００５４】
【表７】
2004500806.tif 000008
【００５５】
同じ実験室（ＭＩＤＩ　ＬＡＢＳＴＭ）が２種類の異なる同定を生じたので、両方のアイデンティティの正当性は疑わしかった。しかし、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の配列決定は現在利用可能な最も信頼できる方法であると考えられるので、Ｌｅｃｌｅｒｃｉａ  ａｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔａの同定をさらに研究しなければならない。経験された全ての相違点によって、この未知微生物（ＬＡＢ−１）は今までに同定されたことがないと結論するのが妥当である。
【００５６】
ＬＡＢ−１によって産生されたエキソ多糖の分析はＦＡＣＥ（糖含量）及びＭＡＬＤＩ（サイズ）によって行なった。図５のＦＡＣＥゲル上に示されたバンドの強度から判定すると、存在するフコース量はガラクトース量の約２倍であり；グルコース量はガラクトース量の約２．５倍であり；マンノース量はフコース量の約３倍である。それ故、ガラクトース：フコース：グルコース：マンノースの比率は約１：２：３：６である。結合の性質と種類及びポリマーの分子量決定に関する他の研究を、当業者に知られるように、行なうことができる。
【００５７】
エキソ多糖のＭＡＬＤＩ研究の結果を図６に示す。このデータは、見出される広範囲な分子量によって実証されるように、多糖の重合と解重合とが容易に生じたことを示す。同定された全ての単糖類は、マンノース、フコース、フルクトース及びガラクトースと同じ速度で移動する中性糖と、フコースと同じ速度で移動する酸性糖と、グルコース及びフコースと同じ速度で移動するアミン糖とであった。全てが六炭素糖である。この事実は、分子量のみが知られているときにポリマーの組成を決定することを不可能にする。１８０未満の分子量を有するような物質は恐らくポリマーの分解生成物（ｂｒｅａｋｄｏｗｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）であると思われる。１０６６．３８の分子量を有する最大ポリマーは約６個の６Ｃ糖から構成された。
【００５８】
後に、マウスにおける免疫原性に関して分析した初期エキソ多糖サンプルは残留アミノ酸を含有することが判明した。存在する少量のタンパク質は培地中の酵母エキスからと死細胞からであった。存在するこれらのアミノ酸によっても、エキソ多糖が非免疫原性であることが判明したが、ごく小さい免疫原性反応が観察された。この反応は、このエキソ多糖がタンパク質を含まないように、エキソ多糖をさらに精製することを必要にした。
【００５９】
エキソ多糖からアミノ酸を除去するための最良の方法は（ｉ）アミノ酸を含まないように培地を改変することと、（ｉｉ）細胞死と細胞破壊とを防止するために微生物の増殖を制限することであった。これらの２つの改変を実施した後に、エキソ多糖がタンパク質を含まないことが発見された（示さず）。さらに深い研究を実施して、免疫原性的性質を決定するためにタンパク質を含まないエキソ多糖をＷＡＳＨＩＮＧＴＯＮ  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹＴＭ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に提供した。結果は満足できるものであり、エキソ多糖免疫化ウサギは１：１００未満（ｌｅｓｓ ｔｈａｔ １：１００）の抗体価又は検出不能を全１２週間の実験にわたって維持した。これに反して、不活化細胞免疫化ウサギは１：１，６３８，４００程度の高い抗体価に達した。
【００６０】
例えばこの研究で特徴付けられたバイオポリマーのような、非常に大きい弾性を有する非免疫原性バイオポリマーは恐らく非常に多くの産業的、農業的及びバイオメディカル用途を有するので、これらの結果は非常に有望である。
【００６１】
ＬＡＢ−１についての多くの情報が集められている。残念ながら、その完全な同定はまだ確定されていない。信頼できる同定方法が用いられているが、結果は相互に一致しない。この微生物は恐らく今までに同定されていないと思われる。
【００６２】
さらに多くの研究が是認されてから、最終的な同定を行なうことができる。さらなる研究はＬＡＢ−１と、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｋｌｕｙｖｅｒａ  ｃｒｙｏｃｒｅｓｃｅｎｓ及びＬｅｃｌｅｒｃｉａ  ａｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔａとの直接の比較を包含すべきである。これらの微生物を比較するために重要な方法は、タンパク質プロフィル測定とＤＮＡ分析を包含する。これらのアプローチから得られた結果は、系統分類的関係を良好に実証する。
【００６３】
エキソ多糖をさらに特徴付けるためには、多糖の単糖結合と分枝を測定すべきである。さらに、その全体的重合の性質を測定することは非常に有用であると考えられる。分子生物学の分野に熟練した人々に知られるように、多糖をコードする遺伝子（単数又は複数種類）の局在を測定することができる。ＬＡＢ−１を同定するためにさらに他の研究を行なうこともでき、このような研究は、染色体ＤＮＡフィンガープリント法、ランダムプライマーＰＣＲプロファイリング、ｒＲＮＡ又は他の遺伝子配列決定、Ｇ＋Ｃ％含量の測定、脂質分析及びＢＩＯＬＯＧＴＭ分析（より包括的な生化学的分析）を包含することができる。さらに、多糖の化学に関する詳細な研究が完成されることになる。
【００６４】
実施例２．工学的（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）廃棄物封じ込めと処理への応用
ＬＡＢ−１菌株を用いて、汚染された土壌と地下水の封じ込めと処理のための環境的バイオフィルムバリヤーを構築することができる。封じ込めバリヤーの目的は、廃棄物処理施設から又はこぼれ（ｓｐｉｌｌｓ）、産業プロセス、不法投棄若しくは他のソースによって汚染された状態になった地域からの化学的汚染物の移送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）を抑制することである。次のもの：（１）地表下のバイオフィルム・カットオフ壁；（２）圧縮されたバイオフィルム処理土壌から成る地表下ライナー；（３）現場（ｉｎ−ｓｉｔｕ）バイオフィルム・ライナー；及び（４）バイオフィルムによってジオテキスタイル（ｇｅｏｔｅｘｔｉｌｅｓ）を処理することによって作製されるバリヤーを包含する、幾つかの異なる種類のバリヤーが可能である。
【００６５】
本明細書に開示した結果は、本明細書に開示したバイオフィルム産生細菌の添加によって、土壌の透水係数（ｈｙｄｒａｕｌｉｃ ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）（Ｋ）を数桁減ずることができることを実証する。ＬＡＢ−１菌株を用いて得られたＫの低下は、１０−７ｃｍ／秒以下のＫ値として定義された、バリヤー物質に関する環境保護局（ＥＰＡ）基準を満たすために充分である。土壌が多様な化学的溶液によって浸透されるときに、この低い透水係数は持続し、このことはバイオフィルム・バリヤーが広範囲の汚染物と適合性であることを示唆する。本明細書に開示したバイオフィルムは、例えば拡散、吸着及び生分解のような汚染物移送機構を制御するためにも有用でありうる。
【００６６】
バイオフィルムと栄養の溶液を、一連の密接な間隔を置いた垂直穴を通して地表下に送り込む。穴周囲の土壌中でのバイオフィルム形成は、土壌浸透性の低下と、汚染物移動に対する工学的バリヤー（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｂａｒｒｉｅｒ）を形成するために充分な汚染物移送の低下とを生じる。例えば、穴の深さと間隔、送り込み圧力（ｐｕｍｐｉｎｇ ｐｒｅｓｓｕｒｅｓ）、細菌と栄養の溶液の組成、及び送り込み（ｐｕｍｐｉｎｇ）時間のような、特定の設計パラメーターはサイト特異的であり、サイト地質学、地表下汚染のタイプと程度、地下水状態、及び個別の基準で考慮しなければならない他の変数に依存する。
【００６７】
図７は、例えば埋立場（ｌａｎｄｆｉｌｌ）のような、工学的廃棄施設中への廃棄物封じ込めのための地表下ライナーの形成に対する本発明の１つの使用例を示す。埋立場１０を断面図で示す。廃棄物１２は地表下ライナー１４内に廃棄される。埋立場１０の形成中にライナー１４が配置される場合には、ライナー１４を付着させる前に、バイオフィルム・ライナーを用いることができる。さらに、廃棄物サイトを囲む封じ込め壁を垂直に立てることができ、汚染除去（ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｎｇ）バイオフィルム・バリヤーの付加的層を含めることができる。
【００６８】
例えば図７に示す埋立場のような、既存の埋立場では、廃棄物は地表下層１８と２０中に浸出物１６として浸出することができる。廃棄物１２を囲み、浸出物１６を捕捉するバイオフィルム・バリヤー壁２８を作製する。このバイオフィルム・バリヤー壁２８は、廃棄物１２が浸出しない層２２、２４中へ達するように構築される。本発明のバイオフィルムの１つの利点は、このバイオフィルムが、漏れている可能性がある既存の埋立場へのこのような補修的適用を可能にし、さらに浸出物１６が地下水層２６に達するのを防止することである。
【００６９】
例えば、バイオフィルム・バリヤー壁２８に関する現在のテクノロジーは微粒状土壌を用いることができ、これは現場圧縮して（ｆｉｅｌｄ ｃｏｍｐａｃｔｅｄ）、１０−７ｃｍ／秒未満の透水係数を得る（一般に、“粘土ライナー”と呼ばれる）。多くのサイトにおいて、このような土壌は容易に入手可能ではなく、オフ−サイトから輸送されなければならず、このことが圧縮土壌ライナーのコストを実質的に高める。本発明のＬＡＢ−１菌株を用いると、圧縮土壌ライナーのために必要な低い透水係数を得るために、容易に入手可能な土壌をバイオフィルムによって処理することによって土壌封じ込め条件を満たすことができる。
【００７０】
ＬＡＢ−１バイオフィルムの１つの特定の使用現場は、慣用的な土壌散布（ｓｏｉｌ ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）装置（例えば、ブルドーザー）を用いたゆるい（非圧縮）リフトでの非処理土壌の散布を包含する地表下バイオフィルム・ライナーの作製である。ゆるいリフトは一般に１５０〜２２５ｃｍ厚さである。水、ＬＡＢ−１及び栄養を包含する溶液を、例えば、土壌に散水するために用いられる慣用的な装置（例えば、スプリンクラー・ホース付きトラック取り付け水タンク）を用いて、土壌に供給する。次に、慣用的な装置（例えば、シープフート・ローラー）を用いて、土壌を圧縮して、典型的に１００〜１５０ｃｍの圧縮リフト厚さを生じる、指定密度を得る。必要なリフト数と、ライナー総厚さは、汚染物移送の分析と、封じ込めに対する規定必要条件とによって決定される、サイト特異的な設計パラメーターである。
【００７１】
圧縮粘土ライナーは典型的に０．６ｍ〜１．３ｍ厚さの範囲である。提案方法は、土壌をバイオフィルム産生溶液によって処理することを除いて、粘土ライナーの現場構築に類似する。或いは、ＬＡＢ−１菌株と栄養の溶液を指定深さの地中に注入して、使用現場でバイオフィルム・ライナーを作製する。このタイプのライナーは偶発的なこぼれ（ａｃｃｉｄｅｎｔａｌ ｓｐｉｌｌｓ）によって汚染されたサイトにおいて特に有用である。或いは、予め増殖したバイオフィルムを土壌中又は上に混入することができる。
【００７２】
ジオテキスタイルをバイオフィルムによって処理することによっても、地表下ライナーを構築することができる。ジオテキスタイルは一般に合成繊維から製造され、合成繊維が一緒に織られ又は絡み合って、土壌の分離、強化、濾過又は排水のために用いられる多孔質布帛を生じる。本明細書に開示するＬＡＢ−１産生バイオフィルムを含有する、適当に配備されたジオテキスタイル中にビチューメン、ゴム−ビチューメン又は他のポリマー混合物をスプレイすることによって、封じ込めバリヤーを作製することができる。ＬＡＢ−１バイオフィルムの使用の特定の１例は、ＬＡＢ−１菌株と栄養を含有する液体溶液をジオテキスタイルに塗布して、孔隙を塞ぎ、浸透性を低下させて、流れに対するバリヤーを作製することにある。
【００７３】
実施例３．材料：土壌と細菌
廃棄物封じ込め能力を分析するために本発明者が用いた土壌は、天然に生成する、容易に入手可能な砂である。この砂は、その粒度分布とＡｔｔｅｒｂｅｒｇ限界とに基づいて、統一土壌分類系において、ＳＭ、又は低塑性の沈泥状砂として分類される。浸透性試験は、最大乾燥密度まで圧縮したときに、約１．５ｘ１０−５ｃｍ／秒の飽和透水係数（Ｋ）を生じる。このＫ値はその土壌を廃棄物封じ込めバリヤーとして用いるために不適切なものにする。初期の研究は、この土壌をバイオフィルム産生菌株ＬＡＢ−１によって処理することによって、Ｋを廃棄物封じ込めのために必要な範囲内である１０−８〜１０−７ｃｍ／秒のオーダーの値にまで低下させることができることを実証した。
【００７４】
水浸透性を試験するために用いることができるバイオフィルムの形成にＬＡＢ−１菌を用いるための操作方法は、Ｄｅｎｎｉｓ，Ｍ．Ｌ．とＴｕｒｎｅｒ，Ｊ．Ｐ．のＪ．ＧＥＯＴＥＣＨＮＩＣＡＬ  ＆  ＧＥＯＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ  ＥＮＧ．１２４：１２０−１２７（１９８８）（これでは、Ｂ．ｉｎｄｉｃａ菌に対して同様な方法を用いている）が教えているように、次の工程：（１）土壌を円筒形試験体に圧縮成形し、この試験体をフレキシブルな壁透過率計（ｗａｌｌ ｐｅｒｍｅａｍｅｔｅｒ）に入れる工程と；（２）試験体にＬＡＢ−１含有溶液を浸透させる工程と；（３）試験体に最初に栄養溶液を浸透させ、次に水を浸透させながら、土壌の透水係数を測定する工程とを包含しうる。
【００７５】
本明細書に開示するＬＡＢ−１菌種によって産生されるバイオフィルムを用いると、約１週間の栄養溶液による浸透を必要とした、充填バイオフィルムの確立時に、透水係数はＫ＝１．５ｘ１０−５から約Ｋ＝５ｘ１０−８ｃｍ／秒までに低下した。この低下の大部分は１〜２日間内に生じて、この期間中にＫは１０−７ｃｍ／秒未満に低下した。
【００７６】
図８は、ＬＡＢ−１によって処理した試験体に関する透水係数対時間を示すグラフである。栄養溶液を６日間後に中断したとしても、低い透水係数は１６０日間以上にわたって持続した。
【００７７】
実施例４．農業への用途
地球の広大な面積が、大規模な開墾なしには耕作に適さない不毛の土地を包含する。不毛の土地の状況下での開墾は灌漑のみでなく、広範囲にわたる土壌改良も必要とする。非生産性の不毛の土地を生産性の農地に上首尾に変換することの経済的及び社会的影響は莫大であり、人類にかなりの利益をもたらす。
【００７８】
土壌処理のためのサポートと栄養の生物学的かつ環境的に健全なソースとしてのＬＡＢ−１の使用は、本明細書に述べるように、砂質の土壌の農業的性質を改良する。多くの天然に存在する不毛の土壌は風成のもの（風によって堆積）であり、砂とシルト・サイズ粒子とから成り、有機分を殆ど又は全く含まない。このような土壌は非常に多孔質であり、このことが作物のために灌漑水を最も必要とする表面からの灌漑水の迅速なしみ込みとしみ出しを促進する。有機物質が存在しないことは一般に、低い栄養分に相当する。多くの不毛の地域は活発な風成環境であり、このような環境では風が沈降移送の主要な作因である。
【００７９】
上部土壌が侵食され、風によって移送されると、農業的発達は重度に影響される。農業用土壌の必要条件に対して砂質の不毛の土壌の特徴を考慮して、本発明は、次のような土壌農業的性質：（１）改良された保水特徴の改良；（２）強化された、植物生長を確立し，支持する能力；及び（３）改良された侵食抵抗性を改良するための農業用土壌の処理へのＬＡＢ−１由来バイオフィルムの使用を包含する。これらの改良は、完成した若しくは乾燥させ、粉末化したバイオフィルムの添加によって、又は慣用的な土壌給水装置（例えば、スプリンクラー・ホース付きトラック取り付けタンク若しくは慣用的な灌漑システム）を用いた、細菌／栄養溶液中のＬＡＢ−１菌種の供給によって達成されうる。
【００８０】
本発明のバイオフィルムは土壌処理のために用いられている。バイオフィルムは土壌の性質を多くの方法で変化させ、農業を支持する土壌の能力を強化した。これらは次の事柄：（１）砂の改良された保湿能力；（２）植物生長のための栄養源として機能する多糖類としてのバイオマス増加；（３）土壌粘着力（ｓｏｉｌ ｃｏｈｅｓｉｏｎ）の改良；及び（４）土壌の侵食抵抗性の増強を包含する。
【００８１】
実施例５．医療的用途
ＬＡＢ−１菌のバイオフィルムは、その低い抗原性、非毒性及びその生分解性を含めて、医用デバイス及び処置において可能な商業的用途を有する、多くの特徴を有する。これらの消費者用途のために、例えば、濃ＮａＯＨを細胞培養に０．２Ｍの最終濃度で加え、続いて３倍量のエタノールを加えてポリマー及びその他の物質を沈降させることによって、エキソ多糖を精製することができる。沈殿を回収して、オリジナル量の半分の水に再溶解する。フェノールによる２回の抽出又は限外濾過によってタンパク質を除去する。当業者に知られるように、水相を透析し、凍結乾燥し、磨砕して、微細な白色粉末を得る。
【００８２】
或いは、エキソ多糖は細胞結合していないので、ＬＡＢ−１によって産生されたエキソ多糖を、アルカリ処理もフェノール抽出も用いずに、精製することができる。これによって精製プロセスが簡単化されるのみでなく、これは精製ＬＡＢ−１エキソ多糖からのアルカリ不安定なアセチル部分の除去を防止することもできる。
【００８３】
ＧｅｒｈａｒｄｔがＭａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１９９１）に述べているフェノール反応によって、培養ブイヨン及びポリマー溶液中の総炭水化物濃度を測定することができる。グルコース、ガラクトース及びキサンタンガム（ＳＩＧＭＡ　ＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＣＯ．ＴＭ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を基準として用いることができる。培養ブイヨン及びポリマー溶液中の総タンパク質濃度はＢＩＯ−ＲＡＤＴＭタンパク質アッセイ（ＢＩＯ−ＲＡＤ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳＴＭ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）を用いて測定することができる。リソザイムを基準として用いることができる。細胞を０．２Ｍ  ＮａＯＨ中でボイルすることによって、細胞タンパク質を放出させることができる。
【００８４】
精製した多糖をさらに、１２０℃の１Ｍトリフルオロ酢酸中で３０分間〜２時間の範囲内の時間加水分解することができる。多糖加水分解物中の単糖は、例えば、８５℃で操作し、溶離剤として水を用いる、ＢＲＯＷＮＬＥＥＴＭポリポア（ｐｏｌｙｐｏｒｅ）ＰＢ，リード負荷（ｌｅａｄ ｌｏａｄｅｄ）カチオン交換カラムを装備したＷＡＴＥＲＳＴＭＨＰＬＣを用いて、分離することができる。検出は，例えば、ＷＡＴＥＲＴＭＭｏｄｅｌ  ４０１示差屈折率検出器を用いて、屈折率によって行なうことができる。
【００８５】
この多糖をプロトンＮＭＲ分光法と赤外線分光法によってさらに特徴付けることができる。赤外線分析を、単糖組成データと共に、突然変異体又は遺伝子操作された菌株からの多糖類の組成及びＩＲスキャンに比較して、構造の変化を検出することができる。
【００８６】
本発明のバイオフィルムは、非−又は弱−免疫原性であるので、抗原のためのレザバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）を提供するワクチン・アジュバント又はキャリヤーとして用いることができる。本発明のＬＡＢ−１由来バイオフィルムを用いて、アジュバントを製造することができる。Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｋｙ等，“Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，第２版，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９７６と、Ｒ．Ｗ．Ｒｏｅｓｋｅ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（Ｎ．Ｙ．）３，１０２（１９８１）が述べているような、多くの確立された方法のいずれかによって、アジュバントを合成することができる。
【００８７】
特に有用な方法は、Ｃ．Ｐｅｎｎｅｙ等，Ｊ．Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　５０，１４５７−１４５９（１９８５）が述べているメタンスルホン酸触媒エステル化方法である。アジュバントの製造中に、反応性官能基を一時的に保護することが望ましいと考えられる。例えば、アミンはウレタンタイプ基によって、アルコールはｔ−ブチル又はベンジル基によって、酸はエステル基によって保護することができる。
【００８８】
今までに述べた手法のいずれかによって、アジュバントを精製することができる。このような精製手法の１つはシリカゲル・クロマトグラフィー、特に、Ｗ．Ｃｌａｒｋ　Ｓｔｉｌｌ等，Ｊ．Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４３，２９２３−２９２５（１９７８）が述べている“フラッシュ”（迅速）クロマトグラフィー法である。しかし、ＨＰＬＣを含めた、他のクロマトグラフィー方法も、アジュバントの精製のために用いることができる。アジュバントを精製するために結晶化も用いることができる。場合によっては、分析純度の生成物が合成から直接得られるので、精製は不要である。ワクチン製剤にアジュバントを製剤化する方法は当該技術分野において周知であり、本明細書には詳述しない。
【００８９】
本発明の基本細菌はヒト病原菌であるように思われず、そのエキソ多糖は毒性でも抗原性でもなく、細菌増殖を容易には支持しないので、このエキソ多糖は腫脹血漿 増量剤（ｏｎｃｏｔｉｃ ｐｌａｓｍａ ｅｘｐａｎｄｅｒ）の理想的なソースを提供する。その上、エキソ多糖が固有の抗原性を有さないことは、これを例えばあらゆる哺乳動物に用いるための理想的な候補にしている。したがって、本発明は、水溶液中に入れたときに、それを必要とする対象の血漿量を増量するために用いることができる、成分の混合物を包含する。
【００９０】
本発明をさらに説明するために、本発明による血漿増量成分の混合物を水溶液として考察することにする。本発明の以下の説明から、当業者はこの混合物を乾燥混合物として生成して、必要に応じて、塩化ナトリウム、流体及び／又はデキストロース等の量に合わせて調節することができることが期待される。
【００９１】
上記成分混合物のエキソ多糖膨張剤（ｏｎｃｏｔｉｃ ａｇｅｎｔ）は、一般に水半溶解性である膨張剤である。水半溶解性膨張剤とは、生きている対象の循環血漿の流体相中に溶解したときに、毛細血管床の穴（ｆｅｎｅｓｔｒａｔｉｏｎ）を通って体組織の間隙スペース中に入って循環からそれらが即座に失われることを阻止するために充分なサイズである部分的水溶性分子を意味する。したがって、多糖膨張剤なる用語は、キチンのような多糖を包含しない、この理由はキチンは水中に溶解しないからである。
【００９２】
精製エキソ多糖を生体適合性流体中に溶解することによって、血漿 増量剤は製造される。本発明による血漿 増量剤溶液は、非限定的に、ナトリウムイオン（１１０〜１２０ｍＥｑ／ｌ）と、カルシウムイオン（５ｍＥｑ／ｌ）と、カリウムイオン（０〜３ｍＥｑ／ｌ）と、マグネシウムイオン（０〜０．９ｍＥｑ／ｌ）と、ビタミンＫ（０〜１０ｍｇ／対象又は０〜３ｍｇ／ｌ）を含めた、付加的成分をさらに含有することができる。さらに、この 増量剤を約ｐＨ７．４に緩衝化して、同化可能な（ａｓｓｉｍｉｌａｂｌｅ）糖（例えば、５〜１０ｍＭのデキストロース又はグルコース）を生成することができる。この増量剤を無菌溶液として提供することが好ましいが、この増量剤を無菌式に再構成することができる、又は再構成後に滅菌することができる粉末として提供することもできる。
【００９３】
本発明を例示的な実施態様を参照して説明してきたが、この説明は制限の意味で解釈されるように意図されない。例示的実施態様の種々な改変及び組み合わせ並びに本発明の他の実施態様は、この説明を参照するならば、当業者に自明であろう。それ故、特許請求の範囲が任意のこのような改変又は実施態様を包含することが意図される。本明細書に引用された参考文献の全ては明白に本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、１００ｘ倍率でのＧｒａｍ染色したＬＡＢ−１の写真である。
【図２】
図２は、固体培養上で増殖した、ＬＡＢ−１及びＢ．ｉｎｄｉｃｉａの総タンパク質分のＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図３】
図３は、液体培養中で増殖した、ＬＡＢ−１及びＢ．ｉｎｄｉｃｉａの総タンパク質分のＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【図４】
図４は、ＬＡＢ−１中の脂肪酸のガスクロマトグラフィーからのデータである。
【図５】
図５は、ＬＡＢ−１によって産生されるエキソ多糖中で同定された糖を示すＦＡＣＥゲルである。レーン：１−ＭＯＮＯラダー基準２（各単糖１００ｐｍｏｌ）；２−アミン加水分解反応生成物；３［Ｓ］−ＭＯＮＯラダー基準２（各単糖１００ｐｍｏｌ；［Ｓ］スキャンに示したトレースに関して走査）；４−中性加水分解反応生成物；５−シアル酸加水分解反応生成物；６−ＮＡＮＡ標識対照１（１００ｐｍｏｌ）；７−ＭＯＮＯ組成物対照；８−ＭＯＮＯラダー基準２（各単糖１００ｐｍｏｌ）。
【図６】
図６は、ＬＡＢ−１によって産生されたエキソ多糖のＭＡＬＤＩトレースである。
【図７】
図７は、本発明のバイオフィルムによって作製されたバリヤーの断面図である。
【図８】
図８は、ＬＡＢ−１含有バイオフィルムの透水係数対時間のグラフである。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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