(57)【要約】本発明は、核酸によってコードされたＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする核酸に関する。本発明はまた、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターおよびこのようなベクターで形質転換された宿主細胞に関する。本発明はまた、病原性Ｃ型肝炎ウイルス株から選択されたＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする核酸を使用したツーハイブリッド方法およびＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドとこれに特異的に結合するポリペプチドとの間の結合を阻害する分子の選択法に関する。
2004507235.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生理学的条件下で配列番号１〜３８が天然に存在するＣ型肝炎タンパク質に特異的に結合する、実質的に配列番号１〜３８のアミノ酸配列またはその変異体からなるポリペプチドをコードする核酸、またはそれに相補的な配列。
【請求項２】
実質的に配列番号１〜３８のアミノ酸配列からなるポリペプチドと少なくとも９５％のアミノ酸が同一であるポリペプチドをコードする、請求項１記載の核酸配列またはそれに相補的な配列。
【請求項３】
実質的に配列番号３９〜７６またはその相補配列からなる、請求項１記載の核酸配列。
【請求項４】
実質的に配列番号３９〜７６からなる核酸と少なくとも９５％の核酸が同一である、請求項１記載の核酸。
【請求項５】
実質的に、
−配列番号１の４５個の連続アミノ酸、
−配列番号２の３０個の連続アミノ酸、
−配列番号３の６５個の連続アミノ酸、
−配列番号４の３０個の連続アミノ酸、
−配列番号５の１３０個の連続アミノ酸、
−配列番号６の２５個の連続アミノ酸、
−配列番号７の２３個の連続アミノ酸、
−配列番号８の４８個の連続アミノ酸、
−配列番号９の３６個の連続アミノ酸、
−配列番号１０の２５個の連続アミノ酸、
−配列番号１１の２４個の連続アミノ酸、
−配列番号１２の３７個の連続アミノ酸、
−配列番号１３の２５個の連続アミノ酸、
−配列番号１４の３０個の連続アミノ酸、
−配列番号１５の２７個の連続アミノ酸、
−配列番号１６の６９個の連続アミノ酸、
−配列番号１７の１３０個の連続アミノ酸、
−配列番号１８の３３個の連続アミノ酸、
−配列番号１９の２５個の連続アミノ酸、
−配列番号２０の４０個の連続アミノ酸、
−配列番号２１の７８個の連続アミノ酸、
−配列番号２２の３９個の連続アミノ酸、
−配列番号２３の５７個の連続アミノ酸、
−配列番号２４の２６個の連続アミノ酸、
−配列番号２５の６８個の連続アミノ酸、
−配列番号２６の３４個の連続アミノ酸、
−配列番号２７の４２個の連続アミノ酸、
−配列番号２８の４８個の連続アミノ酸、
−配列番号２９の１０２個の連続アミノ酸、
−配列番号３０の４９個の連続アミノ酸、
−配列番号３１の９２個の連続アミノ酸、
−配列番号３２の４９個の連続アミノ酸、
−配列番号３３の５５個の連続アミノ酸、
−配列番号３４の６９個の連続アミノ酸、
−配列番号３５の２３個の連続アミノ酸、
−配列番号３６の３３個の連続アミノ酸、
−配列番号３７の３２個の連続アミノ酸、または
−配列番号３８の２２個の連続アミノ酸、
からなるアミノ酸を有するポリペプチドをコードする、請求項１記載の核酸。
【請求項６】
配列番号１〜３８の１つのアミノ酸が１〜３つの置換、付加、または欠失を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１記載の核酸またはその相補配列、または請求項５記載のポリペプチドをコードする核酸またはその相補配列。
【請求項７】
生理学的条件下で配列番号１〜３８が天然に存在するＣ型肝炎タンパク質に特異的に結合する、実質的に配列番号１〜３８のアミノ酸配列またはその変異体からなるポリペプチド。
【請求項８】
該ポリペプチドが配列番号１〜３８のアミノ酸配列またはその変異体と少なくとも９５％のアミノ酸が同一である、請求項７記載のポリペプチド。
【請求項９】
実質的に、
−配列番号１の４５個の連続アミノ酸、
−配列番号２の３０個の連続アミノ酸、
−配列番号３の６５個の連続アミノ酸、
−配列番号４の３０個の連続アミノ酸、
−配列番号５の１３０個の連続アミノ酸、
−配列番号６の２５個の連続アミノ酸、
−配列番号７の２３個の連続アミノ酸、
−配列番号８の４８個の連続アミノ酸、
−配列番号９の３６個の連続アミノ酸、
−配列番号１０の２５個の連続アミノ酸、
−配列番号１１の２４個の連続アミノ酸、
−配列番号１２の３７個の連続アミノ酸、
−配列番号１３の２５個の連続アミノ酸、
−配列番号１４の３０個の連続アミノ酸、
−配列番号１５の２７個の連続アミノ酸、
−配列番号１６の６９個の連続アミノ酸、
−配列番号１７の１３０個の連続アミノ酸、
−配列番号１８の３３個の連続アミノ酸、
−配列番号１９の２５個の連続アミノ酸、
−配列番号２０の４０個の連続アミノ酸、
−配列番号２１の７８個の連続アミノ酸、
−配列番号２２の３９個の連続アミノ酸、
−配列番号２３の５７個の連続アミノ酸、
−配列番号２４の２６個の連続アミノ酸、
−配列番号２５の６８個の連続アミノ酸、
−配列番号２６の３４個の連続アミノ酸、
−配列番号２７の４２個の連続アミノ酸、
−配列番号２８の４８個の連続アミノ酸、
−配列番号２９の１０２個の連続アミノ酸、
−配列番号３０の４９個の連続アミノ酸、
−配列番号３１の９２個の連続アミノ酸、
−配列番号３２の４９個の連続アミノ酸、
−配列番号３３の５５個の連続アミノ酸、
−配列番号３４の６９個の連続アミノ酸、
−配列番号３５の２３個の連続アミノ酸、
−配列番号３６の３３個の連続アミノ酸、
−配列番号３７の３２個の連続アミノ酸、または
−配列番号３８の２２個の連続アミノ酸からなる、請求項７記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号１〜３８のアミノ酸配列または請求項９記載の該ポリペプチドの１つのアミノ酸の１〜３つの置換、付加、または欠失を含むアミノ酸配列を有する、請求項７記載のポリペプチド。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか一項記載のポリペプチドに対する抗体。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか一項記載の核酸を挿入されて含む、組換えベクター。
【請求項１３】
ｐＡＣＴＩＩｓｔプラスミドまたはｐＡＳ２ΔΔプラスミドである、請求項１２記載の組換えベクター。
【請求項１４】
ｐＴ２５、ｐＫＴ２５、ｐＵＴ１８、またはｐＵＴ１８Ｃである、請求項１２記載の組換えベクター。
【請求項１５】
ｐＰ６またはｐＢ５である、請求項１２記載の組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１２〜１５のいずれか一項記載のベクターまたは請求項１〜６のいずれか一項記載の核酸で形質転換された細胞宿主。
【請求項１７】
ａ）適切な培地中で請求項１６記載の宿主細胞を培養する工程と、
ｂ）培養上清または細胞溶解物から組換えポリペプチドを回収する工程とを含む、請求項７〜１０のいずれか一項記載のポリペプチドの産生方法。
【請求項１８】
ａ）アッセイすべきプレイポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された組換え酵母細胞クローンコレクションの少なくとも１つの第１の組換え酵母細胞クローンを請求項７〜１０のいずれか一項記載のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードするベイトポリペプチドを含むプラスミドで形質転換された第２の半数体組換えサッカロマイセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞クローンと交配させる工程と、
ｂ）選択培地にて工程ａ）で得られた二倍体を培養する工程と、
ｃ）該選択培地で増殖した組換え細胞クローンを選択する工程とを含む、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドに結合するプレイポリペプチドをコードする核酸インサートを含むベクターを含む組換え細胞クローンを選択するための、酵母ツーハイブリッドシステム方法。
【請求項１９】
ｄ）工程ｃ）で選択された各組換え細胞クローン中に含まれるプレイポリペプチドを特徴付ける工程をさらに含む、請求項１８記載の酵母ツーハイブリッド方法。
【請求項２０】
ａ）細菌細胞クローンを請求項７〜１０のいずれか一項記載のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードするＳＩＤ（登録商標）ポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換する工程と、
ｂ）各プレイポリヌクレオチドが、所望の生物ゲノム由来のＤＮＡフラグメントであり、各プレイプラスミドが、組換え酵母細胞クローンコレクションの１つの組換え酵母細胞クローン中に含まれる、プレイポリヌクレオチドを含むプレイプラスミドをレスキューする工程と、
ｃ）工程ａ）で得られた組換え細菌細胞クローンを工程ｂ）でレスキューしたプラスミドで形質転換する工程と、
ｄ）選択培地にて工程ｃ）で得られた細菌組換え細胞を培養する工程と、
ｅ）該選択培地で増殖した組換え細胞クローンを選択する工程とを含む、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドに結合するプレイポリペプチドをコードするプレイポリヌクレオチドを含む組換え細胞クローンを同定するための、細菌ツーハイブリッド方法。
【請求項２１】
ｆ）工程ｅ）で選択された各組換え細胞クローン中に含まれるプレイポリペプチドを特徴付ける工程をさらに含む、請求項２０記載の細菌ツーハイブリッド方法。
【請求項２２】
該ポリペプチドが、ヒトポリペプチドである、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
該プレイポリペプチドが、ＨＣＶポリペプチドである、請求項１８〜２１のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
該プレイポリペプチドが、ヒトに病原性であるＨＣＶ株によってコードされる、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
実質的に、
（ｉ）請求項７〜１０のいずれか一項記載のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする第１核酸と、
（ｉｉ）（ｉ）で定義のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドに特異的に結合するプレイポリペプチドをコードする第２の核酸とからなる、２つの核酸の組。
【請求項２６】
実質的に、
配列番号７７／ 配列番号１； 配列番号７８／ 配列番号２； 配列番号７８／ 配列番号３； 配列番号７９／ 配列番号４； 配列番号８０／ 配列番号５；配列番号８１／ 配列番号６； 配列番号８２／ 配列番号７； 配列番号８３／ 配列番号８； 配列番号８４／ 配列番号９； 配列番号８５／ 配列番号１０； 配列番号８６／ 配列番号１１； 配列番号８７／ 配列番号１２； 配列番号８８／ 配列番号１３； 配列番号８９／ 配列番号１４； 配列番号９０／ 配列番号１５； 配列番号９１／ 配列番号１６； 配列番号９２／ 配列番号１７； 配列番号９３／ 配列番号１８； 配列番号９４／ 配列番号１９； 配列番号９５／ 配列番号２０； 配列番号９６／ 配列番号２１； 配列番号９７／ 配列番号２２； 配列番号９８／ 配列番号２３； 配列番号９９／ 配列番号２４； 配列番号１００／ 配列番号２５； 配列番号１０１／ 配列番号２６； 配列番号１０２／ 配列番号２７； 配列番号１０３／ 配列番号２８； 配列番号１０４／ 配列番号２９； 配列番号１０５／ 配列番号３０； 配列番号１０６／ 配列番号３１； 配列番号１０７／ 配列番号３２； 配列番号１０８／ 配列番号３３； 配列番号１０９／ 配列番号３４； 配列番号１１０／ 配列番号３５； 配列番号１１１／ 配列番号３６； 配列番号１１２／ 配列番号３７； 配列番号１１３／ 配列番号３８； 又は配列番号１１４／ 配列番号３９．
からなる、生理学的条件下で天然に存在するＣ型肝炎タンパク質に特異的に結合する、２つの核酸の組。
【請求項２７】
実質的に、
ｉ）請求項７〜１０のいずれか一項記載のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドからなる第１のポリペプチドと、
ｉｉ）第１のポリペプチドに特異的に結合するプレイポリペプチドとも呼ばれる第２のポリペプチドとからなる、２つのポリペプチドの組。
【請求項２８】
実質的に、
配列番号１１４／ 配列番号３９； 配列番号１１５／ 配列番号４０； 配列番号１１５／ 配列番号４１； 配列番号１１６／ 配列番号４２； 配列番号１１７／ 配列番号４３； 配列番号１１８／ 配列番号４４； 配列番号１１９／ 配列番号４５； 配列番号１２０／ 配列番号４６； 配列番号１２１／ 配列番号４７； 配列番号１２２／ 配列番号４８； 配列番号１２３／ 配列番号４９； 配列番号１２４／ 配列番号５０； 配列番号１２５／ 配列番号５１； Ｎｏ． １２６／ 配列番号５２； 配列番号１２７／ 配列番号５３； 配列番号１２８／ 配列番号５４； 配列番号１２９／ 配列番号５５； 配列番号１３０／ 配列番号５６； 配列番号１３１／ 配列番号５７； 配列番号１３２／ 配列番号５８； 配列番号１３３／ 配列番号５９； 配列番号１３４／ 配列番号６０； 配列番号１３５／ 配列番号６１； 配列番号１３６／ 配列番号６２； 配列番号１３７／ 配列番号６３； 配列番号１３８／ 配列番号６４； Ｎｏ． １３９／ 配列番号６５； 配列番号１４０／ 配列番号６６； 配列番号１４１／ 配列番号６７； 配列番号１４２／ 配列番号６８； 配列番号１４３／ 配列番号６９； 配列番号１４４／ 配列番号７０； 配列番号１４５／ 配列番号７１； 配列番号１４６／ 配列番号７２； 配列番号１４７／ 配列番号７３； 配列番号１４８／ 配列番号７４； 配列番号１４９配列番号７５； 又は配列番号１５０／ 配列番号７６．
からなる、生理学的条件下で天然に存在するＣ型肝炎タンパク質に特異的に結合する、２つのポリペプチドの組。
【請求項２９】
請求項２７または２８記載の２つのポリペプチドの間で形成された複合体。
【請求項３０】
ａ）試験すべき分子を含む選択培地にて、その発現が組換え宿主細胞に有毒であるレポーター遺伝子を含む組換え宿主細胞を培養する工程において、該宿主細胞が、
ｉ）第１のベクターが、該２つのポリヌクレオチドの１つとＤＮＡ結合ドメインとを含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、
ｉｉ）第２のベクターが、該２つのポリペプチドのうちの第２のポリペプチドを含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸と該第１および該第２のハイブリッドポリペプチドが相互作用した場合に該有毒レポーター遺伝子を活性化することができる活性化ドメインとを含む、２つのベクターで形質転換されており、そして有毒レポーター遺伝子が活性化されない場合に該組換え宿主細胞を増殖可能にする工程と、
ｂ）工程ａ）で定義の組換え宿主細胞の増殖を阻害する分子を選択する工程とを含む、請求項２７または２８記載の２つのポリペプチドの組の間の結合を阻害する分子の選択方法。
【請求項３１】
ａ）試験すべき分子を含む選択培地にて、その発現が組換え宿主細胞に有毒であるレポーター遺伝子を含む組換え宿主細胞を培養し、該宿主細胞が、
ｉ）第１のベクターが、該２つのポリヌクレオチドの１つと酵素の第１のドメインとを含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、
ｉｉ）第２のベクターが、該２つのポリペプチドのうちの第２のポリペプチドを含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸と該第１および該第２のハイブリッドポリペプチドが、相互作用した場合に該有毒レポーター遺伝子を活性化することができる該酵素の第２の部分とを含み、該相互作用により酵素の触媒活性が回復となり、２つのベクターで形質転換されており、有毒遺伝子が活性化されない場合に該組換え宿主細胞が増殖する工程と、
ｂ）工程ａ）で定義の該組換え宿主細胞の増殖を阻害する分子を選択する工程とを含む、請求項２７または２８記載の２つのポリペプチドの組のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する分子の選択方法。
【請求項３２】
請求項２７または２８記載の２つのポリペプチドの組のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する分子をスクリーニングするためのキットであって、該キットは、その発現が組換え該細胞宿主に有毒なレポーター遺伝子を含む組換え細胞宿主を含み、該細胞宿主が、
ｉ）第１のベクターが、２つのポリペプチドのうちの１つを含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリペプチドおよびＤＮＡ結合ドメインを含む核酸を含み、
ｉｉ）第２のベクターが、該２つのポリペプチドのうちの第２のポリペプチドを含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該第１および該第２のハイブリッドポリペプチドが相互作用した場合に該有毒レポーター遺伝子を活性化することができる活性化ドメインを含む核酸を含む、２つのベクターで形質転換されている、キット。
【請求項３３】
請求項２７または２８記載の２つのポリペプチドの組のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する分子をスクリーニングするためのキットであって、該キットは、その発現が該組換え細胞宿主に有毒なレポーター遺伝子を含む組換え細胞宿主を含み、該細胞宿主が、
ｉ）第１のベクターが該２つのポリペプチド組のうちの１つを含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび酵素の第１のドメインを含む核酸を含み、
ｉｉ）第２のベクターが該２つのポリペプチドのうちの第２のポリペプチド含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび該第１および該第２のハイブリッドポリペプチドが相互作用した場合に該有毒レポーター遺伝子を活性化することができる酵素の第２の部分を含む核酸を含み、該相互作用により酵素の触媒活性が回復する、２つのベクターで形質転換されている、キット。
【請求項３４】
ａ）請求項７〜１０のいずれか一項記載の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体と、
ｂ）それに結合した検出可能分子とを含む、マーカー化合物。
【請求項３５】
前記検出可能分子が、蛍光タンパク質を含む、請求項３４記載のマーカー化合物。
【請求項３６】
前記検出タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）である、請求項３５記載のマーカー化合物。
【請求項３７】
前記検出可能分子が、触媒活性を付与されている、請求項３４記載のマーカー化合物。
【請求項３８】
前記検出可能分子が、加水分解酵素、転移酵素、脱離酵素、異性化酵素、リガーゼ、合成酵素、または酸化還元酵素である、請求項３７記載のマーカー化合物。
【請求項３９】
前記検出可能分子が、放射性である、請求項３４記載のマーカー化合物。
【請求項４０】
前記検出可能分子が、化学発光性である、請求項３４記載のマーカー化合物。
【請求項４１】
前記検出可能分子が、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体に共有結合している、請求項３４〜４０のいずれか一項記載のマーカー化合物。
【請求項４２】
前記検出可能分子が、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体に非共有結合している、請求項３４〜４０のいずれか一項記載のマーカー化合物。
【請求項４３】
前記検出可能分子が、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドに特異的な抗体である、請求項４２記載のマーカー化合物。
【請求項４４】
前記抗体が、放射性または非放射性標識されている、請求項４３記載のマーカー化合物。
【請求項４５】
ａ）前記選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体が、第１のリガンドに共有結合し、
ｂ）前記検出可能分子が、該第１のリガンドに特異的に結合する第２のリガンドを含む、請求項３４記載のマーカー化合物。
【請求項４６】
前記第１のリガンドが、ビオチンであり、前記第２のリガンドが、ストレプトアビジンである、請求項４５記載のマーカー化合物。
【請求項４７】
請求項３４〜４１のいずれか一項記載のマーカー化合物をコードする核酸。
【請求項４８】
請求項４５および４６で定義の第１のリガンドに共有結合した前記選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸。
【請求項４９】
請求項４７および４８のいずれか一項記載の核酸が挿入されて含む、組換えベクター。
【請求項５０】
ｐＡＣＴＩＩｓｔ、ｐＡＳΔΔ、ｐＴ２５、ｐＫＴ２５、ｐＵＴ１８、ｐＵＴ１８Ｃ、ｐＰ６、またはｐＢ５である、請求項４８記載の組換えベクター。
【請求項５１】
請求項４７または４８記載の核酸、または請求項４９または５０記載の組換えベクターでトランスフェクションされている、組換え宿主細胞。
【請求項５２】
原核生物起源である、請求項５１記載の組換え宿主細胞。
【請求項５３】
真核生物起源である、請求項５１記載の組換え宿主細胞。
【請求項５４】
哺乳動物宿主細胞である、請求項５３記載の組換え宿主細胞。
【請求項５５】
ａ）請求項３４〜４６のいずれか一項記載のマーカー化合物をサンプルに接触させる工程と、
ｂ）該マーカー化合物と該目的のポリペプチドとの間で形成された複合体を検出する工程とを含む、サンプル中の目的のポリペプチドを検出する方法。
【請求項５６】
請求項３４〜４６のいずれか一項記載のマーカー化合物を含む、サンプル中の目的のポリペプチドを検出するためのキット。
【請求項５７】
ａ）アッセイすべき細胞宿主を得る工程と、
ｂ）前記宿主細胞を請求項４７または４８記載の核酸または請求項４９または５０記載の組換えベクターでトランスフェクションを行う工程と、
ｃ）前記トランスフェクション細胞宿主によって発現されたマーカー化合物と目的のポリペプチドとの間で形成された複合体を検出する工程とを含む、原核生物または真核生物宿主細胞中の目的のポリペプチドを検出する方法。
【請求項５８】
請求項４７または４８記載の核酸または請求項４９または５０記載の組換えベクターを含む原核生物または真核生物宿主細胞中の目的のポリペプチドを検出するためのキット。
【請求項５９】
ａ）アッセイすべき細胞宿主を得る工程と、
ｂ）該細胞宿主中に請求項３４〜４６のいずれか一項記載のマーカー化合物を導入する工程と、
ｃ）前記細胞中でマーカー化合物と目的のポリペプチドとの間で形成された複合体を検出する工程とを含む、
原核生物または真核生物宿主細胞中の目的のポリペプチドを検出する方法。
【請求項６０】
請求項３４〜４６のいずれか一項記載のマーカー化合物を含む、原核生物または真核生物宿主細胞中の目的のポリペプチドを検出するためのキット。
【請求項６１】
ａ）その上に、請求項７〜１０のいずれか一項記載の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体、または請求項７〜１０のいずれか一項記載の複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドが固定された基質を得る工程と、
ｂ）工程ａ）で定義の基質にアッセイすべきサンプルを接触させる工程と、
ｃ）選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体または複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドと最初からサンプル中に含まれる分子または複数の分子との間で形成された複合体を検出する工程とを含む、
サンプル中の目的のポリペプチドまたは複数のポリペプチドを検出する方法。
【請求項６２】
前記複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体が、規則正しい様式で基質に固定されている、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体、または前記複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体が基質に共有結合されている、請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
前記選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体または前記複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体が基質に非共有結合されている、請求項６１記載の方法。
【請求項６５】
前記選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体または前記複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体が第１のリガンドに共有結合されており、前記基質が前記第１のリガンドに特異的に結合する第２のリガンドでコートされている、請求項６１記載の方法。
【請求項６６】
前記第１のリガンドがビオチンであり、前記第２のリガンドがストレプトアビジンである、請求項６１記載の方法。
【請求項６７】
前記選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体または前記複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体がスペーサーに共有結合し、該スペーサーが前記選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体または該複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドを固定するために基質に共有結合している、請求項６１〜６６のいずれか一項記載の方法。
【請求項６８】
前記検出工程ｃ）が前記基質の光学的特徴の変化を検出することからなる、請求項６１〜６７のいずれか一項記載の方法。
【請求項６９】
請求項７〜１０のいずれか一項記載の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体または請求項７〜１０のいずれか一項記載の前記複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体が固定されている基質を有する、サンプル中の目的のポリペプチドまたは複数のポリペプチドを検出するためのデバイス。
【請求項７０】
薬学的有効量の請求項７〜１０のいずれか一項記載の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、薬学的組成物。
【請求項７１】
ヒトまたは動物のＣ型肝炎ウイルスによるウイルス感染症を予防または治療するための薬物を製造するための請求項７〜１０のいずれか一項記載の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸の使用。
【請求項７２】
請求項７〜１０のいずれか一項記載の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸の使用であって、該ポリヌクレオチドがヒトまたは動物のＣ型肝炎ウイルスによるウイルス感染症を予防または治療するための薬物を製造するための該ヒトまたは該動物で機能的な調節配列の制御下に置かれている、使用。
【請求項７３】
ヒトまたは動物におけるウイルスまたは細菌感染症を予防または治療するための薬物を製造するための請求項７〜１０のいずれか一項記載の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターの使用。
【請求項７４】
１）所定の目的のベイトポリペプチドに特異的に結合する核酸（プレイ核酸）コレクションを選択する工程と、
２）下記
ａ）工程１）の最後で得られたプレイ核酸コレクションから、該ベイトポリペプチドと相互作用し、かつ共通の核酸フラグメントを含むことができるプレイポリペプチドをコードする全てのプレイヌクレオチドを選択する工程と、
ｂ）工程ａ）で選択したプレイポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を整列させて各核酸長の３０％以上が重複する配列を有するヌクレオチド配列を一組または複数の組の配列に集める工程であって、１組の配列中の各共通の重複ヌクレオチド配列によりプレＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列が定義され、
ｃ）２つの各プレＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする２つの配列を整列させる工程であって、
ｉ）重複配列が少なくとも３０ヌクレオチド長である場合、２つの各プレＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列の間の重複核酸配列を、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列と定義し、
ｉｉ）（１）非重複配列が３０以上のヌクレオチド長であり、かつ（２）非重複配列が各プレＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列の定義に使用されたプレイポリヌクレオチド組中に含まれる、任意の１つのポリヌクレオチドの長さの少なくとも３０％を示す場合、２つの各プレＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列の間の非重複核酸配列を、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列と定義する工程、
によってＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする核酸配列を決定する工程とを含む、
選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドの選択方法。
【請求項７５】
該選択工程１）が酵母ツーハイブリッド方法または細菌ツーハイブリッド方法を使用する、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
工程２）が、
ｄ）第１のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列を定義する第１のポリヌクレオチド組中に含まれる重複プレイポリヌクレオチド数を計数する工程と、
ｅ）前記第１のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列に重複する第２のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列を定義する第２のポリヌクレオチド組中に含まれる重複プレイポリヌクレオチド数を計数する工程と、
ｆ）前記第１のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドおよび前記第２のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをそれぞれコードする配列のうちのどの配列が最も多数のプレイポリペプチドを使用して定義されたかを決定し、このプレイ配列組を選択する工程と、
ｇ）工程ｆ）で選択されたプレイ配列組に、最も少数のプレイ配列とＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドとをコードする配列の定義に使用するプレイ配列組中に含みかつ最も多数のプレイ配列とＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列に重複する配列を付加する工程と、
ｈ）工程ｇ）で付加したプレイ配列と最も多数のプレイ配列を含むＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列を定義したプレイ配列組中に既に含まれる配列とを整列させる工程と、
ｉ）工程ｈ）で整列させた全配列の間の重複配列を定義する工程をさらに含み、該重複配列がＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列からなる、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７８】
該生物が、ウイルスである、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
前記ウイルスが、Ｃ型肝炎ウイルスからなる、請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
前記Ｃ型肝炎ウイルスが、ヒトを含む哺乳動物に病原性である、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
請求項７４〜８０のいずれか一項記載の方法によって選択された、ＳＩＤ（登録商標）核酸。
【請求項８２】
請求項８１記載の核酸によってコードされる、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、病原性Ｃ型肝炎ウイルス株によってコードされるポリペプチドに選択的に結合するＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする核酸および該核酸によってコードされるＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドに関する。
【０００２】
本発明はまた、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターおよびこのようなベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【０００３】
本発明はまた、病原性Ｃ型肝炎ウイルス株から選択されたＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする核酸を使用したツーハイブリッド方法およびＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドとこれに特異的に結合するポリペプチドとの間の結合を阻害する分子の選択法に関する。
【０００４】
本発明はまた、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドを含むマーカー化合物、このようなマーカー化合物をコードする核酸、ならびにこれを使用した方法およびキットに関する。
【０００５】
（発明の背景）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、肝臓癌を含むいくつかの肝臓疾患を引き起こす。ＨＣＶゲノムは、少なくとも１０個の成熟ポリペプチドにプロセシングされる１つのポリタンパク質をコードする＋鎖ＲＮＡである。
【０００６】
構造タンパク質は、ポリタンパク質のアミノ末端の４分の１に存在し、非構造（ＮＳ）ポリペプチドはその残りに存在する（概説については、ＨＯＵＧＨＴＯＮ、１９９６を参照のこと）。ゲノム構成は、フラビウイルス属およびペスチウイルス属のゲノム構成に類似し、ＨＣＶは現在フラビウイルス科のメンバーと考えられている。
【０００７】
ＨＣＶの遺伝子産物は、図１に開示のように、Ｎ末端からＣ末端の順で、コア（ｐ２２）、Ｅ１（ｇｐ３５）、Ｅ２（ｇｐ７０）、ＮＳ２（ｐ２１）、ＮＳ３（ｐ７０）、ＮＳ４ａ（ｐ４）、ＮＳ４ｂ（ｐ２７）、ＮＳ５ａ（ｐ５８）、ＮＳ５ｂ（ｐ６６）である。コア、Ｅ１、およびＥ２は、宿主シグナルペプチドによってプロセシングされたウイルスの構造タンパク質である。コアタンパク質およびゲノムＲＮＡは、内部ウイルスコアを構成し、Ｅ１およびＥ２は脂質膜と共にウイルスエンベロープを構成する（ＤＵＢＵＩＳＳＯＮら、１９９４；ＧＲＡＫＯＵＩら、１９９３；ＨＩＧＩＫＡＴＡら、１９９３）。
【０００８】
ＮＳタンパク質は、２つの機能的ドメイン（一方は、ＮＳ２領域およびＮＳ３領域のＮ末端部分を含み、ＮＳ２とＮＳ３との間を自己触媒的に切断する（Ｃｒｏ−１）であり、他方はＮＳ３のＮ末端部分に単独で存在し、ＮＳ３下流の他の部位を切断する（Ｃｒｏ−２））を有するウイルスタンパク質ＮＳ３によってプロセシングされる（ＢＡＲＴＥＮＳＣＨＬＡＧＥＲら、１９９５；ＨＩＧＩＫＡＴＡら、１９９３）。
【０００９】
種々のＨＣＶタンパク質−タンパク質相互作用は、特にツーハイブリッド方法によって既に同定されている。特に、ＦＬＡＪＯＬＥＴら、（２０００）は、ＮＳ３とＮＳ４Ａタンパク質の間およびＮＳ４ＡとＮＳ２タンパク質の間の相互作用を示している。これらの著者はまた、コア−コア、ＮＳ３−Ｅ２、ＮＳ５Ａ−Ｅ１、ＮＳ４Ａ−ＮＳ３、およびＮＳ４Ａ−ＮＳ２相互作用を示している。Ｅ１とＥ２との間の共有結合および非共有結合相互作用は、ＰＡＴＥＬら、（１９９９）によって示されている。ＮＳ３とＨＣＶ　ＲＮＡヘリカーゼとの間のタンパク質相互作用（ＭＩＮら、１９９９；ＧＡＬＬＩＮＡＲＩら、１９９９）およびＮＳ３とＮＳ４Ａとの間の相互作用（ＵＲＢＡＮＩら、１９９９；ＤＩ ＭＡＲＣＯら、２０００；ＢＵＴＫＩＥＷＩＣＺら、２０００）も記載されている。
【００１０】
しかし、先行技術の方法により、全長タンパク質または１つを超える、１つまたは複数のＨＣＶタンパク質との相互作用領域を含み得るＣ型肝炎ウイルスのゲノムによってコードされるタンパク質の巨大ドメインの間の相互作用が同定され得る。ＢＵＴＫＩＥＷＩＣＺら、（２０００）は、ＮＳ３プロテアーゼとＮＳ４Ａ由来の小さなペプチドとの間の相互作用を開示している。しかし、ＢＵＴＫＩＥＷＩＣＺら、（２０００）は、生理学的に関連し得ないＨＣＶ由来のＮＳ４Ａ由来の小ペプチドとＮＳ３プロテアーゼとの間の相互作用についてのインビトロアッセイのみを開示している。
【００１１】
ＨＣＶの治療および検出目的の新規のツールを構築するための生理学的条件下で天然に存在するＨＣＶタンパク質に特異的に結合することができる最小アミノ酸配列を含むポリペプチドが当技術分野で必要である。
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする核酸を提供し、これらのポリペプチドはツーハイブリッド系によるＨＣＶ由来ポリヌクレオチドの第１の選択工程と第１の工程で選択された異なるポリヌクレオチドの間でのアラインメントとを含む第２の選択工程を含む二重選択法の最終産物である。
【００１３】
本発明はまた、ＳＩＤ（登録商標）核酸によってコードされるＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドに関する。
【００１４】
本発明の別の目的は、上記定義のＳＩＤ（登録商標）核酸を含む組換えベクターおよびこのようなベクターまたは核酸で形質転換された宿主細胞である。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、ＳＩＤ（登録商標）核酸を使用したツーハイブリッド方法、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドとそれに特異的に結合するポリペプチドとの間の結合を阻害する分子の選択法、およびこれらの方法を行うためのキットからなる。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドを含むか上記定義のＳＩＤ（登録商標）核酸を含むポリヌクレオチドによってコードされるマーカー化合物ならびにこれらのマーカー化合物を使用した方法およびキットを提供することにある。
【００１７】
本発明はまた、本明細書に開示されるＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドまたはＳＩＤ（登録商標）核酸を使用した薬学的組成物およびヒトもしくは動物のＨＣＶウイルス感染症の予防または治療法に関する。
【００１８】
本出願、種々の刊行物、特許、および公開された特許出願全体を引用する。本出願で参照されたこれらの刊行物、特許、および公開された特許明細書は、本発明が属する技術分野の状況をより完全に説明するための本発明の開示に参照として本明細書に組み入れられる。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、第１に、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【００２０】
本明細書に一般的に使用される、「ベイト」核酸は、「ベイト」ポリペプチドをコードする。このポリペプチドを使用して「ベイト」ポリペプチドに選択的に結合する「プレイ」ポリペプチドをコードする、以前は未知の「プレイ」核酸を選択するポリペプチドを「ベイト」ポリペプチドと呼ぶ。実際、所定のベイトポリペプチドへの結合のために選択した「プレイ」核酸を、ベイトポリペプチドに選択的に結合するプレイポリペプチドをコードする新規のプレイ核酸を選択するための「ベイト」ポリペプチドをコードする「ベイト」核酸として別の選択法または同一の選択法の別のラウンドで使用することができ、該ベイトポリペプチドをコードする核酸は、以前はプレイ核酸コレクションから選択されたと理解される。
【００２１】
選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドおよびその調製法
目的のポリペプチドに特異的に結合する選択相互作用ドメインポリペプチドは、以下の２工程スクリーニング法の結果である：
１）所与の目的のベイトポリペプチドに特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸（プレイ核酸）コレクションの選択および特徴付けからなる第１の工程と
２）工程１）で選択された核酸コレクションからのポリヌクレオチド組の作製後のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする核酸配列の同定からなる２工程手順の第２の工程。
【００２２】
下文に開示の独自の２工程スクリーニング手順の結果として、最終的に選択された各核酸は、目的のベイトポリペプチドと高い特異性で結合する「選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））」ポリペプチドをコードする。
【００２３】
工程１）プレイ核酸の選択
ベイトポリペプチドに特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸コレクションの第１の選択工程を、酵母ツーハイブリッド系によって行う。酵母ツーハイブリッド系をインビボでのタンパク質−タンパク質相互作用を研究するように構築し、ベイトタンパク質の酵母Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインへの融合を信頼する。
【００２４】
本発明によれば、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドをコードする選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリヌクレオチドを選択するための第１の工程は、Ｆｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅら、（１９９７）に記載のツーハイブリッドスクリーニング系およびＦＬＡＪＯＬＥＴら、（２０００）に記載の方法からなる。酵母ツーハイブリッド系は、レポーター遺伝子発現の直接的活性化手段によるタンパク質−タンパク質相互作用を検出するためのハイブリッドタンパク質を利用する。実質的に、２つの推定タンパク質パートナー、目的のベイトポリペプチド、およびプレイポリペプチドをコードする核酸を、一般的には転写因子のＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインにそれぞれ融合する。
【００２５】
プレイＨＣＶ核酸ライブラリーの構築
次いで、ＨＣＶの病原性Ｈ７７株（Ｙａｎａｇｉら、１９９７）のゲノムから調製したゲノムＤＮＡライブラリーを、各ゲノムＤＮＡインサートがＧａｌ４タンパク質の転写ドメインをコードするベクター中のヌクレオチド配列に融合されるように適切なリンカーへのライゲーション後に図１３に示す特異的に設計したベクターｐＰ６中に構築する。
【００２６】
このようにして調製されたゲノムＤＮＡライブラリーのヌクレオチドインサートによってコードされるポリペプチドを、プレイ核酸の本明細書中に記載の選択法の文脈では、「プレイ」ポリペプチドと呼ぶ。
【００２７】
ベイト核酸ライブラリーの構築
ＨＣＶゲノムＤＮＡの噴霧後に得られたＤＮＡフラグメントも図１２に示すプラスミドｐＢ５に挿入し、これらのＤＮＡインサートをＧａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合し、組換えベクターを使用してＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換する。形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を増殖させ、プラスミドＤＮＡを抽出し、配列決定する。
【００２８】
インフレームで融合タンパク質をコードするこれらのプラスミドを、ベイトプラスミドとして使用する。したがって、ベイトプラスミドは、その中にＨＣＶタンパク質の全部または一部からなるポリペプチドまたはＨＣＶゲノムの連続核酸配列によってコードされるＨＣＶタンパク質の全部または一部からなるポリペプチドをコードするＨＣＶのＨ７７株ゲノム由来のＤＮＡフラグメントを挿入した組換えｐＢ５プラスミドコレクションからなる。
【００２９】
選択された本発明のＨＣＶベイト核酸を、配列番号１１４〜１５０のヌクレオチド配列と呼ぶ。
【００３０】
配列番号１１４〜１５０の核配列によってコードされる選択されたＨＣＶベイトポリペプチドは、それぞれ、配列番号７７〜１１３のアミノ酸配列からなる。
【００３１】
検出可能マーカー遺伝子は、既に酵母染色体ＤＮＡ中に存在し、ＦＲＯＭＯＮＴ−ＲＡＣＩＮＥら、（１９９７）またはＦＬＡＪＯＬＥＴら、（２０００）に記載されるような、それぞれ、Ｈｉｓ３およびＬａｃＺからなる。
【００３２】
次いで、先に調製したＤＮＡゲノムまたはＨＣＶ　ＤＮＡライブラリーを含むＥ．ｃｏｌｉ細胞クローンコレクション中に含まれる核酸インサートコレクションを使用して、第１の酵母株（すなわち、Ｙ１８７　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（表現型：ＭＡＴα、Ｇａｌ４Δ、ｇａｌ８０Δ、ａｄｅ２−１０１、Ｈｉｓ３、Ｌｅｕ２−３、−１１２、Ｔｒｐ１−９０１、Ｕｒａ３−５２、ＵＲＡ：：ＵＡＳＧＡＬ１−ＬａｃＺ　Ｍｅｔ））を形質転換する。
【００３３】
目的のベイトポリペプチドをコードする核酸を、適切なベクターに挿入し、該ベクターを使用してＣＧ１９４５（ＭＡＴａ　Ｇａｌ４−５４２　Ｇａｌ１８０−５３８、Ａｄｅ２−１０１、Ｈｉｓ３＊２００、Ｌｅｕ２−３、−１１２、Ｔｒｐ１−９０１、Ｕｒａ３−５２、Ｌｙｓ２−８０１、ＵＲＡ３：：ＧＡＬ４　１７マー（Ｘ３）−ＣｙＣ１ＴＡＴＡ−ＬａｃＺ　ＬＹＳ２：：ＧＡＬ１　ＵＡＳ−ＧＡＬ１ＴＡＴＡ−Ｈｉｓ３　ＣＹＨＲ）であり得る第２の酵母株を形質転換する。
【００３４】
次いで、２つの酵母株を交配して交配細胞コレクションを得る。
【００３５】
Ｘ−Ｇａｌ被覆アッセイで陽性を示す上記の交配細胞コレクション由来のクローンは、組換えベイトポリペプチドとＨＣＶゲノムライブラリー由来の核酸インサートによってコードされるポリペプチドとの間で相互作用を示すクローンである。
【００３６】
上記の交配細胞コレクション由来のクローンをヒスチジンの存在下で選択することもでき、陽性クローンは組換えベイトポリペプチドとＨＣＶゲノムライブラリー由来の核酸インサートによってコードされるポリペプチドとの間で相互作用を示すクローンである。
【００３７】
さらなる工程では、陽性選択クローン中に含まれるプレイ核酸インサートを増幅し、配列決定する。
【００３８】
工程２：目的のベイトポリペプチドに特異的に結合する選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドをコードする核酸配列の同定
これは、ＨＣＶゲノムのＨ７７株由来の本発明のＳＩＤ（登録商標）核酸をコードする核酸を正確に選択する、上記定義の２工程手順の第２の工程である。
【００３９】
下文で開示されるＳＩＤ（登録商標）核酸選択法を、１つのポリタンパク質をコードすることにより連続する読み取り枠を含み、該ポリタンパク質がプロセシングされて少なくとも１０個の構造および非構造成熟ウイルスタンパク質を産生する、ＨＣＶゲノムについて特異的に設計した。
【００４０】
したがって、２工程手順の第２の選択工程は、プレイポリペプチドがベイトポリペプチドと相互作用する、ＨＣＶ由来の目的のプレイポリペプチドの選択相互作用ドメインＳＩＤ（登録商標）をコードするポリヌクレオチドの同定法からなり、該方法は、
ａ）本明細書に記載の２工程手順の第１の工程の最後で得られたプレイヌクレオチドコレクションから、該ベイトポリペプチドと相互作用し、かつ共通の核酸フラグメントを含むことができるプレイポリペプチドをコードする全てのプレイヌクレオチドを選択する工程と、
ｂ）工程ａ）で選択したプレイポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を整列させて各核酸長の３０％以上が重複する配列を有するヌクレオチド配列を一組または複数の組の配列に集める工程であって、１組の配列中の各共通の重複ヌクレオチド配列によりプレＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列が定義され（図８および図９参照のこと）、
ｃ）２つの各プレＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする２つの配列を整列させる工程（図１０を参照のこと）とを含み、
ｉ）重複配列が少なくとも３０ヌクレオチド長である場合、２つの各プレＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列の間の重複核酸配列を、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列と定義し、
ｉｉ）（１）非重複配列が３０を超えるヌクレオチド長であり、かつ（２）非重複配列が各プレＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列の定義に使用されたプレイポリヌクレオチド組中に含まれる任意の１つのポリヌクレオチドの長さの少なくとも３０％を示す場合、２つの各プレＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列の間の非重複核酸配列を、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列と定義する。この方法は、さらに、
ｄ）第１のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列を定義する第１のポリヌクレオチド組中に含まれる重複プレイポリヌクレオチド数を計数する工程と、
ｅ）前記第１のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列に重複する第２のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列を定義する第２のポリヌクレオチド組中に含まれる重複プレイポリヌクレオチド数を計数する工程と、
ｆ）前記第１のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドおよび前記第２のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをそれぞれコードする配列のうちのどの配列が最も多数のプレイポリペプチドを使用して定義されたかを同定し、このプレイ配列組を選択する工程と、
ｇ）工程ｆ）で選択されたプレイ配列組に最も少数のプレイ配列を含むＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列の定義に使用するプレイ配列組中に存在し、かつ最も多数のプレイ配列を含むＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列に重複する配列を付加する工程と、
ｈ）工程ｇ）で付加したプレイ配列と最も多数のプレイ配列を含むＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列を定義したプレイ配列組中に既に含まれる配列とを整列させる工程と、
ｉ）工程ｈ）で整列させた全配列の間の重複配列を定義する工程であって、ここで、該重複配列がＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列からなる工程をさらに含む（図１１を参照のこと）。
【００４１】
ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードするＳＩＤ（登録商標）核酸の選択法ならびにこの選択法によって得ることができるＳＩＤ（登録商標）核酸または任意のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドは、本発明の目的である。
【００４２】
本発明のＳＩＤ（登録商標）核酸
ＨＣＶのＨ７７株のゲノムから出発する上記のように選択されたＳＩＤ（登録商標）核酸は、配列番号１〜３８のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする配列番号３９〜７６の核酸配列である。
【００４３】
本発明の第１の目的は、配列番号１〜３８のアミノ酸配列またはその変異体およびその相補配列からなる群より選択されるポリペプチドをコードする核酸からなる。
【００４４】
本発明の目的のために、第１のポリヌクレオチドの各塩基がその逆方向の第２のポリヌクレオチドの相補塩基と対合する場合、第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドに「相補的である」とみなす。相補塩基は、ＡとＴ（またはＡとＵ）またはＣとＧである。
【００４５】
好ましくは、本発明の範囲内である任意の１つの核酸またはポリペプチドは精製または単離形態である。
【００４６】
本発明の目的のための用語「単離された」は、元の環境（天然に存在する環境）から取り出された生体材料（核酸またはタンパク質）を示す。
【００４７】
例えば、植物または動物中に天然の状態で存在するポリヌクレオチドは単離されていない。植物または動物のゲノム中に天然に挿入された隣接核酸から分離されたポリヌクレオチドは「単離された」とみなされる。
【００４８】
このようなポリヌクレオチドをベクターに含めることができる、そして／またはこのようなポリヌクレオチドを組成物に含めることができるが、その天然の環境を構成しないという事実により、ベクターまたは組成物は単離状態で残存する。
【００４９】
用語「精製された」は、物質が絶対的に純粋な、他の化合物の存在を排除する形態で存在する必要はない。これはむしろ相対的な定義である。
【００５０】
ポリヌクレオチドは、出発物質または天然物質の少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、好ましくは４または５桁精製後の「精製」状態である。
【００５１】
「単離ポリペプチド」または「単離タンパク質」は、通常天然の状態で（例えば、他のタンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質と）会合しているこれらの化合物が実質的に遊離しているポリペプチドまたはタンパク質である。「単離された」は、他の化合物との人工的または合成混合物、または生物活性を妨害せず、かつ例えば不完全な精製、安定剤の添加、または薬学的に許容され得る調製物への配合のために存在し得る夾雑物の存在を排除することを意味しない。
【００５２】
選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドの変異体およびそれをコードする核酸
本明細書に意図されるように、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドの変異体は、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドの変異ポリペプチドまたは選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの核酸変異体によってコードされるポリペプチドであり得る。
【００５３】
選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチド（この用語は本明細書に使用される）のポリペプチド変異体をコードするポリヌクレオチドは、親ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする基準ポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの変異体は天然に存在する変異体（天然に存在する対立遺伝子変異体など）であり得るか、天然に存在することが知られていない変異体であり得る。基準ポリヌクレオチドのこのような天然に存在しない変異体を当技術分野で周知のポリヌクレオチド、細胞、または生物に適用される技術を含む変異誘発技術によって作製することができる。
【００５４】
一般に、相違は、限られており、基準および変異体のヌクレオチド配列は全体的にとても類似しており、多くの領域では同一である。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチドの変異体には、基準選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドをコードする配列番号３９〜７６の基準ポリヌクレオチドとの至適アラインメント後に基準ポリヌクレオチドと少なくとも９５％同一、好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％、最も好ましくは少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列が含まれるが、これらに限定されない。同様に、本発明のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドの変異体は、配列番号１〜３８のアミノ酸配列から選択されたポリペプチドと少なくとも９５％、好ましくは配列番号１〜３８の１つと少なくとも９６％、９７％、９８％、最も好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸が同一であるポリペプチドからなる。
【００５６】
同一性は、２つのペプチドとの間または２つの核酸分子との間の配列同一性をいう。配列間の同一性を、比較目的で整列させることができる各配列中の位置の比較によって同定することができる。比較した配列中の位置が同一の塩基またはアミノ酸で占められている場合、配列はその位置で同一である。核酸配列間の同一の程度は、これらの配列が共有する位置での同一のヌクレオチド数の関数である。アミノ酸配列間の同一の程度は、これらの配列が共有する位置での同一のアミノ酸数の関数である。２つのポリヌクレオチドが、それぞれ（１）２つのポリヌクレオチド間で類似の配列（すなわち、完全なポリヌクレオチド配列部分）を含んでもよく、（２）２つのポリヌクレオチド間で異なる配列をさらに含んでもよく、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列比較を、典型的には、配列類似性の局所的領域を同定および比較するための「比較ウィンドウ」との２つのポリヌクレオチド配列の比較によって行う。本明細書に使用される、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列を少なくとも２０個の連続ヌクレオチドの基準配列と比較することができ、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の一部が２つの配列の適切なアラインメントのために基準配列（付加または欠失していない）と比較して２０％またはそれ以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る、少なくとも２０個の連続ヌクレオチドの位置の概念上のセグメントをいう。比較ウィンドウを同定するための至適な配列アラインメントを、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）の局所ホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｓｃｈ（１９７２）のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）の類似法の検索、これらのアルゴリズム（ウィスコンシンジェネチックスソフトウェアパッケージリリース７．０、ジェネチックスコンピュータグループ、５７５、Ｍａｄｉｓｏｎ科学博士、Ｗ１のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューターによる実行、または検査によって行うことができる。種々の方法によって作製された最良のアラインメント（比較ウィンドウによる最も高い同一％が得られる）を選択する。用語「配列同一性」は、比較ウィンドウによって２つのポリヌクレオチド配列が同一である（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドを基本として）ことを意味する。用語「配列同一％」を、比較ウィンドウによる２つの最適に整列された配列の比較、適合位置数を得るための両配列で核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）が同一となる位置数の同定、適合位置数を比較ウィンドウにおける全位置数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割ることと、結果に１００をかけて配列同一％を得ることによって計算する。
【００５７】
最も好ましくは、２つの核酸または２つのアミノ酸配列の間の核酸またはアミノ酸同一％を、デフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴソフトウェア（１９９８年９月のバージョン２．０６）を使用して計算する。
【００５８】
変異ポリヌクレオチドに存在するヌクレオチドの変化はサイレント（基準ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸が変化しないことを意味する）であり得る。
【００５９】
しかし、ヌクレオチドの変化により、基準配列によってコードされる選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドのアミノ酸が置換、付加、欠失、融合、および短縮されることもあり得る。
【００６０】
置換、欠失、または付加は、１つまたは複数のヌクレオチドが関与し得る。変更により、保存的または非保存的アミノ酸置換、欠失、または付加が起こり得る。
【００６１】
最も好ましくは、変異ポリヌクレオチドによってコードされる選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドの変異体は、そのタンパク質またはポリペプチド相対物に少なくとも同一の結合親和性を有し、これは最初に上記のように選択される。
【００６２】
特異的に結合するポリペプチドについての本発明の所定のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドの親和性を、親和性定数Ｋａ：
【００６３】
【表１】
2004507235.tif 000003
【００６４】
（［遊離ＳＩＤ（登録商標）］、［遊離ポリペプチド］、および［ＳＩＤ（登録商標）／ポリペプチド複合体］は、それぞれ遊離ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチド、ＳＩＤ（登録商標）が特異的に結合する遊離ポリペプチド、およびＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドと該ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドが特異的に結合するポリペプチドとの間に形成された複合体の平衡時の濃度からなる）と定義する。
【００６５】
最も好ましくは、本発明のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドまたはその変異体のそのポリペプチド相対物（ポリペプチドパートナー）に対する親和性を、ＳＺＡＢＯら、（１９９５）およびＥｄｗａｒｄ ａｎｄ Ｌｅａｒｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ（１９９７）などに記載のように、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社が販売しているＢｉａｃｏｒｅ（商標）装置で評価する。
【００６６】
本明細書中に使用される、本発明のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドと別のポリペプチドとの間の結合親和性を基準とした表現「少なくとも同一の親和性」は、Ｋａが基準のＫａ値と同一であるか、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも３倍、最も好ましくは少なくとも５倍であることを意味する。
【００６７】
別の好ましい態様では、本発明の変異ポリヌクレオチドによってコードされる選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドの変異体は、その相対ポリペプチドまたはタンパク質への結合特異性が基準選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドよりも高い。
【００６８】
本発明の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドの変異体は、（１）１つまたは複数、最も好ましくは１〜３個のアミノ酸残基が保存または非保存性アミノ酸残基で置換されており、このような置換アミノ酸残基は遺伝コードによってコードされているものであってもなくてもよいものまたは（２）１つまたは複数のアミノ酸残基が置換基を含むものであり得る。
【００６９】
本発明の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸置換の場合、１つまたは複数の連続的または非連続的アミノ酸を「等価の」アミノ酸に置換する。表現「等価な」アミノ酸は、本明細書中で、基準選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドに関して、対応するペプチドの相対的ポリペプチドまたはタンパク質への結合特性を減少させることなく天然の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチド構造に属するアミノ酸の１つで置換することができる任意のアミノ酸を呼ぶために使用される。
【００７０】
これらの等価のアミノ酸を、置換される元のアミノ酸とのその構造ホモロジー、その純粋な電荷もしくはその疎水性の類似性のいずれかによって同定することができる。
【００７１】
本発明の等価なアミノ酸は、Ｌ型残基のＤ型残基への置換またはグルタミン酸残基のピログルタミン酸化合物への置換を意味する。少なくとも１つのＤ型残基を含むペプチドの合成は、例えば、ＫＯＣＨ（１９７７）に記載されている。本発明の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドの変異体の特定の態様には、タンパク質分解に耐性を示すペプチド分子、例えば（ＣＯＮＨ−ペプチド結合が、（−ＣＨ２ＮＨ−）還元結合、（−ＮＨＣＯ−）レトロインベルソ結合、（−ＣＨ２−Ｏ−）メチレン−オキシ結合、（−ＣＨ２−Ｓ−）チオメチレン結合、（−ＣＨ２ＣＨ２−）カルバ結合、（−ＣＯ−ＣＨ２）ヒドロキシエチレン結合、（−Ｎ−Ｎ−）結合、または−ＣＨ＝ＣＨ結合に置換されたペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００７２】
本明細書に使用される、本発明のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドの変異体はまた、少なくとも：
−配列番号１の４５個の連続アミノ酸、
−配列番号２の３０個の連続アミノ酸、
−配列番号３の６５個の連続アミノ酸、
−配列番号４の３０個の連続アミノ酸、
−配列番号５の１３０個の連続アミノ酸、
−配列番号６の２５個の連続アミノ酸、
−配列番号７の２３個の連続アミノ酸、
−配列番号８の４８個の連続アミノ酸、
−配列番号９の３６個の連続アミノ酸、
−配列番号１０の２５個の連続アミノ酸、
−配列番号１１の２４個の連続アミノ酸、
−配列番号１２の３７個の連続アミノ酸、
−配列番号１３の２５個の連続アミノ酸、
−配列番号１４の３０個の連続アミノ酸、
−配列番号１５の２７個の連続アミノ酸、
−配列番号１６の６９個の連続アミノ酸、
−配列番号１７の１３０個の連続アミノ酸、
−配列番号１８の３３個の連続アミノ酸、
−配列番号１９の２５個の連続アミノ酸、
−配列番号２０の４０個の連続アミノ酸、
−配列番号２１の７８個の連続アミノ酸、
−配列番号２２の３９個の連続アミノ酸、
−配列番号２３の５７個の連続アミノ酸、
−配列番号２４の２６個の連続アミノ酸、
−配列番号２５の６８個の連続アミノ酸、
−配列番号２６の３４個の連続アミノ酸、
−配列番号２７の４２個の連続アミノ酸、
−配列番号２８の４８個の連続アミノ酸、
−配列番号２９の１０２個の連続アミノ酸、
−配列番号３０の４９個の連続アミノ酸、
−配列番号３１の９２個の連続アミノ酸、
−配列番号３０の４９個の連続アミノ酸、
−配列番号３１の９２個の連続アミノ酸、
−配列番号３２の７１個の連続アミノ酸、
−配列番号３３の５５個の連続アミノ酸、
−配列番号３４の６９個の連続アミノ酸、
−配列番号３５の２３個の連続アミノ酸、
−配列番号３６の３３個の連続アミノ酸、
−配列番号３７の３２個の連続アミノ酸、および
−配列番号３８の２２個の連続アミノ酸からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。
【００７３】
いかなる特定の理論に拘束されることを望まないが、本発明者らは、本発明の任意の配列番号１〜３９のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドアミノ酸長よりも約１０％短いアミノ酸長を有するポリペプチドは親ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドの所与の（ベイト）ポリペプチドへの結合特性を維持する可能性が高いと考える。
【００７４】
本発明はまた、配列番号３９〜７６の配列およびその相補配列からなる群より選択されるＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードする核酸に関する。
【００７５】
本発明はまた、上記のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチド変異体の定義を基準として、配列番号３９〜７６の配列からなる群より選択されるＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドの変異体をコードする核酸に関する。
【００７６】
例えば、配列番号１の少なくとも４５個の連続アミノ酸からなるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸は、配列番号３９のポリヌクレオチドの少なくとも１３５個（４５×３）の連続ヌクレオチドを含む。
【００７７】
同一の定義を、本発明の一部である配列番号２〜３８のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドの変異体をコードする核酸にも適用される。
【００７８】
本発明は、さらに、配列番号１〜３８のアミノ酸配列またはその相補配列からなる群より選択されるポリペプチドに関する１つのアミノ酸の１〜３つの置換、付加、または欠失を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸に関する。
【００７９】
本発明の別の目的は、配列番号３９〜７６のアミノ酸配列またはその変異体からなる群より選択されるポリペプチドからなる。
【００８０】
配列番号１〜３８のアミノ酸配列からなる群より選択されるポリペプチドに関する１つのアミノ酸の１〜３つの置換、付加、または欠失を含むアミノ酸配列を有するポリペプチドが本発明のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドの変異体ファミリーに含まれる。
【００８１】
本発明はまた、上記定義のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドまたはその変異体に指向する抗体に関する。
【００８２】
選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体に特異的な抗体は、中立的に放射性標識または非放射性標識することができる。
【００８３】
ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドに対するモノクローナル抗体を、１９７５年のＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎによって記載された技術にしたがってハイブリドーマから調製することができる。ポリクローナル抗体を、免疫性アジュバントと組み合わせたＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドでの哺乳動物（特に、マウスまたはウサギ）の免疫化および抗原として使用したポリペプチドを予め固定したアフィニティークロマトグラフィーカラムでの免疫化動物血清中に含まれる特異的抗体の精製によって調製することができる。
【００８４】
ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドに対する抗体を、トリオーマ技術およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３）によっても産生することができる。
【００８５】
ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドに対する抗体には、一本鎖キメラＦｖ抗体フラグメント（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｍａｒｔｉｎｅａｕら、１９９８）、ファージディスプレイライブラリーによって得られる抗体フラグメント（Ｒｉｄｄｅｒら、１９９５）、およびヒト化抗体（Ｒｅｉｎｍａｎｎら、１９９７；Ｌｅｇｅｒら、１９９７）が含まれる。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物（他の哺乳動物など）を使用して、抗体（例えば、本発明のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドまたはその変異体に指向するヒト化抗体を含む）を発現することができる。
【００８６】
本発明のベクター
上の節で定義の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸を、適切な発現ベクター、すなわち、挿入タンパク質コード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入することができる。このような転写エレメントには、上記定義の調節領域およびプロモーターが含まれる。したがって、本発明のマーカー化合物をコードする核酸を、発現ベクター中のプロモーターに作動可能に連結し、該発現ベクターは複製起点を含み得る。
【００８７】
必要なシグナルの転写および翻訳を、組換え発現ベクターによって得ることが最も好ましい。
【００８８】
本発明に含まれるベクターの構造
広範な種々の宿主／発現ベクターの組み合わせを本発明の核酸の発現に使用することができる。有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体、および合成ＤＮＡ配列のセグメントからなり得る。適切なベクターには、ＳＶ４０および公知の細菌プラスミドの誘導体（たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉプラスミドｃｏｌ　Ｅｌ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭａｌ−Ｃ２、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ（Ｓｍｉｔｈら、１９８８）、ｐＭＢ９、およびその誘導体、ＲＰ４などのプラスミド）；ファージＤＮＡ（例えば、ファージＩの多数の誘導体（例えば、ＮＭ９８９））および他のファージＤＮＡ（例えば、Ｍ１３および糸状菌一本鎖ファージＤＮＡ）；酵母プラスミド（２ｍプラスミドまたはその誘導体など）；真核細胞で有用なベクター（昆虫または哺乳動物細胞で有用なベクターなど）；プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせ由来のベクター（ファージＤＮＡまたは他の発現調節配列を使用するように改変されたプラスミドなど）が含まれる。
【００８９】
例えば、バキュロウイルス発現系では、非融合導入ベクター（ｐＶＬ９４１（ＢａｍＨ１クローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓ）、ｐＶＬ１３９３（ＢａｍＨ１、ＳｍａＩ、ＸｂａＩ、ＥｃｏＲ１、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＢｇｌＩＩ、およびＰｓｔＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＶＬ１３９２（ＢｇｌＩＩ、ｐｓｔＩ、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ、ＳｍａＩ、およびＢａｍＨ１クローニング部位；ＳｕｍｍｅｒｓおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（青色／白色組換えスクリーニングが可能なＢａｍＨ１、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）などであるが、これらに限定されない）および融合導入ベクター（ｐＡｃ７００（ＢａｍＨ１認識部位が開始コドンから始まるＢａｍＨ１およびＫｐｎＩクローニング部位；Ｓｕｍｍｅｒｓ）、ｐＡｃ７０１およびｐＡｃ７０２（異なる読み取り枠を有するｐＡｃ７００同様）、ｐＡｃ３６０（ポリヘドリン開始コドンから３６塩基対下流のＢａｍＨ１クローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（１９５））、およびｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＢａｍＨ１、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位を含む３つの異なる読み取り枠、ＰｒｏＢｏｎｄ精製用のＮ末端ペプチド、およびプラークの青色／白色組換えスクリーニング；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（２２０））などであるが、これらに限定されない）の両方を使用することができる。
【００９０】
本発明での使用が意図される哺乳動物発現ベクターには、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーターなどの誘導プロモーターを含むベクター（例えば、ＤＨＦＲ発現ベクターを含む任意の発現ベクター）またはｐＥＤ（クローン化遺伝子およびＤＨＦＲに両方を発現するベクターを含む、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｂａＩ、ＳｍａＩ、およびＥｃｏＲＩクローニング部位；Ｋａｕｆｍａｎ、１９９１）などのＤＨＦＲ／メトトレキサート同時増幅ベクターが含まれる。または、ｐＥＥ１４（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ，ＳｍａＩ、ＳｂａＩ、ＥｃｏＲＩ、およびＢｃｌＩクローニング部位、このベクターはグルタミン合成酵素およびクローン化遺伝子を発現する；Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）などのグルタミン合成酵素／メチオニンスルホキシミン同時増幅ベクター。別の態様では、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）の調節下でエピソーム発現を指示するベクター（ｐＲＥＰ４（ＢａｍＨ１、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、構成ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー；ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ）、ｐＣＥＰ４（ＢａｍＨ１、ＳｆｉＩ、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、ＰｖｕＩＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、構成ｈＣＭＶ最初期遺伝子、ハイグロマイシン選択マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＥＰ４（ＫｐｎＩ、ＰｖｕＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、ＢａｍＨ１クローニング部位、誘導メタロチオネインＩＩａ遺伝子プロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ８（ＢａｍＨ１、ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｈｅＩ、およびＫｐｎＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ヒスチジノール選択マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲＥＰ９（ＫｐｎＩ、ＮｈｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩ、ＳｆｉＩ、およびＢａｍＨＩクローニング部位、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、Ｇ４１８選択マーカー；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＢＶＨｉｓ（ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ハイグロマイシン選択マーカー、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂によって精製可能でエンテロキナーゼによって切断されるＮ末端ペプチド；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など）を使用することができる。本発明で使用される哺乳動物選択発現ベクターには、ｐＲｃ／ＣＭＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＳｂａＩ、およびＡｐａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＲｃ／ＲＳＶ（ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩクローニング部位、Ｇ４１８選択；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが含まれる。本発明で使用されるワクシニアウイルス哺乳動物発現ベクター（Ｋａｕｆｍａｎ、１９９１、前記を参照のこと）には、ｐＳＣ１１（ＳｍａＩクローニング部位、ＴＫ−およびｂ−ｇａｌ選択）、ｐＭＪ６０１（ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＡｆｌＩ、ＮａｒＩ、ＢｓｐＭＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＡｐａＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；ＴＫ−およびｂ−ｇａｌ選択）、およびｐＴＫｇｐｔＦ１Ｓ（ＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ、ＳａｌＩ、ＡｃｃＩ、ＨｉｄｎＩＩ、ＳｂａＩ、ＢａｍＨＩ、およびＨｐａクローニング部位、ＴＫまたはＸＰＲＴ選択）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
本発明にしたがって酵母発現系を使用して、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体および本明細書に定義のマーカー化合物を発現することもできる。例えば、２つだけ言及するが、非融合ｐＹＥＳ２ベクター（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＧｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｔＸＩ、ＢａｍＨ１、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）または融合ｐＹＥＳＨｉｓＡ、Ｂ、Ｃ（ＸｂａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ１、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、およびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位、ＰｒｏＢｏｎｄ樹脂で精製のＮ末端ペプチドおよびエンチロキナーゼでの切断；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を本発明で使用することができる。
【００９２】
一旦適切な宿主系および増殖条件が確立されると、組換え発現ベクターを増殖させて大量に調製することができる。先に説明したように、使用することができる発現ベクターには、数例挙げると以下のベクターまたはその誘導体が含まれるが、これらに限定されない：ヒトまたは動物ウイルス（ワクシニアウイルスまたはアデノウイルスなど）；昆虫ウイルス（バキュロウイルスなど）；酵母ウイルス；バクテリオファージベクター（例えば、λ）、ならびにプラスミドおよびコスミドＤＮＡベクター。
【００９３】
ベクターを、当技術分野で公知の方法（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション（リソソーム融合）、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクター輸送）によって所望の宿主細胞に移入する（例えば、Ｗｕら、１９９２；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ、１９８８；１９９０年３月１５日提出のカナダ特許出願第２，０１２，３１１号を参照のこと）。
【００９４】
ＤＮＡが細胞内に導入される場合、細胞は外因性または異種ＤＮＡによって「トランスフェクト」されている。トランスフェクトしたＤＮＡの表現型が変化した場合、細胞は外因性または異種ＤＮＡによって「形質転換」されている。
【００９５】
細胞宿主へのベクターの導入のために、Ｅ． Ｗａｇｎｅｒのグループによる、プラスミド−ポリリジン複合体による遺伝子送達に関する研究についての明確な基準を作製する（Ｃｕｒｉｅｌら、１９９１およびＣｕｒｉｅｌら、１９９２）。一定の細胞株への曝露の際に調査されるプラスミド−ポリリジン複合体により、少なくともいくつかの遺伝子発現が示されている。さらに、トランスフェリンのプラスミド−ポリリジン複合体への結合によって発現効率が著しく増加することが見出されている。トランスフェリンによりトランスフェリン受容体を含む細胞との細胞−複合体接触を密接にし、全複合体を細胞のトランスフェリン受容体に結合させる。次に、全複合体の少なくとも一部が調査された細胞中に組み込まれたことが認められている。
【００９６】
いくつかの異なる遺伝子導入アプローチが開発されている。これらには、ウイルスベースのベクターの使用（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）（Ｄｒｕｍｍ， Ｍ． Ｌ．ら、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ， Ｍ． Ａ．ら、１９９２およびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９９２）、ＤＮＡのアシアロロソムコイド／ポリＬリジン複合体と会合する電荷（Ｗｉｌｓｏｎ， Ｊ． Ｍ．ら、１９９２）、ＤＮＡの陽イオンリポソームと会合する電荷（Ｂｒｉｇｈａｍ， Ｋ． Ｌ．ら、１９９３）、およびポリ−Ｌ−リジン抗体複合体との会合における陽イオンリポソームの使用（Ｔｒｕｂｅｔｓｋｏｙ， Ｖ． Ｓ．ら、１９９３）が含まれる。
【００９７】
本発明のベクターを含む組成物
非ウイルスベースのトランスフェクション系がウイルスベクター効率を示さないにもかかわらず、ウイルスベクターと比較した場合の理論的安全性によりインビトロおよびインビボ研究の両方で非常に注目されている。トランスフェクション因子の陽イオン部位と核酸の陰イオン部位との相互作用によって核酸を「コート」する合成陽イオン分子が報告されている。正電荷のコーティングは、負電荷の細胞膜と相互作用して非特異的エンドサイトーシスによる細胞膜を介した核酸の通過を促進すると報告されている（Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ、１９９５）。しかし、これらの化合物は、天然血清阻害に非常に高い感度を示したため、おそらく遺伝子トランスフェクション因子としてのインビボでの有効性が限られている（Ｂｅｈｒ、１９９４）。
【００９８】
脂質様陽イオントランスフェクション薬の有効性を改良するための多数の試みが行われており、そのいくつかはポリ陽イオン分子の使用を含む。例えば、脂質キャリアに共有結合したポリ陽イオン化合物スペルミンを含むいくつかのトランスフェクション薬が開発されている。（Ｂｅｈｒ、１９９４）はリポポリアミンを開示し、これは１つの荷電分子よりも細胞のトランスフェクションの際に有効であることが認められている（それにもかかわらずウイルスベクターよりもはるかに有効性が低い）。しかし、Ｂｅｈｒによって報告された薬剤は、有毒であり、細胞死を招く。
【００９９】
ＤＮＡ輸送のためのいくつかのこのような脂質送達系タンパク質および膜境界を通過する他の化学物質が、研究グループおよび企業によって合成されている。ほとんどの合成スキームは比較的複雑であり、限られたトランスフェクション能力しかない脂質ベースの送達系が作製されている。生体ポリマー輸送効率の高い陽イオン性脂質種が遺伝子治療分野で必要である。長い間、非常に限定された数の一定の第四級アンモニウム誘導（陽イオン）リポソームがＤＮＡと自発的に会合し、細胞膜と融合し、ＤＮＡを細胞質に送達することが知られている（上記のように、これらの種は「サイトフェクチン」と呼ばれている）。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）は、最初に開発された陽イオンリポソーム処方物である。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）は、水中で小さな単層小胞に超音波処理されたＤＯＴＭＡを含む第四級アンモニウムとジオレオイルホスファチジルエタノールアミンとの１：１処方物から構成される。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮに関する問題には、非代謝性エーテル結合、プロテインキナーゼＣ活性阻害、および直接的な細胞傷害性が含まれる。これらの問題について、多数の他の関連化合物が開発されている。本発明のモノアンモニウム化合物は、既存の陽イオンリポソームの能力を改良し、生物活性化合物の非常に有効な送達系として作用する。
【０１００】
本発明の最も好ましいベクター
本発明の最も好ましい組換えベクターには、上記定義の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸が挿入されたｐＡＳΔΔ（図２）、ｐＡＣＴＩＩｓｔ（図３）、ｐＴ１８（図４）、ｐＵＴ１８Ｃ（図５）、ｐＴ２５（図６）、ｐＫＴ２５（図７）、ｐＢ５（図１２）、およびｐＰ６（図１３）が含まれる。
【０１０１】
本発明はまた、図１３に示すベクターｐＰ６からなるツーハイブリッド方法で使用可能なベクターに関する。実施例１で開示のように、Ｃ型肝炎ウイルスの病原性Ｈ７７株由来のゲノムＤＮＡライブラリーからなる組換えプラスミドコレクションの調製にベクターｐＰ６を首尾よく使用している。
【０１０２】
本発明はまた、ベクターｐＢ５からなるツーハイブリッド方法で使用可能なベクターに関する。実施例１で開示のように、酵母ツーハイブリッド方法でのベイトプラスミドとしてベクターｐＢ５を首尾よく使用している。
【０１０３】
組換え細胞宿主
１つの態様では、本発明の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体を、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドをコードする拡散または本発明の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドをコードする核酸が挿入された上記定義の組換えベクターでトランスフェクトするか形質転換されている所望の宿主細胞中で組換えによって産生する。
【０１０４】
組換え細胞宿主は、本発明の別の側面である。
【０１０５】
このような細胞宿主は、一般に、少なくとも１つの本発明の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸のコピーを含む。
【０１０６】
発現に好ましい細胞を、考えられる目的の機能で選択する。例えば、本発明の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドの大量産生を考える態様では、大量の本発明の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドを産生し、選択的なさらなる精製工程を容易に行うことができる場合、その産生に使用する宿主細胞の性質は比較的重要ではない。
【０１０７】
しかし、特異的タンパク質−タンパク質相互作用を阻止する目的で選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドを組換えによって宿主生物内で産生する態様では、目的のポリペプチドを自然に産生すると考えられる宿主生物から宿主生物を選択する。
【０１０８】
したがって、哺乳動物（典型的には、ヒト）細胞ならびに細菌、酵母、真菌、昆虫、線虫、および植物細胞は、本発明の範囲内であり、かつ上記定義の核酸または組換えベクターのいずれかによってトランスフェクトすることができる細胞宿主である。
【０１０９】
適切な組換え宿主細胞の例には、ベロ細胞、ＨＥＬＡ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ２）、ＣＨＯ細胞株（例えば、ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ６１）、ＣＯＳ細胞（例えば、ＣＯＳ−７細胞；ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６５０のＣＯＳ細胞）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３（ＡＴＣＣ番号」：ＣＲＬ６３６１）、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２細胞、２９３細胞、Ｓｆ９細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１７１１）、およびＣｖ１細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号：ＣＣＬ７０）が含まれる。
【０１１０】
本発明で使用可能な他の適切な宿主細胞には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（例えば、ＤＨ５−α）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの原核宿主細胞株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属などの株が含まれる。
【０１１１】
本発明の使用可能なさらに適切な宿主細胞には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ（典型的には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の宿主細胞などの酵母細胞が含まれる。
【０１１２】
本発明はまた、
ａ）本発明のＳＩＤ（登録商標）核酸またはＳＩＤ（登録商標）核酸を含むベクターで形質転換した細胞宿主を適切な培地で培養する工程と、
ｂ）培養上清または細胞溶解物からＳＩＤ（登録商標）組換えポリペプチドを回収する工程とを含む、
上記定義のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドの産生法に関する。
【０１１３】
したがって、組換えによって得られたＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドまたはその変異体を、例えば、ＲＯＵＧＥＯＴら、（１９９４）によって記載された逆相および／または陽イオン交換ＨＰＬＣなどの高速液体クロマトグラフィーによって精製することができる。この種のペプチドまたはタンパク質精製を好む理由は、溶出サンプル中に副産物が認められないことであり、得られた精製タンパク質は治療により適切である。
【０１１４】
本発明のツーハイブリッド方法
ａ）酵母ツーハイブリッド方法
本発明はまた、ａ）アッセイすべきプレイポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換された組換え酵母細胞クローンコレクションの少なくとも１つの第１の組換え酵母細胞クローンを本発明のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドまたはその変異体をコードするベイトポリペプチドを含むプラスミドで形質転換された第２の一倍体組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞クローンと交配させる工程と、
ｂ）選択培地にて工程ａ）で得た二倍体を培養する工程と、
ｃ）該選択培地で増殖した組換え細胞クローンを選択する工程と
を含む、配列番号１〜３８のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドまたはその変異体に結合するプレイポリペプチドをコードする核酸インサートを含むベクターを含む組換え細胞クローンを選択するための、酵母ツーハイブリッド方法に関する。
【０１１５】
上記の酵母ツーハイブリッド方法は、工程ｃ）で選択された各組換え細胞クローン中に含まれるヌクレオチドを特徴付ける工程をさらに含み得る。
【０１１６】
最も好ましくは、当業者は、以下の実施例２に開示のように、このような酵母ツーハイブリッド方法を行うことができる。
【０１１７】
上記の酵母ツーハイブリッド方法によれば、本発明のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドまたはその変異体を、ベイトポリペプチドとして使用する。
【０１１８】
上記酵母ツーハイブリッド方法の好ましい態様では、プレイポリヌクレオチドは約１５０〜約６００ヌクレオチド長であり、かつ組換え細胞クローンコレクションの１つの組換えクローン中に含まれるベクターに挿入される病原性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）株ゲノム由来のＤＮＡフラグメントである。
【０１１９】
ｂ）細菌ツーハイブリッド方法
当業者は、ＫＡＲＩＭＯＶＡら、（１９９８）の技術にしたがって本発明の細菌ツーハイブリッド方法を行うことができる。
【０１２０】
ベイトポリペプチドに特異的に結合するポリペプチドをコードする核酸コレクションの第１の選択工程を、細菌ツーハイブリッド系によって行うこともできる。
【０１２１】
このような細菌ツーハイブリッド系によれば、細菌細胞クローン（好ましくは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞）を、ベイトポリペプチドをコードするベイトポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換する。
【０１２２】
次いで、「酵母ツーハイブリッド系」というタイトルの先の節に記載のゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーを含む酵母クローンコレクションから得たプラスミドのレスキューによって、ＤＮＡインサートを含むプラスミドを得る。例えば、プラスミドレスキューを以下の工程：
（ｉ）従来のＤＮＡ抽出緩衝液およびフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）の使用によって先の節で開示のようにして得た酵母クローンコレクション中に含まれるプラスミドＤＮＡを抽出して遠心分離する工程と、
（ｉｉ）滅菌エッペンドルフチューブに工程（ｉ）の最後で得た所望の体積の上清を移し、沈殿緩衝液（エタノール／ＮＨ４Ａｃ）を添加して遠心分離し、エタノールでの洗浄後にペレットを再懸濁する工程と、
（ｉｉｉ）エレクトロポレーションによって電気形質転換受容性を付与されたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ　ＮＣ１０６６株）を工程（ｉｉ）で得た所望の体積（例えば、１μｌ）の酵母プラスミドＤＮＡ抽出物で形質転換する工程と、
（ｉｖ）形質転換Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞を回収する工程
によって行うことができる。
【０１２３】
または、ＨＣＶゲノムＤＮＡインサートコレクションを含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞クローンコレクションを、細菌細胞でのＤＮＡライブラリーの直接構築によって得ることができる（Ｆｉａｊｏｌｅｔら、（２０００）に開示のものなど）。
【０１２４】
ついで、ベイトポリペプチドをコードするベイトポリヌクレオチドを含むプラスミドおよびプレイポリヌクレオチドをコードするプレイポリヌクレオチドを含むプラスミドの両方で形質転換した細菌組換え細胞を、選択培地で培養する。
【０１２５】
次いで、該選択培地で増殖することができる組換え細胞クローンを選択し、その中に含まれるプラスミドのＤＮＡインサートを配列決定する。
【０１２６】
細菌ツーハイブリッド系は、一般に、プレイポリペプチドおよびベイトポリペプチドが少なくとも１つのレポーター遺伝子の転写の誘発による組換え細胞によって産生されて、１つのプレイポリペプチド中に含まれる特異的ドメインおよびベイトポリペプチド中に含まれる相補ドメインの両方が互いに結合する場合にその転写が活性化される少なくとも１つのレポーター遺伝子を通常使用する方法を意図する。
【０１２７】
本発明は、
ａ）細菌細胞クローンを本発明のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドまたはその変異体をコードするＳＩＤ（登録商標）ポリヌクレオチドを含むプラスミドで形質転換する工程と、
ｂ）各プレイポリヌクレオチドが所望の生物ゲノム由来のＤＮＡフラグメントであり、各プレイプラスミドが組換え酵母細胞クローンコレクションの１つの組換え酵母細胞クローン中に含まれる、プレイポリヌクレオチドを含むプレイプラスミドをレスキューする工程と、
ｃ）工程ａ）で得られた組換え細菌細胞クローンを工程ｂ）でレスキューしたプラスミドで形質転換する工程と、
ｄ）選択培地にて工程ｃ）で得た細菌組換え細胞を培養する工程と、
ｅ）該選択培地で増殖した組換え細胞クローンを選択する工程と
を含む、配列番号１〜３８のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドまたはその変異体に結合するプレイポリペプチドをコードするプレイポリヌクレオチドを含む組換え細胞クローンを同定するための細菌ツーハイブリッド方法に関する。
【０１２８】
上記の細菌ツーハイブリッド系は、ｆ）工程ｅ）で選択された各組換え細胞クローン中に含まれるプレイポリペプチドを特徴付ける工程をさらに含み得る。
【０１２９】
上記の酵母および細菌のツーハイブリッド方法の１つの好ましい態様では、プレイポリペプチドはＣ型肝炎ウイルスを感染している哺乳動物（ヒトおよびサル、典型的にはチンパンジー）によって発現されるヒトポリペプチドである。
【０１３０】
一般に、本明細書に開示の酵母ツーハイブリッド方法または細菌ツーハイブリッド方法を、任意の起源（ウイルス、真菌、細菌、または哺乳動物起源のいずれか、すなわち、原核生物または真核生物起源のいずれか）のプレイポリペプチドを使用して行うことができる。
【０１３１】
上記のツーハイブリッド方法の第２の好ましい態様では、プレイポリペプチドはＨＣＶポリペプチドである。
【０１３２】
最も好ましくは、プレイポリペプチドは、ヒトに対して病原性を示すＣ型肝炎ウイルス株（Ｈ７７株など）によってコードされる。
【０１３３】
本発明の核酸組およびポリペプチドの組
さらに別の側面では、本発明は、
ｉ）本発明の配列番号１〜３９のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドまたはその変異体をコードする第１の核酸と、
ｉｉ）ｉ）で定義のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドに特異的に結合するプレイポリペプチドをコードする第２の核酸
からなる２つの核酸組に関する。
【０１３４】
なおさらなる側面では、本発明はまた、
ｉ）本発明の配列番号１〜３９のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドまたはその変異体からなる第１のポリペプチドと、
ｉｉ）第１のポリペプチドに特異的に結合する第２のポリペプチド
からなる２つのポリペプチド組に関する。
【０１３５】
本発明は、さらに、
ｉ）本発明の配列番号１〜３８のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドからなる第１のポリペプチドと、
ｉｉ）第１のポリペプチドに特異的に結合する第２のポリペプチドと
の間に形成される複合体に関する。
【０１３６】
本発明はまた、２つの相互作用タンパク質が上記定義の２つのポリペプチド組からなる、タンパク質−タンパク質相互作用に関する。
【０１３７】
好ましい態様では、本発明は、２つのポリペプチドが配列番号１〜３８のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドおよびＨＣＶポリペプチドからなるタンパク質−タンパク質相互作用に関する。
【０１３８】
ツーハイブリッド方法を数回反復して行い、それによって共通のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドおよびプレイポリペプチドが選択される場合、各相互作用ポリペプチドの公知および／または疑われる生体機能を考慮したこれらのポリペプチドの間の全ての相互作用のマップを構築することができる。
【０１３９】
表１は、配列番号１〜３８のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドとヒトまたはチンパンジーなどの哺乳動物に病原性を示すＣ型肝炎ウイルスのＨ７７株のゲノムによってコードされる配列番号７７〜１１３のポリペプチドとの間のタンパク質−タンパク質相互作用を示す。
【０１４０】
したがって、表１に示すデータは、本発明の範囲内の特定の核酸組および特定のポリペプチド組を開示する。
【０１４１】
例えば、表１は、配列番号３９の核酸がＨＣＶ　Ｈ７７株のコアタンパク質由来のアミノ酸配列のみを（１００％）含む配列番号１のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドをコードすることを開示する。
【０１４２】
配列番号３９の核酸は、ＹＡＮＡＧＩら、（１９９７）によって記載されたＨＣＶゲノムの第４４６位のヌクレオチドから開始され、第６００位のヌクレオチドで終結する。
【０１４３】
表１はまた、配列番号１のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドが本発明のポリペプチド組の一部であり、該ポリペプチド組の第２のポリペプチドが配列番号１１４の核酸配列によってコードされる配列番号７７のポリペプチドからなり、該核酸配列はコアタンパク質をコードするＨＣＶ　Ｈ７７株のＤＮＡ領域由来の配列の８７％を有することを開示する。
【０１４４】
したがって、本発明の特定のポリペプチド組は、
ｉ）配列番号１のポリペプチドと、
ｉｉ）配列番号７７のポリペプチドと
からなる。
【０１４５】
明確に本発明の一部である表１に開示の全ポリペプチド組に同一の理由が適用される。
【０１４６】
同様に、本発明の特定の核酸組は、
（ｉ）配列番号３９の核酸と、
（ｉｉ）配列番号１１４の核酸と
からなる。
【０１４７】
明確に本発明の一部である表１に開示の全核酸組に同一の理由が適用される。
【０１４８】
したがって、本発明の２つの特定のポリペプチド組は、それぞれ、
配列番号７７／ 配列番号１； 配列番号７８／ 配列番号２； 配列番号７８／ 配列番号３； 配列番号７９／ 配列番号４； 配列番号８０／ 配列番号５； 配列番号８１／ 配列番号６； 配列番号８２／ 配列番号７； 配列番号８３／ 配列番号８； 配列番号８４／ 配列番号９； 配列番号８５／ 配列番号１０； 配列番号８６／ 配列番号１１； 配列番号８７／ 配列番号１２； 配列番号８８／ 配列番号１３； 配列番号８９／ 配列番号１４； 配列番号９０／ 配列番号１５； 配列番号９１／ 配列番号１６； 配列番号９２／ 配列番号１７； 配列番号９３／ 配列番号１８； 配列番号９４／ 配列番号１９； 配列番号９５／ 配列番号２０； 配列番号９６／ 配列番号２１； 配列番号９７／ 配列番号２２； 配列番号９８／ 配列番号２３； 配列番号９９／ 配列番号２４； 配列番号１００／ 配列番号２５． 配列番号１０１／ 配列番号２６． 配列番号１０２／ 配列番号２７； 配列番号１０３／ 配列番号２８． 配列番号１０４／ 配列番号２９； 配列番号１０５／ 配列番号３０； 配列番号１０６／ 配列番号３１； 配列番号１０７／ 配列番号３２； 配列番号１０８／ 配列番号３３； 配列番号１０９／ 配列番号３４； 配列番号１１０／ 配列番号３５； 配列番号１１１／ 配列番号３６； 配列番号１１２／ 配列番号３７； 及び配列番号１１３／ 配列番号３８．
である。
【０１４９】
同様に、本発明の２つの特定の核酸組は、それぞれ、
配列番号１１４／ 配列番号３９； 配列番号１１５／ 配列番号４０； 配列番号１１５／ 配列番号４１； 配列番号１１６／ 配列番号４２； 配列番号１１７／ 配列番号４３； 配列番号１１８／ 配列番号４４； 配列番号１１９／ 配列番号４５； 配列番号１２０／ 配列番号４６； 配列番号１２１／ 配列番号４７； 配列番号１２２／ 配列番号４８； 配列番号１２３／ 配列番号４９； 配列番号１２４／ 配列番号５０； 配列番号１２５／ 配列番号５１； 配列番号１２６／ 配列番号５２； 配列番号１２７／ 配列番号５３； 配列番号１２８／ 配列番号５４； 配列番号１２９／ 配列番号５５； 配列番号１３０／ 配列番号５６； 配列番号１３１／ 配列番号５７； 配列番号１３２／ 配列番号５８； 配列番号１３３／ 配列番号５９； 配列番号１３４／ 配列番号６０； 配列番号１３５／ 配列番号６１； 配列番号１３６／ 配列番号６２； 配列番号１３７／ 配列番号６３； 配列番号１３８／ 配列番号６４； 配列番号１３９／ 配列番号６５； 配列番号１４０／ 配列番号６６； 配列番号１４１／ 配列番号６７； 配列番号１４２／ 配列番号６８； 配列番号１４３／ 配列番号６９； 配列番号１４４／ 配列番号７０． 配列番号１４５／ 配列番号７１； 配列番号１４６／ 配列番号７２． 配列番号１４７／ 配列番号７３； 配列番号１４８／ 配列番号７４； 配列番号１４９／ 配列番号７５； 及び配列番号１５０／ 配列番号７６．
である。
【０１５０】
表１に開示のタンパク質−タンパク質相互作用により、ＨＣＶ　Ｈ７７株のゲノムによってコードされる種々のポリペプチドの間の相互作用のマップを構築可能である。
【０１５１】
このようなタンパク質相互作用マップ（ＰＩＭ（登録商標））では、各ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドは、例えば矢印に特異的に結合するベイトポリペプチドに連結する。
【０１５２】
このようなタンパク質相互作用マップ（ＰＩＭ（登録商標））は、当業者の病原性ＨＣＶ株内で機能的に活性な全代謝経路および／または生理学的経路の解読の一助となり得る。タンパク質相互作用マップおよびＰＩＭ（登録商標）の電算可能なバージョンは、本発明の一部である。
【０１５３】
したがって、さらに別の側面では、本発明は、本発明のタンパク質−タンパク質相互作用を保存した、好ましくは例えばＦＲＯＭＯＮＴ−ＲＡＣＩＮＥら、（１９９７）に示すタンパク質相互作用マップの形態で保存されているコンピュータ読み取り可能な媒体（コンピュータで読み取り可能なフロッピーディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、および全ての電気または磁気フォーマットなど）に関する。
【０１５４】
好ましい態様では、本発明は、保存されたタンパク質−タンパク質相互作用が注釈付きデータベースに例えばインターネットでリンクされている上記定義のコンピュータで読み取り可能な媒体を含む。
【０１５５】
別の好ましい態様では、本発明は、保存されたタンパク質−タンパク質相互作用を含むデータバンクを含み、該データバンクはワールドワイドウェブサイトで利用可能である。
【０１５６】
本発明のタンパク質−タンパク質相互作用インヒビターの選択法
上記の形質転換宿主細胞を、本発明のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドとその結合するポリペプチドパートナーとの間または本発明のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドとＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドおよびその結合するポリペプチドパートナーとの間の結合を阻害する化学物質またはタンパク質化合物との間の相互作用を研究するためのモデルとして使用することもできる。
【０１５７】
ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドおよびその結合パートナーポリペプチドの例は、典型的には、上記の本発明のポリペプチド組である。
【０１５８】
特に、本発明の形質転換宿主細胞を、補助因子またはインヒビター（特に、競合インヒビター）として本明細書に記載のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドと相互作用するかまたはＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドが関連するタンパク質−タンパク質相互作用に対してアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する分子の選択に使用することができる。好ましくは、該形質転換宿主細胞を、特にＣ型肝炎ウイルスによって誘導された病態を予防および／または治療可能な産物を選択するモデルとして使用する。
【０１５９】
したがって、本発明はまた、ａ）試験すべき分子を含む選択培地にてその発現が組換え宿主細胞に有毒であるレポーター遺伝子を含む組換え宿主細胞を培養し、該宿主細胞は、
ｉ）第１のベクターが、該２つのポリペプチドの１つおよびＤＮＡ結合ドメインを含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、
ｉｉ）第２のベクターが、該２つのポリペプチドのうちの第２のポリペプチドを含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸および前記第１および前記第２のハイブリッドポリペプチドが相互作用した場合に該有毒レポーター遺伝子を活性化することができる活性化ドメインを含む２つのベクターで形質転換されており、有毒レポーター遺伝子が活性化されない場合に該組換え宿主細胞が増殖する工程と、
ｂ）工程ａ）で定義の前記組換え宿主細胞の増殖を阻害する分子を選択する工程とを含む、
上記定義の２つのポリペプチドの組の間のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する分子の選択法からなる。
【０１６０】
本発明はまた、ａ）試験すべき分子を含む選択培地にてその発現が組換え宿主細胞に有毒であるレポーター遺伝子を含む組換え宿主細胞を培養し、該宿主細胞は、
ｉ）第１のベクターが、該２つのポリペプチドの１つおよび酵素の第１のドメインを含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含み、
ｉｉ）第２のベクターが、該２つのポリペプチドのうちの第２のポリペプチドを含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸および前記第１および前記第２のハイブリッドポリペプチドが相互作用した場合に該有毒レポーター遺伝子を活性化することができる該酵素の第２の部分を含み、該相互作用により前記酵素の触媒活性が回収される、２つのベクターで形質転換されており、有毒遺伝子が活性化されない場合に該組換え宿主細胞が増殖する工程と、
ｂ）工程ａ）で定義の前記組換え宿主細胞の増殖を阻害する分子を選択する工程とを含む、上記定義の２つのポリペプチドの組のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する分子の選択法に関する。
【０１６１】
好ましい態様では、陰性選択に使用することができる該有毒レポーター遺伝子は、ＵＲＡ３、ＣＹＨ１、またはＣＹＨ２遺伝子である。
【０１６２】
例えば、本発明のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドとその結合タンパク質相対物との間の相互作用を阻害する分子のスクリーニング法は、以下の工程を含み得る：
−透過処理酵母細胞を２つのベクター（それぞれ、本発明のＳＩＤ（登録商標）核酸を含む第１のベクターおよび本明細書に定義のプレイ核酸を含む第２のベクター）で形質転換する工程と、
−正方形の箱上の上記の形質転換透過処理酵母細胞をトップアガーにプレートする工程と、
−凝固直後に候補インヒビター分子のスポッティングによって塗布してトップアガー上で試験する工程と、
−例えば、３０℃で一晩インキュベートする工程と、
−形質転換酵母細胞を増殖させるインヒビター化合物を選択する工程。
【０１６３】
本発明はまた、上記定義の２つのポリペプチドの組のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する分子をスクリーニングするためのキットであって、該キットは、その発現が組換え宿主細胞に有毒なレポーター遺伝子を含む組換え宿主細胞を含み、該宿主細胞が、
ｉ）第１のベクターが２つのポリペプチドのうちの１つを含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸およびＤＮＡ結合ドメインを含み、
ｉｉ）第２のベクターが該２つのポリペプチドのうちの第２のポリペプチドを含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸および前記第１および前記第２のハイブリッドポリペプチドが相互作用した場合に該有毒レポーター遺伝子を活性化することができる活性化ドメインを含む、２つのベクターで形質転換されている、キットを提供する。
【０１６４】
本発明の別の目的は、上記定義の２つのポリペプチドの組のタンパク質−タンパク質相互作用を阻害する分子をスクリーニングするためのキットであって、該キットは、その発現が組換え宿主細胞に有毒なレポーター遺伝子を含む組換え宿主細胞を含み、該宿主細胞が、
ｉ）第１のベクターが２つのポリペプチド組のうちの１つを含む第１のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸およびタンパク質の第１のドメインを含み、
ｉｉ）第２のベクターが該２つのポリペプチドのうちの第２のポリペプチド含む第２のハイブリッドポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸および前記第１および前記第２のハイブリッドポリペプチドが相互作用した場合に該有毒レポーター遺伝子を活性化することができるタンパク質の第２の部分を含み、該相互作用によりタンパク質活性が回復する、２つのプラスミドで形質転換されている、キットからなる。上記の選択法では、活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインの転写は、それぞれＧａｌ４およびＬｅｘＡ由来であり得る。
【０１６５】
第１のドメインが酵素の第１の部分であり、かつ相補ドメインが同じ酵素の第２の部分であり、２つの酵素部分の近さにより酵素活性が回復してレポーター遺伝子が活性化する態様では、酵素の２つの部分は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニル酸シクラーゼの触媒ドメインを形成するＴ２５およびＴ１８ポリペプチドであることが最も好ましい。
【０１６６】
例示的な態様として、レポーター遺伝子は、栄養遺伝子またはその発現が比色によって視覚化される遺伝子（Ｈｉｓ３、ＬａｃＺ、またはＬａｃＺとＨｉｓ３の両方など）からなる群より選択される。
【０１６７】
本発明のマーカー化合物
ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドは従来の検出化合物（抗体または抗体フラグメントなど）を使用して全く達成しえない性質を有するので、本明細書で定義され、目的のポリペプチド（例えば、ベイトポリペプチド）に特異的に結合する本発明の配列番号１〜３８の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドおよびその変異体は、サンプル中の目的のポリペプチド（典型的には、ＨＣＶによってコードされるポリペプチド）の検出、標識、標的、または精製用の試薬として有用である。
【０１６８】
第１に、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドはＣ型肝炎ウイルスに感染した真核細胞中の天然の環境で目的のポリペプチドに特異性の高い様式で結合する巨大ポリペプチドの一部からなるので、本発明のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドは目的のポリペプチドに対して高い結合特異性を示す。
【０１６９】
第２に、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドは、一般に、３ｋＤａからの低分子量であり、それにより一方では産生が容易であり、他方では目的のポリペプチドの局在化または発現の検出を調査する場合に細胞内に容易に移入することができる。さらに、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドのサイズが小さいので核膜または異なる細胞オルガネラ周囲の膜などの内部細胞バリアを通過可能である。
【０１７０】
したがって、本発明の第１の目的は、
ａ）目的のポリペプチドに特異的に結合する選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体と、
ｂ）上記に結合した検出可能分子とを含むマーカー化合物からなる。
【０１７１】
このようなマーカー化合物は、主に、目的のポリペプチド（例えば、サンプル中に含まれる目的のポリペプチド）の検出、標識、または標的に有用である。
【０１７２】
本発明の検出可能分子は、シグナルを発生するか発生を誘導することができる任意の分子を含むか、これらからなる。検出可能分子は、シグナル発生手段を含むシグナル発生系のメンバーであり得る。
【０１７３】
検出可能分子は、同位性または非同位性であり得る。実施例（制限されない）によれば、検出可能分子は、触媒反応系の一部（酵素、酵素フラグメント、酵素基質、酵素インヒビター、補酵素、または触媒など）であり得る。色素原系の一部（フルオロフォア、色素、化学発光物質、発光物質、または増感剤など）。非磁性または磁性であり得る分散粒子、固体支持体、リポソーム、リガンド、受容体、ハプテン放射性同位体等。
【０１７４】
一般に、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドをに関連する本発明で開示の全態様を任意のその変異体にも直接適用されると理解しなければならない。
【０１７５】
蛍光検出可能分子
本発明のマーカー化合物の１つの側面では、検出可能分子は蛍光分子からなる。標識として頻繁に使用される蛍光部分は、例えば、Ｉｃｈｉｎｏｓｅら、（１９９１）記載のものである。他の蛍光検出可能分子は、Ｓｈａｔｔｉｌら、（１９８７）またはＧｏｄｉｎｇら、（１９８６）などが記載のフルオレセインイソチアネー（ＦＩＴＣ）である。蛍光検出可能分子はまた、Ｇｏｄｉｎｇら、（１９８６）およびＳｈａｔｔｉｌら、（１９８５）が教示のフィコエリトリンを含み得る。本発明のマーカー化合物の標識として適切な他の蛍光検出可能分子の例は、ローダミンイソチオシアネート、塩化ダンシル、およびＸＲＩＴＣである。
【０１７６】
別の蛍光検出可能分子は、クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその多数の蛍光タンパク質誘導体からなる。
【０１７７】
当業者は、遺伝子発現およびタンパク質局在化研究のためのＧＦＰの使用を開示したＣＨＡＬＦＩＥら、（１９９４）およびＨＥＩＭら、（１９９４）の文献を都合よく参照することができる。当業者はまた、細胞中の細胞内オルガネラの視覚化用のツールとして野生型ＧＦＰの使用を考察しているＲｉｚｚｕｔｏら、（１９９５）の論文、野生型ＧＦＰを使用した分泌経路を介したタンパク質輸送の視覚化を報告しているＫＡＥＴＨＥＲ ａｎｄ ＧＥＲＤＥＳ （１９９５）の論文、植物細胞におけるＧＦＰ発現に関するＨＵ ａｎｄ ＣＨＥＮＧ （１９９５）の論文、およびキイロショウジョウバエ胚におけるＧＦＰ発現を開示したＤａｖｉｓら、（１９９５）の論文を参照することができる。いくつかのＧＦＰ蛍光変異体の使用のために、当業者は、Ｄｅｌａｇｒａｖｅら、（１９９５）の論文およびＨｅｉｍら、（１９９５）の論文を参照することができる。ＧＦＰをコードするＤＮＡは、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡから市販されている。当業者は、米国特許第６，０２０，１９２号などに記載のヒト化ＧＦＰおよび米国特許第５，９４１，０８４号に開示されるＧＦＰタンパク質も使用することができる。
【０１７８】
本発明のマーカー化合物で使用することができる別の蛍光タンパク質は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）からなる。
【０１７９】
さらに適切な発光タンパク質は、ルシフェラーゼタンパク質からなる。
【０１８０】
触媒活性を示す検出可能分子
本発明のマーカー化合物に含まれる検出可能分子の別の態様では、検出可能分子は触媒活性を付与するので、酵素および触媒活性酵素フラグメントからなる。いくつかの酵素標識は、米国特許第３，６５４，０９０号に記載されている。このような酵素は、例えば、当業者に周知の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、またはグルタチオンペルオキシダーゼであり得る。
【０１８１】
酵素、酵素フラグメント、酵素インヒビター、酵素基質、および酵素反応系の他の成分を、検出可能分子として使用することができる。任意のこれらの成分を検出可能分子として使用する場合、１つの成分を含む化学反応は、シグナル発生系の一部である。
【０１８２】
結合触媒もまた、酵素を非酵素触媒に関連させることができる。酵素は、非酵素触媒によって触媒される反応を受けた反応物を産生することができるか、非酵素触媒は酵素の基質（補酵素を含む）を産生することができる。当業者は、使用することができる広範な（ｗｈｉｔｅ）種々の非酵素触媒を開示した米国特許第４，１６０，６４５号（参照として本明細書に組み入れられる適切な部分）を有利に参照することができる。
【０１８３】
使用した酵素または補酵素により、光（例えば、タイ（ｔｙｅ））を吸収するか照射の際に光を放出する産生物（例えば、蛍光物質）の産生により所望の増幅が得られる。または、触媒反応により直接光を放出させることができる（例えば、化学発光）。このような産生物を得るための多数の酵素および補酵素は、米国特許第４，２７５，１４９号の段落１９〜２３および同第４，３１８，９８０号の段落１０〜１４に（その開示が参照として本明細書に組み入れられる）記載されている。
【０１８４】
多数の酵素の組み合わせは、米国特許第４，２７５，１４９号の段落２３〜２８（その開示が参照として本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【０１８５】
検出可能分子または検出可能分子中に含まれるものとして１つの酵素を使用する場合、使用することができるこのような酵素は、加水分解酵素、転移酵素、離脱酵素、異性化酵素、リガーゼ、合成酵素、および酸化還元酵素である。
【０１８６】
または、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼなどのルシフェラーゼを使用することができる。
【０１８７】
主に、Ｉ．Ｕ．Ｂ分類を基本として選択される酵素は、（ｉ）クラス１の酸化還元酵素および（ｉｉ）クラス３の加水分解酵素である。最も好ましい酸化還元酵素は、（ｉ）クラス１．１、より詳細には１．１．１、１．１．３、および１．１．９９の脱水素酵素および（ｉｉ）クラス１．１１の加水分解酵素、より詳細にはクラス３．１、より詳細には３．１．３およびクラス３．２、より詳細には３．２．１のペルオキシダーゼである。
【０１８８】
デヒドロゲナーゼの例には、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、および乳酸デヒドロゲナーゼが含まれる。オキシダーゼの典型は、グルコースオキシダーゼである。ペルオキシダーゼの例は、西洋ワサビペルオキシダーゼである。加水分解酵素の例は、アルカリホスファターゼ、β−グルコシダーゼ、およびリゾチームである。
【０１８９】
化学発光検出可能分子
本発明のマーカー化合物中に含まれる検出可能分子はまた、化学発光部分からなり得る。化学発光源は、化学反応によって電気的に励起されて検出シグナルとして使用される光を発生することができ、蛍光受容体に対するエネルギーを示す化合物を含む。
【０１９０】
種々の数の化合物ファミリーによって、種々の条件下で化学発光が得られることが認められている。化合物ファミリーは、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジノンである。最も利用されている化合物は、上記化合物の５−アミノアナログであるルミノールである。ファミリーの他のメンバーには、５−アミノ−６，７，８−トリメトキシおよびジメチルアミン−［ｃａ］ベンゾアナログが含まれる。これらの化合物は、アルカリ過酸化水素または次亜塩素酸カルシウムおよび塩基を使用して発光させることができる。
【０１９１】
化合物の別のファミリーは、特許産生物の一般名がロフィンである２，４，５−トリフェニルイミダゾールである。化学発光アナログには、パラジメチルアミノおよびパラメトキシ置換物が含まれる。塩基性条件下でゲリジニウムエステル、ジオキサン、およびシュウ酸塩（通常、オキサリル活性エステル、例えばｐ−ニトロフェニルおよび過酸化物（例えば、過酸化水素））を使用して化学発光物質を得ることもできる。または、ルシフェラーゼまたはルシゲニンと併せてルシフェリンを使用することができる。
【０１９２】
放射性検出可能分子
本発明のマーカー化合物中に含まれる検出可能分子のさらなる態様では、該検出可能分子は、［３Ｈ］、［３２Ｐ］、および［１２５Ｉ］などで放射性標識されている。
【０１９３】
コロイド状金属検出可能分子
なおさらなる態様では、本発明のマーカー化合物に含まれる検出可能分子は、コロイド状金属粒子を含み得る。以前に免疫アッセイでコロイド状金属が使用されている。主に、これらは、コロイド状の鉄または金のいずれかからなる。当業者は、Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ（１９８１）およびＭａｒｔｉｎら、（１９９０）の論文を有利に参照することができる。他の場合、金属をその色で選択する（すなわち、その存在を電子顕微鏡で色または電子密度によって同定する）。色および電子密度は共に金属コロイドの質量に直接比例する。
【０１９４】
本発明のマーカー化合物の構造
本発明のマーカー化合物の第１の好ましい態様では、検出可能分子は配列番号１〜配列番号３８の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体に共有結合している。
【０１９５】
この特定の態様によれば、蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびＹＦＰなど）、酵素または酵素フラグメント（アルカリホスファターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼなど）、化学発光分子、放射性標識、またはコロイド状金属粒子を含む検出可能分子が好ましい。
【０１９６】
検出可能分子の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドへの共有結合に当業者が使用することができる一般的方法は、免疫アッセイに使用する抗体結合物の調製に関連する多数の参考文献に記載されている。
【０１９７】
本発明のマーカー化合物の第２の好ましい態様では、検出可能分子は、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体に非共有結合している。
【０１９８】
この第２の好ましい態様の第１の好ましい側面では、検出可能分子は、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体に特異的な抗体からなる。
【０１９９】
選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体に特異的な抗体は、中立的に放射性または非放射性標識することができる。
【０２００】
本発明のマーカー化合物をコードする核酸
本発明はまた、上記定義のマーカー化合物をコードする核酸に関する。
【０２０１】
本発明に含まれる最も好ましい核酸には、マーカー化合物をコードするポリヌクレオチドが含まれ、配列番号１〜３８の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体は検出可能分子に共有結合しており、検出可能分子自体はポリペプチドからなる。
【０２０２】
最も好ましい核酸は、配列番号３９〜７６の核酸である。
【０２０３】
本発明の核酸の第１の好ましい態様では、該核酸は蛍光タンパク質（ＧＦＰおよびＹＦＰなど）に融合した選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドをコードする。
【０２０４】
本発明の核酸の第２の好ましい態様では、該核酸は触媒活性を付与されたポリペプチド（アルカリホスファターゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素または酵素活性酵素フラグメントなど）に融合した選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドをコードする。
【０２０５】
好ましい態様では、本発明のマーカー化合物をコードする核酸は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にインビトロまたはインビボで細胞中にて転写されてマーカー化合物に翻訳されるＤＮＡコード配列を含む。コード配列の境界を、開始コドンおよび翻訳終止コドンによって同定する。コード配列には、
−例えば、検出可能分子をコードする選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））核酸およびそれに融合した核酸が原核生物起源である場合、原核配列、
−例えば、検出可能分子をコードする核酸が真核宿主生物に由来する場合、真核および原核配列を含み得るが、これらに限定されない。
【０２０６】
コード配列が真核細胞における発現を意図する場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を、通常、コード配列の３′に存在する。
【０２０７】
本発明の核酸配列の最も好ましい態様では、該核酸配列には、核酸配列の発現が調査される宿主生物で機能的なプロモーター配列を含む調節領域が含まれる。
【０２０８】
「調節領域」は、配列の発現を調節する核酸配列を意味する。調節領域は、天然に特定の核酸（相同領域）の発現を担う配列を含み得るか、異なる起源の配列（異なるタンパク質または合成タンパク質の発現を担う）を含み得る。特に、この配列は、特異的または非特異的様式および誘導または非誘導様式で遺伝子の転写を刺激または抑制する真核生物もしくはウイルス遺伝子配列または誘導配列であり得る。調節領域には、複製起点、ＲＮＡスプライス部位、エンハンサー、転写終結配列、標的細胞の分泌経路にポリペプチドを指向させるシグナル配列、およびプロモーターが含まれる。
【０２０９】
「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合して下流（３′方向）コード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を定義する目的のために、プロモーター配列を転写開始部位の３′末端に結合し、バックグラウンド以上で検出可能なレベルでの転写開始に必要な最小数の塩基またはエレメントを含む様に上流（５′方向）を伸長させる。プロモーター配列内に転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングによって都合よく定義される）およびＲＮＡポリメラーゼ結合を担うタンパク質結合部位（コンセンサス配列）が見出される。
【０２１０】
ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写し、トランスＲＮＡスプライシングされて、コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される場合、コード配列は転写および翻訳調節配列の「制御下」にある。
【０２１１】
本発明のマーカー化合物の発現に最も好ましいベクター
本発明のマーカー化合物発現に最も好ましい組換えベクターには、上記定義の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体をコードする核酸が挿入されたｐＡＳΔΔ（図２）、ｐＡＣＴＩＩｓｔ（図３）、ｐＴ１８（図４）、ｐＵＴ１８Ｃ（図５）、ｐＴ２５（図６）、ｐＫＴ２５（図７）、ｐＢ５（図１２）、およびｐＰ６（図１３）が含まれる。
【０２１２】
本発明はまた、上記定義のマーカー化合物を発現するベクター、より詳細には、その発現が調査される宿主細胞中で機能的な適切な調節シグナルに作動可能に連結された該マーカー化合物をコードする核酸が挿入されたベクターに形質転換された組換え宿主細胞に関する。
【０２１３】
好ましい発現用細胞を、調査される対象の機能で選択する。例えば、本発明のマーカー化合物の大量産生を調査する態様では、大量の本発明の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはマーカー化合物を産生し、場合によりさらなる産生工程を容易に行うことができる場合、産生に使用する細胞宿主の性質は比較的無関係である。
【０２１４】
しかし、マーカー化合物が特異的に結合する目的のポリペプチドの定性分析または定量分析用の宿主生物内で組換えによって産生される態様では、宿主生物は、目的のポリペプチドを天然に産生すると疑われる宿主生物から選択される。
【０２１５】
したがって、哺乳動物およびヒト細胞ならびに細菌、酵母、真菌、昆虫、線虫、および植物細胞は、本発明に含まれ、上記定義の核酸または組換えベクターのいずれかでトランスフェクトすることができる細胞宿主である。
【０２１６】
本発明の検出法
本発明は、さらに、配列番号１〜３８の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体および検出のためにこれをコードする核酸（配列番号３９〜７６の核酸など）に関する。本明細書では、上記の節のタイトル「選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチド」などで説明されるように、ＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドのアミノ酸配列が、そのヌクレオチド配列が目的の（ベイト）ポリペプチドへの特異的結合特性について選択されたプレイポリペプチドをコードする核酸配列コレクションに共通のポリヌクレオチド配列からなる核酸によってコードされるので、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドを、このような（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドの目的の所与の（例えば、ベイト）ペプチドに特異性の高い様式で結合する能力によって同定することを指摘する。
【０２１７】
選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドの所定の目的のポリペプチド（ウイルス、酵母、真菌、細菌、昆虫、植物、または哺乳動物ポリペプチド（ヒト起源のポリペプチドを含む）のいずれか）への特定の結合特性により、これを検出が調査される目的のポリペプチドの特異的リガンドとして使用される。
【０２１８】
したがって、当技術分野で公知でありかつ検出リガンドの目的の分子、最も好ましくは目的のポリペプチドに特異的に結合する能力を使用する任意の検出法での選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））の使用は、本発明の範囲内である。
【０２１９】
検出リガンドによる目的の分子、最も好ましくは目的のポリペプチドの認識を使用する検出法は当技術分野で周知であり、主に免疫アッセイに関する豊富な文献（その全体が参照として本明細書に組み入れられる）に例示されている。
【０２２０】
当業者は、特に、Ｍａｇｇｉｏ（１９８０）の書籍（異種アッセイ）、米国特許第３，８１７，８３７号（同種免疫アッセイ）、米国特許第３，９９３，３４５号（免疫蛍光法）、米国特許第４，２３３，４０２号（酵素チャネリング技術）、米国特許第３，８１７，８３７号（酵素増加免疫アッセイ技術）、米国特許第４，３６６，２４１号および欧州特許出願第ＥＰ−Ａ　０１４３５７４号（移動型アッセイ）、米国特許第５，２０２，００６号、米国特許第５，１２０，４１３号および米国特許第５，１４５，５６７号（免疫固定電気泳動、免疫電気泳動）、Ａｇｕｚｚｉら、（１９７７）の文献、Ｗｈｉｔｅら、（１９８６）の文献、Ｍｅｒｌｉｎｉら、（１９８３）の文献、米国特許第５，２２８，９６０号（免疫サブトラクション電気泳動）、Ｃｈｅｎら、（１９９１）の文献、Ｎｉｅｌｓｅｎら、（１９９１）、および米国特許第５，１２０，４１３号（毛細管電気泳動）を参照することができる。
【０２２１】
本発明の細胞検出法
本発明の第１の検出法は、
ａ）本発明のマーカー化合物または複数のマーカー化合物を検出が調査される目的のポリペプチドを含むと疑われるサンプルと接触させる工程と、
ｂ）該マーカー化合物または複数のマーカー化合物と目的のポリペプチドとの間に形成された複合体を検出する工程とを含む、サンプル中の目的のポリペプチドの検出法からなる。
【０２２２】
免疫アッセイの実施に使用することができる各サンプルを含む検出が調査される目的のポリペプチドの存在についてアッセイするサンプルは、任意の性質を示し得る。
【０２２３】
第１の側面では、サンプルは、任意の生体流動体（血液または血液分離産生物（例えば、血清、結晶、軟膜）など）であり得る。
【０２２４】
第２の側面では、サンプルは、構成学的研究のために予め固定した構成切片を含む、任意の単離生体構成サンプルであり得る。
【０２２５】
第３の側面では、サンプルは、細胞培養の培養上清または培養細胞の細胞溶解物であり得る。
【０２２６】
上記の本発明の第１の検出法の第１の好ましい態様では、検出工程ｂ）は、検出可能分子によって内因性に放出された蛍光シグナルの測定からなる。例えば、これは、１つまたは複数のトリプトファンアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドまたはその変異体をうまく利用することができる。
【０２２７】
上記で詳述した本発明の第１の検出法の第２の好ましい態様では、検出工程ｂ）は、検出可能分子の励起波長でエネルギー源を検出可能分子に与える工程と、検出可能分子の放出波長で放出した光を測定する工程からなる。
【０２２８】
マーカー化合物を使用する場合、上記の第２の態様の例は蛍光分子（蛍光タンパク質ＧＦＰまたはＹＦＰなど）に結合する選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））からなる。
【０２２９】
例えば、上記第１の検出法で使用される本発明のマーカー化合物の検出可能分子がＧＦＰタンパク質を含むかこれからなる態様では、検出工程ｃ）は、実質的に４９０ｎｍに等しい放出波長で試験したサンプルを照射する工程と、実質的に５１０ｎｍに等しい放出波長でサンプル中の目的のポリペプチドに結合したマーカー化合物によって放出された光を測定する工程とを含む。
【０２３０】
好ましくは、その検出がサンプル内で調査される目的のポリペプチドに結合しないマーカー化合物を、検出工程を行う前に除去する。
【０２３１】
第３の好ましい態様では、本発明の第１の検出法の検出工程ｃ）は、検出可能分子の触媒活性の測定からなる。この特定の態様では、検出法で使用したマーカー化合物は、酵素または触媒活性酵素フラグメント（「本発明のマーカー化合物」というタイトルの節で既に詳述されているものなど）を含むかまたはこれらからなる検出可能分子を含む。
【０２３２】
第４の好ましい態様では、検出工程ｂ）は、検出可能分子によって放出された放射能の測定からなる。
【０２３３】
本発明は、さらに、本発明のマーカー化合物を含む、サンプル中の目的のポリペプチドを検出するためのキットに関する。
【０２３４】
場合により、該検出キットは、さらに、免疫アッセイで従来より使用されているものと同一であり得る特定の酵素または使用した触媒活性酵素フラグメントの適切な基質および適切な緩衝液などの検出工程ｂ）の実施に必要な試薬を含む。
【０２３５】
本発明の組換え産生マーカー化合物を使用した細胞検出アッセイ
既に上記で記載のように、本発明のマーカー化合物を、遺伝子操作技術によって産生することができる。特に、検出が調査される目的のポリペプチドに特異的に結合する特定のマーカー化合物をコードする核酸を、宿主生物（上記定義のものなどの原核または真核細胞宿主のいずれか）のトランスフェクションまたは形質転換に使用することができるベクターに挿入することができる
【０２３６】
この特定の態様では、このようなトランスフェクションまたは形質転換宿主細胞内で本発明の組換えマーカー化合物の産生を行う。一旦目的の宿主細胞がこのような組換えベクターでトランスフェクトまたは形質転換され、一旦組換えマーカー化合物が目的の細胞宿主内で産生されると、マーカー化合物の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチド部分は細胞宿主内でその特異的標的ポリペプチドに特異的に結合することができる。この状況では、本発明の組換え産生マーカー化合物は、目的の標的ポリペプチドが存在する細胞部位に主に存在する。
【０２３７】
これは、以下に詳述する本発明の第２の検出法の目的である。
【０２３８】
本発明のさらなる目的は、ａ）アッセイすべき細胞宿主を得る工程と、
ｂ）該細胞宿主を本発明のマーカー化合物をコードする核酸または本発明のマーカー化合物をコードする組換えベクターでトランスフェクションを行う工程と、
ｃ）前記トランスフェクション細胞宿主によって発現されたマーカー化合物と目的のポリペプチドとの間で形成された複合体を検出する工程と
を含む、原核生物または真核生物宿主細胞中の目的のポリペプチドを検出する方法からなる。
【０２３９】
本発明のマーカー化合物の一部である選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドが標的細胞宿主によって天然に産生されると考えられるポリペプチドに特異的に結合するので、上記定義の本発明の第２の検出法により、アッセイによってトランスフェクトされた標的細胞宿主によって天然に産生されると考えられるこの標的ポリペプチドが定性的および定量的に検出される。
【０２４０】
例えば、本発明のマーカー化合物の一部である選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドの選択手順がＨＣＶ　Ｈ７７株のゲノムＤＮＡライブラリー由来の核酸インサートを含むクローンコレクションを調製する第１の工程を含む態様では、本発明のこのようなマーカー化合物をコードするベクターでの哺乳動物細胞（好ましくは、ヒト細胞）のトランスフェクションにより、哺乳動物宿主細胞中で天然に発現し、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチド由来のＨＣＶウイルスタンパク質と天然に相互作用するヒトポリペプチドの発現が検出可能である。
【０２４１】
上記定義の本発明の第２の検出法により、第１に本発明の組換え産生マーカー化合物と特異的に結合する目的の標的ポリペプチドが定性的に検出され、それにより目的の標的ポリペプチドが本発明のマーカー化合物を発現するベクターでトランスフェクトされた細胞宿主内で天然に産生される環境条件および分化の時期を知ることが可能である。
【０２４２】
第２に、本発明のこの第２の検出法により、原形質膜、サイトゾル、核、ならびにリボゾーム、ゴルジ装置、リソソーム、ファゴソーム、小胞体、およびクロロプラストなどの任意のオルガネラ中での局在化を含む、細胞内の目的の標的ポリペプチドの局在が可能となる。
【０２４３】
本発明の第２の検出法によるアッセイでの細胞宿主内で発現する目的の標的ポリペプチドの局在化を、当技術分野で周知の任意の手段（共焦点顕微鏡の使用を含む）によって行うことができる。
【０２４４】
第３に、マーカー化合物の一部である検出可能分子によって産生される検出シグナルレベルは、目的の標的ポリペプチドと本発明の組換え産生マーカー化合物との間のアッセイにおける細胞宿主の間で形成された複合体の数に比例するので、本発明の第２の検出法により、アッセイにおいて細胞宿主内での目的の標的ポリペプチドの発現を定量的に分析可能である。
【０２４５】
実質的に、当業者は、上記の「本発明の細胞検出法」というタイトルの節を参照して、本明細書に記載の第２の検出法の検出工程ｃ）の実施に必要な技術を見出すことができる。
【０２４６】
本発明の第２の検出法の第１の態様では、検出工程ｃ）は、組換え発現した本発明のマーカー化合物中に含まれる検出可能分子によって内因的に放出された蛍光シグナルの測定からなる。
【０２４７】
上記の第２の検出法の第２の好ましい態様では、検出工程ｃ）は、検出可能分子の励起波長でエネルギー源を検出可能分子に与える工程と、検出可能分子の放出波長で放出した光を測定する工程からなる。
【０２４８】
本発明の第２の検出法のなおさらなる態様では、検出工程ｃ）は、検出可能分子の触媒活性の測定からなる。
【０２４９】
別の態様では、検出工程ｃ）は、検出可能分子によって放出された放射能の測定からなる。
【０２５０】
本発明の第２の検出法のなおさらなる態様では、検出工程ｃ）により、トランスフェクトした細胞宿主内で、組換え産生マーカー化合物と目的の標的ポリペプチドとの間で形成された複合体の位置付けが可能である。
【０２５１】
本発明のさらなる目的は、本明細書で定義のマーカー化合物をコードする核酸または本発明のマーカー化合物をコードする核酸が挿入された組換えベクターを含む、原核または真核細胞宿主内で目的のポリペプチドを検出するためのキットからなる。
【０２５２】
場合により、上記の検出キットは、検出工程ｃ）の実施に必要な試薬をさらに含み得る。
【０２５３】
細胞宿主内に導入したマーカー化合物を使用した本発明の細胞検出法
配列番号１〜３８の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体を含むマーカー化合物を任意の手段によって先に産生し、その後選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドと特異的に結合する目的の標的ポリペプチドの検出のために標的細胞宿主に導入する、本発明の第３の検出法がある。
【０２５４】
したがって、本発明は、さらに、
ａ）アッセイすべき細胞宿主を得る工程と、
ｂ）該細胞宿主内に本明細書で定義のマーカー化合物を移入する工程と、
ｃ）前記細胞宿主内でマーカー化合物と目的のポリペプチドとの間に形成された複合体を検出する工程と
を含む、原核または真核細胞宿主内での目的のポリペプチドの検出法に関する。
【０２５５】
本発明のマーカー化合物の一部である低分子量の配列番号１〜３８の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドを考慮して、抗体または抗体フラグメントなどの従来の特異的検出可能分子と比較した場合、標的細胞宿主への本発明のマーカー化合物の移入は標識抗体または標識抗体フラグメントなどの従来のマーカーの細胞宿主への導入と比較して容易に行われるという結果を示す。
【０２５６】
上記定義の本発明の第３の検出法によれば、標的細胞宿主内へのマーカー化合物の移入を行う工程ｂ）を、当技術分野で周知の任意の技術（エレクトロポレーション、細胞膜（典型的には原形質膜）を通過する本発明のマーカー化合物の透過を促進する分子の使用）によって行うことができる。
【０２５７】
このような細胞膜を通過する本発明のマーカー化合物の透過を促進する分子には、ペネトラチン（ペントラチン１．ＲＴＭ（Ｅｎｃｏｒ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ）など）、アンテナペディアタンパク質、陽イオン脂質、および陽イオンポリアクリレートが含まれるが、これらに限定されない。
【０２５８】
使用することができる浸透エンハンサーには、グリコール酸ナトリウムなどの胆汁酸塩およびβ−シクロデキストリンなどの他の分子が含まれる。胆汁酸塩は、高分子の膜吸着を増大させることが公知である（Ｐｏｎｔｏｒｏｌｉら、１９８７）。
【０２５９】
先の節で記載の本発明の第２の検出法について既に詳述のように、本発明の第３の検出法により、アッセイにおいて細胞宿主によって発現される目的の標的ポリペプチドを局在化し、該目的の標的ポリペプチドの発現を定性的および定量的に分析することも可能である。
【０２６０】
上記の本発明の第３の検出法における検出工程ｃ）を、本明細書中の先の節に詳述されている第１の検出法および第２の検出法のいずれの検出工程ｃ）と同一の方法で行うことができる。
【０２６１】
上記の第３の検出法の第１の態様では、検出工程ｃ）は、検出可能分子によって内因的に放出される蛍光シグナルの測定からなる。
【０２６２】
第２の態様では、検出工程ｃ）は、検出可能分子の励起波長でエネルギー源を検出可能分子に与える工程と、検出可能分子の放出波長で放出した光を測定する工程からなる。
【０２６３】
第３の態様では、検出工程ｃ）は、検出可能分子の触媒活性の測定からなる。
【０２６４】
第４の態様では、検出工程ｃ）は、検出可能分子によって放出された放射能の測定からなる。
【０２６５】
本発明の第３の検出法の第５の態様では、検出工程ｃ）により、アッセイにおいて標的細胞宿主内でマーカー化合物と目的のポリペプチドとの間で形成された複合体を位置付けることが可能である。
【０２６６】
本発明のさらなる目的は、本明細書に定義のマーカー化合物を含む、原核または真核細胞宿主内で目的のポリペプチドを検出するためのキットからなる。
【０２６７】
上記検出キットは、検出工程ｃ）の実施に必要な試薬をさらに含み得る。
【０２６８】
上記検出キットはまた、アッセイにおける標的細胞宿主内へのマーカー化合物の移入の促進に必要な試薬をさらに含み得る。
【０２６９】
選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドを使用した固相検出法
本発明のさらなる側面では、検出のための配列番号１〜３８の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体の使用には、該選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドを適切な基質に固定した後、アッセイすべきサンプルを該選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドが予め固定された基質に接触させる工程が含まれる。
【０２７０】
その後の工程は、基質上に固定された選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドとアッセイされるサンプル中での存在が疑われる目的の標的ポリペプチドとの間に形成された複合体の検出からなる。
【０２７１】
したがって、本発明はまた、
ａ）選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたは複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドが固定された基質を得る工程と、
ｂ）工程ａ）で定義された前記基質をアッセイすべきサンプルに接触させる工程と、
ｃ）選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたは複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドとサンプル中に含まれる標的ポリペプチドまたは複数の標的ポリペプチドとの間に形成された複合体を検出する工程と
を含む、サンプル中の目的のポリペプチドまたは複数のポリペプチドの検出法からなる第４の検出法に関する。
【０２７２】
タンパク質分子固定用の基質、支持体、または表面は当技術分野で周知であり、これらの多数が固相免疫アッセイの実施で記載されている。
【０２７３】
好ましくは、配列番号１〜３８の配列から選択された異なるアミノ酸配列の複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドを、本発明の第４の検出法で使用する基質に固定する。
【０２７４】
例えば、出発物質としてＨＣＶ　Ｈ７７株のゲノムＤＮＡ由来の核酸を使用した上記の「選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチド」というタイトルの節に記載の方法によって同定した選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドの完全コレクションを、適切な基質上での固定に使用することができる。
【０２７５】
この態様によれば、配列番号１〜３８の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドコレクションを、別の様式で基質に固定して、該基質表面上の既知の位置で固定されたＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドの規則正しい領域を形成する。
【０２７６】
基質、支持体、または表面は、多孔質または非多孔質水溶性物質であり得る。支持体は、親水性であっても疎水性を付与することができてもよく、これには、無機粉末（シリカ、硫酸マグネシウム、およびアルミナなど）；天然重合物質（特に、セルロース物質および繊維含有ペーパーなどのセルロース由来の物質）；合成および改変天然ポリマー（ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架橋デキストラン、アガロース、ポリアクリレート、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタラート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）など）が含まれ、該物質自体を使用するか、他の物質（Ｂｉｏｇｌａｓｓとして市販されているガラス；セラミック用金属）と組み合わせて使用する。
【０２７７】
複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドが固定されている規則正しい領域を、米国特許第５，１４３，８５４号またはＰＣＴ出願国際公開公報第９２／１００９２号（全ての目的のために参照として本明細書に組み入れられる）に開示される技術によって製造することができる。フォトリソグラフィー技術と成形加工技術との組み合わせにより、各選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドが支持体上の非常に小さな領域（「部位」）を占めることができる。いくつかの態様では、この部位は、数ミクロン程の小ささ、または単一選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドと同程度であり得る。
【０２７８】
上記で詳述の第４の検出法の第１の態様では、複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドをある順序で基質に固定する。
【０２７９】
選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））の第２の態様では、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたは複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドは基質に共有結合している。
【０２８０】
該方法の第３の態様では、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたは複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドは基質に非共有結合している。この特定の態様によれば、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたは複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドは第１のリガンド分子に共有結合しており、基質は第２のリガンド分子でコートされており、該第２のリガンド分子は、第１のリガンド分子に特異的に結合する。このような特定の態様によれば、第１のリガンドはビオチンであってよく、この場合、第２のリガンドがストレプトアビジンであることが最も好ましい。
【０２８１】
本発明の第４の検出法のなおさらなる態様では、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたは複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドはスペーサーに共有結合しており、スペーサー自体もまた基質上に選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたは複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドを固定するために基質に共有結合している。このようなスペーサーは、１０〜１５アミノ酸長のポリアラニンまたはポリリジンペプチドなどのペプチドポリマーであり得る。
【０２８２】
上記の第４の検出法のなおさらなる態様では、検出工程ｃ）は、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたは複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドが結合している基質の光学的特徴の変化を検出する工程からなる。
【０２８３】
本発明の第４の検出法のなおさらなる態様では、検出工程ｃ）は、アッセイされるサンプル中に含まれる標的ポリペプチド分子と該支持体に結合した選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたは複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドとの間で複合体が形成される基質のこのような複合体に結合する能力を有する検出可能分子との接触からなる。
【０２８４】
本発明のさらなる目的は、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチド（または複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチド）が固定した基質を含む、サンプル中の目的のポリペプチドまたは複数のポリペプチドを検出するためのデバイスまたは装置からなる。
【０２８５】
上記のこのようなデバイスまたは装置は、複数の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドが規則正しく整列することにより上記の領域などが形成される適切な基質を含み得るか、これらからなる。
【０２８６】
選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドを含む薬学的組成物
配列番号１〜３８の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドが選択され、このような選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体が、
（ｉ）目的の（ベイト）ポリペプチドに高い特異的結合特性を付与し、
（ｉｉ）選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体由来の天然に存在するタンパク質の生物活性を欠くことを特徴とする方法に起因する。
【０２８７】
配列番号１〜３８の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体のこれらの元の性質を、該選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドの第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのいずれかへの特異的な結合による生物の細胞内での第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の天然に存在する相互作用の妨害に使用可能である。
【０２８８】
本発明のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドまたはその変異体は、ＨＣＶタンパク質間またはＨＣＶタンパク質とＣ型肝炎ウイルスを感染した生物由来のタンパク質との間のインビボタンパク質−タンパク質相互作用を妨害することができる。
【０２８９】
例えば、配列番号２のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドは、コアタンパク質とＮＳ３タンパク質ＨＣＶとの間の天然に存在する相互作用を妨害する。同様に、配列番号１７のＳＩＤ（登録商標）ポリペプチドは、ＮＳ４Ａタンパク質とＮＳ４Ｂタンパク質との間の相互作用を妨害する（図１を参照のこと）。
【０２９０】
したがって、本発明の別の目的は、薬学的有効量の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体を含む薬学的組成物からなる。
【０２９１】
本発明はまた、ポリヌクレオチドが適切な調節配列下に置かれている、配列番号１〜３８の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む薬学的有効量の核酸を含む薬学的組成物に関する。
【０２９２】
好ましい核酸は、配列番号３９〜７６のヌクレオチド配列である。
【０２９３】
本発明はまた、選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む薬学的有効量の組換え発現ベクターを含む薬学的組成物に関する。
【０２９４】
本発明はまた、標的ウイルスタンパク質または哺乳動物（典型的には、ヒト）タンパク質に結合する薬学的有効量の配列番号１〜３８の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体をヒトまたは動物の身体に投与する工程を含む、Ｃ型肝炎ウイルスによるヒトまたは動物のウイルス感染の予防または治療法に関する。
【０２９５】
許容される生理学的キャリアおよび／またはアジュバントと共に任意の経路（静脈内経路、筋肉内経路、経口経路、または粘膜経路など）で投与される上記の薬学的組成物も本発明の一部を形成する。
【０２９６】
ＨＣＶによって誘導される病態の予防および／または治療用の薬物としての選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体が最も好ましい。
【０２９７】
薬学的組成物の有効成分としての配列番号１〜３８の選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドは、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた可溶性形態が好ましい。
【０２９８】
薬学的組成物で使用することができるこのような化合物は、ＨＣＶ感染に関連する病態の予防および／または治療への新規のアプローチを提供する。好ましくは、これらの化合物を、全身経路（特に、静脈内経路）、筋肉内、皮内、または経口経路で投与する。
【０２９９】
その投与様式、至適投薬量、および生薬形態を、一般的に患者に対する適切な治療の確立を考慮した基準（例えば、患者の年齢または体重、全身症状の重症度、治療耐性、および認められる副作用など）にしたがって決定することができる。
【０３００】
同定した化合物を、原核微生物感染に関連する障害の治療有効用量で単独、または適切なキャリアまたは賦形剤と混合した薬学的組成物にてヒト患者を含む哺乳動物に投与することができる。本発明の化合物の処方および投与技術を、「レミントンの薬学」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版に見出すことができる。
【０３０１】
本発明で使用される選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその任意の変異体について、細胞培養アッセイから薬学的有効用量を最初に評価することができる。例えば、インビトロ系で所望の効果を示す濃度点又は範囲を含む循環濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて用量を処方することができる。このような情報を使用して、ヒトに有用な用量をより正確に同定することができる。
【０３０２】
薬学的有効用量は、患者の症状が緩和される化合物の量をいう。このような化合物の毒性および治療有効性を、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的方手順（例えば、ＬＤ５０（試験コレクションの５０％致死用量）およびＥＤ５０（コレクションの５０％治療有効用量）の決定）によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、これを、ＬＤ５０とＥＤ５０との間の比として示すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
【０３０３】
これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得たデータを、ヒトの投薬範囲の処方に使用することができる。このような化合物の投薬量は、毒性がほとんどないか無毒であるＥＤ５０を含む循環濃度範囲内であることが好ましい。投薬量は、この範囲内で使用した投薬形態および使用した投与経路によって変化し得る。正確な処方、投薬経路、および投薬量を、患者の状態に照らして各医師が選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、１９７５、「薬理学的な治療の基礎」、第１章を参照のこと）。
【０３０４】
投薬量および投薬間隔を、効果の調整の維持に十分な活性化合物のプラズマレベルが得られるようにそれぞれ調整することができる。効果の調整に必要な投薬量は、個体の特徴および投薬経路に依存する。
【０３０５】
勿論、組成物の投与量は、治療を受ける被験体、被験体の体重、疾患の重症度、投薬様式、および処方する医師の判断に依存する。
【０３０６】
本発明はまた、ヒトまたは動物に薬学的有効量の配列番号１〜３８の選択相互作用ドメイン（ＳＤ（登録商標））ポリペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を投与する工程を含み、該ポリペプチドが該ヒトまたは該動物で機能的な調節配列の調節下に置かれている、ヒトまたは動物のウイルスの予防または治療法に関する。
【０３０７】
好ましいポリヌクレオチドは、配列番号３９〜７６の核酸である。
【０３０８】
本発明はまた、ヒトまたは動物に薬学的有効量のウイルスまたは細菌タンパク質に結合する選択相互作用ドメイン（ＳＤ（登録商標））ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを投与する工程を含む、ヒトまたは動物のウイルスの予防または治療法に関する。
【０３０９】
本発明の他の特徴および利点は、いかなる様式でも本発明に関連することなく以下の実施例を使用した残りの説明で明白となる。
【０３１０】
（実施例）
ＨＣＶゲノムコレクションの調製
１．Ａ．コレクションの調製およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでの形質転換
１．Ａ．１ゲノムＤＮＡ調製物の断片化
伝染性ＨＣＶ　Ｈ７７株（Ｙａｎａｇｉら、Ｐ． Ｎ． Ａ． Ｓ．、１９９７、９４、８７３８〜４３）のゲノムＤＮＡを、２ｂａｒのネブライザー（ＧＡＴＣ）で２分間断片化し、沈殿し、水に再懸濁した。
【０３１１】
得られた噴霧ゲノムＤＮＡを、緑豆ヌクレアーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）（３０℃で３０分間）、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）（３７℃で１０分間）、クレノウ酵素（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（室温で１０分間および１６℃で１時間）で連続的に処理した。
【０３１２】
次いで、ＤＮＡを抽出し、沈殿させ、水に再懸濁した。
【０３１３】
１．Ａ．２．平滑末端ゲノムＤＮＡへのリンカーのライゲーション
オリゴヌクレオチドＨＧＸ９３１（５′末端リン酸化）１μｇ／μｌおよびＨＧＸ９３２を１μｇ／μｌ。
オリゴＨＧＸ９３１配列：５′ＧＧＧＣＣＡＣＧＡＡ−３′（配列番号１５１）。
オリゴＨＧＸ９３２配列：５′−ＴＴＣＧＴＧＧＣＣＣＣＴＧ−３′（配列番号１５２）
【０３１４】
リンカーを予備インキュベートし（９５℃で５分間、６８℃で１０分間、４２℃で１５分間）、室温に冷却し、ゲノムＤＮＡインサートで１６℃で一晩ライゲートした。
【０３１５】
製造者のプロトコールにしたがって、分離カラム（Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ ＴＥ ４００、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にてリンカーをさらに除去した。
【０３１６】
１．Ａ．３．ベクター調製
ｐＧＡＤ３Ｓ２ＸのＳｐｅ１／Ｘｈｏ１フラグメントの以下の二本鎖オリゴヌクレオチド：
【０３１７】
【表２】
2004507235.tif 000004
【０３１８】
への置換によって、プラスミドｐＰ６（図１３）を調製した。
【０３１９】
ｐＰ６ベクターを、Ｓｆｉ１およびＢａｍＨＩ制限酵素（Ｂｉｏｌａｂ）に３７℃で１時間連続的に消化し、抽出し、沈殿させ、水に再懸濁した。消化したプラスミドベクター骨格を、製造者のプロトコールにしたがって、分離カラム（Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ ＴＥ ４００、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にて精製した。
【０３２０】
１．Ａ．４．ベクターのライゲーションとゲノムＤＮＡインサートとの間のライゲーション
調製したベクターを、第２節に記載のようにＴ４　ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用してゲノム平滑末端ＤＮＡと１５℃で一晩ライゲートした。次いで、ＤＮＡを、沈殿させ、水に再懸濁した。
【０３２１】
１．Ａ．５．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉでのライブラリー形質転換
Ｃｅｌｌ Ｐｏｒａｔｏｒ装置（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）を使用して、１．Ａ．４．節由来のＤＮＡをＥｌｅｃｔｒｏｍａｘ ＤＨ１０Ｂ電気コンピテント細胞（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）に形質転換した。ＳＯＣ培地１ｍｌを添加し、３７℃で１時間、形質転換細胞をインキュベートした。チューブあたりＳＯＣ培地９ｍｌを添加し、ＬＢ＋アンピシリン培地にプレートした。コロニーを液体ＬＢ培地に刮ぎ出した。等分し、−８０℃で凍結した。
【０３２２】
得られた組換え細胞クローンコレクションを、ＨＧＸＢＨＣＶ１と呼ぶ。
【０３２３】
１．Ｂ．Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅコレクションの形質転換
Ｓｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株（Ｙ１８７（ＭＡＴα　Ｇａｌ４Δ　Ｇａ１８０Δ　ａｄｅ２−１０１　Ｈｉｓ３　Ｌｅｕ２−３，−１１２　Ｔｒｐ１−９０１　Ｕｒａ３−５２　ＵＲＡ３：：ＵＡＳＧＡＬ１−ＬａｃＺ　Ｍｅｔ）をＨＧＸＢＨＣＶ１　ＨＣＶゲノムＤＮＡライブラリーで形質転換した。
【０３２４】
Ｅ．ｃｏｌｉ中に含まれるプラスミドＤＮＡを、等分したＥ．ｃｏｌｉ凍結細胞（１．Ａ．５．）から抽出した（Ｑｉａｇｅｎ）。
【０３２５】
Ｓｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＹ１８７酵母をＹＰＧｌｕ中で増殖させた。
【０３２６】
酵母キャリアＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用し、標準的なプロトコール（ＧＩＥＳＴら、Ｙｅａｓｔ、１１、３５５〜３６０、１９９５）にしたがって、酵母形質転換を行った。この実験により、ＤＮＡ１０４〜５×１０４細胞／μｇが得られた。プレートあたり２×１０４細胞をＤＯ−Ｌｅｕ培地に広げた。等分して−８０℃で凍結した。得られた組換え細胞クローンコレクションを、ＨＧＸＹＨＣＶ１と呼ぶ。
【０３２７】
１．Ｃ．ベイトプラスミドの構築
プラスミドｐＢ５（図１２を参照のこと）を、ＮｃｏＩ／ＳａＩＩポリリンカーフラグメントの二本鎖オリゴヌクレオチド：
【０３２８】
【表３】
2004507235.tif 000005
【０３２９】
への置換によって調製した。
【０３３０】
第２節に記載の連結ゲノムＤＮＡを、Ｓｆｉ１制限酵素で消化したｐＢ５にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉにＤＮＡ形質転換する。細胞を、増殖させ、プラスミドＤＮＡを抽出し、配列決定した。インフレーム融合タンパク質をコードするこれらのプラスミドを、ベイトプラスミドとして使用した。
【０３３１】
実施例２：酵母系におけるツーハイブリッドを使用したコレクションのスクリーニング
２．Ａ．交配プロトコール
本発明者らは、その利点から、酵母系におけるツーハイブリッド交配を選択した（最初に、ＦＲＯＭＯＮＴ−ＲＡＣＩＮＥら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９７、第１６巻、２７７〜２８２、「網羅的ツーハイブリッドスクリーニングによる酵母ゲノムの機能分析」に記載）が、本発明者らは、Ｆｉｅｌｄｓらに記載の古典的ツーハイブリッド系または酵母逆ツーハイブリッド系においてＨＣＶコレクションをスクリーニングすることもできる。
【０３３２】
親細胞で２つの融合タンパク質が産生されるので、交配手順により選択プレート上で直接選択可能である。レプリカプレーティングは必要ない。このプロトコールは、Ｙ１８７株に形質転換されたライブラリーの使用について記載している。
【０３３３】
交配前に、１．Ｂ．にしたがってＳ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（ＣＧ１９４５株（ＭＡＴａ、Ｇａ１４−５４２　Ｇａｌ１８０−５３８　ａｄｅ２−１０１　Ｈｉｓ３＊２００Ｌｅｕ２−３，−１１２　Ｔｒｐ１−９０１　Ｕｒａ３−５２　Ｌｙｓ２−８０１　ＵＲＡ：：ＧＡＬ４　１７量体（Ｘ３）−ＣｙＣ１ＴＡＴＡ−ＬａｃＺ　ＬＹＳ２：：ＧＡＬ１ＵＡＳ−ＧＡＬ１ＴＡＴＡ−ＨＩＳ３　ＣＹＨＲ））を形質転換し、ＤＯ−Ｔｒｐ培地に広げた。
【０３３４】
１日目の朝：継代培養
工程１．Ｃ．で得たベイトプラスミドを有するＹ１８７細胞の継代培養をＤＯ−Ｔｒｐ培地２０ｍｌ中で行った。３０℃で激しく震盪しながら増殖させた。
【０３３５】
１日目の夕方：培養
ベイトプラスミド継代培養物を有するＹ１８７細胞のＤＯ−Ｔｒｐ継代培養物のＯＤ６００ｎｍを測定した。一次関数に対応させるためにＯＤ６００ｎｍは、０．１と０．５との間でなければならない。ＯＤ６００ｎｍ＝０．００６／ｍｌのＤＯ−Ｔｒｐ５０ｍｌを接種し、３０℃で激しく撹拌しながら一晩増殖させた。
【０３３６】
２日目：交配
培地およびプレート
ＹＰＧｌｕ　１５ｃｍプレート１枚
ＤＯ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ　１３ｍｌを含む５０ｍｌチューブ
ＹＰＧｌｕ　５ｍｌを含む１００ｍｌフラスコ
ＤＯ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓプレート８枚
ＤＯ−Ｌｅｕプレート２枚
ＤＯ−Ｔｒｐプレート２枚
ＤＯ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐプレート２枚
ＤＯ−Ｔｒｐ培地のＯＤ６００ｎｍを測定した。約１のはずである。
【０３３７】
交配のために、ライブラリー細胞ほど多数のベイト細胞を２回使用しなければならない。良好な交配効率を得るために、１０８細胞／ｃｍ２の細胞を回収しなければならない。
【０３３８】
プレイライブラリーとの交配のために３０ＯＤ６００ｎｍ単位のベイト培地（ｍｌ）の量を評価した。
【０３３９】
ＨＧＸＹＨＣＶ１ライブラリーを含むウイルスを氷上でゆっくりと解凍した。ウイルス０．５ｍｌをＹＰＧｌｕ　５ｍｌに添加した。これらの細胞を穏やかに１０分間震盪しながら３０℃に戻す。
【０３４０】
交配
ベイト培養物３０ＯＤ６００ｎｍ単位を５０ｍｌの小瓶に入れた。
【０３４１】
ＨＧＸＹＨＣＶ１ライブラリー培養物をベイト培養物に添加した。遠心分離し、上清を破棄し、ＹＰＧｌｕ培地０．８ｍｌに再懸濁した。
【０３４２】
細胞を、ガラスビーズを含むＹＰＧｌｕプレートに分散させた。プレートの震盪によって細胞を広げた。
【０３４３】
３０℃で４時間３０分間プレート細胞をインキュベートした。
【０３４４】
交配細胞の収集
ＤＯ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ　６ｍｌおよび７ｍｌにて連続的にプレートを洗浄およびリンスした。
【０３４５】
ＤＯ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ　５００μｌで並行して２つを１０倍連続希釈して、１０，０００倍希釈までにした。各１００００倍希釈物５０μｌをＤＯ−ＬｅｕおよびＤＯ−ｔｒｐプレートに広げ、１０００倍希釈物をＤＯ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐプレートに広げた。
【０３４６】
回収細胞３．２ｍｌの４００μｌアリコートを、ＤＯ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ＋Ｔｅｔプレートに広げた。
【０３４７】
４日目
ＤＯ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ＋テトラサイクリンで増殖することができるクローンの選択：この培地により相互作用を示す二倍体クローンを単離可能である。
【０３４８】
対照プレート上のＴｒｐ＋Ｌｅｕ＋コロニーを計数し、ＤＯ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ＋テトラサイクリンプレート上のＨｉｓ＋コロニー数を計数した。
【０３４９】
プロトコールで処理するＨｉｓ＋細胞クローン数を以下のように定義した：
２×１０６Ｔｒｐ＋Ｌｅｕ＋コロニーの場合：
−Ｈｉｓ＋細胞クローン数＜９５個：全てのコロニーを発光測定プロトコールで処理する；
−Ｈｉｓ＋細胞クローン数＞９５個＜５０００個：９５個のコロニーを発光測定プロトコールで処理する；
−Ｈｉｓ＋細胞クローン数＞５００個：３−アミノトリアゾールを含むＤＯ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ＋テトラサイクリンプレートを使用してスクリーニングを繰り返す。
【０３５０】
２．Ｂ．発光測定アッセイ
Ｈｉｓ＋コロニーを、ＤＯ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ＋テトラサイクリン培地を含むマイクロタイタープレートにて震盪しながら３０℃で一晩増殖させた。翌日、一晩培養物を同一の培地を含む新規のマイクロタイタープレートで１５倍希釈した。震盪しながら３０℃で５時間インキュベートした。サンプルを５倍希釈し、ＯＤ６００ｎｍを読み取った。再度希釈して、最終体積１００μｌあたり１００００と７５０００との間の酵母細胞／ウェルにした。
【０３５１】
ウェルあたり、１ステップ酵母溶解緩衝液（Ｔｒｏｐｉｘ）７６μｌ、サファイアＩＩエンハンサー（Ｔｒｏｐｉｘ）２０μｌ、Ｇａｌａｃｔｏｎ Ｓｔａｒ（Ｔｒｏｐｉｘ）４μｌを添加し、３０℃で４０分間インキュベートした。
【０３５２】
照度計（Ｔｒｉｌｕｘ、Ｗａｌｌａｃｈ）を使用して、β−Ｇａｌ読み出し（Ｌ）を測定した。
【０３５３】
ＯＤ６００ｎｍ×Ｌ値および最も高い値の選択相互作用プレイを計算した。
【０３５４】
プロトコールのこの工程で、本発明者らは相互作用を示す二倍体細胞クローンを単離した。次の工程は、選択された相互作用に関連するポリペプチドを同定することである。
【０３５５】
実施例３：陽性クローンの同定
３．Ａ．酵母コロニーのＰＣＲ
導入
酵母コロニーに対するプラスミドＤＮＡフラグメントの直接的ＰＣＲ増幅は、このプラスミドにクローン化された配列の迅速かつ有効な同定手順である。これは、公開されたプロトコールに直接由来する（Ｗａｎｇ Ｈ．ら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２３７、１４５〜１４６、１９９６）。しかし、これは標準化されたプロトコールではない：本発明者らにより株ごとに変化させ、これは実験条件に依存する（細胞数、Ｔａｑポリメラーゼ源など）。このプロトコールを、特定の限局的条件に至適化すべきである。
【０３５６】
材料
−１ウェルあたり、ＰＣＲ混合組成物は以下である：
水３２．５μｌ、
１０×ＰＣＲ緩衝液（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）５μｌ、
ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）１μｌ、
Ｔａｑポリメラーゼ（８５μ／μｌ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）０．５μｌ、
オリゴヌクレオチドＡＢＳ１（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ：５′−ＧＣＧＴＴＴＧＧＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＧＧ−３′）０．５μｌ、
オリゴヌクレオチドＡＢＳ２（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ：５′−ＣＡＣＧＡＴＧＣＡＣＧＴＴＧＡＡＧＴＧ−３′）
ＮａＯＨ　１Ｎ。
【０３５７】
実験
陽性コロニーを、ＤＯ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ＋テトラサイクリン１５０μｌを含む９６ウェル細胞培養クラスター（Ｃｏｓｔａｒ）にて震盪しながら３０℃で一晩増殖させた。培養物を再懸濁し、１００μｌを直ちにＴｈｅｒｍｏｗｅｌｌ９６（Ｃｏｓｔａｒ）に移した。
【０３５８】
室温にて４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
【０３５９】
上清を除去した。各ウェルあたりＮａＯＨ５μｌを分注し、１分間震盪した。
【０３６０】
９９．９℃のサーモサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ９７００、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）中にＴｈｅｒｍｏｗｅｌｌを５分間置き、その後４℃で１０分間置いた。
【０３６１】
各ウェルにＰＣＲミックスを添加し、十分に震盪した。
【０３６２】
ＰＣＲプログラムを以下のように設定した：
９４℃　３分間
９４℃　３０秒間
５３℃　１分３０秒間を３５サイクル
７２℃　３分間
７２℃　５分間
１５℃　∞。
【０３６３】
アガロースゲルでＰＣＲフラグメントの質、量、および長さをチェックした。
【０３６４】
クローン化フラグメントの長さは、評価したＰＣＲフラグメント長−３００塩基対であり、これは増幅隣接プラスミド配列に対応する。
【０３６５】
３．Ｂ．エレクトロポレーションによる酵母からのプラスミドのレスキュー
導入
酵母細胞についての以前のＰＣＲプロトコールは成功することができず、このような場合、本発明者らは、エレクトロポレーションによって酵母からプラスミドをレスキューした。この実験は、Ｅ．ｃｏｌｉの酵母細胞抽出物での形質転換によって酵母細胞からプレイプラスミドを回収する。次いで、本発明者らは、プレイプラスミドを増幅し、クローン化フラグメントを配列決定した。
【０３６６】
材料
プラスミドレスキュー
ガラスビーズ４２５〜６００μｍ（Ｓｉｇｍａ）
イソアミルアルコール（Ａｍｒｅｓｃｏ）とプレミックスしたフェノール／クロロホルム（１／１）
抽出緩衝液：２％Ｔｒｉｔｏｎ×１００、１％ＳＤＳ、ＮａＣｌ　１００ｍＭ、ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０ｍＭ、ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１ｍＭ
混合エタノール／ＮＨ４Ａｃ：プレート上のパッチ中に酢酸ＮＨ４　７．５Ｍ、７０％エタノール、および酵母細胞を含む６体積のエタノール。
【０３６７】
エレクトロポレーション
ＳＯＣ培地
Ｍ９培地
選択プレート：Ｍ９−Ｌｅｕ＋Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ
２ｍｍエレクトロポレーションキュベット（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）
【０３６８】
実験
プラスミドレスキュー
２．Ｃ．節の細胞培養物を使用して、ＤＯ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ上に細胞パッチを調製した。
【０３６９】
各パッチの細胞をエッペンドルフチューブに刮ぎ取り、各チューブにガラスビーズ３００μｌを添加し、抽出緩衝液２００μｌを添加し、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）２００μｌを添加した。
チューブを１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
上清１８０μｌを滅菌エッペンドルフチューブに移し、それぞれにエタノール／ＮＨ４Ａｃ　５００μｌを添加し、ボルテックスした。
チューブを４℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。
７０％エタノール２００μｌでペレットを洗浄し、エタノールを除去し、ペレットを乾燥させた。
ペレットを水１０μｌに再懸濁した。抽出物を−２０℃で保存した。
【０３７０】
エレクトロポレーション
材料：標準的なプロトコール（Ｍａｎｉａｔｉｓ）によって調製した電気コンピテントＭＣ１０６６細胞。
酵母プラスミドＤＮＡ抽出物１μｌをエッペンドルフチューブ中で予め冷却し、氷上に保持した。
プラスミド酵母ＤＮＡ抽出物サンプル１μｌを混合し、電気コンピテント細胞２０μｌを添加し、冷エレクトロポレーションキュベットに移した。
Ｂｉｏｒａｄエレクトロポレーターを、抵抗２００Ω、容量２５μＦ、２．５ｋＶに設定した。キュベットホルダーにキュベットを置き、エレクトロポレーションを行った。
ＳＯＣ　１ｍｌをキュベットに添加し、細胞ミックスを滅菌エッペンドルフチューブに移した。
３７℃で３０分間細胞を回収し、４０００×ｇで１分間スピンして細胞を沈殿させ、上清を流出させた。培地を約１００μｌに保持し、これを細胞の再懸濁に使用し、選択プレート（例えば、Ｍ９−Ｌｅｕプレート）に広げた。
プレートを３７℃で３６時間インキュベートした。
１つのコロニーを増殖させ、プラスミドを抽出した。酵素消化およびアガロースゲルによってインサートの存在およびサイズをチェックした。インサートを配列決定した。
【０３７１】
実施例４：タンパク質−タンパク質相互作用
各ベイトについて、以前のプロトコールによりプレイポリヌクレオチド配列を同定した。ワシントン大学のインターネットサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｓｅｑａｎａｌ／ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ／ｂｌａｓｔｗｕ．ｈｔｍ）で利用可能な適切なソフトウェアプログラム（Ｂｌａｓｔｗｕｎ）を使用して、プレイフラグメントによってコードされたＨＣＶゲノム領域を同定し、コードされた融合タンパク質がＨＣＶポリタンパク質翻訳の読み取り枠と同一であるかどうかを同定することができる。
【０３７２】
実施例５：ＳＩＤ（登録商標）の同定
プレイフラグメントは複数のポリペプチドが重複しているので、ＨＣＶゲノム中の連続ポリペプチドの存在およびプレイライブラリーの高い複雑性により、以前の手段によるＳＩＤ（登録商標）の同定が妨害される。プレイフラグメントが複数の相互作用ドメインと重複し得るので、小さなゲノムサイズと比較して使用したプレイライブラリーの高い複雑性もまた、このような簡単な分析を妨害する。ＨＣＶゲノム領域のフレーム外融合によってコードされるタンパク質プレイによって引き起こされる問題を克服することも必要であった。
【０３７３】
したがって、特定のベイトタンパク質のＳＩＤ（登録商標）を同定するために、以下のこれら全ての問題を考慮した適切なアルゴリズムを考案する必要があった。
【０３７４】
５．１．プレイフラグメントは、対応するポリペプチド配列の読み取り枠にしたがって最初に分類される。これにより、ツーハイブリッドアッセイで結合するフレーム外融合物から生理学的に関連するプレイタンパク質を分離することができる。
【０３７５】
５．２．各プレイフラグメントを他のプレイフラグメントと対で比較し、２つのフラグメントを、その長さの３０％を超えて重複する場合に群集する（図８を参照のこと）。クラスター中の全てのフラグメントがその長さの３０％を超えて重複する場合のみ、さらなるフラグメントをクラスターに割り当てる。
【０３７６】
５．３．このようにして産生されたフラグメントの各クラスターについて、プレ−ＳＩＤを、５．２で定義したクラスター中に存在する全てのフラグメントの相互作用と定義する（図９）。
【０３７７】
５．４．次いで、５．３で定義したプレ−ＳＩＤを対で分析し、２つのプレ−ＳＩＤの間の共通領域が３０ｂｐより大きい場合、ＳＩＤ（登録商標）は、この共通領域と定義する。プレーＳＩＤの非共通領域は３０ｂｐを超える長さであり、かつこの非共通領域がこの領域を含む１つのフラグメントの長さの３０％を超える場合、この非共通領域もＳＩＤ（登録商標）と定義する。
【０３７８】
５．５．５．４で定義された各ＳＩＤに寄与するフラグメント数を計数する。ＳＩＤ（登録商標）が重複する場合、最多数のフラグメントを含むＳＩＤ（登録商標）を同定し、このＳＩＤ（登録商標）に寄与する全てのフラグメントを重複ＳＩＤ（登録商標）から除去する。これらの重複ＳＩＤ（登録商標）中に保持されたフラグメントの検査により、ＳＩＤ（登録商標）の最終配列が同定される（図１１）。
【０３７９】
【表４】
2004507235.tif 000006
2004507235.tif 000007
【０３８０】
（１）同一の列に記載のＳＩＤポリペプチド（４）に結合するＨＣＶのＨ７７株由来のポリペプチドをコードする核酸配列。
（２）Ｙａｎａｇｉら、（１９９７）によって開示された命名法を参照した、配列番号（１）の配列の５′末端および３′末端ヌクレオチドの位置。
（３）同一の列に記載のＳＩＤポリペプチド（４）に結合するＨＣＶのＨ７７株由来のポリペプチドのアミノ酸配列。
（４）同一の列に記載のアミノ酸配列（３）のポリペプチドに結合するＳＩＤポリペプチドをコードする核酸配列。
（５）同一の列に記載のアミノ酸配列（３）のポリペプチドに結合するＳＩＤポリペプチドのアミノ酸配列。
【表５】
2004507235.tif 000008
2004507235.tif 000009
2004507235.tif 000010
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＨＣＶゲノムおよびそれによってコードされるポリタンパク質の一般的概観を示す図である。ＲＮＡコード鎖を、非翻訳領域（ＮＣＲ）については線で示し、コード領域についてはボックスで示す。切断に関する位置および酵素を上に示す。ｐ７はＥ２の２次切断産物である（ＨＯＵＧＨＴＯＮ、１９９６を改変）
【図２】
本発明の組換え「ＳＩＤ（登録商標）」ポリペプチドまたは組換えマーカー化合物の産生に使用することができるプラスミドｐＡＳΔΔの制限地図を示す図である。
【図３】
組換え「選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））」の産生に使用することができるプラスミドｐＡＣＴＩＩの制限地図を示す図である。
【図４】
組換え「選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））」の産生に使用することができるプラスミドｐＵＴ１８の制限地図を示す図である。
【図５】
組換え「選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））」の産生に使用することができるプラスミドｐＵＴ１８Ｃの制限地図を示す図である。
【図６】
組換え「選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））」の産生に使用することができるプラスミドｐＴ２５の制限地図を示す図である。
【図７】
組換え「選択相互作用ドメイン（ＳＩＤ（登録商標））」の産生に使用することができるプラスミドｐＫＴ２５の制限地図を示す図である。
【図８】
プレＳＩＤ核酸を定義するためのツーハイブリッド方法によって最初に選択された異なる重複核酸組の選択を行う、本発明のＳＩＤ（登録商標）核酸の第１の選択工程を示す図である。３つのフラグメントｆｒｇ１、ｆｒｇ２、およびｆｒｇ３の長さは、それぞれｌ１、ｌ２、およびｌ３である。共通部分ｌの長さがｌ１およびｌ２の３０％を超える場合、フラグメントｌ１およびｌ２は互いに密集している。ｆｒｇ１とｆｒｇ３との間の共通部分の長さ（ｌ′）がｌ１およびｌ３の３０％を超え、かつｆｒｇ２とｆｒｇ３との間の共通部分の長さ（ｌ＞＞）がｌ２およびｌ３の３０％を超える場合、フラグメント３はフラグメントｆｒｇ１およびｆｒｇ２と群を形成する。
【図９】
ツーハイブリッド方法によって先に選択された特定の重複核酸組からのプレＳＩＤ（登録商標）核酸の選択を示す図である。プレＳＩＤ（登録商標）は、クラスター中の全てのフラグメント（ｆｒｇ１〜６）の共通部分と定義する。
【図１０】
２つのプレＳＩＤ核酸の間の重複領域からのＳＩＤ（登録商標）核酸の選択を示す図である。２つのプレＳＩＤ（登録商標）の間の長さ（ｌ）が３０ｂｐを超える場合にＳＩＤ（登録商標）が定義される。さらなるＳＩＤ（登録商標）は、その長さ（ｌ′）が対応するプレＳＩＤ（登録商標）（ｆｒｇ１〜６）に寄与する１つのフラグメントの長さの３０％を超える場合に非重複領域によって定義される。
【図１１】
図１０によって同定された２つの重複ＳＩＤ核酸のアラインメント後のＳＩＤ（登録商標）核酸のさらなる同定工程を示す図である。フラグメントｆｒｇ１′およびｆｒｇ２′は、ＳＩＤ（登録商標）１およびＳＩＤ（登録商標）２両方に寄与する（上のパネル）。各ＳＩＤ（登録商標）について、フラグメント数を計数し、フラグメントをほとんどのフラグメントを有するＳＩＤ（登録商標）に割り当てる。残りのフラグメントを再分析し、新規のＳＩＤ（登録商標）をこれらのフラグメント（下のパネル、ＳＩＤ（登録商標）２′−フラグメント３′およびフラグメント４′）の共通領域と定義する。
【図１２】
実施例１で使用することができるベクターｐＢ５の地図を示す。
【図１３】
実施例１で使用することができるベクターｐＰ６の地図を示す。
【図１】
2004507235.tif 000011
【図２】
2004507235.tif 000012
【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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