(57)【要約】本発明は、必要に応じて少なくとも１つの鉄塩の存在下の少なくとも１つの鉄錯化蛋白質、ならびに一酸化窒素代謝の少なくとも１つの前駆体および／または一酸化窒素の少なくとも１つの化学的ドナーを含有する、薬学的組成物またはフードサプリメントと、特に無力症または貧血を処置するための薬学的組成物を製造するためまたはフードサプリメントを製造するための、少なくとも１つの鉄錯化剤および一酸化窒素代謝の少なくとも１つの前駆体および／または一酸化窒素の化学的ドナー、ならびに必要に応じて少なくとも１つの鉄塩の使用とに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として：
−  必要に応じて少なくとも１つの鉄塩の存在下の、少なくとも１つの鉄錯化蛋白質、および
−  一酸化窒素代謝の少なくとも１つの前駆体および／または一酸化窒素の少なくとも１つの化学的ドナー；
ならびに、必要に応じて、少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクル、
を含むことを特徴とする、薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項２】
前記鉄錯化蛋白質が、ラクトフェリンおよびトランスフェリンから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項３】
ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ起源のラクトフェリン、あるいは合成的にまたは組換え経路によって得られるラクトフェリンを含有することを特徴とする、請求項２に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項４】
５０％よりも高い鉄飽和度を示すラクトフェリンを含有することを特徴とする、請求項３に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項５】
前記鉄錯化蛋白質が、０．０１ｍｇ〜５ｍｇの単位用量で使用されることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項６】
前記鉄錯化蛋白質が０．１ｍｇ〜１ｍｇの単位用量で使用されることを特徴とする、請求項５に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項７】
前記鉄塩が、第一鉄塩、第二鉄塩、フマル酸鉄、シュウ酸鉄、アスコルビン酸鉄、グルコン酸鉄、コハク酸鉄、酢酸鉄、およびフェレデテート（ｆｅｒｅｄｅｔａｔｅ）から選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項８】
前記鉄塩が、錯化形態あるいは前記鉄錯化蛋白質で部分的に錯化されたまたは完全に錯化された形態のいずれかで、前記組成物または前記フードサプリメント中に存在することを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項９】
前記鉄塩が０．０１〜１ｍｇの単位用量で使用されることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項１０】
前記鉄塩が０．０５〜０．５ｍｇの単位用量で使用されることを特徴とする、請求項９に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項１１】
一酸化窒素代謝の前駆体が、Ｌ−アルギニンおよびその塩；少なくとも１０重量％のＬ−アルギニンからなる蛋白質およびペプチドから選択されることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項１２】
前記Ｌ−アルギニン塩が、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−アルギニングルタメートおよびＬ−アルギニンアスパルテートから選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項１３】
前記蛋白質および前記ペプチドがルピン（ｌｕｐｉｎ）の抽出物に由来することを特徴とする、請求項１１に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項１４】
前記一酸化窒素の化学的ドナーがＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチル−ペニシラミンであることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項１５】
前記一酸化窒素代謝の前駆体および／または前記一酸化窒素の化学的ドナーが、０．００１ｍｇ〜１ｍｇの単位用量で使用されることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項１６】
前記一酸化窒素代謝の前駆体および／または前記一酸化窒素の化学的ドナーが、０．０１ｍｇ〜０．１ｍｇの単位用量で使用されることを特徴とする、請求項１５に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項１７】
鉄錯化蛋白質／一酸化窒素代謝の前駆体および／または一酸化窒素の化学的ドナー重量比が、好ましくは１／１と１０／１との間であることを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項１８】
鉄錯化蛋白質／一酸化窒素代謝の前駆体および／または一酸化窒素の化学的ドナー重量比が、１／１であることを特徴とする、請求項１７に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項１９】
以下の組み合わせ：
−  ０．０１ｍｇ〜５ｍｇのラクトフェリン、
−  ０．０１〜１ｍｇの鉄塩、および
−  ０．１ｍｇ〜５ｍｇのＬ−アルギニン、
を含有することを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項２０】
以下の組み合わせ：
−  ０．０１ｍｇ〜１ｍｇのラクトフェリン、
−  ０．１ｍｇの鉄塩、および
−  １ｍｇのＬ−アルギニン、
を含有することを特徴とする、請求項１９に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項２１】
スーパーオキシドジスムターゼを更に含有することを特徴とする、前記請求項のいずれか１項に記載の薬学的組成物またはフードサプリメント。
【請求項２２】
無力症および／または貧血の処置のために特に意図される薬学的組成物を製造するための、少なくとも１つの鉄錯化蛋白質、および一酸化窒素代謝の少なくとも１つの前駆体および／または一酸化窒素の少なくとも１つの化学的ドナー、および必要に応じて少なくとも１つの鉄塩の使用。
【請求項２３】
フードサプリメントを製造するための、少なくとも１つの鉄錯化蛋白質、および一酸化窒素代謝の少なくとも１つの前駆体および／または一酸化窒素の少なくとも１つの化学的ドナー、および必要に応じて少なくとも１つの鉄塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの鉄錯化蛋白質および一酸化窒素代謝の少なくとも１つの前駆体を含有する薬学的組成物またはフードサプリメント（ｆｏｏｄ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）、ならびに無力症および／または貧血の処置に特に意図される薬学的組成物を製造するため、またはフードサプリメントを製造するための、少なくとも１つの鉄錯化蛋白質およびＮＯ代謝の少なくとも１つの前駆体の使用に関する。
【０００２】
ラクトフェリン（Ｌｆ）およびトランスフェリン（Ｔｆ）のような鉄を錯化し得る蛋白質は、多くの生物学的特性を有する。
【０００３】
従って、先ず、ヒトＬｆは殺菌活性を有することが、実証された（Ｅ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．， １９７７， Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ＆ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １５ （２）， ３９６−４０１）。
【０００４】
ヒトＬｆは、大抵の生物学的外分泌物（例えば、気管支、唾液、涙液（ｌａｃｒｙｍａｌ）、鼻、胃、膵臓、十二指腸または膣の分泌物）中、およびまた種々の生物学的流体（例えば、滑液および羊水）中、および最後に血漿中に見られる。Ｌｆは、大抵の哺乳動物の初乳（ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ）および乳汁（ｍｉｌｋ）において見られる。乳汁中のＬｆ濃度は、考慮される種および乳汁の成熟に従って変化する。ウシＬｆのクローニング後に行われた最近の研究は、ウシＬｆが６９％蛋白質配列同一性を示すことを実証する（Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９６， １９６， １７７−１８４）。
【０００５】
実際に、ウシＬｆは、その殺菌活性以外に他の重要な生物学的機能を有し、そしてこれらの機能はヒトＬｆのそれよりも重要であるようである。詳細には、ウシＬｆは免疫調節性（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）および抗酸化特性を有することが実証された（Ｐａｕｌ−Ｅｕｇｅｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｍｐｔｅ−ｒｅｎｄｕ ｄｅ ｌ’Ａｃａｄｅｍｉｅ ｄｅｓ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｆｒａｎｃａｉｓｅｓ， １９９３， ３１６， １１３−１１９）。これらの観察によって、このタイプの蛋白質は、細菌感染に対するその保護的活性に加えて、自然免疫を調節することによってまたは造血を刺激することによってのいずれかで、生物に有益であるいくらかの数の免疫刺激（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｎｔ）および抗酸化特性を有し得ることが明確に実証された。これらの特性は、腸細胞（ｅｎｔｅｒｏｃｙｔｅｓ）（Ｉｙｅｒ ａｎｄ Ｌｏｎｎｅｒｄａｌ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｎｕｔｒ．， １９９３， ４７， ２３２−２４１）、食細胞（Ｈ．Ｓ． Ｂｉｒｇｅｎｓ， １９９１， Ｄａｎｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ， ３８ （３）， ２４４−２５２）、およびリンパ球（Ｂｅｎｎｅｔ ａｎｄ Ｄａｖｉｓ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９８１， １２７， １２１１−１２１６； Ｂｉｒｇｅｎｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｈｅａｍａｔｏｌ．， １９８３， ５４， ３８３−３８８）のような、数タイプの細胞の表面でのＬｆレセプターの存在に起因する。
【０００６】
Ｌｆは、ウシの乳汁または初乳において強く示される（数ｍｇ／ｌ）。従って、フードサプリメント分野における半精製（ｓｅｍｉｐｕｒｉｆｉｅｄ）形態でのおよび薬学分野における精製形態でのその使用が、とりわけ、特に鉄欠乏症の場合に、細胞レベルでの鉄輸送および固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）を提供するために、貧血の場合に造血を刺激するために、特に消化管における、特定の病原性細菌因子を排除するために［食物アレルギーおよび不耐性と戦うことにおける機能性サプリメントとして、または例えばスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）のような特定の抗酸化産物についての機能性サプリメントとして］、完全に想像され得る。
【０００７】
研究によって、鉄の腸吸収におけるＬｆの重要性が実証された。詳細には、ヒト胃腸上皮細胞（Ｃａｃｏ−２）への鉄の輸送は、硫酸第一鉄のような遊離形態の鉄を使用するよりもむしろ、錯化形態の鉄を含有するヒトＬｆを使用して優先的に行われる（Ｔ．Ｍ． Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．， １９７９， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， ５５８， １２９−１４１）。
【０００８】
鉄およびＬｆを利用可能とするためのいくつかのメカニズムが提案された：１）鉄が、恐らくインタクトなＬｆによって、腸細胞を介して輸送される（Ｔ．Ｍｉｋｏｇａｍｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４， Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．， ２６７， ３０８−３１５）；２）鉄が原形質膜で放出される（Ｒｏｉｒｏｎ−Ｌａｇｒｏｕｘ ａｎｄ Ｆｉｇａｒｅｌｌａ， １９９０， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １７０， ８３７−８４２）；３）鉄が、Ｌｆの吸着およびそのリソソーム分解の後に放出される［分解産物は経細胞経路によって輸送される］（Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．， １９９６， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ＆ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １２８９， ２９１−２９７）。
【０００９】
ラクトフェリンのような乳蛋白と鉄塩との組み合わせを含有する薬学的組成物がまた提案された；しかし、このタイプの組成物は、細胞レベルで鉄輸送を提供するが、長時間持続性（ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ）様式での細胞におけるその固定（ｆｉｘａｔｉｏｎ）を可能にしない。
【００１０】
Ｌｆを使用して鉄輸送を行うことは可能であるように見える一方、細胞レベルでの長時間持続性鉄固定は、特に貧血の処置におけるこのタイプのプロダクトの使用に重大な因子のままである。しかし、今のところ、細胞レベルでの鉄の輸送および固定の両方を可能にする薬学的組成物は、提案されていない。
【００１１】
この課題を解決するために、本発明者らは、本発明の主題を明らかにした。
【００１２】
従って、本発明の主題は、有効成分として：
−  必要に応じて少なくとも１つの鉄塩の存在下の、少なくとも１つの鉄錯化蛋白質、および
−  一酸化窒素（ＮＯ）代謝の少なくとも１つの前駆体および／または一酸化窒素の少なくとも１つの化学的ドナー（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｏｎｏｒ）；
ならびに、必要に応じて、少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクル、
を含むことを特徴とする、薬学的組成物またはフードサプリメントである。
【００１３】
本発明者らは、実際に、長時間持続性細胞性鉄固定が、ＮＯ代謝の少なくとも１つの前駆体の存在下においておよび／または一酸化窒素の少なくとも１つの化学的ドナーの存在下において、高度に増強される（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｄ）ことを実証した。
【００１４】
本発明に従う薬学的組成物またはフードサプリメント中に使用され得る鉄錯化蛋白質（ｉｒｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、好ましくは、ラクトフェリン（Ｌｆ）およびトランスフェリンが使用される。Ｌｆの使用が特に好ましい。
【００１５】
Ｌｆは、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ起源であってもよく、あるいは合成的にまたは組換え経路によって得てもよい。組換えＬｆの中でも、特に、国際出願ＷＯ ９７／４５１３６およびＷＯ ９８／５０５４３に記載されるものが言及され得る。
【００１６】
一般的に、鉄錯化蛋白質（ｉｒｏｎ−ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、天然形態、またはそれらの鉄飽和度を増加させるために修飾形態で使用され得る。
【００１７】
例えば、Ｌｆを使用する場合、従って、約２０％のオーダーの鉄飽和度を示す天然状態のＬｆ（天然Ｌｆ）と比較して、約８０％よりも大きな値までその鉄飽和度を増加させるために、それを鉄塩の存在下、酸ｐＨで処理してもよい。
【００１８】
本発明の有利な実施形態によれば、好ましくは、５０％より大きな、そしてなおより優先的に８０％より大きな鉄飽和度を示すラクトフェリンが使用される。
【００１９】
鉄錯化蛋白質は、好ましくは、約０．０１ｍｇ〜５ｍｇ、そしてなおより好ましくは約０．１ｍｇ〜１ｍｇの単位用量で使用される。
【００２０】
本発明に従う薬学的組成物またはフードサプリメント中に必要に応じて使用され得る鉄塩の中でも、特に、第一鉄塩（硫酸塩、塩化物）、第二鉄塩（塩化物、硫酸塩、リン酸塩）、フマル酸鉄、シュウ酸鉄、アスコルビン酸鉄、グルコン酸鉄、コハク酸鉄、酢酸鉄、およびフェレデテート（ｆｅｒｅｄｅｔａｔｅ）が言及され得る。
【００２１】
それらが使用される場合、鉄塩は、本発明に従う薬学的組成物またはフードサプリメト中に、錯化されていない（ｎｏｎｃｏｍｐｌｅｘｅｄ）形態［すなわち、鉄塩は、鉄錯化蛋白質で錯化されていない］、あるいは鉄錯化蛋白質で部分的に錯化されたまたは完全に錯化された形態のいずれかで存在し得る。
【００２２】
それらが本発明に従う薬学的組成物またはフードサプリメント中に存在する場合、鉄塩は、好ましくは、約０．０１〜１ｍｇ、そしてなおより優先的には約０．０５〜０．５ｍｇの単位用量で使用される。
【００２３】
ＮＯ代謝の前駆体の中でも、Ｌ−アルギンおよびその塩、例えば、Ｌ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−アルギニングルタメートおよびＬ−アルギニンアスパルテート；Ｌ−アルギニンに富む、即ち少なくとも１０重量％のＬ−アルギニンからなる、蛋白質およびペプチドが言及され得、そして中でも、特に、ルピン（ｌｕｐｉｎ）の抽出物から誘導される蛋白質およびペプチドが言及され得る。
【００２４】
一酸化窒素の化学的ドナー（ｃｈｅｍｉａｌ ｄｏｎｏｒｓ）の中でも、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）が言及され得る。
【００２５】
ＮＯ代謝の前駆体および／またはＮＯの化学的ドナーは、好ましくは、約０．００１ｍｇ〜１ｍｇ、そしてなおより特別には約０．０１ｍｇ〜０．１ｍｇの単位用量で使用される。
【００２６】
Ｌ−アルギニンおよび／またはその塩が、本発明に従う薬学的組成物またはフードサプリメント中に存在する場合、それらは、好ましくは約０．１ｍｇ〜５ｍｇ、そしてなおより特別には約０．５〜２ｍｇの単位用量で使用される。
【００２７】
本発明によれば、鉄錯化蛋白質／ＮＯ代謝の前駆体および／またはＮＯの化学的ドナー重量比は、好ましくは、１／１と１０／１との間である。
【００２８】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、鉄錯化蛋白質／ＮＯ代謝の前駆体および／またはＮＯの化学的ドナー比は、１／１（重量対重量）である。
【００２９】
本発明によれば、以下の組み合わせ：
−  ０．０１ｍｇ〜５ｍｇのラクトフェリン、
−  ０．０１〜１ｍｇの鉄塩、および
−  ０．１ｍｇ〜５ｍｇのＬ−アルギニン、
を含有する薬学的組成物またはフードサプリメントが好ましく与えられる。
【００３０】
本発明によれば、以下の組み合わせ：
−  ０．０１ｍｇ〜１ｍｇのラクトフェリン、
−  ０．１ｍｇの鉄塩、および
−  １ｍｇのＬ−アルギニン、
を含有する薬学的組成物またはフードサプリメントが、なおより特に好ましく与えられる。
【００３１】
本発明の薬学的組成物は、特に貧血の場合に造血を刺激するため、そして無力症の処置のために使用され得る特性を有する。更に、ラクトフェリンの固有の生物学的特性のために、本発明に従う薬学的組成物はまた、それが鉄錯化蛋白質としてラクトフェリンを含有する場合、食物アレルギーおよび不耐性と戦うことにおける機能性サプリメントとして、または特定の抗酸化産物（例えば、特に、ＳＯＤ）と組み合わせての機能性サプリメントとして、（特に、消化管中の）病原性細菌因子の排除のために使用され得る。
【００３２】
この点において、鉄錯化蛋白質として少なくとも１つのラクトフェリン、およびＳＯＤを含有する、本発明に従う薬学的組成物またはフードサプリメントが、特に好ましい。
【００３３】
本発明に従うフードサプリメントは、特に妊婦における、鉄欠乏症または鉄欠乏症の危険性を防止するために使用され得る特性を有する。
【００３４】
本発明に従う薬学的組成物はまた、無力症および／または貧血の処置に意図される薬学的組成物に慣用的に使用されるものような、１以上の更なる有効成分を含有し得、そして中でも、特に、ビタミンＢ１２、葉酸（または、ビタミンＢｃ）およびアスコルビン酸（または、ビタミンＣ）のようなビタミン；補酵素Ｑ１０が言及され得る。
【００３５】
本発明に従う薬学的に許容されるビヒクルは、好ましくは、１以上の、薬学的組成物を調製するために慣用的に使用される賦形剤、例えば、抗凝集剤（ａｎｔｉ−ａｇｇｒｅｇａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、抗酸化剤、色素、フレーバー改良剤（ｆｌａｖｏｒ ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）、スムージング剤（ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、アセンブリング剤（ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、単離剤（ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ）、および一般的に、薬学産業において慣用的に使用される任意の賦形剤からなる。
【００３６】
当然ながら、当業者は、この場合、必要に応じて使用される賦形剤は、本発明と関連する固有の特性と適合性であることを確認するだろう。
【００３７】
本発明に従う薬学的組成物は、好ましくは、８日間、１日当たり１または２用量の割合で、経口投与される。
【００３８】
それは、種々の形態、例えば、錠剤、カプセル剤、飲用懸濁剤、ロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）の形態、または経口投与法に好適な任意の他の形態であり得る。
【００３９】
本発明に従うフードサプリメントは、好ましくは経口的に吸収され、そして種々の形態、例えば、錠剤、カプセル剤、飲用懸濁剤、ロゼンジの形態、またはフードサプリメントの通常のプレゼンテーション（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）に好適な任意の他の形態であり得る。
【００４０】
本発明の主題はまた、薬学的組成物［この組成物は、無力症および／または貧血の処置に特に意図される］を製造するための、少なくとも１つの鉄錯化蛋白質、およびＮＯ代謝の少なくとも１つの前駆体および／または一酸化窒素の少なくとも１つの化学的ドナー、および必要に応じて少なくとも１つの鉄塩の使用である。
【００４１】
本発明の主題はまた、特に妊婦における、鉄欠乏症または鉄欠乏症の危険を示す個体に意図されるフードサプリメントを製造するための、少なくとも１つの鉄錯化蛋白質、およびＮＯ代謝の少なくとも１つの前駆体および／または一酸化窒素の少なくとも１つの化学的ドナー、および必要に応じて少なくとも１つの鉄塩の使用である。
【００４２】
上記アレンジメントに加えて、本発明はまた、ヒト胃腸上皮細胞における鉄固定の増強（ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ）の実証の実施例およびまた添付の図面に言及する、以下の説明から明らかとなるであろう他のアレンジメントを含む。
【００４３】
しかしながら、これらの実施例は本発明の主題の例示目的のみで与えられ、それらは決してその限定を構成しないことが、明確に理解されるべきである。
【００４４】
実施例１：ＮＯ代謝の前駆体による、細胞レベルでの鉄固定の増強効果の実証
この実施例の目的は、細胞レベルでのＬｆによる鉄固定が、ＮＯ代謝の前駆体（例えば、Ｌ−アルギニン）の存在下で高度に増強されることを実証することである。
【００４５】
天然状態において、ウシＬｆ（天然ウシＬｆ）は、約２０％のオーダーの鉄飽和を示す。天然ウシＬｆをｐＨ１で処理して、天然状態で含まれる非標識鉄を、５９Ｆ標識化鉄で置換した。標識化鉄での天然Ｌｆの飽和は、８５％〜１００％のオーダーの標識化鉄飽和度を示す標識化ラクトフェリン（Ｌｆ−５９Ｆｅ）を生じさせ、これは、０．０３μＣｉ／μｇの比放射能についての４５０ｎｍでの分光光度吸収によって明らかにされた。
【００４６】
次いで、Ｌｆ−５９Ｆｅを、固定されていない標識化鉄を除去するために、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ−７５のカラムにおけるゲル濾過によって精製した。
【００４７】
結腸癌から誘導されたＣａｃｏ−２株の腸上皮細胞を、Ｇｉｂｃｏ社によって販売される、１５％（ｖ／ｖ）のウシ胎仔血清、２ｍｍｏｌ／ｌのＬ−グルタミンおよび１％（ｖ／ｖ）のストレプトマイシン−ペニシリンの溶液を含有する、２５ミリモル（ｍｍｏｌａｒ）のＨｅｐｅｓの存在下、ｐＨ７．４で緩衝化されたＲＰＭＩ １６４０培地において、１ｍｌ当たり２×１０６細胞の割合で、インキュベートした。
【００４８】
次いで、細胞レベルでの鉄固定を、Ｌｆ−５９Ｆｅおよび／または標識化鉄および／またはＬ−アルギニンを添加することによって開始した。
【００４９】
細胞培養チューブの１つは、コントロールとして機能するように、これら３つの成分をいずれも受容しなかった。
【００５０】
成分の分布、およびそれらが使用された濃度は、以下の表Ｉに示される：
【００５１】
【表１】
2004520264.tif 000002
【００５２】
次いで、細胞を、Ｅｐｅｎｄｏｒｆチューブにおいて１６時間インキュベートし、培養期間の最後の２時間撹拌を維持した。インキュベート期間にわたって、細胞性鉄（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｒｏｎ）の量を、放射活性を測定するための装置を使用して、最初、３０分後（ｔ＝０．５）、次いで１時間後（ｔ＝１）、次いで毎時間後（ｔ＝２〜ｔ＝１６）、細胞の遠心分離ペレットによって測定した。
【００５３】
図１に観察され得るように、腸細胞による鉄固定は、ｔ＝０．５から観察され、ｔ＝１とｔ＝２との間で最大となって、その後ｔ＝１６まで減少する。この効果は、Ｌｆ−５９Ｆｅが標的細胞へ標識化鉄を輸送し得；しかし、この鉄は、細胞性放射活性鉄が、恐らく細胞性漏出（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｅａｋａｇｅ）の現象によって、引き続いて減少するので、その中に一時的に固定されるだけであることを実証する。これらの細胞培養物に、Ｌ−アルギニン、および必要に応じて放射標識化鉄で補充された場合（細胞培養物４および８）、鉄固定の持続期間の延長化が培養の１６時間までであるように、細胞レベルでの鉄固定度の増加が気付かれる。
【００５４】
従って、鉄錯化蛋白質および必要に応じて鉄塩を含有する薬学的組成物へＮＯ代謝の前駆体を添加することは、細胞レベルで固定される鉄の量を増加させることだけでなく、細胞レベルでの鉄固定の持続時間を延長することを可能にし、この効果は、該組成物が同時に３つの成分の組み合わせを含有する場合に、なお一層顕著である。
【００５５】
更に、そして図２に見られるように、細胞培養チューブ１、２、４および８で行われる実験を繰り返し、かつＬ−アルギニン経路の競合的インヒビター、即ちＮω−ニトロ−Ｌ−アルギニンメチルエステル（Ｌ−ＮＡＭＥ）を、これらのチューブの細胞培養培地へ１ｍＭの割合で添加した場合、この添加は、細胞レベルでの鉄固定度の非常に大きな減少へと至り、これは、細胞をＬ−アルギニン無添加でインキュベートする場合（チューブ２）に観察される程度へ実質的に戻されるようである。この実験は、Ｌ−ＮＡＭＥを使用してＬ−アルギニン代謝をブロックすることによって、培養物中に配置された細胞によるＮＯの産生がブロックされることを示し、これは、内因性ＮＯが細胞レベルでの鉄固定度の増加を担うことを示している。
【００５６】
実施例２：ＮＯの化学的ドナーによる細胞レベルでの鉄固定の増強効果の実証
この実施例の目的は、細胞レベルでのＬｆによる鉄固定がＮＯの化学的ドナー（例えば、ＳＮＡＰ）の存在下で高度に増強されることを実証することである。
【００５７】
腸上皮細胞培養物のチューブを、実施例１において上述したものと同一条件下で、調製および培養した。
【００５８】
次いで、細胞レベルでの鉄固定を、Ｌｆ−５９Ｆｅおよび／または標識化鉄を添加することによって開始した。
【００５９】
細胞培養チューブの１つは、コントロールとして役立つように、該成分をいずれも受容しなかった。
【００６０】
成分の分布、およびそれらが使用された濃度は、以下の表ＩＩに示される：
【００６１】
【表２】
2004520264.tif 000003
【００６２】
次いで培養チューブに、０〜１μＭの範囲の量のＳＮＡＰを受容させ、次いで、放射標識化鉄の細胞固定を、放射活性を測定するための装置を使用して測定した。
【００６３】
図２に観察され得るように、Ｌｆ（細胞培養チューブ２）および必要に応じて放射標識化鉄（細胞培養チューブ４）を含有する組成物へのＳＮＡＰの添加は、上皮細胞における鉄固定度を増加させることを可能にする。
【００６４】
従って、鉄錯化蛋白質および必要に応じて鉄塩を含有する薬学的組成物へＮＯの化学的ドナーを添加することは、細胞レベルでの鉄固定度を増加させることを可能にし、この効果は、該組成物が同時に３つの成分の組み合わせを含有する場合により顕著である。
【００６５】
実施例３：濃度の関数としての細胞レベルでの鉄固定度の研究
上皮細胞培養物の１２チューブを、実施例１において上述した条件に従って調製した。
【００６６】
次いで、細胞レベルでの鉄固定を、Ｌｆ−５９Ｆｅおよび／または標識化鉄および／またはＬ−アルギニンを添加することによって開始した。
【００６７】
細胞培養チューブの１つは、コントロールとして機能するように、これら３つの成分をいずれも受容しなかった。
【００６８】
成分の分布、およびそれらが使用された濃度は、以下の表ＩＩＩに示される：
【００６９】
【表３】
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【００７０】
鉄の細胞固定度を、放射活性を測定するための装置を使用して、７２時間のインキュベーション後に測定した。
【００７１】
１２チューブの各々について得られた結果が、以下の表ＩＶにおいて見られる：
【００７２】
【表４】
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【００７３】
これらの結果は、試験されたＬｆの３つの濃度で、細胞レベルでの鉄固定度の非常に大きな増加が、該細胞培養培地が同時に鉄錯化蛋白質、鉄塩およびＮＯ代謝の前駆体を含有する場合に観察され、従って、Ｌ−アルギニンは細胞による鉄固定の増強において役割を果たすことを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、細胞レベルでの鉄固定に対する、ＮＯ代謝の前駆体の添加の効果を示す。
【図２】
図２は、細胞レベルでの鉄固定度に対する、Ｌ−アルギニン経路におけるインヒビターの添加の効果を示す。
【図３】
図３は、細胞レベルでの鉄固定度に対する、ＮＯの化学的ドナー（ＳＮＡＰ）の添加の効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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