(57)【要約】本発明は、炎症の処置に有用な物質を同定する方法であって、（ａ）該物質を、ＩκＢα遺伝子のプロモーターのＲＯＲ受容体への応答要素を含有する核酸構築物に、該物質を前記応答要素に結合する条件下に、接触させる工程、（ｂ）該物質の応答要素への結合可能性、または応答要素もしくはそれを含むプロモーターの転写活性を測定する工程、および（ｃ）場合により、工程（ｂ）の測定を、突然変異した応答要素を含有する核酸構築物を用いる以外は工程（ａ）および（ｂ）の条件と同様の条件下に成された測定と比較する工程を含んでなる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症の処置に有用な物質を同定する方法であって、
ａ）該物質を、ＩκＢα遺伝子プロモーターのＲＯＲ受容体応答要素を含有する核酸構築物に、該物質を該応答要素に結合させることができる条件下で、接触させて置く工程、
ｂ）該物質の応答要素への可能性のある結合、または応答要素もしくはそれを含有するプロモーターの転写活性を測定する工程、および
ｃ）場合により、工程（ｂ）の測定を、突然変異した応答要素を含有する核酸構築物を用いる以外は工程（ａ）および（ｂ）の条件と同様の条件下に成された測定と比較する工程
を含んでなる方法。
【請求項２】
以下の工程を含む請求項１記載の方法：
ａ）該物質を、ＲＯＲ受容体またはその機能的等価物、およびＩκＢα遺伝子プロモーターの該受容体への応答要素を含有する核酸構築物に、該受容体またはその機能的等価物、該物質または受容体から形成される複合体またはその機能的等価物および該物質を該応答要素に結合させることができる条件下に、接触させておく工程、
ｂ）ＲＯＲ受容体またはその機能的等価物、前記物質またはＲＯＲ受容体から形成される複合体またはその機能的等価物、および該物質の、応答要素への結合可能性、または応答要素もしくはそれを含有するプロモーターの転写活性を測定する工程、および
ｃ）場合により、工程（ｂ）の測定を、突然変異した応答要素を含有する核酸構築物を用いる以外は工程（ａ）および（ｂ）の条件と同様の条件下に成された測定と比較する工程。
【請求項３】
工程（ａ）において、核酸構築物が、ＩκＢα遺伝子プロモーターのＲＯＲ受容体応答要素の少なくとも一つのコピーを含有する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
応答要素が、ＲＯＲα応答要素および好ましくはＩκＢα遺伝子プロモーターのｈＲＯＲα応答要素である、請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
工程（ａ）の核酸構築物が、ＲＯＲ受容体応答要素を含有するＩκＢα遺伝子プロモーターの全てまたは一部を含有する、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）の核酸構築物が、以下の配列またはそのフラグメントからなるまたは含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法：
【表１】
2004507246.tif 000006
【請求項７】
工程（ａ）において、核酸構築物が、ＩκＢα遺伝子のＲＯＲ受容体への少なくとも一つの応答要素を含有するプロモーターの制御下に置かれたリポーター遺伝子を含有する、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）において、核酸構築物が、ＩκＢα遺伝子のプロモーターの制御下に置かれたリポーター遺伝子を含む、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
リポーター遺伝子が、ＩκＢα遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、ホタルまたはレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ遺伝子、分泌されたアルカリホスファターゼ遺伝子またはβガラクトシダーゼ遺伝子の中から選択される、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
以下の工程を含む、請求項７〜９のいずれか１項記載の方法：
ａ）該物質を、ＩκＢα遺伝子プロモーターのＲＯＲ受容体応答要素と機能的に組み合わされた少なくとも一つのリポーター遺伝子を含有する核酸構築物で形質転換された宿主細胞に接触させて置く工程、
ｂ）任意の適当な手段によりリポーター遺伝子の発現を測定する工程、
ｃ）場合により、工程（ｂ）の測定を、突然変異した応答要素を含有する核酸構築物を用いる以外は工程（ａ）および（ｂ）の条件と同様の条件下に成された測定と比較する工程。
【請求項１１】
工程（ａ）の宿主細胞が、ＲＯＲ受容体またはその機能的等価物を発現する、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｃ）において、工程（ｂ）の測定を、有利には、ＸがＡ、Ｔ、ＣおよびＧからなる群より選択される配列：ＧＡＧＣＡＣＡＡＴＧＴＸＸＸＸＸＸＧＡＴＡＧを有する突然変異した応答要素を含有する核酸構築物を用いる以外は工程（ａ）および（ｂ）の条件と同じ条件下に行われる測定と比較する、請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
突然変異されたかまたはされていないＩκＢα遺伝子の受容体応答要素の少なくとも一つのコピーを含有する少なくとも一つの核酸構築物を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
単独でか、またはＲＯＲ受容体もしくはその機能的等価物と複合して、ＩκＢα遺伝子のＲＯＲ受容体応答要素に結合することができる、ＲＯＲ受容体以外の物質。
【請求項１６】
炎症性疾患を予防または処置するための医薬組成物であって、活性成分として少なくとも一種の請求項１５記載の物質を含む医薬組成物。
【請求項１７】
炎症性疾患を処置または予防することを意図した医療品を調製するためのＩκＢα遺伝子の転写アクチベーターの使用。
【請求項１８】
ＩκＢα遺伝子の転写アクチベーターが、単独でか、またはＲＯＲ受容体もしくはその機能的等価物と複合して、ＩκＢα遺伝子の該ＲＯＲ受容体の応答要素に結合することができる物質である、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
ＩκＢα遺伝子の転写アクチベーターが、ＩκＢα遺伝子プロモーターの応答要素へのＲＯＲαの結合のかまたはその転写活性のアクチベーターである、請求項１７記載の使用。
【請求項２０】
単独でか、またはＲＯＲ受容体もしくはその機能的等価物と複合して、ＩκＢα遺伝子プロモーターの応答要素に結合することができると共に、炎症性疾患を処置または予防することを意図した医療品を調製するためにＩκＢαの発現を増大させることができる物質の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、炎症の処置または予防に有用な物質をスクリーニングするための、ＩκＢα遺伝子のＲＯＲ受容体応答要素、より詳しくは、この遺伝子のプロモーターの配列−９１０／−８９８の使用に関する。特別の態様において、本発明は、炎症の処置または予防に有用な物質をスクリーニングするための、ＲＯＲ受容体および／または少なくとも一種のその応答要素またはその機能的等価物の使用に関する。
【０００２】
ＮＦ−κＢ複合体は、ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌファミリーからの種々のタンパク質ダイマーからなる。哺乳動物において、ＮＦ−κＢ１（ｐ５０およびその前駆体ｐ１０５）、ＮＦ−κＢ２（ｐ５２およびその前駆体ｐ１００）、ｃ−Ｒｅｌ、ＲｅｌＡ／ｐ６５およびＲｅｌＢ（Ｇｈｏｓｈ， Ｓ． ｅｔ． ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８， １６：２２５〜６０）の５つのこのファミリーのタンパク質が同定されている。これら全てのタンパク質は、約３００のアミノ酸と２つの「Ｉｇ様」ドメインからなるＲＨＤと呼ばれる高度に維持されたドメインであるＲｅｌ Ｈｏｍｏｌｏｇｙ Ｄｏｍａｉｎを含有する。このＲＨＤドメインは、ＮＦ−κＢタンパク質の二量化、ＤＮＡへの結合、およびＩκＢｓタンパク質との相互作用に包含され、核局在信号（ＮＬＳ）を有する。ＮＦ−κＢダイマーは、コンセンサス配列ＧＧＧＲＮＮＹＹＣＣ（Ｒはプリン塩基、Ｙはピリミジン塩基およびＮは任意の塩基を表す）を認識するために異なる親和性を示す（Ｍｉｙａｍｏｔｏ， Ｓ． Ｖｅｒｍａ， Ｉ． Ｍ．， Ａｄｖ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９５， ６６：２５５〜９２）。ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌファミリーからのタンパク質は、転写活性化のための異なる性能も示す；すなわち、ＲｅｌＢは特定の細胞タイプにおける転写を活性化するが、ｐ６５およびｃ−Ｒｅｌタンパク質のみがそうすることができる。このファミリーにおける異なるタンパク質をコードするノックアウト遺伝子は、そのメンバーの各々に特異的な異なる機能を示した。ｐ５０／ｐ６５ヘテロダイマーは、最初に同定されたダイマーであり、大部分の細胞タイプにおいて最も豊富である。
【０００３】
ＮＦ−κＢ経路は、免疫および炎症応答に含まれる多数の遺伝子の転写を制御する（Ｂａｕｅｒｌｅ， Ｐ． Ａ． ａｎｄ Ｂａｉｃｈｗａｌ， Ｖ．Ｒ．， Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９７， ６５：１１１〜３７； Ｂａｒｎｅｓ， Ｐ． Ｊ． ａｎｄ Ｋａｒｉｎ， Ｍ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． １９９７， Ａｐ１０， ３３６（１５）： １０６６〜７１； Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ， Ｕ． ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９４， １０：４０５〜５５）。このシグナル伝達経路が制御できないと、癌、神経退化疾患、関節炎および喘息のような多くの疾患の原因となる。
【０００４】
ＮＦ−κＢシグナル伝達経路は、広範囲の刺激：すなわち、サイトカイン（ＴＮＦα、ＩＬ−１）、分裂促進剤、リポ多糖、ウイルス、ウイルスタンパク質、二本鎖ＲＮＡ、物理的および化学的ストレスにより活性化される（Ｇｈｏｓｈ， Ｓ． ｅｔ． ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９９８， １６：２２５〜６０； Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ， Ｕ． ｅｔ． ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １９９４， １０：４０５〜５５）。
【０００５】
大多数の不活性化細胞において、ＮＦ−κＢは、その中で抑制タンパク質ＩκＢに結合する不活性細胞質複合体として存在する（Ｆｏｒｍａｎ Ｂ． Ｍ． ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｄ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８， ２４２：５４０〜５４６）。ＮＦ−κＢの活性化は、セリン３２およびセリン３６においてＩκＢαタンパク質をリン酸化するＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）の活性化を介して起こり、それにより、ＩκＢαが分解し、ＮＦ−κＢ　ｐ５２およびｐ６５タンパク質の遊離をもたらす（Ｂａｕｅｒｌｅ， Ｐ． Ａ． ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｄ．， Ｃｅｌｌ １９９６， ８７：１３〜２０； Ｖｅｒｍａ， Ｉ． Ｍ．， Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ， Ｊ．Ｋ．， Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｅ．Ｍ．， Ｖａｎ Ａｎｔｗｅｒｐ， Ｄ． ａｎｄ Ｍｉｙａｍｏｔｏ， Ｓ．， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ． １９９５， ９：２７２３〜２７３５）。このように遊離したＮＦ−κＢダイマーは、核に移行し、そこで転写を制御する。
【０００６】
ＩκＢファミリーは、タンパク質ＩκＢα、ＩκＢβ、ＩκＢγ、ＩκＢε、Ｂｃｌ−３、ＮＦ−κＢ１、ＮＦ−κＢ２を含む（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ， Ｓ． Ｔ． ａｎｄ Ｉｓｒａｅｌ， Ａ．， Ｓｅｍｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． １９９７， Ａｐｒ ８（２）：７５〜８２）。ＩκＢタンパク質は、ＮＦ−κＢシグナル伝達経路の最終段階に包含される。何故なら、これらの新たに合成されたタンパク質は核に導かれ、そこでＤＮＡ結合ＮＦ−κＢ複合体と相互作用して、結合部位からの解離を引き起こし細胞質へ転位して戻すからである（Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｅｉｓｄｅｄｏｓ， Ｆ． ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １９９７， Ｆｅｂ． １１０：３６９〜７８）。
【０００７】
ＩκＢαタンパク質の発現は、このシグナル伝達経路のフィードバック制御を発揮するＮＦ−κＢ経路により制御される（Ｓｕｎ， Ｓ． Ｃ． ｅｔ． ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３， Ｍａｒ ２６， ２５９ （５１０３）：１９１２〜５）。さらに、ＩκＢα発現を制御するためにグルココルチコイドも現れ（Ａｕｐｈａｎ， Ｎ． ｅｔ． ａｌ．， １９９５， Ｏｃｔ． １３， ２７０ （５２３４）：２８６〜９０； Ｓｃｈｅｉｎｍａｎ， Ｒ． Ｉ．， １９９５， Ｏｃｔ． １３， ２７０ （５２３４）：２８３〜６）、一方、エストロゲンが発現水準を低下させる（Ｓｕｎ， Ｓ． Ｃ． ｅｔ． ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９３， Ｍａｒ ２６， ２５９ （５１０３）：１９１２〜５）。最後に、ＩκＢαプロモーターの機能分析により、ＡＰ−１結合部位（Ｋｒａｌｏｖａ， Ｊ． ｅｔ． ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １９９６， Ｊｕｎ． ２０， １２（１２）：２５９５〜６０４）およびＳＰ１結合部位（Ａｌｇａｒｔｅ， Ｍ． ｅｔ． ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １９９９， Ｓｅｐ． １９（９） ：６４１４０〜５３）の重要な役割が明らかになっている。
【０００８】
ＲＯＲα受容体（レチノイド関連オーファン受容体α）（ＮＲ１Ｆ１）は、Ａ／Ｔ豊富領域が先行する半パリンドロームモチーフＡＧＧＴＣＡと、１本の６塩基対配列からなるＲＯＲＥ応答要素を介して、モノマーとして結合する核受容体ファミリーのメンバーである（Ｇｉｇｕｅｒｅ， Ｖ．， ＭｃＢｒｏｏｍ， Ｌ． Ｂ． Ｄ． ａｎｄ Ｆｌｏｃｋ， Ｇ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １９９５， １５：２５１７〜２５２６； ＭｃＢｒｏｏｍ， Ｌ． Ｂ． Ｄ．， Ｆｌｏｃｋ， Ｇ． ａｎｄ Ｇｉｇｕｅｒｅ， Ｖ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １９９５， １５：７９６〜８０８）。特定の条件下に、ＲＯＲαは、Ａ／Ｔ豊富領域が先行し２つのヌクレオチドにより分離される２つの半パリンドロームモチーフＡＧＧＴＣＡの繰り返しからなる応答要素を介してホモダイマー状のＤＮＡに結合することもできる（Ｈａｒｄｉｎｇ， Ｈ． Ｐ． ｅｔ． ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １９９７， Ｏｃｔ１１ （１１）：１７３７〜４６）。
【０００９】
ＲＯＲＥ部位は、下流に位置する遺伝子の転写活性を調整するためにＲＯＲ受容体が結合するＲＯＲ応答要素である。そのような部位を用いて、ＲＯＲ感受性を異種プロモーターに付与することができる。
【００１０】
ＲＯＲα遺伝子は、共通のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）および共通の配位子結合ドメイン（ＬＢＤ）を共有する４つのアイソフォームを有する。これらのアイソフォームは、それらのアミノ末端において異なる（Ｇｉｇｕｅｒｅ， Ｖ． ｅｔ． ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ． １９９４， ８：５３８〜５５３）。ＲＯＲα欠損マウスは、ＤＮＡを結合することができない断端された切断タンパク質を作るＲＯＲα遺伝子中に欠失を収容する、よろめいているマウスに特徴的な脳欠損（運動失調）を示す（Ｈａｍｉｌｔｏｎ， Ｂ． Ａ． ｅｔ． ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ １９９６， ３７９：７３６〜７３９＋； Ｄ‘Ａｍｂｒｏｓｉｏ， Ｄ． ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １９９８， １０１：２５２〜２６２； Ｄｕｓｓａｕｌｔ， Ｉ．， Ｆａｗｃｅｔｔ， Ｄ．， Ｍａｔｈｙｓｓｅｎ， Ａ．， Ｂａｄｅｒ， Ｊ． − Ａ． ａｎｄ Ｇｉｇｕｅｒｅ， Ｖ．， Ｍｅｃｈ． Ｄｅｖ． １９９８， ７０：１４７〜１５３； Ｓｔｅｉｎｍａｙｒ， Ｍ． ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９８， ９５：３９６０〜３９６５）。さらに、よろめいているマウスはＩＬ−１を過剰産生する（Ｋｏｐｍｅｌｓ， Ｂ． ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． １９９２， ５８：１９２〜１９９）。
【００１１】
従来技術において、ＲＯＲα遺伝子中に突然変異（ＤＮＡ結合ドメインの翻訳を妨げる突然変異）を有するよろめいているマウスは、マクロファージ中のＩＬ−１αの過剰産生のような免疫欠損を有する（Ｋｏｐｍｅｌｓ， Ｂ． ｅｔ． ａｌ．， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． １９９２， ５８：１９２〜１９９； Ｋｏｐｍｅｌｓ， Ｂ． ｅｔ． ａｌ．， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． １９９０， ５５：１９８０〜１９８５）。
【００１２】
別の研究において、オーファン核受容体ファミリーに属するＲＯＲα受容体が、ショウジョウバエＳＬ３細胞中のチアゾリジンジオン誘導体であるＣＧＰ５２６０８により活性化されることが報告されている（Ｗｉｅｓｅｎｂｅｒｇ， Ｉ． ｅｔ． ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． １９９８， ５３：１１３１〜１１３８）。この研究は、ＣＧＰ５２６０８が、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で抗関節炎活性を発揮することも示している。しかしながら、ＣＧＰ５２６０８の抗炎症活性が、哺乳動物細胞中でＲＯＲに依存性であることを示すいかなる証拠も提供していない。
【００１３】
そのプロモーター中でのＲＯＲ応答要素の存在のみに基づいて、炎症およびアレルギーの制御に包含される重要な酵素である５−リポキシゲナーゼをコードする遺伝子が、ＲＯＲαの標的であることも示唆されている（Ｓｔｅｉｎｈｉｌｂｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９９５， ２７０ （１３）：７０３７〜７０４０）。
【００１４】
本発明の範囲内で行われた研究は、ＲＯＲα１受容体の新たな機能を明らかにしている。意外にも、本発明者らは、ＲＯＲα１が、ＮＦ−κＢ経路の干渉により炎症応答を下方制御することを初めて証明している。実際、ＮＦ−κＢ経路の主なインヒビターであるＩκＢαタンパク質の転写が、ＩκＢα遺伝子のプロモーター中で確認された新規ＲＯＲＥ応答要素を介してＲＯＲα１により活性化されることが示されている。この応答要素は、完全なＲＯＲＥコンセンサス部位であり、配列ｇａｇｃａｃＡＡＴＧＴＡＧＧＴＣＡｇａｔａｇを有する部位であるＩκＢαプロモーターの位置−９１０／−８９８の間に配される（Ｉｔｏ， Ｃ． Ｙ．， Ｋａｚａｎｔｓｅｖ， Ａ． Ｇ． ａｎｄ Ｂａｌｄｗｉｎ， Ａ． Ｓ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９９４， ２２：３７８７〜３７９２）。
【００１５】
さらに、本発明者らは、この配列の突然変異が、その機能的重要性を示すＲＯＲα１の効果を失うことにつながることを示している。従って、この配列に結合するいかなる他の核受容体または他の物質も、ＩκＢα発現を調節することができる。
【００１６】
ここで、核因子ＮＦ−κＢに結合することにより、ＩκＢαタンパク質は、特定のサイトカインをコードする遺伝子またはＣＯＸ−２遺伝子のような前炎症遺伝子の発現の活性化を妨げる不活性複合体（ＩκＢα−ＮＦ−κＢ）を形成する。これらのデータは、ＩκＢαプロモーターの配列−９１０／−８９８に結合するＲＯＲα１または他の核因子が、慢性炎症性疾患の処置の可能性のある標的であることを証明している。
【００１７】
添付の図１は、本発明において同定される炎症応答の制御に含まれる機構を概説する。
【００１８】
従って、配列−９１０／−８９８の役割を証明することにより、アテローム性動脈硬化症またはリューマチ性関節炎のようなヒト（慢性）炎症性疾患の処置に有用な物質を同定するための新規方法が開発されている。本発明で同定された配列を、この配列を通してＩκＢプロモーターの活性に影響する新規核因子を同定するために用いることができ、その結果、アテローム性動脈硬化症またはリューマチ性関節炎のようなヒト（慢性）炎症性疾患の処置に用い得ることがわかっている。
【００１９】
従って、ＲＯＲα１の標的としてＩκＢαを同定することにより、アテローム性動脈硬化症またはリューマチ性関節炎のようなヒト（慢性）炎症性疾患の処置に有用な物質を同定するための新規方法が同時に開発されている。
【００２０】
従って、本発明の目的は、炎症の処置に有用な物質を同定する方法であって、
ａ）該物質を、ＩκＢα遺伝子のプロモーターのＲＯＲ受容体応答要素を含有する核酸構築物に、該物質を該応答要素に結合させる条件下に、接触させる工程、
ｂ）該物質の応答要素への結合可能性、または応答要素もしくはそれを含有するプロモーターの転写活性を測定する工程、
ｃ）場合により、工程（ｂ）の測定を、突然変異した応答要素を含有する核酸構築物を用いる以外は工程（ａ）および（ｂ）の条件と同様の条件下に成された測定と比較する工程
を含んでなる方法にある。
【００２１】
応答要素は、好ましくは、ＲＯＲα受容体応答要素であり、好ましくはｈＲＯＲα受容体である。
【００２２】
本発明の特定の態様によれば、該物質を該応答要素に結合させる条件は、ＲＯＲ受容体またはその機能的等価物の存在を含む。
【００２３】
すなわち、本発明の方法は以下の工程を含む。
ａ）該物質を、ＲＯＲ受容体またはその機能的等価物およびＩκＢα遺伝子プロモーターの該受容体への応答要素を含有する核酸構築物に、該受容体もしくはその機能的等価物、該物質または前記受容体もしくはその機能的等価物と該物質から形成される複合体を該応答要素に結合させるのに適した条件下に、接触させる工程、
ｂ）ＲＯＲ受容体もしくはその機能的等価物、前記物質またはＲＯＲ受容体もしくはその機能的等価物と該物質から形成される複合体の、応答要素への結合可能性、または応答要素もしくはそれを含有するプロモーターの転写活性を測定する工程、および
ｃ）場合により、工程（ｂ）の測定を、突然変異した応答要素を含有する核酸構築物を用いる以外は工程（ａ）および（ｂ）の条件と同様の条件下に成された測定と比較する工程。
【００２４】
ＲＯＲ受容体の機能的等価物は、ＩκＢα遺伝子のプロモーターのＲＯＲ受容体応答要素に結合することができる任意の核因子を意味すると解される。従って、これは、
後者の所定の配位子へのＲＯＲの選択性と同様の選択性を有する結合部位、および
ＲＯＲと同じ応答要素または同様の核酸配列を有する応答要素を確認するＤＮＡ結合部位
を同時に含有するタンパク質を含む。
【００２５】
ＲＯＲ受容体に言及される「機能的等価物」という用語は、通常、ＲＯＲ受容体の構造から誘導され、ＩκＢα遺伝子の応答要素、特に、配列番号１の応答要素またはその機能的変異体に結合する性能を有する任意のポリペプチドを意味する。機能的等価物は、自然の変異体（多型、スプライシング等）、フラグメント、突然変異株または欠失体等であり得る。好ましくは、これらは、ＲＯＲ受容体、特にＲＯＲα、好ましくはｈＲＯＲαに、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０または９５％の同一性を有する少なくとも一つのアミノ酸領域を含むポリペプチドである。この用語は、さらに、ＲＯＲ受容体のＤＮＡ結合部位を含有するポリペプチドを含む。
【００２６】
すなわち、本発明の要旨において、ＲＯＲ受容体は、ＲＯＲファミリーの全てのアイソフォームα、βおよびγを意味する。ＲＯＲα受容体が、より好ましく、ｈＲＯＲα受容体がさらに好ましい。
【００２７】
ＲＯＲ受容体の機能的等価物は、前述の本発明の方法により同定される核因子でもあり得る。
【００２８】
本発明の方法の有利な態様は、工程（ａ）において、ＲＯＲα応答要素および好ましくはＩκＢα遺伝子プロモーターのｈＲＯＲα受容体の複数のコピーを含有する核酸構築物を用いることにある。例えば、構築物は、１〜１０の、典型的には１〜５のＲＯＲα受容体応答要素のコピーを含有し得る。
【００２９】
本発明の方法の有利な態様は、工程（ａ）において、ＲＯＲ受容体応答要素を含有するＩκＢα遺伝子プロモーターの全てまたは一部を含む核酸構築物を用いることにある。
【００３０】
工程（ａ）による核酸構築物の好ましい例は、以下の配列を有するＩκＢαプロモーターの位置−９１０／−８９８の間の配列を含むかまたはその配列からなる：
【００３１】
【表２】
2004507246.tif 000002
【００３２】
または、限定はされないが上記下線部分の６塩基対コンセンサス配列を含有するそのフラグメントを含むまたはそれからなる。本発明で用いることができるＲＯＲ受容体応答要素構築物の例は、以下の特定の配列を含む。
【００３３】
【表３】
2004507246.tif 000003
【００３４】
特定の態様において、配列番号１の全体を含む核酸が用いられる。前記配列番号１で下線を引かれた６塩基対コンセンサス配列単独と比較すると、この配列は、核酸因子との相互作用に包含される一種以上の領域を含む利点を有する。
【００３５】
この物質、ＲＯＲ受容体またはＲＯＲ受容体および該物質から形成される複合体の応答要素への結合可能性は、当業者に知られている任意の方法により、例えば、該結合に続いて応答要素により作られるシグナルを検出することにより測定することができる。これらは、リポーター遺伝子、結合テスト等を用いるようないかなる直接または間接的方法であっても良い。
【００３６】
すなわち、本発明の好ましい態様は、ＩκＢα遺伝子の応答要素をリポーター遺伝子と組み合わせる核酸構築物を用いることにある。有利な方法において、該リポーター遺伝子が、該応答要素の少なくとも１つのコピーを含有するプロモーターの制御下に置かれる。
【００３７】
従って、リポーター遺伝子は、その配列が、配列番号１またはその機能的変異体を含む任意のプロモーターの制御下に置かれる。そのような特定の配列は、プロモーター中、上流、下流または内部に、同じ方向または反対方向に、１以上のコピー（好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜６のコピー）で存在してよい。本発明の好ましい態様において、リポーター遺伝子が、配列番号１または少なくともコンセンサス領域を含有するそのフラグメントの１以上のコピーを含有するプロモーターの制御下に置かれる。好ましくは、ＲＯＲまたは除去することができる機能的等価物の不在および存在下に異なる活性を有するプロモーターである。
【００３８】
本発明のプロモーターを作るために、ＲＯＲ受容体応答要素を転写最少プロモーターと結びつけることができる。最少プロモーターは、基本活性が低いかまたは無く、転写アクチベーター（例えばＲＯＲ）の存在下に増加することができる転写プロモーターである。従って、最少プロモーターは、哺乳動物細胞中の生来弱いプロモーターであり得、非毒性および／または不十分な発現を生み出して顕著な生物学的効果を引き起こす。有利な場合、最少プロモーターは、転写活性に必須でない領域を除去することにより、天然プロモーターから調製される構築物である。例えば、それは好ましくは、通常１６０ヌクレオチド未満のサイズで、転写開始コドンの周囲に位置する主にＴＡＴＡボックスからなるプロモーターである。最少プロモーターは、例えば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のプロモーター、ＣＭＶ初期プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等のような強いまたは弱いウイルス性もしくは細胞性プロモーターからこのように調製することができる。
【００３９】
好ましい態様において、リポーター遺伝子が、ＩκＢα遺伝子のプロモーターの制御下に置かれる。
【００４０】
その応答要素を含有する配列への核受容体の活性を測定可能にする任意のリポーター遺伝子を、本発明記載のスクリーニング方法において用いることができる。これらは、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、ホタル（Ｌｕｃ）もしくはレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ：Ｒｅｎ）ルシフェラーゼ遺伝子、分泌アルカリホスファターゼ遺伝子（ＳＡＰ）またはβガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）遺伝子およびＩκＢα遺伝子そのものにより例示される。
【００４１】
これらの遺伝子によりコードされるタンパク質の活性は、従来の方法により容易に測定することができ、生成されるタンパク質の量および／またはその酵素活性を測定することにより遺伝子発現への核受容体の効果の間接的な概念が得られる。
【００４２】
本発明のより特別の態様によれば、リポーター遺伝子はＩκＢα遺伝子である。この場合、ＩκＢαタンパク質の蓄積は、リポーター遺伝子の上流でクローンされた複数のＮＦ−κＢ応答要素を含有するリポーターベクターを用いて、ＮＦ−κＢを結合する能力、またはその作用を抑制する能力により測定することができる。
【００４３】
リポーター遺伝子の使用は、リポーターまたはその機能的等価物または該物質が、単独またはＲＯＲ受容体と複合して、該応答要素に結合することができるのみならず、応答要素のまたは該応答要素を含有するプロモーターの転写活性を増加させることができるかどうか確かめる利点を有する。このようにして、炎症応答の抑制における該物質の役割を確認することができる。
【００４４】
有利には、転写活性を増加させるこの能力は、トランスフェクション、ｍＲＮＡもしくはタンパク質のインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での分析ならびにインビトロおよびインビボモデルのような当業者に知られた任意の直接的または間接的方法により、ＩκＢ遺伝子について、工程（ｂ）およびおそらくは工程（ｃ）において、測定することができる。
【００４５】
本発明による方法の一例は以下の工程を含む。
ａ）該物質を、先に定義したようなＩκＢα遺伝子プロモーターのＲＯＲ受容体応答要素と機能的に組み合わされた少なくとも一つのリポーター遺伝子を含有する核酸構築物で形質転換された宿主細胞に接触させる工程、
ｂ）任意の適当な手段によりリポーター遺伝子の発現を測定する工程、
ｃ）場合により、工程（ｂ）の測定を、突然変異した応答要素を含有する核酸構築物を用いる以外は工程（ａ）および（ｂ）の条件と同様の条件下に成された測定と比較する工程。
【００４６】
前記方法の特定の態様によれば、工程（ａ）の宿主細胞が、ＲＯＲ受容体または先に定義したようなその機能的等価物を発現する。
【００４７】
工程（ｃ）において、突然変異した応答要素を含有する核酸構築物、すなわち、ＲＯＲ受容体を機能的に結合できなくするように配列が変えられたＲＯＲ応答要素を用いる以外は工程（ａ）および（ｂ）と同じ条件下の測定により、工程（ｂ）の測定との比較が有利に行われる。そのような突然変異した応答要素は、有利には、次の配列：ＧＡＧＣＡＣＡＡＴＧＴＸＸＸＸＸＸＧＡＴＡＧ（ＸはＡ、Ｔ、ＣおよびＧから選択される）を有する。限定されない例として、以下の突然変異した配列が好ましい。
【００４８】
【表４】
2004507246.tif 000004
【００４９】
本発明の方法により同定することができる物質は、化学的または生物学的化合物であり。例えば、それらは核因子であってよい。
【００５０】
さらに、ＤＮＡ結合タンパク質をコードするクローンを同定するための古典的方法を、本発明の方法で用いることができる。例えば、λｇｔ１１発現ライブラリー（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ． ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９７）のスクリーニング、アフィニティークロマトグラフィーによる精製およびそれに続くタンパク質の配列決定（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． １９９７）、所謂「ワン・ハイブリッド」法（Ｗａｎｇ， Ｍ． Ｍ．， Ｎａｔｕｒｅ １９９３， Ｊｕｌ． ８， ３６４ （６４３３）：１２１〜６），または所謂「ファージディスプレイ」法（Ｓｍｉｔｈ， Ｇ． Ｐ． ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ， Ｊ． Ｋ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９９３， ２１７＋ ： ２２８〜５７； Ｏ’Ｎｅｉｌ， Ｋ． Ｔ． ａｎｄ Ｈｏｅｓｓ， Ｒ． Ｔ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． １９９５， Ａｕｇ． ５（４）＋： ４４３〜９）を用いることができる。
【００５１】
本発明は、また、先に記載した物質を同定する方法において用いることができる、突然変異したまたは変異しないＩκＢα遺伝子の応答要素の少なくとも１つのコピーを含有する少なくとも１つの核酸構築物を含むベクターに関する。
【００５２】
本発明は、さらに、そのようなベクターを含有する宿主細胞に関する。
【００５３】
宿主細胞は、特に、哺乳動物細胞、バクテリアまたは酵母あるいは昆虫細胞のような、前記遺伝子の発現に適した全てのタイプの細胞を意味すると解釈する。本発明の好ましい態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞（肝細胞、線維芽細胞、内皮細胞、筋細胞等）である。さらに好ましくは、そのような細胞はヒト細胞であってよい。これらは、また、初代培養または樹立細胞系である。もう一つの態様において、さらに、原核細胞（バクテリア）、酵母細胞（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ， Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ等）、植物細胞等を用いることができる。
【００５４】
この物質は、その効果、濃度、細胞タイプおよび技術因子に従って、異なる時間で細胞と接触させることができる。
【００５５】
用いられるベクターは、もちろん、トランスフェクトされる細胞のタイプに適しており、プラスミド、ウイルスまたは人工染色体を含む。
【００５６】
試験物質を、任意の適当な支持体の上（または中）、特に、プレート上、試験管またはフラスコ中、膜上等で核酸構築物または細胞と接触させることができる。通常、多くの異なる試験を並行して行なえるようにするマルチウェルプレート中で接触が成される。代表的支持体は、マイクロタイタープレート、および特に、取り扱いが容易な９６〜３８４（またはそれ以上）のウェルを有するプレートを含む。
【００５７】
支持体および試験物質の性質に依り、前記方法の実施のために異なる量の細胞を用いることができる。代表的には、適当な培地において、１０３〜１０６の、好ましくは１０４〜１０５の細胞を一つのタイプの試験物質と接触させる。
【００５８】
試験物質の量（または濃度）は、物質のタイプ（毒性、細胞貫通性能等）、細胞の数、インキュベーション時間等に従って使用者が調節することができる。通常、細胞が、１ｎＭ〜１ｍＭの範囲の量の試験物質に曝露される。もちろん、本発明から逸脱することなく、他の濃度を試験することができる。さらに、各物質を、異なる濃度で並行して試験することができる。また、リポソーム、カチオン性脂質またはポリマーのような、細胞内への物質の貫入を容易にする異なるアジュバントおよび／またはベクターおよび／または生成物も、要すれば、用いることができる。接触時間は、例えば、数分〜数時間または数日、特に、５〜７２時間、通常、１２〜４８時間である。細胞および種々の試薬は、好ましくは、リポーター遺伝子により発現される生成物のデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）合成または検討中の相互作用を可能にするのに充分に長く接触を維持する。
【００５９】
本発明は、また、ＲＯＲ受容体そのものを除く、本発明の方法により同定される物質に関する。
【００６０】
本発明は、また、単独またはＲＯＲ受容体もしくはその機能的等価物と複合して、ＩκＢα遺伝子のＲＯＲ受容体応答要素に結合することができるＲＯＲ受容体以外の少なくとも一種の物質を活性成分として含んでなる、炎症性疾患の予防または処置用の薬学的組成物も目的とする。
【００６１】
本発明は、さらに、炎症性疾患の処置または予防を意図した医薬生成物を調製するための、ＩκＢα遺伝子の転写アクチベーターの使用に関する。
【００６２】
本発明記載の使用の特定の方法によれば、ＩκＢα遺伝子の転写アクチベーターは、単独またはＲＯＲ受容体と複合して、ＩκＢα遺伝子の該ＲＯＲ受容体への応答要素に結合することができる物質である。従って、ＩκＢα遺伝子の転写アクチベーターは、ＩκＢα遺伝子プロモーターの応答要素へのＲＯＲαの結合のまたはその転写活性のアクチベーターであり得る。
【００６３】
したがって、本発明は、さらに、単独またはＲＯＲ受容体もしくはその機能的等価物と複合して、ＩκＢα遺伝子プロモーター応答要素に結合して、炎症性疾患の処置または予防を意図した医薬生成物の調製のためのＩκＢαの発現を増すことができる物質の使用に関する。
【００６４】
本発明の他の利点および特徴が、添付の図面を参照する以下の実施例において明らかとなる。
【００６５】
図２Ａおよび２Ｂは、ＲＯＲα（図２Ａ）およびＧＡＰＤＨ（図２Ｂ）ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析（３５サイクル）に基づいて（Ｃ−ＰＣＲおよびＣ−ＲＴは、それぞれＰＣＲおよびＲＴの陰性コントロールである）、血管壁内における異なるタイプの細胞におけるＲＯＲα発現を示す。
【００６６】
図２Ｃは、Ａｄ−ＲＯＲα１またはＡｄ−ＧＦＰでの２４時間感染後の、平滑筋細胞中での、ＲＯＲα　ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【００６７】
図２Ｄは、Ａｄ−ＲＯＲα１を用いるまたは用いない２４時間感染後の、平滑筋細胞中での、ＲＯＲαタンパク質発現の分析を示す。
【００６８】
免疫細胞化学的検討を、アミノ酸１６３〜２２５へのウサギポリクローナルＲＯＲα抗体を用いて前述（Ｃｈｉｎｅｔｔｉ， Ｇ． ｅｔ． ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． １９８０， ２７３： ２５５７３〜２５５８０）のように行った。
【００６９】
図３Ａおよび３Ｂは、平滑筋細胞における、ＩＬ−６（図３Ａ）およびＩＬ−８（図３Ｂ）の分泌およびＴＮＦαにより誘発されるＣＯＸ−２の発現をＲＯＲα１が抑制することを示す。初代平滑筋細胞をＡｄ−ＲＯＲα１またはＡｄ−ＧＦＰウイルスで１６時間感染させ、次に、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。この処理後、培地中のＩＬ−６およびＩＬ−８の濃度を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、英国在）により測定した。
【００７０】
図３Ｃおよび３Ｄは、ウエスタンブロット分析により測定されたＣＯＸ２およびＲＯＲαタンパク質の発現を示す。ＣＯＸ２タンパク質水準を、細胞中のβアクチン含量に正規化した（ＮＳ＝非特異的）。
【００７１】
図４Ａ〜４Ｃは、ＲＯＲα１によるＮＦ−κＢ活性化の抑制を示す。
【００７２】
図４Ａは、ＲＯＲα１発現ベクター（ｐＳＧ５−ＲＯＲα１、５０ｎｇ）または空ベクター（ｐＳＧ５コントロール）の存在下にリポーター遺伝子（ＮＦ−κＢ）３−Ｌｕｃ（１００ｎｇ）でトランスフェクトしたＰＡＣ１Ａ細胞を示す。トランスフェクションの２時間後、ＬＰＳ（１０ｍｇ／ｍｌ）の存在または非存在下に０．２％ＦＣＳを補足したＤＭＥＭ培地中に細胞を２４時間置いた。
【００７３】
図４Ｂは、Ａｄ−ＲＯＲα１またはＡｄ−ＧＦＰで１６時間感染させ、次に、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）で０、１５、３０および６０分間刺激した初代平滑筋細胞を示す。全（Ｔ；下方ゲル）および核（Ｎ；上方ゲル）タンパク質抽出物を調製し、抗−ｐ６５抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を用いてウエスタンブロットにより分析した。
【００７４】
図４Ｃは、Ａｄ−ＲＯＲα１またはＡｄ−ＧＦＰで１６時間感染させ、次に、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）で３０分間刺激した初代平滑筋細胞を示す。核タンパク質抽出物（５ｍｇ）を調製し、ＮＦ−κＢおよびＳｐ１標識プローブ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＥＭＳＡにより分析した。移動した複合体を矢印で示す。二本矢印は、非結合プローブを示す。
【００７５】
図５Ａおよび５Ｂは、ＲＯＲα発現ベクター（ｐＳＧ５−ＲＯＲα１）で感染した細胞中のＲＯＲα１受容体によるＩκＢα転写の誘発を示す。
【００７６】
図５Ａは、Ａｄ−ＲＯＲα１またはＡｄ−ＧＦＰで１６時間感染させた初代平滑筋細胞を示す。全ＲＮＡを調製し、ＩκＢαおよびＧＡＰＤＨ　ｍＲＮＡをノーザンブロットで測定した。
【００７７】
図５Ｂは、ｐＳＧ５−ＲＯＲα１または空ベクター（ｐＳＧ５、５０ｎｇ）の存在下にＩκＢαプロモーター（１００ｎｇ）のフラグメントでトランスフェクトしたＰＡＣ１Ａ細胞を示す。
【００７８】
図６Ａ〜６Ｃは、ＲＯＲα１によるＩκＢα遺伝子の特異的転写活性化を示す。
【００７９】
ＲＯＲα２またはＲＯＲα３ではなく、ＲＯＲα１が、ＩκＢαプロモーター中のＲＯＲＥ部位に結合する。
【００８０】
図６Ａは、ＲＯＲα１、ＲＯＲα２またはＲＯＲα３（５０ｎｇ）または空ベクターｐＳＧ５（５０ｎｇ）の存在下にリポーターベクター（ＩκＢα−ＲＯＲＥ）２−ＴＫ−Ｌｕｃ（１００ｎｇ）でトランスフェクトしたＰＡＣ１Ａ細胞を示す。
【００８１】
図６Ｂは、ＲＯＲα１（５０ｎｇ）、ＲＯＲα１Δ２３５または空ベクター（５０ｎｇ）の存在下にリポーターベクター（ＩκＢα−ＲＯＲＥ）２−ＴＫ−Ｌｕｃ（１００ｎｇ）でトランスフェクトしたＰＡＣ１Ａ細胞を示す。
【００８２】
図６Ｃは、インビトロで翻訳されたＲＯＲα１タンパク質（ＴＮＴ−Ｔ７，Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＩκＢα−ＲＯＲＥ標識プローブを用いて行われたゲルシフト実験を示す。増加した濃度（１×、１０×および１００×）の天然（ＡＧＧＴＣＡ）または突然変異（ＡＣＣＴＣＡ）したオリゴヌクレオチド競合体を用いて、移動複合体の特異性を証明した。複合体の移動性を高めるために、結合応答に１μｌのＲＯＲα抗体を添加した（Ｓ：複合体のシフト、ＳＳ：複合体のスーパーシフト；ＦＰ：非結合プローブ）。
【００８３】
１−材料および方法
１）細胞培地
ヒト大動脈平滑筋細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ，独国ハイデルベルグ在）およびヒト冠状動脈内皮細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を、通常の条件下に初代培養で維持した。５〜８継代で細胞を用いた。ヒトマクロファージおよびモノサイトを調製し、先に記載したように初代培養で維持した。
【００８４】
２）ＲＮＡ分析
ＲＮＡを調製し、プローブとしてＧＡＰＤＨ　ｃＤＮＡおよびＩκＢαのフラグメントを用いて、先に記載したようにノーザンブロットにより分析した。ＲＯＲα発現のＲＴ−ＰＣＲ分析のために、逆転写酵素により全ＲＮＡを転写し、次に、以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。
【００８５】
【表５】
2004507246.tif 000005
【００８６】
３）アデノウイルス生成
ベクターｐＡＤＣＭＶ２中にｃＤＮＡを挿入した後、大腸菌中での均質組み換えにより組み換えアデノウイルスＡｄ−ＧＦＰおよびＡｄ−ＲＯＲα１を得た。ウイルス粒子のストックを既述したように得た。２９３個の細胞で感染した後に溶解プラークを数えることにより懸濁の滴定量を測定し、ｐｆｕ／ｍｌで定義した。平滑筋細胞培地にウイルスストックを直接加えることにより、細胞当たり１００個のウイルス粒子の複数感染にて細胞を感染させた。
【００８７】
４）プラスミドおよび一過性トランスフェクション
前述のｐＣＭＸベクターから、発現ベクターｐＳＧ５−ｈＲＯＲα１、−ｈＲＯＲα２、−ｈＲＯＲα３および−ＲＯＲαΔ２３５を誘導した。ＩκＢαプロモーターの領域−９２９／＋２２に相当するフラグメントを、ヒトゲノムＤＮＡから増幅し、ＰｒｏｍｅｇａベーシックｐＧＬ２プラスミド中にクローンして構築物ｐ（−９２２／＋２２）ＩκＢα　Ｌｕｃを得た。このフラグメント中に存在するＲＯＲ部位の突然変異（ＡＧＧＴＣＡがＡＣＣＴＣＡに突然変異）を、部位特異的突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）により誘発した。リポーターベクターｐ（−３８５／＋２２）ＩκＢαは、Ｄｒ． Ｉｓｒａｅｌ（Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，パリ在）から寄贈してもらった。リポーターベクター（ＩκＢα−ＲＯＲＥ）２−Ｔｋ−Ｌｕｃを、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の最少プロモーターの上流に、ＩκＢαプロモーターのＲＯＲＥ部位の２つのコピーを挿入することにより作った。構築物（ＮＦ−κＢ）３−Ｌｕｃを、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから得た。ＰＡＣ１Ａ細胞（ラット大動脈平滑筋細胞系）を、既述したようにカチオン性脂質を用いてトランスフェクトした。
【００８８】
ＩＩ−結果
慢性炎症がアテローム性動脈硬化の特徴である（Ｒｏｓｓ， Ｒ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． １９９９， ３４０：１１５〜１２６）ことおよび、よろめいているマウスが前炎症プロフィールを有することを考慮して、本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲにより、血管壁中の異なる種類の細胞におけるＲＯＲ発現を測定した。
【００８９】
内皮細胞、平滑筋細胞（ＳＭＣ）およびモノサイト中で、ＲＯＲα発現を検出した（図２Ａ）。一方、モノサイト誘導マクロファージ中ではＲＯＲα発現ははるかに低かった。
【００９０】
炎症応答の制御におけるＲＯＲαの可能性のある役割を試験するために、本発明者らは、均質組み換えにより、優性なＲＯＲα１アイソフォームをコードするアデノウイルスベクターを生成した（Ｆｏｒｍａｎ， Ｂ． Ｍ ｅｔ． ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． １９９４， ８：１２５３〜１２６１）。Ａｄ−ＲＯＲα１で初代ＳＭＣを感染させると、ＲＯＲαの発現が誘発されたが、陰性コントロールとして用いられるＡｄ−ＧＦＰで感染させると、内因性水準では効果が無かった（図２Ｃ）。ポリクローナル抗−ＲＯＲα抗体（アミノ酸１６３〜２２５）を用いた免疫細胞化学的研究により、タンパク質水準でのこれらの結果が確認され、さらに、内因性ＲＯＲαと外因性ＲＯＲαとの両方が核中で最初に局在化されることを証明した（図２Ｄ）。
【００９１】
次に、ＴＮＦαにより誘発された血管炎症性応答の異なるマーカーへのＲＯＲα１の効果を検討した。
【００９２】
刺激の非存在下では、Ａｄ−ＧＦＰで感染させた細胞中でＩＬ−６とＩＬ−８の両方が検出され、効果は、この構築物の免疫原性による。この弱い誘発は、Ａｄ−ＲＯＲα１での感染により強く抑制された（図３Ａおよび３Ｂ）。ＴＮＦαでＡｄ−ＧＦＰ感染細胞を処理（２４時間）すると、両方のサイトカインが顕著に誘発されたが、これはＡｄ−ＲＯＲα１での感染により強く抑制することができた（図３Ａおよび３Ｂ）。内因性ＲＯＲαタンパク質は、Ａｄ−ＧＦＰ感染細胞中では検出されなかった。これは、疑いも無く、用いた抗体の弱い親和性による。しかしながら、Ａｄ−ＲＯＲα１で感染させた細胞中において、ＲＯＲα発現が増加し、その水準はＴＮＦα刺激により影響されなかった（図３Ｃ）。同じ実験において、ＣＯＸ−２タンパク質水準も測定した。ＴＮＦαはＣＯＸ−２発現を強く誘発したが、Ａｄ−ＲＯＲα１感染細胞では効果が無かった（図３Ｄ）。これらのデータは、ＲＯＲα１が、初代大動脈平滑筋細胞中でＴＮＦαにより誘発される炎症性応答をネガティブレギュレートすることを証明している。
【００９３】
本発明に至る研究の範囲において、ＲＯＲα１の存在または非存在下に、ＮＦ−κＢ経路の制御下に、ＰＡＣ１Ａ細胞（ラット平滑筋細胞系）を一時的にプロモーターでトランスフェクトした。これらの細胞が、ＴＮＦα刺激に応答しないことを考慮して、本発明者らは、ＮＦ−κＢ経路の誘発剤としてＬＰＳを用いた。ＬＰＳ処置は、ＮＦ−κＢ制御下に、プロモーターの活性を大きく増加させた（３倍以上）。この誘発は、ＲＯＲα１で共トランスフェクトした細胞中では低下した。基本的プロモーター活性は、これらの条件下で大きく影響されることは無かった（図４Ａ）。これらの結果は、ＮＦ−κＢの転写活性を抑制することにより、ＲＯＲα１が抗炎症効果を示すことを確証している。
【００９４】
次に、本発明者らは、ウエスタンブロットにより、ｐ６５の核転位へのＲＯＲα１の過剰発現の効果を検討した。本発明者らは、ＴＮＦαで処理すると、Ａｄ−ＧＦＰ感染細胞中でｐ６５の一時的核転位が引き起こされることを発見した。この転位は、Ａｄ−ＲＯＲα１で感染された細胞中ではあまり顕著でなく、このことは、ＲＯＲα１が、ｐ６５タンパク質の全発現を制御することなく、ｐ６５転位を制御することを示している（図４Ｂ）。この移動の低下の効果を試験するために、ゲルシフト実験（ＥＭＳＡ）を行った。感染の２４時間後、ＴＮＦαを３０分間細胞に添加した。この処理期間の最後に、核抽出物を調製し、その配列がＮＦ−κＢコンセンサス部位に相当する標識プローブを用いるゲルシフト実験によりＮＦ−κＢタンパク質ｐ５０およびｐ６５の存在を調べるために用いた。Ａｄ−ＧＦＰ感染細胞は、Ａｄ−ＲＯＲα１で感染させた細胞よりも、ＮＦ−κＢ部位への結合活性がかなり低く、これは、先の結果（図３Ａおよび３Ｂ）に一致する。本発明者らは、ＴＮＦα刺激が、その応答要素に結合するＮＦ−κＢの大きな増加につながり、結合は、Ａｄ−ＲＯＲα１感染細胞中では強度に低下したことを観察した。ＴＮＦαおよびＲＯＲα１過剰発現のいずれも、Ｓｐ１プローブへの核因子の結合に影響を与えず（図４Ｃ）、これは、ＲＯＲα１の作用が、ＮＦ−κＢ経路に特異的であることを示している。
【００９５】
多くの核受容体が、ｐ６５サブユニットとの相互作用により、ＮＦ−κＢにより制御される転写およびＮＦ−κＢ部位への結合を抑制することも知られている（Ｇｏｔｔｌｉｃｈｅｒ， Ｍ． Ｈｅｃｋ， Ｓ． ａｎｄ Ｈｅｒｒｌｉｃｈ， Ｐ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． １９９８， ７６：４８０〜４８９）。例えば、ｐ６５と共トランスフェクションすると、ＰＡＣ１Ａ細胞中においてＮＦ−κＢ制御プロモーターが強度に誘発されることが示された（データを示さず）。この誘発は、ＲＯＲα１との共トランスフェクションにより影響されず、このことは、他の核受容体と対照的に、ＲＯＲα１がｐ６５を利用すること無くＮＦ−κＢ経路のネガティブコントロールを働かせることを示している。
【００９６】
静止期細胞においては、ＩκＢαタンパク質は、ｐ５０／ｐ６５ヘテロダイマーを、不活性細胞質複合体として隔離する。ＲＯＲαがｐ６５転位およびその後のＮＦ−κＢ部位への結合を抑制することを考慮して、ＩκＢα発現水準を、Ａｄ−ＧＦＰまたはＡｄ−ＲＯＲα１で感染させた細胞中で決めた。Ａｄ−ＧＦＰ感染細胞は、低水準のＩκＢα　ｍＲＡＮを発現した（図５Ａ）。ＩκＢα転写体が、Ａｄ−ＲＯＲα１で感染させた細胞中でかなり増加した（図５Ａ）。これらの発見は、ＲＯＲα１が、ＩκＢα遺伝子の発現を誘発することによりＮＦ−κＢ経路を抑制することを示している。
【００９７】
位置−９２９と＋２２との間のＩκＢα遺伝子プロモーターのフラグメントをＰＣＲにより増幅させ、リポーター遺伝子ルシフェラーゼの上流に挿入した（Ｉｔｏ， Ｃ． Ｙ．， Ｋａｚａｎｔｓｅｖ， Ａ． Ｇ． ａｎｄ Ｂａｌｄｗｉｎ， Ａ． Ｓ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９９４， ２２：３７８７〜３７９２）。この構築物は、本発明の基礎を構成する。このベクターおよびＲＯＲα１発現ベクターの共トランスフェクションにより、−９２９／＋２２プロモーターの制御下にルシフェラーゼ活性の増加が誘発されたが、−３８５／＋２２プロモーターでは誘発されなかった。これは、ＲＯＲα１により制御される領域が、位置−９２９と−３８５との間に位置することを示している（図５Ｂ）。この領域の配列分析により、その中の応答要素（ＲＯＲＥ）の存在を示した。このＲＯＲＥ応答要素の突然変異により、ＲＯＲαの効果が妨げられた（図５Ｂ）。この実験は、ＩκＢα転写のＲＯＲα１媒介誘発におけるこの部位の役割を明らかに証明している。
【００９８】
ＲＯＲα遺伝子が幾つかのアイソフォームを有する（Ｇｉｇｕｅｒｅ， Ｖ． ｅｔ． ａｌ．， Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖ． １９９４， ８：５３８〜５５３）ことを考慮して、本発明者らは、異種プロモーター（ＴＫプロモーター）の上流にクローニングされたＩκＢα−ＲＯＲＥ遺伝子プロモーター中に存在するＲＯＲα応答要素の２つのコピーの制御下における、アイソフォームＲＯＲα１、ＲＯＲα２およびＲＯＲα３の構築物への効果を評価した。
【００９９】
ＲＯＲα１は、リポーター遺伝子の活性を強度に誘発し、このことは、ＩκＢα−ＲＯＲＥが、プロモーターとは独立して、機能し得ることを証明している。対照的に、ＲＯＲα２およびＲＯＲα３は、前述の構築物の転写を誘発させず（図６Ａ）、このことは、ＩκＢαの転写活性がＲＯＲα１アイソフォームに特異的であることを示している。
【０１００】
ＬＢＤドメインを欠くネガティブドミナントＲＯＲαΔ２３５が、同じＤＮＡ結合ドメインと競合することにより、ＲＯＲα１誘発転写を抑制することが示された（Ｍｃ Ｂｒｏｏｍ， Ｌ． Ｄ． Ｂ．， Ｆｌｏｃｋ， Ｇ． ａｎｄ Ｇｉｇｕｅｒｅ， Ｖ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９９５， １５：７９６〜８０８）。この突然変異の、ＲＯＲα１により誘発し得るＩκＢα遺伝子ＲＯＲＥの制御下におけるプロモーターへの効果を試験した。ＲＯＲαΔ２３５で共トランスフェクションすると、ＲＯＲα１の効果が消えた（図６Ｂ）。このことは、ＲＯＲαのプロモーターへの結合が、転写の誘発に必須であることを示している。最後に、ＲＯＲα１のその応答要素ＲＯＲＥへの結合を、インビボ翻訳ＲＯＲα１タンパク質を用いてゲルシフトアッセイにより調べた。天然または突然変異した非標識プローブを用いた競合実験またはスーパーシフト実験は、ＩκＢα遺伝子プロモーター中に存在するＲＯＲＥ部位にＲＯＲα１が強い親和性で結合することを明らかに示した。
【０１０１】
すなわち、本発明の範囲内で行った研究中に、本発明者らは、大動脈平滑筋細胞中のＲＯＲα１の過剰発現が、ＴＮＦαにより誘発されるＣＯＸ−２、ＩＬ−６およびＩＬ−８の発現を抑制することを初めて示した。これらの遺伝子の全てが、アテローム性動脈硬化病巣における主用な炎症マーカーである（Ｒｏｓｓ， Ｒ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． １９９９， ３４０：１１５〜１２６）。この研究から生じる結果は、ＲＯＲαが、リポタンパク質代謝の調整剤としてのその役割（アポリポタンパク質Ａ１遺伝子の発現へのその作用を通して起こる（Ｍａｍｏｎｔｏｖａ， Ａ． ｅｔ． ａｌ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９８， ９８：２７３８〜２７４３））に加えて、直接的血管効果を通してアテローム性動脈硬化への保護的役割を果たすことを示している。アテローム性動脈硬化の初期段階中におけるモノサイトの漸増に関係強く含まれる重要なケモカインであるＩＬ−８（Ｒｏｓｓ， Ｒ．， Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． １９９９， ３４０：１１５〜１２６）を下方制御することにより、ＲＯＲα１は、アテローム性動脈硬化病巣の開始および増殖を低下させることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明において同定される炎症応答の制御に含まれる機構を概説する。
【図２Ａ】ＲＯＲα（図２Ａ）およびＧＡＰＤＨ（図２Ｂ）ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析（３５サイクル）に基づいて（Ｃ−ＰＣＲおよびＣ−ＲＴは、それぞれＰＣＲおよびＲＴの陰性コントロールである）、血管壁内における異なるタイプの細胞におけるＲＯＲα発現を示す。
【図２Ｂ】ＲＯＲα（図２Ａ）およびＧＡＰＤＨ（図２Ｂ）ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析（３５サイクル）に基づいて（Ｃ−ＰＣＲおよびＣ−ＲＴは、それぞれＰＣＲおよびＲＴの陰性コントロールである）、血管壁内における異なるタイプの細胞におけるＲＯＲα発現を示す。
【図２Ｃ】Ａｄ−ＲＯＲα１またはＡｄ−ＧＦＰでの２４時間感染後の、平滑筋細胞中での、ＲＯＲα　ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。
【図２Ｄ】Ａｄ−ＲＯＲα１を用いるまたは用いない２４時間感染後の、平滑筋細胞中での、ＲＯＲαタンパク質発現の分析を示す。
【図３Ａ】平滑筋細胞における、ＩＬ−６（図３Ａ）およびＩＬ−８（図３Ｂ）の分泌およびＴＮＦαにより誘発されるＣＯＸ−２の発現をＲＯＲα１が抑制することを示す。初代平滑筋細胞をＡｄ−ＲＯＲα１またはＡｄ−ＧＦＰウイルスで１６時間感染させ、次に、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。この処理後、培地中のＩＬ−６およびＩＬ−８の濃度を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、英国在）により測定した。
【図３Ｂ】平滑筋細胞における、ＩＬ−６（図３Ａ）およびＩＬ−８（図３Ｂ）の分泌およびＴＮＦαにより誘発されるＣＯＸ−２の発現をＲＯＲα１が抑制することを示す。初代平滑筋細胞をＡｄ−ＲＯＲα１またはＡｄ−ＧＦＰウイルスで１６時間感染させ、次に、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）で２４時間刺激した。この処理後、培地中のＩＬ−６およびＩＬ−８の濃度を、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、英国在）により測定した。
【図３Ｃ】ウエスタンブロット分析により測定されたＣＯＸ２およびＲＯＲαタンパク質の発現を示す。ＣＯＸ２タンパク質水準を、細胞中のβアクチン含量に正規化した（ＮＳ＝非特異的）。
【図３Ｄ】ウエスタンブロット分析により測定されたＣＯＸ２およびＲＯＲαタンパク質の発現を示す。ＣＯＸ２タンパク質水準を、細胞中のβアクチン含量に正規化した（ＮＳ＝非特異的）。
【図４Ａ】ＲＯＲα１によるＮＦ−κＢ活性化の抑制を示す。
【図４Ｂ】ＲＯＲα１によるＮＦ−κＢ活性化の抑制を示す。
【図４Ｃ】ＲＯＲα１によるＮＦ−κＢ活性化の抑制を示す。
【図５Ａ】ＲＯＲα発現ベクター（ｐＳＧ５−ＲＯＲα１）で感染した細胞中のＲＯＲα１受容体によるＩκＢα転写の誘発を示す。
【図５Ｂ】ＲＯＲα発現ベクター（ｐＳＧ５−ＲＯＲα１）で感染した細胞中のＲＯＲα１受容体によるＩκＢα転写の誘発を示す。
【図６Ａ】ＲＯＲα１によるＩκＢα遺伝子の特異的転写活性化を示す。
【図６Ｂ】ＲＯＲα１によるＩκＢα遺伝子の特異的転写活性化を示す。
【図６Ｃ】ＲＯＲα１によるＩκＢα遺伝子の特異的転写活性化を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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