(57)【要約】本発明は、ＴＳＶペプチド、このようなペプチドを生成するための方法および組成物、ならびに、ホスフェート消耗障害（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を処置するためにＴＳＶペプチならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストを使用する方法を提供する。１つの局面において、本発明は、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列と、少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。より好ましくは、本発明は、配列番号２からなる群から選択される配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。最も好ましくは、本発明は、配列番号２と同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項２】
配列番号２に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、分泌性低分子量ヒトタンパク質、ならびに、より詳細には、ヒトタキキニンファミリーのタンパク質に関するポリペプチドおよび他の組成物、ならびにこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
多くの低分子量分泌性タンパク質は、増殖を刺激する役割か、増殖を阻害する役割か、または重要な代謝経路の調節のいずれかによって、健康および疾患の両方において甚大な効果を有する。このような分子としては、増殖因子、サイトカイン、ペプチドホルモン、および同様の化合物が挙げられる。増殖因子は、細胞表面上のレセプターに結合するタンパク質であって、主に細胞増殖または細胞分化の活性化を生じる。多くの増殖因子は、多面的であり、多くの異なる細胞型において、細胞分化または他の効果を刺激する；一方で、他のものは、特定の細胞型または組織に特異的である。多くの増殖因子またはこれらの増殖因子由来の産物は、重要な医薬（例えば、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン−α（αＩＮＦ）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＣＭ−ＣＳＦ））となっており；多くの他のもの（例えば、インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、腫瘍増殖因子−α（ＴＧＦ−α）、インターロイキン、繊維芽細胞増殖因子タンパク質、および他のもの）は、種々の疾患（特に癌）におけるその役割を理解するために、集中的な研究下にある（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ，７３−８２頁，Ｊａｍｅｓｏｎ編、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９８））。
【０００３】
タキキニンは、種々の生物学的活性を有する神経ペプチドのファミリーであり、この活性は、以下を含む：海馬発作に続く、疼痛および神経損傷の発症に関連する活性（例えば、Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９６：１２０９６−１２１０１（１９９９）；Ｚｉｍｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：２６３０−２６３５（１９９８）；Ｃａｏら、Ｎａｔｕｒｅ，３９２：３９０−３９４（１９９８））。タキキニン関連ポリペプチドの発現レベルは、合成の転写段階および翻訳後段階にて調節される。
【０００４】
活性タキキニンポリペプチド、およびタキキニンの生物学的効果を増強するか、または調節するための関連化合物の有用性は、疼痛または発作を管理するための新規な治療ストラテジーを提供することによって、当該分野での必要性を満たす。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、ヒトタキキニンスプライシング変異体（ＴＳＶ）ポリペプチド、ＴＳＶポリペプチドに特異的な抗体に関連する組成物、ならびにこのような組成物を作製および使用する方法に関する。本発明はさらに、個体でのＴＳＶポリペプチドの異常な発現に関連する障害を処置するための、ＴＳＶポリペプチド組成物（抗体化合物を含む）を使用する方法を包含する。
【０００６】
１つの局面において、本発明は、配列番号２および配列番号３からなる群から選択される配列と、少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。より好ましくは、本発明は、配列番号２からなる群から選択される配列と少なくとも９７％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。最も好ましくは、本発明は、配列番号２と同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０００７】
別の局面において、本発明は、配列が、配列番号２のポリペプチド中の連続したアミノ酸の部分配列と同一である、６〜３０のアミノ酸からなる単離されたペプチドを含む。このようなペプチドは、ＴＳＶポリペプチドに特異的なペプチド抗体の生成において使用される、抗原性組成物の生成での有用な中間体である。
【０００８】
別の局面において、本発明は、ポリペプチド、ペプチドフラグメント、または上記のペプチドのいずれかに特異的な単離された抗体を含む。好ましくは、本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。このような抗体は、特に、ＴＳＶポリペプチド関連障害を処置する際に、診断的適用および治療的適用を有する。処置方法としては、ＴＳＶポリペプチド抗原に特異的な、抗体または抗体由来の組成物を使用する方法があげられるが、これに限定されない。特定の組織サンプルにおいてＴＳＶポリペプチドを検出するための診断方法、および、組織においてＴＳＶポリペプチドの発現レベルを検出するための診断方法もまた、本発明の一部を形成する。
【０００９】
別の局面において、本発明は、配列番号２のＴＳＶポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを含む。
【００１０】
別の局面において、本発明は、選択された集団において少なくとも２％の頻度を有する、ＴＳＶポリペプチドの天然変異体を含む。より好ましくは、このような天然変異体は、選択された集団において、少なくとも５％、そして最も好ましくは、少なくとも１０％の頻度を有する。この選択された集団は、遺伝的集団の分野における研究の任意の認識された集団であり得る。好ましくは、この選択された集団は、コーカサス人、ネグロイド人またはアジア人である、より好ましくは、選択された集団は、フランス人、ドイツ人、イギリス人、スペイン人、スイス人、日本人、中国人、韓国人、中国系のシンガポール人、アイスランド人、北アメリカ人、イスラエル人、アラブ人、トルコ人、ギリシャ人、イタリア人、ポーランド人、太平洋諸島の人々、またはインド人である。
【００１１】
別の局面において、本発明は、ＴＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。本発明はまた、このようなベクターを含む宿主細胞を含み得る。このようなＴＳＶポリペプチドの発現、および、細胞培養物質からそれを回収するのに適切な条件下で、宿主細胞を培養する工程を含む、ＴＳＶポリペプチドを生成するプロセスもまた、提供される。
【００１２】
なおさらなる局面において、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドならびに薬学的に受容可能なキャリア化合物を含む薬学的組成物および処方物を含む。
【００１３】
（定義）
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」または「ペプチド」または「ペプチドフラグメント」は、ペプチド結合によって連結された、単一の分枝していない鎖アミノ酸残基から作製される化合物をいう。このような化合物中のアミノ酸残基の数は、広範に変化する；しかし、好ましくは、本明細書中でいわれるペプチドは、通常、６〜４０のアミノ酸残基を有する。本明細書中でいわれるポリペプチドおよびペプチドフラグメントは、通常、数十（例えば、２０）アミノ酸残基〜数百（例えば、２００以上）アミノ酸残基間で有する。一般に、ポリペプチドは、組み換えＤＮＡ法によって、より都合よく製造される。
【００１４】
本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、用語「ポリペプチド」と同義語として使用され得るか、または、さらに、ペプチド結合以外の結合によって連結され得る２つ以上のポリペプチド（例えば、ジスルフィド結合によって連結され得るタンパク質を作る、このようなポリペプチド）の複合体をいい得る。用語「タンパク質」はまた、同一のアミノ酸残基を有すが、（特に、このようなタンパク質が真核生物宿主で発現される場合に、付加され得るように）異なる翻訳後改変（例えば、リン酸化、アシル化、グリコシル化など）を有するポリペプチドのファミリーを含み得る。
【００１５】
アミノ酸残基は、本明細書中で以下の標準的一文字表記または三文字表記によって、参照される：Ａ、アラニン；Ｃ、シトシン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｋ、リジン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、グルタミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、スレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；Ｙ、チロシン。
【００１６】
二重鎖に関して「好ましく整合した」は、二重鎖を作るポリペプチドヌクレオチド鎖またはオリゴヌクレオチド鎖が、各鎖中の各々のヌクレオチドが、他方の鎖中のヌクレオチドとＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成するように、互いに二重鎖構造を形成することを意味する。この用語はまた、使用され得るヌクレオチドアナログ（例えば、デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオシドなど）の対を含む。三重鎖に関して、この用語は、三重鎖が、好ましく整合した二重鎖、および、各々のヌクレオチドが、好ましく整合した二重鎖の塩基対と、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ結合または逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ結合を形成する第３の鎖からなることを意味する。逆に、タグとオリゴヌクレオチドとの間の二重鎖における「ミスマッチ」は、二重鎖または三重鎖中のヌクレオチドの対または三つ組みが、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｋならびに／またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ結合および／もしくは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ結合の形成に失敗することを意味する。
【００１７】
参照配列と別の配列（すなわち「候補」配列）との比較に関して使用される、用語「パーセント（％）同一性」または同様の用語は、これらの二つの配列の間の最適な整列において、この候補配列が、示した割合まで等価な多数のサブユニット位置において、参照配列と同一であり、このサブユニットは、ポリヌクレオチド比較に関してはヌクレオチドであり、または、ポリペプチド比較に関してはアミノ酸である。本明細書中で使用される場合、比較される配列の「最適な整列」は、サブユニット間の整合を最大にして、整列の構築において使用されるギャップの数を最小にする整列である。％同一性は、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）（「ＧＡＰ」ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）により記載されるアルゴリズムの市販されたインプリメンテーションを使用して決定され得る。整列を構築するため、および％同一性を計算するため、または他の類似性計測の当該分野での他のソフトウェアとしては、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，２：４８２−４８９（１９８１）（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のアルゴリズムに基づく、「ＢｅｓｔＦｉｔ」プログラムが挙げられる。言い換えれば、例えば、参照アミノ酸配列に対して、少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、参照配列中のアミノ酸残基の５％までが、欠損されるか、もしくは別のアミノ酸で置換され、または参照配列中の全アミノ酸残基の５％までの多数のアミノ酸が、参照配列中に挿入され得る。参照配列のこれらの変更は、参照配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置にて、または、これらの末端位置の間のいずれの場所にて生じ得、この参照配列中の個々の残基、またはこの参照アミノ酸配列中の１つ以上の連続群のいずれかで分散される。本発明の参照配列との比較において、候補配列は、より大きいポリペプチドまたはポリヌクレオチドの構成成分またはセグメントであり得、割合同一性を計算する目的のためのこのような比較は、関連する構成成分またはセグメントに関して実施されるべきであるということが、理解される。
【００１８】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関して、用語「単離された」は、示されたポリペプチドまたはポリヌクレオチドが、その天然の環境の構成成分から分離されていることを意味する。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然または改変されたモノマーまたは連結（デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、これらのアノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などを含む）の直鎖オリゴマーを意味して、これは、モノマー  対  モノマーの相互作用（例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の塩基対形成、塩基スタッキング、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎまたは逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型の塩基対形成など）の規則的パターンを用いてポリヌクレオチド特異的に結合し得る。通常、モノマーは、ホスホジエステル結合、またはこのアナログにより連結され、少しの（例えば、３〜４）モノマー単位〜数十（例えば、４０〜６０）のモノマー単位の範囲のサイズのオリゴヌクレオチドを形成する。オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが連続した文字（例えば、「ＡＴＧＣＣＴＧ」または対応する小文字）によって表されるときはいつでも、その文脈について他に記載または理解されない限り、ヌクレオチドは、左から右へ５’→３’の順序であり、「Ａ」はデオキシアデノシンを表記し、「Ｃ」はデオキシシチジンを表記し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを表記し、「Ｔ」はチミジンを表記し、そして、「Ｕ」はウラジンを表記することが理解される。通常、本発明のオリゴヌクレオチドは、４つの天然ヌクレオチドを含み、そして、これらは、天然のホスホジエステル結合によって、互いに連結される：しかし、これらはまた、非天然のヌクレオチドアナログを含み得、そしてまた、特に、アンチセンスまたは診断的組成物として使用される場合、非天然のヌクレオチド間連結を含み得る。天然または非天然のヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドが、本発明に従って使用され得る（例えば、酵素によるプロセッシングが要求される）場合、通常、天然ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが必要とされることが、当業者に明らかである。
【００２０】
本明細書中で使用される場合、「ヌクレオシド」は、天然のヌクレオシドを含み、これは、２’−デオキシ形態および２’−ヒドロキシ形態を含む（例えば、ＫｏｒｎｂｅｒｇおよびＢａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、第２版（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）中に記載される）。ヌクレオシドを参照して「アナログ」は、これらが特異的にハイブリダイゼーションし得るというだけの条件において、改変塩基部分および／または改変等部分を有する合成ヌクレオシド（例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）；ＵｈｌｍａｎおよびＰｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０）により記載される）などを含む。このようなアナログとしては、結合特性を増強して、複雑さを減少して、特異性を増大するなどのように設計された合成ヌクレオシドを含む。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ＴＳＶポリヌクレオチド、および関連する組成物を含み、これは、以下を含むが、これらに限定されない：ＴＳＶポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドまたはこのフラグメント、ＴＳＶポリペプチドに特異的な抗体本発明のポリヌクレオチドを含む組み換えＤＮＡ構築物およびベクター、ならびに、ＴＳＶ転写産物を複製するため、またはＴＳＶポリペプチドを発現するために使用されるこのような構築物またはベクターを含む宿主細胞。本発明はまた、ＴＳＶポリペプチド、このアゴニストおよびアンタゴニスト、特に、ＴＳＶポリペプチド組成物に特異的なモノクローナル抗体由来のアンタゴニストを含む薬学的組成物を含む。
【００２２】
本発明のＴＳＶポリペプチドおよびペプチドフラグメントは、天然および人工の変異体を含み、この人工の変異体のアミノ酸配列は、１つ以上の置換、挿入または欠失によって、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇの参照アミノ酸配列とは異なる。このような変異体は、通常、当該分野で周知のカセットもしくはＰＣＲ突然変異誘発または他の技術を使用して、ＴＳＶポリヌクレオチドまたはペプチドフラグメントをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発によって、調製されて、変異体をコードするＤＮＡを生成して、その後、以下により完全に記載するように、組み換え細胞培養においてＤＮＡを発現する。変異体ＴＳＶポリペプチドはまた、以下に記載されるような従来のペプチド合成技術または収束合成技術を使用して、化学的に合成され得る。
【００２３】
本発明のポリペプチドの天然変異体は、本発明のオリゴヌクレオチドを使用する分析技術を使用して、選択された集団の個々の従来のスクリーニングによって得られる。好ましくは、ゲノム領域の全てまたは一部を含むゲノム領域が、ＰＣＲまたは同様の技術を使用して増幅され、その後、この増幅された配列は、従来の方法を使用して配列決定されるか、そうでなければ、従来の技術を使用して特異的遺伝子座にて分析される。次いで、この配列は、本発明のポリヌクレオチドと比較されて、コード化タンパク質をもたらすバリエーションが存在するか否かを決定される。好ましくは、本発明の天然ＴＳＶポリペプチド変異体は、集団において２％以上高い、そしてより好ましくは、５％以上高い、そして最も好ましくは、１０％以上高い頻度を有する。
【００２４】
（ＴＳＶポリペプチドの組換え体製造）
本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞において対応するポリペプチドの発現を指向する組み換えＤＮＡ分子において使用され得る。遺伝コードの縮重に起因して、他のＤＮＡ配列は、等価のアミノ酸配列をコードし得、そして、ＴＳＶポリペプチドをクローニングおよび発現するために使用され得る。特定の宿主細胞によって好まれるコドンが選択され得、そして、天然に存在するヌクレオチド配列に置換されて、発現率および／または発現効率を増大する。所望のＴＳＶポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）のため、または、発現のための複製可能なベクターに挿入され得る。このポリペプチドは、当該分野で公知の方法に従う、任意の多数の発現系において、組換え的に発現され得る（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）。適切な宿主細胞としては、酵母、細菌、古細菌（ａｒｃｈｅｂａｃｔｅｒｉａ）、真菌、昆虫および動物細胞（哺乳動物（例えば、骨髄幹細胞（限定されない）を含む幹細胞を含む、原発細胞）を含む）が挙げられる。より詳細には、これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：組み換えバクテリオファージ、プラスミドまたはコスミドのＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌のような微生物、および、酵母発現ベクターで形質転換した酵母。組み換え昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞および哺乳動物発現系もまた、含まれる。発現されるべき核酸配列は、種々の手順によってベクターに挿入され得る。一般に、ＤＮＡは、当該分野で公知の技術を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入され得る。ベクター構成成分としては、一般に、１つ以上にシグナル配列、複製開始点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーターおよび転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらの構成成分の１つ以上を含む適切なベクターの構築は、当業者に公知の標準的連結技術を使用する。
【００２５】
本発明のＴＳＶポリペプチドは、タンパク質の発現を誘導または引き起こすのに適切な条件下で、ＴＳＶポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって、生成される。ＴＳＶポリペプチドの発現に適切な条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択を伴い変化し、そして、日常の実験を介して、当業者によって容易に確認される。例えば、発現ベクターにおける構成型プロモーターの使用は、宿主細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を最適化することを必要とするが、誘導型プロモーターの使用は、誘導のための適切な増殖条件を必要とする。さらに、いくつかの実施形態において、回収の時期が重要である。例えば、昆虫細胞発現で使用されるバキュロウイルス系は、溶解性ウイルスであり、従って、回収時間選択は、産物の収率に重要であり得る。
【００２６】
宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するため、または、所望の様式で発現されたタンパク質をプロセッシングするためのその能力について、選択され得る。タンパク質のこのような改変としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアクリル化が挙げられるが、これらに限定されない。翻訳後プロセッシング（これは、タンパク質の「プレプロ」形態を切断する）はまた、正確な挿入、フォールディングおよび／または機能に重要であり得る。例として、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、Ｗ１３８など）は、このような翻訳後活性について、特定の細胞機構および特徴的機構を有し、そして、正確な改変および導入された外来タンパク質のプロセッシングを保証するために選択され得る。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｖ細胞、Ｓａｃｃｈａｖｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｖｅｖｉｓｉａｅおよび他の酵母、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＳＦ９細胞、Ｃ１２９細胞、２９３細胞、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞およびＨｅＬａ細胞、繊維芽細胞、神経鞘腫細胞株、不死化哺乳動物骨髄様細胞株および不死化哺乳動物リンパ様細胞株、Ｊｕｋａｔ細胞、ヒト細胞および他の原発細胞が、特に目的である。
【００２７】
ＴＳＶポリペプチドをコードする核酸は、機能的に関連する別の核酸配列内に配置することによって、「作動可能に連結」されなければならない。例えば、シグナルペプチドまたは分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドについてＤＮＡに作動可能に連結される；プロモーターまたはエンハンサーは、この配列の転写をもたらす場合、コード配列に作動可能に連結される；あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置付けられる場合、コード配列に作動可能に連結される。一般に「作動可能に連結された」ＤＮＡ配列は、近接しており、そして、分泌リーダーの場合には、近接でかつリーディングフェーズ中にある。しかし、エンハンサーは、近接される必要はない。連結は、従来の制限部位でのライゲーションによって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーは、従来の実施に従って使用される。プロモーター配列は、構成型プロモーターか、または誘導型プロモーターのいずれかをコードする。このプロモーターは、天然に存在するプロモーターであるか、または、ハイブリッドプロモーターのいずれかであり得る。ハイブリッドプロモーター（これは、１つよりも多いプロモーターのエレメントを合わせる）はまた、当該分野で公知であり、そして、本発明において有用である。発現ベクターは、さらなるエレメントを含み得、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有し得、従って、２つの生物（例えば、発現のための哺乳動物または昆虫細胞において、ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物細胞において）において維持されることを可能にする。発現ベクターおよびクローニングベクターの両方は、これらのベクターが１つ以上の選択された宿主細胞で複製するのを可能にする核酸配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母およびウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製開始点は、大半のグラム陰性細菌に適しており、２：プラスミド起点は、酵母に適しており、そして、様々なウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶまたはＢＰＶ）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。さらに、組込み発現ベクターについて、発現ベクターは、宿主細胞ゲノムに対して相同である、少なくとも１つの配列、そして好ましくは、この発現構築物に隣接する２つの相同配列を含む。組込みベクターは、このベクター中への封入に適切な相同配列を選択することによって、宿主細胞における特定の遺伝子座に特異的であり得る。組み込みベクターについての構築は、当該分野で周知である。
【００２８】
好ましくは、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択を可能にするために、選択マーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は、当該分野で周知であり、そして使用される宿主細胞によって変化する。発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的に、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含む。代表的な選択遺伝子は、以下のタンパク質をコードする：（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠損を補完するタンパク質、または（ｃ）複合培地から利用できない必須栄養素を補充するタンパク質（例えば、ＢａｃｉｌｌｉについてのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【００２９】
前立腺腫瘍抗原をコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、発現および細胞培養物からのコードされたタンパク質の回収に適切な条件下で培養され得る。組み替え細胞によって産生されるタンパク質は、使用される配列および／またはベクターに依存して、分泌型であるか、膜結合型であるか、または細胞内に含まれ得る。当業者によって理解されるように、ＴＳＶポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞膜を介したＴＳＶポリペプチドの分泌を指向する、シグナル配列を有するように設計され得る。所望のＴＳＶポリペプチドは、直接的に産生され得るだけでなく、異種ポリペプチド（これは、シグナル配列または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端において特異的切断部位を有する他のポリペプチドであり得る）との融合ポリペプチドとして組み換え産生もされ得る。一般に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはこのベクターに挿入されるＴＳＶポリペプチドコードＤＮＡの一部であり得る。このシグナル配列は、例えば、以下からなる群より選択される、原核生物シグナル配列であり得る：アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダー。酵母分泌についてのシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのα因子リーダー（後者は、米国特許第５，０１０，１８２号に記載される）を含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日公開のＥＰ  ３６２，１７９）、あるいは１９９０年１１月１５日公開のＷＯ９０１１３６４６に記載されるシグナルであり得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列（例えば、同じ種または関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー）は、タンパク質の直接的分泌のために使用され得る。選択される発現系に従って、コード配列は、適切なベクターに挿入され、これは次に、特定の特徴的「制御エレメント」または「調節配列」の存在を必要とし得る。適切な構築物は、当該分野で一般に公知であり（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９０）、そして多くの場合、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．）またはＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）のような業者から入手可能である。
【００３０】
細菌系における発現。細菌細胞の形質転換は、誘導性プロモーター（例えば、「ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ」ファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）または「ｐＳＰＯＲＴ１」（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）のハイブリッドｌａｃＺプロモーター）を使用して達成され得る。さらに、多数の発現ベクターは、容易に検出および／または精製され得る切断可能な融合タンパク質を産生するために、細菌細胞における使用について選択され得、これには、「ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ」（α−ガラクトシダーゼ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）またはｐＧＥＸ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ；Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）が挙げられるが、これらに限定されない。適切な細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そしてＴＳＶポリペプチド遺伝子のコード配列のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る、任意の核酸配列である。細菌プロモーターは、コード配列の５’末端の近位に通常位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、代表的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を提供する。例としては、糖（例えば、ガラクトース、ラクトースおよびマルトース）代謝酵素由来のプロモーター配列、および（例えば、トリプトファンの）生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。バクテリオファージ由来のプロモーターもまた使用され得、そして当該分野で公知である。さらに、合成プロモーターおよびハイブリッドプロモーターもまた有用である；例えば、ｔａｔプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列およびｌａｃプロモーター配列のハイブリッドである。さらに、細菌プロモーターとしては、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして転写を開始する能力を有する、非細菌起源の天然に存在するプロモーターが挙げられ得る。効率のよいリボソーム結合部位もまた、所望される。発現ベクターはまた、細菌中の前立腺腫瘍抗原タンパク質の分泌を提供する、シグナルペプチド配列を含み得る。このシグナル配列は、代表的には、細胞からのタンパク質の分泌を指向する、疎水性アミノ酸から構成されるシグナルペプチドをコードし、当該分野で周知である。このタンパク質は、増殖培地（グラム陽性細菌）または細胞の内膜と外膜との間に位置する周辺腔（グラム陰性細菌）のいずれかに分泌される。細菌発現ベクターはまた、形質転換された細菌株の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含み得る。適切な選択遺伝子としては、薬物耐性遺伝子（例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシンおよびテトラサイクリン）が挙げられる。選択マーカーとしては、生合成遺伝子（例えば、ヒスチジン、トリプトファンおよびロイシン生合成経路における生合成遺伝子）もまた挙げられる。大量のＴＳＶポリペプチドが（例えば、抗体の誘導のために）必要な場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指向するベクターが、所望され得る。このようなベクターとしては、多機能のＥ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（ここで、前立腺腫瘍抗原コー��配列は、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよび引き続く７残基についての配列とインフレームでベクターに連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される）；ＰＩＮベクター［Ｖａｎ  ＨｅｅｋｅおよびＳｃｈｕｓｔｅｒ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：５５０３−５５０９  １９８９］；ＰＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）などが挙げられるが、これらに限定されない。細菌のための発現ベクターは、上記の種々の成分を含み、そして当該分野で周知である。例としては、とりわけ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｖｅｍｏｖｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓについてのベクターが挙げられる。細菌発現ベクターは、当該分野で周知の技術（例えば、塩化カルシウム媒介性のトランスフェクション、エレクトロポレーションなど）を使用して、細菌宿主細胞に形質転換される。
【００３１】
酵母における発現。酵母発現系は、当該分野で周知であり、そしてＳａｃｃｈａｖｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓおよびＣ．ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｖｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｖｏｍｙｃｅｓ  ｆｖａｇｉｌｉｓおよびＫ．ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｖｉｍｏｎｄｉｉおよびＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａ−ｖｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅならびにＹａｖｖｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａについての発現系が挙げられる。酵母宿主における使用に適切なプロモーターの例としては、以下が挙げられる：３−ホスホグリセレートキナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９８０）］または他の解糖酵素［Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：４９００（１９７８）］（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、α因子、ＡＤＨ２ＩＧＡＰＤＨプロモーター、グルコキナーゼアルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ）［例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９０；Ｇｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５３：５１６−５４４、（１９８７）を参照のこと］。増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する、他の酵母誘導性プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ならびにマルトース利用およびガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域が挙げられる。酵母発現における使用に適切なベクターおよびプロモーターは、さらに、ＥＰ  ７３，６５７に記載される。酵母選択マーカーとしては、ＡＤＥ２、ＨＩＳ４、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１およびＡＬＧ７（これは、ツニカマイシンに対する耐性を付与する）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（これは、Ｇ４１８に対する耐性を付与する）；およびＣＵＰ１遺伝子（これは、銅イオンの存在下での酵母の増殖を可能にする）、が挙げられる。酵母発現ベクターは、目的のＴＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡ由来のＴＳＶポリペプチドの細胞内産生または分泌のために構築され得る。例えば、分泌されたシグナルペプチドおよび適切な構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターは、ＴＳＶポリペプチドの直接的細胞内発現のために選択されたプラスミド中の適切な制限部位に挿入され得る。ＴＳＶポリペプチドの分泌のために、ＴＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＴＳＶポリペプチドの発現のために、プロモーターをコードするＤＮＡ、酵母α因子の分泌シグナル配列／リーダー配列およびリンカー配列（必要な場合）と共に、選択されたプラスミド中にクローニングされ得る。次いで、酵母細胞は、上記の発現プラスミドで形質転換され得、そして適切な発酵培地中で培養され得る。次いで、このような形質転換された酵母によって産生されるタンパク質は、１０％トリクロロ酢酸での沈殿によって濃縮され得、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離およびクマシーブルー染色によるゲルの染色によって分析され得る。組み換えＴＳＶポリペプチドは、続いて、当業者に公知の技術によって発酵培地から単離および精製され得る。
【００３２】
哺乳動物系における発現。ＴＳＶポリペプチドは、哺乳動物細胞において発現され得る。哺乳動物発現系は、当該分野で公知であり、そしてレトロウイルスベクター媒介性の発現系を含む。哺乳動物宿主細胞は、多数の異なるウイルスベースの発現系（例えば、アデノウイルス）のいずれかによって形質転換され得、ここで、コード領域は、後期プロモーターおよび３部（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体中に連結され得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１領域またはＥ３領域における挿入は、感染宿主細胞において目的のポリペプチドを発現し得る生存ウイルスを生じる。好ましい発現ベクター系は、ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０１９およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１０１０４８に一般に記載されるようなレトロウイルスベクター系である。適切な哺乳動物発現ベクターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼに結合し得、そしてＴＳＶポリペプチドのコード配列のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始し得る任意のＤＮＡ配列である、哺乳動物プロモーターを含む。プロモーターは、転写開始領域（これは、通常、コード配列の５’末端の近位に位置する）およびＴＡＴＡボックス（通常（ｕｓｉｎｇ）、転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に位置する）を有する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに、正確な部位でＲＮＡ合成を開始させると考えられている。哺乳動物プロモーターはまた、代表的にはＴＡＴＡボックスの１００〜２００塩基対上流に位置する、上流のプロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）を含む。上流のプロモーターエレメントは、転写が開始される割合を決定し、そしていずれの方向でも作用し得る。哺乳動物プロモーターとして特に使用されるものは、哺乳動物ウイルス遺伝子由来のプロモーターである。なぜなら、このウイルス遺伝子は、しばしば高度に発現され、そして広い宿主範囲を有するからである。例としては、ウイルスゲノム（例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日に公開されたＵＫ  ２，２１１，５０４）、アデノウイルス（例えば、２型アデノウイルス）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）から得られたプロモーター、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）から得られたプロモーター、ならびにヒートショックプロモーターから得られたプロモーターが挙げられるが、但し、このようなプロモーターは、宿主細胞系と適合性である。高等真核生物による、ＴＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増加され得る。エンハンサーは、通常約１０〜３００ｂｐのシスに作用するＤＮＡエレメントであり、これは、プロモーターに作用して、転写を増加させる。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が、現在公知である。しかし、代表的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモ��ターエンハンサー、複製起点の後ろ側のポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、好ましくは、プロモーターの５’側に位置する。一般に、哺乳動物細胞によって認識される転写終結配列およびポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’側に位置する調節領域であり、従って、プロモーターエレメントと一緒に、コード領域に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的翻訳後切断およびポリアデニル化によって形成される。転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルの例としては、ＳＶ４０由来の転写ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルが挙げられる。長期の高収率の組み換えタンパク質産生は、安定な発現系においてもたらされ得る。ウイルス複製起点または内因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターは、この目的のために使用され得る。哺乳動物細胞における使用のための選択マーカーを含む適切なベクターは、商業的に容易に入手可能であり、そして当業者に公知である。このような選択マーカーの例としては、それぞれ、ｔｋ細胞またはｈｐｒｔ細胞での使用のための、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼおよびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。外因性核酸を哺乳動物宿主および他の宿主に導入する方法は、当該分野で周知であり、そして使用される宿主細胞によって変化する。技術としては、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、ウイルス感染、リポソーム中のポリヌクレオチドのカプセル化、および核へのＤＮＡの直接的マイクロインジェクションが挙げられる。
【００３３】
昆虫細胞における発現。ＴＳＶポリペプチドはまた、昆虫細胞においても産生され得る。昆虫細胞の形質転換のための発現ベクター、および特にバキュロウイルスベースの発現ベクターは、当該分野で周知である。１つのこのような系において、ＴＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡは、バキュロウイルス発現ベクター内に含まれるエピトープタグの上流に融合される。Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｖｎｉｃａの核多面体病（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ）ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｖｕ  ｆｍｇｉｐｅｖｄｕ  Ｓｆ９細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫において外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用される。ＴＳＶポリペプチドをコードする配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎｅ）遺伝子）中にクローニングされ、そしてポリヘドリンプロモーターの制御下に配置される。ＴＳＶポリペプチドをコードする配列の首尾よい挿入は、このポリヘドリン遺伝子を不活性にし、そしてコートタンパク質の被膜を欠く組み換えウイルスを生じる。次いで、この組み換えウイルスを使用して、ＴＳＶポリペプチドが発現されるＳ．ｆｍｇｉｐｅｖｄｕ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫を感染させる［Ｓｍｉｔｈら、Ｊ．Ｗｏｌ．４６：５８４（１９９４）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ  Ｅ  Ｋら、Ｐｖｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７（１９９４）］。ＴＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡとの融合に適切なエピトープタグとしては、ポリｈｉｓタグおよび免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域のような）が挙げられる。ｐＶＬ１３９３（Ｎｏｖａｇｅｎ）のような市販のプラスミドを含む種々のプラスミドが使用され得る。簡潔には、ＴＳＶポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＴＳＶポリペプチドの所望の部分をコードするＤＮＡが、５’領域および３’領域に相補的なプライマーを用いてＰＣＲによって増幅される。５’プライマーは、隣接する制限部位を組み込み得る。次いで、ＰＣＲ産物は、選択された制限酵素によって消化され、そして発現ベクター中にサブクローニングされる。組み換えバキュロウイルスは、リポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬから市販される）または当業者に公知の他の方法を使用して、上記のプラスミドおよびＢａｃｕｌｏＧｏｌｄＴＭウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｖａ  ｆｖｕｇｉｐｅｖｄａ（「Ｓｆ９」）細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）中に同時トランスフェクトすることによって作製され得る。ウイルスは、Ｓｆ９細胞中にて、２８℃で４〜５日間の培養によって産生され、そしてさらなる増幅のために使用される。手順は、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｅｙら、ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）においてさらに記載されるように実施される。抽出物は、Ｒｕｐｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：１７５−１７９（１９９３）において記載されるように、組み換えウイルスに感染したＳｆ９細胞から調製され得る。あるいは、発現されたエピトープタグ化ＴＳＶポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーによって精製され得るか、または例えば、ＩｇＧタグ化（またはＦｃタグ化）ＴＳＶポリペプチドの精製は、クロマトグラフィー技術（プロテインＡカラムクロマトグラフィーまたはプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む）を使用して実施され得る。
【００３４】
遺伝子発現の評価。遺伝子発現は、例えば、当業者に公知の標準的な技術（例えば、本明細書中に提供される配列に基づく適切に標識されたプローブを使用して、ＤＮＡ検出についてのサザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を決定するためのノーザンブロッティング、ドットブロッティング（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、またはインサイチュハイブリダイゼーション）によって、サンプルにおいて直接的に評価され得る。あるいは、抗体は、特定の二重鎖（ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖またはＤＮＡ−タンパク質二重鎖を含む）のような核酸の検出のためのアッセイにおいて使用され得る。このような抗体は標識され得、そしてアッセイは、この二重鎖が表面に結合した場合に実行され、その結果、表面上での二重鎖の形成の際に、二重鎖に結合した抗体の存在が検出され得る。あるいは、遺伝子発現は、ＴＳＶポリペプチドの発現を直接的に評価するために、細胞または組織切片の免疫組織化学染色および細胞培養物または体液のアッセイによって測定され得る。このような免疫学的アッセイに有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得、そして本明細書中に提供されるＤＮＡ配列に基づくネイティブ配列のＴＳＶポリペプチドに対して調製され得る。
【００３５】
発現されたタンパク質の精製。発現されたＴＳＶポリペプチドは、当業者に公知の種々の方法のいずれかを使用して発現後に精製または単離され得る。適切な技術は、サンプル中に存在する他の成分が何かに依存して変化する。単離または精製によって除去される混入成分は、ポリペプチドについての診断用途または治療用途を代表的には妨害する物質であり、そして、酵素、ホルモンおよび他の溶質を含み得る。選択される精製工程は、例えば、使用される産生プロセスの性質および産生される特定のＴＳＶポリペプチドに依存する。ＴＳＶポリペプチドまたはタンパク質は、培養培地または宿主細胞溶解物から除去され得る。膜結合型の場合、これは、適切な界面活性剤溶液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００）を使用して、または酵素切断によって、膜から放出され得る。あるいは、ＴＳＶポリペプチドの発現に使用される細胞は、種々の物理的手段または化学的手段（例えば、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊）、あるいは細胞溶解薬剤の使用によって、破壊され得る。例示的な精製方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：イオン交換カラムクロマトグラフィー；シリカゲルまたはカチオン交換樹脂（例えば、ＤＥＡＥ）を使用するクロマトグラフィー；例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用するゲル濾過；ＩｇＧのような混入物を除去するためのプロテインＡ  セファロースカラム；ＴＳＶポリペプチドのエピトープタグ化形態を結合するために金属キレートカラムを使用するクロマトグラフィー；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；および硫酸アンモニウム沈殿。通常、単離されたＴＳＶポリペプチドは、少なくとも１回の精製工程によって調製される。例えば、ＴＳＶポリペプチドは、標準的な抗ＴＳＶポリペプチド抗体カラムを使用して精製され得る。限外濾過技術および透析技術はまた、タンパク質濃縮と組み合わせて、有用である（例えば、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８２を参照のこと）。必要な精製の程度は、ＴＳＶポリペプチドの用途に依存して変化する。いくつかの場合には、精製工程は必要ない。一旦、発現され、そして必要に応じて精製されると、本発明のＴＳＶポリペプチドおよび核酸は、以下に詳述するように、多数の適用において有用である。
【００３６】
発現されたタンパク質の標識。本発明の核酸、タンパク質および抗体は、標識され得る。本明細書中において、標識されるとは、化合物が、この化合物の検出を可能にするように結合した、少なくとも１つのエレメント、同位体または化学化合物を有することを意味する。一般に、標識は、以下の３つのクラスに入る：ａ）同位体標識（これは、放射性同位体または重同位体であり得る）；ｂ）免疫標識（これは、抗体または抗原であり得る）；およびｃ）着色色素または蛍光色素。これらの標識は、検出される化合物の生物学的活性も特徴も妨害しない任意の位置で、この化合物に取り込まれ得る。
【００３７】
ＴＳＶポリペプチド融合タンパク質。本発明のＴＳＶポリペプチドはまた、別の異種ポリペプチド配列または異種アミノ酸配列に融合したＴＳＶポリペプチドを含むキメラ分子を形成するような方法で、改変され得る。用語「融合タンパク質」は、本明細書中で使用する場合、「標的化ポリペプチド」に融合したＴＳＶポリペプチドまたはそのドメイン配列を含むキメラポリペプチドをいう。この標的化ポリペプチドは、特定の細胞型またはレセプターの標的化を促進するのに十分な残基を有するが、ＴＳＶポリペプチドの生物学機能を妨害しないように十分短い。標的化ポリペプチドはまた、好ましくは、全く独自であり、その結果、この融合タンパク質は、他の細胞型またはレセプターと実質的に交差反応しない。適切な標的化ポリペプチドは、一般に、少なくとも約１０アミノ酸残基、そして通常は、約１０アミノ酸残基〜約５００アミノ酸残基の間を有する。好ましい標的化ポリペプチドは、約２０アミノ酸残基〜約２００アミノ酸残基を有する。この融合タンパク質はまた、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとのＴＳＶポリペプチドの融合物を含み得る。エピトープタグは、一般に、ＴＳＶポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端に配置される。ＴＳＶポリペプチドのこのようなエピトープタグ化形態は、このタグポリペプチドに対する抗体を使用して検出され得る。また、エピトープタグの提供は、ＴＳＶポリペプチドが、抗タグ抗体またはエピトープタグに結合するアフィニティーマトリックスの別の型を使用することによって容易に精製されることを可能にする。あるいは、この融合タンパク質は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの特定の領域とのＴＳＶポリペプチドの融合物を含み得る。キメラ分子の二価形態について、このような融合物は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域または例えば、ＧＭ−ＣＳＦへの融合物であり得る。好ましい融合タンパク質としては、ＴＳＶポリペプチドの免疫標的化を容易にする分子が挙げられるが、これに限定されない。ＴＳＶポリペプチド融合タンパク質は、当該分野で周知の技術を使用して、種々の他の目的のために作製され得る。例えば、抗体の作製について、所望のエピトープが小さい場合、部分的ＴＳＶポリペプチドまたは完全ＴＳＶポリペプチドは、キャリアタンパク質と融合して、免疫原を形成し得る。あるいは、ＴＳＶポリペプチドは、細胞性免疫応答および／もしくは体液性（抗体ベースの）免疫応答を刺激する抗原の能力を増大するため、または他の理由のために、融合タンパク質として作製され得る。
【００３８】
ＴＳＶポリペプチドの合成遺伝子。一旦、核酸配列情報および／またはアミノ酸配列情報が、ネイティブのタンパク質について利用可能になると、種々の技術が、ネイティブ配列中に実質的に任意の変異を作製するために利用可能となる（例えば、Ｓｈｏｒｔｌｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２２９，ｐｇｓ．１１９３−１２０１（１９８５）；ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．１００、ｐｇｓ．４６８−５００（１９８３）；Ｍａｒｋら、米国特許第４，５１８，５８４号；Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．３４、ｐｇｓ．３１５−３２３（１９８５）；Ｅｓｔｅｌｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ．２３３、ｐｇｓ．６５９−６６３（１９８６）；Ｍｕｌｌｅｎｂａｃｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６１、ｐｇｓ．７１９−７２２（１９８６）；およびＦｅｒｅｔｔｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｖｏｌ．８３、ｐｇｓ．５９７−６０３（１９８６））。従って、これらの参考文献は、参照として援用される。
【００３９】
天然ポリペプチドの改変体（しばしば、「ムテイン」と称される）は、種々の状況において所望され得る。例えば、所望でない副作用は、特に、この副作用活性が所望の活性の部分とは異なるポリペプチドの部分と関連する場合に、特定の改変体によって低減され得る。いくつかの発現系において、ネイティブポリペプチドは、プロテアーゼによる分解に感受性であり得る。このような場合、感受性配列を変化させるアミノ酸の選択された置換および／または欠失は、収率を有意に増強し得る（例えば、英国特許出願２１７３−８０４−Ａにおいて、ヒト組織プラスミノゲンアクチベータの２７５位のＡｒｇは、ＧｌｙまたはＧｌｕによって置換される）。改変体はまた、精製手順における収率を増加させ得、そして／あるいは、酸化、アシル化、アルキル化または他の化学的改変に対して感受性のアミノ酸を排除することによって、タンパク質の保存期間を増加させ得る。例えば、メチオニンは、容易に酸化されてスルホキシドを形成し、これは、多くのタンパク質において生物学的活性の喪失に関連する（例えば、ＢｒｏｔおよびＷｅｉｓｓｂａｃｈ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、Ｖｏｌ．２２３、ｐｇ．２７１（１９８３））。メチオニンは、しばしば、生物学的活性の喪失をほとんど有さないかまたは全く有さずに、より不活性なアミノ酸によって置換され得る（例えば、オーストラリア国特許出願ＡＵ−Ａ−５２４５１／８６）。細菌発現系において、収率は、コンフォメーション的に重要でないシステイン残基を排除または置換することによって、しばしば増加され得る（例えば、Ｍａｒｋら、米国特許第４，５１８，５８４号）。
【００４０】
好ましいカセット変異誘発は、変異タンパク質を生成するために使用される。合成遺伝子は、（適切なベクターに挿入される場合）遺伝子におよそ均一に沿って間隔をあけられた独特の制限エンドヌクレアーゼ部位の配列を用いて構築される。この独特の制限部位は、この遺伝子のセグメントが、所望の変異体をコードする合成オリゴヌクレオチド（すなわち「カセット」）で、都合よく切断および置換されるのを可能にする。独特の制限部位の数および分布の決定は、以下を含むいくつかの因子の考慮を必然的に伴う：（１）発現で使用されるべきベクター中の既存の制限部位、（２）種特異的または属特異的なコドン使用頻度が所望されるか否か、（３）利用可能な異なる非ベクター切断制限エンドヌクレアーゼの数（および合成遺伝子内のそれらの多重度）、ならびに（４）独特の制限部位間のセグメントの合成および／または配列決定の便宜および信頼性。
【００４１】
上記の技術は、ネイティブタンパク質配列において保存的アミノ酸置換などをもたらす便利のよい方法である。本明細書中で使用される場合、「保存的」は、以下を意味する：（ｉ）変更が、立体配置的にできるだけ中立的である（すなわち、ネイティブタンパク質と比較して、変異ポリペプチドの三次構造において最小の変化を生成するように設計される）、ならびに（ｉｉ）変更が、抗原性的にできるだけ中立的である（すなわち、ネイティブタンパク質と比較して、変異ポリペプチドの抗原決定基において最小の変化を生成するように設計される）。以下は、アミノ酸を類似性クラスに好ましく分類したものである：芳香族（ｐｈｅ、ｔｒｐ、ｔｙｒ）、疎水性（ｌｅｕ、ｉｌｅ、ｖａｌ）、極性（ｇｌｎ、ａｓｎ）、塩基性（ａｒｇ、ｌｙｓ、ｈｉｓ）、酸性（ａｓｐ、ｇｌｕ）、低分子（ａｌａ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ｍｅｔ、ｇｌｙ）。立体構造的な中立性が、生物学的活性を保存するのに所望され、そして、抗原的な中立性が、本発明の化合物で処置される患者または動物における免疫原性応答の誘発を回避するために所望される。代替物が立体構造的にかつ抗原的に中立性であるという絶対的確実性を伴って選択することは困難であるが、当業者が、立体構造的にかつ抗原的に中立性である高い確率を有する変更物を作製するように仕向け得るルールが存在する（例えば、Ａｎｆｉｓｅｎ（上記引用）；Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２２９，９３２−９４０頁（１９８５）；および、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｉｃｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２４７，１３０６−１３１０頁（１９９０））。より重要なルールのいくつかとしては、以下が挙げられる：（１）疎水性残基の置換は、抗原性の変化を生じる可能性が低い。なぜならば、これらは、タンパク質の内部に局在しそうであるからである（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ（上記引用）およびＢｏｗｉｅら（上記引用））；（２）生理化学的に類似（すなわち同義）の残基の置換は、立体構造的な変化を生じる可能性が低い。なぜならば、この置換アミノ酸は、置換されたアミノ酸と同じ構造的役割を担い得るからである；ならびに（３）進化的に保存された配列の変更は、有害な立体構造的効果を生成しそうである。なぜならば、進化的保存は、配列が機能的に重要であり得ることを示唆するからである。バリアント配列を選択するためのこのような基本的ルールに加えて、操作された分子の生物学的活性および立体構造を確認するためのアッセイが利用可能である。本発明のポリペプチドについての生物学的アッセイは、引用された参考文献中により完全に記載される。立体構造の変化は、少なくとも以下の２つの周知のアッセイによって試験され得る：微量補体（ｍｉｃｒｏｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）結合法（例えば、Ｗａｓｓｅｒｍａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌ．８７、２９０−２９５頁（１９６１）またはＬｅｖｉｎｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１１，９２８−９３６頁（１９６７）（タンパク質の三次構造の進化研究において広範に使用される））；および立体構造特異的モノクローナル抗体のセットへの親和性（例えば、Ｌｅｗｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２２、９４８−９５４頁（１９８３��）。
【００４２】
（ＴＳＶポリペプチドの化学的製造）
本発明のペプチドは、標準的技術（例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，１９８４））によって合成される。好ましくは、市販のペプチド合成器が使用され（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）モデル４３０Ａ）、そして、本発明のポリペプチドは、集中的（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）合成アプローチにおいて、複数の別個に合成および精製されたペプチドから構築され得る（例えば、Ｋｅｎｔら、米国特許第６，１８４，３４４号ならびにＤａｗｓｏｎおよびＫｅｎｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９：９２３−９６０（２０００））。本発明のペプチドは、カルボキシル末端残基から開始して、全ペプチドが形成されるまで段階的な様式でアミノ酸を添加する架橋化ポリスチレン支持体上の固相合成によって、構築される。以下の参考文献は、合成中に使用される化学物質のためのガイドである：Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．８５、２１４９頁（１９６３）；Ｋｅｎｔら、１８５頁、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １９８４、Ｒａｇｎａｒｓｓｏｎ編（ＡｌｍｑｕｉｓｔおよびＷｅｋｓｅｌｌ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，１９８４）；Ｋｅｎｔら、２１７頁、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８４，Ｉｚｕｍｉｙａ編（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｈ．Ｏｓａｋａ，１９８５）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２３２、３４１−３４７頁（１９８６）；Ｋｅｎｔ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．５７，９５７−９８９頁（１９８８）、ならびに、これらの後者の２つの参考文献中に引用される参考文献。
【００４３】
固体状態の合成において、副生産物の合成を除外することが最も重要であり、この副生産物は、主に、終結ペプチド、欠失ペプチドまたは改変ペプチドである。大半の副反応は、洗浄、良く特徴付けられた樹脂、清浄アミノ酸誘導体、清浄溶媒の使用、ならびに、適切なカップリングおよび切断の方法および反応条件の選択によって、除外または最小化され得る（例えば、ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｃｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編、Ｖｏｌ．２、１−２８４頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９））。１つ以上の残基を失っている欠失ペプチドを避けるようにカップリング反応が完了へと進行していることを決定するために、このカップリング反応をモニターすることが重要である。定量的ニンヒドリン反応は、この目的のために有用である（Ｓａｒｉｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．１１７、１４７頁（１９８１））。Ｎａ−ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）−アミノ酸は、鎖構築の条件に安定であるが強酸に不安定な、適切な側鎖保護基と共に使用される。保護化ペプチド鎖の構築後、この保護基は、除去され、そして、このペプチド固定結合（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｂｏｎｄ）は、チオエステルスカベンジャーの存在下で、低濃度次いで高濃度の無水フッ化水素を使用することによって切断される（Ｔａｍら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｖｏｌ．１０５、６４４２頁（１９８３））。使用される側鎖保護基は、Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）、Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）、Ａｒｇ（ＮＧＴＯＳ）、Ｃｙｓ（４−ＭｅＢｚｌ）およびＨｉｓ（ＩｍＤＮＰ）（Ｂｚｌ、ベンジル；Ｔｏｓ、トルエンスルホキシル；ＤＮＰ、ジニトロフェニル；Ｉｍ、イミダゾール；Ｚ、ベンジルオキシカルボニル（ｂｅｎｚｙｌｏｘｇｙｃａｒｂｏｎｙｌ））。残存するアミノ酸は、側鎖保護基を有していない。各サイクルについて、ｔＢｏｃ  Ｎａ保護化ペプチド−樹脂は、Ｎａ保護基を除去するために、最初に１分間、次いで、１３分間、ジクロロメタン（ＤＣＭ）（Ｍａｌｌｅｎｃｋｒｏｄｔ）中で６５％のトリフルオロ酢酸（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋから）（使用する前に希釈する）に曝露される。このペプチド−樹脂は、ＤＣＭ中で洗浄され、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中の１０％  ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、２回（各１分間）中和される。中和後、ＤＭＦで洗浄する。カップリングは、ＤＭＦ中のアミノ酸の対称無水物を用いて、１６分間実施される。この対称無水物は、６ｍｌのＤＣＭ中に２ｍｍｏｌのアミノ酸を溶解して、そして、２ｍｌのＤＣＭ中に１ｍｍｏｌのジシクロヘキシルカルボジイミド（ｄｉｃｙｃｌｏｈｅｘｙｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加することによって、合成器で調製される。５分後、この活性化アミノ酸は、別個の容器に移され、そして、ＤＣＭは、窒素ガスの連続気流を用いてパージすることによって、エバポレートされる。このＤＣＭは、パージの間の種々の段階にて、ＤＭＦ（合計６ｍｌ）���よって置換される。１回目のカップリング後、ペプチド−樹脂は、ＤＣＭ、ＤＣＭ中の１０％のＤＩＥＡ、次いでＤＣＭを用いて洗浄される。リカップリング（ｒｅｃｏｕｐｌｉｎｇ）のために、同じアミノ酸および活性化剤（ジシクロへキシルカルボジイミド）を、反応容器に経時的に移した。インサイチュでの活性化および１０分間のカップリングの後、十分なＤＭＦを添加して、５０％のＤＭＦ−ＤＣＭ混合物を作製して、そして、このカップリングを、１５分間続ける。アルギニンンは、６０分間、ＤＭＦ中でヒドロキシベンゾトリアゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ）エステルとしてカップリングされ、次いで、同じ様式で、他のアミノ酸にリカップリングされる。アスパラギンおよびグルタミンは、ＤＭＦ中でヒドロキシベンゾトリアゾールエステルとして、２回（各々のカップリングについて４０分）カップリングされる。全ての残基について、この樹脂は、２回目のカップリングの後洗浄され、そして、サンプルは、定量的ニンヒドリン反応によって残渣非カップリングα−アミンを測定するために、自動的に採取される（Ｓａｒｉｎら（上記引用））。
【００４４】
（抗ＴＳＶポリペプチド抗体）
本発明はさらに、抗ＴＳＶポリペプチド抗体を提供する。本発明の抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、二重特異的抗体、およびヘテロ結合体化（ｈｅｔｅｒｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）抗体が挙げられる。
【００４５】
ポリクローナル抗体。本発明の抗ＴＳＶポリペプチド抗体は、ポリクローナル抗体であり得る。ポリクローナル抗体を調製する方法は、当業者に公知である。このようなポリクローナル抗体は、例えば、免疫化剤（好ましくはアジュバント）の１回以上の注射後に、哺乳動物中で生成され得る。代表的に、この免疫化剤および／またはアジュバントは、一連の皮下注射または腹腔内注射によって哺乳動物に注入される。この免疫化剤としては、ＴＳＶポリペプチドまたはこの融合タンパク質が挙げられ得る。免疫される哺乳動物中で免疫原性であることが公知のタンパク質に抗原を結合体化することは、有用であり得る。このような免疫原性タンパク質の例としては、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシチログロブリンおよび大豆トリプシンインヒビターが挙げられるが、これらに限定されない。アジュバントとしては、例えばＦｒｅｕｎｄ完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリルリピドＡ、合成トレハロースジコリノ−ミコレート（ｄｉｃｏｒｙｎｏ−ｍｙｃｏｌａｔｅ））が挙げられる。免疫化プロトコルは、標準的プロトコルに基づいて当業者によってか、または、慣用的実験によって、決定され得る。
【００４６】
モノクローナル抗体。あるいは、抗ＴＳＶ−ポリペプチド抗体は、モノクローナル抗体であり得る。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマによって生成され得、ここで、マウス、ハムスターまたは他の適切な宿主動物が、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するか、または生成し得るリンパ球を誘発するために、この免疫化剤を用いて免疫化される［ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）］。あるいは、このリンパ球は、インビトロで免疫化され得る。この免疫化剤としては、代表的に、ＴＳＶポリペプチドまたはこの融合タンパク質が挙げられる。一般に、脾臓細胞およびリンパ節細胞が、非ヒト哺乳動物供給源が所望される場合使用され、または、ヒト由来の細胞が所望される場合は、末梢血液リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用される。このリンパ球は、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞を生成する［Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、５９−１０３頁（１９８６）］。一般に、不死化細胞株は、形質転換された哺乳動物細胞（例えば、ラット、マウス、ウシまたはヒト由来の骨髄腫細胞）である。このハイブリドーマ細胞は、非融合の不死化細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を好ましく含む、適切な培養培地中で培養される。例えば、親細胞が、酵素ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠如する場合、ハイブリドーマのための培養培地は、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン（ＨＡＴ）を含み、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を防止する。好ましい不死化細胞株は、効率的に融合して、抗体の安定な高レベルの生成を支持して、そして、ＨＡＴ培地のような培地に感応性である細胞株である。より好ましい不死化細胞株は、マウスおよびヒトの骨髄腫細胞株であり、これらは、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤから得られ得る。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の生成について記載されている［Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｚｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，５１−６３頁（１９８７）］。
【００４７】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地（上清）は、ＴＳＶポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。好ましくは、そのハイブリドーマ上清中に存在するモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降により、またはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））により決定される。適切な技術およびアッセイは、当該分野で公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、ＭｕｎｓｏｎおよびＰｏｌｌａｒｄ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析により決定され得る。所望の抗体生成ハイブリドーマ細胞が同定された後、その細胞を限界希釈手順によりクローニングし得、標準的な方法［Ｇｏｄｉｎｇ，１９８６］により増殖させ得る。この目的に適切な培養培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地およびＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。あるいは、そのハイブリドーマ細胞は、哺乳動物中で腹水としてインビボにて増殖され得る。選択されたクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、当業者により慣用的に使用される免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシル−アパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティークロマトグラフィー）により、培養培地または腹水から単離または精製され得る。
【００４８】
そのモノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号に記載の方法のような組換えＤＮＡ法により作製され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、ＴＳＶポリペプチド特異的ハイブリドーマ細胞から単離され得、そして例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用して、配列決定され得る。一旦単離されると、そのＤＮＡは、発現ベクターに挿入され得、次いで、この発現ベクターは、宿主細胞（例えば、サルのＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他の方法でなければ免疫グロブリンタンパク質を精製しない骨髄腫細胞）へとトランスフェクトされて、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得る。そのＤＮＡはまた、例えば、ヒト重鎖もしくは軽鎖の定常ドメインのコード配列を、相同なマウス配列と置換することにより［Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−６８５５（１９８４）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８（１９８４）；Ｔａｋｅｄａら，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４（１９８５）］、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合することにより、改変され得る。非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインと置換され得るか、または本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換されて、キメラ二価抗体を生成し得る。その抗体はまた、一価の抗体であり得る。一価の抗体を調製するための方法は、当該分野で周知である。例えば、インビトロ方法が、一価の抗体を調製するために適切である。抗体を消化して、そのフラグメント（特に、Ｆａｂフラグメント）を生成することは、当該分野で公知の慣用的な技術を使用して達成され得る。
【００４９】
本発明のハイブリドーマに特徴的な抗体および抗体フラグメントはまた、メッセンジャーＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡライブラリーを構築し、抗体分子のセグメントをコードするクローンを選択することによる組換え手段により生成され得る（例えば、Ｗａｌｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第５巻、３１１３−３１２８頁（１９７８）；Ｚａｋｕｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第８巻、３５９１−３６０１頁（１９８０）；Ｃａｂｉｌｌｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８１巻、３２７３−３２７７頁（１９８４）；Ｂｏｓｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第１２巻、３７９１−３８０６頁（１９８４）；Ａｍｓｔｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第８巻、２０５５−２０６５頁（１９８０）；Ｍｏｏｒｅら、米国特許第４，６４２，３３４号；Ｓｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４０巻、１０３８−１０４１頁（１９８８）；およびＨｕｓｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２４６巻、１２７５−１２８１頁（１９８９））。特に、このような技術は、種間モノクローナル抗体を生成するために使用され得る。ここで、１つの種の結合領域が、別の種の抗体の非結合領域と組み合わされて、免疫原性が低減される（例えば、Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，第８４巻、３４３９−３４４３頁（１９８７））。
【００５０】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングされ得る。他の固相イムノアッセイと同様に、試験は、高分子がプラスチックへ非特異的に吸着する傾向に基づく。この反応の不可逆性は、免疫学的活性を喪失することなく、抗原−抗体複合体形成と、そのような複合体の非結合物質からの簡単な分離を可能にする。抗ペプチド血清を力価測定するために、免疫に使用されるものとは異なるキャリアに結合体化されたペプチドが９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルに吸着される。次いで、吸着された抗原を、抗ペプチド血清の希釈物とウェル中で反応させる。非結合抗体を、洗い出し、残りの抗原−抗体複合体を、免疫される動物のＩｇＧに特異的な抗体と反応させる。この二次抗体を、アルカリホスファターゼのような酵素に結合体化させる。酵素基質が添加されたときに生成された目に見える呈色反応産物は、どのウェルが抗ペプチド抗体を結合したかを示す。分光光度計の読み取りを使用することにより、結合したペプチド特異的抗体の量のより良好な定量が可能になる。高力価抗血清は、１０−３〜１０−５の希釈の間で線形力価曲線を生じる。
【００５１】
ＴＳＶペプチド抗体。本発明は、ＴＳＶポリペプチドに由来するペプチド、およびキャリアと本発明のペプチドとの間の結合体を含む免疫原を包含する。本明細書中で使用される場合、用語、免疫原とは、免疫応答を引き起こし得る基質をいう。本明細書中で使用される場合、用語、キャリアとは、本発明のペプチドに化学的に結合体化された場合に、得られた結合体で免疫した宿主生物が、結合体化されたペプチドに特異的な抗体を生成することを可能にする任意の基質をいう。キャリアとしては、赤血球、バクテリオファージ、タンパク質、またはアガロースビーズのような合成粒子が挙げられる。好ましくは、キャリアは、血清アルブミン、γ−グロブリン、キーホールリンペットヘモシアニン、チログロブリン、オボアルブミン、フィブリノゲンなどのようなタンパク質である。
【００５２】
キャリアに合成ペプチドを連結する一般的技術は、いくつかの参考文献に記載されている：例えば、ＷａｌｔｅｒおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」Ｓｅｔｌｏｗら編、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第５巻、６１−９１頁（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．，１９８３）；Ｇｒｅｅｎら、Ｃｅｌｌ、第２８巻、４７７−４８７頁（１９８２）；Ｌｅｒｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第７８巻、３４０３−３４０７頁（１９８１）；Ｓｈｉｍｉｚｕら、米国特許第４，４７４，７５４号；ならびにＧａｎｆｉｅｌｄら、米国特許第４，３１１，６３９号。従って、これらの参考文献は、本明細書中に参考として援用される。また、キャリアにハプテンを連結するために使用される技術は、上記の技術と本質的に同じである（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｕ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８５）における第２０章）。ペプチドをキャリアに結合するための４つの最も一般的に使用されるスキームは、（１）アミノカップリングのためのグルタルアルデヒド（例えば、ＪａｆｆｅおよびＢｅｈｒｍａｎ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，３２８−３２９頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９７９）においてＫａｇａｎおよびＧｌｉｃｋにより、ならびにＷａｌｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，第７７巻、５１９７−５２００頁（１９８０）により開示される）；（２）カルボキシルをアミノへカップリングするための水溶性カルボジイミド（例えば、Ｈｏａｒｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，第２４２巻，２４４７−２４５３頁（１９６７）により開示される）；（３）チロシンをチロシン側鎖にカップリングするためのビス−ジアゾベンジジン（ＤＢＤ）（例えば、ＪａｆｆｅおよびＢｅｈｒｍａｎ編（上記）においてＢａｓｓｉｒｉら，４６−４７頁およびＷａｌｔｅｒら（上記）により開示される）；および（４）システイン（または他のスルフヒドリル）をアミノ基にカップリングするためのマレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）（例えば、Ｋｉｔａｇａｗａら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ），第７９巻，２３３−２３９頁（１９７６）、およびＬｅｒｎｅｒら（上記）により開示される）。所定のペプチドをタンパク質キャリアにカップリングするための適切な方法を選択するための一般的規則は、以下のように述べられ得る：結合に関与する基は、配列中に、好ましくは、セグメントの適切な末端において一回だけ生じなければならない。例えば、ＢＤＢは、チロシン残基が、その潜在的に抗原性特徴について選択された配列の主要な部分に存在する場合には用いてはならない。同様に、中心に位置するリジンは、グルタルアルデヒド法から除外せねばならず、アスパラギン酸およびグルタミン酸の存在により、頻繁に、カルボジイミドアプローチが排除される。一方、適切な残基は、「ネイティブ」タンパク質配列中に存在しようがしまいが、結合部位として選択された配列セ���メントのいずれかの末端に配置され得る。内部セグメントは、アミノ末端およびカルボキシ末端とは異なり、ポリペプチド骨格が連続するネイティブタンパク質中に見いだされる同じ配列からの「非結合末端」にて大きく異なる。問題は、α−アミノ基をアセチル化し、次いで、そのペプチドをそのカルボキシ末端を通じて結合することにより、ある程度まで改善され得る。キャリアタンパク質へのカップリング効率は、合成の１工程につき放射活性アミノ酸を使用するかまたはチロシン残基のヨウ素化により完成したペプチドを標識するかのいずれかにより調製した、放射活性標識したペプチドを使用することで、都合よく測定される。ペプチド中にチロシンが存在することはまた、所望であれば、感度の高いラジオイムノアッセイを設定することを可能にする。従って、チロシンは、ネイティブポリペプチドにより規定されるペプチド配列の一部でない場合、末端残基として導入され得る。
【００５３】
好ましいキャリアは、タンパク質であり、好ましいタンパク質キャリアとしては、ウシ血清アルブミン、ミオグロブリン、オボアルブミン（ＯＶＡ）、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などである。ペプチドは、Ｌｉｕら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第１８巻，６９０−６９７頁（１９７９）により開示されるように、ＭＢＳにより、システインを介してＫＬＨに連結され得る。そのペプチドは、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ  ７．５）、０．１Ｍ  ホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）または１．０Ｍ  酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．０）中に溶解される。ペプチドの溶解のためのｐＨは、ペプチド溶解性を最適にするために選択される。可溶性ペプチドの遊離システインの含有量は、Ｅｌｌｍａｎ法（Ｅｌｌｍａｎ，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，第８２巻，７０７７頁（１９５９））により決定される。各ペプチドについて、０．２５ｍｌの１０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中の４ｍｇのＫＬＨが、０．７ｍｇのＭＢＳ（ジメチルホルムアミド中に溶解した）と反応され、３０分間室温にて攪拌される。ＫＬＨは、３０％を超えるホルムアミド中では溶解しないので、ＭＢＳを滴下して、確実に、ホルムアミドの局所的濃度が高くなりすぎないようにする。次いで、反応産物ＫＬＨ−ＭＢＳを、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５に通過させて、遊離のＭＢＳを除去し、カラム溶出液（ＯＤ２８０によりモニターされる）のピーク画分からのＫＬＨ回収は、約８０％であると推定される。次いで、ＫＬＨ−ＭＢＳは、選択した緩衝液１ｍｌ中に溶解した５ｍｇのペプチドと反応される。そのｐＨを７〜７．５に合わせ、その反応物を、３時間室温にて攪拌する。カップリング効率を、リン酸緩衝化生理食塩水に対する結合体のサンプルの透析により、放射活性ペプチドによりモニターすると、その効率は、８％〜６０％の範囲である。一旦そのペプチド−キャリア結合体が利用可能になると、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が、標準的な技術（例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４）；Ｈｕｒｒｅｌｌ編，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８２）；Ｓｃｈｒｅｉｅｒら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）；米国特許第４，５６２，００３号などに開示される）により生成される。特に、米国特許第４，５６２，００３号は、本明細書中に参考として援用される。
【００５４】
ヒト化抗体。本発明の抗ＴＳＶポリペプチド抗体は、さらに、ヒト化抗体またはヒト抗体を含み得る。用語「ヒト化抗体」とは、非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態をいい、この抗体は、キメラ抗体、その免疫グロブリン鎖もしくはフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）、もしくは抗体の他の抗原結合部分配列）であり、これらは、非ヒト抗体由来の配列のいくらかの部分を含む。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンを含み、ここで、ヒト免疫グロブリンの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基は、所望の結合特異性、親和性および結合能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種のＣＤＲからの残基によって置換される。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、一般的に２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンＣＤＲ領域に対応し、そして全てまたは実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のＦＲ領域である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくと一部、代表的には、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域を含む［Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｖｖ．Ｏｐ．Ｓｔｖｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）］。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体は、抗体のもとの結合活性を維持しながら、ヒト抗体をより密接にまねるために、非ヒトである供給源からそのヒト化抗体に導入される一つ以上のアミノ酸を有する。抗体のヒト化のための方法は、Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；およびＶｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８）においてされに詳説される。このような「ヒト化」抗体は、実質的にインタクト未満の可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列によって置換されている、キメラ抗体である。
【００５５】
ヘテロ結合体抗体。２つの共有結合抗体を含むヘテロ結合抗体はまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合抗体は、合成タンパク質化学における公知の方法（架橋剤を含む方法を含む）を使用してインビトロで調製され得る。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することによって、調製され得る。
【００５６】
二重特異的抗体。二重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する。このような抗体は、モノクローナルであり、そして好ましくは、ヒトまたはヒト化である。本発明の二重特異的抗体の結合特異性のうちの一方は、ＴＳＶポリペプチドに対するものであり、他方は、好ましくは、細胞表面タンパク質またはレセプターもしくはレセプターサブユニットに対するものである。二重特異的抗体を作製するための方法は、当該分野で公知であり、そして一般的に二重特異的抗体の組換え産生は、ハイブリドーマ細胞における２つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づき、ここで、２つの重鎖は、異なる特異性を有する［Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９（１９８３）］。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の無作為な分類が、ハイブリドーマによって潜在的に１０個の異なる抗体分子の産生を生じると考えると、正しい分子の精製は、通常、ある種の親和性精製（例えば、親和性クロマトグラフィー）を必要とする。
【００５７】
抗体アゴニスト。好ましくは、本発明のアンタゴニストは、ＴＳＶポリペプチドに特異的な抗体から誘導される。より好ましくは、本発明のアンタゴニストは、ＴＳＶポリペプチドに特異的なフラグメントまたは結合組成物を含む。抗体は、ジスルフィド結合によって一緒に連結されたポリペプチド鎖のアセンブリを含む。２つの主要なポリペプチド鎖（軽鎖および重鎖と呼ばれる）は、抗体の全ての主要な構造的分類（アイソタイプ）を構成する。重鎖および軽鎖の両方は、さらに、可変領域および定常領域と呼ばれる下位領域に分割される。重鎖は、単一の可変領域および３つの異なる定常領域を含み、そして軽鎖は、１つの可変領域（重鎖の可変領域とは異なる）および１つの定常領域（重鎖の定常領域とは異なる）を含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗体の結合特異性を担う。本明細書中で使用される場合、用語「重鎖可変領域」とは、（１）１１０〜１２５個のアミノ酸長であり、そして（２）そのアミノ酸配列が本発明のモノクローナル抗体の重鎖のアミノ酸配列に対応し、重鎖Ｎ末端アミノ酸から開始する、ポリペプチドを意味する。同様に、用語「軽鎖可変領域」とは、（１）９５〜１１５個のアミノ酸長であり、そして（２）そのアミノ酸配列が本発明のモノクローナル抗体の軽鎖のアミノ酸配列に対応し、軽鎖Ｎ末端アミノ酸から開始する、ポリペプチドを意味する。本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」とは、ＴＳＶポリペプチドに特異的に結合し得る均一な集団の免疫グロブリンをいう。本明細書中で使用される場合、用語「結合組成物」とは、２つのポリペプチド鎖を含む組成物を意味し、この２つのポリペプチド鎖は、（１）作動可能に会合する場合、ＴＳＶポリペプチドに対して高い結合親和性を有する立体構造をとり、そして（２）ＴＳＶポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマから誘導される。用語「作動可能に会合する」は、２つのポリペプチド鎖が、種々の手段によって（ネイティブな抗体フラグメント（例えば、ＦａｂまたはＦｖ）の会合によって、またはカルボキシル末端において遺伝子操作されたシステイン含有ペプチドリンカーによって）、結合のために互いに対して配置され得ることを示すことを意味する。通常、２つのポリペプチド鎖は、ＴＳＶポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域に対応する。好ましくは、本発明のアンタゴニストは、ＴＳＶポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体から誘導される。ＴＳＶポリペプチドをブロックし得るかまたは中和し得るモノクローナル抗体は、ＴＳＶポリペプチド誘導効果を阻害するそれらの能力によって選択される。
【００５８】
抗体のフラグメントの使用および生成もまた周知である。例えば、Ｆａｂフラグメント：Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）；ならびにＦｖフラグメント：Ｈｏｃｈｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１２，ｐｇｓ．１１３０−１１３５（１９７３），Ｓｈａｒｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．１５，ｐｇｓ．１５９１−１５９４（１９７６）およびＥｈｒｌｉｃｈら，米国特許第４，３５５，０２３号；ならびに抗体半分子（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｈａｌｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）：Ａｕｄｉｔｏｒｅ−  Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ，米国特許第４，４７０，９２５号。
【００５９】
（精製および薬学的組成物）
本発明のポリペプチドが、例えば、形質転換された酵母または哺乳動物細胞の分泌産物として、可溶性形態で発現される場合、これらは、当該分野の標準的な手順に従って精製され得、この手順は、硫酸アンモニウム沈降、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、電気泳動、親和性クロマトグラフィーなど（例えば、「Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２：２３３−５７７（１９７７）、およびＳｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２）は、このような精製のガイダンスを提供する）の工程を包含する。同様に、本発明のポリペプチドが不溶性形態（例えば、凝集体、封入体など）で発現される場合、これらは、当該分野において標準的な手順（遠心分離により破壊された宿主細胞から封入体を分離すること、カオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤および還元剤を用いて封入体を溶解すること、溶解された混合物を希釈すること、およびカオトロピック剤および還元剤の濃度を低下させて、その結果、ポリペプチドが生物学的に活性な立体構造をとる）によって精製され得る。後者の手順は、以下の参考文献に開示され、参照として援用される：Ｗｉｎｋｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５：４０４１−４０４５（１９８６）；Ｗｉｎｋｌｅｒら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３：９９２−９９８（１９８５）；Ｋｏｔｈｓら、米国特許第４，５６９，７９０号；ならびに欧州特許出願第８６３０６９１７．５号および同第８６３０６３５３．３号。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、「有効量」とは、自己免疫状態の症状を改善するのに十分な量を意味する。特定の患者に対する有効量は、処置される状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の状態（ｓｔａｔｅ）、患者の全体的な健康、投与方法、副作用の重篤度などのような因子に依存して、変化し得る。一般的に、ＴＳＶポリペプチドは、有効量のＴＳＶポリペプチドおよび薬学的キャリアを含む薬学的組成物として投与される。薬学的キャリアは、本発明の組成物を患者に送達するのに適切な任意の適合性非毒性物質であり得る。一般的に、このような薬剤の非経口的投与に有用な組成物は、周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１５ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９８０）。あるいは、本発明の組成物は、移植可能または注射可能な薬物送達システムによって、患者の身体に導入され得る。例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，Ｖｏｌ．２４，ｐｇｓ．１９９−２３６（１９８４）；Ｌｅｗｉｓ，ｅｄ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８１）；米国特許第３，７７３，９１９号；米国特許第３，２７０，９６０号；など。
【００６１】
非経口的に投与される場合、ＴＳＶポリペプチドは、薬学的キャリアと一緒に、単位投薬注射可能形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）で処方される。このようなキャリアの例は、ノーマルセーライン、リンガー溶液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。不揮発性油およびオレイン酸エチルのような非水性キャリアもまた使用され得る。好ましいキャリアは、５％デキストロース／生理食塩水である。キャリアは、等張性および化学安定性を向上する物質のような少量の添加剤（例えば、緩衝液および保存剤）を含み得る。ＴＳＶポリペプチドは、好ましくは、約５〜２０μｇ／ｍｌの範囲の濃度で、凝集物および他のタンパク質を実質的に含まない精製形態で処方される。好ましくは、ＴＳＶポリペプチドは、約５０〜８００μｇの範囲の量が１日当たり送達される（すなわち、約１〜１６μｇ／ｋｇ／日）ように、連続注入で投与される。毎日の注入速度は、副作用のモニタリング（例えば、血球数、体温など）に基づいて、変化し得る。
【００６２】
ＴＳＶポリペプチドは、ＴＳＶポリペプチド遺伝子を保有する発現ベクターによって一過性トランスフェクトされるかまたは安定に形質転換される哺乳動物細胞の培養上清から精製され得る。ＴＳＶポリペプチドは、ｐｃＤ発現ベクターによって一過性トランスフェクトされるたＣＯＳ７細胞の培養上清から精製される。ｐｃＤを用いるＣＯＳ７細胞のトランスフェクションは、以下のように進行する：トランスフェクションの１日前に、約１０６個のＣＯＳ７サル細胞を、１０％胎仔ウシ血清および２ｍＭグルタミンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ）中、個々の１００ｍｍプレート上に播種する。トランスフェクションを実行するために、この培地を、各プレートから吸引し、そして５０ｍＭ  トリスＨＣｌ  ｐＨ７．４、４００ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストランおよび５０μｇのプラスミドＤＮＡを含む、４ｍｌのＤＭＥと置き換える。プレートを４時間３７℃でインキュベートし、次いで、ＤＮＡ含有培地を取り出し、そしてプレートを２回５ｍｌの無血清ＤＭＥで洗浄する。ＤＭＥをプレートに戻すように加え、これを次いで、さらに３時間３７℃でインキュベートする。プレートを１度ＤＭＥで洗浄し、その後、４％胎仔ウシ血清、２ｍＭグルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／Ｌ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／Ｌ）を含むＤＭＥを、標準濃度で添加する。次いで、細胞を７２時間３７℃でインキュベートし、その後、増殖培地を、ＴＳＶポリペプチドの精製のために収集する。あるいは、トランスフェクションを、実施例に記載されるように、エレクトロポレーションによって達成し得る。トランスフェクションのためのプラスミドＤＮＡを、ｐｃＤ（ＳＲα）または類似の発現ベクター（Ｃａｓａｄａｂａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１３８，ｐｇｓ．１７９−２０７（１９８０）によって記載されるＥ．ｃｏｉ  ＭＣ１０６１もしくは類似の生物中のＴＳＶポリペプチドｃＤＮＡ挿入物を含む）を増殖させることによって得る。プラスミドＤＮＡを標準的な技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９９０，上記））によって培養物から単離される。
【００６３】
本発明のアンタゴニストが抗体から誘導される場合、これらは、通常、非経口的、好ましくは、静脈内で投与される。このようなタンパク質またはペプチドアンタゴニストが免疫原性であり得るので、これらは、好ましくは、従来のＩＶ投与セットによって、または皮下蓄積物（例えば、Ｔｏｍａｓｉら、米国特許第４，７３２，８６３号によって教示される）から、のいずれかで、ゆっくり投与される。非経口的に投与される場合、抗体および／またはフラグメントは、上記のように、薬学的キャリアとともに、単位投薬注射可能形態で処方される。抗体は、好ましくは、凝集物、他のタンパク質、内毒素などを実質的に含まない精製形態で、約５〜３０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、１０〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度で、処方される。好ましくは、内毒素レベルは、２．５ＥＵ／ｍｌ未満である。
【００６４】
アンタゴニストについての投与レジメンを選択することは、いくつかの因子（アンタゴニストの血清ターンオーバー速度、処置される障害と関連するＴＳＶポリペプチドの血清レベル、アンタゴニストの免疫原性、標的ＴＳＶポリペプチドの接近可能性（例えば、無血清ＴＳＶポリペプチドがブロックされる場合）、ＴＳＶポリペプチドのそのレセプターへの親和性とＴＳＶポリペプチドのアンタゴニストへの親和性との相対親和性など）に依存する。好ましくは、投与レジメンは、受容可能なレベルの副作用と矛盾しない、患者に送達されるアンタゴニストの量を最大化する。従って、送達されるアンタゴニストの量は、特定のアンタゴニストおよび処置される状態の重篤度に、一部依存する。適切な用量を選択する際の手引きは、抗体の治療的使用についての文献に見出される。例えば、Ｂａｃｈら，ｃｈａｐｔｅｒ  ２２，Ｆｅｒｒｏｎｅら編，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｎｏｇｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐａｒｋ  Ｒｉｄｇｅ，ＮＪ，１９８５）；およびＲｕｓｓｅｌｌ，ｐｇｓ．３０３−３５７，およびＳｍｉｔｈら，ｐｇｓ．３６５−３８９，Ｈａｂｅｒら編、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７７）。好ましくは、アンタゴニストがモノクローナル抗体またはそのＦａｂサイズフラグメント（結合組成物を含む）を含む場合はいつも、用量は、１日当たり約１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲である。より好ましくは、用量は、１日当たり約１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。
【実施例】
【００６５】
（実施例１）
（ＴＳＶポリペプチドの化学合成）
この実施例において、図１の配列を有するポリペプチドは、標準的な固相ペプチド合成によって合成される。きれいな十分に特徴付けられた樹脂、きれいなアミンの酸誘導体、きれいな溶媒を、全ての操作において使用する。例えば、Ｂａｒａｎｙ  ａｎｄ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｃｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ．，Ｖｏｌ．２，ｐｇｓ  １−２８４（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９）。カップリング反応を、１つ以上の残基を失う欠失ペプチドを避けるように、完了まで進行することを決定するためにモニターする。定量的ニンヒドリン反応は、その目的のために有用である。Ｓａｒｉｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．１１７，ｐｇ  １４７（１９８１）。Ｎａ−ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）−アミノ酸を、鎖の構築条件には安定であるが強酸に対して不安定な適切な側鎖保護基を使用する。保護されたペプチド鎖の構築の後に、保護基が除去され、そしてペプチド固着結合が、チオエステルスカベンジャーの存在下で、高濃度の無水フッ化水素の使用によって切断される（Ｔａｍら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｖｏｌ．１０５，ｐｇ．６４４２（１９８３））。使用される側鎖保護基は、Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）、Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）、Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）、Ｌｙｓ（Ｃｌ−Ｚ）、Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）、Ａｒｇ（ＮＧＴｏｓ）、Ｃｙｓ（４−ＭｅＢｚｌ）、およびＨｉｓ（ＩｍＤＮＰ））。（Ｂｚｌ、ベンジル；Ｔｏｓ、トルエンスルホキシ；ＤＮＰ、ジニトロフェニル；Ｉｍ、イミダゾール；Ｚ、ベンジルオキシカルボニル（ｂｅｎｚｙｌｏｘｇｙｃａｒｂｏｎｙｌ））。残りのアミノ酸は、側鎖保護基を有さない。各サイクルについて、ｔＢｏｃ  Ｎａ保護ペプチド樹脂を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、（Ｍａｌｌｅｎｃｋｒｏｄｔ）中の６５％トリフルオロ酢酸（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ製）（使用前に蒸留した）に暴露する：最初に１分間、次いで、１３分間、Ｎａ−保護基を除去する。ペプチド−樹脂を、ＤＣＭで洗浄し、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中の１０％ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて２回、それぞれ１分間、中和する。ＤＭＦ中のアミノ酸の対称無水物を用いてカップリングを１６分間実行する。この対称無水物は、６ｍｌのＤＣＭ中の２ｍｍｏｌのアミノ酸を溶解し、そして２ｍｌのＤＣＭ中の１ｍｍｏｌのジシクロヘキシルカルボジイミド（Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加することによって、合成機で調製する。５分後、活性化アミノ酸を別の容器に移し、そしてＤＣＭを、窒素ガスの連続ストリームでパージすることによってエバポレートさせる。ＤＣＭを、パージングの間の種々の段階で、ＤＭＦ（合計６ｍｌ）によって置き換える。最初のカップリングの後に、ペプチド樹脂を、ＤＣＭ、ＤＣＭ中の１０％ＤＩＥＡ、次いで、ＤＣＭで洗浄する。再カップリングについて、同じアミノ酸および活性化剤、ジシクロヘキシルカルボジイミドを、連続的に反応容器に移す。インサイチュでの活性化および１０分間のカップリングの後に、十分なＤＭＦを添加して、５０％のＤＭＦ−ＤＣＭ混合物を作製し、そしてカップリングを１５分間続ける。アルギニンを６０分間、ＤＭＦ中のヒドロキシベンゾトリアゾール（Ａｌｄｒｉｃｈ）エステルとしてカップリングし、次いで、他のアミノ酸と同じ様式で再カップリングする。アスパラギンおよびグルタミンを、ＤＭＦ中で、ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルとして、２回、それぞれのカップリングについて４０分間、カップリングする。全ての残渣について、樹脂を、第２のカップリングの後に洗浄し、そしてサンプルを、定量的ニンヒドリン反応（Ｓａｒｉｎら（上記））によって、残りの未カップリングα−アミンをモニタリングするために自動的にとった。
【００６６】
（実施例２）
（ＴＳＶポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体）
雄性Ｌｅｗｉｓラットを、化学的に合成されたＴＳＶポリペプチドの半精製調製物を用いて免疫した。ラットを、最初に、フロイント完全アジュバント中、約５０μｇのＴＳＶポリペプチドを用いて免疫し、そしてフロイント不完全アジュバント中の同じ量の物質を用いて２回ブーストする。試験出血を採取する。この動物に、リン酸緩衝化生理食塩水中２５μｇの最後のブーストを与え、そして４日後、脾臓を、融合のために得た。
【００６７】
約３×１０８個のラット脾細胞を、等しい数のＰ３Ｘ６３−ＡＧ８．６５３マウス骨髄腫細胞（受託番号ＣＲＬ  １５８０でＡＴＣＣから入手可能）と融合する。３８４０マイクロタイタープレートウェルに、１ウェル当たり５．７×１０４個の親骨髄腫細胞で播種した。融合および引き続くハイブリッドの培養のための標準的なプロトコルが、例えば、Ｃｈｒｅｔｉｅｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，Ｖｏｌ．１１７，ｐｇｓ．６７−８１（１９８９）によって記載されるように、続けられる。１２日後、融合上清を収集し、そして化学的に合成されたＴＳＶポリペプチドをコーティングしたＰＶＣプレート上で、間接的なＥＬＩＳＡによってスクリーニングする。
【００６８】
本発明の上記実施形態の記載は、例示および説明のために提示されている。これらは、排他的であることも、発明を開示されたまさにその形態に限定することも意図せず、明らかに多くの改変および変更が、上記教示を考慮して可能である。本発明の原理を最も良く説明し、それによって当業者が、種々の実施形態で、企図される特定の使用に適切な種々の改変を用いて本発明を最も良く使用し得るように、これらの実施形態は、選択されそして記載された。本発明の範囲が、本明細書に添付される特許請求の範囲によって規定されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】図１は、本発明のヒトＴＳＶポリペプチドのアミノ酸配列の列挙である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533834.tif 000030
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533834.tif 000031
【手続補正書】
【提出日】平成15年4月10日(2003.4.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号３に示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９７％の同一性を有する、アミノ酸配列；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のフラグメント
からなる群より選択される、アミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２】
異種アミノ酸配列と融合した、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
請求項１に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体またはそれらのフラグメント。
【請求項４】
請求項１もしくは請求項２に記載のポリペプチドまたはそのフラグメント、あるいは請求項３に記載の抗体またはそのフラグメント、ならび薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項５】
請求項３に記載の抗体を含む、診断組成物。
【請求項６】
ＴＳＶポリペプチドを結合する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１に記載のポリペプチドを提供する工程；および
（ｂ）該ポリペプチドを該ポリペプチドに結合する抗体と接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項７】
請求項３に記載の抗体とサンプルとを接触させる工程を包含する、該サンプル中のＴＳＶポリペプチドを検出するための診断方法。
【請求項８】
請求項１に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが作動可能にプロモーターと連結している、請求項８のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１１】
請求項１０のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１２】
ＴＳＶポリペプチドを作製する方法であって、該方法は、以下：
（ａ）請求項１に記載のＴＳＶポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞の集団を提供する工程；および
（ｂ）該組換えポリヌクレオチドの発現を誘導する条件下で、該宿主細胞の集団を培養し、それによって該ポリペプチドを該宿主細胞の集団中で産生する工程
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記ポリペプチドを前記細胞集団から精製する工程を包含する、請求項１２の方法。
【請求項１４】
ＴＳＶポリペプチド関連障害を処置するための薬学的組成物を調製するための、請求項３に記載の抗体の使用。
【国際調査報告】
2004533834.tif 000032
2004533834.tif 000033