(57)【要約】本発明は、ＨＢＶに対して指向されるエピトープベースのワクチンを開発するために、抗原がＴ細胞によって認識される機構についての本発明者らの知識を使用する。より詳細には、本出願は、薬学的組成物、ならびにＨＢＶ感染の予防および処置における使用の方法についての本発明者らの発見を伝達する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ペプチドを含む組成物であって、ペプチドが以下：
【化１】
2004508320.tif 000123
からなる群から選択される配列からなる、単離、調製されたエピトープを含むことを特徴とする組成物。
【請求項２】
ＦＬＬＳＬＧＩＨＬ、ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ、ＬＰＳＤＦＦＰＳＶ、ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ、ＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶ、ＬＹＳＨＰＩＩＬＧＦ、ＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲおよびＧＬＳＲＹＶＡＲＬからなる群から選択されるエピトープをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記エピトープが、アミノ酸リンカーに結合されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記エピトープが、ＣＴＬエピトープと混合されるか結合されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記エピトープが、ＨＴＬエピトープと混合されるか結合されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＨＴＬエピトープが、汎ＤＲ結合分子であることを特徴とする請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
リポソームをさらに含み、前記エピトープが、リポソーム上またはリポソーム内にあることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記エピトープが脂質に結合されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記エピトープが、ヘテロポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記エピトープが、ホモポリマーであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記エピトープが、ＨＬＡ重鎖、β２−ミクログロブリン、およびストレパビジン複合体に結合され、それによってテトラマーが形成されることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
抗原提示細胞をさらに含み、前記エピトープが、抗原提示細胞上または抗原提示細胞内にあることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記エピトープが抗原提示細胞上のＨＬＡ分子と結合され、これにより、ＨＬＡ分子に拘束される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が存在する場合にはＣＴＬの受容体がＨＬＡ分子とエピトープの複合体に結合することを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗原提示細胞が樹状細胞であることを特徴とする請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
１つまたは複数のペプチドを含み、さらに、少なくとも２つのエピトープを含む組成物であって、その少なくとも１つのエピトープが以下：
【化２】
2004508320.tif 000124
からなる群から選択され、前記１つまたは複数の各ペプチドが、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のネイティブなペプチド配列と１００％等しい５０個未満の連続するアミノ酸を含むことを特徴とする組成物。
【請求項１６】
ＦＬＬＳＬＧＩＨＬ、ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ、ＬＰＳＤＦＦＰＳＶ、ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ、ＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶ、ＬＹＳＨＰＩＩＬＧＦ、ＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲおよびＧＬＳＲＹＶＡＲＬからなる群から選択されるエピトープをさらに含むことを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
１つのペプチドが、少なくとも２つのエピトープを含むことを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記１つまたは複数のペプチドの少なくとも１つが、ヘテロポリマーであることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項１５に示す群から選択されるエピトープが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）エピトープと結合することを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１５に示す群から選択されるエピトープが、ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）エピトープと結合することを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＨＴＬエピトープが、汎ＤＲ結合分子であることを特徴とする請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
リポソームをさらに含み、前記エピトープが、リポソーム上またはリポソーム内にあることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１５に示す群から選択されるエピトープが、脂質に結合されることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２４】
抗原提示細胞をさらに含み、請求項１５に示す群から選択されるエピトープが、抗原提示細胞上または抗原提示細胞内にあることを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２５】
前記エピトープが抗原提示細胞上のＨＬＡ分子と結合され、これにより、ＨＬＡ分子に拘束される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が存在する場合にはＣＴＬの受容体がＨＬＡ分子とエピトープの複合体に結合することを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗原提示細胞が樹状細胞であることを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
１つまたは複数のペプチドと混合される追加的なペプチドをさらに含むことを特徴とする請求項１５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記追加的なペプチドが、ＣＴＬまたはＨＴＬエピトープを含むことを特徴とする請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のネイティブなペプチド配列と１００％同一性を有する５０個未満の連続するアミノ酸を含む単位用量のペプチドおよび薬学的賦形剤を含むワクチンであって、そのペプチドが以下：
【化３】
2004508320.tif 000125
からなる群から選択されるエピトープを含むことを特徴とするワクチン組成物。
【請求項３０】
追加的なエピトープをさらに含むことを特徴とする請求項２９に記載のワクチン組成物。
【請求項３１】
前記追加的なエピトープが、ＦＬＬＳＬＧＩＨＬ、ＦＬＰＳＤＦＦＰＳＶ、ＬＰＳＤＦＦＰＳＶ、ＦＬＬＴＲＩＬＴＩ、ＬＬＶＰＦＶＱＷＦＶ、ＬＹＳＨＰＩＩＬＧＦ、ＳＴＬＰＥＴＴＶＶＲＲおよびＧＬＳＲＹＶＡＲＬからなる群から選択されることを特徴とする請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記追加的なエピトープが、汎ＤＲ結合分子であることを特徴とする請求項３０に記載のワクチン組成物。
【請求項３３】
前記薬学的賦形剤が、アジュバントを含むことを特徴とする、請求項２９に記載のワクチン組成物。
【請求項３４】
抗原提示細胞をさらに含むことを特徴とする、請求項２９に記載のワクチン組成物。
【請求項３５】
前記エピトープが抗原提示細胞上のＨＬＡ分子と結合され、これにより、ＨＬＡ分子に拘束される細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）が存在する場合にはＣＴＬの受容体がＨＬＡ分子とエピトープの複合体に結合することを特徴とする請求項３４に記載のワクチン組成物。
【請求項３６】
前記抗原提示細胞が樹状細胞であることを特徴とする請求項３４に記載のワクチン組成物。
【請求項３７】
リポソームをさらに含み、前記少なくとも１つのエピトープが、リポソーム上またはリポソーム内にあることを特徴とする請求項２９に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（連邦政府によって援助された研究および開発）
本発明は、一部、国立衛生研究所の助成の下で米国政府によって資金援助された。米国政府は、本発明の特定の権利を有する。
【０００２】
（索引）
Ｉ．　　発明の背景
ＩＩ．　発明の概要
ＩＩＩ．図面の簡単な説明
ＩＶ．　発明の詳細な説明
Ａ．定義
Ｂ．ＨＢＶに対するＣＴＬ応答およびＨＴＬ応答の刺激
Ｃ．ＨＬＡ分子に対するペプチドエピトープの結合親和性
Ｄ．ペプチドエピトープ結合モチーフおよびスーパーモチーフ
１．ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ
２．ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ
３．ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ
４．ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ
５．ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ
６．ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフ
７．ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフ
８．ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフ
９．ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフ
１０．ＨＬＡ−Ａ１モチーフ
１１．ＨＬＡ−Ａ２．１モチーフ
１２．ＨＬＡ−Ａ３モチーフ
１３．ＨＬＡ−Ａ１１モチーフ
１４．ＨＬＡ−Ａ２４モチーフ
１５．ＨＬＡ−ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ
１６．ＨＬＡ−ＤＲ３モチーフ
Ｅ．ワクチンの増大する集団適用範囲
Ｆ．免疫応答刺激ペプチドアナログ
Ｇ．スーパーモチーフまたはモチーフを含有するエピトープについての、疾患関連抗原由来のタンパク質配列のコンピュータスクリーニング
Ｈ．ペプチドエピトープの調製
Ｉ．Ｔ細胞応答を検出するためのアッセイ
Ｊ．免疫応答を評価するためのペプチドエピトープの使用
Ｋ．ワクチン組成物
１．ミニ遺伝子ワクチン
２．ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組合わせ
Ｌ．治療目的または予防目的のためのワクチンの投与
Ｍ．キット
Ｖ．　　実施例
ＶＩ．　特許請求の範囲
ＶＩＩ．要約
【０００３】
（Ｉ．発明の背景）
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）による慢性的感染は、世界人口の少なくとも５％が罹患し、肝炎および肝細胞癌の主要な原因である（Ｈｏｏｆｎａｇｌｅ，Ｊ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２３：３３７、１９９０；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．およびＫｎｉｐｅ，Ｄ．、Ｉｎ：Ｆｉｅｌｄｓ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２：２１３７、１９９０）。世界保健機構は、Ｂ型肝炎を、慢性肺疾患に迫る、ＡＩＤＳより広まっている世界的な主たる死因に挙げている。慢性ＨＢＶ感染は無症状のキャリアー段階から継続的な肝細胞壊死および炎症に及び、肝細胞癌につながり得る。
【０００４】
ＨＢＶに対する免疫応答は、Ｂ型肝炎感染を抑制する上で重要な役割を果たしていると信じられている。ヌクレオカプシドコア、ポリメラーゼおよび表面抗原を含むＨＢＶの様々な領域に対する体液性および細胞性応答が同定されてきた。Ｔ細胞仲介免疫、特にクラスＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ）拘束（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、確立したＨＢＶ感染と戦うのに不可欠だと信じられている。
【０００５】
クラスＩヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子は、ほとんど全ての有核細胞の表面上で発現する。ＣＴＬは、クラスＩＨＬＡ分子との複合体の形態で、様々な抗体の細胞内プロセシングに由来するペプチド断片を認識する。次いでこの認識は、直接的にＨＬＡ−ペプチド複合体を有する細胞の破壊またはウイルス複製を阻害する非破壊的機構（例えば、インターフェロンの産生）の活性化をもたらす。
【０００６】
いくつかの研究は、自己制限的急性肝炎と多特異的なＣＴＬ応答との関連を強調している（Ｐｅｎｎａ，Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１５６５、１９９１；Ｎａｙｅｒｓｉｎａ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４６５９、１９９３）。慢性ＨＢＶ感染の自発的およびインターフェロン関与除去Ｕ（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）も活発なＣＴＬ応答の復帰と関連している（Ｇｕｉｄｏｔｔｉ，Ｌ．Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：３７６４、１９９４）。こうしたケースのすべてでＣＴＬ応答はポリクローナルであり、ＨＢＶエンベロープ、コアおよびポリメラーゼ抗原を含む多数のウイルスタンパク質に特異的である。対照的に、慢性肝炎患者では、通常、ＣＴＬ活性は存在しないか弱く抗原的に制限されている。
【０００７】
ＨＢＶ感染の軽減におけるＣＴＬの決定的役割は、ＨＢＶトランスジェニックマウスを用いた研究によってさらに明確にされてきた。ＨＢＶゲノムについてトランジェニックなマウスへのＨＢＶ−特異的ＣＴＬの養子免疫伝達はウイルス複製の抑制をもたらした。この効果は主として、非溶解性でリンホカインベースのメカニズムによって仲介された（Ｇｕｉｄｏｔｔｉ，Ｌ．Ｇ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：３７６４、１９９４；Ｇｕｉｄｏｔｔｉ，Ｌ．Ｇ．、Ｇｕｉｌｈｏｔ，Ｓ．およびＣｈｉｓａｒｉ，Ｆ．Ｖ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：１２６５、１９９４；Ｇｕｉｄｏｔｔｉ，Ｌ．Ｇ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：６１５８、１９９５；Ｇｉｌｌｅｓ，Ｐ．Ｎ．、Ｆｅｙ，Ｇ．およびＣｈｉｓａｒｉ，Ｆ．Ｖ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：３９５５、１９９２）。
【０００８】
ＨＬＡクラスＩ拘束応答の場合と同様に、ＨＬＡクラスＩＩ拘束Ｔ細胞応答は、通常、急性肝炎患者で検出され、慢性肝炎患者では存在しないか弱い（Ｃｈｉｓａｒｉ，Ｆ．Ｖ．およびＦｅｒｒａｒｉ，Ｃ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：２９、１９９５）。ＨＬＡクラスＩＩ応答は、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）の活性化と結びついている。ヘルパーＴリンパ球は、クラスＩＩＨＬＡ分子を認識し、ウイルス増殖を抑えるサイトカイン分泌を通じて直接にＨＢＶ感染の除去に寄与する（Ｆｒａｎｃｏ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：２００１、１９９７）。しかし。疾病解決におけるその主要な役割は、ウイルス特異的ＣＴＬおよびＢ細胞の活性化および拡大の誘導によって仲介されていると信じられている。
【０００９】
ＨＢＶ感染で観察される異種免疫応答を考慮すると、複数のエピトープに対して同時に指向される多特異的な細胞性免疫応答の誘導が、ＨＢＶに対する有効なワクチンの開発のために重要であると思われる。しかし、ＨＢＶ感染を除去する患者に見られる応答に対応する免疫応答を誘発する、ワクチンの実施形態を確立する必要性が存在する。エピトープベースなワクチンが有用と思われる。
【００１０】
適切な技術の開発の際に、エピトープベースワクチンの使用は、現在のワクチンを超えたいくつかの利点を有する。このようなエピトープベースワクチンに含まれるためのエピトープは、ウイルスまたは腫瘍関連抗原の保存領域から選択されるべきで、これによって逸脱変異体（ｅｓｃａｐｅ　ｍｕｔａｎｔ）の可能性が減少する。抗原全体の使用に対するエピトープベースアプローチの利点は、抗原全体に対する免疫応答が抗原の可変領域に対して大きく向けられ、変異に起因する免疫の逸脱を可能にするという証拠が存在することである。さらに、抗原全体に存在し得る免疫抑制性エピトープは、エピトープベースワクチンの使用で回避され得る。
【００１１】
さらに、エピトープベースワクチンのアプローチでは、選択されるエピトープ（ＣＴＬおよびＨＴＬ）を組み合わせる能力、さらに、エピトープの組成を改変する能力があり、例えば免疫原性を増大させる。従って、免疫応答は、必要に応じて、標的疾患のために調節され得る。従来のアプローチでは、同様の応答操作は可能ではない。
【００１２】
エピトープベースの免疫刺激ワクチンの別の主要な利点は、その安全性にある。感染因子またはタンパク質抗原全体（これは、それ自身の固有の生物学的活性を有し得る）によって生じる起こり得る病理学的な副作用が排除される。
【００１３】
エピトープベースワクチンはまた、同じ病原由来の複数の選択された抗原に対する免疫応答を指向し、そしてこれに焦点を合わせる能力を提供する。従って、特定の病原に対する免疫応答における患者間の可変性は、ワクチン組成物中の病原から、複数の抗原由来のエピトープを包含することによって軽減され得る。「病原」は、感染因子または腫瘍関連分子であり得る。
【００１４】
しかし、広範に有効なエピトープベースの免疫療法の開発の最も手強い障壁の１つは、ＨＬＡ分子の極度の多型性である。現在まで、有効で遺伝的に偏りのない集団をカバーすることは、非常に複雑な課題であった；そのような適用範囲には、各個々のＨＬＡ対立遺伝子と対応するＨＬＡ分子に特異的であるエピトープが使用されることが必要であり、その結果、人種的に多様な集団をカバーするために実施不可能なほど多数のエピトープが使用されなければならない。従って、エピトープベースワクチンの使用のために複数のＨＬＡ抗原分子によって結合されるペプチドエピトープの開発の必要性が存在する。多数のＨＬＡ抗原分子が結合すればするほど、ワクチンによる集団のカバー範囲の幅が大きくなる。
【００１５】
さらに、本明細書中でより詳細に記載するように、例えば複数のＨＬＡ抗原に結合し得るペプチドが免疫応答を刺激する親和性でそのような結合をするように、ペプチド結合特性を調節する必要性が存在する。免疫原性と相関する親和性で２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によって拘束されたエピトープの同定は、十分な集団のカバー範囲を提供するために、かつ、多様な集団セグメントにおいて自己制限的急性肝炎において見られる自然免疫応答または慢性ＨＢＶ感染の自発的除去の自然免疫応答を誘発する十分な効力の応答の誘発刺激を可能にするために重要である。このような応答はまた、エピトープの広範な配列を標的にすることができる。本明細書中に開示される技術は、このような好ましい免疫応答について提供される。
【００１６】
この節において提供される情報は、本出願の出願日における当該技術分野の現在理解されている水準を開示することが意図される。本出願の優先日の後に生じた情報がこの節に含まれる。従って、この節の背景は、いずれにしても本発明の優先日を画することを意図していない。
【００１７】
（ＩＩ．発明の概要）
本発明は、例えば、ＨＢＶに対して指向されるエピトープベースワクチンを開発するために、抗原がＴ細胞に認識される機構についての本発明者らの知識を適用する。より詳細には、本出願は、特定のエピトープ薬学的組成物ならびにＨＢＶ感染の防止および処置における使用方法についての本発明者らの発見を伝達する。
【００１８】
適切な技術の開発の際に、エピトープベースワクチンの使用は、特にワクチン組成物中の抗原全体の使用と比較した場合に、現在のワクチンよりいくつかの利点を有する。抗原全体に対する免疫応答は、抗原の可変領域に対して大きく向けられ、変異に起因する免疫の逸脱を可能にする、という証拠が存在する。エピトープベースワクチンに含ませるためのエピトープは、ウイルスまたは腫瘍関連抗原の保存領域から選択され、これによって逸脱変異体の可能性が減少する。さらに、抗原全体に存在し得る免疫抑制性エピトープは、エピトープベースワクチンの使用で回避され得る。
【００１９】
エピトープベースワクチンアプローチのさらなる利点は、選択されるエピトープ（ＣＴＬおよびＨＴＬ）を組合わせる能力、さらに、エピトープの組成を変える能力であり、例えば増大した免疫原性を増大させる。従って、免疫応答は、必要に応じて、標的疾患のために調節され得る。従来のアプローチでは、同様の応答操作は可能ではない。
【００２０】
エピトープベースの免疫刺激ワクチンの別の主要な利点は、その安全性にある。それ自身の固有の生物学的活性を有し得る感染因子またはタンパク質抗原全体によって生じる、起こり得る病理学的な副作用が排除される。
【００２１】
エピトープベースワクチンはまた、同じ病原由来の複数の選択された抗原に対する免疫応答に向けられ、そしてこれに焦点を合わせる能力を提供する。従って、特定の病原に対する免疫応答における患者間の可変性は、ワクチン組成物中の病原由来の複数の抗原由来のエピトープを包含することによって軽減され得る。「病原」は、感染因子または腫瘍関連分子であり得る。
【００２２】
しかし、広範に有効なエピトープベースの免疫療法の開発の最も手強い障壁の１つは、ＨＬＡ分子の極度の多型性である。現在まで、有効で遺伝的に偏りのない集団をカバーすることは、非常に複雑な課題であった；そのようなカバーには、各個々のＨＬＡ対立遺伝子と対応するＨＬＡ分子に特異的であるエピトープが使用されることを必要となり、その結果、人種的に多様な集団をカバーするために実施不可能なほど多数のエピトープが使用されなければならない。従って、エピトープベースワクチンの使用のために複数のＨＬＡ抗原分子によって結合されるペプチドエピトープの必要性が存在する。多数のＨＬＡ抗原分子が結合すればするほど、ワクチンによる集団のカバー範囲の幅が大きくなる。
【００２３】
さらに、本明細書中でより詳細に記載するように、例えば複数のＨＬＡ抗原に結合し得るペプチドが免疫応答を刺激する親和性でそのような結合をするように、ペプチド結合特性を調節する必要性が存在する。免疫原性と相関する親和性で１つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によって拘束されるエピトープの同定は、十分な集団のカバー範囲を提供するために、かつ、多様な集団セグメントにおける感染を防止または清澄するために十分な効力の応答の誘発を可能にするために重要である。このような応答はまた、エピトープの広範な配列を標的にすることができる。本明細書中に開示される技術は、このような好ましい免疫応答について提供される。
【００２４】
好ましい実施形態において、本発明のワクチン組成物に包含するためのエピトープは、モチーフまたはスーパーモチーフを有するエピトープの存在について既知の抗原のタンパク質配列を評価するプロセスによって選択される。次いで、モチーフまたはスーパーモチーフを有するエピトープに対応するペプチドは合成され、選択されるモチーフを認識するＨＬＡ分子に結合する能力について試験する。中程度または高い親和性、すなわち、ＨＬＡクラスＩ分子について５００ｎＭ以下、あるいはＨＬＡクラスＩＩ分子について１０００ｎＭ以下のＩＣ５０（またはＫＤ値）、で結合するこれらのペプチドは、ＣＴＬまたはＨＴＬ応答を誘導する能力についてさらに評価される。免疫原性ペプチドは、ワクチン組成物に包含するために選択される。
【００２５】
スーパーモチーフを有するペプチドは、ＨＬＡスーパータイプファミリー内の複数の対立遺伝子に結合する能力についてさらに試験され得る。さらに、ペプチドエピトープは、結合親和性および／またはＨＬＡスーパータイプ内の複数の対立遺伝子に結合する能力を改変するためにアナログ化（ａｎａｌｏｇｕｅｄ）され得る。
【００２６】
本発明はまた、既知のＨＬＡ型を有する患者におけるＨＢＶワクチンの免疫原活性をモニタリングするための方法を含む実施形態を含み、この方法は、患者由来のＴリンパ球サンプルを、この患者に存在する少なくとも１つのＨＬＡ対立遺伝子の産物に結合する表ＶＩ〜表ＸＸまたは表ＸＸＩＩに記載されるアミノ酸配列からなるＨＢＶエピトープを本質的に含むペプチド組成物と共にインキュベートする工程と、このペプチドに結合するＴリンパ球の存在を検出する工程とを包含する。好適な実施形態では、ペプチドは、テトラマー複合体を含み得る。
【００２７】
本発明のペプチドを定義するための代替的様式は、特定の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子または対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子群への結合と相関する、長さ、一次構造、取り得る二次構造および／または三次構造、または荷電などの物理的性質を列挙することである。ペプチドを定義するためのさらなる様式は、ＨＬＡ結合ポケットの物理的特性、またはいくつかの対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合ポケットによって共有される特性（例えば、ポケットの配置および電荷分布）を列挙すること、ならびにペプチドがこれらのポケットに一致および結合することを説明することである。
【００２８】
以下の議論から明らかなように、他の方法および実施形態も意図される。さらに、本明細書中に記載されるいずれかの方法によって生成される新規な合成ペプチドも本発明の一部である。
【００２９】
（ＩＶ．発明の詳細な説明）
本発明のペプチドおよび対応する核酸組成物は、ＣＴＬまたはＨＴＬいずれかの応答の生成を刺激することによって、ＨＢＶに対する免疫応答を刺激するために有用である。ネイティブなＨＢＶアミノ酸配列から直接的または間接的に誘導されるペプチドは、ＨＬＡ分子に結合し得、ＨＢＶに対する免疫応答を刺激し得る。ＨＢＶおよびその改変体由来の完全なポリタンパク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋから得られ得る。ペプチドはまた、以下に提供される開示から明らかであるように、これまで未知のＨＢＶの改変体についてその後に発見され得る配列情報から容易に決定され得る。
【００３０】
本発明のペプチドは、以下に議論されるように多くの方法において同定されてきた。さらに、改変された免疫原性を示すペプチドアナログを作製するために特定のアミノ酸残基を改変することによって、アナログペプチドが誘導され、ＨＬＡ分子についての結合活性が調節されてきた。さらに、本発明は、多数のＨＬＡ抗原と相互作用することができるエピトープベースワクチンがこれまでのワクチンより集団の広いカバーを提供することを可能にする、組成物および組成物の組合せを提供する。
【００３１】
ＩＶ．Ａ．定義
本発明は、アルファベット順に列挙された以下の定義を参照することにより効果的に理解されすることができる。
【００３２】
「コンピュータ」または「コンピュータシステム」は、一般に以下を含む：プロセッサ；少なくとも１つの情報格納／検索装置（例えば、ハードドライブ、ディスクドライブまたはテープドライブなど）；少なくとも１つの入力装置（例えば、キーボード、マウス、タッチスクリーンまたはマイクロフォンなど）；およびディスプレイ構造。さらに、コンピュータは、ネットワークとつながった通信路を含んでもよい。このようなコンピュータは、上記のものより多いものまたは少ないものを含み得る。
【００３３】
本明細書において「構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）」は、一般に天然に存在しない組成物を指す。構築物は合成技術、例えば、組換えＤＮＡ調製および発現、または核酸もしくはアミノ酸の化学合成技術によって合成することができる。構築物はまた、一方の材料を別の材料に添加または関係させてその形態では天然に存在しない結果とすることによっても合成できる。
【００３４】
「交差反応性結合」は、ペプチドが２つ以上のＨＬＡ分子により結合されることを示す；類義語は、変性結合（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ）である。
【００３５】
「潜在エピトープ（ｃｒｙｐｔｉｃ　ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、単離されたペプチドで免疫されることにより応答を誘発するが、該応答は、エピトープを含む無傷のタンパク質全体が抗原として使用される場合にはインビトロで交差反応性でない。
【００３６】
「優性エピトープ」は、ネイティブな抗原全体で免疫する際に免疫応答を誘導するエピトープである（例えば、Ｓｅｒｃａｒｚら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７２９−７６６、１９９３を参照のこと）。このような応答は、単離されたペプチドエピトープとインビトロで交差反応性である。
【００３７】
特定のアミノ酸配列に関して、「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、またはＴ細胞のコンテクストにおいて、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）タンパク質および／または主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識に必要なアミノ酸残基のセットである。インビボまたはインビトロでの免疫系環境において、エピトープは、免疫グロブリン、ＴＣＲまたはＨＬＡ分子により認識される部位をともに形成する分子の集合的な特徴（一次ペプチド構造、二次ペプチド構造および三次ペプチド構造、ならびに電荷など）である。この開示を通して、エピトープおよびペプチドは、しばしば交換可能に用いられる。
【００３８】
本発明のエピトープおよび追加のアミノ酸を含むタンパク質またはペプチド分子は、なお本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。ある実施形態において、本発明のペプチドの長さに対しては制限がある（さもなければ、構築物ではない）。長さが制限された実施形態は、本発明のエピトープを含むタンパク質／ペプチドがネイティブな配列と１００％同一性を有する領域（すなわち、連続した一続きのアミノ酸）を含む場合に起こる。例えば天然分子全体に対し、解釈（ｒｅａｄｉｎｇ）からエピトープの定義を避けるために、ネイティブなペプチド配列と１００％同一性を有する任意の領域の長さに対して制限がある。従って、本発明のエピトープを含むペプチドおよびネイティブなペプチド配列と１００％同一性を有する領域（さもなければ、構築物ではない）について、ネイティブな配列に対して１００％同一性を有する領域は、一般に以下の長さを有する：６００アミノ酸以下、しばしば５００アミノ酸以下、しばしば４００アミノ酸以下、しばしば２５０アミノ酸以下、しばしば１００アミノ酸以下、しばしば８５アミノ酸以下、しばしば７５アミノ酸以下、しばしば６５アミノ酸以下、およびしばしば５０アミノ酸以下。ある実施形態において、本発明の「エピトープ」は、５アミノ酸に至るまでの任意の増分（４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５）において、ネイティブなペプチド配列に対して１００％同一性を有する５１アミノ酸未満の領域を有するペプチドにより含まれる。
【００３９】
従って、６００アミノ酸より長いペプチドまたはタンパク質配列は、それらがネイティブなペプチド配列と１００％同一性を有する６００個のアミノ酸を超える任意の連続する配列を含まない（さもなければ、構築物ではない）限り、本発明の範囲内にある。ネイティブな配列に対応する５つ以下の連続する残基を有する任意のペプチドについては、本発明の範囲内に入れるために、そのペプチドの最大長さに対する制限はない。ＣＴＬエピトープが、８アミノ酸残基に至るまでの任意の増分において６００残基長未満であることは現在好ましい。
【００４０】
「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」は、ヒトクラスＩまたはクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）タンパク質である（Ｓｔｉｔｅｓら、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第８版、Ｌａｎｇｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｌｏｓ　Ａｌｔｏｓ、ＣＡ（１９９４）を参照のこと）。
【００４１】
「ＨＬＡスーパータイプまたはファミリー」は、本明細書中で使用される場合、共有のペプチド結合特異性に基づいて分類されるＨＬＡ分子のセットを記載する。特定のアミノ酸モチーフを有するペプチドに対して幾分類似した結合親和性を共有するＨＬＡクラスＩ分子は、ＨＬＡスーパータイプに分類される。ＨＬＡスーパーファミリー、ＨＬＡスーパータイプファミリー、およびＨＬＡｘｘ様スーパータイプ分子（ここで、ｘｘは、特定のＨＬＡ型を示す）という用語は、類義語である。
【００４２】
本開示全体を通して、結果は「ＩＣ５０」によって表される。ＩＣ５０は、参照ペプチドの結合の５０％阻害が観察される、結合アッセイにおけるペプチド濃度である。このアッセイが行われる条件（すなわち、制限されたＨＬＡタンパク質および標識ペプチド濃度）が与えられると、これらの値は、ＫＤ値に近似する。結合を決定するためのアッセイは、以下に詳細に記載される（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／２０１２７およびＷＯ９４／０３２０５）。ＩＣ５０値は、アッセイ条件が変化する場合、しばしば劇的に変化し得、使用される特定の試薬（例えば、ＨＬＡの調製物など）に依存することは注意すべきである。例えば、過剰な濃度のＨＬＡ分子は、所与のリガンドの見かけの測定されたＩＣ５０を増大させる。
【００４３】
あるいは、結合は、参照ペプチドに対して表される。特定のアッセイがより感度が高くなるか、またはより感度が低くなる場合、試験されたペプチドのＩＣ５０はいくらか変化し得るが、参照ペプチドに対する結合は、有意には変化しない。例えば、参照ペプチドのＩＣ５０が１０倍増大する条件下でのアッセイ実施では、試験ペプチドのＩＣ５０値も約１０倍シフトする。従って、曖昧さを回避するために、ペプチドが良好な、中程度の、弱い、またはネガティブなバインダーである否かの評価は、一般に、標準的なペプチドのＩＣ５０に対するそのＩＣ５０に基づく。
【００４４】
結合はまた、他のアッセイ系を用いて決定され得る。これらのアッセイ系としては、以下を用いるものが挙げられる：生細胞（例えば、Ｃｅｐｐｅｌｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３３９：３９２、１９８９；Ｃｈｒｉｓｔｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ　３５２：６７、１９９１；Ｂｕｓｃｈら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：４４３、１９９９０；Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１８９、１９９１；ｄｅｌ　Ｇｕｅｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５、１９９５）、界面活性剤溶解物を用いる無細胞系（例えば、Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２０６９、１９９１）、固定化された精製ＭＨＣ（例えば、Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２、２８９０、１９９４；Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：４９４６、１９９４）、ＥＬＩＳＡ系（例えば、Ｒｅａｙら、ＥＭＢＯ　Ｊ．１１：２８２９、１９９２）、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｋｈｉｌｋｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５４２５、１９９３）；高フラックス可溶性相アッセイ（Ｈａｍｍｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３５３、１９９４）、およびクラスＩ　ＭＨＣ安定化またはアセンブリの測定（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３４６：４７６、１９９０；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｃｅｌｌ　６２：５６３、１９９０；Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｃｅｌｌ　６２：２８５、１９９０；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１８９６、１９９２）。
【００４５】
本明細書中で使用される、ＨＬＡクラスＩ分子に関する「高親和性」は、５０ｎＭ以下のＩＣ５０またはＫＤ値を有する結合として規定される；「中程度の親和性」は、約５０ｎＭと約５００ｎＭとの間のＩＣ５０またはＫＤ値を有する結合である。ＨＬＡクラスＩＩ分子に対する結合に関する「高親和性」は、１００ｎＭ以下のＩＣ５０またはＫＤ値を有する結合として規定される；「中程度の親和性」は、約１００ｎＭと約１０００ｎＭとの間のＩＣ５０またはＫＤ値を有する結合である。
【００４６】
２つ以上のペプチド配列のコンテクストにおける「同一性の」またはパーセント「同一性」という用語は、配列比較アルゴリズムを用いてまたは手動アラインメントおよび目視により測定される比較ウィンドウでの最大の対応について比較及びアラインしたとき、同じ２つ以上の配列または部分配列あるいは同じアミノ酸残基を特定の割合有する２つ以上の配列または部分配列をいう。
【００４７】
「免疫原性ペプチド」または「ペプチドエピトープ」は、ペプチドがＨＬＡ分子に結合し、ＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘導するような、対立遺伝子特異的モチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドである。従って、本発明の免疫原性ペプチドは適切なＨＬＡ分子に結合することができ、その後に免疫原性ペプチドが由来する抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の応答またはヘルパーＴ細胞の応答を誘導することができる。
【００４８】
「単離された」または「生物学的に純粋な」という句は、通常は、物質がそのネイティブな形態で見出される場合に、この物質に付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質をいう。従って、本発明に従って単離されたペプチドは、好ましくは、それらのインサイチュ環境において、ペプチドと通常関連する物質を含まない。
【００４９】
「連結する」または「結合する」とは、当業界で知られているペプチドを機能的に連結する任意の方法をいい、組換え融合、共有結合、ジスルフィド結合、イオン結合、水素結合および静電的結合を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
「主要組織適合遺伝子複合体」または「ＭＨＣ」は、生理学的免疫応答を担う細胞相互作用の制御において役割を果たす一群の遺伝子である。ヒトにおいて、ＭＨＣ複合体はＨＬＡ複合体としても公知である。ＭＨＣ複合体およびＨＬＡ複合体の詳細な記載については、Ｐａｕｌ、ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、第３版、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９９３を参照のこと。
【００５１】
用語「モチーフ」とは、特定のＨＬＡ分子により認識される規定の長さのペプチド、通常は、クラスＩ　ＨＬＡモチーフについては約８〜約１３アミノ酸のペプチドおよびクラスＩＩ　ＨＬＡモチーフについては約６〜約２５アミノ酸のペプチドにおける残基のパターンをいう。ペプチドモチーフは、通常、各ヒトＨＬＡ対立遺伝子によりコードされる各タンパク質に対して異なり、一次および二次アンカー残基のパターンが異なる。
【００５２】
「ネガティブ結合残基」または「有害残基（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ　ｒｅｓｉｄｕｅ）」は、ペプチドエピトープのある位置（通常、一次アンカー位置ではない）に存在する場合にペプチドの該ペプチドの対応するＨＬＡ分子に対する結合親和性の減少を生じさせるアミノ酸である。「有害残基」でない残基はすべて「非有害残基」である。
【００５３】
「非ネイティブ」配列または「構築物」とは、天然において見出されない、すなわち、「天然に存在しない」配列をいう。このような配列としては、例えば、脂質化ペプチドそうでなければ改変されたペプチド、およびネイティブなタンパク質配列において連続していないエピトープを含むポリエピトープ組成物が挙げられる。
【００５４】
用語「ペプチド」は、本明細書中で「オリゴペプチド」と互換的に使用され、通常、隣接するアミノ酸のα−アミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合によって互いに連結された一連の残基（通常、Ｌ−アミノ酸）を意味する。実施形態によっては、本発明の好ましいＣＴＬ誘導オリゴペプチドは、長さが１３残基以下であり、通常、約８残基と約１１残基との間で構成され、好ましくは９または１０残基である。実施形態によっては、好ましいＨＴＬ誘導オリゴペプチドは、長さが約５０残基未満であり、通常、約６残基と約３０残基との間で構成され、より通常は、約１２残基と約２５残基との間で構成され、しばしば、約１５残基と約２０残基との間で構成される。
【００５５】
「薬学的に許容可能な」とは、一般に、非毒性の、不活性かつ／または生理学的適合性の組成物をいう。
【００５６】
「一次アンカー残基」は、免疫原性ペプチドとＨＬＡ分子との間の接触点を提供すると理解されているペプチド配列に沿った特定の位置でのアミノ酸である。規定された長さのペプチド内の１〜３つ（通常、２つ）の一次アンカー残基は、一般に、免疫原性ペプチドについて「モチーフ」を規定する。これらの残基は、ＨＬＡ分子のペプチド結合溝と最近接で適合し、その側鎖は、結合溝自体の特定のポケットに埋め込まれていることが理解される。１つの実施形態において、一次アンカー残基は、本発明の９残基のペプチドの二位（アミノ末端位置から）およびカルボキシ末端位置に位置する。各モチーフおよびスーパーモチーフの一次アンカー位置は、表１に示される。例えば、アナログペプチドは、これらの一次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を変更することによって作製され得る。そのようなアナログは、特定のモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を細かく調節するために使用される。
【００５７】
「不規則な認識（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）」は、異なるペプチドが多数のＨＬＡ分子のコンテクストにおいて同じＴ細胞クローンにより認識されることである。不規則な結合は、交差反応性結合と類語である。
【００５８】
「防御免疫応答」または「治療免疫応答」とは、感染因子または腫瘍抗原由来の抗原に対するＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答をいう。この応答は、疾患症状または進行を予防するか、または少なくとも部分的に停止する。この免疫応答はまた、ヘルパーＴ細胞の刺激により促進される抗体応答を含み得る。
【００５９】
用語「残基」とは、アミド結合またはアミド結合ミメティックによってオリゴペプチド中に取りこまれているアミノ酸またはアミノ酸ミメティックをいう。
【００６０】
「二次アンカー残基」は、ペプチド結合に影響し得る、ペプチド中の一次アンカーの位置以外の位置のアミノ酸である。二次アンカー残基は、１つの位置におけるアミノ酸のランダムな分布によって予測されるよりも、結合ペプチドの中で有意に高い頻度で生じる。この二次アンカー残基は、「二次アンカー位置」で生じるといわれる。二次アンカー残基は、高い親和性結合ペプチドの中で高い頻度で存在する残基と同定され得るか、あるいは高い親和性結合で会合する他の残基と同定され得る。例えば、アナログペプチドは、これらの二次アンカー位置における特定の残基の存在または非存在を変更することによって作製され得る。そのようなアナログは、特定のモチーフまたはスーパーモチーフを含むペプチドの結合親和性を精密に調節するために使用される。
【００６１】
「亜優性エピトープ（ｓｕｂｄｏｍｉｎａｎｔ　ｅｐｉｔｏｐｅ）」は、エピトープを含む抗原全体で免疫した際にほとんどまたは全く応答を引き起こさないエピトープであるが、単離ペプチドで免疫することによって応答が得られ、この応答（潜在エピトープの場合とは異なる）はタンパク質全体を用いてインビトロまたはインビボでの応答をリコールする場合に検出される。
【００６２】
「スーパーモチーフ」は、２つ以上のＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるＨＬＡ分子により共有されるペプチド結合特異性である。好ましくは、スーパーモチーフを有するペプチドは、２つ以上のＨＬＡ抗原により、（本明細書中で規定される）高親和性または中程度の親和性で認識される。
【００６３】
「合成ペプチド」とは、化学合成または組換えＤＮＡ技術のような方法を用いた人工ペプチドをいう。
【００６４】
本明細書中で用いられる「ワクチン」は、１つ以上の本発明のペプチドを含む組成物である。本発明のワクチンの多くの実施形態が存在する（例えば、１つ以上のペプチドのカクテル；ポリエピトープペプチドにより構成された本発明の１つ以上のエピトープ；あるいはこのようなペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸（例えば、ポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子）によるもの）。「１つ以上のペプチド」は、１〜１５０の任意の全単位整数、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、または１５０以上の本発明のペプチドを含み得る。このペプチドまたはポリペプチドは、例えば、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、標的化配列または他の配列の付加によって、任意選択により改変することができる。本発明のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと混合されるか連結されて、細胞傷害性Ｔリンパ球およびヘルパーＴリンパ球の両方の活性化を促進し得る。ワクチンはまた、ペプチドパルス化抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含み得る。
【００６５】
ペプチド化合物を記載するために用いた名称は、各アミノ酸残基のアミノ基が左（Ｎ末端）に示され、カルボキシル基が右（Ｃ末端）に示される、従来の慣行に従う。アミノ酸残基位置がペプチドエピトープにおいて言及される場合、それらは、アミノからカルボキシルの方向に番号付けされ、１位はアミノ末端に最も近い位置である。本発明の選択された特定の実施形態を示す式において、アミノ末端基およびカルボキシル末端基は、他に特定されなければ、それらが生理学的ｐＨ値において呈する形態にある。アミノ酸構造式において、各残基は、一般に標準的な３文字または１文字表記により示される。アミノ酸残基のＬ形態は、大文字の１文字記号または最初が大文字の３文字記号により示される。そしてＤ形態を有するこれらのアミノ酸のＤ形態は、小文字の１文字記号または小文字の３文字記号により示される。グリシンは、不斉炭素原子を有さず、単に「Ｇｌｙ」または「Ｇ」と示される。アミノ酸の記号を以下に示す。
【００６６】
【表１】
2004508320.tif 000002
【００６７】
ＩＶ．Ｂ．ＨＢＶに対するＣＴＬ応答およびＨＴＬ応答の刺激
Ｔ細胞が抗原を認識する機構は、過去十年の間に詳細に示されてきた。本発明者らの免疫系の新たな理解に基づいて、本発明者らは、広範な集団においてＨＢＶ感染に対する治療的または予防的免疫応答を誘導し得る有効なペプチドエピトープワクチン組成物を創造した。本願組成物の価値および有効性の理解のために、免疫学関連技術の簡単な総説を提供する。
【００６８】
ＨＬＡ分子とペプチド抗原の複合体は、ＨＬＡ拘束Ｔ細胞により認識されるリガンドとして働く（Ｂｕｕｓ，Ｓ．ら、Ｃｅｌｌ　４７：１０７１、１９８６；Ｂａｂｂｉｔｔ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　３１７：３５９、１９８５；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ａ．およびＢｏｄｍｅｒ，Ｈ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：６０１、１９８９；Ｇｅｒｍａｉｎ，Ｒ．Ｎ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：４０３、１９９３）。単一のアミノ酸置換抗原アナログの研究および内因的に結合し天然でプロセシングされたペプチドの配列決定を通して、ＨＬＡ抗原分子に対する特異的結合に必要なモチーフに対応する重要な残基が同定され、本明細書中に記載され、そして表Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩに示される（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３、１９９８；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　４１：１７８、１９９５；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、ＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ウェブを介して以下にアクセスすること：ｈｔｔｐ：／／１３４．２．９６．２２１／ｓｃｒｉｐｔｓ．ｈｌａｓｅｒｖｅｒ．ｄｌｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍ）；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４７８、１９９８；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｖ．Ｈ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１３、１９９４；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＧｒｅｙ，Ｈ．Ｍ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：７９、１９９２；Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ，Ｆ．およびＨａｍｍｅｒ，Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：５２、１９９４；Ｒｕｐｐｅｒｔら、Ｃｅｌｌ　７４：９２９−９３７、１９９３；Ｋｏｎｄｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：４３０７−４３１２、１９９５；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０−３４９０、１９９６；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３、１９９６；Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＳｉｄｎｅｙ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（印刷中）、１９９９もまた参照のこと）。
【００６９】
さらに、ＨＬＡ−ペプチド複合体のＸ線結晶解析により、対立遺伝子特異的様式でペプチドリガンドが保有する残基と適応するＨＬＡ分子のペプチド結合窪み（ｐｅｐｔｉｄｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｃｌｅｆｔ）内のポケットが明らかになった；次に、これらの残基によってこれらの残基が存在するペプチドのＨＬＡ結合能力が決定される（例えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５８７、１９９５；Ｓｍｉｔｈら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　４：２０３、１９９６；Ｆｒｅｍｏｎｔら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　８：３０５、１９９８；Ｓｔｅｒｎら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　２：２４５、１９９４；Ｊｏｎｅｓ，Ｅ．Ｙ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：７５、１９９７；Ｂｒｏｗｎ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　３６４：３３、１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：８０５３、１９９３；Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　３６０：３６４、１９９２；Ｓｉｌｖｅｒ，Ｍ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　３６０：３６７、１９９２；Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：９２７、１９９２；Ｍａｄｄｅｎら、Ｃｅｌｌ　７０：１０３５、１９９２；Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５７：９１９、１９９２；Ｓａｐｅｒ，Ｍ．Ａ．、Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．およびＷｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：２７７、１９９１を参照のこと）。
【００７０】
従って、クラスＩおよびクラスＩＩの対立遺伝子特異的ＨＬＡ結合モチーフ、またはクラスＩスーパーモチーフの規定は、特定のＨＬＡ抗原を結合する能力を有するタンパク質内の領域の同定を可能にする（例えば、Ｓｅｔｔｅ，Ａ．およびＧｒｅｙ，Ｈ．Ｍ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：７９、１９９２；Ｓｉｎｉｇａｇｌｉａ，Ｆ．およびＨａｍｍｅｒ，Ｊ．、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：５２、１９９４；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ、Ｖ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１３、１９９４；Ｋａｓｔ，Ｗ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：３９０４、１９９４も参照）。
【００７１】
さらに、ペプチドとＨＬＡとの間の相互作用の親和性を定量する様々なアッセイが確立された。こうしたアッセイは、例えば、ＩＣ５０値、抗原提示阻害の測定（Ｓｅｔｔｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３８９３、１９９１）、インビトロアセンブリアッセイ（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｃｅｌｌ　６２：２８５、１９９０）解離率測定（Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１８９６−１９０４、１９９２）およびＲＭＡ．Ｓなどの変異細胞を用いたＦＡＣＳ−ベースアッセイ（Ｍｅｌｉｅｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２９６３、１９９１）。
【００７２】
本発明者らは、結合親和性と免疫原性との相関が、候補ペプチドを評価する場合に考慮されるべき重要な因子であることを見出した。従って、モチーフ検索とＨＬＡ−ペプチド結合アッセイとの組合せにより、エピトープベースワクチンの候補が同定された。それらの結合親和性を決定した後、さらなる確認作業を行って、これらのワクチン候補の中で、抗原性および免疫原性の点で好ましい特徴を有するエピトープを選択し得る。種々のストラテジーを利用して、免疫原性を評価し得る。これらのストラテジーとしては、以下が挙げられる：
１）正常個体由来の初代Ｔ細胞培養物の評価（例えば、Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６０３、１９９５；Ｃｅｌｉｓ，Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：２１０５、１９９４；Ｔｓａｉ，Ｖ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１７９６、１９９７；Ｋａｗａｓｈｉｍａ，Ｉ．ら、Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．５９：１、１９９８）；この手順は、正常被験体由来のＰＢＬを、インビトロで抗原提示細胞の存在下で数週間にわたり試験ペプチドで刺激することを包含する。このペプチドに特異的なＴ細胞は、この期間に活性化され、そして例えば、ペプチド感作標的細胞に伴う５１Ｃｒ放出アッセイを用いて検出される。
２）ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７、１９９６；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈ，Ｐ．Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６５１、１９９６；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３、１９９７）；この方法において、不完全フロイントアジュバント中のペプチドをＨＬＡトランスジェニックマウスの皮下に投与する。免疫して数週間後に、脾細胞を取り出し、そしてインビトロで約１週間にわたり試験ペプチドの存在下で培養する。ペプチド特異的Ｔ細胞は、例えば、ペプチド感作標的細胞および内因的に生成した抗原を発現する標的細胞に伴う５１Ｃｒ放出アッセイを用いて検出される。
３）感染から回復した免疫個体、および／または慢性的に感染した患者からのリコールＴ細胞応答の実証（Ｒｅｈｅｒｍａｎｎ，Ｂ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：１０４７、１９９５；Ｄｏｏｌａｎ，Ｄ．Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　７：９７、１９９７；Ｂｅｒｔｏｎｉ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３、１９９７；Ｔｈｒｅｌｋｅｌｄ，Ｓ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１６４８、１９９７；Ｄｉｅｐｏｌｄｅｒ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６０１１、１９９７）。このストラテジーを適用する際に、リコール応答は、例えば、感染を通じて天然に抗原に曝され、従って、「天然に」免疫応答を生成した被験体由来のＰＢＬを培養することによって検出される。被験体由来のＰＢＬを、インビトロで試験ペプチドおよび抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下で１〜２週間の間培養して、「ナイーブな」Ｔ細胞と比較して、「記憶」Ｔ細胞の活性化を可能にする。培養期間の終わりに、Ｔ細胞活性を、ペプチド感作された標的、Ｔ細胞増殖、またはリンホカイン放出を伴う５１Ｃｒ放出を含むＴ細胞活性についてのアッセイを用いて検出する。
【００７３】
以下は、本発明のペプチドエピトープおよび対応する核酸を記載する。
【００７４】
ＩＶ．Ｃ．ＨＬＡ分子に対するペプチドエピトープの結合親和性
ここに示すように、高度なＨＬＡ多型は、ワクチン開発へのエピトープベースのアプローチと共に考慮すべき重要な因子である。この因子に取り組むために、高いかまたは中程度の親和性で複数のＨＬＡ分子に結合し得るペプチドを同定する工程を包含するエピトープの選択が好ましくは使用され、最も好ましくは、これらのエピトープは、高いかまたは中程度の親和性で２つ以上の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子に結合する。
【００７５】
ワクチン組成物のための目的のＣＴＬ誘導ペプチドとしては、好ましくは、ＩＣ５０またはクラスＩ　ＨＬＡ分子に対する結合親和性の値が５００ｎＭ以下であるペプチドが挙げられる。ＨＴＬ誘導ペプチドとしては、好ましくは、ＩＣ５０またはクラスＩＩ　ＨＬＡ分子に対する結合親和性の値が１０００ｎＭ以下であるペプチドが挙げられる。例えば、ペプチド結合は、インビトロにおいて候補ペプチドが精製ＨＬＡ分子に結合する能力を試験することによって評価される。次いで、高いかまたは中程度の親和性を示すペプチドは、さらなる分析のために考察される。選択されたペプチドは、スーパータイプファミリーの他のメンバーについて試験される。好ましい実施形態において、交差反応結合を阻害するペプチドは、次いで、ワクチンまたは細胞スクリーニング分析において使用される。
【００７６】
本明細書に開示するように、高いＨＬＡ結合親和性は、より大きな免疫原性と相関している。より大きな免疫原性は、いくつかの異なる様式において明確であり得る。免疫原性は、免疫応答が少しでも誘発されるか否か、および任意の特定の応答の効力に対応する。例えば、ペプチドは、強力な応答を生成する場合を除いて、集団の多様なアレイにおける免疫応答を引き起こし得る。これらの原理に従って、９０％近い高結合ペプチドは、中程度の親和性で結合するペプチドの約５０％と対照してみると、免疫原性であることが見出されている。さらに、高結合親和性ペプチドは、より強力な免疫原性応答を引き起こす。結果として、高親和性結合ペプチドが使用される場合、ペプチドは同様の生物学的効果を引き起こす必要はあまりない。従って、本発明の好ましい実施形態において、高結合エピトープが特に望ましい。
【００７７】
ＨＬＡクラスＩ分子に対する結合親和性と結合抗原上の別個のペプチドエピトープの免疫原性との間の関係は、本発明者によって当該分野で初めて決定された。結合親和性と免疫原性との間の相関は、２つの異なる実験的なアプローチで分析された（Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：５５８６−５５９２、１９９４）。第１のアプローチにおいて、１０，０００倍の範囲を超えるＨＬＡ結合親和性の範囲の潜在性あるエピトープの免疫原性が、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウスにおいて分析された。第２のアプローチにおいて、約１００個の異なるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来潜在的エピトープ（全てが、Ａ＊０２０１結合モチーフを保有する）の抗原性は、急性肝炎の患者由来のＰＢＬ（末梢血リンパ球）を使用することによって評価された。これらのアプローチに従って、約５００ｎＭ（好ましくは、ＩＣ５０値が５００ｎＭ以下）の親和性閾値はペプチドエピトープがＣＴＬ応答を引き起こす能力を決定することが決定された。これらのデータは、天然でプロセシングされたペプチドおよび合成Ｔ細胞エピトープに対するクラスＩ結合親和性の測定について当てはまる。これらのデータはまた、Ｔ細胞応答の具現における決定因子の選択の重要な役割を示す。
【００７８】
ＨＬＡクラスＩＩ　ＤＲ分子の状況における免疫原性に関連する親和性閾値も示されている（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１６０：３３６３−３３７３、１９９８、および１９９８年５月２９日出願の米国特許出願番号６０／０８７１９２）。ＤＲ結合親和性の生物学的に有意な閾値を規定するために、３２個のＤＲ拘束エピトープのそれらの拘束エレメントに対する結合親和性のデータベースが集計された。これらの場合の約半分（３２個のエピトープのうち１５個）において、ＤＲ拘束は高結合親和性（すなわち、ＩＣ５０値が１００ｎＭ以下の結合親和性値）に関連していた。これらの場合の残りの半分（３２個のうちの１６個）において、ＤＲ拘束は中程度の親和性（１００〜１０００ｎＭ範囲の結合親和性値）に関連していた。３２個の場合のうちただ１つにおいて、ＤＲ制限は１０００ｎＭ以上のＩＣ５０に関連していた。従って、１０００ｎＭは、ＤＲ分子の状況における免疫原性に関連する親和性閾値として定義され得る。
【００７９】
ＨＬＡ分子に対するペプチドの結合親和性は、以下の実施例１のように決定され得る。
【００８０】
ＩＶ．Ｄ．ペプチドエピトープ結合モチーフおよびスーパーモチーフ（Ｓｕｐｅｒｍｏｔｉｆ）
この数年間で、大部分のＨＬＡクラスＩおよびおそらくクラスＩＩ分子が、ペプチド結合レパートリーが大きく重複すること及び主要なペプチド結合ポケットのコンセンサス構造によって特徴付けられる比較的わずかなスーパータイプに分類することができることを示す証拠が蓄積されている。
【００８１】
ＨＬＡ分子ポケット分析について、結晶学的研究（Ｇｕｏ，Ｈ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　３６０：３６４、１９９２；Ｓａｐｅｒ，Ｍ．Ａ．、Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｐ．Ｊ．およびＷｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：２７７、１９９１；Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｇａｒｂｏｃｚｉ，Ｄ．Ｎ．およびＷｉｌｅｙ，Ｄ．Ｃ．、Ｃｅｌｌ　７５：６９３、１９９３）において記載されるようなＨＬＡクラスＩ分子のＢおよびＦポケットを含む残基が、Ｐａｒｈａｍらのデータベースから集計された（Ｐａｒｈａｍ，Ｐ．、Ａｄａｍｓ，Ｅ．Ｊ．、およびＡｒｎｅｔｔ，Ｋ．Ｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１４３：１４１、１９９５）。これらの分析において、残基９、４５、６３、６６、６７、７０および９９は、Ｂポケットを構成すると考えられ、ペプチドリガンドの２位における残基に対する特異性を決定すると考えられた。同様に、残基７７、８０、８１および１１６は、Ｆポケットの特異性を決定すると考えられ、ＨＬＡ分子により結合されたペプチドリガンドのＣ末端残基に対する特異性を決定すると考えられた。
【００８２】
単一のアミノ酸置換抗原アナログの研究、および内因的に結合し天然でプロセシングされたペプチドの配列決定を通して、ＨＬＡ分子に対する対立遺伝子特異的結合に必要な重要な残基が同定された。これらの残基の存在は、ＨＬＡ分子に対する結合親和性と相関する。高いかまたは中程度の親和性結合に相関するモチーフおよび／またはスーパーモチーフの同定は、ワクチンに含有させるための免疫原性ペプチドエピトープの同定に関する重要な問題である。Ｋａｓｔら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９０４−３９１２、１９９４）は、モチーフ保有ペプチドは、対立遺伝子特異的ＨＬＡクラスＩ分子に結合するエピトープの９０％を構成することを示した。この研究において、９個のアミノ酸長かつ８個のアミノ酸が重なる全ての可能なペプチド（２４０個のペプチド）（これはヒト乳頭腫ウイルス属１６型のＥ６およびＥ７タンパク質の配列全体をカバーする）は、異なる人種間で高頻度で発現される５個の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子への結合について評価された。この偏りのないペプチドのセットは、ＨＬＡクラスＩモチーフの予測値の評価を可能にした。２４０個のペプチドのセットから、高いかまたは中程度の親和性を有する対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子に結合する２２個のペプチドが同定された。これらの２２個のペプチドのうち、２０個（すなわち、９１％）はモチーフを保有していた。従って、この研究は、ワクチンに含有させるためのペプチドエピトープの同定のためのモチーフの値を説明し、モチーフベースの同定技術の適用は潜在性あるエピトープの９０％のスクリーニングを排除する。
【００８３】
このようなペプチドエピトープは、以下に記載される表で同定される。ＨＬＡクラスＩエピトープのための表１は対立遺伝子特異的ＨＬＡクラスＩ分子と中程度のまたは高い親和性で結合するペプチドの９０％以上を含む。
【００８４】
本発明のペプチドはまた、ＭＨＣクラスＩＩ　ＤＲ分子に結合するエピトープを含み得る。クラスＩとクラスＩＩのＨＬＡ分子間の顕著な相違は、クラスＩ分子に結合するペプチドについては厳格なサイズ制限が存在するものの、ペプチドのＮ末端およびＣ末端に対する、モチーフのサイズおよび結合フレームの位置の両方におけるより大きな程度の異質性がクラスＩＩペプチドリガンドについては示され得ることである。この異質性の増加は、クラスＩの対応物と異なり両端で開いているクラスＩＩ分子の結合溝の構造に由来する。ＤＲＢ＊０１０１ペプチド複合体の結晶学的分析（例えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ｄ．Ｒ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５８７、１９９５を参照のこと）は、ＤＲＢ＊０１０１と複合化したペプチドの１位および位置６を占める残基がＤＲＢａ＊０１０１分子上の２つの相補的なポケットに結合し、Ｐ１位置が最も重要なアンカー残基および最も深い疎水性ポケットに対応することを示した。他の研究はまた、Ｐ６位置を様々な他のＤＲ分子に結合する重要なアンカー残基として指摘した。
【００８５】
従って、本発明のペプチドは、いくつかのＨＬＡ特異的アミノ酸モチーフの任意の１つによって同定される（例えば、表Ｉ−ＩＩＩを参照のこと）。モチーフの存在がいくつかの対立遺伝子特異的ＨＬＡ抗原に結合する能力と対応する場合、これはスーパーモチーフと称される。特定のアミノ酸モチーフを有するペプチドに結合する対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、包括的にＨＬＡ「スーパーモチーフ」と称される。
【００８６】
以下に記載されるペプチドモチーフおよびスーパーモチーフは、本発明のペプチドの同定および使用のためのガイダンスを提供する。
【００８７】
それぞれのスーパーモチーフまたはモチーフを保有するペプチドエピトープの例は、各モチーフまたはスーパーモチーフの説明において示されるような表に挙げられる。これらの表は、ペプチドエピトープのいくつかについての結合親和性比のリストを含む。この比は以下の式を使用することによって、ＩＣ５０に変換され得る：標準ペプチドのＩＣ５０／比＝試験ペプチド（すなわち、ペプチドエピトープ）のＩＣ５０。クラスＩペプチドに対する結合親和性を決定するために使用される標準ペプチドのＩＣ５０値は、表ＩＶに示される。クラスＩＩペプチドに対する結合親和性を決定するために使用される標準ペプチドのＩＣ５０値は、表Ｖに示される。結合アッセイのための標準として使用されるペプチドは、標準の例であり；代替の標準ペプチドはまた、このような分析を実施する場合に使用され得る。
【００８８】
各表に列挙されるペプチドエピトープ配列を得るために、２０個のＨＢＶ株（ＨＰＢＡＤＲ、ＨＰＢＡＤＲｌＣＧ、ＨＰＢＡＤＲＡ、ＨＰＢＡＤＲＣ、ＨＰＢＡＤＲＣＧ、ＨＰＢＣＧＡＤＲ、ＨＰＢＶＡＤＲＭ、ＨＰＢＡＤＷ、ＨＰＢＡＤＷ１、ＨＰＢＡＤＷ２、ＨＰＢＡＤＷ３、ＨＰＢＡＤＷＺ、ＨＰＢＨＥＰＢ、ＨＰＢＶＡＤＷ２、ＨＰＢＡＹＲ、ＨＰＢＶ、ＨＰＢＶＡＹＷＣ、ＨＰＢＶＡＹＷＣＩ、ＮＡＤ　ＨＰＢＶＡＹＷＥ）から得たタンパク質配列データが、指定されたスーパーモチーフまたはモチーフの存在について評価された。ペプチドエピトープも保存性に基づいて評価された。保存性の基準は、ペプチドの配列全体が、特定のタンパク質について利用可能な配列の７５％において全体的に保存されていることを必要とする。選択されたペプチドエピトープの保存百分率は表に示される。頻度、すなわち、この２０個の株のうち全体的に保存されるペプチド配列が同定された株の数も示される。表中の「第１位置」のカラムは、エピトープの最初のアミノ酸残基に対応するＨＢＶタンパク質のアミノ酸位置を示す。「アミノ酸の数」は、エピトープ配列中の残基の数を示す。
【００８９】
ＣＴＬ誘導ペプチドエピトープを示すＨＬＡクラスＩモチーフ
以下に示されるＨＬＡクラスＩペプチドエピトープスーパーモチーフおよびモチーフの一次アンカー残基を表Ｉに要約する。表Ｉ（ａ）に記載されるＨＬＡクラスＩモチーフは本願特許請求の範囲に記載された本発明に最も関連するものである。一次および二次アンカー位置は表ＩＩに要約される。ＨＬＡクラスＩスーパータイプファミリーを含む対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は表ＶＩに列挙される。
【００９０】
ＩＶ．Ｄ．１．ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフは、エピトープの２位における小さな（ＴまたはＳ）または疎水性の（Ｌ、Ｉ、ＶまたはＭ）一次アンカー残基及びエピトープのＣ末端位における芳香族の（Ｙ、ＦまたはＷ）一次アンカー残基のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。Ａ１スーパーモチーフ（すなわち、ＨＬＡ−Ａ１スーパータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応するファミリーは、少なくともＡ＊０１０１、Ａ＊２６０１、Ａ＊２６０２、Ａ＊２５０１、およびＡ＊３２０１からなる（例えば、ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：５９３０、１９９３；ＤｉＢｒｉｎｏ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：６２０、１９９４；Ｋｏｎｄｏ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　４５：２４９、１９９７を参照のこと）。Ａ１スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに示される。個々のＨＬＡタンパク質の各々に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフに対して指定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【００９１】
Ａ１スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表ＶＩＩに記載される。
【００９２】
ＩＶ．Ｄ．２．ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ
対立遺伝子特異的ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対する一次アンカーの特異性（Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ　３５１：２９０−２９６、１９９１；Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５５：１２６１−１２６３、１９９２）、およびＨＬＡ　Ａ２ファミリー内の交差反応結合（Ｆｒｕｃｉら、Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８：１８７−１９２、１９９３；Ｔａｎｉｇａｋｉら、Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．３９：１５５−１６２、１９９４）が記載されている。本発明者らは、複数の対立遺伝子特異的ＨＬＡ　Ａ２分子への交差反応結合を決定するさらなる一次アンカー残基を規定した（Ｄｅｌ　Ｇｕｅｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５−６９３、１９９５）。ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフは、エピトープの２位に一次アンカー残基としてのＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱ及びエピトープのＣ末端位に一次アンカー残基としてのＬ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴを有するペプチドリガンドを含む。
【００９３】
ＨＬＡ分子の対応するファミリー（すなわち、これらのペプチドに結合するＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ）は、少なくともＡ＊０２０１、Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、Ａ＊０２０９、Ａ＊０２１４、Ａ＊６８０２、およびＡ＊６９０１からなる。Ａ２スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに示される。以下に詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々への結合は、一次アンカーおよび／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはこのスーパーモチーフに対して指定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【００９４】
Ａ２スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表ＶＩＩＩに記載される。２位において一次アンカー残基Ｖ、Ａ、ＴまたはＱを含み、Ｃ末端位においてＬ、Ｉ、Ｖ、ＡまたはＴを含むモチーフは、本願の特許請求の範囲に記載された発明に特に最も関連するものである。
【００９５】
ＩＶ．Ｄ．３．ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフは、エピトープの２位における一次アンカーとしてのＡ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＳまたはＴ及びエピトープのＣ末端（すなわち、９マーの９位）における一次アンカーとしての正電荷の残基ＲまたはＫのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。Ａ３スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子（ＨＬＡ−Ａ３スーパータイプ）の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともＡ＊０３０１、Ａ＊１１０１、Ａ＊３１０１、Ａ＊３３０１およびＡ＊６８０１を含む。Ａ３スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに示される。以下で詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的ＨＬＡタンパク質の各々に結合するペプチドは、ペプチドの一次および／または二次アンカー位置におけるアミノ酸の置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【００９６】
Ａ３スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表ＩＸに記載される。
【００９７】
ＩＶ．Ｄ．４．ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフは、エピトープの２位における一次アンカーとしての芳香族残基（Ｆ、ＷまたはＹ）及びエピトープのＣ末端位における一次アンカーとしての疎水性残基（Ｙ、Ｆ、Ｌ、Ｉ、ＶまたはＭ）のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。Ａ２４スーパーモチーフ（すなわち、Ａ２４スーパータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応するファミリーは、少なくともＡ＊２４０２、Ａ＊３００１およびＡ＊２３０１を含む。Ａ２４スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに示される。対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【００９８】
Ａ２４スーパーモチーフを含む代表的ペプチドエピトープは、表Ｘに記載される。
【００９９】
ＩＶ．Ｄ．５．ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフは、エピトープの２位における一次アンカーとしてのプロリン及びエピトープのＣ末端位における一次アンカーとしての疎水性または脂肪族のアミノ酸（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、Ｆ、ＷまたはＹ）を保有するペプチドによって特徴付けられる。Ｂ７スーパーモチーフに結合するＨＬＡ分子（すなわち、ＨＬＡ−Ｂ７スーパータイプ）の対応するファミリーは、Ｂ＊０７０２、Ｂ＊０７０３、Ｂ＊０７０４、Ｂ＊０７０５、Ｂ＊１５０８、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊３５０２、Ｂ＊３５０３、Ｂ＊３５０４、Ｂ＊３５０５、Ｂ＊３５０６、Ｂ＊３５０７、Ｂ＊３５０８、Ｂ＊５１０１、Ｂ＊５１０２、Ｂ＊５１０３、Ｂ＊５１０４、Ｂ＊５１０５、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４０１、Ｂ＊５５０１、Ｂ＊５５０２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊５６０２、Ｂ＊６７０１、およびＢ＊７８０１を含む少なくとも２６個のＨＬＡ−Ｂタンパク質からなる（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７、１９９５；Ｂａｒｂｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．５：１７９、１９９５；Ｈｉｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ　３６０：４３４、１９９２；Ｒａｍｍｅｎｓｅｅら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ　４１：１７８、１９９５を参照のこと）。Ｂ７スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに示される。以下に詳細に説明されるように、個々の対立遺伝子特異的ＨＬＡタンパク質の各々に結合するペプチドは、ペプチドの一次および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【０１００】
Ｂ７スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表ＸＩに記載される。
【０１０１】
ＩＶ．Ｄ．６．ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ｂ２７スーパーモチーフは、エピトープの２位における一次アンカーとしての正電荷の残基（Ｒ、ＨまたはＫ）及びエピトープのＣ末端位における一次アンカーとしての疎水性の残基（Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｗ、Ｍ、Ｉ、ＡまたはＶ）のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。Ｂ２７スーパーモチーフ（すなわち、Ｂ２７スーパータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともＢ＊１４０１、Ｂ＊１４０２、Ｂ＊１５０９、Ｂ＊２７０２、Ｂ＊２７０３、Ｂ＊２７０４、Ｂ＊２７０５、Ｂ＊２７０６、Ｂ＊３８０１、Ｂ＊３９０１、Ｂ＊３９０２、およびＢ＊７３０１を含む。Ｂ２７スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに示される。対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【０１０２】
Ｂ２７スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表ＸＩＩに記載される。
【０１０３】
ＩＶ．Ｄ．７．ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ｂ４４スーパーモチーフは、エピトープの２位における一次アンカーとしての負電荷の残基（ＤまたはＥ）及びエピトープのＣ末端位における一次アンカーとしての疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、ＶまたはＡ）のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。Ｂ４４スーパーモチーフ（すなわち、Ｂ４４スーパータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともＢ＊１８０１、Ｂ＊１８０２、Ｂ＊３７０１、Ｂ＊４００１、Ｂ＊４００２、Ｂ＊４００６、Ｂ＊４４０２、Ｂ＊４４０３、およびＢ＊４００６を含む。対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【０１０４】
ＩＶ．Ｄ．８．ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ｂ５８スーパーモチーフは、エピトープの２位における一次アンカー残基としての小さな脂肪族残基（Ａ、ＳまたはＴ）及びエピトープのＣ末端位における一次アンカー残基としての芳香族または疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＭまたはＡ）のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。Ｂ５８スーパーモチーフ（すなわち、Ｂ５８スーパータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともＢ＊１５１６、Ｂ＊１５１７、Ｂ＊５７０１、Ｂ＊５７０２、およびＢ＊５８０１を含む。Ｂ５８スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに示される。対立遺伝子特異的分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【０１０５】
Ｂ５８スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表ＸＩＩＩに記載される。
【０１０６】
ＩＶ．Ｄ．９．ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフ
ＨＬＡ−Ｂ６２スーパーモチーフは、エピトープの２位における一次アンカーとしての極性の脂肪族残基Ｑまたは疎水性の脂肪族残基（Ｌ、Ｖ、Ｍ、またはＩ）及びエピトープのＣ末端位における一次アンカーとして、疎水性残基（Ｆ、Ｗ、Ｙ、Ｍ、Ｉ、Ｖ、ＬまたはＡ）のペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。Ｂ６２スーパーモチーフ（すなわち、Ｂ６２スーパータイプ）に結合するＨＬＡ分子の対応するファミリーの例示的なメンバーは、少なくともＢ＊１５０１、Ｂ＊１５０２、Ｂ＊１５１３、およびＢ＊５２０１を含む。Ｂ６２スーパーファミリーのメンバーであることが予測される他の対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子は、表ＶＩに示される。対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子の各々に結合するペプチドは、一次アンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【０１０７】
Ｂ６２スーパーモチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表ＸＩＶに記載される。
【０１０８】
ＩＶ．Ｄ．１０．ＨＬＡ−Ａ１モチーフ
対立遺伝子特異的ＨＬＡ−Ａ１モチーフは、エピトープの２位における一次アンカー残基として、のＴ、ＳまたはＭ及びエピトープのＣ末端位における一次アンカー残基としてのＹのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。代替の対立遺伝子特異的Ａ１モチーフ（すなわち、「サブモチーフ」）は、２位よりむしろ３位における一次アンカー残基によって特徴付けられる。このサブモチーフは、エピトープの３位における一次アンカー残基としてのＤ、Ｅ、ＡまたはＳ及びＣ末端位における一次アンカー残基としてのＹの存在によって特徴付けられる。伸長したサブモチーフは、３位におけるＤの存在およびＣ末端位におけるＡ、Ｉ、ＬまたはＦの存在によって特徴付けられる。ＨＬＡ　Ａ１に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【０１０９】
Ａ１モチーフのいずれかを含む代表的なペプチドエピトープは、添付の表ＸＶに記載される。２位にＴ、ＳまたはＭを、およびＣ末端位にＹを含むこれらのエピトープはまた、表ＶＩＩに列挙されるＨＬＡ−Ａ１スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープの表に含まれる。
【０１１０】
ＩＶ．Ｄ．１１．ＨＬＡ−Ａ２．１モチーフ
対立遺伝子特異的ＨＬＡ−Ａ２．１モチーフは、９個のアミノ酸エピトープの２位における一次アンカー残基としてのＬまたはＭ及び９個のアミノ酸エピトープのＣ末端位における一次アンカー残基としてのＬまたはＶのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられることが決定された（Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ　３５１：２９０−２９６、１９９１）。さらに、Ａ２．１モチーフは、９個のアミノ酸ペプチドの２位においてＩを含み、Ｃ末端においてＩまたはＡをさらに含むことが決定された（Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５５：１２６１−１２６３、Ｍａｒｃｈ　６、１９９２）。さらに、Ａ２．１対立遺伝子特異的モチーフは、Ｃ末端位にＴを含むことが見出された（Ｋａｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９０４−３９１２、１９９４）。続いて、本発明者らによって、Ａ２．１対立遺伝子特異的モチーフは、Ｖ、Ａ、ＴまたはＱをエピトープの２位に一次アンカー残基としてさらに含むことが規定され、ＭをＣ末端位に一次アンカー残基として含むことが規定されている。従って、ＨＬＡ−Ａ２．１モチーフは、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ａ、ＴまたはＱを有するペプチドリガンドをエピトープの２位に一次アンカー残基として含み、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、ＡまたはＴを、エピトープのＣ末端位における一次アンカー残基として含む。ＨＬＡ−Ａ２．１モチーフの一次アンカー位置を特徴付ける好ましくかつ寛容される残基は、Ａ２スーパーモチーフを示す好ましい残基と同一である（関連のデータの総説については、例えば、Ｄｅｌ　Ｇｕｅｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：６８５−６９３、１９９５；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ　１７：２６１−２６６、１９９６；ＳｅｔｔｅおよびＳｉｄｎｅｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：４７８−４８２、１９９８を参照のこと）。Ａ２．１モチーフを特徴付ける二次アンカー残基は、本明細書中で開示されるように、さらに定義されている。これらは、表ＩＩに開示される。ＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【０１１１】
Ａ２．１モチーフを含む代表的ペプチドエピトープは、表ＶＩＩに記載される。一次アンカー残基Ｖ、Ａ、ＴまたはＱを２位に含み、Ｌ、Ｉ、Ｖ、ＡまたはＴをＣ末端位に含むＡ２．１モチーフは、本明細書中で、特許請求の範囲に記載された発明に特に最も関連するものである。
【０１１２】
ＩＶ．Ｄ．１２．ＨＬＡ−Ａ３モチーフ
対立遺伝子特異的ＨＬＡ−Ａ３モチーフは、エピトープの２位における一次アンカー残基としてのＬ、Ｍ、Ｖ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｔ、Ｆ、Ｃ、ＧまたはＤ及びエピトープのＣ末端位における一次アンカー残基としてのＫ、Ｙ、Ｒ、Ｈ、ＦまたはＡのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。ＨＬＡ−Ａ３に結合するペプチドは、一次および／または二次アンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【０１１３】
代表的なＡ３モチーフを含むペプチドエピトープは、表ＸＶＩに記載される。Ａ３スーパーモチーフを含むペプチドエピトープも表ＩＸに列挙される。
【０１１４】
ＩＶ．Ｄ．１３．ＨＬＡ−Ａ１１モチーフ
対立遺伝子特異的ＨＬＡ−Ａ１１モチーフは、エピトープの２位における一次アンカー残基としてのＶ、Ｔ、Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｓ、Ａ、Ｇ、Ｎ、Ｃ、ＤまたはＦ及びエピトープのＣ末端位における一次アンカー残基としてのＫ、Ｒ、ＹまたはＨのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。ＨＬＡ−Ａ１１に結合するペプチドは、一次および／または２次アンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【０１１５】
Ａ１１モチーフを含む代表的なペプチドエピトープは、表ＸＶＩＩに記載され、Ａ３対立遺伝子特異的モチーフを含むペプチドエピトープも、Ａ３およびＡ１１モチーフの一次アンカー特異性間の広範な重なりのため、この表に示される。さらに、Ａ３スーパーモチーフを含むペプチドエピトープも表ＩＸに列挙される。
【０１１６】
ＩＶ．Ｄ．１４．ＨＬＡ−Ａ２４モチーフ
対立遺伝子特異的ＨＬＡ−Ａ２４モチーフは、エピトープの２位における一次アンカー残基としてのＹ、Ｆ、Ｗ、またはＭ及びエピトープのＣ末端位置における一次アンカー残基としてのＦ、Ｌ、Ｉ、またはＷのペプチドリガンドにおける存在によって特徴付けられる。ＨＬＡ−Ａ２４分子に結合するペプチドは、一次および／または二次のアンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【０１１７】
Ａ２４モチーフを含む代表的ペプチドエピトープは、表ＸＶＩＩＩに示される。これらのエピトープはまた、表Ｘ、ＨＬＡ−Ａ２４スーパーモチーフ保有エピトープにも列挙される。
【０１１８】
ＨＬＡクラスＩＩ　ＨＴＬエピトープを示すモチーフ
以下に描写したＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフおよびモチーフの一次および二次のアンカー残基は、表ＩＩＩに要約される。
【０１１９】
ＩＶ．Ｄ．１５．ＨＬＡ−ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ
モチーフは、３つの共通のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子（ＨＬＡ　ＤＲＢ１＊０４０１、ＨＬＡ　ＤＲＢ１＊０１０１、およびＨＬＡ　ＤＲＢ１＊０７０１）に結合するペプチドについても同定された。包括的に、これらのモチーフ由来の共通の残基は、ＨＬＡ　ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフを示す。これらのＤＲ分子に結合するペプチドは、エピトープの１位における一次アンカー残基としての大きな芳香族残基または疎水性残基（Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、またはＭ）及びエピトープの６位における一次アンカー残基としての小さな非電荷残基（Ｓ、Ｔ、Ｃ、Ａ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、またはＭ）によって特徴付けられるスーパーモチーフを保有する。これらのＨＬＡ型の各々についての対立遺伝子特異的二次効果および二次アンカーも同定されている。これらは、表ＩＩＩにおいて示される。ＨＬＡ−ＤＲ４、ＤＲ１、および／またＤＲ７に結合するペプチドは、一次および／または二次のアンカー位置における置換によって、好ましくはスーパーモチーフのために特定されたそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【０１２０】
保存されたペプチドエピトープ（すなわち、分析のために使用された２０のＨＢＶ株において保存率７５％）は、ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフを含む９残基のコアに対応し（ここで、モチーフの１位は９残基のコアの１位にある）、表ＸＩＸａにおいて示される（例えば、Ｍａｄｄｅｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：５８７−６２２、１９９５も参照のこと）。１５アミノ酸残基長のそれぞれの例示的なペプチドエピトープ（その各々は、保存された９残基のコアを含む）も表の「ａ」節において示される。例示的な１５残基のスーパーモチーフ保有ペプチド（ペプチド数により命名されている）についての交差反応結合データは、表ＸＩＸｂにおいて示される。
【０１２１】
ＩＶ．Ｄ．１６．ＨＬＡ−ＤＲ３モチーフ
２つの代替的なモチーフ（すなわち、サブモチーフ）は、ＨＬＡ−ＤＲ３分子に結合するペプチドエピトープを特徴付ける。第１のモチーフ（サブモチーフＤＲ３Ａ）において、大きな疎水性残基（Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、またはＹ）はアンカー１位に存在し、Ｄはエピトープのカルボキシル末端方向４位にアンカーとして存在する。
【０１２２】
代替のＤＲ３サブモチーフは、エピトープのカルボキシル末端方向６位における正電荷の存在によって、アンカー１位における大きな疎水性残基、および／または４位における負に荷電したアンカー残基またはアミド様アンカー残基の欠失をもたらす。従って、代替の対立遺伝子特異的ＤＲ３モチーフ（サブモチーフＤＲ３Ｂ）について、Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ａ、またはＹはアンカー１位に存在し；Ｄ、Ｎ、Ｑ、Ｅ、Ｓ、またはＴはアンカー４位に存在し；Ｋ、Ｒ、またはＨはアンカー６位に存在する。ＨＬＡ−ＤＲ３に結合するペプチドは、一次および／または二次のアンカー位置における置換によって、好ましくはモチーフのために特定したそれぞれの残基を選択することによって、調節され得る。
【０１２３】
ＤＲ３Ａサブモチーフを含む９残基のコア（ここで、モチーフの１位は９残基のコアの１位にある）に対応する保存されたペプチドエピトープ（すなわち、分析のために使用された２０のＨＢＶ株において保存率７５％の配列）は、表ＸＸａにおいて示される。１５アミノ酸残基長のそれぞれの例示的なペプチドエピトープ（その各々は、保存された９残基のコアを含む）も表ＸＸａにおいて示される。表ＸＸｂは、例示的なＤＲ３サブモチーフＡ保有ペプチド（ペプチド番号によって命名）の結合データを示す。
【０１２４】
ＤＲ３Ｂサブモチーフを含む９残基コアおよびＤＲ３サブモチーフ−Ｂエピトープを含む例示的な１５マーのペプチドそれぞれに対応する保存されたペプチドエピトープ（すなわち、分析のために使用された２０のＨＢＶ株において保存率７５％）は、表ＸＸｃにおいて示される。表ＸＸｄは、例示的なＤＲ３サブモチーフＢ保有ペプチド（ペプチド番号によって命名）の結合データを示す。
【０１２５】
本明細書中の表に示されているＨＬＡクラスＩまたはクラスＩＩのペプチドエピトープの各々は、それだけで本願の発明実施態様であるとみなす。さらに、各々のペプチドエピトープが、任意の他のペプチドエピトープと組み合わせて使用してもよいことも本願の発明実施態様である。
【０１２６】
ＩＶ．Ｅ．ワクチンの拡大された集団適用範囲
広範な集団適用範囲を有するワクチンが好ましい。なぜなら、このワクチンは、より商業的に実行可能であり、一般的にほとんどの人々に適用可能であるからである。広範な集団適用範囲は、全体で考慮した場合に集団のほとんどに存在するＨＬＡ対立遺伝子に結合するペプチドエピトープを選択することを介して、本発明のペプチド（およびこのようなペプチドをコードする核酸組成物）を用いて得ることができる。表ＸＸＩは、様々な人種におけるＨＬＡクラスＩスーパータイプの全体の頻度（表ＸＸＩａ）、ならびにＡ２スーパータイプ、Ａ３スーパータイプ、およびＢ７スーパータイプによって達成される組み合わされた集団適用範囲（表ＸＸＩｂ）を列挙する。このＡ２スーパータイプ、Ａ３スーパータイプ、およびＢ７スーパータイプは、５つの主な人種の各々において４０％を超える平均値でそれぞれ存在する。８０％より多い範囲は、これらのスーパーモチーフの組合せを用いて達成される。これらの結果は、効果的かつ人種的に偏りのない集団適用範囲が制限された数の交差反応性ペプチドを使用した際に達成されることを示唆する。これらの３つの主なペプチド特異性を用いて達した集団適用範囲は大きいが、適用範囲を９５％以上の集団適用範囲に達するように拡大することができ、さらなるスーパーモチーフ保有ペプチドまたは対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの使用の際の正確な多特異性応答をより容易に達成する。
【０１２７】
Ｂ４４スーパータイプ、Ａ１スーパータイプ、およびＡ２４スーパータイプは、これらの主な人種集団において平均２５％〜４０％の範囲内で存在する（表ＸＸＩａ）。全体的にみてあまり普及したものではないが、少なくとも１つの主な人種集団においてＢ２７スーパータイプ、Ｂ５８スーパータイプ、およびＢ６２スーパータイプは各々２５％を超える頻度で存在する（表ＸＸＩａ）。表ＸＸＩｂは、同定されたＨＬＡスーパータイプの５つの主な人種における組み合わせた推定普及率を要約する。Ａ２範囲、Ａ３範囲、およびＢ７範囲がＡ１スーパータイプ、Ａ２４スーパータイプおよびＢ４４スーパータイプを含むことまたは本明細書中に記載されるスーパータイプ全てを含むことにより得られる適用範囲の拡大が示されている。６つの最も頻度の高いスーパータイプ由来のエピトープを含むことによって、９９％の平均集団適用範囲が５つの主な人種について得られる。
【０１２８】
Ａ２スーパータイプ、Ａ３スーパータイプおよびＢ７スーパータイプの上記の定義と共に本明細書中に示されるデータは、Ａ２９、Ｂ８、およびＢ４６の除外が可能である全ての抗原が全部で９つのＨＬＡスーパータイプに分類することができることを示す。６つの最も共通するスーパータイプに焦点を合わせると、主な人種集団すべての９８％以上をカバーする集団適用範囲が与えられる。
【０１２９】
ＩＶ．Ｆ．免疫応答刺激ペプチドアナログ
スーパーファミリーの全ての対立遺伝子のうちの適切な交差反応性を有するペプチドが上記のスクリーニング方法によって同定されるが、交差反応性は常に完全とは限らず、その場合に、ペプチドの交差反応をさらに増加させる方法は有用であり得る；ペプチドの他の特性を改変するためにそのような方法も使用することができる。所与のモチーフまたはスーパーモチーフ内のＨＬＡ対立遺伝子のためのペプチドの交差反応を支配する一般的ルールを確立したならば、より広範な（さもなければ改変された）ＨＬＡ結合能力を達成するために興味あるペプチドの構造の改変（すなわち、アナログ化）を行うことができる。より具体的には、（既知のＴ細胞エピトープおよび適当なスーパーモチーフを含むより伸長されたペプチドセットの双方の中で）最も広範な交差反応パターンを示すペプチドが、本明細書中の教示に従って作製され得る。
【０１３０】
使用したストラテジーは、特定のＨＬＡ分子への結合と相関するモチーフまたはスーパーモチーフを利用する。モチーフまたはスーパーモチーフは一次アンカーを有することによって定義されるが、二次アンカーを改変することもできる。アナログペプチドは、一次アンカー、二次アンカーにおいて、または一次アンカー位置および二次アンカー位置においてアミノ酸残基を置換することによって作製され得る。一般的には、アナログは、すでにモチーフまたはスーパーモチーフを保有するペプチドについて作製される。ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドについて規定されているスーパーモチーフおよびモチーフの好ましい二次アンカー残基は、表ＩＩおよびＩＩＩにそれぞれ示される。
【０１３１】
本発明の多数のモチーフまたはスーパーモチーフについて、それぞれのモチーフまたはスーパーモチーフを結合するＨＬＡスーパータイプの対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子またはメンバーに結合することが有害である残基が規定される（表ＩＩおよびＩＩＩ）。従って、結合が有害である残基の除去が、本発明に従って実行され得る。例えば、Ａ３スーパータイプの場合、このような有害な残基を有する全てのペプチドが分析されたペプチドの集団から除去されると、交差反応性率が２２％から３７％に上昇する（例えば、Ｓｉｄｎｅｙ，Ｊ．ら、Ｈｕ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９、１９９６を参照のこと）。従って、所定のスーパーモチーフ内のペプチドの交差反応性を改善する１つのストラテジーは、単に、ペプチド内に存在する１つ以上の有害な残基を除去し、（ペプチドのＴ細胞認識に影響を与えない）小さな「中性」残基（例えば、Ａｌａ）を置換することである。ペプチド内の有害な残基の除去と共に、スーパーファミリー内の複数の対立遺伝子に対して高い親和性結合に関連する残基が挿入される場合、交差反応の増強が期待されるであろう。
【０１３２】
ワクチンとして使用される場合、アナログペプチドが、インビボでネイティブエピトープに対するＣＴＬ応答を実際に誘発する（またはクラスＩＩエピトープの場合、野生型ペプチドと交差反応するヘルパーＴ細胞を誘発する）ことを確実にするために、アナログペプチドを用いて適切なＨＬＡ対立遺伝子の個体からインビトロでＴ細胞を免疫することができる。その後、免疫された細胞の、野生型ペプチドに感作した標的細胞の溶解を誘導する能力が評価される。内因的に産生された抗原もが関連するＴ細胞によって認識されるか否かを確立するために、適切な遺伝子で感染またはトランスフェクトした抗原提示細胞として、あるいはクラスＩＩエピトープのみの場合はタンパク質抗原全体を用いてパルスされた抗原提示細胞として使用することが望ましい。
【０１３３】
適当な数の交差反応細胞結合因子を確実にする本発明の別の実施形態は、弱く結合するペプチドのアナログを作製することである。５００〜５０００ｎＭの結合親和性を示し、かつ、１つまたは両方の位置において適用可能であるが最適下限の一次アンカーを有するクラスＩペプチドは、それぞれのスーパータイプに従い好ましいアンカー残基を置換することによって「固定」することができる。次いで、このアナログペプチドは、交差結合活性について試験され得る。
【０１３４】
効果的なペプチドアナログを作製するための別の実施形態は、液体環境下でのペプチド安定性または可溶性に対して悪影響を有する残基の置換を含む。この置換は、ペプチドエピトープのいずれかの位置で生じ得る。例えば、システイン（Ｃ）は、α−アミノ酪酸を優先して置換され得る。この化学的性質のために、システインは、ジスルフィド架橋を形成する性向を有し、そしてペプチドを構造的に十分に改変し、結合能力を減少する。αアミノ酪酸でのＣの置換は、この問題を多少とも解決するだけでなく、ある例（概説：Ａ．Ｓｅｔｔｅら、Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ　Ｖｉｒａｌ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ，Ｒ．ＡｈｍｅｄおよびＩ．Ｃｈｅｎ編、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、英国（１９９９）を参照のこと）において結合能力および交差結合能力を実際に改善する。システインのα−アミノ酪酸での置換は、ペプチドエピトープのいずれかの残基（すなわち、アンカー位置または非アンカー位置のいずれか）において生じ得る。
一般的には、ＣＴＬおよびＨＴＬ応答は、全ての可能なエピトープに対して指向されない。それどころか、それらは、少数の「免疫優性（ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ）」決定基に制限される（Ｚｉｎｋｅｒｎａｇｅｌら、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５１５９、１９７９；Ｂｅｎｎｉｎｋら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：１９３５−１９３９（１９８８）；Ｒａｗｌｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３９７７−３９８４（１９９１））。免疫優性（Ｂｅｎａｃｅｒｒａｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　１７５：２７３−２７９（１９７２））は、所定のエピトープの特定のＨＬＡタンパク質を選択的に結合する能力（決定基選択理論）（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：１６３５（１９８３）；Ｒｏｓｅｎｔｈａｌら、Ｎａｔｕｒｅ　２６７：１５６−１５８（１９７７））または既存のＴＣＲ（Ｔ細胞レセプター）特異性（レパートリー理論）によって選択的に認識する能力（Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＴＨＥ　ＳＣＩＥＮＣＥ　ＯＦ　ＳＥＬＦＮＯＮＳＥＬＦ　ＤＩＳＣＲＩＭＩＮＡＴＩＯＮ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、２７０−３１０頁（１９８２））のいずれかによって説明され得る。ほとんどがプロセシング事象と関連している追加の因子は、多くの潜在的な決定基のいずれが免疫優性として提示されるかについて厳密な免疫原性を超えて決定することにおいて、重要な役割をも果たし得ることが証明された（Ｓｅｒｃａｒｚら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：７２９−７６６（１９９３））。
【０１３５】
優性および亜優性の概念は、感染病および癌の両方の免疫療法と関係する。例えば、慢性ウイルス疾患の経過において、亜優性エピトープの補充は、特に、優性ＣＴＬ特異性または優性ＨＴＬ特異性がウイルス機構および他の機構の機能的寛容、抑制、変異によって不活化されている場合、感染を取り除くことに成功するために重要であり得る（Ｆｒａｎｃｏら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：５２４−５３１（１９９５））。癌抗原および腫瘍抗原の場合、最も高い結合親和性ペプチドの少なくともいくつかを認識するＣＴＬは、機能的に不活化され得る。このような場合、より低い結合親和性ペプチドは、優先的に認識される。
【０１３６】
特に、公知の非ウイルス腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）由来の有意な数のエピトープが、中程度の親和性（５０〜５００ｎＭの範囲のＩＣ５０）でＨＬＡクラスＩに結合することが注目されている。例えば、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）またはＣＴＬによって認識される１５個の公知のＴＡＡペプチドのうち８個が、５０〜５００ｎＭ範囲で結合することが見出されている。（これらのデータは、ペプチドとして認識される公知のウイルス抗原の９０％が５０ｎＭ未満のＩＣ５０を有するＨＬＡと結合したが、５０〜５００ｎＭ範囲においては約１０％のみが結合したという評価とは対称的である（Ｓｅｔｔｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５３：５５８−５５９２（１９９４））。癌の環境において、この現象は、推定ではＴ細胞寛容事象による、最も高い結合ペプチドのいくつかを認識するＣＴＬの排除または機能的阻害によるものであろう。
【０１３７】
理論に拘束されることを意図するものではないが、優性エピトープに対するＴ細胞がクローン的に欠失され得るので、亜優性エピトープの選択によって残っているＴ細胞を補充することが可能となり、次いで、これは治療的応答を導くと考えられる。しかし、ＨＬＡ分子の亜優性エピトープへの結合は、しばしば、優性のエピトープに対してよりも活動的ではない。従って、１つ以上のＨＬＡ分子に対する特定の免疫原性エピトープの結合親和性を調節し、それによって、ペプチドによって誘発される免疫応答を調節できる必要性がある。従って、より活動的な応答を誘発するアナログペプチドを調製することが求められている。この能力は、ペプチドベースのワクチンおよび治療剤の有用性を非常に増強する。
【０１３８】
代表的なアナログペプチドは、表ＸＸＩＩに示される。表は、適切な場合、アナログペプチドおよびモチーフまたはスーパーモチーフの長さもしくは配列を示す。「固定された命名」の列にある情報は、それぞれのアナログについての示された位置番号において置換された残基を示す。
【０１３９】
ＩＶ．Ｇ．スーパーモチーフまたはモチーフを含有するペプチドについての、疾患関連抗原由来タンパク質配列のコンピュータスクリーニング
標的抗原におけるスーパーモチーフ保有エピトープまたはモチーフ保有エピトープを同定するために、ネイティブなタンパク質配列（例えば、腫瘍関連抗原）、または感染生物由来の配列、または移植のためのドナー組織由来の配列を、例えば、知的計算またはコンピュータなどのコンピュータ計算手段を用いてスクリーニングし、配列内のスーパーモチーフまたはモチーフの存在を決定する。ネイティブなペプチドの分析から得られた情報が、ネイティブなペプチドの状態を評価するために直接使用され得るか、またはペプチドエピトープを生成するために引き続き利用され得る。
【０１４０】
本願のスーパーモチーフまたはモチーフの発現のためのタンパク質配列を迅速にスクリーニングすることを可能にするコンピュータプログラムは、本発明により包含され、アナログペプチドの生成を可能にするプログラムも同様に含まれる。これらのプログラムは、任意の同定されたアミノ酸配列を分析するかまたは、未知の配列に関して操作し、そして同時に配列を決定し、そしてそのモチーフ保有エピトープを同定することが実行され；アナログが、その上、同時に決定され得る。一般的に、同定された配列は、病原性生物または腫瘍関連ペプチド由来である。例えば、本明細書中で考慮される標的分子は、すべてのＨＢＶタンパク質（例えば、表面、コア、ポリメラーゼおよびＸ）が挙げられる。
【０１４１】
同じ標的タンパク質の複数の改変体の配列が入手できる場合、それらの保存に基づいてペプチドを選択することもできる。保存率について現在好ましい基準は、ペプチドの配列全体が、特定のタンパク質について評価された配列の７５％が合計で保存されることを規定している。保存のこの規定は、本明細書中で使用されている。
【０１４２】
ペプチド結合の予測のために利用される選択基準は、実際の結合と最も効果的に相関するために、可能な限り正確であることが重要である。適切な一次アンカーの存在に基づいて、例えば、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に結合するペプチドの予測は、約３０％の割合でポジティブである（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ　７４：９２９、１９９３）。しかし、広範囲のペプチド−ＨＬＡ結合データベースを分析することにより、本発明者らは、一次アンカー残基単独の存在に基づく同定に対して、予測値を劇的に増大する多数の対立遺伝子特異的多項式アルゴリズムを開発した。これらのアルゴリズムは、正確な一次アンカーの存在または非存在を考慮するだけでなく、（異なる位置における異なるアミノ酸の影響を説明するために）二次アンカー残基のポジティブな存在または有害な存在も考慮に入れる。このアルゴリズムは、本質的に、ペプチドＨＬＡ相互作用の全体の親和性（またはΔＧ）がこの型の一次多項式関数として近似され得るという前提に基づき：
ΔＧ＝ａ１ｉ×ａ２ｉ×ａ３ｉ．．．×ａｎｉ
ここで、ａｊｉは、ｎ個のアミノ酸のペプチドの配列に沿った、所定の位置（ｉ）における所定のアミノ酸（ｊ）の存在の効果を示す係数である。この方法の重要な仮定は、各位置における効果が、本質的に、各他の位置の効果と独立していることである。この仮定は、ペプチドがＨＬＡ分子に結合し、かつ、本質的に伸長したコンホメーションのＴ細胞により認識されることを示す研究により立証される。特定のアルゴリズム係数の誘導が、Ｇｕｌｕｋｏｔａら（Ｇｕｌｕｋｏｔａ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：１２５８、１９９７）に記載されている。
【０１４３】
特定のモチーフをも利用する、好ましいペプチド配列を同定するためのさらなる方法は、神経回路網の使用および分子モデルプログラムの使用を含む（例えば、Ｍｉｌｉｋら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１６：７５３、１９９８；Ａｌｔｕｖｉａら、Ｈｕｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５８：１、１９９７；Ａｌｔｕｖｉａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：２４４、１９９５；Ｂｕｕｓ，Ｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：２０９−２１３、１９９９；Ｂｒｕｓｉｃ，Ｖ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　１４：１２１−１３０、１９９８；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：１６３、１９９３；Ｍｅｉｓｔｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ　１３：５８１、１９９５；Ｈａｍｍｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：２３５３、１９９４；Ｓｔｕｒｎｉｏｌｏら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：５５５　１９９９を参照のこと）。
【０１４４】
例えば、Ａ＊０２０１モチーフペプチドのセットにおいて、少なくとも１つの好ましい二次アンカー残基を含むペプチドの６９％が、任意の有害な二次アンカー残基の存在を回避しながら、５００ｎＭ未満のＩＣ５０を有するＡ＊０２０１を結合することが示されている（Ｒｕｐｐｅｒｔ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ　７４：９２９、１９９３）。これらのアルゴリズムは、カットオフスコアが、所望の通り、より高いかまたはより低い予測結合特性を有するペプチドセットを選択するように調節され得る点でも柔軟である。
【０１４５】
ペプチドエピトープを同定するためのコンピュータスクリーニングを利用することにおいて、タンパク質配列または翻訳された配列のすべてが、モチーフを探索するために開発されたソフトウェア（例えば、［ＦＩＮＤＰＡＴＴＥＲＮＳ］プログラム（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５、１９８４）またはＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈ　１．４ソフトウェアプログラム（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））を使用して分析され、適切なＨＬＡ結合モチーフを含む潜在的なペプチド配列を同定し得る。当業者に理解されるように、既知または未知のペプチド配列に関連して本発明のモチーフを実行するために使用され得るコンピュータプログラミングソフトウェアおよびハードウェアオプションの大きなアレイが、利用可能である。次いで、同定されたペプチドは、カスタマイズされた多項式アルゴリズムを使用してスコアされ、特異的なＨＬＡクラスＩ対立遺伝子またはクラスＩＩ対立遺伝子を結合するそれらペプチドの能力を予測する。
【０１４６】
上記の手順に従って、ＨＬＡスーパータイプ群または対立遺伝子特異的ＨＬＡ分子を結合し得るＨＢＶペプチドおよびそのアナログが同定された（表ＶＩＩ−ＸＸ；表ＸＸＩＩ）。
【０１４７】
ＩＶ．Ｈ．ペプチドエピトープの調製
本発明のペプチドは、組換えＤＮＡ技術または化学合成により、あるいは天然の供給源（例えば、ネイティブな腫瘍または病原性生物）から合成的に調製され得る。ペプチドエピトープは、個々に合成され得るか、またはポリエピトープペプチドとして合成され得る。このペプチドは、好ましくは、他の天然の宿主タンパク質およびそのタンパク質フラグメントを実質的に含まないが、いくつかの実施形態において、このペプチドは、ネイティブなフラグメントまたは粒子に合成的に結合され得る。
【０１４８】
本発明のペプチドは、種々の長さとすることができ、それらの中和（荷電していない）形態または塩の形態のいずれかとすることができる。本発明のペプチドは、グリコシル化、側鎖の酸化またはリン酸化などの改変がされていないか、あるいは該ペプチドがこれらの改変を含み、本明細書中に記載されるように、改変がペプチドの生物学的活性を破壊しない条件に供される。
【０１４９】
可能な場合、ポリエピトープの構築において用い得たのと同様に、約８個〜約１３個のアミノ酸残基、しばしば８個〜１１個、好ましくは９個〜１０個のアミノ酸残基の長さに、本発明のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドエピトープを最適化することが所望され得る。ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドエピトープは、約６〜約３０アミノ酸長の長さ、好ましくは約１３個と約２０個の残基との間に、最適化され得る。ペプチドエピトープは、関連ＨＬＡ分子に結合する内因的にプロセシングされた病原体由来ペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドとサイズが比例していることが好ましいが、本発明のエピトープを含むペプチドの同定および調製も本明細書中に記載される技術を使用して実行され得る。
【０１５０】
代替の実施形態において、本発明のエピトープが、ポリエピトープペプチドとしてまたはポリエピトープペプチドをコードするミニ遺伝子として、連結され得る。
【０１５１】
別の実施形態において、高濃度のクラスＩエピトープおよび／またはクラスＩＩエピトープを含むネイティブなペプチド領域を同定することが好まれる。このような配列は、一般に、この配列が１個のアミノ酸長あたり最も多数のエピトープを含むことに基づいて、選択される。エピトープは、入れ子型（ｎｅｓｔｅｄ）または重複する様式で存在し得ることが理解され、例えば、１０個のアミノ酸長のペプチドは９個のアミノ酸長エピトープを２つおよび１０個のアミノ酸長のエピトープを１つ含むことができ；細胞内プロセシングに際して、各エピトープは、そのようなペプチドの投与の際にＨＬＡ分子により曝露されかつ結合され得る。このより大きい、好ましくは複数のエピトープのペプチドが、合成的により、組換えにより、またはネイティブな供給源からの切断を介して生成され得る。
【０１５２】
本発明のペプチドは、広範な種々の方法において調製され得る。好ましい比較的短いサイズのため、従来の技術に従って溶液中または固体支持体上でペプチドを合成することができる。種々の自動合成装置が市販され、公知のプロトコルに従って使用され得る（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ　＆　Ｙｏｕｎｇ、ＳＯＬＩＤ　ＰＨＡＳＥ　ＰＥＰＴＩＤＥ　ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ、２Ｄ．ＥＤ．、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．、１９８４を参照のこと）。さらに、個々のペプチドエピトープが化学的連結を使用して結合され、本発明の範囲内になおある、より大きいペプチドを産生し得る。
【０１５３】
あるいは、目的の免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を、発現ベクター中に挿入するかあるいは適切な宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトし、発現のための適切な条件下で培養する、組換えＤＮＡ技術を用いることができる。これらの方法は一般に当該分野で公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８９）に一般に記載される。従って、本発明の１つ以上のペプチド配列を含む組換えポリペプチドが、適切なＴ細胞エピトープを提示するために使用され得る。
【０１５４】
本明細書中で実行される好ましい長さのペプチドエピトープについての配列をコードするヌクレオチドが、化学的技術（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）のリン酸トリエステル法）により合成され得る。ペプチドアナログは、ネイティブなペプチド配列をコードする塩基を適切かつ所望の核酸塩基に置換することにより、簡単に作製することができ；例示的な核酸置換は、本明細書中のモチーフ／スーパーモチーフにより規定されるアミノ酸をコードする核酸置換である。次いで、適切なリンカーを用いてコード配列を提供し、当該分野で市販されている発現ベクターに連結し、所望の融合タンパク質を産生するためにそのベクターを用いて適切な宿主を形質転換する。多数のこのようなベクターおよび適切な宿主系が、現在入手できる。融合タンパク質の発現のために、コード配列は、操作可能に連結される開始コドンおよび停止コドン、プロモーター領域およびターミネーター領域ならびに所望の細胞性宿主における発現のための発現ベクターを提供する通常の複製系を用いて提供される。例えば、細菌性宿主と互換性のあるプロモーター配列が、所望のコード配列の挿入のための都合の良い制限部位を含むプラスミドに提供される。得られた発現ベクターは、適切な細菌性宿主に形質転換される。もちろん、酵母細胞宿主、昆虫細胞宿主または哺乳動物細胞宿主も、適切なベクターおよびコントロール配列を使用して、使用され得る。
【０１５５】
ＩＶ．Ｉ．Ｔ細胞応答を検出するためのアッセイ
一旦ＨＬＡ結合ペプチドが同定されると、それらはＴ細胞応答を惹起する能力について試験され得る。モチーフ保有ペプチドの調製および評価は、国際公開第９４／２０１２７号パンフレットおよび国際公開第９４／０３２０５号パンフレットに記載される。簡潔に、特定の抗原由来のエピトープを含むペプチドが合成され、そして適切なＨＬＡタンパク質に結合するそれらの能力について試験される。これらのアッセイは、放射ヨウ素標識された参照ペプチドの結合に関連して、精製されたＨＬＡクラスＩ分子への本発明のペプチドの結合を評価する工程を包含する。あるいは、エンプティークラスＩ分子（すなわち、その中のペプチドを欠く）を発現する細胞は、免疫蛍光染色およびフローマイクロ蛍光測定により、ペプチド結合について評価され得る。ペプチド結合を評価するために使用され得る他のアッセイとしては、ペプチド依存性クラスＩアセンブリアッセイおよび／またはペプチド競合によるＣＴＬ認識の阻害が挙げられる。典型的に５００ｎＭ以下の親和性でクラスＩ分子に結合するこれらのペプチドは、さらに、感染した個体または免疫した個体由来のＣＴＬに対する標的として機能するそれらの能力、および疾患に関連した選択された標的細胞と反応し得るＣＴＬ集団を生じる１次インビトロまたはインビボＣＴＬ応答を誘導し得るそれらの能力について評価される。
【０１５６】
類似のアッセイは、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの評価のために使用される。典型的には１０００ｎＭ以下の親和性で結合することが示されるＨＬＡクラスＩＩモチーフ保有ペプチドは、さらに、ＨＴＬ応答を刺激する能力について評価される。
【０１５７】
Ｔ細胞応答を検出するために利用される従来のアッセイとしては、増殖アッセイ、リンホカイン分泌アッセイ、直接的細胞傷害性アッセイ、および限界希釈アッセイが挙げられる。例えば、ペプチドと共にインキュベートされる抗原提示細胞は、レスポンダー細胞集団においてＣＴＬ応答を誘導する能力についてアッセイされ得る。抗原提示細胞は、通常の細胞（例えば、末梢血単核細胞または樹状細胞）であり得る。あるいは、内部でプロセシングされたペプチドでクラスＩ分子を負荷（ｌｏａｄ）する能力を欠き、かつ、適切なヒトクラスＩ遺伝子でトランスフェクトされた変異体非ヒト哺乳動物細胞株が、インビトロ１次ＣＴＬ応答を誘導するペプチドの能力を試験するために使用され得る。
【０１５８】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ＣＴＬ前駆体のレスポンダー細胞供給源として使用され得る。適切な抗原提示細胞をペプチドと共にインキュベートし、インキュベート後、次いでペプチド負荷された抗原提示細胞を最適化された培養条件下でレスポンダー細胞集団とともにインキュベートする。ポシティブＣＴＬ活性は、放射線標識された標的細胞（特異的ペプチドパルス標的およびペプチド配列が由来する抗原の内因的にプロセシングされた形態を発現する標的細胞の両方）を殺傷するＣＴＬの存在について培養物をアッセイすることによって決定され得る。
【０１５９】
さらに、蛍光標識ＨＬＡテトラマー複合体を用いて染色することによって、抗原特異的Ｔ細胞の直接的な定量を可能にする方法が考え出されている（Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：１０３３０、１９９３；Ａｌｔｍａｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７４：９４、１９９６）。他の比較的最近の技術的な発達は、細胞内リンホカインに対する染色、およびインターフェロン放出アッセイまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイを含む。テトラマー染色、細胞内リンホカイン染色およびＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、全て、従来のアッセイより少なくとも１０倍感度が高いようである（Ｌａｌｖａｎｉ，Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：８５９、１９９７；Ｄｕｎｂａｒ，Ｐ．Ｒ．ら、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：４１３、１９９８；Ｍｕｒａｌｉ−Ｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　８：１７７、１９９８）。
【０１６０】
ＨＬＴ活性化も、Ｔ細胞増殖およびリンホカイン（例えば、ＩＬ−２）分泌などの当業者に公知のこのような技術を使用して評価され得る（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　１：７５１−７６１、１９９４を参照のこと）。
【０１６１】
あるいは、ＨＬＡトランスジェニックマウスの免疫化が、ペプチドエピトープの免疫原性を決定するために使用され得る。ヒトＡ２．１対立遺伝子、ヒトＡ１１対立遺伝子（これらは、ＨＬＡ−Ａ３エピトープを分析するためにさらに使用され得る）、およびヒトＢ７対立遺伝子を有するマウスを含むいくつかのトランスジェニックマウスモデルが特徴付けられ、そして他のもの（例えば、ＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４についてのトランスジェニックマウス）が開発されている。ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ３マウスモデルも開発されている。他のＨＬＡ対立遺伝子を有するさらなるトランスジェニックマウスモデルが、必要ならば作製され得る。マウスは、不完全フロイントアジュバント中に乳化されたペプチドで免疫化され得、そして生じたＴ細胞を、ペプチドパルスされた標的細胞および適切な遺伝子でトランスフェクトされた標的細胞を認識するそれらの能力について試験した。ＣＴＬ応答が上記の細胞傷害性アッセイを使用して分析され得る。同様に、ＨＴＬ応答が、Ｔ細胞増殖またはリンホカイン分泌などのアッセイを使用して分析され得る。
【０１６２】
免疫原性ペプチドエピトープが、表ＸＸＩＩＩに記載される。
【０１６３】
ＩＩＩ．Ｊ．診断薬剤としての、および免疫応答を評価するためのペプチドエピトープの使用
本発明の１つの態様において、本明細書中に記載されるＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ結合ペプチドは、免疫応答を評価するための試薬として使用される。評価される免疫応答は、免疫源として任意の薬剤を使用することによって誘導され、この任意の薬剤は、試薬として使用されるペプチドエピトープ（単数または複数）を認識し、それに結合する、抗原特異的ＣＴＬまたはＨＴＬを産生を生じ得る。このペプチド試薬は、免疫原として使用される必要がない。このような分析について使用されるアッセイ系は、比較的最近の技術開発（例えば、テトラマー、細胞内リホカインの染色およびインターフェロン放出アッセイ、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）を含む。
【０１６４】
例えば、本発明のペプチドは、病原または免疫原への暴露に続いて、抗原特異的ＣＴＬの存在について末梢血単核細胞を評価するためのテトラマー染色アッセイにおいて使用される。ＨＬＡ−テトラマー複合体は、抗原特異的ＣＴＬを直接可視化するために使用され（例えば、Ｏｇｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７９：２１０３−２１０６、１９９８；およびＡｌｔｍａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　１７４：９４−９６、１９９６）、そして末梢血単核細胞のサンプル中における抗原特異的ＣＴＬ集団の頻度を決定する。
【０１６５】
本発明のペプチドを使用するテトラマー試薬は、以下のように生成される：ＨＬＡ分子に結合するペプチドを対応するＨＬＡ重鎖およびβ２−ミクログロブリンの存在下でリフォールディリングして、３分子複合体を生成する。この複合体は、以前にタンパク質に操作された部位で重鎖のカルボキシル末端でビオチン化される。次いで、テトラマー形成がストレプトアビジンの添加によって誘導される。蛍光標識されたストレプトアビジンによって、このテトラマーは、抗原特異的細胞を染色するために使用され得る。次いで、これらの細胞は、例えば、フローサイトメトリーによって容易に同定され得る。このような手順は、診断目的または予後目的のために使用され得る。この手順によって同定された細胞はまた、治療目的のために使用され得る。
【０１６６】
本発明のペプチドはまた、免疫リコール応答を評価するための試薬として使用され得る。（例えば、Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３−５１３、１９９７およびＰｅｎｎａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１５６５−１５７０、１９９１を参照のこと）。例えば、ＨＰＶ感染した個体由来の患者ＰＢＭＣサンプルは、特定のペプチドを使用して抗原特異的ＣＴＬまたはＨＴＬの存在について分析され得る。ＰＢＭＣを培養し、本発明のペプチドで細胞を刺激することによって、単核細胞を含む血液サンプルを評価し得る。適切な培養期間の後、拡大した細胞集団が、例えば、ＣＴＬまたはＨＴＬ活性について分析され得る。
【０１６７】
このペプチドはまた、ワクチンの効力を評価するための試薬として使用される。免疫原と共にワクチン接種された患者から得られたＰＢＭＣは、例えば、上記の方法のいずれかを使用して分析され得る。患者は、ＨＬＡ型であり、そしてその患者に存在する対立遺伝子特異的分子を認識するペプチドエピトープ試薬が分析のために選択される。ワクチンの免疫原性は、ＰＢＭＣサンプル中のＨＰＶエピトープ特異的ＣＴＬおよび／またはＨＴＬの存在によって示される。
【０１６８】
本発明のペプチドはまた、当該分野で周知の技術を使用して、抗体を作製するために使用され得る（例えば、ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｈａｒｌｏｗ、Ｈａｒｌｏｗ　ａｎｄ　Ｌａｎｅ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、１９８９を参照のこと）。これらは、ＨＰＶ感染を診断するための試薬として有用であり得る。このような抗体は、ＨＬＡ分子のコンテクストにおいてペプチドを認識する抗体（すなわち、ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する抗体）を含む。
【０１６９】
ＩＶ．Ｋ．ワクチン組成物
ワクチンおよび本明細書中に記載されるような免疫原性的に有効量の１つまたは複数のペプチドを含むワクチンを調製する方法は、本発明のさらなる実施形態である。一旦適切に免疫原性エピトープが規定されると、それらは、種々の手段によって分類され、そして送達され得、本明細書中で、「ワクチン」組成物といわれる。このようなワクチン組成物としては、例えば、リポペプチド（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏ，Ａ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：３４１、１９９５）、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）マイクロスフィアにカプセル化されたペプチド組成物（例えば、Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：２８７−２９４、１９９１：Ａｌｏｎｓｏら、Ｖａｃｃｉｎｅ　１２：２９９−３０６、１９９４；Ｊｏｎｅｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ　１３：６７５−６８１、１９９５を参照のこと）、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）に含まれるペプチド組成物（例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３４４：８７３−８７５、１９９０；Ｈｕら、Ｃｌｉｎ　Ｅｘｐ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２３５−２４３、１９９８を参照のこと）、多抗原ペプチド系（ＭＡＰ）（例えば、Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５４０９−５４１３、１９８８；Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１９６：１７−３２、１９９６を参照のこと）、多価ペプチドとして処方されたペプチド；弾道的（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達システムで使用するペプチド、典型的には結晶ペプチド、ウイルス送達ベクター（Ｐｅｒｋｕｓ，Ｍ．Ｅ．ら、Ｃｏｎｃｅｐｔｓ　ｉｎ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．，編、３７９頁、１９９６；Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ，Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　３２０：５３５、１９８６；Ｈｕ，Ｓ．Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　３２０：５３７、１９８６；Ｋｉｅｎｙ，Ｍ．−Ｐ．ら、ＡＩＤＳ　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４：７９０、１９８６；Ｔｏｐ，Ｆ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１２４：１４８、１９７１；Ｃｈａｎｄａ，Ｐ．Ｋ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７５：５３５、１９９０）、ウイルスまたは合成起源の粒子（例えば、Ｋｏｆｌｅｒ，Ｎ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９２：２５、１９９６；Ｅｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６、１９９３；Ｆａｌｏ，Ｌ．Ｄ．，Ｊｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．７：６４９、１９９５）、アジュバンド（Ｗａｒｒｅｎ，Ｈ．Ｓ．、Ｖｏｇｅｌ，Ｆ．Ｒ．、およびＣｈｅｄｉｄ，Ｌ．Ａ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３６９、１９８６；Ｇｕｐｔａ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ　１１：２９３、１９９３）、リポソーム（Ｒｅｄｄｙ，Ｒ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５８５、１９９２；Ｒｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ　１７：１３１、１９９６）、あるいは、裸ｃＤＮＡまたは粒子吸収ｃＤＮＡ（Ｕｌｍｅｒ，Ｊ．Ｂ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：１７４５、１９９３；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｈ．Ｌ．、Ｈｕｎｔ，Ｌ．Ａ．、およびＷｅｂｓｔｅｒ，Ｒ．Ｇ．、Ｖａｃｃｉｎｅ　１１：９５７、１９９３；Ｓｈｉｖｅｒ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｃｏｎｃｅｐｔｓ　ｉｎ　ｖａｃｃｉｎｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｋａｕｆｍａｎｎ，Ｓ．Ｈ．Ｅ．，編、４２３頁、１９９６；Ｃｅａｓｅ，Ｋ．Ｂ．、およびＢｅｒｚｏｆｓｋｙ，Ｊ．Ａ．、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：９２３、１９９４ならびにＥｌｄｒｉｄｇｅ，Ｊ．Ｈ．ら、Ｓｅｍ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３０：１６、１９９３）が挙げられる。毒素標的化送達技術（レセプター媒介標的化としても公知であり、例えば、Ａｖａｎｔ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｅｄｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）の技術）も使用され得る。
【０１７０】
本発明のワクチン組成物は、核酸媒介様式を含む。１つまたは複数の本発明のペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡも患者に投与され得る。このアプローチは、例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４７：１４６５（１９９０）ならびに米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，８０４，５６６号；同第５，７３９，１１８号；同第５，７３６，５２４号；同第５，６７９，６４７号；国際公開第９８／０４７２０号パンフレット；および以下により詳細に記載される。ＤＮＡベースの送達技術の例には、「裸ＤＮＡ」、促進された（ブピバカイン、ポリマー、ペプチド−媒介）送達、カチオン性脂質複合体、および粒子媒介送達（「遺伝子銃」）または圧力媒介送達（例えば、米国特許第５，９２２，６８７号を参照のこと）が挙げられる。
【０１７１】
治療または予防免疫目的のために、本発明のペプチドはまた、ウイルスベクターまたは細菌ベクターによって発現され得る。発現ベクターの例としては、弱毒化ウイルス宿主（例えば、ワクシニアまたは鶏痘）が挙げられる。このアプローチは、例えば、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するためのベクターとしてワクシニアウイルスの使用を含む。急性または慢性感染した宿主または非感染宿主への導入の際に、組換えワクシニアウイルスは、免疫原性ペプチドを発現し、それによって、宿主にＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を惹起させる。ワクシニアベクターおよび免疫化プロトコルにおいて有用な方法は、例えば、米国特許第４，７２２，８４８号に記載される。別のベクターは、ＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）である。ＢＣＧベクターは、Ｓｔｏｖｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３５１：４５６−４６０（１９９１）に記載される。本発明のペプチドの治療的投与または免疫化のために有用な広範な種々の他のベクター（例えば、アデノウイルスおよびアデノ衛星ウイルスのベクター、レトロウイルスベクター、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉベクター、解毒化炭疽毒素ベクターなど）は、本明細書中の説明から当業者に明らかである。
【０１７２】
さらに、本発明のワクチンは、特許請求されたペプチドの１つ以上の組成物を包含する。ペプチドは、ワクチン中に個々に存在し得る。あるいは、このペプチドは、同じペプチドの複数のコピーを含むホモポリマーとして、または種々のペプチドのヘテロポリマーとして存在し得る。ポリマーは、免疫学的反応の増加という利点を有し、そして異なるペプチドエピトープが、ポリマーを作り上げるために使用される場合、免疫応答について標的化された病原性生物または腫瘍関連ペプチドの異なる抗原決定基と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導するさらなる能力を有する。組成物は、抗原の天然に存在する領域であり得るか、または例えば、組換えによりまたは化学合成によって調製され得る。
【０１７３】
本発明のワクチンと共に使用されるキャリアは、当該分野で周知であり、例えば、サイログロブリン、ヒト血清アルブミンのようなアルブミン、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（例えば、ポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸）、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが挙げられる。このワクチンは、生理学的に許容可能な（すなわち、受容可能な）希釈剤（例えば、水、または生理食塩水、好ましくはリン酸緩衝化生理食塩水）を含み得る。このワクチンはまた、典型的に、アジュバントを含む。不完全フロイントアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウムまたはミョウバンのようなアジュバントは、当該分野で周知の材料の例である。さらに、本明細書中に記載されるように、ＣＴＬ応答は、本発明のペプチドを脂質（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ））に共役することによってプライムされ得る。
【０１７４】
注射、エアロゾル、経口、経皮、経粘膜、胸膜腔内、鞘内または他の適切な経路を介する、本発明のペプチド組成物を用いる免疫化の際に、宿主の免疫系は、所望の抗原に特異的な、多量のＣＴＬおよび／またはＨＴＬを生成することによって、ワクチンに応答する。その結果、この宿主は、後の感染に対して少なくとも部分的に免疫となるか、または進行中の慢性感染の発症に対して少なくとも部分的に耐性となるか、あるいは抗原が腫瘍関連である場合、少なくともいくつかの治療的利点を得る。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、クラスＩペプチド成分を、目的の標的抗原への中和抗体応答および／またはヘルパーＴ細胞応答を誘導するか、または促進する成分と組み合わせることが所望され得る。このような組成物の好ましい実施形態は、本発明のクラスＩおよびクラスＩＩエピトープを含む。このような組成物の代替的実施形態は、ＰａｎＤＲ分子、例えば、ＰＡＤＲＥ（登録商標）（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；例えば、米国特許第５，７３６，１４２号に記載される）と共に、本発明のクラスＩおよび／またはクラスＩＩエピトープを含む。
【０１７６】
本発明のワクチンはまた、本発明のペプチドを提示するためのビヒクルとして、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば、樹状細胞（ＤＣ）を含み得る。ワクチン組成物は、樹状細胞の動員および採取に続き、インビトロで作製され得、これによって、樹状細胞の負荷がインビトロで起こる。例えば、樹状細胞は、例えば、本発明のミニ遺伝子でトランスフェクトされるか、ペプチドでパルス処理される。次いで、この樹状細胞が、インビボで免疫応答を惹起するために、患者に投与され得る。
【０１７７】
ワクチン組成物は、ＤＮＡベースであれペプチドベースであれ、樹状細胞の動員と組み合わせてインビボで投与し、これにより樹状細胞のインビボでの負荷が引き起こされる。
【０１７８】
同様に、抗原性ペプチドが、エキソビボでＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を惹起するために使用される。得られるＣＴＬまたはＨＴＬ細胞は、治療の他の従来の形態に応答しない、または本発明の治療的ワクチンペプチドまたは核酸に応答しない患者における慢性感染または腫瘍を処置するために使用され得る。特定の抗原（例えば、感染または腫瘍関連抗原）へのエキソビボＣＴＬまたはＨＴＬ応答は、ＤＣなどのＡＰＣの供給源と共に、患者の、または遺伝子的に適合性のＣＴＬもしくはＨＬＴ前駆細胞、および適切な免疫原性ペプチドを、組織培養でインキュベートすることによって誘導される。前駆細胞が活性化され、そしてエフェクター細胞に拡張される適切なインキュベート時間（典型的には約７〜２８日間）の後、これらの細胞は、患者に注入して戻され、ここで、それらは、それらの特異的標的細胞（感染した細胞または腫瘍細胞）を破壊するか、またはこれらの破壊を促進する。トランスフェクトされた樹状細胞はまた、抗原提示細胞として使用され得る。
【０１７９】
本発明のワクチン組成物はまた、ＩＮＦγなどのような免疫アジュバントとの組合せ使用を含め、慢性ウイルス感染に対して使用される他の処置と組み合わせて使用され得る。
【０１８０】
好ましくは、ワクチンにおける使用のためのポリエピトープ組成物への含有のため、またはワクチンに含まれそして／またはミニ遺伝子のような核酸によってコードされる個別のエピトープを選択するためにエピトープのアレイを選択する場合、以下の原理が利用される。以下の原理の各々は、選択をなすために釣り合いを取ることが好ましい。所定のワクチン組成物に組み込まれる複数のエピトープは、エピトープから誘導されるネイティブな抗原中の配列において連続であり得るが、その必要はない。
【０１８１】
１．）投与の際、ＨＢＶ除去と相関されることが観測されている模倣免疫応答エピトープが選択される。ＨＬＡクラスＩについて、これは、ＨＢＶの少なくとも１つの抗原由来の３〜４エピトープを含む。換言すれば、自然にＨＢＶを解消した患者においては、彼らが少なくとも１つのＨＢＶ抗原に対して少なくとも３つのエピトープに対する免疫応答を生成したことが観察された。ＨＬＡクラスＩＩについて、類似の原理が使用される；再び、３〜４エピトープが、少なくとも１つのＨＢＶ抗原から選択される（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７８：１４４７−１４５０を参照のこと）。
【０１８２】
２．）免疫原性を相関付けされるように確立された必要な結合親和性を有するエピトープが選択される：ＨＬＡクラスＩについて、５００ｎＭ以下のＩＣ５０、しばしば２００ｎＭ以下のＩＣ５０；およびクラスＩＩについて、１０００ｎＭ以下のＩＣ５０。
【０１８３】
３．）十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイが、広い集団適用範囲を与えるために選択される。例えば、少なくとも８０％の集団適用範囲を有することが好ましい。モンテカルロ分析（当該分野で公知の統計的評価）は、集団適用範囲の広がりまたは重複性を評価するために使用され得る。
【０１８４】
４．）癌関連抗原からエピトープを選択する場合、アナログを選択することがしばしば有用である。なぜなら、患者は、ネイティブのエピトープに対して発達した寛容性を有し得るからである。感染性疾患関連抗原についてのエピトープを選択する場合、ネイティブのエピトープまたはアナログエピトープのいずれかを選択することが好ましい。
【０１８５】
５．）「入れ子型（ｎｅｓｔｅｄ）エピトープ」といわれるエピトープが特に適切である。入れ子型エピトープは、少なくとも２つのエピトープが所定のペプチド配列において重複する場合に生じる。入れ子型ペプチド配列は、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの両方のエピトープを含み得る。入れ子型エピトープが提供される場合、配列当たり最も大きな数のエピトープを有する配列を提供することが一般的目的である。したがって、１つの形態では、ペプチドにおけるアミノ末端エピトープのアミノ末端およびカルボキシ末端エピトープのカルボキシル末端よりも長いペプチドを提供することが回避される。複数エピトープ配列（例えば、入れ子型エピトープを含む配列）が提供される場合、一般に、病理学的または他の有害な生物学的特性を有さないことを確実にするために配列をスクリーニングすることが重要である。
【０１８６】
６．）ポリエピトープタンパク質が作製される場合、またはミニ遺伝子を作製する場合、目的のエピトープを包含する最も小さなペプチドを作製することが目的である。この原理は、入れ子型エピトープを含むペプチドを選択する場合に使用されるものと同じでない場合に、類似する。しかし、人工のポリエピトープペプチドの場合、サイズを最小化する目的は、ポリエピトープタンパク質中のエピトープの間の任意のスペーサー配列を組み込む必要性に対して釣り合いが取られる。スペーサーアミノ酸残基は、例えば、接合部エピトープ（免疫系によって認識されるが、標的抗原に存在せず、そしてエピトープの人工並位（ｍａｎ−ｍａｄｅ　Ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）によって作製されるのみのエピトープ）を回避するために、またはエピトープ間の切断を容易にし、それによってエピトープ提示を増強するために、導入され得る。接合部エピトープは、一般に、回避される。なぜなら、レシピエントは、非ネイティブエピトープに対する免疫応答を生成し得るからである。「優性エピトープ」である接合部エピトープが、特に関係する。優性エピトープは、他のエピトープに対する免疫応答が減少されるかまたは抑制される激しい（ｚｅａｌｏｕｓ）応答を導き得る。
【０１８７】
７．）同一の目標タンパク質の多数の変種の配列が利用可能な場合、その保存性に基づいて可能性のあるペプチドエピトープを選択することもできる。例えば、保存性の基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの配列全体またはＨＬＡクラスＩＩの９マーのコア全体が、特定のタンパク質抗原について評価される配列の指定されたパーセンテージにおいて保存されていることを規定してもよい。
【０１８８】
ＩＶ．Ｋ．１．ミニ遺伝子ワクチン
複数のエピトープの同時送達を可能にする多くの異なるアプローチが利用可能である。本発明のペプチドをコードする核酸は、特に有用な、本発明の実施形態である。ミニ遺伝子の封入のためのエピトープは、好ましくは、前節に記載されるガイドラインに従って選択される。本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、本発明の１または複数のエピトープを含むペプチドをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。
【０１８９】
複数エピトープミニ遺伝子の使用は、以下および例えば、同時係属出願中の米国特許出願第０９／３１１，７８４号；Ｉｓｈｉｏｋａら、Ｊ．Ｉｍｉｎｕｎｏｌ．１６２：３９１５−３９２５、１９９９；Ａｎ，Ｌ．およびＷｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：２２９２、１９９７；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：８２２、１９９６；Ｗｈｉｔｔｏｎ，Ｊ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：３４８、１９９３；Ｈａｎｋｅ，Ｒ．ら、Ｖａｃｃｉｎｅ　１６：４２６、１９９８に記載される。例えば、１種または複数のＨＢＶ抗原の複数の領域由来のスーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはモチーフ保有エピトープをコードする複数エピトープＤＮＡプラスミド、万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）ヘルパーＴ細胞エピトープ、例えばＰＡＤＲＥ（登録商標）（またはＨＢＶ抗原由来の複数のＨＴＬエピトープ）、および小胞体−転位シグナル配列が操作され得る。ワクチンは他のＴＡＡに由来するエピトープを含んでもよい。
【０１９０】
多エピトープミニ遺伝子の免疫原性は、試験されるエピトープに対するＣＴＬ誘導応答の大きさを評価するために、トランスジェニックマウスにおいて試験され得る。さらに、インビボでのＤＮＡコードエピトープの免疫原性は、ＤＮＡプラスミドでトランスフェクトされた標的細胞に対する特定のＣＴＬ系統のインビトロ応答と相関され得る。従って、これらの実験は、ミニ遺伝子が、１．）ＣＴＬ応答を生成すること、そして２．）誘導されたＣＴＬが、コードされたエピトープを発現する細胞を認識することの両方に役立つということを示し得る。
【０１９１】
例えば、ヒト細胞における発現のための選択されたエピトープ（ミニ遺伝子）をコードするＤＮＡ配列を作製するために、これらのエピトープのアミノ酸配列を逆転写し得る。ヒトコドン使用頻度表を使用して、各アミノ酸についてのコドン選択を導き得る。これらのエピトープコードＤＮＡ配列は、翻訳された場合に、連続的なポリペプチド配列が作製されるように、直接的に隣接され得る。発現および／または免疫原性を最適化するために、さらなるエレメントが、そのミニ遺伝子設計に組み込まれ得る。逆転写され得、そしてそのミニ遺伝子配列に含まれ得るアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる：ＨＬＡクラスＩエピトープ、ＨＬＡクラスＩＩエピトープ、ユビキチン化シグナル配列および／または小胞体ターゲッティングシグナル。さらに、ＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープのＨＬＡ提示は、そのＣＴＬエピトープまたはＨＴＬエピトープに隣接する、合成の（例えば、ポリアラニン）または天然に存在する隣接配列を含むことによって改変され得；そのエピトープを含むこれらのより大きいペプチドは、本発明の範囲内にある。
【０１９２】
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子の＋鎖および−鎖をコードするオリゴヌクレオチドをアセンブルすることによってＤＮＡに変換され得る。重複オリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）が、周知技術を使用して適切な条件下で、合成、リン酸化、精製およびアニーリングされ得る。これらのオリゴヌクレオチドの末端は、例えば、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを使用して連結され得る。次いで、エピトープポリペプチドをコードする、この合成ミニ遺伝子は、所望の発現ベクターにクローニングされ得る。
【０１９３】
好ましくは、当業者に周知の標準的な調節配列が、標的細胞における発現を確実にするためにベクターに含まれる。以下のいくつかのベクターエレメントが所望される：ミニ遺伝子挿入物のための下流クローニング部位を含むプロモーター；効率的な転写終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；およびＥ．ｃｏｌｉ選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性）。多くのプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター）が、この目的に使用され得る。他の適切なプロモーター配列については、例えば、米国特許第５，５８０，８５９号および米国特許第５，５９８，４６６号を参照のこと。
【０１９４】
さらなるベクター改変が、ミニ遺伝子の発現および免疫原性を最適化するために所望され得る。いくつかの場合において、イントロンが、効率的な遺伝子発現に必要とされ、そして１以上の合成イントロンまたは天然に存在するイントロンが、ミニ遺伝子の転写される領域に組み込まれ得る。ｍＲＮＡ安定化配列および哺乳動物細胞における複製のための配列の包含もまた、ミニ遺伝子発現を増大するために考慮され得る。
【０１９５】
一旦、発現ベクターを選択すると、ミニ遺伝子を、プロモーターの下流のポリリンカー領域内にクローニングする。このプラスミドを、適切なＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換し、そしてＤＮＡを、標準的な技術を使用して調製する。ミニ遺伝子の方向およびＤＮＡ配列、ならびにベクターに含まれる他の全てのエレメントは、制限マッピングおよびＤＮＡ配列分析を使用して確認される。正しいプラスミドを保有する細菌細胞は、マスター（ｍａｓｔｅｒ）細胞バンクおよびワーキング（ｗｏｒｋｉｎｇ）細胞バンクとして保存される。
【０１９６】
さらに、免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）は、ＤＮＡワクチンの免疫原性において役割を果たすようである。これらの配列は、免疫原性の増強が所望される場合に、そのベクター中のミニ遺伝子コード配列の外側に含まれ得る。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、ミニ遺伝子コードエピトープおよび第２のタンパク質（免疫原性を増強または減少するために含まれる）の両方の産生を可能にする、二シストロン性（ｂｉ−ｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターが使用され得る。同時発現される場合に免疫応答を有利に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、または同時刺激分子が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内ターゲッティングシグナルに結合され得、そして発現されるＣＴＬエピトープとは別々に発現され；これは、ＣＴＬエピトープとは異なる、ＨＴＬエピトープの細胞区画への指向を可能にする。必要ならば、これは、ＨＬＡクラスＩＩ経路へのＨＴＬエピトープのより効率的な進入を促進し得、これによって、ＣＴＬ誘導を改善する。ＨＴＬ誘導またはＣＴＬ誘導とは対照的に、免疫抑制分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現によって免疫応答を特異的に減少することが、特定の疾患において有利であり得る。
【０１９８】
治療量のプラスミドＤＮＡは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ中での発酵、その後の精製によって生成され得る。ワーキング細胞バンク由来のアリコートを使用して、培養培地に播種し、そして周知技術に従って、シェーカーフラスコまたはバイオリアクター中で飽和になるまで増殖させる。プラスミドＤＮＡを、標準的なバイオ分離技術（例えば、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって供給される固相陰イオン交換樹脂）を使用して精製し得る。必要ならば、スーパーコイルＤＮＡを、ゲル電気泳動または他の方法を使用して、開環形態および線状形態から単離し得る。
【０１９９】
精製プラスミドＤＮＡは、種々の処方物を使用して、注入用に調製され得る。これらの最も単純なものは、滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中での凍結乾燥化ＤＮＡの再構成である。このアプローチ（「裸ＤＮＡ」としても知られる）は、臨床試験において筋内（ＩＭ）投与のために現在使用されている。ミニ遺伝子ＤＮＡワクチンの免疫治療効果を最大化するために、精製プラスミドＤＮＡを処方するための代替的方法が望ましくあり得る。種々の方法が記載されており、そして新しい技術が利用可能になるかもしれない。カチオン性脂質もまた、処方物中で使用され得る（例えば、国際公開第９３／２４６４０号パンフレット；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６（７）：６８２（１９８８）；米国特許第５，２７９，８３３号；国際公開第９１／０６３０９２４６４０号パンフレット；およびＦｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：７４１３（１９８７）に記載されるような）。さらに、糖脂質、融合誘導（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソーム、ペプチドおよび化合物（まとめて、保護的、相互作用的、非凝縮化合物（ＰＩＮＣ）と呼ばれる）もまた、精製プラスミドＤＮＡに複合体化され得、安定性、筋内分散、または特定の器官または細胞型に対する輸送のような変数に影響する。
【０２００】
標的細胞の感作が、ミニ遺伝子コードＣＴＬエピトープの発現およびＨＬＡクラスＩ提示についての機能的アッセイとして使用され得る。例えば、プラスミドＤＮＡが、標準的なＣＴＬクロム放出アッセイについての標的として適切である哺乳動物細胞系統に導入される。使用されるトランスフェクション方法は、最終処方物に依存する。エレクトロポレーションは、「裸」ＤＮＡのために使用され得、一方、カチオン性脂質が、直接的なインビトロトランスフェクションを可能にする。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドを同時トランスフェクトして、細胞自動解析分離装置（ＦＡＣＳ）を使用する、トランスフェクトした細胞の富化を可能にし得る。次いで、これらの細胞を、クロム５１（５１Ｃｒ）標識し、そしてエピトープ特異的ＣＴＬ系統についての標的細胞として使用し；５１Ｃｒ放出によって検出される細胞溶解が、ミニ遺伝子コードＣＴＬエピトープの産生およびＨＬＡ提示の両方を示す。
【０２０１】
インビボ免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ処方物の機能的試験のための第２のアプローチである。適切なヒトＨＬＡタンパク質を発現するトランスジェニックマウスを、このＤＮＡ産物で免疫する。投与の用量および経路は、処方物依存性である（例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡについてはＩＭ、脂質複合体化ＤＮＡについては腹腔内（ＩＰ））。免疫後２１日で、脾細胞を収集し、試験する各エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間再刺激する。その後、ＣＴＬエフェクター細胞について、標準的な技術を使用して、ペプチドがロードされた５１Ｃｒ標識標的細胞の細胞溶解についてのアッセイを行う。ミニ遺伝子コードエピトープに対応するペプチドのＨＬＡ担持によって感作された標的細胞の溶解は、ＣＴＬのインビボ誘導についてのＤＮＡワクチン機能を実証する。ＨＴＬエピトープの免疫原性は、類似の様式でトランスジェニックマウスにおいて評価される。
【０２０２】
あるいは、核酸は、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されるような、弾道的送達を使用して投与され得る。この技術を使用して、ＤＮＡのみから構成される粒子が投与される。さらなる代替的実施形態において、ＤＮＡは、粒子（例えば、金粒子）に接着され得る。
【０２０３】
ミニ遺伝子はまた、当技術分野で知られている他のバクテリアまたはウイルス送達システムを用いて送達することも可能であり、例えば、本発明のエピトープをコードする発現構築物をワクシニアなどのウイルス性ベクターに組み込むことができる。
【０２０４】
ＩＶ．Ｋ．２．ＣＴＬペプチドとヘルパーペプチドとの組合せ
本発明のＣＴＬペプチドを含むワクチン組成物は、所望の特性、例えば、改善された血清半減期、拡大された集団適用範囲、または増強された免疫原性を提供するように改変され得る。
【０２０５】
例えば、ＣＴＬ活性を誘導するペプチドの能力は、Ｔヘルパー細胞応答を誘導し得る少なくとも１つのエピトープを含む配列にペプチドを連結させることによって増強され得る。免疫原性を増強するためのＣＴＬエピトープと組み合わせたＴヘルパーエピトープの使用は、例えば、同時係属中の米国特許出願第０８／８２０３６０号、米国特許出願第０８／１９７，４８４号、および米国特許出願第０８／４６４，２３４号に例示される。
【０２０６】
ＣＴＬペプチドエピトープは、Ｔヘルパーペプチドに直接連結され得るが、しばしば、ＣＴＬエピトープ／ＨＴＬエピトープ結合体は、スペーサー分子に連結される。スペーサーは、典型的に、比較的小さい、中性の分子（例えば、アミノ酸またはアミノ酸模倣物）からなり、これらは、生理学的条件下で実質的に非荷電性である。スペーサーは、典型的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙあるいは非極性アミノ酸または中性極性アミノ酸の他の中性スペーサーから選択される。任意に存在するスペーサーは、必ずしも同じ残基からなる必要はなく、したがって、ヘテロオリゴマーであっても、ホモオリゴマーであってもよいことが理解される。スペーサーは、存在する場合、通常、少なくとも１残基または２残基であり、より通常は、３〜６残基であり、場合によっては１０残基以上である。ＣＴＬペプチドエピトープは、ＣＴＬペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで、直接的にまたはスペーサーを介してのいずれかで、Ｔヘルパーペプチドエピトープに連結され得る。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端は、アシル化され得る。
【０２０７】
特定の実施形態において、Ｔヘルパーペプチドは、その集団の大部分で存在するＴヘルパー細胞によって認識されるペプチドである。これは、多くの、ほとんどの、または全てのＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するペプチドを選択することによって達成され得る。これらは、「ゆるやかに（ｌｏｏｓｅｌｙ）ＨＬＡ拘束された」または「不規則な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）」Ｔヘルパー配列として知られる。不規則なアミノ酸配列の例としては、以下のような抗原由来の配列が挙げられる：破傷風トキソイドの８３０〜８４３位（ＱＹＩＫＡＮＳＫＦＩＧＩＴＥ；配列番号５１４８４）、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ　スポロゾイト周囲（ＣＳ）タンパク質の３７８〜３９８位（ＤＩＥＫＫＩＡＫＭＥＫＡＳＳＶＦＮＶＶＮＳ；配列番号５１４８５）およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　１８ｋＤタンパク質の１１６位（ＧＡＶＤＳＩＬＧＧＶＡＴＹＧＡＡ；配列番号５１４８６）。他の例としては、ＤＲ　１−４−７スーパーモチーフ、またはＤＲ３モチーフのいずれかを保有するペプチドが挙げられる。
【０２０８】
あるいは、天然に見い出されないアミノ酸配列を使用して、ゆるやかなＨＬＡ拘束様式で、Ｔヘルパーリンパ球を刺激し得る合成ペプチドを調製し得る（例えば、国際公開第９５／０７７０７号パンフレットを参照のこと）。汎ＤＲ結合（ｐａｎ−ＤＲ　ｂｉｎｄｉｎｇ）エピトープと呼ばれるこれらの合成化合物（例えば、ＰＡＤＲＥ（登録商標）、Ｅｐｉｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）は、最も好ましくは、ほとんどのＨＬＡ−ＤＲ（ヒトＨＬＡクラスＩＩ）分子を結合するように設計される。例えば、式：ａＫＸＶＡＡＷＴＬＫＡＡａ（ここで、「Ｘ」は、シクロヘキシルアラニン、フェニルアラニンまたはチロシンのいずれかであり、そしてａは、Ｄ−アラニンまたはＬ−アラニンのいずれかである）を有する、汎ＤＲ結合エピトープペプチドは、ほとんどのＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子に結合し、そしてほとんどの個体由来（それらのＨＬＡ型に拘わらず）のＴヘルパーリンパ球の応答を刺激することが見い出されている。汎ＤＲ結合エピトープの代替物は、全て「Ｌ」天然アミノ酸を含み、そしてこのエピトープをコードする核酸の形態で提供され得る。
【０２０９】
ＨＴＬペプチドエピトープはその生物学的特性を変えるためにも改変され得る。例えば、Ｄ−アミノ酸を含有してプロテアーゼ抵抗性を増大させてその血清半減期を延長させることが可能であり、脂質、タンパク質や炭水化物などの他の分子と結合させてその生物学的活性を増大させることもできる。例えば、Ｔヘルパーペプチドは、１個または複数のパルミチン酸鎖とアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれでも結合させ得る。
【０２１０】
ＩＩＩ．Ｋ．３．ＣＴＬペプチドとＴ細胞プライム剤との組合せ
いくつかの実施形態において、本発明の薬学的組成物中に、細胞傷害性Ｔリンパ球をプライムする（ｐｒｉｍｅ）少なくとも１つの成分を含むことが望ましくあり得る。脂質は、ウイルス抗原に対してＣＴＬをインビボでプライムし得る因子として同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、リジン残基のε−アミノ基およびα−アミノ基に結合され得、次いで、例えば、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなどのような１以上の連結残基を介して、免疫原性ペプチドに連結され得る。次いで、この脂質化ペプチドは、ミセルまたは粒子のいずれかで直接的に投与され得るか、リポソーム内に組み込まれ得るか、またはアジュバント（例えば、不完全フロイントアジュバント）中で乳化され得る。好ましい実施形態において、特に効果的な免疫原性組成物は、Ｌｙｓのε−アミノ基およびα−アミノ基に結合されたパルミチン酸を含み、これは、その免疫原性ペプチドのアミノ末端に連結（例えば、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）を介して結合される。
【０２１１】
ＣＴＬ応答をプライムする脂質の別の例として、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルステイニルセリル−セリン（Ｐ３ＣＳＳ））が、適切なペプチドに共有結合された場合にウイルス特異的ＣＴＬをプライムするために使用され得る（例えば、Ｄｅｒｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３４２：５６１、１９８９を参照のこと）。本発明のポリペプチドは、例えば、Ｐ３ＣＳＳに結合され得、そしてこのリポペプチドが、個体に投与され、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的にプライムし得る。さらに、中和抗体の誘導もまた、Ｐ３ＣＳＳ結合体化エピトープでプライムされ得るので、２つのこのような組成物を組み合わせて、体液性応答および細胞性応答の両方をより効果的に誘発し得る。
【０２１２】
ＣＴＬペプチドおよび／またはＨＴＬペプチドはアミノ酸がペプチドの末端に付加され、ペプチドの互いの容易な連結、キャリア支持体またはより大きいペプチドへの結合、ペプチドまたはオリゴペプチドの物理的特性または化学的特性の改変などを提供し得る。チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸またはアスパラギン酸などのアミノ酸が、ペプチドまたはオリゴペプチド（特に、クラスＩペプチド）のＣ末端またはＮ末端に導入され得る。しかし、いくつかの場合において、ＣＴＬエピトープのカルボキシル末端での改変は、ペプチドの結合特性を変更し得ることに留意すべきである。さらに、ペプチドまたはオリゴペプチド配列は、末端ＮＨ２アシル化（例えば、アルカノイル（Ｃ１〜Ｃ２０）アセチル化またはチオグリコリルアセチル化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニア、メチルアミンなど）によって改変されることによって、天然の配列とは異なり得る。いくつかの例において、これらの改変は、支持体または他の分子に連結するための部位を提供し得る。
【０２１３】
ＩＶ．Ｋ．４．ＣＴＬペプチドおよび／またはＨＴＬペプチドをパルスしたＤＣを含むワクチン組成物
本発明のワクチン組成物の実施形態は、患者の血液由来のＰＢＭＣ（またはそこから単離されたＤＣ）へのエピトープ保有ペプチドのカクテルのエキソビボ投与を包含する。ＤＣの収集を容易にするための医薬（例えば、Ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ（登録商標）（Ｍｏｎｓａｎｔｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）またはＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４）が使用され得る。ペプチドでのＤＣのパルス後および患者への再注入の前に、ＤＣを洗浄し、結合されなかったペプチドを除去する。この実施形態において、ワクチンは、ペプチドをパルスしたＤＣを含み、このペプチドをパルスしたＤＣは、その表面上でＨＬＡ分子と複合体化された、そのパルスされたペプチドエピトープを提示する。
【０２１４】
ＤＣはエキソビボでペプチドカクテル（そのうちのいくつかが、目的の１種または複数のＨＢＶ抗原に対するＣＴＬ応答を刺激する）によってパルスすることもできる。場合によっては、ＰＡＤＲＥファミリー分子などのヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ）ペプチドを、ＣＴＬ応答を容易にするために包含することもできる。したがって、好ましくは複数ＨＢＶ抗原からのエピトープを含む本発明によるワクチンは、ＨＢＶ感染の治療に用いることができる。
【０２１５】
ＩＶ．Ｌ．治療目的または予防目的のためのワクチンの投与
本発明のペプチドならびに本発明の薬学的組成物およびワクチン組成物は、典型的には、ＨＢＶ感染を処置および／または予防するために用いることができる。本発明のペプチドを含むワクチン組成物は、ＨＢＶに感染した患者、あるいはＨＢＶ感染に感受性の個体またはそうでなければＨＢＶ感染の危険性がある個体に投与され、ＨＢＶ抗原に対する免疫応答を誘発し、したがって、患者自身の免疫応答能力を増強する。
【０２１６】
本明細書に記載するように、本発明のＣＴＬエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープを含むペプチドは、ＨＬＡ分子によって提示され、そしてそのペプチドに含まれるエピトープに特異的なＣＴＬまたはＨＴＬを接触された場合に、免疫応答を誘発する。このペプチド（またはそれらをコードするＤＮＡ）は個々に投与され得るし、１種または複数のペプチド配列の融合体として投与することもできる。ペプチドがＣＴＬまたはＨＴＬを接触される様式は、本発明に重要ではない。例えば、このペプチドは、インビボまたはインビトロのいずれかでＣＴＬまたはＨＴＬを接触され得る。その接触がインビボで生じる場合、ペプチド自体が患者に投与され得るか、他のビヒクル（例えば、１種または複数のペプチドをコードするＤＮＡベクター、ペプチドをコードするウイルスベクター、リポソームなど）が、本明細書に記載のように、使用され得る。
【０２１７】
ペプチドがインビトロで接触される場合、ワクチン接種薬剤は、細胞の集団（例えば、ペプチドをパルスした樹状細胞、ＨＰＶ−特異的ＣＴＬ（これは、このペプチドをインビトロで抗原提示細胞にパルスすることにより、または抗原提示細胞を本発明のミニ遺伝子でトランスフェクトさせることにより誘導された）を含み得る。このような細胞集団は、その後、治療的有効用量で患者に投与される。
【０２１８】
治療適用において、ペプチド組成物および／または核酸組成物は、ウイルス抗原に対する効果的なＣＴＬおよび／またはＨＴＬ応答を誘発するのに、ならびに症状および／または合併症を治癒または少なくとも部分的に阻止または遅延するのに十分な量で患者に投与される。このことを達成するための十分な量は、「治療的有効用量」として定義される。この用途のために効果的な量は、例えば、投与される特定の組成物、投与の形態、処置される疾患の段階および重篤度、患者の体重および一般的な健康状態、ならびに処方する医師の判断に依存する。
【０２１９】
薬学的組成物のために、本発明の免疫原性ポリペプチド、またはそれらをコードするＤＮＡは、一般に、ＨＢＶに既に感染した患者に投与される。これらのペプチドまたはそれらをコードするＤＮＡは、個々で投与され得るか、または１以上のペプチド配列の融合体として投与され得る。ＨＢＶ感染した患者は、それらの免疫原性ペプチドで別々に処置されるか、または他の処置と適切に組み合わせて処置され得る。
【０２２０】
治療的用途のために、投与は、一般に、ＨＢＶ感染の最初の診断で開始すべきである。この後に、少なくとも症状が実質的に寛解されるまで、およびその後の期間の間で、追加免疫用量を行う。患者に送達するためのワクチン組成物の実施形態（すなわち、ペプチドカクテル、ポリエピトープポリペプチド、ミニ遺伝子、またはＨＢＶ特異的ＣＴＬもしくはパルスした樹状細胞などの実施形態を含むがこれらに限定されない）は、病気の段階や患者の健康状態によって変わり得る。例えば、慢性ＨＢＶ感染の患者においては、ＨＢＶ特異的ＣＴＬを含むワクチンが、代替的実施形態よりもＨＢＶ感染細胞を殺すのにより有効であろう。
【０２２１】
感受性の個体が、感染前または感染中に同定される場合、その組成物を、それらの個体に標的化し得、これにより、より大きい集団への投与の必要性を最小化する。
【０２２２】
ＨＢＶ感染の処置または予防のために使用されるペプチドもしくは他の組成物は、例えば、疾患の明らかな症状を有しない者において使用され得る。この文脈において、細胞傷害性Ｔ細胞応答を有効的に刺激するのに十分な投与の様式により送達される量のペプチドエピトープを提供することが一般的に重要であり、ヘルパーＴ細胞応答を刺激する組成物もまた、本発明のこの実施形態に従って与えられ得る。
【０２２３】
初期の治療的免疫化のための投薬量は、単位投薬量範囲において一般的に生じ、ここで、そのより低い値は約１、５、５０、５００または１０００μｇであり、そしてより高い値は、約１０，０００；２０，０００；３０，０００；または５０，０００μｇである。ヒトに対する投薬量値は、典型的に、７０ｋｇの患者につき、約５００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲に渡る。数週間〜数カ月に渡るブースト養生法に従う、約１．０μｇ〜約５０，０００μｇの間のペプチドのブースター投薬量は、患者の血液から得られるＣＴＬおよびＨＴＬの比活性を測定することにより決定される患者の応答および状態に依存して投与され得る。投与は、少なくとも臨床的症状または実験室の試験が、そのウイルス感染が除去されるか、または低減されることを示すまでおよびその後の一定期間の間継続すべきである。投薬量、投与経路および用量スケジュールは、当該分野において公知の方法論に従って調整される。
【０２２４】
ある実施形態では、本発明のペプチドおよび組成物は、重篤な疾患状態（すなわち、生命を脅かす状況または潜在的に生命を脅かす状況）において使用され得る。そのような場合において、本発明の好ましい組成物における最小量の外来基質および相対的非毒性のペプチドの結果として、これらの規定された投薬量に対して、実質的に過剰なこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、そして治療医師により所望されると感じられ得る。
【０２２５】
本発明のワクチン組成物はまた、予防薬剤として純粋に使用され得る。一般に、初回の予防免疫のための用量は、一般に、単位投薬範囲にあり、低い値で、約１、５、５０、５００または１０００μｇ、そして高い値で、約１０，０００；２０，０００；３０，０００；または５０，０００μｇである。ヒトについての投薬値は、典型的に、７０キログラム患者当たり、約５００μｇ〜約５０，０００μｇの範囲である。これに続いて、ワクチンの初回投与後、約４週間〜６カ月の規定された間隔で投与される約１．０μｇ〜約５０，０００μｇの間のペプチドのブースター投薬量で追加免疫する。このワクチンの免疫原性は、患者の血液のサンプルから得たＣＴＬおよびＨＴＬの比活性を測定することによって評価され得る。
【０２２６】
治療処置のための薬学的組成物は、非経口投与、局所的投与、経口投与、髄腔内投与または局所（例えば、クリームまたは局所用軟膏）投与のために意図される。好ましくは、この薬学的組成物は、非経口的（例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内）に投与される。従って、本発明は、非経口投与のための組成物を提供し、この組成物は、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）に溶解されているか、または懸濁されている免疫原性ペプチドの溶液を含む。種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝化水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸など）が使用され得る。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのままかもしくは凍結乾燥された状態での使用のために包装され得、凍結乾燥された調製物は、投与の前に滅菌溶液と合わせられる。これらの組成物は、生理学的状態に近づけるために必要とされる場合、薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調節剤および緩衝化剤、張度調節剤、湿潤剤、防腐剤など（例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレアートなど））を含み得る。
【０２２７】
薬学的処方物中の本発明のペプチドの濃度は、広範に変動し得（すなわち、約０．１質量％未満（通常は約２重量％もしくは少なくとも約２質量％）から２０質量％〜５０質量％以上と同程度まで）、そして選択された投与の特定様式に従って、主に流体容量、粘性などによって選択される。
【０２２８】
ヒト単位用量形態のペプチド組成物は、ヒト単位用量の受容可能なキャリア、好ましくは水性キャリアを含む薬学的組成物内に代表的に含まれて、そしてヒトに対してそのような組成物を投与するために使用されることが当業者に公知である一定容量の流体において投与される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｅｄｉｔｏｒ、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９８５を参照のこと）。
【０２２９】
本発明のペプチド、および／またはこのペプチドをコードする核酸はまた、リポソームを介して投与され得、このリポソームはまた、特定の組織（例えば、リンパ組織）に対してペプチドを標的とするためか、または感染細胞に対して選択的に標的とするため、およびペプチド組成物の半減期を増加するために役立ち得る。リポソームとしては、エマルジョン、泡沫、ミセル、不溶性単分子膜、液晶、リン脂質分散系、ラメラ層（ｌａｍｅｌｌａｒ　ｌａｙｅｒ）などが挙げられる。これらの調製物において、送達されるべきペプチドは、単独でか、もしくはリンパ系細胞の一般的なレセプターと結合する分子（例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体）と共にか、または他の治療組成物もしくは免疫原性組成物と共にリポソームの一部として取り込まれる。従って、本発明の所望のペプチドで満たされているか、または装飾されているかのいずれかのリポソームは、リンパ系細胞の部位に指向され得、次いで、ここで、そのリポソームは、そのペプチド組成物を送達する。本発明の使用のためのリポソームが、標準的なベシクル形成脂質から形成され、そのベシクル形成脂質としては、一般的に中性リン脂質および負電荷リン脂質ならびにステロール（例えば、コレステロール）が挙げられる。脂質の選択は、例えば、リポソームサイズ、血流におけるリポソームの酸不安定性および酸安定性を考慮して、一般的に導かれる。例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）および米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載されるように、リポソームを調製するための種々の方法が利用可能である。
【０２３０】
免疫系の細胞を標的とするために、リポソーム内に組み込まれるべきリガンドは、例えば、所望の免疫系細胞の細胞表面決定基に対して特異的な抗体またはそのフラグメントを含み得る。ペプチドを含むリポソーム懸濁物は、とりわけ、投与の様式、送達されるペプチド、および処置される疾患の段階に従って変動する用量において、静脈内に、局所に（ｌｏｃａｌｌｙ）、局所的（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）などにおいて投与され得る。
【０２３１】
固体組成物のために、従来の非毒性固体キャリアが使用され得、そのキャリアとしては、例えば、薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、タルク、セルロース、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与のために、薬学的に受容可能な非毒性組成物は、通常使用される任意の賦形剤（例えば、上記に列挙されたそれらのキャリア）、および一般的に１０〜９５％の活性成分（すなわち、本発明の１つ以上のペプチド、およびより好ましくは２５％〜７５％の濃度にて）を取り込むことによって形成される。
【０２３２】
エアロゾル投与のために、免疫原性ペプチドが、界面活性剤および噴霧剤と共に微細に分割された形態で好ましくは提供される。ペプチドの代表的な割合は、０．０１質量％〜２０質量％であり、好ましくは１質量％〜１０質量％である。この界面活性剤は、当然ながら、非毒性でなければならず、そして好ましくは、噴霧剤に可溶性である。そのような薬剤の代表的なものは、６〜２２個の炭素原子を含む、脂肪酸のエステルまたは部分エステル（例えば、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とカプロン酸、オクタン酸、ラウリル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ）酸およびオレイン酸との）である。混合エステル（例えば、混合グリセリドまたは天然グリセリド）が使用され得る。この界面活性剤は、組成物の０．１質量％〜２０質量％、好ましくは０．２５〜５質量％を構成し得る。組成物の残りは、通常、噴霧剤である。キャリアもまた、所望される場合、例えば、鼻腔内送達のためにレシチンと共に含まれ得る。
【０２３３】
ＩＶ．Ｍ．キット
本発明のペプチドおよび核酸組成物は、ワクチン投与のための指示と共にキット中で提供され得る。典型的には、そのキットは、容器中の、好ましくは、単位用量形態の所望のペプチド組成物および投与についての指示書を含む。別のキットは、投与についての指示書と共に、好ましくは、単位用量形態で容器中に本発明の所望の核酸を有するミニ遺伝子構築物を含む。ＩＬ−２またはＩＬ−１２などのリンホカインはまた、そのキットに含まれ得る。また所望され得る他のキット構成成分としては、例えば、滅菌シリンジ、ブースター投薬、および他の所望の賦形剤が挙げられる。
【０２３４】
本発明のエピトープを使用して成功裡に免疫応答を誘導した。これらのエピトープによる免疫応答はエピトープを様々な形態で投与することにより誘導された。エピトープはペプチドとして、核酸として、そして本発明のエピトープをコードする核酸を含むウイルス性ベクターとして投与された。ペプチドに基づいたエピトープ形式の投与に際しては、空のＨＬＡ分子上にエピトープの直接に負荷することにより免疫応答が誘導され、エピトープのインターナリゼーションおよびＨＬＡクラスＩ経路を通じたプロセシングによって細胞上で発現された；いずれにしても、エピトープを発現するＨＬＡ分子は、次いで、ＣＴＬ応答と相互作用し、ＣＴＬ応答を誘導することができた。ペプチドは直接またはリポソームなどの薬剤を使用して送達することができる。それらはさらに、弾道的送達（典型的にはペプチドは結晶の形式である）を使用して送達することができる。ＤＮＡが免疫応答を誘導するために使用される場合、それは裸ＤＮＡとして一般におよそ１〜５ｍｇの服用量範囲で、または弾道的「遺伝子銃」送達によって典型的にはおよそ１０〜１００μｇの服用量範囲で投与される。ＤＮＡは様々な形態、例えば、線形、環状などで送達することができる。本発明に従ってエピトープをコードする核酸を含む、様々なウイルスのベクターが成功裡に使用された。
【０２３５】
したがって、本発明の組成物はいくつかの形式で存在する。本発明のこれらの組成物形式の各々の実施形態は、免疫応答を誘導するために成功裡に使用された。
【０２３６】
本発明の１つの組成物は多くのペプチドを含む。この複数すなわちペプチドカクテルは、一般に１種または複数の薬学的に許容可能な賦形剤と混合される。ペプチドカクテルは、同じペプチドの複数のコピーを含むことができるし、またはペプチドの混合物を含むことができる。ペプチドは天然に存在するエピトープのアナログであり得る。ペプチドは人工のアミノ酸および／または表面活性分子の付加（脂質化、アセチル化、糖鎖形成、ビオチン化、リン酸化など）のような化学的改変を含むことができる。ペプチドはＣＴＬエピトープまたはＨＴＬエピトープであり得る。好ましい実施形態では、ペプチドカクテルが多くの異なるＣＴＬエピトープおよび少なくとも１つのＨＴＬエピトープを含む。ＨＴＬエピトープは、天然のまたは非天然の（例えばＰＡＤＲＥ（登録商標）（Ｅｐｉｍｍｕｎｅ　Ｉｎｃ．、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））であり得る。本発明の実施例中の別個のエピトープの数は、一般に１〜１５０までの全体の単位整数である（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９６、９７、９８、９９、１００または１５０）。
【０２３７】
本発明の組成物のさらなる実施形態は、ポリペプチド複数エピトープ構築物、つまりポリエピトープペプチドを含む。本発明のポリエピトープペプチドは、当技術分野においてよく知られた技術の使用によって調製される。知られた技術の使用によって、本発明のエピトープは互いに連結される。ポリエピトープペプチドは線形でもよいし非線形（例えば、多価）でもよい。これらのポリエピトープな構築物は、人工のアミノ酸、離隔用すなわちスペーサーアミノ酸、隣接（ｆｌａｎｋｉｎｇ）アミノ酸、または隣接したエピトープユニット間の化学的改変を含むことができる。ポリエピトープな構築物は、へテロポリマーでもホモポリマーでもよい。ポリエピトープな構築物は、一般に２〜１５０（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、または１５０）の間の任意の全体の単位整数の数量であり得る。ポリエピトープな構築物は、ＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープを含むことができる。構築物中の１つ以上エピトープは改変、例えば、表面活性材料（例えば脂質）の追加によって、または化学的改変（例えばアセチル化など）されることができる。さらに、複数エピトープ構築物中の結合は、ペプチド結合以外のもの（例えば共有結合、エステル結合、エーテル結合、ジスルフィド結合、水素結合、イオン結合など）であり得る。
【０２３８】
あるいは、本発明の組成物は、ネイティブな配列に相同性（つまり、それと一致するか接触する）を有するアミノ酸の連続、配列、伸張などを含む構築物を含む。アミノ酸のこの伸張は、アミノ酸の少なくとも１つのアミノ酸部分配列であって、アミノ酸のより長いシリーズから開裂または分離された場合に、本発明に従ってＨＬＡクラスＩまたはＨＬＡクラスＩＩエピトープとして機能する配列を含む。この実施形態では、ペプチド配列は、当技術分野で知られているか提供される多くの使用によって、ここに定義されるような構築物となるように改変される。ポリエピトープな構築物、７０〜１００％（例えば７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００パーセント）からの任意の全体の単位整数インクリメントにネイティブな配列への相同性を含むことができる。
【０２３９】
本発明の組成物のさらなる実施形態は、本発明の１つ以上エピトープを含む抗原提示細胞である。抗原提示細胞は樹状細胞のような細胞を示す「プロフェッショナルな」抗原であり得る。抗原提示細胞は、当技術分野において知られているまたは決定された任意の手段によって本発明のエピトープを含むことができる。そのような手段は、１つ以上の個々のエピトープにより、または多数のエピトープを含む１つ以上のペプチドにより樹状細胞のパルスすることを含み、弾道的核酸送達などの核酸投与によって、または核酸を投与するための当技術分野の他の技術（ベクターに基づく（例えばウイルスのベクター）核酸の送達を含む）による。
【０２４０】
本発明の組成物のさらなる実施形態は、本発明の１つ以上のペプチドをコードする核酸、または本発明のポリエピトープペプチドをコードする核酸を含む。当業者には理解されるように、様々な核酸組成物は、遺伝暗号の冗長性により同一のペプチドをコードする。これらの核酸組成物の各々は本発明の範囲内となる。本発明のこの実施形態はＤＮＡまたはＲＮＡを含み、そしてある実施形態においては、ＤＮＡとＲＮＡの組合せを含む。本発明のペプチドをコードする核酸を含む任意の組成物または本発明の他の任意のペプチドに基づく組成物も本発明の範囲以内にあることが理解されるべきである。
【０２４１】
本発明のペプチドに基づく形式は（それらをコードする核酸と同様に）、当技術分野において知られているか将来知られる原理を使用して生成された本発明のエピトープのアナログを含むことができる。アナログ化と関係する原理は、現在、当技術分野の中で知られており、ここに開示される；さらに、アナログ化する原理（ヘテロクリティック（ｈｅｔｅｒｏｃｌｉｔｉｃ）アナログ化）は、１９９９年１月６日に出願され共に係属しているＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／２２６，７７５に開示される。一般に、本発明の組成物は分離されるか精製される。
【０２４２】
（Ｖ．実施例）
本発明は、特定の実施例によってより詳細に記載される。以下の実施例は、例示的な目的について提供され、そして、いずれの方法においても本発明を制限することを意図するものではない。当業者は、本発明に従って、種々の重要でないパラメーターが、別の実施形態を生じるように変化され得るかまたは改変され得ることを容易に理解する。
【０２４３】
実施例１：ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ結合アッセイ
ＨＬＡ分子に結合するペプチドの以下の実施例は、ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩペプチドの結合親和性の定量を示す。結合アッセイは、モチーフ保有であるかまたはモチーフ保有でないかのどちらかであるペプチドを使用して実施し得る。
【０２４４】
細胞溶解物は、開示されたプロトコル（Ｓｉｄｎｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１８．３．１（１９９８）；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：２４７（１９９５）；Ｓｅｔｔｅら、Ｍｏｌ．Ｉｍｕｎｏｌ．３１：８１３（１９９４））に従って調製し、また、ＨＬＡ分子が精製された。ＨＬＡ分子の源として使用される細胞系、および、細胞溶解物からのＨＬＡ分子の抽出のために使用された抗体も、これらの刊行物に記載される。
【０２４５】
エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換したホモ接合性細胞系統、線維芽細胞、ＣＩＲ、または７２１．２２１形質転換体を、ＨＬＡクラスＩ分子の供給源として使用する。これらの細胞は、２ｍＭＬグルタミン（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、５０μＭ　２−ＭＥ、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１０％の加熱不活性化されたＦＣＳ（Ｉｒｖｉｎｅ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ　Ａｎａ、ＣＡ）を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地において培養によってインビトロで維持した。細胞は、２２５ｃｍ２の組織培養フラスコにおいて、または大規模培養のためにローラーボトル装置において成長させた。
【０２４６】
細胞溶解物は以下のように調製された。簡単に言えば、細胞は、５０ｍＭトリスＨＣＩ（ｐＨ８．５、１％Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０（Ｆｌｕｋａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ、Ｂｕｃｈｓ、スイス）を含む）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび２ｍＭ　ＰＭＳＦ中、１０８個の細胞／ｍｌの濃度で溶解した。溶解物は遠心分離（１５，０００×ｇ、３０分間）によって砕片および核を取り除いた。
【０２４７】
ＨＬＡ分子からアフィニティークロマトグラフィーによって溶解物を取り出した。溶解物は、不活性化されたＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ４−Ｂおよびタンパク質Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの２つのプレカラムに２度通した。次に、溶解物を、適当な抗体を結合したＳｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ−４Ｂビーズカラムに通した。次いで、抗ＨＬＡカラムは１０カラム容積の１０ｍＭトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８．０、１％のＮＰ−４０、ＰＢＳ溶液）で、２カラム容積のＰＢＳで、および２カラム容積の０．４％ｎ−オクチルグリコシドを含むＰＢＳで洗浄した。最後に、ＭＨＣ分子は５０ｍＭジエチルアミン（４％のｎ−オクチルグリコシドを含む０．１５Ｍ　ＮａＣｌ溶液。ｐＨ１１．５）で溶出した。１／２５容積の２．０Ｍトリス（ｐＨ６．８）を加え、溶離液ｐＨが約８．０まで低下するように溶出した。次いで、溶離液をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐコンセントレータ（Ａｍｉｃｏｎ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中２０００ｒｐｍでの遠心分離によって濃縮した。タンパク質成分は、ＢＣＡタンパク質アッセイ（（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって評価し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。
【０２４８】
ペプチドのクラスＩおよびクラスＩＩ　ＭＨＣへの結合を測定するために利用されたプロトコルの詳細な記載は公表されている（Ｓｅｔｔｅら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：８１３、１９９４；Ｓｉｄｎｅｙら、ｉｎ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｄ．、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｓｅｃｔｉｏｎ　１８．３、１９９８））。簡単に言えば、ＭＨＣ分子（５〜５００ｎＭ）を精製し、プロテアーゼ阻害剤剤カクテルの存在下、０．０５％のＮｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０（ＮＰ４０）（またはＨ−２　ＩＡ分析用の２０％ｗ／ｖジギトニン）を含むＰＢＳ中で４８時間、様々な無標識ペプチド阻害剤および１〜１０ｎＭ１２５Ｉ−放射標識プローブペプチドと共にインキュベートした。プロテアーゼ阻害剤（各々ＣａｌＢｉｏＣｈｅｍ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の最終濃度は、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、１．３ｎＭ１．１０　フェナンスロリン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｏｌｉｎｅ）、７３μＭペプスタチンＡ、８ｍＭ　ＥＤＴＡ、６ｍＭ　Ｎ−エチルマレイミド（クラスＩＩ分析用の）および２００μＭ　Ｎアルファ−ｐ−トシル−Ｌ−リジンクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）であった。分析はすべて、ＤＲＢ１＊０３０１（ｐＨ４．５で実行された）およびＤＲＢ１＊１６０１（ＤＲ２ｗ２１β１）およびＤＲＢ４＊０１０１（ＤＲｗ５３）（ｐＨ５．０で実行された）を例外としてｐＨ７．０で実行された。ｐＨは別記した（Ｓｉｄｎｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｄ．、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、Ｓｅｃｔｉｏｎ　１８．３、１９９８を参照のこと）ように調節した。
【０２４９】
インキュベーションに続いて、ＭＨＣペプチド複合体を、ＰＢＳ（ｐＨ６．５、０．５％ＮＰ４０および０．１％ＮａＮ３を含む）１．２ｍｌｓ／分で溶出し、７．８ｍｍ×１５ｃｍのＴＳＫ２００カラム（ＴｏｓｏＨａａｓ　１６２１５、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＰＡ）上のゲルろ過によって遊離のペプチドから分離した。ＤＲＢ１＊１５０１（ＤＲ２ｗ２１β１）アッセイに使用された大きなサイズの放射性標識ペプチドは、このような条件下で未結合ピークから結合ピークを分離することがより難しいので、全てのＤＲＢ１＊１５０１（ＤＲ２ｗ２１β１）アッセイを、０．６ｍｌｓ／分で溶出する７．８ｍｍ×３０ｃｍ　ＴＳＫ２０００カラムを用いて実施した。ＴＳＫカラムからの溶出液を、Ｂｅｃｋｍａｎ１７０放射性標識検出器に通過させ、そして、放射活性をプロットしそしてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ３３９６Ａインテグレーターを用いて積算し、そして結合したペプチドの画分を決定した。
【０２５０】
放射性標識ペプチドを、クロラミンＴ法を用いてヨウ素化した。それぞれのアッセイおよびそのアッセイ特異的ＩＣ５０ｎＭにおいて利用される代表的な放射性標識プローブペプチドを、表ＩＶおよびＶに要約した。典型的には、予備実験において、ＭＨＣ調製物の各々を、総放射活性の１０〜２０％と結合するための必要なＨＬＡ分子の濃度を決定するために、固定量の放射性標識ペプチドの存在下で滴定した。続く全ての阻害および直接的結合アッセイを、これらのＨＬＡ濃度で行った。
【０２５１】
これらの条件［標識］＜［ＨＬＡ］および［ＩＣ５０］≧［ＨＬＡ］下で、測定したＩＣ５０値は、真のＫＤ値の合理的な近似値であった。ペプチドインヒビターは、典型的には、１２０μｇ／ｍｌから１．２ｎｇ／ｍｌまでの範囲の濃度で試験し、そして、２〜４の完全に独立した実験で試験した。異なった実験で獲得されたデータの比較を可能にするために、試験されたそれぞれのペプチドついてのＩＣ５０で、阻害についてのポジティブコントロール（典型的には、放射性標識プローブペプチドの未標識バージョン）のＩＣ５０を割ることによって、それぞれのペプチドについて相対的な結合数値を計算する。実験間比較のために、相対結合値を編集した。これらの値は、引き続き目的のペプチドの相対結合で、阻害についてのポジティブコントロールのＩＣ５０ｎＭを割ることによって変換され、ＩＣ５０ｎＭ値に戻ることができる。データ編集のこの方法は最も正確であり、そして異なった日数で試験されたペプチドまたは異なったロットの精製ＭＨＣとの比較について一貫していることを証明する。
【０２５２】
ＨＬＡ−ＤＲ精製（ＬＢ３．１）について使用される抗体は、α鎖特異的であるため、β１分子は、β３（および／またはβ４およびβ５）分子から分離されない。結合アッセイのβ１特異性は、ＤＲＢ１＊０１０１（ＤＲ１）、ＤＲＢ１＊０８０２（ＤＲ８ｗ２）、およびＤＲＢ１＊０８０３（ＤＲ８ｗ３）の場合で明らかであるが、β３は全く発現されない。ＤＲＢ１＊０３０１（ＤＲ３）およびＤＲＢ３＊０１０１（ＤＲ５２ａ）、ＤＲＢ１＊０４０１（ＤＲ４ｗ４）、ＤＲＢ１＊０４０４（ＤＲ４ｗ１４）、ＤＲＢ１＊０４０５（ＤＲ４ｗ１５）、ＤＲＢ１＊１１０１（ＤＲ５）、ＤＲＢ１＊１２０１（ＤＲ５ｗ１２）、ＤＲＢ１＊１３０２（ＤＲ６ｗ１９）およびＤＲＢ１＊０７０１（ＤＲ７）についてもまた示されてきた。ＤＲＢ１＊１５０１（ＤＲ２ｗ２β１）、ＤＲＢ５＊０１０１（ＤＲ２ｗ２β２）、ＤＲＢ１＊１６０１（ＤＲ２ｗ２１β１）、ＤＲＢ５＊０２０１（ＤＲ５１Ｄｗ２１）、およびＤＲＢ４＊０１０１（ＤＲｗ５３）アッセイついてのβ鎖特異性の問題は、線維芽細胞の使用によって回避できる。ＤＲβ分子特異性に関するアッセイの開発および確証は、以前に記載されている（例えば、Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３、１９９８を参照のこと）。
【０２５３】
上記に概略される結合アッセイを、例えば、実施例２に記載されるように、スーパーモチーフおよび／またはモチーフ保有エピトープを分析するために使用し得る。
【０２５４】
実施例２．保存されたＨＬＡスーパーモチーフ保有ＣＴＬ候補エピトープの同定
本発明のワクチン組成物は、広範な集団の適用範囲を達成するために、多数のＨＬＡスーパーモチーフまたはモチーフを含む多数のエピトープを含み得る。この実施例は、そのようなワクチン組成物における含有についてのスーパーモチーフ保有エピトープの同定を例示する。集団適用範囲は、下記のストラテジーを使用して計算した。エピトープは、ＨＬＡ−Ａ２、−Ａ３もしくは−Ｂ７スーパーモチーフまたはＨＬＡ−Ａ１もしくは−Ａ２４モチーフを保有するように選択された。
【０２５５】
スーパーモチーフおよび／またはモチーフ保有エピトープの同定のためのコンピュータサーチおよびアルゴリズム
ＨＬＡクラスＩのスーパーモチーフもしくはモチーフまたはＨＬＡクラスＩＩのスーパーモチーフもしくはモチーフを保有するエピトープについてのコンピュータサーチを、以下のように行った。全ての翻訳されたＨＢＶ単離配列を、適切なＨＬＡ結合モチーフを含む潜在的ペプチド配列を同定するために、テキストストリング（ｔｅｘｔ　ｓｔｒｉｎｇ）サーチソフトウェアプログラム（例えば、ＭｏｔｉｆＳｅａｒｃｈ１．４（Ｄ．Ｂｒｏｗｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ））を用いて分析した；代替のプログラムは、本明細書中に開示されるモチーフ／スーパーモチーフを参照して、当該分野の情報に従って、容易に作製される。さらに、そのような計算は、頭の中で行われ得る。同定されたＡ２スーパーモチーフ配列、Ａ３スーパーモチーフ配列、およびＤＲスーパーモチーフ配列を、特定のＨＬＡクラスＩ分子またはＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するそれらの能力を推定するための多項式アルゴリズムを用いて、スコアリングした。これらの多項式アルゴリズムは、伸長したモチーフおよび精製されたモチーフの両方を考慮し（すなわち、異なる位置での異なるアミノ酸の影響を考慮するために）、かつ以下の前提に基本的に基づく。この前提とは、ペプチドＨＬＡ分子相互作用の親和性全体（言い換えるとΔＧ）は、以下の型の直線的な多項式関数：
「ΔＧ」＝ａ１ｉ×ａ２ｉ×ａ３ｉ．．．．．．×ａｎｉ
として近似し得、ここで、ａｊｉは、ｎアミノ酸のペプチドの配列に沿って、所定の位置（ｉ）での所定のアミノ酸（ｊ）の存在効果を示す係数である。この方法の重要な仮説は、それぞれの位置での効果が互いに実質的に独立している（すなわち、個々の側鎖の独立した結合）ということである。残基ｊがペプチド中の位置ｉで生じる場合、定常量ｊｉが、ペプチドの残りの配列とは無関係なペプチドの結合の自由エネルギーに貢献することが想定される。この仮説は、ペプチドが実質的に伸長したコンフォメーションでＭＨＣに結合しかつＴ細胞によって認識されることを示す本発明者らの研究室の研究（データは本明細書中に示されていない）によって正当化される。
【０２５６】
特定のアルゴリズム係数の誘導法は、Ｇｕｌｕｋｏｔａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：１２５８−１２６、１９９７；（Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３、１９９６；およびＳｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３、１９９８もまた参照のこと）に記載されている。手短には、全てのｉ位置について、アンカーおよび非アンカーも同様に、ｊを有する全てのペプチドの平均相対結合（ＡＲＢ）の相乗平均を、集団の残りと比較して計算し、そして、ｊｉの推定値として使用した。クラスＩＩペプチドについて、多数のアライメントが可能な場合、反復手順に従って、最高のスコアリングのアライメントのみを利用した。試験セットにおける所定のペプチドのアルゴリズムスコアを計算するために、そのペプチドの配列に対応するＡＲＢ値を乗算した。この積が選択される閾値を超える場合、そのペプチドは、結合することが推定される。適切な閾値を、所望される推定のストリンジェンシーの度合いの関数として選択する。
【０２５７】
ＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ交差反応性ペプチドの選択
２０のＨＢＶ単離体由来の完全配列をアライメントし、次いで、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフの一次アンカー特異性を含む保存された９および１０マーの配列を同定するために、カスタマイズしたコンピュータプログラムを利用して、走査した。
【０２５８】
全１５０の保存されたモチーフ陽性配列を同定した。次いで、これらのペプチドを、Ａ＊０２０１特異的多項式アルゴリズムを用いてＡ＊０２０１の好ましい二次アンカー残基の存在について評価した。全８５の保存されたモチーフ保有配列を選択し合成した。
【０２５９】
これらの８５の保存されたモチーフ保有９および１０マーのペプチドのうち８５を、精製したＨＬＡ−Ａ＊０２０１分子にインビトロで結合するそれらの能力について試験した。３４ペプチドが良好なＡ＊０２０１結合体（ＩＣ５０≦５００ｎＭ）であり；１５が高い結合体（ＩＣ５０≦５０ｎＭ）であり１９が中程度の結合体（ＩＣ５０が５０〜５００ｎＭ）であることが見出された（表ＸＸＶＩ）。
【０２６０】
独立した分析の過程で、２５の保存された、ＨＢＶ由来の、適当なＡ２−スーパータイプ一次アンカーを備えた８または１１のマー配列も合成し、Ａ＊０２０１結合について試験した。１つのペプチド、ＨＢＶ　ｅｎｖ　２５９　１　１マー（ペプチド１１４７．１４）は、ＩＣ５０が５００ｎＭ以下でＡ＊０２０１に結合し、また表ＸＸＶＩに含まれていた。表ＸＸＶＩには、ＨＢＶ　ｐｏｌ　５３８　９マーペプチド（これはＡ＊０２０１に５．１ｎＭのＩＣ５０で結合する）（以下を参照））の一置換体であるアナログペプチドも示す。
【０２６１】
３６のＡ＊０２０１結合体のうちの３０は、続けて、追加のＡ２−スーパータイプ対立遺伝子（Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０６およびＡ＊６８０２）への結合能力について試験した。表ＸＸＶＩの中で示されるように、１５／３０の（５０％）ペプチドがＡ２スーパータイプ交差反応結合体（少なくとも試験した５つのＡ２スーパータイプ対立遺伝子のうち３つと結合する結合体）であることが見出された。さらに詳しい分析のためにこれらの１５のペプチドを選択した。
【０２６２】
ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープの選択
同じ２０の単離体由来の配列について、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフの一次アンカーを有する保存されたペプチドの存在を同様に調べた。合計８０の保存された９−または１０マーモチーフを含む配列が同定された。Ａ０３およびＡ１１アルゴリズムを使用する詳しい分析は、いずれか一方または両方のアルゴリズムにおいて高く得点した４０の配列を同定した。対応するペプチドのうちの３６を合成し、ＨＬＡＡ＊０３およびＨＬＡ−Ａ＊１１（２つの最も一般的なＡ３−スーパータイプ対立遺伝子）への結合を試験した。Ａ３および／またはＡ１１とＩＣ５０値≦５００ｎＭの親和性で結合する２３のペプチドが同定された（表ＸＸＶＩ１）。
【０２６３】
独立した一連の研究過程で、３０のＨＢＶ由来の８マーおよび２４の１１マー配列（単離物の７５％以上保存）を選択しＡ＊０３とＡ＊１１についての結合試験を行った。４つの８マーおよび９つの１１マーは、対立遺伝子のいずれかまたは両方と結合することが見出された（表ＸＸＶＩＩ）。最終的に、４つの９マー、および１つの１０マーが、（上に概説した探索基準を使用して選択されていない保存されたＨＢＶ由来ペプチド。但し、それはＡ＊０３および／またはＡ＊１１を結合することが示された）同定され、表ＸＸＶＩＩに含まれている。これらのペプチドのうち２つは標準的でないアンカー（ペプチド２０．０１３１および２０．０１３０）であり、また、他の３つはアルゴリズム陰性（ペプチド１１４２．０５、１０９９．０３および１０９０．１５）である。
【０２６４】
続いて４１個のＡ＊０３および／またはＡ＊１１結合ペプチドのうち３８こをを、他の共通のＡ３−スーパータイプ対立遺伝子（Ａ＊３１０１、Ａ＊３３０１およびＡ＊６８０１）への交差反応性の結合力に関して試験した。これらのペプチドのうちの１７個がＡ３−スーパータイプ交差反応性だったことが判明し、試験した５つのＡ３−スーパータイプ対立遺伝子のうち少なくとも３つと結合した（表ＸＸＶＩＩ）。
【０２６５】
ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有エピトープの選択
同じ２０の単離物をＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフを有する保存された９マーおよび１０マーペプチドの存在について分析し、４６の配列が同定された。対応する３４のペプチドを合成し、ＨＬＡ−Ｂ＊０７０２（最も一般的なＢ７−スーパータイプ対立遺伝子）との結合を試験した。９つのペプチドが、ＩＣ５０値≦５００ｎＭでＢ＊０７０２と結合した（表ＸＸＶＩＩＩ）。次いで、これらの９つのペプチドを、他の共通Ｂ７−スーパータイプ対立遺伝子（Ｂ＊３５０１、Ｂ＊５１、Ｂ＊５３０１およびＢ＊５４０１）との結合について試験した。９つのうち５個のＢ＊０７０２結合体は、試験した５つのＢ７−スーパータイプ対立遺伝子の３個以上に結合することができた。
【０２６６】
Ｂ７−スーパータイプ対立遺伝子の第２のアンカー必要条件を調査する別の研究において、Ｂ７−スーパーモチーフを有するすべての入手可能なペプチドをすべてのＢ７−スーパータイプ対立遺伝子との結合について試験した。その結果、上に記載した３４のペプチドもすべて、他のＢ７との結合について試験した。これらの実験は、少なくとも１つのＢ７−スーパータイプ対立遺伝子とＩＣ５０値≦５００ｎＭで結合するさらに１０個のペプチドを同定し、その中には３つ以上の対立遺伝子と結合する２つのペプチドが含まれていた。これらの１０個のペプチドも表ＸＸＶＩＩＩ中に示す。
【０２６７】
保存されたＢ７−スーパータイプ縮重ＨＢＶ由来９−マーおよび１０マーペプチドの数は、Ａ２−およびＡ３−スーパータイプと比較して少ないため、２０個の単離物を、保存モチーフ保有８−マーおよび１１マーを同定するために再び検査した。この再走査は５１個のペプチドを同定した。これらのうちの３１個を合成し、５つの最も共通のＢ７−スーパータイプ対立遺伝子の各々への結合を試験した。１９個の８−および１１マーペプチドが、少なくとも１つのＢ７−スーパータイプ対立遺伝子と高いまたは中程度の親和性（ＩＣ５０値≦５００ｎＭ）をもって結合した（表ＸＸＶＩＩＩ）。２つのペプチドが、試験した５つの対立遺伝子のうちの３つと結合する縮重した結合体であった。
【０２６８】
要約すれば、分析した単離体において７５％以上保存された縮重Ｂ７−スーパータイプ結合体である９つのＨＢＶ由来ペプチド全体が同定された（表ＸＸＶＩＩＩ）。
【０２６９】
Ａ１およびＡ２４モチーフ保有エピトープの選択
さらに集団適用範囲を拡大するため、ＨＬＡ−Ａ１および−Ａ２４エピトープを本分析に組み入れた。５つの異なる主な人種（白人、北米黒人、中国人、日本人およびラテンアメリカ人）中で、Ａ１は平均１２％以上、Ａ２４は人口におよそ２９％の存在している。これらの対立遺伝子は組み合わせられて、３９％の平均頻度でこれらの同じ人口の中で表わされるであろう。Ａ１とＡ２４がＡ２−、Ａ３−およびＢ７−スーパータイプ対立遺伝子と合わせた場合、合計の適用範囲は主要な人種中で＞９５．４％である；比較すると、Ａ２−、Ａ３−およびＢ７−スーパータイプを合わせた適用範囲が８６．２％である。
【０２７０】
Ａ１とＡ２４バインダーに対するＨＢＶの系統的な分析はまだ終わっていない。しかしながら、独立した研究の過程で、Ａ＊０１０１に５００ｎＭ未満のＩＣ５０で結合する１５個の保存されたＨＢＶ由来ペプチドが同定され（表ＸＸＩＸ）；これらのうちの７個は１００ｎＭ未満のＩＣ５０で結合する。同様の文脈の中で、１４個の保存されたＡ＊２４０２結合ＨＢＶ由来ペプチドがさらに同定され、それらのうちの６個は、Ａ＊２４０２に１００ｎＭ未満のＩＣ５０で結合する（表ＸＸＩＸ）。
【０２７１】
実施例３：免疫原性の確認
Ａ＊０２０１免疫原性の評価
上に識別された１５個のＨＢＶ由来ＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ交差反応性ペプチドの免疫性分析を表ＸＸＸに要約する。ペプチドは、３つの系の少なくとも１つでの免疫原性についてスクリーニングした。ペプチドはインビトロでの主要抗原特異的ＣＴＬの誘導のためにヒトＰＢＭＣ（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６０３、１９９５）を使用してスクリーニングし；このデータは、表ＸＸＸの中「主要なＣＴＬ」として示す。
【０２７２】
ヒトＰＢＭＣからの主要抗原特異的ＣＴＬのインビトロ誘導用のプロトコルは、ウェントワースら（Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈら、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：６０３、１９９５）に記載されている。ＣＤ８＋Ｔ細胞のために正常な寄贈者からのＰＢＭＣを富裕化し、ＩＬ−７の存在下にペプチド負荷抗原提示細胞（ＳＡＣ−Ｉ活性化されたＰＢＭＣ）と共にインキュベートした。７日の培養後、ペプチドでパルスされた照射された自系付着細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ａｄｈｅｒｅｎｔ　ｃｅｌｌｓ）を使用して新たに培養物を刺激し、次いで、７日後に細胞傷害活性について試験した。
【０２７３】
さらに、ＨＬＡトランスジェニックマウスがペプチド免疫原性を評価するために使用され；このデータは表ＸＸＸの「トランスジェニックＣＴＬ」に示す。従来の研究は、Ａ＊０２０１／Ｋｂトランスジェニックマウスで誘導されたＣＴＬがヒト中で誘導されたＣＴＬに似た特異性を示すことを示している（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７、１９９１；Ｗｅｎｔｗｏｒｔｈら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：９７、１９９６）。
【０２７４】
ペプチド免疫に続くトランスジェニックマウス中のＣＴＬ誘導はＶｉｔｉｅｌｌｏら（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７、１９９１）およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３、１９９７）に記載されている。簡単に言えば、合成ペプチド（５０μｇ／マウス）およびヘルパーエピトープＨＢＶコア１２８（１４０μｇ／マウス）を不完全なフロイントアジュバント（ＩＦＡ）中に乳化し、尾の基部において皮下注入した。注入の１１日後に、脾細胞を、ペプチド負荷した同質遺伝子的なＬＰＳ芽細胞の存在下でインキュベートした。６日後に、ペプチドパルス標的を使用して、培養物を細胞障害活性について分析した。
【０２７５】
また、ペプチドを、急性感染ＨＢＶ患者の中のリコールＣＴＬ応答のリコールを刺激する能力に関して試験し（Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３、１９９７年；Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１６５５−１６６５、１９９６年；Ｎａｙｅｒｓｉｎａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４６５９、１９９３）；これらのデータは「表ＸＸＸ」中に「患者ＣＴＬ」として示す。天然感染過程でペプチドが認識されることが示されるため、患者の免疫原性データは特に有益である。これらのデータは、ペプチドが、ＣＴＬの目標を表わす人間の細胞中で処理され提示されることを実証する。さらに、患者中のＣＴＬ応答の誘導が感染の解消に関連付けられたように、このデータはワクチン設計に特に関連する。
【０２７６】
リコールＣＴＬ応答の評価については、Ｂｅｒｔｏｎｉら（Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３、１９９７）によって記載されるようにしてスクリーニングが行われた。簡単に言えば、ＨＢＶに急性感染した患者からのＰＢＭＣを、１０μｇ／ｍｌの合成ペプチド存在下で培養した。７日後に、培養物をペプチドで再刺激した。ペプチドでパルスされた標的細胞を使用し、培養物を１４日目に細胞障害活性についてアッセイした。
【０２７７】
１５個のＡ２スーパータイプを結合するペプチドのうち１１個は利用したシステムの少なくとも１つにおいて免疫原性であることが見出された。１１個のペプチドのうちの５個は、以前にＨＢＶ急性感染患者中のものと同一視されている（Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３、１９９７）。追加の縮重した５つのペプチド（１０６９．０６、１０９０．７７、１１４７．１４、９２７．４２および９２７．４６）が、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１のトランスジェニックマウス中でＣＴＬ応答を誘導した。１１個の免疫原性スーパータイプ交差反応性ペプチドは３つのＨＢＶ抗原によってコードされる；コア、エンベロープおよびポリメラーゼである。
【０２７８】
このセット（１１個の免疫原性Ａ２−スーパーモチーフ保有エピトープ）は、１つのアナログペプチド１０９０．７７を含んでいる。野生体ペプチド１０９０．１４（これからこのアナログは誘導される）はＡ２−スーパータイプ非交差反応性であるが、しかし急性ＨＢＶ患者からのリコールＣＴＬ応答において認識され、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１のトランスジェニックマウスにおいてもヒトの初代培養物においても免疫原性であることが示された（表ＸＸＸ）。野生体ペプチド１０９０．１４と１０９０．７７アナログの交差認識に取り組むさらなる研究は、以下に詳細に記載される。
【０２７９】
独立した分析の過程で、表ＸＸＸｂに示す非交差反応性ペプチドのうち１４個（１０９０．１４を含む）は少なくとも１つの系において免疫原性であることが見出された。これらのペプチドのうち５個のペプチドが患者において認識され；４つのペプチドが、トランスジェニックマウス中のＣＴＬを誘導した。
【０２８０】
結論として、１１個のＡ２−スーパータイプ交差反応性ペプチドが、調べた３つのシステムの少なくとも１つにおいて免疫原性を示すことができることが識別された。
【０２８１】
Ａ＊０３／１１免疫原性の評価
１７個のＡ３−スーパータイプ交差反応性ペプチドの免疫原性のうち７個を評価した（表ＸＸＸＩ）。前節に記載したように、Ａ３−スーパーモチーフ保有ペプチドは初代培養物、患者の応答、またはＨＬＡ−Ａ１１トランスジェニックマウスを使用してスクリーニングした（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３、１９９７）。ペプチド１．０２１９を例外として、表ＸＸＸＩ挿入表にリストされた保存された交差反応性ペプチドはすべて、免疫原性であることが見出された。
【０２８２】
さらに、交差反応性スーパータイプ結合を示す、保存性の弱いペプチド（１１５０．５１；４０％が保存された）は、トランスジェニックマウスにおいて免疫原性であることが見出され、表ＸＸＸＩに含まれていた。同様に他の２つの保存されているが交差反応性でないペプチドも、急性感染ＨＢＶ患者（Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３、１９９７）において認識されることが示された。これらのエピトープは表ＸＸＸＩ中に示される。
【０２８３】
８個の保存された免疫原性ＨＢＶ誘導Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープのうちの７個（交差反応性ペプチド６個をすべて含む）について、患者において陽性データが得られた点は注目に値する。これらのエピトープは、１つのエピトープがコアタンパク質配列に由来している他は主にポリメラーゼタンパク質配列に由来する。Ｘ抗原では多くの交差反応性ペプチドが識別されていたが（表ＸＸＸＩ）、現在まで、これらのペプチドは免疫原性についてスクリーニングされていない。
【０２８４】
要約すれば、急性感染患者においてＣＴＬによって認識されるか、ＨＬＡトランスジェニックマウスにおいてＣＴＬを誘導する、７個のＡ３−スーパーモチーフ保有交差反応性ペプチドが識別された。
【０２８５】
Ｂ７免疫原性の評価
ＨＢＶ由来ＨＬＡ−Ｂ７−スーパーモチーフ保有、交差反応性ペプチドが関係する免疫原性の研究を表ＸＸＸＩＩに要約する。ＨＬＡ−Ｂ７ペプチドは、もっぱら、初代培養物または急性感染ＨＢＶ患者のいずれかにおいて応答を測定するヒトシステムでスクリーニングした。スクリーニングされた７つの縮重したペプチドのうち４個は免疫原性を示した。交差反応性でない１つのペプチド（ＸＲＮ＜３）、１１４７．０４も、急性感染ＨＢＶ患者（Ｂｅｒｔｏｎｉら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：５０３、１９９７年；Ｔａｂｌｅ　ＸＸＸＩＩを見る）において認識されることが示された。
【０２８６】
要約すれば、急性感染ＨＢＶ患者において認識される、５つの保存されたＨＢＶ由来Ｂ７−スーパーモチーフ保有エピトープが識別された。これらのエピトープは、４つの異なるＨＢＶ抗原（コア、エンベロープ、ポリメラーゼおよびＸ）をカバーすることができる。
【０２８７】
実施例４：アナログを作製することによって天然のペプチドの結合能力を改善するための伸長したスーパーモチーフの実施
本明細書中に示されるように、ＨＬＡモチーフおよびスーパーモチーフ（一次および／または二次の残基を含む）は、高度に交差反応性の天然のペプチドの調製において有用である。さらに、ＨＬＡモチーフおよびスーパーモチーフの規定はまた、アナログ化、または「修正（ｆｉｘｅｄ）されて」、ペプチドに特定の特徴（例えば、スーパータイプを構成するＨＬＡ分子の群内のより優れた交差反応性、および／またはそれらＨＬＡ分子のいくつかまたは全てについてのより優れた結合親和性）を与える天然のペプチド配列内の残基を同定することによって、当業者が高度に交差反応性のエピトープを操作するのを可能とする。調整された結合親和性を示すアナログペプチドの例を、この実施例に示す。
【０２８８】
一次アンカー残基を用いるアナログ化
クラスＩペプチド配位子は、その結合親和性および／または縮重を増加させるために改変するか「固定」できることが示された（シドニーら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３４８０、１９９６）。同様にこれらの固定されたペプチドは、野生体エピトープに特異的なＴ細胞により免疫原性および交差反応性認識を増加させることも示すであろう（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２５３９、１９９６年；Ｐｏｇｕｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：８１６６、１９９５）。特に、Ａ２スーパータイプペプチドの主要なアンカーは「固定」してもよく、２位でＬまたはＶに（または天然の場合はＭに）およびＣ末端をＶにアナログ化してもよい。表ＸＸＶＩに示すように、１４個のうちの９個のＡ２−スーパータイプ交差反応性結合ペプチドは、これらの基準によって「固定可能」であり、２１個の非交差反応性結合体のうち１６個も同様である。固定に対する理想的候補は、少なくとも３個のＡ２−スーパータイプ対立遺伝子特異的分子とＩＣ５０≦５０００ｎＭで結合するペプチドである。
【０２８９】
より広く交差反応性なエピトープを生成するこの戦略の効能の１つの例は、ペプチド１０９０．１４（表ＸＸＶＩ）のケースによって提供される。以前に、このペプチドは、検討されたそれぞれの系において高度に免疫原性であることが示された。しかし、単一のＡ２−スーパータイプ対立遺伝子特異的分子、Ａ＊０２０１に対する結合性のみを示す。このエピトープの非交差反応的結合能力は集団適用範囲を制限し、したがって候補ワクチンにこのペプチドを含む価値を制限する。結合親和性および交差反応性を増加させるための努力において、ペプチド１０９０．１４のＣ−末端を「アラニン」からＡ２−スーパーモチーフの好適残基「バリン」に変更した。この変更はＡ＊０２０１の結合能力（２００ｎＭから５．１ｎＭまで）に劇的な増加（４０倍）をもたらしたが、他の３個のＡ２−スーパータイプ対立遺伝子特異的分子に結合することができるペプチドをも生じた（ペプチド１０９０．７７、表ＸＸＶＩ参照）。
【０２９０】
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１トランスジェニックマウスを用いた研究は、１０９０．７７ペプチドで免疫にされたマウスからのＣＴＬ応答が天然に存在するペプチド１０９０．１４またはバリン置換アナログ（つまり１０９０．７７）のいずれかが負荷された標的細胞を認識することを示した。実際、１０９０．７７誘導されたＣＴＬによる溶解は、標的細胞を負荷するために使用されたのがアナログであるか野生型の配列であるか判別不能であった（Ｂ．Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ、出版されていないデータ）。
【０２９１】
ワクチン構築物設計のためのこれらの観察の重要性は、効力のあるウイルスの応答阻害剤、ラミブジンで慢性のＨＢＶ患者が治療された研究によって示される。ラミブジンを用いた拡張治療は、１０９０．１４エピトープにおいて２位をメチオニンからバリンに代えたＨＢＶの薬剤耐性菌の選択をもたらし、エピトープに基づくワクチンをラミブジンと併用することが、野生体および突然変異体配列の両方を認識するＣＴＬ反応を誘導する能力を持つ必要があってもよいことを示唆する。
【０２９２】
交差認識がネイティブなペプチド（１０９０．１４）とアナログペプチドおよびラミブジン誘導変異体Ｍ２ペプチドの間で可能であることを実証するために、１０９０．７７アナログペプチドを使用してＣＴＬを生成した。次いで、野生体ペプチド（１０９０．１４）またはラミブジン誘導変異体Ｍ２ペプチドのいずれかによってこれらのＣＴＬ培養物を刺激した。次いで、野生体またはラミブジン誘導変異体ペプチドのいずれかが負荷された標的細胞を溶解するこれらＣＴＬの能力を分析した。いずれかのペプチドを示す標的細胞は、同様にいずれかのＣＴＬ培養によって溶解された（表ＸＸＶＩ）。
【０２９３】
これらの研究はペプチドのアナログ化することは、どのように野生体と突然変異体のエピトープ間の交差認識を可能にすると共にＨＬＡ−Ａ２スーパータイプ縮重の劇的な増加をもたらすことができるかを実証する。より具体的に言えば、これらの結果は、アナログペプチド１０９０．７７を利用するワクチンが、野生株ＨＢＶおよび抗ラミブジンＨＢＶ株の両方を認識する反応を刺激していることを示す。
【０２９４】
同様に、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有エピトープのアナログを生成してもよい。例えば、２位で好ましいＶ、およびＣ−末端でＲまたはＫを有するようにペプチドをアナログ化することもできる。Ａ３−スーパータイプ縮重ペプチドのうち表ＸＸＶＩＩで識別された１２個が主要なアンカー固定に対する候補であり、２４個の非交差反応性結合体のうちの１９個も同様である。
【０２９５】
アナログペプチドは、Ａ＊０３とＡ＊１１に結合することが最初に試験され、次いで、親ペプチドと比較して等価、または改善された結合能力を示すものがＡ３−スーパータイプ交差応答性に関して試験されるであろう。必要な場合には、次いで、改善された交差反応性を実証するアナログを免疫原性について評価さらに評価する。
【０２９６】
代表的には、Ｂ７のスーパーモチーフ保有エピトープを識別することはより困難である。Ａ２−およびＡ３−スーパータイプエピトープの場合と同様に、ペプチドアナログ化戦略を用いて、増加した交差反応性結合を備えた付加的なＢ７スーパーモチーフ保有ペプチドを生成することができる。一般に、Ｂ７のスーパーモチーフ保有ペプチドは２位でＰをそれらのＣ−末端でＩを有するように固定されるべきである。
【０２９７】
２つの異なるＢ７様ペプチド（ＨＢＶ　ｅｎｖ　３１３およびＨＢＶ　ｐｏｌ　５４１）のＣ−末端がＩ残基で置換された一次アンカー単一アミノ酸残基を表わすアナログを合成し、それらのＢ７−スーパータイプ結合能力に関して試験した。両方の場合において、Ｉ置換が結合親和性および／または交差反応性に全面的な肯定的な効果があったことが見出された。ＨＢＶ　ｅｎｖ　３１３の場合には、Ｉ９の（Ｃ−末端位置９でのＩ）置換が、Ｂ＊５４０１の結合親和性をほぼ４００倍に増加することによって結合された４から５個の対立遺伝子からの交差反応性を増加させるのに有効であった。ＨＢＶ　ｐｏｌ　５４１の場合には、増加した交差反応性は、Ｂ＊５４０１結合の実質的な増加によって同様に達成された。さらに、Ｂ＊０７０２、Ｂ＊５１およびＢ＊５３０１への結合親和性における著しい増加が、ＨＢＶ　ｐｏｌ　５４１　Ｉ９アナログで観察された。
【０２９８】
二次アンカー残基でのアナログ化
さらに、ＨＬＡスーパーモチーフは、交差反応性特性に関係している二次アンカー位置の特定の残基を識別することにより、高度に交差反応的なペプチドを操作することにおいて価値がある。これを実証するため、５つの異なるＢ７−スーパータイプ結合性ペプチドのうちの位置１および３で単一のアミノ酸置換を表わすペプチドの第２のセットを合成し、Ｂ−７スーパータイプ結合能力について試験した。４／４のケースでは、位置１でネイティブな残基を芳香性の残基Ｆ（「Ｆｌ」置換）に替える効果が、親ペプチドと比較して、交差反応性の増加をもたらし、また、ほとんどの例で、結合親和性が３倍以上に増加した（表ＸＸＶＩＩＩ）。より具体的には、ＨＢＶ　ｅｎｖ　３１３、ＭＡＧＥ２　１７０およびＨＢＶ　ｃｏｒｅ　１６８については、完全なスーパータイプ交差反応性がＦ１置換アナログで達成された。これらの増加はＢ＊５４０１結合親和性を劇的に増加させることにより達成された。さらに、親和性における増加は、ＨＢＶ　ｃｏｒｅ　１６８（Ｂ＊３５０１とＢ＊５３０１）およびＭＡＧＥ２　１７０　（Ｂ＊３５０１、Ｂ５１およびＢ＊５３０１）の場合に他の対立遺伝子について見られた。最後に、ＭＡＧＥ３　１９６の場合には、Ｆ１置換はＢ＊０７０２結合における増加のために交差反応性を増加させるのに有効であった。Ｂ５１の結合能力をほぼ７０倍に増加させる点も注目された。
【０２９９】
２つのアナログが、位置３でのスーパーモチーフの肯定的なＦ置換（「Ｆ３」置換）を使用して作られた。両方の例で、結合親和性および交差反応性の増加が達成された。特に、ＨＢＶ　ｐｏｌ　５４１の場合には、Ｆ３置換は、Ｂ＊５４０１結合に対するその影響の効力により交差反応性を増加させるのに有効であった。ＭＡＧＥ３　１９６の場合、完全なスーパータイプ交差反応性が、Ｂ＊０７０２およびＢ＊３５０１の結合能力を増加させることにより達成された。また、ＭＡＧＥ３　１９６の場合には、Ｂ＊３５０１、Ｂ＊５１、Ｂ＊５３０１およびＢ＊５４０１について４０倍と５０００倍の間に結合能力が増加することは注目に値する。
【０３００】
結論として、これらのデータは、単一のアミノ酸置換であってもその使用によって、ＨＬＡスーパータイプ分子用のペプチド配位子の結合親和性および／または交差反応性を増加させることが可能であることを実証する。
【０３０１】
実施例５：ＨＬＡ−ＤＲ結合モチーフによる保存されたＨＢＶ誘導配列の識別　以下に概説するように、実施例１〜３に記載されたのと同様な方法論を用いることにより、ＨＬＡクラスＩＩスーパーモチーフまたはモチーフ保有ペプチドエピトープも識別できる。
【０３０２】
ＨＬＡ−ＤＲ−スーパーモチーフ保有エピトープの選択
ＨＬＡクラスＩｌ分子は、典型的には、長さで１２から２０残基の間でペプチドを結合する。しかし、ＨＬＡクラスＩと同様に、特異性および相互作用のエネルギーは通常、約９残基の短いコア領域に含まれている。ほとんどのＤＲ分子は、位置１（Ｐｌ）の疎水性残基が主要なアンカー（ｍａｉｎ　ａｎｃｈｏｒ）であるこの９−マーコア内の重複する特異性を共有している（Ｏ’Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６６３、１９９１；Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３、１９９８）。さらに、位置６（Ｐ６）の中の小さいか疎水性残基の存在も、ほとんどのＤＲペプチド相互作用にとって重要である。この重複するＰ１―Ｐ６特異性は９マーコア領域内に、ＤＲスーパーモチーフとして定義された。クラスＩ分子とは異なり、ＤＲ分子は結合力のある溝の両端で開いていて、したがって長さの変わるより長いペプチドを提供することができる。実際、ペプチド−ＤＲ相互作用のほとんどのエネルギーがコア領域によって寄与されるように見えている一方、側面に位置する残基は高い親和性相互作用にとって重要であると思われる。また、ＭＨＣ結合には厳密に必要でないが、側方に位置する残基はＴ細胞認識のためのほとんどの実例において明らかに必要である。
【０３０３】
ＨＢＶ由来ＤＲ交差反応性ＨＴＬエピトープを識別するために、ＨＬＡクラスＩモチーフ配列の識別用に走査したのと同じ２０個のＨＢＶポリタンパク質モチーフ配列を、結合性ＨＬＡ−ＤＲのためのモチーフを備えた配列の存在に関して走査した。特に、９−マーコアを含むＤＲ−スーパーモチーフで構成された１５マー配列、および領域の側面を守る３残基Ｎ−末端およびＣ−末端が選択された。走査したＨＢＶ株の少なくとも８５％（１７／２０）で１５マー配列の１００％が保存されることがさらに必要とされた。これらの基準を使用して、３６個の非冗長（ｎｏｎ−ｒｅｔｕｎｄａｎｔ）配列が識別された。これらのペプチドのうちの３５個を続いて合成した。
【０３０４】
ＤＲ分子に結合するペプチドを予測するためのアルゴリズムも開発されている（Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３、１９９８）。個々のＤＲ分子に特異的なこれらのアルゴリズムは９マーコア領域のスコアリングおよびランキングを可能にする。選択表を使用して、これらのアルゴリズムが、適当なＤＲ分子と結合する可能性の高いペプチド配列を効率的に選択することが見出された。さらに、アルゴリズム（特にＤＲ１、ＤＲ４ｗ４およびＤＲ７のためのもの）を実行すると、連続して効率的にＤＲ交差反応性ペプチドを選択することができることが見出された。
【０３０５】
これらのアルゴリズムが追加のペプチドを識別するかどうか確かめるために、上述で使用したのと同じＨＢＶポリタンパク質を、９マーコア領域の１００％が８５％（１７／２０の株）保存されている１５−マーペプチドの存在を調べるために再走査した。次に、これらのペプチドの各々の９マーコア領域にＤＲ１、ＤＲ４ｗ４およびＤＲ７アルゴリズムを使用して得点を付けた。その結果、８個のさらなる配列が識別され合成された。
【０３０６】
要約すると、９マーコア領域がＤＲスーパーモチーフを含んでいたか、ＤＲの結合性配列を予測するアルゴリズムを使用して選択された、４４個の１５マーペプチドが識別された。これらのペプチドのうちの４３個が合成された（表ＸＸＸＩＩＩ）。
【０３０７】
上記のＨＢＶ由来ペプチドの分析を実行する一方、９つのペプチド（これらはそのＤＲ１、ＤＲ４ｗ４およびＤＲ７アルゴリズムプロフィールに基づいてＤＲ交差反応性結合力のあるペプチドであると予測されたが、９マーコア領域が８０％しか保存されていない）も識別された。９５％が保存されているＤＲスーパーモチーフコア領域を含むが、Ｎ終点から取り除かれた１つの残基だけが位置決定された追加ペプチドがあらかじめ合成された。これらの１０個のペプチドもさらに分析するために選択され、表ＸＸＸＩＩＩの中で示される。
【０３０８】
最後に、２つのペプチドＣＦ−０８および１１８６．２５（上述で選択されたペプチド（２７．０２８０）と冗長である）を追加的な分析のために考慮した。ペプチド１１８６．２５は多数のＤＲ−スーパーモチーフ配列を含んでいる。ペプチドＣＦ−０８は両方の２７．０２８０および１１８６．２５を入れ子にする２０マーである。これらのペプチドは表ＸＸＸＩＩＩの中で示される。
【０３０９】
上述で識別された５５個のＨＢＶ由来ペプチドを、共通のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を結合するそれらの能力に関して試験した。集団適用範囲およびほとんどのＤＲ対立遺伝子（例えばＳｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３、１９９８参照）の結合性レパートリー間の関係の両方を最大限にするために、ＤＲアッセイの連続パネルに対する結合に関してペプチドをスクリーニングした。これらのスクリーニングパネルの構成、および関連する抗原の発現型頻度は、表ＸＸＸＩＶに示される。ペプチドはすべて、一次パネル中の対立遺伝子（ＤＲ１、ＤＲ４ｗ４およびＤＲ７）に結合するかを最初に試験した。次いで、これらの３つの対立遺伝子のうちの少なくとも２つと結合するペプチドだけが、二次分析（ＤＲ２ｗ２β１、ＤＲ２ｗ２β２、ＤＲ６ｗｌ９およびＤＲ９）において結合するか試験した。最後に、４つの二次パネル対立遺伝子の少なくとも２つと結合するペプチド、したがって全部で７つの対立遺伝子の４つと結合するペプチドのみを三次分析で結合するかをスクリーニングした（ＤＲ４ｗ１５、ＤＲ５ｗ１１およびＤＲ８ｗ２）。
【０３１０】
試験に際して、もともとの５５個のペプチドのうちの２５個（４５％）が一次パネル対立遺伝子の２つ以上と結合することが見出された。これらの２５個のペプチドを続いて二次分析において試験した時、２０個は一次および二次の分析パネル中の７つのＤＲ対立遺伝子の少なくとも４つと結合することが分かった。最後に、二次スクリーニング過程を通る２０個のペプチドのうちの１８個を三次分析において結合するか試験した。その結果、１２個のペプチドが、１０個の共通ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子のうち少なくとも７つと結合することが示された。これらの１２個のペプチド配列および一次から三次パネルに至る各分析に対するそれらの結合能力を表ＸＸＸＶの中に示す。また、ペプチドＣＦ−０８および８５７．０２（今までに試験した対立遺伝子の５／５および５／６それぞれと結合する）も示す。
【０３１１】
要約すると、多数のＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子と結合できる、ＨＢＶゲノムの１２個の独立領域に由来する１４個のペプチドが識別された。このペプチドセットは、Ｃｏｒｅ（Ｎｕｃ）、ＰｏｌおよびＥｎｖ抗原から少なくとも２つのエピトープを各々含んでいる。
【０３１２】
保存されたＤＲ３モチーフペプチドの選択
ＨＬＡ−ＤＲ３は白人、黒人およびヒスパニック系の人口において広く分布している対立遺伝子であるので、ＤＲ３結合能力はＨＴＬエピトープの選択において重要な基準である。しかし、以前に生成されたデータは、ＤＲ３が他のＤＲ対立遺伝子と稀にしか交差反応しないことが示されている（Ｓｙｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：２６３４−２６４０、１９９２；Ｇｅｌｕｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２−５７４８、１９９４；Ｓｏｕｔｈｗｏｏｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：３３６３−３３７３、１９９８）。これは、ＤＲ３ペプチド結合性モチーフは、ほとんどの他のＤＲ対立遺伝子の特異性とは異なるように見えるという点で完全に驚くべきではない。
【０３１３】
ＤＲ３と結合するペプチドを効率的に識別するために、目標タンパク質を、Ｇｅｌｕｋら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５７４２−５７４８、１９９４）によって報告された２つのＤＲ３特異的結合性モチーフのうちの１つを保持する保存された配列について分析した。１８個の配列が識別された。これらの配列のうちの８つは、表ＸＸＸＶＩに示すペプチドと大部分は冗長であり、３個は以前に他の研究用に合成されたペプチドであった。７個のユニークな配列が合成された。
【０３１４】
ＤＲ３モチーフを含む１８個のペプチドのうちの１７個をそれらのＤＲ３結合能力に関して試験した。４つのペプチドが、ＤＲ３に１０００ｎＭあるいはそれより良好な親和性で結合することが見出された（表ＸＸＸＶＩ）。
【０３１５】
実施例６．ＨＰＶ由来ＨＴＬエピトープの免疫原性
この例は、免疫原性ＤＲスーパーモチーフおよびＤＲ３のモチーフ保有エピトープを実施例５の中で方法論を用いて識別されたものの中から決定する。
【０３１６】
ＨＴＬエピトープの免疫原性は、ＨＴＬ応答を刺激する能力の評価および／または適当なトランスジェニックマウスモデルの使用により、ＣＴＬエピトープの免疫原性の決定と類似したやり方で評価される。免疫原性は、１）正常なＰＢＭＣを使用するインビトロでの一次誘導、または２）癌患者ＰＢＭＣからのリコール応答：に関してスクリーニングすることにより決定される。
【０３１７】
実施例７．集団適用範囲の広さを決定するための種々の人種背景におけるＨＬＡスーパータイプの表現型の頻度の算出
この実施例は、複数のスーパーモチーフおよび／またはモチーフを含む複数のエピトープを構成するワクチン組成物の集団の適用範囲の広さの評価を例証する。
【０３１８】
集団適用範囲を分析するために、ＨＬＡ対立遺伝子の遺伝子頻度を、決定した。各ＨＬＡ対立遺伝子についての遺伝子頻度を、二項分布式ｇｆ＝１−（ＳＱＲＴ（１−ａｆ））を利用して、抗原または対立遺伝子頻度から算出した（例えば、Ｓｉｄｎｅｙら、Ｈｕｍａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：７９−９３、１９９６を参照のこと）。全体的な表現型頻度を得るために、蓄積（ｃｕｍｌａｔｉｖｅ）遺伝子頻度を算出し、そして蓄積抗原頻度は、逆の式［ａｆ＝１−（１−Ｃｇｆ）２］の使用により、導かれる。
【０３１９】
頻度データが、ＤＮＡタイピングのレベルにおいて利用可能でない場合、血清学的に規定される抗原頻度への対応が、仮定された。合計の潜在的なスーパータイプ集団適用範囲を得るために、結合の不安定性を仮定せず、そしてスーパータイプの各々に属することが確認された対立遺伝子のみを含んだ（最小の評価）。遺伝子座中の組合せにより達成される合計の潜在的適用範囲の評価を、考えられるＢ対立遺伝子により含まれることが期待され得るＡに含まれない集団の比率をＡの適用範囲に足すことにより行った（例えば、合計＝Ａ＋Ｂ＊（１−Ａ））。Ａ３様スーパータイプの確認されたメンバーは、Ａ３、Ａ１１、Ａ３１、Ａ＊３３０１、およびＡ＊６８０１である。Ａ３様スーパータイプは、Ａ３４、Ａ６６、およびＡ＊７４０１を潜在的に含み得るが、これらの対立遺伝子を、全体の頻度の算出には含まなかった。同様に、Ａ２様スーパータイプファミリーの確認されたメンバーは、Ａ＊０２０１、Ａ＊０２０２、Ａ＊０２０３、Ａ＊０２０４、Ａ＊０２０５、Ａ＊０２０６、Ａ＊０２０７、Ａ＊６８０２、およびＡ＊６９０１である。最終的に、Ｂ７様スーパータイプの確認された対立遺伝子は、Ｂ７、Ｂ＊３５０１−０３、Ｂ＊５１、Ｂ＊５３０１、Ｂ＊５４０１、Ｂ＊５５０１−２、Ｂ＊５６０１、Ｂ＊６７０１、およびＢ＊７８０１である（潜在的にはまた、Ｂ＊１４０１、Ｂ＊３５０４−０６、Ｂ＊４２０１、およびＢ＊５６０２）。Ａ２スーパータイプ、Ａ３スーパータイプおよびＢ７スーパータイプを組み合わせることにより達成される集団適用範囲は、５つの主要な人種集団において約８６％である（表ＸＸＩを参照のこと）。適用範囲を、Ａ１モチーフおよびＡ２４モチーフを保有するペプチドを含むことにより拡大し得る。５つの異なる主要な人種集団（白色人種、北米黒色人種、中国人、日本人、およびスペイン系人種）にまたがり、平均して、Ａ１は、集団の１２％そしてＡ２４は、集団の２９％で存在する。合わせて、これらの対立遺伝子は、これらの同じ人種集団において平均３９％の頻度で示された。主要な人種にまたがる合計の適用範囲は、Ａ１およびＡ２４が、Ａ２スーパータイプ対立遺伝子、Ａ３スーパータイプ対立遺伝子およびＢ７スーパータイプ対立遺伝子の適用と組み合わさる場合、９５％より大きい。
【０３２０】
ＨＬＡクラスＩＩ分子のための集団適用範囲は本開示に基づいて同様に開発することができる。
【０３２１】
候補ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩの要約
要約すると、先に示したデータに基づいて、３４個の保存されたＣＴＬエピトープがワクチン候補として選択された（表ＸＸＸＶＩＩ）。これら３４個のエピトープのうち、７個はコアから、１８個はポリメラーゼから、そして９個はエンベロープから由来するものである。Ｘ抗原からのエピトープは、パッケージに含まれていない。このタンパク質は低量で発現し、したがって、免疫学的な重要性は小さいからである。
【０３２２】
ＣＴＬエピトープのこのパネルによって与えられた集団適用範囲は５つの主要人種の各集団において９５％を超えると推測される。モンテカルロ分析（図１）を使用して、白人、北アメリカの黒人、日本人、中国人およびヒスパニック系で構成された集団中の個体のおよそ９０％が、ワクチン候補エピトープの５つ以上を認識するだろうことは予測される。
【０３２３】
好ましいＣＴＬエピトープは３４個の個別のペプチドを含んでいるが、２つのペプチドは、より長いペプチド内に完全に入れ子にされているため、ワクチン候補に含まれなければならないペプチドの数は有効的に減っている。具体的にはＡ２−拘束ペプチド９２７．１５は、Ｂ７−拘束ペプチド２６．０５７０内に入れ子にされ、Ｂ７−拘束ペプチド９８８．０５はＡ２−拘束ペプチド９２４．０７内に入れ子にされる。同様に、Ａ−２４拘束ペプチド２０．０１３６とＡ２−拘束ペプチド１０１３．０１は、同じコア領域を含み第１のアミノ酸でのみ異なっている。関連して言えば、Ａ２−拘束ペプチド１０９０．１４およびＢ７−拘束ペプチド１１４７．０５は、２つのアミノ酸によって重なっており、１つの連続するペプチド配列としてこれら２つのエピトープを運搬する可能性を高めている。
【０３２４】
ペプチドのセットは９個のＡ２−拘束ＣＴＬエピトープ；４つのポリメラーゼ誘導エピトープ、４つのエンベロープ誘導エピトープおよびコアエピトープを含む。これらの９個のペプチドのうちの７個は急性患者からのリコールＣＴＬ分析で認識される。患者において認識された７個のペプチドのうち、２個は非交差反応性結合ペプチドである。潜在的なワクチン候補としてのこれらのペプチドの包含は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１が、検査されたすべての人種において主に発現されるＡ２−スーパータイプ対立遺伝子であるという観察から生じる。そのため、ペプチドを結合する交差反応性でないＡ＊０２０１の包含は、抗原適用範囲および集団適用範囲の冗長性を増加させる。患者の免疫原性データを欠くわずか２つのＡ２−拘束ペプチドは、ペプチド１０９０．７７および１０６９．０６である。１０９０．７７ペプチドは急性ＨＢＶ患者の中で認識された高度に免疫原性なペプチドのアナログである。アナログペプチドを認識する能力に関して、患者におけるリコール応答が試験されていないことが、ＨＬＡトランスジェニックマウスの中で行われた免疫原性研究は、１０９０．７７で誘導されるＣＴＬは、天然に存在する配列を伴う標的細胞を認識することができることを示した。これらのデータは、１０９０．７７のペプチドに対して増加されるＣＴＬは、交差反応性であり、ＨＢＶ感染細胞を認識するべきであるということを示している。Ａ６８０２へのその高い結合親和性性がより大きな人口適用範囲をもたらすので、ペプチド１０６９．０６は潜在的なワクチンエピトープとして含まれていた。該ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスおよび主なヒト培養において免疫原である。
【０３２５】
好ましいＣＴＬエピトープは７個のＡ３−スーパータイプ拘束ペプチドを含んでおり；６個はポリメラーゼ抗原に由来し、１個はコア領域に由来する。Ａ３−スーパータイプワクチン候補ペプチドはすべて患者において免疫原である。ペプチド１１４２．０５は非交差反応性のＡ３−拘束ペプチドであるが、それは、患者の中で認識されることを示されており、結合性ＨＬＡ−Ａ１と結合することができる。
【０３２６】
９個のＢ７−拘束ペプチドが実施例において識別された好ましいＣＴＬエピトープである。このグループのうち、３つのエピトープが、患者の中で認識されることが示された。一方、これらのペプチドのうちの１つ、１１４７．０４は非交差反応性の結合体であり、これは主要Ｂ７スーパータイプ対立遺伝子のうちの２つにＩＣ５０または結合親和性価値１００ｎＭ未満で結合する。６個のＢ７スーパータイプエピトープは、スーパータイプ結合に基づく好ましいエピトープとして含まれていた。ヒトにおける免疫原性研究（Ｂｅｒｔｏｎｉら、１９９７；Ｄｏｏｌａｎら、１９９７；Ｔｈｒｅｌｋｅｌｄら、１９９７）は、高度に交差反応的なペプチドは、エピトープとしてほとんど常に認識されることを実証した。これらの結果を踏まえれば、また、利用可能な免疫原性データが限定的であるという点に照らして、選択基準としてＢ７−スーパータイプ結合親和性の使用が適当であると考えられた。
【０３２７】
同様に、Ａ１−およびＡ２４−拘束ペプチドに関する免疫原性データは少ない。１つの好ましいＣＴＬエピトープ１０６９．０４は、急性ＨＢＶ患者からのリコール応答において認識されることが報告された。これまでの節で議論したように結合親和性＜１００ｎＭのペプチドの高い割合は免疫原性であることがわかる。この理由で、結合親和性＜１００ｎＭであるすべてのＡ１およびＡ２４ペプチドは好ましいＣＴＬエピトープと見なされた。この選択基準を用いて、３個のＡ１−拘束ペプチドおよび６個のＡ２４−拘束ペプチドは、候補エピトープとして確認される。詳しい分析で、３個のコア由来ペプチドが中間の親和性を有するＡ２４と結合することが見出された。この研究の過程で、比較的少ないコアエピトープしか識別されなかったので、抗原適用範囲により大きな冗長性をもたらすために、中間のＡ２４結合性コアペプチドも好ましいエピトープのセットに包含された。
【０３２８】
好ましいＨＢＶ由来ＨＴＬエピトープのリストは、表ＸＸＸＶＩＩに要約される。ＨＴＬエピトープのセットは、１２個のＤＲスーパーモチーフ結合性ペプチドおよび４個のＤＲ３結合性ペプチドを含む。ＨＴＬエピトープの大部分はポリメラーゼに由来する；２個のエンベロープおよび２個のコアに由来するエピトープも好ましいＨＴＬエピトープのセットに含まれる。ＨＴＬエピトープのパネルによって表わされる、評価された集団適用範囲の合計は、５つの主要人種集団の各々において９１％を超えている（表ＸＸＸＶＩＩＩ）。
【０３２９】
実施例９：プライミング後に内因的にプロセシングされる抗原の生成の認識
この実施例は、実施例１〜５に記載されるように同定されかつ選択されたネイティブなペプチドエピトープまたは類似のペプチドエピトープにより誘導されるＣＴＬが、内因的に合成される、すなわちネイティブな抗原を認識することを決定する。
【０３３０】
実施例３におけるようなペプチドエピトープ（例えば、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有エピトープ）を用いて免疫されたトランスジェニックマウスから単離されたエフェクター細胞を、ペプチドでコートされた刺激細胞を使用してインビトロで再刺激する。６日後、エフェクター細胞を、細胞傷害性についてアッセイし、そしてペプチド特異的細胞傷害性活性を含む細胞株をさらに再刺激する。さらに６日後、これらの細胞株を、ペプチドの非存在下または存在下で、５１Ｃｒ標識Ｊｕｒｋａｔ−Ａ２．１／Ｋｂ標的細胞に関する細胞傷害性活性について試験し、そしてまた、内因的に合成された抗原を保有する５１Ｃｒ標識標的細胞（例えば、ＨＢＶ発現ベクターを用いて安定にトランスフェクトされる細胞）に関して試験する。
【０３３１】
この結果は、ペプチドエピトープを用いてプライムされた動物から得られたＣＴＬ系統が、内因的に合成されたＨＢＶ抗原を認識することを示す。このような分析に使用されるべきトランスジェニックマウスモデルの選択は、評価されているエピトープに依存する。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／Ｋｂトランスジェニックマウスに加え、いくつかの他のトランスジェニックマウスモデル（ヒトＡ１１を有するマウスを含む）（これはまた、Ａ３エピトープ、およびＢ７対立遺伝子を評価するために使用され得る）が特徴付けられており、そして他（例えば、ＨＬＡ−Ａ１およびＡ２４に対するトランスジェニックマウス）が開発されている。ＨＬＡ−ＤＲ１マウスモデルおよびＨＬＡ−ＤＲ３マウスモデルもまた開発されており、これを、ＨＴＬエピトープを評価するために使用し得る。
【０３３２】
実施例９：トランスジェニックマウスにおけるＣＴＬ−ＨＴＬ結合体化エピトープの活性
本実施例は、ＨＢＶ　ＣＴＬ／ＨＴＬペプチド結合体の使用によるトランスジェニックマウスにおけるＣＴＬおよびＨＴＬの誘導を例示する。同様な研究はＯｓｅｒｏｆｆら、Ｖａｃｃｉｎｅ　１６：８２３−８３３（１９９８）に見出される。
【０３３３】
ペプチド組成物は、複数のＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープを含むことができ、さらに、複数ＨＰＶ標的抗原から選択されるエピトープを含み得る。エピトープは実施例１〜６に記載されるような方法論を用いて識別される。例えば、そのようなペプチド組成物は、例えば、多数のＨＬＡファミリーのメンバーと５００ｎＭ以下の親和性で結合する少なくとも１つのＣＴＬエピトープ、またはそのエピトープのアナログを含む好ましいエピトープと結合するＨＴＬエピトープを含み得る。所望であれば、ペプチドは脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）されてもよい。
【０３３４】
免疫手順：トランスジェニックマウスの免疫は文献記載（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４７５３−４７６１、１９９７）のように実行される。例えば、Ａ２／Ｋｂマウス（それらはヒトＨＬＡ　Ａ２．１対立遺伝子に関する遺伝子組換体で、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１モチーフまたはＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有エピトープの免疫原性の評価に役立つ）は、不完全フロイントアジュバント中で、またはペプチド組成物が脂質化されたＣＴＬ／ＨＴＬ結合体である場合は、ＤＭＳＯ／食塩水の中で、もしくはペプチド組成物がポリペプチドである場合は、ＰＢＳあるいは不完全フロイントアジュバント中で、皮下に（尾の基部）に０．１ｍｌのペプチドをプライミングされる。プライミングの７日後に、これらの動物から得られた脾細胞は、ペプチドで覆われた、照射された同質遺伝子ＬＰＳ−活性化リンパ芽球で新たに刺激される。
【０３３５】
細胞株：ペプチド特異的細胞傷害性アッセイのための標的細胞は、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂキメラ遺伝子を用いてトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞である（例えば、Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１００７、１９９１）。
【０３３６】
インビトロのＣＴＬ活性：プライムの１週間後、脾臓細胞（３０×１０６細胞／フラスコ）を、３７℃において、１０ｍｌの培養培地／Ｔ２５フラスコ中で、同族の、照射された（３０００ラド）、ペプチドコートされたリンパ芽球（１０×１０６細胞／フラスコ）と、共培養する。６日後、エフェクター細胞を回収し、細胞毒性活性についてアッセイする。
【０３３７】
細胞傷害性活性についてのアッセイ：標的細胞（１．０〜１．５×１０６）を、３７℃において、２００μｌの５１Ｃｒの存在下でインキュベートする。６０分後、細胞を３回洗浄し、そしてＲ１０培地で再懸濁する。１μｇ／ｍｌの濃度において必要とされるペプチドを添加する。アッセイについて、１０４　５１Ｃｒ標識標的細胞を、Ｕボトムの９６穴プレートにおいて、異なる濃度のエフェクター細胞（２００μｌの最終用量）に添加する。３７℃におけるインキュベーション６時間後、上清の０．１ｍｌのアリコートを、各穴から除去し、そして放射活性を、マイクロメディック（ｍｉｃｒｏｍｅｄｉｃ）自動γ計測器において計測する。百分率特異的溶解を、式により測定する：百分率特異的放出＝１００×（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）。同じ条件下の別個のＣＴＬアッセイの実行の間で、比較を容易にするために、％５１Ｃｒ放出データを、溶解単位／１０６個の細胞として表す。１つの溶解単位を、６時間５１Ｃｒ放出アッセイにおいて１０，０００個の標的細胞である３０％の溶解を達成するために必要とされるエフェクター細胞の数として任意に規定する。特異的な溶解単位／１０６を得るために、ペプチドの非存在下で得られる溶解単位／１０６を、ペプチドの存在下で得られる溶解単位／１０６から引く。例えば、３０％の５１Ｃｒ放出が、ペプチドの非存在下、５０：１のエフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ）比（すなわち、１０，０００個の表ＴＫＥＩＩ標的に対して、５×１０５個のエフェクター細胞）において、およびペプチドの存在下、５：１のエフェクター（Ｅ）：標的（Ｔ）比（すなわち、１０，０００個の標的に対して、５×１０４個のエフェクター細胞）において得られるならば、特異的溶解単位は、［（１／５０，０００）−（１／５００，０００）］×１０６＝１８ＬＵである。
【０３３８】
この結果を、免疫原性ＣＴＬ／ＨＴＬ結合体ワクチン沈殿物を注入された動物のＣＴＬ応答の大きさを評価するために、分析し、そして実施例３で概略されるようなＣＴＬエピトープを使用して達成されるＣＴＬ応答の大きさと比較する。これと類似する分析を、複数のＣＴＬエピトープおよび／または複数のＨＴＬエピトープを含むペプチド結合体の免疫原性を評価するために実施し得る。これらの手順に従って、ＣＴＬ応答を誘導し、そして付随して、ＨＴＬ応答を、このような組成物の投与に際して誘導することを見出す。
【０３３９】
実施例１０．ＨＢＶ特異的ワクチン中の含有のためのＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープの選択
本実施例は、本発明のワクチン組成物のためのペプチドエピトープの選択についての手順を例示する。この組成物中のペプチドは、核酸配列の形態で、ペプチドをコードする単一または１つまたは複数の配列（すなわち、ミニ遺伝子）であり得るか、または単一のエピトープおよび／またはポリエピトープなペプチドであり得る。
【０３４０】
以下の原理は、ワクチン組成物中の含有のためのエピトープアレイを選択する際に用いられる。選択を行うためには以下の原理のそれぞれのバランスを取る。
【０３４１】
投与の際に、ＨＢＶ除去と相互に関係があることが観察されている免疫応答を模倣するエピトープを選択する。使用するエピトープの数は自然にＨＢＶを解消する患者の観察に依存する。例えば、自然にＨＢＶを解消する患者が少なくとも１つのＨＰＢ抗原上で少なくとも３個のエピトープに対する免疫応答を生ずることが観察された場合、次いで、３〜４個のエピトープがＨＬＡクラスＩに包含されるべきである。同様の理由がＨＬＡクラスＩＩエピトープを決定するのにも使用される。
【０３４２】
エピトープはしばしば、ＨＣＬクラスＩ分子に対する５００ｎＭ以下のＩＣ５０の結合親和性を有するか、またはクラスＩＩに対する１０００ｎＭ以下のＩＣ５０の結合親和性を有するエピトープを選択する。
【０３４３】
十分なスーパーモチーフ保有ペプチド、または対立遺伝子特異的モチーフ保有ペプチドの十分なアレイを、広範な集団適用範囲を与えるために選択する。例えば、エピトープを、少なくとも８０％の集団適用範囲を提供するために選択する。モンテカルロ分析（当該分野で公知の統計的評価）を使用して、集団適用範囲の広さ、または重複を評価し得る。
【０３４４】
ポリエピトープ組成物（例えば、ミニ遺伝子）を作製する場合、典型的には、目的のエピトープを含む可能な最も小さいペプチドを生成することが所望される。この使用される原理は、ネストされるエピトープを含むペプチドを選択する場合に使用される原理と同じでない場合、類似する。
【０３４５】
同一の標的タンパク質の多数の変種の配列が利用可能である場合、タンパク質ペプチドエピトープはその保存性に基づいて選択することもできる。例えば、保存性の基準は、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドの全配列またはクラスＩＩ結合ペプチドの全９マーのコアが、特定のタンパク質抗原について評価される配列の指定されたパーセンテージで保存されることを規定してもよい。
【０３４６】
ワクチン組成物中の含有のためのペプチドエピトープを、例えば、表ＸＸＸＶＩＩａおよびｂに列挙されるエピトープから選択する。選択されるペプチドから構成されるワクチン組成物は、投与される場合、安全で、効果的であり、そして急性ＨＢＶ感染を排除する免疫応答の大きさに類似の免疫応答を誘発する。
【０３４７】
実施例１１：ミニ遺伝子の複数のエピトープＤＮＡプラスミドの構築
この実施例は、ミニ遺伝子発現プラスミドの構築のための誘導を提供する。ミニ遺伝子プラスミドは、もちろん、本明細書中に記載されるようなＣＴＬおよび／またはＨＴＬエピトープもしくはエピトープのアナログの種々の構造を含み得る。発現プラスミドの構築および評価の例を、例えば、同時に係属しているＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１１，７８４（５／１３／９９に出願された）において記載する。このようなプラスミドの例を図２に示し、ミニ遺伝子構築物におけるＨＢＶエピトープの位置を例示する。こうしたプラスミドは、例えば、複数のＣＴＬおよびＨＴＬペプチドエピトープも含み得る。
【０３４８】
ミニ遺伝子発現プラスミドは、典型的には、複数のＣＴＬペプチドエピトープおよびＨＴＬペプチドエピトープを含み得る。本実施例において、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープ、ＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープ、ＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフ保有ペプチドエピトープならびにＨＬＡ−Ａ１モチーフ保有ペプチドエピトープおよびＨＬＡ−Ａ２４モチーフ保有ペプチドエピトープを、ＤＲスーパーモチーフ保有エピトープおよび／またはＤＲ３エピトープと共に使用する（図２）。好ましいエピトープを、例えば、表ＸＸＶＩ〜ＸＸＸＩＩＩにおいて同定する。複数のスーパーモチーフ／モチーフが広範な集団適用範囲を保証するために示されるように、複数のＨＢＶ抗原（例えば、コア、ポリメラーゼおよびＸタンパク質）由来のＨＬＡクラスＩスーパーモチーフまたはモチーフ保有ペプチドエピトープを選択する。同様に、ＨＬＡクラスＩＩエピトープを、複数のＨＢＶ抗原から選択し、広範な集団適用範囲を提供し、すなわち、ＨＬＡ　ＤＲ−１−４−７スーパーモチーフ保有エピトープおよびＨＬＡ　ＤＲ−３モチーフ保有エピトープを、ミニ遺伝子構築物中の含有のために選択する。次いで、選択されたＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを、発現ベクターにおける発現のためにミニ遺伝子中に組み込む。
【０３４９】
本実施例は、このようなミニ遺伝子保有発現プラスミドの構築に使用される方法を示す。ミニ遺伝子組成物のために使用され得る他の発現ベクターは利用可能であり、そして当業者に公知である。
【０３５０】
ミニ遺伝子ＤＮＡプラスミドは、コンセンサスＫｏｚａｋ配列ならびにコンセンサスマウスκＩｇ軽鎖シグナル配列、続いて本明細書中に開示された原理に従って選択されたＣＴＬエピトープおよび／またはＨＴＬエピトープのストリングを含む。
【０３５１】
１５個のヌクレオチド重複を含む平均約７０ヌクレオチド長である重複オリゴヌクレオチド（例えば、８個のオリゴヌクレオチド）を合成し、そしてＨＰＬＣ精製する。このオリゴヌクレオチドは、選択されたペプチドエピトープならびに適切なリンカーヌクレオチドをコードする。最終的なマルチエピトープミニ遺伝子を、ＰＣＲを用いる３セットの反応で重複オリゴヌクレオチドを伸長することによって結合する。Ｐｅｒｋｉｎ／Ｅｌｍｅｒ９６００ＰＣＲ機器を使用し、そして以下の条件を使用して全部で３０サイクルを実施する：９５℃で１５分間、アニーリング温度（各プライマー対の最も低く計算されたＴｍより５°下）で３０秒間、および７２℃で１分間。
【０３５２】
第１回目のＰＣＲ反応について、２つのオリゴヌクレオチドの各々の５μｇを、アニーリングし、そして伸長する：オリゴヌクレオチド１＋２、３＋４、５＋６、および７＋８を、Ｐｆｕポリメラーゼ緩衝液（ｌｘ＝１０ｍＭ　ＫＣＬ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−クロライド、ｐＨ８．７５、２ｍＭ　ＭｇＳＯ４、０．１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１００μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）、０．２５ｍＭ　各ｄＮＴＰ、および２．５ＵのＰｆｕポリメラーゼを含む１００μｌの反応物と合わせる。全長ダイマー生成物を、ゲル精製し、そして、２つの反応物（１＋２と３＋４の生成物、ならびに５＋６と７＋８の生成物を含む）を１０サイクルにわたり混合し、アニーリングし、そして伸長させる。次いで、この２つの反応物の半分を混合し、そして、５サイクルのアニーリングおよび伸長を実施し、その後に、隣接プライマーを添加して、全長生成物をさらに２５回サイクルで増幅する。全長生成物を、ゲル精製し、そしてｐＣＲ−ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化し、そして、個々のクローンを、配列決定によってスクリーニングする。
【０３５３】
実施例１２．プラスミド構築およびこの構築物が免疫原性を誘導する程度
プラスミド構築物（例えば、実施例１１に従って構築されたプラスミド）が免疫原性を誘導し得る程度を、エピトープを発現する核酸構築物を備えたＡＰＣの形質導入またはトランスフェクションに続くＡＰＣによるエピトープ提示について試験することによりインビトロで評価することができる。このような研究は、「抗原性」を決定し、そして、ヒトＡＰＣの使用を可能にする。このアッセイは、ある状況においてＡＰＣによって提示されるこのエピトープの能力を示し、この状況は、細胞表面上のエピトープ−ＨＬＡクラスＩ複合体の密度を定量することによって、Ｔ細胞により認識される。定量を、ＡＰＣから溶出されたペプチドの量を直接測定することによって実施し得る（例えばＳｉｊｔｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：６８３−６９２、１９９６；Ｄｅｍｏｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ　３４２：６８２−６８４、１９８９参照）；または、ペプチド−ＨＬＡクラスＩ複合体の数を、感染もしくはトランスフェクトされた標的細胞によって誘導された溶解物またはリンホカイン放出の量を測定し、次いで、等価なレベルの溶解物またはリンホカイン放出を得るのに必要であるペプチドの濃度を決定することによって評価することができる（例えばＫａｇｅｙａｍａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５６７−５７６、１９９５参照）。
【０３５４】
あるいは、免疫原性は、マウスへのインビボ注入およびこれに続くＣＴＬおよびＨＴＬ活性のインビトロ評価を通じて評価することができ、ＣＴＬおよびＨＴＬ活性はそれぞれ、例えば、同時係属する１９９９年５月１３日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１１，７８４およびＡｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　１：７５１−７６１、１９９４に詳述されるように、細胞傷害性および増殖アッセイを用いて分析される。
【０３５５】
例えば、少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドを含むＤＮＡミニ遺伝子構築物（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０９／３１１、７８４に記載されているようにして生成されるｐＭｉｎミニ遺伝子構築物）がＣＴＬをインビボで誘導する能力を評価するために、ＨＬＡ−Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスを、例えば１００μｇの裸のｃＤＮＡを用いて筋内で免疫する。ｃＤＮＡ免疫によって誘導されたＣＴＬのレベルを比較するための手段として、対照の動物群もまた、実際のペプチド組成物（これは、ミニ遺伝子によってコードされるのと同様に単一のポリペプチドとして合成される複数エピトープを含む）で免疫する。
【０３５６】
免疫動物からの脾細胞を、各それぞれの組成物（ミニ遺伝子またはポリエピトープペプチドにコードされるペプチドエピトープ）で２回刺激し、次いで、５１Ｃｒ放出アッセイにおいてペプチド特異的細胞傷害活性についてアッセイする。この結果は、Ａ２拘束エピトープに対して指向されるＣＴＬ応答の大きさを示し、したがって、ミニ遺伝子ワクチンおよびポリエピトープワクチンのインビボ免疫原性を示す。したがって、このミニ遺伝子が、ポリエピトープペプチドワクチンと同様に、ＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフペプチドエピトープに対して指向される免疫応答を誘発することを見出した。同様の分析がまた、他のＨＬＡ−Ａ３トランスジェニックマウスモデルおよびＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いて実施され、ＨＬＡ−Ａ３モチーフおよびＨＬＡ−Ｂ７モチーフまたはＨＬＡ−Ａ３スーパーモチーフおよびＨＬＡ−Ｂ７スーパーモチーフによるＣＴＬ誘導を評価する。
【０３５７】
ミニ遺伝子をコードするクラスＩＩエピトープのインビボでのＨＴＬ誘導能力を評価するために、ＤＲトランスジェニックマウスを、あるいは適当なマウスＭＨＣ分子と交差反応するそうしたエピトープについて評価するために、例えば、Ｉ−Ａｂ拘束マウスを、プラスミドＤＮＡ１００μｇを用いて筋内に免疫する。ＤＮＡ免疫付与により誘導されるＨＴＬレベルと比較する手段として、対照動物の一群も完全フロイントアジュバントに乳化させた実際のペプチド組成物で免疫する。ＣＤ４＋Ｔ細胞、すなわちＨＴＬを、被免疫動物の脾細胞から精製し、各組成物（ミニ遺伝子中にコードされたペプチド）それぞれで刺激する。３Ｈ−チミジン組み込み増殖アッセイ（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　１：７５１−７６１、１９９４参照）を用いてＨＴＬ応答を測定する。結果はＨＴＬ応答の大きさを示し、従って、ミニ遺伝子のインビボでの免疫原性を実証する。
【０３５８】
実施例１１に記載するように構築されるＤＮＡミニ遺伝子は、プライムブーストプロトコルを用いてブースト剤と組み合わせたワクチンとして評価してもよい。ブースト剤は、組換えタンパク質（例えば、Ｂａｒｎｅｔｔら、Ａｉｄｓ　Ｒｅｓ．ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　１４、Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　３：Ｓ２９９−Ｓ３０９、１９９８）または組換えワクチン、例えば、目的の完全タンパク質をコードするミニ遺伝子またはＤＮＡを発現するもの（例えば、Ｈａｎｋｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ　１６：４３９−４４５、１９９８；Ｓｅｄｅｇａｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　９５：７６４８−５３、１９９８；ＨａｎｋｅおよびＭｃＭｉｃｈａｅｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ　６６：１７７−１８１、１９９９；およびＲｏｂｉｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．５：５２６−３４、１９９９）から構成することができる
【０３５９】
例えば、プライムブーストプロトコルで使用されるＤＮＡミニ遺伝子の効能は、最初はトランスジェニックマウスで評価する。この例では、Ａ２．１／Ｋｂトランスジェニックマウスを１００μｇのＤＮＡミニ遺伝子（少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２スーパーモチーフ保有ペプチドを含む免疫原性ペプチドをコードする）でＩＭにより免疫する。インキュベーション期間（３〜９週間の範囲）の後、ＤＮＡミニ遺伝子によってコードされるのと同一の配列を発現する組換えワクチンウイルス１０７ｐｆｕ／マウスを用いて、マウスをＩＰでブーストする。対照マウスは、ミニ遺伝子配列を含まない１００μｇのＤＮＡまたは組換えワクチンで免疫するか、ミニ遺伝子をコードするＤＮＡを用いるがワクチンブーストは行わずに免疫する。さらに２週間のインキュベーション期間の後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてペプチド特異的活性についてマウスからの脾細胞を直ちに分析する。さらに、ミニ遺伝子内にコードされるＡ２拘束ペプチドエピトープおよび組換えワクチンを用いて脾細胞をインビトロで刺激し、次いで、ＩＮＦ−γ　ＥＬＩＳＡにおいてペプチド特異的活性について分析する。
【０３６０】
プライムブーストプロトコルにおいて利用されるミニ遺伝子は、ＤＮＡ単独よりもＨＬＡ２−Ａ２スーパーモチーフペプチドに向けてより大きな免疫応答を誘発することが見出される。こうした分析は、ＨＬＡ−Ａ１１またはＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスモデルを用いてＨＬＡ−Ａ３またはＨＬＡ−Ｂ７モチーフまたはスーパーモチーフエピトープにより誘導されるＣＴＬを評価して行うこともできる。
【０３６１】
人間におけるプライムブーストプロトコルの使用は実施例２０に記載する。
【０３６２】
実施例１３：予防的使用のためのペプチド組成物
本発明のワクチン組成物は、感染の危険性がある人のＨＪＢＶ感染を予防するのに用いることもできる。例えば、実施例９および／または実施例１０に選択されるような複数のＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを含むポリエピトープペプチドエピトープ組成物（またはこれを含む核酸）であって、集団の８０％より多くを標的とするように選択される組成物を、ＨＢＶ感染の危険性がある個体に投与する。
【０３６３】
例えば、複数のエピトープを包む単一のポリペプチドとしてペプチドベースの組成物を提供することができる。このワクチンは、典型的には、フロイント不完全アジュバントなどのアジュバントを含む生理学的溶液中に投与される。最初の免疫のためのペプチドの用量は、７０ｋｇの患者に対して、約１〜約５０，０００μｇ、一般的に１００〜５，０００μｇである。ワクチンの最初の投与の後に、続いて４週でブースター投与量、ＰＢＭＣサンプル中のエピトープ−特異的ＣＴＬ集団の存在を決定する技術によるこの患者における免疫応答の大きさの評価が続く。必要とされるならば、さらなるブースター投与量を投与する。この組成物は、ＨＰＶ感染に対する予防法として、安全かつ効果的の両方であることが見出される。
【０３６４】
あるいは、トランスフェクト剤を典型的に含む組成物を、当該分野で公知の方法論および本明細書中に開示される方法論に従って、核酸ベースのワクチンを投与するために使用することができる。
【０３６５】
実施例１４：ネイティブなＨＢＶ配列由来のポリエピトープワクチン組成物
ネイティブなＨＢＶポリタンパク質配列を、好ましくは各クラスＩおよび／またはクラスＩＩのスーパーモチーフまたはモチーフについて規定されたコンピュータアルゴリズムを用いてスクリーニングし、複数のエピトープを含むポリタンパク質の「比較的に短い（ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｓｈｏｒｔ）」領域を同定する。そして、この配列は、好ましくは、ネイティブ抗原全体よりも短い長さである。複数の異なる、重複さえしているエピトープを含むこの比較的に短い配列を選択し、そして使用してミニ遺伝子構築物を作製する。この構築物を操作して、ネイティブなタンパク質配列に対応するペプチドを発現させる。「比較的に短い」ペプチドは、一般的に、２５０アミノ酸長より短く、しばしば１００アミノ酸長より短く、好ましくは７５アミノ酸長より短く、そしてより好ましくは５０アミノ酸長より短い。上述のワクチン組成物のタンパク質配列は、配列内に含まれる最大数のエピトープを有する、すなわち高いエピトープ濃度を有するので、選択される。本明細書中で述べられるように、エピトープモチーフがネスト（ｂｅ　ｎｅｓｔｅｄ）されてもよいし、重複（すなわち、互いに関してフレームシフトする）であってもよい。例えば、ｆ重複エピトープを有する、２つの９マーのエピトープおよび１つの１０マーのエピトープが１０アミノ酸ペプチド中に存在し得る。このようなワクチン組成物を、治療目的または予防目的のために投与する。
【０３６６】
ワクチン組成物は、例えば、少なくとも１つのＨＢＶ標的抗原由来の３つのＣＴＬエピトープおよび少なくとも１つのＨＴＬエピトープを含む。このポリエピトープのネイティブな配列は、ペプチドとしてかまたはこのペプチドをコードする核酸配列としてかのいずれかで投与される。あるいは、アナログが、このネイティブな配列から作製され得、これによって、１つまたは複数のエピトープは、ポリエピトープペプチドの交差反応性および／または結合親和性特性を変化させる置換を含む。
【０３６７】
本実施例の実施形態は、免疫系プロセシングの今まで発見されていない態様が、ネイティブなネスト配列（ｎｅｓｔｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に適用され、これによって、治療的または予防的な免疫応答を誘導するワクチン組成物の生成を容易にする可能性を提供する。さらなるこのような実施形態は、現在未知であるＨＬＡ構造に関するモチーフ保有エピトープの可能性を提供する。さらに、本実施形態（アナログを欠く）は、ネイティブなＨＢＶ抗原に実際に存在する複数のペプチド配列に対する免疫応答を指向し、したがって、任意の連結エピトープを評価する必要を回避する。最後に、本実施形態は、核酸ワクチン組成物を生成する場合に規模の経済を提供する。
【０３６８】
本実施例に関連して、コンピュータプログラムは、当該分野における原理に従って導かれ得、これは、標的配列において、配列長当たりの最も大きい数のエピトープを同定する。
【０３６９】
実施例１５．複数の疾患に指向されるポリエピトープワクチン組成物
本発明のＨＢＶペプチドエピトープを、１つまたは複数の他の疾患に関連する標的抗原由来のペプチドエピトープと共に使用し、ＨＢＶならびに他の疾患の予防または治療に有用であるワクチン組成物を作製する。他の疾患の例としては、ＨＩＶおよびＨＣＶおよびＨＰＶが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３７０】
例えば、集団の９８％より多くを標的とする複数のＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを含むポリエピトープなペプチド組成物は、ＨＢＶ感染およびＨＩＶ感染の両方について危険性がある個体に投与するために作製され得る。この組成物は、種々の疾患に関連される供給源由来の複数のエピトープを組み込む単一ポリペプチドとして提供され得るか、または１つまたは複数の異なるエピトープを含む組成物として投与され得る。
【０３７１】
実施例１６．免疫応答を評価するためのペプチドの使用
本発明のペプチドを使用して、ＨＢＶを指向する特異的ＣＴＬ集団またはＨＴＬ集団の存在について、免疫応答を分析し得る。このような分析は、Ｏｇｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７９：２１０３−２１０６、１９９８に記載されるような方法で実施され得る。以下の実施例において、本発明に従うペプチドを、免疫原としてではなく、診断目的または予防目的のための試薬として使用する。
【０３７２】
本実施例において、高度に感受性のヒト白血球抗原テトラマー複合体（「テトラマー」）を、例えば、感染の異なる段階におけるＨＬＡ　Ａ＊０２０１陽性個体由来のＨＢＶ　ＨＬＡ−Ａ＊０２０１特異的ＣＴＬ頻度、または引き続くＡ＊０２０１モチーフを含むＨＢＶペプチドを用いた免疫の断面（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ）分析に使用する。テトラマー複合体を、記載されるように合成する（Ｍｕｓｅｙら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３７：１２６７、１９９７）。簡潔に言うと、精製ＨＬＡ重鎖（本実施例におけるＡ＊０２０１）およびβ２ミクログロブリンを、原核生物発現系の手段によって合成する。この重鎖を、膜貫通細胞質テイルの欠失およびＢｉｒＡ酵素ビオチン化部位を含む配列のＣＯＯＨ末端添加によって改変する。重鎖、β２ミクログロブリン、およびペプチドを、希釈によって再度折り畳む。４５ｋＤの再度折り畳まれた生成物を、高速タンパク質液体クロマトグラフィーによって単離し、次いで、ビオチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）、アデノシン５’三リン酸、およびマグネシウムの存在下で、ＢｉｒＡによってビオチン化する。ストレプトアビジン−フィコエリトリン結合体を、１：４のモル比で添加し、そして、テトラマー生成物を、１ｍｇ／ｍｌに濃縮する。得られた生成物を、テトラマー−フィコエリトリンと呼ぶ。
【０３７３】
患者の血液サンプルの分析に関して、約１００万個のＰＢＭＣを、３００ｇで５分間遠心分離し、そして、５０μｌの冷リン酸緩衝化生理食塩水に再懸濁する。三色分析を、抗ＣＤ８−Ｔｒｉｃｏｌｏｒ、および抗ＣＤ３８と共に、テトラマー−フィコエリトリンで実施する。ＰＢＭＣを、テトラマーおよび抗体を用いて氷上で３０〜６０分間インキュベートし、次いで、ホルムアルデヒド固定の前に２回洗浄する。９９．９８％を越える対照サンプルを含むようにゲートを適用する。テトラマーについての対照としては、Ａ＊０２０１陰性個体およびＡ＊０２０１陽性未感染ドナーの両方が挙げられる。次いで、テトラマーで染色された細胞の割合を、フローサイトメトリーによって決定する。この結果は、エピトープ拘束ＣＴＬを含むＰＢＭＣサンプル中の細胞数を示し、これによって、ＨＢＶエピトープに対する免疫応答の程度を直ちに示し、このようにして、ＨＢＶ感染の段階、ＨＢＶへの曝露の状態または保護的応答もしくは治療的応答を誘発するワクチンへの曝露を示す。
【０３７４】
実施例１７：リコール応答（ｒｅｃａｌｌ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を評価するためのペプチドエピトープの使用
本発明のペプチドエピトープを、患者における急性応答またはリコール応答などのＴ細胞応答を評価するための試薬として使用する。このような分析は、感染から回復した患者、ＨＢＶに慢性的に感染する患者、またはＨＢＶワクチンをワクチン接種された患者に対して実施され得る。
【０３７５】
例えば、ワクチン接種された個体のクラスＩ拘束ＣＴＬ応答を、分析し得る。ワクチンは、任意のＨＢＶワクチンでよい。ＰＢＭＣを、ワクチン接種された個体およびＨＬＡ型の個体から回収する。次いで、複数のＨＬＡスーパータイプファミリーのメンバーとの交差反応性を提供するスーパーモチーフを最適には保有する本発明の適切なペプチドエピトープを、そのＨＬＡ型を保有する個体由来のサンプルの分析のために使用する。
【０３７６】
ワクチン接種された個体由来のＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度勾配（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）上で分離し、ＨＢＳＳ（ＧＩＢＣＯ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で３回洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（これは、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、およびＨｅｐｅｓ（ｌ０ｍＭ）が補充され、１０％　熱不活性化ヒトＡＢ血清を（完全ＲＰＭＩ）を含む）中に再懸濁し、そして、マイクロ培養（ｍｉｃｒｏｃｕｌｔｕｒｅ）形式を用いて平面培養する。本発明のエピトープを含む合成ペプチドを、１０μｇ／ｍｌで各ウェルに添加し、そしてＨＢＶコア１２８〜１４０エピトープを、刺激の最初の週の間に、Ｔ細胞補助の供給源として１μｇ／ｍｌで各ウェルに添加する。
【０３７７】
マイクロ培養形式において、４×１０５個のＰＢＭＣを、９６ウェルの丸底プレートにおいて１００μｌ／ウェルの完全ＲＰＭＩ中、８個の複製培養物において、ペプチドで刺激する。３日目および１０日目に、１００ｍｌの完全ＲＰＭＩおよび２０Ｕ／ｍｌ最終濃度のｒＩＬ−２を各ウェルに添加する。７日目に、培養物を、９６ウェルの平底プレートに移し、そして、ペプチド、ｒＩＬ−２および１０５個の照射された（３，０００ｒａｄ）自系供給細胞で再刺激する。培養物を、１４日目に、細胞傷害活性に関して試験する。陽性のＣＴＬ応答は、以前に記載されたように（Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．２：１１０４、１１０８、１９９６；Ｒｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９７：１６５５−１６６５、１９９６；およびＲｅｈｅｒｍａｎｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：１４３２−１４４０、１９９６）未感染の対照被験体との比較に基づいて、１０％より大きい特異的５１Ｃｒ放出を示すために、８個の複製培養物のうちの２つ以上を必要とする。
【０３７８】
標的細胞株は、自系および同種異系のＥＢＶ形質転換Ｂ−ＬＣＬであり、これらは、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＡＳＨＩ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入されるか、または記載されたように（Ｇｕｉｌｈｏｔら、Ｊ　Ｖｉｒｏｌ．６６：２６７０−２６７８、１９９２）患者のプールから確立されるかのいずれかである。
【０３７９】
細胞傷害性アッセイを、以下の方法で実施する。標的細胞は、同種異系のＨＬＡが一致したＢリンパ芽球細胞株または自系ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ芽球細胞株のいずれかからなり、これらの細胞株を、１０μＭの本発明の合成ペプチドエピトープと共に一晩インキュベートし、そして１００μＣｉの５１Ｃｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｃｏｒｐ．、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて１時間標識し、この後、これらをＨＢＳＳを用いて４回洗浄する。
【０３８０】
細胞傷害活性を、３，０００個の標的／ウェルを含むＵ底の９６ウェルプレートを用いて、標準的な４−ｈ、分裂ウェル（ｓｐｌｉｔ　ｗｅｌｌ）５１Ｃｒ放出アッセイにおいて決定する。刺激されたＰＢＭＣを、１４日目に、２０〜５０：１のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比において試験する。百分率細胞傷害性を、式：１００×［（実験的な放出−自発的な放出）／最大の放出−自発的な放出）］から決定する。最大の放出は、洗浄剤（２％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００；Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）による標的の溶解により決定する。自発的な放出は、全ての実験に対して、最大放出の２５％未満である。
【０３８１】
このような分析の結果は、ＨＬＡ拘束ＣＴＬ集団がＨＢＶまたはＨＢＶワクチンへの事前の曝露によって刺激された程度を示す。
【０３８２】
同様にクラスＩＩ拘束ＨＴＬ応答も分析され得る。精製されたＰＢＭＣを、９６ウェル平底プレート中、１．５×１０５細胞／ウェルの密度で培養し、そして１０μｇ／ｍｌの合成ペプチド、全抗原、またはＰＨＡを用いて刺激する。細胞を、慣用的に、各条件について４〜６ウェルの反復実験において平面培養する。培養の７日後、この培地を取り除き、そして、１０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を含む新鮮な培地で置きかえる。２日後、１μＣｉ　３Ｈ−チミジンを、各ウェルに添加し、そしてさらなる１８時間インキュベーションを続ける。次いで、細胞性のＤＮＡを、ガラスファイバーマット上に収集し、そして、３Ｈ−チミジン取りこみについて分析する。抗原特異的Ｔ細胞増殖を、抗原の存在下での３Ｈ−チミジン取りこみを抗原の非存在下での３Ｈ−チミジン取り込みで割った比として、算出する。
【０３８３】
実施例１８：ヒトにおける特異的ＣＴＬ応答の誘導
本発明のＨＢＶ　ＣＴＬエピトープおよびＨＴＬエピトープを含む免疫原性組成物に関するヒト臨床試験を、ＩＮＤフェーズＩ、用量増大研究（５、５０、および５００μｇ）として設定し、そして、無作為化、二重ブラインドのプラシーボ制御された試験として実行する。このような試験は、例えば以下のように設計される：
全部で約２７人の被験体を、登録し、そして３群に分ける：
群Ｉ：３人の被験体に、プラシーボを注射し、そして６人の被験体に、５μｇのペプチド組成物を注射する；
群ＩＩ：３人の被験体に、プラシーボを注射し、そして６人の被験体に、５０μｇのペプチド組成物を注射する；
群ＩＩＩ：３人の被験体に、プラシーボを注射し、そして６人の被験体に、５００μｇのペプチド組成物を注射する。
【０３８４】
最初の注射の４週間後、全ての被験体に同じ投与量でブースター接種を受けさせる。
【０３８５】
本研究において測定された終点は、ペプチド組成物の安全性および寛容性ならびにこの組成物の免疫原性に関連する。ペプチド組成物に対する細胞性免疫応答は、このペプチド組成物の固有の活性の指標であり、従って、生物学的効果の測定としてみなされ得る。以下に、安全性および効果の終点に関する臨床データおよび実験室データを要約する。
【０３８６】
安全性：有害事象の発生率を、プラシーボ処置群および薬物処置群においてモニターし、そして、程度および可逆性に関して評価する。
【０３８７】
ワクチン効果の評価：ワクチン効果の評価に関して、被験体を、注射の前および注射の後に採血する。末梢血単核細胞を、新鮮なヘパリン処理された血液からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって単離し、凍結培地に等分し、そして凍結保存する。サンプルを、ＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性についてアッセイする。
【０３８８】
このようにして、ワクチンが、安全かつ有効であることの両方を見出される。
【０３８９】
実施例１９：ＨＢＶに感染した患者におけるフェーズＩＩ試験
フェーズＩＩ試験を、慢性ＨＢＶ感染を有する患者（男性および女性）へのＣＴＬ−ＨＴＬペプチド組成物の投与の効果を研究するために実施する。この試験の主要な目的は、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）における一過性発赤（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｆｌａｒｅ）、ＡＬＴの正常化、およびＨＢＶ　ＤＮＡの減少によって明らかにされるように、慢性的に感染されるＨＢＶ患者においてＣＴＬを誘導するための有効な用量および投与計画を決定すること、これらの患者におけるＣＴＬ応答を誘導することの安全性を確立すること、および、どの程度までＣＴＬ活性化が慢性的に感染されるＣＴＬ患者の臨床状況を改善するかを調べることである。このような研究は、例えば以下のように設計される：
本研究は、米国およびカナダの複数のセンターで実施される。試験の設計は、オープン標識の非制御された用量増大プロトコルであって、ここで、ペプチド組成物は、単一用量として投与され、６週間後に引き続き同じ用量の単一ブースターショットによって投与される。用量は、１回の注射当たり５０、５００、および５，０００μｇである。薬物関連有害効果が記録される。
【０３９０】
３つの患者群が存在する。第１の群を、５０μｇのペプチド組成物を有して注射し、そして第２群および第３群を、それぞれ、５００および５，０００μｇのペプチド組成を有してで注射する。各群の中の患者は、年齢が２１〜６５歳の範囲であり、男性および女性の両方を含む。患者は多様な人種背景を表す。この患者らは全員が、ＨＢＶに５年間以上感染しており、そして、彼ら全員は、ＨＩＶ陰性、ＨＣＶ陰性およびＨＤＶ陰性であるが、陽性レベルのＨＢｅ抗原およびＨＢｓ抗原を有する。
【０３９１】
ＡＬＴ発赤の大きさおよび発生率および血液中のＨＢＶ　ＤＮＡのレベルを、ペプチド組成物の投与の効果を評価するためにモニターする。血液中のＨＢＶ　ＤＮＡのレベルは、治療の進行の間接的な指標である。ワクチン組成物は、慢性ＨＢＶ感染の治療において、安全かつ有効であることの両方を見出される。
【０３９２】
実施例２０．プライムブースト（ｐｒｉｍｅ　ｂｏｏｓｔ）プロトコルを用いたＣＴＬ応答の誘導
同様に、プライムブーストプロトコルを、ワクチンのヒトへの投与のために使用することもできる。このようなワクチン投与計画としては、例えば裸のＤＮＡの初回投与、続くこのワクチンをコードする組換えウイルスを用いるブースト、または組換えタンパク質／ポリペプチドもしくはアジュバント中に投与されるペプチド混合物の初回投与が挙げられる。
【０３９３】
例えば、初回免疫は、実施例１１に構築されたような発現ベクターを用いて、複数の部位に０．５〜５ｍｇの量で、ＩＭ（またはＳＣまたはＩＤ）で投与される裸の核酸の形態で、実施してよい。同様に、核酸（０．１〜１０００μｇ）を、遺伝子銃を用いて投与することもできる。次いで、３〜４週間のインキュベーション期間の後、ブースター用量を投与する。このブースターは、５×１０７〜５×１０９ｐｆｕの用量で投与される組換え鶏痘ウイルスであり得る。ＭＶＡ、カナリア痘ウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスなどの代替の組換えウイルスも同様に、このブースターに使用することができ、あるいは、ポリエピトープなタンパク質もしくはこのペプチドの混合物を投与することができる。ワクチン効果の評価のために、患者の血液サンプルを、免疫前、ならびに初期ワクチンおよびブースター用量のワクチンの投与後の間に得る。末梢血単核細胞を、新鮮なヘパリン処理された血液からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離によって単離し、凍結培地に等分し、そして凍結保存する。サンプルを、ＣＴＬ活性およびＨＴＬ活性についてアッセイする。
【０３９４】
この結果は、ＨＢＶに対する保護的免疫を達成するか、またはＨＢＶ感染を治療するのに十分である大きさの応答が生成されることを示す。
【０３９５】
実施例２１．樹状細胞（ＤＣ）を用いるワクチン組成物の投与
本発明のペプチドエピトープを含むワクチンは、ＤＣなどのＡＰＣを用いて投与することができる。本実施例において、ペプチドパルスされたＤＣを、ＣＴＬ応答をインビボにおいて刺激するために患者に投与する。本方法において、樹状細胞を単離し、増殖し、そして、本発明のペプチドＣＴＬエピトープおよびペプチドＨＴＬエピトープを含むワクチンを用いてパルスする。樹状細胞を、患者に注入して戻し、インビボにおいてＣＴＬ応答およびＨＴＬ応答を誘発する。次いで、誘導されたＣＴＬおよびＨＴＬは、特定の標的細胞（この細胞は、ワクチン中のエピトープが誘導されるタンパク質を保有する）を破壊するかまたはこの細胞の破壊を容易にする。
【０３９６】
例えば、エピトープ保有ペプチドのカクテルをエキソビボでＰＢＭＣに投与するか、それからＤＣを単離する。Ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ（商標）（Ｍｏｎｓａｎｔｏ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）やＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４などのＤＣの採取を用意する薬剤を用いることもできる。ＤＣをペプチドでパルスした後であって、患者に再注入する前に、ＤＣを洗浄して未結合ペプチドを除去する。
【０３９７】
臨床的に理解されるように、また、当業者によって臨床的結果に基づいて容易に決定されるように、患者に再注入されるＤＣの数は変化することができる（例えば、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．４：３２８、１９９８；Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．２：５２、１９９６およびＰｒｏｓｔａｔｅ　３２：２７２、１９９７参照）。典型的には患者当たり２〜５０×１０６ＤＣが投与されるが、１０７または１０８といったより多数のＤＣも提供し得る。このような細胞集団は典型的には５０〜９０％の間のＤＣを含む。
【０３９８】
いくつかの実施形態においては、ペプチド負荷されたＰＢＭＣをＤＣの精製を行わずに患者に注入する。例えば、Ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ（商標）などの薬剤処理後で生成されるＤＣを含むＰＢＭＣをＤＣの精製を行わずに患者に注入する。投与されるＰＢＭＣの合計数はしばしば１０８〜１０１０の範囲である。一般に患者に注入される細胞の用量は、それぞれの患者の血液中のＤＣのパーセンテージに基づき、例えば、特異的抗ＤＣ抗体を用いる免疫蛍光分析によって決定される。したがって、例えば、与えられた患者の末梢血においてＰｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ（商標）が２％のＤＣを可動化し、その患者が５×１０６のＤＣを受け取るべきならば、次いで、患者は、全量２．５×１０８のペプチド負荷されたＰＢＭＣを注入されるであろう。Ｐｒｏｇｅｎｉｐｏｉｅｔｉｎ（商標）などの薬剤により可動化されるＤＣのパーセントは典型的には２〜１０％との間である評価されるが、当業者が理解するように、これは変化し得る。
【０３９９】
エキソビボでのＣＴＬ／ＨＴＬ応答の活性化
あるいは、ＨＰＶ抗原に対するエキソビボのＣＴＬ応答またはＨＴＬ応答は、組織培養物中、患者のまたは一般的に適合性の、ＣＴＬまたはＨＴＬ前駆体細胞をＤＣなどのＡＰＣの供給源および適切な免疫原性ペプチドと共にインキュベートすることによって誘導され得る。前駆体細胞が活性化され、エフェクター細胞に拡大される適切なインキュベーション時間（典型的には約７〜２８日間）の後、細胞を、患者に注射して戻し、ここで、これらの細胞は、それらの特定の標的細胞を破壊するか（ＣＴＬ）またはそれらの破壊を容易にする（ＨＴＬ）。
【０４００】
実施例２２：モチーフ保有ペプチドを同定する代替方法
モチーフ保有ペプチドを同定するための別の方法は、規定されたＭＨＣ分子を保有する細胞からこれらを溶出することである。例えば、組織型（ｔｉｓｓｕｅ　ｔｙｐｉｎｇ）に使用されるＥＢＶ形質転換されたＢ細胞株は、ＨＬＡ分子をこの細胞が発現するかを決定するために徹底的に特徴付けられてきた。特定の場合において、これらの細胞は、単一の型のＨＬＡ分子のみ発現する。これらの細胞を、病原性生物で感染し得るか、または目的の抗原（例えば、ＨＢＶタンパク質）を発現する核酸でトランスフェクトし得る。次いで、感染の結果（またはトランスフェクトの結果として）産生されたペプチドの内因性抗原プロセシングによって産生されたペプチドは、細胞内のＨＬＡ分子に結合し、輸送され細胞表面上に提示される。次いで、ペプチドを、緩酸条件に曝露することによってＨＬＡ分子から溶出し、そしてこれらのアミノ酸配列を、例えば、質量スペクトル分析によって決定する（例えば、Ｋｕｂｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：３９１３、１９９４）。なぜなら、特定のＨＬＡ分子に結合する大部分のペプチドは、モチーフ保有であることから、これは、細胞上に発現された特定のＨＬＡ分子と関連するモチーフ保有ペプチドを得るための代替様式である。
【０４０１】
あるいは、内因性ＨＬＡ分子を発現しない細胞株を、単一のＨＬＡ対立遺伝子をコードする発現構築物でトランススフェクトし得る。次いで、これらの細胞を、記載されるように使用し得、すなわち、これらの細胞を、病原体もしくは細胞表面上に提示された目的の抗原に対応するペプチドを単離するために、病原体で感染し得るか、または目的の抗原をコードする核酸でトランスフェクトし得る。このような分析から得られたペプチドは、この細胞中で発現される単一のＨＬＡ対立遺伝子への結合に対応するモチーフを保有する。
【０４０２】
当業者に明らかなように、当業者は、１より多くのＨＬＡ対立遺伝子を保有する細胞について同様の分析を実施することができ、そして引続いて発現される各ＨＬＡ対立遺伝子に特異的なペプチドを決定することができる。さらに、当業者はまた、タンパク質抗原を用いる負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）のような感染またはトランスフェクト以外の手段が、細胞に抗原の供給源を提供するために使用され得ることも認識するであろう。
【０４０３】
本願明細書中の実施例は、本発明の範囲を制限するためではなく、本発明を例示するために提供される。本発明の他の変形は、当業者に容易に明らかであり、そして添付される特許請求の範囲に含まれる。本明細書中に引用される全ての刊行物、特許および特許出願は、全ての目的に関して参照よって本明細書中に組み込まれる。
【０４０４】
【表２】
2004508320.tif 000003
【０４０５】
【表３】
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【０４０６】
【表４】
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【０４０７】
【表５】
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【０４０８】
【表６】
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【０４０９】
【表７】
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【０４１０】
【表８】
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【０４１１】
【表９】
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【０４１２】
【表１０】
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【０４１３】
【表１１】
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【０４１４】
【表１２】
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【０４１５】
【表１３】
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【０４１６】
【表１４】
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【０４１７】
【表１５】
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【０４１８】
【表１６】
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【０４１９】
【表１７】
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【０４２０】
【表１８】
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【０４２１】
【表１９】
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【０４２２】
【表２０】
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【０４２３】
【表２１】
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【０４２４】
【表２２】
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【０４２５】
【表２３】
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【０４２６】
【表２４】
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【０４２７】
【表２５】
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【０４２８】
【表２６】
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【０４２９】
【表２７】
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【０４３０】
【表２８】
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【０４３１】
【表２９】
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【０４３２】
【表３０】
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【０４３３】
【表３１】
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【０４３４】
【表３２】
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【０４３５】
【表３３】
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【０４３６】
【表３４】
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【０４３７】
【表３５】
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【０４３８】
【表３６】
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【０４３９】
【表３７】
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【０４４０】
【表３８】
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【０４４１】
【表３９】
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【０４４２】
【表４０】
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【０４４３】
【表４１】
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【０４４４】
【表４２】
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【０４４５】
【表４３】
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【０４４６】
【表４４】
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【０４４７】
【表４５】
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【０４４８】
【表４６】
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【０４４９】
【表４７】
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【０４５０】
【表４８】
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【０４５１】
【表４９】
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【０４５２】
【表５０】
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【０４５３】
【表５１】
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【０４５４】
【表５２】
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【０４５５】
【表５３】
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【０４５６】
【表５４】
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【０４５７】
【表５５】
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【０４５８】
【表５６】
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【０４５９】
【表５７】
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【０４６０】
【表５８】
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【０４６１】
【表５９】
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【０４６２】
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【表１２０】
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【０５２３】
【表１２１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、平均集団における、ＨＬＡ−ＡおよびＢ分子により結合したＨＣＶ候補エピトープの数の関数としての遺伝子型の総頻度のグラフを提供する。
【図２】
図２は、実験モデルのミニ遺伝子構築物中のペプチドエピトープの位置を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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