(57)【要約】本発明は、物質を含む非ガス状流体を、流体を膨張させるための濃密ガス（（ａ）反溶媒および（ｂ）反溶媒の極性を改変する改変剤を含有する）と接触させる工程を包含する、物質の微粒子を形成する方法およびその方法によって形成された粒子を提供する。本発明は、反溶媒（ａｎｔｉ−ｓｏｌｖｅｎｔ）沈殿により、物質（特に、インスリンのようなｐＨ感受性タンパク質）の微粒子を形成するための方法に関する。本発明はまた、この方法により生成されるｐＨ感受性生物学的活性物質の微粒子、およびｐＨ感受性の生物学的活性物質を含む組成物（特に薬学的組成物）に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質の微粒子を形成する方法であって、該方法は、該物質を含有する非ガス状流体を、該流体を膨張させるための濃密ガスと接触させる工程を包含し、該濃密ガスが、（ａ）反溶媒および（ｂ）該反溶媒の極性を改変する改変剤を含む、方法。
【請求項２】
前記反溶媒が、非ガス状流体のｐＨを有意に変化させない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物質が、ｐＨ感受性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記物質が、生物学的に活性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記改変剤が、前記反溶媒の極性を改変し、かつ前記非ガス状流体に対して抽出剤として作用する、方法。
【請求項６】
前記非ガス状流体が、水溶液である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記反溶媒が、Ｃ１−４アルカンガス、Ｃ２−４アルケンガス、Ｃ２−４アルキンガス、冷媒ＲＦ１３４ａ、またはこれらの２種以上からなる群から選択される、方法。
【請求項８】
前記反溶媒が、アルカンガスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記反溶媒がエタンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記改変剤が、Ｃ１−６アルカノール、Ｃ１−６チオールおよびＣ１−６アミンからなる群から選択される、方法。
【請求項１１】
前記改変剤が、エタノールである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、十分な改変剤が、実質的に全ての非ガス状流体を抽出するのに使用され、前記物質の沈殿を促進する、方法。
【請求項１３】
前記反溶媒および改変剤が、単一の相として維持される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記物質を含有する前記非ガス状流体と前記濃密ガスが、単一の相として維持される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の方法であって、前記単一の相は、前記濃密ガスの温度および圧力を調整すること、および前記流体の膨張前に各々の流体の相対的な流速を制御することのいずれかまたは両方によって維持される、方法。
【請求項１６】
前記濃密ガスが、５℃〜４５℃の間であり、そして５〜２００ｂａｒの間の圧力である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記物質が、タンパク質、核酸、リポソーム、脂質（リン脂質を含む）、水溶性ポリマー、制御送達コーティング、界面活性剤および植物ステロール（天然もしくは合成）からなる群から選択される、方法。
【請求項１８】
前記形成された粒子の約５０％が、直径６２５〜１０，０００ナノメートルの間である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記形成された粒子の５０％より多くが、直径１０，０００ナノメートル未満である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記形成された粒子の５０％より多くが、６，５００ナノメートルより小さい、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、前記反溶媒および改変剤が、前記非ガス状流体と接触される前に合わせられる、方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、前記非ガス状流体中の前記物質の濃度が、前記非ガス状流体／物質と前記反溶媒／改変剤との間に単一の相を維持するように調整される、方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法によって形成される、物質の微粒子。
【請求項２４】
前記粒子が、主として生物学的に活性なインスリンを含有する、請求項２３に記載の微粒子。
【請求項２５】
前記粒子の少なくとも５０％が、直径１０，０００ナノメートル未満である、請求項２４に記載の微粒子。
【請求項２６】
全てが直径６５００ｎｍ未満である、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の微粒子。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法によって生産される微粒子の形態である、ｐＨ感受性の生物学的活性物質。
【請求項２８】
有効量の，請求項１〜２７のいずれか１項によって生産される物質の微粒子を被験体に投与する工程を包含する、被験体を処置する方法。
【請求項２９】
前記粒子が、ｐＨ感受性の生物学的活性物質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記物質の投与が、吸入である、請求項２８または２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
投与が、経皮適用、経口、徐放または持続性放出である、請求項２８および２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
インスリン依存性糖尿病が、インスリン粒子の投与によって処置される、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法であって、前記微粒子が、該粒子が形成される第１の容器から濃密ガスと共に第２の収集容器に流れ、該第２の容器から該粒子が収集される、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記第２の収集容器は、入口および入り口上部に配置された出口を有し、ここで、前記微粒子および濃密流体は、該入口を通過し、そして出口を通る濃密流体の流れを、該第２の収集容器から収集され得る微粒子の比率を最大限にするように調節する、方法。
【請求項３５】
有効量の薬学的組成物の被験体への投与によって被験体を処置するための薬学的組成物の製造における、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法により形成される微粒子または請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の微粒子の使用。
【請求項３６】
前記粒子が、ｐＨ感受性の生物学的活性物質である、請求項３５に記載の微粒子の使用。
【請求項３７】
微粒子を形成する方法であって、該微粒子の各々が、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の微粒子と実施的に同様の形状およびサイズである、方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（分野）
本発明は、反溶媒（ａｎｔｉ−ｓｏｌｖｅｎｔ）沈殿により、物質（特に、インスリンのようなｐＨ感受性タンパク質）の微粒子を形成するための方法に関する。本発明はまた、この方法により生成されるｐＨ感受性生物学的活性物質の微粒子、およびｐＨ感受性の生物学的活性物質を含む組成物（特に薬学的組成物）に関する。
【０００２】
（背景）
本明細書の全体にわたり、他に示されない限り、知っている書類、行為（ａｃｔ）または項目（ｉｔｅｍ）を参照するかまたは考察する場合、この参照または考察は、その知っている書類、行為もしくは項目またはそれらの任意の組合せが、優先日当時、一般常識の一部であったことを認めるものではない。
【０００３】
タンパク質のような脆弱な分子の均一なミクロンサイズの（または、狭いサイズ範囲内の）粒子の製造は、薬学産業分野における挑戦である。
【０００４】
微粒子の１つの用途は、薬物の肺吸収である。これは、いくつかの肺疾患（例えば、気管支ぜん息）を含む多くの適用のための、重要な進入経路である。この投与様式の１つの利点は、表面積が大きいために循環へのアクセスが迅速であることである。血中への薬物のほとんど瞬間的な吸収と同様に、肺への送達は、肝臓の最初の通過による損失を回避するという利点、および肺疾患の場合には、所望の作用部位における局所適用という利点を有する。
【０００５】
肺への送達はまた、伝統的に薬物の全身投与により処置されていた状態の処置の代替を提供し得る。タンパク質の投与は、適切な事例である。インスリンは、胃腸管において安定ではないので、現在では注射により投与される。糖尿病患者は、何回かの注射を自分で施す必要がある。しかし、不便さおよび痛みを伴うため、注射の使用は応じ難い。肺へのタンパク質の投与は、そのタンパク質が生物学的活性の有意な損失なしに微粒子として形成され得る限り、このような患者により受け入れられそうであり、それゆえ、注射の魅力的な代替である。治療用薬物の投与のためのエアロゾル送達の使用のための通常の基準は、その薬物が、生物学的活性を（明らかに）維持したまま（これには、物質の構造が維持されることがしばしば必要とされる）、約０．０５〜１０μｍ、好ましくは１〜５μｍの範囲のサイズを有する粒子を含む粒状形態であることである。このような粒子の製造における共通の問題は、粒径の許容できない変動である。
【０００６】
微粒子形態の薬物はまた、経口送達、制御送達、または徐放性送達の領域での使用に適切である。このような技術の１つの適用は、薬物が有効である投薬レベルと薬物が毒性となる投薬レベルとの間に小さな差がある薬物の場合である。後者の技術において、粒子が均一な粒径を有することがまた重要である。
【０００７】
微粒子医薬の別の適用は、経皮的薬物送達である。伝統的な皮下、静脈内などの注射以外に、新しい投与方法（例えば、薬物送達のための、皮膚を通る微細なチャネルを作製するためのレーザー）が使用されている。経皮高圧薬物送達を含む同様の機構もまた使用されている。従って、薬学的微粒子または薬学的ミクロンサイズの粒子の適用が増加している。
【０００８】
溶媒または反溶媒として、臨界点付近または臨界点を越えた流体を利用する濃密ガス技術は、近年発達してきた。２つの濃密ガス方法が、固体粒子の製造のために考慮されてきた。その第１の方法は、超臨界溶液の急速膨張（Ｒａｐｉｄ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）（ＲＥＳＳ）として公知であり、そしてノズルを通して目的の材料の超臨界溶液を膨張させることを包含する。いくつかの微粒子を生成するための有効な方法を提供するが、ＲＥＳＳ法の適用は、濃密二酸化炭素中のタンパク質の低い溶解度により制限される。
【０００９】
第２の方法は、ガス反溶媒プロセスとして公知であり、代表的には濃密二酸化炭素を反溶媒として使用して、有機溶液から溶質を急速に沈殿させることを包含する。反溶媒が溶液を膨張させ、それにより溶媒の溶媒和力を減少させ、そして最終的に溶質の沈殿を生じる。
【００１０】
ガス反溶媒プロセスは、２つの様式でミクロンサイズの粒子を生成するために利用されてきた。第１の様式は、単純にガス反溶媒プロセス（ＧＡＳ）として公知であり、沈殿が生成するまで溶質を含有する有機溶液に反溶媒を段階的に添加することを包含する。第２の様式は、エアロゾル溶媒抽出系（Ａｅｒｏｓｏｌ　Ｓｏｌｖｅｎｔ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ）（ＡＳＥＳ）として公知であり、ノズルを通して流動性濃密ガス流中に目的の溶質を含有する溶液を連続的に導入することを包含する。溶液が濃密ガス中に噴霧されるにつれて、高度の過飽和により微粒子の沈殿を生じる。一般的に、このプロセスを使用する沈殿は急速であり、温和な操作温度および操作圧力を必要とする。
【００１１】
このＧＡＳプロセスは、インスリン、リゾチーム、およびペルオキシダーゼのミクロンサイズ粒子の生成について試みられてきた。これらの技術をｐＨ感受性タンパク質の微粉化粒子の生成に適用する困難さは、これらの技術が、タンパク質を有機溶媒（潜在的な変性剤である）に曝露することを含むことである。これは、例えば不活性化インスリンである。有機溶媒はまた、廃棄がより困難であるので望ましくない。従って、このプロセスは、非常に不適切である。
【００１２】
この制限を克服する１つの試みにおいて、ＡＳＥＳプロセスのある形態が開発されており、超臨界流体による溶液増強分散（Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ　ｂｙ　Ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｆｌｕｉｄ）（ＳＥＤＳ）と呼ばれる。ＳＥＤＳは、ＡＳＥＳプロセスを使用するが、特別な同軸ノズルを用い、これにより部分的に、有機溶媒への曝露の問題が克服される。この技術は、水溶液からのリゾチームの生体活性粒子の生成を容易にし、このことの利点は、水がタンパク質にとって自然で好ましい媒質であるということである。しかし、ｐＨ感受性物質の変性は、水性キャリアを考慮すると、粒子形成の間のｐＨ変化により起こり得る。
【００１３】
本発明者らは、いくつかのタンパク質の生物学的活性は、ＣＯ２が反溶媒として使用される場合に、不利な影響を受け得ることを見出した。本発明者らは、ＣＯ２の水溶液への溶解が、インスリンのようなｐＨ感受性タンパク質の生物学的活性および／または構造に影響を及ぼし得る程度まで水相のｐＨを低下させると考えている。
【００１４】
ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ　ＡＢのＷＯ００／３０６１２は、ｐＨ分解を受けやすい薬物の粒子を製造する方法を開示する。ＳＥＤＳプロセスを使用して、水和形態の、酸に不安定な物質は、生成物の実質的な分解なしに得られると述べられている。このプロセスは、物質の、溶媒または溶媒の混合物（有機溶媒、例えば、アルコール、エーテル、またはケトン）中への溶解を包含する。この溶液は、次いで、濃密ガスと接触されて、有機溶媒を抽出し、そして微粒子を沈殿させる。これらの溶媒はまた、改変剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）または共溶媒としてこのプロセスに添加され得る。しかし、この方法はまた、目的の物質を、アルコール、エーテルまたはケトン（これらは、通常ｐＨ感受性分子を変性させる）を用いて溶液にすることを包含する。
【００１５】
粒子生成物の製造および収集のための現存の装置は、同じ容器において集塵機および収集デバイスを備える。目的の生成物を含有する溶液および反溶媒（これは、濃密ガスおよび、必要に応じて改変剤を含有する）は、同時に沈殿容器を通過する。粒子が形成されるにつれて、それらは重力下で収集デバイスの底へと降下し、そして圧密され得るか、凝集し得る（ａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）（物理的会合）かまたは集塊化し得る（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｅｄ）（化学的に結合される）。粒子はまた、例えば、濃密ガス反溶媒の高圧および高流速に起因して、プロセスの最後の洗浄段階の間さらに圧密され得る。
【００１６】
２つ以上の粒子の集合が、弱い凝集力（例えば、ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗａａｌ’ｓ力）により一緒に保持される場合に凝集が起こる。凝集体は、せん断力および／または溶媒により分散され得る。他方、集塊化は、２つ以上の粒子の集合が、強い粒子間力（例えば、結晶結合）により一緒に保持される場合におこる。集塊物は、破壊して分散させるのがより困難である。
【００１７】
小粒子形成プロセスにおいて、粒子が集塊化または圧密されることを回避することが望ましい。なぜならば、特に活性成分に対する損傷を回避しながら、この物質を破壊することがより困難であるからである。従って、このようなプロセスから生じた粒子は、大きさおよび形状が均一でなく、このことは、薬学的適用におけるこのような粒子の使用に理想的ではない。しかし、ある程度の凝集は、生成された粒子が細か過ぎて収集することができないいくつかの状況では望ましくあり得る。凝集しなかった微粉末は、系から洗い落とされて低い収率を生じ得る。粒子間の凝集は、粒子をより大きくして収集し易くし、そして収集後、この凝集体は、機械的な力により破壊され得る。
【００１８】
医薬の肺送達のために使用される粒子は、理想的には直径が５μｍ〜１０μｍ未満であるべきである。このサイズの粒子が、エアロゾル化し易く、吸入された場合に、容易に肺に到達し得る。しかし、粒子が収集容器で圧密される場合、５μｍ未満の（従って、肺送達に適切な）直径を有する粒子の質量分率は低い。
【００１９】
公知の単一工程装置を使用する収集プロセスは、ケーキングが起きる前に沈殿した粒子を取り出すために操作を規則的に中断する必要性に起因して、短い操作時間を伴う、本質的にバッチプロセスである。従って、このような装置を使用する粒子の製造は、必然的にバッチ型（ｂａｔｃｈ−ｗｉｓｅ）プロセスである。従って、このプロセスは、非効率的であり、そして生成物の低い収率および回収になり得る。
【００２０】
ｐＨ感受性物質の構造および／または活性（特に、生物学的活性）を維持しながら、この物質の微細な、比較的均一な粒子を生成することに伴う問題を克服するために研究が行われてきた。
【００２１】
これらの研究はまた、より効率的な様式で作動し、そして装置を使用して形成される粒子に損傷を与えず、平均粒径を実質的に増加させない、粒子形成用の装置を設計するために行われた。
【００２２】
（発明の要旨）
第１の局面において、本発明は、物質の微粒子を形成する方法を提供し、この方法は以下：
物質を含有する非ガス状流体を、この流体を膨張させるための濃密ガスと接触させる工程であって、この濃密ガスが、（ａ）反溶媒および（ｂ）反溶媒の極性を改変する改変剤を含む、工程、
を包含する。
【００２３】
好ましくは、この反溶媒は、非ガス状流体のｐＨを有意に変更しない。
【００２４】
本発明の方法は、この物質の微粒子を生成し得、そしてｐＨ感受性物質および生物学的に活性な物質の粒子の製造に特に有用である。なぜならば、このような物質の生物学的活性が実質的に保持されるからである。この方法はまた、水溶性物質に特に適している。
【００２５】
非ガス状流体は、好ましくは水溶液である。
【００２６】
本発明の方法において使用される反溶媒は、中性の溶媒および／または比較的低い極性の溶媒であるべきである。適切な溶媒としては、Ｃ１〜４アルカンガス、Ｃ２〜４アルケンガス、Ｃ２〜４アルキンガス、フルオロ炭化水素、ＲＦ１３４ａのような冷媒、およびいくつかの有機溶媒（例えば、ヘキサン）、またはこれらの２種以上が挙げられる。好ましくは、反溶媒は、アルカンガスである。エタンは、特に好ましい反溶媒である。
【００２７】
改変剤は、非ガス状流体−生物学的活性物質溶液の非ガス状流体の実質的に全てを吸収するかまたは抽出するのに十分な量で存在し得る。
【００２８】
この改変剤は、反溶媒の極性を改変し、そして非ガス状流体の抽出剤（すなわち、溶媒）として作用する、任意の物質であり得る。この改変剤は、Ｃ１〜６アルカノール、Ｃ１〜６チオールおよびＣ１〜６アミンからなる群から選択され得る。好ましくは、この改変剤は、エタノールである。
【００２９】
特に好ましい反溶媒／改変剤の組合せは、エタン／エタノールである。
【００３０】
濃密ガスは、種々の温度および圧力であり得る。好ましくは、濃密ガスの温度は、−２０℃〜約１００℃の範囲であり、最も好ましくは約５℃〜約４５℃である。より低い温度は、増加した粘度および減少した質量移動特性を生じ、そしてこれが、この方法の効率を低下させる。高温は、操作するためにより多く費用がかかり、そして物質に損傷を与え得る。好ましくは、濃密ガスは、約１ｂａｒ〜４００ｂａｒの範囲の圧力を有する。約５〜２００ｂａｒの間の圧力は、特に好ましい。最も好ましくは、濃密ガスの圧力は、溶媒、反溶媒および改変剤の混合物を、第２相に溶解したままであり得そしてその系から洗浄され得る沈殿の損失を低減する単一相として維持するような圧力にされる。
【００３１】
好ましくは、反溶媒ガスおよび改変剤の両方は、ｐＨ感受性の生物学的に活性な物質に対して実質的に不活性である。
【００３２】
本発明の方法により製造される粒子はまた、リポソーム、脂質（リン脂質を含む）、水溶性ポリマー、制御送達コーティング、界面活性剤、植物ステロール、および当該分野で公知の任意の他の送達剤のような送達剤を含み得る。
【００３３】
好ましくは、本発明の方法により生成される微粒子の実質的に全ては、１０，０００ｎｍ未満の粒径を有する。より好ましくは、微粒子は、６，５００ｎｍ以下のサイズを有する。５，０００ｎｍまでの範囲のサイズを有する粒子は、肺への投与に特に有用である。より小さい粒子が所望される場合、本発明の方法は、ナノメートルサイズまでの粒子を製造し得るが、このような粒子は、収集するのが困難であり、そして自然に凝集してより大きな粒子になり得る。
【００３４】
好ましくは、形成される粒子の約５０％は、６２５ナノメートルと１０，０００ナノメートルとの間の直径である。
【００３５】
ｐＨ感受性の生物学的活性物質の溶液は、任意の適切な様式で濃密ガスと接触され得る。好ましくは、この溶液は、濃密ガス中に液滴として導入される。例えば、この溶液および濃密ガスは、これら二つをノズルなどを通して並行に噴霧することにより接触され得る。あるいは、この溶液は、濃密ガスを通して噴霧され得る。さらなる選択肢は、この溶液を濃密ガスの流れに対して並行かまたは向流で通すことである。この溶液は、薄膜または複数の流れの形態で濃密ガスの連続体を通過され得る。
【００３６】
好ましくは、本発明の方法は、ＡＳＥＳプロセスを使用して行われる。用語「ｐＨ感受性の生物学的活性物質」とは、本明細書全体を通して使用される場合、生物学的活性（例えば、酵素活性、チャネル機能（例えば、イオンチャネル）、レセプターまたは結合機能、ホルモン活性もしくは神経伝達物質活性、または他の薬理学的活性）を有する任意の天然もしくは合成の物質、またはタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチドアナログもしくはペプチドミメティック、あるいは核酸またはタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドに関連した核酸であって、正常の生理学的ｐＨ範囲（例えば、６．８〜７．５）の外側のｐＨ、特に低いｐＨ（例えば、５．０未満）により不利に影響を受けるものをいう。このｐＨにより引き起こされる、生物学的活性に対する不利な影響は、例えば、この物質における分解、切断もしくはコンホメーション変化、または活性部位もしくは結合ドメインの不活性化の結果であり得る。
【００３７】
このｐＨ感受性の生物学的活性物質は、好ましくは、抗菌剤、ウイルス、抗ウイルス剤、抗真菌薬剤、抗生物質、ヌクレオチド、ＤＮＡ、アンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、酵素、ホルモン、免疫抑制剤、プロテアーゼインヒビター、血栓崩壊性抗凝固薬、中枢神経系刺激薬、うっ血除去薬、利尿血管拡張薬、抗精神病薬、神経伝達物質、鎮静薬、麻酔薬（ａｎａｅｓｔｈｅｔｉｃ）、界面活性剤、鎮痛薬、抗癌剤、抗炎症剤、抗酸化剤、抗ヒスタミン薬、ビタミン、ミネラル、ステロール、植物ステロール、脂質および脂肪酸エステルからなる群から選択される。
【００３８】
より好ましくは、このｐＨ感受性の生物学的活性基質は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチドアナログまたはペプチド模倣物から選択される。最も好ましくは、このｐＨ感受性の生物学的活性基質は、タンパク質インスリン、エリスロポエチン、カルシトニン、ＬＨＲＨ、ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｉｎ）、上皮成長因子、ＤＮａｓｅ血小板由来成長因子、インターロイキン、インターフェロン、サイトカイン、免疫グロブリンのペプチド、ＴＮＦおよび他の生物学的活性ペプチド、ＴＮＦインヒビターに基づくモノクローナル抗体、ならびにサイトカインおよびインターロイキンのインヒビターに基づく抗体から選択される。
【００３９】
第２の局面において、本発明は、本発明の方法によって作製される、ｐＨ感受性の生物学的活性基質の粒子を含有する薬学的組成物を提供する。
【００４０】
この薬学的組成物は、好ましくは、吸入送達（例えば、測定された用量の吸入器または噴霧器による送達）に適する形態である。さらに、経皮送達システム（例えば、レーザー発生皮膚チャネルまたは高圧皮膚チャネルを備える、最近のデバイス）およびより従来的な非経口投与が用いられ得る。
【００４１】
第３の局面において、本発明は、被験体の処置の方法を提供し、この方法は、本発明の方法によって作製される、ｐＨ感受性の生物学的活性基質の有効量の粒子を被験体に投与する工程を包含する。
【００４２】
好ましくは、生物学的活性基質の粒子の投与は、吸入（好ましくは、エアロゾル）によるものである。
【００４３】
第３の局面の方法は、本発明の方法によって作製されるインスリン粒子の投与による、インスリン依存性肥満症の処置であり得る。
【００４４】
第４の局面において、本発明は、「デュアルステージ（ｄｕａｌ　ｓｔａｇｅ）」プロセスにおいて分離収集容器を用いることによって、修飾因子によってその極性を変化させるように修飾された中性反溶媒（ａｎｔｉｓｏｌｖｅｎｔ）の使用によって、先行技術において可能である粒子よりも小さい粒子を提供し、特にこのプロセスにおいて、新しく形成された微粒子は、重力によって均衡が保たれている粒子を通って、反対方向に流れる濃密流体の力によって、この容器内でその大部分が懸濁され、粒子の凝集および凝塊形成を減少させる。
【００４５】
本明細書において、用語「濃密ガス」とは、臨界圧力（Ｐｃ）および臨界温度（Ｔｃ）に実質的に近いか、またはそれよりも上である流体を意味する。実際には、この流体の圧力はおそらく、（０．５−１．５）Ｐｃの範囲内であり、そしてその温度は、（０．５−１．２）Ｔｃの範囲内である。
【００４６】
この説明において用いられる場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）（またはその文法的な活用形）」は、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」と等価であり、そして、他のエレメントまたは特徴の存在を排除するとしてとられるべきではないことが、理解される。
【００４７】
本発明の方法は、その好ましい形態において、１つ以上の以下の利点を提供し得る：
１．狭い粒子サイズ分布を有する、タンパク質および他の医薬品の微小粉末を作製する能力。
【００４８】
２．水溶液を用いることによって、材料の濃厚溶液を、生物学的活性の失活の最小の危険性で処理することを可能にする能力。水溶液はまた、取り扱いがより容易であり、そしてより安価である。
【００４９】
３．好ましい反溶媒のうちの１つ（エタン）の使用は、酸性ｐＨ環境に関連する問題を克服する（エタンは中性である）。
【００５０】
４．エタノールのような有機化合物の、エタン相における修飾因子としての使用は、インスリンを含む、作製される粉末の形態学的特性を増強させるようである。いかなる特定の理論によっても束縛されないことを所望するが、この作製された粉末の形態学的特性はまた、接触の時間、粒子が互いに接触している期間、および粒子が沈殿後に互いに接触している期間における、溶液の相対濃度に依存する。これらの変動は、この方法の使用の間に調節され、結果を最適化し得る。
【００５１】
５．エタノールのような基質を、上記の３に記載されるような反溶媒に対する修飾因子として用い、さらに生物学的活性基質（この基質中において、９８〜１００％の生物学的活性が保持されている）の微粒子を作製する能力。
【００５２】
６．溶媒流かまたは修飾された反溶媒流のいずれかに、さらなる成分を導入する、タンパク質または医薬品と共沈される際の溶解速度および／またはバイオアベイラビリティーを増強する能力。
【００５３】
７．超臨界のために必要とされる温度より低い温度で材料を処理し、それによって熱分解の危険性を減少させる能力。
【００５４】
８．先行技術において特許請求された範囲よりも低い圧力で作用し、それによって処理の潜在的なコストを減少させる能力。
【００５５】
いかなる特定の理論にも束縛されることなく、水溶液のｐＨに対するＣＯ２の影響は、エタノールで修飾されたエタンを反溶媒として用いるので、排除されると思われる。この反溶媒／修飾因子の組み合わせの利用は、水溶液から沈殿したインスリンの生物学的活性を有意に分解しないことを、見出した。
【００５６】
本発明の別の局面は、沈殿器および収集器が２つの別個の容器であり、この容器において、圧密化、凝塊形成および凝集の問題に、より影響されない微粒子（狭い粒子サイズ分布を有する）が作製され得る、装置を提供する。さらに、この粒子は、先行技術の装置を用いて作製される粒子よりも微細であり、そして５μｍ未満の直径を有する粒子の質量分率は、先行技術の装置におけるそれよりも高い。不可欠なバッチ処理がまた、半連続的になされ得る。
【００５７】
収集器デバイス内で、この粒子は、濃密ガスの流れによってそれらの粒子に働く力によって懸濁され、この力は一般に、粒子の重量に等しく、そして逆方向である。従って、新しく形成される粒子は、前に形成された粒子の上端に沈降せず、それらの粒子の形状を変形し得る重量を受けず、そして次いで、より凝集しにくい。
【００５８】
さらに、このような装置の使用は、１回の実験あたりの、粒子のより高い収率および回収率、より長い実験時間で、１回の実験あたりより多くの材料を処理する能力を可能にし、これらの全ては、より効率的な処理およびより大きい生産能力を導く。
【００５９】
このような装置は、容易にスケールアップされ、より多量の材料を処理し得る。
【００６０】
本発明がより容易に理解され得るために、本発明者らは、例として、以下の非制限的な実施形態を提供する。
【００６１】
ＡＳＥＳ装置（図１０ａ、図１０ｂおよび図１１）についての構成を設計して、薬物の、作製される微粒子の割合を改良した。この薬物は、そのように収集され得、そして作製物の収率および回収率を増大させ得た。圧密化を最小化し、そして沈殿の微粒子質量（ＦＰＭ）分率を増大させるために、沈降容器と収集容器との間にフィルターを有さない、二連の沈降容器および収集容器配置を用いた。この沈殿および反溶媒は、第１容器から並流的に、そして第２容器に向流的に、通過した。図１１の実施形態は、「並行」収集容器を有し、２つの収集容器の間で交替することによって、連続的な（バッチではない）動作を可能にする。
【００６２】
本発明を例示する実施例は、上記の任意のタンパク質に対して適切であるが、所望の活性成分としてインスリンを用いて説明される。同様に、例示の目的のために、この実施例は、反溶媒としてのエタンおよび修飾因子としてのエタノールの使用を説明する。
【００６３】
（実施例）
（材料）
低内毒素ウシインスリン（２８．５ＵＳＰ単位／ｍｇの凍結乾燥粉末、ロット番号４７Ｈ０５７３）および水酸化ナトリウムを、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入し、そして、受け取った状態で用い、そして、脱イオン水に溶解させた。液体二酸化炭素および液体エタン（工業等級９９．９５％）を、ＢＯＣ　Ｇａｓｅｓから購入した。
【００６４】
（実施例１−標準ＡＳＥＳ装置）
（手順）
図１において概略的に示される、ＡＳＥＳ装置を用いた。この装置は、ノズル２に合致する沈降容器１を含む。このノズルを通して、目的の物質の溶液ならびに濃密ガスおよび修飾因子を、噴霧する。
【００６５】
目的の物質の溶液を、リザーバー３から、ポンプ４によって沈降容器に汲み入れる。濃密ガスを、静的ミキサー５に、ポンプ６によって汲み入れる。修飾因子を、リザーバー７から静的ミキサー５に、ポンプ８によって同時に汲み入れる。
【００６６】
静的ミキサーを出た後、濃密ガス／修飾因子の混合物は、冷却コイル９を通過し、そして次いで、沈降容器１に入る。この流体の流れは、沈降容器およびフィルター１０を通って続く。流速を、計測バルブ１１によって制御する。この装置を、水浴中に配置し、この水浴を、ヒーター１２によって加熱し、沈降容器の温度を制御および維持する。
【００６７】
エタンを含むエタノールの所望の混合物を、静的ミキサー５において調製する。この容器を、シリンジポンプ（ＩＳＣＯ　Ｍｏｄｅｌ　５００）６を介して二酸化炭素で最初に加圧し、２０〜１８０ｂａｒの圧力を達成して、エタン／エタノール混合物を単一相として維持する。次いで、修飾エタンを、所望の処理条件で沈降容器１内に送達し、そして、この系からＣＯ２を一掃する。ヒーター１２によって加熱された、温度制御水浴を用いて、動作温度を±０．１℃以内に制御する。
【００６８】
一旦、所望の温度および気圧（すなわち、２５℃および１５０ｂａｒ）が容器１内で達成され、そしてこの容器がエタン混合物中３０ｍｏｌ％のエタノールで満たされると、タンパク質（低内毒素ウシインスリン（２８．５ＵＳＰ単位／ｍｇの凍結乾燥粉末、ロット番号４７Ｈ０５７３、Ｓｉｇｍａから購入）を含有する水溶液を、溶媒送達ユニット（Ｗａｔｅｒｓ　ｐｕｍｐ、Ｍｏｄｅｌ　５１０）４を用いて、一定の流速でリザーバー３から汲み上げ、そしてキャピラリーノズル２（内径５０μｍ）を通してチャンバーに噴霧する。計測バルブ２１によって、ノズルを通しての圧力低下を、約５０ｂａｒに調節した。この圧力低下を調節して、この処理の効率を最適化し得る。修飾エタンを、出口に配置された計測バルブ１１で調節される一定の流速で、チャンバーを通して連続的に送り込んだ。
【００６９】
沈降の後、タンパク質中の水残渣およびエタノール残渣を、動作圧力で、修飾エタンによって洗い流した。次いで、この沈降チャンバーを、次第に減圧し、そして、特徴付けのためにこの粉末を収集した。
【００７０】
動作条件、水性フィードと反溶媒との流速比、および修飾因子モル分率を、３相平衡データを用いて最適化して、沈降容器内にエタン−エタノール−水の均一な混合物を得た。
【００７１】
反溶媒中のエタノールのモル分率を０．３に固定し、そして、反溶媒に対するフィードの体積流速比０．４／１２を、この処理に用いた。これは、この系（特に、沈降容器）において、単一の均一相を維持するように、最初に調節する。反溶媒の高い流速は、液滴からのより高速な水の抽出を生じる、チャンバーを越えての水性噴霧ミストの分散および混合を容易にした。
【００７２】
ここで、エアロゾル薬物送達システムに適する均一な粒子サイズを有する、微小化されたタンパク質粒子が、室温で１つの工程において、水溶液から作製され得る。
【００７３】
記載される実施形態において、毒性の化学薬品は用いなかった。本発明者らは、最終作製物中の残渣エタノール含有量が１０ｐｐｍ未満であることを見出している。
【００７４】
本発明の、小さな粒状材料は、経口の制御または持続された放出を提供するためか、あるいは吸入投与または経皮投与および従来の様式のために処方される、薬学的調製物の調製において、特に有用である。
【００７５】
（実施例２−修正されたＡＳＥＳ装置）
（手順）
通常の、および修正されたＡＳＥＳ装置の概略図を、それぞれ図９ａ、９ｂ、１０ａ、１０ｂおよび１１に示す。この設定の主な部分は、先に記載した装置（図１）の中で、沈殿物を分離しそして回収するために、底部にフィルターのついた１つの容器のみからなる、高圧容器である。修正された設計（図１０ａおよび１０ｂ）では、第２の高圧力容器（粒子収集容器）を追加し、これらの２つの容器の間にフィルターはなく、このフィルターは、粒子収集容器の下流にある。
【００７６】
図１０ａおよび１０ｂに図示された、修正されたＡＳＥＳ装置を参照すると、この装置は、ノズル２を装着する沈殿容器１を含む。このノズルを通して、目的の物質の溶液および濃密な気体および修飾因子を噴霧する。
【００７７】
この目的の物質の溶液を、ポンプ４によって貯蔵器３から沈殿容器に供給する。この濃密な気体を、ポンプ６によって静置攪拌機５に供給する。この修飾因子を、ポンプ８によってその貯蔵器７から静置攪拌機５へ同時に供給する。
【００７８】
この静置攪拌機を離れる際、濃密な気体／修飾因子混合物を、冷却コイル９に通して通過させ、そして次いで沈殿容器１の中へ入れる。この流体の流れを、沈殿容器に通して継続し、次いで収集容器１４の中へ入れる。この流体の流れを、次いで、フィルター１０に通して通過させる。流速を、計量弁１１により制御する。一旦この弁に通して通過させると、この流体の流れを、低温で、冷トラップまたはセパレーター１３に通して通過させ、濃密な気体から溶媒および修飾因子を分離する。この濃密な気体を、次いでこの系に通して再利用し得る。この装置を水浴中に設置し、これをヒーター１２で加熱し、沈殿容器の温度を制御し、そして維持する。
【００７９】
図１１は、２つの粒子収集容器を組み込む修正された設計を示す。この装置は、図１０ａおよび１０ｂに記載されたように作動するが、一旦第１の粒子収集容器がいっぱいに満たされると、濃密ガスの流れ（形成された粒子を含む）は、第２の粒子収集容器へと方向転換し得る。第１の粒子収集容器からの粒子の除去は、装置、特に沈殿容器がまだ作動中の間にもたらされ得る。一旦、第２の粒子収集容器がいっぱいに満たされると、濃密な気体の流れ（沈殿した粒子を含む）は、第３の粒子収集容器へ方向転換し得るか、またはこのときまでに浄化されている第１の粒子収集容器に戻り得る。このように、この装置は継続した様式で作動し得る。
【００８０】
研究室スケールにおいて、ビューセル（ｖｉｅｗ　ｃｅｌｌ）（例えば、Ｊｅｒｇｕｓｏｎ視野ゲージの１３−Ｒ−３２モデルのような）を、沈殿段階の視覚的観察のための沈殿容器として利用し得る。同軸のノズルを、溶液および反溶媒を噴霧するために、容器に連結させる。毛細管チューブ（ＳＧＥ、ＰＥＥＫチューブ長さ２００ｍｍ、内径５０μｍ、および外径１．５９ｍｍ）からなるこのノズルを、ステンレス鋼チューブ（Ａｌｌｔｅｃｈ、内径２．１６ｍｍ、および外径３．１８ｍｍ）に挿入する。このシステムの３つのポンプは、タンパク質溶液（Ｗａｔｅｒｓモデル５１０）、エタノール（Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ、シリーズ１０５０）および反溶媒（例えば、エタンおよびＣＯ２（ＩＳＣＯシリンジポンプ５００Ｄ））の送達のためにある。この反溶媒を、静置攪拌機（ＫＯＦＬＯ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて、エタノールとインラインで混合した。この混合物の組成を、各々のポンプの流速により調整した。この反溶媒の流速を出口の計量弁により制御した。このエタノール／水／反溶媒混合物を、このプロセスを操作する圧力および温度で、均一な相に維持した。二酸化炭素／エタノール混合物を、予熱コイルに通して通過させ、系の温度に到達させた。この高圧容器を、恒温ヒーター（Ｔｈｅｒｍｏｌｉｎｅ　Ｕｎｉｓｔａｔ　ヒーター／循環器）からなる水浴中に入れて、温度を制御した。
【００８１】
この系の圧力を、Ｄｒｕｃｋ圧力指示器につなげたＤｒｕｃｋ圧力変換器（Ｍｏｄｅｌ　ＰＤＣＲ　９１１）でモニターした。計量弁の後に、この反溶媒および溶媒を分離し、そしてこの溶媒を容器中で回収した。高圧容器の後に、このフィルターを設置して、このライン内に残存しているすべての微細な粉末を回収した。
【００８２】
（粒子の調製）
この粒子の調製を、図１０ｂ（上記で述べた）に示されたこの装置を用いておこなった。所望されるエタンとエタノールの混合物を、静置攪拌機５中で調製する。この容器を、はじめに、シリンジポンプ（ＩＳＣＯ　Ｍｏｄｅｌ　５００）６を経て、二酸化炭素で加圧し（これは装置の滅菌を補助する）、２０〜１８０バールの圧力に到達させ、単相としてエタン／エタノール混合物を維持する。この修飾されたエタンは、次いで所望のプロセス条件で沈殿容器１に送達し、そしてＣＯ２をこの系から除去した。この操作温度を、ヒーター１２により加温される、温度を制御された水浴を利用して±０．１℃以内に制御する。
【００８３】
ＡＳＥＳプロセスによる微紛化を、最初に水浴中に高圧容器を配置し、この系の温度を調整することによりおこなった。系が、このプロセスの温度に接近した後、系の圧力を、頂部から容器へ反溶媒を添加することにより調整した。次いで、この反溶媒の流速を、出口の計量弁により調整した。所望の量のエタノールを、次いで、各々のラインの流速を制御することにより、この系に添加した。この反溶媒としてＣＯ２を用いる際、ＣＯ２−２０ｍｏｌ％エタノール混合物を到達させるために、エタノールおよびＣＯ２を、それぞれ３．４ｍＬ／分および１５ｍＬ／分の流速で、静置攪拌機に通して通過させた。この反溶媒としてエタンを用いる際、エタン−３０ｍｏｌ％エタノール混合物を、エタンおよびエタノールについて、それぞれ１５ｍＬ／分および２．４ｍＬ／分の流速を用いて調製した。
【００８４】
この系が定常状態に近づいた後、インスリン溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）０．１ｍＬ／分を、ノズル内部に通して噴霧した。この溶液は、反溶媒の高流速に起因して分散した。水の抽出を、エタノールによる液滴から促進させ、そして微細なインスリン粒子を形成させた。この溶液の噴霧後、操作する圧力および温度で、容器体積の５倍当量のエタンを収集容器に通すことにより、エタノールおよび水残渣を、沈殿物から除去した。少量のエタンはまた、ノズルを通して除去し、すべての残存する溶液を除去した。一旦出口の計量弁を調節すると、沈殿が開始し、その結果、粒子収集容器中で、上方に流れる濃密ガスにより、粒子に働く力が、粒子の重量によって（重力によって）釣り合いをとられ、その結果、粒子は、事実上収集容器内で懸濁され、密集しない。他の類似した配置が企図され得る（例えば、収集容器を通して流れる濃密ガスの力と逆の力を発生させるために、軸の周りを回転する収集容器）。次いで、この容器を加圧し、そしてこの生成物を両容器から回収し、気密な容器に封入し、そして特性解析のために、冷凍庫（−１８℃）に貯蔵する。
【００８５】
エタン／３０ｍｏｌ％エタノールを使用して水溶液から沈殿したインスリン粒子の特性に対する、この装置の設計の効果を、２５℃および１５５バールで試験した。このことをさらに下記で述べる。
【００８６】
（実施例３）
エタン／エタノールを用いたインスリンの処理は、モノマー含量のインビトロ試験により示される場合、生物的活性の保持を提供することが実証された。ＣＯ２−エタノールで処理されたインスリンは、この観点において有意な非活性化を受けた。単一段階のプロセス（実施例１および図１に図示した）において、ＣＯ２−エタノールおよびエタン−エタノールで処理された物質の粒子の特性は、表１に示されるように、類似している。
【００８７】
【表１】
2004513974.tif 000002
二重段階のプロセス（実施例２および図１０ａ、１０ｂおよび１１に図示した）において、ＣＯ２−エタノール系における微細な粒子の質量は、単一の段階のプロセスで得られた粒子質量と類似している。このパラメーターの劇的な増加を、エタン−エタノールで処理された物質について得た。
【００８８】
Ｄ（０．５，Ｖ）のいくらかの減少が、２段階ＣＯ２−エタノール処理方法でおこるが、この物質の２１．９％のみが分散され得、空気力学的直径５μｍ未満の物質を生成する。２段階エタン−エタノールプロセスを用いて得られたこの物質は、表２に示されるように、劇的に減少したＤ（０．５，Ｖ）を有し、空気力学直径５μｍ未満の物質量の、１００％増加と一致する。
【００８９】
【表２】
2004513974.tif 000003
（実施例４−実施例２からのインスリン粒子の回収）
別の比較方法として、図９ｂに示された装置を用いて、インスリンを、単一段階装置でナノサイズの粒子として沈殿させ、そのほとんどは５０〜５００ｎｍの範囲の大きさであった。粒子サイズ分布研究では、粒子が凝集し、ミクロンサイズの粒子を形成することを示した。沈殿した微紛化粉末の微細な粒子質量は、２０％のみだった。この粒子を、容器の底部におけるフィルターアセンブリ上で回収した。反溶媒の高圧および高流速に一部起因し、この粉末は密集し、そして分散が困難であった。この凝集しなかった微細な粒子を、フィルターを通して通過することで、この系から洗浄され、それゆえに収率は低かった（４０％）。
【００９０】
インスリンを、図１０ｂに示された装置を用いて、５０〜５００ｎｍの大きさに及ぶナノサイズの粒子として沈殿させた。修正されたＡＳＥＳ装置により処理された、インスリンの微細な粒子質量は、４５％に増大した。第１の容器の底部におけるフィルターを除去し、あまり密集していない沈殿物を生成した。この沈殿物は、沈殿容器から下方に移動し、そして、途中まで、収集容器を通して上方に運ばれ、ここで、粒子の重力が、反溶媒（濃密な流体）流動方向とは逆の流れで、粒子に作用し、容器中で粒子を懸濁させる。これは粒子の密集を最小限にする。第２（すなわち、粒子回収）容器の追加により、微細な粒子質量の改良された回収および収率９０％への増加が可能となった。図４は、単一のチャンバーおよび二重のチャンバーの装置における、インスリン粉末の空気力学的粒子サイズ分布を示す。
【００９１】
（実施例５−インスリン粉末の特性解析）
（インスリン粉末の生化学的完全性）
粒子形成プロセスの後、インスリンの生物学的活性が維持されたかどうか決定するために、インスリン粉末の生化学的完全性を、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて評価した。タンパク質−Ｐａｋ１２５カラム（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）をインスリンに用いた。この移動相は、３００ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３）からなった。
【００９２】
この粉末サンプルを溶解し、１０分間ゆっくりと攪拌して完全に溶解させることによって、脱イオン水中の１ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。この上清液を０．４５ｍｍ膜フィルターに通して濾過し、そして次いでＨＰＬＣカラムに注入した。
【００９３】
モノマーおよび可溶凝集体の割合を、このサンプル中のモノマーおよび高分子量可溶種の両方のピーク面積と標準濃度１ｍｇ／ｍＬのピーク面積との比較により決定した。不溶凝集体の割合を、このサンプルとタンパク質標準溶液との合計のピーク面積による相違から評価した。モノマー含量の定量化に、ソフトウェアＭｉｌｌｅｎｎｉｕｍ３．５を用いた。インスリンのＨＰＬＣスペクトルを図６に示す。このサンプルのモノマー含量は、９９．５％であり、従って、供されたインビトロ測定結果は、生物学的活性の維持が、ほとんど完全であったことを提示する。
【００９４】
（インスリン脱アミド試験）
このプロセスにより脱アミド化したインスリンの、割合を決定するため、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて、インスリンの試験をおこなった。逆相カラム（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ（登録商標）Ｃ１８、５μｍパック、４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を用いて、非脱アミド化インスリンから脱アミドインスリンを分離した。０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル２６％〜３３％溶出液（流速１ｍＬ／分）の濃度勾配方法を用いた。この吸光度を２８０ｎｍでモニターした。
【００９５】
脱アミドインスリンの割合を、分解生成物のピーク面積と標準インスリン（同濃度のインスリンを含む（２ｍｇ／ｍＬ））の面積を比較することにより決定した。
【００９６】
インスリンおよび脱アミドインスリンの分離のためのＨＰＬＣクロマトグラムを、図７に示す。脱アミドインスリンの割合は、ＨＰＬＣクロマトグラムが３．０であると決定し、従って、沈殿による粒子化後の、分子の生物学的活性および分子の化学的完全性の維持におけるインビトロのさらなる証拠を提供した。
【００９７】
（粒子サイズおよび形態）
ＳＥＭ像（図８）により、インスリンは、２００ｎｍ〜５００ｎｍの大きさにおよぶナノサイズの粒子として沈殿することを示した。これらの微細なインスリン粒子は、分子間の分子間相互作用に起因して凝集し得、より大きな粒子を形成する。レーザ回折研究による粒子の分析により、インスリン粉末は、塊状であり、５μｍ（５０００ｎｍ）の粒子サイズの中央値を有することを示した。
【００９８】
（インパクションによるエアロゾル特性解析）
このタンパク質粒子のエアロゾル性能を決定するために、５ステージＭａｒｐｌｅ−Ｍｉｌｌｅｒ　Ｉｍｐａｃｔｏｒ（Ｍｏｄｅｌ　１６０、ＭＳＰ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＳＡ）を用いて（カットオフ直径は１０．０μｍ、５．０μｍ、２．５μｍ、１．２５μｍ、および０．６２５μｍ）、インビトロでの粒子の試験を評価した。Ｍａｒｐｌｅ−Ｍｉｌｌｅｒ　ｉｍｐａｃｔｏｒは、ステンレス鋼製の入口のど部、５つのインパクションステージおよび一体的なフィルターステージからなる。これらのステージを、先にプロピレングルリコール／メタノール（５０：５０）で被覆して粒子が弾まないようにし、このように、より低いステージに、粗い粒子が持ち越される可能性を最小限にする。
【００９９】
１０〜２０ｍｇの質量のインスリンを、ゼラチンカプセル（大きさ３、Ｐａｒｋ　Ｄａｖｉｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の中に計量して入れ、そして減圧源（ＥＲＷＥＫＡ　ＧＭＢＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、６０Ｌ／分にて粉末吸入装置（Ｄｉｎｋｉｈａｌｅｒ（Ａｖｅｎｔｉｓ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ））により、Ｍａｒｐｌｅ　Ｍｉｌｌｅｒ　Ｉｍｐａｃｔｏｒの中に瞬時に分散させた。
【０１００】
各々のステージで回収したタンパク質の画分を、インスリンの標準１％溶液の吸光度に対する、タンパク質溶液の吸光度を測定することにより計算した。インスリンにおけるアッセイ方法の結果（１％溶液の相対的なＵＶ吸収の測定値）および標準曲線を表３に示す。
【０１０１】
【表３】
2004513974.tif 000004
ナノサイズ粒子として沈殿したインスリンはまた凝集し、ミクロンサイズの粒子となった。中央値粒子サイズ（レーザー回折より決定した）は約５μｍ、および微細な粒子画分（５μｍ未満のものの％）は、図８に示されたように、少なくとも４２％であった（これをＭａｒｐｌｅ　Ｍｉｌｌｅｒ　Ｉｍｐａｃｔｏｒにより決定した）。この得られた微細な粒子質量（ＦＰＭ）は、文献で報告された値と比較して有意に大きい。他の方法で得られたインスリンにおけるＦＰＭの最大値は、１０％であった。
【０１０２】
（反溶媒としてエタノール／ＣＯ２を用いたインスリン粒子の調製）
最後に、比較として、反溶媒として、低エンドトキシンウシインスリンおよび２０ｍｏｌ％エタノール（ＣＯ２中）を含む水溶媒を用いて、実施例２のように実験をおこなった。生成されたインスリン粉末の空気力学的粒子サイズ分布を図４に示す。反溶媒として、エタン／エタノール混合物を用いて生成した、１０μｍより大きい粒子画分は約４５％であり、これは、反溶媒として二酸化炭素を用いて生成した１０μｍより大きいサイズの粒子の画分より非常に低いことがわかり得る。よって、１０μｍ未満のサイズの粒子の画分は、二酸化炭素による実験よりも、エタノール／エタン実験の場合において、同様に高い割合である。
【０１０３】
本明細書において開示され、そして定義された本発明は、本文もしくは図面で述べられ、または明白である、２つ以上の個々の特徴すべての代替的な組み合わせに拡張することが理解される。これらすべての異なる組み合わせは、本発明の種々の代替的な局面を構築する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明のプロセスにおいて用いられ得る、装置の実施形態の概略図である。
【図２】
図２は、インスリンの走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）の画像を示す。図２（ａ）は、凍結乾燥されたインスリンの画像であり、ここで粒子は、プレート様の形態を有する。図２（ｂ）は、４５℃および１５５ｂａｒで本発明の方法を用いて作製された、球状のインスリン粒子を示す。
【図３】
図３は、反溶媒として（ａ）エタノールで修飾した二酸化炭素；および（ｂ）エタノールで修飾したエタンを用いて、２５℃および１５５ｂａｒで作製されたインスリンのＳＥＭ画像を示す。
【図４】
図４は、二酸化炭素中の２０モル％エタノールおよびエタン中の３０ｍｏｌ％エタノールを用いて、２５℃および１５０ｂａｒで沈殿させた、インスリン粒子の流体力学的サイズ分布を比較するグラフを示す。
【図５】
図５は、インスリンモノマーのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図６】
図６は、インスリンおよび脱アミド化インスリンの分離に対するＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図７】
図７は、インスリン粒子のＳＥＭを示す。
【図８】
図８は、インスリン粉末の流体力学的サイズ分布を表すグラフを示す。
【図９ａ】
図９ａは、沈降容器（これは、容器の底部に、粒子が容器の外に運ばれることを防止するためのフィルターを有する）を備える、通常の生産規模のＡＳＥＳ装置の概略図を示す。
【図９ｂ】
図９ｂは、図１ａに表した装置の、研究室規模のバージョンを示す。
【図１０ａ】
図１０ａ（生産規模）および図１０ｂ（研究室規模）は、別個の粒子収集容器を有する、本発明の別の実施形態（これはまた、「デュアルステージ」装置とも呼ばれる）を図示する。
【図１０ｂ】
図１０ａ（生産規模）および図１０ｂ（研究室規模）は、別個の粒子収集容器を有する、本発明の別の実施形態（これはまた、「デュアルステージ」装置とも呼ばれる）を図示する。
【図１１】
図１１は、本発明の別の実施形態（１つより多い粒子収集容器を有する装置）を描写する。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年7月31日(2002.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質の微粒子を形成する方法であって、該方法は、該物質を含有する非ガス状流体を、該流体を膨張させるための濃密ガスと接触させる工程を包含し、該濃密ガスが、（ａ）反溶媒および（ｂ）該反溶媒の極性を改変する改変剤を含む、方法。
【請求項２】
前記反溶媒が、非ガス状流体のｐＨを有意に変化させない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物質が、ｐＨ感受性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記物質が、生物学的に活性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記改変剤が、前記反溶媒の極性を改変し、かつ前記非ガス状流体に対して抽出剤として作用する、方法。
【請求項６】
前記非ガス状流体が、水溶液である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記反溶媒が、Ｃ１−４アルカンガス、Ｃ２−４アルケンガス、Ｃ２−４アルキンガス、冷媒Ｒ１３４ａ、またはこれらの２種以上からなる群から選択される、方法。
【請求項８】
前記反溶媒が、アルカンガスである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記反溶媒がエタンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、前記改変剤が、Ｃ１−６アルカノール、Ｃ１−６チオールおよびＣ１−６アミンからなる群から選択される、方法。
【請求項１１】
前記改変剤が、エタノールである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法であって、ここで、十分な改変剤が、実質的に全ての非ガス状流体を抽出するのに使用され、前記物質の沈殿を促進する、方法。
【請求項１３】
前記反溶媒および改変剤が、単一の相として維持される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記物質を含有する前記非ガス状流体と前記濃密ガスが、単一の相として維持される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３または１４に記載の方法であって、前記単一の相は、前記濃密ガスの温度および圧力を調整すること、および前記流体の膨張前に各々の流体の相対的な流速を制御することのいずれかまたは両方によって維持される、方法。
【請求項１６】
前記濃密ガスが、５℃〜４５℃の間であり、そして５〜２００ｂａｒの間の圧力である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法であって、前記物質が、タンパク質、核酸、リポソーム、脂質（リン脂質を含む）、水溶性ポリマー、制御送達コーティング、界面活性剤および植物ステロール（天然もしくは合成）からなる群から選択される、方法。
【請求項１８】
前記形成された粒子の約５０％が、直径６２５〜１０，０００ナノメートルの間である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記形成された粒子の５０％より多くが、直径１０，０００ナノメートル未満である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記形成された粒子の５０％より多くが、６，５００ナノメートルより小さい、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、前記反溶媒および改変剤が、前記非ガス状流体と接触される前に合わせられる、方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法であって、前記非ガス状流体中の前記物質の濃度が、前記非ガス状流体／物質と前記反溶媒／改変剤との間に単一の相を維持するように調整される、方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法によって形成される、物質の微粒子。
【請求項２４】
前記粒子が、主として生物学的に活性なインスリンを含有する、請求項２３に記載の微粒子。
【請求項２５】
前記粒子の少なくとも５０％が、直径１０，０００ナノメートル未満である、請求項２４に記載の微粒子。
【請求項２６】
全てが直径６５００ｎｍ未満である、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の微粒子。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法によって生産される微粒子の形態である、ｐＨ感受性の生物学的活性物質。
【請求項２８】
有効量の，請求項１〜２７のいずれか１項によって生産される物質の微粒子を被験体に投与する工程を包含する、被験体を処置する方法。
【請求項２９】
前記粒子が、ｐＨ感受性の生物学的活性物質である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記物質の投与が、吸入である、請求項２８または２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
投与が、経皮適用、経口、徐放または持続性放出である、請求項２８および２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
インスリン依存性糖尿病が、インスリン粒子の投与によって処置される、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法であって、前記微粒子が、該粒子が形成される第１の容器から濃密ガスと共に第２の収集容器に流れ、該第２の容器から該粒子が収集される、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記第２の収集容器は、入口および入り口上部に配置された出口を有し、ここで、前記微粒子および濃密流体は、該入口を通過し、そして出口を通る濃密流体の流れを、該第２の収集容器から収集され得る微粒子の比率を最大限にするように調節する、方法。
【請求項３５】
有効量の薬学的組成物の被験体への投与によって被験体を処置するための薬学的組成物の製造における、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法により形成される微粒子または請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の微粒子の使用。
【請求項３６】
前記粒子が、ｐＨ感受性の生物学的活性物質である、請求項３５に記載の微粒子の使用。
【請求項３７】
微粒子を形成する方法であって、該微粒子の各々が、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の微粒子と実施的に同様の形状およびサイズである、方法。
【国際調査報告】
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