(57)【要約】異種抗体を含む血漿からなるバイオアッセイ試薬が提供される。詳細には、開示されるバイオアッセイ試薬は、第１の動物種由来の血漿および第１の動物種に固有の抗原を認識する少なくとも１つの第２の異なる動物種に由来する抗体を含む。より詳細には、自己免疫疾患を有する患者（詳細には、血液中に存在する抗血液因子抗体（阻害因子）を有する血友病者）を処置することが意図される治療剤の効力を評価するためのバイオアッセイが提供される。開示されるバイオアッセイ試薬を作製および使用するための関連する方法もまた提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の動物種由来の血漿および少なくとも１つの第２の動物種由来の抗体を含む、異種抗体を含む血漿であって、ここで、該抗体が該第１の動物種に固有の抗原を認識する、異種抗体を含む血漿。
【請求項２】
前記抗原が、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、アミノ酸、糖タンパク質、炭水化物、および核酸からなる群より選択される、請求項１に記載の異種抗体を含む血漿。
【請求項３】
前記第１の動物種が、偶蹄目、奇蹄目、げっ歯目、ウサギ目および霊長目からなる群より選択される動物目のメンバーである、請求項１に記載の異種抗体を含む血漿。
【請求項４】
前記少なくとも１つの第２の動物種が、偶蹄目、奇蹄目、げっ歯目、ウサギ目および霊長目からなる群より選択される動物目のメンバーであり、但し、該第２の動物種が前記第１の動物種と異なる、請求項１に記載の異種抗体を含む血漿。
【請求項５】
前記第１の動物種がＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎである、請求項３に記載の異種抗体を含む血漿。
【請求項６】
前記第２の動物種がＣａｐｒａ属に由来する、請求項４に記載の異種抗体を含む血漿。
【請求項７】
前記Ｃａｐｒａ属の種が、ａｅｇａｇｒｕｓ、ｉｂｅｘ、ｐｙｒｅｎａｉｃａ、ｃｙｌｉｎｄｒｉｃｏｒｎｉｓ、ｈｉｒｃｕｓ、およびｆａｌｃｏｎｅｒｉからなる群より選択される、請求項６に記載の異種抗体を含む血漿。
【請求項８】
前記抗原が血液凝固因子である、請求項１に記載の異種抗体を含む血漿。
【請求項９】
前記血液凝固因子が、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子およびフォン・ビルブラント因子からなる群より選択される、請求項８に記載の異種抗体を含む血漿。
【請求項１０】
以下：
第１の動物種由来の血漿；および
該第１の動物種に固有の抗原を認識する、少なくとも１つの第２の動物種に由来する抗体、
を包含する、バイオアッセイ試薬。
【請求項１１】
前記抗原が、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、アミノ酸、糖タンパク質、炭水化物、および核酸からなる群より選択される、請求項１０に記載のバイオアッセイ試薬。
【請求項１２】
前記抗原が血液凝固因子である、請求項１０に記載のバイオアッセイ試薬。
【請求項１３】
前記血液凝固因子が、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子およびフォン・ビルブラント因子からなる群より選択される、請求項１２に記載のバイオアッセイ試薬。
【請求項１４】
前記第１の動物種が、偶蹄目、奇蹄目、げっ歯目、ウサギ目および霊長目からなる群より選択される動物目から選択される、請求項１０に記載のバイオアッセイ試薬。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの第２の動物種が、偶蹄目、奇蹄目、げっ歯目、ウサギ目および霊長目からなる群より選択される動物目のメンバーであり、但し、該第２の動物種が前記第１の動物種と異なる、請求項１０に記載のバイオアッセイ試薬。
【請求項１６】
前記第１の動物種がＨｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎである、請求項１４に記載の異種抗体を含む血漿。
【請求項１７】
前記第２の動物種がＣａｐｒａ属に由来する、請求項１５に記載の異種抗体を含む血漿。
【請求項１８】
前記Ｃａｐｒａ属の種が、ａｅｇａｇｒｕｓ、ｉｂｅｘ、ｐｙｒｅｎａｉｃａ、ｃｙｌｉｎｄｒｉｃｏｒｎｉｓ、ｈｉｒｃｕｓ、およびｆａｌｃｏｎｅｒｉからなる群より選択される、請求項１７に記載の異種抗体を含む血漿。
【請求項１９】
自己抗体疾患治療剤の効力を評価するためのインビトロ方法であって、該方法は、以下：
該自己抗体疾患治療剤を、異種抗体を含む血漿と混合して、混合物を形成する工程；および
該自己抗体疾患治療剤の、該異種抗体を含む血漿に対する効果を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項２０】
前記自己抗体疾患治療剤が、抗血液凝固因子抗体治療剤である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出工程が、血液凝固アッセイである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
自己抗体疾患治療剤の効力を評価するためのインビトロバイオアッセイキットであって、該キットは、以下：
第１の動物種に固有の抗原を認識する、少なくとも１つの第２の動物種に由来する抗体と混合される、該第１の動物種の血漿に由来する第１の試薬；および
該第１の試薬の該自己抗体疾患治療剤に対する効果を検出する第２の試薬、
を備える、インビトロバイオアッセイキット。
【請求項２３】
前記第２の試薬が血液凝固時間を検出する、請求項２２に記載のインビトロバイオアッセイキット。
【請求項２４】
前記効果を測定するのに適切な分析基準をさらに備える、請求項２２に記載のインビトロバイオアッセイキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、２番目の動物種由来の抗体（異種抗体）を含む、１番目の動物種由来の血漿を提供する。具体的には、本発明は、生物学的アッセイ（バイオアッセイ）試薬として有用な、異種抗体を含む血漿を提供する。より具体的には、本発明は、バイオアッセイ試薬、試薬を作成する方法、および自己免疫および血液学的障害を治療するのに使用する化合物の、生物学的活性を決定する目的のアッセイにおいて試薬を使用する方法を提供する。
【０００２】
（発明の背景）
最もよくある血液学的障害の１つは、血友病である。血友病は、凝固因子の欠損によって起こる血液凝固（止血）障害によって特徴付けられる疾患である。止血は、多数の多様な酵素、補助因子、高分子および細胞シグナル伝達化合物が関与する複雑な生物学的過程である。血友病は遺伝性または獲得性であり得、そしていずれも重症度において異なる。遺伝性血友病は、通常１つの止血成分または経路のみが関与するが、獲得性血友病は一般的に、複数の止血経路が関与する。
【０００３】
一般的に、血友病はドナー血漿由来または組換えＤＮＡ技術による凝固因子の濃縮製剤を用いて治療される。最も頻繁に使用される置換凝固因子は、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子を含む。置換凝固因子濃縮製剤を用いた血友病治療の最も重大な副作用の１つは、１つまたはそれ以上のこれら凝固因子に対する阻害抗体の発現である。一般的に、凝固因子レシピエントによる阻害抗体の発現は、まれな出来事である。血友病Ｂ（クリスマス病）において、１％以下の患者が阻害抗体を発現する。しかし、いくつかの報告は全ての血友病Ａ患者の４５％が、いくらかの阻害抗体を有すると推定している。さらに、阻害因子は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を含む様々な自己免疫疾患と関連し得る。しかし、ＳＬＥ患者で見出される阻害因子は、特定の凝固因子に対するものではなく、むしろ多くの凝固経路反応を非特異的に阻害する抗リン脂質抗体である。
【０００４】
一般的に、レシピエントの免疫系が、置換凝固因子に対して、それがウイルスのような外来性物質（抗原）であるかのように反応する場合に、阻害抗体が形成する。抗原に反応して、置換凝固因子と反応および中和化する抗体が形成される。特定の凝固因子に対して阻害抗体を発現した血友病患者は、もはやこれらの置換凝固濃縮製剤を含む調製物を用いて有効に治療できない。従って、阻害抗体を有する患者に対する治療の開発に、かなりの努力が注がれてきた。
【０００５】
阻害抗体陽性患者における出血の発現を治療するために、最も成功した血液凝固欠損治療の１つは、Ｆａｃｔｏｒ　Ｅｉｇｈｔ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　Ｂｙｐａｓｓｉｎｇ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＦＥＩＢＡ）である。ＦＥＩＢＡは、プールしたヒト血漿から作成され、そして第ＩＩ因子、活性化第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子を含む。ＦＥＩＢＡは、血液凝固カスケードの異なる点で同時に作用することによって、第ＶＩＩＩおよび第ＩＸ因子の必要性を回避する（血友病Ａ患者は第ＶＩＩＩ因子阻害剤を有していることが多く、一方血友病Ｂ患者は第ＩＸ因子阻害剤を有していることが多い）。
【０００６】
全ての生物学的試薬および治療剤を、そのインビトロでの診断的、またはインビボでの治療的使用の前に、厳しく評価しなければならない。過去には、抗阻害血液凝固治療剤は、ヒト血友病に類似した遺伝的欠損を示す血友病イヌ、またはこのような動物に血液凝固因子抗体を投与することによって一過性血友病が確立した動物のような実験動物を用いてインビボで評価されてきた。しかし、血友病の副作用のために、これらの動物モデルは確立および維持するのが困難である。さらに、動物モデルはヒト血友病を完全にシミュレートするわけではなく、そして／または一過性血友病状態の正常化による偏った結果を示し得る。ヒト血液凝固障害の成功した動物モデルの例が、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ　８２（１９８８）、２０６−２１１、ＷＯ９５／０１５７０およびＡＴ　４０４　４２９　Ｂに記載されている。従って、非ヒト動物試験系は、抗凝固因子阻害抗体治療の治療的効果を評価するために決して理想的ではないことが証明された。
【０００７】
適当な標準がインビボで確立され、そして適当な感受性および特異性を有する十分な一貫した試験試薬が入手可能ならば、血液凝固欠損治療剤の効力を、インビトロで正確に評価し得る。現在のインビトロ試験試薬は、一般的に特定の血液凝固障害を示す患者の血清または血漿（本明細書中で以後集合的に血漿と呼ぶ）由来である。このような血漿は、特に阻害抗体を有する患者由来の試料はまれである。従って、ヒト血漿由来の標準化試験試薬は、一貫して提供するのが非常に困難である。
【０００８】
さらに、血友病患者由来のドナー血漿において、血液によって運ばれる病原体の混入が普通である。多くの血友病患者は、プールしたヒト血漿由来の血液因子濃縮製剤を何十年も使用している。結果として、彼らは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトリンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ　Ｉ）、ヒトリンパ球向性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ　ＩＩ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、および他の潜在的な同定されていないウイルスおよび／または非ウイルス性病原体が混入した製品に曝露されたかもしれない。従って、血液凝固欠損、特に阻害抗体障害を有するヒト血漿は希少であるだけでなく、利用可能な供給源はまた、感染性の病原体で汚染されていることが多い。結果として、血液凝固障害、自己免疫疾患を治療する目的の治療薬剤、および特に抗凝固因子阻害抗体治療剤をインビトロで試験するのに適当な、一定した、十分に特徴付けられた、非感染性のヒト血漿の必要性が存在する。
【０００９】
（発明の概要）
従って、治療薬剤の効力を決定するインビトロバイオアッセイ試薬を提供することが、本発明の目的である。
【００１０】
自己免疫疾患治療剤を試験するのに有用な、インビトロバイオアッセイ試薬、インビトロ試験方法およびキットを提供することが、本発明の別の目的である。
【００１１】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトリンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ　Ｉ）、ヒトリンパ球向性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ　ＩＩ）、Ｂ型肝炎ウイルス、およびＣ型肝炎ウイルスのような、血液によって運ばれる感染性病原体に対する曝露の危険性を排除する、ヒト血漿を含むインビトロバイオアッセイ試薬を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【００１２】
抗血液凝固因子抗体（阻害抗体）を有する血友病患者を治療するために使用する治療剤のインビトロ試験に適当な、抗血液凝固因子抗体を含む血漿を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１３】
より広い意味において、本発明は、１つの動物の血漿を、少なくとも１つの別の異なる動物由来の抗体と混合することによって作成したバイオアッセイ試薬である（異種抗体を含む血漿）。異種抗体は、血漿供給源として使用した動物（１番目の動物種）に固有の抗原を認識する。正常な、健康な動物の免疫系は、一般的に固有の抗原を認識せず、結果として、本発明の異種抗体を産生するために、これらの抗原を２番目の動物種に接種しなければならない。本発明の異種抗体によって認識される適当な抗原は、脂質、リン脂質、糖脂質、タンパク質、アミノ酸、糖タンパク質、炭水化物、および核酸を含むがこれに限らない。本発明の１つの実施態様において、異種抗体によって認識される抗原は、第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、およびフォン・ビルブラント因子を含むがこれに限らない、血液凝固因子抗原である。
【００１４】
あらゆる動物種を血漿供給源として使用し得る。一般的に、血漿供給源は、本発明が試験しようとしている治療剤を用いて治療される動物由来である。例えば、本発明の１つの実施態様において、バイオアッセイはヒト自己免疫疾患を治療するために使用される治療剤の効力を試験する目的であり、従って、ヒト（１番目の動物、霊長類目）が最適な血漿供給源である。他の適当な動物目は、偶蹄目、奇蹄目、げっ歯目、およびウサギ目を含むがこれに限らない。
【００１５】
異種抗体は、上記で簡単に説明した理由のために、２番目の動物種で産生される。適当な２番目の動物目は、２番目の動物種が１番目の動物種と異なり、そして２番目の動物が投与された抗原を免疫学的に認識するならば、偶蹄目、奇蹄目、げっ歯目、ウサギ目、および霊長類目を含むがこれに限らない。本発明の１つの実施態様において、ヤギ（偶蹄目、Ｃａｐｒａ種）を使用して、本発明の異種抗体を産生する。適当なＣａｐｒａ種は、ａｅｇａｇｒｕｓ、ｉｂｅｘ、ｐｙｒｅｎａｉｃａ、ｃｙｌｉｎｄｒｉｃｏｒｎｉｓ、ｈｉｒｃｕｓ、およびｆａｌｃｏｎｅｒｉを含むがこれに限らない。
【００１６】
従って、本発明は、少なくとも１つの他の動物種由来の抗体（異種抗体）を含む、１番目の動物種の血漿を含むバイオアッセイ試薬に関する。これらの異種抗体は、血漿成分が由来する種に固有の抗原に対して指向される。本発明の１つの実施態様において、血漿成分に存在する自己免疫抗体は、異種抗体を加える前に除去される（免疫涸渇（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔｅｄ））。本発明は、動物において使用する前に、自己免疫治療剤を効力に関して試験するために理想的に適合する、一貫した、標準化バイオアッセイ試薬を提供する。さらに、本発明のバイオアッセイ試薬を、検出可能な血液によって運ばれる感染性病原体を含まないヒト血漿を用いて調製し得る。
【００１７】
本組成物は、免疫学の分野において当業者に公知の方法を用いて、産生するのが容易である（Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．６８（２）（１９９２）、１５５−１５９；Ｂｒｉｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　４６（１９８０）４７１−４８１）。しかし、１番目の動物種に固有の抗原を認識する、ウシ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、およびラットのような、しかしこれに限らない２番目の動物種由来の異種抗体を含む正常ヒト血漿（１番目の動物種）の組み合せは知られていない。結果として、本発明は、異種抗体を含む血漿を用いた、治療剤のインビトロ効力分析の新規方法および試薬を提供する。
【００１８】
（図面の簡単な説明）
図１は、（ａ）第ＶＩＩＩ因子に対する天然に存在する自己抗体を含む、ヒト第ＶＩＩＩ因子欠損血漿（阻害抗体を含む患者血漿）、（ｂ）第ＶＩＩＩ因子に対するインヒビター（本発明の異種抗体）を加えたヒト第ＶＩＩＩ因子欠損（免疫涸渇（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔｅｄ））血漿、および（ｃ）第ＶＩＩＩ因子に対するインヒビター（本発明の異種抗体）を加えたヒト正常血漿の、凝固時間減少を図表で比較する。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一般的に、異種抗体を含む血漿を形成するために、少なくとも１つの他の異なる動物種由来の抗体（異種抗体）と混合した、１つの動物種由来の正常血漿からなるバイオアッセイ試薬に関する。具体的には、開示されるバイオアッセイ試薬は、第１の動物種由来の血漿および、第１の動物種に固有の抗原を認識する、少なくとも１つの第２の異なる動物種由来の抗体を含む。より具体的には、自己免疫疾患を有する患者、具体的にはその血液中に存在する抗血液因子抗体（阻害抗体）を有する血友病患者を治療するための治療剤の効力を評価するバイオアッセイが意図される。開示されるバイオアッセイ試薬を作製および使用するための関連する方法も提供される。
【００２０】
一般的に、正常動物の体のタンパク質、糖タンパク質、脂質、糖脂質、炭水化物、核酸および他の構造成分（抗原）は、体液性免疫反応（抗体を産生する血漿細胞からなる免疫系の部分）を誘発しない。すなわち、我々の免疫系は、一般的に我々自身に対して抗体を作成しない。しかし、まれな場合に、動物の免疫系がそれ自身の抗原に対して抗体を産生し、「自己抗体」および「自己免疫」疾患を引き起こす。重篤な場合には、攻撃的な自己免疫疾患は、生命を脅かし得る。
【００２１】
自己抗体は、一般的にはいくつかの方法の１つで形成する。自己免疫疾患の最も一般的な原因は、遺伝に基づく。遺伝的素因がある人の免疫系は、それ自身の抗原に対して、それが外来抗原であるかのように反応し、そしてそれに対して抗体を形成する。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、遺伝に基づく自己免疫疾患の例である。ここで、体の体液性免疫系は、それ自身の核酸、核タンパク質、およびリン脂質に対して自己抗体を形成する（４０％〜６０％のＳＬＥ患者は、抗リン脂質抗体を形成する）。自己免疫疾患はまた、薬物誘発性であり得るか、または、密接に関連する種由来の治療剤を反復して注射することによる、長期の免疫系刺激の結果であり得る。後者の例は、プールされたヒト血漿由来の血液凝固因子濃縮製剤を受ける血友病患者であり、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、フォン・ビルブラント因子（ｖＷＦ）、および／またはリン脂質が挙げられるがこれに限定されない血液凝固因子に対する抗体（阻害抗体）を産生する。
【００２２】
動物の自身の抗原に対する免疫反応の誘導は、まれな事象であり、従って自己抗体を有するヒト血漿の供給はまれである。さらに、自己抗体を含むヒト血漿、特に阻害因子を含む血漿は、血液によって運ばれる病原体汚染の発生率が高い。これらの病原体としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒトリンパ球向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ　Ｉ）、ヒトリンパ球向性ウイルスＩＩ型（ＨＴＬＶ　ＩＩ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、および他の潜在的な同定されていないウイルスおよび／または非ウイルス性病原体が挙げられるがこれに限定されない。従って、検出可能な血液によって運ばれる病原体を含まない、自己抗体を含む大量の血漿を産生する能力は、重大な科学的進歩である。しかし、動物自身の抗原に対して免疫反応を誘導することは、成功するためには最も重大な障害のままである。
【００２３】
本発明の発明者は、１つの種（血漿ドナー）由来の、検出可能な血液によって運ばれる病原体を含まない動物血漿を、血漿ドナーに固有の抗原と反応する抗体と混合するシステムを考案することによって、前述の障害を克服した。望ましい抗体を産生するために、血漿ドナー由来の抗原を、血漿ドナー種から抽出し、そして当業者に公知の方法を用いて、異なる動物種（免疫動物）を免疫するために使用した。免疫動物の体液性免疫系が、外来抗原としての抽出された血漿ドナー抗原に対して反応し、異種抗体の産生を引き起こす。
【００２４】
異種抗体産生動物は、その免疫系が抗原と免疫学的に反応するように、血漿ドナー動物と分類学的に十分異なっていなければならない。例えば、血漿ドナーがヤギ（偶蹄目ウシ科ヤギ亜科に属する）ならば、異種抗体を産生するために使用される動物は、同じ亜科のメンバー（例えばヒツジ）ではなく、別の科または亜科のメンバー、例えばウシ（ウシ科ウシ亜科に属する）、マウス（げっ歯目）、ウマ（奇蹄目）、ウサギ（ウサギ目）等でなければならない。本発明の１つの実施態様において、血漿ドナーはヒト（Ｈｏｍｏ　ｓａｐｉｅｎ；ヒト科；霊長類目）であり、そして免疫動物はヤギ（Ｃａｐｒａ種；ａｅｇａｇｒｕｓ、ｉｂｅｘ、ｐｙｒｅｎａｉｃａ、ｃｙｌｉｎｄｒｉｃｏｒｎｉｓ、ｈｉｒｃｕｓ、およびｆａｌｃｏｎｅｒｉを含むグループから選択される種）である。
【００２５】
本発明の教示によって、血漿ドナー（「第１の動物種」）に固有の任意の抗原を、この抗原に対する異種抗体が誘導されるように、１つまたはそれ以上の異なる動物（「第２の動物種」）に投与し得る。異種抗体を抽出し、そして健康な非感染個体由来のドナー血漿と組み合せ得る。抗体抽出方法は重要ではなく、そしてドナー血漿に供給される異種抗体調製物の性質に依存する。異種ポリクローナル抗体調製物をドナー血漿と組み合せる場合、第２群の動物の抗体を含む腹水、血漿、血漿画分、血漿調製物、または血清が提供される。より高い程度の異種抗体の純度が望ましい場合、例えば、免疫沈降、ゲル電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーであるがこれに限定されない、当業者に公知の方法を用いて血漿または腹水を精製することによって、免疫グロブリン調製物を得ることができる（Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１３４（１９６９）２７９−２８４；Ｖｏｘ．Ｓａｎｇ．２３（１９７２）２７９−２９０）。
【００２６】
あるいは、異種モノクローナル抗体を、当業者に公知の方法を用いて調製し得る（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．７３（１９８１）３−４６）。このような異種（ポリクローナルおよびモノクローナル）抗体調製物を提供するための全ての方法が、原則として本発明に適当である。しかし、本発明の再現性および一貫性は、高度に特異的かつ精製された異種抗体を用いた場合に増強される。
【００２７】
本発明の１つの実施態様において、本発明による組成物は、凍結乾燥形態で提供され、それは要求に応じて再構築されるが、長期間安定に保存される。本発明の別の実施態様において、異種抗体を含む血漿は、第１群の動物の阻害抗体を含まず、従って、加えた異種抗体がドナー血漿に既に存在する固有の抗体を干渉し得る危険性を軽減する。固有の自己抗体の存在は、当業者に公知のイムノアッセイを用いて、前もって決定され得る。
【００２８】
本発明による組成物は、自己免疫疾患、特に阻害抗体を有する血友病患者を処置するために使用される治療剤の効力を試験するのに特に適当である。例えば、本発明の教示に従う、自己抗体疾患治療剤の効力を評価するインビトロの方法は、自己抗体疾患治療剤を、本発明の異種抗体を含む血漿と混合して、混合物を形成する工程を含む。次に、異種抗体を含む血漿に対する、自己抗体疾患治療剤の効果を検出する。本発明の１つの実施態様において、自己抗体疾患治療剤は、抗血液凝固因子抗体治療剤であり、そして血液凝固アッセイを用いて、この治療剤に対する異種抗体を含む血漿の効果を決定する。この方法は、ヒト患者において血液凝固障害を処置する能力について物質を評価するのに特に適当である。
【００２９】
図１は、Ｆａｃｔｏｒ　Ｅｉｇｈｔ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　Ｂｙｐａｓｓｉｎｇ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＦＥＩＢＡ）を用いて処置された、ヒト第ＶＩＩＩ因子欠損血漿の凝固時間の減少を図表で比較する。曲線（ａ）はコントロールであり、そして第ＶＩＩＩ因子に対する天然に存在する自己抗体を含む、ヒト第ＶＩＩＩ因子欠損血漿（阻害抗体を含む患者血漿）の凝固時間の減少を示す。曲線（ｂ）は、本発明の異種抗体を加えた、ヒト第ＶＩＩＩ因子欠損（免疫涸渇（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔｅｄ））血漿を示す。最後に、曲線（ｃ）は、本発明の異種抗体を加えた、ヒト正常血漿を示す。ＦＥＩＢＡの効果は全ての例においてほとんど同一である。従って、本発明の異種抗体を含む血漿は、天然に存在する自己抗体および阻害因子を有する血漿を厳密にシミュレートすると結論できる。
【００３０】
本発明の別の実施態様において、異種抗体を、分子生物学の分野において当業者に公知の組換えＤＮＡ技術を用いて得た固有の抗原から産生する。組換え抗原調製物を、天然に存在する阻害抗体を含む血漿と同等か、またはそれより高い力価を有する、異種抗体を含む血漿の産生を可能にする精密な仕様で作製し得る。
【００３１】
本発明は、高スループットの慣用的な試験のために、またはその生物学的起源に起因して、生物学的活性、濃度、および／または組成物の異なるバイオアッセイ試薬の、単一バッチコントロールのために適当である。本発明の別の局面によって、自己抗体疾患に罹患した患者、特にインヒビター患者に適用される能力について物質を評価するためのキットが提供される。本発明によるこのキットは、本発明による組成物および評価される物質を含む。さらに、そのようなキットは、好ましくは、凝固時間を測定する試薬ならびに標準調製物および参照試料を含み、これらもまた、凍結乾燥形態で提供され得る。
【００３２】
本発明を実施例および図面でより詳しく記載するが、それに制限されない。
【００３３】
（実施例１）
（ヤギ抗ヒト第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）を用いた、異種抗体を含む血漿の調製）
ヤギを、以下のプロトコールによって、ヒト組換えＦＶＩＩＩで免疫する。完全フロイントアジュバントとともに３２．５μｇのヒト組換えＦＶＩＩＩの皮下注射によって一次免疫し、そして３および８週間後に、不完全フロイントアジュバントとともに６５μｇのタンパク質で２回追加免疫注射する。血液試料を、間隔をおいて採取し、そして抗ＦＶＩＩＩインヒビター力価を機能的アッセイ（Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイ）で測定する。２回目の追加免疫から３週間後、６０００Ｂｅｔｈｅｓｄａユニット／ｍｌの阻害抗体力価を有するクエン酸化抗血漿を、血漿瀉血によって得る。血漿のプールを、＜−２０℃でアリコートで凍結保存する。
【００３４】
異種抗体を含む血漿の調製に関しては、ヤギ抗ヒトＦＶＩＩＩ抗血漿を５６℃で７０分間加熱し、得られた不溶性の物質を遠心分離によって除去して、そして上清を、抗ＦＶＩＩＩ抗体力価に関して機能的アッセイ（Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイ）で測定する。約１．８ｍｌの上清を、５７ｍｌのヒト正常血漿、および６ｍｌのＨＥＰＥＳ／グリシン緩衝液（ａｑｕａ　ｄｅｓｔ．中１０％（ｗ／ｖ）ＨＥＰＥＳ、１０％（ｗ／ｖ）グリシン、ｐＨ６．６）と混合する。混合物を凍結乾燥し、そして再構築まで２〜８℃で保存する。
【００３５】
（実施例２）
（ヤギ抗ヒト第ＶＩＩＩ因子を用いた、異種抗体を含む血漿の調製）
ヤギ抗ヒトＦＶＩＩＩ抗血漿を５６℃で７０分間加熱し、得られた不溶性の物質を遠心分離によって除去して、そして上清を抗ＦＶＩＩＩ抗体力価に関して機能的アッセイ（Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイ）で測定する。約０．３ｍｌの上清を、１５ｍｌのＦＶＩＩＩ欠損血漿（免疫涸渇（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔｅｄ））と混合する。混合物を凍結乾燥し、そして再構築まで２〜８℃で保存する。
【００３６】
（実施例３）
（ヤギ抗ヒト第ＶＩＩＩ因子を用いた、異種抗体を含む血漿の調製）
ヤギ抗ヒトＦＶＩＩＩ抗血漿を５６℃で１２０分間加熱し、得られた不溶性の物質を遠心分離によって除去して、そして上清を抗ＦＶＩＩＩ力価に関して機能的アッセイ（Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイ）で測定する。約０．６３ｍｌの上清を、２０ｍｌのヒト正常血漿、および１．５ｍｌのＨＥＰＥＳ／グリシン緩衝液（ａｑｕａ　ｄｅｓｔ．中１０％（ｗ／ｖ）ＨＥＰＥＳ、１０％（ｗ／ｖ）グリシン、ｐＨ６．６）と混合する。混合物を凍結乾燥し、そして再構築まで２〜８℃で保存する。
【００３７】
（実施例４）
（ヤギ抗ヒト第ＶＩＩＩ因子を用いた、異種抗体を含む血漿の調製）
ヤギ抗ヒトＦＶＩＩＩ抗血漿を、いくらか改変したＫｉｓｔｉｅｒら（Ｖｏｘ　Ｓａｎｇ．１９６２、７；４１４−４２４）に従って、免疫グロブリン分画に供する。簡単には、低温上清（ｃｒｙｏｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）を２０％エタノールで２回沈降し、得られた沈殿を溶解してそして１７％エタノールにする。分離後、上清を２５％エタノールで沈降し、ペレットを溶解する。得られた免疫グロブリン溶液は１２ｍｇタンパク質／ｍｌを含み、そして凍結保存される。
【００３８】
免疫グロブリン溶液（１ｍｌ）を、１３．５ｍｌの免疫涸渇（ｉｍｍｕｎｏｄｅｐｌｅｔｅｄ）ＦＶＩＩＩ欠損血漿と混合し、そして１．５ｍｌのＨＥＰＥＳ／グリシン緩衝液（ａｑｕａ　ｄｅｓｔ．中１０％（ｗ／ｖ）ＨＥＰＥＳ、１０％（ｗ／ｖ）グリシン、ｐＨ６．６）を加える。混合物を凍結乾燥し、そして２〜８℃で保存する。
【００３９】
（実施例５）
（ヤギ抗ヒト第ＩＸ因子（ＦＩＸ）を用いた、異種抗体を含む血漿の調製）
ヤギを、以下のプロトコールによって、精製ヒト血漿由来ＦＩＸで免疫する。完全フロイントアジュバントとともに９０μｇのヒトｐｄＦＩＸの皮下注射によって一次免疫し、そして３および８週間後に、不完全フロイントアジュバントとともに９０μｇのタンパク質で２回追加免疫注射する。血液試料を、間隔をおいて採取し、そして抗ＦＩＸインヒビター力価を機能的アッセイ（Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイ）で測定する。２回目の追加免疫から２週間後、１１００Ｂｅｔｈｅｓｄａユニット／ｍｌの阻害抗体力価を有するクエン酸化抗血漿を、血漿瀉血によって得る。血漿のプールを、＜−２０℃でアリコートで凍結保存する。
【００４０】
異種抗体を含む血漿の調製に関しては、ヤギ抗ヒトＦＩＸ抗血漿を５６℃で１２０分間加熱し、得られた不溶性の物質を遠心分離によって除去して、そして上清を、抗ＦＩＸ力価に関して機能的アッセイ（Ｂｅｔｈｅｓｄａアッセイ）で測定する。２ｍｌの上清を、３４ｍｌのヒト正常血漿、および４ｍｌのＨＥＰＥＳ／グリシン緩衝液（ａｑｕａ　ｄｅｓｔ．中１０％（ｗ／ｖ）ＨＥＰＥＳ、１０％（ｗ／ｖ）グリシン、ｐＨ６．６）と混合する。混合物を凍結乾燥し、そして再構築まで２〜８℃で保存する。
【００４１】
（実施例６）
（ヤギ抗ヒトフォン・ビルブラント因子を用いた、異種抗体を含む血漿の調製）
ヤギを、ヒト血漿由来フォン・ビルブラント因子で免疫する。完全フロイントアジュバントとともに２ｍｇのヒト血漿由来フォン・ビルブラント因子の皮下注射によって一次免疫し、そして４および８週間後に、不完全フロイントアジュバントとともに２ｍｇのタンパク質で２回追加免疫注射する。血液試料を、間隔をおいて採取し、そして抗フォン・ビルブラント因子インヒビター力価をＥＬＩＳＡで測定する。２回目の追加免疫から１週間後、１：１０，０００より高いインヒビター力価を有するクエン酸化抗血漿を、血漿瀉血によって得る。血漿のプールを、＜−２０℃でアリコートで凍結保存する。
【００４２】
異種抗体を含む血漿の調製に関しては、ヤギ抗ヒトフォン・ビルブラント因子抗血漿を５６℃で７０分間加熱し、得られた不溶性の物質を遠心分離によって除去して、そして上清をＥＬＩＳＡで測定する。１０ｍｌの上清を、３５ｍｌのヒト正常血漿、および５ｍｌのＨＥＰＥＳ／グリシン緩衝液（ａｑｕａ　ｄｅｓｔ．中１０％（ｗ／ｖ）ＨＥＰＥＳ、１０％（ｗ／ｖ）グリシン、ｐＨ６．６）と混合する。混合物を凍結し、そして＜−２０℃で保存する。
【００４３】
ここで本発明を、いくつかの実施態様を参照して記載してきたが、当業者は、その範囲または意図から逸脱することなく、様々な置換、省略、改変、および変化がなされ得ることを認識する。よって、前述の記載は、本発明の単なる例示とみなされ、そしてその制限ではないことが意図される。さらに、特定の科学的出版物および／または特許および特許出願に対して特定の参照がなされ、それらは全て本明細書中においてその全体が参考として援用される。
【国際公開パンフレット】
2004514117.tif 000002
2004514117.tif 000003
2004514117.tif 000004
2004514117.tif 000005
2004514117.tif 000006
2004514117.tif 000007
2004514117.tif 000008
2004514117.tif 000009
2004514117.tif 000010
2004514117.tif 000011
2004514117.tif 000012
2004514117.tif 000013
2004514117.tif 000014
2004514117.tif 000015
2004514117.tif 000016
2004514117.tif 000017
2004514117.tif 000018
2004514117.tif 000019
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004514117.tif 000020
【国際調査報告】
2004514117.tif 000021
2004514117.tif 000022
2004514117.tif 000023