(57)【要約】本発明により、膜融合タンパク質のファミリーおよびこのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが同定されている。これらのタンパク質とポリヌクレオチドは、レオウイルス科から誘導される。２種類の膜融合タンパク質が変温性宿主から単離したレオウイルスから単離されており、p14タンパク質はニシキヘビから単離した爬虫類レオウイルス(RRV)から、また、p16タンパク質はサケから単離したアクアレオウイルス(ＡＱＶ)から単離された。これらのタンパク質をコードする遺伝子をクローニングして、配列決定した。これらのタンパク質のアミノ酸配列の分析により、いずれのタンパク質も他の膜融合タンパク質で見られる典型的な融合ペプチドを欠いていることが示されている。細胞でのこれらのタンパク質の発現により、細胞-細胞融合が生じる。
2004520019.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたタンパク質であって、
(a)  レオウイルス科のゲノムによってコードされ、
(b)  膜融合タンパク質であり、
(c)  少なくとも１個の膜貫通ドメインを含んでなり、
(d)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩが
(i)  １７〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．６〜０．７であり、かつ
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であるものであり、かつ
(e)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩＩが
(i)  １６〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．３〜０．４であり、
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であり、かつ
(iv)  ７残基反復を含むものである、
タンパク質。
【請求項２】
タンパク質であって、
(a)  膜融合タンパク質であり、
(b)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩが
(i)  １７〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．６〜０．７であり、かつ
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であるものであり、
(c)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩＩが
(i)  １６〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．３〜０．４であり、
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であり、かつ
(iv)  ７残基反復を含むものであり、
(d)  請求項１に記載のタンパク質に対して少なくとも３３％の全体的な同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ
(e)  請求項１に記載のタンパク質の膜貫通ドメインに対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインを含んでなる、
タンパク質。
【請求項３】
オルトレオウイルスおよびアクアレオウイルスからなる属から選択されるレオウイルスのゲノムによってコードされる、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
天然において変温性宿主に感染するレオウイルスのゲノムによってコードされる、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
７以上の等電点を有するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
多くとも２５残基の連続配列内に存在する少なくとも３個の正に帯電したアミノ酸残基からなる正のクラスターであって、前記連続配列がＣ末端側の膜貫通ドメインに隣接する多くとも１００残基内に存在するものである、正のクラスター、をさらに含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
少なくとも３個の連続したプロリン残基を含んでなるポリプロリンモチーフを含んでなる非膜貫通ドメインをさらに含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
脂肪族アシル化配列をさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９】
単離されたタンパク質であって、
(a)  配列番号２、
(b)  配列番号６、および
(c)  配列番号８
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、タンパク質。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる、単離されたタンパク質。
【請求項１１】
配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる、単離されたタンパク質。
【請求項１２】
タンパク質であって、
(a)  膜融合タンパク質であり、
(b)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩが
(i)  １７〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．６〜０．７であり、かつ
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であるものであり、
(c)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩＩが
(i)  １６〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．３〜０．４であり、
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であり、かつ
(iv)  ７残基反復を含むものであり、
(d)  配列番号２に対して少なくとも３３％の全体的な同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ
(e)  配列番号２の第３９〜５７アミノ酸の配列に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインを含んでなる、
タンパク質。
【請求項１３】
タンパク質であって、
(a)  膜融合タンパク質であり、
(b)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩが
(i)  １７〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．６〜０．７であり、かつ
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であるものであり、
(c)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩＩが
(i)  １６〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．３〜０．４であり、
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であり、かつ
(iv)  ７残基反復を含むものであり、
(d)  配列番号６に対して少なくとも３３％の全体的な同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ
(e)  配列番号６の配列5' WAIPPLAICCCCCICCTGGLYLV 3'に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するか、または配列番号６の配列5' YIALASVILVTLVISLIWNCLGTGLIL 3'に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインを含んでなる、
タンパク質。
【請求項１４】
多くとも２５残基の連続配列内に存在する少なくとも３個の正に帯電したアミノ酸残基からなる正のクラスターであって、前記連続配列がＣ末端側の膜貫通ドメインに隣接する多くとも１００残基内に存在するものである、正のクラスター、をさらに含んでなる、請求項１２または１３に記載のタンパク質。
【請求項１５】
少なくとも３個の連続したプロリン残基を含んでなるポリプロリンモチーフを含んでなる非膜貫通ドメインをさらに含んでなる、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１６】
脂肪族アシル化配列をさらに含んでなる、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記脂肪族アシル化配列がミリスチル化コンセンサス配列であり、該コンセンサス配列が、
（イニシエーターMet無し）Gly1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-
（但し、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6は帯電していない小型の残基であり、かつAA6はプロリンではない）
である、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
AA5がセリンまたはトレオニンである、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号１または配列番号５、または同一アミノ酸配列をコードするその縮重変異体、またはそのスプライス変異体ヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
プロモーターに機能しうる形で連結された、請求項１９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
プロモーターが誘導性である、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質を含む細胞。
【請求項２４】
請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項２５】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質を含むリポソーム。
【請求項２６】
請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むリポソーム。
【請求項２７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項２８】
２以上の膜の融合を促進する方法であって、融合させる複数の膜を請求項１〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質の有効量と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項２９】
前記複数の膜が、細胞膜、リポソーム膜、およびプロテオリポソーム膜からなる群より選択されるものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の膜が細胞の膜であり、かつヘテロカリオンが生産される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数の膜が、不死化細胞および一次Ｂ細胞もしくはＴ細胞のものである、ハイブリドーマ細胞を生産するための、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ハイブリドーマ細胞が、モノクローナル抗体、サイトカイン、および免疫モジュレーターから選択される物質を生産するものである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ハイブリドーマ細胞がモノクローナル抗体を生産するものであり、かつ前記複数の膜が不死化細胞および抗体産生細胞のものである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記不死化細胞がヒトまたはマウスのＢ細胞骨髄腫細胞またはＴ細胞骨髄腫細胞であり、かつ前記抗体産生細胞が免疫化した哺乳動物由来の単離された脾臓細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数の膜が、リポソーム膜、リポソーム膜と細胞膜、およびプロテオリポソーム膜と細胞膜からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記リポソームまたは前記プロテオリポソームが生物活性薬剤を含むものである、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、膜融合を促進する新規なクラスのタンパク質に関する。これらのタンパク質およびそれらをコードするポリヌクレオチドは、レオウイルス科から誘導されるものである。
【発明の背景】
【０００２】
膜融合反応は、真核細胞では広く知られている。細胞内では、膜は、エンドサイトーシス、細胞小器官形成、細胞小器官間輸送(inter-organelle traffic)、および構成的および調節性エキソサイトーシスなどの工程において融合される。細胞間では、膜融合は精子−卵融合および筋芽細胞融合の際に起こる。
【０００３】
膜融合は、リポソームを用いて細胞膜をリポソーム膜と融合させることによって、および細胞−細胞融合を誘発してヘテロカリオンを産生する様々な化学物質または脂質によって、人工的に誘発されている。生物膜の融合を誘発することが示されている天然に存在するタンパク質は、主としてエンベロープウイルスの融合タンパク質である。
【０００４】
リポソームに基づく送達系では、リポソームは生物活性分子を脂質小胞内部に被包して細胞へ送達するのに用いられる。しかしながら、会合した水層に沿って脂質二重層の両表面上に配向した極性脂質の頭部の存在により、自発的な膜融合が熱力学的に不都合であるとされている。
【０００５】
膜融合を促進する目的で、様々な化学物質や脂質が用いられてきた。しかしながら、これらの試薬は、通常は細胞傷害性作用を示す（例えば、Iwamoto et al., Biol. Pharm. Bull. 19:860-863 (1996)およびMizuguchi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 218:402-407 (1996)を参照されたい）。
【０００６】
生理学的条件下での膜融合には、一般的に、タンパク質が介在すると考えられている。これによって、融合促進タンパク質（プロテオリポソーム）を含み、細胞傷害性が減少したリポソームが開発されるに至った（例えば、Cheng, Hum. Gene Ther. 7:275-282 (1996); Hara et al., Gene 159:167-174 (1995); およびFindeis et al., Trends Biotechnol., 11:202-205 (1993)を参照されたい）。
【０００７】
生物膜の細胞間融合を誘発することが明確に示されているタンパク質は、エンベロープウイルスのタンパク質およびエンベロープのないウイルス由来の２種類のタンパク質のみである。総てのエンベロープウイルスは、ウイルスエンベロープと細胞膜との融合に関与するタンパク質をコードする。これらのウイルス融合タンパク質は、影響を受けやすい細胞への感染にとって本質的なものである。エンベロープウイルス由来の融合タンパク質の作用の機構は、タンパク質が介在した膜融合の典型とされている（例えば、White, Ann. Rev. Physiol., 52:675-697 (1990);およびWhite, Science, 258:917-924 (1992)を参照されたい）。
【０００８】
ほとんどのエンベロープウイルス融合タンパク質は、比較的大型のマルチマー性のＩ型膜タンパク質であり、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、低ｐＨで活性化される融合タンパク質、および中性ｐＨで機能するセンダイウイルスＦタンパク質が挙げられる。これらはウイルスの構造タンパク質であり、融合タンパク質の大部分はビリオンの外部表面上に配向し、ウイルス粒子と細胞膜との間の相互作用を促進している。
【０００９】
エンベロープウイルス由来の融合タンパク質の作用機構によれば、ウイルスエンベロープと細胞膜との融合は、ウイルス融合タンパク質に含まれている融合ペプチドモチーフと呼ばれる両親媒性のα−へリックス領域によって実現される。この種の融合ペプチドモチーフは、典型的には、１７〜２８残基長で、疎水性（平均疎水性度が約０．６±０．１）であり、高含量のグリシンおよびアラニン、典型的には３６％±７％のグリシンおよびアラニンを含む（White, Annu. Rev. Physiol., 52:675-697 (1990)）。
【００１０】
総てのエンベロープウイルス融合タンパク質は、エネルギーを供給して熱力学的障壁を克服し、膜融合を促進する広汎なコンホメーション変化を介して作用すると考えられている。これらのコンホメーション変化は、コイルドコイル構造を形成する７残基反復領域によって媒介されることが多い（例えば、Skehel and Wiley, Cell, 95:871-874 (1998)を参照されたい）。膜融合の誘発における融合ペプチドモチーフの重要性が認識されるようになった結果、リポソーム−細胞融合を増強するのに融合ペプチドモチーフを含む小型ペプチドが使用されるようになった（例えば、Muga et al., Biochemistry 33:4444-4448 (1994)を参照されたい）。
【００１１】
エンベロープウイルス融合タンパク質は細胞−細胞融合をも誘発し、ポリカリオン（シンシチウム）を形成する。感染細胞内部でウイルス融合タンパク質が合成されると、融合タンパク質は小胞体およびゴルジ輸送系を介して細胞膜へ輸送されるようになり、これは感染細胞からの感染性子孫ウイルスの組立および発芽における本質的段階である（Petterson, Curr. Top. Micro. Immunol., 170:67-106 (1991)）。融合タンパク質の合成、輸送およびフォールディングは、タンパク質を細胞内輸送経路へ標的化するためのシグナルペプチド、タンパク質へのＮ結合型炭水化物付加のためのグリコシル化シグナル、および細胞膜にタンパク質を固定するための膜貫通ドメインなどの様々な成分によって促進される。これらのタンパク質は、再構成されたプロテオリポソーム（「ヴィロソーム」）において、細胞培養およびイン・ビボのいずれにおいてもタンパク質依存性リポソーム−細胞融合の増進に用いられている（例えば、Ramani et al., FEBS Lett., 404:164-168 (1997); Scheule et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 13:330-343 (1995);およびGrimaldi, Res. Virol., 146:289-293 (1995)を参照されたい）。
【００１２】
エンベロープウイルスとは異なり、エンベロープのないウイルスは、ウイルス膜を有さず、膜融合による侵入を行なわないため、一般的には融合タンパク質をコードしていない。エンベロープのないウイルスの子孫ウイルス粒子は脂質エンベロープを得る必要がないので、通常、これらのウイルスは感染細胞から発芽せず、むしろ細胞溶解によって放出される。その結果、エンベロープのないウイルスは感染細胞の表面では融合タンパク質を発現せず、従って、一般にシンシチウム形成を誘発しない。
【００１３】
しかしながら、レオウイルス科に属する特定のウイルスは、シンシチウム形成を誘発する（例えば、Duncan et al., Virology, 212:752-756 (1995)、Duncan, Virology, 260:316-328 (1999)、およびこれらに引用されている文献を参照されたい）。レオウイルス科は、断片化した二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ゲノムを含むエンベロープのないウイルスのファミリーである（例えば、Nibert et al., レオウイルスおよびそれらの複製(Reoviruses and their replication):基礎ウイルス学(Fundamental Virology), 第３版,  B. N. Fields, D. M. Knipe and P. M. Howley (監修), Lippincott-Raven Press, NY (1996)を参照されたい）。
【００１４】
レオウイルス科のうち、オルトレオウイルス属は、トリおよび哺乳動物のレオウイルス原型によって代表される２種類の性質の異なるサブグループを有する（Duncan, Virology, 260:316-328 (1999)を参照されたい）。トリレオウイルス（ＡＲＶ）は総て膜融合性(fusogenic)であり、速やか且つ広汎な細胞−細胞融合を誘発し、感染細胞培養物においてシンシチウムを形成する（Robertson and Wilcox, Vet. Bull., 56:726-733 (1986)を参照されたい）。
【００１５】
哺乳動物レオウイルスは、一般的には膜融合性ではない。しかしながら、少なくとも２つの例外がある。一つはオオコウモリから単離され、Nelson Bayウイルス（ＮＢＶ）と命名されたものである（Gard and Compans, J. Virol., 6:100-106 (1970)を参照されたい）。他方はヒヒから単離され、ヒヒレオウイルス(Baboon Reovirus;ＢＲＶ)と呼ばれているものである（Duncan et al., Virology, 212:752-756 (1995)を参照されたい）。
【００１６】
膜融合性レオウイルスは、変温性宿主からも単離されている。シンシチウム形成を誘発する２株の爬虫類レオウイルス（ＲＲＶ、オルトレオウイルス属の一員）がヘビから単離されている（Ahne et al., Arch. Virol. 94:135-139 (1987)、およびVieler et al., Arch. Virol. 138:341-344 (1994)を参照されたい）。更に、魚類（魚）宿主種にのみ感染するアクアレオウイルス属（ＡＱＶ）も、細胞−細胞融合を誘発する（Samal et al., J. Virol. 64:5235-5240 (1990)を参照されたい）。これらのウイルスは、膜融合を誘発できるエンベロープのないウイルスとして知られる数少ない例である。
【００１７】
これまでに、２種類の膜融合タンパク質が、エンベロープのないウイルスから同定され、配列決定されている：ＡＲＶの２株およびＮＢＶに由来するp10タンパク質、およびＢＲＶ由来のp15タンパク質。p10タンパク質はＡＲＶとＮＢＶとの間で３３％のアミノ酸同一性を有しており、明らかに相同タンパク質である。ＢＲＶ由来のp15タンパク質はp10には相同ではなく、異なるクラスに属する。p10およびp15タンパク質のいずれのアミノ酸配列も、融合ペプチドモチーフを含む（ＡＲＶおよびＮＢＶの残基９〜２４、およびＢＲＶの残基６８〜８７、国際公開第９９／２４５８２号パンフレット、１９９９年５月２０日発行；p10タンパク質は、国際公開第９９／２４５８２号パンフレットでは「p11」と表されている）。しかしながら、p10タンパク質由来の融合ペプチドモチーフ(Shmulevitzand Duncan, EMBO J., 19:902-912 (2000))は、エンベロープウイルス由来の典型的な融合モチーフで見られるものより遙かに疎水性が低い点で非定型である。p10由来の融合モチーフの疎水性は、典型的な値が０．６±０．１であるのに対して約０．３〜０．４と評価されている。それにも拘わらず、p10由来の融合モチーフは、一層典型的な融合モチーフで見られる７残基反復、すなわち１位および４位の残基が無極性である７残基配列を含んでいる（p10の７残基配置を示している図６を参照されたい）。保存されている無極性残基は、一般に、膜相互作用特性に重要な両親媒性へリックスの疎水性表面を形成する働きをすると考えられている。p10およびp15に７残基反復が存在することは、これらのタンパク質がエンベロープウイルス由来の膜融合タンパク質と同様な機構によって膜融合を促進することを示唆している。
【発明の概要】
【００１８】
本発明によれば、新規なクラスの膜融合タンパク質であって、レオウイルスに由来し、かつ、そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフを持たないものが提供される。
【００１９】
一つの態様によれば、このクラスのものは、レオウイルス科のゲノムによってコードされ、少なくとも１個の膜貫通ドメインを含んでなり、かつ、そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフを含まない膜融合タンパク質である。融合ペプチドモチーフ（Ｉ型）は、典型的には１７〜２８残基長のアミノ酸配列であり、疎水性が約０．６〜０．７であり、かつ、そのアラニンとグリシンの含量の和が約２９〜４３％である。融合ペプチドモチーフ（II型）は、１６〜２０残基長であり、疎水性値が約０．３〜０．４であり、アラニンとグリシンの含量の和が約２９〜４３％であり、かつ、１個の７残基反復を含む。
【００２０】
他の態様によれば、本発明によるタンパク質は、上記に定義されているようにアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフを全く含まず、かつ、それらがレオウイルスによってコードされる膜融合タンパク質に対して少なくとも３３％の全体的同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、レオウイルスによってコードされる膜融合タンパク質の膜貫通ドメインに対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインを含んでなる点において、レオウイルス科に関連する膜融合タンパク質である。
【００２１】
一つの実施態様によれば、本発明によるタンパク質は、オルトレオウイルスまたはアクアレオウイルスのゲノム、または天然において変温性宿主に感染するレオウイルスのゲノムによってコードされ、またはこれに関連している。具体的には、一つの実施態様によれば、本発明によるタンパク質は、配列番号２または配列番号６のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質である。他の実施態様によれば、本発明によるタンパク質は、上記に定義されているように融合ペプチドモチーフを全く含まないアミノ酸配列を有し、かつ、オルトレオウイルスまたはアクアレオウイルスによってコードされる膜融合タンパク質に対して少なくとも３３％の全体的同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ、オルトレオウイルスまたはアクアレオウイルスによってコードされる膜融合タンパク質の膜貫通ドメインに対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインを含んでなるという点において、オルトレオウイルスまたはアクアレオウイルスに関連する膜融合タンパク質である。
【００２２】
他の実施態様によれば、本発明によるタンパク質は、上記に定義されているように融合ペプチドモチーフを含まないアミノ酸配列を有し、配列番号２に対して少なくとも３３％の全体的同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号２の第３９〜５７残基の配列に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインを含んでなる膜融合タンパク質である。
【００２３】
他の実施態様によれば、本発明によるタンパク質は、上記に定義されているように融合ペプチドモチーフを含まないアミノ酸配列を有し、配列番号６に対して少なくとも３３％の全体的同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ配列番号６の予測される第一の膜貫通配列：5' WAIPPLAICCCCCICCTGGLYLV 3'に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するか、または配列番号６の予測される第二の膜貫通配列：5' YIALASVILVTLVISLIWNCLGTGLIL 3'に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインを含んでなる膜融合タンパク質である。
【００２４】
他の実施態様によれば、レオウイルスのゲノムによってコードされ、またはこれに関連するアミノ酸配列は、中性または塩基性タンパク質を含んでなり、すなわちそれらの等電点は７以上である。
【００２５】
他の実施態様によれば、本発明によるタンパク質は、多くとも２５残基の連続配列内に存在する少なくとも３個の正に帯電したアミノ酸残基からなる正のクラスターであって、前記連続配列がＣ末端側の膜貫通ドメインに隣接する多くとも１００残基内に存在するものである、正のクラスター、をさらに含んでなるものである。
【００２６】
他の実施態様によれば、本発明によるタンパク質、特にp14に関連するものは、少なくとも３個の連続したプロリン残基を含んでなるポリプロリンモチーフを含んでなる非膜貫通ドメインをさらに含んでなるものである。
【００２７】
他の実施態様によれば、本発明によるタンパク質は、ミリスチル化コンセンサス配列のような脂肪族アシル化配列をさらに含んでなるものである。
【００２８】
本発明の他の態様によれば、本発明によるタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド、具体的には、配列番号１または配列番号５、または同一アミノ酸配列をコードするその縮重変異体(degenerate variations)、またはそのスプライス変異体ヌクレオチド配列（splice variant nucleotide sequences）を含んでなる、単離されたポリヌクレオチドが提供される。本発明による単離ポリヌクレオチドは、誘導性プロモーターでもよいプロモーターに機能しうる形で連結されることによって発現される。
【００２９】
本発明の他の態様によれば、本発明によるタンパク質またはポリヌクレオチドを含む細胞が提供される。
【００３０】
本発明の他の態様によれば、本発明によるタンパク質またはポリヌクレオチドを含むリポソームが提供される。リポソームが生物活性薬剤を細胞に送達するために用いられる実施態様においては、リポソームまたはプロテオリポソームは本発明によるタンパク質および生物活性薬剤の双方を含有する。
【００３１】
本発明の他の態様によれば、本発明によるタンパク質に対して反応性を有する抗体が提供される。
【００３２】
本発明の他の態様によれば、２以上の膜の融合を促進する方法であって、融合させる複数の膜を本発明によるタンパク質の有効量と接触させることを含んでなる方法が提供される。一つの実施態様によれば、前記複数の膜は、細胞−細胞融合、リポソーム−リポソーム融合、または細胞−リポソーム融合のいずれが必要とされるかによって、細胞膜、リポソーム膜またはプロテオリポソーム膜とされる。
【００３３】
一つの実施態様によれば、細胞間の融合は、融合させようとする（複数の）細胞において本発明による膜融合タンパク質を発現させることによって行われる。
【００３４】
他の実施態様によれば、本発明による融合法は、ヘテロカリオン、特に、モノクローナル抗体、サイトカインまたは免疫モジュレーターを生産するためのハイブリドーマ細胞を生産するために用いられる。ハイブリドーマ細胞がモノクローナル抗体を生産する場合には、前記複数の膜は不死化細胞および抗体産生細胞のものである。
【発明の具体的説明】
【００３５】
(A)  タンパク質
ＲＲＶ由来のp14タンパク質およびＡＱＶ由来のp16タンパク質などのタンパク質のクラスを同定した。これらのタンパク質は、膜融合特性を有する。従って、p14、p16および関連ポリペプチドなどのこのクラスのタンパク質を用いて、膜融合を促進することが可能となる。
【００３６】
本発明の一つの態様によれば、レオウイルスのゲノムによってコードされ、かつ、融合ペプチドモチーフを含まないアミノ酸配列を有するタンパク質が提供される。
【００３７】
レオウイルス科には、トリレオウイルス、哺乳動物レオウイルスおよび爬虫類レオウイルスなどのオルトレオウイルス属、並びにアクアレオウイルス属がある。
【００３８】
本発明で定義されるように、融合ペプチドモチーフには、Ｉ型およびII型の２つのクラスのものがある。Ｉ型は、典型的にはエンベロープタンパク質由来の融合タンパク質に見られる。モチーフＩ型は、１６〜３６残基長、好ましくは１７〜２８残基長のアミノ酸配列からなり、その疎水性は約０．５〜０．８、好ましくは約０．６〜０．７であり、アラニンとグリシンの含量の和は約２４〜４４％、好ましくは２９〜４３％である。
【００３９】
モチーフＩＩ型は非定型モチーフである。これは、ＡＲＶおよびＮＢＶのp10タンパク質などの種類の融合タンパク質に見られる。これは、１５〜２０残基長、好ましくは１６〜１８残基長のアミノ酸配列からなり、その疎水性値は約０．２〜０．４、好ましくは約０．３〜０．４であり、アラニンとグリシンの含量の和は約２４〜４４％、好ましくは２９〜４３％であり、少なくとも１個の７残基反復を含む。
【００４０】
本発明によれば、７残基反復は、１位および４位が無極性である７残基配列である。保存された無極性の１位および４位の残基は、両親媒性へリックスの疎水性表面の一部を形成すると考えられ、従って、それらを含むタンパク質では、それらは融合タンパク質と膜との相互作用にとって本質的成分であると考えられる。
【００４１】
疎水性値は、当技術分野で知られている方法によって決定される。本発明によれば、この値は、Eisenberg. (1984). Ann. Rev. Biochem. 53:595-623の規格化された疎水性尺度を用いて計算される。
【００４２】
「ポリペプチド」または「タンパク質」とは、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはホスホリル化）とは無関係に、アミノ酸の任意の鎖を意味する。いずれの用語も、本明細書においては互換的に用いられる。
【００４３】
本発明の他の態様によれば、上記に定義されているように融合ペプチドモチーフを全く含まないアミノ酸配列を有する膜融合タンパク質であり、かつ、レオウイルスによってコードされる膜融合タンパク質に対して少なくとも３３％の全体的同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる点においてレオウイルスに関連するタンパク質が提供される。これらのタンパク質は、レオウイルスによってコードされる膜融合タンパク質の膜貫通ドメインに対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインをも含んでなる。全体的同一性の百分率は、少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、および７５％とされてもよい。膜貫通ドメインとの同一性の百分率は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％とされてもよい。
【００４４】
一つの態様によれば、本発明によるタンパク質は、このタンパク質がレオウイルス科によってコードされる膜融合タンパク質に対して少なくとも３３％の全体的同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる点においてレオウイルス科に関連している。３３％の全体的同一性は、ＡＲＶ（１７６株および１３８株）およびＮＢＶのp10タンパク質間の同一性に基づいている。
【００４５】
一つのクラスとして、本発明によるタンパク質において、それらの膜融合特性を保持していれば、相当な量の配列変異が許容されることは明らかである。従って、レオウイルス科由来の膜融合タンパク質は、厳密な全体的同一性によるよりはむしろ機能および全体的構造によって関連付けられている。タンパク質は、簡単な試験を用いて容易に決定することができる膜融合特性を有する点で機能的に定義される。一つのこのような試験は例４および例８に例示されているものであり、その試験では、膜融合活性について試験されるタンパク質を細胞で発現させ、細胞をシンシチウム形成について顕微鏡下で調べる。
【００４６】
本発明によるタンパク質は、レオウイルス科によってコードされる点、または主に膜貫通ドメインにおいてレオウイルス科融合タンパク質に関連付けられている点において構造的に定義される。膜貫通ドメインは、当技術分野で容易に認識される。典型的な膜貫通ドメインは、アミノ酸残基が平均で２９個であり、平均疎水性が０．７±０．０９であり、かつアラニンとグリシンの含量の和が１６％±８％である連続配列として、White, Annu. Rev. Physiol., 52:675-697 (1990)に記載されている。
【００４７】
一つの実施態様によれば、本発明によるタンパク質は、オルトレオウイルスもしくはアクアレオウイルスのゲノム、または天然において変温性（冷血）宿主に感染するレオウイルスのゲノムによってコードされ、またはこれに関連付けられている。オルトレオウイルスとしては、トリおよび哺乳動物レオウイルスが挙げられる。アクアレオウイルスは、天然において魚に感染するレオウイルスである。変温性宿主としては、ヘビ、ニシキヘビのような爬虫類、および魚が挙げられる。
【００４８】
具体的には、一つの実施態様は、配列番号２または配列番号６のアミノ酸配列を含んでなるタンパク質とされる。他の実施態様によれば、本発明によるタンパク質は、上記に定義されているように融合ペプチドモチーフを全く含まないアミノ酸配列を有し、かつ、それらがオルトレオウイルスまたはアクアレオウイルスによってコードされる膜融合タンパク質に対して少なくとも３３％の全体的同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、さらにはオルトレオウイルスまたはアクアレオウイルスによってコードされる膜融合タンパク質の膜貫通ドメインに対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインを含んでなるという点において、オルトレオウイルスまたはアクアレオウイルスに関連する膜融合タンパク質である。全体的同一性の百分率は、少なくとも４０％、４５％、５０％、６０％、および７５％とされてもよい。膜貫通ドメインとの同一性の百分率は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％とされてもよい。
【００４９】
p16（配列番号６）の正確なＮ末端は決定されていない。しかしながら、Ｎ末端残基は、配列番号６の最初の１７残基内に配置されていることが示されている。イニシエーターコドンの正確な同定は本発明にとって本質的ではないが、このイニシエーターは当技術分野で知られている方法を用いて容易に決定することができる。例えば、終止コドンを、例５で説明されているように、最初の１７コドンに系統的に挿入することができる。あるいは、p16を、これを発現する細胞から単離し、そのＮ末端領域を微小配列決定することができる。
【００５０】
他の実施態様によれば、本発明による膜融合タンパク質は中性または塩基性であり、すなわちそれらの等電点（pI）は７以上であり、好ましくは８より大きく、さらに好ましくは、９より大きい。タンパク質のpIは、当技術分野で知られている標準的方法を用いて容易に決定することができる。
【００５１】
他の実施態様によれば、本発明によるタンパク質は、多くとも２５残基、好ましくは２３残基、さらに好ましくは２１残基、最も好ましくは２０残基の連続配列内に存在する少なくとも３個、好ましくは４個、さらに好ましくは６個、最も好ましくは７個の正に帯電したアミノ酸残基からなる正のクラスターをさらに含んでなり、前記連続配列は、Ｃ末端側の膜貫通ドメインに隣接する多くとも１００残基、好ましくは多くとも９０残基、さらに好ましくは多くとも８０残基内に存在する。
【００５２】
他の実施態様によれば、本発明によるタンパク質は、少なくとも３個、好ましくは４個、さらに好ましくは５個の連続したプロリン残基を含んでなるポリプロリンモチーフを含んでなる非膜貫通ドメインをさらに含んでなる。具体的な実施態様によれば、ポリプロリンモチーフを含んでなる本発明による融合タンパク質は、p14タンパク質に関連付けられる。
【００５３】
他の実施態様によれば、本発明によるタンパク質は、脂肪族アシル化配列、好ましくはミリスチル化コンセンサス配列：（イニシエーターMet無し）Gly1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-（但し、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6は帯電していない小型の残基であり、AA3およびAA4は好ましくは中性であり、AA5は好ましくはセリンまたはトレオニンであり、AA6はプロリンではなく、AA7およびAA8は好ましくは塩基性である）(Towler et al. Annu. Rev. Biochem. 57:69-99 (1988); Resh. Biochim. Biophys. Acta. 1451:1-16 (1999))をさらに含んでなる。具体的な実施態様によれば、脂肪族アシル化配列を含んでなる本発明による融合タンパク質は、p14タンパク質に関連付けられている。
【００５４】
本明細書に記載されているように、本発明は実質的に精製したタンパク質をも包含する。本明細書で用いられる「実質的に精製したタンパク質」は、これが天然に存在する環境から分離され、および／またはこれが合成される環境に存在するタンパク質類の大部分を含まないタンパク質として定義される。例えば、実質的に精製したタンパク質は、細胞質タンパク質を含まない。当業者であれば、本発明によるタンパク質を、天然供給源、すなわちレオウイルスに感染した細胞から精製し、または組換え法によって産生させることができることを容易に理解するであろう。
【００５５】
本発明による膜融合タンパク質の有用な誘導体、例えば、融合促進断片を、アミノ酸配列のコンピューター補助分析を用いて設計し、有望な膜貫通領域または高い正電荷の領域を同定することができる。へリックス傾向、７残基反復および平均疎水性のようなパラメーターにより、有用な融合促進断片および変異体の基礎として用いることができる潜在的な疎水性の膜相互作用断片を明らかにすることができる。
【００５６】
本発明の一つの態様によれば、配列番号２、４、６および８に同一または実質的に同一な配列が提供される。「実質的に同一なアミノ酸配列」とは、参照アミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％同一であり、かつ、好ましくは参照配列との相違の大部分が保存的アミノ酸置換によるものである配列を意味する。
【００５７】
保存的アミノ酸置換は、同一クラスのアミノ酸内における置換である。これらのクラスとしては、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、およびチロシンのような帯電していない極性側鎖を有するアミノ酸、リシン、アルギニン、およびヒスチジンのような塩基性側鎖を有するアミノ酸、アスパラギン酸およびグルタミン酸のような酸性側鎖を有するアミノ酸、およびグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、およびシステインのような非極性側鎖を有するアミノ酸が挙げられる。
【００５８】
同一性の百分率は、Sequence Analysis Software Package (Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705)のような配列分析ソフトウェアを用いて測定される。アミノ酸配列は、同一性が最大となるように整列させる。適正に整列させるために、ギャップを人工的に配列中に導入してもよい。最適な整列が設定されたならば、位置の総数に対して両方の配列のアミノ酸が同一である位置を総て記録することによって、同一性度を確立する。
【００５９】
配列番号２、４、６または８に対して相同な配列を有するタンパク質としては、天然に存在するアレル変異体(allelic variants)、並びに配列番号２、４、６または８のポリペプチドの膜融合特性を保持している突然変異体または任意の天然には存在しない変異体が挙げられる。当技術分野で知られているように、アレル変異体は、ポリペプチドの生物学的機能、すなわち膜融合活性を保持している、１以上のアミノ酸の置換、欠失または付加を有することを特徴とするポリペプチドの代替形態である。
【００６０】
天然には存在しない相同体およびそれらの断片は、アミノ酸配列変化および／または欠失を許容すると思われるタンパク質の領域を同定するための既知の方法を用いて設計される。一例として、異なる種由来の相同ポリペプチドを比較し、保存配列を同定する。より異なる配列は、配列変化を最も許容しやすい。配列間での同一性および類似性の百分率は、例えば、BLAST相同性検索アルゴリズムを用いて解析することができる(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))。あるいは、ポリペプチド中の特定のアミノ酸残基または配列をイン・ビトロで突然変異させた後、突然変異体ポリペプチドを膜融合を促進するそれらの能力についてスクリーニングすることができる。
【００６１】
当業者であれば、本発明によるスクリーニング法を行うことによって、過度の実験を行うことなく、レオウイルスによってコードされ、またはレオウイルスによってコードされたタンパク質に関連する特定のタンパク質が膜融合活性を有するかどうかが決定されることを理解するであろう。スクリーニング手順は、以下の工程を含んでなる：
(i)  試験タンパク質を送達し、またはこのタンパク質をコードするポリヌクレオチドからこれを発現させることによって、タンパク質をシンシチウム形成を受けやすい細胞に導入する工程；および
(ii)  関連性のないタンパク質を細胞に導入したネガティブコントロールと比較して、シンシチウムが形成したかどうかを決定することによって、膜融合が起こったかどうかを観察する工程。
【００６２】
(B)  抗体
本発明の一つの態様によれば、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の双方の抗体が提供される。このような抗体は、診断目的、治療目的などに用いることができる。好ましくは、治療用途には、用いられる抗体はモノクローナル抗体である。抗体は、組換え体、例えば、キメラ（例えば、ヒト定常領域と会合したネズミ起源の可変領域から構成されている）、ヒト化（動物、例えば、ネズミ起源の超可変領域と一緒になったヒト免疫グロブリン定常主鎖）、および／または一本鎖であってもよい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体はいずれも、免疫グロブリン断片、例えば、F(ab)'2断片またはFab断片の形態であってもよい。本発明による抗体は、任意のアイソタイプ、例えば、IgGまたはIgAであり、ポリクローナル抗体は単一アイソタイプまたはアイソタイプの混合物である。
【００６３】
本発明によるタンパク質または断片に対する抗体は、哺乳動物をこのタンパク質または断片を含んでなる組成物で免疫することによって生成される。ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を産生する方法は、当技術分野では周知である。総説については、「抗体、実験室便覧(Antibodies, A Laboratory Manual)」, Cold Spring Harbor Laboratory, E. Harlow and D. Lane監修(1988)、およびD.E. Yelton et al., 1981. Ann. Rev. Biochem. 50:657-680を参照されたい。
【００６４】
ポリクローナル抗体は、TyrをＣ末端に付加し、これを抗原としてＢＳＡに４℃で２時間の反応によりビスジアゾ化ベンジジン（ＢＤＢ）連結することによってカップリングさせた合成ペプチドで、３ヶ月齢の雄および雌白色ニュージーランドウサギを免疫することによって得ることができる。反応混合物を透析して低分子量物質を除去し、保持物質(retentate)を液体窒素で冷凍し、−２０℃で保管する。動物を、Benoit et al. P.N.A.S. USA, 79, 917-921 (1982)に記載の手順に従ってペプチド抗原１mgの当量で免疫する。４週間隔で、動物に抗原２００μgを投与することによって追加免疫し、１０〜１４日後に採血する。３回目の追加免疫の後、抗血清を、クロラミンＴ法によって調製した放射性ヨウ素化抗原ペプチドへの結合能力について検討した後、ＣＭＣ−イオン交換カラムクロマトグラフィーによって精製する。次に、抗原分子を哺乳動物から採取し、周知の手法、例えば、ＤＥＡＥ−Sephadexを用いることによって所望な程度まで単離して、IgG画分を得る。
【００６５】
モノクローナル抗体については、Kohler & Milstein (1975) Nature 256:495-497を参照されたい。一般に、モノクローナル抗体を調製する手順は、動物をタンパク質または断片（「抗原」）で免疫することを含む。このような動物の脾臓細胞を抽出し、適当な骨髄腫細胞株と融合させる。融合の後、生成するハイブリドーマ細胞を選択的にＨＡＴ培地に保持した後、Wands et al. Gastro-enterology. 80:225-232 (1981)に記載の方法でクローニングする。次に、このような選択を介して得たハイブリドーマ細胞を分析して、抗原に結合可能な抗体を分泌するクローンを同定する。
【００６６】
抗体の特異性を高めるために、抗体を固相に付着した免疫ポリペプチドを用いて免疫アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。抗体を、ポリペプチドが抗体分子と免疫反応して固相に付着した免疫複合体を形成するのに十分な時間、固相に付着した免疫ポリペプチドと接触させる。結合した抗体を、標準的手法によって複合体から分離する。
【００６７】
ラジオイムノアッセイは、同じウサギからのその後の採血物(bleeds)からの抗血清および血清を用いて確立する。本来のタンパク質は、合成ペプチド抗原と比較して等モルベースでの抗体によって認識される。
【００６８】
このようにして産生した抗体は、とりわけ、試験試料に含まれる融合タンパク質の濃度を検出する診断方法およびシステムにおいて用いることができる。さらに、抗融合タンパク質抗体を、治療方法、例えば、望ましくない融合過程の発生を遮断するのに用いることもできる。抗融合タンパク質抗体は、このような融合タンパク質の免疫アフィニティーまたはアフィニティークロマトグラフィー精製に用いることもできる。
【００６９】
従って、本発明の一つの態様によれば、生物学的試料から本発明によるポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を精製する方法であって、生物学的試料を用いて抗体ベースのアフィニティークロマトグラフィーを行うことを含み、抗体が本発明による単一特異性抗体である方法が提供される。
【００７０】
本発明による精製方法で使用するには、抗体はポリクローナルまたは単一特異性であり、好ましくはIgG型である。精製IgGは、標準的方法を用いて抗血清から調製される（例えば、Coligan et al.,「免疫学における最新の実験法(Current Protocols in Immunology)」(1994)John Wiley & Sons, Inc., New York, NY.を参照されたい）。通常のクロマトグラフィー支持体ならびに抗体を移植するための標準的方法は、例えば、「抗体：実験室便覧(Antibodies: A Laboratory Manual)」, D. Lane, E. Harlow監修(1988)に記載されており、以下にその概略を説明する。
【００７１】
簡単に説明すれば、膜融合タンパク質を含む細胞抽出物のような生物学的試料の好ましくは緩衝溶液を、好ましくは生物学的試料を希釈する目的で用いた緩衝液で平衡化したクロマトグラフィー材料に添加して、本発明によるポリペプチドまたはポリペプチド誘導体（すなわち、抗原）をこの材料上に吸着させる。本発明による抗体にカップリングしたゲルまたは樹脂のようなクロマトグラフィー材料は、バッチ形態またはカラムに入っている。未結合成分を洗い流し、次に抗原をグリシン緩衝液、またはカオトロピック剤、例えばグアニジンＨＣｌ、または高塩濃度（例えば、３M  ＭｇＣｌ２）を含む緩衝液のような適当な溶出緩衝液で溶出する。溶離画分を回収し、抗原の存在を、例えば、２８０nmでの吸光度を測定することによって検出する。
【００７２】
(C)  ポリヌクレオチド、それらの発現および使用
本発明の一つの態様によれば、本発明による膜融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。一つの実施態様によれば、前記ポリヌクレオチドは、配列番号１および５を有するものである。
【００７３】
「単離されたポリヌクレオチド」という用語は、それが天然に存在する環境から取り出されたポリヌクレオチドと定義される。例えば、生きているウイルスのゲノムに存在するか、または遺伝子バンクの一部として存在する天然のＤＮＡ分子は「単離された」ものではないが、例えば、クローニング操作（増幅）の結果としての、ウイルスゲノムの他の部分から分離された同分子は「単離された」ものである。典型的には、単離されたポリヌクレオチド分子は、天然に存在するゲノムにおいてそれが５′末端または３′末端で直接連続しているポリヌクレオチド領域を含まない（例えば、コード領域）。このような単離されたポリヌクレオチドはベクターまたは組成物の一部であってもよく、このようなベクターまたは組成物がこのようなポリヌクレオチドの天然における環境の一部ではないという点で、「単離されている」と定義することもできる。
【００７４】
本発明によるポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または合成ＤＮＡ）、またはそれらの修飾体、変異体、相同体、もしくは断片である。ＤＮＡは二本鎖または一本鎖であり、一本鎖の場合には、コード鎖または非コード（アンチセンス）鎖である。配列番号２、４、６および８に示される本発明によるタンパク質をコードする配列のいずれか１つは、(a)コード配列、(b)(a)の転写から誘導されるリボヌクレオチド配列、または(c)遺伝コードの重複または縮重により同じポリペプチドをコードするコード配列である。
【００７５】
相同ポリヌクレオチド配列は、相同アミノ酸配列と同様に定義される。好ましくは、相同ポリヌクレオチド配列は、本発明によるタンパク質をコードする配列もしくは配列番号１および５のコード配列、または配列番号２、４、６および８のタンパク質をコードする配列に対して、少なくとも４５％、より好ましくは６０％、最も好ましくは８５％同一である配列である。
【００７６】
相同ポリペプチドまたはアレル変異体をコードするポリヌクレオチドは、通常の方法によって抽出したゲノムウイルスポリヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって再生される（例２参照）。これは、コード領域の５′末端および３′末端の上流および下流に調和する合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用を含む。適当なプライマーは、配列番号１および５で提供されるヌクレオチド配列に従って設計される。この手順は、下記の通りである。すなわち、１０〜４０個、好ましくは１５〜２５個のヌクレオチドからなるプライマーを選択する。効率的なハイブリダイゼーションを確保するのに十分な割合、すなわち総ヌクレオチド含量の少なくとも４０％、好ましくは５０％のＣおよびＧヌクレオチドを含むプライマーを選択するのが有利である。標準的なＰＣＲ反応は、典型的には、１００μl当たりTaqＤＮＡポリメラーゼ０．５〜５単位、デオキシヌクレオチドをそれぞれ２０〜２００μM、好ましくは等濃度、総デオキシヌクレオチド濃度に対して０．５〜２．５mMのマグネシウム、１０５〜１０６個のターゲット分子、およびそれぞれのプライマー約２０pMを含む。約２５〜５０ＰＣＲサイクルを、プライマーの真のＴｍを１５℃〜５℃下回るアニーリング温度で行う。アニーリング温度をさらに厳密にすることによって、間違ってアニールされるプライマーの識別性が向上し、プライマーの３′末端における間違ったヌクレオチドの結合が減少する。９５℃〜９７℃の変性温度が典型的であるが、より高温がＧ＋Ｃの豊富なターゲットの変性に適当である場合もある。行うサイクルの数は、ターゲット分子の出発濃度によって異なるが、典型的には、４０を上回るサイクル数は、非特異的バックグラウンド産物が蓄積しがちであるので、勧められない。
【００７７】
相同ポリペプチドまたはアレル変異体をコードするポリヌクレオチドを再生するための他の方法は、ＤＮＡまたはＲＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングによる方法である。ハイブリダイゼーション手順は当技術分野で周知であり、Ausubel et al., (Ausubel et al.,「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & Sons Inc., 1994)、Silhavy et al. (Silhavy et al.「Experiments with Gene Fusions」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1984)、およびDavis et al. (Davis et al.,「A Manual for Genetic Engineering: Advanced Bacterial Genetics」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1980)に記載されている。ハイブリダイゼーション条件を最適化するのに重要なパラメーターは、これより高い温度では２本の相補的ＤＮＡ鎖が互いに分離する温度である臨界融解温度を得るのに用いられる式に反映されている(Casey & Davidson, Nucl. Acid Res. (1977) 4:1539)。約６００ヌクレオチド以上のポリヌクレオチドについては、この式は下記の通りである。すなわち、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１×（％Ｇ＋Ｃ）＋１６．６ｌｏｇ（カチオンのイオン濃度）−０．６３×（％ホルムアミド）−６００／塩基数である。適当なストリンジェンシー条件下では、ハイブリダイゼーション温度（Ｔｈ）は、Ｔｍ計算値より約２０〜４０℃、２０〜２５℃、または好ましくは３０〜４０℃低い。当業者であれば、最適温度および塩濃度が容易に決定することができることを理解するであろう。
【００７８】
ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの修飾体または組合せなどの本発明によるポリヌクレオチド分子は、様々な用途を有する。ＤＮＡ分子は、例えば、(i)組換え宿主系でコードされたポリペプチドを産生する方法に、(ii)遺伝子送達系の一部、例えば、送達されると発現されて膜融合を促進するリポソームとして、(iii)作動したときにポリヌクレオチドを発現して膜融合を促進する発現カセットの一部として調節要素に機能しうる形で連結され、さらには(iv)プローブまたはプライマーとして、用いられる。
【００７９】
従って、本発明の一つの態様は、(i)発現に要する要素の制御下、特に適当なプロモーターの制御下、におかれた本発明によるポリヌクレオチドを含む発現カセット、(ii)本発明による発現カセットを含む発現ベクター、(iii)本発明による発現カセットおよび／または発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションした原核または真核細胞、ならびに(iv)本発明によるポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を産生する方法であって、本発明による発現カセットおよび／または発現ベクターで形質転換またはトランスフェクションした原核または真核細胞を、宿主細胞に細胞傷害性なしに本発明によるＤＮＡ分子を発現させる条件下で培養し、宿主細胞培養物からコードされたポリペプチドまたはポリペプチド誘導体を回収することを含む方法、を包含する。
【００８０】
組換え発現系は、原核細胞および真核細胞宿主から選択される。本発明によるタンパク質は膜融合を促進するので、保持することができ、かつ細胞傷害性の許容限界内でタンパク質を発現することができる宿主細胞が選択される。真核生物宿主としては、酵母細胞（例えば、Saccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastoris）、植物細胞、および好ましくは細胞壁を有し、宿主細胞の一体性が融合活性によって損なわれない細胞が挙げられる。好ましい発現系は、E. coliのような原核細胞宿主である。細菌および真核細胞は、当業者に対する商業的供給元、例えば、American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, Maryland)などの多数の様々な供給源から入手することができる。組換えタンパク質発現に用いられる細胞の商業的供給元によれば、細胞の用法についての指示も提供される。
【００８１】
当業者は、総てのベクターと発現調節配列と宿主とが、本発明によるポリヌクレオチドを良好に発現すると予想されるわけではないことを容易に理解するであろう。しかしながら、下記の指針によれば、ベクター、発現調節配列、および宿主は、過度の実験を行うことなく、かつ、本発明の範囲から逸脱することなく選択することができる。
【００８２】
ベクターの選択において、宿主は、発現した膜融合タンパク質の融合活性によって影響を受けないように選択しなければならない。さらに、宿主は、そこに存在し、かつ複製する可能性があるベクターと適合するものを選択しなければならない。ベクターコピー数、コピー数を調節する能力、抗生物質耐性のような他のタンパク質の発現に関して考慮する。発現調節配列の選択においては、多くの可変要素が考慮される。重要な可変要素の中には、配列の相対強度（例えば、様々な条件下で発現を行う能力）、配列の機能を調節する能力、発現されるポリヌクレオチドと調節配列との間の適合性がある（例えば、効率的転写を妨げるヘアピン構造を回避する目的で、二次構造が考慮される）。宿主の選択においては、単細胞性宿主であって、選択したベクターと適合性であり、発現産物のあらゆる可能な毒性作用に耐性であり、この産物を効率的に発現することができ、産物を所望な配座で発現することができ、スケールアップが容易であり、かつ最終産物の精製に用いることが容易であるものが選択される。
【００８３】
発現カセットの選択は、選択される宿主系および発現したポリペプチドの所望な特徴によって異なる。典型的には、発現カセットとしては、選択される宿主系で機能し、かつ構成的または誘導性であることができるプロモーター、リボソーム結合部位、必要な場合には開始コドン（ＡＴＧ）、シグナルペプチドをコードする領域、本発明によるポリヌクレオチド、終止コドン、および場合によっては３′末端領域（翻訳および／または転写ターミネーター）が挙げられる。シグナルペプチドコード領域は本発明によるポリヌクレオチドに隣接し、適当なリーディングフレームに置かれている。シグナルペプチドコード領域は、成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子と同種または異種のものであり、発現に用いられる宿主の分泌機構と適合性である。本発明によるＤＮＡ分子によって構成されるオープンリーディングフレームは、単独で、またはシグナルペプチドと共に、プロモーターの調節下に置かれ、転写および翻訳が宿主系で起こるようにする。
【００８４】
プロモーターおよびシグナルペプチドコード領域は広く知られており、当業者には利用可能であり、例えば、アラビノースによって誘導可能であり、かつE. coliのようなグラム陰性細菌で機能するSalmonella typhimurium（および誘導体）のプロモーター（プロモーターaraB）（米国特許第５，０２８，５３０号明細書およびCagnon et al.の文献(Cagnon et al., Protein Engineering (1991) 4(7):843)に記載）、Ｔ７ポリメラーゼを発現する多数のE. coli株で機能するＲＮＡポリメラーゼをコードするバクテリオファージＴ７ポリメラーゼの遺伝子のプロモーター（米国特許第４，９５２，４９６号明細書に記載）、OspAリピド化シグナルペプチドおよびRlpBリピド化シグナルペプチド(Takase et al., J. Bact. (1987) 169:5692)が挙げられる。
【００８５】
本明細書で使用が意図されるプロモーターとしては、誘導性プロモーター（例えば、最小ＣＭＶプロモーター、最小ＴＫプロモーター、改質ＭＭＬＶ ＬＴＲ）、構成的プロモーター（例えば、ニワトリのα−アクチンプロモーター、ＭＭＬＶ ＬＴＲ（非改質）、ＤＨＦＲ）、および／または組織特異的プロモーターが挙げられる。
【００８６】
本発明の実施において使用が意図される誘導性プロモーターは、誘導条件下でｍＲＮＡの転写を最大限に促進する働きをする転写調節領域を含んでなる。適当な誘導性プロモーターの例としては、ＩＰＴＧに応答性のE. coli lacオペレーター（Nakamura et al., Cell, 18:1109-1117, 1979を参照されたい）、重金属（例えば、亜鉛）の誘導に応答性のメタロチオネインプロモーター金属調節要素（Evans et al.,米国特許第４，８７０，００９号明細書を参照されたい）、ＩＰＴＧに応答性のファージＴ７ｌａｃプロモーター（Studier et al., Meth. Enzymol., 185: 60-89, 1990、および米国特許第４，９５２，４９６号明細書を参照されたい）、熱ショックプロモーター、ＴＫ最小プロモーター、ＣＭＶ最小プロモーター、合成プロモーターなどに相当するＤＮＡ配列が挙げられる。
【００８７】
発現カセットは、典型的には発現ベクターの一部であり、発現ベクターは選択された発現系で複製する能力について選択される。発現ベクター（例えば、プラスミドまたはウイルスベクター）は、例えば、Pouwels et al.に記載されているものから選択することができる（「Cloning Vectors: A Laboratory Manual」1985, Supp. 1987）。適当な発現ベクターは、様々な商業的供給元から購入することができる。
【００８８】
宿主細胞を発現ベクターで形質転換／トランスフェクションする方法は当技術分野で周知であり、Ausubel et al.によって記載されているように、選択された宿主系によって異なる（Ausubel et al., 「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & Sons Inc., 1994）。
【００８９】
発現が起こると、本発明による組換えポリペプチド（またはポリペプチド誘導体）が産生され、細胞内区画に留まり、細胞外媒質または細胞周辺腔に分泌／排出され、または細胞膜に埋設される。ポリペプチドは、細胞抽出物から、または組換え細胞培養物を遠心分離した後に上清から、実質的に精製された形態で回収される。典型的には、組換えポリペプチドは、抗体ベースのアフィニティー精製によって、または当業者が容易に用いることができる他の周知の方法、例えば、ポリペプチドまたはその誘導体をコードするポリヌクレオチドの小さなアフィニティー結合ドメインへの融合によって精製される。免疫アフィニティーによって本発明によるポリペプチドを精製するのに有用な抗体は、下記のようにして得られる。
【００９０】
本明細書により提供される配列情報によって、診断目的に用いられる特異的なヌクレオチドプローブおよびプライマーの設計が可能となる。従って、本発明の一つの態様によれば、配列番号１または５に示されるコード配列に見られる配列、またはこれら配列から遺伝コードの縮重によって誘導される配列を有するヌクレオチドプローブまたはプライマーが提供される。
【００９１】
プライマーは、通常は、増幅過程（例えば、ＰＣＲ）、伸長過程、または逆転写法においてＤＮＡの酵素的重合の開始に用いられる約１０〜約４０ヌクレオチドのプローブである。ＰＣＲを伴う診断法に用いられるプライマーは、当技術分野で知られている方法によって標識される。
【００９２】
一つの実施態様によれば、場合によって標識された、融合タンパク質をコードするｃＤＮＡまたはその断片を用いて、新規な融合タンパク質をコードする別の配列について（複数の）ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムなど）を探索することができる。このようなスクリーニングは、典型的には、まず、約４２℃未満の温度、約５０％未満のホルムアミド濃度、および中〜低塩濃度を含んでなる低ストリンジェンシー条件下で行われる。ここで好ましいスクリーニング条件は、約３７℃の温度、約２０％のホルムアミド濃度および約５×標準クエン酸含有生理食塩水（ＳＳＣ；２０×ＳＳＣは３M塩化ナトリウム、０．３Mクエン酸ナトリウム，pH７．０を含む）を含んでなる。このような条件では、安定なハイブリッドの同定に完全な同一性を必要とすることなくプローブ配列と実質的な程度の類似性を有する配列が同定される。「実質的な類似性」という用語は、少なくとも５０％の同一性を有する配列を表している。好ましくは、ハイブリダイゼーション条件であって、プローブと少なくとも７０％の同一性を有するが、プローブとの同一性がより低い配列から識別される配列が同定できるものが選択される。
【００９３】
本明細書で用いられる核酸「プローブ」は、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらの類似体であって、配列番号１または５のいずれかに記載の任意の１４以上の連続塩基と同じ（またはその相補体である）少なくとも１４、好ましくは少なくとも２０、さらに好ましくは少なくとも５０の連続塩基を含むヌクレオチドの配列を有するものである。プローブは、以下に記載されるように、当技術分野で周知の方法によって標識し、様々な診断キットで用いることができる。
【００９４】
本明細書で用いられる「標識」および「指示手段」という用語は、それらの様々な文法上の形態において、複合体の存在を示すための検出可能なシグナルの産生に直接的または間接的に関与している単一原子および分子を表す。標識および指示手段は、核酸プローブ、発現したタンパク質、ポリペプチド断片、または本発明による抗体またはモノクローナル抗体組成物の一部である抗体分子に結合させ、または組込むことができる。これらの原子または分子は、単独で、または別の試薬と組み合わせて用いることができる。そのような標識は、それら自身臨床診断化学の分野において周知である。
【００９５】
標識手段は、抗体または抗原を変性することなく、それらに化学的に結合して、有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（色素）を形成する蛍光標識剤であることができる。適した蛍光標識剤は、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンwithoutイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ローダミン８２００スルホニルクロリド（ＲＢ−２００〜ＳＣ）などのような蛍光色素である。免疫蛍光分析法については、「Antibody As a Tool」, Marchalonis et al.監修のDeLuca著「Immunofluorescence Analysis」, John Wiley & Sons, Ltd., pp. 189-231 (1982)に記載されている。
【００９６】
好ましい実施態様によれば、指示基は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼなどの酵素である。主要な指示基が酵素である場合には、受容体−リガンド複合体（免疫反応体）が形成されている事実を可視化するには、別の試薬が必要である。ＨＲＰに対するこのような別の試薬としては、過酸化水素、およびジアミノベンジジンのような酸化色素前駆体が挙げられる。グルコースオキシダーゼと共に用いられる別の試薬は、２，２′−アジノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−Ｇ−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。
【００９７】
放射性元素も有用な標識剤であり、本明細書で実例として用いられる。典型的な放射性標識剤はγ線放射物を生成する放射性元素である。１２４Ｉ、１２５Ｉ、１２６Ｉ、１３１Ｉおよび５１Ｃｒのようなγ線を放射する元素は、１つのクラスの放射性元素指示基である。特に好ましいものは、１２５Ｉである。もう一つの群の有用な標識手段は、陽電子を放射する１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎなどの元素である。このようにして放射された陽電子は、動物体内に存在する電子と遭遇してγ線を生成する。３２Ｐ、１１１Ｉｎまたは３Ｈのようなβ放射体も有用である。
【００９８】
基質への標識の結合、すなわち核酸プローブ、抗体、ポリペプチド、およびタンパク質の標識は、当技術分野では周知である。例えば、ハイブリドーマによって産生した抗体分子は、培地に一成分として供給される放射性同位体を含むアミノ酸の代謝的取り込みによって標識することができる。例えば、Galfre et al., Meth. Enzymol., 73:3-46 (1981)を参照されたい。活性化官能基によるタンパク質接合の手法が、特に適用可能である。例えば、Aurameas et al., Scand. J. Immunol., Vol. 8, Suppl. 7:7-23 (1978)、Rodwell et al., Biotech., 3:889-894 (1984)、および米国特許第４，４９３，７９５号明細書を参照されたい。
【００９９】
(D)  膜融合タンパク質およびポリヌクレオチドを含む組成物
本明細書で用いられているように、本発明による組成物は１個または数個の本発明による膜融合タンパク質または誘導体を含む。
【０１００】
本発明による組成物での使用について、一つの実施態様によれば、膜融合タンパク質またはその誘導体を、リポソーム、好ましくは、中性またはアニオン性リポソーム、微小球、ＩＳＣＯＭＳ、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）中に、またはこれと共に製剤化され、送達が促進され、および／または免疫応答が増強される。これらの化合物は、当業者であれば容易に入手でき、例えば、「Liposomes: A Practical Approach」, RCP New Ed, IRL press (1990)を参照されたい。
【０１０１】
アニオン性および中性リポソームは、当技術分野では周知であり（例えば、リポソームの作製方法の詳細な説明については「Liposomes: A Practical Approach」, RCP New Ed, IRL press (1990)を参照されたい）、ポリヌクレオチドなどの広範囲の産物の送達に有用である。
【０１０２】
カチオン性脂質も当技術分野で知られており、薬剤または遺伝子送達に日常的に用いられている。このような脂質としては、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）としても知られるLipofectin（商標）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン）、およびＤＣ−Ｃｈｏｌ（３−β−（Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール）のようなコレステロール誘導体が挙げられる。これらのカチオン性脂質の記載は、欧州特許第１８７，７０２号明細書、国際公開第９０／１１，０９２号パンフレット、米国特許第５，２８３，１８５号明細書、国際公開第９１／１５，５０１号パンフレット、国際公開第９５／２６，３５６号パンフレット、および米国特許第５，５２７，９２８号明細書に見出すことができる。ポリヌクレオチドの送達のためのカチオン性脂質は、好ましくは、例えば国際公開第９０／１１，０９２号パンフレットに記載されているように、ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）のような中性脂質と共同して用いられる。
【０１０３】
カチオン性リポソームを含む製剤は、所望により他のトランスフェクション促進化合物を含んでもよい。多数の化合物が、国際公開第９３／１８，７５９号パンフレット、国際公開第９３／１９，７６８号パンフレット、国際公開第９４／２５，６０８号パンフレット、および国際公開第９５／２，３９７号パンフレットに記載されている。それらの化合物としては、核膜を通るＤＮＡの輸送を促進するのに有用なスペルミン誘導体（例えば、国際公開第９３／１８，７５９号パンフレットを参照されたい）およびＧＡＬＡ、Gramicidine Sおよびカチオン性胆汁塩のような膜浸透化化合物（例えば、国際公開第９３／１９，７６８号パンフレットを参照されたい）が挙げられる。
【０１０４】
本発明においては、本明細書に記載されているような、活性成分として溶解または分散された融合タンパク質、そのポリペプチド断片、または抗融合タンパク質抗体とともに、生理学的に許容可能な担体を含む治療組成物も意図される。
【０１０５】
本明細書で用いられる「医薬上許容可能な」および「生理学的に許容可能な」という用語、ならびにそれらの様々な文法上の形態は、組成物、担体、希釈剤、および試薬に対して用いられる場合において、互換的に用いられ、これらの材料が悪心、眩暈、胃の不調などの望ましくない生理学的効果を生じることなく哺乳動物に投与することができることを表している。
【０１０６】
溶解または分散した活性成分を含む薬理組成物の調製方法は、当技術分野で周知である。典型的には、このような組成物は液状溶液または懸濁液のような注射可能なものとして調製されるが、使用前に液体での溶液化または懸濁に適当な固形形態を調製することもできる。この調製物は乳化することもできる。
【０１０７】
活性成分は、医薬上許容可能であり、かつ活性成分と適合性である賦形剤と、本明細書に記載の治療方法において使用するのに適当な量で混合することができる。適した賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、ならびにそれらの組合せである。さらに、所望であれば、この組成物は、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤などの、活性成分の効力を高める補助物質を微量含むことができる。
【０１０８】
本発明による治療組成物は、成分の医薬上許容可能な塩を含むことができる。医薬上許容可能な非毒性の塩としては、例えば、塩酸、塩化臭素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、アントラニル酸、桂皮酸、ナフタレンスルホン酸、スルファニル酸などの無機酸を用いて形成される（ポリペプチドの遊離アミノ基にて形成される）酸付加塩が挙げられる。
【０１０９】
遊離カルボキシル基を用いて形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基、およびモノ−、ジ−およびトリ−アルキルおよび−アリールアミン（例えば、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、メチルアミン、ジメチルアミンなど）、および所望により置換されていてもよいエタノールアミン（例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミンなど）などの有機塩基から誘導することもできる。
【０１１０】
生理学的に許容可能な担体は、当技術分野で周知である。液状担体の例は、活性成分および水以外の材料を含まないか、または生理学的pH値を有するリン酸ナトリウム、生理食塩水、もしくはこれらの両者、例えばリン酸緩衝食塩水、のような緩衝液を含む、滅菌水性溶液である。さらにまた、水性担体は、２種類以上の緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムのような塩類、デキストロース、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含むことができる。
【０１１１】
液体組成物は、水の他に、あるいは水を排除して、液相を含むこともできる。このような別の液相の例は、グリセリン、綿実油のような植物油、および水−油エマルションである。
【０１１２】
治療上有効量は、所望な効果を得るために算出された所定の量である。必要な投与量は、具体的な治療および所望の治療の期間によって異なるが、１日当たり約１０μg／体重ｋｇ〜約１mg／体重ｋｇの投与量が治療に用いられることが予想される。場合によっては、このような化合物を蓄積（デポー）形態または長期持続形態で投与するのが特に有利であることがある。治療上有効量は、典型的には、生理学的に許容可能な組成物として投与したときに、約０．１μg/ml〜約１００μg/ml、好ましくは約１．０μg/ml〜約５０μg/ml、さらに好ましくは少なくとも約２μg/mlであり、通常は５〜１０μg/mlの血漿濃度を得るのに十分な本発明による融合タンパク質またはそのポリペプチド断片の量である。抗体は、当技術分野で知られている運用に従って釣り合った適量で投与される。
【０１１３】
(E)  使用方法
本発明の一つの態様によれば、本発明によるタンパク質、ポリヌクレオチドおよび組成物の使用方法が提供される。従って、融合させる複数の膜を上記タンパク質の有効量と接触させることを含んでなる、膜融合を促進する方法が提供される。
【０１１４】
本発明による融合が意図される膜としては、細胞膜、リポソーム膜、プロテオリポソーム膜などが挙げられる。
【０１１５】
本発明のさらに別の実施態様によれば、モノクローナル抗体、サイトカイン、および免疫モジュレーターの産生に有用なＢ細胞またはＴ細胞ハイブリドーマ細胞のようなヘテロカリオンを産生する方法であって、例えば、不死化骨髄腫細胞および一次Ｂ細胞もしくはＴ細胞を上記タンパク質の任意の１種類以上の存在下で接触させることを含んでなる方法、が提供される。本明細書での使用が意図される不死化細胞としては、ヒトまたはマウスＢ細胞骨髄腫細胞、Ｔ細胞骨髄腫などが挙げられ、本明細書での使用が意図される抗体産生細胞としては、免疫した哺乳動物に由来する精製された脾臓細胞などが挙げられる。
【０１１６】
本発明のさらに別の実施態様によれば、リポソーム−リポソーム融合物またはリポソーム−細胞融合物の産生方法であって、リポソームの形成に適する脂質と適当な細胞を本明細書に記載の１種類以上のタンパク質の存在下にて接触させることを含んでなる方法、が提供される。
【０１１７】
本発明のさらに別の実施態様によれば、リポソームを用いる生物活性化合物の細胞内送達の改良法であって、上記リポソームに本明細書に記載の１種類以上のタンパク質を組込むことを含んでなる改良法、が提供される。
【０１１８】
効率的な膜融合を促進する能力は、臨床的、工業的および基礎研究状況において広汎な実用性を有する。レオウイルス融合タンパク質を、例えば、モノクローナル抗体産生を目的としたハイブリドーマ細胞の産生の際に細胞−細胞融合を促進するための化学的に誘導した膜融合の代替物として用いることができる。この場合には、レオウイルス融合タンパク質は、一過性または恒久的にトランスフェクションした細胞個体群の内側から誘導的に発現して、これらの細胞と標的細胞個体群との融合を開始する。
【０１１９】
非定型レオウイルス融合タンパク質は、リポソーム−細胞融合の増強にも応用される。リポソームは、核酸、タンパク質、および代謝調節因子を細胞に導入する手段として開発されたものである。リポソーム−細胞融合は十分に実証されているが、膜融合における好ましくない熱力学的現象により融合の変化しやすい効率および細胞傷害性が見られ、これにより、細胞結合および融合を促進する特定のタンパク質を含むリポソームであるプロテオリポソームが開発されている。
【０１２０】
当技術分野で報告されているプロテオリポソーム研究のほとんどは、様々なエンベロープウイルス融合タンパク質の使用に関するものである。本発明によれば、本発明によるレオウイルス融合タンパク質と関連した新規な構造上の特徴をプロテオリポソームにおいて利用することにより、細胞培養物中およびイン・ビボの双方における生物活性化合物（例えば、核酸、タンパク質またはペプチド、薬理学的薬剤など）の細胞内送達を高めることが可能となる。
【０１２１】
本明細書に記載のレオウイルス融合タンパク質は、異なる種（例えば、トリ、およびヒトなどの哺乳動物）由来の多様な細胞型（例えば、繊維芽細胞およびマクロファージ）での膜融合を促進し、このことは、これらのタンパク質の限定された細胞受容体特異性および一般的実用性を示唆している。特異的受容体結合タンパク質をリポソーム膜に包含させることによって、レオウイルス融合タンパク質を含むプロテオリポソームを特異的な細胞型に標的化することも可能である。この場合には、受容体結合タンパク質により、リポソームの標的化した細胞への付着が付与され、その後、レオウイルス融合タンパク質によって媒介されるリポソーム−細胞融合が増強される。
【０１２２】
細胞−細胞融合を誘導するp14およびp16の実証された能力は、ヘテロカリオンの産生、例えば、モノクローナル抗体産生を目的とするハイブリドーマの生成における使用が可能であることを示唆している。細胞−細胞融合の誘導は、通常は化学的な膜融合性物質(fusogen)であるポリエチレングリコール（PEG）を用いて引き起こされる。この手順は細胞−細胞融合を引き起こすが、細胞に対する毒性作用によってヘテロカリオンの効率的単離が妨げられる。一般に、「天然の」膜融合はタンパク質−脂質相互作用によって実現されると考えられており、従って、タンパク質依存性の膜融合は化学誘導細胞融合より遙かに細胞傷害性が少ないと考えられる。
【０１２３】
効率的な細胞−細胞融合を促進する小型レオウイルス融合タンパク質の実証された能力は、化学誘導細胞融合に対する代替法としてそれらの使用が可能であることを示唆している。強力な誘導性プロモーターの制御下における細胞の一個体群でのp14またはp16の発現によって第二の細胞個体群との融合を引き起こすことができ、細胞傷害性が減少し、さらに効率的にヘテロカリオンを単離することができる。
【０１２４】
本明細書に記載されているエンベロープのないウイルスの融合タンパク質の非定型群は、生物活性分子の細胞内送達のためのリポソーム−細胞融合のタンパク質依存性の増強におけるエンベロープウイルス融合タンパク質の使用の代替物である。レオウイルス融合タンパク質の潜在的利点は、それらの独特な構造的および生物学的特徴に関連している。構造上の観点では、レオウイルス融合タンパク質の大きさが小さいことは、この系によって提供される最も明らかな利点である。エンベロープウイルス融合タンパク質は、大型であること、翻訳後にグリコシル化されること、および複雑な三次構造を有することにより、組換えＤＮＡ法および原核生物または真核生物発現系を用いる機能性タンパク質の合成および精製において問題が生じやすい。
【０１２５】
プロテオリポソームでのエンベロープウイルス融合タンパク質の使用に関する研究の大半はウイルス粒子の産生を伴い、次いでこれは精製され、洗剤で可溶化され、融合タンパク質を含むウイルスエンベロープは洗剤を除去することによって「ヴィロソーム」に再構成される（Grimaldi in Res. Virol., 146:289-293 (1995)、およびRamani et al., FEBS Lett., 404:164-168 (1997)を参照されたい）。ほとんどのエンベロープウイルス融合タンパク質とは異なり、レオウイルス融合タンパク質は小さな膜タンパク質である。それらの大きさが小さく、かつドメイン組織が単純であることは、これらのタンパク質を多様な発現および精製プロトコールを用いて機能的形態で産生することが一層容易であり、かつ一層経済的であることを示唆している。レオウイルス融合タンパク質が小型であることが、より複雑でないタンパク質フォールディング経路および正確なタンパク質配座に必要な三次構造に寄与しているとも考えられる。結果として、さらに多様な抽出および可溶化手順（例えば、洗剤および変性剤の選択）が利用可能となり、これにより機能性融合タンパク質の精製およびリポソームへの組込みが促進される。
【０１２６】
レオウイルス融合タンパク質の魅力的な生物学的特性は、多数の細胞型を用いる、pHに依存しないそれらの融合機構に関連する。レオウイルス融合タンパク質は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質とは異なり、中性pHにおいて機能し、これにより、生理学的条件下での細胞培養物およびイン・ビボにおけるそれらの使用が単純化される。さらに、レオウイルス融合タンパク質は、多数の種類の細胞を融合し、これにより、融合性物質としてのそれらの広汎な実用性が示唆される。このような細胞としては、標準的なトランスフェクション試薬を用いてのトランスフェクションが困難とされている樹状細胞、ニューロン、および幹細胞などの一次細胞型を挙げることができる。従って、レオウイルス融合タンパク質を用いて、リポソーム−細胞融合、ならびにＤＮＡもしくは他の生物活性化合物の多様な培養細胞型、一次細胞培養物、組織外植片への、またはイン・ビボでの効率的な細胞内送達を促進することができる。
【０１２７】
レオウイルス融合タンパク質を用いてヘテロカリオンを産生するには、タンパク質を、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて、制御された誘導的なやり方で細胞内から発現させることが必要となる。この方法の有用性は、既に非誘導的なやり方で同種の細胞−細胞融合において実証されている。同様なやり方で、これらのタンパク質は、異種の細胞型間の細胞−細胞融合を誘導的やり方で促進することができる。
【０１２８】
増強されたリポソーム−細胞融合のためのレオウイルス融合タンパク質の開発には、機能的融合タンパク質を発現させて精製し、それらをリポソーム膜中に組込んでプロテオリポソームを産生する必要がある。p14およびp16タンパク質は、標準的手順を用いて発現させ、精製することができる。発現は、タンパク質の発現レベルおよび機能活性によって、様々な発現系、例えば、バキュロウイルスまたは酵母真核生物の発現ベクターまたは原核生物の発現ベクターを用いて行うことができる。様々な洗剤抽出手順を用いてタンパク質を可溶化し、次にこれを標準的タンパク質精製プロトコールを用いて洗剤−タンパク質複合体として精製することができる。タンパク質は様々な洗剤（例えば、０．８％ Triton X100、０．８％ NP40、０．８％ オクチルグルコシド）に容易に溶解し、これにより、機能性タンパク質の精製において多様な方法を用いることが可能となる。レオウイルス融合タンパク質が小型であることは、タンパク質の可溶化および精製が、一層大きく、より複雑な膜タンパク質を精製するための同様な方法よりも、かなり簡単であることを示唆している。
【０１２９】
洗剤−タンパク質複合体を脂質と混合し、インフルエンザＨＡまたはセンダイウイルス Fタンパク質を含むヴィロソームを生成するのに用いられる方法と同様の標準的な公表された手順（Grimaldi, Res. Virol., 146:289-293 (1995)、およびRamani et al., FEBS Lett., 404:164-168 (1997)を参照されたい）に従って、透析、クロマトグラフィーまたは抽出によって洗剤を除去することができる。これらの手順によって、プロテオリポソーム、小胞膜に埋設されたＡＲＶ、ＮＢＶ、またはＢＲＶ融合タンパク質を含む脂質小胞が産生される。また、プロテオリポソーム産生の最適条件は、リポソーム−細胞融合の効率に影響を与える可能性があるプロテオリポソームの脂質組成および大きさと同様に、経験的に決定することができる。目的とする生物活性分子（例えば、核酸、タンパク質またはペプチド、薬理学的化合物など）をプロテオリポソームの形成中に含ませ、リポソーム内の分子のパッケージングを容易にすることができる。プロテオリポソームは、遠心分離によって精製し、タンパク質によって増強されたプロテオリポソームと細胞膜との融合によって、細胞培養物中またはイン・ビボで生物活性分子を細胞内に送達するのに用いることができる。
【０１３０】
上述のように、化合物の細胞内送達の目的でのリポソームまたはプロテオリポソームの使用は当技術分野で知られており、その方法の開発が幾つかの領域で進行している。本発明による系に独特な点は、既知の膜融合性の変温性レオウイルスのみから単離された、エンベロープを持たないウイルスの融合タンパク質の、非定型な、以前には同定されていない群を用いることである。この新規な群の融合タンパク質における、通常見られない構造および機能特性は、これらのタンパク質が、現在タンパク質依存性の膜融合の開発に関連した問題の多くを回避し得ることを示唆している。
【０１３１】
本発明は、幾つかの好ましい本発明の実施態様に関して詳細に説明されているが、その改質および変更は、説明され、かつ特許請求されている発明の精神および範囲内にあることが理解されるであろう。
【実施例】
【０１３２】
例１：ウイルス増殖および精製
ウイルスは、サルVero細胞でプラーク精製し、増殖させた。ウイルス粒子は、文献の記載（Duncan, Virology, 219: 179-189, 1996を参照されたい）に従って、分画遠心分離によって感染細胞の溶解物から単離し、濃縮した。
【０１３３】
例２：ｃＤＮＡの合成およびクローニング
ウイルスゲノムｄｓＲＮＡ断片を、ビリオン外の混入細胞核酸を除去するためにＲＮアーゼおよびＤＮアーゼで前処理した保存濃縮ウイルスから単離した。ウイルス粒子は１％ＳＤＳを用いて粉砕し、ウイルスｄｓＲＮＡをフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈澱によって単離した。ゲノムｄｓＲＮＡ（２０μg）の一部をE. coliポリ−Ａポリメラーゼを用いてポリ−Ａ尾部を付け、尾部を付けたＲＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分画し、個々のゲノム断片を、RNaidプロトコール(Bio101)を用いて、その製造業者が指示した手順に従って単離した。
【０１３４】
尾部のあるＳクラスゲノム断片を、Superscript逆転写酵素(Life Technologies Inc.)およびオリゴ−ｄＴプライマーを用いる逆転写の鋳型として用いた。＋および−ｃＤＮＡ鎖の一部を、Ventポリメラーゼ (New England Biolabs)およびNotI制限酵素部位を含むオリゴ−ｄＴプライマーを用いるＰＣＲ増幅の鋳型として用いた。
【０１３５】
ＰＣＲ反応の生成物をNotIで消化し、アガロースゲル上でサイズ分画し、完全長Ｓゲノム断片に相当する生成物をGeneclean (Bio101)を用いてゲル精製した。個々のNotI消化した二本鎖ｃＤＮＡをpBluescript (Stratagene)のNotI部位にクローニングし、配列決定の鋳型として用いた。
【０１３６】
例３：配列決定および配列分析
クローニングしたｃＤＮＡを、NRC/Dalhousie Joint Sequencing Core Facilityの自動ＤＮＡシークエンサー(Licor)を用いて配列決定した。総ての配列は、両方のｃＤＮＡ鎖から完全に決定した。完全長ｃＤＮＡ配列を集め、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアを用いて分析した（Devereaux et al., Nucleic Acids Res., 12:387-395 (1984)を参照されたい）。
【０１３７】
例４：ＲＲＶおよびＡＱＶの融合タンパク質をコードするゲノム断片の同定
ＲＲＶおよびＡＱＶｃＤＮＡクローンを、ＣＭＶプロモーターの制御下で真核生物発現ベクターpcDNA3 (Invitrogen)中にサブクローニングした。プラスミドＤＮＡを単離し、Qiagenミディカラム(Qiagen)上で製造業者の指示に従って精製した。プラスミドＤＮＡ（１μg）をLipofectamine（3μl）(Life Technologies Inc.)と混合し、１２穴クラスタープレートで増殖させたサブコンフルエントな細胞単層のトランスフェクションに用いた。トランスフェクションした細胞単層を３７℃で２４〜４８時間インキュベーションした後、文献の記載（Duncan et al., Virology, 224:453-464 (1996)を参照されたい）に従って、メタノールで固定し、水溶性のWright-Giemsa染料(DiffQuik; VWR-Canlab)で染色した。染色した単層の光学顕微鏡観察により細胞融合を評価し、シンシチウム集束体（フォーカス）を１００倍の倍率で撮影した。このプロトコールを用いて、ＲＲＶのＳ１ゲノム断片およびＡＱＶのゲノム断片７が、これらのウイルスの融合タンパク質をコードするものと決定した。
【０１３８】
例５：p14およびp16融合タンパク質の同定
爬虫類レオウイルス（ＲＲＶ）およびアクアレオウイルス（ＡＱＶ）によって誘導される細胞−細胞融合に関与する２種類の関連性のない融合タンパク質を同定した。これらのタンパク質は、本明細書では（ＲＲＶについて）p14および（ＡＱＶについて）p16と呼ばれ、それらの近似的予測分子量を反映している。p14およびp16をコードする遺伝子をクローニングし、配列決定した。これらのタンパク質の配列から予測される構造上の構成を分析し、それらの膜融合特性を直接明らかにした。ＲＲＶのＳ１ゲノム断片およびＡＱＶのゲノム断片７の構成を図１に概略的に示し、ｃＤＮＡ配列および推定翻訳生成物を図２〜５（配列番号１〜６）に示す。
【０１３９】
爬虫類レオウイルスのp14：
配列分析により、ＲＲＶのＳ１ゲノム断片は長さが１５０１塩基対であり、かつ他のＲＲＶゲノム断片に存在する保存末端ヌクレオチド配列：5'-GTTA...TCATC-3'を含むことが決定され、この配列はＳ１ゲノム断片の完全長ｃＤＮＡ配列を表すことを示唆している。これは、あらゆる爬虫類レオウイルスのあらゆるゲノム断片について報告される初めてのヌクレオチド配列である。
【０１４０】
配列分析により、２種類の連続した重複ＯＲＦが存在することが明らかになった。配列類似性に基づき、ヌクレオチド３８６〜１４３２に及ぶ第二のＯＲＦ（ＡＴＧ開始コドンを含み、終止コドンが無い）は典型的なレオウイルス細胞付着タンパク質の３４９アミノ酸相同物であって、トリレオウイルスについてはシグマＣと呼ばれ、哺乳動物レオウイルスについてはシグマ１と呼ばれるものをコードする(Shapouri et al., J. Gen. Virol., 76:1515-1520)。
【０１４１】
ヌクレオチド２５〜３９９に及ぶ第一のＯＲＦは、以前には同定されていない推定１２５アミノ酸のタンパク質をコードする。第一のＯＲＦの推定された１２５アミノ酸生成物は、既知のレオウイルスタンパク質の中に相同物を持たず、データーバンクに含まれる任意のタンパク質に対する有意な配列類似性を示さない。第一のＯＲＦを、特異的プライマーを用いるＰＣＲによってpcDNA3にサブクローニングした。トランスフェクション細胞で第一のＯＲＦのみが発現した結果、細胞−細胞融合を生じ（例８を参照されたい）、ＲＲＶがp14と呼ばれる新規な１４Kdaの融合タンパク質をコードすることを示唆していた。
【０１４２】
アクアレオウイルスのp16：
ＡＱＶのゲノム断片７の配列は長さが１３９８塩基対であり、かつ他のＡＱＶゲノム断片に存在する保存末端ヌクレオチド配列：5'-GTTT...TCATC-3'を含むことが見出され、この配列はゲノム断片７の完全長ｃＤＮＡ配列を表すことが示唆された。これは、あらゆるアクアレオウイルスのゲノム断片７について報告される初めてのヌクレオチド配列である。
【０１４３】
配列分析により、ＡＱＶのゲノム断片７上のＯＲＦの複雑な配置が明らかになった。第一のメチオニン開始コドンは、遺伝子の５′末端から４８８ヌクレオチドまでには見られない。この開始コドンの次に、恐らく以前に同定されているＮＳ２８タンパク質であって、この遺伝子断片の唯一の既知の遺伝子産物である推定２７８アミノ酸タンパク質をコードする単一ＯＲＦが続く（Subramanian et al., Virology, 205:75-81 (1994)）。この開始コドンに先行する５′末端の４８７ヌクレオチド中には、全３種の読み枠においてＯＲＦが含まれる。読み枠「ａ」におけるＯＲＦはヌクレオチド１〜２６７にわたり、読み枠「ｂ」におけるＯＲＦはヌクレオチド８〜４８１にわたり、読み枠「ｃ」におけるＯＲＦはヌクレオチド３〜３０２にわたる。これらの各ＯＲＦは通常のＡＴＧ開始コドンを欠いているが、例えば、センダイウイルスのＰｍＲＮＡによってコードされるＣタンパク質で起こるように（Curran and Kolakofsky, EMBO J., 7:245-251 (1988)を参照されたい）、開始コドンとしてメチオニン以外のコドンを用いて機能することができると考えられる。これらのＡＱＶのＯＲＦは、読み枠ａ、ｂおよびｃについて、それぞれ８９、１５８または１００アミノ酸のタンパク質をコードすることができる。
【０１４４】
ＡＱＶゲノム断片７の５′末端の４８４ヌクレオチドを、特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅によってpcDNA3にサブクローニングし、トランスフェクション細胞で発現させたところ、細胞−細胞融合が誘導されることを見出した。この結果から、ＡＱＶ融合タンパク質はゲノム断片の５′末端附近に存在する３種類の推定小型ＯＲＦのうちの１個によってコードされることが確かめられた。
【０１４５】
この領域によってコードされる３種類の可能な遺伝子産物のうち、読み枠ｂにおいて可能性のあるp16と呼ばれる１５８アミノ酸生成物のみが、膜融合を引き起こすことができるタンパク質について予測されるように、膜局在化タンパク質であることが予測された（TMpredおよびPSORTアルゴリズムを用いて決定されるように、２個の膜貫通領域がp16に存在することが予測される；例７を参照されたい）。第二のＯＲＦによってコードされるp16がＡＱＶ融合タンパク質を表すことを確かめるため、位置指定突然変異誘発法を用いて５９位にＣからＴへの置換を挿入した。この置換により、読み枠ｂに翻訳停止部位が特異的に導入され、これにより１７コドンのみの後にp16ＯＲＦの未成熟終止が生じる。この置換により細胞融合が排除され、よって、ＯＲＦｂの予測されたp16遺伝子産物がＡＱＶ融合タンパク質であることが確かめられた。p16ＯＲＦは典型的なメチオニン開始コドンを欠いているので、p16の正確な開始部位は現在のところは知られていないが、５９位の終止コドンを遺伝子工学で作製するのに用いたヌクレオチド置換の上流に存在する１７コドンのうちの一つであることは明らかである。
【０１４６】
例６：p14の配列分析
ＲＲＶp14融合タンパク質は、長さが１２５アミノ酸のみの最も小さな既知の融合タンパク質の一つである。これは、エンベロープウイルス融合タンパク質、細胞ＳＮＡＲＥタンパク質、またはトリレオウイルスおよびNelson Bayレオウイルスについて既に同定されている融合タンパク質（Shmulevitzand Duncan, EMBO J., 19:902-912 (2000), White, Annu. Rev. Physiol., 52:675-697 (1990), Weber et al., Cell, 92:759-772 (1998)）などの、膜融合タンパク質とされているものなど、データーベースにおける任意のタンパク質と有意な配列類似性を示さない。従って、p14は、新規な膜融合タンパク質である。
【０１４７】
p14タンパク質は、TMpredおよびPSORTアルゴリズムを用いて検出された、残基３９〜５７の間に位置する単一の推定膜貫通ドメインを含んでいる（図４を参照されたい）。これは、Ｎ末端ミリスチル化コンセンサス配列(MGXXXS/T)をも含んでおり、これは、このタンパク質をアシル化することができることを示唆している。配列分析では、膜貫通ドメインのC−近位側に塩基性残基のクラスター、およびタンパク質のＣ末端附近に位置するポリプロリンモチーフおよびＮ連結型グリコシル化コンセンサス配列(NXS/T)も検出された（図４を参照されたい）。
【０１４８】
興味深いことに、p14は、エンベロープウイルス融合タンパク質の細胞内ドメインに位置し、かつ融合タンパク質の標的となる膜への挿入に関与している疎水性アミノ酸の小さな伸長部である、明らかな融合ペプチドを欠いている。さらに、p14タンパク質は、エンベロープウイルス融合タンパク質で見られる、再編成に要するいかなる７残基反復をも欠いている。p14において融合ペプチドおよび７残基反復モチーフが欠けていることは、p14が、詳細に報告されているエンベロープウイルス融合タンパク質について提案された機構（White, Ann. Rev. Physiol., 52:675-697 (1990)を参照されたい）とは異なる機構によって膜融合を促進することができることを示唆している。
【０１４９】
例７：p16の配列分析
ＡＱＶp16融合タンパク質は、ＲＲＶp14融合タンパク質、トリレオウイルスまたはNelson Bayレオウイルスの融合タンパク質、またはデーターベース中の任意の他のタンパク質のいずれとも明白な配列相同性を示さない。p16タンパク質は、大きさが約１５８アミノ酸である。正確な大きさは知られておらず、p16ＯＲＦ中に存在する１７Ｎ末端コドンのいずれがこのタンパク質の開始コドンとして働くかによって異なる。p14とは異なり、p16タンパク質は、およそ残基３５〜５７および９２〜１１０の間に位置する２種類の推定膜貫通ドメインを有する。膜貫通ドメインのこの配置は、p16について、珍しいポリトピック(polytopic)膜配向を示唆している。p14の場合と同様に、p16は、膜貫通ドメインに隣接する塩基性残基のクラスターを含み、p16は明白な融合ペプチドおよび７残基反復モチーフをも欠いている。
【０１５０】
例８：p14およびp16融合タンパク質による細胞−細胞融合の誘導
これらのレオウイルスタンパク質の融合を誘導する能力は、他のレオウイルスタンパク質の非存在下、トランスフェクション細胞でそれらを発現させることによって直接実証されており、細胞内発現により、この群の膜融合性レオウイルスによるウイルス感染に特徴的な細胞−細胞融合およびシンシチウム形成が誘導される。従って、ウズラまたはVero細胞単層を、ＲＲＶまたはＡＱＶ融合タンパク質を発現するプラスミドＤＮＡで模擬トランスフェクションまたはトランスフェクションした。トランスフェクション細胞を固定し、感染から２４時間後に、Wright-Giemsa染料を用いて核を染色し、染色した単層を１００倍の倍率で写真撮影した。
【０１５１】
ＲＲＶp14またはＡＱＶp16を発現するプラスミドのトランスフェクションによって、広汎な細胞融合が生じ、多核シンシチウム（ポリカリオン）が発生した。ポリカリオンの発生は、トランスフェクション細胞を染色して細胞核を表示したときには明白であり、これは大きなシンシチウム細胞内での核のクラスタリングを明らかに示していた。模擬トランスフェクション細胞は、シンシチウム形成の兆候を示さず、細胞融合がトランスフェクション細胞内でのレオウイルスタンパク質の発現の直接的結果であることを示唆していた。これらの結果は、本発明によるレオウイルス融合タンパク質の膜融合を誘導する能力を明確に示している。
【０１５２】
他のレオウイルスタンパク質のトランスフェクションによっては細胞融合を誘導することはできず、これはp14またはp16に特異的なことであることを示唆している。さらに、これらのタンパク質はいずれもトリまたは哺乳動物起源の様々な細胞型で細胞融合を誘発し、膜融合を誘発するためのこれらのタンパク質の一般的有用性を示唆している。
【０１５３】
本発明は、幾つかの好ましい本発明の実施態様に関して詳細に説明されているが、その改質および変更は、説明され、かつ特許請求されている発明の精神および範囲内にあることが理解されるであろう。
【０１５４】
配列の概要
配列番号１は、爬虫類レオウイルス（ＲＲＶ）のＳ１ゲノム断片のｃＤＮＡヌクレオチド配列である。p14をコードするオープンリーディングフレームが示されている。
【０１５５】
配列番号２は、配列番号１によってコードされるp14タンパク質の推定アミノ酸配列である。
【０１５６】
配列番号３は、爬虫類レオウイルス（ＲＲＶ）のＳ１ゲノム断片のｃＤＮＡヌクレオチド配列である。シグマＣタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが示されている。
【０１５７】
配列番号４は、配列番号１または３によってコードされるシグマＣタンパク質の推定アミノ酸配列である。
【０１５８】
配列番号５は、アクアレオウイルス (ＡＱＶ)のゲノム断片７のｃＤＮＡヌクレオチド配列である。p14をコードするオープンリーディングフレームが示されている。
【０１５９】
配列番号６は、配列番号５によってコードされるp16タンパク質の推定アミノ酸配列である。イニシエーターコドンは最初の１７コドンのうちの一つであり、その正確な位置は決定されていないことに留意されたい。
【０１６０】
配列番号７は、アクアレオウイルス（ＡＱＶ）のゲノム断片７のｃＤＮＡヌクレオチド配列である。NS28タンパク質をコードするオープンリーディングフレームが示されている。
【０１６１】
配列番号８は、配列番号５または７によってコードされるNS28タンパク質の推定アミノ酸配列である。
【図面の簡単な説明】
【０１６２】
【図１】図１は、レオウイルス融合タンパク質をコードするゲノム断片の概略図である。図１Ａは、爬虫類レオウイルス（ＲＲＶ）由来のＳ１ゲノム断片を表す。図１Ｂは、アクアレオウイルス（ＡＱＶ）由来のゲノム断片７を表す。それぞれの図における太線は、ｃＤＮＡを示す。ボックス部分はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を表す。ＯＲＦは、ＯＲＦの名称またはコードされる遺伝子産物（ボックス内）、および各ＯＲＦにおけるアミノ酸コドンの数によって特定されている。小さな数字は、ｃＤＮＡまたは示したＯＲＦの最初および最後のヌクレオチドを表す。膜融合タンパク質をコードするＯＲＦには斜線が付されている。
【図２】図２は、ビシストロニックＲＲＶ Ｓ１ゲノム断片のヌクレオチド配列（配列番号１）、ならびにp14融合タンパク質をコードする第一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の推定アミノ酸配列（配列番号２）および無関連のシグマＣ細胞接着タンパク質をコードする第二のＯＲＦの推定アミノ酸配列（配列番号４）を表す。
【図３】図３は、ポリシストロニックＡＱＶゲノム断片７のヌクレオチド配列（配列番号５）、ならびにp16融合タンパク質をコードする５′−近位ＯＲＦの推定アミノ酸配列（配列番号６）および無関連の非構造ウイルスタンパク質NS28をコードする３′−近位ＯＲＦの推定アミノ酸配列（配列番号８）を表す。
【図４】図４は、ＲＲＶp14融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）を表す。予測される膜貫通ドメインには、上部に罫線を引き、その旨を記載している。正に帯電したアミノ酸のクラスターは、＋印で標識している。Ｃ末端付近のポリプロリン領域の上部には罫線を引き、その旨を表示している(pro)。Ｎ末端コンセンサスミリスチル化配列(MGXXXS/T)も表示している(myr)。
【図５】図５は、ＡＱＶp16融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号６）を表す。予測される膜貫通ドメインには、上部に罫線を引き、その旨を記載している。膜貫通ドメインに隣接する正に帯電したアミノ酸のクラスターは、＋印で標識している。
【図６】図６は、ＡＲＶおよびＮＢＶに由来するp10タンパク質の融合ペプチドモチーフ内の無極性アミノ酸の概略図である。７残基反復は両親媒性へリックスの疎水性表面を構成すると考えられ、これは、この種の膜融合タンパク質と膜との相互作用にとって重要であると考えられる。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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2004520019.tif 000093
2004520019.tif 000094
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520019.tif 000095
2004520019.tif 000096
【手続補正書】
【提出日】平成15年8月4日(2003.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたタンパク質であって、
(a)  レオウイルス科のゲノムによってコードされ、
(b)  膜融合タンパク質であり、
(c)  少なくとも１個の膜貫通ドメインを含んでなり、
(d)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩが
(i)  １７〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．６〜０．７であり、かつ
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であるものであり、かつ
(e)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩＩが
(i)  １６〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．３〜０．４であり、
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であり、かつ
(iv)  ７残基反復を含むものである、
タンパク質。
【請求項２】
タンパク質であって、
(a)  膜融合タンパク質であり、
(b)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩが
(i)  １７〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．６〜０．７であり、かつ
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であるものであり、
(c)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩＩが
(i)  １６〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．３〜０．４であり、
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であり、かつ
(iv)  ７残基反復を含むものであり、
(d)  請求項１に記載のタンパク質に対して少なくとも３３％の全体的な同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ
(e)  請求項１に記載のタンパク質の膜貫通ドメインに対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインを含んでなる、
タンパク質。
【請求項３】
オルトレオウイルスおよびアクアレオウイルスからなる属から選択されるレオウイルスのゲノムによってコードされる、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
天然において変温性宿主に感染するレオウイルスのゲノムによってコードされる、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
７以上の等電点を有するものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
多くとも２５残基の連続配列内に存在する少なくとも３個の正に帯電したアミノ酸残基からなる正のクラスターであって、前記連続配列がＣ末端側の膜貫通ドメインに隣接する多くとも１００残基内に存在するものである、正のクラスター、をさらに含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
少なくとも３個の連続したプロリン残基を含んでなるポリプロリンモチーフを含んでなる非膜貫通ドメインをさらに含んでなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
脂肪族アシル化配列をさらに含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９】
レオウイルス科のゲノムによってコードされる単離されたタンパク質であって、
膜融合タンパク質であり、少なくとも１個の膜貫通ドメインを含んでなり、融合ペプチドモチーフＩおよび融合ペプチドモチーフＩＩを含まず、配列番号２および配列番号６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、タンパク質。
【請求項１０】
配列番号２のアミノ酸配列を含んでなる、単離されたタンパク質。
【請求項１１】
配列番号６のアミノ酸配列を含んでなる、単離されたタンパク質。
【請求項１２】
タンパク質であって、
(a)  膜融合タンパク質であり、
(b)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩが
(i)  １７〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．６〜０．７であり、かつ
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であるものであり、
(c)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩＩが
(i)  １６〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．３〜０．４であり、
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であり、かつ
(iv)  ７残基反復を含むものであり、
(d)  配列番号２に対して少なくとも３３％の全体的な同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ
(e)  配列番号２の第３９〜５７アミノ酸の配列に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインを含んでなる、
タンパク質。
【請求項１３】
タンパク質であって、
(a)  膜融合タンパク質であり、
(b)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩが
(i)  １７〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．６〜０．７であり、かつ
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であるものであり、
(c)  そのアミノ酸配列が融合ペプチドモチーフＩＩを含まず、ここで、該融合ペプチドモチーフＩＩが
(i)  １６〜２８残基長のアミノ酸配列であり、
(ii)  疎水性値が０．３〜０．４であり、
(iii)  アラニンとグリシンの含量の和が２９〜４３％であり、かつ
(iv)  ７残基反復を含むものであり、
(d)  配列番号６に対して少なくとも３３％の全体的な同一性を有するアミノ酸配列を含んでなり、かつ
(e)  配列番号６の配列5' WAIPPLAICCCCCICCTGGLYLV 3'に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するか、または配列番号６の配列5' YIALASVILVTLVISLIWNCLGTGLIL 3'に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインを含んでなる、
タンパク質。
【請求項１４】
多くとも２５残基の連続配列内に存在する少なくとも３個の正に帯電したアミノ酸残基からなる正のクラスターであって、前記連続配列がＣ末端側の膜貫通ドメインに隣接する多くとも１００残基内に存在するものである、正のクラスター、をさらに含んでなる、請求項１２または１３に記載のタンパク質。
【請求項１５】
少なくとも３個の連続したプロリン残基を含んでなるポリプロリンモチーフを含んでなる非膜貫通ドメインをさらに含んでなる、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１６】
脂肪族アシル化配列をさらに含んでなる、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記脂肪族アシル化配列がミリスチル化コンセンサス配列であり、該コンセンサス配列が、
（イニシエーターMet無し）Gly1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-
（但し、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6は帯電していない小型の残基であり、かつAA6はプロリンではない）
である、請求項１６に記載のタンパク質。
【請求項１８】
AA5がセリンまたはトレオニンである、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
配列番号１または配列番号５、または同一アミノ酸配列をコードするその縮重変異体、またはそのスプライス変異体ヌクレオチド配列を含んでなる、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２１】
プロモーターに機能しうる形で連結された、請求項１９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２２】
プロモーターが誘導性である、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項２４】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質が単離された前記ポリヌクレオチドから発現するものである、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質を含むリポソーム。
【請求項２６】
請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むリポソーム。
【請求項２７】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質に対する抗体。
【請求項２８】
２以上の膜の融合を促進する方法であって、融合させる複数の膜を請求項１〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質の有効量と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項２９】
前記複数の膜が、細胞膜、リポソーム膜、およびプロテオリポソーム膜からなる群より選択されるものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記複数の膜が細胞の膜であり、かつヘテロカリオンが生産される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記複数の膜が、不死化細胞および一次Ｂ細胞もしくはＴ細胞のものである、ハイブリドーマ細胞を生産するための、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ハイブリドーマ細胞が、モノクローナル抗体、サイトカイン、および免疫モジュレーターから選択される物質を生産するものである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ハイブリドーマ細胞がモノクローナル抗体を生産するものであり、かつ前記複数の膜が不死化細胞および抗体産生細胞のものである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記不死化細胞がヒトまたはマウスのＢ細胞骨髄腫細胞またはＴ細胞骨髄腫細胞であり、かつ前記抗体産生細胞が免疫化した哺乳動物由来の単離された脾臓細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数の膜が、リポソーム膜、リポソーム膜と細胞膜、およびプロテオリポソーム膜と細胞膜からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記リポソームまたは前記プロテオリポソームが生物活性薬剤を含むものである、請求項３５に記載の方法。請求項９が補正された。国際出願時の請求項２３が削除され国際出願時の請求項２４が新たな請求項２３になり、請求項２４が新たに追加された。その他の請求項は国際出願のままである。
【国際調査報告】
2004520019.tif 000097
2004520019.tif 000098
2004520019.tif 000099
2004520019.tif 000100
2004520019.tif 000101
2004520019.tif 000102