(57)【要約】本発明は、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの変異体（突然変異体）に関し、この変異体はα−アミラーゼ活性を有しかつ、特に高い温度および／または低いｐＨ、および／または低いＣａ２＋において、前記親α−アミラーゼに関して変更された安定性を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
４９、６０、１０４、１３２、１６１、１７０、１７６、１７９、１８０、１８１、１８３、２００、２０３、２０４、２０７、２１２、２３７、２３９、２５０、２８０、２９８、３１８、３７４、３８５、３９３、４０２、４０６、４２７、４３０、４４０、４４４、４４７、４８２のグループから選択される１または２以上の位置に変更を含んでなる親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの変異体であって、ここで
（ａ）　１または２以上の変更は独立的に
（ｉ）　前記位置を占めるアミノ酸から下流のアミノ酸の挿入、
（ｉｉ）　前記位置を占めるアミノ酸の欠失、または
（ｉｉｉ）　前記位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸による置換、
であり、
（ｂ）　変異体はα−アミラーゼ活性を有し、そして
（ｃ）　各位置は配列番号８に示すアミノ酸配列を有する親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応する、
親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの変異体。
【請求項２】
変異体が下記の変異の１または２以上を有する、請求項１に記載の変異体：Ｔ４９Ｉ；Ｄ６０Ｎ；Ｎ１０４Ｄ；Ｅ１３２Ａ、Ｖ、Ｐ；Ｄ１６１Ｎ；Ｋ１７０Ｑ；Ｋ１７６Ｒ；Ｇ１７９Ｎ；Ｋ１８０Ｔ；Ａ１８１Ｎ；Ｄ１８３Ｎ；Ｄ２００Ｎ；Ｘ２０３Ｙ；Ｄ２０４Ｓ；Ｄ２０７Ｖ、Ｅ、Ｌ、Ｇ；Ｘ２１２Ｉ；Ｋ２３７Ｐ；Ｓ２３９Ｗ；Ｅ２５０Ｇ、Ｆ；Ｎ２８０Ｓ；Ｘ２９８Ｑ；Ｌ３１８Ｍ；Ｑ３７４Ｒ；Ｅ３８５Ｖ；Ｑ３９３Ｒ；Ｙ４０２Ｆ；Ｈ４０６Ｌ、Ｗ；Ｌ４２７Ｉ；Ｄ４３０Ｎ；Ｖ４４０Ａ；Ｎ４４４Ｒ、Ｋ；Ｅ４４７Ｑ；Ｑ４８２Ｋ、ここでナンバリングのために配列番号８を使用する。
【請求項３】
変異体が下記の変異を有する、請求項１または２に記載の変異体：
【化１】
2004508815.tif 000026
【化２】
2004508815.tif 000027
ここでナンバリングのために配列番号８を使用する。
【請求項４】
親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼがバシラス・リヘニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（配列番号８）、バシラス・アミロリクファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（配列番号１０）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（配列番号６）の株に由来する、請求項１〜３のいずれかに記載の変異体。
【請求項５】
親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼが下記のいずれかである、請求項１〜４のいずれかに記載の変異体：ＬＥ１７４；ＬＥ１７４＋Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｉ２０１Ｆ；ＬＥ１７４＋Ｍ１９７Ｌ；ＬＥ１７４＋Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｍ１９７Ｌ＋Ｉ２０１Ｆ。
【請求項６】
変異体が下記の位置の１または２以上において変異されている、請求項１に記載の変異体：Ｔ５１Ｉ；Ｄ６２Ｎ；Ｎ１０６Ｄ；Ｄ１３４Ａ、Ｖ、Ｐ；Ｄ１６３Ｎ；Ｘ１７２Ｑ；Ｋ１７９Ｒ；Ｇ１８４Ｎ；Ｋ１８５Ｔ；Ａ１８６Ｎ；Ｄ１８８Ｎ；Ｄ２０５Ｎ；Ｍ２０８Ｙ；Ｄ２０９Ｓ；Ｘ２１２Ｖ、Ｅ、Ｌ、Ｇ；Ｌ２１７Ｉ；Ｋ２４２Ｐ；Ｓ２４４Ｗ；Ｎ２５５Ｇ、Ｆ；Ｎ２８５Ｓ；Ｓ３０３Ｑ；Ｘ３２３Ｍ；Ｄ３８７Ｖ；Ｎ３９５Ｒ；Ｙ４０４Ｙ；Ｈ４０８Ｌ、Ｗ；Ｘ４２９Ｉ；Ｄ４３２Ｎ；Ｖ４４２Ａ；Ｘ４４６Ｒ、Ｋ；Ｘ４４９Ｑ、Ｋ；Ｘ４８４Ｋ、ここでナンバリングのために配列番号４（ＳＰ７２２）を使用する。
【請求項７】
変異体が下記の変異を有する、請求項１または６に記載の変異体：Ｅ２１Ｖ＋Ｎ２８５Ｓ；Ｄ１３４Ａ＋Ｅ２１２Ｖ；Ｎ２５５Ｇ＋Ｈ４０８Ｌ＋Ｘ４２９Ｉ；Ｅ２１２Ｖ＋Ｘ３２３Ｍ；Ｄ６２Ｎ＋Ｅ２１２Ｖ＋Ｘ３２３Ｍ；Ｔ５１Ｉ＋Ｄ１３４Ｖ＋Ｖ４４２Ａ；Ｔ５１Ｉ＋Ｋ１７９Ｒ＋Ｅ２１２Ｖ＋Ｙ４０４Ｆ；Ｄ３８７Ｖ＋Ｎ３９５Ｒ；Ｎ１９５Ｆ＋Ｘ２１２Ｖ＋Ｋ２６９Ｓ、ここでナンバリングのために配列番号４（ＳＰ７２２）を使用する。
【請求項８】
親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼがＳＰ６９０（配列番号２）；ＳＰ７２２ （配列番号４）；ＡＡ５６０（配列番号１２）；＃７０７α−アミラーゼ（配列番号１３）；ＫＳＭ−ＡＰ１３７８から成る群から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の変異体。
【請求項９】
親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼが下記のいずれかである、請求項１〜８のいずれかに記載の変異体：ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｍ２０２Ｌ；ＢＳＧ＋Ｉ１８１＊＋Ｇ１８２＊；ＢＳＧ＋Ｉ１８１＊＋Ｇ１８２＊＋Ｎ１９３Ｆ；ＢＳＧ＋Ｉ１８１＊＋Ｇ１８２＊＋Ｍ２００Ｌ；ＢＳＧ＋Ｉ１８１＊＋Ｇ１８２＊＋Ｎ１９３Ｆ＋Ｍ２００Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｍ２０２Ｌ。
【請求項１０】
親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼが、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、なおより好ましくは少なくとも約９０％、なおより好ましくは少なくとも９５％、なおより好ましくは少なくとも９７％、なおより好ましくは少なくとも９９％の配列番号８に対する同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜９のいずれかに記載の変異体。
【請求項１１】
親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼが、低い、好ましくは中程度の、より好ましくは高いストリンジェンシイの条件下に、配列番号７のアミノ酸配列とハイブリダイゼーションする核酸配列によりコードされる、請求項１〜１０のいずれかに記載の変異体。
【請求項１２】
変異体が、特に７０〜１２０ ℃の高い温度および／またはｐＨ ４〜６の低いｐＨにおいて、変更された安定性を有する、請求項１〜１１のいずれかに記載の変異体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を含んでなるＤＮＡ構築物。
【請求項１４】
請求項１３に記載のＤＮＡ構築物を保持する組換え発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載のＤＮＡ構築物または請求項１４に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項１６】
微生物、好ましくは細菌または真菌である、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
細胞がグラム陽性細菌、例えば、バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バシラス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ）、バシラス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシラス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシラス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）またはバシラス・スリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）である、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれかに記載のα−アミラーゼ変異体を含んでなる組成物。
【請求項１９】
バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ） （ＢＳＧ）α−アミラーゼ、特にＳＰ９６１を、特に１：１０〜１０：１、好ましくは１：２の比で、さらに含んでなる、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
組成物がグルコアミラーゼ、プルラナーゼおよび／またはフィターゼをさらに含んでなる、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれかに記載のα−アミラーゼ変異体を含んでなる洗浄剤組成物。
【請求項２２】
他の酵素、例えば、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、他のデンプン分解酵素、グルコアミラーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、ＣＧＴアーゼ、マンナナーゼ、キチナーゼ、ラッカーゼおよび／またはセルラーゼをさらに含んでなる、請求項２１に記載の洗浄剤組成物。
【請求項２３】
澱粉を液化のための請求項１〜１２のいずれかに記載のα−アミラーゼ変異体または請求項１８〜２０のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項２４】
エタノールを製造するための請求項１〜１２のいずれかに記載のα−アミラーゼ変異体または請求項１８〜２０のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項２５】
洗浄および／または皿洗浄のための請求項１〜１２のいずれかに記載のα−アミラーゼ変異体または請求項１８〜２０のいずれかに記載の組成物の使用。
【請求項２６】
繊維材料を洗浄するための請求項１〜１２のいずれかに記載のα−アミラーゼ変異体または請求項１８〜２０のいずれかに記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの変異体（変異体）に関する。この変異体は、α−アミラーゼ活性を有しかつ前記親α−アミラーゼに関して下記の性質の少なくとも１つにおいて変更を示す：例えば、特に高い温度および／または低いｐＨ条件、特に低いカルシウム濃度における、安定性。本発明の変異体は、澱粉の変換、エタノール製造、洗濯、皿洗浄、硬質表面のクリーニング、繊維材料の糊抜き、および／または甘味剤の製造に適する。
【０００２】
発明の背景
α−アミラーゼ（α−１，４−グルカン−４−グルカノヒドロラーゼ、Ｅ．Ｃ． ３．２．１．１） は、澱粉および他の直鎖状および分枝鎖状の１，４−グリコシドオリゴ−および多糖類の加水分解を触媒する、酵素のグループを構成する。
【０００３】
発明の簡単な説明
本発明の目的は、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼを提供することである。この変異体は、対応する親α−アミラーゼ、すなわち、非変異のα−アミラーゼに比較して、α−アミラーゼ活性を有しかつ前記親α−アミラーゼに関して下記の性質の少なくとも１つにおいて変更を示す：例えば、特に高い温度および／または低いｐＨ条件、特に低いカルシウム濃度における、安定性。
【０００４】
命名法
本発明の説明および特許請求の範囲において、アミノ酸残基についての慣用の１文字コードおよび３文字コードを使用する。言及を容易にするために、下記の命名法を使用することによって、本発明のα−アミラーゼ変異体を記載する：１または２以上のもとのアミノ酸；１または２以上の位置；１または２以上の置換されたアミノ酸。
【０００５】
本発明によれば、例えば、位置３０におけるアスパラギンによるアラニンの置換は次のように示される：
Ａｌａ３０Ａｓｎ または Ａ３０Ｎ
同一位置におけるアラニンの欠失は次のように示される：
Ａｌａ＊ またはＡ３０＊
そして追加のアミノ酸残基、例えば、リシンの挿入は次のように示される：
Ａｌａ３０ＡｌａＬｙｓまたはＡ３０ＡＫ
アミノ酸残基、例えば、アミノ酸残基３０〜３３の構成的ストレッチの欠失は、（３０−３３）＊ または Δ（Ａ３０−Ｎ３３） として示される。
【０００６】
特定のα−アミラーゼが他のα−アミラーゼと比較して「欠失」を含有しかつこのような位置において挿入を行う場合、これは位置３６におけるアスパラギン酸挿入について次のように示される：
＊３６Ａｓｐまたは ＊３６Ｄ
多重変異はプラス符号による分離される、すなわち：
Ａｌａ３０Ａｓｐ　＋　Ｇｌｕ３４Ｓｅｒ　または　Ａ３０Ｎ＋Ｅ６４Ｓ
これは位置３０および３４において、それぞれ、アスパラギンおよびセリンによりアラニンおよびグルタミン酸を置換する変異を表す。
【０００７】
１または２以上の内のいずれかのアミノ酸残基を所定の位置に挿入するとき、それは次のように示される：
Ａ３０Ｎ、Ｅまたは
Ａ３０ＮまたはＡ３０Ｅ
さらに、変更に適当な位置は本明細書において特定の変更を示唆しないで同定されるとき、その位置に存在するアミノ酸残基を任意のアミノ酸残基で置換させることができることを理解すべきである。こうして、例えば、位置３０におけるアラニンの変更を説明するが、特定せず、アラニンを欠失させるか、あるいは任意の他のアミノ酸、すなわち、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ａ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖの任意の１つで置換することができることを理解すべきである。
【０００８】
さらに、「３０Ｘ」は下記の置換の任意の１つを意味する：Ａ３０Ｒ、Ａ３０Ｎ、Ａ３０Ｄ、Ａ３０Ｃ、Ａ３０Ｑ、Ａ３０Ｅ、Ａ３０Ｇ、Ａ３０Ｈ、Ａ３０Ｉ、Ａ３０Ｌ、Ａ３０Ｋ、Ａ３０Ｍ、Ａ３０Ｆ、Ａ３０Ｐ、Ａ３０Ｓ、Ａ３０Ｔ、Ａ３０Ｗ、Ａ３０Ｙ、またはＡ３０Ｖ；または短縮して：Ａ３０Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ。
親酵素 − ナンバリングに使用する − がその位置における置換のために示唆された問題のアミノ酸残基を既に有する場合、下記の命名法を使用する：
「Ｘ３０Ｎ」または「Ｘ３０Ｎ、Ｖ」、この場合において、例えば、ＮまたはＶの１つが野生型で存在する。こうして、他の対応する親酵素が位置３０において「Ａｓｎ」または「Ｖａｌ」に置換されていることを意味する。
【０００９】
発明の詳細な開示
本発明の目的は、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの変異体を提供することである。この変異体はα−アミラーゼ活性を有しかつ、高い温度および／または低いｐＨ、特に低いカルシウム濃度において、変更された安定性を示す。
【００１０】
Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ
バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種による産生される多数のα−アミラーゼは、アミノ酸レベルで高度に相同性（同一性）である。既知のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）α−アミラーゼの同一性を下記表１において見出すことができる：
【００１１】
【表１】
2004508815.tif 000002
【００１２】
例えば、配列番号８に示すアミノ酸配列を含んでなるバシラス・リヘニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ（ＴｅｒｍａｍｙｌＴＭとして商業的に入手可能である）は、配列番号１０に示すアミノ酸配列を含んでなるバシラス・アムロリクファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼと約８１％相同性であり、そして配列番号６に示すアミノ酸配列を含んでなるバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ（ＢＳＧ）と約６５％相同性である。
【００１３】
さらに、相同的α−アミラーゼはＷＯ ９５／６３９７に開示されかつ、それぞれ、配列番号２および配列番号４に描写されているＳＰ６９０およびＳＰ７２２を包含する。他のアミロースはバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種に由来し、配列番号１２に示されているＡＡ５６０、およびバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種に由来し、配列番号１３に示され、Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １５１（１９８８）、ｐｐ． ２５−３１に記載されている＃７０７である。
ＫＳＭ ＡＰ１３７８ α−アミラーゼはＷＯ ９７／００３２４（ＫＡＯ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に開示されている。
【００１４】
なお他の相同的α−アミラーゼは、ＥＰ ０５２６６６（ＡＴＣＣ ２７８１１）に記載されているバシラス・リヘニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）株により産生されるα−アミラーゼ、およびＷＯ ９１／００３５３およびＷＯ ９４／１８３１４において同定されているα−アミラーゼを包含する。他の商業的Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは下記の商品名で販売されている製品の中に含まれる：ＯｐｔｉｔｈｅｒｍＴＭおよびＴａｋａｔｈｅｒｍＴＭ （Ｓｏｌｖａｙ）；ＭａｘａｍｙｌＴＭ （Ｇｉｓｔ−ｂｒｏｃａｄｅｓ／ Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）、Ｓｐｅｚｙｍ ＡＡＴＭおよびＳｐｅｚｙｍｅ Ｄｅｌｔａ ＡＡＴＭ （Ｇｅｎｅｎｃｏｒから入手可能である）、およびＫｅｉｓｔａｓｅＴＭ （Ｄａｉｗａから入手可能である）、Ｄｅｘ ｌｏ、ＧＣ ５２１（Ｇｅｎｅｎｃｏｒから入手可能である）およびＵｌｔｒａｐｈｌｏｗ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能である）。
【００１５】
これらのα−アミラーゼ間で見出される実質的な相同性のために、それらはα−アミラーゼの同一クラス、すなわち、「Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ」のクラスに属すると考えられる。
したがって、本発明の関係において、用語「Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ」は、アミノ酸レベルにおいて、ＴｅｒｍａｍｙｌＴＭ、すなわち、本明細書において配列番号８に示すアミノ酸を有するバシラス・リヘニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼに対して実質的な同一性を示すα−アミラーゼ、特にバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）α−アミラーゼを示すことを意図する。
【００１６】
換言すると、本明細書において配列番号２、４、６、８、１０、１２および１３に示すアミノ酸配列を有する、すべての下記のα−アミラーゼは「Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ」であると考えられる。他のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、ｉ） 配列番号２、４、６、８、１０、１２および１３に示すアミノ酸配列の少なくとも１つと少なくとも６０％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、または少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％の相同性（同一性）を表示するα−アミラーゼ、および／または配列番号１、３、５、７、９から明らかであり、そしてこの明細書の上に特定したα−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列に対してハイブリダイゼーションするＤＮＡ配列によりコードされるα−アミラーゼである（前記エンコーディング配列は、それぞれ、配列番号２、４、６、８、１０および１２に示すアミノ酸配列をコードする）。
【００１７】
相同性
相同性は、第２配列から第１配列の由来を示す２つの配列間の同一性の程度として決定することができる。相同性は、この分野において知られているコンピュータープログラム、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージで提供されるＧＡＰ（前述した）により決定することができる。こうして、Ｇａｐ ＧＣＧｖ８を同一性についてのデフォルトスコアリングマトリックスおよび下記のデフォルトパラメーターとともに使用することができる：５．０のＧＡＰ発生ペナルティーおよび０．３のＧＡＰエクステンションペナルティー、それぞれ核酸配列の比較のために、および３．０のＧＡＰ発生ペナルティーおよび０．１のＧＡＰエクステンションペナルティー、それぞれタンパク質配列の比較のために。ＧＡＰはＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｈ、（１９７０）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８、ｐ． ４４３−４５３の方法を使用してアラインメントを作り、同一性を計算する。
【００１８】
Ｔｅｒｍａｍｙｌ（配列番号８）と、例えば、他のα−アミラーゼとの間の構造的アラインメントを使用して、他のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ中の同等／対応位置を同定することができる。前記構造的アラインメントを得る１つの方法は、ギャップペナルティーのデフォルト値、すなわち、３．０のギャップ発生ペナルティーおよび０．１のギャップエクステンションペナルティーを用いて、ＧＣＧパッケージからパイル・アップ（Ｐｉｌｅ Ｕｐ）プログラムを使用することである。他の構造的アラインメントは、疎水性クラスター分析（Ｇａｂｏｒｉａｕｄ他、（１９８７）、ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ ２２４、ｐｐ． １４９−１５５）および逆スレッディング（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）（Ｈｕｂｅ， Ｔ；Ｔｏｒｄａ， ＡＥ、ＰＲＯＴＥＩＮ ＳＣＩＥＮＣＥ Ｖｏｌ． ７、Ｎｏ． １、ｐｐ． １４２−１４９（１９９８））を包含する。
【００１９】
ハイブリダイゼーション
上記Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの特性決定において使用するオリゴヌクレオチドプローブは、問題のα−アミラーゼの完全なまたは部分的ヌクレオチドまたはアミノ酸配列をベースとして適当に調製することができる。
ハイブリダイゼーションを試験するために適当な条件は、５×ＳＳＣ中で前ソーキングし、および２０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５０ ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ６．８、および５０ ｍｇの変性超音波処理仔ウシ胸腺ＤＮＡの溶液の中で４０ ℃において１時間プレハイブリダイゼーションし、次いで同一溶液に１００ ｍＭ ＡＴＰを４０ ℃において１８時間補充し、次いで２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳの中で３０分間４０ ℃において（低いストリンジェンシイ）、好ましくは５０ ℃において（中程度のストリンジェンシイ）、より好ましくは６５℃において（高いストリンジェンシイ）、なおより好ましくは７５ ℃において（非常に高いストリンジェンシイ）フィルターを３回洗浄することを包含する。ハイブリダイゼーション法について、下記の文献にいっそう詳細に記載されている：Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９。
【００２０】
本発明の関係において、「に由来する」は問題の生物の株により産生されたまたは産生可能なα−アミラーゼばかりでなく、かつまたこのような株から単離されたＤＮＡ配列によりコードされ、前記ＤＮＡ配列で形質転換された宿主生物の中で産生されたα−アミラーゼを示すことを意図する。最後に、この用語は、合成および／またはｃＤＮＡ由来のＤＮＡ配列によりコードされかつ問題のα−アミラーゼの同定特性を有する、α−アミラーゼを示すことを意図する。また、この用語は、親α−アミラーゼが天然に存在するα−アミラーゼの変異体、すなわち、天然に存在するα−アミラーゼの１または２以上のアミノ酸残基の修飾（挿入、置換、欠失）の結果である変異体であることができることを示すことを意図する。
【００２１】
親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ
本発明によれば、上に定義したＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのすべてを親（すなわち、バックボーン）α−アミラーゼとして使用することができる。本発明の好ましい態様において、親α−アミラーゼはバシラス・リヘニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、例えば、上に言及したもの１つ、例えば、配列番号８に示すアミノ酸配列を有するバシラス・リヘニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼに由来する。
【００２２】
親ハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ
親α−アミラーゼ（すなわち、バックボーンα−アミラーゼ）は、また、ハイブリッドα−アミラーゼ、すなわち、少なくとも２つα−アミラーゼに由来する部分的アミノ酸配列の組み合わせを含んでなるα−アミラーゼであることができる。
【００２３】
親ハイブリッドα−アミラーゼは、アミノ酸の相同性（同一性）および／またはＤＮＡハイブリダイゼーション（上に定義した）をベースとして、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのファミリーに属することを決定できるものであることができる。この場合において、ハイブリッドα−アミラーゼは典型的にはＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの少なくとも１つの部分と、微生物（細菌または真菌）および／または哺乳動物由来のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼまたは非Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼから選択される１または２以上の他のα−アミラーゼの１または２以上の部分とから構成される。
【００２４】
こうして、親ハイブリッドα−アミラーゼは、少なくとも２つＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼから、または少なくとも１つのＴｅｒｍａｍｙｌ様および少なくとも１つの非Ｔｅｒｍａｍｙｌ様細菌α−アミラーゼからに由来する、部分的アミノ酸配列の組み合わせを含んでなることができる。部分的アミノ酸配列が由来するＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、本明細書において言及する特定のＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの任意のものであることができる。
【００２５】
例えば、親α−アミラーゼは、バシラス・リヘニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の株に由来するα−アミラーゼのＣ末端部分と、バシラス・アムロリクファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の株またはバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の株に由来するＮ末端部分とを含んでなる。例えば、親α−アミラーゼはバシラス・リヘニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼのＣ末端部分の少なくとも４３０アミノ酸残基を含んでなることができ、そして、例えば、下記のアミノ酸セグメントを含んでなることができる：
【００２６】
ａ） 配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するバシラス・アミロリクファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼの３７ Ｎ末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントおよび配列番号８に示すアミノ酸配列を有するバシラス・リヘニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ、またはＴｅｒｍａｍｙｌ配列と同一であるハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼ、すなわち、配列番号８に示すバシラス・リヘニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ、ただしＮ末端の３５アミノ酸残基（成熟タンパク質の）はＢＡＮ（成熟タンパク質）のＮ末端の３３残基により置換されている、すなわち、配列番号１０に示すバシラス・アミロリクファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ、の４４５ Ｃ末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメント；または
【００２７】
ｂ） 配列番号６に示すアミノ酸配列を有するバシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼの６８ Ｎ末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメントおよび配列番号８に示すアミノ酸配列を有するバシラス・リヘニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼの４１５ Ｃ末端アミノ酸残基に対応するアミノ酸セグメント。
【００２８】
他の適当な親ハイブリッドα−アミラーゼは、ＢＡＮ、バシラス・アミロリクファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼのＮ末端（成熟タンパク質のアミノ酸１〜３００）およびＴｅｒｍａｍｙｌからのＣ末端（成熟タンパク質のアミノ酸３０１〜４８３）を構築するＷＯ ９６／２３８７４（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋから）に前に記載されたものである。
【００２９】
本発明の好ましい態様において、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは配列番号８または配列番号１０のハイブリッドα−アミラーゼである。詳しくは、親ハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、配列番号８に示すバシラス・リヘニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼの４４５ Ｃ末端アミノ酸残基と、配列番号１０に示すバシラス・アミロリクファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）に由来するα−アミラーゼの３７ Ｎ末端アミノ酸残基（これは適当には下記の突然変異体をさらに有することができる：Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ （配列番号８におけるナンバリングを使用する））とを含んでなるハイブリッドα−アミラーゼであることができる。後者の記載するハイブリッドは下記の実施例において使用し、ＬＥ１７４と呼ぶ。
【００３０】
他の特別に意図する親α−アミラーゼは、より少ない変異を有するＬＥ１７４、すなわち、下記のものを包含する：Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ；Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ；Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ；Ｑ２６４Ｓ；Ｈ１５６Ｙ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ；Ｈ１５６Ｙ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ；Ｈ１５６Ｙ＋Ｑ２６４Ｓ；Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ； Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｑ２６４Ｓ；Ｈ１５６Ｙ＋Ｑ２６４Ｓ；Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ｑ２６４Ｓ； Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ；Ｈ１５６Ｙ＋Ａ１８１Ｔ＋Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ。また、これらのハイブリッドは本発明の一部分である。
【００３１】
好ましい態様において、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、ＬＥ１７４、ＳＰ７２２、またはＡＡ５６０であり、下記の任意のものを包含する：ＬＥ１７４＋Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋１２１０Ｆ；ＬＥ１７４＋Ｍ１９７Ｌ；ＬＥ１７４＋Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｍ１９７Ｌ＋Ｉ２０１Ｆ；またはＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｍ２０２Ｌ；ＳＰ７２２＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｍ２０２Ｌ；ＢＳＧ＋Ｉ１８１＊＋Ｇ１８２＊；ＢＳＧ＋Ｉ１８１＊＋Ｇ１８２＊＋Ｎ１９３Ｆ；ＢＳＧ＋Ｉ１８１＊＋Ｇ１８２＊＋Ｍ２００Ｌ；ＢＳＧ＋Ｉ１８１＊＋Ｇ１８２＊＋Ｎ１９３Ｆ＋Ｍ２００Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｍ２０２Ｌ；ＡＡ５６０＋Ｄ１８３＊＋Ｇ１８４＊＋Ｎ１９５Ｆ＋Ｍ２０２Ｌ。
【００３２】
他の意図する親α−アミラーゼは、Ｉ２０１Ｆの中に追加の置換を有するＬＥ１７４であるＬＥ４２９を包含する。本発明によれば、ＬＥ３３５は、ＬＥ４２９に比較して、Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａの中に追加の置換基を有するα−アミラーゼである；ＬＥ３９９はＬＥ３３５＋Ｇ４８Ａ、すなわち、Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｉ２０１Ｆを有するＬＥ１７４である。
【００３３】
変更された性質
下記の節において、本発明の変異体の中に存在する変異と、それから生ずる性質の望ましい変更（親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの性質に関する）との間の関係を説明する。
前述したように、本発明は、特に高温においておよび／または低いｐＨにおいて、特に低いカルシウム濃度において、変更された性質（前述した）を有するＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼに関する。
本発明の関係において、「高温」は７０〜１２０ ℃、好ましくは８０〜１００ ℃、特に８５〜９５ ℃の温度を意味する。
【００３４】
本発明の関係において、用語「低いｐＨ」は４〜６、好ましくは４．２〜５．５、特に４．５〜５の範囲のｐＨを意味する。
本発明の関係において、用語「高いｐＨ」は８〜１１、特に８．５〜１０．６の範囲のｐＨを意味する。
本発明の関係において、用語「低いカルシウム濃度」は６０ ｐｐｍ、好ましくは４０ ｐｐｍ、より好ましくは２５ ｐｐｍ、特に５ ｐｐｍより低いカルシウムの遊離カルシウムレベルを意味する。
特別に意図する変更された性質に関して特別に意図する親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼは、前述の親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼおよび親ハイブリッドＴｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼである。
【００３５】
ＴｅｒｍａｍｙｌＴＭα−アミラーゼは出発点として使用するが、例えば、ＳＰ７２２、ＢＳＧ、ＢＡＮ、ＡＡ５６０、ＳＰ６９０、ＫＳＭ ＡＰ１３７８、および＃７０７の中の対応する位置は開示した通りであり、特別にまた意図されると理解すべきである。
好ましい態様において、本発明の変異体は特に高温においておよび／または低いｐＨにおける変更された性質を有する。
１つの面において、本発明は、前述の変更された性質を有する変異体に関する。
【００３６】
第１の面において、親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼの変異体は、４９、６０、１０４、１３２、１６１、１７０、１７６、１７９、１８０、１８１、１８３、２００、２０３、２０４、２０７、２１２、２３７、２３９、２５０、２８０、２９８、３１８、３７４、３８５、３９３、４０２、４０６、４２７、４３０、４４０、４４４、４４７、４８２のグループから選択される１または２以上の位置（アミノ酸のナンバリングについて配列番号８を使用する）に変更を含んでなり、ここで
（ａ）　 １または２以上の変更は独立的に
（ｉ）　前記位置を占めるアミノ酸から下流のアミノ酸の挿入、
（ｉｉ） 前記位置を占めるアミノ酸の欠失、または
（ｉｉｉ） 前記位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸による置換、
であり、
（ｂ）　 変異体はα−アミラーゼ活性を有し、そして
（ｃ）　 各位置は配列番号８に示すアミノ酸配列を有する親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのアミノ酸配列の位置に対応する。
【００３７】
ＴｅｒｍａｍｙｌＴＭ （配列番号８） において、このような対応する位置は次の通りある：Ｔ４９；Ｄ６０；Ｎ１０４；Ｅ１３２；Ｄ１６１；Ｋ１７０；Ｋ１７６；Ｇ１７９；Ｋ１８０；Ａ１８１；Ｄ１８３；Ｄ２００；Ｘ２０３；Ｄ２０４；Ｄ２０７；Ｘ２１２；Ｋ２３７；Ｓ２３９；Ｅ２５０；Ｎ２８０；Ｘ２９８；Ｌ３１８；Ｑ３７４；Ｅ３８５；Ｑ３９３；Ｙ４０２；Ｈ４０６；Ｌ４２７；Ｄ４３０；Ｖ４４０；Ｎ４４４；Ｅ４４７；Ｑ４８２。
ＳＰ７２２ （配列番号４） において、対応する位置は次の通りある：Ｔ５１；Ｄ６２；Ｎ１０６；Ｄ１３４；Ｄ１６３；Ｘ１７２；Ｋ１７９；Ｇ１８４；Ｋ１８５；Ａ１８６；Ｄ１８８；Ｄ２０５；Ｍ２０８；Ｄ２０９；Ｘ２１２；Ｌ２１７；Ｋ２４２；Ｓ２４４；Ｎ２５５；Ｎ２８５；Ｓ３０３；Ｘ３２３；Ｄ３８７；Ｎ３９５；Ｙ４０４；Ｈ４０８；Ｘ４２９；Ｄ４３２；Ｖ４４２；Ｘ４４６；Ｘ４４９；Ｘ４８４。
他の親α−アミラーゼの中の対応する位置は前述したようにアラインメントによる見出すことができ、第１図におけるアラインメントに示す。
【００３８】
好ましい態様において、本発明の変異体（ナンバリングについて配列番号８ （ＴｅｒｍａｍｙｌＴＭ）を使用する） は、下記の置換の１または２以上を有する：Ｔ４９Ｉ；Ｄ６０Ｎ；Ｎ１０４Ｄ；Ｅ１３２Ａ、Ｖ、Ｐ；Ｄ１６１Ｎ；Ｋ１７０Ｑ；Ｋ１７６Ｒ；Ｇ１７９Ｎ；Ｋ１８０Ｔ；Ａ１８１Ｎ；Ｄ１８３Ｎ；Ｄ２００Ｎ；Ｘ２０３Ｙ；Ｄ２０４Ｓ；Ｄ２０７Ｖ、Ｅ、Ｌ、Ｇ；Ｘ２１２Ｉ；Ｋ２３７Ｐ；Ｓ２３９Ｗ；Ｅ２５０Ｇ、Ｆ；Ｎ２８０Ｓ；Ｘ２９８Ｑ；Ｌ３１８Ｍ；Ｑ３７４Ｒ；Ｅ３８５Ｖ；Ｑ３９３Ｒ；Ｙ４０２Ｆ；Ｈ４０６Ｌ、Ｗ；Ｌ４２７Ｉ；Ｄ４３０Ｎ；Ｖ４４０Ａ；Ｎ４４４Ｒ、Ｋ；Ｅ４４７Ｑ；Ｑ４８２Ｋ。
【００３９】
好ましい態様において、本発明の変異体（ナンバリングについて配列番号４ （ＳＰ７２２）を使用する） は、下記の置換の１または２以上を有する：Ｔ５１Ｉ；Ｄ６２Ｎ；Ｎ１０６Ｄ；Ｄ１３４Ａ、Ｖ、Ｐ；Ｄ１６３Ｎ；Ｘ１７２Ｑ；Ｋ１７９Ｒ；Ｇ１８４Ｎ；Ｋ１８５Ｔ；Ａ１８６Ｎ；Ｄ１８８Ｎ；Ｄ２０５Ｎ；Ｍ２０８Ｙ；Ｄ２０９Ｓ；Ｘ２１２Ｖ、Ｅ、Ｌ、Ｇ；Ｌ２１７Ｉ；Ｋ２４２Ｐ；Ｓ２４４Ｗ；Ｎ２５５Ｇ、Ｆ；Ｎ２８５Ｓ；Ｓ３０３Ｑ；Ｘ３２３Ｍ；Ｄ３８７Ｖ；Ｎ３９５Ｒ；Ｙ４０４Ｙ；Ｈ４０８Ｌ、Ｗ；Ｘ４２９Ｉ；Ｄ４３２Ｎ；Ｖ４４２Ａ；Ｘ４４６Ｒ、Ｋ；Ｘ４４９Ｑ、Ｋ；Ｘ４８４Ｋ、ここでナンバリングのために配列番号４（ＳＰ７２２）を使用する。
好ましい二重、三重および多重変異 − ナンバリングの基準として配列番号８を使用する − は、下記の変異から成る群から選択される：
【００４０】
【化３】
2004508815.tif 000003
【００４１】
【化４】
2004508815.tif 000004
【００４２】
【化５】
2004508815.tif 000005
【００４３】
【化６】
2004508815.tif 000006
【００４４】
【化７】
2004508815.tif 000007
【００４５】
【化８】
2004508815.tif 000008
【００４６】
【化９】
2004508815.tif 000009
【００４７】
【化１０】
2004508815.tif 000010
【００４８】
【化１１】
2004508815.tif 000011
【００４９】
【化１２】
2004508815.tif 000012
【００５０】
【化１３】
2004508815.tif 000013
【００５１】
【化１４】
2004508815.tif 000014
【００５２】
【化１５】
2004508815.tif 000015
【００５３】
【化１６】
2004508815.tif 000016
【００５４】
【化１７】
2004508815.tif 000017
【００５５】
【化１８】
2004508815.tif 000018
【００５６】
【化１９】
2004508815.tif 000019
【００５７】
【化２０】
2004508815.tif 000020
【００５８】
【化２１】
2004508815.tif 000021
ここでナンバリングのために配列番号８を使用する。
【００５９】
好ましい態様において、変異体は下記の置換基を有する：Ｋ１７０Ｑ＋Ｄ２０７Ｖ＋Ｎ２８０Ｓ；Ｅ１３２Ａ＋Ｄ２０７Ｖ；Ｄ２０７Ｅ＋Ｅ２５０Ｇ＋Ｈ４０６Ｌ＋Ｌ４２７Ｉ；Ｄ２０７Ｖ＋Ｌ３１８Ｍ；Ｄ６０Ｎ＋Ｄ２０７Ｖ＋Ｌ３１８Ｍ；Ｔ４９Ｉ＋Ｅ１３２Ｖ＋Ｖ４４０Ａ；Ｔ４９Ｉ＋Ｋ１７６Ｒ＋Ｄ２０７Ｖ＋Ｙ４０２Ｆ；Ｑ３７４Ｒ＋Ｅ３８５Ｖ＋Ｑ３９３Ｒ；Ｎ１９０Ｆ＋Ａ２０９Ｖ＋Ｑ２６４Ｓ；Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｉ２０１Ｆ；Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｉ２０１Ｆ；Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｉ２０１Ｆ；Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；Ｔ４９Ｉ＋Ｉ２０１Ｆ；Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ；Ｄ１６１Ｎ＋Ｇ１７９Ｎ＋Ｋ１８０Ｔ＋Ａ１８１Ｎ＋Ｄ１８３Ｎ＋Ｄ２００Ｎ＋Ｄ２０４Ｓ＋Ｋ２３７Ｐ＋Ｓ２３９Ｗ＋Ｈ４０６Ｗ＋Ｄ４３０Ｎ＋Ｎ４４４Ｋ＋Ｅ４４７Ｑ＋Ｑ４８２Ｋ、ここでナンバリングのために配列番号８を使用する。
特定の変異体は下記のものを包含す：ＬＥ３９９；ＬＥ１７４＋Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ；ＬＥ１７４＋Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ＋Ｉ２０１Ｆ；ＬＥ１７４＋Ｇ４８Ａ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｉ２０１Ｆ；ＬＥ１７４＋Ｔ４９Ｉ＋Ｇ１０７Ａ＋Ｉ２０１Ｆ；　ＬＥ１７４＋Ｇ４８Ａ＋Ｔ４９Ｉ；ＬＥ１７４＋Ｇ４８Ａ；ＬＥ１７４＋Ｇ１０７Ａ＋Ｉ２０１Ｆ； ＬＥ１７４＋Ｉ２０１Ｆ、これらは特に本発明の意図する変異体である。
【００６０】
安定性
本発明の関係において、高温（すなわち、７０〜１２０ ℃）および／または極端なｐＨ （すなわち、それぞれ、低いまたは高いｐＨ、すなわち、ｐＨ ４〜６またはｐＨ ８〜１１） において、特に６０ ｐｐｍ以下の遊離（すなわち、非結合、したがって溶液中の）カルシウム濃度において、変更された安定性、特に改良された安定性（すなわち、より高いまたはより低い）を達成することに関して重要な変異は、「変更された性質」の節において列挙した変異の任意のものを包含する。安定性は、下記の「材料および方法」の節に記載するように測定することができる。
【００６１】
本発明の変異体における一般的変異
１つの態様において、本発明の変異体は、上に概説した修飾に加えて１または２以上の修飾を含んでなることができる。こうして、α−アミラーゼ変異体の一部分の中に存在する１または２以上のプロリン（Ｐｒｏ）は、非プロリン残基で修飾および／または置換されたことが好都合であることがある。このような非プロリン残基は、任意の可能な、天然に存在する非プロリン残基、好ましくはアラニン、グリシン、セリン、トレオニン、バリンまたはロイシンであることができる。
【００６２】
同様に、１つの態様において、親α−アミラーゼの中に存在する１または２以上のシステイン残基を非システイン残基、例えば、セリン、アラニン、トレオニン、グリシン、バリンまたはロイシンで置換することができる。
さらに、配列番号１０のアミノ酸フラグメント１８５〜２０９に対応するアミノ酸フラグメントの中に存在する１または２以上のＡｓｐおよび／またはＧｌｕが、それぞれ、Ａｓｎおよび／またはＧｌｎで置換されるように、本発明の変異体を、唯一の修飾としてまたは上に概説した修飾の任意と組み合わせて、修飾することができる。また、配列番号１０のアミノ酸フラグメント１８５〜２０９に対応するアミノ酸フラグメントの中に存在する１または２以上のＬｙｓ残基を、Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼにおいて、Ａｒｇで置換することも重要である。
【００６３】
本発明は、上に概説した修飾の一または２以上を組込んだ変異体を包含することを理解すべきである。
さらに、下記の位置（ナンバリングのために配列番号８ （Ｔｅｒｍａｍｙｌ）を使用する）：Ｍ１５、Ｖ１２８、Ａ１１１、Ｈ１３３、Ｗ１３８、Ｔ１４９、Ｍ１９７、Ｎ１８８、Ａ２０９、Ａ２１０、Ｈ４０５、Ｔ４１２の１または２以上の中に、下記の単一、二重または三重または多重の変異を導入することが有利であることがある：Ｍ１５Ｘ、特にＭ１５Ｔ、Ｌ；Ｖ１２８Ｘ、特にＶ１２８Ｅ；Ｈ１３３Ｘ、特にＨ１３３Ｙ；Ｎ１８８Ｘ、特にＮ１８８Ｓ、Ｔ、Ｐ；Ｍ１９７Ｘ、特にＭ１９７Ｔ、Ｌ；Ａ２０９Ｘ、特にＡ２０９Ｖ；Ｍ１９７／Ｗ１３８Ｆ；Ｍ１９７Ｔ／Ｗ１３８Ｙ；Ｍ１５Ｔ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ；Ｍ１５／Ｖ１２８Ｅ／Ｈ１３３Ｙ／Ｎ１８８Ｓ；Ｅ１９９Ｃ／Ｓ１３０Ｃ；Ｄ１２４Ｃ／Ｒ１２７Ｃ；Ｈ１３３Ｙ／Ｔ１４９Ｉ；Ｇ４７５Ｒ、Ｈ１３３Ｙ／Ｓ１８７Ｄ；Ｈ１３３Ｙ／Ａ２０９Ｖ。
【００６４】
本発明のα−アミラーゼ変異体を製造する方法
遺伝子の中に変異を導入するいくつかの方法がこの分野において知られている。α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニングを簡単に説明した後、α−アミラーゼをコードする配列内の特異的部位において変異を発生させる方法を説明する。
【００６５】
α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列のクローニング
この分野においてよく知られている種々の方法を使用して、問題のα−アミラーゼを産生する任意の細胞または微生物から、親α−アミラーゼをコードするＤＮＡ配列を単離することができる。第１に、研究すべきα−アミラーゼを産生する生物からの染色体ＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを使用して、ゲノムＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡライブラリーを構成すべきである。
【００６６】
次いで、α−アミラーゼのアミノ酸配列が知られている場合、均質な、標識化α−アミラーゼコード配列を合成し、問題の生物から調製したゲノムライブラリーからα−アミラーゼコードクローンを同定するために使用することができる。選択的に、低いストリンジェンシイのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下に、α−アミラーゼコードクローンを同定するプローブとして、既知のα−アミラーゼ遺伝子に対して相同的な配列を含有する標識化オリゴヌクレオチドプローブを使用することができる。
【００６７】
α−アミラーゼコードクローンを同定するなお他の方法は、ゲノムＤＮＡのフラグメントを発現ベクター、例えば、プラスミドの中に挿入し、生ずるゲノムＤＮＡライブラリーでα−アミラーゼ陰性細菌を形質転換し、次いでα−アミラーゼの基質を含有する寒天上に、形質転換された細菌をプレートし、これにより同定すべきα−アミラーゼをクローンに発現させることを包含する。
【００６８】
選択的に、酵素を発現するＤＮＡ配列を確立された標準的法、例えば、Ｓ． Ｌ． ＢｅａｕｃａｇｅおよびＭ． Ｈ． Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２、１９８１、ｐｐ． １８５９−１８６９に記載されているホスホロアミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓ他、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ． ３、１９８４、ｐｐ． ８０１−８０５に記載されている方法により合成的に調製することができる。ホスホロアミダイト法において、オリゴヌクレオチドを、例えば、自動化ＤＮＡ合成装置中で合成し、精製し、アニールし、結合させ、適当なベクター中でクローニングする。
【００６９】
最後に、ＤＮＡ配列は混合ゲノムおよび合成起源、混合合成およびｃＤＮＡ起源または混合ゲノムおよびｃＤＮＡ起源であることができ、標準的技術に従い、合成、ゲノムまたはｃＤＮＡ起源のフラグメント（適当ならば、全体のＤＮＡ配列の種々の部分に対応するフラグメント）をすることによって調製することができる。また、ＤＮＡ配列は、例えば、下記の文献に記載されているように、特定のポリマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製することができる：米国特許第４，６８３，２０２号またはＲ． Ｋ． Ｓａｉｋｉ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９、１９８８、ｐｐ． ４８７−４９１。
【００７０】
位置指定変異誘発
いったんα−アミラーゼコードＤＮＡ配列が単離され、そして望ましい変異部位が同定されると、合成オリゴヌクレオチドを使用して変異を導入することができる。これらのオリゴヌクレオチドは所望の変異部位をフランクするヌクレオチド配列を含有する；ある種の方法において、α−アミラーゼ遺伝子を保持するベクターの中に、α−アミラーゼコード配列を架橋する、ＤＮＡの一本鎖ギャップをつくる。次いで、所望の変異を支持する合成ヌクレオチドを一本鎖ＤＮＡの相同的部分に対してアニールする。
【００７１】
次いで残留するギャップをＤＮＡポリメラーゼＩ （クレノウフラグメント）で充填し、Ｔ４ポリメラーゼを使用して構築物を結合する。この方法の特定の例はＭｏｒｉｎａｇａ他、（１９８４） に記載されている。米国特許第４，７６０，０２５号には、カセットの小さい変更を実施することによって、多重変異をコードするオリゴヌクレオチドを導入することが記載されている。しかしながら、種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドを導入することができるので、Ｍｏｒｉｎａｇａ法によりなおより大きい種類の変異を一度に導入することができる。
【００７２】
α−アミラーゼコードＤＮＡ配列の中に変異を導入する他の方法は、ＮｅｌｓｏｎおよびＬｏｎｇ （１９８９） に記載されている。それは、ＰＣＲ反応におけるプライマーの１つとして、化学的に合成されたＤＮＡ鎖を使用することによって、導入された所望の変異を含有するＰＣＲフラグメントを発生させる３工程方法を包含する。ＰＣＲ発生フラグメントから、制限エンドヌクレアーゼを使用する切断により、変異を保持するＤＮＡフラグメントを単離し、発現プラスミドの中に再挿入する。
【００７３】
本発明の変異体を製造する別法は、例えば、ＷＯ ９５／２２６２５（Ａｆｆｙｍａｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎ．Ｖ．）またはＷＯ ９６／００３４３（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ Ａ／Ｓ）に記載するような、遺伝子シャフリング、あるいは１または２以上の問題の変異、例えば、１または２以上の置換および／または１または２以上の欠失を含んでなるハイブリッドを生ずる他の対応する技術を包含する。本発明による１または２以上の所望の変異を有するハイブリッドを提供するために適当に使用できる、親α−アミラーゼの例は、ＥＰ １，００２，３３４（引用することによって本明細書の一部とされる）に開示されているＫＳＭ−Ｋ３６およびＫＳＭ−Ｋ３８α−アミラーゼを包含する。
【００７４】
α−アミラーゼ変異体の発現
本発明によれば、前述の方法により、またはこの分野において知られている任意の他の方法により製造された変異体をコードするＤＮＡ配列は、発現ベクターを使用して、酵素形態で発現させることができる。発現ベクターは、典型的には、制御配列、例えば、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、翻訳開始シグナル、および、必要に応じてリプレッサー遺伝子または種々のアクチベーター遺伝子を含む。
【００７５】
本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列を保持する組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に付すことができる、任意のベクターであることができ、そしてベクターの選択はベクターを導入する宿主細胞にしばしば依存するであろう。こうして、ベクターは自律的に置換するベクター、すなわち、その複製が染色体の複製に対して独立である、染色体外実在物、例えば、プラスミド、バクテリオファージまたは染色体外因子、ミニクロモソームまたは人工染色体として存在するベクターであることができる。選択的に、ベクターは、宿主細胞の中に導入したとき、宿主細胞ゲノムの中に組込まれ、それが組込まれた１または２以上の染色体と一緒に複製できるものであることができる。
【００７６】
ベクターにおいて、ＤＮＡ配列は適当なプロモーター配列に操作可能に結合されるべきである。プロモーターは、選択した宿主細胞において転写活性を示す、任意のＤＮＡ配列であることができ、そして宿主細胞に対して相同的または異質であるタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。特に細菌宿主において、本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列の転写を指令するために適当なプロモーターの例は、次の通りである：
【００７７】
大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のｌａｃオペロンのプロモーター、バシラス・リヘニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、バシラス・アミロリクファシエンス（Ｂ． ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）のプロモーター、バシラス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子のプロモーター、およびその他。
【００７８】
真菌宿主における転写に有効なプロモーターは、下記の酵素をコードする遺伝子に由来するものである：アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａ． ｏｒｙｚｅ）アルカリ性プロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａ． ｏｒｙｚｅ）トリオースホスフェートイソメラーゼまたはアスペルギルス・ニヅランス（Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｎｓ）アセトアミダーゼ。
【００７９】
また、本発明の発現ベクターは、適当な転写ターミネーターと、真核生物において、本発明のα−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ配列に操作可能に結合したポリアデニル化配列を含んでなることができる。停止およびポリアデニル化配列は、適当にはプロモーターと同一源に由来することができる。
さらに、ベクターは、問題の宿主細胞におけるベクターの発現を可能とするＤＮＡ配列を含むことができる。このような配列は、プラスミドｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＡＭＢ１およびｐＩＪ７０２の複製起点である。
【００８０】
また、ベクターは、選択可能なマーカー、例えば、その産物が宿主細胞中の欠陥を補足する遺伝子、例えば、バシラス・ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはバシラス・リヘニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）からのｄａｌ遺伝子、または抗生物質耐性、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含むことができる。さらに、ベクターはアンピシリン選択マーカー、例えば、ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｎｉａＤおよびｓＣ、ヒグロマイシン耐性を発生させるマーカーを含むことができるか、あるいは選択は、例えば、ＷＯ ９１／１７２４３に記載されているように、共トランスフォーメーションにより達成させることができる。
【００８１】
細胞内発現はいくつかの関係において、例えば、ある種の細菌を宿主細胞として使用するとき、好都合であることがあるが、発現は細胞外であることが一般に好ましい。一般に、本明細書に記載するバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）α−アミラーゼは発現されたプロテアーゼを培地の中に分泌させる前領域（ｐｒｅｒｅｇｉｏｎ）を含む。望ましい場合、この前領域は異なる前領域またはシグナル配列で置換することができ、それぞれの前領域をコードするＤＮＡ配列の置換により好都合に達成することができる。
【００８２】
それぞれ、α−アミラーゼ変異体をコードするＤＮＡ構築物、プロモーター、ターミネーターおよび他の因子を結合し、かつ複製に必要な情報を含有する適当なベクターの中にそれらを挿入する手順は当業者によく知られており、（例えば、下記の文献を参照のこと： Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、１９８９）。
【００８３】
上に定義した本発明のＤＮＡ構築物または発現ベクターを含んでなる、本発明の細胞は、本発明のα−アミラーゼ変異体の組換え体の産生において宿主細胞として好都合に使用される。好都合には、宿主染色体の中にＤＮＡ構築物（１または２以上のコピーで）組込むことによって、変異体をコードする本発明のＤＮＡ構築物で細胞を形質転換することができる。ＤＮＡ配列は細胞の中で安定に維持される可能性が高いので、この組込み一般に１つの利点であると考えられる。宿主染色体の中へのＤＮＡ構築物の組込みは、慣用法に従い、例えば、相同的または異質的組換えにより実施することができる。選択的に、異なる型の宿主細胞に関して前述したように発現ベクターで細胞を形質転換することができる。
【００８４】
本発明の細胞は、高等生物、例えば、哺乳動物または昆虫の細胞であることがあるが、好ましくは微生物細胞、例えば、細菌または真菌（酵母を包含する）細胞である。
【００８５】
適当な細菌の例は次の通りである：グラム陽性細菌、例えば、バシラス・ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バシラス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｒｅｖｉｓ）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｌｕｓ）、バシラス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・アミロリクファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、
【００８６】
バシラス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシラス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｕｔｕｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシラス・スリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、またはストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）またはストレプトマイセス・ムリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｕｒｉｎｕｓ）、またはグラム陰性菌、例えば、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）。細菌の形質転換は、例えば、プロトプラストの形質転換により、またはそれ自体知られている方法においてコンピテント細胞を使用することによって実施することができる。
【００８７】
酵母生物は、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはシゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）の種から好適に選択される。フィラメント状真菌は好都合にはアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）の種、例えば、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚｅ）またはアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）に属する。真菌細胞は、プロトプラストを形成し、プロトプラストを形質転換し、次いでそれ自体知られている方法に従い細胞壁を再生することを包含するプロセスにより形質転換することができる。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主細胞を形質転換する適当な手順は、ＥＰ ２３８ ０２３に記載されている。
【００８８】
なお他の面において、本発明は、本発明のα−アミラーゼ変異体を製造する方法に関し、この方法は変異体の産生を促進する条件下に前述の宿主細胞を培養し、細胞および／または培地から変異体を回収することを含む。
細胞の培養に使用する培地は、問題の宿主細胞を成長させ、そして本発明のα−アミラーゼ変異体を発現させるために適当な、任意の慣用の培地を包含する。適当な培地は商業的供給会社から入手可能であるか、あるいは発表された処方に従い調製することができる（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）のカタログに記載されているように）。
【００８９】
宿主細胞から分泌されるα−アミラーゼ変異体は、よく知られている手順により培地から好都合に回収することができる。このような手順は、遠心または濾過により培地から細胞を分離し、硫酸アンモニウムのような塩により培地のタンパク質成分を沈降させ、次いでクロマトグラフィー、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、またはその他の使用を包含する。
【００９０】
工業的応用
本発明のα−アミラーゼ変異体は、種々の工業的応用を可能とする価値のある性質を有する。特に、本発明の酵素変異体は洗浄、皿洗浄、および硬質表面のクローニング用洗浄剤組成物の成分として使用することができる。
変更された性質を有する本発明の変異体は、澱粉プロセス、特に澱粉の変換、特に澱粉の液化において使用することができる（例えば、下記文献を参照のこと、米国特許第３，９１２，５９０号、ＥＰ特許公開Ｎｏ． ２５２ ７３０および６３ ９０９、ＷＯ ９９／１９４６７、およびＷＯ ９６／２８５６７、すべての参考文献は引用することによって本明細書の一部とされる）。また、本発明の変異体に加えて、ＡＭＧ、プルラナーゼ、および他のα−アミラーゼを含んでなる、澱粉を変換する組成物が意図される。
【００９１】
さらに、本発明の変異体は、澱粉および全穀粒から甘味料およびエタノール（例えば、米国特許第５，２３１，０１７号を参照のこと、引用することによって本明細書の一部とされる）、例えば、燃料、飲料および工業用エタノールを製造するとき、特に有用である。
また、本発明の変異体は、繊維材料の糊抜きに使用することができる（例えば、下記文献を参照のこと、ＷＯ ９５／２１２４７、米国特許第４，６４３，７３６号、引用することによって本明細書の一部とされる）。
【００９２】
洗浄剤組成物
前述したように、本発明の変異体は洗浄剤組成物の中に適当に混入することができる。洗浄剤組成物に関係する成分（例えば、洗濯または皿洗浄用洗浄剤）、このような洗浄剤組成物の中に変異体を配合するために適当な方法、および洗浄剤組成物の関係する型の例についてのそれ以上の詳細については、例えば、下記の文献を参照のこと：ＷＯ ９６／２３８７４およびＷＯ ９７／０７２０２。
【００９３】
本発明の変異体を含んでなる洗浄剤組成物は、下記の他の酵素の１または２以上をさらに含んでなることができる：プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、他のデンプン分解酵素、グルコアミラーゼ、マルトジェニックアミラーゼ、ＣＧＴアーゼおよび／またはセルラーゼ、マンナナーゼ（例えば、ＭａｎｎａｗａｙＴＭ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、デンマーク国）、ペクチナーゼ、ペクチンリアーゼ、キチナーゼ、ラッカーゼ、および／または他のα−アミラーゼ。
本発明のα−アミラーゼ変異体は好都合に使用される濃度において洗浄剤の中に混入することができる。本発明の変異体は、慣用レベルの洗浄剤を使用するとき、洗浄／皿洗浄液の１リットル当たり０．００００１〜１０ ｍｇ（純粋な、活性酵素タンパク質として計算する）のα−アミラーゼに対応する量で混入されることが現在考えられる。
【００９４】
組成物
本発明は、また、本発明の変異体、および好ましい態様において、また、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂ． ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）α−アミラーゼ（ＢＳＧ）、特にそれらの変異体を含んでなる組成物に関する。
【００９５】
他の態様において、組成物は、本発明の変異体に加えて、下記の酵素を含んでなる：グルコアミラーゼ、特にアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）に由来するグルコアミラーゼ（例えば、Ｇ１またはＧ２アスペルギルス・ニガー（Ａ． ｎｉｇｅｒ）ＡＭＧは下記の文献に開示されている：Ｂｏｅｌ他（１９８４）、「アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）からのグルコアミラーゼＧ１またはＧ２は２つの異なるが、精密に関係するｍＲＮＡから合成される」、ＥＭＢＯ Ｊ． ３（５）、ｐ． １０９７−１１０２）、またはそれらの変異体、特にＷＯ ００／０４１３６またはＷＯ ０１／０４２７３に開示されている変異体またはＷＯ ９９／２８４４８に開示されているタラロマイセス・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）ＡＭＧ。
【００９６】
特定の組み合わせは、ＬＥ３９９およびＷＯ ００／０４１３６またはＷＯ ０１／０４２７３に開示されている変異体、特に下記の置換の１または２以上を有する変異体：Ｎ９Ａ、Ｓ５６Ａ、Ｖ５９Ａ、Ａ１１９Ｐ、Ａ２４６Ｔ、Ｎ３１３Ｇ、Ｅ３４２Ｔ、Ａ３９３Ｒ、Ｓ３９４Ｒ、Ｙ４０２Ｆ、Ｅ４０８Ｒ、特にすべての変異を有する変異体である。
ある態様において、本発明の組成物は、また、プルラナーゼ、特にバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プルラナーゼを含んでなる。
【００９７】
材料および方法
酵素：
ｐＤＮ１５２８は、Ｔｅｒｍａｍｙｌをコードする完全な遺伝子ａｍｙＬを含有し、その発現はそれ自身のプロモーターにより指令される。さらに、このプラスミドはプラスミドｐＵＢ１１０からの複製起点ｏｒｉと、クロラムフェニコールに対する耐性を付与するｐＣ１９４からのｃａｔ遺伝子を含有する。ｐＤＮ１５２８はＷＯ ９６／３８７４の第９図に示されている。
【００９８】
方法：
低ｐＨフィルターアッセイ
１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＴＹ寒天プレート上の酢酸セルロース（ＯＥ ６７、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、ドイツ国ダッセル）およびニトロセルロースフィルター（Ｐｒｏｔｒａｎ−Ｂａ ８５、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ、ドイツ国ダッセル）のサンドイッチ上に、３７℃において少なくとも２１時間バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ライブラリーをプレートする。酢酸セルロース層をＴＹ寒天プレート上に配置する。
【００９９】
各フィルターサンドイッチにプレーティング後であるが、インキュベーション前に針でしるしをつけて、フィルター上に陽性の変異体を局在化できるようにし、クエン酸塩緩衝液、ｐＨ ４．５を含む容器に、結合した変異体を有するニトロセルロースフィルターを移し、８０ ℃において２０分間（野生型バックボーン中の変異体についてスクリーニングするとき）または８５ ℃において６０分間（ＬＥ３９９バックボーン中の変異体をスクリーニングするとき）インキュベートした。コロニーを有する酢酸セルロースフィルターを温室においてＴＹプレート上で使用するまで貯蔵する。
【０１００】
インキュベーション後、クエン酸塩緩衝液、ｐＨ ６．０中に１％アガロース、０．２％澱粉を含有するアッセイプレート上で、残留活性を検出する。フィルターサンドイッチと同一方法でニトロセルロースフィルターを有するアッセイプレートにしるしをつけ、５０ ℃において２時間インキュベートした。フィルターを除去した後、アッセイプレートを１０％ルゴール溶液で染色する。澱粉分解性変異体を暗青色バッ上にクグラウンド白色スポットとして検出し、次いで貯蔵プレート上で同定する。陽性変異体を第１スクリーンと同一条件下に２回再スクリーニングする。
【０１０１】
二次スクリーニング
再スクリーニング後、陽性形質転換体を貯蔵プレートから取り上げ、二次プレートアッセイにおいて試験する。陽性形質転換体を５ ｍｌのＬＢ＋クロラムフェニコール中で３７℃において２２時間成長させる。各陽性形質転換体のバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物および対照として対応するバックボーンを発現するクローンをクエン酸塩緩衝液、ｐＨ ４．５中で９０ ℃においてインキュベートし、０、１０、２０、３０、４０、６０および５８０分に試料を取る。３μｌの試料をアッセイプレート上にスポッティングする。アッセイプレートを１０％ルゴール溶液で染色する。改良された変異体はバックボーンよりも高い残留活性（アッセイプレート上でハローとして検出される）を有する変異体として見られる。改良された変異体をヌクレオチド配列決定により決定する。
【０１０２】
未精製変異体の安定性アッセイ
分析すべき変異体を発現するバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物を、１０ ｍｌのＬＢ＋クロラムフェニコール中で３７℃において２１時間成長させる。８００μｌの培養物を２００μｌのクエン酸塩緩衝液、ｐＨ ４．５と混合する。試料の時点数に対応する数の７０μｌのアリコートをＰＣＲ管中で作り、ＰＣＲ装置中で種々の時点（典型的には５、１０、１５、２０、２５および３０分）について７０ ℃（野生型バックボーン中の変異体について）または９０ ℃（ＬＥ３９９中の変異体について）においてインキュベートする。
【０１０３】
０分の試料は高温においてインキュベートしない。「α−アミラーゼ活性についてのアッセイ」において後述するように、２０ μｌを２００μｌのα−アミラーゼＰＮＰ−Ｇ７基質ＭＰＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ ＭａｎｎｈｅｉｍのカタログＮｏ． １６６０７３０）に移すことによって、試料中の活性を測定する。結果を活性百分率（０時点に関して）対時間としてプロットするか、あるいはある時間インキュベートした後の残留活性百分率として記載する。
【０１０４】
α−アミラーゼ変異体の発酵および精製
−８０ ℃のストックからの１０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天上に、関係する発現プラスミドを収容するバシラス・ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）株をストリークし、３７℃において一夜成長させる。５００ ｍｌの震蘯フラスコ内の１０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを示す１００ ｍｌのＰＳ−１培地に、コロニーを移す。
ＰＳ−１培地の組成：
パール糖　　　　　　　　　　　　１００ ｇ／ｌ
ダイズ荒粉　　　　　　　　　　　４０ ｇ／ｌ
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２ Ｈ２Ｏ　　　　　　　　 １０ ｇ／ｌ
ＰｌｕｒｏｎｉｃＴＭ ＰＥ ６１００　　　　　　　０．１ ｇ／ｌ
ＣａＣＯ３　　　　　　　　　　　　　 ５ ｇ／ｌ
培養物を３７℃において２７０ ｒｐｍで５日間震蘯する。
【０１０５】
４５００ ｒｐｍにおいて２０〜２５分間遠心することによって、細胞を細胞デブリを発酵槽から除去する。次いで、上清を濾過して完全に透明な溶液を得る。濾液を濃縮し、ＵＦフィルター（１００００カットオフ膜）上で洗浄し、緩衝液を２０ ｍＭ酢酸塩ｐＨ ５．５に交換する。ＵＦ濾液をＳ−セファローズＦ．Ｆ．上に適用し、同一緩衝液中の０．２ Ｍ ＮａＣｌを使用する段階的溶離により溶離を実施する。溶出液を１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ９．０に対して透析し、Ｑ−セファローズＦ．Ｆ．上に適用し、６カラム体積の直線勾配０〜０．３ Ｍ ＮａＣｌで溶離する。活性を含有する分画（Ｐｈａｄｅｂａｓアッセイ）をプールし、ｐＨをｐＨ ７．５に調節し、０．５％ｗ／ｖ活性炭で５分間で処理することによって残留する色を除去する。
【０１０６】
精製された変異体の安定性の測定
同一構成を使用して、精製された変異体のすべての安定性の試験を実施する。この方法は次の通りである：酵素を関係する条件下にインキュベートする（１〜４）。試料が種々の時点において、すなわち、０、５、１０、１５および３０分後に取り、アッセイ緩衝液（０．１ ｍｌの５０ ｍＭ Ｂｒｉｔｔｏｎ緩衝液ｐＨ ７．３）中の２５倍に希釈し（すべての採取した試料について同一）、標準的条件ｐＨ ７．３、３７ ℃においてファデバス（Ｐｈａｄｅｂａｓ）アッセイ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して活性を測定する。
インキュベーション前（０分）に測定した活性を参照（１００％）として使用する。百分率の傾斜をインキュベーション時間の関数として計算する。例えば、３０分のインキュベーション後の残留活性を表に示す。
【０１０７】
比活性の測定
ファデバス （Ｐｈａｄｅｂａｓ）アッセイ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して活性／ｍｇ酵素として、比活性を測定する。製造業者の使用説明書に従う（また、「α−アミラーゼ活性についてのアッセイ」参照）。
【０１０８】
α−アミラーゼ活性についてのアッセイ
１．ファデバスアッセイ
基質としてファデバス（ＰｈａｄｅｂａｓＴＭ）錠剤を使用する方法により、α−アミラーゼ活性を測定する。ファデバス錠剤（ＰｈａｄｅｂａｓＴＭ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃにより供給される）は、ウシ血清アルブミンおよび緩衝物質と混合され、錠剤化された、架橋した青色澱粉ポリマーを含有する。
【０１０９】
単一の測定毎に、５ ｍｌの５０ ｍＭ Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液、０．１ ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨをＮａＯＨで問題の値に調節する）を含有する管中に、１つの錠剤を懸濁させる。試験を問題の温度において水浴中で実施する。試験すべきα−アミラーゼをｘ ｍｌの５０ ｍＭ Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液の中に希釈する。１ ｍｌのこのα−アミラーゼ溶液を５ ｍｌの５０ ｍＭ Ｂｒｉｔｔｏｎ−Ｒｏｂｉｎｓｏｎ緩衝液に添加する。澱粉をα−アミラーゼで加水分解して、可溶性の青色フラグメントを得る。α−アミラーゼ活性の関数として、生ずる青色溶液の吸収を６２０ ｎｍにおいて分光光度測定的に測定する。
【０１１０】
１０または１５分のインキュベーション（試験時間）後に測定する６２０ ｎｍにおける吸収は６２０ ｎｍにおいて０．２〜２．０吸収の範囲であることが重要である。この吸収範囲において、活性と吸収との間に線形性が存在する（ランバート−ベールの法則）。したがって、酵素の希釈をこの基準に適合するように調節しなくてはならない。特定した組の条件 （温度、ｐＨ 、反応時間、緩衝条件）下に、１ ｍｇの所定のα−アミラーゼはある量の基質を加水分解し、青色が発生するであろう。色強度を６２０ ｎｍにおいて測定する。測定した吸収は、所定の組の条件下における問題のα−アミラーゼの比活性（活性／ｍｇの純粋なα−アミラーゼタンパク質）に直接比例する。
【０１１１】
２．別法
ＰＮＰ−Ｇ７基質を使用する法により、α−アミラーゼ活性を測定する。ＰＮＰ−Ｇ７は、ｐ−ニトロフェニル−α，Ｄ−メトヘプタオシドの略号であり、エンド−アミラーゼにより切断することができるブロックドオリゴ糖である。切断後、キットの中に含まれているα−グルコシダーゼは基質を加水分解して遊離ＰＮＰ分子を解放し、この分子は黄色を有し、λ＝４０５ ｎｍ（４００〜４２０ ｎｍ）における可視分光測定により測定することができる。ＰＮＰ−Ｇ７基質およびα−グルコシダーゼを含有するキットは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（カタログＮｏ． １０５４６３５）により製造されている。
【０１１２】
試薬溶液を調製するために、供給業者が推奨するように、１０ ｍｌの基質／緩衝液を５０ ｍｌの酵素／緩衝液に添加する。２０μｌの試料を９６ウェルのマイクロタイタープレートに移し、２５ ℃においてインキュベートすることによって、アッセイを実施する。２５ ℃に前もって平衡化した２００μｌの試薬溶液を添加する。この溶液を混合し、１分間前インキュベートし、ＯＤ ４０５ ｎｍにおける吸収を３０秒毎に４分間にわたってＥＬＩＳＡリーダーにより測定する。
時間従属的吸収曲線の勾配は、所定の条件下に問題のα−アミラーゼの活性に直接比例する。
【０１１３】
実施例
実施例１．
親酵素と比較した、低いｐＨ 、高温および低いカルシウムイオン濃度において改良された安定性を有するバシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ変異体の、誤りがちのＰＣＲ変異誘発による、構築。
【０１１４】
誤りがちのＰＣＲ変異誘発およびライブラリーの構築
親バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼの低いｐＨおよび低いカルシウム濃度における安定性を改良するために、誤りがちのＰＣＲ変異誘発を実施した。野生型バシラス・リヘニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）α−アミラーゼ遺伝子をコードするプラスミドｐＤＮ１５２８を鋳型として使用して、誤差の割合の増加がランダム点変異に導くＰＣＲ条件下に、下記のプライマーを使用して、この遺伝子を増幅した：２２１４９：５’−ＣＧＡ ＴＴＧ ＣＴＧ ＡＣＧ ＣＴＧ ＴＴＡ ＴＴＴ ＧＣＧ−３’ （配列番号１４）および２４８１４：５’−ＧＡＴ ＣＡＣ ＣＣＧ ＣＧＡ ＴＡＣ ＣＧＴ Ｃ−３’ （配列番号１５）。利用したＰＣＲ条件は次の通りであった：１０　ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ ８．３、５０ ｍＭ ＫＣｌ、４ ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３ ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．１ ｍＭ ｄＧＴＰ／ｄＡＴＰ、０．５ ｍＭ ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ、および２．５単位のＴａｑポリメラーゼ／１００μｌの反応。
【０１１５】
生ずるＰＣＲフラグメントをゲル上で精製し、下記のプライマーを使用するｐＤＮ１５２８のＰＣＲ増幅によりつくられたゲル精製ベクターフラグメントとともにＰＣＲをベースとするマルチマー化工程において使用て、挿入フラグメントに対するオーバーラップを形成した：＃２４：５’−ＧＡＡ ＴＧＴ ＡＴＧ ＴＣＧ ＧＣＣ ＧＧＣ ＡＡＡ ＡＣＧ ＣＣＧ ＧＴＧ Ａ−３’ （配列番号１６）および＃２７：５’−ＧＣＣ ＧＣＣ ＧＣＴ ＧＣＴ ＧＣＡ ＧＡＡ ＴＧＡ ＧＧＣ ＡＧＣ ＡＡＧ−３’ （配列番号１７）。マルチマー化反応を引き続いてバシラス・ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の中に導入した（Ｓｈａｆｉｋｈａｎｉ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２３（１９９７）、３０４−３１０）。
【０１１６】
スクリーニング
前述の誤りがちのライブラリーを低ｐＨフィルターアッセイにおいてスクリーニングした（「材料および方法」参照）。再スクリーニング時に陽性と試験されるクローンを二次スクリーニングに付して、材料および方法に記載されている液体アッセイにおいて安定性についてスクリーニングした。
【０１１７】
結果：
【表２】
2004508815.tif 000022
【０１１８】
【表３】
2004508815.tif 000023
【０１１９】
【表４】
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【０１２０】
実施例２．
親酵素と比較して、低いｐＨおよび低いカルシウムイオン濃度において改良された安定性への実施例１から新しい（非野生型）バックボーンへの変異の選択の、位置指定変異誘発による、転移。
【０１２１】
位置指定変異誘発
ＫＥ４９３（Ｋ１７６Ｒ＋Ｄ２０７Ｖ＋Ｙ４０２Ｆ）からの変異をＬＥ３９９に転移させて、ＬＥ４９５を生成した。これはオーバーラップＰＣＲ法による実施した（ＫｉｒｃｈｈｏｆｆおよびＤｅｓｒｏｓｉｅｒｓ、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２（１９３３）、３０１−３０４）。
【０１２２】
下記のプライマーを使用するＬＥ３９９鋳型の増幅により、２つのオーバーラップＰＣＲフラグメントを発生させた：フラグメントＡ：＃３１２ Ｍｕｔ１７６ ５’−ＣＣＣ ＧＡＡ ＡＧＣ ＴＧＡ ＡＣＣ ＧＣＡ ＴＣＴ ＡＴＡ ＧＧＴ ＴＴＣ ＡＡＧ ＧＧＡ ＡＧＡ ＣＴＴ ＧＧＧ ＡＴＴ−３’ （配列番号１８）（変異したコドンをボールドフェースで示す）および２９０ Ｄ２０７オーバーラップ　５’−ＡＧＧ ＡＴＧ ＧＴＣ ＡＴＡ ＡＴＣ ＡＡＡ ＧＴＣ ＧＧ−３’ （配列番号１９）；フラグメントＢ：＃３１３ Ｍｕｔ２０７ ５’−ＣＣＧ ＡＣＴ ＴＴＧ ＡＴＴ ＡＴＧ ＡＣＣ ＡＴＣ ＣＴＧ ＴＴＧ ＴＣＧ ＴＡＧ ＣＡＧ ＡＧＡ ＴＴＡ ＡＧＡ ＧＡＴ ＧＧＧ Ｇ−３’ （配列番号２０）および＃３１４ Ｍｕｔ４０２５’−ＣＧＡ ＣＡＡ ＴＧＴ ＣＡＴ ＧＧＴ ＧＧＴ ＣＧＡ ＡＡＡ ＡＡＴ ＣＡＴ ＧＣＴ ＧＴＧ ＣＴＣ ＣＧＴ ＡＣＧ−３’ （配列番号２１）。
【０１２３】
フラグメントＡおよびＢを等モル比で混合し、引き続いて外部のプライマーを使用して全長フラグメントを増幅した：＃３１２ Ｍｕｔ１７６および＃３１４ Ｍｕｔ４０２。前述したように鋳型ＬＥ３９９上でプライマー＃２９６ Ｙ４０２ｍｕｌｔｉ ５’−ＴＴＴ ＣＧＡ ＣＣＡ ＣＣＡ ＴＧＡ ＣＡＴ ＴＧＴ ＣＧ−３’ （配列番号２２）および＃３０５ ３９９Ｍｕｌｔｉ１７６ ５’−ＴＡＴ ＡＧＡ ＴＧＡ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＣＴ ＴＴＣ ＧＧＧ−３’ （配列番号２３）を使用してつくられたベクターＰＣＲフラグメントとのマルチマー化反応において、このフラグメントを使用した。マルチマー化反応を引き続いてバシラス・ズブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の中に形質転換した。
【０１２４】
クローンを前述のアッセイにおいて安定性についてスクリーニングした。安定性が増加したいくつかのクローンにおけるＬＥ４９３からの変異の存在を配列決定により確認した。
ＬＥ３９９をコードする鋳型をプライマー＃３１２ Ｍｕｔ１７６および＃３１４ Ｍｕｔ４０２を使用して増幅し、プライマー＃２９６ Ｙ４０２ｍｕｌｔｉおよび＃３０５ ３９９Ｍｕｌｔｉ１７６を使用してＬＥ３９９鋳型をＰＣＲ増幅して得られたベクターフラグメントとのマルチマー化反応において、生ずるＰＣＲフラグメントを使用することによって、ＬＥ４９７を得た。
結果：
【０１２５】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
第１図は、５つの親Ｔｅｒｍａｍｙｌ様α−アミラーゼのアミノ酸配列のアラインメントである。一番左の番号は、次のように代表的アミノ酸配列を表示する：
１：配列番号４ （ＳＰ７２２）
２：配列番号２ （ＳＰ６９０）
３：配列番号１０ （ＢＡＮ）
４：配列番号８ （ＢＬＳ）
５：配列番号６ （ＢＳＧ）
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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