(57)【要約】繊毛虫からのβ−ヘキソースアミニダーゼをコードする核酸。
2004500017.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊毛虫からのβ−ヘキソースアミニダーゼをコードする核酸。
【請求項２】
細胞外β−ヘキソースアミニダーゼをコードすることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
配列番号１を特に有する、図１中の核酸配列又はその一部を特徴とする請求項１又は３に記載の核酸。
【請求項４】
図２に記載のアミノ酸配列を有する蛋白質。
【請求項５】
配列ＭＱＫＩＬＬＩＴＦＬＬＧＩＡＬＡＱを特に有する請求項４に記載の蛋白質のＮ−末端フラグメント。
【請求項６】
請求項５のＮ−末端フラグメント、特に請求項１〜４のいずれかに記載の核酸のフラグメントをコードする核酸。
【請求項７】
組換え型蛋白質及びペプチドの相同又は非相同発現、並びに相同又は非相同組換え（“ノックアウト、“遺伝子置換”）のための請求項１〜４若しくは請求項６に記載の核酸又はその一部の使用。
【請求項８】
請求項１〜４、６に記載の核酸、又はその一部が、相同又は非相同発現において、通常のエンハンサー、プロモーター、オペレーター、オリジン、ターミネーター、抗生物質耐性、又は他の核酸若しくはＤＮＡフラグメント、又はウイロイド、ウイルス、細菌、花虫類動物、原生動物、真菌、植物、動物若しくはヒトのいずれかの種類の配列と組み合わされる方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか又は請求項６に記載の核酸が、ベクター、プラスミド、コスミド、染色体又はミニクロモソーム、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ｒＤＮＡ、又はいずれかの種類の環状若しくは線状ＤＮＡ若しくはＲＮＡに挿入され、又はその中で使用される方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、β−ヘキソースアミニダーゼをコードする核酸に関する。
【０００２】
細菌、酵母又は哺乳動物細胞のような微生物中での異種（ｆｏｒｅｉｇｎ）蛋白質の発現は、組換え型蛋白質のバイオテクノロジー的な調製及び生成のために非常に重要である。従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に基づく細菌発現系が、インシュリン、インターロイキン−２、組織プラスミノゲン、活性化物質（ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、プロテアーゼ又はリパーゼのような組換え型ペプチド又は蛋白質の製造に使用される。グラム陰性菌では、発現系は、ラックオペロン（ｌａｃ ｏｐｅｒｏｎ）又はトリプトファンオペロンにような遺伝的成分の使用に主に基づいている。ホストとは異種の蛋白質は、細胞内の“封入体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ）”内で、又は周辺細胞腔（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｓｐａｃｅ）内で、β−ラクタマーゼ（ｌａｃｔａｍａｓｅ）に基づく発現系が使用される場合に生成される。周囲の発酵培地（ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ）内での組換え型蛋白質の精製は、確立されていない。グラム陽性菌では、今までのところ、ほぼ専用の（ａｌｍｏｓｔ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ）細胞に固有な蛋白質が導入され、かつ発現されている。
【０００３】
Ｓ．セレビシアエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、クルイベロマイシス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、又はピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母もまた、ヒトのＸＩＩＩａ因子、ウシのプロキモシン（ｐｒｏ−ｃｈｙｍｏｓｉｎ）、又は表面抗原のような組換え型蛋白質の非相同発現のために使用される。酵母では、発現系は、ガラクト−キナーゼ−エピメラーゼ、酸ホスファターゼ、又はアルコール脱水素酵素の遺伝的成分から構成されるシャトル（ｓｈｕｔｔｌｅ）ベクター（酵母及び細菌の両方を有するベクター）に基づいている。一般に、組換え型蛋白質は、細胞の細胞質内で生成される。アルファ因子のような酵母に固有のシグナル配列が使用される場合、発現された蛋白質もまた、発酵培地内に分泌され得る。分泌された蛋白質のグリコシル化は、“高マンノース（ｈｉｇｈ ｍａｎｎｏｓｅ）”型によって達成される。
【０００４】
齧歯類動物（ｒｏｄｅｎｔｓ）からの（ＣＨＯ細胞、Ｃ１２７細胞）、又はサル（ｓｉｍｉａｎｓ）からの（ベロ（ｖｅｒｏ）、ＣＶ−１又はＣＯＳ細胞）様々な細胞のような哺乳動物細胞もまた、組換え型蛋白質の非相同発現のために使用される。ここでは、発現系は、組換え型ウイルス（ＢＰＶベクター）又はシャトルベクターに基づいている。発現の調節のために、ウイルスのＳＶ４０エンハンサー／プロモーター系又は細胞のエンハンサー成分が使用される。異種遺伝子が、発現系によって理解され、かつターゲッティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）のために使用されるそれら独自のシグナル配列を通常もたらすので、エリトロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）にような組換え型蛋白質が発酵培地内へ分泌される。
【０００５】
更に、グリコシル化細胞外酵素のバイオテクノロジー的な生成のために、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）のような繊毛虫（ｃｉｌｉａｔｅｓ）が使用される。繊毛虫は、標準発酵法を用いる安価な発酵培地上で成長するであろう。そのような繊毛虫の形質転換のために、繊毛虫テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）に基づくベクターが利用され得る。繊毛虫中での細菌蛋白質の非相同発現のために、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）からの遺伝子からなるＤＮＡ構成が使用される。異種蛋白質の転写、ターゲッティング、及びグリコシル化の調節のために適当な遺伝的成分が利用され得る場合、繊毛虫は、治療に役立つ組換え型蛋白質の安価な生成のために理想的な発現系である。
【０００６】
今まで使用されてきたグラム陰性菌発現系は、蛋白質の変性と共に細胞における“封入体”の形成を通常引き起こす。組換え型蛋白質を回収するためには、細胞を溶解しなければならず、かつ変性された不活性蛋白質を機能させるために折り返さなければならない。これは、更なる費用集約的な（ｃｏｓｔ−ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ）方法段階をもたらし、かつ所望の蛋白質の収率を低下させる。真核生物蛋白質のために重要なグリコシル化は、完全に省略される。グラム陽性菌発現系が使用される場合、発酵培養液中での高い蛋白質分解活性による目的の蛋白質の分解は、更なる問題である。
【０００７】
非相同発現のために酵母が使用される場合、所望の目的の蛋白質は、それを細胞溶解によって取り除かなければならない場所からの細胞内だけで、しばしば生成される。細菌発現系において、これは、更なる時間及び費用集約的な方法段階をもたらす。酵母に固有なシグナルペプチドが使用される場合、異種蛋白質は、分泌のために正確には接合及びグリコシル化されない。
【０００８】
それに反して、組換え型蛋白質の生成のために哺乳動物細胞系が使用される場合、所望の蛋白質は、正確に接合及びグリコシル化され、細胞外状態で、発酵培地中に見られる。しかし、一方ここでの欠点は、ウイルスベクターによる生成細胞系のゲノム中に導入された遺伝子の不完全な処理及び非能率的な翻訳による低い発現率である。一方、哺乳動物細胞のための血清含有発酵培地は、非常に費用集約的である。また、剪断感受性（ｓｈｅａｒ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）細胞系のための発酵技術は、気泡を含まない通気（ｂｕｂｂｌｅ−ｆｒｅｅ ａｅｒａｔｉｏｎ）を構成するため、複雑であり、かつ同様に高価である。更なる問題は、マイコプラズマ及びウイルスからの細胞系に対する高い汚染危険性（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｒｉｓｋ）から生じる。概して（Ａｌｌ ｉｎ ａｌｌ）、組換え型蛋白質のバイオテクノロジー的な調製のための哺乳動物細胞の使用の結果、非常に高い費用、安全の要求及び低収率がもたらされる。
【０００９】
テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）のような繊毛虫の使用には、蛋白質の生成における上記欠点は当てはまらない。従って、例えば食料粒子の消化に関連する数種の酸加水分解酵素が、複合グリコシル化（ｃｏｍｐｌｅｘ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）によって高品質で細胞から輸送される。
【００１０】
アラン（Ａｌａｍ）らのＪ．Ｅｕｋ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３（４），１９９６の２９５〜３０３ページには、テトラヒメナ・ピリフォルミス（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ ｐｙｒｉｆｏｒｍｉｓ）の酸α−グルコシダーゼをコードする遺伝子のクローニングが記載されている。しかし、蛋白質の小さな部分だけが細胞から輸送される。
【００１１】
しかし、今までは、他の異種グリコシル化真核生物蛋白質を、発酵培地中にも分泌される繊毛虫における発現にもたらすことは出来なかった。これは、発現ベクターを構成するために必要な、繊毛虫に固有の分泌された酸加水分解酵素からのＤＮＡ配列が、今まで知られていなかったことによるものである。
【００１２】
本発明の目的は、繊毛虫の分泌蛋白質の発現のためのＤＮＡ配列を提供することである。ＤＮＡ配列は、繊毛虫における形質転換の後に、発酵培地内に輸送されるべき発現系中に非相同蛋白質をもたらすであろう。この系は、培養条件下において、細胞から多量に輸送される非相同蛋白質の高発現率も達成するであろう。
【００１３】
この目的は、配列番号１（Ｓｅｑ．Ｉｄ．Ｎｏ．１）の配列を有し、かつβ−ヘキソースアミニダーゼをコードする核酸を使用する系によって達成される。
【００１４】
特に、β−ヘキソースアミニダーゼの本発明のＤＮＡ配列は、シグナルペプチド及びプロペプチド、並びに任意に更に蛋白質のターゲッティングのための遺伝的成分を含む。ベクター中でのこれら配列の使用は、細胞から輸送され、かつそれにより細胞溶解なしに発酵培養液から精製されるべき非相同発現された蛋白質をもたらす。
【００１５】
図１は、繊毛虫からのβ−ヘキソースアミニダーゼをコードする核酸を示す。図２は、配列番号１による核酸の対応する発現生成物を示す。本発明は、配列番号２によるこの蛋白質にも関する。
【００１６】
特に、本発明は、本発明による蛋白質のシグナル配列に関する。これは、好ましくは本発明による蛋白質のアミノ酸１〜１７である。本発明は、Ｎ−末端フラグメントをコードする核酸にも関する。これは、好ましくは、特に図１に記載の核酸配列１〜５１を有する本発明による核酸のフラグメントである。
【００１７】
本発明の更なる態様は、組換え型蛋白質の相同又は非相同発現のための、及び相同又は非相同組換え（“ノックアウト（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）、“遺伝子置換（ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）”）のための、本発明による酸加水分解酵素の核酸配列又はその一部の使用である。
【００１８】
本発明は、β−ヘキソースアミニダーゼをコードする本発明による核酸又はその一部が、相同又は非相同発現において、通常のエンハンサー、プロモーター、オペレーター、オリジン、ターミネーター、抗生物質耐性、又は他の核酸若しくはＤＮＡフラグメント、又はウイロイド（ｖｉｒｏｉｄｓ）、ウイルス、細菌、花虫類動物（ａｒｃｈｅｚｏａｎｓ）、原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａｎｓ）、真菌、植物、動物若しくはヒトのいずれかの種類の配列と組み合わされる方法にも関する。
【００１９】
特に、本発明による核酸又はその一部は、ベクター、プラスミド、コスミド、染色体若しくはミニクロモソーム（ｍｉｎｉｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）、トランスポゾン、ＩＳエレメント、ｒＤＮＡ、又はいずれかの種類の環状若しくは線状ＤＮＡ若しくはＲＮＡ内に挿入される。
【００２０】
当業者は、配列番号１による核酸と少なくとも４０％の相同性を有する核酸も、本発明により使用され得ることを理解するであろう。配列番号２による蛋白質もまた、その機能を損なうことなく変性され得るであろう。従って、例えば、アミノ酸のいわゆる保存的な（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ）交換を行うこともできる。従って、例えば、疎水性アミノ酸が交換され得る。
【００２１】
繊毛虫からのβ−ヘキソースアミニダーゼの精製及び単離のために、及びその配列の決定のために、以下の方法を使用することができる。これは、以下の実施例によって説明される。
【００２２】
【実施例】
実施例１
合計３．２リットルの細胞培養液から、末期の（ｌａｔｅ）対数的成長段階にある繊毛虫テトラヒメナの細胞を、４００ｍｌの飢餓培地（ｓｔａｒｖｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ）（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）中で洗浄し、細胞を攪拌しながら更に４時間インキュベートした。その後、細胞を含まない培養液の上清を採取し、孔径を小さくしたいくつかのフィルターによって濾過し、細かい（ｐａｒｔｉｃｕｌａｒ）物質を全て取り除いた。濾液を、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）超濾過セルによって濃縮し、次のイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）のために、開始（ｓｔａｒｔｉｎｇ）バッファー中で再度緩衝液処理した。
【００２３】
回収されたクロマトグラフィー画分を、酸加水分解酵素、酸ホスファターゼ（ａＰＡｓｅ）及びβ−ヘキソースアミニダーゼ（β−Ｈｅｘ）に対して特異的な４−ニトロフェニル基質を用いて試験し、最も高いβ−Ｈｅｘ活性を有する画分を混合した。それらを、別のアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）超濾過によって濃縮し、アフィニティークロマトグラフィーのために開始バッファー中で再度緩衝液処理した。回収されたクロマトグラフィー画分の上記の酵素活性を試験し、酸加水分解酵素に対して最も高い活性を有する画分を混合し、リン酸塩バッファー（ＰＢ）中で再度緩衝液処理した。合計８回の精製から、加水分解酵素を含有するクロマトグラフィー画分を貯留し、濃縮し、分割し、更なる特徴化まで凍結させた。
【００２４】
このように精製された加水分解酵素の一部を、二次元ＳＤＳゲル電気泳動（合計８つのゲル）によって分離し、主なスポットをそれぞれ穴を開けて回収した。これらのゲル片に存在する蛋白質、β−Ｈｅｘを、蛋白質分解酵素トリプシンによって消化した。このように得られたペプチドフラグメントを、ゲル片から濾し出し、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって分離した。ＨＰＬＣフラグメントの純度を、質量分光法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）によって試験し、純粋な画分、即ち、規定の質量のペプチドを一種のみ含有するものを、エドマン（Ｅｄｍａｎ）分解を用いてＮ−末端から配列決定した。
【００２５】
トリプシン消化によって得られたペプチドフラグメントの配列から、β−ヘキソースアミニダーゼに特異的なＰＣＲプライマーを得た。存在するβ−Ｈｅｘ配列との配列比較により、ＲＴ−ＰＣＲのためのプライマーの組合せを予め選択することができた。この情報によって、ノーザンハイブリダイゼーション（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）によってその品質を予め試験した、単離された全ＲＮＡから、ＲＴ−ＰＣＲを用いて最初の特異的ｃＤＮＡフラグメントを増幅して配列決定した。これらのフラグメントを用いて、更なるＰＣＲ実験に用いられる配列特異的プライマーを構成した。得られた各プライマー及び各部分配列を、データベース列（ｄａｔａ ｂａｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）によって確認し、更なる実験の前に、全ての見落とした（ｏｖｅｒｌｏｏｋｅｄ）ベクター配列も特に確認した。５´−及び３´−ＲＡＣＥによって、ｃＤＮＡ配列を５´−及び３´−末端で延長させた。このように完成されたβ−Ｈｅｘ ｃＤＮＡの配列は、その後、更なる配列分析の基礎として役立った。
【００２６】
繊毛虫からこのように得られたβ−ヘキソースアミニダーゼの配列は、図１に記載のように読まれる。合計で、この配列は、１６５６塩基対の長さを有するオープン・リーディング・フレーム（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）と共に、β−ヘキソースアミニダーゼの５´−及び３´−非翻訳（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）領域を含む１８３６塩基対を含む。相補性アミノ酸配列は、５５１個のアミノ酸長さを有し、図２に記載のように読まれる。
【００２７】
β−ヘキソースアミニダーゼの配列は、合計９個のグリコシル化部位を有し、細胞のメカニズムの選別による酵素のターゲッティングのためのシグナルペプチド及びプロ配列（ｐｒｏ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、繊毛虫からのβ−ヘキソースアミニダーゼをコードする核酸を示す。
【図２】図１は、繊毛虫からのβ−ヘキソースアミニダーゼをコードする核酸を示す（続き）。
【図３】図２は、配列番号１による核酸の対応する発現生成物を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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