(57)【要約】１つの実施形態において、本発明は、５’−ＣＴＡＧＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣ−３’の配列を含むか、もしくはこれに由来する第１のオリゴヌクレオチドまたはこれに対して相補的な核酸配列に関する。第１のオリゴヌクレオチドは、１５と３０の間のヌクレオチドの核酸を伴って使用されて、Ｖβ１３．１遺伝子の一部を増幅し得、このヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドの配列を含まず、そしてＶβ１３．１　Ｔ細胞におけるＶβ１３．１遺伝子のＶβからＪβの領域に見出され、ここでこのオリゴヌクレオチドおよび核酸の配列は、Ｖβ１３．１遺伝子対の同じ鎖上には見出されない。あるいは、この第１のオリゴヌクレオチドは、Ｖβ１３．１　Ｔ細胞のＴ細胞レセプターにおいて見出されるＬＧＲＡＬＴＹモチーフの検出方法において、標識基を伴って使用され得る。
2004506743.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３の配列を含む、８〜約４５アミノ酸長のペプチド。
【請求項２】
配列番号３である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号３２のアミノ酸２〜２１を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号３２のアミノ酸２〜２１からなる、請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
ヒトにおける自己免疫疾患を処置する方法であって、以下：
（ａ）ヒトからＭＢＰ８３−９９　Ｖβ１３．１　Ｔ細胞を得る工程；
（ｂ）ＭＢＰ８３−９９　Ｖβ１３．１　Ｔ細胞から核酸サンプルを得る工程；
（ｃ）以下から選択されるか以下に由来するプライマー対と、前記核酸配列とを接触させる工程：
（ｉ）約１５〜３０ヌクレオチド長の第１のオリゴヌクレオチドであり、配列番号１の少なくとも１０の連続したヌクレオチド、またはこれに相補的な核酸を含む、オリゴヌクレオチド；および
（ｉｉ）約１５および３０のヌクレオチド長の第２のオリゴヌクレオチドであり、該第１のオリゴヌクレオチド配列を含まず、Ｔ細胞のＴ細胞レセプターにおけるＶβ１３．１遺伝子のＶβからＪβ領域において見出される。オリゴヌクレオチド、
ここで該第１および該第２のオリゴヌクレオチドの配列が該Ｔ細胞レセプター遺伝子の同じ鎖上には見出されない、工程；および
（ｄ）ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸の存在を検出する工程；および、該核酸が検出された場合、
（ｅ）９〜約４５アミノ酸長のペプチドを、ヒトに投与する工程であって、ここで該ポリペプチドが配列番号３の配列を含む、工程、
を包含する、方法。
【請求項６】
Ｖβ１３．１遺伝子配列が配列番号２である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記投与する工程がさらに、Ｔ細胞活性化マーカーペプチドを投与する工程を包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドが配列番号３２のアミノ酸２〜２１を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドが配列番号３２のアミノ酸２〜２１からなる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
自己免疫疾患を処置するための薬学的組成物であって、８〜約４５アミノ酸長のペプチドを含み、ここで該ペプチドが配列番号３の配列を含む、組成物。
【請求項１１】
前記ペプチドが配列番号３である、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドが配列番号３２のアミノ酸２〜２１を含む、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記ペプチドが配列番号３２のアミノ酸２〜２１からなる、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、２０００年２月２２日出願の同時係属出願番号第０９／５０７，８１９号の一部継続である。
【０００２】
アメリカ合衆国政府は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ（国立衛生研究所）から助成金番号ＮＳ３６１４０に従って本発明において権利を所有し得る。
【０００３】
（１．発明の分野）
本発明は概して、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ））の処置の分野に関する。さらに詳細には、本発明は、幾人かのＭＳ患者において見出されたＴ細胞レセプター配列、およびその検出のための方法に関する。
【０００４】
（２．関連技術の説明）
ヒトおよび他の哺乳動物において、Ｔ細胞レセプターがＴ細胞で見出される。Ｔ細胞レセプターは、α鎖およびβ鎖を含み、β鎖は、Ｎ末端からＣ末端に以下の領域を含む：Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ−Ｃβ。Ｔ細胞レセプターは、Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ領域で天然に異なる。
【０００５】
抗原が抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってＴ細胞に提示されるとき、この抗原を認識するように生じた可変領域（Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ）を有するＴ細胞レセプターが、このＡＰＣ上でこの抗原に結合する。次いでＴ細胞レセプターを保有するＴ細胞が活性化（クローンの拡大）をうける。
【０００６】
多数の自己免疫疾患の病原は、この生物体によって正常には示される抗原に対する自己免疫性Ｔ細胞応答に依存すると考えられる。このような疾患の例は、ミエリン抗原（特にミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ））に対するＴ細胞応答において一般に生じる、多発性硬化症（ＭＳ）である。ＭＢＰ反応性Ｔ細胞は、インビボ活性化をうけ、そしてＭＳを有する患者の血中および脳脊髄液において、コントロールの個体とは対照的にさらに高い前駆体頻度で生じることが見出されている。これらのＭＢＰ−反応性Ｔ細胞は、Ｔｈ１サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＴＮＦ、およびγ−インターフェロン）を生じる。これらのＴｈ１サイトカインは、炎症性細胞の中枢神経系への遊走を促進し、そしてＭＳにおけるミエリン破壊的な炎症性応答を増悪する。
【０００７】
多数の調節機構が、ＭＳの処置において利用され得る。このうちの１つは、細胞外ドメインを有する限られた数のＴ細胞膜関連ペプチドの１つ以上を用いるワクチン接種である。Ｖａｎｄｅｎｂａｎｋ、米国特許第５，６１４，１９２号は、Ｔ細胞レセプターの第二の相補性決定領域（ＣＤＲ２）の少なくとも一部を含む１５〜３０アミノ酸の免疫原性のＴ細胞レセプターペプチドの使用による自己免疫疾患の処置を開示している。Ｚｈａｎｇによる同時係属の米国特許出願（６０／０９９，１０２）は、免疫原性Ｔ細胞活性化マーカーペプチドと組み合わせた免疫原性Ｔ細胞レセプターペプチドの使用による自己免疫疾患の処置を開示する。
【０００８】
Ｔ細胞レセプターペプチドを用いたワクチン接種の１領域は、ＭＳのような自己免疫疾患を有する患者のＴ細胞レセプターにおいてどのような共通のモチーフが（もし存在するなら）見出されるかを決定することによって改善される。このようなモチーフが見出されれば、この患者は、処置を促進するために、このモチーフに同一なペプチドでワクチン接種され得る。
【０００９】
従って、自己免疫疾患を有する患者のＴ細胞レセプターにおいて見出される共通のモチーフのアミノ酸配列を有することが所望され得る。ＰＣＲのような便利な方法によって、患者のサンプルにおいてこのようなモチーフを容易に検出し得ることがまた所望される。さらに、自己免疫疾患を有する患者の処置のために、検出されたモチーフに同一なペプチドを使用することが所望され得る。
【００１０】
本発明は、Ｖβ１３．１Ｔ細胞のサブセットのＴ細胞レセプターにおいて見出されたこのような共通のモチーフ、「ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフ」、およびＰＣＲによるその容易な検出のための方法を開示する。このモチーフは、アミノ酸配列Ｌｕｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ（配列番号３）を有する。このモチーフは、ＭＢＰのアミノ酸８３〜９９（本明細書において以降は、「ＭＢＰ８３〜９９」）を認識するいくつかのＴ細胞のいくつかのＴ細胞レセプターにおいて見出される。Ｖβ１３．１　Ｔ細胞のこのサブセットの場合におけるこのモチーフは、本明細書において以降は、「Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ」と呼ばれ得る。このモチーフに同一なペプチドは、患者にワクチン接種して、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹが関連する自己免疫疾患を処置または予防するために用いられ得る。このような自己免疫疾患の１つは、ＭＳである。
【００１１】
（発明の要旨）
１つの実施形態において、本発明は、配列番号１の少なくとも１０連続するヌクレオチドを含む約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド、またはそれに対して相補的な配列もしくはそれから誘導された配列に関する。なおより好ましいのは、配列番号の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、もしくは２３連続するヌクレオチド、またはそれに相補的な配列を含む、約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。最も好ましいのは、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれの相補的な配列を含む、約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。
【００１２】
さらなる一連の実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ　Ｔ細胞において見出された核酸配列の増幅または検出において必要とされ得る。このような実施形態の１つのサブシリーズにおいて、このオリゴヌクレオチドがプライマー対において用いられる。このプライマー対は、以下を包含するかまたは以下から誘導され、ここで（ａ）および（ｂ）の配列は、Ｔ細胞レセプター遺伝子の同じ鎖においては見出されない：
（ａ）第一プライマーであって、この第一プライマーは約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、配列番号１の少なくとも１０連続するヌクレオチド、またはそれに対して相補的な配列を含む、第一プライマー；および
（ｂ）第二のプライマーであって、この第二プライマーは、約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、配列（ａ）を含まず、そしてこの第二プライマーは、Ｔ細胞のＴ細胞レセプターにおけるＶβ１３．１遺伝子（配列番号２）のＶβ〜Ｊβの領域において見出され得る、第二プライマー。
【００１３】
好ましくは、この第一プライマーは、配列番号１の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、もしくは２３連続するヌクレオチド、またはそれに対して相補的な配列を含む、約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。最も好ましいのは、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれに対して相補的な配列を含む、約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。
【００１４】
このような実施形態の別のサブシリーズにおいて、このオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドプローブとして用いられ、このオリゴヌクレオチドプローブは、以下を含む：
（ａ）約１５〜３０ヌクレオチド長であり、配列番号１の少なくとも１０連続するヌクレオチド、またはそれに相補的な配列を含む、オリゴヌクレオチド；および
（ｂ）標識化部分。
【００１５】
好ましくは、このオリゴヌクレオチドは、約１５〜３０ヌクレオチド長であり、そして配列番号１の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、もしくは２３連続するヌクレオチド、またはそれに対して相補的な配列を含む。最も好ましいのは、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれに対して相補的な配列を含む、約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。標識化部分は、好ましくは３２Ｐまたはジゴキシゲニンから選択される。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを発現するＭＢＰ８３〜９９　Ｖβ１３．１　Ｔ細胞を検出する方法に関し、この方法は以下を包含する：
（ｉ）ＭＢＰ８３−９９　Ｖβ１３．１　Ｔ細胞から核酸サンプルを得る工程；
（ｉｉ）この核酸サンプルと、以下から選択または誘導されたプライマー対とを接触する工程：
（ａ）約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含む第一プライマーであって、配列番号１の少なくとも１０連続するヌクレオチド、またはそれに相補的な配列もしくはそれから誘導された配列を含む、第一プライマー；および
（ｂ）約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含む第二プライマーであって、（ａ）の配列を含まず、そしてＶβ１３．１　Ｔ細胞におけるＶβ１３．１遺伝子（配列番号２）のＶβ〜Ｊβの領域に見出される、第二プライマー、であって、
ここで（ａ）および（ｂ）の配列は、Ｖβ１３．１遺伝子の同じ鎖では見出されない工程；ならびに
（ｉｉｉ）ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸の存在を検出する工程。
【００１７】
好ましくは、この第一プライマーは、配列番号１の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２３連続するヌクレオチド、またはそれに相補的な配列を含む、約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。最も好ましいのは、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれに相補的な配列を含む、約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。
【００１８】
本発明の別の実施形態は、ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを含む（すなわち、配列番号３の配列を含む）、８〜約４５アミノ酸残基長のペプチドに関する。本発明の実施形態の種々の局面において、このペプチドは、配列番号３２の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２連続するアミノ酸を含む。好ましくはペプチド配列は、配列番号３であり、この配列は、配列番号３２の残基２〜２１である。最も好ましくは、このペプチド配列は、配列番号３２の残基２〜２１である。
【００１９】
なお別の実施形態において、本発明は、自己免疫疾患を処置するための方法に関しており、この方法は以下を包含する：
（ａ）ヒトからＭＢＰ８３−９９Ｖβ１３．１　Ｔ細胞を得る工程；
（ｂ）上記の方法によってＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸の存在を検出する工程；
および、この核酸が検出される場合、
（ｃ）各々がＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを有する、９〜約４５アミノ酸長の１つ以上のペプチドをヒトに投与する工程。本発明のこの実施形態の種々の局面において、ヒトに投与されたこのペプチドは各々、配列番号３２の９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、または３２連続するアミノ酸を含む。好ましくはこのペプチド配列は、配列番号３であるか、またはこのペプチド配列は、配列番号３２の残基２〜２１を含む。最も好ましくは、このペプチド配列は、配列番号３２の残基２〜２１である。
【００２０】
なおさらなる実施形態において、本発明は、自己免疫疾患をモニタリングする方法に関しており、この方法は、以下を包含する：
（ａ）ヒトからＭＢＰ８３−９９Ｖβ１３．１　Ｔ細胞を得る工程；
（ｂ）上記の方法によってＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸の存在を検出する工程；
および、この核酸が検出される場合、
（ｃ）この核酸を定量する工程。
【００２１】
（例示的な実施形態の記載）
本発明の理解を助けるために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００２２】
「ＰＣＲ」とは、ポリメラーゼン連鎖反応を意味し、例えば、一般に、米国特許第４，６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｎｓに対して、１９８７年７月２８日に発行された）（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載される。ＰＣＲは、増幅技術であり、ここで、選択されたオリゴヌクレオチドおよびプライマーが、重合因子（例えば、ポリメラーゼ）および４種のヌクレオチド三リン酸の存在下で核酸テンプレートとハイブリダイズされ、伸長産物がこのプライマーから形成される。次いで、これらの産物は、変性され、そしてその後の検出を容易にするために、存在する核酸の数および量を増幅するサイクル反応において、テンプレートとして使用される。種々のＰＣＲ技術が利用可能であり、そして本発明に従う方法と共に使用され得る。
【００２３】
「プライマー」とは、天然または合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを意味し、テンプレート分子上の特定のＤＮＡ配列に相補的なＤＮＡ合成の開始点として作用し得る。
【００２４】
用語「〜に由来するプライマーまたはプローブ」に関して、「〜に由来する」とは、列挙されたオリゴヌクレオチド配列に限定されないが、列挙されたヌクレオチド配列におけるバリエーション（列挙された配列に対するバリエーションが、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列、すなわちＬｕｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ（配列番号３）をコードするＴ細胞レセプターＤＮＡの検出においてプライマーとして作用する能力を保持する程度まで、ヌクレオチド付加、欠失または置換を含む）をも含む、プライマーまたはプローブを意味する。
【００２５】
「免疫原性」とは、ペプチドを説明するために使用する場合、Ｔ細胞媒介性、抗体、またはこれら両方のいずれかの免疫応答を誘導し得るペプチドを意味する。「抗原性」とは、抗体によって遊離形態で認識され得るペプチド、そして抗原特異的Ｔ細胞の場合には、ＭＨＣ分子について意味する。
【００２６】
「免疫関連疾患」とは、免疫系がこの疾患の病因に関与する疾患を意味する。免疫関連疾患のサブセットは、自己免疫疾患である。本発明によって企図される自己免疫疾患としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：慢性関節リウマチ、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、グレーヴズ病、炎症性腸疾患、自己免疫性ブドウ膜網膜炎（ｕｖｅｏｒｅｔｉｎｉｔｉｓ）、多発性筋炎、および特定の型の糖尿病。本発明の開示の観点から、当業者は、本発明の組成物および方法によって処置可能な他の自己免疫疾患を容易に認識し得る。「Ｔ細胞媒介性疾患」は、生物において通常見出されるＴ細胞認識ペプチドの結果として、生物において引き起こされる疾患を意味する。
【００２７】
「処置」または「処置する」は、疾患からの動物の保護をいう場合、疾患を予防、抑制（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）または抑圧（ｒｅｐｒｅｓｓ）することを意味する。疾患を予防することは、疾患の誘導前に、本発明の組成物を動物に投与することを包含する。疾患を抑制することは、疾患の誘導後だが臨床的外観の前に、本発明の組成物を動物に投与することを包含する。疾患を抑圧することは、疾患の臨床的外観の後に、本発明の組成物を動物に投与することを包含する。疾患誘導の過程のいつであるかがいつも明らかであるわけではないが、ヒトの医学において、本発明の組成物が投与されることが理解される。
【００２８】
１つの局面において、本発明は、以下の配列または以下に由来する配列を含むプライマー対に関する：
（ａ）約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである第一のプライマーであって、配列番号１の少なくとも１０連続するヌクレオチドまたはこれに相補的な核酸配列を含む、プライマー；および
（ｂ）約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである第二のプライマーであって、（ａ）の配列を含まず、そしてＶβ１３．１　Ｔ細胞におけるＴ細胞レセプター遺伝子のＶβ〜Ｊβの領域において見出される、プライマー。ここで、（ａ）および（ｂ）の配列は、Ｔ細胞レセプター遺伝子と同じ鎖上には見出されない。
【００２９】
好ましくは、この第一のプライマーは、約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、配列番号の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３連続するヌクレオチド、あるいはこれらに対して相補的な配列を含む。最も好ましいものは、約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、配列番号１のヌクレオチド配列またはこれに対して相補的な配列を含む。
【００３０】
本発明に従うプライマーは、ヒトＶβ１３．１　Ｔ細胞のＴ細胞レセプターをコードする遺伝子のフラグメントを増幅するように設計され、このフラグメントは、アミノ酸モチーフ、Ｌｕｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ（配列番号３）を含む。ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを含む、Ｔ細胞レセプターをコードする、Ｖβ１３．１　Ｔ細胞由来の遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋに提出され、登録番号ＡＦ１１７１３２を有する。ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを含む、Ｔ細胞レセプターをコードする、Ｖβ１３．１　Ｔ細胞由来の遺伝子の配列は、本明細書中で配列番号２として与えられる。本発明に従う方法において、Ｖβ１３．１　Ｔ細胞由来のＴ細胞レセプター遺伝子の約４００ｂｐのフラグメントは、２つのプライマーを使用して増幅され、ここで、第一のプライマーは、ＣＤＲ３領域にあり、そして第二のプライマーは、Ｃβ領域にある。Ｔ細胞レセプター遺伝子のＶβ−Ｄβ−Ｊβ領域は、ＣＤＲ３領域とＣβ領域との間を含む。好ましい実施形態において、これらのプライマーは、上記のプライマー対である。
【００３１】
本発明に従うプライマーはまた、プライマー（ａ）〜（ｂ）に由来するオリゴヌクレオチドを含む。配列は、プライマーの１つと実質的に同じ配列を有するかまたは含み、そして上記のようなＶβ１３．１　Ｔ細胞由来のＴ細胞レセプター遺伝子のＶβ−Ｄβ−Ｊβ領域のほぼ同じＣＤＲ３領域またはＣβ領域に選択的にアニーリングする能力を保持する場合に、プライマー（ａ）または（ｂ）に由来する。より具体的には、このプライマーは、Ｖβ１３．１　Ｔ細胞由来のＴ細胞レセプター遺伝子のＶβ−Ｄβ−Ｊβ領域の同定された領域に対する選択性を保持する限り、長さまたは配列中の１以上の位置の核酸の種類が、プライマー（ａ）または（ｂ）とは異なり得る。例えば、このプライマーは、少なくとも１５ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドであり得、ここで、この１５ヌクレオチドは、プライマー（ａ）〜（ｂ）の配列から選択されるかまたはこれらに由来する、一連の１５連続核酸と同一である。このプライマーはまた、約３０ヌクレオチド以下の任意のオリゴヌクレオチドであり得、プライマー（ａ）〜（ｂ）のいずれかから選択されるかまたはこれらに由来する配列を有する、セグメントを含む。プライマー中のヌクレオチドの数は、選択性を保持するために十分高くあるべきだが、プライマー合成およびＰＣＲ手順において有効性および作動可能性を保持するために、十分低くなければならない。このプライマーは、プライマー（ａ）〜（ｂ）の配列に対するバリエーションが、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹの検出においてプライマーとして作用する能力を保持する範囲で、ヌクレオチドの欠失、付加または置換を含むバリエーションを有し得る。
【００３２】
本発明に従うＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ検出方法は、サンプルにおける任意のＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹの存在を検出する手順において、上記の一対のプライマーを使用する。Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹの存在について試験されるサンプルは核酸であり、好ましくはＤＮＡである。このＤＮＡはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＰＣＲにより予め増幅されたＤＮＡまたは任意の他の形態のＤＮＡであり得る。このサンプルは、Ｔ細胞レセプターβ鎖遺伝子を発現する任意の動物組織またはヒト身体組織から、直接的または間接的に単離され得る。好ましい身体組織は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。サンプルがゲノムＤＮＡである場合、これは身体組織から直接的に単離され得る。サンプルがｃＣＮＡである場合、これは身体組織から直接的に単離されたｍＲＮＡの逆転写により間接的に単離され得る。サンプルがＰＣＲにより予め増幅されたＤＮＡである場合、これはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または任意の他の形態のＤＮＡの増幅により間接的に単離され得る。
【００３３】
好ましい実施形態において、Ｖβ１３．１　Ｔ細胞由来のＴ細胞レセプター遺伝子の部分（ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする配列を含む部分）は、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ（５’−ＣＴＡＧＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣ−３’（配列番号１））の存在を検出する能力を増強するために増幅される。この増幅は、サンプルにおける部分の感受性、選択性および迅速な増幅を提供する任意の特定のＰＣＲ技術または設備を用いるＰＣＲ反応によって実施され得る。
【００３４】
例えば、このＰＣＲ増幅は、以下の手順で実行され得、ここで、反応混合物は以下の成分を含み調製される：５μＬ　１０×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭ　ＫＣｌ）、３μＬ　２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１μＬ　１０ｍＭ　ｄＮＴＰ混合物、０．３μＬ　Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）（ＡｍｐｌｉＴａｑ　Ｇｏｌｄ、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）、３０ｐｍｏｌのプライマーＡ、および３０ｐｍｏｌのプライマーＢ。本発明の開示を考慮して、当業者は、Ｖβ１３．１　Ｔ細胞由来のＴ細胞レセプター遺伝子部分のＰＣＲ増幅の目的のために、適切なプライマーＡおよびプライマーＢを選択し得る。上記の混合物は１μＬのサンプルＤＮＡを増幅するために適切である。以下、増幅されるＤＮＡは「テンプレート」と呼ぶ。
【００３５】
一旦、サンプルＤＮＡが上記の反応混合物に添加されると、このＰＣＲ反応は９５℃で１分間（変性）；５６℃で２０秒間（アニーリング）、および７２℃で４０秒間（伸長）について総計３５サイクルの増幅プロフィールを用いて実行され得る。
【００３６】
ＰＣＲ反応において、このテンプレートは、２つのオリゴヌクレオチドプライマーについて熱変性およびアニーリングされ得る。オリゴヌクレオチドは、増幅される核酸配列の領域を一括する。熱安定性のＤＮＡポリメラーゼは、反応混合物に含まれる。ポリメラーゼは、適切な相補的核酸を添加することにより、相補的なＤＮＡにアニールされたプライマーを伸長する。好ましいポリメラーゼは、少なくとも９５℃の温度で安定な特徴を有し、５０〜６０の前進性を有し、そして１分あたり５０ヌクレオチドよりも速い伸長速度を有する。
【００３７】
およそ４０ＰＣＲサイクルが、代表的なＰＣＲ増幅反応において用いられる。しかし、特定のＰＣＲ反応は、わずか１５〜２０サイクルまたは５０サイクルほどで実施される。各々のサイクルは、融解工程から構成され、ここで、テンプレートは約９５℃よりも高い温度に加温される。
【００３８】
次いで、ＰＣＲ反応の温度は、プライマーがテンプレートにアニールすることを可能にするために冷却される。このアニーリング工程において、この反応温度は、約５５℃〜７２℃の間でおよそ２０秒間調整される。より長時間またはより短時間は、特定の反応に依存して実施され得る。
【００３９】
次いで、ＰＣＲ反応の温度は、ポリメラーゼによって影響されるプライマーの最大伸長を可能にするために加温される。この伸展工程において、この反応温度は、約７０℃〜７５℃の間でおよそ４０秒間調整される。より高温またはより低温および／あるいはより長時間またはより短時間は、特定の反応に依存して実施される。
【００４０】
さらに、最初のサイクルが始まる前に、この反応物混合物は、約５分〜１５分の期間で最初の変性が実施される。同様に、最終のサイクルが終了した後、この反応混合物は、約５分〜１０分の期間で最後の伸展が実施され得る。
【００４１】
増幅は、２工程ＰＣＲを使用して実施され得る。この技術において、第一のＰＣＲ増幅反応は、目的の領域よりも長く、かつ目的の領域を含んでいる第一の領域の増幅を実施される。次いで、第二のＰＣＲ増幅反応は、目的の領域を増幅させるためのテンプレートとして第一の領域を用いて、実施される。第一のＰＣＲ反応からのいずれかのプライマーが第二のＰＣＲ反応において使用され得る場合、第二のＰＣＲ反応は、「セミネスト化（ｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄ）」である。第一のＰＣＲ反応からのどちらのプライマーも第二のＰＣＲ反応において使用され得ない場合、第二のＰＣＲ反応は、「ネスト化（ｎｅｓｔｅｄ）」である。
【００４２】
本発明の方法を実施する好ましい様式において、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフが２工程ＰＣＲにより増幅される。第一のＰＣＲ反応において、第一のプライマー（Ｔ細胞レセプター遺伝子のＶβ領域にアニールする）および第二のプライマー（Ｔ細胞レセプター遺伝子のＣβ領域にアニールする）を用いて、上に開示の反応混合物および反応プロフィールを使用して、このサンプルは増幅される。第一のＰＣＲ反応は、第一の領域（約６００ｂｐであり、そしてＶβからＶβ−Ｄβ−Ｊβ連結を通ってＣβまで伸展する）を増幅する。第二のＰＣＲ反応は、ネスト化またはセミネスト化される；第一の領域部分は、プライマーペアー（ａ）−（ｂ）を用いて部分的に増幅される。第二のＰＣＲ反応は、目的の領域を増幅する。
【００４３】
サンプルにおいてＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹをコードする任意のＤＮＡの増幅後、この増幅産生物は検出される。この検出は、多くの手順により実施され得る。例えば、増幅産生物のアリコートは、電気泳動ゲル上に充填され得る（電場はサイズによりＤＮＡ分子を分離するために印加される）。別の方法において、増幅産生物のアリコートは、ＳＹＢＲグリーン、臭化エチジウムまたはＤＮＡに結合し、検出シグナルを発するような他の分子を用いて染色されたゲル上に充填される。例えば、臭化エチジウムはＤＮＡに結合し、紫外光に照射された場合、可視光を発する。乾燥させたゲルは、代替的に放射標識または化学標識されたオリゴヌクレオチド（増幅されたテンプレートの配列部分に相補的である）（これ以降、「オリゴヌクレオチドプローブ」と名付ける）を含み、フィルムにこのゲルを曝露することによりオートラジオグラフが取られる。
【００４４】
別の実施形態において、本発明はオリゴヌクレオチドプローブに関し、以下
（ａ）配列番号１の少なくとも１０の連続したヌクレオチド、またはそれに相補的な核酸配列を含む、約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド；および
（ｂ）標識部分
を包含する。
【００４５】
好ましい「（ａ）」は、約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドであり、これは、配列番号１の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の連続したヌクレオチド、またはそれらに相補的な配列を含む。好ましくは、標識部分は３２Ｐまたはジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｎｇｅｎｉｎ）から選択される。
【００４６】
本発明のプライマーを用いて産生された増幅産生物の検出のために有用な、代表的な放射標識されたオリゴヌクレオチドは、Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ領域に由来する。Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ領域は、上に開示の二工程セミネスト化ＰＣＲにより増幅される（ここで、ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする配列に対応するプライマーが使用される）場合、増幅されたＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ領域のいずれかの鎖の部分に相補的な約１０以上のヌクレオチド、そして好ましくは約１８以上のヌクレオチドの任意のオリゴヌクレオチドが使用され得る。より好ましくは、オリゴヌクレオチド５’−ＣＴＡＧＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＣＴＣＡＣＣＴＡＣ−３’（配列番号１）またはそれらに相補的な核酸配列がプローブとして使用される。
【００４７】
本発明はまた試験キットを包含し、これは、配列番号１の少なくとも１０の連続したヌクレオチドまたはそれに相補的な核酸配列を含む、約１５〜３０ヌクレオチド長の第一のプライマー（ａ）を含む。
【００４８】
１つの好ましい実施形態において、試験キットはさらに第二のプライマー（ｂ）を包含し、ここで、第二のプライマーは、（ａ）の配列を含まない約１５〜３０ヌクレオチド長の核酸配列であり、そしてＴ細胞におけるＶβ１３．１　Ｔ細胞レセプター遺伝子のＶβからＪβまでの領域に見出される。ここで（ａ）および（ｂ）の配列は、Ｔ細胞レセプター遺伝子の同じ鎖において見出されない。
【００４９】
より好ましい前記第一のプライマーは、配列番号１の１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３の連続したヌクレオチド、またはそれらに相補的な配列を含む、約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。最も好ましくは、配列番号１のヌクレオチドまたはそれらの相補的配列を含む、約１５〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドである。最も好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド配列、またはそれに相補的な配列を含む約１５〜３０ヌクレオチド長である。
【００５０】
この実施形態において、この試験キットは、上記のようなＰＣＲ技術によるＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ　ＤＮＡの増幅において有用な少なくとも１つの試薬をさらに含む。キットに含まれ得る例示的な試薬としては、緩衝液、デオキシヌクレオシド三リン酸、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）、ポジティブコントロールのためのＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ　ＤＮＡおよびネガティブコントロールのための非Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ　ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。この試験キットに含まれ得る他の試薬は、当業者に公知である。
【００５１】
別の好ましい実施形態において、この試験キットはさらに、標識部分を含む。好ましい標識部分は３２Ｐまたはジゴキシゲニンである。
【００５２】
本発明の別の実施形態は、ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを含む（すなわち、配列番号３の配列を含む）、８〜約４５アミノ酸残基長のペプチドに指向される。本発明のこの実施形態の種々の局面において、このペプチドは、配列番号３２の８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２の連続したアミノ酸を含む。好ましくは、このペプチド配列は、配列番号３または配列番号３２の２〜２１残基である。最も好ましくは、このペプチド配列は、配列番号３２の２〜２１残基である。本発明のこの実施形態の好ましい局面において、このペプチドは精製されたペプチドとして存在する。「精製されたペプチド」とは、サンプル中のポリペプチドの大部分（５０％より多く）が所望のペプチドであることをいう。好ましくは、所望のペプチドは、精製されたペプチドサンプル中のペプチドの７０％より多くを構成する。より好ましくは、このペプチドは、サンプル中のペプチドの９０％より多くを構成する。さらにより好ましくは、このペプチドは、サンプル中のペプチドの９５％より多くを構成する。さらに、用語「精製されたペプチド」とは、サンプルが本発明の作用を妨害する物質を含まないことを示す。
【００５３】
本発明のこの局面に従うペプチドは、天然または合成（当業者に公知の市販の供給源から入手し得る）のいずれかの、本発明に適合可能な任意の供給源に由来し得る。
【００５４】
本発明の他の実施形態は、上記のペプチドを含む薬学的組成物を提供する。薬学的なペプチド組成物を生成する方法は、当該分野に公知である（例えば、米国特許第６，０６６，６１９号および同第６，０６８，８５０号を参照のこと（これらは参考として本明細書中に援用される））。本発明のこの実施形態の種々の局面は、薬学的に受容可能な賦形剤、キャリアまたは希釈剤を含み得、そして生物学的に有害ないかなる物質をも含まない。本発明の薬学的組成物は当業者によって処方され得る。例示的な薬学的処方物はまた、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａｌｆｏｎｓｏ　Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、第１６版、１９８０）に記載され、これは薬学分野における標準的な参考書であり、本明細書中に援用される。
【００５５】
薬学的組成物はさらに、着色剤または安定剤、浸透剤、抗菌剤または組成物の機能を妨害しない任意の他の物質を含み得る。本発明の薬学的組成物は、例えば、薬学的に受容可能な非経口的ビヒクルに関連する溶液、懸濁液、または乳濁液として処方され得る。このビヒクルは、等張性を維持する添加物（例えば、塩化ナトリウムまたはマンニトール）および化学的安定性を維持する添加物（例えば、緩衝液および保存剤）を含み得る。内毒素汚染が安全なレベル（例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満）で維持されるべきであることは、理解されるべきである。さらに、ヒトの投与のために、調製物は、滅菌性、発熱性、一般的な安全性および米国食品医薬品局の生物学的基準によって必要とされるような純度基準に見合うべきである。この処方物は濾過のような一般的な技術を用いることによって滅菌され得る。
【００５６】
句「薬学的に受容可能な」とは、動物またはヒトに必要に応じて投与された場合、有害な、アレルギー性の、または別の指向していない反応を生じない物質および組成物をいう。これらの有害な影響のいずれかを引き起こす物質は、本発明の範囲内で「生物学的に有害」として分類される。薬学的に受容可能な物質および組成物としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：溶媒、分散培地、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張性剤および吸収遅延剤。任意の慣用的な成分の使用は、本発明に不適合なものを除いて考慮される。さらに、他のいくつかの薬学的に好都合な目的に利用される補助的活性成分もまた、即時性の組成物に組み込まれ得る。
【００５７】
本発明はまた、自己免疫疾患を処置する方法を含む。この疾患は、少なくとも幾人かの患者について、ＬＧＲＡＧＬＴＹを含むＴ細胞レセプターがＶβ１３．１　Ｔ細胞で見出される疾患である。Ｔ細胞の他の型、および／またはＶβ１３．１　Ｔ細胞（ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを含むＴ細胞レセプターを欠く）が、この患者によって示され得る。この方法は、以下：
（ａ）ヒトからＭＢＰ８３−９９　Ｖβ１３．１　Ｔ細胞を得る工程；
（ｂ）上記の方法によってＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸の存在を検出する工程；
（ｃ）ヒトに、９〜約４５アミノ酸残基長の１つ以上のペプチドを含む薬学的組成物を投与する工程；を包含し、ここで、各々のペプチドはＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを含んでいる。
【００５８】
この方法の種々の局面において、薬学的組成物はヒトに投与され、これは、配列番号３２の配列の９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１または３２の連続したアミノ酸を有する１つ以上のペプチド含む。好ましくは、このペプチド配列は、配列番号３または配列番号３２の２〜２１残基を含むペプチド配列である。最も好ましくは、このペプチド配列は、配列番号３２の２〜２１残基である。
【００５９】
この自己免疫疾患は、ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを含むＴ細胞レセプターがＶβ１３．１　Ｔ細胞に見出される任意の自己免疫疾患であり得る。本発明により考慮される自己免疫疾患としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：慢性関節リウマチ、重症筋無力症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）、グレーヴズ病、炎症性腸疾患、自己免疫ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎および特定の型の糖尿病。好ましい自己免疫疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）である。
【００６０】
ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸が上に開示の方法により検出される場合、この自己免疫疾患は上記のような１つ以上のペプチドを含む薬学的組成物を投与することによって処置され得る。本発明の薬学的組成物は、単独、またはＴ細胞活性マーカーペプチドと組み合わせて投与され得る。好ましくは、この薬学的組成物は、Ｚｈａｎｇ、米国特許出願第６０／０９９，１０２号（これは、本明細書中で参考として援用される）の開示にしたがって、Ｔ細胞活性マーカーペプチドと組み合わせて投与される。ペプチドの投与は、免疫原性応答を引き起こし得、ここで、この患者は、Ｖβ１３．１　Ｔ細胞で見出されたＴ細胞レセプターのＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフを認識し、かつそれに結合する抗体およびＴ細胞レセプターを発達させる。
【００６１】
Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹは、ＭＳを患った患者およびこの疾患を患っていない正常な個体の両方に存在し得るので、本発明の薬学的組成物が、ＭＳを有する患者および正常な個体の両方に投与され得ることが考えられる。
【００６２】
代替の実施形態において、ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフをコードする核酸が上に開示された方法によって検出される場合、自己免疫疾患は、核酸を定量化することによってモニタリングされ得る。核酸が、サンプル（例えば、ＰＢＭＣ）中に多量に存在すればするほど、Ｖβ１３．１　Ｔ細胞の数は多くなり、おそらく自己免疫の症状の重篤度は高くなる。また、高度なＶβ１３．１　Ｔ細胞レベルの提示と症状の出現との間の時間に依存して、臨床医は、症状の重篤度を最小にするための処置を適用する機会を設け、そして／またはこの症状が現れる前に、この疾患を処置し得る。
【００６３】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証することが含まれる。これらの実施例において開示される技術（この技術は、以下に示される）は、本発明者らによって発見され、本発明の実施において十分に機能し、従って、その実施のために好ましい様式で構成されるとみなされ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、本開示の観点から、当業者は、開示された特定の実施形態において、多くの変更がなされ得、そしてさらに、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同じ結果または類似の結果が得られることを理解すべきである。
【００６４】
（実施例）
（実施例１：ＭＳを有する、異なる患者由来のＭＢＰ８３−９９特異的Ｔ細胞クローンの間で共有される、Ｔ細胞レセプターＶβ−Ｄβ−Ｊβ　ＤＮＡ配列および配列モチーフ）
ＣＤ４＋非依存性Ｔ細胞クローンの２０個のパネルを、ＭＳを有する７人の患者から作製した。全てのＴ細胞クローンは、抗原掲示細胞としてＤＲＢ１＊１５１０でトランスフェクトされたマウス線維芽細胞（Ｌ細胞）を使用することによって決定されるように、ＨＬＡ−ＤＲ２の状況においてミエリン塩基性タンパク質の８３−９９ペプチド（ＭＢＰ８３−９９）を認識した。Ｔ細胞クローンを、Ｖα特異的オリゴヌクレオチドプライマーおよびＶβ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用する逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）における、ＴＣＲ　Ｖ遺伝子再配列について特徴付け、続いて、Ｖα−Ｊα接合部領域およびＶβ−Ｄβ−Ｊβ接合部領域について配列決定した。これらの接合部領域の配列を、表１および表２に示す。
【００６５】
表１は、逆転写ＰＣＲ（これは、Ｖα遺伝子ファミリーに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのパネルを使用する（使用された特有のプライマーの配列は、各クローンに対応するＤＮＡ配列において下線を施すことによって示される））によるＶα遺伝子用法によって特徴付けられる、非依存性ＭＢＰ８３−９９特異性Ｔ細胞クローンの２０個のパネルを用いた分析結果を要約する。各クローンの「Ｖα」、「ｎ」、「Ｊα」および「Ｃα」部分のアミノ酸配列を、以下のように表１に示す：「ｎ」部分には下線を施し、「Ｖα」および「Ｊα」配列を、「ｎ」配列のそれぞれの側に太字で示し、そして「Ｃα」配列には下線を施さず、通常の字体で示す。増幅ＰＣＲ産物を、ジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｎｇｅｎｉｎ）標識Ｃα　ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、続いて、ＤＮＡ配列について分析した。
【００６６】
表２は、非依存性ＭＢＰ８３−９９特異的Ｔ細胞クローンの２０個のパネルの分析結果を要約する。これらのクローンを、逆転写ＰＣＲ（これは、２６のＶβ遺伝子ファミリーに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットを使用する（各クローンに対する特定のプライマーの配列は、対応するＤＮＡ配列において下線を施すことによって示される））によるＶβ遺伝子用法について分析した。各クローンの「Ｖβ」、「Ｄ」、「Ｊβ」および「Ｃβ」部分を、以下のように表２に示す：「Ｄ」部分には下線を施し、「Ｖβ」および「Ｊβ」配列を、「Ｄ」配列のそれぞれの側に太字で示し、そして残りの配列である「Ｃβ」配列は、通常の字体である（下線でも太字でもない）。増幅ＰＣＲ産物を、ジゴキシゲニン標識Ｃβ　ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせ、続いて、ＤＮＡ配列について分析した。
【００６７】
（表１：ＭＢＰ８３−９９ペプチドに特異的なＴＣＲ　Ｖα遺伝子配列）
【００６８】
【表１】
2004506743.tif 000003
2004506743.tif 000004
（表２：ＭＢＰ８３−９９ペプチドに特異的なＴＣＲ　Ｖβ遺伝子配列）
【００６９】
【表２】
2004506743.tif 000005
2004506743.tif 000006
2004506743.tif 000007
ＶαおよびＶβの再配列は、個々のＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞クローンの間で変化したが、所定の個体由来の、これらの非依存性Ｔ細胞クローンの多くが、同じＶα−ＪαおよびＶβ−Ｄβ−Ｊβ接合部領域配列と、同一のＶα鎖およびＶβ鎖を共有した。この知見は、以前に報告されたように（Ｖａｎｄｅｖｙｖｅｒ　１９９５，Ｗｕｃｈｅｒｐｆｅｎｎｉｎｇ　１９９４）、ＭＳを有する所定の患者におけるＭＢＰ８３−９９特異的Ｔ細胞のインビボでのクローン増殖と一致する。
【００７０】
興味深いことに、表１および表２に示されるように、１人の患者（ＭＳ−１）由来の非依存性Ｔ細胞クローン（クローンＥ２．６）は、別の患者（ＭＳ−２）から得られた４つのＴ細胞クローンのうちの３つのクローン（クローンＣ３．１、Ｄ７．１６およびＦ３．４）と、同じＶβ１３．１およびＶα１７を共有した。これらのＴ細胞クローンのＶβ１３．１は、Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ接合部領域内に同一のＤＮＡ配列を共有した。
【００７１】
（実施例２：Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ特異的オリゴヌクレオチドプライマーは、もとのＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞クローン、およびもとのＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞を含有するＰＢＭＣ中に存在する、対応するＤＮＡ配列を検出する際に、高度に特異的であり、かつ高感受性であった）
１４のオリゴヌクレオチドプライマーのセットを、非依存性ＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞クローンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ接合部領域内のＤＮＡ配列に従って合成し、続いて、ＲＴ−ＰＣＲにおいて、これらの特異性について試験した。これらのオリゴヌクレオチドプライマーのＤＮＡ配列を、表３に示す。
【００７２】
（表３：Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ特異的オリゴヌクレオチドプライマーのＤＮＡ配列）
【００７３】
【表３】
2004506743.tif 000008
これらのＶβ−Ｄβ−Ｊβ特異的プライマーは、もとのＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞クローン内に存在するＤＮＡ配列に排他的に結合したが、関連していないＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞クローン由来の配列には結合しなかった（図２）。このことは、もとのＶβ−Ｄβ−Ｊβ　ＤＮＡ配列に対する、それらの高度な特異性を示唆する。クローンＭＳ１−Ｅ２．６およびクローンＭＳ２−Ｃ３．１についての例外にのみ注意した（これらにおいて、同じプライマーが、Ｔ細胞クローンによって共有されるＶβ−Ｄβ−Ｊβ接合部のＤＮＡ配列に結合した）。
【００７４】
Ｖβ−Ｄβ−Ｊβオリゴヌクレオチドプライマーの特異性、およびＰＣＲ検出システムの高感度性を考慮して、本発明者らは、５’ＶβプライマーおよびＶβ−Ｄβ−Ｊβ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用する、この二段階ＰＣＲ検出システムを使用して、ＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞クローンが由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）検体中に存在する、対応するＶβ−Ｄβ−Ｊβ　ＤＮＡ配列を検出するか否かを求めた。２つの別々の実験の結果は、もとのＰＢＭＣ検体におけるＶβ−Ｄβ−Ｊβ配列のポジティブな検出を示した。従って、Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ配列がフィンガープリントとして働くＰＣＲ検出システムは、同一のＤＮＡ配列を探索することによって、末梢血単核細胞内に存在するＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞を追跡する際に、特異的でありかつ感受性であるという知見が実証された。
【００７５】
（実施例３：ＭＳを有する異なる患者および健康な個体に由来するＰＢＭＣ標本中の共通のＶβ−Ｄβ−Ｊβ　ＤＮＡ配列の検出）
次いで、本発明者らは、ＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞クローンのＶβ−Ｄβ−Ｊβ接合領域に対応するＤＮＡ配列が、ＭＳを有する患者の群および健康な個体の群から無作為に選択したＰＢＭＣ標本中に検出され得るか否かを調べた。（第１のＰＣＲにおいて）対応するＶβファミリーに対する特異的なプライマーおよび（第２の半ネストティドＰＣＲにおいて）Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ配列に対する特異的なプライマーを使用する同一のＰＣＲ増幅系を使用した。これと、対応するＶβ−Ｄβ−Ｊβプローブを用いるサザンブロット分析を併用し、ハイブリダイゼーションを実施した。この２工程ＰＣＲ検出系の特定の必要条件ならびにＶβ−Ｄβ−Ｊβプライマーおよびプローブの特異性を与える場合、同定されたＤＮＡ配列は特定のＴＣＲ　Ｖβ鎖由来であり、そして、このＤＮＡ配列は、目的のＶβ−Ｄβ−Ｊβ配列に対して、同一性または類似性のいずれかを表す。
【００７６】
これらの結果によって、１つのＶβ−Ｄβ−Ｊβオリゴヌクレオチドプライマー（ＭＳＩ−Ｅ２．６，Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ）のみが、ＭＳを有する異なった患者から得た４８個のＰＢＭＣ標本のうち１５個のＰＢＭＣ標本（３１％）において、相補的ＴＣＲ　Ｖβ１３．１　ＤＮＡ配列を検出したことが示された。従って、この知見によって、ＭＳを有するこれらの患者においてＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹを発現するＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞の存在が示される。類似の実験条件下で、同じプライマーはまた、健康な個体から得た２０個のＰＢＭＣ標本のうち５個のＰＢＭＣ標本（２５％）において対応するＤＮＡ配列を検出した。残りの１３個のＶβ−Ｄβ−Ｊβプライマーは、ＰＢＭＣ標本の同じパネルにおいていずれの配列シグナルも同定できなかった。これらの結果は、３つの別個の実験において再現可能であった。増幅のための第１のＰＣＲにおいて１３．１特異的プライマーを使用したので、Ｅ２．６プライマーによって増幅された同定されたＤＮＡ産物は、Ｖβ１３．１を発現するＴ細胞に由来する。
【００７７】
さらに、この同定されたＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列はまた、ＭＳ（ＭＳ−３５，ＭＳ３６およびＭＳ３９）を有する５人の患者から生成された２４個の短期（ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ）ＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞株のうち１３個の細胞株（５４％）において増幅され、これらの患者のＰＢＭＣ標本は、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列を含むことが示された。従って、これらの結果によって、これらのＰＢＭＣ標本において検出されたＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ　ＤＮＡ配列が、ＭＢＰ８３−９９を認識する数人のＴ細胞に由来することを確認した。この知見はまた、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列を発現するＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞は、ＭＳを有する患者において見出されたＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞株のうちの全てまたは大部分のＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞株を表すことを示唆する。
【００７８】
併用したＰＣＲ−ＤＮＡハイブリダイゼーション検出系（ここで、Ｖβ−Ｄβ−Ｊβ配列をフィンガープリントとして使用した）によって、同一のＶβ−Ｄβ−Ｊβ接合部配列の検出による抗原特異的Ｔ細胞の追跡における強力なツールを提供した。この検出系の高い特異性および感度によって、末梢血Ｔ細胞における特定のＶβ−Ｄβ−Ｊβ配列の同定を可能にした。この研究によって、ＭＢＰの免疫優性の８３−９９のペプチドを認識し、同一のＶβ−Ｄβ−Ｊβ配列を一様に発現する、Ｖβ１３．１　Ｔ細胞の共通のサブセットが、ＭＳを有する患者のうち約３０％に存在するということを初めて実証した。この結果を、本明細書中に記載される段階的な実験に基づいて得た。第一に、同一のＤＮＡ配列（Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ）を、ＭＳを有する異なる患者に由来する独立したＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞クローンにおいて見出した。第二に、この配列を、ＭＳを有する異なる患者から得たＰＢＭＣ標本のＴＣＲ　Ｖβ１３．１から増幅したｃＤＮＡ産物中で同定した。第三に、このＤＮＡ配列を、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列を含むことが示されているＰＢＭＣ標本から生成した短期の独立したＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞株において検出した。Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列を発現するＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞は、ＭＳを有する数人の患者から生じたＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞株のうち全てまたは大部分を示すようである。最後に、ＰＢＭＣ標本におけるＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列の存在を、組換えＤＮＡクローニングおよび直接的なＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００７９】
さらに、共通のＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列を発現するＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞がまた、数人の健康な個体においても存在することは驚くべきことではない。これまで報告された研究は、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞（これは、免疫優性の８３−９９ペプチドを認識するＴ細胞を含む）がまた、数人の健康な個体においても存在することを示す（Ｚｈａｎｇ　１９９４，Ｏｔａ　１９９０）。しかし、これらのＴ細胞は、健康な個体とは対照的に、ＭＳを有する患者においてインビボ活性化およびクローン性増殖を受けるという機能的な違いが存在する（Ｚｈａｎｇ　１９９４）。
【００８０】
共通のＶβ−Ｄβ−Ｊβ配列を共有するこれらのＶβ１３．１　ＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞は、ＭＳを有する数人の患者において見出されるＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞のうちの有意な部分を表し得る。この可能性は、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹ配列が、２回の刺激サイクル後にＭＳを有する患者から生じた短期ＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞株のうちの４０％で存在したという観察によって支持される。
【００８１】
同定された共通のＶβ−Ｄβ−Ｊβ配列を、定量的ＰＣＲ検出系における特異的なマーカーとして使用して、この疾患に潜在的に関連するインビボクローン増殖およびインビボの活性をモニターする目的のために、ＭＳ患者の大きな群において血液および脳脊髄液におけるＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞の共通のサブセットを検出し得る。この方法は、従来の細胞培養に基づくアッセイよりも優れており、これは、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞のインビトロの選択および増殖が、しばしば、細胞培養に特有の種々の阻害性因子によって阻まれるからである。これは、直接的なエキソビボ分析を使用してＭＢＰ反応性Ｔ細胞を定量する場合に、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の頻度がＭＳを有する患者において驚く程高いことが見出された最近の研究（Ｈａｆｌｅｒ（最後に列挙された著者）ＪＥＭ　１９９７）と合致する。
【００８２】
さらに、このＴＣＲに対応する合成ペプチドは、ＭＳを有する患者において、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞に対する抗イディオタイプＴ細胞の応答を誘導することが示された（Ｃｈｏｕら，Ｊ．Ｉ．）。従って、共通のＣＤＲ配列を含有するＴＣＲペプチドは、そのＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞が共通のＣＤＲ３配列モチーフを保有する患者の群においてＭＢＰ反応性Ｔ細胞の特定のサブセットを抑制するために抗イディオタイプＴ細胞を誘引する、大変大きな潜在能力のあるものであり得る。このような共通のＣＤＲ３ペプチドで免疫することは、ＭＳを有する患者における潜在的な処置手順としてＣＤＲ２ペプチドまたは個体依存性ＣＤＲ３ペプチドよりも有益である（Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ　１９９６）。
【００８３】
（実施例４：ＭＳを有する患者におけるＴ細胞ワクチン接種による免疫ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンおよび２０マーのＴＣＲペプチドに対する免疫応答の誘導ならびに免疫された患者由来の共通のＣＤＲ３配列を組み込むＴＣＲペプチドに対する特異的な抗体を産生するＢ細胞株の生成）
照射を受けた自己ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンで皮下接種することによって、ＭＳを有する患者における実質的な抗イディオタイプＴ細胞応答が誘導されることが実証され、これはワクチン接種に使用される循環ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の進行性の枯渇と相関した（Ｍｅｄａｅｒら，１９９５）。
【００８４】
（材料および方法）
（試薬およびペプチド）
細胞培養に使用した培地は、Ａｉｍ−Ｖ無血清培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）であった。ＭＢＰの免疫優性ペプチド（残基８３〜９９）および２０アミノ酸の２つのＴＣＲペプチドを、Ｃｈｉｒｏｎ　Ｍｉｍｏｔｏｐｅ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）によって合成した。このペプチドの純度は、９５％を超えた。
【００８５】
（ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の前駆体頻度の評価）
ＰＢＭＣを、ＭＢＰ（４０μｇ／ｍＬ）の存在下にて（全部で９６ウェルに対して）２００，０００細胞／ウェルでプレートした。７日後、全ての培養物を、照射した自己ＰＢＭＣの存在下にてＭＢＰで再刺激した。さらに１週間後、各ウェルを４つのアリコート（１アリコート当たり約１０４細胞）に分割し、そして、ＭＢＰの存在下およびＭＢＰの非存在下で、１０５の照射した自己ＰＭＢＣを用いて二連で培養した。この培養を、３日間維持し、そして最後の１６時間の培養の間、１ウェル当たり１μＣｉにて［３Ｈ］チミジン（Ｎｙｃｏｍｅｄ　Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）でパルスした。次いで、細胞を、自動細胞収集機を使用して収集し、そして［３Ｈ］チミジンの取り込みを測定した。
【００８６】
１分当たりの計数（ｃｏｕｎｔｓ　ｐｅｒ　ｍｉｎｕｔｅ）（ＣＰＭ）は、１０００を超え、そして、少なくとも３倍分、（ＭＢＰの非存在下で）参照ＣＰＭを超過した場合、ウェル／培養物を、ＭＢＰまたはＭＢＰのペプチドについて特異的であると規定した。次いで、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞の前駆体頻度を、初期培養において播種されたＰＢＭＣの総数（１９．２×１０６細胞）で特定のウェルの数を除算することによって評価した。
【００８７】
（ミエリン反応性Ｔ細胞クローン）
陽性同定されたＴ細胞株を、２μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン−タンパク質（ＰＨＡ−Ｐ）の存在下で限界希釈アッセイを使用してクローン化した。培養物に、３〜４日毎に新たな培地を供給した。増殖陽性ウェルを、増殖アッセイでのＭＢＰ８３−９９ペプチドに対する特異的反応性について試験した。得られたＭＢＰ８３−９９特異的Ｔ細胞クローンを、さらに特徴づけ、そしてこれをＴ細胞ワクチン接種のために使用した。
【００８８】
（ＴＣＲ　Ｖ遺伝子分析およびＤＮＡ配列決定）
免疫ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンのＴ細胞レセプターＶ遺伝子再編成を、逆転写ＰＣＲを使用して分析した。ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の遺伝子を増幅し、そして他に記載されるように直接的に配列決定した（Ｖａｎｄｅｖｙｅｒら，１９９５；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｃ．Ｑ．ら、１９９８）。簡潔には、総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を使用して１０６細胞の各ＭＢＰ８３−９９反応性Ｔ細胞クローンから抽出した。総ＲＮＡから逆転写された第一鎖ｃＤＮＡを、ＴＣＲ　ＶαおよびＶβの遺伝子ファミリー（この配列は、刊行された（Ｖａｎｄｅｖｙｅｒら，１９９５；Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｃ．Ｑ．ら、１９９８））に特異的な１セットのプライマーを用いるＰＣＲ増幅に供した。増幅されたＰＣＲ産物を、電気泳動によって１％アガロースゲル中で分離し、エチジウムブロマイドで染色した。この視覚化したＰＣＲ産物を切出し、その後、これを、配列分析前にＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）を使用して精製した。精製したＰＣＲ産物を、Ｔ７配列決定キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）で直接的に配列決定した。１．５μｇのテンプレートを、ジデオキシ鎖終止法を使用して２ｐｍｏｌの対応するＶ遺伝子プライマーを用いて配列決定した。
【００８９】
（照射された自己ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンを用いるＭＳ患者の免疫）
磁気共鳴画像法で確認した臨床的に明確なＭＳを有する２人の患者を、この研究に含めた。彼らを、二年を超える再発弛張性（ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ）ＭＳを有するとして診断した。これらの患者は、この研究前の少なくとも三ヶ月間にいずれの免疫調製薬物も服用していなかった。照射された自己ＭＢＰ８３−９９反応性Ｔ細胞クローンでの免疫を、以前に記載したように実施した（Ｊ．Ｚｈａｎｇら、１９９２，１９９３）。簡潔には、ＭＢＰ８３−９９反応性Ｔ細胞クローンを、活性化し、そしてＰＨＡの存在下にて注射前に７日間増殖させた。次いで、Ｔ細胞に、（６０Ｃｏ源を使用して）１０，０００　ｒａｄで照射し、滅菌生理食塩水で完全に洗浄した。２つの自己Ｔ細胞クローン由来の全部で４×１０７の細胞を、２ｍｌの無菌生理食塩水に再懸濁し、これを腕の皮下に注射した。各患者は、二ヶ月の間隔で総計４回の注射を受け、免疫Ｔ細胞クローンに対するＰＢＭＣの増殖で定義されるような、十分な免疫応答を達成した。このプロトコルは、ｔｈｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｕｂｊｅｃｔｓ　Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ　ａｔ　Ｂａｙｌｏｒ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅにより承認を得た。同意書を、実験手順を説明した後に患者から得た。これらの患者を、各免疫の前後に、有害事象および障害スコア（Ｅｘｐａｎｄｅｄ　Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ　Ｓｃａｌｅ　Ｓｃｏｒｅ）に対して評価した。ガドリニウム増強ＭＲＩスキャンを、免疫前、および免疫後の異なる時点において実施した。この臨床的評価および放射線写真的評価は、別個の臨床研究の部分である。
【００９０】
（ＥＢＶ形質転換による抗体産生Ｂ細胞株の生成）
この方法は、他のところに記載されている（Ｊ．Ｚｈａｎｇ，１９８９，１９９１）。簡潔には、ＰＢＭＣを、ＥＢＶを産生するＢ９５．８株（ＡＴＣＣ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）の無細胞上清および０．５μｇ／ｍｌのＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ　Ａ（Ｓａｎｄｏｚ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の存在下でマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中に２０，０００　細胞／ウェルでプレートし、Ｔ細胞増殖を選択的に阻害した。細胞を、３〜４日毎に培地を変えつつ１４日間培養した。第１４日目に、この増殖陽性ウェルを視覚化し、そして培養物上清を、試験のために収集した。特定の抗体を産生するＢ細胞の前駆体頻度を、プレートされたＰＢＭＣの総数で陽性ウェルの数を除算することによって評価した。陽性Ｂ細胞株を、その後、増殖のために２４ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）に移した。このＢ細胞株は、代表的に、２〜１０μｇ／ｍｌの比較的純粋な抗体を産生した。
【００９１】
（抗ＴＣＲ抗体のＥＬＩＳＡによる検出）
培養物上清を、個々のＢ細胞株から収集し、そしてこれらを、ＥＬＩＳＡを使用して抗イディオタイプ抗体の存在について試験した。簡潔には、マイクロタイタープレートを、４℃にて、このモチーフ陽性ＴＣＲペプチドまたはコントロールＴＣＲペプチドでそれぞれ１μｇ／ｍｌの濃度で一晩被覆した。ウェルを、次いで、３７℃にて２時間、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）含有ＰＢＳでブロックし、そしてこれらを、０．９％　ＮａＣｌ溶液中の０．０２％　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）にて４回洗浄した。各サンプルおよびそのコントロールを、隣のウェルに添加し、２時間インキュベートした。プレートを、４回洗浄し、そして１：１５００希釈率で西洋ワサビペルオキシダーゼに結合体化したヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共に３０分間インキュベートした。クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）中の０．０１２５％テトラメチルベンジジン／０．００８％Ｈ２Ｏ２を基質として使用し、そして発色を２Ｎ　Ｈ２ＳＯ４を使用して停止した。光学密度を、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｂｉｏｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して測定した。培地のみを含むウェルを、バックグラウンドコントロールとして供給した。
【００９２】
（免疫ブロット分析）
溶解物を、他のところに記載される標準的な方法（Ｈｊｅｌｍｅｌａｎｄら，１９８４）を使用して、共通ＣＤＲ３配列を発現する代表的なＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローン（ＭＳ７．Ｅ２．６）から調製した。簡潔には、５×１０６のＴ細胞を、以下を含む１００μｌの溶解緩衝液中で溶解した：１５０Ｍ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、１ｍＭ　ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン。細胞残屑を、１３，０００ｇにて、２０分間、４℃で遠心分離した。得られた溶解物を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して電気泳動した。ブロッティング後、ニトロセルロースメンブレンを、細片（ｓｔｒｉｐ）に切断し、次いで、０．１％　Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水中の５％低脂肪粉乳（ｍｉｌｋ−ＴＢＳＴ）でブロックした。次いで、この細片を、室温にて、１時間、ミニインキュベーショントレイ中で希釈していない上清と共にインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヤギ抗ヒトＩｇＧおよびＩｇＭ（重鎖および軽鎖）を二次抗体（２％　ｍｉｌｋ−ＴＢＳＴ中の１００ｎｇ／ｍｌ）として使用して、そしてこれを洗浄した細片と共に４５分間インキュベートし、その後、メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）上のタンパク質の増強された化学発光視覚化を行った。非反応性抗体を産生するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株から得た上清を陰性コントロールとして使用した。ウサギポリクローナル抗ヒトＴＣＲβ鎖抗体（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を、陽性コントロールとして含めた。
【００９３】
（フローサイトメトリー）
共通ＣＤＲ３配列を発現する代表的なＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローン（ＭＳ７−Ｅ２．６）を、４℃にて、３０分間、個々のＢ細胞株由来の抗イディオタイプ抗体と共にインキュベートした。非反応性抗体を産生するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株から得た上清をコントロールとして使用した。ＦＡＣＳ緩衝液（５％ウシ胎仔血清および０．０１％アジ化ナトリウムを含有するＰＢＳ）を用いて２３００ｒｐｍにて、２分間、４℃で遠心分離により洗浄した後、細胞を再懸濁し、そしてフルオレセインに結合体化したヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＩｇＭ抗体（ＦＩＴＣ）で染色した。２回の洗浄後、この細胞を、３００μｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用してフローサイトメトリーで分析した。ＦＩＴＣ結合体化抗ＩｇＧ１を使用してバックグラウンド染色を検出した（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）。
【００９４】
（阻害アッセイ）
２０，０００細胞の免疫ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローン（モチーフ陽性およびモチーフ陰性のＴ細胞クローン）を、ＭＢＰの８３〜９９ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）の存在下およびこれの非存在下にて、照射された自己ＰＢＭＣ（１００，０００細胞／ウェル）と共に１５０μｌ中で培養した。５０μｌの希釈していない上清を各ウェルに添加した。細胞増殖を、［３Ｈ］−チミジン取り込みアッセイで７２時間後に測定した。非反応性抗体を産生するＥＢＶ形質転換Ｂ細胞株から得た上清をコントロールとして使用した。
【００９５】
（結果）
（免疫ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンの機能的および構造的な特徴）
４つのＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンのパネルを、再発性弛張性ＭＳを有する２人の患者から生成した。これらのＴ細胞クローンは、ＣＤ４表現型を示し、そしてＤＲ４分子またはＤＲ２（ＤＲＢ１＊１５０１）分子に関してＭＢＰの８３〜９９免疫優性ペプチドを認識した。これらを、ＶαおよびＶβに特異的なプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲによってＴＣＲ　Ｖ遺伝子再編成について分析し、その後Ｖα−ＪαおよびＶβ−Ｄβ−Ｊβ接合領域について配列決定した。患者ＭＳ７由来の独立したＴ細胞クローン（Ｅ２．６）は、同一のＴＣＲ　Ｖα１７遺伝子およびＶβ１３．１遺伝子を、異なる患者（ＭＳ２７）から得た別のＴ細胞クローン（Ｃ３．１）と共有した。２つのＴ細胞クローンは、Ｖβ１３．１−Ｄβ−Ｊβ接合領域中に同一の配列（配列番号３）を有したが、一方で、これらのＶα１７鎖は、２つ別個のＶα−Ｊα接合領域配列を有した。上述したように、同定されたＬｕｅＧｌｙＡｒｇＡｌａＧｌｙＬｅｕＴｈｒＴｙｒ（配列番号３）という配列は、ＭＳを有する異なる患者（２３）におけるＭＢＰの８３−９９免疫優性領域を認識するＶβ１３．１Ｔ細胞において共通ＣＤＲ３モチーフに相当した。
【００９６】
（ＭＳに罹患した患者におけるＴ細胞ワクチン接種による、ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンおよび２０マーＴＣＲペプチドの免疫化に対する免疫応答の誘導）
各患者は、合計４回の皮下接種を、２回照射した自家ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローン（２×１０７細胞／クローン）で２ヶ月の間を空けて受けた。ＰＢＭＣの免疫化自家Ｔ細胞クローンに対する増殖性応答を、ベースラインおよび最後の免疫化から２ヶ月に対応する２つの時点で試験した。図８Ａに示すように、両方の照射した免疫化Ｔ細胞クローンに対する増殖性応答は、Ｔ細胞ワクチン接種後に、これらの患者において増加し、実質的にベースライン値を超えた。さらに、ＣＤＲ３共通配列を取りこんだＴＣＲペプチド（モチーフポジティブペプチド、配列番号３２のアミノ酸２〜２１からなる）に対する応答は、非免疫化Ｔ細胞クローンに由来するコントロールＣＤＲ３ペプチド（モチーフネガティブペプチド、配列番号４８のアミノ酸１〜２０からなる）と対照的に、ワクチン接種後に明白であった。しかし、モチーフポジティブペプチドに応答する特異的増殖の強度は、照射した免疫化Ｔ細胞による誘導よりかなり低かった（図８Ａ）。免疫化Ｔ細胞に対する増殖性応答は、免疫化された患者中の循環するＭＢＰ応答性Ｔ細胞の頻度の減少に逆相関した（図８Ｂ）。
【００９７】
（免疫化された患者由来のＣＥＲ３共通配列を取りこむＴＣＲペプチドに対する特異的抗体を産生するＢ細胞株の生成）
次いで、本発明者らは、照射したＴ細胞での免疫化が、患者における特定の抗イディオタイプ抗体応答を誘発するか否かを試験した。Ｔ細胞全体が、血清抗イディオタイプ抗体の検出を妨げ得る表面分子のアレイを発現したので、共通のＣＤＲ３配列を取りこんだＴＣＲペプチド（モチーフポジティブペプチド）を、スクリーニングに対する抗原として用いた。非免疫化ＭＢＰ応答性Ｔ細胞クローン由来の２０マーＴＣＲペプチド（モチーフネガティブペプチド）を、コントロールとして全ての実験に含んだ。コントロールペプチドのＣＤＲ３配列は、免疫化Ｔ細胞クローンにおいて検出されなかった。
【００９８】
２人の患者に由来する血清を用いて試験した場合に、ＴＣＲペプチドまたは元の免疫化Ｔ細胞のいずれかに対する非特異的抗体応答性を、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリを用いて検出し得た（データは示さず）。抗イディオタイプ抗体がワクチン接種された患者に存在するか否かをさらに確証するために、本発明者らは、抗体産生Ｂ細胞株のパネルを、ワクチン接種後の血液検体から、ＥＢＶ形質転換と限外希釈とを合わせた細胞培養に基づく技術を用いて、作製した（材料および方法を参照のこと）。
【００９９】
プレワクチン接種のＰＢＭＣは、実験に使用できなかったので、２つのランダムに選択された健常者由来の細胞をコントロール対象として用いて、同じ実験条件下で分析した。得られたＢ細胞株（各患者／個体由来の９２細胞株）の上清を、モチーフポジティブＴＣＲペプチドに対する抗体およびコントロールＴＣＲペプチドに対する抗体の存在について、それぞれＥＬＩＳＡで試験した。抗体がモチーフポジティブＴＣＲペプチドに対して特異的な応答を呈するが、コントロールＴＣＲペプチドに対しては応答しない場合、抗体を抗イディオタイプとして規定した。図９において示されるように、特異的抗イディオタイプ抗体を産生するＢ細胞は、２人の非免疫コントロール対象と比較して、ＭＳ７およびＭＳ２７患者において、それぞれ１．７５×１０−６の頻度で前駆細胞に生じた。対照的に、コントロールペプチドに対する非特異的抗体の反応性が、同じ上清において検出された。この結果は、抗イディオタイプ抗体を産生するＢ細胞の高頻度が、Ｔ細胞ワクチン接種に関することを示唆する。
【０１００】
本明細書において開示および権利を主張する全ての組成物および／または方法は、本発明の開示を考慮することで過度の実験を伴わずに、作製および実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態について記載されるが、この組成物ならびに／または方法および本明細書に記載される方法の工程もしくは工程の順序に、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく改変が適用され得ることは当業者にとって明らかである。より詳細には、化学的および生理学的の両方に関連する特定の因子が、本明細書に記載される因子に置換され得、同じかまたは同様の結果が達成されることは明らかである。当業者に明らかである全てのこのような同様の置換および改変は、添付される特許請求の範囲に規定されるように、本発明の趣旨、範囲および概念に含まれるとみなされる。
【０１０１】
【表４】
2004506743.tif 000009
【図面の簡単な説明】
以下の図面は、本明細書の一部をなし、そして本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書中に示される特定の実施形態の詳細な記載と組み合わせてこれらの図面の１以上を参照して、より理解され得る。
【図１】図１は、ＰＢＭＣ由来のＰＣＲ産物のクローニングおよび配列決定のための実験手順を示す。ＰＢＭＣ試料由来のｃＤＮＡを、５’Ｖβ１３．１プライマーおよび３’Ｊβプライマーによって増幅し、そしてＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフの発現について陽性の４つのＰＢＭＣ試料由来のｃＤＮＡ、ＴＡクローニングベクターｐＣＲ２．１にライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉに形質転換した。プラスミドＤＮＡを、Ｍ１３プライマーおよびＬＧＲＡＧＬＴＹ特異的プライマーを用いてＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲによる明白な増幅を示した陽性のプラスミドを、Ｖβ１３．１プライマーを用いて、ＶβＤβＪβ配列について、Ｖβ１３．１プライマーを用いて配列決定した。
【図２】図２は、単一アラニン置換を有するアナログペプチドに対する、２つのＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞クローンの反応性パターンを示す。同一のＶβ１３．１再編成（ＭＳ７−Ｅ２．６およびＭＳ２７−Ｃ３．１について）および類似のＶα−Ｊα接合部配列（ＭＳ７−Ｅ２．６およびＭＳ７−Ｅ３．１について）を示す２対のＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞クローンを、［３Ｈ］−チミジン取り込みアッセイにおいて、アラニン置換されたペプチドのパネルに対する反応性について試験した。ＤＲＢ１＊１５０１を発現するマウス繊維芽細胞株を、抗原提示細胞の供給源として使用した。各アナログペプチドに対するこれらのクローンの増殖応答を、７２時間後に測定し、そして結果を取り込まれたＣＰＭとして示す。四角の囲み（ｓｈａｄｅｄ　ｂｏｘ）は、アナログペプチドに対する応答における、Ｔ細胞クローンの増殖の５０％より大きい減少を示す。
【図３】図３は、元のＴ細胞クローンおよび無関係のＴ細胞クローンを用いた、ＣＤＲ３オリゴヌクレオチドの特異性の交差試験を示す。ＴＣＲ　ＶＤＪ領域に特異的なオリゴヌクレオチドのセットを、元のＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞クローンならびに同じ個体および異なる個体由来の無関係のＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞クローンに存在する既知の標的ＤＮＡ配列の検出における、その特異性について試験した。ＣＤＲ３特異的オリゴヌクレオチドを順方向プライマーとして、そして３’−Ｃβプライマーを逆方向プライマーとして使用して、ＰＣＲ反応を実行した。塗りつぶした四角は、元のＴ細胞クローンまたは同じＣＤＲ３配列を共有するＴ細胞クローンに存在するＤＮＡ配列の陽性の検出を示す。全てのプライマーもまた、無関係のＣＤＲ３配列を有するランダムに選択されたＴ細胞クローンのＤＮＡ産物に対する結合について試験した（斜線の四角）。
【図４】図４は、ＭＳを有する患者に由来する、ランダムに選択されたＰＢＭＣ試料における、モチーフＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹに相補的な標的ＤＮＡ配列の検出を示す。ランダムに選択されたＭＳ患者（ｎ＝４８）に由来するＰＢＭＣ試料から調製されたｃＤＮＡを、５’−Ｖβ１３．１特異的プライマーおよび３’−Ｃβプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲで最初に増幅した。次いで、増幅したＰＣＲ産物を、ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフに特異的なジゴキシゲニン標識したオリゴヌクレオチドプローブと、引き続いてハイブリダイズさせた。元のＭＢＰ８３−９９クローン（ＭＳ７−Ｅ２．６）および無関係のＴ細胞クローン（ＭＳ３２−Ｂ９．８）を、それぞれ、陽性コントロールおよび陰性コントロールとして使用した。ＭＳ−７およびＭＳ−２７は、クローンＭＳ７−Ｅ２．６（表１のＭＳ−７）およびクローンＭＳ２７−Ｃ３．１（表１のＭＳ−２７）が由来した元のＰＢＭＣ試料であった。星印は、ＤＲＢ１＊１５０１の陽性の発現を示す。
【図５】図５は、正常な被験体に由来する、ランダムに選択されたＰＢＭＣ試料におけるＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフの検出を示す。２０人の正常な被験体（ＮＳ）から得られたＰＢＭＣ試料を、図４の説明に記載されるのと同じ条件下で分析した。元のクローン（ＭＳ７−Ｅ２．６）および無関係のクローン（ＭＳ３２−Ｂ９．８）を、それぞれ、陽性コントロールおよび陰性コントロールとして使用した。星印は、ＤＲＢ１＊１５０１の陽性の発現を示す。
【図６】図６は、ＭＳ患者および正常な被験体に由来するＰＢＭＣ試料におけるＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフの発現の半定量的比較を示す。モチーフＶβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹの発現を、ＭＳの個体および正常な個体のＰＢＭＣに由来する各ｃＤＮＡにおけるＣβ発現と比較して、半定量的ＰＣＲによって分析した。相対的発現レベルを、（ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフの発現／Ｃβの発現）×１００％として計算した。
【図７】図７は、ＭＳを有する患者に由来する短期ＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞株における、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフの検出を示す。独立した短期ＭＢＰ８３−９９　Ｔ細胞株のパネルを、ＭＢＰの合成８３−９９ペプチドを使用して、ＭＳを有する５人の患者から作製した。これら全てのＴ細胞株を、ＭＢＰ８３−９９ペプチドに対するその特異的反応性について確認した（ＭＢＰ８３−９９に応答したＣＰＭ／コントロールＣＰＭ＞５）。ｃＤＮＡ産物を、５’−Ｖβ１３．１特異的プライマーおよび３’−Ｃβプライマーを使用して、ＰＣＲで増幅した。増幅されたＰＣＲ産物を、サザンブロット分析において、Ｖβ１３．１−ＬＧＲＡＧＬＴＹモチーフに対応するジゴキシゲニン標識したオリゴヌクレオチドプローブと、引き続いてハイブリダイズさせた。元のＭＢＰ８３−９９クローン（ＭＳ７−Ｅ６．２）および無関係のＴ細胞クローン（ＭＳ３２−Ｂ９．８）由来のｃＤＮＡ産物を、それぞれ、陽性コントロールおよび陰性コントロールとして使用した。
【図８】図８は、免疫されたＭＳ患者におけるＭＢＰ反応性Ｔ細胞の頻度と関連付けた、免疫ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローンおよびＴＣＲペプチドに対する、ＰＢＭＣ（末梢血単核球）の増殖応答を示す。８Ａ：２人の免疫された患者から得られたＰＢＭＣの増殖応答を、以下のように定義される刺激指数として示す。共通ＣＤＲ３配列を発現する、照射された免疫ＭＢＰ反応性Ｔ細胞クローン（モチーフ陽性Ｔ細胞クローンの、ＭＳ７−Ｄ２．２およびＭＳ２７−Ｄ４．４）と共に培養したＰＢＭＣの数／分（ＣＰＭ）／単独培養されたＰＢＭＣのＣＰＭと単独培養された照射されたＴ細胞のＣＰＭとの合計。モチーフ陽性ペプチド（配列番号３２のアミノ酸２〜２１）およびコントロールＴＣＲペプチド（配列番号４８のアミノ酸１〜２０）に対する増殖応答を、増殖アッセイにおいて決定し、ここで、ＰＢＭＣを、それぞれ、ＴＣＲペプチド（２０μｇ／ｍｌ）と共に、１００，０００細胞／ウェルで５日間培養した。全ての実験を、基準（前）および４回目のワクチン接種後２ヶ月（後）に対応する２つの時点で実施した。８Ｂ：ＭＢＰに特異的なＴ細胞の前駆体頻度を、同じ時点で推定した。ＮＳ＝正常な被験体。
【図９】図９は、免疫された患者のＰＢＭＣにおいてＴＣＲペプチドに対する抗イディオタイプ抗体を産生するＢ細胞の推定前駆体頻度を示す。ＰＢＭＣを、２人の免疫されたＭＳ患者および、免疫されていない２人のランダムに選択された健康個体から得た。細胞を、ＥＢＶ産生細胞株およびシクロスポリンＡ（Ｓａｎｄｏｚ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に由来する上清の存在下で培養した。増殖陽性の全てのウェルを、ＥＬＩＳＡにおいて、モチーフ陽性ＴＣＲペプチドおよびコントロールのＴＣＲペプチドに対して反応性の抗体の存在について、評価した。ＴＣＲペプチドに対する抗イディオタイプ抗体を産生するＢ細胞の前駆体頻度を、陽性ウェルの数を、最初にプレートされたＰＢＭＣの総数で除算することによって、概算した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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