(57)【要約】（ａ）配列番号１の位置１〜2332のDNA配列によりコードされるポリペプチド；（ｂ）DNA配列が発現される条件下で配列番号１の配列を含んで成る細胞を培養することによって生成されるポリペプチド；（ｃ）配列番号２の位置１〜773のアミノ酸配列；又はエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するそのフラグメントに対して少なくとも97％同一性の配列を有するエンド−β−１，４−グルカナーゼ酵素；及び（ｄ）配列番号１の位置１〜2322に示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドの１つから選択される、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性（EC3. 2. 1. 4）を示す酵素は、洗剤及び織物用途において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１の位置１〜2332のDNA配列によりコードされるポリペプチド；
（ｂ）DNA配列が発現される条件下で配列番号１の配列を含んで成る細胞を培養することによって生成されるポリペプチド；
（ｃ）同一性が3.0のGAP創造ペナルティー及び0.1のGAP延長ペナルティーを用いてGCGプログラムパッケージに提供されるGAPにより決定される場合、配列番号２の位置１〜773のアミノ酸配列；又はエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するそのフラグメントに対して少なくとも97％同一性の配列を有するエンド−β−１，４−グルカナーゼ酵素の１つから選択される、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性（EC3. 2. 1. 4）を示す酵素。
【請求項２】
45℃で５×SSCを含んで成るハイブリダイゼーション条件及び60℃で２×SCを含んで成る洗浄条件下で配列番号１の位置１〜2322に示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドを有する、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性（EC3. 2. 1. 4）を示す酵素。
【請求項３】
前記酵素が、バチルスsp., DSM12648に対して内因性であるポリペプチドを含んで成る請求項１又は２記載の酵素。
【請求項４】
少なくとも４〜11、好ましくは5.5〜10.5の範囲のpHで活性である請求項１〜３のいずれか１項記載の酵素。
【請求項５】
（ａ）ヌクレオチド１〜2322の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；
（ｂ）（ａ）の種相同体；
（ｃ）配列番号２の位置１〜773のアミノ酸配列；又はエンドーグルカナーゼ活性を有するそのフラグメントに対して97％以上、同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；
（ｄ）上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）に対して相補的な分子；及び
（ｅ）上記（ａ）又は（ｂ）の縮重ヌクレオチド配列；
から成る群から選択された、エンド−β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドがDNAである請求項５記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項７】
配列番号１の位置１〜2322に示される配列を含んで成るDNAプローブ、及び少なくとも約100個の長さの塩基対を有する配列番号１の位置１〜2322の副配列を含んで成るDNAプローブから成る群から選択された、変性された二本鎖DNAプローブに対して、中位の緊縮性条件下でハイブリダイズする、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項８】
原核生物、好ましくは細菌、より好ましくはグラム陽性細菌からのDNAライブラリーから単離されるか、又はそれに基づいて生成される請求項５記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項９】
バチルス属に属する株、特にバチルスsp. の株、特にバチルスsp., DSM12648からのDNAライブラリーから単離されるか又はそれに基づいて生成される請求項８記載の単離されたヌクレオチド分子。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれか１項記載のポリヌクレオチド分子を含んで成るポリヌクレオチド構造体。
【請求項１１】
次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；（ａ）ヌクレオチド1〜2322の配列番号１に示されるようなヌクレオチドを含んで成る、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；（ｂ）配列番号２の位置１〜773のアミノ酸配列、又はエンド−グルカナーゼ活性を有するそのフラグメントに対して97％以上、同一であるエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の縮重ヌクレオチド分子から成る群から選択されたDNAセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成る発現プロモーター。
【請求項１２】
請求項11記載の発現ベクターを導入されている、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞。
【請求項１３】
原核細胞、特に細菌細胞、又はエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を示すポリペプチドをコードするDNAセグメントが起因する内因性細胞である請求項12項記載の細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、バチルスの株、好ましくはバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）又はバチルス・レンタン（Bacillus lentus）の株に属する請求項13記載の細胞。
【請求項１５】
前記細胞が、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）の株、好ましくはバチルス・リケニホルミスATCC14580の株に属する請求項13記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、シュードモナス（Pseudomonas）の株、好ましくはシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescons）又はシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）の株に属する請求項１記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、ストレプトミセス（Streptomyces）の株に属する請求項13記載の細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、サッカロミセス（Saccharomyces）の株、好ましくはサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）の株に属する請求項13記載の細胞。
【請求項１９】
エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドの生成方法であって、請求項12記載の発現ベクターを導入されている細胞を培養し、それにより、前記細胞がDNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現し、そしてそのポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
【請求項２０】
請求項１記載の酵素を含んで成る酵素組成物。
【請求項２１】
プロテアーゼ、セルラーゼ（エンドグルカナーゼ）、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、他のマンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はそれらの混合物から成る群から選択された１又は複数の酵素をさらに含んで成る請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
（ｉ）相同不純物を有さず、そして（ii）請求項19記載の方法により生成される、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有する単離された酵素。
【請求項２３】
有効量の請求項１〜４、又は22のいずれか１項記載の酵素、又は請求項20又は21記載の酵素組成物により処理されるセルロース含有バイオマスの分解方法。
【請求項２４】
ａ）配列番号２の位置340〜540におけるCBD、及びｂ）バチルスsp. AA349株DSM12648以外の源からの触媒ドメイン（CAD）を含んで成る、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を示すハイブリッドエンド−グルカナーゼ。
【請求項２５】
前記触媒ドメイン（CAD）が、
（ａ）バチルス・レンタス株NCIMB40250、
（ｂ）ヒューミコラ・インソレンス株DSM1800、
（ｃ）フサリウム・オキシスポリウム株DSM2672又は
（ｄ）バチルスsp. AC13株NCIMB40482
から成る群から選択された源に由来するエンド−グルカナーゼである請求項24記載のハイブリッドエンド−β−１，４−グルカナーゼ。
【請求項２６】
請求項１〜４のいずれか１項記載のエンド−β−１，４−グルカナーゼ、又は請求項24又は25記載のハイブリッドエンド−β−１，４−グルカナーゼを含んで成る組成物。
【請求項２７】
請求項１〜４のいずれか１項記載のエンド−β−１，４−グルカナーゼ、又は請求項24又は25記載のハイブリッドエンド−β−１，４−グルカナーゼの洗剤組成物への使用。
【請求項２８】
請求項１〜４のいずれか１項記載のエンド−β−１，４−グルカナーゼ、又は請求項24又は25記載のハイブリッドエンド−β−１，４−グルカナーゼの織物仕上工程への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バチルスsp., DSM 12648に対して内因性である、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を示す酵素、そのようなエンド−β−１，４−グルカナーゼをコードする単離されたポリヌクレオチド分子、及び洗剤、紙及びパルプ、油掘削、油抽出、ワイン及びジュース、食品成分、動物飼料又は繊維産業への前記酵素の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
セルロースは、β−１，４−グルコシド結合によりグルコースのポリマーである。セルロース鎖は多くの分子内及び分子間水素結合を形成し、不溶性セルロース極微小フィブリルの形成をもたらす。グルコースへのセルロースの微生物加水分解は、次の３種の主要クラスのセルラーゼを包含する：（ｉ）エンド−β−１，４−グルカナーゼとも呼ばれる、セルロースを通してランダムにβ−１，４−グルコシド結合を分解するエンド−グルカナーゼ（EC３．２．１．４）；（ii）非還元性末端からセルロースを消化し、セロビオースを開放するセロビオヒドロラーゼ（EC3. 2. 1. 91）；及び（iii）グルコースを放出するためにセロビオース及び低分子量セロデキストリンを加水分解するβ−グルコシダーゼ（EC3. 2. 1. 21）。
【０００３】
β−１，４−グルコシド結合はまた、他の天然に存在するポリマー、例えば植物、例えば大麦及びオート麦からのβ−グルカンにも存在する。多くの場合、エンド−グルカナーゼはまた、そのような非セルロースポリマーの加水分解を提供する。
【０００４】
セルラーゼは、多くの微生物により生成され、そしてしばしば、多形で存在する。セルロースの酵素分解の経済的有意性の認識は、産業的に使用され得る微生物セルラーゼについての集中的な研究を促進して来た。結果として、多数のセルラーゼの酵素性質及び主要構造が調べられて来た。触媒ドメインのアミノ酸配列の疎水性クラスター分析の結果に基づけば、それらのセルラーゼは、グリコシルヒドロラーゼの異なるファミリーに認識され；菌類及びグリコシルヒドロラーゼは35のファミリーに分類される（Henrissat, B. : A Classification of glycosyl hydrolases based on amino  acid sequence similarities. Biochem. J. 280 (1991), 309-316; Henrissat. B., and Bairoch, A. : New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293 (1993), 781-788）。
【０００５】
ほとんどのセルラーゼは、プロリン及びヒドロキシアミノ酸残基に富んでいるリンカーにより分離される、セルロース−結合ドメイン（CBD）及び触媒ドメイン（CAD）から成る。もう１つの種類のセルラーゼは、５種のファミリーのグリコシルヒドロラーゼ（I−V）を付与するそれらのCBDの類似性に基づいて確立されて来た（Gilkesなど. (1991)）。
【０００６】
セルラーゼは、菌類、放線菌類、粘液細菌及び細菌を包含する多数の微生物により合成されるが、しかしまた、植物によっても合成される。特に、広範囲の種類の特異性のエンド−β−１，４−グルカナーゼが同定されている。多くの細菌エンドグルカナーゼが記載されている（Gilbert, H. J. and Hazlewood, G. P. (1993) j. Gen. Microbiol. 139: 187-194; Henrissat. B., and Bairoch, A. : New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem. J. 293 (1993), 781-788）。
【０００７】
セルロース分解酵素の重要な産業使用は、製紙用パルプの処理、例えば排水の改良、又は古紙のインキ抜きのためである。セルロース分解酵素のもう１つの重量な産業的使用は、セルロース織物又は布の処理のためであり、例えば洗剤組成物又は布ソフトナー組成物における成分としてであり、新しい布の生物仕上げ（衣料品の仕上げ）のためであり、そしてセルロース含有布、特にデニムの“ストーン−ウォシュド（stone-washed）”外観を得るためであり、そしてそのような処理のためのいくつかの方法が、例えばGB−A−１368599号、EP−A−0307564号及びEP−A−0435876号、WO91/17243号、WO91/10732号、WO91/17244号、WO95/24471号及びWO95/26398号に提案されている。日本特許出願番号13049/1999号は、洗剤のために適切なバチルスsp., KSM-S237 (FERM-P-16067として寄託されている)に由来する耐熱性アルカリセルラーゼを開示する。
【０００８】
セルラーゼ、好ましくはエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性（EC3. 2. 1. 4）が所望される用途のために使用され得る新規セルラーゼ酵素又は酵素調製物を供給するための必要性が存在する。
【０００９】
本発明の目的は、わずかな酸性〜アルカリ性条件下で実質的なβ−１、４−グルカナーゼ活性を有する新規酵素及び酵素組成物、及び製紙用パルプ処理、織物処理、洗濯工程、抽出工程又は動物飼料における改良された性能を提供することであり；好ましくは、そのような新規の良好な性能のエンドグルカナーゼは、組換え技法を用いることにより高い収率で生成できるか又は生成される。
【発明の開示】
【００１０】
本発明者は、バチルス、sp. AA349 (DSM 19648)の株に内因性である、実質的なエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性（EC3. 2. 1. 4として酵素命名法に従って分類される）を有する新規酵素を見出しており、そして本発明者は、そのような酵素をコードするDNA配列のクローニング発現において成功した。本発明のエンド−β−１，４−グルカナーゼは、界面活性剤及び/又は漂白剤を含むアルカリ水溶液を包含する適用への使用のためにそれを例外的に十分に適切にする安定性及び活性の性質を有する。そのような適用条件は、家庭及び産業用洗剤、織物仕上げ処理及びセルロースパルプの製造又は再循環において非常に共通して見出される。
【００１１】
本発明のβ−１，４−グルカナーゼはそのような適切な適用条件下でその活性を異例の程度に維持するので、それは、例えば、製紙用パルプ加工又は織物処理において使用される場合、他の既知の酵素よりも有用であろうことが企画される。
また、本発明のβ−１，４−グルカナーゼはFe（II）イオンにより有意に不活性化されないことが注目される。第一鉄イオンの存在に対する酵素活性の感受性は、例えば金属容器において起こる工程において酵素の適用性に制限を加える。
【００１２】
従って、第１の観点においては、本発明は、
（ａ）配列番号１のDNA配列のすべて又は一部によりコードされるポリペプチド；
（ｂ）DNA配列が発現される条件下で配列番号１の配列を含んで成る細胞を培養することによって生成されるポリペプチド；
【００１３】
（ｃ）同一性が3.0のGAP創造ペナルティー及び0.1のGAP延長ペナルティーを用いてGCGプログラムパッケージに提供されるGAPにより決定される場合、（I）配列番号２の位置１〜773のアミノ酸配列、又はエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するそのフラグメント、（II）配列番号２の位置１〜約340のアミノ酸配列、及び（III）配列番号２の位置１〜約540〜773のアミノ酸配列に対して少なくとも97％、好ましくは98％、より好ましくは98.5％、さらにより好ましくは99％同一性の配列を有するエンド−β−１，４−グルカナーゼ酵素；及び
【００１４】
（d）45℃で５×SSCを含んで成るハイブリダイゼーション条件及び60℃で２×SCを含んで成る洗浄条件下で配列番号１の位置１〜2322に示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされる、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するポリペプチド；
の１つから選択される、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性（EC3. 2. 1. 4）を示す酵素に関する。好ましい態様においては、そのようなフラグメントは、位置１〜663±50のアミノ酸、好ましくは位置１〜663±25のアミノ酸から成るポリペプチドである。
【００１５】
第２の観点においては、本発明は、
（ａ）ヌクレオチド１〜2322の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；
（ｂ）上記（ａ）の種相同体；
（ｃ）アミノ酸残基１〜773の配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも97％、好ましくは98％、より好ましくは98.5％、さらにより好ましくは99％同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；及び
（ｄ）上記（ａ）又は（ｂ）の縮重ヌクレオチド配列から成る群から選択された、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を示す酵素の触媒的活性ドメインをコードする単離されたポリヌクレオチド分子、好ましくはDNA分；好ましくは、
配列番号１の位置１〜2322に示される配列を含んで成るDNAプローブ、及び少なくとも約100個の長さの塩基対を有する配列番号１の位置１〜2322の副配列を含んで成るDNAプローブから成る群から選択された、変性された二本鎖DNAプローブに対して、中位の緊縮性条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチド分子に関する。
【００１６】
第３，４及び５の観点においては、本発明は、例えば本発明のポリヌクレオチド分子であるDNAセグメントを含んで成る発現ベクター；前記DNAセグメント又は発現ベクターを含んで成る細胞；及びエンド−グルカナーゼ活性を示す酵素の生成を可能にする条件下で細胞を培養し、そして培養物から酵素を回収することを含んで成る、酵素の生成方法を提供する。
【００１７】
さらにもう１つの観点においては、本発明は、（ｉ）相同不純物を有さず、そして（ii）上記方法により生成されることを特徴とする、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を示す単離された酵素を提供する。
本発明の好ましい態様においては、エンド−グルカナーゼは、５〜11の範囲のpH、好ましくは６〜10.5での最適pH, 及び20〜60℃の温度で活性を示す。
【００１８】
エンド−グルカナーゼは、グリコシルヒドロラーゼのファミリー５に属する触媒的活性ドメイン（このドメインは、配列番号２の位置１〜340に対応する）、及びファミリー17に属するセルラーゼ結合ドメイン（CBD）（このドメインは、配列番号２の位置341〜540に対応する）を含んで成る。配列番号２の残りは、未知の機能のドメインである。
本発明のエンド−グルカナーゼは、多くの産業用途において、特に改良された抗―再付着及び洗浄効果のために洗剤組成物において、及び織物の処理において好都合である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
ギリシャに起因する土壌サンプルから単離された菌株バチルスsp. AA349は、DSMZ−Deutsche Sammlung von Mikroorgamismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D-38124 Braunschweig, Federal Republic of Germany に1999年1月25日、特許出願のための微生物の寄託の国際承認に基づいて、ブダペスト条約に従って寄託され、そして受託番号DSM12648として命名された。
【００２０】
用語“機能的酵素性質”とは、本明細書において使用される場合、１又は複数の触媒活性を示すポリペプチドの物理的及び化学的性質を意味する。機能的酵素性質の例は、酵素活性、特異的酵素活性、最大活性に対する相対的酵素活性（pH又は温度のいずれかの関数として測定される）、安定性（時間にわたっての酵素活性の劣化）、DSC溶解温度、N−末端アミノ酸配列、分子量（通常、SDS−PAGEにより測定される）、等電点（pI）である。
【００２１】
本発明においては、用語“発現ベクター”とは、その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連結される対象ポリペプチドをコードするセグメントを含んで成る、線状又は環状DNA分子を示す。そのような追加のセグメントは、プロモーター及びターミネーター配列を包含することができ、そして任意には、複製の１又は複数の起点、１又は複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、および同様のものを含むことができる。
【００２２】
発現ベクターは一般的に、プラスミド又はウィルスDNAに起因し、又は両要素を含むことができる。本発明の発現ベクターは、組換えDNA方法に便利にゆだねられるいずれかの発現ベクターであり得、そしてベクターの選択はしばしば、それが導入される予定である宿主細胞に依存するであろう。従って、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体複製に無関係である。染色体外実存体として存在するベクター、たとえばプラスミドであり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に組込まれ、そしてそれが組込まれている染色体と共に複製されるベクターであり得る。
【００２３】
用語“組換え発現される”又は“組換え的に発現される”とは、ポリペプチド又はタンパク質の発現に関して本明細書において使用される場合、当業界における標準の定義に従って定義される。タンパク質の組換え的発現は一般的に、上記に記載されるような発現ベクターを用いることによって行われる。
【００２４】
用語“単離される”とは、ポリヌクレオチド分子に適用される場合、そのポリヌクレオチドがその天然の遺伝子環境から除去されており、そして従って他の外来の又は所望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成システム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノムクローンを含むそれらの分子である。本発明の単離されたDNA分子は、それらが通常関連する他の遺伝子を有さないが、しかし天然に存在する5’及び3’側の未翻訳領域、たとえばプロモーター及びターミネーターは含むことができる。関連する領域の同定は、当業者に明らかであろう（たとえば、Dynan and Tijan, Nature 319: 774-78, 1985を参照のこと）。用語“単離されたポリヌクレオチド”とは他方では、“クローン化されたポリヌクレオチド”とも称することができる。
【００２５】
タンパク質/ポリペプチドに適用される場合、用語“単離された”とは、タンパク質がその天然の環境以外の条件において見出されることを示す。好ましい形においては、単離されたタンパク質は、他のタンパク質、特に他の相同タンパク質（すなわち“相同不純物”（下記参照のこと））を実質的に有さない。40％よりも高い純粋な形、より好ましくは60％よりも高い純粋な形でタンパク質を提供することが好ましい。
さらにより好ましくは、SDS−PAGEにより決定される場合、高く精製された形、すなわち80％以上、より好ましくは95％以上、及びさらにより好ましくは99％以上の純粋な形でタンパク質を提供することが好ましい。
【００２６】
用語“単離されたタンパク質/ポリペプチド”とは、他方では、“精製されたタンパク質/ポリペプチド”とも呼ばれ得る。
用語“相同不純物”とは、本発明のポリペプチドが最初に得られる相同細胞に起因するいずれかの不純物（たとえば、本発明のポリペプチド以外の他のポリペプチド）を意味する。
用語“〜から得られた”とは、特定の微生物源に関して本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチド及び/又はポリペプチドが特定源により、又はその源からの遺伝子が挿入されている細胞により生成されることを意味する。
【００２７】
用語“作用可能に連結される”とは、DNAセグメントを言及する場合、そのセグメントが、それらの意図された目的に関して機能するよう、たとえば転写がプロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに進行するよう配列されることを意味する。
用語“ポリヌクレオチド”とは、5’から3’末端に読み取られるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖ポリマーを示す。ポリヌクレオチドはRNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロで合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。
【００２８】
用語“ポリヌクレオチド分子の相補体”とは、対照配列に比較して、相補的な塩基配列及び逆の配向を有するポリヌクレオチドを示す。たとえば、配列5’ ATGCACGGG 3’は、5’ CCCGTGCAC 3’に対して相補的である。
用語“縮重ヌクレオチド配列”とは、１又は複数の縮重コドンを含むヌクレオチドの配列を示す（ポリペプチドをコードする対照ポリヌクレオチド分子に比較して）。縮重コドンは、異なったヌクレオチドトリプレットを含むが、しかし同じアミノ酸残基をコードする（すなわち、GAU及びGACトリプレットはそれぞれ、Aspをコードする）。
【００２９】
用語“プロモーター”とは、RNAポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供するDNA配列を含む遺伝子の部分を示す。プロモーター配列は通常、遺伝子の5’非コード領域に検出されるが、しかし必ずしもそうではない。
用語“分泌シグナル配列”とは、より大きなポリペプチドの成分として、それが合成される細胞の分泌経路を通してそのより大きなポリペプチドを方向づけるポリペプチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。大きなペプチドは、通常、分泌経路を通して、遷移の間、分泌ペプチドを除去するために分解される。
【００３０】
ポリヌクレオチド：
本発明の好ましい態様においては、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも中位の緊縮条件下で、配列番号1の類似する大きさの領域、又はそれらに対して相補的な配列にハイブリダイズするであろう。
【００３１】
特に、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号１の位置１−2322に示され、酵素の触媒ドメインをコードするいずれかの十分な配列を含んで成る変性された二本鎖DNAプローブ、又は少なくとも中位の緊縮条件下で、しかし好ましくは、下記に詳細な説明されるような高い緊縮性条件下で、少なくとも約100個の長さの塩基対を有する、それぞれ配列番号1の副配列を含んで成るいずれかのプローブに対してハイブリダイズするであろう。ヌクレオチドプローブと相同DNA又はRNA配列の間の、中位又は高い緊縮下でのハイブリダイゼーションを決定するための適切な実験条件は、５×SSC（塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム、Sambrook など., 1989）において、ハイブリダイズするDNAフラグメント又はRNAを含むフィルターの10分間のプレソーキング、及び５×SSC、５×Denhardtの溶液（Sambrookなど., 1989）、0.5％SDS及び100μg/mlの変性され、音波処理されたサケ精子DNA（Sambrookなど., (1989）Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY)の溶液におけるフィルターのプレハイブリダイゼーション、続いて、10ng/mlの濃度のランダム−プライムされた（Feinberg, A. P. and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132: 6-13）、32P−dCTP−ラベルされた（１×109cpm/μgよりも高い比活性）プローブを含む同じ溶液における約45℃で12時間のハイブリダイゼーションを包含する。
【００３２】
次に、フィルターは、２×SSC, 0.5％SDSにより、少なくとも60℃（中位の緊縮性）、さらにより好ましくは少なくとも65℃（中位/た化位緊縮性）、さらにより好ましくは少なくとも70℃（高い緊縮性）、及びさらにより好ましくは少なくとも75℃（非常に高い緊縮性）で、30分間、2度洗浄される。
【００３３】
オリゴヌクレオチドプローブがそれらの条件下でハイブリダイズする分子は、X−線フィルムを用いて検出される。
前で示されたように、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、DNA及びRNAを包含する。DNA及び単離するための方法は、当業界において良く知られている。興味ある遺伝子をコードするDNA及びRNAは、当業界において知られている方法により、Gene Banks 及びDNAライブラリーにおいてクローン化され得る。
【００３４】
次に、本発明のエンド−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが同定され、そして、たとえばハイブリダイゼーション又はPCRにより単離される。
本発明はさらに、異なった細菌株からの相対ポリペプチド及びポリヌクレオチド（オルト体又はパラ体）を提供する。バチルスの種を包含する、グラム−陽性好アルカリ性菌株からのエンド−グルカナーゼポリペプチドは、特に興味あるものである。
【００３５】
本発明のエンド−グルカナーゼ活性を示すポリペプチドの種相同体は、従来のクローニング技法と組合して、本発明より提供される情報及び組成物を用いてクローン化され得る。たとえば、本発明のDNA配列は、タンパク質を発現する細胞型から得られる染色体DNAを用いて、クローン化され得る。適切なDNA源は、本明細書に開示される配列から企画されたプローブによりノザンブロットをプローブすることによって同定され得る。次にライブラリーが、陽性細胞系の染色体DNAから調製される。次に、本発明のエンド−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明のDNA配列が、種々の方法により、たとえば本明細書に開示される配列から企画されたプローブ、又は開示された配列の基づいての１又は複数の変性プローブによりプローブすることによって単離され得る。
【００３６】
DNAはまた、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）（Mullis, アメリカ特許第4,683,202号）を用いて、又は本明細書に開示される配列からの企画されたプライマーを用いてクローン化され得る。さらなる方法においては、DNAライブラリーは、宿主細胞を形質転換し、またはトランスフェクトするために使用され得、そして興味あるDNAの発現が、材料及び方法、及び例1及び２に記載のようにして、B. sp., DSM12648からクローン化され、発現され、そして精製された、エンド−グルカナーゼに対して生ぜしめられた抗体（モノクローナル又はポリクローナル）により、又はエンド−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドに関連する活性試験により検出され得る。
【００３７】
配列番号１に示されるDNA配列の一部及び/又は本発明の類似するDNA配列をコードするエンド−グルカナーゼは、エンド−グルカナーゼ活性を有する酵素を生成する、細菌類バチルスsp. の株、好ましくはDSM12648の株、又は本明細書に記載されるようなもう１つの又は関連する生物からクローン化され得る。
【００３８】
他の関連する配列を得るために本発明の配列の使用法：本発明のエンド−β−１，４−グルカナーゼをコードするポリヌクレオチド配列に関する本明細書における、開示される配列情報が、他の相同エンド−グルカナーゼを同定するための手段として使用され得る。例えば、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）は、種々の微生物源、特に種々のバチルス種からの他の相同エンド−グルカナーゼをコードする配列を増幅するために使用され得る。
【００３９】
ポリペプチド：
配列番号２の位置１〜773のアミノ酸配列は、86kDaの計算された分子量を有する成熟エンド−グルコナーゼ配列である。配列番号２の位置１〜約340は、本発明のエンド−グルカナーゼ酵素の触媒的活性ドメインであると思われる。約340〜約540の位置は、本発明のエンド−グルカナーゼ酵素のセルロース結合ドメインであると思われる。配列の残り、すなわち位置540〜773の機能は現在、未知である。
本発明は、（ｉ）配列番号２の位置１〜773のアミノ酸配列、又はエンド−グルカナーゼ活性を有するそのフラグメントを含んで成るエンド−グルカナーゼ酵素を提供する。
【００４０】
配列番号２の位置１〜773のフラグメントは、前記アミノ酸から欠失された１又は複数のアミノ酸、及び/又はこのアミノ酸配列のカルボキシル末端を有するポリペプチドである。１つの態様においては、本発明は、（ii）そのようなモノ−ドメインエンド−グルカナーゼはまた、本明細書に記載される産業用途において有用であることが企画されるので、配列番号２の位置１〜約340のアミノ酸配列を含んで成るエンド−グルカナーゼ酵素を提供する。もう１つの態様においては、本発明は、（iii）触媒活性ドメイン及びセルロース結合ドメインを含んで成るそのようなエンド−グルカナーゼはまた、本明細書に記載される産業の用途において有用であることが企画されるので、配列番号２の位置１〜約540〜773のアミノ酸配列を含んで成るエンド−グルカナーゼ酵素を提供する。好ましい態様においては、そのようなフラグメントは、位置１〜663±50のアミノ酸、好ましくは１〜663±25のアミノ酸から成るポリペプチドである。
【００４１】
本発明はまた、上記（ｉ）、（ii）又は（iii）のポリペプチドに対して実質的に相同であるエンド−グルカナーゼポリペプチド及びその種相同体（パラ体又はオルト体）を提供する。用語“実質的に相同”とは、配列番号２のアミノ酸番号１〜773に示される配列、又はエンド−グルカナーゼ活性を有するそのフラグメント、又はそのオルト体又はパラ体に対して少なくとも97％、好ましくは98％、より好ましくは98.5％、及び最も好ましくは99％又はそれ以上との同一性であるポリペプチドを示すために本明細書において使用される。
【００４２】
％配列同一性は、従来の方法、すなわち当業者において知られているコンピュタープログラムパッケージプログラム、たとえば引用により本明細書に組込まれる、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453において開示されるようなGCGプログラムパッケージ（Program Manual for the Wisconsin Package, Version8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）に提供されるGAPにより決定される。GAPは、ポリペプチド配列比較のために次の設定を用いて使用される：3.0のGAP創造ペナルティー及び0.1のGAP延長ペナルティー。
【００４３】
ポリヌクレオチド分子の配列同一性は、DNA配列比較に関して次の設定でのGAPを用いて類似する方法により決定される：5.0のGAP創造ペナルティー及び0.3のGAP延長ペナルティー。
【００４４】
実質的に相同のタンパク質及びポリペプチドは、１又は複数のアミノ酸置換、欠失又は付加を有するものとして特徴づけられる。それらの変化は好ましくは、保存性アミノ酸置換（表２を参照のこと）及びタンパク質又はポリペプチドの折りたたみ又は活性に対して実質的に影響を与えない他の置換であるマイナーな性質のもの；典型的には、１〜約30個の少数のアミノ酸の欠失；および短いアミノ−又はカルボキシル−末端延長、たとえば、アミノ酸−末端メチオニン残基約20〜25個までの残基の小さなリンカーペプチドの延長、又は精製を促進する小さな延長（親和性標識）、たとえばポリ−ヒスチジン路、プロテインAの延長である（Nilsson など., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson など., Methods Enzymol. 198: 3, 1991）。
【００４５】
一般的には、Fordなど., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991 (引用により本明細書に組込まれる)を参照のこと。親和性標識をコードするDNAは、商業的供給者（たとえば、Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ; New England Biolabs, Beverly, MA）から入手できる。
【００４６】
しかしながら、上記変更が好ましくは，マイナーな性質のものであったとしても、そのような変更はまた、大きな性質のもの、例えば、エンド−グルカナーゼ活性を有する本発明のポリペプチドへの、300個までのアミノ酸の大きなポリペプチドの融合、又は両アミノ−又はカルボキシル−末端延長としての融合でもあり得る。
【００４７】
【表１】
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【００４８】
20個の標準のアミノ酸の他に、非標準のアミノ酸（たとえば、４−ヒドロキシプロリン、６−N−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン及びα−メチルセリン）は、本発明のポリペプチドのアミノ酸残基により置換され得る。制限された数の非アミノ酸、遺伝子コードによりコードされないアミノ酸、及び不自然なアミノ酸が、アミノ酸残基により置換され得る。“不自然なアミノ酸”は、タンパク質合成の後、修飾され、そして/又は標準のアミノ酸の側鎖とは異なるそれらの側鎖に科学構造を有する。不自然なアミノ酸は、化学的に合成され得、又は好ましくは、市販されており、そしてピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン及び３,３−ジメチルプロリンを包含する。
【００４９】
本発明のペクチン酸リアーゼポリペプチドにおける必須アミノ酸は、当業界において知られている方法、たとえば特定部位の突然変異誘発、又はアラニン−走査突然変異誘発に従って同定され得る（Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085, 1989）。後者の技法においては、単一のアラニンの突然変異が分子におけるあらゆる残基に導入され、そして得られる変異体分子は、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定するために、生物学的活性（すなわち、ペクチン分解活性）について試験される。
【００５０】
また、Hilton など., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996を参照のこと。酵素又は他の生物学的相互作用の活性部位はまた、推定上の接触部位アミノ酸の突然変異に関して、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性ラベリングのような技法により決定されるように、構造の物理的分析によっても決定され得る。たとえば、de Vos など., Science 255: 306-312, 1992; Smith など., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver など., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992を参照のこと。必須アミノ酸の本体はまた、本発明のポリペプチドに関連するポリペプチドとの相同性の分析からも推定され得る。
【００５１】
複数のアミノ酸置換は、突然変異誘発、組換え及び/又はシャフリング、続く適切なスクリーニング方法、たとえばReidhaar-Olson and Sauer (Science 241: 53-57, 1988), Bowie and Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-2156, 1989), WO95/17413号又はWO95/22625号により開示される既知の方法を用いて、生成され、そして試験され得る。手短に言及すれば、それらの著者は、ポリペプチドにおける複数位置の同時ランダム化、又は組換え/異なった突然変異のシャフリング（WO95/17413号、WO95/22625号）、続いての機能的ポリペプチドについての選択、及び次に、個々の位置での可能な置換の範囲を決定するために、突然変異誘発されたポリペプチドの配列決定のための方法を開示する。使用され得る他の方法は、ファージ表示（たとえば、Lowman など., Biochem. 30: 10832-10837, 1991; Ladner など., アメリカ特許第5,223,409号；Huse, WIPO Publication WO92/06204号）及び特定領域の突然変異誘発（Derbyshire など., Gene 46: 145, 1986; Ner など., DNA 7: 127, 1988）を包含する。
【００５２】
上記に開示されるような突然変異誘発/シャフリング方法は、宿主細胞においてクローン化され、突然変異誘発されたポリペプチドの活性を検出するために、高い処理量の自動化されたスクリーニング方法と組み合わされ得る。活性ポリペプチドをコードする突然変異誘発されたDNA分子は、宿主細胞から回収され、そして近代装置を用いて急速に配列決定され得る。それらの方法は、興味あるポリペプチドにおける重要な個々のアミノ酸残基の急速な決定を可能にし、そして未知の構造体のポリペプチドに適用され得る。
【００５３】
上記で論じられた方法を用いて、当業者は、上記（I）,（II）又は（III）のポリペプチドに対して実質的に相同であり、そして野生型タンパク質のエンド−グルカナーゼ活性を保持する種々のポリペプチドを同定し、そして/又は調製することができる。
【００５４】
本発明のエンド−グルカナーゼ酵素は、触媒的活性ドメイン、すなわち配列番号２の位置１〜約340を含んで成る酵素コアの他に、また、セルロース結合ドメイン（CBD）を含んで成り、前記セルロース結合ドメイン及び触媒的活性ドメインは作用可能に連結される。そのセルロース結合ドメイン（CBD）は、上記及び配列番号２に記載されるコードされた酵素の内部部分として存在することができ、又はエンド−グルカナーゼ中に導入され、従って酵素ハイブリッドを創造する。この場合、用語“セルロース−結合ドメイン”とは、Peter Tommeなど.,“Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties” in “Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates”, John N, Saddler and Michael H. Penner (Eds.), ACS Symposium Series, No.618, 1996により定義されるとおりであるものとして理解されるべきである。
【００５５】
この定義は、120よりも多くのセルロース−結合ドメインを10種のファミリー（I−X）に分類し、そしてCBDが種々の酵素、たとえばセルラーゼ（エンド−グルカナーゼ）、キシラナーゼ、マンナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アセチルエステラーゼ及びキチナーゼに見出されることを示す。DBDはまた、藻類、たとえば赤藻類ポルフィラ・パーピュレア（Porphyra purpurea）において、非加水分解性多糖−結合タンパク質として見出されている（Tommeなど.,前記を参照のこと）。
【００５６】
しかしながら、CBDのほとんどは、セルラーゼ及びキシラナーゼであり、CBDはタンパク質のN及びC末端で見出され、又は内部に存在する。酵素ハイブリッドは当業界において知られており（たとえば、WO90/00609号及びWO95/16782号を参照のこと）、そしてエンド−グルカナーゼ酵素をコードするDNA配列に、リンカーを伴って又は伴わないで、連結されるセルロース−結合ドメインをコードするDNAのフラグメントを少なくとも含んで成るDNA構造体を用いて、宿主細胞を形質転換し、そして融合された遺伝子を発現するために宿主細胞を増殖することによって調製され得る。
【００５７】
酵素ハイブリッドは、次の式：
CBD−MR−X
により記載され、ここで前記CBDは少なくともセルロース−結合ドメインに対応するアミノ酸配列のN−末端又はC−末端領域であり；MRは中間領域（リンカー）であり、そして結合、又は好ましくは、約２〜約100個の炭素原子、より好ましくは２〜40個の炭素原子の短い結合基であり得；又は好ましくは約２〜約100個のアミノ酸、より好ましくは２〜40個のアミノ酸であり得；そしてXは本発明のDNA配列によりコードされる触媒的活性ドメインに対して少なくとも対応するポリペプチドのN−末端又はC−末端の領域である。
【００５８】
類似する手段で、配列番号２の位置340〜540に対応するセルロース結合ドメインは、バチルスsp. AA349以外の源からのエンド−グルカナーゼ及び他のタンパク質とハイブリッドを形成するために使用され得る。配列番号２の位置１〜約340のエンド−グルカナーゼを置換する他の源からのエンド−グルカナーゼの例は、（ａ）バチルス・レンタス、例えばWO9110732号に開示されるバチルス・レンタンNCIMB40250、（ｂ）WO9117243号に開示されるヒューミコラ・インソレンスDSM1800、（ｃ）WO9117243号に開示されるフサリウム・オキシスポリウムDSM2672、及び（ｄ）EP0651785号に開示されるバチルスsp. AC13NCIMB40482からのエンド−グルカナーゼを包含する。
【００５９】
免疫学的交差反応：
免疫学的交差反応性の決定に使用されるべきポリクローナル抗体、特にモノ−特異的ポリクローナル抗体は、生成されたセルロース分解酵素の使用により調製され得る。より特定には、本発明のエンド−グルカナーゼに対する抗血清が、N. Axelsen など., A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific Publications, 1973, Chapter 23, 又はA. Johnstone and R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, 1982 (より詳しくは、p.27-31) に記載される方法に従って、ウサギ（又は他のゲッ歯動物）を免疫化することによって生ぜしめられ得る。
【００６０】
精製された免疫グロブリンは、たとえば塩沈殿（(NH4)2 SO4）、続いて透析、及びDEAE−Sephadex上でのイオン交換クロマトグラフィーにより、抗血清から得られる。タンパク質の免疫化学特徴化が、Outcherlony 二重拡散分析（O. Ouchterlony, Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir, Ed.), Blackwell Scientific Publication, 1967, pp.655-706）、ロケット免疫電気泳動、又は架橋された免疫電気泳動（N. Axelsen など.,A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Blackwell Scientific, 1973, Chapters 2, 3and 4)のいずれかにより行われ得る。
【００６１】
微生物源：
本発明に関しては、用語“〜から得られた”又は“〜から得ることができる”とは、特定源に関して本明細書において使用される場合、酵素が特定源、又は前記源からの遺伝子が挿入されている細胞により生成されるか、又は生成され得ることを意味する。
本発明のエンド−グルカナーゼは、バチルス属の株、特にバチルスsp. AA349の株に属するグラム陽性細菌から得られることが現在企画される。
【００６２】
好ましい態様においては、本発明のエンド−グルカナーゼは、バチルスsp. AA349, DSM12648の株から得られる。本発明の酵素に対して相同の酵素をコードするDNA配列はバチルス属に属する他の株から得られることが現在企画される。
本発明のエンド−グルカナーゼがクローン化されているバチルスsp. AA349の株は、寄託番号DSM12648として寄託されている。
【００６３】
DNA構造体：
１つの観点においては、本発明は、宿主細胞ゲノム中への本発明のポリヌクレオチドの組み込みに使用するためのDNA構造体に関する。前記構造体は、２種のポリヌクレオチド配列、すなわち第１及び第２DNA配列を両端に有する本発明のポリヌクレオチドを含むべきであり、ここで前記フランギング配列は、効果的な組換えの発生のために宿主細胞ゲノム上の領域に対して十分な相同性の少なくとも１つの副配列をそれぞれ含むべきである。
【００６４】
組換え発現ベクター：
本発明の酵素をコードするDNA構造体を含んで成る組換え発現ベクターは、便利には、組換えDNA方法にゆだねられ得るいずれかのベクターであり得る。ベクターの選択は、それが導入される宿主細胞にしばしば依存する。従って、ベクターは自律的に複製するベクター、すなわち染色体存在物として存在するベクター（この複製は染色体複製に無関係である）、例えばベクターであり得る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、その宿主細胞ゲノム中に一部又は完全に組み込まれ、そしてそれが組み込まれている染色体と一緒に複製されるベクターであり得る。
【００６５】
ベクターは好ましくは、本発明の酵素をコードするDNA配列がそのDNAの転写のために必要とされる追加のセグメントに作用可能に連結されている発現ベクターである。一般的に、発現ベクターは、プラスミド又はウィルスDNAに由来し、又は両要素を含むことができる。用語“作用可能に連結される”とは、セグメントが、それらの意図された目的のために協調して機能し、例えば転写がプロモーターにより開始し、そして酵素をコードするDNA配列を通して進行するよう配置されることを示す。
【００６６】
プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示す配列を有するいずれかのポリヌクレオチドであり、そして宿主細胞に対して相同であるか又は異種のタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。
【００６７】
細菌宿主細胞に使用するための適切なプロモーターの例は、バチルス・ステアロサーモフィラス  マルトゲン性アミラーゼ遺伝子、バチルス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリスアルカリプロテアーゼ遺伝子又はバチルス・プミラスキシロシダーゼ遺伝子のプロモーター、又はファージλPR又はPLプロモーター又はE．コリlac, trp又はtacプロモーターを包含する。
【００６８】
本発明の酵素をコードするDNA配列はまた、必要なら、適切なターミネーターに操作可能に連結され得る。
本発明の組換えベクターはさらに、問題の宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするDNA配列を含んで成る。
ベクターはまた、選択マーカー、例えば宿主細胞における欠損を補足する生成物をコードする遺伝子、又は抗生物質、例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、エリトロマイシン、テトラサイクリン、スペクチノマイシン又は同様のものに対する耐性、又は重金属又は除草剤に対する耐性をコードする遺伝子を含んで成ることができる。
【００６９】
宿主細胞の分泌経路中に本発明の酵素を方向づけるためには、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列又はプレ配列としても知られている）が、組換えベクターに供給され得る。分泌シグナル配列は、正しい読み取り枠で酵素をコードするDNA配列に連結される。分泌シグナル配列は、酵素をコードするDNA配列の5’側に通常、位置する。分泌シグナル配列は、酵素と通常関連するその配列であり得るか、又はもう１つの分泌されるタンパク質をコードする遺伝子からであり得る。
それぞれ、本発明の酵素をコードするDNA配列、プロモーター及び任意には、ターミネーター及び/又は分泌シグナル配列を連結するために、又は適切なPCR増幅によりそれらの配列をアセンブリーするために、及び複製又は組み込みのために必要な情報を含む適切なベクター中にそれらを挿入するために使用される方法は、当業者に良く知られている（例えば、Sanbrookなど., (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY）。
【００７０】
宿主細胞：
宿主細胞中に導入される、クローン化されたDNA分子は、問題の宿主に対して相同であっても、又は異種であっても良い。宿主細胞に対して相同である場合、すなわち天然において宿主細胞により生成される場合、それは、典型的には、もう１つのプロモーター配列、又は適用できるなら、その天然の環境においてよりももう１つの分泌シグナル配列及び/又はターミネーター配列に作用可能に連結されるであろう。用語“相同”とは、問題の宿主生物に対して生来の酵素をコードするDNA配列を包含することが意図される。用語“異種”とは天然において宿主細胞により発現されないDNA配列を包含することが意図される。従って、DNA配列は、もう1つの生物からであり得るか、又はそれは合成配列でもあり得る。
【００７１】
本発明のクローン化されたDNA分子又は組換えベクターが導入される宿主細胞は、本発明の酵素を生成できるいずれかの細胞であり得、そして細胞、酵母、菌類及び高等真核細胞を包含する。
【００７２】
培養に基づいて、本発明の酵素を生成することができる菌類宿主細胞の例は、グラム陽性細菌、例えばバチルス株、特にバチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・ラウタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・サーキュランス、バチルス・コアギュランス、バチルス・メガテリウス、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・サブチリス及びバチルス・スリンジエンシス、ラクトバチラス（Lactobacillus）の株、ストレプトコーカス（Streptococcus）の株、ストレプトミセスの株、特にストレプトミセス・リビダンス又はストレプトミセス・ムリナスの株、又はグラム陰性細菌、例えばE.コリの株である。
【００７３】
細菌の形質転換は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、接合により、又はそれ自体知られている態様でのコンピテント細胞を用いることによりもたらされ得る（例えば、Sanbrookなど., (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY）。
【００７４】
細胞、例えばE．コリにおいて酵素を発現する場合、酵素は、典型的には不溶性粒質物（封入体として知られている）として細胞質に保持され得るか、又は細菌分泌配列により細胞周辺腔に向けられ得る。前者の場合、細胞は溶解され、そして粒質物が回収され、そして変性され、この後、酵素は変性剤を希釈することによって再生される。後者の場合、酵素は、細胞周辺腔の内容物を放すために、例えば音波処理又は浸透ショックにより細胞を破壊することにより、細胞周辺腔から回収され得る。
グラム−陽性細胞、例えばバチルス又はストレプトミセス株において酵素を発現する場合、酵素は細胞質に保持され得るか、又は細菌分泌配列により細胞外培地に向けられ得る。
【００７５】
培養に基づいて、本発明の酵素を生成することができる菌類宿主細胞の例は、例えばアスペルギラス（Aspergillus）又はフサリウム（Fusarium）の株、特にA.アワモリ（A．awamori） A. ニジュランス（A．nidulans）、A．ニガー（A．niger）、A．オリザエ（A．oryzae）及びF．オキシスポウム（F．oxysporum）、及びトリコダーマ（Trichoderma）の株、好ましくはT．ハルジアナム（T．harzianum）、T．レセイ（T．reesei）及びT．ビリデ（T．viride）である。
【００７６】
菌類細胞は、プロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換、続くそれ自体既知の態様での細胞壁の再生を包含する工程により形質転換され得る。宿主細胞としてのアスペルギラスの株の使用は、EP238,023号（Novozymes A/S）（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。
【００７７】
培養に基づいて、本発明の酵素を生成することができる酵母起源の宿主細胞の例は、例えばハンセヌラsp. (Hansenula sp.)の株、クルイベロミセスsp. (Kluyveromyces sp.)の株、特にk．ラクチス（K. lactis）及びk．マルシアヌス（K. marcianus）、ピチアsp. (Pichia sp.) の株、サッカロミセス（Saccharomyces）の株、特にS．カリスベルゲンシス（S．carisbergensis）、S．セレビサエ（S．cerevisae）、S．クルイベリ（S. kluyveri） 及びS．ウバラム（S．uvarum）、シゾサッカロミセルsp. (Schizosaccharomyces sp.) の株、特にS．ポンベ（S. pombe）、及びヤロウィアsp. (Yarrowia sp.) の株、特にY．リポリチカ（Y．lipolytica）である。
培養に基づいて、本発明の酵素を生成することができる植物起源の宿主細胞の例は、例えばソラナム・ツベロサム（Solanum tuberosum）又はニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）である。
【００７８】
エンド−グルカナーゼ酵素の生成方法：
本発明は、本発明の単離された酵素の生成方法を提供し、ここで前記酵素をコードするDNA配列により形質転換されている適切な宿主細胞が、前記酵素の生成を可能にする条件下で培養され、そしてその得られる酵素が培養物から回収される。
【００７９】
本明細書において定義されるように、単離されたポリペプチド（例えば、酵素）は、他のポリペプチドを実質的に有さず、例えばSDS-PAGEにより決定される場合、少なくとも約20％、好ましくは少なくとも約40％、より好ましくは少なくとも約60％、さらにより好ましくは少なくとも約80％、最も好ましくは約90％、及びさらに最も好ましくは約95％以上の純度のポリペプチドである。
前記酵素をコードするDNA配列を含んで成る発現ベクターが異種細胞中に形質転換される場合、本発明の酵素の異種組換え生成を可能にすることができる。
【００８０】
それにより、相同不純物を有さないことにおいて特徴づけられる高く精製された又はモノ−成分のエンド−グルカナーゼ組成物を製造することが可能である。
この場合、相同不純物とは、本発明の酵素が本来得られる相同細胞に起因するいずれかの不純物（例えば、本発明の酵素以外のポリペプチド）を意味する。
本発明においては、相同宿主細胞は、バチルス sp. AA349の株であり得る。
【００８１】
形質転換された宿主細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖するために適切ないずれかの従来の培地であり得る。発現されたサセルロース分解酵素は、便利には、培養培地中に分泌され、そして良く知られている方法、例えば培地から細胞を、遠心分離又は濾過により分離し、培地のタンパク質性成分を、塩、例えば硫酸アンモニウムにより沈殿せしめ、続いて、クロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー又は同様の方法により、それらから回収され得る。
【００８２】
酵素組成物：
さらなる観点においては、本発明は、上記に記載のようなエンド−グルカナーゼ活性を示す酵素を含んで成る酵素組成物に関する。
本発明の酵素組成物は、本発明のエンド−グルカナーゼの他に、１又は複数の他の酵素、例えばヘミセルラーゼ、例えばキシラナーゼ及びマンナナーゼ、他のセルラーゼ又はエンド−β−１，４−グルカナーゼ成分、キチナーゼ、リパーゼ、エステラーゼ、ペクチナーゼ、クチナーゼ、フィターゼ、オキシドレダクターゼ（ペルオキシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、ラッカーゼ）、プロテアーゼ、アミラーゼ、レダクターゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ又はそれらの混合物を含んで成る。
【００８３】
酵素組成物は、当業界において知られている方法に従って調製され得るか、又は液体又は乾燥組成物の形で存在することができる。例えば、酵素組成物は、粒質又は微粒質の形で存在することができる。組成物に包含されるべき酵素は、当業界において知られている方法に従って安定化され得る。
エンド−グルカナーゼは、多くの異なった産業及び用途への可能性ある使用を有する。本発明の酵素組成物の好ましい使用の例は、下記に与えられる。本発明の酵素組成物の用量、及び組成物が使用される他の条件は、当業界に知られている方法に基づいて決定され得る。
【００８４】
本発明の酵素組成物は、次の目的の少なくとも１つのために有用であり得る。
使用：
バイオマス分解：
本発明の酵素又は酵素組成物は、例えば次の通りに都合良く適用され得る：
−樹皮剥離、すなわち好都合なエネルギー節約をもたらす機械ドラムでの樹皮剥離の前、ペクチンに富んでいる形成層を部分的に分解することができる加水分解酵素による前処理のために；
【００８５】
−繊維分離（精練又は叩解）、すなわち繊維の表面上での酵素の加水分解効果によるエネルギー消費の低下をもたらす精錬又は叩解の前、加水分解酵素による、セルロース繊維含有材料の処理のために；
−繊維改良、すなわちより深く侵入する酵素（例えば、粗い繊維をより柔軟にするために）を必要とする繊維壁を通しての部分的加水分解が必要とされる場合、繊維性質の改良のために；
【００８６】
−排水のために。製紙用パルプの排水性は、加水分解酵素によるパルプの処理により改良され得る。本発明の酵素又は酵素組成物の使用は、より効果的であり、例えば繊維と紙製造機械の金網との間の中空の空間をブロックすることによって排水速度を制限する微細画分における強く水和化された微フィブリルの束の高い弛緩率をもたらす。
リグノセルロースパルプの処理は、例えばWO93/08275号、WO91/02839号及びWO92/03608号に記載のようにして行なわれ得る。
【００８７】
洗濯：
本発明の酵素又は酵素組成物は、織物及び衣服の家庭用又は産業用洗濯のための洗剤組成物において、及び本発明の酵素又は酵素調製物を含む洗浄溶液による機械洗浄の１又は複数の洗浄サイクルの間、布の処理を含んで成る、布の機会洗浄処理のための工程において有用であり得る。
典型的には、洗浄工程において使用される洗剤組成物は、従来の成分、例えば界面活性剤（アニオン性、非イオン性、両性イオン、両性）、ビルダー、漂白剤（過硼酸塩、過炭酸塩又は過酸化水素）、及び他の成分、例えば引用により本明細書に組込まれるWO97/01629号に記載されるような成分を含んで成る。
【００８８】
本発明のエンド−１，４−グルカナーゼは、利点、例えば改良されたしみの除去及び低められた土壌の再付着を提供する。しみ、例えば食料のしみは、しみの完全な除去を困難にするβ−グルカンを含む。また、布のセルロース繊維は、特に“非結晶”及び表面領域に、この酵素により分解されるβ−グルカンポリマーを有する。しみにおけるか又は布上のそのようなβ−グルカンの加水分解は、洗浄工程の間、布上の土壌の結合を低める。
【００８９】
家庭用洗濯工程は、広範囲の条件下で行なわれる。通常、洗浄時間は、５〜60分であり、そして洗浄温度は、15〜60℃、最も通常には20〜40℃である。洗浄溶液は通常、中性又はアルカリ性であり、最も通常には、pH７〜10.5である。漂白剤は、特に白色布の洗濯のために通常使用される。それらの漂白剤は通常、過酸化水素漂白剤、例えば過硼酸ナトリウム、過炭酸ナトリウム又は過酸化水素である。
【００９０】
織物適用：
もう１つの態様においては、本発明は、織物仕上げ工程、例えば生物−仕上げへの本発明のエンド−グルカナーゼの使用に関する。生物−仕上げは、取り扱いに関して、布の品質を改良する糸表面の特定の処理、及び布の湿潤性の損失を伴なわない外観である。生物−仕上げの最も重要な効果は、少ないけば及び毛玉、高められた光沢/ラスター、改良された布取り扱い、高められた永続性の軟化、及び変更された水吸着性により特徴づけられ得る。生物−仕上げは通常、ニット及び織布の製造の間、湿式法において生じる。湿式法は、例えば糊抜き、精練、漂白、洗剤、乾燥/印刷及び仕上げのような工程を含んで成る。それらの個々の段階の間、布は多かれ少なかれ、機械作用にゆだねられる。
【００９１】
一般的、織物が編まれるか又は織られた後、布は任意の糊抜き段階に進行し、続いて、精練段階、等に進行する。糊抜きは、織物からの糊の除去作用である。織機上での織る前、縦糸はしばしば、それらの引張り強度を高めるために、スターチ又はスターチ誘導体から成る糊により被覆される。織った後、糊被膜は、均質性及び耐洗浄性結果を確かめるために、布のさらなる加工の前、除去されるべきである。精練工程においては、不純物が布から除去される。本発明のエンド−グルカナーゼは、セルロース及び綿織物、並びに靭皮繊維の精練に都合良く使用され得、そして不純物の除去の効率を改良することができる。
【００９２】
セルロース織物に永続的なプレスを付与するための最も通常使用される方法の１つは、セルロース架橋化学による仕上げを通してである。架橋は分子レベルでセルロースを固定し、そして実質的に、セルロース製衣服の収縮及びしわを低める。本発明のエンド−グルカナーゼによる、持続性プレス処理されたセルロース織物の処理は、縁の磨耗を低めるために、応力を受ける部分の選択的緩和をもたらすことができる。さらに、本発明のエンド−グルカナーゼは、印刷工程に使用される織物及び装置から過剰のカルボキシメチルセルロース基材のプリントペーストを効果的に除去するために使用され得る。
【００９３】
生物−仕上げの効果を達成するために、セルロース分解及び機械的作用の組合せが必要とされることが知られている。“超−軟度”は、セルロースによる処理が軟化剤による従来の処理と組合される場合、達成できることも知られている。本発明のエンド−グルカナーゼ及びこの酵素と、セルロース製品（天然及び製造されたセルロース製品、布、衣服、糸及び織物）の生物−仕上げのための他の酵素との組み合わせの使用は、好都合であり、例えばより十分な仕上げが達成され得ることが企画される。生物−仕上げは、例えばWO93/20278号に記載される方法を適用することによって得られると思われる。本発明のエンド−グルカナーゼは、同時、又は連続的織物湿式法、例えば糊抜き、精練、漂白、生物−仕上げ、染色及び仕上げに適用され得ることがさらに企画される。
【００９４】
ストーン−ウォシング：
染色された布、特にデニム布又はジーンズにおける“ストーン−ウォシュド”外観は、布の色の所望する局部淡色化を提供するために軽石の存在下でそのような布から製造されるデニム又はジーンズを洗浄することによって、又は布を酵素的に、特にセルロース分解酵素により処理することによって提供され得ることが知られている。単独で、又は他の酵素と組合しての本発明のエンド−グルカナーゼによる処理は、例えばアメリカ特許第4,832,864号に開示されるように、単独で、従来の工程において必要とされるよりも少量の軽石と共に、又はWO95/09225号に開示されるように、パーライトと共に行なわれ得る。本発明のエンド−グルカナーゼによるデニム布の処理は、従来の方法に比較して、バックステインを低めることができる。
【００９５】
材料及び方法：
菌株及びドナー生物：
上記で言及されたバチルスsp. DSM 12648は、配列番号１に示される、エンド−β−１，４−グルカナーゼコードのDNA配列を含んで成る。
【００９６】
バチルス・スブチリスPL2306。この株は、既知のバチルス・スブチリスセルラーゼ遺伝子の転写単位を破壊されているapr 及びnpr遺伝子（Diderichsen, B., Wedsted , U., Hedegaarc, L., Jensen, B.R., Sjoholm, C. (1990) Cloning of ald B, Which encodes alpha-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis, J. Bacteriol., 172, 4315-4321）を有するバチルス・スブチリスDN1885であり、これはセルラーゼ陰性細胞をもたらす。この破壊は、（eds. A. L. Sonenshein, J. A. Hoch and Richard Losick (1993) Bacillus suhtillis and other Gram-Positive Bacteria, American Society Microbiology, p.618）に実質的に記載のようにして行った。
【００９７】
コンピテント細胞を、Yasbin, R. E., Wilson, G. A. and Young, F. E. (1975) Transformation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis: evidence for elective induction of prophage in competent cells, J. Bacteriol. 121: 296-304 により記載のようにして、調製し、そして形質転換した。
【００９８】
一般的な分子生物学法：
特にことわらない限り、DNA操作及び形質転換は、分子生物学の標準方法を用いて行なわれた（Sambrook など.(1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY;  Ausubel, F. M. など. (eds.) “Current Protocols in Molecular Biology”. John Wiley and sons, 1995; Harwood, C. R., and Cutting, S. M. (eds.) “Molecular Biological Methods for Bacillus”. John Wiley and Sons, 1990）。
DNA操作の酵素は、製造業者の説明書に従って使用された（例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、等がNew England Biolabs, Inc. から得られる）。
【００９９】
プラスミド：
pMOL944 :このプラスミドは、プラスミドをバチルス・スブチリスにおいて増殖可能にする要素、カナマイシン耐性遺伝子を実質的に含み、そしてバチルス・リケニホルミスATCC14580のamyL遺伝子からクローン化された強いプロモーター及びシグナルペプチドを有するpUB110誘導体である。シグナルベプチドは、シグナルペプチドとの融合においてタンパク質の成熟部分をコードするDNAをクローン化するために、そのシグナルペプチドを便利にするSacII部位を含む。これは、細胞の外部方向に向けられるプレ−タンパク質の発現をもたらす。
【０１００】
このプラスミドは、下記に手短に説明される従来の遺伝子工学技法により構成された。
pMOL944の構成：
pUB110 プラスミド（Mckenzie, T. など., 1986, Plasmid 15: 93-103）を、ユニーク制限酵素NciIにより消化した。プラスミドpDN1981 (P. L. Jorgensen など., 1990, Gene, 96, p37-42) 上にコードされるamyl プロモーターから増幅されたPCRフラグメントを、NciIにより消化し、そしてNciIにより消化されたpUBに挿入し、プラスミドpSJ2624を得た。使用される２種のPCRプライマーは次の配列を有する：
【０１０１】
# LWN5494（配列番号３）:
5’-GTCGCCGGGGCGGCCGCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3’
# LWN5495（配列番号４）:
5’-GTCGCCCGGGAGCTCTGATCAGGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3’
プライマー#LWN5494は、プラスミドにNotI部位を挿入する。
【０１０２】
次に、プラスミドpSJ2624を、SacI及びNotIにより消化し、そしてpDN1981上にコードされるamyLプロモーターに基づいて増幅された新規のPCRフラグメントを、SacI及びNotIにより消化し、そしてこのDNAフラグメントを、SacI−NotI消化されたpSJ2624に挿入し、プラスミドpSJ2670を得た。
このクローニングは、第１のamyLプロモータークローニングを、同じプロモーターにより置換するが、しかし反対の方向にである。PCR増幅のために使用される２種のプライマーは、次の配列を有する：
【０１０３】
#LWN5938（配列番号５）:
5’-GTCGGCGGCCGCTGATCACGTACCAAGCTTGTCGACCTGCAGAATGAGGCAGCAAGAAGAT-3’
#LWN5939（配列番号６）:
5’-GTCGGAGCTCTATCAATTGGTAACTGTATCTCAGC-3’
プラスミドpSJ2670を、制限酵素PstI及びBclIにより消化し、そしてアルカリアミラーゼSP722（引用により本明細書に組み込まれるWO95/26397号として公開された国際特許出願に開示される）をコードするクローン化されたDNA配列から増幅されたPCRフラグメントをPstI及びBclIにより消化し、そして挿入し、プラスミドpMOL944を得た。PCR増幅のために使用される２種のプライマーは次の配列を有する：
#LWN7864（配列番号７）:
5’-AACAGCTGATCACGACTGATCTTTTAGCTTGGCAC-3’
#LWN7901（配列番号８）:
5’-AACTGCAGCCGCGGCACATCATAATGGGACAAATGGG-3’
プライマー#LWN7901は、プラスミドにおけるSacII部位を挿入する。
【０１０４】
ゲノムDNA調製：
DSM12648株は、１％カルボキシメチル−セルロース＋（別々にオートクレーブされ、そして室温に冷却された後、無菌下で添加される0.1MのNa2CO3＋0.1MのNaHCO3）を含む液体培地２×TYにおいて増殖された。30℃及び300rpmでの16時間のインキュベーションの後、細胞を収穫し、そしてゲノムDNAを、Pitcherなど., (Pitcher, D. G., Saunders, N. A., Owen, R. J., Rapid extraction of bacterial genomic DNA with guanidium thoicyanate; Lett Appl Microbiol 1989, 8: 151-156) に記載される方法により単離した。
【０１０５】
培地：
TY（Ausubel, F. M. など. (eds.) “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, 1995に記載される通りである）。
２×TY（Ausubel, F. M. など. (eds.) “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, 1995に記載される通りである）。
LB寒天（Ausubel, F. M. など. (eds.) “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, 1995に記載される通りである）。
LBPGは、0.5％グルコース及び0.05Mのリン酸カリウムにより補充されたLB寒天である。
AZCL−HE−セルロースが、LBPG−寒天に0.5％まで添加される。AZCL−HE−セルロースはMegazyme, Australiaからである。
BPX培地は、EP0506780号（WO91/09129号）に記載される。
Cal 18-2培地は、特許出願WO00/75344A1に記載される。
【０１０６】
エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性の決定：
ECU方法：
ECU方法においては、カルボキシメチル−セルロース（CMC）の溶液の粘度を低める酵素サンプルの能力が決定され、そしてその結果がECUで与えられる。粘度の低下は、エンド−セルラーゼ活性に比例する。条件：HerculesからのCMC型7LFD, 0.1Mのリン酸緩衝液においてpH7.5, 40℃で30分間の31.1g/lの反応CMC濃度。振動粘度計、例えばMIVI3000, Sofraser, Franceが、粘度を測定するために使用される。
【０１０７】
Cellazyme C方法：
Cellazyme Cは、Magazyme International Ireland Ltdによりタブレット型で供給されるエンド−グルカナーゼアッセイ基質である。次のように言及するMegazyme’s pamphlet CZC7/99を参照のこと：“基質は、水に水和化するが、しかし水不溶性である材料を生成するためにHE−セルロースを染色し、そして架橋することによって調製される。エンド−β−１，４−グルカナーゼによる加水分解が水溶性の着色されたフラグメントを生成し、そしてそれらの開放速度（590nmでの吸光度の上昇）が酵素活性に直接的に関連することができる”。
【０１０８】
酵素サンプルが、試験管において適切な緩衝液6mlに添加され、１つのCellazyme Cタブレットが添加され、そして管を振盪することによって分散され、次に管が40℃での水浴に配置される。内容物が、約15, 30, 45及び60分後、手短に振盪することによって混合される。60分後、その溶液が、Whatman GF/Cフィルター（９cmの直径）を通して濾過された。濾過された溶液の吸光度が、590nmで測定される。
次の例は本発明を例示するものである。
【実施例】
【０１０９】
例１．バチルスsp. からのエンド−β−１，４−グルカナーゼのクローニング及び発現
B．サブチリスにおける成熟エンド−グルカナーゼのサブクローニング及び発現：
本発明のエンド−グルカナーゼコードのDNA配置を、下記２種のオリゴヌクレオチドから成るPCRプライマー組を用いてPCR増幅した：
＃168684（配列番号９）：
5’−CAT TCT GCA GCC GCG GCA GCA GAA GGA AAC ACT CGT GAA GAC−3’
＃168685（配列番号10）
5’−GCG TTG AGA CGC GCG GCC GCT TAC TCT TCT TTC TCT TCT TTC TC−3’
制限部位SacII及びNotIは下線が引かれている。
【０１１０】
オリゴヌクレオチドを、200μMの個々のdNTP、 2.6単位のHiFidelityTM拡張酵素混合物及び200pモルの個々のプロモーターにより補充されたHiFidelityTM PCR緩衝液（Boehringer Mannheim, Germany）において、PCR反応に使用した。上記のようにバチルスsp. DSM12648から単離された染色体DNAを、鋳型として使用した。
【０１１１】
RCR反応を、DNA熱サイクラー（Landgraf, Germany）を用いて行った。94℃での１分間の１回のインキュベーションに続いて、10回のPCRサイクルを、94℃で15秒間の変性、60℃で１分間のアニーリング、及び72℃で２分間の延長のサイクルプロフィール、続いて94℃で15秒、60℃で60秒及び72℃で120秒での20回の変性サイクル(この延長段階で、20秒があらゆるサイクルに付加される)を用いて実施した。増幅生成物の５μlアリコートを、0.7％アガロースゲル（NuSieve, FMC）において、電気泳動により分析した。2.4kb のサイズのDNAフラグメント出現は、遺伝子セグメントの正しい増幅を示した。
【０１１２】
PCRフラグメントのサブクローニング：
上記のようにして生成されたPCR生成物の45μlのアリコートを製造業者の説明書に従って、QIAquick PCR精製キット（Qiagen, USA）を用いて精製した。精製されたDNAを、50μMのトリス−HCl（pH8.5）に溶出し、５μgのpMOL944及び25μlの精製されたPCRフラグメントをSacII及びNotIにより消化し、0.7％のアガロースゲル（NuSieve、 FMC）ゲルにおいて電気泳動し、相当するフラグメントをゲルから切り出し、そして製造業者の説明書に従って、QIAquick Gel 抽出キット（Qiagen, USA）を用いて精製した。次に単離されたPCR  DNAフラグメントを、SacII−NotIにより消化され、そして精製されたpMOL944に連結した。連結は、0.5μgの個々のDNAフラグメント、１単位のT4 DNAリガーゼ及びT4リガーゼ緩衝液（Boehringer Mannheim, Germany）を用いて、16℃で一晩行われた。
【０１１３】
連結混合物を用いて、コンピテントバチルス・スブチリスPL2306を形質転換した。形質転換された細胞を、LBPG−10μg/mlのカナマイシン−寒天プレート上にプレートした。37℃で18時間のインキュベーションの後、コロニーをプレート上に見出した。いくつかのクローンを、一晩の培養ブイヨンからプラスミドDNAを単離することによって分析した。
【０１１４】
１つのそのような陽性クローンを、上記に使用のようにして寒天プレート上に数度、再画線培養し；このクローンをMB1181-7と命名した。クローンMB1181-7を、TY-10μg/mlのカナマイシンにおいて37℃で一晩、増殖し、そして次の日、1mlの細胞を、Qiaprep Spin Plasmid Miniprep Kit #27106を用いて、B．サブチリスプラスミド調製物についての製造業者の推薦に従って、細胞からプラスミドを単離するために使用した。このDNAを配列決定し、そして成熟エンド−グルカナーゼをコードする配列番号１（bp1-2322）におけるエンド−グルカナーゼ遺伝子に対して同一のDNA配列を示した。この誘導されたタンパク質配列は、配列番号２に示されている。
【０１１５】
例２．バチルスsp. DSM12648からのエンド−グルカナーゼの発現及び回収
例１に記載のようにして得られたMB1181-7を、10μg/mlのカナマイシンを有する15×200mlのCal−18−2培地を含む、500mlの２−そらせ板付き振盪フラスコにおいて、37℃で４日間、300rpmで増殖せしめ、それにより、約2500mlの培養ブイヨンを得た。培養物流体を、11％アルミン酸ナトリウム（培養ブイヨン１L当たり10mg）と共に、50％CaCl2（培養ブイヨン１L当たり10ml）を添加し、20％蟻酸を添加することによってpH7.0〜7.5に維持することによって凝集した。カチオン性剤Superfloc C521 (培養ブイヨン１L当たり10％（v/v）希釈溶液25ml)及びアニオン性剤Superfloc A130 (培養ブイヨン１L当たり0.1％（w/v）希釈水溶液75ml)を、前記凝集物を完全にするために、撹拌しながら添加した。凝集された材料を、Sorval RC3B 遠心分離機を用いて、10000rpmで30分間、6℃での遠心分離により分離した。得られる上清液は、エンド−グルカナーゼ活性を含んだ。
【０１１６】
前記上清液を、WhatmanガラスフィルターGF/D及びCを用いて透明にした。次に、限外濾過を用いて、溶液を濃縮し、そしてそのイオン強度を低めた。限外濾過膜は、10kDaのカットオフを有するFiltron UFであった。限外濾過の後、溶液は、3mS/cm以下の導電率を有した。そのpHをpH8に調節した。
【０１１７】
次に、Q−Sepharose上でのアニオン−交換クロマトグラフィーを、追加の精製のために使用した。限外濾過からの溶液を、25mモルのトリス（pH8.0）の緩衝液により平衡化されたQ−Sepharose（Pharmacia）含有の300mlのカラムに適用した。エンド−グルカナーゼは、Q−Sepharoseに結合し、そして次に、それを、0.5MのNaClグラジエントを用いて溶出した。高いエンド−グルカナーゼ活性を有する画分をプールした。最終のプールされたエンド−グルカナーゼ溶液のエンド−グルカナーゼ活性は、約1000ECU/mlであった。
【０１１８】
例３．本発明のエンド−グルカナーゼの特徴化
例２からのエンド−グルカナーゼのサンプルを、0.1Mの酢酸緩衝溶液（pH6.0）により平衡化された100mlのSuperdex200カラムを用いて、サイズクロマトグラフィーに適用した。エンド−グルカナーゼは、単一のピークとして溶出した。２の精製された酵素溶液を、下記のように、追加の特徴化のために使用した。
サイズクロマトグラフィー精製からの酵素は、73kDaとして推定される、約70〜80kDaの分子に対応する位置でSDS−PAGEにおける単一バンドを付与した。精製されたエンド−グルカナーゼの等電点は、約4.2であった。
【０１１９】
N末端配列を決定した。その結果は、下記の通りであった：
XEGNTRE（配列番号11）。Xは注入であり、そしてDNA配列番号決定に基づいての配列に見出されるようなAであり得る。従って、このN−末端配列は、配列番号２のN−末端配列と一致する。
タンパク質濃度を、145800のモル消衰係数を用いて決定した（配列から推定されるアミノ酸組成に基づいて）。
ウサギポリクローナル一特異的血清を、従来の技法を用いて、精製された酵素に対して生じしめた。血清は、本発明のエンド−グルカナーゼを有する単一の沈殿物をアガロースゲルにおいて形成した。
【０１２０】
例４．洗剤及び漂白剤を含む溶液における40℃での安定性
例２からのエンド−グルカナーゼの安定性を、次の条件下で評価した。
漂白剤を含む粉末洗剤の溶液を調製した。粉末洗剤は、Wfk Testgewebe GmbH, D-41379, Germanyにより供給されるIEC−A洗剤であった。これは、IEC 60456 Woshing Machine Reference Base Detergent, タイプAである。漂白剤は、また、wfk Testgewebeにより供給される、IEC 60456過硼酸ナトリウム、タイプSPBであった。
【０１２１】
濃度：
粉末洗剤、IEC−A    ：         4.0g/l
過硼酸ナトリウム・４水和物  ： 1.0g/l
炭酸水素ナトリウム  ：         0.5g/l
水硬度       ：                15°dH (塩化カルシウム及び塩化マグネシウムの溶液を添加することによる)
溶液pH       ：                10.0
【０１２２】
洗剤溶液の5mlアリコードを、試験管に移し、そしてそれらを、40℃の水浴において10分間、予備−加熱した。
2.4ECU/mlの活性を有する酵素溶液を、例２からのサンプルを水により希釈することによって調製した。
酵素希釈溶液100μlを、個々の前記予備−加熱された試験管に添加し、そして混合した。溶液を、特定の期間40℃で維持し、次に氷水においてすばやく冷却し、次に凍結貯蔵した。
【０１２３】
対照サンプルを、０, 50, 100, 150μlの同じ酵素溶液を、洗剤溶液の5mlサンプルに、室温で添加し、次に冷却し、そして凍結することによって調製した。
次に、熱処理された及び対照のサンプルにおける活性を決定した。溶液を融解し、そして次に、pH9.5の緩衝液（下記参照のこと）1mlを添加し、合計体積を6mlにした。活性を、上記材料及び方法セクションに記載されるように、Cellazyme Cタブレット方法を用いてアッセイした。
【０１２４】
pH9.5の緩衝液を、下記ａ）及びｂ）を混合することによって調製し、pH9.5を付与した。
ａ）5.0g/LのBerol 537（Akzo Nobelからの非イオン性界面活性剤）を含む、0.25Mのリン酸緩衝液（pH7.0）（NaN2PO4・H2O及びNaOHからの調製された）、
ｂ）5.0g/LのBero l537（Akzo Nobelからの非イオン性界面活性剤）を含む、0.25Mの炭酸ナトリウム。
加熱されたサンプルにおける活性を、加熱されていない標準に見出される活性の％として表した。結果は次の通りであった。
【０１２５】
【表２】
2004536593.tif 000003
約10％の活性のみが、この漂白剤含有洗剤溶液においての40℃で１時間後、失われた。
【０１２６】
例５．漂白剤を含むアルカリ溶液における50℃での安定性
例２からのエンド−グルカナーゼの安定性を、次の条件下で評価した。
過硼酸ナトリウム漂白剤（過硼酸ナトリウム・４水和物、wfk TestgewebeからのタイプSPB）の溶液を調製した。
【０１２７】
濃度：
【表３】
2004536593.tif 000004
【０１２８】
この溶液の5mlアリコードを、試験管に移し、そしてそれらを、50℃の水浴において10分間、予備−加熱した。
2.5ECU/mlの活性を有する酵素溶液を、例２からのサンプルを水により希釈することによって調製した。
酵素希釈溶液100μlを、個々の前記予備−加熱された試験管に添加し、そして混合した。溶液を、特定の期間50℃で維持し、次に氷水においてすばやく冷却し、次に凍結貯蔵した。
【０１２９】
対照サンプルを、０, 50, 100, 150μlの同じ酵素溶液を、洗剤溶液の5mlサンプルに、室温で添加し、次に冷却し、そして凍結することによって調製した。
次に、熱処理された及び対照のサンプルにおける活性を、例４におけるのと同じ方法に従って決定した。
加熱されたサンプルにおける活性を、加熱されていない標準に見出される活性の％として表した。結果は次の通りであった。
【０１３０】
【表４】
2004536593.tif 000005
50％以下の活性が、このアルカリ漂白剤溶液においての50℃で30分後、失われた。
【０１３１】
例６．Fe（II）イオンによる阻害についての試験
Fe（II）による例２からのエンド−グルカナーゼの不活性化を、次の通りにして評価した。
Fe（II）スルフェートの1mM溶液を、0.1Mのグリシン緩衝液（pH9）に、FeSO4・7H2O（Merck, p. a.）を溶解することによって調製した。
2.6ECU/mlであることが計算された活性を有する酵素の２種の溶液を、ａ）0.1Mのグリシン緩衝液、及びｂ）1mMのFe（II）を含む0.1Mのグリシン緩衝液による例２からのサンプルの希釈により調製した。それらの２種の溶液を、約25℃で30分間、撹拌した。
【０１３２】
次に、それらの２種の溶液からの0, 50, 100, 150μlのサンプルを、6mlの緩衝液（5mlの水及び例４に記載されるpH9.5の緩衝液1ml）に希釈し、そして活性をCellazyme Cダブレット方法により決定した。
グリシン緩衝液において調製されたサンプルと、グリシン緩衝液＋FeSO4・7H2Oにおいて調製されたその対応するサンプルとの間に有意な活性差異は存在しなかった。
酵素は、1mMのFe（II）イオンによる処理により不活性化されない。
【０１３３】
例７．洗浄性能試験
この試験は、例２において得られるエンド−グルカナーゼによるしみの除去及び抗−再沈着効果を示す。さらに、この試験は、酵素性能が、過硼素酸ナトリウム漂白剤が包含される場合、実質的に変更されないことを示す。
綿のスワッチを、β−グルカン（大麦からの）及びカーボンブラックにより汚した。汚されたスワッチを、きれいなスワッチと共に洗浄する。洗浄の後、スワッチをすすぎ、そして乾燥した。汚されたスワッチからの土壌の除去及びきれいなスワッチ上への土壌の再付着を、参照測定値により決定した。エンド−グルカナーゼの添加を伴なわないで又はそれを伴っての洗浄の後の土壌の除去及び土壌の再付着を比較する。
【０１３４】
スワッチ：いずれかの水溶性汚染物を除去するための用心として予備洗浄された100％綿布、タイプ＃2003（Tanigashira, Osaka, Japan）から、サイズ５×５cm、約0.3gの重量の布を切断する。
洗浄装置：体積250mlのビーカーを、水浴加熱により温度調節しながら撹拌する。装置は、複数−ビーカーミニチュア撹拌洗浄機。
【０１３５】
洗剤溶液：脱イオン水中に次のものを添加することにより調製する：
炭酸ナトリウム、0.5g/l；炭酸水素ナトリウム、0.7g/l；水硬度12°dHを得るためのCa2+/Mg2+；アニオン性界面活性剤、Surfac SDBS80 (ナトリウムアルキルベンゼンスルホネート)、0.5g/l；非イオン性界面活性剤、Berol 537（Akzo Nobel）、1.0g/l；過硼酸ナトリウム、wfk TestogewebeからのタイプSPB、O又は1.0g/l。溶液のpHは、約9.5である。
【０１３６】
洗浄方法：100mlの洗剤溶液を、個々のビーカーに添加する。水浴温度は40℃である。機械撹拌機を、約125rpmで操作する。洗剤溶液を10分間、前もって暖め、そして次にエンド-グルカナーゼ及びスワッチを添加する。個々の場合、３種の汚れたスワッチ（下記のようにして調製された）及び３種のきれいなスワッチを、個々のビーカー中に添加する。30分間の洗浄の後、スワッチを、洗剤溶液から除き、水道水により５分間すすぎ、吸水紙上に広げ、そして乾燥する。
【０１３７】
反射率測定：Macbeth 7000 Calor Eey 反射率分光光度計を用いて行なった。汚れたスワッチの場合、個々のスワッチを、汚れた領域の中心で１度、測定し、次に平均値を計算する。きれいなスワッチの場合、個々のスワッチを個々の側部上を１度、測定し、次に平均値を計算する。反射率測定は、500nmですべて行なう。
【０１３８】
汚れたスワッチ：汚れたスワッチを、β−グルカン（大麦からの）及びカーボンブラック（Sentaku Kagaku Kyokai, Tokyo, Japanにより供給される“洗剤試験のためのカーボン”）を用いて製造する。100mlの水道水に約0.67gのβ−グルカンを撹拌し、そして50℃以上に暖めることによって溶解する。0.33gのカーボンブラックを添加する。Ultra Turrax T25ブレンダーを用いて、4000rpmで２分間、ブレンドする。個々のスワッチの中心に、250μlのβ−グルカン/カーボンを適用する。室温で一晩、乾燥する。
【０１３９】
この例に使用されるスワッチは、汚れの適用の前、93.5の平均反射率値を有し、そして汚れの適用の後、17.5を有した。
エンド−グルカナーゼの添加：例２からのエンド−グルカナーゼを添加し、１Lの洗剤溶液当たり0.20又は100ECUの活性濃度を付与した。
結果：漂白剤を含まない洗剤（洗浄後の反射率測定値の平均）：
【０１４０】
【表５】
2004536593.tif 000006
【０１４１】
結果：漂白剤を含む洗剤（洗浄後の反射率測定値の平均）：
【表６】
2004536593.tif 000007
【０１４２】
エンド−グルカナーゼは、エンド−グルカナーゼを伴なわないでの洗浄の後の結果に比較して、エンド−グルカナーゼと共に洗浄した後の汚れたスワッチの高められた反射率値により見出されるように、布からの汚れの除去を高めた。エンド−グルカナーゼはまた、エンド−グルカナーゼと共に洗浄した後のきれいなスワッチの高められた反射率値により見出されるように、汚れの再付着を低める。エンド−グルカナーゼにより提供される汚れの除去及び抗−再付着の改良性は、漂白剤の添加により実質的に変更されない。
【０１４３】
例８．洗浄性能試験
きれいな綿布を、家庭用洗剤の溶液により、汚れた綿布と共に洗浄する。洗浄は、Terg−O−Tometerにおいて行なわれる。洗浄の間、汚れは、その汚れた布から洗剤液体中に開放される。次に、この汚れは、きれいな綿上に再付着することができる。洗浄の後、綿布をすすぎ、そして乾燥し、そして次に、汚れの再付着の程度を検出するために、反射率分光光度計により測定する。
【０１４４】
洗剤：粉末の家庭用洗剤、Asian。
洗剤濃度：硬度４°dHを有する、水中、0.67g/l。
T−O−Tビーター当たり洗剤溶液1000ml。
綿布：下記から成る適切にサイズ分類された断片を含んで成る、T−O−Tビーカー当たり合計33gの布：
白色の綿織布、＃2003（Tanigashira, Osaka, Japan）、合計重量11g、
白色の綿両面編み、合計重量13g、
汚れた綿布、タイプEMPA101（EMPA, Switzerland）、合計重量9g。
洗浄：温度25°、洗浄時間40分、125rpm。洗浄の後、＃2003綿を、水道水により10分間、すすぎ、次に乾燥する。
【０１４５】
反射率測定：＃2003綿織布の断片の両側を、Macbeth7000反射率分光光度計（500nm）を用いて測定する。個々のT−O−Mビーカーからの測定のための平均結果を計算する。
酵素添加：この試験においては、例２に記載のようにして調製されたエンド−グルカナーゼを、洗浄段階の開始の前、洗剤液体に添加した。
【０１４６】
結果：
【表７】
2004536593.tif 000008
前記結果から、本発明のエンド−グルカナーゼの添加が汚れの再付着を低めることが結論づけら得る。
【０１４７】
例９．pH及び温度の関数としてのエンド−グルカナーゼの活性
例２からのエンド−グルカナーゼの活性を、40℃の反応温度を用いて、広範囲の溶液pH値で測定した。
酵素をまず、水により希釈し、約0.07ECU/mlの活性を有する溶液を得た。
750μlのCMC溶液（Hercules, タイプ７LFD、水に溶解される２％（w/w）濃度）及び1000μlの緩衝溶液を、試験管において混合し、そして40℃に予備加熱した。使用される緩衝溶液は下記に記載される。次に、0.07ECU/mlの酵素溶液250μlを添加し、そしてその混合物を40℃で20分間インキュベートした。次に、下記に記載されるPHBA試薬1000μlを添加し、そして管を煮沸水において10分間、加熱した。最終的に、溶液を氷水において冷却し、そして410nmでの吸光度を分光光度計により測定した。酵素溶液を添加する前、PHBAH試薬を添加することによって決定されるブランク吸光度値を控除した。
【０１４８】
PHBAH試薬を次の通りに調製した：1.5gのヒドロキシ安息香酸ヒドラジド及び5.0gの酒石酸カリウムナトリウムを、水中、２％（w/w）水酸化ナトリウム溶液100mlに溶解する。
次の緩衝液を使用した。すべての場合、緩衝液濃度は0.1Mであった：
酢酸緩衝液、pH4.0, 4.5, 5.0, 5.5、
MES緩衝液、pH6.0（MESは２−[N−モルホリノ]エタンスルホン酸である）、
MOPS緩衝液、pH6.5, 7.0, 7.5 (MOPSは３−[N−モノホリノ]プロパンスルホン酸である、
バルビツル酸緩衝液、pH8.0, 8.5、
グリシン緩衝液、pH9.0, 9.5, 10.0, 10.5。
410nmでの吸光度（−ブランク値）は、酵素の活性の測定である。結果は次の通りであった：
【０１４９】
【表８】
2004536593.tif 000009
【０１５０】
結果は、酵素がアルカリ性pHで最大活性を有することを示す。酵素は、8.1〜10.5のpH範囲で最大活性の約90％又はそれ以上を有する。
例２からのエンド−グルカナーゼの活性を、pH 10.0の反応を用いて、広範囲の温度で測定した。
酵素をまず、水により希釈し、約0.07ECU/mlの活性を有する溶液を得た。
【０１５１】
750μlのCMC溶液（Hercules, タイプ７LFD、水に溶解される２％（w/w）濃度）及び1000μlの0.1Mグリシン緩衝溶液（ｐH10.0）を、試験管において混合し、そして特定の温度に予備加熱した。使用される緩衝溶液は下記に記載される。次に、0.07ECU/mlの酵素溶液250μlを添加し、そしてその混合物を特定の温度で20分間インキュベートした。次に、下記に記載されるPHBA試薬1000μlを添加し、そして管を煮沸水において10分間、加熱した。最終的に、溶液を氷水において冷却し、そして410nmでの吸光度を分光光度計により測定した。酵素溶液を添加する前、PHBAH試薬を添加することによって決定されるブランク吸光度値を控除した。
【０１５２】
410nmでの吸光度（−ブランク値）は、酵素の活性の測定である。結果は次の通りであった：
【表９】
2004536593.tif 000010
酵素は、20〜60℃の温度で高い活性を有し、約40〜50℃で最高の活性を有する。
【０１５３】
例10．連続装置における本発明のエンド−グルカナーゼを用いての生物仕上げ
使用される布は、100％綿の漂白されたインターロックであるKnitted Fabric460 (Test Fabric Inc.)である。この布を、それぞれ約12.5gの重量の20×30cmの断片に切断する。個々のスワッチの重量を、65±２％の相対温度及び21±2℃（70±３°F）で少なくとも24時間のコンディショニングの後、決定する。
【０１５４】
例２において得られた本発明のエンド−グルカナーゼを、15mMのリン酸ナトリウムに配合する。試験は、種々の酵素濃度及び異なったpHで行なわれる。スワッチを、45秒以下の間、酵素溶液と接触し、そして次に、パッドを通して撹拌し、この後、それらの重量を計り、そしてMathis蒸気レンジ（Type PSA-HTF）(Werner Mathis USA Inc. Concord, NC) においてすぐに吊るす。布上への溶液の百分率（％湿潤吸収率）及び布に対するエンド−グルカナーゼ活性の割合を決定する。布スワッチを、90℃及び100％相対湿度で90分間、処理する。次に、すべてのスワッチを移し、そして脱イオン水により５分間、すすぎ、その後、それらを乾燥する。最終的に、スワッチを、評価の前、65±2％相対湿度及び21±2℃（70±3F）で少なくとも24時間、コンディショニングする。
【０１５５】
布の強度を、ASTM D3786-87: Standard Test Method for Hydraulic Bursting Strenght of Knitted Goods and Nonwoven Fabrics-Diaphragm Bursting Strength Tester Methodに従って、Mullen BrustテスターモデルC上で測定し、そして強度の損失を決定する。ピリング特徴を、ASTM D4070-89: Standard Test Method for Pilling Resistance and Other Related Surface Changes of Textiles Fabrics (Martindale Pressure Tester Method) に従って測定する。500回の回転の後、布上でのピリングを、標準尺度１〜５に対して視覚的に評価する（ここで、１は非常に重度のピリングを示し、そして５はピリングが存在しないことを示す）。
【０１５６】
例11．連続装置における本発明のエンド−グルカナーゼを用いての生物仕上げ
生物仕上げを、例10に記載のようにして実質的に行なう。但し、緩衝液は、2.5Lの脱イオン水に溶解された9.53gの四硼酸ナトリウム・10H2Oから成り、そしてpH9.2に調節される。
スワッチを、例10に記載のようにして撹拌し、そして処理する。布の湿潤吸収率は94％であった。布を、pH9.2、90℃及び100％の相対湿度で90分間、処理する。すすぎ、乾燥評価工程は、例10におけるのと同じである。
【０１５７】
例12．組合せ処理
次の実験を、組合された精練及び生物仕上げにおける例２において得られたエンド−グルカナーゼの効果を評価するために行なう。使用される布は、非精練の漂白されていない100％綿布であるFabric4600である。布の調製及び緩衝液は、上記例11に記載と同じである。大量溶液は、次のものを含む：（ａ）6.12CMCU/ml及び4.9CMCU/g布の濃度での、上記例２に記載のような緩衝液中、例２のエンド−グルカナーゼ；及び（ｂ）1.93mv−モル/ml/分の濃度での熱安定性ペクチン酸リアーゼ。スワッチを、例10に記載のようにして、撹拌し、そして処理する。布の湿潤の吸収率は80％である。
【０１５８】
処理条件は、pH9.2, 90℃、100％の相対湿度（RH）であり、そして処理は90分である。すすぎ、乾燥、評価方法は、上記例10に記載と同じである。湿潤速度を、標準AATCC（American Association of Textile Chemists and Colorists）Test Method 79-1995” Absorbency of Bleached Textiles” に従って評価する。1cmの高さのビューレットからの水滴を、布検体のピンと張られた表面への落下を可能にする。布表面上での水の消出の時間を、湿潤時間として記録する。
【０１５９】
例13．デニム磨耗
次の例は、デニムジーンズ又は他の衣類を処理するために及び均等に配置された色の変化を有するデニム衣類を生成するために、例２において得られた本発明のエンド−グルカナーゼの使用を例示する（デニム磨耗）。磨耗とは、セルラーゼ処理及び機械作用の組合された効果のために、縦糸−染色されたデニムの退色に関する。得られる効果は、軽石により達成されるストーン−ウォシュドデニムのその効果に類似する布の外観である。
【０１６０】
洗浄試験を、次の条件下で行なう：
織物：
ブルーデニムDAKOTA、14 1/2oz, 100％綿。デニムを切断し、そして約37.5×100cm（それぞれ約375g）の大きさの“脚”のように縫い合せる。
酵素：
アミラーゼ：AQUAZYMTM ULTRA 1200L (Novozymes A/Sからの)、
本発明のエンド−グルカナーゼ。
【０１６１】
デニム磨耗プロトコール：
装置：Tonello G1 30Washing/Dyeing/Stone 洗浄機械（Tonello S.r.I., Via della Fisica, 1/3, Sarcedo (VI)-Italia）。
織物装填：8kgのデニム“脚”。
糊抜き段階：0.2％AQUAZYMTM ULTRA (重量％の布)
0.05％のTergitol 15-S-9 (重量％の布)
10分
75℃
LR（液体比）10：１
【０１６２】
すすぎ段階：３分、60℃、LR 15：1
磨耗段階：10ECU/gデニムエンドグルカナーゼ
60分
50℃
LR ８：１
【０１６３】
不活性化段階：２％炭酸ナトリウム（重量％の布）
80℃
20分
LR 10：１
すすぎ段階：２×３分、LR 15：１
抽出段階：110gで５分
デニムサンプルを混転乾燥する。評価の前、20℃、65％相対温度で24時間、サンプルをコンディショニングする。
【０１６４】
試験/分析：
デニム磨耗及びバックスティンニング：
磨耗及びバックスティンニングのレベルを決定するためにデニムサンプルの反射率を測定する。デニム磨耗を、平均L*として測定し（より高いL*は、より一層の磨耗に対応する）、そしてバックスティンニングを、HunterLab Labscan XE分光光度計（Hunter Associates Laboratory, Inc., Reston, VA20190 USA）上での平均b*（より負のｂ*、すなわち“青色”は、よりバックスティンニングに対応する）として測定する。
【０１６５】
デニム磨耗及びバックスティンニングの可視評価：
デニムを評価する５人の当業者は、デニム製の“脚”を可視的に等級付けし、そして１（低い効果）〜５（高い効果）を割り当てるために質問される。
重量の損失：
重量の損失を決定するために、処理の前及び後でサンプルの重量を計量する。
引裂強さ：
デニムサンプルの引裂強さを、ASTM D 1424-83 “Standard Test Method for Tear Resistance of Woven Fabrics by Falling Pendulum (Elmendorf) Apparatus” に従って、Elmendorf引裂テスターを用いて決定する。
【国際公開パンフレット】
2004536593.tif 000011
2004536593.tif 000012
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2004536593.tif 000061
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004536593.tif 000062
【手続補正書】
【提出日】平成15年5月19日(2003.5.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１の位置１〜2332のDNA配列によりコードされるポリペプチド；
（ｂ）酵素の生成が可能な条件下で培養された宿主細胞による配列番号１の配列の発現によって生成されるポリペプチド；
（ｃ）同一性が3.0のGAP創造ペナルティー及び0.1のGAP延長ペナルティーを用いてGCGプログラムパッケージに提供されるGAPにより決定される場合、配列番号２の位置１〜773のアミノ酸配列；又はエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するそのフラグメントに対して少なくとも98.5％同一性の配列を有するエンド−β−１，４−グルカナーゼ酵素の１つから選択される、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性（EC3. 2. 1. 4）を示す酵素。
【請求項２】
酵素が、45℃で５×SSCを含んで成るハイブリダイゼーション条件及び60℃で２×SSCを含んで成る洗浄条件下で配列番号１の位置１〜2322に示されるヌクレオチド配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドである、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性（EC3. 2. 1. 4）を示す酵素。
【請求項３】
前記酵素が、バチルスsp., DSM12648に対して内因性であるポリペプチドを含んで成る請求項１又は２記載の酵素。
【請求項４】
少なくとも４〜11、好ましくは5.5〜10.5の範囲のpHで活性である請求項１〜３のいずれか１項記載の酵素。
【請求項５】
（ａ）ヌクレオチド１〜2322の配列番号１に示されるようなヌクレオチド配列を含んで成るポリヌクレオチド分子；
（ｂ）配列番号２の位置１〜773のアミノ酸配列；又はエンドーグルカナーゼ活性を有するそのフラグメントに対して98.5％以上、同一であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；
（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）に対して相補的な分子；及び
（ｄ）上記（ａ）又は（ｂ）の縮重ヌクレオチド配列；
から成る群から選択された、エンド−β−１，４−エンドグルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドがDNAである請求項５記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項７】
配列番号１の位置１〜2322に示される配列を含んで成るDNAプローブ、及び少なくとも約100個の長さの塩基対を有する配列番号１の位置１〜2322の副配列を含んで成るDNAプローブから成る群から選択された、変性された二本鎖DNAプローブに対して、中位の緊縮性条件下でハイブリダイズする、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項８】
原核生物、好ましくは細菌、より好ましくはグラム陽性細菌からのDNAライブラリーから単離されるか、又はそれに基づいて生成される請求項５記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項９】
バチルス属に属する株、特にバチルスsp. の株、特にバチルスsp., DSM12648からのDNAライブラリーから単離されるか又はそれに基づいて生成される請求項８記載の単離されたヌクレオチド分子。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれか１項記載のポリヌクレオチド分子を含んで成るポリヌクレオチド構造体。
【請求項１１】
次の作用可能に連結された要素：転写プロモーター；（ａ）ヌクレオチド1〜2322の配列番号１に示されるようなヌクレオチドを含んで成る、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；（ｂ）配列番号２の位置１〜773のアミノ酸配列、又はエンド−グルカナーゼ活性を有するそのフラグメントに対して97％以上、同一であるエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子；及び（ｃ）（ａ）又は（ｂ）の縮重ヌクレオチド分子から成る群から選択されたDNAセグメント；及び転写ターミネーターを含んで成る発現プロモーター。
【請求項１２】
請求項11記載の発現ベクターを導入されている、DNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現する培養された細胞。
【請求項１３】
原核細胞、特に細菌細胞、又はエンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を示すポリペプチドをコードするDNAセグメントが起因する内因性細胞である請求項12項記載の細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、バチルスの株、好ましくはバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）又はバチルス・レンタン（Bacillus lentus）の株に属する請求項13記載の細胞。
【請求項１５】
前記細胞が、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）の株、好ましくはバチルス・リケニホルミスATCC14580の株に属する請求項13記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞が、シュードモナス（Pseudomonas）の株、好ましくはシュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescons）又はシュードモナス・メンドシナ（Pseudomonas mendocina）の株に属する請求項１記載の細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、ストレプトミセス（Streptomyces）の株に属する請求項13記載の細胞。
【請求項１８】
前記細胞が、サッカロミセス（Saccharomyces）の株、好ましくはサッカロミセス・セレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）の株に属する請求項13記載の細胞。
【請求項１９】
エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有するポリペプチドの生成方法であって、請求項12記載の発現ベクターを導入されている細胞を培養し、それにより、前記細胞がDNAセグメントによりコードされるポリペプチドを発現し、そしてそのポリペプチドを回収することを含んで成る方法。
【請求項２０】
請求項１記載の酵素を含んで成る酵素組成物。
【請求項２１】
プロテアーゼ、セルラーゼ（エンドグルカナーゼ）、β−グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、他のマンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はそれらの混合物から成る群から選択された１又は複数の酵素をさらに含んで成る請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
（ｉ）相同不純物を有さず、そして（ii）請求項19記載の方法により生成される、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を有する単離された酵素を含んで成る酵素組成物。
【請求項２３】
有効量の請求項１〜４、又は22のいずれか１項記載の酵素、又は請求項20又は21記載の酵素組成物により処理されるセルロース含有バイオマスの分解方法。
【請求項２４】
ａ）配列番号２の位置340〜540におけるCBD、及びｂ）バチルスsp. AA349株DSM12648以外の源からの触媒ドメイン（CAD）を含んで成る、エンド−β−１，４−グルカナーゼ活性を示すハイブリッドエンド−グルカナーゼ。
【請求項２５】
前記触媒ドメイン（CAD）が、
（ａ）バチルス・レンタス株NCIMB40250、
（ｂ）ヒューミコラ・インソレンス株DSM1800、
（ｃ）フサリウム・オキシスポリウム株DSM2672又は
（ｄ）バチルスsp. AC13株NCIMB40482
から成る群から選択された源に由来するエンド−グルカナーゼである請求項24記載のハイブリッドエンド−β−１，４−グルカナーゼ。
【請求項２６】
請求項１〜４のいずれか１項記載のエンド−β−１，４−グルカナーゼ、又は請求項24又は25記載のハイブリッドエンド−β−１，４−グルカナーゼを含んで成る組成物。
【請求項２７】
請求項１〜４のいずれか１項記載のエンド−β−１，４−グルカナーゼ、又は請求項24又は25記載のハイブリッドエンド−β−１，４−グルカナーゼの洗剤組成物への使用。
【請求項２８】
請求項１〜４のいずれか１項記載のエンド−β−１，４−グルカナーゼ、又は請求項24又は25記載のハイブリッドエンド−β−１，４−グルカナーゼの織物仕上工程への使用。
【国際調査報告】
2004536593.tif 000063
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