(57)【要約】本発明において、ペプチジル薬のプロリポソームおよび前記プロリポソームを含むエンテリック製剤が開示されてあり、そこにおいては、前記プロリポソームは、有機溶媒にペプチジル薬とリン脂質を溶解すること、および得られた溶液を水溶性キトサンで被覆することによって調製される。本発明にしたがって、プロリポソームおよびエンテリック製剤を使用するペプチドの経口デリバリーシステムは、ペプチジル薬の安定性および生体有用性を顕著に向上させる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機溶剤にペプチド薬とリン脂質を溶かすことおよび得られた溶液を水溶性キトサンで被覆することによって調製されるプロリポソーム。
【請求項２】
ペプチド薬がアプロチニン、ブセレリン、カルシトニン、デスモプレッシン、エルカトニン、グルカゴン、ゴナドトロピン、ゴナドレリン、ゴセレリン、ヒルジン、ロイプロレイン、リプレッシン、ナファレリン、オクトレオチド、オキシトシン、プロチレリン、サルカトニン、サーモレリン、ソマトスタチン、ソマトロピン、テルリプレッシン、テトラコサクリン、チモペンチン、トリプトレリン、バソプレッシン、アルブミン、インシュリン、インターフェロン、イムノグロブリン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよび糖タンパク質からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載のプロリポソーム。
【請求項３】
前記水溶性キトサンが８５％〜９９％の脱アセチル化度および１００，０００〜５００，０００の分子量をもつことを特徴とする請求項１または２に記載のプロリポソーム。
【請求項４】
用いられるリン脂質がＬ−α卵ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、コレステロール、ステアリルアミン、ジアセチルホスフェート、ホスファチジルセリンおよびメトキシポリエチレングリコールジステアロイルホスファチジル−エタノールアミンからなる群から選択されるということを特徴とする請求項１または２に記載のプロリポソーム。
【請求項５】
有機溶剤にペプチド薬とリン脂質を溶解すること、得られた溶液を水溶性キトサンで被覆してプロリポソームを調製すること、そのプロリポソームを従来の製薬上許容される方法にしたがって製薬上許容される製剤に処方すること、およびついで、得られた製剤に、従来のエンテリックコーティング法にしたがって腸溶性被膜をつけること、によって調製されるペプチド薬のプロリポソームの腸溶性被膜製剤。
【請求項６】
ペプチド薬がアプロチニン、ブセレリン、カルシトニン、デスモプレッシン、エルカトニン、グルカゴン、ゴナドトロピン、ゴナドレリン、ゴセレリン、ヒルジン、ロイプロレイン、リプレッシン、ナファレリン、オクトレオチド、オキシトシン、プロチレリン、サルカトニン、サーモレリン、ソマトスタチン、ソマトロピン、テルリプレッシン、テトラコサクリン、チモペンチン、トリプトレリン、バソプレッシン、アルブミン、インシュリン、インターフェロン、イムノグロブリン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよび糖タンパク質からなる群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
ｐＨレベルを３〜４の範囲に調節するためにｐＨレベルの調節試剤とプロリポソームを混合することを特徴とする、請求項５または６に記載の製剤。
【請求項８】
脂肪酸またはその塩、胆汁酸、コール酸塩、サリチル酸およびサリチル酸塩から選択された吸収促進剤をペプチド薬の吸収促進剤として添加することを特徴とする請求項５、６または７に記載の製剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ペプチドおよび蛋白質の薬剤（以下「ペプチド薬」と称する）の経口投与製剤およびそれを生産する方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
遺伝子組換え技術および固相ペプチド合成技術の急速な発展にしたがって、臨床分野で使用されるペプチド薬の種類は、１９９０年代に急速な増加傾向で多くなり、バイオテクノロジーの著しい発展のために加速され、約１００種またはそれ以上の薬剤が開発され、現在世界で商品化されている。
【０００３】
しかしながら、現在開発され、商品化された大部分のペプチド薬は注射薬の形態であり、したがって、１）患者への注射には痛みが伴うこと、２）それが冷蔵庫での貯蔵の必要といった貯蔵における困難さをもっていること、および３）患者が薬を打ってもらうために病院に行かねばならないこと、において欠点を持っている。したがって、ペプチド薬の経口薬剤を開発することが緊急に求められているが、そのような開発は第１段階にあり、現在に至るまで重要でない結果を提供しているに過ぎない。
【０００４】
ペプチド薬の注射に含まれる上記の欠点を経口薬剤によって克服することができるならば、１）ペプチド薬を患者に最も適した投与形態で処方することができること、２）製剤の安定性が増して、流通や有効期間の確立などの、生産、販売および消費の条件が、今までの剤形に比較して都合よくかつ有利に変更できること、および３）患者に好まれる経口薬剤のマーケットが今までの薬剤のマーケットに急速に置き換わること、が期待される。したがって、経口薬剤を開発する技術的研究が活発になされてきた。
【０００５】
一般に、ペプチド薬の経口薬剤を開発することにおける技術的な問題点は、よく知られた論文（レイモンド　Ｍ．レイリー、ロンメル・ドミンゴおよびジャスビル・サンドゥ、Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ、３２巻（４）、３１３〜３２３頁、１９９７年；ヨセフ　Ａ．フィックス、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１３巻、Ｎｏ．１２、１９９６年；アミン　Ｐ．サヤニおよびイー　Ｗ．チェン、Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、１３巻（１および２）８５〜１８４頁、１９９６年；ジェーン　Ｐ．Ｆ．バイ、リ−リン・チャンおよびジャン−ホワ・グオ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、１２巻（４）、３３９〜３７１頁、１９９５年）に報告されている。
【０００６】
そのようなペプチド薬の経口薬剤を開発することにおいて解決すべき主要な問題は、１）腸管での低い吸収、２）小腸に存在するプロテイナーゼによる効力の消滅、および３）吸収後の生体内における短い半減期のために効力を維持することの困難さ、を含む。したがって、研究は、そのような問題に焦点を置いている。
【０００７】
これらの問題の中で、まず、以下の方法が腸管での低い吸収を解決するために広く使用されてきた：１）生体膜を通しての薬の透過を増すためにナノスフィア粒子またはミクロスフィア粒子中に薬を包含すること（イストヴァン・トート、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、１８３巻、１９９９年、５１〜５５頁；Ｅ．ビョルク、Ｕ．イサクソン、Ｐ．エドマン、Ｊ．Ｄｒｕｇ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　２、５０１〜５０７頁、１９９５年；シンジ・サクマ、ノリオ・スズキ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、１４９巻、１９９７年、９３〜１０６頁）；２）吸収促進剤と一緒に薬を使用する方法（パトリック．Ｊ．シンコ、ヨン−ヒー・リー、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６巻、Ｎｏ．４、１９９９年、５２７〜５３３頁；Ｊ．Ｃ．スコット−モンクリーフ、Ｚ．シャオ、Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．８３巻、１４６５〜１４６９頁、１９９４年；Ｅ．Ａ．ホスニー、Ｎ．Ｍ．カン、Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖｅｌ．Ｉｎｄ．Ｐｈａｒｍ．、２１巻、１５８３〜１５８９頁、１９９５年；イサオ・ササキ、ヒデユキ・トザキ、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、２２巻、（６）、６１１〜６１５頁、１９９９年；アンソミーＣ．チャオ、ジョウゼフ・ヴ・ヌグエン、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ、１９１巻、１９９９年、１５〜２４頁）；３）ペプチド構造を改変する方法（ディーブン・シャー、ウェイ・チャン、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、８５巻、Ｎｏ．１２、１９９６年、１３０６〜１３０９頁；カズノリ・イワナガ、サトシ・オノ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、８８巻、Ｎｏ．２、１９９９年、２４８〜２５２頁；イストヴァン、ジョンＰ．マルキンソン、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９９９年、４２巻、４０１０〜４０１３頁）；４）薬の構造を改変する、または、酵素阻害剤と一緒に薬を使用する方法（Ｐ．ビュールネイヤー、Ａ．カセリ、Ｗ．ヒューラー、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３１巻、１８３９頁、１９９８年；Ａ．ヤマモト、Ｔ．タニグチ、Ｋ．リキュ、Ｔ．ツジ、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１巻、１４９６〜１５００年、１９９４年）；および５）生体中の薬の安定性を増すための、ミクロスフィア中への薬の包含または薬の改変（デイヴィド．Ｆ．ラニー、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、５９巻、１０５〜１１４頁、２０００年；イアン　Ｍ．チャップマン、オウラ　Ｈ．ペスコヴィズ、ゲイル・マーフィー、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　＆　Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、１９９７年、８２巻、Ｎｏ．１０、３４５５〜３４６３頁）。さらに、ペプチド薬の調製を開発する研究が、多数の方法によって活発に遂行された（Ｚ．アイディン、Ｊ．アクブガ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、１３１巻、１０１〜１０３頁、１９９６年；Ｋ．アレデー、Ｅ．ジアナシ、Ｉ．オリエンティおよびＶ．ゼッキ、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ、１９７７年、１４巻、Ｎｏ．５、５６７〜５７６頁；Ａ．ポーク、Ｂ．アムスデン、Ｋ．ド・ヤオ、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、８３巻、Ｎｏ．２、１９９４年、１７８〜１８５頁）。
【０００８】
さらに、そのようなペプチド薬の経口製剤を開発する１つの方法として、リポソームが利用された。この方法は、１）薬がナノスフィア粒子またはミクロスフィア粒子に比較的容易に包含される、および２）リポソームが小腸管粘膜中に容易に吸収される、という利点を持っており、したがって近年広く研究されてきた。そのような方法に関する先行技術は、Ｌｉｐｏｔｅｃ、Ｓ．Ａ．による特許（欧州特許第０８５５１７９号　Ａ２）に開示されている技術を含む。しかしながら、この方法は、リポソームを調製する際に１）水の使用が薬の安定性に関する問題を引き起こす可能性があること、２）粉体の形でのリポソームを調製するために凍結乾燥または乾燥の工程が使用されなければならないこと、３）その水溶液中の安定性が凝集、沈降、融合、酸化反応、リン脂質加水分解などを含むリポソーム自体の特性の故に低いこと、および４）生産工程中にリプロダクティビリティと滅菌を提供することは困難であること、という、リポソームを医薬品として使用する点で数個の欠点を持っている。
【０００９】
（発明の詳細な説明）
上に述べたような先行技術に関係している問題を解決するために 本発明者らは、ペプチド薬の化学修飾よりはむしろ物理的修飾に重点を置いてペプチド薬の製剤を長期間研究し、試験した。こうして本発明を完成した。
【００１０】
したがって、本発明は上記したような先行技術に含まれている問題点を改良する方法を提供する。その方法においては、１）水溶性キトサンを使用して、リポソームの前駆体としてのプロリポソームを調製し、それによって腸管粘膜への吸収を増加させる、２）ｐＨを調整する試剤を使用して、水性の腸液中でのペプチド薬の安定性を増す、３）ペプチド薬がスムーズに腸管粘膜に吸収されるために、吸収促進剤などのような添加物を添加する、ついで４）製品を経口投与にふさわしい製剤に処方する、そして、同時に５）薬が壊れないで腸管に容易に移行し、吸収されるように、該製剤を腸溶性被膜で被覆する。
【００１１】
すなわち、本発明は、粉末の形のリポソームを調製するために凍結乾燥または蒸発の工程（これは、欧州特許第０８５５１７９号で開示されているようなリポソームを用いる経口用製剤を調製する以前の方法において発生する問題を引き起こす可能性がある）を行わないで、短時間に高收率の、リポソームの前駆体としてのプロリポソームを調製することができ、したがって、このプロセスの工程は簡単であり、ペプチド薬の湿気と温度（これが、ペプチド薬の欠点を構成する）に対する安定性が増すという利点を持っており、そして、生体有用性を増すためにプロリポソームを調製する担体としてキトサンを使用する。
【００１２】
具体的には、本発明によれば、１）水溶性キトサンの水溶解性を利用して、水溶性キトサンの上に被覆したペプチド薬を粉末形状で調製するために有機溶媒を使用する、
２）ペプチド薬を胃酸から保護するために、薬に腸溶性被膜をつける、
３）薬が腸に達すると、粉末の形をした粉状プロリポソームが、水溶性キトサンの水に溶解する物理的特性によって腸の中でリポソームとなり、薬は腸粘膜にスムーズに吸収され、同時にフリーの陽イオンをもつキトサンが腸粘膜に結合するという性質を提供する、
４）大概のペプチド薬の水溶液中での不安定性による、経口投与後の腸における薬の容易な分解を防ぐために、ｐＨレベルを制御するための試剤を添加し、大概のペプチド薬が３〜４のｐＨレベルで安定であるということを利用して、腸中の薬の安定度を増加させる、そして
５）ペプチド薬が、細胞間のパラトランスパターンにしたがって腸粘膜に容易に吸収されるために、ペプチド薬が腸粘膜に容易に吸収されるように、吸収促進剤のような添加剤が結合される。
【００１３】
以下に、本発明をさらに具体的に説明する。
キトサンは、天然の高分子物質であり、カニ、エビなどのような甲殻類の殻および昆虫の外皮、キノコ、菌類の細胞膜に広く分布しており、それらを含む生体を維持し、保護する役割を演じている多糖類キチンから作られた物質である。
【００１４】
具体的には、キチンは、セルロースと類似している、側鎖のない非常に長い鎖構造をした高分子物質であって、２位の炭素原子が水酸基（−ＯＨ）の代わりにアセチルアミノ基（−ＮＨＣＯＣＨ３）に置換されている。キトサンは、キチンの２位の炭素原子上に存在するアミノ基に結合したアセチル基の脱アセチル化によって生成する物質であり、多数のフリーの陽イオンを持つことができるので、種々の生理活性を持っている。
【００１５】
この理由のために、高品質のキトサンが開発され、食品、化粧品、医薬品および吸収剤、植物細胞の賦活剤、廃水処理用凝集剤などのような種々の産業分野において広く使用されている。特に、キトサンの脂肪を結合する能力は、植物フィブリンのそれよりはるかに優れていて、キトサンは、病気に対する免疫性および耐性を向上させ、さらに生体中で毒性を持たず、したがって、無害であることが、近年明らかにされた。
【００１６】
しかしながら、最近種々の分野で広く使用されてきているキトサンは、水またはアルコールに溶解させることができず、蟻酸、乳酸、酢酸などのような有機酸の水溶液、または希塩酸のような無機酸の水溶液だけに溶解することができるので、それは、製剤の分野の中では限られた適用性を持つ。
【００１７】
こうして、本発明者らは、水溶性のキトサンを使用するペプチド薬（ＪＫ ＦＭ−０１：Ｊａ　Ｋｗａｎｇ社）の経口薬剤を調製する研究をし、そこで本発明を完成した。本発明で使用される水溶性キトサンは、１）脱アセチル化度が８５〜９９％である、２）水への溶解度が９９．９９％またはそれ以上である、３）分子量が１００，０００〜５００，０００であって、医薬製品中の賦形剤としておそらく使用することができる、そして、４）それは食品添加物に対する標準的要件を満たす、ということに特徴づけられる。
【００１８】
すなわち、本発明で使用されるキトサンの主要な特徴は、９９．９９％またはそれ以上の水溶解度である。本発明で使用されるキトサンの水溶解度が以前のキトサンのそれより高い理由は、１）キチンをアルカリ性水溶液で処理すること、およびアセチルアミノ基をアミノ基へ加水分解すること（そのあとに多段階式の分離膜法が続く）によって脱アセチル化工程を遂行することで、キトサンを調製するための方法が、キトサンの水溶性を維持しつつ、アセチル化度の８５〜９９％への増大を可能にしていること、２）キトサンは、多段階式分離膜工程を通して９０％またはそれ以上の純度で調製することができること、および、３）キトサンの２位にある炭素原子に対する脱アセチル化工程の間にアミノ基が活性化されるので、キトサンが水分子と接触すると、キトサンの特性を維持しながら、キトサンは容易に水に溶解することができる。
【００１９】
さらに、本発明の特徴は、医薬品および化粧品の分野で使用されてきたリポソームの問題点を取り除くことおよび同時にキトサンの長所を保持しながら、水溶液中に溶解することのできる水溶性キトサンを利用すること、によってペプチド薬の経口薬剤を調製することである。
【００２０】
すなわち、１９６５年にリポソームが、バムガムら （『膨潤したリン脂質の薄膜を通しての１価イオンの拡散』Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１３巻、２３８〜２５２頁、１９６５年）によって単層または多層リン脂質二重膜閉鎖小胞として報告されて以来、過去数十年の間、リポソームは、１）表面電荷、２）サイズ、および３）リポソームの使用目的および最終使用に適合するための脂質含量、を加減することによって、それを調製する多数の方法にしたがって調製され、食品、化粧品および医薬品に使用されてきた。
【００２１】
特に、近年、リポソームは、医薬品分野において、１）薬の持続的活性および目標への誘導、２）急性毒性の緩和および免疫反応の緩和または増進、３）薬の安定化、ならびに４）投薬処方の変更、という目的のために種々の薬剤を開発するために使用されている。しかしながら、薬剤の開発のために利用されてきたリポソームは、１）凝集、２）沈降、３）融合、４）酸化反応、および５）リン脂質の加水分解、を含むリポソーム自体の特性の故に、その水溶液中の安定度が低く、６）大量生産のためのプロセス中の滅菌性およびリプロダクティビリティの効率は低い、という医薬品において効果的に使用されるには不十分な欠点を持っている。
【００２２】
上の理由のために、本発明者らは、そのような以前のリポソーム製剤に含まれている問題を除くために長期間広範囲にわたって研究し、その結果、驚くべきことに、担体として水溶性キトサンを使用してリポソームの前駆体として固体粉末形状のプロリポソームを調製することによって以前のリポソーム調製の問題すべてを取り除くことができることを発見した。こうして我々は本発明を完成した。
【００２３】
したがって、本発明の目的は、水溶性のキトサンを使用することによって調製されるペプチド薬のプロリポソームを提供することである。
【００２４】
本発明のもう一つの目的は、従来の製薬方法にしたがって水溶性のキトサンを使用して作られたペプチド薬のプロリポソームから処方される経口薬剤を提供することである。
【００２５】
本発明の更なる目的は、従来の製薬方法にしたがって水溶性キトサンを使用して作られたペプチド薬のプロリポソームから処方される経口薬剤を調製するプロセスを提供することである。
【００２６】
一般に、プロリポソームを調製するための担体は、次の特性を持たなければならない：１）プロリポソームからリポソームに変換されるためには、それが水に溶かされるので、それは水溶性でなければならない、および２）プロセスの過程において使用される有機溶媒へのその溶解度は低くなければならない。本発明において使用される水溶性のキトサンは上記したようにプロリポソームの担体特性を持つだけでなく、薬の経口投与の場合に、キトサンが腸内で水の作用によって溶解するとき、脂質と結合するためにキトサン自身に含まれているフリーの陽イオンの働きによって引き起こされる接着特性を向上させる効果のせいで、生体中でペプチド薬の吸収を増加させることができる。
【００２７】
本発明で使用することができるペプチド薬の典型的な例は、アプロチニン、ブセレリン、カルシトニン、デスモプレッシン、エルカトニン、グルカゴン、ゴナドトロピン、ゴナドレリン、ゴセレリン、ヒルジン、ロイプロレイン、リプレシン、ナファレリン、オクトレオチド、オキシトシン、プロチレリン、サルカトニン、サーモレリン、ソマトスタチン、ソマトロピン、テルリプレッシン、テトラコサクリン、チモペンチン、トリプトレリン、バソプレシン、アルブミン、インシュリン、インターフェロン、免疫グロブリン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、グリコプロテインなどを含む。さらに、もちろん、他のペプチド薬および蛋白質薬もまた本発明の範囲内に含まれる。
【００２８】
本発明にしたがってペプチド薬を含むプロリポソームを調製することに使用されるリン脂質は、リポソームの調製のために従来から使用されている製薬上許容できるリン脂質、たとえばホスファチジル−ＤＬ−グリセリン−ジミリストイル、Ｌ−α卵ホスファチジルコリン、大豆ホスファチジルコリン（レシチン）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、コレステロール、ステアリルアミン、ジアセチルホスフェート、ホスファチジルセリン、メトキシポリエチレングリコールジステアロイルホスファチジルエタノールアミンなどを含む。
【００２９】
アミノ酸から成るペプチド薬は、一般に、それらの構造の中にアスパラギン類またはグルタミン残基を含み、これらの残基は、アミド分解、β−脱離、ジスルフィド交換、ラセミ化、酸化反応などのような反応を起こし、それらは、最終的にペプチド薬としての活性の喪失を起こす構造上の変性を容易に誘発する可能性がある。そのような問題を防ぐための方法として、本発明は、本発明による経口薬剤が、腸内のペプチド薬を安定に保持するために、腸内で容易に溶解するとき、アスパラギン類およびグルタミン残基が化学反応を引き起こさないｐＨ３〜４にｐＨレベルを調整するための試剤を使用する。
【００３０】
本発明でｐＨレベルを制御するための試剤としては、医薬品において経口投与のために一般に使用することができるどんな試剤でも使用することができ、その典型的な例は、クエン酸、クエン酸ナトリウム、アジピン酸、リン酸１水素ナトリウムなどを含む。ｐＨレベルを調整するための試剤は、総量に基づいて１．０％〜５０％の量が使用される。
【００３１】
本発明のもう一つの特徴は、薬が経口経路を通して投与されるとき、腸管の上皮細胞になんら損傷を起こさない天然物または食品に由来する吸収促進剤を使用することによって、小腸へのペプチド薬の吸収を促進することである。本発明において使用することができる吸収促進剤は、カプリン酸、オレイン酸などのような脂肪酸またはその塩、胆汁酸の塩としてのコール酸塩、デオキシコール酸、サリチル酸塩ベースの吸収促進剤、またはモノグリセリドベースの吸収促進剤を含む。本発明の実施例の部で一般に使用される吸収促進剤は、望ましくはコール酸ベースの塩としてのデオキシコレートであって、望ましくは、０．１〜１０％の量が使用される。
【００３２】
（本発明を遂行するための態様）
本発明は、以下の実施例と実験によってさらに具体的に説明される。しかし、本発明の範囲は、これらの実施例および実験によって制限されない。
【００３３】
（実施例１）
プロリポソームの調製（サケカルシトニンを調製する実施例）
篩を通した水溶性キトサン粉末（１０６μｍ〜３００μｍ）４ｇを１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、ロータリーエバポレータに載せ、減圧下３０分間室温で乾燥させた。リン脂質としての卵レシチン２６７ｍｇをクロロホルム３０ｍｌに溶解し、ついでサケカルシトニン２７ｍｇの溶液（前もってメタノール１０ｍｌに溶解しておいた）と混合した。
【００３４】
水溶性キトサンの入った１００ｍｌの丸底フラスコの温度を２０〜３０℃に維持している間に、有機溶媒に溶かしたリポソーム成分の混合液の一定量（約１ｍｌ）を添加し、ついで、ロータリーエバポレータの回転を１２０〜１５０ ｒｐｍに保った。水溶性のキトサンが完全に乾燥して自由流動の状態になると、再び有機溶媒の混合液を加えて、繰り返し皮膜を塗った。最終的な溶液を添加し、乾燥し、ついで、有機溶媒を除去するために生成物を２４時間凍結乾燥機中で再乾燥させた（収率：９５％以上）。
【００３５】
（実施例２）
プロリポソームの調製（デスモプレシンを調製する実施例）
篩を通した水溶性キトサン粉末（１０６μｍ〜３００μｍ）３ｇを１００ｍｌの丸底フラスコに入れ、ロータリーエバポレータに載せて、室温、減圧下で３０分間乾燥した。リン脂質としてのホスファチジル−ＤＬ−グリセロール−ジミリストイル１６０ｍｇを、クロロホルム２４ｍｌに溶解し、ついでデスモプレッシン２０ｍｇの溶液（前もってエタノール１２ｍｌに溶解した）と混合した。
【００３６】
水溶性キトサンの入った１００ｍｌの丸底フラスコの内温を２０〜３０℃に維持している間に、有機溶媒に溶解したリポソーム成分の混合液の一定量（約１ｍｌ）を添加し、ついで、ロータリーエバポレータの回転を１２０〜１５０ ｒｐｍに保った。水溶性のキトサンが完全に乾燥して自由流動の状態になると、有機溶媒の混合液を再び加え、繰り返し皮膜を塗った。
最終溶液を添加し、乾燥し、ついで生成物を、有機溶媒を除去するために２４時間冷凍乾燥機で再乾燥した（収率：９６％以上）。
【００３７】
（実施例３〜３３）
アプロチニン、ブセレリン、エルカトニン、グルカゴン、ゴナドトロピン、ゴナドレリン、ゴセレリン、ヒルジン、ロイプロレイン、リプレシン、ナファレリン、オクトレオチド、オキシトシン、プロチレリン、サルカトニン、サーモレリン、ソマトスタチン、ソマトロピン、テルリプレッシン、テトラコサクリン、チモペンチン、トリプトレリン、バソプレッシン、アルブミン、インシュリン、インターフェロン、免疫グロブリン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦおよびグリコプロテインから成る群から選択した個々の薬品を、個々のペプチド薬を含む対応するプロリポソームを調製するために、実施例１または２に類似した方法にしたがって、使用した。
【００３８】
（実験１）
プロリポソーム中への薬の包含の確認（Ｃｒｙｏ−ＳＥＭ確認）
サケカルシトニンを含むプロリポソーム中への薬の包含を確かめるために、薬を含まないプロリポソームと薬を含むプロリポソームを、超低温電子顕微鏡によって比較観察した。試料の前処理のために、まず、液体試料（プロリポソームから水和させたリポソーム）の１滴（約３μｌ）を直径１ｃｍの円盤状試料テーブルに落とし、超低温−伝達システムの窒素流通チャンバー（ＣＴ １５００ Ｃｒｙｏｔｒａｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、英国）に液体窒素を充満させた。ついで、その試料をチャンバーにすばやく入れ、減圧下で１分間固化させた。
【００３９】
次に、試料を−１７０℃に調整された極低温室へ移し、減圧状態を確認した。すると、冷却した試料は自発的に壊れ、裂けた。その壊れた試料を、超低温−伝達システムに結合している走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ−５４１０ＬＶ、日本電子（株）、日本）の試料テーブルに移し、温度を−７０℃に調整し、その温度で試料を５分間保持して試料表面から水分を蒸発させた。
【００４０】
昇華の完了後、試料を再び極低温室へ移し、ついで金被覆にかけた。２０ｋＶの加速電圧の下で、試料の壊れて裂けた断面を観察して、生成したままのリポソームの形および薬の包含を確認した。その写真を図１に示す。
【００４１】
（実験２）
プロリポソームの溶解の観察
水溶性のキトサンを使用して生成したプロリポソームの水和過程を光学顕微鏡によって観察するために、プロリポソーム顆粒を顕微鏡のスライド上にマウントし、焦点を調節した。４００倍の倍率で、１滴の水を顆粒の上に落とし、１分後に水和過程を観察して水中でのプロリポソームの溶解過程を確認した。その写真を図２に示す。
【００４２】
（実験３）
生成したリポソームの粒子径の分析
実験例１で調製した水溶性キトサンプロリポソーム５ｍｇに蒸留水５ｍｌを添加し、ボルテックスミキサーで振盪してプロリポソームを溶解し、ついでそれを３０分間水和した。このように調製したリポソームの粒径および分布を粒径分析器によって測定した。その結果を図３にグラフとして示す。
【００４３】
（実験４）
プロリポソーム内のサケカルシトニンの定量分析および安定性
安定性を確認し、定量分析を遂行するために、サケカルシトニン約５μｇに対応する調製されたプロリポソームの重量を正確に測り、メタノール３００μｌに溶解し、ついでボルテックスミキサーを用いて完全に溶解した。０．４５μｍのフィルターを通して濾過した後、４０μｌのアリコートをＨＰＬＣにかけ、プロリポソーム中のサケカルシトニン含量を定量した。室温での安定度および冷凍庫内の安定度の測定から得られた結果を図４に示す。薬の含量を分析するために利用したＨＰＬＣの条件は、次の通りである：
ＨＰＬＣ条件：カラム−Ｃ１８（Ｓｕｃｅｌｐｏ社）
流速−１ｍｌ／分
溶媒Ａ−０．１％トリフルオロ酢酸／アセトニトリル
溶媒Ｂ−０．１％トリフルオロ酢酸／水
【００４４】
（実験５）
経口薬剤（錠剤）の調製およびエンテリックコーティング
錠剤は、韓国薬局方の「調製のための一般的規定」の部で定められている錠剤を調製する一般的な方法による湿式プロセスではなく、乾式プロセスの方法における直接圧縮成形によって調製した。本発明の効果を検討するために調製された個々の試料の組成は、以下の表１に示し、直接圧縮成形によって調製された個々の試料は、腸溶性被膜をつけるために酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）によって被覆した。被覆の結果は、韓国薬局方で定められている一般的試験法を用いて、人工胃液（溶液１）および人工腸液（溶液２）中での分解試験を遂行することによって確認し、次の表２に記載する。
【００４５】
【表１】
2004506003.tif 000003
【００４６】
【表２】
2004506003.tif 000004
【００４７】
本発明の効果を確かめるために、インビボおよびインビトロ両方の試験を行うために、試料を使用した。
【００４８】
（実験６）
細胞を使用するインビトロ試験
（１）完全培地の調製
ＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地）１Ｌ×２、重炭酸ナトリウム７．４ｇ、およびＨＥＰＥＳ２．６ｇを、前もって滅菌し、冷却した蒸留水２Ｌに添加し、ついで、プレート撹拌機中で約１〜１．５時間撹拌した。
【００４９】
撹拌後、ｐＨメータを用いて、ｐＨレベルを１Ｎ塩酸で７．４に調節した。溶液は、フィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｆｉｌｔｅｒ ４３００１５）を通して濾過し、ついで５０ｍｌのピペットを用いて、５００ｍｌの瓶に、各瓶に４５０ｍｌずつ分配した。
【００５０】
その溶液４５０ｍｌの入った５００ｍｌの瓶に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）５０ｍｌ、ストレプトマイシン５ｍｌおよびｍｅｍ非必須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ）５ｍｌを添加した。調製した完全培地が汚染されているかどうかを確認するために、２５ｍｌのＴ−フラスコに完全培地約６ｍｌを入れ、顕微鏡による観察の後、汚染を確認するためにインキュベータ中で１日以上インキュベーションした。
【００５１】
（２）ＣａＣＯ２細胞の解凍
調製し、ついで冷蔵庫中に保存した完全培地を、３７℃の水浴で約２０分間暖め、ついで５ｍｌのピペットを使用して４、５回混合した。ついで、その培地５ｍｌを１５ｍｌの遠心管に入れた。ニトロタンクから細胞系（ＡＴＣＣ ＨＴＢ−３７、ロット９４４４９５）を取り出し、瓶のキャップを少し開いて３７℃の水浴中で解凍した。細胞系が完全に解凍されたことを確認した後に、細胞系を保存している瓶のキャップを開いて、５ｍｌのピペットで５、６回混合した。瓶の全含量は、上の１５ｍｌの遠心管に入れた。
【００５２】
１５ｍｌの遠心管を１０００ｒｐｍの遠心機を用いて７分間遠心して上清を分離し、それを取り出し除去した。そこへ培地１ｍｌを加えて、ついでピペットで４、５回混合し細胞を破壊した。１５ｍｌのコニカルチューブに入っている溶液の全量を２５ｍｌのＴ−フラスコに移し、ついでそれをインキュベータ中で保存した。
【００５３】
（３）養生している細胞培地の変化
インキュベータ中に保存された２５ｍｌのＴ−フラスコをインキュベータから取出し、フラスコの底にある培地を除去して、完全培地（前もって調整し、冷蔵庫に保存してあった）を３７℃の水浴で２０分間加温することによって置き換え、ついで、培地のアリコート５ｍｌを、ピペットをフラスコの底に接触させないように注意しながら２５ｍｌのＴ−フラスコに入れた。
【００５４】
（４）継代培養
トリプシンＥＤＴＡ容器およびフリーの培地、完全培地（冷蔵庫に保存されていた）を、３７℃の水浴で約２０分間加温し、ついで、インキュベータに保存されていた２５ｍｌのＴ−フラスコに入っていた培地を除去し、トリプシンＥＤＴＡ２ｍｌを２５ｍｌのＴ−フラスコに入れた。
【００５５】
トリプシンＥＤＴＡが均一に分散するようにし、ついでそのフラスコを３７℃の水浴中で４分間保った。完全培地１０ｍｌを２５ｍｌのＴ−フラスコに添加し、そのフラスコを振盪して、細胞を分離した。分離した溶液をピペットを用いて１５ｍｌのコニカルチューブに移し、１０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を除去した。完全培地２ｍｌをＴ−フラスコに加えて、細胞が十分ばらばらになるようにし、ついでインキュベータ中で再インキュベーションした。（この実験では、４０回の継代を越える細胞を使用した。）
【００５６】
（５）トランスウェル膜のコラーゲンによる被覆
滅菌した０．１％酢酸１０ｍｌをラット尾部コラーゲン２５ｍｇに添加し、マグネチックバーを入れて３〜５時間攪拌することによってそれを溶解した。得られた溶液を、１：１．５の割合の６０％エタノール溶液で希釈し、０．３ｍｇ／ｍｌの最終濃度にした。ついで、コラーゲン溶液５０μｌをトランスウェル（Ｃｏｓｔａｒ ３４０１）の上部の膜に均一に塗布し、キャップを開いたまま層流の中でＵＶ光のもとで４〜５時間放置することによって乾燥させた。
【００５７】
（６）トランスウェルプレートに細胞を播種すること
完全な培地の０．５ ｍｌと１．５ｍｌを、それぞれ、被覆したトランスウェルの上部コンパートメントと下部コンパートメントに導入し、インキュベータの中で１５分間インキュベーションした。ついで、培地を除去し、完全培地１．５ｍｌを、再被覆したトランスウェルの下部コンパートメントに再度入れた。継代培養の下で４０回の継代を越える細胞を、２．５〜３×１０５細胞／ｍｌの濃度に希釈し、ついで被覆したトランスウェルの上部コンパートメントに導入し、実験に使用するために２〜３週間インキュベーションした。
【００５８】
（７）ＣａＣＯ２細胞単一層の特性の確認
トランスウェル上への細胞の接種から２〜３週後に、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ　Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　Ｓｙｓｔｅｍ（ミリセル−ＥＲＳ抵抗システム）によって経上皮電気抵抗（ＴＥＥ）を測定して２５０Ωｃｍ２またはそれ以上の抵抗値を確認した。これは、細胞の単一層がよく確立していることを意味する。Ｃｌ４−マンニトールを使用して透過性実験を行ったとき、（＜レシーバー　ｄｐｍ／＜ドナー　ｄｐｍ＞）／ｈｒ／ｃｍ２は、０．４％を下回った。これは、細胞単一層がよく確立していたことを意味する。実験の特定の含量は、次の通りである。
使用した薬濃度：５０ｍＣｉ／ｍｍｏｌの比活性を持つＣｌ４−マンニトール２〜１０μＭ
Ｃ１４−マンニトールの定量：試料１００μｌを採取し、ＬＳＣバイアルに添加し、そこへＬＳＣ反応混液２ｍｌを添加し、１０秒間の攪拌後、液体シンチレーションカウンター（ＬＳＣ）によってｄｐｍ単位でＣ１４−マンニトールの含量を測定した。
【００５９】
（８）薬の透過試験（サルカトニンの場合）
トランスウェルの上部コンパートメントに存在する、調べた培地を、ピペットを使用して除去した。上の実施例１で調製したプロリポソームをトランスバッファーに溶解して薬の濃度（４．０μｇ／ｍｌ）にし、ついで、トランスウェルの上部コンパートメントに導入し、それを、３７℃の振盪水浴中８５ｒｐｍでゆっくり振盪しながら、薬の添加後１５分間隔で、フラッシュバッファーの入っている新しいウェルへ移した。
【００６０】
薬は、トランスウェルのドナー部分のウェルからサンプリングし、ついで、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡキット（Ｐｅｎ．Ｌａｂ．）によってサルカトニンに関する定量分析を行った。結果を図５に示す。
【００６１】
（実験７）
ラットを使用するインビボ試験
体重２５０ｇ〜３００ｇのＳＤ雄ラット（１群につきラット５匹）を、実験開始の１日前からは飲料水だけを与え、かつ実験環境に適応させた。カニューレを大腿静脈および動脈に挿入するために、麻酔薬としてのケタミンとｌｕｍｐｕｎとの１：４の比率の混合物４００μｌを筋内内に注射した、ついで、ラットを手術台に固定し、脚の大腿静脈および動脈を、鋏とピンセットを使用して見つけ、カニューレを挿入した。
【００６２】
カニューレ挿入後、血液採取を確認するために、シリンジを用いて静脈と動脈から血液を吸引した。ついで、処方１、２、３、４または５の試料を、経口用カプセルゾンデを使用してラットに経口的に投与し、一定時間の間隔で、血液５００μｌを大腿動脈から採集した。血液サンプルを採集し、その間、対応する量の食塩水を大腿静脈に注入した。
【００６３】
採集した血液は、１０，０００ｒｐｍの遠心機で１０分間遠心し、上清を分離し、そこから薬の含量を、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡキット（Ｐｅｎ． Ｌａｂ．）を使用して定量した。
【００６４】
別個に、お互いの生体有用性の増加を比較するために、経口投与した薬の同量を大腿静脈に注入し、その血液を、各処方の場合の血液採集の方法と類似した手法にしたがって前処理した。ついで、薬を定量して、生体有用性を計算した。それを次の表３に記す。
【００６５】
【表３】
2004506003.tif 000005
【００６６】
（産業上の適用性）
こうして、本発明は、１）水溶性のキトサンを使用して、リポソームの先駆物質としてのプロリポソームを調製し、それによって腸管粘膜への吸収を増加させる、２）ｐＨ調整試剤を使用して水性の腸液中のペプチド薬の安定性を上げる、３）ペプチド薬がスムーズに腸管粘膜に吸収されるために、吸収促進剤などのような添加剤を添加する、ついで４）経口投与に適した製剤に製品を処方する、そして、同時に５）薬が分解しないで腸に移行し、吸収されるように、製剤を腸溶性被膜で被覆する、方法を提供する。
【００６７】
すなわち、本発明は、欧州特許第０８５５１７９号に開示されているようなリポソームを用いる経口用製剤を調製する以前の方法において起こる問題を引き起こす可能性がある、粉末の形のリポソームを調製するために凍結乾燥または蒸発の工程を行わないで、短時間に高收率のプロリポソーム（リポソームの前駆体として）を調製することができ、したがって、該プロセスの工程は簡単であり、ペプチド薬の湿気と温度（これがペプチド薬の欠点を構成する）に対する安定性が増し、そして、キトサンが生体有用性を増すためにプロリポソームを調製する担体として使用される、といういくつかの利点を持っている。
【図面の簡単な説明】
【図１】サケカルシトニンと水溶性キトサンから作られたプロリポソームおよび薬剤の含有物の形を示す写真である。
【図２】水溶性のキトサンを使用してプロリポソームの水和過程の観察から得られた、水への溶解のプロセスを示す顕微鏡による写真である。ここで、図２ａは、プロリポソーム粉末を示す写真であり、図２ｂは、プロリポソームからリポソームの生成を示す写真である。
【図３】プロリポソームの水和から生成したリポソームの粒度および分散を示すグラフである。
【図４】時間経過における、本発明による一態様としてのサケカルシトニンのプロリポソーム中のサケカルシトニン含量の変化を示すグラフである。
【図５】本発明による一態様としての、サケカルシトニンのプロリポソームを含む種々の処方の薬物透過性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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