(57)【要約】本発明は、効力単独に基づいて化合物を評価するのではなく、治療効力とよりよく相関する化合物を評価するためのインビトロ方法に関する。一般に、本発明の方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）化合物の標的レセプターに対する化合物についての効力値を決定する工程；（ｉｉ）この標的レセプターに対するこの化合物についての脱感作値を決定する工程；および（ｉｉｉ）この効力値と、この脱感作値とを比較する工程。化合物の所望される作用が、レセプターアゴニストである場合、この化合物の脱感作値は、この化合物の効力値を超えるべきである。これにより、効力に必要とされる化合物の濃度もまた、そのレセプターを同時に脱感作しないようにし、本質的に所望の効果を無効にしないことが確認される。本発明の方法は、新規化合物、ならびにＡＢＴ−２２９およびＥＭ−５７４（臨床試験が既に開始されている２つのモチリド化合物）を評価するために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＣＲレセプターに対するアゴニスト活性を有する化合物の治療効力を評価するための方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該ＧＰＣＲレセプターに対する試験化合物についての効力値を決定する工程；
（ｉｉ）該ＧＰＣＲレセプターに対する該試験化合物についての脱感作値を決定する工程；および
（ｉｉｉ）該効力値と該脱感作値とを比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記比較する工程が、前記効力値に対する前記脱感作値の比を算出することにより達成される、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記脱感作値が前記効力値の１０倍未満である場合に、前記試験化合物を拒否する工程をさらに包含する、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記脱感作値が前記効力値の１０倍を超える場合に、さらなる評価のために前記試験化合物を受け入れる工程をさらに包含する、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記脱感作値が前記効力値の１００倍未満である場合に前記試験化合物を拒否する工程をさらに包含する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記脱感作値が前記効力値の１００倍を超える場合に、さらなる評価のために前記試験化合物を受け入れる工程をさらに包含する、方法。
【請求項７】
合成モチリンレセプターの遺伝子およびエクオリンの遺伝子を発現する、細胞株。
【請求項８】
請求項７に記載の細胞株であって、前記細胞株がＨＥＫ２９３細胞であり、前記モチリンレセプターが、合成ヒトモチリンレセプター遺伝子である、細胞株。
【請求項９】
モチリンレセプターのアゴニストをスクリーニングするための方法であって、該方法は、試験化合物と、モチリンレセプターの遺伝子およびエクオリンの遺伝子を発現する細胞とを接触させる工程、を包含する、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、効力値および脱感作値を決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記脱感作値が前記効力値の１０倍未満である場合に、前記試験化合物を拒否する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、前記脱感作値が前記効力値の１０倍を超える場合に、さらなる評価のために前記試験化合物を受け入れる工程をさらに包含する、方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の方法であって、前記感作値が前記効力値の１００倍未満である場合に前記試験化合物を拒否する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の方法であって、前記脱感作値が前記効力値の１００倍を超える場合に、さらなる評価のために前記試験化合物を受け入れる工程をさらに包含する、方法。
【請求項１５】
モチリンレセプターに対する効力値を超える該モチリンレセプターに対する脱感作値を有する以下の式の化合物であって：
【化１】
2004530108.tif 000011
ここで、Ｗは、ＯまたはＮＲであり；
Ｒは、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルケニルアリール、またはアルキニルアリールであり；
Ｒ０は、ヒドロキシルまたはメトキシであり；
Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、ハライド、ＮＨ２、ＯＲ９、
【化２】
2004530108.tif 000012
であり（ここで、Ｒ９は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、アリール、またはヘテロアリールであり、そしてＲ１０およびＲ１１は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、またはアリールである）；
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリールからなる群より選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、一緒になって、シクロアルキルまたはシクロアリール部分を形成し；
Ｒ４は、水素またはメチルであり；
Ｒ５は、水素、ヒドロキシルまたはオキソであり；
Ｒ６は、ヒドロキシル、ＯＲ１２（ここで、Ｒｌ２は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、またはＣ２〜Ｃ１０アルキニルである）であり；
Ｒ７は、メチル、Ｃ３〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アミドアルキルアリール、アミドアルケニルアリール、またはアミドアルキニルアリールであり；そして
ｘは、単結合または二重結合である、
化合物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の化合物であって、前記脱感作値が、前記効力値の少なくとも１０倍である、化合物。
【請求項１７】
請求項１５に記載の化合物であって、前記脱感作値が、前記効力値の少なくとも１００倍である、化合物。
【請求項１８】
請求項１５に記載の化合物であって、Ｗは、ＯまたはＮＲであり；Ｒは、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、アリール、またはアルキルアリールであり；Ｒ０は、ヒドロキシルまたはメトキシであり；Ｒ１は、水素またはヒドロキシルであり；Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、フェニル、またはベンジルであり；Ｒ４は、メチルであり；Ｒ５は、ヒドロキシルまたはオキソであり；Ｒ６は、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ５アルコキシであり；Ｒ７は、メチル、Ｃ３〜Ｃ５アルキル、Ｃ２〜Ｃ５アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５アルキニル、アリール、アルキルアリールまたはアルケニルアリールであり；そしてｘは、単結合または二重結合である、化合物。
【請求項１９】
請求項１５に記載の化合物であって、Ｗは、ＯまたはＮＲであり；Ｒは、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、フェニル、またはベンジルであり；Ｒ０は、ヒドロキシルまたはメトキシであり；Ｒ１は、水素またはヒドロキシルであり；Ｒ２は、メチルであり；Ｒ３は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、、ブチル、イソブチル、ｓｅｃブチルまたはｔｅｒｔブチルであり；Ｒ４は、メチルであり；Ｒ５は、ヒドロキシルであり；Ｒ６は、ヒドロキシルまたはメトキシであり；Ｒ７は、メチル、ビニル、プロピル、イソブチル、ペンチル、プロプ−２−エニル、プロパルギル、ブト−３−エニル、２−アジドエチル、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、シクロヘキシル、フェニル、またはベンジルであり；そしてｘは、単結合または二重結合である、化合物。
【請求項２０】
請求項１５に記載の化合物であって、Ｗは、ＯまたはＮＨであり；Ｒ０は、メトキシであり；Ｒ１は、水素またはヒドロキシルであり；Ｒ２は、メチルであり；Ｒ３は、メチル、エチル、またはイソプロピルであり；Ｒ４は、メチルであり；Ｒ５は、ヒドロキシルであり；Ｒ６は、ヒドロキシルまたはメトキシであり；Ｒ７は、プロピル、ブト−３−エニル、２−アジドエチル、フェニル、またはベンジルであり；そしてｘは、単結合または二重結合である、化合物。
【請求項２１】
約１０を超える効力比を有する、以下の式の化合物であって：
【化３】
2004530108.tif 000013
Ｗは、ＯまたはＮＨであり；Ｒ１は、水素またはヒドロキシルであり；Ｒ３は、メチル、エチル、またはイソプロピルであり；そしてＲ７は、プロピルである、化合物。
【請求項２２】
ＧＰＣＲレセプターに対するアゴニスト活性を有するモチリドの治療効力を評価する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該ＧＰＣＲレセプターに対する該モチリドについての効力値を決定する工程；
（ｉｉ）該ＧＰＣＲレセプターに対する該モチリドについての脱感作値を決定する工程；および
（ｉｉｉ）該効力値と、該脱感作値とを比較する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
モチリンレセプターに対するアゴニスト活性を有するモチリドの治療効力を評価する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該モチリンレセプターに対する該モチリドについての脱感作値を決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
モチリンレセプターに対するアゴニスト活性を有するモチリドの治療有用性を評価する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ｉ）該モチリンレセプターに対する該モチリドについての脱感作値を決定する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
多くの潜在的薬物候補は、それらのインビトロでの有望な結果が、臨床試験の間に治療的効力に変換されないので、さらなる開発からは手を引かれている。化合物を臨床試験に送るためにかかる時間および費用は、１０年もの歳月および２００万ドル程度であり得るので、臨床フェーズで潜在的薬物が失敗することも非常に多い。
【０００２】
レセプターアゴニストとして作用する潜在的薬物候補について、レセプター脱感作は、インビトロ効力と臨床効力の欠如との間の分離に寄与し得る。レセプター脱感作は、代表的には、アゴニストを使用したレセプターの連続刺激の際に生じる。レセプターが、最初にアゴニストに曝されると、最初の応答は、通常ピークに達し、ある持続性レベル（ｔｏｎｉｃ  ｌｅｖｅｌ）まで減少する。このアゴニストが、短期間の間除去されると、レセプターこの脱感作状態は、アゴニストの第２の添加が減少した応答を引き起こすように維持される。より長期間のアゴニストの除去は、概して、レセプターの最大応答の能力をリセットさせる。
【０００３】
脱感作には、２つの型が存在する：同種脱感作および異種脱感作。同種脱感作は、レセプターを刺激しているアゴニストによってのみ誘導されるレセプターの応答の減少として規定される。異種脱感作は、レセプターについてのアゴニスト以外の何かにより誘導されるレセプターの応答の減少として規定される。例えば、１つのシグナル伝達経路に対して作用する異なるホルモンについてのレセプターは、そのレセプターの１つのみが連続して刺激されると、あまり有効でなくなる可能性がある。このような異種脱感作は、一般的なフィードバック機構による各レセプターの改変、またはそのレセプター自体に対して遠位のエフェクター経路においてある共通する点で発揮される効果のいずれかから生じ得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
レセプター脱感作が重要であるにもかかわらず、薬物送達は、概して、アゴニスト効力について焦点を当てている。しかし、レセプター脱感作は、臨床効力に対して顕著に影響を及ぼすので、治療用途についてレセプター脱感作を評価し、これを組み込むための方法が必要であり、望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
本発明は、効力単独に基づいて化合物を評価するのではなく、治療効力とよりよく相関する化合物を評価するためのインビトロ方法に関する。一般に、本発明の方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）化合物の標的レセプターに対する化合物についての効力値を決定する工程；（ｉｉ）この標的レセプターに対するこの化合物についての脱感作値を決定する工程；および（ｉｉｉ）この効力値と、この脱感作値とを比較する工程。化合物の所望される作用が、レセプターアゴニストである場合、この化合物の脱感作値は、この化合物の効力値を超えるべきである。このことにより、効力について必要とされる化合物の濃度もまた、そのレセプターを同時に脱感作しないようにし、従って、本質的に所望の効果を無効にしないことが確認される。
【０００６】
（図面の詳細な説明）
図１は、エクオリンを介したＧＰＣＲ作動を測定する原理を例示する模式図である。簡潔には、ＧＰＣＲに結合するアゴニストは、ＧαサブユニットのＧβγサブユニットからの解離、およびＧＴＰのＧＤＰ＋Ｐｉへの加水分解を生じる。次いで、Ｇαは、ＩＰ３を生成するＰＬＣβを活性化する。このＩＰ３は、細胞内貯蔵庫からのＣａ＋＋放出を引き起こすレセプターを標的とする。エクオリンによるＣａ＋＋結合は、光子放出を伴うセレンテラジン補因子の酸化を引き起こす。アゴニスト刺激の後に、細胞のトリトンＸ−１００溶解物は、残りのエクオリンをＣａ＋＋に曝す。Ｆ値は、アゴニスト応答を、アゴニスト応答およびトリトンＸ−１００応答の合計で除算することにより算出される。
【０００７】
図２は、示された濃度のモチリンに曝された際の、エクオリンおよびモチリンレセプターを安定に発現する５０，０００個のＨＥＫ２９３細胞のルミネセンス応答を示すグラフである。ｙ軸は、ルミネセンス応答（ｃｐｓ）を表し、ｘ軸は、時間（秒）を表す。モチリンの濃度は、提供される。
【０００８】
図３は、ＨＥＫ２９３細胞において一過性発現されるオーファンレセプターＣＲＬＲ（カルシトニンレセプター様レセプター）を示すグラフである。この発現は、１０ｎＭのヒトＣＧＲＰでチャレンジした場合に特定の細胞外酸性化応答を媒介する。各点は、細胞の個々のチャンバからの酸性化応答を示す。
【０００９】
図４は、入り混じったＧプロテインＧα１６ありまたはなしで発現されたＣ３ａレセプターのＣａ２＋動員応答を示す。各四角は、細胞の個々のマイクロタイタープレートウェルからのＦＬＩＰＲを介して同時に決定された応答を示す。ｙ軸は、各区画において、細胞内カルシウムレベルに対応し、ｘ軸は、時間に対応する。各掃引線（ｔｒａｃｅ）の左側の応答は、示されるようにＣ３ａ（または緩衝液）でのチャレンジに対応し；各掃引線の右側の応答は、各ウェルについての内部コントロールとしての２００μＭのムスカリンでのチャレンジに対応する。列Ａ〜Ｄを、Ｃ３ａレセプターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を使用して生成し、列Ｅ〜Ｈを、Ｃ３ａレセプターおよびＧα１６の両方でトランスフェクトした細胞を使用して生成した。これらのデータの定量を、図５に示す。
【００１０】
図５は、Ｃ３ａレセプター単独（黒四角）またはＣ３ａレセプターとＧα１６（黒丸）で一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞における、Ｃ３ａにより誘導されたカルシウム動員を示す。図４に例示される、各ウェルにＣ３ａを添加した後の最大Ｃａ２＋応答（ピーク高）を使用して、用量応答曲線を構築した。図５における各点は、８回の測定の平均±ＳＥＭを示す。
【００１１】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、レセプターアゴニストとして作用する潜在的薬物の治療効力を評価するための方法に関する。代表的な薬物発見試行において、これらの化合物は、主に、それらの標的レセプターに結合する際のそれらの応答を誘発する能力に対して評価される。応答を誘発する能力はまた、化合物の効力といわれ、ほとんどの場合、ＥＣ５０値（すなわち、最大応答の５０％を誘発する化合物の濃度）の観点から表される。効力は、概して、初期のインビトロスクリーニングアッセイ、ときには、前臨床評価アッセイの間中ずっと、主な考慮事項である。
【００１２】
しかし、効力への集中は、治療効力を欠くので、臨床試験の間に失敗する潜在的薬物候補を生じ得る。アゴニストのそれらのそれぞれのレセプターに対する時間を経るにつれた結合が、徐々に減少した応答を引き起こし得るので、効力に加えて、脱感作はまた、考慮されるべきである。この現象は、レセプターの作用機構の固有の部分である。脱感作は、本来のレセプター応答を阻害する濃度の観点で表され、ほとんどの場合、ＩＣ５０値（すなわち、最大応答の５０％を阻害する化合物の濃度）の観点で表される。
【００１３】
効力および脱感作がレセプターの作用機構の一部であるという認識にもかかわらず、潜在的薬物候補を評価する際に、効力および脱感作の両方を考慮する方法は、先行技術で存在していない。本発明は、このような方法を提供する。
【００１４】
概して、本発明の方法は、以下の工程を包含する：（ｉ）化合物の標的レセプターに対する化合物についての効力値を決定する工程；（ｉｉ）この標的レセプターに対するこの化合物についての脱感作値を決定する工程；および（ｉｉｉ）この効力値と、この脱感作値とを比較する工程。化合物の所望される作用が、レセプターアゴニストである場合、化合物の脱感作値は、化合物の効力値を超えるべきである。このことにより、効力について必要とされる化合物の濃度もまた、そのレセプターを同時に脱感作しないようにし、従って、本質的に所望の効果を無効にしないことが確認される。好ましい実施形態において、効力値および脱感作値は、類似の反応条件を使用して算出される。例えば、無細胞レセプターアッセイを使用して、効力値を算出し、次いで、同じシステムを使用して、脱感作値を算出すべきである。同様に、効力値および脱感作値が、類似の様式にて表されるべきである。例えば、効力値は、ＥＣ５０の観点で表されるのであれば、脱感作値は、ＩＣ５０の観点で表されるべきである；効力値が、ＥＣ９０の観点で表されるのであれば、脱感作値は、ＩＣ９０の観点で表されるべきである。
【００１５】
本発明の１つの局面において、効力値と脱感作値の比較は、脱感作値  対  効力値の比を算出することにより達成される。この比は、「効力指数」といわれる。１にほぼ等しい比は、効力に必要な濃度が脱感作値に必要な濃度と類似であることを示す。換言すると、所望の生物学的応答に要する濃度はまた、脱感作を誘導する濃度であるので、この化合物は、所望の応答がレセプター活性化である場合は治療的に有効でない可能性が高い。これらの環境下で、所望の生物学的応答に要する濃度は、脱感作を誘導する濃度未満であるべきである。好ましい実施形態において、この効力指数は、少なくとも１０であり、より好ましくは、少なくとも２５である。なおより好ましい実施形態において、効力指数は、少なくとも５０である。約１００を超える効力指数が、最も好ましい。しかし、所望の応答が脱感作である場合、脱感作値が効力値にほぼ等しいか、またはこの効力値未満の化合物が好ましい。
【００１６】
本発明の別の局面において、ＧＰＣＲのスクリーニング方法が提供される。活性化の際にカルシウムイオンイン（「Ｃａ＋＋」）フラックスを引き起こすＧＰＣＲ（モチリンレセプターおよびセロトニンレセプターのようなホスファチジルイノシトール経路およびカルシウム経路を介してシグナル伝達するＧＰＣＲ（例えば、５ＨＴ２ａおよび５ＨＴ２ｃ））については、この方法は、細胞株において、ＧＰＣＲをコードする遺伝子を発現する工程、およびエクオリンの遺伝子を発現する工程を包含する。ネイティブ状態での活性化の際にカルシウムイオン流入を引き起こさないＧＰＣＲについては、この方法は、細胞株において、有望なＧα（例えば、Ｇα１６）とともにＧＰＣＲをコードする遺伝子およびエクオリンの遺伝子を発現する工程を包含する。例えば、有望なＧαとＧＰＣＲとの同時発現は、Ｓｔａｂｌｅｓら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５２：１１５−１２６（１９９７）（本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【００１７】
効力値を測定するための方法は、（ＧＰＣＲおよびエクオリンを発現する）細胞株を試験化合物に曝露する工程および得られたルミネセンスを測定する工程を包含する。脱感作値を測定するための方法は、細胞株を試験化合物に対して予め処理する工程、この細胞株を既知のアゴニストに曝露する工程、および得られたルミネセンスを測定する工程を包含する。得られた細胞が、クローニングされたレセプターのアゴニストに曝露される場合、活性化されたレセプターは、カルシウムイオン流動（これは、次いで、エクオリンの一瞬の光の放射を引き起こす）を引き起こす。放射された光の量は、使用される細胞の数およびレセプター応答の程度の両方に比例する。効力値および脱感作値を測定するための方法は、ＧＰＣＲおよびエクオリンを発現する細胞を試験化合物に曝露する工程、ならびに得られたルミネセンスを測定する工程を包含する。脱感作値を測定するための方法は、ＧＰＣＲおよびエクオリンを発現する細胞を試験化合物に曝露する工程；混合物細胞から試験化合物を除去する工程；この細胞をＧＰＣＲアゴニストに曝露する工程；および得られたルミネセンスを測定する工程を包含する。発現アッセイおよびレセプターアッセイのためのプロトコルは、実施例１および２にさらに記載される。次いで、効力値および脱感作値は、比較され、そして上記のように各試験化合物について評価される。
【００１８】
（本発明の方法の例示的適用）
本発明の方法は、モチリンレセプターを特に参照して、さらに例示される。モチリンは、２２アミノ酸のペプチドであり、モチリンレセプターとの結合に際して、胃の運動性を刺激する。モチリンレセプターの非ペプチドアゴニストは、増強された胃腸の運動性が示されるかまたは所望される障害の処置のための運動促進（ｐｒｏｋｉｎｅｔｉｃ）剤として評価されている。このような障害の例示的な例としては、胃不全麻痺、胃食道逆流疾患、拒食症、胆嚢うっ血、手術後の麻痺性イレウス、強皮症、腸の偽閉塞、胃炎、嘔吐および慢性便秘症（結腸の活動力欠如）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
見込みのある新規のクラスの運動促進剤であるモチライド（ｍｏｔｉｌｉｄｅ）は、モチリンレセプターのアゴニストであるマクロライド化合物（例えば、エリスロマイシンおよびその誘導体）である。特定のモチライドは、胃不全麻痺を有する患者において、胃および小腸における筋肉収縮を誘導し、食道の蠕動を増大させ、そして胃が空になるのを加速することが示されている。実際、臨床試験が、ＡＢＴ−２２９（１）およびＥＭ−５２７（２）を含むいくつかのモチライドについて開始されている。これらの構造を以下に示す：
【００２０】
【化４】
2004530108.tif 000002
しかし、本発明の方法に基づいて、ＡＢＴ−２２９もＥＭ−５７４も、良好な薬物候補として予測されていない。
【００２１】
モチリンレセプターおよびエクオリンを同時発現させ、そして効力指数を、エリスロマイシン６，９−エノールエーテル（３）、ＡＢＴ−２２９およびＥＭ−５７４について計算した。
【００２２】
【化５】
2004530108.tif 000003
エリスロマイシン６，９−エノールエーテルについての効力指数は、２，００００より大きく、そしてＡＢＴ−２２９およびＥＭ−５７４の両方についての効力指数は、それぞれ、１０未満である。エリスロマイシン６，９−エノールエーテルは、良好な薬物候補となるべき効力（ナノモル濃度範囲のＥＣ５０）および効力指数を有するが、この化合物は、酸中で不安定であり、胃の環境において非機能性の分解産物へと分解する。ＡＢＴ−２２９は、最近、胃食道逆流疾患の処置における効力の欠如のために、臨床試験から撤退された。Ｖａｎ  Ｈｅｒ  Ｗａａｒｄｅら、Ａｌｉｍｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  １４：４５３−４６２（２０００）を参照のこと。効力指数に基づいて、ＥＭ−５７４は、同じ運命をたどると予測される。ＡＢＴ−２２９およびＥＭ−５７４のような化合物の教訓は、脱感作が、治療的効力を決定する際に役割を果たし、そして評価プロセスにおいて、早くからこれに関して考慮するべきである、ということである。
【００２３】
ＡＢＴ−２２９およびＥＭ−５７４の教訓を適用して、新規の化合物を、本発明の方法に従って評価する。これらの化合物は、以下の式：
【００２４】
【化６】
2004530108.tif 000004
の化合物であり、ここで、
Ｗは、ＯまたはＮＲであり；
Ｒは、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルケニルアリールまたはアルキニルアリールであり；
Ｒ０は、ヒドロキシルまたはメトキシであり；
Ｒ１は、水素、ヒドロキシル、ハライド、ＮＨ２、ＯＲ９、
【００２５】
【化７】
2004530108.tif 000005
からなる群より選択され、ここで、Ｒ９は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、アリールまたはヘテロアリールであり、そしてＲ１０およびＲ１１は、各々独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルまたはアリールであり；
Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、アリール、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリールからなる群より選択されるか、あるいはＲ２およびＲ３は、一緒になってシクロアルキル部分またはシクロアリール部分を形成し；
Ｒ４は、水素またはメチルであり；
Ｒ５は、水素、ヒドロキシルまたはオキソであり；
Ｒ６は、ヒドロキシル、ＯＲ１２であり、ここで、Ｒ１２は、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニルまたはＣ２〜Ｃ１０アルキニルであり；
Ｒ７は、メチル、Ｃ３〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アミドアルキルアリール、アミドアルケニルアリールまたはアミドアルキニルアリールであり；そしてｘは、単結合または二重結合である。その脱感作値が効力値よりも高い式Ｉの化合物が、良好な薬物候補である。好ましい実施形態において、脱感作値は、効力値の少なくとも１０倍である。より好ましい実施形態において、脱感作値は、効力値の少なくとも２５倍である。さらにより好ましい実施形態において、脱感作値は、効力値の少なくとも５０倍である。脱感作値が効力値の少なくとも１００倍である式Ｉの化合物が最も好ましい。
【００２６】
多数の化合物は、１以上の不斉中心を含む。全ての立体異性体は、純粋な化合物および立体異性体の混合物同様、本発明の範囲内に含まれる。同様に、全ての幾何異性体もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００２７】
本明細書中で使用する場合、用語「アルキル」は、必要に応じて置換された直鎖、分枝または環状の炭化水素をいう。「アルケニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する、必要に応じて置換された直鎖、分枝または環状の炭化水素をいう。「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する、必要に応じて置換された直鎖、分枝または環状の炭化水素をいう。置換アルキル、置換アルケニルまたは置換アルキニルは、１以上の置換基によって置換されたアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基をそれぞれいう。置換基の例示的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ハロ；トリフルオロメチル；トリフルオロメトキシ；ヒドロキシ；アルコキシ；シクロアルコキシ；ヘテロシクロオキシ；オキソ（＝Ｏ）；アルカノイル（−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル）；アリールオキシ；アルカノイルオキシ；アミノ；アルキルアミノ；アリールアミノ；アラルキルアミノ；シクロアルキルアミノ；ヘテロシクロアミノ；二置換アミン（ここで、２つのアミノ置換基は、アルキル、アリールまたはアラルキルから選択される）；アルカノイルアミノ；アロイルアミノ；アラルカノイルアミノ；置換アルカノイルアミノ；置換アリールアミノ；置換アラルカノイルアミノ；チオール；アルキルチオ；アリールチオ；アラルキルチオ；シクロアルキルチオ；ヘテロシクロチオ；アルキルチオノ；アリールチオノ；アラルキルチオノ；アルキルスルホニル；アリールスルホニル；アラルキルスルホニル；スルホンアミド（例えば、ＳＯ２ＮＨ２）；置換スルホンアミド；ニトロ；シアノ；カルボキシ；カルバミル（例えば、ＣＯＮＨ２）；置換カルバミル（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、ここで、Ｒ’およびＲ”は、各々独立して、水素、アルキル、アリール、アラルキルなどである）；アルコキシカルボニル、アリール、グアニジノおよびヘテロシクロ（例えば、インドリル（ｉｎｄｏｙｌ）、イミダゾリル、フリル、チエニル、チアゾリル、ピロリジル、ピリジル、ピリミジルなど。適用可能な場合、この置換基は、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、アリールまたはアラルキルなどによってさらに置換され得る。
【００２８】
用語「アリール」は、６〜１２個の炭素原子を有する、必要に応じて置換された芳香族環をいい、Ｎ、ＳおよびＯのような１以上のヘテロ原子を含み得る。アリールの例示的な例としては、以下がが挙げられるが、これらに限定されない：ビフェニル、フリル、イミダゾリル、インドリル、イソキノリル、ナフチル、オキサゾリル、フェニル、ピリジル、ピロリル（ｐｙｒｒｙｌ）、キノリル、キノキサリル、テトラゾリル、チアゾリル、チエニルなど。置換アリールは、例えば、１〜４個の置換基（例えば、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニルおよびアリール；ハロ；トリフルオロメトキシ；トリフルオロメチル；ヒドロキシ；アルコキシ；シクロアルキルアルコキシ；ヘテロシクロオキシ；アルカノイル；アルカノイルオキシ；アミノ；アルキルアミノ；アラルキルアミノ；シクロアルキルアミノ；ヘテロシクロアミノ；ジアルキルアミノ；アルカノイルアミノ；チオ；アルキルチオ；シクロアルキルチオ；ヘテロシクロチオ；ウレイド；ニトロ；シアノ；カルボキシ；カルボキシアルキル；カルバミル；アルコキシカルボニル；アルキルチオノ；アリールチオノ；アルキルスルホニル；スルホンアミド；アリールオキシなど）によって置換されたアリール基をいう。置換基は、例えば、ハロ、ヒドロキシ；アルキル、アルコキシ；アリール、置換アリール、置換アルキル、置換アラルキルなどによってさらに置換され得る。
【００２９】
用語「アルキルアリール」または「アリールアルキル」は、アルキル基を介して直接結合したアリール基（例えば、ベンジル）をいう。同様に、「アルケニルアリール」および「アリールアルケニル」は、アルケニル基を介して直接結合したアリール基をいい、そして「アルキニルアリール」および「アリールアルキニル」は、アルケニル基を介して直接結合したアリール基をいう。
【００３０】
用語、アミドアルキルアリールは、式−ＺＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｒ’Ｒ”の基をいい、ここで、Ｚは、存在してもしなくてもよく、そしてＺおよびＲ’は、各々独立して、必要に応じて置換されたＣ１〜Ｃ１０アルキル、アルケニルまたはアルキニルであり、そしてＲ”は、必要に応じて置換されたアリールである。
【００３１】
用語「ハロゲン」、「ハロ」または「ハライド」は、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素をいう。
【００３２】
用語「エリスロマイシン」は、以下の式：
【００３３】
【化８】
2004530108.tif 000006
の化合物ならびにその誘導体およびアナログをいい、ここでＲ８はエチルまたはＲ７であり、そしてＲ０、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、本明細書に記載される通りである。
【００３４】
本発明の化合物中の遊離ヒドロキシル基は、ヒドロキシル保護基で必要に応じて保護され得る。用語「ヒドロキシル保護基」は、このような目的のために当該分野で公知の基をいう。一般に使用されるヒドロキシル保護基は、例えば、Ｔ．Ｈ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｅｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｙｅ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）（これは、本明細書中で参考として援用される）に開示される。例示的なヒドロキシル保護基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：テトラヒドロピラニル；ベンジル；メチルチオメチル；エチルチオメチル；ピバロイル；フェニルスルホニル；トリフェニルメチル；三置換シリル（例えば、トリメチルシリル；トリエチルシリル；トリブチルシリル；トリイソプロピルシリル；ｔ−ブチルジメチルシリル；トリ−ｔ−ブチルシリル；メチルジフェニルシリル；エチルジフェニルシリル；ｔ−ブチルジフェニルシリルなど）；アシルおよびアロイル（例えば、アセチル、ピバロイルベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、４−ニトロベンゾイルおよび脂肪族アシルアリールなど）。本発明の化合物のヒドロキシル保護バージョンもまた、本発明の範囲内に包含される。
【００３５】
上記の基における明示した置換に加えて、本発明の化合物は、適用可能な他の置換を含み得る。例えば、エリスロマイシン骨格または骨格置換基は、（例えば、水素の１つを置換することによってか、または非水素基を誘導体化することによって）、１以上の置換基（例えば、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、フェニルまたは官能基）でさらに置換され得る。適切な官能基の例示的な例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルコール、スルホン酸、ホスフィン、ホスホネート、ホスホン酸、チオール、ケトン、アルデヒド、エステル、エーテル、アミン、第四級アンモニウム、イミン、アミド、イミド（ｉｍｉｄｅ）、イミド（ｉｍｉｄｏ）、ニトロ、カルボン酸、ジスルフィド、カーボネート、イソシアネート、カルボジイミド、カルボアルコキシ、カルバメート、アセタール、ケタール、ボロネート、シアノヒドリン、ヒドラゾン、オキシム、ヒドラジド、エナミン、スルホン、スルフィド、スルフェニルおよびハロゲン。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、この化合物は式Ｉの化合物であり、ここで、Ｗは、ＯまたはＮＲであり；Ｒは、水素、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、アリールまたはアルキルアリールであり；Ｒ０は、ヒドロキシルまたはメトキシであり；Ｒ１は、水素またはヒドロキシルであり；Ｒ２およびＲ３は、各々独立して、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、フェニルまたはベンジルであり；Ｒ４はメチルであり；Ｒ５は、ヒドロキシルまたはオキソであり；Ｒ６は、ヒドロキシルまたはＣ１〜Ｃ５アルコキシであり；Ｒ７は、メチル、Ｃ３〜Ｃ５アルキル、Ｃ２〜Ｃ５アルケニル、Ｃ２〜Ｃ５アルキニル、アリール、アルキルアリールまたはアルケニルアリールであり；そしてｘは、単結合または二重結合である。
【００３７】
別の実施形態において、この化合物は式Ｉの化合物であり、ここで、Ｗは、ＯまたはＮＲであり；Ｒは、水素、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、フェニルまたはベンジルであり；Ｒ０は、ヒドロキシルまたはメトキシであり；Ｒ１は、水素またはヒドロキシルであり；Ｒ２はメチルであり；Ｒ３は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃブチルまたはｔｅｒｔブチルであり；Ｒ４はメチルであり；Ｒ５はヒドロキシルであり；Ｒ６は、ヒドロキシルまたはメトキシであり；Ｒ７は、メチル、ビニル、プロピル、イソブチル、ペンチル、プロプ−２−エニル、プロパギル、ブト−３−エニル、２−アジドエチル、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、クロロヘキシル、フェニルまたはベンジルであり；そしてｘは、単結合または二重結合である。
【００３８】
別の実施形態において、この化合物は式Ｉの化合物であり、ここで、Ｗは、ＯまたはＮＨであり；Ｒ０はメトキシであり；Ｒ１は、水素またはヒドロキシルであり；Ｒ２はメチルであり；Ｒ３はメチル、エチルまたはイソプロピルであり；Ｒ４はメチルであり；Ｒ５はヒドロキシルであり；Ｒ６は、ヒドロキシルまたはメトキシであり；Ｒ７は、プロピル、ブト−３−エニル、２−アジドエチル、フェニルまたはベンジルであり；そしてｘは、単結合または二重結合である。
【００３９】
別の実施形態において、本発明は、以下の式：
【００４０】
【化９】
2004530108.tif 000007
の化合物を提供し、ここで、ＷはＯまたはＮＨであり；Ｒ１は、水素またはヒドロキシルであり；Ｒ３は、メチル、エチルまたはイソプロピルであり；そしてＲ７はプロピルである。
【００４１】
本発明の１つの局面において、約１０より多い効力指数を有する、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物が提供される。本発明の別の局面において、約１００より多い効力指数を有する、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物が提供される。本発明のなお別の局面において、約１０００より多い効力指数を有する、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの化合物が提供される。効力および脱感作の両方が考慮されるので、これらの化合物は、その意図された目的についての治療効力を有すると考えられる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合、用語「アゴニスト」は、天然に存在する物質によって通常刺激されるレセプターにて活性を刺激し、従って応答を誘発する任意の化合物をいい得る。
【００４３】
本明細書中で使用される場合、用語「ＧＰＣＲ」は、Ｇタンパク質共役レセプターをいう。
【００４４】
試験化合物は、例えば、低分子、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、またはこれらの任意の組み合わせもしくは一部であり得る。さらに、試験化合物は、特異形態でかまたはライブラリー中に存在し得る。
【００４５】
ＧＰＣＲ発現細胞における指示剤としてのエクオリンの使用は、単に例示に過ぎない。例えば、当業者に公知の任意の指示剤（例えば、蛍光タンパク質、放射性標識または抗体）が、本発明の方法において使用され得る。例えば、蛍光カルシウム指示色素（例えば、Ｆｌｕｏ−３およびＦｌｕｏ−４）が使用されて、細胞内カルシウムレベルの変化を反映し得る。さらに、ｐＨの変化は、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒによって以下のように測定され得、細胞外酸性化速度の変化を示す。本発明が、エクオリンを指示剤として使用するモチリンレセプターに基づくアッセイに限定されないことが、提供される開示に基づいて理解されるべきである。
【００４６】
（出発物質）
本発明の化合物は、組換えＤＮＡ技術および有機化学の組み合わせによって、本発明の方法に従って調製され得る。
【００４７】
組換えＤＮＡ技術に関して、本発明の実施は、他に示さない限り、当業者の技術範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学および微生物学の従来技術を使用する。このような技術は、参考文献において完全に説明される。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ編（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓら、米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ，Ｐｒｅｓｓ、１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；学術論文、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；およびＭｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５４巻および第１５５巻（Ｗｕら、編）を参照のこと。
【００４８】
組換え技術を使用して、多くの例において、「非天然」のエリスロマイシンまたはエリスロマイシン誘導体（これらは、天然に存在するエリスロマイシンＡ、Ｂ、ＣまたはＤとは、１以上の部位が異なる）を提供する。任意の適切な組換え手段が使用され得るが、有用な出発点は、ベクター中にクローニングされ、従って、Ｅ．ｃｏｌｉにおける遺伝子操作およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにけるポリケチドの発現を受け入れる、完全６−ｄＥＢ合成遺伝子クラスターである。米国特許第５，６７２，４９１号；同第５，８３０，７５０号；同第５，８４３，７１８号；同第５，７１２，１４６号；および同第５，９６２，２９０号（これらは全て、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。一旦アグリコンが形成されると、これは、次に、所望の特性を有する変換株によって、適切な位置でヒドロキシル化および／またはグリコシル化および／またはメチル化される。
【００４９】
特に有用な変換株は、Ｓａｃｃａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ｅｒｙＡ変異体であり、この変異体は、６−ｄＥＢを生成できないが、所望の変換をなお実行し得る（Ｗｅｂｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６４（１）：４２５−４３３（１９８５）。この変異株は、外因的に補充された６−ｄＥＢを取り込み、これを、エリスロノライド（ｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｄｅ）Ｂ、３−α−ミカロシルエリスロノライド（ｍｙｃａｒｏｓｙｌｅｒｙｔｈｒｏｎｏｌｉｄｅ）Ｂ、エリスロマイシンＤ、エリスロマイシンＣそして最終的にエリスロマイシンＡに変換することによって、これをエリスロマイシンＡに処理する。エリスロマイシンＡへの代替の経路は、エリスロマイシンＢを介する経路であり、ここで、外因的に補充された６−ｄＥＢは、エリスロノライドＢ、３−α−ミカロシルエリスロノライドＢ、エリスロマイシンＤ、エリスロマイシンＢそして最終的にエリスロマイシンＡに変換される。他の変異株（例えば、ｅｒｙＢ変異体、ｅｒｙＣ変異体、ｅｒｙＧ変異体および／またはｅｒｙＫ変異体）または複数の遺伝子に変異を有する他の変異株を使用して、Ｃ−６およびＣ−１２でのヒドロキシル化、Ｃ−３およびＣ−５でのグリコシル化、ならびにＣ−３”−ＯＨでのメチル化の任意の組み合わせを有する化合物を作製し得る。任意のこれらの産物は、本発明の実行のための出発物質として使用され得る。
【００５０】
Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａ由来のデオキシエリスロノライドＢ（Ｃ−１３での置換基がメチルまたはエチルであるエリスロマイシン）シンターゼ（「ＤＥＢＳ」）を、米国特許第５，６７２，４９１号に記載される組換え発現系において使用して、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒにおいてアグリコンを生成し得る。必要に応じて、オレアンドライド（ｏｌｅａｎｄｏｌｉｄｅ）またはメガロマイシン（ｍｅｇａｌｏｍｉｃｉｎ）ポリケチドシンターゼ（「ＰＫＳ」）遺伝子を、この発現系において使用し得る。ＰＣＴ公開ＷＯ０１／２７２８４およびＷＯ００／２６３４９（これらは各々、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。
【００５１】
Ｃ−１３での置換基が、時折メチルでもエチルでもないエリスロマイシンについて、化学的生合成（ここで、ＳＮＡＣ−ジケチドと称される活性化チオエステルは、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ  ＣＨ９９９／ｐＪＲＪ２または機能的に類似する株（モジュール１のケトシンターゼドメインが、変異（ＫＳ１ｏ変異）によって不活化されているＰＫＳを含む）の発酵によって、１３置換された６−ｄＥＢ誘導体（１３−Ｒ−１３−デスエチル−６−ｄＥＢ化合物）に変換される）として公知の技術を使用し得る。この方法論は、ＰＣＴ公開ＷＯ９７／０２３５８およびＷＯ９９／０３９８６ならびに米国特許第６，０６６，７２１号（これらは全て、本明細書中で参考として援用される）に記載される。さらなるＳＮＡＣ−ジケチド化合物および対応するアグリコンは、ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４７１７（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【００５２】
６−ｄＥＢおよび６−ｄＥＢ誘導体（例えば、１３−置換６−ｄＥＢ）は、適切な変換株によって所望のエリスロマイシン出発物質へと変換される。例えば、ポストＰＫＳ産物の任意の１つは、出発物質（例えば、エリスロノライドＢ、３−α−ミカロシルエリスロノライドＢ、エリスロマイシンＤ、エリスロマイシンＢ、エリスロマイシンＣおよびエリスロマイシンＡに対する１３−置換対応物（ここで、通常Ｃ−１３に存在するエチル基は、別の置換基で置換される））として使用され得る。特に、１３−置換エリスロマイシンＡは、６−ｄＥＢを生成し得るが、なお所望の変換を実行し得るｅｒｙＡ変異体を用いる発酵によって作製され得る。１３−置換エリスロマイシンＢは、ｅｒｙＡ変異体を用いる発酵によって作製され得、このｅｒｙＡ変異体は、６−ｄＥＢを生成し得ず、かつｅｒｙＫ（１２−ヒドロキシラーゼ）遺伝子が欠失されているか、または他の方法で不活化されている。あるいは、エリスロマイシンＢ誘導体は、Ｓ．ｅｒｙｔｈａｅａのＫＳ１ｏ／ｅｒｙＫ変異株において作製され得る。改変６−ｄＥＢを作製するために化学生合成を使用するための一般的方法は、１３−プロピル−６−ｄＥＢ（１３−プロピル−１３−デスエチル−６−ｄＥＢ）を特に参照して、実施例６により例示される。ｅｒｙＡ変換株を使用することによって、改変６−ｄＥＢ化合物を所望のヒドロキシル化形態およびグリコシル化形態に変換するための一般的方法は、１３−プロピル６−ｄＥＢを１３−プロピルエリスロマイシンＡ（１３−プロピル−１３−デスエチル−エリスロマイシンＡ）に変換することを特に参照して、実施例７によって例示される。
【００５３】
（合成方法）
本明細書中に記載される方法は、一般的に、明らかに制限されない限り、全てのエリスロマイシンおよびエリスロマイシン誘導体（例えば、エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ、１３置換エリスロマイシンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ、エリスロノリドＢ、３−α−ミカロシルエリスロノリドＢ、ならびにそれらの誘導体）に適用可能である。特定の実施形態に対するこのような参照は、例示の目的のみのためであり、いかなる方法によっても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００５４】
エノールエーテル化合物は、６，９−エノールエーテルエリスロマイシンまたは８，９−アンヒドロエリスロマイシン６，９−エノールエーテル、あるいはジヒドロフランとも称される。６，９−エポキシドは、エポキシドまたはテトラヒドロフランとも称される。明らかに制限されない限り、これらの用語は、ラクトン（Ｗ＝Ｏ）化合物またはラクタム（Ｗ＝ＮＲ）化合物の両方に言及し得る。
【００５５】
Ｗ＝Ｏであるエノールエーテル化合物は、エリスロマイシン出発物質をマイルドな酸で処理することにより形成される。対応するエポキシドは、エノールエーテルのＣ−９とＣ−９との間の炭素−炭素二重結合を還元することにより形成される。エポキシド化合物（Ｗ＝Ｏ）を形成するための代替の方法は、エリスロマイシンの遊離ヒドロキシルを保護し、Ｃ−９オキソを水素化ホウ素ナトリウムで還元して９−ジヒドロ−エリスロマイシン中間体（Ｃ−（は、−ＣＨＯＨ−である）を形成する方法である。適切な保護基の例として、Ｃ−２’およびＣ−４’’ヒドロキシルのためのアセチル、ならびにＣ−１１およびＣ−１２ヒドロキシルのための環式カルバメートが挙げられる。Ｃ−９のヒドロキシル基は、その後活性化され、そして置き換えられて所望のエポキシド生成物が形成される。
【００５６】
エノールエーテルおよびエポキシド化合物（Ｗ＝Ｏ）は、必要に応じて、対応するラクタム（Ｗ＝ＮＲ）に変換され得る。エノールエーテルまたはエポキシドラクトンは、炭酸カリウムで処理され、１２員の誘導体が形成され、この誘導体は、Ｍａｒｔｉｎスルフランで処理され、１２員の１２，１３エポキシドが形成される。この１２，１３エポキシドは、ＮＨ２Ｒと反応して、エリスロマイシンラクタムが形成される。
【００５７】
エノールエーテルおよびエポキシドのラクトンおよびラクタムの誘導体は、所望の修飾をすることにより作製され得る。例えば、１１−オキソ化合物は、Ｃ−１１ヒドロキシルを、カルボジイミドおよびメチルスルホキシドで酸化することにより作製される。Ｃ−１２アルコキシ化合物は、Ｃ−１２ヒドロキシル基をアルキル化することにより作製される。他の修飾の例として、３’Ｎの脱メチル化およびその後のアルキル化、ならびにＣ−３’’ヒドロキシル基での修飾が挙げられる。これらの型の修飾の詳細なプロトコルは、実施例に提供される。
【００５８】
（オーファンレセプターをスクリーニングするための機能性アッセイ）
本発明の方法は、オーファンレセプターをスクリーニングするのに使用され得る。この例において、オーファンレセプターをスクリーニングするために使用される機能性アッセイの選択は、成功のために重要である。このアッセイは、広範なカップリング機構を利用するために、可能な限り一般的であるべきである。サイトセンサーマイクロフィジオメーター（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ  ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ）を用いた細胞の代謝活性化の測定は、おそらく、利用可能な最も一般的なアッセイであるが、その低いスループットにより妨げられる。哺乳動物細胞における代替のアッセイ系は、標準的な方法を用いて直接的であるかまたはレポーター遺伝子アッセイの使用を介してかのいずれかの細胞内ｃＡＭＰまたはＣａ２＋レベルの変化の測定に大部分が集中している。マイクロタイタープレートフォーマットでの化合物およびペプチドの比較的大きなライブラリーのスクリーニングを可能にするために、高スループットのアッセイ系を使用することはどんどん重要になっており；９６ウェルフォーマットまたは３８４ウェルフォーマットのアッセイは、ｃＡＭＰレベルの測定のために容易に開発され得る。
【００５９】
蛍光に基づくアッセイ（例えばＣａ２＋移動）について、９６ウェル蛍光プレートリーダーは、従来の蛍光定量よりも高いスループットを提供するが、標準的なプレートリーダーは、個々のウェルからの連続的な読み取りを可能にするのみであり、Ｃａ２＋移動のような高速の応答を測定する場合、データキャプチャーの速度を制限する。リアルタイムで９６ウェル蛍光の同時読み取りを可能にするための電荷結合素子（ＣＣＤ）画像化カメラ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓにより開発されたＦＬＩＰＲシステム）の使用は劇的にスループットを増大し得る。特定のレセプターのカップリング経路は、配列情報からデノボで予測することが困難なので、種々のアッセイ系は、オーファンレセプターをスクリーニングする際に使用されるべきである。
【００６０】
（サイトセンサーマイクロフィジオメーター（Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ  Ｍｉｃｒｏｐｈｙｓｉｏｍｅｔｅｒ））
サイトセンサーマイクロフィジオメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｃｅｓ）により使用されるマイクロフィジオメーターの原理は、他所に十分に記載されているが、本質的に、このアプローチは、細胞表面上のレセプターが刺激された際の細胞の代謝活性化の一般的な測定として、細胞外酸性化速度の変化の検出を利用する。
【００６１】
簡単にいうと、細胞は、高感度ｐＨ検出器として機能する光アドレス可能電位差測定センサ（ＬＡＰＳ）の近位に固定される。低緩衝液収容能の「ランニング培地」は、細胞を通して灌流され、そして定期的な時間間隔で、ランニング培地の流れが一時的に停止される。その結果、細胞の周囲の培地は、徐々に酸性となり、このｐＨ変化はＬＡＰＳにより検出される。ｓｌｏｐ−ｆｌｏｗ相の間の酸性化の速度が、測定されるパラメータである。代表的に、この方法において細胞外酸性化速度のサンプリングは、アッセイの正確な設定に依存して１〜２分毎に１度行なわれる。ほとんどの細胞型は、マイクロフィジオメーター中で数時間維持され得、このことは、データが蓄積されるための相当な時間を可能にする。細胞外酸性化速度は、一般的に、試験薬物の添加直前の基準速度のパーセンテージとして表され、そして時間に対してプロットされる（図３のように）。洗練された流体システムは、操作者が、流れを作り出すことなく、試験薬物への細胞の曝露を制御することを可能にする。
【００６２】
図３に示されるように、ＨＥＫ２９３細胞において一時的に発現されたオーファンレセプターＣＲＬＲ（カルシトニンレセプター様レセプター）は、１０ｎＭヒトＣＧＲＰを用いてチャレンジした場合に、特定の細胞外酸性化応答を媒介する。各点は、細胞の個々のチャンバからの酸性化応答を表す。
【００６３】
（オーファンレセプターをスクリーニングするためのサイトセンサーマイクロフィジオメーターの使用）
以下のプロトコルが、オーファンレセプターをスクリーニングするために使用され得る。
【００６４】
１．レセプターのトランスフェクションの４８時間後、１〜２分間かけて５ｍｌのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないリン酸緩衝生理食塩水中に２００ｍｇ／ｌ）を添加することにより、フラスコから接着細胞を穏やかに持ち上げる。細胞を引き離すために必要である場合、フラスコを穏やかに叩く。ＥＤＴＡを吸引し、そして２０ｍｌのマイクロフィジオメーターランニング培地（最小必須培地、ＭＥＭ、ＮａＨＣＯ３を含まないＥａｇｌｅ塩を含み、６．６ｍｌ／ｌの４Ｍ  ＮａＣｌが補充されている）に添加する。全ての細胞が引き離されるまでＥＤＴＡのインキュベーションを繰り返す。
【００６５】
２．細胞を計数し、５分間３００×ｇで遠心分離し、次いで、ランニング培地に再懸濁して２〜３×１０６細胞／１００μｌの濃度にする。
【００６６】
３．以下のようにして、細胞カプセルカップアセンブリ上のアガロース中にトランスフェクト細胞の懸濁物を固定する：２００μｌアリコートのアガロース（細胞捕捉キット、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｖｅｃｅｓ、カタログ番号Ｒ８０２３）を沸騰水中で溶解し、次いで、加熱ブロックにて３７℃にする。予め温めておいた試験管中で１容量のアガロースを３容量の細胞懸濁物と混合する（気泡が入らないよう、およびこの混合物が３０度未満（この温度未満で固化する）に冷めないように注意しながらこの混合物をピペットで数回上下することにより混合する）。
【００６７】
４．ブルースペーサーリングをカプセルカップに配置し、このリングの中央に１０μｌ細胞／アガロース混合物を注意深くスポットし（混合物がリングに触れないように注意し、そうでなければカプセルの中央から逃す）、そしてこの混合物を固化することにより（２〜３分間）、細胞をマイクロフィジオメーターに移す。
【００６８】
５．カップを保持するウェルに１ｍｌのランニング培地を注意深く添加し、そしてカップ自体に０．２ｍｌを添加する。挿入物を添加し、次いで０．２ｍｌのランニング培地にこの挿入物を添加する。挿入物がカップの底に沈んだ場合、アセンブリ全体をサイトセンサーに移し得る。
【００６９】
６．製造元の指示書に従い、サイトセンサーマイクロフィジオメーターを設定し、パラメータを以下のように設定した：総ポンプサイクル時間＝１分３０秒間；５０％全速にて１分間、次いで３０秒間のポンプオフ；１分８秒間〜１分２８秒間「格付けする（Ｇｅｔ  ｒａｔｅ）」。チャンバ温度を、３７℃に設定する。３０秒で試験リガンドをポンプサイクルに添加する前に安定化するために、少なくとも１時間格付けのために与える。
【００７０】
オーファンＧタンパク質共役レセプターＣＲＬＲ（カルシトニンレセプター様レセプター）は、Ａｉｙａｒらによって、機能性アッセイ（ｃＡＭＰ）および放射性リガンド結合アッセイの両方においてレセプターを安定に発現させるＨＥＫ２９３細胞の分析に基づき、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）レセプターとして同定された。しかし、他のグループは、この知見を再現することができず、ＣＲＬＲが真正のＣＧＲＰレセプターではないといういくつかの推測が存在した。サイトセンサーマイクロフィジオメーターは、ＣＲＬＲが、ＨＥＫ２９３細胞において一時的に発現される場合、ＣＧＲＰに対する強力な特異的な応答を生じる（図３）ことを実証するために使用され得る代替のアッセイシステムであり、このことは、Ａｉｙａｒらの知見を確認する。より最近の刊行物はまた、適切な条件下で発現される場合のＣＧＲＰレセプターとしてのこのレセプターの機能化と一致する。
【００７１】
（Ｃａ２＋の動員）
細胞内カルシウムレベルの変化は、蛍光カルシウムインジケーター色素（例えば、Ｆｌｕｏ−３およびＦｌｕｏ−４）を用いて慣用的に検出され得る。細胞を、細胞膜を透過するアセトキシメチルエステル形態の色素と共にインキュベートする。一旦細胞内に入ると、この色素は、細胞内エステラーゼによるエステル部分の切断により、その遊離酸形態に変換される。この変換は、色素を細胞を不透過性にし、それによって、細胞内に捕捉される。エステル化対応物ではなく、遊離酸形態のみが、カルシウムイオンに結合する際に蛍光を発し、そしてこの特性は、アッセイの基礎をなす。
【００７２】
２つの方法が、Ｃａ２＋移動応答を分析するために記載される；第１の方法は、標準的な蛍光プレートリーダー（Ｆｌｕｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ、Ｌａｂ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）を通じた検出に関し、懸濁物中の細胞に適しており；第２の方法は、ＦＬＩＰＲ（蛍光光度画像化プレートリーダー：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を通じた検出に関する。ＦＬＩＰＲは、１秒毎にデータを読み取りながらマイクロプレートの９６ウェル全てを同時に読み取る能力を有し、従って高スループットである。ＦＬＩＰＲ画像化システムは、半共焦点様式で設定され、それによって、単層中の接着細胞と共に使用するのにより適合させる。感度はまた、細胞上の流体層からのバックグラウンドの蛍光を消滅することにより増強される。
【００７３】
（Ｆｌｕｏｓｋａｎ勾配蛍光プレートリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたＣａ２＋の移動測定）
以下のプロトコルが、カルシウム移動を測定するために使用され得る。
【００７４】
１．３７℃にてアッセイ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２００μＭ  ＣａＣｌ２、および０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＨａｎｋｓ平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、ｐＨ７．４）を調製する。
【００７５】
２．ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中でＦｌｕｏ−３／ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を再構成する。１ｍＭのストック濃度が適切である。
【００７６】
３．トランスフェクションの４８時間後に、２ｍｌのバーシーン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加することによりフラスコから接着細胞を持ち上げる。バーシーンが完全に単層を覆ったことを確認するためにフラスコを穏やかに振盪し、次いで、フラスコを３７℃にて５〜１０分間インキュベートする。
【００７７】
４．フラスコに８ｍｌの増殖培地を添加する（エチレンビス（オキシエチルニトリロ）四酢酸［ＥＧＴＡ］を中和するため）。溶液をピペットで数回上下させ、均一な細胞懸濁物を調製する。
【００７８】
５．５０ｍｌのコニカルチューブに細胞懸濁物を移す。１５００ｒｐｍ、５分間の遠心分離により細胞をペレット状にする。増殖培地を吸引し、次いで、細胞ペレットを１０ｍｌのアッセイ緩衝液に再懸濁し、そして遠心分離プロセスを繰り返す。
【００７９】
６．緩衝液を吸引し、そして細胞を１２ｍｌの新鮮なアッセイ緩衝液に再懸濁して、細胞の全ての塊が十分に分散したことを確認する。チューブをホイールでラップして内容物を光から保護し、次いで、色素の終濃度が１μＭになるようにＦｌｕｏ−３／ＡＭを添加する。完全に混合する。特定の細胞型（例えば、ＣＨＯ）について、細胞からの色素の漏出を防止するために、ローディング緩衝液中に２．５ｍＭのプロベネシドを含む必要がある。
【００８０】
７．細胞が沈降および凝集するのを防ぐためにときどきチューブを攪拌しながら、３７℃で２０分間インキュベートする。
【００８１】
８．３６ｍｌのアッセイ緩衝液を添加し、ウェルを混合し、そして３７℃にてさらに２５分間インキュベートする。これにより、色素の完全な加水分解を確認する。
【００８２】
９．工程６と同様に細胞を遠心分離する。２０ｍｌの新鮮なアッセイ緩衝液中に細胞ペレットを再懸濁する。
【００８３】
１０．細胞を計数し、工程６と同様に細胞を遠心分離し、次いでアッセイ緩衝液中に再懸濁して２×１０６細胞／ｍｌの密度にする。Ｆｌｕｏ−３の充填の２時間以内に細胞を使用するべきである。
【００８４】
１１．Ｆｌｕｏｓｋａｎリーダーをプログラムし、８ウェルの単一カラムを繰り返し読み取る。各ウェルの反復的な読み取りを３．４秒毎に行い得、そしてこのタイムフレームは、Ｃａ２＋の移動応答の検出を可能にするのに十分である。４８５ｎｍの励起および５３８ｎｍの発光に対してフィルターを設定する。
【００８５】
１２．使用直前に、１．７ｍｌの細胞懸濁物を２ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、簡単に微量遠心分離し細胞をペレットにする。緩衝液を吸引し、細胞ペレットを１．７ｍｌの新鮮なアッセイ緩衝液に再懸濁する。
【００８６】
１３．９６ウェル、クリアボトム、黒壁プレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）の第１カラムにおける８ウェルの各々に１９０μｌの細胞懸濁物をピペッティングし、そしてアッセイを開始する。３．４秒間間隔で各ウェルにおいて６回の基準（ｂａｓｅｌｉｎｅ）読み取りを行う。
【００８７】
１４．マルチチャンネルピペットを用いて、カラムにおける８つ全てのウェルに試験リガンドを添加し、３〜４回混合し、次いで、再度３．４秒間間隔でプレートの読み取りを３０回継続する。アゴニストの添加後できるだけ素早く読み取りを反復する。
【００８８】
１５．プレート上の残りのカラムについて、１３〜１５の工程を繰り返す。リーダーを、カラム１の後にカラム２などと機械が自動的にアッセイするよう設定し得る。
【００８９】
プレートリーダーは、プレートランの最後に自動的に結果シートを生成する。蛍光値は、各時点での各ウェルについて、行（Ａ１、Ａ２、Ａ３など）に沿ってプレートのウェルの参照および行に沿って時点を用いて列挙される（注釈：Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎは、各値の周囲に空のセルを自動的に挿入し、これらのセルは、データ分析のためのマクロを設計する場合に考慮されなければならない）。
【００９０】
読み取りは、３．４秒間毎に行なわれ、そして１０秒間の遅延が、各ウェル毎に６回目と７回目の読み取り（すなわち、最後の基準読み取りおよびアゴニスト添加後の第１読み取り）の間で想定される。結果は、以下のようにして分析され得る。
【００９１】
１．平均基準値を算出するために最初の６回の読み取りを平均する。
【００９２】
２．アゴニスト添加後の各時点について基準を超える蛍光の増加を決定し、基準値のパーセンテージとして表す。
【００９３】
３．時間に対する蛍光の変化としてデータをプロットする。
【００９４】
（ＦＬＩＰＲ（蛍光光度画像化プレートリーダー）を用いたＣａ２＋移動測定）
以下のプロトコルが、カルシウム移動を測定するために使用され得る。
【００９５】
１．レセプターのトランスフェクションの２４時間後、細胞を収集してポリ−Ｄ−リジンでコーティングされた９６ウェル黒壁／クリアボトムマイクロタイタープレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ）に、ウェル毎に３×１０４細胞でプレートした。
【００９６】
２．１８〜２４時間後、培地を吸引し、そして４μＭ  Ｆｌｕｏ−３／ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ；２０％プルロン酸を含有するＤＭＳＯ中に２ｍＭの調製ストック溶液を調製する）、０．１％ＢＳＡ、および２．５μＭプロベネシドを含有する１００μｌの新鮮なＥＭＥＭを各ウェルに添加し、３７℃にて１時間インキュベートした。
【００９７】
３．培地を吸引し、１００μｌの同一の緩衝液（Ｆｌｕｏ−３／ＡＭを含まない）と置き換え、そして３７℃で１０分間インキュベートする。０．１％  ＢＳＡ、２．５μＭプロベネシド、および２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４（緩衝液Ａ）を含有するＫｒｅｂｓ  Ｒｉｎｇｅｒ  Ｈｅｎｓｃｌｅｉｔ（ＫＲＨ；１１８ｍＭ  ＮａＣｌ、４．６ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１１ｍＭグルコース、１．１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を含むＤｅｎｌｅｙセルウォッシャー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）で細胞を３回洗浄する。最後の洗浄後、最終容量１００μｌまで吸引する。
【００９８】
４．９６ウェルポリプロピレンマイクロプレート中に、緩衝液Ａ中の３倍終濃度で潜在的なリガンド、組織抽出物、または化合物ライブラリーのプレートを調製し、３７℃に温める。
【００９９】
５．Ｆｌｕｏ−３を充填した細胞を含むマイクロプレートおよびリガンドプレートをＦＬＩＰＲに置き、そしてモニタリングする。蛍光の記録の最初に、１秒毎の測定値を６０秒間、次いで３秒毎の測定値をさらに６０秒間読み取る。１０秒で細胞プレートにアゴニスト（５０μｌ）を添加し、そしてアゴニストの添加後のバックグラウンドを上回る最大蛍光計数を使用してそのリガンドについての最大活性を定義する。ＦＬＩＰＲソフトウェアで蛍光の読み取りを正規化し、時間０での全てのウェルについての等価な読み取りを得る。
【０１００】
（オーファンレセプターとの無差別なＧタンパク質の使用）
より最近、レセプターと無差別なＧタンパク質Ｇα１５／１６との同時発現またはＧｑに基づくキメラＧタンパク質との同時発現による、ホスホリパーゼＣおよびＣａ２＋の移動に関与する共通の経路にＧＰＣＲの異種シグナル形質導入を通すことが可能となった。例えば、Ｃ３ａレセプターは、最初、ＨＥＫ２９３細胞において発現される場合、Ｃ３ａに応答して弱いＣａ２＋移動を生じるかまたは全く生じないオーファンレセプターとして記載された。しかし、Ｇα１６と同時発現される場合、強い応答が見られる（図４および５）この同時トランスフェクションアプローチは、一般的に成功していないかもしれないが、オーファンレセプターの機能的なカップリングを促進するため、および１つのシグナル形質導入システムにおいて優先的に集中させることによりそれらのスクリーニングを効率化するために有用な技術であり得る。
【０１０１】
（フラッシュプレートを使用したフラッシュプレート技術ｃＡＭＰ決定の使用を通じたｃＡＭＰレベルの決定）
以下のプロトコルが、ｃＡＭＰレベルを決定するために使用され得る。
【０１０２】
１．アッセイの２４時間前にＨＥＫ２９３細胞を、１００μｌの増殖培地中に１０５細胞／ウェルの密度で９６ウェルマイクロタイタープレートに接種する。３７℃にて一晩インキュベートする。ウェルは、翌日に少なくとも９５％のコンフルーエンスに達するはずである。
【０１０３】
２．１０μｌ  ＩＢＭＸ（３−イソブチル−１−メチルキサンチン；終濃度０．５ｍＭ）を添加し、細胞を３７℃にて３０分間インキュベートする。
【０１０４】
３．１０μｌの推定リガンドを添加し、直後に１０μｌの増殖培地（ｃＡＭＰ刺激応答の決定のため）または１０μｌフォルスコリン（ｃＡＭＰ阻害応答の決定のため）を３０μＭの終濃度で添加する。３７℃にて１０分間インキュベートする。
【０１０５】
４．１０μｌの氷冷５％過塩素酸（ＰＣＡ）を添加して反応を停止する。
【０１０６】
５．４℃にて１時間静置して平衡に達した後、１００μｌの７５ｍＭ  ＫＯＨを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウムを用いてサンプルを中和する。
【０１０７】
６．４℃にて少なくとも１．５時間インキュベートして中和を確実に完了し、そして沈殿物を沈降し、その後、沈殿をかき乱さないように注意しながらサンプルをｃＡＭＰ［１２５Ｉ］フラッシュプレート（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ番号ＳＭＰ００１）に移す。
【０１０８】
７．代表的にＨＥＫ２９３細胞について、アッセイのために、１０〜４０μｌの中和したサンプルをフラッシュプレートに移す。製造元の指示書に従いキット試薬を再構成し、そしてサンプルを、フラッシュプレート中でアッセイ緩衝液により１００μｌまでボリュームアップする。
【０１０９】
８．１００μｌの［１２５Ｉ］ｃＡＭＰ作用トレーサーを添加し、プレートをシールし、そして４℃で一晩インキュベートした後、計数する。
【０１１０】
図４は、無差別なＧタンパク質Ｇα１６と共にかまたはそれを伴わずに発現されたＣ３ａレセプターのＣａ２＋移動応答を示す。各々の四角は、細胞の個々のマイクロタイタープレートウェルからＦＬＩＰＲを通じて同時に決定された応答を表す。各四角のｙ軸は、細胞内カルシウムレベルに対応し、そしてｘ軸は時間に対応する。各トレースの左手側の応答は、示されるようなＣ３ａ（または緩衝液）によるチャレンジに対応し；各トレースの右手側の応答は、各ウェルについての内部コントロールとしての２００μＭムスカリンによるチャレンジに対応する。カラムＡ〜Ｄを、Ｃ３ａレセプターでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を用いて生成し、カラムＥ〜ＨをＣ３ａレセプターおよびＧα１５の両方でトランスフェクトした細胞を用いて生成した。これらのデータの数量を図５に示す。
【０１１１】
図５は、Ｃ３ａレセプター単独（黒四角）またはＣ３ａレセプターとＣα１６（黒丸）で一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞におけるＣ３ａにより誘導されるカルシウム移動を示す。図４に示されるように、各ウェルへのＣ３ａ添加後の最大Ｃａ２＋応答（ピーク高）を、用量応答曲線を作成するために使用した。図５の各点は、８つの測定値の平均±ＳＥＭを表す。
【０１１２】
このアッセイは、Ｇｓ共役オーファンレセプターまたはＧｉ共役オーファンレセプターを活性化するリガンドをスクリーニングするのに使用され得るだけでなく、恒常的に活性であり得るレセプターを探索するのにも使用され得る。例えば、上昇した基底ｃＡＭＰレベルは、オーファンレセプターＧＰＲ３を発現するＨＥＫ２９３細胞において検出され得、このレセプターについて報告された恒常的な活性と一致する。このようなレセプターは、上昇した活性の基底レベルを減少させ、次いでそのレセプターのインビボでの生物学を探索するためのツールとして使用され得る逆アゴニスト活性を有する化合物についてのスクリーングに適している。
【０１１３】
フラッシュプレートアッセイ（ＳＭＰ００４）の「均一な」バージョンは、ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓにより開発されている。このフォーマットにおいて、細胞および試験物質は、フラッシュプレートに直接添加され、インキュベーションは１回の添加（放射標識を含む）により停止され、次いで、プレートは室温にて２〜２４時間後に計数される。ピペッティング工程数の減少は、より高いスループットをもたらす。しかし、組織抽出物をスクリーニングする場合、過剰なタンパク質性物質（このアッセイを妨害し得る）を除去するための酸沈殿工程の欠如に注意が必要である。
【０１１４】
まとめると、本発明は、ＧＰＣＲレセプターアゴニストとしての作用機構を有する薬物候補を評価する方法を提供する。化合物を評価するために有効指標を使用することにより、臨床効果または治療効果の欠如から起こる失敗の危険性を最小限に抑えられる。本発明の方法は、モーティライド（ｍｏｔｉｌｉｄｅ）に適用され、新規化合物および現在臨床試験で研究されている化合物の両方が評価される。
【０１１５】
本発明はさらに、以下の実施例により記載される。この実施例は、特定の実施形態を参照して本発明を説明するためのみに提供される。これらの例示は、本発明の特定の局面を説明するものであるが、開示される発明の範囲の限定または制限を示すものではない。
【実施例】
【０１１６】
（実施例１）
（細胞株におけるＧＰＣＲおよびエクオリンの同時発現および能力測定）
その標的レセプターをコードする遺伝子を、クローニングし、そして哺乳動物発現ベクター（例えば、ｐＣＤＮＡ３．１）中に配置する。その遺伝子は、合成であっても天然由来であってもよい。次いで、ｐｍｔＡＥＱ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから入手可能なエクオリン発現プラスミド）およびレセプター発現構築物を、市販のトランスフェクションキット（例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲｌ））を使用して、ＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクトする。この時点で、安定な細胞株を、一般的技術を使用してこのトランスフェクション混合物から選択し得るか、または一過性トランスフェクションから得た異種混合物を、直接使用し得る。次いで、エクオリンとその標的レセプターとを発現する細胞を、採取する。そしてその細胞を、０．１ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、０．１ｇ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、３６ｍｇ／Ｌピルビン酸塩、および１ｇ／Ｌグルコース（リン酸緩衝溶液（「ＰＢＳ」）中）を含むリン酸緩衝生理食塩水溶液中に、２．５μＭコエレンテラジンｆおよび３００μＭ還元グルタチオンとともに、０．５〜４時間浸漬する。その細胞を、洗浄し、そしてＰＢＳ中に５００，０００細胞／ｍＬに希釈する。１００μｌの種々の濃度の試験アゴニストを、９６ウェル白色プラスチックアッセイプレートのウェル中に配置する。１００μＬの細胞アリコートを、各ウェルに添加し、各添加後に、統合された発光を３０〜６０秒間測定し、そしてそのアゴニスト応答として捉える。次いで、１００μＬのＰＢＳ中１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を、各ウェルに注入し、そしてその統合された発光を、３０〜６０秒間にわたり第２回目の測定を行い、それをトリトン応答として捉える。このアゴニスト応答とこのトリトン応答との合計によって除算したアゴニスト応答と等しいとして、値Ｆを計算する。Ｆを、このアゴニスト濃度に対してプロットし、そしてそのデータを、直角双曲線に適合させて、その化合物についてのＥＣ５０値を得る。
【０１１７】
（実施例２）
（ＧＰＣＲとエクオリンとを発現する細胞株における脱感作測定）
標的レセプターとエクオリンとを発現する細胞を、増殖させ、採取し、そして計数する。次いで、細胞を、５００，０００細胞を含む１ｍＬ反応物において、種々の濃度の試験化合物とともにＰＢＳ中でインキュベートする。この反応物を、３７℃にて、設定時間（脱感作の時間依存性を決定するために最初変動される）の間インキュベートする。この反応物を希釈し、細胞を、遠心分離によりその試験化合物から分離させ、（０．１ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、０．１ｇ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、３６ｍｇ／Ｌピルビン酸塩、および１ｇ／Ｌグルコースを含む、ＰＢＳ中に）再懸濁し、そして再遠心分離して、残りのすべての試験化合物を洗い去る。エクオリン補因子を再構成するために、その後、その細胞を、２．５μＭコエレンテラジンｆおよび３００μＭ還元グルタチオンを含む５ｍＬ  ＰＢＳ中に再懸濁し、そして３７℃にて３０〜４５分間インキュベートする。この細胞を、さらに１度遠心分離し、その後、アッセイのために８００μＬのＰＢＳ中に再懸濁する。
【０１１８】
１００μＬの細胞を、９６ウェル白色アッセイプレートのウェル中に配置し、そしてそのレセプターを飽和させるのが既知である量のアゴニストを、添加する。各細胞アリコート（種々の濃度の試験化合物で事前処理済み）に、そのアゴニストでチャレンジし、そして統合された発光を、３０〜６０秒間測定する（「アゴニスト応答」）。次いで、１００μＬのＰＢＳ中１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を、各ウェルに注入し、そしてその統合された発光を、３０〜６０秒間にわたり第２回目の測定を行う（「トリトン応答」）。その後、そのレセプターの部分的活性化を、Ｆ＝アゴニスト応答／（アゴニスト応答＋トリトン応答）として表現する。その後、Ｆを、この試験化合物の関数としてプロットし、そして生じた曲線を、直角双曲線に適合させて、その試験化合物によるそのレセプターの脱感作についてのＩＣ５０値を得る。
【０１１９】
（実施例３）
（モチリンレセプターおよびエクオリンの発現）
モチリンレセプターをコードする合成遺伝子を、天然に存在するヒトモチリン遺伝子の配列に基づいて、一般的方法を使用して設計した。その合成におけるエラーを訂正して、Ｋｏｓ１２７−４２−６１（モチリンレセプターをコードする合成遺伝子を含む、ｐＵＣ由来ベクター）を得た。ｐｋｏｓ１２７−４２−６１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント（ヒトモチリンレセプターをコードする完全配列合成遺伝子と、上流Ｋｏｚａｋ配列と、を含む）を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター中にサブクローニングした。生じたプラスミド構築物（ｐｋｏｓ１２７−１５９）を、制限分析およびＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１２０】
ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）を、５％ＣＯ２を含む大気中で、Ｔ１７５フラスコ中で３７℃にて、約９５％コンフルエンスまで増殖させた。各Ｔ１７５フラスコを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｐｌｕｓ試薬と、製造業者により供給されるプロトコルとを使用して、合計１１．５μｇのＤＮＡでトランスフェクトした。一過性トランスフェクションのために、ｐｋｏｓ１２７−１５９（「モチリンレセプターＤＮＡ」）対ｐｍｔＡＥＱ（「エクオリンＤＮＡ」）の比は、１０：１であった。一方、安定細胞株を生成するために実施したトランスフェクションは、レセプターＤＮＡ：エクオリンＤＮＡ比  １：１０を使用した。その培地を除去し、細胞の層を５ｍＬのＴｒｙｐｓｉｎ−ＥＤＴＡで３７℃にて２０分間処理することによって、一過性トランスフェクトされた細胞を、トランスフェクションの１８〜２２時間後に採取した。このトリプシン反応を、１０％ウシ胎仔血清含有ＭＥＭα培地５０ｍＬでクエンチし、その細胞懸濁物を、１０ｍＬピペットで破砕した。その細胞を、遠心分離によって採取し、５０ｍＬのＰＢＳで洗浄した。５０μＬアリコートを、５０μＬのトリパンブルー（０．４％ｖ／ｖ）と混合し、そして血球計を使用して計数した。
【０１２１】
安定細胞株の生成のために、細胞を、トランスフェクション後３日間回復させ、３日後の時間で、培地を、８００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を含む新鮮な培地で置換した。非トランスフェクト細胞のフラスコもまた、８００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８の存在下でインキュベートした。その培地を、トランスフェクションの７日後に交換した。トランスフェクションの１０日後までに、トランスフェクト細胞のうちの約８０％が死滅した。非トランスフェクトコントロールを含むフラスコ中に、生細胞は見えなかった。トランスフェクションの２週間後、十分に分離した単一コロニー群が見えた。これらのコロニー群を、マーカーペンを用いて円で囲んだ。培地を、吸引し、ＰＢＳの薄層で置換した。そして、クローンを単離した。円で囲んだコロニーの領域をピペットの先端で引っ掻き、同時に、そのピペットの先端にＰＢＳ（および細胞）を流した。クローンを、８００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を含むＭＥＭα中の２４ウェルまたは６ウェルの組織培養クラスター中に分配した。コロニーを、約２週間増幅させ、その後、ＭＥＭα培地および２００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８を含む二連ウェルに分割した。
【０１２２】
（実施例４）
（モチリンレセプター活性化アッセイ）
モチリンレセプターおよびエクオリンを、一過性または安定のいずれかで発現するＨＥＫ２９３細胞を含むフラスコを、レセプター活性化アッセイにおいて使用した。細胞を、１０％ｖ／ｖウシ胎仔血清を含むＭＥＭα培地を含むＴ１７５フラスコ中で、８０〜１００％コンフルエンスまで増殖させ、トリプシン処理により採取し、そして血球計を使用して計数した。トリパンブルー染色を使用して、それらの細胞のうちの＞８０％の生存を確認した。これらの細胞を、予め温めた（３７℃）ＰＢＳおよび２．５μＭコエレンテラジンｆ（メタノール中の２．５ｍＭストックから）および３００μＭ還元グルタチオン３０ｍＬ中に、再懸濁した。エクオリン中へのコエレンテラジンｆ補因子の再構成を、５％ＣＯ２を含む大気中で３７℃にて１〜４時間進行させ、その時点で、それらの細胞を、遠心分離により採取し、２×５０ｍＬの予め温めたＰＢＳで洗浄し、予め温めたＰＢＳ中に再懸濁して、濃度約５×１０５〜１０６細胞／ｍＬにし、そしてそのアッセイの持続期間の間、３７℃にて維持した。
【０１２３】
試験化合物のストック溶液（２０ｍＭ）を、エタノール中にて作製した、そしてＰＢＳ中に１００倍希釈した。モチリンを、濃度１８５μＭまで水中に溶解した。モチリンおよび試験化合物の連続１０倍希釈物を、ＰＢＳ中にて作製して、１０−４〜１０−１１Ｍの範囲の一連のストック溶液を作製した。３連の１００μＬアリコートを、白色の不透明９６ウェルアッセイプレートのウェル中に配置した。ＰＢＳのみまたはＰＢＳ中１％ｖ／ｖエタノールを含むコントロールウェルもまた、含めた。そのプレートを、２つの試薬注入機を備えたＷａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０多重標識計数機に装填した。その注入機のうちの１つを使用して、各ウェルに、１００μＬの細胞懸濁物（約５×１０４〜１０５）を添加した。そしてその生物発光応答を、３０〜６０秒の経過にわたって測定した。その後、第２回目の測定を、ＰＢＳ中の１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（１００μｌ）の注入後に行った。各試験化合物に対する細胞のＦ値を、式Ｉを使用して計算し、そしてデータを、式２に適合させて、その試験化合物についてのＥＣ５０を得た。
【０１２４】
式１：Ｆ＝アゴニスト応答／（アゴニスト応答＋トリトン応答）
式２：Ｆ＝基底応答＋（総変化＊［アゴニスト］／（ＥＣ５０＋［アゴニスト］）。
【０１２５】
（実施例５）
（モチリンレセプター脱感作アッセイ）
モチリンレセプターとエクオリンとを安定発現するＨＥＫ２９３細胞を、コンフルエント付近にまで増殖させ、トリプシン処理により採取し、トリパンブルーで染色し、そして計数し、その後、約５×１０５〜１０６細胞／ｍＬに希釈した。その後、約５００，０００細胞を含む１ｍＬ反応物中にて種々の濃度の試験化合物とともにインキュベートした。この反応物を、設定時間（脱感作の時間依存性を決定するために単一濃度の化合物について最初に変化させる）の間、３７℃にてインキュベートした。この反応物を希釈し、細胞を、遠心分離により試験化合物から分離し、ＰＢＳ中に再懸濁し、そして再遠心分離して、残りのすべての試験化合物を洗い流した。その後、その細胞を、２．５μＭコエレンテラジンｆおよび３００μＭ還元グルタチオンを含むＰＢＳ  ５ｍＬ中に再懸濁し、そしてエクオリンの必須補因子を再構成するために、３７℃にて３０〜４５分間インキュベートした。その細胞を、さらに１回遠心分離し、その後、アッセイのために８００μｌのＰＢＳ中に再懸濁した。
【０１２６】
１００μＬの細胞アリコートを、９６ウェル白色アッセイプレートのウェル中に配置し、試薬注入系を備えたＶｉｃｔｏｒ多重標識計数機を使用して、１００μＬの１．８５μＭモチリンを添加した。各細胞アリコート（種々の濃度の試験化合物で事前処理済み）を、そのモチリンでチャレンジし、そして統合された発光を、３０〜６０秒間測定した（「アゴニスト応答」）。次いで、１００μＬのＰＢＳ中１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を、各ウェルに注入し、そしてその統合された発光を、３０〜６０秒間にわたり第２回目の測定を行った（「トリトン応答」）。そのレセプターのＦ値を、Ｆ＝アゴニスト応答／（アゴニスト応答＋トリトン応答）として表現した。Ｆを、この試験化合物の関数としてプロットし、そして生じた曲線を、直角双曲線に適合させて、その試験化合物によるそのレセプターの脱感作についてのＩＣ５０値を得た。
【０１２７】
（実施例６）
（１３−プロピル−６−デオキシエリスロノリドＢ（１３−プロピル−６−ｄＥＢ）を生成する方法）
ＣＨ９９９／ｐＪＲＪ２（モジュール１のケトシンターゼドメインが変異により不活化されているＰＫＳを含む、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）作業細胞バンクの１ｍｌバイアルを、融解し、そしてそのバイアルの内容物を、２５０ｍＬのバッフルフラスコ中の５０ｍＬのＭｅｄｉｕｍ  １に添加した。
【０１２８】
Ｍｅｄｉｕｍ  １は、４５ｇ／Ｌコーンスターチ、１０ｇ／Ｌコーン浸漬液、１０ｇ／Ｌ乾燥不活化ビール酵母、および１ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ３を含む。この溶液を、１２１℃にて９０分間オートクレーブ処理することによって滅菌する。滅菌後、１００％  ＤＭＳＯ中の１ｍＬ／Ｌの滅菌ろ過５０ｍｇ／ｍｌチオストレプトンおよび１ｍＬ／Ｌのオートクレーブ処理した１００％アンチフォームＢケイ素エマルジョン（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）を、使用前に添加する。
【０１２９】
そのフラスコを、インキュベーター／振盪機中に配置し、３０±１℃および１７５±２５ＲＰＭにて４８±１０時間維持する。その後、５０ｍＬ培養物を、５００ｍＬのＭｅｄｉｕｍ  １を含む２．８Ｌバッフルフラスコに添加する。このフラスコを、３０±１℃および１７５±２５ＲＰＭにて４８±１０時間、インキュベーター／振盪機中にてインキュベートする。その後、５００ｍＬ培養物を、５ＬのＭｅｄｉｕｍ  １を含む１０Ｌ発酵槽に接種するために使用する。２．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４および２．５Ｎ  ＮａＯＨの添加、攪拌速度６００ＲＰＭ、および空気流速１〜２ＬＰＭによって、この発酵槽を、３０℃、ｐＨ６．５にて制御する。必要な場合は、アンチフォームＢの５０％溶液の添加によって、泡を制御する。この発酵槽培養物を、これらの条件下で２４±５時間増殖させる。
【０１３０】
１２１℃にて４５分間１００ＬのＭｅｄｉｕｍ  １を滅菌することによって、１５０Ｌの発酵槽を調製する。増殖期間の後、１０Ｌ発酵槽からの内容物を、１５０Ｌ発酵槽に無菌的に添加する。２．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４および２．５Ｎ  ＮａＯＨの添加、攪拌速度（５００〜７００ＲＰＭ）、空気流速（１６〜５０ＬＰＭ）および／またはバックプレッシャー制御（０．１〜０．４バール）による溶存酸素≧８０％空気飽和によって、この発酵槽を、３０℃、ｐＨ６．５にて制御する。必要な場合、アンチフォームＢの５０％溶液の添加によって、泡を制御する。
【０１３１】
３５±５時間にて、溶存酸素が最小に達し、かつ発酵槽の発生気体中のＣＯ２含量が最大に達した後、（２Ｒ，３Ｒ）−２−メチル−３−ヒドロキシペンタノイル−Ｎ−アセチルシステアミン（プロピルジケチド）を、最終濃度２ｇ／Ｌに添加する。プロピルジケチドを、ジメチルスルホキシド中に比２：３（ジケチド：ＤＭＳＯ）で可溶化することによって、調製し、その後、濾過滅菌する（０．２μｍ、ナイロンフィルター）。１３−プロピル−６−デオキシエリソノリドＢ（１３−プロピル−６ｄＥＢ）の生成は、８日目に生じる。その発酵槽を採集する。その発酵ブロスを、Ａｌｐｈａ  Ｌａｖａｌ  ＡＳ−２６遠心分離機において２０，５００ｇにて遠心分離する。その生成物は、主に遠心分離濾液（ｃｅｎｔｒａｔｅ）中にある。遠心分離された細胞塊を廃棄する。
【０１３２】
遠心分離後、固相抽出を、ＨＰ２０樹脂（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）を使用して実施する。カラムサイズを、遠心分離濾液の容積および力価に基づいて選択して、ＨＰ２０樹脂１リトルあたり１５ｇ  １３−プロピル−６−ｄＥＢのローディング容量を超えないようにする。遠心分離されたブロスを、直線流速３００±２０ｃｍ／ｈにて樹脂床に通す。このカラムに対する圧力は、１５ｐｓｉを越えてはならない。その後、この樹脂を、２カラム容量（ＣＶ）の水で、その後、２ＣＶの３０％メタノールで、各々３００±２０ｃｍ／ｈの速度で洗浄する。１３−プロピル−６ｄＥＢを、３００±２０ｃｍ／ｈの速度で７〜１０ＣＶの１００％メタノールを使用して溶出させる。溶出の間、１ＣＶごとの画分を収集する。その後、これらの画分を分析し、そして生成物を含む画分を合わせて、遠心分離されたブロス中にもとの１３−プロピル−６−ｄＥＢのうちの＞９５％を含む生成物プールを得る。この生成物プールを、ロータリーエバポレーションを使用して固体にまで減少させる。この段階での生成物の純度は、５〜３５％である。その固体を、もとのブロス容量１００Ｌあたり３Ｌの１００％メタノール中に懸濁し、２０分間混合し、そして濾過することによって、メタノール不溶性物質を、この生成物プールから除去する。
【０１３３】
その最終精製工程は、ＨＰ２０ＳＳ樹脂（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）を使用するクロマトグラフィーである。カラムのサイズは、生成物の量に基づいて選択し、１リットルのＨＰ２０ＳＳ樹脂あたり１５ｇの１３−プロピル−６−ｄＥＢというローディング容量を越えないようにする。濾過されたメタノール溶液を、等容量の水を添加することによって希釈する。その５０％メタノール溶液を、直線流速３００±２０ｃｍ／ｈにて樹脂床に通す。その後、このカラムを、２ＣＶの５０％メタノールで、３００±２０ｃｍ／ｈの速度で洗浄する。生成物を、３００±２０ｃｍ／ｈの速度で１２ＣＶの７０％メタノールを使用して溶出させる。溶出の間、１ＣＶごとの画分を収集する。その後、これらの画分を分析し、そして＞５０ｍｇ／Ｌの１３−プロピル−６−ｄＥＢを含み、＞２０％のクロマトグラフィー純度を有する画分を、合わせる。その生成物プールを、ロータリーエバポレーションを使用して固体にまで減少させる。この段階での生成物の純度は、＞６５％であり、適切なエリスロマイシンへの生体変換に適切である。
【０１３４】
（実施例７）
（１３−プロピルエリスロマイシンＡの生成方法）
作業細胞バンクＫ３９−１４Ｖ（６−ｄＥＢを産生不能である、Ｓ．ｅｒｙｔｈｒａｅａのｅｒｙＡ変異体）からの１ｍＬバイアルを、融解し、そしてそのバイアルの内容物を、２５０ｍＬバッフルフラスコ中の５０ｍＬのＭｅｄｉｕｍ  ２に添加する。
【０１３５】
Ｍｅｄｉｕｍ  ２は、１６ｇ／Ｌコーンスターチ、１０ｇ／Ｌコーンデキストリン、１５ｇ／Ｌダイズミール粉末、４ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ３、５ｇ／Ｌコーン浸漬液、６ｇ／Ｌダイズ油、２．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、および１ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を含む。この溶液を、１２１℃にて６０分間オートクレーブ処理することにより滅菌し、そしてオートクレーブ処理した１ｍＬ／Ｌの１００％アンチフォームＢケイ素エマルジョン（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ）を、使用前に添加する。
【０１３６】
このフラスコを、インキュベーター／振盪機中に配置し、３４±１℃および１７５±２５ＲＰＭにて４８±１０時間維持する。その後、５０ｍＬ培養物を、５００ｍＬのＭｅｄｉｕｍ  ２を含む２．８Ｌバッフルフラスコに添加する。このフラスコを、３４±１℃および１７５±２５ＲＰＭにて４８±１０時間、インキュベーター／振盪機中にてインキュベートする。その後、５００ｍＬ培養物を、５ＬのＭｅｄｉｕｍ  ２を含む１０Ｌ発酵槽に接種するために使用する。２．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４および２．５Ｎ  ＮａＯＨの添加、攪拌速度６００ＲＰＭ、および空気流速１〜２ＬＰＭによって、この発酵槽を、３４℃、ｐＨ７．０にて制御する。必要な場合は、アンチフォームＢの５０％溶液の添加によって、泡を制御する。この発酵槽培養物を、これらの条件下で２４±５時間増殖させる。
【０１３７】
１２１℃にて４５分間１００ＬのＭｅｄｉｕｍ  ３を滅菌することによって、１５０Ｌの発酵槽を調製する。Ｍｅｄｉｕｍ  ３は、１７．５ｇ／Ｌコーンスターチ、１６ｇ／Ｌコーンデキストリン、１６．５ｇ／Ｌダイズミール粉末、４ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ３、６ｇ／Ｌコーン浸漬液、３ｇ／Ｌダイズ油、３．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、および１ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４を含む。増殖期間の後、この１０Ｌ発酵槽からの内容物を、１５０Ｌ発酵槽に無菌的に移す。２．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４および２．５Ｎ  ＮａＯＨの添加、攪拌速度（５００〜７００ＲＰＭ）、空気流速（１５〜５０ＬＰＭ）および／またはバックプレッシャー制御（０．１〜０．４バール）による溶存酸素≧８０％空気飽和によって、この発酵槽を、３４℃、ｐＨ７．０にて制御する。アンチフォームＢの５０％溶液の添加によって、泡を制御する。
【０１３８】
２４±５時間後、５８〜６０ｍＬ／時間の１５％デキストリン（ｗ／ｖ）供給を開始する。このデキストリン溶液を、この供給期間の間継続的に混合する。２４±５時間後、２５ｇの１３−プロピル−６ｄＥＢを、この発酵槽に添加する。この１３−プロピル−６ｄＥＢは、２５ｇの１３−プロピル−６ｄＥＢを４００〜６００ｍＬの１００％エタノール中に可溶化し濾過する（０．２μｍ、ナイロンフィルター）ことによって、調製する。６０±１０時間後、１３−プロピル−６ｄＥＢから１３−プロピル−エリスロマイシンＡへの変換が停止する。この発酵槽を採取する。この発酵槽のブロスを、Ａｌｐｈａ  Ｌａｖａｌ  ＡＳ−２６遠心分離機中で２０，５００ｇにて遠心分離する。この生成物は、主に遠心分離濾液中にある。遠心分離された細胞塊を廃棄する。
【０１３９】
遠心分離後、固相抽出を、ＨＰ２０樹脂（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｉ）を使用して実施する。カラムサイズを、遠心分離濾液の容積および力価に基づいて選択して、ＨＰ２０樹脂１リトルあたり１５ｇ  １３−プロピル−６−エリスロマイシンＡのローディング容量を超えないようにする。遠心分離されたブロスを、ｐＨ９に調整し、その後、直線流速２７５±２５ｃｍ／ｈにてこの樹脂床に通す。このカラムに対する圧力は、１５ｐｓｉを越えてはならない。その後、この樹脂を、１カラム容量（ＣＶ）の水で２７５±２５ｃｍ／ｈの速度で洗浄する。１３−プロピル−６ｄＥＢを、２７５±２５ｃｍ／ｈの速度で５ＣＶの１００％メタノールを使用して溶出させる。溶出の間、１ＣＶごとの画分を収集する。その後、これらの画分を分析し、そして生成物を含む画分を合わせて、生成物プールを得る。この生成物プールを、ロータリーエバポレーションを使用して固体にまで減少させる。
【０１４０】
その固体を、もとのブロス容量１００Ｌあたり１Ｌの１００％メタノール中に懸濁し、ｐＨ９に調整し、そして濾過することによって、メタノール不溶性物質を、この生成物プールから除去する。この生成物プール（濾液）を、ロータリーエバポレーションを使用して固体にまで減少させる。
【０１４１】
もとのブロス容量１００Ｌあたり２Ｌの４：１ヘキサン：アセトンを添加し、２０分間混合し、そして濾過することによって、この生成物プール（固体）から１３−プロピル−エリスロマイシンＡを抽出する。残りの固体を、同じ方法でさらに２回抽出し、そして濾液を合わせる。この生成物プールを、ロータリーエバポレーションを使用して固体にまで減少させる。
【０１４２】
その最終精製工程は、ＨＰ２０ＳＳ樹脂（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）を使用するクロマトグラフィーである。カラムのサイズは、生成物の量に基づいて選択し、１リットルのＨＰ２０ＳＳ樹脂あたり１５ｇの１３−プロピルエリスロマイシンＡというローディング容量を越えないようにする。これ以前の工程からの固体を、もとのブロス容量１００Ｌあたり１Ｌのメタノール中に溶解し、そして等量の水を添加する。この５０％メタノール溶液を、直線流速２７５±２５ｃｍ／ｈにてこの樹脂床に通す。その後、このカラムを、１ＣＶの５０％メタノールで、その後、３ＣＶの６０％メタノールで、各々２７５±２５ｃｍ／ｈの速度で洗浄する。生成物を、各々２７５±２５ｃｍ／ｈの速度の３ＣＶの７０％メタノール、その後１０ＣＶの７５％メタノールを使用して溶出させる。溶出の間、１ＣＶごとの画分を収集する。その後、これらの画分を分析し、そして１３−プロピル−エリスロマイシンＡを含む画分を、合わせる。その生成物プールを、ロータリーエバポレーションを使用して固体にまで減少させる。
【０１４３】
（実施例８）
（８，９−アンヒドロ−６，９−ヘミアセタール（エノールエーテル）形成）
無水アセトニトリル（２ｍＬ）中のエリスロマイシン（１００ｍｇ）の溶液を、薄層クロマトグラフィーにより出発物質が消滅したことがわかるまで（２日間）、不活性雰囲気下で、ジクロロ酢酸（０．０１５ｍＬ）で処理する。この反応混合物を、濃縮し、５０ｍＬのジクロロメタン中に再溶解し、そして飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄する。その有機相を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして濃縮して粗生成物を得る。シリカゲルクロマトグラフィー（アセトン＋２％  Ｅｔ３Ｎ、ヘキサン）により、純粋な生成物を得る。上記手順において、このエリスロマイシンを対応するエリスロマイシン誘導体に置換することによって、本発明の他の化合物を形成する。
【０１４４】
本発明の化合物のうちの１つである８，９−アンヒドロエリスロマイシンＡ６，９−ヘミアセタールについての例示的ＮＭＲデータは、以下の通りである。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ１７８．２，１５１．７，１０２．９，１０１．４，９４．６，８５．５，８０．１，７８．２，７８．１，７６．３，７５．３，７３．０，７０．８，７０．１，６８．８，６５．８，６５．６，４９．５，４４．７，４３．２，４２．６，４０．３，３４．６，３０．５，２８．７，２６．２，２１．５，２１．３，２１．０，１８．２，１６．１，１５．０，１３．４，１１．９，１１．４，１０．８，８．６。
【０１４５】
（実施例９）
（８，９−アンヒドロエリスロマイシン６，９−ヘミアセタールから（８Ｓ，９Ｒ）−９−デキソ−６，９−エポキシエリスロマイシンへの水素化）
２４ｍＬの氷酢酸中の８，９−アンヒドロエリスロマイシン６，９−ヘミアセタール（０．５５ｍｍｏｌ；実施例８）の溶液を、ジフルオロ酢酸（０．１ｍＬ）および酸化プラチナ（０．４ｇ）で処理する。この混合物を、周囲温度にて４ａｔｍの水素下で３時間、または薄層クロマトグラフィーにより示される出発物質の消滅まで、振盪する。酢酸アンモニウム（０．３ｇ）を添加し、そしてこの混合物を１５分間攪拌し、その後、濾過し濃縮する。その残渣を、ジクロロメタン中に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そしてエバポレートする。シリカゲルクロマトグラフィー（アセトン＋２％  Ｅｔ３Ｎ、ヘキサン）により、純粋な生成物を得る。
【０１４６】
（実施例１０）
（１４員マクロライドから１２員マクロライドへの環収縮）
メタノール（５０ｍＬ）中の８，９−アンヒドロエリスロマイシン６，９−ヘミアセタール誘導体（１ｍｍｏｌ；実施例８）および炭酸カリウム（２００ｍｇ）の溶液を、この反応が平衡に達したことが薄層クロマトグラフィー分析により示されるまで、還流下で加熱する。この混合物をエバポレートして乾燥させ、その後、ＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、そしてシリカゲルでクロマトグラフする。１４員エノールエーテルと９−デオキソ−６，９−エポキシドの両方を、この手順を使用して、それらの１２員マクロライド対応物へと変換させる。２’−Ｏ−アセテート、４’’−Ｏ−ホルメート、４’’−Ｏ−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル）、または１１，１２−環状カルボネートを含む誘導体を、このプロセスの間に脱保護させる。
【０１４７】
（実施例１１）
（３’−Ｎ−デスメチルエリスロマイシン誘導体）
酢酸ナトリウム３水和物（３００ｍｇ）およびヨウ素（１１６ｍｇ）を、３ｍＬのメタノール中のエリスロマイシン（３００ｍｇ）の溶液に連続して添加する。反応混合物を、１２０Ｗフラッドランプに曝し、そして完全に反応するまで（薄層クロマトグラフィー分析により決定する）攪拌する。過剰な試薬を、飽和チオ硫酸ナトリウム溶液の添加によりクエンチし、そして、揮発性物質を減圧下で除去し、そして混合物をジクロロメタンで希釈する。有機相を、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そして濃縮して、粗生成物を得た。シリカゲルクロマトグラフィー（アセトン＋２％Ｅｔ３Ｎ、ヘキサン）により、純粋な生成物を得る。
【０１４８】
３’−Ｎ−デスメチル−８，９−アンヒドロエリスロマイシン６，９−ヘミアセタールを、上記の手順において、エリスロマイシンを８，９−アンヒドロエリスロマイシン６，９−ヘミアセタールに交換することにより調製する。
【０１４９】
（実施例１２）
（３’−Ｎ−デスメチル−３’−Ｎ−アルキル−エリスロマイシン誘導体）
アセトニトリル（６ｍＬ）中の３’−Ｎ−デスメチルエリスロマイシン誘導体（０．５ｍｍｏｌ；実施例１１）の溶液を、ジイソプロピルエチルアミン（０．２３ｍＬ）およびアルキル化剤（０．６ｍｍｏｌ）を用いて処理し、そしてエリスロマイシン出発物質が消費されるまで（薄層クロマトグラフィー分析により決定される）、不活性雰囲気下で４０〜８０℃で攪拌する。反応混合物を減圧下で濃縮し、そしてジクロロメタンに再溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そして濃縮して、粗生成物を得る。シリカゲルクロマトグラフィー（アセトン＋２％Ｅｔ３Ｎ、ヘキサン）により、純粋な生成物を得る。
【０１５０】
この手順に有用なアルキル化剤としては、ヨウ化エチル、臭化ベンジル、２−ヨードプロパン、４−ブロモ−１−ブテン、臭化アリル、臭化プロパルギル、またはヨウ化ｓｅｃ−ブチル、あるいは対応するトリフルオロメタンスルホネート（これらは、それぞれ、３’−Ｎ−エチル誘導体、イソプロピル誘導体、ブテニル誘導体、アリル誘導体、プロパルギル誘導体、またはｓｅｃ−ブチル誘導体を生じる）が挙げられる。
【０１５１】
３’−Ｎ−デスメチル−３’−Ｎ−アルキル−８，９−アンヒドロエリスロマイシン６，９−ヘミアセタールを、上記の手順において、３’−Ｎ−デスメチル−エリスロマイシンを３’−Ｎ−デスメチル−８，９−アンヒドロエリスロマイシン６，９−ヘミアセタール（実施例１１）に交換することにより調製する。
【０１５２】
（実施例１３）
（２’−Ｏ−アセチル−エリスロマイシン）
酢酸エチル（５０ｍＬ）中のエリスロマイシン（１３．４ｍｍｏｌ）の０℃溶液を、無水酢酸（１．４ｍＬ）で３０分間処理し、次いで、周囲温度で４時間維持する。混合物を、飽和ＮａＨＣＯ３でクエンチし、酢酸エチルで抽出する。抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そして減圧下で乾燥するまで濃縮して、粗生成物を得る。この生成物を、再結晶するかまたはシリカゲルクロマトグラフィーにより精製するかのいずれかを行う。本発明化合物の１つである、２’−Ｏ−アセチル−１３−プロピルエリスロマイシンＡ（これをアセトニトリルから再結晶した）についてのＮＭＲデータは以下である：
【０１５３】
【化１０】
2004530108.tif 000008
（実施例１４）
（２’−Ｏ−アセチル−４’’−デオキシ−エリスロマイシン）
工程１．１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の２’−Ｏ−アセチル−エリスロマイシン（３．５ｍｍｏｌ；実施例１３）、チオカルボニルジイミダゾール（１ｇ）、および４−ジメチルアミノピリジン（０．６７ｇ）の混合物を、周囲温度にて一晩攪拌する。この混合物を１５０ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３で処理し、次いで、有機相を水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そしてエバポレートする。生成物４’’−Ｏ−チオカルボニルイミダゾリドを結晶化する。
【０１５４】
工程２．工程１からの生成物を、６０ｍＬのトルエンに溶解し、そして９８℃に加熱する。水素化トリブチルスズ（１．９ｍＬ）、次いで２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（６０ｍｇ）を添加し、そして加熱を３５分間続ける。混合物を減圧下で濃縮する。油状の残渣を、３４０ｍＬのアセトニトリルに溶解し、５部のヘキサンで洗浄し、そして濃縮して、粗生成物を得る。シリカゲルクロマトグラフィーによる精製により、純粋な生成物を得る。本発明の化合物の１つである、２’−Ｏ−アセチル−４’’−デオキシエリスロマイシンＡについてのＮＭＲデータは以下である：
【０１５５】
【化１１】
2004530108.tif 000009
（実施例１５）
（２’−Ｏ−アセチル−４’’−Ｏ−（２，２，２，−トリクロロエトキシカルボニル）−エリスロマイシン）
ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）中の２’−Ｏ−アセチルーエリスロマイシン（１００ｍｍｏｌ；実施例１３）および４−メチルアミノピリジン（４９．０ｇ）の溶液を、−７８℃に冷却し、そして不活性雰囲気下で攪拌する。トリクロロエチルクロロホルメート（５０ｍＬ）を滴下し、そして混合物を４８時間攪拌する。周囲温度まで温めた後、混合物を冷リン酸緩衝液（５％ＫＨ２ＰＯ４と１％Ｋ２ＨＰＯ４の１：１  ｖ／ｖ混合物）、次いでブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そして濃縮する。生成物を、結晶化またはシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０１５６】
（実施例１６）
（２’−Ｏ−アセチル−エリスロマイシンＡ  １１，１２−サイクリックカルボネート）
１３ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の２’−Ｏ−アセチル−４’’−デオキシ−エリスロマイシンＡ（１．６ｍｍｏｌ；実施例１４）、１，１−カルボニルジイミダゾール（１．６４ｇ）、および４−ジメチルアミノピリジン（０．４１ｇ）の混合物を、固体を溶解するまで穏やかに温め、次いで、周囲温度で一晩攪拌する。飽和ＮａＨＣＯ３（２０ｍＬ）を添加し、そして１５分間攪拌し、次いで混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。抽出物を水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そしてエバポレートして、２’−Ｏ−アセチル−４’’−デオキシ−エリスロマイシンＡ  １１，１２−サイクリックカルボネートを得る。
【０１５７】
２’−Ｏ−アセチル−４’’−Ｏ−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル）エリスロマイシンＡ  １１，１２−サイクリックカルボネートを、上記の手順において、２’−Ｏ−アセチル−４’’−デオキシ−エリスロマイシンＡを、２’−Ｏ−アセチル−４’’−Ｏ−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル）エリスロマイシンＡ（実施例１５）に交換することにより作製する。
【０１５８】
（実施例１７）
（（９Ｓ）−９−ジヒドロ−エリスロマイシン）
１０ｍＬのエタノール中の２’−Ｏ−アセチル−４’’−デオキシ−エリスロマイシンＡ  １１，１２−サイクリックカルボネート（０．５ｍｍｏｌ；実施例１６）の溶液を、水素化ホウ素ナトリウム（２００ｍｇ）で処理し、そして反応を薄層クロマトグラフィーによりモニターする。反応が約８０％完了した時に、０．５Ｍリン酸緩衝液（５０ｍＬ）を添加し、そして混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。抽出物をリン酸緩衝液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そしてエバポレートする。生成物である（９Ｓ）−２’−Ｏ−アセチル−４’’−デオキシ−９−ジヒドロ−エリスロマイシンＡ  １１，１２−サイクリックカルボネートを、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。本発明の化合物の１つである、（９Ｓ）−２’−Ｏ−アセチル−９−ジヒドロエリスロマイシンＡ  １１，１２−サイクリックカルボネートについてのＮＭＲデータは以下である：
【０１５９】
【化１２】
2004530108.tif 000010
（９Ｓ）−２’−Ｏ−アセチル−９−ジヒドロ−エリスロマイシンＡを、２’−Ｏ−アセチル−４’’−デオキシ−エリスロマイシンＡ  １１，１２−サイクリックカルボネートの代わりに、２’−Ｏ−アセチル−４’’−Ｏ−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル）エリスロマイシンＡ  １１，１２−サイクリックカルボネート（実施例１６）に代えることにより作製する。
【０１６０】
（実施例１８）
（９−デオキソ−６，９−エポキシ−エリスロマイシン）
２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の（９Ｓ）−２’−Ｏ−アセチル−４’’−デオキシ−９−ジヒドロ−エリスロマイシンＡ  １１，１２−サイクリックカルボネート（１ｍｍｏｌ；実施例１７）の溶液を、０℃にて、ピリジン（０．２６ｍＬ；実施例２１）および無水トリフルオロメタンスルホン酸（０．３５ｍＬ）で処理する。３０分後、飽和ＮａＨＣＯ３を添加し、そして混合物をＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。抽出物を、水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そしてエバポレートする。生成物である（８Ｒ，９Ｒ）−２’−Ｏ−アセチル−４’’−デオキシ−９−デオキソ−６，９−エポキシ−１３−デスエチル−１３−Ｒ−エリスロマイシンＡを、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
【０１６１】
（実施例１９）
（２’−Ｏ−アセテートおよび１１，１２−サイクリックカルボネート保護の除去）
２５ｍＬのメタノール中の２’−Ｏ−アセチル−エリスロマイシン１１，１２−サイクリックカルボネート（１ｍｍｏｌ；実施例１６）の溶液を、炭酸カリウム（３ｍｍｏｌ）で処理する。反応の完了の際に、混合物をエバポレートし、そして残渣をＣＨ２Ｃｌ２中に溶解する。抽出物を、水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そしてエバポレートする。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
【０１６２】
（実施例２０）
（４’’−Ｏ−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル）保護の除去）
ヨウ化サマリウムを、４０ｍＬのテトラヒドロフラン中のサマリウム（３．４３ｍｍｏｌ）とヨウ素（３．０９ｍｍｏｌ）の溶液を、還流下で、２．５時間、攪拌することにより調製する。周囲温度まで冷却する際に、１０ｍｇのＮｉＩ２を添加し、そして混合物を−７８℃まで冷却する。１０ｍＬのテトラヒドロフラン中の４’’−Ｏ−（２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル）保護化エリスロマイシン誘導体（０．３８６ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、そして混合物を、−７８℃にて１時間攪拌する。反応を飽和ＮａＨＣＯ３の添加によりクエンチし、周囲温度まで温め、そしてエーテルで抽出する。抽出物を、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そしてエバポレートする。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。
【０１６３】
（実施例２１）
（１２員マクロライド１２，１３−エポキシド）
ＣＨ２Ｃｌ２中の１２員マクロライド（１ｍｍｏｌ；実施例１０）の溶液を、ＣＨ２Ｃｌ２中のビス［α，α−ビス（トリフルオロメチル）ベンゼンメタノラート］−ジフェニルイオウ（１．５ｇ）の溶液に添加する。４５分後、サルフラン（ｓｕｌｆｕｒａｎｅ）（０．７５ｇ）の第２の部分を添加し、そして反応を、さらに３０分間続ける。混合物を酢酸エチルに注ぎ、そして５％ＮａＨＣＯ３水を、水相のｐＨが７に達するまで添加する。有機相を分離し、そして水相を酢酸エチルで３回抽出する。有機相を合わせ、ＮａＣｌ水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そしてエバポレートする。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
【０１６４】
（実施例２２）
（エリスロマイシンＡラクタム）
７Ｎのメタノール性アンモニア（１００ｍＬ）中のエポキシド（１ｍｍｏｌ；実施例２１）および塩化アンモニウム（２ｇ）の溶液を、気密ボンベ（ｓｅａｌｅｄ  ｂｏｍｂ）に入れ、そして１００℃にて４日間加熱する。ボンベを冷却し、そして開放し、混合物を乾燥するまでエバポレートする。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
【０１６５】
（実施例２３）
（Ｎ−アルキル−エリスロマイシンＡラクタム）
エポキシド（１ｍｍｏｌ；実施例２１）、アルキルアミンＲ−ＮＨ２（０．５ｍｏｌ）、および濃ＨＣｌ（５ｍｍｏｌ）の溶液を、気密ボンベに入れ、そして１００℃にて４日間加熱する。ボンベを冷却し、そして開放し、混合物を乾燥するまでエバポレートする。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
【０１６６】
（実施例２４）
（３’−Ｎ−デスメチル−エリスロマイシンラクタム）
１０ｍＬの８０：２０メタノール／水中の９−デオキソ−６，９−エポキシ−エリスロマイシンＡラクタム（１ｍｍｏｌ；実施例２２）および酢酸ナトリウム３水和物（６９０ｍｇ）を、４７℃に加熱し、そしてヨウ素（２５７ｍｇ）で処理する。ｐＨを、必要な場合、１Ｎ  ＮａＯＨの添加により８〜９の範囲に維持する。２時間後、無色混合物を、水に注ぎ、そしてｐＨ１０に調整し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。抽出物を、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３およびブラインで連続して洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そしてエバポレートする。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
【０１６７】
（実施例２５）
（３’−Ｎ−デスメチル−エリスロマイシンラクタムの代替の調製）
４０ｍＬの無水ＣＨ３ＣＮ中のデオキソ−６，９−エポキシ−１３−エリスロマイシンＡラクタム（１ｍｍｏｌ；実施例２２）の溶液を、０℃にて、少量のＮ−ヨードスクシンイミド（２７０ｍｇ）で処理する。添加の後、混合物を周囲温度にて１２時間維持する。混合物を酢酸エチルで希釈し、そしてＮａＨＳＯ３水、５％Ｎａ２ＣＯ３、およびブラインで連続して洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そしてエバポレートする。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
【０１６８】
（実施例２６）
（３’−Ｎ−デスメチル−３’−Ｎ−アルキル−エリスロマイシンラクタム）
ＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）中の３’−Ｎ−デスメチル−９−デオキソ−６，９−エポキシ−エリスロマイシンＡラクタム（１ｍｍｏｌ；実施例２４および２５）の溶液を、周囲温度で２日間攪拌しながら、固体ＮａＨＣＯ３（４２０ｍｇ）およびアルキル化剤（例えば、ハロゲン化アルキルまたはアルキルスルホネート）（１．１ｍｍｏｌ）で処理する。混合物を酢酸エチルで希釈し、そして飽和ＮａＨＣＯ３およびブラインで連続して洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そしてエバポレートする。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
【０１６９】
（実施例２７）
（３’−Ｎ−デスメチル−３’−Ｎ−アルキル−エリスロマイシンラクタムの代替の調製）
２０ｍＬのメタノール中の３’−Ｎ−デスメチル−９−デオキソ−６，９−エポキシ−エリスロマイシンＡラクタム（２ｍｍｏｌ；実施例２４および２５）およびアルデヒドまたはケトン（８ｍｍｏｌ）の溶液を、周囲温度にて１２時間、酢酸（０．４６ｍＬ）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．２５ｇ）で処理する。更なるアルデヒドまたはケトン（４ｍｍｏｌ）、酢酸（０．２３ｍＬ）、およびＮａＢＨ３ＣＮ（０．１３ｇ）を添加し、そして反応をさらに２４時間続ける。混合物を乾燥するまで濃縮し、次いで、ＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、そして５％水性Ｎａ２ＣＯ３およびブラインで連続して洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥し、ろ過し、そしてエバポレートする。生成物を、シリカゲルクロマトグラフィーにより単離する。
【０１７０】
（実施例２８）
（２’−Ｏ−アセチル−４’’−Ｏ−ホルミル−エリスロマイシン）
（工程１．  ２’，４’’−ジ−Ｏ−ホルミルエリスロマイシン）エーテル（２５ｍＬ）およびピリジン（０．５ｍＬ）中のエリスロマイシン（１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、０℃にて、ギ酸、酢酸、無水物（ｆｏｒｍｉｃ  ａｃｅｔｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）（１８ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応混合物を０℃にて１時間および２５℃にて３時間攪拌する。反応混合物を氷に注ぎ、そしてＥｔ２Ｏ層を、冷飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下で濃縮する。次いで、残渣を、エーテルまたはアセトニトリルから結晶化する。
【０１７１】
（工程２．  ４’’−Ｏ−ホルミルエリスロマイシン）アセトン（１０ｍＬ）中の２’，４’’−ジ−Ｏ−ホルミルエリスロマイシン（１ｍｍｏｌ）の溶液に、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１０ｍＬ）を添加し、そして反応混合物を、ＴＬＣ分析により十分に完了したとみなされるまで攪拌する。揮発性物質を、減圧下で取り除き、そして水性残渣を塩化メチレンで抽出する。有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下で濃縮する。残渣を、次いで、エーテルまたはアセトニトリルから結晶化する。
【０１７２】
（工程３．  ２’−Ｏ−アセチル−４’’−Ｏ−ホルミルエリスロマイシン）塩化メチレン（２５ｍＬ）中の４’’−Ｏ−ホルミルエリスロマイシンＡ（１ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃で、無水酢酸（１．１ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応混合物を、一晩攪拌する。過剰な試薬を、飽和ＮａＨＣＯ３溶液の添加によりクエンチする。有機層を、硫酸マグネシウムで乾燥し、減圧下で濃縮し、そして残渣をアセトニトリルから再結晶する。
【０１７３】
（実施例２９）
（１１−ケトエリスロマイシン）
塩化メチレン（１３ｍＬ）中の、２’−Ｏ−アセチル−４’’−Ｏ−ホルミルエリスロマイシン６，９−エノールエーテル（実施例２８、１ｍｍｏｌ）、メチルスルホキシド（１１ｍｍｏｌ）、およびジシクロヘキシルカルボジイミド（３ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃にて、トリフルオロ酢酸ピリジニウム（３ｍｍｏｌ）を滴下する。反応混合物を、室温で４時間攪拌し、そしてろ過する。ろ過を、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下で濃縮する。残渣を、フラッシュクロマトグラフィーにより精製する。
【０１７４】
（実施例３０）
（１２−Ｏ−アルキル−１１−ケトエリスロマイシン）
ジメチルホルムアミド（１５ｍＬ）中の２’−Ｏ−アセチル−４’’−Ｏ−ホルミル−１１−デオキシ−１１−オキソエリスロマイシン６，９−エノールエーテル（実施例２９、１ｍｍｏｌ）の溶液に、０℃にて、水素化ナトリウム（１．５ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応混合物を２０分間攪拌する。次いで、アルキル化剤（例えば、１２−Ｏ−メチルを生成するためにヨードメタン）（２ｍｍｏｌ）を添加し、そして反応混合物を、２時間またはＴＬＣにより完了したとみなされるまで攪拌する。過剰の試薬を、飽和ＮａＨＣＯ３溶液の添加によりクエンチし、そして混合物を酢酸エチルで抽出する。合わせた有機層を、水およびブラインで洗浄し、次いで、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下で濃縮する。次いで、残渣をメタノール（７．５ｍＬ）に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（０．５ｍＬ）を添加し、そして反応混合物を一晩攪拌する。反応混合物を、塩化メチレンで抽出し、そして合わせた有機層をブラインで洗浄し、そして減圧下で濃縮する。残渣を、フラッシュクロマトグラフィーにより精製する。
【０１７５】
（実施例３１）
（１１−デオキシエリスロマイシンＢ  ６，９−エノールエーテル）
ＴＨＦ中の２’−Ｏ−アセチル−４’’−Ｏ−ホルミルエリスロマイシンＢ  ６，９−エノールエーテルの０℃溶液を、不活性雰囲気下で、６０％水素化ナトリウムで処理し、そして３０分間攪拌し、そして周囲温度まで温める。次いで、二硫化炭素を添加し、反応混合物を１時間攪拌し、そしてヨウ化メチルを添加し、そしてさらに１時間攪拌する。過剰な試薬を飽和重炭酸ナトリウム溶液の添加によりクエンチし、そして揮発性物質を減圧下で除去する。水性の残渣を塩化メチレンで抽出し、そして合わせた有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、そして減圧下で濃縮して、粗生成物を得る。この粗生成物を、トルエンに溶解し、そして不活性雰囲気下で加熱還流する。次いで、水素化トリブチルスズおよびＡＩＢＮを添加し、そして反応混合物を１時間、還流温度で維持し、そして室温まで冷却する。揮発性物質を、減圧下で除去し、残渣をアセトニトリルに溶解し、次いで、ヘキサンで繰返し洗浄する。アセトニトリル層を、減圧下で濃縮する。残渣を、フラッシュクロマトグラフィーにより精製し、そしてメタノールに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（３体積％）を添加し、そして反応混合物を、一晩攪拌する。反応混合物を、塩化メチレンで抽出し、そして合わせた有機層をブラインで洗浄し、そして減圧下で濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィーで精製する。
【０１７６】
多数の改変が、前述の系の基本的な教示から逸脱することなく、前述の系に対してなされ得る。本発明を、１つ以上の特定の実施形態を参照して、かなり詳細に記載してきたが、当業者は、変更が本明細書中に具体的に開示される実施形態に対してなされ得、それにもかかわらず、これらの改変および改良は、添付の特許請求の範囲に示されるような、本発明の範囲および精神の範囲内にあることを認識する。本明細書中で引用された全ての刊行物または特許文献は、各々のこのような刊行物または文献が、本明細書中で参考として援用されることを具体的かつ個別に示されるように、本明細書中で参考として援用される。
【０１７７】
上記の刊行物および文献の引用は、前述のいずれかが適切な先行技術であるという承認として解釈されないし、これらの刊行物または文献の内容またはデータに関する任意の承認とはならない。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図１は、エクオリンを介したＧＰＣＲ作動（ａｇｏｎｉｓｍ）を測定する原理を示す模式図である。
【図２】図２は、エクオリンおよびモチリンレセプターを安定に発現する５０，０００個のＨＥＫ２９３細胞のルミネッセンス応答を示すグラフである。
【図３】図３は、ＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現されたオーファンレセプターＣＲＬＲ（カルシトニンレセプター様レセプター）を示すグラフである。
【図４】図４は、Ｃ３ａレセプターのＣａ２＋動員応答の模式図である。
【図５】図５は、Ｃ３ａレセプターで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞においてＣ３ａにより誘導されたカルシウム動員を示すグラフである。
【図１】
2004530108.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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2004530108.tif 000072
2004530108.tif 000073
2004530108.tif 000074
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004530108.tif 000075
【国際調査報告】
2004530108.tif 000076
2004530108.tif 000077
2004530108.tif 000078