(57)【要約】本発明は、アデノシン受容体によるグリコーゲン合成キナーゼ3β（GSK-3β）の調整に関する。リガンドのタイプに依存して、調整は、キナーゼ活性のダウンレギュレーションまたはアップレギュレーションによって現れるであろう。したがって、アデノシン受容体またはARLsの組合せを使用することにより、細胞においてGSK-3β活性を調節することを含む、治療的な効果を達成するための方法および医薬組成物が、本発明によって提供される。調整がGSK-3β活性の活性化を含むときは、ARLは、アデノシンA1受容体アゴニスト（A1RAg）、アデノシンA3受容体アゴニスト（A3RAg）、アデノシンA2受容体アンタゴニスト（A2RAn）または前述のもののの組合せであってもよく、一方、調整がGSK-3β活性の阻害を含むときは、ARLは、アデノシンA1受容体アンタゴニスト（A1RAn）、アデノシンA3受容体アンタゴニスト（A3RAn）、アデノシンA2受容体アゴニスト（A2RAg）または前述のもののの組合せを含んでもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的な治療のための方法であって、治療的な効果を達成するための活性な薬剤の有効な量を必要な患者に投与することを含み、該治療的な効果は、細胞においてGSK-3β活性を調整することを含み、かつ前記活性な薬剤は、アデノシン受容体リガンド（ARL）である方法。
【請求項２】
請求項1に記載の方法であって、前記調整は、GSK-3β活性の活性化を含み、かつ前記ARLは、アデノシンA1受容体アゴニスト（A1RAg）、アデノシンA3受容体アゴニスト（A3RAg）、アデノシンA2受容体アンタゴニスト（A2RAn）または前述のもののの組合せから選択される方法。
【請求項３】
請求項1に記載の方法であって、前記調整は、GSK-3β活性の阻害を含み、かつ前記ARLは、アデノシンA1受容体アンタゴニスト（A1RAn）、アデノシンA3受容体アンタゴニスト（A3RAn）、アデノシンA2受容体アゴニスト（A2RAg）または前述のもののの組合せから選択される方法。
【請求項４】
前記ARLがA1RAgである、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
請求項5に記載の方法であって、前記A1RAgがN6-シクロペンチルアデノシン（CPA）、2-クロロ-CPA（CCPA）、N6-シクロヘキシルアデノシン（CHA）、N6-(フェニル-2R-イソプロピル)アデノシン（R-PIA）および8-{4-[({[(2-アミノエチル)アミノ]カルボニル}メチル)オキシル-フェニル}-1,3-ジプロピルキサンチン（XAC）からなる群から選択される方法。
【請求項６】
前記ARLがアデノシンA1受容体アゴニスト（A3RAg）である、請求項2に記載の方法。
【請求項７】
請求項6に記載の方法であって、前記A3RAgは、2-(4-アミノフェニル)エチルアデノシン（APNEA）、N6-(4-アミノ-3-ヨードベンジル)アデノシン-5'-(N-メチルウロンアミド)（AB-MECA）、N6-(2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N-メチル-ウロンアミド（IB-MECA）および2-クロロ-N6-(2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N-メチル-ウロンアミド（Cl-IB MECA）よりなる群から選択される方法。
【請求項８】
前記A3RAgがCI-IB-MECAである、請求項6に記載に記載の方法。
【請求項９】
前記ARLがキサンチン-7-リボシド誘導体である、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
前記ARLがアデノシンA2受容体アンタゴニスト（A2RAn）である、請求項2に記載の方法。
【請求項１１】
前記A2RAnが3,7-ジメチル-1-プロパルギル-キサンタン（DMPX）である、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
請求項2に記載の方法であって、その治療にGSK-3β活性の上昇を必要とする病気または疾患の治療のための方法。
【請求項１３】
前記疾患が毛損失である、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記ARLがA1RAnである請求項3に記載の方法。
【請求項１５】
前記A1RAnが1,3-ジプロピル-8-シクロペンチルキサンチン（DPCPX）である請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
前記ARLがA3RAnである請求項3に記載の方法。
【請求項１７】
請求項16に記載の方法であって、前記A3RAnは、5-プロピル-2-エチル-4-プロピル-3-エチルスルフィニルカルボニル）-6-フェニルピリジン-5-カルボン酸塩（MRS-1523）および9-クロロ-2-(2-フラニル)-5[(フェニルアセチル)アミノ][1,2,4]-トリアゾロ[1,5-c]キナゾリン（MRS-1200）からなる群より選択される方法。
【請求項１８】
前記ARLがアデノシンA2RAgである、請求項3に記載の方法。
【請求項１９】
前記A2RAgがN6-[2-(3,5-ジメトキシフェニル)-2-(2-メチルフェニル)-エチル]アデノシン（DMPA）である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
請求項3に記載の方法であって、その治療にGSK-3β活性の抑制を必要とする病気または疾患の治療のための方法。
【請求項２１】
前記疾患が細胞の変性に関連した疾患である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記疾患が神経変性疾患または神経外傷疾患である、請求項20に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患が精神障害と関連している、請求項20に記載の方法。
【請求項２４】
前記疾患がインスリン非依存型糖尿病である、請求項20に記載の方法。
【請求項２５】
前記活性な薬剤が経口的に投与される、請求項1に記載の方法。
【請求項２６】
治療的な効果を、必要な患者において達成するための医薬組成物であって、該治療的な効果は、標的細胞においてGSK-3β活性を調整することを含み、該組成物は、少なくとも1つの活性な薬剤の治療的に有効な量と1つまたは複数の薬学的に許容される添加物とを含み、前記活性な薬剤は、アデノシン受容体リガンド（ARL）である医薬組成物。
【請求項２７】
請求項26の組成物であって、前記調整は、GSK-3β活性の活性化を含み、前記ARLは、アデノシンA1受容体アゴニスト（A1RAg）、アデノシンA3受容体アゴニスト（A3RAg）、アデノシンA2受容体アンタゴニスト（A2RAn）または前述のもののの組合せから選択される組成物。
【請求項２８】
請求項26の組成物であって、前記調整は、GSK-3β活性の阻害であり、前記ARLは、アデノシンA1受容体アンタゴニスト（A1RAn）、アデノシンA3受容体アンタゴニスト（A3RAn）、アデノシンA2受容体アゴニスト（A2RAg）または前述のもののの組合せから選択される組成物。
【請求項２９】
前記ARLがA1RAgである、請求項27の組成物。
【請求項３０】
請求項29の組成物であって、前記A1RAgは、N6-シクロペンチルアデノシン（CPA）、2-クロロ-CPA（CCPA）、N6-シクロヘキシルアデノシン（CHA）、N6-（フェニル-2R-イソプロピル)アデノシン（R-PIA）および8-{4-[({[(2-アミノエチル)アミノ]カルボニル}メチル)オキシル-フェニル}-1,3-ジプロピルキサンチン（XAC）からなる群より選択される組成物。
【請求項３１】
前記ARLがA3RAgである、請求項27の組成物。
【請求項３２】
請求項31の組成物であって、前記A3RAgが2-(4-アミノフェニル)エチルアデノシン（APNEA）、N6-（4-アミノ-3-ヨードベンジル）アデノシン-5'-(N-メチルウロンアミド)（AB-MECA）、N6-(2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N-メチル-ウロンアミド（IB-MECA）および2-クロロ-N6-(2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N-メチル-ウロンアミド（Cl-IB-MECA）からなる群より選択される組成物。
【請求項３３】
前記A3RAgがCl-IB-MECAである、請求項32に記載の組成物。
【請求項３４】
ARLがキサンチン-7-リボシド誘導体である、請求項31に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ARLがA2RAnである、請求項27に記載の組成物。
【請求項３６】
前記A2RAnが3,7-ジメチル-1-プロパルギル-キサンタン（DMPX）である、請求項35に記載の組成物。
【請求項３７】
請求項27に記載の組成物であって、その治療にGSK-3β活性の上昇を必要とする病気または疾患の治療のための、組成物。
【請求項３８】
毛損失の治療のための、請求項37に記載の組成物。
【請求項３９】
前記活性な薬剤がA3RAnである、請求項28に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項39に記載の組成物であって、前記A3RAnは、5-プロピル-2-エチル-4プロピル-3-エチルスルファニルカルボニル）-6-フェニルピリジン-5-カルボン酸塩（MRS-1523）および9-クロロ-2-(2-フラニル)-5-[(フェニルアセチル)アミノ][1,2,4]-トリアゾロ[1,5-c]キナゾリン（MRS-1200）である組成物。
【請求項４１】
前記ARLがA1RAnである、請求項28に記載の組成物。
【請求項４２】
前記A1RAnが1,3-ジプロピル-8-シクロペンチルキサンチン（DPCPX）である、請求項41に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ARLがA2RAgである、請求項28に記載の組成物。
【請求項４４】
請求項43に記載の組成物であって、前記A2RAgは、N6-[2-(3,5-ジメトキシフェニル)-2-（メチルフェニル）-エチル]アデノシン（DMPA）である組成物。
【請求項４５】
請求項26に記載の組成物であって、その治療にGSK-3β活性の抑制を必要とする病気または疾患の治療のための、組成物。
【請求項４６】
前記疾患が細胞の変性と関連した疾患である、請求項45に記載の組成物。
【請求項４７】
前記疾患が神経変性疾患または神経外傷疾患である、請求項45に記載の組成物。
【請求項４８】
前記疾患が精神障害と関連している、請求項45に記載の組成物。
【請求項４９】
前記疾患がインスリン非依存型糖尿病である、請求項45に記載の組成物。
【請求項５０】
経口投与のために処方される、請求項26に記載の組成物。
【請求項５１】
細胞においてGSK-3β活性を調整するための、アデノシン受容体リガンドの使用。
【請求項５２】
GSK-3β活性を上昇するための請求項51に記載の使用であって、前記ARLは、A1RAg、A3RAg、A2RAnまたは前述のもののあらゆる組合せから選択される使用。
【請求項５３】
GSK-3β活性を抑制するための請求項51に記載の使用であって、前記ARLは、A1RAn、A3RAn、A2RAgまたは前述のもののあらゆる組合せから選択される使用。
【請求項５４】
GSK-3β活性の抑制をその治療のために必要とする病気または疾患の治療のための医薬組成物の調製のための、アデノシン受容体リガンド（ARL）の使用。
【請求項５５】
請求項51に記載の使用であって、実質的に明細書において説明した通りの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、GSK-βのモジュレーターとしてアデノシンアゴニストおよびアンタゴニストを治療上使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノシン受容体カスケード
アデノシンは、全ての体細胞に存在する普遍的なヌクレオシドである。代謝的に活性な細胞またはストレスを与えられた細胞から放出され、その後に調節分子として作用する。特異的A1、A2アデノシンA2BおよびA3 Gタンパク質結合細胞表面受容体を介して細胞に結合することにより、アデニリルシクラーゼおよびホスホリパーゼCのレベルを調節することによってシグナル伝達分子として作用する(非特許文献1,2)。アデノシン受容体は、以降の本願明細書において「A1受容体」または「A1R」などを指す。A3受容体(A3R)に対するアデノシンおよびそのアゴニストの結合は、Giタンパク質カスケードを活性化することが知られており、これがアデニル酸シクラーゼ活性およびcAMPの産生を阻害する。cAMPは、タンパク質キナーゼおよびB（それぞれPKAおよびPKB／Akt）のレベルと活性とを調節し、種々の細胞外シグナルによって誘導されるキナーゼカスケードにおいて中心的な役割を演じている（非特許文献3,4）。PKAは、触媒サブユニットであるPKAcを含み、これは、cAMPで活性化することによって親分子から分離される。最近、ファン（Fang）ら（非特許文献5）は、PKAcが、インスリンに応答してグリコーゲン合成を調節するセリン／スレオニンキナーゼであるグリコーゲン・シンターゼ・キナーゼー3β（GSK-3β）をリン酸化して不活性化することを示した。また、GSK-3βは、PKB／Aktの直接の基質として作用し、そのリン酸化および不活性化を誘導する（非特許文献6）。
【０００３】
Wntシグナル伝達経路
Wntシグナリング経路は、その最も有名な参加者であるβ-カテニンおよびLef/Tctと共に、悪性黒色腫を含む多くの新形成における重要なプレーヤーとして明らかになっている。Wntのプレーヤーは、細胞増殖および細胞の運命を調節するパラクリンおよびオートクリンな因子のファミリーである[Peifer M. and Polakis P. Science 287:1606-1609 (2000)]。Wnt経路によるシグナリングは、WntリガンドがFrizzledファミリーの膜貫通受容体に結合するときに開始される（図1）。Frizzleds（Frz）は、Dishevelled（Dsh）を介してシグナルを送り、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3（GSK-3β）、APC、AXINおよびその他のタンパク質を含む複合体のキナーゼ活性を阻害する。複合体は、β-カテニンをターゲットし、エキソン3のスレオニンおよびセリン残基をリン酸化する。リン酸化されたβ-カテニンは、ユビキチン-プロテアソーム経路によって迅速に分解される。β-カテニンのエキソン3のセリンおよびスレオニン残基における変異は、カテニンのリン酸化を遮断し、タンパク質の安定化を生じる。一旦Wntシグナリングによる低リン酸化が起こると、安定化β-カテニンが細胞に蓄積され、これが核に移行して転写因子のLef/Tcfファミリーに結合し、サイクリンDおよびc-mycを含むWnt標的遺伝子の発現をアップレギュレートする[Sakanaka C, et ao. Recent Prog Horm Res. 55）：225-236 (2000)].
Wntシグナリングおよびヒト疾患
GSK-3β欠損に関連した疾患
メラノーマの発生にWnt経路が関与することは、β-カテニンのN末端における単一突然変異の存在によって発見された[Robbins P F et al. J Exp Med. 183:1185-1192 (1996)]。この発見は、APC（adenomaious polyposis coli）およびβ-カテニンなどのWnt経路の下流の成分が、ヒト癌に関与することを示唆する後者の報告によって支持された。また、Wntリガンドは、腫瘍において高度に発現されているといういくつかの報告もある。
【０００４】
加えて、Wnt/APC/β-カテニン/Tcf経路における欠損は、その他の腫瘍にも関係するという報告がある。たとえば、APCにおける体細胞の突然変異は、典型的には、調節活性を持たない切断されたタンパク質を導き、フリーのβ-カテニンが蓄積する原因となり得る。あるいは、β-カテニンの変異は、β-カテニンの半減期を増加することができ、後者では、次いでmycおよびサイクリンDなどの細胞周期調節因子の転写を刺激することができる。β-カテニンのレベルは、これらの細胞にAPCを過剰発現することによって減少することができ、および／またはGSK-3βの活性の増強は、β-カテニンのリン酸化およびその分解を引き起こす[Robbins P F et al. J Exp Med. 183: 1185-1192 (1996); Barker N et al. Adv Cancer Res. 77: 1-24 (2000)]。
【０００５】
GSK-3βの機能亢進に関する疾患
キナーゼGSK-3βは、もう一つのキナーゼであるサイクリン依存性キナーゼ（CDK5）と共に、神経変性アルツハイマー疾患において観察される微小管結合タンパク質tauの異常な過剰リン酸化の一部原因であることが見出された。したがって、GSK-3βを阻害する薬剤は、アルツハイマー疾患の治療または予防だけでなく、前頭葉退化（frontal lobe degeneration）、好銀性グレイン疾患（argyrophilic grains disease）および亜急性硬化全脳炎（subacute scleroting panencephalitis）（神経中枢系におけるウィルス感染の後遺合併症として）などのその他の過剰リン酸化に関連した変性疾患の治療または予防のために、また、急性脳卒中などの神経外傷疾患の治療、分裂病および躁うつ病などの精神（気分）病の治療のためにも有用であろう。
【０００６】
加えて、増加されたGSK-3活性がインスリン抵抗性およびタイプII糖尿病（インスリン非依存型糖尿病）の発生に関与することが示されている。したがって、ここで示唆たように、GSK-3β活性を抑制する薬剤は、タイプII糖尿病の治療または予防に使用してもよい。
【非特許文献１】Linden J. The FASEB J 5:2668-2676 (1991)
【非特許文献２】Stiles G. L. Clin. Res. 38:10-18 (1990)
【非特許文献３】Fishman P. et al. Cancer Research 58:3181-3187 (1998)
【非特許文献４】Sable CL, et al. FEBS Lett 409:253-257 (1997);
【非特許文献５】Fang X, et al. Proc Nat Acad Sci U S A. 97:11960-11965(2000);
【非特許文献６】Cross DA, et al. Nature 378:785-789.(1995);
【非特許文献７】Fishman, P. et al. Eur. J. Cancer 36: 1452-1458 (2000);
【非特許文献８】Moule SK, et al. J Biol chem Mar 272:7713-7729 (1997);
【発明の開示】
【０００７】
発明の要旨
本発明は、GSK-3β活性を調節することができる薬剤を提供することを、その目的として有する。本発明に従ったこれらの薬剤は、アデノシン受容体のアゴニストまたはアンタゴニストである。
【０００８】
本発明は、アゴニストまたはアンタゴニストのいずれかであるアデノシン受容体のリガンドが、Wntシグナル伝達経路を調節することができるという驚くべき所見に基づいている。たとえば、黒色腫細胞におけるA3アデノシン受容体（A3AR）の活性化は、cAMPレベルを減少し、これによりPKAおよびPKB／Aktの両者の活性化を阻止した。その結果、GSK-3βはリン酸化されず、活性型のままであり、細胞周期停止およびアポトーシスの誘導して引き起こした。
【０００９】
GSK-3βおよびWntシグナル伝達経路のその他の成分は、上述したものを含む種々のヒトの病気または疾患を治療するための薬剤の標的として提案された。しかし、これらを直接の標的とし、かつ影響を及ぼすためには、該薬が細胞に入る必要がある。本発明に従って、これらの薬剤は、標的細胞表面に存在する受容体であるアデノシン受容体を介して間接的にターゲットされる。
【００１０】
したがって、本発明は、最も広義な治療的な治療のための方法であって、治療的な効果を達成するための活性な薬剤の有効な量を必要な患者に投与することを含み、該治療的な効果は細胞におけるGSK-3β活性を調整することを含み、かつ該活性な薬剤はアデノシン受容体リガンド（ARL）である方法に関する。
【００１１】
本願明細書において用いられる「リガンド」の用語は、アデノシン受容体の1つまたは複数に結合し、これによりその対応する受容体の活性に影響（完全にまたは部分的に）を与えることができるあらゆる分子をいう。本発明に従ったリガンドは、特異的であってもよく、たとえば、A1RLは、アデノシンA1受容体に特異的に結合する受容体である。あるいは、リガンドが一つ以上の受容体に結合して活性を調整する場合であってもよい。たとえば、リガンドは、アデニル酸シクラーゼを阻害することが知られているアデノシンA1およびA3受容体アゴニストであってもよい。
【００１２】
リガンドは、アデノシン受容体の完全アゴニスト、完全アンタゴニスト、部分的アゴニストまたは部分的アンタゴニストであってもよい。本明細書において使用されるものとして、化合物が、アデノシン受容体の活性化によって達成可能な最大に起こりうる応答を生じる（または誘導する（たとえば、濃度を増加したとき））場合は、これがこの受容体の「完全アゴニスト」である。この目的のために、本発明に従った薬剤は、これがアデニル酸シクラーゼ活性を完全に阻害することができる場合は、アデノシンA1またはA3受容体の完全アゴニストであり、一方、本発明に従った薬剤は、これがアデニル酸シクラーゼを完全に活性化することができる場合は、アデノシンA1またはA3受容体の「完全アンタゴニスト」とみなされるべきである。加えて、「部分的アゴニスト」は、どんなに高濃度を適用しても、この受容体の最大の活性化を生じさせることができない薬剤である。この目的のために、本発明に従った薬剤は、これがアデニル酸シクラーゼ活性を部分的に阻害することができる場合は、アデノシンA1またはA3受容体の「部分的アゴニスト」であり、一方、薬剤がアデニル酸シクラーゼを部分的に活性化することができる場合は、これがアデノシンA1またはA3受容体の「部分的アンタゴニスト」である。
【００１３】
使用されるべき特異的リガンドは、体内に示されたアデノシン受容体のタイプ、また、GSK-3β活性を阻害または活性化することを望むかどうかといった、体内の標的細胞に依存する。GSK-3βを活性化することを望む場合は、A1RまたはA3Rアゴニストを使用すればよい。しかし、標的細胞にA2Rが示されている場合、A2Rのアンタゴニストを同様に使用してもよく、この受容体を遮断した結果として、アデノシンが標的細胞により、または周囲の細胞により放出され、あるいは体内の循環によって標的細胞に送達され、これらの細胞に存在するA1RまたはA3Rにのみ、より作用することにより、事実上A1RまたはA3Rのアゴニスト活性を達成するであろう。同様に、A2Rアゴニストを必要とすることの指標として、A1RもしくはA3Rの1つまたは両方のアンタゴニストが使用されてもよく、事実上A2Aアゴニスト活性の達成と同様の効果を有する。
【００１４】
本発明により、2つの主要な態様が提供される。第一の態様は、本願明細書において「GSK-3β活性化の態様」と称される、細胞におけるGSK-3β活性の増強に関し、これはGSK-3βの欠陥または機能不全に関連した病気または疾患の治療のために、治療的な価値を有しているであろう。上文に記載された通り、新形成がGSK-3β欠損と関連していることが記載されている。したがって、GSK-3β活性を高めることができる薬剤は、異常な細胞増殖と関連した病気もしくは疾患の治療または予防において、治療的な使用をすることもできる。この目的のために、本発明は、このキナーゼの活性を高める薬剤を提供する。これらの薬剤は、アデノシン受容体リガンドであり、非限定の実施例には、アデノシンA1受容体アゴニスト（A1RAg）、アデノシンA3受容体アゴニスト（A3RAg）、アデノシンA2（A2AおよびA2Bを含む）受容体アンタゴニスト（A2RAn）およびA1RAg、A3RAgおよびA2RAnのあらゆる組合せを含む。
【００１５】
本発明の第二の態様は、本願明細書において「GSK-3β阻害の態様」と称される、キナーゼ活性の減少/抑制に関し、したがって、これは、上昇したGSK-3β活性に関連した病気または疾患の治療のために、治療的な価値を有するであろう。上記のように、このキナーゼによる過剰リン酸化によって生じるいくつかの疾患がある。したがって、GSK-3β活性を抑制することでことができる薬剤は、このような疾患の治療または予防をにおいて治療的な使用を有していてもよい。この目的のために、本発明は、GSK-3β活性を阻害する薬剤を提供する。これらの生物活性物質は、ARLであり、これらの非限定の例には、アデノシンA1受容体アンタゴニスト（A1RAn）、アデノシンA3受容体アンタゴニスト（A3RAn）、アデノシンA2（A2AおよびA2Bを含む）受容体アゴニスト（A2RAg）またはA1RAn、A3RAnおよびA2RAgのあらゆる組合せを含む。
【００１６】
本願明細書において使用されるものとして、「治療」の用語は、本発明によって提供される薬剤の治療的に有効な量のを投与することをいい、治療的な効果を達成するために十分な量により、毛損失、アルツハイマー病、急性脳卒中、分裂病、躁うつ病、その他などの病気に関連した望まれない症状を回復すること、それらが起こる前にこのような症状の徴候を予防すること、症状の悪化を遅らせること、疾患の進行を遅らせること、重篤度を少なくすることもしくは病気を治癒すること、生残率を改善することもしくは疾患に罹患した患者のより迅速な回復を生じさせること、生じた疾患形態の予防、または上記のうちの2つ以上の組合せを引き起こす。
【００１７】
本明細書の目的において「有効な量」は、当業者に既知であろうこのような考慮をすることによって決定される。該量は、上記の通りに所望の治療的な効果を達成するために有効でなければならず、すなわち、GSK-3βの調整は、とりわけ治療される疾患のタイプおよび重篤さ、並びに治療法に依存する。有効な量は、典型的には適切に計画された臨床試験（たとえば、用量範囲研究）において決定され、当業者は、有効な量を決定するためのこのような試験を行う方法を知っているであろう。一般に知られているとおり、有効な量は、受容体に対するリガンドの親和性、体内におけるその分布プロフィール、体内における半減期などの薬理学的パラメーターを含む種々の因子に、望まれない副作用に、また、あるとしても年齢および性別、その他などの因子に依存する。
【００１８】
本発明は、また、必要な患者において治療的な効果を達成するための医薬組成物であって、該治療的な効果は、標的細胞においてGSK-3β活性を調整することを含み、該組成物は、活性な薬剤の有効な量および1つまたは複数の薬学的に許容される添加物を含み、該活性な薬剤は、アデノシン受容体リガンド（ARL）またはARLの組合せである医薬組成物を提供する。
【００１９】
本明細書において、「標的細胞」の用語は、GSK-3βのレベルが（たとえば、前記治療の枠組み内において所望の治療的な効果を達成するために）調整されるべき細胞を示すために使用される。標的細胞は、その中にGSK-3βレベルが異常な細胞、すなわち、正常状態（非病気状態）の下において同じタイプの細胞内のGSK-3βと比較して上昇または減少されている細胞があってもよい。また、標的細胞は、ときには、その中にGSK-3βの調整が前記治療の枠組み内において所望の治療的な効果を生ずるであろう正常な非病気細胞があってもよい。一般に、標的細胞内のGSK-3βレベルの調整は、このような治療を必要とする患者において前記治療を生じる。
【００２０】
本発明は、また、上記したとおりの本発明の両態様のための医薬組成物を提供する。したがって、第1の態様、すなわち、「GSK-3β活性化の態様」に従って、本発明の組成物は、細胞においてGSK-3β活性を上昇することができる1つまたは複数の薬剤を含むであろう。このような薬剤は、たとえば、A1RAg、A3RAg、A2RAnおよび前述のものの組合せを含む。「GSK-3β阻害の態様」に従って、組成物は、細胞においてGSK-3β活性を抑制することができる1つまたは複数の薬剤を含み、該薬剤は、ARLまたはARLのあらゆる組合せである。本態様に従って使用してもよいARLの例は、A1RAn、A3RAn、A2RAgを含む。また、本発明の組成物は、当業者によって容易に認識され、1つまたは複数の薬学的に許容されるキャリア、稀釈剤または賦形剤を含む。医薬組成物は、経口、非経口、経鼻または局所的な投与のために処方されてもよい。投与方法は、活性成分として使用される特異的リガンドの生物有用性に、およびときには適応症にも依存する。
【００２１】
また、本発明は、GSK-3βの活性を調整することによって治療することができる病気または疾患の治療のための医薬組成物を調整するための、上記記載のリガンドの使用を提供する。
【発明の詳細な記載】
【００２２】
以下の特定の実施例において示されるであろう通り、減少されたβ-カテニンおよびLef/TcfレベルによるGSK-3βの増加されるレベルは、IB-MECA（N6-(2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N-メチルウロンアミド）またはCl-IB-MECA（2-クロロ-N6-(2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N-メチルウロンアミド）のいずれかでB-16黒色腫細胞を処理した後、並びにWnt経路の最終産物のうちの1つであり、かつ細胞周期進行の鍵となるエレメントのサイクリンD1のレベルの減少の後に見出された。
【００２３】
さらに、以下の特定の実施例において示されるであろう通り、黒色腫細胞におけるA3ARの活性化は、cAMPレベルの減少を引き起こし、これにより種々の細胞外シグナルによって誘導されるキナーゼカスケードの中心的な役割を演じているPKAおよびPKB/Aktの両者の不活性化を生じる。その結果、GSK-3βは、リン酸化されず、その活性型のままであり、細胞周期停止およびアポトーシスの誘導が引き起こされる。
【００２４】
したがって、本発明は、治療的な治療のための方法であって、治療的な効果を達成するための活性な薬剤の有効な量を必要な患者に投与することを含み、該治療的な効果は、細胞においてGSK-3β活性を調整することを含み、かつ前記活性な薬剤は、アデノシン受容体リガンド（ARL）またはARLの組合せである方法を提供する。
【００２５】
本発明のGSK-3β活性化の態様の場合において、アデノシン受容体リガンドは、アデノシンA1受容体アゴニスト（A1RAg）、アデノシンA3受容体アゴニスト（A3RAg）、アデノシンA2受容体アンタゴニスト（A2RAn）、並びにA1RAg、A3RAgおよびA2RAnのあらゆる組合せから選択することができる。
【００２６】
本発明の薬剤のいくつかおよびそれらの合成手順は、米国特許第5,688,774号、米国特許第5,773,423号、米国特許第5,573,772号、米国特許第5,443,836号、米国特許第6,048,865号、WO95/02604、WO99120284およびWO99/06053、WO97/27173に詳細に見出すことができる。
【００２７】
GSK-3β活性化の態様の1つの側面によれば、活性な薬剤は、A1RAgである。このような薬剤の非限定の例には、N6-シクロペンチルアデノシン（CPA）、2-クロロ-CPA（CCPA）、N6-シクロヘキシルアデノシン（CHA）、N6-(フェニル-2R-イソプロピル)アデノシン（R-PIA）および8-{4-[({[(2-アミノエチル)アミノ]カルボニル}メチル)オキシル-フェニル}-1,3-ジプロピルキサンチン（XAC）を含む。
【００２８】
GSK-3β活性化の態様のもう一つの側面によれば、活性な薬剤は、A3RAgである。このような薬剤の非限定の例には、2-(4-アミノフェニル)エチルアデノシン（APNEA）、N6-(4-アミノ-3-ヨードベンジル)アデノシン-5'-(N-メチルウロンアミド)（AB-MECA）およびN6-(2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N-メチルウロンアミド（IB-MECA）または2-クロロ-N6-(2-ヨードベンジル)-アデノシン-5'-N-メチルウロンアミド（Cl-IB-MECA）を含む。その他のA3RAgは、N6-ベンジル-アデノシン-5'-アルキルウロンアミド-N1-オキシドまたはN6-ベンジルアデノシン-5'-N-ジアリルウロン-アミド-N1-オキシドを含む。
【００２９】
さらに、GSK-3β活性化の態様の一部を形成する活性な薬剤は、A2RAnである。非限定の例には、3,7-ジメチル-1-プロパルギル-キサンタン（DMPX）を含む。
【００３０】
GSK-3β阻害の態様に関する場合、ARLは、アデノシンA1受容体アンタゴニスト（A1RAn）、アデノシンA3受容体アンタゴニスト（A3RAn）、アデノシンA2受容体アゴニスト（A2RAg）、並びにA1RAn、A3RAnおよびA2RAgのあらゆる組合せから選択されてもよい。
【００３１】
GSK-3β阻害の態様の1つの側面によれば、活性な薬剤は、A1RAnである。このような薬剤の非限定の例には、1,3-ジプロピル-8-シクロペンチルキサンチン（DPCPX）を含む。
【００３２】
この態様のさらなる側面によれば、活性な薬剤は、A3RAnである。このような薬剤の非限定の例には、5-プロピル-2-エチル-4-プロピル-3-エチルスルファニルカルボニル）-6-フェニルピリジン-5-カルボン酸エステル（MRS-1523）および9-クロロ-2-(2-フラニル)-5-[(フェニルアセチル)アミノ][1,2,4]-トリアゾロ[1,5-c]キナゾリン（MRS-1200）を含む。
【００３３】
さらに、A2RAgは、GSK-3β阻害の態様ための薬剤として選択されてもよい。このような薬剤は、N6-[2-(3,5-ジメトキシフェニル)-2-(2-メチルフェニル)-エチル]アデノシン（DMPA）であってもよいが、これに限定されない。
【００３４】
本願明細書において開示された活性な薬剤は、良好な医療実務に従って、個々の患者の臨床状態、投与の部位および方法、投与の日程計画、患者の年齢、性別、体重、並びに開業医に既知のその他の因子を考慮して、投与および服用されてもよい。したがって、活性な薬剤は、経口的に、皮下に、または静脈内、動脈内、筋肉内、腹膜内および鼻腔内の投与を含む非経口的に、並びに注射技術によって投与されてもよい。しかし、経口投与が好ましい。
【００３５】
所望の治療的な効果を達成するために、活性な薬剤は、低分子量化合物として、または薬学的に許容されるその塩として投与されてもよく、薬学的に許容される添加物と組み合わせて単独で投与することもできる。したがって、本発明は、必要な患者において治療的な効果を達成するための医薬組成物であって、該治療的効果は、細胞におけるGSK-3β活性を調整することを含み、該組成物は、1つまたは複数の活性な薬剤の治療的に有効な量と薬学的に許容される添加物とを含み、前記活性な薬剤は、ARLである医薬組成物も提供する。
【００３６】
本願明細書において使用される「薬学的に許容される添加物」の用語は、前記活性な薬剤と組み合わせた1つまたは複数の物質をいい、希釈液、賦形剤、キャリア、固体もしくは液体の充填剤、またはカプセル化物質（これは、典型的には剤形のために添加され、これらに特定の形態が与えられた場合に（たとえば、ピル形態で、単純なシロップ、芳香族粉末およびその他の種々のエリキシルとして）、これらに形態または粘稠性を与える。添加物は、また、製剤に安定性、滅菌性および等張性を提供するための物質（たとえば、抗菌物質防腐剤、抗酸化剤、キレート剤および緩衝液）、微生物の作用を遮断するための物質（たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸その他同種のものなどの抗菌性および抗真菌性の薬剤）、または製剤に食用のフレーバその他を提供するための物質であってもよい。
【００３７】
好ましくは、添加物は、不活性、非毒性の物質であり、本発明の活性成分と反応しない。さらに、添加物は、活性な薬剤のその受容体に対する結合を高めるようにデザインされてもよい。しかし、ときには、添加物は、アジュバントを含んでもよく、これは、定義によると、予測できる方法で活性成分の作用に影響を与える物質である。
【００３８】
添加物は、従来使用されるもののいずれであることもでき、溶解性および化合物との反応性の欠如（アジュバントのように、このような反応性が望まれない場合）などの物理化学的な考慮によって、および投与の経路によって制限されるのみである。
【００３９】
本願明細書において例証したとおり、ヒトは、一般に実験動物より長く治療され、この治療は、病気の経過の長さおよび活性な薬剤の有効性に比例した長さを有する。用量は、一回用量または数日の期間にわたって多回用量であってもよい。治療は、一般に病気の経過の長さおよび活性な薬剤の有効性、並びに治療される生物種に比例した長さを有する。
【００４０】
本発明の活性な薬剤は、経口的に患者に投与されてもよい。タブレット、懸濁液、溶液、乳剤、カプセル、粉末、シロップその他同種のものの中の活性な薬剤を投与するなどの従来の方法は、有用である。
【００４１】
経口投与のためには、本発明の組成物は、活性な薬剤の経口デリバリーを容易にするための添加物を含んでもよい。経口投与のために適切な製剤は、(a)水、塩類溶液またはオレンジ液汁などの希釈液中に溶解された化合物の有効な量などの液状溶液；（b）それぞれ活性成分の予め定められた量を固体または顆粒として含む、カプセル、サッシェ、タブレット、ロゼンジおよびトローチ；(c)粉末；（d）適切な液体の懸濁液；および、（e）適切な乳剤からなることもできる。液状製剤は、薬学的に許容される界面活性剤、懸濁剤または乳化剤の添加を伴い、または伴わずに、水、およびアルコール（たとえば、エタノール、ベンジルアルコールおよびポリエチレンアルコールなどの稀釈液を含む。カプセル形態は、通常硬いか、または柔らかいゼラチン型であって、たとえば、界面活性剤、滑沢剤、並びにラクトース、シュークロース、リン酸カルシウムおよびトウモロコシ澱粉などの不活性賦形剤を含んでいることもできる。タブレット形態は、ラクトース、シュークロース、マンニトール、トウモロコシ澱粉、ジャガイモデンプン、アルギン酸、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、ガーゴム、コロイド性二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウムkタルク（croscarmellose sodiumk talc）、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、並びにその他の賦形剤、着色剤、希釈液、緩衝作用剤、崩壊剤、湿潤剤、防腐剤、香料および薬学的に適合できるキャリアの一つまたは複数を含む。ロゼンジ形態は、フレーバ、通常シュークロースおよびアカシアまたはトラガカンタ中に活性な薬剤を含むことができ、並びにゼラチンおよびグリセリンなどの不活性塩基、またはシュークロースおよびアカシア、乳剤、ジェル、その他同種のものの中に活性成分を含む錠剤であることもできる。このような添加物は、一般に当業者に既知である。
【００４２】
あるいは、活性な薬剤は、患者に非経口的に投与されてもよい。この場合、組成物は、一般に単位用量注射可能形態（溶液、懸濁液、乳剤）に処方されるであろう。注射に適した医薬製剤は、滅菌の水溶液または分散剤、および滅菌の注射可能な溶液または分散剤に再構成するための滅菌の粉末を含んでいてもよい。キャリアは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、脂質ポリエチレングリコールその他などの植物油；オレイン酸エチルおよびイソプロピルミリスチン酸エチルなどの脂肪酸エステル、並びにそれ自体既知である種々のその他の溶媒系であることもできる。キャリアは、活性な薬剤の物理的および化学的特性に基づいて選択してもよい。
【００４３】
活性な成分が乏しい水溶解性を有しており、したがって油性のキャリアが使用される場合には、たとえば、リン脂質などの乳化剤（たとえば、レクチンまたはその他の種々の薬学的に許容される乳化剤の1つ）を使用することによって、適切な流動性を維持することができる。それ自体既知であるが、界面活性剤および処置条件の適切な選択により、エマルジョン液滴の粒子径を制御することも可能であろう。
【００４４】
非経口的な製剤に用いられる適切なセッケンは、活性な成分が乏しい水溶解性を有している場合には、脂肪性アルカリ金属、アンモニウムおよびトリエタノールアミン塩を含み、かつ適切な界面活性剤は、以下のものを含む；(a)たとえば、ジメチルジアルキルハロゲン化アンモニウムおよびアルキルハロゲン化ピリジニウムなどの陽イオン界面活性剤；（b）たとえば、アルキル、アリールおよびオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル、並びにモノグリセリド硫酸塩およびスルホサクシネートなどのアニオン界面活性剤；(c)たとえば、脂肪族アミン酸化物、脂肪酸アルカノールアミドおよびポリオキシ-エチレンポリプロピレンコポリマーなどの非イオン性界面活性剤；（d）たとえば、アルキル-β-アミノプリオピオネート（alkyl-β-aminopriopionates）および2-アルキル-イミダゾリン四級アンモニウム塩などの両性界面活性剤、および(3)その混合液。
【００４５】
さらに、注射部位における刺激作用を最小または除去するために、組成物は、約12〜約17の親水性親油性比（HLB）を有する1つまたは複数の非イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。適切な界面活性剤は、モノオレイン酸ソルビタンなどのポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、およびプロピレングリコールとプロピレンオキサイドの縮合によって形成される疎水性塩基とエチレンオキサイドの高分子量付加生成物を含む。
【００４６】
さらにもう一つの側面にしたがって、本発明は、細胞におけるGSK-3β活性を調整するための、アデノシンA1受容体リガンド（A1RL）、アデノシンA2受容体リガンド（A2RL）およびアデノシンA3受容体リガンド（A3RL）、並びにA1RL、A2RLおよびA3RLからなる群より選択される活性な薬剤の使用に関する。
【００４７】
活性な薬剤は、必要な患者において治療的な効果を達成するための医薬組成物であって、該治療的な効果は、細胞においてGSK-3β活性を調整することを含み、該組成物は、薬学的に許容される添加物を含み、該活性な薬剤は、アデノシンA1受容体リガンド（A1RL）、アデノシンA2受容体リガンド（A2RL）およびアデノシンA3受容体リガンド（A3RL）、並びにA1RL、A2RLおよびA3RLからなる群より選択される医薬組成物の調製に使用してもよい。
【００４８】
上記の通り、治療的な効果は、GSK-3β活性の上昇または抑制を含んでもよい。GSK-3β活性を上昇するためには、活性な薬剤は、A1RAg、A3RAg、A2RAn、および前述のもののあらゆる組合せから選択され、一方GSK-3β活性の抑制のためには、該治療的な薬剤は、
A1RAn、A3RAn、A2RAg、並びに前述のもののあらゆる組合せから選択される。
【００４９】
明らかなことに、本発明の多数の改変およびバリエーションは、上記の教示を考慮して起こりうる。したがって、アデノシン受容体リガンドによる、細胞におけるGSK-3β活性のその他のいずれの効果も、これが本発明に添付された請求の範囲内であり、本発明の一部を形成すること、および本発明は、特に以下に記載したものとは別のものが実施されてもよいことは、理解されるべきである。
【実施例】
【００５０】
実施例1
材料
IB−MECAおよびMRS1523は、PBI／Sigma（Natick, MA, USA）から購入した。両試薬については、10mMの貯蔵溶液をDMSO溶液に調製し、所望の濃度にするために培地でさらに稀釈を行い；細胞培養のためのRPMI、ウシ胎児血清（FBS）および抗生物質は、Beit Haemek, Haifa, Israelから購入した。GSK-3β、PKAc、PKB/Akt、c-Mycに対するウサギポリクローナル抗体、マウスポリクローナルβ-カテニンおよびβ-カテニンに対するヤギポリクローナル抗体は、Santa CruzBiotechnology Inc., CA, USAから購入し；サイクリンD1に対するウサギポリクローナル抗体（これは、サイクリンD2と交叉反応する）は、Upstate Biotechnology Lake Placid, NYから購入し；セリン437がリン酸化されたPKB/Aktおよびセリン9がリン酸化されたGSK-3βに対する抗体（ウサギポリクローナル）は、Cell Signaling Technology, Vevery, MA, USAから購入した。cAMPを解析するために、市販のELISAキットのcAMP EIA system（Assay Dsighns INc., Ann Harbor, USA）を使用した。
【００５１】
細胞は、10%のFBS、200mMグルタミン、100U/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを補ったRPMI培地中で維持した。これらは、週に二回新たに調製した培地に移した。全ての研究について、我々は、血清を不足させた細胞を使用した。FBSを培養液から18時間除去し、実験は、1%FBSを補ったRPMI培地中の細胞の単層上において、37℃の5%インキュベーター内で行った。
【００５２】
方法
細胞取り込みアッセイ
細胞増殖を評価するために使用した[3H]-チミジン取り込みアッセイ。B16-F10黒色腫細胞(1.5×104/ml)を、96穴プレートにおいてIB-MECA（0.001μM-10μM）と共に24時間インキュベートした。IB-MECAがA3ARに結合することにより、腫瘍細胞に対してその効果を及ぼすかどうかを試験するために、A3ARに対するアンタゴニストのMRS-1523をIB-MECAの存在下で細胞培養液に添加した。MRS-1523のみの存在下でインキュベートしたB16-F10黒色腫細胞の培養液を対照として使用した。インキュベーションの最後の6時間に、各ウェルを1μCi[3H]-チミジンでパルスした。細胞を回収して、LKB液体シンチレーションカウンター（LKB, Piscataway, NJ, USA）で[3H]-チミジン取り込みを測定した。これらの実験は、少なくとも10回繰り返した。
【００５３】
ウエスタンブロット解析
PKA、GSK-3β（全ておよびリン酸化されたもの）、PKB/Akt（全ておよびリン酸化されたもの）、β-カテニン、c-mycおよびサイクリンD1の発現レベルを検出するために、IB-MECA処理または未処理の血清除去B16-F10黒色腫細胞由来のタンパク質抽出物を利用した。A3ARに対するIB-MECAの特異性を確かめるために、アゴニスト投与の30分前に0.01μM MRS-1523を培養液に添加した。さらに、A2Rの活性化で生じる現象の連鎖をまねるために、細胞を8Br cAMPとインキュベートした。
【００５４】
インキュベーション期間の最後に、細胞を氷冷PBSおよび氷冷溶解緩衝液（TNN緩衝液、50mMトリス緩衝液 pH=7,5、150mM NaCl、NP40）で洗浄した。細胞片を7500×gで10分間遠心することによって除去した。上清をウエスタンブロット解析に利用した。タンパク質濃度は、Bio-Radタンパク質アッセイ色素試薬を使用して測定した。等量のサンプル（50μg）を、12%ポリアクリルアミドゲルを使用してSDS-PAGEによって分離した。次いで、分離したタンパク質をニトロセルロース膜上（Schleicher & Schuell, Keene, NH, USA）に電気ブロットした。膜を1%のウシ血清アルブミンでブロックして、所望の一次抗体（1：1000に稀釈）と4℃において24時間インキュベートした。次いで、ブロットを洗浄して、二次抗体と室温において1時間インキュベートした。BCIP／NBTカラーディベロプメントキット（Promega, Madison, W1, USA）を使用してバンドを記録した。異なった図に示されたデータは、少なくとも3回の異なった実験の代表的なものを示す。
【００５５】
免疫組織化学染色
IB-MECA処理および未処理のB16-F10黒色腫細胞検体の免疫組織化学染色は、以下のプロトコールにしたがって行った：細胞をPoly-L-リジンコートしたガラスチャンバースライド上で培養し、これを約90%コンフルエントにさせ、次いで、これらをPBSで洗浄して冷却アセトンで3分間固定した。蛍光システム（Immunofluorescence Kit, Vector Laboratories）を使用して免疫組織科学を行った。スライドをPBSでリンスして、1%BSAの5%正常ウマ血清またはヤギ血清を含むPBS溶液中で室温において2時間ブロックした。次いで、細胞を一次抗体と室温において一晩、加湿したチャンバー内でインキュベートした。PBSでリンスした後、FITC結合2次抗体を室温において暗闇で1時間インキュベートした。最後に、細胞をPBSでリンスして、チャンバーを除去してスライドを水性マウンティング培地でカバーガラスをかぶせた。FITCキューブおよび位相フィルターを使用して、紫外線顕微鏡で写真を撮った。
【００５６】
リボヌクレアーゼタンパク質アッセイ（RPA）
RPAは、サイクリンD1の発現レベルを調査するために行った。このアッセイでは、RNAをIB-MECA処理および未処理B-16黒色腫細胞から抽出した。購入先（pharminogen, San Diago, CA）による指示に従ってアッセイを行った。これにより、異なったmRNA種のそれぞれ異なった長さおよび配列を示す一連のテンプレートを作製することができる。プローブセットを溶液中の標的RNAに対して過剰にハイブリダイズさせ、その後、フリーのプローブおよびその他の一本鎖RNAをRNaseで消化した。残りの「RNase保護された」プローブを精製し、変性ポリアクリルアミドゲルによって分離して、リン光体イメージングによって定量した。次いで、もとのRNAサンプル中の各mRNA量を、保護されたプローブ断片のおおよそのサイズにおける強度に基づいて測定した。
【００５７】
統計的解析
結果は、スチューデントｔ検定を使用して統計的に評価した。統計的解析のために、異なった実験の平均値の間で比較を行った。統計的有意性の基準は、p＜0.05とした。
【００５８】
結果
B16-F10黒色腫細胞株の増殖に対するA3ARアゴニストのIB-MECAの効果を調査した。IB-MECAは、黒色腫細胞に対して濃度依存的な阻害効果を及ぼした。細胞増殖の阻害は、試験した全ての濃度において統計的に有意であったp＜0.001。A3ARアンタゴニストのMRS-1523は、IB-MECAの阻害効果を逆転したことは、腫瘍増殖の抑制がA3ARを介して特異的に媒介されることを示している（図1）。
【００５９】
上記結果は、関与したシグナリング経路がA3ARの活性化の下流であるという決定を導いた。リガンドと受容体の間の相互作用は、A3AR活性化後に減少されることが既知であるcAMPの産生を測定することによって評価した。さらに、cAMPの下流エレメントであるPKAcを評価した。cAMPレベルの目立った減少が観察され（IB-MECA=0.5±0.041pg/ml対、対照=4.2±0.31pg/ml、p＜0.0001）、アデニル酸シクラーゼ活性の阻害が確かめられた。
【００６０】
ウエスタンブロット解析では、IB-MECAと10分間インキュベーションすることによりPKAcの発現レベルが減少した後、20分後に全てのPKAcが消失することが示された（図2A）。同様に、リン酸化されたPKB/Aktの減少されたレベルは、PKAcレベルの減少後に確認された（図2B）。
【００６１】
全GSK-3βレベルの増加は、全ての時点において図3Aに示されるが、図3Bでは、0.01μMおよび10μMのIB-MECAで黒色腫細胞を処理した後のGSK-3βレベルの濃度依存的な増加を示す。同時に、リン酸化されたGSK-3β（GSK-3β-P）のレベルの減少が確認され、活性GSK-3βがアップレギュレートされるという所見を確認した（図3C）。非関連タンパク質のβ-アクチンの一定なレベルが観察され、これらの応答の特異性が結論づけられた（図3A）。IB-MECA処理メラノーマ細胞において述べたGSK-3βの増強された染色（免疫組織化学染色）は、これらの結果を支持する（データ示さず）。
【００６２】
A3ARの活性化は、アデニリルシクラーゼの活性を阻害し、cAMPレベルの減少を引き起こす。これは、A2ARの活性化が、アデニリルシクラーゼの活性の増加の後に、cAMPレベルの上昇を生じるであろうことを示唆する。GSK-3βレベルに対するA2AR活性化の影響を評価するために、B16-F10黒色腫細胞の培養液に8Br cAMPを添加することにより、受容体活性化後に生じる下流の現象をまねた。GSK-3βレベルの減少は、8Br cAMPで処理した後に確認され（図3D）、GSK-3βの発現は、A2RAgによって阻害することができることを示唆する。したがって、種々の受容体に対するアゴニストを使用すると、GSK-3βレベルを変化させて、細胞内で逆の反応を引き起こすことができるであろう。
【００６３】
図1に関して示した結果と相関して、イムノブロットアッセイにより、A3RAn、MRS-1523は、PKAcの減少およびGSK-3βレベルの増加を逆転することが示されており（図4）、キナーゼ活性の調整は、A3ARなどのアデノシン受容体を介していることが確認された。
【００６４】
これらの結果を考慮して、GSK-3βによってリン酸化された後に分解されることが知られているβ-カテニンのレベルを試験した。実際に、ウエスタンブロット解析により、B16-F10黒色腫細胞をIB-MECA処理した後に、減少したβ-カテニンレベルが示された（図5）。同様のデータが免疫組織化学染色によっても示されたことから、IB-MECA処理した細胞における減少した染色と比較して、対照細胞におけるβ-カテニンの細胞質および核における染色が高レベルであることを示している（結果示さず）。
【００６５】
β-カテニンが細胞核に移行した後に転写されることが知られているサイクリンD1およびc-mycは、IB-MECA処理したB16-F10細胞ではダウンレギュレートされていることが両者において見出された（図6Aおよび6B）。RPAを使用して、サイクリンD1およびD2レベルは、IB-MECA処理したサンプルで減少されることを示した（結果示さず）。
【００６６】
実施例2
Wnt経路のエレメントは、インビトロでIB-MECAによって変化されるか、さらにインビボにおいてCl-IB-MECA（もう1つのA3RAg）によって生じるどうかを決定するために、同様の一連の研究を大腸癌マウス動物モデルにおいて利用した。Balb/Cヌードマウスの脇腹に1.2×106のHCT-116ヒト大腸癌細胞を皮下注射することにより、動物モデルを作製した。マウスには、二日毎に6μg/KgのCl-IB-MECAを経口（胃管栄養法）で処理した。
【００６７】
30日後、マウスを屠殺して大腸癌病巣由来の組織サンプルを回収し、β-カテニンおよびサイクリンD1の発現を解析した。
【００６８】
結果
図7A、7Bおよび7Cは、Cl-IB-MECA処理および未処理マウスに由来する腫瘍組織からのタンパク質抽出物のウエスタンイムノブロットを示す。結果は、β-カテニン、サイクリンD1およびc-mycのレベルのそれぞれの減少を示し、これはインビトロの結果と一致する。
【００６９】
上記記載の結果は、A3RAgで媒介される黒色腫および大腸癌細胞のインビトロにおける増殖に、Wntシグナリング経路が関与している証拠を提供する。
【００７０】
したがって、A3RAgは、以下の現象を誘導すると結論づけられるであろう：GSK-3βの活性化とその後のβ-カテニンのリン酸化は、その分解を引き起こし、これにより、β-カテニンの核への移行およびサイクリンD1の誘導を阻止し、これが最終的に細胞周期停止を引き起こす。
【００７１】
実施例3
毛増殖に対するCl-IB-MECAの効果が測定され、毛増殖とWnt経路との間の関連が示唆された。
【００７２】
材料
腫瘍細胞
大腸癌細胞（HCT-116）を使用し、ATTC Rockville, Marylandから購入した。細胞は、10%ウシ胎児血清（FBS, Biological Industries, Beit Haemek, Israel）を含むRPMI培地中でルーチンで維持した。週に二回、細胞を新たに調整した培地に移した。
【００７３】
ヌードマウス
ヌードマウス（BalbC 起源）には、HCT-166ヒト大腸癌細胞を皮下に接種し、これにより目に見える腫瘍を発生させた。
【００７４】
薬
Cl-IB-MECAは、DMSOに溶解し、10mMの濃度の貯蔵溶液として保存した。マウスに投与する前に、各マウスが6μg/kg体重の用量を受けられるような濃度に、貯蔵溶液をPBSで稀釈した。
【００７５】
方法
ヌードマウス（BalbC 起源）には、HCT-166ヒト大腸癌細胞を皮下に接種した。これらのマウスを2つの群に分けた：
研究群、この群には、DMSOに溶解してPBSで稀釈したCl-IB-MECA（6μg/kg体重）を毎日かつ経口で投与し。
対称群、この群には、DMSOのみを毎日かつ経口で投与した。
【００７６】
結果
毎日処理して30日後、研究群由来のマウスの皮膚に毛が増殖した。これらの結果は、この特定の非限定の実施例において使用したCl-IB-MECAなどのアデノシンアゴニストが、Wnt経路においてGSK-3βの活性化を介して、毛損失を治療または阻止する薬剤、並びに毛の増殖を誘導する潜在的な薬剤であることが示唆される。
【００７７】
実施例4
材料および方法
初代ヒト星状膠細胞およびミクログリアの調製
精製した初代ヒト星状膠細胞およびミクログリア細胞は、16-20週齢のヒト胎児脳組織から、Coleとde Vellis[R.Cole and J. de Villis. In: Protocols for neural cell culture. S. Fedoroff and A. Richardson(Eds) Human Press, Totowa, NJ, pp.117-130.(1997)]、およびYongとAntel「V.W. Yong and J.P. Antel. In: Protocols for neural cell culture. S. Fedoroff and A. Richardson(Eds) Human Press, Totowa, NJ, pp.157-172.(1997)]の方法に基づく修正された手順によって調製した。脳組織は、抗生物質ゲンタマイシンおよびアンフォテリシンBを含む氷冷ハンクの緩衝塩溶液（Hank's Balanced Salt Solution（HBSS））中で洗浄した。血管および髄膜を除去して、組織を小片に切り刻んだ。切り刻んだ後、組織を0.05%トリプシン中でインキュベーションすることによって酵素的に分離し、かつ75μmナイロンメッシュフィルターを数回通すことによって機械的に粉砕した。生じた単一細胞懸濁液を洗浄し、ペレットにし、10%ウシ胎児血清、インスリン、ゲンタマイシンおよびL-グルタミンを含むDMEM：F12溶液を162cm2フラスコあたり2-10×106細胞の濃度でまいた。7-10日培養後、37℃のインキュベーター中に、回転式振とう器に200rpmで一晩おくことにより、ミクログリア細胞を単離した。非接着細胞を除去して、1〜3時間新たなフラスコに接着させた。接着後、細胞を洗浄して10%ウシ胎児血清、インスリンゲンタマイシン、L-グルタミンおよびN1サプリメントを含む培地で再び培養（refed)した。星状膠細胞は、15%ウシ胎児血清、インスリン、ゲンタマイシンおよびL-グルタミンを含む培地中で接着した細胞からサブカルチャーし、混入したミクログリアを繰り返し回転振とうすることにより除去した。培養した星状膠細胞およびミクログリア細胞は、次の感染のために、ウェル当たり2.5×105の濃度で6ウェルのプレートにプレートにまいた。
【００７８】
HIV-1ウイルスの調製
初代HIB-1単離体SF162およびJR-FL由来の脳を、本質的にGartner およびPopovic12によって記載されたとおりに、末梢血単核球細胞(PBMC)中で培養した。PBMCは、ヒト軟膜からフィコール勾配によって単離し、10%ウシ胎児血清およびゲンタマイシンを含むRPMI中に2.5×106/mlの濃度でプレートにまいた。細胞を、5μg/mlのフィトヘマグルチニン(PHA)を添加することによって48時間刺激した。刺激後、細胞にSF162またはJR-FLを感染させて、p24ELISAアッセイによって高力価のHIV-1が検出されるまで7-10日間培養した。ウイルス産生が最適なときに、HIV-1を含む上清を分注し、使用するまで-70℃において貯蔵した。p24ELISAアッセイを貯蔵液の一定分量で行って、ウイルス力価を決定した。
【００７９】
初代ヒト胎児星状膠細胞およびミクログリア細胞の感染およびCl-IB-MECAによる処理
6ウェルプレートに、ウェル当たりミクログリア細胞および星状膠細胞(2.5×105)をプレートにまいた。翌日、細胞を洗浄して新鮮な培地で再び培養した。2×104p24unitのSF162またはJR-FLウイルスのいずれかを、ウェルあたりに全部で1mlの種菌ウイルスで添加した。対照実験では、ウイルスを添加しなかった。細胞をウイルスと共に37℃で一晩インキュベートし、PBSで激しく洗浄し、2mlの新鮮な培地で再び培養した。培養液には、IB-MECAまたはCl-IB-MECAを0.01μMの濃度で24時間毎に処理した。感染後に、500μlの培地を示した回数取り除いて、-70℃において後の解析のために貯蔵した。各回の培地を除去して、体積量の新鮮な培地を添加した。対照実験では、IB-MECAおよびCl-IB-MECAを省いた。
【００８０】
p24ELISAアッセイ
HIV-1ウイルスのコアタンパク質のp24を検出するためのELISAアッセイは、市販に利用できるp24ELISAキット(NEN/Dupont）を利用して、製造者の指示に従って、50μlの回収した上清で行った。
【００８１】
結果
表1〜3に見られる、HIV感染細胞から回収した培養液に存在するp24タンパク質の量は、IB-MECAまたはCl-IB-MECAのいずれでも処理していない対照(HIV)と比較して、IB-MECA（HIVおよびIB-MECA）およびCl-IB-MECA（HIVおよびCl-IB-MECA）で処理したHIV感染細胞において有意に減少する。
【００８２】
表1は、JR-FLが感染した星状膠細胞におけるHIV複製に対するIB-MECAおよびCl-IB-MECAの効果を示し、ここで、p24タンパク質（pg/ml）は、HIV感染後5日の細胞培養液由来の培地において測定した。
【００８３】
表2は、SF162が感染した星状膠細胞におけるHIV複製に対するIB-MECAおよびCl-IB-MECAの効果を示し、ここで、p24タンパク質（pg/ml）は、上記の通りに測定した。
【００８４】
表3は、SF162が感染したミクログリア/SFにおけるHIV複製に対するIB-MECAおよびCl-IB-MECAの効果を示し、ここで、p24タンパク質（pg/ml）は、HIV感染後5日および10日の細胞培養液由来の培地において測定した。
【表１】
2004520404.tif 000002
【表２】
2004520404.tif 000003
【表３】
2004520404.tif 000004
これらの結果は、周知のA3RAgであるCl-IB-MECAおよびIB-MECAが、ウイルスの複製を阻害することを示唆する。さらに、この阻害効果は、GSK-3βの調整に関与していることも示唆される。
【００８５】
考察
アデノシンおよびそのA3ARアゴニストであるIB-MECAおよびCl-IB-MECAによって腫瘍細胞増殖が阻害されることは、すでに記載されている（非特許文献7）。
【００８６】
今回、A3ARの活性化は、シグナル伝達経路において重要な役割を演じていることが示された。IB-MECAは、B16-F10黒色腫細胞の増殖を濃度依存的に阻害した。A3ARアンタゴニストのMRS-1523を培養系に投与することにより、ほとんどの阻害効果が逆転したことは、IB-MECAの活性は、A3ARを介して媒介されていることを示す。
【００８７】
細胞周期の進行を制御するシグナル伝達経路の1つにWntがあり、これは、胚発生および腫瘍発生の際に非常に活性である。悪性黒色腫を含む多くの新形成において、GSK-3βは、β-カテニンをリン酸化することができない。安定化されたβ-カテニンは、細胞内に蓄積し、核に移行して、そこで転写因子のLef/Tcfファミリーに結合してサイクリンD1およびc-mycを含むWnt標的遺伝子の発現をアップレギュレートする。したがって、GSK-3βは、β-カテニンのレベルを調整しているので、該経路において顕著な役割を有している。図8は、A3RAgによるWnt経路活性化の模式図を提供する。
【００８８】
二種のエフェクタータンパク質PKB/AktおよびPKAは、GSK-3βのレベルおよび活性を制御し、したがって、Wnt経路の調節に直接関与している。両者は、GSK-3βをセリン9および21でリン酸化して、その不活性化を誘導し、β-カテニンのリン酸化をできなくする。cAMPは、親分子に由来するPKAユニットを分解することによりPKAを活性化することが確証された。PKB/Aktは、種々の成長因子による刺激に応答して、ホスファチジルイノシトール3'-キナーゼ（PI3-キナーゼ）依存性の経路を介して、活性化されることが知られている（非特許文献8）。しかし、フィリーパ（Fillipa）ら（非特許文献3）は、PKB/AktがcAMPを上昇する薬剤によって活性化されることも示した。このグループは、PKAc（cAMPによる活性化後）は、293ヒト腎臓胚性細胞においてPI3K非依存的な経路でPKB/Aktをリン酸化して活性化することができることを示した。
【００８９】
今回、IB-MECAによるか、またはCl-IB-MECAによるA3ARの活性化は、campの形成の減少を誘導し、その結果、これがPKAcおよびPKB/Aktを減少すること、並びにこの活性化はA3RAnによるか、またはA2RAgによって遮断されるであろうことを示して開示した。したがって、PKAcおよびPKB/Aktのダウンレギュレーションは、GSK-3βのリン酸化を一時停止させ、これによりGSK-3βをその活性型に戻らせていることが示唆される。IB-MECAまたはCl-IB-MECA処理の後に見出されたリン酸化されたGSK-3βのレベルの減少は、この概念を支持する。
【００９０】
cAMP/GSK-3β経路の特異性は、IB-MECA処理したB16-F10細胞にMRS-1523を導入し、これがPKAcおよびGSK-3βのレベルの変化を阻止することによって確認された。
【００９１】
これらの現象の後、β-カテニンレベルの減少が、その後のc-mycおよびサイクリンD1レベルの減少と共に観察された。細胞周期の進行は、サイクリン依存性キナーゼによって制御され、その活性は、一連のサイクリンによって調節される。サイクリンD1およびサイクリンD2は、それぞれ早期および後期G1期にピークに達することが報告されている。結果は、IB-MECAによりサイクリンD1およびサイクリンD2のmRNA並びにタンパク質レベルの減少を示し、G1/S移行におけるこれらの重要な役割が示唆される。
【００９２】
GSK-3βは、サイクリンD1のThr-286を直接リン酸化し、これにより、サイクリンD1の代謝回転を迅速にトリガーすることが示されている[Diehl JA, et al. Genes Dev 12:3499-3511(1998)]。GSK-3β活性に対するIB-MECAの刺激効果は、この経路を介してサイクリンD1レベルの減少を引き起こすであろう。
【００９３】
あわせて、A3RAg（たとえば、IB-MECAまたはCl-IB-MECA）などのアデノシン受容体は、受容体のレベルで始まる現象の連鎖を調整し（このとき、これがcAMP、PKAcおよびPKB/Aktをダウンレギュレートする）、これによりWntの鍵となるエレメントのGSK-3βを活性化することができる。アデノシン受容体リガンドがWnt経路を妨害する能力は、これらが癌治療、並びにその治療にGSK-3β活性の調整を必要とするその他の疾患に適用できるかもしれないことを示唆する。たとえば、その他の種々の臨床状況における機構に、GSK-3βが関与することが記載されている。これは、アルツハイマー病の病因と関連するtauの神経細胞におけるリン酸化に応答性であり、糖尿病タイプIIおよびHIV感染細胞において過剰発現されている[Aggirwar SB, et al. J. Neurochem 73:578-86,(1999); Niloulina S.E., et al. Diabetes 49:263-271(2000)]。受容体の活性化（アゴニスト）または遮断（アンタゴニスト）を介した細胞内GSK-3βレベルの調整は、GSK-3βのアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションから生じるか、または関与する病気の機構と戦うための標的として、この受容体を使用することを可能にする。
【００９４】
本発明を理解し、かつこれが実際にどのように行われてよいかを参照するために、添付図面を参照し、非限定の実施例による好ましい態様をここに記載する：
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図1は、B16-F10黒色腫細胞の増殖に対するA3RアゴニストであるIB-MECAの阻害効果の濃度依存性を示す線図である。B16-F10黒色腫細胞を、担体（対照）または種々の濃度のIB-MECA（0.001μM-10μM）で、1%FBSの存在下において24時間処理した。細胞増殖は、[3H]-チミジン取り込みアッセイによって測定した。A3アデノシン受容体アンタゴニストのMRS-1523（0.01μM）は、IB-MECAの阻害効果を中和した。データ点は、4回の独立した実験の平均±SEM値である。
【図２Ａ】図2A-2Bは、細胞をIB-MECAに暴露した後の細胞タンパク質抽出物から決定された、PKAc、リン酸化されたPKB/Akt（セリン473がリン酸化されている）および総PKB/Aktのレベルを示すウエスタンブロット解析である（対照は、IB-MECAに暴露していないこと以外は同じ細胞に由来する）。図2Aは、10分後にPKAcのレベルが減少し、20分後に全てが消失することを示す。NSは、非刺激細胞を表す。
【図２Ｂ】図2A-2Bは、細胞をIB-MECAに暴露した後の細胞タンパク質抽出物から決定された、PKAc、リン酸化されたPKB/Akt（セリン473がリン酸化されている）および総PKB/Aktのレベルを示すウエスタンブロット解析である（対照は、IB-MECAに暴露していないこと以外は同じ細胞に由来する）。図2Bは、リン酸化されたPKB/Aktのレベルが30分後にも変化しないが、3時間後の処理細胞では消失し、一方、総PKB/Aktのレベルは、アッセイを通じて変化しなかったことを示す。NSは、非刺激細胞を表す。
【図３Ａ】図3A-3Dは、担体（対照）または0.01μMのIB-MECA（または図3では、10μMも）により、示した時間（図3A）で細胞を処理することによるGSK-3βおよびβ-アクチンのレベルを示す。
【図３Ｂ】図3A-3Dは、担体（対照）または0.01μMのIB-MECA（または図3では、10μMも）により、示した濃度（図3B）で細胞を処理することによるGSK-3βおよびβ-アクチンのレベルを示す。
【図３Ｃ】図3A-3Dは、担体（対照）または0.01μMのIB-MECA（または図3では、10μMも）により、示した時間（図3A）または濃度（図3B）で細胞を処理することによるGSK-3βおよびβ-アクチンのレベルを示す。また、リン酸化されたGSK-3β（GSK-3β-P）のレベルを、IB-MECA（0.01μM）（図3C）で処理することによって測定した。
【図３Ｄ】図3A-3Dは、担体（対照）または0.01μMのIB-MECA（または図3では、10μMも）により、示した時間（図3A）または濃度（図3B）で細胞を処理することによるGSK-3βおよびβ-アクチンのレベルを示す。加えて、A2Rの活性化をまねた、8BrcAMPで処理することによるGSK-3βのレベルの減少が観察された（図3D）。
【図４】図4は、B16-F10黒色腫細胞抽出物におけるPKAcおよびGSK-3βのレベルを示すウエスタンイムノブロットである。担体（対照）IB-MECAまたはIB-MECAおよびA3RアンタゴニストMRS-1523（0.01μM）を含む細胞培養液を確立した。MRS-1523は、IB-MECAの能力を遮断して、PKAcおよびGSK-3βのレベルを、それぞれ減少/増加した。
【図５】図5は、IB-MECAでB16-F10黒色腫細胞を処理することによるβ-カテニンのレベルを示すウエスタンイムノブロットである。一方、β-カテニンのレベルは、未処理細胞において容易に検出され（左レーン）、処理細胞においては、低レベルでのみ検出される。
【図６Ａ】図6A-6Bは、それぞれ、担体（対照）またはIB-MECA（0.01μM）で処理することによる、B16-F10黒色腫処理細胞におけるサイクリンD1およびc-Mycのレベルを示す。
【図６Ｂ】図6A-6Bは、それぞれ、担体（対照）またはIB-MECA（0.01μM）で処理することによる、B16-F10黒色腫処理細胞におけるサイクリンD1およびc-Mycのレベルを示す。
【図７Ａ】図7A-7Cは、A3RアゴニストCl-IB-MECAで処理または未処理の、HCT-116大腸癌を有するマウスに由来する腫瘍組織からのタンパク質抽出物のウエスタンブロット解析である。Cl-IB-MECAで調整後のβ-カテニン（図7A）のレベルを、それぞれ抗β-カテニン、抗サイクリンD1および抗c-myc抗体を使用して測定した。未処理マウスの全てのサンプルにおいて顕著なレーンを検出し（左レーン「対照」）、一方の処理群では、タンパク質レベルの減少が観察される（右レーン「Cl-IB-MECA」）。
【図７Ｂ】図7A-7Cは、A3RアゴニストCl-IB-MECAで処理または未処理の、HCT-116大腸癌を有するマウスに由来する腫瘍組織からのタンパク質抽出物のウエスタンブロット解析である。サイクリンD1（図7B）のレベルを、それぞれ抗β-カテニン、抗サイクリンD1および抗c-myc抗体を使用して測定した。未処理マウスの全てのサンプルにおいて顕著なレーンを検出し（左レーン「対照」）、一方の処理群では、タンパク質レベルの減少が観察される（右レーン「Cl-IB-MECA」）。
【図７Ｃ】図7A-7Cは、A3RアゴニストCl-IB-MECAで処理または未処理の、HCT-116大腸癌を有するマウスに由来する腫瘍組織からのタンパク質抽出物のウエスタンブロット解析である。c-myc（図7C）のレベルを、それぞれ抗β-カテニン、抗サイクリンD1および抗c-myc抗体を使用して測定した。未処理マウスの全てのサンプルにおいて顕著なレーンを検出し（左レーン「対照」）、一方の処理群では、タンパク質レベルの減少が観察される（右レーン「Cl-IB-MECA」）。
【図８】図8は、たとえば、A3RAgのみによって媒介されるシグナリング経路の模式図である。同様の経路は、他のアデノシンリガンドであるmutatis motandisについても適用する。
【図１】
2004520404.tif 000005
【図２Ａ】
2004520404.tif 000006
【図２Ｂ】
2004520404.tif 000007
【図３Ａ】
2004520404.tif 000008
【図３Ｂ】
2004520404.tif 000009
【図３Ｃ】
2004520404.tif 000010
【図３Ｄ】
2004520404.tif 000011
【図４】
2004520404.tif 000012
【図５】
2004520404.tif 000013
【図６Ａ】
2004520404.tif 000014
【図６Ｂ】
2004520404.tif 000015
【図７Ａ】
2004520404.tif 000016
【図７Ｂ】
2004520404.tif 000017
【図７Ｃ】
2004520404.tif 000018
【図８】
2004520404.tif 000019
【国際公開パンフレット】
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2004520404.tif 000021
2004520404.tif 000022
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2004520404.tif 000064
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520404.tif 000065
【国際調査報告】
2004520404.tif 000066
2004520404.tif 000067
2004520404.tif 000068
2004520404.tif 000069
2004520404.tif 000070
2004520404.tif 000071
2004520404.tif 000072
2004520404.tif 000073
2004520404.tif 000074