(57)【要約】本発明は、固形腫瘍への最適なウイルス送達法に関する。二つのアプローチが、ウイルスに曝される固形腫瘍内部の腫瘍細胞の数を増加させるために適合され得る。ウイルスは固形腫瘍内の複数の部位に運ばれ得るか、あるいは、このウイルスは、送達されるウイルスが固形腫瘍においてより多くの細胞に達するような大容量で、単一部位に送達され得る。本発明の方法においては、正常細胞よりも腫瘍細胞内で選択的に複製し得る任意のウイルス（例えば、レオウイルス）が、使用される。レオウイルスが使用される場合、レオウイルスは、好ましくは哺乳動物ウイルスであり、より好ましくはヒトレオウイルスであり、さらにより好ましくは血清型３ヒトレオウイルスであり、そして最も好ましくは、Ｄｅａｒｉｎｇ株血清型３ヒトレオウイルスである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
固形腫瘍の成長を抑制するために該腫瘍にウイルスを送達する方法であって、該腫瘍を保持する被験体に有効量のウイルスを投与する工程を包含し、ここで、該ウイルスが以下：
（ａ）該固形腫瘍内の複数部位への、該ウイルスを含む組成物の送達；および
（ｂ）該腫瘍への、該ウイルスを含む組成物の直接送達であって、ここで該組成物の容量が、該腫瘍の容量の約１０％〜約１００％である送達、
から成る群から選択される基礎投与により腫瘍細胞を選択的に死滅させ得る、方法。
【請求項２】
前記ウイルスがレオウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記レオウイルスが哺乳動物レオウイルスである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物レオウイルスがヒトレオウイルスである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒトレオウイルスが血清型３ウイルスである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記血清型３ウイルスがＤｅａｒｉｎｇ株ウイルスである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスが、改変型アデノウイルス、改変型ＨＳＶ、改変型ワクシニアウイルス、改変型パラポックスウイルスｏｒｆウイルス、ｐ５３発現ウイルス、ＯＮＹＸ−０１５ウイルス、デルタ２４ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ｈｒＲ３が欠損した単純ヘルペスウイルス１型変異体、ニューカッスル病ウイルス、脳炎ウイルス、帯状ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、および麻疹ウイルスからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記（ａ）において、前記ウイルスが、前記腫瘍塊中の少なくとも３つの部位に送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記（ａ）において、前記ウイルスが、前記腫瘍塊中の少なくとも５つの部位に送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記（ａ）において、前記ウイルスが、前記腫瘍の約０．２５立方センチメートルあたり１つの部位に送達される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記（ｂ）において、前記組成物の容量が、前記腫瘍の少なくとも３０％の容量である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記（ｂ）において、前記組成物の容量が、前記腫瘍の少なくとも５０％の容量である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記（ａ）において、送達される前記ウイルス組成物の総量が、前記腫瘍の容量の約１０％〜約１００％である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの追加投与をさらに包含する請求項１に記載の方法であって、該追加投与が；
（ａ）前記固形腫瘍内の複数部位への、前記ウイルスを含む組成物の送達；
（ｂ）該腫瘍への、該ウイルスを含む組成物の直接送達であって、ここで該組成物の容量が該腫瘍の約１０％〜約１００％の容量である送達、
（ｃ）経皮パッチ、皮膚へのスプレー、あるいは局所投与による該ウイルスの送達であって、ここで該腫瘍が表層性腫瘍である送達；および
（ｄ）該ウイルスの全身送達、
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの追加投与が、前記基礎投与の前、または後に行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの追加投与が、前記基礎投与と同時である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウイルスがレオウイルスである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記レオウイルスが哺乳動物レオウイルスである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記哺乳動物レオウイルスがヒトレオウイルスである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒトレオウイルスが血清型３ウイルスである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記血清型３ウイルスがＤｅａｒｉｎｇ株ウイルスである、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はウイルスによって引き起こされる腫瘍崩壊の有効性を増加させるための、固形腫瘍への最適なウイルス送達法に関する。
【０００２】
（参考文献）
米国特許第６，１１０，４６１号
米国特許第６，１３６，３０７号
ＷＯ９４／１８９９２，　１９９４年９月１日公開
ＷＯ９４／２５６２７，　１９９４年１１月１０日公開
ＷＯ９４／０８６９２，　１９９９年２月２５日公開
【０００３】
【表１】
2004513184.tif 000003
2004513184.tif 000004
2004513184.tif 000005
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全ての刊行物、特許、および特許出願は、各々の刊行物、特許出願、または特許が、詳細に、そして個々にその全体において参考として援用されることを示しているのと同様に、本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００４】
（発明の背景）
ウイルス治療、特にレオウイルス治療は、新規の選択的な癌治療である（米国特許第６，１１０，４６１号，および同第６，１３６，３０７号；Ｃｏｆｆｅｙら、１９９８）。哺乳動物のレオウイルスに対するレセプターであるシアル酸は遍在性の分子であり、従ってレオウイルスは多数の細胞に結合し得る。しかし、殆どの細胞はレオウイルス感染に感受性がなく、その細胞レセプターへのレオウイルスの結合によっては、ウイルスの複製やウイルス粒子の産生は起こらない。これがおそらく、レオウイルスが任意の特定の疾患に関与していることが知られていない理由である。
【０００５】
ｒａｓ癌遺伝子により形質転換された細胞は、レオウイルス感染に感受性を示すが、一方、非形質転換細胞は感受性を示さない（Ｓｔｒｏｎｇら，１９９８）。例えば、レオウイルス耐性のＮＩＨ３Ｔ３細胞は活性型ＲａｓあるいはＲａｓを活性化するタンパク質Ｓｏｓにより形質転換された場合、レオウイルス感染が促進される。同様に、レオウイルス感染に耐性をもつマウス線維芽細胞は、ＥＧＦレセプター遺伝子またはＶ−ｅｒｂＢ癌遺伝子（これらは両方ともＲａｓ経路を活性化する）によりトランスフェクトされた後、感受性を示すようになる（Ｓｔｒｏｎｇら，１９９３；Ｓｔｒｏｎｇら，１９９６）。このように、レオウイルスは活性化型Ｒａｓ経路を有する細胞において、選択的に感染し、複製する。このことが、レオウイルス癌治療の基礎を成している。
【０００６】
ウイルスが癌細胞内で複製するためには、ウイルスが効果的に腫瘍に運ばれることが重要である。しかし、従来の送達法は、固形腫瘍に対するウイルス治療に対する問題を有する。癌患者はしばしば免疫力が低下しているため、このウイルスは、健康体では通常起こらないような疾患を引き起こし得る。さらに、固形腫瘍は癌患者の全身の循環から頻繁に単離される。従って、ウイルスが固形腫瘍に達し得ない間に、患者の全身をウイルスに曝し、免疫の低下している個体において望ましくない臨床状態の危険を追わせるようなウイルスの全身送達は最適ではない。
【０００７】
別の一般的な送達法は腫瘍内注射である。理論的に、腫瘍内に注射されたウイルスはより多くのウイルス粒子を産生するために癌細胞内で複製する。その後、腫瘍を通して伝播し、結果的に各々の腫瘍細胞において複製する。しかし、レオウイルスの単一注射はその注射部位で腫瘍細胞を殺し、局所的なネクローシスを引き起こす一方、他の腫瘍細胞は注射部位の外側で増殖し続け、最終的に腫瘍増殖を生じ得る。この結果は、固形腫瘍へのレオウイルスの伝播が十分ではないことを示唆する。それ故に固形腫瘍への最適なウイルス送達法が必要とされている。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、固形腫瘍への最適なウイルス送達法に関する。二つのアプローチが、固形腫瘍内の、ウイルスに曝される腫瘍細胞の数を増加させるために適合され得る。ウイルスは固形腫瘍中の複数の部位に送達され得るか、または、固形腫瘍中の単一部位に大量に送達され得、それによって送達されたウイルスは固形腫瘍のより多くの腫瘍細胞に到達し得る。
【０００９】
従って、本発明の一つの局面は、以下からなる群から選択される基礎投与により、腫瘍を有する被験体に有効量のウイルスを投与する工程を包含する、腫瘍の増殖を減少させるための、固形腫瘍へのウイルスの送達法に関する：
（ａ）固形腫瘍内の複数部位への、ウイルスを含む組成物の送達；および
（ｂ）腫瘍への、ウイルスを含む組成物の直接送達（この組成物の容量は、腫瘍の約１０％〜約１００％の容量である）。
【００１０】
ウイルスが腫瘍内の複数部位に送達される場合、少なくとも３つの部位、より好ましくは少なくとも５つの部位が標的化されることが好ましい。最も好ましくは、送達部位の数が腫瘍の容量によって決定され、腫瘍約０．２５立方センチメートルにつき１つの部位にウイルスが到達することである。しかし、このことは、それぞれの送達が異なる０．２５立方センチメートルにおいて起こらなければならないという意味ではない。そうではあるが、投与部位はできるだけ均一に散布されることが望ましい。
【００１１】
ウイルスが大量に送達される場合、その容量は腫瘍の約１０％〜約１００％の容量内であるべきである。ウイルスを含む組成物の容量は、少なくとも腫瘍容量の３０％あることが好ましい。ウイルスは、腫瘍容量の少なくとも５０％の容量に送達されることが、より好ましい。
【００１２】
複数部位での大量の投与は相互に排他的ではない。これら二つの投与方法を結びつけることが熟考されている。さらに、本発明の別の局面において、この方法は上記の基礎投与に加えて少なくとも１つ以上の投与をさらに含み得る。追加投与は次から成る群から選択され得る：
（ａ）固形腫瘍内の複数部位への、ウイルスを含む組成物の送達；
（ｂ）ウイルスを含む組成物の腫瘍への直接送達（組成物の容量は、腫瘍の約１０％〜約１００％容量である）；
（ｃ）経皮パッチ、皮膚へのスプレー、または局所的な投与によるウイルスの送達（この腫瘍は表在性腫瘍である）；および
（ｄ）ウイルスの全身送達；
追加投与は、基礎投与と同時に行われ得る。あるいは、例えば基礎投与の前日か翌日といったように、追加投与を基礎投与と異なる時間に実施し得る。
【００１３】
正常細胞よりも腫瘍細胞内で選択的に複製し得る任意のウイルス（例えば、レオウイルス）が、本発明において有用であると企図される。レオウイルスが使用される場合、レオウイルスは、好ましくは哺乳動物ウイルスであり、より好ましくはヒトレオウイルスであり、さらにより好ましくは血清型３ヒトレオウイルスであり、そして最も好ましくは、Ｄｅａｒｉｎｇ株血清型３ヒトレオウイルスである。本発明において有用な他のウイルスとしては、改変型アデノウイルス、改変型ＨＳＶ、改変型ワクシニアウイルス、改変型パラポックスウイルスｏｒｆウイルス、ｐ５３発現ウイルス、ＯＮＹＸ−０１５ウイルス、デルタ２４ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型変異体（ｈｒＲ３が欠損している）、ニューカッスル病ウイルス、脳炎ウイルス、帯状ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、および麻疹ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明は、固形腫瘍へのウイルス（特に、レオウイルス）の最適な送達法に関する。従来、治療剤は固形腫瘍に単一用量として注射されていた。しかし、この方法はレオウイルス癌治療に有効ではない。レオウイルスは複製能を有するウイルスであり中心の病巣より伝播し得るが、腫瘍塊の周囲の腫瘍細胞の高分裂率の結果、全身腫瘍組織量はなおも増加し得る。従って、本発明はより多くの腫瘍細胞へのウイルス送達に適切である。その結果、二つのアプローチ、またはその組み合わせのいずれかを使用することにより、感染効率を増加させ得る。ウイルスは固形腫瘍内の複数の部位に送達され得るか、または、大量に送達され得、それによって送達されたウイルスは固形腫瘍のより多くの腫瘍細胞に到達し得る。
【００１５】
本発明をさらに詳細に記載する前に、本明細書中で使用される用語を、以下の通り（他に示されない限り）に定義する。
【００１６】
（定義）
「腫瘍」は新生物（ｎｅｏｐｌａｓｍ）としても知られ、新生物細胞を含む新生物（ｎｅｗ　ｇｒｏｗｔｈ）である。また「新生物細胞」は増殖疾患を有する細胞としても公知で、異常に高速に増殖する細胞のことをいう。新生物は異常な組織成長物であり、概して別個の集団を形成し、それらは正常な組織成長物よりもより急速な細胞増殖により成長する。新生物は部分的または全体的に、正常組織との構造的な組織化や機能的協調の欠陥を示す。本明細書中で使用する場合、腫瘍は固形腫瘍だけでなく造血性腫瘍を含むことを意図する。
【００１７】
腫瘍は良性（良性腫瘍）または悪性（悪性腫瘍または癌）であり得る。悪性腫瘍は、大きく３つの主要タイプに分類され得る。上皮構造から発生した悪性腫瘍は、癌腫と呼ばれる。筋肉、軟骨組織、脂肪、または骨のような結合組織由来の悪性腫瘍は肉腫と呼ばれ、免疫系成分を含む造血構造（血液細胞形成に関連する構造）に影響する悪性腫瘍は白血病またはリンパ腫と呼ばれる。他の新生物として、神経線維腫が挙げられるが、これに限定されない。
【００１８】
「腫瘍の成長を抑制する」方法とは、この方法の適用により、この腫瘍が、この方法により処理されていない同一の腫瘍と比較して、低重量または小型化を示すことを意味する。好ましくは、腫瘍の成長は、腫瘍の重量または大きさにおける正味の減少が生じる程度まで抑制される。
【００１９】
「有効量」とは、所望の効果を生ずるのに十分な量である。本発明における所望の効果とは、腫瘍成長を抑制することである。従って、ウイルスの有効量とは、腫瘍成長を抑制するのに十分な、投与されたウイルスの全量である。代表的に、ウイルスの有効量は１０３と１０１２プラーク形成単位（ＰＦＵ）との間である。各場合における有効量は、動物の種および大きさ、ならびに重症度や腫瘍の性質によって変わる。
【００２０】
「腫瘍細胞の選択的死滅」または「腫瘍細胞での選択的複製」は、ウイルスが正常細胞よりも腫瘍細胞を優先的に死滅させる、または、正常細胞よりも優先的に腫瘍細胞内で複製することを意味する。
「レオウイルス」は、天然に存在しようと、改変されていようと、組み換えられていようと、レオウイルス属に分類される任意のウイルスのことを言う。レオウイルスは二本鎖の、セグメント状のＲＮＡゲノムを有するウイルスである。ビリオンは直径６０〜８０ｎｍで二つの同心性の正十二面体のキャプシド殻を有する。ゲノムは、１０〜１２の別個のセグメントの２本鎖ＲＮＡからなり、１６〜２７ｋｂｐの全ゲノムの大きさである。個々のＲＮＡセグメントは大きさの点で異なる。３つの関連するが異なる型のレオウイルスが多数の種から回収されている。３つの型全てが共通の補体結合抗原を共有する。
【００２１】
ヒトレオウイルスは３つの血清型から成る：１型（Ｌａｎｇ株またはＴ１Ｌ）、２型（Ｊｏｎｅｓ株、Ｔ２Ｊ）、そして３型（Ｄｅａｒｉｎｇ株またはＡｂｎｅｙ株、Ｔ３Ｄ）。３つの血清型は中和や血球凝集素抑制法（例えば，Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．ら，１９９６を参照のこと）に基づきで容易に同定され得る。
【００２２】
レオウイルスは天然に存在しているか、または改変され得る。自然の供給源から単離され得、実験室で人為的に改変されていない場合、そのレオウイルスは「天然に存在する」。例えば、レオウイルスは、「フィールドソース（ｆｉｅｌｄ　ｓｏｕｒｃｅ）」、すなわち、レオウイルスに感染したヒト由来であり得る。
【００２３】
レオウイルスは改変され得るが、なおも活性Ｒａｓ経路を有する哺乳動物細胞に溶解的に感染し得る。レオウイルスは、増殖細胞への投与前に、化学的、または生化学的に前処理され得る（例えば、キモトリプシンまたはトリプシンのようなプロテアーゼによる処理）。プロテアーゼによる前処理は、ウイルスの外殻又はキャプシドを取り除き、ウイルスの感染性を増加し得る。レオウイルスはリポソームまたはミセルでコートされ得る（ＣｈａｎｄｒｏｎおよびＮｉｂｅｒｔ，１９９８）。例えば、新規の、感染性の、不完全ビリオン粒子を生成するため、ビリオンはアルキル硫酸塩界面活性剤のミセル形成濃度の存在下でキモトリプシンにより処理され得る。
【００２４】
レオウイルスは、異なる病原表現型を有する２つ以上の型のレオウイルス由来の組み換え（例えば、再構成）レオウイルスであり得、異なる抗原決定部位を含み、それによってレオウイルスサブタイプに曝された哺乳動物による免疫応答を減少または予防する。そのような組換えビリオンは、再分類される異なるサブタイプのレオウイルスの哺乳動物細胞の同時感染により、そして得られたビリオンキャプシド内への異なるサブタイプのコートタンパク質の組み込みにより作成され得る。
【００２５】
「アデノウイルス」は約３．６キロベースの二本鎖ＤＮＡウイルスである。ヒトにおいて、アデノウイルスは、目および呼吸器、胃腸ならびに尿路で複製し、疾患を引き起こし得る。４７の公知のヒト血清型の約３分の１が、ヒトアデノウイルス疾患の殆どの場合の原因となっている（Ｂｒｏｏｋｓら，１９９８）。アデノウイルスは、抗ウイルス性の宿主防衛機構に対抗する、いくつかの遺伝子産物をコードする。アデノウイルスのウイルス関連ＲＮＡ（ＶＡＩ　ＲＮＡまたはＶＡ　ＲＮＡ１）はアデノウイルス感染後、後半に細胞質内に高濃度で蓄積される小さな、構造化されたＲＮＡである。これらのＶＡＩ　ＲＮＡは、ＰＫＲの２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合モチーフに結合し、自己リン酸化によるＰＫＲのｄｓＲＮＡ依存活性化をブロックする。従って、ＰＫＲは機能し得ず、ウイルスは細胞内で複製し得る。ビリオンの過剰産生は、最終的に細胞死を招く。弱毒化または改変型アデノウイルスは、活性化されたＲａｓ経路を有さない細胞内で複製し得ない。しかし、弱毒化または改変型アデノウイルスは活性化されたＲａｓ経路を有する細胞内で複製し得る。
【００２６】
用語「弱毒化アデノウイルス」または「改変型アデノウイルス」とは、ＰＫＲの活性化を防止する遺伝子産物が、ＰＫＲ活性化がブロックされないように欠損、阻害、または変異していることを意味する。好ましくは、ＶＡＩ　ＲＮＡは転写されない。このような弱毒化または改変型アデノウイルスは、活性化Ｒａｓ経路を有さない正常細胞では複製し得ない。しかし、活性化Ｒａｓ経路を有する細胞では感染および複製し得る。
【００２７】
「単純ヘルペスウイルス」（ＨＳＶ）とは、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）または単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）のことを言う。ＨＳＶ遺伝子γ１３４．５は遺伝子産物である感染細胞タンパク質３４．５（ＩＣＰ３４．５）をコードする。このタンパク質はＰＫＲにより発揮される抗ウイルス効果を抑制し得る。ＩＣＰ３４．５は、プロテインホスファターゼ１に相互作用し、そしてｅＩＦ−２αを脱リン酸化する活性に切り換えることにより、ＰＫＲ活性を抑制する、固有の機能を有する（Ｈｅら，１９９７）。野生型ウイルス、または遺伝子操作によりγ１３４．５遺伝子を削除されたウイルスのいずれかに感染された細胞において、γ１３４．５欠損ウイルスに感染された細胞ではｅＩＦ−２αはリン酸化され、タンパク質合成は停止される。γ１３４．５欠損ウイルスは、ＩＣＰ３４．５の活性を必要としない、活性化Ｒａｓ経路を有する細胞内で複製可能であると考えられる。ＨＳＶは活性化Ｒａｓ経路を有さない細胞では複製し得ない。従って、ＨＳＶは活性化Ｒａｓ経路を有する細胞では複製し得る。
【００２８】
用語「弱毒化ＨＳＶ」または「改変型ＨＳＶ」とは、ＰＫＲの活性化を防止する遺伝子産物が、ＰＫＲ活性化がブロックされないように欠損、阻害、または変異していることを意味する。好ましくは、ＨＳＶ遺伝子γ１３４．５は転写されない。このような弱毒化または改変型ＨＳＶは、活性化Ｒａｓ経路を有さない正常細胞では複製し得ない。しかし、活性化Ｒａｓ経路を有する細胞では感染および複製し得る。
【００２９】
「パラポックスウイルスｏｒｆウイルス」は、ポックスウイルスである。このウイルスは、ヒトを含む異なる哺乳動物種において、急性の皮膚病変を誘導する。パラポックスウイルスｏｒｆウイルスは、破壊された皮膚または損傷した皮膚を通してヒツジ、ヤギ、およびヒトに自然感染し、上皮細胞の再生の際に複製し、痂皮に変化する膿疱性損傷を誘導する（Ｈａｉｇら，１９９８）。パラポックスウイルスｏｒｆウイルスは、ＰＫＲ活性の阻止に関連するＯＶ２０．０Ｌ遺伝子をコードする（Ｈａｉｇら，１９９８）。パラポックスウイルスｏｒｆウイルスは、活性化Ｒａｓ経路を有さない細胞では複製し得ない。従って、パラポックスウイルスｏｒｆウイルスは活性化Ｒａｓ経路を有する細胞で複製する。
【００３０】
用語「弱毒化パラポックスウイルスｏｒｆウイルス」または「改変型パラポックスウイルスｏｒｆウイルス」とは、ＰＫＲの活性化を抑制する遺伝子産物（単数及び複数）が、ＰＫＲ活性化がブロックされないように欠損、阻害、または変異していることを意味する。好ましくは、ＯＶ２０．０Ｌ遺伝子は転写されない。このような弱毒化または改変型パラポックスウイルスｏｒｆウイルスは、活性化Ｒａｓ経路を有さない正常細胞では複製し得ない。しかし、活性化Ｒａｓ経路を有する細胞では感染および複製し得る。
【００３１】
「ワクシニアウイルス」は、オルトポックスウイルス属のウイルスのことを言う。このウイルス属はヒトに感染し、局在の病変を生じる（Ｂｒｏｏｋｓら，１９９８）。ワクシニアウイルスは、２つの全く異なる機構を介してＰＫＲ活性の下方制御において役割を果たす２つの遺伝子をコードする。Ｅ３Ｌ遺伝子は２０ｋＤａおよび２５ｋＤａの２つのタンパク質をコードし、これらは感染の初期に発現され、ＰＫＲ活性を阻害し得るｄｓＲＮＡ結合活性を有する。Ｅ３Ｌ遺伝子の欠失または破壊は、活性化Ｒａｓ経路を有する細胞において、許容的なウイルスの複製を引き起こす。ワクシニアウイルスのＫ３Ｌ遺伝子は、ＰＫＲの偽基質であるｐＫ３をコードする。
【００３２】
Ｅ３機能を破壊する残基の欠失はｄｓＲＮＡ結合を阻害するよう機能する。更に、Ｅ３タンパク質のアミノ末端領域はＰＫＲのカルボキシ末端領域ドメインに相互作用するので、このドメインの欠失または点変異は抗ＰＫＲ機能を抑制する（Ｃｈａｎｇら，１９９２，１９９３，１９９５；Ｓｈａｒｐら，１９９８；Ｒｏｍａｎｏら，１９９８）。ワクシニアウイルスのＫ３Ｌ遺伝子は、ＰＫＲの偽基質であるｐＫ３をコードする。Ｋ３Ｌ内には機能喪失変異が存在する。Ｋ３Ｌタンパク質のＣ末端部分の短縮、またはそのＣ末端部分内での点変異の作製のいずれかにより、ｅＩＦ−２αにおいて７９から８３残基への相同性がＰＫＲ抑制活性を消滅させる（Ｋａｗａｇｉｓｈｉ−Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，１９９７）。
【００３３】
用語「弱毒化ワクシニアウイルス」または「改変型ワクシニアウイルス」とは、ＰＫＲの活性化を防止する遺伝子産物が、ＰＫＲ活性化がブロックされないように欠損、阻害、または変異していることを意味する。好ましくは、Ｅ３Ｌ遺伝子および／またはＫ３Ｌ遺伝子は転写されない。このような弱毒化または改変型ワクシニアウイルスは、活性化Ｒａｓ経路を有さない正常細胞内で複製し得ない。しかし、活性化Ｒａｓ経路を有する細胞で感染および複製し得る。
【００３４】
（方法）
本発明者らは、ウイルスに曝される腫瘍細胞の数を増加させる目的により、固形腫瘍への腫瘍崩壊ウイルスの効果的な送達法を開発した。腫瘍崩壊ウイルスは、腫瘍細胞において選択的に複製し得るが正常細胞ではそうではないウイルスであり、それにより腫瘍細胞を死滅させるウイルスである。従って、より多くの腫瘍細胞をウイルスに曝すことは、より多くの腫瘍細胞死とウイルス治療のより高い効力を導き得る。
【００３５】
固形腫瘍への治療剤の送達の伝統的な方法は、腫瘍内に治療剤の単一用量を注射することである。図１Ａに示されるように、注射部位周辺の細胞は薬剤に曝される。代表的には、腫瘍の縁にある残りの細胞は成長し続ける。固形腫瘍の外側にある細胞はより速く成長する細胞であるため、腫瘍細胞の成長を低減するためのこの方法の能力は限定される。
【００３６】
ウイルス感染細胞の増加した数は、全身送達を使用して達成され得る。この方法において、循環中のウイルスは、腫瘍の外側部分において急速に成長している細胞に接触しかつ感染し得る。一度外側の細胞が感染されると、ウイルスは腫瘍の内側に拡散し得る（図１Ｄ）。しかし、上記で述べたように、この方法は全身をウイルスに不必要に曝す。更に、もし腫瘍が全身の循環から遮断されていれば、ウイルスは腫瘍に全く到達しないであろう。
【００３７】
本発明においては、２つの方法を使用することにより、固形腫瘍へのウイルス送達の効率を増加する。ウイルスは、腫瘍内の複数部位、特に腫瘍の外側部分に注射され得る。図１Ｂで示すように、ウイルスは、単一注射よりもかなり大きな腫瘍の部分に拡散し得、そして腫瘍増殖は拘束される。あるいはウイルスは、大量の液体中で単一部位に送達され得、これは、ウイルスのより広い拡散を可能にする（図１Ｃ）。最適な容量は実験的に決定されることを必要とする。しかし、最小限１０％の腫瘍容量が最適な結果を達成するために必要とされる。ウイルス含有組成物の容量は、腫瘍容量の少なくとも３０％であることが好ましい。より好ましくは、ウイルスは、腫瘍容量の少なくとも５０％である容量中で送達される。投与の適用範囲を決定するため、色素のようなコントラスト剤または他の指示薬が、投与された組成物の検出を容易にするためにこの組成物に加えられ得る。
【００３８】
ウイルスは任意の適切な薬学的賦形剤内で、固形腫瘍に投与され得る。複数部位に送達するため、複数投与に有用な任意のデバイスが採用され得る。例えば、直接注射が、針とシリンジで複数回繰り返され得る。あるいは、複数のインジェクターを備えたデバイスを使用して、複数部位に同時に注射し得る。
【００３９】
正常細胞よりもむしろ腫瘍細胞において選択的に複製し得る任意のウイルスは、本発明に有用である。そのようなウイルスの例は、レオウイルス、改変型アデノウイルス、改変型ＨＳＶ、改変型ワクシニアウイルス、改変型パラポックスウイルスｏｒｆウイルス、ｐ５３発現ウイルス、ＯＮＹＸ−０１５ウイルス、デルタ２４ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ｈｒＲ３が欠損した単純ヘルペスウイルス１型変異体、ニューカッスル病ウイルス、脳炎ウイルス、帯状ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、および麻疹ウイルスを含む。これらの腫瘍崩壊性ウイルスは以下に論じられる。
【００４０】
アデノウイルス、ＨＳＶ、ワクシニアウイルス、およびパラポックスウイルスｏｒｆウイルスは、二本鎖ＲＮＡキナーゼ（ＰＫＲ）に打ち勝つ機構を発達させたウイルスである。正常には、ウイルスが細胞に入る場合、ＰＫＲは活性化され、タンパク質合成をブロックする。そして、ウイルスはこの細胞において複製し得ない。しかし、アデノウイルスは、大量の小型ＲＮＡ、ＶＡ１　ＲＮＡを作製する。ＶＡ１　ＲＮＡは広範囲にわたる２次構造を有し、正常にはＰＫＲを活性化する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と競争してＰＫＲに結合する。ＰＫＲを活性化するためにｄｓＲＮＡの最低限の長さを必要とするため、ＶＡ１　ＲＮＡはＰＫＲを活性化しない。その代わりに、その大量の効力によりＰＫＲを隔離する。従って、タンパク質合成はブロックされず、アデノウイルスは細胞内で複製し得る。
【００４１】
ワクシニアウイルスは、異なる機構でＰＫＲを下方制御する２つの遺伝子産物、Ｋ３ＬおよびＥ３Ｌをコードする。Ｋ３Ｌ遺伝子産物は、ＰＫＲの天然基質であるｅＩＦ−２αのアミノ末端領域との限られた相同性を有し、そしてＰＫＲの偽基質として働き得る。Ｅ３Ｌ遺伝子産物は、ｄｓＲＮＡ結合タンパク質であり、そしてアクチベーターｄｓＲＮＡを隔離することにより見かけ上機能する。
【００４２】
同様に、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）遺伝子γ１３４．５は、遺伝子産物である感染細胞タンパク質３４．５（ＩＣＰ３４．５）をコードする。このタンパク質は、ＰＫＲにより発揮される抗ウイルス効果を防止し得る。パラポックスウイルスｏｒｆウイルスは、ＰＫＲ活性をブロックすることに関与するＯＶ２０．０Ｌ遺伝子をコードする。従って、これらのウイルスはＰＫＲによって阻害されることなく、細胞に首尾良く感染し得る。
【００４３】
改変型アデノウイルス、改変型ＨＳＶ、改変型ワクシニアウイルス、または改変型パラポックスウイルスｏｒｆウイルスにおいて、ウイルスの抗ＰＫＲ機構は変異されているか、あるいはそうでなければ不活性化されている。従って、これらの改変型ウイルスは、正常なＰＫＲ機能を有する正常な細胞では複製し得ない。しかし、ｒａｓがＰＫＲを不活性化するため、ｒａｓ活性化新生物細胞は、ＰＫＲによるタンパク質合成阻害を受けにくい。従って、これらの細胞は、改変型アデノウイルス、改変型ＨＳＶ、改変型ワクシニアウイルス、または改変型パラポックスウイルスｏｒｆウイルスによる感染に感受性である。
【００４４】
これらのウイルスは、ウイルスＰＫＲインヒビターの、既知の構造−機能関係に従って、改変あるいは変異され得る。例えば、Ｅ３タンパク質のアミノ末端領域が、ＰＫＲのカルボキシル末端領域ドメインと相互作用するため、このドメインの欠失あるいは点変異が抗ＰＫＲ機能を妨げる（Ｃｈａｎｇら，１９９２，１９９３，１９９５；Ｓｈａｒｐら，１９９８；Ｒｏｍａｎｏら，１９９８）。ワクシニアウイルスのＫ３Ｌ遺伝子は、ｐＫ３（ＰＫＲの偽基質）をコードする。Ｋ３Ｌ内には機能喪失変異がある。先端欠失によるか、あるいはＫ３Ｌタンパク質のＣ末端部分（ｅＩＦ−２αにおける残基７９〜８３に相同）内に点変異を置くかのいずれかにより、ＰＫＲ阻害活性を消滅させる（Ｋａｗａｇｉｓｈｉ−Ｋｏｂａｙａｓｈｉら，１９９７）。
【００４５】
他の腫瘍崩壊ウイルスは、腫瘍サプレッサ遺伝子を保持することにより、新生物細胞を選択的に殺傷するウイルスを含む。例えば、ｐ５３は正常細胞の制御不能な増殖を阻害する細胞性腫瘍サプレッサである。しかし、全腫瘍のおよそ半分が、機能的に減損したｐ５３を有しており、制御不能状態で増殖する。従って、野生型ｐ５３遺伝子を発現するウイルスは、ｐ５３遺伝子産物の不活性化により新生物となる新生物細胞を選択的に死滅させ得る。そのようなウイルスが構築され、そして変異体ｐ５３を発現する癌細胞においてアポトーシスを誘導することを示された（Ｂｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙら、１９９６）。
【００４６】
同様のアプローチは、腫瘍サプレッサのウイルスインヒビターに関する。例えば、特定のアデノウイルス、ＳＶ４０およびヒトパピローマウイルスは、ｐ５３を不活性化するタンパク質を含有し、それにより、それら自身の複製を可能にする（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ，１９９９）。アデノウイルス血清型５に関して、このタンパク質は、Ｅ１Ｂ領域によってコードされる５５ｋｄのタンパク質である。ＯＮＹＸ−０１５ウイルス（Ｂｉｓｃｈｏｆｆら，１９９６；Ｈｅｉｓｅら，２０００；ＷＯ９４／１８９９２）におけるように、この５５ｋｄのタンパク質をコードするＥ１Ｂ領域が欠失している場合、５５ｋｄのｐ５３インヒビタ−はもはや存在しない。結果として、ＯＮＹＸ−０１５が正常細胞に入る場合、ｐ５３は、細胞増殖機構に頼る、細胞増殖及びウイルス複製を抑圧するために機能する。従って、ＯＮＹＸ−０１５は正常細胞では複製しない。その一方、ｐ５３機能が破壊された新生物細胞では、ＯＮＹＸ−０１５は複製し得、そして最終的に細胞を死滅させ得る。従って、このウイルスを使用して、ｐ５３欠損新生物細胞に選択的に感染し、かつ死滅させ得る。当業者はまた、確立された技術に従い、アデノウイルス血清型５、または他のウイルスにおいてｐ５３インヒビター遺伝子を変異および破壊し得る。
【００４７】
別の例は、デルタ２４ウイルスであり、このウイルスは、Ｅ１Ａ領域に２４塩基対の欠失を有する変異体アデノウイルスである（Ｆｕｅｙｏら，２０００）。この領域は、細胞腫瘍サプレッサＲｂへの結合およびＲｂ機能の阻害を担い、それによって、細胞増殖機構を、従ってウイルス複製を、制御不能状態で進行することを可能にする。デルタ２４は、Ｒｂ結合領域に欠失を有し、そしてＲｂに結合しない。従って、変異体ウイルスの複製は正常細胞ではＲｂにより阻害される。しかし、Ｒｂが不活性化されており、そしてその細胞が新生物となれば、デルタ２４はもはや阻害されない。その変わりに、その変異体ウイルスは効率的に複製し、そしてＲｂ欠失細胞を溶解する。
【００４８】
なお別の腫瘍崩壊ウイルスは、インターフェロン感受性ウイルスを含む。水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）は、インターフェロン存在下で、新生物細胞を選択的に殺傷する。インターフェロンは、細胞表面レセプターに結合する循環性因子であり、これは、最終的に、標的細胞における抗ウイルス応答、および成長阻害および／またはアポトーシスシグナルの誘導の両方を導く。インターフェロンを理論的に使用し、腫瘍細胞の増殖を抑制し得るけれども、インターフェロン経路のメンバーの腫瘍特異的変異により、この試みはあまり成功していない。
【００４９】
しかし、インターフェロンによって発揮される増殖阻害を避けるためにインターフェロン経路を破壊することによって、腫瘍細胞は、それらの抗ウイルス応答を同時に弱め得る。実際に、ＶＳＶ（エンベロープで覆われた、ネガティブセンスＲＮＡウイルス）は、インターフェロン存在下で、様々なヒト腫瘍細胞株において急速に複製し、それらを殺傷したこと、その一方、正常ヒト一次細胞培養は、見かけ上インターフェロンにより保護されたことが示された。ＶＳＶの腫瘍内部注射はまた、皮下へのヒト黒色種異種移植を行ったヌードマウスの全身腫瘍組織量を軽減した（Ｓｔｏｊｄｌら，２０００）。
【００５０】
他のインターフェロン感受性ウイルス（ＷＯ９９／１８７９９）、すなわち、インターフェロン存在下で正常細胞において複製しないウイルスは、異なる濃度のインターフェロン存在下で、正常細胞の培養物を増殖させる工程、その培養物を目的のウイルスと接触させる工程、次いで所定の時間のインキュベーションの後、細胞死滅の百分率を決定する工程、により単離され得る。好ましくは、２０％より少ない正常細胞が死滅し、そしてより好ましくは、１０％より少ない正常細胞が死滅する。
【００５１】
また、いくつかの新生物細胞が高レベルの酵素を発現するという事実を利用し、そしてこの酵素に依存するウイルスを構築することも可能である。例えば、リボヌクレオチドレダクターゼは、肝臓転移において豊富であるが、正常肝臓においては稀である。従って、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）変異体（リボヌクレオチドレダクターゼ（ｈｒＲ３）発現が欠損している）は、結腸癌細胞では複製するが、正常肝臓細胞では複製しないことが示された（Ｙｏｏｎら，２０００）。
【００５２】
以上で論じたウイルスに加え、根本的な機構は必ずしも明らかではないが、様々な他のウイルスが腫瘍死滅に関係している。ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、悪性細胞で優先的に複製する。そして、最も共通して使用される株は７３−Ｔ株である（Ｒｅｉｃｈａｒｄら，１９９２；Ｚｏｒｎら，１９９４；Ｂａｒ−Ｅｌｉら，１９９６）。腫瘍内部への接種の後に、ＮＤＶが全身腫瘍組織量を低減した臨床上の抗腫瘍活性はまた、様々な腫瘍（頸部癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、黒色腫、及び腎臓癌を含む）で観察された（ＷＯ９４／２５６２７；Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ，１９９９）。
【００５３】
更に、脳炎ウイルスは、マウス肉腫腫瘍において腫瘍崩壊性効果を有することが示されたが、正常細胞での感染性を減少するために弱毒化が必要とされ得る。腫瘍退化が、帯状ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘ウイルス、および麻疹ウイルスに感染した腫瘍患者において記載されている（総説については、Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓ，１９９９を参照のこと）。本明細書中で開示された方法、および当該分野における周知の技術に従って、当業者は、本発明の方法を使用して腫瘍増殖を阻害するために、どのウイルスを用い得るかを決定するために、これらまたは他のウイルスの新生物細胞を選択的に殺傷する能力を試験し得る。
【００５４】
以下の実施例は、本発明を例示するために提供され、そしていかなる様式においても本発明の範囲を限定するとして解釈されるべきではない。
【００５５】
（実施例）
以下の実施例において、次の略語は後の意味を有している。定義されていない略語は、それらの一般的に受け入れられた意味を有する。
℃＝摂氏温度
ｈｒ＝時間
ｍｉｎ＝分
ｍＭ＝マイクロモル濃度
ｍＭ＝ミリモル濃度
Ｍ＝モル濃度
ｍｌ＝ミリリットル
ｍｌ＝マイクロリットル
ｍｇ＝ミリグラム
ｍｇ＝マイクログラム
ＰＡＧＥ＝ポリアクリルアミドゲル電気泳動
ｒｐｍ＝回転／分
ＦＢＳ＝胎児ウシ血清
ＤＴＴ＝ジチオスレイトール
ＳＤＳ＝ドデシル硫酸ナトリウム
ＰＢＳ＝リン酸緩衝化生理食塩水
ＤＭＥＭ＝ダルベッコ改変イーグル培地
α−ＭＥＭ＝α−改変イーグル培地
β−ＭＥ＝β−メルカプトエタノール
ＭＯＩ＝感染効率
ＰＦＵ＝プラーク形成単位
ＰＫＲ＝二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ
ＥＧＦ＝上皮成長因子
ＰＤＧＦ＝血小板由来成長因子
ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド
ＣＰＥ＝細胞変性効果
（実施例１；局所および全身レオウイルス投与）
免疫コンピテントのＣ３Ｈマウスに、ｒａｓ形質転換Ｃ３Ｈ−１０Ｔ１／２線維芽細胞を移植し、そして腫瘍の成長を可能にした（Ｃｏｆｆｅｙら，１９９８）。腫瘍構築後、マウスを、以下に示す様々な経路と治療スケジュールで、Ｄｅａｒｉｎｇ株レオウイルスで処理した：
（Ａ）０日目に１ｘ１０９ＰＦＵの血管内注射；
（Ｂ）０日目から４日目に毎日１ｘ１０９ＰＦＵの腹腔内注射（５回注射）；および
（Ｃ）１日おきに１ｘ１０９ＰＦＵの腫瘍内注射。
【００５６】
コントロールマウスを、死滅レオウイルスで処理した。全ての動物における腫瘍サイズを、１日おきに評価した。
【００５７】
結果を図２に示す。腹膜腔内注射は、５回繰り返した場合でさえ、腫瘍サイズの縮小にあまり効果的ではなかった。レオウイルスの一回の血管内注射は、約２週間の間、腫瘍に対し効果的であった。その後、腫瘍は再び成長を始めた。一方、腫瘍中への複数注射は、腫瘍増殖を効果的に阻害した。従って、局所および全身レオウイルスの投与の両方は、レオウイルス治療に使用し得る。
【００５８】
（実施例２：腫瘍への複数部位へのレオウイルス投与の効果）
固形腫瘍中の複数部位でのレオウイルス投与の効果を研究するため、当該分野で確立された方法に従い、固形腫瘍をマウス中に形成させる。例えば、上記実施例１、または米国特許第６，１１０，４６１号の実施例８を参照のこと。
【００５９】
Ｄｅａｒｉｎｇ株レオウイルスを、以下の投与過程に従い、腫瘍保持マウスに投与する：
Ａ．０日目に５ｘ１０９ＰＦＵの単一腫瘍内注射；
Ｂ．０日目に各２．５ｘ１０９ＰＦＵの２回の腫瘍内注射（合計５ｘ１０９ＰＦＵ）；
Ｃ．０日目に各１ｘ１０９ＰＦＵの５回の腫瘍内注射（合計５ｘ１０９ＰＦＵ）；および
Ｄ．０日目に１ｘ１０９ＰＦＵの静脈内注射。
【００６０】
コントロール実験においては、腫瘍保持マウスに死滅レオウイルスを投与する。腫瘍サイズを、それぞれのマウスについて、１日おきに評価した。これらの結果は、コントロールと比較して、全処理過程が腫瘍サイズを減少し、５回の腫瘍内注射が最も効果的であることを示す。
【００６１】
（実施例３；大容量のレオウイルス投与）
上記のように、腫瘍をマウス中に形成させる。各腫瘍のサイズを評価し、そして５ｘ１０９ＰＦＵのレオウイルスを、腫瘍サイズの１０％、２０％、３０％、５０％、７５％、および１００％に等しいビヒクル容量中に、それぞれ調整し、そして腫瘍中に注射する。コントロールマウスの一つの群に、同じ方法で処方された死滅レオウイルスを与える。別のコントロール群には、同じ方法で２０ｕｌのビヒクル中の５ｘ１０９ＰＦＵのレオウイルスを与える。次いで１日おきに腫瘍のサイズを測定する。
【００６２】
これらの結果は、より大きな容量が、腫瘍サイズを減少することにおいて、特に、最初の腫瘍サイズの２０％〜５０％容量がより効果的であることを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、固形腫瘍へのウイルス送達の種々の方法を示す。（Ａ）固形病巣へのウイルスの単回注射を示す。複製コンピテントウイルスは中央の病巣から伝播し得るが、腫瘍塊の周縁上の腫瘍細胞の高い分裂率の結果、全身腫瘍組織量がなお増加し得る。（Ｂ）複数投与（単一のインターバルの間であるか、または延長された時間にわたる）は、感染した腫瘍細胞の総数を増加することによって、全身腫瘍組織量を減少する能力を増加する。これは、注入された感染性粒子の総数が単回注射において同じであっても当てはまる。（Ｃ）感染性粒子の総数が同じままであるとしても、増加した数の感染細胞もまた、送達容量を増加することにより達成され得る。（Ｄ）増加した数の感染細胞はまた、全身送達により達成し得る。腫瘍発生の間に生じる血管系は、この経過を経由する効率的な腫瘍内送達を可能にしないけれども、循環中のウイルスは、腫瘍の外側部分で急速に成長する細胞に接触かつ感染し得る。次いで、ウイルスの拡散が、外側から内側に向かって生じ得る。
【図２】
図２は、レオウイルスの局所投与および全身投与を示す。図２は、免疫コンピテントのマウスにおける、種々の経路および注射スケジュールを介したレオウイルスの投与の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004513184.tif 000045
【国際調査報告】
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