(57)【要約】生物学的試料のDNA依存的DNA重合を測定する方法が記載される。この方法は、内部で塩基対とすることができない、固相に結合した一本鎖の短い特異配列を有するプライマーを供給し、プライマー構築物を、プライマーに相補的な配列の一部を有する一本鎖のデオキシヌクレオチド鋳型と、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸であってその一つを修飾して標識抗体によって特異的に認識されるようにしたものを含む反応混合物と接触させ、レトロウイルス逆転写酵素(RT)のようなDNAポリメラーゼを含んでなる生物学的試料を混合物に加え、ポリメラーゼ反応を進行させ、固定化反応生成物を標識抗体と共にインキュベーションし、結合した標識抗体の量を検出し、DNA重合の尺度としての組込まれた修飾したデオキシヌクレオシド三リン酸の量を結合した抗体の標識によって測定する段階を含んでなり、薬剤感受性試験に用いることができる。商業用包装も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料のDNA依存的DNA重合を測定する方法であって、
a)  内部で塩基対とすることができない、固相に結合した一本鎖の短い特定配列を有するプライマーを供給し、
b)  プライマー構築物を、プライマーに相補的な配列の一部を有する一本鎖のデオキシヌクレオチド鋳型と、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸であってその一つを修飾して標識抗体によって特異的に認識されるようにしたものを含む反応混合物と接触させ、
c)  DNAポリメラーゼを含んでなる生物学的試料をb)の混合物に加え、
d)  ポリメラーゼ反応を進行させ、
e)  d)から生成する固定化反応生成物を標識抗体と共にインキュベーションし、
f)  結合した標識抗体の量を、用いた標識によって検出し、
g)  DNA重合の尺度としての組込まれた修飾したデオキシヌクレオシド三リン酸の量を結合した抗体の標識によって測定する段階を含んでなる、方法。
【請求項２】
DNAポリメラーゼがレトロウイルス逆転写酵素(RT)である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
レトロウイルスRTがヒト免疫不全ウイルス(HIV) RTである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
修飾したデオキシヌクレオシド三リン酸が５−ブロモデオキシウリジン５′−三リン酸(BrdUTP)であり、標識抗体がアルカリホスファターゼ(Ap)に結合した抗BrUモノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
測定したDNA重合を薬剤感受性試験に用いる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
a)  内部で塩基対とすることができない、固相に結合した一本鎖の短い特定配列を有するプライマー、
b)  a)のプライマーに相補的な配列の一部を有する一本鎖のデオキシヌクレオチド鋳型、
c)  ４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸であって、その一つを修飾して標識抗体によって特異的に認識されるようにしたもの、および
d)  c)の修飾したデオキシヌクレオシド三リン酸を認識する標識抗体を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のDNA依存的DNA重合を測定するための記載されたまたはデーターキャリヤー使用説明書を含む、商業用包装。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNA重合の測定方法およびこの方法の応用に関する。更に正確には、本発明は、DNA依存的DNA重合の測定方法に関する。
【０００２】
背景
この数十年間に、逆転写、すなわちRNA依存的DNA重合の新たな測定方法が急速に発達してきた。DNA依存的DNA重合の定量方法に関する一層複雑な問題については、これまでは余り注目されることはなかった。
【０００３】
古典的DNAポリメラーゼ活性分析法は、DNアーゼで処理したDNA(「活性化DNA」)のプライマー/鋳型としての使用、および放射能標識したヌクレオチドのDNAへの組込みを含んでいる(Aposhian and Komberg 1962)。酸でプレシプタブルの放射能を測定することによって、組込まれたヌクレオチドの量および存在する酵素単位の数を計算することができる。しかしながら、放射能の使用は一般に制限されておりまた多くの実験室で止められるようになってきており、このため、放射能に基づく手法から離れる一般的傾向がある。
【０００４】
DNAポリメラーゼについては、新たに作製されたDNAに組込まれたジゴキシゲニン標識したヌクレオチドのELISAに基づく商業的分析法が用いられている（Roche Molecular Biochemicals Cat. no 1468120, 米国特許第５，６３５，３５０号明細書）。この分析法は、嵩高な基を有する２種類の異なるヌクレオチド基質類似体、標識としてのジゴキシゲニン、および生成物の固定化のためのビオチンの使用によって妨げられる。その結果、重合反応速度とその後の検出感度は減少する。著しく偏向した反応速度特性を有する基質類似体を用いると、この系は異なるポリメラーゼの薬剤感受性の研究に余り関連性がなくなる。
【０００５】
もう一つの一層有望な代替法は、色素PicoGreenと二本鎖DNAとの特異的反応に基づくDNAポリメラーゼホロ酵素の蛍光に基づく分析法である(Seville et all 1996)。後者の方法は、一層広範囲の様々なDNA重合酵素に適するように最近改質されている(Tveit and Kristensen 2001)。この分析法は技術的に簡単であり、天然ヌクレオチドの利用に基づいている。しかしながら、検出感度は未だ古典的な放射性DNAポリメラーゼ分析法と同じ範囲であり、報告されている応用では０．５〜０．５U DNAポリメラーゼ/試料の検出範囲を示している。
【０００６】
HIV治療は、現在は多剤療法に基づいている。この投薬計画は、利用可能な３種類総ての薬剤であるヌクレオシド類似体、非ヌクレオシド類似体およびプロテアーゼ阻害薬の組合せに基づいている。この方法は、突然変異体ウイルスが生き残る確率を最小限にすることである。
【０００７】
RT阻害薬は、ヌクレオシド類似体または非ヌクレオシド類似体である。非ヌクレオシド阻害薬は、活性部位に接近しているが接触はしていないRT酵素の疎水性ポケットに結合している。HIV-1複製は、ポリメラーゼ結合部位に関して触媒的なアスパルテート残基を置換することによってアロステリックに阻害される。
【０００８】
現在用いられているヌクレオシド阻害薬は、それらが３′−ヒドロキシル基を欠いているので、DNA鎖の伸長を終結させる。ヌクレオシド阻害薬を用いる長期間の治療により、通常は耐性ウイルスを発生させる。この過程は、ウイルスpol遺伝子に突然変異が漸進的に出現し、それぞれが画定されたアミノ酸を置換することと関連している[総説については、Vandamme et al 1998を参照されたい]。酵素レベルでのこれらの置換の影響は複雑であり、原始的なDNAエディティング機能の増加が挙げられる。この反応はヌクレオチド依存的であり、ジヌクレオシドポリホスフェートと伸長性DNAの３′末端を生成する[Arion et al 1998, Meyer et al 1999]。
【０００９】
HIV-1RT並びに他の逆転写酵素は、３種類の異なる酵素反応、すなわちRNA依存的DNA重合、DNA依存的DNA重合、およびDNA-RNAハイブリッド(RNアーゼH)におけるRNAの分解を行う。pol遺伝子によってコードされたHIVRTは、p66とp5lサブユニットからなるヘテロ二量体である。RNA依存的DNA重合とDNA依存的DNA重合はいずれも、p66サブユニットに局在する同一活性部位によって行われる(総説については、Goff 1990を参照されたい）。これらの薬剤の反応機構は、主としてRNA依存的DNA重合反応についてのそれらの作用によって定義されている。DNA依存的DNA重合反応に対する影響については、比較的余り研究されていない。
【００１０】
反応機構および活性の代謝薬剤が知られており且つ利用可能である場合には、表現型ウイルスの薬剤感受性を酵素レベルで決定することができる。使用される酵素分析法とウイルス単離技術によっては、薬剤感受性試験は、理論的には一次ウイルス単離であるウイルス培養増殖物からの上清について、または患者から直接回収したウイルス製剤について行うことができる。通常のRT活性分析法は、人工的鋳型プライマー構築物および標識したデオキシヌクレオシド三リン酸をヌクレオチド基質として用いることによって行われる。鋳型/プライマー対のポリ(rA)/オリゴ(dT)は、HIVの測定並びに他のレトロウイルスRTについて最も効率的且つ最も多く用いられる組合せである。薬剤感受性試験に関するときのこの種類の分析法の欠点は、非ヌクレオシド類似体またはrAと塩基対を組むことができる類似体しか試験できないことである。他のヌクレオチド塩基の類似体は、可変ポリマー鋳型に基づく分析法が必要である。ピリミジン塩基を含むRNAポリマーはRNアーゼに感受性であり且つ実際には生物学的試料と適合性でないことが知られている。従って、薬剤感受性試験を目的とするポリメラーゼ分析系が逆転写の阻害および古典的表現型薬剤耐性試験の結果と相関する結果を生じる場合には、この分析法を可変DNA鋳型に基づくようにするのが有利である。
【００１１】
現在用いられているHIV療法は、DNAポリメラーゼ阻害薬の有効性の一例に過ぎない。細菌や他の微生物における最近の状況が関係する耐性の発生により、新たな種類の抗微生物薬の探求に弾みがついている。DNAポリメラーゼは、この活動の際の主要な目的の一つである。それ自体、技術的に簡単なポリメラーゼ分析法であって、潜在的な環境上の危険性を引き起こさず且つ広範囲の微生物DNAポリメラーゼアイソザイムに対する薬剤スクリーニングに応用することができる分析法が強く求められている。見出された薬剤の毒性は、相当する哺乳類のDNAポリメラーゼに対して更に評価しなければならない。
【００１２】
ポリメラーゼ−αおよび−δのような増殖に関連したポリメラーゼの定量を用いて、細胞増殖を観察することができる。これに関連して、現在、もう一つの細胞増殖に関連した酵素であるチミジンキナーゼの血清濃度を用いて、悪性疾患の予知および分類することが述べられている（米国特許第４，６３７，９７７号明細書）。チミジンのリン酸化は、DNA合成の目的でチミジン三リン酸を提供する２種類の細胞内合成経路の一方である。DNAポリメラーゼ自身の測定は、チミジンキナーゼ活性またはチミジン組込みと比較して一層正確に全DNA合成を評価する可能性を有する。
【００１３】
発明の説明
本発明は、比色または蛍光により生成物を検出することができるマイクロタイタープレートフォーマットにおける非放射性DNAポリメラーゼ分析法を提供する。
【００１４】
好ましい態様では、本発明は、ヌクレオシド三リン酸基質として５−ブロモデオキシウリジン５′−三リン酸(BrdUTP)を用いる。BrdUTPの５′位の臭素とチミジン三リン酸の５′位のメチル基の間のVan der Waals半径の差は極微(２．０Åと比較して１．９５Å)であり、これら２種類のヌクレオシドの酵素反応速度特性は、極めて類似している。この方法は芳香族化し、３nUポリメラーゼ活性／試料までの検出範囲を有することができる。
【００１５】
本発明の応用の一つは、薬剤感受性試験である。これまでに認可されている総ての抗レトロウイルス薬は、ウイルスプロテアーゼまたはRTの酵素反応を妨げる。更に、伝達系路にはレトロウイルスインテグラーゼの機能に影響を与える候補薬剤もある。
【００１６】
特に本発明は、広汎な種類のDNA依存的DNAポリメラーゼを測定する手続きを提供する。これは、比較的短い鋳型が用いられているが、高度に発展的なDNAポリメラーゼ系の研究にも適していることが明らかなっている。細菌性ポリメラーゼIおよびIIIの活性、哺乳類DNAポリメラーゼα、βおよびγ、ヒト血清中の増殖関連ポリメラーゼ活性、およびHIVRTによるDNA依存的DNA重合の測定に対する有用性が明らかにされるが、この方法は実質的に総てのウイルスおよび細胞性DNAポリメラーゼの研究に用いることができる。本発明のDNAポリメラーゼ分析法を従来の技術と識別する特徴の一つは、その優れた感度であり、３nUまでのE. coli DNAポリメラーゼI活性を検出することができる。
【００１７】
従って、本発明の一態様は、生物学的試料でのDNA依存的DNA重合を測定する方法であって、
a)  内部で塩基対とすることができない、固相に結合した一本鎖の短い特定配列を有するプライマーを供給し、
b)  プライマー構築物を、プライマーに相補的な配列の一部を有する一本鎖のデオキシヌクレオチド鋳型と、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸であってその一つを修飾して標識抗体によって特異的に認識されるようにしたものを含む反応混合物と接触させ、
c)  DNAポリメラーゼを含んでなる生物学的試料をb)の混合物に加え、
d)  ポリメラーゼ反応を進行させ、
e)  d)から生成する固定化反応生成物を標識抗体と共にインキュベーションし、
f)  結合した標識抗体の量を、用いた標識によって検出し、
g)  DNA重合の尺度としての組込まれた修飾したデオキシヌクレオシド三リン酸の量を結合した抗体の標識によって測定する段階を含んでなる、方法に関する。
【００１８】
一態様では、DNA重合は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)RTのようなレトロウイルス逆転写酵素(RT)によって行われる。
【００１９】
もう一つの態様では、修飾したデオキシヌクレオシド三リン酸は５−ブロモデオキシウリジン５′−三リン酸(BrdUTP)であり、標識抗体はアルカリホスファターゼ(Ap)に結合した抗BrdUモノクローナル抗体である。
【００２０】
本発明による方法の好ましい態様では、測定したDNA重合を用いて薬剤感受性試験を行う。
【００２１】
薬剤感受性試験を行ってある種の薬剤が哺乳類個体で有効であるかどうかを評価し、その結果を用いてその個体に対する薬剤投与療法を選択することができる。実際には、個体を幾つかの時点で試験して、上記個体における薬剤治療の展開を観察する。
【００２２】
本発明は、本発明によるDNA依存的DNA重合を測定するための記載されたまたはデーターキャリヤー使用説明書を含んでなる商業用包装にも関する。この包装は、少なくとも下記の項目
a)  内部で塩基対とすることができない、固相に結合した一本鎖の短い特定配列を有するプライマー、
b)  a)のプライマーに相補的な配列の一部を有する一本鎖のデオキシヌクレオチド鋳型、
c)  ４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸であって、その一つを修飾して標識抗体によって特異的に認識されるようにしたもの、および
d)  c)の修飾したデオキシヌクレオシド三リン酸を認識する標識抗体を含んでなる。
【００２３】
本発明は、後記の本発明の態様の非制限的記載および図面によって説明されている。
【００２４】
引用文献の教示内容は、引用によって本明細書に包含されている。
【００２５】
態様の説明
プライマーをコーティングしたマイクロタイタープレートの製造
１−エチル（３−ジメチルアミノ−プロピル）カルボイミド塩酸（最終濃度１０mg/ml）を１００mMの１−メチルイミダゾール緩衝液（pH７．０） に加え、この混合物を用いてプライマー構築物を最終濃度１μg/mlに希釈した。１００μl分量のプライマー溶液を、Nalge Nunc NucleoLink（商品名）透明ストリップ（カタログ番号248259）からなるマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに入れた。プレートを３７℃で６〜８時間インキュベーションし、２MＮａＯＨ中で２mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)で十分に洗浄し、３個の５リットルバイアル中で水で浸漬した。ウェル中に残っている流体を、吸収布または紙の上から下へプレートを軽く叩いて除いた。プレートを室温で３０分間乾燥させ、最後に−２０℃で凍結保管した。
【００２６】
DNAポリメラーゼ分析法のプロトコール
DNAポリメラーゼ分析法は、９６穴マイクロタイタープレートのウェルに共有結合している特異配列を有する短プライマーに基づいている。反応混合物は、プライマーに相補的な配列の一部と４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸を有する一本鎖のデオキシヌクレオチド鋳型を含んでいる。しかしながら、チミジン三リン酸は、５−ブロモデオキシウリジン５′−三リン酸(BrdUTP)に置換されている。ポリメラーゼ反応中にDNAに組込まれるブロモデオキシウリジン一リン酸(BrdUMP)は、アルカリホスファターゼ(Ap)に接合した抗BrdUモノクローナル抗体で検出される。Ap基質である４−メチルウンベリフェリルホスフェートを用いて、蛍光生成物を検出する。
【００２７】
DNAポリメラーゼ反応混合物１００μlを、プライマーをコーティングしたマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに加えた。試料をDNAポリメラーゼ塩基緩衝液で希釈し、５０μl試料希釈物をプレートのそれぞれのウェルに移すことによってポリメラーゼ反応を開始した。マイクロタイタープレートを３３℃でインキュベーションし、所定時間の後にプレートを３mMホウ酸緩衝液（pH８．９）中で１．５%(v/v)オクトフェノキシポリエトキシエタノール(Triton X-100)で洗浄することによって反応を終結した。通常は、４時間および一晩（１６時間）の２種類のインキュベーション時間を用いて、重合反応の直線性をチェックした。プレートを２MＮａＯＨ中２mMＥＤＴＡで十分に洗浄し、３個の５リットルバイアル中水で浸漬した。
【００２８】
次に、プレートを、５０mMＮａＣｌ、３７．５mM（ＮＨ４）２ＳＯ４、１mg/ml硫酸デキストラン、１% TritonX-100および２５mg/mlのSigma製脱脂乾燥乳を含む２５mM（ビス［２−ヒドロキシエチル］イミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン；２−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ［ヒドロキシメチル］−１，３−プロパンジオール）(Bis Tris)緩衝液（pH７．２）中で４．８μg/mlに希釈した１００μlアルカリホスファターゼ (Ap)に接合した抗BrdUモノクローナル抗体と共に３３℃で９０分間インキュベーションした。
【００２９】
次いで、プレートを１．５%(v/v) TritonX-100を含む３mMホウ酸緩衝液（pH８．９）で再度洗浄して、未結合標識抗体を除去した。アルカリホスファターゼ活性は、Tris緩衝液（pH８．９）に溶解した４−メチルウンベリフェリルホスフェート基質を用いて測定した。蛍光は、定義された間隔で４６０nmでWallac Victor 2リーダーで読み取った（励起３５５nm）。
【００３０】
可変DNA鋳型についての第二の鎖の合成の阻害の測定のプロトコール
修飾したDNAポリメラーゼ分析法で、阻害を検討した。薬剤を５段階で連続希釈し、２５μl分量をマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに移し、１００μl DNAポリメラーゼ反応混合物と混合し、２５μlの酵素希釈物を加えることによって酵素反応を開始した。非ヌクレオシド類似体は、４種類総てのデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)の濃度をdNTP競合阻害薬の研究で１μMまで減少しながら、標準反応条件で検討した。ポリメラーゼ反応を、一晩進行させた（３３℃、１６〜２４時間）。その後、プレートを洗浄することによって、反応を終結した。IC50値は、検討を行ったポリメラーゼ活性を５０%阻害する薬剤の濃度と定義した。
【００３１】
RT活性の測定のプロトコール
Cavidi Tech（ウプサラ, スウェーデン）から発売されている比色によるRT分析法(Cavidi（商品名）Lenti RTキット)を用いて、検討を行ったウイルス製剤のRT活性のレベルを測定した。この方法は、文献に記載されている(Ekstrand et al 1996)。要約すれば、９６穴マイクロタイタープレートのウェルに共有結合したポリ(rA)は、３３℃の逆転写段階中に５−ブロモ−デオキシウリジン５′−三リン酸(BrdUTT)の組込みの鋳型として働く。DNAに組込まれたブロモデオキシウリジン一リン酸(BrdUMP)の量は、アルカリホスファターゼ(Ap)に接合した抗BrdUモノクローナル抗体を用いて検出される。Ap基質である４−メチルウンベリフェリルホスフェートを最後に用いて、蛍光検出を行う。
【００３２】
逆転写の阻害の測定のプロトコール
阻害の検討は、改良Cavidi HSキットLenti RT分析法で行った。阻害薬を５段階で連続希釈し、２５μl分量をマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに移して、１００μlのRT反応混合物と混合し、５０μlの酵素希釈液を加えることによって酵素反応を開始した。最終ヌクレオシド三リン酸基質(BrdUTP)濃度は１６μMであり、プライマー(odT22)量は１２ng/ウェルであった。RT反応を一晩進行させた（３３℃、１６〜２４時間）。その後、プレートの洗浄によって反応を終結した。IC50値は、検討を行ったRT活性を５０%阻害する薬剤の濃度と定義した。
【００３３】
可溶性の細胞酵素の破壊後にミニカラムからのウイルスRTの単離に基づく、RT遮断抗体を含む材料からのウイルスRTの単離のプロトコール
1)  用いる４．５mlプラスチックチューブを標識する。それらをNalgeneボックスに入れる。試料（例えば、HIV感染個体からのEDTA血漿）１mlをそれぞれの標識したチューブに加える。５，５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を緩衝水に溶解した６６mM溶液１００μlを加え、試料を室温で１時間攪拌してインキュベーションする。
【００３４】
この手続き中に、ビリオン内に含まれる酵素を損なわないままに、遊離の血漿酵素の活性を破壊する。次に、ビリオンを、幾つかの分離手続きによって、５，５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）、酵素活性遮断抗体およびウイルスRTの定量を妨害することがある他の物質から精製することができる。下記のプロトコールは、Fractogel（商品名）EMD TMAE Hicapゲルの使用に基づいている。
【００３５】
2)  分離ゲルを注意深く懸濁し、１５００μlのゲルスラリーをそれぞれの試料前処理チューブに移す。
【００３６】
3)  チューブをオービタルシェーカー(orbital shaker)上で水平に横倒しにして、試料をゲルスラリーと共に室温で９０分間インキュベーションする。
【００３７】
4)  所望な量の１０mlプラスチックミニカラムを標識して、分析を行う試料を同定する。カラム洗浄装置、すなわちSupelco Visiprep固相抽出真空マニホールドにカラムを設置する。結合チューブの内容物をそれらの相当するカラムに移す。移す前に、チューブを軽く攪拌して、ゲルを均等に分布させる。
【００３８】
5)  総てのカラムを充填したならば、真空にして、ゲルを吸引乾燥する。真空を止め、それぞれのカラムに９ml緩衝液Aを満たすことによって洗浄を開始する。総てのカラムが満たされたならば、真空にして、ゲルを吸引乾燥する。
【００３９】
6)  段階５を更に３回繰り返し、全部で４つの洗浄液を得る。それぞれの洗浄の後に、ゲルを吸引乾燥する。４回目の洗浄の後、ゲルを吸引乾燥した後、真空を止め、段階７に進む。
【００４０】
洗浄段階では、未結合のRT遮断抗体および５，５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）を系から除去する。
【００４１】
7)  総ての乾燥ゲルにコンディショニング緩衝液(B)９mlを加える。１分後、真空にして、ゲルを吸引乾燥する。
【００４２】
8)  段階７を繰り返す。真空を止める前に、総てのコンディショニング緩衝液(B)が総てのゲルから除去されたことをチェックする。
【００４３】
9)  カラム洗浄装置の上部を持ち上げる。標識したチューブを有するチューブホルダーを、清浄な容器に設置する。装置の上部を再装備する。それぞれのカラムからの小チュービングがそれらの相当するチューブに下ることを確認する。
【００４４】
10)  ６００μlのリーシス緩衝液(C)を、それぞれのカラムに加える。緩衝液をカラム中に５分間静止させる。次に、徐々に真空にして、ゲルを吸引乾燥する。これにより、それぞれのチューブに、結合したゲルからウイルス溶解物約６００μlを生じる。
【００４５】
段階１０からの溶解物における回収されたRT活性は、本質的にRT遮断抗体、薬剤および細胞ポリメラーゼ活性を持たず、感受性RT活性分析法、すなわちCavidi HSキットLenti RTであって、Ekstrand et al [7]によって報告された方法に基づくもので定量することができる。このプロトコールに準じて得られる２５μlの溶解物は、試料中のRT活性の測定に十分である。残りの５７５μlの試料は、−７０℃以下で凍結して、後で薬剤感受性試験に使用するものとする。
【００４６】
注：  システイン改質剤に感受性でないRT酵素、例えば、野生型HIV1RTは、場合によっては５mMまでの５，５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）の存在下で分析することができる。他方、MULVRTおよびある種の治療耐性HIV1株（例えば、突然変異Y1 81Cを含む）由来のRTのような感受性酵素は、スルフヒドリル還元剤、すなわちシステインまたはシステアミンをリーシス緩衝液に加える必要がある。
【００４７】
材料
DNAポリメラーゼ分析法のプライマー／鋳型
プライマー配列は、１８塩基の5'-GTC-CCT-GTT-CCG-GCG-CCA-3' （配列番号：１２）であり、一次アミンにＣ６スペーサーアームによって５′末端で結合している。
【００４８】
鋳型構築物は、異なる機能を有する３個の部分を含んでいる。５′末端から：BrdUシグナルの増幅に用いる(A)nポリマー、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸に依存するポリメラーゼ反応を得るための可変部分(GTCA)m、およびプライマーに相補的な配列。
【００４９】
例に包含される実験では、特に断らない限り、ｎ＝１２およびｍ＝５である。
【００５０】
ヌクレオシド、酵素阻害薬、および抗ウイルス薬
ddATP、２′，３′−ジデオキシアデノシン三リン酸；ddGTP、２′，３′−ジデオキシグアノシン三リン酸；ddCTP、２′，３′−ジデオキシシチジン三リン酸；ddTTP、２′，３′−ジデオキシチミジン三リン酸。TMAU、６−（［３，４−トリメチレン］アニリノ）ウラシル。
【００５１】
テノフォビール、（Ｒ）−９−（２−ホスホニルメトキシ−プロピル）アデニン；ネビラピン、（１１−シクロプロピル−５，１１−ジヒドロ−４−メチル−６Ｈ−ジピリド［３，２−ｂ：２′，３′−ｆ］［１，４］ジアゼピン−６−オン）(NVP)；およびエファビレンツ、（−）−６−クロロ−４−シクロプロピルエチニルトリフルオロメチル−１，４−ジヒドロ−２Ｈ−３，１−ベンズオキサジン−２−オン）(EFV)。
【００５２】
酵素
DNAポリメラーゼI (E. coli) は、Amersharn Bioscienceから購入した。Staphylococus aureus由来の組換えDNAポリメラーゼIIIは、文献記載の方法で製造した(Brown et al 1998)。哺乳類DNAポリメラーゼα（子ウシ胸腺）およびβ（ヒト）は、CHIMERx （ミルウォーキー）から購入した。DNAポリメラーゼγは、文献記載の方法でウシ心臓から精製した(Pileur et al 2000)。
【００５３】
HIV-1RTのNNRTI耐性突然変異体を製造した(L1001, K103N, L100I/K103N, Y181Q)。突然変異の鋳型として、BH10単離物から構築したpETRT発現ベクターを用いた。市販の位置指定突然変異誘発キットQuikChange (Stratagene)を用いて、突然変異を行った。突然変異は、DNA配列分析によって確かめた。RTの突然変異した形態および本来の形態を、上記の方法で単離した[Lindberg et al 2002]。
【００５４】
AZT特異的突然変異を有する組換えHIV-1RTの製造の手続きは、突然変異をHXB2-D単離物からRTコード領域に導入することを除き、同様であった。
【００５５】
HIV感染個体由来の血漿試料
未治療患者または通常の組合せ治療で治療した患者由来の血漿試料を、遡及的に選択した。それぞれの試料のHIV-1RNAの量は標準HIV1RNAPCR によって測定した(Cobas, Roche Diagnostica)。リンパ増殖疾患の患者からの血清試料は、 the Department of Internal Medicine, Uppsala University, Akademiska sjukhuset, Uppsalaから得た。
分離ゲル：  例えば、３１４mMの（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）(MES) pH５．１, ４１３mMのヨウ化カリウムおよびヘパリン０．５mg/mlにFractogel（商品名）EMD TMAEまたはFractogel（商品名）EMD TMAE Hicapを加えたもの。
ミニカラム、例えば、Biorad Poly-Prep（商品名）(7311553)
ミニカラム洗浄装置、すなわちSupelco Visiprep固相抽出真空マニホールド。
プラスチックチューブ、例えば、Nunc 4.5ml低温チューブ。
固定prAを有するマイクロタイタープレート、すなわちNalge Nunc NucleoLinck（商品名）。
システイン改質剤、例えば、０．８７Mのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（pH８．３）で緩衝した６６mMの５，５′−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）水溶液。
穏和なスルフヒドリル還元剤、例えば、３３mMのシステアミン水溶液。
【００５６】
使用緩衝液
A)  洗浄緩衝液：  ２０mM MES pH５．４，５００mM酢酸カリウム(KAc)。
【００５７】
B)  コンディショニング緩衝液：  RT分析適合性緩衝液、例えば、５０mMの（Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）(Hepes) pH７．６，KAc２５mM，塩化マグネシウム(MgCl2)２０mM，エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル），Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸(EGTA)０．２mM，スペンニン２mM、および熱不活性化したウシ血清アルブミン(BSA) ０．５mg/ml。
C)  リーシス緩衝液：  洗剤、例えば、１．２５％ポリオキシエチレン４ラウリルエーテル(Brij 30)、１３ng/mlのodT22およびコンディショニング緩衝液(B)と同一成分を含むRT分析適合性緩衝液。ＳＨ酸化／修飾に感受性のRTでウイルスを加工するときには、場合によってはスルフヒドリル還元剤、すなわち０．２mMシステアミンを加える。
【００５８】
RT反応混合物：  （Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−（２−エタンスルホン酸）(Hepes)１１．７mM , pH７．６、BrdUTP２８．３μM、odT22１２０ng/ml、MgCl2４mM、デキストラン硫酸０．５g/l、スペルミン２mM、Triton-X 100 ０．５%(v/v)、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸(EGTA)０．２mM，スペンニン２mM、および熱不活性化したウシ血清アルブミン(BSA) ０．５mg/ml。
【００５９】
DNAポリメラーゼγおよびレトロDNAポリメラーゼ塩基緩衝液  Hepes５０mM, pH８．０、MgCl2８mM、デキストラン硫酸１．５g/l、スペルミン１mM、Triton-X 100 ０．５%(v/v)、EGTA ０．２mM、ジチオトレイトール(DTT)１．５mM、およびウシ血清アルブミン(BSA)０．５mg/ml。
【００６０】
DNAポリメラーゼIII塩基緩衝液  （２−（N-モルホリノ）エタンスルホン酸(MES) ４０mM, pH６．８, 酢酸カリウム(KAc)４０mM, MgCl2１０mM, スペルミン2 mM, ポリオキシソルビタンものラウレート(Tween 20), ０．５%(v/v), EDTA ０．１mM, ジチオトレイトール１mM、およびウシ血清アルブミン(BSA)５０μg/ml。
【００６１】
DNAポリメラーゼβ塩基緩衝液  ３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸(AMPSO) ２０mM，pH８．３, MgCl2１mM, スペルミジン３mM, BSA１μg/ml, EDTA１０μM, DTT０．１mM, Tween 20 ０．０１%。
【００６２】
DNAポリメラーゼ反応混合物  ２４μMのBrdUTP, ４９．５μMのdGTP, ４９．５μMのdATP, ４９．５μMのdCTP、および５００ngの鋳型/mlで補強したDNAポリメラーゼ塩基緩衝液。
【００６３】
ATPとのレトロDNAポリメラーゼ反応混合物  DNAポリメラーゼγおよびレトロDNAポリメラーゼ反応混合物を３．２mMのATPで強化し、pHを７．１に調整した。
【００６４】
例
例１  HIVRTによる第二の鎖の合成のための異なる鋳型の利用
２００ng/mlから出発する指示された鋳型構築物の２段階希釈シリーズを、「プライマーをコーティングしたマイクロタイタープレートの製造」に準じて固定化プライマーを有するマイクロタイタープレートのそれぞれのウェルに加えた。１００fgの組換えHIV1RTをそれぞれのウェルに加え、RT反応の時間を１８時間とした。それぞれの鋳型におけるポリメラーゼ活性を、DNAポリメラーゼγおよびレトロDNAポリメラーゼ塩基緩衝液を用いて「DNAポリメラーゼ分析法のプロトコール」に準じて測定した。５０mMＮａＣｌあるいは１００mMを、抗BrdUモノクローナル抗体の結合の際に用いた。測定した活性を鋳型の濃度に対してプロットし、それぞれの鋳型の種類について得た最大シグナルをそれぞれのグラフのプラトー値から計算した。
【００６５】
結果を、表１にまとめる。A-尾の長さとポリメラーゼ分析法で得ることができる最大シグナルとの間には、明らかな相関が見られた。A-尾の長さは、増加したイオン強度で結合する生成物検出に用いられる抗体の能力にも影響した。
【００６６】
例２  DNAポリメラーゼIIIのTMAUによる阻害に対する鋳型配列の影響
６−アニリノウラシルは、グラム陽性菌由来のDNAポリメラーゼIIIの選択的阻害薬である。アニリノウラシル分子は、それを不活性なDNA-薬剤-タンパク質複合体に封鎖することによってそのポリメラーゼIIIターゲットを阻害する(Tarantino et al 1990)。薬剤TMAUは、GTPの類似体と考えることができる。１．２５ng/ウェルの組換えDNAポリメラーゼIIIに対する所定濃度のTMAUの阻害能は、(CTGA)6-A12（配列番号：１０）(!)または(CTG)6-A3（配列番号：１１）(%)を鋳型として用いる「可変DNA鋳型についての第二の鎖の合成の阻害の測定のプロトコール」に準じて測定した。ポリメラーゼ反応時間は１時間であり、DNAポリメラーゼIII反応混合物中のGTP濃度は２．５μMに減少した。所定の鋳型で得られるポリメラーゼ活性を、阻害薬の非存在下でインキュベーションした同一ポリメラーゼで測定した活性の%に再計算した。
【００６７】
結果を、図１に示す。この高度に特異的な阻害薬は、使用した鋳型の配列によって様々な阻害能を示した。本発明は、検討を行う酵素または阻害薬が必要とする特異的条件を説明する目的で容易に変化させることができるDNA鋳型である系を提供する。
【００６８】
例３  DNAポリメラーゼ分析法の検出感度
HIV1野生型RT (")、哺乳類DNAポリメラーゼβ (#)、およびE. coli DNAポリメラーゼI (%)の連続希釈の活性を、所定の酵素に最適化した塩基緩衝液を用いて「DNAポリメラーゼ分析法のプロトコール」に準じて測定した。用いたポリメラーゼ反応時間は、一晩（１８時間）であった。結果を、図２に示す。３種類の酵素製剤のそれぞれは、用いた酵素の量と回収した生成物の量との間に直線的関係を示した。分析バックグラウンドは、３８００rfu/時であった。有意なシグナル検出のためのカットオフ値として二重バックグラウンドを用いると、１０nUまでのHIV1野生型RT、６ nUまでの哺乳類DNAポリメラーゼβ、および３nUまでのE. coli DNAポリメラーゼIを検出することができた。
【００６９】
例４  異なる分析系における５種類のDNAポリメラーゼの活性
DNAポリメラーゼα、DNAポリメラーゼβ、DNAポリメラーゼγ、非ホジキンリンパ腫の患者由来の血清、およびHIV-1 RTを、「DNAポリメラーゼ分析法のプロトコール」および「RT活性の測定のプロトコール」に準じて所定のポリメラーゼ塩基緩衝液に基づく反応溶液を用いて測定した。用いたポリメラーゼ反応時間は、２時間であった。実測した活性を、それぞれの酵素についての最適版条件での可変DNA鋳型での活性の%に再計算した。結果を、表２に示す。検討した５種類の酵素製剤のそれぞれは、最適反応条件に関してそれらを個々に選択した。しかしながら、DNAポリメラーゼαおよびヒト血清ポリメラーゼは、同様なパターンを示した。HIV- 1 RTおよびDNAポリメラーゼγのみが、逆転写酵素分析法において有意な活性を示した。
【００７０】
例５  ４種類総てのDNA塩基に対するジデオキシ類似体による阻害を測定するためのDNAポリメラーゼ分析法の能力の証明
８０fgの組換え野生型HIV1 RTの活性に対する所定濃度のddATP (!)、ddGTT (")、ddCTP (#)およびddTTP (%)の阻害能を、「可変DNA鋳型に対する第二の鎖の合成の阻害の測定のプロトコール」に準じて測定した。それぞれの阻害薬濃度でのポリメラーゼ活性を、阻害薬の非存在下でのコントロールの活性の%に再計算した。結果を、図３に示す。
【００７１】
鋳型 (CTGA)6-A12（配列番号：１０）を用いるポリメラーゼ反応は、４種類のDNA塩基総てに対するジデオキシ類似体による阻害に感受性であることが分かった。IC50の測定値は、ddCTPについての２０nMからddATPについての８０nMまで変化した。
【００７２】
例６  HIV1 RTによる第一および第二の鎖のDNA合成についての非ヌクレオシド阻害薬の影響の比較
所定の組換えHIV1 RTに対する３種類の非ヌクレオシド阻害薬の影響は、DNAポリメラーゼγおよびレトロDNAポリメラーゼ塩基緩衝液を用いる「可変」DNA鋳型に対する第二の鎖の合成の阻害の測定のプロトコール」および「逆転写の阻害の測定のプロトコール」に準じてそれぞれ測定した。重合反応の時間は、それぞれ(CTGA)6-A12（配列番号：１０）での第二の鎖の合成については１９時間であり、prAでの第一の鎖の合成については２時間であった。得られたRT活性を、阻害薬の非存在下でインキュベーションした同一RTで測定した活性の%に再計算した。
【００７３】
結果を、表３にまとめる。これらの分析系はいずれも、耐性(Y181C, V179D)および感受性RT酵素を識別する能力を有していた。阻害薬のいずれかについてのIC50値は、２種類の分析系のいずれかで用いられる酵素の量の５倍の差では有意に影響されなかった。更に、第一または第二の鎖のDNA合成の阻害の測定によって得られるIC50値には有意差がなかった。
【００７４】
例７  抗ウイルス薬テノフォビールに対する耐性の基礎となる生化学機構の証明
ヌクレオシド類似体を用いるHIV感染個体の長期間の治療により、耐性ウイルスが発生する。この過程は、ウイルスpol遺伝子における突然変異の漸進的出現と関連する。酵素レベルでのこれらの置換の影響は複雑であり、原始的なDNAエディティング機能の増加が挙げられる。この反応はヌクレオチド依存性であり、ジヌクレオシドポリホスフェートと伸長性のDNAの３′末端を生成する。
【００７５】
所定の組換えHIV1 RT４pg/ウェルに対するテノフォビール三リン酸の連続希釈の影響を、DNAポリメラーゼγおよびレトロDNAポリメラーゼ塩基緩衝液に基づく標準反応溶液、およびATPを補足した同一反応溶液を用いて「可変DNA鋳型に対する第二の鎖の合成の阻害の測定のプロトコール」に準じて測定した。重合反応の時間は、１９時間であった。得られたRT活性を、阻害薬の非存在下でインキュベーションした同一RTの活性の%に再計算した。結果を、図４に示す。
符号： 標準反応溶液中のHIV- 1野生型RT (○)、ATPとのDNAポリメラーゼ反応溶液中のHIV- I野生型RT (●)、標準DNAポリメラーゼ反応溶液中のT69S→SS/L210W/T215Y HIV-1突然変異体RT (()、ATPとのDNAポリメラーゼ反応溶液中のT69S→SS/L210W/T215Y HIV-1突然変異体RT (")。
【００７６】
図４に示した結果は、ATP依存的加リン酸分解反応を支持する能力を有する反応溶液を用いるときに、野生型と突然変異体RTの薬剤感受性の差が約１０倍に増加することを示している。
【００７７】
例８  血漿由来RTを用いるネビラピンに対する感受性の測定
ストックホルム、スウェーデンからの３HIV感染個体由来の血漿の１ml試料を、「可溶性細胞酵素を破壊した後、ミニカラムからウイルスRTを単離することに基づく、RT遮断抗体を含む材料からウイルスRTの単離プロトコール」に準じて処理した。それぞれの血漿RTおよび２種類のコントロール酵素を、「DNAポリメラーゼγおよびレトロDNAポリメラーゼ塩基緩衝液」を用いる「可変DNA鋳型での第二の鎖の合成の阻害の測定のプロトコール」に準じてネビラピンの連続希釈の組に対して滴定した。図５参照。
符号：(') １４００００のゲノムコピー/mlを有する患者１由来のRT、(!) １８００００のゲノムコピー/mlを有する患者２由来のRT、および(%) ３９００００のゲノムコピー/mlを有する患者３由来のRT、(#) 組換えHIV-1野生型RTからなるコントロール、(") 中位のネビラピン耐性を有する組換えHIV-1RT突然変異体RT (L100I)からなるコントロール。
【００７８】
患者RTについて測定されたネビラピンに対するIC50値は、０．７から１．２μMまで変化した。コントロールの野生型RTについては０．５μMであり、中位のネビラピン耐性を有する突然変異体RTについては＞１０μMであることと比較されたい。
【００７９】
例９  リンパ増殖性疾患の患者由来の血清におけるDNAポリメラーゼ活性の検出
非ホジキンリンパ腫の４名の患者および６名の健康な血液ドナー由来の血清を、DNAポリメラーゼIII塩基緩衝液で連続希釈した。各希釈段階のポリメラーゼ活性を、２および６時間のポリメラーゼ反応時間を用いる「DNAポリメラーゼ分析のプロトコール」に準じて測定した。
【００８０】
DNAポリメラーゼ活性/μl血清試料および時間ポリメラーゼ分析法を希釈段階で計算したところ、形成した生成物の量と分析に加えた血漿の量には直線関係があった（表４参照）。
【００８１】
非ホジキンリンパ腫の患者由来のそれぞれの血清試料は、個々の量のDNAポリメラーゼ活性を含み、DNA-ポリメラーゼαと同様の特性を有した（表３参照）。活性の量は、健康な血液ドナーで見られた平均値の約２〜１９０倍の範囲であった。
【００８２】
【表１】
2004533255.tif 000002
【００８３】
【表２】
2004533255.tif 000003
【００８４】
【表３】
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【００８５】
【表４】
2004533255.tif 000005
【００８６】
非ホジキンリンパ腫の４名の患者および６名の健康な血液ドナー由来の血清を、DNAポリメラーゼIII塩基緩衝液で連続希釈した。各希釈段階でのポリメラーゼ活性を、「DNAポリメラーゼ分析法のプロトコール」に準じて測定した。表にまとめたDNAポリメラーゼ活性を希釈範囲から計算したところ、形成した生成物の量と加えた血漿の量には直線関係があった。分析バックグラウンド８５４flu/時を、総ての値から差し引いた。
【００８７】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】鋳型配列での変動のTMAUによるDNAポリメラーゼIIIの阻害に対する影響。
【図２】DNAポリメラーゼ分析法の検出感度。  HIV-1野生型RT(") 、 哺乳類DNAポリメラーゼβ(#)、および E. coli DNAポリメラーゼI(%)
【図３】４種類総てのDNA塩基に対するジデオキシ類似体による阻害を測定するためのDNAポリメラーゼ分析法の能力。  符号：ddATP(!)、 ddGT(")、 ddCTP(#)、および ddTP(%)
【図４】抗ウイルス薬テノフォビールに対する耐性の元になっている生化学機構は、ATP依存的加リン酸分解反応の高まりに基くことを示す。  符号：標準反応溶液中のHIV- 1野生型RT (○)、ATPとの反応溶液中のHIV- I野生型RT(●) 、 標準反応溶液中のHIV-1突然変異体RT(()、 ATPとの反応溶液中のHIV-1突然変異体RT(")
【図５】HIVに感染した個体由来の血漿から単離したRTを用いる抗ウイルス薬ネビラピンに対する感受性の測定。  符号： ('), (!)および(%) 感染個体由来のRT、(#) 組換えHIV-1野生型RTからなるコントロール、(") 突然変異した(L100I)中位のネビラピン耐性を有する組換えHIV-1RTからなるコントロール
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
2004533255.tif 000044
2004533255.tif 000045