(57)【要約】本発明は、配列番号７、８、１１または１２におけるアミノ酸配列を有するタンパク質、その類似タンパク質、天然に生じる変異体および相同機能的等価体、ならびにアッセイにおいて使用するための及び応答性核内受容体およびコアクチベーター（該コアクチベーターは前記タンパク質でありＣＯＡＳＴＥＲと称され、該核内受容体は好ましくはステロイド受容体である）により促進される転写活性の調節方法において使用するためのそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
2004506445.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ）配列番号７、８、１１もしくは１２におけるアミノ酸配列または配列番号７もしくは８におけるアミノ酸番号１−２３４の配列を有するタンパク質、
Ｂ）配列番号７、８、１１または１２における配列に対して少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
Ｃ）配列番号７または８におけるアミノ酸番号１−２３４の配列に対して少なくとも９０％の類似性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質、
Ｄ）配列番号７、８、１１または１２における配列を有するタンパク質の天然に生じる変異体であるタンパク質、
Ｅ）Ａ、Ｂ、ＣまたはＤで定義されるタンパク質の相同機能的等価体であるタンパク質
よりなる群から選ばれることを特徴とするタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、応答性核内受容体をも含む系内での発現に付す発現させることによる該ポリヌクレオチドの使用。
【請求項３】
該タンパク質と該応答性核内受容体との結合に関するアッセイにおける、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
該応答性核内受容体がプロゲストゲン受容体、エストロゲン受容体またはグルココルチコイド受容体である、請求項２または３に記載の使用。
【請求項５】
ポリヌクレオチドが導入され発現に付されしうる、応答性核内受容体を更に含むんでなる系であって、該ポリヌクレオチドが請求項１に記載のタンパク質をコードすることを特徴とする系。
【請求項６】
系における応答性核内受容体およびコアクチベーターにより促進される転写活性の調節方法であって、該方法が該系への物質の添加を含んでなりみ、該物質が該コアクチベーターの機能を妨害または増強し、該コアクチベーターが請求項１に記載のタンパク質であることを特徴とする方法。
【請求項７】
該方法が調節の度合の測定のためのインビトロアッセイであり、調節の度合を定量することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該物質が該コアクチベーターの機能を妨害または増強する系がヒトまたは動物の体内の細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
該応答性核内受容体がプロゲストゲン受容体、エストロゲン受容体またはグルココルチコイド受容体である、請求項６〜８のいずれか１以上の項に記載の方法。
【請求項１０】
該コアクチベーターの機能を妨害または増強する物質を含むんでなる、請求項８に記載の方法において使用するための医薬組成物。
【請求項１１】
標識ポリヌクレオチドまたはその断片とＲＮＡとの定量的ハイブリダイゼーションに関して試験することを含むんでなる、応答性核内受容体関連疾患の診断方法であって、該ポリヌクレオチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、９および１０よりなる群からの配列の１以上に対して少なくとも９０％の相同性を有する配列を有することを特徴とする診断方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、新規タンパク質、応答性核内受容体とコアクチベーターとの結合に関するアッセイ、および応答性核内受容体により促進される転写活性の調節方法に関する。
【０００２】
本発明は、生物における核内受容体の機能の利用の分野におけるものである。核内受容体は広範な機能を有するが、それらの最も顕著な役割は、エストラジオール、コルチゾールおよびプロゲステロンのようなホルモンに対して細胞を応答させることにある。核内受容体を介して、該ホルモンは細胞内の遺伝子転写に影響を及ぼし、それにより該細胞はそれらの機能を変化させうる。さらに、核内受容体による遺伝子転写の活性化は、コアクチベーターにより促進され又は更には可能となることが公知である。いくつかのそのようなコアクチベーターが公知である。例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａら（Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１５４，ｐｐ　７６−８３，１９９９）は、核内ホルモン受容体とコアクチベーターとの相互作用を利用するホルモン活性を有する化学物質に関するスクリーニング方法を記載している。それらの方法は、該コアクチベーターと核内受容体（これはその特定のコアクチベーターに対して応答性である）との相互作用が、該核内受容体に結合するリガンドにより安定化されうるという知見に基づくものである。また、そのようなアッセイは、一般に、ホルモンの作用および遺伝子の転写の制御メカニズムを解明するために重要である。これらの技術により、治療、診断、美容および避妊を目的として、特に核内受容体の機能に関連した生理的過程に影響を及ぼすための新規医薬を開発することが可能である。本発明は、配列番号７、８、１１または１２において与えられるアミノ酸配列を有するタンパク質を入手可能にする。そのようなタンパク質は、応答性核内受容体を、そのＤＮＡ転写促進機能において同時活性化（コアクチベート）する作用を有する。コアクチベーターとしてのそのようなタンパク質の機能の知見により、本発明はまた、ある系における応答性核内受容体およびコアクチベーターにより促進される転写活性の調節の新規方法であって、該方法が該系への物質の添加を含んでなり、該物質が本発明のコアクチベーターの機能を妨害または増強することを特徴とする方法を提供する。この方法は、該コアクチベーターの遺伝子を該系内に導入してそれを発現させることにより、ならびに該コアクチベーターおよび／または該コアクチベーター−核内受容体複合体の機能を変化させうる化合物を同定し次いで使用することにより行うことができる。したがって、本発明における物質なる語は、例えば、化合物またはベクター（該ベクターは、本発明のタンパク質をコードする遺伝子を含む）を意味する。そのような調節は、治療、避妊、診断および美容目的に核内転写過程を妨害または増強するために用いることが可能であり、それは、該調節の定量のためのアッセイにおいて使用することが可能である。したがって、系なる語は、分子的および／または生物学的に定められる環境を意味し、該調節物質が導入されうるインビトロ系およびインビボ系を意味する。インビトロ系は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの転写／翻訳を可能にする混合物であり、インビボ系は、細胞もしくは組織培養内またはヒトもしくは動物の体内に存在しうる細胞である。明らかに、核内受容体の活性の調節なる語は、該受容体の転写活性の増加または減少を意味し、一方、同時活性化なる語は、該受容体の転写活性の増強を意味する。
【０００３】
そのようなタンパク質を表すと推定される配列は、ＥＭＢＬ／ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪデータベースのアクセッション番号ＡＢ０１１１４８を参照することによりＮａｇａｓｅら（ＤＮＡ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｖｏｌ　５，ｐｐ　３１−３９，１９９８）による公開において遺伝子番号ＫＩＡＡ０５７６で既に報告されており、ここでは、それはタンパク質　Ｉｉｄ　ＢＡＡ２５５０２に関連づけられている。遺伝子ＫＩＡＡ０５７６はＲＮＡ段階以降は発現されておらず、公知ＤＮＡ配列に対する非常に弱い相同性（＜３０％同一のヌクレオチド）からは、核酸マネージメント操作（ｎｕｃｌｅｉｃ　ｍａｎａｇｅｍｅｔ）以外のそれ以上の具体的な機能は推定されなかった。
【０００４】
該タンパク質の配列における若干の修飾は前記用途に同等に有用であることが明らかであるため、本発明は、配列番号７、８、１１または１２における配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の類似性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をも提供する。類似性なる語は、アミノ酸の相違を考慮した場合にはタンパク質間の類似性の度合を意味するが、その異なるアミノ酸は、ほとんど等しいサイズ、親油性、酸性度などを考慮すると、機能的に類似している。類似性（％）は、ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９；１０９１５−１０９１９（１９９２））に記載のｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスのような類似性スコアリングマトリックスを使用する配列の最適アライメントにより計算することができる。ｂｌｏｓｕｍ６２類似性マトリックスとＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３−４５３（１９７０））のアルゴリズムとを使用する２つの配列の最適アライメントならびに類似性（％）の計算は、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｕｏｕｐ（ＧＣＧ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）のＧＡＰプログラムを該プログラムのデフォルトパラメーターを用いて使用して行うことが可能である。
【０００５】
本発明のもう１つの態様は、前記の同時活性化機能が、配列番号７または８におけるアミノ酸番号１−２３４の配列を有するタンパク質によっても得られうることにある。トランケート化（短小化）タンパク質は、より大きなタンパク質と同じ又は部分的に同じ機能を有しうることが公知である。このトランケート化タンパク質も使用されうることが判明しており、したがって、本発明のこの態様は、配列番号７または８におけるアミノ酸番号１−２３４の配列に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の類似性を有する配列を有するタンパク質をも提供する。
【０００６】
配列番号７、８、１１または１２における配列を有するタンパク質の天然に生じる変異体であるタンパク質を提供することが、本発明のもう１つの態様である。配列番号７、８、１１または１２において定義されるタンパク質に対して少なくとも８０％の類似性、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より一層好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の類似性を有するアミノ酸配列を有しヒト組織または非ヒト種の組織に由来するタンパク質も、応答性核内受容体を同時活性化するために同様に使用することができる。そのような多型形態および種ホモログも、本発明により入手可能となったタンパク質のクラスに含まれる。配列番号７、８、１１または１２により定義されるタンパク質の示されている構造および機能における共通の性質により定義されるクラスに属する天然に存在するタンパク質を、任意の文字の並びで、ＣＯＡＳＴＥＲタンパク質と称することとする。初期の文書、少なくとも、本発明者らの研究組織内で頒布された文書においては、本発明のタンパク質に名称を与えるために、任意の文字の並びであるＭＦＣが使用されている。したがって、ＭＦＣおよびＣＯＡＳＴＥＲは同義語である。他のＣＯＡＳＴＥＲ断片も生物学的組織において見出される。そのような断片はスプライス変異体にコードされる。
【０００７】
さらに、該タンパク質の構造およびＣＯＡＳＴＥＲタンパク質の機能を開示して、本発明は、前記タンパク質の相同機能的等価体であるタンパク質をも提供する。相同機能的等価体は、前記で示した割合の１つより低い類似性を有するため又は前記で定義されているとおりの断片ではないため又は非天然由来であるため既に定義されている特性を完全には満足しないが、本発明の既に定義されているタンパク質と共通の特徴的機能を尚も有するタンパク質である。例えば、ＣＯＡＳＴＥＲタンパク質の断片は、応答性核内受容体の同時活性化のために単独で使用されるだけでなく、該核内受容体活性化作用を利用するために、他のタンパク質から知られた他のタンパク質配列と融合されることも可能である。そのような断片は無傷インタクトなＣＯＡＳＴＥＲタンパク質の断片の配列と１００％同一である必要はない。さらに、ＣＯＡＳＴＥＲタンパク質およびそのスプライス変異体と機能的に等価なタンパク質を、コードするポリヌクレオチド配列における意図的な突然変異、挿入または欠失により人工的に製造することができる。本明細書中に詳細に特徴づけられているタンパク質と或るタンパク質との高度の類似性は、タンパク質をＣＯＡＳＴＥＲタンパク質と機能的に等価なものとする。本明細書においては、本発明のタンパク質は、任意の前記のとおり、いかなる構造的に類似した又は機能的に等価な人工タンパク質、スプライス変異体またはＣＯＡＳＴＥＲタンパク質（前記の定義のとおり）を意味する。
【０００８】
該タンパク質の有用性を考慮すると、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、応答性核内受容体をも含む系内で発現させることによる、該ポリヌクレオチドの使用を提供することが、本発明の１つの態様である。ＤＮＡヌクレオチド配列およびＲＮＡ配列の両方が、本発明のタンパク質をコードする目的を果たすため、該ポリヌクレオチドはＤＮＡまたはＲＮＡでありうる。本発明での使用のための好ましいＤＮＡは、配列番号１、２、３、４、５、６、９または１０において与えられる配列である。当技術分野で一般に公知の方法により、真核細胞、細菌、プラスミドまたはベクター内に該ポリヌクレオチドを人工的に導入し、該遺伝子の転写を可能にすることにより、発現を得ることができる。本発明のタンパク質と該核内受容体との相互作用を利用することが可能となるためには、ＤＮＡまたはＲＮＡの転写および／または翻訳のための成分あるいは無傷インタクトな細胞（おそらくは全生物の一部）（おそらくは全生物の一部）との混合物でありうる系は該応答性核内受容体をも含有する又は生成すべきである。これらの技術に関する実用的な情報源は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，１９８９において見出されうる。
【０００９】
ヌクレオチドの場合、同じアミノ酸をコードするヌクレオチドトリプレットで前記配列中のトリプレットが置換されうることによる類似性の度合に言及されることがある。より一般的には、ヌクレオチドの相同配列に言及される。
【００１０】
ポリヌクレオチドの相同性は、該配列の最適アライメントの後、以下のとおりに定められる。
【００１１】
【数１】
2004506445.tif 000003
【００１２】
最適アライメントは、マッチの数を最大にしギャップの数を最小にするＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８；４４３−４５３（１９７０））のアルゴリズムを使用して行うことができる。実際には、類似性なる語を、ポリヌクレオチドの相同性に対しての類似した定義を有する相同性に置き換えることにより、より限定された範囲のタンパク質を定義することが可能である。本発明のタンパク質に関する相同性なる語の前記のようなそのような使用は、該タンパク質中のアミノ酸残基の同一性（％）に基づく。あるいはまた、このようにして定義されるタンパク質の相同性の度合なる語の代わりに、タンパク質の同一性の度合なる語を用いることが可能である。
【００１３】
コドン可変性に適応させるために、本発明はまた、本明細書に開示する配列と同じアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。本明細書に提供する配列情報は、誤って同定された塩基の排除を要するほどに狭く解釈されるべきではない。本明細書に開示する具体的な配列は、いくつかの他の種または対立遺伝子変異体の完全な遺伝子を単離するために容易に使用することが可能である。該配列は、例えば、プローブを製造するために、または完全な変異体遺伝子の単離および同定を可能にするＤＮＡ増幅反応におけるプライマーとして使用される合成オリゴヌクレオチドを製造するためのソース起源として使用することができる。完全な遺伝子配列は、適当な宿主細胞内での該タンパク質の発現のためのベクター分子の製造において使用することができる。
【００１４】
本発明は更に、若干の変異を有する又は多型部位を有するポリヌクレオチドに関する。若干の変異を有するポリヌクレオチドは、天然成熟タンパク質と同じ生物学的機能を保有する変異体ポリペプチドをコードしうる。多型部位は診断目的に有用である。
【００１５】
もう１つの態様においては、本発明は、ａ）本発明のＤＮＡを、好ましくは関心のあるポリヌクレオチドを高度に発現する組織から単離されたＲＮＡ、（ゲノム）ＤＮＡまたはｃＤＮＡである核酸に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズさせ、ｂ）当業者に公知の方法により該核酸を単離する工程を含んでなる、ポリヌクレオチドの単離方法を提供する。該組織は、好ましくはヒト由来である。好ましくは、リボ核酸は、卵母細胞、卵巣または精巣から単離される。該ハイブリダイゼーション条件は、好ましくは、高度にストリンジェントである。
【００１６】
本発明において、「ストリンジェント」なる語は、６５℃の温度で１×ＳＳＣ、０．１％　ＳＤＳの洗浄条件を意味し、高度にストリンジェントな条件は、０．３×ＳＳＣ、より好ましくは０．１×ＳＳＣまでのＳＳＣの減少を意味する。好ましくは、最初の２回の洗浄を、それぞれ１５〜３０分間にわたり続けて２回行う。高度にストリンジェントな条件下で洗浄する必要がある場合には、０．１×ＳＳＣでの追加的な洗浄を１５分間にわたり１回行う。ハイブリダイゼーションは、例えば、０，５Ｍ　リン酸バッファー（ｐＨ７．５）／７％　ＳＤＳ中、６５℃で一晩にわたり行うことができる。
【００１７】
代替手段として、該遺伝子の単離方法は、本発明の核酸に由来するプライマーを使用する遺伝子増幅法を含みうる。また、例えばハイブリダイゼーションにより得たクローンを、例えばＲＡＣＥ　ｃＤＮＡクローンと組合せることにより、完全なｃＤＮＡを得ることが可能である。
【００１８】
転写の調節を利用するためには、該系はまた、応答性核内受容体の遺伝子およびこれらの核内受容体の応答性プロモーター要素を含むべきである。本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、組換え核内受容体タンパク質と共に、該タンパク質と該応答性核内受容体との結合に関するアッセイにおいて使用する組換えＣＯＡＳＴＥＲタンパク質の製造に使用することができる。
【００１９】
応答性核内受容体なる語は、本明細書においては、ＣＯＡＳＴＥＲタンパク質により活性化されうるいかなる任意の核内受容体を意味するものとして用いられている。好ましくは、該アッセイの系内の核内受容体は、ステロイド受容体、より好ましくはプロゲストゲン受容体、エストロゲン受容体またはグルココルチコイド受容体である。応答性核内受容体および本発明のコアクチベーターにより促進される転写活性の調節の方法は、調節の度合を測定するためのインビトロアッセイであることが可能であり、調節の度合を定量することを含む。調節または結合の度合の定量の手段は、本明細書に記載されているような酵母ツーハイブリッドアッセイまたは哺乳類細胞系内での同様のツーハイブリッドアッセイを含みうる。あるいは、結合効率の検出を可能にするために適切に標識された核内受容体およびＣＯＡＳＴＥＲの単離された組換えタンパク質を使用して、結合効率を測定することができる。該タンパク質の標識では、該組換えタンパク質に直接的または間接的に結合した放射能もしくは蛍光分子または酵素特性を有する分子を使用することが可能である。あるいは、ＢＩＡＣＯＲＥのようなアフィニティーに基づくバイオセンサーシステム系により、結合効率を測定することができる。あるいは、β−ガラクトシダーゼまたはジヒドロ葉酸レダクターゼのような機能的タンパク質の相補を駆動する、ＣＯＡＳＴＥＲタンパク質と該核内受容体との相互作用を用いるインビトロまたはインビボ相補アッセイにより、結合効率を測定することが可能であり、これにより、該相補タンパク質の機能が該結合効率の尺度として利用される。
【００２０】
また、応答性核内受容体および本発明のコアクチベーターにより促進される転写活性の調節の方法は、ヒトまたは動物への該物質の投与を含む該ヒトまたは動物の身体の治療処理でありうる。そのような物質は、該核内受容体の活性化のための、より多量のコアクチベーターの産生を可能にするよう、該コアクチベーターの遺伝子を該生物の細胞内に導入するベクターでありうる。あるいは、それは、内因性ＣＯＡＳＴＥＲタンパク質の作用を妨げる本発明のタンパク質の産生を可能にして該核内受容体の作用の減弱を引き起こすよう、該生物の細胞内に欠損コアクチベーターの遺伝子を導入するベクターでありうる。該物質はまた、該コアクチベーターと該応答性核内受容体との相互作用に影響を及ぼす化学的化合物でありうる。そのような化合物は、該コアクチベーターと該応答性核内受容体との結合に関するアッセイにおける又は該応答性核内受容体の作用の調節の定量のためのアッセイにおける通常のスクリーニングにより得ることができる。したがって、ＣＯＡＳＴＥＲタンパク質と応答性核内受容体との結合を調節する化合物または核内受容体−ＣＯＡＳＴＥＲ複合体の活性を調節する化合物を選択するために本発明のアッセイまたは方法を使用しうることが、本発明のもう１つの態様である。そのようなアッセイにおいては、化合物は、それらがＣＯＡＳＴＥＲと応答性核内受容体との相互作用を誘発または妨げる能力に関して、またはそれらが応答性核内受容体を介して若しくはＣＯＡＳＴＥＲおよびレポーターＤＮＡの存在下で転写を調節する能力に関して試験される。レポーターＤＮＡは、研究中の核内受容体に応答性であるプロモーター、および転写活性がモニターされうるレポーター遺伝子よりなる。該プロモーターは、核内受容体応答性遺伝子の単離された天然プロモーター、または基礎コアプロモーター（例えば、ＴＡＴＡボックス）に融合したコンセンサス核内受容体応答性要素の（多数のコピーの）合成カセット（多数コピーの）でありうる。適当なレポーター遺伝子には、酵素アッセイにより活性がモニターされうる酵素（例えば、ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ）をコードする遺伝子、蛍光特性を有するタンパク質（例えば、グリーン蛍光タンパク質）をコードする遺伝子、または転写産物のレベルがモニターされうる遺伝子が含まれる。
【００２１】
ＣＯＡＳＴＥＲは、エストロゲン受容体αおよび半部分アゴニストの存在下でエストロゲン受容体応答性要素（ＥＲＥ）含有プロモーターの作用を増強し、それにより新規半部分アゴニストの同定を可能にするするため、後者のアッセイが特に有利である。公知のＥＲＥに基づくアッセイは、すべての半部分アゴニスト（例えば、ラロキシフェン）を認識しうるわけではない。
【００２２】
本発明はまた、物質（該物質は本発明のコアクチベーターの機能を妨害または増強する）をヒトまたは動物の体内に投与することを含む或る系における、応答性核内受容体およびコアクチベーターにより促進される転写活性の、前記調節方法のための医薬としての医薬組成物を提供する。本発明はまた、該コアクチベーターの機能を妨害または増強する物質を含む、前記における使用のための医薬組成物を提供する。前記のとおり、本発明により提供されるアッセイで同定された化合物は、本発明のタンパク質のコアクチベーターとしての機能を妨害または増強しうる。あるいは、本発明のタンパク質の遺伝子を含むベクターを、医薬用途のために製剤化することができる。
【００２３】
該物質を１以上の医薬上許容される佐補助剤［例えば、標準的な参考書であるＧｅｎｎａｒｏら，Ｒｅｍｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（第１８版，Ｍａｃｋ　ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０、特に、Ｐａｒｔ　８：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅを参照されたい）に記載されているもの］と混合することによる医薬の製造方法は、当技術分野においてよく知られている。適当な補助佐剤は、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（第２版，Ａ．ＷａｄｅおよびＰ．Ｊ．Ｗｅｌｌｅｒ編；Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ；Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ；Ｌｏｎｄｏｎ，１９９４）に記載されている。該物質と医薬上許容される補助佐剤との混合物は、丸剤、錠剤のような固形投与単位に圧縮したり、あるいはカプセル剤または坐剤に加工することができる。また、医薬上適した液体を使用することにより、該物質を、溶液、懸濁液またはエマルションの形態の注射剤として、あるいは噴霧剤、例えば鼻腔内噴霧剤として適用することができる。投与単位（例えば、錠剤）の製造の場合には、通常の添加剤、例えば充填剤、着色剤、高分子結合剤などが意図される。
【００２４】
そのような医薬組成物は、ＣＯＡＴＥＲ活性化核内受容体関連治療において、より詳しくは、ホルモン刺激腫瘍増殖に対して、男性または女性の避妊のために、女性における更年期閉経愁訴および更年期閉経後障害の治療のために、同化促進性薬物治療のために、心臓病に対して、ならびに減少したホルモン活性による老化の治療のために使用することができる。ＣＯＡＳＴＥＲタンパク質は組織特異的発現プロフィールを示すため、そのような医薬は組織特異的治療に貢献しうる。さらに、ＣＯＡＳＴＥＲの存在または調節は、核内受容体リガンドの薬理学的特性を改変しうる。例えば、ラロキシフェンは、通常はアンタゴニストであるが、ＣＯＡＳＴＥＲが細胞内で明らかに発現されている場合には、ラロキシフェンはアゴニスト特性を示す。
【００２５】
また、本発明のタンパク質またはその断片をコードする配列を有する適切に標識されたポリヌクレオチドも、本発明により入手可能となる。これらは、生物におけるＣＯＡＳＴＥＲ−ＲＮＡの異常な発現に関連した疾患を同定するためにＲＮＡのストリンジェントな定量的ハイブリダイゼーションによる診断方法において使用することができる。ハイブリダイゼーションでＲＮＡの正確な同定を行うためには、これらの方法は、少なくとも５００ヌクレオチド長を有するそのような標識ポリヌクレオチドの使用を伴うのが有利でありうる。しかし、より実用的であり尚もこの目的に有効であるためには、２０〜５０ヌクレオチド長も好ましい。診断目的には、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）のようなヌクレオチド鎖反応により、ＣＯＡＳＴＥＲ　ｍＲＮＡの発現を検出することも可能である。この目的には、逆転写酵素を使用して、サンプル試料から単離されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成する。ついでＣＯＡＳＴＥＲアンチセンスおよびセンスオリゴヌクレオチドプライマーの存在下、該ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応において鋳型として使用する。適当な検出方法と組合された同位体もしくは非同位体標識により又は直接分光光度もしくは比色法により測定されうる増幅されたＰＣＲ産物の量は、ＣＯＡＳＴＥＲ　ｍＲＮＡの相対発現レベルを表す。
【００２６】
標識は種々の方法で行うことができる。放射能標識の場合には、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、該放射能標識ハイブリッドの１秒当たりのデスインテグレーション（ｄｅｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）の数の定量により測定することができる。あるいは、ハイブリダイズした放射能標識断片は、オートラジオグラフィーまたは同様の方法により可視化することができる。非同位体標識法は、しばしば、該断片の標識中に取り込まれるビオチン化ヌクレオチドを使用する。ついで、成功裏にハイブリダイズした断片を、取り込まれたビオチンに基づき検出することができる。該ビオチン部分は、蛍光または酵素特性を有する分子に共役したアビジン分子を使用して検出することができる。蛍光または酵素活性の量を、該ハイブリダイゼーション効率の尺度として用いる。該診断方法は、腫瘍増殖を伴う疾患に特に有用であろう。ＣＯＡＳＴＥＲ遺伝子は腫瘍細胞系内で強く発現されることが顕著である。該診断方法は、診断する生物からの生検の実施またはスキャンにより行うことができるが、該方法は、ヒトまたは動物の身体上では実施されない方法に厳密に限定されうる。そのような場合、該方法は、ハイブリダイゼーションのための入手可能な生物学的材料のインビトロ試験を含む。ＣＯＡＳＴＥＲに対する核内受容体の感受性を考慮して、該方法は、好ましくは、疑われる疾患がステロイド受容体、より好ましくはプロゲストゲン受容体、エストロゲン受容体またはグルココルチコイド受容体の機能不全に関連している場合に用いられる。
【００２７】
また、本発明のためのタンパク質は、これらのタンパク質に対する抗体を製造するために使用することが可能であり、該抗体は、本発明に開示する同時活性化過程における変化を伴う障害の診断方法において使用することができる。モノクローナルおよびポリクローナル抗体の製造方法は、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ｇ．Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｋ．Ｓｔｒｕｈｌ編，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ　Ｉｎｃ．）のような標準的な実験マニュアルに記載されている。免疫は、ＣＯＡＳＴＥＲタンパク質の粗製もしくは精製調製物を使用して、または抗体ドナー生物を免疫するために直接使用されるＣＯＡＳＴＥＲの哺乳類発現ベクターを使用するＤＮＡワクチン接種により行うことができる。
【００２８】
ＣＯＡＳＴＥＲタンパク質および真核細胞、細菌、プラスミドまたはベクター内に人工的に取り込まれるＣＯＡＳＴＥＲをコードするポリヌクレオチドは、ヒト精巣からのＲＮＡの逆転写により得たｃＤＮＡ鋳型上でのポリメラーゼ連鎖反応による増幅により得ることができる。該ポリメラーゼ連鎖反応は、ＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡの開始コドンを含むセンスプライマー（例えば、ＡＴＧＧＧＡＧＡＣＣＣＧＧＧＧＴＣＧＧＡ；配列番号１３）、およびＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡの終結コドンを含むアンチセンスプライマー（例えば、ＴＴＡＣＡＴＴＴＣＣＴＣＡＡＧＡＣＴＴＣ；配列番号１４）を利用すべきである。適当な発現ベクターにおけるこのようにして得られたｃＤＮＡのクローニングは、ＣＯＡＳＴＥＲタンパク質の産生を可能にする。ヌクレオチドの欠失および挿入により、部分的に同一である人工ＣＯＡＳＴＥＲタンパク質を、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ（前掲）に記載の当業者によく知られた方法により得ることができる。ＣＯＡＳＴＥＲタンパク質は、ＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡを含有する発現ベクターのトランスフェクションにより生物内に導入することができる。該ベクターは、トランスフェクトされた生物において遺伝子発現を駆動しうるプロモーターと、このプロモーターの下流のＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡとを含有すべきである。また、該ベクターは、転写および翻訳の適切な開始および終結のためのシグナルと、該転写産物の適切なプロセシングのためのシグナルとを含有すべきである。哺乳類細胞内へのＣＯＡＳＴＥＲの導入のためには、ウイルスプロモーター、例えば、シミアンウイルス４０、ラウス肉腫長末端反復配列またはサイトメガロウイルス最初期プロモーターが、ＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡの転写の駆動に適している。ウイルスプロモーターを含有するプラスミドベクターの具体例には、ｐＣＤＮＡ３．１、ｐＲＳＶおよびｐＮＧＶ１が含まれる。プラスミドを介した哺乳類細胞内へのＣＯＡＳＴＥＲの導入に加えて、ＣＯＡＳＴＥＲの運搬および発現のためのウイルスビヒクルを使用するトランスダクションにより、ＣＯＡＳＴＥＲを哺乳類細胞内に導入することが可能である。適当なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルスおよびバキュロウイルスが含まれる。細菌細胞内へのＣＯＡＳＴＥＲの導入のためには、Ｔ７プロモーターのような細菌プロモーターを含有するベクターが適している。細菌発現ベクターの具体例には、ｐＲＳＥＴおよびｐＥＴが含まれる。酵母内へのＣＯＡＳＴＥＲの導入のためには、適当なベクターには、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）内への導入のためのｐＹＥＳ、およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）内への導入のためのｐＰＩＣが含まれる。
【００２９】
該アッセイのための応答性核内受容体を選択するためには、直接的な方法が利用可能である。例えば、核内受容体が一過性トランスフェクションアッセイにおいてよってＣＯＡＳＴＥＲタンパク質により同時活性化されるか否かについて試験することができる。同時活性化が存在する場合には、該核内受容体は応答性である。核内受容体の作用は、プロモーターの下流に連結した遺伝子の転写の誘発である。例えば、ツーハイブリッドアッセイにより、該核内受容体がＣＯＡＳＴＥＲタンパク質と相互作用するか否かを試験することができる。同様に、人工タンパク質のＣＯＡＳＴＥＲタンパク質の機能的等価体を、実施例に記載のアッセイにおいて常套的に試験することができる。
【００３０】
本発明の変異体および用途の以下の説明は、本発明およびその使用を更に実施可能なものとすることを意図している。
【００３１】
選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）にリガンド化されたＥＲαの同時活性化はＡＦ１領域に依存する
図４は、ＣＯＡＳＴＥＲが、４ＯＨ−タモキシフェンでリガンド化（ｌｉｇａｎｄｅｄ）されたＥＲαのコアクチベーターであるが、４ＯＨ−タモキシフェンでリガンド化されたＥＲβのコアクチベーターではないことを示している。これらの結果は、ＳＥＲＭ　４ＯＨ−タモキシフェンがＡＦ１機能を介してシグナリングするという従来の観察と良く符合する。該ＡＦ１機能はＥＲαのＡＢドメイン内にはあるが、ＥＲβにおいては構造的にも機能的にも保存されていない（ＭｃＩｎｅｒｎｅｙら，１９９８，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１３９，４５１３−４５２２）。この見解を立証するために、本発明者らは、２つの受容体キメラ上でＣＯＡＳＴＥＲの同時活性化能を試験した。既に記載されているとおり（ＭｃＩｎｅｒｎｅｙら，１９９８，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１３９，４５１３−４５２２）、ＥＲβ／αキメラは、ＥＲαのＣＤＥＦドメインに融合したＥＲβのＡＢドメインを含有する。トランスフェクション実験においては、該ＥＲβ／α受容体は、１７β−エストラジオールの存在下では、ＣＯＡＳＴＥＲにより同時活性化を可能にするが、ＳＥＲＭ　４ＯＨ−タモキシフェンおよびラロキシフェンの存在下では、それを可能にしない（図８）。この観察は、ＳＥＲＭによりリガンド化された受容体のＣＯＡＳＴＥＲによる同時活性化が、１７β−エストラジオールによりリガンド化された受容体の同時活性化とは異なることを示している。４ＯＨ−タモキシフェンによるシグナリングがＥＲα　ＡＦ１を必要とするという従来の観察と一致して、本発明者らの結果は、４ＯＨ−タモキシフェンがＥＲβ／αキメラ上で作動性を示さないことを示している。さらに、本発明者らのデータは、該細胞内のＣＯＡＳＴＥＲレベルの上昇が活性におけるこの遮断に打ち勝たないことを示しており、このことは、ＳＥＲＭによりリガンド化された受容体の同時活性化がＥＲα　ＡＦ１を必要とすることを示している。ＥＲβのＣＤＥＦドメインに融合したＥＲα　ＡＦ１を含有するＥＲα／βキメラ上での状況は、より複雑である。ＥＲα／βキメラは、野生型ＥＲαまたはＥＲβ受容体の場合と比較して減少した１７β−エストラジオールの存在下での活性および４ＯＨ−タモキシフェンの作動性を示すことが、既に示されている（ＭｃＩｎｅｒｎｅｙら，１９９８，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　１３９，４５１３−４５２２）。本発明者らのデータは、これらの結果を証明し拡張するものであり、４ＯＨ−タモキシフェンおよび１７β−エストラジオールに加えて、ラロキシフェンもＥＲα／βキメラを介してシグナリングしうることを示している。しかし、ＥＲα／βキメラはＣＯＡＳＴＥＲによる同時活性化に対して不感受性である。組合された結果は、ＥＲα／βキメラが特有のコンホメーションを取ることを示しており、１７β−エストラジオールによりリガンド化された野生型ＥＲβ上で見出されるとおりの同時活性化が、ＡＦ２機能および配列（ＥＲβのＮ末端のもの）の両方に左右されることを示唆している。
【００３２】
ＣＯＡＳＴＥＲは新規ＳＥＲＭを同定する
ＣＯＡＳＴＥＲの不存在下、４ＯＨ−タモキシフェンはＥＲα上でアゴニストとして機能しうるが、ラロキシフェンはそのように機能し得ないことを、図４および５に示す結果は示している。該細胞内のＣＯＡＳＴＥＲレベルの上昇は、作動能を有するリガンドとしてのラロキシフェンの同定を可能にする。本発明者らは、ＣＯＡＳＴＥＲが、抗エストロゲン剤として既に同定されている化合物のプール中の新規潜在的ＳＥＲＭの同定を可能にするか否かを問うた。この目的のために、本発明者らは、新規抗エストロゲン剤として同定された化合物ＯＲＧ４３１４３、ＯＲＧ３９６６０およびＯＲＧ３９６６９の活性をハイスループットスクリーニングアッセイ（Ｄｅｃｈｅｒｉｎｇら，２０００，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　７，５６１−５７６に記載の方法）において試験した。図９は、これらの化合物がすべて、抗エストロゲン剤として挙動することを示している。注目すべきことに、化合物ＯＲＧ３９６６９は抗エストロゲンアッセイにおいて部分活性を示している。ＣＯＡＳＴＥＲ同時活性化アッセイにおいて試験した場合、この群の抗エストロゲン剤は、３つの異なる機能的クラスに分類される（図１０）。第１のクラスは４ＯＨ−タモキシフェンおよびＯＲＧ３９６６９を含み、ＥＲα上で何らかの作動性を示しＣＯＡＳＴＥＲの存在下で作動性を増強した化合物の一群を代表する。第２のクラスは、ＣＯＡＳＴＥＲの不存在下でＥＲＥレポーターのＥＲα媒介転写に対して不活性（サイレント）な抗エストロゲンの一群である。しかし、ＣＯＡＳＴＥＲレベルが上昇すると、これらの化合物はアゴニストとなる。化合物ラロキシフェンおよび新規抗エストロゲンＯＲＧ４３１４３は、この第２のクラスの代表例である。最後のクラスの抗エストロゲン剤はＩＣＩ　１６４，３８４およびＯＲＧ３９６６０を含み、ＥＲＥ受容体上で作動性を示さずＣＯＡＳＴＥＲの存在下で不活性（サイレント）なままである化合物の一群を代表する。
【００３３】
ＣＯＡＳＴＥＲの組織分布
ＣＯＡＳＴＥＲ　ｍＲＮＡの組織分布をノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲにより調べた。ヒト多組織ノーザンブロットを７９４ｂｐのＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた。調べたほとんどすべての組織が約５ｋＢのサイズのｍＲＮＡ種に対するハイブリダイゼーションを示しており、精巣、卵巣、心臓、胎盤および骨格筋においては、より高いシグナルが示され、その他の組織においては、より低いシグナルが示されるか又は全くシグナルが示されなかった（図６）。さらに、精巣内に特有に存在する４ｋＢの転写産物に対して、非常に強力なハイブリダイゼーションシグナルが観察される。５ｋＢの転写産物のサイズは、本発明者らが単離しているｃＤＮＡのサイズと良く合致する。４ｋＢの転写産物はスプライス変異体に相当しうる。この転写産物の精巣特異的発現パターンは顕著であり、精巣の生理学における機能的役割を示唆している。また、腫瘍に由来する種々のヒト細胞系において並びにヒトおよびマカク・ファスシキュラタ（Ｍａｃａｃａ　ｆａｓｃｉｃｕｌａｔａ）（シノモルグスザル）組織からのＲＮＡサンプルにおいて、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＣＯＡＳＴＥＲからのｍＲＮＡの発現を調べた。該ＲＴ−ＰＣＲの半定量的結果を図７および１１に示す。該結果は、乳上皮癌細胞系ＭＣＦ−７およびＴ−４７ならびに膣上皮細胞系ＳＷ９５４において高い発現を示している。骨肉腫細胞系Ｕ−２　ＯＳおよびＨＯＳ、子宮内膜上皮癌細胞系Ｉｓｈｉｋａｗａ、血管内皮細胞系ＶＥ１０３ＥＲαならびに内皮細胞系ＨＳ７６０Ｔにおいては、中等度の発現が観察された。骨肉腫細胞系ＭＧ６３および子宮内膜上皮癌細胞系ＥＣＣ−１においては、発現は検出されなかった。ＣＯＡＳＴＥＲの高い発現を示す細胞系（ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＳＷ９５４）は高レベルのＥＲαを含有することが報告されており（Ｄｅｃｈｅｒｉｎｇら，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７，５６１−５７６）、このことは、ＣＯＡＳＴＥＲが腫瘍細胞のＥＲα媒介増殖に寄与しうることを示唆している。組織由来のＲＮＡ上でのＲＴ−ＰＣＲの結果を図１１に示す。ＲＴ−ＰＣＲ法は、ノーザンブロット（図６）により示されたとおりの精巣内での高い発現を証明している。また、骨組織において、高い発現が認められる。これは、核内受容体−ＣＯＡＳＴＥＲ相互作用を可能にするリガンドが骨代謝に影響を及ぼしうることを示している。
【００３４】
さらに、実施例および図面により、本発明を例示し明瞭化または特定することとする。以下の図面により、説明を例示する。
【００３５】
図１．ＣＯＡＳＴＥＲのヌクレオチドおよびアミノ酸配列の具体例
このＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡ配列は、３０３９塩基対（１０１３アミノ酸）のオープンリーディングフレームを有する４９９９塩基対の長さを有する。ほぼ完全な相同性（９９％）を有するＫＩＡＡ０５７６をコードするｃＤＮＡの既に公開されている配列（アクセッション番号ＡＢ０１１１４８）は、１０６１アミノ酸のオープンリーディングフレームを与える２８３２位における１４４ヌクレオチドの挿入を示す。ジンクフィンガーモチーフが太字で示されており、ＬＸＸＬＬモチーフが下線で示されている。コンセンサス核局在化シグナルのアミノ酸配列が、下線付きのイタリック体で示されている。ＡＴＧ開始コドンおよびインフレーム翻訳終結コドンが太字のイタリック体で示されている。
【００３６】
図２．該ＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡ配列は約１１５キロダルトンのタンパク質をコードしている。ＣＯＡＳＴＥＲの完全なオープンリーディングフレームを含有する鋳型ｐＣＤＮＡ３．１．ＨＩＳＣ．ＣＯＡＳＴＥＲを、インビトロで転写し翻訳した（［３５Ｓ］−メチオニンの存在下）。対照として、平行して、ｐＢＫ−ＳＲＣ−１（Ｏｎａｔｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０，１３５４−１３５７）を転写し翻訳した。標識タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。この図は、電気泳動パターンのオートラジオグラフを示す。レーン１：ｐＢＫ−ＳＲＣ−１の翻訳産物。レーン２：ｐＣＤＮＡ３．１ＨＳＣ．ＣＯＡＳＴＥＲの翻訳産物。ＣＯＡＳＴＥＲタンパク質の位置が矢印で示されている。
【００３７】
図３．ＥＲβとＣＯＡＳＴＥＲとの間のホルモン依存性相互作用。プラスミドｐＧＢＴ９．ＥＲβ、およびＧＡＬ４活性化ドメインとＣＯＡＳＴＥＲアミノ酸１−２３４との融合体をコードするプラスミドで形質転換された酵母宿主株ＡＨ１０９において、酵母ツーハイブリッドアッセイを行った。この図は、１０−８Ｍ　１７β−エストラジオール（陰影付き斜線の棒線）および１０−５Ｍ　ラロキシフェン（黒塗りの棒線）に応答した該形質転換酵母細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。該形質転換酵母細胞のバックグラウンドβ−ガラクトシダーゼ活性が白抜きの棒線で示されている。
【００３８】
図４．４ＯＨ−タモキシフェンおよびラロキシフェンに応答したＥＲαおよびＥＲβの差次的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）同時活性化。Ｕ−２　ＯＳ細胞を、示されているとおりにｐ４ＥＲＥ−ＴＡＴＡ−ＬＵＣおよびｐＮＧＶ１．ＥＲαまたはｐＮＧＶ１ＥＲβで一過性にトランスフェクトした。示されている場合には、細胞をＣＯＡＳＴＥＲ発現構築物ｐＣＤＮＡ３．１ＨＩＳＡ．ＣＯＡＳＴＥＲΔもしくはｐＣＤＮＡ３．１ＨＩＳＣ．ＣＯＡＳＴＥＲまたは発現構築物ｐＣＤＮＡ３．１ＨＩＳＣ．ＧＲＩＰ１でコトランスフェクトした。この図は、ホルモンの不存在下（白抜きの棒線）または１０−７Ｍ　ラロキシフェン（陰影付き斜線の棒線）もしくは１０−７Ｍ　４ＯＨ−タモキシフェン（黒塗りの棒線）の存在下で該細胞をインキュベートした後のルシフェラーゼ活性（ｌ．ａ．）を示す。誤差線は三重の実験における標準偏差を示す。
【００３９】
図５．ＥＲαの存在下またはＣＯＡＴＥＲと組合されたＥＲαの存在下でのエストロゲン応答性エレメントの用量依存的活性化。Ｕ−２　ＯＳ細胞をｐ４ＥＲＥ−ＴＡＴＡ−ＬＵＣおよびｐＮＧＶ１．ＥＲαで一過性にトランスフェクトした。黒塗りの記号で示されたトランスフェクション実験はＣＯＡＳＴＥＲ発現構築物ｐＣＤＮＡ３．１ＨＩＳＣ．ＣＯＡＳＴＥＲで補足された。この図は、漸増濃度のラロキシフェン（正方形で示されている）または４ＯＨ−タモキシフェン（三角形で示されている）と共に該細胞をインキュベートした後のルシフェラーゼ活性（ｌ．ａ．）を示す。誤差線は三重の実験における標準偏差を示す。
【００４０】
図６．ＣＯＡＳＴＥＲ転写産物の組織分布。ヒト多組織ノーザンブロットを［３２Ｐ］標識ＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。この図は該ブロットのオートラジオグラフを示す。該ＣＯＡＳＴＥＲプローブは、矢印で示されている約５ｋＢおよび４ｋＢのサイズの２つのｍＲＮＡ種にハイブリダイズしている。該ブロット上に表された組織は、脾臓（ａ）、胸腺（ｂ）、前立腺（ｃ）、精巣（ｄ）、卵巣（ｅ）、小腸（ｆ）、結腸（ｇ）、末梢血白血球（ｈ）、心臓（ｉ）、脳（ｊ）、胎盤（ｋ）、肺（ｌ）、肝臓（ｍ）、骨格筋（ｎ）、腎臓（ｏ）および膵臓（ｐ）を含む。サイズ標準物の泳動パターンがこの図の左側に示されている（サイズはキロベース単位）。
【００４１】
図７．腫瘍細胞系内でのＣＯＡＳＴＥＲの発現。ＣＯＡＳＴＥＲの相対発現レベルをＲＴ−ＰＣＲにより測定した。この図は、該ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動イメージのスキャニングにより測定されたＰＣＲ産物の相対強度を示す。表されている細胞系は、ＭＣＦ−７（ａ）、Ｔ−４７Ｄ（ｂ）、Ｕ−２　ＯＳ（ｃ）、ＭＧ６３（ｄ）、ＨＯＳ（ｅ）、ＥＣＣ−１（ｆ）、Ｉｓｈｉｋａｗａ（ｇ）、ＶＥ１０３（ｈ）、ＨＳ７６０Ｔ（ｉ）およびＳＷ９５４（ｊ）を含む。
【００４２】
図８．エストラジオール（Ｅ２）、ラロキシフェンまたは４−ヒドロキシ−タモキシフェン（４ＯＨＴ）の添加に応答した、ＥＲβ／αキメラ受容体およびＣＯＡＳＴＥＲでトランスフェクトした細胞において光計数／秒（ｃｐｓ）で定量したルシフェラーゼ発現。
【００４３】
図９．種々の濃度（濃度の対数で表されている）のラロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）、ＩＣＩ１６４，３８４、Ｏｒｇ４３１４３、Ｏｒｇ３９６６０およびＯｒｇ３９６６９の存在下での標準量のエストラジオールの添加に応答したエストロゲン活性（％）。
【００４４】
図１０．ＣＯＡＳＴＥＲ同時活性化アッセイにおける化合物の効果。
【００４５】
図１１．ヒトおよびマカク・ファスシキュラタ（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｔａ）組織におけるＣＯＡＳＴＥＲの発現。ＣＯＡＳＴＥＲの相対発現レベルをＲＴ−ＰＣＲにより測定した。この図は、Ｔａｑｍａｎリアルタイム定量ＰＣＲ法により測定されたＰＣＲ産物の相対強度を示す。ＲＮＡ材料の起源として使用した組織がこの図の下に示されている。マカク・ファスシキュラタ（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｔａ）由来である骨組織以外の全ての組織はヒト由来である。
【００４６】
（実施例）
ステロイド受容体の新規コアクチベーターの同定
結果および考察
酵母ツーハイブリッドスクリーニング
ホルモン依存的にＥＲβと相互作用するタンパク質としてのＣＯＡＳＴＥＲの同定のために、ＥＲβをベイト（おとり餌）として使用する酵母ツーハイブリッドスクリーニングを行った。該ツーハイブリッドシステム系は、ＧＡＬ応答性プロモーターからＨＩＳ３、ＭＥＬ１、ＡＤＥ２およびｌａｃＺレポーター遺伝子を発現する酵母株（ＡＨ１０９）よりなるものであった。ＥＲβは、このシステム系において、ＧＡＬ４　ＤＮＡ結合ドメインとの融合体として発現された。この系においては、ＥＲβは単独では、１７β−エストラジオールの存在下で該レポーター遺伝子を活性化し得ない（結果は示していない）。ＥＲβを発現する宿主株をヒト骨肉腫ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した。このライブラリーは、ＧＡＬ４トランス活性化ドメインとの翻訳融合体としてｃＤＮＡを発現する。ＥＲβとライブラリーコード化タンパク質との間の相互作用は、該レポーター遺伝子の活性化、ならびにヒスチジンおよび／またはアデニンを欠く培地上での増殖を可能にする。合計３．５×１０６個のコロニーをスクリーニングした。該形質転換酵母細胞を、１７−βエストラジオールの存在下およびヒスチジンを欠く培地上での増殖に関して選択した。５６０個のＨＩＳ＋コロニーを選択し、１７−βエストラジオールの不存在下または存在下、それらのＡＤＥ＋表現型に関してレプリカプレーティングによりスクリーニングした。ホルモン依存性ＨＩＳ＋，ＡＤＥ＋表現型を示した２７個の酵母形質転換体を選択した。該ライブラリー由来プラスミドＤＮＡをこれらの２７個のクローンから単離し、観察された表現型が該形質転換ＤＮＡに依存することを確認するために、ＡＨ１０９．ｐＧＢＴ９．ＥＲβ宿主酵母株内に再導入した。酵母β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）トランス活性化アッセイにおいては、再試験した２７個中２１個の陽性体がホルモン誘導性ｌａｃＺ＋表現型を示した。これらの陽性体の配列分析は、ステロイド受容体に対する２つのよく知られたコアクチベーターであるＵＢＣ９（ユビキチン共役酵素）およびＳＵＧ１を同定した。また、いくつかのジンクフィンガーモチーフとＬＸＸＬＬドメインとを有しステロイド受容体とコアクチベーターとの相互作用に関与しているらしい核タンパク質をコードすると予想されるｃＤＮＡ配列を同定した。このｃＤＮＡを更なる研究のために選択し、それは、ステロイド受容体の機能的コアクチベーターをコードすることが判明した。したがって、本発明者らは、この新規コアクチベーターをＣＯＡＳＴＥＲと命名した。
【００４７】
ＣＯＡＳＴＥＲ：ステロイド受容体の新規コアクチベーター
ＣＯＡＳＴＥＲの一次構造
ツーハイブリッドスクリーニングにおいて単離したプラスミドｐＡＣＴ２．ＣＯＡＳＴＥＲΔのインサート挿入断片を配列決定し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用してこの配列をＩｎｃｙｔｅ　Ｌｉｆｅｓｅｑ　ＧｏｌｄおよびＧｅｎｂａｎｋデータベースと比較した。合計２７０個のＩｎｃｙｔｅ　ＥＳＴ配列を同定した。ＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡの３’末端を含有するクローン２９０５７５７をＩｎｃｙｔｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＵＳＡ）から得、完全に配列決定した。また、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースの検索は、ＣＯＡＳＴＥＲ配列が、未知機能の推定タンパク質であるＫＩＡＡ０５７６（Ｎａｇａｓｅら，ＤＮＡ　Ｒｅｓ．５，３１−３９）をコードする遺伝子とほぼ完全な相同性（９９％）を共有することを示した。該ＫＩＡＡ０５７６配列はＣＯＡＳＴＥＲのスプライス変異体に相当し、１４４塩基対のインフレーム挿入断片を含有する。ＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡ配列の５’末端を同定するために、ＲＡＣＥ　ＰＣＲを用いた。５’非翻訳領域において異なる２つの異なる断片を同定した。図１は、完全なＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡ配列の概観を示す。最長のＲＡＣＥ断片に対応するｃＤＮＡは、４０９９ヌクレオチドの長さを有し、３０３９ヌクレオチド（１０１３アミノ酸）のオープンリーディングフレームを含有する。該ＫＩＡＡ０５７６は、１０６１アミノ酸のオープンリーディングフレームを与える２８３２における１４４ヌクレオチドの挿入断片を示す。ＣＯＡＳＴＥＲおよびＫＩＡＡ０５７６のどちらに関しても、該ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列は、９個のジンクフィンガードメイン（Ｃ２Ｈ２型）、核局在化部位およびＬＸＸＬＬ核内受容体相互作用モチーフを含有するタンパク質を予想させる。
【００４８】
ＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡはタンパク質をコードしている
ＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡが実際にタンパク質をコードしているか否かを調べるために、ＣＯＡＳＴＥＲの完全なオープンリーディングフレーム（アミノ酸１−１０１３）を含有するプラスミドｐＣＤＮＡ３．１ＨＩＳＣ．ＣＯＡＳＴＥＲをインビトロで転写および翻訳した。図２は、約１１５キロダルトンのタンパク質がＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡにコードされることを示している。該タンパク質の観察されたサイズは、図１に示すｃＤＮＡ配列の長さと完全に一致する。該結果は更に、ＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡが、ｐＢＫ−ＳＲＣ−１にコードされるタンパク質（これは公知コアクチベーターＳＲＣ−１のオープンリーディングフレームを含有する）とは異なるタンパク質をコードすることを示している。
【００４９】
ＣＯＡＳＴＥＲは酵母内でＥＲβと相互作用する
プラスミドｐＡＣＴ２．ＣＯＡＳＴＥＲΔは最初は酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいて単離された。このプラスミドにコードされるタンパク質が実際に酵母内でＥＲβと相互作用することを確認するために、プラスミドｐＡＣＴ２．ＣＯＡＳＴＥＲΔをＡＨ１０９．ｐＧＢＴ９．ＥＲβ受容株内に再導入した。図３は、後続のツーハイブリッドアッセイの結果を示す。該結果は、増殖培地への１７β−エストラジオールの添加がβ−ガラクトシダーゼレポーター活性の用量依存的誘導を引き起こすことを示している。これに対して、抗エストロゲン剤であるラロキシフェンは該レポーターの活性を誘導することが不可能である。この不能性は、既に報告されているとおりの抗エストロゲン剤に対する酵母細胞の耐性に関連しているかもしれない（Ｌｙｔｔｌｅら，Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４２，６７７−６８５；ＩＨ，未公開の結果）。あるいは、それは、ＥＲβの抗エストロゲン剤誘導性コンホメーションが、ＣＯＡＳＴＥＲとの相互作用を可能にしないことを示している可能性がある。ＥＲβ発現プラスミドまたはＣＯＡＳＴＥＲ発現プラスミドの単体での該酵母株の形質転換は、１７β−エストラジオール誘導性ｌａｃＺ＋表現型を与えなかった（データは示していない）。総合すると、これらの結果は、ＥＲβおよびＣＯＡＳＴＥＲが１７β−エストラジオール依存的に酵母内で相互作用することを示している。該相互作用は、ＣＯＡＳＴＥＲのＬＸＸＬＬモチーフには無関係である。なぜなら、このモチーフは、該酵母ツーハイブリッドアッセイにおいて使用したプラスミドｐＡＣＴ２．ＣＯＡＳＴＥＲΔによってはコードされていないからである。
【００５０】
ＣＯＡＳＴＥＲは哺乳類細胞における機能的コアクチベーターである
哺乳類環背景境中でのＣＯＡＳＴＥＲの機能的役割を調べるために、完全長ＣＯＡＳＴＥＲ（アミノ酸１−１０１３）ｃＤＮＡを哺乳類細胞発現ベクター内にクローニングした。ホルモン応答性要素の制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有するプラスミドまたはおよびステロイド受容体発現プラスミドと組合せたＣＯＡＳＴＥＲ発現プラスミドでのＵ−２　ＯＳ細胞のコトランスフェクションにより、ＣＯＡＳＴＥＲの機能的役割を分析した。トランスフェクション後、研究中の受容体に対する適当なホルモンで細胞を刺激した。結果を表１に示す。
【００５１】
【表１】
2004506445.tif 000004
表１の説明：ＣＯＡＳＴＥＲはステロイド受容体のコアクチベーターである。Ｕ−２　ＯＳ細胞は、ｐＮＧＶ１．ＥＲβおよびｐ４ＥＲＥ−ＴＡＴＡ−ＬＵＣ（１）、ｐＮＧＶ１．ＥＲαおよびｐ４ＥＲＥ−ＴＡＴＡ−ＬＵＣ（２）、ｐＫＣＲＥ．ＰＲおよびｐＭＭＴＶ−ＬＵＣ（３）またはｐＮＧＶ１．ＧＲおよびｐＭＭＴＶ−ＬＵＣ（４）で一過性にトランスフェクトした。示されている場合には、ＣＯＡＳＴＥＲ発現構築物ｐＣＤＮＡ３．１ＨＩＳＣ．ＣＯＡＳＴＥＲを該トランスフェクション混合物に加えた。トランスフェクション後、最上部の行に示されているホルモンと共に該細胞をインキュベートした。この表は、ルシフェラーゼ活性±標準偏差（三重の実験からのもの）を示す。Ｏｒｇ２０５８＝１６α−エチル−２１−ヒドロキシ−１９−ノルプレグン−４−エン−３，２０−ジオン。
【００５２】
表１から認められうるとおり、ＣＯＡＳＴＥＲはプロゲステロン受容体（ＰＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）ならびにエストロゲン受容体αおよびβ（ＥＲαおよびＥＲβ）のコアクチベーターである。すべての場合において、アゴニストでリガンド化された受容体の活性はＣＯＡＳＴＥＲの共発現により更に増強される。ＥＲαまたはＥＲβがアンタゴニストＩＣＩ１６４，３８４でリガンド化された場合には、ＣＯＡＳＴＥＲの共発現は該転写活性を増強せず、このことは、ＣＯＡＳＴＥＲがコアクチベーターとして機能するのを該アンタゴニスト誘導性コンホメーションが可能にしないことを示している。ステロイド受容体の不存在下でＣＯＡＳＴＥＲがトランスフェクトされた場合には、該レポーター遺伝子の活性は誘導されなかったが（データは示していない）、このことは、該ステロイド受容体およびＣＯＡＳＴＥＲの両方が該活性増強に要求されることを示している。
【００５３】
ＣＯＡＳＴＥＲはエストロゲン受容体αの半部分アゴニストを同定する
ＥＲαおよびＥＲβに対するＣＯＡＳＴＥＲの同時活性化能を、抗エストロゲン剤ラロキシフェンおよび４ＯＨ−タモキシフェンの存在下で更に調べた。比較のために、平行して、ヒトＴＩＦ２／ＳＲＣ−２のマウスオルソログであるコアクチベーターＧＲＩＰ１を分析した。トランスフェクション実験は、ＥＲＥ−レポーターを読取りに使用した場合には、Ｕ−２　ＯＳ細胞においては、４ＯＨ−タモキシフェンがＥＲαの転写活性に関するアゴニストとしては作用するが、ＥＲβの転写活性に関しては作用しないことを示した（図４）。ＣＯＡＳＴＥＲまたはＧＲＩＰ１のコトランスフェクションは、４ＯＨ−タモキシフェンでリガンド化されたＥＲαの活性の増強を引き起こす。興味深いことに、ＣＯＡＳＴＥＲはラロキシフェンの存在下で転写を活性化しうる（その化合物は、それ以外の場合にはこの系内でのアゴニストではない）。この現象はＥＲα媒介転写に関しては観察されるが、ＥＲβがエストロゲン受容体として存在する場合には観察されない。さらに、コアクチベーターＧＲＩＰ１は、ラロキシフェンおよびＥＲαの存在下、該レポーター遺伝子の発現を活性化し得ない。このデータは、ＣＯＡＳＴＥＲのトランケート化形態ＣＯＡＳＴＥＲΔの活性が、完全長ＣＯＡＳＴＥＲの活性と同じであることを示している。このことは、ラロキシフェンまたは４ＯＨ−タモキシフェンでリガンド化されたＥＲαに対するＣＯＡＳＴＥＲの同時活性化能にはアミノ酸１−２３４で十分であることを示している。さらに、ＥＲα媒介転写に対するＣＯＡＳＴＥＲの効果を、ＣＯＡＳＴＥＲの存在下および不存在下、リガンドであるラロキシフェンおよび４ＯＨ−タモキシフェンに関する用量反応曲線を作成することにより調べた。図５に示すデータは、ラロキシフェンがＥＲαおよびＣＯＡＳＴＥＲの存在下でＥＲＥ駆動遺伝子転写に対してアゴニストとして作用するという観察を証明している。ＣＯＡＳＴＥＲを使用しなかった場合には、ラロキシフェンは、該リガンドの高濃度においてさえも該レポーター遺伝子を活性化し得ない。抗エストロゲン剤である４ＯＨ−タモキシフェンはこの系におけるアゴニストである。しかし、ＣＯＡＳＴＥＲの発現は該転写応答の大きさを増加させる。どちらの化合物に関しても、ＥＲαおよびＣＯＡＳＴＥＲの存在下での該レポーターの活性は、該アッセイにおいて用いた濃度に左右される。ここに記載の結果は、ＣＯＡＳＴＥＲが、ラロキシフェンおよび４ＯＨ−タモキシフェンのような混合されたプロフィールの抗エストロゲン剤のアゴニスト／アンタゴニストのバランスに影響を及ぼしうることを示している。従来の報告は、ラロキシフェンが、ＥＲβに対して非古典的（非ＥＲＥ）経路を介してアゴニストとして作用しうることを示している（Ｚｏｕら，Ｍｏｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３，４１８−４３０；Ｐａｅｃｈら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７７，１５０８−１５１０）。本発明者らが知る限りにおいては、これらのデータは、古典的エストロゲン応答性要素（ＥＲＥ）経路上のラロキシフェンの作動性の最初の観察を提供するものである。また、これらは、ラロキシフェンがＥＲα上でアゴニストとして作用しうることを最初に示すものである。これらの観察は、抗エストロゲン剤の作用のメカニズムを我々が理解する際に重要である。ラロキシフェンでリガンド化されたＥＲαを活性化するＣＯＡＳＴＥＲの特性は、これまでに記載されているＧＲＩＰ１のようなコアクチベーターからＣＯＡＳＴＥＲを区別するものである。さらに、ＣＯＡＳＴＥＲは化合物の半部分アゴニスト特性を同定しうるため、本明細書に記載のアッセイは新規エストロゲン受容体リガンドの薬理学的スクリーニングに特に有利に使用することができる。
【００５４】
ＣＯＡＳＴＥＲの組織分布
ＣＯＡＳＴＥＲ　ｍＲＮＡの組織分布をノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲにより調べた。ヒト多組織ノーザンブロットを７９４ｂｐのＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた。調べたほとんどすべての組織が約５ｋＢのサイズのｍＲＮＡ種に対するハイブリダイゼーションを示しており、精巣、卵巣、心臓、胎盤および骨格筋においては、より高いシグナルが示され、その他の組織においては、より低いシグナルが示されるか又は全くシグナルが示されなかった（図６）。さらに、精巣内に特有に存在する４ｋＢの転写産物に対して、非常に強力なハイブリダイゼーションシグナルが観察される。５ｋＢの転写産物のサイズは、本発明者らが単離しているｃＤＮＡのサイズと良く合致する。４ｋＢの転写産物は、詳細な構造が未だ明らかでないスプライス変異体に相当しうる。しかし、この転写産物の精巣特異的発現パターンは顕著であり、精巣の生理学における機能的役割を示唆している。また、腫瘍に由来する種々のヒト細胞系において、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＣＯＡＳＴＥＲからのｍＲＮＡの発現を調べた。該ＲＴ−ＰＣＲの半定量的結果を図７に示す。該結果は、乳上皮癌細胞系ＭＣＦ−７およびＴ−４７ならびに膣上皮細胞系ＳＷ９５４において高い発現を示している。骨肉腫細胞系Ｕ−２　ＯＳおよびＨＯＳ、子宮内膜上皮癌細胞系Ｉｓｈｉｋａｗａ、血管内皮細胞系ＶＥ１０３ＥＲαならびに内皮細胞系ＨＳ７６０Ｔにおいては、中等度の発現が観察された。骨肉腫細胞系ＭＧ６３および子宮内膜上皮癌細胞系ＥＣＣ−１においては、発現は検出されなかった。ＣＯＡＳＴＥＲの高い発現を示す細胞系（ＭＣＦ−７、Ｔ−４７Ｄ、ＳＷ９５４）は高レベルのＥＲαを含有することが報告されており（Ｄｅｃｈｅｒｉｎｇら，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．７，５６１−５７６）、このことは、ＣＯＡＳＴＥＲが腫瘍細胞のＥＲα媒介増殖に寄与しうることを示唆している。
【００５５】
材料および方法
酵母ツーハイブリッドスクリーニング
酵母培地
酵母宿主株および形質転換体を完全培地（ＹＰＤ）内または最小少合成ドロップアウト（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　Ｄｒｏｐｏｕｔ）（ＳＤ）培地内で培養した。該完全培地は、酵母株の増殖のための最適比率のペプトン、酵母エキスおよびデキストロースの混合物である（酵母プロトコールハンドブックＣｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔａ，ＵＳＡ，プロトコールＰＴ３０２４−１を参照されたい）。該最小少ＳＤ培地は、２％　デキストロース、０．６７％　酵母窒素塩基およびアミノ酸とヌクレオシドとの特定の混合物である（例えば、ＳＤ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐは、ヒスチジン、ロイシンおよびトリプトファンを欠く培地である）。すべてのこれらの培地はＢＩＯ１０１（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＵＳＡ）から購入した。
【００５６】
ツーハイブリッドスクリーニング
サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＡＨ１０９（ＭＡＴａ，ｔｒｐ１−９０１，ｌｅｕ２−３，１１２，ｕｒａ３−５２，ｈｉｓ３−２００，ｇａｌ４Δ，ｇａｌ８０Δ，ＬＹＳ２：：ＧＡＬ１ＵＡＳ−ＧＡＬ１ＴＡＴＡ−ＨＩＳ３，ＧＡＬ２ＵＡＳ−ＧＡＬ２ＴＡＴＡ−ＡＤＥ２，ＵＲＡ３：：ＭＥＬ１ＴＡＴＡ−ｌａｃＺ）は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ　ＵＳＡから入手した。酵母株ＡＨ１０９内でベイトとしてＥＲβタンパク質を発現させるために、プラスミドｐＧＢＴ９．ＥＲβ（Ｗ．Ｋｒｕｉｊｅｒ，Ｒｉｊｋｓｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅｉｔ　Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓにより快く贈呈されたもの）を使用した。このプラスミドは、ＧＡＬ４　ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列に融合したＥＲβのコード配列（アミノ酸１−５３０）を含有し、選択マーカーとしてＴＲＰ１遺伝子を含有する。標準的な酢酸リチウム法をＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＵＳＡ，プロトコール＃ＰＴ３２４７−１）からの説明マニュアルに従い用いて、酵母株ＡＨ１０９をｐＧＢＴ９．ＥＲβで形質転換し、形質転換体をＳＤ−トリプトファン（ＳＤ−Ｔｒｐ）プレート上で選択した。このプレートから、単コロニーを選択し、親クローンとして保存した。ついで、これらのクローンのＨＩＳ３バックグラウンド発現を、適当な選択プレート上でのプレーティングにより判定した。１７β−エストラジオールの存在下のヒスチジン欠損培地上で増殖するクローンを捨てた。ついで、低いＨＩＳ３バックグラウンド発現を有するクローンを、酵母内でエストロゲン受容体と相互作用することが示されたコアクチベーターＧＲＩＰ１をコードするプラスミド（Ｈｏｎｇら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｏｌ．１７：２７３５−２７４４）である陽性対照ｐＧＲＩＰ１（Ｍ．ＳｒａｌｌｃｕｐＳｔａｌｌｃｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡにより快く贈呈されたもの）で形質転換した。ついで、ｐＧＲＩＰ１および１７β−エストラジオールの存在下で高いＨＩＳ３発現を示した親クローン（ＡＨ１０９．ＥＲβ）を、該ライブラリーのスクリーニングのための受容クローンとして選択した。ヒト骨肉腫Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ　ｃＤＮＡライブラリーをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＵＳＡ，ｃａｔ．＃：ＨＬ４０２６ＡＨ）から入手した。このライブラリーは、ＧＡＬ４活性化ドメイン（ＡＤ）と融合したクローン化インサート挿入断片を発現し選択マーカーとしてＬＥＵ２遺伝子を含有するベクターｐＡＣＴ２において構築した。受容クローンＡＨ１０９．ＥＲβを、該骨肉腫ｃＤＮＡライブラリーからの１００μｇのプラスミドＤＮＡで形質転換した。形質転換体を、１０−８Ｍ　１７β−エストラジオールを含有するＳＤ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓプレート上で選択し、ＨＩＳ＋コロニーを同定した。１０−８Ｍ　１７β−エストラジオールの不存在下および存在下、ＳＤ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｄｅ培地上でのプレートレプリカプレーティングにより、ＨＩＳ＋コロニーを再スクリーニングした。ホルモン依存性ＨＩＳ＋／ＡＤＥ＋表現型を示した酵���形質転換体を後続の研究のために選択した。これらの形質転換体から、粗（クルード）ミニプレップ単離に関するプロトコール（基本プロトコールＹ１．４を参照されたい）に従い、ＤＮＡを単離した。該粗ミニプレップを使用して、エレクトロポレーションにより大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＫＣ８を形質転換し、該ライブラリー由来プラスミドを含有する形質転換体をロイシン欠損培地上で選択した。ライブラリーインサート挿入断片をＰｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＵＳＡ）からのＡＢＩシークエンサー上で配列決定した。Ｂｌａｓｔ類似性検索をＩｎｃｙｔｅデータベースに対して行った。
【００５７】
酵母におけるβ−ガラクトシダーゼに関する化学発光レポーター遺伝子アッセイ：
単コロニーを液体ＳＤ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ培地内で３０℃で一晩培養した。これらの一晩培養物を、９６ウェル培養プレート内の９０μｌのＳＤ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ培地中で０．１のＯＤ６００まで希釈した。１０μｌの１０回濃縮ホルモンストック溶液を加え、プレートを、２００ｒｐｍの激しい振とう下、３０℃で５時間インキュベートした。ついで、Ｔｒｏｐｉｘ（Ｔｒｏｐｉｘ，Ｉｎｃ．，Ａｖｅｎｕｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＵＳＡ）のＧａｌａｃｔｏｎ　Ｐｌｕｓ化学発光検出システム系および一工程酵母細胞溶解（Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ　Ｙｅａｓｔ　Ｌｙｓｉｓ）バッファーを使用して、β−ガラクトシダーゼ活性を測定した。Ｖｉｃｔｏｒ装置（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＵＳＡ）を使用して、発光をモニターした。
【００５８】
ＣＯＡＳＴＥＲの５’ＲＡＣＥ（Ｒａｐｉｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ）：
ＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡの５’末端を単離するために、ヒト精巣Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＵＳＡ，Ｃａｔ．＃７４１４−１）を使用して、５’ＲＡＣＥ−ＰＣＲ実験を行った。遺伝子特異的プライマーＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＡＣＧＴＧＴＧＧＣＣと共にＭａｒａｔｈｏｎ　ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＵＳＡ）を該製造業者の説明に従い使用して、ＲＡＣＥ　ＰＣＲを行った。２つの異なる断片（〜６５０ｂｐおよび〜８００ｂｐ）を得た。該断片をアガロースゲルから単離し、Ｑｕｉａｑｕｉｃｋ遠心カラム（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＵＳＡ）を使用して精製し、ｐＣＲ２．１ＴＯＰＯキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を使用してクローニングした。遺伝子特異的プライマーＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＡＣＧＴＧＴＧＧＣＣおよびＡＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＴＧを使用するコロニーＰＣＲにより、インサート挿入断片を含有するコロニーを同定した。陽性クローンの配列分析をＡＢＩシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＵＳＡ）上で行った。
【００５９】
組換えプラスミド：
まず、ＣＯＡＳＴＥＲのトランケート化形態をコードするプラスミド（ｐＡＣＴ２．ＣＯＡＳＴＥＲΔ　アミノ酸１−２３４）を酵母ツーハイブリッドスクリーニングにおいて単離した。このプラスミドからのインサート挿入断片を哺乳類細胞発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１ＨＩＳＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）内にクローニングして、プラスミドｐＣＤＮＡ３．１ＨＩＳＡ．ＣＯＡＳＴＥＲΔを得た。該ＣＯＡＳＴＥＲ　ｃＤＮＡの３’末端を含有するプラスミドをＩｎｃｙｔｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＵＳＡ）から得た。このプラスミド（ＩｎｃｙｔｅクローンＩＤ　２９０５７５７）をＳａｃＩ／ＮｏｔＩ（アミノ酸３３０−１０６１）で消化した。プライマーＣＴＡＧＧＴＡＣＣＧＧＡＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＴＧＣ（配列番号１５）およびＧＧＣＡＧＴＧＡＧＣＴＣＣＡＴＧＴＧＧＧ（配列番号１６）（制限部位に下線が付されている）を使用して、ヒト精巣Ｍａｒａｔｈｏｎ　Ｒｅａｄｙ　ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ｃａｔ．＃７４１４−１）上、ＰＣＲにより、該ＣＯＡＳＴＥＲの５’末端（アミノ酸１−３３２）を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＫｐｎＩおよびＳａｃＩで消化し、ＳａｃＩ−ＮｏｔＩ制限断片と共に、ＫｐｎＩ−ＮｏｔＩ制限ｐＣＤＮＡ３．１ＨＩＳＣベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）内に連結した。後者のプラスミドをｐＣＤＮＡ３．１ＨＩＳＣ．ＣＯＡＳＴＥＲと命名した。トランスフェクション研究のために、ヒトエストロゲン受容体αおよびβならびにグルココルチコイド受容体のｃＤＮＡのタンパク質コード領域を哺乳類発現ベクターｐＮＧＶ１（アクセッション番号Ｘ９９２７４）内に挿入した。プロゲステロン受容体のタンパク質コード領域を哺乳類発現ベクターｐＫＣＲＥ（Ｓｔａｍら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２７，１５３）内に挿入した。レポータープラスミドｐＭＭＴＶ−ＬＵＣを、ベクターｐＭａｎＭｎｅｏＬＵＣ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＵＳＡ）を修飾することにより構築した。該ネオマイシンカセットを、ｅｎｄｏＲ　ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩでの消化およびそれに続くクレノウポリメラーゼでの平滑化およびＴ４　ＤＮＡリガーゼによる連結により除去した。レポーターベクター４ＥＲＥ．ＴＡＴＡＬｕｃは４つのエストロゲン応答性要素（ＥＲＥ）の制御下でルシフェラーゼ遺伝子を含有し、Ｐ．ｖ．ｄ．Ｓａａｇ（Ｎｅｄｅｒｌａｎｄｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｕｔ　ｖｏｏｒ　Ｏｎｔｗｉｋｋｅｌｉｎｇｓｂｉｏｌｏｇｉｅ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から贈られたものである。ＧＲＩＰ１の哺乳類発現プラスミドは、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨでのｐＧＲＩＰ１（Ｍ．Ｓｔａｌｌｃｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡにより快く贈呈されたもの）の制限消化により構築した。得られた断片を、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化されたｐＣＤＮＡ３．１ＨＩＳＣベクター内に連結して、プラスミドｐＣＤＮＡ３．１ＨＩＳＣ．ＧＲＩＰ１を得た。
【００６０】
細胞培養および一過性トランスフェクション：
Ｕ−２　ＯＳ細胞をＡＴＴＣ（ＨＴＢ−９６）から得、フェノールレッドを含有しないＭ５０５培地中の単層培養として湿気雰囲気（５％　ＣＯ２）中で３７℃で維持した。後者の培地は、２．５ｍｇ／ｍｌ　炭酸ナトリウム、５５μｇ／ｍｌ　ピルビン酸ナトリウム、２．３μｇ／ｍｌ　β−メルカプトメタノール、１．２μｇ／ｍｌ　エタノールアミン、３６０μｇ／ｍｌ　Ｌ−グルタミン、０．４５μｇ／ｍｌ　亜セレン酸ナトリウム、６２．５μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシンおよび５％　木炭処理ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）で補足された栄養培地（Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｅｄｉｕｍ）Ｆ１２（Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２，Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，Ｂｒｅｄａ，ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）とダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，Ｂｒｅｄａ，ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）との混合物（１：１）よりなる。１．１０５個の細胞を２４ウェル組織培養プレート内に播き、リポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，Ｂｒｅｄａ，ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用してＤＮＡを導入した。この目的のために、６２．５μｌのＯｐｔｉｍｅｎ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ　Ｂｒｅｄａ，ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）中のプラスミドＤＮＡを等容積の希釈リポフェクチン試薬（６２．５μｌのＯｐｔｉｍｅｎ中の１．７５μｌのリポフェクチン）と混合し、室温で３０分間放置した。該細胞を無血清Ｍ５０５培地で１回洗浄した後、２５０μｌのＯｐｔｉｍｅｎおよび該ＤＮＡ−リポフェクチン混合物を該細胞に加えた。３７℃（５％　ＣＯ２）で５時間インキュベートした後、５％　木炭処理ウシ胎仔血清で補足されたＭ５０５培地で細胞を１回洗浄し、ホルモンを該培地に加えた。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。翌日、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、７５μｌの細胞溶解バッファー（０．１Ｍ　リン酸バッファー，ｐＨ７．８，０．２％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００）の添加により細胞抽出物を作製した。室温で５分間インキュベートした後、３０μｌのアリコートを５０μｌのルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）に加えた。Ｖｉｃｔｏｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＵＳＡ）を使用して、発光を測定した。
【００６１】
ノーザンブロット分析：
プラスミドｐＣＤＮＡ３．１ＨＩＳＡ．ＣＯＡＳＴＥＲΔをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで消化して、プローブ（ヌクレオチド１８３−９２８）を得た。Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ　Ｇｏ　ＤＮＡ標識ビーズを製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の説明に従い使用して、該ＤＮＡ断片を［ａ３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。ヒト多組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＵＳＡ，ｃａｔ．＃７７６０−１７および７７５９−１）をａ３２ＰｄＣＴＰ標識ＤＮＡ断片とハイブリダイズさせた（基本プロトコールＲ１．５を参照されたい）。以下の洗浄条件を用いて、ノーザンブロットを洗浄した：２×３０分間の２×ＳＳＣ／０．１％　ＳＤＳ（６５℃）および１×１５分間の１×ＳＳＣ／０．１％　ＳＤＳ（６５℃）。
【００６２】
細胞系におけるＣＯＡＳＴＥＲ発現のＲＴ−ＰＣＲ分析：
ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩキット（ＢＲＬ）を使用して、ＲＮＡｚｏｌ　Ｂ（Ｃｉｎｎａ／Ｂｉｏｔｅｃｘ）を使用して多数のヒト細胞系から単離した２μｇの全ＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡを作製した。一部のｃＤＮＡをＣＯＡＳＴＥＲの特異的ＰＣＲ増幅（プライマーはセンスＴＧＡＧＧＣＡＴＣＴＧＡＧＴＣＡＡＣＡおよびアンチセンスＣＧＡＧＣＣＡＧＡＧＴＴＡＡＡＧＣＡ）に使用した。２０、２５、３０および３５のＰＣＲサイクルの後、サンプルを採取した。該ＰＣＲサンプルを１．５％　アガロースゲル上で分析した。ゲルイメージをＩｍａｇｅｑｕａｎｔ５．０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｄｙｎａｍｉｃｓ）で定量した。
【００６３】
インビトロ翻訳：
ＴｎＴ共役網状赤血球ライセートシステム系（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＵＳＡ，ｃａｔ．＃Ｌ５０２０）を、該ライセートと共に提供された説明書に従い、［３５Ｓ］メチオニンの存在下、ｐＣＤＮＡ３．１ＨＩＳＣ．ＣＯＡＳＴＥＲ鋳型からのＣＯＡＳＴＥＲのインビトロ転写／翻訳に使用した。平行して、プラスミドｐＢＫ−ＳＲＣ−１（Ｏｎａｔｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０，１３５４−１３５７）にコードされるＳＲＣ−１の断片を対照として分析した。標識タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、オートラジオグラフィーにより可視化した。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＯＡＳＴＥＲのヌクレオチドおよびアミノ酸配列の具体例である。
【図２】ｐＣＤＮＡ３．１ＨＩＳＣ．ＣＯＡＳＴＥＲをインビトロで転写し、翻訳し、分析した結果。電気泳動パターンのオートラジオグラフを示す。
【図３】１０−８Ｍ　１７β−エストラジオール（陰影付き斜線の棒線）および１０−５Ｍ　ラロキシフェン（黒塗りの棒線）に応答した該形質転換酵母細胞のβ−ガラクトシダーゼ活性を示す。
【図４】ホルモンの不存在下（白抜きの棒線）または１０−７Ｍ　ラロキシフェン（陰影付き斜線の棒線）もしくは１０−７Ｍ　４ＯＨ−タモキシフェン（黒塗りの棒線）の存在下で該細胞をインキュベートした後のルシフェラーゼ活性（ｌ．ａ．）を示す。
【図５】漸増濃度のラロキシフェン（正方形で示されている）または４ＯＨ−タモキシフェン（三角形で示されている）と共に該細胞をインキュベートした後のルシフェラーゼ活性（ｌ．ａ．）を示す。
【図６】ＣＯＡＳＴＥＲ転写産物の組織分布。該ブロットのオートラジオグラフを示す。
【図７】腫瘍細胞内でのＣＯＡＳＴＥＲの発現。該ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動イメージのスキャニングにより測定されたＰＣＲ産物の相対強度を示す。
【図８】エストラジオール（Ｅ２）、ラロキシフェンまたは４−ヒドロキシ−タモキシフェン（４ＯＨＴ）の添加に応答した、ＥＲβ／αキメラ受容体およびＣＯＡＳＴＥＲでトランスフェクトした細胞において光計数／秒（ｃｐｓ）で定量したルシフェラーゼ発現。
【図９】種々の濃度（濃度の対数で表されている）のラロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）、ＩＣＩ１６４，３８４、Ｏｒｇ４３１４３、Ｏｒｇ３９６６０およびＯｒｇ３９６６９の存在下での標準量のエストラジオールの添加に応答したエストロゲン活性（％）。
【図１０】ＣＯＡＳＴＥＲ同時活性化アッセイにおける化合物の効果。
【図１１】ヒトおよびマカク・ファスシキュラタ（Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｔａ）組織におけるＣＯＡＳＴＥＲの発現。ＣＯＡＳＴＥＲの相対発現レベルをＲＴ−ＰＣＲにより測定した。この図は、Ｔａｑｍａｎリアルタイム定量ＰＣＲ法により測定されたＰＣＲ産物の相対強度を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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