(57)【要約】本発明は、ツツガムシ病診断用遺伝子組み換え抗原蛋白質に関するもので、オリエンティアツツガムシの抗原決定基から由来した２種以上の蛋白の遺伝子を連結したＤＮＡを含むベクトルで形質転換させた菌株を培養して得られる遺伝子組み換え蛋白質抗原を用いて、ツツガムシ病を診断する方法によれば、オリエンティアツツガムシ病源体を培養して診断用抗原として使用する間接免疫蛍光抗体法に相応する診断感応度及び特異性も有するので、これを利用する場合、ツツガムシ病診断の既存剤型が有している限界の病源体培養を必要としないだけでなく、単一遺伝子組み換え蛋白を使用する場合と比べて診断感応度が増加し、別途に生産された単一遺伝子組み換え蛋白を混合して使用することに比べて、生産費用を減少させることができる、優秀な診断用剤型を経済的に確保することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリエンティアツツガムシの抗原決定基から由来した２種以上の蛋白質が融合されたことを特徴とするツツガムシ病診断用融合蛋白質。
【請求項２】
上記２種以上の蛋白質は、オリエンティアツツガムシの５６ｋＤａ蛋白質から由来したものであることを特徴とする請求項１に記載のツツガムシ病診断用融合蛋白質。
【請求項３】
上記２種以上の蛋白質は、オリエンティアツツガムシの異種血清型菌株から由来したものであることを特徴とする請求項１または２に記載のツツガムシ病診断用融合蛋白質。
【請求項４】
上記２種以上の蛋白質は、オリエンティアツツガムシのギリアム、カーフ及びカトーから由来したものであることを特徴とする請求項３に記載のツツガムシ病診断用融合蛋白質。
【請求項５】
オリエンティアツツガムシの抗原決定基から由来した２種以上の蛋白質の遺伝子を有するＤＮＡ断片を含むことを特徴とするベクトルＤＮＡ。
【請求項６】
上記ベクトルは、オリエンティアツツガムシの５６ｋＤａ蛋白質から由来した遺伝子を有するＤＮＡ断片を含むことを特徴とする請求項５に記載のベクトルＤＮＡ。
【請求項７】
上記ベクトルは、オリエンティアツツガムシの異種血清型菌株から由来した２種以上の蛋白質の遺伝子を有するＤＮＡ断片を含むことを特徴とする請求項５または６に記載のベクトルＤＮＡ。
【請求項８】
上記ベクトルは、オリエンティアツツガムシのギリアム、カーフ及びカトーから由来した少なくとも２種以上の蛋白質の遺伝子を有するＤＮＡ断片を含むことを特徴とする請求項７に記載のベクトルＤＮＡ。
【請求項９】
請求項８に記載のベクトルであって、上記ベクトルはｐＴＧＰ１であることを特徴とするベクトル。
【請求項１０】
請求項８に記載のベクトルであって、上記ベクトルはｐＴＧＰＴ２であることを特徴とするベクトル。
【請求項１１】
請求項８に記載のベクトルであって、上記ベクトルは寄託番号１００６５ＢＰとして寄託されたｐＥＴｂ７であることを特徴とするベクトル。
【請求項１２】
請求項５乃至８のいずれかに記載のベクトルで形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１乃至４のいずれかに記載のツツガムシ病診断用融合蛋白質を製造する方法であって、請求項５乃至８のいずれかに記載のベクトルで形質転換された細胞を培養する段階を含むことを特徴とするツツガムシ病診断用融合蛋白質の製造方法。
【請求項１４】
上記形質転換された細胞は、大腸菌、酵母、真核細胞、動物組織細胞及び植物組織細胞で構成された群のうち選択された少なくとも一つ以上の細胞であることを特徴とする請求項１２に記載のツツガムシ病診断用融合蛋白質の製造方法。
【請求項１５】
請求項１乃至４のいずれかに記載の融合蛋白質を使用することを特徴とするツツガムシ病の診断方法。
【請求項１６】
請求項１乃至４のいずれかに記載の融合蛋白質を含むことを特徴とするツツガムシ病診断用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ツツガムシ病診断用遺伝子組み換え融合蛋白質抗原に関するもので、より詳しくは、オリエンティアツツガムシ（Ｏｒｉｅｎｔｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ）の抗原決定基を構成する二つ以上の蛋白の遺伝子を連結し、タンデムキメラ（Ｔａｎｄｅｍ ｃｈｉｍｅｒａ）形態で融合させた遺伝子組み換え蛋白質抗原を用いて、ツツガムシ病を血清学的に診断する方法に関するものである。
【０００２】
（背景技術）
【非特許文献１】Ｓｈｉｒａｉ， Ａ．， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｄ． Ｍ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｇ． Ｗ． 外２名： Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ｒｅａｒｅｄ ｃｈｉｇｇｅｒｓ． Ａｍ． Ｊ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ．， ３１（２）： ３９５−４０２， １９８２
【非特許文献２】Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ．， Ｕｒａｋａｍｉ， Ｈ． 及びＡ． Ｔａｍｕｒａ．： Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅｓ ｏｆ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９： ４７５， １９８５
【非特許文献３】Ｔａｍｕｒａ， Ａ．， Ｕｒａｋａｍｉ， Ｈ．， 及びＴｓｕｒｈａｒａ， Ｔ： Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ ｂｙ ｐｅｒｃｏｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２６：３２１， １９８２
【非特許文献４】Ｗｅｉｓｓ， Ｅ．： Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． ３６： ３４５， １９８２
【０００３】
ツツガムシ病は、リケッチア属のスクラップチフス（Ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）群に属するオリエンティアツツガムシに因るもので、媒介体の毛ダニの幼虫が人の組織液を吸入する際、口腔部位に存在した菌体が人に直接感染されて発病するようになる。その症状には、潜伏期以後の突然の発熱、激しい頭痛、刺し口、発赤及び点状出血などがある。
【０００４】
ツツガムシ病を媒介する毛ダニは、レプトトロンビディウム（Ｌｅｐｔｏｔｒｏｍｂｉｄｉｕｍ）属に属する節足動物の一種で、自然系で自由生活をする。このような毛ダニの幼虫が変態をする時は、脊椎動物の組織液を必要とし、動物の体に一時寄生をするようになるが、人はこの時期の幼虫によって感染される。韓国で採集されるトロンビキュリド（ｔｒｏｍｂｉｃｕｌｉｄ）ダニ類は、約２０種で（Ｔｒａｕｂ， Ｒ．， Ｍ． Ｌ． Ｍｏｒｒｏｗ及びＬ． Ｊ． Ｌｉｐｏｖｓｋｙ： Ｎｅｗ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｃｈｉｇｇｅｒｓ ｆｒｏｍ Ｋｏｒｅａ． Ｐｒｏｃ． Ｅｎｔ． Ｓｏｃ． Ｗａｓｈ． ６０： １４５−６６， １９５８）、このうち、オリエンティアツツガムシを媒介するものとしては、レプトトロンビディウムパーリドゥーム（Ｌｅｐｔｏｔｒｏｍｂｉｄｉｕｍ ｐａｌｌｉｄｕｍ）とレプトトロンビディウムスクテラン（Ｌｅｐｔｏｔｒｏｍｂｉｄｉｕｍ ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｓ）などがある。
【０００５】
オリエンティアツツガムシは、リケッチア属に属する細胞内絶対寄生細菌であって、大きさが０．３〜０．７μｍ程度の短い桿菌または桿球菌の形態をしている。リケッチア属は、チフス（ｔｙｐｈｕｓ）群、発疹熱（ｓｐｏｔｔｅｄ ｆｅｖｅｒ）群、スクラップチフス（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）群に分類され、ここに塹壕熱（ｔｒｅｎｃｈ ｆｅｖｅｒ）を誘発する塹壕熱ロカリメア（Ｒｏｃｈａｌｉｍｅａ ｑｕｉｎｔａｎａ）と、Ｑ熱（Ｑ ｆｅｖｅｒ）を誘発するコクシエラバーネッティ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ）とが追加される。このような分類は、宿主動物、菌を伝播する媒介虫の種類、ワイル−フェリックス（Ｗｅｉｌ−Ｆｅｌｉｘ）検査及び補体結合反応の反応傾向によるもので、最近、抗原分析と分子生物学的な方法によって、これらの分類が確認されている。
【０００６】
リケッチア属に属する菌は、全部ダニやシラミ、ノミなどの昆虫を媒介にして人に疾病を誘発するが、病気の症状や力学的な様相は、各群によって相違する。同じ群の菌相互間には、血清学的に関連があるが、他群の菌とは血清学的交差反応がない。スクラップチフス（ｓｃｒｕｂ ｔｙｐｈｕｓ）群に属するオリエンティアツツガムシは、一つの種に分類されているが、抗原構造が異なる血清型が多く、このような抗原の差異によって、ギリアム（Ｇｉｌｌｉａｍ）、カーフ（Ｋａｒｐ）、カトー（Ｋａｔｏ）などの血清型に分類される（Ｔｒａｕｂ， Ｒ． 及びＣ． Ｌ． Ｗｉｓｓｅｒｍａ， Ｊｒ．， １９７４）。これら３種類の原型菌株の他、アジア地域では、ＴＡ６７８、ＴＡ６８６、ＴＡ７１６、ＴＡ７６３、ＴＨ１８１７などの新しい血清型が分離され（Ｓｈｉｒａｉ， Ａ．， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ， Ｄ． Ｍ．， Ｂｒｏｗｎ， Ｇ． Ｗ． 外２名： Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ−ｒｅａｒｅｄ ｃｈｉｇｇｅｒｓ． Ａｍ． Ｊ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ．， ３１（２）： ３９５−４０２， １９８２）、韓国では、ギリアム、カーフ及びカトーの他、既存に知られた原型菌株と血清学的反応様相が異なるボリョン（ｂｏｒｙｏｎｇ）株が分離されたことがある（Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｋａｎｇ， １９８７）。この報告によれば、地域的に北側に位置した京畿道で分離されるオリエンティアツツガムシの血清型と、忠清道の南側で分離されるオリエンティアツツガムシの血清型とは、血清的に異なり、忠清道地方で分離された血清型の菌株は、原型菌株と相違する血清学的特性を有するという。
【０００７】
このような血清型の多様性を決定するオリエンティアツツガムシの細胞膜蛋白抗原には、種特異抗原と血清型特異抗原などが存在する。オリエンティアツツガムシを精製し、抗原をポリアクリルアミドゲル電気泳動とイムノブロッティング（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔｔｉｎｇ）により分析した結果、７０、６０、５４〜５６、４６〜４７ｋＤａの主要抗原が存在することが明らかになったが（Ｔａｋａｈａｓｈｉ， Ｋ．， Ｕｒａｋａｍｉ， Ｈ． 及びＡ． Ｔａｍｕｒａ．： Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｅｎｖｅｌｏｐｅｓ ｏｆ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２９： ４７５， １９８５）、このうち、４６〜４７ｋＤａ、５４〜５６ｋＤａ及び７０ｋＤａの蛋白質が抗原性を有し、７０ｋＤａと４６〜４７ｋＤａ蛋白質は、菌株特異抗原である（Ｔａｍｕｒａ， Ａ．， Ｕｒａｋａｍｉ， Ｈ．， 及びＴｓｕｒｈａｒａ， Ｔ： Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｓｈｉ ｂｙ ｐｅｒｃｏｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２６：３２１， １９８２）。
【０００８】
一方、オリエンティアツツガムシをトリプシンで処理すれば、マウスＬ細胞に浸透する能力が消失されるが、これはオリエンティアツツガムシの膜蛋白質（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）と病原性との間に密接な関係があることを示唆することで（Ｗｅｉｓｓ， Ｅ．： Ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｅ． Ａｎｎ． Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． ３６： ３４５， １９８２）、菌株血清型によって差異を示すオリエンティアツツガムシの病原性は、細胞表面に存在するこのような特異的細胞膜蛋白の構造上の差異に起因すると推測される（Ｔａｍｕｒａなど， １９８２）。
【０００９】
オリエンティアツツガムシの病原性は、血管内皮細胞への浸透による全身微細血管炎に起因する。血中に浸透したオリエンティアツツガムシは、能動食菌作用によって血管細胞内に食菌されるが、ファゴソームから細胞質内に遊離したオリエンティアツツガムシは、二分裂で増殖するようになる（Ｔａｍｕｒａなど， １９８２）。このようなオリエンティアツツガムシの増殖によって、血管内皮細胞は破壊されるかまたは増殖が触発され、微細血栓と血管周囲炎症を誘発するようになる。
【００１０】
オリエンティアツツガムシに対する防御免疫機転は、まだ完全に明らかになっていないが、体液性免疫機転と細胞性免疫機転とが、両方とも関与すると考えられる。オリエンティアツツガムシに感染されたヌードマウス（ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ）では、抗原に対する抗体は形成されたが、再感染に対する免疫的防御効果は誘導されなかった。また、免疫されたマウスから分離したＴリンパ球の伝達によって、オリエンティアツツガムシの再感染に対する抵抗性を提供できるという報告と共に（Ｓｈｉｒａｉなど， １９８２）、細胞性免疫機転が作用するとの証拠として、患者の臨床相とＴリンパ球の数との連関性を挙げることができる。一方、免疫抗体がオリエンティアツツガムシの食細胞感染を５０％抑制したという報告は、体液性免疫反応の関連性を示唆している。
【００１１】
人におけるツツガムシ病に対する免疫は、１つの血清型に特異である。すなわち、病気にかかった後生じる防御免疫能力は、同じ血清型に対しては数年間持続されるが、他の血清型に対しては数ケ月しか持続されない。例えば、４ヶ月間観察した患者のうち、最初にギリアム血清型に感染され、２ヶ月後カーフ血清型に再感染された例が、血清学的検査によって証明されたことがある。
【００１２】
ツツガムシ病の臨床症状としては、全身リンパ線腫脹、加被形成及び発疹などがある。一般に、ツツガムシ病は、臨床症状が軽くて、症状による臨床診断が容易な疾患と認識されているが、報告によれば、非典型的な臨床症状を示す例が多くて、全身リンパ線腫脹や加被形成などツツガムシ病の特徴的な症状がない場合には、レプトスピラ症、腸チフス及び腎症候群出血熱などとの鑑別診断が難しい。
【００１３】
現在、ツツガムシ病の診断は、患者の血液からオリエンティアツツガムシを分離して確認する方法、患者の血清内でオリエンティアツツガムシに対する抗体を検出する方法、及びＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いて患者の血液内でオリエンティアツツガムシのＤＮＡを増幅して検査する方法がある。このうち、菌体を培養して疾病を診断する方法は、培養に４週以上の時間が必要なので、実際患者の診断目的としては適切でなく、ＰＣＲを利用する方法は、未だに開発段階にある。従って、現在、ツツガムシ病の診断には、ワイル−フェリックス法、補体結合反応法、間接免疫蛍光抗体法、免疫酵素測定法、及び免疫付着赤血球凝集法などの血清学的方法が使用されている。
【００１４】
しかし、これら血清学的方法のうち、ワイル−フェリックス法は、ツツガムシ病だけでなく、レプトスピラ病、変形菌の尿道感染及びその他発熱疾患においても、偽陽性反応が高く現れ、感受性が非常に低いため、現在、ツツガムシ病の診断自体には使用されていない。
【００１５】
また、補体結合反応は、技術的な面において検査方法が非常にややこしいという短所があり、再現性が低いだけでなく、精製されたオリエンティアツツガムシ抗原を必要とし、これによって抗体力価が低い場合には、偽陰性反応の可能性があって、ツツガムシ病診断に広く使用されていない。
【００１６】
従って、現在は、間接免疫蛍光抗体法及び免疫酵素測定法が最も広く使用されているが、この２つの方法は、感受性及び特異性が高く、ＩｇＧとＩｇＭとを鑑別して測定できるので、初期感染と再感染とを区別できるという長所があり、現在、ＷＨＯでも優先的に勧められている方法である。
【００１７】
一方、間接免疫蛍光抗体法の検査は、必要な抗原を得るために組織培養やタマゴ孵化などのできる施設が要求され、蛍光顕微鏡を備えた検査室でのみ検査できるという短所を有し、血清を１：１０または１：２０程度低く希釈する場合、偽陽性反応が現れるという短所がある。
【００１８】
これによって、オリエンティアツツガムシの主抗原の遺伝子を遺伝工学的方法により、大腸菌内で多量発現させて生産した組み換え抗原を使用し、ツツガムシ病を診断しようとする試みが進んでいる。
【００１９】
（発明の開示）
本発明では、従来のツツガムシ病診断における難しさに鑑みてなされたもので、菌培養を必要としないだけでなく、単一遺伝子組み換え抗原を使用することより診断的感応度が増加し、別途に生産された単一遺伝子組み換え蛋白を混合して使用することに比べて、生産費用を減少させることができる、ツツガムシ病診断に利用し得る遺伝子組み換え融合蛋白質及びこれを製造する方法を提供することを目的とする。
【００２０】
上記目的を達成するために、本発明は、ツツガムシ病を診断するための抗原として、オリエンティアツツガムシの抗原決定基から由来した２種以上の蛋白がタンデムキメラ（ｔａｎｄｅｍ−ｃｈｉｍｅｒａ）形態で融合された融合蛋白質を利用することを特徴とする。
【００２１】
ここで、上記ツツガムシ病の診断のための抗原は、オリエンティアツツガムシの５６ｋＤａ蛋白から由来した蛋白断片が融合されたものが好ましく、ギリアム、カーフ及びカトーのようなオリエンティアツツガムシの多様な異種血清型菌株から選択された２種以上から由来した蛋白の融合蛋白がより好ましい。
【００２２】
上記目的を達成するために、本発明では、ツツガムシ病を診断するための上記融合蛋白を製造する方法として、下記段階を含む方法を提供する。
１）オリエンティアツツガムシの抗原決定基から由来した２種以上の蛋白の遺伝子を有するＤＮＡ断片を含むことを特徴とする発現ベクトルであって、ツツガムシ病を診断するための上記融合蛋白の発現ベクトルを構築する段階、
２）上記発現ベクトルを宿主細胞に導入する段階、
３）上記導入された形質転換体を培養する段階、
４）上記形質転換体の培養培地及び／または上記形質転換体から上記融合蛋白を獲得する段階。
【００２３】
本発明では、オリエンティアツツガムシの５６ｋＤａ蛋白が、抗原性を有して診断的価値があるという既知の事実に基づき、オリエンティアツツガムシの５６ｋＤａ蛋白を用いて、ツツガムシ病の診断を行うことを特徴とする。
【００２４】
ツツガムシ病の診断のために、オリエンティアツツガムシの５６ｋＤａ蛋白から由来した蛋白を含む融合蛋白は、下記段階を経て製造及び精製される。
ａ）オリエンティアツツガムシの標準血清型であるギリアム、カーフ及びカトー株の５６ｋＤａ蛋白から由来する蛋白をコーディングする遺伝子断片を重合酵素連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ： ＰＣＲ）により増幅する段階、
ｂ）これら増幅されたＤＮＡ断片を直列連結した後、蛋白発現用ベクトルにクローニングする段階、
ｃ）上記発現ベクトルを大腸菌に導入する段階、
ｄ）形質転換された大腸菌を培養する段階、
ｅ）組み換え融合蛋白をツツガムシ病を診断するための抗原として精製する段階。
【００２５】
すなわち、上記方法は、上記５６ｋＤａ蛋白から由来した蛋白の遺伝子断片をクローニングした後、オリエンティアツツガムシの５６ｋＤａ蛋白から由来した蛋白を大量に生産することと要約される。上記方法によって得られた組み換え融合蛋白が、ツツガムシ病患者の血清に対して強い反応性を表すため、このように生産された遺伝子組み換え抗原蛋白を利用すれば、特別な検査機構や装備を必要としない受動血球凝集反応（ＰＨＡ）キットのような診断キットを開発でき、大規模な検査物処理に要求される力価測定のための免疫酵素測定法（ＥＬＩＳＡ）にも有用に利用される。
【００２６】
以下、本発明によるツツガムシ病診断用組み換え融合抗原蛋白質の製造方法及びツツガムシ病の診断方法を詳細に説明する。
【００２７】
まず、オリエンティアツツガムシのギリアム、カーフ及びカトー株をマウスＬ−９２９細胞で培養した後、精製する。その後、それぞれの精製された菌株を酵素分解させた後、フェノール抽出とエタノール沈殿によりＤＮＡを精製する。
【００２８】
オリエンティアツツガムシ由来の５６ｋＤａ蛋白遺伝子の配列を基にして、ボリョン（Ｂｏｒｙｏｎｇ）、ギリアム、カーフ及びカトー株の血清型間アミノ酸配列が３０％以上の相同性を表す領域を選択し、ボリョン、ギリアム、カーフ及びカトー株の領域を増幅するためのオリゴヌクレオシドプライマーを製作する。これらボリョン、ギリアム、カーフ及びカトー株由来の遺伝子断片を上記ＰＣＲプライマー対及び精製されたＤＮＡ鋳型を用いてＰＣＲ増幅させる。
【００２９】
ＰＣＲ産物を精製した後、ｐＴＹＢ１２ベクトルの多重クローニング部位（ＭＣＳ）に連結させる。まず、ｐＴＹＢ１２ベクトルにギリアムのＤＮＡ断片を導入してベクトルｐＴＧ３を構築し、ｐＴＧ３にカーフのＤＮＡ断片を導入してベクトルｐＴＧＰ１を構築した後、ｐＴＧＰ１にカトーのＤＮＡ断片を導入してベクトルｐＴＧＰＴ２を製作する。また、ギリアム、カーフ及びカトーの遺伝子断片が直列連結したＤＮＡ断片を得た後、ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクトルに導入してベクトルｐＥＴｂ７を構築する。
【００３０】
上記製作された発現ベクトルで大腸菌を形質転換した後、融合蛋白質の発現のために、形質転換された大腸菌を培養する。融合蛋白質の発現を電気泳動及びウェスタンブロット法で確認した後、対応するクローンから融合蛋白抗原を分離精製する。分離精製された抗原を免疫学的定量及び定性分析に使用する。
【００３１】
ここで、「免疫学的定量及び定性分析」とは、上記分離精製された蛋白を使用し、オリエンティアツツガムシに感染した既往歴（ａｎａｍｎｅｓｉｓ）があるか否かを調べるために、人や動物の血清からオリエンティアツツガムシに対する抗体を定性及び定量分析する技術をいう。例えば、免疫学的定性及び定量分析は、ＥＬＩＳＡ及び受動血球凝集法のような抗原−抗体相互作用を利用した定量方法及び定性方法を含む。
【００３２】
本発明による組み換え融合蛋白質を用いてツツガムシ病患者と正常人を診断した結果、９３．６％の診断感応度（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）と９４．２％の診断特異性（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を得ることができた。
【００３３】
（発明を実施するための最良の形態）
より詳しくは、本発明を好ましい具体例及び実施例により説明する。ただし、本発明がこれらの例のみに限定されるものではない。
【００３４】
また、本発明は、オリエンティアツツガムシの他の血清型から由来した５６ｋＤａ蛋白の遺伝子断片を用いて製造された組み換え融合蛋白抗原と関連した実施例を説明するが、本発明の範囲は、全世界に自然的に存在する約３０余種以上のオリエンティアツツガムシの血清型から由来する２２、４７、５６、５８、６０、１１０、１１５及び１３０ｋＤａ蛋白と、オリエンティアツツガムシから由来する他の血清型の抗原決定基から由来した蛋白とから、選択された２種以上の蛋白がタンデムキメラ形態に融合された抗原を含む。
【００３５】
また、本実施例では、本発明による上記組み換え融合蛋白抗原を発現させるための宿主として、大腸菌を利用したが、酵母、その他真核細胞、動物または植物組織細胞、及びＤＮＡ組み換え哺乳類から分離された細胞を使用することも本発明の範囲に含まれる。
【００３６】
実施例１：菌株、プラスミド及び培地
オリエンティアツツガムシの実験的血清型としては、ツツガムシ病患者から分離し、ソウル大学校医科大学微生物学教室で保管中のオリエンティアツツガムシのボリョン株と、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９）から得られたギリアム、カーフ及びカトー株を使用した。
【００３７】
プラスミドｐＣＹＢ１、ｐＣＹＢ２、ｐＣＹＢ３、ｐＣＹＢ４、ｐＴＹＢ１２（ＮＥＢ＃６９０２）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）とｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を下記実験に利用し、プラスミドの増幅及び蛋白質の発現のための宿主としては、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＥＲ２５６６株を使用した。
【００３８】
オリエンティアツツガムシ由来の遺伝子断片が導入されたベクトルで大腸菌を形質転換した後、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ Ａ９５１８）が１００μｇ／ｍｌの濃度に含有されたＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）液体培地（ｂｒｏｔｈ）またはＬＢ寒天プレート培地で３７℃で培養した。
【００３９】
実施例２：オリエンティアツツガムシの培養及び精製
１５０ｃｍ３細胞培養容器（Ｆａｌｃｏｎ ３２０２５）において、約５×１０７個のマウスＬ−９２９細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９）を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ； Ｇｉｂｃｏ Ｌａｂ． Ｇｒａｎｄ ｉｓｌａｎｄ Ｎ． Ｙ．）が含まれたＥＭＥＭ−１０ ｍｅｄｉｕｍ（Ｅａｒｌｅｓ’ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ， Ｇｉｂｃｏ ４１０−１５００ ＥＧ）を使用し、５％のＣＯ２存在下で３７℃で培養した。細胞が増殖して培養容器の基底面を完全に覆った時、次の感染実験に使用した。
【００４０】
培地の９５％を除去した後、オリエンティアツツガムシのギリアム、カーフ、カトー及びボリョン株の浮遊液を、それぞれ上記培養培地に入れて、３７℃の二酸化炭素培養器で９０分間静置して培養した。ダウノマイシン（Ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）０．４μｇ／ｍｌと５％ウシ胎児血清が含有されたＥＭＥＭ−５Ｄを添加した後、５％のＣＯ２存在下で３４℃で培養した。８０％以上の細胞が感染された時、細胞を収穫した。
【００４１】
ゲノムＤＮＡ精製のためのオリエンティアツツガムシは、次の方法によって用意した。オリエンティアツツガムシに感染されたマウスＬ−９２９細胞を２０枚の１５０ｃｍ２細胞培養容器で培養した後、感染された細胞を４℃で８，０００×ｇで１５分間遠心分離（Ｓｏｒｖａｌ）し、沈殿させた後、上清を除去した。その次、ペレットを６．５ｍｌのＴＳ緩衝液（３３ｍＭ トリス−ＨＣＬ ７．４， ０．２５Ｍ スクロース）により浮遊させた。浮遊液に含まれた細胞をホモジナイザー（Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｈｊｅｍ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）で３分間破砕した後、４００×ｇで１０分間遠心分離して細胞を沈めた。上清に最終濃度が４０％になるように濾過液（ｐｅｒｃｏｌ）を添加した後、６０分間平均密度遠心分離（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｄｅｎｓｉｔｙ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）を行い、オリエンティアツツガムシを分離した。
【００４２】
実施例３：オリエンティアツツガムシＤＮＡの精製
精製されたオリエンティアツツガムシを、１％のＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ）及び１００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫが含まれた緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣＬ ｐＨ８．０， １０ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０， １５０ｍＭ ＮａＣｌ）に入れて、その混合物を５０℃で２時間反応させて上記菌株を融解させた。その後、同量のフェノールを添加して徐々に混合した後、１２，０００×ｇで５分間遠心分離して上清を回収し（以下、フェノール抽出と略称する）、同じ方法でフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）混合液を用いて、さらに２回蛋白質を抽出して除去した。最終濃度が０．３ｍＭになるように３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．４）をＤＮＡ−溶解相（ＤＮＡ−ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ ｐｈａｓｅ）に添加した後、ＤＮＡ溶液の２倍体積の１００％エタノールと混合し、−２０℃で１８時間放置した。４℃で１２，０００×ｇで１５分間遠心分離し、ＤＮＡを沈殿させた。ペレットに１００％エタノールと同じ体積に７０％エタノールを添加し、４℃で１２，０００×ｇで５分間遠心分離してＤＮＡを洗浄した。真空乾燥器（ｓｐｅｅｄ ｖａｃｕｕｍ ｄｒｙｅｒ； Ｓａｖａｎｔ ＳＶＣ１００−Ｈ）でＤＮＡを１０分間乾燥させた後、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０， １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）５０μｌに浮遊させた（以下、エタノール沈殿と略称する）。
【００４３】
実施例４：マウス抗−オリエンティアツツガムシ血清の製作
クローンの検索とウェスタンブロット分析に使用するために、オリエンティアツツガムシのボリョン株に対するＣ３Ｈ／ＨｅＤｕｂマウスの抗血清を次のように製作した。
【００４４】
まず、上記マウスＬ−９２９細胞から分離し、マウスＣ３Ｈ／ＨｅＤｕｂで測定したオリエンティアツツガムシボリョン株の１０００×ＭＬＤ５０を、１次免疫として実験マウスに皮下注射した。その後、最初注射した日から２週間おきに総３回注射した。最終注射した２週後、マウスを犠牲させて血清を収穫した。間接免疫蛍光抗体法（ＩＦＡ）によりボリョン株に対する抗体力価を測定し、力価が１：１２８０以上である血清を収集して使用した。
【００４５】
上記収穫した血清から大腸菌に対する抗体は、次の方法により吸着除去した。ｐＴＹＢ１２ベクトルで形質転換された大腸菌を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンが含有されたＬＢ液体培地１リットルで１８時間振盪培養した後、この培養液をツイン−２０が０．０５％含まれたＴＢＳＴ（ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ， ３００ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ７．４）で３回洗浄し、２０ｍｌＴＢＳＴで浮游させた。浮游液を１００℃で加熱した後、浮游液の菌株を超音波粉砕器（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ、Ｑｕｉｇｌｅｙ−Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ Ｉｎｃ．）で最大出力値で３分間処理し、菌体を破砕させた。同じ体積の抗血清と混合して室温で４時間徐々に振りながら吸着させた後、２０分間２，０００×ｇで遠心分離し、細胞残渣を除去して上清を獲得した。
【００４６】
この抗血清を利用したウェスタンブロット分析や免疫学的検索では、非特異反応性の有意な（ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ）減少を確認した。
【００４７】
実施例５：オリエンティアツツガムシから由来した５６ｋＤａ蛋白質の大腸菌内発現、分離及び精製
（１）重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を利用した５６ｋＤａ蛋白質遺伝子の増幅
オリエンティアツツガムシ５６ｋＤａ蛋白質遺伝子配列（Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ： Ｌ０４９５６）を基にして、オリエンティアツツガムシの血清型であるボリョン株、ギリアム、カーフ、カトー株間で測定された高順位保存相同性を示す部位を選択した後、ギリアム、カーフ、カトー株において、それぞれ一対ずつのオリゴヌクレオシドプライマーを製作した。すなわち、ギリアムでは、１２７〜１０９２塩基で構成される配列を有するＤＮＡ断片を増幅するために、１２７−１４０ヌクレオシドで構成されるＤＮＡ配列に相補的な前位プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ）、及び１０６９−１０９２ヌクレオシドで構成されるＤＮＡ配列に相補的な逆位プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ）を製作した。同様に、カーフでは、１１８〜１０１３塩基で構成される配列を有するＤＮＡ断片を増幅するための、カトーでは、１２１〜９５７塩基で構成される配列を有するＤＮＡ断片を増幅するためのそれぞれの前位及び逆位プライマー対を注文製作した（Ｏｌｉｇｏ． Ｅｔｃ． Ｃｏ． Ｗｉｌｓｏｎｖｉｌｌｅ， ＯＲ．）．
【００４８】
ギリアム前位プライマー：５’ ＧＧＡ ＣＡ’Ｔ ＡＴＧ ＡＴＴ ＡＣＴ ＧＧＴ ＧＣＡ ＧＡＡ ３’（配列１）
ギリアム逆位プライマー：５’ ＡＴＣ Ｇ’ＴＣ ＧＡＣ ＡＴＴ ＴＡＡ ＡＡＧ ＣＣＴ ＡＡＣ ３’（配列２）
カーフ前位プライマー：５’ ＧＴＴ Ｇ’ＴＣ ＧＡＣ ＧＧＡ ＡＴＧ ＡＴＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ３’（配列３）
カーフ逆位プライマー：５’ ＧＧＣ ＡＴＧ ＡＣＡ ＡＡＡ ＴＴＧ’ ＡＡＴ ＴＣＴ ＡＴＣ ３’（配列４）
カトー前位プライマー：５’ ＧＴＣ ＧＴＴ ＧＧＡ Ｇ’ＡＡ ＴＴＣ ＡＴＴ ＡＣＴ ＧＧＣ ３’（配列５）
カトー逆位プライマー：５’ ＴＴＧ ＣＴＧ ＣＣＣ ＧＧＧ’ ＣＣＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ３’（配列６）
【００４９】
ここで、ＣＡ’ＴＡＴＧは制限酵素Ｎｄｅ Ｉの制限位置、Ｇ’ＴＣＧＡＣはＳａ１ Ｉの制限位置、Ｇ’ＡＡＴＴＣはＥｃｏＲＩの制限位置、そしてＧＧＧ’ＣＣＣはＳｍａ Ｉの制限位置を示す。
【００５０】
オリエンティアツツガムシに感染されないＬ９２９細胞から分離したＤＮＡのＰＣＲのために、プライマー対を利用した時、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡバンドが発見されなかった。このような結果は、本発明によるプライマーが、オリエンティアツツガムシに対して特異的であることを意味する。一方、Ｌ９２９細胞からのＤＮＡ精製は、オリエンティアツツガムシからのＤＮＡ精製と同じ方法で実施した。
【００５１】
上記プライマーとオリエンティアツツガムシのＤＮＡを鋳型として用い、次の方法によりＰＣＲ反応を実施して、ギリアム、カーフ及びカトーのＤＮＡ断片を増幅させた。すなわち、オリエンティアツツガムシＤＮＡ１００ｎｇをＰＣＲ反応混合液（プライマー各々４００ｎＭ， ５０ｍＭ ＫＣｌ， １０ｍＭ トリス ｐＨ９．０， ０．１％トリトンＸ−１００， ｄＮＴＰ各々０．２ｍＭ， ＭｇＣｌ２ １ｍＭ）に、最終５０μｌになるように混合した後、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃａｔ＃ Ｍ１８６１， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）２．５Ｕを添加した。ＰＣＲは、熱循環システム（Ｔｈｅｒｍａｌ ｃｙｃｌｅｒ ｓｙｓｔｅｍ ９６００， Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ）を使用し、９４℃で３分間予備変性（ｐｒｅｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）を１回実施した後、９４℃で１５秒間変性、６０℃で１分間アニーリング／伸張（ａｎｎｅａｌｉｎｇ／ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）を３５回繰り返し、最終伸張を７２℃で２分間進んだ。
【００５２】
増幅されたそれぞれのＰＣＲ産物は、エチジウムブロミド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ）が含有されたアガロースゲルに電気泳動した後、紫外線を照射して観察した。
【００５３】
（２）ＰＣＲ産物の精製及び発現ベクトルへのクローニング
それぞれのＰＣＲ産物をＱＩＡＥＸゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｃａｔｓｗｏｒｔｈ ＣＡ．）を用いて、アガロースゲルから分離精製した後、ＴＥ緩衝液２０μｌで再懸濁した。精製されたＰＣＲ産物４００ｎｇをクレーナウ（Ｋｌｅｎｏｗ）緩衝液（２０Ｍｍ トリス−ＨＣｌ， １００ｍＭ ＭｇＣｌ２， ｐＨ８．０）に混合した後、クレーナウ断片（Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ， Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍ２２０， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）２．５Ｕを添加した。３７℃で３分間反応させた後、さらにｄＮＴＰ混合物（各々０．１２５ｍＭ）を添加して３７℃で１時間反応させた。上記フェノール抽出及びエタノール沈殿を行った後、１０μｌのＴＥ浮遊液が得られた。
【００５４】
ｐＴＹＢ１２ベクトルを精製した後、該当制限酵素をベクトルに処理した後、上記得られたそれぞれのＰＣＲ産物をベクトルにクローニングした。まず、ｐＴＹＢ１２ベクトルとギリアムのＰＣＲ産物を制限酵素Ｎｄｅ ＩとＳａｃ Ｉにより完全に切断した後、ＣＩＡＰ（Ｃａｌｆ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で脱リン酸化し、フェノール抽出及びエタノール沈殿して１０μｌのＴＥ浮遊液が得られた。切断されたベクトル１００ｎｇと切断されたＰＣＲ産物１００ｎｇを混合し、最終濃度が３．５μｌになるようにして、その混合物を４５℃で１５分間処理した後、氷に放置した。ここに、１０×リガーゼ緩衝液（２５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７．８， １００ｍＭ ＭｇＣｌ２， ２０ｍＭ ＤＴＴ， ４ｍＭ ＡＴＰ）０．５μｌとリガーゼ２Ｕを混合し、４℃で１８時間反応させた。ベクトルＤＮＡの増幅のために、大腸菌ＥＲ２５６６を上記ライゲーションされたベクトル大腸菌で形質転換させた。このようにして構築されたベクトルをｐＴＧ３と称した。
【００５５】
同様に、ベクトルｐＴＧ３とカーフ由来のＰＣＲ産物を制限酵素Ｓａ１ ＩとＥｃｏＲ Ｉで切断し、導入した後、ライゲーションして大腸菌ＥＲ２５６６にクローニングして増幅させた。このようにして構築されたベクトルをｐＴＧＰ１と称した。
【００５６】
同様に、ｐＴＧＰ１とカトー由来のＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＲ ＩとＳｍａ Ｉで切断し、導入した後、ライゲーションして大腸菌ＥＲ２５６６にクローニングして増幅させた。このようにして構築された断片が導入されたものをｐＴＧＰＴ２と称した。
【００５７】
ギリアムから由来したＤＮＡ断片のベクトルｐＴＧＰＴ２における大きさは９５２ｂｐｓ、カーフ由来のＤＮＡ断片は８７３ｂｐｓ、カトー由来のＤＮＡ断片は９１５ｂｐｓで、全体導入されたＤＮＡ断片は２，６４０ｂｐｓ、蛋白質大きさは約９７ｋＤａになる。
【００５８】
次に、構築されたｐＴＧＰＴ２ベクトルを制限酵素Ｎｄｅ ＩとＳｍａ Ｉで
切断し、ギリアム、カーフ及びカトーのＤＮＡ断片が直列に連結したＤＮＡ断片を得た。ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクトルをＸｈｏ Ｉで切断し、フェノール抽出及びエタノール沈殿処理した後、クレーナウ断片を入れてｄＴＴＰ及びｄＣＴＰを加え、３７℃で３０分間反応させた。これをさらにフェノール抽出及びエタノール沈殿処理して得られたＴＥ浮遊液をＳＩヌクレアーゼで処理し、２３℃で１５分間反応させた後、もう一度フェノール抽出及びエタノール沈殿処理した。ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクトルを平滑末端（ｂｒｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ）で処理した後、このベクトルをＮｄｅ Ｉにより切断してフェノール抽出及びエタノール沈殿処理した。その後、ギリアム、カーフ及びカトーから由来した遺伝子断片を有するＤＮＡ断片を、Ｘｈｏ Ｉ−Ｎｄｅ Ｉ処理したベクトルにライゲーション方法によって挿入した。上記得られたベクトルを大腸菌ＥＲ２５６６を使用して増幅させた。ギリアム、カーフ及びカトーから由来した遺伝子断片を有するＤＮＡ断片が含まれたｐＥＴ２２ｂ（＋）をｐＥＴｂ７と称した。
【００５９】
それぞれの構築されたベクトルで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換させた後、免疫学的検索により陽性クローンが得られた。
【００６０】
上記構築されたベクトルｐＥＴｂ７を特許手続のための微生物寄託の国際協力に係るブダペスト条約によって、大田に所在している韓国遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に２０００年８月２５日付で寄託番号ＫＣＴＣ １８０４２Ｐとして寄託した。
【００６１】
図１は、オリエンティアツツガムシの３つの血清型ギリアム、カーフ及びカトーから由来した５６ｋＤａ蛋白遺伝子断片を直列結合させた例を示す模式図で、（Ａ）はベクトルｐＴＧＰＴ２、（Ｂ）はベクトルｐＥＴｂ７の場合を示す。
【００６２】
図２は、オリエンティアツツガムシから由来した５６ｋＤａ蛋白遺伝子断片をｐＴＹＢ１２ベクトルに順次に導入し、ｐＴＧ３、ｐＴＧＰ１、及びｐＴＧＰＴ２ベクトルを製作する過程を説明する模式図である。
【００６３】
図３は、ｐＴＧＰＴ２ベクトルから由来した直列結合させた５６ｋＤａ蛋白遺伝子断片をｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクトルに導入し、ｐＥＴｂ７ベクトルを製作する過程を説明する模式図である。
【００６４】
図４は、クローニングされたベクトルの電気泳動写真であり、ＭはλＨｉｎｄＩＩＩサイズマーカ、ＶはｐＴＹＢ１２ベクトル、ＧはｐＴＧ３ベクトル、ＰはｐＴＧＰ１ベクトル、及びＴはｐＴＧＰＴ２ベクトルを示す。
【００６５】
図５は、クローニングされたベクトルｐＥＴｂ７の電気泳動写真で、ＭはλＨｉｎｄＩＩＩサイズマーカ、１はｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクトル（５４９３ｂｐｓ）、及び２はｐＥＴｂ７ベクトル（８００４ｂｐｓ）を示す。
【００６６】
（３）コンピテント細胞（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ）の製作。
ＬＢ培地で振盪培養した大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を同じ培地で１００倍希釈し、６００ｎｍでの吸光度が０．３に達する時まで再培養した。氷中で上記培養液を放置した後、４℃で２０分間４００×ｇで遠心分離し、氷中で保管していた０．１Ｍ ＣａＣｌ２で洗浄した後、上清を捨てた。培養した培地の１／２体積の０．１Ｍ ＣａＣｌ２を添加し、大腸菌を再浮遊させた。氷中で１時間放置した後、４℃で２０分間４，０００×ｇで遠心分離して上清を捨てた後、培養した培地の１／１０体積の０．１Ｍ ＣａＣｌ２で浮游し、これを形質転換のためのコンピテント細胞として使用した。
【００６７】
（４）形質転換
上記において製作したライゲーションベクトル１μｌと上記得られたコンピテント細胞１００μｌとを混合し、氷中で１時間放置した後、４２℃で１８０秒間熱衝撃を与えた。ＬＢ培地５００μｌを添加した後、３７℃で１時間培養した。８，０００×ｇで１分間遠心分離し、上清を捨てた後、ペレットを２００μｌのＬＢで浮遊し、形質転換細胞を含む浮遊液をＬＢ寒天プレート培地に広げて接種した後、３７℃で１８時間培養した。
【００６８】
（５）形質転換された大腸菌コロニーの免疫学的検索
ＬＢ寒天培地上に位置したＮＣ紙上に、形質転換された大腸菌を接種し、３７℃で１８時間培養した。３ＭＭワットマン紙（ｗｈａｔｍａｎ ｐａｐｅｒ）３枚を重なった上に、コロニーが形成されたＮＣ紙を載置し、新しいＮＣ紙をその上に重なって置いた。３ＭＭワットマン紙３枚をさらに重なって置いた後、圧力を加えて複製ＮＣ紙を製作した。各ＮＣ紙をアンピシリン（１００μｌ／ｍｌ）が含まれたＬＢ培地上に載置し、３７℃で４時間培養した。複製ＮＣ紙を０．１ｍＭ ＩＰＴＧとアンピシリン（１００μｌ／ｍｌ）が含まれたＬＢ寒天プレート培地上に移した後、さらに３時間培養して蛋白質発現を誘導した。
【００６９】
培養済みＮＣ紙をクロロホルムが充填された密封ガラス内に入れ、１０分間露出させた後、リゾチーム緩衝液（５００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ５ｍＭ ＭｇＣｌ２， ３％ウシ血清アルブミン（ｗ／ｖ）、リゾチーム４００μｇ／ｍｌ、ＤＮＡａｓｅ １Ｕ／ｍｌ）に浸漬して１時間ゆっくり振りながら融解させた。ＮＣ紙表面を柔らかく拭いた後、新しいリゾチーム緩衝液に浸漬して同じ方法で１時間反応させた。ＴＢＳＴ緩衝液（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ０．０５％ツイン２０）で１０分ずつ２回洗浄した後、抗血清により検索を実施した。
【００７０】
ＮＣ紙をＴＢＳＴ（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ８．０， １５０ｍＭ ＮａＣｌ， ０．０５％ツイン２０）で３回洗浄した後、３％ウシ血清アルブミンにより室温で３０分間反応させて余白部位を遮断した。オリエンティアツツガムシのボリョン株に対する血清をＴＢＳＴで１／４０希釈し、ＮＣ紙と３０分間室温で反応させた後、ＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄した。ＴＢＳＴで１０，０００倍希釈した２次抗体（アルカリホスファターゼ共有結合された抗マウスＩｇＧ（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ， Ｐｒｏｍｅｇａ Ｓ３７２１））を、ＮＣ紙と室温で３０分間反応させた後、ＴＢＳＴで１０分ずつ３回洗浄した。３ＭＭペーパーで濾過した発色基質溶液（１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ９．５， １００ｍＭ ＮａＣｌ， ５ｍＭ ＭｇＣｌ２， ニトロブルーテトラゾリウム（ｎｉｔｒｏｂｌｕｅ ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ）０．３ｍｇ／ｍｌ， ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸０．１５ｍｇ／ｍｌ）を入れ、光を遮断して５分間反応させ、陽性クローンを得た。
【００７１】
（６）ポリアクリルアミドゲル電気泳動とウェスタンブロット分析
Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｌａｅｍｍｌｉ， １９７０）の方法を変形してポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウェスタンブロット分析を次のように施行した。
【００７２】
０．１％ＳＤＳが含有された０．３７Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）溶液に、アクリルアミドとビスアクリルアミド（３０：０．８）の混合液を添加した後、陰圧により空気を除去し、過硫酸アンモニウムとＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチレンジアミンを、それぞれ０．０３％（ｗ／ｖ）と０．０６６％（ｗ／ｖ）になるように入れて、重合反応を起こし分離用ゲル（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｇｅｌ）を製作した。
【００７３】
０．１％ＳＤＳが含有された０．１２５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）溶液に、アクリルアミドとビスアクリルアミド（３０：０．８）の混合液を最終濃度が５％になるように添加し、積層用ゲル（ｓｔａｃｋｉｎｇ ｇｅｌ）を製作した後、これを分離用ゲル上に載置した。
【００７４】
電気泳動する大腸菌の蛋白質は、次の方法により用意した。
形質転換された大腸菌を一晩培養した後、培地により１００倍希釈し、６００ｎｍにおける吸光度が０．５に達する時まで培養した後、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加して３時間培養した。４℃で２０分間４，０００×ｇで遠心分離した後、上清を捨ててペレットを５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で１回洗浄した。遠心分離後、上清を捨てて大腸菌を含むペレットをサンプル緩衝液（２％ＳＤＳ， ５％メルカプトエタノール， ２０％グリセロール、０．００１％ブロモフェノールブルー（ｗ／ｖ）， ０．１Ｍトリス−ＨＣｌ ｐＨ６．８）で浮遊させた後、１００℃で５分間加熱した。室温で１０分間１０，０００ｇで遠心分離した後、上清を回収してウェル当たり１０μｌずつ電気泳動した。
【００７５】
電気泳動が終わったゲルは、染色またはイムノブロッティングをして蛋白質を確認した。
染色のために、ゲルを染色液（水：メタノール：酢酸（５：５：２）及び０．１％（ｗ／ｖ）クマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ）Ｒ２５０）に浸漬し、１時間染色した後、脱色液（２５％メタノール， １０％酢酸）で２時間脱色した。
イムノブロッティングのために、ゲルとＮＣ紙を重なった後、９０Ｖで１時間転写した。転写が終わったＮＣ紙は、免疫学的検索方法により蛋白質を検出した。
【００７６】
図６は、ｐＴＹＢ１２ベクトルにクローニングされたオリエンティアツツガムシの３つの血清型ギリアム、カーフ及びカトーから由来した５６ｋＤａ蛋白遺伝子発現を示す電気泳動写真で、ここで、ＶはｐＴＹＢ１２ベクトルで形質転換された大腸菌ＥＲ２５６６で発現された蛋白質断片、ＧはｐＴＧ３ベクトルで形質転換された大腸菌ＥＲ２５６６で発現されたギリアム由来の５６ｋＤａ蛋白断片の融合蛋白質、ＰはｐＴＧＰ１ベクトルで形質転換された大腸菌ＥＲ２５６６で発現されたギリアム由来の５６ｋＤａ蛋白断片と、カーフ由来の５６ｋＤａ蛋白断片の融合蛋白質、ＴはｐＴＧＰＴ２ベクトルで形質転換された大腸菌ＥＲ２５６６で発現されたギリアム由来の５６ｋＤａ蛋白断片、カーフ由来の５６ｋＤａ蛋白断片及びカトー由来の５６ｋＤａ蛋白断片の融合蛋白質を示す。
【００７７】
図７は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクトルにクローニングされたオリエンティアツツガムシの３つの血清型ギリアム、カーフ及びカトーから由来した５６ｋＤａ蛋白遺伝子の発現を示す電気泳動写真である。
【００７８】
ここで、レーン１はｐＴＧＰＴ２ベクトルで形質転換された大腸菌ＥＲ２５６６で発現されたギリアム、カーフ及びカトー由来の５６ｋＤａ蛋白断片の融合蛋白を示し、レーン２はｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクトルで形質転換された大腸菌ＥＲ２５６６の場合、レーン３はｐＥＴｂ７ベクトルで形質転換された大腸菌ＥＲ２５６６が発現するギリアム、カーフ及びカトー由来の５６ｋＤａ蛋白断片の融合蛋白質を示す。
【００７９】
（７）組み換え抗原の分離及び精製
▲１▼　ｐＴＧＰＴ２で形質転換された大腸菌を３７℃で培養した後、培地で１００倍希釈して再培養し、６００ｎｍにおける吸光度が０．５に到達すれば、０．３ｍＭ　ＩＰＴＧを添加して４〜３７℃で１８〜７２時間培養した。上記培地を４℃で１５分間４，０００×ｇで遠心分離した後、融解緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ， ３０ｍＭ ＮａＣｌ， ０．２％ツイン−２０， １０ｍＭ−メルカプトエタノール， １０ｍＭ ＥＤＴＡ， １０ｍＭ ＥＧＴＡ ｐＨ７．０）で浮游した。リゾチーム（１ｍｇ／ｍｌ）を混合した後、氷中で３０分間放置し、大腸菌を融解させた。超音波粉砕器により最大出力の５０％で１分間粉砕した後、４℃で３０分間９，０００×ｇで遠心分離し、上清を回収した。上記のような方法で、ペレットから蛋白質を３回溶出して得られた上清を混合した。その後、０．０５％ツイン−２０が含まれたコラム緩衝液を同量添加した後、ＮａＣｌ濃度とｐＨをそれぞれ０．５Ｍと７．０に調整して分離精製に使用した。
【００８０】
親和クロマトグラフィ樹脂（ｃｈｉｔｉｎ等）２ｇを６０ｍｌのコラム緩衝液（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ， ０．５Ｍ ＮａＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ， １ｍＭ アジ化ナトリウム）に混合し、室温で３０分間再水和（ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）した。２．５×５０ｃｍコラムに、上記再水和された樹脂を満たした後、コラム体積の３倍容量のコラム緩衝液で洗浄した。大腸菌融解液を１ｍｌ／分の速度で通過させた後、０．０５％ツイン−２０が含まれたコラム緩衝液２体積で洗浄し、さらにコラム緩衝液２体積のみで洗浄した。
【００８１】
２８０ｎｍで溶出液の吸光度を測定しながら、分画当たり溶出液２ｍｌを収集した。最高吸光度を有する分画１０個を収集した後、蛋白質の濃度を定量するために、２８０ｎｍと２６０ｎｍで吸光度をそれぞれ測定した。蛋白質濃度は、次の一般式（１）で計算した。
蛋白質濃度（ｍｌ／ｍｌ）＝１．５５×ＯＤ２８０ｎｍ−０．７７×ＯＤ２６０ｎｍ　………………（１）
【００８２】
図８は、オリエンティアツツガムシのギリアム、カーフ、カトーから由来した５６ｋＤａ蛋白遺伝子の直列結合体を含むｐＥＴｂ７ベクトルで形質転換された大腸菌由来の融合蛋白を精製する過程を示すもので、ここで番号は分画順序を表し、溶出された各分画はドットブロットした後、マウス抗血清で免疫酵素染色したのである。
【００８３】
▲２▼　ｐＥＴｂ７ベクトルで形質転換された大腸菌の場合、組み換え融合蛋白質は、次のような方法によって精製した。
ｐＥＴｂ７で形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、アンピシリンが含有されたＬＢ培地で３７℃条件下で培養した後、同じＬＢ培地で１００倍希釈して再培養した。６００ｎｍにおける吸光度が０．６になる時まで培養し、最終濃度が０．３ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３７℃で３時間培養した。培養された菌を５，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上清を捨ててペレットを結合緩衝液（５ｍＭ イミダゾール， ０．５Ｍ ＮａＣｌ， ２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ， ｐＨ７．９）で再懸濁した。再懸濁液を超音波処理（ｓｏｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ）して蛋白を抽出した後、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、含有体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄｉｅｓ）としての蛋白質を獲得した。このような含有体を４Ｍウレア（ｕｒｅａ）が含有された結合緩衝液と混合した後、１時間氷に放置し培養することによって変成させた。１６，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上清をＨｉｓ−樹脂に添加した。
【００８４】
精製に必要なＨｉｓ−樹脂（Ｈｉｓ−ｒｅｓｉｎ）の量は、上清１００ｍｌ当たり約２．５ｍｌ程度で、適量の樹脂をコラムに満たした後、平衡になるように放置した。ここに滅菌された蒸溜水を樹脂体積の３倍以上流した後、電荷緩衝液（５０ｍＭ ＮｉＳＯ４）を樹脂体積の５倍以上流し、樹脂が電荷を有するようにした。次に、４Ｍウレアを含有した十分な量の結合緩衝液を添加し、コラムが平衡に到達するようにした。
【００８５】
その次、上記においてコラムを通過した蛋白質上清を用意した後、４Ｍウレアを含有した樹脂体積の１０倍以上の結合緩衝液を流し、非特異的結合蛋白質を除去した。次いで、樹脂体積の６倍程度の４Ｍウレアを含有した洗浄緩衝液（６０ｍＭイミダゾール， ０．５Ｍ ＮａＣｌ， ２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ， ｐＨ７．９）を流し、残りの非特異的結合蛋白質を除去した。４Ｍウレアを含有した洗浄緩衝液をほとんど流した後、溶出分画を収集した。溶出された蛋白質分画を炭酸塩緩衝液を用いて、連続的にウレアの濃度を縮めながら透析した。最後に、ウレアが除去された蛋白質をＥＬＩＳＡを行うのに利用した。
【００８６】
溶出が終わった樹脂は、樹脂体積の３倍以上のストリップ緩衝液（１００ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．５Ｍ ＮａＣｌ， ２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ， ｐＨ７．９）を流し、Ｎｉ＋によって誘導された電荷を除去した後、再使用できる。
【００８７】
実施例６：酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
上記で用意した組み換え融合蛋白抗原を０．０５Ｍ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）により、濃度が１．２５μｇ／ｍｌになるように希釈した後、ＥＩＡ用ポリ塩化ビニルプレート（ＴｉｔｅｒＴｅｋ， ｆｌａｔ ｂｏｔｔｏｍ， ｓｏｆｔｐｌａｔｅ）９６ウェルに２００μｌずつ分注した後、４℃で１８時間反応させて抗原を貼付けた。ツイン−２０が０．０５％含有されたリン酸緩衝液（以下、ＰＢＳＴと記す）で３回洗浄し、５％脱脂乳により室温で１時間予期されぬ反応を遮断した。
【００８８】
上記用意した血清を１：１００に希釈し、室温で３０分間反応させた後、ＰＢＳＴで６回洗浄した。２次抗体（ホースラディシュペルオキシダーゼ−共有結合された抗−マウスＩｇＧ、ホースラディシュペルオキシダーゼ−共有結合された抗−マウスＩｇＭ： Ｊａｃｋｓｏｎ １０９−０３５−００３）をＰＢＳＴで１０，０００倍希釈し、室温で３０分間反応させた後、ＰＢＳＴで６回洗浄した。
【００８９】
発色基質溶液（クエン酸リン酸緩衝液、Ｈ２Ｏ２ ０．４μｌ／ｍｌ、ｏ−フェニレンジアミン ０．４ｍｇ／ｍｌ）を添加し、１５分間発色させて、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４を添加して発色反応を停止した後、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）読取機（Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ ７００）を用いて、波長４９２ｎｍにおいて吸光度を測定した。
【００９０】
図９は、オリエンティアツツガムシから由来した５６ｋＤａ蛋白遺伝子の直列結合体により発現された組み換え融合蛋白抗原と、ツツガムシ病患者及び正常人の各血清との反応性をＥＬＩＳＡで評価したのを示すものである。図９において、横軸は間接免疫蛍光抗体法（ＩＦＡ）によって測定した血清の抗体力価であり、縦軸は酵素免疫測定法の吸光度を示す。
【００９１】
図１０は、オリエンティアツツガムシから由来した５６ｋＤａ蛋白遺伝子の直列結合体により発現された組み換え融合蛋白抗原を使用した酵素免疫測定法の感応度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）及び特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を示すもので、９３．６％の診断感応度と、９４．２％の診断特異性を得ることができることが分かる。
【００９２】
（産業上の利用の可能性）
以上で説明したように、本発明による組み換え遺伝子蛋白質抗原を用いてツツガムシ病を診断する方法は、オリエンティアツツガムシ病源体を培養し、診断用抗原として使用する間接免疫蛍光抗体法に相応する診断感応度と特異性を有する。従って、本発明では、病源体培養を必要としないだけでなく、単一遺伝子組み換え蛋白を使用する場合に比べて、診断感応度が増加し、多くの単一遺伝子組み換え蛋白混合物を使用する診断法に比べて、費用が低減される優れた効果がある。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、オリエンティアツツガムシの３つの血清型ギリアム、カーフ、カトーから由来した５６ｋＤａ蛋白の遺伝子断片を、直列結合させた例を示す模式図で、（Ａ）はベクトルｐＴＧＰＴ２、（Ｂ）はベクトルｐＥＴｂ７の場合を示す。
【図２】図２は、オリエンティアツツガムシの３つの血清型ギリアム、カーフ、カトーから由来した５６ｋＤａ蛋白の遺伝子断片を、ｐＴＹＢ１２ベクトルに順次に導入し、ｐＴＧ３、ｐＴＧＰ１及びｐＴＧＰＴ２ベクトルを製作する過程を説明する模式図である。
【図３】図３は、５６ｋＤａ蛋白の遺伝子断片が直列に連結したものを、ｐＴＧＰＴ２ベクトルからｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクトルに導入し、ｐＥＴｂ７ベクトルを製作する過程を説明する模式図である。
【図４】図４は、クローニングされたベクトルの電気泳動の結果で、ＭはλＨｉｎｄＩＩＩサイズマーカー、ＶはｐＴＹ１２ベクトル、ＧはｐＴＧ３ベクトル、ＰはｐＴＧＰ１ベクトル、及びＴはｐＴＧＰＴ２ベクトルである。
【図５】図５は、クローニングされたベクトルｐＥＴｂ７の電気泳動の結果で、ＭはλＨｉｎｄＩＩＩサイズマーカー、レーン１はｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクトル（５４９３ｂｐｓ）、及びレーン２はｐＥＴｂ７ベクトル（８００４ｂｐｓ）である。
【図６】図６は、ｐＴＹＢ１２ベクトルにクローニングされたオリエンティアツツガムシの３つの血清型ギリアム、カーフ及びカトーから由来した５６ｋＤａ蛋白の遺伝子発現を示す電気泳動写真で、ＶはｐＴＹＢ１２で形質転換された大腸菌ＥＲ２５６６由来の蛋白質を示し、ＧはｐＴＧ３で形質転換された大腸菌ＥＲ２５６６で発現されたギリアム由来の５６ｋＤａ蛋白質を示し、ＰはｐＴＧＰで形質転換された大腸菌ＥＲ２５６６で発現されたギリアム及びカーフ由来の蛋白質断片の融合蛋白質を示し、ＴはｐＴＧＰＴ２で形質転換された大腸菌ＥＲ２５６６で発現されたギリアム、カーフ及びカトー由来の５６ｋＤａ蛋白質断片の融合蛋白質を示す。
【図７】図７は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクトルにクローニングされたオリエンティアツツガムシの３つの血清型ギリアム、カーフ及びカトーから由来した５６ｋＤａ蛋白遺伝子の発現を示す電気泳動写真で、レーン１はｐＴＧＰＴ２で形質転換された大腸菌ＥＲ２５６６で発現されたギリアム、カーフ及びカトー由来の５６ｋＤａ蛋白質断片の融合蛋白質を示し、レーン２はｐＥＴ２２ｂ（＋）で形質転換された大腸菌ＥＲ２５６６を示し、レーン３はｐＥＴｂ７で形質転換された大腸菌ＥＲ２５６６で発現されたギリアム、カーフ及びカトー由来の５６ｋＤａ蛋白質断片の融合蛋白質を示す。
【図８】図８は、オリエンティアツツガムシのギリアム、カーフ、カトーから由来した５６ｋＤａ蛋白遺伝子の直列結合体を含むｐＥＴｂ７ベクトルで形質転換された大腸菌由来の融合蛋白を精製する過程を示したもので、ここで番号は分画順序を表し、溶出された各分画はドットブロットした後、マウス抗血清で免疫酵素染色したのである。
【図９】図９は、オリエンティアツツガムシの５６ｋＤａ蛋白の遺伝子の直列結合体により発現された組み換え融合蛋白抗原と、ツツガムシ病患者及び正常人の各血清との反応性をＥＬＩＳＡで評価したことを示すもので、ツツガムシ病患者が間接免疫蛍光抗体法（ＩＦＡ）によって診断されたのである。図９において、横軸はＩＦＡによって分析された血清の抗体力価を、縦軸はＥＬＩＳＡによって分析された吸光度を示す。
【図１０】図１０は、オリエンティアツツガムシの５６ｋＤａ蛋白の遺伝子の直列結合体により発現された組み換え融合蛋白抗原を使用したＥＬＩＳＡの感応度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）及び特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を示すもので、ツツガムシ病の診断のための感応度は９３．６％で、特異性は９４．２％である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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