(57)【要約】本発明はβｉｇ−ｈ３の内部ドメインを用いた細胞接着および創傷治癒の方法に関する。特に、本発明は細胞接着および創傷治癒のためにβｉｇ−ｈ３の第２または第４内部ドメインを１つまたは複数含み、βｉｇ−ｈ３の第２または第４内部ドメインが、インテグリンとの相互作用に必須で、βｉｇ−ｈ３内部ドメインの塩基配列で高度の相同性を示すアスパラギン酸およびイソロイシンを有する、組換え蛋白質を用いる方法に関する。βｉｇ−ｈ３の第２または第４内部ドメインを１つまたは複数含む組換え蛋白質は、それ自体で細胞接着および創傷治癒に有効であり、細胞培養用培地および創傷治癒剤の開発に使用できる。
2004521605.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
βｉｇ−ｈ３のドメインの一部を含む組換え蛋白質を用いて哺乳類細胞を接着する方法。
【請求項２】
組換え蛋白質がβｉｇ−ｈ３の第２ ｆａｓ−１ドメイン、βｉｇ−ｈ３の第４ ｆａｓ−１ドメイン、またはβｉｇ−ｈ３の第２および第４ドメインの両方を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
βｉｇ−ｈ３の第２または第４ドメインが、単一コピーまたは複数コピーとして存在する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
βｉｇ−ｈ３の第２ ｆａｓ−１ドメインがβｉｇ−ｈ３のアミノ酸配列２３７〜３７７位を含み、発現ベクターｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩから発現される、請求項２記載の方法。
【請求項５】
βｉｇ−ｈ３の第４ ｆａｓ−１ドメインがβｉｇ−ｈ３のアミノ酸配列４９８〜６３７位を含み、発現ベクターｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶから発現される、請求項２記載の方法。
【請求項６】
組換え蛋白質がβｉｇ−ｈ３のアミノ酸配列５０２〜６３７位を４重に重複して含み、発現ベクターｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ４Ｘから発現される、請求項３記載の方法。
【請求項７】
βｉｇ−ｈ３のアミノ酸２３７〜３７７位を含み、βｉｇ−ｈ３の第２ ｆａｓ−１ドメインを発現する能力のある、発現ベクターｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩ。
【請求項８】
請求項７記載の発現ベクターで形質転換され、大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）ＢＬ２１／Ｈｉｓβ−ｇ（受託番号ＫＣＴＣ ０９０５ＢＰ）として識別される新規の大腸菌株。
【請求項９】
βｉｇ−ｈ３のアミノ酸４９８〜６３７位を含み、βｉｇ−ｈ３の第４ ｆａｓ−１ドメインを発現する能力のある、発現ベクターｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ。
【請求項１０】
請求項９記載の発現ベクターで形質転換され、大腸菌ＢＬ２１／Ｈｉｓβ−ｅ（受託番号ＫＣＴＣ ０９０４ＢＰ）として識別される新規の大腸菌株。
【請求項１１】
βｉｇ−ｈ３のアミノ酸配列５０２〜６３７位を４重に重複して含み、βｉｇ−ｈ３の第２または第４ ｆａｓ−１ドメインを複数コピー含む組換え蛋白質を発現する、発現ベクターｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ４Ｘ。
【請求項１２】
請求項１１の発現ベクターで形質転換され、大腸菌ＢＬ２１／Ｈｉｓβ−ｅ４ｘ（受託番号ＫＣＴＣ ０９０６ＢＰ）として識別される新規の大腸菌株。
【請求項１３】
以下の段階を含む、請求項１記載の方法：
１） 発現ベクターを用いて、βｉｇ−ｈ３の第２および／または第４ドメインを１コピーまたは複数コピー含む組換え蛋白質を調製する段階；
２） 組換え蛋白質を固相支持体上にコーティングする段階；および
３） 蛋白質でコーティングした固相支持体上に細胞を添加する段階。
【請求項１４】
βｉｇ−ｈ３のドメインの一部を含む組換え蛋白質によって、哺乳類の創傷を治癒する方法。
【請求項１５】
以下の段階を含む、請求項１４記載の方法：
１） βｉｇ−ｈ３の第２および／または第４ドメインを１コピーまたは複数コピー含む組換え蛋白質で固相支持体をコーティングする段階；
２） 固相支持体に細胞を接着させる段階；および
３） 固相支持体を創傷に当てる段階。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は細胞接着および創傷治癒に使用するペプチドに関する。より詳細には、本発明はβｉｇ−ｈ３の第２および／または第４ ｆａｓ−１ドメインを１コピーまたは複数コピー含むペプチドの、細胞接着および創傷治癒における使用に関するが、この第２および／または第４ドメインは、インテグリンへの結合に必須で、細胞接着を仲介する２つのアミノ酸、アスパラギン酸およびイソロイシンに高度の相同性を持つ。また、本発明は細胞接着および創傷治癒に有用なペプチドの発現系にも関する。
【０００２】
発明の背景
βｉｇ−ｈ３は細胞外マトリックス蛋白質であり、その発現は、活性型ＴＧＦ−βのシグナル伝達に続いて、ヒトメラノーマ細胞、乳房上皮細胞、ケラチノサイト、および肺線維芽細胞を含む種々の細胞株で誘導される（Ｓｋｏｎｉｅｒ， Ｊ．ら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３、５７１、１９９４）。βｉｇ−ｈ３遺伝子は、ＴＧＦ−βで処理されたヒト肺腺癌細胞株から作製されたｃＤＮＡライブラリーのディファレンシャルハイブリダイゼーションスクリーニングによって、最初に単離された。βｉｇ−ｈ３遺伝子は、種間で高度に保存されている６８３アミノ酸の蛋白質をコードしている。これは、Ｎ末端に分泌シグナルペプチド、Ｃ末端にＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ （ＲＧＤ）モチーフを含んでいる。ＲＧＤモチーフは、細胞接着を調節する多くの細胞外マトリックス蛋白質に見出され、いくつかのインテグリンのリガンド認識配列となっている（Ｓｔｏｎｉｅｒ， Ｊ．ら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１１、５１１、１９９２）。
【０００３】
いくつかの研究によると、βｉｇ−ｈ３は細胞の成長および増殖、創傷治癒、ならびに細胞接着に関与していることが知られているが、これらの機能の根底にある機序は、いまだ不明である。しかし、βｉｇ−ｈ３は様々な組織において、形態形成、および細胞と細胞外マトリックス蛋白質の相互作用に重要な働きをしていると考えられる。
【０００４】
細胞接着および剥離の仲介におけるβｉｇ−ｈ３の役割に関連する証拠が、いくつかの研究で提供されている。例えば、精製βｉｇ−ｈ３蛋白質は、皮膚の線維芽細胞の接着および伸展を促進するが、無血清培地中で、Ａ５４９、ＨｅＬａおよびＷｉ−３８細胞の接着を阻害することがわかっている。特に、βｉｇ−ｈ３は腫瘍細胞の増殖に阻害活性があり、コロニー形成および形態に影響を与えることが知られている。阻害活性は、βｉｇ−ｈ３発現プラスミドをＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞にトランスフェクトすると、細胞の増殖、およびこれらの細胞がヌードマウスで腫瘍を形成する能力が著しく低下したという報告によって、示されている。さらに、創傷治癒法は、薬学的に有効量のβｉｇ−ｈ３を創傷に塗布すると、細胞、特に線維芽細胞が創傷部位に広がり、接着するという知見に基づいて、開発された。したがって、様々な細胞株においてＴＧＦ−βによって誘導される細胞接着分子であるβｉｇ−ｈ３は、細胞の増殖、細胞の分化、創傷治癒、形態形成、および細胞接着に非常に重要な役割を果たす（Ｒａｗｅ， Ｉ．Ｍ．ら、Ｉｎｖｅｓｔ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ３８、８９３、１９９７； Ｌｅｂａｒｏｎ， Ｒ． Ｇ．ら、Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １０４、８４４、１９９５）。
【０００５】
βｉｇ−ｈ３は、内部の相同性を持つ１４０アミノ酸、すなわちｆａｓ−１ドメインの繰り返しを４つ含む。内部の繰り返しドメインは、哺乳類、昆虫、ウニ、植物、酵母、および細菌を含む様々な種の分泌蛋白質または膜蛋白質に見られる、高度に保存された配列を持つ。保存された配列を含む蛋白質の例は、ペリオスチン、ファシクリンＩ、ウニＨＬＣ−２、藻類のＣＡＭ、およびマイコバクテリウムＭＰＢ７０である。これらの蛋白質の保存されたドメイン（以後、ｆａｓ−１と呼ぶ）は、各々約１０アミノ酸の２つの高度に保存された枝、Ｈ１およびＨ２を持つ約１１０アミノ酸から１４０アミノ酸から構成されている（Ｋａｗａｍｏｔｏ， Ｔ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ． １３９５、２８８、１９９８）。
【０００６】
４つのｆａｓ−１ドメインは、βｉｇ−ｈ３、ペリオスチン、およびファシクリンＩに見られ、２つのｆａｓ−１ドメインはＨＬＣ−２、１つのみのｆａｓ−１ドメインはＭＰＢ７０に見られる。これらの蛋白質の機能は明らかにされていないが、そのいくつかは、細胞接着分子として作用することが知られている。例えば、βｉｇ−ｈ３、ペリオスチン、およびファシクリン１は、それぞれ線維芽細胞、骨芽細胞、および神経細胞の接着を仲介すると報告されている。また、藻類のＣＡＭが藻類ボルボックスの胚に存在する細胞接着分子であることが開示されている（ＬｅＢａｒｏｎ， Ｒ． Ｇ．ら、Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １０４、８４４、１９９５； Ｈｏｒｉｕｃｈｉ， Ｋ．ら、Ｊ． Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ． Ｒｅｓ． １４、１２３９、１９９９； Ｈｕｂｅｒ， Ｏ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ． １３、４２１２、１９９４）。
【０００７】
当初、βｉｇ−ｈ３の細胞接着活性はＣ末端のＲＧＤモチーフによって仲介されると考えられていた。しかし、研究の結果、ＲＧＤモチーフは軟骨細胞の伸長の促進に必要ではなく、Ｃ末端のプロセッシングによってＲＧＤモチーフが削除された成熟可溶性βｉｇ−ｈ３が細胞接着を阻害できることが分かり、βｉｇ−ｈ３のＲＧＤモチーフは、βｉｇ−ｈ３の細胞接着活性の仲介にはなくても構わないという結論に達した。さらに、βｉｇ−ｈ３のＲＧＤモチーフはβｉｇ−ｈ３の細胞接着特性の仲介には不要である一方で、βｉｇ−ｈ３はインテグリンα１β１を介して線維芽細胞の伸長を促進することが最近報告された。最近の報告によると、βｉｇ−ｈ３はインテグリンに特異的に結合し、ＲＧＤモチーフには関係なく、細胞接着および細胞の伸長を促進する（Ｏｈｎｏ， Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １４５１、１９６、１９９９）。さらに、βｉｇ−ｈ３の保存されたペプチドＨ１およびＨ２は、βｉｇ−ｈ３を介する細胞接着には影響しないことが分かった。これらの結果を合わせると、βｉｇ−ｈ３の細胞接着活性に不可欠なアミノ酸は、Ｈ１およびＨ２領域以外のどこかに存在すると示される。βｉｇ−ｈ３の繰り返しのｆａｓ−１ドメインの間のみならず他の蛋白質のｆａｓ−１ドメインの間の相同性に基づくコンピュータ検索では、Ｈ１およびＨ２ペプチド以外に、いくつかの高度に保存されたアミノ酸があることが明らかにされ、これは細胞接着活性にこの保存されたアミノ酸配列が関与している可能性を示唆する。
【０００８】
細胞接着に重要な役割を果たすことが知られているβｉｇ−ｈ３のドメインのうち、第２または第４ドメインのいずれかが、本発明に係る分子の細胞接着に必須の最小のドメインと同定される。これらの知見に基づき、この必須の機能的ドメインを含む組換え蛋白質も、本発明に係る創傷治癒に有効であると同定される。
【０００９】
創傷治癒の最近の研究は、細胞生物学と分子生物学に分かれており、創傷治癒の促進は、種々の臨床分野に拡大している応用法がある。しかし、創傷治癒の細胞生物学的および分子生物学的機構は、いまだ不明である。現在までに開示された知見によると、創傷治癒は外傷に対する組織の応答で、化学走性、細胞の分化と複製、マトリックス蛋白質の合成、血管新生、および創傷の再建を含む、複雑な生物学的過程を通して組織の修復が行われる（Ｓｔｅｅｄ， Ｄ． Ｌ．ら、Ｃｌｉｎ． Ｐｌａｓｔ． Ｓｕｒｇ． ２５、３９７、１９９８）。
【００１０】
成長因子は、創傷治癒過程の初期段階に出現し、その後の創傷治癒過程を制御する、代表的な物質である。創傷治癒の全ての段階に大きな影響を持つ成長因子は、細胞の増殖、分化、および代謝を制御し、炎症と組織修復、細胞増殖に関与する種々の種類の細胞を引きつける化学走性の特性によって創傷の環境を再編成するために作用し、血管新生および細胞外マトリックスの合成および分解を刺激する。ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）は線維芽細胞を創傷に引きつけ、増殖させるが、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）はそれらにコラーゲンを合成させる。ＰＤＧＦは創傷治癒に関与する大部分の細胞に化学走性を引き起こし、血管新生、再構成、および収縮を刺激し、創傷治癒細胞を活性化する（Ｍｕｓｔｏｅ， Ｔ． Ａ．ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８７、６９４、１９９１； Ｌｅｐｉｓｔｏ， Ｊ．ら、Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ． ５３、５９６、１９９２）。ＥＧＦ（上皮成長因子）はケラチノサイトの移動、血管新生、および顆粒化組織発生を刺激し、ケラチノサイトおよび線維芽細胞の有糸分裂誘発を活性化する（Ｆｒａｎｋｌｉｎ， Ｊ． Ｄ．ら、Ｐｌａｓｔ． Ｒｅｃｏｎｓｔ． Ｓｕｒｇ． ６４、７６６、１９７９； Ｂｕｃｋｌｙ， Ａ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８２、７３４０、１９８５）。ｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞成長因子）は血管新生、上皮化、およびコラーゲン線維の沈着を刺激し、種々の形のヘパリンと会合して関連する機能を果たす（Ｔｓｕｂｏｉ， Ｒ．ら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７２、２４５、１９９０； Ｋｉｎｓｎｏｒｔｈ， Ａ． Ｎ．ら、Ｂｒ． Ｊ． Ｓｕｒｇ． ７７、４０９、１９９０）。ＩＧＦ（インスリン様成長因子）は細胞の分化を促進する。ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）は血管の透過性を上昇し、内皮の分裂を促進する。
【００１１】
創傷治癒に関与する成長因子やサイトカインのうちで、ＴＧＦ−βが最も代表的である。このサイトカインは哺乳類では３つの形態で存在し（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３）、様々な細胞の増殖と分化に重要な役割を果たし、細胞増殖の制御、免疫応答の調節、骨形成の刺激、軟骨特異的高分子の誘導、および創傷治癒の促進を含む種々の複雑な機能を持つ（Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｎ． Ｔ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｓｕｒｇ． １６５、７２８、１９９３）。ＴＧＦ−βは創傷治癒時には上皮に出現し、再上皮化の際にケラチノサイト内でインテグリン発現を刺激すると考えられている。ＴＧＦ−β発現の最近の研究では、ＴＧＦ−β３ ｍＲＮＡは正常な皮膚の上皮ならびに急性および慢性の創傷で発現され、ＴＧＦ−β１ ｍＲＮＡは正常な皮膚および慢性創傷で発現されないが、急性の創傷から再生した上皮層で発現され、ＴＧＦ−β２ ｍＲＮＡはどこでも発現されないことが分かった（Ｓｃｈｍｉｄ， Ｐ．ら、Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １７１、１９１、１９９３）。この作用から、機構ははっきりと確立していないものの、ＴＧＦ−βは再上皮化に重要な役割を果たしていると期待される。
【００１２】
βｉｇ−ｈ３の発現はＴＧＦ−βによって上方制御されており、これはβｉｇ−ｈ３がＴＧＦ−βの何らかのシグナル伝達の仲介に関与していることを示唆する。βｉｇ−ｈ３発現プラスミドで形質転換されたＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞は、腫瘍発生能力が低下していることが報告されている（Ｓｋｏｎｉｅｒ， Ｊ．ら、ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １３、５７１、１９９４）。反対に、βｉｇ−ｈ３はデキサメタゾン処理した幹細胞、一部の腫瘍細胞、およびメロレオストーシスの限局性骨化過剰の皮膚病変部から培養された線維芽細胞で下方制御されている。βｉｇ−ｈ３は骨形成の負の調節因子として働くことも報告されている（Ｇｅｎｉｎｉ， Ｍ．ら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６６、５７１、１９９６； Ｓｃｈｅｎｋｅｒ， Ｔ．ら、Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ． Ｒｅｓ． ２３９、１６１、１９９８； Ｋｉｍ． Ｊ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７７、１６９、２０００）。これらの機能に加え、細胞接着分子として知られるβｉｇ−ｈ３は、皮膚において線維芽細胞の接着と伸長を促進する。目の組織におけるβｉｇ−ｈ３の分布の研究によると、この接着分子は正常な成人の角膜上皮、角膜内胎児間質細胞、ならびに創傷治癒過程における内皮および間質細胞で発現されると報告されている。さらに、βｉｇ−ｈ３は腎臓の傍糸球体装置および近位尿細管で発現されており、その発現は真性糖尿病で増加する。さらに、正常人の冠動脈の内皮下平滑筋にも見つかっており、その量は動脈硬化の血管内皮で増加している。しかし、正常な皮膚組織および皮膚創傷におけるβｉｇ−ｈ３の発現ははっきりと確立していない（Ｋｌｉｎｔｗｏｒｔｈ， Ｇ． Ｋ．ら、Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５２、７４３、１９９８； Ｍｕｎｉｅｒ， Ｆ． Ｌ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５、２４７、１９９７； Ｓｔｒｅｅｔｅｎ Ｂ． Ｗ．ら、Ａｒｃｈ． Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ． Ｖｉｓ． Ｓｃｉ． ３８、８９３、１９９７）。上述のように、正常ヒト組織におけるβｉｇ−ｈ３の分布と発現は、まだ明らかではない。特に、皮膚創傷におけるβｉｇ−ｈ３の発現パターンに関する報告はない。しかし、一部の研究グループらは、βｉｇ−ｈ３は皮膚の線維芽細胞の接着と伸長を促進するように機能すると報告しているので、創傷治癒の促進に貢献すると期待される。
【００１３】
発明の概要
このような背景を考慮に入れ、本発明に至るβｉｇ−ｈ３の仲介する細胞接着に関する集中的で徹底的な研究の結果、コンピュータ検索による分析で、βｉｇ−ｈ３のｆａｓ−１ドメインおよび他のペプチドのｆａｓ−１ドメインの間に、Ｈ１およびＨ２モチーフに加えて、高度に保存されたアミノ酸配列が存在し、特に、Ｈ２領域の付近の位置のアスパラギン酸およびイソロイシン残基に高度な相同性が検出されるという知見が得られた。さらに、各々保存されたアミノ酸残基を含むβｉｇ−ｈ３の第２および第４ドメインは、α３β１インテグリンを介した細胞接着を誘導することが分かった。さらに、βｉｇ−ｈ３の第２および／または第４ ｆａｓ−１ドメインを持つようにデザインされた組換え蛋白質は、細胞接着および伸長活性、ならびに創傷治癒効果の点では、野生型のβｉｇ−ｈ３と同一であると同定された。
【００１４】
したがって、細胞接着、伸長、および剥離活性に必須の保存されたアミノ酸配列を含むペプチドを提供することは、本発明の目的である。
【００１５】
細胞接着および創傷治癒における該ペプチドの使用法を提供することも、本発明のもう１つの目的である。
【００１６】
該ペプチドの発現系を提供することも、本発明の更なる目的である。
【００１７】
細胞を接着する方法を提供することも、本発明のまた更なる目的である。
【００１８】
創傷治癒の方法を提供することも、本発明のさらにもう１つの目的である。
【００１９】
本発明の１つの局面により、哺乳類細胞の接着に有用なβｉｇ−ｈ３のドメインの一部を含む組換え蛋白質が提供される。
【００２０】
本発明の別の局面により、それぞれアミノ酸２３７〜３７７位および４９８〜６３７位に対応する、βｉｇ−ｈ３の第２および第４ ｆａｓ−１ドメインを発現する能力のある発現ベクター、ｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩ、ｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ、およびｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ４Ｘが提供される。
【００２１】
本発明の更なる局面により、それぞれ発現ベクターｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩ、ｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ、およびｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ４Ｘで形質転換された大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）株が提供され、これらは大腸菌 ＢＬ２１／Ｈｉｓβ−ｇ（受託番号ＫＣＴＣ ０９０５ＢＰ）、大腸菌 ＢＬ２１／Ｈｉｓβ−ｅ（受託番号ＫＣＴＣ ０９０４ＢＰ）および大腸菌 ＢＬ２１／Ｈｉｓβ−ｅ４ｘ（受託番号ＫＣＴＣ ０９０６ＢＰ）として識別された。
【００２２】
本発明のまた更なる別の局面により、以下の段階を含む、細胞を接着する方法が提供される：発現ベクターを用いてβｉｇ−ｈ３の第２および／または第４ドメインを１コピーまたは複数コピー含む組換え蛋白質を調製する段階；組換え蛋白質を固相支持体にコーティングする段階；および蛋白質でコーティングされた固相支持体に細胞を添加する段階。
【００２３】
本発明のさらに別の局面により、細胞接着における組換え蛋白質の使用が提供される。
【００２４】
本発明のさらに別の局面により、創傷治癒における組換え蛋白質の使用が提供される。
【００２５】
本発明のまたさらに別の局面により、以下の段階を含む、創傷治癒方法が提供される：βｉｇ−ｈ３の第２および／または第４ドメインを１コピーまたは複数コピー含む組換え蛋白質で固相支持体をコーティングする段階；固相支持体に皮膚細胞を接着させる段階；および固相支持体を創傷に当てる段階。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明では、βｉｇ−ｈ３の第２および第４ ｆａｓ−１ドメインに基づいて組換え蛋白質が調製され、単独または組み合せて細胞接着および伸長のために使用される。第２および第４ドメインを選択するために、細胞接着および伸長で活性なβｉｇ−ｈ３のドメインが同定された。そのために、いくつかのインテグリンでリガンド認識配列として知られるＣ末端配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ （ＲＧＤ）について、βｉｇ−ｈ３の細胞接着特性に対するその影響を調べた。細胞接着活性は、接着した細胞の数および表面積を用いて測定された。その結果、βｉｇ−ｈ３はＲＧＤモチーフとは無関係に、細胞接着および伸長を促進することが分かった。
【００２７】
この結果を元にして、化学試薬を用いて、βｉｇ−ｈ３の細胞接着活性の特異性を調べ、βｉｇ−ｈ３の細胞表面受容体の性質に関するさらなる手がかりを得た。化学試薬を用いて得られたデータは、βｉｇ−ｈ３の細胞接着活性に関与しているβｉｇ−ｈ３の細胞表面受容体が、ＲＧＤ依存性インテグリンの１つで、βｉｇ−ｈ３との相互作用には２価の陽イオンが必要である可能性を示唆する。
【００２８】
次に、βｉｇ−ｈ３の細胞接着機能に必須の最小ドメインを同定するために、各ｆａｓ−１ドメインが細胞接着を仲介する能力を調べた。
【００２９】
この実験は、ｆａｓ−１ドメインが、βｉｇ−ｈ３、ペリオスチン、ファシクリンＩ、ＨＬＣ−２、および藻類ＣＡＭのような様々な細胞接着分子に見られ、そのような接着分子中に存在するｆａｓ−１ドメインの数が蛋白質によって異なるという事実に基づいていた。この事実から、βｉｇ−ｈ３の細胞接着活性には４つのｆａｓ−１ドメインすべてが必要ではない可能性があり、極端な場合には１つのドメインのみがβｉｇ−ｈ３の細胞接着活性を仲介する可能性があると推論された。本発明では、βｉｇ−ｈ３の第２または第４ ｆａｓ−１ドメインのいずれかで、βｉｇ−ｈ３の細胞接着機能には十分であることが明らかである。これらの結果により、βｉｇ−ｈ３の４つのドメインに共通のＨ１およびＨ２配列は、βｉｇ−ｈ３の細胞接着活性の仲介には必須ではないという結論に至る。さらに、２つのアミノ酸、すなわち第２および第４ ｆａｓ−１ドメイン内のＨ２領域付近の位置でアスパラギン酸およびイソロイシンが高度に保存されていることが見出され、これはこれらのアミノ酸残基が細胞接着関連モチーフを構成することを示した。細胞接着にこの２つの保存されたアミノ酸が必須であることは、βｉｇ−ｈ３の第４ ｆａｓ−１ドメインの置換変異体を用いて同定された。
【００３０】
本発明の別の態様では、βｉｇ−ｈ３の第２および第４ ｆａｓ−１ドメインが、個別にまたは組み合せて使用される創傷治癒法が提供される。
【００３１】
細胞接着活性ドメインのみを含む変異βｉｇ−ｈ３蛋白質と、ドメインの一部を含む野生型βｉｇ−ｈ３ （βｉｇ−ｈ３−ＷＴ） の創傷治癒効果が比較された。このため、細胞接着活性ドメインを含む組換え蛋白質がラットに塗布された。
【００３２】
βｉｇ−ｈ３の第４ ｆａｓ−１ドメインを含む組換え蛋白質が軟膏の薬学的に有効な成分として使用されると、再上皮化および膠原線維の形成に加えて、創傷の収縮が観察された。最終的には、これらの結果は、保存されたアスパラギン酸およびイソロイシンの存在するβｉｇ−ｈ３の第２または第４ ｆａｓ−１ドメインの１つが、創傷治癒に有用で、このため創傷の治療薬の開発に用いることができることを意味する。
【００３３】
また、βｉｇ−ｈ３の第２ ｆａｓ−１ドメインまたは第２および第４ドメインを含む組換え蛋白質を用いると、優れた細胞接着および創傷治癒効果が得られた。
【００３４】
全てのドメインを含む蛋白質と比較して、ドメインの一部を含む組換え蛋白質は、水溶性の形態で合成されるので変性を受けないために、大量に生成できるという利点を有する。
【００３５】
実施例
以下の実施例を考慮すると本発明がより良く理解できるが、以下の実施例は本発明の説明のためであり、本発明を制限すると解釈されるべきものではない。
【００３６】
実施例１
ＲＧＤ非依存性βｉｇ−ｈ３蛋白質の細胞接着活性の同定
１−１  組換えβｉｇ−ｈ３蛋白質の生成
実際に細胞接着および伸長活性を持つβｉｇ−ｈ３のドメインを見つけるために、リガンド認識配列として知られるＣ末端配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ （ＲＧＤ）をβｉｇ−ｈ３の細胞接着特性に対する影響について調べた。そのため、ＲＧＤの削除された組換えβｉｇ−ｈ３蛋白質（βｉｇｈ３−ΔＲＧＤ）および野生型組換えβｉｇ−ｈ３蛋白質（βｉｇｈ３−ＷＴ）が調製された。
【００３７】
まず、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされた全長ヒトβｉｇ−ｈ３ ｃＤＮＡ （ｐＢｓβｉｇ−ｈ３）がＮｄｅＩおよびＢｇｌＩＩで消化された。このＤＮＡ断片は、ｐＥＴ−２９ｂ（＋） （Ｎｏｖａｇｅｎ Ｉｎｃ．）のＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングされた。βｉｇｈ３−ＷＴはβｉｇ−ｈ３ ｃＤＮＡから切り出された１３５１ ｂｐのＮｃｏＩ断片をこのクローンのＮｃｏＩ部位に導入して調製された。βｉｇｈ３ΔＲＧＤは、図１に示すように、βｉｇｈ３−ＷＴプラスミドの３’ 断片をＡｏＣＩおよびＮｏｔＩで切り出して、平滑末端化および自己連結させることによって、βｉｇｈ３−ＷＴから誘導された。
【００３８】
各組換えプラスミドで形質転換した大腸菌 ＢＬ ２１ ＤＥ３は、５９５ ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ）が０．５〜０．６に達するまで、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含むＬＢ培地中で３７℃で培養された。組換えβｉｇ−ｈ３蛋白質は、１ ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−（−）−チオガラクトピラノシド （ＩＰＴＧ）を用いて３７℃で３時間誘導された。沈殿を溶解緩衝液（５０ ｍＭトリス塩酸（ｐＨ ８．０）、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ トライトンＸ−１００、１ ｍＭ ＰＭＳＦ、０．５ ｍＭ ＤＴＴ）に再懸濁して、その後超音波処理した。封入体を２０ ｍＭを含む８Ｍ尿素の変性緩衝液で溶解し、変性した蛋白質をＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。組換え蛋白質は２００ ｍＭイミダゾール溶液で溶出し、その後５０ ｍＭ ＮａＣｌを含む２０ ｍＭトリス塩酸緩衝液中で尿素を高濃度から低濃度に順次下げて透析した。これらの組換え蛋白質は、図２に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて解析した。
【００３９】
１−２ 組換えβｉｇ−ｈ３ ｆａｓ−１ドメイン蛋白質の細胞接着活性についてのアッセイ法
このアッセイ法に使用したヒト角膜上皮 （ＨＣＥ） 細胞は、１５％ 牛胎児血清、ゲンタマイシン（４０μｇ／ｍｌ）、インスリン（５μｇ／ｍｌ）、コレラ毒素（０．１μｇ／ｍｌ）およびヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）を補充したＤＭＥＭ （ＥＭＥＭ／Ｆ−１２、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で、５％ ＣＯ２中で３７℃で培養された。
【００４０】
細胞接着アッセイ法は以下のように実行された。まず、組換えβｉｇ−ｈ３蛋白質または他の細胞外マトリックス蛋白質を、３７℃で１時間インキュベートして９６穴マイクロ培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ）の底に接着させ、０．２％ ＢＳＡを含むＰＢＳでブロッキングした。コーティングされた細胞外マトリックス蛋白質は、ヒト血漿ビトロネクチン（Ｐｒｏｍｅｇａ）、精製ヒト血漿フィブロネクチン（ｐＦＮ）、ニワトリＩ型およびＩＩ型コラーゲン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）、ウシＩＶおよびＶＩ型コラーゲン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、マウスラミニン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）だった。細胞をトリプシン処理し、２ ｘ １０５細胞／ｍｌの濃度で培地中に再懸濁した。細胞懸濁液０．１ ｍｌを組換え蛋白質でコーティングされたプレートの各ウェルに添加した。
【００４１】
３７℃で１時間インキュベーション後、接着しなかった細胞をＰＢＳで洗い流した。接着した細胞をヘキソサミニダーゼの基質として３．７５ ｍＭ ｐ−ニトロフェノール−Ｎ−アセチル １−β−Ｄ−グリコサミニドおよび０．２５％ トライトンＸ−１００を含む５０ ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ ５．０中で３７℃で１時間インキュベートし、その後５ ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ ｍＭグリシン緩衝液ｐＨ １０．４を添加して酵素活性を阻害した。マルチスキャン ＭＣＣ／３４０マイクロプレートリーダー（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ ＭＣＣ／３４０ ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）によって４０５ ｎｍの吸光度を測定した。
【００４２】
細胞接着活性の指標として細胞面積を決定するため、４ ｘ １０４細胞を４８穴プレート中の基質に添加した。接着した細胞を８％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）で固定し、２０％メタノール中の０．２５％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ）で染色した。細胞面積の測定は、イメージプロプラスソフトウェア（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ ｐｌｕｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ）（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）によって行なった。各実験では１部位につき２００または３００の測定を３回繰り返して行なった。データは特定の時点における平均面積±平均の標準誤差として報告する。
【００４３】
図３に示すように、βｉｇｈ３−ＷＴおよびβｉｇｈ３−ΔＲＧＤを用いた細胞接着および伸長活性の測定の結果では、βｉｇｈ３−ＷＴに接着したＨＣＥ細胞の数および表面積の方が、陰性対照であるアルブミンに接着したものより明らかに大きく、フィブロネクチンに接着した細胞と同程度だった。図４Ａおよび４Ｂに示すように、βｉｇ−ｈ３の細胞接着および伸長活性は、濃度依存的であった。ＲＧＤモチーフを欠失しているβｉｇ−ｈ３ΔＲＧＤは、細胞の接着および伸長を支持する点で同等に有効だった（図５Ａおよび５Ｂ）。これらの結果を合わせると、βｉｇ−ｈ３がＲＧＤモチーフには依存せずに細胞接着および伸長を支持することが確認される。
【００４４】
実験例１：βｉｇ−ｈ３の細胞接着活性に関与するβｉｇ−ｈ３の細胞表面受容体の同定
１−１：マトリックスペプチドおよび試薬を用いた細胞接着活性の同定
βｉｇ−ｈ３蛋白質の細胞接着活性に関与する細胞表面受容体を同定するために、種々の試薬を用いた阻害アッセイ法が行われた。
【００４５】
まず、プラスチックの培養皿に１０μｇ／ｍｌフィブロネクチン、βｉｇｈ３−ＷＴ、またはβｉｇｈ３−ΔＲＧＤがコーティングされた。ＨＣＥ細胞を５ ｍＭ ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌ βｉｇｈ３−ＷＴ、１００μｇ／ｍｌ βｉｇｈ３−ΔＲＧＤ、１ ｍＭ ＲＧＤ、１ ｍＭ ＲＧＥまたは１００μｇ／ｍｌフィブロネクチンを含むまたはそれらをいずれも含まない培地中で３０分間あらかじめインキュベートし、実施例１のように細胞接着についてアッセイした。
【００４６】
βｉｇ−ｈ３の細胞接着は、βｉｇ−ｈ３自体、ＲＧＤペプチドおよびＥＤＴＡで著しく阻害され、フィブロネクチンおよびＥＧＴＡで部分的に阻害されたが、ＲＧＥペプチドでは阻害されなかった。図６Ａに示すように、フィブロネクチンに対する細胞接着も、フィブロネクチン自体、ＲＧＤペプチドおよびＥＤＴＡで著しく阻害され、βｉｇ−ｈ３およびＥＧＴＡで部分的に阻害されたが、ＲＧＥペプチドでは阻害されなかった。これらの結果は、βｉｇ−ｈ３の細胞接着活性に関与しているβｉｇ−ｈ３の細胞表面受容体が、ＲＧＤ依存性インテグリンの１つである可能性を示す。
【００４７】
１−２：細胞接着活性に対する２価陽イオンの効果
βｉｇ−ｈ３の仲介する接着の２価陽イオンに対する感受性を分析するために、細胞を２ ｘ １０５細胞／ｍｌの濃度でＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）（１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、２５ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ ７．４）に懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、ＨＢＳで２度洗い、同じ緩衝液に再懸濁した。その後、細胞の一部（５０μｌ）をマイクロプレートウェルに添加し、最終濃度の２倍の濃度の２価陽イオン（ＭｎＣｌ２、ＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２）を含むＨＢＳアリコート ５０μｌと、加湿した５％ＣＯ２大気中で、３７℃で３０分間インキュベートした。続いて、これをリガンドでコーティングした皿に播き、接着アッセイ法を行なった。
【００４８】
図６Ｂに示すように、βｉｇ−ｈ３への細胞接着は、Ｍｎ２＋で強く促進され、程度は落ちるがＭｇ２＋で促進されるが、Ｃａ２＋ではわずかに促進されるのみだった。これらを合わせると、この結果はβｉｇ−ｈ３の細胞表面受容体が、βｉｇ−ｈ３との相互作用に２価陽イオンを必要とするＲＧＤ依存性インテグリンの一種であることを示す。
【００４９】
１−３：インテグリンに対するモノクローナル抗体を用いたβｉｇ−ｈ３の細胞表面受容体の同定
βｉｇ−ｈ３の受容体を同定するために、インテグリンのサブユニットの機能を阻害するモノクローナル抗体の、βｉｇ−ｈ３でコーティングされた表面へのＨＣＥ細胞の接着に対する効果を検討した。このため、まず、ＨＣＥ （３ ｘ １０５細胞／ｍｌ）を、種々のインテグリンに対するモノクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）の各々の存在下で、インキュベーション溶液中で、３７℃で３０分間あらかじめインキュベートした。あらかじめインキュベートされた細胞を、βｉｇ−ｈ３蛋白質であらかじめコーティングされたプレートに移し、さらに３７℃で１時間インキュベートし、ヘキソサミニダーゼ基質に結合するβｉｇ−ｈ３の定量分析を行なった。値は、モノクローナル抗体の非存在下でβｉｇ−ｈ３に接着する細胞数に対する割合で示される。
【００５０】
βｉｇ−ｈ３でコーティングされた表面への接着は、α３サブユニットに対する抗体によって、特異的に阻害された。インテグリンα３サブユニットは、インテグリンβ１サブユニットとカップルすることが知られているので、図６Ｃに示すように、抗β１抗体はβｉｇ−ｈ３に対する細胞接着を著しく阻害した。ＨＴ１０８０細胞を用いても、同様な結果が観察された。
【００５１】
機能阻害抗体の対照実験として、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、およびＩ型コラーゲンが基質として用いられた。ＨＣＥ細胞はインテグリンサブユニットに対する機能阻害モノクローナル抗体とあらかじめインキュベートし、１０μｇ／ｍｌフィブロネクチン、ビトロネクチン、Ｉ型コラーゲン、またはラミニンでコーティングされたウェルに移した。インキュベーション後、接着した細胞数が分析された。
【００５２】
フィブロネクチンに対する細胞接着は、インテグリンα３およびα５に対する抗体で、明らかに阻害された。図６Ｄに示すように、ビトロネクチンおよびＩ型コラーゲンヘの接着は、それぞれインテグリンαｖおよびα２に対する抗体で阻害されたが、ラミニンに対する細胞接着は、インテグリンα３およびα６に対する抗体で阻害された。一方で、β１インテグリンに対する抗体は、上述の全てのリガンドに対する細胞接着を効果的に阻害した。
【００５３】
別の対照実験として、α５インテグリンは発現するがα３インテグリンは発現しないことが既知のＫ５６２細胞が使用された。Ｋ５６２細胞を、βｉｇｈ３−ＷＴ、フィブロネクチン、ラミニン、またはＩ型コラーゲンでコーティングされたプレートに播き、１時間インキュベートした後、ヘキソサミニダーゼ分析を行なった。Ｋ５６２細胞はβｉｇ−ｈ３には接着しなかったが、フィブロネクチンとビトロネクチンには接着した。これらの結果を合わせると、図６Ｅに示すように、インテグリンα３β１はＨＣＥ細胞においてβｉｇ−ｈ３の特異的な受容体であることが示唆される。
【００５４】
実施例２：βｉｇ−ｈ３の細胞接着活性に必須のドメインの同定
βｉｇ−ｈ３の細胞接着活性を付与する必須のアミノ酸を同定するために、各繰り返しドメインが細胞接着を仲介する能力があるか決定するために調べた。
【００５５】
４つの繰り返しドメインにそれぞれ対応する４つの組換え蛋白質が調製された：図７のように、アミノ酸１２９〜２４１位、２３７〜３７７位、３６８〜５０６位、および４９８〜６３７位をそれぞれコードしている４つのβｉｇ−ｈ３ ｃＤＮＡ断片をＰＣＲで増幅し、ｐＥＴ−２９ｂ （＋）のＥｃｏＲＶ−ＸｈｏＩ部位にクローニングし、得られた４つの発現ベクターｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−Ｉ、ｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩ、ｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩＩ、およびｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶを用いて、組換え蛋白質が調製された。発現ベクターｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩおよびｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶによる大腸菌形質転換体は、大腸菌ＢＬ２１／Ｈｉｓβ−ｇおよび大腸菌ＢＬ２１／Ｈｉｓβ−ｅと命名され、それぞれ受託番号ＫＣＴＣ ０９０５ＢＰおよびＫＣＴＣ ０９０４ＢＰとして、韓国バイオサイエンス・バイオテクロノジー研究所（Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （ＫＲＩＢＢ）のコリアンコレクションフォータイプカルチャー（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）に２０００年１２月４日に寄託された。
【００５６】
組換え蛋白質βｉｇ−ｈ３ Ｄ−Ｉ、βｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩ、βｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＩＩ、およびβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶの発現および精製は、実施例１−１に記述される手順に従い、図８に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定された。
【００５７】
図９に示すように、細胞接着の仲介に関して、第２および第４ ｆａｓ−１ドメインは野生型βｉｇ−ｈ３と比較して同様に活性であるが、第１のｆａｓ−１ドメインは弱く、第３のｆａｓ−１ドメインは全く活性を持たなかった。
【００５８】
インテグリンサブユニットに対する機能阻害抗体を用いた実験では、図１０に示すように、第２および第４ ｆａｓ−１ドメインに仲介される細胞接着のいずれも、α３およびβ１インテグリンに対する抗体でほぼ完全に阻害され、これは第２および第４ ｆａｓ−１ドメインの両方が、α３β１インテグリンとの相互作用に必須のアミノ酸を持つことを示唆する。第１および第３ドメインはＨ１またはＨ２配列を持つが、細胞接着活性は持たないので、これらの結果はまた、Ｈ１配列もＨ２配列もβｉｇ−ｈ３の細胞接着活性を仲介しないという結論を支持する。
【００５９】
実施例３：βｉｇ−ｈ３の細胞接着に必須の保存されたアミノ酸配列の同定
３−１：アミノ酸配列のアライメントによる、保存されたモチーフの同定
独立して細胞接着を示すβｉｇ−ｈ３の第２および第４ ｆａｓ−１ドメインにおける細胞接着を担うアミノ酸配列を見つけるために、βｉｇ−ｈ３の繰り返しｆａｓ−１ドメイン間のみならず、他の蛋白質のｆａｓ−１ドメイン間の相同性に基づくコンピュータ検索が行われた。その結果、図１１に示すように、Ｈ２領域の近くの２つのアミノ酸、アスパラギン酸およびイソロイシンが、種々の蛋白質間で高度に保存されていることが分かった。さらに、アスパラギン酸およびイソロイシンは、いずれも高度な細胞接着活性を持つβｉｇ−ｈ３の第２および第４ ｆａｓ−１ドメイン中で保存されているが、中程度の細胞接着活性を示す第１ ｆａｓ−１ドメインではアスパラギン酸しか保存されていないことが分かった。細胞接着活性を示さない第３ ｆａｓ−１ドメインは、２つのアミノ酸のいずれも持たない。この事実は、さらにＨ２領域近くのアスパラギン酸およびイソロイシン残基が、細胞接着および伸長活性の仲介には不可欠であるという根拠となる。
【００６０】
３−２：置換変異体を用いた保存されたアミノ酸配列の細胞接着活性の同定
２つのアミノ酸が細胞接着に必須であることをさらに確認するために、βｉｇ−ｈ３の第４ ｆａｓ−１ ドメインを含む組換え蛋白質に、図１２に示すように置換によって変異を導入した。βｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶの置換変異体をＰＣＲによって調製し、塩基配列決定で配列を確認した。変異蛋白質は、実施例１−１と同様に単離および精製し、図１３に示すようにＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【００６１】
βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶのＰｒｏ６１６、Ａｓｐ６１７およびＩｌｅ６１８が組み合せでそれぞれＳｅｒ、ＡｌａおよびＳｅｒで置換されている変異蛋白質の細胞接着活性が調べられた。Ａｓｐ６１７の代わりにＡｌａを持つＤ６１７Ａ （βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ−ＰａＩ）と命名された変異蛋白質、およびＩｌｅ６１８の代わりにＳｅｒを持つＩ６１８Ｓ （βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ−ＰＤｓ）と命名された変異蛋白質は、細胞接着を著しく阻害したが、Ｐｒｏ６１６の代わりにＳｅｒを持つＰ６１６Ｓ （βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ−ｓＤＩ）と命名された変異蛋白質は、細胞接着活性に影響がないことがわかった。３つのアミノ酸が変異しているＰ６１６Ｓ／Ｄ６１７Ａ／Ｉ６１８Ｓ （βｉｇｈ３ ＤＩＶ−ｓａｓ）と命名された変異蛋白質も、図１４に示すように、細胞接着を阻害した。
【００６２】
Ａｓｐ６１７およびＩｌｅ６１８に変異のある第１ ｆａｓ−１ドメインにおいて、第１ ｆａｓ−１ドメインを介した細胞接着活性がほぼ完全に失われたことは、６１７番目の位置のアスパラギン酸および６１８番目の位置のイソロイシンが、βｉｇｈ３の細胞接着活性の仲介に非常に重要なことを証明した。
【００６３】
実施例４：創傷治癒をもたらすβｉｇｈ３ドメインの同定
４−１：組換えβｉｇｈ３蛋白質の発現および精製
細胞接着において活性のあるβｉｇ−ｈ３ドメインのみで、４つ全てのｆａｓ−１ドメインを含む天然型βｉｇ−ｈ３のような創傷治癒機能を示すかどうかを調べるため、図１５に示すような種々の組換えβｉｇｈ３蛋白質が調製された：４つのｆａｓ−１ドメインを全て含むＨｉｓ−β−ｂ；第４ドメインのみを含むβｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ；および各々少なくとも１つの第４ドメインを含むβｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ、βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ２Ｘ、βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ３Ｘおよびβｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ４Ｘ。実施例１で調製されたβｉｇｈ３−ＷＴと同じ細胞接着活性を示す組換えβｉｇ−ｈ３蛋白質Ｈｉｓ−β−ｂは、組換え発現ベクターｐＥＴ−２９βから、そのＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ部位にβｉｇ−ｈ３ ｃＤＮＡからあるアミノ末端領域を削除して得られたＡｓｐ７１８−ＢｇｌＩＩ断片を結合して、調製された。組換え蛋白質Ｈｉｓ−β−ｂおよびβｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶは、実施例１−１および実施例３と同様にして発現および精製された。
【００６４】
βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ、βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ２Ｘ、βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ３Ｘおよびβｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ４Ｘのように少なくとも１つの第４ドメインを含む組換え蛋白質は、以下のように調製された。第４ドメインに対応するアミノ酸４９８〜６３７位をコードするＤＮＡ断片をＰＣＲで調製し、このＰＣＲ産物をクレノウ酵素によって平滑末端にした。この平滑末端ｃＤＮＡ断片をβｉｇ−ｈ３の第４ドメインを含むｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶのＥｃｏＲＶ部位に挿入し、得られた発現ベクターをｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ２Ｘと命名した。ｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ２Ｘの挿入断片はＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩによる消化によって切り出し、クレノウ処理で平滑末端にし、この平滑末端断片をｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶおよびｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ２ＸのＥｃｏＲＶ部位に挿入した。得られた発現ベクターはｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ３Ｘおよびｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ４Ｘと命名された。全ての組換え蛋白質の発現は、１ ｍＭ ＩＰＴＧの存在下で３時間誘導され、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離された。単離された組換え蛋白質は、５０ ｍＭ ＮａＣｌおよび３００ ｍＭイミダゾールを含む２０ ｍＭトリス塩酸によって溶出して精製した。図１６Ａに示すように、βｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ２Ｘ、βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ３Ｘおよびβｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ４Ｘは、４つの全てのドメインを含むβｉｇ−ｈ３組換え蛋白質とは異なり、可溶性の形態で合成され、変性を受けないので、大量に生成可能である。図１６Ｂに示すように、非変性ゲルを用いた電気泳動では、βｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶはポリマーを形成しないが、２Ｘは部分的にポリマーを形成し、３Ｘおよび４Ｘはそれぞれ簡単にポリマーを形成することが分かった。
【００６５】
βｉｇ−ｈ３の第４ドメインを４つ含む発現ベクターｐβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ４Ｘを持つ大腸菌ＢＬ２１／Ｈｉｓ β−ｅ４Ｘは、受託番号ＫＣＴＣ ０９０６ＢＰとして、韓国バイオサイエンス・バイオテクロノジー研究所（Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ） （ＫＲＩＢＢ）のコリアンコレクションフォータイプカルチャー（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ）に２０００年１２月４日に寄託された。
【００６６】
陽性対照のフィブロネクチンは、ラットクエン酸血漿から、ゼラチン−セファロース４Ｂを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。血漿は非置換セファロース４Ｂから室温で濾過され、溶出液は０．０５ Ｍ ＥＡＣＡ（εアミノカプロン酸）、０．０２ Ｍクエン酸ナトリウム、および０．０２％アジ化ナトリウムを含む０．０５ Ｍトリス塩酸で平衡化したゼラチンセファロース４Ｂに添加した。溶出後、大部分の血漿蛋白質は、１ Ｍ塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗い出された。その後、吸収されたフィブロネクチンは３ Ｍ尿酸等張緩衝液で溶出し、その後、これをＰＢＳ、ｐＨ ７．２に対して約４８時間透析してフィブロネクチンを精製した。濃度は２８０ ｎｍのＵＶ吸光度で決定し、凍結乾燥してから−２０℃で保存した。
【００６７】
４−２：第４ドメインを含むβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶの創傷治癒活性の測定
天然型βｉｇ−ｈ３蛋白質のように４つのｆａｓ−１ドメイン全てを含む組換えβｉｇ−ｈ３蛋白質Ｈｉｓ−β−ｂと、第４ドメインのみを含む組換えβｉｇ−ｈ３蛋白質βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶの創傷治癒活性を比較するために、組換え蛋白質を含む軟膏基剤が以下のように試験された。
【００６８】
各々直径が２ ｃｍの４つの真皮層全体の創傷を、ラットの背中に作製し、塗布される軟膏によって試験群１−Ａ、１−Ｂ、１−Ｃおよび１−Ｄに分割した。
【００６９】
１−Ａ：物質と混合しない軟膏基剤を１日１ ｇｍの用量でコーティングした。
【００７０】
１−Ｂ：フィブロネクチンが１００μｇ／ｍｌの濃度で基剤と混合された軟膏を１日１ ｇｍの用量でコーティングした。
【００７１】
１−Ｃ：Ｈｉｓβ−ｂ蛋白質が１００μｇ／ｍｌの濃度で基剤と混合された軟膏を１日１ ｇｍの用量でコーティングした。
【００７２】
１−Ｄ：βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ蛋白質が１００μｇ／ｍｌの濃度で基剤と混合された軟膏を１日１ ｇｍの用量でコーティングした。
【００７３】
エーテル麻酔したラットの背中を刈り込み、ベタジン溶液で刈り込んだ領域を滅菌した。試験群１では、各ラットの背中をＮｏ．１５の外科用ナイフを用いて切り、真皮層全体を貫通する直径２ ｃｍの４つの円形の創傷を作製した。試験群１−Ａ、１−Ｂ、１−Ｃおよび１−Ｄ用の軟膏を創傷に約１ ｇの量で塗布し、これを合成ドレッシング（テガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）３Ｍ（登録商標））で覆い、軽く包帯を当てた。軟膏の塗布は、毎日行なった。
【００７４】
各軟膏には、水性物質（ＳａｍＡ基剤）と共に、１ ｇあたり、鯨蝋３８ ｍｇ、ステアリルアルコール１１６ ｍｇ、ポリエチルグリコール３８ ｍｇ、濃縮グリセリン１９２ ｍｇ、エタノール２３ ｍｇ、ラウリル硫酸ナトリウム ｍｇ（？？）、エチルパラオキシベンゾエート０．８７ ｍｇ、ブチルパラオキシベンゾエート０．１２ ｍｇ、および精製水が含まれていた。
【００７５】
まず、創傷の形態が観察された。各創傷の近くに同一のものさしを置き、各創傷から同一の距離で写真を撮影した。写真はコンピュータでスキャンし、ＮＩＨイメージ解析システム（Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｃｓ）を用いて創傷の面積の測定に用いた。写真をとるために、ラットをエーテル麻酔し、筋肉を完全に弛緩させた。測定は２２日目まで、１日おきに１回行なった。試験群間の比較のために、ＡＮＯＶＡ検定およびシェファー（Ｓｃｈｅｆｆｅｒ）検定にしたがって、測定値を解析した。
【００７６】
全ての試験群において、創傷面積は創傷の形成直後から次第に低下した。フィブロネクチンおよび組換えβｉｇ−ｈ３蛋白質が塗布された試験群では、軟膏基剤のみが塗布された試験群よりも創傷面積が早く低下した。軟膏塗布の７日目以降に、創傷面積に有意差が見られた。統計的には、Ｉ−Ａ群間および他の群間に、有意差（ｐ＜０．０５）が見られたが、それらの群の間では、有意差は見られなかった。結果を以下の表１および図１７に示す。
【００７７】
2004521605.tif 000003
値：平均±標準偏差
＊：ＡＮＯＶＡおよびシェファー検定でｐ＜０．０５
ａ， ｂ：垂直的に統計的有意差のあるデータ
【００７８】
組織学的分析は、光学顕微鏡下で行なった。創傷部位の生検は、３日目、７日目、１０日目、１４日目および２０日目に採取し、１０％ホルマリンで固定し、パラフィンで固めた。サンプルの６μｍの切片をヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）およびマッソン３色染色法で染色してから顕微鏡で観察した。各試験物質の時間による創傷治癒効果は、再上皮化および膠原線維の形成で評価した。再上皮化については、上皮層がない場合をゼロ、上皮化の開始を１＋、不完全な上皮層構造を２＋、完全な上皮層構造を３＋として、上皮の形成を半定量化した。試験群間の比較および各郡内での時間による差については、ＡＮＯＶＡ検定およびシェファー検定を用いて、測定値を統計的に解析した。膠原線維の形成については、３色染色で膠原線維の形成があまり観察されない場合に１＋、膠原線維がまばらに形成されている場合に２＋、密な膠原線維が観察されれば３＋と等級付けした。
【００７９】
光学顕微鏡観察では、再上皮化は試験群１−Ｂ、１−Ｃ、および１−Ｄでは７〜１０日目に開始し、２０日に完了した。これに対して対照群１−Ａでは、再上皮化は１４日でもまだ開始しておらず、２０日には完了していない。結果を以下の表２および図１８に示す。
【００８０】
2004521605.tif 000004
【００８１】
膠原線維形成の結果を以下の表３に示す。表３に見られるように、試験群１−Ａおよび１−Ｄでは、７日目まで等級＋１が継続し、膠原線維はあまり形成されていないが、試験群１−Ｂおよび１−Ｃでは２＋となっている。しかし、１０日目には全ての試験群で２＋となり、比較的豊富な膠原線維が見られた。図１９に示すように、１４日目には、膠原線維が密に形成され、きちんと配列されていた。当然、膠原線維がより密であれば、創傷治癒過程が改善していることを意味する。
【００８２】
2004521605.tif 000005
膠原線維の形成段階
０：なし
１＋：あまりない
２＋：まばらに形成
３＋：非常に密
【００８３】
４−３：少なくとも１つの第４ドメインを含む組換え蛋白質βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ、βｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ２Ｘ、βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ３Ｘおよびβｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ４Ｘの創傷治癒効果
第４ドメインのみを含むβｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶが創傷治癒に有効であるという知見に基づいて、創傷治癒活性をアッセイするために、第４ドメインをそれぞれ２重、３重および４重に含むβｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ２Ｘ、βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ３Ｘおよびβｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ４Ｘが調製された。
【００８４】
実施例１−２と同様にして、組換え蛋白質のＨＣＥ細胞接着活性をアッセイした。結果は図２０に示されている。組換え蛋白質βｉｇ−ｈ３−Ｄ−ＩＶ、βｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ２Ｘ、βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ３Ｘおよびβｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ４Ｘは、すべてＨＣＥ細胞の接着の誘導に有効であることがわかった。
【００８５】
組換え蛋白質の創傷治癒効果を調べるために、以下の実験を行なった。
【００８６】
体重２５０〜３００ ｇｍのＳＤ（Ｓｐｒａｑｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）系統のラットを、一定の温度および湿度で、標準的飼料を用いて飼育した。
【００８７】
試験群２では、各ラットの背中に、真皮層全体を通る４つの円形創傷が形成され、関心のある材料と混合したキトサン基剤でコーティングされた。
２−Ａ：キトサン基剤のみでコーティングした創傷
２−Ｂ：５００μｇ／ｍｌのフィブロネクチンと混合したキトサン基剤でコーティングされた創傷
２−Ｅ：５００μｇ／ｍｌのβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ３Ｘ蛋白質と混合したキトサン基剤でコーティングされた創傷
２−Ｆ：５００μｇ／ｍｌのβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ４Ｘ蛋白質と混合したキトサン基剤でコーティングされた創傷
【００８８】
キトサン基剤の複合物は、以下のように調製された。分子量６００，０００ Ｄａの可溶性キトサン（ポリ（１−４） ２−アミノ−２−デオキシ−β−Ｄ−グルカン）１ ｇを無菌蒸留水１００ ｍｌに溶解し、得られた１％溶液を２ ｍｌずつ１２穴のプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）に分注し、その後、１ウェルあたり１００μｇのゲンタマイシンを添加した。フィブロネクチン、βｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ ３Ｘおよびβｉｇｈ３ Ｄ−ＩＶ ４Ｘは、濃度が５００μｇ／ｍｌになるように個々に添加し、−７０℃で凍結し、凍結乾燥機（Ｉｌｓｈｉｎ）で１２時間凍結乾燥して円盤型の複合物を得た。
【００８９】
エーテル麻酔したラットの背中を刈り込み、刈り込んだ部分をベタジン溶液で滅菌した。真皮層全体を貫通する直径７ ｍｍの４つの円形の創傷を各ラットの背中に形成した。創傷を試験群２−Ａ、２−Ｂ、２−Ｅおよび２−Ｆに使用した複合物でそれぞれ覆い、テガダーム（登録商標） （３Ｍ）で覆って、軽く包帯を当てた。複合物は、３日ごとに新しいものに交換した。
【００９０】
実施例４−２のように、創傷治癒効果は創傷の外見によって評価した。
【００９１】
組換え蛋白質βｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ３Ｘまたはβｉｇ−ｈ３ Ｄ−ＩＶ ４Ｘを含む複合物から、高い創傷治癒効果が得られた。
【００９２】
試験群２−Ａの全てのラット、試験群２−Ｂの１匹、および試験群２−Ｅおよび２−Ｆ各々における２匹ずつを除いて、全てのラットは１２日から１５日目で創傷から完全に回復した。全ての創傷は、創傷の形成直後にサイズが縮小した。試験群２−Ａでは、創傷面積は治癒期間全体にわたって、比較的ゆっくりと低下することが観察された。他の試験群では、創傷面積は最初の３日間に大きく低下し、９日目まで次第に低下し、その後、再び大きく低下した。創傷間の比較に注目すると、表４および図２１に示されるように、試験群２−Ａよりも、試験群２−Ｂ、２−Ｅ、および２−Ｆにおいて、１５日間の全期間に大きな有意差（ｐ＜０．０５）が見られた。
【００９３】
2004521605.tif 000006
値：平均±標準偏差
＋：ＡＮＯＶＡ検定でｐ＜０．０５
ａ， ｂ：統計的有意差のあるデータ
【００９４】
したがって、βｉｇ−ｈ３の第２および第４ドメインを含む本発明の組換え蛋白質は、単独または組み合せ、または複数で、細胞接着および創傷治癒に有効であり、究極的に細胞培養および創傷治癒剤の開発に用いることができる。
【００９５】
産業への応用可能性
本発明では、インテグリンとの会合に必須であることが既知の１つのアスパラギン酸残基および１つのイソロイシン残基が高度に保存されている、βｉｇ−ｈ３の第２および第４ドメインを少なくとも１つ含む組換え蛋白質が提供される。また、組換え蛋白質自体は、細胞接着および創傷治癒に有用であり、細胞培養法および創傷治癒剤の開発に貢献できる。
【００９６】
本発明は例証を挙げて説明されており、使用された用語は限定ではなくむしろ説明のためのものであると意図され、理解されるべきである。上記の開示を考慮すると、本発明の多くの修正または変法が可能である。したがって、添付の特許請求の範囲内で、本発明は具体的に記述された以外の方法で実施され得ることを理解されるべきである。
2004521605.tif 000007
2004521605.tif 000008
2004521605.tif 000009
【図面の簡単な説明】
【図１】組換え蛋白質βｉｇｈ３−ＷＴおよびβｉｇｈ３−ΔＲＧＤを示す模式図であり、保存された領域は
2004521605.tif 000010
【図２】組換え蛋白質βｉｇｈ３−ＷＴおよびβｉｇｈ３−ΔＲＧＤのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す写真である。
【図３】クリスタルバイオレット染色の、組換え蛋白質βｉｇｈ３−ＷＴおよびβｉｇｈ３−ΔＲＧＤのＨＣＥ細胞接着および伸長効果を示す顕微鏡写真である。
【図４】組換え蛋白質βｉｇｈ３−ＷＴおよびβｉｇｈ３−ΔＲＧＤのＨＣＥ細胞の接着および伸長活性が、接着した細胞の数（Ａ）および表面積（Ｂ）で測定したところ、濃度依存的であることがわかる曲線を示す。
【図５】組換え蛋白質βｉｇｈ３−ＷＴおよびβｉｇｈ３−ΔＲＧＤのＨＣＥ細胞接着活性を、接着した細胞の数（Ａ）および表面積（Ｂ）について比較したヒストグラムを示す。
【図６Ａ】組換え蛋白質βｉｇｈ３−ＷＴおよびβｉｇｈ３−ΔＲＧＤのＨＣＥ細胞接着活性に対する種々の化合物の効果を示すヒストグラムである。
【図６Ｂ】組換え蛋白質βｉｇｈ３−ＷＴのＨＣＥ細胞接着活性に対する種々の２価の陽イオンの影響を示すヒストグラムである。
【図６Ｃ】組換え蛋白質βｉｇｈ３−ＷＴのＨＣＥ細胞接着活性に対する抗インテグリンモノクローナル抗体の阻害効果を示すヒストグラムである。
【図６Ｄ】種々の蛋白質のＨＣＥ細胞接着活性に対する抗インテグリンモノクローナル抗体の阻害効果を示すヒストグラムである。
【図６Ｅ】組換え蛋白質βｉｇｈ３−ＷＴおよびマトリックス蛋白質へのＫ５６２細胞の接着特異性を示すヒストグラムである。
【図７】βｉｇ−ｈ３のｆａｓ−１ドメインのそれぞれを持つ組換え蛋白質を示す模式図である。
【図８】βｉｇ−ｈ３のｆａｓ−１ドメインを含む組換え蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す写真である。
【図９】βｉｇ−ｈ３のｆａｓ−１ドメインを含む組換え蛋白質のＨＣＥ細胞接着活性を示すヒストグラムである。
【図１０】βｉｇ−ｈ３のｆａｓ−１ドメインを含む組換え蛋白質のＨＣＥ細胞接着活性に対する抗インテグリン抗体の阻害効果を示すヒストグラムである。
【図１１】ｆａｓ−１ドメインを含む種々のマトリックス蛋白質のアミノ酸配列の一部を示す。
【図１２】βｉｇ−ｈ３の第４ドメインの置換変異体を示す模式図である。
【図１３】βｉｇ−ｈ３の第４ドメインの組換え置換変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す写真である。
【図１４】βｉｇ−ｈ３の第４ドメインの置換変異体の細胞接着活性を示すヒストグラムである。
【図１５】βｉｇ−ｈ３の第４ドメインを１コピー、２コピー、３コピー、および４コピー含む、組換え蛋白質βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ、βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ２Ｘ、βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ３Ｘ、およびβｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ４Ｘを示す模式図である。
【図１６】１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ （Ａ）および８％非変性ＰＡＧＥ （Ｂ）で流した、Ｎｉ−ＮＴＡアガロース樹脂を用いて精製した組換え蛋白質βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ、βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ２Ｘ、βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ３Ｘ、およびβｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ４Ｘの写真を示す。
【図１７】軟膏基剤単独（Ａ）を塗布された、およびこの軟膏基剤とフィブロネクチン（Ｂ）、Ｈｉｓ−β−ｂ （Ｃ）、およびβｉｇ−ｈ３−Ｄ−ＩＶ （Ｄ）を合わせて塗布した創傷の光学写真を示す。
【図１８】軟膏基剤単独（Ａ）で治療された、およびこの軟膏基剤とフィブロネクチン（Ｂ）、Ｈｉｓ−β−ｂ （Ｃ）、およびβｉｇ−ｈ３−Ｄ−ＩＶ （Ｄ）を合わせて治療された後の、再上皮化の過程にある創傷の顕微鏡写真を示す。
【図１９】軟膏基剤単独（Ａ）で治療された、およびこの軟膏基剤とフィブロネクチン（Ｂ）、Ｈｉｓ−β−ｂ （Ｃ）、およびβｉｇ−ｈ３−Ｄ−ＩＶ （Ｄ）を合わせて治療された後に形成された膠原線維を持つ創傷の光学写真である。
【図２０】βｉｇ−ｈ３の第４ドメインを少なくとも１コピー含む組換え蛋白質βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ、βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ２Ｘ、βｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ３Ｘ、およびβｉｇｈ３−Ｄ−ＩＶ ４ＸのＨＣＥ細胞接着活性を示すヒストグラムである。
【図２１】キトサン基質単独（Ａ）で治療された、およびこの軟膏基剤とフィブロネクチン（Ｂ）、βｉｇ−ｈ３ ３Ｘ （Ｃ）、およびβｉｇ−ｈ３ ４Ｘ （Ｄ）を合わせて治療された後に面積が縮小した創傷の光学写真を示す。
【図１】
2004521605.tif 000011
【図２】
2004521605.tif 000012
【図３】
2004521605.tif 000013
【図４】
2004521605.tif 000014
【図５】
2004521605.tif 000015
【図６Ａ】
2004521605.tif 000016
【図６Ｂ】
2004521605.tif 000017
【図６Ｃ】
2004521605.tif 000018
【図６Ｄ】
2004521605.tif 000019
【図６Ｅ】
2004521605.tif 000020
【図７】
2004521605.tif 000021
【図８】
2004521605.tif 000022
【図９】
2004521605.tif 000023
【図１０】
2004521605.tif 000024
【図１１】
2004521605.tif 000025
【図１２】
2004521605.tif 000026
【図１３】
2004521605.tif 000027
【図１４】
2004521605.tif 000028
【図１５】
2004521605.tif 000029
【図１６】
2004521605.tif 000030
【図１７】
2004521605.tif 000031
【図１８】
2004521605.tif 000032
【図１９】
2004521605.tif 000033
【図２０】
2004521605.tif 000034
【図２１】
2004521605.tif 000035
【国際公開パンフレット】
2004521605.tif 000036
2004521605.tif 000037
2004521605.tif 000038
2004521605.tif 000039
2004521605.tif 000040
2004521605.tif 000041
2004521605.tif 000042
2004521605.tif 000043
2004521605.tif 000044
2004521605.tif 000045
2004521605.tif 000046
2004521605.tif 000047
2004521605.tif 000048
2004521605.tif 000049
2004521605.tif 000050
2004521605.tif 000051
2004521605.tif 000052
2004521605.tif 000053
2004521605.tif 000054
2004521605.tif 000055
2004521605.tif 000056
2004521605.tif 000057
2004521605.tif 000058
2004521605.tif 000059
2004521605.tif 000060
2004521605.tif 000061
2004521605.tif 000062
2004521605.tif 000063
2004521605.tif 000064
2004521605.tif 000065
2004521605.tif 000066
2004521605.tif 000067
2004521605.tif 000068
2004521605.tif 000069
2004521605.tif 000070
2004521605.tif 000071
2004521605.tif 000072
2004521605.tif 000073
2004521605.tif 000074
2004521605.tif 000075
2004521605.tif 000076
2004521605.tif 000077
2004521605.tif 000078
2004521605.tif 000079
2004521605.tif 000080
2004521605.tif 000081
2004521605.tif 000082
2004521605.tif 000083
2004521605.tif 000084
2004521605.tif 000085
2004521605.tif 000086
2004521605.tif 000087
2004521605.tif 000088
2004521605.tif 000089
2004521605.tif 000090
2004521605.tif 000091
2004521605.tif 000092
2004521605.tif 000093
2004521605.tif 000094
2004521605.tif 000095
2004521605.tif 000096
2004521605.tif 000097
2004521605.tif 000098
2004521605.tif 000099
2004521605.tif 000100
2004521605.tif 000101
2004521605.tif 000102
2004521605.tif 000103
2004521605.tif 000104
2004521605.tif 000105
2004521605.tif 000106
2004521605.tif 000107
2004521605.tif 000108
【国際調査報告】
2004521605.tif 000109
2004521605.tif 000110