(57)【要約】本発明は、細胞及びタンパク質の基材への付着を、有効量の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンを含む組成物を基材に細胞及びタンパク質の付着が防止され又は大いに低減されるように適用することにより阻止する方法に関係する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
基材依存性細胞の基材への付着を阻止する方法であって、接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンコーティングを該基材に基材依存性細胞の付着が阻止されるように適用することを含む、当該方法。
【請求項２】
基材を、哺乳動物の細胞及び組織、非哺乳動物の細胞及び組織、医療用デバイス、発酵用ユニット、バイオリアクター及び固体支持体よりなる群から選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物組織が、軟らかい組織である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
哺乳動物組織が、硬い組織である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記の医療用デバイスを、ステント、カテーテル、コンタクトレンズ、胸部インプラント、ペースメーカー及びシャントよりなる移植可能な及び移植可能でないデバイスの群から選択する、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
基材依存性細胞を、繊維芽細胞、マクロファージ、上皮細胞、体細胞及び内皮細胞よりなる群から選択する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンが、接着性溶液、ヒドロゲル、ペースト、粒子、ビーズ、ペレット、再水和可能なフィルム又はスポンジである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンが、共有結合により架橋された、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンが、イオン結合により架橋された、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
タンパク質の基材への付着を阻止する方法であって、接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンコーティングを該基材に該タンパク質の付着が阻止されるように適用することを含む当該方法。
【請求項１１】
基材を、哺乳動物の細胞及び組織、非哺乳動物の細胞及び組織、医療用デバイス、発酵用ユニット、バイオリアクター及び固体支持体よりなる群から選択する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物組織が、軟らかい組織である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
哺乳動物組織が、硬い組織である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記の医療用デバイスを、ステント、カテーテル、コンタクトレンズ、胸部インプラント、ペースメーカー及びシャントよりなる群から選択する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンが、接着性溶液、ヒドロゲル、ペースト、粒子、ビーズ、ペレット、再水和可能なフィルム又はスポンジである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンが、共有結合により架橋された、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンが、イオン結合により架橋された、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
細胞集団を得るための方法であって：
ａ）培養培地に接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンを補い；
ｂ）該細胞集団をこの補った培地で増殖させ；
そして
ｃ）該細胞を増殖させて分化させる
ことを含み、該集団中の基材依存性細胞の増殖を阻止することを特徴とする上記の方法。
【請求項１９】
前記の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンが、溶液、ヒドロゲル又はペーストである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンヒドロゲルが、共有結合により架橋された、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンヒドロゲルが、イオン結合により架橋された、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記の集団中の基材依存性細胞の付着を阻止する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
タンパク質又は抗体生成における使用に適した細胞の集団を得るための方法であって：
ａ）培養培地に接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンを補い；
ｂ）該細胞集団をこの補った培地で増殖させる
ことを含み、該集団中での細胞間接着を阻止し且つ該タンパク質又は抗体の生成を増進させることを特徴とする上記の方法。
【請求項２４】
前記の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンが、溶液、ヒドロゲル又はペーストである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンヒドロゲルが、共有結合により架橋された、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンヒドロゲルが、イオン結合により架橋された、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記の集団中の基材依存性細胞の付着を阻止する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
炎症細胞又はタンパク質の医療用デバイスへの付着を阻止する方法であって、該デバイスを接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンで、炎症細胞の付着が阻止されるようにコーティングすることを含む当該方法。
【請求項２９】
前記の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンが、接着性溶液、ヒドロゲル、再水和可能なフィルム又はスポンジである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンが、共有結合により架橋された、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記の接着性Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンが、イオン結合により架橋された、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記の医療用デバイスを、ステント、カテーテル、ペースメーカー、胸部インプラント、コンタクトレンズ及びシャントよりなる群から選択する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記の炎症細胞を、繊維芽細胞、マクロファージ、単球及びリンパ球よりなる群から選択する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
固体支持体と接触する細胞ベースの製品において基材依存性細胞の付着を阻止する方法であって、該細胞ベースの製品を接着性ＮＯＣＣコーティングを有する固体支持体と接触させることを含む当該方法。
【請求項３５】
前記のＮ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンが、接着性溶液、ヒドロゲル、ペースト、再水和可能なフィルム又はスポンジである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記のＮ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンが、共有結合により架橋された、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記のＮ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンが、イオン結合により架橋された、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記のＮ，Ｏ−カルボキシメチルキトサンを、前記の固体支持体上にコーティングする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記の細胞ベースの製品が、細胞培養物である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記の細胞ベースの製品が、生物学的試料である、請求項３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記の生物学的試料が、血液である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記の生物学的試料が、血漿である、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
細胞及びタンパク質の基材への付着は、多くの状況で提示された周知の問題である。例えば、抗体を生成するための培養において、繊維芽細胞は、組織培養基材に結合した細胞外マトリクスタンパク質に付着する。同様に、泌尿器用カテーテル中では、細菌細胞が、カテーテル壁に付着し；動脈カテーテル中では、血小板が、カテーテルの先端に付着し；そしてコンタクトレンズでは、タンパク質が、レンズの表面を覆う。
【０００２】
様々な生体用接着剤が、当分野では知られている。Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等の米国特許第４，６１５，６９７号は、生体用接着剤を、接着された２つのもの（切り出されたばかりのウサギの胃の切片）を離すのに、そこに開示された手順に従って少なくとも約５０ダイン／ｃｍ２の力を必要とする物質と規定している。Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等に開示されている生体用接着剤は、水膨潤性であるが、水不溶性の、繊維性の、架橋されたカルボキシ官能性ポリマーである。
【０００３】
この細胞及びタンパク質の基材への付着の問題を改善するための様々な試みが用いられてきたが、満足すべきものは見出されていない。この問題を、基材に接着して、細胞及びタンパク質の付着を阻止する生体適合性物質を用いて解決することは望ましいことである。
【０００４】
ある種の細胞例えばマクロファージ及び繊維芽細胞は、表面又は基材に付着した場合にのみ活性であって増殖するので、「基材依存性細胞」と呼ばれる。この付着は、細胞外マトリクス中に見出されるビトロネクチン及びフィブロネクチン等のタンパク質のファミリー（「付着分子又はタンパク質」）を介して起きる。強く接着する物質で被覆された表面は、細胞外マトリクスタンパク質の付着をブロックすることによって、基材依存性細胞の付着を阻止することができる。それ故、ここに記載したような接着性物質は、ある種のタンパク質及びある種の細胞の付着を阻止する組成物において有用であり又はかかる付着を阻止するデバイスを形成することができる。
【０００５】
発明の要約
本発明は、細胞の基材への付着を阻止する方法を特徴とする。この発明は、部分的に、Ｎ，Ｏ−カルボキシメチルキトサン（「ＮＯＣＣ」）の接着性コーティングの発見に基づいており、特に、ＮＯＣＣの接着性コーティングを哺乳動物の組織等の様々な基材に、基材依存性細胞等の他の細胞の付着を阻止するように適用することができるという発見に基づいている。更に、これらのＮＯＣＣの接着性コーティングが、細胞又はタンパク質の付着の阻止が望ましい他の領域（例えば、医療用デバイス上での細胞集団の調製及び細胞ベースの製品の製造）でも利用できるということが見出されている。この発明は又、タンパク質の表面への付着の阻止に対する応用をも有している。
【０００６】
本発明は、様々な合成材料及び哺乳動物組織に対して接着性の組成物を提供する。本発明は又、ＮＯＣＣの接着性コーティングを基材に細胞及びタンパク質の付着が阻止されるように適用することによって細胞及びタンパク質の基材への付着を阻止する方法をも提供する。この組成物中の接着性ＮＯＣＣの量は、基材依存性細胞の付着を阻止するのに有効なものであるべきであり、好ましくは、０．０５〜５％（ｗ／ｖ）の濃度、最も好ましくは、０．１〜２．５％（ｗ／ｖ）の濃度であるべきである。
【０００７】
一具体例において、この発明は、基材依存性細胞の基材への付着を、接着性ＮＯＣＣを含む組成物を基材に基材依存性細胞の付着が阻止されるように適用することによって阻止する組成物及び方法を提供する。この方法を応用して、基材依存性細胞の哺乳動物組織、医療用デバイス、発酵用ユニット、バイオリアクター及び固体支持体への付着を阻止することができる。好適具体例において、これらの阻止される基材依存性細胞には、繊維芽細胞、マクロファージ、上皮細胞及び内皮細胞が含まれる。
【０００８】
他の具体例において、この発明は、タンパク質の基材への付着を、接着性ＮＯＣＣを含む組成物をタンパク質様物質の付着が阻止されるように適用することによって阻止する組成物及び方法を提供する。この方法を応用して、タンパク質のコンタクトレンズ、医療用デバイス、発酵用ユニット、バイオリアクター及び固体支持体への付着を阻止することができる。
【０００９】
他の具体例において、この発明は、培養培地に接着性ＮＯＣＣを補い、その補った培地で細胞集団を増殖させ、それらの細胞を細胞集団内で基材依存性細胞が増殖しないように生育又は分化させることによって細胞集団例えば哺乳動物細胞を得るための方法において利用することができる。
【００１０】
他の具体例において、この発明は、タンパク質又は抗体の調製における利用に適した細胞を、培養培地に接着性ＮＯＣＣを補い、その補った培地で細胞を細胞集団内の細胞間付着（又は凝集）が阻止されてタンパク質又は抗体の生成が増進されるように増殖させることによって得るための方法を提供する。
【００１１】
更に別の具体例において、この発明は、炎症細胞及び血小板の医療用デバイスへの付着を、該デバイスを接着性ＮＯＣＣを含む組成物で血小板又は炎症細胞の医療用デバイスへの付着が阻止されるように被覆することによって阻止する方法を提供する。好適具体例において、体内式の医療用デバイスは、ステント又はシャントである。他の好適具体例において、炎症細胞には、繊維芽細胞、マクロファージ及び単球が含まれる。
【００１２】
更に別の具体例において、この発明は、固体支持体と接触する細胞ベースの製品における繊維芽細胞の付着を、接着性ＮＯＣＣをその細胞ベースの製品に繊維芽細胞の付着が阻止されるように導入することによって阻止する方法を含む。
【００１３】
他の具体例において、この発明は、軟らかい（粘膜性又は非粘膜性）組織又は硬い組織に対して接着性である接着性デバイス又は組成物により薬物、タンパク質及び他の治療剤を送達する組成物及び方法を提供する。好適具体例において、この接着性送達デバイスは、頬内、経口、膣内、吸入用送達システム等として利用することができる。このデバイスは、溶液、クリーム、ペレット、粒子、ビーズ、ゲル及びペーストを含む様々な形態であってよい。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞及びタンパク質の様々な基材への付着の阻止に関係する。この発明の方法は、細胞及びタンパク質の付着の阻止において予想外の利益を与えるＮ，Ｏ−カルボキシメチルキトサン（「ＮＯＣＣ」）の接着性コーティングを利用する。
【００１５】
ＮＯＣＣは、甲殻類及び多くの昆虫類の殻に見出されるキチンの誘導体である。キチン及びその誘導体は、通常、生体適合性であって、身体により自然に再吸収され、以前に、持続的な薬物放出、骨の誘導及び止血のために用いられた（Ｃｈａｎｄｙ及びＳｈａｒｍａ、Ｂｉｏｍａｔ．Ａｒｔ．Ｃｅｌｌｓ ＆ Ｉｍｍｏｂ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：７４５−７６０（１９９１）；Ｋｌｏｋｋｅｖｏｌｄ，Ｐ．等、Ｊ．Ｏｒａｌ．Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ．Ｓｕｒ．５０：４１−４５（１９９２））。その普及率のために、キチンは、廃棄物から比較的安価に、大規模に得ることができる。Ｈａｙｅｓの米国特許第４，６１９，９９５号（その全内容を本明細書中に参考として援用する）に開示されたように、ＮＯＣＣは、キトサン構造のグルコサミン単位のアミノ及び第一ヒドロキシル部位の両者の幾つかにカルボキシメチル置換基を有する。ＮＯＣＣは、非架橋型で溶液として利用することができ、又は安定なゲルへ架橋若しくは複合体化させることができる。その有利な物理的特性及び比較的安価であるために、ＮＯＣＣは、細胞及びタンパク質の付着の阻止における利用に対して有利な特性を提供する。
【００１６】
定義
用語「阻止する」（又はその任意の形態）は、その最も広い意味に定義され、最少化する、阻害する、抑える、抑圧する、抑制する、束縛する、制限する等を包含する。
【００１７】
用語「接着性ＮＯＣＣ」又は「ＮＯＣＣの接着性コーティング」は、実施例１に記載した手順を用いて、新たに切り出された組織間の少なくとも約１００ダイン／ｃｍ２の接着を示すＮＯＣＣのコーティング又は組成物を意味する。
【００１８】
用語「基材」は、細胞が付着することのできる任意の対象物をいう。基材の例には、哺乳動物の組織（骨等の硬い組織並びに粘膜及び非粘膜組織等の軟らかい組織を含む）、非哺乳動物組織、哺乳動物及び非哺乳動物の細胞（真核生物及び原核生物の両者を含む）、医療用デバイス、発酵用ユニット、バイオリアクター及び固体支持体（例えば、細胞培養プレート）が含まれるが、これらに限らない。
【００１９】
用語「基材依存性細胞」は、基材に付着した場合にのみ活性である細胞を意味する。基材依存性細胞の例には、繊維芽細胞、マクロファージ、上皮細胞、体細胞及び内皮細胞が含まれるが、これらに限らない。
【００２０】
用語「医療用デバイス」は、医学的理由により体内に移植され又はその一部が体内に及んでいる（カテーテル等）任意のデバイス並びに身体に付け又は接触させたときに医学的利益を与えるデバイスを意味する。医療用デバイスの例には、カテーテル、コンタクトレンズ、ステント、シャント、胸部インプラント及びペースメーカーが含まれるが、これらに限らない。
【００２１】
用語「炎症細胞」は、任意の型の身体的危害に対する非特異的免疫応答に関与する細胞を意味する。炎症細胞の例には、繊維芽細胞、マクロファージ、好中球、単球及びリンパ球が含まれるが、これらに限らない。
【００２２】
用語「細胞ベースの製品」は、細胞を含む任意の製品を意味する。細胞ベースの製品の例には、血液、血漿、細胞培養のアリコート等が含まれるが、これらに限らない。
【００２３】
この発明は、基材依存性細胞及びタンパク質の基材への付着を、接着性ＮＯＣＣを含む組成物を基材にそれらの基材依存性細胞又はタンパク質の付着が阻止されるように適用することによって阻止する方法を提供する。好適具体例において、この方法を応用して、基材依存性細胞の哺乳動物組織、医療用デバイス、発酵用ユニット、バイオリアクター及び固体支持体への付着を阻止する。好適具体例において、阻止される基材依存性細胞には、繊維芽細胞、マクロファージ、上皮細胞及び内皮細胞が含まれる。
【００２４】
この発明は又、細胞例えば哺乳動物細胞の集団を、培養培地に接着性ＮＯＣＣを補い、その補った培地において細胞集団を増殖させ、それらの細胞を基材依存性細胞がその細胞集団中で増殖しないように生育又は分化させることによって得るための方法において利用することもできる。
【００２５】
この発明は、更に、タンパク質及び抗体生成の効率を、培養培地に接着性ＮＯＣＣを補って、その補った培地において細胞を細胞集団内で細胞間付着が阻止され且つタンパク質又は抗体の生成が増進されるように増殖させることによって増大させる方法をも提供する。
【００２６】
この発明は又、炎症細胞又はタンパク質の医療用デバイスへの付着を、該デバイスを、接着性ＮＯＣＣを含む組成物で、炎症細胞又はタンパク質のその医療用デバイスへの付着が阻止されるように被覆することによって阻止する方法をも提供する。好適具体例において、医療用デバイスは、カテーテル、コンタクトレンズ、ステント、ペースメーカー、胸部インプラント又はシャントである。この方法は、繊維芽細胞、マクロファージ、単球を含む様々な炎症細胞並びにアルブミン等のタンパク質の付着の防止に有用である。
【００２７】
更に別の具体例において、この発明は、固体支持体と接触する細胞ベースの製品中の繊維芽細胞の付着を、その細胞ベースの製品を接着性のコーティングをされた固体支持体に繊維芽細胞の付着が阻止されるように導入することによって阻止する方法を包含する。
【００２８】
本発明において利用する接着性ＮＯＣＣは、多くの形態をとることができる。例えば、接着性ＮＯＣＣは、溶液、ヒドロゲル、ペースト、再水和可能なフィルム、クリーム、泡又はスポンジにて用いることができる。これらの形態は、当業者に周知の方法によって調製される。
【００２９】
本発明で用いる接着性ＮＯＣＣは、親化合物であっても架橋されていてもよい。架橋された接着性ＮＯＣＣは、共有結合で架橋されていてもイオン的に架橋されていてもよい。ＮＯＣＣを架橋する様々な方法が当分野で知られており、この発明の範囲内にある。加えて、接着性ＮＯＣＣが架橋される程度を、当業者は、過度の実験をせずに、特定の応用のために最適化することができる。架橋の程度は、コーティングの接着強さにおおよそ反比例するということが見出されている。即ち、接着性ＮＯＣＣの架橋の程度が大きい程、接着の程度が低い。好適具体例において、架橋の程度は、１：５（架橋剤のモル数対ＮＯＣＣモノマーのモル数）未満であり、一層好ましくは１：１００〜１：１０００である（モルベース）。
【００３０】
幾つかの接着性ＮＯＣＣの生体接着強度を、Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈから入手可能なポリカルボフィル、架橋したアクリル酸ポリマーのそれと比較した。実施例１に一層完全に記載したように、低粘度及び高粘度のＮＯＣＣの溶液並びに高粘度のＮＯＣＣのヒドロゲルを調製した。生体接着剤を胃及び盲腸の組織試料に適用して、その生体接着強度を、米国特許第４，６１５，６９７号（参考として、本明細書中に援用する）に開示された手順の改変バージョンによって測定した。ポリマーの両組織表面への移行は、このポリマーの接着力が凝集力を上回ることを示した。結果の要約は、表１及び２並びに図２に示してある。好適具体例において、この発明の接着性ＮＯＣＣコーティングの生体接着強度は、望ましくは、少なくとも約１０００ダイン／ｃｍ２より大きく、一層好ましくは、少なくとも約２０００ダイン／ｃｍ２より大きく、最も好ましくは、少なくとも約３０００ダイン／ｃｍ２より大きい。
【００３１】
クエン酸緩衝液中の低粘度及び高粘度ＮＯＣＣポリマーの溶液は、共に、胃の組織の粘膜表面へのコーティングとして適用した際に、ポリカルボフィルと同様の挙動を示した（表１）。これは又、クエン酸緩衝液の代わりにリン酸緩衝塩溶液（並びに、非粘膜性、盲腸組織）を用いるＮＯＣＣの同様の溶液についても真であった（表２）。ＮＯＣＣが架橋されるにつれて、これらの材料の凝集力が増大して接着力が低下するということが認められた。凝集力の喪失は、架橋の程度に依存した。これらの発見が、接着性ＮＯＣＣの架橋が一層多くの構造をポリマーに導入する（これが結果的に組織表面との相互作用を制限する）という事実のせいであるということはありそうなことである。
【００３２】
ＮＯＣＣの骨組織に付着する能力も又、研究した。その結果は、ＮＯＣＣが骨組織に付着することを示している（図５）。第三回目の洗浄の後に、９．５×１０−３±０．００２μＬ／ｍｍ２（又は約０．１μｇＮＯＣＣ／ｍｍ２）の１２５Ｉ標識されたＮＯＣＣが、ラットの大腿骨に付着したままであった。
【００３３】
驚くべきことに、本発明の接着性ＮＯＣＣコーティングは、基材依存性細胞の細胞付着を阻止することが示された。それ故、本発明の接着性ＮＯＣＣコーティングは、多くの領域において応用可能性を有している。加えて、接着性ＮＯＣＣコーティングは、哺乳動物の硬い組織にも軟らかい組織にも適用することができる（例えば、骨又は胃の組織）。或は、接着性ＮＯＣＣコーティングは、非生物学的基材例えば医療用デバイス及び固体支持体に適用することができる。かかる基材の例には、ステント、シャント、コンタクトレンズ、ミクロ滴定プレート及び細胞培養プレートが含まれる。
【００３４】
典型的には、細胞又は組織培養物中の繊維芽細胞は、培養基材（通常、プラスチック）に結合した細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質に付着する。培養物中のＥＣＭタンパク質は、典型的には、これらのタンパク質並びに細胞成長に必要な他の因子を与えるように血清を補った培養培地に由来する。或は、もし培養培地中にＥＣＭタンパク質がないならば、繊維芽細胞は、それら自身のＥＣＭタンパク質を分泌してそれらに付着するであろう。正常な、付着性の繊維芽細胞は、非常に特徴的な形態を有している：即ち、それは、平らになって、細胞性付属肢即ち細胞から基材表面上に伸びる突起を示し、これは、繊維芽細胞がその基材に対して付着性であることを示す。
【００３５】
本発明は、接着性ＮＯＣＣコーティングの存在下で組織培養培地中にプレートされた基材依存性細胞例えば繊維芽細胞が、その特徴的形態を有さず、細胞の付着を示す突起を示さないという観察を利用する（図６ｂ）。
【００３６】
培地中の接着性ＮＯＣＣの存在下又は非存在下での、繊維芽細胞の形態の初期の観察は、繊維芽細胞が接着性ＮＯＣＣを有しない無血清培地にプレートされた場合には、それらが「粘着性」形態を示すこと、即ち、それらの細胞が平らになって複雑な突起を有するということを示した。実施例３に一層完全に記載したように、繊維芽細胞を、接着性ＮＯＣＣの存在下又は非存在下で、組織培養プレート上に、４つの異なるコーティング条件下でプレートした。コーティング処理に関係なく、観察された細胞の約８０％は、接着性ＮＯＣＣの非存在下で正常の培養繊維芽細胞のように見えた。対照的に、繊維芽細胞を接着性ＮＯＣＣの存在下でプレートした場合には、接着性形態を示す細胞の数は、有意に減少した。事実、ＥＣＭタンパク質が存在しない場合には、接着性ＮＯＣＣの存在下で、細胞は付着しなかった。ＥＣＭタンパク質が存在する場合には、幾つかの細胞付着が認められたが、その付着は、接着性ＮＯＣＣの非存在下で生じるものより有意に少なかった（図７）。
【００３７】
ヒアルロン酸（ＨＡ）も又、この系で試験して、それがＮＯＣＣと同様の効果を有するかどうかを測定した。同様の形態学的実験を、０．１％ＨＡを含むｓｆＲＰＭＩ（無血清又は無タンパク質ＲＰＭＩ培地）中にプレートした細胞において行ったとき、ＨＡは、繊維芽細胞の形態に対して同様の効果を有しないことが認められた（図８）。
【００３８】
繊維芽細胞の接着も又、５１Ｃｒ接着アッセイ（５１Ｃｒ放出アッセイ）を用いて定量的に測定した。その結果は、接着性ＮＯＣＣが３Ｔ３繊維芽細胞のプラスチックへの付着を９０％より多くブロックするということを、このアッセイを用いて確認した（図９）。この結果は、以前の仕事と合わせて、接着性ＮＯＣＣが基材に接着して、ＥＣＭタンパク質の付着を競争様式で邪魔するということを示唆している。
【００３９】
競争アッセイを、関心あるＥＣＭタンパク質を含む、変化する濃度のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補った培地を用いて、ＮＯＣＣの存在下又は非存在下で行った。予想されるように、プレート用培地中のＦＣＳの存在は、接着性ＮＯＣＣの繊維芽細胞接着に対する阻止効果を投与量依存様式で逆転させ、１０％ＦＣＳは、ＮＯＣＣの存在下で３Ｔ３のプレートへの結合を完全に回復させるということが見出された（図１０）。この効果については、次の２つの可能な説明がある：１）接着性ＮＯＣＣが、プレートに結合するＥＣＭタンパク質への繊維芽細胞の付着を妨げるか、又は２）接着性ＮＯＣＣが、ＥＣＭタンパク質のプレートへの結合を競争様式で妨げる。
【００４０】
これらの可能性を扱うために、組織培養プレートを、変化する濃度のＦＣＳを含む無血清培地を用いて予備コーティングした。接着性ＮＯＣＣの存在は、繊維芽細胞のＦＣＳコートしたプレートへの付着を邪魔せず、これは、接着性ＮＯＣＣが繊維芽細胞の、すでにプレート上に付着しているＥＣＭタンパク質への付着を阻止しないことを確認した（図１１）。この結果は、組織培養プレートを接着性ＮＯＣＣコーティングで被覆することにより確認された。その結果（図１２）は、接着性ＮＯＣＣ被覆されたプラスチックへの繊維芽細胞の付着がＦＣＳの存在下では排除されることを示している。この結果は、接着性ＮＯＣＣがプラスチックプレート表面に結合してＥＣＭタンパク質の沈着又は付着を防止するという仮説を支持する。従って、接着性ＮＯＣＣは、細胞付着を、繊維芽細胞のＥＣＭタンパク質への付着を阻止するよりもＥＣＭタンパク質の沈着を防止することによって阻止することができる。ＥＣＭタンパク質ネットワークの非存在下では、繊維芽細胞は、基材に結合することができない。
【００４１】
下記の、非制限的実施例は、この発明を更にはっきりさせるであろう。
【００４２】
実施例１
この実施例においては、幾つかの接着性ＮＯＣＣコーティング組成物の生体接着力を、ポリカルボフィルとのそれと比較する。ポリカルボフィル（Ｂ．Ｆ．Ｇｏｏｄｒｉｃｈ， Ａｋｒｏｎ， オハイオ）を、０．２Ｍ クエン酸緩衝液（ｐＨ４．８）及び０．９％塩溶液（ｐＨ６．８）の両方における４％ｗ／ｖ溶液として調製した。低粘度（「ＬＶ」）ＮＯＣＣ（２４０ｃｐｓ、ブルックフィールドスピンドル３、５０〜１００ｒｐｍ）を、クエン酸緩衝液（ｐＨ５．６）中の４％ｗ／ｖ溶液として調製した。高粘度（「ＨＶ」）ＮＯＣＣ（Ｐ７８ＮＯＣＣ１）を、クエン酸緩衝液（ｐＨ５．６）中の２．５％ｗ／ｖ溶液として調製した。高粘度ＮＯＣＣを、クエン酸緩衝液（ｐＨ５．６〜５．７）中で１％及び２．５％として調製し、オートクレーブにかけて架橋した（１：５００）。ＨＶ ＮＯＣＣを、リン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）中の２．５％溶液としても調製した。ゲルを１％ＨＶ ＮＯＣＣから、ＰＢＳ中で架橋させることにより（１：１００）及びオートクレーブ後に塩溶液中で架橋させることにより（１：２５０）形成した。
【００４３】
胃及び盲腸の両組織を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから、試験直前に採取して、塩溶液中で湿らせておいた。組織試料を、円形プラスチックディスク上に載せて、胃の組織の内面と盲腸組織の外面を露出させた。組織試料を、これらのプラスチックディスクの端の周りに、縫合糸で適所に保持した。これらのディスクは、３及び５ｍｌのシリンジのプランジャーから得られたものであり；ディスクの直径は、それぞれ、７．０（表面積３８．５ｍｍ２）及び９．５ｍｍ（表面積７０．９ｍｍ２）であった。これらの組織ホルダーを、ＭＴＳサーボ水圧式材料試験機のカンチレバーロードセル及びアクチュエーターに取り付けた（図１参照）。
【００４４】
温度補償ロードセルを、デイトロニック３７２０ストレインゲージコンディショニングユニットに、ハーフブリッジ構成で、針金で結びつけた。データの収集を、ｌａｂＶＩＥＷソフトウェア及び１２ビットＮＢ−ＭＩＯ−１６データ収集ボードを備えたマッキントッシュセントリス６５０コンピューターを用いて行った。このカンチレバーロードセルを、０〜３グラムの作動範囲にわたって、Ｍｅｔｔｌｅｒ ＰＪ ３６０バランスにて照合された一連の検定用マス（０．１、０．２３、０．５、１〜３．０ｇ）を用いて較正した。少なくとも、結果の出力をボルトからグラム重に変換するための平方較正曲線を決定した。
【００４５】
新鮮な組織試料の対の一層小さい直径の組織は、３０μｌの試験材料を受けた。ソフトウェアは、組織試料を取り付けて生体用接着剤のコーティングを塗布した後にゼロの読みとなるように設計された。次いで、この試験用システムのアクチュエーターを、変位ポテンシオメーターを用いて手動で進めて、合せ面を加圧し、同時に、生じた荷重レベルをコンピューターモニターにて視覚的にモニターした。合せ面を０．９ｇの名目荷重で１分間加圧されたままにした。次いで、コンピューターは、アクチュエーターを１２．０ｍｍ／分の一定速度で変位させて、伸延力を経時的にモニターした。破壊後に、コンピューターは、ピーク伸延荷重を測定し、荷重曲線をスプレッドシートファイルに保存した。
【００４６】
同じ試料の反復試験のために、これらの組織を注射針の側部を用いてこすり、適宜クエン酸緩衝液又は水ですすぎ、そして同じポリマーの新たなアリコートを塗布した。新鮮な組織を異なる各ポリマー試料に対して用い；すべてのクエン酸緩衝液中の試料を胃の組織について試験して、中性ｐＨのすべての試料を盲腸組織について試験した。すべての試験を空気中で行った。
【００４７】
すべてのポリマー試料を、一層小さい表面積の組織試料に１平方ｍｍ当たり約１μｌの割合で塗布した。アクチュエーターの伸延の後に、両組織表面へのポリマーの移行は、そのポリマーの接着力が凝集力を上回ることを示した。例えば、ポリカルボフィルは、盲腸及び胃の組織の両方に対して接着性であり、破壊を引き起こすには２３００〜２８００ダイン／ｃｍ２の張力が必要であった。この破壊は、分離後にポリマーが両組織表面に認められたので、接着ではなく凝集であった。結果の要約を表１及び２並びに図２に示す。
【００４８】
低粘度及び高粘度の両接着性ＮＯＣＣポリマー溶液（クエン酸緩衝液中）は、胃の組織の粘膜表面へのコーティングとして塗布された場合に、ポリカルボフィルと類似の挙動を示した。両接着性ＮＯＣＣ試料は、凝集し得ず、組織の分離を達成するのにポリカルボルフィルより大きい力を必要とした。しかしながら、高粘度のＮＯＣＣ溶液を架橋してヒドロゲルを形成した場合には、それらは、一層凝集性となって、一層大きい直径のディスクからポリカルボフィルの場合の８５％（１％ゲル）及び５３％（２．５％ゲル）の力で分離することにより破壊された。
【００４９】
盲腸の外表面への接着の強さ（表２）は、再び、ＮＯＣＣ溶液（２．５％高粘度）がポリカルボフィルに匹敵することを示した。接着性ＮＯＣＣが架橋されるにつれて、それらの材料の凝集が増して接着が減少するということも認められた。接着の消失は、架橋の程度に依存した。
【００５０】
この条件下で測定したポリカルボフィルが米国特許第４，６１５，６９７号で報告されたように接着力を２倍示したということに注意すべきである。これは、おそらく、溶液中でなくて空中で試験したことによるものであろう。胃及び盲腸組織の両者について、接着性ＮＯＣＣ溶液は、ポリカルボフィルの性能に匹敵し又はそれを超えた：破壊を達成するのに要した力はポリカルボフィルのそれに等しいか又はそれより大きく、破壊は凝集によるものであり接着によるものではなかった。
【００５１】
両方の型の組織上のＮＯＣＣヒドロゲルは、接着性であったが、それらは、架橋されてない材料より有意に低い接着性であった。それらは、凝集よりも接着層破壊を示し；架橋程度の増大が接着力を減少させることも認められた。これらの発見は、接着性ＮＯＣＣの架橋は一層多くの構造をポリマーに導入し、それは、組織表面との相互作用を制限し、又、ポリマー鎖同士を結合して増大した凝集性を生じるので、意外ではなかった。
【００５２】
他の発見は、２．５％の高粘度ＮＯＣＣ溶液と１％ＮＯＣＣゲル（クエン酸中）の両者が、ＰＢＳ中の相当物よりも一層接着性であるというものであった。本発明を制限するものではないが、この差異は、おそらく、クエン酸環境の影響によって説明されるであろう。中性ｐＨにおいて、ＮＯＣＣは、負に帯電したカルボキシレート基（−ＣＯＯ）の存在から生じるアニオン種として存在し；ＮＯＣＣ上の遊離のアミンは、主として未帯電である。対照的に、酸性のクエン酸緩衝液（ｐＨ５．６）中では、アミン基は、プロトン化されて、正に帯電したアンモニウム部位（−ＮＨ３＋）を形成し、これは、クエン酸イオンにイオン的に結合する。かかる塩は、米国特許第５，４１２，０８４号に記載されており、その開示を参考として本明細書中に援用する。シトレートが３つのカルボキシレート基を有する（その内２つは、ｐＨ５．６で負に帯電している）ので、正味の結果は、酸性のシトレートにおいてＮＯＣＣは増大した数のカルボキシレート基をポリマーと結合して有し、それ故、増大した生体接着性を示すというものである。
【００５３】
【表１】
2004500150.tif 000002
【００５４】
【表２】
2004500150.tif 000003
【００５５】
実施例２
この実施例は、本発明の接着性ＮＯＣＣコーティングの接着特性を説明する。
【００５６】
６匹の雌のラットをペントバルビタールナトリウム（６０ｍｇ／ｋｇ）を用いて麻酔してから、頚椎脱臼により殺した。１２本の大腿骨を採取し、結合組織を鋭利な切開により取り除いた。過剰の結合組織を、ラットの大腿骨から、それらのラットの大腿骨を沸騰水に３０分間浸すことにより除去した。次いで、それらの大腿骨をすすいで風乾した。
【００５７】
各大腿骨を、１ｍｌの１２５Ｉ標識したＮＯＣＣに、大腿骨の表面積の半分が１２５Ｉ溶液と直接接触するように浸した（図３）。大腿骨の他の半分は、その大腿骨を操作するために用いた。続いて、大腿骨を、直ちにシンチレーションバイアルに入れてγカウンターラック置くか、又は、一様な「洗浄」にかけてからシンチレーションバイアルに入れてγカウンターラックに置く。
【００５８】
３本の１２５Ｉ処理した大腿骨の４つのグループを１回の洗浄、２回の洗浄、３回の洗浄にかけ又は洗浄しなかった。１回の洗浄は、大腿骨を、約１５０ｍｌのＰＢＳ中で５秒間一様に攪拌することよりなった。２回の洗浄は、大腿骨を洗浄し、それをＰＢＳから１秒間取り出し、次いで、洗浄を１回繰り返すことよりなった。それ故、３回の洗浄は、大腿骨の洗浄、取り出し、洗浄、取り出し及び最後の１回の洗浄よりなった。ＰＢＳ溶液は、大腿骨の各グループにつき交換した。
【００５９】
１２５ＩＮＯＣＣの活性を、ベックマンγカウンターにより評価した。ラットの大腿骨に付着した１２５ＩＮＯＣＣの量を、方程式１を用いて計算したが、それは、１ｍｌの１２５ＩＮＯＣＣの活性（７．２×１０７ＣＰＭ）及び大腿骨上の１２５ＩＮＯＣＣの活性（γカウンターにより検出）を用いるものである。結果を図４に示す。
【数１】
2004500150.tif 000004
【００６０】
次に、大腿骨の単位面積当たりの１２５ＩＮＯＣＣの量を計算した。１２５ＩＮＯＣＣ溶液と直接接触した表面積を、一本の代表のラットの大腿骨について計算した。
【数２】
2004500150.tif 000005
【００６１】
次いで、単位面積当たりの１２５ＩＮＯＣＣの量を、方程式３を用いて、１２５ＩＮＯＣＣと直接接触したラットの大腿骨の表面積によりラットの大腿骨に付着した１２５ＩＮＯＣＣの量を割ることによって計算した。
【数３】
2004500150.tif 000006
【００６２】
ラットの大腿骨の表面積は、２２８ｍｍ２であると計算された（半径＝２．２５ｍｍで、大腿骨の全高＝３０ｍｍ）。
【００６３】
表３には、各大腿骨の洗浄の回数、１２５ＩＮＯＣＣの活性、大腿骨に付着した１２５ＩＮＯＣＣの量及び大腿骨の単位面積当たりの１２５ＩＮＯＣＣの量の概略を示してある。
【００６４】
【表３】
2004500150.tif 000007
【００６５】
これらの結果は、１２５ＩＮＯＣＣがラットの大腿骨に付着することを示している。第三回目の洗浄の後に、１２５ＩＮＯＣＣの９．５×１０−３＋／−０．００２μＬ／ｍｍ２（又は約０．１μｇＮＯＣＣ／ｍｍ２）が、ラットの大腿骨に付着したままであるということが見出された。
【００６６】
実施例３
この実施例は、細胞付着に対する接着性ＮＯＣＣの効果を説明する。第一のアッセイにおいて、３Ｔ３繊維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリン、２ｍＭ １−グルタミン及び５０μＭ２−メルカプトエタノールを補ったＲＰＭＩ培養培地中で培養を維持した（該培地を完全ＲＰＭＩ（ｃＲＰＭＩ）と呼ぶ）。３Ｔ３繊維芽細胞を、ストック培養フラスコからトリプシン処理により取り出し、洗浄して、無血清ＲＰＭＩ（ｓｆＲＰＭＩ；１０％ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ）中に３．０×１０５細胞／ｍｌの濃度に再懸濁させた（単独で又は０．１％ＮＯＣＣと共に）。
【００６７】
次いで、これらの細胞を、４種類の異なるコーティング処理剤で予備コーティングした（一晩、室温で）９６ウェルＮｕｎｃｌｏｎ組織培養プレートにプレートした。これらは、１）対照としてのリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）、２）ＰＢＳ中の１５μｇ／ｍｌの濃度のビトロネクチン（ビトロネクチンは、繊維芽細胞が付着するＥＣＭタンパク質）、３）対照としてのｓｆＲＰＭＩ及び４）多くのＥＣＭタンパク質を含むｃＲＰＭＩであった。予備コーティング後に、プレートをＰＢＳ中で３回洗ってコーティング用培地を除去した。細胞を、３．０×１０４細胞／ウェルの濃度でプレートし、３７度恣意で９０分間インキュベートした。次いで、細胞を顕微鏡観察して、形態に基づいて接着性か非接着性か分類した。２００の細胞を各ウェル中で計数し（各コーティング処理を三連で行った）、接着性％の平均値±標準偏差（ＳＤ）を計算した。
【００６８】
この第二のアッセイは、接着性ＮＯＣＣの繊維芽細胞の付着に対する効果の定量を可能にする。このアッセイにおいては、３Ｔ３細胞を、放射性のクロム（Ｎａ２５１ＣｒＯ４の形態の５１Ｃｒ）で標識して、ｓｆＲＰＭＩに懸濁させ、９６ウェルのＮｕｎｃｌｏｎデルタプラスチックプレートのウェルに２×１０４細胞／ウェルの濃度で加えて、付着させる。３７℃での９０分間のインキュベーションの後に、繊維芽細胞の大きい割合が、プラスチックに付着する。プレートのＰＢＳでの洗浄は、未付着の及びゆるく付着した細胞を除去した。残っている付着性細胞の数を、１０％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ；洗剤）による溶解とウェル内容物の採集によって評価した。次いで、この溶解物をガンマーカウンターで計数し、１分間当たりの崩壊を記録した。この溶解物からの放射能のレベルを２×１０４の標識した繊維芽細胞中に存在する放射能（各ウェルに付着した細胞の数を示す）と比較した。この付着アッセイを、０．１％ＮＯＣＣの存在下又は非存在下で行った。
【００６９】
ＮＯＣＣの存在下又は非存在下での繊維芽細胞の形態の視覚的検査は、繊維芽細胞をｓｆＲＰＭＩ中にプレートした場合に、それらが一貫して「付着」形態を示すこと；即ち、これらの細胞が平らになって複雑な突起を有することを示した。このコーティング処理にかかわらず、約８０％の細胞は、正常な培養繊維芽細胞らしく見えた。対照的に、繊維芽細胞を０．１％ＮＯＣＣを含有するｓｆＲＰＭＩ中にプレートした場合には、付着形態を示す細胞の数は、非常に減少した。事実、ＰＢＳ又はｓｆＲＰＭＩ（ＥＣＭタンパク質は存在しない）で予備コーティングしたウェル、ＮＯＣＣの存在下で、細胞は付着しなかった。ウェルをビトロネクチン又はｃＲＰＭＩで予備コーティングした場合には、幾らかの細胞が付着したが、その付着は、ＮＯＣＣの非存在下で生じるものより有意に少なかった（図７）。
【００７０】
ヒアルロン酸（ＨＡ）も又、このシステムで試験して、それがＮＯＣＣと同様の効果を有するかどうかを測定した。同様の形態的実験を、０．１％ＨＡを含むｓｆＲＰＭＩ中にプレートした細胞について行った場合には、ＨＡが繊維芽細胞の形態に対して同じ効果を有しないということが認められた（図８）。
【００７１】
繊維芽細胞の付着を測定する一層定量的な方法を達成するために、５１Ｃｒ付着アッセイが開発された。５１Ｃｒ付着アッセイを用いる最初の実験は、３Ｔ３繊維芽細胞のコーティングしてないＮｕｎｃｌｏｎデルタプレートへの付着に対する接着性ＮＯＣＣの効果を調べる視覚的検査により得られた結果を確認した。これらの結果は、接着性ＮＯＣＣが３Ｔ３繊維芽細胞のプラスチックへの付着を９０％より多くブロックすることをこのアッセイを用いて確認した（図９）。この結果は、前の仕事と合わせて、ＮＯＣＣがプラスチックに結合してＥＣＭタンパク質の沈着を競争的様式で邪魔することを示唆している。
【００７２】
競争アッセイを行って、これらの結果を、関心あるＥＣＭタンパク質を含むＦＣＳの濃度を変えて用いて試験した。５１Ｃｒ付着アッセイを、２％、５％又は１０％ＦＣＳを補ったＲＰＭＩをプレート用培地として用いて行った（０．１％ＮＯＣＣの存在下又は非存在下で）。プレート用培地中のＦＣＳの存在が、繊維芽細胞の付着に対する接着性ＮＯＣＣの阻止効果を投与量依存様式で逆転させ、１０％ＦＣＳは、接着性ＮＯＣＣの存在下で３Ｔ３のプレートへの結合を完全に回復させるということが見出された（図１０）。しかしながら、この効果については、次の２つの可能な説明がある：１）接着性ＮＯＣＣが、プレートに結合するＥＣＭタンパク質への繊維芽細胞の付着を妨げるか、又は２）接着性ＮＯＣＣが、ＥＣＭタンパク質のプレートへの結合を競争的様式で妨げる。
【００７３】
これらの可能性を扱うために、プレートを、２〜１０％の範囲で変化する濃度のＦＣＳを含むＲＰＭＩの形態でのＥＣＭで一晩４℃で予備コーティングした。次いで、未結合のＥＣＭタンパク質を洗い去った。この付着アッセイを、これらの予備コーティングしたプレートとｓｆＲＰＭＩ中に懸濁させた細胞を用いて、０．１％ＮＯＣＣの存在下又は非存在下で行った。接着性ＮＯＣＣの存在は、繊維芽細胞のコーティングされたプレートへの付着を邪魔せず、それ故、接着性ＮＯＣＣは、既にプレート上に沈着しているＥＣＭタンパク質への繊維芽細胞の付着を阻止しないということが確かめられた（図１１）。
【００７４】
接着性ＮＯＣＣがＥＣＭタンパク質のプラスチック表面への沈着を競争的に邪魔することを確認するために、プレートをＮＯＣＣ（ｓｆＲＰＭＩ中）で一晩４℃で予備コーティングして洗浄した。２％、５％又は１０％のＦＣＳを補ったＲＰＭＩ中に懸濁させた繊維芽細胞を、かかるＮＯＣＣコーティングしたプレート又はコーティングしてない対照用プレートに付着させた。この実験においては、１時間後に、プレートに付着したトリチウム化チミジン標識した細胞の活性を測定することによって繊維芽細胞の付着を測定した。その結果（図１２）は、ＮＯＣＣコーティングされたプラスチックへの繊維芽細胞の付着は、２．５又は１０％ＦＣＳの存在下で除去されることを示したが、これは、接着性ＮＯＣＣがプラスチックプレート表面に結合してＥＣＭタンパク質の沈着を妨げるという仮説を支持している。ＥＣＭネットワークの非存在下では、繊維芽細胞は、基材に結合することができない。
【００７５】
実施例４
この実施例においては、トリチウム化チミジンで標識された上皮細胞を用いて、それらの培養プレートへの付着をＮＯＣＣが除去することができるかどうかを試験した。培養プレートを、４℃で一晩、ＮＯＣＣ（ｓｆＲＰＭＩ中）で予備コーティングして洗浄した。標識された上皮細胞をＦＣＳを補ったＲＰＭＩ中に懸濁させて、ＮＯＣＣコーティングされたプレート又は対照のコーティングされてないプレートに付着させた。これらの上皮細胞の付着を、１時間後に、トリチウム化チミジン標識した細胞の活性をプレートからの溶解に続いて測定することにより測定した。その結果（図１３に示す）は、ＮＯＣＣ予備コーティングが上皮細胞の付着を妨げることを示している。
【００７６】
実施例５
この実施例においては、実施例４に記載したものと類似の実験を行ったが、但し、標識した上皮細胞の代わりに、トリチウム化チミジン標識したマクロファージ（Ｊ７７４Ｍ０）を用いた。再び、プレートを０．１％ＮＯＣＣで予備コーティングし、マクロファージをＰＭＲＩに懸濁して、ＮＯＣＣコーティングしたプレート又は対照のコーティングしてないプレートに付着させた。図１４は、ＮＯＣＣ予備コーティングが、マクロファージのプレートへの付着を阻止することを示している。
【００７７】
前述の実施例は、単に例示するためのものであり、当業者は、記載した手順の他の改変物を決定することができるであろうが、それらもこの発明の範囲内にある。従って、この発明は、後述の請求の範囲及びその同等物により規定される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
実施例１で使用する装置の略図である。
【図２】
実施例１の結果を示す棒グラフである。
【図３】
実施例２で用いる手順の略図である。
【図４】
方程式１を用いて計算した、ラット大腿骨に付着した１２５Ｉ−ＮＯＣＣの全容積を示すグラフである。
【図５】
方程式３を用いて計算した、ラット大腿骨に付着した１２５Ｉ−ＮＯＣＣの全容積を示すグラフである。
【図６】
ＮＯＣＣの非存在下で増殖した繊維芽細胞（６ａ）及びＮＯＣＣの存在下で増殖した繊維芽細胞（６ｂ）の間での形態的差異を示す写真である。
【図７】
ＮＯＣＣの存在下及び非存在下で増殖した繊維芽細胞による、様々な予備コーティング条件下での付着の比較を示す棒グラフである。
【図８】
ＮＯＣＣの存在下及び非存在下で増殖した繊維芽細胞による、様々な予備コーティング条件下での付着の比較を示す棒グラフである。
【図９】
ＮＯＣＣの存在下及び非存在下で増殖した繊維芽細胞による、５１Ｃｒ放出アッセイにより測定した、付着の比較を示す棒グラフである。
【図１０】
ＮＯＣＣの存在下及び非存在下で増殖した繊維芽細胞による、５１Ｃｒ放出アッセイにより測定した、付着の比較を示す棒グラフである。
【図１１】
ＮＯＣＣの存在下及び非存在下で増殖した繊維芽細胞による、５１Ｃｒ放出アッセイにより測定した、様々な予備コーティング条件下での付着の比較を示す棒グラフである。
【図１２】
ＮＯＣＣで予備コーティングされたプレート及びＮＯＣＣを伴わないプレートで増殖した繊維芽細胞による、トリチウムチミジンで標識した細胞を用いて測定した、付着の比較を示す棒グラフである。
【図１３】
ＮＯＣＣで予備コーティングされたプレート及びＮＯＣＣを伴わないプレートで増殖した上皮細胞による、トリチウムチミジンで標識した細胞を用いて測定した、付着の比較を示す棒グラフである。
【図１４】
ＮＯＣＣで予備コーティングされたプレート及びＮＯＣＣを伴わないプレートで増殖したマクロファージによる、トリチウムチミジンで標識した細胞を用いて測定した、付着の比較を示す棒グラフである。
【図１】
2004500150.tif 000008
【図２】
2004500150.tif 000009
【図３】
2004500150.tif 000010
【図４】
2004500150.tif 000011
【図５】
2004500150.tif 000012
【図７】
2004500150.tif 000013
【図８】
2004500150.tif 000014
【図９】
2004500150.tif 000015
【図１０】
2004500150.tif 000016
【図１１】
2004500150.tif 000017
【図１２】
2004500150.tif 000018
【図１３】
2004500150.tif 000019
【図１４】
2004500150.tif 000020
【国際公開パンフレット】
2004500150.tif 000021
2004500150.tif 000022
2004500150.tif 000023
2004500150.tif 000024
2004500150.tif 000025
2004500150.tif 000026
2004500150.tif 000027
2004500150.tif 000028
2004500150.tif 000029
2004500150.tif 000030
2004500150.tif 000031
2004500150.tif 000032
2004500150.tif 000033
2004500150.tif 000034
2004500150.tif 000035
2004500150.tif 000036
2004500150.tif 000037
2004500150.tif 000038
2004500150.tif 000039
2004500150.tif 000040
2004500150.tif 000041
2004500150.tif 000042
2004500150.tif 000043
2004500150.tif 000044
2004500150.tif 000045
2004500150.tif 000046
2004500150.tif 000047
2004500150.tif 000048
2004500150.tif 000049
2004500150.tif 000050
2004500150.tif 000051
2004500150.tif 000052
2004500150.tif 000053
2004500150.tif 000054
2004500150.tif 000055
2004500150.tif 000056
2004500150.tif 000057
【国際調査報告】
2004500150.tif 000058
2004500150.tif 000059
2004500150.tif 000060