(57)【要約】単一の生細胞、細胞の一部分又は細胞群の中の複数種タンパク質の活性が、レポータ分子を導入することによって同時に測定される。１種又は複数種のレポータは、対象の酵素によって化学的に修飾される。場合によっては、１種又は複数種の酵素は、前記細胞に対し刺激又は医薬化合物を添加することによって作用を受ける。複数種の酵素と複数種のレポータの反応を低下させるか又は終了させ、次にレポータと修飾されたレポータを取り出す。前記１種又は複数種の酵素の活性は、残っているレポータの量、生成した変性レポータの量を測定することによって、又はレポータの量を変性レポータの量と比較することによって求められる。異なるタンパク質の活性のデータベースを編集する。異なる時点、条件及び各種の細胞型での一連の実験を実施することによって、健康状態及び疾病状態における分子細胞のメカニズムのデータベースを作る。細胞を各種の化合物に暴露することによって、医薬を開発しスクリーニングするためのデータを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中のタンパク質活性を評価する方法の改良であって、
単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中に４種以上のタンパク質活性のレポータ分子を導入することを含んでなる改良。
【請求項２】
請求項１に記載の改良において、
単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中にタンパク質活性のレポータ分子を導入することが、単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中に５種以上のタンパク質活性のレポータ分子を導入することを含む
ことを特徴とする改良。
【請求項３】
請求項１に記載の改良において、
単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中にタンパク質活性のレポータ分子を導入することが、単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中に６種以上のタンパク質活性のレポータ分子を導入することを含む
ことを特徴とする改良。
【請求項４】
請求項１に記載の改良において、
単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中にタンパク質活性のレポータ分子を導入することが、単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中に１０種以上のタンパク質活性のレポータ分子を導入することを含む
ことを特徴とする改良。
【請求項５】
シグナル伝達経路を描出する方法であって、
単一細胞、細胞の一部分又は細胞群のデータ測定を一回行い、次いで
単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中の３種以上のタンパク質のタンパク質活性を検出又は定量する
ことを含んでなる方法。
【請求項６】
請求項５に記載の方法において、
タンパク質活性を検出又は定量することが、単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中の４種以上のタンパク質のタンパク質活性を検出又は定量することを含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項５に記載の方法において、
タンパク質活性を検出又は定量することが、単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中の５種以上のタンパク質のタンパク質活性を検出又は定量することを含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項５に記載の方法において、
タンパク質活性を検出又は定量することが、単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中の６種以上のタンパク質のタンパク質活性を検出又は定量することを含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項５に記載の方法において、
タンパク質活性を検出又は定量することが、単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中の１０種以上のタンパク質のタンパク質活性を検出又は定量することを含む
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中のタンパク質活性を検出する方法であって、
単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中の１種又は複数種のタンパク質活性を同定するか又はそのタンパク質活性に応答するレポータ分子を、単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中に導入し、
そのレポータ分子を前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群から放出させ、次いで
そのレポータ分子を検知して、１種又は複数のタンパク質活性を同定することを含んでなる方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、
さらに、前記レポータ分子が示すタンパク質活性を記録し、次いで
前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中におけるタンパク質活性の状態に対応するタンパク質活性の表を編集作成することを含んでなる方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載の方法であって、
さらに、前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群からレポータ分子を放出させる前に、前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群を１種又は複数種の外部刺激に暴露することを含んでなる方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法において、
前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群を前記１種又は複数種の外部刺激に暴露することが、前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群を医薬化合物に暴露することを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法において、
前記１種又は複数種の外部刺激に対応するタンパク質活性の表を編集作成することが、医薬化合物に応答する細胞のタンパク質活性の表を編集作成することを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法において、
前記１種又は複数種の外部刺激に対応するタンパク質活性の表を編集作成することが、医薬化合物に対する細胞応答の地図を編集作成することを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法において、
前記レポータ分子を放出させ、その放出されたレポータ分子を検知し、そのレポータ分子が示すタンパク質活性を記録し、次いで、１種又は複数種の外部刺激に対応するタンパク質活性の表を編集作成することが、放出すること、検知すること、記録すること及び少なくとも一つの望ましい応答と一つの望ましくない他の応答を編集作成することを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１０に記載の方法において、
１種又は複数種のタンパク質活性を同定するレポータ分子を単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中に導入することが、前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中に吸収される補助分子又は補助ポリマーに結合させることによって前記レポータ分子を前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中に導入することを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、
前記レポータ分子を補助分子又は補助ポリマーに結合させることによって前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中に導入することが、ペプチド又はペプチド類似体を結合させることによって前記レポータ分子を前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中に導入することを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１０に記載の方法であって、
さらに、前記レポータ分子を標識付けしてそれを検知しやすくすることを含んでなる方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法において、
前記レポータ分子を標識付けしてそれを検知しやすくすることが、蛍光基、安定同位体もしくは放射性同位体又はビオチンからなる群から選択された少なくとも一つの成分で前記レポータ分子を標識付けすることを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１９に記載の方法において、
前記レポータ分子を蛍光基、安定同位体もしくは放射性同位体又はビオチンからなる群から選択された少なくとも一つの成分で標識付けすることが、各レポータ分子を同じ標識で標識付けすることを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１９に記載の方法において、
前記レポータ分子を蛍光基、安定同位体もしくは放射性同位体又はビオチンからなる群から選択された少なくとも一つの成分で標識付けすることが、各レポータ分子を異なる標識で標識付けすることを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項２３】
天然の基質を生理的濃度で含有している単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中のタンパク質活性を検出する方法の改良であって、
前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中にレポータ分子を天然基質の濃度と比べて生理的濃度より低い濃度で導入し、そのレポータ分子が１種又は複数種のタンパク質活性を同定することを含んでなる改良。
【請求項２４】
請求項１０に記載の方法において、
前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中に１種又は複数種のタンパク質活性を同定するレポータ分子類を導入することが、少なくとも１種のレポータ分子の濃度が１０マイクロモル以下である前記レポータ分子類を導入することを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項２５】
請求項１０に記載の方法において、
前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中に１種又は複数種のタンパク質活性を同定するレポータ分子類を導入することが、少なくとも１種のレポータ分子の濃度が１マイクロモル以下である前記レポータ分子類を導入することを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項２６】
請求項１０に記載の方法において、
前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中に１種又は複数種のタンパク質活性を同定するレポータ分子類を導入することが、少なくとも１種のレポータ分子の濃度が１００ナノモル以下である前記レポータ分子類を導入することを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項２７】
請求項１０に記載の方法であって、
さらに、前記レポータ分子及び変性されたレポータ分子を前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群から放出させることによって、前記レポータ分子を伴う化学反応を低下させるか又は終了させることを含んでなる方法。
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法において、
レポータ分子を伴う化学反応を低下させるか又は終了させることが、希釈することによって前記化学反応を低下させるか又は終了させることを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項１０に記載の方法であって、
さらに、前記レポータ分子を伴う化学反応を捕捉剤又は阻害剤を使用することによって低下させるか又は終了させることを含んでなる方法。
【請求項３０】
請求項１０に記載の方法であって、
さらに、前記レポータ分子を標識付けし、そして前記レポータ分子を伴う化学反応を未標識レポータ分子を導入することによって停止させることを含んでなる方法。
【請求項３１】
請求項１０に記載の方法であって、
さらに、前記レポータ分子及び未変性のレポータ分子を前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群から放出させる前に、前記レポータ分子を伴う化学反応を停止させることを含んでなる方法。
【請求項３２】
請求項２９に記載の方法において、
前記レポータ分子を伴う化学反応を捕捉剤又は阻害剤を使用することによって低下させるか又は終了させることが、前記捕捉剤又は阻害剤をケージ化捕捉剤又はケージ化阻害剤から光化学的に導入することを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項３３】
請求項１０に記載の方法であって、
さらに、前記レポータ分子及び／又は未変性のレポータ分子を前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群から放出させた後に、前記レポータ分子を伴う化学反応を停止させることを含んでなる方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法において、
前記レポータ分子及び／又は変性されたレポータ分子を前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群から放出させることと前記レポータ分子を伴う化学反応を停止させることとの間の時間間隔が１秒未満である
ことを特徴とする方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の方法において、
前記レポータ分子及び／又は変性されたレポータ分子を前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群から放出させることと前記レポータ分子を伴う化学反応を停止させることとの間の時間間隔が３３ミリ秒未満である
ことを特徴とする方法。
【請求項３６】
請求項３３に記載の方法において、
前記レポータ分子及び／又は変性されたレポータ分子を前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群から放出させることと前記レポータ分子を伴う化学反応を停止させることとの間の時間間隔が１０マイクロ秒未満である
ことを特徴とする方法。
【請求項３７】
請求項１０に記載の方法であって、
さらに、前記レポータ分子と変性されたレポータ分子を、電気泳動法、マイクロクロマトグラフィ、質量分光法、蛍光偏光分光法又はアフィニティアレイによって識別することを含んでなる方法。
【請求項３８】
請求項１０に記載の方法であって、
さらに、前記レポータ分子及び／又は変性されたレポータ分子を、蛍光偏光分光法、質量分光法、伝導性又は放射能検出によって識別することを含んでなる方法。
【請求項３９】
請求項１０に記載の方法であって、
さらに、二次元ゲル電気泳動法、タンパク質質量分光法、酵母２ハイブリッド検定法、構造生物学、細胞内イオンなどの指示薬、細胞内タンパク質配置測定法、ＤＮＡアレイ、又は有鞘及び無鞘のフローを含むフローサイトメトリ及びマイクロフルイディクスデバイスでのフローサイトメトリもしくはこれらの組合せを使用して、レポータ分子及び／又は変性されたレポータ分子を検出することを含んでなる方法。
【請求項４０】
請求項１０に記載の方法であって、
さらに、二次元ゲル電気泳動法、タンパク質質量分光法、酵母２ハイブリッド検定法、構造生物学、細胞内イオンなどの指示薬、細胞内タンパク質配置測定法、ＤＮＡアレイ、又は有鞘及び無鞘のフローを含むフローサイトメトリ及びマイクロフルイディクスデバイスでのフローサイトメトリを使用して、レポータ分子及び／又は変性されたレポータ分子を検出することを組み合わせて実施することを含んでなる方法。
【請求項４０】
請求項１０に記載の方法において、
前記レポータ分子を検知することが、３種以上のタンパク質のタンパク質活性を検出及び／又は定量することを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項４１】
請求項１０に記載の方法において、
前記レポータ分子を検知することが、４種以上のタンパク質のタンパク質活性を検出及び／又は定量することを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項４２】
請求項１０に記載の方法において、
前記レポータ分子を検知することが、５種以上のタンパク質のタンパク質活性を検出及び／又は定量することを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項４３】
請求項１０に記載の方法において、
前記レポータ分子を検知することが、６種以上のタンパク質のタンパク質活性を検出及び／又は定量することを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項４４】
請求項１０に記載の方法において、
前記レポータ分子を検知することが、１０種以上のタンパク質のタンパク質活性を検出及び／又は定量することを含んでいる
ことを特徴とする方法。
【請求項４５】
１種又は複数種のタンパク質のレポータ分子を導入することによって変性された単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中のタンパク質活性を測定する装置であって、
前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群を溶解する手段と、
単一細胞もしくは細胞群の内容物又は単一細胞もしくは細胞群の内容物の一部を収集する手段と、
レポータ分子と変性されたレポータ分子とを識別する手段と、
レポータ分子及び／又は変性されたレポータ分子を検知する手段と
を備えてなる装置。
【請求項４６】
請求項４５に記載の装置であって、
さらに、前記レポータ分子類によって示されるタンパク質活性を記録する手段と、
タンパク質活性の表を編集作成する手段と
を備えてなる装置。
【請求項４７】
請求項４５に記載の装置であって、
さらに、前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中にレポータ分子類を導入する手段を備えてなる装置。
【請求項４８】
請求項４７に記載の装置であって、
レポータ分子類を導入する前記手段が、マイクロインジェクション、オプトインジェクション、オプトポレーション、エレクトロポレーション、又は前記レポータを前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中へと入らせる補助分子の結合のための手段を備えている
ことを特徴とする装置。
【請求項４９】
請求項４５に記載の装置において、
レポータ分子類を導入する前記手段が、マイクロインジェクション、オプトインジェクション、オプトポレーション、エレクトロポレーション、又は前記レポータを前記単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中へと入らせる補助分子の結合のための手段を備えている
ことを特徴とする装置。
【請求項５０】
請求項４５に記載の装置であって、
さらに、単一細胞、細胞の一部分又は細胞群を収集装置に提供する手段を備えてなる装置。
【請求項５１】
請求項５０に記載の装置において、
前記提供する手段が、マルチウェルプレート、ジエレクトロフォレーシストラップ、レーザツィーザ、マイクロルーメン又はマイクロルーメンのアレイからなる群から選択される一つの手段を備えている
ことを特徴とする装置。
【請求項５２】
請求項４５に記載の装置において、
前記収集する手段が、マイクロルーメンを通して吸引する手段を備えている
ことを特徴とする装置。
【請求項５３】
請求項４５に記載の装置において、
前記収集する手段が、マイクロルーメン、マイクロウェル、ナノウェル、ピコウェル又はマイクロフルイディクスチップからなる群から選択される一つの手段を備えている
ことを特徴とする装置。
【請求項５４】
請求項４５に記載の装置において、
前記溶解するための手段が、レーザ、衝撃波を提供する手段、電界を提供する手段、前記単一細胞もしくは細胞群又は単一細胞もしくは細胞群の内容物の一部を化学試薬で処理する手段からなる群から選択される一つの手段を備えている
ことを特徴とする装置。
【請求項５５】
請求項４５に記載の装置において、
前記識別する手段が、電気泳動を使用する手段、マイクロクロマトグラフィを使用する手段、質量分光法を使用する手段、アフィニティアレイを使用する手段又はそれらの組合せからなる群から選択される一つの手段を備えている
ことを特徴とする装置。
【請求項５６】
請求項５５に記載の装置において、
前記アフィニティアレイを使用する手段が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、タンパク質、受容体、酵素、抗体又はそれらの組合せからなる群から選択される生物分子のアレイを備えている
ことを特徴とする装置。
【請求項５７】
請求項４５に記載の装置において、
前記識別する手段が、マイクロフルイディクスデバイスで行われる電気泳動を実施する手段を備えている
ことを特徴とする装置。
【請求項５８】
請求項４５に記載の装置において、
前記検知する手段が、蛍光分光法を使用する手段、質量分光法を使用する手段、伝導性を利用する手段又は放射能の検出を利用する手段からなる群から選択される一つの手段を備えている
ことを特徴とする装置。
【請求項５９】
請求項４５に記載の装置であって、
さらに、コンピュータで制御される収集デバイスを備えてなる装置。
【請求項６０】
請求項４５に記載の装置であって、
さらに、コンピュータで制御される溶解デバイスを備えてなる装置。
【請求項６１】
請求項４５に記載の装置であって、
さらに、コンピュータで制御される識別デバイスを備えてなる装置。
【請求項６２】
請求項４５に記載の装置であって、
さらに、コンピュータで制御される検知デバイスを備えてなる装置。
【請求項６３】
請求項４５に記載の装置であって、
さらに、前記レポータ分子の変化を記録するために前記検知する手段に連結されたデータプロセッサを備えてなる装置。
【請求項６４】
請求項４５に記載の装置であって、
さらに、タンパク質活性の表を編集作成するためにデータプロセッサを備えてなる装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、細胞内の分子の生化学分析及び化学分析の領域に関し、詳しく述べると、単一細胞、細胞の集団又は細胞の一部分の中における複数種のタンパク質の内部化学活性の活性化を測定する検定と方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
全ての細胞は、細胞を環境に応答させて生命の営みを行わせるタンパク質の複雑なネットワークで構成されている（図１〜２）。いかなる時点においても、細胞内の全てのタンパク質が活性である訳ではない。生きている細胞の中でどのタンパク質が活性であるか、及びタンパク質のネットワークが生きている細胞の中でどのように相互作用しているかを調べることは、生物学においても医薬の開発においても複雑な問題である。
【０００３】
生物体が刺激に応答する能力は、生物体が生存するために不可欠である。細胞間及び細胞内の連絡の故障から疾病がもたらされることが多い。例えば、ＩＩ型糖尿病は、細胞が炭水化物代謝を調節するインシュリンのシグナルを受信及び／又は処理することができないことが原因である。シグナルは、一般に、細胞膜において、受容体と称呼される分子によって受信される。シグナル伝達分子と受容体が細胞外表面において結合すると、受容体の形態が変化する。その結果、細胞の内側の受容体の化学活性を変動させる。如何なる細胞も、その細胞を各種のシグナルに応答できるようにするいくつもの異なる受容体をもっている。細胞が由来している組織のタイプが、その細胞の表面にどの受容体が存在するかを決定する。異なる細胞は異なるシグナルに応答するが、同じシグナルが、異なる組織に由来する細胞に異なる応答を引き出すことがある。例えば、エピネフリンは、血管の平滑筋を収縮させるが、腸の平滑筋を弛緩させる。細胞がシグナルにどのように応答するかは、シグナルが受信された時点及びシグナルが受信された後に、どのタンパク質が細胞内の存在していてかつ活性化されたかによって決まる。
【０００４】
シグナルに応答して、細胞内の各種のタンパク質は、活性化され及び不活性化される。タンパク質の活性を変えるため細胞が利用する共通の方策は、リン酸基をタンパク質に付加するか又はタンパク質から取り除くことである。リン酸基のタンパク質への付加は、キナーゼと呼ばれている酵素（それ自体タンパク質である）によって行われる。上述のネットワークにおける多くのタンパク質は、酵素である。キナーゼ類に加えて、多くの他のタイプの酵素が細胞内に存在している。ホスファターゼ類、ヌクレアーゼ類、グリコシダーゼ類、リパーゼ類及びプロテアーゼ類は、ほんの少ない例である。酵素は、重要な医薬の標的である。キナーゼ類や他のタイプの酵素に対する医薬の開発の課題は、対象の酵素にだけ特異的な分子を見つけることである。多くの有望な医薬が、その期待される標的に所望の効果を有していることがあるが、細胞内の１又は２種以上の追加のタンパク質の活性に対して望ましくない作用があることもある。酵素活性の現在利用可能な生体外生化学検定法は、誤解を招く結果をもたらすことが多く、それは、生細胞中に存在する他の酵素及び酵素活性のモジュレータがその検定法に存在しないからである（表１）。
【０００５】
【表１】
2004514885.tif 000002
【０００６】
これらの因子を検定法に追加することは、それらの素性と濃度が分かっていないことが多いので、困難である。これら因子の濃度やタンパク質の活性が時間の経過とともに変化することがあることから、状況は更に複雑になっている（表２）。
【０００７】
【表２】
2004514885.tif 000003
【０００８】
医薬の全効果を正確に試験するには、シグナル伝達経路の全ての成分が存在しかつ無傷のままでなければならない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、タンパク質の活性をその天然の細胞環境内で分析できることが強く要求されている。さらに、タンパク質類は、相互に接続されているネットワーク中に存在しているので、多種類のタンパク質の活性は、細胞環境内の混乱又はネットワーク内の他のタンパク質の異常活性の影響を受ける。したがって、対象の単一又は複数の細胞内で同時に複数種のタンパク質の活性を測定できることが重要である。我々は、下記の方法を除いて、複数タンパク質の活性を生きた細胞の中で同時に測定できるタンパク質活性の生化学検定法を知らない。
【００１０】
多くの疾病状態が不適切なタンパク質活性、すなわち、大きすぎる又は小さすぎる活性に関連していることが、現在分かっている。一例は、ヒトの癌の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）である。ＣＭＬの大部分の症例は、キナーゼ、すなわち、癌遺伝子ｂｃｒ−ａｂｌのタンパク質産物が、不適切に「ターンオンされた（ｔｕｒｎｅｄ−ｏｎ）」状態で存在している。この不適切な活性化によって、血球の無制御の増殖が起こって、癌となって現れる。癌遺伝子の他のタンパク質産物が癌発生に役割を演じていることが分かっている。とはいえ、当該遺伝子又はそのタンパク質産物の存在が、癌の出現と完全に相関関係がある訳ではない。同じ細胞内のこのようなタンパク質の活性及び正常タンパク質の活性を無傷のタンパク質経路の関連で測定する手段は、疾病の過程に重要な見通しを明らかにするであろう。冒された細胞内の活性タンパク質と不活性タンパク質のマップで構成された疾病の素描（有様の概要を描き出すこと）を提供すれば、疾病の分子病因論が、現在のゲノミクスとプロテオミクスの技術が示すよりも、一層正確に理解できると考えられる（表３）。
【００１１】
【表３】
2004514885.tif 000004
【００１２】
異なる組織の細胞内、健康な細胞と病気にかかった細胞内及び異なる環境と薬理の刺激に応答する細胞内におけるタンパク質活性のデータベースを作れば、生物医学の研究、医薬の研究に対して、及び生きている生物体すべての自然のプロセスについての我々の基本的理解に対してさえも、劇的な影響を与えるであろう。
【００１３】
単一細胞、細胞群又は細胞の一部分の中での酵素の活性化を測定する既存の技法には、元々からの種々の制約がある。近年、ゲノミクスの変革を越えて我々の知識を広げるための手段として、プロテオミクス、すなわち、生物体が産生する全てのタンパク質の同定において、多くの進展が見られる。あいにく、現在のプロテオミクスの技法には、酵素の機能を研究することにおいて重大な欠点がある。過去２０年間にわたって、最良標準は二次元ゲル電気泳動法であった。この技法は、タンパク質分離に対し非常に高い分解能を提供するが、実施することが難しく、かつ多くの重要な細胞タンパク質、特にアバンダンスが低いタンパク質又は疎水性のタンパク質（これらの特性は、たとえ大部分の酵素でなくとも、多くの酵素の一般的な特性である）を検出することができない。生命情報科学を組み合わせた新しい質量分光法によって、電気泳動法で分離されたタンパク質の同定が改善されたとはいえ、実施が難しいことと感度という基本的な問題は解決されていない。新しいチップベースの方法は、多数のタンパク質活を迅速に同定することについてはまだ約束を果たしておらず、しかも感度、特異性及び定量化は、依然として解決しなければならない問題である。現在のプロテオーム法は、ほぼ全てがタンパク質を同定することに力を注いでおり、場合によっては、タンパク質濃度のおおまかな定量を行うことに努力していると理解することが重要である。しかし、これらのやり方は、最も重要なタンパク質の決定的なパラメータ、すなわち、「酵素の活性」を直接には測定しない。酵素の存在も濃度もその活性の有効な尺度ではない。タンパク質の活性をリン酸化された種を同定することによって測定する試みがなされている（多くのタンパク質が１又は複数のリン酸基を付加されることによって「スイッチオン」される）が、そのようなやり方は活性の間接的な尺度を提供するに過ぎず、しかもそのような種を単一細胞、細胞群又は細胞の一部分の中に検出することは困難に満ちている。
【００１４】
最近まで、伝統的な生化学検定法が、酵素活性を測定する唯一の信頼し得る手方であった。キナーゼ類に対しては、これらの方法の大部分が、キナーゼの基質を細胞抽出物又は単離されたタンパク質でリン酸化して生体内キナーゼの活性を推定する（図３）。このやり方には、以下の三つの重大な欠点がある。すなわち、１）これらの方法は感度が劣っているので、多数の細胞の細胞質をプールしなければならない。２）複数の細胞は、それらの活性化状態に関して同期していないので、実際にはキナーゼ活性の時間平均レベルが測定される。そして、３）シグナル伝達酵素が存在している経路とネットワークとの正常な関係が破壊される。大部分の他のタイプの酵素の活性を測定する場合も、類似の欠点がある。最近の画像形成法は、いくつかの酵素について単一細胞内において空間的に所在を突きとめることができる（図４）。一般に、対象の酵素は細胞内で特異的抗体類、その酵素のインヒビター類又は蛍光タグ類によって標識付けされる。あいにく、この方法では、たとえ細胞内における酵素の所在位置からその酵素の活性レベルを推定する試みを行うことができるとしても、不活性の酵素分子と活性の酵素分子の両方が強調されてしまう。現在開発中の第三のやり方は、蛍光指示薬を使用して酵素活性を測定する方法である。このやり方は、種々のイオン濃度（すなわち、Ｃａ２＋）を測定するには、良好であるが、これまでのところ、生きた細胞内の酵素活性を測定するのには一般的に適用できる状況にない。これらの技法の全てに対するさらなる制約は、これらの技法が、単一細胞内の多種類の酵素の活性を同時に測定できないことである。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
この発明は、単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中のタンパク質活性を検出する方法である。この方法は、細胞の中に１又は複数種のタンパク質活性を同定するレポータ分子を導入するステップを含んでいる。それらレポータ分子を細胞から放出させ、そして１又は複数種のタンパク質活性のレポータ分子を検知するセンサに暴露させる。
【００１６】
この発明は、また、細胞中に同細胞内のタンパク質活性に応答するレポータ分子を導入し、同レポータ分子を同細胞から放出させ、その放出されたレポータ分子を検知し、同レポータ分子が示すタンパク質活性を記録し、そして単一細胞又は複数細胞内のタンパク質活性の状態に対応するタンパク質活性の表を編集作成するステップを含んでなる単一細胞、細胞の一部分又は複数細胞のタンパク質活性の説明書を作る方法と定義することもできる。
【００１７】
この発明は、さらに、細胞中に同細胞内のタンパク質活性に応答するレポータ分子を導入し、同細胞を単一もしくは複数の外刺激（ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｔｉｍｕｌｕｓ ｏｒ ｓｔｉｍｕｌｉ）に暴露し、同レポータ分子を同細胞から放出させ、その放出されたレポータ分子を検知し、同レポータ分子が示すタンパク質活性を記録し、そして単一もしくは複数の外刺激に対応するタンパク質活性の表を編集作成するステップを含んでなる単一もしくは複数の外刺激に応答する単一細胞、細胞の一部分又は複数細胞のタンパク質活性の説明書を作る方法と定義することができる。
【００１８】
一実施態様では、前記外刺激は医薬化合物である。前記表は、同医薬化合物に応答する細胞タンパク質の活性を編集したものである。同表は、医薬化合物に対する細胞の応答のマップである。同細胞応答は、少なくとも一つの望ましい細胞応答と望ましくない他の細胞応答を含んでいる。
【００１９】
前記のレポータ分子は、単一細胞又は複数の細胞の中に取り込まれる補助分子又はポリマーに結合させることによって細胞内に導入される。その補助分子は、ペプチド又はペプチド類似体である。
【００２０】
前記レポータ分子は、検出しやすいように標識付けされる。その標識は、蛍光基、安定同位体もしくは放射性同位体又はビオチンで構成されている。同レポータ分子は、同じ又は異なる標識をもっていてもよい。そのうえ、前記レポータを標識付けするのに使用される蛍光基は、標識付けされたレポータ分子を、その電気泳動特性に関係なく、スペクトル特性に基づいて検出し、分離し、そして同定できるように、異なるスペクトル特性を持っていてもよい。
【００２１】
一実施態様では、前記レポータが天然基質の濃度と比べて生理的濃度より低い濃度（ｓｕｂｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）で存在している。どのレポータの濃度も１０マイクロモル以下であり、好ましくは、１マイクロモル以下、又は１００ナノモル以下である。
【００２２】
別の実施態様では、前記レポータを含む化学反応を、前記レポータと変性レポータ（ａｌｔｅｒｅｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ）を単一細胞又は複数の細胞から放出することによって、低下させるか又は終了させる。さらに別の実施態様では、前記レポータを伴う化学反応を希釈によって低下させるか終了させる。さらに別の実施態様では、前記レポータを伴う化学反応を、捕捉剤又は阻害剤を使用することによって、停止させる。さらなる実施態様では、前記レポータは標識付けされていて、そしてそのレポータを伴う化学反応を、標識なしのレポータを導入することによって停止させる。一実施態様では、前記レポータを含む化学反応を、単一細胞又は複数の細胞から前記レポータ及び未変性レポータ（ｕｎａｌｔｅｒｅｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒ）を放出させる前に、停止させる。一実施態様では、捕捉剤、阻害剤又は標識付けされていないレポータは、ケイジ化された（ｃａｇｅｄ）捕捉剤、阻害剤又は標識なしのレポータから光化学的に導入される。別の実施態様では、前記レポータを伴う化学反応は、単一細胞及び／又は複数の細胞から前記レポータ及び／又は未変性レポータを放出した後に停止させる。
【００２３】
一つの例示実施態様では、レポータ及び／又は変性レポータの単一細胞又は複数の細胞からの放出とレポータを含む化学反応の停止との間の時間は、様々で、１秒未満、３３ミリ秒未満又は１０マイクロ秒未満でさえある。
【００２４】
各種実施態様で、レポータと変性レポータは、電気泳動法、マイクロマトグラフィ、質量分光法、蛍光分光法、蛍光偏光分光法、アフィニチィアレイなどの手法で識別される。レポータ分子を各種のスペクトル特性を有するタグで標識付けして、それらを、タグの独特のスペクトル特性を利用して蛍光分光法により分離することによって、レポータ分子を識別することが、具体的に意図されている。
【００２５】
各種実施態様で、レポータ及び／又は変性レポータは、蛍光分光法、偏光技術、質量分光法、伝導性、放射能検出、その他の方法で検知される。
【００２６】
上記の諸方法は、二次元ゲル電気泳動法、タンパク質質量分光法、酵母２ハイブリッド検定法、構造生物学、細胞内イオンなどの指示薬、細胞内タンパク質位置測定法（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、ＤＮＡアレイ及びフローサイトメトリ（有鞘（ｓｈｅａｔｈｅｄ）及び無鞘（ｕｎｓｈｅａｔｈｅｄ）のフロー及びマイクロフルイディクスデバイス（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｄｅｖｉｃｅ）のフローサイトメトリを含む）と組み合わせて、如何なる目的にも使用することができる。３種以上のタンパク質のタンパク質活性が検出及び／又は定量され、そして好ましくは、４種、５種、６種、又は１０種以上のタンパク質のタンパク質活性が検出及び／又は定量される。具体的に述べると、単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中の３種、４種、５種、６種、又は１０種以上のタンパク質のタンパク質活性が検出及び／又は定量される。この発明は、単一細胞、細胞の一部分又は細胞群の中の３種、４種、５種、６種、又は１０種以上のタンパク質のタンパク質活性の検出及び／又は定量を意図するものである。
【００２７】
したがって、この発明は、単一細胞又は細胞群の中にタンパク質活性のレポータを３種以上導入することによって細胞内のタンパク質活性を評価する方法と特徴づけられるものである。
【００２８】
また、この発明は、単一細胞又は複数の細胞の中の１種又は複数種のタンパク質のタンパク質活性を測定する装置であって、単一細胞又は複数の細胞を溶解する手段と、単一細胞又は複数の細胞の内容物又はその内容物の一部分を収集する手段と、レポータ分子及び変性レポータ分子を識別する手段と、レポータ分子及び／又は変性レポータ分子を検知する手段とを備えてなる装置とも特徴づけることができる。
【００２９】
あるいは、この発明は、単一又は複数種のタンパク質のタンパク質活性を測定する装置であって、単一細胞又は複数の細胞を溶解する手段と、単一細胞又は複数の細胞の内容物又は内容物の一部を収集する手段と、レポータ分子と変性レポータ分子を識別する手段と、レポータ分子及び／又は変性レポータ分子を検知する手段と、同レポータ分子が指示したタンパク質活性を記録する手段と、タンパク質活性の表を編成作成する手段とを備えてなる装置である。
【００３０】
上記装置は、さらに、レポータ分子を単一細胞又は複数細胞の中に導入する手段を備えている。そのレポータ分子を導入する手段としては、マイクロインジェクション、オプトインジェクション、オプトポレーション、エレクトロポレーション、又はレポータを単一細胞又は複数細胞の中へと通過させる補助分子の結合がある。上記装置は、さらに、複数細胞を収集装置に提供する手段を備えている。その細胞提供手段は、マルチウェルプレート（ｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）、ジエレクトロフォレーシストラップ（ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｔｒａｐ）、レーザツィーザ（ｌａｓｅｒ ｔｗｅｅｚｅｒｓ）、マイクロルーメン（ｍｉｃｒｏｌｕｍｅｎ）もしくはマイクロルーメンのアレイ、又はその他の手段である。上記収集手段は、マイクロルーメンを通しての吸引である。収集手段は、マイクロルーメン、マイクロウェル、ナノウェル、ピコウェル、又はマイクロフルイディクスチップである。細胞を溶解する手段は、レーザ、衝撃波、圧電仲介超音波（ｐｉｅｚｏ−ｅｌｅｃｔｒｉｃ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｗａｖｅ）、電界（ＡＣ又はＤＣ）の印加、又は化学薬剤による処理である。識別の手段は、電気泳動法、マイクロクロマトグラフィ、質量分光法、アフィニティアレイ、その他の手段である。そのアフィニティアレイは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、タンパク質、受容体、酵素又は抗体などの生物分子（ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）のアレイである。識別の手段は、マイクロフルイディックスデバイスで行われる電気泳動法である。検知の手段は、蛍光分光法、質量分光法、伝導性又は放射能検出である。
【００３１】
前記装置は、さらに、コンピュータ制御収集デバイス、コンピュータ制御溶解デバイス、コンピュータ制御識別デバイス、コンピュータ制御検知デバイス、前記センサに連結されてレポータの変化を記録するデータプロセッサ、及び／又はタンパク質活性の表を編集作成するデータプロセッサを備えている。
【００３２】
この発明は、単一細胞又は細胞群の中の細胞活性のレポータを３種、４種、５種、６種、又は１０種以上、導入することによって、単一細胞内のタンパク質活性を評価する方法である。この発明は、キャピラリ又はマイクロルーメン内での電気泳動を利用して、細胞のシグナル伝達経路を解明する方法である。この発明は、キャピラリ又はマイクロルーメン内での電気泳動を利用して行う複数の酵素反応の分析を含む細胞のシグナル伝達経路を解明する方法である。この発明は、酵素反応のレポータを単一細胞又は複数細胞の中に導入し、そのレポータを収集し、そしてそのレポータを、キャピラリ又はマイクロルーメン内の電気泳動を利用して分析するステップを含む、細胞のシグナル伝達経路を解明する方法である。
【００３３】
この発明は、文章を流暢にするため、場合によっては、機能を実施するステップ又は手段として記述してきたが、この発明は、作用と構造を目的とするものであり、その作用又は構造によって実行される関連機能に必ずしも定義又限定されるべきでないと明確に解すべきである。したがって、この発明は、上記記述から、３５ＵＳＣ１１２の下での手段及びステップの解釈によって限定されると解釈すべきではない。この発明は、添付図面を見ることによってより良く視覚化することができる。なお、これら図面を通して同じ要素には同じ番号が付けてある。
【００３４】
この発明の例示実施態様と請求項に記載のその定義は、この発明の望ましい実施態様についての以下の説明を見ることによって、一層よく理解できるであろう。
【００３５】
【発明の実施の形態】
単一の生きている細胞、細胞の一部分又は細胞群の中の複数種のタンパク質の活性が同時に検査される。広範囲に異なる条件下で、この方法を複数の細胞に適用することによってデータベースが編集作成される。そのタンパク質活性は、１又は２種以上のレポータ分子（基質）を１又は２以上の細胞の中に導入することによって測定される。その１種又は複数種のレポータは、対象の酵素によって化学的に修飾される。いくつかの場合においては、対象の１種又は複数種の酵素は、その細胞に刺激又は医薬化合物を添加することによって作用を受ける。酵素とレポータ間の反応を低下させるか又は終了させて、レポータ及び修飾させたレポータを細胞から取り出す。１種又は複数種の酵素の活性は、残っているレポータ分子の量を測定するか、生成した変性レポータ分子の量を測定するか、又はレポータ分子の量を変性レポータ分子の量と比較することによって求められる。異なるタンパク質の活性のデータベースが編集作成される。異なる時点で、変化させた条件下で、そして種々の細胞型（ｃｅｌｌ ｔｙｐｅｓ）について、一連の実験を行うことによって、前記データベースは、健康な状態と疾病状態における細胞の挙動の分子メカニズムを理解するための知識の価値ある宝庫になる。細胞を各種化合物に暴露することによって、この方法は、医薬を開発しスクリーニングするための価値あるデータを提供する。
【００３６】
この発明は、単一の生きた細胞１４、細胞１４の一部分又は細胞１４の群の中の複数種のタンパク質の活性を同時に検査する装置及び方法である（図５〜６）。図５Ａは、この発明によって分析される単一細胞１４又は細胞１４の群の上にマイクロルーメンを配置したことを示す略図である。図５Ａの上部の図では、穴１２を有するマイクロルーメン１０が、複数の細胞１４の近くに配置されている。穴１２の直径は、単一細胞１４を取り込むのに丁度充分な直径である。図５Ａの下部の図では、マイクロルーメン１０’が穴１６を有し、その穴は複数の細胞１４の近くに配置されている。穴１６の直径は、複数の細胞１４を同時に又はほぼ同時に取り込むことができるが、又は少なくとも、複数細胞のマイクロルーメン１０’中への収集取り込みに関連して分析する期間内又はその期間の間、取り込むことができる充分な直径である。
【００３７】
図５Ｂは、１個、４個又は１０個の細胞１４を同時にサンプリングする前（０ｍｓ）とサンプリングした後（３３ｍｓ）の顕微鏡写真画像を集めたものである。この顕微鏡写真画像は、２行３列に配置され、上の行はサンプリング前で、下の行はサンプリング後である。第一列は単一細胞１４を示し、中央列は４細胞１４を示し、そして右端の列は１０個の細胞１４を示す。これらの顕微鏡写真の画像は、単一、４個及び１０個の細胞の取込みを明確に示している。従来の細胞操作機器を使用するに際し、同時にサンプリングできるつまり群としてサンプリングできる細胞１４の数は任意であり、取込みに使用されるマイクロルーメンのオリフィスと取込み容積によってのみ限定される、と解すべきである。図５Ｃは、標準及び１個又は４個の細胞１４の内容物を分析した典型的な電気泳動図を示す。細胞１４には、予めオレゴングリーンと２種のフルオレセイン異性体を入れてあった。
【００３８】
任意の数の細胞１４をサンプリングできるだけでなく、多くの場合、細胞の一部をサンプリングすることもできる。図６Ａ（ｉ）は、マイクロルーメン１０が細胞１４の延びた突起の遠位末端１８をサンプリングするために配置されて使用さてているところを示す線図的描写である。図６Ａ（ｉｉ）は、マイクロルーメン１０が細胞１４の突起１８のより近位の部分をサンプリングするために配置されて使用されているところを示す線図的描写である。図６Ａ（ｉｉｉ）は、マイクロルーメン２０がマイクロフルイディクスチップ２２の隣りに配置され又はそのチップの一部として画成されて、マイクロルーメン２０内に入っている細胞１４の突起２４をサンプリングするために使用されているのを示す線図的描写である。図６Ａ（ｉｖ）は、マイクロルーメン２０がマイクロフルイディクスチップ２２の隣りに配置されるか又はそのチップの一部として画成されて、マイクロルーメン２０内に入っているか又はマイクロルーメン２０の入口の近くに位置する細胞１４の突起の遠位末端２６をサンプリングするために使用されるのを示す線図的描写である。図６Ａ（ｉ）〜（ｉｖ）の線図的描写は、図６Ｂに示す顕微鏡写真中の実際の細胞１４の場合について示しており、図６Ｂでは、サンプリング前の画像、画像形成を開始してから３０ｍｓ後の時点の細胞１４とその突起の画像、及び次いでマイクロルーメン１０を取り外した後の画像を示し、図中、細胞１４に対するマイクロルーメン１０のオリフィスの位置の中心を黒いドットで表示している。サンプリング前及びサンプリング後の画像を比べることによって、突起１８の遠位末端が、取り除かれていることを明確に見ることができる。図６Ｃは、二つの電気泳動図を示す。一方は、オレゴングリーンと２種のフルオセイン異性体の標準を示し、そして他方は、オレゴングリーン及び同じ二つのフルオレセインの異性体を予め入れた細胞１４の突起１８を分析した内容を示す。
【００３９】
広範囲の異なる条件下で、この発明を細胞に適用して得られるデータベースが編集作成される。生細胞１４中の複数種のタンパク質の活性を検定できるデバイスが、発明の名称「Ｆａｓｔ Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ Ｌａｓｅｒ Ｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ」で１９９８年３月６日付けで出願された米国特許出願第０９／０３６，７０６号、及び発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ Ｃｈａｎｇｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ」で１９９９年７月２１日付けで出願された米国一部継続特許出願第０９／３５８，５０５号に記載の装置を使った好ましい実施態様によって達成できる。なお、この出願はこれらの特許出願と関連しているものであり、かつ両特許出願はここに援用されることを明言する。
【００４０】
この発明では、タンパク質活性が、１又は２種以上のレポータ分子（基質）を１又は２以上の細胞１４中に導入することによって測定される。一種又は複数種のレポータは、対象の酵素によって化学的に修飾される。いくつかの場合では、対象の一種又は複数種の酵素は、細胞１４に対する刺激又は医薬化合物の添加によって作用を受ける。酵素とレポータとの間の反応は、低下させ又は終了させて、そのレポータと修飾されたレポータを細胞１４から取り出す。前記一種又は複数種の酵素の活性は、残っているレポータ分子の量を測定するか、生成された変性レポータ分子の量を測定するか、又はレポータ分子の量を変性レポータ分子の量と比較することによって、求められる。図７は、（ａ）にレポータ分子２８の細胞１４中への導入を線図的に図解する。（ｂ）では、細胞１４中の不活性酵素３０がレポータ２８と全く化学反応をせず、次いでそのレポータ２８は細胞１４から抽出され、電気泳動図３２によって不変性レポータとして測定される。図７の（ｃ）では、活性酵素３０’が少なくともいくつかのレポータ２８と反応して、いくつかの変性レポータ２８’を形成し、それら両レポータ２８と２８’が抽出され、次いで両者が電気泳動図３２’で検出され測定される。
【００４１】
異なるタンパク質の活性のデータベースが編集作成される。異なる時点で、変化する条件下で、及び各種の細胞型について、一連の実験を実施することによって、前記データベースは、健康な状態と病気にかかった状態における細胞の挙動の分子的メカニズムを理解するための知識の価値ある宝庫となる。細胞１４を各種化合物に暴露しながら、上記方法を適用すると、医薬を開発しスクリーニングを行うのに価値あるデータが提供される。
【００４２】
レポータを細胞１４に導入できる方法は多数ある。それらの方法としては、限定はされないが、マイクロインジェクション、オプトポレーション、オプトインジェクション、エレクトロポーション、ベシクル融合及びピノサイトーシスがある。図８は、単一細胞１４に、レポータ分子２８を、ピペット３４でマイクロインジェクションもしくは単純脂肪利用マイクロインジェクションによって、又はレーザ３６を使用するオプトインジェクションによって、どのようにして入れることができるかを線図的に図解している。図９は、複数の細胞１４に、レポータ分子２８を、電極３８問の溶液中でのエレクトロポレーションによって、レポータ２８を運ぶ溶液内でレーザ３６を使うオプトポレーションによって、及びピノサイトーシス、ベシクル生成及び膜透過性基質を利用するなどの各種受動的技法（ｐａｓｓｉｖｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）のいずれかによって、どのようにして入れることができるかを線図的に図解している。レポーター２８は、また、細胞１４に輸送される補助分子に共有結合させることによって、細胞１４中に導入することができる。それらの補助分子としては、限定はされないが、ＨＩＶ−ＴＡＴペプチド、アンテナペディアペプチド、ＶＰ２２ペプチド及びそれらの類似体がある。また補助分子は、レポータ２８を特定の細胞レベル以下のオルガネラ中に局在化させるのを目的とするペプチド配列でもよく、図１０に、核に局在化させた、ＰＫＣに対する基質が、核に局在化させたタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）に対するレポータ分子２８が入っている細胞１４の蛍光画像（左側）と透過光画像（右側）に示されている。ＰＫＣに対するレポータは、補助分子、すなわち核局在化配列（ＮＬＳ）として知られているペプチドと融合された。これら２分子が結合すると、生成された分子（ＮＳＬ−ＰＫＣ）を、細胞核内に選択的に局在化させる。
【００４３】
レポータ２８の補助分子への結合は、直接結合であってもよいし、またはリンカー分子による結合であってもよい。そのリンカー分子は、非開裂性でもよく、またはレポータ２８と補助分子が細胞１４内ではもはや結合しないように細胞内で開裂してもよい。レポータ２８は、標識付けされてなくてもよいし、又はそのレポータを検出しやすくするため標識を結合させてもよい。標識のいくつかの例としては、限定はされないが、発蛍光団、安定同位体、放射性同位体及びビオチンがある。類似しているが識別できる程度に僅かに異なる標識（例えば、異なるスペクトル特性を有する発蛍光団）を使用することができる。さらに、細胞１４は、分子生物学由来の標準技術によってレポータ分子２８を産生させることができる。グリーン蛍光のタンパク質又はその誘導体を、対象の分子と融合させることによって製造される各種の生物分子は、その一例である。
【００４４】
レポータ２８が研究中のシステムに与えかねない作用を最小限にするため、細胞１４内のレポータ２８の濃度は、活性を測定している酵素３０に対する正常基質の濃度より低いか又は類似していることが理想的である。この技法は、細胞１４内のレポータ２８の濃度が１００ナノモルと低いときに、酵素活性を検出するために使用することができる。ここでは、単分子を検出できるので、１０ｎＭと低いレポータ２８の細胞濃度を利用することができる。
【００４５】
試験中のレポータ２８と酵素３０の間の反応は、前記細胞内容物を希釈することによって、又は捕捉剤、酵素阻害剤又は標識なしのレポータ２８を添加することによって、低下させるか停止させることができる。その反応は、レポータ２８が細胞１４から取り出されるのと同時に、レポータ２８が細胞１４から取り出される前に、又はレポータ２８が細胞１４から取り出された後に、終了させることができる。もし、レポータ２８を細胞１４から放出した後に、反応を停止させる場合は、レポータ２８の細胞１４からの放出と反応の停止との間の時間は、１秒未満が理想的である。神経細胞１４などのいくつかの細胞型の場合は、ある種の酵素反応は、３３ｍｓ未満で停止させなければならない。酵素で触媒される生物分子の反応の反応速度を考えると、どの場合でも、これらの反応を１０マイクロ秒以下で終了させることは、正確な測定を行うために必要な時間軸分解能（ｔｅｍｐｏｒａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）をはるかに超えている。
【００４６】
レポータ２８が対象の酵素３０によって修飾された程度は、レポータ２８と修飾されたレポータ２８’とを識別し、次いでレポータ２８と修飾されたレポータ２８’の一方又は両方を定量することによって求めることができる。レポータ２８と修飾されたレポータ２８’とを識別する方法としては、限定はされないが、ＤＮＡ、タンパク質その他の分子の電気泳動法、マイクロクロマトグラフィ、質量分光法及びアフィニティアレイによる分離方法がある。レポータ２８及び／又は変性レポータ２８’の定量方法としては、限定はされないが、蛍光分光法、蛍光偏光分光法、質量分光法、電気化学的検出法、伝導性、放射能検出法又はＥＬＩＳＡ法がある。
【００４７】
細胞１４又は細胞１４の集団の活性をより完全に評価するため、タンパク質活性を測定する上記の方法は、分子生物学及び細胞生物学で通常利用される他の方法と組み合わせて利用することができる。そのような方法としては、限定はされないが、フローサイトメトリ、マイクロフルイディクスデバイスで実施されるフローサイトメトリ、二次元ゲル電気泳動法、タンパク質質量分光法、構造生物学、細胞内イオンなどのインジケータ、細胞内タンパク質配置探索法（ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）（限定はされないが、抗体ベースの方法とグリーン蛍光タンパク質ベースの方法がある）及びアフィニティアレイがある。図１１は、質量分光法４８を利用するプロテオーム検定法を線図的に図解している。この方法では、細胞１４が領域４０内で溶解され、マイクロルーメン４２内で電気泳動で分離され、検定検出領域４４内でレーザ３６によって蛍光で検出され、次いでエレクトロスブレー４６で分散されて質量分光法４８で分析される。図１２Ａは、ゲノミクス検定法を図解しており、そこでは、細胞１４が領域４０内で溶解され、マイクロルーメン４２内で電気泳動で分離され、検定検出領域４４内でレーザ３６によって蛍光で検出され、次いで混合チャンバとＰＣＲチャンバ５０内で混合及び複製されて、ＲＮＡハイブリッド形成アレイ５２を使用して検出される。図１２Ｂは、貯槽５４からの細胞１４が、コンピュータ６６によって制御されながら貯槽５６からのキナーゼ基質と混合されて領域５８で溶解されるシグナル伝達マイクロチップを線図的に図解している。その細胞内容物は、コンピュータ制御マイクロフルイディクスを利用してＤＮＡ／ＲＮＡアレイ分析を行うためＰＣＲチップ６０の方に誘導されるか、又は６２において蛍光で検出され、その後、廃棄物貯槽６４に堆積させる。
【００４８】
アフィニティアレイ５２は、限定はされないが、好ましくはＤＮＡ又はタンパク質のアレイである。フローサイトメトリは、タンパク質活性を測定する上記方法と組み合わせて、検定を実行する速度を上げることができる。図１３は、フローサイトメトリによる分析を線図的に図解している。セルインテロゲーション（ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）がフローサイトメトリ領域６６内の細胞１４に行われて、細胞の溶解が６８で起こる。その細胞内容物は、７０のところで電気泳動で分離され、次に７２のところでレーザ３６によって蛍光で検出される。フローサイトメトリは、有鞘又は無鞘の流体流で達成することができる。図１４は、蛍光顕微鏡法又はパッチクランプ法がどのようにして前記検定法と組み合わせられ得るかを線図的に図解している。図１４の上部は、サンプリングチャンバ７４内でのマイクロルーメン１０の使用を示し、そのチャンバ内には、Ｃａ２＋指示薬、膜電位指示薬又は蛍光酵素基質を含む細胞１４が入れられており、そして、その細胞は対物レンズ７６を通して蛍光で画像形成される。図１４の下部では、マイクロルーメン１０がカバーグラス７６上の細胞１４内のチャンバ７４の中に挿入されており、その細胞１４にはパッチピペット７８によって蛍光酵素基質が入れられている。
【００４９】
複数種の酵素３０を分析するこの方法の性能は、機能的に相互に作用する酵素のネットワークを発見して、生体内での医薬選択性を評価するのに利用することができる。複数種のレポータを細胞１４中に導入することによって、複数種の酵素を試験研究することができる（図１５〜１８）。例えば、個々の細胞１４、細胞１４の一部分又は細胞１４群の中の４種の酵素の活性を同時に測定するため、４種のレポータを細胞１４内に導入し、反応を停止させ、次いで、それらレポータが修飾された程度が図１５と１５Ｂに示すようにして測定される。図１５Ａは、この明細書において「シグナル伝達経路の素描（有様を解明しその概要を描き出すことを意味する）」と定義されるもので、単一細胞１４内における４種の酵素の活性の測定の概略線図である。レポータ２８（１）〜（４）を細胞１４中に入れ、次に、未変性レポータ２８（１）〜（４）と変性レポータ２８’（１）〜（４）が溶解され、分離され、次いで分析されて、未変性レポー２８（１）〜（４）と変性レポータ２８’（１）〜（４）の相対的量と存在とを示す４つの識別できる電気泳動図が作成される。図１５Ｂは、シグナル伝達経路の素描で、単一細胞１４内における未変性レポータ２８（１）〜（３）及び変性レポータ２８’（１）〜（３）に関する３種の酵素の活性の測定結果を示す類似の概略線図である。５種以上の酵素の活性を同時に評価するため、図１６〜１８に線図で示すように、試験される各対応する酵素３０に対し追加のレポータ２８（ｊ）が導入され、単一細胞１４内の５種の未変性レポータ２８（１）〜（５）と変性レポータ２８’（１）〜（５）が図１６に示され、単一細胞１４内の１０種の未変性レポーター２８（１）〜（１０）と変性レポーター２８’（１）〜（１０）が図１７に示され、そして単一細胞１４内の多数の未変性レポータ２８（１）〜（ｎ）と変性レポータ２８’（１）〜（ｎ）が図１８に示されている。これらのレポーターは、１種の酵素３０に対して特異的であってもよく、又はいくつかの数種の酵素３０に対する基質であってもよい。いくつかの酵素３０と反応するレポータ２８の場合、単一酵素３０の活性は、オーバラップしている特異性を有するレポータ２８の群を導入することによって測定することができる。例えば、レポータ２８Ａは酵素３０（１）、（２）及び（３）と相互に作用し、そしてレポータ２８Ｂは酵素３０（２）、３０（３）及び３０（４）と相互に作用する。レポータ２８Ａと２８Ｂの両者が細胞１４内に導入される。もし、レポータ２８Ａだけが修飾されたならば、酵素３０（１）〜（４）のうち酵素３０（１）だけが活性である。もし、レポータ２８Ｂだけが修飾されたならば、酵素３０（４）だけが活性である。ある期間にわたる刺激に対する細胞１４の応答は、細胞１４の群に単一または複数のレポータ２８を入れ、その細胞１４の群を刺激し、次いで、これら細胞１４のサブグループを、上記方法で所定の期間で検査することによって測定することができる。
【００５０】
上記の方法には、同じ細胞１４内の多数の酵素３０の活性化状態を同時に測定するという可能性、すなわち、図１８に任意の数ｎの酵素について線図的に図解するように、単一細胞１４、細胞１４の集団又は細胞１４の一部分の「酵素の指紋（ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ）」を作成する可能性がある。明らかに、単一細胞１４、細胞１４の集団又は細胞１４の一部分の中における非常に多数のシグナル伝達経路を測定することは、正常状態と疾病状態における正常なシグナル伝達経路と異常なシグナル伝達経路の役割の理解をもたらすであろう。そのうえ、酵素３０は、医薬療法の有望な目標であり、そして薬理的アンタゴニスト（拮抗剤）の開発は激しい研究分野である。正常細胞及び疾病細胞１４内で関与している酵素３０の数、素性（ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ）及び活性化度を測定することは、医薬目標を同定し、活性化合物をスクリーニングするのに役立つ。基本的な癌生物学と医薬開発に加えて、上記方法は、臨床医学に大きな有望性を有する。多種の疾病が病理学的基準で引き続き分類されているが、それらの表現型の基礎になっている分子ベース（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂａｓｉｓ）では異なっていることが知られている。異なる疾病状態の異なる挙動を実際に推進しているのは、組織構造上の外観ではなく、変性された細胞内タンパク質の活性なのである。表面の受容体又は遺伝子型などの分子基準による疾病の指紋付けは、現在、疾病の分類と治療法の決定を行う際に価値ある助けになることが認識されている。しかし、それらの測定法は、依然として、どの経路が調整されていないのかを間接的に評価しているに過ぎない。単一細胞１４、細胞１４の集団又は細胞１４の一部分の「酵素の指紋を採る」ことは、与えられた患者の疾病に関わるシグナル伝達経路の直接の尺度を提供する。こうして、特定の患者の疾病を推進する調整されていない経路における、目標とする個々の化学療法の方式を容易に構想することができる。
【００５１】
多くの異なるタイプの細胞１４内において刺激あり又は刺激なしで多数種の酵素の活性を分析することによって、タンパク質活性の地図を作成することができる。このようにして、医薬の活性の素描と医薬の可能性を、図１９に線図で示すように評価することができる。レポータを入れた細胞１４を対象の化合物又は医薬８０で処理して、それから電気泳動図８２を得て、それが図１８で考察したような酵素の指紋を提供する。電気泳動図８２のこの酵素の指紋を、次いで分離電気泳動図のデータベースと比較する。なお、そのデータベースは、複数の酵素経路の酵素指紋を含んでいて、その内の１又は２以上の望ましい酵素経路が電気泳動図８４が示すように低毒性で有効な作用を受けたか、電気泳動図８６が示すように有効な作用を受けなかったか、又は電気泳動図８８が示すように高毒性で効果的な作用を受けたかである。有効な作用としては、そのときの用途で要望されることによって、１又２以上の酵素経路の促進又は阻害がある。
【００５２】
細胞標的の化合物（例えば、限定はされないが、毒性試験）も図２０に示すようにして同定できる。レポータ２８を入れた細胞１４を、対象の化合物又は物質８０で、現在知られているか又はその後に考案される方法で再び如何様にも処理する。Ａ→Ｂ、Ｅ→Ｆ、Ｉ→Ｊ、Ｍ→Ｎ及びＱ→Ｒのシグナル伝達ステップ（これらのアルファベット文字は、対象の各種生化学経路を表す）に関連するレポータ２８を想定する。化合物８０がこれらシグナル伝達ステップに作用しなかった場合、前記データベースに含まれている電気泳動図８０が知られている。酵素ＹがステップＡ→Ｂを停止させる場合、電気泳動図９２が得られる。酵素ＺがステップＱ→Ｒを停止させる場合、電気泳動図９４が得られる。負の副作用があることが知られている医薬の活性の素顔をこの方法で調べて、新しい医薬の候補を、その化合物を動物実験又は人体実験に使用する前に、同じ負の副作用についてスクリーニングするのに利用することができる。新しい医薬が検査されそして新しいレポータ２８が開発されると、新しく発見された関係を、先に組み立てられたデータベースに付け加えることによって、新しい活性地図を組み立てることができる。同様に、タンパク質活性マップを使用して、疾病状態又は前疾病（ｐｒｅｄｉｓｅａｓｅ）の状態を同定し分類することができる。これらのタンパク質活性地図は、図２１と２２に線図的に描写されているように、患者の診断、予後及び治療計画を行うのに有用である。図２１では、細胞の試料を特定の患者から採取して、選択されたレポータ２８を入れる。電気泳動図９６がその患者の酵素指数として得られる。次いで、その酵素指数を、データベースの中の酵素指数と比較して、患者を診断するか又は患者になされた治療の予後を行う。図２２は、複数細胞の場合に正常状態又は疾病状態を見つける方法を図解する。再び、細胞試料を採取する。図２２の左部分に、８個の細胞１４が示されており、それら細胞は全て正常である。例えば、正常細胞１４は、阻害されたシグナル伝達経路Ｎ→Ｑと阻害されていないシグナル伝達経路Ｎ→Ｏを持っている。図２２の右部には８個の細胞１４の試料が示され、それらの細胞の中の２個の細胞１４’は前疾病又は疾病の状態にある。前疾病又は疾病の状態の細胞１４’において、シグナル伝達経路Ｎ→Ｑは阻害されておらず、そしてシグナル伝達経路Ｎ→Ｏが阻害されている。両方の試料がこの発明に従って分析され、これら個々の細胞のＮ→ＯとＮ→Ｑのシグナル伝達経路の一連の電気泳動図が得られ、図２２の下部分に示してある。これらの電気泳動図は、複数細胞の分析において、もちろん併合される。左部分には、正常細胞のみからの寄与があるが、右部分には前疾病又は疾病の状態の二つの細胞１４’の寄与がある。上記活性マップは、疾病発生に直接又は間接的に関与している経路とタンパク質を同定するので、それらの地図は、新しい医薬の標的を同定するために使用することができる。
【００５３】
これらのタンパク質活性地図は、図２３と表３に象徴的に図解されているようなＤＮＡアレイ、二次元ゲル／質量分光法、及びタンパク質アレイなどの他の高度に並列のマッピング技法と殆ど同様に使用されるであろう。しかしながら、この発明の方法は、ＲＮＡ又はタンパク質の素性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）／濃度を定量するのではなくて、タンパク質の活性を測定する（図２３と表３）。この発明の方法の用途は、ＤＮＡアレイ、タンパク質アレイ及び質量分光法の場合とほとんど同じである。タンパク質活性地図のデータベースとしての分析は、生物系を分析するのに重要な手法である。タンパク質活性地図をデータ記録として使用すると、全ての可能な条件下で、各種細胞１４内のタンパク質活性の全てを同定する。これらの用途としては、限定はされないが、代謝経路の特性決定、調節経路の特性決定、疾病組織及び正常組織の特性決定、医薬標的の同定、医薬と毒性薬剤の作用のメカニズムの確立がある。タンパク質活性地図のデータベースは、生物学的プロセスをより充分に理解するため、ｍＲＮＡ発現のデータベース、タンパク質の素性／濃度その他のデータベースに連結してもよい。
【００５４】
単一の生細胞１４、細胞１４の一部分又は細胞１４の群の中の複数種の酵素の活性を同時に検査する方法において前述した各ステップは、個々に又は組み合わせて、コンピュータによって制御することができる。例えば、限定はされないが、細胞の位置検出デバイス、収集デバイス、分離デバイス、細胞溶解デバイス及びレポータ検出デバイスはすべてコンピュータで制御することができる。種々の検定ステップのコンピュータ制御を、単独で又は他の技法と組み合わせて利用して、単一又は複数の細胞１４内の複数種の酵素の活性を同時に検査する方法の処理速度（スループット）を高めることができる。それらの他の方法としては、限定はされないが、アレイの表面特性を処理することによってアレイ５２上に細胞１４を配置する方法、及び図２４と２５に線図的に描写したような細胞１４の多重連続分析（ｓｅｒｉａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）又は多重並列分析（ｐｒａｌｌｅｌ ａｎａｌｙｓｉｓ）がある。図２４は、細胞１４又はマイクロルーメン１０のいずれかを、コンピュータ制御電気機械デバイスで互いに他方に対して移動させて連続検査することを意図している。図２５は、複数のマイクロルーメン１０が、複数細胞１４の同時検定又は並列検定を行うために複数のチャンネルを形成することを想定している。また、図１２Ｂに示したようなコンピュータ自動化マイクロチップベースのやり方や、図１８と関連して考案したような電気泳動図上の多数のピークを識別し同定する情報科学の技法も含まれる。
【００５５】
【付言】
多くの変更と変形が、当業者によってこの発明の精神と範囲から逸脱することなくなされであろう。したがって、例証した実施態様は、例示だけを目的として説明されていること、そしてこの発明を以下の発明及びその各種実施態様で定義されているように限定すると見なすべきではないことを、理解すべきである。
【００５６】
この発明及びその各種実施態様を記述するのにこの明細書で使用されている用語は、それらの通常定義されている意味の趣旨にのみ解すべきではなく、この明細書における特別の定義によって通常定義されている意味の範囲を超えた構造、材料又は行為を含むと解すべきである。したがって、もし、ある要素が、この明細書に文脈から、２以上の意味を含んでいると解することができる場合は、その使用は、この明細書及び用語自体によって支持されるすべての可能な意味を包含していると解すべきである。
【００５７】
したがって、以下の発明及びその各種実施態様の用語と要素の定義は、文言で述べられている要素の組合せのみならず、事実上同じ方式で事実上同じ機能を果たして事実上同じ結果を得るための同等の構造、材料又は行為の全てを含むものとこの明細書において定義されているのである。したがって、この意味で、この発明及びその各種実施様態における要素のどの一つでも、二以上の要素で同等の置換をすることができ、又は請求項における２以上の要素を単一の要素で置換をすることができると、意図されている。
【００５８】
現在知られているか又は後に案出されるかを問わず、当業者から見て請求項の主題からの些細な変更は、この発明及びその各種実施様態の範囲内に同等として入っているとの意図であることを明言する。したがって、当事者に現在知られているか又は後に知られる自明の置換は、前記定義された要素の範囲内にあると定義される。
【００５９】
したがって、この発明とその各種実施様態は、上記に具体的に図解され記載されているもの、概念上同等であるもの、置換可能性が自明であるもの、そしてまたこの発明の必須のアイデアを本質的に組み入れているものを含んでいると解すべきである。
【００６０】
【関連出願】
この出願は、２０００年１１月２２日付けで出願された米国仮特許願第６０／２５２，８６１号に関連しかつその優先権を主張するものであり、その米国仮特許願は、１９９９年７月２１日付けで出願され、発明の名称が「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｕｓｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ Ｃｈａｎｇｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ Ｍｏｂｉｌｉｔｙ」である米国特許願第０９／３５８，５０５号の一部継続出願であり、その米国特許願は、１９９８年３月６日付けで出願され、発明の名称が「Ｆａｓｔ Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ Ｌａｓｅｒ Ｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ」である米国特許願第０９／０３６，７０６号の一部継続出願であった。上記最後に記載の件は、現在、米国特許第６，１５６，５７６号（２０００年）として発行されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】タンパク質の複雑な相互に作用するネットワークを描写する細胞の線図である。各アルファベット文字はタンパク質を表し、そして矢印は、それらタンパク質が互いにどのように相互に作用し得るかを表す。
【図２】三つの知られているタンパク質経路：マイトジェン活性化タンパク質（ｍｉｔｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＡＰ）キナーゼのカスケード、ホスホイノシチドのカスケード及びホスファチジルイノシトール−３キナーゼのカスケードの線図である。これら経路中の多くの既知要素が略語（すなわち、Ｓｏｓ、Ｒａｓなど）で示してあり、矢印は、どの分子がこれら経路の他のメンバーと相互に作用できるのかを表す。これらカスケードの内の大部分の要素又は分子は、酵素である（他の酵素のカスケード又はシグナル伝達ネットワークにおける要素と同様）。
【図３】酵素の活性を測定する現行測定法の例を示す。図３に示す技法は、単細胞測定に対する感度が充分出ない。そのうえ、多くのステップを必要とし、異常に時間が掛かり、しかも多くの人力が必要である。この検査フォーマットは、複数種の酵素を同時に測定できない。
【図４】酵素の活性を測定する現行測定法の例を示す。図４に示す技法は、酵素活性化の間接的な測定法なので、アーチファクトを起こしやすい。そのうえ、小サブセットの酵素すなわち細胞内で移行する酵素にのみ限定される。この検査フォーマットは、複数種の酵素を同時に測定できない。
【図５Ａ】この発明によって分析される単一細胞又は細胞群の上にマイクロルーメンが配置されていることを示す略図である。
【図５Ｂ】図５Ａに線図で描写したデバイスによって採取した１、４又は１０個の細胞を同時にサンプリングする前（０ｍｓ）及びした後（３３ｍｓ）の顕微鏡写真の画像を集めたものである。
【図５Ｃ】図５Ｂに描写したようにサンプリングされた標準及び１又は４個の細胞の内容物を分析した典型的な電気泳動図を示す。細胞には、予めオレゴングリーン及び２種のフルオレセイン異性体を入れた。
【図６Ａ】ｉ〜ｉｖは、細胞のごく小部分だけが分析されるように、マイクロルーメンを細胞の一部分の近くにどのように配置できるかについての４例を示す略図である。
【図６Ｂ】図６Ａに線図で描写したように細胞の突起のうちの一つをサンプリングする前とサンプリングした後の細胞の顕微鏡写真の画像を集めたものである。
【図６Ｃ】オレゴングリーン及び２種のフルオレセイン異性体の標準品の、又は図６Ｂに示すように、予めオレゴングリーン及び２種のフルオレセイン異性体を入れた細胞の突起の内容物の、典型的な電気泳動図を示す。
【図７】単一細胞、細胞群又は細胞の一部分の酵素活性を測定するのに使用される検査法の線図的図解（ａ〜ｃ）である。一例として、キナーゼ検査法を描写してある。
【図８】単一細胞にレポータ分子をどのようにして入れることができるかを示すいくつかの例の略図を集めたものである。
【図９】複数細胞にレポータ分子をどのようにして入れることができるかを示すいくつかの例の略図を集めたものである。
【図１０】核に局在しているタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）に対するレポータ分子を入れた細胞の蛍光画像と透過光画像を示す。
【図１１】この検査法を質量分光法とどのように組み合わせることができるかについて一例を描写している。
【図１２Ａ】この検査法をＤＮＡアレイとどのように組み合わせることができるかについての一例を示す。
【図１２Ｂ】この検査法をＤＮＡアレイとどのように組み合わせることができるかについての一例を示す。
【図１３】フローサイトメトリー（有鞘又は無鞘）をこの検査法とどのように組み合わせることができるかについて一例を示す。
【図１４】蛍光分光法又はパッチクランプ法をこの検査法とどのように組み合わせることができるかについて一例を示す。
【図１５Ａ】この明細書で「シグナル伝達経路の素描」と定義される、単一細胞内の４種の酵素活性の測定を示す線図である。
【図１５Ｂ】単一細胞内の３種の酵素活性の測定を示すシグナル伝達経路の素描の線図である。
【図１６】単一細胞内の５種の酵素活性の測定を示すシグナル伝達経路の素描の線図である。
【図１７】単一細胞内の１０種の酵素活性の測定を示すシグナル伝達経路の素描の線図である。
【図１８】細胞に「酵素の指紋をつけて」シグナル伝達経路の素描を得るのに利用できる細胞内の多数種の酵素活性の測定の概要図である。この場合、各種レポータは、異なるスペクトル特性を有する蛍光タグで標識して、それらレポータをそれらの電気泳動特性でなくそれらのスペクトル特性に基づいて分離して識別するのに役立てることができる。
【図１９】化合物又は医薬に暴露された細胞から得た活性素描（つまり、酵素の指紋）を、既知の医薬又は化合物から得た活性素描のデータベースと比較できる一方法の概要図である。
【図２０】細胞にレポータの混合物を入れて医薬又は化合物で阻害されることがある酵素ステップを示すことによって、医薬の標的をどのように同定できるかの一例の描写である。
【図２１】レポータ分子を患者の単一もしくは複数の細胞中に入れることによって個別の診断、予後及び又は治療をどのように実行できるかを示す一例である。
【図２２】レポータ分子を細胞内に入れて酵素素描を比較することによって、疾病状態又は前疾病状態を正常状態からどのようにして識別できるかを示す概要図である。
【図２３】ゲノミクス、プロテオミクス及びシグナル伝達の類似点並びに酵素活性地図に対する用途が現在使用中又はゲノミクス及びプロテオミクスの技法に予想される酵素活性地図と同等であろう見込みを描写している。
【図２４】分析すべき細胞をコンピュータ制御によって同定し選択する様、及び細胞又はマイクロルーメンの移動をコンピュータ制御する様を描写している。
【図２５】多数の細胞の高度の並列分析を行うため、レポータ分子を入れた細胞のアレイの上に配置されたマイクロルーメンのコンピュータ制御アレイの略要図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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