(57)【要約】目的とする細胞内小器官または構造の組織化に影響を与えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法が提供される。この方法は、（ａ）目的とするポリペプチドをそれぞれがコードする複数の発現構築物を含む発現ライブラリーを複数の細胞内で発現し；（ｂ）複数の細胞の目的とする細胞内小器官または構造を強調表示し；そして（ｃ）目的とする細胞内小器官または構造の細胞内分布および／または程度が変化される複数の細胞のうちの１種または複数の細胞を単離して、それによって目的とする細胞内小器官または構造の組織化に影響を与えることができるポリペプチドを単離することを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的とする細胞内小器官または構造の組織化に影響を与えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法であって：
（ａ）目的とするポリペプチドをそれぞれがコードする複数の発現構築物を含む発現ライブラリーを複数の細胞内で発現し；
（ｂ）前記複数の細胞の目的とする細胞内小器官または構造を強調表示し；そして
（ｃ）目的とする細胞内小器官または構造の細胞分布および／または程度が変更されている前記複数の細胞のうちの１種または複数の細胞を単離し、それによって目的とする細胞内小器官または構造の組織化に影響を与えることできるポリペプチドを単離する
ことを含む方法。
【請求項２】
前記強調表示工程は、
（ｉ）目的とする細胞内小器官または構造に会合されるか、またはその一部分を形成する分子を標識化すること；および
（ｉｉ） 目的とする細胞内小器官または構造に会合することができる標識化された分子を前記複数の細胞内に供給すること
からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって実施される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記標識化された分子の標識は、蛍光標識、放射性標識、エピトープ標識、ビオチン標識および酵素標識からなる群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記標識化された分子は標識化されたポリペプチドであり、さらに、前記複数の細胞内に供給する場合には、前記レポーターポリペプチドは前記標識化されたポリペプチドをコードする核酸構築物を前記複数の細胞内で発現することによってもたらされる、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記内因性分子は、タンパク質、脂質、第２メッセンジャー、イオン、フリーラジカル、細胞内小器官および構造からなる群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項６】
前記細胞は哺乳動物セルラインである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
工程（ｃ）の前に、前記複数の細胞を固定化する工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
目的とする細胞内小器官または構造に局在化することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法であって、
（ａ）ポリペプチド標識に融合された目的とするポリペプチドをそれぞれがコードする複数の発現構築物を含む発現ライブラリーを複数の細胞内で発現し；
（ｂ）前記ポリペプチド標識を介して、前記複数の細胞内に目的とする前記ポリペプチドを局在化させ；そして
（ｃ）前記目的とするポリペプチドが目的とする細胞内小器官または構造に局在化される前記複数の細胞のうちの１種または複数の細胞を単離して、それによって、目的とする細胞内小器官または構造に局在化することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する
ことを含む方法。
【請求項９】
前記ポリペプチド標識は、エピトープタグ、蛍光タンパク質および酵素からなる群から選択される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞は哺乳動物セルラインである、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｂ）の前に、前記複数の細胞を固定化する工程をさらに含む、請求項８記載の方法。
【請求項１２】
目的とする細胞内小器官または構造に局在化されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法であって、
（ａ）ポリペプチド標識に融合された目的とするポリペプチドをそれぞれがコードする複数の発現構築物を含む発現ライブラリーを複数の細胞内で発現し；
（ｂ）前記複数の細胞中の目的とする細胞内小器官または構造を強調表示し；
（ｃ）前記ポリペプチド標識を介して、前記複数の細胞内で目的とする前記ポリペプチドを局在化させ；そして
（ｄ）前記目的とするポリペプチドが目的とする前記強調表示された細胞内小器官または構造と共局在化される前記複数の細胞のうちの１種または複数の細胞を単離し、それによって目的とする細胞内小器官または構造に局在化されているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する
ことを含む方法。
【請求項１３】
前記強調表示工程は、
（ｉ）目的とする細胞内小器官または構造に会合されるか、またはその一部分を形成する内因性分子を標識化すること；および
（ｉｉ） 目的とする細胞内小器官または構造に会合することができる標識化された分子を前記複数の細胞内に供給すること
からなる群から選択された少なくとも１つの方法によって実施される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記標識化された分子の標識は、蛍光標識、放射性標識、エピトープ標識、ビオチン標識および酵素からなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記標識化された分子は標識化されたポリペプチドであり、さらに、前記複数の細胞内に供給する場合には、前記レポーターポリペプチドは前記標識化されたポリペプチドをコードするための核酸構築物を前記複数の細胞内で発現することによってもたらされる、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
前記内因性分子は、タンパク質、脂質、第２メッセンジャー、イオン、フリーラジカル、細胞内小器官および構造からなる群から選択される、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチド標識は、エピトープタグ、蛍光タンパク質および酵素からなる群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞は哺乳動物セルラインである、請求項１２記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｂ）の前に、前記複数の細胞を固定化する工程をさらに含む、請求項１２記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリペプチド標識が強調表示された目的とする細胞内小器官または構造と共局在化される前記複数の細胞のうちの１種または複数の細胞を単離する工程は、相互相関画像処理と組み合わせたデジタル顕微鏡で実施される、請求項１２記載の方法。
【請求項２１】
標的ポリペプチドに特異的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法であって、
（ａ）第１ポリペプチド標識に融合された目的とするポリペプチドをそれぞれがコードする複数の発現構築物を含む発現ライブラリーを複数の細胞内で発現し；
（ｂ）（ｉ）前記第１ポリペプチド標識と区別され得る第２ポリペプチド標識；
（ｉｉ） 特定の細胞内小器官または構造に前記キメラポリペプチドを局在化させるためのポリペプチドドメインおよび
（ｉｉｉ）標的ポリペプチドの少なくとも一部分
を含むキメラポリペプチドを前記複数の細胞内に供給し；そして
（ｃ）前記第１および第２ポリペプチド標識のそれぞれを介して、前記複数の細胞内に前記目的とするポリペプチドおよび前記キメラポリペプチドを局在化させ；そして
（ｄ）前記目的とするポリペプチドが前記キメラポリペプチドと共局在化する前記複数の細胞のうちの１種または複数の細胞を単離し、それによって標的ポリペプチドに特異的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する
ことを含む方法。
【請求項２２】
前記第１および第２ポリペプチド標識のそれぞれは、エピトープタグ、蛍光タンパク質および酵素からなる群から独立して選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞は哺乳動物細胞である、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
前記キメラポリペプチドを前記複数の細胞内に供給する工程は、前記キメラポリペプチドを発現する発現構築物を前記複数の細胞中に導入することによって実施される、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
前記目的とするポリペプチドが前記キメラポリペプチドと共局在化する前記複数の細胞のうちの１種または複数の細胞を単離する工程は、相互相関画像処理と組み合わせたデジタル顕微鏡によって実施される、請求項２１記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｃ）の前に、前記複数の細胞を固定化する工程をさらに含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）ポリペプチド標識；
（ｂ）特定の細胞内小器官または構造に前記キメラポリペプチドを局在化させるためのポリペプチドドメイン；および
（ｃ）目的とするポリペプチドの少なくとも一部分
を含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド領域を含む核酸構築物。
【請求項２８】
前記ポリペプチド標識はエピトープタグ、酵素および蛍光タンパク質からなる群から選択される、請求項２７記載の核酸構築物。
【請求項２９】
（ａ）ポリペプチド標識：
（ｂ）特定の細胞内小器官または構造に前記キメラポリペプチドを局在化させるためのポリペプチドドメイン；および
（ｃ）目的とするポリペプチドの少なくとも一部分
を含むキメラポリペプチドをコードする発現構築物を含むレポーター細胞。
【請求項３０】
前記ポリペプチド標識はエピトープタグ、酵素および蛍光タンパク質からなる群から選択される、請求項２９記載のレポーター細胞。
【請求項３１】
異常な細胞表現型を少なくとも部分的に逆転することができる少なくとも１種の動因を同定する方法であって、
（ａ）少なくとも１種の動因に異常な表現型を特徴とする細胞を暴露し；そして
（ｂ）異常な細胞表現型に関連する少なくとも１つの細胞構成成分の変化をモニターし、前記変化は少なくとも部分的な表現型逆転の指標であり、それによって異常な細胞表現型を少なくとも部分的に逆転することにおける少なくとも１種の動因の能力を決定する
ことを含む方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つの細胞構成成分を強調表示する工程をさらに含み、前記強調表示工程は
（ｉ）異常な細胞表現型に関連する前記少なくとも１つの細胞構成成分を標識化すること；および
（ｉｉ）前記細胞内に異常な細胞表現型に関連する前記少なくとも１つの細胞構成成分を供給すること（ただし、前記少なくとも１つの細胞構成成分は標識に融合されている）
からなる群から選択される少なくとも１つの方法にて実施される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの細胞構成成分を供給することは、前記少なくとも１つの細胞構成成分または前記少なくとも１つの細胞構成成分を発現するための核酸構築物を細胞中に導入することによって実施される、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記標識は蛍光標識、放射性標識、エピトープ標識、ビオチン標識および酵素標識からなる群から選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの細胞構成成分の前記変化は、前記少なくとも１つの細胞構成成分の細胞分布、生化学的修飾、発現の程度および活性からなる群から選択される少なくとも１つのパラメーターにおける変化を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの細胞構成成分における変化をモニターする工程は、
（ｉ）前記細胞の前記少なくとも１つの細胞構成成分を正常な細胞表現型を特徴とする第２細胞のものと対比すること；および
（ｉｉ）工程（ａ）の前および工程（ｂ）に続いて、前記細胞内で前記少なくとも１つの細胞構成成分を対比すること
からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって実施される、請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞は哺乳動物起源のものである、請求項３１記載の方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１種の動因は、試験条件および試験化合物からなる群から選択される、請求項３１記載の方法。
【請求項３９】
前記試験条件は、成長条件および放射線条件からなる群から選択される、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記試験化合物は、合成品および天然物からなる群から選択される、請求項３８記載の方法。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの細胞構成成分は、タンパク質、脂質、第２メッセンジャー、イオン、フリーラジカル、細胞内小器官および構造からなる群から選択される、請求項３１記載の方法。
【請求項４２】
工程（ａ）の前に、異常な細胞表現型を特徴とする前記細胞を生成する工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４３】
異常な細胞表現型を特徴とする前記細胞は、病原性起源のものである、請求項３１記載の方法。
【請求項４４】
工程（ｃ）の前に、前記細胞を固定化する工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４５】
細胞中の複数の区別され得る分子の共局在化を定量化する方法であって、
（ａ）前記細胞の複数の画像を得るために、前記複数の区別され得る分子の各々について、細胞の画像を取得し、前記複数の画像の個々の画像それぞれは、細胞中の前記複数の区別され得る分子のうちの１つの分布を示し；そして
（ｂ）少なくとも１対の前記個々の画像における相関係数を計算し、それによって、細胞中の少なくと１対の前記区別され得る分子の共局在化を定量化する
工程を含む方法。
【請求項４６】
前記複数の画像のそれぞれは、標準化された画像である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
細胞中の分子の局在化をモニターする方法であって、
（ａ）異なった時点で細胞の複数の画像を取得し、前記複数の画像のそれぞれは細胞中の前記分子の分布を示し；そして
（ｂ）前記複数の画像の少なくとも１対の画像の相関係数を計算し、それによって、細胞中の分子の局在化をモニターする
工程を含む方法。
【請求項４８】
前記複数の画像のそれぞれは標準化された画像である、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
（ｃ）工程（ｂ）の前に、複数の歪みベクトル、すなわち各対の前記画像のそれぞれの小領域について１つの歪みベクトルを計算し、前記歪みベクトルは、前記対であるそれぞれの小領域の各々の領域相関係数を最大にするように選択され；そして
（ｄ）前記複数の画像の前記少なくとも１対の画像における歪みを補正するために、前記複数の歪みベクトルを使用する
工程をさらに含む請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
細胞中の複数の区別され得る分子の共局在化を定量化するシステムであって、
（ａ）前記細胞の複数の画像を得るために、前記複数の区別され得る分子の各々について細胞の画像を取得し、前記複数の画像の個々の画像それぞれは、細胞中の前記複数の区別され得る分子のうちの１つの分布を示し；そして
（ｂ）少なくとも１対の前記個々の画像について相関係数を計算し、それによって細胞中の少なくとも１対の前記区別され得る分子の共局在化を定量化する
ためのデータ処理機を含むシステム。
【請求項５１】
細胞中の分子の局在化をモニターするためのシステムであって、
（ａ）異なった時点で細胞の複数の画像を取得し、前記複数の画像のそれぞれは、細胞中の前記分子の分布を示し；そして
（ｂ）前記複数の画像の少なくとも１対の画像について相関係数を計算し、それによって細胞中の分子の局在化をモニターする
ためのデータ処理機を含むシステム。
【請求項５２】
前記データ処理機は、さらに
（ｃ）複数の歪みベクトル、すなわち各対の前記画像のそれぞれの小領域について１つの歪みベクトルを計算し、前記歪みベクトルは前記対のそれぞれの小領域の各々の領域相関係数を最大とするように選択され；そして
（ｄ）前記複数の画像の前記少なくとも１対の画像における歪みを補正するために、前記複数の歪みベクトルを使用するためのものである、請求項５１記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明の分野および背景
本発明は特定の細胞内小器官または構造に局在化されるタンパク質、特定の細胞内小器官または構造の形成、組織化および／または維持に関与するタンパク質および他のタンパク質に結合するタンパク質などの特定機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離する方法に関する。さらに、本発明は異常な細胞表現型を少なくとも部分的に逆転することができる薬学的活性化動因をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
ゲノムワイド配列決定により生じる大量の情報により、生物の遺伝子産物の全セットが今や予測され得る。
このポストゲノム時代の生物学の挑戦は、潜在的治療標的またはリード（ｌｅａｄｓ）の同定を可能とするために遺伝子機能を解明することである。
ヒトゲノムの個々の遺伝子数（〜３０，０００）および既存の化学を使用して達成され得る特殊な潜在的治療リード数（〜１００，０００×百万）の最近の推定は、全ての潜在的治療標的の構造−活性を完全にマップ化するには、１０１２以上の分析が必要とされることを示唆している（１）。
【０００３】
機能的ゲノム学
多くのスクリーニング法がタンパク質機能の特性化を可能とするために開発されている。このような方法は、典型的には種々のタンパク質−タンパク質相互作用分析を使用する。このような分析から生じたデータは、タンパク質機能の解明を容易にし、それ自体、これまでに特性化されていないタンパク質の可能性ある生物学的役割への洞察をもたらす。
【０００４】
２つの大規模スクリーニング法、酵母２ハイブリッドシステムおよびタンパク質質量分析法は潜在的タンパク質−タンパク質相互作用の同定において価値があることが証明されている（２）。
酵母２ハイブリッドシステムは、転写活性化剤を含む多くのタンパク質が独立して機能することができるモジュルドメインからなるとの原理に依拠する人工的転写ベースの分析法である。個々のドメインが別個に発現され、次いで、非共有結合相互作用を介して、きわめて近接させられた場合、このようなドメインは集合的に機能して未処置タンパク質の活性を再構成することができる。
【０００５】
２ハイブリッドシステムは、活性化ドメインハイブリッドのライブラリーをスクリーニングして、目的とするタンパク質に結合するタンパク質を同定するために使用され得る。これらのスクリーニングは、同定された新規なタンパク質のクローン化された遺伝子を直ちに利用できるという結果を生じる。タンパク質の重複領域をコードする複数のクローンがしばしば同定されるから、相互作用の最小ドメインは初期スクリーニングから解明され得る（３）。
【０００６】
２ハイブリッド法は初めて提示されてから、かなり発展しているけれども（４）、これは今もほとんど核に局在化され得るタンパク質に限定され、したがって、ある種の細胞外タンパク質を用いる有効な利用を妨げている。
さらに、２ハイブリッドシステムはいくつかの他の固有の制限を受ける；第１に、タンパク質は折りたたまれ、酵母細胞中に安定に存在し、そして融合タンパク質として活性を保持することができなければならず；第２に、酵母中で生じないか、または非能率的に生じるポスト翻訳修飾に依存する相互作用は検出されないであろう；第３に、転写に正常には関与しないものを含む多くのタンパク質はＤＮＡ結合ドメインに融合された場合、転写を活性化するであろう；および第４に、第３の非ペプチド性因子を含む相互作用は検出されないであろう。
【０００７】
タンパク質−タンパク質相互作用の多くは余りに弱く、今日までに確立されたスクリーニング法によって検出されないようであるが、タンパク質質量分光測定法の最近の進歩は、タンパク質−タンパク質複合体の同定を容易にしている（５）。これらの複合体から得たタンパク質およびトリプシン分解ペプチドは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、質量から誘導された配列、および生物のゲノムによってコードされる予測タンパク質のデータベースと対比される配列によって分析される。もしも質量のみから正確な配列を予測することができないなら、１６個までのアミノ酸配列のストレッチを産生する断片化法が使用され得る（６）。
【０００８】
質量分光測定法は有望な方法であるけれども、高価な操作および装置ならびに高度に熟練した技術者の必要性により制限される。より重要なことに、この方法はまたしばしば得ることが難しいか、またはほとんど不可能である単離タンパク質複合体の必要性によっても制限される。
タンパク質機能はまたタンパク質の細胞内局在化を探索することによっても解明され得る。真核生物細胞はその中で生じるプロセスが基本的なハウスキーピング活性またはより特定化された機能のどちらに関与しようとも、高度に区画化されている。
【０００９】
多くの小器官、区画およびドメインの存在は、細胞が秩序立った正確な方法で数千もの分子の分布を自己支配することを可能とする。真核生物機能の制御は、種々の細胞成分の差別的区画化に依拠する。細胞内局在化と機能の間のこの近接した関係は、ときには、タンパク質局在化に基づいてタンパク質機能を決定することを可能とする。
所与の区画に局在化されるタンパク質の同定は、典型的には細胞破砕と超遠心分離という時間のかかる手順を必要とする。細胞は浸透圧ショックにより、超音波振動により、細胞を小さな開口部中に無理に入れることにより、またはそれらを粉砕することによって破壊され得る。これらの手順は細胞の膜を破壊するが、もし注意深く適用されるなら、核、ミトコンドリア、リソソーム、およびペルオキソームなどの小器官をそのまま残す。
【００１０】
このような分画法を使用して、その生化学的特性のほとんどを維持したまま、小器官などの細胞内粒子を単離することができる。
分画方法はいくつかの固有の制限を受ける。まず、このような方法は達成できる収量および濃縮（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）に依存する。第２に、精製された画分は、画分に通常会合されない種々の細胞成分で汚染されている一方で、精製中に失われた機能的関連成分を欠いている。第３に、このような方法は細胞分画に影響を受けやすく、単離することが難しい一時的または制限された局在化を成分に示させる区画にのみ適用され得る。最後に、タンパク質成分の相対的量および生化学的特性はさらなる重荷を強いることがあり得る。
【００１１】
治療リード化合物をスクリーニングすること
治療リードの大規模スクリーニングは、目下、１件毎に多くの分析法を実施することを含む。伝統的なスクリーニング技術は放射性標識の検出に基づく。しかしながら、放射能に基づくスクリーニング法は、試薬の価格および１分析当たりの価格のみならず、放射性分析法の小型化に関連する固有の制限によっても制限される。
数年間にわたって、蛍光および化学発光検出法が伝統的な放射能検出法に代わって開発されている。しかしながら、蛍光標識化は本質的に感度が高いけれども、これは生物環境および光散乱などの光物理学効果の両方からバックグランド効果を受けやすいから、大規模スクリーニングにおいて十分な成果をもたらさない。
【００１２】
新規な蛍光検出法がこれらの困難を克服するために開発されている。放射能に代わって広く使われる１つの極めて万能で、かつ感度の高い方法は、ユウロピウムロピウム（ユウロピウム）などの稀土ランタニドイオン（ＬｎＴＲＦ）の時間分解蛍光（ＴＲＦ）測定に基づく。Ｅｕ＋３標識は放射能分析に通常使用される１２５沃素と少なくとも同じくらい高い感度を有するから、この技術は大規模スクリーニングにおける放射能の代替物として、広い用途がますます見出された。さらに、放射性標識を使用して、開発されている多くのタイプの分析法は異なった標識試薬を使用することによって、簡単にランタニド系分析法に切り換えられる。ランタニド分析法へ首尾よく変換されている放射能に基づく分析法の例としては、ユウロピウム標識化ストレプトアビジンに基づくビオチン化標的の検出法（７）、およびユウロピウム標識抗ホスホチロシンを使用するチロンシンキナーゼ分析法（８）が挙げられる。しかしながら、ＬｎＴＲＦ標識化はいくつかの大きな欠点を有する。このような標識を含む分析法は、アミン標識化反応においてユウロピウムキレートの完全性を確実にするために、ｐＨ＞７に限定される。さらに、このスクリーニング方法はランタニド蛍光を高めるために、複合体からユウロピウムを解離する増強溶液の使用を必要とする。
【００１３】
ケージ化Ｅｕ＋３からアロフィコシアニン（ＡＰＣ）へのＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）に基づく分析法は、さらにＬｎＴＲＦ法の範囲を広げている。この方法は重複する発光／吸光スペクトルを有する２つの蛍光物質が、互いにある距離内にあり、そしてそれらの遷移双極子が適切に配向されている場合、高エネルギー供与体蛍光物質の刺激が低エネルギー受容体蛍光物質を励起して光量子を放射させるという原理に基づいている。その定義にて暗示されるように、エネルギー移動に基づく分析法を選択するに当たって、大きく考慮することは、リガンド結合または酵素代謝回転時に誘導される距離的変化である。可能性あるエネルギー移動に関して、その距離は約４０〜５０Å未満でなければならない。この距離を総合的視野で見ると、４０Åは分子量２６，０００Ｄａを有するタンパク質分子の直径にほぼ相当する。したがって、分子スケールでの距離に対するＦＲＥＴの感度は、その可能性に大きな制限を課する。
【００１４】
蛍光性細胞に基づく機能的方法の使用は、治療リードのための大規模スクリーニングの最先端にある。このような細胞機能的分析法は、リード化合物の大規模スクリーニングにおいて増大する応用を見出している（９）。
機能的スクリーニング方法は、生化学的分析を越えた多くの利点を有する。例えば、受容体結合性化合物をスクリーニングする場合、機能的スクリーニングは、研究者が異なった結合形態間（アゴニスト対アンタゴニスト）を識別し、経路の生化学的特性化の程度に関係なく、標的ベースをシグナル伝達カスケードの多数の成分にまで広げることを可能とする。
機能的特性化及び治療リードスクリーニングの上記された方法のうちのいくつかは、学術的分野および商業的分野の両方で使用されているけれども、費用効果が高く、かつ正確である一方で、大規模で容易に実行されうるタンパク質機能の特性化および治療リードの同定への新しいアプローチの必要性が存在する。
【００１５】
本発明の要約
本発明の１つの態様では、目的とする細胞内小器官または構造の組織化に影響を与えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法であって、（ａ）目的とするポリペプチドをそれぞれがコードする複数の発現構築物を含む発現ライブリーを複数の細胞内で発現し；（ｂ）複数の細胞の目的とする細胞内小器官または構造を強調表示し；そして（ｃ）目的とする細胞内小器官または構造の細胞分布および／または程度が変更されている前記複数の細胞のうちの１種または複数の細胞を単離し、それによって目的とする細胞内小器官または構造の組織化に影響を与えることができるポリペプチドを単離することを含む方法が提供される。
【００１６】
本発明の他の態様では、目的とする細胞内小器官または構造に局在化することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法であって、（ａ）ポリペプチド標識に融合された目的とするポリペプチドをそれぞれがコードする複数の発現構築物を含む発現ライブラリーを複数の細胞内で発現し；（ｂ）ポリペプチド標識を介して、複数の細胞内に目的とするポリペプチドを局在化させ；そして（ｃ）目的とするポリペプチドが目的とする細胞内小器官または構造に局在化されている複数の細胞のうちの１種または複数の細胞を単離し、それによって、目的とする細胞内小器官または構造に局在化することができるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法が提供される。
【００１７】
本発明のなおも他の態様では、目的とする細胞内小器官または構造に局在化されているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法であって、（ａ）ポリペプチド標識に融合された目的とするポリペプチドをそれぞれがコードする複数の発現構築物を含む発現ライブラリーを複数の細胞内で発現し；（ｂ）複数の細胞の目的とする細胞内小器官または構造を強調表示し；（ｃ）ポリペプチド標識を介して、複数の細胞内で目的とするポリペプチドを局在化させ、そして（ｄ）目的とするポリペプチドが強調表示された目的とする細胞内小器官または構造に共局在化されている複数の細胞のうちの１種または複数の細胞を単離し、それによって目的とする細胞内小器官または構造に局在しているポリペプドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法が提供される。
【００１８】
本発明のなおも他の方法では、標的ポリペプチドに特異的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法であって、（ａ）第１ポリペプチド標識に融合された目的とするポリペプチドをそれぞれがコードする複数の発現構築物を含む発現ライブラリーを複数の細胞内で発現し；（ｂ）（ｉ）第１ポリペプチド標識から区別されうる第２ポリペプチド標識；（ｉｉ）特定の細胞内小器官または構造にキメラポリペプチドを局在化させるためのポリペプチドドメイン；および（ｉｉｉ）標的ポリペプチドの少なくとも一部分を含むキメラポリペプチドを複数の細胞内に供給し；そして（ｃ）第１および第２ポリペプチド標識のそれぞれを介して、複数の細胞内に目的とするポリペプチドおよびキメラポリペプチドを局在化させ；そして（ｄ）目的とするポリペプチドがメキラポリペプチドとともに共局在化する複数の細胞のうちの１種または複数の細胞を単離して、それによって標的ポリペプチドに特異的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法が提供される。
【００１９】
以下に説明される本発明の好ましい実施態様のさらなる態様では、強調表示工程は（ｉ）目的とする細胞内小器官または構造に会合されるか、または一部分を形成する内因性分子を標識化すること；および（ｉｉ）目的とする細胞内小器官と会合することができる標識化された分子を複数の細胞内に供給することからなる群から選択される少なくとも１つの方法によって実施される。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、標識化された分子の標識は蛍光標識、放射性標識、エピトープ標識、ビオチン標識および酵素からなる群から選択される。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、標識化された分子は標識化されたポリペプチドであり、さらに複数の細胞内に供給する場合、レポーターポリペプチドは標識化されたポリペプチドをコードする核酸構築物を複数の細胞内で発現することによってもたらされる。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、内因性分子はタンパク質、脂質、第２メセンジャー、イオン、フリーラジカル、細胞内小器官および構造からなる群から選択される。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、ポリペプチド標識はエピトープタグ、蛍光タンパク質および酵素からなる群から選択される。
【００２０】
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、細胞は哺乳動物セルラインである。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、この方法は工程（ｂ）の前に、複数の細胞を固定化する工程をさらに含む。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、ポリペプチド標識が強調表示された目的とする細胞内小器官または構造と共局在化する複数の細胞のうちの１種または複数の細胞を単離する工程は、相互相関画像処理と組み合わせたデジタル顕微鏡によって実施される。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、第１および第２ポリペプチド標識のそれぞれは、エピトープタグ、蛍光タンパク質および酵素からなる群から独立して選択される。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、キメラポリペプチドを複数の細胞内に供給する工程は、キメラポリペプチドを発現する発現構築物を複数の細胞中に導入することによって実施される。
【００２１】
本発明の付加的態様では、（ａ）ポリペプチド標識；（ｂ）特定の細胞内小器官または構造にキメラポリペプドを局在化させるためのポリペプチドドメイン；および（ｃ）目的とするポリペプチドの少なくとも一部分を含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド領域を含む核酸構築物が提供される。
【００２２】
本発明のなおも付加的態様では、（ａ）ポリペプチド標識；（ｂ）特定の細胞内小器官または構造にキメラポリペプチドを局在化させるためのポリペプチドドメイン；および（ｃ）目的とするポリペプチドの少なくとも一部分を含むキメラポリペプチドをコードする発現構築物を含むレポーター細胞が提供される。
【００２３】
本発明のなおも付加的態様では、異常な細胞表現型を少なくとも部分的に逆転することができる少なくとも１種の動因を同定する方法であって、（ａ）少なくとも１種の動因に、異常な表現型を特徴とする細胞を暴露し；そして（ｂ）異常な細胞表現型に関連する少なくとも１つの細胞構成成分における変化をモニターすることを含み、その変化は少なくとも部分的な表現型逆転の指標であり、それによって異常細胞表現型を少なくとも部分的に逆転することにおける少なくとも１種の動因の能力を決定する方法が提供される。
【００２４】
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、この方法は少なくとも１種の細胞構成成分を強調表示する工程をさらに含む。その際、強調表示工程は（ｉ）異常な細胞表現型に関連する少なくとも１種の細胞構成成分を標識化すること；（ｉｉ）異常な細胞表現型に関連する少なくとも１つの細胞構成成分を細胞内に供給すること（ただし、少なくとも１つの細胞構成成分が標識に融合されている）からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって実施される。
【００２５】
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、少なくとも１つの細胞構成成分を供給することは、少なくとも１つの細胞構成成分または少なくとも１つの細胞構成成分を発現する核酸構築物を細胞中に導入することによって実施される。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、少なくとも１つの細胞構成成分における変化は、少なくとも１つの細胞構成成分の細胞分布、生化学的修飾、発現濃度および活性からなる群から選択される少なくとも１つのパラメーターにおける変化を含む。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、少なくとも１つの細胞構成成分の変化をモニターする工程は、（ｉ）細胞の少なくとも１つの細胞構成成分を正常な細胞表現型を特徴とする第２細胞のものと対比すること；（ｉｉ）工程（ａ）の前、および工程（ｂ）に続いて細胞内で少なくとも１つの細胞構成成分を対比することからなる群から選択される少なくとも１つの方法によって実施される。
【００２６】
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、少なくとも１つの動因は、試験条件および試験化合物からなる群から選択される。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、試験条件は成長条件および放射線条件からなる群から選択される。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、試験化合物は合成品および天然物からなる群から選択される。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、少なくとも１つの細胞構成成分は、タンパク質、脂質、第２メッセンジャー、イオン、フリーラジカル、細胞内小器官および構造からなる群から選択される。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、この方法は工程（ａ）の前に異常細胞表現型を特徴とする細胞を生成する工程をさらに含む。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、異常細胞表現型を特徴とする細胞は病原性起源のものである。
【００２７】
本発明のさらなる態様では、細胞中の複数の区別され得る分子の共局在化を定量化する方法であって、（ａ）細胞の複数の画像を得るために、複数の区別され得る分子のそれぞれについて細胞の画像を取得し、複数の画像の個々の画像それぞれは、細胞中の複数の区別され得る分子の１つの分布を示し；そして（ｂ）少なくとも１対の個々の画像における相関係数を計算し、それによって細胞中の少なくとも１対の区別され得る分子の共局在化を定量化する方法が提供される。
【００２８】
本発明のなおもさらなる態様では、細胞中の分子の局在化をモニターする方法であって、（ａ）異なった時点で細胞の複数の画像を取得し、複数の画像のそれぞれは細胞中の分子の分布を示し；そして（ｂ）複数の画像の少なくとも１対の画像について相関係数を計算し、それによって細胞中の分子の局在化をモニターする方法が提供される。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、複数の画像のそれぞれは標準化された画像である。
説明される好ましい実施態様のなおもさらなる態様では、この方法は、（ｃ）工程（ｂ）の前に、複数の歪みベクトル、すなわち各対の画像のそれぞれの小領域について１つの歪みベクトルを計算し、その歪みベクトルは、対である各小領域のそれぞれの領域相関係数を最大にするために選択され；そして（ｄ）複数の画像の少なくとも１対の画像中の歪みを補正するために複数の歪みベクトルを使用する工程を含む。
【００２９】
本発明のなおもさらなる態様では、細胞中の複数の区別され得る分子の共局在化を定量化するためのシステムであって、（ａ）細胞の複数の画像をうるために、複数の区別され得る分子のそれぞれについて細胞の画像を取得し、複数の画像の個々の画像のそれぞれは細胞中の複数の区別され得る分子の１つの分布を示し；そして（ｂ）少なくとも１対の個々の画像について相関係数を計算し、それによって細胞中の少なくとも１対の区別され得る分子の共局在化を定量化するためのデータ処理機を含むシステムが提供される。
【００３０】
本発明のなおもさらなる態様では、細胞中の分子の局在化をモニターするためのシステムであって、（ａ）異なった時点で細胞の複数の画像を取得し、複数の画像のそれぞれは細胞中の分子の分布を示し；そして（ｂ）複数の画像の少なくとも１対の画像について相関係数を計算し、それによって、細胞中の分子の局在化をモニターするためのデータ処理機を含むシステムが提供される。
【００３１】
以下に説明される本発明の好ましい実施態様のさらなる態様では、データ処理機はさらに、（ｃ）複数の歪みベクトル、すなわち各対の画像のそれぞれの小領域について１つの歪みベクトルを計算し、この歪みベクトルは、対である各小領域のうちのそれぞれの領域相関係数を最大にするように選択され；そして（ｄ）複数の歪みベクトルを使用して、複数の画像の少なくとも１対の画像における歪みを補正するためのものである。
【００３２】
本発明は、一方で細胞内局在化に基づき、新規な細胞内標的を解明し、他方で新規な治療リードを発見することを可能とする新規なスクリーニング法を提供することによって、現在公知である構成の欠点を首尾よく解消する。本発明の方法は、マルチウェル中および自動画像処理での試料のロボット調製およびコンピュータ化された顕微鏡によるリアルタイムな分析に基づく高処理能力スクリーニング分析法に容易に適用可能である。これらの方法と顕微鏡技術における現在の能力の適用を微量試料の高速スクリーニングへ結び付けると、１日当たり、１００，０００個以上の試料を試験できることが予測される。これは遺伝子および薬物ライブラリーのスクリーニングから急速なフィードバックを得ることを可能とする。
【００３３】
図面の簡単な説明
本発明は添付する図面を参照して、実施例としてここに説明される。特に詳細に図面を参照した詳細な事項は、実施例として、および本発明の好ましい実施態様の説明的議論を目的として示されたものであり、さらに、本発明の原理および概念上の態様のもっとも有益で、かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために示されることが強調される。この点について、本発明の基礎的理解において必要であるよりもより詳細に発明の構造的詳細を示すような試みはなされていない。図面を引用する説明は、いかにして本発明のいくつかの形態が実際に具体化されるかを当業者に明かにする。
【００３４】
図中、
図１は２つの異なった細胞成分の共局在化の程度を記録するための相関分析を示す。細胞は固定化され、そして異なった色：赤色（Ｃｙ３）、緑色（ＦＩＴＣ）または青色（ＤＡＰＩ）を有する蛍光性物質を使用し、各列に示されるように、２種の異なった成分について２重標識化されていた。２重標識化された細胞中で各成分の標識化画像が得られ、第１および第２カラムに示されている。第３カラムは２つの標識化の重ね合わせを示す。成分の名称ならびにそれらの画像はそれらの標識化色に従って着色されている。各列中、左の画像と真中の画像の間の相関性が計算され（等式１に従って、ここで、ＭおよびＮは２つの画像である。）、そして示されている。
【００３５】
図２は原繊維接着動力学におけるアクト−ミオシン阻害剤の効果の相関分析を示す。ＨＦＦ細胞は説明されるように（１０）、ＧＦＰ−テンシンを形質移入した後、初めの２４時間を経時的に蛍光を記録することによって分析された。記録中、アクト−ミオシン収縮性を有する異なった阻害剤が第１矢印によって示される時点で添加され（２ｍＭ  Ｌａｔ−Ａ、１５０ｍＭ  Ｈ−７または１００ｍＭ  ＭＬ−７）、そして第２矢印で示される時点で洗い出された。各デジタル映像では、病巣接触を有しない原繊維接着のみを含む２８５μｍ２の一定四方枠（Ｉ）が、時間の関数として取得された。相関性は映像の持続時間中に、対である連続する時点（ＩｔおよびＩｔ＋１）の間で計算された。ＩｔおよびＩｔ＋１間の相関性は（等式１に従って、ここでＮ＝ＩｔおよびＭ＝Ｉｔ＋１である。）計算された。グラフは時間の関数（ｔ）として、この相関性を示す。
【００３６】
図３はシミュレートされた並進、収縮または回転歪みの相関分析を示す。パキシリンで染色された１つのＨＦＦ細胞のデジタル画像が得られた。次いで、もとの画像は３種のシミュレートされた歪み：回転、収縮または並進された画像のいずれかを得るためにデジタル処理された。２つの複合画像が作成された：１つはもとの画像（緑色）の４つのコピーから構成され、かつ第２のものは回転、収縮、並進およびもとの画像（赤色）から構成される。左側の画像はこれらの２つの複合画像の重ね合わせを示す。この画像は７８４の部分的に重複するサブ画像四方枠に分けられる。各枠について、緑色および赤色画像の間の相関性（Ｃ，等式２、ここで、ＮおよびＭは２つの複合体の同じ枠に相当する）を最大とする並進ベクトル［ａｍａｘ，ｂｍａｘ］、等式４）が見出された。各枠の並進ベクトル［ａｍａｘ，ｂｍａｘ］は、このベクトルに等しい長さおよび方向を有する枠の中心から始まる線によって右図に示されている。線の色は見出された最大相関性、カラースペクトルスケールによってコードされるＣｍａｘを示す。
【００３７】
好ましい実施態様の説明
本発明は特定機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を単離する方法に関する。特に、本発明は特定の細胞内小器官または構造に局在化されるタンパク質をコードする遺伝子、特定の細胞内小器官または構造の形成、組織化、調節および／または維持に関与するタンパク質および他のタンパク質に結合するタンパク質を単離するために使用され得る。
【００３８】
本発明による方法の原理および操作は、図面およびそれに伴う説明を参照してよりよく理解される。
本発明の少なくとも１つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明はその応用において以下の説明に開示されるかまたは図面に示される構築の詳細および成分の配置に限定されないと理解されるべきである。本発明は他の実施態様が可能であるか、または種々の方法で実行されるかあるいは実施され得る。また、ここで使用される語法および術語は説明の目的であり、限定として見なされるべきでないと理解されるべきである。
【００３９】
所与のＤＮＡ配列からコードされたタンパク質の機能を解明する能力は、バイオテクノロジーの基本的目標である。現在の技術は本質的に生化学のプロトコールに基づき、タンパク質−タンパク質相互作用マップまたはタンパク質局在化のいずれかからタンパク質機能を解明する。このような生化学的技術は労力を要し、時間がかかり、ときには結果として誤った解釈となる。
【００４０】
本発明はタンパク質機能を解明するための新規な方法を提供する。以下に説明され、かつ、続く実施例の項にて説明されるように、本発明は細胞表現型における目的とするタンパク質の効果を同定するために、このような効果が最小であるケースにおいてすら、使用され得る新規な可視的スクリーニング方法を提供する。ここで使用される「ポリペプチド」という用語は、数個から数千個のアミノ酸の長さを有するアミノ酸ポリマーを呼ぶ。これはいかなる起源または生物から得た特性化されたまたはまだ特性化されていないタンパク質の画分または全配列のいずれかを示すことができる。ゲノムまたはｍＲＮＡ源のいずれかを起源とするポリヌクレオチド断片は、本発明によって使用されるポリペプチドをコードするために好ましくは使用されるけれども、例えば、異なった長さを有する合成または混合されたＤＮＡセグメントであり得るポリヌクレオチド配列の組み合わせも使用され得ることが理解されるであろう。したがって、ポリペプチドという用語は、ここで、当該技術分野で周知である種々の合成法によって製造されるポリヌクレオチドによってコードされるキメラおよび組み合わせたポリペプチドを呼ぶためにも使用される。
【００４１】
ここで使用される「標識分子」という語句は、定量化可能な活性または特性を示す分子を呼ぶ。標識分子は直接的に又は間接的に定量化され得るポリペプチドなどの「ポリペプチド標識」であってもよい。例えば、ポリペプチド標識は好適な基質が存在するとき、発色物質を生じる酵素であり得る。このような酵素としては、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−Ｄ−グルコロニダーゼ（ＧＵＳ）などが挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチド標識は緑色蛍光タンパク質を含む緑色蛍光タンパク質群、黄色蛍光タンパク質、青緑色蛍光タンパク質および赤色蛍光タンパク質ならびにそれらの増強された誘導体に属するポリペプチドなどの発蛍光物質である。このような場合、ポリペプチド標識は好適な刺激光の適用時に発生されるその蛍光によって定量化され得る。また、ポリペプチド標識は特異的抗体が他の細胞性エピトープと実質的に交差反応しないで結合することができるかなり特殊なポリペプチド配列、エピトープタグであり得る。このようなエピトープタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、ロイシンタグ、ＩｇＧタグ、ストレプトアビジンタグなどが挙げられる。ポリペプチド標識のさらなる詳細は、Ｍｉｓａｗａら（１１）に見出され得る。
【００４２】
また、標識化された分子は放射性同位元素またはビオチン分子などの直接または間接に検出される化学薬品であり得る。
標識化された分子は染料でもあり得る。様々な多数の細胞浸透性蛍光染料ならびに散布性細胞染料が生細胞中の細胞構成成分に選択的に会合することができる。その例としては、細胞内小器官および構造染色、天然脂質（例えば、リン脂質、スフィンゴ脂質、脂肪酸、トリグリセリドおよびステロイド）のための蛍光性類似体などの脂質染色、種々の反応性酸素種（生細胞膜中のヒドロペルオキシドなど）を検出するためのプローブおよびマグネシウム、ナトリウム、カリウム、水素、亜鉛、塩化物プロトンなどのイオン検出のための蛍光性指示薬が挙げられるが、これらに限定されない。このような染料は当該技術分野で周知であり、例えば、分子プローブから市場で入手可能である［例えば、「蛍光性プローブと研究化学薬品のハンドブック」（ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｓｅｃｔｉｏｎｓ／１２００．ｈｔｍｌ）、１１章−アクチン、チューブリンおよびヌクレオチド結合性タンパク質のためのプローブ、１２章−小器官のためのプローブ、１３章−脂質および膜のためのプローブ、１８章−シグナル伝達のためのプローブ、１９章−一酸化窒素を含む反応性酸素種のためのプローブ、２０章−Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋および他の金属のための指示薬、２１章−ｐＨ指示薬を参照］。
【００４３】
ここで使用するように、「シス作用調節因子」という用語はトランス作用調節因子を結合し、その下流に位置するコード配列の転写を調節するポリヌクレオチド配列を呼ぶ。例えば、転写調節因子は特定転写調節因子によって活性化されるプロモーター配列の一部分であるか、またはそれはプロモーター配列に隣接するか、あるいは離れて、そこからの転写を上方制御することにおいて機能するエンハンサーであり得る。シス作用調節因子はまた、そのような配列が翻訳を上方制御する翻訳調節因子に結合することができる翻訳調節配列因子でもあり得る。
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を呼ぶ。例えば、構造遺伝子の場合、発現は構造遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）への転写および１種以上のポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を含む。
【００４４】
本発明の１つの態様では、目的とする細胞内小器官または構造に局在化されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法が提供される。このような細胞内小器官または構造は、例えば、細胞膜、細胞核、細胞染色質、ミトコンドリア、クロロプラスチッド、小胞体、ゴルジ装置、リソソーム、分泌小胞、病巣接着構造、接着結合構造、密着結合、接着斑、中間フィラメント、ミクロフィラメント構造または微小管構造である。
【００４５】
本発明のこの態様における方法は数工程で実施される。第１工程では発現ライブラリーが調製される。
発現ライブラリーは複数の発現構築物を含む。発現ライブラリーの発現構築物のそれぞれは、目的とする細胞内小器官または構造への局在化について試験される、複数のポリペプチドのうちの１つのポリペプチドをコードする第１ポリヌクレオチドを含む。第１ポリヌクレオチドは１つまたは複数の細胞、組織または生物から単離されたｍＲＮＡを逆転写および所望によりＰＣＲ増幅して得られるｃＤＮＡ断片であり得る。それは合成核酸であるか、またはゲノムから誘導された断片化された核酸であり得る。第１ポリヌクレオチドは比較的短く、数個のアミノ酸をコードするか、またはそれより長く数十、数百または数千個のアミノ酸をコードするものであり得る。第１ポリヌクレオチドの長さについて特に制限は存在しない。１つの実施例では、ｍＲＮＡの起源としては包皮線維芽細胞（一次）、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）および／またはヒト上皮細胞（ＨｅＬａまたはＭＣＦ−７）がある。
【００４６】
本発明のこの態様における発現ライブラリーの発現構築物のそれぞれは、上記説明したように、第１ポリヌクレオチドの上流または下流に結合され、かつポリペプチド標識をコードするインフレームの第２ポリヌクレオチドをさらに含む。このポリペプチド標識は重要でないけれども、標識は細胞内局在化について試験されるポリペプチドの三次元構造を変化させるべきでないことが理解されるであろう。
【００４７】
本発明のこの態様における発現ライブラリーの発現構築物のそれぞれは、構築物からキメラタンパク質の発現を指示する少なくとも１つのシス作用調節因子、例えば、プロモーターおよびエンハンサーをさらに含む。本発明に関連して使用される特に選ばれたプロモーターは、第２の重要性を有し、そしていかなる好適なプロモーターをも含むであろう。しかしながら、転写開始部位はオープンリーディングフレームの上流に局在化されることを確実にする必要があることが、当業者には理解されるであろう。本発明の好ましい実施態様では、選択されるプロモーターは目的とする特定の宿主細胞中で活性である因子を含む。これらの因子はヒートショクタンパク質を含む、ストレスあるいは飢餓の条件でこれらの細胞の生存にとって必須である遺伝子の転写を活性化する転写調節因子から選択され得る。
【００４８】
本発明における構築物は、好ましくは適当な選択マーカーをさらに含む。本発明のより好ましい実施態様では、構築物は複製の起点をさらに含む。本発明の他の最も好ましい実施態様では、構築物はシャトルベクターであり、構築物は大腸菌（構築物は適当な選択マーカーおよび複製の起点を含む）中で増殖することができ、選択された生物の細胞における増殖またはゲノムでの組み込みに適合性を有し得る。本発明のこの態様における構築物は、例えばプラスミド、バクミド（ｂａｃｍｉｄ）、ファージミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたは人工染色体であり得る。
ここで説明されるように、ライブラリー調製の過程で、多くの個々の構築物は例えばフレーム結合の外など故に作動的ではないであろう。しかしながら、これはライブラリーの大きさを増加させることによって容易に克服され、それによって作動できる構築物の十分な表示を可能とする。
【００４９】
したがって、本発明のこの態様における発現ライブラリーは、ポリペプチド標識に融合された特殊な配列をそれぞれが含む種々のキメラタンパク質をコードする。本発明のこの態様における方法の次の工程では、発現ライブラリーは複数の細胞中に導入される。特定の細胞に入る構築物の数を制御するような処置をとって、好ましくは、１つの構築物が個々の細胞それぞれに導入される。広範囲なタイプの細胞が本発明では使用され得る。その例としては、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球細胞、神経細胞などの細胞が挙げられる。このような細胞は培養物中で容易に増殖されるにちがいない。したがって、具体的な例としては、２９３Ｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｈ５Ｖ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＬ−細胞などの種々のセルラインが挙げられるが、これらに限定されない。
タンパク質新規合成法において十分な時間、インキュベーションした後、形質移入（感染）または形質転換された細胞中のキメラポリペプチドの局在化は、ポリペプチド標識によって決定される。本発明のこの態様の１つの実施態様では、これは本質的に蛍光性である標識を使用して直接に実施される。
【００５０】
本発明のこの態様の他の実施態様では、ポリペプチド標識を局在化させることは、形質転換細胞を検出可能なシグナルを発生することができる、発蛍光性または発色性標識（すなわち、染料または蛍光性抗体）と接触させることを要する。これはしばしば、染色の前に形質転換された細胞に浸透させる付加的工程を必要とする。細胞浸透固定化プロトコールは当該技術分野で周知であり、例えば、（１２）において明白に記載されている。
その後、ポリペプチド標識が目的とする細胞内小器官または構造に局在化される細胞を単離するために、スクリーニング手法（手動または自動）が使用される。単離された細胞は増殖され、目的とする細胞内小器官または構造に局在化されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはＰＣＲ増幅などの方法を使用して、そこから単離されて、このようなタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドを得る。
単離されるべきポリヌクレオチドに隣接する配列が公知であり、したがって適当な増幅プライマーが設計され得るから、ＰＣＲ増幅は容易に実施され得る。ＰＣＲ増幅プロトコールは例えば、「ＰＣＲプロトコール：方法と応用への指針」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（１９９０）に見出され得る。
【００５１】
ポリペプチド標識が目的とする細胞内小器官または構造に局在化される１つまたは複数の細胞のスクリーニングは、例えば顕微鏡を使用して手動で実施され得る。代わりに、自動化高処理能力スクリーニングは、デジタルカメラと組み合わせた顕微鏡およびＣｅｌｌｏｍｉｃｓ Ｉｎｃ．，米国による商品名ＡＲＡＹＳＣＡＮの下で販売されている製品などの多くのパターン認識アルゴリズムのいずれか１つを使用して実施され得る。
したがって、１つの例では、感染細胞が１つのウェル当たり、たった１つまたは２つのクローンの成長を可能とするように予め較正された密度で平ガラス底マルチウェル（９６）プレート中に分配される。典型的な実験では、１０〜１００プレートが調製され、顕微鏡にて試験される。このスクリーニングは手動で実施され得る。しかしながら、自動化工程に取り付けることができるものは、例えば、Ｄｅｌｔａ Ｖｉｓｉｏｎ 顕微鏡、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ自動化顕微鏡または均等物のためのマルチウェル付属品がある。
【００５２】
さらに、細胞の試験（蛍光タンパク質分布だけでない）としては、例えば位相差顕微鏡により検出可能な特別な変化（例えば、アポトーシス、接合部の損失、伸びまたは丸めなど）がある。
一旦、同定されると、陽性ウェル中の細胞はマルチウェルプレート中に再クローン化され、詳細な免疫細胞化学研究のためにカバーガラス上に置かれる。
さらなる研究を目的とする細胞は、凍結保存されるか、または関連する抗体、例えば種々の細胞骨格性および結合性標識抗体で２重標識されることによって広範囲に特性化される。
選択されたクローンから得たｃＤＮＡは上記したようにして回収される。増幅されたｃＤＮＡはレトロウイルスベクター中に再クローン化され、選択と結果確認の他の繰り返しに使用される。
【００５３】
確証された表現型を有するクローンから得たｃＤＮＡは回収され、そして配列決定される。新規なタンパク質／遺伝子が発見された場合、挿入ＤＮＡはｃＤＮＡライブラリースクリーニング、またはＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）のいずれかに使用されて、完全長ｃＤＮＡを得る。
明かにされていない遺伝子産物の機能を目的とする全細胞系スクリーニング方法は当該技術分野で公知であるけれども（ＷＯ９９／２４５６３、ＷＯ００／６１８０９、ＷＯ００／３９３４６、ＷＯ９９／５３０９８）、このような方法はしばしば、スクリーニング方法として極めて一般的な表現型（すなわち、細胞成長、死、分化、生存、形質転換など）を使用する。このような先行技術の方法は、中間的またはヌルの表現型を検出するためには使用されず、それ自体で、このような表現型を引き起こす遺伝子産物を明かにするためにも使用され得ない。
明確な対照として、本発明の可視的スクリーニング方法は細胞中の組織化または構造のレベルにあるスクリーニングの結果を使用し、それ自体で下記のものによる一層高いスクリーニング感度を得ることができる；第１に、効果は細胞死、生存または形質転換に比べて、より早期に検出され得る。第２に、このような可視的結果はより特異的であり、狭い範囲の細胞内機序を含む。最後に、微小であるかまたは一時的な変化ですら検出され得る。
【００５４】
本発明の可視的スクリーニング方法は、細胞骨格および接着会合タンパク質などの特定の細胞内小器官または構造に会合される新規なタンパク質をコードする新規な遺伝子の発見につながるであろう。原則的には、種々の細胞起源から得たｃＤＮＡの使用、および融合タンパク質が天然タンパク質の結合能力を維持する場合には提案された分析法は、特定の細胞内部位に会合されるタンパク質の全て、またはほとんどを明らかにするであろう。このような発見はこのような部位の組立ておよび機能の分子的基礎および特定タンパク質の役割をより十分に理解する唯一の機会をもたらすであろう。
【００５５】
上記方法の改良は、本発明の他の態様を構成する。したがって、目的とする細胞内小器官または構造に局在化されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する改良法が提供される。本発明のこの態様における方法は、次の工程を実行することによって実施される。第１工程では、本発明の第１態様に関して上記された発現ライブラリーと類似する発現ライブラリーが調製される。
【００５６】
本発明のこの態様における方法の第２工程では、発現ライブラリーは複数の細胞中に導入される。本発明のこの態様と本発明の先の態様との相違点は、この態様ではスクリーニングは、２つの標識を使用して実施されることである。１つの標識はライブラリー構築物からコードされる未知ポリペプチドを同定するポリペプチド標識であり、一方、第２標識は目的とする細胞内小器官または構造を同定する。細胞中の標識のそれぞれを別個に局在化できることが重要であるから、２つの標識は区別され得るように選択される。
本発明の好ましい態様では、目的とする細胞内小器官または構造を標識化することは、特定の染料または標識化された抗体を使用して実施される。
【００５７】
他の好ましい実施態様では、目的とする細胞内小器官または構造を標識化することは、第２ポリペプチド標識および目的とする細胞内小器官または構造にキメラポリペプチドを局在化させるための融合ポリペプチドを含むキメラペプチドを使用して実施される。キメラポリペプチドのこのような発現および局在化は、第２キメラポリペプチドをコードする発現構築物で細胞を形質転換することにより達成され得る。また、キメラポリペプチドは、例えばリポソーム輸送（１３）、ペプチド微量注入（１４）、微量穿針法（１５）または電気泳動（１６）によって、ポリペプチドとして細胞中に導入され得る。このような場合、ポリペプチドは発現され、天然ポリペプチドとして他の細胞系から採取されるか、または周知先行技術法によって、インビトロで合成され得る。合成ペプチドは細胞中にあるとき、ポリペプチドをより安定にさせる修飾を含むことができる。
下記表１は特定の細胞内小器官または構造にキメラポリペプチドを局在化させるために使用され得る融合ポリペプチドのいくつかの例を示す。
【００５８】
【表１】
2004520014.tif 000002
【００５９】
標識化した後、異なったポリペプチド標識または染料を識別するフィルターを典型的には備えた拡大光学装置は、第１ポリペプチド標識が第２ポリペプチド標識と共局在化されるか、または代わって染料と共局在化される複数の細胞のうちの１種または複数の細胞をスクリーニングするために使用される。第１ポリペプチド標識が第２ポリペプチド標識または染料と共局在化される細胞は、例えばＰＣＲによって第１ポリヌクレオチドを回収するために使用され、それによって、目的とする細胞内小器官または構造に局在化されるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離する。
【００６０】
本発明のこの態様の好ましい実施態様では、第１ポリペプチド標識が第２ポリペプチド標識または染料と共局在化される複数の細胞のうちの１種または複数の細胞をスクリーニングする工程は、以下にさらに詳細に説明される相互相関画像処理ソフトウエアと組み合わされたデジタル顕微鏡によって実施される。
【００６１】
本発明のなおも他の態様では、目的とする細胞内小器官または構造の組織化に影響を与えるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法が提供される。本発明のこの態様における方法は、次の工程を実行して実施される。第１工程では、構築物からのポリペプチドの発現を指示する少なくとも１つのシス作用調節因子のもとに置かれた目的とする細胞内小器官または構造の組織化に影響を与えることについて試験される、複数のポリペプチドの１つをそれぞれコードする複数の発現構築物を含む発現ライブラリーが調製される。
次の工程では、発現ライブラリーは目的とする細胞内小器官または構造が上記説明したように標識化される複数の細胞中に導入される。
最後に、拡大光学装置はポリペプチド標識またはインビボ染料の細胞内分布または量が現われる複数の細胞のうちの１つまたは複数の細胞をスクリーニングするために使用される。このような細胞は単離され、増殖され、目的とする細胞内小器官又は構造の組織化に影響を与えるタンパク質をコードするポリヌクレオチドが上記説明したようにして単離される。
【００６２】
ポリペプチド標識または染料の細胞内分布または量が現われた１種または複数の細胞のスクリーニングは、顕微鏡を使用して手動で行われ得る。しかしながら、特定の細胞内小器官および構造の染色パターンは周知であるから、デジタルカメラと組み合わせた顕微鏡および多くのパターン認識アルゴリズムのうちのいずれか１つを使用することは、ポリペプチド標識またはインビボ染料の異なった分布パターンを有する細胞を同定するために使用され得る。
【００６３】
本発明のなおも他の態様では、目的とする標的タンパク質に特異的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを単離する方法が提供される。本発明のこの態様における方法は、次の工程を実行して実施される。第１工程では、それぞれが（ｉ）目的とする標的タンパク質に特異的に結合することについて試験される複数のポリペプチドのうちの１つのポリペプチドをコードする第１ポリヌクレオチド；（ｉｉ）第１ポリペプチド標識をコードする第２ポリヌクレオチド、第２ポリヌクレオチドは第１ポリヌクレオチドの上流または下流に結合されている；および（ｉｉｉ）構築物からの第１キメラタンパク質の発現を指示するための少なくとも１つのシス作用調節因子を有する複数の発現構築物を含む発現ライブラリーが調製される。
【００６４】
次いで、発現ライブラリーは（ｉ）第１ポリペプチド標識と区別され得る第２ポリペプチド標識；（ｉｉ）予め定められた細胞内小器官または構造に第２キメラタンパク質を局在化、例えば固着させるための融合ポリペプチド；および（ｉｉｉ）標的ポリペプチドの少なくとも融合部分を含む第２キメラタンパク質を発現する複数の細胞中に導入される。
キメラポリペプチドのそれぞれは、ポリペプチド標識のそれぞれを介して、細胞内に局在化され、その後、第１ポリペプチド標識が第２ポリペプチド標識と共局在化される複数の細胞のうちの１種または複数の細胞についてスクリーニングするために、拡大光学装置が使用される。第１ポリペプチド標識が第２ポリペプチド標識と共局在化される細胞は、試験されるポリペプチドが標的タンパク質に特異的に結合する細胞であるようである。このような細胞はその後、増殖され、そして標的タンパク質に特異的に結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが単離される。単離されたポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの標的タンパク質への特異的結合は、その後、特に限定されないが、ゲル遅延、共免疫沈澱、親和性カラムなどの当該技術分野で周知である方法を使用して実証される。結合が検出されないなら、次いで単離されたタンパク質は、予め定められた細胞内小器官または構造に共局在化されるが、試験条件下で標的タンパク質に直接に結合しないか、または標的タンパク質に結合する他のタンパク質を結合するタンパク質をコードする。
【００６５】
本発明のこの態様では、キメラタンパク質を発現する発現構築物、およびこのような発現構築物を含むレポーター細胞が提供される。発現構築物は（ａ）ポリペプチド標識をコードする第１ポリヌクレオチド；（ｂ）予め定められた細胞内小器官または構造にキメラタンパク質を局在化させるためのポリペプチドをコードするインフレーム第２ポリペプチド；および（ｃ）標的タンパク質の少なくとも融合部分をコードするインフレーム第３ポリヌクレオチドを含み、そしてレポーター細胞系は上記のものを発現する。
本発明のこの態様の好ましい実施態様では、第１ポリペプチド標識が第２ポリペプチド標識と共局在化される複数の細胞のうちの１種または複数の細胞をスクリーニングする工程は、以下にさらに詳細に説明されるように、相互相関画像処理と組み合わせたデジタル顕微鏡によって実施される。
【００６６】
以下は、生存または固定化細胞中の分子の共局在化を定量化する新規な方法の説明であり、新規な方法は２つの別なポリペプチド標識が使用され、特定の細胞内小器官または構造への共局在化が陽性の指標であって、興味深い結果を示す本発明の態様を実施するために使用され得る。したがって、この新規な方法は分子の細胞内局在部位の自動化同定を可能とする。生細胞を試験する場合、細胞中の特定分子の位置における変化を経時的に測定することを可能とする。
【００６７】
２つの成分の対比のため、細胞は２つの蛍光タンパク質を形質移入され、生存または固定化について試験されるか、あるいはまず固定化され、次いで２重免疫標識されるかあるいは染色され得る。２つの蛍光性画像は次いで高解像ＣＣＤカメラおよび好適なフィルターを使用して取得され、２つの画像は加工される（以下参照）。画像間の相関分析は共局在化の程度を示す全体的な相関係数を決定する。原則的には、相関値１は、２つの画像間の同一性を示し、−１は逆の分布（「ポジティブ−ネガティブ関係」）を示し、そして「０」は相関性なしを示す。
動的変化を研究するには、１つ以上の蛍光性成分を発現する生細胞の画像が異なった時点で取得され、上記のように対比される。
異なった時点で、または異なった標識化により同じフィールドを示す類似した画像間の並進および回転シフトおよび他の歪みを検出し、測定し、そして補正するために、２つのフレーム間の小領域の局所相関性を最大とする並進ベクトルが計算され、そして使用される。これらの並進ベクトルのコレクションは画像間の歪みを示す指標であり、それを補正するための数学的手段を提供する。
【００６８】
この新規な方法の基本的考えは、相関性が画像類似性の定量的基準であることにある。相関性は２つの標準化画像ＭおよびＮの標準化画素毎の掛け算として定義され（等式１）、２つの画像間の類似性がより高いほど、これはより高い。したがって、ＮおよびＭが同じ画像であって初めて、相関性はその最大値１となる。Ｎが−Ｍ（逆画像）に等しい場合、この相関性はその最小値、−１に達し、ＮおよびＭが全体的に無関係な画像である場合、相関性は０に近づく。以下の相関性等式（等式１）は、互いに置換される２つの画像の類似性を評価するために拡大適用される（等式２）。これが動的プロセスを特性化するためにいかにして適用され得るかを説明するために、ＮおよびＭが２つの近接した時点で得られた同じフィールドの２つの画像である４つのケースを検討する：（ｉ）等式１がそのフィールドでいかなる変化も欠くことを示す相関性（ＮがＭに等しいから）；（ｉｉ）このフィールドの対象物全てがｘ軸にそって１つの画素、Ｍｘ，ｙ＝Ｎｘ＋１，ｙなどのように並進されるなら、上記相関性は１より小さくなるであろう。対象物が１画素よりも大きい場合、これらは２つの画像において重複し、したがって、ＮおよびＭの相関値はなおも１に近づくであろう；（ｉｉｉ）もしも対象物が２つの画像において対象物間に重複を有しないで、Ｍｘ，ｙ＝Ｎｘ＋１００，ｙなどのように１００画素に並進されるなら、相関性は低いであろう。しかしながら、１つの並進ベクトル［ａｍａｘ，ｂｍａｘ］、等式４）、すなわちケース（ｉｉ）の場合には（１，０）、ケース（ｉｉｉ）の場合には（１００，０）が存在する。これは２つの画像を完全に重複するようにさせ、Ｍｘ，ｙ＝Ｎｘ＋ａ，ｙ＋ｂ  として、そしてより一般的に並進された相関性（Ｃ，等式２）をユニティーの最大値に戻すであろう；（ｉｖ）もしも対象物が１００画素で動くが、移動された異なったものが異なった方向へ動いたなら、２つの画像は重複しないから、全ての可能性ある並進ベクトルにおいて相関性は低いであろう。
【００６９】
このようにして、対象物転位速度は簡単な相関性によって記録され得る（等式１）。もしも転位が速度および方向において均一であるなら（１に近いＣｍａｘによって示されるように、等式５）、そのとき、それを追跡することは並進ベクトル［ａｍａｘ，ｂｍａｘ］（等式４）によって可能である。他方、低いＣｍａｘはフレーム内の変化しうる転位を示すであろう。
【００７０】
【数１】
2004520014.tif 000003
【００７１】
ＭおよびＮは２つの（２Ｗ＋１）＊（２Ｌ＋１）長方形画像である。Ｍｘ，ｙおよびＮｘ，ｙはこれらの画像の画素（ｘ，ｙ）の強度である。Ｃａ，ｂは並進ベクトル（ａ，ｂ）によるＭおよび並進されたＮ（ｘ，ｙ）間の標準化された相関性である。ＨはＣａ，ｂを最大化するための探索範囲を限定し、そしてＤは許容された（ａ，ｂ）ベクトルの得られたグル−プである。見出された最大相関スコアはＣｍａｘであり、対応する並進ベクトルは（ａｍａｘ，ｂｍａｘ）である。その和（ｘ，ｙ）がＭｘ，ｙまたはＮｘ，ｙのいずれかが背景よりもより高い強度を示す画像の領域に限定される場合、感度が極めて高く、かつ洗練されたバージョンの相関性が導入される。
【００７２】
上記説明された本発明の方法は、そのタンパク質産物が特定の細胞内局在化を示す遺伝子の単離方法を提供する。この可視的スクリーニング方法は、それが細胞内局在化と機能の間の近接した関係から利益を得ているから特別な意義を有する。したがって、遺伝子産物の優先的局在化を決定することは、その機能を理解する上で本質的な工程である。さらに、特定の局在化パターンを有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、これらの細胞から直接にクローン化され得る。この視覚的細胞系スクリーニング方法はまた、治療上の可能性ある動因の単離にも使用される。細胞表現型を追跡する画像技術に基づくスクリーニング方法は、このスクリーニングで同定される潜在的な治療上のリードとこのようなもので治療される可能性ある疾患および症候群との間の直接的相関性を可能とし、これを製薬業界によって応用される費用効果の高い方法とする。
【００７３】
上記説明された新規なスクリーニングシステムおよび方法はまた、異常な細胞表現型を少なくとも部分的に逆転させることができる動因のスクリーニングの使用にも応用され得る。
したがって、本発明の付加的態様では、異常な細胞表現型を少なくとも部分的に逆転させることができる動因の同定方法が提供される。
【００７４】
ここで使用されるように、「動因」という用語は、異常な細胞表現型を逆転または部分的に逆転させることができる分子または条件を呼ぶ。
本発明で動因として利用され得る分子の例としては、核酸、例えばポリヌクレオチド、リボザイムおよびアンチセンス分子（ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ペプチド核酸および変化したバックボーンおよび／または基本構造または他の化学的修飾を有するポリヌクレオチド類縁体を含むがこれらに限定されない）；タンパク質、ポリペプチド、炭水化物、脂質および「低分子」医薬品候補が挙げられるが、これらに限定されない。「低分子」は例えば、分子量が約１０，０００ダルトン未満、好ましくは約５，０００ダルトン未満、および最も好ましくは約１，５００ダルトン未満である天然化合物（例えば、植物抽出物、微生物培養液などから誘導された化合物）または合成有機または有機金属化合物である。
【００７５】
本発明の動因として好適に使用される条件の例としては、例えば、温度、湿度、大気圧、気体濃度、成長培地、接触表面、（γ線照射、ＵＶ照射、Ｘ線照射などの）放射線暴露および培養物中の他の細胞の存否が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において動因として好適に使用される他の好適な条件は、（ｉ）細胞内細菌：ミオバクテリウム・ツバキュローシス（Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ， ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ミオバクテリウム・レプラエ（Ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、リステリア・モノサイトジーンズ（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ブルセラ・アボータス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、（ｉｉ）細胞内真菌：シューモシスチス・カリニイ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラタム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、クリプトコッカス・ネオフォーマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、（ｉｉｉ）細胞内寄生虫：レイシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）種、（ｉｖ）細胞内ウイルス：単純ヘルペス・ウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）、痘瘡（Ｖａｒｉｏｌａ）、麻疹ウイルス（Ｍｅａｓｌｅｓ ｖｉｒｕｓ）などの細胞内侵入微生物による感染が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
ここで使用されるように、「異常な細胞表現型」という用語は、例えば、遺伝子型と環境との相互作用によって産生される細胞の正常な可視的性質または機能的特性からの一次的または永久的偏差 （ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）に関する。「異常な細胞表現型」は細胞構成成分の異常な発現に関与している。この細胞構成成分は細胞内または細胞外構造因子、リガンド、ホルモン、神経伝達物質、成長調節因子、酵素、ケモトキシン（ｃｈｅｍｏｔｏｘｉｎ）、血清タンパク質、受容体、低分子量化合物のための担体、医薬、免疫調節剤、癌遺伝子、第２メッセンジャー、シグナル伝達分子、サイトカイン、腫瘍抑制剤、毒素、イオン、腫瘍抗原、抗原、アンチセンス阻害剤、３本鎖形成阻害剤、リボザイムとして、またはその活性を変化させる目的において細胞構造の特定構造決定部位を認識するリガンドして機能し得る。ここで使用されるように、異常な細胞表現型に関連している細胞構成成分は、上記した遺伝子産物のいずれであってもよく、また、これはその例がここに言及される細胞内小器官または構造であり得る。
【００７７】
本発明のこの態様における方法は、異常な細胞表現型を特徴とする細胞をまず得ることによって実施される。本発明で使用され得る細胞としては、好ましくはイヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ細胞、およびヒト細胞などの哺乳動物起源のセルライン、初代培養物、永久細胞培養物が挙げられる。
本発明の１つの好ましい実施態様では、異常細胞表現型を特徴とする細胞は病原性起源のものである。その例としては、例えば、Ｔ４７Ｄ、Ａ４３１、ＭＣＦ７およびＳＫＯＶ３などの癌細胞または病原性起源の他のセルラインが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
本発明のこの態様の他の好ましい実施態様では、異常細胞表現型を特徴とする細胞は、例えば、遺伝子の発現の程度（上または下）またはそのタンパク質産物の比活性を変化させる人工的介入を介して得られる。これは内因性ポリヌクレチド配列を操作するか、あるいは細胞中に外因性ポリヌクレオチド配列を導入することによって実施される。
内因性ポリヌクレオチド配列の操作は、例えばシス作用調節因子の導入によって実施され得る。また、ナン−センス、ミス−センス、アンチセンスまたはリボザイムコード配列が、内因性コード配列の転写または翻訳を特異的にまたは非特異的に無効にするために細胞中に導入され得る。
上記したように、異常細胞表現型はまた、１つ以上の遺伝子、またはその機能的部分をコードする外因性ポリヌクレオチド配列を細胞中に導入して得られ得る。このような外因性ポリヌクレオチドはレトロウイルスベクター、相同組換え事象などを介して細胞中に導入され得る。ある場合には、ポリヌクレオチドはコードされるポリペプチドの生物活性が変化されるように、例えばランダム突然変異誘発、活性部位での点突然変異、切断などによって変異され得る。
【００７９】
内因性ポリヌクレオチド配列の操作は、エチルメチルスルフォネート、エチルニトロソ尿素などの化学品またはアドリアマイシンなどの当該技術分野で公知である化学療法剤の使用によって実施され得るが、これらに限定されない。
また、異常な細胞表現型は物理的に誘発される。好ましくは、これは細胞を表面接触および照射などの物理的ストレスに曝すことによって実施される。後者はセシウム１３７源などによって供給されるものなどのγ線照射、ＵＶ照射およびＸ線照射を含む。物理的または化学的操作、またはこれらの組み合わせの場合、所望の細胞表現型を誘発するに十分な時間を越えて、しかも細胞の生存を維持ながら処理が実施される。
異常な細胞表現型を特徴とする細胞を生成または得た後、またはその間に、検出可能な標識が好ましくは異常な細胞表現型に関連する細胞構成成分に結合され、それによって、異常な表現型（例えば、部分的逆転）における変化を密接にモニターすることを可能とする。
【００８０】
したがって、本発明のこの態様における方法は、細胞構成成分を強調表示する工程をさらに含む。１つの実施態様では、強調表示することは特定染料または標識化抗体で内因性細胞構成成分を標識化することによって達成され得る。また、外因性標識化細胞構成成分は細胞内に導入され得る。このような外因性構成成分は発現構築物から異所的に発現されるか、細胞中にそのまま導入され得る。外因性細胞構成成分を強調表示することは、選択された標識によって達成される。
【００８１】
このような「標識化された」細胞は、次いで目的とする動因に付される。動因は当該技術分野で周知である分子的または生化学的方法論を使用して、その細胞に接触されるか、または細胞中に導入され得る。その例としては、形質移入、抱合、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接微量注入、リポソーム融合などが挙げられるが、これらに限定されない。好適な導入方法の選択は宿主細胞および使用される動因の種類に依存する。
動因の存在下、適当な時間、インキュベーションした後に、細胞は回収され、典型的にはレポーター分子を検出するためのフィルターを備えた拡大光学装置が、異常細胞表現型の少なくとも部分的な逆転（例えば、異常表現型よりも正常表現型により近い表現型となる変化）が生じた細胞をスクリーニングするために使用される。
【００８２】
本発明のこの態様の他の好ましい実施態様では、異常表現型と関連する細胞構成成分の正常表現型パターン（例えば、発現の程度、細胞分布、生化学的修飾、活性など）が公知である場合、このような正常パターンは異常表現型の少なくとも部分的な逆転を示す細胞を同定するために使用され得る。
また、異常細胞表現型の逆転の決定は、正常表現型を特徴とする細胞との関係において、動因での処理後に、異常細胞表現型に関連する細胞構成成分のパターンを同じ細胞構成成分と対比することによって実施される。これは例えば、非形質転換細胞に対するｖ−Ｓｒｃ形質転換細胞中でのアクチン組織化によってうまく説明される（以下の実施例の項の実施例４を参照）。
なおも、また、異常な細胞表現型の逆転の決定は、動因処理に先立って、そしてその後に関連する細胞構成成分のパターンを異常な細胞表現型と対比して実施される。
【００８３】
異常な細胞表現型の逆転の決定は、また異常な細胞表現型と関連する２つ以上の細胞構成成分を相関させて実施され得る。これは２つの細胞構成成分が識別され得ると仮定して、相互相関画像処理ソフトウェアと組み合わせたデジタル顕微鏡によって実施され得る。このようなものの例としては、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の分布およびＨＰＶ−１６Ｅ５形質転換細胞中に誘引される（ｉｎｄｕｓｉａｌ）ｐＨ組成がある（以下の実施例の項の実施例６を参照）。
異常細胞表現型の逆転は、また異常細胞表現型と関連する細胞構成成分を固定された細胞構成成分と相関させることによって決定され得る。このような方法は以下の実施例の項の実施例５によってうまく説明される。
異常な表現型逆転のさらなる確認のためには、細胞は例えばアポトーシス、接合部の損失、伸びまたは丸めなどを含む生理学的変化などの特別な変化について顕微鏡で試験される。
【００８４】
本発明は理論的には１つの細胞で実施され得るけれども、このような方法は効率的でないかあるいは望ましくない。好ましくは、本発明の方法は同時に種々の動因をスクリーニングするために、複数の細胞を使用する高い処理能力のスクリーニングのために使用される。
このような大規模処理能力スクリーニング方法では、動因はそれぞれが（ｉ）異常表現型を逆転させる能力について試験される複数のポリペプチドのうちの１つをコードするポリヌクレオチド（動因）および（ｉｉ）発現構築物からのポリペプチド発現を指示する少なくとも１つのシス作用調節因子を有する複数の発現構築物を含む発現ライブラリーなどのライブラリーの一部分であってもよい。
【００８５】
また、例えば、Ｍｅｒｃｋ， Ｇｌａｘｏ， ＮｏｖａｒｔｉｓおよびＢｒｉｓｔｏｌ Ｍｅｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂを含む化学会社から入手可能である化学ライブラリーもまたスクリーニングに使用され得る。選択的には、例えば、Ｐａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ またはＭｙｃｏｓｅａｒｃｈから入手可能であるか、あるいは当該技術分野で公知である方法で容易に産生しうる細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態である天然化合物のライブラリーもまた、本発明で使用され得る。
【００８６】
大規模スクリーニングを遂行するには、個々の動因に付される細胞集団は異常表現型逆転の同定を容易にするために区画化され得る。これはウェル当たりたった１つまたは２つのクローンの成長を可能する予め較正された密度で平ガラス底マルチウェルプレート中に細胞集団を等分することにより実施される。
スクリーニング工程では、Ｄｅｌｔａ Ｖｉｓｉｏｎ顕微鏡、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ自動化顕微鏡へのマルチウェル付属品などのロボットを使用する自動化スクリーニング法が好ましいけれども、手による手順も行い得る。
一旦同定されると、異常な細胞表現型を少なくとも部分的に逆転させることができる動因が回収される。もしも動因がポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド発現産物であるなら、細胞が単離され、増殖され、そして上記したように例えばＰＣＲ増幅によってポリヌクレオチド動因を単離するために使用される。
【００８７】
回収された動因はさらに、作用の正確な機序について分析され、種々の生化学的および細胞生物学的方法を使用して、最適な効果に調節される。最終的には、単離された動因のいずれが潜在的リード化合物であるかを識別することは、種々の疾患の薬理学的モデルでの動因の効果を試験して達成され得る。疾患の進行または発症に影響を与える動因は、薬剤開発のリードを構成する。
このような動因は癌、糖尿病および肥満症などの代謝障害、心肺疾患、ウイルス性感染症および他の公知症状および疾患などの多くの病理学的状態の治療に適用され得る。
【００８８】
本発明の付加的な目的、利点および新規な態様は以下の実施例を検討するとき、当業者には明らかとなるであろう。これらの実施例は限定することを意図していない。さらに、上記説明され、特許請求の範囲の項で請求されたように、本発明の種々の実施態様および態様のそれぞれは以下の実施例中に実験的サポートを見出す。
【００８９】
実施例
上記説明とともに本発明を非限定的方法にて説明する下記実施例が参照される。
一般的に、ここで使用される命名法および本発明で使用される研究的手法は分子的、生化学的、微生物学的および組換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は文献中に十分に説明されている。例えば、以下のものを参照されたい。「分子クローニング：研究室マニュアル」Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら、（１９８９）；「分子生物学の最新プロトコール」第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｒ．Ｍ．編（１９９４）； Ａｕｓｕｂｅｌ ら、「分子生物学の最新プロトコール」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ （１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ、「分子クローニングの実用指針」 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）；Ｗａｔｓｏｎ ら、「組換えＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｂｉｒｒｅｎ ら（編集）「ゲノム分析：研究室マニュアルシリーズ」第１〜４巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８８）；米国特許第４，６６６，８２８号；第４，６８３，２０２号：第４，８０１，５３１号、第５，１９２，６５９号および第５，２７２，０５７号に開示される方法論；「細胞生物学：研究室ハンドブック」第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ， Ｊ． Ｅ．編集 （１９９４）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙによる「動物細胞の培養−基礎技術のマニュアル」Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９９４）、第３版；「免疫学の最新プロトコール」第Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．編集、（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら（編集）、「基本的および臨床的免疫学」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ （１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編集）、「細胞免疫学の選択的方法」Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８０）；使用可能な免疫分析法は特許および科学文献中に広く記載されている。例えば、以下のものを参照されたい。米国特許第３，７９１，９３２号；第３，８３９，１５３号；第３，８５０，７５２号；第３，８５０，５７８号；第３，８５３，９８７号；第３，８６７，５１７号；第３，８７９，２６２号；第３，９０１，６５４号；第３，９３５，０７４号；第３，９８４，５３３号；第３，９９６，３４５号；第４，０３４，０７４号；第４，０９８，８７６号；第４，８７９，２１９号；第５，０１１，７７１号および第５，２８１，５２１号；「オリゴヌクレオチド合成」Ｇａｉｔ， Ｍ．Ｊ．編集 （１９８４）；「核酸ハイブリダイゼーション」Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編集 （１９８５）；「転写および翻訳」Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．編集 （１９８４）；「動物細胞培養」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ， Ｒ．Ｉ．編集 （１９８６）；「固定化細胞および酵素」ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６）；「分子クローニングの実用指針」Ｐｅｒｂａｌ， Ｂ．， （１９８４）および「酵素学の方法」第１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲプロトコール：方法と応用の指針」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ （１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「タンパク質精製お��び特性化の戦略−研究室コースマニュアル」ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ （１９９６）；これらの全てはここに十分に開示されるが如く参考として導入される。
【００９０】
実施例１
細胞中の対であるタンパク質の共局在化分析
細胞中の異なったタンパク質間の空間的関係を決定するために、２つの標識の画像が得られ、相関分析に付された（等式１に従って、ＮおよびＭは２つの標識の画像である）。
図１はこのような対比の１０個の例を示す。大きな重複構造（すなわち、カドヘリン／カテニン；テンシン／ａ５；パキシリン／ＰＹ）では、高い値（＞〜０．７−０．８）が得られたことが示される。相関性のないもの（すなわち、カドヘリンまたはカテニン／ＤＡＰＩ）は０に近かった。部分的な重複は中間値を示した。
【００９１】
実施例２
生細胞中のテンシン運動性におけるアクトミオシン阻害剤の効果
ラトルンキュリン−Ａ（Ｌａｔ−Ａ）、Ｈ−７およびＭＬ−７などのアクトミオシン収縮性阻害剤は、原繊維接着の転位を阻止する （Ｚａｍｉｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．２， １９１−１９６， ２０００）。この効果の動態学を知るために、等式１の相関分析が阻害剤による処理の前、中および後のＧＦＰ−テンシン形質移入細胞のデジタル映像に適用された。処理前には、原繊維接着は大いに動的であり、したがって、２つの経時的フレーム間の相関性は低かった（＜０．６５、図２）。Ｌａｔ−Ａ、Ｈ−７またはＭＬ−７の添加後、原繊維接着の転位が阻害され、経時的フレーム間の相関性がより高くなった（Ｌａｔ−Ａ、Ｈ−７およびＭＬ−７についてそれぞれ、〜０．７８、０．８１および０．９２）。Ｌａｔ−Ａに対する最大応答迄の持続時間は相対的に短かった（添加後、〜１８分間）が、一方、Ｈ−７およびＭＬ−７に対する応答持続時間はよりゆるやかであった（Ｈ−７添加後、〜５０分間およびＭＬ−７添加後、〜８０分間）。薬剤を水洗した後、原繊維接着の転位は回復し、相関性はより低レベルにもどった。Ｈ−７からの回復は相対的に速く（＜２０分間）、一方、Ｌａｔ−７およびＭＬ−７からの回復は相対的に長い時間がかかった（＞８０分間）。
【００９２】
実施例３
同じフィールドの画像間の歪みを確認すること
画像間の歪みを特性化する相関分析の能力を試験するために、１つの元の画像から回転、並進または収縮された変形体が作られ、そして、２つの複合体：４つのもとの画像から得た１つの複合体および元のもの、並進、収縮および回転された変形体から得た第２番目の複合体（図３）が作られた。複合体画像は７８４平方フレームに分けられ、各フレームについて２つの画像間の相関性（等式４、［ａｍａｘ、ｂｍａｘ］）を最大とする並進ベクトルが見出された。各フレームで見出された結果は、並進ベクトルに等しい大きさおよび方向ならびに見出された最大相関性（等式５、ｃｍａｘ）に比例する色を有する線で示されている。その結果は、並進ベクトルが実際に構造の局所的並進を首尾よく追跡したことを示し、全体として、複合体の４つのサブドメインに達成された大きな歪みの型（収縮、回転、並進および非歪み）を示した。最大相関性についての研究は並進的移動に制限されるから、１の相関性は動きがなく、かつ並進されたサブドメインにおいてのみ見出された（図３）。
【００９３】
実施例４
Ｈ−Ｒａｓ形質転換細胞中のアクチン細胞骨格の減少
背景：
癌細胞は近隣細胞への低接着性または細胞外マトリックスおよび未組織細胞骨格への低接着性を示す変更された形態学をしばしば特徴とする（１７）。これらの変化はその増大した運動性、接触阻害および足場依存性の減少ならびにその局所的部位から解離し、近隣組織へ侵入するかあるいは離れた転移病巣を形成する傾向を含む癌細胞の悪性特質のいくつかに原因があると考えられている。変更された形態学または「形質転換された表現型」とは、インビボ原腫瘍細胞および二次腫瘍細胞の態様であるが、培養物中にも認められ得る（１８）。形質転換の最も顕著な態様の１つは、組織化されたアクチン細胞骨格の減少であり、これは多種多様のインビボ腫瘍細胞およびインビトロ癌遺伝子形質転換細胞について報告されている。両方の場合、マトリックスに付着された病巣接着において平行低下（ｐａｒａｌｌｅｌ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を示すストレスファイバーの損失が注目される。したがって、癌遺伝子感染から生じる形質転換された表現型を逆転させる薬理学的動因の単離を目的とするスクリーニングが、本発明によって成し遂げられ得る。
【００９４】
Ｈ−Ｒａｓ感染ＧＦＰ−アクチンレポーターセルライン：緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）に融合されたアクチンを発現するラットまたはヒト起源のレポーター細胞は、細胞形質転換を誘発するＨ−Ｒａｓをコードするレトロウイルスベクターで感染され得る。
スクリーニングおよび分析：形質転換細胞はマルチウェルプレート中で培養され、細胞骨格変化を可能とする時間間隔で薬理学的動因で処理される。続いて、処理された細胞はフィラメント検出および定量化アルゴリズムを使用して、アクチン濃度について直接に試験され得る。形質転換された表現型の逆転を誘発する動因は同定され、さらに特性化され得る。
【００９５】
実施例５
ＨＩＶ−１Ｎｅｆタンパク質によるＭＨＣ−１の下方制御
背景：
ヒトおよびサルの免疫不全ウイルス（ＨＩＶおよびＳＩＶ）は、宿主細胞の表面で免疫認識の重要な仲介物である主要組織適合性複合体Ｉ型（ＭＨＣ−Ｉ）の発現を下方制御することができる（１９）。この下方制御では、ＨＩＶは３種の異なったウイルスタンパク質によって仲介される３種の異なったメカニズムを使用する。ウイルスのＴａｔタンパク質はＭＨＣ−Ｉの転写を抑制し、Ｖｐｕは内質細網中に新生ＭＨＣ−Ｉ鎖を保持し、そしてＮｅｆは血漿膜からＭＨＣ−Ｉ分子の選択的内部移行を仲介する。ＭＨＣ−Ｉ下方制御のこれらのメカニズムは、ＨＩＶ感染細胞が細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）による検出を回避することを可能とする（２０）。しかしながら、Ｉ型下方制御はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞による攻撃にウイルス感染細胞を潜在的に暴露する。この矛盾はＨＩＶが選択的にＭＨＣ−Ｉの特定成分を下方制御する事実によって説明され得る。ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂは有意にＨＩＶによって下方制御されるが、ＮＫ細胞の細胞毒性からヒトリンパ系細胞を保護するＨＬＡ−ＣまたはＨＬＡ−Ｅにおいては効果が見られなかった。この選択的下方制御はＨＩＶ−感染細胞がＮＫ細胞が仲介する溶解を避けることを可能とし、（ＨＩＶについて）ＣＴＬからの逸脱とＮＫ細胞からの保護の維持との間のバランスを示す（２１）。ＨＩＶ感染細胞が免疫系による認識を避けることを可能とする分子メカニズムを理解することは、治療動因の単離の基礎となり得る。
【００９６】
Ｎｅｆ感染レポーター細胞：ヒトリンパ系細胞はＨＩＶ  Ｎｅｆタンパク質の発現を指示する哺乳動物発現ベクターで感染される。ベクターのみで感染されたコントロール細胞はコントロールとして使用する。
スクリーニングおよび分析：感染細胞はマルチウェルプレート中で培養され、ＭＨＣ−Ｉの上方制御を可能とする時間間隔で、薬理学的動因を使用して処理され得る。特に、細胞はＨＬＡ−Ａに対する蛍光物質結合抗体を使用して細胞外染色され得る。このスクリーニングで陽性と認識される動因、すなわちＨＬＡ−Ａを上方制御する動因は、さらに潜在的治療動因として分析される。
【００９７】
実施例６
ＨＰＶ−１６Ｅ５感染細胞の変更されたエンドソーム酸性化
背景：
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は基礎的ヒトケラチン生成細胞に感染し、上皮分化層中で増殖する（２２）。ある種のＨＰＶのＥ６、Ｅ７およびＥ５タンパク質は、ＨＰＶ感染に関連する病原性に寄与する癌遺伝子活性を有する（２３，２４）。特に、ＨＰＶ−１６Ｅ５オープンリーディングフレームは、ウイルスの病原性とその複製の両方に寄与する活性を有する小さな高度に疎水性であるタンパク質（２５）をコードする。このタンパク質はヒトケラチン生成細胞の上皮成長因子（ＥＧＦ）と相乗的に作用し、リガンド仲介受容体エンドサイトーシスに続くエンドソーム区画中でのＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）の分解を阻害する分裂促進活性を有する（２６）。事実、Ｅ５感染ケラチン生成細胞中で、エンドソーム酸性化の有意な阻害が観察される。これは細胞内小胞中で未分解ＥＧＦＲ分子の長期保持を説明するかもしれない。エンドソーム酸性化の阻害は、液胞型プロトンＡＴＰａｓｅの１６ｋＤａサブユニットへのＥ５の結合によって仲介される（２７）。このポンプ（ｐｕｍｐ）は、ＡＴＰ加水分解からのエネルギーを使用して、細胞質ｐＨ（７．０〜７．２）に対して、エンドソームおよびリソソーム中で低い内部ｐＨ（４．５〜５．０）を確立し、そして維持し、小胞中へプロトンの流入を生じる（２８）。したがって、ＨＰＶ複製効率に関連する小器官の酸性化は、ある範囲の悪性腫瘍に対する潜在的治療動因をスクリーニングする手段として使用することができる。
【００９８】
ＨＰＶ−１６Ｅ５レポーター細胞の産生：ＨＰＶの正常宿主細胞として使用するヒト包皮ケラチン生成細胞は、好適なプロモーターのコントロール下にＥ５コード遺伝子を電気穿孔法によって形質移入され得る。形質移入されたクローンはウエスタンブロット分析によってＥ５発現について解明され、エンドソームｐＨがリソセンサーグリーンＤＮＤ−１８９（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏｋ／ｃｈａｐｔｅｒ ２１．３）を使用して決定される。
【００９９】
スクリーニングおよび分析：形質転換細胞はマルチウェルプレート中で培養され、薬学的動因で処理され得る。続いて、処理された細胞は製造者 （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｉｎｃ．）が示すように、（上記された）リソセンサーグリーンを適用され得る。形質転換された表現型の逆転を誘発する動因は、デジタル顕微鏡を使用して、小胞ｐＨの正常な酸性化によって可視化され得る。
【０１００】
実施例７
多剤耐性（ＭＤＲ）腫瘍細胞におけるホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）活性の上方制御
背景：
多剤耐性（ＭＤＲ）は癌の化学的治療の失敗の主要な原因であり、しばしば癌細胞中のＰ−グリコプロテイン（Ｐ−ｇｐ）などの薬剤輸送体の高められた発現に関与している（２９）。種々の刺激、すなわち低下された細胞外ｐＨ、熱ショック、亜砒酸塩、細胞毒性薬剤、抗癌剤、癌遺伝子の形質移入、ＨＩＶ−ＩおよびＵＶ−照射が、ｍｄｒ１遺伝子の発現を増加させる。しかしながら、ＭＤＲはカベオリン発現の大量上方制御およびカベオラの高められた表面密度などの膜の組成および特性の変更を含むさらなる生化学的変化を伴う。さらに、ホスホリパーゼＤ（ＰＬＤ）、カベオラの構成酵素および界面活性剤不溶性糖脂質富化膜（ＤＩＧｓ）は、ヒトＭＤＲ癌細胞において上方制御される（３０）。したがって、ＭＤＲ表現型を逆転するように指向された動因は、癌治療の分野への大きな重要性を有する。
ＧＦＰ−カベオリン−１形質移入ＭＤＲレポーター細胞−ＭＣＦ７−ＡｄｒＲヒト乳癌細胞は、模範的ＭＤＲ細胞として選択され得る。ＭＤＲ表現型を生じないコントロール細胞とともに、これらの細胞はＧＦＰ−カベオリン−１を形質移入され得る。
スクリーニングおよび分析−形質移入された細胞はマルチウェルプレート中で培養され、カベリオン−１の下方制御を可能とする時間間隔にて薬学的動因で処理され得る。続いて、処理された細胞のカベリオン−１濃度が測定される。ＭＤＲ表現型の逆転を誘発する動因が同定され、さらに特性化され得る。
【０１０１】
本発明はその特定の実施態様とともに説明されているけれども、多くの代替、修正および変更が当業者には明白となることは明かである。したがって、その真髄および添付される請求項の広い範囲内に入るこのような代替、修正および変更の全てを包括することが意図される。本明細書中に言及された全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物、特許または特許出願それぞれが、あたかも具体的におよび個々に参考文献として、ここに導入されることを示されるような同じ範囲で、明細書中に参考文献としてその全体が導入される。さらに、本出願中のいかなる参考文献の引用または確認は、このような参考文献が本発明の先行技術として有用であるとの是認として解釈されるべきでない。さらに、本発明の態様のいずれかの文脈中に提供される特定の詳細および実施例であって本発明の他の態様の文脈中では具体的に説明されていない特定の詳細および実施例は、本発明のこのような他の態様の文脈においても有用であり、かつ説明的であることを意味する。
【参考文献】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
２つの異なった細胞成分の共局在化の程度を記録するための相関分析を示す。
【図２】
原繊維接着動力学におけるアクト−ミオシン阻害剤の効果の相関分析を示す。
【図３】
シミュレートされた並進、収縮または回転歪みの相関分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004520014.tif 000071
2004520014.tif 000072
2004520014.tif 000073
2004520014.tif 000074