(57)【要約】ＵＥＡ１ミメティック、それらを含む医薬製剤、ならびに治療および診断用ターゲティング物質としてのそれらの使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬物質と細胞接着性リガンドとを含んでなる医薬製剤であって、前記細胞接着性リガンドは有機環状部分を含んでなり、前記有機環状部分はポリヒドロキシ置換部分およびポリアルコキシ置換部分のいずれかを含んでなる医薬製剤。
【請求項２】
細胞接着性リガンドが医薬物質を含んでなる担体物質に共有結合および非共有結合のいずれかで結合している、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
担体物質が、ナノ粒子、ミクロ粒子、およびリポソームのうちから選択される、請求項２に記載の医薬製剤。
【請求項４】
有機環状部分の骨格が５〜７個の原子からなる骨格環を含んでなる、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項５】
５〜７個の原子からなる環状骨格が不飽和である、請求項４に記載の医薬製剤。
【請求項６】
環状骨格の原子がすべて炭素原子である、請求項４に記載の医薬製剤。
【請求項７】
有機環状部分の骨格が、フェニル、ナフチル、シクロヘキシル、ベンジル、ベンゾイル、ピリジン、およびジヒドロベンゾピランのうちから選択されるラジカルの骨格と同一である、請求項４に記載の医薬製剤。
【請求項８】
有機環状部分は、フェニル、ナフチル、シクロヘキシル、ベンジル、ベンゾイル、ピリジン、およびジヒドロベンゾピランのうちから選択されるラジカルの２個以上のヒドロキシル基が置換されているものである、請求項４に記載の医薬製剤。
【請求項９】
選択されたラジカルの各環状骨格の２〜４個のヒドロキシルが置換されている、請求項８に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
選択されたラジカルがガロイルラジカルである、請求項８に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
有機環状部分が足場部分に共有結合している、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
細胞接着性リガンドが、足場部分によって連結されている２つ以上の有機環状部分を含んでなる、請求項１１に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
２つの有機環状部分間で足場に沿った環から環までの最短長が１〜２０原子である、請求項１２に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
足場部分が、アミノ酸、グアニジン、ヒダントイン、チオヒダントイン、チオ尿素、カテキン、アシルアミン、二環性アミン、三環性アミン、および糖類のうちから選択される部分を含んでなる、請求項１１に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
足場部分がアミノ酸を含んでなる、請求項１３に記載の医薬製剤。
【請求項１６】
トリヒドロキシフェニルまたはトリメトキシフェニル部分がアミノ酸に結合している、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
アミノ酸がリシンである、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項１８】
足場部分が少なくとも２個のアミノ酸を含むペプチドを含んでなる、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項１９】
足場部分が少なくとも２個のアミノ酸の双方に結合している、請求項１５に記載の医薬製剤。
【請求項２０】
少なくとも２個のアミノ酸が共にリシンである、請求項１８に記載の医薬製剤。
【請求項２１】
選択された足場部分がアシルアミンである、請求項１４に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
アシルアミンが、Ｘ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙの構造を有し、前記式中、ＸはＣおよびＮのうちから選択される少なくとも２個の原子を含む線状骨格を有し、Ｙは有機環状部分を含む、請求項２１に記載の医薬製剤。
【請求項２３】
有機環状部分が、アシルアミンの（Ｃ＝Ｏ）基に対して、直接または１０原子を超えないリンカー部分骨格を介して結合している、請求項２０に記載の医薬製剤。
【請求項２４】
少なくとも１個のアミノ酸のＲ基がアシルアミンのＸ部分に結合しており、前記アミノ酸は、Ｄ−ノルロイシン、Ｌ−ノルロイシン、Ｄ−チロシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−アルギニン、およびＬ−アルギニンのうちから選択される、請求項２２に記載の医薬製剤。
【請求項２５】
有機環状部分がアシルアミンのＸ部分に結合しており、前記有機環状部分は、Ｄ−ナフチルメチル、Ｌ−ナフチルメチル、およびＬ−ｐ−クロロベンジルのうちから選択される、請求項２２に記載の医薬製剤。
【請求項２６】
Ｙ部分が、３，４，５−トリヒドロキシフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、４−ビフェニルメチル、および４−エチル−４−ビフェニルメチルのうちから選択される、請求項２２に記載の医薬製剤。
【請求項２７】
−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙがガロイル基である、請求項２２に記載の医薬製剤。
【請求項２８】
Ｘが、線状骨格に対して直接または１０原子を超えないリンカー部分骨格を介してそれぞれ結合している２〜１０個の有機環状部分を含んでなる、請求項２２に記載の医薬製剤。
【請求項２９】
細胞接着性リガンドが、表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７Ａ、表７Ｂ、および表８に記載されている化合物のうちから選択される化合物を含んでなる、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３０】
表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７Ａ、表７Ｂ、および表８に列挙されている化合物のうちから選択される化合物。
【請求項３１】
腸上皮細胞を有する生物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）に医薬製剤を投与する方法であって、請求項１に記載の医薬製剤を投与することを含んでなる方法。
【請求項３２】
細胞接着性リガンドが、医薬物質を含有する担体（好ましくはその表面）に共有結合または非共有結合している、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ヒトまたは動物の組織上で実施される診断または予後診断法であって、ＵＥＡ１またはＵＥＡ１ミメティックを組織の細胞に付与するステップと、得られた結合ＵＥＡ１またはＵＥＡ１ミメティックパターンを画像化するステップと、そのパターンを評価するステップとを含んでなる方法。
【請求項３４】
細胞が胃腸管の上皮細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
画像化するステップが染色による、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ＵＥＡ１またはＵＥＡ１ミメティック調製物およびそれらの調製物に適合する画像化システムを含んでなる診断キット。
【請求項３７】
胃腸管の炎症または腫瘍状態の診断または評価に用いるための請求項４に記載の診断キット。
【請求項３８】
ＵＥＡ１ミメティックが有機環状部分を含んでなる細胞接着性リガンドであり、前記有機環状部分がポリヒドロキシ−またはポリメトキシ置換部分を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬製剤、とりわけ、経腸投与に適した医薬製剤、特に経口剤形に関する。本発明は、特に、身体の上皮層、特に胃腸管（ＧＩＴ）の内腔表層を覆う小腸上皮細胞を介した薬物またはワクチンなどの医薬活性成分の取り込みを改善するように医薬製剤を適合させることに関する。本発明の１つの態様は、上皮層を介した医薬活性成分の輸送を促進するために医薬製剤に組み込み得る新規化合物を含めた化合物種の同定、調製および使用に関する。そのような化合物には、特定の天然化合物のミメティックとして他の目的に有用な新規化合物が含まれる。
【０００２】
さらに、本発明は、特に、組織の状態または症状を確立する助けとするために、ヒトまたは動物由来の身体の特定組織細胞型を例えば染色または標識して画像化することを含む病状の診断および予後診断に有用な組成物および方法に関する。特に、一態様において、本明細書に開示されている組成物は、胃腸管（ＧＩＴ）細胞の研究または評価に用いられる。これは、関連細胞に、炎症、新生組織形成、形成異常、または、他の異常な、恐らく悪性の細胞形質転換があることが疑われるかまたは既知である症状の評価であり得る。特に対象となる疾患としては、結腸ガン、潰瘍性大腸炎およびクローン病がある。
【０００３】
別の態様において、本明細書に開示されている組成物および方法は、悪性であれ非悪性であれ、ヒトまたは動物組織の血管の体内状態の評価に適用できる。
【背景技術】
【０００４】
本発明のドラッグ／ワクチンデリバリー態様の背景
身体に投与される医薬活性成分の効果が投与経路に大きく依存することは周知である。理想的には活性成分を罹患部位に局所的に集中させたいと思うのは当然であるが、これを直接達成する実践的な方法はほとんどない。多くの薬物に関して、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内）が最も効果的であるが、これは周知の制限および不利点を有する。そのような制限および不利点には、体内における局所的高濃度の薬剤物質による副作用の危険性、注射部位における感染の危険性、および一般に患者の応諾を低下させがちな幾分の不快さまたは不便さが挙げられる。患者の応諾は、薬物を日常的に自己投与しなければならない場合には特に重要である。
【０００５】
他の経路は、経上皮性関門、例えば、口腔内、経鼻、経膣、経腸および腸内薬物輸送を利用する。これらのうち、経腸投与、特に経口投与は、特に便利であり、患者にも好まれる。しかし、経腸ドラッグデリバリーは、活性成分が系に入る経路が極めて間接的であるために問題があることが周知である。経口投与された薬物が治療効果を発揮するには、血液循環系に入るか免疫系と相互作用するために、胃の酸性環境を生き抜き、次いで、上皮性関門、すなわち、腸内膜を横断しなければならない。
【０００６】
医薬活性成分をコーティングし、さらに／または賦形剤中にカプセル化して、ＧＩＴの目標領域に到達するまで、胃を通過させて生き残らせるための多くの実践的な提案が公開されている。現在のところ特に興味を引く１つの製剤タイプは、生浸食性（ｂｉｏｅｒｏｄｉｂｌｅ）または生分解性高分子賦形剤から形成された所謂ミクロ粒子およびナノ粒子である。これらの粒子は、活性物質をＧＩＴに沿って移行させるときに活性物質を保持、保護することができ、次いで、腸壁を介して吸収可能であり、その後、血流中で分解し、活性成分を放出してその治療効果を及ぼす。
【０００７】
しかし、そうは言っても、これらの製剤を用いた場合の生体内利用率は実際のところ非経口経路の場合よりはるかに低く、かつ患者によってかなり異なる。これは、一般に、場合により生浸食性／生分解性カプセル化形態の活性物質を、粘膜層および高選択性上皮細胞を有する腸壁を通過させることが難しいためであると考えられる。
【０００８】
この点に関する特定の難問は、ホルモンや酵素などの生物学的またはバイオテクノロジー産物の医薬利用に関連して生じる。これらは、一般に、高分子、例えば、タンパク質、ペプチド、遺伝子、ＤＮＡ片、ＤＮＡワクチン、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどである。高分子は、分子サイズが大きいために、上皮を横断することが難しい。高分子は、ＧＩＴ内では、酸や酵素の作用のために安定性が低い。したがって、経口経路を介したその生体内利用率は極めて低く、そのような薬物が稀少かつ高価であることを考えると二重に問題である。現在のところ、不利点も付随する非経口投与のみが利用可能である。他の経路を介したこれらの高分子薬物およびワクチンの生体内利用率を高めることが極めて望ましいであろう。
【０００９】
どの経上皮機構を機能させるにしても、それが活性物質を持続的に存在させ、かつ／またはある種の生化学的刺激が活性物質の細胞取り込みを促進させるように、薬物活性粒子に腸壁に対する正の親和性を与える方法に関して種々の提案が発表されている。
【００１０】
これに関してある研究が行われ、特定の糖残基に対して特異的親和性を有する天然タンパク質物質である種々のレクチンがモデル小腸上皮細胞型細胞系に特異的に結合するであろうと指摘され、証明された。これは、この小腸上皮細胞表面がオリゴ糖部分を有しているためである。したがって、特に、非毒性植物レクチンが既にヒト食物中に存在していることを考慮に入れて、経口ドラッグデリバリー用担体としてレクチンを利用することが提案された。以下の刊行物を参照されたい。エフ  ガバーら（Ｆ．Ｇａｖｏｒ  ｅｔ  ａｌ）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  第５５巻、１３１〜１４２ページ（１９９８年）；エヌ  フォスターら（Ｎ．Ｆｏｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ）、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６、第５巻、５３６〜５４１ページ（１９９８年）；シー  エム  レアら（Ｃ．Ｍ．Ｌｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ）、Ｐｈａｒｍｓ  Ｒｅｓ．第１２巻、５４７〜５５３ページ（１９９２年）、および関連テーマに関する他の記事。
【００１１】
これらの興味深い結果にもかかわらず、ＧＩＴにおける原薬の「細胞接着性」（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｏｎ）を促進するためにレクチンを利用することは、そのような大きなタンパク質分子が腸内の酵素作用下にも製剤の調製プロセス中にも分解したり活性を失ったりしがちであるために、依然として問題である。この大きなサイズと、潜在的な免疫原性および細胞毒性とが相俟って、薬物やワクチンをヒトＧＩＴに、またヒトＧＩＴを横断してデリバリーするターゲティング物質としてのレクチン自体の利用が制限される。
【００１２】
本発明者らは、上皮細胞親和性、したがって、経腸投与医薬製剤の部分、成分またはコーティングとして有用になる「細胞接着」能力を示す代替物質を同定、テスト、調製することを目的として、極めて広範囲な研究を実施した。
【００１３】
本発明の診断および予後診断態様の背景
腸粘膜における表面糖残基の変性および／または発現増加は、悪性形質転換、異形成変化および広範性（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ）大腸炎に関連していることが指摘されている。例えば、潰瘍性大腸炎やクローン病患者由来の組織は、ウレクス・エウロパエウス（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ）Ｉ（ＵＥＡ１）標識部位の異常分布を示した〔ヨシオカら（Ｙｏｓｈｉｏｋａ  ｅｔ  ａｌ）、１９８９年〕。これらの症状では、ヒト腸杯細胞ムチン上のレクチン結合部位の発現が特異的に変化したので、これは、上記疾患における腫瘍危険性を評価するための別のアプローチを提供し得る（ヨシオカら、１９８９年）。大腸ガンではＵＥＡ１やドリコス・ビフロラス（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｂｉｆｌｏｒｕｓ）凝集素のパターンも、正常な粘膜および腺腫に比べて変化した〔イワカワら（Ｉｗａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ）、１９９６年〕。
【００１４】
ＵＥＡ１は、フコース残基に結合すること、特に、上皮細胞に結合することが知られているハリエニシダ（ウレクス・エウロパエウス）由来の約６０ｋＤａのレクチンタンパク質である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らはＵＥＡ１の特性を調べ、多かれ少なかれ（場合によっては高度に）ＵＥＡ１の特異的上皮細胞結合活性を共有するが、分子構造がより単純であるために、高安定性、低コスト、標識の容易さ、または多価形態での使用可能性を有し得るという意味で、ＵＥＡ１を模倣する他の分子を同定、合成しようと大量の研究を行った。以後、「ＵＥＡ１ミメティック」と称されるこれらの他の分子は、任意の多様な有機分子構造を有し得る。これらの分子は、ペプチド、ペプチドミメティックおよび／または小有機分子であってよい。多様な（限定されない）そのような分子や、そのような分子の同定法および製造法は後で説明する。
【００１６】
本発明者らは、ヒト腸組織切片との結合におけるＵＥＡ１およびその模擬体の有効性を確認した。上述した種々の病状間関係を考慮して、本発明者らは、上皮細胞に特異的に結合する位置確認（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）物質としてＵＥＡ１またはＵＥＡ１ミメティックを用い、画像化手段により、ＧＩＴ細胞の状態を評価する方法および組成物である本発明の第１態様を提示する。
【００１７】
本発明の第２態様は、ＵＥＡ１が、種々のヒト組織の血管内皮細胞に、組織の血液型または分泌状態に関係なく特異的に結合するという事実に関連する。種々の悪性組織および非悪性組織研究で、血管のＵＥＡ１染色が評価されている。例えば、膀胱、前立腺および睾丸の悪性および非悪性組織のほとんどの血管は容易に特定された〔フジメら（Ｆｕｊｉｍｅ  ｅｔ  ａｌ）、１９８４年〕。ＵＥＡ１は、正常な脳でも新血管形成がある腫瘍組織でも、等しい強度、感度、および信頼性をもって血管の内皮細胞を視覚化した〔ウエーバーら（Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ）、１９８５年〕。ＵＥＡ１およびＦＶＩＩＩ／ＲＡＧ抗体によって、大、中、小血管が等しく良好に示されたが、毛細血管および内皮細胞の新芽はＵＥＡ１によってより均一かつ濃く染色された。また、ＵＥＡ１は、良性血管病変の内皮細胞の特異的かつ高感度マーカーでもあった〔ミエッティネンら（Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ）、１９８３年〕。さらに、ＵＥＡ１は、内皮性肉腫の多くの腫瘍細胞も染色した。メラノーマ、退形成性ガン、および他のタイプの肉腫はネガティブであった。
【００１８】
ＵＥＡ１は、正常組織の血管も腫瘍組織の血管も等しい強度で染色するので、明らかな腫瘍血管特異的ターゲティング物質ではない。しかし、本発明者らは、ＵＥＡ１染色が種々の正常および病的事象に関連した血管分布研究において潜在的用途を有することに気付いている。血管侵襲は腫瘍状態を評価する際に病理学者が用いる最も重要な診断および予後診断パラメータなので、ＵＥＡ１やＵＥＡ１を模倣するそのミメティック、例えば、ペプチド、ペプチドミメティックおよび／または小有機分子はリンパ管障害の診断の確立に有用である。
【００１９】
したがって、本明細書に開示されているようなＵＥＡ１およびそのミメティック、ならびに上記第１態様のような画像化用に適合させ得る対応組成物の血管障害の観察による病気の診断／予後診断における使用は本発明のさらなる態様である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
１つの一般態様において、本発明は、医薬物質と細胞接着性リガンドとを含む医薬製剤であり、細胞接着性リガンドは有機環状（Ｃ、Ｎ、Ｏおよび／またはＳ）部分を有し、有機環状部分はポリヒドロキシまたはポリアルコキシ置換部分（それぞれ、少なくとも２個のヒドロキシまたは２個のアルコキシ基）を含む。ポリヒドロキシ置換有機環状部分が好ましい。ポリアルコキシ置換有機環状部分に関しては、好ましくはＣ１−Ｃ５アルコキシ、より好ましくはＣ１−Ｃ３アルコキシであり、ここで、例えば、Ｃ２アルコキシはエトキシである。
【００２１】
リガンドは、医薬物質を含有する担体物質に共有または非共有結合させ得る。リガンドは担体表面に結合させるのが好ましい。
特に重要な実施形態において、担体物質は、ナノ粒子、ミクロ粒子、およびリポソームのうちから選択される。
【００２２】
いくつかの好ましい実施形態において、有機環状部分の骨格は、５〜７個の原子からなる骨格環を含む。（本発明の目的のために、ベンゼンは、単一環中に６個の炭素原子の骨格を有し、ナフタレンは、１０個の炭素原子の骨格を有するとともに、それぞれ６個の炭素原子からなる２つの骨格環を有し、これら２つの環は２個の炭素原子を共有している）。５〜７個の原子からなる骨格環は、不飽和（すなわち、芳香族）であってよい。いくつかの特に好ましい実施形態において、骨格環の原子はすべて炭素原子である。
【００２３】
有機環状部分の好ましい骨格は、フェニル、ナフチル、シクロヘキシル、ベンジル、ベンゾイル、ピリジンおよびジヒドロベンゾピランのうちから選択されるラジカルの骨格と同一のものである。そのような骨格は、２個以上のヒドロキシラジカルで置換されているのが特に好ましく、２〜４個のヒドロキシラジカルで置換されているのが最も好ましい。非常に好ましい有機環状部分は、ガロイルラジカルまたはトリメトキシフェニルラジカルである。
【００２４】
非常に好ましい一連の実施形態において、有機環状部分は、足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）部分に共有結合している。１つのそのような実施形態において、細胞接着性リガンドは、足場部分を介して結合した２つ以上の有機環状部分を含む。好ましい構造体のなかには、足場に沿って２つの有機環状部分間の環から環までの最短長が１〜２０原子のものがある。（例を示すと、下記の化合物２の場合、ナフチルラジカルとクロロフェニルラジカルとの間の環から環までの最短長は６であり、ナフチルラジカルとビフェニルラジカルとの間では５である）。
【００２５】
好ましい足場部分群は、アミノ酸、グアニジン、ヒダントイン、チオヒダントイン、チオ尿素、カテキン、アシルアミン、二環性アミン、三環性アミン、および糖類のうちから選択される部分を含む。アミノ酸１個を含む足場が非常に好ましく、少なくとも１個のアミノ酸（好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜２０個、最も好ましくは２〜６個のアミノ酸）からなるペプチドを含むものも同様に好ましい。トリヒドロキシベンゾイルまたはトリメトキシベンジル部分が（直接またはリンカーを介して）１個のアミノ酸に、またはアミド官能基を介して複数のアミノ酸に結合しているのも非常に好ましい。足場の構築には、リシンが非常に好ましいアミノ酸である。
【００２６】
Ｘは、それぞれ、直接または１０原子を超えないリンカー部分骨格を介して線状骨格に結合している２〜１０個の有機環状部分を含むのが好ましい。
別の好ましい足場部分はアシルアミンである。好ましいアシルアミンは、構造Ｘ−ＮＨ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙのものであり、式中、Ｘは、ＣおよびＮのうちから選択される少なくとも２個（好ましくは２〜２０個）の原子を有する線状骨格を含む。より好ましくは、Ｘは、それぞれ、直接または１０原子を超えないリンカー部分骨格を介して線状骨格に結合している２〜１０個の有機環状部分を含む。
【００２７】
Ｙは、ポリヒドロキシまたはポリメトキシ有機環状部分を含むのが好ましい。そのような有機環状部分は、直接または１０原子を超えないリンカー部分骨格によってアシルアミンの（Ｃ＝Ｏ）基に結合しているのが特に好ましい。一連の好ましい実施形態において、Ｙ部分は、３，４，５−トリヒドロキシフェニル、３，４，５−トリメトキシフェニル、４−ビフェニルメチル、および４−エチル−４−ビフェニルメチルのうちから選択される。１つの非常に好ましい実施形態において、−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙはガロイル基である。
【００２８】
一連の好ましい実施形態において、少なくとも１個のアミノ酸のＲ基（例えば、シクロヘキシルアラニンのシクロヘキシルメチル部分）は、アシルアミンのＸ部分に結合しており、このアミノ酸は、Ｄ−ノルロイシン、Ｌ−ノルロイシン、Ｄ−チロシン、Ｌ−チロシン、Ｄ−シクロヘキシルアラニン、Ｌ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−アルギニン、およびＬ−アルギニンのうちから選択される。有機環状部分はアシルアミンのＸ部分に結合していてよく、この有機環状部分は、例えば、Ｄ−ナフチルメチル、Ｌ−ナフチルメチル、およびＬ−ｐ−クロロベンジルのうちから選択され得る。
【００２９】
特定の細胞接着性リガンドの例に関して、細胞接着性リガンドは、以下の表１〜表６、表７Ａ、表７Ｂおよび表８に示されている化合物のうちから選択される化合物を含む。〔上記は、例えば、表１、表２および表３の個々の欄のＲ１、Ｒ２、Ｒ３化合物が、化学図表中の（これらの表の直前に記載の−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨＲ１−Ｎ（−）−ＣＨ２−ＣＨＲ２−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ３に相当する）いくぶん小さいＲ１、Ｒ２、およびＲ３部分の生成に用いられる化合物であったことを考慮に入れている〕。その結果、表１のＲ１としてのナフチルアラニンに相当するＮａｐ−ａｌａの記載は、化学図表中の対応するＲ１ラジカルがナフチルメチル−であることを示しており、表１のＲ３としての３，４，５−トリメトキシ安息香酸の記載は、化学図表中の対応するＲ３ラジカルが、３，４，５−トリメトキシフェニルであることを示している。類似の状況が他の表の場合にも存在することが分るであろう。
【００３０】
表４に関して、リガンドは、少なくとも３０、より好ましくは、少なくとも２０という、２５０．０（μｇ／ｍｌ）での１段階アッセイの平均阻害％（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｔｉｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ａｖｇ  ％  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を有する化合物を含むのが好ましい。
【００３１】
表６に関して、リガンドは、２５０未満、好ましくは１００未満、最も好ましくは３０未満の１段階アッセイＩＣ５０（５０μｇ／ｍｌ）を有する化合物を含むのが好ましい。
表７（Ａ）に関して、細胞接着性リガンドは、３５０ｕＭ以下、好ましくは２００ｕＭ未満、より好ましくは１００ｕＭ未満の第２段階ＩＣ５０値（ｕＭ）を有する表７（Ａ）に示されている２コピー構造を含むのが好ましい。
【００３２】
表７（Ｂ）に関して、細胞接着性リガンドは、２５０ｕＭ以下、より好ましくは２００ｕＭ未満、さらに好ましくは５０ｕＭ未満、最も好ましくは３ｕＭ未満の第２段階ＩＣ５０値（ｕＭ）を有するものとして示されている４コピー構造化合物を含むのが好ましい。
【００３３】
表８に関して、細胞接着性リガンドは、第２段階アッセイにおいて、１５０未満、好ましくは１５未満のＩＣ５０（ｕＭ）を有する化合物を含むのが好ましい。
表１、表２、表３、表４、表５、表６、表７、表７（Ａ）、表７（Ｂ）および表８に記載されているテスト化合物は、それら自体が本発明の態様である。
【００３４】
別の一般態様において、本発明は、腸上皮細胞を有する生物（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）に医薬製剤を投与する方法であり、この方法は、請求項１に記載の医薬製剤を投与するステップを含む。一連の重要な実施形態において、細胞接着性リガンドは、医薬物質を含有する担体（好ましくはその表面）に共有結合または非共有結合している。
【００３５】
本発明者らは、上皮細胞親和性を示し、したがって、経腸投与医薬製剤の部分、成分またはコーティングとして有用になる「細胞接着」能力を示す代替物質を同定、テスト、調製するために、極めて広範囲にわたる研究を実施した。
【００３６】
本発明者らは、フコース残基に結合すること、特に上皮細胞に結合することが知られているハリエニシダ（ウレクス・エウロパエウス）由来の約６０ｋＤａのレクチンタンパク質であるレクチンＵＥＡ１を用いたコンペティティブアッセイで、ペプチド有機分子と非ペプチド有機分子とを含めた多くのコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングした。
【００３７】
本発明者らは、２個以上、好ましくは３個以上のヒドロキシまたはヒドロキシ置換基を有する環状有機基が腸管上皮細胞を含めた上皮細胞に関して結合活性部分であり得ることを見出した。そのような結合活性部分、特に、有機骨格または「足場」上に２つ以上の結合活性部分を有する有機化合物は、医薬製剤の細胞接着性リガンドとして用いられ得る。
【００３８】
環式基は炭素環または複素環であってよい。環式基は、芳香族環系、非芳香族環系、縮合芳香族環系または部分縮合芳香族環系であってよい。
ポリヒドロキシ置換芳香族基、例えば、フェニルや関連アリール環系、例えばナフチルのジオール、トリオール、テトロールなど、または、シクロヘキセニルなどの脂環式基も好ましい。フェニルまたは関連する環は、ベンジルもしくはベンゾイル基、または関連環系の同等物のような分子骨格または足場に結合していることがある。
【００３９】
この環上の複数のヒドロキシ基は隣接していてよい。
特に、本発明者らは、トリヒドロキシベンジルまたはベンゾイルとして足場に結合し得るトリヒドロキシフェニル基を用いて良好な結果を得た。
【００４０】
本発明者らが発見した最も好ましい結合活性部分は、例えば、アミドまたは他のアシル結合を介して足場に結合して、ガロイル（３，４，５−ヒドロキシベンゾイル）基を構成し得る、３，４，５−ヒドロキシフェニル基をベースとしている。
【００４１】
ヒドロキシ基は、−ＯＨ形態をとるのが好ましいが、チオール類似体や、マスク形態、例えば、アルコキシル化形態も有用なことがある。
上述のように、本発明者らは、有機分子足場または骨格上に２つ以上、好ましくは３つ以上の上記結合活性部分を与えると良好な結果が得られることを見出した。この足場には多様な選択肢が存在する。足場は、有害な物質に分解しないであろうという意味で生体適合性であるのが好ましいことは勿論であり、一般に、炭素、窒素、酸素、硫黄および水素以外は含んでいないことが好ましい。足場は、線状、分枝、環状またはこれらの任意の組合わせであってよい。
【００４２】
足場は、官能基を介して結合した炭化水素物質からなるのが好ましい。適当な官能基は、アミノ、アミド、アシル、エーテル、エステル、カルボン酸および尿素結合から選択されるのが好ましいが、それらには限定されない。
【００４３】
生体受容性が確立されていることを考えると、アミノ酸単位および／またはその類似体もしくは誘導体をベースとするか、それらを含む分子足場が好ましい。足場は、１つ以上、好ましくは複数の上記結合活性部分で置換されたアミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド（好ましくは２〜１０個、より好ましくは１〜６個のアミノ酸）であるか、それらを含み得る。足場には、天然または合成アミノ酸を用い得る。
【００４４】
非ペプチド足場も可能である。当業者には、すでに、有効性が確立されているペプチドミメティック分子および分子骨格は既知であり、これらの足場には、上記官能基や結合を用いた種々のタイプの分子のうち、複素環を含む分子、グアニジン、ヒダントイン、チオヒダントイン、チオ尿素、カテキン、アシルアミン、糖類などが含まれる。
【００４５】
足場が、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチドまたはそれらの類似体を含んでいる場合、少なくとも１つの結合活性部分が足場のＣ末端に結合している。
足場は、結合活性基が、場合により、炭化水素鎖などの分枝スペーサー鎖を介してそこから枝分れする線状または環状骨格を提供し得る。
【００４６】
結合活性部分と足場とは、アミノ、アミド、アシル、エーテル、アルキレン、アルケニレンまたは他の適当な官能基、またはこれらの任意の組合わせを介して結合していてよい。
【００４７】
本明細書に提案されている多くの結合活性化合物（リガンド）は新規であると考えられるが、一般に糖基質上の複数のガロイル置換基を特徴とする既存の化合物やその類似体、例えば、タンニン酸および他のタンニンを用いることも可能である。これらの既知物質の場合、これは、新たに提案された使用法および製剤である。
【００４８】
リガンド化合物を全体として（１つ以上の結合活性部分＋任意の足場）またはその多量体として考えて、その分子は、腸管内で十分安定であるように、従来の生化学的方法に基いて設計される。先に説明したようなレクチン類と比較すると、このリガンドの分子量は低くてよく、これを適当な化学組成と組合わせると、安定性が得られ、免疫原性および細胞毒性の可能性が低下するだけでなく、合成リガンドの製造および処理を容易にすることができる。好ましい分子量は、５０００未満、好ましくは２０００または１５００未満であるが、但し、その多量体は除外しない。
【００４９】
しかしながら、本提案は、本明細書に有効性が開示されている結合活性部分を他のタイプの分子に用いる可能性も含むことに留意されたい。例えば、これらの結合活性部分は、生分解性ポリマーなどの医薬製剤に用いられている高分子賦形剤上の置換基またはグラフト体として用いられ得る。リガンド分子は、全体として、医薬製剤上または医薬製剤中に共有または非共有結合し得る。同様に、リガンド分子は、全体として、薬物または抗原もしくはアジュバントに共有または非共有結合し得る。
【００５０】
これらの結合活性部分およびリガンド化合物を利用する新規な医薬製剤は本発明の１つの態様である。経腸、例えば経口製剤におけるドラッグデリバリーを促進するための結合活性部分およびリガンド化合物の使用は別の態様である。
【００５１】
本明細書で提案されているリガンド化合物は、大部分は新規であり、したがって、それら自体でＵＥＡ１模擬体として、本明細書で権利請求されている本発明の一態様である。
対応方法、すなわち、新規結合化合物の合成を含む方法や、新規であるなしにかかわらずリガンド化合物をブレンド、結合、コーティングまたは他の手段により製剤に組み込むことを含む医薬製剤の製法を含めた方法は、本明細書で権利請求されている本発明の態様である。
【００５２】
本発明の特定の実施形態において、上述の細胞接着性リガンドの１種は、医薬物質を含む担体物質に共有または非共有結合している。例えば、担体物質は、ナノ粒子、ミクロ粒子およびリポソームのうちから選択される。担体物質は、本明細書の他の項でより詳細に説明されているように、１０ｎｍから５００μｍの範囲内の最大寸法を有するのが好ましい。本発明の特定の実施形態において、医薬物質は薬物または治療薬である。他の特定の実施形態において、医薬物質は病原体抗原である。
【００５３】
本発明のいくつかの態様は、医薬物質のデリバリーを目標とする細胞接着性リガンドの使用を含む。
本発明は、一態様において、腸上皮細胞を有する生物に医薬物質を投与する方法であり、この方法は、腸上皮細胞を、担体物質に共有または非共有結合している上述の細胞接着性リガンドの１種に接触させるステップを含む。好ましい実施形態において、生物は哺乳動物である。哺乳動物はヒトであるのが最も好ましい。
【００５４】
本発明の方法の特定の実施形態において、担体物質は、ナノ粒子、ミクロ粒子およびリポソームのうちから選択される。担体物質は、１０ｎｍから５００μｍの範囲の主要寸法を有するのが好ましい。好ましい実施形態において、担体物質は、薬物を装填しているか、薬物をカプセル封入している。リガンド−担体物質のデリバリーに好ましい投与経路は経口経路である。他の実現可能な経路は、経腸、皮下、筋肉内および静脈内経路である。
【００５５】
本明細書に用いられている限りにおいて、用語「担体物質」は、医薬物質を運ぶことができる粒子または液滴と定義される。ミクロ粒子は、主要寸法が、１〜５μｍ、最も好ましくは１〜３μｍの範囲の粒子と定義される。ナノ粒子は、主要寸法が、１μ未満、好ましくは１〜５００ｎｍの範囲、最も好ましくは１０〜５００ｎｍの範囲の粒子と定義される。
【００５６】
本明細書に用いられている限りにおいて、主要寸法は、球状粒子の場合にはその直径であり、棒状体粒子の場合にはその長さである。他の粒子の場合、主要寸法はその粒子が有し得る最長寸法である。
【００５７】
医薬物質を装填するか医薬物質をカプセル封入するナノ粒子およびミクロ粒子は、腸上皮細胞組織を標的とする本発明のリガンドなどの細胞接着性リガンドでコーティングされ得る。そのコーティングは、共有または非共有結合により形成され得る。共有結合は、吸着または任意の他のコーティング法により達成することができる。いずれの場合にも、完成した粒子または後で粒子の一部を構成する粒子成分に対して結合が行なわれ得る。
【００５８】
生分解性粒子が好ましい。
あるいは、医薬物質を直接細胞接着性リガンドに結合させてもよい。
「医薬物質」は、治療薬または診断薬である。治療薬は、既存の病気を治療するため、または将来発生する可能性のある病気を予防するために投与されるものである。診断薬は、診断処置の一部として投与される任意の物質である。
【００５９】
治療薬の例は、薬物、遺伝子、遺伝子デリバリーベクター、および抗原／ワクチンである。
薬物には、例えば、鎮痛薬、抗偏頭痛薬、抗凝固薬、制吐薬、心・血管作動薬、降圧薬、麻薬拮抗薬、キレート剤、抗狭心症薬、化学療法薬、鎮静薬、抗腫瘍薬、プロスタグランジンおよび抗利尿薬、アンチセンスオリゴヌクレオチド、遺伝子修正ハイブリッドオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡＩｉ）オリゴヌクレオチド、ＲＮＡサイレンシング（ｓｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチド、アプタマーオリゴヌクレオチドおよび三重らせん形成オリゴヌクレオチド、ＤＮＡワクチン、アジュバント、組換えウイルスが含まれる。
【００６０】
遺伝子デリバリーベクターの例は、ＤＮＡ分子、ウイルスベクター〔例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびシンドビスウイルス（ｓｉｎｄｂｕｓ  ｖｉｒｕｓ）〕、ならびにカチオン脂質コートＤＮＡおよびＤＮＡデンドリマーである。
【００６１】
薬物としては、慣用的な小分子薬、タンパク質、オリゴペプチド、ペプチド、および糖タンパク質が挙げられる。
薬物の例は、インスリン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子調節タンパク質、心房性ナトリウム利尿タンパク質、コロニー刺激因子、ベタセロン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、インターフェロン（例えば、α、β、またはγインターフェロン）、ソマトロピン、ソマトトロピン、ソマトスタチン、インスリン様成長因子（ソマトメジン）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、組織プラスミノーゲンアクチベータ（ＴＰＡ）、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、オキシトシン、エストラジオール、成長ホルモン、酢酸ロイプロリド、第ＶＩＩＩ因子およびインターロイキン（例えば、インターロイキン−２）である。さらに、代表的な薬物には、鎮痛薬（例えば、フェンタニル、スフェンタニル、ブトルファノール、ブプレノルフィン、レボルファノール、モルフィン、ヒドロモルフォン、ヒドロコドン、オキシモルフォン、メタドン、リドカイン、ブピバカイン、ジクロフェナック、ナプロキセンおよびパベリン）、抗偏頭痛薬（例えば、スマトリプタンおよび麦角アルカロイド）、抗凝固薬（例えば、ヘパリンおよびヒルジン）、制吐薬（例えば、スコポラミン、オンダンセトロン、ドンペリドンおよびメトクロプラミド）、心・血管作動薬、降圧薬、および血管拡張薬〔例えば、ジルチアゼム（ｄｉｌｔｉｚｅｍ）、クロニジン、ニフェジピン、ベラパミル、イソソルビト−５−モノニトレート、有機硝酸薬および心疾患の治療に用いられている物質〕、鎮静薬（例えば、ベンゾジアゼピンおよびフェノチアジン（ｐｈｅｎｏｔｈｉｏｚｉｎｅｓ））、麻薬拮抗薬（例えば、ナルトレキソンおおびナロキソン）、キレート剤（例えば、デフェロキサミン）、抗利尿薬（例えば、デスモプレシンおよびバソプレシン）、抗狭心症薬（例えば、ニトログリセリン）、抗腫瘍薬（例えば、５−フルオロウラシルおよびブレオマイシン）、プロスタグランジン、ならびに化学療法薬（例えば、ビンクリスチン）がある。
【００６２】
治療薬である抗原の例は、腫瘍抗原、病原体抗原およびアレルゲン抗原である。ワクチン製剤は、少なくとも１種の抗原を含んでいるであろう。「病原体抗原」は、病原体に特異的な抗原、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫または菌類由来の抗原である。
【００６３】
重要な病原体の例としては、コレラ菌（ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｓ）、腸管毒素原性大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）、ロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、赤痢菌種（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）、パラインフルエンザ・ウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）、インフルエンザ・ウイルス、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ウサギウイルス（ｒａｂｂｉｔ  ｖｉｒｕｓ）およびＥＢウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）がある。
【００６４】
一般的なウイルスには以下の科が含まれる：ピコルナウイルス科（ｐｉｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）；カリシウイルス科（ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）；トガウイルス科（ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）；フラビウイルス科（ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）；コロナウイルス科（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ラブドウイルス科（ｒｈａｂｏｄｖｉｒｉｄａｅ）；フィロウイルス科（ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）；パラミクソウイルス科（ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）；オルトミクソウイルス科（ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）；ブンヤウイルス科（ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）；アレナウイルス科（ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）；レオウイルス科（ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）；レトロウイルス科（ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）；パルボウイルス科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）；パポーバウイルス科（ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）；アデノウイルス科（ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）；ヘルペスウイルス科（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）および梅毒ウイルス科（ｐｏｘｙｖｉｒｉｄａｅ）。
【００６５】
一般的な細菌には以下のものが含まれるが、それらには限定されない：緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．）；セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．）；シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍａｎａｓ  ｓｐ．）；セパシア菌（Ｐ．ｃｅｐａｃｉａ）；アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）；表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）；エシェリキア・フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）；肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｓ）；黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）；フェモフィルス属（Ｈａｅｍｏｆｉｌｕｓ  ｓｐ．）；ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ．）；髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）；バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｓｐ．）；シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）；ブランハメラ属（Ｂｒａｎｈａｍｅｌｌａ  ｓｐ．）；サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｉａ  ｓｐ．）；シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．）；リステリア属（Ｌｅｓｔｅｒｉａ  ｓｐ．）；動物パスツレラ症病原菌（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）；ストレプトバシラス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）；Ａ群溶血性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）；プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐ．）；クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．）；エリシペロトリックス属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｓｐ．）；スピリルム属（Ｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）；スピロヘータ属（Ｆｕｓｏｓｐｉｒｏｃｈｅｔａ  ｓｐ．）；梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）；ボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐ．）；放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）；マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐ．）；クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）；リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐ．）；スピロヘータ属（Ｓｐｉｒｃｈａｅｔａ  ｓｐ．）；レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）；マイコバクテリア属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｓｐ．）；ウレアプラズマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ  ｓｐ．）；ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）；トリコモナス属（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｒａｓ  ｓｐ．）；およびプロテウス・ミラビリス（Ｐ．ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）。
【００６６】
寄生虫には以下のものが含まれるが、それらには限定されない：熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）；三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）；卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌ）；四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａ）；ゴンディ・トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）；メキシコ・リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍｅｘｉｃａｎａ）；熱帯リーシュマニア（Ｌ．ｔｒｏｐｉｃａ）、大リーシュマニア（Ｌ．ｍａｊｏｒ）；エチオピア・リーシュマニア（Ｌ．ａｅｔｈｉｏｐｉｃａ）；ドノバン・リーシュマニア（Ｌ．ｄｏｎｏｖａｎｉ）；クルーズ・トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）；ブルース・トリパノソーマ（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ）；マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）；ビルハルツ住血吸虫（Ｓ．ｈａｅｍａｔｏｂｉｕｍ）；日本住血吸虫（Ｓ．ｊａｐｏｎｉｕｍ）；旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）；バンクロフト糸状虫（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ  ｂａｎｃｒｏｆｔｉ）；マレー糸状虫（Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｌｉ）；赤痢アメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）；ぎょう虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｕｓ  ｖｅｒｍｉｃｕｌｏａｒｕｓ）；有鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓｏｌｉｕｍ）、無鉤条虫（Ｔ．ｓａｇｉｎａｔａ）、膣トリコモナス（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｖａｇｉｎｉｔｉｓ）、腸トリコモナス（Ｔ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、口腔トリコモナス（Ｔ．ｔｅｎａｘ）；ランブル鞭毛虫（Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｌｉａ）；クリプトスポリジウム・パルブム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）；ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、ウシバベジア（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ）、バベジア・ジバージェンス（Ｂ．ｄｉｖｅｒｇｅｎｓ）、畑ネズミバベジア（Ｂ．ｍｉｃｒｏｔｉ）、イソスポラベリ（Ｉｓｏｓｐｏｒｅ  ｂｅｌｌｉ）、ひとイソスポラ（Ｉ．ｈｏｍｉｎｉｓ）；二核アメーバ（Ｄｉｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｆｒａｇｉｌｅｓ）；回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）；回虫（Ａｓｃａｒｉｓ  ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）；アメリカ鉤虫（Ｎｅｃａｔｏｒ  ａｍｅｒｉｃａｎｉｓ）；ズビニ鉤虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ  ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）；糞線虫（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓ  ｓｔｅｒｃｏｒａｌｉｓ）；カピラリア・フィリピネンシス（Ｃａｐｉｌｌａｒｉａ  ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｎｓｉｓ）；アンギオストロンギルス・カントネンシス（Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｙｓ  ｃａｎｔｏｎｅｎｓｉｓ）；小形条虫（Ｈｙｍｅｎｏｌｅｐｉｓ  ｎａｎ）；広節裂頭条虫（Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ  ｌａｔｕｍ）；単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）、多包条虫（Ｅ．ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｌａｒｉｓ）；ウェステルマン肺吸虫（Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓ  ｗｅｓｔｅｒｍａｎｉ）；パラゴニムス・カリエンシス（Ｐ．ｃａｌｉｅｎｓｉｓ）；クロノルキス・シネンシス（Ｃｈｌｏｎｏｒｃｈｉｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ）；ねこ肝吸虫（Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓ  ｆｅｌｉｎｅａｓ）；タイ肝吸虫（Ｏ．ｖｉｖｅｒｉｎｉ）、肝蛭（���ａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）、疥癬虫（Ｓａｒｃｏｐｔｅｓ  ｓｃａｂｉｅｉ）、ヒトシラミ（Ｐｅｄｉｃｕｌｕｓ  ｈｕｍａｎｕｓ）；毛ジラミ（Ｐｈｔｈｉｒｕｓ  ｐｕｂｉｓ）；および南米産ウマバエ（Ｄｅｒｍａｔｏｂｉａ  ｈｏｍｉｎｉｓ）。
【００６７】
一般菌類には以下のものが含まれるが、それらには限定されない：クリプトコックス・ネオホルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）；ブラストミセス・デルマティティジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｍａｔｉｔｉｄｉｓ）；アジェロミセス・デルマティティジス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）；ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｆｒａｉ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）；コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）；カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・パロプシロシス（Ｃ．ｐａｒｏｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・ギリエルモンディ（Ｃ．ｇｕｉｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ）およびカンジダ・クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）を含めたカンジダ属の細菌（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）；アスペルギルス・フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・フラーブス（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）およびアスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）を含めたアスペルギルス属の細菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）；リゾープス属の細菌（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）；リゾムコール属の細菌（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ）；クニングハメラ属の細菌（Ｃｕｎｎｉｇｈａｍｍｅｌｌａ  ｓｐｅｃｉｅｓ）；アポフィソミセス・サクセネア（Ａ．ｓａｋｓｅｎａｅａ）、アポフィソミセス・ムコール（Ａ．ｍｕｃｏｒ）およびアポフィソミセス・アブシディア（Ａ．ａｂｓｉｄｉａ）を含めたアポフィソミセス属の細菌（Ａｐｏｐｈｙｓｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）；スポロスリックス・シェンキー（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ）；パラコクシジオイデス・ブラジリエンジス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）；シュードアレシェリア・ボイジイ（Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａ  ｂｏｙｄｉｉ）；トルロプシス・グラブラタ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ）；ならびにデルマトフィルス属の細菌（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｙｒｅｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ）。
【００６８】
アレルゲンである抗原は、ハプテン、または、花粉、ほこり、かび、胞子、ふけ、昆虫および食品由来の抗原であり得る。特定の例としては、トキシコデンドロン属のウルシオールおよびセスキテルペノイドラクトンがある。
【００６９】
アジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント、フロイント不完全アジュバント、ハンタータイターマックス、ゲルブアジュバント、リビアジュバント、モンタニドＩＳＡアジュバント、アルミニウム塩アジュバントおよびニトロセルロース吸着タンパク質がある。
【００７０】
別の一般態様において、本発明者らは、ＵＥＡ１およびその模擬体のヒト腸組織切片との結合における有効性を確認した。種々の病状間の上述の関係を考えて、本発明者らは、上皮細胞に特異的に結合する局在性物質（ｌｏｃａｌｉｓａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）としてＵＥＡ１またはＵＥＡ１ミメティックを用い、画像化によりＧＩＴ細胞の状態を評価する方法および組成物である本発明の第１態様を提示する。関連病状としては、任意の上述の病状、例えば、結腸ガン、潰瘍性大腸炎およびクローン病が挙げられる。ＵＥＡ１またはＵＥＡ１ミメティック局在性物質は、多様な方法のいずれかで診断／予後診断画像化用に有効利用され得、これらの物質は、本来、慣用のものであり得る。例えば、ＵＥＡ１およびＵＥＡ１ミメティックは、その抗体または他の特異的結合物質、および抗体または他の特異的結合物質と反応させて特徴的な画像／色を生成するための１種または複数種の造影剤（例えば、染色検査キット）と共にイムノアッセイ法で用いられ得る。
【００７１】
これに代わって、ＵＥＡ１またはＵＥＡ１ミメティックは、直接標識されるか、例えばビオチニル化されるなど何らかの他の手段を介して標識され得るので、検査細胞上に結合したその存在は、アビジンまたは他の適切な画像化物質と反応させるか、使用標識のタイプを検査することにより検証することができる。他の可能性としては、ＮＭＲ画像化および放射線標識がある。
【００７２】
本発明にための組成物は、任意の必要な相補的結合物質および画像化メディアを含む診断／予後診断画像化キットの一部として、標識し得るＵＥＡ１またはＵＥＡ１ミメティックを含み得る。
【００７３】
血管障害の観察による症状の診断／予後診断における本明細書に開示されているＵＥＡ１およびそのミメティックならびに上記第１態様におけるような画像化に適合され得る組成物の使用は、本発明のさらなる態様である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７４】
本明細書に開示されている特定の結合活性部分、それらを有するリガンド化合物の同定に至る本発明者らの実験研究、それらの活性の検証、および本発明を具体化するリガンド化合物の種々の例について以下に詳細に説明する。
【００７５】
上皮細胞の表面受容体に結合し得る低分子量リガンドの探索は、ペプチド分子と非ペプチド（有機）分子を共に含む種々のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることから始めた。これらのライブラリーは、オリゴペプチド混合物群がオリゴペプチド鎖の単一所定位置に１つの所定残基を含むポジショナルスキャニングフォーマットで合成した〔ピニラら（Ｐｉｎｉｌｌａ  ｅｔ  ａｌ）、米国特許第５，５５６，７６２号、ピニラら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第１３巻、第６項、１９９２年〕。
【００７６】
合成コンビナトリアルライブラリーから得た化合物および混合物の上皮細胞結合能力を競合アッセイで測定した。これらのアッセイは、コンビナトリアルライブラリーの化合物および混合物によるビオチニル化ＵＥＡ１と上皮細胞系Ｃａｃｏ−２（結腸ガン細胞−２）膜調製物との結合阻害を測定するように設定した。この細胞系は慣用の上皮細胞モデルである。１種または複数種の化合物がＵＥＡ１の結合を阻害することができれば、それは、この化学物質自体が上皮細胞表面上のフコース残基に結合していること、したがって、潜在的リガンドであることを意味するであろう。
【００７７】
このケースでは、２種の競合阻害アッセイ、すなわち、１段階アッセイと２段階アッセイを用いた。これらのアッセイは、１段階アッセイでは、混合物／化合物およびビオチニル化ＵＥＡ１をＣａｃｏ−２細胞膜調製物と一緒にインキュベートしたのに対し、２段階アッセイでは、ビオチニル化ＵＥＡ１の不在下で混合物／化合物と細胞調製物のみを一緒にインキュベートし、次のステップでビオチニル化ＵＥＡ１を添加したという点で互いに異なっていた。２段階アッセイで追加ステップを加えたのは、ビオチニル化ＵＥＡ１とＣａｃｏ−２細胞膜との結合を阻害する化合物は、それ自体がＣａｃｏ−２細胞の表面受容体に結合し、ビオチニル化ＵＥＡ１には結合しないことによって阻害を行うことを裏付けるためであった。各アッセイを詳細に説明する。
【００７８】
Ｃａｃｏ−２細胞膜（Ｐ１００）画分および細胞質（Ｓ１００）画分の調製
１．  密集Ｃａｃｏ−２細胞単層（７５ｃｍ２フラスコ中で３７℃および５％ＣＯ２下に最大１週間まで成長させたもの）をダルベッコのＰＢＳ（ＤＰＢＳ）で２回洗浄した。
２．  細胞単層を１０ｍＭ  ＥＤＴＡ−ＤＰＢＳで５〜１０分間３７℃で処理し、１０００ｒｐｍで５分間遠心して細胞を回収した。
３．  細胞をＤＰＢＳで３回洗浄した。
４．  細胞ペレットを３容量の氷冷ＨＥＤ緩衝液〔２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６７）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  ジチオトレイトール、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）〕に再懸濁し、細胞を氷上で３分間膨潤させた。
５．  細胞を３０秒間ホモジナイズした。
６．  ホモジネートを、硬質壁管中、４０，０００ｒｐｍで、４５分間、４℃下に遠心した。
７．  上清（Ｓ１００）を除去し、ペレット（Ｐ１００）をＨＥＤＧ緩衝液〔２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６７）、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ  ジチオトレイトール、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ〕に再懸濁し、３容量の緩衝液を加え、ペレットを再懸濁し、１０００ｒｐｍで２分間遠心した。上清を除去し、氷上に貯蔵した。第１上清に第２上清を添加してこの手順を繰り返した。
８．  例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイを用いて、タンパク質濃度を測定した。
９．  すべての画分を使用するまで−８０℃下に貯蔵した。
【００７９】
１段階アッセイ：
１．  Ｃａｃｏ−２細胞の膜調製物を９６ウエルマイクロタイタープレート上で室温下に２時間半インキュベートするか、４℃下に一晩インキュベートしてプレートを膜調製物でコーティングした。各ウエルに、（０．０５Ｍの炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中）１０μｇ／ｍｌの膜調製物１００μｌを加えた。
２．  プレートをはじいて、軽くたたいて、乾燥させ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＤＰＢＳ（２００μｌ／ウエル）で室温下に１〜４時間ブロックした後、水中で３回洗浄した。
３．  ウエルに、５０μｌ／ウエル（１．５％ＢＳＡ／ＤＰＢＳ中）のコンビナトリアルライブラリー由来混合物／化合物を加えた。Ｃａｃｏ−２細胞膜調製物を未結合ＵＥＡ１と共にインキュベートしたコントロールウエルも調製した。０．０４μｇ／ｍｌから出発して１６０μｇ／ｍｌまでのこのコントロール化合物の１〜４倍希釈系列を調製した（１．５％ＢＳＡ／ＤＰＢＳ中５０μｇ／ウエル）。
４．  各ウエルに１μｇ／ｍｌ（１．５％ＢＳＡ／ＤＰＢＳ中５０μｌ）の最終濃度のビオチニル化ＵＥＡ１を加え、プレートを４℃下で一晩インキュベートした。
５．  一晩インキュベートした後、プレートを十分に（３〜６回）洗浄した。プレートをはじいて、軽くたたいて乾燥させ、市販の西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合したストレプトアビジン〔カルビオケム社（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）〕でビオチニル化ＵＥＡ１を検出した。この試薬は、各ウエルに１００μｌの試薬を加えると最終濃度になるように、１．５％ＢＳＡ−ＤＰＢＳ中で調製した１：５０００希釈度で各ウエルに加えた。プレートを室温下に１時間インキュベートした。
６．  次いで、プレートを３〜６回洗浄し、各ウエルにＨＲＰ基質ＯＰＤ（オルトフェニルジアミン）を添加して、ビオチン−ストレプトアビジン結合を検出した。各ウエルに、１．６ｍｇ／ｍｌの最終濃度のこの基質１００μｌ／ウエルを添加した。ウエルに添加する前、プレート当たり５０μｌの３％Ｈ２Ｏ２を添加して、この基質を活性化させ、暗所で反応を展開させた。
７．  約５〜１０分後または十分な発色が得られた後、各ウエルに５０μｌの４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。慣用の９６ウエルプレート読取り分光光度計を用いて各ウエルのＯＤ４９０（４９０ｎｍにおける吸光度）を測定した。
【００８０】
２段階アッセイ：
１．  １段階アッセイで説明したものと同じ方法で、９６ウエルプレートをＣａｃｏ−２細胞膜調製物でコーティングした。
２．  プレートをはじいて、軽くたたいて乾燥させ、室温下に１．５％ＢＳＡ−ＤＰＢＳ（２００μｌ／ウエル）で１〜４時間ブロックした後、水で３回洗浄した。
３．  次いで、個々のウエルに、コンビナトリアルライブラリー由来混合物／化合物を加えた（１．５％ＢＳＡ−ＤＰＢＳ中１００μｌ／ウエル）。０．０４μｇ／ｍｌから出発して１６０μｇ／ｍｌまでの１〜４倍希釈で調製した各種濃度の精製ＵＥＡ１を含有するコントロールウエルも調製した。各ウエルに、これらの最終濃度で１００μｌを添加した。
４．  次いで、プレートを一晩インキュベートしたが、このステップで、競合物（ビオチニル化ＵＥＡ１）自体の不在下で、混合物および化合物はＣａｃｏ−２細胞膜と相互作用するであろう。
５．  一晩インキュベートした後、プレートを水で３〜６回十分に洗浄した。６．  各ウエルに、１００μｇ／ウエルの１．５％ＢＳＡ−ＤＰＢＳ中１μｇ／ｍｌの最終濃度のビオチニル化ＵＥＡ１を加え、プレートを室温下に２時間インキュベートした。
７．  プレートを３〜６回洗浄した後、市販のＨＲＰ標識ストレプトアビジンを用いてビオチンを検出したが、この試薬は、各ウエルに１００μｌ加えると最終濃度になるように、１．５％ＢＳＡ−ＤＰＢＳ中で調製した１：５０００希釈で各ウエルに添加した。プレートを室温下に１時間インキュベートした。
８．  ３〜６回洗浄した後、各ウエルに、１００μｌ／ウエルのＨ２Ｏ２によって活性化されたＯＰＤ（最終濃度  １．６ｍｇ／ｍｌ）を添加し、暗所で反応を展開させた。
９．  約１０〜１５分後または十分な発色が得られた後、５０μｌの４Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。
１０．  分光光度計を用いて、各プレートの４９０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００８１】
結果：
結果は、阻害活性率またはＩＣ５０（ＵＥＡ１の５０％阻害が記録された化合物濃度）として示されている。未結合（ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）のＵＥＡ１コントロール（１：４希釈：１６０μｇ／ｍｌ〜０．０４μｇ／ｍｌ）の４９０ｎｍの吸収を用いて標準曲線を作成した。未結合ＵＥＡ１の最高濃度は１６０μｇ／ｍｌであった。このレベルのタンパク質を含有するウエルは色の変化をほとんど示さなかったが、前以てインキュベートした高レベルのＵＥＡ１はＣａｃｏ−２膜調製物上の大部分のＵＥＡ１結合部位に結合し、その結果、（後で添加した）ビオチニル化ＵＥＡ１が結合する部位は残っておらず、したがってビオチニル化ＵＥＡ１は検出されなかった。
【００８２】
０．０４μｇ／ｍｌの未結合ＵＥＡ１を含有するウエルは低濃度のＵＥＡ１としては４９０ｎｍにおいて高い吸光度を示したが、これは、ほとんどのＵＥＡ１受容体が非結合状態で残され、それによって、ビオチニル化ＵＥＡ１がＣａｃｏ−２細胞膜上のこれらの受容体に結合し、その結果、これらのウエルの４９０ｎｍにおける高吸光度が生じたことを意味していた。１６０μｇ／ｍｌでの吸光度は１００％阻害とみなし、スケールの他端（０．０１μｇ／ｍｌ）での吸光度は０％阻害とみなした。各化合物または化合物混合物の阻害率を同様な結合曲線から予測した。各化合物の系列希釈液を用いて、活性化合物のＩＣ５０値を測定した。
【００８３】
コンビナトリアルケミストリーを用いて、ライブラリーと称される多種多様な大量のペプチドおよび非ペプチド（有機）化合物を１段階および２段階アッセイでテストした。各ライブラリーは共通の足場すなわち骨格を含んでいる。各ライブラリーの化合物は、多岐にわたる分枝および線状側鎖および基を足場骨格上に異なる配列で配置して合成される。異なるライブラリーにおいて、同一元素は、別タイプの足場上に同じようにまたは違うように配置され得る〔マイヤーら（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ）に付与された米国特許第５８５９１９０号、ホーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ）に付与された米国特許第４６３１２１１号、ピニラ（Ｐｉｎｉｌｌａ）に付与された米国特許第５５５６７６２号参照〕。例として、コンビナトリアルケミストリーで用いた有機骨格のいくつかを以下に列挙する。本発明の活性化合物を同定するためにスクリーニングしたライブラリーは、以下に明示されている骨格構造には限定されなかった。
【００８４】
【化１】
2004536109.tif 000002
テストした多様なライブラリーのうち、それぞれ、チオヒダントイン、Ｎ−６−アシルアミノビサイクリックグアニジン、Ｎ−アシルアミンおよびポリフェニル尿素をベースとするライブラリーは、高阻害活性を示した。調査を縮小するために、これらの活性混合物の個々の化合物の分子量を計算し、それぞれの阻害活性をテストした。その結果、ほとんどのライブラリーの個々の精製化合物が阻害活性を示すことが明らかになった。これらの化合物には、Ｎ−アシルアミンをベースとするライブラリー由来化合物が含まれていた。そのようなアシルアミンの構造は、例えば、式Ａで表される。
【００８５】
【化２】
2004536109.tif 000003
アシルアミンは固相樹脂上で合成した。この場合、Ｒ１基およびＲ２基は、入ってくる各アミノ酸のＮ末端をＢＯＣ（Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニル）でブロックしてその反応への関与を回避することを含む慣用のｔＢＯＣケミストリーを用いて結合させたアミノ酸から得た。Ｎ末端は、アミノ酸が一旦結合したらブロック解除される。アシルアミン合成の場合、先ず、アミノ酸のアミド結合をメチル化し、次いで、アミンに還元した。成長する鎖のＮ末端をカルボン酸でアシル化してＲ３を付加した。この分子の左側に見られるアミンは、入ってくるアミノ酸のカルボキシ末端と反応する外に伸びるアミノ基を有する固相ｍＢＨＡ樹脂から得た。フッ化水素と一緒にインキュベートしている間にこのアミンが固相担体から分離すると、このアミノ基が放出されて、アシルアミンのアミノ末端が形成される。
【００８６】
このスキームを以下に示す。
【００８７】
【化３】
2004536109.tif 000004
【００８８】
表１、表２、および表３は、３種のＮ−アシルアミンベースライブラリーに属する化合物の阻害活性を示している。
【表１】
2004536109.tif 000005
【００８９】
【表２】
2004536109.tif 000006
【００９０】
【表３】
2004536109.tif 000007
これらのライブラリーの化合物は、同じＮ−アシルアミン足場を有するが、各足場上の側基の配置が異なる。例えば、ライブラリー  ＴＰＩ  １０６６（表１）は、芳香族官能基を有する化合物を含んでおり、ライブラリー  ＴＰＩ  １０１２（表２）は、Ｎ−アシルアミンベース足場上に芳香族官能基と非芳香族官能基が配置されている化合物を含んでおり、ライブラリー  ＭＳＩ  ２２（表３）の化合物は、Ｎ−アシルアミン足場は芳香族基と芳香族基に結合しているアミノ酸とを有するという意味で最初の２種のライブラリーの組合わせである。結果は、５０μｇ／ｍｌまたは２５０μｇ／ｍｌのこれらの化合物による平均阻害率として示されている。ＭＳＩ由来化合物は２倍希釈でテストしたことに留意されたい。テストしたいくつかのＴＰＩ  １０６６由来合成化合物の構造を以下に示す。
【００９１】
【化４】
2004536109.tif 000008
本発明者らは、これらのアシルアミンライブラリーから、Ｒ３位にヒドロキシ置換基またはヒドロキシを備えた置換基を有する環式基を含む化合物がビオチニル化ＵＥＡ１結合の最も有効な阻害物質であることを見出した（表２）。ライブラリー  ＴＰＩ  １０１２の場合、Ｒ１位、Ｒ２位およびＲ３位に以下の基を有する化合物が最大活性を示した。
【００９２】
【化５】
2004536109.tif 000009
これらの結果を考慮して、ガロイル基などのポリヒドロキシアリール基および一部の他の環式基の複数のコピー（複製）が化合物の阻害活性を増大させるかどうかを見極めるために、各種カルボン酸を用いてさらなるライブラリーを合成した。これらの化合物は、カルボン酸がα位とε位のアミン基に結合しているリシン足場上で合成した。それぞれカルボン酸を有する２種の異なる構造体、すなわち、式（Ｃ）で表される「２コピー」構造体と、式（Ｂ）で表される「４コピー」構造体を調製した。
【００９３】
【化６】
2004536109.tif 000010
これらの２コピー構造体および４コピー構造体の合成には各種カルボン酸を用いた。このライブラリーのリシン足場に結合している酸の構造を以下に示す。
【００９４】
【化７】
2004536109.tif 000011
参考例として、リシン足場上に４コピーの没食子酸を有する化合物を合成するための反応スキームをこれから説明する。そのような化合物の典型的な合成法は固相有機化学法を含む。この反応スキームは図１に示されている。
１．  「ティーバッグ」と称されるポリプロピレン製メッシュパケット内に、１００ｍｇ量のｍＢＨＡ（メチルベンズヒドリルアミン、８．８ｍｍｏｌ／ｇ相当）誘導体化ポリスチレン樹脂を入れた。この性質のメッシュは、既に、ホーテン  アール  エイ（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８２巻、５１３１ページ、１９８５年に開示されている。この樹脂の官能基であるメチルベンズヒドリルアミンは、この合成法の第１ステップのための結合部位である。この樹脂が入ったメッシュパケットをポリエチレン製のビンに入れた。樹脂を５ｍｌの塩化メチレンで３回洗浄し、５ｍｌの５％ジイソプロピルエチルアミン／塩化メチレン溶液で３回中和した。次いで、Ｆｍｏｃ−Ｄ−リシン（Ｂｏｃ）−ＯＨ（６当量）を、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）中のＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、６当量）およびＤＩＰＣＤＩ（ジイソプロピルカルボジイミド、６当量）の存在下で２時間結合させ（図１のステップ１）、化合物Ａ（図１）を得た。すべての試薬は、完全なアシル化を確実にするために６倍過剰で用いた。この混合物を樹脂と一緒に２時間振盪した。次いで、過剰な試薬をＤＭＦおよび塩化メチレンで洗浄除去した。
２．  ｔ−ＢＯＣ保護基を５ｍｌの５５％トリフルオロ酢酸／塩化メチレン溶液で３０分かけて除去した（図１のステップ２）。次いで、樹脂を、塩化メチレン、イソプロパノール、再び塩化メチレンで洗浄した。
３．  次いで、Ｆｍｏｃ基を５ｍｌのＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液で３０分かけて除去した（図１のステップ３）。過剰な塩基をＤＭＦで３回洗浄して除去した。
４．  上述のように結合手順を繰返し（図１のステップ４）、Ｆｍｏｃ−Ｄ−リシン（Ｂｏｃ）−ＯＨをαアミノ位とεアミノ位に結合させて、化号物Ｂ（図１）を得た。
５．  再び、ｔ−Ｂｏｃ基とＦｍｏｃ基を除去した（ステップ５およびステップ６）。
６．  次いで、メッシュパケットと樹脂を、ＤＭＦに溶かした没食子酸（３，４，５−トリヒドロキシ安息香酸、６当量）、ＨＯＢｔ（６当量）およびＤＩＰＣＤＩ（６当量）の溶液に浸漬した。
７．  反応混合物を一晩振盪した（ステップ７）。すべての結合をカイザー試験でテストして反応の完全性を検証した。
８．  没食子酸を結合させた後、没食子酸がフェノール性であるために形成されたエステルを除去する処理が必要であった。これらのエステルは、樹脂から最終的に開裂する際に加水分解されたが、合成後の精製プロセスを困難にする好ましくない副産物として残留した。ティーバッグを、１５ｍｌの１０％メタノール／９０％ジオキサンに溶かした２ｍｌのヒドラジンの溶液で処理し、一晩振盪した（ステップ８）。最後にティーバッグをジオキサンで３回洗浄した。
９．  捕捉剤としての５％アニソールを含むフッ化水素酸により化合物を樹脂から開裂させた（ステップ９）。この反応を０℃で９０分間にわたって維持し、次いで、窒素流で過剰なＨＦを除去した。９５％酢酸／５％水で抽出し、凍結乾燥させた後、所望生成物Ｃ（図１）を得た。
【００９５】
これらの化合物（ライブラリー  Ｎ７８）のビオチニル化ＵＥＡ１結合阻害活性を表４に示す。
【００９６】
【表４】
2004536109.tif 000012
表４で分るように、ポリヒドロキシフェニル構造体は、ビオチニル化ＵＥＡ１のＣａｃｏ−２細胞膜との結合阻害活性が個々のモノヒドロキシフェニル化合物より有意に高かった。その場合、これらの基が配置される足場の存在または性質がこれらの化合物の阻害活性に貢献するかどうかという問題があった。これを調べるために、先ず、１個以上のヒドロキシ基が付いた芳香族基を有する一群（ライブラリー  ＭＳＩ  ２６）の市販化合物、例えば、没食子酸と、他の関連化合物とを阻害アッセイでテストした。この実験でテストした化合物（表５）の構造を以下に示す。
【００９７】
【化８】
2004536109.tif 000013
【００９８】
【化９】
2004536109.tif 000014
【００９９】
【表５】
2004536109.tif 000015
表５で分るように、種々のポリヒドロキシフェニル含有化合物の（感知できる程度ではあるが）かなり低い阻害活性は、ＵＥＡ１受容体との結合には、分子足場がより望ましいことを示唆していた。さらに、多数のポリヒドロキシフェニル基を有する化合物の方が高い阻害活性を示した。これらの結果から、足場上に多数の活性側基を有することによって効果が最適化されることが示された。
【０１００】
そのために、以下に示されているような、各種ポリヒドロキシアリール基、例えばガロイルや他の環式基を異なる足場に結合させた。
【０１０１】
【化１０】
2004536109.tif 000016
このライブラリーでは、好ましくは最大４個または４個以上のヒドロキシル部分を含む以下に示されているような分枝および線状骨格を合成した。得られた化合物（ライブラリー  ＭＳＩ  ２７）を１段階アッセイおよび２段階アッセイでテストし、その結果を表６に示す。
【０１０２】
【化１１】
2004536109.tif 000017
【０１０３】
【化１２】
2004536109.tif 000018
これらの線状化合物および分枝化合物のビオチニル化ＵＥＡ１結合阻害活性の分析結果は、これらの化合物の活性が没食子酸基数の増加に伴って増大することを示している（活性化合物の構造は以下に示されている）。
【０１０４】
リシン足場上に側基として他のカルボン酸が結合している化合物は活性ではなかった（表６）。
【０１０５】
【表６】
2004536109.tif 000019
【０１０６】
【表７】
2004536109.tif 000020
【０１０７】
【表８】
2004536109.tif 000021
第２のＭＳＩ２７化合物ライブラリー群（ＭＳＩ  ４０と称される）を合成し、新規な群からの化合物のビオチニル化ＵＥＡ１結合阻害活性を、それらと化学的に同一のＭＳＩ２７からの対応物と比較した。表７（Ａ）および表７（Ｂ）に示されているように、両群からの化学的に同一の化合物は同様な挙動を示した。さらに、活性結合部分として没食子酸を有するこれらのライブラリー由来化合物を、リシンの線状または分枝足場上に他のカルボン酸が側基として結合している化合物と比較した。表７（Ａ）および表７（Ｂ）で分るように、側基として没食子酸を有する化合物は低いＩＣ５０値を示したが、これは、これらの化合物のＵＥＡ１受容体結合阻害活性がカルボン酸の一般的特徴というよりむしろ特定の没食子酸構造に関連することを示唆していた。
【０１０８】
【表９】
2004536109.tif 000022
【０１０９】
【表１０】
2004536109.tif 000023
【０１１０】
【化１３】
2004536109.tif 000024
【０１１１】
【化１４】
2004536109.tif 000025
これらのデータから、２個以上のポリヒドロキシアリール基を有することが良好な阻害に貢献することは明らかである。したがって、以下に例を示すそのような最大８個または勿論それ以上であってよいガロイルポリヒドロキシ側基がリシンおよび他の足場に結合している各種化合物を合成した。これらの化合物の阻害活性を表８に示す。
【０１１２】
【表１１】
2004536109.tif 000026
【０１１３】
【表１２】
2004536109.tif 000027
【０１１４】
【表１３】
2004536109.tif 000028
【０１１５】
【表１４】
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【０１１６】
【表１５】
2004536109.tif 000030
【０１１７】
【表１６】
2004536109.tif 000031
【０１１８】
【表１７】
2004536109.tif 000032
【０１１９】
【表１８】
2004536109.tif 000033
【０１２０】
【表１９】
2004536109.tif 000034
【０１２１】
【表２０】
2004536109.tif 000035
【０１２２】
【表２１】
2004536109.tif 000036
【０１２３】
【表２２】
2004536109.tif 000037
【０１２４】
【表２３】
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【０１２５】
【表２４】
2004536109.tif 000039
【０１２６】
【表２５】
2004536109.tif 000040
【０１２７】
【表２６】
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【０１２８】
【表２７】
2004536109.tif 000042
【０１２９】
医薬製剤
本発明が関連する医薬製剤の種類に関しては、一般的に言えば、身体の上皮細胞に適用される任意の種類の製剤であってよいが、より具体的に言えば、一般的には腸溶製剤、最も好ましくは経口製剤であろうということが上記説明から分るであろう。これらの医薬製剤は、典型的には、カプセル剤、錠剤、散剤などの固体、マイクロエマルションおよび他のタイプのものなどの乳濁液、ならびに懸濁液からなるか、それらを含む。好ましい実施形態としては、例えば、溶媒蒸発法により、医薬活性成分を生分解性ポリマー本体またはコーティング中にカプセル封入した制御放出経口製剤がある。この種のコーティングは当業では公知であり、例えば、ポリラクチドポリマーコーティングが、本発明者らの国際出願第ＷＯ−Ａ−００／１２１２４号や他の文献に記載されている。使用され得る生分解性ポリマーのタイプに特に制限はない。
カプセル封入された医薬活性物質は、小粒子、特に、ミクロ粒子まはたナノ粒子形態であるのが好ましい。例えば、カプセル封入医薬活性物質は、粒子の少なくとも５０％が５μｍより小さいか、より好ましくは粒子の少なくとも５０％が６００ｎｍより小さい粒状製剤であってよい。生分解性ポリマー中にカプセル封入された薬物活性物質を含むこのタイプのミクロ粒子組成物およびナノ粒子組成物は、それら自体、当業者には公知である。例えば、国際出願第ＷＯ−Ａ−００／１２１２４号および同第ＷＯ−Ａ−９６／３１２０２号を参照されたい。
【０１３０】
本発明のリガンド化合物は、当該化合物に適した物理・化学的技術を用いる任意の適切な方法で、薬物製剤に結合させるか、薬物製剤上にコーティングされるか、薬物製剤とブレンドされ得る。これらは、典型的には、受動的吸着、１段階合成時の直接結合（例えば、標準カラム上または溶液中でのリガンド−ペプチド薬剤合成）、（例えば、カルボジイミドなどの標準法を用いたリガンドのアミノ基とカルボン酸修飾薬剤またはデリバリーシステムとの）共有結合、および（例えば、ビオチニル化リガンドとストプレおよびアビジン修飾薬物またはデリバリーシステムを用いた）ビオチン−ストレプトアビジン相互作用からなるが、それらには限定されない。
これも公知の方法であるが、粒状製剤には、粒子が無傷で腸内に通過できるように胃液から粒状製剤を保護する「腸溶コーティング」を施し得る。
【０１３１】
レクチンミメティックの結合親和性を特性決定するための全細胞結合アッセイの開発
ＵＥＡ１の種々のレクチンミメティックの結合親和性を特性決定するための全細胞結合アッセイを開発した。このアッセイは、溶液中の全細胞を用いて活性を高める官能基を同定する目的でこれらのＵＥＡ１ミメティックの構造活性解析を可能にするために開発された。
【０１３２】
方法：
ストレプトアビジンＥＩＴＣプローブを用いたビオチニル化ＵＥＡ１とＵＥＡ１のビオチニル化レクチンミメティックの結合に関して、Ｃａｃｏ−２細胞をフローサイトメトリーで解析した。１．０μｇ／ｍｌ程度の低濃度ではビオチニル化ＵＥＡ１の明らかな結合（陽性）が見られたのに対し、ＵＥＡ１のレクチンミメティックの結合は、最大６５μＭまでの濃度でも陰性であった。信号を増幅するために、ＦＩＴＣ−アビジンＤサンドイッチプロトコルを用いた。この方法では、ビオチニル化化合物を細胞に結合させた後、一連のＦＩＴＣ−アビジンＤ／抗アビジンＤ／ＦＩＴＣ−アビジンＤ染色を実施すると、蛍光信号が数倍に増大した。
【０１３３】
結果：
上述のサンドイッチプロトコルによって、０．０２μｇ／ｍｌというビオチニル化ＵＥＡ１サンプル測定能力からも明らかなように、蛍光信号が増大した。ストレプトアビジン−ＦＩＴＣプローブを用いた場合、以前は、下限が１．０μｇ／ｍｌであった。死細胞はＦＩＴＣ−アビジンＤに非特異的に結合することが知られているので、死細胞用蛍光染料である核酸染色用７−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を用いて死細胞を解析から除去した。ＵＥＡ１のビオチニル化レクチンミメティックの結合は５０μｍ濃度および１０μｍ濃度で証明された。
【０１３４】
テストしたＣａｃｏ−２細胞集団のおおよそ１５％は、ＦＬ１（ＦＩＴＣ）陽性であり、バックグラウンド蛍光を除去した後では両濃度でＦＬ３（７−ＡＡＤ）陰性であった。ストレプトアビジンＦＩＴＣ染色ではこれらの濃度の化合物を検出できなかった。
【０１３５】
結論：
全細胞結合アッセイは、ＵＥＡ１の小分子レクチンミメティックの結合親和性を特性決定するために開発された。これによって、溶液中の全細胞を用いて活性を高める官能基を同定するためのこれらのミメティックの構造活性解析が可能になるであろう。このアッセイは、今後のイン・ビボ研究用のＵＥＡ１小細胞模擬体の選択に役立つと考えられ、本発明において独立した新規の態様である。
【０１３６】
没食子酸ＵＥＡ１ミメティック化合物のイン・ビボ・モデル粒子系デリバリー仲介能力の評価：
マウスモデルで、没食子酸側鎖を有する化合物のＵＥＡ１模擬能力をイン・ビボで評価した。ここでは、これらの化合物でコートした粒子のＭ細胞による結合および取り込みを評価した。
【０１３７】
方法：
通常の方法を用い、室温下で、ビオチニル化リガンドＭＳＩ  ３５−２（４コピーの没食子酸；リシン足場）（図５参照）、ＵＥＡ１コントロール〔ベクターラボラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）〕およびビオシチンコントロール〔モレキュラープローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）〕を蛍光Ｅｓｔａｐｏｒストレプトアビジンポリスチレン粒子（ＦＩＴＣ標識；直径０．２８９μｍ）に吸着させた。
【０１３８】
１つ以上のパイエル板を含むマウス腸ループにポリスチレン粒子懸濁液（典型的には、１ｍｌ当たり５．０×１０１０粒子を含む５００μｌ）を接種し、３０分間インキュベートした。パイエル板を摘出してメタノール中で固定し、その後の共焦点顕微鏡検査による解析用にＭ細胞をＵＥＡ１−ローダミンで対比染色した。アルゴン／クリプトン混合ガスレーザーを備えたＲｉｏＲａｄ  ＭＲＣ  ６００走査型共焦点レーザー顕微鏡で染色組織を調べた。観察した総面積当たりの粒子数を測定し、定量記録した。典型的な手順および全プロトコルの詳細については、フォスター  エヌ（Ｆｏｓｔｅｒ，Ｎ．）、クラーク  エム  エイ（Ｃｌａｒｋ，Ｍ．Ａ．）、ジェプソン  エム  エイ（Ｊｅｐｓｏｎ，Ｍ．Ａ．）およびハースト  ビー  エイチ（Ｈｉｒｓｔ，Ｂ．Ｈ．）、Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  １  ｌｅｃｔｉｎ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ  ｔｏ  ｍｏｕｓｅ  Ｐｅｙｅｒ’ｓ  ｐａｔｃｈ  Ｍ−ｃｅｌｌｓ  イン・ビボ．Ｖａｃｃｉｎｅ、第１６巻（５）、５３６〜５４１ページ、１９９８年を参照されたい。
【０１３９】
結果：
ＭＳＩ  ３５−２ＵＥＡ１およびコントロールでコートした粒子の結合および取り込みに関する散布図（対数目盛）は図２〜図４に示されている。
【０１４０】
図２：ＭＳＩ  ３５−２没食子酸ミメティックでコートした粒子の表面結合および取り込み。
図３：ＵＥＡ１でコートした粒子の表面結合および取り込み。
【０１４１】
図４：ビオシチンミメティックでコートした粒子の表面結合および取り込み。
散布図上の各点は１画像を表す。
結論：
ビオチニル化リガンド  ＭＳＩ  ３５−２（４コピーの没食子酸；リシン足場）でコートした蛍光ストレプトアビジンポリスレチン粒子は、マウス腸ループモデルにおいて、イン・ビボでＵＥＡ１コートコントロール粒子に匹敵するかそれを超えるＭ細胞への結合および取り込みを示した。Ｍ細胞への結合および取り込みはビオシチンコートコントロール粒子を用いて観察したものより有意に高かった。
【０１４２】
モデル粒子系を用いて、標的化経口ドラッグデリバリーアプリケーションにおけるこれらのレクチンミメティック利用の可能性が実証された。マウス腸ループモデルにおけるこのミメティックのＭ細胞特異性は、抗原提示細胞へのワクチンデリバリーとの関連で特に重要である。
【０１４３】
ヒト組織切片のＵＥＡ１染色：
病状の診断／予後診断指標としてのＵＥＡ１の利用をヒト組織で検証した。
方法：
１．  免疫組織化学手順：
０．２５μｇ／ｍｌのＵＥＡ１、１：１０，０００希釈のヤギ抗ＵＥＡ１およびＶｅｃｔｏｒ  ＡＢＣ−ＡＰ  Ｋｉｔ（ＡＫ５００２）を用いたヒト組織切片のＶｅｃｔｏｒ  Ｒｅｄ  基質キット（ＳＫ−５１００）顕微鏡解析により、リガンド結合部位に明るい紫紅色の沈積物がはっきり示された。ヤギ抗ＵＥＡ１抗体の適用および検出用染色の前に一次リガンドの不在下に実施したネガティブコントロールでは、極くわずかなバックグラウンドが示された。ポジティブコントロール抗体（すなわち、ＣＤ３１；組織抗原が保存され、免疫組織化学解析用にアクセス可能であったことを裏付けるためのもの）で染色された組織により、組織の完全性が確認された。
【０１４４】
【表２８】
2004536109.tif 000043
結果：
図６、図７は、染色細胞サンプルの画像を示している。正常な組織では、回腸の粘膜上皮細胞も結腸の粘膜上皮細胞も、ＵＥＡ１による、吸収杯細胞、Ｍ細胞、および陰窩小腸上皮細胞の中程度の陽性細胞質標識を示した。この染色反応は、回腸より結腸の方がわずかに顕著であり、細胞質空胞内の、特に粘膜細胞の微繊毛内腔表層に沿った部分で最も強く現われた。染色物質は繊毛間および表層粘膜細胞の内側を覆う粘液中に分泌された。細胞膜および／またはグリコカリックスは染色されたが、細胞間接合部はリガンド結合部位の染色でははっきり示されなかった。両サンプル中の杯細胞では、微細な埃様から点状の細胞質小胞の染色が示され、ほぼすべての杯細胞で、大きな細胞質粘液胞内の球状タンパク塊が強度に染色されていた。粘液を含む杯細胞の一部が染まらなかったので、この染色は、リガンドが、粘液全般ではなく、先端面の粘液または先端−粘液インターフェースの特定の成分に結合することを示唆していた。いくつかのマクロファージは貪食残骸のように見えるものに関して陽性であった。
【０１４５】
正常および病的回腸および結腸ならびに結腸ガンの支質全体では、内皮細胞すべてに中程度から強度の染色があり、神経軸索を取り囲むシュワン細胞に低度から中程度の染色があった。マイスネル神経叢や筋層間神経叢およびそれらの軸索は一様に陽性であった。
【０１４６】
結腸ガンサンプルにおける染色強度は正常結腸のものと同様であった。しかし、そのパターンはいくぶん異なっていた。結腸ガン切片では、細胞質染色のフォーカスは、正常結腸のものより小さめで、より均一なサイズおよび細胞質分布を有する傾向があった。正常組織では、杯細胞で反応性が示されたのに対し、ガン組織杯細胞ではあまり認められず、強度には染まらなかった。結腸ガン切片において、染色反応性は正常サンプルのものと同様であったが、評価した腫瘍性組織と同じサンプル中で隣接する正常結腸組織のものより著しく高かった。
【０１４７】
リガンドを用いた炎症性腸疾患の免疫組織学的評価は、それぞれクローン病と潰瘍性大腸炎の２症例の染色からなるものであった。ＵＥＡ１受容体の発現は、クローン病ではすべての小腸粘膜上皮細胞型で有意に増大するようであり、潰瘍性大腸炎ではすべての結腸粘膜上皮細胞で有意に減少するようであった。
【０１４８】
結論：
この正常細胞と罹患細胞との間に見られるＵＥＡ１染色強度および／または染色パターン化の違いは、本発明の技術における診断または予後診断の基礎となっている。
【０１４９】
ＵＥＡ１および没食子酸ＵＥＡ１ミメティック化合物によるヒト組織切片のさらなる染色：
没食子酸ＵＥＡ１ミメティックもヒト組織の病状の診断／予後診断指標として用いるのに適当であるかどうかを判断するための第１ステップとして、ＵＥＡ１とこのミメティックとによる正常ヒト組織の染色を比較した。
【０１５０】
方法：
ＵＥＡ１とビオチニル化リガンド  ＭＳＩ  ３５−２（４コピーの没食子酸；リシン足場）（図５参照）を上述のものと類似の染色プロトコルに用いた。一次リガンドの不在下で実施したネガティブコントロールでは、わずかなバックグラウンドが見られた。
【０１５１】
結果：
表９は、ＵＥＡ１とＵＥＡ１ミメティックに関する正常ヒト組織染色プロファイルの要約である。
【０１５２】
【表２９】
2004536109.tif 000044
結論：
ＵＥＡ１ミメティックを用いて大腸切片上で観察した染色プロファイルは、（上述のような）ＵＥＡ１を用いて得られたものと同等であった。これは、ヒトＣａｃｏ−２細胞膜画分、すなわち、結腸上皮細胞に特異的な特徴を示す細胞を用いて実施したＵＥＡ１ミメティックの選択手順と関連している。予想通り、ＵＥＡ１ミメティックは小腸切片の染色も示した。興味深いことには、ＵＥＡ１ミメティックを用いると、胃腸または他の臓器の組織は染色されなかった。これは、すべての組織型を染色したＵＥＡ１とは好対照であり、臨床用にＵＥＡ１よりミメティックを選択する際の好材料であり得る。
【０１５３】
没食子酸ＵＥＡ１ミメティックの内皮細胞への結合および取り込みの評価：
没食子酸ＵＥＡ１ミメティックを、（ａ）（血管新生のモニターによる）病状の診断／予後診断および（ｂ）医薬製剤の治療的デリバリーにおけるその適用を評価するために、内皮細胞透過性アッセイで既知細胞透過性ペプチドと比較した。
【０１５４】
方法：
１．  ２４ウエルプレート上で、円形カバースリップ上にＥＣＶ−３０４細胞をカバースリップ当たり２×１０５細胞の濃度で接種し、密集増殖させた。
２．  血清含有培地を無血清培地（ペニシリンストレプトマイシン添加ＯｐｔｉＭＥＭ）に置き換えた。
３．  培地５００μｌ中１０μＭの最終濃度になるように、細胞を取り囲む培地にリガンドの水性ストック溶液を直接加えた。
４．  １つのサンプルプレートを３７℃下、５％ＣＯ２で強化された空気中で、また他方のプレートは４℃下、空気中で、それぞれ１時間インキュベートした。
５．  次いで、カバースリップをＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した。
６．  細胞を固定し、−２０℃で１０分間５００μｌのメタノール中で細胞膜透過させた。
７．  さらに、ＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した。
８．  細胞を５００μｌのＰＢＳ中５％牛乳溶液〔マーベル社（Ｍａｒｖｅｌ）〕中で１時間室温でインキュベートして非特異的結合部位をブロックした。
９．  ペプチドを、５００μｌの１５ｎＭ  ストレプトアビジン−ＦＩＴＣで１時間室温で染色した。
１０．  細胞をＰＢＳで５分間ずつ３回洗浄した。
１１．  次いで、ウエルからカバースリップを取り出し、水にさっと漬けた後、Ｄａｐｉ蛍光染色するためにガラススライド上にＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤をマウントした。
【０１５５】
結果：
ＵＥＡ１ミメティックと既知細胞透過性ペプチドおよび関連コントロールとの比較に関しては図８を参照されたい。ＵＥＡ１ミメティックは、核の強度の染色と、細胞質全体の広範な染色を示した。
【０１５６】
結論：
内皮細胞によるＵＥＡ１ミメティックの取り込みは、このミメティックが内皮細胞／血管のマーカーとして、したがって、病状の診断または予後診断マーカーとして用いるのに適していることを示している。
【０１５７】
さらに、この取り込みプロファイルは、ドキソルビシンなどの治療薬の細胞へのデリバリーを仲介することが知られているＳｙｎＢ１ペプチドのものと関連していた。さらに、（ＳｙｎＢｉの場合と同様に）脂質膜との直接相互作用が関与するメカニズムを介した医薬製剤デリバリーにおけるＵＥＡ１ミメティックのさらなる用途も研究されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】４コピーの没食子酸を有する化合物の合成を示す図。
【図２】ＭＳＩ  ３５−２没食子酸ミメティックでコートした粒子の表面結合および取り込みを示す図。
【図３】ＵＥＡ１でコートした粒子の表面結合および取り込みを示す図。
【図４】ビオシチンミメティックでコートした粒子の表面結合および取り込みを示す図。
【図５】ＭＳＩ  ３５：ビオチニル化２コピーおよび４コピー構造を示す図。
【図６】染色されたヒト組織サンプルを示す図。
【図７】染色されたヒト組織サンプルを示す図。
【図８】内皮細胞透過性アッセイを示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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