(57)【要約】本発明は、細胞に核酸を送達するための新規のそして意外にも有効な方法を提供する。これらの方法は、エンドソーム膜不安定剤（例えばカルシウム）の存在が、ＳＰＬＰまたは「安定化プラスミド−脂質粒子」として処方されるプラスミドのトランスフェクション効率の劇的増大をもたらす、という発見に基づいている。
2004508012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中に核酸を導入するための核酸−脂質粒子組成物であって、前記粒子が陽イオン性脂質、粒子の凝集を抑制する複合脂質、核酸およびエンドソーム膜不安定剤を含む組成物。
【請求項２】
前記エンドソーム膜不安定剤が前記核酸−脂質粒子の外側に存在する請求項１記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項３】
前記エンドソーム膜不安定剤が前記核酸−脂質粒子の外側および内側の両方に存在する請求項１記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項４】
前記エンドソーム膜不安定剤がＣａ＋＋イオンである請求項１記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項５】
Ｃａ＋＋イオンの濃度が約０．１ ｍＭ〜１００ ｍＭである請求項４記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項６】
Ｃａ＋＋イオンの濃度が約１ ｍＭ〜２０ ｍＭである請求項５記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項７】
前記粒子が約１５０ ｎｍ未満の中央値直径を有する請求項１記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項８】
前記陽イオン性脂質がＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびＮ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）ならびにそれらの組合せからなる群から選択される一成員である請求項１記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項９】
前記粒子が付加的非陽イオン性脂質をさらに含む請求項１記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項１０】
前記非陽イオン性脂質がＤＯＰＥ、ＰＯＰＣおよびＥＰＣからなる群から選択される請求項９記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項１１】
前記粒子がＣａ＋＋イオンキレート化を促進する官能基を含む請求項１記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項１２】
粒子の凝集を抑制する前記複合脂質が、次式：
Ａ−Ｗ−Ｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉ
（式中、Ａは脂質部分であり、
Ｗは親水性ポリマーであり、そして
Ｙはポリ陽イオン性部分である）
を有する請求項１記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項１３】
ＷがＰＥＧ、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーおよびそれらの組合せからなる群から選択されるポリマーであり、前記ポリマーが約２５０〜約７０００ダルトンの分子量を有する請求項１２記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項１４】
Ｙが選定ｐＨで少なくとも４の正電荷を有する請求項１２記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項１５】
Ｙがリシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、それらの誘導体およびそれらの組合せからなる群から選択される一成員である請求項１２記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項１６】
Ａがジアシルグリセロリル部分、ジアルキルグリセロリル部分、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ部分、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン部分および１，２−ジアルキル−３−アミノプロパン部分からなる群から選択される一成員である請求項１２記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項１７】
ＷがＰＥＧである請求項１２記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項１８】
Ｗがポリアミドポリマーである請求項１２記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項１９】
Ｗが約２５０〜約２０００ダルトンの分子量を有する請求項１２記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項２０】
式ＩＩ：
【化１】
2004508012.tif 000008
（式中、Ｘは単一結合、または少なくとも１つのエチレンオキシド単位に前記脂質を共有結合する官能基からなる群から選択される一成員であり、
Ｚは単一結合、または陽イオン性基に前記少なくとも１つのエチレンオキシド単位を共有結合する官能基からなる群から選択される一成員であり、そして
ｎは約６〜約５０の値を有する整数である）
の一般構造を有する請求項１７記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項２１】
Ｘが単一結合、ホスファチジルエタノールアミノ、ホスファチジルエタノールアミド、ホスホロ、ホスホ、ホスホエタノールアミノ、ホスホエタノールアミド、カルボニル、カルバメート、カルボキシル、カルボネート、アミド、チオアミド、酸素、硫黄およびＮＲ（ここで、Ｒは水素またはアルキル基である）からなる群から選択される一成員である請求項２０記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項２２】
Ｚが単一結合、ホスファチジルエタノールアミノ、ホスファチジルエタノールアミド、ホスホロ、ホスホ、ホスホエタノールアミノ、ホスホエタノールアミド、カルボニル、カルバメート、カルボキシル、カルボネート、アミド、チオアミド、酸素、硫黄およびＮＲ（ここで、Ｒは水素またはアルキル基である）からなる群から選択される一成員である請求項２０記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項２３】
Ａがジアシルグリセロリル部分であり、
Ｘがホスホエタノールアミドであり、
ＺがＮＲ（ここでＲは水素原子である）であり、そして
Ｙが約１〜約１０個の塩基性アミノ酸またはそれらの誘導体からなる群から選択される一成員である
請求項２０記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項２４】
Ａが２つの脂肪アシル鎖を有するジアシルグリセロリル部分であり、各アシル鎖が別々に２〜３０炭素長であり、そして飽和されているかまたは種々の程度の飽和を有する請求項２３記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項２５】
Ｙがリシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、それらの誘導体およびそれらの組合せからなる群から選択される一成員である請求項２３記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項２６】
Ａが２つの脂肪アシル鎖を有するジアシルグリセロリル部分であり、各アシル鎖が飽和Ｃ−１８炭素鎖であり、そして
Ｙが４つのリシン残基またはそれらの誘導体を有する陽イオン性基である
請求項２３記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項２７】
粒子の凝集を抑制する前記複合脂質がＰＥＧ−脂質である請求項１記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項２８】
前記ＰＥＧ−脂質がＰＥＧ−セラミドである請求項２７記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項２９】
前記ＰＥＧ−セラミドのセラミドが約８〜約２０個の炭素原子を有する脂肪酸基を含む請求項２８記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項３０】
前記ＰＥＧ−脂質がＰＥＧ−ホスファチジルエタノールアミンである請求項２８記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項３１】
粒子の凝集を抑制する前記複合脂質がＡＴＴＡ−脂質である請求項１記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項３２】
前記核酸がプラスミド、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムからなる群から選択される請求項１記載の核酸−脂質粒子組成物。
【請求項３３】
細胞中への核酸の導入方法であって、以下の：
前記細胞を核酸−脂質粒子組成物と接触させ、前記粒子が陽イオン性脂質、粒子の凝集を抑制する複合脂質、および核酸ならびにエンドソーム膜不安定剤を含むことを包含する方法。
【請求項３４】
前記エンドソーム膜不安定剤が前記核酸−脂質粒子の外側に存在する請求項３３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項３５】
前記エンドソーム膜不安定剤がＣａ＋＋イオンである請求項３３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項３６】
Ｃａ＋＋イオンの濃度が約０．１ ｍＭ〜１００ ｍＭである請求項３５記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項３７】
Ｃａ＋＋イオンの濃度が約１ ｍＭ〜２０ ｍＭである請求項３６記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項３８】
前記粒子が約１５０ ｎｍ未満の中央値直径を有する請求項３３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項３９】
前記陽イオン性脂質がＮ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）およびＮ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）ならびにそれらの組合せからなる群から選択される一成員である請求項３３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項４０】
前記粒子が付加的非陽イオン性脂質をさらに含む請求項３３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項４１】
前記非陽イオン性脂質がＤＯＰＥ、ＰＯＰＣおよびＥＰＣからなる群から選択される請求項４０記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項４２】
前記粒子がＣａ＋＋イオンキレート化を促進する官能基を含む請求項３３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項４３】
粒子の凝集を抑制する前記複合脂質が、次式：
Ａ−Ｗ−Ｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉ
（式中、Ａは脂質部分であり、
Ｗは親水性ポリマーであり、そして
Ｙはポリ陽イオン性部分である）
を有する請求項３３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項４４】
ＷがＰＥＧ、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーおよびそれらの組合せからなる群から選択されるポリマーであり、前記ポリマーが約２５０〜約７０００ダルトンの分子量を有する請求項４３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項４５】
Ｙが選定ｐＨで少なくとも４の正電荷を有する請求項４３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項４６】
Ｙがリシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、それらの誘導体およびそれらの組合せからなる群から選択される一成員である請求項４３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項４７】
Ａがジアシルグリセロリル部分、ジアルキルグリセロリル部分、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ部分、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン部分および１，２−ジアルキル−３−アミノプロパン部分からなる群から選択される一成員である請求項４３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項４８】
ＷがＰＥＧである請求項４３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項４９】
Ｗがポリアミドポリマーである請求項４３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項５０】
Ｗが約２５０〜約２０００ダルトンの分子量を有する請求項４３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項５１】
式ＩＩ：
【化２】
2004508012.tif 000009
（式中、Ｘは単一結合、または少なくとも１つのエチレンオキシド単位に前記脂質を共有結合する官能基からなる群から選択される一成員であり、
Ｚは単一結合、または陽イオン性基に前記少なくとも１つのエチレンオキシド単位を共有結合する官能基からなる群から選択される一成員であり、そして
ｎは約６〜約５０の値を有する整数である）
の一般構造を有する請求項４８記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項５２】
Ｘが単一結合、ホスファチジルエタノールアミノ、ホスファチジルエタノールアミド、ホスホロ、ホスホ、ホスホエタノールアミノ、ホスホエタノールアミド、カルボニル、カルバメート、カルボキシル、カルボネート、アミド、チオアミド、酸素、硫黄およびＮＲ（ここで、Ｒは水素またはアルキル基である）からなる群から選択される一成員である請求項５１記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項５３】
Ｚが単一結合、ホスファチジルエタノールアミノ、ホスファチジルエタノールアミド、ホスホロ、ホスホ、ホスホエタノールアミノ、ホスホエタノールアミド、カルボニル、カルバメート、カルボキシル、カルボネート、アミド、チオアミド、酸素、硫黄およびＮＲ（ここで、Ｒは水素またはアルキル基である）からなる群から選択される一成員である請求項５１記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項５４】
Ａがジアシルグリセロリル部分であり、
Ｘがホスホエタノールアミドであり、
ＺがＮＲ（ここでＲは水素原子である）であり、そして
Ｙが約１〜約１０個の塩基性アミノ酸またはそれらの誘導体からなる群から選択される一成員である
請求項５１記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項５５】
Ａが２つの脂肪アシル鎖を有するジアシルグリセロリル部分であり、各アシル鎖が別々に２〜３０炭素長であり、そして飽和されているかまたは種々の程度の飽和を有する請求項５４記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項５６】
Ｙがリシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、それらの誘導体およびそれらの組合せからなる群から選択される一成員である請求項５４記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項５７】
Ａが２つの脂肪アシル鎖を有するジアシルグリセロリル部分であり、各アシル鎖が飽和Ｃ−１８炭素鎖であり、そして
Ｙが４つのリシン残基またはそれらの誘導体を有する陽イオン性基である
請求項５４記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項５８】
粒子の凝集を抑制する前記複合脂質がＰＥＧ−脂質である請求項３３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項５９】
前記ＰＥＧ−脂質がＰＥＧ−セラミドである請求項５８記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項６０】
前記ＰＥＧ−セラミドのセラミドが約８〜約２０個の炭素原子を有する脂肪酸基を含む請求項５９記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項６１】
前記ＰＥＧ−脂質がＰＥＧ−ホスファチジルエタノールアミンである請求項５９記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項６２】
粒子の凝集を抑制する前記複合脂質がＡＴＴＡ−脂質である請求項３３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項６３】
前記核酸がプラスミド、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムからなる群から選択される請求項３３記載の細胞中への核酸の導入方法。
【請求項６４】
脂質二重層中のＨＩＩ相構造の誘導方法であって、前記脂質二重層をエンドソーム膜不安定剤と接触させ、それにより脂質二重層中にＨＩＩ相構造を誘導することを包含する方法。
【請求項６５】
前記脂質二重層がＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＰＳ：Ｃｈｏｌを含む請求項６４記載のＨＩＩ相構造の誘導方法。
【請求項６６】
前記エンドソーム膜不安定剤がＣａ＋＋イオンである請求項６４記載のＨＩＩ相構造の誘導方法。
【請求項６７】
Ｃａ＋＋イオンが低レベルの陽イオン性脂質と協力して作用して、ＨＩＩ相形成を誘発する請求項６６記載のＨＩＩ相構造の誘導方法。
【請求項６８】
細胞中に核酸を導入するための核酸−脂質粒子組成物の使用であって、前記粒子が陽イオン性脂質、粒子の凝集を抑制する複合脂質、核酸およびエンドソーム膜不安定剤を含む使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
臨床的に有用である遺伝子療法には、有効且つ安全な遺伝子送達系が必要とされる。ウイルスベクターは、相対的に効率的な遺伝子送達系であるが、しかし野生型への逆戻りの可能性ならびに免疫応答問題といった種々の制限を蒙る。その結果、非ウイルス性遺伝子送達系が注目増大を受け入れつつある（Ｗｏｒｇａｌｌ， ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８： ３７−４４（１９９７）； Ｐｅｅｔｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７： １６９３−１６９９ （１９９６）； Ｙｅｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １： １９２−２００（１９９４）； Ｈｏｐｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ １５： １−１４（１９９８））。プラスミドＤＮＡ−陽イオン性リポソーム複合体は一般に、最も一般的に用いられる非ウイルス性遺伝子送達ビヒクルである（Ｆｅｌｇｎｅｒ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ ２７６： １０２−１０６（１９９７）； Ｃｈｏｎｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：６９８−７０８（１９９５））。しかしながら複合体は、全身適用に適さない十分に特定されていない大型の系であり、かなりの有毒副作用を引き出す（Ｈａｒｒｉｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９： ８１６−８２３（１９９５）； Ｈｕａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５： ６２０−６２１（１９９７）； Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １５： ６４７−６５２（１９９７）； Ｈｏｆｌａｎｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４：７４２−７４９（１９９７））。
【０００２】
近年の研究は、プラスミドＤＮＡが、二重層脂質小胞内に封入された単一プラスミドからなる小（直径約７０ ｎｍ）「安定化プラスミド−脂質粒子」（ＳＰＬＰ）中に封入され得る（Ｗｈｅｅｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：２７１−２８１（１９９９））。これらのＳＰＬＰは、典型的には、「フソゲニック」脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、低レベルの陽イオン性脂質を含有し、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）コーティングの存在により水性媒質中で安定化される。ＳＰＬＰは、それらが静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に循環寿命延長を示し、遠位腫瘍部位での血管透過性強化のためにこのような領域で選択的に集積し、そしてこれらの腫瘍部位で導入遺伝子発現を媒介し得るので、全身性用途を有する。ルシフェラーゼマーカー遺伝子を含有するＳＰＬＰのｉ．ｖ．注射後に腫瘍で観察される導入遺伝子発現のレベルは、プラスミドＤＮＡ−陽イオン性リポソーム複合体（リポプレックス）または裸ＤＮＡを用いて達成され得るレベルより優っている。いくつかの用途における最適治療利益のためには、依然として発現レベルの改良が必要とされ得る（例えばＭｏｎｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇ． ７：４３９−４５２（２０００）参照）。
【０００３】
陽イオン性ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質またはＣＰＬは、正電荷を付与するために脂質二重層中への挿入のために設計された（Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． １１：４３３−４３７（２０００）参照）。例えば１つまたはそれ以上の遠位正電荷を含有するＰＥＧに結合されたジステアロイル−ＰＥ（ＤＳＰ）含有ＣＰＬが合成され、そしてｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞結合およびリポソームの取込み強化を促進することが示された（Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． １１：４３３−７（２０００））。
【０００４】
したがって、細胞中に核酸を導入するための新規の且つより効率的な方法に対する当業界における強い必要性が依然として存在する。本発明は、このおよびその他の必要性を取り扱う。
【０００５】
発明の要約
本発明は、細胞に核酸を送達するための有効な組成物、方法および使用を提供する。本発明の組成物および方法は、脂質処方物中のエンドソーム膜不安定剤の存在がトランスフェクション効率の劇的増大をもたらすという意外な発見に基づいている。本発明の組成物および方法はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで用いられ得るし、哺乳類細胞（例えばヒト）を含めた任意の細胞型のトランスフェクション効率を増大するために用いられ得る。
【０００６】
このようなものとして、一実施態様において、本発明は、陽イオン性脂質、粒子の凝集を抑制する複合脂質、核酸およびエンドソーム膜不安定剤を含む細胞中に核酸を導入するための核酸−脂質粒子組成物を提供する。好ましい局面では、核酸−脂質粒子は、「安定化プラスミド−脂質粒子」（ＳＰＬＰ）である。典型的にはＳＰＬＰは直径１５０ ｎｍ未満であり、二重層脂質小胞内に封入された単一プラスミドを含む。凝集を抑制する複合脂質は、典型的には親水性ポリマーを含む。好ましい実施態様では、親水性ポリマーは、約２５０〜約７０００ダルトンの分子量を有するＰＥＧまたはポリアミド（例えばＡＴＴＡ）である。エンドソーム膜不安定剤は、粒子の内側、粒子の外側、または粒子の内側と外側の両方に存在し得る。好ましくは、エンドソーム膜不安定剤はＣａ＋＋イオンである。ある種の局面では、Ｃａ＋＋イオンの濃度は約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭである。
【０００７】
ある種の実施態様では、凝集を抑制する複合脂質は、「陽イオン性ポリマー脂質」（ＣＰＬ）である。好ましい局面では、ＣＰＬは次式：
Ａ−Ｗ−Ｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉ
を有し、式Ｉ中、Ａは脂質部分であり、Ｗは親水性ポリマーであり、そしてＹはポリ陽イオン性部分である。ある種の好ましい実施態様では、Ｙはリシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミンおよびそれらの組合せから選択される。
【０００８】
別の実施態様では、本発明は、細胞中への核酸の導入方法であって、細胞を核酸−脂質粒子組成物と接触させることを包含する方法であり、粒子が陽イオン性脂質、粒子の凝集を抑制する複合脂質、核酸およびエンドソーム膜不安定剤を含む方法を提供する。エンドソーム膜不安定剤は、粒子の内側、粒子の外側、または粒子の内側と外側の両方に存在し得る。ある種の実施態様では、エンドソーム膜不安定剤は、粒子の前に、粒子の後に、同時にまたはそれらの組合せで細胞を接触させる。
【０００９】
さらに別の実施態様では、本発明は、脂質二重層中のＨＩＩ相構造の誘導方法であって、脂質二重層をエンドソーム膜不安定剤と接触させ、それにより脂質二重層中にＨＩＩ相構造を誘導することを包含する方法を提供する。ある種の局面では、エンドソーム膜不安定剤（例えばＣａ＋＋イオン）は、低レベルの陽イオン性脂質と相乗的にまたは付加的に作用して、ＨＩＩ相形成を誘導し得る。
【００１０】
本発明の組成物、方法および使用は、多数の利益を提供する。例えばエンドソーム膜不安定剤の存在は、核酸のトランスフェクション効率の劇的増大をもたらす。トランスフェクション効率を増大することにより、細胞内の遺伝子産物の量は、大いに増大される。さらに本発明の組成物および方法はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで用いられ得るし、ヒトを含めた任意の細胞型のトランスフェクション効率を増大するために用いられ得る。
【００１１】
本発明のこれらのおよびその他の利点、目的および実施態様を、以下の図面および詳細な説明と一緒になってさらに詳細に説明する。
【００１２】
本発明の詳細な説明および好ましい実施態様
Ｉ．序論
本発明は、細胞に核酸を送達するための新規の且つ以外にも有効な組成物および方法を提供する。これらの組成物および方法は、エンドソーム膜不安定剤（例えばカルシウム）の存在が、ＳＰＬＰまたは「安定化核酸（例えばプラスミド）−脂質粒子」として処方される核酸（例えばプラスミド）のトランスフェクション効率の劇的増大をもたらす、という発見に基づいている。典型的には、ＳＰＬＰは直径約１５０ｎｍ未満（さらに好ましくは直径約７０ｎｍ）であり、二重層脂質小胞内に封入された単一プラスミドから成る。
【００１３】
本明細書中で用いる場合、「エンドソーム膜不安定剤」（ＥＭＤ）という用語は、エンドソーム膜の崩壊または不安定化を促し、それによりそれらの内容物の放出を強化すると考えられる作用物質（単数または複数）を指す。エンドソームは、典型的には選択的透過性膜により細胞の残りのものから単離される別個の細胞内区画である。適切なＥＭＤとしては、一価金属イオン、例えばＫ＋、Ｎａ＋、二価金属イオン、例えばＭｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、および陽イオン性脂質との金属イオンの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。最も好ましいＥＭＤはＣａ２＋イオンであって、この場合、Ｃａ２＋イオンを含有するＳＰＬＰに関しては、Ｃａ２＋イオンの非存在下でのＳＰＬＰより約１０６倍高いトランスフェクション効率が観察される。
【００１４】
本発明の方法はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで用いられ得るし、哺乳類細胞を含めた任意の細胞型のトランスフェクション効率を増大するために用いられ得る。例えばｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクションに関しては、エンドソーム膜不安定剤（例えばカルシウム）がトランスフェクション培地に付加され得る。例えば広範囲のカルシウム濃度のいずれか、例えば０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲の濃度が用いられ得る。好ましくは約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、最も好ましくは約８〜約１０ｍＭが用いられる。一実施態様では、エンドソーム膜不安定剤（例えばカルシウム）は、トランスフェクション培地中へのＳＰＬＰの希釈後に所望の最終濃度を生じる高濃度で先ずＳＰＬＰに付加される。他の実施態様では、エンドソーム膜不安定剤（例えばカルシウム）は、細胞中へのトランスフェクションの時点でＳＰＬＰに付加される。エンドソーム膜不安定剤はＳＰＬＰと同時投与され得るし、それはＳＰＬＰの投与前に投与され得るし、あるいはそれはＳＰＬＰの投与後に投与され得る。
【００１５】
Ｉｎ ｖｉｖｏでは、トランスフェクションの部位でのエンドソーム膜不安定剤（例えばカルシウム）濃度の局所的増大を生じる任意の方法が用いられ得る。例えば粒子は、エンドソーム膜不安定剤を混入するよう処方され得るし、粒子は投与前に高エンドソーム膜不安定剤（例えばカルシウム）濃度を含有する溶液中に浸漬され得るし、あるいは粒子は高エンドソーム膜不安定剤（例えばカルシウム）濃度を含有する緩衝液または処方物中に投与され得る。このような方法は、粒子の局所的送達のために、例えば腫瘍内注入のために特に用いられ、この場合、例えばカルシウムイオンの同時投与は局所的高カルシウム濃度を生じ、それにより送達の部位またはその付近への粒子のトランスフェクション強化をもたらし得る。さらにエンドソーム膜不安定剤はＳＰＬＰと同時投与され得るし、それはＳＰＬＰの投与前に投与され得るし、あるいはそれはＳＰＬＰの投与後に投与され得る。
【００１６】
ある種のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ実施態様では、ＳＰＬＰは、例えばエンドソーム膜不安定剤をキレート化するためのキレート化分子、例えばエンドソーム膜不安定剤キレート化剤で誘導される脂質をそれらの表面に包含し、それにより粒子の全身的送達後でさえ、局所的高エンドソーム膜不安定剤濃度の生成を可能にするよう処方される。例えばある種のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ実施態様では、粒子は、その表面にカルシウムキレート化分子、例えばカルシウムキレート化剤で誘導される脂質を含み、それにより粒子の全身送達後でさえ局所的高カルシウム濃度の生成を可能にするよう処方される。
【００１７】
任意のＳＰＬＰ粒子を用いて本発明を実行し得る。例えば広範囲の濃度の陽イオン性およびその他の脂質のいずれかを含むＳＰＬＰが用いられ得る。同様に、ＳＰＬＰは、広範な種々の陽イオン性およびその他の脂質のいずれかを含み得る。ＳＰＬＰは、任意の供給源からの、そして任意のポリヌクレオチド配列を含む任意のプラスミドを用いて調製され得るし、ならびに多数の方法のいずれかを用いて調製され得る。
【００１８】
本発明は、ＳＰＬＰ−ＣＰＬと呼ばれる陽イオン性ＰＥＧ脂質を含有するＳＰＬＰも提供する。好ましい実施態様では、４つの正電荷を有するＰＥＧ脂質を含むＳＰＬＰ−ＣＰＬ４が用いられる。ＳＰＬＰおよびＳＰＬＰ−ＣＰＬは、多数の官能基のいずれかを含むよう誘導され得るし、その例としては、カルシウムキレート化剤、細胞または組織特異的ターゲッティング分子、標識等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明で用いるための適切なＳＰＬＰおよびＳＰＬＰ−ＣＰＬ、ならびにＳＰＬＰおよびＳＰＬＰ−ＣＰＬの製造および使用方法は、例えば米国特許出願６０／１３０，１５１および０９／５５３，６３９に、ならびにＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＣＡ００／００４５１に教示されている（これらの教示内容は各々、参照により本明細書中に含まれる）。
【００２０】
ＩＩ．定義
「脂質」という用語は、有機化合物の一群を指し、その例としては脂肪酸のエステルが挙げられ（これらに限定されない）、そして水中で不溶性であるが、しかし多数の有機溶媒中では可溶性であることを特徴とする。それらは通常は少なくとも３つのクラスに分類される：（１）脂肪および油ならびに蝋を含む「単純脂質」；（２）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」；（３）ステロイドのような「誘導脂質」。
【００２１】
「小胞形成脂質」という用語は、疎水性部分および極性頭基を有し、そしてほとんどのリン脂質により例示されるように、単独で、水中で二重層小胞中に自発的に生成され得る任意の両親媒性脂質を含むよう意図される。
「小胞採用脂質」という用語は、他の両親媒性脂質と組合せて脂質二重層中に安定的に組入れられ、二重層膜の内部疎水性領域と接触する疎水性部分および膜の外部極性表面に向けて配向されたその極性頭基部分を有する任意の両親媒性脂質を包含するよう意図される。小胞採用脂質としては、独力で、非ラメラ相を採用する傾向があり、さらに二重層安定化構成成分の存在下で二重層構造を想定し得る脂質が挙げられる。典型的例は、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）である。二重層安定化構成成分としては、ＳＰＬＰの凝集を抑制する複合脂質、ポリアミドオリゴマー（例えばＡＴＴＡ−脂質誘導体）、ペプチド、タンパク質、洗剤、脂質誘導体、ＰＥＧ−脂質誘導体、例えばホスファチジルエタノールアミンに結合されたＰＥＧ、およびセラミドに接合されたＰＥＧが挙げられるが、これらに限定されない（米国特許第０８／４８５，６０８号、現在は米国特許第５，８８５，６１３号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）参照）。
【００２２】
「両親媒性脂質」という用語は、一部は、脂質物質の疎水性部分が疎水性相中に配向するが、一方親水性部分は水性層に向けて配向する任意の適切な物質を指す。両親媒性脂質は、通常は脂質小胞の主要構成成分である。親水性特徴は、極性または荷電基、例えば炭水化物、ホスファト、カルボン酸、スルファト、アミノ、スルフヒドリル、ニトロ、ヒドロキシ基等の存在に由来する。疎水性は、非極性基の含入により付与され、その例としては、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに１つまたはそれ以上の芳香族、脂環式または複素環式基（単数または複数）により置換されるこのような基が挙げられるが、これらに限定されない。両親媒性化合物の例としては、リン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質が挙げられるが、これらに限定されない。リン脂質の代表例としては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リソホスファチジルコリン、リソホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンまたはジリノレオイルホスファチジルコリンが挙げられるが、これらに限定されない。リンを欠くその他の化合物、例えばスフィンゴ脂質、糖スフィンゴ脂質ファミリー、ジアシルグリセロールおよびβ−アシルオキシ酸も、両親媒性脂質と呼ばれる基内である。さらに前記の両親媒性脂質は、他の脂質、例えばトリグリセリドおよびステロールと混合され得る。
【００２３】
「中性脂質」という用語は、選定ｐＨで非荷電または中性両イオン性形態で存在する多数の脂質種のいずれかを指す。生理学的ｐＨでは、このような脂質としては、例えばジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシドおよびジアシルグリセロールが挙げられる。
【００２４】
「疎水性脂質」という用語は、非極性基を有する化合物を指し、それらの基の例としては長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、ならびに１つまたはそれ以上の芳香族、脂環式または複素環式基（単数または複数）により任意に置換されるこのような基が挙げられるが、これらに限定されない。適切な例としては、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパンおよび１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが上げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
「ジアシルグリセロリル」という用語は、別々に２〜３０個の、エステル結合によりグリセロールの１−および２−位置に結合された炭素原子を有する２−脂肪アシル鎖Ｒ１およびＲ２を意味する。アシル基は飽和され得るか、または種々の程度の不飽和を有し得る。
「ジアルキルグリセロリル」という用語は、エーテル結合によりグリセロールの１−および２−位置に結合された２つのＣ１〜Ｃ３０のアルキル鎖を意味する。
【００２６】
「Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ」という用語は、以下の：
【化３】
2004508012.tif 000003
を意味する。
【００２７】
「１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパン」という用語は、エステル結合によりプロパンの１−および２−位置に結合された２−脂肪アシル鎖Ｃ１〜Ｃ３０を意味する。アシル基は飽和され得るか、または種々の程度の不飽和を有し得る。プロパン分子の３−位置は、結合された−ＮＨ−基を有する。１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパンは、以下の一般式を有する：
【化４】
2004508012.tif 000004
【００２８】
「１，２−ジアルキル−３−アミノプロパン」という用語は、エーテル結合によりプロパンの１−および２−位置に結合された２−アルキル鎖（Ｃ１〜Ｃ３０）を意味する。プロパン分子の３−位置は、結合された−ＮＨ−基を有する。１，２−ジアシル−３−アミノプロパンは、以下の一般式を有する：
【化５】
2004508012.tif 000005
「非陽イオン性脂質」という用語は、前記の任意の中性脂質ならびに陰イオン性脂質を指す。陰イオン性脂質の例としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リソホスファチジルグリセロールおよび中性脂質と連結されるその他の陰イオン性改質基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
「陽イオン性脂質」という用語は、選定ｐＨで、例えば生理学的ｐＨで、正味正電荷を保有する多数の脂質種のいずれかを指す。このような脂質としては、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）、Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）、Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＡＰ」）、３−（Ｎ−（Ｎ‘，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（「ＤＣ−Ｃｈｏｌ」）およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロプ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明に用いられ得る陽イオン性脂質の多数の市販調製物が利用可能である。これらとしては、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡおよび１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（「ＤＯＰＥ」）を含む市販陽イオン性リポソーム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ））；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（「ＤＯＳＰＡ」）および（「ＤＯＰＥ」）を含む市販陽イオン性リポソーム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ））；ならびにＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（エタノール中のジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（「ＤＯＧＳ」）を含む市販陽イオン性脂質（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ））が挙げられる。以下の脂質は陽イオン性であり、生理学的ｐＨ以下で正電荷を有する：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ等。
【００３０】
「フソゲニック」という用語は、細胞の膜と融合するリポソーム、ＳＰＬＰまたはその他の薬剤送達系の能力を指す。膜は、形質膜または細胞小器官周囲の膜、例えばエンドソーム、核等であり得る。フソゲネシスは、このような膜とのリポソームの融合である。
「デンドリマー」という用語は、多世代を有する分枝鎖ポリマーとの関連を包含する。デンドリマーでは、各世代は多分枝点を作り出す。
【００３１】
「リガンド」という用語は、反応性官能基を伴う任意の分子、化合物または装置を包含し、例としては、脂質、両イオン性脂質、担体化合物、キレート化部分、生親和性化合物、バイオマテリアル、バイオポリマー、バイオメディカル装置、分析的検出可能化合物、治療的活性化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫刺激剤、放射能標識、フルオロゲン、ビオチン、薬剤、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖、リポソーム、ヴィロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、ターゲッティング剤または毒素が挙げられる。前記の一覧は例証であって、網羅的であるよう意図されない。
【００３２】
「ＡＴＴＡ」または「ポリアミド」という用語は、米国特許出願第０９／２１８，９８８号（１９９８年１２月２２日提出）に開示された化合物を指すが、これらに限定されない。これらの化合物としては、次式：
【化６】
2004508012.tif 000006
（式中、Ｒは水素、アルキルおよびアシルからなる群から選択される一成員であり；Ｒ１は水素およびアルキルからなる群から選択される一成員であり；あるいは任意にＲおよびＲ１ならびにそれらが結合される窒素は、アジド部分を形成し；Ｒ２は水素、任意置換アルキル、任意置換アリールおよびアミノ酸の側鎖から選択される群の一成員であり；Ｒ３は水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノおよびＮＲ４Ｒ５（ここでＲ４およびＲ５は別々に水素またはアルキルである）からなる群から選択される一成員であり；ｎは４〜８０であり；ｍは２〜６であり；そしてｑは０または１である）を有する化合物が挙げられる。その他のポリアミドが本発明の化合物中に用いられ得ることは、当業者には明らかである。
【００３３】
本明細書中で用いる場合、「アルキル」という用語は、分枝または非分枝炭化水素鎖、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソ−ブチル、ｔｅｒｔブチル、オクタ−デシルおよび２−メチルペンチルを意味する。これらの基は、このような鎖に一般的に結合される１つまたはそれ以上の官能基、例えばヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプトまたはチオ、シアノ、アルキルチオ、ヘテロシクリル、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルバルコイル、アルキル、アルケニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、アミド等で任意に置換されて、アルキル基、例えばトリフルオロメチル、３−ヒドロキシヘキシル、２−カルボキシプロピル、２−フルオロエチル、カルボキシメチル、シアノブチル等を生成し得る。
【００３４】
「アルキレン」という用語は、前記のような二価アルキル、例えばメチレン（−ＣＨ２−）、プロピレン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−）、クロロエチレン（−ＣＨＣｌＣＨ２−）、２−チオブテン（−ＣＨ２ＣＨ（ＳＨ）ＣＨ２ＣＨ２−）、１−ブロモ−３−ヒドロキシル−４−メチルペンテン（−ＣＨＢｒＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−）等を指す。
【００３５】
「アルケニル」という用語は、１つまたはそれ以上の炭素−炭素二重結合を含有する分枝または非分枝炭化水素鎖を意味する。
「アルキニル」という用語は、１つまたはそれ以上の炭素−炭素三重結合を含有する分枝または非分枝単価水素鎖を意味する。
「アリール」という用語は、例えばフェニル、ナフチル、インデニル等のような好ましくは約６〜１４個の炭素原子を有する少なくとも１つの芳香族環を形成し、そしてこのような鎖に一般的に結合される１つまたはそれ以上の官能基、例えばヒドロキシル、ブロモ、フルオロ、クロロ、ヨード、メルカプトまたはチオ、シアノ、シアノアミド、アルキルチオ、複素環式、アリール、ヘテロアリール、カルボキシル、カルバルコイル，アルキル、アルケニル、ニトロ、アミノ、アルコキシル、アミド等で置換されてアリール基、例えばビフェニル、ヨードビフェニル、メトキシビフェニル、アントリル、ブロモフェニル、ヨードフェニル、クロロフェニル、ヒドロキシフェニル、メトキシフェニル、ホルミルフェニル、アセチルフェニル、トリフルオロメチルチオフェニル、トリフルオロメトキシフェニル、アルキルチオフェニル、トリアルキルアンモニウムフェニル、アミドフェニル、チアゾリルフェニル、オキサゾリルフェニル、イミダゾリルフェニル、イミダゾリルメチルフェニル等を形成する炭素原子の鎖を意味する。
【００３６】
「アシル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）Ｒ基（ここでＲは前記のようなアルキルまたはアリールである）、例えばホルミル、アセチル、プロピオニルまたはブチリルを意味する。
「アルコキシ」という用語は、−ＯＲ−（ここでＲはアルキルである）を意味する。
【００３７】
「アミド」という用語は、アミド結合：−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−（ここでＲは水素またはアルキルである）を意味する。
「アミノ」という用語は、アミン結合：−ＮＲ−（ここでＲは水素またはアルキルまたは末端ＮＨ２である）を意味する。
「カルボキシル」という用語は、基−Ｃ（Ｏ）Ｏ−を意味し、そして「カルボニル」という用語は基−Ｃ（Ｏ）−を意味する。
【００３８】
「カルボネート」という用語は、基−ＯＣ（Ｏ）Ｏ−を示す。
「カルバメート」という用語は、基−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−を意味し、そして「尿素」という用語は基−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−を意味する。
「ホスホロ」という用語は、基−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−を意味する。
「塩基性アミノ酸」という用語は、選定ｐＨで、例えば生理学的ｐＨで正味正電荷を有する天然アミノ酸ならびに合成アミノ酸および／またはアミノ酸模倣物を指す。この群としては、リシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
「ホスホリルエタノールアミノ」という用語は、基−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−を意味する。
「ホスホリルエタノールアミド」という用語は、基−ＯＰ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−を意味する。
「ホスホ」という用語は、５価リン部分−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｏ−を意味する。
【００４０】
「ホスホエタノールアミノ」という用語は、基−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−を意味する。
「ホスホエタノールアミド」という用語は、基−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）ＯＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−を意味する。
「エチレンオキシド単位」という用語は、基−ＯＣＨ２ＣＨ２−を意味する。
【００４１】
「ＣＰＬ」という用語は、陽イオン性ポリマー脂質、例えば陽イオン性ＰＥＧ脂質を指す。好ましいＣＰＬは、式ＩおよびＩＩの化合物である。このようなＣＰＬは、米国特許出願第０９／５５３，６３９号（２０００年４月２０日提出）およびＰＣＴ特許出願第ＣＡ ００／００４５１号（２０００年４月２０日提出。これは２０００年１０月２６日にＷＯ ００／６２８１３として公開された）に開示されている。
【００４２】
「ｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｍ」という用語は、１つの正電荷を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬを指す「ＣＰＬ１」という用語に包含される。ｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｍ中の「ｄ−」は、ＣＰＬが蛍光ダンシル基を含有することを示す。ＣＰＬがダンシル部分なしで合成され得ることは糖業者には明らかであり、したがって「ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｍ」という用語は前記の「ＣＰＬ１」という用語に包含される。
【００４３】
「ｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｄ」という用語は、２つの正電荷を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬを指す「ＣＰＬ２」という用語に包含される。
「ｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｔ１」という用語は、３つの正電荷を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬを指す「ＣＰＬ３」という用語に包含される。
「ｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ１」という用語は、４つの正電荷を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬを指す「ＣＰＬ４ａ」という用語に包含される。
【００４４】
「ｄ−ＤＳＰＥ−ＣＰＬ−Ｑ５」あるいはＤＳＰＥ−ＰＥＧＱｕａｄ５あるいはＤＳＰＥ−ＣＰＬ−４という用語はすべて、４つの正電荷を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬを指す「ＣＰＬ４（またはＣＰＬ４ｂ）」という用語に包含される。頭基領域を修飾することにより、１つ（モノまたはＭ）、２つ（ジまたはＤ）、３つ（トリまたはＴ）および４つ（クアドまたはＱ）の正電荷を含有するＣＰＬが合成された。種々のＱｕａｄＣＰＬが合成され、それゆえこれらはＱ１〜Ｑ５と番号を付けられる。
【００４５】
略語「ＨＢＳ」は、Ｈｅｐｅｓ−緩衝化食塩水を指し、「Ｒｈｏ−ＰＥ」はローダミン−ホスファチジルエタノールアミンを指し、そして「ＬＵＶ」は「大型単一ラメラ小胞」を指す。
【００４６】
ＩＩ．核酸−脂質粒子（ＳＰＬＰ）およびその特性
核酸−脂質粒子あるいはＳＰＬＰは、典型的には陽イオン性脂質および核酸を含む。このようなＳＰＬＰは、好ましくは非陽イオン性脂質および二重層安定化構成成分も含み、さらに好ましくはＳＰＬＰの凝集を抑制する複合脂質も含む。本発明のＳＰＬＰは、約１５０ ｎｍ未満の平均直径を有し、そして実質的に非毒性である。さらに核酸は、本発明のＳＰＬＰ中に存在する場合、ヌクレアーゼによる分解に対して水性溶液に耐性である。このようなＳＰＬＰは、米国特許第５，９７６，５６７号およびＰＣＴ特許公告ＷＯ９６／４０９６４に非常に詳細に開示されている（これらの教示内容はともに、参照により本明細書中に含まれる）。
【００４７】
Ａ．ＳＰＬＰ構成成分
種々の適切な陽イオン性脂質が、単独で、あるいは１つまたはそれ以上のその他の陽イオン性脂質種または中性脂質種と組合せて、本発明に用いられ得る。
本発明において有用である陽イオン性脂質は、生理学的ｐＨで正味正電荷を保有する多数の脂質種のいずれか、例えばＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＭＲＩＥまたはそれらの組合せであり得る。多数のこれらの脂質および関連類似体（これらも本発明において有用である）は、同時係属中ＵＳＳＮ０８／３１６，３９９、米国特許第５，２０８，０３６号、第５，２６４，６１８号、第５，２７９，８３３号および第５，２８３，１８５号に記載されている（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。さらに陽イオン性脂質の多数の市販調製物が利用可能であり、本発明に用いられ得る。これらとしては、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む市販陽イオン性リポソーム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ））；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む市販陽イオン性リポソーム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ））；ならびにＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（ＤＯＧＳを含む市販陽イオン性脂質（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ））が挙げられる。
【００４８】
本発明に用いられる非陽イオン性脂質は、安定複合体を生成し得る種々の中性非荷電性両イオン性または陰イオン性脂質のいずれかであり得る。それらは好ましくは中性であるが、しかしそれらは代替的に正または負に荷電され得る。本発明に有用な非陽イオン性脂質の例としては、リン脂質関連物質、例えばレシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオシピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイル−ホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）およびジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）が挙げられる。付加的非リン含有脂質は、例えばステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノオレエート、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性アクリル酸ポリマー、トリエタノールアミン−ラウリルスルフェート、アルキル−アリールスルフェートポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウムブロミド等、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリンおよびセレブロシドである。その他の脂質、例えばリソホスファチジルコリンおよびリソホスファチジルエタノールアミンが存在し得る。非陽イオン性脂質としては、同時係属中ＵＳＳＮ０８／３１６，４２９（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されたようなポリエチレングリコール−ベースポリマー、例えばＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、およびリン脂質とまたはセラミドと接合されたポリエチレングリコール（ＰＥＧ−Ｃｅｒと呼ばれる）が挙げられる。
【００４９】
好ましい実施態様では、非陽イオン性脂質は、ジアシルホスファチジルコリン（例えばジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジリノレオイルホスファチジルコリン）、ジアシルホスファチジルエタノールアミン（例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびパルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、セラミドまたはスフィンゴミエリンである。これらの脂質中のアシル基は、好ましくはＣ１０〜Ｃ２４の炭素鎖を有する脂肪酸由来のアシル基である。さらに好ましくは、アシル基はラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルまたはオレオイルである。特に好ましい実施態様では、非陽イオン性脂質は１，２−ｓｎ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンまたは卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）である。
【００５０】
一実施態様では、ＳＰＬＰはさらに、二重層安定化構成成分（ＢＳＣ）を含む。適切なＢＳＣとしては、ポリアミドオリゴマー、ペプチド、タンパク質、洗剤、脂質誘導体、ＰＥＧ−脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンに結合されたＰＥＧおよびセラミドに結合されたＰＥＧ、が挙げられるが、これらに限定されない（米国特許第５，８８５，６１３号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）参照）。好ましくは二重奏安定化構成成分は、ＰＥＧ−脂質またはＡＴＴＡ−脂質である。本発明の好ましい実施態様では、ＢＳＣは、ＳＰＬＰの凝集を抑制する複合脂質である。適切な複合脂質としては、ＰＥＧ−脂質複合体、ＡＴＴＡ−脂質複合体、陽イオン性ポリマー−脂質複合体（ＣＰＬ）またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の好ましい実施態様では、ＳＰＬＰはＰＥＧ−脂質複合体またはＡＴＴＡ−脂質複合体を、ＣＰＬと一緒に含む。
【００５１】
本発明に用いられるＣＰＬは、以下の構造的特徴を有する：（１）脂質二重層中にＣＰＬを混入するための脂質アンカー、例えば疎水性脂質；（２）陽イオン性頭基に脂質アンカーを連結するための親水性スペーサー、例えばポリエチレングリコール；ならびに（３）陽子化可能陽イオン性頭基を生成するためのポリ陽イオン性部分、例えば天然アミノ酸。このようなものとして、本発明は、式Ｉ：
Ａ−Ｗ−Ｙ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉ
（式中、Ａ、ＷおよびＹは以下の通りである）
の化合物を提供する。
【００５２】
式Ｉに関しては、「Ａ」は脂質部分、例えば、脂質アンカーとして作用する両性脂質、中性脂質または疎水性脂質である。適切な脂質例としては、小胞形成脂質または小胞採用脂質が挙げられ、そしてその例としてはジアシルグリセロリル、ジアルキルグリセロリル、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパンおよび１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
「Ｗ」は、ポリマーまたはオリゴマー、例えば親水性ポリマーまたはオリゴマーである。好ましくは親水性ポリマーは、非免疫原性であるかまたは低固有免疫原性を保有する生適合性ポリマーである。あるいは親水性ポリマーは、適切なアジュバントとともに用いられる場合には、弱抗原性であり得る。適切な非免疫原性ポリマーとしては、ＰＥＧ、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーおよびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、ポリマーは約２５０〜約７０００ダルトンの分子量を有する。
【００５４】
「Ｙ」は、ポリ陽イオン性部分である。ポリ陽イオン性部分という用語は、選定ｐＨで、好ましくは生理学的ｐＨで、正電荷を、好ましくは少なくとも２つの正電荷を有する化合物、誘導体または官能基を指す。適切なポリ陽イオン性部分としては、塩基性アミノ酸およびそれらの誘導体、例えばアルギニン、アスパラギン、グルタミン、リシンおよびヒスチジン；スペルミン；スペルミジン；陽イオン性デンドリマー；ポリアミン；ポリアミン糖；およびアミノ多糖が挙げられる。ポリ陽イオン性部分は、線状、例えば線状テトラリシン、分枝鎖またはデンドリマー構造であり得る。ポリ陽イオン性部分は、約２〜約１５の正電荷を、好ましくは約２〜約１２の正電荷を、さらに好ましくは約２〜約８の正電荷を、選定ｐＨ値で有する。どのポリ陽イオン性部分を用いるかの選択は、所望されるリポソーム用途の種類によって決定され得る。
【００５５】
ポリ陽イオン性部分上の電荷は、全リポソーム部分周囲に分布されるか、あるいはそれらは、リポソーム部分のある特定領域において別個の濃度の電荷密度で、例えば電荷スパイクであり得る。電荷密度がリポソーム上に分布される場合、電荷密度は均等に分布されるかまたは非均等に分布され得る。ポリ陽イオン性部分の電荷分布の変動はすべて、本発明に包含される。
【００５６】
脂質「Ａ」および非免疫原性ポリマー「Ｗ」は、種々の方法により、好ましくは共有結合により結合され得る。当業者に既知の方法は、「Ａ」および「Ｗ」の共有結合のために用いられ得る。適切な結合としては、アミド、アミン、カルボキシル、カルボネート、カルバメート、エステルおよびヒドラゾン結合が挙げられるが、これらに限定されない。「Ａ」および「Ｗ」は結合を実施するための相補的官能基を有さなければならない、ということは当業者に明らかである。脂質上の１つおよびポリマー上の１つのこれら２つの基の反応は、所望の結合を提供する。例えば脂質がジアシルグリセロールであり、そして末端ヒドロキシルが例えばＮＨＳおよびＤＣＣで活性化されて活性エステルを生成し、次にアミノ基を含有するポリマーと、例えばポリアミドと反応させられる場合（米国特許出願第０９／２１８，９８８号（１９９８年１２月２２日提出）参照）、アミド結合は２つの基の間に形成される。
【００５７】
ある種の実施態様では、「Ｗ」は「Ｙ」と結合され、好ましくは共有結合される。「Ａ」および「Ｗ」に関する場合と同様に、「Ｗ」の「Ｙ」との結合は、一方はポリマー上そして他方はポリ陽イオン性部分上の官能基の相補的反応性により生成され得る。例えば「Ｗ」上のアミン官能基は、活性化カルボキシル基、例えばアシルクロリドまたはＮＨＳエステルと反応されて、アミンを生成し得る。反応性基の適切な選択により、所望の結合が得られる。その他の活性化カルボキシル基としては、カルボン酸、カルボキシレートエステル、カルボン酸ハリドおよびその他の活性化形態のカルボン酸、例えば反応性無水物が挙げられるが、これらに限定されない。反応性酸ハリドとしては、例えば酸塩化物、酸臭化物および酸フッ化物が挙げられる。
【００５８】
ある場合には、ポリ陽イオン性部分は、結合されたリガンド、例えばカルシウムを錯化するためのターゲッティングリガンドまたはキレート化部分を有する。好ましくは、リガンドが結合された後、陽イオン性部分は正電荷を保持する。ある場合には、結合されるリガンドは正電荷を有する。適切なリガンドとしては、反応性官能基を有する化合物または装置（これらに限定されない）が挙げられ、その例としては、脂質、両性脂質、担体化合物、生親和性化合物、バイオマテリアル、バイオポリマー、バイオメディカル装置、分析的検出可能化合物、治療的活性化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫刺激剤、放射能標識、フルオロゲン、ビオチン、薬剤、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、多糖、リポソーム、ヴィロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、その他のターゲッティング部分または毒素が挙げられる。エンドソーム膜不安定剤をキレート化または錯化するための適切なキレート化部分をいかに記載する。
【００５９】
ある種の好ましい実施態様では、その他の部分が式Ｉの化合物中に組入れられて、式ＩＩの化合物を生成する：
【００６０】
【化７】
2004508012.tif 000007
式ＩＩ中で、「Ａ」は脂質部分、例えば両性脂質、中性脂質または疎水性脂質部分である。適切な脂質例としては、ジアシルグリセロリル、ジアルキルグリセロリル、Ｎ−Ｎ−ジアルキルアミノ、１，２−ジアシルオキシ−３−アミノプロパンおよび１，２−ジアルキル−３−アミノプロパンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
式ＩＩ中で、「Ｘ」は単一結合、あるいは脂質を少なくとも１つのエチレンオキシド単位に共有結合する官能基である。適切な官能基としては、ホスファチジルエタノールアミノ、ホスファチジルエタノールアミド、ホスホロ、ホスホ、ホスホエタノールアミノ、ホスホエタノールアミド、カルボニル、カルバメート、カルボキシル、カルボネート、アミド、チオアミド、酸素、ＮＲ（ここで、Ｒは水素またはアルキル基である）および硫黄が挙げられるが、これらに限定されない。ある場合には、脂質「Ａ」は、単一結合によりエチレンオキシドに直接結合される。エチレンオキシド単位の数は、約１〜約１６０、好ましくは約６〜約５０の範囲であり得る。
【００６２】
式ＩＩ中、「Ｚ」は単一結合、あるいはエチレンオキシド単位をポリ陽イオン性部分と共有結合する官能基である。適切な官能基としては、ホスホ、ホスホエタノールアミノ、ホスホエタノールアミド、カルボニル、カルバメート、カルボキシル、アミド、チオアミド、ＮＲ（ここで、Ｒは水素原子またはアルキル基からなる群から選択される一成員である）が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施態様では、末端エチレンオキシド単位は、ポリ陽イオン性部分に直接結合される。
【００６３】
式ＩＩ中、「Ｙ」は式Ｉと関連して前記したようなポリ陽イオン性部分である。式ＩＩ中で、指数「ｎ」は約６〜約１６０の範囲の整数値である。
例示的実施態様では、式ＩＩの化合物は、図２１に略記したように一般化手法を用いて合成され得る。図２１は、本発明の特定の一実施態様を説明し、したがって単なる実例であって、本明細書中の特許請求の範囲を限定すべきでない。明らかに、図２１に説明された反応模式図になされ得る多数のその他の変更、代替事項および修正を当業者は認識する。図２１に関しては、クロロホルム溶液中の脂質、例えばＤＳＰおよび塩基、例えばトリエチルアミンの溶液が（ｔ−Ｂｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ３４００−ＣＯ２ＮＨＳ）に付加され、溶液は周囲温度で攪拌される。次に溶液は窒素流下で濃縮、乾燥される。次に、クロマトグラフィーを用いて脂質が消失するまで、ジエチルエーテルを用いたクロロホルム混合溶液の反復沈降により、残渣が精製される。精製ＣＰＬ複合物は溶媒中に溶解され、その後ＴＦＡが付加されて、溶液は室温で攪拌される。溶液は、窒素流下で再び濃縮され得る。次にジエチルエーテルを用いた混合物の反復沈降により残渣が精製されて、脂質−ＰＥＧ−ＮＨ２、例えばＤＳＰＥ−ＰＥＧ−ＮＨ２あるいは１つの陽子化可能陽イオン性頭基を有するＤＳＰＥ−ＣＰＬ−１を生じる。次に、本明細書中で前記したようなホスフェートおよびフルオレサミン検定により、ホスホリル−脂質アンカーおよび遠位第一級アミンの比が測定され得る。
【００６４】
この例示的実施態様では、陽子化可能アミノ基の数は、ポリ陽イオン性部分を作製するために増大され得る。化学量論的量の例えばＮα，Ｎε−ジ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−リシンＮ−ヒドロキシスクシニドを増分的に付加することにより、ポリ陽イオン性部分は約２〜約１６の正電荷から増大し得る。前記のように、正電荷は、任意数の適切なポリ陽イオン性部分、例えばリシン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン、ポリアミンおよびそれらの誘導体または組合せを用いて組入れられ得る。本発明の合成方法を用いて、陽イオン基、例えばアミノ基の数は、ＣＰＬ合成中に容易に制御され得る。
【００６５】
さらに上で説明したように、エンドソーム膜不安定剤は、核酸−脂質粒子中に組み入れられ得る。このような実施態様では、エンドソーム膜不安定剤は、多数の異なる投入技法のいずれかを用いて核酸−脂質粒子中に投入され得る（実施例ＩおよびＩＩ参照）。例示的投入方法は、例えば米国特許第４，８８５，１７２号、米国特許第５，０５９，４２１号および米国特許第５，１７１，５７８号（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に開示されている。さらに、特に好ましいイオノフォア媒介性投入方法は、米国特許第５，８３７，２８２号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に開示され特許請求されている。
【００６６】
さらに前記のように、エンドソーム膜不安定剤をキレート化するのに適したキレート化部分がＣＰＬのようなＳＰＬＰの脂質構成成分のいずれかに付着、連結または結合され得る。本発明の好ましい実施態様では、キレート化部分は、金属キレート化剤である。金属キレート化剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンビス（オキシエチレンニトリロ）−四酢酸（ＥＧＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ‘，Ｎ“，Ｎ”’−四酢酸、トランス−１，２−シクロヘキシレンジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ‘，Ｎ’−四酢酸、Ｎ６−カルボキシメチル−Ｎ３，Ｎ９−［２，３−ジヒドロキシ−Ｎ−メチルプロピルカルバモイルメチル］−３，６，９−トリアザウンデカンジオン酸、Ｎ６−カルボキシメチル−Ｎ３，Ｎ９−ビス（メチルカルバモイルメチル）−３，６，９−トリアザウンデカンジオン酸、Ｎ３，Ｎ６−ビス（カルボキシメチル）−Ｎ９−３−オキサペンタメチレン−カルバモイルメチル−３，６，９−トリアザウンデカンジオン酸またはＮ３，Ｎ６−ビス（カルボキシメチル）−Ｎ９−［３，３−ビス（ジヒドロキシホスホリル）−３−ヒドロキシプロピル−カルバモイルメチル］−３，６，９−トリアザウンデカンジオン酸、金属イオン輸送タンパク質、金属イオン封鎖剤、金属キレートリガンド等を用いて、エンドソーム膜不安定剤をキレート化し得る。さらに、米国特許第５，８７６，６９５号（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に開示された金属キレート化剤も用いられ得る。本発明の組成物および方法に用いるのに適したその他のキレート化剤は、当業者に既知である。
【００６７】
２．核酸構成成分
本発明はプラスミドの使用に関して実施例に記載されているが、しかし本明細書中に記載した方法は他のより大きい核酸またはオリゴヌクレオチドに等しく適用可能である、と当業者は理解する。このようなものとして、適切な核酸としては、プラスミド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイムならびにその他のポリ−およびオリゴ−ヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明で有用な核酸（複合体および粒子の両方を含む）は、典型的には１０〜１００，０００ヌクレオチド残基を有するヌクレオチドポリマーである。典型的には、核酸は、細胞タンパク質の発現の修復または強化のために被験者に投与されるものである。さらに核酸は、相補的核酸の存在または非存在に関する臨床的診断を提供するための標識（例えば放射能標識、蛍光標識または比色定量的標識）を保有し得る。したがって核酸またはヌクレオチドポリマーは、Ｓｔｅｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１００４−１０１１（１９９３）による再検討に、ならびに米国特許第５，２６４，４２３号および第５，２７６，０１９号（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載された核酸類似体、例えばアンチセンス誘導体を含有するゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドを包含する核酸のポリマーであり得る。さらに核酸は、転写および翻訳調節配列、例えばプロモーター配列およびエンハンサー配列をコードし得る。
【００６９】
ヌクレオチドポリマーは、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、あるいは二本鎖ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。二本鎖ＤＮＡの例としては、構造遺伝子、制御および終結領域を含む遺伝子、ならびに自己複製計、例えばプラスミドＤＮＡが挙げられる。
一本鎖核酸としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡと相補的）、リボザイムおよび三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。安定性を増大するために、いくつかの一本鎖化核酸は、好ましくは、安定非ホスホジエステル結合で置換されるヌクレオチド結合、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネートまたはＯ−アルキルホスホトリエステル結合のいくつかまたはすべてを有する。
【００７０】
本発明に用いられる核酸としては、１つまたはそれ以上の糖部分においておよび／または１つまたはそれ以上のピリミジンまたはプリン塩基において修飾が成された核酸も挙げられる。糖修飾の例としては、ハロゲン、アルキル基、アミン、アジド基による１つまたはそれ以上のヒドロキシル基の置換を包含し、あるいはエーテルまたはエステルとして機能化される。さらに全糖は、立体的および電子的に類似の構造で、例えばアザ−糖および炭素環式糖類似体で置換され得る。プリンまたはピリミジン塩基部分の修飾としては、例えばアルキル化プリンおよびピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、あるいは当業者に既知のその他の複素環式置換基が挙げられる。
【００７１】
多遺伝子配列も、本発明の方法に用いられ得る。したがって異なるタンパク質に関する配列は、ある鎖またはプラスミド上に置かれ得る。非コード配列も、適切な発現を達成するのに必要な程度に存在する。
本発明の方法に用いられる核酸は、天然供給源から単離され、ＡＴＣＣまたはＧｅｎＢａｎｋライブラリーのような供給源から得られ、あるいは合成法により調製され得る。合成核酸は、種々の溶液または固相法により調製され得る。一般に、固相合成法が好ましい。ホスフィット−トリエステル、ホスホトリエステルおよびＨ−ホスホネート化学による核酸の固相合成のための手法の詳細な説明は、広範に利用可能である（例えば米国特許第４，４０１，７９６号（Ｉｔａｋｕｒａ）；米国特許第４，４５８，０６６号および第４，５００，７０７号（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ等）；Ｂｅａｕｃａｇｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ２２：１８５９−１８６２（１９８１）；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， １０３：３１８５−３１９１（１９８１）；Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ４：１−１７（１９８２）；Ｊｏｎｅｓ， ｃｈａｐｔｅｒ ２， Ａｔｋｉｎｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， ｃｈａｐｔｅｒ ３， ａｎｄ Ｓｐｒｏａｔ， ｅｔ ａｌ．， ｃｈａｐｔｅｒ ４， ｉｎ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｇａｉｔ（ｅｄ．）， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．（１９８４）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ２７： ４６９−４７２（１９８６）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １４：５３９９−５４０７（１９８６）；Ｓｉｎｈａ， ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ２４：５８４３−５８４６（１９８３）；およびＳｉｎｈａ， ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２：４５３９−４５５７（１９８４）参照）（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。
【００７２】
ａ．細胞中の遺伝子の導入および発現のためのベクター
本発明の重要な局面は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで選定遺伝子を導入し、その後宿主細胞中で選定遺伝子を発現するための本明細書中で提供される脂質−核酸粒子の使用である。したがって粒子中の核酸は、宿主細胞中で発現され得るベクターを特定的に包含する。プロモーター、エンハンサー、ストレスまたは化学的調節プロモーター、抗生物質感受性または栄養素感受性領域、ならびに治療的タンパク質コード配列は、必要な場合に含まれ得る。
【００７３】
要約すると、天然または合成核酸の発現は、典型的には、プロモーター（構成的または誘導可能的）に当該核酸を操作可能的に連結し、発現ベクター中に構築物を組入れ、そして適切な宿主細胞中にベクターを導入することにより達成される。典型的ベクターは、転写および翻訳ターミネーター、転写および翻訳開始配列、ならびに特定核酸の発現の調節に有用なプロモーターを含有する。ベクターは、任意に、少なくとも１つの個々のターミネーター配列、真核生物または原核生物またはその両方でのカセットの複製を可能にする配列（例えばシャトルベクター）、ならびに原核生物および真核生物系の両方のための選択マーカーを含有する遺伝子発現カセットを含む。ベクターは、原核生物、真核生物または好ましくはその両方における複製および組込みに適している（Ｇｉｌｉｍａｎ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈ（１９７９）， Ｇｅｎｅ， ８：８１−９７； Ｒｏｂｅｒｔｓ ｅｔ ａｌ． （１９８７）， Ｎａｔｕｒｅ， ３２８：７３１−７３４； Ｂｅｒｇｅｒ ａｎｄ Ｋｉｍｍｅｌ， Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ｖｏｌｕｍｅ １５２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）； Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， （２ｎｄ ｅｄ．） Ｖｏｌ．１−３， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．，（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）；およびＦ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ｅｄｓ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ａ ｊｏｉｎｔ ｖｅｎｔｕｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．，（１９９４ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）参照）。生物学的試薬および実験装置のメーカーからの製品情報は、既知の生物学的方法に有用な情報も提供する。このようなメーカーとしては、ＳＩＧＭＡ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）、Ｃｈｅｍ Ｇｅｎｅｓ Ｃｏｒｐ．， Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ）、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．， ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ， ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ Ｃｈｅｍｉｅ ＡＧ， Ｂｕｃｈｓ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）、ならびに当業者に既知の多数のその他の市販供給元が挙げられる。
【００７４】
外来核酸が操作可能的に連結されるベクターは、これらの核酸を宿主細胞中に導入し、それらの複製および／または発現を媒介するために用いられ得る。「クローニングベクター」は、外来核酸を複製し、増幅するために、そして特定の外来核酸含有ベクターのクローンを得るために有用である。「発現ベクター」は、外来核酸の発現を媒介する。いくつかのベクターは、クローニングおよび発現ベクターの両方である。
【００７５】
概して、細胞中に外来遺伝子を輸送するために用いられる特定ベクターは、特に重要であるというわけではない。選定宿主細胞中でのはげのために用いられる慣用的ベクターのいずれかが用いられ得る。
発現ベクターは、典型的には真核生物転写単位または真核生物細胞中での外因性遺伝子の発現に必要とされるすべての素子を含有する「発現カセット」を含む。典型的発現カセットは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ配列と操作可能的に連結されるプロモーターおよび転写体の効率的ポリアデニル化に必要とされるシグナルを含有する。
【００７６】
真核生物プロモーターは、典型的には２つの型の認識配列、即ちＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーター素子を含有する。転写開始部位の２５〜３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡ合成を開始するのにＲＮＡポリメラーゼを向けるのに関与すると考えられる。その他の上流プロモーター素子は、転写が開始される速度を確定する。
【００７７】
エンハンサー素子は、連結された同種または異種プロモーターから１，０００倍まで転写を刺激し得る。エンハンサーは、転写開始部位から下流または上流に置かれる場合に、活性である。ウイルスに由来する多数のエンハンサー素子は広範な宿主範囲を有し、種々の組織中で活性である。例えばＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多数の細胞型に適している。本発明に適しているその他のエンハンサー／プロモーターの組合せとしては、ポリオーマウイルス、ヒトまたはネズミサイトメガロウイルス由来のもの、種々のレトロウイルス、例えばネズミ白血病ウイルス，ネズミまたはラウス肉腫ウイルスおよびＨＩＶからの長期反復が挙げられる（Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ ａｎｄ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ． １９８３参照）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。
【００７８】
プロモーター配列のほかに、発現カセットは、効率的終結を提供するための構造遺伝子の下流の転写終結領域も含有すべきである。終結領域は、プロモーター配列と同一供給源から得られるし、あるいは異なる供給源から得られる。
選定構造遺伝子によりコードされるｍＲＮＡが効率的に翻訳されるものである場合、ポリアデニル化配列も一般にベクター構築物に付加される。２つの別個の配列素子は、正確且つ効率的ポリアデニル化のために必要とされる。富ＧＵまたはＵ配列はポリアデニル化部位から下流に位置し、そして６つのヌクレオチドＡＡＵＡＡＡの高保存配列は、１１〜３０ヌクレオチド上流に位置する。本発明に適した終結およびポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０由来のもの、または発現ベクター上にすでに存在する遺伝子の部分ゲノムコピーが挙げられる。
【００７９】
既述の素子のほかに、本発明の発現ベクターは、典型的には、クローン化核酸の発現のレベルを増大するよう、または形質導入化ＤＮＡを保有する細胞の同定を促すよう意図されたその他の特殊素子を含有し得る。例えば多数の動物ウイルスは、許容細胞型におけるウイルスゲノムの染色体外複製を促すＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを保有するプラスミドは、適切な因子がプラスミド上にまたは宿主のゲノムとともに保有される遺伝子により提供される限り、エピソーム的に複製される。
【００８０】
本発明の発現ベクターは、典型的には、細菌中でのベクターのクローニングを促進する原核生物配列、ならびに真核生物細胞、例えば哺乳類細胞中でのみ発現される１つまたはそれ以上の真核生物転写単位をともに含有する。原核生物配列は、好ましくはそれらが真核生物細胞中でのＤＮＡの複製を妨げないよう選択される。
【００８１】
選定遺伝子は、普通は、ＤＮＡ配列がベクター中に機能的に挿入される場合に発現される。「機能的に挿入される」とは、それが適正リーディングフレームおよび配向で挿入され、そして適正調節素子と操作可能的に連結されることを意味する。典型的には、遺伝子はプロモーターから下流に挿入され、そして停止コドンが後に続くが、しかしハイブリッドタンパク質としての生成とその後の切断が、所望により用いられ得る。
【００８２】
レトロウイルスのような真核生物ウイルスからの調節素子を含有する発現ベクターが、典型的には用いられる。ＳＶ４０ベクターとしては、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が挙げられる。ウシパピローマウイルス由来のベクターとしてはｐＢＶ−１ＭＴＨＡが挙げられるし、エプスタインバーウイルス由来のベクターとしては、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が挙げられる。その他のベクターの例としては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、ならびにＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ネズミ乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核生物細胞中での発現に有効であることが示されたその他のプロモーターの指令下でタンパク質の発現を可能にする任意のその他のベクターが挙げられる。
【００８３】
種々のベクターが用いられ得るが、しかし、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターは、標的細胞をトランスフェクトし、そして標的細胞中にゲノムを組入れる高効率性のために、真核生物細胞を修飾するために有用である、ということに留意すべきである。さらに、レトロウイルスベクターを保有するレトロウイルスは、広範な種々の組織からの細胞を感染し得る。
【００８４】
前記のレトロウイルスベクターのほかに、細胞はアデノ随伴ウイルスベクターを用いてリポフェクトされ得る（例えばＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ． １８５， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（Ｄ．Ｖ． Ｇｏｅｄｄｅｌ， ｅｄ．）（１９９０）またはＭ． Ｋｒｉｅｇｅｒ（１９９０）， Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ参照）（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、生産的感染を達成するためにヘルパーウイルス、例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルスを必要とする。ヘルパーウイルス機能の非存在下ではＡＡＶは宿主細胞のゲノムに一体化する（部位特異的に）が、しかし一体化ＡＡＶゲノムは病原性作用を有さない。一体化過程は、宿主が適切な環境条件（例えば溶解性ヘルパーウイルス）に曝されるまで、ＡＡＶゲノムを遺伝的に無傷に保持させて、その時点でそれは溶解性生活環に再入する。Ｓａｍｕｌｓｋｉ（１９９３）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， ３：７４−８０ならびにその中に引用された参考文献は、ＡＡＶ生活環の概要を提供する。ＡＡＶベクターの概要に関しては、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．（１９８７）， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６０：３８−４７；米国特許第４，７９７，３６８号（Ｃａｒｔｅｒ等（１９８９））；ＷＯ９３／２４６４１（Ｃａｒｔｅｒ等（１９９３））；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ， ５：７９３−８０１；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９４）， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， ９４：１３５１およびＳａｍｕｌｓｋｉ（上記）も参照されたい。
【００８５】
組換えワクシニアを産生するために設計されたプラスミド、例えばｐＧＳ６２（Ｌａｎｇｆｏｒｄ， Ｃ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．（１９８６）， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ６： ３１９１−３１９９）も用いられ得る。このプラスミドは、外来核酸の挿入のためのクローニング部位、挿入核酸の合成を指図するためのワクシニアのＰ７．５プロモーター、および外来核酸の両端と側面を接するワクシニアＴＫ遺伝子から成る。
【００８６】
どのようなベクターが用いられようと、一般にベクターは、当該遺伝子産物をコードする当該遺伝子を発現可能形態で含有するよう遺伝子工学処理される。適切な種類の遺伝子産物としては、細胞傷害性／自殺遺伝子、免疫モジュレーター、細胞受容体リガンド、腫瘍サプレッサーおよび抗血管新生遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。選択される特定遺伝子は、意図される目的または治療によっている。このような当該遺伝子の例は、以下にならびに明細書全体に記載されている。細胞傷害性／自殺遺伝子は、細胞を殺害し、アポトーシスを引き起こし、または細胞周期中に細胞を休止させ得る遺伝子である。このような遺伝子としては、免疫毒素のための遺伝子、チミジンキナーゼ、シトクロームＰ４５０　２Ｂ１、デオキシシチジンキナーゼまたはシトシンデアミナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。アシクロビルおよびガンシクロビル（チミジンキナーゼのための）、シクロホスファミド（シトクロームＰ４５０　２Ｂ１のための）、５−フルオロシトシン（シトシンデアミナーゼのための）のような作用物質は、典型的には本発明の脂質−核酸組成物とともに（例えば同時にまたは非同時的に）全身投与されて、所望の細胞傷害性または細胞増殖抑制性作用を達成する。免疫モジュレーター遺伝子は、１つまたはそれ以上の免疫応答を調整する遺伝子である。免疫モジュレーター遺伝子の例としては、サイトカイン、例えば増殖因子（例えばＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＧＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＳＣＦ等）、インターロイキン（例えばＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２０等）、インターフェロン（例えばＩＦＮ−δ、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ等）およびＴＮＦが挙げられる。細胞受容体リガンドとしては、細胞表面受容体（例えばインスリン受容体、ＥＰＯ受容体、Ｇ−タンパク質結合受容体、チロシンキナーゼ活性を有する受容体、サイトカイン受容体、増殖因子受容体等）と結合し、受容体が関与する生理学的経路（例えばグルコースレベル調整、血球発達、有糸分裂誘発等）を調整し（例えば抑制し、活性化する等）得るリガンドが挙げられる。細胞受容体リガンドの例としては、サイトカイン、増殖因子、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、インスリン、グルカゴン、Ｇ−タンパク質結合受容体リガンド等が挙げられる。腫瘍サプレッサー遺伝子は、細胞、特に腫瘍細胞の増殖を抑制し得る遺伝子である。したがって腫瘍細胞へのこれらの遺伝子の送達は、癌の治療に有用である。腫瘍サプレッサー遺伝子としては、ｐ５３（Ｌａｍｂ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ６：１３７９−１３８５（１９８６）， Ｅｗｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：８５−８７（１９９２）， Ｅｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９１） Ｃｅｌｌ ６６：１１５５−１１６４およびＨｕ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． ９：１１４７−１１５５（１９９０））、ＲＢ１（Ｔｏｇｕｃｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９３） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １７：５３５−５４３）、ＷＴ１（Ｈａｓｔｉｅ， Ｎ．Ｄ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖ． ３：４０８−４１３（１９９３））、ＮＦ１（Ｔｒｏｆａ���ｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ７２：７９１−８００（１９９３）， Ｃａｗｔｈｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６２：１９３−２０１（１９９０））、ＶＨＬ（Ｌａｔｉｆ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１３１７−１３２０（１９９３））およびＡＰＣ（Ｇｏｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ６６：５８９−６００（１９９１））が挙げられるが、これらに限定されない。抗血管新生遺伝子は、新血管形成を抑制し得る。これらの遺伝子は、新血管形成が疾患の病理学的発達に一役を演じる癌を治療するために特に有用である。抗血管新生遺伝子の例としては、エンドスタチン（例えば米国特許第６，１７４，８６１号参照）およびアンギオスタチン（例えば米国特許第５，６３９，７２５号参照）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
ベクターはさらに通常は、核酸増幅、例えばナトリウム、カリウムＡＴＰアーゼ、チミジンキナーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＣＡＤ（カルバミルホスフェートシンテターゼ、アスパルテートトランスカルバミラーゼおよびジヒドロオロターゼ）、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロフォレートレダクターゼおよびアスパラギンシンテターゼおよびウアバイン選択を生じる選択可能マーカーを含む。あるいは、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターの使用、ポリヘドリンプロモーターまたはその他の強力バキュロウイルスプロモーターの指図下でのコード配列の使用のような核酸増幅を包含しない高収率発現系も適している。
【００８８】
プラスミド以外の核酸が用いられる場合、核酸は、Ｓｔｅｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１００４−１０１１（１９９３）による再検討に、ならびに米国特許第５，２６４，４２３号および第５，２７６，０１９号（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載された核酸類似体、例えばアンチセンス誘導体を含有し得る。
ビリオン粒子をパッケージングするためのサイズ制限のために、ウイルスゲノム中に相対的に小型の非ウイルス核酸配列を取り入れ得るだけであるウイルスベースの遺伝子療法ベクターと違って、本発明の脂質−核酸複合体は、細胞中に大型（例えば５０〜５，０００キロ塩基）外因性核酸を移すために用いられ得る。リポフェクションのこの局面は、遺伝子療法のための標的であり得る多数の遺伝子が１００キロ塩基以上に及び（例えばアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）遺伝子、ハンチントン舞踏病遺伝子）、そして大型相同ターゲッティング構築物または導入遺伝子が治療に必要であり得るため、特に有益である。
【００８９】
細胞は、（１）外因性核酸、（２）ポリ陽イオンと共有結合される受容体−リガンドタンパク質（「ｒｌｐ」）および（３）陽イオン性または中性脂質を含む受容体認識トランスフェクション複合体と細胞を接触することにより、高効率でそして細胞型特異性により、外因性核酸でリポフェクトされ得る。ポリ陽イオン結合受容体認識タンパク質および適切な陽イオン性（または中性）脂質の組合せが核酸をトランスフェクトするために用いられ得るということ、そしてその組合せが、受容体認識タンパク質により付与される細胞型ターゲッティング特異性を保持し、そして陽イオン性脂質、中性脂質またはリポポリアミンの含入により一部付与される高効率トランスフェクションも示すということが判明した。
【００９０】
外因性核酸は、典型的にはｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡであり、最も典型的には外因性核酸は、プラスミドまたはウイルスゲノムのようなクローニングベクター中のｄｓＤＮＡ、例えばクローン化ＤＮＡ配列である。多種の外因性核酸が、例えば非結合核酸配列の同時トランスフェクションのために、またはｉｎ ｖｉｖｏ相同組換えシャッフリングを成し遂げるために、トランスフェクション複合体中に併合され得る。しばしば外因性核酸（単数または複数）は、トランスフェクション複合体を組入れる細胞中で自律的複製ができず、そして相同組換えまたは非相同組込みにより宿主細胞染色体中で一時的に発現されるか、または安定的に組み込まれる。しばしば少なくとも１つの選択可能マーカー（例えばｎｅｏ（登録商標）発現カセット）が外因性核酸（単数または複数）中に含入されて、外因性核酸（単数または複数）を組入れた細胞の選択を促す。典型的には、外因性核酸は、外因性核酸を組入れた標的細胞中で発現されるポリペプチドをコードする構造遺伝子を含み、そして構造遺伝子は通常は適切なシス−作用調節素子（例えばプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化部位）と操作可能的に連結される。遺伝子療法は種々の方法で実施され得るが、しかし典型的受容体−認識リポフェクション複合体は、少なくとも１つの転写単位を含む核酸を含む。
【００９１】
本発明の脂質核酸粒子は、核酸の種のほかに、受容体認識分子（ｒｌｍ）、例えばタンパク質を含有するよう設計され得る。ｒｌｍは、核酸−脂質粒子を含む脂質と共有結合され得る。粒子上のその存在は効率および特異性を増大し、粒子は標的細胞と接触し、進入する。例えば適切なｒｌｍは、例えばエンドサイトーシスおよび／または膜融合の過程によりｒｌｍ−ポリ陽イオン複合体を含むトランスフェクション複合体のインターナリゼーションを媒介する標的細胞の細胞表面受容体と結合する非免疫グロブリンタンパク質である。付加的適切なｒｌｍ種は、典型的には、ポリペプチドタンパク質（例えば接着分子、例えばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＥＬＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１）を含む天然生理学的リガンドである。真核生物細胞上のウイルス受容体と結合し、ウイルスインターナリゼーションを媒介するウイルスタンパク質（例えばスパイク糖タンパク質）は、ｒｌｍ−ポリ陽イオン複合体を形成するためのｒｌｍ種としても用いられ得る。例としては、細胞表面受容体と結合し、インターナリゼーションおよび／または膜融合をもたらすウイルス糖タンパク質、例えばＨＳＶ−１のｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＨおよびｇＩビリオン糖タンパク質、ならびにＨＩＶ−１のｇｐ１２０も挙げられる。
【００９２】
天然タンパク質の断片および類似体が、ならびに本発明のトランスフェクション複合体を形成するに際してのｒｌｍ種としての全長成熟タンパク質が用いられ得る。例えば標的細胞との付着を媒介する接着分子またはビリオン付着タンパク質の一部分を含む断片、類似体および融合タンパク質は、細胞付着および／または膜融合に不可欠でない天然全長タンパク質の他の部分を伴わずにｒｌｍ種として用いられ得る。したがって、例えばビリオン糖タンパク質の細胞質尾ペプチド部分は通常は、省かれ得るし、その結果生じるタンパク質は依然として適切なｒｌｍとして役立ち得る。
【００９３】
選択されるｒｌｍは、特定標的細胞型に伴って変わる。肝細胞に対する特異的ターゲッティングのためには、アシアロ糖タンパク質（ガラクトース末端性）は、ｒｌｍ種として選択される。アシアロ糖タンパク質の例としては、アシアロオロソムコイド、アシアロフェツインおよびデシアリル化水疱性口内炎ウイルスビリオンタンパク質が挙げられる。これらは、末端シアル酸およびペヌルチメートガラクトース残基を保有する糖タンパク質の化学的または酵素的デシアリル化により生成される。あるいは、肝細胞を選択的に標的にするリポフェクション複合体を生成するのに適したｒｌｍ種は、還元的ラクトース化によりラクトースまたはその他のガラクトース末端炭水化物（例えばアラビノガラクタン）を非ガラクトース保有タンパク質と結合することにより作製され得る。肝細胞ターゲッティングのためのその他の有用なガラクトース末端炭水化物としては、天然糖タンパク質から得られる炭水化物樹、特に末端ガラクトース残基を含有し、または末端ガラクトース残基を曝露するよう酵素的に処理され得るトリ−およびテトラ−触角状構造が挙げられる。マクロファージ、内皮細胞またはリンパ球をターゲッティングするためには、マンノースまたはマンノース−６−ホスフェートを含むｒｌｍ種、あるいはこれらの末端炭水化物構造を含む複合炭水化物が用いられ得る。
【００９４】
種々の異なる細胞表面受容体が哺乳類細胞の表面に存在するため、非肝臓細胞への核酸の細胞特異的ターゲッティングは、種々のｒｌｍ種を含むリポフェクション複合体を包含し得る。例えばトランスフェリンは、トランスフェリン受容体を発現する細胞に対して受容体認識トランスフェクション複合体を形成するための適切なｒｌｍとして用いられ得る。その他の受容体リガンド、例えばポリペプチドホルモン（例えば成長ホルモン、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、インスリン、ＩＬ−２、ＩＬ−４等）は、コグネイト受容体を発現する細胞に受容体認識トランスフェクション複合体を局在化するために用いられ得る。
【００９５】
核酸−脂質粒子は、多ｒｌｍ種を含み得る。しばしば、膜融合活性を有する作用物質（例えばインフルエンザウイルスヘマグルチニン、ＨＳＶ−１ｇＢおよびｇＤ）は、単独で、またはその他のｒｌｍ種と、典型的には膜融合活性を欠くものと組合せて、ｒｌｍ−ポリ陽イオン複合体を形成するためのｒｌｍとして用いられる。
【００９６】
これらのトランスフェクション法は一般に、（１）本質的に外因性核酸、予定細胞表面受容体と結合する非免疫グロブリン受容体認識分子と連結されるポリ陽イオンで本質的に構成されるポリ陽イオン複合体、および本質的に中性または陽イオン性脂質からなる脂質構成成分（任意に第四級アンモニウム洗剤および／またはリポポリアミンを含む）からなる核酸−脂質粒子を生成し、そして（２）予定細胞表面受容体を発現する細胞を、前記細胞中への外因性核酸の取込みを可能にする生理学的トランスフェクション条件下で、受容体認識トランスフェクション複合体と接触させる過程を包含する。代替的実施態様では、ｒｌｍは、共有結合により、しばしば架橋剤による共有結合により、またはペプチド結合により、ポリ陽イオンに結合される。
【００９７】
ＩＩＩ．ＳＰＬＰおよびＳＰＬＰ−ＣＰＬの調製ならびにサイジング
一実施態様では、本発明は、疎水性核酸−脂質中間物質複合体により生成される脂質−核酸粒子を提供する。複合体は、好ましくは電荷中和される。洗剤ベースのまたは有機溶媒ベースの系におけるこれらの複合体の操作は、核酸が保護される粒子形成をもたらし得る。
【００９８】
本発明は、プラスミドまたはその他の核酸が脂質二重層中に封入され、分解から保護される血清安定性プラスミド−脂質粒子の製造方法を提供する。さらに、本発明において生成される粒子は、好ましくは生理学的ｐＨで中性であるかまたは負に荷電される。Ｉｎ ｖｉｖｏ適用のためには、中性粒子が有益であるが、一方、ｉｎ ｖｉｔｒｏ用途に関しては、粒子は、より好ましくは、負に荷電される。これは、核酸が陽イオン性脂質中に封入され得る正荷電リポソーム処方物全体での凝集低減というさらなる利点を提供する。
【００９９】
本発明の方法により作製される粒子は、約５０〜約１５０ ｎｍのサイズを有し、大多数の粒子は約６５〜８５ ｎｍである。粒子は、洗剤透析法により、または構成成分の混合中に単一相を提供するために有機溶媒を利用する逆相法の変法により生成され得る。生成の任意の特定メカニズムに縛られることなく、プラスミドまたはその他の核酸は、陽イオン性脂質の洗剤溶液と接触されて、被覆プラスミド複合体を生成する。これらの被覆プラスミドは、凝集し、沈降し得る。しかしながら洗剤の存在は、この凝集を低減し、そして被覆プラスミドを余分量の脂質（典型的には非陽イオン性脂質）と反応させて、プラスミドまたはその他の核酸が脂質二重層中に封入される粒子を生成する。有機溶媒を用いてプラスミド−脂質粒子の生成に関して以下に記載される方法は、類似の模式図に従う。
【０１００】
いくつかの実施態様では、粒子は洗剤透析を用いて生成される。したがって本発明は、血清安定性プラスミド−脂質粒子の製造方法であって、以下の：
（ａ）洗剤溶液中でプラスミドを陽イオン性脂質と併合して、被覆プラスミド−脂質複合体を形成し、
（ｂ）非陽イオン性脂質を被覆プラスミド−脂質複合体と接触させて、プラスミド−脂質複合体および非陽イオン性脂質を含む洗剤溶液を生成し、そして
（ｃ）過程（ｂ）の洗剤溶液を透析して、血清安定性プラスミド−脂質粒子の溶液を提供するが、この場合、プラスミドは脂質二重層中に封入され、そして粒子は血清安定性であり、約５０〜約１５０ ｎｍのサイズを有する
ことを包含する方法を提供する。被覆プラスミド−脂質複合体の初期溶液は、洗剤溶液中でプラスミドを陽イオン性脂質と併合することにより生成される。
【０１０１】
これらの実施態様では、洗剤溶液は、好ましくは１５〜３００ｍＭ、さらに好ましくは２０〜５０ｍＭの臨界ミセル濃度を有する中性洗剤の水性溶液である。適切な洗剤の例としては、例えばＮ，Ｎ‘−（（オクタノイルイミノ）−ビス−（トリメチレン））−ビス−（Ｄ−グルコンアミド）（ＢＩＧＣＨＡＰ）；ＢＲＩＪ３５；デオキシ−ＢＩＧＣＨＡＰ；ドデシルポリ（エチレングリコール）エーテル；Ｔｗｅｅｎ２０；Ｔｗｅｅｎ４０；Ｔｗｅｅｎ６０；Ｔｗｅｅｎ８０；Ｔｗｅｅｎ８５；Ｍｅｇａ８；Ｍｅｇａ９；Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−０８；Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（登録商標）３−１０；トリトンＸ−４０５；ヘキシル−、ヘプチル−、オクチル−およびノニル−β−Ｄ−グルコプラノシド；およびヘプチルチオグルコピラノシドが挙げられ、オクチルβ−Ｄ−グルコピラノシドおよびＴｗｅｅｎ−２０が最も好ましい。洗剤溶液中の洗剤の濃度は、典型的には約１００ｍＭ〜約２Ｍ、好ましくは約２００ｍＭ〜約１．５Ｍである。
【０１０２】
陽イオン性脂質およびプラスミドは、典型的には併合されて、約１：１〜約２０：１の、好ましくは約１：１〜約１２：１の、さらに好ましくは約２：１〜約６：１の電荷比（＋／−）を生じる。さらに溶液中のプラスミドの全体的濃度は、典型的には約２５ μｇ／ｍＬ〜約１ ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約２５ μｇ／ｍＬ〜約２００ ｍｇ／ｍＬ、さらに好ましくは約５０ μｇ／ｍＬ〜約１００ ｍｇ／ｍＬである。洗剤溶液中のプラスミドおよび陽イオン性脂質の組合せは、典型的には室温で、被覆複合体が生成するのに十分な時間、保持される。あるいはプラスミドおよび陽イオン性脂質は洗剤溶液中で併合され、約３７℃までの温度に温められ得る。温度に対して特に感受性であるプラスミドに関しては、被覆複合体は、低温で、典型的には約４℃以下で生成され得る。
【０１０３】
好ましい実施態様では、生成されるＳＰＬＰ中の核酸対脂質比（質量／質量比）は、約０．０１〜約０．０８の範囲である。精製過程が典型的には非封入核酸ならびに空のリポソームを除去するために、出発物質の比もこの範囲内である。別の好ましい実施態様では、ＳＰＬＰ調製は、核酸約４００μｇ／総脂質１０ｍｇまたは約０．０１〜約０．０８の、さらに好ましくは約０．０４の核酸対脂質比を用い、これは総脂質１．２５ｍｇ／核酸５０μｇに相当する。
【０１０４】
被覆プラスミド−脂質複合体の洗剤溶液は次に、非陽イオン性脂質と接触されて、プラスミド−脂質複合体および非陽イオン性脂質の洗剤溶液を提供する。この過程で有用である非陽イオン性脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピンおよびセレブロシドが挙げられる。好ましい実施態様では、非陽イオン性脂質は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミドまたはスフィンゴミエリンである。これらの脂質中のアシル基は、好ましくはＣ１０〜Ｃ２４の炭素鎖を有する脂肪酸由来のアシル基である。さらに好ましくはアシル基は、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルまたはオレオイルである。特に好ましい実施態様では、非陽イオン性脂質は１，２−ｓｎ−ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）または卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）である。最も好ましい実施態様では、プラスミド−脂質粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏで特性強化を示すフソゲン性粒子であり、非陽イオン性脂質はＤＯＰＥである。その他の好ましい実施態様では、非陽イオン性脂質はさらに、同時係属中ＵＳＳＮ０８／３１６，４２９（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）に記載されたようなルベースのポリマー、例えばＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００およびセラミドに接合されたポリエチレングリコールを含む。
【０１０５】
本発明の方法に用いられる非陽イオン性脂質の量は、典型的にはプラスミド５０μｇに対して総脂質約２〜約２０ｍｇである。好ましくは、総脂質の量は、約５〜約１０ｍｇ／プラスミド５０μｇである。
プラスミド−脂質複合体および非陽イオン性脂質の洗剤溶液の生成語、洗剤は、好ましくは透析により除去される。洗剤の除去は、プラスミドを取り囲む脂質−二重層の形成を生じて、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍのサイズを有する血清安定性プラスミド−脂質粒子を提供する。このように生成された粒子は凝集せず、任意にサイズ調整されて均一粒子サイズを達成する。
【０１０６】
血清安定性プラスミド−脂質粒子は、リポソームのサイジングに利用可能な方法のいずれかによりサイズ調整され得る。サイジングは、所望のサイズ範囲および粒子サイズの相対的に狭い分布を達成するために実行され得る。
粒子を所望のサイズにサイジングするために、いくつかの技法が利用可能である。リポソームのために用いられる、そして本発明の粒子にも等しく適用可能である一サイジング方法は、米国特許第４，７３７，３２３号に記載されている（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。浴またはプローブ音波処理による粒子懸濁液の音波処理は、約５０ｎｍ未満のサイズの粒子への漸次サイズ低減を生じる。均質化は、大型粒子から小型粒子に断片かするためにエネルギーを剪断することによる別の方法である。典型的均質化手法では、粒子は、選定粒子サイズ、典型的には約６０〜８０ ｎｍが観察されるまで、標準エマルションホモジナイザーにより再循環される。両方法において、粒子サイズ分布は、慣用的レーザー光線粒子サイズ識別またはＱＥＬＳによりモニタリングされ得る。
【０１０７】
小孔ポリカルボネート膜または不斉セラミック膜による粒子の押出しも、相対的に良好に限定されたサイズ分布に粒子サイズを低減するための有効な方法である。典型的には懸濁液は、所望の粒子サイズ分布が達成されるまで、１つまたはそれ以上の回数、膜を通して循環される。粒子は、連続的小孔膜を通して押出されて、サイズの漸次低減を達成し得る。
【０１０８】
別の群の実施態様では、本発明は、血清安定性プラスミド−脂質粒子の製造方法であって、以下の：
（ａ）有機溶媒中に陽イオン性脂質および非陽イオン性脂質を含む混合物を調製し、
（ｂ）核酸の水性溶液を過程（ａ）の前記混合物と接触させて、透明単一相を提供し、そして
（ｃ）前記有機溶媒を除去してプラスミド−脂質粒子の懸濁液を提供するが、この場合、前記プラスミドは脂質二重層中に封入され、そして粒子は血清中で安定であり、約５０〜約１５０ ｎｍのサイズを有する
ことを包含する方法を提供する。
【０１０９】
この群の実施態様において有用であるプラスミド（または核酸）、陽イオン性脂質および非陽イオン性脂質は、前記の洗剤透析方法に関して記載されたのと同様である。
有機溶媒の選択は、典型的には溶媒極性、ならびに溶媒が粒子形成の後期段階で除去され得る容易性についての考察を包含する。可溶化剤としても用いられる有機溶媒は、プラスミドおよび脂質の透明単一相混合物を提供するのに十分な量である。適切な溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、シクロペンタン、ベンゼン、トルエン、メタノールまたはその他の脂肪族アルコール、例えばプロパノール、イソプロパノール、ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、イソ−ブタノール、ペンタノールおよびヘキサノールが挙げられる。２つまたはそれ以上の溶媒の組合せも、本発明で用いられ得る。
【０１１０】
プラスミドと、陽イオン性および非陽イオン性脂質の有機溶液との接触は、典型的には水性溶液であるプラスミドの一次溶液および脂質の二次有機溶液を一緒に混合することにより成し遂げられる。この混合は、任意数の方法により、例えば機械的手段により、例えば渦巻ミキサーを用いることにより起こり得る、と当業者は理解する。
【０１１１】
プラスミドが脂質の有機溶媒と接触された後、有機溶媒は除去され、したがって血清安定性プラスミド−脂質粒子の水性懸濁液を生成する。有機溶媒を除去するために用いられる方法は、典型的には低圧での蒸発、または混合物全体の不活性ガス（例えば窒素またはアルゴン）流の吹込みを包含する。
このように形成された血清安定性プラスミド−脂質粒子は、典型的には約５０ｎｍ〜１５０ｎｍにサイズ調整される。さらなるサイズ低減または粒子中のサイズの均質化を達成するために、サイジングは前記と同様に実行され得る。
【０１１２】
その他の実施態様では、本方法はさらに、本発明の組成物を用いて細胞の形質転換を実行するのに有用である非脂質ポリ陽イオンを付加することを包含する。適切な非脂質ポリ陽イオンの例としては、ヘキサジメチリンブロミド（商標名ポリブレンＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（登録商標）でＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡから販売されている）またはヘキサジメチリンのその他の塩が挙げられる。その他の適切なポリ陽イオンとしては、例えばポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ポリアリルアミンおよびポリエチレンイミンの塩が挙げられる。
【０１１３】
その他の実施態様では、本発明のプラスミド−脂質粒子中に用いられるポリオキシエチレン複合体は、接合基（即ちホスファチジン酸またはホスファチジルエタノールアミン）を適切に官能化されたポリオキシエチレン誘導体と組合せることにより調製され得る。例えばホスファチジルエタノールアミンは、ポリオキシエチレンビス（ｐ−トルエンスルホネート）と併合されて、ホスファチジルエタノールアミン−ポリオキシエチレン複合体を提供する（Ｗｏｏｄｌｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １１０５：１９３−２００（１９９２）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）参照）。
【０１１４】
ある種の実施態様では、脂質−核酸複合体の生成は、単一相系（例えばＢｌｉｇｈおよびＤｙｅｒ単一相または水性および有機溶媒の同様の混合物）で、または適切な混合による二相系で実行され得る。
複合体の生成が単一相系で実行される場合、陽イオン性脂質および核酸は各々単一相混合物の容積中に溶解される。２つの溶液の組合せは、複合体が生成する単一混合物を提供する。あるいは複合体は、陽イオン性脂質が核酸（水性相中に存在する）と結合し、それを有機相に「引き寄せる」二相混合物中に生成し得る。
【０１１５】
別の実施態様では、本発明は脂質−核酸粒子の製造方法であって、以下の：
（ａ）非陽イオン性脂質および洗剤を含む溶液と核酸を接触させて核酸−脂質混合物を生成し、
（ｂ）核酸−脂質混合物と陽イオン性脂質を接触させて核酸の負電荷の一部分を中和し、そして核酸および脂質の電荷中和混合物を生成し、そして
（ｃ）電荷中和混合物から洗剤を除去して、核酸が分解から保護される脂質−核酸粒子を提供する
ことを包含する方法を提供する。
【０１１６】
一群の実施態様では、非陽イオン性脂質および洗剤の溶液は水性溶液である。核酸と非陽イオン性脂質および洗剤の溶液との接触は、典型的には核酸の一次溶液ならびに脂質および洗剤の二次溶液を一緒に混合することにより成し遂げられる。この混合は、任意数の方法により、例えば機械的手段により、例えば渦巻ミキサーを用いることにより起こり得る、と当業者は理解する。好ましくは核酸溶液は洗剤溶液でもある。本発明の方法に用いられる非陽イオン性脂質の量は、典型的には用いられる陽イオン性脂質の量に基づいて決定され、典型的には陽イオン性脂質の量の約０．２〜５倍、好ましくは用いられる陽イオン性脂質の量の約０．５〜２倍である。
【０１１７】
このようにして生成される核酸−脂質混合物は、陽イオン性脂質と接触されて、存在する核酸（またはその他のポリ陰イオン性物質）に関連する負電荷の一部分を中和する。用いられる陽イオン性脂質の量は、典型的には核酸の負電荷の少なくとも５０％を中和するのに十分な量である。好ましくは負電荷は、少なくとも７０％中和され、さらに好ましくは少なくとも９０％中和される。本発明において有用である陽イオン性脂質としては、例えばＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＣ−ＣｈｏｌおよびＤＭＲＩＥが挙げられる。これらの脂質および関連類似体は、同時係属中ＵＳＳＮ０８／３１６，３９９、米国特許第５，２０８，０３６号、第５，２６４，６１８号、第５，２７９，８３３号および第５，２８３，１８５号に記載されている（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。さらに陽イオン性脂質の多数の市販調製物が利用可能であり、本発明に用いられ得る。これらとしては、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む市販陽イオン性リポソーム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＵＳＡ））；ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを含む市販陽イオン性リポソーム（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ））；ならびにＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（ＤＯＧＳを含む市販陽イオン性脂質（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡ））が挙げられる。
【０１１８】
陽イオン性脂質と核酸−脂質混合物の接触は、多数の技法のいずれかにより、好ましくは陽イオン性脂質の溶液および核酸−脂質混合物を含有する溶液を一緒に混合することにより成し遂げられ得る。２つの溶液の混合（または任意のその他の方法での接触）時に、核酸に関連した負電荷の一部分が中和される。それにもかかわらず、核酸は依然として非縮合状態であり、親水性特徴を獲得する。
【０１１９】
陽イオン性脂質が核酸−脂質混合物と接触された後、洗剤（または洗剤および有機溶媒の組合せ）が除去され、このようにして脂質−核酸粒子を形成する。洗剤を除去するために用いられる方法は、典型的には透析を包含する。有機溶媒が存在する場合、除去は典型的には減圧での蒸発により、または混合物全体に不活性ガス（例えば窒素またはアルゴン）流を吹き込むことにより成し遂げられる。
【０１２０】
このように生成された粒子は、典型的には約１００ｎｍ〜数ミクロンにサイズ調整される。粒子におけるさらなるサイズ低減または粒子の均質性を達成するために、脂質−核酸粒子は音波処理され、濾過され、あるいはリポソーム処方物で用いられ、当業者に既知であるその他のサイジング技法を施される。
その他の実施態様では、方法はさらに、本発明の組成物を用いて細胞のリポフェクションを実行するのに有用である非脂質ポリ陽イオンを付加することを包含する。適切な非脂質ポリ陽イオンの例としては、ヘキサジメチリンブロミド（商標名ポリブレンＰＯＬＹＢＲＥＮＥ（登録商標）でＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ， ＵＳＡから販売されている）またはヘキサジメチリンのその他の塩が挙げられる。その他の適切なポリ陽イオンとしては、例えばポリ−Ｌ−オルニチン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ポリアリルアミンおよびポリエチレンイミンの塩が挙げられる。これらの塩の付加は、好ましくは粒子が形成された後である。
【０１２１】
別の局面では、本発明は、脂質−核酸粒子の製造方法であって、以下の：
（ａ）ある量の陽イオン性脂質を溶液中で核酸と接触させる。溶液は約１５〜３５％の水および約６５〜８５％の有機溶媒を含み、そして陽イオン性脂質の量は、約０．８５〜２．０の＋／マイナス電荷比を生じて、疎水性電荷中和脂質−核酸複合体を提供するのに十分な量であり、
（ｂ）溶液中の疎水性電荷中和脂質−核酸複合体を非陽イオン性脂質と接触させて、脂質−核酸混合物を提供し、そして
（ｃ）脂質−核酸混合物から有機溶媒を除去して、核酸が分解から保護される脂質−核酸粒子を提供する
ことを包含する方法を提供する。
【０１２２】
本発明のこの局面において有用である核酸、非陽イオン性脂質、陽イオン性脂質および有機溶媒は、洗剤を用いた前記の方法に関して記載されたものと同一である。実施態様の一群では、過程（ａ）の溶液は単一相である。実施態様の別の群では、過程（ａ）の溶液は二相である。
好ましい実施態様では、陽イオン性脂質は、ＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＧＳまたはそれらの組合せである。その他の好ましい実施態様では、非陽イオン性脂質はＥＳＭ、ＤＯＰＥ、ポリエチレングリコールベースのポリマー（例えばＰＥＧ２０００、ＰＥＧ５０００、ＰＥＧ改質リン脂質またはＰＥＧ改質セラミド）またはそれらの組合せである。さらにその他の好ましい実施態様では、有機溶媒はメタノール、クロロホルム、メチレンクロリド、エタノール、ジエチルエーテルまたはそれらの組合せである。
【０１２３】
特に好ましい実施態様では、核酸はプラスミドであり、陽イオン性脂質はＤＯＤＡＣ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＳＰＡ、ＤＭＲＩＥ、ＤＯＧＳまたはそれらの組合せであり、非陽イオン性脂質はＥＳＭ、ＤＯＰＥ、ポリエチレングリコールベースのポリマーまたはそれらの組合せであり、そして有機溶媒はメタノール、クロロホルム、メチレンクロリド、エタノール、ジエチルエーテルまたはそれらの組合せである。
【０１２４】
前記のように、陽イオン性脂質との核酸の接触は、典型的には核酸の一次溶液および脂質の二次溶液を一緒に混合することにより、好ましくは機械的手段により、例えば渦巻ミキサーを用いることにより成し遂げられ得る。その結果生じる混合物は、前記の本発明の一局面に関して記載されたような複合体を含有する。これらの複合体は次に、非陽イオン性脂質の付加および有機溶媒の除去により、粒子に転化される。非陽イオン性脂質の付加は、典型的には、複合体を含有する混合物に非陽イオン性脂質の溶液を単に付加することにより成し遂げられる。逆付加も用いられ得る。有機溶媒のその後の除去は、当業者に既知のそして前記の方法により成し遂げられ得る。
【０１２５】
本発明の方法のこの局面に用いられる非陽イオン性脂質の量は、典型的には、電荷中和脂質−核酸複合体を提供するために用いられた陽イオン性脂質の量の約０．２〜５倍の量である。好ましくはその量は、用いられた陽イオン性脂質の量の０．５〜２倍である。
さらに別の局面では、本発明は、前記の方法により調製される脂質−核酸粒子を提供する。これらの実施態様では、脂質−核酸粒子は、正味電荷中性であるか、または粒子により大きい遺伝子リポフェクション活性を提供する全体的伝家を保有する。好ましくは、粒子の核酸構成成分は、所望のタンパク質をコードするか、または望ましくないタンパク質の産生を遮断する核酸である。特に好ましい実施態様では、核酸はプラスミドであり、非陽イオン性脂質は卵スフィンゴミエリンであり、そして陽イオン性脂質はＤＯＤＡＣである。
【０１２６】
ＳＰＬＰ−ＣＰＬ（ＣＰＬ含有ＳＰＬＰ）の製造のための種々の一般的方法が、本明細書中で考察されている。２つの一般的技法としては、「後挿入」技法、即ち例えば予備生成ＳＰＬＰ中へのＣＰＬの挿入、ならびにＣＰＬが例えばＳＰＬＰ生成過程中に脂質混合物中に含入される「標準」技法が挙げられる。後挿入技法は、主としてＳＰＬＰ二重層膜の外側面にＣＰＬを有するＳＰＬＰを生じ、一方標準技法は内および外面の両方にＣＰＬを有するＳＰＬＰを提供する。
【０１２７】
特に「後挿入」は、ＳＰＬＰを生成し（任意の方法により）、そして適切な条件（好ましくは６０℃で２〜３時間）下で、ＣＰＬの存在下で予備生成ＳＰＬＰをインキュベートすることを包含する。６０〜８０％のＣＰＬがレシピエント小胞の外葉片中に挿入されて、約５〜１０ｍｏｌ％まで（総脂質と比較して）の最終濃度を生じる。本方法は特に、リン脂質（コレステロールを含有し得る）から作られる小胞に、そしてＰＥＧ−脂質（例えばＰＥＧ−セラミド）を含有する小胞に有用である。
【０１２８】
「標準」技法の一例では、本発明のＣＰＬ−ＳＰＬＰは、押出しにより生成され得る。この実施態様では、ＣＰＬを含む脂質のすべてがクロロホルム中に同時溶解され、これは次に窒素中およびその後の高真空下で除去される。脂質混合物は適切な緩衝液中で水和され、１００ｎｍの孔サイズを有する２つのポリカーボネートフィルターを通して押出される。その結果生じるＳＰＬＰは、内および外面の両方にＣＰＬを含有する。さらに別の標準技法では、ＣＰＬ−ＳＰＬＰの生成は、例えば米国特許第５，９７６，５６７号および第５，９８１，５０１号（これらの記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）で考察されたような洗剤透析またはエタノール透析法を用いて成し遂げられ得る。
【０１２９】
ＩＶ．医薬調製物
本発明の核酸−脂質粒子は、単独で、または投与経路および標準製薬業務にしたがって選択される生理学的に許容可能な担体（例えば生理食塩水またはリン酸塩緩衝液）との混合物中で投与され得る。一般に、生理食塩水は、医薬上許容可能な担体として用いられる。その他の適切な担体としては、例えば水、緩衝化水、０．４％食塩水、０．３％グリシン等が挙げられ、安定性強化のための糖タンパク質、例えばアルブミン、リポタンパク質、グロブリン等を含む。
【０１３０】
医薬担体は一般に、粒子形成後に付加される。したがって粒子が形成された後、粒子は医薬上許容可能な担体、例えば生理食塩水中に希釈され得る。
医薬処方物中の粒子の濃度は、選択される特定投与方式にしたがって、広範に、即ち約０．０５重量％未満から、通常は約または少なくとも約２〜５重量％、そして１０〜３０重量％まで変わり得るし、そして主として流体容積、粘度等により選択される。例えば濃度は、治療に関連した流体負荷を下げるために増大され得る。これは、アテローム硬化症関連うっ血性心不全または重症高血圧患者において特に望ましい。あるいは刺激性脂質から成る粒子は、投与部位での炎症を低減するために低濃度に希釈され得る。
【０１３１】
前記のように、ＰＥＧ−脂質複合体、例えばＰＥＧ−セラミドまたはＰＥＧ−ＰＥ、ガングリオシドＧＭ１改質脂質またはＡＴＴＡ−脂質を粒子に含入するのがしばしば望ましい。このような構成成分の付加は、粒子凝集を防止し、循環寿命を増大し、そして標的組織への脂質−核酸粒子の送達を増大するための手段を提供する。典型的には、粒子中の構成成分の濃度は、約１〜２０％、さらに好ましくは約３〜１０％である。
【０１３２】
医薬組成物は、慣用的な周知の滅菌技法により滅菌され得る。水性溶液は、使用のために包装されまたは無菌条件下で濾過されて、凍結乾燥され、凍結乾燥調製物は投与前に滅菌水性溶液と併合される。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要な場合には医薬上許容可能な補助物質、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、張度調整剤等、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化カルシウムを含有し得る。さらに粒子懸濁液は、貯蔵時のフリーラジカルおよび脂質−過酸化物損害に対して脂質を防護する脂質保護剤を含み得る。親油性フリーラジカル消滅剤、例えばアルファトコフェロール、および水溶性鉄特異的キレート化剤、例えばフェリオキサミンが適している。
【０１３３】
それらの使用の別の例では、脂質−核酸粒子は、広範囲の局所投与形態、例えばゲル、油、エマルション（これらに限定されない）中に組入れられる。例えば核酸−脂質粒子を含有する懸濁液が処方され、局所的クリーム、ペースト、軟膏、ゲル、ローション等として投与され得る。
本発明は、キット形態の脂質−核酸粒子も提供し得る。キットは、典型的には、脂質−核酸粒子の種々の素子およびエンドソーム膜不安定剤（例えばカルシウムイオン）を保持するために区画化される容器から成る。キットは、好ましくは脱水形態で、それらの再水和および投与のための使用説明書とともに本発明の組成物を含入する。さらにその他の実施態様では、粒子および／または粒子を含む組成物は、粒子の表面に付着されるターゲッティング部分を有する。脂質（例えば本発明の粒子中に用いられるもの）にターゲッティング部分（例えば抗体、タンパク質）を付着させる方法は、当業者には既知である。
【０１３４】
Ｖ．脂質−核酸粒子処方物の投与
本発明の血清安定性核酸−脂質粒子は、細胞中への核酸の導入に有用である。したがって本発明は、細胞中への核酸（例えばプラスミド）の導入方法も提供する。本方法は、前記のように粒子を先ず生成し、次にトランスフェクションが起こるのに十分な時間の間細胞と粒子を接触することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実行される。
【０１３５】
本発明の核酸−脂質粒子は、それらが混合されるかまたは接触されるほとんどすべての細胞型に吸着され得る。一旦吸着されれば、粒子は細胞の一部分によりエンドサイトースされ、脂質を細胞膜と交換し、または細胞と融合する。粒子の核酸部分の移入または組入れは、これらの経路のいずれかにより起こり得る。特に融合が起こると、粒子膜は細胞膜に組み込まれ、粒子の内容物は細胞内流体と併合する。
【０１３６】
１．Ｉｎ ｖｉｔｒｏ遺伝子移入
ｉｎ ｖｉｔｒｏ適用に関しては、核酸の送達は植物または動物起源であれ、脊椎動物または無脊椎動物であれ、いかなる組織または型であれ、培養中で増殖する任意の細胞に対してであり得る。好ましい実施態様では、細胞は動物細胞、さらに好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくはヒト細胞である。
【０１３７】
細胞および脂質−核酸粒子間の接触は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実行される場合、生物学的適合培地中で起こる。粒子の濃度は特定用途によって広範に変わるが、しかし一般に、約１μｍｏｌ〜約１０ｍｍｏｌである。核酸−脂質粒子による細胞の治療は一般に、生理学的温度（約３７℃）で、約１〜４８時間、好ましくは約２〜４時間の間実行される。
【０１３８】
好ましい実施態様の一群では、脂質−核酸粒子懸濁液は、約１０３〜約１０５細胞／ｍＬ、さらに好ましくは２ ｘ １０４細胞／ｍＬの細胞密度を有する６０〜８０％集密プレート化細胞に付加される。細胞に付加される懸濁液の濃度は、好ましくは約０．０１〜０．２μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは約０．１μｇ／ｍＬである。
２．Ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子移入
あるいは本発明の組成物は、当業者に既知の方法を用いたｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子移入のためにも用いられ得る。特にＺｈｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１： ２０９−２１１（１９９３）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）は、ＤＯＴＭＡ−ＤＯＰＥ複合体を用いたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）発現プラスミドの静脈内送達を記載する。Ｈｙｄｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５０−２５６（１９９３）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）は、リポソームを用いた、マウスの気道の上皮への、ならびに肺の肺胞への嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス調節物質（ＣＦＴＲ）遺伝子の送達を記載する。Ｂｒｉｇｈａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． ２９８： ２７８−２８１（１９８９）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）は、細胞ない酵素クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）をコードする機能性原核生物遺伝子によるマウスの肺のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクションを記載する。
【０１３９】
Ｉｎ ｖｉｖｏ投与に関しては、医薬組成物は、好ましくは非経口的に、即ち関節内、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内に投与される。さらに好ましくは、医薬組成物は、ボーラス注射により、静脈内にまたは腹腔内に投与される（例えば米国特許第５，２８６，６３４号（Ｓｔａｄｌｅｒ等）参照）（この記載内容は、参照により本明細書中に含まれる）。細胞内核酸送達は、Ｓｔｒａｕｂｒｉｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． １０１： ５１２−５２７（１９８３）； Ｍａｎｎｉｎｏ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６８２−６９０（１９８８）； Ｎｉｃｏｌａｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． ６：２３９−２７１（１９８９）およびＢｅｈｒ， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． ２６：２７４−２７８（１９９３）でも考察された。脂質ベースの治療薬のさらにその他の投与方法は、例えば米国特許第３，９９３，７５４号（Ｒａｈｍａｎ等）、米国特許第４，１４５，４１０号（Ｓｅａｒｓ）、米国特許第４，２３５，８７１号（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ等）、米国特許第４，２２４，１７９号（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）、米国特許第４，５２２，８０３号（Ｌｅｎｋ等）および米国特許第４，５８８，５７８号（Ｆｏｕｎｔａｉｎ等）に記載されている。
【０１４０】
ある種の実施態様では、医薬調製物は、組織への調製物の直接適用により標的組織と接触され得る。適用は、局所的「開放」または「閉鎖」手法によりなされ得る。「局所的」とは、環境に曝露された組織、例えば皮膚、口腔咽頭部、外耳道等への医薬調製物の直接適用を意味する。「開放」手法は、患者の皮膚を切開し、医薬調製物が適用される下層組織を可視化することを包含する手法である。これは一般に、外科的手法により、例えば肺にアクセスするための開胸術、腹部内臓にアクセスするための側腹切開術、または標的組織へのその他の直接的外科的アプローチにより成し遂げられる。「閉鎖」手法は、内部標的組織が直接可視化されないが、しかし皮膚における小創傷を通して器機を挿入することによりアクセスされる侵襲性手法である。例えば調製物は、針洗浄により腹膜に投与され得る。同様に、医薬調製物は、脊髄麻酔または脊髄のメトラザミド画像形成のために一般に実行されるような腰椎穿刺中の注入とその後の患者の適切な位置調節により髄膜または脊髄に投与され得る。あるいは調製物は、内視鏡装置を通して投与され得る。
【０１４１】
脂質−核酸粒子は、肺に吸入されるエーロゾル中（Ｂｒｉｇｈａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｓｃｉ． ２９８： ２７８−２８１（１９８９）参照）でも、または疾患部位での直接注入（Ｃｕｌｖｅｒ， ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ， ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ， Ｉｎｃ．， Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ． Ｐｐ．７０−７１（１９９４））によっても投与され得る。
本発明の方法は、種々の宿主において実施され得る。好ましい宿主としては、哺乳類、例えばヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、畜牛、ウマ、ヒツジ等が挙げられる。
【０１４２】
投与される粒子の量は、核酸対脂質の比、用いられる特定の核酸、診断されている疾患状態、患者の年齢、体重および症状、ならびに臨床医の判断によっているが、しかし一般的には約０．０１〜約５０ｍｇ／体重１ｋｇ、好ましくは約０．１〜約５ｍｇ／体重１ｋｇ、または約１０８〜１０１０粒子／注射である。
３．遺伝子の機能性コピーの挿入
遺伝子療法のいくつかの方法は、宿主染色体中に遺伝子の機能性コピーを組込むことにより、内因性遺伝子中の欠陥を補償するのに役立つ．挿入遺伝子は宿主ＤＮＡを用いて複製され、欠陥遺伝子を補償するレベルで発現される。このアプローチによる治療に対して改善可能な疾患はしばしば、劣性突然変異により特性化される。即ち内因性遺伝子の両コピーは、症状が現れるのを欠いているに違いない。このような疾患としては、嚢胞性繊維症、鎌状赤血球貧血、β−サラセミア、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、重症複合型免疫欠損病、α−１−アンチトリプシン欠損症、白子症、アルカプトン尿症、リソソーム蓄積症、エーレルス−ダンロー症候群、血友病、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ欠損、無ガンマグロブリン血症、尿崩症、レッシュ−ナイハン症候群、筋ジストロフィー、ヴィスコット−オールドリッチ症候群、ファブリー病、脆弱Ｘ症候群等が挙げられる。その他の劣性突然変異は当業界で既知であり、それらを治療するための本発明の方法の使用が本明細書中で意図される。
【０１４３】
前記の遺伝子欠陥を補償するために外因性機能性遺伝子を導入するためのいくつかの方法が存在する。一アプローチにおいては、疾患に罹患している患者から細胞が取り出され、ｉｎ ｖｉｔｒｏで脂質−ベクター複合体と接触させられる。細胞は、疾患症状が明示される組織型から取り出されるべきである。細胞が複製できない場合、用いられるベクターは選択マーカーであり、マーカーをインターナライズおよび発現した細胞が選択され得る．特に選択が実施されない場合、細胞中への遺伝子の移入の頻度が高い、例えば細胞の少なくとも約１、５、１０、２５または５０％であることが重要である。
【０１４４】
細胞ゲノム中へのベクターの取込み、そして任意に選択後、細胞は患者に再導入される。この適用、そして以下で考察されるその他のもの（優性突然変異を矯正するための部位特異的組換えを除く）においては、補償されつつある欠陥遺伝子に占められているのと同じ部位に、脂質−核酸粒子により供給される遺伝子が送達される必要はない。
【０１４５】
あるいは脂質−ベクター複合体は、医薬組成物として患者に直接導入され得る。複合体は、治療的有効用量で、治療中の遺伝性障害に罹患した組織（単数または複数）に送達される。このおよびその他の方法において、治療的有効用量とは、疾患およびその合併症の症状を治癒するかまたは少なくとも部分的に阻止するのに十分な量である。前記の症状の治療のための本発明の組成物の有効用量は、多数の異なる因子、例えば投与手段、標的部位、患者の生理学的状態および投与されるその他の薬剤によって変わる。したがって治療投与量は、安全性および効力を最適にするために滴定される必要がある。約１０ｎｇ〜１ｇ、１００ｎｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１０ｍｇ、または３０〜３００μｇＤＮＡ／患者が典型的である。投与経路としては、口腔、鼻、胃、静脈内、皮内および筋内が挙げられる。
【０１４６】
核酸−脂質複合体は、生殖系列変更を達成するために、胚性幹細胞または接合子を移入するためにも用いられ得る（Ｊａｅｎｉｓｃｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４０：１４６８−１４７４（１９８８）； Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １０１， ４１４（１９８４）； Ｈｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃ．Ｓ．Ｈ．Ｌ． Ｎ．Ｙ．（１９８６）；およびＨａｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１５：６８０（１９８５）； Ｇａｎｄｏｌｆｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔ． ８１：２３−２８（１９８７）； Ｒｅｘｒｏａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｎｉｍ． Ｓｃｉ． ６６： ９４７−９５３ （１９８８）およびＥｙｅｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔ． ８５： ７１５−７２０ （１９８９）； Ｃａｍｏｕｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔ． ７２： ７７９−７８５ （１９８４）； Ｈｅｙｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２７： ５９６８（１９８７）参照）。しかしながらこれらの方法は、目下、ヒト胚を操作する場合の倫理的および調節的束縛のために、ヒト治療よりも獣医学的適用により適している。
【０１４７】
一例として、嚢胞性繊維症（ＣＦ）は、通常は、白色人種集団において高発生率を有する致死的劣性遺伝病である。この疾患に関与する遺伝子は、Ｒｉｏｒｄａｎ ｅｔ ａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１０５９−１０６５（１９８９）により単離された。それは上皮細胞膜を通しての塩素イオン（Ｃｌ−）の移入に関与する嚢胞性繊維症膜貫通コンダクタンス調節物質（ＣＦＴＲ）と呼ばれるタンパク質をコードする。遺伝子の突然変異は、上皮細胞におけるＣｌ−分泌の欠損を引き起こして、種々の臨床的症状発現をもたらす。ＣＦは、外分泌腺分泌濃化、膵不全、腸閉塞および脂肪の吸収不良を含めた多数の症状を有するが、しかし死亡率に影響を及ぼす最も重篤な因子は慢性肺疾患である。したがってＣＦ患者を治療するために、機能性ＣＦＴＲ遺伝子産物に関するコード配列を含有するベクターは、脂質と、任意に製剤賦形剤と複合されて、ベクター−脂質組成物が肺に達するよう、鼻投与により患者に導入され得る。ベクター−脂質複合体の用量は、好ましくは約１０８〜１０１０粒子である。
【０１４８】
別の例として、αまたはγグロブリン遺伝子の欠陥（ＭｃＤｏｎａｇｈ ＆ Ｎｉｅｎｈｕｉｓ ｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｆａｎｃｙ ａｎｄ Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ（ｅｄｓ． Ｎａｔｈａｎ ＆ Ｏｓｋｉ， Ｓａｕｎｄｅｒｓ， ＰＡ， １９９２） ａｔ ｐｐ．７８３−８７９参照）は、遺伝子の機能性コピーを含有する核酸−脂質複合体による造血性幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏ治療により補償され得る。遺伝子は幹細胞中に融合し、これは次に患者に再導入される。ファンコニー貧血補体Ｃ群に関与する遺伝子の欠陥は、類似戦略により治療され得る（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９４：１４４０−１４４８（１９９４）参照）。
【０１４９】
その他の用途としては、癌細胞または癌になる危険性のある細胞中への腫瘍抑制遺伝子の機能性コピーの導入が挙げられる。内因性腫瘍抑制遺伝子の一方または両方のコピーにおける欠陥を有する個体は、特に癌を発症する危険性がある。例えばリー−フラウメニ癌症候群は、個体が突然変異対ｐ５３対立遺伝子を受容して、種々の癌の初期開始を生じる遺伝性症状である（Ｈａｒｒｉｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１９８０−１９８１（１９９３） Ｆｒｅｂｏｕｒｇ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ ８９：６４１３−６４１７（１９９２）； Ｍａｌｋｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５０：１２３３（１９９０））。癌細胞または癌になる危険性のある細胞中での腫瘍抑制遺伝子の発現は、細胞増殖およびその他の癌状態の症状発現を予防し、阻止しおよび／または逆転するのに有効である。本発明に用いるための適切な腫瘍抑制遺伝子としては、ｐ５３（Ｂｕｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ７０：２４５−２５２（１９８８））、ＡＰＣ、ＤＣＣ、Ｒｂ、ＷＴ１およびＮＦ１（Ｍａｒｘ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：７５１−７５２（１９９３）； Ｍａｒｓｈａｌｌ， Ｃｅｌｌ ６４：３１３−３２６（１９９１））が挙げられる。腫瘍抑制遺伝子の機能性コピーを保有する脂質−核酸複合体は、通常は、意図された作用部位に最も近位の経路によりｉｎ ｖｉｖｏで投与される。例えば皮膚癌は局所投与により、そして白血病は静脈内投与により治療され得る。
【０１５０】
４．遺伝子発現の抑制
本発明の核酸−脂質複合体を用いる遺伝子療法の方法は、病原性微生物、例えばＨＩＶに感染したまたは感染する危険性のある患者または細胞の予防的または治療的処置のためにも用いられ得る。妨害ウイルス複製の標的遺伝子機能を遮断する場合のアンチセンス分子の有効性は、多数の異なる系において実証されている（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３５：４５２−５４（１９８８）， Ｍａｌｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５８：２０５−１４（１９８９） ＆ Ｔｒｏｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５９：１１３−２０（１９８９））。用いられるベクターとしては、アンチセンス転写体をコードするＤＮＡセグメントが挙げられるが、これは病原性微生物からのゲノムのセグメントと相補的である。セグメントは、好ましくは微生物の生活環において不可欠な役割を演じるべきであり、そして微生物に独特でもある（または少なくとも療法を施されている患者の天然ゲノムのゲノムからは少なくとも存在しない）必要がある。例えばＨＩＶウイルス上の抑制のための適切な部位としては、ＴＡＲ、ＲＥＶまたはｎｅｆが挙げられる（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１４８５−１４８８（１９９２））。Ｒｅｖは、核からの非スプライス化ＨＩＶｐｒｅ　ｍＲＮＡの輸送を促す調節ＲＮＡ結合タンパク質である（Ｍａｌｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３８：２５４（１９８９））。Ｔａｔは、５‘フランキングｍＲＮＡ中の認識配列を結合することにより機能する転写アクチベーターであると考えられる（Ｋａｒｎ ＆ Ｇｒａｅｂｌｅ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． ８：３６５（１９９２））。核酸−脂質複合体は、治療的有効用量で、ｅｘ ｖｉｖｏに、または静脈内注射により、白血球または造血性幹細胞中に導入される。治療は、ＨＩＶ−ヒトに予防的に、またはＨＩＶにすでに感染したヒトに投与され得る。
【０１５１】
接着タンパク質をコードする内因性レシピエント細胞遺伝子の発現を抑制するために、同様の方法が用いられる。接着タンパク質発現の抑制は、望ましくない炎症応答を未然に防ぐのに有用である。選定ベクター中に存在するアンチセンスセグメントにより抑制され得る接着タンパク質としては、インテグリン、セレクチンおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリー成員が挙げられる（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３４６： ４２５−４３３（１９９０）； Ｏｓｂｏｒｎ， Ｃｅｌｌ ６２：３（１９９０）； Ｈｙｎｅｓ， Ｃｅｌｌ ６９：１１（１９９２）参照）。インテグリンは、一般に短細胞質ドメインを有するα鎖（１２０〜１８０ｋＤａ）およびβ鎖（９０〜１１０ｋＤａ）から成るヘテロ二量体膜貫通糖タンパク質である。３つの既知のインテグリンＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１およびＰ１５０，９５は、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂおよびＣＤ１１ｃと呼ばれる異なるアルファサブユニット、ならびにＣＤ１８と呼ばれる共通のベータサブユニットを有する。ＬＦＡ−１（αＬβ２）は、リンパ球、顆粒球および単球上で発現され、主にＩＣＡＭ−１と呼ばれるＩｇ−ファミリー成員対向受容体と（そしておそらくは小程度にＩＣＡＭ−２と）結合する。ＩＣＡＭ−１は、多数の細胞、例えば白血球および内皮細胞上で発現され、そしてサイトカイン、例えばＴＮＦおよびＩＬ−１により血管内皮上で上向き調節される。Ｍａｃ−１（αＭβ２）は好中球および単球上に分布され、ＩＣＡＭ−１（そしておそらくはＩＣＡＭ−２）とも結合する。第三β２インテグリンであるＰ１５０，９５（αＸβ２）も、好中球および単球上に見出される。セレクチンは、Ｌ−セレクチン、Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチンから成る。
【０１５２】
５．形質転換される細胞
本発明の組成物および方法は、広範な種々の細胞型をｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで処理するために用いられる。これらの中で最もしばしば遺伝子療法のために標的化されるものは、造血性前駆体（幹）細胞である。その他の細胞としては、標的化細胞の一部分が非分裂中であるかまたはゆっくり分裂しているものが挙げられる。これらの例としては、繊維芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞、骨格筋および平滑筋細胞、骨芽細胞、ニューロン、静止リンパ球、最終分化細胞、緩徐または非周期変化一次細胞、実質細胞、リンパ系細胞、上皮細胞、骨細胞等が挙げられる。本方法および組成物は、広範な種々の脊椎動物、例えば哺乳類、ヒト細胞集団のほかに、特に獣医学的に重要なもの、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ネズミ、ウサギ、ブタ等の細胞とともに用いられ得る。
【０１５３】
細胞の組織培養が必要とされ得る程度に、それは当業界で周知である。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）（Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ， ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）、Ｋｕｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， Ｋｕｃｈｌｅｒ， Ｒ．Ｊ．， Ｄｏｗｄｅｎ， Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓ， Ｉｎｃ．，ならびにそこに引用された参考文献は、細胞の培養に対する一般的指針を提供する。培養細胞系はしばしば、細胞の単一層の形態であるが、しかし細胞懸濁液も用いられ得る。
【０１５４】
遺伝子療法は、標的細胞への治療用遺伝子の効率的送達によっている。遺伝子療法のために標的化されたほとんどの体細胞、例えば造血細胞、皮膚繊維芽細胞およびケラチノサイト、肝細胞、内皮細胞、筋肉細胞およびリンパ球は、普通は非分裂製である。遺伝子療法のために最も広範に用いられるベクターであるレトロウイルスベクターは、残念ながら、有効な形質導入のためには細胞分裂を要する（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０：４２３９−４２４２（１９９０））。これは、他の遺伝子療法ベクター、例えばアデノ随伴ベクターに関しても言えることである（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：８９１５−８９１９（１９９４）； Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：８２８２−８２８７（１９９４）； Ｓｒｉｖａｓｔｒａｖａ， Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ ２０：５３１−５３８（１９９４））。近年、ＨＩＶベースのベクターは、非分裂細胞をトランスフェクトすることが報告された。それにもかかわらず、多数の遺伝子療法処置のための好ましい標的である大多数の幹細胞は、普通は増殖中でない。したがって形質導入の効率はしばしば相対的に低く、遺伝子産物は治療的または予防的有効量で発現され得ない。このために、遺伝子移入前または移入中の幹細胞の刺激（例えば増殖因子を用いた処置による）、５−フルオロウラシルによる前処理、サイトカインの存在下での感染、ならびに幹細胞が感染中に分裂する見込みを増大するためのベクター感染期間の延長といった技術を研究者が開発するに至ったが、しかしこれらによりかなえられた成功は限定されていた。
【０１５５】
６．外来核酸の検出
当該遺伝子をコードする核酸構築物で既定の細胞が形質導入された後、どの細胞または細胞株が遺伝子産物を発現したかを検出すること、そして工学処理細胞中の遺伝子産物の発現のレベルを査定することは、重要である。これは、遺伝子産物をコードする核酸の検出を必要とする。
【０１５６】
当業者に周知の多数の手段のいずれかにより、本明細書中で核酸およびタンパク質が検出され、定量される。これらの例としては、分析的生化学的方法、例えば分光測光法、放射線撮影、電気泳動、毛管電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィー等、ならびに種々の免疫学的方法、例えば流体またはゲル沈降素反応、免疫拡散（単一または二重）、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光検定等が挙げられる。核酸の検出は、周知の方法、例えばサザン分析、ノーザン分析、ゲル電気泳動、ＰＣＲ、放射能標識、シンチレーション計数およびアフィニティークロマトグラフィーにより行われる。
【０１５７】
核酸ハイブリダイゼーションフォーマットの選択は重要ではない。種々の核酸ハイブリダイゼーションフォーマットが当業者に既知である。例えば一般的フォーマットとしては、サンドイッチ検定および競合または置換検定が挙げられる。ハイブリダイゼーション技法は一般に、”Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ， Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，” Ｅｄ． Ｈａｍｅｓ， Ｂ．Ｄ． ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ， Ｓ．Ｊ．， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９８５に記載されている。
【０１５８】
ハイブリダイゼーション検定の感度は、検出中の標的核酸を増加させる核酸増幅系の使用により強化され得る。分子プローブとして用いるために、またはその後のサブクローニングのための核酸断片を生成するために配列を増幅するのに適したｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅技法が既知である。このようなｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅方法により技術者を指図するのに十分な技法の例、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅およびその他のＲＮＡポリメラーゼ媒介性技法（例えばＮＡＳＢＡ）は、Ｂｅｒｇｅｒ、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌならびにＭｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９８７）、米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ． ｅｄｓ） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ． Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）； Ａｒｎｈｅｉｍ ＆ Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔｏｂｅｒ １， １９９０）， Ｃ＆ＥＮ ３６−４７； Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｏｆ ＮＩＨ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ３：８１−９４（１９９１）； （Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６：１１７３（１９８９）； Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：１８７４（１９９０）； Ｌｏｍｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３５：１８２６（１９８９）； Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１： １０７７−１０８０（１９８８）； Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８： ２９１−２９４（１９９０）； Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ， Ｇｅｎｅ， ４：５６０（１９８９）； Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ８９：１１７（１９９０）およびＳｏｏｋｎａｎａｎ ａｎｄ Ｍａｌｅｋ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １３：５６３−５６４（１９９５）に見出される。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅核酸の改良型クローニング方法は、米国特許第５，４２６，０３９号（Ｗａｌｌａｃｅ等）に記載されている。当業界で近年記載されたその他の方法は、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ（登録商標）、Ｃａｎｇｅｎｅ， Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｏｎｔａｒｉｏ）およびＱベータレプリカーゼ系である。これらの系は、選択配列が存在する場合にのみＰＣＲまたはＬＣＲプライマーが延長または結繋されるよう設計される突然変異体を直接同定するために用いられ得る。あるいは選択配列は一般に、例えば非特異的ＰＣＲプライマーを用いて増幅され、増幅標的領域は、突然変異を示す特異的配列に関して後にプローブされ得る。
【０１５９】
例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ増幅法において、プローブとして用いるための、遺伝子プローブとして用いるための、または阻害剤構成成分としてのオリゴヌクレオチドは、典型的には、例えばＮｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２：６１５９−６１６８（１９８４）に記載されたような自動合成機を用いて、Ｂｅａｕｃａｇｅ ａｎｄ Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ２２（２０）：１８５９−１８６２（１９８１）により記載された固相ホスホラミダイトトリエステル法にしたがって化学的に合成される。オリゴヌクレオチドの精製は、必要な場合には、典型的にはネイティブアクリルアミドゲル電気泳動により、またはＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｒｅｇｎｉｅｒ， Ｊ． Ｃｈｒｏｍ．， ２５５：１３７−１４９（１９８３）に記載されたように陰イオン交換ＨＰＬＣにより実施される。合成オリゴヌクレオチドの配列は、Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂｅｒｔ（１９８０） ｉｎ Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｌｄａｖｅ（ｅｄｓ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ６５：４９９−５６０の化学分解法を用いて立証され得る。
【０１６０】
遺伝子の発現レベルを確定するための代替的手段は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションである。Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検定は周知であり、Ａｎｇｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １５２：６４９−６６０（１９８７）に一般的に記載されている。Ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション検定では、細胞は固体支持体、典型的にはガラススライドに固定される。ＤＮＡがプローブされる場合、細胞は熱またはアルカリにより変性される。細胞は次に、中等度温度でハイブリダイゼーション溶液と接触されて、標識される特異的プローブのアニーリングを可能にする。プローブは、好ましくは放射性同位元素または蛍光レポーターにより標識される。
【０１６１】
７．外来遺伝子産物の検出
生成物を産生するための当該遺伝子の発現は、種々の方法により検出されるかまたは定量され得る。好ましい方法は、特異的抗体の使用を包含する。
ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生方法は、当業者に既知である（例えばＣｏｌｉｇａｎ（１９９１）， ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ， Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ， ＮＹ；およびＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ（１９８９）， ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ； Ｓｔｉｔｅｓ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．） ＢＡＩＳＩＣ ＡＮＤ ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ （４ｔｈ ｅｄ．） Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｌｏｓ Ａｔｌｏｓ， ＣＡおよびそこに引用された参考文献；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）， ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ： ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ ＡＮＤ ＰＲＡＣＴＩＣＥ（２ｎｄ ｅｄ．） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ；およびＫｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５−４９７（１９７５）参照）。このような技法としては、ファージまたは類似のベクターにおける組換え抗体のライブラリーからの抗体の選択による抗体調製を包含する（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）およびＷａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３４１：５４４−５４６（１９８９）参照）。特異的モノクローナルおよびポリクローナル抗体および抗血清は、通常は少なくとも約．１ｍＭの、さらに通常は少なくとも約１μＭ、好ましくは少なくとも約．１μＭまたはそれ以上で、最も典型的にはそして好ましくは．０１μＭまたはそれ以上のＫＤで結合する。
【０１６２】
試料中の所望のポリペプチド（例えばペプチド、転写体または酵素消化産物）の存在は、ウエスタンブロット分析を用いて検出され得る。本技法は一般に、分子量に基づいたゲル電気泳動により試料産物を分離し、分離タンパク質を適切な固体支持体（例えばニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルターまたは誘導ナイロンフィルター）に移し、そして分析物タンパク質と特異的に結合する標識抗体とともに試料をインキュベートすることを包含する。標識抗体は、固体支持体上の分析物と特異的に結合する。これらの抗体は直接標識されるか、あるいは標識抗体と特異的に結合する標識剤、例えば抗体（例えば標識化ヒツジ抗マウス抗体。この場合、分析物に対する抗体はネズミ抗体である）を用いてその後検出される。
【０１６３】
Ｖ．実施例
実施例Ｉ：ＳＰＬＰのトランスフェクション能力に及ぼすカルシウムの作用
Ａ．材料と方法
１．材料。Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）はＳ． Ａｎｓｅｌｌ博士から入手し、そして１−Ｏ−（２−（ω−メトキシエチレングリコール）スクシノイル）−２−Ｎ−アラキドイルスフィンゴシン（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）は、Ｚ． Ｗａｎｇ博士（Ｉｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂｕｒｎａｂｙ， ＢＣ）が合成した。１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）は、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ （Ｖａｎｃｏｕｖｅｒｔ， ＢＣ）から入手した。１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−（ホスホ−Ｌ−セリン）（ＤＯＰＳ）および１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リスサミンローダミンＢスルホニル）（Ｒｈ−ＤＯＰＥ）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ， ＡＬ）から購入した。コレステロール（Ｃｈｏｌ）、オクチルグルコピラノシド（ＯＧＰ）、ＨＥＰＥＳ、ＭｇＣｌ２およびＮａＣｌは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ）から入手した。ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ陰イオン交換カラムおよびセファロースＣＬ−４Ｂサイジングカラム物質は、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ， Ｍｏ）から入手した。ルシフェラーゼ検定キットは、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ． （Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）から購入した。ピコグリーンｄｓＤＮＡ検出試薬は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）から入手した。ヒトＣＭＶ極初期プロモーター−エンハンサー素子の制御下でルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードスルプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶＬｕｃ）は、Ｉｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｕｒｎａｂｙ， ＢＣ）から入手した。ウシハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞は、アメリカ培養細胞コレクションＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から入手し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１００ Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したダルベッコの変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。５．０％ＣＯ２を含有スル湿潤化大気中で３７℃で単一層としてＢＨＫ細胞を保持した。
【０１６４】
２．ＳＰＬＰの調製。いくつかの修正を加えて、Ｗｈｅｅｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：２７１−２８１（１９９９）に記載されたようにＳＰＬＰを調製した。要するに、総量１０ μｍｏｌのＤＯＤＡＣ、ＤＯＰＥ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０（７：８３：１０；ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）をクロロホルム中に溶解し、窒素ガス流下で乾燥した。高真空下で２時間、残留溶媒を除去した。その結果生じた脂質フィルムを、連続攪拌しながら、０．２ ＭＯＧＰを含有するＨＢＳ緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳおよび１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）１ｍｌ中で水和させた。プラスミドＤＮＡ（４００μｇ／ｍｌ）を水和脂質に付加し、混合物をＨＢＳ緩衝液に対して３６〜４８時間透析し、２回、緩衝液を取り換えた。ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィーにより非封入プラスミドを除去し、前記のように（Ｍｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４１９：１３７−１５０（１９９９））スクロース密度勾配を用いて空脂質小胞を除去した。高ＤＯＤＡＣ含量処方物（ＤＯＤＡＣ／ＤＯＰＥ／ＰＥＧ−ＣＣｅｒＣ２０、１４：７６：１０， ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）のために、前記のように（Ｚｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１４３８−１４４７（１９９９））３０ｍＭクエン酸ナトリウムを含有するＨＢＳ緩衝液中で、ＳＰＬＰを先ず調製した。前記のピコグリーン検定（Ｚｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１４３８−１４４７（１９９９））を用いてプラスミド閉じ込めに関してＳＰＬＰを特性化し、準弾性光散乱を用いてサイズ調整した。
【０１６５】
３．Ｃａ２＋の存在下でのトランスフェクション。トランスフェクション前に、１ ｘ １０４細胞／９６ウエルプレート１ウエルの密度でＢＨＫ細胞を一夜プレート化した。ＣａＣｌ２ストック溶液をｄＨ２Ｏ中に調製し、濾過することにより滅菌した。ＳＰＬＰ中に封入されたプラスミドＤＮＡ０．５ μｇをトランスフェクションのウエル当たりで用いた。実験に必要な場合、先ず適切な濃度のＣａにＳＰＬＰを付加し、その後、培地を混合物に付加して、１００μｌ／ウエルの最終トランスフェクション容積を得た。細胞に適用されるトランスフェクション培地の最終容積に関して、Ｃａ２＋濃度を算定した。最終容積は、２０容積％のＣａ２＋およびＳＰＬＰ混合物ならびに８０容積％の培地を含有した。前記のように（Ｗｈｅｅｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：２７１−２８１（１９９９））遺伝子に関する検定の前に、細胞をトランスフェクション複合体とともに適切な時間インキュベートした。Ｍｉｂｒｏ ＢＣＡタンパク質検定試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を用いて確定された総細胞タンパク質に対して、相対的ルシフェラーゼ活性を標準化した。
【０１６６】
４．細胞脂質取込みの確定。実験前日に、１ ｘ １０５細胞／１２ウエルプレート１ウエルでＢＨＫ細胞をプレート化した。脂質処方物中に混入した０．５ｍｏｌ％Ｒｈ−ＤＯＰＥを用いて、ＳＰＬＰを調製した。漸増濃度のＣａ２＋（０〜１４ｍＭ）と混合したＳＰＬＰを、完全培地中に８０ ｎｍｏｌの脂質用量で細胞に付加した（最終容積１ ｍｌ）。３７℃で４、８および２４時間インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、２５０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ８．０）中に０．１％ＴＸ−１００を含有する緩衝液の付加により溶解した。それぞれ１０および１０ｎｍのスリット幅で５６０ｎｍのλｅｘおよび５９０ｎｍのλｅｍを用いてパーキン−エルマー発光分光光度計で、溶解物のローダミン蛍光を測定した。溶解物蛍光を脂質標準の蛍光と比較することにより脂質取込みを確定し、それを総細胞タンパク質に対して標準化した。細胞内ＳＰＬＰ局在化を確定するために、蛍光顕微鏡を用いた。細胞を、４ｍｏｌ％Ｒｈ−ＤＯＰで標識した小胞でトランスフェクトした。蛍光顕微鏡下での分析の前に、トランスフェクション培地を完全培地と取り換えた。以下の明細でＯｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌｓ（Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ， ＶＴ）からのローダミンフィルターを用いて、Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００ツァイス蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｊｅｎａ ＧｍｂＨ）で蛍光顕微鏡写真を撮った：λｅｘ＝５６０±２０ ｎｍ、６００ ｎｍＬＰおよびＤＣ５９０ ｎｍ。
【０１６７】
５．３１Ｐ　ＮＭＲ分光測定。３．８μｓ６０°パルスおよび１．５−ｓ反復時間を用いて、８１．０２ ＭＨｚで広帯域分離に関して、ソリッドステート３１Ｐ　ＮＭＲスペクトルを記録した。自由誘導減衰（ＦＩＤ）を２５００〜３００スキャン上で集積し、５０Ｈｚ線拡大によりフーリエ変換した。リン脂質混合物（２５μｍｏｌの総リン脂質）を２ｍｌの緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．４）中での回転混合により分散させた。２００ｍＭＣａＣｌ２ストックのアリコートを付加することにより、漸増濃度のＣａ２＋を小胞中で滴定した。３サイクルの凍結−解凍を実施することにより、Ｃａ２＋平衡を保証した。Ｂｒｕｋｅｒ可変温度ユニットにより温度を２５℃に維持した。リン酸／Ｄ２Ｏの混合物を、すべての３１Ｐ　ＮＭＲスペクトル中での化学シフトに関する参照として用いた。
【０１６８】
６．プラスミドＤＮＡの細胞内プロセシング。実験前日に、ＢＨＫ細胞を３ ｘ １０５細胞／６ウエルプレート１ウエルでＢＨＫ細胞をプレート化した。ＳＰＬＰ中に封入された２．５μｇプラスミドＤＮＡを、Ｃａ２＋の非存在下または存在下（８ｍＭ）で、２、４および８時間、細胞とともにインキュベートした。適切な時点で、細胞をＰＢＳで洗浄し、外部ＳＰＬＰをトリプシン処理により除去した。遠心分離によりトリプシン処理細胞をペレット化し、細胞を再懸濁して、等張緩衝液（２５０ｍＭスクロース、３ｍＭＭｇＣｌ２、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）で洗浄した。その後、１ｍｇ／ｍｌでプロナーゼＥ（Ｓｉｇｍａ）を含有する溶解緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７．５、０．５％ＳＤＳ、１ｍＭＥＤＴＡ）２５０μｌとともに３７℃で一夜インキュベートすることにより、ペレット化細胞を溶解した。ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡおよび送達プラスミドＤＮＡ）を前記のように抽出した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｉ， １．２１−１．５２（１９８９）． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｃ． Ｎｏｌａｎ， ｅｄｉｔｏｒ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）。２６０ｎｍでの吸光度を測定することにより、ＤＮＡ回収を確定した。各試料からの６μｇの総ＤＮＡを、一組のｐＣＭＶＬｕｃ標準（０〜５ｐｇ）を用いてナイロン移送膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上でドットブロットさせるか、または１％アガロースゲルに負荷して、６０Ｖで２時間、サザン分析のためにサイズ分別した。両ブロットを、Ｔ７ＱｕｉｃｋＰｒｉｍｅＴＭキット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてＰｓｔＩ切断−ｐＣＭＶＬｕｃプラスミドで調製したＰ−標識化プラスミドＤＮＡプローブと、６８℃で一夜ハイブリダイズした。０．１％ＳＤＳを含有する２ＸＳＳＣでブロットを３回洗浄し、次にＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒスクリーン上で曝露し、これをその後走査した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ−ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒＴＭＳＩ）。
【０１６９】
７．ＳＰＬＰ内へのＣａ２＋の閉じ込め。ＳＰＬＰ（ＤＯＤＡＣ／ＤＯＰＥ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０／Ｒｄ−ＤＯＰＥ、１０：７９．５：１０：０．５， ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）を最初に、クエン酸塩緩衝液（１５０ｍＭクエン酸ナトリウムおよび１５０ｍＭクエン酸）中でｐＨ４で調製した。ＨＢＳ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡させたＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィーにより非封入プラスミドを除去し、前記のように（Ｍｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４１９：１３７−１５０（１９９９））スクロース密度勾配を用いて空脂質小胞を除去した。２．５ｍＭＣａＣｌ２およびイオノフォアＡ２３１８７（０．１μｇ／μｍｏｌ脂質）とともに室温で３０秒間、ＤＮＡ負荷小胞をインキュベートすることにより、Ｃａ２＋負荷を実施した。緩衝液を２回取り換えて、ＨＢＳ緩衝液中での透析により、非負荷Ｃａ２＋およびイオノフォアを除去した。ＣａＣｌ標準曲線（０〜５０ｎｍｏｌ）に対する膜非透過性吸収剤指示薬Ａｓｅｎａｚｏ ＩＩＩ（１０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７中で０．１ｍＭ）を用いることにより、ＴＸ−１００（０．２％）の非存在下および存在下で内部Ｃａ２＋濃度を測定した。６５０ｎｍでの吸光度を、Ｃａ２＋存在の指標として測定した。前記のピコグリーン検定（Ｚｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１４３８−１４４７（１９９９））を用いてプラスミド閉じ込めに関してＳＰＬＰを特性化し、準弾性光散乱を用いてサイズ調整した。Ｃａ２＋の内部濃度は、〜１７５ｍＭであることが判明した。
【０１７０】
８．ＣＰＬの挿入。ＣＰＬ挿入前に、多少の修正を加えて、前節に記載したようにＳＰＬＰを調製した。全体で１０μｍｏｌのＤＯＤＡＣ、ＤＯＰＥ、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０およびＲｄ−ＤＯＰＥ（７：８２．５：１０：０．５； ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）を含有するＳＰＬＰを、連続攪拌しながら、０．２ ＭＯＧＰを含有するＨＢＳ緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳおよび１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５）１ｍｌ中で水和させた。プラスミドＤＮＡ（４００μｇ／ｍｌ）を水和脂質に付加し、混合物をＨＢＳ緩衝液に対して３６〜４８時間透析し、２回、緩衝液を取り換えた。ＤＥＡＥ陰イオン交換クロマトグラフィーにより非封入プラスミドを除去した。ダンシル蛍光マーカーで標識したメタノール中のＣＰＬストックをＳＰＬＰに付加して、所望のモル比を得た（小胞脂質に関しては４ｍｏｌ％ＣＰＬまで）。ＣＰＬおよびＳＰＬＰを６０℃で３時間までの間インキュベートし、氷上で室温に冷却した。スクロース密度勾配を用いて、空脂質小胞および非挿入ＣＰＬをともに除去した。パーキン−エルマー発光分光光度計を用いて、ＣＰＬの挿入レベルを定量した。要するに、スクロース密度勾配前の初期ダンシル／ローダミン（Ｄ／Ｒｉ）蛍光比および単離ＣＰＬ−ＳＰＬＰの最終Ｄ／Ｒ（Ｄ／Ｒｆ）比を測定した。ローダミン蛍光はλｅｘ＝５６０ ｎｍおよびλｅｍ＝５９０ｎｍで検定したが、一方、ダンシル蛍光はλｅｘ＝３４０ ｎｍおよびλｅｍ＝５１０ｎｍで検定し、１０および１０ ｎｍのスリット幅を用いた。挿入％は、以下のように算定した：
挿入％＝（［Ｄ／Ｒ］ｆ）＊１００／（Ｄ／Ｒ）ｉ
前記のピコグリーン検定（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９９）を用いてプラスミド閉込めに関してＣＰＬ−ＳＰＬＰをさらに特性化し、そして準弾性光散乱を用いてサイズ調整した。
【０１７１】
Ｂ．結果
１．ＳＰＬＰのトランスフェクション能力はＣａ２＋の存在下で劇的に強化される。ＳＰＬＰ、特にＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０により安定化されたＳＰＬＰはｉｎ ｖｉｔｒｏでより低レベルのトランスフェクションを示し得る、ということを過去の研究は示している（Ｗｈｅｅｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：２７１−２８１（１９９９）； Ｍｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４１９：１３７−１５０（１９９９））。ここでは、ＳＰＬＰのトランスフェクション能力に及ぼすＣａ２＋の作用を調べた。洗剤透析法を用いて、ＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０（８４：６：１０； ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）脂質混合物およびｐＣＭＶＬｕｃから調製したＳＰＬＰを、前記の材料と方法に記載したように空小胞および非封入プラスミドから精製した。次に適量のＣａＣｌ２をＳＰＬＰ調製物に付加して、ＢＨＫ細胞への適用前に培地中に希釈後、所望のＣａ２＋濃度を得た。ＢＨＫ細胞およびＳＰＬＰを一緒に２４時間インキュベートし、その後、トランスフェクト化細胞をルシフェラーゼ発現に関して検定した。
【０１７２】
図１に示したように、Ｃａ２＋の存在は、ルシフェラーゼ発現レベルの劇的増強を生じ、最適Ｃａ２＋濃度ではＳＰＬＰトランスフェクション能力の〜６００倍の増大を観察した。トランスフェクションにおけるこのＣａ２＋媒介性増大は、プラスミドＤＮＡ−陽イオン性脂質複合体に関して前に観察されたものより、ＳＰＬＰ系に関しては有意に大きい。ＳＰＬＰトランスフェクション能力を刺激するために必要な最適Ｃａ２＋濃度は、８〜１０ｍＭの範囲で、プラスミドＤＮＡ−陽イオン性脂質複合体のトランスフェクション能力の最適刺激に必要な量（５〜２５ｍＭ）より多少低かった。さらにＳＰＬＰのトランスフェクション能力を刺激するＣａ２＋の能力は、非常に特異的であった。図１に示したように、ＭｇＣｌ２またはＮａＣｌをＣａＣｌ２の代わりに用いた場合、トランスフェクション能力の増強は観察されなかった。
【０１７３】
２．ＳＰＬＰはＣａ２＋の存在下で安定である。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０を伴うＳＰＬＰは、ｉｎ ｖｉｖｏでの循環時間延長を示し、外部ヌクレアーゼから封入プラスミドを保護し、そして細胞と容易に相互作用する高安定系である（Ｗｈｅｅｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：２７１−２８１（１９９９）； Ｍｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４１９：１３７−１５０（１９９９）； Ｍｏｎｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇ． ７：４３９−４５２（２０００））。したがって、Ｃａ２＋の存在下でのＳＰＬＰのトランスフェクション特性強化が、細胞取込み強化をもたらすＳＰＬＰの不安定化または凝集のためでなかったことを実証するのは重要であった。サイズの変化を検出するために準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）を用いて、そしてＤＮＡ漏出を検出するためにピコグリーンフルオロフォア検定を用いて、Ｃａ２＋の存在下でのＳＰＬＰの安定性を調べた。ＱＥＬＳ実験のために、ＣａＣｌ２をＳＰＬＰ懸濁液に付加して、５０ｍＭという高い濃度を達成した。ＳＰＬＰサイズまたはサイズ分布の変化は観察されなかった。プラスミド放出実験に関しては、８ｍＭＣａ２＋の存在下または非存在下で１０％ＦＢＳを含有するＨＢＳ緩衝液中で３７℃で、ＳＰＬＰをインキュベートした。ピコグリーン検定を用いて２４時間に亘って、プラスミド放出を検定した。プラスミド放出は観察されなかった。
【０１７４】
３．Ｃａ２＋はＳＰＬＰの細胞取込みに影響を及ぼさない。プラスミドＤＮＡ−陽イオン性脂質複合体のトランスフェクション活性を強化するＣａ２＋の能力は、Ｃａ２＋の存在下での細胞中への複合体の取込みの増大に寄与した（Ｌａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４６３：２７９−２９０（２０００））。この点では、複合体と比較した場合のＳＰＬＰの低トランスフェクション能力は、少なくとも一部は、ＳＰＬＰの極低レベルの細胞取込みから生じる（Ｍｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４１９：１３７−１５０（１９９９））。したがって、細胞へのＳＰＬＰ取込みを増大することによりＣａ２＋がＳＰＬＰトランスフェクション能力を刺激するか否かを確定することは、興味深いことであった。０．５ｍｏｌ％Ｒｈ−ＤＯＰＥを含有するＳＰＬＰを用いて、前記の材料と方法に記載したように、１２ｍＭまでのＣａ２＋の存在下でＢＨＫ細胞中へのＳＰＬＰ取込みを測定した。ＳＰＬＰを細胞とともに４、８および２４時間インキュベートし、細胞内脂質のレベルを測定した。細胞増殖を説明するために、各時点での脂質取込みを総細胞タンパク質に対して標準化した。図２に示したように、試験したＣａ２＋の濃度の範囲全体でＳＰＬＰのトランスフェクション能力が数百倍まで変化した場合でも、Ｃａ２＋はＳＰＬＰの細胞取込みを有意に増大しない、ということを結果は示している。
【０１７５】
４．蛍光試験はＣａ２＋存在下でのＳＰＬＰ取込み後のエンドソーム不安定化強化を示す。ＳＰＬＰの取込みがＣａ２＋の付加により刺激されないという事実は、トランスフェクションのＣａ２＋依存性強化が蓄積されたＳＰＬＰのより効率的利用から生じなければならない、ということを示唆する。１つの可能性は、Ｃａ２＋がＳＰＬＰの取込み後にエンドソームの不安定化を多少促し、したがってプラスミドの細胞内送達を強化する、というものである。蛍光的標識化脂質を含有する小胞の取込み語のエンドソーム不安定化は、細胞内蛍光として蛍光顕微鏡により検出され得るが、一方、安定エンドソーム中への取込みは局在化「小斑点」出現を生じる、ということを過去の研究は示している（Ｆｅｌｇｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：７４１３−７４１７（１９８７））。ＳＰＬＰの細胞分布を可視化し得るために、高レベルのＲｈ−ＤＯＰＥ（４ｍｏｌ％）を小胞処方物とともに混入した。このようなＲｈ−標識化ＳＰＬＰを、１０ｍＭＣａ２＋の存在下および非存在下でＢＨＫ細胞上でインキュベートし、蛍光顕微鏡により８時間目に細胞形態を検査した。前節で認められたＳＰＬＰ取り込みの定量的測定値と一致して、Ｃａ２＋の非存在下または存在下で、同様レベルのローダミン蛍光を検出した。しかしながら、図３に示したように、蛍光顕微鏡で検出した場合の細胞の外観は、Ｃａ２＋の存在下または非存在下においてまったく異なった。多少の小斑点構造は観察されるが、しかし蛍光標識ＳＰＬＰを含有するＢＨＫ細胞は、Ｃａ２＋が含まれた場合に、より拡散性のパターンを示した。Ｃａ２＋の非存在下では、蛍光パターンは、エンドソーム区画中のＳＰＬＰ保持と一致して、高小斑点性であった。
【０１７６】
５．プラスミドＤＮＡの細胞内プロセシング。先の蛍光顕微鏡結果は、Ｃａ２＋がエンドソーム区画を不安定化することによりトランスフェクションを強化し、したがってＳＰＬＰ関連プラスミドの細胞質送達を強化する、ということを示唆する。ＳＰＬＰプラスミドがＣａ２＋の存在下でより容易にエンドソームから逃れ得る場合、それはリソソーム経路での分解を回避し、より無傷な細胞内プラスミドＤＮＡが存在する。ドットブロット検定を用いて、プラスミドＤＮＡの細胞内送達を測定し、サザンブロット分析を用いてプラスミドの組込みを検査した。８ｍＭＣａ２＋の非存在下または存在下で２、４および８時間、細胞をＳＰＬＰとともにインキュベートした。異なる系に関する無傷細胞内プラスミドＤＮＡのレベルを、前記の材料と方法に記載したような細胞からのＤＮＡの単離後に比較し、結果を図４に示す。図４Ａに示したように、Ｃａ２＋の存在下で細胞をＳＰＬＰでトランスフェクトすると、ＢＨＫ中の無傷プラスミドの量は、８時間インキュベーション期間後に約１０倍に増大した。これは、Ｃａ２＋の存在下で調製されたＳＰＬＰでトランスフェクトした細胞中により多くの無傷プラスミドＤＮＡが存在することを示したサザン分析にも反映されている（図４Ｂ）。無傷プラスミドＤＮＡのこのようなレベル強化は、Ｃａ２＋の代わりにＭｇを用いた場合には観察されなかったが、このことは、Ｃａ２＋の特異性を実証する（図４Ｂ）。
【０１７７】
６．Ｃａ２＋はエンドソーム膜を不安定化する能力と一致した方法で二重層脂質構造を不安定化する。陰イオン性脂質と併合して、非二重層（ＨＩＩ相）構造を誘導することにより二重層膜を不安定化するイオン対を生成することにより、陽イオン性脂質が高分子、例えばプラスミドＤＮＡの細胞内送達を刺激する、ということを近年の研究は示唆する。この点では、非二重層ヘキサゴナルＨＩＩ相構造を誘導することにより、不飽和ＰＥと組合せて酸性脂質、例えばホスファチジルセリン（ＰＳ）を含有する脂質二重層をＣａ２＋が不安定化し得る、ということが周知である（Ｈｏｐｅ， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０７：３２３−３２６（１９７６）； Ｔｉｌｃｏｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ６４１：１８９−２０１（１９８１））。ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレステロールを含有する関連系においてＨＩＩ相構造をＣａ２＋が誘導し得る、ということも示されている。例えばＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＯＰＳ／コレステロール（１：１：１：３； モル比）の混合物への付加も、二重層をヘキサゴナルＨＩＩ相遷移に誘導する（Ｔｉｌｃｏｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３： ２６９６−２７０３ （１９８４））。したがって、ＳＰＬＰ中の陽イオン性脂質と協力して作用することにより、Ｃａ２＋がＳＰＬＰトランスフェクションを刺激して、エンドソーム膜の脂質二重層を不安定化するということが可能である。
【０１７８】
この可能性を調べるために、ＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＯＰＳ／Ｃｈｏｌ（１：１：１：３；モル比）から成るＭＬＶのＣａ２＋依存性多型性を、３１Ｐ　ＮＭＲを用いて、少量のＤＯＤＡＣの非存在下および存在下で調べた。二重層組織化におけるリン脂質は非対称３１Ｐ　ＮＭＲ線形状を生じ、低視野肩および高視野ピークを有するが、一方、ヘキサゴナルＨＩＩ相中のリン脂質は、２つのより狭いものの一因子である逆非対称を有する線形状を生じる（Ｃｕｌｌｉｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ ５５９：３９９−４２０（１９７９））。図５Ａに示したように、ＤＯＤＡＣの非存在下で、Ｃａ２＋は、０．５：１のＣａ２＋対ＤＯＰＳ比での３１Ｐ　ＮＭＲにより報告されているように、二重層からヘキサゴナルＨＩＩ相への遷移を刺激し得る。あるいは、少量のＤＯＤＡＣ（ＤＯＰＣ／ＤＯＰＥ／ＤＯＰＳ／コレステロール／ＤＯＤＡＣ；１：１：１：３：０．２５；モル比）を含有するＭＬＶにおいては、主にＨＩＩ相構造を誘導するためには、０．２５：１のＣａ２＋対ＤＯＰＳ比のみが必要である（図５Ｂ）。狭中央ピークは、小ラメラ構造から、または構成成分リン脂質が等方性運動平均化を経る立方体相のような非二重層構造中の脂質から生じ得る。
【０１７９】
７．外部Ｃａ２＋はＳＰＬＰトランスフェクション能力を強化するために必要とされる。最終組の実験を実行して、ＳＰＬＰ内に封入されたＣａ２＋が導入遺伝子発現を刺激し得るか否かを確定した。他所に詳述されているように（Ｆｅｌｇｎｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６９：２５５０−２５６１（１９９４））、Ｃａ２＋は、Ｃａ２＋イオノフォアＡ２３１８７が存在する場合、ｐＨ勾配（内側酸性）に応答して、大型単一ラメラ小胞（ＬＵＶ）中に負荷される。２００ｍＭという高い内部Ｃａ２＋濃度が達成され得る。前記の材料と方法に記載したように、ＳＰＬＰはクエン酸塩緩衝液の存在下でｐＨ４で容易に調製され、次に、洗剤透析手法後に外部ｐＨがｐＨ７．５に挙げられる。外部ＣａＣｌ２およびイオノフォアの付加は次に、ＳＰＬＰ中へのＣａ２＋の負荷を生じて、〜１７５ｍＭの内部濃度を達成する。図６に示したように、封入Ｃａ２＋の存在はＳＰＬＰトランスフェクション能力の強化を生じるが、しかしＣａ２＋の外部レベルはトランスフェクション過程を刺激するのに主要な役割を演じる、と思われる。
【０１８０】
８．改良型ＳＰＬＰ系に及ぼすＣａ２＋の作用。ＳＰＬＰの一制限は、小胞上の限定陽イオン性脂質およびＰＥＧの存在の結果、系が細胞に最適に取込まれない、という点である（Ｍｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４１９：１３７−１５０（１９９９））。正電荷を増大するための簡単な一方法は、陽イオン性含量を増大することによる（Ｚｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：１４３８−１４４７（１９９９））。しかしながらＳＰＬＰに伴って増大するトランスフェクション効率はＤＯＤＡＣ濃度を増大し、したがってこのような系はより低いＤＮＡ封入に屈従した。近年、陽イオン性ポリ（エチレングリコール）脂質複合体（ＣＰＬ）として既知の陽イオン性脂質の新規の種類が合成された（Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． １１：４３３−４３７（２０００））。本試験に用いられる典型的ＣＰＬは、疎水性セラミドアンカーを含有し、これは、４つのリシン残基から作られる陽イオン性頭基に連結される親水性ＰＥＧスペーサーに結合される。その表面に挿入されるＳＰＬＰｗ／ＣＰＬは、リポソームおよび細胞形質膜間の相互作用強化を示す、ということが示されている（Ｃｈｅｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊ． Ｃｈｅｍ． １１：４３３−４３７（２０００））。
【０１８１】
ＣＰＬ−ＳＰＬＰ系に及ぼすＣａ２＋の影響を調べるために、実験を実行した。より高いＤＯＤＡＣ含量（１４ｍｏｌ％）を含有するＳＰＬＰも含まれた。ＣＰＬ−ＳＰＬＰ調製のために、前記の洗剤透析法を用いてプラスミドＤＮＡをリポソーム中に負荷し、そして特性化挿入法を用いて予備生成ＳＰＬＰ中にＣＰＬを挿入した。ＣＰＬを挿入して、最終４ｍｏｌ％挿入効率を得たが、このレベルは最適細胞結合および取り込みを提供することが示されている。Ｃａ２＋を８ｍＭでＳＰＬＰおよびＣＰＬ−ＳＰＬＰ調製物に付加して、ＢＨＫ細胞に適用する前に培地中に希釈した。ＢＨＫ細胞をトランスフェクトリポソームと一緒にインキュベーション後２４時間で、ルシフェラーゼに関して検定することにより、遺伝子発現を確定した。図７に示したように、それぞれ高ＤＯＤＡＣ含量またはＣＰＬを含有するＳＰＬＰに関して、トランスフェクションの〜２０００倍増および１０５倍増を検出した。
【０１８２】
Ｃ．考察
本実施例は、Ｃａ２＋がｉｎ ｖｉｔｒｏでのＳＰＬＰトランスフェクション能力の大強化を生じることを実証する。
Ｃａ２＋がＳＰＬＰのトランスフェクション能力を刺激するメカニズムは、いくつかの観察を説明しなければならない。第一に、トランスフェクション強化は、Ｃａ２＋存在下の無傷プラスミドの高細胞内レベルに起因すると思われる。これらの高レベルのプラスミドは、しかしながら、細胞中へのＳＰＬＰの取込み増大から生じると考えられる。第二に、本過程は、蛍光標識ＳＰＬＰの取込み語の細胞の「小斑点」外観の低減を伴う。最後に、本作用はＣａ２＋特異的である。最初の２つの観察は明らかに、ＳＰＬＰのエンドサイトーシス後のＢＨＫ細胞のエンドソーム不安定化強化と一致する。したがって残存する問題は、Ｃａ２＋が特異的方法でこの不安定化をいかにして促し得るか、ということである。この点に関して、エンドソームが不安定化されてそれらの内容物の放出を強化する方法に関するコンセンサスは目下示されていないが、しかしながら多数の先導的観察がなされている。これらの中で主なものは、陽イオン性脂質が高分子、例えばプラスミドおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞内送達を劇的に強化し得るという（Ｂｅｎｎｅｔｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４１：１０２３−１０３３（１９９２）； Ｂａｒｒｏｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ６：１１７９−１１８３（１９９９））、そしてこの過程が、エンドソーム膜を不安定化し、したがってエンドソーム内容物の細胞ない放出を促す陽イオン性脂質の能力によっていると考えられる（Ｗａｔｔｉａｕｘ， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４１７：１１９−２０２（１９９７）； Ｘｕ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：５６１６−５６２３（１９９６））という観察である。陽イオン性脂質は、一般的特性として、非二重層ヘキサゴナルＨＩＩ相構造を形成するために陰イオン性脂質と併合する能力を示すということを、近年の研究は示して、陽イオン性脂質がエンドソームを不安定化するメカニズムがエンドソーム膜の二重層組織化を崩壊する能力によっているということを提唱した。同様に、Ｃａ２＋が二重層組織化を崩壊し、ＨＩＩ相構造を誘導する場合、細胞内送達における同様の強化が予測され得る。
【０１８３】
Ｃａ２＋は陰イオン性脂質を含有する従来の二重層脂質系中にＨＩＩ相構造を誘導し得るという、そして、他の陽イオン、例えばＭｇ２＋はＨＩＩ相構造を誘導し得ないし、同様の作用を生じるために高濃度を要しないので、この作用はＣａ２＋特異的であるというかなりの証拠が認められる（Ｔｉｌｃｏｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３： ２６９６−２７０３ （１９８４））。本発明の実施例に示されているように、Ｃａ２＋はＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＰＳ：Ｃｈｏｌから成る二重層中にＨＩＩ相構造を誘導し得るし、そして低レベルの陽イオン性脂質ＤＯＤＡＣと相乗的に作用して、ＨＩＩ相形成を誘発し得る。モデル膜行動をエンドソーム内側の行動と直接関連付けることは難しいが、しかし新規の酸性脂質（リソビスホスファチジン酸；ＬＢＰＡ）の生成のためにそれらが「初期」から「後期」に動くので、エンドソームの陰イオン性脂質含量は増大するということ、そしてＬＢＰＡと陽イオン性脂質、例えばＤＯＤＡＣの混合物がＨＩＩ相を採用する、ということが既知である。したがってこれらの結果は、Ｃａ２＋が陽イオン性脂質と共働してエンドソーム不安定化を促すことによりトランスフェクションを強化する、という理論を支持する。このような提案は、ＬＢＰＡへのＣａ２＋の付加がＨＩＩ層の形成を生じるという観察とも一致する。その他の研究者は、リン酸カルシウム（ＣａＰｉ）媒介性トランスフェクション中のエンドソーム放出の媒介に（Ｌｏｙｔｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７９：４２２−４２６（１９８２）； Ｏｒｒａｎｔｉａ， ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９０：１７０−１７４（１９９０））、ならびにポリ陽イオン媒介性遺伝子移入に（Ｂｏｔｔｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １３９５：７８−８７（１９９８）； Ｈａｂｅｒｌａｎｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４４５：２１−３０（１９９９））、Ｃａ２＋が一役を演じる、ということを示唆する。
【０１８４】
本試験の意外な局面は、前に報告されたプラスミドＤＮＡ−陽イオン性脂質複合体のトランスフェクション特性に及ぼすＣａ２＋の影響（Ｌａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４６３：２７９−２９０（２０００））と、ＳＰＬＰに関して本明細書中に報告された結果との間の不一致に関する。特に従来の研究は、Ｃａ２＋が複合体のトランスフェクション能力を２０倍まで強化し得るということ、そしてこれがエンドソーム放出強化というよりむしろ、細胞中への複合体の取込み強化に寄与するということを実証した。意外な局面は、Ｃａ２＋存在下でのＳＰＬＰのトランスフェクション能力増大は細胞によるＳＰＬＰの取込み増大に関連しないが、一方Ｃａ２＋は脂質およびプラスミドの両方の取り込みにより立証されるような複合体の取込みの少なくとも２倍増を引き起こしたということである（Ｌａｍ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １４６３：２７９−２９０（２０００））。この不一致は、複合体と比較した場合のＳＰＬＰの非常に異なる物理的特性に関連すると思われる。複合体は、高（等モル）レベルの陽イオン性脂質を含有する大型の正荷電系であり、一方、ＳＰＬＰは小型の安定した、本質的に中性の小胞であり、低レベルの陽イオン性脂質を含有するＰＥＧコーティングを有する。複合体と比較した場合のＳＰＬＰ中の低レベルの陽イオン性脂質は、ＳＰＬＰ中に存在する陽イオン性脂質がエンドソーム中のすべての利用可能な陰イオン性脂質と併合するのに不十分で、したがって最大不安定化を達成するためにはＣａ２＋の付加的存在を要するので、Ｃａ２＋に対する感度増大に直接的に関連し得る。
【０１８５】
考察の最終トピックは、本明細書に示された結果を、ｉｎ ｖｉｖｏでのトランスフェクション能力強化を示すＳＰＬＰの生成に拡張することに関する。他所で強調されているように（Ｗｈｅｅｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：２７１−２８１（１９９９）；Ｚｈａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６： １４３８−１４４７ （１９９９））、ＳＰＬＰ送達の好ましい方法は、全身性適用によるものであり、この場合、疾患部位、例えば腫瘍部位での長期循環寿命および蓄積が必要とされる。本発明の結果は、トランスフェクション強化を生じるために、Ｃａ２＋が好ましくはＳＰＬＰの外側にあることを示唆する。これを達成するために、ＳＰＬＰへのＣａ２＋キレート化剤の付着による漸増表面Ｃａ２＋濃度を目指す戦略は、ｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション強化を生じる必要がある。さらに例えば高濃度のカルシウムとともにＳＰＬＰの局所的（例えば腫瘍内）送達により、あるいはトランスフェクションの所望部位へのカルシウムの局所送達と組合せたＳＰＬＰの全身性送達により、トランスフェクションの部位で、カルシウム濃度の局所的増大が生じ得る。
【０１８６】
実施例ＩＩ：陽イオン性ＰＥＧを含有する安定化プラスミド−脂質粒子はトランスフェクション能力強化を示す
Ａ．材料と方法
１．材料。ＤＯＰＥは、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ （Ｖａｎｃｏｕｖｅｒｔ， ＢＣ）から入手した。Ｒｈ−ＤＯＰＥおよびピコグリーンは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）から入手した。ＤＯＤＡＣは合成し、且つＩｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， ＢＣ）のＳ． Ａｎｓｅｌｌ博士から入手した。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０は、他所に示されたように合成し（Ｗｅｂｂ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １３７２：２７２−２８２（１９９８））、且つＺ． Ｗａｎｇ博士（Ｉｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂｕｒｎａｂｙ， ＢＣ）により提供された。ｐＣＭＶＬｕｃプラスミドは、ヒトＣＭＶ初期プロモーターの制御下でＰｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ遺伝子をコードし、Ｐ． Ｔａｍ博士（Ｉｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂｕｒｎａｂｙ， ＢＣ）により提供された。ｐＣＭＶＧＦＰプラスミドは、Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａからのグリーン蛍光タンパク質に関する遺伝子を含有し、Ｐ． Ｔａｍ博士（Ｉｎｅｘ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｂｕｒｎａｂｙ， ＢＣ）により提供された。ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ、セファロースＣＬ−４Ｂ、オクチル−β−Ｄ−ガラクトシドおよびＨＥＰＥＳは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ （Ｏａｋｖｉｌｌｅ， ＯＮ）から入手した。リポフェクチンは、Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＯＮ）から入手した。ＢＨＫ細胞は、Ｒ． ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙ博士（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ＵＢＣ）から入手した。
【０１８７】
２．ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の調製。それぞれ非封入プラスミドおよび空小胞を除去するために陰イオン交換（ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ）クロマトグラフィーおよびスクロース密度勾配遠心分離による精製を用いて、Ｗｈｅｅｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：２７１−２８１（１９９９））の方法にしたがって、ＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ：ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０（８４：６：１０）からなり、プラスミドｐＣＭＶＬｕｃ（またはｐＣＭＶＧＦＰ）を含有するＳＰＬＰを調製した。脂質フィルムを生成する前に、８３．５：１０：６：０．５（ＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ：ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０：Ｒｈ−ＰＥ）のモル比でＣＨＣｌ３中に他の構成成分脂質とともにＲｈ−ＰＥを溶解することにより、Ｒｈ−ＰＥを含有するＳＰＬＰを調製した。
【０１８８】
別記しない限り、Ｈｅｐｅｓ緩衝化食塩水（ＨＢＳ）、ｐＨ７．５中で６０℃で２〜３時間、ＣＰＬ４（１２．５、１９および３０ｎｍｏｌ）とともにＳＰＬＰ（５００ｎｍｏｌ脂質）をインキュベートすることにより、予備生成ＳＰＬＰ中にＣＰＬ４を挿入した。ＨＢＳ中で平衡させたセファロースＣＬ−４Ｂカラム上でのゲル濾過クロマトグラフィーにより、非組入れＣＰＬ４を除去した。分画（１ｍｌ）を収集し、ＣＰＬ４、リン脂質およびＤＮＡ含量に関して検定した。３つの構成成分すべてを含有する分画をプールし、濃縮した。それぞれ１０および２０ ｎｍの励起および発光スリット幅を有するパーキン−エルマーＬＳ５２発光分光光度計を用いて、λｅｘ＝３４０ ｎｍでの励起後、λｅｍ＝５１０ｎｍでのダンシル標識化ＣＰＬの蛍光により、ＣＰＬ４含量を確定した。標準曲線は、ＨＢＳ中のダンシル化ＣＰＬのストック溶液から得た。Ｒｈ−ＰＥを含有するＳＰＬＰに関しては、それぞれ１０および２０ ｎｍの励起および発光スリット幅を用いて、λｅｘ＝５６０ ｎｍでの励起後、λｅｍ＝５９０ｎｍで測定されるＲｈ標識の蛍光から、リン脂質含量を確定した。Ｒｈ標識を含有しないＳＰＬＰに関しては、Ｂｌｉｇｈ ａｎｄ Ｄｙｅｒ（Ｃａｎ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ３７：９１１−９１７（１９５９））による脂質抽出後、Ｆｉｓｋｅ−Ｓｕｂｂａｒｏｗ（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ６６：３７５−４００（１９２５））の方法を用いて、リン脂質を測定した。前記のようなピコグリーン検定キット（Ｍｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４１９：１３７−１５０（１９９９）を用いて、プラスミドでなを確定した。
【０１８９】
Ｒｈ−ＰＥ含有系に関しては、セファロースカラムの前にダンシル体ローダミン比をカラム後の比で割って１００％を掛けることにより、ＣＰＬ４の組入れを確定した。その他の系に関しては、ＣＰＬ４含量を総脂質含量で割って１００を掛けることにより、組入れを確定した。
攪拌しながら２５μＬのＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ（０．８ｍＭ）とともに８８μｇ／ｍＬプラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶＬｕｃまたはｐＣＭＶＧＦＰ）２５μＬを付加し、その後、細胞に付加する前に、室温で３０分間インキュベートすることにより、１．５：１（負対正）の電荷非で、リポプレックスを調製した。リポフェクチンリポプレックスを同様に調製した。
【０１９０】
小胞方式で操作するＮｉｃｏｍｐモデル２７０サブミクロン整粒器を用いて、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）試験を実施した。Ｗｈｅｅｌｅｒ等（上記）が記載したのと同様に、凍結−割断電子顕微鏡試験を実施した。
５０％マウス血清とともにＳＰＬＰ系をインキュベート後、フェノール：クロロホルム抽出を用いて、サザン分析用のＤＮＡを抽出した。その結果生じたＤＮＡを次に、１％アガロースゲルを通して電気泳動処理し、ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移して、サザン分析を施した。膜を、最新プロトコールによりルシフェラーゼ遺伝子からの無作為プライム化３２Ｐ−標識ＰｖｕＩＩ制限断片に曝露した。ＰｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒＴＭＳＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いてハイブリダイゼーション強度を定量した。データを、非消化ＤＮＡに関して既定量の無傷ＤＮＡに変換した。
【０１９１】
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ， Ｉｎｃ．， Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ， Ｂ．Ｃ．により実施されたＨＰＬＣ分析により、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０およびＤＯＰＥのレベルを確定した。
３．取込みおよびトランスフェクション試験。すべての取込みおよびトランスフェクション試験に関してトランスフェクション前に、１ ｘ １０４細胞／９６ウエルプレート１ウエルの密度でＢＨＫ細胞を一夜プレート化、形質転換化ＢＨＫ細胞株（ｔｋ−）を用いた。ＳＰＬＰの細胞取込みを確定するために、１２ウエルプレートの各ウエルに１ｘ１０５ＢＨＫ細胞を植え付けて、５％ＣＯ２中で３７℃で、２ｍｌの完全培地（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）中で一夜インキュベートした。４０ｍＭＣａＣｌ２を含有する培地中のＳＰＬＰ、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４、または２００μＬの容積中のＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣリポプレックスを、２０Μｍの最終脂質用量で８００μＬの完全培地と混合し、細胞に付加した。プラスミドＤＮＡ濃度は、ＳＰＬＰ系およびリポフレックスに関してはそれぞれ１．４μｇ／ｍＬおよび２．２μｇ／ｍＬに相当した。細胞を３７℃で指定時間インキュベートし、ＰＢＳで２回洗浄して、６００μＬの溶解緩衝液（ＰＢＳ中の０．１％トリトンＸ−１００）で溶解した。それぞれ１０および１０ｎｍのスリット幅で、５６０ｎｍのλｅｘおよび６００ｎｍのλｅｍを用いて、ローダミン蛍光を確定した。５３０ｎｍの発光物フィルターも用いた。溶解物中の蛍光を脂質標準の蛍光と比較することにより脂質取込みを確定し、それをＢＣＡタンパク質検定（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）により確定される細胞数に対して標準化した。指示された場合、以下の明細でＯｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌｓ（Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ， ＶＴ）からのローダミンフィルターを用いて、Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００ツァイス蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｊｅｎａ ＧｍｂＨ）を用いて蛍光顕微鏡写真を撮った：励起５６０±２０／二色性フィルター５９０／ロングパス発光６００。
【０１９２】
以下の例外を伴って、前記と同様に、脂質取込みに及ぼすＣａ２＋およびＭｇ２＋の作用を調べた。１ｍＬの完全培地中の２４ウエルプレート中に、ＢＨＫ細胞（５ｘ１０４／ウエル）を植え付けて、３７℃で一夜インキュベートした。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４（４０ｎｍｏｌ）を総容積１００μＬ中のＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２と混合した。完全培地（４００μＬ）をＳＰＬＰ−ＣＰＬ４に付加して、最終陽イオン濃度を４〜１４ｍＭとした。次にこの混合物を細胞に付加し、３７℃で４時間インキュベートした。次に細胞をＰＢＳで２回洗浄して、６００μＬの溶解緩衝液（ＰＢＳ中の０．１％トリトンＸ−１００）で溶解した。
【０１９３】
別記しない限り、５％ＣＯ２中で３７℃で一夜のインキュベーション前に、１５０μＬ完全培地中の９６ウエルプレートの各ウエル中にプレート化した１ ｘ １０４ＢＨＫ細胞を用いて、トランスフェクション試験を実施した。２０μＬＨＢＳ（ＳＰＬＰ）または４０ｍＭＣａＣｌ２含有するＨＢＳ（ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４）中の０．５μｇのｐＣＭＶＬｕｃに対応するＳＰＬＰおよびＳＰＬＰ−ＣＰＬ４を８０μＬの完全培地に付加して、プラスミド濃度を５．０μｇ／ｍＬとした。４時間のトランスフェクション時間ならびに２４時間の総インキュベーション時間をルーチンに用いた。トランスフェクション時間は、細胞がプラスミド含有粒子とともにインキュベートされる時間と定義され、一方、総インキュベーション時間は、トランスフェクション時間（この後、トランスフェクション培地が取り換えられる）＋その後の、細胞が導入遺伝子発現に関して検定される前にインキュベートされる時間である。２４時間後、１００μＬの溶解緩衝液を用いて細胞を溶解し、４０μＬの溶解物を９６ウエル発光プレートに移した。ルシフェラーゼ反応キット（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）、ルシフェラーゼ標準（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｈｅｉｍ）およびＭＬ３２００微小滴定プレート発光系（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ， Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ， ＶＡ）を用いて、ルシフェラーゼ活性を確定した。ＢＣＡタンパク質検定（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）により確定される細胞数に対して、活性を標準化した。
【０１９４】
トランスフェクション時間経過試験は、ｐＣＭＶＬｕｃを含有するＳＰＬＰ、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４ならびにリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＯＮ）およびＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣリポプレックスを包含した。前記と同様にリポプレックスを調製した。４、８および２４時間のトランスフェクション時間後、トランスフェクション培地を除去し、４および８時間トランスフェクションの場合には、２４時間の総インキュベーション時間の間、完全培地に取り換えた。２４時間目に、全細胞を溶解し、前記と同様にルシフェラーゼ活性およびタンパク質含量（ＢＣＡ検定）に関して検定した。
【０１９５】
ｐＣＭＶＧＦＰを含有するＳＰＬＰ−ＣＰＬ４、ＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣリポプレックスおよびリポフェクチンリポプレックスをｐＣＭＶＬｕｃに関して記載したのと同様に調製した。５．０μｇ／ｍＬのプラスミドＤＮＡ用量で前記と同様に、トランスフェクションを実施した。２４および４８時間試料をインキュベーション後、トランスフェクション培地を除去し、細胞を洗浄して、新鮮な培地を細胞に付加した。次に、ツァイス蛍光顕微鏡下で、細胞を観察した。以下の明細で、フルオレセインフィルター（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌｓ）を用いて、ＧＦＰを発現する細胞の数を計数した：励起４７５±２０／二色性フィルター５００／発光５３５±２２．５。トランスフェクション効率は、ＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージとして表した。
【０１９６】
Ｂ．結果
１．陽イオン性ＰＥＧ脂質は予備生成ＳＰＬＰ中に挿入され得る。ＳＰＬＰは、リポプレックスより低い細胞中への取込みおよびより低いトランスフェクション能力を示す、ということを過去の研究は示している（Ｍｏｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １４１９： １３７−１５０ （１９９９））。表面関連陽イオン性ＰＥＧ脂質（ＣＰＬ）、特にＰＥＧ分子の末端に４つの電荷を含有するもの（ＣＰＬ４；構造に関しては、図８Ａ参照）は、細胞中へのＬＵＶの取込みを劇的に強化し得る。さらにＣＰＬは、簡単なインキュベーションプロトコールを用いて、ＳＰＬＰと同様に脂質組成物とともに予備生成ＬＵＶ中に挿入され得る。したがって、ＳＰＬＰ中にＣＰＬ４を挿入するために同様の手法が開発され得るか、否かを調べた。６ｍｏｌ％の陽イオン性脂質Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、８４ｍｏｌ％の「フソゲニック」ヘルパー脂質ジレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびセラミド（Ｃｅｒ）アンカーに結合されたＰＥＧ２０００から成る１０ｍｏｌ％の安定化脂質（ＰＥＧ−Ｃｅｒ）を含有する脂質混合物から、Ｗｈｅｅｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：２７１−２８１（１９９９）の洗剤透析手法により、ｐＣＭＶＬｕｃを含有するＳＰＬＰを調製した。ＰＥＧ−Ｃｅｒのセラミドアンカーは、商法から容易に交換せず、したがって高安定性ＳＰＬＰ系に寄与するＣアシル鎖（ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）を含有した（Ｗｈｅｅｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：２７１−２８１（１９９９））。洗剤透析法は、１プラスミド／小胞、遊離プラスミドおよび空小胞を含有するＳＰＬＰの混合物を生成した。他所に記載されているように（Ｗｈｅｅｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：２７１−２８１（１９９９））、それぞれＤＥＡＥカラムクロマトグラフィーおよび密度遠心分離により、遊離プラスミドおよび空小胞を除去することにより、ＳＰＬＰを精製した。
【０１９７】
予備生成ＳＰＬＰ中へのＣＰＬ４の後挿入に関する手法は、図８Ｂに説明されている。精製ＳＰＬＰを、６０℃で３時間まで、ＣＰＬ４（〜５ｍｏｌ％）とともにインキュベートし、次にカラムクロマトグラフィーにより非組入れＣＰＬ４から分離した。図９に示したように、これは、利用可能な８０％までのＣＰＬ４のＳＰＬＰとの会合を生じ、これはＳＰＬＰ−ＣＰＬ４系中の総脂質の４ｍｏｌ％に対応する。
【０１９８】
２．ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４はＣＰＬ４の挿入後に凝集し、二価陽イオンの付加後に脱凝集する。ＣＰＬを含有するＬＵＶは凝集する傾向があり、そしてこの凝集は培地のイオン強度を増大することにより抑制され得る、ということを過去の研究は示している。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４も凝集を受けやすく、そしてこの凝集はＮａＣｌ、ＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２をＳＰＬＰ−ＣＰＬ４処方物に付加することにより逆転され得る、ということが判明した。この作用は、図１０に説明されており、これは、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）により測定される粒子の平均直径の標準偏差における変化によりモニタリングした場合のＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の凝集に及ぼすＣａＣｌ２およびＭｇＣｌ２の付加の影響を示している。両陽イオンに関しては、標準偏差は陽イオン濃度の増大に伴って低減し、最適脱凝集は約３０ｍＭより上で起こる。この行動は、凍結−割断電子顕微鏡によっても可視化され得る。図１１Ａに示したように、ＳＰＬＰの凍結−割断顕微鏡写真は小単一分散粒子を明示するが、一方、ＣａＣｌ２の非存在下で調製されたＳＰＬＰ−ＣＰＬ４は高度に凝集される（図１１Ｂ）。図１１Ｃに示したように、４０ｍＭＣａＣｌ２の付加は、この凝集を逆転して、ＳＰＬＰ調製物と同様に単一分散粒子を生成する。
【０１９９】
ＱＥＬＳおよび凍結割断電子顕微鏡を用いて、ＣａＣｌ２存在下でのＳＰＬＰおよびＳＰＬＰ−ＣＰＬ４のサイズを比較した。ＱＥＬＳ試験は、ＳＰＬＰおよびＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の平均直径がそれぞれ８０±１９ｎｍおよび７６±１５ｎｍであることを明示し、一方凍結割断試験は、６８±１１ｎｍおよび６４±１４ｎｍの直径を示した。ＳＰＬＰ直径に関するこれらの値は、従来の研究と密接に一致する（Ｗｈｅｅｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：２７１−２８１（１９９９）））。
【０２００】
３．ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０含量およびＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の安定性。ＣＰＬ４が挿入されて、４ｍｏｌ％という高いレベルの総ＳＰＬＰ脂質を達成し得るという観察は、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の外側単一層中のＣＰＬ４のレベルが８ｍｏｌ％であることを示す。ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０の初期濃度が１０ｍｏｌ％であるとすると、これは、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の外側単一層中のＰＥＧ−脂質の総レベルが約１８ｍｏｌ％になることを示唆する。これらのレベルは、脂質小胞中に通常組み入れられ得るＰＥＧ−脂質のレベルより高く（Ｗｏｏｄｌｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １１１３：１７１−１９９（１９９２））、ＣＰＬ４として取り換えられる外側単一層中のＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０のいくつかが挿入されたという可能性を生じる。これは、ＨＰＬＣを用いてＣＰＬ４の挿入の前および後にＳＰＬＰに関してＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０対−ＤＯＰＥの比を測定することにより調べた。前記のようにＣＰＬ４をＳＰＬＰ中に挿入した。非組み入れ物質の除去後の分析は、４ｍｏｌ％ＣＰＬ４（総ＳＰＬＰ脂質に対して標準化）がＳＰＬＰ中に挿入されたことを確定した。ＣＰＬ４の挿入前は、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０対−ＤＯＰＥ比は０．０９１で、７．６ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０含量に対応し、ＤＯＰＥが脂質含量の８４ｍｏｌ％を構成すると想定された。ＣＰＬ４の挿入後、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０対−ＤＯＰＥ比は０．０７２であると判明し、６．０ｍｏｌ％のＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０含量を示した。ＣＰＬ４の挿入中にＳＰＬＰから失われるＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０のすべてが外側単一層から失われると仮定すると、これは、挿入過程中に外側単一層のＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０含量画７．６ｍｏｌ％から４．４ｍｏｌ％に低減することを示す。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の外側単一膜中の総ＰＥＧ−脂質含量は、次に外側単一層脂質の１２．４ｍｏｌ％であると概算し得る。
【０２０１】
５０％マウス血清中で４時間までのインキュベーション後のＳＰＬＰおよびＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の安定性は、図１２で説明されている。すべての場合、封入プラスミドＤＮＡは血清分解から完全に保護された。これに対比して、リポプレックス中のプラスミドの本質的に完全な分解が、血清中でのインキュベーションの３０分以内に観察された。
【０２０２】
４．ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４はＢＨＫ細胞中への取込み強化およびトランスフェクション能力の劇的強化を示す。次の組の実験は、ＢＨＫ細胞中へのＳＰＬＰの取込みに及ぼす組入れＣＰＬの影響およびその結果生じるＳＰＬＰ−ＣＰＬ４系のトランスフェクション能力を確定することを目指した。４ｍｏｌ％までのＣＰＬ４を含有するＳＰＬＰを４０ｍＭＣａＣｌ２の存在下で調製し、ＢＨＫ細胞に付加し（最終ＣａＣｌ２濃度８ｍＭ）、種々の時間の間インキュベートした。次に、前記の材料と方法に示したように、会合ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４に関して細胞を検定した。図１３Ａに示したように、ＣＰＬ４を含有しないＳＰＬＰの取込みは、８時間のインキュベーション後でさえ最小であるが、しかし３ｍｏｌ％またはそれ以上のレベルのＣＰＬ４を含有するＳＰＬＰに関しては、取込みは劇的に改善される。例えば４ｍｏｌ％のＣＰＬ４を含有するＳＰＬＰは、ＣＰＬの非存在下でのＳＰＬＰに関して達成された値の約５０倍より高い蓄積レベルを８時間で示す。この取込み強化は、図１３Ｂに可視的に説明されており、これはローダミン標識化ＳＰＬＰおよびＳＰＬＰ−ＣＰＬ４とともに４時間インキュベーション後のＢＨＫ細胞の蛍光顕微鏡写真を示している。前期の材料と方法に記載されたトランスフェクションプロトコールを用いて、ＳＰＬＰ、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４およびプラスミドＤＮＡ−陽イオン性リポソームリポプレックス（ＤＯＤＡＣ／ＤＯＰＥ；１：１）のトランスフェクション特性を調べた。このプロトコールは、ＳＰＬＰまたはリポプレックスとともにＢＨＫ細胞を４時間（トランスフェクション時間）インキュベートし、その後培地を取り換えて、さらにインキュベートして導入遺伝子発現を最大にすることを包含する。総インキュベーション時間（トランスフェクション時間＋培地交換後のインキュベーションの時間）を２４時間で一定に保持した。図１４に示したように、漸増量のＣＰＬ４の存在は、ＳＰＬＰ系に関するトランスフェクション能力の劇的増大を生じた。４ｍｏｌ％ＣＰＬ４を含有するＳＰＬＰ−ＣＰＬ４は、ＳＰＬＰを用いて達成されたよりも多少高い３ｘ１０３のルシフェラーゼ発現レベルを示した。
【０２０３】
５．Ｃａ２＋はＳＰＬＰ−ＣＰＬ４のトランスフェクション活性に必要とされる。上記の実施例１は、ＳＰＬＰのトランスフェクション能力がＣａ２＋の存在に対して高度に感受性であることを実証しており、この場合、〜１０ｍＭのＣａ２＋の存在がトランスフェクション能力を数百倍に強化する。したがって、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４のトランスフェクション活性に及ぼすＣａ２＋の影響を確定することは興味深いことであった。４ｍｏｌ％ＣＰＬ４を含有するＳＰＬＰをＢＨＫ細胞とともに４８時間、種々の量のＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２の存在下でインキュベートし、ルシフェラーゼ活性を確定した。図１５に示したように、トランスフェクション活性は主に、トランスフェクション培地中のＣａ２＋の存在によっていた。１０ｍＭの最適ＣａＣｌ２濃度では、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４は、対応する量のＭｇＣｌ２が存在した場合よりも１０５倍より高いトランスフェクション能力を示した。
【０２０４】
Ｃａ２＋またはＭｇ２＋の存在下でのＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の異なるトランスフェクション特性が細胞中への取込みの差により説明され得るか否かを調べるために、ＭｇＣｌ２またはＣａＣｌ２の存在下で４時間インキュベーション後に、ＢＨＫ細胞中へのＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の蓄積をモニタリングした。図１６に示したように、ＢＨＫ細胞中へのＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の取込みは、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋の両方に関して同一である。Ｃａ２＋またはＭｇ２＋取り込みは、おそらくはＢＨＫ細胞の表面の負荷電ＣＰＬ４結合部位が覆われるために、二価陽イオンの濃度が増大するとわずかに低減する、ということが留意され得る。これらの結果は、Ｃａ２＋がＳＰＬＰの細胞取込みにほとんど影響を及ぼさないことを示す従来の研究と一致する。
【０２０５】
ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４は、リポプレックスのトランスフェクション能力に匹敵するかまたはそれ以上であるトランスフェクション能力をｉｎ ｖｉｔｒｏで示す。図１４に示したデータは、４時間の間ＢＨＫ細胞に適用した場合に、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４より〜１００倍高いレベルの遺伝子発現をＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣリポプレックスが生じることを示す。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４が安定系であるとすると、取り込みは長時間にわたっておそらくは継続し得る。したがってＳＰＬＰ−ＣＰＬ４またはリポプレックスが４、８および２４時間のトランスフェクション時間の間、ＢＨＫ細胞に適用された場合に達成されるトランスフェクションレベルを調べた。２つの型のリポプレックス、即ちＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ（１：１）リポプレックス（電荷比１．５）、ならびにトランスフェクション試薬リポフェクチンを用いて生成され、電荷比１．５のＤＯＰＥ／ＤＯＴＭＡ（１：１）リポプレックスから成るリポプレックスを用いた。図１７に示したように、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の能力はトランスフェクション時間の増大に伴って顕著に増大し、これは、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４系の取込み率がトランスフェクションに関する限定因子であり得ることを示唆する。トランスフェクション期間直後にルシフェラーゼ発現に関して細胞が検定される２４時間トランスフェクション時間に関しては、トランスフェクションレベルはリポフェクチンまたはＤＯＰＥ／ＤＯＤＡＣリポプレックスにより達成されるものに匹敵する。
【０２０６】
さらなる実験を実施して、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４およびリポプレックスを用いた２４および４８時間のトランスフェクション時間後のトランスフェクションレベルを確定したが、この場合、ルシフェラーゼ活性はトランスフェクション期間直後に検定した。図１８Ａに示したように、リポフェクチン（ＤＯＰＥ：ＤＯＴＭＡ）リポプレックスの活性は２４時間後に〜２０００ｎｇルシフェラーゼ／細胞タンパク質１ｇに横ばいになった。同様の結果が、ＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣリポプレックスに関して得られた。これに対比して、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４処方物の活性は、インキュベーション時間が増大すると、増大し続けて、４８時間で４０００ｎｇ／細胞タンパク質１ｍｇに対応するルシフェラーゼ発現レベルに達した。この活性は、ＳＰＬＰ（Ｃａ２＋非存在下）に関して観察されたよりも約１０６倍高く、リポフェクチンリポプレックスにより達成されたレベルのほぼ２倍であった。
【０２０７】
６．ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４は非毒性且つ効率的トランスフェクション剤である。リポプレックスが細胞に対して毒性であり得る、ということは周知である。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４は低レベルの陽イオン性脂質を含有し、おそらくはリポプレックスより低毒性である。それぞれＳＰＬＰ−ＣＰＬ４およびリポプレックスに関して約８０Μｍおよび４５μＭの総脂質用量に対応する、５．０μｇ／ｍＬのプラスミドに対応するＳＰＬＰ−ＣＰＬ４およびリポプレックスのレベルに２４および４８時間曝露後の細胞生存可能性を確定することにより、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４およびリポプレックスの毒性を検定した。図１８Ｂに示したように、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４は補ドン度毒性を示さなかったが、一方リポプレックスは高毒性であった。細胞生存率は、リポフェクチンリポプレックスとともに４８時間インキュベーション語には３０％に過ぎなかったが、一方、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４とともに４８時間インキュベーション後には〜９５％の細胞が生育可能であった。
【０２０８】
ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４によりトランスフェクトされた細胞の割合により示されるようなトランスフェクションの効率を確定するための試験も実施した。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を含有するプラスミドを用いて、トランスフェクト化細胞の割合を確定した。蛍光顕微鏡により、ＧＦＰ発現を検出した。図１９Ａおよび１９Ｂに示したように、２４時間で約３５％の細胞、そして４８時間で５０％の細胞がＳＰＬＰ−ＣＰＬ４によりトランスフェクトされ、見かけの細胞死は認められなかった。これに対比して、リポフェクチンリポプレックスは、３５％未満の最大トランスフェクション効率を示し、２４時間トランスフェクション時間語の細胞生存率は〜５０％に過ぎなかった（図１９Ｃ）。同様の低トランスフェクション効率および高毒性は、ＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣリポプレックスを用いても観察された。
【０２０９】
Ｃ．考察
これらの結果は、ＳＰＬＰ中へのＣＰＬ４の組入れがＢＨＫ細胞中への取込み改善を生じ、そしてＣａ２＋が存在する場合のＳＰＬＰのトランスフェクション能力を劇的に強化することを実証する。興味深い３つの点が認められる。第一は、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４系の化学組成および構造、ならびにＳＰＬＰの栄養機能およびトランスフェクション能力を改質するための後挿入手法の一般性に関する。第二は、ＳＰＬＰの取込み強化、Ｃａ２＋の存在および観察されるトランスフェクション活性の間の関連に関する。最後に、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４系の特性をリポプレックスと比較するのは興味深い。これらの領域の各々を、以下で順次取り扱う。
【０２１０】
ここに示された結果は、６０℃でのインキュベーションを含めた簡単な方法を用いて、陽イオン性ＰＥＧ脂質ＣＰＬ４が予備生成ＳＰＬＰ中に挿入され得ることを実証する。例えばＳＰＬＰ外側単一層中の総脂質の約８ｍｏｌ％に相当するレベルにＣＰＬ４を挿入する能力は、同様のインキュベーションプロトコールを用いてＰＥＧ−ＰＥが予備生成ＬＵＶ中に挿入されて、循環寿命延長を示す系を生じ得ることを実証する他の研究者の結果と一致する（Ｕｓｔｅｒ， ｅｔ ａｌ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ３８６：２４３−２４６（１９９６））。それは、ＳＰＬＰ系と同様に脂質組成物を含有する予備生成ＬＵＶ中にＣＰＬ４が挿入され得ることを示す従来の結果とも一致する。外側単一層中で達成されるＰＥＧ−脂質の総レベル（１２．４ｍｏｌ％）は、ＬＵＶ中へのＰＥＧ−脂質の組入れの最大レベルが一般に７〜１０ｍｏｌ％である場合より高い（Ｗｏｏｄｌｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １１１３：１７１−１９９（１９９２））。しかしながら、ＰＥＧ−脂質は、溶解作用が観察される前に１５ｍｏｌ％という高いレベルまでＬＵＶ中に組入れられうる、と多数の著者が報告している（Ｅｄｗａｒｄｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７３：２５８−２６６（１９９７）； Ｋｅｎｗｏｒｔｈｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ６８：１９０３−１９２０（１９９５）； Ｈｒｉｓｔｏｖａ， ｅｔ ａｌ．， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２８：７６９３−７６９９（１９９５））。これらは、構造変化（球から円板への）が、１２ｍｏｌ％より高いＰＥＧ−ＰＥレベルでジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）リポソームに関してのみ観察され、溶解作用は１５ｍｏｌ％より上で観察された冷却電子顕微鏡試験を包含する（Ｅｄｗａｒｄｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ７３：２５８−２６６（１９９７））。同様に、Ｘ線試験は、非二重層ミセル構造が１５ｍｏｌ％より上のＰＥＧ−脂質レベルに関して観察されるだけであることを示す（Ｋｅｎｗｏｒｔｈｙ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ６８：１９０３−１９２０（１９９５）； Ｈｒｉｓｔｏｖａ， ｅｔ ａｌ．， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ２８：７６９３−７６９９（１９９５））。
【０２１１】
ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４系がＣＰＬ４の挿入後に凝集する傾向は、ＣＰＬ４を含有するＬＵＶも凝集する従来の観察と一致する。この凝集の理由は一般に理解されていないが、しかし２つの一般的指摘がなされ得る。第一に、相互作用はおそらくは、高イオン強度での凝集が抑制されるとすると、小胞間の静電的相互作用によるものと思われる。第二に、凝集は後挿入過程それ自体の結果ではなく、そういうものとして、凝集はＣＰＬ４を含有するＬＵＶに関しても観察され、この場合、ＣＰＬ４はＬＵＶが生成された脂質混合物中に存在した。陽イオン性頭基は、リン脂質ホスフェート基のレベルで対向する膜と相互作用する、ということもあり得る。あるいは、凝集現象は、ストレプタビジンのようなタンパク質を結合し得る配座を採用するＰＥＧコーティングの能力に関連し得る（Ｓｈｅｔｈ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：８３９９−８４０４（１９９７））。
【０２１２】
考察の第二点は、ＣＰＬ４がＳＰＬＰ系のトランスフェクション能力を増大するメカニズムに関する。リポプレックス系に含入される陽イオン性脂質は細胞中への取込みを刺激する場合に直接的役割を演じる（Ｍｉｌｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７：１２８７５−１２８８３（１９９８））ということを、そしてこの取り込みがリポプレックス上の正電荷のために起こる（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｏｕｄｅ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １２４０：３４−４０（１９９５））ということを多数の研究が示している。細胞表面のヘパリンスルホン化プロテオグリカンはこの過程において主要な役割を演じる、ということが示唆された（Ｍｉｓｌｉｃｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：１２３４９−１２３５４（１９９６）； Ｍｏｕｎｋｅｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：２６１６４−２６１７０（１９９８））。ＣＰＬ４の付加後のＳＰＬＰの取込み強化は、Ｃａ２＋の類似の付加的存在によるものであり得るが、トランスフェクション能力の増大はＣａ２＋のの付加的存在に大いによっている。実施例Ｉは、Ｃａ２＋の存在が〜６００倍のＳＰＬＰトランスフェクション能力の増大を生じることを、そしてこの増大が、取込み増大に起因するというよりむしろ、取込み後のエンドソーム膜の不安定化に役立つＣａ２＋の能力に起因することを示す。したがって、ＳＰＬＰを上回るＳＰＬＰ−ＣＰＬ４に関するトランスフェクション能力の観察された改善は、Ｃａ２＋の存在によりエンドソーム膜を不安定化する能力増強と結び付けられたＣＰＬ４により媒介される取り込みの改善に起因すると言える。この点に関しては、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４（Ｃａ２＋存在下）のトランスフェクション能力は、Ｃａ２＋非存在下でのＳＰＬＰのトランスフェクション能力と比較して、〜１０４（図１４）の一因子により増大される。これは、４ｍｏｌ％ＣＰＬの存在により約５０倍に（図１３Ａ、４時間インキュベーション）、Ｃａ２＋の存在による〜６００の一因子を掛けたＢＨＫ細胞中へのＳＰＬＰの取り込み増大により説明され得る。
【０２１３】
最後の考察領域は、他の非ウイルスベクターを上回るＳＰＬＰ−ＣＰＬの利点に関するもので、これは、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４系の十分に限定されたモジュール性、ならびに毒性および能力問題を包含する。第一に、不良限定数のプラスミド／粒子を含有する大型、不均質、不安定系である他の非ウイルス系、例えばリポプレックスに対比して、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４は、１プラスミド／粒子を含有する小型で、均質な、安定系である（Ｗｈｅｅｌｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：２７１−２８１（１９９９））。重要な点は、ＳＰＬＰが、モジュール様式で構築され得る、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４のようなより洗練された系の基本構成成分である点である。例えばＣＰＬの陽イオン性基の代わりに特異的ターゲッティングリガンドを含有するＰＥＧ−脂質の後挿入は、特定の細胞および組織に対して特異的に標的化されるＳＰＬＰを生じる必要がある。毒性に関しては、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４は、リポプレックスよりも、組織培養中のＢＨＫ細胞に対して顕著に低毒性である。これはおそらくは、リポプレックスと比較した場合、ＳＰＬＰ中に含入される低比率の陽イオン性脂質に関連する。最後に、ＣＰＬ４またはＣａ２＋を伴わないＳＰＬＰは、プラスミドＤＮＡ−陽イオン性脂質複合体または裸プラスミドＤＮＡのトランスフェクション特性よりもすでに優れている全身投与後のｉｎ ｖｉｖｏトランスフェクション特性を示す。ここに示した結果は、細胞中へのＳＰＬＰ取込みを促すリガンドの使用により、そしてＣａ２＋濃度の局所的増大をもたらす方法により、さらに有意の利益が予測され得ることを示唆する。
【０２１４】
要するに、ここに示した結果は、陽イオン性ＰＥＧ脂質がＳＰＬＰ中に後挿入されて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＢＨＫ細胞中への取り込み改善を示す十分限定されたＳＰＬＰ−ＣＰＬ４系を生じ得ることを実証する。Ｃａ２＋の存在下では、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４系は、Ｃａ２＋の非存在下でのＳＰＬＰと比較した場合、１０６倍まで増大されるトランスフェクション能力を生じる。これらの結果は、細胞中への取込み後、ＳＰＬＰ系が非毒性、高トランスフェクション効力存在であることを示し、そしてエンドサイトーシスを受ける細胞表面リガンドに対して標的化されるＳＰＬＰがｉｎ ｖｉｖｏでのトランスフェクション能力の有意の強化をもたらすことを示す。
【０２１５】
本明細書中に記載された実施例および実施態様は説明のためだけのものであり、そしてそれにかんがみて種々の修正または変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲内に、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるものである、と理解されるべきである。本明細書中に引用された出版物、特許および特許出願はすべて、それらの記載内容が参照により本明細書中に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＳＰＬＰトランスフェクションに及ぼすＣａ２＋の作用および特異性。漸増濃度のＣａＣｌ２（●）、ＭｇＣｌ２（黒四角）またはＮａＣｌ（黒三角）（０〜１４ｍＭ）を、細胞へのそれらの付加前にＳＰＬＰ中で滴定した。ＳＰＬＰ（ＤＯＤＡＣ／ＤＯＰＥ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０；７：８３：１０ ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）小胞中に封入された０．５μｇのｐＣＭＶＬｕｃプラスミドを用いて、１ ｘ １０４細胞／９６ウエルプレートの１ウエルでプレート化された細胞をトランスフェクトした。実施例Ｉの材料と方法に記載したように細胞をＳＰＬＰとともに２４時間インキュベートし、Ｌｕｃ活性を測定した。実験はすべて、三重反復試験で実施した。
【図２】
ＳＰＬＰの細胞取込みに及ぼすＣａ２＋の作用。０．５ｍｏｌ％Ｒｄ−標識化ＤＯＰＥ（ＤＯＤＡＣ／ＤＯＰＥ／ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０／Ｒｈ−ＤＯＰＥ；７：８２．５：１０：０．５ ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ／ｍｏｌ）を含有するＳＰＬＰを用いて、細胞脂質取込みをモニタリングした。Ｃａ２＋（０〜１４ｍＭ）の存在下で調製された８０ ｎｍｏｌの脂質小胞を、適切な時間まで、細胞上でインキュベートした。実施例Ｉの材料と方法に記載したように４時間（●）、８時間（黒四角）または２４時間（黒三角）でのＲｄ蛍光を測定することにより、脂質取込みレベルを確定した。実験はすべて、三重反復試験で実施した。
【図３】
ＳＰＬＰの細胞局在化。４ ｍｏｌ％Ｒｈ−ＤＯＰＥ標識化小胞１００ ｎｍｏｌを、カルシウム（１０ｍＭ）の非存在下（Ａ）または存在下（Ｂ）で細胞（１ ｘ １０５細胞／１２ウエルプレートの１ウエルでプレート化）上でインキュベートした。８時間時点で、トランスフェクト培地を完全ＤＭＥＭ培地と置き換えて、蛍光顕微鏡を用いて細胞を検査した。以下の明細でＯｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌｓ（Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ， ＶＴ）からのローダミンフィルターを用いて、Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００ツァイス蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｊｅｎａ ＧｍｂＨ）で蛍光顕微鏡写真を撮った：λｅｘ＝５６０±２０ ｎｍ、６００ ｎｍＬＰおよびＤＣ５９０ ｎｍ。
【図４】
プラスミドＤＮＡの細胞内プロセシングは、Ｃａの存在の影響を受けた。実施例Ｉの材料と方法に記載したように、２．５μｇプラスミドＤＮＡを含有するＳＰＬＰを用いて、８ｍＭＣａ２＋の非存在下（●）または存在下（黒四角）でＢＨＫ細胞をトランスフェクトした。適切な時点（２時間、４時間および８時間）で、細胞からＤＮＡを抽出し、特異的３２Ｐ−標識化プラスミドＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションにより細胞内ＤＮＡを検出した。（Ａ）材料と方法に記載したようなドットブロット分析により確定されるプラスミドＤＮＡ取込みのレベル。（Ｂ）サザンブロット分析により確定される細胞内プラスミドＤＮＡの完全性。レーン１および１１：ｐＣＭＶＬｕｃ対照；レーン２、５、８および１２；非トランスフェクト化対照；レーン３、６、９および１３：ＳＰＬＰでトランスフェクトされた細胞；レーン４、７、１０および１４：ＳＰＬＰおよび８ｍＭＣａ２＋でトランスフェクトされた細胞；ならびにレーン１５：ＳＰＬＰおよび８ｍＭＭｇ２＋でトランスフェクトされた細胞。実験はすべて、三重反復試験で実施した。
【図５】
ＣａＣｌ２の存在下での種々のモデル膜の３１Ｐ　ＮＭＲスペクトル。（Ａ）Ｃａ２＋を、０：１〜０．５：１（モル比）の範囲のＣａ２＋／ＤＯＰＳ比で小胞（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＳ／ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ、１：１：１：３）中で滴定した。（Ｂ）Ｃａ２＋を、０：１〜０．２５：１（モル比）の範囲のＣａ２＋／ＤＯＰＳ比で小胞（ＤＯＰＥ／ＤＯＰＳ／ＤＯＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＤＯＤＡＣ、１：１：１：３：０．２５）中で滴定した。３サイクルの凍結−解凍により、脂質二重層を横断する陽イオンの平衡を保証した。スペクトルを同一ピーク高に釣り合いを取った。実施例Ｉの材料と方法に記載したように実験を実行した。
【図６】
トランスフェクションに及ぼすＣａ２＋含有ＳＰＬＰの作用。材料と方法に記載したように、ｐＨ勾配の存在下でＡ２３１８７を用いてＣａ２＋を負荷した。漸増濃度のＣａ２＋（０〜１４ｍＭ）を、ＤＭＥＭ希釈前にＳＰＬＰ（黒四角）およびＣａ２＋含有ＳＰＬＰ（●）の両方に付加した。ＳＰＬＰ中に封入された０．５μｇのｐＣＭＶＬｕｃプラスミドを用いて、１ ｘ １０４細胞／９６ウエルプレートの１ウエルでプレート化された細胞をトランスフェクトした。実施例Ｉの材料と方法に記載したようにＬｕｃ活性を測定した。実験はすべて、三重反復試験で実施した。
【図７】
改良型ＳＰＬＰ系に及ぼすＣａ２＋の作用。より高いＤＯＤＡＣ含量（１４ｍｏｌ％）またはＣＰＬ（４ｍｏｌ％）を含有するＳＰＬＰを用いて、８ｍＭＣａの存在下（斜線バー）または非存在下（白バー）で細胞をトランスフェクトした。０．５μｇのｐＣＭＶＬｕｃを、各トランスフェクション実験における各処方物中に用いた。実施例Ｉの材料と方法に略記したように、Ｌｕｃ発現に関して検定する前に、細胞を小胞に２４時間曝露した。実験は三重反復試験で実施した。
【図８】
ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の生成。Ａ．ダンシル化ＣＰＬ４の構造。ＣＰＬ４は、脂質アンカー、ＤＳＰＥに結合されたＰＥＧ３４００分子の末端に４つの正電荷を保有する。Ｂ．予備生成ＳＰＬＰ中へのＣＰＬ４の挿入のためのプロトコール。ＳＰＬＰおよびＣＰＬ４を６０℃で３時間一緒にインキュベートし、セファロースＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィーを用いて非混入ＣＰＬ４を除去する。さらなる詳細に関しては、実施例ＩＩの材料と方法を参照されたい。
【図９】
６０℃でのＳＰＬＰ中へのＣＰＬ４の挿入に関する時間経過。ダンシル化ＣＰＬ４（０．３μｍｏｌ）を、１．５ｍＬの総容積中に３６０μｇのｐＣＭＶＬｕｃを含有する６μｍｏｌのＤＯＰＥ：ＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０：ＤＯＤＡＣ：Ｒｈ−ＰＥ（８３．５：１０：６：０．５；ｍｏｌ％）から成るＳＰＬＰに付加し、６０℃でインキュベートした。混合物のアリコート（２５０μＬ）を指示された時点で採取して、セファロースＣＬ−４Ｂカラムクロマトグラフィーを用いて非取込みＣＰＬ４を除去した。実施例ＩＩの材料と方法に記載したように、ＣＰＬ４混入を確定した。
【図１０】
ＣＰＬ４の後挿入のＳＰＬＰの脱凝集に及ぼす陽イオン濃度の作用。実施例ＩＩの材料と方法に記載したように、ＳＰＬＰを調製し、４ｍｏｌ％ＣＰＬ４を挿入した。漸増濃度のＣａ２＋（●）およびＭｇ２＋（黒四角）の存在下でのＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の平均直径および平均直径の標準偏差を、ＱＥＬＳにより確定した。５００ｍＭストック溶液からのＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２をＳＰＬＰ−ＣＰＬ４に付加した（４００Μｌ中１８０ｎｍｏｌ）。Ｃａ２＋またはＭｇ２＋の付加は、約３０ｍＭの陽イオン濃度での平均直径の標準偏差の低減により示されるように、より単分散性調製物を生じる。
【図１１】
（Ａ）ＳＰＬＰ、（Ｂ）ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４および（Ｃ）４０ｍＭＣａＣｌ２の存在下でのＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の凍結−割断電子顕微鏡写真。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４は実施例ＩＩの材料と方法に記載したように調製され、そして４ｍｏｌ％ＣＰＬ４を含有した。プレートＡのバーは、２００ｎｍに相当する。
【図１２】
封入プラスミドのサザン分析により検定した場合のＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の血清安定性。図９に対する凡例に示したようにＳＰＬＰを調製し、後挿入プロトコールを用いて４ｍｏｌ％のＣＰＬ４を挿入した。５０％マウス血清の存在下で３７℃で指示時間の間、５μｇｐＣＭＶＬｕｃを含有するＳＰＬＰ−ＣＰＬ４をインキュベートし、１μｇのプラスミドＤＮＡに対応する混合物のアリコートを取り出し、プラスミドＤＮＡを抽出し、材料と方法に記載したようにサザン分析に付した。レーン１〜４は、それぞれ０、１、２および４時間インキュベーション時間後の裸プラスミドＤＮＡの行動を示し；レーン５〜８は、０、１、２および４時間インキュベーション時間後のＳＰＬＰから抽出されたプラスミドの行動を示し；そしてレーン９〜１２は０、１、２および４時間インキュベーション時間後の４ｍｏｌ％ＣＰＬ４を含有するＳＰＬＰから抽出されたプラスミドＤＮＡの行動を示す。
【図１３Ａ】
ＢＨＫ細胞中へのＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の取込みに及ぼすＳＰＬＰ中に混入されたＣＰＬ４の量の影響。０（●）、２（黒四角）、３（黒三角）または４（◆）ｍｏｌ％ＣＰＬ４を含有するＳＰＬＰの取込みを調べた；比較のために、ＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣリポプレックス（○）の取込みを示す。ＳＰＬＰ中へのＣＰＬ４の挿入およびリポプラックスの調製を、実施例ＩＩの材料と方法に記載したように実施した。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４培地は、凝集を防止するために４０ｍＭのＣａＣｌ２を含有し、ＢＨＫ細胞の付加は、８ｍＭへのＣａＣｌ２濃度の希釈を生じた。取込みプロトコールは、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中の１０５ＢＨＫ細胞を伴うＳＰＬＰ−ＣＰＬ４のインキュベーションを包含した。インキュベーション後、細胞を溶解し、実施例ＩＩの材料と方法に記載したようにローダミン−ＰＥの取込みを測定した。
【図１３Ｂ】
４時間インキュベーション後のＳＰＬＰ（パネルＩ）および４ｍｏｌ％ＣＰＬ４を含有するＳＰＬＰ（パネルＩＩ）の取込み後のＢＨＫの蛍光顕微鏡写真。左の顕微鏡写真は位相差方式で、そして右の写真は（ローダミン）蛍光方式で撮影した。
【図１４】
種々の量のＣＰＬ４を含有するＳＰＬＰによるトランスフェクション後のＢＨＫ細胞中のルシフェラーゼ発現。後挿入法を用いて２、３および４ｍｏｌ％ＣＰＬ４を含有するＳＰＬＰを調製した。実施例ＩＩの材料と方法に記載したように、４時間のトランスフェクション時間および２４時間の完全インキュベーション時間を用いて、５．０μｇ／ｍＬｐＣＭＶＬを含有するＳＰＬＰ、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４およびＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣ（１：１）リポプレックスでＢＨＫ細胞（１０４）をトランスフェクトした。培地での希釈およびＢＨＫ細胞への付加後のＳＰＬＰ−ＣＰＬ含有系中のＣａＣｌ２濃度は８ｍＭであった。トランスフェクション後、材料と方法に記載したように細胞を溶解し、ルシフェラーゼおよびＢＣＡ検定を実施した。
【図１５】
ＳＰＬＰ−ＣＬＰ４のトランスフェクション能力に及ぼすＣａ２＋（●）およびＭｇ２＋（黒四角）の影響。実施例ＩＩの材料と方法に記載したように、後挿入法により、４ｍｏｌ％ＣＰＬ４を含有するＳＰＬＰ−ＣＰＬ４を調製した。漸増濃度のＣａＣｌ２またはＭｇＣｌ２をＳＰＬＰ−ＣＰＬ４（５．０μｇｐＣＭＶＬｕｃ／ｍＬ）に付加し、ＢＨＫ細胞に移して、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で４８時間インキュベートした。次に細胞を溶解し、実施例ＩＩの材料と方法に記載したように、ルシフェラーゼ活性およびタンパク質含量を測定した。
【図１６】
ＢＨＫ細胞によるＳＰＬＰ−ＣＰＬ４の取込みに及ぼすＣａ２＋（●）およびＭｇ２＋（黒四角）の作用。図８に関して示したように陽イオン濃度の増大によりＳＰＬＰ−ＣＰＬ４を調製し、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で４時間、ＢＨＫ細胞（〜８０Μｍ脂質および〜５．０μｇｐＣＭＶＬｕｃ／ｍＬ／ウエル）とともにインキュベートした。次に細胞を溶解し、実施例ＩＩの材料と方法に記載したように、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４含量（Ｒｈ−ＰＥ脂質標識により示されるような）および細胞タンパク質を測定した。
【図１７】
ＳＰＬＰ、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４およびリポプレックスに関するトランスフェクション時間の一関数としてのＢＨＫ細胞中のルシフェラーゼ発現。後挿入法により、４ｍｏｌ％ＣＰＬ４を含有するＳＰＬＰ−ＣＰＬ４を調製した。ＤＭＥＭおよび１０％ＦＢＳ中のＢＨＫ細胞を、４、８および２４時間のトランスフェクション時間および２４時間の総インキュベーション時間を用いて、ＳＰＬＰ、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４およびリポプレックス（５．０μｇ／ｍＬｐＣＭＶＬ）とともにインキュベートした。次に、ルシフェラーゼ活性およびタンパク質含量に関して細胞を検定した。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４（●）、ＳＰＬＰ（黒逆三角）、ＤＯＰＥ：ＤＯＤＡＣリポプレックス（黒四角）およびリポフェクチンリポプレックス（◆）でのトランスフェクション後のルシフェラーゼ活性を、トランスフェクション時間の一関数としてプロットした。リポプレックスを、１．５：１の投入比で調製した。
【図１８】
Ａ．ＢＨＫ細胞によるトランスフェクション時間延長後の４ｍｏｌ％ＣＰＬ４を含有するＳＰＬＰ−ＣＰＬ４（●）およびリポフェクチンリポプレックス（◆）のトランスフェクション能力。ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４およびリポプレックスを、図１０に示したように生成した。１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で２４および４８時間、ＢＨＫ細胞をトランスフェクトしたが、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４およびリポフェクチンリポプレックス（投入比１．５：１）は５．０μｇ／ｐＣＭＶＬｕｃ １ｍＬを含有した。トランスフェクション後、細胞溶解物中で、ルシフェラーゼ発現レベルおよび細胞タンパク質レベルを測定した。溶解物中のタンパク質含量に関してルシフェラーゼ活性を正規化し、トランスフェクション時間の一関数としてプロットした。
Ｂ．細胞溶解物中のタンパク質濃度に基づいた細胞生存により検定した場合のトランスフェクション時間の一関数としての４ｍｏｌ％ＣＰＬ４を含有するＳＰＬＰ−ＣＰＬ４（●）およびリポフェクチンリポプレックス（◆）の毒性。
【図１９】
ＧＦＰをコードするプラスミドを含有するＳＰＬＰ−ＣＰＬ４およびリポプレックスでトランスフェクトされるＢＨＫ細胞の蛍光および位相差顕微鏡写真。細胞を、ＳＰＬＰ−ＣＰＬ４で２４時間（Ａ１、Ａ２）および４８時間（Ｂ１、Ｂ２）、ならびにリポフェクチンで２４時間（Ｃ１、Ｃ２）トランスフェクトした。実施例ＩＩの材料と方法に記載したように、ｐＣＭＶＧＦＰを用いてＳＰＬＰおよびリポプレックスを調製した。４ｍｏｌ％ＣＰＬ４を含有するＳＰＬＰ−ＣＰＬ４は後挿入法により調製され、ＣａＣｌ４を含有して、トランスフェクション培地中に８ｍＭＣａＣｌ２濃度を生じた。２４および４８時間のトランスフェクション時間の間、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中でＳＰＬＰ−ＣＰＬ４またはリポフェクチン（５．０μｇ／ｍＬ）とともにＢＨＫ細胞（１０５）をインキュベートし、トランスフェクション期間直後に検査した。
【図２０】
陽イオン性リポプレックスにより媒介される細胞膜の崩壊に関するメカニズム。標的細胞との結合（過程１）およびその細胞中へのエンドサイトーシス（過程２）後、陽イオン性リポプレックスを後期エンドソーム区画に移す（過程３）。陽イオン性脂質はエンドソーム膜の脱安定化を誘導して、エンドソーム膜とのリポプレックスの融合（過程４）、あるいは非二重層相へのエンドソーム膜の完全リモデリング（過程５）をもたらす。
【図２１】
種々の量の負荷ヘッド基（ａ．）Ｅｔ３Ｎ／ＣＨＣｌ３；（ｂ．）ＴＦＡ／ＣＨＣｌ３；ｃ．ＥｔＮ／ＣＨＣｌＮα、Ｎε−ジ−ｔ−Ｂｏｃ−Ｌ−リシンＮ−ヒドロキシスクシニドエステルを有する陽イオン性ＰＥＧ−脂質複合体の調製のための合成模式図。
【図１】
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【図２】
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【図４Ａ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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2004508012.tif 000027
2004508012.tif 000028
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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