(57)【要約】サンプルにおける赤血球系、巨核球もしくは血小板細胞系列の造血細胞数またはその発現産物を決定するために、動物個体から得られたサンプルをアッセイする段階を含む、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）またはプリオン病の診断のための方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルにおける赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞の相対数を決定するために、動物個体から得られたサンプルをアッセイする段階を含む、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断方法。
【請求項２】
伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）が、スクレイピー、ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、慢性消耗性疾患（ＣＷＤ）、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、または新変異型（ｎｖ）ＣＪＤである、請求項１記載の、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断方法。
【請求項３】
サンプルが、全血もしくは分画化された血液、骨髄のような造血組織、または脾臓由来である、請求項１または請求項２記載の、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断方法。
【請求項４】
アッセイされる赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞が、多能性幹細胞、骨髄系幹細胞、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞（コロニー形成単位 顆粒球／赤血球／単球／巨核球）、ＢＦＵ−Ｅ細胞（芽球形成単位−赤血球系）、ＣＦＵ−Ｅ細胞（コロニー形成単位−赤血球系）、前赤芽球、網赤血球、赤血球、巨核球または血小板を含む、請求項１から３のいずれか一項記載の、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断方法。
【請求項５】
赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞の数が、該細胞の発現産物に関して評価される、前記請求項のいずれかに記載の、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断方法。
【請求項６】
アッセイされる発現産物が赤血球系分化関連因子（ＥＤＲＦ）である、請求項５記載の、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断方法。
【請求項７】
アッセイされる造血細胞が、抗ＴＥＲ−１１９抗体、抗グリコホリンＡ抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗ＥＤＲＦ抗体または抗ヘモグロビン抗体に対する反応によって特徴付けられる、請求項１から４のいずれか一項記載の、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断方法。
【請求項８】
アッセイされる細胞が、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球、網赤血球（原始赤血球）を含む、請求項７記載の、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断方法。
【請求項９】
アッセイされる造血細胞が、抗ＣＤ６１抗体に対する反応によって特徴付けられる、請求項１から４のいずれか一項記載の、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断方法。
【請求項１０】
アッセイされる細胞が、Ｅ／Ｍｅｇ細胞、巨核芽球、巨核球または血小板の細胞である、請求項９記載の、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断方法。
【請求項１１】
赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞の発現産物の、サンプルにおける相対量を決定するために、動物個体から得られたサンプルをアッセイする段階を含む、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断方法。
【請求項１２】
赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞に対する抗体を含む、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断のためのキット。
【請求項１３】
赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞の発現産物に対する抗体を含む、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断のためのキット。
【請求項１４】
抗体が結合する赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞の発現産物がＥＤＲＦである、請求項１３記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）またはプリオン病についての診断の新しい方法に関する。
【０００２】
ＴＳＥ生物学の包括的大要は、刊行されたレビュー版（Ｐｒｕｓｉｎｅｒ， Ｓ．Ｂ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５ １３３６３〜１３３８３（１９９８））、および／またはインターネット上（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｄ−ｃｏｗ．ｏｒｇ）に見いだすことができる。伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）またはプリオン病は、遺伝的、感染的または散発的機序を介して症状発現する、中枢神経系（ＣＮＳ）の例外なく致死的な疾患群である。それらは、ヒツジにおけるスクレイピー、ウシにおけるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ならびに、ヒトにおけるクールー、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、新変異型（ｎｖ）ＣＪＤ、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群（ＧＳＳ）および致死性家族性不眠症を含む。ＴＳＥ疾患は、エルク（ｅｌｋ）、シカ、ミンク、ネコ（ＦＳＥ）のような他種、ならびに、ニアーラ、アラビアンオリックス、チーターおよびグレータークードゥーのような外来動物種においても症状発現する。シカおよびエルクにおいては慢性消耗性疾患（ＣＷＤ）も同定されており、これはヒトにも伝播する可能性があることが示唆されている。
【０００３】
ＴＳＥ疾患は、長い無症候性のインキュベーション期間に続く、しばしば、神経変性、空胞形成、グリア細胞の増殖、およびプロテアーゼ抵抗性のプリオンタンパク質Ｓｃ（ＰｒＰＳｃ）、即ち宿主にコードされる糖タンパク質ＰｒＰＣの異常なアイソフォームの沈着からなる、比較的迅速な臨床的経過によって特徴付けられる。プロテイナーゼＫ感受性の正常なＰｒＰＣの、プロテイナーゼＫ抵抗性の異常なアイソフォームＰｒＰＳｃへの変換は、ＴＳＥ疾患に頻繁に認められる特徴的な特質である。
【０００４】
ＢＳＥの流行、および、その後のヒトにおける新変異型ＣＪＤの出現の結果、英国においては現在、ＴＳＥ疾患への関心が非常に高まっている；ＴＳＥ疾患はＢＳＥから生じ、ＢＳＥに感染した組織がヒトの食物連鎖に侵入した結果、種の壁を越えてヒトに生じたと考えられる。大多数の英国市民が、ＢＳＥ感染性物質に曝露された可能性が高い。ヒツジにおける天然のスクレイピーの問題に加え、動物の飼料中にＢＳＥ感染素材が存在していた結果として、ヒツジにおいても、および他の農業種においても、準臨床的な無症候性のレベルでＢＳＥが潜在している可能性のあることが、大きな懸念となっている。
【０００５】
英国民集団がｎｖＣＪＤを潜在的に有している程度、および、続いて疾患を進行させる比率は、現在のところ不明である。現在、ヒトまたは動物において潜在的ＴＳＥ感染を評価する有効な生前診断法はない。ＴＳＥ感染した農業種をヒトの食物連鎖から取り除くためにも、およびヒトにおける潜在的なＴＳＥ感染を評価するためにも、適切な診断法、理想的には、血液のように容易に入手可能な組織において行うものが望ましい。現在のところ、同定されている唯一の疾患特異的な高分子はＰｒＰＳｃである。しかし、ＰｒＰＳｃは、扁桃の生検にて検出しうるＴＳＥ疾患（Ｃｏｇｈｌａｎ， Ａ．， Ｎｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ， ５ （１９９６年６月１５日））もあるが、実用的には、死後のＣＮＳ組織においてのみ検出可能である。近年、ＴＳＥ感染した動物個体の血液においてＰｒＰＳｃが検出できることが示された（Ｓｃｈｍｅｒｒら， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ８５３ （１−２） ２０７〜２１４ （１９９９））。しかし、これは、ＰｒＰＳｃの検出が一般にそうであるように、時間のかかる、かつ著しく技術を要する手法である。その上、ＰｒＰＳｃは、明らかにＴＳＥ疾患に罹患したヒトおよび動物個体のＣＮＳ組織において、しばしば検出不可能である。したがって、ＴＳＥ感染を評価する有効な生前診断法はない。それゆえに、理想的な診断法は、ＰｒＰＳｃに基づかないものであるべきであり、血液のように容易に入手可能な組織において、潜在的なＴＳＥ感染の評価ができるものであろう。そのような診断テストは、理想的には、治療的介入戦略を実行できるように、初期の段階で、生きた個体において、ＴＳＥ感染の評価を行うことができるものである。
【０００６】
ＴＳＥ感染した動物個体のＣＮＳ組織において差別的に発現される遺伝子について、幾つか公表された報告がある。しかし、今までのところ、ＴＳＥ感染した動物個体の脾臓、骨髄または血液における差別的な遺伝子発現について他に報告はない。ＴＳＥ感染した動物個体に由来する血液は感染性であることが示され、ＰｒＰＣタンパク質が幾つかの造血細胞において発現されることが示されたが、本発明以前には、赤血球系造血細胞とＴＳＥ病理学的機序との間の関係は認識されていない。現在のＴＳＥの診断の取り組みについての包括的な概要は、インターネット上（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｄ−ｃｏｗ．ｏｒｇ／００／ｓｃｉ＿ａｒｃｈｉｖｅ＿ｆｒａｍｅ．ｈｔｍｌ）にて見出すことができる。
【０００７】
ＴＳＥの最新の研究ではこれまでのところ、ＥＤＲＦまたは赤血球系造血細胞の生物学を、ＴＳＥ病理学的機序に関連付けできていない、すなわち、脾臓、血液または骨髄における、ＴＳＥ感染の非ＰｒＰＳｃ分子マーカーを同定できていない。当技術分野におけるほとんどの研究者は、ＰｒＰＳｃの検出を意図した方法に焦点を当てているようである。
【０００８】
現在、ＥＤＲＦ、即ち造血組織の赤血球系細胞において通常発現される遺伝子が、ＴＳＥ感染した動物個体の造血組織において差別的に発現されることが見出されている。ＥＤＲＦは、脾臓、骨髄および血液中、赤血球系および巨核球／血小板系列の造血細胞において発現される。したがって、造血、特に赤血球生成は、ＴＳＥ感染した個体において驚くほどに影響を受けているものと考えられる。
【０００９】
本発明の第一の局面に従い、サンプル中の赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞の相対数を決定するために、動物個体から得られたサンプルをアッセイする段階を含む、ある動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断方法が提供される。
【００１０】
伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）またはプリオン病には、ヒツジにおけるスクレイピー、ウシにおけるウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）、ならびに、ヒトにおけるクールー、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、新変異型（ｎｖ）ＣＪＤ、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー症候群（ＧＳＳ）および致死性家族性不眠症が含まれる。ＴＳＥ疾患は、プリオンタンパク質Ｓｃ（ＰｒＰＳｃ）、即ち、宿主にコードされる糖タンパク質ＰｒＰＣの異常なアイソフォームの沈着によって特徴付けられる。プロテイナーゼＫ感受性の正常なＰｒＰＣの、プロテイナーゼＫ抵抗性の異常なアイソフォーム ＰｒＰＳｃへの変換は、ＴＳＥ疾患に認められる特徴である。
【００１１】
本発明の目的のために、ＴＳＥ感染という用語は、ＴＳＥ疾患状態という用語と同等に使用される。ＴＳＥ疾患が伝播される正確な機構については、科学的議論において今もなお問題とされる。実験動物は、実験室においてＴＳＥ疾患に「感染させられる」ことが可能である。臨床的症状発現は十分に明らかであるのだが、実際に遭遇する疾患が、その用語の通常の意味における「感染」かどうかは未だ分かっていない。
【００１２】
ＴＳＥ疾患に罹患する動物には、ヒツジ、ウシ、ヒト、ネコ、エルク、シカ、ミンクのような哺乳動物、ニアーラ、アラビアンオリックス、チーターおよびグレータークードゥーのような外来動物種、ならびに、例えばニワトリ、シチメンチョウ、ホロホロチョウのような家禽などの鳥類種が含まれる。したがって本出願に従った方法は、ヒツジ、ウシ、シカ、エルクまたはヒトにおけるＴＳＥについての診断方法に及ぶ。
【００１３】
本発明に従ってアッセイされるサンプルは、典型的には、例えば血液に基づくサンプル、または、造血細胞源に由来するもののような生物学的サンプルである。サンプルとしては、全血または分画化された血液（または部分的に分画化された血液）、血漿、骨髄のような造血組織、または脾臓に由来するものが可能である。サンプルには、サンプル分析を最適化するために、付加的な成分を添加することができる。例えば、血液サンプルにおいては、血餅形成による凝固を避けるために、ヘパリン、ＥＤＴＡおよび／またはクエン酸ナトリウムのような物質を加えると好都合であろう。他のサンプル源には、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、涙、乳、精液、粘液性分泌物、例えば脳、肝臓、胸腺、膵臓のような組織または器官の生検材料が含まれる。
【００１４】
赤血球系系列の造血細胞には、多能性幹細胞、骨髄系幹細胞、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞（コロニー形成単位 顆粒球／赤血球／単球／巨核球）、ＢＦＵ−Ｅ細胞（芽球形成単位−赤血球系）、ＣＦＵ−Ｅ細胞（コロニー形成単位−赤血球系前赤芽球）、網赤血球および赤血球が含まれる。赤血球系系列の造血細胞は、図１１において図式的に示される。
【００１５】
単能性造血細胞は、単一の細胞系列に方向付けられる細胞である；両能性造血細胞は、例えば赤血球または巨核球の細胞系列のいずれかに分化することができるＥ／Ｍｅｇすなわち赤血球／巨核球細胞のように、２つの可能な細胞系列のうち１つに方向付けられる細胞である；三能性造血細胞は、３つの可能な細胞系列のうち１つに方向付けられる細胞である。
【００１６】
前赤芽球からの赤血球の成熟には、次の通りに、ジャンキエラ（Ｊｕｎｑｕｉｅｒａ）またはウィーター（Ｗｈｅａｔｅｒ）の定義によって説明されるように、認識されている以下の細胞タイプを経由する進行が含まれる：
2004513347.tif 000002
巨核球および血小板系列の造血細胞は、Ｅ／Ｍｅｇ前駆細胞、巨核芽球および分化した巨核球または血小板の細胞を含む。
【００１７】
それゆえ、本発明に従った方法では、赤血球系、巨核球もしくは血小板系列の上記の造血細胞タイプの１つもしくはそれ以上、または、赤血球系、巨核球もしくは血小板系列の造血細胞タイプの１つもしくはそれ以上に関連する発現産物についてのアッセイが意図され得る。
【００１８】
赤血球系系列の造血細胞に関連するある発現産物は、赤血球系分化関連因子（ＥＤＲＦ）である。ＥＤＲＦは、ヘモグロビン陽性正常芽細胞および網赤血球、即ち、赤血球を含めた赤血球産生を通じての細胞を含む、赤血球系もしくは巨核球系列、または、Ｅ／Ｍｅｇ細胞、芽球形成単位（ＢＦＵ−Ｅ）細胞、コロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｅ）細胞、前赤芽球（原始赤芽球）、初期正常芽細胞（好塩基性赤芽球または前正赤芽球）、中間型赤芽球（正赤芽球または多染性赤芽球）、後期正常芽細胞（正染性正赤芽球または正染性赤芽球）を経由して進行し得る、両能性細胞において発現される。
【００１９】
通常ＥＤＲＦを発現する、特定の関心対象の細胞は、抗ＴＥＲ−１１９抗体を用いて同定することができる、即ちＴＥＲ−１１９＋細胞である。ＴＥＲ−１１９抗体は、免疫原Ｃ５７ＢＬ／６マウス１４日齢胎児肝臓細胞（Ｉｋｕｔａら， Ｃｅｌｌ ６２， ８６３〜８７４ （１９９０））に対して生じさせた、アイソタイプラット（Ｗｉｓｔａｒ）のＩｇＧ２ｂκ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏから入手可能なＴＥＲ−１１９抗体）である。ＴＥＲ−１１９抗体は、全ての赤血球系産生器官における赤血球系系列の細胞と反応し、ＥＤＲＦを発現するような細胞タイプの全てではないが、ほとんどの細胞と反応する。ＴＥＲ−１１９抗原は、初期赤芽球から成熟赤血球までの段階を通じ、赤血球系細胞上において特異的に発現されるが、ＣＦＵ−ＥまたはＢＦＵ−Ｅ活性をもつ細胞上には発現されない。本発明の方法においてこのようにアッセイできる細胞には、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球、網赤血球（原始赤血球）および赤血球が含まれる。そのような細胞の特徴付けにおいて有用な代替抗体は、抗グリコホリンＡ抗体、抗ＥＤＲＦ抗体、抗ＣＤ６１抗体、抗ＣＤ７１抗体、抗トランスフェリン抗体、抗フェリチン抗体、抗ＥＤＲＦ抗体および抗ヘモグロビン抗体である。抗ＣＤ６１抗体は、前駆細胞から成熟細胞までの巨核球／血小板系列の細胞を検出するために使用することができる（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ−ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍから商品として入手可能である）。
【００２０】
本発明の本局面の好ましい態様においては、診断方法には、ＥＤＲＦを発現する赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞数についてアッセイする段階が含まれる。そのような細胞は、限定はしないが、Ｅ／Ｍｅｇ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞、ＢＦＵ−Ｅ細胞、ＣＦＵ−Ｅ細胞、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球、網赤血球（原始赤血球）を含み得る。通常ＥＤＲＦを発現する細胞系列の枯渇は、被験個体におけるＴＳＥ感染（またはＴＳＥ疾患状態）を示すものである。細胞系列の枯渇は、非感染個体において存在する、アッセイされるクラスの細胞数に関係する。言い換えれば、特定の細胞の正常な数からの有意な偏差が認められる。正常範囲は、統計的に関連性のある、健康な非感染個体からなる集団をアッセイすることによって決定できる。
【００２１】
別の発現マーカーとしては、ＴＳＥ感染またはＴＳＥ疾患状態を有している被験個体において同様に枯渇すると考えられる、ヘモグロビンが可能である。
【００２２】
サンプル中の細胞数の測定は、任意の従来法を用いて行うことができる。例えば、細胞数は、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）；例えばギムザ−ライト組織染色のような特定の細胞の染色による、手作業の計測を用いてアッセイすることができる。または、赤血球または網赤血球のような造血細胞数を計測するために設置できる自動血液分析装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ−ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ）を使用することができる。例えば赤血球数の測定に定常的に用いられるヘマトクリット、赤血球沈殿容積等を使用して、サンプル中の細胞数を評価することも可能である。前駆細胞数を評価する別の方法は、血液／骨髄を、メチルセルロースのような半固形培地において培養し、コロニーを計測するものである。
【００２３】
抗体を用いた、関心対象の造血細胞の同定では、例えば、ビオチンと、または蛍光マーカーによって標識された抗体と連結された抗体のような、抗体の修飾型を使用することができる。関心対象の抗体について陽性である細胞は、蛍光細胞分析分離装置（ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリーまたは磁気ビーズ分離法を用いて都合良く分離することができる。例えば、赤血球系系列の細胞は、適切なレポーター部分と結合することができる、ＴＥＲ−１１９抗体のような抗体を用いて同定することができる。
【００２４】
例えば血液学および／または細胞学などの、サンプル採集および分析の標準的技術を用いて、対照または正常な集団の値を確立することが可能である。ある集団について意味のある平均値を定義付けるために、標準の統計的技術を使用することができ、年齢、性別および／または遺伝子型のような因子を考慮する必要があり得る、および、非感染個体または非感染個体集団に基づくことが可能である。
【００２５】
静脈血、指先の血液および動脈血における血球数の最近の比較（Ｙａｎｇら， Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ｈａｅｍ． ２３， １５５〜１５９ （２００１））によって、定義付けられたヒト集団における正常な血液細胞集団数が以下の通りであることが証明された：
2004513347.tif 000003
【００２６】
本発明の本局面の好ましい態様においては、診断方法は、ＥＤＲＦを発現する赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞を含むサンプルにおけるＥＤＲＦの相対濃度についてアッセイする段階を含む。そのような細胞には、限定はしないが、Ｅ／Ｍｅｇ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞、ＢＦＵ−Ｅ細胞、ＣＦＵ−Ｅ細胞、前赤芽球、好塩基性赤芽球、多染性赤芽球、正染性赤芽球、網赤血球（原始赤血球）、巨核球または血小板が含まれ得る。マウス、ヒトおよびウシのＥＤＲＦのヌクレオチド配列は、図３において示され、予測されるアミノ酸配列は、図４において示される。ＥＤＲＦの相対濃度は、サンプル中のＥＤＲＦタンパク質レベルを測定することにより、直接的にアッセイすることができる、または、サンプル中の細胞におけるＥＤＲＦ発現レベルを示す、ＥＤＲＦをコードするｍＲＮＡレベルを測定するために、ＥＤＲＦ ｃＤＮＡを用いることによって間接的にアッセイすることができる。サンプルにおけるＥＤＲＦレベルの減少は、被験個体におけるＴＳＥ感染（またはＴＳＥ疾患状態）を示すものである。発現レベルの減少は、非感染個体において存在する発現レベルと関係する。正常範囲は、健康な非感染個体からなる、統計的に関連性のある集団をアッセイすることによって決定することができる。
【００２７】
さらなる診断アッセイは、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る、ＥＤＲＦに対する抗体の使用に関しうる。ポリクローナル抗体は、適切な動物宿主（例えば、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギまたはサル）において、本発明の物質を動物個体に注入してその産生を刺激することによって、生じさせることができる。必要な場合は、本発明の物質と共にアジュバントを投与することができる。抗体はその後、ＥＤＲＦへの結合によって、または、さらに下記にて説明されるように、精製することができる。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマから生産することができる。これらは、不死化細胞系を形成するために、骨髄腫細胞と、望ましい抗体を産生する脾臓細胞とを融合することによって形成することができる。これは、コーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルステイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）のよく知られた技術である（Ｎａｔｕｒｅ ２５６， ５２〜５５ （１９７５））。
【００２８】
特定のタンパク質に結合するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を生産するための技術は、当技術分野において今日、十分に開発されている。それらについては、例えばロイト（Ｒｏｉｔｔ）ら、免疫学第２版（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ （１９８９）， Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ， Ｌｏｎｄｏｎ）のような、免疫学の標準的な教材において議論されている。
【００２９】
完全な抗体に加え、本発明には、ＥＤＲＦに結合できるようなそれらの誘導体が含まれる。ゆえに、本発明は、抗体断片および合成構築物を含む。抗体断片および合成構築物の例は、ドゥガル（Ｄｏｕｇａｌｌ）ら、Ｔｉｂｔｅｃｈ １２， ３７２〜３７９ （１９９４年９月）によって与えられている。抗体断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片を含む（Ｒｏｉｔｔら［上記］を参照のこと）。Ｆｖ断片を修飾し、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子として知られる合成構築物を生産することが可能である。これは、分子の安定性に寄与する、Ｖｈ領域およびＶｌ領域を共有結合するペプチドリンカーを含む。
【００３０】
他の合成構築物にはＣＤＲペプチドが含まれる。これらは、抗原結合決定基を含む合成ペプチドである。ペプチド模倣物もまた使用することができる。これらの分子は通常、ＣＤＲループ構造を模倣し、抗原相互作用性の側鎖を含む、立体配座的に制限された有機環である。合成構築物には、キメラ分子も含まれる。したがって、例えば、ヒト化（または霊長類化）抗体またはそれらの誘導体は、本発明の範囲内にある。ヒト化抗体の一例は、ヒトのフレームワーク領域を有するが、げっ歯動物の超可変領域を有するような抗体である。合成構築物はまた、抗原への結合に加えて、ある望ましい特性を分子に提供するような、共有結合された部分を含有する分子をも含む。例えば、その部分は、標識（例えば、蛍光標識または放射性標識のような、検出可能な標識）、または薬学的に活性な作用物質であることが可能である。
【００３１】
ＥＤＲＦに対して特異的な抗体またはそれらの誘導体には、様々な他の使用がある。それらは、ＥＤＲＦ自体の、またはＥＤＲＦを発現する細胞の、精製および／または同定において使用することができる。結果として、それらは本発明に従った診断法において用いることができる。
【００３２】
ＥＤＲＦに対する適切な抗体の調製後、一般的に利用可能な幾つかの技術（例えば、抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８８））において説明されるようなもの）のうちの１つによって、それを単離または精製することができる。一般に適した技術には、ペプチドもしくはタンパク質アフィニティーカラム、ＨＰＬＣもしくはＲＰ−ＨＰＬＣ、プロテインＡもしくはプロテインＧカラム上における精製、またはこれらの技術の組み合わせが含まれる。ＥＤＲＦに対する組換え抗体は、標準法に従って調製し、ＥＬＩＳＡ、ＡＢＣ、ドットブロットアッセイ等を含む一般に利用可能な手法を用いて、ＥＤＲＦへの特異性についてアッセイすることができる。
【００３３】
サンプル中に発現されたＥＤＲＦタンパク質についてアッセイする方法の一例は、ウエスタンブロット法である。サンプルからのタンパク質の抽出物は、変性ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を通して分画することができる。混合物をその後、エレクトロブロッティングによって、ニトロセルロースまたはナイロンの固形膜上に移行し、固定化することができる。負荷された膜をその後、抗ＥＤＲＦ抗体と共にインキュベートする。その結果生じる抗原−抗体複合体をその後、任意の適切な手法によって検出することができる。例えば、レポーター部分（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）が連結された抗ＥＤＲＦ抗体に対して生じさせた第二抗体を加えることができる。酵素作用によって生じた反応産物は、その後、膜上の標的タンパク質の位置を示すために使用することが可能である。酵素反応レベルの測定は、サンプル中に存在する標的タンパク質レベルを示すものである。検出系の感度は、ビオチン−ストレプトアビジン系を用いることによって、または、化学発光検出によって、高めることができる。
【００３４】
または、ＥＤＲＦタンパク質レベルは、放射免疫測定法（ＲＩＡ）または酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の標準技術によってアッセイすることができる。抗体は、レポーター酵素に連結され、その後、マイクロタイタープレート上に固定化される。その後、測定されるサンプルの溶解物を添加して、抗体−抗原複合体を形成させる。洗浄および基質の調製後、産物形成レベルは、サンプル中に存在する抗原レベル、即ち標的タンパク質レベルに比例する。別の方法は、時間分解型蛍光測定法に基づくデルフィアシステム（ＤＥＬＦＩＡ ｓｙｓｔｅｍ）である。デルフィアリサーチシステム（Ｄｅｌｆｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｗａｌｌａｃ）では、蛍光を発する分子に模倣させた場合の、ユウロピウム、サマリウムおよびテルビウムを含むランタニド系列からの金属蛍光が測定される。抗体は標識され、マイクロタイタープレート上に固定化される。測定されるサンプルからの溶解物をプレートに加え、抗体−抗原複合体を形成させる。洗浄後、シグナルを検出する。
【００３５】
発現の準備ができている、ＥＤＲＦをコードするＲＮＡ転写産物の存在は、ノーザンブロット法を用いてアッセイすることができる（Ｔｈｏｍａｓ， Ｐ．Ｓ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７， ５２０１〜５２０５ （１９８０））。手短に言えば、後のハイブリダイゼーションアッセイにおける使用のために、サンプル細胞からの変性ＲＮＡを、ニトロセルロースまたはナイロンフィルター上に移行する。毛管作用によって、または電場の作用下に置くことによって、膜上に移行する以前に、変性アガロースゲルにおいてＲＮＡの電気泳動を行う。検出可能にするために、ＥＤＲＦ ＲＮＡに特異的な、放射性標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを、フィルターに結合されたＲＮＡにハイブリダイズさせる。または、その特異性が蛍光エネルギー移行（ＦＲＥＴ）プローブの使用に由来する、リアルタイムの定量的ＲＴ−ＰＣＲ法である「ｔａｑｍａｎ（商標）」を用いて、または、特有のクラスの構造に特異的なエンドヌクレアーゼ酵素（切断酵素）の発見に基づく「インベーダー」技術によって、ＲＮＡレベルを測定することができる。インベーダープローブおよびシグナルプローブは、インベーダープローブがシグナルプローブの部分を置き換えるように、標的ＤＮＡ／ＲＮＡ上の重複部位にハイブリダイズするよう設計される。これにより、切断酵素によって認識および切断され、それによって検出可能な産物が作製されるような構造が形成される。
【００３６】
または、本発明の本局面は、対照または正常な集団の値と比較した、サンプル中の赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞数を決定するために、動物個体から得られたサンプルをアッセイする段階を含む、ある動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断方法として定義され得る。
【００３７】
本発明の第二の局面に従い、赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞の発現産物の、サンプルにおける相対量を決定するために、動物個体から得られたサンプルをアッセイする段階を含む、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断方法が提供される。アッセイされる赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞の発現産物は、上記に説明されるようなものが可能である。サンプルの分析および発現産物の検出のための方法は、上記に説明されるようなものが可能である。
【００３８】
統計的に関連性のある健康な非感染個体集団をアッセイすることによって決定される正常範囲と発現産物の量が比較される、本アッセイによっては、サンプル中の造血細胞の実数に関係なく、個体におけるＴＳＥの存在を証明することができる。
【００３９】
本発明の第三の局面に従い、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在についての診断のためのキットであり、赤血球系、巨核球もしくは血小板系列の造血細胞に対する抗体、またはＥＤＲＦに対する抗体を含むキットが提供される。本発明の本局面の代替の態様においては、キットは、赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞、およびＥＤＲＦの、双方に対する抗体を含み得る。そのような二重抗体キットでは、診断法の感度はより高いものが許容され得る。
【００４０】
赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞に対して特異的な抗体は、上記に説明されるようなものである。ＥＤＲＦに対する抗体は、上記に説明されるように作製することができる。
【００４１】
抗体の標的への結合についてのアッセイは、ＥＬＩＳＡ、ＡＢＣ、ドットブロットアッセイ法のような、一般に利用可能な標準技術を用いて行うことができる。蛍光マーカーまたは放射性マーカーのような付加的な検出標識を使用することも可能である。
【００４２】
上記に議論されるように、サンプルをアッセイすることができる組織源には、血液もしくはその分画、または他の組織および／もしくは器官が含まれ得る。したがって、本出願の方法は、レシピエントへの輸血または移植に先立つ、血液（またはその分画）、組織、および／または器官の事前のスクリーニングにおける利用を見出し得る。血液もしくはその分画、または他の組織および／もしくは器官の供給源は、レシピエントに関して同種、または異種であることが可能である。本発明の第一の局面に従った方法を用い、サンプルがＴＳＥ感染の存在について陽性の結果を示す場合、これによって、そのサンプルが分析された個体から提供された血液（またはその分画）、組織および／または器官を、後にレシピエントへの輸血または移植において使用することを避けるように決定することが可能になる。そのような手段によって、ＴＳＥ感染の一般集団への潜在的な経路を回避することが可能である。
【００４３】
あるいは、血液または組織または器官に基づく産物の調製以前に、血液（もしくはその分画）、組織、および／または器官のサンプルについて、スクリーニングを行うことができる。そのような産物は、全血または別の組織源から調製される、血液の血漿、または、例えば第ＩＸ因子、第ＸＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＸＩＩ因子、第Ｖ因子、第ＸＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＶＩＩＩＶＷＦＡｇ因子のような血液凝固因子の濃縮物、または、成長ホルモン、エリスロポエチン、サイロキシンもしくはインスリンのようなホルモンを含み得る。
【００４４】
したがって、本発明の第四の局面に従い、血液産物を調製するための方法であり、サンプルが得られた動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在について血液サンプルをアッセイする段階を含むような方法であり、アッセイが、サンプル中の赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞の相対数を決定する段階を含むような方法が提供される。
【００４５】
本発明の好ましい態様においては、動物個体における伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）の存在について診断する方法は、以下のように行うことができる：
‐選択的なサンプルの調製段階（例えば、血餅形成阻害剤；保存剤等の添加）を含む、サンプルの採集
‐以下による、サンプル中の赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞の相対数を決定する段階
（ａ）サンプル中の細胞集団の直接的な測定、または、
（ｂ）そのような細胞系列の発現産物（例えば、ＥＤＲＦタンパク質またはＥＤＲＦタンパク質をコードするＲＮＡ）に関する間接的な測定。
【００４６】
そのような好ましい方法の一例は、以下の段階を含み得る：
（１）組織源からのサンプルの採集および／または調製；
（２）細胞数の計測に先立つ、サンプル中の細胞の選択的標識；
（３）以下のいずれかによる、サンプル中の赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞数の決定；
（ｉ）手作業の計測による決定；または
（ｉｉ）自動計測による決定；および
（４）正常な非感染個体に由来する対照参照サンプルと結果を比較する段階。
【００４７】
代替法は、以下の段階を含み得る：
（１）組織源からのサンプルの採集および／または調製；
（２）赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞の細胞サンプルの単離；
（３）例えばＥＤＲＦ発現レベルのアッセイにおいて、以下のいずれかを行うような、細胞中の発現産物レベルのアッセイ：
（ｉ）（例えばウエスタンブロット法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、もしくはＥＬＩＳＡによって）ＥＤＲＦタンパク質レベルを決定する；または
（ｉｉ）（例えばノーザンブロット法、もしくはＲＴ−ＰＣＲによって）ｃＤＮＡプローブを用いてｍＲＮＡレベルを決定する；
（４）正常な非感染個体に由来する対照参照サンプルと結果を比較する段階。
【００４８】
正常な非感染個体に由来する対照参照サンプルは、統計解析において正常範囲または正常値を確立するのに十分な、正常な非感染個体の集団から収集されたサンプルを含み得る。
【００４９】
本発明に従った方法においては、赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞数を、そのような細胞の発現産物に関して評価することができる。発現産物は、タンパク質、もしくはポリペプチドが可能であり、または、そのタンパク質もしくはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子であり得る。
【００５０】
本発明に従った方法においては、アッセイの結果により、赤血球系、巨核球または血小板系列の造血細胞の細胞数において、対照または正常な集団の値と比較して減少が示される場合に、アッセイされる個体においてＴＳＥ感染の診断を行うことが可能である。
【００５１】
対照または正常な集団の値は、上記に説明されるように確立でき、非感染個体または非感染個体集団に基づくことが可能である。
【００５２】
本発明の第二の局面およびそれ以後の局面についての好ましい特徴は、第一の局面に必要な変更を加えたものに関する。
【００５３】
本発明は、ここで、本発明を例証する目的で存在するものであって、限定するものとは解釈されない、以下の図および実施例に関してさらに説明される。以下の図について言及する。
【００５４】
材料および方法：
ＴＳＥ感染したマウスに由来する全ての組織は、ニューロパソジェネシスユニット（Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｕｎｉｔ， ＮＰＵ）（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ）から得られた。対照および天然のヒツジスクレイピー症例に由来する血液は、ＮＰＵから得られた。ＢＳＥの現場症例に由来する組織は、ＭＡＦＦ中央獣医学研究所（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＣＶＬ）（Ｗｅｙｂｒｉｄｇｅ）から得られた。ヒトのＲＮＡは、クロンテック社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， ＵＫ）から購入した。マウスの造血細胞に対して反応性の抗体は、ベクトンディッキンソン社（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， ＵＫ）から購入した。デイヴィッヅバイオテクノロジー社（Ｄａｖｉｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に委託し、マウスおよびヒトの赤血球系分化関連因子（ＥＤＲＦ）ペプチドを合成し、これらのペプチドに対する抗血清を生産した。ヒトおよびマウスの全長ＥＤＲＦ ｃＤＮＡは、ＩＭＡＧＥコンソーシアムを介し、ヒトゲノムマッピングプロジェクト（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ， ＵＫ）を通して無償で得られた。造血細胞ｃＤＮＡのドットブロットは、ノーマン・イスコヴ氏（Ｎｏｒｍａｎ Ｉｓｃｏｖｅ， Ｃａｎａｄａ）から寄贈された。
【００５５】
実施例１：遺伝子発現の解析
ＴＳＥ感染モデルとして、十分に特徴付けられたＭｅ７スクレイピー株を、Ｃ５７Ｂｌマウスの脳内に注入した。１：１０ ｗ／ｖの正常な脳のホモジェネート２０μｌを、年齢および性別の一致したマウスの脳内に注入した。脳および脾臓は、対照およびＴＳＥ感染動物個体から、注入後１０、２０、３０、４０、６０、８０、１００および１６２日目に採集した。注入後１６２日目は、本モデルにおける疾患の最終段階を表す。総ＲＮＡは、「収集された」組織から単離され、引き続き行われるディファレンシャルディスプレイ逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＤＤＲＴ−ＰＣＲ）のためのｃＤＮＡ亜集団を合成するため、鋳型として使用された。ＤＤＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡフィンガープリントの作製を介して、任意の特定の細胞タイプまたは組織における遺伝子発現を視覚化させる、強力な分子ツールである。研究中の２つまたはそれ以上のサンプル間で差別的に発現される遺伝子は、本技術を用いて容易に同定することができ、回収可能である。ＤＤＲＴ−ＰＣＲ解析は、本質的に、以前に説明されたように（Ｌｉａｎｇら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７， ９６７〜９７１ （１９９２））、改変を加えながら（Ｍｉｅｌｅら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２５（１）， １３８〜１４４ （１９９８））実行された。ＤＤＲＴ−ＰＣＲ技術を用いて、ＴＳＥ疾患病理学的機序の様々な病期にマウスの脾臓において発現された遺伝子を、対照脾臓において発現された遺伝子と比較した。差別的に発現されたｃＤＮＡを表すバンドは、以前に説明されたように（Ｍｉｅｌｅら， 「発現遺伝学 （Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」， ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄおよびＰａｒｄｅｅ編， ４３３〜４４４， Ｎａｔｉｃｋ：Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ （１９９９） （ａ）；Ｍｉｅｌｅら， Ｐｒｅｐ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２９ （３）， ２４５〜２５５ （１９９９） （ｂ））、回収され、クローニングされた。ヌクレオチドおよびタンパク質の公共データベースの、コンピューター支援相同性検索に従って、クローニングされたｃＤＮＡを配列決定および同定した。クローニングされたｃＤＮＡは、標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら， 「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （１９８９））に従った、ノーザンハイブリダイゼーション解析およびサザンハイブリダイゼーション解析におけるプローブとして使用するため、放射標識に使用した。
【００５６】
ウシの配列に対する相同プローブとして使用する、ウシのＥＤＲＦ核酸配列領域をクローニングするために、以下のデジェネレートオリゴヌクレオチドプライマーおよびウシゲノムＤＮＡを鋳型として用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。プライマーは、マウスとヒトのＥＤＲＦの間のオープンリーディングフレームの相同性に基づいて設計された。
2004513347.tif 000004
【００５７】
第一ラウンドのＰＣＲは、標準の濃度の試薬およびＥＤ１ＦおよびＥＤ２Ｒプライマーを用いて実行し、９４℃にて１分間、５０℃にて１分間、および７２℃にて１分間を、４０サイクル行った。ネステッドＰＣＲについては、ＥＤ３ＦおよびＥＤ２Ｒプライマーを用いたことを除いては、第一ラウンドのＰＣＲと同じ条件下で、１μｌのＰＣＲ産物を使用した。予測された１６８ ｂｐのサイズのＤＮＡのＰＣＲ産物をゲル精製し、Ｔ／ＡクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。幾つかのクローンから単離されたプラスミドＤＮＡを、正方向および逆方向に配列決定し、ウシのＥＤＲＦについての部分的なコンセンサスオープンリーディングフレーム配列を編集した。
【００５８】
本解析のための供給源素材は、疾患病理学的機序の定義付けられた様々な病期において、対照およびスクレイピー（Ｍｅ７株）感染マウス（脳内接種経路）から収集された脾臓組織であった。疾患病理学的機序の後期の病期において、ＴＳＥ感染マウスの脾臓においてダウンレギュレートされると考えられる、ある転写産物が同定された（図１）。この転写産物に相当するｃＤＮＡは、ＤＤＲＴ−ＰＣＲゲルから回収、精製されて、ＰＣＲ再増幅され、および、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫＩＩ＋クローニングベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へクローニングされた。
【００５９】
図１における結果は、疾患病理学的機序の様々な病期における、年齢および性別の一致した対照およびスクレイピー感染マウス（脳内経路）の脾臓における発現遺伝子のサブセットを比較したＤＤＲＴ−ＰＣＲゲルの図を示す。１、感染後１０日目；２、感染後２０日目；３、感染後３０日目；４、感染後４０日目；５、感染後６０日目；６、感染後８０日目；７、感染後１００日目；８、感染後１６２日目（最終）。スクレイピー感染脾臓においてダウンレギュレートされたこの転写産物に相当するｃＤＮＡは、回収され、以前に説明されたように（Ｍｉｅｌｅら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２５（１）， １３８〜１４４ （１９９８）；Ｍｉｅｌｅら， 「発現遺伝学（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」， ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄおよびＰａｒｄｅｅ編， ４３３〜４４４， Ｎａｔｉｃｋ：Ｅａｔｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ （１９９９） （ａ）；Ｍｉｅｌｅら， Ｐｒｅｐ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２９（３）， ２４５〜２５５ （１９９９） （ｂ））、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へクローニングされた。標準ＤＮＡ配列決定に引き続く、ヌクレオチドおよびタンパク質の公共データベースのコンピューター支援相同性検索によって、このｃＤＮＡが５０５ヌクレオチドのマウスの赤血球系分化関連因子のｍＲＮＡ（ｍＥＤＲＦ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＡＦ０５５０８５、ＡＦ０６０２２０）断片を表すことが示された。この遺伝子は、ヌクレオチドの公共データベースにおいてのみ説明されている。しかし、ＤＤＲＴ−ＰＣＲのｃＤＮＡ断片はまた、ｍＥＤＲＦとの１００％の相同性での合致に加え、はるかにより大きな、マウスのＴＥＬ癌遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ００７９６１．１）の小領域とも、核酸レベルにて１００％合致する。実際、全５０５ヌクレオチドのｍＥＤＲＦ ｃＤＮＡ配列は、アンチセンスの向きにおいて、マウスのＴＥＬ ｃＤＮＡと１００％合致する（図２を参照のこと）。
【００６０】
図２は、図１に示されるＤＤＲＴ−ＰＣＲゲルから単離されたｃＤＮＡの配列同一性を示す。ｃＤＮＡは、５０５ヌクレオチドの、ハツカネズミ（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）の赤血球系分化関連因子のｍＲＮＡ（ｍＥＤＲＦ）の位置２６３から末端まで、ヌクレオチドレベルにて１００％合致する。しかし、それはまた、アンチセンスの向きにおいて、ハツカネズミ（Ｍｕｓ Ｍｕｓｃｕｌｕｓ）のｅｔｓ変異型遺伝子６（ＴＥＬ癌遺伝子）の位置７９６から５８２までとも１００％合致する。ＤＤＲＴ−ＰＣＲプライマーの位置には下線を施してある。（ｂ）ＥＤＲＦおよびＴＥＬの双方の転写産物についての、詳細なコンピューター支援解析により、双方の転写産物は同じゲノム遺伝子座上にコードされるが、互いにアンチセンスに並ぶことが示される。線影を施した四角い部分は、（ａ）において示された配列の図式的な位置を表す。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号は以下の通りである：マウスのＥＤＲＦ（ＡＦ０５５０８５、ＡＦ０６０２２０）、マウスのＴＥＬ（ＮＭ００７９６１．１）。全長のヒトおよびマウスのＥＤＲＦ ｃＤＮＡを表すクローンは、ヒトゲノムマッピングプロジェクト（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ， Ｈｉｎｘｔｏｎ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）を通して得られた（各々、ＩＭＡＧＥクローン番号 ２３０２２１および４６６４０７）。
【００６１】
実施例２：ウシのＥＤＲＦ配列のクローニング
上記に言及されたＤＤＲＴ−ＰＣＲ ＥＤＲＦ ｃＤＮＡ断片は、全ＥＤＲＦ ｃＤＮＡ配列を表してはいない。全長のマウスおよびヒトのＥＤＲＦ ｃＤＮＡクローン（各々、ＩＭＡＧＥ ＩＤ ２３０２２１および４６６４０７）は、ヒトゲノムマッピングプロジェクト（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｍａｐｐｉｎｇ Ｐｒｏｊｅｃｔ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）から無償で得られた。これらの全長ｃＤＮＡを、双方向に配列決定した。その配列情報は図３において示される。発現試験におけるプローブとして将来的に使用する、ウシのＥＤＲＦ ＲＮＡについての相同プローブを得るために、ウシのゲノムＤＮＡについてデジェネレートＰＣＲ（材料および方法を参照のこと）を行った。予測されるサイズのＰＣＲ産物を精製し、ｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。これらのクローンのヌクレオチド配列は、図３において示される。配列解析によって、この部分的ＤＮＡ配列が、マウスおよびヒトのＥＤＲＦに対する、ウシの相同遺伝子のオープンリーディングフレーム領域を示すことが確認される。
【００６２】
図３は、マウスおよびヒトの全長ＥＤＲＦ ｃＤＮＡの核酸配列、およびウシの部分的なＥＤＲＦの配列を示す。全長（ａ）マウスおよび（ｂ）ヒトのＥＳＴ ｃＤＮＡクローンは、ＩＭＡＧＥコンソーシアムを介し、ヒトゲノムマッピングプロジェクトを通して得られた（各々、ＩＭＡＧＥ ＩＤ ４６６４０７および２２０２２１）。ｃＤＮＡ ＥＳＴクローンを、正方向および逆方向に配列決定した。（ｃ）実験の背景において述べられたように、デジェネレートオリゴヌクレオチドを用いたネステッドＰＣＲに従って合成されたウシのＥＤＲＦの部分的な１６７ ｂｐ配列。変異型ヌクレオチド（保存的アミノ酸置換）については下線を施してある。ヌクレオチドレベルにおいて、マウスおよびヒトのＥＤＲＦ ｃＤＮＡ配列は、４０３ヌクレオチドに渡って７２．２％同一である。ウシのＥＤＲＦの部分的なＤＮＡ配列は、マウスのＥＤＲＦ ｃＤＮＡの位置１５３から３１８まで、および、ヒトのＥＤＲＦ ｃＤＮＡ の位置１７１から３３７までと合致する。ヌクレオチドレベルにおいて、ウシのＥＤＲＦは、１６７ヌクレオチドに渡って、ヒトのＥＤＲＦ配列に対して７８．４％、マウスのＥＤＲＦ配列に対して７５．６％同一である。
【００６３】
実施例３：ＥＤＲＦタンパク質に対する抗血清の作製
図３にて示される、ヒト、マウスのＥＤＲＦ ｃＤＮＡ配列および部分的なウシのＥＤＲＦ ｃＤＮＡ配列を利用し、これらの配列によってコードされるアミノ酸配列を推定した（図４を参照のこと）。デイヴィッヅバイオテクノロジー社（Ｄａｖｉｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）は、マウスおよびヒトの概念上のＥＤＲＦタンパク質に由来するペプチドを合成し、ニワトリの免疫感作に続く抗血清の作製を行っている。
【００６４】
図４は、マウスおよびヒトのＥＤＲＦアミノ酸配列、およびウシの部分的なＥＤＲＦタンパク質のアミノ酸配列を示す。配列は、マウスおよびヒトの全長のＥＤＲＦ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列、およびウシの部分的なオープンリーディングフレームＤＮＡ配列（図３にて示されるヌクレオチド配列）に基づく概念上の翻訳物である。ａおよびｂにおいて下線を施したペプチドは、デイヴィッヅバイオテクノロジー社（Ｄａｖｉｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に委託して、合成し、ヒトおよびマウスのＥＤＲＦタンパク質に対する抗体の産生のために、ニワトリを免疫化するように選択されたペプチドを表す。アミノ酸レベルにおいて、ヒトおよびマウスのＥＤＲＦタンパク質は６３．７％同一であり、ウシの部分的ＥＤＲＦタンパク質（５５アミノ酸）は、ヒトのＥＤＲＦタンパク質に対して７２．７％、マウスのＥＤＲＦタンパク質に対して６７．３％同一である。図３において示されるウシの変異型ＥＤＲＦヌクレオチドは、イソロイシンまたはスレオニンであり得るコドン６番を例外としては、保存的アミノ酸置換をもたらすことに注意する。
【００６５】
実施例４：ＴＥＬとＥＤＲＦとの間の関係
コンピューター支援配列アラインメントに基づき、ＥＤＲＦは、ＴＥＬに対してアンチセンスのＤＮＡ鎖上にコードされると考えられる。ＴＳＥ感染脾臓において差別的に発現されるものとして同定された転写産物（図１）が、ＥＤＲＦまたはＴＥＬを表すのかどうかを確立することが重要である。全長ｍＥＤＲＦプローブを用いた予備的サザンブロット解析により、ＥＤＲＦおよびＴＥＬが同じゲノム遺伝子座上にコードされている可能性が高いことが示される（図５）。しかし、一本鎖リボプローブを用いたノーザン解析によって、およそ５００ヌクレオチドのＥＤＲＦ転写産物が、ＴＳＥ感染マウスの脾臓（Ｍｅ７脾臓）においては十分に発現されないＲＮＡであること、および、これらの条件下にてＴＥＬは検出不可能であることが示される（ＥＤＲＦセンスリボプローブ‐ＴＥＬ ＲＮＡに対してアンチセンス）。これらの実験は、ＤＤＲＴ−ＰＣＲによって差別的に発現されるものとして同定された転写産物がｍＥＤＲＦであることを、正式に証明するものである。
【００６６】
図５は、マウスのＥＤＲＦおよびＴＥＬが同じゲノム遺伝子座に存在すること、および、転写産物の向きの解析を示す。（ａ）様々な制限エンドヌクレアーゼを用いて分解された、および、放射標識されたマウスの全長ＥＤＲＦ ｃＤＮＡをプローブとして用いた、マウスのゲノムＤＮＡのサザンブロット。およそ５０５ ｂｐのＥＤＲＦ ｃＤＮＡ核酸配列は、ＴＥＬに対して１００％同一である。各制限分解について単一のバンドが検出されることにより、ＥＤＲＦおよびＴＥＬが同じゲノム遺伝子座上にコードされる可能性が高いことが示される。マウスのＥＤＲＦ ｃＤＮＡはＥｃｏＲＩ部位を含み、ＥＤＲＦおよびＴＥＬが同じゲノム遺伝子座上にコードされているならば、ｍＥＤＲＦ全長ｃＤＮＡをプローブとして用いた場合に、続いて２つのバンドの検出がもたらされるはずである。（ｂ）核酸配列解析から示される、同じゲノム遺伝子座上にコードされるＴＥＬおよびＥＤＲＦ転写産物は互いにアンチセンスであることをさらに調べるために、様々なマウス組織のＲＮＡのノーザンブロットに対して、放射標識一本鎖インビトロ転写リボプローブをプローブとして用いた。ＥＤＲＦ ＲＮＡは、ＥＤＲＦアンチセンスリボプローブ（ＴＥＬセンスリボプローブ）を用いてのみ検出される。これによって、ＥＤＲＦは実際、ＴＥＬに対してアンチセンスの転写産物であり、オルタナティブスプライシングを受けたＴＥＬの転写産物ではないことが示される。ＴＥＬ ＲＮＡは、ＴＥＬアンチセンスリボプローブを用いたこれらの条件下においては検出できない。したがって、ＥＤＲＦおよびＴＥＬの転写産物は、サイズ、向きおよび量に関して著しく異なる。Ｔａｑｍａｎ ＲＴ−ＰＣＲ解析によって、ＥＤＲＦとは異なり、ＴＥＬ ＲＮＡはスクレイピー感染したマウス脾臓において差別的に発現されないことが示された。
【００６７】
実施例５：ＥＤＲＦ ＲＮＡ発現の組織分布
多様なマウス組織のノーザン解析によって、ＥＤＲＦがマウスの脾臓、骨髄および全血においてのみ発現され、ＥＤＲＦ転写産物の最高レベルを有する組織は骨髄であることが示される（図６ａ）。胸腺においてはＥＤＲＦ発現は検出可能でないことから、ＥＤＲＦ発現はリンパ球とは関連しないことが示される点に注意する。成体マウスにおいては、これらの組織は、造血活性を有する組織を表し、胸腺を例外として、赤血球生成組織を表す。ヒトの組織においては（ＲＮＡ はＣｌｏｎｔｅｃｈ社から購入された）、ＥＤＲＦは骨髄において発現されるが、脾臓においては発現されない（図６ｂ）。ヒトにおいては、骨髄が造血活性を有する主要な組織である。ＥＤＲＦはまた、ヒトの全血においても発現される（図６ｃ）。ヒト血液のバッフィーコート（リンパ球を含有する）および非リンパ球分画の解析によって、血液におけるＥＤＲＦ発現が赤血球と関連し、リンパ球とは関連しないことが示される。
【００６８】
図６は、マウスおよびヒトのＥＤＲＦ ｍＲＮＡ発現の組織分布を示す。マウスおよびヒトの放射標識ｃＤＮＡプローブを用いて、様々な（ａ）マウスおよび（ｂ、ｃ）ヒトの組織のノーザン解析を行った。（ａ）マウスのＥＤＲＦは、脾臓、骨髄および全血においてのみ発現される。（ｂ、ｃ）ヒトのＥＤＲＦは、骨髄および全血においてのみ発現される。これらの組織は、造血組織（マウスにおいては脾臓、骨髄および血液、およびヒトにおいては骨髄および血液）である。ＥＤＲＦ発現は、ヘモグロビン（赤血球系細胞においてのみ発現される）を発現する組織と相関する。１８Ｓ ｒＲＮＡをプローブとすることにより、全てのレーンにおいてＲＮＡが同等に負荷されていることが示される。（ｃ）ヒトの血液のバッフィーコートおよび赤血球分画におけるＥＤＲＦのノーザン解析により、それに続くヘモグロビン検出によって示されるように、赤血球系細胞について濃縮した分画とＥＤＲＦ発現が関連していることが示される。
【００６９】
実施例６：実験的ＴＳＥ疾患のげっ歯動物に由来する組織におけるＥＤＲＦ発現
ＴＳＥ疾患病理学的機序の様々な病期のマウス（Ｍｅ７スクレイピー株）由来の脾臓におけるＥＤＲＦの発現について調べた。図７ａにおいて示されるように、ＥＤＲＦは、モック感染させた対照と比較して、ＴＳＥ疾患の最終病期におけるマウスの脾臓において、著しくダウンレギュレートされる。このダウンレギュレーションは、脾臓における疾患病理学的機序の過程のおよそ３分の１において明らかである。ヘモグロビンβ鎖もまた、疾患の最終病期のマウスの脾臓においてダウンレギュレートされる。さらなる研究により、ヘモグロビンβ鎖と同様に、ＥＤＲＦのダウンレギュレーションは、他の実験的ＴＳＥ疾患での疾患病理学的機序の最終病期のげっ歯動物個体由来の脾臓においても明らかであることが示された（図７ｂ）。さらに、この影響は、ＴＳＥ感染のハムスターモデル（ＬＶＧハムスター、２６３Ｋスクレイピー株）において明らかである。したがって、脾臓におけるＥＤＲＦおよびヘモグロビンβ鎖の差別的な発現は、これらの様々なＴＳＥ疾患モデルに共通の特徴である。ＥＤＲＦはまた、マウスの骨髄および全血においても発現されるため、ＴＳＥ感染マウスのこれらの組織において、ＥＤＲＦが差別的に発現されるかどうかを調べた。図７ｃにおいて示されるように、ＥＤＲＦは、分析された疾患病理学的機序の最終病期のマウスの骨髄および血液においてもダウンレギュレートされている。しかし、マウスの脾臓から得られた結果とは対照的に、スクレイピー感染させたマウスに由来する骨髄または血液においては、ヘモグロビンβ鎖は差別的に発現されない。
【００７０】
図７は、対照およびスクレイピー感染した、脾臓、骨髄および全血における、ＥＤＲＦ発現のノーザン解析を示す。（ａ）疾患病理学的機序の様々な病期において、対照およびスクレイピー感染（Ｍｅ７株）マウス（Ｃ５７Ｂｌ系）の脾臓から単離されたＲＮＡ。ＥＤＲＦは、疾患病理学的機序の最終病期（感染後１６２日目）のスクレイピー感染マウスの脾臓においては、対照と比較して著しくダウンレギュレートされる。このダウンレギュレーションは、より早い段階において検出可能である。スクレイピー感染マウスの脾臓においては、ヘモグロビンβ鎖ＲＮＡもダウンレギュレートされる。（ｂ）ＴＳＥ疾患の他のげっ歯動物モデルにおいてＥＤＲＦのダウンレギュレーションが明らかであることの確認。様々な対照ならびにスクレイピー感染近交系マウス（ＶＭおよびＳＶ）およびハムスター（ＬＶＧ）に由来する脾臓。スクレイピー株は、Ｍｅ７、８７Ｖ、７９Ａおよび２６３Ｋであり、これらのモデルのインキュベーション期間が示される。ＥＤＲＦおよびヘモグロビンβ鎖の双方は、様々なスクレイピー株の感染後、様々な遺伝子型のげっ歯動物個体由来の脾臓において著しくダウンレギュレートされる。これによって、ＥＤＲＦのダウンレギュレーションが見出されるのはマウスに限られた現象ではないことも示される。（ｃ）ＥＤＲＦはまた、骨髄および全血においても発現される（図５を参照のこと）。したがって、スクレイピー感染マウス由来の組織においてＥＤＲＦが同様に差別的に発現されるかどうかを決定するため、対照およびスクレイピー感染マウス由来の骨髄および全血（骨髄；ＶＭマウス／８７Ｖスクレイピー株、全血；Ｃ５７Ｂｌマウス／Ｍｅ７スクレイピー株）を調べた。ＥＤＲＦは、疾患病理学的機序の最終病期のスクレイピー感染マウス由来の骨髄および全血においてダウンレギュレートされる。脾臓とは対照的に、疾患の最終病期のスクレイピー感染マウス由来の骨髄および血液においては、ヘモグロビンβ鎖ＲＮＡは同様のレベルにて発現される。１８Ｓ ｒＲＮＡ をプローブとして用いることにより、全てのレーンにおいて同様のＲＮＡ が負荷されていることが確認される。疾患病理学的機序の最終病期では、脾臓（＞３０倍）、骨髄（８倍）および全血（４倍）において、ＥＤＲＦがダウンレギュレートされる。全てのサンプルは、脳内注入を介した感染後に、マウスから得られた。
【００７１】
これらの結果は、感染した動物個体と感染していない動物個体との間の、造血組織における分子の相違を初めて示すものである。
【００７２】
実施例７：ＴＳＥ疾患の天然の現場症例由来の組織におけるＥＤＲＦの発現
造血組織において観察された、ＴＳＥ感染のＥＤＲＦ発現に対する影響は、実験的げっ歯動物モデルに特有の現象であるのか、または、他の天然のＴＳＥ疾患と共通の現象であるのかをさらに調べた。天然スクレイピーの初期の臨床的徴候を表すヒツジ（疾患による死亡の１．５ヶ月前）から全血を得た。対照素材は、同じＰｒＰ遺伝子型（ＰｒＰ遺伝子型は疾患への感受性に影響を与えることがよく知られた因子である）の、年齢、品種および性別の一致したヒツジから採集した。放射標識された、ヒトの全長ＥＤＲＦ ｃＤＮＡを用いた、ヒツジの全血から単離されたＲＮＡのノーザン解析では、天然のスクレイピーの現場症例の血液においては十分に発現されない、およそ３．５ Ｋｂの転写産物が検出された（図８ａ）。このノーザンブロットの、ウシの部分的なＥＤＲＦ ｃＤＮＡを用いたリプロービングでは、同じ転写産物にハイブリダイズする。したがって、検出されたヒツジの転写産物は、マウスまたはヒトのＥＤＲＦより著しく大きいが、この転写産物が実際、ヒツジのＥＤＲＦ ＲＮＡを表している。また、健康なウシ個体およびＢＳＥへの罹患が疑われる（および後にＢＳＥを有することが病理学的に確認された）ウシ個体からも、脾臓および胸骨骨髄を得た。対照およびＢＳＥウシ個体は、品種が一致した、妊娠していない、およそ同様の年齢（＞３．５歳）の雌であった。ウシの部分的なＥＤＲＦ ｃＤＮＡを利用したノーザン解析により、ウシのＥＤＲＦ転写産物が、マウスおよびヒトのＥＤＲＦとおよそ同じサイズ（およそ５００ヌクレオチド）であることが示された。ヒトと同様に、ウシは脾臓においてＥＤＲＦを発現しないことが見出された。しかし、胸骨骨髄の解析によって、ＴＳＥ作用物質に実験的に感染させたマウスの骨髄におけるものと同じように、ウシのＥＤＲＦは、ＢＳＥの徴候を表す動物個体においては劇的にダウンレギュレートされることが示される（図８ａ）。
【００７３】
図８は、ＴＳＥ疾患の天然の現場症例の血液および骨髄におけるＥＤＲＦ発現のノーザン解析を示す。（ａ）ヒツジは、年齢、品種および性別の一致した、同じＰｒＰ遺伝子型（ＡＲＱヘテロ接合体）のものであった。対照およびスクレイピーのヒツジの血液を同時に採集した。スクレイピーヒツジの血液は、疾患による死亡のおよそ１．５ヶ月前に、スクレイピーの初期の臨床的徴候を表していたヒツジ個体から得られた。ヒト、ウシおよびヒツジのゲノムＤＮＡのサザン解析によって、ヒトのＥＤＲＦ ｃＤＮＡがウシおよびヒツジの配列に対して適したプローブであることが示された（非表示）。したがって、ノーザンブロットでは、放射標識されたヒトおよびウシのＥＤＲＦ ｃＤＮＡをプローブとして用いた。ヒトの血液のＲＮＡは、実験についての正の対照としての役割を担う。ホスホイメージャー解析により、推定上のヒツジのＥＤＲＦ ＲＮＡが、天然スクレイピーの初期の段階の臨床的徴候を有するヒツジ（この段階における比較的健康な動物個体）の血液においておよそ５０％ダウンレギュレートされることが示される。ウシの部分的ＥＤＲＦ ｃＤＮＡを、同じ転写産物にハイブリダイズするプローブとして用いることにより、この３．５ Ｋｂの転写産物が真のヒツジのＥＤＲＦ相同遺伝子であることがさらに示される。（ｂ）ＢＳＥの最初の明らかな徴候を示した時点において屠殺された、病理学的に確認されたＢＳＥ罹患ウシ個体、および健康な対照の、胸骨骨髄におけるＥＤＲＦ発現。ウシは、品種の一致した雌であり、妊娠しておらず、およそ同じ年齢（＞３．５歳）のものであった。ノーザンブロットは、放射標識されたウシの部分的ＥＤＲＦ ｃＤＮＡをプローブとして用いた。ウシのＥＤＲＦ ＲＮＡは、マウスおよびヒトのＥＤＲＦ ＲＮＡとおよそ同じサイズであり、天然ＢＳＥに罹患したウシの骨髄において劇的にダウンレギュレートされる。これらの実験により、プリオン病の指標としてのＥＤＲＦは、プリオン病の天然の現場症例において適用可能であり、ＥＤＲＦの差別的な発現は、げっ歯動物において実験的に誘導されたプリオン病に特有の現象ではないことが示される。
【００７４】
これらの実験は、ＥＤＲＦの差別的な発現、および、おそらく、ＥＤＲＦを発現する造血細胞タイプの機能障害のいくつかの局面は、ＴＳＥ疾患の実験的症例および天然の現場症例の双方に共通の特徴であることを明らかに示すものである。
【００７５】
実施例８：ＥＤＲＦを発現する造血細胞タイプの決定
ＥＤＲＦは、明らかに新規の、有用な、ＴＳＥ感染の生前マーカーおよび指標である。認められるＥＤＲＦの差別的な発現が、この遺伝子の発現の影響を表している可能性がある、または、ＥＤＲＦ発現と関連する造血細胞タイプの漸進的な減少／枯渇を示している可能性がある。この問題を解決する第一段階として、ＥＤＲＦを発現する造血細胞タイプをさらに定義付けた。マウスの別個の造血細胞系列に対して反応性の抗体のパネルを得た（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ／Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。これらの抗体は、全骨髄細胞懸濁液から様々な造血系列を枯渇させるために使用された。その後、残りの細胞からＲＮＡを単離し、ノーザン解析によってＥＤＲＦ発現を評価した。任意の特定の分画におけるＥＤＲＦ発現の減少は、除去された細胞がＥＤＲＦを発現するものであったことを示すものである。図９から認められるように、ヘモグロビンβ鎖の発現と同様に、ＴＥＲ−１１９陽性細胞を枯渇させられた骨髄において、ＥＤＲＦ発現は劇的に減少する。ＴＥＲ−１１９抗体は、初期のＢＦＵ−Ｅ前駆細胞またはＣＦＵ−Ｅ前駆細胞を例外として、赤血球発生の全ての段階の造血細胞と反応する。
【００７６】
図９は、ＥＤＲＦを発現する、マウスの造血細胞系列の決定を示す。ＥＤＲＦは、マウスの脾臓、骨髄および全血においてのみ発現される（図５を参照のこと）。ヒトの血液のバッフィーコート分画における検出可能なシグナルの欠如が示すのと同様に、マウスまたはヒトのいずれかの胸腺において検出可能なシグナルが欠けていることは、ＥＤＲＦ発現がＴ細胞またはＢ細胞とは関連しないことを示す（図５を参照のこと）。どの造血細胞系列がＥＤＲＦを発現するのかを決定するために、マウスの骨髄細胞懸濁液を、方向付けられていない幹細胞について濃縮し、あるいは、ある抗体パネル（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社より購入）およびＣＥＬＬｅｃｔｉｏｎビオチン結合ダイナビーズ（Ｄｙｎａｌ社から購入）を用いて、特定の細胞集団を枯渇させた。引き続き、ＲＮＡを単離し、放射標識された、マウスのＥＤＲＦ ｃＤＮＡプローブを用いたノーザン解析に使用した。ＥＤＲＦシグナルは、赤血球系細胞を枯渇させられた細胞懸濁液からのＲＮＡにおいてのみ著しく減少した。予測されるように、本分画においては、ヘモグロビンβ鎖ＲＮＡも減少した。ＴＥＲ−１１９抗体は、ＢＦＵまたはＣＦＵ活性を有する、方向付けられた赤血球系細胞（ＢＦＵｅ／ＣＦＵｅ）とは反応しない。方向付けられていない造血幹細胞について濃縮した分画からのＲＮＡにおいて検出可能なＥＤＲＦ発現は、ＢＦＵｅ およびＣＦＵｅ赤血球系細胞におけるＥＤＲＦ発現を表す可能性が高いが、方向付けられていない幹細胞におけるＥＤＲＦ発現の可能性を、現在のところ拭い去ることはできない。同様に、ＥＤＲＦ発現は、ＴＥＲ−１１９陽性選択された造血細胞において検出することができる。しかし、発現は、他の系列（ＣＤ３＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ４５Ｒ＋、Ｂ２２０＋、Ｌｙ−６Ｇ＋細胞）においても、より低いレベルにて検出できる。したがってＥＤＲＦ発現は、赤血球系系列の造血細胞と主に関連しているが、他の非Ｂ／非Ｔ細胞、造血細胞においても発現されている。しかし、本分画におけるヘモグロビンの発現は、赤血球系細胞が他の系列と共精製されていることを示している。ＥＤＲＦは、赤血球系系列においてのみ発現される可能性が高い。ＥＤＲＦを発現する細胞系列のさらなる特徴付けは、図１０において示される。スクレイピー感染した脾臓、骨髄および血液において見出されたＥＤＲＦ発現のダウンレギュレーションが、特定の遺伝子効果を表しているのかどうか、または、脾臓におけるヘモグロビンのダウンレギュレーションを考えると、可能性がより高いと思われるが、このダウンレギュレーションが赤血球系細胞の枯渇によって引き起こされるのかどうかは、未だ決定付けられていない。
【００７７】
これらの結果は、ＥＤＲＦ発現が主として赤血球系細胞と関連しており、ＴＥＲ−１１９細胞を枯渇させられた同じ分画におけるヘモグロビンβ鎖発現の減少がこれを実証することを示すものである。
【００７８】
確認のために、陽性選択実験を行った。明らかに、ＥＤＲＦ発現（およびヘモグロビン）はＴＥＲ−１１９濃縮分画と関連している。ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｅ細胞は、方向付けられていない多能性造血幹細胞をも含む細胞分画中に残る。濃縮ＴＥＲ−１１９陰性細胞およびＢＦＵ−Ｅ／ＣＦＵ−Ｅ陰性細胞における明白なＥＤＲＦ発現は、これらの調製物においてはヘモグロビンも検出可能であるため、明らかに、混入によるものである。ＥＤＲＦはまた、ＢＦＵ−Ｅ／ＣＦＵ−Ｅ細胞および幹細胞の混合集団から単離されたＲＮＡにおいても明らかに存在する。しかし、これらの前駆細胞タイプのいずれがＥＤＲＦを発現するのかは明らかではない。これを明らかにするために、発生の定義付けられた段階において造血細胞から単離されたＲＮＡから合成された増幅ｃＤＮＡを含むドットブロットを得た（カナダのＮｏｒｍａｎ Ｉｓｃｏｖｅ氏から寄贈された）。
【００７９】
図１０は、ＥＤＲＦを発現する造血細胞のさらなる特徴付けを示す。略語は以下の通り：Ｅ、ヘモグロビン陽性正常芽細胞および網赤血球；Ｍｅｇ、巨核球；Ｍａｃ、マクロファージ；Ｎｅｕｔ、好中球；Ｍａｓｔ、マスト細胞；ＢＦＵ−Ｅ、赤血球を含む前駆細胞産生コロニー；ＣＦＵ−Ｅ、前赤芽球／ＣＦＵ−Ｅ期におけるヘモグロビン陰性細胞。例えば、Ｅ／Ｍｅｇ／Ｍａｃは、赤血球系、巨核球またはマクロファージ系列を経由して発生することができる、多能性前駆細胞を示す。同様に、Ｍａｃ前駆細胞は、マクロファージ系列を経由して進行するよう方向付けられた単能性細胞を示す。ＥＤＲＦ発現は、（ｉ）赤血球系または巨核球系列を経由して進行し得る両能性細胞、（ｉｉ）ＢＦＵ−Ｅ細胞、（ｉｉｉ）ＣＦＵ−Ｅ細胞および（ｉｖ）ヘモグロビン陽性正常芽細胞および網赤血球において検出された。最も高いＥＤＲＦ発現は、ヘモグロビン陰性ＣＦＵ−Ｅ 赤血球系細胞において認められた。この系のＴ細胞は、コンカナバリンＡによって処理した脾臓細胞の培養から得られた。これらの濃縮Ｔ細胞は、ヘモグロビン陽性赤血球系細胞の混入を含む。Ｔ細胞分画における明らかなＥＤＲＦ発現（碁盤目位置Ｃ３）は、ＥＤＲＦを発現する赤血球系細胞の混入があることを表す可能性が高い。ヒトの「バッフィーコート」におけるＥＤＲＦ発現の欠如（図６）は、これを実証するものである。したがって、赤血球系系列を経由して進行するよう方向付けられた全ての造血細胞、および赤血球系細胞の発生の全ての段階（ＴＥＲ−１１９＋、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−Ｅ細胞を含む）において、ならびに巨核球／血小板系列に沿って分化できる細胞において、ＥＤＲＦは発現される。
【００８０】
図１０が示すように、ＥＤＲＦ発現は、ＢＦＵ−Ｅ細胞およびＣＦＵ−Ｅ細胞を含む、赤血球系系列に方向付けられた細胞とのみ関連する。造血幹細胞は、ＥＤＲＦを発現しない。ＥＤＲＦ発現は、ＣＦＵ−Ｅ赤血球系細胞において最高である。本系において、ＥＤＲＦが低レベルにて検出可能である、最も初期の段階は、赤血球系または巨核球系列を経由して進行し得る両能性細胞におけるものである。ＥＤＲＦは明らかに、赤血球系系列の造血細胞と関連している。
【００８１】
図１１は、赤血球系系列に方向付けられた造血細胞に対するＥＤＲＦ発現の対応付けを示す。（ａ）特定の細胞系列を枯渇させられた骨髄懸濁液におけるＥＤＲＦ ＲＮＡ発現。レーンＡ；非処理の全骨髄。レーンＢからＧは、ＣＤ３ｅ＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０＋、Ｌｙ−６Ｇ＋、ＴＥＲ−１１９＋および系列陰性（幹）細胞を各々枯渇させられた骨髄懸濁液を表す。マウスの骨髄懸濁液は、製造者の使用説明書に従い、ＢＤファーミンゲン社（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）から購入された個々のビオチン結合抗体パネル、および、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を用いて、特定の造血細胞系列を枯渇させた。抗体は、以下の造血系列に対して反応性であった：ＣＤ３ｅ（胸腺細胞、Ｔリンパ球）；ＣＤ１１ｂ（顆粒球、単球／マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞およびＢ−１細胞）；ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ｐｒｏ−Ｂから成熟および活性化したＢ細胞までのＢ系列細胞）；Ｌｙ−６Ｇ（単球、好中球、分化および成熟中の顆粒球）；ＴＥＲ−１１９（初期の赤芽球から成熟赤血球までの段階の、赤血球系系列へ方向付けられた全ての細胞）。（ｂ）および（ｃ）造血細胞階層の概要説明。略語：Ｍｅｇ、巨核球；Ｅ、赤血球系；Ｍａｓｔ、マスト細胞；Ｍａｃ、マクロファージ；Ｎｅｕｔ、好中球；Ｂ、Ｂ細胞；Ｔ、Ｔ細胞；ｐ、前駆細胞；ＢＦＵ−Ｅ／ＣＦＵ−Ｅ、芽球およびコロニー形成単位、赤血球系前駆細胞。（ｂ）ＥＤＲＦ発現は、赤血球系の発生の全ての段階の細胞に限定される。（ｃ）造血細胞におけるＰｒＰ ＲＮＡ発現。ＥＤＲＦおよびＰｒＰ転写産物の共発現は、両能性Ｅ／ｍｅｇ細胞（星印により示される）において起こる。発現レベルは、より濃い陰付けがより高い発現レベルを示すように、陰付けの程度によって示される。造血階層の１６段階を示す個々の細胞から精製されたｐｏｌｙ（Ａ）＋ｍＲＮＡから合成されたｃＤＮＡのドットブロットは、Ｎ．イスコヴ氏（Ｎ． Ｉｓｃｏｖｅ）（トロント大学、カナダ）から寄贈された。
【００８２】
結果の概要
本結果は、ＴＳＥ疾患に罹患した動物個体の造血組織において差別的に発現される、未知の機能を有するタンパク質をコードする遺伝子を同定するものである。この遺伝子のこの発現プロフィールは、赤血球系系列の造血細胞において、独占的でないにしても主に発現され、高度に特異的である。したがって、これにより、新規の、ＰｒＰＳｃに基づかない、造血組織において容易に検出可能なＴＳＥ感染の分子マーカー／特質が示される。これは、以前には報告されていないものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、疾患病理学的機序の様々な病期における、年齢および性別の一致した対照マウスおよびスクレイピー感染マウス（脳内経路）の脾臓における、発現された遺伝子のサブセットを比較する、ＤＤＲＴ−ＰＣＲゲルのパネルを示す。１、感染後１０日目；２、感染後２０日目；３、感染後３０日目；４、感染後４０日目；５、感染後６０日目；６、感染後８０日目；７、感染後１００日目；８、感染後１６２日目（最終）。
【図２】図２は、図１にて示されるＤＤＲＴ−ＰＣＲゲルから単離されたｃＤＮＡの配列同一性を示す。
【図３】図３は、マウスおよびヒトの全長ＥＤＲＦ ｃＤＮＡの核酸配列、およびウシのＥＤＲＦの部分配列を示す。全長（ａ）マウスおよび（ｂ）ヒトのＥＳＴ ｃＤＮＡクローンは、ＩＭＡＧＥコンソーシアムを介してヒトゲノムマッピングプロジェクトを通して得られた（各々、ＩＭＡＧＥ ＩＤ ４６６４０７および２２０２２１）。ｃＤＮＡ ＥＳＴクローンは、正方向および逆方向に配列決定を行った。（ｃ）実験の背景において述べられるように、デジェネレートオリゴヌクレオチドを用いたネステッドＰＣＲに従って合成された、ウシのＥＤＲＦの１６７ ｂｐの部分配列。
【図４】図４は、マウスおよびヒトのＥＤＲＦのアミノ酸配列、ならびにウシの部分的なＥＤＲＦタンパク質の配列を示す。
【図５】図５は、マウスのＥＤＲＦおよびＴＥＬが同じゲノム遺伝子座に存在すること、および、転写産物の向きの解析を示す。（ａ）様々な制限エンドヌクレアーゼを用いて分解し、放射標識されたマウスの全長ＥＤＲＦ ｃＤＮＡをプローブとした、マウスのゲノムＤＮＡのサザンブロット；（ｂ）放射標識された、インビトロにて転写された一本鎖リボプローブをプローブとした、様々なマウスの組織のＲＮＡのノーザンブロット。
【図６】図６は、マウスおよびヒトのＥＤＲＦ ｍＲＮＡ発現の組織分布を示す。マウスおよびヒトの、放射標識ｃＤＮＡプローブを用いて、様々な（ａ）マウスおよび（ｂ、ｃ）ヒト組織のノーザン解析を行った。
【図７】図７は、対照およびスクレイピー感染した、脾臓、骨髄および全血における、ＥＤＲＦ発現のノーザン解析を示す。（ａ）疾患病理学的機序の様々な病期において、対照およびスクレイピー感染（Ｍｅ７株）マウス（Ｃ５７Ｂｌ系）の脾臓から単離されたＲＮＡ；（ｂ）様々な対照およびスクレイピー感染近交系マウス（ＶＭおよびＳＶ）およびハムスター（ＬＶＧ）由来の脾臓。スクレイピー株は、Ｍｅ７、８７Ｖ、７９Ａおよび２６３Ｋであり、これらのモデルのインキュベーション期間が示される；（ｃ）対照およびスクレイピー感染マウスに由来する、骨髄および全血（骨髄；ＶＭマウス／８７Ｖ スクレイピー株、全血；Ｃ５７Ｂｌマウス／Ｍｅ７スクレイピー株）。
【図８】図８は、ＴＳＥ疾患の天然の現場症例の血液および骨髄におけるＥＤＲＦ発現のノーザン解析を示す。（ａ）ヒツジは、年齢、品種および性別が一致しており、同じＰｒＰ遺伝子型（ＡＲＱヘテロ接合体）のものであった。対照およびスクレイピーのヒツジの血液を同時に採集した；（ｂ）ＢＳＥの最初の明らかな徴候において屠殺された、病理学的に確認されたＢＳＥ罹患ウシ、および健康な対照の、胸骨骨髄におけるＥＤＲＦ発現。
【図９】図９は、ＥＤＲＦを発現する、マウスの造血細胞系列の決定を示す。
【図１０】図１０は、ＥＤＲＦを発現する造血細胞のさらなる特徴付けを示す。略語は以下の通り：Ｅ、ヘモグロビン陽性の正常芽細胞および網赤血球；Ｍｅｇ、巨核球；Ｍａｃ、マクロファージ；Ｎｅｕｔ、好中球；Ｍａｓｔ、マスト細胞；ＢＦＵ−Ｅ、赤血球を含む前駆細胞産生コロニー；ＣＦＵ−Ｅ、前赤芽球／ＣＦＵ−Ｅ期におけるヘモグロビン陰性細胞。
【図１１】図１１は、赤血球系系列に方向付けられた造血細胞に対するＥＤＲＦ発現の対応付けを示す。（ａ）特定の細胞系列を枯渇させられた骨髄懸濁液におけるＥＤＲＦ ＲＮＡの発現。レーンＡ：非処理の全骨髄。レーンＢからＧは、各々、ＣＤ３ｅ＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０＋、Ｌｙ−６Ｇ＋、ＴＥＲ−１１９＋および系列陰性（幹）細胞を枯渇させられた骨髄懸濁液を表す；（ｂ）および（ｃ）は、造血細胞階層の概要説明。略語：Ｍｅｇ、巨核球；Ｅ、赤血球系；Ｍａｓｔ、マスト細胞；Ｍａｃ、マクロファージ；Ｎｅｕｔ、好中球；Ｂ、Ｂ細胞；Ｔ、Ｔ細胞；ｐ、前駆細胞；ＢＦＵ−Ｅ／ＣＦＵ−Ｅ、芽球およびコロニー形成単位、赤血球系前駆細胞。
【図１２】図１２は、造血の図解を示すものである。
【図１３】図１３は、赤血球系系列の造血細胞の図解を示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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