(57)【要約】【課題】タンパク質のプロフィール化から腎臓病を検知する方法。【解決手段】本発明は、腎臓の病状の特徴である酵素切断がタンパク質ポリペプチド鎖に沿って生じる位置と共に、損なわれていない濾過されたタンパク質から誘導された特定のフラグメントの大きさおよび連鎖に関して、尿タンパク質フラグメント化プロフィールを形成し、分析する方法を提供する。濾過されたタンパク質は、腎臓通過の間に分解されるという認識をもって、本出願に記載の方法は、非腎臓病によって生じるタンパク質から誘導されるタンパク質フラグメントを検出することが可能である。これらの濾過されたタンパク質の尿分析は、現在では、これらのタンパク質の損なわれていない形態を検出できない。したがって、記載されているように、本方法は、病気の重さを検知可能である腎臓通過の間の分解で得られるフラグメントを検出し、分析する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）被験者から尿サンプルを採取し、
（ｂ）尿サンプルを装置に装填して、尿タンパク質のフラグメント化プロフィールを作り、
（ｃ）尿サンプルのタンパク質を加水分解的に切断する条件下で、患者からの尿サンプルをプロテアーゼで処理し、
（ｄ）加水分解的に処理された尿サンプルを装置に装填して、加水分解的に処理された尿タンパク質のフラグメント化プロフィールを作り、
（ｅ）工程（ｃ）および工程（ｄ）のフラグメント化プロフィールを比較し、それらタンパク質プロフィールが被験者の腎臓の病状を表示することよりなる
被験者の腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症を診断する方法。
【請求項２】
タンパク質フラグメント化プロフィールが、損なわれていない濾過されたタンパク質から誘導された特定のフラグメントの大きさおよび連鎖について比較されることよりなる請求項１の方法。
【請求項３】
タンパク質フラグメント化プロフィールが、タンパク質の酵素切断が生じた位置について比較されることよりなる請求項１の方法。
【請求項４】
タンパク質フラグメント化プロフィールが、対照サンプルのタンパク質フラグメント化プロフィールと比較されることよりなる請求項１の方法。
【請求項５】
装置がクロマトグラフィー、電気泳動又は沈殿装置である請求項１の方法。
【請求項６】
装置が１次元、２次元又は３次元電気泳動装置である請求項１の方法。
【請求項７】
装置がＨＰＬＣ装置である請求項１の方法。
【請求項８】
装置が質量分析装置である請求項１の方法。
【請求項９】
ペプチド連鎖を測定するためのアミノ酸シーケンシング工程をさらに含む請求項１の方法。
【請求項１０】
工程が実施期間にわたり繰り返される請求項１の方法。
【請求項１１】
時間の経過によるフラグメント化プロフィールの変化が、腎臓病の初期段階を表示する請求項１の方法。
【請求項１２】
疾病が、腎症、尿崩症、Ｉ型糖尿病、II型糖尿病、腎臓の疾病（腎糸体炎、バクテリア及びウイルス性腎糸体炎、ＩｇＡ腎症、及びヘノッホ−シェーンライン紫斑病、膜状増殖性糸体腎炎、膜性腎症、ジェーグレン徴候群、ネフローゼ症候群（極少病変、巣状腎糸球体硬化症及び関連する機能不全）、急性腎不全、急性管状間質性腎炎、腎盂腎臓炎、ＧＵ路炎症性疾病、プレクランプシア、腎移植拒絶、乾癬、逆流性腎症、腎石症）、遺伝性腎臓病（髄質嚢胞、髄質スポンジ、多嚢胞腎臓病（オートゾーム優性多嚢胞腎臓病、オートゾーム劣性多嚢胞腎臓病、管状硬化症）、フォン・ヒッペル−リンドウ病、家族性薄糸球体基部膜病、コラーゲンIII 腎糸球体病、フィブロネクチン腎糸球体病、アルポート症候群、ファブリー病、爪・膝蓋骨症候群、先天性泌尿器異常）、モノクロナール高ガンマグロブリン血症（多発性骨髄細胞腫、アミロイド症及び関連する機能異常）、熱病（家族性地中海熱、ＨＩＶ感染エイズ）、炎症性疾病（全身的脈管炎（結節性多発性動脈炎、ウエゲナー多発性肉芽腫症、多発性動脈炎、壊死性及び半月状腎糸球体炎）、多発性筋炎、皮膚筋炎、膵臓炎、ロイマチス様関節炎、全身的紅斑性狼瘡、通風）、血液機能異常（鎌状赤血球病、血栓性血小板減少紫斑病、溶血尿毒症症候群、急性皮質壊死、腎臓の血栓性栓塞）、外傷及び手術（広い範囲の損傷、火傷、腹部及び脈管の手術、麻酔薬の注入）、薬物（ペニシラミン、ステロイド類）及び薬物乱用、悪性の疾病（上皮細胞の（肺、乳房）疾病、悪性腺腫（腎臓の）、黒色腫、リンパ性網内症、多発性骨髄細胞腫）、循環器の疾病（心筋梗塞、心不全、末梢血管病、高血圧、冠状心臓血管病、非アテローム硬化性心臓血管病、アテローム硬化性心臓血管病）、皮膚病（乾癬、全身的硬化症）、呼吸器の疾病（ＣＯＰＤ、閉塞性睡眠無呼吸、高標高におけるヒポイア）、及び内分泌の疾病（アクロメガリー、真性糖尿病、尿崩症）よりなる群から選択される疾病を含む請求項１の方法。
【請求項１３】
タンパク質が、アルブミン、グロブリン（α−グロブリン（α1−グロブリン、α2−グロブリン）、β−グロブリン、γ−グロブリン）、ユウグロブリン、プソイドグロブリンＩ及びII、フィブリノーゲン、α1酸性糖タ ンパク質（オロソムコイド）、α1糖タンパク質、α1リポタンパク質、セルロプラスミン、α2１９Ｓ糖タンパク質、β1トランスフェリン、β1リポプロテイン、免疫グロブリンＡ、Ｅ、ＧおよびＭ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、ラクテート・デヒドロゲナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、ミオグロビン、リゾチーム、タンパク質ホルモン、成長ホルモン、インスリン、又は上皮小体ホルモンよりなる群のタンパク質を含む請求項１の方法。
【請求項１４】
（ａ）被験者から尿サンプルを採取し、
（ｂ）尿サンプルを装置に装填して、尿タンパク質のフラグメント化プロフィールを作り、
（ｃ）尿サンプルのタンパク質を加水分解的に切断する条件下で、患者からの尿サンプルをプロテアーゼで処理し、
（ｄ）加水分解的に処理された尿サンプルを装置に装填して、加水分解的に処理された尿タンパク質のフラグメント化プロフィールを作り、
（ｅ）工程（ｃ）および工程（ｄ）のフラグメント化プロフィールを比較し、タンパク質フラグメントが被験者の腎臓を通過するタンパク質の増加を表示することよりなる
被験者の非腎臓病を診断する方法。
【請求項１５】
疾病がタンパク質のレベルが循環系で上昇する請求項１４の方法。
【請求項１６】
疾病が癌を含む請求項１４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症、特に糖尿病の初期の段階を検知する改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
【特許文献１】
ＷＯ００／３７９４４
【特許文献２】
米国特許第５２４６８３５号
【非特許文献１】
Osicka，T.M．et al.「Nephrology」2:199-212(1996)
【非特許文献２】
Karger，BL Hancock WS(eds.), High Resolution Separation and Analysis of biological Macromolecules. Part A Fundamentals in Methods in Enzymology, Vol.270, 1996 (Academic Press, San Diego, California, USA)
【非特許文献３】
Karger BL, Hancock WS(eds.), High Resolution Separation and Analysis of biological Macromolecules. Part B Applications in Methods in Enzymology, Vol.271, 1996 (Academic Press, San Diego, California, USA)
【非特許文献４】
Harding SE, Rowe, AJ, Horton JC(eds.) Analytical Ultracentrifugation in Biochemistry and Polymer Science. 1992, Royal Soc. Chemistry, Cambridge, UK
【非特許文献５】
Goding JW, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice. Production and Application of Monoclonal Antibodies in Cell Biology, Biochemistry and Immunology, 2nd Edition 1986, Academic Press, London, UK
【非特許文献６】
Johnstone A, Thorpe R, Immunochemistry in Practice, 3rd edition 1996, Blackwell Science Ltd., Oxford, UK
【非特許文献７】
Price CP, Newman DJ(eds.) Principles and Practice of Immunoassay, 2nd Edition, 1997 Stockton Press, New York, NY, USA。
【０００３】
尿中に過剰のアルブミンの如きタンパク質が出現することは、腎臓病であることを示している。糖尿病性腎症はそのような疾病である。
【０００４】
出願人は、アルブミンを含むタンパク質が、天然（native）タンパク質と腎臓通過の間に特に作られたフラグメントとの混合物として正常に排泄されることを発見した（非特許文献１）。タンパク質は、管状細胞を含むポスト糸球体（基部膜）細胞によって、腎臓通過の間に著しく分解される。腎管状細胞のリソソームが、腎臓通過の間に排泄されるタンパク質の分解の原因となっている。図１は、濾過された完全なアルブミンの管状細胞への移行、およびアルブミンの排泄アルブミンフラグメントへの分解を説明している。分解生成物は管状内腔に排泄される。正常な個体では、尿内のアルブミンの殆どがフラグメント化される。
【０００５】
リソソームの活性が低下する、又はリソソームに対する基質を支配する細胞内プロセスが低下する場合は、高い分子量の、そして実質的に全長のアルブミンがより多く尿に現れる。これは腎臓組織における細胞プロセスが不均衡になっていることを反映している。
【０００６】
出願人は、アルブミンおよび免疫グロブリンの如き大部分の血漿タンパク質が腎臓によって濾過されるとき、それらは次いで排泄される前に腎臓の細胞によって分解されることを発見した（ＰＣＴ公報、特許文献１）。濾過されたタンパク質は管状細胞によって吸収されるらしい。管状細胞は腎臓フィルターを超えて横たわっており、そして最初の濾過物に直接接触する。タンパク質が管状細胞によって取り込まれるとき、それらはリソソームに向かい、そこで部分的に分解されて種々の大きさのフラグメントになり、そして次いで細胞の外側に噴き戻される。これらの噴き戻されたフラグメントは、特定の型のタンパク質のどれかから生じた少なくとも６０の異なるフラグメントであり、次いで尿中に排泄される。
【０００７】
出願人は、腎臓病においては、タンパク質のフラグメント化が阻止されることを発見した。このことは、濾過された実質的に全長のタンパク質が腎臓病に罹患した人では排泄されることを意味する。排泄されたタンパク質の、このフラグメント化からフラグメント化阻止への転移は、新しい薬剤および診断アッセイの発展のための出発点となる。例えば、糖尿病において腎合併症が発症することの最初の変化は、排泄されたアルブミンのフラグメント化プロフィールにおける変化に関連する。これは、糖尿病性腎症の進行と同義である外見上明らかなミクロアルブミン尿症に導く。これは、糖尿病において管状細胞のリソソーム活性が抑制されることによるらしい。したがって、薬剤は腎合併症が起こる糖尿病においてリソソーム活性に向けられるように処方することができる。また、薬剤はリソソーム活性が影響する他の腎臓病に、またはリソソーム活性が非腎臓組織において消える状態にある腎合併症を伴わない糖尿病に有用である。その様な薬剤には、抗癌薬の如き抗増殖性薬剤が含まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、過剰のアルブミンが発見された時点では、腎臓病は恐らく不可逆的で治療は殆ど効果がない段階に進行している。それ故、当該技術において、その様な疾病を疾病が阻止できるかまたは疾病の初期に処置が開始できるように、可能な限り早く発見するために、現在公知のラジオイムノアッセイよりも感度のある試験を提供することが要求され続けている。
【０００９】
しかしながら、診断の目的で尿タンパク質プロフィールを用いる従来の試みは、利用可能な技術の不十分な再現性、感度および迅速性のために、臨床的有効性に関してかなり失望するものである。したがって、腎臓病および／または疾病、特に糖尿病の腎臓合併症の初期の段階で発見する改良された方法に関して、方法の改善が要求され続けている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様において、本発明は、腎臓病及び／又は疾病、特に糖尿病の腎臓合併症の初期の段階を発見する改善された方法に関するものである。フラグメント化プロフィールは、大きさ、およびタンパク質ポリペプチド鎖に沿って起こる酵素切断の位置と共に、損なわれていない濾過されたタンパク質から誘導される特定のフラグメントの連鎖により決定される。フラグメント化プロフィールは、腎臓の病状の特徴を示している。したがって、腎臓病を含む疾病の初期の兆候を発見する方法、病気に対する患者の性向を決定する方法、病気の発症を防止する方法、および可能な限り初期段階で病気を治療する方法が本発明の目的である。
【００１１】
この方法は、被験者から尿を採取し、全フラグメントを分離することを含む。特定の実施態様において、分離はＨＰＬＣ（１次元、２次元または３次元電気泳動および／またはクロマトグラフィー）により行い、次いでフラグメントを質量分析法により大きさで分類し、そして、アミノ酸シーケンシングを用いてペプチド連鎖およびどこで酵素切断が生じたかを決定する。
【００１２】
特定の疾病に限定されるものではないけれども、本発明の方法によれば、診断される疾病には、腎症、尿崩症、Ｉ型糖尿病、II型糖尿病、腎臓の疾病（腎糸体炎、バクテリア及びウイルス性腎糸体炎、ＩｇＡ腎症、及びヘノッホ−シェーンライン紫斑病、膜状増殖性糸体腎炎、膜性腎症、ジェーグレン徴候群、ネフローゼ症候群（極少病変、巣状腎糸球体硬化症及び関連する機能不全）、急性腎不全、急性管状間質性腎炎、腎盂腎臓炎、ＧＵ路炎症性疾病、プレクランプシア、腎移植拒絶、乾癬、逆流性腎症、腎石症）、遺伝性腎臓病（髄質嚢胞、髄質スポンジ、多嚢胞腎臓病（オートゾーム優性多嚢胞腎臓病、オートゾーム劣性多嚢胞腎臓病、管状硬化症）、フォン・ヒッペル−リンドウ病、家族性薄糸球体基部膜病、コラーゲンIII 腎糸球体病、フィブロネクチン腎糸球体病、アルポート症候群、ファブリー病、爪・膝蓋骨症候群、先天性泌尿器異常）、モノクロナール高ガンマグロブリン血症（多発性骨髄細胞腫、アミロイド症及び関連する機能異常）、熱病（家族性地中海熱、ＨＩＶ感染エイズ）、炎症性疾病（全身的脈管炎（結節性多発性動脈炎、ウエゲナー多発性肉芽腫症、多発性動脈炎、壊死性及び半月状腎糸球体炎）、多発性筋炎、皮膚筋炎、膵臓炎、ロイマチス様関節炎、全身的紅斑性狼瘡、通風）、血液機能異常（鎌状赤血球病、血栓性血小板減少紫斑病、溶血尿毒症症候群、急性皮質壊死、腎臓の血栓性栓塞）、外傷及び手術（広い範囲の損傷、火傷、腹部及び脈管の手術、麻酔薬の注入）、薬物（ペニシラミン、ステロイド類）及び薬物乱用、悪性の疾病（上皮細胞の（肺、乳房）疾病、悪性腺腫（腎臓の）、黒色腫、リンパ性網内症、多発性骨髄細胞腫）、循環器の疾病（心筋梗塞、心不全、末梢血管病、高血圧、冠状心臓血管病、非アテローム硬化性心臓血管病、アテローム硬化性心臓血管病）、皮膚病（乾癬、全身的硬化症）、呼吸器の疾病（ＣＯＰＤ、閉塞性睡眠無呼吸、高標高におけるヒポイア）、及び内分泌の疾病（アクロメガリー、真性糖尿病、尿崩症）が含まれる。特定のタンパク尿および特にアルブミン尿（ミクロ−又はマクロ−）は、これらの疾病のマーカーである。
【００１３】
第２の態様において、本発明は、非腎臓病を発見する改良された方法を提供する。濾過されたタンパク質が腎臓通過の間に分解されることが認められるが、本発明に記載の方法はまた、非腎臓病によって発生したタンパク質から誘導されるタンパク質フラグメントを検知することができる。癌の如き非腎臓病は、循環系（circulation）に高レベルのタンパク質を発生する。これらの濾過されたタンパク質の尿分析は、これらのタンパク質の損なわれていない形を今のところ検知しない。それ故、腎臓通過の間の分解から生じるフラグメントを検知しそして分析する下記の方法は、重大な疾病を検知することができる。
【００１４】
両態様は、所望のタンパク質およびそのフラグメントを尿サンプルから三次元法において分離し、フラグメントを単離し、そしてタンパク質およびそのフラグメントの連鎖を決定することによって非抗体技術を用いることができる。この分析法は実施期間を通して繰り返される。実施期間でのフラグメントプロフィールにおける変化は、個々の疾病の初期段階を示す。連鎖分析により決定されたフラグメントの大きさの変化は、被験者がどの型の腎臓病を発症する傾向にあるのかを示すことができる。
【００１５】
本発明のこれらおよびその他の目的は、本発明の以下の記載、添付の図面および添付の請求の範囲から十分理解されるであろう。
【００１６】
本出願人は、アルブミンおよび免疫グロブリンの如き大部分の血漿タンパク質を含むタンパク質が腎臓によって濾過される場合、物質が排泄される前にそれらは腎臓の細胞によって引き続いて分解されることを発見した。濾過されたタンパク質は、管状細胞によって引き取られるようである。管状細胞は腎臓フィルターを越えて横たわり、そして最初の濾過物と直接接触する。タンパク質が管状細胞によって内部に取り込まれると、それらはリソソームに向けられ、そこで種々のサイズのフラグメントに部分的に分解され、そして次いで細胞の外側に噴き戻される。これらの噴き戻されたフラグメントは、特定の型のタンパク質のどれかから生じた少なくとも６０の異なるフラグメントであり、次いで尿中に排泄される。
【００１７】
出願人は、腎臓病においては、蛋白質のフラグメント化が阻止されることを発見した。このことは、濾過された実質的に全長のタンパク質が腎臓病に罹患した人では排泄されることを意味する。排泄されたタンパク質の、このフラグメント化からフラグメント化阻止への転移は、新しい薬剤および診断アッセイの発展のための出発点となる。例えば、糖尿病における腎合併症の発症が起こる最初の変化は、排泄されたアルブミンのフラグメント化プロフィールにおける変化に関連する。これは、糖尿病性腎症の進行と同義である外見上明らかなミクロアルブミン尿症に導く。これは、糖尿病において管状細胞のリソソーム活性が抑制されることによるらしい。
【００１８】
したがって、薬剤は腎合併症が起こる糖尿病においてリソソーム活性に向けられるように処方することができる。また、薬剤はリソソーム活性が影響する他の腎臓病に、またはリソソーム活性が非腎臓組織において消える状態の腎合併症のない糖尿病に有用である。その様な薬剤には、抗癌薬の如き抗増殖性剤又はＴＧＦ−ベータを無力にする抗体が含まれる。
【００１９】
出願人は、特定のタンパク質のタンパク質フラグメントアレイを検出するためのユニークなアッセイを発見した。それは被験者の尿において検出される。タンパク質フラグメントアレイの検出およびタンパク質フラグメントアレイの変化は、腎臓病になる傾向を予言している。
【００２０】
タンパク質フラグメントアレイの原理が図１６に示されている。損なわれていないタンパク質は、タンパク質内の特定のアミノ酸連鎖で表される領域の系列によって代表される。すべてのタンパク質はこれら特定の第一次構造を有している。アルブミンまたは免疫グロブリンの如き血漿からのそのようなタンパク質が濾過されたとき、それはそのまま濾過される。しかしながら、タンパク質が濾過された後、中心に近い方の管状細胞のような腎細胞に取り上げられ、そして酵素によってリソソームで多くのフラグメントに分解される（図１６参照）。これらのフラグメントは、尿で排泄される。正常に機能する腎臓については、フラグメント化のプロセスは、多くの個々の濾過されたタンパク質から誘導される小さなフラグメントを最大限に作り、そして最後に排泄される。図１７は、アルブミンのトリプシン消化からのフラグメント化プロフィールを示す。同様なプロフィールが対照の正常なボランティアの尿において観察される（図１８）。各タンパク質から作られるフラグメントの数およびペプチド分裂の性質（すなわち、タンパク質での切断が起こる位置）に関して、フラグメントプロフィールは特定のものである。個々のフラグメントの大きさおよび連鎖の特徴は、タンパク質に作用するリソソーム酵素の特殊性および活性度により特徴付けられる。
【００２１】
Ｖ−８、トリプシンおよびＬｙｓ−Ｃの如きプロテアーゼは、精製されたタンパク質のペプチドマップの作成に用いることができる。他のプロテアーゼとして、対象のタンパク質のペプチド結合の一つ又は限られた数のみをプロテアーゼ分裂する限定的プロテオリシス（酵素的切断）を引き起こすプロテアーゼは、好ましく使用することができる。プロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ（キモトリプシン、トリプシン、エラスターゼ、カリクレインおよびサブスティリシン族（substilisin family））、システインプロテアーゼ（パパイン、アクチニジン又はブロメラインの如き植物プロテアーゼ、カテプシン、サイトゾル性カルパイン（cytosolic calpains）および、パラシティックプロテアーゼ(例えば、トリパノソーマ（Trypanosoma）、スキストソーマ（Schistosoma）からの)、アスパルチックプロテアーゼ（ペプシン、キモシン、カテプシンＤ、およびレニンの如きペプシン族）、細菌プロテアーゼ（ペニシロペプシン、リゾプスペプシン、エンドチアペプシン）およびレトロペプシンの如きウイルスプロテアーゼ）、およびメタロプロテイナーゼ（テルモリシン、ネプリリシン、アラニルアミノペプチダーゼ、およびアスタシン）の如きプロテアーゼのいかなる群からのものでもよい。
【００２２】
腎臓病においては、濾過されたタンパク質のフラグメント化プロセスが阻止される。フラグメントの数は減少し、そしてフラグメントの大きさは増大する（図１９参照）。これは、リソソーム酵素による切断の点がより少ないという事実による。それ故、大きさおよびアミノ酸連鎖により、フラグメントプロフィールは、アルブミン又は免疫グロブリンの如き特定の濾過されたタンパク質について正常な腎臓から得られるのものとは、かなり異なる。フラグメント化阻止の度合は病気の重さに依存する。病気が進行するにつれ、フラグメント化の度合は図Ａで示すように小さくなる。
【００２３】
特許文献２（米国特許第５２４６８３５号）は、ヒトの尿のアルブミンのフラグメントを検出することによって腎臓病を診断する方法を開示している。この米国特許は、フラグメントが血漿から誘導され、そして腎臓によって濾過されることを開示している。この米国特許における尿のフラグメントの検出方法は、慣用のアルブミン抗体に結合する親和力を用いることを包含している。本発明の方法と対比して、上記米国特許の方法では、糖尿病においてアルブミンフラグメントの検出が増加する。本発明においては、糖尿病性腎症の診断は、フラグメントの数が減少したときになすことができる。本発明において調べられるアルブミンフラグメントは、アルブミン抗体によって検出される必要はない。
【００２４】
上記米国特許と対比して、本発明の一態様においては、患者から尿を採取し、そしてＨＰＬＣ（１次元、２次元または３次元電気泳動および／またはクロマトグラフィー）によって全てのフラグメントを分離し、次いで質量分析によりフラグメントを大きさで分類（sizing）し、そして次いで、アミノ酸シーケンシング（amino acid sequencing）を用いて、ペプチド連鎖およびどこでペプチド切断が起こったかを決定する。
【００２５】
タンパク質フラグメントは、限定されるものではないが、クロマトグラフィー、電気泳動法、沈殿法、又はそれらの組合わせを含む当業界で公知の種々の方法によって検出することができる。それらは、非特許文献２、３または４に記載され、これらの文献はそっくりそのまま本明細書に組み込まれて参照される。
【００２６】
電気泳動法には、限定されるものではないが、移動界面電気泳動法、ゾーン電気泳動法、及び等電集束法が含まれる。
【００２７】
クロマトグラフ法には、限定されるものではないが、分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、濾紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、気−液クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、及び疎水性相互反応クロマトグラフィーが含まれる。好ましい方法は、サイジングゲルクロマトグラフィー及び疎水性相互反応クロマトグラフィーである。さらに好ましい方法は、ＨＰＬＣカラムを用いる疎水性相互反応クロマトグラフィーである。
【００２８】
ＨＰＬＣはフラグメント化プロフィールを産出すのに好ましい。ＨＰＬＣでのフラグメント化プロフィールは、多数のフラグメント種を表す一連のピークによって特徴付けられる。
【００２９】
変性されたアルブミン又は未変性アルブミンを検出するためのＨＰＬＣカラムは、Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−ＣＢ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）の如き疎水性カラムであってもよい。５０μｌのサンプルループを用いることができる。アルブミン及びその分解生成物の検出においてＨＰＬＣに好適な溶離溶剤には、アセトニトリル溶剤の如き標準溶離溶剤が含まれる。好ましくは、水／１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の緩衝液、続いて６０％アセトニトリル／０．０９％ＴＦＡの緩衝液を用いることができる。６０％アセトニトリル／０．０９％ＴＦＡの０ないし１００％のグレードが好ましいことが分かった。
【００３０】
疎水性カラム用の好適なＨＰＬＣ条件は次の通りである。
溶剤Ａ  Ｈ2Ｏ、  １％トリフルオロ酢酸
溶剤Ｂ  ６０％アセトニトリル、０．０９％ＴＦＡ
溶剤Ａ２  ９９．９６＞００．００：４９．５８ｍｉｎ
圧力      ９．０１４Ｍパスカル（〜１１００ｐｓｉ）
溶剤Ｂ２  ０．０４＞１００．０：４９．５８ｍｉｎ
圧力      ７．１５４Ｍパスカル
ＨＰＬＣにおいて用いられる波長は約２１４ｎｍである。
【００３１】
アルブミンに関して、変性されたアルブミンは、３９〜４４分の間で溶離する（図５参照）。アルブミンフラグメントは、非常に早く、主に２０分以下で溶離する。
【００３２】
定義
「フラグメント化タンパク質又はフラグメントアルブミン」は、腎臓通過の間に生じる化学的、酵素的又は物理的分解の後のポスト糸球体分解生成物を含む。これらの成分は、小さくなったサイズをもつか、及び／又は疎水性に変化する。
【００３３】
ここで用いる「損なわれていないアルブミン、変性されたアルブミン、又はアルブミンの変性された形態」は、天然アルブミンと同様なサイズ及び構造的特徴をもつ化合物であって、アミノ酸連鎖が天然アルブミンと実質的に同一であるものを意味する。好ましくは濾過された損なわれていない蛋白質である。それは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）において天然アルブミンと同じ位置又はその近くで溶離される（図５参照）。しかしながら、その構造は、小さな酵素が介在した変性又はその塩基構造の付加のいずれかによって生化学的に変性されているか、及び／又は慣用的に用いる抗アルブミン抗体による検知から逃れるような３次元構造の変化によって物理的に変性されている。生化学的変性は、エンド又はエキソ−ペプチターゼの如き酵素によってなされてもよい。アルブミンの３次元（３Ｄ）構造は、幾つかの方法で変えることができる。リガンドはアルブミンに結合してもよく、又はこれらのどのような組み合わせでもよい。本発明の方法によって検出される変性されたアルブミンは、入手可能な抗体を使用する現在の、及び慣用のラジオイムノアッセイによっては検出できず、そしてフラグメントではない。
【００３４】
慣用の抗アルブミン抗体は、免疫化学品の供給者から購入することができる。例えば、モノクロナール抗体カタログ番号Ａ６６８４（クローンｎｏ．ＨＳＡ−１１）、及びＡ２６７２（クローンｎｏ．ＨＳＡ−９）、並びに液体血清、凍結乾燥分別品、液体ＩｇＧ留分、及び腹水流体の形態のモノクロナール抗体は、カタログ「1994 Sigma-Biochemicals Organic Compounds for Research and Diagnostic Reagents」の第１１５１〜１１５２頁の免疫化学品の章で見られるように、シグマ社、セントルイス、ＭＯから得ることができる。
【００３５】
ここで用いる損なわれていない／変性されたアルブミン（intact/modified albumin）には、実質的に全長（full-length）のアルブミン、フラグメント化された、化学的に変性された、又は物理的に変性されたアルブミンが含まれる。ここで用いる損なわれていない／変性されたアルブミンは、全長のアルブミンの分子量よりも以下の、同等の又は以上の分子量をもつアルブミンを示し、そしてクロマトグラフィー、好ましくはＨＰＬＣ、最も好ましくは疎水ＨＰＬＣの如き、分離媒体における天然アルブミンの位置又はその近くで溶離されるものを意味する。ここで用いるフラグメント化されたアルブミンは、慣用の抗アルブミン抗体によって検出されないアルブミンのフラグメントに関するものを意味し、その存在により、腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症の初期の段階で診断することが検知される。損なわれていない／変性されたアルブミンの存在の検出は、腎臓病になる傾向を示している。
【００３６】
ここで用いる「損なわれていないタンパク質、変性されたタンパク質又はタンパク質の変性された形態」は、慣用のラジオイムノアッセイによって検出できない実質的に全長のタンパク質の形態のものを含む。限定されるものではないが、蛋白質には、アルブミン、グロブリン（α−グロブリン（α1−グロブリン、α2−グロブリン）、β−グロブリン、γ−グロブリン）、ユウグロブリン、プソイドグロブリンＩ及びII、フィブリノーゲン、α1酸性糖タンパク質（オロソムコイド）、α1糖タンパク質、α1リポタンパク質、セルロプラスミン、α2１９Ｓ 糖タンパク質、β1トランスフェリン、β1リポプロテイン、免疫グロブリンＡ、Ｅ、ＧおよびＭ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、ラクテート・デヒドロゲナーゼ、グルコース・オキシダーゼ、ミオグロビン、リゾチーム、蛋白質ホルモン、成長ホルモン、インスリン、上皮小体ホルモンが含まれる。
【００３７】
ここで用いる「腎臓病」は、腎臓の如何なる機能不全をも含む。腎臓病は、尿中に損なわれていない又は変性されたアルブミンが存在することによって確認される。好ましくは、腎臓病の早期の診断は、尿中の変性されたタンパク質の存在、又は時間の経過で尿中の変性タンパク質の増加を検出することによって行われる。
【００３８】
ここで用いる「低リソソーム活性」は、正常な個体におけるリソソーム活性の正常なレベルに対して、及び／又はリソソームにタンパク質を渡すリソソーム機構に対して比較される。リソソームの活性がタンパク質をフラグメントにするには不十分であって、そのため損なわれていないタンパク質が正常な低いレベルよりも多量に排泄される。
【００３９】
ここで用いる「リソソーム活性化化合物」は、リソソームの再活性化に有益な化合物をいう。この化合物は、リソソームに直接又は間接的に作用して、リソソームの機能を活性化する。これらの化合物には、限定されるものではないが、抗癌化合物、抗増殖化合物、パラセタモール、ビタミンＡ（レチン酸）又はレチノールの誘導体、又はＴＧＦベーターを中性化する抗体を含む化合物よりなる群から選択することができる。
【００４０】
「マクロアルブミン尿」は、個体が、慣用のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定されたものとして、尿にアルブミン２００μｇ／ｍｉｎよりも多く排泄する状態である。
【００４１】
「ミクロアルブミン尿」は、個体が、慣用のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定されたものとして、尿にアルブミンを少なくとも２０μｇ／ｍｉｎ排泄する状態である。ＲＩＡは、１５．６ｎｇ／ｍｌまで測定し、６μｇ／ｍｉｎより低いクリアランスをもつ正常な被験者の尿中のアルブミンを測定することが可能である。しかしながら、アルブミン排泄が２０μｇ／ｍｉｎを超える場合、腎臓病の処置は限られ、そしてこの時点から完全な回復は困難になる。
【００４２】
ここで用いる「ミクロアルブミン尿性」は、慣用のラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定されたものとして、少なくとも２０μｇ／ｍｉｎの排泄割合で、アルブミンが尿に排泄される時の状態である。
【００４３】
ここで用いる「天然」及び「未変性」は、有機体、好ましくは人間に自然に見出されるタンパク質を記載するために用いられ、腎糸球体の濾過工程によって変性されなかったものである。
【００４４】
ここで用いる「正常な個体」は、病気をもたない個体であって、尿中に発見される損なわれていないアルブミンが病気のインディケイターとなる。好ましくは、その病気は腎臓病である。
【００４５】
「リソソーム活性の正常レベル」は、正常な個体の病気にかかっていない腎臓に見出だされるリソソーム活性のレベルである。
【００４６】
ここで用いる「ノルモアルブミン尿性」は、アルブミンが尿に排泄され、そしてＲＩＡによって検出できないか、又は２０μｇ／ｍｉｎ（ＲＩＡで測定されるものとして）より少なく排泄される状態を意味する。
【００４７】
ここで用いる「病気になる傾向」は、変性されたアルブミンの如き変性されたタンパク質の存在及び排泄速度の測定によって判断されるものとして、個体に結果として病気があることを意味する。
【００４８】
ここで用いる「タンパク尿」は、尿にタンパク質が、通常、アルブミンの形態で存在するものであり、そのタンパク質は、水溶性であり、熱によって凝固する。これに関して「特定のタンパク尿」は、尿に所定のタンパク質が存在することをいう。
【００４９】
ここで用いる「ラジオイムノアッセイ」は、放射線で標識化された所定の抗体又は抗原を用いて物質を検出及び測定する方法である。
【００５０】
ここで用いる「リソソームの再活性化」は、リソソーム活性が活性化して、タンパク質、特にアルブミンの分解がリソソームの不活性状態に比較して増加することを含む。
【００５１】
ここで用いる「回復」は、回復される要素（component）が、その前の機能と比較して改善された機能を持つように、完全に又は部分的に回復することを意味する。
【００５２】
ここで用いる「損なわれていないおよび損なわれていない変性されたタンパク質の合計」は、生物サンプルにおける損なわれていないタンパク質および損なわれていない変性されたタンパク質の合計量を意味する。
【００５３】
ここで用いる「全タンパク質」は、天然の、未変性の、変性された又は尿に排泄されたフラグメント化された形態で存在する所定の濾過されたタンパク質をいう。これは慣用のラジオイムノアッセイ又はタンパク質の検出に現在使用されている慣用の方法によっては検出されないタンパク質を含んでいる。好ましくはタンパク質はアルブミンである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
検出方法
尿タンパク質プロフィールは、ハンペル他（Hampel D. et al., J.Am.Soc.Nephrol. 12(5): 1026-35(2001)）の方法を用いて作られ、試験することができる。彼は高感度生産技術、すなわち、ＳＥＬＤＩ（surface-enhanced laser desorption/ionization）プロテインチップ（登録商標）（ProteinChip）アレイ−飛翔時間質量分析法を開発した。ハンペル他は、尿のタンパク質プロフィールのための技術の適用可能性をテストし、そして放射対照媒体（radiocontrast medium）を受け入れる患者へのその使用を例証するためにテストした。ラットについて、試験尿プロフィールにおける精度、感度、およびＳＥＬＤＩの再現性のアセスメントを、イオキシラン（ioxilan）および対照としての高張食塩水の両者の静脈注射による投与の前および後に行った。ラットへのイオキシランの投与では、多くのタンパク質で重量が変わるという変化が生じた。次いで、心臓カテーテルを差し込んでいる患者からの尿サンプルを得た。患者に関しては、心臓カテーテルを差し込んでいる間に放射対照媒体を注入する複雑でないケースでさえも、タンパク質組成に変動が生じたが、６ないし１２時間後にベースラインの値に戻った。ある所定の分子の質量を持つタンパク質は多量に変化した。腎機能が減じている患者に関して、これらの変化は６ないし１２時間の範囲内で可逆的ではなかった。原理の証拠として、タンパク質の一つはβ2ミクログロブリンとした。腎臓合併症のない患者に関してさえも、広い範囲の分子の大きさを持つタンパク質が、尿に現れるかあるいは尿から消失する。
【００５５】
尿蛋白プロフィールはまた商業的に入手できるプロテインチップ（登録商標）システム（Ciphergen Biosystems, Fremont, CA, USA）を用いて作られ、試験することができる。それはSELDI（Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization）技術を用いて、フェムトモル（femtomole）レベルにおけるタンパク質の分離、検出および分析を生物サンプルから直接迅速に行う。各アルブミンチップは、サンプルについて、８つの個々の化学的に処理されたスポットを含んでいる。この準備作業は、多数のサンプルの同時的分析を容易にする。着色した疎水性被覆は、サンプルをスポットに保持し同時に、チップの型の迅速な同定を可能にする。プロテインチップ（登録商標）アレイに塗布した数ミクロリットルのサンプルは、プロテインチップ（登録商標）リーダーで分析するのに十分なタンパク質を生成する。
【００５６】
より希釈されたサンプルに関して、プロテインチップ（登録商標）バイオプロセッサーが５００μｌまでの適用に用いることができる。タンパク質サンプルの質量決定は、サンプルの結晶化、サンプルのイオン化、真空チューブを通しての飛翔、およびイオン化されたタンパク質の検出によって行うことができる。非特定化結合タンパク質および他の不純物をプロテインチップ（登録商標）アレイから洗浄して除いた後，化学的エネルギ・アブソービング・モレキュール（ＥＡＭ）溶液を塗布し、そして乾燥させ、その間に微細な結晶がチップ上に形成する。これらの結晶は、ＥＡＭおよび関係するタンパク質を含んでいる。プロテインチップ（登録商標）アレイをプロテインチップ（登録商標）リーダーに挿入した後、レーザービームをサンプルに集光させる。それは、ＥＡＭ結晶に埋没したタンパク質を脱着させ、そしてイオン化を引き起こす。次いで、開放されたイオンは、イオン検出器に向かって真空チューブを通してそれらを「飛翔」させる加速電界にさらされる。最後に、イオン化されたタンパク質は、検出され、そして正確な質量が飛翔時間（TOF）に基づいて決定される。
【００５７】
Ｖ−８、トリプシンおよびＬｙｓ−Ｃの如きプロテアーゼは、図の右に示されるようにオン−チッププロテアーゼ消化によって、プロテインチップ（登録商標）アレイに結合した精製されたタンパク質のペプチドマップを作成するのに用いることができる。得られるフラグメントの分子量は、同定のためにペプチドデータベースと比較することができる。この工程は１時間より短い。
【００５８】
さらに、１２のプロテインチップアレイを一列に並べて、９６−ウエルプレートフットプリント（96-well plate footprint）を作る。プロテインチップアレイ技術を用いる典型的な実験は、仕事台における１ないし３時間の作業が必要であり、続いてプロテインチップリーダーで自動的にサンプル分析が行われる。したがって、全工程は午後のみで完結させることができる。
【００５９】
他の方法
本発明によれば、限定されるものではないが、処置される疾病には、腎臓病（腎糸体炎、バクテリア及びウイルス性腎糸体炎、ＩｇＡ腎症、及びヘノッホ−シェーンライン紫斑病、膜性増殖性腎糸体炎、膜性腎臓病、ジェーグレン徴候群、糖尿病、ネフローゼ症候群（極少病変、巣状腎糸球体硬化症及び関連する機能不全）、急性腎不全、急性管状間質性腎炎、腎盂腎臓炎、ＧＵ路炎症性疾病、プレクランプシア（Pre-clampsia)、腎移植拒絶、乾癬、逆流性腎症、腎石症）、遺伝性腎臓病（髄質嚢胞、髄質スポンジ、多嚢胞腎臓病（オートゾーム優性多嚢胞腎臓病、オートゾーム劣性多嚢胞腎臓病、管状硬化症）、フォン・ヒッペル−リンドウ病、家族性薄糸球体基部膜病（familial thin-glomerular basement membrane disease) 、コラーゲンIII 腎糸球体病、フィブロネクチン腎糸球体病、アルポート症候群、ファブリー病、ネール−パテラ症候群、先天性泌尿器異常）が含まれる。
【００６０】
本発明の一態様において、腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症になる傾向又はその早期の診断を決定する方法を提供する。この方法は、尿サンプル中のアルブミン含有量の変化を測定することを含む。疾病は腎臓病に限定される必要はないけれども、腎臓病であってもよい。
【００６１】
本発明の方法において、尿で検出されるタンパク質の例として、ここではアルブミンのみが用いられる。患者におけるアルブミンが慣用のＲＩＡによって分析された場合には、ノルモアルブミン尿症患者又は正常な個体は、若年者で３〜１０μｇ／ｍｉｎの範囲、そして老年者ではそれ以上のアルブミンを尿に有することが予期される。しかしながら、ノルモアルブミン尿症患者もまた、もしもＨＰＬＣによって測定されるならば、尿中にアルブミンのレベルを示す。出願人は、これらのレベルは、おおよそ５μｇ／ｍｉｎであることを見出した。腎臓病の進行に伴い、損なわれていない／変性されたアルブミンのレベルは、ＲＩＡにより測定されるものとして、おおよそ２０〜２００μｇ／ｍｉｎのマクロアルブミン尿のレベルまで増加するであろう。これはＨＰＬＣ、又は変性アルブミンを含む全アルブミンを測定する方法によって測定された場合、非常に高くなるであろう。損なわれていない／変性されたアルブミンをモニターすることによって、腎臓病の初期の徴候が検出される。しかしながら、これらのレベルは、現在商業的に利用されている抗体を用いるラジオイムノアッセイの如き、現在利用可能な方法では、恐らく、抗体が或るエピトープを検出するために、検出することができない。もしもアルブミンが上記したどれかの方法で変性されているならば、エピトープはそれによって破壊されて、変性されたアルブミンを検知不可能にする。
【００６２】
糖尿病性腎症をもつことが疑われる患者は、ＲＩＡ法の如き、現在利用されている方法によってアルブミンを検出する場合には、１０年ないし１５年後まで腎臓悪化の徴候を示さないであろう。個体がミクロアルブミン尿の状態に入った場合に、少なくとも２０μｇ／ｍｉｎの尿排泄速度がＲＩＡによって検出される。また、変性されたアルブミンの排泄を観察することによって、腎臓における変化及び腎臓病の発症可能性が検出される。
【００６３】
ノルモアルブミン尿の被験者、又はノルモアルブミン尿性糖尿病患者は、ＲＩＡによる測定として、２０μｇ／ｍｉｎよりも低い低アルブミン排泄速度を何年も持ち続ける。尿中のアルブミンの存在は、腎臓の機能が害されている兆候である。このレベルが変化し始めるや否や、処置を開始することができる。
【００６４】
正常の個体においては、少量のアルブミンが尿中で検出可能である。全濾過アルブミンは、尿中にフラグメント化したアルブミンとして主に現れる。いくつかのアルブミンは、ノルモアルブミン尿の個体において検出される。しかしながら、ノルモアルブミン尿の個体において、尿におけるアルブミンの排泄速度は、５μｇ／ｍｉｎ程度に低い。このレベルは一般にＲＩＡによって検出可能である。
【００６５】
本発明の変性されたタンパク質は、限定されるものではないがクロマトグラフィー、電気泳動法および沈殿法又はそれらの組合せを含む当業界で公知の種々の方法で検出することができる。それは、非特許文献２、３または４に記載されており、それらの文献はそっくりそのまま本明細書に組み込まれて参照される。
【００６６】
電気泳動法には、限定されるものではないが、移動境界電気泳動、ゾーン電気泳動および等電集束法が含まれる。
【００６７】
クロマトグラフィーには、限定されるものではないが、分配クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、濾紙クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、気−液クロマトグラフィー、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィーおよび疎水性相互反応クロマトグラフィー（hydrophobic interaction chromatography）が含まれる。好ましくは、サイジングゲルクロマトグラフィーおよび疎水性相互反応クロマトグラフィーであり、より好ましくは、ＨＰＬＣカラムを用いる疎水性相互反応クロマトグラフィーである。
【００６８】
変性されたタンパク質は、また特定のアルブミン染料の使用によって検出することができる。そのような方法は、Pegoraro et al., American Journal of Kidney Diseases 35(4): 739-744 (April 2000) に記載されており、その全開示が本明細書に組み込まれて参照される。変性されたアルブミンおよび全アルブミンはこの染色法によって検出可能であり、変性されたアルブミンおよび全部又は損なわれていないアルブミンの合計が得られる。この検出法は、尿からアルブミン成分を最初に分離して又は分離することなく用いることができる。そのような染料は通常分子量１００００未満のフラグメントを検知しないが、しかし変性アルブミンを検知する。
【００６９】
この染色検出法は、アルブミンブルー５８０の如き染料を用いる。そのような染料は、当然非蛍光性であるが、しかし損なわれていないアルブミンならびに変性されたアルブミンと結合することによって蛍光を発する。しかしグロブリンには結合しない。それ故、グロブリンは、分別していない尿において測定を行なうアッセイには支障をきたさない。
【００７０】
出願人は、糖尿病の中で、ノルモアルブミン尿性糖尿病患者が慣用のＲＩＡによって分析した時に、殆ど検出できないレベルの変性されたアルブミン又はアルブミンのフラグメントをもつことを見出した。彼等は、正常であるように見える。しかしながら、尿をＨＰＬＣによって試験した場合、変性アルブミンのレベルは、正常の個体で見られるよりも遥かに大きい。アルブミンのこの差異は、損なわれていない又は変性された形態にある全てのアルブミン（全アルブミン）を十分に検出するためには、慣用のＲＩＡは無力であるということに帰する。したがって、ＨＰＬＣは、フラグメント化プロフィールを作るのに好適である。ＨＰＬＣ上のフラグメント化プロフィールは、損なわれていない又は変性された形態にあるアルブミンの多数の種類を表す一連のピークによって特徴付けられる。
【００７１】
本発明の好ましい態様において、被験者について腎臓病になる傾向又は早期の診断を決定する方法は、被験者がミクロアルブミン尿症になる前に行なわれる。
【００７２】
本発明のＨＰＬＣ法によるサンプル中のアルブミン含有量の測定は、慣用のＲＩＡによる測定とは異なる結果をもたらす。ＨＰＬＣ技術では、低いレベルのアルブミンが正常の個体において観察される。変性されたアルブミンのレベルが検出され始め、そしてそのレベルが上昇し、そしてミクロアルブミン尿症に向かって進行したとき、患者は腎臓病になる傾向をもつと決定することができる。
【００７３】
正常な個体においては、ＨＰＬＣが作るフラグメント化プロフィールは、全長天然アルブミンが溶離する領域にピークが存在しないことによって特徴付けられる。その代り、多数のフラグメント化されたアルブミンが検出できる。純粋なタンパク質生成物（未変性の）は、本質的に単一のピークを作る。例えば、疎水性ＨＰＬＣを用いて、アルブミンが３９〜４４分間の範囲で溶離することが観察された（図５）。したがって、正常な個体は、腎臓病がないか又は腎臓病になる傾向がないことを示す明確なフラグメント化プロフィールを作る。しかしながら、腎臓病の進行に従って、最初に変性アルブミン量の増加、次いでその後に天然の形態のものが検出される。フラグメント化プロフィールは変化し始め、そしてより多くの生成物が、全長のアルブミンの領域において追加のピークとして、又は尿中のより多くの損なわれない／変性されたアルブミンを表す拡大されたピークとして現れる。
【００７４】
尿サンプルのフラグメント化プロフィールが作られるＨＰＬＣにおいて、変性されたアルブミンは、天然アルブミンが溶離する領域に現れ、しかし変性されたアルブミンの多数の形態の存在を示す多数のピークとして現れる。
【００７５】
さらに好ましい実施態様において、腎臓病になる傾向は、少なくとも１種の変性されたアルブミンの存在を決定又は同定することによって測定される。これは、ＨＰＬＣプロフィール上の特定のピークの存在によって決定又は同定され、好ましくは、ピークは天然アルブミンの溶離位置に相当する位置の範囲内にある。
【００７６】
腎臓病になる傾向を決定する方法は、如何なる個体にも適用可能である。腎臓病は、バクテリア感染、アレルギー、先天性の欠陥、石、腫瘍、化学物質又は糖尿病を含む多数の要因によって引き起こされる。好ましくは、本方法は、腎臓病に進行するかも知れない糖尿病患者について腎臓病になる傾向を確定するために適用できる。個体はノルモアルブミン尿性糖尿病であるのが好ましい。しかしながら、正常な個体について、尿中の損なわれていない又は変性されたアルブミンのレベルが増加するのを測定することによって、病気になる傾向をモニターすることができる。
【００７７】
本発明の方法は、上記したように非抗体分離法を用いて実施することができる。しかしながら、変性されたタンパク質に対して特異的な抗体もまた変性されたタンパク質の存在を検出するために用いることができる。
【００７８】
変性されたタンパク質に対する抗体は、次の方法によって得ることができる。実施例によりアルブミンに関する処理のみを特に記載するが、尿中の他の如何なるタンパク質に対する抗体製造にも容易に適用することができる。この方法は、例えば腎臓合併症に進行するであろう糖尿病患者を同定するために、どの変性されたアルブミン分子が最も感受性あるマーカーであるかを決定する。
【００７９】
変性されたアルブミンは、例えば予備的ＨＰＬＣにより、変性されたアルブミン分子の定量的分離を行うことによって特徴付けられる。変性されたタンパク質は、グリケーションの如き、リガンドの結合について分析される。続いて、個々の変性されたタンパク質のアミノ酸連鎖が、好ましくは、例えば、非特許文献２又は３ に記載された方法を用いる質量分析法によって測定され、そしてこれらの文献は、そっくりそのまま本明細書に組み込まれて参照される。好ましい実施態様において、約３ないし４の変性されたアルブミンスピーシズであってもよい。
【００８０】
変性されたアルブミンに対する抗体を発生させる方法は、糖尿病患者、例えば、腎臓合併症に進行する患者を予言する変性されたアルブミンのための診断的イムノアッセイを発展させる。これを遂行するために、ＨＰＬＣによって十分な量の変性されたアルブミンが用意される。抗体は、良好な力価を発生させるために、変性されたアルブミンを兎等の動物に連続的に注入することによって作られ、そして抗体は、例えば、非特許文献５又は６に記載の方法を用いる慣用の技術によって単離される。これらの文献はそっくりそのまま本明細書に組み込まれて参照される。得られた抗体は、ポリクロナール抗体またはモノクロナール抗体である。
【００８１】
好ましくは、変性されたアルブミンの少なくとも１つのスピーシズが単離され、そして腎臓病になる傾向を決定するのに用いるために同定される。単離されたスピーシズは、イムノアッセイに用いるための抗体を発生させるために用いられる。抗体には、酵素系、放射性、蛍光性または化学的発光性ラベルが付けられる。限定されるものではないが、検出方法には、ラジオイムノアッセイ、免疫性ラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ、又はプロテインＡイムノアッセイが含まれる。アッセイは、例えば、非特許文献５、６又は７に記載された方法によって行われる。これらの文献はそっくりそのまま本明細書に組み込まれて参照される。
【００８２】
本発明の目的は、所望により定量的にまたは非定量的に、サンプル中の変性されたアルブミンの如き変性されたタンパク質の存在または不存在を迅速、かつ正確に測定するための物品またはキットを提供することにある。キットの各構成要素は、その適当な容器に個々に包装させることができる。個々の容器はまた、内容が確認できるようにラベル付けをしてもよい。さらに、個々の包装された構成要素は所望の全構成要素を保持できる、より大きな容器に入れてもよい。キットに関連して、キットの使い方を説明する指示書きがあってもよい。これらの指示書きはキットの上に書かれるか又はキットに添付してもよい。
【００８３】
また、本発明は、腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症のための治療剤を決定する方法に関するものであって、
（ａ）疾病の処置が可能であると思われる薬剤を必要とする人にそれを投与し、
（ｂ）その人から尿サンプルを採取し、そして
（ｃ）サンプル中のタンパク質の変性された形態をアッセイすることよりなり、そして尿中にタンパク質の変性された形態が存在するか又は存在しないか、又は時間の経過でタンパク質の改変された形態の量が低下するかのいずれかであることが、その薬剤が腎臓病及び／又は疾病の腎臓合併症のための治療剤であることを表す。治療剤は、リソソームに直接または間接的に作用して活性化するリソソーム活性剤であってもよく、そしてそれによって、リソソームがポスト糸球体濾過タンパク質を消化させるが、それは健康な腎臓のしるしである。
【００８４】
リソソームへのタンパク質の授受のプロセスは、糖尿病におけるアルブミン尿のメカニズムにおいて役割を演ずる。授受に関係する細胞内分子は、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）である。薬剤または治療剤は、リソソーム授受を活性化するか、またはＰＫＣを阻止するように処方することができる。
【００８５】
したがって、本発明の一態様において、リソソームに対する基質、又はリソソームから離れる生成物を支配して、リソソームまたはプロセスを再活性化するのに使用するためのリソソーム活性化化合物が提供される。
【００８６】
本発明の他の態様において、リソソーム活性化化合物およびキャリアを含む組成物が提供される。
【００８７】
本発明のさらに他の態様において、腎臓病を阻止または処置する方法が提供され、その方法は、被験者にリソソーム活性化化合物の有効量を投与することを含んでいる。
【００８８】
本発明のさらに他の態様は、リソソームに対する基質、又はリソソームから離れる生成物を支配して、リソソームまたはプロセスを再活性化することが可能な化合物を同定するために、多数の化合物を選別する方法を提供し、その方法は、次の工程を含む：
（ａ）上記化合物をリソソームにさらし、そしてリソソームを活性化する能力に関して上記化合物をアッセイし、ここで活性化された時に該リソソームは変化した活性を持つものであり、
（ｂ）腎臓組織において細胞プロセスを実質的に正常なレベルに回復させる能力についてアッセイし、ここで上記腎臓組織は低いリソソーム活性を持つものであり、及び／又は
（ｃ）組織を回復して実質的に正常なレベルの腎臓組織に転換する能力についてアッセイすることよりなり、ここで上記腎臓組織は低いリソソーム活性を持つものである。
【００８９】
リソソームは、腎臓において、タンパク質、特にアルブミンの分解に関係する。ミクロアルブミン尿の場合、不活性化リソソームのために、実質的な量のアルブミンがリソソームによる分解から恐らく免れる。リソソームによる分解の回復は、腎臓における細胞プロセス及び組織転換のバランスを回復することである。
【００９０】
リソソーム活性化化合物は、リソソームに直接又は間接的に作用する化合物であってもよい。間接的に作用することによって、化合物はリソソームの活性に影響する成分に作用する。それにも拘らず、結果はリソソームの活性化をもたらし、それによってタンパク質の分解が増進される。
【００９１】
本発明の他の態様において、リソソーム活性化化合物及びキャリアを含む組成物が提供される。
【００９２】
この組成物は、生理学的に許容可能な又は製剤的に許容可能な組成物であってもよい。しかしながら、リソソーム活性化化合物の安定貯蔵のために許される組成物であるべきである。組成物が製剤的に許容可能な組成物である場合、腎臓病を阻止又は処置する方法に用いるのに適している。
【００９３】
本発明のさらに他の態様において、腎臓病を阻止又は処置する方法が提供され、そして上記方法は、被験者にリソソーム活性化化合物の有効量を投与することを含む。
【００９４】
上記したように、リソソーム活性化化合物は、リソソームを再活性化するように作用して、細胞プロセス及び組織転換が全面的に又は一部回復され、それ故に腎臓が部分的に又は全面的に回復することになる。如何なる場合においても、腎臓病を持つ動物にリソソーム活性化化合物を投与することによって、リソソーム活性が完全に又は部分的に回復する。
【００９５】
投与の方法は、経口または非経口投与であってもよい。経口投与には、錠剤、カプセル、粉末、シロップ等で投与することが含まれる。非経口投与には、静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内のルートが含まれる。
【００９６】
リソソームの変化した活性は、好ましくは、リソソームの活性を増大して、アルブミン分解が改善されるような変化である。リソソームを活性化するのみならず、細胞プロセス及び／または組織転換を改善する能力は、最も望ましいリソソーム活性化化合物の特徴である。リソソーム活性化化合物は腎臓機能の回復に使用するのが望ましい。
【００９７】
本発明の他の態様において、被験者における腎臓病を阻止する方法を提供し、その方法は、
（ａ）尿サンプルの損なわれていない、および変性された損なわれていないアルブミンの量を測定し、
（ｂ）慣用のＲＩＡ法によって検出できないように変性された、尿中の損なわれていないアルブミンの量の変化を測定し、ここでその変化は腎臓病になる傾向を示すものであり、そして
（ｃ）変化が測定された時に腎臓病の動物を処置することよりなる。
【００９８】
次の実施例は、本発明の説明のために示したものであり、そして限定するためのものではない。
【実施例】
【００９９】
実施例１：ヒト漿液アルブミン（ＨＳＡ）のサイズ・イクスクルージョン・クロマトグラフィー（Size Exclusion Chromatography）
尿中のアルブミンの分配を分析するための尿を提供するために、正常で健康なボランティアを採用した。
【０１００】
3Ｈ［ＨＳＡ］（ヒト漿液アルブミン）を健康なボランティアに注射し、そして尿及び血漿を集め、Ｇ−１００カラムを用いるサイズ・イクスクルージョン・クロマトグラフィーによって分析した。カラムは、４℃において２０ｍｌ／ｈｒでＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）を用いて溶離した。カラムのボイド容積（Ｖ0）は青色デキストランＴ２０００ で測定し、全容積をトリチウム原子含有水（tritiated water）で測定した。
【０１０１】
トリチウム放射能は、１ｍｌの水性サンプルで、３ｍｌのシンチラントを用いて測定し、そしてＷａｌｌａｃ１４１０液体シンチレーション計数管（Wallac Turku, Finland)上で計測した。
【０１０２】
図２は、尿及び血漿中のアルブミンの分配を説明する。
【０１０３】
実施例２：正常で健康なボランティア及び糖尿病患者のアルブミン排泄
実施例１において用いられた3Ｈ［ＨＳＡ］を正常で健康なボランティア及び 糖尿病患者に注射した。尿のサンプルを集め、そして3Ｈ［ＨＳＡ］が実施例１ におけるように測定した。
【０１０４】
正常で健康なボランティア（図３）は、実施例１において行ったようなサイズ・イクスクルージョン・クロマトグラフィー上にアルブミンのフラグメントが排泄されたことを示している。
【０１０５】
糖尿病患者（図４）は、サイズ・イクスクルージョン・クロマトグラフィー上に実質的に全長の及びフラグメント化されたアルブミンが存在していることを示している。しかしながら、これらの方法で検出可能なアルブミンの排泄速度は、５μｇ／ｍｉｎ（対照）及び１４５７μｇ／ｍｉｎ（糖尿病）であった。
【０１０６】
実施例３：ＨＰＬＣ上の損なわれていないアルブミン及び損なわれていない／変性されたアルブミンの測定
正常で健康なボランティア、ノルモアルブミン尿性糖尿病患者及びマクロアルブミン尿症患者から、尿サンプルを集めた。尿は、５０ｍｌ尿標本容器に中ほどまで集められた。尿はさらに使用するまで凍結させた。ＨＰＬＣ分析に先立って、尿を５０００ｇで遠心処理した。
【０１０７】
サンプルを、疎水性カラム：Ｚｏｒｂａｘ３００ＳＢ−ＣＢ（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を用いてＨＰＬＣ上で分析した。５０μｌのサンプルループが使用された。
【０１０８】
サンプルは、次の条件を用いてカラムから溶離した。
溶剤Ａ  Ｈ2Ｏ、  １％トリフルオロ酢酸
溶剤Ｂ  ６０％アセトニトリル、０．０９％ＴＦＡ
溶剤Ａ２  ９９．９６＞００．００：４９．５８ｍｉｎ
圧力      ９．０１４Ｍパスカル（〜１１００ｐｓｉ）
溶剤Ｂ２  ０．０４＞１００．０：４９．５８ｍｉｎ
圧力      ７．１５４Ｍパスカル
２１４ｎｍの波長を用いた。
【０１０９】
実施例４：標準技術によって抗体製造のための変性されたアルブミンの精製
慣用のイムノケミカルアッセイを含むタービティマー（turbitimer）によって測定された損なわれていないアルブミン濃度４３．５ｍｇ／ｌを持つミクロアルブミン尿症の患者からの尿を３０ｋＤａ膜を通して最初に濾過して、尿中の変性されたアルブミンを低分子量（＜３０,０００）タンパク質フラグメントから分離した。フィルターに残留した物質から、タービティマーアッセイによる測定で、収量２７．４ｍｇ／ｌの損なわれていないアルブミンが得られた。次いで、この残留した物質をセファデックス（Sephadex）Ｇ１００を用いたサイズ・イクスクルージョン・クロマトグラフィーで処理した。集められた物質は、損なわれていないアルブミンと共に溶離するピーク成分であった。この物質から、タービティマー法による測定で、収量１５．２ｍｇ／ｌのアルブミンが得られた。この物質は、次いで損なわれていないアルブミン抗体カラムを用いて親和クロマトグラフィー処理した。このカラムは、慣用のエピトープを持つアルブミンに結合するのみである。カラムから溶離する物質の収量は、＜６ｍｇ／ｌ（タービティマーの最低感度）であった。これは、親和性カラムに結合するイムノ反応性アルブミンとして期待される。溶離物は、次いで、逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィー（上記した）処理して、サンプル中のイムノ非反応性アルブミンの量を測定した。変性された精製アルブミン３０．９１ｍｇ／ｌに相当する１４５２単位面積が図５に示すものとして記録された。この変性された精製アルブミンは、次いで、標準手段によって抗体製造のために用いることができる。
【０１１０】
（結果）
図５は、アルブミン単独のＨＰＬＣプロフィールを示す。ほぼ３９〜４４分の保持時間において溶離する本質的に単一のピークが得られた。
【０１１１】
図６は、血漿のＨＰＬＣプロフィールを示すものであって、およそ３９〜４４分の保持時間における明確なアルブミンピーク並びに他の血漿タンパク質に相当するピークを示している。
【０１１２】
図７は、尿サンプルにアルブミンのピークを示さない正常で健康なボランティアのＨＰＬＣプロフィールを示す。この個体は、尿に排泄されたアルブミンを恐らく活性リソソームを経由して分解する。実質的にフラグメント化された生成物は、幾つかのスピーシズ、特に約１４．５分より以下の保持時間におけるスピーシズが目立つことを示していることが明らかである。
【０１１３】
ノルモアルブミン尿性糖尿病患者の尿（ＲＩＡにより測定されたものとして、アルブミン排泄速度８．０７μｇ／ｍｉｎ）を分析したとき（図８）、少量の変性されたアルブミンがおよそ３９〜４４分の保持時間において溶離することが明らかである。慣用の試験では、尿サンプルに＜６ｍｇ／ｌのアルブミンの存在を示すが、本発明の方法では、尿サンプルの真のアルブミン含有量が２６．７ｍｇ／ｌであることを示した。この個体に対しては疾病の治療を開始すべきである。アルブミン副生物又はフラグメント化したアルブミンは、正常で健康なボランティアにおけるように存在していた。
【０１１４】
ノルモアルブミン尿性糖尿病患者の他の尿サンプル（アルブミン排泄速度１７．０４μｇ／ｍｉｎ）を分析した（図９）。ＲＩＡ試験ではこの患者についてアルブミンが尿に排泄されたことを示す。しかしながら、ＨＰＬＣ上に（図９）およそ３９〜４４分の保持時間においてアルブミンまたは変性されたアルブミンのピークが明白である。慣用の試験では尿サンプルに＜６ｍｇ／ｌのアルブミンの存在を示すが、本発明の方法では、尿サンプルの真のアルブミン含有量が８１．３ｍｇ／ｌであることを示した。この個体に対しては疾病の治療を開始すべきである。このピークは、多数のピーク外観を示し始める。損なわれていないアルブミンに相当する小さいピークは、変性されたアルブミンが３９〜４４分のピークとして現れたことを示している。アルブミンのピークを持たない正常で健康なボランティアのプロフィールと比較して、このアルブミンのピークの存在は、損なわれていない／変性されたアルブミン量の検出可能なレベルに変化があることを示している。これは腎臓病になる傾向を合図している。
【０１１５】
ノルモアルブミン尿性糖尿病患者からの他の尿サンプル（アルブミン排泄速度４．３７μｇ／ｍｉｎ）を分析した。そしてＨＰＬＣプロフィールを図１０に示す。また、変性されたアルブミンが、およそ３９〜４４分の保持時間に多数のピークを示すものとして検出された。この患者はＲＩＡにより再び正常アルブミンとして登録された。慣用の試験では、尿サンプルに＜６ｍｇ／ｌのアルブミンの存在を示すが、本発明の方法では、尿サンプルの真のアルブミン含有量が４９１ｍｇ／ｌであることを示した。この個体に対しては疾病の治療を開始すべきである。変性されたアルブミンのアセスメントがこれらの変化を同定するために必要であることが明らかである。この患者は腎臓病になる傾向を持つと決定されるであろう。腎臓病が進行するに従って、変性されたアルブミンピークは増え続けるであろう。
【０１１６】
このことは、マクロアルブミン尿患者の尿サンプルを分析した図１１に示されている。およそ３９〜４４分の保持時間に多数のピークを示す非常に重要なアルブミンピークがあることが明白であった。この患者のアルブミン含有量は１７９６ｍｇ／ｌであった。この個体の処置は進行中である。
【０１１７】
本発明方法により、図１２〜図１４に経時の調査によって示しているように、腎臓病になる傾向が早期に検知できるようになる。図１２〜図１４は、糖尿病のＡＣＥインヒビター処置が、本発明の変性されたアルブミンの検出法が用いられるべきであるよりも後に開始された状態を示している。本発明による方法を用いた変性されたタンパク質の検出は、慣用のＲＩＡを用いるよりも腎臓病の発症を予言するためのより有効な方法である。
【０１１８】
実施例５
図１６は、損なわれていない濾過されたタンパク質が正常な機能の腎臓および病気の腎臓によって分解される様子を説明する図解図である。
【０１１９】
図１７は、分子量３０，０００でカットする膜で濾過されたアルブミンのトリプシン消化サンプルのＨＰＬＣプロフィールを示す。濾過物は、２ないし３０分の間に溶離する多くのピークを生じる。
【０１２０】
図１８は、１０ないし３０分の範囲で溶離する多くのフラグメントを示す対照の正常な個体のＨＰＬＣプロフィールを示す。マクロアルブミン尿（１分当り１４５７ミクログラム）の糖尿病患者のＨＰＬＣプロフィールとは、１０ないし３０分の範囲で非常に相違するフラグメントプロフィールを示している。
【０１２１】
図１９は、腎臓病の被験者のＨＰＬＣプロフィールを説明する。図１８と比較して、濾過されたタンパク質のフラグメント化は阻止されている。フラグメントの数は減少し、そしてフラグメントの大きさは増大している。
【０１２２】
ここで引用された文献の全ては、その全体が参照される。
【０１２３】
最後に、種々の他の改変及び／または変更が、ここに示された本発明の精神を逸脱することなくなされることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、濾過された損なわれていないタンパク質が管状細胞中を進行すること及びアルブミンが分解して排泄アルブミンフラグメントを生じることを示す。
【図２】図２（２ａ及び２ｂ）は、正常で健康なボランティアからサイズ・イクスクルージョン・クロマトグラフィーによって集められた（ａ）尿及び（ｂ）血漿における（3Ｈ）ＨＳＡの代表的なプロフィールを示す。尿は殆どフラグメント化されたアルブミンを含んでいる。そして血漿は、殆ど損なわれていないアルブミンを含んでいる。
【図３】図３は、フラグメント化されたアルブミンピークを示すが、サイズ・イクスクルージョン・クロマトグラフィーからの損なわれていないアルブミンのピークのない正常で健康なボランティアからの尿を示す。
【図４】図４は、サイズ・イクスクルージョン・クロマトグラフィーからの損なわれていないアルブミン及びフラグメント化されたアルブミンのピークの両者を示す糖尿病患者からの尿を示す。
【図５】図５は、アルブミン単独のＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図６】図６は、アルブミンピークを示す正常で健康なボランティアからの血漿のＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図７】図７は、アルブミンのフラグメント化された生成物を含むが、損なわれていないアルブミンのピークがない正常で健康なボランティアからの尿のＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図８】図８は、アルブミン分解生成物、及びおよそ３９〜４４分の保持時間において小さな変性されたアルブミンのピークを示しているノルモアルブミン尿性糖尿病患者からの尿サンプルのＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図９】図９は、腎不全の徴候を示し、およそ３９〜４４分の保持時間において特徴的スパイク状のアルブミンピークの存在を示しているノルモアルブミン尿性糖尿病患者からの尿サンプルのＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図１０】図１０は、腎不全の徴候を示し、およそ３９〜４４分の保持時間において特徴的スパイク状の変性されたアルブミンのピークの存在を示しているノルモアルブミン尿性糖尿病患者のＨＰＬＣプロフィールを示す。
【図１１】図１１は、高いレベルのノーマルアルブミン、及びおよそ３９〜４４分の保持時間において特徴的スパイク状の外観を示しているマクロアルブミン尿性糖尿病患者のＨＰＬＣを示す。
【図１２】図１２は、糖尿病性腎症の発症の前に変性タンパク質が検出された患者の経時の調査を示し、糖尿病性腎症になりやすいことを示し、そして慣用のＲＩＡ法に依存することにより処置が遅延することを示している。
【図１３】図１３は、糖尿病性腎症の発症の前に変性タンパク質が検出された患者の経時の調査を示し、糖尿病性腎症になりやすいことを示し、そして慣用のＲＩＡ法に依存することにより処置が遅延することを示している。
【図１４】図１４は、糖尿病性腎症の発症の前に変性タンパク質が検出された患者の経時の調査を示し、糖尿病性腎症になりやすいことを示し、そして慣用のＲＩＡ法に依存することにより処置が遅延することを示している。
【図１５】図１５は、実施例４の変性アルブミンの純度の基準として用いられるＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図１６】図１６は、濾過された損なわれていないタンパク質が正常な機能の腎臓および病気の腎臓によって分解される様子を説明する図解図である。
【図１７】図１７は、分子量３０，０００でカットする膜で濾過されたアルブミンのトリプシン消化サンプルのＨＰＬＣプロフィールを示す。濾過物は、２ないし３０分の間に溶離する多くのピークを生じる。
【図１８】図１８は、１０ないし３０分の範囲で溶離する多くのフラグメントを示す対照である正常な個体のＨＰＬＣプロフィールを示す。マクロアルブミン尿（１分当り１４５７ミクログラム）の糖尿病患者のＨＰＬＣプロフィールとは、１０ないし３０分の範囲で非常に相違するフラグメントプロフィールを示している。
【図１９】図１９は、腎臓病の被験者のＨＰＬＣプロフィールを説明する。図１８と比較して、濾過されたタンパク質のフラグメント化は阻止されている。フラグメントの数は減少し、そしてフラグメントの大きさは増大している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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