(57)【要約】樹状細胞は、抗原特異的免疫応答において重要な役割を担う。抗原提示樹状細胞の走化性または活性化を促進することによって、癌および自己免疫疾患を含む疾患状態を処置するための、材料および方法が提供される。特に、哺乳動物における癌を処置するための方法が提供され、この方法は、有効量の標的構築物をこの哺乳動物に投与する工程を包含し、この標的構築物は、６Ｃｋｉｎｅまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体および標的部分を含有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における癌を処置するための方法であって、該方法は、有効量の標的構築物を該哺乳動物に投与する工程を包含し、該標的構築物が、６Ｃｋｉｎｅまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体および標的部分を含有する、方法。
【請求項２】
前記標的部分が、少なくとも１０アミノ酸のペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的部分が、タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記標的部分が、低分子である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記標的部分が、ベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標的部分が、抗体または抗体フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標的部分が、フォレートレセプターを認識する抗体フラグメントである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記標的部分が、フォレートレセプター、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプター、上皮増殖因子レセプター、ＣＡ１２５腫瘍抗原、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ  ８、高分子量黒色種抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、チロペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、インスリン様増殖因子レセプター（ＩＧＦ−Ｒ）、テロメラーゼおよびｐ５３からなる群より選択される腫瘍関連抗原を認識する、方法。
【請求項１０】
前記標的部分が、腫瘍脈管構造のような腫瘍支質に関連した抗原を認識する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗原が、α  ｖインテグリン、ＶＥＧＦレセプター、プロテオグリカンＮＧ２、およびフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインからなる群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
送達部位において、前記標的構築物の除放を可能にする物質を投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的構築物が、静脈内投与、腫瘍内投与、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与または局所投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の組み合わせを投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＦＬＴ３−Ｌ、またはＦＬＴ３−ＬおよびＧ−ＣＳＦもしくはＧＭ−ＣＳＦを含有する融合タンパク質を投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記融合タンパク質とともに活性化剤を投与する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記活性化剤が、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＲＡＮＫ−Ｌ、ＲＡＮＫのアゴニスト、ＣＤ４０−Ｌ、ＣＤ４０のアゴニスト、およびｔｏｌｌ様レセプターファミリーの分子のアゴニストからなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌が、黒色種、乳癌、膵臓癌、結腸癌、肺癌、神経膠腫、肝細胞癌、子宮内膜癌、胃癌、腸癌、腎癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、肝臓癌、頭頸部癌、結腸直腸癌、食道癌、胃癌、眼の癌、膀胱癌、膠芽細胞腫、および転移性癌からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物における疾患状態を処置するための方法であって、該方法は、有効量の標的構築物を該哺乳動物に投与する工程を包含し、該標的構築物が、６Ｃｋｉｎｅまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体および標的部分を含有し、ここで、該標的部分が、以下：
ａ）細菌に由来する抗原；
ｂ）ウイルスに由来する抗原；
ｃ）寄生生物に由来する抗原；
ｄ）真菌に由来する抗原；
ｅ）自己免疫疾患または炎症性状態の経過中に特異的に発現される抗原；および、
ｆ）植物または動物によって発現されるアレルゲン、
からなる群より選択される疾患関連抗原を認識する、方法。
【請求項２０】
６Ｃｋｉｎｅまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体および標的部分を含有する、標的構築物。
【請求項２１】
前記標的部分が、少なくとも１０アミノ酸のペプチドである、請求項２０に記載の標的構築物。
【請求項２２】
前記標的部分が、タンパク質である、請求項２０に記載の標的構築物。
【請求項２３】
前記標的部分が、低分子である、請求項２０に記載の標的構築物。
【請求項２４】
前記標的部分が、ベクターである、請求項２０に記載の標的構築物。
【請求項２５】
前記標的部分が、ウイルスベクターである、請求項２４に記載の標的構築物。
【請求項２６】
前記標的部分が、抗体または抗体フラグメントである、請求項２０に記載の標的構築物。
【請求項２７】
前記標的部分が、フォレートレセプターを認識する抗体フラグメントである、請求項２６に記載の標的構築物。
【請求項２８】
請求項２０に記載の標的構築物であって、前記標的部分が、フォレートレセプター、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプター、上皮増殖因子レセプター、ＣＡ１２５腫瘍抗原、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ  ８、高分子量黒色種抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ  １７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、チロペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、インスリン様増殖因子レセプター（ＩＧＦ−Ｒ）、テロメラーゼおよびｐ５３からなる群より選択される腫瘍関連抗原を認識する、標的構築物。
【請求項２９】
前記標的部分が、腫瘍脈管構造のような腫瘍支質に関連した抗原を認識する、請求項２０に記載の標的構築物。
【請求項３０】
前記抗原が、α  ｖインテグリン、ＶＥＧＦレセプター、およびプロテオグリカンＮＧ２からなる群より選択される、請求項２９に記載の標的構築物。
【請求項３１】
請求項２０に記載の標的構築物であって、前記標的部分が、以下：
ａ）細菌に由来する抗原；
ｂ）ウイルスに由来する抗原；
ｃ）寄生生物に由来する抗原；
ｄ）真菌に由来する抗原；
ｅ）自己免疫疾患または炎症性状態の経過中に特異的に発現される抗原；および、
ｆ）植物または動物によって発現されるアレルゲン、
からなる群より選択される疾患関連抗原を認識する、標的構築物。
【請求項３２】
６Ｃｋｉｎｅまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体および標的部分を含有する標的構築物であって、該標的部分が、フォレートレセプターを認識する抗体フラグメントを含有する、標的構築物。
【請求項３３】
請求項２０に記載の標的構築物を含有する、プラスミド。
【請求項３４】
樹状細胞に特に適したプロモーター配列をさらに含有する、請求項３３に記載のプラスミド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、疾患状態、特に、癌を処置するときのケモカインの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原の取り込みおよびそれらのＴ細胞への提示に特化されている。従って、ＤＣは、抗原特異的免疫応答における重要な役割を担っている（Ｃａｕｘら，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １６：２；Ｓｔｅｉｎｍａｎ，１９９１，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１−２９６）。このプロセスは、末梢におけるＤＣによる抗原の捕捉ならびにプロセシング、リンパ管を介したＤＣの局所リンパ節への遊走、およびＴ細胞へのこのプロセシングを受けた抗原の提示に関する（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：６６７３：２４５）。
【０００３】
近年において、研究者らは、癌の処置においてＤＣ活性を活用することを試みてきた。動物モデルにおいて、２×１０５ほどの少数の抗原パルスを受けたＤＣが、未処置のマウスへ注射されたときに免疫を誘導する（Ｉｎａｂａら，１９９０，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１９７−２０６）。Ｆｌａｍａｎｄら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９４，２４：６０５−６１０）は、Ｂ細胞リンパ腫由来のイディオタイプ抗原を用いてマウスＤＣをパルスし、そして、それらを未処置のマウスに注射した。この処置によって、このレシピエントマウスは、その後の腫瘍誘発（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）から有効に保護され、そして、持続性免疫状態が樹立された。抗原単独、または抗原でパルスしたＢ細胞の注射は、なんら効果がなく、これは、抗原応答の原因となるのは、ＤＣに独特の特性であったことを示唆した。ＤＣは、抗腫瘍性免疫を誘導することができるだけではなく、ＤＣはこのプロセスが生じるには絶対不可欠であることが想定されてきた（Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：７２２−７２７；Ｇｒａｂｂｅら，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １６：１１７−１２０；Ｈｕａｎｇら，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６１−９６５）。Ｈｕａｎｇおよび共同研究者（Ｈｕａｎｇら，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６４：９６１−９６５）は、抗腫瘍性免疫を生じることが知られているＢ７−１でトランスフェクトした細胞をマウスに接種した。彼らは、ＭＨＣ適合性ＡＰＣを有するマウスのみが、腫瘍誘発を拒絶し得ることを実証した。マウスにおいて、腫瘍抗原負荷しインビトロで産生されたＤＣが、種々の群によって、腫瘍の発症を予防し、そして、より重要なことには、樹立された腫瘍の退行が誘導されたことを示した（Ｍａｙｏｒｄｏｍｏら，１９９５，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１：１２９７−１３０２；Ｐａｇｌｉａら，１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９３：３１７−３２２）。
【０００４】
ヒトにおける研究によって、ＤＣの類似の役割を実証した。ペプチド特異的ＣＴＬは、ペプチドパルスしたＤＣを使用して、精製したＣＤ８＋Ｔ細胞から容易に誘導されるが、ペプチドパルスした単球が使用されたときには、ペプチド特異的ＣＴＬは誘導されなかったことが報告されている（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５３：９９６−１００３）。最近、進行したＢ細胞リンパ腫を有する患者が、患者自身の腫瘍イディオタイプでパルスしたＤＣを用いて処理された（Ｈｓｕら，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２：５２）。これによって、患者のＢ細胞リンパ腫は測定可能なほどの減少を生じた。ＰＳＭ抗原でパルスしたＤＣを使用して前立腺癌を処置することが、Ｍｕｒｐｈｙら（Ｔｈｅ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  １９９６  ２９：３７１）によって報告されている。黒色腫を有している患者を、ＭＡＧＥ−１腫瘍抗原由来のペプチドでパルスしたＧＭ−ＣＳＦ活性化ＡＰＣで処置する臨床試験が実施されている（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １５３：９９６−１００３）。免疫前では、２人の患者由来の腫瘍浸潤リンパ球は、主に、ＣＤ４＋であって、かつ、特異的腫瘍反応性は欠如していた。対照的に、免疫後では、同一の患者由来の腫瘍浸潤リンパ球は、支配的に、ＣＤ８＋であって、ＭＡＧＥ−１特異的抗腫瘍性細胞傷害性を示した。従って、これらの研究によって、ＤＣは、免疫応答を刺激する、独特かつ強力な能力を有していることが明らかである。癌におけるＤＣの使用を評価する他の第Ｉ相臨床試験は、Ｄａｌｌａｌら，２０００，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：５８３−５８８によって概説されている。
【０００５】
重要な臨床的興味から、原発性腫瘍病巣への樹状細胞の組織的浸潤は、有意な患者の生存の長期化および膀胱癌腫、肺癌腫癌腫、食道癌腫、胃癌腫、および鼻咽頭癌腫を有する患者における転移性疾患の発生率の低減に関連している。対照的に、比較的乏しい臨床的な予後が、ＤＣの密度が低い浸潤を提示する病巣およびＤＣ浸潤が頻繁に欠損する病巣を有する患者に観察される（Ｂｅｃｋｅｒ，１９９３，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  ７：１８７；Ｚｅｉｄら，１９９３，Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２５：３３８；Ｆｕｒｉｈａｔｏｎら，１９９２，６１：４０９；Ｔｓｕｊｉｔａｎｉら，１９９０，Ｃａｎｃｅｒ  ６６：２０１２；Ｇｉａｎｎｉら，１９９１，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１８７：４９６；Ｍｕｒｐｈｙら，１９９３，Ｊ．Ｉｎｖ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１００：３３５８）。．
ケモカインは、白血球の遊走および活性化を調節する低分子量タンパク質である（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，１９９３，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３５１：１８３−１８６；Ｓｃｈａｌｌら，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：８６５−８７３；Ｒｏｌｌｉｎｓ，１９９７，Ｂｌｏｏｄ  ９０：９０９−９２８；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら，１９９４，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：９７−１７９）。いくつかのケモカインが、インビトロでＤＣを誘引することが示されている（Ｄｉｅｕ−Ｎｏｓｊｅａｎら，１９９９，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６６：２５２−２６２；Ｓｏｚｚａｎｉら，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：３２９２−３２９５；Ｓｏｚｚａｎｉら，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１９９３−２０００；Ｘｕら，１９９６，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６０：３６５−３７１；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１３１７−１３２２；Ｒｏａｋｅら，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８１：２２３７−２２４７）。ケモカインは、活性化白血球自体から分泌されており、そして、炎症刺激の際に、間質細胞（内皮細胞および上皮細胞を含む）によって分泌されている（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，１９９３，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．３５１：１８３−１８６；Ｓｃｈａｌｌら，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：８６５−８７３；Ｒｏｌｌｉｎｓ，１９９７，Ｂｌｏｏｄ  ９０：９０９−９２８；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら，１９９４，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：９７−１７９）。ケモカインに対する応答は、７回膜貫通型Ｇタンパク質結合レセプターによって媒介される（Ｒｏｌｌｉｎｓ，１９９７，Ｂｌｏｏｄ  ９０：９０９−９２８；Ｐｒｅｍａｃｋら，１９９６，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：１１７４−１１７８；Ｍｕｒｐｈｙ，Ｐ．Ｍ．１９９４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：５９３−６３３）。
【０００６】
６Ｃｋｉｎｅは、ケモカインのＣＣファミリーに属している（Ｈｅｄｒｉｃｋ  ｅｔ．ａｌ，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１５８９−１５９３）。これはまた、ＣＫ−β−９、ｅｘｏｄｕｓ−２、ＴＣＡ−４およびＳＬＣ（ヒトタンパク質については、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｏ００５８５）として知られており、そして、ＣＣＬ２１と新しいケモカイン命名法において再命名されている（Ｚｌｏｔｎｉｋら，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３７６５−３７６９）。ヒト６Ｃｋｉｎｅ（ｈ６Ｃｋｉｎｅ）は、このケモカインレセプターＣＣＲ７に結合するが、マウス６Ｃｋｉｎｅ（ｍ６Ｃｋｉｎｅ）は、低親和性にも関わらず、ＣＣＲ７ならびにＣＸＣＲ３レセプターに結合する（Ｊｅｎｈら，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２：３７６５５−３６７６９）。このＣＣＲ７レセプターは、樹状細胞のセブセットによって発現されおり（Ｄｉｅｕら，１９９８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：３７３−３８６）、Ｔ細胞およびＢ細胞によっても発現されており（Ｎａｇｉｒａら，１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：１５１６−１５２３；Ｓａｌｌｕｓｔｏら，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：７０８−７１２）、そして、ナチュラルキラー細胞によっても発現されており（Ｋｉｍら，１９９９，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９３：２２６−２３５）；６Ｃｋｉｎｅは、これらの細胞についての化学走性因子であることが示されている。さらに、ＣＸＣＲ３レセプターに結合する他のケモカイン（例えば、ＩＰ−１０およびＭｉｇ）（Ｗａｎｇら，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２２０：１−１７）は、血管形成性阻害（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）活性を保持しており、そして、このような活性は、マウス６Ｃｋｉｎｅについても実証されている（Ｓｏｔｏら，１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８２０５−８２１０）。
【０００７】
近年、マウス６Ｃｋｉｎｅは、マウスの腫瘍に注射されると、抗腫瘍効果を有することが示されている（Ｓｈａｒｍａら，２００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４５５８−４５６３）。さらに、Ｖｉｃａｒｉらは、ｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するように操作されたＣ２６結腸癌腫腫瘍細胞が、親細胞株よりも低い腫瘍原性であり、そして、この効果は、インビボでのＣＤ８＋細胞活性およびナチュラルキラー細胞活性に依存することを示した（Ｖｉｃａｒｉら，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：１９９２−２０００）。ｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するＣ２６腫瘍は、この研究において、親腫瘍と比較して、樹状細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞によって有意に浸潤されることが示された。
【０００８】
外科的療法、放射線療法、化学療法、および免疫生物学的方法のような、癌治療において現在利用可能な方法は、限定的な成功を収めているか、または深刻かつ所望されない副作用を生じるているか、のいずれかである。多くの臨床的に診断される固形腫瘍（ここで、この腫瘍は局在化した増殖物である）において、外科的に取り除くことが、処置における主要な手段であると考えられている。しかし、外科手術後の多くの場合、および時期的に遅れてしまった後においては、もとの腫瘍は、すでに転移してしまっていることが観察され、その結果、癌浸潤の２次的な部分は、その身体全体に広がっており、そして、その後、この患者は、２次的な癌増殖のために死亡する。化学療法は、癌の処置において広く使用されているが、化学療法は、通常、細胞増殖の阻止に基づく、全身性の処置である。したがって、化学療法は、正常な細胞を含む、全ての増殖細胞に影響与える非特異的な処置様式であって、所望されず、かつ、しばしば深刻な副作用を生じる。
【０００９】
従って、異常な免疫応答から生じると考えられる疾患、特に、癌を処置する新規の方法に対する必要性が存在する。樹状細胞を操作することによる、免疫応答を操作するための方法および治療が、これらの疾患の処置において有用である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、抗原提示樹状細胞の遊走および／または活性化を促進することによって、疾患（例えば、癌）に対する免疫療法のための材料および方法を提供することのよって上述の要件を満たす。ここで、ヒトケモカイン６Ｃｋｉｎｅは、癌の処置に有用な化学療法剤である。具体的には、ヒト６Ｃｋｉｎｅは、腫瘍増殖および転移を阻害することが見出された。したがって、本発明は、有効量の６Ｃｋｉｎｅを抗原発現の所望部位（例えば、腫瘍）へと標的化投与することを含む免疫療法の方法を提供する。
【００１１】
具体的には、本発明は、哺乳動物における癌を処置する方法を提供し、この方法は、６Ｃｋｉｎｅまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくはその変異体および標的部分を含む標的構築物の有効量を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００１２】
本発明の特定の実施形態において、この標的部分は、ペプチド、タンパク質、または低分子である。他の好ましい実施形態において、この標的部分は、ウイルスベクターのようなベクターである。より好ましい実施形態において、この標的部分は、抗体または抗体フラグメントである。最も好ましい実施形態において、この標的部分は、ＳｃＦｖフラグメントである。
【００１３】
好ましい実施形態において、この標的部分は、以下からなる群より選択される、腫瘍関連抗原を認識する：葉酸レセプター、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプター、上皮増殖因子レセプター、ＣＡ１２５腫瘍抗原、Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ  ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１  およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ１７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、チロペルオキシダーゼ（ｔｈｙｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ｇｐ１００、インシュリン様増殖因子レセプター（ＩＧＦ−Ｒ）、テロメラーゼおよびｐ５３。他の好ましい実施形態において、この標的部分は、腫瘍性間質（例えば、α  ｖインテグリン）、ＶＥＧＦレセプターおよびプロテオグリカンＮＧ２およびフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに関連する抗原を認識する。
【００１４】
本発明の別の実施形態において、この方法は、その送達部位において標的構築物の低速度放出を可能にする物質を投与する工程を包含する。特定の実施形態において、この標的構築物は、静脈内、腫瘍内、真皮内、筋内、皮下、または局所的に、投与される。
【００１５】
本発明の別の局面において、サイトカインは、６Ｃｋｉｎｅ標的構築物と併用され、その前もしくはそれと同時のいずれかで、投与される。１つの好ましい局面において、このサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４である。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の投与は、前駆体からのＤＣの産生を刺激し、それによって、抗原を捕捉しそしてプロセシングするＤＣの数を増大させる。別の好ましい局面において、ＦＬＴ−３ＬまたはＦＬＴ−３およびＧ−ＣＳＦを含む融合タンパク質、あるいはＦＬＴ−３ＬおよびＧＭ−ＣＳＦが、６Ｃｋｉｎｅ標的構築物と併用して投与される。
【００１６】
本発明のさらに別の局面において、活性化因子（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＲＡＮＫ−ＬまたはＲＡＮＫのアゴニスト、ＣＤ４０−ＬまたはＣＤ４０のアゴニストおよびＣｐＧオリゴヌクレオチドのような分子のｔｏｌｌ様レセプターファミリーのアゴニスト（Ｈｅｍｍｉら，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：７４０−７４５）は、と６Ｃｋｉｎｅ標的構築物と併用して投与される。
【００１７】
本発明のさらに別の局面において、他のケモカインは、６Ｃｋｉｎｅ標的構築物の前、その後、または、それと同時に、併用して、投与される。
【００１８】
最終的に、本発明は、６Ｃｋｉｎｅまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくはその改変体および標的部分を含む構築物、およびその標的構築物を含むプラスミドを提供する。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本明細書中に引用される全ての参考文献は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【００２０】
本発明者らは、６Ｃｋｉｎｅまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体の標的化された投与が、腫瘍増殖の減少を生じることを発見した。このような標的化された投与は、標的部分の特異性と、６Ｃｋｉｎｅの免疫刺激活性とを組み合わせている。６Ｃｋｉｎｅは、ＣＣＲ７レセプターとの相互作用を介して、樹状細胞の抗原送達部位への移動を増大させる。樹状細胞は、腫瘍由来抗原を取り込み、これを提示して、適応性（ａｄａｐｔｉｖｅ）免疫応答を開始し、先天性の免疫応答を担う因子を分泌する。さらに、６Ｃｋｉｎｅは、ＣＣＲ７レセプターおよび／またはＣＸＣＲ３レセプターを介して、免疫応答のエフェクター（例えば、Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞）の腫瘍への補充を促進し得る。最後に、６Ｃｋｉｎｅは、局所的血管形成阻害（ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｃ）活性を発揮し、それにより、腫瘍の発生を妨害し得る。標的化された６Ｃｋｉｎｅの投与は、腫瘍内の組織進入および分布を改善し得、その免疫原性を減少させ得る。本明細書中に記載の標的構築物および方法は、６Ｃｋｉｎｅまたはその標的部分の前進送達に関連する毒性の危険性を減少させつつ、生物学的活性をもたらす形態および濃度にて、６Ｃｋｉｎｅの局所的送達を提供することにより、遠隔部位での腫瘍の処置を可能にする。
【００２１】
従って、本発明は、哺乳動物における癌の新たな処置を提供し、この方法は、６Ｃｋｉｎｅまたはその生物学的に活性なフラグメントもしくは改変体および標的部分を含む標的構築物の有効量を哺乳動物に投与することを包含する。
【００２２】
標的構築物の「有効量」は、ＣＣＲ７レセプターとの相互作用を通じて、抗原送達部位への樹状細胞の移動を増大させるに十分な量である。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「６Ｃｋｉｎｅ」は、６Ｃｋｉｎｅの生物学的に活性なフラグメントおよび改変体を含む。生物学的に活性なフラグメントまたは改変体とは、コントロールに対して少なくとも２の移動指数にて、ＣＣＲ７を発現する樹状細胞の移動を誘導するか、そして／または測定可能な免疫応答を刺激するに十分な６Ｃｋｉｎｅ分子の一部または誘導体を意味する。測定可能な免疫応答は、好ましくは、腫瘍抗原に対する増強した抗原特異的刺激として評価され得る。これは、以下のうちのいずれかを含む：ｉ）血清中の抗原特異的免疫グロブリンレベル（代表的には、Ｂ細胞応答として公知）；ｉｉ）アイソタイプスイッチングのためにＴ細胞が媒介する補助を必要とする、特定のクラスの免疫グロブリンの生成；ｉｉｉ）抗原刺激に応じたＴリンパ球による特定のリンホカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４）の生成；ｉｖ）リンパ球の規定された集団（例えば、血液、脾臓、リンパ節、腫瘍）の抗原特異的細胞傷害性応答。さらに、腫瘍に対する測定可能な免疫応答は、腫瘍抗原に特異的ではないが、腫瘍に対する身体応答に関与する活性（例えば、ナチュラルキラー細胞活性または多核性細胞活性）、特定のサイトカイン（例えば、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−α）の放出、阻害性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０）の生成の減少、および新脈管形成の減少を検出することによって評価され得る（そして用語「先天性免疫」のもとで推定される）。
【００２４】
本発明において使用するための「６Ｃｋｉｎｅ」は、細胞（特に、樹状細胞）の限定されたサブセット、または白血球（例えば、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞）の他のサブセット（これらは全てＣＣＲ７レセプターを発現する）において活性な身体の天然タンパク質である。この用語は、下記に規定されるように、天然に存在する哺乳動物６Ｃｋｉｎｅ、ならびにその改変体およびフラグメントを含む。好ましくは、６Ｃｋｉｎｅは、ヒト起源またはマウス起源である。ヒト６Ｃｋｉｎｅおよびマウス６Ｃｋｉｎｅの配列は、登録番号Ｏ０９００６（マウス）およびＯ００５８５（ヒト）のもとでＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース中に寄託されている。
【００２５】
本発明を実施する際に使用される６Ｃｋｉｎｅは、天然産物と同一のアミノ酸配列を有する組換えタンパク質、または天然産物に由来するが、その本来の化学走化性特性を維持すると同時に、その薬物動態特性を変化させ、そして／または新規な生物学的特性を付与する改変を含む組換えタンパク質であり得る。
【００２６】
用語「６Ｃｋｉｎｅ」はまた、天然産物の改変体およびフラグメントを含む。本発明の目的に関して、６Ｃｋｉｎｅポリペプチドおよび６Ｃｋｉｎｅ改変体は、天然産物ポリペプチドと少なくとも７０％の配列同一性を有する。配列同一性％を決定するための方法は、以下で議論される。
【００２７】
「６Ｃｋｉｎｅ改変体」とは、ネイティブタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に１以上のアミノ酸の欠失または付加により；ネイティブタンパク質の１以上の部位にて１以上のアミノ酸の欠失または付加により；あるいはネイティブタンパク質の１以上の部位にて１以上のアミノ酸の置換により、ネイティブタンパク質から得られたポリペプチドをいう。このような改変体としては、変異体、フラグメント、対立遺伝子改変体、相同なオルソログが挙げられ、本発明において有用なネイティブ６Ｃｋｉｎｅフラグメントの融合物は、グリコシル化、リン酸化、非天然アミノ酸アナログの置換などにより改変され得る。
【００２８】
本発明の目的に関して、６Ｃｋｉｎｅ改変体は、一般に、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、好ましくは約９０％〜９５％以上、より好ましくは約９８％の同一性を有する。
【００２９】
本発明の方法において有用な６Ｃｋｉｎｅタンパク質の改変体は、わずか１〜３３アミノ酸残基、わずか１０〜３０アミノ酸残基、わずか１〜１５アミノ酸残基、わずか１〜１０アミノ酸残基（例えば、６〜１０アミノ酸残基）、わずか５アミノ酸残基、わずか４、３、２もしくはさらに１アミノ酸残基だけ、開示されたポリペプチドとは異なり得る。
【００３０】
同一性および類似性を計算するための方法は、当該分野で公知である。例えば、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｕｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１を参照のこと。一般に、２つのアミノ酸配列の同一性％を決定するために、それらの配列を最適な比較目的のために並置させる。２つの配列間の同一性％は、それらの配列により共有される同一部分の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重なり合う位置）×１００）。例えば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、そのポリペプチドのアミノ酸配列が参照アミノ酸配列の１００アミノ酸あたり最大５つのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、そのポリペプチドが参照配列と同一であることを意図する。参照アミノ酸配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノ末端位置もしくはカルボキシ末端位置またはそれらの末端位置の間のいずれかの場所（参照配列または参照配列内の１以上の連続するグループ中の残基の中で個々に点在する）で生じ得る。
【００３１】
２つの配列間の同一性％の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。本発明の目的に関して、２つのポリペプチド配列間の配列同一性％は、ＢＥＳＴＦＩＴコンピュータープログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７１１）を使用して、デフォルト設定を使用して決定される。ＢＥＳＴＦＩＴを使用して、本発明に従って特定の配列が、参照配列に対して、例えば、９５％同一であるか否かを決定する場合、パラメーターは、当然のことながら、同一性％が、参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、参照配列中のアミノ酸残基の総数の最大５％の相同性にてギャップが許容されるようなセットである。
【００３２】
本発明の方法において有用な６Ｃｋｉｎｅ改変体は、アミノ酸置換、欠失、短縮および挿入により選られ得る。好ましい６Ｃｋｉｎｅポリペプチド改変体は、１以上の保存的アミノ酸置換を有する。例えば、保存的アミノ酸置換は、１以上のアミノ酸残基にて行われ得る。好ましくは、置換は、非本質的なアミノ酸残基にて行われる。
【００３３】
「非本質的な」アミノ酸残基は、生物学的活性のうちの１つも変更することなく、６Ｃｋｉｎｅの野生型配列から改変され得る残基であるのに対して、「本質的な」アミノ酸残基は、所定の生物学的活性に必要である。
【００３４】
「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸のファミリーは、当該分野で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。例えば、Ｂｏｗｉｅら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６（これは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。好ましくは、このような置換は、保存されたシステイン残基（例えば、アミノ末端の連続システイン残基）については、なされない。
【００３５】
本発明の方法において有用な６Ｃｋｉｎｅ改変体は、天然に存在する改変体から単離され得るか、変異誘発もしくは組換え操作後に単離され得るか、または合成的に生成され得る。天然に存在する対立遺伝子改変体は、周知の分子生物学的技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術）の使用によって同定され得る。このような操作のための方法は、当該分野で一般に公知である。さらに、６Ｃｋｉｎｅタンパク質の改変体は、変異誘発または組換え操作によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更の方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｋｕｎｋｅｌ、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２；Ｋｕｎｋｅｌら、１９８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３６７−３８２；米国特許第４，８７３，１９２号；ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編、（１９８３）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）およびこれらにおいて引用される参考文献を参照のこと。目的のタンパク質の生物学的活性に影響を与えない適切なアミノ酸置換に関するガイダンスは、Ｄａｙｈｏｆｆら、１９７８、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）（これは、本明細書中で参考として援用される）のモデルにおいて見出され得る。
【００３６】
従って、本発明の方法において有用なポリペプチドには、天然に存在するタンパク質ならびにその改変体および修飾形態の両方が包含される。このような改変形態は、上記で議論された所望の６Ｃｋｉｎｅ活性を保有し続ける。マウス６ＣｋｉｎｅのみがＣＸＣＲ３レセプター（これは、おそらく、血管形成阻害活性を媒介する）に結合し、ヒト６ＣｋｉｎｅはＣＸＣＲ３レセプターに結合しないので、この方法において有用なポリペプチドとしては、ＣＸＣＲ３レセプターを介して生物学的に活性であり得る、ヒト６Ｃｋｉｎｅの改変体が挙げられ得る。明らかに、改変体をコードするＤＮＡ中に作成される変異は、リーディングフレームの外側の配列に位置すべきではなく、そして好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を生じ得る相補的領域を創出しない。欧州特許出願公開番号７５，４４４を参照のこと。
【００３７】
「６Ｃｋｉｎｅポリペプチドフラグメント」によって、６Ｃｋｉｎｅのアミノ酸配列の一部が意図される。本明細書中で使用する場合、６Ｃｋｉｎｅポリペプチドフラグメントは、全長６Ｃｋｉｎｅポリペプチドの樹状細胞走化性活性、抗腫瘍活性または血管形成阻害活性の少なくとも３０％を保持する。さらに、本発明の目的のために、６Ｃｋｉｎｅフラグメントは、全長６Ｃｋｉｎｅポリペプチドの少なくとも１０個連続するアミノ酸残基を含む。従って、６Ｃｋｉｎｅポリペプチドフラグメントは、全長６Ｃｋｉｎｅの少なくとも１０個連続するアミノ酸残基、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、約１００個およびこの全長ポリペプチドの１１０〜１１個まで連続するアミノ酸残基の範囲であり得る。
【００３８】
本発明の方法において有用な改変体６Ｃｋｉｎｅタンパク質および全長ポリペプチドフラグメントは、６Ｃｋｉｎｅの生物学的活性を有さなければならない。特に、これらは、ネイティブタンパク質の所望の生物学的活性（すなわち、本明細書中で記載される樹状細胞走化性活性、血管形成阻害活性または抗腫瘍活性）を有さなければならない。さらに、ヒト６Ｃｋｉｎｅの改変体は、ネイティブのマウス６Ｃｋｉｎｅタンパク質と類似の血管形成阻害活性を有し得る。本発明の目的のために、「６Ｃｋｉｎｅ改変体」は、全長６Ｃｋｉｎｅポリペプチドの樹状細胞走化性活性、腫瘍阻害活性または血管形成阻害活性の少なくとも３０％を示す。より代表的には、改変体は、６０％より高いこれらの活性の少なくとも１つを示し；さらにより代表的には、改変体は、８０％より高いこれらの活性の少なくとも１つを示す。
【００３９】
本明細書中の有用なタンパク質配列の欠失、挿入および置換は、このタンパク質の特徴における急激な変化を生じるとは予測されず、ヒトタンパク質の意図された改変は、マウスタンパク質の血管形成阻害活性と類似の血管形成阻害活性を導入することが予測される。しかし、置換、欠失または挿入を行う前に置換、欠失または挿入の正確な影響を予測することが困難な場合、当業者は、この効果が、慣用的なスクリーニングアッセイによって評価されることを理解する。すなわち、樹状細胞走化性活性は、当業者に公知の標準的な走化性アッセイによって評価され得る。例えば、Ｒｕｂｂｅｒｔら、１９９８、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６０：３９３３およびＮａｇｉｒａら、１９９７、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１９５１８（これらは、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。同様に、血管形成阻害活性は、血管形成の卵絨毛尿膜モデルまたはげっ歯類角膜モデルにおいて測定され得る。例えば、Ｓｏｔｏら、１９９８、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：８２０５（この内容は、本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。抗腫瘍活性は、実施例２〜５に記載されるように、非ヒト哺乳動物被験体における腫瘍細胞の移植を使用して決定され得る。
【００４０】
ＣＣＲ７に対する６Ｃｋｉｎｅの結合に関与するアミノ酸は、樹状細胞に対する６Ｃｋｉｎｅの走化性活性に必須である。このようなアミノ酸は、当該分野で公知の方法によって同定され得る。このような方法としては、アラニンスキャニング変異誘発、分子進化（Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９６、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：３１５−３１９；Ｃｒａｍｅｒｉら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  １５：２８８−２９１；Ｐａｔｔｅｎら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４−７３３；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９１：１０７４７−５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｗ．Ｐ．、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ  ３７０：３８９−３９１）、または部位特異的変異誘発が挙げられる。Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１を参照のこと。得られた変異体は、生物学的活性について試験され得る。結合に必須の部位は、構造的分析（例えば、結晶化、光親和性標識または核磁気共鳴）によって決定され得る。ｄｅＶｏｓら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６およびＳｍｉｔｈら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９を参照のこと。
【００４１】
「標的部分」は、本明細書で言及される場合、腫瘍関連抗原または腫瘍の非癌性成分（例えば、腫瘍脈管）によって特異的に発現される構造を、認識または標的化する部分である。本発明に従う標的部分の例としては、腫瘍関連抗原または腫瘍の非癌性成分によって特異的に発現される構造を認識または標的化する、ペプチド、タンパク質、低分子、ベクター、抗体または抗体フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、標的部分は、ペプチド、タンパク質、低分子、ベクター（例えば、ウイルスベクター）、抗体または抗体フラグメントである。より好ましい実施形態において、標的部分は、抗体または抗体フラグメントである。最も好ましい実施形態において、標的部分は、ＳｃＦｖフラグメントである。
【００４２】
標的部分は、ヒトにおいて、例えば、以下に記載されたような、腫瘍細胞によって発現される抗原に特異的であり得る：葉酸レセプター（Ｍｅｌａｎｉら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４１４６−４１５４）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕレセプター、上皮増殖因子レセプターおよびＣＡ１２５腫瘍抗原（Ｇｌｅｎｎｉｅら、２０００、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：４０３−４１０）。いくつかの他の腫瘍抗原が標的として使用され得、そして、腫瘍の悪性細胞による変異形態下で、優先的に発現されるか、独自に発現されるか、過剰発現されるかまたは発現されるかのいずれかである（Ｂｏｏｎら、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：６８１−６８３）。これらとしては、以下が挙げられ得る：Ｍｅｌａｎ−Ａ、チロシナーゼ、ｐ９７、β−ＨＣＧ、ＧａｌＮＡｃ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−１２、ＭＡＲＴ−１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ１８、ＣＥＡ、ＤＤＣ、黒色腫抗原ｇｐ７５、ＨＫｅｒ８、高分子量黒色腫抗原、Ｋ１９、Ｔｙｒ１およびＴｙｒ２、ｐＭｅｌ１７遺伝子ファミリーのメンバー、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＡ、ＰＳＭ、α−フェトプロテイン、チロペルオキシダーゼ、ｇｐ１００、インスリン様増殖因子レセプター（ＩＧＦ−Ｒ）、テロメラーゼおよびｐ５３。このリストは、網羅的であることを意図せず、本発明の実施において使用され得る抗原の型の例示にすぎない。あるいは、標的部分は、悪性細胞とは異なる腫瘍成分（特に腫瘍血管）によって優先的に発現される抗原に特異的であり得る。αｖインテグリンのファミリーである、ＶＥＧＦレセプター、プロテオグリカンＮＧ２およびフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインは、このような腫瘍血管関連抗原の例である（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９７、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５４２−５４６；Ｎｉｌｓｓｏｎら、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（２）：７１１−７１６）。例えば、６Ｃｋｉｎｅは、Ｎｉｌｓｓｏｎら、２００１、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１（２）：７１１−７１６に記載される標的化方法に従って、抗体フラグメントを使用してフィブロネクチンのＥＤ−Ｂドメインに標的化され得る。
【００４３】
本発明に従う標的部分として有用な抗体および抗体フラグメントは、当該分野で公知の方法に従って選択され得る。具体的には、抗体は、選択された標的抗原で動物を免疫した、従って、モノクローナル抗体が生成された後に誘導され得る。あるいは、抗体フラグメントは、ファージディスプレイライブラリーから誘導され得、その中で標的抗原に対する特異性に基づいて選択される。両方の場合において、抗原認識に関与しない抗体の一部は、この抗体が、元々の抗体フラグメントよりも患者において免疫原性でないように改変され得る。このようなプロセスは、「抗体ヒト化」と称される。このような抗体構築物の生成については、例えば、Ｈｕｄｓｏｎら、１９９９、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５４８−５５７を参照のこと。
【００４４】
標的部分が抗体または抗体フラグメントである標的構築物は、その特異性および効力を改善するための多数の方法によって改変され得る。例えば、抗体の親和性は、多価フラグメントの構築または親和性成熟によって改善され得る（Ｈｕｄｓｏｎら、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：５４８−５５７）。
【００４５】
本発明の別の局面において、標的部分は、腫瘍細胞または腫瘍脈管によって発現される腫瘍関連抗原に特異的に結合する、少なくとも１０アミノ酸のペプチドであり得る（Ｂｕｒｇら、１９９９、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：２８６９−２８７４；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４−３６６；Ａｒａｐら、１９９８、Ｓｃｉｃｅｎｃｅ  ２７９：３７７−３８０）。標的部分はまた、腫瘍関連抗原に結合するタンパク質または天然低分子もしくは合成低分子（例えば、抗原の天然のリガンドもしくはこのリガンドの改変体、またはこの抗原に結合する低分子）であり得る。
【００４６】
既知の腫瘍関連抗原または他の腫瘍関連構造に特異的に結合するペプチドおよびタンパク質は、当業者によって選択され得る。例えば、タンパク質である標的部分は、所定の腫瘍関連標的についての既知のリガンド、既知のリガンドの改変体、あるいは結合パートナー−結合パートナー様式でか、または共有結合もしくは非共有結合のいずれかの天然の生理学的に適切なタンパク質−タンパク質相互作用で腫瘍関連標的と相互作用する他のタンパク質、から選択され得る。腫瘍関連標的を使用する薬物スクリーニングは、腫瘍関連抗原への結合親和性を有するタンパク質を同定するために実施され得る。
【００４７】
低分子である標的部分はまた、公知のスクリーニング手順によって同定され得る。特に、所定の標的（例えば、レセプターのような腫瘍関連分子）に特異的に結合する低分子についてのスクリーニング方法は、当該分野で周知である。例えば、Ｍｅｅｔｉｎｇｓ  ｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ  ０１７７２−１７４９を参照のこと。
【００４８】
本発明の別の他の局面において、標的部分は、６Ｃｋｉｎｅを腫瘍に送達するベクターであり得る。例えば、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター（実施例ＩＶを参照のこと）、レトロウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクター）またはＤＮＡベクターが使用され得る。腫瘍に対するウイルスベクターの特異的標的化は、特定の器官または組織に対する特定のウイルスの天然の親和性を使用して達成され得る。例えば、ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ属由来のベクターは、神経細胞の優先的な感染を有することが示されている（米国特許第５，３２８，６８８号を参照のこと）。あるいは、条件付き複製ウイルスベクターが、不都合な広いスペクトルの感染を回避しつつ、特定の細胞型における６Ｃｋｉｎｅの選択的発現を達成するために使用され得る。条件付き複製ベクターの例は、２０００年４月２０日公開のＷＯ  ００／２２１３７；Ｐｅｎｎｉｓｉ，Ｅ．、１９９６  Ｓｃｉｅｃｎｃｅ  ２７４：３４２−３４３；Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ３０Ａ（８）：１１６５−１１７１に記載される。さらに、ウイルスゲノムは、特定の条件下でのみ導入遺伝子の複製または発現を達成する誘導性プロモーターを含むように改変され得る。誘導性プロモーターの例は、専門文献において公知である（例えば、Ｙｏｓｈｉｄａら、１９９７  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２３０：４２６−４３０；Ｌｉｄａら、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（９）：６０５４−６０５９；Ｈｗａｎｇら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７１（９）：７１２８−７１３１；Ｌｅｅら、１９９７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７（９）：５０９７−５１０５；およびＤｒｅｈｅｒら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７２（４６）；２９３６４−２９３７１を参照のこと）。６Ｃｋｉｎｅ導入遺伝子はまた、特定の細胞型においてのみ導入遺伝子を発現させる、組織特異的なプロモーター領域の制御下にあり得る。
【００４９】
細胞型特異性または細胞型標的化はまた、ウイルスエンベロープタンパク質の改変によって特徴的に広い感染性を有するウイルス由来のベクターによって達成され得る。例えば、細胞標的化は、独自の細胞表面レセプターとの特異的相互作用を有する改変されたノブドメインおよびファイバードメインの発現を達成するために、ウイルスゲノムのノブコード配列およびファイバードメインの選択的改変によって、アデノウイルスベクターを用いて達成されている。このような改変の例は、Ｗｉｃｋｈａｍら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｏｌ  ７１（１１）：８２２１−８２２９（アデノウイルスファイバータンパク質へのＲＧＤペプチドの組み込み）；Ａｍｂｅｒｇら、１９９７  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２７：２３９−２４４（眼および生殖管への親和性を達成するための、アデノウイルスファイバー遺伝子の改変）；ＨａｒｒｉｓおよびＬｅｍｏｉｎｅ、１９９６、ＴＩＧ  １２（１０）：４００−４０５；Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、１９９７、Ｊ．Ｖｉｏｌ．７１（６）：４７８２−４７９０；Ｍｉｃｈａｅｌら、１９９５、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：６６０−６６８（アデノウイルスファイバータンパク質へのガストリン放出ペプチドフラグメントの組み込み）；ならびにＯｈｎｏら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：７６３−７６７（シンドビスウイルスへのプロテインＡ−ＩｇＧ結合ドメインの組み込み）に記載される。
【００５０】
細胞特異的標的化の他の方法は、ウイルス表面への、抗体、抗体フラグメント、ペプチドまたはリガンドの結合体化によって達成されている（例えば、Ｈａｉｓｍａら、２０００、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：９０１−９０４；Ｍａｒｔｉｎら、１９９９、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７３：６９２３−６９２９、Ｍｉｃｈａｅｌら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２６８：６８６６−６８６９、Ｗａｔｋｉｎｓら、１９９７、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１００４−１０１２；Ｄｏｕｇｌａｓら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１５７４−１５７８；Ｎｉｌｓｏｎら、１９９６、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ３：２８０−２８６（レトロウイルスタンパク質へのＥＧＦの結合体化）を参照のこと）。
【００５１】
ＤＮＡベクターの特異性は、ベクター内にＤＮＡ結合カチオン性テイルを含ませることによって（Ｃｈｅｎら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：３５７−３６４９）、または血管から腫瘍へと優先的に溢出する脂質構造体（例えば、リポソーム）内にＤＮＡベクターを含ませることによって、改善され得る。
【００５２】
上記の異なる標的構築物の、腫瘍に対する特異性は、無関係の腫瘍または健常な組織と比較して、腫瘍細胞または腫瘍血管へのインビトロでの特異的結合によって分析され得る（Ｍｅｌａｎｉら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４１４６−４１５４）。これは、例えば、１１１Ｉｎ、１２５Ｉまたは９９Ｔｅｃで放射性標識された６Ｃｋｉｎｅ構築物の、血液、腫瘍および他の器官における分布を測定することによって、さらに分析され得る（Ｍａｌａｎｉら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４１４６−４１５４；Ａｄａｍｓら、１９９８、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ７７：１４０５−１４１２；Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：３６４−３６６）。
【００５３】
本発明の標的構築物方法の多くの他の改変が、その特異性および効力を改善するためになされ得る。例えば、標的構築物の、例えば、ペグ化またはリポソームに含めることによる改変は、血中半減期を増大させ得、従って、その効力を増大させ得る（Ｃｈａｐｍａｎら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：７８０−７８３）。本発明の標的構築物の異なる組み合わせまたは改変は、異なる民族グループ、性別および地理的分布との最適な機能を提供するために使用され得る。
【００５４】
本発明の種々の型の標的構築物の送達様式は、注射（静脈内注射、腫瘍内注射、皮内注射、筋内注射および皮下注射）によるもの、または局所的送達（例えば、軟膏もしくはパッチ）であり得る。
【００５５】
本発明の標的構築物は、単独でか、またはその送達部位での徐放を可能にする物質（貯留物）と組み合わせて投与され得る。
【００５６】
原発性癌および転移癌の両方が、本発明に従って処置され得る。処置され得る癌の型としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：黒色腫、乳癌、膵臓癌、結腸癌、肺癌、神経膠腫、肝細胞癌、子宮内膜癌、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）癌、小腸癌、腎癌、前立腺癌、甲状腺癌、卵巣癌、精巣癌、肝臓癌、心臓癌、頭部および頸部の癌、結腸直腸癌、食道癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）癌、眼の癌、膀胱癌、神経膠芽細胞腫ならびに転移性癌腫。用語「癌腫」は、呼吸系癌腫、胃腸系癌腫、尿生殖系癌腫、前立腺癌腫、内分泌系癌腫および黒色腫を含む、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍をいう。転移は、この用語が本明細書中で使用される場合、限局性リンパ節に対して離れた部位への、腫瘍の伝播として定義される。
【００５７】
本発明の別の実施形態において、標的構築物は、癌関連抗原とは異なる疾患関連抗原に標的化される。これには、ヒトまたは動物において疾患を引き起こすことが公知の生物（例えば、細菌、ウイルス、寄生生物（例えば、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）および真菌）に由来する抗原が挙げられる。これにはまた、自己免疫疾患または炎症状態の過程の間に特異的に発現される抗原、および植物または動物によって発現されるアレルゲンが挙げられる。
【００５８】
ＤＣの成熟を活性化、誘導または刺激するように設計された部分が、有利に投与され得る。このような因子の例は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、ＲＡＮＫ−ＬまたはＲＡＮＫのアゴニスト、ＣＤ４０−ＬまたはＣＤ４０のアゴニスト、およびｔｏｌｌ様レセプターファミリー分子のアゴニスト（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）である（Ｈｅｍｍｉら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：７４０−７４５）。このような活性化因子は、以下の成熟シグナルを提供し得る：ｉ）ＣＣＲ７（６Ｃｋｉｎｅのレセプター）の発現を増加させるシグナル、ｉｉ）排出リンパを通る、組織からリンパ器官へ向けてのＤＣの移動を駆動するシグナル、ｉｉｉ）免疫応答（特に、抗腫瘍応答）を増強する分子（例えば、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−α）を分泌するようにＤＣを活性化するシグナル（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：２４５−２５２）。標的構築物がプラスミドベクターによって送達される本発明の実施形態において、これらの核酸配列は、ベクターの一部であり得る。
【００５９】
ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４は、６Ｃｋｉｎｅ融合構築物と組み合わせて、有利に投与され得る。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４は、循環するＤＣの数を増加させる目的のために投与され得、このＤＣは、次いで、６Ｃｋｉｎｅ融合タンパク質が引き続いて注射される腫瘍中に、局所的に補充され得る。このプロトコルは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を用いた、少なくとも５〜７日間の全身的な前処置を含む。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の局所的投与、ＤＣ前駆体（単球）からＤＣ（これは、次いで、同じ部位において送達された抗原を捕捉し得る）への局所的分化による代替法が、有利である。他のタンパク質（例えば、ＦＩＴ−３ＬおよびＧ−ＣＳＦを含む融合タンパク質もしくはＦＬＴ−３ＬおよびＧＭ−ＣＳＦを含む融合タンパク質）もまた、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の代わりに使用され得る。
【００６０】
さらに、他のサイトカインまたは複数のサイトカインの組み合わせが、本発明の６Ｃｋｉｎｅ標的構築物と組み合わせて有利に投与され得る。有利な効果を有することが示されているサイトカインとしては、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−５、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、Ｔｅｃｋ、ＤＣ  ｔａｃｔｉｎ−β、ＭＤＣ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３およびＭＣＰ−４が挙げられ得る（例えば、Ｓｏｚｚａｎｉら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：３２９２−３２９５；Ｓｏｚｚａｎｉら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１９９３−２０００；Ｘｕら、１９９６、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．６０；３６５−３７１；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１３１７−１３２２；Ｒｏａｋｅら、１９９５、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ  １８１：２２３７−３３４７および欧州特許出願ＥＰ０  ９７４  ３５７  Ａ１（１９９８年７月１６日出願、２０００年１月２６日公開）を参照のこと）。
【００６１】
一般に、標的構築物および／または活性化因子および／またはサイトカインは、薬学的キャリア中に、有効量のケモカインおよび／または抗原および／または活性化因子および／またサイトカインを含む薬学的組成物として投与される。これらの試薬は、例えば、従来の薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤（例えば、免疫原性アジュバント）中のさらなる活性成分または不活性成分を、生理学的に無害の安定剤および賦形剤と共に、治療用途のために組み合わされ得る。薬学的キャリアは、本発明の組成物を患者に送達するのに適切な、任意の適合性の非毒性物質であり得る。
【００６２】
有効な治療に必要な試薬の量は、多数の異なる因子（投与手段、標的部位、患者の生理学的状態および投与される他の医薬を含む）に依存する。従って、処置投薬量は、安全性および効力を最適にするために力価決定されるべきである。特定の癌の処置に有効な用量の動物試験は、ヒトの投薬量をさらなる予測的な指標を提供する。種々の考慮事項が、例えば、Ｇｉｌｍａｎら（編）（１９９０）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｅｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第８版、Ｐｒｅｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版（１９９０）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに記載される。例えば、静脈内投与、腹腔内投与または筋内投与、経皮拡散などのための投与方法は、これらの文献中および以下で考察される。薬学的に受容可能なキャリアとしては、水、生理食塩水、緩衝液、および例えばＭｅｒｃｋ  Ｉｎｄｅｘ、Ｍｅｒｃｋ  ＆  Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙに記載される他の化合物が挙げられる。徐放性処方物または徐放装置が、連続的な投与のために使用され得る。
【００６３】
標的構築物および／または活性化因子についての投薬量範囲は、適切なキャリアと共に、１ｍＭ未満の濃度、代表的には約１０μＭ未満の濃度、通常約１００ｎＭ未満、好ましくは約１０ｐＭ（ピコモル濃度）、そして最も好ましくは約１ｆＭ（フェムトモル濃度）の量であることが通常予測される。一般に、処置は、化合物の最適用量未満である、より小さい投薬量で開始される。その後、この投薬量は、この状況下で最適な効果が達成されるまで、小さい増分ずつ増加される。特定の状況についての適切な投薬量および投与レジメンの決定は、当業者の範囲内である。
【００６４】
標的部分がベクターである標的構築物の投薬量は、使用される特定のベクターの効力および患者の状態、ならびに処置される患者の体重または表面積に大きく依存する。用量サイズはまた、特定のベクターの投与に伴う任意の有害な副作用の存在、性質および程度、または特定の患者中の形質導入される細胞型によって決定される。この処置において投与されるベクターの有効量を決定する際に、医師は、ベクターの循環血漿レベル、ベクターの毒性、疾患の進行度および抗ベクター抗体の産生を評価する。核酸についての代表的な用量は、投与経路および遺伝子送達系に高度に依存する。送達方法に依存して、この投薬量は、約１ｉｇ〜１００ｍｇ以上の範囲内に容易に入り得る。一般に、ベクター由来の裸の核酸の等価用量は、代表的な７０ｋｇの患者について約１ｉｇ〜１００ｉｇであり、そしてウイルス粒子を含むベクターの用量は、治療核酸の等価量を得るように計算される。
【００６５】
本発明の実施におけるＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の好ましい生物学的活性用量は、循環ＣＤ１４＋／ＣＤ１３＋前駆細胞の数の最大の増加；ＤＣ前駆体および成熟ＤＣの表面上での抗原提示分子の発現；Ｔ細胞に対する抗原提示活性；および／または成熟ＤＣ機能と一致する抗原依存的Ｔ細胞応答の刺激、を誘導する投与の組み合わせである。本発明の実施において、皮下投与のために使用されるＩＬ−４の量は、代表的には、約０．０５〜約８．０μｇ／ｋｇ／日、好ましくは０．２５〜６．０μｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは０．５０〜４．０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。皮下投与のために使用されるＧＭ−ＣＳＦの量は、代表的に、約０．２５μｇ／ｋｇ／日〜約１０．０μｇ／ｋｇ／日、好ましくは約１．０〜８．０μｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは約２．５〜５．０μｇ／ｋｇ／日の範囲である。特定の患者についての有効量は、上記に示したパラメーターのうち１つ以上の有意な変化を測定することによって確立され得る。
【実施例】
【００６６】
（実施例）
本発明は、以下の非限定的な実施例によって例示され得る。
【００６７】
（実施例Ｉ）
（ｈ６Ｃｋｉｎｅケモカインに対するヒト樹状細胞の応答）
この実施例において、本発明者らは、ヒト６Ｃｋｉｎｅ（「ｈ６Ｃｋｉｎｅ」）が、ヒトにおいてインビトロで、樹状細胞の全ての既知のサブセットについての走化性因子であることを示した。特に、ｈ６Ｃｋｉｎｅは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＣＤ４０Ｌとの短時間のインキュベーション期間後に、ヒト血液樹状細胞に対して活性である（図１）。
【００６８】
ＣＤ１ａ＋ランゲルハンス島細胞、ＣＤ１４＋間質ＤＣ、単球由来のＤＣ、循環血液ＤＣ１１ｃ＋  ＤＣ、単球および循環血液のＣＤ１１ｃ−プラスマ細胞様ＤＣを含む異なるヒトＤＡ集団を、成熟の前および後に、ヒト６Ｃｋｉｎｅに応答した遊走アッセイにおいて研究した。ＣＤ３４誘導ＤＣ前駆体を、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＴＮＦおよびＳＣＦの存在下での６日間の培養後に、ＣＤ１ａおよびＣＤ１４の発現によってＦａｃｓ分類することによって単離した。細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ単独（未成熟）またはＧＭ−ＣＳＦ＋ＣＤ４０−Ｌ（成熟）中で、少なくとも２日間にわたって１２日目まで培養した。単球由来ＤＣを、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４の存在下で５日間培養することによって生成し、そしてＣＤ４０−Ｌで最後の２日間、活性化（成熟）したかまたは活性化しなかった（未成熟）。ヒト循環血液１１ｃ＋  ＤＣおよびＣＤ１１ｃ−プラスマ細胞様ＤＣを、磁気ビーズ除去によって富化し、そして系統マーカーＦＩＴＣネガティブ、ＨＬＡ−ＤＲ三色ポジティブ、およびＣＤ１１ｃ  ＰＥポジティブおよびＣＤ１１ｃ  ＰＥネガティブへと、三重染色を使用してｆａｃｓ分類した。１１ｃ＋  ＤＣおよびＣＤ１１ｃ−プラスマ細胞様ＤＣを、ＣＤ４０−Ｌと共に（成熟）または伴わずに（未成熟）、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−３の存在下で３時間培養した。走化性アッセイを、５μｍまたは８μｍの孔サイズのＴｒａｎｓｗｅｌｌ（直径６．５ｍｍ、ＣＯＳＴＡＲ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用いて１〜３時間の間実施し、そしてｆａｃｓ分析により明らかにした。全ての集団は、６Ｃｋｉｎｅに応答したが、ＣＤ４０−Ｌ活性化の後のみであった。６Ｃｋｉｎｅに対する同様の走化性応答を、ＴＮＦαおよびＬＰＳによる活性化後に獲得した（示していない）。
【００６９】
（造血性因子、試薬、および細胞株）
ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（比活性：２．１０６Ｕ／ｍｇ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）、ｒｈＴＮＦα（比活性：２×１０７Ｕ／ｍｇ、Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、ｒｈＳＣＦ（比活性：４×１０５Ｕ／ｍｇ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａｂｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ）、およびｒｈＩＬ−４（比活性：２．１０７Ｕ／ｍｇ、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、ＮＪ）を、それぞれ、１００ｎｇ／ｍｌ、２．５ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、および５０Ｕ／ｍｌの至適濃度で使用した。組換えヒト６Ｃｋｉｎｅ／ＣＣＬ２１は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製であり、そして至適濃度（１μｇ／ｍｌ）で使用した。マウスＣＤ４０リガンドをトランスフェクトした細胞株（ＣＤ４０−ＬＬ細胞）を、ＤＣ成熟の刺激因子として使用した。
【００７０】
（末梢血からのＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ１１ｃ−ＤＣの濃縮）
循環血ＣＤ１１ｃ＋およびＣＤ１１ｃ−ＤＣを、以前に記載されたようにして末梢血から調製した［Ｇｒｏｕａｒｄら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４（６６０７）３６４−３６７］。簡単にいうと、末梢血単核細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅにより単離し、そして系統陽性細胞を、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）抗体、抗ＣＤ１９（４Ｇ７）抗体、抗ＣＤ１４（ＭＯＰ９）抗体、抗ＣＤ５６（ＮＫＨ１、Ｃｏｕｌｔｅｒ）抗体、抗ＣＤ１６（ＩＯＮ１６、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）抗体、抗ＣＤ３５（ＣＲ１、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）抗体、および抗グリコホリンＡ（ＪＣ１５９、ＤＡＫＯ）抗体、ならびに磁気ビーズ（抗マウスＩｇコートＤｙｎａｂｅａｄｓ、Ｄｙｎａｌ）を用いて除去した。枯渇および染色の全ての手順を、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡの存在下で実施した。濃縮された集団は、１５〜２５％の間のＣＤ１１＋Ｄｃおよび１０〜３０％の間のＣＤ１１Ｃ−ＤＣを含み、ＨＬＡ−ＤＲ（ｔｒｉｃｏｌｏｒ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ＣＤ１１ｃ（ＰＥ、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の発現および系統マーカー（ＦＩＴＣ）ＣＤ１ａ（Ｏｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｒａｒｉｔａｎ、ＮＪ）；ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ５７、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ３（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の欠失によって識別された。
【００７１】
（臍帯血ＣＤ３４＋ＨＰＣからのＤＣの生成）
ＣＤ３４＋細胞を、記載されるような陽性選択を通じて臍帯血単核画分から単離し（Ｃａｕｘら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：６９５−７０６；Ｃａｕｘら、１９９０、Ｂｌｏｏｄ  ７５：２２９２−２２９８）、１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｆｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＵＫ）、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、Ｌｅｖａｌｏｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）からなるエンドトキシンを含まない完全培地中、ＳＣＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦα、ならびに記載されるような２．５％  ＡＢ＋ヒト血清の存在下で培養した（Ｃａｕｘら、１９９６、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：６９５−７０６）。これらの培養物を４日目に同一条件に分割し、そして６日目および１０日目に、ＧＭ−ＣＳＦのみを補充されており１２日目までＡＢ＋ヒト血清を補充しない完全培地に分割することによって、至適濃度を維持した。
【００７２】
（末梢血単球の単離）
単球を、ＰＢＭＣの調製、それに続く５２％  Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配後に免疫磁気的枯渇（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｄｙｎａｌ  Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）により精製した。枯渇を、抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）モノクローナル抗体、抗ＣＤ１９（４Ｇ７）モノクローナル抗体、抗ＣＤ８（ＯＫＴ８）モノクローナル抗体、抗ＣＤ５６（ＮＫＨ１、Ｃｏｕｌｔｅｒ）モノクローナル抗体、および抗ＣＤ１６（ＩＯＮ１６、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）モノクローナル抗体を用いて実施した。単球由来樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４の存在下で６〜７日間精製単球を培養することにより生成した（Ｓａｌｌｕｓｔｏら、１９９４、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９−１１１８）。
【００７３】
（トランスウェル中での走化性アッセイ）
走化性アッセイを、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（直径６．５ｍｍ、ＣＯＳＴＡＲ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を用い、５×１０５細胞／ウェルで実施した。ＣＤ３４＋ＨＰＣ由来ＤＣ前駆体を、５ｍ孔サイズのインサート中で１時間インキュベートし、そして走化性細胞を、ＣＤ１ａおよびＣＤ１４のいずれかで二重染色することによって分析した。単球および単球由来ＤＣを５μｍ孔サイズのインサート中で２時間インキュベートし、そして移動を、ＣＤ１４および／またはＣＤ１ａ染色により明らかにした。濃縮した血液ＤＣ集団を、３μｍ孔サイズのインサート中で３時間インキュベートし、そして移動を、ＣＤ１１ｃ±／ＨＬＡ−ＤＲ＋／系統についての三重染色により明らかにした。
【００７４】
（実施例ＩＩ）
（腫瘍モデルにおけるケモカインｍ６Ｃｋｉｎｅ遺伝子移入）
この例において、本発明者らは、以下のことを示した：
−  ｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するよう操作したＣ２６結腸癌腫瘍細胞は、発癌性が低いこと、およびこの効果は、インビボでのＣＤ８＋細胞およびナチュラルキラー細胞活性に依存すること（図２）。
−  ｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するＣ２６腫瘍は、親腫瘍と比較して、樹状細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞により有意に浸潤されること（図３）。
−  ｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するよう操作したＣ２６結腸癌腫瘍細胞は、親Ｃ２６腫瘍よりも血管形成性が低いこと（図４）。
【００７５】
６〜１０週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｉｆｆａ−Ｃｒｅｄｏ、Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、そして本発明者らの設備で、標準的な条件下で管理した。動物およびそれらのケアに関する手順を、ＥＥＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ８６／６０９、ＯＪＬ  ３５８．１、１９８７年１２月１２日に従って実施した。
【００７６】
全ての腫瘍細胞の培養を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１ｍＭ  ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、Ｇｅｎｔａｌｌｉｎ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、Ｕｎｉｏｎ、ＮＪ）、２×１０−５Ｍ  β−２メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ  Ｐａｒｋ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）中で実施した。全ての細胞培養を、加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２、３７℃にて実施した。マウス６Ｃｋｉｎｅ（ｍ６Ｃｋｉｎｅ）をコードするｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターを含むｐｃＤＮＡ３ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中にクローニングした。Ｃ２６結腸癌腫瘍細胞（Ｍａｒｉｏ  Ｐ．Ｃｏｌｏｍｂｏ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｏ  Ｎａｚｉｏｎａｌｅ  ｐｅｒ  ｌｏ  Ｓｔｕｄｉｏ  ｅ  ｌａ  Ｃｕｒａ  ｄｅｉ  Ｔｕｍｏｒｉ、Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙの懇意により提供された）を、Ｆｕｇｅｎｅ試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用い、製造者の指示に従ってこの構築物でトランスフェクトした。ｍ６Ｃｋｉｎｅ／ＳＬＣ  ｍＲＮＡ（Ｃ２６−６ＣＫ）を発現する単一のＣ２６クローンを、８００μｇ／ｍｌでのネオマイシン（Ｓｉｇｍａ）選択後に獲得した。Ｃ２６またはＣ２６−６ＣＫ腫瘍細胞を、１００μｌ  ＤＭＥＭ中で右側にｓ．ｃ．注射し、そして腫瘍の増殖を、週に３回、触診によりモニターした。抗体枯渇について、０．５ｍｇの抗ＣＤ８（クローン２．４３）、ラットコントロール（ＧＬ１１３）精製抗体、または２００μｌのウサギ抗アシアロＧＭ１血清（Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）を、腫瘍接種の１日前に２００μｌ  ＰＢＳ中でｉ．ｐ．注射し、次いで、０．２ｍｇの抗体または１００μｌの抗アシアロＧＭ１血清を、３日後および実験課程の間週に一度注射した。図１は、皮下Ｃ２６−６ＣＫ細胞注射が、ログランク分析（ＡおよびＢ：Ｃ２６＋コントロール  対  Ｃ２６−６ＣＫ＋コントロール）で、親腫瘍細胞と比較して、腫瘍の取り込みを有意に遅らせた（ｐ＜０．０１）ことを示す。インビボでの特異的な抗体によるＣＤ８＋細胞（Ａ）またはナチュラルキラー細胞活性（Ｂ）の枯渇は、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍細胞の遅延した発癌性を部分的に回復させた。このことは、ＣＤ８＋細胞およびＮＫ細胞が、腫瘍の増殖を遅延させる上で役割を果たしていることを示す。
【００７７】
腫瘍を、約１ｃｍの大きさに達した場合に外科的に除去した。腫瘍塊を、小片に刻み、そして攪拌しながら、コラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）溶液中で、３７℃にて３０分間インキュベートした。次いで、懸濁物を、ＤＭＥＭ中で数回洗浄した。細胞懸濁物の染色を、ＰＢＳ＋５％ＦＣＳ中で実施した。ＦＩＴＣ標識特異的抗体、ビオチン標識特異的抗体、またはＰＥ標識特異的抗体と共にインキュベートする前に、Ｆｃレセプターを、Ｆｃ−ＢｌｏｃｋＴＭ  ＣＤ１６／ＣＤ３２抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いてブロックした。この研究において使用した種々の抗体（全てＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ製）は、ＣＤ８β（５３−５．８）、ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、抗ＭＨＣクラスＩＩ  Ｉ−Ａｄ／Ｉ−Ｅｄ（２６９）、ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）であった。ビオチニル化抗体を、ＰＥ−ストレプトアビジン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた明らかにした。表現型パラメーターを、ＦａｃＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）において獲得し、そしてＣｅｌｌ  Ｑｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。図２において、Ｃ２６野生型腫瘍またはｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するＣ２６−６ＣＫ腫瘍を、ＣＤ８  Ｔ細胞およびＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣクラスＩＩ＋樹状細胞（ＤＣ）浸潤について、全腫瘍懸濁物（ｎ＝７）のフローサイトメトリー分析により分析した。データは、Ｃ２６腫瘍と比較しての、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍における両方の白血球サブセットの有意な動員を示す（スチューデントｔ検定）。これらの結果は、腫瘍へのｍ６Ｃｋｉｎｅ遺伝子移入が、免疫応答（抗腫瘍応答を含む）を開始するために必須の細胞である樹状細胞、および養子免疫応答の効果細胞であるＣＤ８  Ｔ細胞の両方の動員を促進することを示唆する。
【００７８】
いくつかの実験において、液体窒素中で急速凍結する前に腫瘍を動物から取り出し、そしてＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｅｌｋｈａｒｔ、ＩＮ）中に埋め込み、そして免疫組織化学手順まで−８０℃で保存した。ガラススライド上にアプライした５μｍの低温保持切片をアセトン中で固定し、そして室温にて１０分間、１％Ｈ２Ｏ２と共にインキュベートした。次いで、スライドを、ビオチン−ブロックＴＭ試薬およびアビジン−ブロックＴＭ試薬（両方ともＶｅｃｔｏｒ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ製）と共にインキュベートした。全てのインキュベーションの後に、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中で２分間洗浄を３回行った。次いで、スライドを、同一種の二次抗体（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）由来の１／１０希釈の血清と共に３０分間予めインキュベートした。次いで、スライドを、連続的に、５μｇ／ｍｌの精製ＣＤ１０５（クローンＭＪ７／１８、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ビオチニル化二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ製ウサギ抗ラット抗体）、ストレプトアビジン−アルカリ（Ｖｅｃｔｏｒ製ＡＢＣキット）と共にインキュベートした。酵素反応を、対応するベクター基質を用いて実施した。血管形成アッセイを、インビボで発達した腫瘍細胞を含有するＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）ペレットのヘモグロビン含有量を決定することにより実施した。腹部正中線において、２×１０５  Ｃ２６細胞またはＣ２６−６ＣＫ細胞と混合した０．５ｍｌ  Ｍａｔｒｉｇｅｌを、ＢＡＬＢ／ｃマウスに、ｓ．ｃ．注射した。９日後、Ｍａｔｒｉｇｅｌペレットを取り出し、周囲の結合組織を解剖により取り除き、そしてペレットを、４℃にて９０分間、ＭａｔｒｉＳｐｅｒｓｅ溶液ｖ／ｖ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中で液化した。ヘモグロビン含有量を、Ｄｒａｂｋｉｎ法（Ｓｉｇｍａ製試薬）により決定した。図４Ａは、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍の血管新生が親Ｃ２６腫瘍よりも少なかったことを示す。図４Ｂは、Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイにおいて、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍細胞が、Ｃ２６細胞よりも低い血管形成性であることを示す。全体的に、これらの結果は、腫瘍へのｍ６Ｃｋｉｎｅケモカインの遺伝子移入が、腫瘍の血管系に対して血管形成効果を有することを示す。
【００７９】
（実施例ＩＩＩ）
（インビボでの腫瘍へのケモカイン６Ｃｋｉｎｅの局所送達）
この例において、本発明者らは、既存のＣ２６腫瘍への組換えヒトまたはマウス６Ｃｋｉｎｅタンパク質の注射が、腫瘍保有マウスの生存度を増加させることを示した。ｈ６Ｃｋｉｎｅの注射は、腫瘍の増殖を遅延させる（図５）。
【００８０】
６〜１０週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｉｆｆａ−Ｃｒｅｄｏ、Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から購入し、そして本発明者らの設備で、標準的な条件下で管理した。動物およびそれらのケアに関する手順を、ＥＥＣ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）Ｃｏｕｎｃｉｌ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ８６／６０９、ＯＪＬ  ３５８．１、１９８７年１２月１２日に従って実施した。
【００８１】
全ての腫瘍細胞の培養を、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、１ｍＭ  ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）、Ｇｅｎｔａｌｌｉｎ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、Ｕｎｉｏｎ、ＮＪ）、２×１０−５Ｍ  β−２メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を補充したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐａｉｓｌｅｙ  Ｐａｒｋ、Ｓｃｏｔｌａｎｄ）中で実施した。全ての細胞培養を、加湿インキュベーター中、５％ＣＯ２、３７℃にて実施した。Ｃ２６親細胞およびヒト葉酸レセプターを安定に発現するＣ２６細胞（Ｃ２６−ＦＲ細胞）ならびにＪ５５８Ｌハイブリドーマは、Ｍａｒｉｏ  Ｐ．Ｃｏｌｏｍｂｏ（Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）により提供された。
【００８２】
Ｃ２６細胞を、１００μｌ  ＤＭＥＭ中で右側にｓ．ｃ．注射し、そして腫瘍の増殖を、週に３回、触診によりモニターした。いくつかの実施形態において、腫瘍体積を、カリパスを用いてモニターし、そして腫瘍体積＝小直径２×大直径×０．４として算出した。組換えケモカインを用いた処置のために、マウスに、１０ｎｇの＞９７％純度の組換えヒトまたはマウス６Ｃｋｉｎｅ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を、５０μｌ  ＰＢＳ下で腫瘍内注射した。図５は、ｈ６Ｃｋｉｎｅまたはｍ６Ｃｋｉｎｅを注射したマウスが、ＰＢＳ媒体のみと比較して生存度における改善を示すことを示す（Ａ）。ｈ６Ｃｋｉｎｅの注射もまた、腫瘍の増殖を減少させた（Ｂ）。これらのデータは、組換え６Ｃｋｉｎｅケモカインの腫瘍内送達が抗腫瘍効果を有することを示す。
【００８３】
（実施例ＩＶ）
（転移性腫瘍のｒＡｄ／６Ｃｋｉｎｅ移動）
この例は、マウス６Ｃｋｉｎｅのアデノウイルス送達が、インビボで確立した腫瘍における腫瘍の増殖および自発的な転移を阻害することを示す（図６を参照のこと）。
【００８４】
（６Ｃｋｉｎｅ  ｃＤＮＡを保有する組換えアデノウイルスの構築および精製）
マウス６Ｃｋｉｎｅ  ｃＤＮＡプラスミドｐＴ７Ｔ３Ｄを、ＤＮＡＸから（Ａｌｂｅｒｔ  Ｚｌｏｔｎｉｃｋ研究室のＤｅｖｏｒａ  Ｒｏｓｓｉ氏から）獲得した。マウス６Ｃｋｉｎｅ  ｃＤＮＡを保有する組換えアデノウイルスベクターを、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて相同組換えを実施することにより構築した（Ｃ．Ｃｈａｒｔｉｅｒ  ＥＤ、Ｍ．Ｇａｎｔｚｅｒ、Ａ．Ｄｉｅｔｅｒｌｅ、Ａ．Ｐａｖｉｒａｎｉ、およびＭ．Ｍｅｈｔａｌｉ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂｙ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９６；７０（７）：４８０５−１０）。６Ｃｋｉｎｅ  ｃＤＮＡインサートを切り出し、そしてＸｂａＩおよびＢａｍＨｉ部位を、それぞれ、５’末端および３’末端に、ＰＣＲにより導入した（プライマー：ＳＴＰ３４１−Ｘｂａ６ｃ；ＴＡＴ  ＡＡＴ  ＡＴＣ  ＴＡＧ  ＡＴＣ  ＴＣＡ  ＣＣＴ  ＡＣＡ  ＧＣＴ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＴＣＡ  ＴＣおよびＳＴＰ３４２−Ｂａｍ６ｃ；ＴＡＡ  ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＡＴ  ＴＧＡ  ＡＧＴ  ＴＣＧ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＴＣＣ）。全長６Ｃｋｉｎｅ  ｃＤＮＡを含む、得られるＸｂａＩ／ＢａｍＨＩインサートを、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ切断したｐＴＲＡＣＮ’’Ｂ’’移入ベクター（ＳＣＨ５８５００と同一のＡｄ骨格を含む、Ｔｒａｎｓｇｅｎｅから受け取ったＡｄ骨格ベクターから改変された；Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９６．７０：４８０５）に記載されるベクターから改変された、Ｂ骨格プラスミドベクターｐＴＧ４２１５内に含まれる相同配列を含む改変シャトルベクター）に連結した。マウス６Ｃｋｉｎｅ  ｃＤＮＡ導入遺伝子配列を含有する得られる移入ベクターｐＴＲＡＣＮ’’Ｂ’’を、ｐＴＥ−ｍ６ＣＫと命名した。移入ベクターｐＴＥ−ｍ６ＣＫを、ｐＴＧ４２１５と共に、組み換えのためにＥ．ｃｏｌｉ（ＢＪ５１８３）中へと同時形質転換した。次いで、得られる組み換えウイルスＤＮＡ  ｐＡＣＮ−ｍ６Ｃｋｉｎｅを精製し、そして制限酵素消化および導入遺伝子配列分析により確認した。確認したＤＮＡ  ｐＡＣＮ−ｍ６Ｃｋｉｎｅ  ＤＮＡを、ＰａｃＩで直線化し、そして組み換えアデノウイルス、マウス６Ｃｋｉｎｅ  ｃＤＮＡ（ＣＭＣＢ）の生成のために、２９３細胞をトランスフェクトするために使用された。ウイルス粒子（ＰＮ）濃度を、アニオン交換ＨＰＬＣおよび０．１％  ＳＤＳ（ｗ／ｖ）中でのＡ２６０ｎｍの測定を用いて決定した。ウイルス構築物の感染性を、フローサイトメトリーに基づくアデノウイルス感染アッセイを用いて確認し、そして細胞感染単位（Ｃ．Ｉ．Ｕ）として表した。
【００８５】
雌性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ＢｙＪ：Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、３×１０５  ４Ｔ１−ｐ５３乳房腫瘍細胞（同系）を、０．２ｍｌの容量（媒体）で、皮下経路により動物の左側に注射した。動物は、腫瘍がＶＰＢＳ中でＣＭＣＢ（１ｅ１０  ＰＮ／注射）の１００μｌの５０〜１００ｍｍ３の大きさに成長した場合に、腫瘍内注射を受けた。マウスは、２週間にわたって週に３回（月曜日、水曜日、金曜日）注射を受けた。腫瘍を、カリパスを用いて週に３回測定（長さ、幅、深さ）し、そして以下の式：
Ｖ＝４／３ｒ３（ここで、ｒ＝（Ｗ（ｍｍ）＋Ｌ（ｍｍ）＋Ｄ（ｍｍ））を６で割ったもの）
に従って腫瘍体積も算出した。腫瘍が１０００ｍｍ３を超えた場合に、その動物を屠殺した。
【００８６】
各群から３匹のマウスを、腫瘍が５０ｍｍ３に達した時点（代表的に、１０日目）で屠殺し、そして腫瘍および肺を、以下に記載される生化学的分析用の組織処理のため、および肉眼および組織学的手段により転移の存在を評価するために切除した。
【００８７】
図６に示されるように、６Ｃｋｉｎｅのアデノウイルス送達は、免疫を増強し、そして血管形成を抑制することにより、確立された腫瘍において腫瘍の増殖および自発的な転移を阻害する。
【００８８】
（実施例Ｖ）
（インビボでの腫瘍への６Ｃｋｉｎｅの標的化された送達）
この例において、本発明者らは、以下のことを示した：
−  標的化送達アプローチにおいて、ｍ６Ｃｋｉｎｅまたはｈ６Ｃｋｉｎｅのいずれかに融合された腫瘍抗原（葉酸レセプター、ＦＲ）を認識する単鎖抗体からなる標的構築物を分泌するハイブリドーマの注射により、ＦＲを発現する腫瘍の増殖が特異的に低減されること（図７）。
−  ｈ６Ｃｋｉｎｅに融合された腫瘍抗原（葉酸レセプター、ＦＲ）を認識する単鎖抗体からなる組み換え標的構築物の注射により、ＦＲを発現する腫瘍の増殖が特異的に低減されること（図８）。
【００８９】
（ｈ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖおよびｍ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖの構築および発現）
ｍ６Ｃｋｉｎｅおよびｈ６Ｃｋｉｎｅの全長オープンリーディングフレームを、ｐｃＤＮＡ３ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。次いで、Ｃｅｃｉｌｉａ  ＭｅｌａｎｉおよびＭａｒｉｏ  Ｃｏｌｏｍｂｏ、Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙから獲得したｐＨＩＬ−２／ＭＯＶＳＤベクター（Ｍｅｌａｎｉら、１９９８、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：４１４６−４１５４）に含まれるヒトＩＬ−２  ｃＤＮＡを、標準的なサブクローニング手順を用いてｍ６Ｃｋｉｎｅ配列またはｈ６Ｃｋｉｎｅ配列で置換した。得られたｐｍ６ＣＫ／ＭＯＶＳＤベクターおよびｐｈ６ＣＫ／ＭＯＶＳＤベクターは、免疫グロブリンκプロモーター下で、タンパク質のフォールディングを促進することが知られている１３アミノ酸スペーサーに融合され、次いでヒトα葉酸レセプター（ＦＲ）に対するＭＯＶ１９抗体のＶＨおよびＶκ部分に融合されたｍ６Ｃｋｉｎｅケモカインまたはｈ６Ｃｋｉｎｅケモカインをコードする；このベクターはまた、マウスκ軽鎖（Ｃκ）の定常部分ならびに免疫グロブリンＨエンハンサーおよび免疫グロブリンκエンハンサーをコードする（図７）。スプライシングコンセンサス配列は、転写後に、ＶκとＣκとの間の融合を確実にする（図７）。ｐｍ６ＣＫ／ＭＯＶＳＤベクターおよびｐｈ６ＣＫ／ＭＯＶＳＤベクターを配列決定し、そしてプロトプラスト融合によりＪ５５８Ｌ骨髄腫細胞にトランスフェクトし、そして安定なトランスフェクタントをＧ４１８で選択した。耐性細胞の上清を、特異的なポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｍ６Ｃｋｉｎｅまたはｈ６ＣｋｉｎｅについてＥＬＩＳＡによりスクリーニングし、そして最も良い産生コロニーをサブクローニングして高発現クローンを獲得した。
【００９０】
（ｈ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖおよびｍ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖの融合タンパク質の精製）
ラット抗マウスＣκ  ｍＡｂ１８７．１（ＡＴＣＣ番号ＨＢ５８）を、ＰＦＨＭ  ＩＩタンパク質を含まないハイブリドーマ培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で増殖した産生ハイブリドーマの高密度培養物（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＧ、Ｗａｌｌｉｓｅｌｌｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からＨＰＬＣにより精製し、次いで、製造者に指示に従いＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）に連結した。ＰＦＨＭ  ＩＩ中で高密度で増殖したｈ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖまたはｍ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖを産生するＪ５５８Ｌ細胞の上清を、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析し、濾過し、そしてＣκアフィニティカラムにロードした。この融合タンパク質を、５０ｍＭ  グリシン酸緩衝液（ｐＨ２．５）を用いて溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ｂａｓｅで平衡化し、そして３．４ｎＭ  ＰＢＳ−ＥＤＴＡ中で十分に透析した。
【００９１】
精製した融合タンパク質の分子サイズおよび免疫反応性を、ウェスタンブロットにより試験した。精製タンパク質を、非還元条件下で１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、そしてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）上に電気ブロットした。４℃で一晩、ＰＢＳ／５％ＢＳＡで飽和させた後、フィルターを、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中、室温にて１時間、１μｇ／ｍｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウスＣκ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）とハイブリダイズさせた。ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中で十分に洗浄した後、フィルターをＤＡＢ基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）と共にインキュベートした。ウェスタンブロッティングにより、ｈ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖ（図８レーン５）精製タンパク質およびｍ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖ（図８レーン９）精製タンパク質について予想された大きさ（４６ｋＤａ）の顕著なバンドが明らかとなった。
【００９２】
ｈ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖ融合タンパク質と共に見られたいくつかの微量のバンドは、おそらく、ｍ６Ｃｋｉｎｅ  ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖ融合タンパク質と比較した場合に過剰にロードされたタンパク質に起因する。ｈ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖ融合タンパク質およびｍ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖ融合タンパク質のＦＲへの特異的結合（Ｊ５５８Ｌ上清由来かまたはアフィニティーカラム精製後のいずれか）を、Ｃ２６細胞およびＣ２６−ＦＲ細胞において、二次抗体としてビオチニル化抗Ｃκ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）抗体、抗ｍ６Ｃｋｉｎｅ抗体または抗ｈ６Ｃｋｉｎｅ抗体（両方ともＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いてフローサイトメトリーにより調査した。両方の融合タンパク質は、Ｃ２６−ＦＲに結合するが、Ｃ２６細胞には結合しない（データは示していない）。ｈ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖ融合タンパク質およびｍ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖ融合タンパク質の走化性活性を、マウス樹状細胞のトランスウェル走化性アッセイを用いて評価した。両方の骨髄由来マウス樹状細胞を、以前に記載されたようにして獲得した（Ｖｉｃａｒｉら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：１９９２−２０００）。走化性アッセイを、３７℃で２時間、５μｍ孔のトランスウェル（Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）において実施した。簡単にいうと、ｈ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖの上清およびｍ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖの上清の６００μｌの連続希釈またはＲＰＭＩ１６４０＋２％ＦＣＳ中の組み換えｈ６Ｃｋｉｎｅもしくはｍ６Ｃｋｉｎｅを下チャンバに配置し、そして１００μｌのＲＰＭＩ１６４０＋２％ＦＣＳ中の２×１０５の樹状細胞を上チャンバに配置した。移動した細胞を収集し、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ８６発現について染色し、そしてＦＡＣＳにより分析した。結果は、ｈ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖ融合タンパク質およびｍ６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖ融合タンパク質が、組み換えケモカインによって得られた結果と同様に、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８６＋樹状細胞の特異的走化性をモル濃度基準で誘導したことを示した（データは示していない）。
【００９３】
（６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖを用いたインビボ処理）
６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９構築物を産生するＪ５５８ハイブリドーマによる処理のために、以前に示されたように、マウスを、Ｃ２６腫瘍細胞またはＣ２６−ＦＲ腫瘍細胞を用いて右側でｓ．ｃ．チャレンジし、そしてその後、左側で、１×１０６の親細胞または６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９構築物を発現するよう改変したＪ５５８細胞を、１００μｌ容量のＲＰＭＩ１６４０下でｓ．ｃ．注射した（図９）。標的ｈ６Ｃｋｉｎｅまたはｍ６Ｃｋｉｎｅ融合タンパク質を分泌する両方のハイブリドーマは、この融合タンパク質の抗体部分の標的であるＦＲを発現する腫瘍においてのみ、腫瘍増殖における有意な減少を誘導した（図９）。
【００９４】
組み換え６Ｃｋｉｎｅ／ＭＯＶ１９構築物による処理のために、Ｃ２６−ＦＲ腫瘍を有する７匹のマウスの群を、２００μｌのＰＢＳの下で、１μｇまたは１０μｇの精製組み換え融合タンパク質を用いて（図８で分析されたように）、全身麻酔下でｉ．ｖ．注射した（第６日目に開始して、２日毎に７回行った）（図１０）。コントロールマウスには、ＰＢＳのみを注射した。図１０に示されるように、標的ｈ６Ｃｋｉｎｅまたはｍ６Ｃｋｉｎｅ融合タンパク質の注射により、２つの異なる用量において、Ｃ２６−ＦＲ腫瘍の増殖の有意な減少が誘導された。
【００９５】
図９および図１０からのデータは、腫瘍へのケモカイン６Ｃｋｉｎｅの標的化送達が、抗腫瘍効果を有することを示す。
【００９６】
これらの結果は、６Ｃｋｉｎｅおよび腫瘍関連抗原を認識する抗体フラグメントを含む標的構築物が、有用な癌処置であることを示す。
【００９７】
本発明の意図および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの改変および変更がなされ得、そしてこれらは、当業者に明らかである。本明細書中に記載される特定の実施形態は、例示のみの目的で提供され、そして本発明は、添付の特許請求の範囲（このような特許請求の範囲に認められる等価物の全範囲と共に）によってのみ限定されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】図１は、ヒト６Ｃｋｉｎｅは、ヒトの血液内のヒト樹状細胞の全てのサブセットについての走化性因子であることを示す。
【図２】図２は、ｌｏｇｒａｎｋ分析（ＡおよびＢ：Ｃ２６＋コントロール  対  Ｃ２６−６ＣＫ＋コントロール）によって、ｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するように操作されたＣ２６結腸癌腫細胞は、親腫瘍細胞と比較して、より低く腫瘍原性であることを示している（ｐ＜０．０１）。インビボで特異的な抗体を用いてＣＤ８＋細胞（Ａ）またはナチュラルキラー細胞（Ｂ）の活性を枯渇することによって、部分的に、Ｃ２６−６ＣＫ腫瘍細胞の遅延された腫瘍形成性（ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ）を部分的に戻し、このことは、ＣＤ８＋細胞およびＮＫ細胞が、腫瘍増殖を遅延させることにおける役割を担っていることを示している。
【図３】図３は、ｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するＣ２６野生型腫瘍またはＣ２６−６ＣＫ腫瘍は、Ｃ２６腫瘍と比較したときに、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣクラスＩＩ＋樹状細胞（ＤＣ）によって有意に浸潤されることを示している。
【図４】図４は、ｍ６Ｃｋｉｎｅを発現するように操作されたＣ２６結腸癌腫腫瘍細胞は、親Ｃ２６腫瘍細胞よりも腫瘍原性でないことを示している。
【図５】図５は、ｍ６Ｃｋｉｎｅまたはｈ６Ｃｋｉｎｅの注入によって、インビボにおけるマウスでの腫瘍増殖を鈍化されることを示している。
【図６】図６は、マウス６Ｃｋｉｎｅのアデノウイルスによる送達が、インビボで樹立された腫瘍において腫瘍増殖および自発的転移を阻害することを示している。
【図７】図７は、ｐｈ６ＣＫＭＯＶ１９ベクターまたはｐｍＣＫＭＯＶ１９ベクターの概略図的表現である。転写およびＳＤ部位とＳＡ部位との間のスプライシングの後に、組み換えポリペプチドは、１３アミノ酸スペーサーを介してＭＯＶ１９  ＳｃＦｖに融合しているか、または、κ免疫グロブリンの定常鎖であるＣκに融合している、ケモカインｍ６Ｃｋｉｎｅまたはｈ６Ｃｋｉｎｅからなる。ＭＯＶ１９  ＳｃＦｖ抗体フラグメントは、ヒトの葉酸レセプター（ＦＲ）を認識する。この両方の融合タンパク質の推定分子量は、４６ＫＤａである。
【図８】図８は、精製した、ｈ６ＣｋｉｎｅＭＯＶ１９（レーン５）融合タンパク質およびｍ６ＣｋｉｎｅＭＯＶ１９  ＳｃＦｖ（レーン９）融合タンパク質のウェスタンブロット分析を示す。
【図９】図９は、腫瘍抗原ＦＲを認識する、単鎖抗体フラグメントに融合した、ｍ６Ｃｋｉｎｅまたはｈ６Ｃｋｉｎｅからなる融合タンパク質を分泌するハイブリドーマの注射は、親Ｃ２６腫瘍細胞と比較した場合に、ＦＲを発現する腫瘍において、腫瘍増殖の減少を誘導することを示す。
【図１０】図１０は、ｈ６Ｃｋｉｎｅに融合している、腫瘍抗原ＦＲを認識する、単鎖抗体からなる組み換え融合タンパク質の注射によって、ＦＲを発現する腫瘍の増殖を特異的に低減することが示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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