(57)【要約】少なくとも一つの親ポリペプチドの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドであって、親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し、又はその他の方法で改変するために、少なくとも一つの親ポリペプチドにおけるそれらの連結とは異なる関係で該セグメントが互いに連結されている合成ポリペプチドが開示される。本発明の合成ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチド及び該合成ポリヌクレオチドを含む発現構築物も開示される。前記の分子及び免疫増強組成物を構築する方法、並びに疾病又は状態を治療及び／又は予防する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一つの親ポリペプチドの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドであって、該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するように、該セグメントが該少なくとも一つの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されるものである合成ポリペプチド。
【請求項２】
本質的に単一の親ポリペプチドの異なるセグメントからなる、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項３】
本質的に複数の異なる親ポリペプチドの異なるセグメントからなる、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項４】
該合成ポリペプチドにおけるセグメントが該少なくとも一つの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる順序又は配置で逐次連結されるものである、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項５】
該合成ポリペプチドにおけるセグメントが該少なくとも一つの親ポリペプチドにおけるそれらの順序又は配置と比べ無作為に配置されるものである、請求項４記載の合成ポリペプチド。
【請求項６】
個々のセグメントの大きさは少なくとも４アミノ酸である、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項７】
個々のセグメントの大きさが約２０から約６０までのアミノ酸である、請求項６記載の合成ポリペプチド。
【請求項８】
個々のセグメントの大きさが約３０アミノ酸である、請求項６記載の合成ポリペプチド。
【請求項９】
親ポリペプチド配列の少なくとも３０％を含む、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項１０】
該セグメントの少なくとも一つが、一つ以上の他の該セグメントに部分的な配列同一性又は配列相同性を含むものである、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項１１】
配列同一性又は配列相同性が個々のセグメントの一端又は両端に含まれるものである、請求項１０記載の合成ポリペプチド。
【請求項１２】
該セグメントの一端又は両端が一つ以上の他の該セグメント内に含まれるアミノ酸配列と同一若しくは相同である少なくとも４個の連続したアミノ酸を含むものである、請求項１１記載の合成ポリペプチド。
【請求項１３】
個々のセグメントの大きさが他の該セグメント若しくは他の該セグメントのそれぞれと同一若しくは相同な配列の大きさの約２倍である、請求項１０記載の合成ポリペプチド。
【請求項１４】
個々のセグメントの大きさが約３０アミノ酸であり且つ他の該セグメント若しくは他の該セグメントそれぞれに同一若しくは相同な配列の大きさが約１５アミノ酸である、請求項１３記載の合成ポリペプチド。
【請求項１５】
任意選択的なスペーサーがこれらのセグメントの一部又は全ての間に介在するものである、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項１６】
このスペーサーが隣接するセグメント（単数又は複数）のプロテアーゼ加水分解処理及び／又は提示を変更するものである、請求項１５記載の合成ポリペプチド。
【請求項１７】
該スペーサーが少なくとも一つの中性アミノ酸を含むものである、請求項１６記載の合成ポリペプチド。
【請求項１８】
該スペーサーが少なくとも一つのアラニン残基を含むものである、請求項１６記載の合成ポリペプチド。
【請求項１９】
該少なくとも一つの親ポリペプチドが疾病状態と関連するものである、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項２０】
該少なくとも一つの親ポリペプチドが、病原体生物のポリペプチド、癌関連ポリペプチド、自己免疫疾患関連ポリペプチド、アレルギー関連ポリペプチド又はこれらの変異型若しくはウイルスから選択されるものである、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項２１】
該少なくとも一つの親ポリペプチドがウイルスのポリペプチドである、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項２２】
該ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又は肝炎ウイルスから選択されるものである、請求項２１記載の合成ポリペプチド。
【請求項２３】
該ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、且つ、該少なくとも一つの親ポリペプチドがｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ及びｎｅｆ、又はこれらの組み合わせから選択されるものである、請求項２２記載の合成ポリペプチド。
【請求項２４】
該少なくとも一つの親ポリペプチドが癌関連ポリペプチドである、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項２５】
癌がメラノーマである、請求項２４記載の合成ポリペプチド。
【請求項２６】
該少なくとも一つの親ポリペプチドがメラニン細胞分化抗原（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ） である、請求項２５記載の合成ポリペプチド。
【請求項２７】
該少なくとも一つの親ポリペプチドが、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ、ＴＲＰ−１、Ｔｙｒｏｓ、ＴＲＰ２、ＭＣ１Ｒ、ＭＵＣ１Ｆ、ＭＵＣ１Ｒ又はこれらの組み合わせから選択されるメラニン細胞分化抗原である、請求項２５記載の合成ポリペプチド。
【請求項２８】
該少なくとも一つの親ポリペプチドがメラノーマ特異的抗原である、請求項２５記載の合成ポリペプチド。
【請求項２９】
該少なくとも一つの親ポリペプチドが、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ｇｐ１００Ｉｎ４、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＰＲＡＭＥ、ＴＲＰ２ＩＮ２、ＮＹＮＳＯ１ａ、ＮＹＮＳＯ１ｂ、ＬＡＧＥ１又はこれらの組み合わせから選択されるメラノーマ特異的抗原である、請求項２５記載の合成ポリペプチド。
【請求項３０】
少なくとも一つの親ポリペプチドの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドであって、該セグメントが該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し若しくは他の方法で改変するように該少なくとも一つの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されるものである合成ポリヌクレオチド。
【請求項３１】
少なくとも一つの親ポリペプチドの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを製造する方法であって、該セグメントが該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し若しくは他の方法で改変するように該少なくとも一つの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されるものであり、
少なくとも一つの親ポリペプチドの異なるセグメントをコードする核酸配列の複数を同じ読み取り枠内で一緒に連結して合成ポリヌクレオチドを形成させる工程であって、該合成ポリヌクレオチドの配列が該少なくとも一つの親ポリペプチドにおける該セグメントの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されていいる該セグメントをコードするものである工程、
を含む方法。
【請求項３２】
それぞれの親ポリペプチドの配列を断片に断片化する工程及び該断片をそれぞれの親ポリペプチドの配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結する工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
該断片が無作為に一緒に連結されるものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
それぞれの親ポリペプチドの配列又はそのセグメントを逆翻訳して該親ポリペプチド又は該セグメントをコードする核酸配列を得る工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
それぞれの親ポリペプチド配列のアミノ酸が逆翻訳されて目的の細胞における他の同義コドンよりもより高い翻訳効率を持つコドンを与えるものである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
該親ポリペプチド配列のアミノ酸が逆翻訳されて、隣接する若しくは局在する配列要素との関係で課題の実行を阻害する望ましくない配列を形成する傾向のより小さなコドンを与えるものである、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
該親ポリペプチド配列のアミノ酸が逆翻訳されて、隣接する若しくは局在する配列要素との関係で、クローニング又は配列決定から選ばれる課題の実行を阻害するパリンドロム配列又は重複配列から選択される望ましくない配列を形成する傾向のより小さなコドンを与えるものである、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
セグメントをコードする核酸の間に少なくとも一つのスペーサー残基をコードするスペーサーオリゴヌクレオチドを連結する工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３９】
スペーサーオリゴヌクレオチドが２から３のスペーサー残基をコードするものである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
該スペーサー残基が中性アミノ酸である、請求項３８又は請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
該スペーサー残基がアラニンである、請求項３８又は請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
他のコードされたセグメントと比べ相同性を有するが同一ではないアミノ酸配列をコードする少なくとも一つの変異型核酸配列を、他のセグメントを含む核酸配列と同じ読み取り枠内で連結する工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４３】
該変異型セグメントが、一つ以上の他のコードされたセグメントと比べ保存された及び／又は保存されていないアミノ酸相違を含むものである、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該相違が配列多型に相当するものである、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
望みの全ての相同配列を生じさせるため縮重塩基が該少なくとも一つの変異型核酸配列に設計され又は組み込まれるものである、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
宿主細胞により効率的に翻訳されるように該合成ポリヌクレオチドのコドン組成を最適化する工程をさらに含むものである、請求項３１記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも一つの親ポリペプチドの異なるセグメントの複数を含む合成ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを含む合成構築物であって、該セグメントが、該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又はたの方法で改変するため該少なくとも一つの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されるものであり、該合成ポリヌクレオチドが調節ポリヌクレオチドに機能しうるように連結されるものである合成構築物。
【請求項４８】
免疫刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む、請求項４７記載の合成構築物。
【請求項４９】
該免疫刺激分子がインバシンタンパク質（Ｉｎｖ）のドメインを含むものである、請求項４８記載の合成構築物。
【請求項５０】
該免疫刺激分子が配列番号：１４６７に記載された配列又はその免疫刺激同族体を含むものである、請求項４８記載の合成構築物。
【請求項５１】
該免疫刺激分子がＴ細胞共刺激分子である、請求項４８記載の合成構築物。
【請求項５２】
該免疫刺激分化が、Ｂ７分子又はＩＣＡＭ分子から選択されるＴ細胞共刺激分子である、請求項４８記載の合成構築物。
【請求項５３】
該免疫刺激分子が、Ｂ７分子又は生物学的に活性なその断片、又はこれらの変異型若しくは誘導体である、請求項４８記載の合成構築物。
【請求項５４】
該免疫刺激分子がインターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子又はインターフェロンから選択されるサイトカインである、請求項４８記載の合成構築物。
【請求項５５】
該免疫刺激分子が免疫調節オリゴヌクレオチドである、請求項４８記載の合成構築物。
【請求項５６】
請求項１記載の合成ポリペプチド、請求項３０記載の合成ポリヌクレオチド又は請求項４７記載の合成構築物から選択される免疫増強物質を、薬学的に許容しうる担体と共に含む、免疫増強組成物。
【請求項５７】
アジュバントをさらに含む、請求項５６記載の組成物。
【請求項５８】
好ましくは病原体又は癌に対する免疫応答を調節する方法であって、請求項１記載の合成ポリペプチド、請求項３０記載の合成ポリヌクレオチド、請求項４７記載の合成構築物、又は請求項５６記載の組成物から選択される免疫増強物質の有効量を、このような治療を必要とする患者に投与する工程を含む方法。
【請求項５９】
疾病又は状態を治療及び／又は予防する方法であって、請求項１記載の合成ポリペプチド、請求項３０記載の合成ポリヌクレオチド、請求項４７記載の合成構築物、又は請求項５６記載の組成物から選択される免疫増強物質の有効量を、このような治療を必要とする患者に投与する工程を含む方法。
【請求項６０】
少なくとも一つの親ポリペプチドの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドの配列を設計するためのコンピュータプログラム生産物であって、該セグメントが該少なくとも一つの親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するため該少なくとも一つの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されるものであり、該プログラム生産物が
該少なくとも一つの親ポリペプチドの配列を入力として受け入れるコード、
それぞれの親ポリペプチドの配列を断片に断片化するコード、
該断片を、該親ポリペプチド配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結するコード、及び
該コード類を記憶するコンピュータ読み取り可能媒体、
を含むコンピュータプログラム生産物。
【請求項６１】
該断片を無作為に再配置するコードをさらに含む、請求項６０記載のコンピュータプログラム生産物。
【請求項６２】
該少なくとも一つの親ポリペプチドの配列又は該断片にスペーサー残基の配列を連結するコードをさらに含む、請求項６０記載のコンピュータプログラム生産物。
【請求項６３】
少なくとも一つの親ポリペプチドの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドの配列を設計するためのコンピュータプログラム生産物であって、該セグメントが該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するため該少なくとも一つの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されるものであり、該プログラム生産物が
該少なくとも一つの親ポリペプチドの配列を入力として受け入れるコード、
それぞれの親ポリペプチドの配列を断片に断片化するコード、
それぞれの断片の配列を逆翻訳して該断片をコードする核酸配列を与えるコード、
それぞれの該核酸配列を同じ読み取り枠内で一緒に連結して、該断片が該少なくとも一つの親ポリペプチド配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されているポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を与えるコード、及び
該コード類を記憶するコンピュータ読み取り可能媒体、
を含むプログラム生産物。
【請求項６４】
該核酸配列を無作為に再配置するコードをさらに含む、請求項６３記載のコンピュータプログラム生産物。
【請求項６５】
それぞれの親ポリペプチド配列のアミノ酸を逆翻訳して目的の細胞内で他の同義コドンよりもより高い翻訳効率を持つコドンを与えるコードをさらに含む、請求項６４記載のコンピュータプログラム生産物。
【請求項６６】
それぞれの親ポリペプチド配列のアミノ酸を逆翻訳して、隣接する又は局在する配列要素との関係で、課題の実行に阻害的な望ましくない配列を形成する傾向のより小さなコドンを与えるコードをさらに含む、請求項６３記載のコンピュータプログラム生産物。
【請求項６７】
該核酸配列の一つ以上にスペーサーオリゴヌクレオチドを連結するコードをさらに含む、請求項６３記載のコンピュータプログラム生産物。
【請求項６８】
少なくとも一つの親ポリペプチドの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドの配列を設計するためのコンピュータであって、該セグメントが該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するため該少なくとも一つの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されるものであり、該コンピュータが
（ａ）少なくとも一つの親ポリペプチドの配列を含む機械読み取り可能データをコードするデータ記憶物質を含む機械読み取り可能データ記憶媒体、
（ｂ）該機械読み取り可能データを処理するための指令を記憶するワーキングメモリ、
（ｃ）該機械読み取り可能データを処理して該合成ポリペプチド配列を与えるための、該ワーキングメモリに及び該機械読み取り可能データ記憶媒体に連結された中央処理装置、及び
（ｄ）該合成ポリペプチド配列を受け入れるための、該中央処理装置に連結された出力ハードウェア、
を含むコンピュータ。
【請求項６９】
該機械読み取り可能データを処理する工程がそれぞれの親ポリペプチドの配列を断片に断片化する工程及び該断片を該親ポリペプチドの配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結する工程を含むものである、請求項６８記載のコンピュータ。
【請求項７０】
該機械読み取り可能データを処理する工程が該断片を無作為に再配置する工程を含むものである、請求項６８記載のコンピュータ。
【請求項７１】
該機械読み取り可能データを処理する工程が該少なくとも一つの親ポリペプチドの配列又は該断片にスペーサー残基の配列を連結する工程を含むものである、請求項６８記載のコンピュータ。
【請求項７２】
少なくとも一つの親ポリペプチドの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドの配列を設計するためのコンピュータであって、該セグメントが該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するため該少なくとも一つの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されるものであり、該コンピュータが
（ａ）少なくとも一つの親ポリペプチドの配列を含む機械読み取り可能データをコードするデータ記憶物質を含む機械読み取り可能データ記憶媒体、
（ｂ）該機械読み取り可能データを処理するための指令を記憶するワーキングメモリ、
（ｃ）該機械読み取り可能データを処理して該合成ポリヌクレオチド配列を与えるための、該ワーキングメモリ及び該機械読み取り可能データ記憶媒体に連結された中央処理装置、及び
（ｄ）該合成ポリヌクレオチド配列を受け入れるための、該中央処理装置に連結された出力ハードウェア、
を含むコンピュータ。
【請求項７３】
該機械読み取り可能データの処理工程がそれぞれの親ポリペプチドの配列を断片に断片化する工程、それぞれの断片の配列を逆翻訳して該断片をコードする核酸配列を与える工程、及び該核酸配列のそれぞれを同じ読み取り枠内で一緒に連結して、該断片が該少なくとも一つの親ポリペプチド配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されているポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を与える工程を含むものである、請求項７２記載のコンピュータ。
【請求項７４】
該機械読み取り可能データの処理工程が該核酸配列を無作為に再配置する工程を含むものである、請求項７２記載のコンピュータ。
【請求項７５】
該機械読み取り可能データの処理工程がそれぞれの親ポリペプチド配列のアミノ酸を逆翻訳して、目的の細胞内で他の同義コドンよりもより高い翻訳効率を持つコドンを与える工程を含むものである、請求項７２記載のコンピュータ。
【請求項７６】
該機械読み取り可能データの処理工程がそれぞれの親ポリペプチド配列のアミノ酸を逆翻訳して、隣接する又は局在する配列要素との関係で、課題を実行を阻害する望ましくない配列を形成する傾向のより小さなコドンを与える工程を含むものである、請求項７２記載のコンピュータ。
【請求項７７】
該機械読み取り可能データの処理工程が該核酸配列の一つ以上にスペーサーオリゴヌクレオチドを連結する工程を含むものである、請求項７２記載のコンピュータ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的に免疫応答を調節する物質に関する。より具体的には、本発明は親ポリペプチドの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドであって、親ポリペプチドの一つ以上の機能が抑えられ、排除され若しくは他の方法で改変されるように、且つ、適切な宿主に導入されるとき該合成ポリペプチドが該親ポリペプチドに対する免疫応答を誘導できるように、該セグメントが相互に連結されているものである合成ポリペプチドに関する。本発明は、合成ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチド、及びこれらのポリヌクレオチドを含む合成構築物にも関する。
【０００２】
本明細書で言及する種々の出版物の書誌学的情報は明細書の末尾に集めてある。
【０００３】
発明の背景
ワクチン及び治療法の開発に携わる現代の還元主義者は何十年もの間、免疫系に関係する病原体又は癌タンパク質の部分を追跡してきたのであり、そしてこれらにのみ焦点を当てようと試みる。今日では、このアプローチの効率は、行なわれた精力的な研究とそれが産みだした有効なワクチン及び治療法の数を考慮すると比較的貧弱なものであった。しかし、このアプローチはその貧弱な効率にもかかわらず今なお活発におこなわれている。それは、このアプローチにより開発されたワクチンがしばしば極めて安全であるからであり、そして免疫システムを完全に理解することによってのみ新たなワクチン戦略が開発され得るからである。
【０００４】
研究努力から大きな利益を得た一つの分野は適応性の免疫システムが如何にして作動するか、より具体的にはＴ細胞及びＢ細胞が病原体や癌の特定の部分を如何にして認識するかについての知識である。Ｔ細胞は主として細胞−媒介性免疫に関与するのに対し、Ｂ細胞は抗体−媒介性の免疫の形成に関与する。適応性細胞性免疫に関与するＴ細胞の二つの最も重要なタイプは、αβＣＤ８＋ 細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びＣＤ４＋ Ｔヘルパーリンパ球である。ＣＴＬは多くのウイルス、腫瘍、一部の細菌及び一部の病原体に対する細胞性免疫の重要な媒介体である。何故なら、それらは感染した細胞を直接殺すことができそして感染生物の拡散に対する強力な効果を有し得る種々の因子を分泌することができるからである。ＣＴＬは、８〜１０アミノ酸長の、Ｉ型主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子（ヒトではヒト白血球抗原−ＨＬＡｓと呼ばれる）（ジャーデッツキーら，１９９１、フレモントら， １９９２、ロツシュケら， １９９０） により提示される外来性の細胞内タンパク質から由来するエピトープを認識する。Ｔヘルパー細胞はＣＴＬ応答を増強し、調節し、そして長命記憶ＣＴＬの確立に必要である。これらもＩＦＮ−γなどのサイトカインを分泌することにより感染生物を阻害する。Ｔヘルパー細胞はほとんどが１２〜２５アミノ酸長の、ＩＩ型ＭＨＣ分子（チスら，１９９３、ニューカムら， １９９３） により提示される細胞外タンパク質から由来するエピトープを認識する。Ｂ細胞、より具体的にはそれが分泌する抗体はほとんどの細胞外生物の制御及び排除の際の重要な媒介体である。抗体は主に生物の表面にある立体構造的抗原決定基を認識するが、しばしば抗体は短い直鎖状の抗原決定基を認識しうる。
【０００５】
Ｔ細胞エピトープ及び直鎖状Ｂ細胞エピトープが如何に処理され免疫システムに提示されるかについての理解における顕著な前進があったにもかかわらず、エピトープに基づくウイルスの全能力は十分には活用されてこなかった。その主な理由は、ヒト集団における極端に多いＨＬＡ多型を網羅するため、かかるワクチンに含めねばならない異なるＴ細胞エピトープの数が巨大であることである。ヒトＨＬＡの多様性は、全病原体ワクチンがサブユニット又はぺプチドに基づくワクチン戦術よりも集団カバーの点でしばしばより優れている主な理由の一つである。にもかかわらず、この問題を解決しようとした一連のエピトープに基づく戦術がある。例えば、ぺプチドブレンドワクチン、ぺプチド結合ワクチン及びポリペプチドワクチンである（即ち、複数のエピトープのひもを含む）（ダイオールら，１９９５、トムソンら， １９９６、トムソンら， １９９８、トムソンら， １９９８） 。しかしながら、これらのアプローチは、エピトープの特性決定の速度が遅いことのためばかりでなく、該集団において現存する全てのＨＬＡ多型をそれらがカバーすることは実際上不可能でもあるために、常に最適には届かないものとなる。幾つかの戦術は、エピトープを同定せずその代わりにより大きな量の配列情報を組み込むことにより、両方の問題を回避しようと努力した、例えば、遺伝子又はタンパク質全体を用いるというアプローチ、及び複数のタンパク質又は遺伝子の配列を一緒に混合するというアプローチである。しかし、これらの戦術により用いられたタンパク質はなお機能を有し、従ってワクチンの安全性を傷つけ得る、例えば癌タンパク質全体。代わりの戦術は遺伝子を断片化しそれらを別々に又は複合体混合物として発現させることにより、例えば、ライブラリーＤＮＡ免疫化により、又はこれらの断片を再度連結することにより、ワクチンの安全性を改善しようと試みた。これらのアプローチは、なお最適とは言い難い。何故なら、これらは複雑過ぎ、免疫形成のレベルが低く、全てのタンパク質がもはや機能しないこと及び／又は全ての断片が存在することを保証できず、実質的には完全な免疫学的網羅を傷つけるものである。
【０００６】
実質的に完全な免疫学的網羅を可能とする安全で効率的な戦術がないということは、殊にＨＩＶや肝炎Ｃウイルスなどの急速に変異し且つ永続的なウイルスに対するワクチンを開発しようと努力する場合には、重要な問題である。何故なら、集団の部分しか網羅しないことは将来ワクチン耐性病原体を再発生させ得るであろうからである。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、長さが約９ｋｂのＲＮＡレンチウイルスであり、これはＣＤ４＋ Ｔ細胞に感染し、Ｔ細胞の減少を惹起し、通常感染後３〜８年でＡＩＤＳを惹き起こす。それは、世界保健機構（ＷＨＯ）及びＵＮＡＩＤＳにより評価されたＡＩＤＳ流行最新情報（１９９９年１２月） による、現在のＨＩＶ感染者数又はＡＩＤＳによる死亡者数がそれぞれ３３６０万人及び１６３０万人であることからも明らかなように、現在、最も深刻なヒトウイルス感染である。ＨＩＶの拡散は、ヒト集団の半数以上が住んでいる世界の地域で今も最速で増加しつつある。従って、有効なワクチンはこの流行の拡散を抑制するために絶対に必要である。緊急性にもかかわらず、ＨＩＶのための有効なワクチンは、免疫保護の相関性を特定することの遅延、適切な動物モデルの欠如、ＨＩＶの８個もの異なるサブタイプの存在、及びＨＩＶの突然変異の高速度のために、かなり離れた彼方にある。
【０００７】
かなりの量の研究が、ＨＩＶの臨床単離物に対して防御できる、中和性の抗体応答を形成できるワクチンを開発しようとする目的で実施されてきた。これらの努力にもかかわらず、ＨＩＶのエンベロープタンパク質上の重要な抗原決定基の多様性、不安定性及び接近不可能性が、このようなワクチンの開発を極めて困難にしており、おそらく不可能としているということが今や明らかである（クオングら，１９９８） 。ＨＩＶ感染を阻止する抗体の能力が限られていることは、ＡＩＤＳの開発が主としてＨＩＶへのＣＴＬの応答性の低減と相関しており、抗体レベルの変化には相関していないという観察（オッグら，１９９８） により裏付けられてもいる。こうして、ＣＴＬにより媒介され抗体によっては媒介されない応答がイン・ビボの無症候性の状態を維持するのに決定的に重要であるようにみえる。先在するＨＩＶに特異的なＣＴＬ応答が潜伏しているＨＩＶ感染の発症を阻止できることを示唆する証拠も幾つかある。この証拠は、個体が感染することなくＨＩＶに特異的ＣＴＬ応答を生じ、そしてウイルスへの反復接触にもかかわらず潜伏性ＨＩＶ感染の発症から防御されるようにみえるという幾つかの症例からのものである（ロウランド−ジョーンズら，１９９５、パニミアニ， １９９８） 。これらの観察を合わせると、広範囲の強力なＣＴＬ応答を形成できるワクチンは個体がＨＩＶに潜伏性に感染するのを停止でき、又は少なくとも感染した個体を生活において無症候に留まらせることを可能にすることを示唆する。実際、今日までに開発されたＨＩＶワクチン候補は全てサブタイプＢのＨＩＶタンパク質（西方世界サブタイプ）から誘導されたのに対し、全世界のＨＩＶ感染の大多数はサブタイプＡ／Ｅ又はＣ（ＥとＡはエンベロープタンパク質を除き類似する）（開発途上世界サブタイプと呼ばれる）により惹起されている。従って、現存する候補ワクチンは、より普通のＨＩＶサブタイプに対して適切ではないこともありうる。最近、サブタイプＢのワクチンが他の普通のＨＩＶサブタイプに対して部分的に有効である（ロウランド−ジョーンズら，１９９８） という有力な証拠が現れた。従って、ＨＩＶの全ての株の全ての単離物に対してその有効性が実質的に完全であるようなワクチンが望ましいということは今なお変わらない。
【０００８】
発明の概要
本発明は部分的に免疫増強組成物の有効性を高めるための新規な戦術に関する。この戦術は、親のポリペプチドの配列情報を利用して親ポリペプチドの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドを製造する工程に関する。この合成ポリペプチドは、該セグメントが親ポリペプチドの配置とは異なる配置となるような順序で一緒に連結されている。親ポリペプチドとの関連性におけるこの変化の結果として、合成ポリペプチドにおける連結されたセグメントの順序は親ポリペプチド内に含まれる順序とは異なる。以下により詳細に記述するように、この戦術は親ポリペプチドの構造及び／又は機能に重大な破壊を惹き起こしつつも、親ポリペプチドによりコードされる潜在的に有用なエピトープの破壊は最小限に留められるように、巧く使用される。
【０００９】
こうして、本発明の一つの側面では、少なくとも一つの親ポリペプチドの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドであって、これらのセグメントが該少なくとも一つの親ポリペプチドにおける連結と比べ異なる関係で一緒に連結されているものである合成ポリペプチドが提供される。
【００１０】
一つの実施態様では、該合成ポリペプチドは本質的に単一の親ポリペプチドの異なるセグメントから成るものである。
【００１１】
別の実施態様では、該合成ポリペプチドは本質的に複数の異なる親ポリペプチドの異なるセグメントから成るものである。
【００１２】
該合成親ポリペプチドの該セグメントは、該少なくとも一つの親ポリペプチドにおける対応するセグメントのそれと比べ異なる順序又は異なる配置で順に連結されていることが好ましい。
【００１３】
該セグメントの少なくとも一つは他の一つ以上の該セグメントへの部分的な配列同一性又は配列相同性を含むことが好ましい。この配列同一性又は配列相同性は該少なくとも一つのセグメントの一方又は両方の末端に含まれることが好ましい。
【００１４】
別の一側面では、本発明は上で広く述べた合成ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドに関する。
【００１５】
さらに別の一側面によれば、本発明は、調節ポリヌクレオチドに機能しうるように連結されている、上で広く述べた該ポリヌクレオチドを含む合成構築物を意図する。
【００１６】
本発明のさらなる一側面では、上で広く述べた合成ポリヌクレオチドを製造する方法であって、
少なくとも一つの親ポリペプチドの異なるセグメントをコードする複数の核酸配列を同じ読み取り枠の中で一緒に連結して、その配列が該少なくとも一つの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で共に連結された該セグメントをコードする合成ポリヌクレオチドを形成する工程、
を含む方法が提供される。
【００１７】
この方法は、それぞれの親ポリペプチドの配列を断片に断片化し、該断片を該親ポリペプチドの配列におけるそれら断片の連結と比べ異なる関係で一緒に連結する工程をさらに含むことが好ましい。このタイプの好ましい実施態様では、該断片は無作為に一緒に連結される。
【００１８】
この方法は、それぞれの親ポリペプチドの配列又はそれらのセグメントを逆翻訳して、該親ポリペプチド又は該セグメントをコードする核酸配列を得る工程をさらに含むことが好ましい。このタイプの好ましい実施態様では、該親ポリペプチド配列のアミノ酸は逆翻訳されてコドンを与える。このコドンは目的の細胞中の他の同義のコドンよりも高い翻訳効率を有する。該親ポリペプチド配列のアミノ酸は、隣接若しくは局在する配列要素との関係で、課題（例えば、クローニング又は配列決定）の実行に支障をきたす望ましくない配列（例えば、パリンドローム配列又は重層配列）の形成の頻度を低下させるコドンを得るように逆翻訳されることが好ましい。
【００１９】
別の一側面では、本発明は上で広く述べた合成ポリペプチドの配列を設計するためのコンピュータプログラム生産物であって、
少なくとも一つの親ポリペプチドの配列を入力として受け入れるコード、
それぞれの親ポリペプチドの配列を断片に断片化するコード、
該断片を該親ポリペプチド配列における断片の連結と比べ異なる関係で連結するコード、
これらのコードを記憶するコンピュータ読み取り可能媒体、
を含むコンピュータプログラム生産物を包含する。
【００２０】
別の一側面では、本発明は、上で広く述べた合成ポリヌクレオチドの配列を設計するこめのコンピュータプログラム生産物であって、
少なくとも一つの親ポリペプチドの配列を入力として受け入れるコード、
それぞれの親ポリペプチドの配列を断片に断片化するコード、
それぞれの断片の配列を逆翻訳して該断片をコードする核酸配列を与えるコード、
該核酸配列のそれぞれを同一読み取り枠の中で一緒に連結して、該断片が少なくとも一つの親ポリペプチド配列における該断片の連結と比べ異なる関係で一緒に連結されているポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を与えるコード、及び
これらのコードを記憶するコンピュータ読み取り可能媒体、
を含むコンピュータプログラム生産物を提供する。
【００２１】
さらに別の一側面では、本発明は上で広く述べた合成ポリペプチドの配列を設計するためのコンピュータであって、
（ａ）機械読み取り可能データでエンコードされたデータ記憶材料を含む機械読み取り可能記憶媒体であって、該機械読み取り可能データが少なくとも一つの親ポリペプチドの配列を含むものである機械読み取り可能記憶媒体、
（ｂ）該機械読み取り可能データを処理するための命令を記憶するためのワーキングメモリ、
（ｃ）該ワーキングメモリ及び該機械読み取り可能データ記憶媒体に連結しており、且つ該機械読み取り可能データを処理して該合成ポリペプチド配列を与えるための中央処理装置、及び
（ｄ）該合成ポリペプチド配列を受け入れるための該中央処理装置に連結している出力ハードウェア、
を含むコンピュータを提供する。
【００２２】
好ましい実施態様では、該機械読み取り可能データの処理工程は、それぞれの親ポリペプチドの配列を断片に断片化する工程、及び該断片を該親ポリペプチドの配列における該断片の連結と比べ異なる関係で連結する工程を含む。
【００２３】
さらに別の一側面では、本発明は上で広く述べた合成ポリヌクレオチドの配列を設計するためのコンピュータであって、
（ａ）機械読み取り可能データをエンコードされたデータ記憶材料を含む機械読み取り可能データ記憶媒体であって、該機械読み取り可能データが少なくとも一つの親ポリペプチドの配列を含むものである機械読み取り可能データ記憶媒体、
（ｂ）該機械読み取り可能データを処理するための命令を記憶するためのワーキングメモリ、
（ｃ）該ワーキングメモリ及び該機械読み取り可能データ記憶媒体に連結しており、且つ該機械読み取り可能データを処理し該合成ポリヌクレオチド配列を与えるための中央処理装置、及び
（ｄ）該中央処理装置に連結しており、且つ該合成ポリヌクレオチド配列を受け入れるための出力ハードウェア、
を含むコンピュータに関する。
【００２４】
好ましい実施態様では、該機械読み取り可能データの処理工程は、それぞれの親ポリペプチドの配列を断片に断片化する工程、それぞれの断片の配列を逆翻訳して該断片をコードする核酸配列を得る工程、及び該核酸配列を同じ読み取り枠の中で連結して、少なくとも一つの親ポリペプチド配列における該断片の連結と比べ異なる関係で該断片が連結されているポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を与える工程を含む。
【００２５】
別の一側面によれば、本発明は、上で広く述べた合成ポリペプチド、上で広く述べた合成ポリヌクレオチド及び上で広く述べた合成構築物からなる群より選択される免疫増強物質を、薬学的に許容しうる担体と共に含む組成物を意図する。
【００２６】
この組成物は任意選択的にアジュバントを含んでもよい。
【００２７】
さらなる一側面では、本発明は、好ましくは病原体若しくは癌に対する免疫応答を調節する方法であって、上で広く述べた合成ポリペプチド、上で広く述べた合成ポリヌクレオチド及び上で広く述べた合成構築物、又は上で広く述べた組成物からなる群より選択される免疫増強物質の有効量を、このような治療を必要とする患者に投与する工程を含む方法を包含する。
【００２８】
本発明のさらなる一側面によれば、疾病又は状態の治療及び／又は予防のための方法であって、上で広く述べた合成ポリペプチド、上で広く述べた合成ポリヌクレオチド及び上で広く述べた合成構築物、又は上で広く述べた組成物からなる群より選択される免疫増強物質の有効量を、このような治療を必要とする患者に投与する工程を含む方法が提供される。
【００２９】
本発明は、上で広く述べた合成ポリペプチド、合成ポリヌクレオチド及び合成構築物の研究、及び免疫応答の調節での使用をも包含する。
【００３０】
配列の簡単な記述：一覧表
【００３１】
【表Ａ】
2004506410.tif 000002
【００３２】
【外１】
2004506410.tif 000003
【００３３】
【外２】
2004506410.tif 000004
【００３４】
【外３】
2004506410.tif 000005
【００３５】
【外４】
2004506410.tif 000006
【００３６】
【外５】
2004506410.tif 000007
【００３７】
【外６】
2004506410.tif 000008
【００３８】
【外７】
2004506410.tif 000009
【００３９】
【外８】
2004506410.tif 000010
【００４０】
【外９】
2004506410.tif 000011
【００４１】
【外１０】
2004506410.tif 000012
【００４２】
【外１１】
2004506410.tif 000013
【００４３】
【外１２】
2004506410.tif 000014
【００４４】
【外１３】
2004506410.tif 000015
【００４５】
【外１４】
2004506410.tif 000016
【００４６】
【外１５】
2004506410.tif 000017
【００４７】
【外１６】
2004506410.tif 000018
【００４８】
【外１７】
2004506410.tif 000019
【００４９】
【外１８】
2004506410.tif 000020
【００５０】
【外１９】
2004506410.tif 000021
【００５１】
【外２０】
2004506410.tif 000022
【００５２】
【外２１】
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【００５３】
【外２２】
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【００５４】
【外２３】
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【００５５】
【外２４】
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【００５６】
【外２５】
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【００５７】
【外２６】
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【００５８】
【外２７】
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【００５９】
【外２８】
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【００６０】
【外２９】
2004506410.tif 000031
【００６１】
【外３０】
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【００６２】
【外３１】
2004506410.tif 000033
【００６３】
【外３２】
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【００６４】
【外３３】
2004506410.tif 000035
【００６５】
【外３４】
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【００６６】
【外３５】
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【００６７】
【外３６】
2004506410.tif 000038
【００６８】
【外３７】
2004506410.tif 000039
【００６９】
【外３８】
2004506410.tif 000040
【００７０】
【外３９】
2004506410.tif 000041
【００７１】
【外４０】
2004506410.tif 000042
【００７２】
【外４１】
2004506410.tif 000043
【００７３】
【外４２】
2004506410.tif 000044
【００７４】
【外４３】
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【００７５】
【外４４】
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【００７６】
【外４５】
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【００７７】
【外４６】
2004506410.tif 000048
【００７８】
【外４７】
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【００７９】
【外４８】
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【００８０】
【外４９】
2004506410.tif 000051
【００８１】
【外５０】
2004506410.tif 000052
【００８２】
【外５１】
2004506410.tif 000053
【００８３】
【外５２】
2004506410.tif 000054
【００８４】
【外５３】
2004506410.tif 000055
【００８５】
【外５４】
2004506410.tif 000056
【００８６】
【外５５】
2004506410.tif 000057
【００８７】
【外５６】
2004506410.tif 000058
【００８８】
【外５７】
2004506410.tif 000059
【００８９】
【外５８】
2004506410.tif 000060
【００９０】
【外５９】
2004506410.tif 000061
【００９１】
【外６０】
2004506410.tif 000062
【００９２】
【外６１】
2004506410.tif 000063
【００９３】
発明の詳細な説明
１．定義
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書で用いられるとき、この冠詞の文法上の客体の一つ又は一つ以上（即ち、少なくとも一つ）を指す。例を挙げれば、「ａｎ　ｅｌｅｍｅｎｔ」は一つの要素又は二つ以上の要素を意味する。
【００９４】
本明細書で用いるとき、用語「約」とは、言及した数量、レベル、値、寸法、大きさ、又は量に対して、３０％だけ、好ましくは２０％だけ、そしてより好ましくは１０％だけ変化する数量、レベル、値、寸法、大きさ又は量を指す。
【００９５】
「抗原結合分子」とは標的抗原に対して結合性の親和性を有する分子を意味する。この用語は免疫グロブリン、免疫グロブリン断片及び抗原結合活性を示すタンパク質枠組みから誘導される非−免疫グロブリンに及ぶものと理解される。
【００９６】
本明細書で用いられる用語「クレード」は生物の仮定的種及びその子孫若しくはその生物の同一の祖先型から発生したグループを指す。クレードは先祖に基づく定義を持ち、そしてシナプス形態（ｓｙｎａｐｏｍｏｒｐｈｉｅｓ） に基づく識別を保持している。クレードの識別は定義が変わらなくても変化しうるであろうことに注意すべきである。
【００９７】
本明細書を通じ、文脈が他の意義を要求しない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた工程若しくは要素又は工程群若しくは要素群を含むことを意味するが、如何なる他の工程若しくは要素又は工程群若しくは要素群を排除することを意味するものではないと理解される。
【００９８】
「発現ベクター」とは、該ベクターによりコードされるタンパク質の合成を指令できる任意の自律性の遺伝子要素を意味する。このような発現ベクターは当分野の実務者には知られている。
【００９９】
本明細書で用いられるとき、用語「機能」とは生物学的機能、酵素的機能、又は治療上の機能を意味する。
【０１００】
「相同性」とは、同一のアミノ酸又は表Ｂの下方で定義されたような同類置換を構成するアミノ酸の数のパーセンテージを意味する。相同性はＧＡＰ（デベローら，１９８４， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２， ３８７−３９５） などの配列比較プログラムを用いて決定しうる。このようにして、本明細書で引用されたものに類似の長さの又は実質的に異なる長さの配列は、それらの整列にギャップを挿入することにより比較されうる。このようなｇａｐは、例えば、ＧＡＰにより用いられる比較アルゴリズムにより決定される。
【０１０１】
当分野で良く知られているように、免疫応答を増強すること（「免疫増強」）とは、外来の又は疾病特異的な抗原（例えば、癌抗原）に応答する動物の能力を増強することを意味する。即ち、このような抗原を攻撃するように準備されたこれらの細胞が、その数、活性、及びこれらの抗原を検出し破壊する能力において増強される。免疫応答の強さは下記の標準的試験により測定される。即ち、当分野で知られた手段による末梢血リンパ球の直接測定、ナチュラルキラー細胞の細胞障害性検定（例えば、プロビンシアリ，Ｍ．ら，１９９２，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １５５： １９−２４参照） 、細胞増殖検定 （例えば、ホッレンヴァイダー， Ｉ．　及びグロセウルト， Ｐ． Ｊ． ら （１９９２， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １４９： １３３−１３５） 参照）、免疫細胞及びサブセットの免疫検定（例えば、レフラー，Ｄ． Ａ． ら （１９９２， Ｃｙｔｏｍ． １３： １６９−１７４） 、リボルチニ， Ｌ．ら （１９９２， Ｃａｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３４： ２４１−２５１）　参照） 、又は細胞媒介性免疫の皮膚試験（例えは、チャング，Ａ． Ｅ． ら（１９９３， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３： １０４３−１０５０）参照）である。上の試験により測定されたとき免疫応答の強さにおける如何なる統計学的有意の増加も、本明細書で用いられる「増強された免疫応答」、「免疫向上」又は「免疫増強」と考えられる。増強された免疫応答は、発熱や炎症並びに全身的及び局部的感染の回復などの肉体的発現、及び疾病の症候の緩和、即ち、腫瘍サイズの減少、ハンセン病、結核、マラリア、ナフタウス潰瘍 （ｎａｐｈｔｈｏｕｓ ｕｌｃｅｒｓ） 、ヘルペス性いぼ及びパピローマ性いぼ、歯肉炎、アテローム性動脈硬化症、カポジ肉腫などのＡＩＤＳの併発症、気管支感染などを含むがこれらに限定されない疾病又は状態の症候の緩和によっても示される。このような肉体的発現も、本明細書で使用される「増強された免疫応答」、「免疫向上」又は「免疫増強」を明確に確定する。
【０１０２】
本明細書で「免疫−相互作用性」というときは、分子の間の、とりわけ該分子の一方が免疫システムの一成分又はそれを模倣するものである場合の、任意の相互作用、反応、又は他の形態の結合についての言及をも含む。
【０１０３】
「単離された」とは、その天然の状態でそれに通常付随する成分を実質的に含まない又は本質的に含まない物質を意味する。
【０１０４】
「調節する」とは、癌及び生物、好ましくは病原性生物からなる群より選択される構成員の標的抗原に対する免疫応答を直接的にか又は間接的に増加させ又は減少させることを意味する。
【０１０５】
「天然遺伝子」とは、タンパク質を天然でコードする遺伝子を意味する。
【０１０６】
「天然ポリペプチド」という用語は、本明細書で用いるとき、天然に存在するポリペプチドを意味する。
【０１０７】
「から得られた」とは、例えば、ポリヌクレオチド抽出物又はポリペプチド抽出物などの試料が宿主の特定の供給源から単離され、又はそれに由来することを意味する。例えば、該抽出物は該宿主から直接単離された組織又は生物体液から得ることができる。
【０１０８】
本明細書で用いられるとき用語「オリゴヌクレオチド」とは、ホスホジエステル結合を介して連結された複数のヌクレオチド残基（デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチド、又はそれらの関連する構造変異体若しくは合成類似体）から成るポリマー（又はその関連する構造変異体若しくは合成類似体）を意味する。したがって、用語「オリゴヌクレオチド」は、通常そのヌクレオチド残基及びそれらの間の結合が天然に生ずるものであるヌクレオチドポリマーを意味するが、この用語はその範囲内にぺプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボ核酸、などを含むが、これらに限定されない種々の類似体を含むものと理解される。この分子の正確な大きさは具体的適用に応じて変化し得る。オリゴヌクレオチドは通常長さはかなり短く、一般に約１０から３０ヌクレオチド残基までであるが、この用語は如何なる長さの分子をも意味し得る。もっとも、大きなオリゴヌクレオチドに対しては用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」が通常用いられる。
【０１０９】
「機能しうるように連結された」とは、ポリヌクレオチドが転写されそしてポリペプチドが翻訳されるように、転写調節ポリヌクレオチド及び翻訳調節ポリヌクレオチドがポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関して配置されることを意味する。
【０１１０】
本明細書で用いられるとき用語「親ポリペプチド」とは、通常、天然遺伝子によりコードされるポリペプチドを意味する。しかし、この親ポリペプチドは天然に生じない、組換え技法を用いて工学処理されたタンパク質にも対応することができる。この場合には、親ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、同一ポリペプチドをコードする天然の遺伝子と比べ異なるが同義のコドンを含んでもよい。または、この親ポリペプチドは天然ポリペプチド配列に対応しなくてもよい。例えば、該親ポリペプチドは複数のポリペプチドに共通の一つ以上のコンセンサス配列を含んでもよい。
【０１１１】
用語「患者」とは、ヒト又は他の哺乳動物の患者を意味し、本発明の方法を用いて検査又は治療をすることが望まれる任意の個体を含む。しかしながら、「患者」は症候が存在することを意味するものではないと理解される。本発明の範囲に入る適当な哺乳動物としては、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、実験室テスト動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ）及び捕獲された野性動物（例えば、キツネ、シカ、ディンゴ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
「薬学的に許容しうる担体」とは、哺乳動物に局所投与又は全身投与で安全に使用できる固体若しくは液体の充填剤、希釈剤又はカプセル化用物質を意味する。
【０１１３】
「ポリペプチド」、「ぺプチド」及び「タンパク質」は本明細書では互換可能に用いられ、アミノ酸残基のポリマー及びその変異体及び合成類似体を意味する。こうして、これらの用語は、天然に生ずるアミノ酸ポリマーに適用されると同様に、一つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に生ずるアミノ酸の化学類似体などの天然に生じない合成アミノ酸であるようなアミノ酸ポリマーにも適用される。
【０１１４】
本明細書で用いるとき用語「ポリヌクレオチド」又は「核酸」とは、ｍＲＮＡ、ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡを意味する。この用語は通常長さが３０ヌクレオチド残基より大きなオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１１５】
「プライマー」とは、ＤＮＡの１本の鎖と対になると、適切な重合化物質の存在下でプライマー伸長生産物の合成を開始できるオリゴヌクレオチドを意味する。このプライマーは増幅の最大効率のために１本鎖であることが好ましいが、代わりに二本鎖であることもできる。プライマーは重合化物質の存在下で伸長生産物の合成を開始するのに十分な長さでなければならない。プライマーの長さは、適用、使用温度、鋳型反応条件、他の試薬、及びプライマーの供給源などの多くの要因に左右される。例えば、標的配列の複雑さに依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは通常１５〜３５又はそれ以上のヌクレオチド残基を含むが、より少ないヌクレオチド残基を含むこともできる。プライマーは約３５ヌクレオチドから数キロ塩基以上までの大きなポリヌクレオチドであることもできる。プライマーは、それがハイブリダイズしそして合成の開始のための部位として役立つように設計された鋳型上の配列に「実質的に相補的」であるように選択され得る。「実質的に相補的」とは、該プライマーが標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズするのに十分な相補性を有することを意味する。プライマーはそれがハイブリダイズするように設計された鋳型とのミスマッチを含まないことが好ましいが、これは本質的ではない。例えば、プライマー配列の残りの部分が鋳型に相補的である場合は、非−相補的ヌクレオチド残基をプライマーの５’末端に結合させることができる。または、プライマー配列が鋳型とハイブリダイズし該プライマーの伸長生産物の合成のための鋳型を形成する程に鋳型の配列と十分な相補性を有しているとすれば、非−相補的ヌクレオチド残基又は非−相補的ヌクレオチド残基の鎖をプライマー中に散在させることができる。
【０１１６】
「プローブ」とは、別の分子の特定の配列又は部分配列又は他の部分に結合する分子を意味する。特に断らない限り、用語「プローブ」は、通常、しばしば「標的ポリヌクレオチド」と呼ばれる別のポリヌクレオチドに相補的塩基対合により結合するポリヌクレオチドプローブを意味する。プローブは、該プローブとの完全な配列相補性を持たない標的ポリヌクレオチドに、ハイブリダイゼーション条件の厳格性に依存して、結合できる。プローブは直接的又は間接的に標識化できる。
【０１１７】
「組換えポリペプチド」とは、組換え技法を用いて、即ち、組換え体又は合成ポリヌクレオチドの発現により、作製されたポリペプチドを意味する。
【０１１８】
二つ以上のポリヌクレオチド又はポリペプチドの間の配列の関係を記述するために用いられる用語には、「参照配列」、「比較窓」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」及び「実質的同一性」が含まれる。「参照配列」は、ヌクレオチド残基及びアミノ酸残基の両端を含めて、長さが少なくとも１２、ときには１５〜１８であり、しばしば少なくとも２５のモノマー単位である。二つのポリヌクレオチドは、それぞれ（１）二つのポリヌクレオチドの間で類似する配列（即ち、完全なポリヌクレオチド配列の一部だけ）、及び（２）二つのポリヌクレオチドの間で異なっている配列を含むから、二つ（又はそれ以上の）ポリヌクレオチドの間の配列比較は、通常、配列類似性のある局部領域を同定し比較するために「比較窓」の上でこの二つのポリヌクレオチドの配列を比較することにより行なわれる。「比較窓」とは、二つの配列が最適に整列した後に、その中で配列が同数の連続した位置の参照配列と比較される少なくとも５０、通常約５０から約１００、より普通には約１００から約１５０の連続した位置の観念的セグメントを言う。この比較窓は、二つの配列の最適整列に対し、参照配列（これは付加又は欠失を含まない）と比較したとき約２０％未満の付加又は欠失（即ち、ギャップ）を含んでもよい。比較窓を整列させるための配列の最適整列は、アルゴリズム（ウイスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ・リリース ７．０，ジェネティクス・コンピュータ・グループ，５７５ サイエンス・ドライブ・マジソン，ＷＩ，ＵＳＡのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ実施によって、又は観察により行なうことができる。そして最良の整列（即ち、比較窓の上で最高の相同性パーセンテージを生ずるもの）は選択された種々の方法のいずれかにより与えられる。例えば、アルチュールら，１９９７， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９ により開示されたようなプログラムのＢＬＡＳＴファミリーを参照してもよい。配列分析の詳細な論述はアウスベルら，「分子生物学の現在のプロトコル」Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ． １９９４−１９９８， １５章のユニット １９．３ に見出すことができる。
【０１１９】
「配列同一性」という用語は、本明細書で用いられるとき、比較窓の上で、配列がヌクレオチド毎の比較又はアミノ酸毎の比較で同一となる程度を意味する。こうして、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較窓の上で二つの最適整列した配列を比較し、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）又は同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、及びＭｅｔ）が両方の配列に現れる位置の数を決定し、比較窓の位置の総数（即ち、その窓の大きさ）で適合した位置の数を割り、そしてその結果に１００を乗ずることにより計算して配列同一性のパーセンテージを得る。本発明の目的では、「配列同一性」は、ソフトウェアを付随する参照マニュアルで使用される標準的省略値を用いるＤＮＡＳＩＳコンピュータプログラム（ウインドウズ用２．５版、ヒタチ・ソフトウェア・エンジニアリング Ｃｏ． Ｌｔｄ．，サウス・サンフランシスコ、カリフォルニア、ＵＳＡ から入手可能） により計算された「適合パーセンテージ」を意味すると理解される。
【０１２０】
本明細書で用いられるとき、用語「合成ポリヌクレオチド」とは、天然には通常見出されない形にポリヌクレオチドを操作することによりイン・ビトロで形成されたポリヌクレオチドを意味する。例えば、合成ポリヌクレオチドは発現ベクターの形であることができる。一般に、このような発現ベクターには、該ポリヌクレオチドに機能しうるように連結された転写調節ポリヌクレオチドや翻訳調節ポリヌクレオチドが含まれる。
【０１２１】
本明細書で用いられる用語「同義コドン」とは、別のコドンと異なるヌクレオチド配列を持つがそのコドンと同じアミノ酸をコードするコドンを意味する。
【０１２２】
「翻訳効率」とは、発生期のポリペプチド鎖中に、コドンによりコードされたアミノ酸を組み込む、細胞のタンパク質合成機構の効率を意味する。この効率は、例えば、該細胞が該コドンを含むＲＮＡ鋳型からポリペプチドを合成できる速度により、又はそのような鋳型から合成されるポリペプチドの量により明示することができる。
【０１２３】
「ベクター」とは、ポリヌクレオチド分子、好ましくは、例えば、ポリヌクレオチドがそれに挿入され若しくはクローニングされ得るプラスミド、バクテリオファージ、酵母又はウイルスから誘導されるＤＮＡ分子を意味する。ベクターは好ましくは、一つ以上のユニークな制限部位を含み、標的細胞若しくは組織又はその子孫細胞若しくは組織を含む一定の宿主細胞中で自律複製でき、又はクローニングされた配列が再生産可能なように該一定の宿主のゲノムと一体化できるものである。従って、ベクターは自律的に複製するベクター、即ち染色体外の実体として存在し、その複製が染色体の複製とは無関係な、例えば、直鎖状若しくは閉環したプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工的染色体であることができる。ベクターは自己複製を確かにするための何らかの手段を含むことができる。または、ベクターは宿主細胞に導入されると、ゲノムと一体化しそれが合体した染色体（単数又は複数）と一緒に複製されるものであることができる。ベクター系は、単一のベクター若しくはプラスミド、二つ以上のベクター又はプラスミドを含むことができ、これらは一緒になって宿主細胞のゲノム又はトランスポゾンに導入されるべき総ＤＮＡとなる。ベクターの選択は、通常、該ベクターが導入される宿主と該ベクターとの適合性に左右される。本発明の場合、ベクターは動物で、好ましくは哺乳動物細胞中で機能しうるように働くウイルス又はウイルス由来のベクターであることが好ましい。このようなベクターはポックスウイルス、アデノウイルス又は酵母から誘導しうる。該ベクターは適当な形質転換体の選択に使用できる抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカーを含むことができる。このような耐性遺伝子の例は当業者に知られており、抗生物質カナマイシン及びＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標））に対する耐性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子や抗生物質ハイグロマイシンＢに対する耐性を付与するｈｐｈ遺伝子が挙げられる。
【０１２４】
２．合成ポリペプチド
本発明者らは、驚くべきことに、親ポリペプチドの異なるセグメントを該親ポリペプチドにおける該セグメントの連結と比べ異なる関係で融合し、結合し又は他の仕方で連結することによって、親ポリペプチド中に存在する潜在的に有用なエピトープの同時破壊を最小にしながら、該親ポリペプチドの少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又はその他の仕方で改変するのに十分な程度に親ポリペプチドの構造を破壊することができることを発見した。関係におけるこの改変の結果として、得られた合成ポリペプチドにおける連結されたセグメントの順序は該親ポリペプチド内に含まれる順序とは異なる。本発明の合成ポリペプチドは免疫増強薬として有用であり、そしてこれらは本明細書の他所ではスクランブル抗原ワクチン、超弱毒化ワクチン又は「Ｓａｖｉｎｅ」と呼ばれる。
【０１２５】
こうして、本発明は広く言えば少なくとも一つの親ポリペプチドの複数の異なるセグメントを含む合成ポリペプチドであって、該セグメントが少なくとも一つの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されるものである合成ポリペプチドに関する。
【０１２６】
該合成ポリペプチドにおける該セグメントが、該少なくとも一つの親ポリペプチドにおける対応するセグメントのそれと比べ異なる順序又は異なる配置で順に連結されるということは、好ましいが、本質的ではない。例えば、Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄという連続した又は重なり合った四つのセグメントを含む親ポリペプチドの場合、これらのセグメントは２３種の他の可能な順序で連結して合成ポリペプチドを形成しうる。これらの順序は、Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｃ、Ａ−Ｃ−Ｂ−Ｄ、Ａ−Ｃ−Ｄ−Ｂ、Ａ−Ｄ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｄ−Ｃ−Ｂ、Ｂ−Ａ−Ｃ−Ｄ、Ｂ−Ａ−Ｄ−Ｃ、Ｂ−Ｃ−Ａ−Ｄ、Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ａ、Ｂ−Ｄ−Ａ−Ｃ、Ｂ−Ｄ−Ｃ−Ａ、Ｃ−Ａ−Ｂ−Ｄ、Ｃ−Ａ−Ｄ−Ｂ、Ｃ−Ｂ−Ａ−Ｄ、Ｃ−Ｂ−Ｄ−Ａ、Ｃ−Ｄ−Ａ−Ｂ、Ｃ−Ｄ−Ｂ−Ａ、Ｄ−Ａ−Ｂ−Ｃ、Ｄ−Ａ−Ｃ−Ｂ、Ｄ−Ｂ−Ａ−Ｃ、Ｄ−Ｂ−Ｃ−Ａ、Ｄ−Ｃ−Ａ−Ｂ、及びＤ−Ｃ−Ｂ−Ａから成る群より選択されうる。これらのセグメントの再配置は無作為であることが好ましいが、親配列の完全な又は部分的な再組立てを結果とし生ずる再配置（例えば、ＡＤＢＣ、ＢＡＣＤ、ＤＡＢＣ）を排除又は他の仕方で最小にすることが特に好ましい。しかし、このような完全な又は部分的な再組立ての確率は再配置するセグメントの数が増加するにつれて減少することが認められる。
【０１２７】
該セグメントの順序は、親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し、又は他の仕方で改変するのに十分な程度に親ポリペプチドの構造が破壊されるように、親ポリペプチドに存在する順序と比べ組み替えられ、順序を付けなおし、又は他の仕方で再配置することが適当である。親ポリペプチドのセグメントは合成ポリペプチド中で無作為に再配置されることが好ましい。
【０１２８】
該親ポリペプチドは、疾病又は状態と関連するポリペプチドであることが好ましい。例えば、該親ポリペプチドは病原生物又は癌により発現されるポリペプチドでありうる。または、該親ポリペプチドは、糖尿病（例えば、若年発症糖尿病）、多発性硬化症、リュウマチ性関節炎、重症筋無力症、アトピー性皮膚炎、及び乾癬及び強直性脊椎炎などを含むがこれらに限定されない自己免疫疾患に関連する自己ぺプチドであることができる。従って、本発明の合成分子は、自己免疫疾患若しくは状態又はアレルギー若しくは耐性が望まれる他の状態に苦しむ患者に耐性を誘導するのに有用でありうる。例えば、耐性は、治療すべき個体の未成熟の樹状突起細胞を本発明の合成ポリペプチドと接触させることにより、又は本発明の合成ポリペプチドを未成熟樹状突起細胞中で発現させることにより、誘導しうる。耐性はまた、アレルギー性応答（例えば、喘息、花粉症）を惹き起こす抗原に対しても誘導しうる。この場合、該親ポリペプチドは、例えば、トーマス及びスミス（１９９８， Ａｌｌｅｒｇｙ， ５３（９）： ８２１−８３２）により記述されたようなハウスダスト−ダニ・アレルゲン性タンパク質を含むがこれらに限定されないアレルゲン性タンパク質であることが好ましい。
【０１２９】
病原生物には、酵母、ウイルス、細菌、及び寄生体が含まれるがこれらに限定されない。病原生物の如何なる天然の宿主も、本発明により意図されており、哺乳動物、鳥類、及び魚類が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、該病原生物は、ウイルスであり、それはＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルスでありうる。該ＲＮＡウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ポリオウイルス、及びインフルエンザウイルス、ラウス肉腫ウイルス、又は日本脳炎ウイルスなどのフラビウイルスであることが好ましい。好ましい実施態様では、該ＲＮＡウイルスは肝炎株Ａ、Ｂ及びＣを含むがこれらに限定されない肝炎ウイルスである。該ＤＮＡウイルスは、単純ヘルペスウイルス、エプスタイン−バールウイルス、サイトメガロウイルス及びパルボウイルスなどを含むが、これらに限定されないヘルペスウイルスであることが好ましい。好ましい態様では、該ウイルスはＨＩＶであり、該親ポリペプチドは、好ましくはｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ及びｎｅｆ、又はそれらの組合せから選択される。代わりの好ましい実施態様では、該ウイルスはＣ１ａ型肝炎ウイルスであり、親ポリペプチドはＣ１ａ型肝炎ウイルスポリタンパク質である。
【０１３０】
別の実施態様では、該病原生物は、ナイセリア・スピーシーズ、メニンゴコッカル・スピーシーズ、ヘモフィルス・スピーシーズ、サルモネラ・スピーシーズ、ストレプトコッカル・スピーシーズ、レジオネラ・スピーシーズ、及びミコバクテリウム・スピーシーズを含むがこれらに限定されない細菌である。
【０１３１】
さらに別の実施態様では、該病原生物は、プラスモディウム・スピーシーズ、シストソマ・スピーシーズ、ライシュマニア・スピーシーズ、トリパノソーマ・スピーシーズ、トキソプラスマ・スピーシーズ、及びギアルディア・スピーシーズを含むがこれらに限定されない寄生体である。
【０１３２】
任意の癌又は腫瘍が本発明によって意図される。例えば、該癌又は腫瘍は、メラノーマ、肺癌、乳癌、子宮頸癌、前立腺癌、結腸癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、移植後リンパ増殖病（ＰＴＬＤ）、ホジキンリンパ腫などを含むが、これらに限定されない。該癌又は腫瘍はメラノーマであることが好ましい。このタイプの好ましい実施態様では、該親ポリペプチドは、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ、ＴＲＰ−１、Ｔｙｒｏｓ、ＴＲＰ２、ＭＣ１Ｒ、ＭＵＣ１Ｆ、ＭＵＣ１Ｒ又はそれらの組合せから選択されることが好ましいメラニン細胞分化抗原である。このタイプの代わりの好ましい実施態様では、該親ポリペプチドは、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ｇｐ１００Ｉｎ４、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＰＲＡＭＥ、ＴＲＰ２１Ｎ２、ＮＹＮＳＯ１ａ、ＮＹＮＳＯ１ｂ、ＬＡＧＥ１又はそれらの組合せから選択されるのが好ましいメラノーマ特異的抗原である。
【０１３３】
好ましい実施態様では、該セグメントは大きさに基づいて選択される。本発明のセグメントは、該親ポリペプチドによりコードされる抗原に対する免疫応答を誘発するために利用できる任意の適当な大きさであればよい。幾つかの要因がセグメントの大きさの選択に影響を与えることができる。例えば、セグメントの大きさは、Ｔ細胞エピトープ及びそれらのプロセッシング要件の大きさを含むように、又はそれに対応するように選択するのが好ましい。当分野の実務家はＩ型限定Ｔ細胞エピトープが８と１０の間のアミノ酸長であることができ、そして非天然型の隣接残基に隣接して置かれる場合には、かかるエピトープは、それらが効率的にプロセスされ提示されることを確実にするために、一般に２〜３個の天然の隣接アミノ酸を要求できることを認識するであろう。ＩＩ型限定Ｔ細胞エピトープは、長さが１２と２５の間のアミノ酸に及ぶことができ、天然の隣接残基がある役割を果たすと信じられているものの、効率的なプロテアーゼ水解プロセスのために天然型の隣接残基を必要としない。ＩＩ型限定エピトープの別の重要な特徴は、それらが一般に中央にあるＩＩ型ＭＨＣ分子に特異的に結合する９〜１０のアミノ酸のコアと、配列とは無関係の様式で（ブラウンら，１９９３） ＩＩ型ＭＨＣ抗原の両側にある保存構造と結合することによりこのコア安定化結合の両側に隣接している配列とを含むことである。こうして、ＩＩ型限定エピトープの機能性領域は通常長さが１５アミノ酸よりも短い。直鎖状のＢ細胞エピトープ及びそれらのプロセスを行なう因子の大きさは、ＩＩ型限定エピトープと同様に、該エピトープはしばしば１５アミノ酸よりも大きさが小さいが、極めて変動し易い。前述のことから、セグメントの大きさは少なくとも４アミノ酸、好ましくは少なくとも７アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２アミノ酸、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸、そしてより好ましくは少なくとも３０アミノ酸であることが好ましいが、これは本質的なものではない。該セグメントの大きさは好ましくは２０００アミノ酸よりも小さく、より好ましくは１０００アミノ酸よりも小さく、より好ましくは５００アミノ酸よりも小さく、より好ましくは２００アミノ酸よりも小さく、より好ましくは１００アミノ酸よりも小さく、より好ましくは８０アミノ酸よりも小さく、さらにより好ましくは６０アミノ酸よりも小さく、なお一層好ましくは４０アミノ酸よりも小さい。この点で、該セグメントの大きさは、合成ポリペプチドが親ポリペプチドの構造に比べ機能的に異なる構造を採るようにできるだけ小さいことが好ましい。該セグメントの大きさはＴ細胞エピトープの損失を最小にする程に十分大きいことが好ましい。特に好ましい実施態様では、該セグメントの大きさは約３０アミノ酸である。
【０１３４】
隣接するセグメントの間隔を相互に空けるために任意選択的にスペーサーを利用することができる。したがって、セグメントの一部又は全部の間にオプションとしてスペーサーを介在させることができる。このスペーサーは隣接するセグメント（単数又は複数）のプロテアーゼ処理及び／又は提示を適切に変更する。このタイプの好ましい実施態様では、該スペーサーは隣接するセグメント（単数又は複数）のプロテアーゼ処理及び／又は提示を増強し、又は他の方法で強化する。該スペーサーは少なくとも一つのアミノ酸を含むことが好ましい。該少なくとも一つのアミノ酸は中性アミノ酸であることが好ましい。該中性アミノ酸はアラニンであることが好ましい。また、該少なくとも一つのアミノ酸はシステインである。
【０１３５】
好ましい実施態様では、セグメントは、それが一つ以上の他のセグメントと部分的な配列同一性若しくは配列相同性を持つように選択される。それぞれのセグメントの一端若しくは両端には、該セグメントの一つ以上の他のセグメント内に含まれるアミノ酸配列と同一か又は相同な少なくとも４個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも７個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも１０個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５個の連続したアミノ酸、そしてさらに一層好ましくは少なくとも２０個の連続したアミノ酸が含まれることが好ましい。それぞれのセグメントの末端若しくは各端には、該セグメントの一つ以上の他のセグメント内に含まれるアミノ酸配列と同一か又は相同な５００個未満の連続したアミノ酸、より好ましくは２００個未満の連続したアミノ酸、より好ましくは１００個未満の連続したアミノ酸、より好ましくは５０個未満の連続したアミノ酸、より好ましくは４０個未満の連続したアミノ酸、そしてさらにより好ましくは３０個未満の連続したアミノ酸が含まれることが好ましい。このような配列の重なり（本明細書の別の箇所では「重なっている断片」又は「重なっているセグメント」と呼ばれる）は、セグメント境界にある潜在的なエピトープが失われないことを確実にし、そしてセグメント境界にある又はその近くにあるエピトープが処理を阻害するアミノ酸の側若しくは近くに位置したとしても有効に処理されることを確実にするのが好ましい。該セグメントの大きさは該重なりの大きさの約２倍であることが好ましい。
【０１３６】
好ましい実施態様では、セグメントがそれらの間に部分的配列相同性を有する場合、該相同配列は保存された及び／又は保存されていないアミノ酸相違を含むことが好ましい。典型的な同類置換は次の表に列挙されている。
【０１３７】
【表Ｂ】
2004506410.tif 000064
【０１３８】
【外６２】
2004506410.tif 000065
【０１３９】
保存又は非保存的相違は対応する親ポリペプチドにおける多型に対応しうる。多型性ポリペプチドは種々の病原性生物及び癌により示される。例えば、多型性ポリペプチドは異なるウイルス株若しくはクレードにより、又は異なる個体における癌により示される。
【０１４０】
それぞれのセグメントの間の配列の重なりは、親ポリペプチドに現存する順序に比べ該セグメントのかき混ぜ若しくは再配置から生じうる如何なるエピトープ配列の破壊をも最小にすることが好ましい。上述の重なり合うセグメントが合成ポリペプチドを形成するために用いられるならば、対応するセグメントが親ポリペプチドに通常存在する順序と比べてこれらのセグメントが一緒に連結される順序を変更することは必要でないかも知れない。この点で、このような重なり合うセグメントは、合成ポリペプチド中で連結されるとき、該親ポリペプチドの構造と比べ異なる構造であって該親ポリペプチドと関連する一つ以上の機能を与えない構造を採用することができる。例えば、それぞれが親ポリペプチドの連続した３０アミノ酸を含み且つ一つ以上の隣接するセグメントとの１０アミノ酸重なり配列を有する４個のセグメントＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄの場合、該合成ポリペプチドはセグメントＡ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、及びＣ−Ｄを架橋する二重の１０アミノ酸配列を持つことになる。これらの二重の配列の存在は、親ポリペプチドと比べて異なる構造とし、機能を排除し若しくは改変するのに十分である。
【０１４１】
好ましい実施態様では、セグメントの大きさは約３０アミノ酸であり、それぞれのセグメントの一端若しくは両端での配列の重なりは約１５アミノ酸である。しかしながら、他の適切なセグメントの大きさや配列の重なりの大きさも本発明で意図されており、これらは当業者により容易に確認できることが理解されよう。
【０１４２】
合成ポリペプチドの構築において親ポリペプチドのセグメントの全てを利用することは好ましいが必要ではない。親ポリペプチド配列の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらに一層好ましくは少なくとも７０％、さらに一層好ましくは少なくとも８０％、そしてさらに一層好ましくは少なくとも９０％が合成ポリペプチドの構築に使用されることが好ましい。しかしながら、合成ポリペプチドを構築するために利用される親ポリペプチドからの配列情報が大きければ大きい程、免疫原としての合成ポリペプチドがカバーする集団の大きさはより大きくなることが理解される。親ポリペプチドからの配列情報がない場合（例えば、免疫原性エピトープの見かけ上の欠如のため）は、排除することが好ましい。
【０１４３】
当業者は、病原性生物（例えば、ウイルス）又は癌に対する合成ポリペプチドを調製する場合、該生物若しくは癌により発現される複数の異なるポリペプチドからの配列情報を使用することが好ましいことを認めるであろう。したがって、好ましい実施態様では、本発明の合成ポリペプチドを形成するため複数の異なるポリペプチドからのセグメントが一緒に連結される。この点で、合成ポリペプチドの構築では特定の供給源からの、若しくはそれに関連する可能な限り多くの親ポリペプチドを利用することが好ましい。親ポリペプチドの供給源には、病原性生物及び癌が含まれるが、これらに限定されない。該供給源によって発現される親ポリペプチドの少なくとも約３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、そしてさらにより好ましくは少なくとも９０％が、合成ポリペプチドの構築に使用されることが好ましい。ウイルス由来の親ポリペプチドには、潜伏性ポリペプチド、調節ポリペプチド若しくはそれらの複製周期の間の初期に発現されるポリペプチドが含まれることが好ましいがが、これらに限定されない。寄生体若しくは細菌由来の親ポリペプチドには、分泌性ポリペプチド及び寄生体若しくは細菌の表面で発現されるポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。癌若しくは腫瘍由来の親ポリペプチドは癌特異的ポリペプチドであることが好ましい。
【０１４４】
親ポリペプチド内の超可変配列は合成ポリペプチドの構築から排除することが好ましい。
【０１４５】
本発明の合成ポリペプチドは当業者に知られた任意の適切な手順により調製されうる。例えば、該ポリペプチドは、溶液合成又は例えば、アサートン及びシェファード（１９８９，固相ぺプチド合成： 実用的アプローチ，ＩＲＬ プレス， オックスフォード） の第９章、及びロバーグら（１９９５， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９： ２０２） に記載された固相合成を用いて合成しうる。合成は、例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）又は９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学（コリガンら「タンパク質科学の現代のプロトコル，ジョン・ウィリー＆サンズ，インク．１９９５−１９９７ の ９．１章、スチュワートとヤング，１９８４，固相ぺプチド合成， 第 ２版， ピアース・ケミカル・コウ．，ロックフォード， ＩＩＩ 、及びアサートン及びシェファード， 上掲を参照） のいずれかを用いうる。
【０１４６】
また、該ポリペプチドは下記の工程、
（ａ）合成ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを含む合成構築物であって、該合成ポリヌクレオチドが調節ポリヌクレオチドに機能しうるように連結しているものであり、該合成ポリペプチドが親ポリペプチドの異なるセグメントを複数含むものであり、該セグメントが該親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で共に連結されているものである合成構築物を調製する工程、
（ｂ）該合成構築物を適切な宿主細胞中に導入する工程、
（ｃ）該宿主細胞を培養して該合成構築物から合成ポリペプチドを発現させる工程、及び
（ｄ）該合成ポリペプチドを単離する工程、
を含む手順により調製しうる。
【０１４７】
該合成構築物は発現ベクターの形であることが好ましい。例えば、発現ベクターはプラスミドなどの自己複製性の染色体外ベクター、又は宿主ゲノム中に合体するベクターであることができる。調節ポリヌクレオチドには、プロモーター配列、リーダー配列若しくはシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始配列及び転写停止配列、翻訳開始配列及び翻訳停止配列、及びエンハンサー配列若しくはアクチベーター配列が含まれるのが通常であるが、これらに限定されない。当分野で知られている構成的若しくは誘導性のプロモーターが本発明で意図される。プロモーターは天然に生ずるプロモーターか又は二つ以上のプロモーターの要素を結合したハイブリッドプロモーターのいずれかでありうる。調節ポリヌクレオチドは一般的に発現に用いられる宿主細胞に適するものである。適切な発現ベクター及び適切な調節ポリヌクレオチドの無数のタイプが、種々の宿主細胞に対して当分野で知られている。
【０１４８】
好ましい実施態様では、発現ベクターは、形質転換した宿主細胞の選択を可能とする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当分野で良く知られており、使用される宿主細胞に応じて変化する。
【０１４９】
発現ベクターは、本発明の合成ポリペプチドが融合相手との融合ポリペプチドとして発現されるように、融合相手（典型的には発現ベクターにより与えられる）を含みうる。融合相手の主な利点は、それが該融合ポリペプチドの同定を助け、及び／又はその精製を助けることである。該融合ポリペプチドを発現させるために、該融合相手とポリヌクレオチドの翻訳読み取り枠が一致するように、本発明のポリヌクレオチドを発現ベクターに連結することが必要である。
【０１５０】
融合相手の周知の例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヒトＩｇＧのＦｃ部分、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）及びヘキサヒスチジン（ＨＩＳ６ ）が含まれるが、これらに限定されない。これらの融合相手はアフィニティクロマトグラフィーにより融合ポリペプチドを単離するのにとりわけ有用である。アフィニティクロマトグラフィーにより融合ポリペプチドを精製するための、アフィニティクロマトグラフィー用の関連マトリックスは、それぞれグルタチオン結合樹脂、アミロース結合樹脂、及びニッケル若しくはコバルト結合樹脂である。このようなマトリックスの多くは「キット」の形で入手可能である。例えば、（ＨＩＳ６ ）融合相手で有用なＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ（商標）システム（キアゲン）やファルマシアＧＳＴ精製システムである。好ましい実施態様では、組換えポリヌクレオチドは市販のベクターｐＦＬＡＧ（商標）中で発現する。
【０１５１】
当分野で周知の別の融合相手は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。この融合相手は本発明の融合ポリペプチドを蛍光顕微鏡又はフローサイトメトリーにより同定させる蛍光「標識」として役立つ。このＧＦＰ標識は、本発明の融合ポリペプチドの細胞内局在を求める場合に又は本発明の融合ポリペプチドを発現する細胞を単離する場合に有用である。蛍光標示式細胞分取法（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー法はこの後者の適用においてとりわけ有用である。該融合相手はファクターＸａ 、トロンビン及びインテイン（タンパク質イントロン）などのためのプロテアーゼ開裂部位をも有することが好ましい。これらは関連プロテアーゼに本発明の融合ポリペプチドを部分的に消化させることによりそれから本発明の組換えポリペプチドを放出させる。次いで、この放出されたポリペプチドは、引続きクロマトグラフィー分離により該融合相手から単離することができる。本発明の融合相手は、その範囲に「エピトープ標識」をも含む。これは通常特異的な抗体が入手可能な短いぺプチド配列である。特異的なモノクローナル抗体が容易に入手可能なエピトープ標識の周知の例としては、ｃ−Ｍｙｃ、インフルエンザウイルス、赤血球凝集素、及びＦＬＡＧ標識が挙げられる。また、融合相手は免疫の他の形を強化するために与えうる。例えば、該融合相手は、標的抗原上の立体構造的エピトープと免疫相互作用性である抗原結合性分子、又は標的抗原の翻訳後修飾に免疫相互作用性の抗原結合性分子（例えば、グリコシル化標的抗原と免疫相互作用性である抗原結合性分子）であってもよい。
【０１５２】
合成構築物を宿主細胞中に導入する工程は、トランスフェクションや形質転換などの任意の適切な方法により行なってよく、その選択は使用される宿主細胞に依存することになる。このような方法は当業者に周知である。
【０１５３】
本発明の合成ポリペプチドは合成構築物で形質転換される宿主細胞を培養することにより製造されうる。タンパク質発現に適する条件は発現ベクター及び宿主細胞の選択に応じて変化する。これは機械的実験を通して当業者により容易に確認される。
【０１５４】
発現のための適切な宿主細胞は原核細胞又は真核細胞でありうる。本発明のポリペプチドの発現に好ましい宿主細胞の一つは細菌である。使用される細菌は大腸菌でありうる。また、該宿主細胞は、例えば、バキュロウイルス発現システムで利用されうるＳＦ９細胞などの昆虫細胞であってもよい。
【０１５５】
合成ポリペプチドは、例えば、サムブルックら，「分子クローニング．実験室マニュアル」（コールドスプリングハーバープレス，１９８９） 、とりわけセクション１６及び１７、アウスベルら「分子生物学のカレントプロトコル」（ジョン・ウィリー＆サンズ，インク．１９９４−１９９８）、特に１０章及び１６章、及びコリガンら「タンパク質科学のカレントプロトコル」（ジョン・ウィリー＆サンズ，インク．１９９５−１９９７）、特に １章、 ５章及び ６章） に記載されているような標準的プロトコルを用いて当業者は便利に調製しうる。
【０１５６】
合成ポリペプチドのアミノ酸は、任意の非天然型若しくは任意の天然型アミノ酸であることができる。ぺプチド合成の間における非天然アミノ酸及び誘導体の例としては、４−アミノ酪酸、６−アミノヘキサン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、２−チエニルアラニン及び／又はアミノ酸のＤ異性体の使用が含まれるが、これらに限定されない。本発明で意図される非天然アミノ酸のリストを表Ｃに示す。
【０１５７】
【表Ｃ】
2004506410.tif 000066
【０１５８】
【外６３】
2004506410.tif 000067
【０１５９】
【外６４】
2004506410.tif 000068
【０１６０】
本発明は、通常の分子生物学的技法を用いて、プロテアーゼ加水分解的な分解に対する抵抗性を変えるため又は溶解性を最適にするため又はそれらを免疫原物質としてより適するようにするため、本発明の合成ポリペプチドを改変することをも意図する。
【０１６１】
３．本発明の合成ポリヌクレオチドの調製
本発明は、例えば上掲セクション２で述べた合成ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを意図する。親ポリペプチドのセグメントをコードするポリヌクレオチドは任意の技法により製造することができる。例えば、そのようなポリヌクレオチドは容易に入手可能な機械を用いて新たに合成することができる。ＤＮＡの逐次合成は、例えば、米国特許第４，２９３，６５２号に記載されている。新たな合成の代わりに、該親ポリペプチドの少なくとも一つのセグメントをコードするポリヌクレオチドを切断するため制限エンドヌクレアーゼの使用、及び切断したポリヌクレオチドであって該親ポリペプチドの異なるセグメントをコードするものを複数、枠を揃えて一緒に連結するためのリガーゼの使用を含む組換え技法を用いてもよい。適切な組換え技法は、例えば、アウスベルら（上掲）及びサムブルックら（上掲）の関連部分に記載されている。これらは参照により本明細書にインコーポレートされる。該合成ポリヌクレオチドは、例えば、ホートンら（１９９０， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８（５）： ５２８−５３５ 、１９９５， Ｍｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３（２）： ９３−９９、及び １９９７， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ６７： １４１−１４９ ）により記述されたオーバーラップ伸長（ＳＯＥｉｎｇ）によるスプライシングを用いて構築されることが好ましい。しかしながら、本発明は合成構築物を構築するための如何なる一つの特定の技法に依存するものでも、それに関するものでもないことに注意すべきである。
【０１６２】
合成ポリヌクレオチドに対する種々の改変は、細胞内安定性や半減期を増加させるための手段として導入してもよい。考えられる改変としては、該分子の５’及び／又は３’末端にリボ−又はデオキシ−ヌクレオチドの隣接配列の添加、又はオリゴデオキシリボヌクレオチド骨格内にホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエート若しくは２’Ｏ−メチルホスホジエステラーゼ結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
したがって、本発明は上に広く述べた合成ポリヌクレオチドを製造する方法であって、同じ読み取り枠内に親ポリペプチドの異なるセグメントをコードする少なくとも二つの核酸配列を一緒に連結して本発明の合成ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを形成する工程を含む方法を意図する。親ポリペプチドの少なくとも１０セグメント、好ましくは少なくとも２０セグメント、より好ましくは少なくとも４０セグメントそしてより好ましくは少なくとも１００セグメントをコードする核酸配列を該合成ポリヌクレオチドを製造するために用いることが好ましい。
【０１６４】
該方法は、親ポリペプチドのセグメントを選択する工程、該選択されたセグメントを逆翻訳する工程、及び該選択されたセグメントをコードする核酸配列を調製する工程をさらに含むことが好ましい。該方法は、該核酸配列を無作為に一緒に連結して合成ポリヌクレオチドを形成する工程をさらに含むことが好ましい。該核酸配列はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドでありうる。
【０１６５】
セグメントは大きさに基づいて選択するのが好ましい。追加的に、又は代替的に、セグメントは、それらが一つ以上の他のセグメントと部分的な配列同一性若しくは部分的な相同性（即ち、配列重なり合い）を持つように選択される。上に述べたセグメントの大きさ及び配列の重なり合いには幾つかの要因が影響を与え得る。配列重なり合いの場合には、大量の重複した核酸配列はしばしば、かかる配列の核酸増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、ＰＣＲ）の間に、細菌宿主中での組換えプラスミドの増殖の間に、又はかかる配列を含む組換えウイルスの増幅の間に、核酸の一部が失われるという結果を生じ得る。したがって、好ましい実施態様では、一つ以上の他のコードされたセグメントと配列同一性若しくは配列相同性を持つセグメントをコードする核酸配列は、該同一配列若しくは該相同配列が連続するような配置では一緒に連結されない。また、重複領域では異なるコドンを使用して特定アミノ酸をコードすることが好ましい。このような状況では、親ポリペプチド配列のアミノ酸は、隣接配列要素若しくは局部配列要素に関連して、課題の実行（例えば、クローニング若しくは配列決定）を困難にする望ましくない配列（例えば、重複配列若しくはパリンドローム配列）を形成する傾向のより小さいコドンを与えるように逆翻訳されることが好ましい。または、セグメントは、それらがカルボキシ末端のロイシン残基を含むように、又は該セグメントをコードする逆翻訳された配列が逆翻訳された配列のスプライシングを便利にするための制限酵素部位を含むように、選択されうる。
【０１６６】
該方法は、任意選択的に、セグメントをコードする核酸の間に少なくとも一つのスペーサー残基をコードするスペーサーオリゴヌクレオチドを連結する工程をさらに含む。このようなスペーサー残基（単数又は複数）は、該セグメント内のエピトープが有効に処理され提示されることを確実にする点で有利でありうる。該スペーサーオリゴヌクレオチドは２〜３のスペーサー残基をコードすることが好ましい。このスペーサー残基は中性アミノ酸であることが好ましく、アラニンであることが好ましい。
【０１６７】
任意選択的に、該方法は、他のセグメントを含む核酸配列と同じ読み取り枠内で他のコードされたセグメントと比べ相同であるが同一ではないアミノ酸配列を有する変異型セグメントをコードする少なくとも一つの変異型核酸配列を連結する工程をさらに含む。該変異型セグメントは、一つ以上の他のコードされたセグメントと比べ保存された及び／又は保存されていないアミノ酸相違を含むことが好ましい。このような相違は上で論じた多型に対応しうる。好ましい実施態様では、所望のあらゆる相同配列を生ずるように、縮重した塩基が設計され又は少なくとも一つの変異型核酸配列に組み込まれる。
【０１６８】
多数の多型をカバーしようと意図する場合、単一の合成ポリヌクレオチドではなく、全ての変異型セグメントをコードする複数の合成ポリヌクレオチドを構築することが好ましい。例えば、多型ポリペプチドの間に８５％未満の相同性がある場合、２以上の合成ポリヌクレオチドを構築することが好ましい。
【０１６９】
該方法は、それが宿主細胞により効率的に翻訳されるように該合成ポリヌクレオチドのコドン組成を最適化する工程をさらに含むことが好ましい。この点で、異なるコドンの翻訳効率が生物の間で変動し、そしてコドン利用におけるこのような相違が特定生物におけるタンパク質発現のレベルを高めるために利用することができることが良く知られている。この点で、哺乳動物宿主細胞におけるウイルスポリペプチドの発現を高めるため同義のコドンを持つ親ポリヌクレオチドに存在するコドンの置き換えを開示するシードら（国際公開ＷＯ９６／０９３７８）を参照しうる。コドン最適化のためには、第１又は第２最多使用頻度コドンが用いられることが好ましい。
【０１７０】
制限部位に依存することなく、イン・ビトロで突然変異ＤＮＡ断片を直接形成させる、ＰＣＲによるＤＮＡ配列の組み換え法であるオーバーラップ伸長による遺伝子スプライシング、即ち「遺伝子ＳＯＥｉｎｇ」（上掲）は、合成ポリヌクレオチドの構築のために使用することが好ましい。プライマーの５’末端に組み込まれた配列を改変することにより、ＰＣＲ生産物の如何なる対も、一端が共通の配列を共有するように作製することができる。ＰＣＲ条件の下では、該共通の配列は二つの異なる断片由来の鎖を相互にハイブリダイズさせオーバーラップを形成させる。ＤＮＡポリメラーゼによるこのオーバーラップの伸長により、組換え分子が生成する。しかしながら、長い合成構築物における問題は、合成の間に突然変異が一般に増幅された生産物の中に組み込まれるということである。この場合には、該合成の種々の工程でリゾルベース処理を行なうことが好ましい。リゾルベースはバクテリオファージにコードされ、二本鎖ＤＮＡの破壊又は誤対合を認識するエンドヌクレアーゼであり、主にホリデイ結合を解くためにバクテリオファージにより用いられる（ミズウチ，１９８２、ユイルら， １９９５） 。例えば、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは合成ＤＮＡ構築の中で突然変異を認識し転化した二本鎖ＤＮＡを切断するために用いることができる。突然変異ＤＮＡ鎖を、次いで突然変異していない即ち正しいＤＮＡ配列とハイブリダイズさせる。これはＤＮＡ塩基の誤対合を生ずる。この誤対合した塩基はリゾルベースにより認識される。リゾルベースは次いでこのＤＮＡを近くで切断し、正しくハイブリダイズした無傷の配列のみを残す。誤りが下流の合成生産物に組み込まれないように、スプライシング又は増幅の間に熱安定なリゾルベース酵素を用いることが好ましい。
【０１７１】
本発明の合成ポリヌクレオチドは、例えば、上掲セクション２に記載したような合成構築物の形で調節ポリヌクレオチドに機能しうるように連結することができる。本発明の合成構築物はとりわけ核酸ワクチンとしての有用性を有する。調節ポリヌクレオチド及び合成構築物の選択は意図する宿主に依存する。
【０１７２】
本発明の合成ポリペプチドの発現のための典型的発現ベクターは、例えばアレンら（２０００， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４（９）： ４９６８−４９７８）により記述された改変アンカラ・ワクシニアウイルス、例えばボイル及びクーパー（１９８８， Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ． １０： ３４３−３５６） により記述された鶏痘ウイルス、及びフォングらにより米国特許第６，０５１，４２８号で記述された単純ヘルペス・アンプリコンを含むが、これらに限定されない。または、好ましくは大量のＤＮＡ又はＲＮＡ配列情報を受容できるアデノウイルス及びエプスタイン−バールウイルスのベクターが使用できる。
【０１７３】
合成ポリペプチドの発現に利用できる好ましいプロモーター配列には、例えばクマール及びボイル（１９９０， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９： １５１−１５８）により開示されたＰ７．５ 又はＰＥ／Ｌプロモーター、ＣＭＶ及びＲＳＶプロモーターが含まれる。
【０１７４】
該合成構築物は、任意選択的に、免疫刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む。この免疫刺激分子は該合成ポリペプチドの融合相手でありうる。または、免疫刺激分子は該合成ポリペプチドとは別に翻訳されうる。該免疫刺激分子は一般的な免疫刺激ぺプチド配列を含むことが好ましい。例えば、該免疫刺激ぺプチド配列は、例えばブレットら（１９９３， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３： １６０８−１６１４） により開示されたイェルシニア・スピーシーズ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｓｐｐ） 細菌由来のインバシン（Ｉｎｖａｓｉｎ）タンパク質（Ｉｎｖ）のドメインを含みうる。この免疫刺激性は、このインバシンドメインがＴ細胞、とりわけ活性型免疫即ち記憶Ｔ細胞上に存在するβ１インテグリン分子と相互作用する能力から生ずる。合成ポリペプチドへの連結のためのインバシン（Ｉｎｖ）ドメインの好ましい実施態様は米国特許第５，７５９，５５１号で既に記述された。該Ｉｎｖドメインは、Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ（配列番号：１４６７）の配列を有し、又は別のイェルシニア・スピーシーズのインバシンタンパク質の対応する領域由来のその免疫刺激性の相同体である。このような相同体は、したがって、株ごとの変異に合わせるためのアミノ酸残基の置換、欠失又は挿入を含みうる、但し、該相同体が免疫刺激性を保持することを条件とする。一般的免疫刺激配列はスペーサー配列により該合成ポリペプチドに任意選択的に連結されうる。
【０１７５】
別の実施態様では、該免疫刺激分子は、好ましくはＴ細胞共刺激分子である免疫刺激膜分子又は免疫刺激可溶性分子を含みうる。該Ｔ細胞共刺激分子はＢ７分子又はその生物活性断片、又はこれらの変異型若しくは誘導体であることが好ましい。該Ｂ７分子はＢ７−１及びＢ７−２を含むが、これらに限定されない。該Ｂ７分子はＢ７−１であることが好ましい。また、該Ｔ細胞共刺激分子はＩＣＡＭ−１及びＩＣＡＭ−２などのＩＣＡＭ分子でありうる。
【０１７６】
別の実施態様では、該免疫刺激分子はサイトカインであることができる。サイトカインには、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、及びインターフェロンが含まれるが、これらに限定されない。または、該免疫刺激分子は例えばクリーグにより米国特許第６，００８，２００号で開示された免疫調節オリゴヌクレオチドを含みうる。
【０１７７】
該合成ポリヌクレオチドの大きさは、宿主細胞が転写し、翻訳し、又はプロテアーゼ加水分解処理し、そして免疫系にエピトープを提示する能力を超えないことが好ましい。当分野の実務家も、該合成ポリヌクレオチドの大きさが宿主細胞において該合成ポリヌクレオチドを発現する発現ベクターの能力に強い影響を与えることを認識する。この関係で、ＤＮＡワクチン注射の効力は２０ｋｂを超える発現ベクターでは減少することが知られている。このような状況では、単一の大きな合成構築物ではなく、より小さな合成構築物の多数を利用することが好ましい。
【０１７８】
４．免疫増強性組成物
本発明はセクション２で述べた合成ポリペプチド、及びセクション３で述べた合成ポリヌクレオチド又は合成構築物からなる群より選択される免疫増強物質を、薬学的に許容しうる担体と共に含む組成物をも意図する。一つ以上の免疫増強物質が免疫増強組成物の調製における活性物質として使用できる。このような調製には、当業者に知られた日常的方法が使用される。典型的には、このような組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして注射可能なものとして調製され、注射前に液体にする溶液若しくは懸濁液に適した固体形も調製されうる。該調製物は乳化剤としてもよい。活性免疫原成分はしばしば薬学的に許容しうるそして該活性成分と禁忌でない賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、など及びそれらの混合物である。さらに、所望ならば、該ワクチンは加湿剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、及び／又はワクチンの有効性を高めるアジュバントなどの補助的物質を少量含んでもよい。有効でありうるアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｕｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７， ｎｏｒ−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ １９８３Ａ， ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、及び２％スクアレン／トゥイーン８０乳剤中に細菌から抽出された３成分、モノホスホリルリピドＡ、ジミコール酸トレハロース及び細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含むＲＩＢＩが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、アジュバントの有効性は該組成物の投与から生ずる抗体であって、該組成物で処理された細胞により提示される一つ以上の抗原に対する抗体、の量を測定することにより求められる。
【０１７９】
該免疫増強物質は中性形若しくは塩形として組成物中に処方される。薬学的に許容しうる塩としては、酸付加塩（ぺプチドの遊離のアミノ基で形成される）及び、例えば塩酸若しくはリン酸などの無機酸とで形成される酸付加塩、又は酢酸、蓚酸、酒石酸、マレイン酸、などの有機酸とで形成される酸付加塩が挙げられる。遊離のカルボキシル基とで形成される塩は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、若しくは水酸化第二鉄、などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基からも誘導されうる。
【０１８０】
望むならば、徐放若しくは間欠性放出に適した免疫増強物質を含む装置若しくは組成物が効果的に体内に埋め込まれ、又は体内へのかかる物質の比較的緩和な放出のためにそこに局部的に適用されうるであろう。
【０１８１】
該組成物は、例えば皮下か又は筋肉内に注射により腹腔内に便利に投与される。他の投与方式に適するさらなる製剤には座薬が含まれ、場合によっては経口剤が含まれる。座薬については、例えば、ポリアルキレングリコール、又はトリグリセリドなどの従来形の結合剤及び担体が含まれうる。かかる座薬は、０．５ ％〜１０％、好ましくは １％〜 ２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成しうる。経口用製剤には、例えば薬学グレードのマンニトール、乳糖、澱粉、炭酸マグネシウム、などの通常用いられる賦形剤が含められる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、徐放剤又は粉末の形状をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含む。
【０１８２】
該哺乳動物、とりわけヒトに遺伝子治療構築物を投与するには、直接の経口摂取を介する送達、全身注射、又は選択された組織（単数又は複数）若しくは細胞への送達、又は該哺乳動物若しくは適合する供与体から単離された細胞に送達することによる間接投与が含まれうる。後者のアプローチの１例は、幹細胞治療であろう。この場合、成長及び分化の能力を有する単離された幹細胞がＳｏｘ１８核酸を含むベクターでトランスフェクトされる。該幹細胞は一定期間培養され、次いで治療されるべき哺乳動物に移送される。
【０１８３】
核酸に基づく組成物に関しては、かかる組成物の送達の全ての方式が本発明で意図される。動物の細胞若しくは組織へのこれらの組成物の送達は、例えば、微小投射砲撃、リポソーム媒介トランスフェクション（例えば、リポフェクチン又はリポフェクタミン）、電気穿孔法、リン酸カルシウム、又はＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクションにより促進されうる。代わりの実施態様では、合成構築物は、当分野で知られているように、「裸のＤＮＡ」組成物の形状で治療的若しくは予防的組成物として使用されうる。適切な送達法の議論は「分子生物学のカレントプロトコル」（アウスベルら編，ジョン・ウィリー＆サンズ・インク．， １９９７ 版） の第９章、又はインターネットサイト，ＤＮＡｖａｃｃｉｎｅ．ｃｏｍ．上に見出される。該組成物は皮内送達（例えば、ｐａｎｊｅｔ（商標）送達を用いて）又は筋肉内送達により投与されうる。
【０１８４】
該合成ポリヌクレオチドを標的細胞中に導入する工程は、意図する使用及び種に応じて異なり、１以上の非ウイルスベクター及びウイルスベクター、陽イオン性リポソーム、レトロウイルス、及び例えばマリガン，Ｒ．Ｃ．（１９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０ ９２６−９３２） に記載されたアデノウイルスを含むことができる。この文献は参照により本明細書にインコーポレートされる。このような方法は、例えば、下記のものを含む。
【０１８５】
Ａ．注射（ウォルフら，１９９０， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７ １４６５−１４６８ 、これは参照により本明細書にインコーポレートされる） 、外科的埋め込み、点滴注入、又は任意の他の手段による合成ポリヌクレオチドの局部適用。この方法は、注射、外科的埋め込み、点滴注入、又は任意の他の手段による、該治療の有効性を増加させるように該合成ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質に応答する細胞の局部適用と組み合わせて使用することもできる。この方法は、注射、外科的埋め込み、点滴注入、又は任意の他の手段による、該タンパク質の活性に要求される別の因子若しくは因子群の局部適用と組み合わせて使用することもできる。
【０１８６】
Ｂ．ＤＮＡ（カラブレッタら， １９９３， Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ． Ｒｅｖ． １９ １６９−１７９ 、これは参照により本明細書にインコーポレートされる） 若しくはＲＮＡ単独、又はリポソーム（ズーら，１９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１： ２０９−２１２、これは参照により本明細書にインコーポレートされる）、ウイルスキャプシド若しくはナノ粒子（バートリングら，１９９１， Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３ ３９０−４０５、これは参照により本明細書にインコーポレートされる） との組み合わせ、又は任意の他の送達媒介体との組み合わせ、での注射による一般的全身送達。該合成ポリヌクレオチドを標的化分子（例えば、抗体を用いるいわゆる，「マジックビュレット」アプローチ）を連結することにより、又は注射、外科的埋め込み、又は任意の他の手段による、該合成ポリヌクレオチドをコードするタンパク質の活性に要求される別の因子若しくは因子群の局部的適用により、又は該タンパク質に応答する細胞の局部適用により改良された標的化が達成されるかも知れない。
【０１８７】
Ｃ．細胞での該合成ポリヌクレオチドの発現を増加させるようなトランスフェクション（例えば、リン酸カルシウムの存在下で， チェンら，１９８７，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７ ２７４５−２７５２、又は陽イオン性リピド及びポリアミンの存在下で， ローズら， １９９１， ＢｉｏＴｅｃｈ． １０ ５２０−５２５ 、これらの文献は参照により本明細書にインコーポレートされる）、感染、注射、電気穿孔法（シゲカワら，１９８８， ＢｉｏＴｅｃｈ． ６ ７４２−７５１、これは参照により本明細書にインコーポレートされる）又は任意の他の方法により、エクス・ビボで改変された該細胞の注射又は埋め込み又は任意の手段による送達。該改変はプラスミド、バクテリオファージ、コスミド、ウイルス（アデノウイルス若しくはレトロウイルス、マリガン，１９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０ ９２６−９３２ 、ミラー， １９９２， Ｎａｔｕｒｅ ３５７ ４５５−４６０、サーモンズら， １９９３， Ｈｕｍ． Ｇｅｎ． Ｔｈｅｒ， ４ １２９−１４１ 、これらは参照により本明細書にインコーポレートされる）又は他のベクター類、又はリポソーム（ズーら， １９９３， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１ ２０９−２１２ 、これは参照により本明細書にインコーポレートされる）、ウイルスキャプシド若しくはナノ粒子（バートリングら， １９９１， Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３ ３９０−４０５、これは参照により本明細書にインコーポレートされる）などの他の改変物質、又は他の改変の任意の媒介体により媒介され得る。遺伝子若しくは遺伝子生産物の送達ビークルとしての細胞の使用はバールら，１９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４ １５０７−１５１２ 、及びダワンら， １９９１， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４ １５０９−１５１２ により記載されている。これらの文献は参照により本明細書にインコーポレートされる。処理された細胞は、該処理された被検体でのそれらの生存を促進する任意の栄養素、成長因子、マトリックス又は他の物質と組み合わせて送達することができる。
【０１８８】
疾病又は状態を治療及び／又は予防する方法であって、かかる治療を必要とする患者に上に広く述べた組成物の治療上有効量を投与する工程を含む方法も本発明に含まれる。該疾病又は状態は例えば上述の病原性生物又は癌により惹き起こさうる。
【０１８９】
好ましい実施態様では、本発明の免疫増強組成物は癌の治療又は癌の予防に適する。本発明の実施により適切に処理されうるであろう癌としては、肺癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、結腸癌、頭頸部癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、膀胱癌、腎臓癌、骨癌、肝臓癌、食道癌、脳癌、精巣癌、子宮癌、メラノーマ、及び種々の白血病及びリンパ腫が挙げられる。
【０１９０】
別の実施態様では、免疫増強組成物はウイルス感染、細菌感染又は寄生体感染の治療又は予防に適している。本発明によって意図されるウイルス感染には、ＨＩＶ、肝炎、インフルエンザ、日本脳炎ウイルス、エプスタイン−バールウイルス及び呼吸シンシチウムウイルスにより惹き起こされる感染が含まれるが、これらに限定されない。細菌感染には、ナイセリア・スピーシーズ、メニンゴコッカル・スピーシーズ、ヘモフィルス・スピーシーズ、サルモネラ・スピーシーズ、ストレプトコッカル・スピーシーズ、レジオネラ・スピーシーズ、及びミコバクテリウム・スピーシーズによって惹起されるものが含まれるが、これらに限定されない。本発明により包含される寄生体感染には、プラスモディウム・スピーシーズ、シストソーマ・スピーシーズ、ライシュマニア・スピーシーズ、トリパノゾーマ・スピーシーズ、トキソプラズマ・スピーシーズ及びギアルディア・スピーシーズによって惹起されるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９１】
上記の組成物又はワクチンは用量製剤と適合する方法で、そして疾病又は状態から患者を和らげるのに治療上有効な量で、又は該患者における疾病又は状態の発症を防止するのに予防的に有効な量で投与されうる。患者に投与される用量は、本発明の論旨では、血液損失の減少若しくは停止などの患者に有益な応答を経時的に起こすのに十分な量であるべきである。投与されるべき組成物又はワクチンの量は、年齢、性別、体重、及び一般的健康状態を含む治療すべき被検体の状態に左右される。この点で、投与される組成物又はワクチンの正確な量は実務家の判断に依存する。疾病又は状態の治療において投与される組成物又はワクチンの有効な量を決定する際は、医師が時間をかけて疾病又は状態の進行を評価する。いずれにしても、当業者は本発明の組成物又はワクチンの適切な用量を容易に決定しうる。
【０１９２】
好ましい実施態様では、患者に準備させるために第１日に及び８週目に該患者にＤＮＡに基づく免疫増強物質（例えば、１００μｇ）を皮内に送達する。次いで、実質的に同じ免疫増強物質を発現できる組換えポックスウイルス（例えば、１０７ ｐｆｕ／ｍＬ）をそれぞれ１６週及び２４週目にブースターとして皮内に送達する。
【０１９３】
免疫化の有効性は任意の適切な方法を用いて評価しうる。例えば、ぺプチド被覆若しくは組換えウイルスで感染した細胞の上での刺激した脾臓細胞若しくは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を用い、５１Ｃｒ標識化標的細胞を用いるＣＴＬ溶解検定法を採用しうる。このような検定法は例えば霊長類、マウス又はヒトの細胞（アレンら，２０００， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６４（９）： ４９６８−４９７８ 、ウッドベリら， 以下に） を用いて実施しうる。または、免疫化の有効性は、新鮮な及び刺激したＰＢＭＣの両方のクラスＩ・ＨＬＡテトラマー染色（例えば、アレンら，上掲参照）、増殖検定（アレンら，上掲）、Ｅｌｉｓｐｏｔ（商標）検定法、及び細胞内ＩＦＮ−γ染色（アレンら，上掲）、線形Ｂ細胞応答に対するＥＬＩＳＡ検定法、及び該合成ポリヌクレオチドを発現する細胞試料のウェスタンブロットを含むがこれらに限定されない一つ以上の方法を用いて監視しうる。
【０１９４】
５．コンピュータ関連実施態様
本発明の合成ポリペプチド配列又は合成ポリヌクレオチド配列の設計又は構築は、ソフトウェアをプログラムされたコンピュータの助けを借りて容易にすることが好ましい。該ソフトウェアはとりわけ親配列を断片に断片化し、そしてこれらの断片を該親配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結する。本発明の所望の合成分子の構築のための親配列の使用の準備として、それがコンピュータ読み取り可能な書式で記憶されることが必要である。こうして、本発明によれば、親分子（例えば、親ポリペプチド）に関する配列データは機械読み取り可能記憶媒体中に記憶され、それは該親分子の配列を断片に断片化し、ついで該親分子におけるそれらの連結と比べ異なる関係で該断片を一緒に連結するように該データを処理することができる。
【０１９５】
従って、本発明の別の一実施態様は、機械読み取り可能データをコードされるデータ記憶物質を含む機械読み取り可能データ記憶媒体であって、該データの使用についての指令をプログラムされた機械により使用されるとき、親配列を断片に断片化し、そして該親配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係でこれらの断片を一緒に連結する機械読み取り可能データ記憶媒体を提供する。このタイプの好ましい実施態様では、それぞれの断片の配列を逆翻訳して該断片をコードする核酸配列を与え、そして該核酸配列のそれぞれを同じ読み取り枠内で一緒に連結して、該断片が親ポリペプチド配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されているポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を与えることができるものである機械読み取り可能データ記憶媒体が提供される。
【０１９６】
別の実施態様では、本発明は本発明の合成ポリペプチド及び／又は合成ポリヌクレオチドの配列を設計するコンピュータであって、該コンピュータが（ａ）親ポリペプチドの配列を含む機械読み取り可能データをコードされるデータ記憶材料を含む機械読み取り可能データ記憶媒体、（ｂ）該機械読み取り可能データの処理についての指令を記憶するためのワーキングメモリ、（ｃ）該ワーキングメモリ及び該機械読み取り可能データ記憶媒体に連結しており、且つ、該機械読み取り可能データを該合成ポリペプチド配列及び／又は該合成ポリヌクレオチド配列に処理するための中央処理装置、及び（ｄ）該中央処理装置に連結しており、且つ、該合成ポリペプチド配列及び／又は該合成ポリヌクレオチド配列を受け入れるための出力ハードウェアを含むものであるコンピュータを包含する。
【０１９７】
さらに別の実施態様では、本発明は、本発明の合成ポリヌクレオチドの配列を設計するためのコンピュータプログラム生産物であって、親ポリペプチドの配列を入力として受け入れるコード、該親ポリペプチドの配列を断片に断片化するコード、それぞれの断片の配列を逆翻訳して該断片をコードする核酸配列を与えるコード、該核酸配列のそれぞれを同じ読み取り枠内で一緒に連結してポリヌクレオチド配列を与えるコードであって、該ポリヌクレオチド配列が該断片が該親ポリペプチド配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されているポリペプチド配列をコードするものであるコード、及び該コード類を記憶するコンピュータ読み取り可能媒体を含むコンピュータプログラム生産物を意図する。
【０１９８】
これらの実施態様の様相は図２３に示してある。図２３は、中央処理装置（「ＣＰＵ」）２０、例えばＲＡＭ（ランダム・アクセス・メモリ）又は「コア」メモリでもよいワーキングメモリ２２、大量記憶メモリ２４（１以上のディスクドライブ又はＣＤ−ＲＯＭドライブなど）、１以上の陰極線管（「ＣＲＴ」）表示用端末装置２６、１以上のキーボード２８、１以上の入力回線３０、及び１以上の出力回線４０を含み、これらの全てがバス５０により従来型の双方向システムにより相互連結されているコンピュータ１１を含むシステム１０を示す。
【０１９９】
入力回線３０によりコンピュータ１１に連結されている入力ハードウェア３６は種々の方法で実行しうる。例えば、本発明の機械読み取り可能データは電話回線又は専用データ回線３４により連結されたモデム（単数又は複数）３２の使用を経由して入力されうる。代替的に若しくは追加的に、該入力ハードウェア３６はＣＤを含んでもよい。または、表示用端末装置２６と連結したＲＯＭドライブ又はディスクドライブ２４、キーボード２８も入力装置として使用しうる。
【０２００】
出力回線４０によりコンピュータ１１と連結した出力ハードウェア４６は同様に従来型の装置により実行しうる。例を挙げれば、出力ハードウェア４６は本明細書に記載の合成ポリヌクレオチド配列又は合成ポリペプチド配列を表示するためのＣＲＴ表示用端末装置２６を含みうる。出力ハードウェアは、ハードコピーを作製するためのプリンター４２、又はシステムの出力を後の使用のために記憶するためのディスクドライブ２４を含んでもよいかも知れない。
【０２０１】
操作中に、ＣＰＵ２０は種々の入力及び出力装置３６、４６の使用を調整し、大量記憶メモリ２４からのデータアクセス及びワーキングメモリ２２へのアクセス及びワーキングメモリからのアクセスを調整し、そしてデータ処理工程の順序を決定する。本明細書の機械読み取り可能データを処理するために幾つかのプログラムを使用しうる。代表的なプログラムは、例えば、図２４に例示したフロー図に概述した工程を使用しうる。大まかに述べれば、これらの工程には、（１）少なくとも一つの親ポリペプチド配列を入力する工程、（２）任意選択的にポリペプチド配列それぞれの末端にアラニンスペーサーを付加する工程、（３）該ポリペプチド配列を断片（例えば、３０アミノ酸長）に断片化する工程、該断片は重なり合っている（例えば、１５アミノ酸まで）ことが好ましい、（４）該断片を逆翻訳して各断片に対する核酸配列を与える工程であって、該逆翻訳では細胞型に対する第１及び第２最適翻訳効率コドンを使用することが好ましく、該コドンが連続する断片の重なりにおいて相互に枠から交替してはみ出すことが好ましい工程、（５）該断片を無作為に再配置する工程、（６）再配置された断片が親ポリペプチド配列の少なくとも一部を再生するか否かをチェックする工程、（７）再配置された断片が該少なくとも一部を再生する場合、該断片の無作為再配置を繰り返す工程、又はそうではなく（８）該再配置された断片を一緒に連結して合成ポリペプチド配列及び／又は合成ポリヌクレオチド配列を作製する工程、及び（９）該合成ポリペプチド配列及び／又は合成ポリヌクレオチド配列を出力する工程が含まれる。とりわけ上述の工程を用いるアルゴリズムの一例を図２５に示す。例を挙げれば、このアルゴリズムは、図２６及び図２７に例示したようなＣ１ａ肝炎及びメラノーマに対する本発明の合成ポリヌクレオチド及び合成ポリペプチドの設計に使用された。
【０２０２】
図２８は、本発明の合成分子を設計するための、機械読み取り可能データ又は一連の指令をコードでき、且つ図２３のシステム１０などのシステムにより実行されうる磁気データ記憶媒体１００の断面図を示す。媒体１００は従来型のフレキシブルディスク又はハードディスクであることができ、それは、従来型であってもよい適切な基板１０１、及び従来型であってもよい一面又は両面上の、その極性又は方向が磁気的に変化できる磁気ドメイン（可視的ではない）を含む適切な被覆１０２を有するものであることができる。媒体１００はディスクドライブ又は他のデータ記憶装置２４の軸を受け入れるための開口（示してない）をも有する。媒体１００の被覆１０２の磁気ドメインは、図２３のシステム１０などのシステムにより実行するために、従来型であってもよい方式で、本明細書に記載のものなどの機械読み取り可能データをコードするように分極され方向付けされる。
【０２０３】
図２９は光学読み取り可能データ記憶媒体１１０の断面を示す。媒体１１０は、本明細書の合成分子を設計するための、かかる機械読み取り可能データ、又は一連の指令をコードすることもでき、図２３のシステム１０などのシステムにより実行することができる。媒体１１０は従来型のコンパクト・ディスク・リード・オンリーメモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）又は光学的に読み取り可能で且つ光磁気的に書き込み可能な光磁気ディスクなどの再書き込み可能媒体であることができる。媒体１００は、従来型であってもよい適切な基板１１１、及び従来型であってもよい、通常は基板１１１の一方の側の適切な被覆１１２を持つことが好ましい。
【０２０４】
ＣＤ−ＲＯＭの場合には、周知のように、被覆１１２は反射性であり、機械読み取り可能データをコードするために複数のピット１１３で刻印される。被覆１１２の表面でレーザー光線を反射することによりピットの配置が読まれる。実質的には透過性であることが好ましい保護被覆１１４が被覆１１２の表面に重層される。
【０２０５】
光磁気ディスクの場合には、周知のように、被覆１１２はピット１１３を持たず、その代わりにその極性又は方向がレーザーなどにより（示してない）ある温度を超えて加熱されると磁気的に変化できる磁気ドメインを複数持っている。該ドメインの方向は被覆１１２から反射されたレーザー光の偏光を測定することにより読むことができる。該ドメインの配置は上述のように該データをコードする。
【０２０６】
本発明が容易に理解され、実用的効果を理解するために、以下に特に好ましい非限定的実施態様を記載する。
【０２０７】
実施例
ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの調製
実験プロトコル
プラスミド
プラスミドｐＤＮＡＶａｃｃはアンピシリン耐性であり、且つＣＭＶプロモーター及びエンハンサー、合成イントロン、多数クローニング部位（ＭＣＳ）及びＳＶ４０ポリＡシグナル配列（トムソンら，１９９８） を含む発現カセットを含む。プラスミドｐＴＫ７．５ は選択カセット、ポックスウイルス７．５ 初期／後期プロモーター及びワクシニアウイルスＴＫ遺伝子配列が両側に隣接したＭＣＳを含む。
【０２０８】
組換えワクシニアウイルス
ＨＩＶ−１のｇａｇ、ｅｎｖ（ＩＩＢ）及びｐｏｌ（ＬＡＩ）遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスは先に述べたように使用し、ＶＶ−ＧＡＧ、ＶＶ−ＰＯＬ、ＶＶ−ＥＮＶ（ウッドベリら，１９９９、ケントら， １９９８） と表示した。
【０２０９】
マーカー・レスキュー組換え
Ｓａｖｉｎｅ構築物を含む組換えワクシニアウイルスは、先に記述されたプロトコル（ボイルら，１９８５） を用いるマーカー・レスキュー組換えにより作製した。プラーク精製ウイルスはサザンブロット及びＰＣＲによりＴＫ現象型及び適切なゲノム配置について試験した。
【０２１０】
オリゴヌクレオチド
脱塩した５０ナノモルの量のオリゴヌクレオチドをライフ・テクノロジーズから購入した。短いオリゴヌクレオチドを１００μＬの水に再懸濁し、その濃度を測定し、次いでＰＣＲ又は配列決定反応に使用するため２０μＭまで希釈した。スプライシング反応のための長いオリゴヌクレオチドは２０μＬのホルムアミド添加緩衝液中で９４℃で５分間変性させ、次いで０．５μＬを６％ポリアクリルアミドゲル上でゲル精製した。完全長のオリゴヌクレオチドを含むゲルのスライスをエチジウム・ブロミドで可視化し、切取り、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（商標） 管に取り、２００ μＬの水と混合した後、１ ｍＬ注射器のプランジャーで砕いた。スプライシング反応に使用する前に、粉砕したゲルを適当な容積の緩衝液中に再懸濁し、この再懸濁液の１〜２μＬを直接スプライシング反応に使用した。
【０２１１】
配列決定
配列決定はダイ・ターミネーター配列決定反応を用いて行い、ジョン・カーティン・スクール・オブ・メディカル・リサーチのバイオメディカル・リソース・ファシリティによりＡＢＩ自動配列決定装置を用いて分析された。
【０２１２】
ＨＩＶ感染患者からのリンパ球の再刺激
ＶＶ−ＡＣ１＋ＶＶ−ＢＣ１（プール１）又はＶＶ−ＡＣ２＋ＶＶ−ＢＣ２＋ＶＶ−ＣＣ２（プール２）を含む二つのプールの組換えワクシニアウイルスを用いてＨＩＶ感染患者の血液試料からのリンパ球を再刺激した。簡単に述べれば、ＣＴＬ細胞系統をＨＩＶ感染供与者のＰＢＭＣから作製した。総ＰＢＭＣの５分の１がプール１又はプール２ワクシニアウイルスのいずれかで感染した。次いでこれを元の細胞懸濁液に戻した。次いで、該感染細胞懸濁液をＩＬ−７と共に１週間培養した。
【０２１３】
ＣＴＬ検定
再刺激されたＰＢＭＣを標準５１Ｃｒ放出ＣＴＬ検定におけるエフェクターとして用いた。標的は、次のウイルス、即ち、プール１、プール２、ＶＶ−ＧＡＧ、ＶＶ−ＰＯＬ又はＶＶ−ＥＮＶで感染させた自己由来のＥＢＶで形質転換したリンパ芽球細胞系統（ＬＣＬ）であった。検定の対照には、感染していない標的、ＶＶ−ｌａｃＺ（ウイルス対照）で感染させた標的、及びＫ５６２細胞が含まれた。
【０２１４】
結果
ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの設計
Ｓａｖｉｎｅ戦術の主な目的は、潜在的Ｔ細胞エピトープが無傷で残りそしてワクチン又は治療が極めて安全であるように、可能な限り多くの病原体又は癌からのタンパク質配列情報を含めることである。ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅはこの戦術を他の戦術と比較するためだけでなく、最大限可能な集団をカバーし、主要なＨＩＶクレードの要求を満たすであろうＨＩＶワクチンを作製するためにもここに記載されている。
【０２１５】
合成アプローチを用いるという多くの利点を開拓するためにまず幾つかの設計基準が決定された。一つの利点は、これらのワクチンを設計するためにタンパク質のコンセンサス配列を使用することが可能なことである。ＨＩＶのように高度に可変性のウイルスのコンセンサス配列を用いることは、より良好なワクチン網羅性を与えるはずである。何故なら、個々のウイルス単離物の配列は他のウイルス単離物の大多数に対してＣＴＬを誘導するエピトープを失ってしまっているからである。こうして、個々の単離物の配列ではなく各ＨＩＶクレードのコンセンサス配列を使用することは、より良好なワクチン網羅性を与える筈である。この一歩をさらに進めれば、全てのＨＩＶクレードの要求を満たすコンセンサス配列は、個々のクレードに対するコンセンサス配列だけを使用するよりも理論的にはより良好な網羅性を与えるはずである。しかしながら、このような配列を設計する前に、もし該種々のクレードがそれらの相対的重要性により最初にランク付けされたならば、より適切で注目すべきＨＩＶワクチンが構築されるかも知れないと決定された。このようなランク付けを行なうために、次の問題が検討された。即ち、各クレードの現在の罹患率、各クレードの増加速度、及び該ＨＩＶ流行（図１及び図２）と闘う世界の種々の領域の能力である。これらの基準から、次のランク付けが得られた。即ち、クレードＥ≧クレードＡ＞クレードＣ＞クレードＢ＞クレードＤ＞他のクレードである。クレードＥとＡはほぼ同じであると考えられた。これらはエンベロープのタンパク質配列がかなり異なる点を除き、極めて似ているからである。
【０２１６】
設計された配列を合成する場合の別の利点は、それらの設計に縮重した配列を組み込むことが可能であることである。ＨＩＶの場合には、これは、種々のＨＩＶクレード及び単離物の要求を満たす該ワクチンの能力を改良するため、２以上のアミノ酸を種々の位置に含め得ることを意味する。異なるＨＩＶクレードにおける突然変異、そして個々の単離物の配列における突然変異も、特定のＴ細胞エピトープをほとんど破壊する一方で、新たな潜在的に有用なエピトープをその側に形成できる（ゴールダーら，１９９７） 結果となるから、網羅性は改良される。縮重アミノ酸配列を組み込むことは、しかし、２以上の構築物が一緒に作製され混合されねばならないことをも意味する。要求される構築物の数は突然変異が該設計中に組み込まれる頻度に依存する。このアプローチは余分の構築物の構築を必要とする一方、これらの構築物は長い縮重オリゴヌクレオチドの同じセットから調製でき、このような相当のクレード間網羅性を得るための費用を顕著に減らすことができる。
【０２１７】
該設計の中にアミノ酸の突然変異を組み込むために、以下に示す理論的に全ての組み合わせが含まれるように最大８個の構築物が必要となるであろうことを意味した一組の縮重規則を開発した。即ち、１）９個のアミノ酸（即ち、ＣＴＬエピトープに存在する）からなる任意のグループ内の３個（又はより少なく）の位置における２個のアミノ酸、２）９個のアミノ酸からなる任意のグループ内の１個の位置における３個のアミノ酸及び別の１個（又はなし）の位置における２個のアミノ酸、３）９個のアミノ酸からなる任意のグループ内の１個の位置における４個のアミノ酸及び別の１個（又はなし）の位置における２個のアミノ酸である。これらの規則が９個のアミノ酸（ＣＴＬエピトープの大きさの平均）に適用されクラスＩＩ限定エピトープの要求を満たすアミノ酸配列のより大きな範囲に適用しなかった理由は、クラスＩＩ限定エピトープが一般に中央に９個のアミノ酸の核となる配列を持つからである。これらのアミノ酸は、配列とはほとんど無関係な方式でクラスＩＩ・ＭＨＣ抗原のいずれかの側と会合することにより、結合を安定化する余分の隣接配列を持つクラスＩＩ・ＭＨＣ分子に特異的に結合する（ブラウンら，１９９３） 。
【０２１８】
上述のＨＩＶクレードのランク付け、アミノ酸縮重規則、及び一部の状況ではアミノ酸間の類似性を用いて、そしてロスアラモスＨＩＶ配列データべースにより編集されたＨＩＶクレードのそれぞれのコンセンサスタンパク質配列を用いて、各ＨＩＶタンパク質に対する縮重コンセンサスタンパク質配列を設計した（図３〜１１）（ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース，１９９７） 。一部の状況では、上の設計基準のそれぞれが適用される順序が変更されたことを指摘することは重要である。毎回これがなされたが、第１の目的はクレード間の相違の要求を満たす該Ｓａｖｉｎｅの能力を強化することであった。クレードＥ及びクレードＣの一部のＨＩＶタンパク質のコンセンサス配列が入手できなかった場合には、それぞれクレードＥ及びクレードＣに対する二つの単離された配列、ゲンバンク受託番号Ｕ５１１８９ 及びＵ４６０１６ を使用した（ガオら，１９９６、サルミネンら， １９９６） 。ＨＩＶエンベロープタンパク質の超可変領域及び一部の場合にはこれらの領域（超可変領域１〜２及び３〜５）の間のコンセンサス配列の設計は困難であった。そこでこれらの領域はワクチン設計から除外された。
【０２１９】
各ＨＩＶタンパク質に対して一旦縮重コンセンサス配列が設計されると、次に該タンパク質配列の全てを安全に該ワクチン中に組み込むためのアプローチが決定された。ワクチンが安全であることを確実にするための一つの便利なアプローチは体系的に断片化し、そして該タンパク質配列を無作為に一緒に再配置して該タンパク質の構造及び機能を排除若しくは他の方法で改変することである。しかしながら、このタンパク質配列はなお免疫学的に機能性でなければならず、このことは該配列を断片化するために使用される方法が潜在的なエピトープを破壊してはならないことを意味する。タンパク質配列を体系的に断片化する最良のアプローチに基づいて決定するため、使用された主要な基準はＴエピトープの大きさ及びそれらの処理の要件であった。クラスＩ限定Ｔ細胞エピトープは８〜１０のアミノ酸長であり、それが非天然の両側残基に隣接して置かれた場合、それらの効率的な処理及び提示を確実にするためには、両側に２〜３の天然アミノ酸を一般に必要とする（デルヴァルら，１９９１、トムソンら， １９９５） 。クラスＩＩ限定Ｔ細胞エピトープは、１２〜２５アミノ酸長の範囲であり、処理のために天然の残基が両側にあることを必要とするようであるが、それらの処理経路の複雑さの故に全ての場合において両側の天然残基役割を排除することは困難である（トムソンら，１９９８） 。また、クラスＩＩ限定エピトープは、ＣＴＬエピトープより大きいにもかかわらず、一般に９〜１０アミノ酸の核配列を有しており、これらのアミノ酸は配列特異的な方式でＭＨＣ分子に結合する。こうして、現在の知識に基づいて、有利なアプローチは、断片境界に跨がって存在するかも知れない潜在的エピトープが失われないことを確実にするため、そして断片境界の近くにあり、隣接断片の阻害アミノ酸の側若しくは近くに置かれたＣＴＬエピトープが効率的に処理されることを確実にするため、少なくとも１５のアミノ酸により該断片を重なり合わせることであると決定された。
該断片の最適な大きさを決定する際に、使用された主な基準は、サイズがタンパク質の構造及び機能に最大限の破壊を惹き起こす程に十分小さく、しかし、さらに不必要な重複が一切なく可能な限り効率的に配列情報をカバーする程に十分大きくなければならないということであった。これらの基準に基づき、該断片は重なりの大きさの２倍となり、この場合には３０アミノ酸長となるであろう。
【０２２０】
次に設計された縮重タンパク質配列を、３０アミノ酸長で且つ１５アミノ酸だけ重なりあう断片に分離した。これらの断片がエピトープ処理を阻止できるアミノ酸（デルヴァルら，１９９１） に直接隣接して置かれないことを確実にするため、各タンパク質の最初の断片及び最後の断片の最初及び最後又はエンベロープタンパク質セグメントに二つのアラニンアミノ酸を添加した。次の工程は、各タンパク質配列をＤＮＡに逆翻訳することであった。同一若しくは相同なアミノ酸配列のタンデム反復をコードするＤＮＡ配列を構築することになる場合には、該Ｓａｖｉｎｅの発現を最大化するために、ＤＮＡ配列の重複を回避した。この点で、第１及び第２最多共通使用の哺乳動物コドン（図１２に示す）をこれらの反復領域のアミノ酸に割当てた。第１コドンを反復配列の一方のアミノ酸をコードするために使用し、第２のしかし同義のコドンを他方の反復配列に使用した（例えば、図１３のｇａｇＨＩＶタンパク質を参照）。設計されたアミノ酸突然変異を準備するために、２７塩基の任意のグループの幾つかの位置に、ＩＵＰＡＣのＤＮＡコードを用いて２以上の塩基を割り当てた（３塩基を超える変化はなし）（８個の可能な組み合わせ）（図１２）。必要な縮重塩基が多過ぎるためアミノ酸の特定の組み合わせを組み込み得ない場合には、上に略述したタンパク質コンセンサス設計規則に従って、アミノ酸縮重の一部若しくは全てを除去した。また、縮重コドンが停止コドンをコードするか否かを決定するため縮重コドンをチェックした。もし停止コドンを回避し得なかった場合は、上に概述したタンパク質コンセンサス設計規則に従って、このアミノ酸縮重も再び簡単化された。
【０２２１】
次に、設計されたＤＮＡセグメントを無作為にかき集め、結合して約８４０ｂｐの大きさの２２のサブカセットを作った。付着末端を生ずる制限酵素ＸｂａＩ、ＳｐｅＩ、ＡｖｒＩＩ又はＮｈｅＩの一つに対する部位を組み込む余分のＤＮＡ配列及び３個の追加の塩基対（未成熟タックポリメラーゼ停止を準備するため）を各サブカセットの各末端に添加した（図１４）。これらの余分のＤＮＡ配列の一部も、該サブカセットが連結されそして３個の大きなカセットとして又は一つの完全長タンパク質としてのいずれかで発現され得るように、ＳａｌＩ又はＸｈｏＩの付着制限部位、コザックシグナル配列、及び開始若しくは停止コドンを含んでいた（図１４及び１５）。
【０２２２】
ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅを設計する際に、研究を要した一つの問題は、このような大きなＤＮＡ分子が完全に発現されるであろうか否か、そして該分子の末端近くにコードされているエピトープが免疫系に効率的に提示されるか否かということであった。本発明者らも二つ以上の縮重Ｓａｖｉｎｅ構築物を一緒に混合すると、突然変異した配列を認識するＴ細胞応答を誘導できるということを示そうと望んだ。両方の問題を検討するために、Ａ／ＮＴ／６０／６８株及びＨ２−Ｄｂで制限されたものと比べインフルエンザ株Ａ／ＰＲ／８／３４の７１位及び７２位における二つのアミノ酸だけ異なる縮重ネズミインフルエンザ核タンパク質ＣＴＬエピトープであるＮＰ３６５−３７３をコードするＤＮＡを、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅ設計の末端の最後の停止コドンの前に挿入した（図１５）。本発明者らによる突然変異した配列の組み込みにおける有効性の検討を可能とした、これらの天然に生ずるＮＰ３６５−３７３配列両方の重要なそして通常見られない特徴は、それらがもう一方の配列と交差反応をしないＣＴＬ応答を起こすということである（タウンゼンドら，１９８６） 。これは、通常見られない特徴である。何故なら、突然変異により破壊されないエピトープは通常交差反応をするＣＴＬ応答を誘導するからである。
【０２２３】
各サブカセット（ライフ・テクノロジーズ）の構築を可能にするため、１０長までのオリゴヌクレオチド、１００長までの塩基、及び二つの短い増幅オリゴヌクレオチドを合成した。各オリゴヌクレオチドを設計する際、その３’末端は、そして多くの場合その５’末端も、ＰＣＲスプライシングの間の効率的な伸長を確実にするため、「ｃ」又は「ｇ」のいずれかでなければならなかった。長いオリゴヌクレオチドのそれぞれの重なり領域は、ほぼ５０％Ｇ／Ｃ含量で少なくとも１６ｂｐとなるように設計された。オリゴヌクレオチドの重なりは、後のスプライシングの困難を避けるために、縮重ＤＮＡ塩基が縮重アミノ酸をコードした場所には置かなかった。これがあまりに困難であった場合は、上に概述し図１２に示したタンパク質コンセンサス設計規則に従って、一部の縮重塩基を除去した。図１６は各サブカセットに対するオリゴヌクレオチド設計の１例を示す。
【０２２４】
ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの構築
設計された１０のオリゴヌクレオチドの各グループのうちの５個を、段階的不斉ＰＣＲ（サンドゥーら，１９９２） 及び重なり伸長によるスプライシング（ＳＯＥｉｎｇ）（図１７ａ）を用いて一緒にスプライスした。次いで、各サブカセットをＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＫＳ− 中にクローニングし、そして１６の個々のクローンの配列決定を行なった。変異、欠失、及び挿入は、長いオリゴヌクレオチドのアクリルアミドゲル精製にもかかわらず、各サブカセットのクローンの大部分に存在した。最小の突然変異を持つ機能性のＳａｖｉｎｅを構築するため、挿入も欠失も持たず、従って完全なオープン・リーディング・フレームを持ち、設計されていない突然変異を最小にしか持たない各サブカセットの二つのクローンを使用可能な１６の中から選択した。次いで、このサブカセットをそれらのプラスミドから切り出し、ポリメラーゼ混合物である Ｅｌｏｎｇａｓｅ（商標）（ライフ・テクノロジー） 、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、及び付着性制限酵素ＸｂａＩ／ＳｐｅＩ／ＡｖｒＩＩ／ＮｈｅＩを用いて段階的ＰＣＲ増幅後の連結により連結して、図１４に概述し図１７ｂに示したカセットＡ、Ｂ及びＣの二つのコピーを作製した。これらのカセットに予想された配列を図３０に示す。次いで、各カセットを Ｅｌｏｎｇａｓｅ（商標）でＰＣＲにより再増幅し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＫＳ− 中にクローニングし、そして得られたプラスミドクローンの３個を、全長構築物をカバーするように設計された３６個の配列決定用プライマーのうちの１２個を用いて配列決定した。最小の又はさらなる突然変異を持たないクローンを選択して、ＤＮＡワクチン注射用のプラスミド中に移転させ、又は組換えポックスウイルスを作製するために使用した。各Ｓａｖｉｎｅ構築物における設計された突然変異及び設計されなかった突然変異の数のまとめを表１に示す。
【０２２５】
【表１】
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【０２２６】
配列決定によって得られた二つの構築された全長クローン中に存在する突然変異のまとめである。２クローン中の設計された突然変異、予想される突然変異及び実際に存在する突然変異のそれぞれの数、並びに各カセット及び全長クローン中の設計されなかった突然変異の数が含まれる。
【０２２７】
ＨＩＶ・ＳａｖｉｎｅＤＮＡワクチン及び組換えワクシニアウイルス
ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅ構築物の免疫学的有効性を試験するため、該カセット配列をＤＮＡワクチン及びポックスウイルスベクター中に移転させた。これらのベクターは、以下に述べる免疫学的検定法で別々に使用されるか、又はイン・ビボで強力なＴ細胞応答を形成することが既に示された「プライム−ブースト」プロトコル（ケントら，１９９７） で一緒に使用されるかのいずれかである。
【０２２８】
ＤＮＡワクチン注射用プラスミドは、選択されたプラスミドクローン由来のカセットをＸｂａＩ／ＸｈｏＩ（カセットＡ）又はＸｂａＩ／ＳａｌＩ（カセットＢ及びＣ）で切り出し、それらをＸｂａＩ／ＸｈｏＩで切断したｐＤＮＡＶａｃｃ中に連結してそれぞれｐＤＶＡＣ１、ｐＤＶＡＣ２、ｐＤＶＢＣ１、ｐＤＶＢＣ２、ｐＤＶＣＣ１、ｐＤＶＣＣ２を形成させることにより構築した（図１８ａ）。これらのプラスミドを次にそれらのＸｂａＩ部位にＸｂａＩ／ＡｖｒＩＩを用いてｐＴＵＭＥＲＡ２から切り出した、アデノウイルスＥ１Ａタンパク質（パーソンら，１９８０） 由来の合成小胞体（ＥＲ）シグナル配列をコードするＤＮＡ断片をクローニングすることによりさらに改変した（図１８ａ）。ＥＲシグナル配列はイン・ビボでＣＴＬエピトープ及びＴヘルパーエピトープの両方の提示を強化することが先に示された（イシオカ，Ｇ．Ｙ．，１９９９、トムソンら， １９９８） 。次いで、プラスミドｐＤＶＥＲＡＣ１、ｐＤＶＥＲＢＣ１、ｐＤＶＥＲＣＣ１及びｐＤＶＥＲＡＣ２、ｐＤＶＥＲＢＣ２、ｐＤＶＥＲＣＣ２を一緒に混合してプラスミドのプール１及びプール２をそれぞれ作製した。各プラスミドプールは設計された全長ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの一つのコピーを集合的にコードする。
【０２２９】
ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅ配列を発現する組換えワクシニアウイルスを形成するためのプラスミドは、該選択されたプラスミドクローンからＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ（カセットＡ）又はＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ（カセットＢ及びカセットＣ）を用いて種々のＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅカセットを切り出すことにより構築し、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで切断したマーカー・レスキュープラスミドｐＴＫ７．５ 中にクローニングした。次にこれらのｐＴＫ７．５ 誘導プラスミドを用いて、確立されたプロトコル（ボイルら，１９８５） を用いるマーカー・レスキュー組換えにより組換えワクシニアウイルスを形成させた。こうして、ＶＶ−ＡＣ１、ＶＶ−ＡＣ２、ＶＶ−ＢＣ１、ＶＶ−ＢＣ２、ＶＶ−ＣＣ１及びＶＶ−ＣＣ２を作製した（図１８ｂ）。
【０２３０】
それぞれが全長のＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの生成物をコードするさらに二つのＤＮＡワクチンプラスミドを構築した（図１８ｃ）。簡単に述べれば、カセットＢの二つの生成物をＸｈｏＩで切り出し、ＸｈｏＩ／ＳａｌＩで切断したカセットＡ配列を含む対応する該選択プラスミドクローンの中にクローニングしてそれぞれｐＢＳＡＢ１及びｐＢＳＡＢ２を作製した。ｐＢＳＡＢ１及びｐＢＳＡＢ２中で連結されたＡ／ＢカセットをＸｂａＩ／ＸｈｏＩで切り出し、それぞれｐＤＶＣＣ１及びｐＤＶＣＣ２中にクローニングし、そしてＸｂａＩ／ＸｈｏＩで切断してｐＤＶＦＬ１及びｐＤＶＦＬ２を形成させた。次いで、図１８ａに概述したのと同じクローニング戦術を用いて、ＥＲシグナル配列を含むようにこれらをさらに改変した。
【０２３１】
ＨＩＶ感染患者由来のＨＩＶ特異的リンパ球の再刺激
本発明者らは、ＨＩＶ感染患者からのＨＩＶ特異的ポリクローナルＣＴＬ応答を再刺激するＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの能力を検討した。３名の異なる患者から得たＰＢＭＣを二つのＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅワクシニアウイルスプール（プール１はＶＶ−ＡＣ１及びＶＶ−ＢＣ１を含み、プール２はＶＶ−ＡＣ２、ＶＶ−ＢＣ２及びＶＶ−ＣＣ２を含んでいた）を用いてイン・ビトロで再刺激し、次いでＳａｖｉｎｅワクシニアウイルスプールの一方か又はｇａｇ、ｅｎｖ又はｐｏｌを発現するワクシニアウイルスのいずれかで感染させたＬＣＬに対するＣＴＬ溶解検定に使用した。図１９は、３種の検定の全てにおいて、該ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅウイルスプールが両方とも、天然のＨＩＶ抗原の全体を発現する標的を認識できたが感染させなかった又は対照のワクシニアウイルスで感染させた標的を認識できなかったＨＩＶ特異的ＣＴＬ応答を再刺激したことを明確に示す。さらに、３例全てにおいて、両プールは３種のＨＩＶ天然抗原を全て認識した応答を再刺激した。この結果は、該混合したＳａｖｉｎｅ構築物が単一抗原に基づくワクチンの使用よりもより広い免疫学的網羅を与えることを示唆する。Ｓａｖｉｎｅウイルスプールで感染させた標的のそれぞれの場合における溶解のレベルは、他のいずれの感染標的について記録された溶解よりも有意に高かった。これは多分に、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ、及びここでは分析されなかったがその配列もＳａｖｉｎｅ構築物中に組み込まれている他のＨＩＶ抗原、に対する総合されたＣＴＬ応答を反映するものである。
【０２３２】
ＨＩＶ抗原それぞれのＣＴＬ認識は主に各患者のＨＬＡ背景により制御されており、従ってＨＩＶ抗原全体についてのＣＴＬ溶解のパターンは患者それぞれで異なっている。このＣＴＬ溶解パターンが、ＣＴＬ再刺激に第２Ｓａｖｉｎｅワクシニアウイルスプールを使用した場合に変化しなかったことは興味深い。従って、これらの検定では、本発明者らは、プール１がカセットＣＣ１を発現するワクシニアウイルスを欠如しているにもかかわらず、そして各プールにおけるカセットＡとカセットＢの間に多くのアミノ酸の相違があるにもかかわらず（表１を参照）、プール１とプール２の間の明確な相違を示すことができなかった。
【０２３３】
上述のことから、本発明者らは、新規なワクチン／治療戦略を開発した。一つの実施態様で、病原体又は癌のタンパク質配列を体系的に断片化し、ＤＮＡに逆翻訳し、無作為に再配置し次いで一緒に連結する。次に、設計された合成ＤＮＡ配列を長いオリゴヌクレオチドを用いて構築し、それを様々の送達ベクター中に移転できる。ここで使用されるワクチンベクターは、ＤＮＡワクチンプラスミド及び「プライム−ブースト」プロトコルで一緒に使用すると強力なＴ細胞応答を誘発することが既に示されている（ケントら，１９９７） 組換えポックスウイルスベクターであった。集められた抗原ワクチン即ち「Ｓａｖｉｎｅ」の重要な利点は、該設計のための出発時の配列情報の量が病原体又は癌由来のタンパク質配列の大部分を含めるように容易に拡大でき、それによりワクチン又は治療が所与の集団を可能な最大限まで網羅することを可能とすることである。
【０２３４】
ここで述べる体系的断片化のアプローチの一実施態様は、Ｔ細胞エピトープの大きさ及び処理についての必要条件に基づくものであり、タンパク質配列の構造及び機能に最大の破壊を惹き起こすように設計された。この断片化アプローチは、任意の組み込まれたタンパク質配列からのＴ細胞エピトープの最大可能範囲が存在し、且つ機能的なそしてワクチンの安全性を危うくするタンパク質が存在しないことを確実にする。
【０２３５】
Ｓａｖｉｎｅの別の重要な利点は、タンパク質のコンセンサス配列がそれらの設計に使用できることである。この特徴は、該設計がその配列がかなり変化する病原体抗原又は癌抗原の要求を満たす必要がある場合にだけ適用可能である。ＨＩＶは高度な変異原性のあるウイルスであり、従ってＨＩＶの地域的単離物のみでなく現在のＨＩＶの全世界的流行に関与する主要なＨＩＶクレードをもカバーするような能力を持つワクチンを設計するために、この特徴が広く利用された。ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅを構築するために、一組の長いオリゴヌクレオチドを合成した。これには、該ワクチンが任意の９アミノ酸長における全ての組み合わせを含むために８個の構築物が理論的に必要となるというように縮重塩基を含んでいた。本発明者らはこのアプローチが以下の理由で改良できると信ずる。即ち、１）縮重塩基は理論的には均等に現れるべきであるが、実際には一部の縮重塩基が一方の塩基又は他方の塩基に偏り、構築された二つの全長ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅにおける設計された突然変異の予想頻度よりも低くなった（表１を参照）。２）ＨＩＶクレードコンセンサス配列に実際に存在する配列組み合わせだけがクレードの完全網羅を得るために要求され、従って、必要となる全長構築物の数は減少するであろう。しかしながら、構築物の数を減らすために、別の組の長いオリゴヌクレオチドが合成されねばならず、このような相当のワクチン網羅を可能とできるワクチンを作製するために必要となる費用、時間及び努力は顕著に増加することになろう。
【０２３６】
ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅ合成ＤＮＡ配列の構築の間の重要な問題は、設計されなかった突然変異（以下「非設計突然変異」ともいう）の組み込みであった。最も深刻なタイプの突然変異は挿入、欠失又は停止コドンを生ずるものであった。これらの変化は全て、合成された配列の枠を変化させ及び／又はＳａｖｉｎｅタンパク質の未成熟先端切断を引き起こした。これらのタイプの突然変異は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの構築の間にサブカセット構築及びカセット構築の後に複数のクローンを配列決定して機能性のクローンを選択することにより、除去された。これらの非設計突然変異の主要な起源は、Ｓａｖｉｎｅ合成に使用した該長いオリゴヌクレオチド、それらをゲル精製したにもかかわらず、の中にあった。この問題は初期のサブカセットをより小さくし、それにより各サブカセットクローン中に間違ったオリゴヌクレオチドが組み込まれる可能性を減らすことにより減少させることができるであろう。非設計突然変異の第２の主要な原因はＰＣＲに要求されるＰＣＲサイクル及びサブカセットのリガーゼ媒介連結の数が大きいことであった。サブカセット連結プロセスの間に余分の配列決定及びクローン選択の工程を含めることは、将来の構築物中の非設計突然変異の頻度を減らす助けとなろう。最後に、全ての工程でかかる突然変異の頻度を減らす助けとなるであろう別の方法は、リゾルベース処理を使用することである。リゾルベースは二本鎖ＤＮＡの破壊を認識するバクテリオファージにコードされるエンドヌクレアーゼであって、主にホリデイ結合を分解するためにバクテリオファージにより使用された（ミズウチ，１９８２、ユーイルら， １９９５） 。Ｔ７エンドヌクレアーゼＩは既に本発明者らによって、合成ＤＮＡ構築において、突然変異を認識し間違った二本鎖ＤＮＡを切断して正しい配列のゲル精製を可能にするために使用された。間違った配列の切断は、単純な変性及びハイブリダイゼーション工程の後に突然変異したＤＮＡが正しいＤＮＡ配列にハイブリダイズし、リゾルベースにより認識され得るＤＮＡ塩基の誤対合を生ずることから生ずる。この方法は誤りの頻度を５０％減少させた。この方法のさらなる最適化及びこのタイプの酵素の熱安定なものの使用により、長いＳａｖｉｎｅの構築の間の誤りの頻度をさらに減少させうるであろう。
【０２３７】
Ｓａｖｉｎｅカセットを発現するワクシニアウイルスの二つのプールは両方とも、クレードＢのＨＩＶウイルスで感染させた３名の異なる患者からのＨＩＶ特異的応答を再刺激することを示した。これらの結果は、該ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅが該集団をより広く網羅するはずであるという明確な指摘を与える。何故なら、各患者は異なるＨＬＡパターンを有しており、両プールは試験した３種の天然ＨＩＶタンパク質の全てに対するＨＩＶ特異的ＣＴＬ応答を３名全ての患者で再刺激できたからである。また、両プールは３名の患者全てで事実上同一のＣＴＬパターンを再刺激することが示された。この結果は予想外であった。何故なら二つのプールの間のアミノ酸の相違により一部の応答は失われたり又は獲得されたりしたはずだからであり、そしてプール１は全長ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの３分の２を発現できるに過ぎないからである。ＣＴＬ溶解のこのパターンが該二つのウイルスプールの間で変化しなかった二つの理由が示唆された。第一に、Ｓａｖｉｎｅ構築物中の配列は、断片の配列が重なっているのでほとんど全て重複している。従って、該Ｓａｖｉｎｅの３分の１が喪失しても、僅か３種のＨＩＶタンパク質に対する僅か３名の患者試料において相違が検出される程に十分なＴ細胞エピトープを排除しなかったかも知れないということである。第二に、突然変異はしばしばＴ細胞エピトープを破壊するが、それらが機能的状態に留まるならば、それらが形成するＣＴＬは別のエピトープ配列を認識できることが少なくないことである。この所見を併せ考えると、僅か二つのＳａｖｉｎｅ構築物を結合することが強力な多数クレードをカバーしうることが間接的に示唆される。ＨＩＶウイルスの異なる株により形成されるＣＴＬを刺激するＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの能力を直接検討するためにさらなる実験が行なわれつつある。感染患者からのＣＤ４＋Ｔ細胞のＨＩＶ−１特異的応答を刺激する該二つのＨＩＶ−１Ｓａｖｉｎｅワクシニアベクタープールの能力も試験された（図２０）。両プールとも一貫したパターンを示すことはなかったが、両患者はＣＤ４＋Ｔ細胞の有意の増殖を示した。このことは該二つのプールが、いずれかのプールを独立に用いる場合よりもより広いワクチンの網羅を可能とすることを示唆する。
【０２３８】
本発明者らは新規なワクチン戦略を作製した。この戦略は今日までに本発明者らが最も効果的なＨＩＶ候補ワクチンであると信ずるものを作製するために用いられた。本発明者らはこのワクチンを用いて未経験マウスを免疫化した。図２１は、上述の該ＨＩＶ−１Ｓａｖｉｎｅが未経験マウスにおいてＧａｇ・ＣＴＬ応答及びＮｅｆ・ＣＴＬ応答を形成できることを決定的に示す。しかしながら、Ｎｅｆ・ＣＴＬエピトープはプール１にのみ存在するように見えたことに注目すべきである。何故なら、それはプール２により再刺激されなかったからである。このことは、ＨＩＶ−１・Ｓａｖｉｎｅプール１成分及びプール２成分を一緒に混合してより広いワクチン網羅を得ることの有用性のさらなる証明である。
【０２３９】
ＨＩＶ−１・Ｓａｖｉｎｅワクシニアベクターも、免疫前の Ｍ． ｎｅｍｅｓｔｒｉｎａモンキーにおけるイン・ビボでのＨＩＶ−１応答を再刺激するために使用された。これらの実験（図２２）は、ＩＮＦ−γエリスポット及びＣＤ６９のＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞上での発現により、ＨＩＶ−１・Ｓａｖｉｎｅのイン・ビボでのＨＩＶ−１特異的応答を再刺激する能力が別のＨＩＶ−１候補ワクチンと同等又は多分より良好であることを示した。
【０２４０】
これは、Ｔ細胞の応答が予防又は回復のために重要であると考えられる他の多くのヒト感染又は癌に適用できる一般的戦略である。これを心に留めて本発明者らは、メラノーマ、子宮頸癌、及びＣ肝炎に対するＳａｖｉｎｅを構築することを始めた。メラノーマの場合、現在同定されたメラノーマ抗原の大部分は二つのグループに分けられた。一つはメラノーマと関連する抗原を含むものであり、一つはしばしばメラノーマ中で高レベル調節されるメラニン細胞由来の分化抗原を含むものである。二つのＳａｖｉｎｅ構築物は目下これらの二つのグループの要求を満たすように構築されることになる。区別をする理由は、メラノーマの治療はまずメラノーマ特異的抗原の断片のみを組み込むＳａｖｉｎｅを用いて進められるかも知れないということである。若しこのＳａｖｉｎｅが何らかの転移を抑えるのに失敗するときは、メラニン細胞特異的抗原を含むより特異性の低いＳａｖｉｎｅを次に使用できる。他の癌、例えば、精巣癌や乳癌もメラノーマに特異的な抗原の多くを発現することを指摘するのは重要である。従って、該メラノーマ特異的Ｓａｖｉｎｅは他の癌に対しても治療上の利益を有しうる。
【０２４１】
小さなＳａｖｉｎｅは子宮頸癌に対しても構築されている。このＳａｖｉｎｅは、全世界的な子宮頸癌の惹起の大部分と直接関連付けられたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の二つの株、ＨＰＶ−１６及びＨＰＶ−１８由来の二つの抗原、Ｅ６及びＥ７を含む。該二つの株の間のこれらの二つの抗原の配列の相違が多数あり、通常二つのＳａｖｉｎｅの構築が要求されるであろう。しかしながら、このＳａｖｉｎｅは小さいので、両株からの抗原断片は一緒に集められる。Ｓａｖｉｎｅアプローチのためには、一つのウイルスからの抗原の全て又は大部分を含めることが通常より良好であるが、この場合には、Ｅ６及びＥ７のみがウイルス潜伏又は子宮頸癌の間に発現される。従って、単純さの利益のため、生殖器いぼに対してはＳａｖｉｎｅ中に全てのＨＰＶ抗原が望まれるであろうが、ＨＰＶゲノムの残りは含められない。
【０２４２】
世界における肝臓疾患の主要な原因であるＣ型肝炎の２株に対しても二つのＳａｖｉｎｅが構築された。Ｃ型肝炎はワクチン又は治療法についての必要条件においてＨＩＶに類似している。しかしながら、主要なＣ型肝炎株は、種々のＨＩＶクレードの場合よりも相互に顕著に低い相同性、６９〜７９％を共有する。この要求を満たすために、本発明者らはオーストラリア１ａ型及び３ａ型に存在する二つの主要な株の要件を満たすように二つの別の構築物を構築することを決定した。これらの二つの型を合計するとこの国のＣ型肝炎感染のほぼ８０〜９５％を惹起している。両構築物はＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅとほぼ同じ大きさであるが、単一ワクチン又は治療に一緒に混合されることになる。
【０２４３】
全体として、Ｓａｖｉｎｅワクチン戦術は広範なヒトの疾病に適用される可能性のある一般的技法であると考えられる。また、それは各抗原の特性決定を行なう必要がないので、この技法は動物ワクチンに盛んに適用され並びに特定試薬や適当な研究費が欠如することによりそして動物ワクチンに関する報酬が貧弱なことによりワクチン又は治療の研究がしばしば阻害される場合に活発に適用されるものとも考えられる。
【０２４４】
実施例２
Ｃ型肝炎Ｓａｖｉｎｅ
合成された免疫調節分子もＣ型肝炎を治療するために設計された。一つの例では、重なり合うセグメント（１５アミノ酸だけ重なる３０アミノ酸のセグメント）へのＣ型肝炎のポリタンパク質コンセンサス配列の断片化、これらのセグメントのかき集めた順序への再配置、及び図２６に示すようなＳａｖｉｎｅ核酸配列及びＳａｖｉｎｅアミノ酸配列の出力を容易にするため、図２５のアルゴリズムを該Ｃ１ａ型肝炎のポリタンパク質コンセンサス配列に適用した。典型的なＤＮＡカセット（Ａ、Ｂ及びＣ）も図２６に示す。これらは、単一の発現可能オープンリーディングフレームにそれらを連結するのを容易にするため、それらの末端に適当な制限酵素部位を含む。
【０２４５】
実施例３
メラノーマＳａｖｉｎｅ
メラノーマを治療又は予防するための別々のＳａｖｉｎｅ核酸配列及びＳａｖｉｎｅアミノ酸配列を得るため、図２７に示すように、メラニン細胞分化抗原（ｇｐ１００、ＭＡＲＴ、ＴＲＰ−１、Ｔｙｒｏｓ、Ｔｒｐ−２、ＭＣ１Ｒ、ＭＵＣ１Ｆ及びＭＵＣ１Ｒ）に、そしてメラノーマ特異的抗原（ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ｇｐ１００Ｉｎ４、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＰＲＡＭＥ、ＴＲＰ２ＩＮ２、ＮＹＮＳＯ１ａ、ＮＹＮＳＯ１ｂ及びＬＡＧＥ１）にも図２５のアルゴリズムが適用された。
【０２４６】
実施例４
リゾルベース修復実験
リゾルベースは、ポリヌクレオチド中の誤りを修復するために有利に使用することができる。下記の手順はＤＮＡの誤りが共通であった合成３４０ｂｐ断片のリゾルベース修復を概述する。
【０２４７】
方法
該３４０ｂｐ断片をＰＣＲ増幅し、４％アガロースゲル上でゲル精製した。スピン精製の後、ほぼ１００ｎｇに相当する溶出物の１０ｕＬを該リゾルベース修復処理に付した。ＤＮＡ試料の残りは後のクローニングのため無処理の対照として保存した。
【０２４８】
２μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液、２μＬの２０ｍＭのＭｇＣｌ２ 及び６μＬの ＭｉｌｌｉＱ（商標） 水（ＭＱＷ）及びタックＤＮＡポリメラーゼを１０μＬのＤＮＡ試料に添加した。この混合物を次の熱プロフィール（９５℃で５分、６５℃で３０分、冷却して３７℃に保持）に付した。５μＬの１０×Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ緩衝液、８μＬの１／５０μＬのＴ７エンドヌクレアーゼＩ酵素貯蔵液、及び１７μＬのＭＱＷを添加し、混合し、そして３０分間インキュベートした。該試料にローディング緩衝液を添加し、この試料を４％アガロースゲル上で電気泳動した。全長断片に相当するぼんやりしたバンドを切り出し、さらに１５回ＰＣＲのサイクルを行なった。増幅された断片をアガロースゲル精製し、未処理のＤＮＡ試料と共にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（商標）中にクローニングした。各ＤＮＡ試料について１１のプラスミドクローンを配列決定し、誤りの数及びタイプを比較した（表参照）。
【０２４９】
緩衝液は以下のようであった。
１０×Ｔ７エンドヌクレアーゼ緩衝液
２．５ ｍＬの１ＭのトリスｐＨ ７．８、０．５ ｍＬの １ＭのＭｇＣｌ２ 、２５μＬの １ＭのＤＴＴ、５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、 ２ｍＬのＭＱＷで総容量を５ｍＬとした。
Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ貯蔵液
ジェフ　ベイボン（セント・ビンセンツ・ホスピタル）により調製され、取得された濃縮酵素試料を次の希釈用緩衝液を用いて１／５０に希釈した。希釈用緩衝液：５０μＬの １ＭのトリスｐＨ ７．８、０．１ μＬの １ＭのＥＤＴＡｐＨ ８、５ μＬの １００ｍＭのグルタチオン、５０μＬの１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、２．３ ｍＬのＭＱＷ、２．５ ｍＬのグリセロールを総量 ５ｍＬとした。
【０２５０】
結果
その結果を表２及び表３にまとめておく。
【０２５１】
【表２】
2004506410.tif 000070
【０２５２】
【表３】
2004506410.tif 000071
【０２５３】
【外６５】
2004506410.tif 000072
【０２５４】
考察／結論
全体として、得られた正しいクローンの数は有意に異なることはなかったが、誤りのレベルには有意の相違があった。該一つの構築物中に連結される長いオリゴヌクレオチドの数が大きくなるにつれて、即ち、正しいクローンを得る機会での未処理試料対処理試料の間の相違を増加させるにつれ、誤りについてのこの減少は有意に増加するようになる。Ｔ４エンドヌクレアーゼＶＩＩ などの別のリゾルベースを混合すると修復をさらに増強し又は誤りに対するバイアスをさらに増加させうるであろうと思われる。
【０２５５】
この実験は、例えば、校正用ＰＣＲ酵素の使用又は最適化条件の使用により最適化されなかったということは重要である。最後に、若し、例えば熱安定なリゾルベースを含めることにより、正常なＰＣＲの間に修復反応が行なわれるならば、既に損傷を受けた長いオリゴヌクレオチドの増幅や、誤りを誘導したＰＣＲの正常な蓄積は、ＰＣＲの間に誤りを読み取るポリメラーゼを使用したときでさえ、有意に減少しうるであろうと考えられる。損傷を受けた長いオリゴヌクレオチドの該修復はＳａｖｉｎｅなどの長いＤＮＡ断片の合成にとってはとりわけ重要である。何故なら、長いオリゴヌクレオチド損傷の割合は通常５％未満であるが、１０個のオリゴヌクレオチドを連結した後での誤りの割合はほぼ５０％に近づくからである。このことは、最良の校正用ＰＣＲ酵素を用いたときでさえ真実である。何故なら、これらの酵素は連結反応におけるはっきりした大多数（９５％）として存在する正しいオリゴヌクレオチド鋳型を用いて該配列の完全さを確認しないからである。
【０２５６】
全ての特許、特許出願及び本明細書で引用した出版物の開示はその全体が参照により本明細書にインコーポレートされる。
【０２５７】
本明細書における如何なる言及の引用もかかる言及が本出願に対する「先行技術」として利用できるものと解すべきではない。
【０２５８】
本明細書を通じて、その目的は、如何なる一つの実施態様に又は特徴の具体的収集に本発明を限定することなく、本発明の好ましい実施態様を説明することであった。したがって、当業者は、本開示に照らして、本発明の範囲を逸脱することなく例示された具体的実施態様に様々な修飾や変更を加え得ることを認めるはずである。このような修飾及び変更は全て添付の特許請求の範囲の範囲内に含められると意図される。
【０２５９】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、世界の種々の地域で１９９８年にＡＩＤＳに罹患している人々の数及びこれらの地域における最も優勢なＨＩＶクレード（ｃｌａｄｅｓ） を示すグラフ表示である。ＵＮＡＩＤＳにより作製された見積もりである。
【図２】
図２は、普通のＨＩＶクレードの出現頻度及び将来の見積もりの傾向を示すグラフ表示である。グラフは国際エイズワクチン・イニシャティブ（ＩＡＶＩ）からのものである。
【図３】
図３は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築のために用いられたＨＩＶｇａｇ（配列番号：１）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｇａｇタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図４】
図４は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｐｏｌ（配列番号：２）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｐｏｌタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図５】
図５は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｖｉｆ（配列番号：３）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｖｉｆタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図６】
図６は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｖｐｒ（配列番号：４）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｖｐｒタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図７】
図７は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｔａｔ（配列番号：５）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｔａｔタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図８】
図８は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｒｅｖ（配列番号：６）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｒｅｖタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図９】
図９は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｖｐｕ（配列番号：７）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｖｐｕタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図１０】
図１０は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｅｎｖ（配列番号：８）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｅｎｖタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図１１】
図１１は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｎｅｆ（配列番号：９）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｎｅｆタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図１２】
図１２は、各ＨＩＶタンパク質の設計された縮重コンセンサス配列の系統的断片化及び各セグメントのＤＮＡ配列への逆翻訳を図示する図式的表示である。無作為再配列の間に用いられたセグメントの数及び除去されたアミノ酸も示してある。白四角で囲まれたアミノ酸はこの設計から除去された。その理由は、所望のアミノ酸の組合せに提供する縮重コドンが本発明の明細書で概述される縮重配列ルールの組み込みに従うにはあまりに多くの縮重塩基を必要としたからである。白円で囲まれたアミノ酸は関連するセグメントでのみ除去された。これらがオリゴヌクレオチド重なり領域をコードしていたというのが主な理由である。星印でマークされたアミノ酸は対応する重なり領域と比べ一つの断片で異なるように設計された（ｔａｔ遺伝子を参照）。
【図１３】
図１３は、ＨＩＶタンパク質セグメントを逆翻訳するために使用された哺乳動物の第１最多使用頻度コドン及び第２最多使用頻度コドンを示す図式的表示である。１塩基のみが変化した二つのアミノ酸の第１及び第２最多使用頻度縮重コドンも全て示してある。２塩基以上が変化した場合に用いられたコドンは、各アミノ酸のコドン全てを比較することによりそれぞれの場合で探し出した。縮重塩基のＩＵＰＡＣコドンも示してある。
【図１４】
図１４は、サブカセット、カセット及び全長Ｓａｖｉｎｅ・ｃＤＮＡのおおよその大きさ、及びそれらを連結する際に関与する制限部位を示すＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅのための構築計画を例示する。それらの設計の間にサブカセットに加えられた余分の配列、及び該サブカセット、カセット及び全長ｃＤＮＡが如何にして構築されそして適当なＤＮＡプラスミドに移転されたかの簡単な記述も示してある。「全長構築物の説明」：ｐＡはＸｈｏＩ／ＳａｌＩで切断し、ＢカセットのＸｈｏＩアーム中にクローニングした。ｐＡＢはＸｈｏＩで切断してＣカセットのＸｈｏＩアーム中にクローニングした。全長構築物は５’末端でＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ又は３’末端でＢｇｌＩＩでのいずれかで切断可能である。「カセットを切断するためのオプション」：Ａ）５’末端でのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ、３’末端でのＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ、Ｂ）５’末端でのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ、３’末端でのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ、Ｃ）５’末端でのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ、３’末端でのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ。「開裂用プラスミドベクター」：ｐＤＮＡＶａｃｃはＸｂａＩ／ＸｈｏＩで切断可能である（ＤＮＡワクチン注射）、ｐＢＣＢ０７ベクター又はｐＴＫ７．５ベクターはＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで切断可能である（組換え体ワクシニア）、ｐＡｖｉｐｏｘベクター、ｐＡＦ０９ベクターはＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで切断可能である（組換え体Ａｖｉｐｏｘ）。
【図１５】
図１５は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅ構築物の全長ＤＮＡ（１７２５３ｂｐ）及びタンパク質配列（５７４２アミノ酸）を示す。それぞれ設計されたＨＩＶタンパク質の各断片の位置、断片の数（括弧内）、スペーサー残基（２個のアラニン残基）及び該スペーサーがどの断片のためのものであるか（白ボックス及び矢印）などと共に断片の境界が示してある。サブカセット又はカセットの境界に対応する配列（影を付したボックス）を結合する残基の制限部位の位置も、開始コドン及び停止コドン、コザック配列、ネズミインフルエンザウイルスＣＴＬエピトープ配列の位置（３’末端の近く）、両末端の重要な制限部位、及び各縮重アミノ酸の位置（‘Ｘ’で示す）と共に示す。
【図１６】
図１６は、サブカセットＡ１に対して設計されたＤＮＡ配列中のオリゴヌクレオチドのレイアウト及び位置を図示する。短い増幅オリゴヌクレオチドにアニールする配列は平行線を付したボックスで示し、オリゴヌクレオチド重なり領域の位置は濃い影で示す。
【図１７】
図１７において、パネル（ａ）はサブカセットＡ１の二つの半分の段階的不斉ＰＣＲ（それぞれレーン２〜５及び７〜９）及びＳＯＥｉｎｇによる最終スプライシング（レーン１０）を図示する。レーン１のＤＮＡ標準はＳａｕ３ＡＩで消化したｐＵＣ１８である。パネル（ｂ）は示された各カセットの段階的連結媒介結合及びＰＣＲ増幅を示す。レーン１のＤＮＡ標準はＥｃｏＲＩで切断したＳＰＰ１である。
【図１８】
図１８において、パネル（ａ）は一つのＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅカセットを発現するＤＮＡワクチンプラスミドの構築の概要を示す。パネル（ｂ）は一つのＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅカセットを発現するワクシニアウイルスを形成するためのマーカーレスキュー組換えに使用するプラスミドの構築の概要を示す。パネル（ｃ）はＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅ全長ｃＤＮＡをそれぞれが発現するＤＮＡワクチンプラスミドの構築の概要を示す。
【図１９】
図１９は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅ構築物で３回ＨＩＶ感染させた患者のＨＩＶ特異的ポリクローナルＣＴＬ応答の再刺激を示す。３名の異なる患者から得たＰＢＭＣを、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅカセットを発現するワクシニアウイルスのプールで感染させることにより７日間再刺激した。プール１はＶＶ−ＡＣ１及びＶＶ−ＢＣ１を含み、プール２はＶＶ−ＡＣ２、ＶＶ−ＢＣ２及びＶＶ−ＣＣ２を含むものであった。次いで、再刺激されたＰＢＭＣを自己由来のＬＣＬ（５０：１のエフェクター：標的比）と混合し、これを感染させないか又はＨＩＶタンパク質であるｇａｇ（ＶＶ−ｇａｇ）、ｅｎｖ（ＶＶ−ｅｎｖ）又はｐｏｌ（ＶＶ−ｐｏｌ）、ＶＶ−ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅプール１（明るいバー）又はプール２（暗いバー）又は対照のワクシニアウイルス（ＶＶ−Ｌａｃ）のいずれかで感染させ、放出された５１Ｃｒの量を用いて特異的溶解パーセントを測定した。Ｋ５６２細胞はその刺激された培養におけるＮＫ細胞に媒介された死滅のレベルを測定するために使用した。
【図２０】
図２０は、ＨＩＶ−１・Ｓａｖｉｎｅのプール１若しくはプール２のいずれかで再刺激されたＨＩＶ−１感染患者から得たＰＢＭＣのＣＤ４＋ 増殖を示す図式的表示である。簡単に述べれば、ＰＢＭＣをＣＦＳＥで染色し、ＨＩＶ−１・Ｓａｖｉｎｅのプール１若しくはプール２のいずれかをコードするＶＶを加え又は加えずに６日間培養した。次いで、再刺激された細胞を抗体で標識し、ＦＡＣＳで分析した。
【図２１】
図２１は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅでワクチン注射したマウスにおけるＣＴＬ応答を示すグラフ表示である。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、図１８ａに記載した６個のプラスミドを含むＨＩＶ−１・Ｓａｖｉｎｅ・ＤＮＡワクチンで免疫化した（５０μｇ／脚の筋肉内注射として総量１００μｇのＤＮＡを投与）。１週間後に、ＨＩＶ−１・Ｓａｖｉｎｅのプール１を含むポックスウイルス（１×１０７ ｐｆｕ）を用いて免疫応答をブーストした。３週間後に、これらのマウスから得た脾臓細胞をＶＶ−プール１又はＶＶ−プール２で５日間再刺激し、得られたエフェクターを、ＨＩＶ−１から天然の抗原を発現するＣＴＲＶＶ、ＶＶ−プール又はＶＶで感染させた標的に対する５１Ｃｒ放出細胞障害検定に用いた。
【図２２】
図２２は、ＨＩＶ免疫アカゲザル（実験の２年前にｇａｇ−ｐｏｌを発現する組換えＦＰＶをワクチン注射し、ＨＩＶ−１で感染させた）の免疫応答を示す。サル１及び２はＶＶ・Ｓａｖｉｎｅプール１（一緒になって全ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅを発現する３種のＶＶ）で０日に１回免疫化した。サル３はＦＰＶ−ｇａｇ−ｐｏｌで２回免疫化した、即ち、０日は最初のＦＰＶ−ｇａｇ−ｐｏｌ免疫化の３週間後である）。Ａ）アルドリチオール−２で失活させた全ＨＩＶ−１で刺激された（２０時間、２０μｇ／ｍＬ）全血（０．５ｍＬ、ヘパリンで抗凝結処理された静脈血）のＥＬＩＳＰＯＴによるＩＦＮγ検出。次いで血漿試料を遠心分離（１０００×ｇ）し、捕捉ＥＬＩＳＡを用い抗原特異的ＩＦＮについて二連で検定した。Ｂ）ＨＩＶ−１特異的ＣＤ６９＋ ／ＣＤ８＋ Ｔ細胞のフローサイトメトリー検出。新たに単離されたＰＢＭＣを上のように失活させたＨＩＶ−１で１６時間刺激し、洗浄し、抗体で標識した。次いで、細胞を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター用いて分析し、データはＣｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔソフトウエアを用いて分析した。Ｃ）ＨＩＶ−１特異的ＣＤ６９＋ ／ＣＤ４＋ Ｔ細胞のフローサイトメトリー検出はＢ）に記載したように行なった。
【図２３】
図２３は、図２８及び図２９の記憶媒体によりエンコードされた命令を実行するために用いられたシステムの図を示す。
【図２４】
図２４は、本発明の合成ポリヌクレオチド及び合成ポリペプチドを設計する方法の実施態様を示すフロー図を図示する。
【図２５】
図２５は、図２４に示す方法の工程をとりわけ利用するアルゴリズムを示す。
【図２６】
図２６は、ポリタンパク質配列の断片化、該セグメントの再配置、再配置されたセグメントの連結及びＣ型肝炎感染を治療及び／又は予防するためのＳａｖｉｎｅの調製のための合成ポリヌクレオチド配列及び合成ポリペプチド配列の出力を実行するために、入力したＣ１ａ型肝炎のコンセンサスポリタンパク質配列に図２５のアルゴリズムを適用する１例を示す。
【図２７】
図２７は、下記の配列の断片化を容易にし、該セグメントを再配置し、該再配置されたセグメントを連結し、そしてメラノーマを治療及び／又は予防するためのＳａｖｉｎｅの調製のための合成ポリヌクレオチド及び合成ポリペプチドを出力させるために、入力したコンセンサスメラノサイト分化抗原（ｇｐ１００、ＭＡＲＴ、ＴＲＰ−１、Ｔｙｒｏｓ、Ｔｒｐ−２、ＭＣ１Ｒ、ＭＵＣ１Ｆ及びＭＵＣ１Ｒ）及びコンセンサスメラノーマ特異的抗原（ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ｇｐ１００Ｉｎ４、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＰＲＡＭＥ、ＴＲＰ２ＩＮ２、ＮＹＮＳＯ１ａ、ＮＹＮＳＯ１ｂ及びＬＡＧＥ１）に図２５のアルゴリズムを適用する１例を例示する。
【図２８】
図２８は、磁気記憶媒体の断面図を示す。
【図２９】
図２９は、光学的読み取り可能データ記憶媒体の断面図を示す。
【図３０】
図３０は、６個のＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅカセット配列〔Ａ１（配列番号：３９３）、Ａ２（配列番号：３９９）、Ｂ１（配列番号：３９５）、Ｂ２（配列番号：４０１）、Ｃ１（配列番号：３９７）及びＣ２（配列番号：４０３）〕。Ａ１、Ｂ１及びＣ１は、全長のＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅ（配列番号：４０５）の実施態様を構築するため各カセットの末端に与えられた、例えば、便利な制限酵素部位を用いて、一緒に結合させることができる。Ａ２、Ｂ２及びＣ２も、一緒に結合せて、主要なＨＩＶクレードで共通する３５０アミノ酸の突然変異を持つ全長ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの別の実施態様を得る。これらのカセットＡ／Ｂ／Ｃは、該カセットの開始コドンの後又は停止コドンの前に組み込まれた特異的制限酵素部位を用いて連結して単一の構築物とすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３−１】
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【図４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１２−８】
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【図１２−９】
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【図１２−１０】
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【図１２−１１】
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【図１２−１２】
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【図１２−１３】
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【図１２−１４】
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【図１２−１５】
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【図１２−１６】
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【図１２−１７】
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【図１２−１８】
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【図１２−１９】
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【図１２−２０】
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【図１２−２１】
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【図１２−２２】
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【図１２−２３】
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【図１２−２４】
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【図１２−２５】
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【図１２−２６】
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【図１２−２７】
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【図１２−２８】
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【図１２−２９】
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【図１２−３０】
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【図１２−３１】
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【図１２−３２】
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【図１２−３３】
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【図１２−３４】
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【図１２−３５】
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【図１２−３６】
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【図１２−３７】
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【図１２−３８】
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【図１２−３９】
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【図１３】
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【図１３−１】
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【図１４】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１５−８】
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【図１５−９】
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【図１５−１０】
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【図１５−１１】
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【図１５−１２】
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【図１５−１３】
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【図１５−１４】
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【図１５−１５】
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【図１５−１６】
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【図１５−１７】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−Ａ】
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【図１８−Ｂ】
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【図１８−Ｃ】
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【図１９】
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【図１９−１】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２−Ａ】
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【図２２−Ｂ】
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【図２２−Ｃ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２５−５】
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【図２５−６】
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【図２５−７】
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【図２５−８】
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【図２５−９】
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【図２５−１０】
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【図２５−１１】
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【図２５−１２】
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【図２５−１３】
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【図２５−１４】
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【図２６】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【図２６−５】
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【図２６−６】
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【図２６−７】
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【図２６−８】
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【図２６−９】
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【図２６−１０】
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【図２６−１１】
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【図２６−１２】
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【図２６−１３】
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【図２６−１４】
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【図２６−１５】
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【図２６−１６】
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【図２６−１７】
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【図２６−１８】
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【図２６−１９】
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【図２６−２０】
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【図２６−２１】
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【図２６−２２】
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【図２６−２３】
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【図２６−２４】
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【図２６−２５】
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【図２６−２６】
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【図２６−２７】
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【図２６−２８】
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【図２６−２９】
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【図２６−３０】
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【図２６−３１】
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【図２６−３２】
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【図２６−３３】
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【図２６−３４】
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【図２６−３５】
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【図２６−３６】
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【図２６−３７】
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【図２６−３８】
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【図２７】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２７−４】
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【図２７−５】
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【図２７−６】
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【図２７−７】
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【図２７−８】
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【図２７−９】
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【図２７−１０】
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【図２７−１１】
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【図２７−１２】
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【図２７−１３】
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【図２７−１４】
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【図２７−１５】
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【図２７−１６】
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【図２７−１７】
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【図２７−１８】
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【図２７−１９】
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【図２７−２０】
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【図２７−２１】
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【図２７−２２】
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【図２７−２３】
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【図２７−２４】
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【図２７−２５】
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【図２７−２６】
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【図２７−２７】
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【図２７−２８】
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【図２７−２９】
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【図２７−３０】
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【図２７−３１】
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【図２７−３２】
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【図２７−３３】
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【図２７−３４】
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【図２７−３５】
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【図２７−３６】
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【図２７−３７】
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【図２７−３８】
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【図２７−３９】
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【図２７−４０】
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【図２７−４１】
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【図２７−４４】
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【図２７−４５】
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【図２７−４６】
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【図２７−４９】
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【図２７−５０】
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【図２７−５１】
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【図２７−５３】
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【図２７−５４】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３０−４】
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【図３０−５】
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【図３０−６】
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【図３０−７】
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【図３０−８】
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【図３０−９】
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【図３０−１０】
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【図３０−１１】
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【国際公開パンフレット】
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2004506410.tif 000291
2004506410.tif 000292
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【手続補正書】
【提出日】平成14年2月7日(2002.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つ以上の親ポリペプチドからの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドであって、該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で変更するように、該セグメントがその又はそれぞれの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されるものであり、そのように連結されたセグメントの如何なる対もその又はそれぞれの親ポリペプチドの少なくとも一部に構造及び／又は機能が実質的に類似する生産物を生じないものである合成ポリペプチド。
【請求項２】
本質的に単一の親ポリペプチドからの異なるセグメントからなる、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項３】
本質的に複数の異なる親ポリペプチドからの異なるセグメントからなる、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項４】
該合成ポリペプチドにおけるセグメントがその又はそれぞれの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる順序又は配置で逐次連結されるものである、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項５】
該合成ポリペプチドにおけるセグメントがその又はそれぞれの親ポリペプチドにおけるそれらの順序又は配置と比べ無作為に配置されるものである、請求項４記載の合成ポリペプチド。
【請求項６】
個々のセグメントの大きさは少なくとも４アミノ酸である、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項７】
個々のセグメントの大きさが約２０から約６０までのアミノ酸である、請求項６記載の合成ポリペプチド。
【請求項８】
個々のセグメントの大きさが約３０アミノ酸である、請求項６記載の合成ポリペプチド。
【請求項９】
親ポリペプチド配列の少なくとも３０％を含む、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項１０】
該セグメントの少なくとも一つが、一つ以上の他の該セグメントに部分的な配列同一性又は配列相同性を含むものである、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項１１】
配列同一性又は配列相同性が個々のセグメントの一端又は両端に含まれるものである、請求項１０記載の合成ポリペプチド。
【請求項１２】
該セグメントの一端又は両端が一つ以上の他の該セグメント内に含まれるアミノ酸配列と同一若しくは相同である少なくとも４個の連続したアミノ酸を含むものである、請求項１１記載の合成ポリペプチド。
【請求項１３】
個々のセグメントの大きさが他の該セグメント若しくは他の該セグメントのそれぞれと同一若しくは相同な配列の大きさの約２倍である、請求項１０記載の合成ポリペプチド。
【請求項１４】
個々のセグメントの大きさが約３０アミノ酸であり且つ他の該セグメント若しくは他の該セグメントそれぞれに同一若しくは相同な配列の大きさが約１５アミノ酸である、請求項１３記載の合成ポリペプチド。
【請求項１５】
任意選択的なスペーサーがこれらのセグメントの一部又は全ての間に介在するものである、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項１６】
このスペーサーが隣接するセグメント（単数又は複数）のプロテアーゼ加水分解処理及び／又は提示を変更するものである、請求項１５記載の合成ポリペプチド。
【請求項１７】
該スペーサーが少なくとも一つの中性アミノ酸を含むものである、請求項１６記載の合成ポリペプチド。
【請求項１８】
該スペーサーが少なくとも一つのアラニン残基を含むものである、請求項１６記載の合成ポリペプチド。
【請求項１９】
個々の親ポリペプチドが疾病状態と関連するものである、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項２０】
個々の親ポリペプチドが、病原体生物のポリペプチド、癌関連ポリペプチド、自己免疫疾患関連ポリペプチド、アレルギー関連ポリペプチド又はこれらの変異型若しくはウイルスから選択されるものである、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項２１】
個々の親ポリペプチドがウイルスのポリペプチドである、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項２２】
該ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又は肝炎ウイルスから選択されるものである、請求項２１記載の合成ポリペプチド。
【請求項２３】
該ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、且つ、該少なくとも一つの親ポリペプチドがｅｎｖ、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ及びｎｅｆ、又はこれらの組み合わせから選択されるものである、請求項２２記載の合成ポリペプチド。
【請求項２４】
個々の親ポリペプチドが癌関連ポリペプチドである、請求項１記載の合成ポリペプチド。
【請求項２５】
癌がメラノーマである、請求項２４記載の合成ポリペプチド。
【請求項２６】
個々の親ポリペプチドがメラニン細胞分化抗原（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ） である、請求項２５記載の合成ポリペプチド。
【請求項２７】
個々の親ポリペプチドが、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ、ＴＲＰ−１、Ｔｙｒｏｓ、ＴＲＰ２、ＭＣ１Ｒ、ＭＵＣ１Ｆ、ＭＵＣ１Ｒ又はこれらの組み合わせから選択されるメラニン細胞分化抗原である、請求項２５記載の合成ポリペプチド。
【請求項２８】
個々の親ポリペプチドがメラノーマ特異的抗原である、請求項２５記載の合成ポリペプチド。
【請求項２９】
該少なくとも一つの親ポリペプチドが、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ｇｐ１００Ｉｎ４、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＰＲＡＭＥ、ＴＲＰ２ＩＮ２、ＮＹＮＳＯ１ａ、ＮＹＮＳＯ１ｂ、ＬＡＧＥ１又はこれらの組み合わせから選択されるメラノーマ特異的抗原である、請求項２５記載の合成ポリペプチド。
【請求項３０】
一つ以上の親ポリペプチドからの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドであって、該セグメントが該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し若しくは他の方法で改変するようにその又はそれぞれの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されるものであり、そのように連結されたセグメントの如何なる対もその又はそれぞれの親ポリペプチドの少なくとも一部に構造及び／又は機能が実質的に類似する生産物を生じないものである合成ポリヌクレオチド。
【請求項３１】
合成ポリヌクレオチドを製造する方法であって、
一つ以上の親ポリペプチドからの異なるセグメントを複数コードする核酸配列を同じ読み取り枠内で一緒に連結して合成ポリヌクレオチドを形成させる工程であって、該合成ポリヌクレオチドの配列がその又はそれぞれの親ポリペプチドにおける該セグメントの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されていいる該セグメントをコードするものであり、このように連結されたセグメントの如何なる対もその又はそれぞれの親ポリペプチドの少なくとも一部に構造及び／又は機能が実質的に類似する生産物を生じないものである工程、
を含む方法。
【請求項３２】
個々の親ポリペプチドの配列をセグメントにセグメント化する工程及び該セグメントを個々の親ポリペプチドの配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結する工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
該断片が無作為に一緒に連結されるものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
個々の親ポリペプチドの配列又はそのセグメントを逆翻訳して該親ポリペプチド又は該セグメントをコードする核酸配列を得る工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
個々の親ポリペプチド配列のアミノ酸が逆翻訳されて目的の細胞における他の同義コドンよりもより高い翻訳効率を持つコドンを与えるものである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
個々の親ポリペプチド配列のアミノ酸が逆翻訳されて、隣接する若しくは局在する配列要素との関係で課題の実行を阻害する望ましくない配列を形成する傾向のより小さなコドンを与えるものである、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
個々の親ポリペプチド配列のアミノ酸が逆翻訳されて、隣接する若しくは局在する配列要素との関係で、クローニング又は配列決定から選ばれる課題の実行を阻害するパリンドロム配列又は重複配列から選択される望ましくない配列を形成する傾向のより小さなコドンを与えるものである、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
セグメントをコードする核酸の間に少なくとも一つのスペーサー残基をコードするスペーサーオリゴヌクレオチドを連結する工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３９】
スペーサーオリゴヌクレオチドが２から３のスペーサー残基をコードするものである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
該スペーサー残基が中性アミノ酸である、請求項３８又は請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
該スペーサー残基がアラニンである、請求項３８又は請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
他のコードされたセグメントと比べ相同性を有するが同一ではないアミノ酸配列をコードする少なくとも一つの変異型核酸配列を、他のセグメントを含む核酸配列と同じ読み取り枠内で連結する工程をさらに含む、請求項３１記載の方法。
【請求項４３】
該変異型セグメントが、一つ以上の他のコードされたセグメントと比べ保存された及び／又は保存されていないアミノ酸相違を含むものである、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該相違が配列多型に相当するものである、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
望みの全ての相同配列を生じさせるため縮重塩基が該少なくとも一つの変異型核酸配列に設計され又は組み込まれるものである、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
宿主細胞により効率的に翻訳されるように該合成ポリヌクレオチドのコドン組成を最適化する工程をさらに含むものである、請求項３１記載の方法。
【請求項４７】
一つ以上の親ポリペプチドからの異なるセグメントの複数を含む合成ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドを含む合成構築物であって、該セグメントが、該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又はたの方法で改変するためその又はそれぞれの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されるものであり、このように連結されたセグメントの如何なる対もその又はそれぞれの親ポリペプチドの少なくとも一部に構造及び／又は機能が実質的に類似する生産物を生じないものであり、該合成ポリヌクレオチドが調節ポリヌクレオチドに機能しうるように連結されるものである合成構築物。
【請求項４８】
免疫刺激分子をコードする核酸配列をさらに含む、請求項４７記載の合成構築物。
【請求項４９】
該免疫刺激分子がインバシンタンパク質（Ｉｎｖ）のドメインを含むものである、請求項４８記載の合成構築物。
【請求項５０】
該免疫刺激分子が配列番号：１４６７に記載された配列又はその免疫刺激同族体を含むものである、請求項４８記載の合成構築物。
【請求項５１】
該免疫刺激分子がＴ細胞共刺激分子である、請求項４８記載の合成構築物。
【請求項５２】
該免疫刺激分化が、Ｂ７分子又はＩＣＡＭ分子から選択されるＴ細胞共刺激分子である、請求項４８記載の合成構築物。
【請求項５３】
該免疫刺激分子が、Ｂ７分子又は生物学的に活性なその断片、又はこれらの変異型若しくは誘導体である、請求項４８記載の合成構築物。
【請求項５４】
該免疫刺激分子がインターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子又はインターフェロンから選択されるサイトカインである、請求項４８記載の合成構築物。
【請求項５５】
該免疫刺激分子が免疫調節オリゴヌクレオチドである、請求項４８記載の合成構築物。
【請求項５６】
請求項１記載の合成ポリペプチド、請求項３０記載の合成ポリヌクレオチド又は請求項４７記載の合成構築物から選択される免疫増強物質を、薬学的に許容しうる担体と共に含む、免疫増強組成物。
【請求項５７】
アジュバントをさらに含む、請求項５６記載の組成物。
【請求項５８】
好ましくは病原体又は癌に対する免疫応答を調節する方法であって、請求項１記載の合成ポリペプチド、請求項３０記載の合成ポリヌクレオチド、請求項４７記載の合成構築物、又は請求項５６記載の組成物から選択される免疫増強物質の有効量を、このような治療を必要とする患者に投与する工程を含む方法。
【請求項５９】
疾病又は状態を治療及び／又は予防する方法であって、請求項１記載の合成ポリペプチド、請求項３０記載の合成ポリヌクレオチド、請求項４７記載の合成構築物、又は請求項５６記載の組成物から選択される免疫増強物質の有効量を、このような治療を必要とする患者に投与する工程を含む方法。
【請求項６０】
一つ以上の親ポリペプチドからの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドの配列を設計するためのコンピュータプログラム生産物であって、
その又はそれぞれの親ポリペプチドの配列を入力として受け入れるコード、
その又はそれぞれの親ポリペプチドの配列をセグメントにセグメント化するコード、
該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するために、その又はそれぞれの親ポリペプチド配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係で該セグメントを一緒に連結するコードであって、このように連結されたセグメントの如何なる対もその又はそれぞれの親ポリペプチドの少なくとも一部分に構造及び／又は機能が実質的に類似する生産物を生じないものであるコード、及び
該コード類を記憶するコンピュータ読み取り可能媒体、
を含むプログラム生産物。
【請求項６１】
該セグメントを無作為に再配置するコードをさらに含む、請求項６０記載のコンピュータプログラム生産物。
【請求項６２】
個々のセグメントの配列にスペーサーの配列を連結するコードをさらに含む、請求項６０記載のコンピュータプログラム生産物。
【請求項６３】
一つ以上の親ポリペプチドの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドの配列を設計するためのコンピュータプログラム生産物であって、
その又はそれぞれの親ポリペプチドの配列を入力として受け入れるコード、
その又はそれぞれの親ポリペプチドの配列をセグメントにセグメント化するコード、
個々のセグメントの配列を逆翻訳して該個々のセグメントをコードする核酸配列を与えるコード、
それぞれの該核酸配列を同じ読み取り枠内で一緒に連結して、その又はそれぞれの親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するために、該セグメントがその又はそれぞれの親ポリペプチド配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されているポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を与えるコードであって、このように連結されたセグメントの如何なる対もその又はそれぞれの親ポリペプチドの少なくとも一部分に構造及び／又は機能が実質的に類似する生産物を生じないものであるコード、及び
該コード類を記憶するコンピュータ読み取り可能媒体、
を含むコンピュータプログラム生産物。
【請求項６４】
該核酸配列を無作為に再配置するコードをさらに含む、請求項６３記載のコンピュータプログラム生産物。
【請求項６５】
個々の親ポリペプチド配列のアミノ酸を逆翻訳して目的の細胞内で他の同義コドンよりもより高い翻訳効率を持つコドンを与えるコードをさらに含む、請求項６３記載のコンピュータプログラム生産物。
【請求項６６】
個々の親ポリペプチド配列のアミノ酸を逆翻訳して、隣接する又は局在する配列要素との関係で、課題の実行に阻害的な望ましくない配列を形成する傾向のより小さなコドンを与えるコードをさらに含む、請求項６３記載のコンピュータプログラム生産物。
【請求項６７】
該核酸配列の一つ以上にスペーサーオリゴヌクレオチドを連結するコードをさらに含む、請求項６３記載のコンピュータプログラム生産物。
【請求項６８】
一つ以上の親ポリペプチドからの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドの配列を設計するためのコンピュータであって、該コンピュータが
（ａ）その又はそれぞれの親ポリペプチドの配列を含む機械読み取り可能データをコードするデータ記憶物質を含む機械読み取り可能データ記憶媒体、
（ｂ）該機械読み取り可能データを処理するための指令を記憶するワーキングメモリ、
（ｃ）該機械読み取り可能データを処理して該合成ポリペプチド配列を与えるための、該ワーキングメモリ及び該機械読み取り可能データ記憶媒体に連結された中央処理装置であって、該処理工程がその又はそれぞれの親ポリペプチドの配列をセグメントにセグメント化する工程及び該セグメントを該その又はそれぞれの親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するため該その又はそれぞれの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結する工程を含むものであり、このように連結されたセグメントの如何なる対もその又はそれぞれの親ポリペプチドの少なくとも一部分に構造及び／又は機能が実質的に類似する生産物を生じないものである中央処理装置、及び
（ｄ）該合成ポリペプチド配列を受け入れるための、該中央処理装置に連結された出力ハードウェア、
を含むコンピュータ。
【請求項６９】
該機械読み取り可能データを処理する工程が該セグメントを無作為に再配置する工程を含むものである、請求項６８記載のコンピュータ。
【請求項７０】
該機械読み取り可能データを処理する工程が該セグメントの配列にスペーサーの配列を連結する工程を含むものである、請求項６８記載のコンピュータ。
【請求項７１】
一つ以上の親ポリペプチドの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドをコードする合成ポリヌクレオチドの配列を設計するためのコンピュータであって、該コンピュータが
（ａ）少なくとも一つの親ポリペプチドの配列を含む機械読み取り可能データをコードするデータ記憶物質を含む機械読み取り可能データ記憶媒体、
（ｂ）該機械読み取り可能データを処理するための指令を記憶するワーキングメモリ、
（ｃ）該機械読み取り可能データを処理して該合成ポリヌクレオチド配列を与えるための、該ワーキングメモリ及び該機械読み取り可能データ記憶媒体に連結された中央処理装置であって、該処理工程がその又はそれぞれの親ポリペプチドの配列をセグメントにセグメント化する工程、該セグメントの配列を逆翻訳して各セグメントに対し該セグメントをコードする核酸配列を与える工程、及び該その又はそれぞれの親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するため該その又はそれぞれの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で該セグメントが一緒に連結されている該核酸配列のそれぞれを同じ読み取り枠内で一緒に連結する工程を含むものであり、このように連結されたセグメントの如何なる対もその又はそれぞれの親ポリペプチドの少なくとも一部分に構造及び／又は機能が実質的に類似する生産物を生じないものである中央処理装置、及び
（ｄ）該合成ポリヌクレオチド配列を受け入れるための、該中央処理装置に連結された出力ハードウェア、
を含むコンピュータ。
該セグメントが該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するため該少なくとも一つの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されるものであり、
【請求項７２】
該機械読み取り可能データの処理工程が該核酸配列を無作為に再配置する工程を含むものである、請求項７１記載のコンピュータ。
【請求項７３】
該機械読み取り可能データの処理工程が個々の親ポリペプチド配列のアミノ酸を逆翻訳して、目的の細胞内で他の同義コドンよりもより高い翻訳効率を持つコドンを与える工程を含むものである、請求項７１記載のコンピュータ。
【請求項７４】
該機械読み取り可能データの処理工程が個々の親ポリペプチド配列のアミノ酸を逆翻訳して、隣接する又は局在する配列要素との関係で、課題の実行を阻害する望ましくない配列を形成する傾向のより小さなコドンを与える工程を含むものである、請求項７２記載のコンピュータ。
【請求項７５】
該機械読み取り可能データの処理工程が該核酸配列の一つ以上にスペーサーオリゴヌクレオチドを連結する工程を含むものである、請求項７１記載のコンピュータ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
こうして、本発明の一つの側面では、一つ以上の親ポリペプチドからの異なるセグメントを複数含む合成ポリペプチドであって、該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するために、これらのセグメントが該その又はそれぞれの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されているものであり、そしてこのように連結されたセグメントの如何なる対もその又はそれぞれの親ポリペプチドの少なくとも一部分に構造及び／又は機能が実質的に類似する生産物を生じないものである合成ポリペプチドが提供される。


【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
別の実施態様では、該合成ポリペプチドは本質的に複数の異なる親ポリペプチドからの異なるセグメントから成るものである。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
該合成親ポリペプチドの該セグメントは、該その又はそれぞれの親ポリペプチドにおける対応するセグメントのそれと比べ異なる順序又は異なる配置で順に連結されていることが好ましい。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
本発明のさらなる一側面では、上で広く述べた合成ポリヌクレオチドを製造する方法であって、
一つ以上の親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するために、該一つ以上の親ポリペプチドからの異なるセグメントを複数コードする核酸配列を同じ読み取り枠の中で一緒に連結して、その配列が該その又はそれぞれの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結された該セグメントをコードする合成ポリヌクレオチドを形成し、そしてこのように連結されたセグメントの如何なる対も該その又はそれぞれの親ポリペプチドの少なくとも一部分に構造及び／又は機能が実質的に類似する生産物を生じないものである工程、
を含む方法が提供される。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
この方法は、個々の親ポリペプチドの配列をセグメントにセグメント化し、該セグメントを該個々の親ポリペプチドの配列におけるそれらセグメントの連結と比べ異なる関係で一緒に連結する工程をさらに含むことが好ましい。このタイプの好ましい実施態様では、該セグメントは無作為に一緒に連結される。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１８】
この方法は、個々の親ポリペプチドの配列又はそれらのセグメントを逆翻訳して、該親ポリペプチド又は該セグメントをコードする核酸配列を得る工程をさらに含むことが好ましい。このタイプの好ましい実施態様では、該親ポリペプチド配列のアミノ酸は逆翻訳されてコドンを与える。このコドンは目的の細胞中の他の同義のコドンよりも高い翻訳効率を有する。該親ポリペプチド配列のアミノ酸は、隣接若しくは局在する配列要素との関係で、課題（例えば、クローニング又は配列決定）の実行に支障をきたす望ましくない配列（例えば、パリンドローム配列又は重層配列）の形成の頻度を低下させるコドンを得るように逆翻訳されることが好ましい。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
別の一側面では、本発明は上で広く述べた合成ポリペプチドの配列を設計するためのコンピュータプログラム生産物であって、
その又はそれぞれの親ポリペプチドの配列を入力として受け入れるコード、
その又はそれぞれの親ポリペプチドの配列をセグメントにセグメント化するコード、
その又はそれぞれの親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するために、その又はそれぞれの親ポリペプチド配列におけるセグメントの連結と比べ異なる関係で該セグメントを連結するコードであって、このように連結されたセグメントの如何なる対もその又はそれぞれの親ポリペプチドの少なくとも一部分ち構造及び／又は機能が実質的に類似する生産物を生じないものであるコード、及び
これらのコード類を記憶するコンピュータ読み取り可能媒体、
を含むコンピュータプログラム生産物を包含する。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２０】
別の一側面では、本発明は、上で広く述べた合成ポリヌクレオチドの配列を設計するこめのコンピュータプログラム生産物であって、
少なくとも一つの親ポリペプチドの配列を入力として受け入れるコード、
それぞれの親ポリペプチドの配列をセグメントにセグメント化するコード、
個々のセグメントの配列を逆翻訳して該セグメントをコードする核酸配列を与えるコード、
その又はそれぞれの親ポリペプチドの配列を入力として受け入れるコード、
その又はそれぞれの親ポリペプチドの配列をセグメントにセグメント化するコード、
個々のセグメントの配列を逆翻訳して該個々のセグメントをコードする核酸配列を与えるコード、
該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するために、該核酸配列のそれぞれを同一読み取り枠の中で一緒に連結して、該断片がその又はそれぞれの親ポリペプチド配列における該セグメントの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されているポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を与えるコードであって、このように連結されたセグメントの如何なる対もその又はそれぞれの親ポリペプチドの少なくとも一部分に構造及び／又は機能が実質的に類似する生産物を生じないものであるコード、及び
これらのコードを記憶するコンピュータ読み取り可能媒体、
を含むコンピュータプログラム生産物を提供する。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
さらに別の一側面では、本発明は上で広く述べた合成ポリペプチドの配列を設計するためのコンピュータであって、
（ａ）機械読み取り可能データでエンコードされたデータ記憶材料を含む機械読み取り可能記憶媒体であって、該機械読み取り可能データがその又はそれぞれの親ポリペプチドの配列を含むものである機械読み取り可能記憶媒体、
（ｂ）該機械読み取り可能データを処理するための命令を記憶するためのワーキングメモリ、
（ｃ）該ワーキングメモリ及び該機械読み取り可能データ記憶媒体に連結しており、且つ該機械読み取り可能データを処理して該合成ポリペプチド配列を与えるための中央処理装置であって、該処理工程がその又はそれぞれの親ポリペプチドの配列をセグメントにセグメント化する工程、及び該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するために、その又はそれぞれの親ポリペプチドにおける該セグメントの連結と比べ異なる関係で該セグメントを一緒に連結する工程を含み、このように連結されたセグメントの如何なる対もその又はそれぞれの親ポリペプチドの少なくとも一部分に構造及び／又は機能が実質的に類似する生産物を生じないものである中央処理装置、及び
（ｄ）該合成ポリペプチド配列を受け入れるための、該中央処理装置に連結している出力ハードウェア、
を含むコンピュータを提供する。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
さらに別の一側面では、本発明は上で広く述べた合成ポリヌクレオチドの配列を設計するためのコンピュータであって、
（ａ）機械読み取り可能データをエンコードされたデータ記憶材料を含む機械読み取り可能データ記憶媒体であって、該機械読み取り可能データが少なくとも一つの親ポリペプチドの配列を含むものである機械読み取り可能データ記憶媒体、
（ｂ）該機械読み取り可能データを処理するための命令を記憶するためのワーキングメモリ、
（ｃ）該ワーキングメモリ及び該機械読み取り可能データ記憶媒体に連結しており、且つ該機械読み取り可能データを処理し該合成ポリヌクレオチド配列を与えるための中央処理装置であって、該処理工程がその又はそれぞれの親ポリペプチドの配列をセグメントにセグメント化する工程、該セグメントの配列を逆翻訳して該セグメントをコードする各セグメントに対する核酸配列を与える工程、及び該核酸配列のそれぞれを同じ読み取り枠内で一緒に連結してポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を与える工程を含むものであり、該ポリペプチド配列において該セグメントが、該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するためにその又はそれぞれの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されているものであり、このように連結されたセグメントの如何なる対もその又はそれぞれの親ポリペプチドの少なくとも一部分に構造及び／又は機能が実質的に類似する生成物を生じないものである中央処理装置、及び
（ｄ）該中央処理装置に連結しており、且つ該合成ポリヌクレオチド配列を受け入れるための出力ハードウェア、
を含むコンピュータに関する。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
こうして、本発明は広く言えば一つ以上の親ポリペプチドからの複数の異なるセグメントを含む合成ポリペプチドであって、該親ポリペプチドと関連する少なくとも一つの機能を抑制し、排除し又は他の方法で改変するために、該セグメントがその又はそれぞれの親ポリペプチドにおけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されるものであり、このように連結されたセグメントの如何なる対もその又はそれぞれの親ポリペプチドの少なくとも一部分に構造及び／又は機能が実質的に類似する生産物を生じないものである合成ポリペプチドに関する。


【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９４】
５．コンピュータ関連実施態様
本発明の合成ポリペプチド配列又は合成ポリヌクレオチド配列の設計又は構築は、ソフトウェアをプログラムされたコンピュータの助けを借りて容易にすることが好ましい。該ソフトウェアはとりわけ親配列をセグメントにセグメント化し、そしてこれらのセグメントを該親配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結する。本発明の所望の合成分子の構築のための親配列の使用の準備として、それがコンピュータ読み取り可能な書式で記憶されることが必要である。こうして、本発明によれば、親分子（例えば、親ポリペプチド）に関する配列データは機械読み取り可能記憶媒体中に記憶され、それは該親分子の配列をセグメントにセグメント化し、ついで該親分子におけるそれらの連結と比べ異なる関係で該セグメントを一緒に連結するように該データを処理することができる。


【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９５】
従って、本発明の別の一実施態様は、機械読み取り可能データをコードされるデータ記憶物質を含む機械読み取り可能データ記憶媒体であって、該データの使用についての指令をプログラムされた機械により使用されるとき、親配列をセグメントにセグメント化し、そして該親配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係でこれらのセグメントを一緒に連結する機械読み取り可能データ記憶媒体を提供する。このタイプの好ましい実施態様では、それぞれのセグメントの配列を逆翻訳して該セグメントをコードする核酸配列を与え、そして該核酸配列のそれぞれを同じ読み取り枠内で一緒に連結して、該セグメントが親ポリペプチド配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されているポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を与えることができるものである機械読み取り可能データ記憶媒体が提供される。


【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１９７】
さらに別の実施態様では、本発明は、本発明の合成ポリヌクレオチドの配列を設計するためのコンピュータプログラム生産物であって、親ポリペプチドの配列を入力として受け入れるコード、該親ポリペプチドの配列をセグメントにセグメント化するコード、それぞれの断片の配列を逆翻訳して該セグメントをコードする核酸配列を与えるコード、該核酸配列のそれぞれを同じ読み取り枠内で一緒に連結してポリヌクレオチド配列を与えるコードであって、該ポリヌクレオチド配列が該セグメントが該親ポリペプチド配列におけるそれらの連結と比べ異なる関係で一緒に連結されているポリペプチド配列をコードするものであるコード、及び該コード類を記憶するコンピュータ読み取り可能媒体を含むコンピュータプログラム生産物を意図する。


【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
操作中に、ＣＰＵ２０は種々の入力及び出力装置３６、４６の使用を調整し、大量記憶メモリ２４からのデータアクセス及びワーキングメモリ２２へのアクセス及びワーキングメモリからのアクセスを調整し、そしてデータ処理工程の順序を決定する。本明細書の機械読み取り可能データを処理するために幾つかのプログラムを使用しうる。代表的なプログラムは、例えば、図２４に例示したフロー図に概述した工程を使用しうる。大まかに述べれば、これらの工程には、（１）少なくとも一つの親ポリペプチド配列を入力する工程、（２）任意選択的にポリペプチド配列それぞれの末端にアラニンスペーサーを付加する工程、（３）該ポリペプチド配列をセグメント（例えば、３０アミノ酸長）にセグメント化する工程、該セグメントは重なり合っている（例えば、１５アミノ酸まで）ことが好ましい、（４）該セグメントを逆翻訳して各セグメントに対する核酸配列を与える工程であって、該逆翻訳では細胞型に対する第１及び第２最適翻訳効率コドンを使用することが好ましく、該コドンが連続するセグメントの重なりにおいて相互に枠から交替してはみ出すことが好ましい工程、（５）該セグメントを無作為に再配置する工程、（６）再配置されたセグメントが親ポリペプチド配列の少なくとも一部を再生するか否かをチェックする工程、（７）再配置されたセグメントが該少なくとも一部を再生する場合、該セグメントの無作為再配置を繰り返す工程、又はそうではなく（８）該再配置されたセグメントを一緒に連結して合成ポリペプチド配列及び／又は合成ポリヌクレオチド配列を作製する工程、及び（９）該合成ポリペプチド配列及び／又は合成ポリヌクレオチド配列を出力する工程が含まれる。とりわけ上述の工程を用いるアルゴリズムの一例を図２５に示す。例を挙げれば、このアルゴリズムは、図２６及び図２７に例示したようなＣ１ａ肝炎及びメラノーマに対する本発明の合成ポリヌクレオチド及び合成ポリペプチドの設計に使用された。


【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１９】
各ＨＩＶタンパク質に対して一旦縮重コンセンサス配列が設計されると、次に該タンパク質配列の全てを安全に該ワクチン中に組み込むためのアプローチが決定された。ワクチンが安全であることを確実にするための一つの便利なアプローチは体系的にセグメント化し、そして該タンパク質配列を無作為に一緒に再配置して該タンパク質の構造及び機能を排除若しくは他の方法で改変することである。しかしながら、このタンパク質配列はなお免疫学的に機能性でなければならず、このことは該配列をセグメント化するために使用される方法が潜在的なエピトープを破壊してはならないことを意味する。タンパク質配列を体系的にセグメント化する最良のアプローチに基づいて決定するため、使用された主要な基準はＴエピトープの大きさ及びそれらの処理の要件であった。クラスＩ限定Ｔ細胞エピトープは８〜１０のアミノ酸長であり、それが非天然の両側残基に隣接して置かれた場合、それらの効率的な処理及び提示を確実にするためには、両側に２〜３の天然アミノ酸を一般に必要とする（デルヴァルら，１９９１、トムソンら， １９９５） 。クラスＩＩ限定Ｔ細胞エピトープは、１２〜２５アミノ酸長の範囲であり、処理のために天然の残基が両側にあることを必要とするようであるが、それらの処理経路の複雑さの故に全ての場合において両側の天然残基役割を排除することは困難である（トムソンら，１９９８） 。また、クラスＩＩ限定エピトープは、ＣＴＬエピトープより大きいにもかかわらず、一般に９〜１０アミノ酸の核配列を有しており、これらのアミノ酸は配列特異的な方式でＭＨＣ分子に結合する。こうして、現在の知識に基づいて、有利なアプローチは、セグメント境界に跨がって存在するかも知れない潜在的エピトープが失われないことを確実にするため、そしてセグメント境界の近くにあり、隣接セグメントの阻害アミノ酸の側若しくは近くに置かれたＣＴＬエピトープが効率的に処理されることを確実にするため、少なくとも１５のアミノ酸により該セグメントを重なり合わせることであると決定された。
該セグメントの最適な大きさを決定する際に、使用された主な基準は、サイズがタンパク質の構造及び機能に最大限の破壊を惹き起こす程に十分小さく、しかし、さらに不必要な重複が一切なく可能な限り効率的に配列情報をカバーする程に十分大きくなければならないということであった。これらの基準に基づき、該セグメントは重なりの大きさの２倍となり、この場合には３０アミノ酸長となるであろう。


【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
次に設計された縮重タンパク質配列を、３０アミノ酸長で且つ１５アミノ酸だけ重なりあうセグメントに分離した。これらのセグメントがエピトープ処理を阻止できるアミノ酸（デルヴァルら，１９９１） に直接隣接して置かれないことを確実にするため、各タンパク質の最初のセグメント及び最後のセグメントの最初及び最後又はエンベロープタンパク質セグメントに二つのアラニンアミノ酸を添加した。次の工程は、各タンパク質配列をＤＮＡに逆翻訳することであった。同一若しくは相同なアミノ酸配列のタンデム反復をコードするＤＮＡ配列を構築することになる場合には、該Ｓａｖｉｎｅの発現を最大化するために、ＤＮＡ配列の重複を回避した。この点で、第１及び第２最多共通使用の哺乳動物コドン（図１２に示す）をこれらの反復領域のアミノ酸に割当てた。第１コドンを反復配列の一方のアミノ酸をコードするために使用し、第２のしかし同義のコドンを他方の反復配列に使用した（例えば、図１３のｇａｇＨＩＶタンパク質を参照）。設計されたアミノ酸突然変異を準備するために、２７塩基の任意のグループの幾つかの位置に、ＩＵＰＡＣのＤＮＡコードを用いて２以上の塩基を割り当てた（３塩基を超える変化はなし）（８個の可能な組み合わせ）（図１２）。必要な縮重塩基が多過ぎるためアミノ酸の特定の組み合わせを組み込み得ない場合には、上に略述したタンパク質コンセンサス設計規則に従って、アミノ酸縮重の一部若しくは全てを除去した。また、縮重コドンが停止コドンをコードするか否かを決定するため縮重コドンをチェックした。もし停止コドンを回避し得なかった場合は、上に概述したタンパク質コンセンサス設計規則に従って、このアミノ酸縮重も再び簡単化された。


【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３３】
上述のことから、本発明者らは、新規なワクチン／治療戦略を開発した。一つの実施態様で、病原体又は癌のタンパク質配列を体系的にセグメント化し、ＤＮＡに逆翻訳し、無作為に再配置し次いで一緒に連結する。次に、設計された合成ＤＮＡ配列を長いオリゴヌクレオチドを用いて構築し、それを様々の送達ベクター中に移転できる。ここで使用されるワクチンベクターは、ＤＮＡワクチンプラスミド及び「プライム−ブースト」プロトコルで一緒に使用すると強力なＴ細胞応答を誘発することが既に示されている（ケントら，１９９７） 組換えポックスウイルスベクターであった。集められた抗原ワクチン即ち「Ｓａｖｉｎｅ」の重要な利点は、該設計のための出発時の配列情報の量が病原体又は癌由来のタンパク質配列の大部分を含めるように容易に拡大でき、それによりワクチン又は治療が所与の集団を可能な最大限まで網羅することを可能とすることである。


【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３４】
ここで述べる体系的セグメント化のアプローチの一実施態様は、Ｔ細胞エピトープの大きさ及び処理についての必要条件に基づくものであり、タンパク質配列の構造及び機能に最大の破壊を惹き起こすように設計された。このセグメント化アプローチは、任意の組み込まれたタンパク質配列からのＴ細胞エピトープの最大可能範囲が存在し、且つ機能的なそしてワクチンの安全性を危うくするタンパク質が存在しないことを確実にする。


【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３７】
Ｓａｖｉｎｅカセットを発現するワクシニアウイルスの二つのプールは両方とも、クレードＢのＨＩＶウイルスで感染させた３名の異なる患者からのＨＩＶ特異的応答を再刺激することを示した。これらの結果は、該ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅが該集団をより広く網羅するはずであるという明確な指摘を与える。何故なら、各患者は異なるＨＬＡパターンを有しており、両プールは試験した３種の天然ＨＩＶタンパク質の全てに対するＨＩＶ特異的ＣＴＬ応答を３名全ての患者で再刺激できたからである。また、両プールは３名の患者全てで事実上同一のＣＴＬパターンを再刺激することが示された。この結果は予想外であった。何故なら二つのプールの間のアミノ酸の相違により一部の応答は失われたり又は獲得されたりしたはずだからであり、そしてプール１は全長ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの３分の２を発現できるに過ぎないからである。ＣＴＬ溶解のこのパターンが該二つのウイルスプールの間で変化しなかった二つの理由が示唆された。第一に、Ｓａｖｉｎｅ構築物中の配列は、セグメントの配列が重なっているのでほとんど全て重複している。従って、該Ｓａｖｉｎｅの３分の１が喪失しても、僅か３種のＨＩＶタンパク質に対する僅か３名の患者試料において相違が検出される程に十分なＴ細胞エピトープを排除しなかったかも知れないということである。第二に、突然変異はしばしばＴ細胞エピトープを破壊するが、それらが機能的状態に留まるならば、それらが形成するＣＴＬは別のエピトープ配列を認識できることが少なくないことである。この所見を併せ考えると、僅か二つのＳａｖｉｎｅ構築物を結合することが強力な多数クレードをカバーしうることが間接的に示唆される。ＨＩＶウイルスの異なる株により形成されるＣＴＬを刺激するＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの能力を直接検討するためにさらなる実験が行なわれつつある。感染患者からのＣＤ４＋Ｔ細胞のＨＩＶ−１特異的応答を刺激する該二つのＨＩＶ−１Ｓａｖｉｎｅワクシニアベクタープールの能力も試験された（図２０）。両プールとも一貫したパターンを示すことはなかったが、両患者はＣＤ４＋Ｔ細胞の有意の増殖を示した。このことは該二つのプールが、いずれかのプールを独立に用いる場合よりもより広いワクチンの網羅を可能とすることを示唆する。


【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４０】
これは、Ｔ細胞の応答が予防又は回復のために重要であると考えられる他の多くのヒト感染又は癌に適用できる一般的戦略である。これを心に留めて本発明者らは、メラノーマ、子宮頸癌、及びＣ肝炎に対するＳａｖｉｎｅを構築することを始めた。メラノーマの場合、現在同定されたメラノーマ抗原の大部分は二つのグループに分けられた。一つはメラノーマと関連する抗原を含むものであり、一つはしばしばメラノーマ中で高レベル調節されるメラニン細胞由来の分化抗原を含むものである。二つのＳａｖｉｎｅ構築物は目下これらの二つのグループの要求を満たすように構築されることになる。区別をする理由は、メラノーマの治療はまずメラノーマ特異的抗原のセグメントのみを組み込むＳａｖｉｎｅを用いて進められるかも知れないということである。若しこのＳａｖｉｎｅが何らかの転移を抑えるのに失敗するときは、メラニン細胞特異的抗原を含むより特異性の低いＳａｖｉｎｅを次に使用できる。他の癌、例えば、精巣癌や乳癌もメラノーマに特異的な抗原の多くを発現することを指摘するのは重要である。従って、該メラノーマ特異的Ｓａｖｉｎｅは他の癌に対しても治療上の利益を有しうる。


【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４１】
小さなＳａｖｉｎｅは子宮頸癌に対しても構築されている。このＳａｖｉｎｅは、全世界的な子宮頸癌の惹起の大部分と直接関連付けられたヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の二つの株、ＨＰＶ−１６及びＨＰＶ−１８由来の二つの抗原、Ｅ６及びＥ７を含む。該二つの株の間のこれらの二つの抗原の配列の相違が多数あり、通常二つのＳａｖｉｎｅの構築が要求されるであろう。しかしながら、このＳａｖｉｎｅは小さいので、両株からの抗原セグメントは一緒に集められる。Ｓａｖｉｎｅアプローチのためには、一つのウイルスからの抗原の全て又は大部分を含めることが通常より良好であるが、この場合には、Ｅ６及びＥ７のみがウイルス潜伏又は子宮頸癌の間に発現される。従って、単純さの利益のため、生殖器いぼに対してはＳａｖｉｎｅ中に全てのＨＰＶ抗原が望まれるであろうが、ＨＰＶゲノムの残りは含められない。


【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４７】
方法
該３４０ｂｐ断片をＰＣＲ増幅し、４％アガロースゲル上でゲル精製した。スピン精製の後、ほぼ１００ｎｇに相当する溶出物の１０μＬを該リゾルベース修復処理に付した。ＤＮＡ試料の残りは後のクローニングのため無処理の対照として保存した。


【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、世界の種々の地域で１９９８年にＡＩＤＳに罹患している人々の数及びこれらの地域における最も優勢なＨＩＶクレード（ｃｌａｄｅｓ） を示すグラフ表示である。ＵＮＡＩＤＳにより作製された見積もりである。
【図２】
図２は、普通のＨＩＶクレードの出現頻度及び将来の見積もりの傾向を示すグラフ表示である。グラフは国際エイズワクチン・イニシャティブ（ＩＡＶＩ）からのものである。
【図３】
図３は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築のために用いられたＨＩＶｇａｇ（配列番号：１）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｇａｇタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図４】
図４は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｐｏｌ（配列番号：２）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｐｏｌタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図５】
図５は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｖｉｆ（配列番号：３）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｖｉｆタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図６】
図６は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｖｐｒ（配列番号：４）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｖｐｒタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図７】
図７は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｔａｔ（配列番号：５）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｔａｔタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図８】
図８は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｒｅｖ（配列番号：６）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｒｅｖタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図９】
図９は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｖｐｕ（配列番号：７）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｖｐｕタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図１０】
図１０は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｅｎｖ（配列番号：８）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｅｎｖタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図１１】
図１１は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの実施態様の構築物のために使用されたＨＩＶｎｅｆ（配列番号：９）のための親ポリペプチド配列の重なり合うセグメントを示す図式的表示である。ＨＩＶモレキュラー・イミュノロジー・データベース１９９７、ベッテ　コルバー、ジョン　ムア、クリスチャン　ブランダー、リチャード　クープ、バートン　ヘインズ、及びブルース　ウォーカー編、ロス・アラモス・ナショナル・ラボラトリ出版、Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、ロス・アラモス、ニューメキシコ、Ｐｕｂ ＬＡＵＲ ９８−４８５ から入手したＨＩＶｎｅｆタンパク質の共通のＨＩＶクレードコンセンサス配列の整列も示してある。
【図１２】
図１２は、各ＨＩＶタンパク質の設計された縮重コンセンサス配列の系統的断片化及び各セグメントのＤＮＡ配列への逆翻訳を図示する図式的表示である。無作為再配列の間に用いられたセグメントの数及び除去されたアミノ酸も示してある。白四角で囲まれたアミノ酸はこの設計から除去された。その理由は、所望のアミノ酸の組合せに提供する縮重コドンが本発明の明細書で概述される縮重配列ルールの組み込みに従うにはあまりに多くの縮重塩基を必要としたからである。白円で囲まれたアミノ酸は関連するセグメントでのみ除去された。これらがオリゴヌクレオチド重なり領域をコードしていたというのが主な理由である。星印でマークされたアミノ酸は対応する重なり領域と比べ一つのセグメントで異なるように設計された（ｔａｔ遺伝子を参照）。
【図１３】
図１３は、ＨＩＶタンパク質セグメントを逆翻訳するために使用された哺乳動物の第１最多使用頻度コドン及び第２最多使用頻度コドンを示す図式的表示である。１塩基のみが変化した二つのアミノ酸の第１及び第２最多使用頻度縮重コドンも全て示してある。２塩基以上が変化した場合に用いられたコドンは、各アミノ酸のコドン全てを比較することによりそれぞれの場合で探し出した。縮重塩基のＩＵＰＡＣコドンも示してある。
【図１４】
図１４は、サブカセット、カセット及び全長Ｓａｖｉｎｅ・ｃＤＮＡのおおよその大きさ、及びそれらを連結する際に関与する制限部位を示すＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅのための構築計画を例示する。それらの設計の間にサブカセットに加えられた余分の配列、及び該サブカセット、カセット及び全長ｃＤＮＡが如何にして構築されそして適当なＤＮＡプラスミドに移転されたかの簡単な記述も示してある。「全長構築物の説明」：ｐＡはＸｈｏＩ／ＳａｌＩで切断し、ＢカセットのＸｈｏＩアーム中にクローニングした。ｐＡＢはＸｈｏＩで切断してＣカセットのＸｈｏＩアーム中にクローニングした。全長構築物は５’末端でＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ又は３’末端でＢｇｌＩＩでのいずれかで切断可能である。「カセットを切断するためのオプション」：Ａ）５’末端でのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ、３’末端でのＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩ、Ｂ）５’末端でのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ、３’末端でのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ、Ｃ）５’末端でのＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ、３’末端でのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ。「開裂用プラスミドベクター」：ｐＤＮＡＶａｃｃはＸｂａＩ／ＸｈｏＩで切断可能である（ＤＮＡワクチン注射）、ｐＢＣＢ０７ベクター又はｐＴＫ７．５ベクターはＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで切断可能である（組換え体ワクシニア）、ｐＡｖｉｐｏｘベクター、ｐＡＦ０９ベクターはＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで切断可能である（組換え体Ａｖｉｐｏｘ）。
【図１５】
図１５は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅ構築物の全長ＤＮＡ（１７２５３ｂｐ）及びタンパク質配列（５７４２アミノ酸）を示す。それぞれ設計されたＨＩＶタンパク質の各セグメントの位置、セグメントの数（括弧内）、スペーサー残基（２個のアラニン残基）及び該スペーサーがどのセグメントのためのものであるか（白ボックス及び矢印）などと共にセグメントの境界が示してある。サブカセット又はカセットの境界に対応する配列（影を付したボックス）を結合する残基の制限部位の位置も、開始コドン及び停止コドン、コザック配列、ネズミインフルエンザウイルスＣＴＬエピトープ配列の位置（３’末端の近く）、両末端の重要な制限部位、及び各縮重アミノ酸の位置（‘Ｘ’で示す）と共に示す。
【図１６】
図１６は、サブカセットＡ１に対して設計されたＤＮＡ配列中のオリゴヌクレオチドのレイアウト及び位置を図示する。短い増幅オリゴヌクレオチドにアニールする配列は平行線を付したボックスで示し、オリゴヌクレオチド重なり領域の位置は濃い影で示す。
【図１７】
図１７において、パネル（ａ）はサブカセットＡ１の二つの半分の段階的不斉ＰＣＲ（それぞれレーン２〜５及び７〜９）及びＳＯＥｉｎｇによる最終スプライシング（レーン１０）を図示する。レーン１のＤＮＡ標準はＳａｕ３ＡＩで消化したｐＵＣ１８である。パネル（ｂ）は示された各カセットの段階的連結媒介結合及びＰＣＲ増幅を示す。レーン１のＤＮＡ標準はＥｃｏＲＩで切断したＳＰＰ１である。
【図１８】
図１８において、パネル（ａ）は一つのＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅカセットを発現するＤＮＡワクチンプラスミドの構築の概要を示す。パネル（ｂ）は一つのＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅカセットを発現するワクシニアウイルスを形成するためのマーカーレスキュー組換えに使用するプラスミドの構築の概要を示す。パネル（ｃ）はＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅ全長ｃＤＮＡをそれぞれが発現するＤＮＡワクチンプラスミドの構築の概要を示す。
【図１９】
図１９は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅ構築物で３回ＨＩＶ感染させた患者のＨＩＶ特異的ポリクローナルＣＴＬ応答の再刺激を示す。３名の異なる患者から得たＰＢＭＣを、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅカセットを発現するワクシニアウイルスのプールで感染させることにより７日間再刺激した。プール１はＶＶ−ＡＣ１及びＶＶ−ＢＣ１を含み、プール２はＶＶ−ＡＣ２、ＶＶ−ＢＣ２及びＶＶ−ＣＣ２を含むものであった。次いで、再刺激されたＰＢＭＣを自己由来のＬＣＬ（５０：１のエフェクター：標的比）と混合し、これを感染させないか又はＨＩＶタンパク質であるｇａｇ（ＶＶ−ｇａｇ）、ｅｎｖ（ＶＶ−ｅｎｖ）又はｐｏｌ（ＶＶ−ｐｏｌ）、ＶＶ−ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅプール１（明るいバー）又はプール２（暗いバー）又は対照のワクシニアウイルス（ＶＶ−Ｌａｃ）のいずれかで感染させ、放出された５１Ｃｒの量を用いて特異的溶解パーセントを測定した。Ｋ５６２細胞はその刺激された培養におけるＮＫ細胞に媒介された死滅のレベルを測定するために使用した。
【図２０】
図２０は、ＨＩＶ−１・Ｓａｖｉｎｅのプール１若しくはプール２のいずれかで再刺激されたＨＩＶ−１感染患者から得たＰＢＭＣのＣＤ４＋ 増殖を示す図式的表示である。簡単に述べれば、ＰＢＭＣをＣＦＳＥで染色し、ＨＩＶ−１・Ｓａｖｉｎｅのプール１若しくはプール２のいずれかをコードするＶＶを加え又は加えずに６日間培養した。次いで、再刺激された細胞を抗体で標識し、ＦＡＣＳで分析した。
【図２１】
図２１は、ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅでワクチン注射したマウスにおけるＣＴＬ応答を示すグラフ表示である。Ｃ５７ＢＬ６マウスを、図１８ａに記載した６個のプラスミドを含むＨＩＶ−１・Ｓａｖｉｎｅ・ＤＮＡワクチンで免疫化した（５０μｇ／脚の筋肉内注射として総量１００μｇのＤＮＡを投与）。１週間後に、ＨＩＶ−１・Ｓａｖｉｎｅのプール１を含むポックスウイルス（１×１０７ ｐｆｕ）を用いて免疫応答をブーストした。３週間後に、これらのマウスから得た脾臓細胞をＶＶ−プール１又はＶＶ−プール２で５日間再刺激し、得られたエフェクターを、ＨＩＶ−１から天然の抗原を発現するＣＴＲＶＶ、ＶＶ−プール又はＶＶで感染させた標的に対する５１Ｃｒ放出細胞障害検定に用いた。
【図２２】
図２２は、ＨＩＶ免疫アカゲザル（実験の２年前にｇａｇ−ｐｏｌを発現する組換えＦＰＶをワクチン注射し、ＨＩＶ−１で感染させた）の免疫応答を示す。サル１及び２はＶＶ・Ｓａｖｉｎｅプール１（一緒になって全ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅを発現する３種のＶＶ）で０日に１回免疫化した。サル３はＦＰＶ−ｇａｇ−ｐｏｌで２回免疫化した、即ち、０日は最初のＦＰＶ−ｇａｇ−ｐｏｌ免疫化の３週間後である）。Ａ）アルドリチオール−２で失活させた全ＨＩＶ−１で刺激された（２０時間、２０μｇ／ｍＬ）全血（０．５ｍＬ、ヘパリンで抗凝結処理された静脈血）のＥＬＩＳＰＯＴによるＩＦＮγ検出。次いで血漿試料を遠心分離（１０００×ｇ）し、捕捉ＥＬＩＳＡを用い抗原特異的ＩＦＮについて二連で検定した。Ｂ）ＨＩＶ−１特異的ＣＤ６９＋ ／ＣＤ８＋ Ｔ細胞のフローサイトメトリー検出。新たに単離されたＰＢＭＣを上のように失活させたＨＩＶ−１で１６時間刺激し、洗浄し、抗体で標識した。次いで、細胞を、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター用いて分析し、データはＣｅｌｌ−Ｑｕｅｓｔソフトウエアを用いて分析した。Ｃ）ＨＩＶ−１特異的ＣＤ６９＋ ／ＣＤ４＋ Ｔ細胞のフローサイトメトリー検出はＢ）に記載したように行なった。
【図２３】
図２３は、図２８及び図２９の記憶媒体によりエンコードされた命令を実行するために用いられたシステムの図を示す。
【図２４】
図２４は、本発明の合成ポリヌクレオチド及び合成ポリペプチドを設計する方法の実施態様を示すフロー図を図示する。
【図２５】
図２５は、図２４に示す方法の工程をとりわけ利用するアルゴリズムを示す。
【図２６】
図２６は、ポリタンパク質配列の断片化、該セグメントの再配置、再配置されたセグメントの連結及びＣ型肝炎感染を治療及び／又は予防するためのＳａｖｉｎｅの調製のための合成ポリヌクレオチド配列及び合成ポリペプチド配列の出力を実行するために、入力したＣ１ａ型肝炎のコンセンサスポリタンパク質配列に図２５のアルゴリズムを適用する１例を示す。
【図２７】
図２７は、下記の配列の断片化を容易にし、該セグメントを再配置し、該再配置されたセグメントを連結し、そしてメラノーマを治療及び／又は予防するためのＳａｖｉｎｅの調製のための合成ポリヌクレオチド及び合成ポリペプチドを出力させるために、入力したコンセンサスメラノサイト分化抗原（ｇｐ１００、ＭＡＲＴ、ＴＲＰ−１、Ｔｙｒｏｓ、Ｔｒｐ−２、ＭＣ１Ｒ、ＭＵＣ１Ｆ及びＭＵＣ１Ｒ）及びコンセンサスメラノーマ特異的抗原（ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ｇｐ１００Ｉｎ４、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＰＲＡＭＥ、ＴＲＰ２ＩＮ２、ＮＹＮＳＯ１ａ、ＮＹＮＳＯ１ｂ及びＬＡＧＥ１）に図２５のアルゴリズムを適用する１例を例示する。
【図２８】
図２８は、磁気記憶媒体の断面図を示す。
【図２９】
図２９は、光学的読み取り可能データ記憶媒体の断面図を示す。
【図３０】
図３０は、６個のＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅカセット配列〔Ａ１（配列番号：３９３）、Ａ２（配列番号：３９９）、Ｂ１（配列番号：３９５）、Ｂ２（配列番号：４０１）、Ｃ１（配列番号：３９７）及びＣ２（配列番号：４０３）〕。Ａ１、Ｂ１及びＣ１は、全長のＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅ（配列番号：４０５）の実施態様を構築するため各カセットの末端に与えられた、例えば、便利な制限酵素部位を用いて、一緒に結合させることができる。Ａ２、Ｂ２及びＣ２も、一緒に結合せて、主要なＨＩＶクレードで共通する３５０アミノ酸の突然変異を持つ全長ＨＩＶ・Ｓａｖｉｎｅの別の実施態様を得る。これらのカセットＡ／Ｂ／Ｃは、該カセットの開始コドンの後又は停止コドンの前に組み込まれた特異的制限酵素部位を用いて連結して単一の構築物とすることができる。




【国際調査報告】
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