(57)【要約】第１のパートナーと第２および第３の結合パートナーとのコンジュゲートを調製し、第４の結合パートナーを調製し、結合パートナーとの分子間結合を形成させ、ここに、第１の結合パートナーは第２の結合パートナーとで試料複合体を形成し、第３の結合パートナーは第４の結合パートナーとで参照複合体を形成し、力を分子間結合に適用し、その結果、試料複合体または参照複合体の解離がもたらされ、次いで、２つの結合複合体のうちいずれが解離したかを決定する；工程を含むことを特徴とする結合複合体を特徴付けおよび／または同定する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の結合パートナーと第２および第３の結合パートナーのコンジュゲートとを調製し、第４の結合パートナーを調製し、
結合パートナーの分子間結合を形成し、ここに、第１の結合パートナーは第２の結合パートナーとで試料複合体を形成し、第３の結合パートナーは第４の結合パートナーとで参照複合体を形成し、
力を該分子間結合に適用し、その結果、試料複合体または参照複合体が解離され、次いで、
２つの結合体のうちいずれが解離したかを決定する；
工程を含むことを特徴とする結合複合体を特徴付けおよび／または同定する方法。
【請求項２】
まず、第２および第３の結合パートナーからコンジュゲートを調製し、次いで、試料複合体および／または参照複合体を形成する請求１記載の方法。
【請求項３】
まず、試料複合体および／または参照複合体を形成し、次いで、第２および第３の結合パートナーを結合させることによってコンジュゲートを調製する請求項１記載の方法。
【請求項４】
第１の結合パートナーを第１の保持手段に固定化し、第４の結合パートナーを第２の保持手段に固定化し、固定化された第１の結合パートナーを第２の結合パートナーと接触させることによって試料複合体を生じさせ、固定化された第４の結合パートナーを第３の結合パートナーと接触させることによって参照複合体を生じさせ、次いで、第１および第２の保持手段を相互に向けて移動させる工程を含み、この場合、第２および第３の結合パートナーは相互と相互作用できるようになる請求項３記載の方法。
【請求項５】
第１の結合パートナーおよび第４の結合パートナーが同一である請求項１ないし４いずれか１記載の方法。
【請求項６】
第１および第２の結合パートナーが、相互に特異的に結合するリガンドおよび受容体である請求項１ないし５いずれか１記載の方法。
【請求項７】
試料複合体が非特異的相互作用に基づく請求項１ないし５いずれか１記載の方法。
【請求項８】
参照複合体が特異的または非特異的相互作用に基づく請求項１ないし７いずれか１記載の方法。
【請求項９】
好ましくは試料複合体の結合パートナーのうち少なくとも１つが物体である請求項１ないし８いずれか１記載の方法。
【請求項１０】
試料複合体の結合パートナーのうち少なくとも１つが生体分子である前記請求項いずれか１記載の方法。
【請求項１１】
第１および／または第４の結合パートナーを、好ましくは、各々が各物体を有する、各々、第１および第２の保持手段に固定する前記請求項いずれか１記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの物体が、好ましくは、それに複数の試料複合体および／または参照複合体が連結することができる巨視的に大きな表面を有する請求項９ないし１１いずれか１記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの物体が、好ましくは、粒子、磁性粒子、常磁性粒子、反磁性粒子、コロイド、分子、荷電分子、ポリマーおよび多重荷電ポリマーを含む群から選択されるナノレベルで小さいものである請求項９ないし１２いずれか１記載の方法。
【請求項１４】
分子間結合を解離させるための力を巨視的張力によって適用する前記請求項いずれか１記載の方法。
【請求項１５】
力を磁場によって適用する前記請求項いずれか１記載の方法。
【請求項１６】
力を水力学流によって適用する前記請求項いずれか１記載の方法。
【請求項１７】
音波、好ましくは超音波におけるカップリングによって力を適用する前記請求項いずれか１記載の方法。
【請求項１８】
静電力を適用することによって力を形成する前記請求項いずれか１記載の方法。
【請求項１９】
吊り下げ手段および／または該連結の分子立体配座の変化によって力を適用する前記請求項いずれか１記載の方法。
【請求項２０】
与えられた力速度を維持しつつ力を適用する前記請求項いずれか１記載の方法。
【請求項２１】
力速度の設定を、それで保持手段を分離する引き抜き速度によって行う請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
力速度の設定を、その結合との分子間結合のバネ定数によって行う請求項２０または２１記載の方法。
【請求項２３】
バネ定数の設定を、リガンドの結合または受容体を連結させる連結よりなるポリマーの長さの変動によって行う請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
試料複合体および／または参照複合体が、低分子量物質、ポリマー、蛋白質、抗体、抗原、ハプテン、天然または合成核酸、粒子、ウイルス、ファージ、細胞、細胞成分および／またはキレート化剤のごとき複合体−形成性物質を含む群から選択される少なくとも１つの成分を有する前記請求項いずれか１記載の方法。
【請求項２５】
第１の結合パートナーを第１の保持手段に固定化し、第４の結合パートナーを第２の保持手段に固定化し、試料を表す第２および第３の結合パートナーのコンジュゲートを調製し、ここに、第２の結合パートナーは第１の結合パートナーに結合でき、かつ第３の結合パートナーは第４の結合パートナーに結合でき、次いで、第１および第２の保持手段を相互に向けて移動させる工程を含み、その場合、試料の結合パートナーは他の２つの会合した結合パートナーと相互作用できるようになる請求項１ないし２４いずれか１記載の方法。
【請求項２６】
試料を表す第１の結合パートナーを第１の保持手段に固定化し、第４の結合パートナーを第２の保持手段に固定化し、第２および第３の結合パートナーのコンジュゲートを調製し、ここに、第２の結合パートナーは試料に結合でき、かつ第３の結合パートナーは第４の結合パートナーに結合でき、次いで、第１および第２の保持手段を相互に向けて移動させる工程を含み、ここに、会合した結合パートナーは相互作用できるようになる請求項１ないし２４いずれか１記載の方法。
【請求項２７】
試料複合体および／または参照複合体、好ましくは、少なくとも１つの結合パートナーを標識し、次いで、力の適用後に起こる解離位置を間接的または直接的に検出する工程を含む前記請求項いずれか１記載の方法。
【請求項２８】
第２および第３の結合パートナーのコンジュゲート、第２の結合パートナーまたは第３の結合パートナーに第１のマーカーを設け、第１または第４の結合パートナーに第１のマーカーとは異なる第２のマーカーを設ける請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
解離位置の同定を、保持手段の１つに結合した第１のマーカーの量を確認し、同保持手段に結合した第２のマーカーの量を確認し、次いで、確認した値を相互に比較しおよび／またはそれらを相互に関連付けることによって行う請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
まず、第１、第２、第３および第４の結合パートナーを含む分子間結合を第１の保持手段上に形成させ、次いで、第２の工程において、第２の保持手段に対するカップリングを行う請求項１ないし３、５ないし２４または２７いずれか１記載の方法。
【請求項３１】
（ｉ）第１の結合パートナーＢＰ１と第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートとを第１の保持手段上に結合させ、
第４の結合パートナーＢＰ４を第２の保持手段に固定化し、
第３の結合パートナーＢＰ３および第４の結合パートナーＢＰ４が相互に結合できるように、２つの保持手段を相互に向けて移動させるか、あるいは
（ｉｉ）第４の結合パートナーＢＰ４と第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートとを第２の保持手段上に結合させ、
第１の結合パートナーＢＰ１を第１の保持手段に固定化し、次いで、
第２の結合パートナーＢＰ２および第１の結合パートナーＢＰ１が相互に結合できるように、２つの保持手段を相互に向けて移動させる請求項１ないし３または５ないし２９いずれか１記載の方法。
【請求項３２】
結合パートナーの少なくとも１つが核酸、特にＤＮＡを含む請求項２７ないし３１いずれか１記載の方法。
【請求項３３】
結合パートナーの少なくとも２つが天然または合成核酸を含む請求項２７ないし３２いずれか１記載の方法。
【請求項３４】
標識を蛍光分子によって行う請求項２７ないし３３いずれか１記載の方法。
【請求項３５】
結合複合体の結合パートナーに第１の発蛍光団を設け、第２の結合パートナーに第２の発蛍光団を設け、その間で、蛍光共鳴移動（ＦＲＥＴ）が起こる請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
結合複合体の結合パートナーに発蛍光団を設け、第２の結合パートナーに、発蛍光団の蛍光を消光する分子を設ける請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
標識が、蛍光ナノスコピック半導体粒子（量子ドット）を含む請求項２７ないし３３いずれか１記載の方法。
【請求項３８】
放射性標識を含む請求項２７ないし３３いずれか１記載の方法。
【請求項３９】
マーカーが酵素、または反応によってシグナル物質を生じる酵素がそれに結合することができるアフィニティーマーカーを含む請求項２７ないし３３いずれか１記載の方法。
【請求項４０】
検出可能なシグナルを生じる酵素の活性化を、複合体の解離にカップリングさせる請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
マーカーがエレクトロルミネセンスの分子、電気化学的に検出可能な分子、または質量分析によって検出することができる質量マーカーを含む請求項２７ないし３３いずれか１記載の方法。
【請求項４２】
該方法が多くの同様な分子間結合に対して行われる請求項１ないし４１いずれか１記載の方法。
【請求項４３】
分子間結合の一種のみがただ１つの力速度においてテストされ、分子間結合が常に同一の試料複合体および常に同一の参照複合体を含む請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
分子間結合の一種のみが異なる力速度においてテストされ、分子間結合が常に同一の試料複合体および常に同一の参照複合体を含む請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
種々の分子間結合がただ１つの力速度においてテストされ、分子間結合が常に同一の試料複合体を含むが、異なる解離力を持つ変化する参照複合体を含む請求項４２記載の方法。
【請求項４６】
種々の分子間結合が種々の力速度においてテストされ、分子間結合が常に同一の試料複合体を含むが、異なる解離力を持つ変化する参照複合体を含む請求項４２記載の方法。
【請求項４７】
分子間結合がただ１つの手法に対して系列的にテストされる請求項４４ないし４６いずれか１記載の方法。
【請求項４８】
種々の分子間結合または力速度が、好ましくは、別々の手法において平行してテストされる請求項４４ないし４６いずれか１記載の方法。
【請求項４９】
加えて、カップリング数および／またはカップリング効率、すなわち、現実に形成されたカップリングの数および最大可能なカップリングの数の比が少なくともほぼ決定され、所望により、試料複合体または参照複合体が解離したか否かを決定するにおいて、カップリング数および／またはカップリング効率が考慮される前記請求項いずれか１記載の方法。
【請求項５０】
（ｉ）最初の工程（＝力比較）において、分離操作の後に第１の保持手段から第２の保持手段へ移動した第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定し、および／または分離操作の後に、第１の保持手段から第２の保持手段に移動しなかった第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定し、
ここに、第１の結合パートナーＢＰ１は第４の結合パートナーＢＰ４とは異なり、および
（ｉｉ）カップリング効率を測定するための第２の工程（＝自己−比較）において、分離操作の後に第１の保持手段から第２の保持手段に移動した第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定し、および／または分離操作の後に第１の保持手段から第２の保持手段に移動しなかった第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定し、
ここに、第２の工程における第１の結合パートナーＢＰ１および第４の結合パートナーＢＰ４は同一であって、第２の結合パートナーＢＰ２が第３の結合パートナーＢＰ３と実質的に同一であるように、第１の結合パートナーＢＰ１は第４の結合パートナーＢＰ４としても用いられるか、あるいは第４の結合パートナーＢＰ４は第１の結合パートナーＢＰ１としても用いられる請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
（ｉ）第１の結合パートナーＢＰ１と第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートとを第１の保持手段上に結合させ、
第４の結合パートナーＢＰ４を第２の保持手段に固定化させ、
第３の結合パートナーＢＰ３および第４の結合パートナーＢＰ４が相互に結合できるように、２つの保持手段を相互に向けて移動させ、
分離操作の後に第１の保持手段から第２の保持手段に移動した第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定し、および／または分離操作の後に第１の保持手段から第２の保持手段に移動しなかった第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定し、
（ｉｉ）第４の結合パートナーＢＰ４と第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートとを第２の保持手段に結合させ、
第１の結合パートナーＢＰ１を第１の保持手段に固定化し、
第２の結合パートナーＢＰ２および第１の結合パートナーＢＰ１が相互に結合できるように、２つの保持手段を相互に向けて移動させ、
分離操作の後に第２の保持手段から第１の保持手段に移動した第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定し、および／または分離操作の後に第２の保持手段から第１の保持手段に移動しなかった第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定する請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
第１の結合パートナーと、第２および第３の結合パートナーのコンジュゲートと、第４の結合パートナー、
結合パートナーの分子間結合のための手段、ここに、第１の結合パートナーは第２の結合パートナーとで試料複合体を形成し、第３の結合パートナーは第４の結合パートナーとで参照複合体を形成し、
分子間結合に力を適用し、その結果、試料複合体または参照複合体の解離をもたらすための手段、および
２つの結合複合体のうちいずれが解離したかを決定するための手段；
を含むことを特徴とする結合複合体を特徴付けおよび／または同定するための装置。
【請求項５３】
まず、第２および第３の結合パートナーからコンジュゲートが形成され、次いで、試料複合体および／または参照複合体が形成される請求項５２記載の装置。
【請求項５４】
まず、試料複合体および／または参照複合体が形成され、次いで、第２および第３の結合パートナーを連結させることによってコンジュゲートが調製される請求項５２記載の装置。
【請求項５５】
第１の結合パートナーが第１の保持手段に固定化され、第４の結合パートナーが第２の保持手段に固定化され、第２の結合パートナーが第１の結合パートナーとで試料複合体を形成し、および第３の結合パートナーが第４の結合パートナーとで参照複合体を形成し、第１および第２の保持手段を相互に向けて移動させるための手段を含み、その場合、第２および第３の結合パートナーが相互作用できるようになる請求項５４記載の装置。
【請求項５６】
第１の結合パートナーおよび第４の結合パートナーが同一である請求項５２ないし５５いずれか１記載の装置。
【請求項５７】
第１および第２の結合パートナーが、相互に特異的に結合するリガンドおよび受容体である請求項５２ないし５６いずれか１記載の装置。
【請求項５８】
試料複合体が非特異的相互作用に基づく請求項５２または５６いずれか１記載の装置。
【請求項５９】
参照複合体が特異的または非特異的相互作用に基づく請求項５２ないし５８いずれか１記載の装置。
【請求項６０】
好ましくは試料複合体の結合パートナーのうち少なくとも１つが物体である請求項５２ないし５９いずれか１記載の装置。
【請求項６１】
試料複合体の結合パートナーのうちの少なくとも１つが生体分子である請求項５２ないし６０いずれか１記載の装置。
【請求項６２】
第１および／または第４の結合パートナーが、好ましくは、各々が各物体を有する、各々、第１および第２の保持手段に固定される請求項５２ないし６１いずれか１記載の装置。
【請求項６３】
少なくとも１つの物体が、好ましくは、複数の試料複合体および／または参照複合体がそれに連結することができる巨視的に大きな表面を有する請求項６０ないし６２いずれか１記載の装置。
【請求項６４】
少なくとも１つの物体が、好ましくは、粒子、磁性粒子、常磁性粒子、反磁性粒子、コロイド、分子、荷電分子、ポリマーおよび多重荷電ポリマーを含む群から選択され、ナノレベルで小さい請求項６０ないし６３いずれか１記載の装置。
【請求項６５】
分子間結合を解離させるための力手段が、巨視的張力を適用するための手段を有する請求項５２ないし６４いずれか１記載の装置。
【請求項６６】
磁気力を適用するための手段を含む請求項５２ないし６５いずれか１記載の装置。
【請求項６７】
水力学力を適用するための手段を含む請求項５２ないし６６いずれか１記載の装置。
【請求項６８】
音波、好ましくは超音波におけるカップリングのための手段を含む請求項５２ないし６７いずれか１記載の装置。
【請求項６９】
静電力を適用するための手段を含む請求項５２ないし６８いずれか１記載の装置。
【請求項７０】
吊り下げ手段および／または連結の分子立体配座の変化を生じさせるための手段を含む請求項５２ないし６９いずれか１記載の装置。
【請求項７１】
与えられた力速度を維持しつつ力が適用される請求項５２ないし７０いずれか１記載の装置。
【請求項７２】
保持手段がそれで分離される力速度、好ましくは引き抜き速度を設定するための手段を含む請求項７１記載の装置。
【請求項７３】
力速度が、その結合と共に分子間結合のバネ定数によって設定することができる請求項７１または７２記載の装置。
【請求項７４】
バネ定数が、リガンドの結合または受容体に連結する連結よりなるポリマーの長さの変動によって設定することができる請求項７３記載の装置。
【請求項７５】
試料複合体および／または参照複合体が、低分子量物質、ポリマー、蛋白質、抗体、抗原、ハプテン、天然または合成核酸、粒子、ウイルス、ファージ、細胞、細胞成分および／またはキレート化剤のごとき複合体−形成性物質を含む群から選択される少なくとも１つの成分を有する請求項５２または７４いずれか１記載の装置。
【請求項７６】
第１の結合パートナーを第１の保持手段に固定化し、第４の結合パートナーを第２の保持手段に固定化し、コンジュゲートが、試料を表す第２および第３の結合パートナーを含み、ここに、第２の結合パートナーは第１の結合パートナーに結合することができ、かつ第３の結合パートナーは第４の結合パートナーに結合することができ、第１および第２の保持手段を相互に向けて移動させるための手段を含み、ここに、試料の結合パートナーは他の２つの会合した結合パートナーと相互作用できるようになる請求項５２ないし７５いずれか１記載の装置。
【請求項７７】
試料を表す第１の結合パートナーを第１の保持手段に固定化し、第４の結合パートナーを第２の保持手段に固定化し、コンジュゲートは第２および第３の結合パートナーを含み、ここに、第２の結合パートナーは試料に結合することができ、かつ第３の結合パートナーは第４の結合パートナーに結合することができ、第１および第２の保持手段を相互に向けて移動させるための手段を含み、ここに、会合した結合パートナーは相互作用できるようになる請求項５２ないし７５いずれか１記載の装置。
【請求項７８】
試料複合体および／または参照複合体、好ましくは少なくとも１つの結合パートナーに対する標識、および力の適用後に起こる解離位置を間接的または直接的に検出するための手段を含む請求項５２ないし７７いずれか１記載の装置。
【請求項７９】
第２および第３の結合パートナーのコンジュゲートに対する第１のマーカーおよび第１または第４の結合パートナーに対する第２のマーカーを含み、ここに、第２のマーカーは第１のマーカーとは異なる請求項７８記載の装置。
【請求項８０】
標識を蛍光分子によって行う請求項７８または請求項７９記載の装置。
【請求項８１】
結合複合体の結合パートナーに第１の発蛍光団が設けられ、第２の結合パートナーに第２の発蛍光団が設けられ、その間で、蛍光共鳴移動（ＦＲＥＴ）が起こる請求項８０記載の装置。
【請求項８２】
結合複合体の結合パートナーに発蛍光団が設けられ、第２の結合パートナーに、発蛍光団の蛍光を消光する分子が設けられる請求項８０記載の装置。
【請求項８３】
標識が蛍光を発するナノスコピック半導体粒子を含む（量子ドット）請求項７８または７９記載の装置。
【請求項８４】
標識が放射性である請求項７８または７９記載の装置。
【請求項８５】
標識が、酵素、または反応によってシグナル物質を生じさせる酵素がそれに結合することができるアフィニティーマーカーを有する請求項７８または７９記載の装置。
【請求項８６】
検出可能なシグナルを生じる酵素の活性化を、複合体の解離とカップリングさせる請求項８５記載の装置。
【請求項８７】
標識がエレクトロルミネセンスの分子、電気化学的に検出可能な分子、または質量分析によって検出することができる質量標識を含む請求項７８または７９記載の装置。
【請求項８８】
測定操作がそこで行われる多くの同様な分子間結合を有する請求項５２ないし８７いずれか１記載の装置。
【請求項８９】
分子間結合の一種のみがただ１つの力速度においてテストされ、ここに、分子間結合は常に同一の試料複合体および常に同一の参照複合体を含む請求項８８記載の装置。
【請求項９０】
分子間結合の一種のみが種々の力速度においてテストされ、ここに、分子間結合は常に同一の試料複合体および常に同一の参照複合体を含む請求項８８記載の装置。
【請求項９１】
種々の分子間結合がただ１つの力速度においてテストされ、ここに、分子間結合は常に同一の試料複合体を含むが、種々の解離力を持つ種々の参照複合体を含む請求項８８記載の装置。
【請求項９２】
種々の分子間結合が種々の力速度においてテストされ、ここに、分子間結合は常に同一の試料複合体を含むが、種々の解離力を持つ種々の参照複合体を含む請求項８８記載の装置。
【請求項９３】
分子間結合がただ１つの手法にて系列的にテストされる請求項９０ないし９２いずれか１記載の装置。
【請求項９４】
種々の分子間結合または力速度が、好ましくは、別々の手法において並行してテストされる請求項９０ないし９２いずれか１記載の装置。
【請求項９５】
試料複合体の解離力がほぼ決定できるように、参照複合体の解離力が選択される請求項５２ないし９４いずれか１記載の装置。
【請求項９６】
請求項１ないし５１いずれか１記載の方法を実施するための結合複合体を同定するためのキット。
【請求項９７】
請求項５２ないし９５いずれか１記載の手段を有する結合複合体を同定するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、特に示差力試験（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｆｏｒｃｅ ｔｅｓｔ）によって分子の解離力を区別することによって、結合複合体を特徴付けおよび／または同定するための方法および装置に関する。
【０００２】
平衡定数に基づく結合試験
分子間の非共有結合相互作用は、水素架橋、イオン力、疎水性力およびファンデルワールス力による結合パートナーの原子の相互作用に基いている。弱い相互作用は、化学反応によって形成または解離される共有結合よりも数桁低い。
【０００３】
高度の選択的結合特性を有する結合パートナー間の非共有結合的な相互作用は、化学分析および診断で使用される分子検出に必須である。以後、本明細書中では、かかる相互作用を特異的相互作用という。生化学的モジュールを同定または特徴付けする方法は、一般的に結合試験を含む。
【０００４】
結合試験はリガンドと受容体との特異的相互作用による結合複合体の形成およびその複合体の同定に基づく。
【０００５】
診断結合試験において、重要な考慮事項は試料中の既知の物質を同定して：
−試料物質の同一性を決定すること
−複合体試料混合物中の試料物質を同定すること
−試料物質の変形を区別すること、および
−試料物質の濃度を決定することである。
【０００６】
新たな診断剤または治療剤を開発するための結合試験において、重要な考慮事項は所定の結合パートナーに対して、好適な未だ知られていない第２の結合パートナーを見出すことである、すなわち；
−所定の受容体に結合する複数の試料物質を同定すること、
−受容体に対する試料物質の結合定数を決定すること、および
−さらに、結合（オン・レート）または解離（オフ・レート）の速度のごときさらなる結合特性を決定すること。
【０００７】
免疫診断において、受容体は一般的に抗体または抗体誘導体であり、それを用いて、タンパク質、低分子物質のみならずウイルスおよび全細胞の形態の抗原を検出および同定することが可能である。
【０００８】
分子的診断においては、受容体に関しては、ＤＮＡまたはＲＮＡのごとき核酸を含み、それを用いて試料中で核酸を同定するプローブを参照する。
【０００９】
最も広範に普及している免疫診断試験は酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）である。ＥＬＩＳＡ法においては、第１の抗体を表面に固定化する。それは、第１の結合部位（エピトープ）によって、添加した試料混合物の抗原に選択的に結合する。マーカーが配された、遊離溶液中に存在する第２の抗体は、抗原の第２のエピトープに結合する。分離工程において、抗原に結合しなかった標識した抗体の画分を分別する。第１の抗体、抗原および第２の抗体を含む表面の背部に存在したままのサンドイッチ複合体は、マーカーによって同定する。色を形成することによってシグナルを発生する酵素は、一般的に、マーカーに結合し得る。最終的に、その色は調べる試料中の抗原の量に関する測定となる。
【００１０】
典型的な分子的診断試験はサザーンハイブリダイゼーションである。それは試料混合物の相補的核酸に対する既知の核酸分子、すなわちプローブの相互作用に基づいている。試料を表面に固定化し、標識したプローブを添加する。好適な緩衝液および温度条件下においては、プローブ分子が試料の相補的配列に結合する。結合しなかったプローブを分離した後に、プローブおよび試料分子を含む形成した核酸二本鎖をマーカーによって定量する。
【００１１】
小型化プローブ配置（ＤＮＡマイクロアレイ）上での高度にパラレルな核酸解析に基づくリバース・サザーンハイブリダイゼーションにおいては、プローブ分子を表面に結合させ、標識した分子を遊離溶液に添加する。
【００１２】
ＥＬＩＳＡおよびサザーンハイブリダイゼーションは、結合結果を標識手法によって同定し、結合パートナーのうちの１つを表面に結合させるという共通の態様を有する。全ての現在の結合試験と共通してそれが有するさらなる特性は、お互いに対する２つの結合パートナーの結合特性を、得られる結合複合体における結合エネルギーの大きさに基づいて特徴付けることである。
【００１３】
力成分をやはり使用する分析方法は、ＷＯ９９／４５１４２によって記載されている。これには、張力によって、試料物質の沈澱によって結合された後に直ちに核酸複合体を分離することが含まれる。その複合体の分離の結果、２の発蛍光団の空間的な分離によって蛍光シグナルを生じる。
【００１４】
このことに関して、核酸二本鎖の代わりに試料物質の結合複合体を分離することも可能であろうという事実については何ら提供されていない。したがって、２つの結合複合体の結合力の間の力の比較は存在しない。それどころか、ＷＯ９９／４５１４２では、分析物の存在および不存在を判定することしかできない。
【００１５】
ＷＯ９９／４５１４２においては、試料物質と受容体との間の結合力の大きさが価値ある分析情報事項を表すことも、記載したものを判定するための手段となることも具体的に表現されていない。
【００１６】
分子相互作用のモデル
２つの結合パートナー間の化学的相互作用は種々のモデルによって記載し得る。古典的な理論構造は熱力学である。熱力学の発展のために決定的な因子は、個々の分子における分子相互作用を長時間にわたって測定することが不可能であったことであった。したがって、そこにおいては、巨視的に測定可能なパラメータに基づく粒子の相互作用が記載されている。それは、結合を解離するために必要なエネルギーとして定義される結合エネルギーの概念を生じる。お互いに対する２つの結合パートナーの結合エネルギーは、平衡定数によって遊離しているおよび結合している結合パートナーの濃度レベルを測定することによって推定し得る。
【００１７】
分子的相互作用の特徴付けの基本的に異なる概念は、個々の分子において、例えば原子間力顕微鏡を用いる力測定によって可能となった。２つの結合パートナーの原子間に生成する力は、加えられる解離力によって実験的に測定し得る。ある種の条件下においては、結合複合体の結合ポテンシャルは解離力の比率依存性から再構成し得る。その結合エネルギーに基づく結合複合体の特徴付けとは対照的に、力測定の際の複合体の分解は熱的励起によってではなく操作的な介入によって支配される。
【００１８】
極めて単純化した結合モデルを本明細書に記載して、結合ポテンシャルを説明する。
結合複合体は唯一その結合エネルギーによって特徴付けされるものではない。それは、それに特徴的であってその結合および分解の確率を決定する活性化障壁をも有する。各結合複合体は、決まった空間構造をも有する。その構造を説明する特徴的なパラメータは、結合長またはポテンシャル幅である。それらのパラメータは、図１に示す結合ポテンシャルの以下の単純なモデルに要約し得る。
【００１９】
結合した状態において、リガンドは最低のポテンシャルで存在する。複合体を切り離すためには、リガンドは結合ポケットまたは結合ポテンシャルの外側へのポテンシャル障壁を越えなければならない。その目的に必要な力は、ポテンシャルの微分係数（傾き）によって決まる。
【００２０】
機械的な切断作用に重ね合わされるのは、熱的活性化による複合体の自発的分解である。その自発的分解は、活性化障壁ΔＧに依存する。複合体に加えた力は、依然として克服すべき活性化障壁を低くする。したがって、いずれかの加えられた力によって、複合体は所定時間内に分解する特定の確率を有する。したがって、複合体が実際に分解する時点の力は、如何に迅速に力を加えるのかにも依存する。複合体が分解するまで一定の力速度ｒで加える力を連続的に増加する場合には、加える力の比率に依存して（ｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｎ）、複合体に対する以下の平均解離力が得られる：
【００２１】
【数１】
2004525341.tif 000002
【００２２】
種々の力速度にて各々の平均解離力を測定すれば、それから、結合複合体の特徴である結合幅Δｘおよび複合体の分解速度ｋｄｅｃｏｍｐ．を決定することが可能である。
【００２３】
したがって、解離力の測定は、結合複合体の特徴付けに対する新たなアプローチを表す。
【００２４】
分子的な力の測定の方法
大部分の結合試験では結合エネルギーに基づいて選択的な相互作用を検出するが、結合複合体の特徴的な解離力の利点を享有する方法の例が存在する。
【００２５】
かかる装置の第１の例は、Ｉｓｒａｅｌａｃｈｖｉｌｉによって１９７６年に開発された“表面力測定装置（ＳＦＡ）”である（米国特許第５，８６１，９５４号、１９９９、Ｉｓｒａｅｌａｃｈｖｉｌｉ）。その装置を用いて、互いに対する２の分子の層の接着力を測定し得る。その目的のために、各試料物質を円筒形の曲面マイカシートに加え、それは理想的な場合には１の点のみで接触させる。お互いに対してマイカ表面の正確に制御された移動によって、分子の層間に力を加える。加えた力に依存してお互いに対する表面の移動を測定すると、２の分子の層間の接着力に関する情報が得られる。
【００２６】
分子の力を測定する第２の方法には、“原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）”が含まれる。ＡＭＦは、生物学的受容体−リガンド対であるビオチン−ストレプトアビジン系の弱い相互作用の解離力を測定するのに成功した最初のものである（Ｅ． Ｌ． Ｆｌｏｒｉｎ， Ｖ． Ｔ． ＭｏｙおよびＨ． Ｅ． Ｇａｕｂ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６４， ４１５（１９９４））。ＳＦＡと異なり、ＡＦＭは接触させる巨視的な表面を含まない。ＡＦＭの先端はわずか数ナノメートルのサイズであり、理想的な場合にはその末端で個々の原子上の点に近づき得る。最良のシナリオにおいては、個々の分子、例えばＤＮＡ二本鎖をＡＦＭ先端と第２の表面との間に吊り下げ（ｓｕｓｐｅｎｄ）得る。ここで先端を表面から引き離すと、分子の応力およびＡＦＭ片持ちバネの曲げを生じ、片持ちバネの既知のバネ定数にて分子結合力を測定することができる。
【００２７】
診断適用の指向を目的とするＡＦＭ法の修飾は、Ｌｅｅらに対する米国特許第５，９９２，２２６号に記載されている。本明細書においては、試料を、平らな表面に存在させる代わりに、点で終結する突出部とＡＦＭ先端との間に結合させる。
【００２８】
分子力を特徴付ける第３の方法は、微視的な小磁性ビーズの使用に基づく。受容体を磁性ビーズに結合し、それを、表面に結合したリガンドと結合複合体を形成させる。磁性ビーズを所定の磁場に曝した場合には、所定の引抜き力（ｐｕｌｌｉｎｇ ｆｏｒｃｅ）が表面とビーズの間の結合複合体に加わり得る。それを結合複合体の分離が生じるまで変化させつつ、磁性ビーズの位置が引抜き力の方向で観察されれば、受容体とリガンドとを分裂させるのに必要である解離力を測定することが可能である。
【００２９】
磁性ビーズでの解離力の同定は、力を結合リガンドと非結合リガンドの分離にのみ用いる免疫サンドイッチ試験に由来するものである（Ｒｏｈｒに対する米国特許第５，４４５，９７０号および第５，４４５，９７１号、１９９５年）。原理的には、抗体に対する抗原の弱い特異的結合を強い特異的結合から区別し得るような、引抜き力の正確な釣合いをより広範なアプローチが提供する（Ｌｅｅに対する国際公開番号ＷＯ９９／３６５７７、１９９９年）。
【００３０】
第４の方法には、“光ピンセット”を用いる力測定が含まれる。その手法の基本はＡｒｔｈｕｒ Ａｓｈｋｉｎまでさかのぼる。引抜き力を加えることは、本明細書中においては、微視的な粒子を捕捉および移動させ得る強力に集光したレーザー光線を移動させることによって実行する。
【００３１】
診断目的で力測定するための光ピンセットの適用は、Ｋｉｓｈｏｒｅによって記載されている（Ｋｉｓｈｏｒｅら、米国特許第５，６２０，８５７号、１９９７年）。
【００３２】
第５の方法は、プローブでコートした表面に対する試料物質でコートした弾力性ピラー（等角ピラー（ｃｏｎｆｏｒｍａｌ ｐｉｌｌａｒ））の接着に基づく。ピラーが再度表面から脱着する場合、試料を同定するよう働く解離力を測定することが可能である（Ｄｅｌａｍａｒｃｈｅらに対する特許ＥＰ ０ ９６２ ７５９、１９９９）。結合エネルギーに基づく代わりに解離力に基づいて結合複合体を特徴付けすることにより、幾つかの非常に重要な利点が得られる。結合のポテンシャル幅によって、結合の特徴付けの新たな独立パラメータを得ることが可能であり、それは同一の結合エネルギーを含む種々の結合様式をお互いに区別することを可能にする。それは、特に、タンパク質に関する非特異的および特異的結合を識別することに関して、および完全に相補的である核酸二本鎖と誤対合である核酸二本鎖との間を区別するために適用される。
【００３３】
本発明の目的は、単純な試験を許容する方法および装置を提供することである。
その目的は、特許請求の範囲の特徴によって達成される。
【００３４】
本発明のさらなる目的は、現在までの技術水準では不可能である広範な応用および商業的用途にアクセス可能な解離力を区別することに基づく結合試験の記載した利点を作成することである。
【００３５】
本発明は、従来の力識別方法を超える利点を有する。分子力測定の従来の方法は、完全に異なる目的を元来供した方法のさらなる発展である。ＳＦＡ法は表面力について開発され、ＡＦＭは表面をイメージングするために開発され、磁性ビーズは分子を分離するために開発され、等角ピラー法は表面を構成するための分取方法として開発された。
【００３６】
本発明のさらなる目的は、複数の非協同的な個々の事象を同時に試験することによって結合複合体の結合特性を試験し得る力試験を提供することである。
【００３７】
磁性ビーズを用いる方法の場合、得られた結果は、一般的に、ビーズに固定した複数の結合複合体としての複数の協同的な事象に基づく解離力である。
【００３８】
本発明のさらなる目的は、結合複合体の分離および結果の検出を時間に関して分離する力試験（１回限り）である。これは、単純な装置構造および検出方法を選択する観点における高度の融通性を生じる。
【００３９】
本発明のさらなる目的は複雑な装置構造を必要としない力学的試験であり、その実施は熟練者を必要としない。
【００４０】
本発明のさらなる目的は、多くの異なる試料の高度に平行した測定を許容する力学的試験である。
【００４１】
本発明のさらなる目的は、光ピンセットおよび磁性ビーズの張力を遥かに超える張力を実行し得る力学的試験である。
【００４２】
本発明のさらなる目的は、ＥＬＩＳＡのごとき方法において可能であるよりも結合パートナーに関するより迅速な結合動力学を提供することであり、そこでは遊離溶液中に存在する反応パートナーの拡散速度によって動力学が制限される。
【００４３】
記載した方法とは対照的に、本発明は、結合ポテンシャルを測定するための発端から設計され、現在の技術水準を超える重要な利点を供する手法に基づく。
【００４４】
Ｉｓｒａｅｌａｃｈｖｉｌｉによる表面力装置は生体分子の解析には好適でない。その装置の構造は極めて複雑であって費用が高く、その理由のために診断目的にはとても好適であるとはいえない。種々の物質の平行測定は記載していないが、それは困難を伴ってのみ実行し得ると考えられる。
【００４５】
原子間力顕微鏡の主たる利点は、高レベルの力分解能である。しかしながら、複雑な装置の構造は、高い調達費用を生じ、熟練者を必要とする取扱いは基礎研究から外れた用途には不適当な設備の一部としている。さらなる制限は、統計的に保証された測定結果には複数の一連の実験が必要であって、したがって長時間かかることである。ＡＦＭは診断測定法の観点から最も重要な要求されるもののうちの１について固有の不利益、すなわち多くの異なる試料物質の平行測定にも欠点を有する。
【００４６】
磁性ビーズの使用は力の適用に関する問題を生じる。実用的な粒子サイズおよび磁場強度はＤＮＡ二本鎖を引き離すことができるであろう力を許容せず、それによって、その方法は分子診断における使用から排除される。同じ問題が光ピンセットの使用に関して当てはまる。ここでは、生成し得る引抜き力は１００ｐＮよりも極めて低く、したがって低すぎてＤＮＡ二本鎖を試験することができない。
【００４７】
本発明は以下の有利な特性を有し得る：
−単純かつ有利な装置構造
−単純な取扱い
−複数の結合事象の同時測定での高レベルの力分解能
−非限定的な引抜き力
−多くの結合複合体の非協同的な同時試験。
【００４８】
各複合体についての結果が他の複合体と独立して生じる、すなわち非協同的である、測定手法の間に多くの同様な試料複合体を同時に試験する可能性は、本発明の主たる利点の１として見るべきである。等角ピラーまたは磁性ビーズを用いる記載する方法は、幾つかの複合体の単離が残存する複合体の分離確率に対して影響を有するため、常に協同的な事象を含む。その場合においては、個々の事象に関する情報が失われる。
【００４９】
本発明を説明するために用いる用語は以下のように定義する：
吊り下げ：結合パートナーを保持デバイスに連結すること。
結合特性：結合しない；結合親和性；結合様式のごとき２つの結合パートナーの互いの関係。
結合複合体：複数の結合パートナーを含む複合体；互いに相互作用関係にあり、引抜き力によって分離し得る分子もしくは物体または物体および分子。
結合パートナー：もう１の結合パートナーから引抜き力によって分離し得る結合複合体の構成物。結合パートナーは互いに特異的または非特異的に相互作用し得る。該相互作用は非共有的である。
【００５０】
生体分子：生物系から得られる分子または生物系からのものと同一である人工分子。
コンジュゲート：２つの結合パートナーの連結。
連結：コンジュゲートの連結要素。
参照複合体：参照値としての解離力または既知の解離力を有する結合複合体。
リガンド：特異的結合複合体の結合パートナーのうちの１つ。
平均解離力：その個々の解離力が熱的励起によって変化する複数の同様な結合複合体の解離力の算術平均。
試料（または標的）：試料または標的複合体を形成し得る分子、ポリマーほか。
試料または標的複合体：特徴付け／同定すべき結合複合体。これにはその結合特性を決定すべき２の既知の結合パートナーが含まれるか、またはこれには既知の結合パートナーが含まれるかのいずれかである。これには未知または既知の解離力が含まれ得る。
【００５１】
受容体：特異的結合複合体の結合パートナーのうちの１つ。
分離：結合複合体を含む結合パートナーから結合複合体を含まない結合パートナーを分離すること。
【００５２】
特異的相互作用：高度の分子認識によって区別される、結合複合体の２つの結合パートナーの間の分子相互作用。
解離力（または分離力）：機械的に結合複合体を分離するために必要な最大の力。
分子間結合：コンジュゲートの第２の結合パートナーに結合する第１の結合パートナーと、コンジュゲートの構成物であって第４の結合パートナーに結合する第３の結合パートナーの配置。
カップリング：分子間結合によって２の保持手段を連結すること。
【００５３】
カップリングパートナー：互いに結合し、かつ、そのようにカップリングを実行する２つの要素。
保持手段：それによって力を分子間結合に加え得る手段。
カップリング数：試験試行において実際に実行されるカップリングの数。
カップリング効率：実際になされたカップリングの数（カップリング数）および最大限可能なカップリングの数の比：
【００５４】
【数２】
2004525341.tif 000003
【００５５】
以後、本明細書において本発明を実施例および図面によってより詳細に記載する。図中：
図１は結合複合体の単純化した結合ポテンシャルを図示する。
【００５６】
図２は示差力試験の原理を示し；Ｂ１およびＢ２のコンジュゲートに引抜き力を加えた後、Ｆ１＜Ｆ２の場合にはＢ１の分裂が起こり、Ｆ１＞Ｆ２の場合にはＢ２の分裂が起こる。
【００５７】
図３は物体との非特異的相互作用と、結合パートナーとの特異的相互作用との間の相異を図示する。
【００５８】
図４は不完全に対合した核酸二本鎖からの完全に対合した核酸二本鎖の相異を図示する。
【００５９】
図５はサンドイッチ様式の５つの独立した同様な結合複合体に対する比較力試験の同時実行を図示し；この場合においては、試料が結合パートナーＢＰ２およびＢＰ３を有し、試料は標識されている；Ｆ１＞Ｆ２なので、結合複合体Ｂ２が優先的に分裂する、および
【００６０】
図６は捕捉様式の５つの独立した同様な結合複合体に対する比較力試験の同時実行を図示し；この場合においては、試料は結合パートナーＢＰ１を有し、かつ、表面１に結合しており、ＢＰ２およびＢＰ３のコンジュゲートは標識されている；Ｆ１＞Ｆ２なので、結合複合体Ｂ２が優先的に分裂する。
【００６１】
図７は本発明の方法を行なうために好適であるピラー装置の可能な具体例を図示し、可能な構造のより正確な記載は実験例１に見出される。
【００６２】
図８は複合体ビオチン／ストレプトアビジンおよびイミノビオチン（ｉｍｉｎｏｂｉｏｔｉｎ）／ストレプトアビジンを比較するための力試験後の支持体または基材（８Ａ）およびピラー（８Ｂ）を図示する。
【００６３】
図９は２つのＤＮＡ二本鎖を比較するための力試験後の基材（９Ａおよび９Ｃ）およびピラー（９Ｂおよび９Ｄ）のそれぞれの図であり、図９Ａは実験２ａにおける基材を示し、図９Ｂは実験２ａにおけるピラーを示し、図９Ｃは実験２ｂにおける基材を示し、図９Ｄは実験２ｂにおけるピラーを示す。
【００６４】
図１０は力比較後の基材およびピラーの評価結果を示し、ここではＤＮＡ二本鎖を同一の二本鎖（１０Ｃおよび１０Ｄ）およびさらなる二本鎖（１０Ａおよび１０Ｂ）に対して比較した（実験例２を参照されたい）、１０Ａ：実験２ａにおける基材；１０Ｂ：実験２ａにおけるピラー；１０Ｃ：実験２ｂにおける基材；１０Ｄ：実験２ｂにおけるピラー；これらには各々蛍光プロフィールの部分が含まれる。
【００６５】
図１１は完全カップリング（Ａ）および部分的カップリング（ＢおよびＣ）を有するコンジュゲートの分布を概略的に図示する。
【００６６】
図１２はリバース・ピラーリング（ｐｉｌｌａｒｉｎｇ）法の原理を示し、ＡおよびＣは各々ピラーリング操作の間に一緒になった表面を示し、標識した試料は左側の１の手に結合しているか（Ａ）、または右側のもう１の手に結合している（Ｂ）。ここで“Ｘ”によって確認される結合パートナーは、２／３のカップリング効率のレベルを有し、各々他の表面に対する結合を形成せず、したがってそれらは分離操作における表面の間の分布にも含まれない。
【００６７】
図１３はデスチオビオチン上のビオチンからストレプトアビジンおよびその反対のリバース・ピラーリングの測定結果の例を示す。
【００６８】
図１４はカップリングを行うことができる種々の方法を図示する。
１．第１の結合パートナーＢＰ１
２．第２の結合パートナーＢＰ２
３．第３の結合パートナーＢＰ３
４．第４の結合パートナーＢＰ４
５．結合複合体１（Ｂ１）
６．結合複合体２（Ｂ２）
７．分子間結合
８．第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３のコンジュゲート
９．第２の結合パートナーの吊り下げ
１０．第４の結合パートナーＢＰ４の吊り下げ
１１．第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３の連結  １２．引抜き速度のベクトル
１３．表面１
１４．表面２
１５．試料
１６．第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３と一緒の試料
１７．試料の吊り下げ
１８．標識
【００６９】
本発明は、従来の力試験と比較して解離力を決定するために完全に異なる原理を含む、方法およびその方法を行なうための装置を含む。
【００７０】
示差力試験には、互いに結合した２つの結合複合体が含まれる。２つの結合複合体のうちの１の解離力よりも少なくとも高い力を加えた際には、２つの結合複合体のうちの１の分裂が起こる。より高い解離力を有する結合複合体はその状況では元来のままである。２つの結合複合体のうちの１つの解離力が知られている場合には、そのようにして、第２の結合複合体の解離力が第１のものよりも高いかまたは低いかを結論付けることが可能である。示差力試験は多数の診断適用に使用し得る。本発明は、診断的な検出および同定の方法、または生化学的分子または高度の特異的な分子認識を有する分子の結合特性を特徴付けするのに特に好適である。
【００７１】
本発明は、結合パートナーの結合特性の特徴付けを、結合パートナーの結合複合体を分離するのに必要な解離力に基づいて行なうことを提供する。
【００７２】
本発明による示差力試験は、単一の分子間結合に対して実行し得る。しかしながら、複数の同様な分子間結合を力試験で用いることが好ましい。本願において分子間結合のある種の構成要素および／または方法の工程を単数で言及する場合（例えば、結合パートナー、結合複合体、コンジュゲート、分子間結合、カップリングパートナー、試料または標的など）、それは本発明を個々の分子間結合に対する力試験に限定することを意味するものではない。それとは反対に、それは複数の分子間結合を用いる力試験をも包含するものである。単数の使用は本発明の議論を以後より簡単にするために供するものである。実際には、一般的に多数の分子、結合パートナー、複合体などに対して試験を行なうことは当業者であれば分かる。
【００７３】
結合複合体Ｂ１（５）を分離するために加えなければならない解離力Ｆ１を特徴付けする手法は、第２の結合複合体Ｂ２（６）を分離するために加えなければならない参照解離力Ｆ２と比較することによって行なう。両方の結合複合体は連結して分子間結合を形成し、その２つの側に引抜き力を加える。それによって力を加え得る２の保持手段を分子間結合が連結する場合を、カップリングという。２つの系列的に配置した結合複合体に対して加える引抜き力は大きさが等しいことは強調しなければならない。引抜き力が解離力（Ｆ１またはＦ２）のうちの１よりも高い値を越える場合、それは解離力がより低い結合複合体の結合パートナーの分離を生じる。例えば、結合複合体Ｂ１の分離が起こる場合、それはそれからＦ１＜Ｆ２であることが結果として起こる。図２は力試験の原理を図示する。
【００７４】
結合複合体Ｂ１（５）は、一般的に、試料複合体、すなわちその結合特性を特徴付けすべき結合複合体またはその中の結合パートナーを既知の結合特性を通して同定すべき、もう１の結合パートナーとの結合複合体を含む。しかしながら、これは、２の結合パートナーの間または結合パートナーと物体との間の決定されていない非特異的な相互作用をも含み得る。
【００７５】
Ｂ２（６）は、一般的に、参照複合体、すなわちその結合特性が試料複合体を比較するパラメータ、特に解離力を予め決定する結合複合体を含む。
【００７６】
通常、試料複合体には第１の結合パートナーＢＰ１および第２の結合パートナーＢＰ２が含まれ、一方、参照複合体には第３の結合パートナーＢＰ３および第４の結合パートナーＢＰ４が含まれる。しかしながら、本発明によれば、試料複合体が第３の結合パートナーおよび第４の結合パートナーＢＰ４を含み、参照複合体が第１の結合パートナーおよび第２の結合パートナーＢＰ２を含んでいてもよい。
【００７７】
本明細書中にて前記した原理は狭義の“測定”を含むものではなく、むしろ“計量”を含むものである。ドイツ工業規格（ＤＩＮ）によれば、“計量”なる語は、試験すべき事項をもう１の事項の既知の値または度合いと比較する試験手法と説明している。その意味において、本発明は、結合複合体Ｂ１の解離力を第２の既知の解離力と比較することも提供する。それに対して、“測定する”とは、決定すべき値が測定スケール上の特定の数値を与える試験手法を含む。それは、ＡＦＭを用いるかまたは当該技術の水準の他の方法のうちの１を用いる力測定の状況に対応する。
【００７８】
本発明の詳細には、試験すべき各試料複合体を、参照複合体である微視的スケール上の力計量に関連付けることが含まれる。各試料複合体を独立して試験し、多くの個々の試験の結果が最終的に測定結果を与える。その原理に従う詳細は、時間に関して分離して、結合複合体の分離および検出操作を実行し得ることの可能性である。
【００７９】
本発明は特に熱的励起を考慮する。結合複合体Ｂ１またはさらなる結合複合体Ｂ２を分離するために必要である解離力が、結合パートナー間の相互作用が熱的励起に付されるために変化することは、分子相互作用の前記に論じたモデル（図１）から明らかであろう。したがって、本発明によれば、Ｆ１＞Ｆ２またはＦ１＜Ｆ２のいずれかを表す統計学的に確かな平均値、すなわち平均解離力を形成することができるために、２の結合対の比較を好ましくは複数の時間において行なう。それは、多くの同様の結合複合体を同時に同一の解離力に曝し、いくつの結合複合体Ｂ１およびいくつの結合複合体Ｂ２が分離されたかを決定することによって起こる。
【００８０】
本発明は、それに加えてまたはそれとは別に、力速度依存性を考慮する。示差力試験を実行する観点から重要なパラメータは、解離力Ｆ１およびＦ２が異なる力速度において非常に変化し得るため、加えた引抜き力の速度である。前記した原理によって示差力試験を再現性よく繰返し得るためには、１の所定の力速度のみで操作することが重要となり得る。
【００８１】
力速度は、第１の結合パートナーＢＰ１および第４の結合パートナーＢＰ４の吊り下げと共に２つの結合複合体のコンジュゲートの引抜き力の速度および弾性によって決まる。
【００８２】
示差試験の各適用に依存して、結合複合体についての所定の一部の情報を得るために力速度を意図的に変化させることも可能である。
【００８３】
好ましい具体例において、本発明は、２つの保持手段の間をカップリングする結合パートナーＢＰ１、ＢＰ２、ＢＰ３およびＢＰ４を含む分子間結合のカップリングの数または効率を考慮する。特に同様な大きなの２つの解離力を比較する場合、解離力の実際の比率を確かめ得るために、試験の評価にカップリング数および／またはカップリング効率を含めるのが有利である。
【００８４】
本発明の使用の例：
１．結合様式の区別
１．１特異的および非特異的な相互作用の区別
第１の結合パートナーを表面に固定化する結合試験の中心的問題は非特異的なバックグラウンドシグナルである。非特異的なバックグラウンドシグナルは、遊離溶液に添加して表面に非特異的に結合した第２の結合パートナーの分子によって引起こされる。したがって、それには、特異的シグナル、すなわち第１の結合パートナーに特異的に結合する第２の結合パートナーの分子のシグナル、に関する重複が含まれる。非特異的および特異的相互作用は同様の大きさの結合エネルギーと結合し得るため、結合エネルギー間の識別に基づく結合試験によってそれらを区別することは困難である。
【００８５】
図３は非特異的および特異的結合を区別するための示差力試験を示す。ＢＰ２およびＢＰ３のコンジュゲートは非特異的に表面に結合し、表面に固定化した結合パートナーＢＰ１に特異的に結合し、結合パートナーＢＰ１とで結合複合体Ｂ１を形成する。ＢＰ４はＢＰ３と結合複合体Ｂ２を形成する。所定の力速度について、結合対Ｂ２の解離力Ｆ２は表面に対する結合パートナーＢＰ２の非特異的結合の解離力よりも高い。しかしながら、ＢＰ１およびＢＰ２の特定の解離力Ｆ１はＦ２よりも高い。したがって、引抜き力を加えた後に、非特異的に結合したコンジュゲートの分離が起こるが、特異的に結合したものの分離は起こらない。
【００８６】
１．２実施例中のより強い特異的結合からのより弱い特異的結合の区別：完全対合からの核酸二本鎖中の個々の塩基誤対合の区別
リバース・サザーンハイブリダイゼーションによる核酸配列変異型を区別する観点からの重要な問題は、固定化したプローブに結合した核酸試料分子を区別して、それらが完全に相補的に結合しているか、またはそれらが個々の塩基誤対合を有するかを確かめることである。約１５−２５塩基対の１の所定のプローブのみを用いる試験においては、個々の塩基誤対合を結合エネルギーに基づいて完全対合から区別することもできる。その目的のため、ハイブリダイゼーション手法を完全に対合した複合体の融解点近くで行なう。その条件下では、誤対合は不安定である。しかしながら、リバース・ハイブリダイゼーションを用いる場合と同様に、複数の種々の配列のプローブの構造の場合においては、そのオプションは適用しない。
【００８７】
図４は個々の塩基誤対合からの完全塩基対合の区別を示す。
本発明は、以下の手段を用いて効果を奏する（ｃａｒｒｙ ｉｎｔｏ ｅｆｆｅｃｔ）：
１．働かせる力
分子間結合に対して働かせる引抜き力の操作は非常に異なる方法で実行することができ、このことに関して、加える力の性質は重要な考慮事項ではない。
【００８８】
好ましい具体例において、引抜き力は機械的な巨視的張力である。その目的のために、分子間結合は２の物体の間に固定し、２の複合体のうちの１の分離が起こるまでは互いから移動する。物体はナノ視野的に小さいものとすることができるが、それは巨視的に大きな表面を含むこともできる。
【００８９】
第２のケースにおいて、引抜き力は、分子間結合に固定化し、それに対して磁場が作用する磁性ビーズによって生成する。これには、各々分子間結合の各末端に固定化され、反磁性特性を有する場合も常磁性特性を有する場合もある２の異なる粒子が含まれ得る。
【００９０】
第３のケースにおいては、大きな分子またはポリマーに分子間結合を結合し、流体の流動中でその抵抗によって引抜き力を生成する可能性を使用する。音波または特に超音波をカップリングし得る粒子間に分子間結合を結合する場合には動的引抜き力を作り上げることができる。。
【００９１】
第４のケースには、例えば電気泳動法を用いる場合と同様に、荷電分子に対する電場の影響を使用することが含まれる。その目的のため、分子間結合を少なくとも１の末端で荷電分子、好ましくは増強した荷電ポリマーに結合する。両端を荷電分子に結合した場合、これらには反対に荷電した分子が含まれる。
【００９２】
第５のケースにおいては、結合パートナーＢＰ１およびＢＰ２の吊り下げ手段またはＢＰ２とＢＰ３との間の結合を形成するポリマーを短くすることによって力を加える。そのケースにおいては、短くする効果は、化学媒体中の変化、例えばｐＨ−値または塩濃度によって引起こされるポリマーにおける立体配座変化に基づく。
【００９３】
２．力速度の変動
それにより分子に張力を適用する力速度は２つのパラメーターによって決定される。一方において、それは、結合パートナーＢＰ２およびＢＰ４の吊り下げ手段のバネ定数またはＢＰ２およびＢＰ３の間の連結のバネ定数であり、他方、それは引き抜き速度である。力速度を変化させるためには、異なるバネ定数または異なる引き抜き速度いずれかを採用する。
吊り下げまたはコンジュゲートのバネ定数を変化させる好ましい様式は、吊り下げまたは連結を形成するポリマーの長さを変化させることを含む。
【００９４】
３．検出
検出の目的は、引き抜き力の適用後に、分子間結合の２つの結合複合体のいずれが分離したかを決定することにある。それは間接的または直接的になすことができる。
【００９５】
間接的検出は、引き抜き力の適用に先立って、結合複合体Ｂの一部である遊離結合パートナーＢＰに向けられる。それは、遊離結合パートナーに向けられたプローブを添加することによって達成される。もし、例えば、結合複合体Ｂ１の分離が起これば、ＢＰ１および／またはＢＰ２を検出するのが可能である。
【００９６】
直接的検出は、２つの引き抜き方向のうちいずれにおいて、分裂が起こった後に結合パートナーＢＰ３およびＢＰ２のコンジュゲートが変位したかを検出することを含む。その目的では、ＢＰ３およびＢＰ２を含むコンジュゲートにマーカーを設ける。２つの複合体のうちいずれが分離したかを判断する操作は、力の適用の後であって分離の後に、表面または保持手段の一方にあるＢＰ２およびＢＰ３のコンジュゲートの量を測定することによって行うことができる。測定操作は、力の適用の後であって分離の後に、第１の保持手段にあるＢＰ２およびＢＰ３のコンジュゲートの量を測定し、次いで、力の適用の後であって分離の後に、第２の保持手段にあるＢＰ２およびＢＰ３のコンジュゲートの量を測定することによっても行うことができる。
【００９７】
技術水準にある非常に広い範囲の異なる方法を、間接的検出においてプローブを、または直接的検出において標識を検出し同定するのに用いることができる。好ましい具体例は蛍光を発する分子の周りの標識を含む。ここに、結合複合体の２つの結合パートナーに、その間で共鳴移動が起こる２つの異なる発蛍光団を設ける手法によって、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）を用いることもできる。２つの発蛍光団の分離に際して、蛍光シグナルは失われる。更なる修飾は、結合複合体の２つの結合パートナーのうちの１つに発蛍光団を設け、発蛍光団の蛍光を消光する分子を他方に設けることを含む。結合パートナーの分離に際し、発蛍光団の消光は排除され、従って、シグナルの強度の増加が起こる。用いられる好ましい発蛍光団はナノスケールのコロイド半導体粒子である（量子ドット）。さらなるオプションは放射性標識であり、これは、シグナルを増強する酵素がそれに結合するアフィニティーマーカー、化学ルミネセンス、電気化学標識または質量分析で標識する。
【００９８】
４．試料
本明細書中に記載する示差力試験を広い範囲の試料で用いることができる。好ましくは、これらは蛋白質、一般には抗体、抗原、ハプテンまたは天然および合成核酸を含む。しかしながら、これはウイルス、ファージ、細胞成分または全細胞を含むこともできる。さらに、キレート化剤のごとき複合体−形成性物質を考慮することもできる。
【００９９】
５．参照複合体
サンドイッチ様式で当てはまるごとく、参照複合体の結合パートナーは、それ自体、試料の成分であり得る。参照複合体は、原理的には、試料複合体と同一の成分からなることができる。
【０１００】
６．分子間結合の時間配列
コンジュゲート（８）を形成するための結合パートナーＢＰ２（２）およびＢＰ３（３）の連結は、ＢＰ２およびＢＰ３とＢＰ１またはＢＰ４との相互作用が起こる前に起こり得る。あるいは、ＢＰ２およびＢＰ３のコンジュゲートは、ＢＰ１およびＢＰ４との相互作用が起こった後にのみ形成され得る。
【０１０１】
７．カップリング
用語カップリングは、分子間結合の２つの保持手段への連結を示すのに用いられる。カップリングに関与する２つのエレメントはカップリングパートナー（ＫＰ１およびＫＰ２）という。場合１（後記参照）で当てはまるごとく、カップリングパートナーは結合パートナーを含むことができる。しかしながら、他の場合には、カップリングパートナーは結合パートナーとは異なる（場合２および３参照）。カップリングは、好ましい具体例の例示によりここに記載する。保持手段としての２つの表面、力を適用するための巨視的張力、および結合パートナー２または３あるいはコンジュゲートへの標識を用いる場合、カップリングは種々の方法で行うことができる；図１４は以下の場合を模式的に示す：
【０１０２】
１．ＢＰ１を第１の表面に結合させる。ＢＰ２およびＢＰ３のコンジュゲートを第１の表面でインキュベートし、その場合、ＢＰ１およびＢＰ２から複合体Ｂ１が形成される。第２の表面を第１の表面に向けて移動し、これは、ＢＰ３およびＢＰ４からのＢ２の形成を含む。Ｂ２の形成は、結合パートナー１ないし４の連結および分子間結合の２つの表面へのカップリング双方を供する。従って、ＢＰ３およびＢＰ４はカップリングパートナーも含む。
【０１０３】
２．ＢＰ１を第１の表面に結合させる。分子間結合の形成が起こるように、ＢＰ２およびＢＰ３のコンジュゲートならびにＢＰ４を第１の表面でインキュベートする。第２の表面を第１の表面に向けて移動させ、これは、第２の表面へのＢＰ４の結合を含む。この工程は、第１の表面に既に形成された分子間結合のカップリングを含む。この場合、ＢＰ４は、第２の表面に結合した第２のカップリングパートナーに結合するカップリングパートナーに連結される。
【０１０４】
３．ＢＰ１を第１の表面に結合させる。ＢＰ２を第１の表面でインキュベートし、それによりＢ１の形成が起こる。ＢＰ４を第２の表面に結合させる。ＢＰ３を第２の表面でインキュベートし、それにより、Ｂ２の形成が起こる。第２の表面を第１の表面に向けて移動させ、これは、ＢＰ２およびＢＰ３のコンジュゲートの形成を含む。この工程は、分子間結合の形成および２つの表面への分子間結合のカップリングを共に含む。この場合、ＢＰ２およびＢＰ３は、各々、カップリングパートナーの各々の１つに連結される。
【０１０５】
理想的には、Ｂ１およびＢ２の解離力の比率は、テストの実行の後に第１の表面に依然として残るコンジュゲートの量および第２の表面に移動したコンジュゲートの量から直接的に決定することができよう。しかしながら、現実的には、もし存在するほぼ全ての標識された結合パートナーを首尾よくカップリングさせることができないなら、それらの値は多かれ少なかれ誤りである。図１１はそれを明らかに示す。
【０１０６】
そのような場合、他の表面への標識されたコンジュゲートの移動は、Ｂ１およびＢ２の力の速度、およびカップリングした分子間結合の量（カップリング数）の双方に依存する。例えば、第１の表面から第２の表面への小さな移動は、Ｂ１の解離力がＢ２のそれよりも大きく、少数の分子間結合のみが第２の表面にカップリングされたことを示し得る。同時に、第１の表面に残った標識されたコンジュゲートの量は増加し、かくして、カップリングしなかったコンジュゲートによって誤りとなり、いわば、力比較に付されない。
【０１０７】
もし現実に起こったカップリングの数（カップリング数）が最大可能なカップリングに関連付けられれば、それはカップリング効率を与える。その点で、最大可能なカップリングの数は、より少数である２つのカップリングパートナーのうちのその１つの数によって制限される。本発明によると、従って、カップリング数またはカップリング効率、すなわち、現実に形成されたカップリングの数および最大可能なカップリングの数の比を少なくともほぼ決定することができ、おそらくは、試料複合体または参照複合体が分離されたかを確認するにおいてカップリング数またはカップリング効率を考慮する。
【０１０８】
誤差の源としての非定量的カップリングを排除するには、種々の操作手法がある：
ａ）「自己−比較」での参照実験
ｂ）試験の「逆の実行」
ｃ）表面の分子間結合の「二重標識」およびプレ形成。
「自己−比較」（ａ）および「逆実行」（ｂ）を場合１）に関してここでは記載する（前記参照）：
【０１０９】
「自己−比較」（ａ）においては、現実の力の比較以外に、参照実験も行う。力比較では、標識されたコンジュゲートを、第１の表面に結合した第１の結合パートナー（例えばＢＰ１）と共にインキュベートし、さらなる結合パートナー（例えばＢＰ４）で修飾された第２の表面への移動を確認する。力比較手法において、ＢＰ１およびＢＰ４は、その解離力比率を確認すべき異なる結合パートナーを含む。参照試験は同様に行い、その場合、双方の表面の結合パートナーは結合パートナーＢＰ４（すなわち第２の表面にある力比較の結合パートナー）と同一である。参照試験に関しては、２つの同一の複合体を比較する「自己−比較」が挙げられる。
【０１１０】
さて、結合複合体（Ｂ１またはＢ２）のいずれがより大きな解離力を有するかに関する情報を得ることができるためには、２つの要件が満足されなければならない：力比較および自己−比較のための同一のカップリング効率ならびに、第１の表面に結合した全ての結合パートナーまたは第２の表面に結合した全ての結合パートナーの同一の密度。それらの予備的条件下にて、もし、第２の表面への移動が参照実験の場合よりも力比較の場合に少ないことが判明すれば、より大きな解離力をＢ１（ＢＰ１およびＢＰ２）に帰すことができる。もし、対照的に、移動は参照実験における方が大きければ、Ｂ２（ＢＰ３およびＢＰ４）はより大きい解離力を有する。
【０１１１】
従って、本発明が、（ｉ）第１の工程（＝力比較）において、分離操作の後に第１の保持手段から第２の保持手段に移動した第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定し、および／または分離操作の後に、第１の保持手段から第２の保持手段に移動しなかった第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定し、ここに、第１の結合パートナーＢＰ１は第４の結合パートナーＢＰ４とは異なり、（ｉｉ）カップリング効率を測定するための第２の工程（＝自己−比較）において、分離操作の後に第１の保持手段から第２の保持手段に移動した第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定し、および／または分離操作の後に第１の保持手段から第２の保持手段に移動しなかった第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定し、ここに、第２の工程における第１の結合パートナーＢＰ１および第４の結合パートナーＢＰ４が同一であって、第２の結合パートナーＢＰ２が第３の結合パートナーＢＰ３と実質的に同一であるように、第１の結合パートナーは第４の結合パートナーＢＰ４としても用いられるか、あるいは、第４の結合パートナーＢＰ４は第１の結合パートナーＢＰ１としても用いられる方法にも関する。
【０１１２】
しかしながら、自己−比較での参照試験は、実験例１で当てはまるように、２つの同一の結合パートナーでのコンジュゲートが入手できる場合にのみ行うことができる。異なる種類の場合、以下の解決のうちの１つに対して源を有する必要がある。
【０１１３】
試験の「逆実行」（ｂ）において、標識されたコンジュゲートを、第１の実行において、第１の表面に結合したＢＰ１と共にインキュベートし、表面２への移動をＢＰ４にて測定する。第２の実行において、コンジュゲートを第２の表面のＢＰ４と共にインキュベートし、第１の表面への移動を確認する。
【０１１４】
従って、また、本発明は、第１の実行において、（ｉ）第１の結合パートナーＢＰ１と第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３のコンジュゲートとを第１の保持手段に結合させ、第４の結合パートナーＢＰ４を第２の保持手段に固定化し、第３の結合パートナーＢＰ３および第４の結合パートナーＢＰ４が相互に結合できるように、２つの保持手段を相互に向けて移動させ、分離操作後に第１の保持手段から第２の保持手段に移動した第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定し、および／または分離操作の後に第１の保持手段から第２の保持手段に移動しなかった第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定し；およびさらなる実行において、（ｉｉ）第４の結合パートナーＢＰ４と第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートとを第２の保持手段に結合させ、第１の結合パートナーＢＰ１を第１の保持手段に固定化し、第２の結合パートナーＢＰ２および第１の結合パートナーＢＰ１が相互に結合できるように、２つの保持手段を相互に向けて移動させ、分離操作の後に第２の保持手段から第１の保持手段に移動した第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定し、および／または分離操作の後に第２の保持手段から第１の保持手段に移動しなかった第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートの量を測定する方法に関する。
【０１１５】
もし該比が第１および第２（逆）実行において（コンジュゲートの）移動から形成されれば、それは、２つの結合複合体の解離力の比率をやはり与える。両実行についてもカップリング効率は同等であると推定できるので、それはその比の形成において短縮され、従って、もはや結果に取り込まれない。この手法の具体例は実験例２に記載される。
【０１１６】
以下、場合２）に関して「二重標識」（ｃ）を記載する（前記参照）：
場合２）は、第２の標識を用いることを含み、その第２の表面への移動はカップリング数に対応する。この手法の具体例は実験例３に記載する。１）とは異なり、この場合においては、Ｂ１およびＢ２は予め第１の表面に共同して形成され、それに関し、コンジュゲートおよびＢＰ４には区別可能な標識が施される。２つの表面が相互に向けて移動することにより、ＢＰ４に連結したカップリングパートナーが第２のカップリングパートナーを担う第２の表面に結合するや否やカップリングが起こる。第２の表面に結合してしまったＢＰ４の量は、かくして、カップリング数に対応する。今や、該手法は、第２の表面に移動した、あるいは第１の表面から脱離した標識されたコンジュゲートの量を測定することを含む。もしその量がカップリング数の半分未満であれば、ＢＰ１およびＢＰ２の複合体がＢＰ３およびＢＰ４の複合体よりも大きな解離力を有すると結論することができる。もし移動したコンジュゲートの量がカップリングの量の半分よりも大きければ、ＢＰ１およびＢＰ２の複合体はＢＰ３およびＢＰ４の複合体よりも低い解離力を有すると結論することができる。この手法の具体例は実験例３に記載する。
【０１１７】
好ましくは、従って、第２および第３の結合パートナーのコンジュゲート、第２の結合パートナーまたは第３の結合パートナーには第１のマーカーを設け、第１または第４の結合パートナーには第２のマーカーを設け、第２のマーカーは第１のマーカーとは異なる。
【０１１８】
次いで、具体例においては、保持手段のうちの１つに結合した第１のマーカーの量を確認し、同保持手段に結合した第２のマーカーの量を確認し、次いで、確認された値を一緒に比較しおよび／または相互に関連付けることによって分離位置を検出する。試料または参照複合体の分離の程度についての情報は、例えば、基質またはピラーに結合した第１および第２のマーカーの量の比から得ることができる。
【０１１９】
ある具体例においては、それに関しては、第１、第２、第３および第４の結合パートナーを含む分子間結合が、まず、第１の保持手段に形成され、次いで、第２の工程において、第２の保持手段へのカップリングが行われる。
【０１２０】
もう１つの具体例においては、（ｉ）第１の結合パートナーＢＰ１と第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートを第１の保持手段に結合させ、第４の結合パートナーＢＰ４を第２の保持手段に固定化し、第３の結合パートナーＢＰ３および第４の結合パートナーＢＰ４が相互に結合できるように、２つの保持手段を相互に向けて移動させるか、あるいは（ｉｉ）第４の結合パートナーＢＰ４と第２の結合パートナーＢＰ２および第３の結合パートナーＢＰ３を含むコンジュゲートとを第２の保持手段に結合させ、第１の結合パートナーＢＰ１を第１の保持手段に固定化し、第２の結合パートナーＢＰ２および第１の結合パートナーＢＰ１が相互に結合できるように、２つの保持手段を相互に向けて移動させる。
【０１２１】
結合パートナーのうちの少なくとも１つは核酸、特にＤＮＡを含むことができる。好ましくは、結合パートナーのうちの少なくとも２つは天然または合成核酸を含む。
【０１２２】
発明の好ましい具体例
Ｂ１およびＢ２のコンジュゲートが２つの表面の間に固定される本発明の第１の好ましい具体例において、機械的巨視的張力によって引き抜き力を適用し、マーカーによって直接的に検出を行う。
【０１２３】
この具体例は、ここでは、全ての他の具体例、すなわち、サンドイッチ様式および捕獲様式によっても実行することができる２つの様式に関連して記載する：
【０１２４】
示差力試験のサンドイッチ様式においては（図５）、ＢＰ２およびＢＰ３のコンジュゲートは試料（１５）を含む。試料の結合パートナーＢＰ２（２）は、第１の表面（１３）に結合した結合パートナーＢＰ１（１）に対して特異的である。さらなる結合パートナーＢＰ３（３）は、第２の表面（１４）に結合した、結合パートナーＢＰ４のうちの１つ（４）に対して特異的である。２つの表面を接触させると、試料とＢＰ１およびＢＰ４との相互作用が起こり、それにより、表面（１３，１４）は生じた結合複合体Ｂ１およびＢ２によって合わされる。さて、もし表面が相互から引き抜かれたならば、好ましくは、より低い解離力を有する結合複合体のうちのその１つは破壊される。試料はその表面に付着し、そこには、依然として無傷の結合複合体がある。
【０１２５】
示差力試験の捕獲様式において（図６）、試料（１５）を第１の表面（１３）に固定化する。該試料は、第２の結合パートナーＢＰ２（２）に対して特異的な第１の結合パートナーＢＰ１（１）を有する。ＢＰ２をＢＰ３（３）に連結させてコンジュゲートを形成させ、ここに、ＢＰ３は、第２の表面（１４）に結合した第４の結合パートナーＢＰ４に結合する。
【０１２６】
２つの表面を接触させ、それにより、ＢＰ１とＢＰ２との相互作用が起こる。さて、もし表面が引き離されたならば、好ましくは、２つの複合体、すなわち、ＢＰ１とＢＰ２との複合体またはＢＰ３とＢＰ４との複合体のいずれかの弱い方が破壊される。２つの表面の間のＢＰ２およびＢＰ３のコンジュゲートの分布を測定し、２つの複合体のうちいずれがより安定であるかに関する情報が得られる。
【０１２７】
捕獲様式における試料（１５）の結合は共有結合により、または弱い相互作用によって行うことができる。
本発明を実施するための好ましい装置は：
ｉ）反応パートナーの結合のための２つの表面を含む使用手段、
ｉｉ）表面に結合した結合パートナー、
ｉｉｉ）２つの分子を接触させ、結合パートナーの分子相互作用が起こってしまった後に再度それらを分離するための装置、
ｉｖ）それに基づき２つの表面の間の分布が測定できる、結合パートナーＢＰ２および結合パートナーＢＰ３のコンジュゲートのための標識手段、および
ｖ）標識手段の検出用の装置；
を含む。
【０１２８】
実験例１：
複合体ビオチン／ストレプトアビジンおよびイミノビオチン／ストレプトアビジンの比較のための力試験
該実験は、複合体ビオチン／ストレプトアビジンおよびイミノビオチン／ストレプトアビジンの解離力の差を示差力試験によって測定できることを示す。
【０１２９】
原理：
ビオチンおよびイミノビオチンを基材に結合させる。蛍光−標識ストレプトアビジンを固定化されたハプテンに結合させる。ビオチンで被覆したプランジャーまたはピラーを、ピラーに結合したビオチンがハプテンによってカップリングしたストレプトアビジンを基材に結合させることができるように基材に向けて移動させる。次いで、ピラーを再度取り出す。結論として、該手法は、ストレプトアビジンのどの程度の割合が基材のイミノビオチンからピラーのビオチンに移動したか、およびストレプトアビジンのどの程度の割合が基材のビオチンからピラーのビオチンに移動したかを決定することを含む。
【０１３０】
表面の分離に際し、２つの結合のうちの１つは脱着しなけらばならない。その状況において、結合のいずれが機械的により安定であるかに応じて、リガンドはピラーまたは基材いずれかに対して結合したままである。
【０１３１】
実行：
ピラーの被覆
微細構造ピラーはＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）から作成した。その場合、該構造は、幅約２５μｍおよび深さ１μｍの窪みによって分離された約１００×１００μｍを測定する小さなピラーフィート部分よりなるものであった。ピラーおよび基材を接触させることが、その間の緩衝液が変位することを予め推定することができる。平滑な表面が関与する場合、これはおそらく極端に困難であるかまたはゆっくりであろう。ピラー中の溝は、緩衝液が迅速に流動し、ピラーフィート部分と基材との完全な接触を保証することを確実とする。
【０１３２】
微細構造のさらなる利点は、ピラー中の溝と鏡像関係にある基材上のピラーによって「プレスされて離される」分子はないことである。残りの「グリッド」の強度値はピラーの前面の分子の密度を表し、かくして、評価手法において参照値として利用することができる。
【０１３３】
微細構造のピラーを生じさせるためには、複数回数の脱気の後、シリコーンエラストマーおよび架橋剤の１：１０混合物を含む組成物（Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４，Ｄｏｗ．Ｃｏｒｎｉｎｇ）を、適切な微細構造としたシリコーンウェハーおよび平滑なプレキシグラスプレートの間に注ぎ、雰囲気温度にて２４時間垂直にインキュベートする。重合の後、ピラーの構成された表面を、プラズマ炉中、１ミリバールにおいて１５秒間Ｈ２Ｏプラズマに暴露した。酸化された表面を、１０％Ｈ２Ｏ中の３％アミノシラン（３−アミノプロピルジメチルエトキシシラン；ＡＢＣＲ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）および８７％エタノールと共に３０分間インキュベートした。シラン化表面を非常に純粋な水で洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥した。
【０１３４】
その一端がＮＨＳによって活性化されたカルボキシル基を有し、他方、他端がビオチン基を有する二官能性ＰＥＧをシランのアミノ基に結合させた。２ｍｇ／１００μｌのＭＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン（Ｓｈｅａｒｗａｅｅｒ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）を含む２０μｌの溶液を、１ｃｍ２の面積を持つピラー上で、カバーグラス下で１時間インキュベートした。それを非常に純粋な水で洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥した。
【０１３５】
基質のコーティング；
飽和ＫＯＨ−エタノール溶液での１００分間の処理によって、ガラス目的担体を洗浄した。洗浄した表面を１０％Ｈ２Ｏ中の３％アミノシラン（３−アミノプロピルジメチル−エトキシシラン；ＡＢＣＲ，  Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）および８７％エタノールと共に３０分間インキュベートした。シラン化表面を非常に純粋な水で洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥した。その一端がＭＨＳによって活性化されたカルボキシ基を有し、他端がｔ−Ｄｏｃ保護アミノ基（ＮＨＳ−ＢＢＣ  ＮＨ−ｔＢｏｃ，Ｓｈｅａｒｗａｄｅｒ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）を有する二官能性ＰＥＧをシランのアミノ基に結合させた。次いで、ｔＢＯＣ保護基をトリフルオロ酢酸で開裂させた。ＮＨＳ−ビオチンおよびＮＨＳ−イミノビオチン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を、各々、ＢＭＳＯ中の５０ｍＭストック溶液から希釈して、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水，Ｓｉｇｍａ）で５ｍＭの最終濃度を得た。各々、アミノ−官能性化ガラス基材へのビオチンまたはイミノビオチンの結合はその溶液から行った。それを飽和水雰囲気の中で１時間インキュベートし、非常に純粋な水で洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥した。
【０１３６】
ストレプトアビジンＡｌｅｘａｆｌｏｕｒ−５４６コンジュゲート（Ｍｏｌｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ）を結合させる目的で、グリシン／ＮａＯＨ−緩衝液（ｐＨ１０）中の０．１ｍｇ／ｍｌの濃度の溶液を作成した。基材を該溶液と共に２０分間インキュベートし、次いで、その緩衝液中で５分間洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥させた。
【０１３７】
ピラー手法；
プレスまたはピラー手法は図７中の例によって示されるごとく単純な装置で行うことができる。該装置はベースプレート（１）、２つのガイドバー（２）、ピラースライダーまたはキャリッジ（３）、ピラーヘッドパッド（４）、ピラーヘッド（５）およびピラーパッド（６）を含む（図７参照）。ベースプレートガイドバーおよびピラーキャリッジは金属で作成することができる。ピラーヘッドパッドはフォームゴムを含むことができ、ピラーヘッドはプレキシグラスを含むことができる。ピラーは四角形で１ｃｍ２の面積であり、１ｍｍの厚みである。ピラーパッドは同一寸法であるが、両面が平滑であり、例えば、特に柔軟なＰＤＭＳを含む。
【０１３８】
ピラープレス操作では、基材をベースプレート上に置き、ピラーをピラーヘッド上に置く。両者を緩衝液（ｐＨ１０）で覆う。キャリッジをガイドバーに導入し、ピラーが基材と接触するようになるまで手で下方に移動させる。分離も手で行われる。
【０１３９】
ピラーヘッドパッドの機能は、ピラーに適用する場合に、ピラーヘッドを基材に対して正確に平行な位置となるようにすることである。ピラーパッドは、ピラーおよび基材の間のわずかな凹凸を補うように働く。
【０１４０】
表面は、ピラーに結合したビオチンが基材のストレプトアビジンと相互作用できるように、相互に向けて移動させた。３０分間のインキュベーション時間の後、表面を相互から分離した。
【０１４１】
測定
ピラーおよび基材をマーカーＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５４６に関してレーザースキャナ（ｔｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｇｅｍｅ  Ｔａｃ  ＬＳ  ＩＶ）でスキャンした。
【０１４２】
評価および結果：
ビオチンまたはイミノビオチンからビオチンへの異なる移動は、ストレプトアビジン−ハプテン複合体の異なる機械的安定性を反映する。ビオチンのビオチンへの移動は現実のカップリング事象の半分に対応し、すなわち、カップリング数移動の２倍に対応する。
【０１４３】
ビオチン結合したストレプトアビジンの１５％はビオチン−被覆ピラーによって捕らえられる。３０％はイミノビオチンからビオチンに移動する。両試験についてのカップリング効率は同一であると仮定し、かつ、基材上のイミノビオチンおよびビオチンの密度は同等であるという条件に従い、ストレプトアビジン−ビオチン結合は、ストレプトアビジン−イミノビオチン結合よりも強いと結論することができる。
【０１４４】
図８Ａおよび８Ｂは、ピラープレス操作の後における基材およびピラーを示す。ＡＦＭ力スペクトロメーターでの測定は、受容体／リガンド対ビオチン／アビジンにつき１６０ｐｎ±２０ｐｍおよびイミノビオチン／アビジンにつき８５±１５を与えた（Ｆｌｏｒｉｎ，  Ｅ．Ｌ，  Ｍｏｙ  Ｖ．Ｔ．およびＧａｕｂ  Ｈ．Ｅ．Ｓｓｃｉｅｎｃｅ  １５，  Ａｐｒｉｌ  １９９４，Ｖｏｌ２６４，  ｐｐ４１５−４１７：”  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｆｏｒｃｅｓ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｌｉｇａｎｄ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐａｒｉｓ”）。ビオチン／ストレプトアビジンおよびイミノビオチン／ストレプトアビジンの間の力の比較は、定性的には同一の結果をもたらす。
【０１４５】
実験例：
複合体ビオチン／ストレプトアビジンおよびデスチオビオチン／ストレプトアビジンの比較の例を用いる約逆ピラープレスでの力地点
該実験は、複合体ビオチン／ストレプトアビジンおよびデスチオビオチン／ストレプトアビジンの解離力の差は、逆ピラープレス示差力試験によって測定されることを示した。
【０１４６】
ピラーおよび基材の作成：
微細構造ピラーはＰＢＭＳ（ポリジメチルシロキサン）から作成した。その場合、該構造は、幅２５μｍおよび深さ１μｍの窪みによって分離された約１００×１００μｍを測定する小さなピラーフィート部分よりなるものであった。ピラーおよび基材を接触させることは、その間の緩衝液が変位されることを予め測定させる。平滑な表面が関与する場合、極端に困難であるかゆっくりとしたものであろう。ピラー中の水は緩衝液が迅速に流動し、ピラー２の部分と基材の完全な接触を保証することを確実とする。
【０１４７】
微細構造のさらなる利点は、ピラー中の溝と鏡像関係にある基材上のピラーによって「プレスして離される」分子はないことである。残りの「グリッド」の強度値はピラー前面の分子の密度を表し、かくして、評価手法において参照値として利用することができる。
【０１４８】
１ｍｍ厚みの微細構造ピラーを作成するには、複数回脱気の後、シリコーンエラストマーおよび架橋財（Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４，  Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）の１：１０混合物を含む組成物を、適切な構造のシリコーンウェハーおよび平滑なプレキシグラスプレートの間に注ぎ、雰囲気温度にて２４時間垂直に重合させた。
【０１４９】
基材もやはり１ｍｍ厚みのＰＤＭＳよりなるものであった。しかしながら、基材は加工しなかった。その作成には、混合物を２つの垂直に配置したプレキシグラスプレートの間に注ぎ、雰囲気温度にて２４時間インキュベートした。
【０１５０】
ピラーおよび基材のコーティング：
重合した加工および未加工ＰＤＭＳプレートを１ｃｍ２のサイズに切断した。次いで、該ピースをプラズマ炉中にて２ミリバールにおいて３０秒間Ｈ２Ｏプラズマに暴露した。酸化された表面を、１０％でＨ２Ｏ中の２％アルデヒドシラン（４−トリエトキシシリルブタナール，  Ａｍｃｈｒｏ，  Ｈａｔｔｅｒｓｈｅｉｍ，  ドイツ国）および８８％エタノールの溶液と共に３０分間インキュベートした。シラン化表面をエタノールおよび非常に純粋な水で洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥した。
【０１５１】
官能性化基材およびピラーを、２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン；  Ｒｏｔｈ，  Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，  ドイツ国）を含むＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水；Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＵＳＡ）中で一晩インキュベートした。その場合、ＢＳＡはそのアミノ基にて表面のアルデヒド基に結合する。安定化目的で、得られたシッフ塩基を１％水素化ホウ素ナトリウムで１５分間還元した。次いで、ＭＨＳ−活性化ビオチンおよびデスチオビオチン（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＵＳＡ）をＢＳＡの未使用アミノ基に結合させた。その目的で、ＢＭＳＯ中の５０ｍｍストック溶液を各々作成した。次いで、それらをＰＢＳで希釈して５ｍＭ反応溶液を作成し、それに関し，５０ｍＭのＥＤＣ（１−エチル−３−ジメチルアミノ−プロピル）カル物体ミド；  Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）および２５ｎＭのＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を活性化目的で添加した。反応溶液を１５分間プレインキュベートし、次いで、ＢＳＡ表面で３０分間インキュベートした。ＢＳＡ上でさらに活性化したカルボキシ基を０．１Ｍグリシン溶液中で２時間ブロックした。ピラーおよび基材を非常に純粋な水で洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥した。
【０１５２】
各ピラー組成に応じて蛍光−標識ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７コンジュゲート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  Ｅｕｇｅｎｅ）を基材またはピラーに結合させた。０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，  ＵＳＡ）を含むＰＤＳ中の０．１ｍｇ／ｍｌ濃度の溶液を、その目的で対応する表面で２０分間インキュベートした。
【０１５３】
ピラー手法：
プレスまたはピラー手法は、図７中の例によって示されるごとく単純な装置で行うことができる。該装置はベースプレート（１）、２つのガイドバー（２）、ピラースライダーまたはキャリッジ（３）、ピラーヘッドパッド（４）、ピラーヘッド（５）およびピラーパッド（６）、を含む（図７参照）。ベースプレート、ガイドバーおよびピラーキャリッジは金属で作成することができる。ピラーヘッドパッドはフォームゴムを含むことができ、ピラーヘッドはプレキシグラスを含むことができる。ピラーは四角形で、１ｃｍ２の面積であって、１ｍｍの厚みとすることができる。ピラーパッドは同一寸法であるが、両側が平滑であり、例えば、特に柔軟なＰＤＭＳを含む。
【０１５４】
ピラーヘッドパッドの機能は、ピラーに適用した場合に、ピラーヘッドを基材に対して正確に平行な位置とすることである。ピラーパッドは、ピラーおよび基材の間のわずかな凹凸を補うように働く。
【０１５５】
ピラープレス操作では、基材をベースプレート上に置き、ピラーをピラーパッド上に置く。両者を緩衝液で覆う。キャレッジをガイドバーの導入し、ピラーが基材に接触するまで手で下方に移動させる。分離も手で行われる。
【０１５６】
表面は、１つの表面の遊離結合パートナーが他の表面のストレプトアビジンおよび各他の結合パートナーの複合体と相互作用できるように相互に向けて移動させた。３０分間のインキュベーション時間の後、表面を相互から分離した。
【０１５７】
以下の逆手法を行った：
【表１】
2004525341.tif 000004
【０１５８】
ビオチンの同一表面を持つ、基材またはピラーへの結合は同一の結果を生じるに違いなく、従って、対照として供する。
ピラーおよび基材は、マーカーＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７に関し、レーザースキャナー（ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ，Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）でスキャンした。
【０１５９】
評価および結果：
原理：
逆実行は、カップリング効率とは独立した評価を可能とする。この場合、第１および第２の表面での結合パートナーの異なる密度となり得る。［これは、それらのみが２つの表面で共有できるので、最大可能なカップリングのみが考慮される点で達成される］。評価手法においては、移動した発蛍光団のみを考慮する。図１２は、種々の結合複合体Ｂ１およびＢ２の結合力の比が、表面１に移動する蛍光強度および表面２に移動するものの比から計算することができる（図１２Ｂ：第１の表面から第２の表面に移動した発蛍光団の数＝２；  図１２Ｄ：第２の表面から第１の表面に移動した発蛍光団の数＝６）。この点、より低い密度の結合パートナーを有する表面では、それは正確には逆実行の双方の部分的実行に対して一定であると予め推定させるに過ぎない。その仮定は、比較すべき結合パートナーＢＰ１およびＢＰ４の非常に似た特性（例えばサイズ）によってここでは許容され、ピラープレス手法に先立って蛍光強度の測定によってチェックすることもできる。評価手法は、カップリング効率に対する異なるアフィニティー定数の影響を考慮しない。
【０１６０】
図１３は、例を挙げて、測定結果およびその評価を示す。ここでは、完全には調和しなかった２つのスポットを接触させたので、全移動およびその他非特異的移動を、ラインスキャンによってスポットの重複領域において確認することができる。全移動および非特異的移動に関する平均値は、２つの独立した試験で測定したスポットの全ての列から計算した。特異的移動は全移動および非特異的移動の差から得られる。
【０１６１】
プレス実験の逆手法の平均値は以下の表に示す：
【０１６２】
ストレプトアビジンの基材からピラーへの移動：
【表２】
2004525341.tif 000005
【０１６３】
ストレプトアビジンのピラーから基材への移動：
【表３】
2004525341.tif 000006
【０１６４】
測定精度の限界内で、双方の試験が同一結果を与える。デスチオビオチンへの移動およびビオチンへの移動の比は平均して０．１８である。結合力についての明らかな定性的情報がその関係に基づいて可能である：逆ピラープレス操作は、ストレプトアビジンおよびデスチオビオチンの間の結合力がストレプトアビジンおよびビオチンの間の結合力よりも弱いことを示す。ストレプトアビジン／ビオチン／デスチオビオチンは、表面への複数結合が可能である複合体システムであるので、結合力の関係に関する定量的情報は限定的にしか可能でない。
【０１６５】
実験例３：
２つのＤＮＡ−二本鎖の比較のための力試験
該実験は、２つのＤＮＡ−二本鎖の解離力が示差力試験によって比較できることを示す。この例においては、二本鎖１は２０塩基対長の二本鎖を含み、他方、二本鎖２は３０塩基対長の二本鎖を含む。
【０１６６】
原理：
オリゴヌクレオチド１（＝オリゴ１）は基材に末端にて結合する。オリゴヌクレオチド２（＝オリゴ２）はオリゴ１とハイブリダイズし、次いで、試料複合体が形成される。オリゴヌクレオチド３（＝オリゴ３）はオリゴ２とハイブリダイズし、参照複合体が形成される。オリゴ２およびオリゴ３を異なる発蛍光団で標識する。オリゴ３はさらにビオチンで標識する。ストレプトアビジンで被覆したピラーを、３つのハイブリダイズしたオリゴを持つ基材上にプレスする。それにより、ビオチンのオリゴ３からピラーのストレプトアビジンへの結合が生じる。ピラーを取り出し、その場合、オリゴ１とオリゴ２およびオリゴ３との分子間結合において、試料複合体の開裂および参照複合体の開裂いずれかが起こる。
【０１６７】
試料複合体は２０ｂｐのＤＮＡ−二本鎖である。参照複合体は３０ｂｐのＤＮＡ−二本鎖を含み、その２０は試料複合体のそれと同一である。参照として、第２の実験を行い、ここに、試料および参照複合体は２０ｂｐの長さであり、同一のＧＣ−含有量を有する。
【０１６８】
それにより基材上に予め形成された分子間結合のカップリングがビオチン／ストレプトアビジン結合によって行われる効率はピラープレス操作で限定的にしかモニターできないので、該力テストにおいては、該手法をオリゴ２を標識することのみに限定して、試料および参照複合体の解離力の比率を計算するのは可能でない。オリゴ３に関して第２の標識が必要である。もし、２つの標識に基づき、該手法が、どれくらい多数のオリゴ２がピラー上のオリゴ３に関して富化されたか、または基材上で枯渇されたかを決定することを含み、それは、オリゴ２がオリゴ１またはオリゴ３に関してより大きな解離力を有するか否かの尺度を与える。
【０１６９】
オリゴの蛍光標識の事象においては、測定結果の偽化がマーカー間の蛍光共鳴移動（ＦＲＥＴ）によって起こらないことに注意すべきである。分子間結合のマーカー間のＦＲＥＴの少量はしばしば避けがたいので、該実験における分子間結合内のマーカーに注意を払うべきである、参照実験は相互から同一の間隔を設ける。
【０１７０】
実験：３０ｂｐに対して２０ｂｐ（＝実験２ａ）
【化１】
2004525341.tif 000007
【０１７１】
参照実験：２０ｂｐに対して２０ｂｐ（＝実験２ｂ）
【化２】
2004525341.tif 000008
【０１７２】
実行：
１．基材のコーティング：
用いた基材は、アルデヒド基で官能性化したガラス目的担体であった（Ｔｅｌｅｃｈｅｍ，Ａｔｌａｎｔａ：Ｓｕｐｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｓｌｙｄｅｓ）。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を、ストレプトアビジンの吸着に対する保護としてのガラス表面に共有結合させた。その目的で、各々、末端アミノ基および末端カルボキシ基を持つ２ｍｇの二官能性ＰＥＧ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ；分子量＝３４００ｇ／ｍｏｌ）を１００μｌのＰＢＳ（リン酸生理食塩水緩衝液，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）に溶解し、目的担体上にて、カバーグラス下で２時間インキュベートした。アミノ基とアルデヒド基の反応に由来するシッフ塩基を１％ＮａＢＨ４溶液で５分間還元した。それに際し、基材を非常に純粋な水で洗浄し、油を含まない窒素ジェットを吹き付けて乾燥させた。
【０１７３】
２．オリゴ１の結合：
オリゴ１：５’ＮＨ２−ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ  ＴＣＴＣＣＧＧＣＴＴＴＡＣＧＧＣＧＴＡＴ（配列番号：１）
【０１７４】
オリゴ１は５’末端にアミノマーカーおよび１０アデニンのスペーサーを有する。さらに２０塩基がオリゴ２とで試料複合体を形成する。ＰＢＳ（リン酸生理食塩水緩衝液；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）中の５ｍｇ／ｍｌ  ＥＣＤ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノ−プロピル）カル物体ミド；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）および５ｍｇ／ｍｌ  ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を含む２５μＭオリゴ１の混合物の、各々、１μｌの数滴を被覆された基材上にスポットした。基材を飽和Ｈ２Ｏ雰囲気中で１時間インキュベートし、０．２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）で洗浄し、非常に純粋な水ですすぎ、窒素を吹き付けて乾燥させた。
【０１７５】
３．ハイブリダイゼーション：
オリゴ２ａ：５’ＴＴＧＣＴＣＣＣＡＧＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＡＴＡＡＴＣＧＴＡＡＣＧＡＧＧＧＧＴＴＡＴＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＧＣＣＣＧＧＡＧＡ−Ｃｙ３（配列番号：２）
オリゴ２ｂ：５’ＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＡＧＴＣＣＣＴＴＴＧＡＴＡＡＴＣＧＴＡＡＣＧＡＧＧＧＧＴＴＡＴＡＣＧＣＣＧＴＡＡＡＧＣＣＧＧＡＧＡ−Ｃｙ３（配列番号：３）
オリゴ３：５’  Ｃｙ５−ＡＧＧＧＡＣＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＴＣＴＧＧＧＡＧＣＡＡ  ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ−ＢＩＯ（配列番号：４）
【０１７６】
該オリゴ２ａおよび２ｂは５’末端にＣｙ３−マーカー（シアニン３，Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ）を有する。オリゴ３はＣｙ５−マーカー（シアニン５，Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を５’末端に有する（全てのオリゴはメタビオンからのものである，Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ）。
【０１７７】
７５０ｍＭのＮａｃｌを含むクエン酸緩衝液（ｐＨ＝７．２）中のオリゴ２ａ（１μＭ）およびオリゴ３（２μＭ）の混合物の５μｌを、結合したオリゴ１のスポットの上のカバーグラス下に置いた。ハイブリダイゼーション組成物を８０℃にて飽和Ｈ２Ｏ雰囲気中で１５分間インキュベートし、次いで、雰囲気温度まで冷却した。雰囲気温度にて、基材を１５ｍＭのＮａＣｌ／０．２％ＳＤＳで１回洗浄し、１５ｍＭのＮａｃｌで２回目に洗浄した。次いで、該手法は非常に純粋な水ですすぎ、それを窒素を吹き付けて乾燥することを含んだ。該手法は、オリゴ２ａをオリゴ２ｂで置き換え、参照実験で同様であった。
【０１７８】
４．ピラーの被覆：
１ｍｍ厚みの微細構造ピラーはＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）から作成した。その場合、該構造は、幅約２５μｍおよび深さ１μｍの窪みによって分離された約１００×１００μｍのピラーフット部分よりなるものであった。その目的で、複数回脱気した後、シリコーンエラストマーおよび架橋剤（Ｓｙｌｇａｒｄ  １８４，Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ）の１：１０混合物を含む組成物を、適切に構築したシリコーンウエハーおよび平滑なプレキシグラスプレートの間に注ぎ、雰囲気温度にて２４時間インキュベートした。重合の後、ピラーの構築した表面をプラズマ炉中にて１ミリバールで１５秒間Ｈ２Ｏプラズマに暴露した。
【０１７９】
酸化した表面を、１０％Ｈ２Ｏ中の３％アミノシラン（３−アミノプロピルジメチル−エトキシシラン；ＡＢＣＲ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）および８７％エタノールと共に３０分間インキュベートした。シラン化表面をまずエタノールで、次いで非常に純粋な水で洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥させた。二官能性ＰＥＧをシランのアミノ基に結合させ、該ＰＥＧの一端はＮＨＳ−活性化カルボキシ基を有し、他端はビオチン基を有する。２０ｍｇ／ｍｌのＮＨＳ−ＰＥＧ−ビオチン（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）を含む２０μｌの溶液を、１ｃｍ２の表面積を持つピラー上にてカバーグラス下で１時間インキュベートした。次いで、該手法は非常に純粋な水で洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥することを含んだ。ＰＢＳ中の０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａ）を、ビオチン化した表面に置き、３０分間インキュベートした。洗浄は非常に純粋な水で行い、続いて、窒素を吹き付けて乾燥させた。
【０１８０】
５．ピラープレス：
新たに調製したピラーおよび基材を、４００ｇ／ｃｍ２の圧力下にて、１５ｍＭのＮａＣｌの溶液と共に結合したオリゴ（オリゴ１＋オリゴ２＋オリゴ３）を含むスポット上にプレスした。３０分後、ピラーを非常にゆっくりと持ち上げた。基材およびピラーを非常に純粋な水で洗浄し、窒素を吹き付けて乾燥させた。
【０１８１】
６．ピラーおよび基材は、マーカーＣｙ３およびＣｙ５に関し、２色レーザースキャナー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＧｅｎｅＴａｃ  ＬＳ  ＩＶ）でスキャンした。測定結果の比較を確実とするために、実験および参照実験のピラーならびに実験および参照実験の基材を同等なレーザー強度にてスキャンした。
【０１８２】
評価
ピラーおよび基材を各実験につき評価した。
基材の評価：
差ΔＣｙ３ＵｎｔおよびΔＣｙ５Ｕｎｔは、非プレス溝の強度からプレス表面の強度を引くことによって得た。比ＱＡ Ｕｎｔ＝ΔＣｙ３Ｕｎｔ／ΔＣｙ５Ｕｎｔは実験Ａ（オリゴ２ａ）については２つの差から得られ、比ＱＢ Ｕｎｔ＝ΔＣｙ３Ｕｎｔ／ΔＣｙ５Ｕｎｔは実験Ｂ（オリゴ２ｂ）では該差から得た。比ＱＵｎｔ＝ＱＡ Ｕｎｔ／ＱＢ Ｕｎｔは、基材上の、各々、オリゴ２ａおよび２ｂの枯渇の差に関する尺度として得た。
【０１８３】
ピラーの評価：
差ΔＣｙ３ＳｔおよびΔＣｙ５Ｓｔは、ピラー表面の強度からそれに対してオリゴが移動した溝の強度を差し引くことによって得た。比ＱＡ Ｓｔ＝ΔＣｙ３Ｓｔ／ΔＣｙ５Ｓｔは実験Ａ（オリゴ２ａ）では２つの差から得られ、他方、比ＱＢ Ｓｔ＝ΔＣｙ３Ｓｔ／ΔＣｙ５Ｓｔは実験Ｂ（オリゴ２ｂ）では該差から得られた。比ＱＳｔ＝ＱＡ Ｓｔ／ＱＢ Ｓｔは、基材上の、各々、オリゴ２ａおよびオリゴ２ｂの富化の差に関する尺度として得た。
【０１８４】
結果
実験２ｂの基材では、該手法は、値ＱＢ Ｕｎｔ＝０．３６±０．０８を与え、実験２ｂの基材では、ＱＡ Ｕｎｔ＝０．６９±０．０９を与えた。それは、ＱＵｎｔ＝ＱＡ Ｕｎｔ／ＱＢ Ｕｎｔ＝０．９２を与えた。
【０１８５】
２ｂのピラーでは、該手法はＱＢ Ｓｔ＝０．６１±０．０８を与え、２ａのピラーでは、ＱＡ Ｓｔ＝１．２０±０．０８を与えた。それは、ＱＳｔ＝ＱＡ Ｓｔ／ＱＢ Ｓｔ＝１．９７を与えた。
【０１８６】
実験２ａは、ピラー側の３０ｂｐ二本鎖および基材側の２０ｂｐ二本鎖の力の比較を含むものであった。もし、２ａについての結果（ＱＡ Ｕｎｔ＝０．６９，ＱＡ Ｓｔ＝１．２）を単独で考慮すれば、２つの二本鎖のうちいずれの１つがより安定であるか、またはピラーを基材から分離した場合に、２つのうちいずれが他方よりも開裂する頻度が高いかについてのいずれの情報も有することができない。実験２ａ単独からのそのような情報は、もしＣｙ３およびＣｙ５の現実の物質量を蛍光強度の測定されたレベルから計算できる場合にのみ可能であろう。本実験は対応するキャリブレーション値を含まないので、実験２ａにおける３０ｂｐ二本鎖と２０ｂｐ二本鎖との力の比較では、実験ｂにおける２０ｂｐ二本鎖とさらなる２０ｂｐ二本鎖との力の比較を参照として用いるべきである。
【０１８７】
実験２ａおよび参照実験２ｂからの比は、基材についてＱＵｎｔ＝ＱＡ Ｕｎｔ／ＱＢ Ｕｎｔ＝１．９２、およびピラーにつきＱＳｔ＝ＱＡ Ｓｔ／ＱＢ Ｓｔ＝１．９７を与える。それは、基材２ａにつき、ほぼ２倍多いＣｙ３−標識オリゴが２ｂにおいてプレスにより離れ、およびほぼ２倍多いＣｙ３−標識オリゴが２ｂにおいてピラーに移動したことを意味する。
【０１８８】
同一数のＣｙ５−およびＣｙ３−発蛍光団が同一レベルの蛍光強度を有するであろう測定手法においては、２つの２０ｂｐ二本鎖の同一安定性によって、ＱＢ Ｕｎｔ＝０．５およびＱＢ Ｓｔ＝０．５が参照実験２ｂにおいて予測されるであろう。ここに確認されるＱＢ Ｕｎｔ＝０．３６は、キャリブレートされた測定手法で予測されるべき結果に対して、１．３９のファクターだけ余りにも小さい。もしＱＢ Ｕｎｔがそのファクターによって０．５まで修正されれば、それは、実験２ａの修正を与える：
ＱＡ Ｕｎｔ ｃｏｒｒ．＝ＱＡ Ｕｎｔ×１．３９＝０．６９×１．３９＝０．９６。
【０１８９】
ＰＤＭＳピラーでは、物質の特異的蛍光特性によって、それにつき特定の修正ファクターを計算する必要がある。基材に対すると同様に、それは：
ＱＢＳｔ ｃｏｒｒ．＝０．５＝ＱＢ Ｓｔ×０．８２
ＱＡ Ｓｔ ｃｏｒｒ．＝１．２０×０．８２＝０．９８
を与える。
【０１９０】
それより、全ての形成された全ての分子間結合において、全ての試料複合体（２０ｂｐ）の９７％が開裂し、全ての参照複合体（３０ｂｐ）のうち３％のみが開裂すると結論することができる。
図９Ａおよび９Ｂは、実験２ａにおけるプレス操作後の基材およびピラーの図を示す。図９Ｃおよび９Ｄは、実験２ｂにおけるプレス操作後の基材およびピラーの図を示す。各場合、色または色素Ｃｙ３のみが示される。
【０１９１】
図１０Ａおよび１０Ｃは、各々、オリゴヌクレオチド２ａおよび２ｂとの力比較後における基材の結果を示す。図１０Ｂおよび１０Ｄは、対応して、ピラーについての結果を示す。これは、蛍光プロフィールの一部を含む。プロフィールの進行は、図９Ｃ中の矢印によって示される。グラフ１０Ａおよび１０Ｃの最大は、基材の非−プレス領域を表す明るいグリッド線に対応する。ピークの間にある最小は、ピラーフット部分に結合したストレプトアビジンとの接触の結果として、それからオリゴがプレスして離された暗い四角形に対応する。１０Ｂおよび１０Ｄ中のグラフの最少は、それに対して発蛍光団が移動しなかった、ピラー上の暗いグリッド線に対応する。最大は、基材との接触の結果として、ピラーにオリゴが移動した明るい四角形に対応する。
【０１９２】
ＱＳｔおよびＱ  Ｕｎｔは、オリゴ２ａおよびオリゴ３の間の二本鎖が、オリゴ２ｂおよびオリゴ３の間の二本鎖よりも少なくとも５０％高い解離力を有することを示した。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、結合複合体の単純化した結合ポテンシャルを模式的に示す図である。
【図２】図２は、示差力試験の原理を模式的に示す図である。
【図３】図３は、物体との非特異的相互作用と、結合パートナーとの特異的相互作用との間の相違を示す概略図である。
【図４】図４は、不完全に対合した核酸二本鎖からの完全に対合した核酸二本鎖の相違を示す概略図である。
【図５】図５は、サンドイッチ様式の５つの独立した同様な結合複合体に対する比較力試験の同時実行を示す図である。
【図６】図６は、捕捉様式の５つの独立した同様な結合複合体に対する比較力試験の同時実行を示す図である。
【図７】図７は、本発明の方法を行うのに適したピラー装置の可能な具体例を示す概略図である。
【図８】図８Ａは、複合体ビオチン／ストレプトアビジンおよびイミノビオチン／ストレプトアビジンを比較するための力試験後の支持体または基材を示す図である。
図８Ｂは、複合体ビオチン／ストレプトアビジンおよびイミノビオチン／ストレプトアビジンを比較するための力試験後のピラーを示す図である。
【図９Ａ】図９Ａは、２つのＤＮＡ二本鎖を比較するための力試験後の基材を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、２つのＤＮＡ二本鎖を比較するための力試験後のピラーを示す図である。
【図９Ｃ】図９Ｃは、２つのＤＮＡ二本鎖を比較するための力試験後の基材を示す図である。
【図９Ｄ】図９Ｄは、２つのＤＮＡ二本鎖を比較するための力試験後のピラーを示す図である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、力比較後の基材の評価結果を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、力比較後のピラーの評価結果を示す図である。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、力比較後の基材の評価結果を示す図である。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、力比較後のピラーの評価結果を示す図である。
【図１１】図１１Ａは、完全カップリングを有するコンジュゲートの分布を示す概略図である。
図１１Ｂは、部分的カップリングを有するコンジュゲートの分布を示す概略図である。
図１１Ｃは、部分的カップリングを有するコンジュゲートの分布を示す概略図である。
【図１２】図１２Ａは、リバース・ピラーリング法の原理を示す模式図である。
図１２Ｂは、リバース・ピラーリング法の原理を示す模式図である。
図１２Ｃは、リバース・ピラーリング法の原理を示す模式図である。
図１２Ｄは、リバース・ピラーリング法の原理を示す模式図である。
【図１３】図１３Ａ−１は、デスビオチン上のビオチンからストレプトアビジンおよびその反対のリバース・ピラーリングの測定結果を示す概略図である。
図１３Ａ−２は、デスビオチン上のビオチンからストレプトアビジンおよびその反対のリバース・ピラーリングの測定結果を示す概略図である。
図１３Ｂ−１は、デスビオチン上のビオチンからストレプトアビジンおよびその反対のリバース・ピラーリングの測定結果を示す概略図である。
図１３Ｂ−２は、デスビオチン上のビオチンからストレプトアビジンおよびその反対のリバース・ピラーリングの測定結果を示す概略図である。
【図１４】図１４は、カップリングを行うことができる種々の方法の概略図である。
【図１】
2004525341.tif 000009
【図２】
2004525341.tif 000010
【図１０Ａ】
2004525341.tif 000011
【図１０Ｂ】
2004525341.tif 000012
【図１０Ｃ】
2004525341.tif 000013
【図１０Ｄ】
2004525341.tif 000014
【図１１】
2004525341.tif 000015
【図１３】
2004525341.tif 000016
【図１４】
2004525341.tif 000017
【国際公開パンフレット】
2004525341.tif 000018
2004525341.tif 000019
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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