(57)【要約】ジチオカルバマート、特にテトラエチルチウラムジスルフィド、およびチオカルバマートアニオンは、種々の細胞型の癌細胞の成長を強力に阻害する。このような阻害効果は、銅イオンなどの重金属イオン、サイトカイン、およびセルロプラスミンによって増強される。腫瘍成長を減少させ、且つ他の抗癌薬の効果を増大させるためのテトラエチルチウラムジスルフィドの使用方法を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量の式：
【化１】
2004525079.tif 000011
（式中、Ｒ２およびＲ３は同一であっても異なっていてもよく、水素、非置換もしくは置換アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、またはヘテロアリール基を示し、Ｍは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、およびリチウムからなる群から選択されるアルカリ金属であり、ｎは該アルカリ金属の価数である）のジチオカルバマートチオラートアニオンを投与するステップを含む、ヒトの癌を治療し、Ｐ糖蛋白質膜毒素排出ポンプの遮断によって従来の癌化学療法に対する腫瘍の感受性を高め、Ｐ糖蛋白質膜毒素排出ポンプの遮断によって抗レトロウイルス治療に対するＡＩＤＳ患者の感受性を高める方法。
【請求項２】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンが、薬学的に許容可能な塩の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを、体重あたり約１２５ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日の投薬量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを、約２５０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の投薬量で投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを非経口投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを経口投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを、ヒ素、ビスマス、コバルト、銅、クロム、ガリウム、金、鉄、マンガン、ニッケル、銀、チタン、バナジウム、セレン、および亜鉛からなる群から選択される金属と、低分子量のアニオンとを含む金属錯体と組み合わせて投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを、ヒ素、ビスマス、コバルト、銅、クロム、ガリウム、金、鉄、マンガン、ニッケル、銀、チタン、バナジウム、セレン、および亜鉛からなる群から選択される金属のイオンを含む金属キレートと組み合わせて投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記金属錯体を、有機アニオンとのキレートとして投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記有機アニオンが、クエン酸イオン、酢酸イオン、グリコン酸イオン、グリシン酸イオン、プロピオン酸イオン、および乳酸イオンからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを、ヒ素、ビスマス、コバルト、銅、クロム、ガリウム、金、鉄、マンガン、ニッケル、銀、チタン、バナジウム、セレン、および亜鉛からなる群から選択される金属のイオンと、低分子量のアニオンとを含む金属キレートと組み合わせて投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
治療有効量の式：
【化２】
2004525079.tif 000012
（式中、Ｒ２およびＲ３は同一であっても異なっていてもよく、水素、非置換もしくは置換アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、またはヘテロアリール基を示し、Ｍは、ヒ素、ビスマス、ガリウム、マンガン、セレン、亜鉛、チタン、バナジウム、クロム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、銀、銀、および金からなる群から選択される重金属であり、Ａｎは、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、酢酸イオン、および低分子量の有機または無機の薬学的に許容可能なアニオンからなる群から選択されるアニオンであり、ｎは金属の価数である）のジチオカルバマートチオラート金属錯体を投与するステップを含む、ヒトの癌を治療し、Ｐ糖蛋白質膜毒素排出ポンプの遮断によって従来の癌化学療法に対する腫瘍の感受性を高め、Ｐ糖蛋白質膜毒素排出ポンプの遮断によって抗レトロウイルス治療に対するＡＩＤＳ患者の感受性を高める方法。
【請求項１３】
前記ジチオカルバマートチオラート金属錯体が薬学的に許容可能な塩の形態である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ジチオカルバマートチオラート金属錯体を、体重あたり約１２５ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日の投薬量で投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ジチオカルバマートチオラート金属錯体を、約２５０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の投薬量で投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ジチオカルバマートチオラート金属錯体を非経口投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを経口投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記金属錯体を、有機アニオンとのキレートとして別個に投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記有機アニオンが、クエン酸イオン、酢酸イオン、グリコン酸イオン、グリシン酸イオン、プロピオン酸イオン、および乳酸イオンからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
治療有効量の式：
【化３】
2004525079.tif 000013
（式中、Ｒ２およびＲ３は同一であっても異なっていてもよく、水素、非置換もしくは置換アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、またはヘテロアリール基を示し、Ｍは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、およびリチウムからなる群から選択されるアルカリ金属であり、ｎはアルカリ金属の価数である）のジチオカルバマートチオラートアニオンを投与するステップを含む、ヒト心血管系に対する低酸素症または虚血による損傷を低減する方法。
【請求項２１】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンが、薬学的に許容可能な塩の形態である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを、体重あたり約１２５ｍｇ／日〜体重あたり約１０００ｍｇ／日の投薬量で投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを、ジスルフィラムとして約２５０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の投薬量で投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを非経口投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを経口投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを、ヒ素、ビスマス、コバルト、銅、クロム、ガリウム、金、鉄、マンガン、ニッケル、銀、チタン、バナジウム、セレン、および亜鉛からなる群から選択されるイオンを含む金属錯体と組み合わせて投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記金属錯体を、有機アニオンとのキレートとして投与する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記有機アニオンが、クエン酸イオン、酢酸イオン、グリコン酸イオン、グリシン酸イオン、プロピオン酸イオン、および乳酸イオンからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを、ヒ素、ビスマス、コバルト、銅、クロム、ガリウム、金、鉄、マンガン、ニッケル、銀、チタン、バナジウム、セレン、および亜鉛からなる群から選択される金属のイオンを含む金属キレートと組み合わせて投与する、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
治療有効量の式：
【化４】
2004525079.tif 000014
（式中、Ｒ２およびＲ３は同一であっても異なっていてもよく、水素、非置換もしくは置換アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、またはヘテロアリール基を示し、Ｍは、ヒ素、ビスマス、ガリウム、マンガン、セレン、亜鉛、チタン、バナジウム、クロム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、銀、銀、および金からなる群から選択される重金属であり、Ａｎは、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、酢酸イオン、および低分子量の有機または無機の薬学的に許容可能なアニオンからなる群から選択されるアニオンであり、ｎは金属の価数である）のジチオカルバマートチオラート金属錯体を投与するステップを含む、ヒト心血管系に対する低酸素症または虚血による損傷を低減する方法。
【請求項３１】
前記ジチオカルバマートチオラート金属錯体が薬学的に許容可能な塩の形態である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ジチオカルバマートチオラート金属錯体を、体重あたり約１２５ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日の投薬量で投与する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ジチオカルバマートチオラート金属錯体を、ジスルフィラムとして約２５０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の投薬量で投与する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ジチオカルバマートチオラート金属錯体を非経口投与する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ジチオカルバマートチオラート金属錯体を経口投与する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記金属錯体を、有機アニオンとのキレートとして別個に投与する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記有機アニオンが、クエン酸イオン、酢酸イオン、グリコン酸イオン、グリシン酸イオン、プロピオン酸イオン、および乳酸イオンからなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
治療有効量の式：
【化５】
2004525079.tif 000015
（式中、Ｒ２およびＲ３は同一であっても異なっていてもよく、水素、非置換もしくは置換アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、またはヘテロアリール基を示し、Ｍは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、およびリチウムからなる群から選択されるアルカリ金属であり、ｎはアルカリ金属の価数である）のジチオカルバマートチオラートアニオンを投与するステップを含む、ヒトの喘息または炎症の治療方法。
【請求項３９】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンが、薬学的に許容可能な塩の形態である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを、体重あたり約１２５ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日の投薬量で投与する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを、ジスルフィラムとして約２５０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の投薬量で投与する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを非経口投与する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを非経口投与する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを、ヒ素、ビスマス、コバルト、銅、クロム、ガリウム、金、鉄、マンガン、ニッケル、銀、チタン、バナジウム、セレン、および亜鉛からなる群から選択される金属のイオンを含む金属錯体と組み合わせて投与する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
前記金属錯体を、有機アニオンとのキレートとして別個に投与する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記有機アニオンが、クエン酸イオン、酢酸イオン、グリコン酸イオン、グリシン酸イオン、プロピオン酸イオン、および乳酸イオンからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記ジチオカルバマートチオラートアニオンを、ヒ素、ビスマス、コバルト、銅、クロム、ガリウム、金、鉄、マンガン、ニッケル、銀、チタン、バナジウム、セレン、および亜鉛からなる群から選択される金属のイオンを含む金属キレートと組み合わせて投与する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４８】
治療有効量の式：
【化６】
2004525079.tif 000016
（式中、Ｒ２およびＲ３は同一であっても異なっていてもよく、水素、非置換もしくは置換アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、またはヘテロアリール基を示し、Ｍは、ヒ素、ビスマス、ガリウム、マンガン、セレン、亜鉛、チタン、バナジウム、クロム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、銀、銀、および金からなる群から選択される重金属であり、Ａｎは、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、酢酸イオン、および低分子量の有機または無機の薬学的に許容可能なアニオンからなる群から選択されるアニオンであり、ｎは金属の価数である）のジチオカルバマートチオラートアニオンを投与するステップを含む、喘息および炎症の治療方法。
【請求項４９】
前記ジチオカルバマートチオラート金属錯体が、薬学的に許容可能な塩の形態である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ジチオカルバマートチオラート金属錯体を、体重あたり約１２５ｍｇ／日〜約１０００ｍｇ／日の投薬量で投与する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記ジチオカルバマートチオラート金属錯体を、ジスルフィラムとして約２５０ｍｇ／日〜約５００ｍｇ／日の投薬量で投与する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記ジチオカルバマートチオラート金属錯体を非経口投与する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
前記ジチオカルバマートチオラート金属錯体を非経口投与する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記金属錯体を、有機アニオンとのキレートとして別個に投与する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
前記有機アニオンが、クエン酸イオン、酢酸イオン、グリコン酸イオン、グリシン酸イオン、プロピオン酸イオン、および乳酸イオンからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、一般に、癌の治療方法、特にジチオカルバマート誘導体（ｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）を使用した癌の治療方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
制御されない悪性細胞の成長である癌は、現代医学の主要な健康上の問題であり、米国での死因としての心臓疾患のみの次位を占めている。心臓の腺癌などの悪性疾患およびホジキン病などのリンパ腫は現代の化学療法による抗新生物薬投薬計画に比較的十分に反応するが、他の癌、特に非小細胞肺癌、膵癌、前立腺癌、および結腸癌は化学療法の反応性が低い。初期には化学療法に感受性を示す小細胞肺癌でさえも、寛解後に再発して広範に転移して患者を死に至らしめる。したがって、この疾患に対するより良好な治療アプローチが必要である。また、ほとんど全ての現在利用可能な抗新生物薬は、顕著に有毒である（骨髄の抑制、腎不全、口内炎、腸炎、および脱毛症など）。
【０００３】
２０世紀の終わりに、全ての他の腫瘍型よりも悪性黒色腫の発症が劇的に増加した。悪性黒色腫の生物学的研究により、悪性細胞増殖の転写因子の重要性の例が提供されている。悪性黒色腫は、転移性を示し、化学療法およびγ線照射などの従来の化学療法に耐性を示す。ヒトの悪性黒色腫の発症は、多段階のプロセス（メラノサイトから母斑への移行、放射状の成長、およびその後の垂直方向への成長（成長因子への依存の減少、足場依存性の減少、接触阻害の減少、ならびに照射および薬物耐性の増加に関連する自立性黒色腫の転移性表現型））を経て進行する。
【０００４】
黒色腫進行の分子の理解は、細胞分裂誘起刺激に対する培養黒色腫細胞の応答の研究に由来する。培養では、メラノサイト増殖および分化は、ｃＡＭＰを増加させる薬剤によって陽性に制御され（Ｐ．Ｍ．Ｃｏｘら、「ＭＨＣクラスＩＩＤｒαプロモーターを異常な構成性発現およびＳＶ４０  Ｔ抗原による活性化にＡＴＦ／ＣＲＥＢ結合モチーフが必要である」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０、４８８１〜４８８７、１９９２；Ｒ．Ｈａｌａｂａｎら、「培養によって成長させたヒトメラノサイトのチロシナーゼによる制御」、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，９７、４８０〜４８８、１９８３；Ｄ．Ｊｅａｎら、「ＣＲＥＢおよびその関連タンパク質はヒト黒色腫細胞の生存因子として作用する」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３、２４８８４〜２４８９０、１９９８；Ｐ．Ｋｌａｔｔら、「一酸化窒素は、特異的標的化Ｓ−グルタチオニル化によるｃ−Ｊｕｎ  ＤＮＡ結合を阻害する」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４、１５８５７〜１５８６４、１９９９；Ｊ．Ｍ．Ｌｅｈｍａｎｎら、「ＭＵＣ１８（ヒト黒色腫の腫瘍進行マーカー）は、免疫グロブリンスーパーファミリーの神経細胞接着分子に配列類似性を示す」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、９８９１〜９８９５；Ｍ．Ｌｕｃａら、「ＭＵＣ１８発現とヒト黒色腫細胞の転移能力との間の直接的相関」、Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．，３、３５〜４１、１９９３；Ｊ．Ｐ．Ｒｉｃｈａｒｄｓら、「ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）およびリン酸化ＣＲＥＢの構造特性の分析」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１、１３７１６〜１３７２３、１９９６；Ｓ．Ｘｉｅら、「優性阻害型ＣＲＥＢは腫瘍成長およびヒト黒色腫細胞の転移を阻害する」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１５、２０６９〜２０７５、１９９７を参照のこと）、ＣＲＥ（コンセンサスモチーフ５’−ＴＧＡＣＧＴＣＡ−３’またはｃＡＭＰ応答エレメント）に結合するいくつかのｃＡＭＰ応答性転写因子は、メラノーマ成長および転移を媒介する優れた役割を果たす。ＭｅＷｏ黒色腫細胞では、転写因子ＣＲＥＢ（ＣＲＥ結合タンパク質）およびその関連ファミリーメンバーＡＴＦ−１は、ＣＲＥ依存性遺伝子発現により腫瘍の成長、転移、および生存を促進する。前出のＤ．Ｊｅａｎらを参照のこと。転移性ＭｅＷｏメラノーマ細胞における優性阻害型ＫＣＲＥＢ構築物の発現により、ヌードマウスにおける腫瘍形成性および転移能力が増加する。Ｓ．Ｘｉｅら、「ヒト黒色腫細胞によるＭＣＡ／ＭＵＣ１８の発現により腫瘍成長および転移性が増大する」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７、２２９５〜２３０３、１９９７を参照のこと。ＫＣＲＥＢトランスフェクト細胞は、基質メタロプロテイナーゼ２（ＭＰＰ２、７２ｋＤａのコラゲナーゼＩＶ型）のｍＲＮＡおよび活性を有意に減少させ、それにより基底膜（転移能力における重要な成分）を介した侵入が減少する。
【０００５】
メラノーマ転移に関連する細胞表面接着分子ＭＣＡＭ／ＭＵＣ１８（前出のＪ．Ｍ．Ｌｅｈｍａｎｎら；前出のＭ．Ｌｕｃａら；前出のＳ．Ｘｉｅら、を参照のこと）はまた、ＫＣＲＥＢトランスフェクションによってダウンレギュレーションされる。前出のＳ．Ｘｉｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，を参照のこと。さらに、ＭｅＷｏ細胞におけるＫＣＲＥＢの発現により、タプシガルジン誘導性アポトーシスに感受性が与えられ、これにより、ＣＲＥＢおよびその関連タンパク質がヒト黒色腫細胞の生存因子として作用し、それにより悪性表現型の獲得に寄与することが示唆される。前出のＤ．Ｊｅａｎらを参照のこと。
【０００６】
黒色腫細胞は、通常Ｂリンパ球および単球／マクロファージ細胞株の抗原定時細胞のみに見出される主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）抗原を異常に発現する。Ｐ．Ｍ．Ｃｏｘら、「ＡＴＦ／ＣＲＥＢ結合モチーフは、ＭＨＣクラスＩＩＤｒαプロモーターの異常な構成性発現およびＳＶ４０のＴ抗原による活性化に必要である」、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０、４８８１〜４８８７、１９９２を参照のこと。Ｂ１６黒色腫細胞では、これはＡＴＦ／ＣＲＥＢモチーフの構成性活性化によるＭＨＣ  ＩＩ  ＤＲαプロモーターの活性化による。ＣＲＥＢファミリータンパク質はまた、ＵＶ応答エレメント（ＵＲＥ、５’−ＴＧＡＣＡＡＣＡ−３’）に結合し、ＣＲＥＢファミリーメンバーＡＴＦ２のＵＲＥ結合により、ＭｅＷｏ黒色腫株における照射および化学療法薬ｃｉｓ白金、１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン（ａｒａＣ）、またはマイトマイシンＣへの耐性が付与される。Ｚ．Ｒｏｎａｉら、「ＡＴＦ２はヒト黒色腫細胞に照射耐性を付与する」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１６、５２３〜５３１、１９９８を参照のこと。したがって、ＣＲＥＢファミリーの転写因子は、この重要な腫瘍型の悪性潜在性に重要な役割を果たす。これにより、ＡＴＦ／ＣＲＥＢ媒介性転写の標的化分子破壊が比較的耐性の高い悪性黒色腫の成長および転移の調節に治療的に有用であることが他の因子によって示唆される。前出のＤ．Ｊｅａｎおよび前出のＺ．Ｒｏｎａｉを参照のこと。
【０００７】
多数の転写因子の正電荷ＤＮＡ結合ドメインは、修復過程を刺激する過酸化水素または一酸化窒素（ＮＯ）などの薬剤によって酸化的に改変することができるシステインを含み、これによりグルタチオン（ＧＳＨ）とタンパク質チオールとの間に混合ジスルフィドが形成される。前出のＰ．Ｋｌａｔｔら；およびＨ．Ｓｉｅｓ、「グルタチオンおよび細胞機能におけるその役割」、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，２７、９１６〜９２１、１９９９を参照のこと。このいわゆるタンパク質の「Ｓ−グルタチオニル化」の結果として、通常、正電荷の転写因子であるＤＮＡ結合ドメインは、ＧＳＨの二つのカルボキシル末端基によって負電荷となる。電荷の変化により、その各ＤＮＡコンセンサス配列に結合する転写因子が破壊される。前出のＰ．Ｋｌａｔｔら、および前出のＨ．Ｓｉｅｓを参照のこと。この機構は、どのようにしてＮＯがＤＮＡ結合領域内のシステインの特異的に標的化されたＳ−グルタチオニル化によるｃ−Ｊｕｎ  ＤＮＡ結合を阻害するかを説明するために実証されてきており、類似の機構により、一般にどのようにして窒素ストレスがＦｏｓ、ＡＴＦ／ＣＲＥＢ、Ｍｙｂ、およびＲｅｌ／ＮＦκＢファミリー転写因子の活性化を機能的に阻害するかが示唆されている。前出のＰ．Ｋｌａｔｔらを参照のこと。
【０００８】
ジチオカルバマートは、金属と錯体を形成してスルフヒドリル基およびグルタチオンと反応する広範な分子クラスを含む。金属触媒による、その対応するジスルフィドへの変換後、ジチオカルバマートは、重要なタンパク質チオールとの混合ジスルフィドの形成により、システインプロテアーゼを阻害する。Ｃ．Ｓ．Ｉ．Ｎｏｂｅｌら、「アポトーシスのジチオカルバマート阻害機構：ジチオカルバマートジスルフィドによるチオールの酸化によりカスパーゼ３プロ酵素のプロセシングが阻害される」、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，１０、６３６〜６４３、１９９７を参照のこと。ＣＲＥＢは、ＤＮＡ結合領域中にＤＮＡ結合には不可欠ではないがＳ−グルタチオニル化の反応部位を提供し得る３つのシステイン（Ｃｙｓ３００、Ｃｙｓ３１０、およびＣｙｓ３３７）を含む。Ｓ．Ｏｒｒｅｎｉｕｓら、「ジチオカルバマートおよび細胞死の酸化還元調節」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，２４、１０３２、１０３８、１９９６を参照のこと。
【０００９】
最近、還元スルフヒドリル基を含むジチオカルバマート（例えば、ピロリジンジチオカルバマート（ＰＤＴＣ））が、培養直腸結腸癌細胞の増殖を阻害することが示された。「抗酸化剤により直腸結腸癌の化学療法薬の細胞傷害性を増強する：Ｃ／ＥＢＰβを介したｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１のｐ５３依存性誘導」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，３、１２３３〜１２４１、１９９７；Ｃｈｉｎｅｒｙら、「抗酸化剤によりシクロオキシゲナーゼ２発現、プロスタグランジン産生、および直腸結腸癌細胞が減少する」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５８、２３２３〜２３２７、１９９８を参照のこと。
【００１０】
その還元チオ酸形態に加えて、ジチオカルバマートは、三つの他の形態で存在する。これは、例えば、ａ）チオ酸の縮合二量体であるジスルフィド（ジスルフィド結合により還元スルフヒドリル基が消滅する）、ｂ）一般にナトリウムなどのアルカリ金属塩としての負電荷チオラートアニオン、およびｃ）ジチオカルバマートの二つの隣接硫黄原子がチタン、バナジウム、クロム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、銀、または金の金属イオンと結合した遷移元素の１，１−ジチオラト錯体である。ジチオカルバマートのジスルフィド、チオラートアニオン、および遷移金属錯体は全て、還元スルフヒドリル分子部分を含まず、遊離基の電子を捕捉するための還元スルフヒドリルからのプロトンの供与により抗酸化剤として機能することができないという点でＣｈｉｎｅｒｙらによって使用されたＰＤＴＣの還元形態と構造的に異なる。Ｃｈｉｎｅｒｙらの教示によれば、還元スルフヒドリル、チオカルバマートジスルフィド、チオラートアニオン、および遷移金属錯体の欠如により、ジチオカルバマートのこれら３つの非還元化学形態は抗酸化剤として機能することができないので、癌に対する抗増殖薬としての活性を示さないはずである。
【００１１】
１９９９年９月８日提出の米国特許出願第０９／３９２，１２２号では、ジチオカルバマートジスルフィドジスルフィラムが腫瘍細胞に対する癌化合療法の感受性を高め、これを癌化学療法薬と組み合わせて使用して、その新生物治療効果を増大させることができることが報告された。最近、ジスルフィラムが細胞からの種々の細胞傷害薬をポンピングする原形質膜状のＰ糖蛋白質ポンプ（ＡＴＰ駆動性の１７０ｋｄの流出ポンプ）の成熟を防止することが示された研究でこの効果が説明された。Ｔ．Ｗ．Ｌｏｏら、「ジスルフィラム（アルコール中毒症治療に使用される薬物）によるインビトロでの薬物耐性の遮断」、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９２、８９８〜９０２、２０００を参照のこと。この効果により、腫瘍細胞中のＰ糖蛋白質に媒介される薬物耐性が減少し、癌化学療法に対する腫瘍細胞の感受性が高められる。
【００１２】
したがって、本発明の目的は、癌の治療方法を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、癌治療用の薬学的組成物を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、治療自体による損傷の危険性を伴わずに、より良好に癌患者を治療するために、単独でまたは既存の薬物と組み合わせて利用可能な比較的毒性の低い薬剤を提供することである。
【００１５】
［発明の要旨］
本発明は、ジチオカルバマートジスルフィドまたはチオカルバマートアニオンのいずれかを単独で使用するか、重金属イオンと組み合わせて使用するか、重金属イオンのチオカルバマート錯体を使用した、確立された癌の治療方法を提供する。
【００１６】
ジチオカルバマートジスルフィドおよびその対応するチオラートアニオンのみで、その構造内の抗酸化性スルフヒドリル基の非存在下で確立された腫瘍細胞の成長に対する強力な阻害効果を示すことを発見した。チオカルバマートジスルフィドおよびその対応するチオラートアニオンは、現在利用可能な新生物薬に対する応答が不十分であることが知られている、確立された黒色腫および非小細胞肺癌細胞の成長の阻害に有効である。さらに、驚いたことに、確立された腫瘍細胞に対するジチオカルバマートジスルフィドおよびその対応するチオラートアニオンの抗増殖効果および抗新生物効果が、それ自体では癌細胞の成長を害することのない濃度における遷移金属塩で、癌細胞を同時治療することによって大いに強化されることをさらに発見した。遷移金属の強化機能は、ジチオカルバマートジスルフィド由来のチオラートアニオンの形成を促進することである。さらなる腫瘍細胞成長阻害効果を、例えば、銅、亜鉛、金、および銀イオンなどの重金属イオンの添加、または重金属イオン錯体としてのチオカルバマートの投与により顕著に強化することができる。
【００１７】
これらの種の化学的活性は、抗酸化作用に由来するのではなく、ジチオカルバマートと悪性細胞増殖に必要な遺伝子産物の発現の促進に必要な転写因子のＤＮＡ結合領域などの細胞タンパク質上の重要な部位に存在するシステインのスルフヒドリル部分との混合ジスルフィドの形成の刺激に由来する。
【００１８】
癌治療に有用なジチオカルバマートジスルフィドには、式：
Ｒ２Ｒ３Ｎ（Ｓ）ＣＳ−ＳＣ（Ｓ）ＮＲ２Ｒ３
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、同一であっても異なっていてもよく、水素、非置換もしくは置換アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、またはヘテロアリール基を示す）のものが含まれるが、これらに限定されない。アルキル基はシクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基を含むことができる。式中のＲ１、Ｒ２、およびＮ原子は共にＮ複素環（例えば、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアリールである）を形成することができる。同様に、式中のＲ３、Ｒ４、およびＮ原子は共にＮ複素環（例えば、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアリールである）を形成することができる。典型的には、Ｒ１およびＲ２は共に水素ではなく、Ｒ３およびＲ４は共に水素ではない。
【００１９】
本発明の別の態様によれば、治療的に有効な量のジチオカルバマートジスルフィド、好ましくは、ジスルフィラム、または式：
【化７】
2004525079.tif 000002
（式中、Ｒ２およびＲ３は同一であっても異なっていてもよく、水素、非置換もしくは置換アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、またはヘテロアリール基を示し、Ｍは重金属（例えば、ヒ素、ビスマス、ガリウム、マンガン、セレン、亜鉛、チタン、バナジウム、クロム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、銀、または金）であり、ｎは金属の価数であり、Ａｎは、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、酢酸イオン、および低分子量の有機または無機の薬学的に許容可能なアニオンからなる群から選択されるアニオンである）の対応するジエチルジチオカルバマートチオラート金属錯体を患者に投与するステップを含む、患者の確立された癌の治療方法が得られる。
【００２０】
好ましい実施形態では、重金属イオンを、ジチオカルバマートジスルフィドまたは対応するチオラートアニオンとの錯体またはキレートとして投与する。適切な重金属イオンには、ヒ素、ビスマス、コバルト、銅、クロム、ガリウム、金、鉄、マンガン、ニッケル、銀、チタン、バナジウム、セレン、および亜鉛のイオンが含まれるが、これらには限定されない。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、ジチオカルバマートジスルフィドまたは対応するチオラートアニオンおよび重金属イオンを、別の抗癌薬と組み合わせて投与する。
【００２２】
さらに、本発明は、ジチオカルバマートチオラートアニオンまたは重金属ともジチオカルバマート錯体の投与により化学療法薬に対する癌細胞の感受性を高めて、癌細胞から吸収された抗新生物薬を排出するように機能する腫瘍細胞膜Ｐ糖蛋白ポンプを阻害する方法を提供する。
【００２３】
本発明の別の態様によれば、本発明は、薬学的に許容可能な担体およびジチオカルバマートと重金属イオンとの間の錯体を含む薬学的組成物を提供する。任意選択的に、組成物は、別の抗癌薬をさらに含むことができる。
【００２４】
本発明の活性化合物を、種々の投与経路によって投与することができる。例えば、活性化合物を、経口、静脈内、皮内、皮下、および局所的に投与することができる。
【００２５】
本発明は、種々の型の癌の治療に有効である。これらの癌としては、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、リンパ腫および前立腺癌が挙げられるが、これらには限定されない。特に、本発明は、特に、黒色腫、肺癌、乳癌、および前立腺癌の治療に有効である。従って、本発明でのジチオカルバマートジスルフィドおよびチオラートアニオンの使用により、ヒトおよび他の動物の容易に利用可能且つ容易に使用される癌治療が得られる。
【００２６】
［発明の詳細な説明］
本発明は、本発明の好ましい実施形態が示されている添付の実施例を参照して以下に完全に説明される。しかし、多数の異なる形態で本発明を実施することができ、本明細書中に記載の実施形態に制限されると解釈すべきではなく、むしろ、本開示が完璧且つ完全であり且つ本発明の範囲が当業者に伝わるようにこれらの実施形態を提供する。
【００２７】
本明細書中で使用される、用語「ジチオカルバマートジスルフィド」は、式：
Ｒ１Ｒ２Ｎ（Ｓ）ＣＳ−ＳＣ（Ｓ）ＮＲ３Ｒ４
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、同一であっても異なっていてもよく、水素、非置換もしくは置換アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、またはヘテロアリール基を示す）を有する化合物をいう。アルキル基はシクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基を含むことができる。式中のＲ１、Ｒ２、およびＮ原子は共にＮ複素環（例えば、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアリールである）を形成することができる。同様に、式中のＲ３、Ｒ４、およびＮ原子は共にＮ複素環（例えば、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアリールである）を形成することができる。典型的には、Ｒ１およびＲ２は共に水素ではなく、Ｒ３およびＲ４は共に水素ではない。したがって、ジチオカルバマートジスルフィドは、還元スルフヒドリル基を有するジチオカルバマートのジスルフィド形態である。
【００２８】
多数のジチオカルバマートが既知であり、当分野で合成されている。ジチオカルバマートの非限定的な例としては、ジエチルジチオカルバマート、ピロロロジンジチオカルバマート、Ｎ−メチルおよびＮ−エチルジチオカルバマート、ヘキサメチレンジチオカルバマート、イミダゾリンジチオカルバマート、ジベンジルジチオカルバマート、ジメチレンジチオカルバマート、ジポリルジチオカルバマート、ジブチルジチオカルバマート、ジアミルジチオカルバマート、Ｎ−メチルおよびＮ−シクロプロピルメチルジチオカルバマート、シクロヘキシルアミルジチオカルバマート、ペンタメチレンジチオカルバマート、ジヒドロキシエチルジチオカルバマート、Ｎ−メチルグルコサミンジチオカルバマート、ならびにそれらの塩および誘導体が挙げられる。典型的には、スルフヒドリル含有ジチオカルバマートを酸化して、ジチオカルバマートジスルフィドを形成することができる。
【００２９】
スルフヒドリル含有ジチオカルバマートを、プロトン受容体として、アルカリ金属の水酸化物との処理によりその対応するチオラートアニオンに変換して、構造：
【化８】
2004525079.tif 000003
（式中、Ｒ２およびＲ３は同一であっても異なっていてもよく、水素、非置換もしくは置換アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、またはヘテロアリール基を示し、Ｍは、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、バリウム、およびリチウムからなる群から選択されるアルカリ金属であり、ｎはアルカリ金属の価数である）を得ることができる。
【００３０】
最後に、ジチオカルバマートの重金属錯体を、ジチオカルバマートのジスルフィドまたはチオラートアニオン形態の金属塩での処理のいずれかによって合成して、金属が両方の硫黄原子と錯体を形成する種々の有用な以下の金属錯体：
【化９】
2004525079.tif 000004
（式中、Ｒ２およびＲ３は同一であっても異なっていてもよく、水素、非置換もしくは置換アルキル、アルケニル、アリール、アルコキシ、またはヘテロアリール基を示し、Ｍは重金属（例えば、ヒ素、ビスマス、ガリウム、マンガン、セレン、亜鉛、チタン、バナジウム、クロム、鉄、コバルト、ニッケル、銅、銀、銀、または金）であり、ｎは重金属の価数であり、Ａｎは、塩素イオン、臭素イオン、ヨウ素イオン、酢酸イオン、および低分子量の無機の薬学的に許容可能なアニオンからなる群から選択されるアニオンである）を得ることができる。
【００３１】
詳細には、好ましいジチオカルバマートの金（ｇｏｌｄ）１，１−ジチオキレートは、式：
【化１０】
2004525079.tif 000005
（式中、Ｒ２、Ｒ３はエチルであり、Ａｎは低分子量のアニオンである）を有する。
【００３２】
ジチオカルバマートジスルフィドの任意の薬学的に許容可能な形態、それらの対応するチオラートアニオン、およびジチオカルバマート金属キレートを使用することができる。例えば、ジスルフィラムとして知られているテトラエチルチウラムジスルフィドを、本発明の実施形態で使用する。ジスルフィラムは、以下の式：
Ｒ１Ｒ２Ｎ（Ｓ）ＣＳ−ＳＣ（Ｓ）ＮＲ３Ｒ４
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は全てエチルである）を有する。ジスルフィラムは、アルコール中毒の治療に臨床的に使用されており、ジスルフィラムは肝臓アルデヒドデヒドロキナーゼを阻害する。
【００３３】
ジスルフィラムのチオラートアニオンの誘導体は、ジエチルジチオカルバマートアニオンであり、その塩は、以下の式：
【化１１】
2004525079.tif 000006
を有する。
【００３４】
最後に、金（ＡｕＩＩＩ）１，１−ジチオラト錯体として以下に例示したジエチルジチオカルバマートの重金属錯体は、式：
【化１２】
2004525079.tif 000007
（式中、Ｒ２およびＲ３はエチルであり、Ａｎは低分子量のアニオンである）を示す。
【００３５】
ジチオカルバマートおよびそのジスルフィドの製造方法は、一般に当分野で既知である。例示的な方法は、例えば、Ｔｈｏｒｎら、「ジチオカルバマートおよび関連化合物」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９６２；ならびに米国特許第５，１６６，３８７号、同第４，１４４，２７２号、同第４，０６６，６９７号、同第１，７８２，１１１号、および１，７９６，９７７号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている。
【００３６】
本明細書中で使用される、用語「癌の治療」は、特に、癌と診断された患者、すなわち、確立された癌（ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｃａｎｃｅｒ）を有する患者に治療薬を投与して癌性組織中の悪性細胞のさらなる成長または拡大を阻害し、及び／または悪性細胞を死滅させることをいう。
【００３７】
本発明は、患者の癌の治療方法を提供する。本発明によれば、ジチオカルバマートジスルフィド、その対応するチオラートアニオン、およびその重金属錯体（それぞれジスルフィラム、ジエチルジチオカルバマートアニオン、およびジクロロ（ジエチルチオカルバミル）金（ＩＩ）など）が重金属イオンに依存する様式で、腫瘍細胞の成長を阻害することができることが発見された。特に、銅、亜鉛、金、および銀イオンなどの重金属イオンがジチオカルバマートジスルフィドおよびそのチオラートアニオンの腫瘍細胞に対する阻害効果を有意に増強する一方で、このような重金属イオンの枯渇により、ジスルフィラムおよびジエチルジチオカルバマートアニオンによる成長阻害が防げられる。金属によって発揮される機能は、チオラートアニオンが細胞タンパク質のタンパク質システインスルフヒドリル基と混合ジスルフィドを形成することができるように、インビボでのチオラートアニオンの形を化学的に触媒するか安定化することである。
【００３８】
本発明の一つの態様によれば、患者の確立された癌の治療方法が得られる。ジチオカルバマートジスルフィドを、確立された癌を有する患者に投与して癌を治療することができる。好ましくは、投与したチウラムジスルフィドは、テトラエチルチウラムジスルフィド（すなわち、ジスルフィラム）などのテトラアルキルチウラムジスルフィドである。
【００３９】
本発明の別の態様では、癌患者の治療方法は、治療有効量のジチオカルバマートチオラートアニオンを患者に投与するステップを含む。
【００４０】
本発明の別の態様では、癌患者の治療方法は、治療有効量のジチオカルバマートジスルフィドまたはそのチオラートアニオンおよび重金属イオンを患者に投与するステップを含む。
【００４１】
重金属イオンの非限定的な例には、ヒ素、ビスマス、コバルト、銅、クロム、ガリウム、金、鉄、マンガン、ニッケル、銀、チタン、バナジウム、セレン、および亜鉛のイオンが含まれる。好ましくは、金、銀、亜鉛、セレン、および銅の各イオンを使用する。このような重金属イオンの供給源は、当業者に既知である。例えば、このようなイオンを、硫酸塩もしくは塩化物または任意の他の薬学的に許容可能な形態で得ることができる。好ましくは、塩は、キレート化形態であるか、胃腸管からの金属の吸収が増強されるように薬学的に許容可能な有機アニオン（酢酸イオン、グリシン酸イオン、グルコン酸イオン、プロピオン酸イオン、または乳酸イオンなど）と錯体を形成している。
【００４２】
一つまたは複数のジチオカルバマートジスルフィドまたは対応するチオラートアニオンおよび一つまたは複数の重金属イオンを、患者に投与することができる。ジチオカルバマートジスルフィドまたはチオラートアニオンおよび重金属イオンを、組み合わせるか、または別個で投与することができる。好ましくは、これらをキレート化錯体として投与する。当分野で既知であるように、ジチオカルバマートは優れたキレート化剤であり、重金属をキレート化してキレートを形成することができる。ジチオカルバマートと重金属イオンとのキレートの調製は、当業者に既知である。例えば、ジエチルジチオカルバマートと銅イオン、亜鉛イオン、銀イオン、または金イオンとのキレートを、適切な溶媒中でジスルフィラムまたはジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムと、例えば、ＣｕＳＯ４、ＺｎＣｌ２、Ｃ３Ｈ５ＡｇＯ３、またはＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏとの混合によって都合よく合成してキレートを形成させることができる。他のジチオカルバマート−重金属イオンキレートは、例えば、Ｄ．Ｃｏｕｃｏｕｖａｎｉｓ、「ジチオ酸および１，１−ジチオラート錯体の化学」、Ｐｒｏｇ．Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ．，１１、２３４〜３７１、１９７０；Ｄ．Ｃｏｕｃｏｕｖａｎｉｓ、「ジチオ酸および１，１−ジチオラート錯体の化学、１９６８〜１９７７」、Ｐｒｏｇ．Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ．，２６、３０２〜４６９、１９７８；Ｒ．Ｐ．Ｂｕｒｎｓら、「遷移金属の１，１−ジチオラト化合物」、Ａｄｖ．Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍ．，２３、２１１〜２８０、１９８０；Ｌ．Ｉ．Ｖｉｃｔｏｒｉａｎｏら、「塩化銅（ＩＩ）とテトラルキチウラムジスルフィドとの反応」、Ｊ．Ｃｏｏｒｄ．Ｃｈｅｍ．，３５、２７〜３４、１９９５；Ｌ．Ｉ．Ｖｉｃｔｏｒｉａｎｏら、「ジチオカルバミン酸銅：合成および反応性」、Ｊ．Ｃｏｏｒｄ．Ｃｈｅｍ．，３９、２３１〜２３９、１９９６（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）に開示されている。
【００４３】
本発明の別の態様によれば、治療的に有効な量のジチオカルバマートアニオン化合物および患者の上記重金属イオンの細胞内レベルを上昇させることができる細胞内重金属イオン刺激物質を患者に投与するステップを含む、癌患者の治療方法が提供される。
【００４４】
細胞内重金属イオン担体は既知である。例えば、セルロプラスミンを患者に投与して細胞内の銅レベルを上昇させることができる。他の重金属イオン担体が当分野で既知であり、これらもまた本発明の態様にしたがって投与することができる。重金属イオン担体およびジチオカルバマートジスルフィドまたはチオラートアニオンを、いっしょに、または別個で、好ましくは別個の組成物として投与することができる。
【００４５】
セルロプラスミンは、ヒトの体内で天然に産生されるタンパク質であり、ヒト血清から精製することができる。３つを超える４３〜４５ｋＤのドメインと錯体を形成する７個の銅原子を有するこの１３２ｋＤの糖タンパク質は、急性期反応物質であり、且つヒト血漿中の主要な銅含有タンパク質である。Ｈａｌｌｉｗｅｌｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８６、１〜８５、１９９０を参照のこと。細胞に輸送される場合、少なくとも数個の結合第二銅イオンは、患者に投与されたジチオカルバマートジスルフィドまたはチオラートアニオンとの錯体形成に利用可能である。Ｐｅｒｃｉｖａｌら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５８、３１４０〜３１４６、１９９０を参照のこと。典型的には、セルロプラスミンおよびジチオカルバマートジスルフィドまたはチオラートアニオンを、異なる組成物で投与する。ジチオカルバマートジスルフィドまたはチオラートアニオンを、およそ同時に投与しても幾らか時間をおいてもよい。例えば、セルロプラスミンをジチオカルバマートジスルフィドまたはチオラートアニオンを患者に投与する約５分〜約１２時間前後に投与することができる。
【００４６】
別の態様では、重金属イオンキャリヤの代わりに、ジチオカルバマートジスルフィドまたは対応するチオラートアニオンに加えてサイトカインを投与する。適切なサイトカインには、例えば、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、およびインターロイキン６（ＩＬ−６）が含まれる。このようなサイトカインは、患者に投与した場合、患者の身体に急性期反応を誘導して患者の血清セルロプラスミンの上昇を刺激することができる。
【００４７】
このようなサイトカインの生化学的および生理学的特性が当分野で広く研究されており、当業者に既知である。サイトカインを、ヒトまたは動物血清から精製することができる。これらを、遺伝子操作技術で得ることもできる。さらに、上記で識別したサイトカインの市販サンプルを本発明で使用することもできる。遺伝子または化学的に改変したサイトカインを投与することもできる。例えば、あるペプチドサイトカインは、このようなサイトカインがポリエチレングリコールなどの水溶性の非免疫原性ポリマーと結合した場合に動物体内での循環時間がより長くなることが知られている。
【００４８】
典型的には、サイトカインを、ジチオカルバマートジスルフィドまたは対応するチオラートアニオンと異なる組成物で投与する。サイトカインおよびジチオカルバマートジスルフィドまたはチオラートアニオンを、ほぼ同時または互いに幾らか時間をおいて投与することができる。例えば、サイトカインを、ジチオカルバマートジスルフィドまたはチオラートアニオンから約５分後〜約２４時間前後に投与することができる。
【００４９】
本発明の別の態様によれば、本発明の方法を、従来の癌化学療法と組み合わせて使用することができる。ジチオカルバマートジスルフィドまたはチオラートアニオンを使用する治療、重金属を別個に使用するもしくは使用しない治療、または、ジチオカルバマート重金属キレートとして使用した治療により、従来の癌化学療法に対する腫瘍の感受性が増大し、従来の癌化学療法薬がより有効になる。例えば、本発明の方法を、従来の照射療法または化学療法に補足することができる。したがって、本発明の一つの実施形態では、本発明の方法は、ジチオカルバマートジスルフィド化合物または対応するチオラートアニオンおよび重金属ならびに他の抗癌薬を患者に投与するステップを含む。セルロプラスミンまたはサイトカインおよびジチオカルバマートジスルフィドまたはチオラートアニオンによる治療を、他の抗癌薬治療と共に行って、抗癌薬の有効性を増大させることができる。
【００５０】
当分野で既知の任意の抗癌薬を、使用するジチオカルバマートジスルフィドまたはチオラートアニオン化合物、重金属イオン、セルロプラスミン、および／またはサイトカインと薬学的に適合可能である限り、本発明で使用することができる。「薬学的に適合可能な」は、他の抗癌薬が癌治療に逆効果であるか、患者が任意の実質的な副作用を起こすような方法で上記組成物と直接にまたは間接的に相互作用または反応しないことを意図する。
【００５１】
当分野で既知の抗癌薬の例には、ブスルファン、クロラムブシル、ヒドロキシウレア、イフォスファミド、マイトマイシン、ミトーテン、クロラムブシル、メクロレタミン、カルムスチン、ロムスチン、シスプラチン、カルムスチン、ヘルセプチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ニトロソウレア、フォテムスチン、ビンデシン、エトポシド、ダウノルビシン、アドリアマイシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ストレプトゾシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、ペントスタチン、マイトトキサントロン、バルルビシン、シタラビン、フルダラビン、フロクスウリジン、クラルドリビン、メトトレキセート、メルカプトプリン、チオグアニン、カペシタビン、イリノテカン、ダカルバジン、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、アルトレタミン、トポテカン、プロカルバジン、ビノレルビン、ペガスパルガーゼ、ビンクリスチン、リツキサン、ビンブラスチン、トレチノイン、テニポシド、フルオロウラシル、メルファラン、ブレオマイシン、サリチル酸塩、アスピリン、ピロキシカム、イブプロフェン、インドメタシン、ナプロシン、ジクロフェナク、トルメチン、ケトプロフェン、ナムブエトン、オキサプロジン、ドキシルビシン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）などの非選択性シクロオキシゲナーゼインヒビター類、および選択性シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）インヒビター類が含まれる。
【００５２】
使用する抗癌薬を、ジチオカルバマートジスルフィドまたはチオラートアニオン化合物、重金属化合物、またはジチオカルバマート−重金属キレート、セルロプラスミンおよび／または上記のサイトカインを含む同一の医薬製剤中で同時に投与することができる。抗癌薬を、ほぼ同時に投与することもできるが、別個に投与することができる。あるいは、抗癌薬を、ジチオカルバマートジスルフィドまたはチオラートアニオン化合物、重金属化合物、またはジチオカルバマート−重金属キレート、セルロプラスミンおよび／または上記のサイトカインの投与と異なる時間に投与することができる。最良の投与様式の決定にはいくらかの経験が必要であり、一旦本開示を適用すれば、これは当業者の能力の範囲内である。
【００５３】
本発明の方法は、ヒトの治療に特に有用である。また、本発明の方法は、動物、詳細には、イヌ、ウシ、ブタ、および他の動物などの哺乳動物の治療に適切である。本方法は、種々の型の癌の治療に有用である。この癌には、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、腎癌、結腸直腸癌、乳癌、膵臓癌、胃癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮癌、リンパ腫、および前立腺癌が含まれるが、これらに限定されない。特に、本発明は、特に、黒色腫、肺癌、乳癌、および前立腺癌の治療に有効である。
【００５４】
本発明の活性化合物を、典型的には、非経口、静脈内、経口、皮内、皮下、または局所投与などの任意の適切な経路によって薬学的に許容可能な担体中で投与する。本発明の活性化合物を治療に有効な量で投与して、治療を受けた患者がいかなる深刻な副作用を引き起こすことなく所望の治療効果が達成される。
【００５５】
ジチオカルバマートジスルフィド化合物であるジスルフィラムおよびそのジエチルジチオカルバマートチオラートアニオンは、当分野で決定された従来の臨床範囲内の量で投与した場合に有効である。米国食品医薬品局承認のジスルフィラム（Ａｎｔａｂｕｓｅ（登録商標））を、Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、１９１０１から経口投与用の２５０ｍｇおよび５００ｍｇの錠剤で購入することができる。典型的には、約１２５〜約１０００ｍｇ／日、好ましくはジスルフィラムとして約２５０〜約５００ｍｇ／日、ジエチルジチオカルバマートとして１００〜５００ｍｇ／日、または週に１回、５ｍｇ／ｋｇの静脈内投与、または１０ｍｇ／ｋｇの経口投与で有効である。しかし、投薬量は、治療を受ける患者の体重によって変化し得る。有効成分を一度に投与するか、多数のより少量に分割して所定の時間間隔で投与することができる。各ジスルフィラムの適切な投薬単位は、例えば、約５０〜約１０００ｍｇ／日、好ましくは約２５０〜約５００ｍｇ／日である。検出可能な治療効果を達成するためのジスルフィラムの望ましいピーク濃度は、一般に、約０．０５〜約１０μＭ、好ましくは約０．５〜約５μＭである。ジチオカルバマートチオラートアニオンおよびジチオカルバマート−重金属錯体についても類似の濃度範囲が望ましい。
【００５６】
徐放のために皮下に移植したジスルフィラムは、適切な血漿濃度の達成のための８００〜１６００ｍｇで有効であることも示された。これを、無菌技術を使用して前腹壁の皮下空間にジスルフィラムを手術によって移植して達成することができる。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈ．，４５、２４２〜２４７、１９８４を参照のこと。さらに、８０％のポリ（グリコール酸−Ｌ−乳酸）共重合体および２０％のジスルフィラムなどの徐放投薬形態を使用することができる。他のジチオカルバマートジスルフィド化合物の治療有効量を、ジスルフィラムの上記投薬範囲およびジスルフィラムおよび他のジチオカルバマートジスルフィド化合物の分子量、または当分野で既知の他の方法に基づいて、評価または計算することもできる。
【００５７】
ジエチルジチオカルバマートチオラートアニオンは、以前は癌化学療法薬自体として推奨されていたことも、癌化学療法薬に対する腫瘍の感受性を増大させる治療としても示唆されていなかった。ＨＩＶ感染治療のために、ヒトに、１週間に１回、静脈投与の場合には５ｍｇ／ｋｇ、または経口投与の場合には１０ｍｇ／ｋｇを使用することで治療していた。この投薬計画に対する最小の副作用には、口内での金属の味、膨満、およびアルコール飲料に対する不耐性が含まれる。胃内でのジエチルジチオカルバマートの塩酸への曝露の際、二硫化炭素が遊離する可能性があるために、腸内のアルカリ性環境中で、有効な薬物のみを遊離するためのジエチルジチオカルバマートチオラートアニオンの腸溶性経口投薬形態が好ましい。ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムの経口腸溶性形態は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｍｅｒｉｅｕｘ、Ｌｙｏｎ、ＦｒａｎｃｅのＩｍｕｔｈｉｏｌ（登録商標）として１２５ｍｇの錠剤で利用可能である。
【００５８】
重金属イオンを、薬学的に適切な塩の形態の水溶液として別個に投与することができる。理想的には、塩形態は、吸収を増大させるために酢酸塩、乳酸塩、グリシン酸塩、クエン酸塩、プロピオン酸塩、またはグルコン酸塩である。しかし、重金属を、１，１−ジチオラート錯体としてイオンがジチオカルバマートと錯形成したキレート形態で投与することが好ましい。したがって、有利に使用される重金属イオンの量は、キレート中の重金属イオンとジチオカルバマートとの比に基づいて、投与されるジチオカルバマートジスルフィド化合物の量に比例する。このようなキレートまたは複合体の調製方法は既知であり、好ましい方法は上記および以下の実施例で開示されている。
【００５９】
治療有効量のＩＬ−６は、約１〜約１００μｇ／ｋｇ／日、好ましくは約５〜約５０μｇ／ｋｇ／日であり得る。インターフェロンαを、約０．１×１０６〜約１０×１０６国際単位／日、好ましくは約３〜約８×１０６国際単位／日で投与することができ、投与頻度は、１週間に３回から１日１回までであり得る。インターフェロンβの適切な投薬量は、約１〜約２００μｇ／日、好ましくは約１０〜約１００μｇ／日の範囲であり、これを１週間に１回から１日に１回まで投与することができる。インターフェロンγを、約１〜約１０００μｇ／日、好ましくは約５０〜約２５０μｇ／日の投薬量で投与することができる。セルロプラスミンを、約１〜約１００ｍｇ／日、好ましくは約５０〜約３０ｍｇ／日の量で投与することができる。
【００６０】
上記投薬量範囲は例示のためのみであり、本発明の範囲を制限することを意図するものではないと理解すべきである。各活性化合物の治療に有効な量は、因子によって変化し得る。この因子には、当業者に明らかな使用化合物の活性、患者の体内での活性化合物の安定性、緩和すべき病態の重症度、治療を受ける患者の総重量、投与経路、身体による活性化合物の吸収、分散、および排出の容易さ、治療を受ける患者の年齢および重症度などが含まれるが、これらに限定されない。種々の因子が長期間変化するにつれて、投与量を調整することもできる。
【００６１】
有利には、活性化合物を、非経口（すなわち、静脈内または筋肉内）で患者に送達させる。非経口投与のために、活性化合物を、溶液もしくは懸濁液、または使用前に溶液または懸濁液に変換するための凍結乾燥形態に処方することができる。薬学的に許容可能な担体または希釈剤として、滅菌水、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））を都合よく使用することができる。従来の溶媒、界面活性剤、安定剤、ｐＨ平衡緩衝液、抗菌薬、および抗酸化剤（酢酸、クエン酸、もしくはリン酸緩衝液、塩化ナトリウム、デキストラン、不揮発性油、グリセリン、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、アスコルビン酸、二硫化ナトリウムなどが含まれるが、これらに限定されない）を全て非経口処方物に使用することができる。非経口投与のために、活性化合物、特に、吸収性を高め、且つ潜在的な毒性を減少させるためにリポソーム中に含まれたジチオカルバマートと金属とのキレートを処方することができる。非経口処方物を、任意の従来の容器（バイアル、アンプル、およびシリンジなど）で保存することができる。
【００６２】
活性化合物を、密封したゼラチンカプセルまたは圧縮された錠剤において経口送達させることもできる。カプセルおよび錠剤を、任意の従来の技術で調製することができる。例えば、活性化合物を、賦形剤（例えば、デンプン、ラクトース）、結合剤（例えば、ゼラチン、セルロース、ガム）、崩壊剤（例えば、アルギン酸塩、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、およびコーンスターチ）、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、二酸化珪素）、および甘味料または香料（例えば、グルコース、スクロース、サッカリン、サリチル酸メチル、およびペパーミント）などの薬学的に許容可能な担体を含む処方物に組み込むことができる。カプセルおよび錠剤の香り、味、色、および形状を改変するために、カプセルおよび錠剤に種々のコーティングを調製することもできる。さらに、カプセルに脂肪油などの液体担体を含めることもできる。ジチオカルバマートチオラートアニオンおよびジチオカルバマート−金属錯体の投与には、胃の酸性環境におけるジチオカルバマート由来の二硫化炭素の放出を防止し、且つジチオカルバマート−金属キレートの完全性を保存するために胃酸に対して非透過性であるが小腸のアルカリ性環境で溶解する腸溶性カプセルとして化合物を投与することが望ましい。
【００６３】
本発明で使用された活性化合物を含むチューイングガム、懸濁液、シロップ、ウェハース、エリキシルなどの他の経口処方物形態を調製することもできる。香味、味、色、および特殊な形態の形状の種々の改変剤も含むことができる。さらに、嚥下が不可能な患者における経腸栄養チューブによる都合のよい投与のために、活性化合物を、オリーブ油、トウモロコシ油、およびベニバナ油などの許容可能な親油性の植物油に溶解することができる。
【００６４】
活性化合物を、直腸、膣、鼻、または粘膜への適用を介して局所投与することもできる。局所用処方物は、一般に当分野で既知であり、クリーム、ゲル、軟膏、ローション、粉末、ペースト、懸濁液、スプレー、およびエアロゾルが含まれる。典型的には、局所用処方物には、一つまたは複数の増粘剤、湿潤剤、および／または軟化剤（キサンタンガム、ワセリン、蜜蝋、またはポリエチレングリコール、ソルビトール、鉱物油、ラノリン、スクラレンなどが含まれるが、これらに限定されない）が含まれる。局所投与の特殊な形態を、経皮パッチによって送達させる。経皮パッチの調製方法は、例えば、Ｂｒｏｗｎら、Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、３９、２２１〜２２９、１９８８（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）で開示されている。
【００６５】
活性化合物を、徐放のための皮下移植によって送達させることもできる。これを、無菌技術を使用して前腹壁の皮下空間に任意の適切な処方物を手術によって移植して達成することができる。例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｓｙｃｈ．，４５、２４２〜２４７、１９８４を参照のこと。ヒドロゲルなどの特殊なキャリアへの有効成分の組み込みによって徐放を達成することができる。典型的には、ヒドロゲルは、水中で膨潤してゲル様物質を形成することができる高分子量生体適合性ポリマーの網状組織である。ヒドロゲルは、一般に、当分野で既知である。例えば、ポリエチレングリコールまたはコラーゲン、ポリ（グリコール酸−Ｌ−乳酸）共重合体で作製したヒドロゲルは、本発明に適切である。例えば、Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．，７３、１７１８〜１７２０、１９８４を参照のこと。
【００６６】
活性化合物を、水溶性の非免疫原性高分子量ポリマーと結合（すなわち、共有結合）させて、ポリマー結合物を形成することもできる。有利には、このようなポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）は、活性化合物に、溶解性および安定性を付与し、免疫原性を減少させることができる。結果として、結合物中の活性化合物は、患者に投与した場合、体内でより長い半減期を有し、より良好な効率を示す。現在、タンパク質置換療法および他の治療用途にＰＥＧ化タンパク質が使用されている。例えば、ＰＥＧ化アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＧＥＮ（登録商標））を使用して、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤＳ）を治療する。ＰＥＧ化Ｌ−アスパラギナーゼ（ＯＮＣＡＰＳＰＡＲ（登録商標））を使用して、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）を治療する。
【００６７】
あるいは、マイクロカプセルおよびナノカプセルを含む徐放または保護の他の形態が当分野で既知であり、上記のヒドロゲルは、活性化合物の経口、非経口、局所、および皮下投与の全てに使用することができる。
【００６８】
上記考察のように、別の好ましい送達形態は、担体としてリポソームを使用する。リポソームは、コレステロール、リン脂質、脂肪酸、およびこれらの誘導体などの種々の脂質から形成されたミセルである。活性化合物を、このようなミセル内に封入することができる。そのなかに有効成分を含むリポソーム懸濁液の調製方法は、一般に、当分野で既知であり、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号（引用することにより本明細書の一部をなすものとする）で開示されている。リポソームの形態で送達されるいくつかの抗癌薬が当分野で既知であり、Ｌｉｐｓｏｍｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪから市販されている。リポソーム送達により活性化合物の毒性を減少させてその安定性を向上させることができることが示されている。
【００６９】
活性化合物を、治療を受ける患者の別の疾患または症状を治療または予防するための他の活性因子と組み合わせて投与することもできる。しかし、このような他の活性因子は、治療する癌に対する本発明の活性化合物を妨害することも悪い影響を与えることもあるべきではないと理解すべきである。このような他の活性因子には、抗ウイルス薬、抗生物質、抗真菌薬、抗炎症薬、抗凝固薬、心筋薬、コレステロール低下薬、高血圧薬などが含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
任意の形態の癌の治療のためにジチオカルバマートジスルフィドまたはチオラートアニオン療法がなされた個体は、血流中のアセトアルデヒドの蓄積による悪心および嘔吐の進行を回避するために、任意の形態のアルコールへの曝露に警戒しなければならないと理解すべきである。したがって、被験体は、飲料を含むアルコールの摂取を絶つだけでなく、アルコールを含む咳用シロップなどの処方箋なしの処方物の摂取も消毒用アルコールの局所的使用もすべきではない。
【００７１】
［実験手順］
＜材料＞
ヒト悪性細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。ＲＰＭＩ培地１６４０、ＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、抗菌抗真菌薬（１０，０００Ｕのペニシリン、１０，０００μｇのストレプトマイシン、および２５μｇのアンホテリシンＢ／ｍｌ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、およびトリプシン−エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）溶液を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）のＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ部門から購入した。ヒトＢｃｌ−２、ｐ５３、ｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１、サイクリンＡおよびＢ１、ＣＲＥＢ１、ＡＴＦ１、ＡＴＦ２、ｃ−Ｊｕｎ、およびＪｕｎＢに対するウサギポリクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から得たものであった。ｃ−ＦｏｓおよびＡ４３１細胞溶解標準に対するウサギポリクローナル抗体は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から得たものであった。ペルオキシダーゼ標識ロバポリクローナル抗ウサギＩｇＧは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）から得たものであり、ペルオキシダーゼ標識抗ヤギＩｇＧは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から得たものであった。ＤＮＡプローブを含む電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を、ＰｒｏＭｅｇａ社（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。プロテアーゼインヒビターは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から得たものであった。２’，７’−ジクロロフルオレセインの二酢酸塩（ＤＣＦ−ＤＡ）を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）から購入した。特記しない限り、ピロリジンジチオカルバマート（ＰＤＴＣ）、ジエチルジチオカルバマート、テトラエチルチウラムジスルフィド（ジスルフィラム）、バトクプロインジスルホン酸（ＢＣＰＳ）、金属塩、非酵素細胞溶解溶液（Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標））、Ｎω−ニトロ−Ｌ−アルギニン、インドメタシン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および他の全ての材料を、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
【００７２】
＜悪性細胞株の培＞
ヒト悪性細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。黒色腫細胞株ＣＲＬ１５８５および１６１９を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で培養し、非酵素細胞溶解溶液（Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（登録商標）：（Ｓｉｇｍａ社製）に通過させた。前立腺癌細胞株ＣＲＬ１４３５（ＰＣ−３）もまた、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０中で培養したが、０．０５％のトリプシンおよび０．５３ｍＭのＥＤＴＡに通過させた。扁平上皮肺癌ＮＣＩ−Ｈ５２０および腺扁平上皮肺癌ＮＣＩ−Ｈ５９６細胞株を、１０％のＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、および１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウムを含むＲＰＭＩ  １６４０中で培養し、トリプシン／ＥＤＴＡに通過させた。小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ８２を、懸濁液として１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０中で培養した。上記全てを、５％のＣＯ２／大気を含む３７℃の湿った環境で成長させた。乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３を、自由に大気とガス交換される３７℃の湿った環境にて２ｍＭのＬ−グルタミンおよび１０％のＦＢＳを含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚのＬ−１５培地中で、成長させ、トリプシン／ＥＤＴＡに通過させた。
【００７３】
＜細胞培養処理＞
ジチオカルバマートのジスルフィドが抗酸化剤として作用する遊離チオールを含まないので、ほとんどの実験をテトラエチルチウラムジスルフィドであるジスルフィラムを使用して行った。細胞増殖に重要な選択遺伝子の活性化に対するジスルフィラムの効果を研究するために、悪性黒色腫細胞を、１００×１５ｍｍのプラスチック製のぺトリ皿にコンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）まで成長させ、５μＭのジスルフィラムまたは５μＭのジスルフィラム＋１．６μＭのＣｕＳＯ４で処理した。この薬剤での慢性治療におけるヒト被験体の定常血漿および組織濃度に近づけるためにこの用量を選択した。ジスルフィラムをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解して、ＤＭＳＯの最終濃度を０．３〜０．５％未満とする。同体積のＤＭＳＯをコントロール実験物に添加した。以下に概説のように、核タンパク質を採取し、環状ＡＭＰ応答エレメントのＤＮＡコンセンサス結合配列を使用して、電気泳動移動度ゲルシフトアッセイを行った。ジスルフィラムおよび金属が転写因子の結合に直接影響を与えているかどうかを同定するために、いくつかの実験では、５μＭのジスルフィラムおよび／または１．６μＭのＣｕＳＯ４（最終濃度）を、薬物または金属の非存在下で、１０％のＦＢＳで刺激したコントロール細胞から得た核タンパク質の結合反応物に添加した。結合緩衝液の還元剤として２．５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）または３．０ｍＭのＧＳＨのいずれかを使用して、結合反応物へのジスルフィラムおよびＣｕＳＯ４のインビトロ添加を行った。
【００７４】
悪性細胞株に対するジスルフィラム（０．１５〜５．０μＭ）、ジエチルジチオカルバマート（ＤＤＣ、１．０μＭ）、またはＰＤＴＣ（０．６２５〜５．０μＭ）の効果を、１０％のＦＢＳで刺激した培養物で研究した。２４〜７２時間後に細胞を計数した。いくつかの実験では、ジスルフィラムまたはＰＤＴＣを細胞のプレーティング直後に添加した。他の実験では、細胞をプレーティングし、２４〜７２時間成長させた後、ジスルフィラムまたはＰＤＴＣを含む新鮮な培地を添加し、２４〜７２時間後に細胞数をアッセイした。培地に添加したジスルフィラムとＮ，Ｎ’−ビス（２−クロロエチル−Ｎ−ニトロソウレア）（カルムスチンまたはＢＣＮＵ、１．０〜１０００μＭ）またはシスプラチン（０．１〜１００μｇ／ｍｌ）との間の相乗効果を研究した。ジスルフィラムに対する金属の効果を、培養培地に添加した０．２〜１０μＭの銅イオン（ＣｕＳＯ４として提供）、亜鉛イオン（ＺｎＣｌ２として）、銀イオン（乳酸銀として）、または金イオン（ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏとして）を用いて研究した。培養培地への金属塩の添加によってｐＨは変化しなかった。生物学的に関連する銅の供給源を得るために、いくつかの実験では、培地に低濃度および高濃度の正常な成人血清濃度（２５０および５００μｇ／ｍｌ）のヒトセルロプラスミンを補足した。
【００７５】
ジスルフィラムの潜在的な酸化還元効果を、３組の実験で研究した。チオカルバマートの毒性の媒介または調整における細胞グルタチオン（ＧＳＨ）の重要性を、ジスルフィラム処理後の細胞内ＧＳＨレベルの測定によって研究した。以下に概説のように、１．６μＭのＣｕＳＯ４を含むか、または含まないジスルフィラム（５μＭ）を１００×１５ｍｍのプラスチック製皿上でコンフルエンスまで成長させた細胞に添加し、ＧＳＨの測定のために、２４時間後に細胞を採取した。また、ジスルフィラムまたはＰＤＴＣの非特異性抗酸化効果が細胞成長阻害を説明できるかどうかを評価するために、悪性細胞株の増殖に対する強力な親油性抗酸化プロブコール（１．０〜１０００μＭ）の効果を研究した。最後に、ジスルフィラム（０．６２５〜５μＭ）、銅（０．２〜１．６μＭＣｕＳＯ４）、または１．２５μＭのジスルフィラム＋種々の濃度の銅に対する細胞内酸化剤の生成を、直接測定した。
【００７６】
腫瘍細胞成長に対するシクロオキシゲナーゼ阻害の役割を調査するために、シクロオキシゲナーゼ１（ＣＯＸ１）およびシクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）インヒビターであるインドメタシン（５μｇ／ｍｌ）またはサリチル酸ナトリウム（１ｍＭ）の存在下または非存在下でジスルフィラムを用いるか、または用いないで細胞を培養した。ジスルフィラムがＮＯ生成の妨害または刺激によって成長の遅延を誘導しているかどうかを探索するために、成長培地に添加した一酸化窒素シンターゼインヒビターＮω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（１００μＭ）の存在下または非存在下でジスルフィラムを使用するかまたは使用しないで増殖を調べた。
【００７７】
最後に、細胞に対する多数のジチオカルバマートの効果は、銅イオンの細胞内レベルの増加にあった。ジスルフィラム由来の細胞傷害性の媒介における銅の役割をさらに探索するために、細胞外成分中のＣｕ２＋を隔離するために培地に添加した非透過性Ｃｕ２＋キレート剤であるバソクプリオインジスルホン酸（ＢＣＰＳ、１００μＭ）を添加するか添加しないで細胞を培養した。細胞を、種々の濃度のジスルフィラム（０．６２５〜５．０μＭ）で１２時間処理し、以下に概説のように細胞内銅レベルを測定した。
【００７８】
＜電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）＞
核タンパク質を単離し、以前に詳細に記載のようにＤＮＡ結合反応を行った（例えば、Ｒ．Ｄａｓｈｔａｋｉら、「ジヒドロエピアンドロステロンおよびアナログはＡＰ−１のＤＮＡ結合および気道平滑筋の増殖を阻害する」、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．，２８５、８７６〜２１９、１９９８；Ｔ．Ｋｅｎｎｅｄｙら、「特定の大気汚染による銅依存性炎症および核因子κＢ活性化」、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９、３６６〜３７８、１９９８を参照のこと）。単層を冷ＤＰＢＳで２回洗浄し、氷上でプロテアーゼインヒビターＰＩ（１ｍＭ  Ｐｅｆａｂｌｏｃ、５０μｇ／ｍｌアンチパイン、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチン、４０μｇ／ｍｌベスタチン、３μｇ／ｍｌ  Ｅ−６４、および１００μｇ／ｍｌキモスタチン）を含む０．７ｍｌの冷原形質抽出緩衝液ＣＥＢ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．９）、６０ｍＭＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ）で１０分間平衡化した。界面活性剤Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０（ＮＰ−４０）を最終濃度０．１％まで添加し、細胞スクレイパーで取り出した。核を遠心分離によってペレット化し、ＣＥＢ／ＰＩで洗浄した。次いで、核を氷上のＰＩを含む核抽出緩衝液ＮＥＢ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、４００ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１．５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、および２５％のグリセロール）中で２０分間インキュベートし、短時間スピンして破片を除去し、電気泳動移動度シフトアッセイを行うまで、−８０℃で保存した。
【００７９】
［γ３２Ｐ］−ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでのリン酸化によって末端標識された環状ＡＭＰ応答エレメントＣＲＥ（ＰｒｏＭｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）についてコンセンサスオリゴヌクレオチド（５’−ＡＧＡＧＡＴＴＧＣＣＴＧＡＣＧＴＣＡＧＡＧＡＧＣＴＡＧ−３’および３’−ＴＣＴＣＴＡＡＣＧＧＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＣＴＣＧＡＴＣ−５’）を使用してＥＭＳＡを行った。２μｇの核タンパク質（Ｐｉｅｒｃｅ法によって同定）および３０〜８０，０００ｃｐｍの３２Ｐ末端標識二本鎖ＤＮＡプローブの１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）溶液、５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、０．５ｍＭのＤＴＴ（表示した場合以外）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、５０μｇ／ｍｌポリｄＩ−ｄＣ、および４％のグリセロールを使用して、ＤＮＡとタンパク質との結合反応を行った。標識プローブ以外の全ての結合反応成分を合わせ、標識プローブの添加前に室温で１０分間インキュベートし、その後さらに２０分間インキュベートした。
【００８０】
標識プローブ前に添加したＣＲＥまたはＮＦ−κＢの１０×非標識野生型オリゴヌクレオチド配列（ｐ５０、５’−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’および３’−ＴＣＡＡＣＴＣＣＣＣＴＧＡＡＡＧＧＧＴＣＣＧ−５’）を使用して競合実験を行った。１μｇのスーパーシフト抗体（ｓｕｐｅｒｓｈｉｆｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ）との結合反応物のインキュベーション後に電気泳動することによってスーパーシフト実験を行った。Ｔｒｉｓ−グリシン−ＥＤＴＡ（ＴＧＥ、１２０ｍＭのグリシンおよび１ｍＭのＥＤＴＡの２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．５）溶液）緩衝液中での５％の未変性ポリアクリルアミドゲルでサンプルを電気泳動した。ゲルを乾燥させ、画像増強スクリーンを使用した−８０℃でのオートラジオグラフィーによって分析した。Ｋｏｄａｋ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ１次元画像分析ソフトウェア（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ社製、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用して、バンドのデンシメトリーを行った。
【００８１】
＜細胞培養物増殖の測定＞
培養細胞の増殖を、以前に報告されたミトコンドリアのスクシニルデヒドロゲナーゼの作用による可溶性黄色テトラゾリウム色素３−［４，５−ジメチルチアゾール］−２−イル−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）のその不溶性紫色ホルマザンへの代謝還元に基づく比色法を使用して定量した（例えば、Ｓ．Ｊ．Ｈｉｒｓｔら、「血清および血小板由来成長因子に応答する培養ヒトおよびウサギ気道平滑筋の増殖の定量」、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，７、５７４〜５８１、１９９２；前出のＲ．Ｄａｓｈｔａｋｉら、Ｒ．；Ｓ．Ｓ．Ｂｒａｒら、「血清誘導性および血小板由来の成長因子誘導性気道平滑筋成長における反応性酸素種の必要性」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４、２００１７〜２００２６、１９９９を参照のこと）。このアッセイは、細胞の死滅および生存とを経験的に区別する。増殖研究のために、細胞を、２４ウェルの非コートプラスチックプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に５０，０００細胞／ウェルで播種し、各培地およびマイトジェンと培養した。２４〜９６時間後、培地を除去し、細胞をＣａ２＋およびＭｇ２＋（ＤＰＢＳ）を含まない１ｍｌの滅菌ダルベッコ改変リン酸緩衝化生理食塩水で２回洗浄し、培地を、１００μｇ／ｍｌのＭＴＴを含む１ｍｌ／ウェルの新鮮な培地と交換し、プレートをさらに１時間インキュベートした。ＭＴＴ含有培地を除去し、各ウェルに０．５ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加し、溶解した紫色のホルマザン色素の吸光度を５４０ｎｍで測定した。各処理条件で合計４〜６ウェルを研究した。１５分〜３時間インキュベートした５０〜２００μｇ／ｍｌのＭＴＴを使用して予備研究を行って、変換速度が直線であり、且つ細胞の存在数と比例する至適濃度およびインキュベーション時間を決定した。ＭＴＴホルマザン還元生成物の吸光度（Ａ５４０）は、Ｒ２＝０．９９の血球計によって計数した細胞数と相関していた。いくつかの実験では、ＭＴＴアッセイならびにＦＢＳおよびインヒビターに対する応答もまた、０．０１ｃｍ２の接眼レンズグリッドを使用した４０倍で観察したギムザ改変ライト染色単層のウェルあたり１０箇所の視野の細胞の計数によって確認した。
【００８２】
＜細胞傷害性およびアポトーシスの測定＞
細胞傷害性を評価するために、細胞を、２４ウェルプレートに５０，０００／ウェルでプレーティングし、２４時間成長させた。次いで、ジスルフィラムを添加した。さらに３６時間後、培地を除去し、０．１％のトリパンブルーを含むＤＰＢＳと交換した。細胞死を、４つの異なるウェルについて、５つの１０倍の無作為な視野における平均トリパンブルー陽性細胞の計数によって評価した。
【００８３】
ジスルフィラム誘導性アポトーシスを同定する為に、３５ｍｍぺトリ皿またはガラススライドでコンフルエンスまで成長した細胞を、ジスルフィラムまたは賦形剤としてＤＭＳＯで処理した。フルオレセイン−ＦｒａＥＬ（登録商標）ＤＮＡ断片化検出キット（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用したＤＮＡフラグメントの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）依存性３’−ＯＨフルオレセイン末端標識によってアポトーシスを研究した。アポトーシスを、臭化エチジウム染色アガロースゲルに対するエンドヌクレアーゼ依存性ＤＮＡ断片化の視覚的評価によっても研究した。
【００８４】
＜ＤＮＡ細胞周期の測定＞
ＤＮＡ細胞周期に対するジスルフィラムの効果を研究するために、細胞を２５ｃｍ２のプラスチックフラスコ中でコンフルエンスまで成長させ、１０％のＦＢＳ＋ＤＭＳＯ賦形剤、ＦＢＳおよびＤＭＳＯ賦形剤＋銅供給源としての２５０μｇ／ｍｌのセルロプラスミン、ＦＢＳ＋５μＭのジスルフィラムまたはＦＢＳ＋５μＭのジスルフィラムおよび２５０μｇ／ｍｌのセルロプラスミンで処理した。細胞のトリプシン処理から２４時間後、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１％のＢＳＡを含む冷ＤＰＢＳで２回洗浄し、氷冷７０％エタノールで３０分間固定し、ヨウ化プロピジウムのＤＰＢＳおよび１ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡの１０μｇ／ｍｌの溶液中での３７℃で３０分間のインキュベーションによって染色した。ＦＡＣＳｔａｒＰＬＵＳＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ社製、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を使用して、ＤＮＡ細胞周期測定を行った。
【００８５】
＜タンパク質の免疫アッセイ＞
細胞を溶解し、タンパク質を単離し、先に詳述のように、ヒトｂｃｌ−２、ｐ５３、ｐ２１ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１、サイクリンＡおよびサイクリンＢ１に対する２μｇ／ｍｌのウサギポリクローナル一次抗体ならびにペルオキシダーゼ標識ロバポリクローナル抗ウサギＩｇＧを使用した免疫アッセイによって定量した。細胞を、氷上に置き、冷ＤＰＢＳで２回洗浄し、０．５ｍｌのボイル緩衝液（１０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］グリセロールおよび２％［ｗｔ／ｖｏｌ］のドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］の８３ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）溶液）に掻き取り、４回のピペッティングによって取り出した。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用したタンパク質の同定のために、アリコートを取り出した。１０％のβ−メルカプトエタノールおよび０．０５％のブロモフェノールブルーを添加後、溶解物を５分間ボイルし、免疫ブロッティングを行うまで−８０℃で保存した。解凍したサンプル中のタンパク質を、１２％のポリアクリルアミドゲルで（１５μｇタンパク質／レーン）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、移行緩衝液（０．０２５ＭのＴｒｉｓ、０．１９２Ｍのグリシン、２．６ｍＭのＳＤＳ、および２０％［ｖｏｌ／ｖｏｌ］のメタノール（ｐＨ８．０））中での１００ボルトで１時間の湿式トランスブロット法を使用して０．４５μｍのＨｙｂｏｎｄ  ＥＣＬニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に電気的に移行させた。ブロットを、５％の脱脂粉乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ社製、Ｇｌｅｎｄａｌｅ、ＣＡ）を含むブロッキング緩衝液（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）を使用して４℃で一晩ブロックした。それぞれ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中で５分間５回リンスした後、ブロットを、２．０μｇ／ｍｌの一次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。上位のように再度リンス後、ブロットをブロッキング緩衝液で５０００倍に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二時抗体と共に室温で１時間インキュベートした。免疫ブロットを上記のように再度リンスし、増強化学発光法（ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、Ｅｎｇｌａｎｄ）によって検出した。オートラジオグラフィーフィルム（Ｘ−ＯＭＡＴＡＲ、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ社製、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を１０、３０、または６０秒間免疫ブロットに曝露して、満足な画像を得た。
【００８６】
＜細胞内の銅の測定＞
上記概説のように、細胞を、５０，０００細胞／ウェルの初期プレーティング密度の１２ウェルプラスチック組織培養プレート中で培養し、コンフルエンスまで成長させ、ジスルフィラムまたは賦形剤ＤＭＳＯで処理した。培地を除去し、細胞をＤＰＢＳで２回洗浄した。次いで、細胞を１．０ｍｌの３ＮのＨＣｌ／１０．０％のトリクロロ酢酸に掻き取り、７０℃で１６時間加水分解した。加水分解物を、６００ｇｍで１０分間遠心分離して破片を除去し、３２５．７５４および２２４．７００ｎｍの波長での高周波誘導結合プラズマ発光分光学（モデルＰ３０、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）を使用して上清中の銅を測定した。金属夾雑物を最小にするために、この実験ではガラス製品よりもプラスチック製品を使用し、全ての水性溶媒に２回蒸留脱イオン水を使用した。１ｍｌの加水分解物あたりの銅のｎｇとして結果を報告する。
【００８７】
＜反応性酸素種の細胞内生成の測定＞
ＣｕＳＯ４を含む、または含まないジスルフィラムに応答する反応性酸素種の生成を、２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセテート（ＤＣＦ−ＤＡ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）および以前に報告された方法（Ｊ．Ａ．Ｒｏｙａｌｌら、「培養内皮細胞中の細胞内Ｈ２Ｏ２の蛍光プローブとしての２’，７’−ジクロロフルオレセインおよびジヒドロローダミン１２３の評価」、Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３０２、３４８−３５５、１９９３、を参照のこと）の修正形態を使用して研究した。この方法は、細胞ペルオキシダーゼの存在下でのＨ２Ｏ２によるジクロロフルオレセインの２’，７’−ジクロロフルオレセインへの酸化に基づく。細胞を、２４ウェルのプラスチックプレートに５０，０００細胞／ウェルでプレートし、コンフルエンスまで成長させた。培地をウェルから吸引し、１０μＭのＤＣＦ−ＤＡを含む１００μｌの培地と交換し、プレートを３７℃で３０分間インキュベートしたＳ。ＤＣＦ−ＤＡ含有培地を吸引し、細胞を培地のみで２回洗浄し、１００μｌの新鮮な培地をウェルに添加した。蛍光マイクロプレートリーダー（ＨＴＳ７０００）上のプレートを使用して、細胞を５倍濃度のジスルフィラムおよび／またはＣｕＳＯ４を含む２５μｌの培地で刺激して、それぞれ最終濃度０〜５．０μＭのジスルフィラムおよび／または０〜１．６μＭのＣｕＳＯ４を得た。ジクロロフルオロセインの相対濃度を、４８５ｎｍの励起波長および５３５ｎｍの発光波長を使用した３７℃での蛍光のモニタリングによって直ちに測定した。
【００８８】
＜細胞内のグルタチオンの測定＞
１．６μＭのＣｕＳＯ４を含む、または含まないジスルフィラム（５μＭ）を、１００×１５ｍｍのプラスチック皿でコンフルエンスまで成長させた細胞に添加し、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）−グルタチオンリダクターゼリサイクリングアッセイを使用したＧＳＨの測定のために２４時間後に細胞を採取した（Ｍ．Ｅ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、「生体サンプル中のグルタチオンおよびグルタチオンジスルフィドの同定」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１１３、５４８〜５５５、１９８５を参照のこと）。
【００８９】
＜ジスルフィラムと金属キレートとの合成＞
ジスルフィラムと多数の金属とのキレートを、１５０ｍｇのジスルフィラムのクロロホルム溶液（７．５ｍｇ／ｍｌ）と３０ｍｌの５倍モル過剰のＣｕＳＯ４、ＺｎＣｌ２、Ｃ３Ｈ５ＡｇＯ３（乳酸銀）、またはＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏの２回ガラス蒸留脱イオン水との激しい混合によって合成した。混合物を、１，０００ｇｍで１０分間遠心分離し、上層の水相をデキャントした。下層のクロロホルム相を蒸発させ、ジスルフィラムと金属とのキレート沈殿物を得た。
【００９０】
別の合成では、１５０ｍｇのジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムを、１０ｍｌの脱イオン水に溶解した。これに、２５０ｍｇのＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏを添加する。得られた沈殿を遠心分離によって回収し、クロロホルム中に再溶解した。クロロホルム相を蒸発させ、得られたジチオカルバマートと金とのキレートを結晶として沈殿させた。
【００９１】
これらを分析して、その分子量、融点、溶解度、元素組成、および結晶構造を同定した。
【００９２】
＜統計分析＞
データを、平均値±標準誤差として示す。全ての測定の複製の最小数は、示さない限り４である。複数の群の相違を、一元配置分散分析を使用して比較した。使用した事後的検定は、ニューマンクールス多重比較検定であった。有意性の両側検定を使用した。有意性を、ｐ＜０．０５と想定した。
【００９３】
［実施例１］
本実施例は、ジチオカルバマートジスルフィドが環状ＡＭＰ応答エレメントへのＤＮＡ結合を阻害することを示す。
【００９４】
Ｍ１６１９黒色腫細胞を、１００×１５ｍｍのプラスチックぺトリ皿上で６０％コンフルエンスまで成長させ、核タンパク質を採取し、電気泳動移動度ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して行った。結果を、図１Ａ〜１Ｃに示す。５μＭジスルフィラムと１．６μＭの硫酸銅との組み合わせでの６、１２、または２４時間の細胞の処理により、ＣＲＥへの転写因子結合を実質的に妨害する。２、６、１２、または２４時間の処理のためのＥＭＳＡ：ＦＢＳのみ、レーン１、５、９、および１３；ＦＢＳ＋ＤＭＳＯ賦形剤、レーン２、６、１０、１４；ＦＢＳ＋ジスルフィラム、レーン３、７、１１、１５；ＦＢＳ＋ジスルフィラム＋ＣｕＳＯ４、レーン４、８、１２、１６。
【００９５】
ＣＲＥ錯体（ＩおよびＩＩ）を標識する。増殖Ｍ１６１９悪性黒色腫細胞由来の核タンパク質は、環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）コンセンサス配列を用いた電気泳動移動度シフトアッセイにおいて、ＤＮＡ結合活性の二つの強い構成性バンド（ＩおよびＩＩ）を示した（図１Ａ、レーン１）。両バンドは、結合反応物へ１０倍の非標識ＣＲＥコンセンサスオリゴヌクレオチドを添加することにより消滅した（レーン８）。スーパーシフト実験により、一番上のバンドＩＩがＣＲＥ結合タンパク質活性化転写因子２（ＡＴＦ−２、レーン５）を含む一方で、下の錯体Ｉは少量の成分としてＡＴＦ−１（レーン４）を含むＣＲＥＢ−１（レーン２）を含むことが証明された。レーン６〜レーン８に示す競合実験により、ＤＮＡ結合反応の特異性が証明される。レーン６はＦＢＳ（ウシ胎児血清）のみ、レーン７は結合反応物に添加した１０倍非標識ＣＲＥプローブを含むＦＢＳ、レーン８は結合反応物に添加した１０倍非標識ＮＦ−κＢプローブを含むＦＢＳである。
【００９６】
図１Ｂに示すように、ジスルフィラムのみでＣＲＥへのＤＮＡ結合をわずかに減少させるが、遷移金属である銅を使用した細胞処理と組み合わせた場合、ジスルフィラムは６時間の処理後のＣＲＥへの転写因子の結合を消滅させた。
【００９７】
錯体を含む上流のＡＴＦ−２は、より高い阻害に対する感受性を示した。これを図１Ｃで証明し、これは上流の錯体ＩＩ実験物を含むＡＴＦ−２に対して行ったデンシメトリーの結果をバンドの平均合計強度として示している。ほぼコンフルエントな細胞をＤＭＳＯ賦形剤、ジスルフィラム、銅、またはジスルフィラム＋銅の組み合わせで８時間処理した複製実験物（ｎ＝４）におけるＥＭＳＡ。ジスルフィラム＋銅の組み合わせにより、上流の錯体ＩＩのＤＮＡ結合が半分に減少し、これにより、ＡＴＦ−２がチウラムジスルフィドといくつかの金属との間の相互作用によって阻害に対して非常に感受性が高くなるが示唆される。上記で使用した濃度で、ジスルフィラム＋銅はまた、１２時間の処理後にＮＦ−κＢのＤＮＡ結合を阻害し、２４時間後にＡＰ−１のＤＮＡ結合を阻害したが（データ示さず）、ＣＲＥへの結合に対しては劇的な阻害効果を示さなかった。
【００９８】
ＣＲＥへの転写因子の結合阻害が、ジスルフィラムおよび銅による直接的転写因子の改変に起因するものであるかどうかを同定するために、非処理Ｍ１６１９細胞由来の核タンパク質を使用して行った結合反応物への各薬剤の直接添加効果を研究した。結果を図２に示す。この中の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を行い、結合反応物へのジスルフィラム＋銅の添加によりＣＲＥへのＤＮＡ結合が減少することが示された。レーン１、ウシ胎児血清刺激Ｍ１６１９細胞由来の核タンパク質（ＦＢＳ）；レーン２、ＦＢＳ＋ＤＭＳＯ賦形剤；レーン３、ＦＢＳ＋ジスルフィラム（５μＭ）；レーン４、ＦＢＳ＋１．６μＭ  ＣｕＳＯ４；レーン５、ＦＢＳ＋ジスルフィラム＋ＣｕＳＯ４；レーン６、ＦＢＳのみ；レーン７、ＦＢＳ＋ジスルフィラム；レーン８、ＦＢＳ＋ＣｕＳＯ４；レーン９、ＦＢＳ＋ジスルフィラム＋ＣｕＳＯ４；レーン１０、ＦＢＳ＋ジスルフィラム＋ＣｕＳＯ４。レーン１〜５では、還元剤としてＤＴＴ（２．５ｍＭ）を結合反応物に添加し、レーン６〜９では、ＧＳＨ（３．０ｍＭ）を使用した。ジスルフィラムのみ（レーン３）またはジスルフィラムおよび銅（レーン５）により、ＣＲＥへの転写因子結合が減少するが、これらの薬剤の効果は、結合反応を還元剤としてＤＴＴ（レーン３およびレーン５）の代わりにＧＳＨと共に行った場合に（レーン７およびレーン９）さらに示された。ＧＳＨの存在下でのジスルフィラムおよび銅によるＣＲＥへの結合の阻害は、より強力な還元剤ＤＴＴの同時添加により逆になる（レーン１０）。
【００９９】
結合反応物へのジスルフィラムのみの添加により、錯体ＩＩを含む上流のＡＴＦ２においてＣＲＥへのＤＮＡ結合が減少した（図２、レーン３）。この効果は、ジスルフィラムが銅イオンと組み合わされた場合に増大する（レーン５）。これらの結果は、ＤＮＡ結合領域においてジスルフィラムとシステインとの間に混合ジスルフィドが形成されることによるＣＲＥへのＡＴＦ２結合の最も穏やかな破壊と一致し、これにより、銅が混合ジスルフィドの生成を触媒することが示唆される。しかし、ＣＲＥ結合の減少は、還元剤としてＤＴＴの代わりにＧＳＨを用いて結合反応を行った場合、よりいっそう増強される（ジスルフィラムについては図２のレーン７、ジスルフィラム＋銅についてはレーン９）。ＧＳＨの存在下でのジスルフィラムおよび銅によるＣＲＥへの錯体ＩＩを含むＡＴＦの阻害は、強力な非電荷還元剤ＤＴＴの同時添加により逆になった（図２、レーン１０）。
【０１００】
これらの結果は、ＧＳＨ（核区画内にｍＭ濃度で認められる細胞モノチオール）は、ジチオカルバマート付加物と反応して混合ジスルフィドを含む、かさ高い、負電荷のＧＳＨが得られ、ＡＴＦ２のＤＮＡ結合をより有効に破壊することができることを示す。
【０１０１】
［実施例２］
本実施例は、ジチオカルバマートおよび銅がサイクリンＡ発現を阻害することを示す。転写因子ＣＲＥＢ−１およびｃ−ＦｏｓまたはＡＴＦ２およびＪｕｎファミリーメンバーのヘテロ二量対は、サイクリンＡプロモーター中のＣＲＥエレメントへの結合によりサイクリンＡ発現をアップレギュレーションすることが知られている。
【０１０２】
ジスルフィラムおよび銅がＣＲＥへの転写因子ＤＮＡ結合を破壊するので、サイクリンＡ発現に対するその効果を研究した。図３Ａは、ジスルフィラムおよび銅は細胞周期タンパク質サイクリンＡの発現を減少させることを示す。Ｍ１６１９黒色腫細胞を、６０×１５ｍｍのプラスチック皿で、同じ密度でプレートし、８０％コンフルエンスまで成長させ、ＤＭＳＯ賦形剤（５μｌ／ｍｌ）、ジスルフィラム（ＤＳ、５μＭ）、またはジスルフィラムとＣｕＳＯ４（１．６μＭ）との組み合わせで処理した。表示の時間後、細胞を溶解し、タンパク質を抽出し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびその後にウサギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）を使用したウェスタンブロッティングに供した。ジスルフィド＋ＣｕＳＯ４での２、４、８、１２、２４、および３６時間後の処理についての典型的な実験を示す。
【０１０３】
図３Ｂは、細胞をＤＭＳＯ賦形剤（５μｌ／ｍｌ、レーン１〜４）、ジスルフィラム（５μＭ、レーン５〜８）、（５μＭ／ｍｌ）、ＣｕＳＯ４（１．６μＭ、レーン９〜１２）またはジスルフィラムとＣｕＳＯ４（レーン１３〜１６）との組み合わせで処理した実験を複製している。溶解から２４時間後、免疫ブロットを行ってサイクリンＡをアッセイした。図３Ｃでは、デンシメトリーによる図３Ｂの実験の定量を示す。バンドの平均総強度を示す。全ての他の処理と比較して＊ｐ＜０．００１。
【０１０４】
ジスルフィラムまたは銅のみでは効果はほとんどないが（図３ＢおよびＣ）、ジスルフィラム＋銅の組み合わせでの処理により長期間サイクリンＡ発現が徐々に減少し（図３Ａ）、２４時間で２／３を超えるサイクリンＡ発現が減少した（図３Ｂおよび３Ｃ）。対照的に、本発明者らが研究した細胞株ではＢ１レベルは変化せず、ジスルフィラムは、細胞周期インヒビターｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ１またはプロアポトーシスおよび抗アポトーシスタンパク質ｐ５３またはｂｃｌ−２の発現に対して一貫した効果を示さなかった（データ示さず）。
【０１０５】
［実施例３］
本実施例は、ジスルフィラムが黒色腫細胞株および他の腫瘍細胞株に対して抗増殖性を示すことを例示する。サイクリンＡ発現の破壊により、細胞周期の進行および細胞増殖を損なうはずである。したがって、通常の臨床量でのヒトが容易に達成する濃度を使用してＭ１６１９黒色腫成長に対するジスルフィラムの効果を研究した。ジスルフィラムは、Ｍ１６１９黒色腫のインビトロ成長の強力なインヒビターであった（図４Ａ）。図４Ａは、ジスルフィラムがＭ１６１９ヒト黒色腫細胞株の増殖を阻害することを示す。１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）で刺激した細胞を、５０，０００細胞／ウェルの密度プレートし、ＤＭＳＯ賦形剤（５μＭ／ｍｌ）またはジスルフィラム（ＤＳ）を、表示の濃度でウェルに添加した。２４時間後、可溶性黄色テトラゾリウム色素３−［４，５−ジメチルチアゾール］−２−イル−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の５４０ｎｍの吸光度（Ａ５４０）として測定されるその不溶性紫色ホルマザンへの細胞数依存性還元の評価によって増殖を定量した（６，７）。＊ＦＢＳ＋ＤＭＳＯ賦形剤コントロールと比較して、ｐ＜０．０１であった。
【０１０６】
ジスルフィラムはまた、Ｍ１５８５黒色腫、前立腺癌、非小細胞および小細胞肺癌、および乳癌を含む、種々の他の悪性細胞株の成長を阻害する（表１）。これは、ジスルフィラムを培地に添加することにかかわりなく、あてはまる。各値は、ＤＭＳＯ賦形剤で処理したコントロール培地と比較した平均±ＳＥ％成長阻害を示す。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で刺激した細胞を、５０，０００細胞／ウェルの密度でプレートした。いくつかの研究では（最初に処理）、ＤＭＳＯ賦形剤（５μｌ／ｍｌ）またはジスルフィラム（ＤＳ）を、表示の濃度でウェルに添加した。４８時間後、図４に記載のように増殖を定量した。
【０１０７】
他の研究では（２４時間後の処理）、細胞を、２４時間（Ｍ１６１９、Ｍ１５８５、およびＨ５９６肺癌）または４８時間（乳癌）成長させた。ＤＭＳＯ賦形剤（５μｌ／ｍｌ）またはジスルフィラム（ＤＳ）を、表示の濃度でウェルに添加した。さらに２４時間（肺癌）または４８時間後（乳癌）、図４に記載のように増殖を定量した。％増殖阻害を、１００×（１．０−ジスルフィラム処理細胞におけるＭＴＴホルマザンのＡ５４０／ＤＭＳＯ賦形剤処理細胞におけるＭＴＴホルマザンの平均Ａ５４０）として計算した。いくつかの株では、最も穏やか（１０％未満）であるが、統計的に有意な阻害効果が、ＤＭＳＯ賦形剤のみを使用して認められた。各値は、少なくとも４つの実験の平均を示す。ＡＦＢＳ＋ＤＭＳＯ賦形剤コントロールと比較して、ｐ＜０．０１であった。
【０１０８】
【表１】
2004525079.tif 000008
【０１０９】
図４Ｂでは、細胞非透過性Ｃｕ２＋キレート剤であるバソクプロインジスルホン酸がジスルフィラム由来の成長阻害を防止することを示す。Ａに記載のようにＭ１６１９黒色腫細胞を刺激およびプレートし、５０または１００μＭバソクプロインジスルホン酸（ＢＣＰＳ）の非存在下または存在下で、１．２５μＭジスルフィラム（ＤＭ）またはＤＭＳＯ賦形剤（５μ／ｍｌ）をウェルに添加した。４８時間後、記載のように増殖を定量した。＊ＦＢＳ＋ＤＭＳＯと比較して、ｐ＜０．００１；ＦＢＳ＋ＤＳと比較して、ｐ＜０．００１であった。
【０１１０】
図４Ｃは、成長培地への銅の補足によりジスルフィラムの抗増殖活性が増強されることを示す。図４Ａに記載のようにＭ１６１９黒色腫細胞を刺激およびプレーティングし、ＣｕＳＯ４またはＣｕＳＯ４＋０．６２５μＭのジスルフィラムを補足した。さらに２４時間後、増殖を定量した。培地への０．２μＭのＣｕＳＯ４の添加でさえも、０．６２５μＭジスルフィラムが、薬物の５０％阻害（ＩＣ５０）濃度（Ａ）から１００％阻害（ＩＣ１００）濃度に変換させる。＊ＣｕＳＯ４なしと比較してｐ＜０．００１であった。
【０１１１】
図４Ｄに示す結果は、セルロプラスミンがジスルフィラムの抗増殖活性を増強するための銅供給源として作用することができることを示す。Ｍ１６１９黒色腫細胞をプレートし、刺激し、正常なヒト血清レベルの上限レベル（５００μｇ／ｍｌ）を示す濃度のヒトセルロプラスミン（Ｃｅｒｕｌｏ）の存在下または非存在下での０．６２５μＭのジスルフィラムまたは５μＭのＤＭＳＯ賦形剤の存在下または非存在下で２４時間成長させた。２４時間後、増殖を定量した。＊ＦＢＳ＋ＤＭＳＯと比較して、＋ｐ＜０．００１；ＦＢＳ＋ＤＳと比較して、ｐ＜０．００１であった。
【０１１２】
ジスルフィラムは、壊死およびアポトーシスの療法を誘導した。低用量のジスルフィラムでの単層の処理でさえ、トリパンブルー色素取り込みを顕著に増加させた（非処理、ＤＭＳＯ賦形剤処理、または０．６２５μＭのジスルフィラムで処理したＨ５２０肺腺癌細胞についてそれぞれ６±２個、８±３．６個、および９４±１８個のトリパンブルー陽性細胞／ウェル；非処理、ＤＭＳＯ賦形剤処理、または０．６２５μＭのジスルフィラムで処理したＨ８２小細胞肺癌細胞についてそれぞれ１２±０．９個、１６．５±２．１個、および９３±１２個のトリパンブルー陽性細胞／ウェル；非処理またはＤＭＳＯ賦形剤処理コントロールと比較してｐ＜０．００１）。ジスルフィラムはまた、ＤＮＡフラグメントの３’−ＯＨフルオレセイン末端標識（図５Ａよび５Ｂ）および臭化エチジウム染色アガロースゲルでのＤＮＡラダー形成を増強した（データ示さず）。最近報告されたＰ糖蛋白質媒介薬物耐性に対する効果と一致して（Ｔ．Ｗ．Ｌｏｏら、「ジスルフィラム（アルコール中毒の治療に使用される薬物）によるインビトロでの薬物耐性の遮断」、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，９２、８９８〜９０２、２０００を参照のこと）、ジスルフィラムは黒色腫細胞（化学療法薬に対する腫瘍の周知の耐性）に対する他の抗新生物薬の抗増殖効果を増大させた（表２）。
【０１１３】
図５Ａでは、Ｍ１６１９黒色腫細胞をＤＭＳＯ賦形剤で処理した。図５Ｂでは、Ｍ１６１９黒色腫細胞を５μＭのジスルフィラムで処理した。ジスルフィラムは、ＤＮＡフラグメントの３’−ＯＨフルオレセイン末端標識を顕著に増大させる。細胞を、３５ｍｍのぺトリ皿またはガラスライド上でコンフルエンスまで成長させ、ジスルフィラムまたは賦形剤としてＤＭＳＯで１５時間処理した。フルオレセイン−ＦｒａＥＬ（商標）ＤＮＡ断片化検出キット（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用したＤＮＡフラグメントの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）依存性３’−ＯＨフルオレセイン末端標識によってアポトーシスを研究した。
表２は、ジスルフィラムおよびシスプラチンの組み合わせまたはジスルフィラムおよびカルムスチンの組み合わせがシスプラチンまたはカルムスチンのみよりもＭ１６１９細胞に対する高増殖性が有意に高いことを示す。
【０１１４】
【表２】
2004525079.tif 000009
【０１１５】
Ａでは、Ｍ１６１９黒色腫細胞を、２４ウェルプレート中、５０，０００細胞／ウェルの密度で１０％のＦＢＳおよびＲＰＭＩ１６４０中で培養した。４８時間後、シスプラチンおよび２．５μＭのジスルフィラムまたはＤＭＳＯ（５μｌ／ｍｌ）を培地に添加した。さらに２４時間後、増殖を定量した。各バーは、最小限の４つの実験の平均ＭＴＴホルマザンの吸光度を示す。ＡＤＭＳＯ賦形剤と比較して、ｐ＜０．０５；ＢＤＭＳＯ賦形剤と比較して、ｐ＜０．０１であった。
【０１１６】
Ｂでは、Ｍ１６１９細胞を、上記のようにカルムスチンおよび０．６μＭジスルフィラムまたはＤＭＳＯ（５μｌ／ｍｌ）を培地に添加して培養した。２４時間後、増殖を定量した。各バーは、最小限の４つの実験の平均ＭＴＴホルマザンの吸光度を示す。ＣＤＭＳＯ賦形剤と比較して、ｐ＜０．００１であった。
【０１１７】
ジスルフィラムは、そのスルフヒドリル含有関連ＰＤＴＣよりも新生物細胞株の成長インヒビターとして強力であった。例として、Ｍ１５８５に対する５０％インヒビター濃度（ＩＣ５０）は、ＰＤＴＣについては１．２５μＭで在るが、ジスルフィラムでは０．３μＭであった。これにより、チオカルバマートの活性抗増殖性の構築物は抗酸化剤として頻繁に使用されているチオールを含有する単量体の形態を減少させないようであることが示唆される。
【０１１８】
［実施例４］
ジチオカルバマートジスルフィドの抗増殖活性は、銅との錯体形成に依存する。ＰＤＴＣは、培地中のウシ胎児血清に由来する銅の錯体形成およびその後の細胞への銅輸送の促進によって媒介される正常な胸腺細胞のアポトーシスを誘導する。ジスルフィラムによるＣＲＥ  ＤＮＡ結合の阻害は、図１Ａ〜１Ｃおよび図２より、銅依存性であることが示されており、ジスルフィラムによるＭ１６１９の成長阻害を研究して、成長培地中に存在する金属と錯体を形成する能力に依存するかどうかを同定した。図４Ａは、銅と組み合わせたジスルフィラムがＭ１６１９黒色腫細胞のＳ期細胞周期停止およびアポトーシスを誘導することを示す。非同調Ｍ１６１９黒色腫細胞を、ＤＭＳＯ賦形剤（Ａ）、５μＭジスルフィラム（Ｂ）、または銅（Ｃ）供給源としての５μＭジスルフィラム＋２５０μｇ／ｍｌセルロプラスミン（Ｃｅｒｕｌｏ）の存在下で成長させた。２４時間後、細胞を採取し、フローサイトメトリー分析を行った。細胞周期中の各期における核の比率（括弧）を、ＭＯＤＦＩＴ  ＤＮＡ分析ソフトウェアを使用して同定した。ジスルフィラムは、Ｓ期の細胞の比率を増加させる。ジスルフィラムとセルロプラスミンとの組み合わせは、Ｓ期の細胞数を増加させ、Ｇ２−Ｍ細胞周期への進行を防止して、アポトーシスを誘導する。
【０１１９】
以下の表３は、ジスルフィラムは、銅の細胞内取り込みを非常に増大させことを示し、図４Ｂは、強力な細胞非透過性Ｃｕ２＋キレート剤であるバソクプロインジスルホン酸（ＢＣＰＳ）がジスルフィラム由来の成長阻害を顕著に減少させることを示す。逆に、ジスルフィラムの抗増殖活性は、それ自体が細胞成長に影響を与えない濃度の銅の培地への補足によって非常に増強される（図４Ｃ）。銅輸送タンパク質セルロプラスミンは、ヒト血清中に通常存在するレベルで、錯体形成してジスルフィラムの抗増殖活性を増強することができる銅の供給源として作用することもできる（図４Ｄ）。
【０１２０】
Ｍ１６１９黒色腫培養物のジスルフィラム処理（図４Ｂ）は、Ｇ０〜Ｇ１期の細胞数をわずかに減少させ、細胞周期のＳ期の一部を増加させる。ジスルフィラムでの処理へのセルロプラスミン由来の銅の添加により、これらの効果が非常に増大する。フローサイトメトリー細胞周期分析によって同定したところ、２／３を超える細胞がＳ期に存在し、Ｇ２−Ｍ期には存在せず、６％がアポトーシスを起こしている（図４Ｃ）。これらの研究により、ジチオカルバマートおよびそのジスルフィドによる悪性細胞株の成長阻害は、一定の金属イオンとの相互作用だけでなく、これらの金属イオンとの錯体形成に依存し、その細胞内輸送を増強することが示唆される。
【０１２１】
【表３】
2004525079.tif 000010
【０１２２】
Ｍ１６１９黒色腫細胞を、１０％のＦＢＳの存在下で２４ウェルプレートに５０，０００細胞／ウェルで培養し、コンフルエンスまで成長させた。ジスルフィラムまたはＤＭＳＯ賦形剤（５μｌ／ｍｌ）を表示の濃度で添加し、細胞をさらに６時間インキュベートした。細胞から上清を除去し、単層をＤＰＢＳで２回洗浄した。細胞を、１．０ｍｌの３ＮのＨＣｌ／１０％のトリクロロ酢酸に掻き出し、７０℃で１６時間加水分解した。６００ｇで１０分間遠心分離した後、３２４．７５４および２２４．７００ｎｍの波長での高周波誘導結合プラズマ発光分光学を使用して銅を測定した。４つの複製について報告する。金属夾雑物を最小にするために、この実験ではガラス製品よりもプラスチック製品を使用し、全ての水性溶媒に２回蒸留脱イオン水を使用した。ＡＤＭＳＯコントロールと比較してｐ＜０．０１；ＢＤＭＳＯコントロールと比較してｐ＜０．００１であった。
【０１２３】
［実施例５］
本実施例は、ジチオカルバマートジスルフィドにより酸化還元機構による増殖を増加させないことを示す。
【０１２４】
ジスルフィラムは、Ｍ１６１９細胞中のＧＳＨを枯渇させることができず（ＦＢＳのみについては２２８±１８；ＤＭＳＯ賦形剤コントロールについては２５４±７；５μＭジスルフィラムについては２７３±１１ｎｍｏｌのＧＳＨ／μｇ細胞タンパク質）、５．０μＭジスルフィラムと１．６μＭ  ＣｕＳＯ４との組み合わせは、細胞内ＧＳＨを増加させた（２９３±１６ｎｍｏｌ  ＧＳＨ／μｇ細胞タンパク質；ＦＢＳのみと比較してｐ＜０．０５）。同様に、Ｈ２Ｏ２感受性細胞内プローブ２’，７’−ジクロロフルオレセインを使用して測定したところ、ジスルフィラム（０．６２５〜５μＭ）、ＣｕＳＯ４（０．２〜１．６μＭ）、１．２５μＭジスルフィラムと０．２〜１．６μＭのＣｕＳＯ４との組み合わせのいずれによっても、Ｍ１６１９細胞中の反応性酸素種の生成を測定することができない。Ｊ．Ａ．Ｒｏｙａｌｌら、「培養内皮細胞中の細胞内Ｈ２Ｏ２のための蛍光プローブとしてとしての２’，７’−ジクロロフルオレセインおよびジヒドロローダミン１２３の評価」、Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，３０２、３４８〜３５５、１９９３を参照のこと。ベースラインの蛍光である１，４３１±２３単位は、いかなる処理によっても増加しなかった。
【０１２５】
さらに、強力な抗酸化剤プロブコールは、いかなる本発明者らの腫瘍細胞株の成長を有意に阻害しなかった（データを示さず）。細胞内の銅の増大により、Ｓ−ニトロソグルタチオンおよび他のニトロソチオールのＣｕ２＋媒介性分解により、反応性窒素種である一酸化窒素（ＮＯ）のレベルも増加する（Ｄ．Ｒ．Ａｒｎｅｌｌｅら、「Ｓ−ニトロソチオールのジエチルジチオカルバマート誘導性分解」、Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ：Ｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｃｈｅｍ．，１、５６〜６４、１９９７；Ｍ．Ｐ．Ｇｏｒｄｇｅら、「Ｓ−ニトロソチオールの生物活性の銅キレート化誘導性減少」、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１１４、１０８３〜１０８９、１９９５；Ａ．Ｃ．Ｆ．Ｇｏｒｒｅｎら、「銅イオンおよびグルタチオンの存在下でのＳ−ニトロソグルタチオンの分解」、Ａｒｃｈｉｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ、３３０、２１９〜２２３８、１９９６を参照のこと）。同様に、ＮＯは、ミトコンドリアの透過性の移行を誘導して他の効果が得られ、アポトーシスを誘導すると考えられている（Ｓ．Ｂ．Ｈｏｒｔｅｌａｎｏら、「一酸化窒素は、ミトコンドリア透過性の移行を介してアポトーシスを誘導する」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４１０、３７３〜３７７、１９９７；Ｙ．Ｈ．Ｓｈｅｎら、「一酸化窒素は、異なる経路によりアポトーシスを誘導および阻害する」、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４３３、１２５〜１３１、１９９８を参照のこと）。
【０１２６】
一酸化窒素シンターゼインヒビターＮω−ニトロ−Ｌ−アルギニン（ＬＮＡＭＥ）のみで細胞成長をわずかに増強する一方で（２３．７±２．３％の増加；ＤＭＳＯ賦形剤コントロールと比較してｐ＜０．０１）、ＬＮＡＭＥは、ジスルフィラムの抗増殖効果を消滅させなかった（ジスルフィラムのみによる３６．８±４．０％阻害に対して、ジスルフィラム＋ＬＮＡＭＥの存在下での成長は２６．７±３．１％阻害；ＤＭＳＯ賦形剤コントロールと比較して、ｐ＜０．００１であるが、互いに有意に異なるものではない）。最後に、抗酸化剤として機能するＰＤＴＣは、シクロオキシゲナーゼ２の発現の減少によって結腸直腸癌の成長の一部が妨害されると推定されている。Ｒ．Ｃｈｉｎｅｒｙ、前出のＮａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，；前出のＲ．Ｃｈｉｎｅｒｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，を参照のこと。しかし、シクロオキシゲナーゼインヒビターでは、本発明者らが研究した細胞株の成長を減少させることができなかった（データは示さず）。したがって、まとめると、これらのデータにより、ジスルフィラムは細胞酸化還元状態により成長を阻害しないようであると示唆される。
【０１２７】
［実施例６］
本実施例は、銅以外の金属がジチオカルバマートジスルフィドの抗増殖活性を増強することができることを示す。腸および細胞の両レベルにおける銅の吸収は亜鉛カチオンによって遮断されるので、ウィルソン病（銅の過負荷による遺伝病）の好ましい治療として酢酸亜鉛が使用されている。
【０１２８】
培地中の高濃度の亜鉛は、異なるヒト結腸腺癌細胞中での銅の取り込み、および輸送に影響を与えるので、培地への亜鉛補足により銅依存性と考えられるジスルフィラムの抗増殖活性を阻害し得るかを同定した。活性の減少の代わりに、塩化亜鉛もまた、ジスルフィラムの抗増殖能力を実質的に増強する（図７Ａ）。ジチオカルバマートは、盛んに銅と錯体を形成するが、他の金属とキレート化して（Ｒ．Ｐ．Ｂｕｒｎｓら、「遷移元素の１，１−ジチオラト錯体」、Ａｄｖ．Ｉｎｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒａｄｉｏｃｈｅｍ．，２３、２１１〜２８０、１９８０を参照のこと）、種々の金属塩の補足によってジスルフィラム活性もまた増強することができる能力を上げることができる。
【０１２９】
図７Ａ〜７Ｄは、他の金属もまたジスルフィラムの抗増殖活性を増強することを示す。図７Ａは、亜鉛がジスルフィラムの抗増殖活性を強化することを示す。図４のように、Ｍ１６１９細胞を刺激およびプレーティングした。２４時間後、細胞を、０．６２５μＭのジスルフィラムの非存在下または存在下で、表示濃度の塩化亜鉛（ＺｎＣｌ２）にて処理した。さらに２４時間後、細胞を計数した。＊ＺｎＣｌ２なしと比較してｐ＜０．０１；＋ＺｎＣｌ２なしと比較してｐ＜０．００１であった。
【０１３０】
図７Ｂは、亜鉛だけでなく、金および銀でもジスルフィラムの抗増殖活性を往生的に増強することができることを示す。これは、ジスルフィラム、およびおそらく他のジチオカルバマートならびにそのジスルフィドによる細胞増殖の減損は、重金属の存在によって依存し、且つ触媒として増強するという仮説をさらに支持する。図７Ｂでは、ジスルフィラムの抗増殖活性が、培地への他の重金属の補足によって増強された。上記のようにプレーティングおよび刺激したＭ１６１９細胞を、ＦＢＳのみ、ＤＭＳＯ賦形剤（５μｌ／ｍｌ）、ジスルフィラム（ＤＳ、０．１５μＭ）、５μＭ濃度の金属塩（硫酸銅、ＣｕＳＯ４；乳酸銀、Ｃ３Ｈ５ＡｇＯ３；塩化金ＨＡｕＣｌ４・３Ｈ２Ｏ）またはＤＳ＋金属塩の組み合わせで処理した。４８時間後、細胞を計数した。＊ＤＭＳＯと比較してｐ＜０．０５；＋ＤＳのみと比較してｐ＜０．００１であった。
【０１３１】
図７Ｃは、ジスルフィラムの金との錯体が抗増殖活性を増強させたことを示す。上記のようにプレーティングおよび刺激したＭ１６１９細胞を、ＦＢＳのみ、ＤＭＳＯ賦形剤（５μｌ／ｍｌ）、ジスルフィラム（ＤＳ、１６０ｎＭ）、または方法に概説した濃度のジスルフィラムとの金錯体（ＡｕＤＳ）で処理した。４８時間後、細胞を計数した。＊ＤＭＳＯと比較してｐ＜０．００１；＋ＤＳと比較してｐ＜０．００１であった。
【０１３２】
［実施例７］
本実施例は、チオラートアニオンの形成はジチオカルバマートおよびそのジスルフィドの抗増殖活性を媒介することを示す。
【０１３３】
金属を用いた上記所見に照らして、Ｃｕ２＋、Ｚｎ２＋、Ａｇ１＋、またはＡｕ３＋を含む多数の金属イオンとのジスルフィラムのキレートを合成した。ジスルフィラムと金属との錯体の生成の際、ジスルフィラム含有クロロホルム相の色の変化（単黄色から金イオンとの錯体形成による金色がかった橙色）によって水相由来の金属イオンのキレート化が示唆された。全ての金属錯体は、ジスルフィラムと比較して抗増殖活性を増大させたが、ほとんどの活性化合物は、金のジスルフィラムとの錯体によって形成されており（図７Ｃ）、これはｎＭ濃度で抗増殖活性を示した。
【０１３４】
本化合物のＸ線結晶構造により、ジエチルジチオカルバマートのチオラートアニオンおよび他の二つの金の原子価に塩素が結合したキレートであることが明らかとなった（図８）。方法に概説のように錯体を作製した。評価のために、結晶を、Ｎｏｎｉｕｓ  Ｋａｐｐａ−ＣＣＤ回折計に載せた。結晶を十分に回折させ、Ｍｏ  Ｋα照射（λ＝０．７１７３Ａ）を使用してθにおける２７．５°のデータセットを回収した。最小二乗法による細胞パラメータの精密化によって、ａ＝１１．５１６７（５）、ｂ＝７．２４７２（２）、ｃ＝１２．９３５０（７）Ａの単位格子パラメータおよび１０７９．６（１）Ａ３の体積を有する斜方晶系Ｐ細胞が明らかとなった。系統的削除試験により、Ｐｎｍａであるべき空間群が認められた。ＳＩＲ９２を使用した直説法によって構造を解釈し、ジクロロ（ジエチルチオカルバミル）金（ＩＩ）である結晶が明らかとなった。構造を、首尾のよい溶液および３．３および３．２％のＲ因子（ＥＳＤは１．４９９である）に対する８９３の反射光（Ｉは３δ（Ｉ）以上）についての８３個の別個の変数によって確認した。金錯体は、Ａｕおよび４つの配位原子がｘ，０．２５，ｚでの鏡像である四角い平面錯体である。有機リガンドは、互いに鏡面によって関連する二つの部位を占めるジエチルアミンリガンドとともに不規則になっている。
【０１３５】
これらの結果により、細胞固定化ジスルフィド形成の促進に重要な近位反応性ジチオカルバマート構造は、銅および他の金属によって十分に還元されたジチオカルバマートまたはそのジスルフィドから生成されたチオラートアニオンであることが示唆される。この仮説を試験するために、チオラートジエチルジチオカルバミン酸ナトリウムの単独または完全に還元されたチオ酸の形成を促進するために成長培地に添加された低濃度のＤＴＴの存在下でのＭ１６１９増殖を阻害する能力を比較した。図７Ｄは、チオラートによる成長阻害は、黒色腫細胞のみの成長に影響を与えないＤＴＴ濃度によって非常に減損される。図７Ｄでは、チオラートジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物（ＮａＤＤＣ）の抗炎症活性は、成長培地中の低濃度のＤＴＴによって減少する。上記のようにプレーティングおよび刺激したＭ１６１９細胞を、ＦＢＳのみ、ＮａＤＤＣ（１μＭ）、ＤＴＴ（１００μＭ）、またはＮａＤＤＣ＋ＤＴＴで処理した。４８時間後、細胞数を計数した。＊ＦＢＳと比較してｐ＜０．００１；＋ＮａＤＤＣのみと比較してｐ＜０．００１であった。したがって、転写因子のＤＮＡ結合および細胞増殖の破壊における金属の機能は、ジチオカルバマートアニオン（ＤＮＡ結合領域のシステインと混合ジスルフィドに縮合する反応性化学形態）を形成し、転写因子をＳ−グルタチオニル化させるＧＳＨへの二次的結合を促進することであり得る。
【０１３６】
本明細書中に含まれる説明および関連する図面に存在する教示の利点を用いて、本発明に属する当業者は多数の修正形態および本発明の他の実施形態を思い浮かべるであろう。したがって、本発明は、開示の特定の実施形態に制限されず、修正形態および他の実施形態は添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが意図されると理解すべきである。本明細書中に特定の用語を例示しているが、これらは一般的および記述的意味で使用しており、制限を目的としない。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１ＡはＭ１６１９黒色腫細胞が環状ＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）に対して構成性ＤＮＡ結合活性を示すことを示す。
【図１Ｂ】
図１Ｂはジチオカルバマートジスルフィドジスルフィラムおよび銅がＣＲＥに結合する転写因子を阻害することを示す。
【図１Ｃ】
図１Ｃは、ほぼコンフルエントの細胞を、ＦＢＳのみ、ＤＭＳＯ賦形剤（５μｌ／ウェル）、ジスルフィラム（５μＭ）、ＣｕＳＯ４（１．６μＭ）、またはジスルフィラム＋銅の組み合わせについて８時間試験した複製試験（ｎ＝４）由来の核タンパク質を使用してＥＭＳＡを行ったことを示す。
【図２】
図２はＤＮＡ結合への転写因子結合反応物に直接結合するジスルフィラムまたはジスルフィラム＋銅の添加効果を示す。
【図３Ａ】
図３Ａはジスルフィラムおよび銅が細胞周期タンパク質サイクリンＡの発現を減少させることを示す。
【図３Ｂ】
図３Ｂは細胞を、ＤＭＳＯ賦形剤（５μｌ／ウェル、レーン１〜４）、ジスルフィラム（５μＭ、レーン５〜８）、（５μｌ／ｍｌ）、ＣｕＳＯ４（１．６μＭ、レーン９〜１２）、およびＣｕＳＯ４（レーン１３〜１６）で処理した試験（それぞれｎ＝４）を複製したことを示す。細胞溶解から２４時間後、免疫ブロットを行ってサイクリンＡをアッセイした。
【図３Ｃ】
図３Ｃはデンシトメトリーによる図３Ｂの試験物の定量を例示する図である。
【図４Ａ】
図４ＡはジスルフィラムがＭ１６１９ヒト黒色腫細胞株の増殖を阻害することを示す。
【図４Ｂ】
図４Ｂは細胞非透過性Ｃｕ２＋キレート剤であるバソクプロインジスルホン酸がジスルフィラム由来の成長阻害を防止することを示す。
【図４Ｃ】
図４Ｃは成長培地への銅の補足によりジスルフィラムの抗増殖活性が増強されることを示す。
【図４Ｄ】
図４Ｄはセルロプラスミンがジスルフィラムの抗増殖活性を増強するための銅供給源として作用することができることを示す。
【図５Ａ】
図５ＡはＭ１６１９黒色腫細胞をＤＭＳＯ賦形剤で処理したことを示す。
【図５Ｂ】
図５ＢはＭ１６１９黒色腫細胞を５μＭのジスルフィラムで処理したことを示す。
【図６Ａ】
図６Ａは銅と組み合わせたジスルフィラムがＭ１６１９黒色腫細胞のＳ期細胞周期停止およびアポトーシスを誘導することを示す。
【図６Ｂ】
図６Ｂは銅と組み合わせた５μＭジスルフィラムがＭ１６１９黒色腫細胞のＳ期細胞周期停止およびアポトーシスを誘導することを示す。
【図６Ｃ】
図６Ｃは５μＭジスルフィラム＋銅供給源としての２５０μｇ／ｍｌのセルロプラスミン（Ｃｅｒｕｌｏ）を示す。
【図７Ａ】
図７Ａは他の金属もまたジスルフィラムの抗増殖活性を増強することを示す。
【図７Ｂ】
図７Ｂはジスルフィラムの抗増殖活性が他の重金属での培地の補足によって増強されたことを示す。
【図７Ｃ】
図７Ｃはジスルフィラムの金との錯体が抗増殖活性を増強させたことを示す。
【図７Ｄ】
図７Ｄはジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム三水和物（ＮａＤＤＣ）の抗増殖活性が、成長培地中で低濃度のＤＴＴによって減少したことを示す。
【図８】
図８は四塩化金とジスルフィラムとの混合から形成された錯体のＸ線結晶構造を示す。
【図１Ａ】
2004525079.tif 000017
【図１Ｂ】
2004525079.tif 000018
【図１Ｃ】
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【図２】
2004525079.tif 000020
【図３Ａ】
2004525079.tif 000021
【図３Ｂ】
2004525079.tif 000022
【図３Ｃ】
2004525079.tif 000023
【図４Ａ】
2004525079.tif 000024
【図４Ｂ】
2004525079.tif 000025
【図４Ｃ】
2004525079.tif 000026
【図４Ｄ】
2004525079.tif 000027
【図５Ａ】
2004525079.tif 000028
【図５Ｂ】
2004525079.tif 000029
【図６Ａ】
2004525079.tif 000030
【図６Ｂ】
2004525079.tif 000031
【図６Ｃ】
2004525079.tif 000032
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2004525079.tif 000034
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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2004525079.tif 000113
2004525079.tif 000114
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004525079.tif 000115
【国際調査報告】
2004525079.tif 000116
2004525079.tif 000117