(57)【要約】本発明は、キメラポリペプチドをコードする新規なキメラ核酸、これらのポリペプチドをインビトロとインビボとの両方で発現するための構築物、単離されたキメラポリペプチド、薬学的組成物ならびにこれらの組成物を作製および使用する方法を提供する。これらの組成物および方法は、選択された抗原の免疫原性を刺激または増強するため、あるいはこの抗原に対して特異的な細胞免疫応答を刺激または増強するために、特に有用である。本発明の核酸は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の配列を含む、第１のポリペプチドドメインと、抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラポリペプチドをコードする核酸であって、該キメラポリペプチドが、以下：
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の配列を含む、第１のポリペプチドドメイン、および
抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメイン、
を含む、核酸。
【請求項２】
前記第１のポリペプチドドメインをコードする核酸が、前記第２のポリペプチドドメインをコードする核酸に対して５’側にある、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記第２のポリペプチドドメインをコードする核酸が、前記第１のポリペプチドドメインをコードする前記核酸に対して５’側にある、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
前記熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメントが、シャペロン活性を有する、請求項１に記載の核酸。
【請求項５】
前記熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）が、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ　７０）を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項６】
前記熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ　７０）が、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来である、請求項１に記載の核酸。
【請求項７】
前記熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）が、配列番号９の残基３１２〜６２５により示されるような配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項８】
前記熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）が、配列番号９の残基約５１７〜残基約６２５によって示されるような配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項９】
前記Ｆｌｔ−３リガンドポリペプチドが、配列番号２５の残基約１〜残基約１８９によって示されるような配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１０】
前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）が、配列番号３の残基約２４７〜残基約４１７によって示されるような配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１１】
前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）が、配列番号３の残基約２５３〜残基約３６４によって示されるような配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１２】
前記ＧＭ−ＣＳＦ配列が、ジスルフィド架橋を含むＧＭ−ＣＳＦフラグメントである、請求項１に記載の核酸。
【請求項１３】
前記ＧＭ−ＣＳＦフラグメントが、配列番号１の残基約１８〜残基約２２、または残基約３４〜残基約４１、または残基約３８〜残基約４８、または残基約５２〜残基約６１、または残基約９４〜残基約１１５、または残基約９５〜残基約１１１によって示されるような配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１４】
前記抗原性ポリペプチドが、ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドエピトープを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項１５】
前記ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドエピトープが、約８アミノ酸残基と約１１アミノ酸残基との間の長さである、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
前記抗原性ポリペプチドがウイルス由来である、請求項１に記載の核酸。
【請求項１７】
前記ウイルスがヒトパポバウイルスである、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１８】
前記ウイルスがヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である、請求項１６に記載の核酸。
【請求項１９】
前記ウイルスがヒトパピローマウイルス−１６（ＨＰＶ−１６）である、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】
前記抗原性ポリペプチドが、ヒトパピローマウイルスＥ６ポリペプチドまたはヒトパピローマウイルスＥ７ポリペプチドを含む、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２１】
前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、背急行１６に記載の核酸。
【請求項２２】
前記抗原性ポリペプチドが、腫瘍特異的ポリペプチドまたは腫瘍関連ポリペプチドである、請求項１に記載の核酸。
【請求項２３】
前記腫瘍特異的ポリペプチドまたは腫瘍関連ポリペプチドが、腫瘍細胞の表面上で発現される抗原を含む、請求項２２に記載の核酸。
【請求項２４】
前記腫瘍特異的ポリペプチドまたは腫瘍関連ポリペプチドが、変異体ｐ５３、ＭＡＧＥ−１またはＭＡＧＥ−３である、請求項２２に記載の核酸。
【請求項２５】
前記抗原性ポリペプチドが病原体由来である、請求項１に記載の核酸。
【請求項２６】
前記病原体が、マラリア、ＨＩＶ−１、ウシウイルス性下痢症ウイルス、サイトメガロウイルス、脳炎ウイルス、肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはインフルエンザウイルスである、請求項２５に記載の核酸。
【請求項２７】
前記キメラポリペプチドが、細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインを含む第３のポリペプチドドメインをさらに含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項２８】
前記細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ）の細胞質トランスロケーションドメインを含む、請求項２７に記載の核酸。
【請求項２９】
前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ）の細胞質トランスロケーションドメインが、配列番号３の残基約２５３〜残基約３６４によって示されるような配列を含む、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３０】
前記細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインが、Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ、またはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の毒素の細胞質トランスロケーションドメインを含む、請求項２７に記載の核酸。
【請求項３１】
前記第３のポリペプチドドメインをコードする核酸が、前記第１もしくは第２のドメインをコードする核酸に対して５’側にあるか、または該第１もしくは第２のドメインをコードする核酸の間に位置するか、または該第１もしくは第２のドメインをコードする核酸に対して３’側に位置する、請求項２７に記載の核酸。
【請求項３２】
調節核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３３】
前記調節核酸配列が、転写調節配列を含む、請求項３２に記載の核酸。
【請求項３４】
キメラポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセットであって、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）を含む、第１のポリペプチドドメインと；抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含む、発現カセット。
【請求項３５】
発現ベクターまたはプラスミドを含む、請求項３４に記載の発現カセット。
【請求項３６】
自己複製ＲＮＡレプリコンを含む、請求項３４に記載の発現カセット。
【請求項３７】
前記自己複製ＲＮＡレプリコンがシンドビスウイルス自己複製ＲＮＡベクターを含む、請求項３６に記載の発現カセット。
【請求項３８】
前記自己複製ＲＮＡレプリコンがシンドビスウイルス自己複製ＲＮＡベクターＳＩＮｒｅｐ５を含む、請求項３７に記載の発現カセット。
【請求項３９】
キメラポリペプチドをコードする核酸を含む形質転換細胞であって、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）を含む、第１のポリペプチドドメインと；抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含む、形質転換細胞。
【請求項４０】
キメラポリペプチドであって、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）を含む、第１のポリペプチドドメインと；抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含む、キメラポリペプチド。
【請求項４１】
前記第１のポリペプチドドメインが、前記第２のポリペプチドドメインに非共有結合している、請求項４０に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４２】
前記第１のポリペプチドドメインが、前記第２のポリペプチドドメインに共有結合している、請求項４０に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４３】
前記キメラポリペプチドが組換えポリペプチドである、請求項４２に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４４】
薬学的組成物であって、以下：
キメラポリペプチドをコードする核酸、
キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、または
キメラポリペプチド、および
薬学的に受容可能な賦形剤、
を含み、ここで、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）と；抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含む、薬学的組成物。
【請求項４５】
前記組成物が、リポソームを形成するようにリン脂質を用いて処方されている、請求項４４に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
ＤＮＡワクチンであって、以下：
キメラポリペプチドをコードする核酸、
キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、または
キメラポリペプチド、ならびに
薬学的に受容可能な賦形剤、
を含み、ここで、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）と；抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含む、ＤＮＡワクチン。
【請求項４７】
キメラポリペプチドをコードする核酸を含むかまたはキメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む、粒子であって、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）と；抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含む、粒子。
【請求項４８】
前記粒子が、粒子ボンバードメントに適した材料を含む、請求項４７に記載の粒子。
【請求項４９】
前記材料が金を含む、請求項４８に記載の粒子。
【請求項５０】
免疫応答を誘導する方法であって、該方法が、有効量の組成物を投与する工程を包含し、該組成物が、以下：
キメラポリペプチドをコードする核酸、
キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、または
キメラポリペプチド、あるいは
該核酸、該ベクター、該キメラポリペプチドもしくはこれらの組み合わせを含む、ＤＮＡワクチン、
を含み、ここで、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）と；抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含み、
ここで、該有効量での該組成物の投与が、免疫応答を誘導する、方法。
【請求項５１】
誘導される前記免疫応答が、細胞傷害性Ｔ細胞応答を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記キメラポリペプチドをコードする前記核酸またはベクターが、裸のＤＮＡとして投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記裸のＤＮＡが、遺伝子銃またはその等価物によって投与される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記組成物がリポソーム処方物として投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物が皮内投与される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】
病原体による感染に対して哺乳動物にワクチン接種する方法であって、該方法が、有効量の組成物を投与する工程を包含し、該組成物が、以下：
キメラポリペプチドをコードする核酸、
キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、または
キメラポリペプチド、あるいは
該核酸、該ベクター、該キメラポリペプチドもしくはこれらの組み合わせを含む、ＤＮＡワクチン、
を含み、ここで、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）と；病原体由来の抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインとを含み、
ここで、該有効量での該組成物の投与が、該病原体に対する免疫応答を誘導する、方法。
【請求項５７】
腫瘍抗原に対して哺乳動物にワクチン接種する方法であって、該方法が、有効量の組成物を投与する工程を包含し、該組成物が、以下：
キメラポリペプチドをコードする核酸、
キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクターまたは
キメラポリペプチド、あるいは
該核酸、該ベクター、該キメラポリペプチドもしくはこれらの組み合わせを含む、ＤＮＡワクチン、
を含み、ここで、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）と；腫瘍抗原を含む第２のポリペプチドドメインとを含み、
ここで、該組成物の投与が、該腫瘍抗原に対する免疫応答を誘導する、方法。
【請求項５８】
抗原に対して哺乳動物にワクチン接種するための薬学的処方物を調製するための、組成物の使用であって、該薬学的処方物が、以下：
キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、キメラポリペプチド、またはこれらの組み合わせ、および
薬学的に受容可能な賦形剤、
を含み、ここで、該キメラポリペプチドが、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）と；腫瘍抗原を含む第２のポリペプチドドメインとを含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０００年２月９日に出願された米国特許出願番号（「ＵＳＳＮ」）０９／５０１，０９７号（これは１９９９年１０月２０日に出願されたＵＳＳＮ０９／４２１，６０８のＣＩＰである）の一部継続（ＣＩＰ）である。上述の出願はそれぞれ、それらの全体が、そして全ての目的のために、明白に本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（連邦支援調査についての陳述）
本発明は、国立衛生研究所の助成金ＲＯ１　ＣＡ７２６３１−０１およびＲＦＡ　ＣＡ−９５−０２０のもと連邦政府の支援によってなされた。連邦政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００３】
（技術分野）
本発明は、一般的に、免疫学および医学に関する。本発明は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメインおよび抗原性ポリペプチド（例えば、腫瘍関連抗原または病原体に由来する抗原）を含むキメラ分子を用いて、抗原特異的免疫応答（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答）を増強するための組成物および方法を提供する。従って、本発明の１つの実施形態は、ＤＮＡワクチンに関連する。
【０００４】
（背景）
抗原特異的免疫治療は、新生物細胞に対して特異的な免疫を開発し得、一方、正常細胞を攻撃しないので、癌の制御のためのアプローチとして最近現れた。ＤＮＡワクチン接種は、抗原をコードするＤＮＡ（それ自身は抗原ではない）が被験体に注入される点で、伝統的なワクチン接種と異なる。抗原の産生（すなわち、ワクチンのＤＮＡによってコードされた抗原の発現）は、ワクチン接種された個体の体内で起こる。しかし、従来のＤＮＡワクチンは、制限を有する。例えば、ほとんどのＤＮＡワクチンの主要な欠点は、それらの効力である。
【０００５】
（要旨）
本発明は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメイン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）配列を含む第１のポリペプチドドメイン、および抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドをコードする核酸を提供する。このキメラ核酸の融合タンパク質産物はまた、いくつかのドメインを有し得、任意の順序で、ＨＳＰドメインのカルボキシ末端フラグメント、ＦＬドメイン、ＥＴＡ　ｄＩＩドメイン、またはＧＭ−ＣＳＦドメインの任意の組合せを含む。他のドメインはまた、例えば、融合ポリペプチドを精製するかまたはインサイチュでポリペプチドを同定するなどの際の補助のために付加され得る。代替の実施形態において、第１のポリペプチドドメインをコードする核酸は、第２のポリペプチドドメインをコードする核酸に対して５’側にあり、そして第２のポリペプチドドメインをコードする核酸は、第１のポリペプチドドメインをコードする核酸に対して５’側にある。従って、このキメラ核酸の融合タンパク質産物は第１のポリペプチドドメインに対してアミノ末端かカルボキシ末端かのいずれかに、抗原性ポリペプチドを有し得；たとえキメラ核酸が２より多いドメインをコードしても、ドメインの任意の順序が受容され得る。
【０００６】
１つの実施形態において、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメントは、シャペロン活性（例えば、ペプチドシャペロン活性）を有する。熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）（またはその核酸コード配列）は、例えば、ヒトまたは細菌のＨＳＰを含む任意の生物に由来し得る。ＨＳＰは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来するＨＳＰ７０のような熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）を含み得る。熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は、配列番号９の残基３１２〜６２５によって示される配列、または配列番号９の残基約５１７〜残基約６２５によって示される配列、あるいはそれらの機能的等価物を含み得る。
【０００７】
代替の実施形態において、Ｆｌｔ−３リガンドポリペプチド（またはその核酸をコードする配列）は、例えば、ヒトまたは細菌を含む任意の生物に由来する。Ｆｌｔ−３リガンドポリペプチドは、配列番号２５の残基約１〜残基約１８９によって示される配列を含み得る。
【０００８】
代替の実施形態において、細胞質トランスロケーションドメイン（またはその核酸コード配列）は、例えば、ヒトまたは細菌を含む任意の生物に由来する。細胞質トランスロケーションドメインは、毒素（例えば、細菌（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）由来の毒素（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ））に由来し得、例えば、ＥＴＡ　ｄＩＩは、配列番号３の残基約２４７〜残基約４１７によって示される配列を含む。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメインはまた、配列番号３の残基約２５３〜残基約３６４によって示される配列を含む。
【０００９】
代替の実施形態において、ＧＭ−ＣＳＦ配列（またはその核酸コード配列）は、例えば、ヒトまたは細菌を含む任意の生物に由来する。ＧＭ−ＣＳＦ配列は、ＧＭ−ＣＳＦフラグメント（例えば、ジスルフィド架橋を含むフラグメント）であり得る。ＧＭ−ＣＳＦフラグメントはまた、配列番号１の残基約１８〜残基約２２、または残基約３４〜残基約４１、または残基約３８〜残基約４８、または残基約５２〜残基約６１、または残基約９４〜残基約１１５、または残基約９５〜残基約１１１で示されるような配列を含み得る。
【００１０】
１つの実施形態において、抗原性ポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドエピトープを含む。ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドエピトープは、長さが約８のアミノ酸残基と約１１、または約１５、または約２５、または約５０のアミノ酸残基との間であり得る。抗原性ポリペプチドは、任意の病原体または微生物に由来し得る。代替の実施形態において、抗原性ポリペプチドは、ヒトウイルス（例えば、ヒトパポバウイルス）のようなウイルスに由来し得る。パポバウイルスは、ヒトパピローマウイルス−１６（ＨＰＶ−１６）のようなヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）であり得る。抗原性ポリペプチドは、ヒトパピローマウイルスＥ６ポリペプチドまたはヒトパピローマウイルスＥ７ポリペプチドを含み得る。このウイルスはまた、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（例えば、ＨＩＶ−１）のようなレンチウイルスであり得る。
【００１１】
抗原性ポリペプチドが由来し得る他の病原体としては、ほんのいくつかを挙げると、マラリア、ウシウイルス性下痢症ウイルス、サイトメガロウイルス、脳炎ウイルス、肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはインフルエンザウイルスが挙げられる。
【００１２】
抗原性ポリペプチドはまた、腫瘍特異的または腫瘍関連ポリペプチドであり得る。腫瘍特異的ポリペプチドまたは腫瘍関連ポリペプチドは、腫瘍細胞の表面に発現される抗原を含み得る。腫瘍特異的または腫瘍関連ポリペプチドは、変異体ｐ５３、ＭＡＧＥ−１またはＭＡＧＥ−３であり得る。
【００１３】
１つの実施形態において、核酸は、細胞質のトランスロケーションポリペプチドドメインを含む第３のポリペプチドドメインをさらに含むキメラポリペプチドをコードする。従って、本発明は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメインまたは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）配列（あるいは任意のそれらの組合せ）を含む第１のポリペプチドドメイン、抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメイン、および細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインを含む第３のポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドをコードする核酸を提供する。上記のように、これらのドメインは、任意の順序でキメラ核酸またポリペプチドに存在し得る。
【００１４】
細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインは、任意の供給源（例えば、ヒトおよび細菌など）に由来し得る。細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ）の細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ）の細胞質トランスロケーションドメインは、配列番号３の残基約２５３〜残基約３６４によって示される配列を含み得る。細胞質トランスロケーションポリペプチドドメインは、細菌毒素（例えば、Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ、またはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓに由来する毒素）のような病原体毒素の細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。第３のポリペプチドドメインをコードする核酸は、第１または第２のドメインをコードする核酸に対して５’側に位置するか、第１または第２のドメインをコードする核酸の間に位置するか、または第１または第２のドメインをコードする核酸に対して３’側に位置する。
【００１５】
核酸は、さらに、転写調節配列（例えば、プロモーターまたはエンハンサー）あるいは翻訳調節配列のような調節核酸配列を含み得る。
【００１６】
本発明は、本発明のキメラ核酸を含む発現カセット（例えば、プラスミド、ベクター、ウイルス）を提供し、これは、例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメインを含む第１のポリペプチドドメイン；および抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドをコードする核酸を含む。発現カセットは、少なくとも１つのプロモーターおよび１つのコード配列を含む。プロモーターは、構成的、誘導的および組織特異的であり得る。発現カセットはまた、細胞質トランスロケーションドメインに対するコード配列を含み得る。発現カセットはまた、シンドビスウイルス自己複製ＲＮＡベクター（例えば、自己複製ＲＮＡベクターＳＩＮｒｅｐ５）のような自己複製ＲＮＡレプリコンを含み得る。
【００１７】
本発明は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメインを含む第１のポリペプチドドメイン；および抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドをコードする核酸を含む形質転換された細胞を提供する。この核酸はまた、細胞質トランスロケーションドメインに対するコード配列を含み得る。
【００１８】
本発明は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメインを含む第１のポリペプチドドメイン；および抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドを提供する。融合タンパク質は、マルチドメイン化され、本発明のキメラ核酸に対して類似であり得る。融合タンパク質はまた、細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。第１のポリペプチドドメインは、第２のポリペプチドドメインに、非共有結合的に結合し得る。あるいは、第１のポリペプチドドメインは、第２のポリペプチドドメインに共有結合的に結合し得、例えば、それは、組換えタンパク質であり得る。キメラポリペプチドが、マルチドメイン化される場合、結合／融合タンパク質スキームの任意の組合せが考案され得る。
【００１９】
本発明は、キメラポリペプチドをコードする核酸（本発明のキメラ核酸）、本発明のキメラポリペプチドをコードする核酸を含む発現カセット（例えば、プラスミド、ベクター、ウイルス）、またはキメラポリペプチドを含む薬学的組成物を提供し、ここで、キメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメイン；および抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメイン；ならびに薬学的に受容可能な賦形剤を含む。融合タンパク質はまた、細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。
【００２０】
薬学的組成物は、任意の処方物を含み得、例えば、それは、リン脂質によって処方され得、リポソームを形成し得る。この薬学的組成物は、例えば、経口または非経口投与あるいは銃式（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）投与などに適し得る。この薬学的組成物は、任意の適切な投薬または形態（例えば、錠剤、液体、吸入剤、および注射／銃式のための粒子など）であり得る。
【００２１】
本発明は、キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、またはキメラポリペプチドを含むＤＮＡワクチンを提供し、ここで、キメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメイン；および抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメイン；ならびに薬学的に受容可能な賦形剤を含む。融合タンパク質また、細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。
【００２２】
本発明は、キメラポリペプチドをコードする核酸またはキメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む粒子を提供し、ここで、キメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメイン；および抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドを含む。融合タンパク質はまた、細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。この粒子は、粒子のボンバードメントに適切な任意の材料（例えば、金）を含み得る。
【００２３】
本発明は、免疫応答を誘発する方法を提供し、この方法は、キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、またはキメラポリペプチド（このキメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメイン；および抗原性ポリペプチドドメインを含む第２のポリペプチドを含む）、あるいは核酸、ベクター、キメラポリペプチドまたはそれらの組合せを含むＤＮＡワクチンを含む組成物の有効量を投与する工程を包含し、ここで、有効量でのこの組成物の投与は免疫応答を誘発する。融合タンパク質はまた、細胞質トランスロケーションドメインを含み得る。この方法は、優先的Ｔ細胞応答（例えば、優先的細胞傷害性Ｔ細胞応答）のような細胞性応答を含む免疫応答を誘発し得る。この方法において、キメラポリペプチドをコードする核酸またはベクターは、裸のＤＮＡ分子として投与され得る。本発明の核酸（例えば、裸のＤＮＡ）は、遺伝子銃または等価物によって投与され得る。あるいは、この方法において、この組成物はリポソーム処方物として投与され得る。組成物は、吸入剤などによって皮内投与され得る。
【００２４】
本発明はまた、病原体による感染に対して哺乳動物にワクチン接種する方法を提供し、この方法は、キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、またはキメラポリペプチド（ここで、このキメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメイン；および病原体に由来する抗原性ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインを含む）、あるいは核酸、ベクター、キメラポリペプチドまたはそれらの組合せを含むＤＮＡワクチンを含む組成物の有効量を投与する工程を包含し、ここで、この組成物の投与は、その病原体に対する免疫応答を誘発する。
【００２５】
本発明はまた、腫瘍抗原に対する哺乳動物のワクチン接種の方法を提供し、この方法は、キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、またはキメラポリペプチド（ここで、このキメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメイン；および腫瘍抗原を含む第２のポリペプチドを含む）、あるいは、核酸、ベクター、キメラポリペプチドまたはそれらの組合せを含む組成物の有効量を含むＤＮＡワクチンを投与する工程を包含し、ここで、この組成物の投与は、その腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発する。
【００２６】
本発明はまた、抗原に対して哺乳動物をワクチン接種のための薬学的処方物を調製するための組成物の使用を提供し、ここで、この薬学的処方物は、キメラポリペプチドをコードする核酸、キメラポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、キメラポリペプチド、またはそれらの組合せを含み、ここで、このキメラポリペプチドは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメイン；ならびに腫瘍抗原を含む第２のポリペプチドおよび薬学的に受容可能な賦形剤を含む。
【００２７】
本発明の１以上の実施形態の詳細は、添付される図面および以下の記述に記載される。本発明の他の特徴、目的および利点は、この記述および図面から、そして特許請求の範囲から明白である。
【００２８】
本明細書中に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、ＧｅｎＢａｎｋ配列およびＡＴＣＣ寄託物は、全ての目的において、本明細書中に参考として説明的に援用される。
【００２９】
（詳細な説明）
本発明は、キメラポリペプチドをコード新規キメラ核酸、インビボおよびインビトロの両方でこれらのポリペプチドを発現するための構築物、単離されたキメラポリペプチド、薬学的組成物、ならびにこれらの組成物を作製する方法および使用する方法を提供する。これらの組成物および方法は、選択された抗原の免疫原生性を刺激するかまたは増強するか、またはその免疫原に特異的な細胞性免疫応答を刺激するかもしくは増強するために特に有用である。本発明の核酸は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメイン、または顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）配列を含む第１のポリペプチドドメイン、および抗原ポリペプチドを含む第２のポリペプチドドメインを含む。
【００３０】
本発明の１つの実施形態は、キメラ核酸によりコードされる標的抗原の免疫原性（例えば、ＤＮＡワクチン）が、熱ショックタンパク質（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ熱ショックタンパク質　７０（ＨＳＰ７０）（例えば、配列番号９を参照のこと）のカルボキシ末端タンパク質、またはＦｌｔ−３リガンド（例えば、配列番号２５を参照のこと）または顆粒−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（配列番号１）または細胞質トランスロケーションドメイン（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ＥＴＡ　ｄＩＩ　配列番号３を参照のこと））をコードする第１のドメイン；ならびに抗原（例えば、病原体または腫瘍由来の抗原性ペプチド）をコードする第２のドメインを含むＤＮＡのキメラ核酸中に存在することにより増強されるという発見に基づく。従って、本発明は、ＤＮＡワクチンの効力（従って、臨床効率）を有意に増強するワクチン接種の組成物および方法を提供する。
【００３１】
１つの実施形態では、本発明のキメラ核酸は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）（例えば、ＨＳＰ７０）のカルボキシ末端ドメイン（ＣＤ）を含む第１のドメイン（第１ドメインＤＮＡによりコードされる）および第２のドメイン（第２ドメインＤＮＡによりコードされる）（例えば、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ制限抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩ−結合ペプチドエピトープ））を含むキメラポリペプチドを含む免疫原性組成物をコードする。１つの実施形態では、タンパク質のカルボキシ末端フラグメントは、少なくとも１０アミノ酸長であるポリペプチドまたはペプチドであり、そして天然に存在するタンパク質の半分のカルボキシ末端に由来する。例えば、ＨＳＰ７０のカルボキシ末端フラグメントは、そのアミノ酸配列が配列番号９のおおよそ残基３１２〜約６２５にわたるＨＳＰ７０の部分に由来するペプチドであり；このペプチドは、これらの残基のコード領域にわたるＤＮＡによりコードされる。カルボキシ末端ドメイン（ＣＤ）フラグメントはまた、配列番号９の残基約５１７〜約６２５のアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。
【００３２】
例えば、この免疫原性組成物は、配列番号９の残基５１７〜６２５のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするＤＮＡを含む第１のドメイン、および（必要に応じて連結される）ＭＨＣクラスＩ制限抗原をコードする第２のＤＮＡを含む第２のドメインを含むキメラポリペプチドを含み得る。従って、本発明は、パピローマウイルスＥ７−ＨＳＰ７０−ＣＤ融合ポリペプチド、ならびに融合ポリペプチドをコードするキメラ核酸（ＤＮＡ）を含み得る。必要に応じて、組成物は、ＨＳＰ７０のアミノ末端フラグメント由来の残基を含むポリペプチド（例えば、配列番号９の残基１６１〜３７０）をコードするＤＮＡを含む。ＤＮＡ成分（例えば、第１および第２（ならびに必要に応じて第３の）のＤＮＡ）が作動可能に連結される（すなわち、組換えタンパク質上のドメイン上にアレンジされる）順序は、免疫原性に影響することなく変更され得る。例えば、ＨＳＰをコードする（またはＦｌｔ−３リガンドをコードするか、もしくは細胞質トランスロケーションドメインをコードする）ＤＮＡ配列は、抗原をコードする配列に対して５’または３’に配置される。１つの実施形態では、抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩ制限抗原）が、ＨＳＰ由来残基、Ｆｌｔ−３リガンド由来残基または細胞質トランスロケーションドメイン由来残基に対してアミノ末端に配置される、ＤＮＡ構築物が、組み合えポリペプチドをコードするように、これらのポリペプチドをコードする核酸ドメインは、インフレームである（すなわち、ＤＮＡは、作動可能に連結される）。
【００３３】
以下で議論されるように、抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩ制限抗原）は、病原体（例えば、ウイルス）、癌組織（例えば、腫瘍特異的ポリペプチドまたは腫瘍関連ポリペプチド）に由来し得る。本発明のＤＮＡワクチンは、発現カセット（例えば、ＨＳＰまたはＦｌｔ−３リガンドまたは細胞質移動ドメインのカルボキシ末端フラグメントをコードする第１のＤＮＡならびに（必要に応じて連結される）抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩ制限抗原）をコードする第２のＤＮＡを含む発現ベクターまたはプラスミドベクター）を含み得る。本発明の治療法は、本明細書中に記載される免疫原性組成物を哺乳動物に投与することにより哺乳動物において抗原に対する細胞毒性Ｔ細胞応答を誘導する方法を含む。
【００３４】
代替的な実施形態では、本発明のキメラ核酸または免疫原性組成物は、以下の成分を含む：（ａ）専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）に結合するポリペプチド、または、ＨＳＰのカルボキシ末端フラグメント、Ｆｉｔ−３リガンドもしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）をコードする配列を含む第１のＤＮＡ；（ｂ）細胞質トランスロケーターポリペプチド（例えば、ＥＴＡ　ｄＩＩを含む）を含む第２のＤＮＡ、および（ｃ）抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩ制限抗原）をコードする配列を含む第３のＤＮＡ。第１、第２および第３のＤＮＡは、作動可能に連結され得る。「作動可能に連結される」は、１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が別のポリペプチドをコードする別のＤＮＡにインフレームで結合されて、組換えキメラ（すなわち、「融合」）タンパク質を生成することを意味する。作動可能に連結されたＤＮＡメッセージの翻訳は、キメラポリペプチドまたは融合遺伝子産物を生じる。本発明は、キメラ核酸およびキメラポリペプチドを含み、ここで全ての可能な組み合わせで連結される（すなわち、第１、第２および第３のＤＮＡが作動可能に連結される順序は、無関係である）。
【００３５】
構築物（例えば、発現カセット、ベクターなど）はまた、調節配列（例えば、転写調節配列または翻訳調節配列）を含み得る。ポリペプチドをコードする配列および調節配列は、適切な分子（例えば、転写アクチベータータンパク質）が、調節配列に結合する場合に、遺伝子発現を可能にする方法で接続される。
【００３６】
１つの実施形態において、免疫原性組成物の第１の核酸ドメインは、ＨＳＰ（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）（配列番号９））のフラグメントをコードする。所定のタンパク質の「フラグメント」は、参照ポリペプチドより短い長さのポリペプチドである。例えば、このポリペプチドは、少なくとも９または１０アミノ酸長であるが、成熟参照タンパク質またはポリペプチドの総残基数よりも少ない。例えば、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＨＳＰ７０のフラグメントは、７０ｋＤａ未満の分子量である。ＨＳＰ７０のフラグメントは、天然に存在するＨＳＰ７０のアミノ酸配列に少なくとも５０％同一であるアミノ酸配列を有する。ＨＳＰ７０フラグメントの長さは、６２５アミノ酸未満である。このフラグメントは、参照タンパク質の生物学的活性を有し得る。例えば、１つの実施形態において、このフラグメントは、プロフェッショナルな抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞（ＤＣ））に結合し得るか、またはこのフラグメントは、細胞質内へのこのキメラポリペプチド（この免疫原性組成物のＤＮＡによってコードされる）のトランスロケーションを媒介し得る。いくつかの実施形態において、この第１のＤＮＡまたは第２のＤＮＡ（あるいは、両方）は、熱ショックタンパク質またはＥＴＡ（ｄＩＩ）（例えば、配列番号３）のフラグメントをコードする。
【００３７】
（この免疫原性組成物の）ＤＮＡの第２のドメイン（または、細胞質トランスロケーションドメインもまた存在する場合には、第３のドメイン）は、ＭＨＣクラスＩ拘束抗原のような、抗原エピトープをコードし得る。１つの実施形態において、抗原は、ヒトパポバウイルス（例えば、子宮頸癌関連ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ））のようなウイルスに由来する。このウイルス抗原は、ＨＰＶ−１６由来のＥ６抗原またはＥ７抗原の全部または一部であり得る。本発明のキメラ核酸によって発現され得る他のウイルス抗原としては、ウシウイルス下痢症ウイルスのＥ２抗原；サイトメガロウイルスのｐｐＵＬ８３またはｐｐ８９；脳炎ウイルスＳＬＥのｐｒＭ／Ｅ；Ｂ型肝炎ウイルスのＨＢＶ表面抗原またはＨＢＶコア抗原；ＨＩＶ−１抗原（例えば、ｇｐ１６０）；ＩＣＰ２７、ｇＤ２、糖タンパク質Ｂ、または単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｂが挙げられる。あるいは、抗原は、変異体ｐ５３；黒色腫細胞に関連するＭＡＧＥ−１またはＭＡＧＥ−３のような、癌（例えば、腫瘍関連）抗原（例えば、腫瘍細胞の表面上に発現される癌関連抗原）であり得る。他の抗原としては、マラリアペプチド（ＮＡＮＰ）４０、ＨＩＶ−１　ｐ２４、またはインフルエンザ核タンパク質が挙げられる。
【００３８】
キメラポリペプチドの第１のドメインをコードするＤＮＡは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）配列、またはそのフラグメントを含み得る。１つの実施形態において、そのコードされるタンパク質は、ジスルフィド架橋（例えば、配列番号１のＣｙｓ５１とＣｙｓ９３に架かるジスルフィド架橋）を含む、機能的ＧＭ−ＣＳＦフラグメントである。ＧＭ−ＣＳＦの他の生物学的に活性なフラグメントは、配列番号１の残基１８〜２２、３４〜４１、３８〜４８、５２〜６１、９４〜１１５、９５〜１１１を含むポリペプチドである。
【００３９】
あるいは、第１のポリペプチドドメインをコードするＤＮＡは、Ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）（例えば、配列番号２５を参照のこと）、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド、またはＴＮＦレセプター配列（またはそのＡＰＣ結合フラグメント）、あるいはＡＰＣ結合ポリペプチド配列を含み得る。
【００４０】
第２のポリペプチドドメインをコードするＤＮＡは、Ｐｓｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ（ＥＴＡ）のトランスロケーションドメイン配列（例えば、ＥＴＡのドメインＩＩ（ｄＩＩ）（例えば、配列番号３のおよそ２５３〜およそ３６４にわたる残基））のような、トランスロケーションドメイン配列をコードし得る。トランスロケーションドメインは、それが連結するタンパク質またはポリペプチドの、細胞のサイトゾルへのトランスロケーションを誘導するポリペプチドである。例えば、第２のＤＮＡは、Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（例えば、破傷風））、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ）またはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素由来のペプチドをコードし得る。本発明は、特定の機構によって限定されないが、免疫原性組成物のトランスロケーションドメインをコードするＤＮＡの存在は、エンドソーム／リソソーム画分からサイトゾルへの抗原のトランスロケーションを介して、その組成物によってコードされる抗原のＭＨＣクラスＩ提示を増強する。好ましくは、毒素をコードする遺伝子の毒素ドメインは、変異または欠失されている。
【００４１】
免疫原性組成物は、上記の第１、第２および第３のＤＮＡを必ずしも含む必要はない。代替的実施形態において、第３のドメイン（免疫が所望される標的抗原）をコードするＤＮＡは、ＨＳＰ（例えば、配列番号９を参照のこと）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（例えば、配列番号２５を参照のこと）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメイン（配列番号３を参照のこと）、またはＡＰＣ結合ポリペプチド（トランスロケーターポリペプチドをコードするＤＮＡの非存在下にある）をコードするＤＮＡに作動可能に連結され；別の実施形態において、キメラ核酸は、トランスロケーター（例えば、細胞質トランスロケーター）ポリペプチドをコードするＤＮＡをさらにコードする。例えば、本発明のキメラ核酸は、Ｅ７−ＥＴＡ、Ｅ７−ＨＳＰ７０、Ｅ７−ＧＭ−ＣＳＦまたはＥ７−ＦＬ（すなわち、Ｅ７−Ｆｌｔ−３リガンド）を含む融合ポリペプチドをコードし得る。本発明の免疫原性組成物は、免疫が要求される抗原をコードするＤＮＡに作動可能に連結された、配列番号２５（Ｆｌｔ−３リガンド）のおよそ１〜およそ１８９の残基をコードするＤＮＡを含み得る。
【００４２】
本発明のキメラ核酸はまた、Ｅ７−ＨＳＰ７０融合ポリペプチド、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７融合ポリペプチド、またはＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７（すなわち、ＧＭ成分を含まない）を含む、免疫原性組成物をコードし得る。
【００４３】
本発明はまた、ＤＮＡワクチンを提供する。ＤＮＡワクチン組成物は、（ａ）熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメイン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）配列、あるいはプロフェッショナル抗原提示細胞に結合するポリペプチドをコードする、第１のＤＮＡ、および（ｂ）抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩ拘束抗原）をコードする、第２のＤＮＡを含む、プラスミドまたは他の発現ベクターを含み得る。このワクチンは、細胞質トランスロケーターポリペプチドをコードするＤＮＡを含む、第３のドメインを含み得る。これらのポリペプチドドメインコード配列（ＤＮＡ）は、その第１、第２、そして適切な場合には、第３のＤＮＡが、「インフレーム」（作動可能に連結される）になる様式で、発現（例えば、プラスミド）ベクターにクローニングされる。この発現（プラスミド）ベクターが取り込まれた細胞において転写および翻訳される場合、このベクターは、上記のドメイン（例えば、ＡＰＣ結合部分、細胞質トランスロケーター部分、およびクラスＩ拘束抗原エピトープ）を含む、キメラポリペプチドの産生を指向する。
【００４４】
代替的な実施形態において、本発明のキメラ核酸（ＤＮＡ）（ポリヌクレオチド）、発現カセットおよびポリペプチドは、単離されている。「単離されている」によって、例えば、目的の遺伝子配列にその生物の天然に存在するゲノム中で隣接する遺伝子を含まない、核酸分子を意味する。従って、この用語には、例えば、ベクター；自律複製プラスミドまたはウイルス；あるいは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれているか、または、他の配列とは独立した別々の分子（例えば、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるｃＤＮＡあるいはゲノムまたはｃＤＮＡフラグメント）として存在する、組換えＤＮＡが含まれる。この用語には、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えＤＮＡもまた含まれる。この用語は、天然に存在するゲノム中で天然においてそれに隣接する１以上の他の遺伝子によって隣接されている所定のＤＮＡ配列を含む、ゲノムＤＮＡの大きいセグメント（例えば、コスミドクローンに存在するセグメント）を排除する。本明細書中の「単離された」の定義もまた参照のこと。
【００４５】
核酸分子（またはポリヌクレオチド）は、ＲＮＡおよびＤＮＡ（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡを含む）の両方を含む。一本鎖の場合、この核酸分子は、センス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。従って、この用語には、例えば、ベクター、自律複製プラスミドまたはウイルス、あるいは原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡのその天然の部位以外の部位に組み込まれているか、または、他の配列とは独立した別々の分子（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるｃＤＮＡあるいはゲノムまたはｃＤＮＡフラグメント）として存在する、組換えＤＮＡが含まれる。この用語には、さらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の部分である組換えＤＮＡもまた含まれる。
【００４６】
所定の参照配列（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＨＳＰ７０（配列番号９）のカルボキシ末端部分、Ｆｌｔ−３リガンド（配列番号２５）、ＧＭ−ＣＳＦ（配列番号１）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ＥＴＡ　ｄＩＩ（配列番号３）の細胞質トランスロケーションドメイン）のヌクレオチド配列を有する鎖、あるいは生物学的に等価な活性を有するに十分高い配列同一性を有するか、または参照配列を有するＤＮＡの鎖またはその相補体に対して高いストリンジェンシーでハイブリダイズする鎖を含む、免疫原性組成物（例えば、キメラポリペプチドまたは「融合タンパク質」）をコードするキメラ核酸（ＤＮＡ）（本発明の発現カセット、ベクター、ＤＮＡワクチンにおけるコード配列を含む）は、本発明の範囲内にある。例えば、本発明の範囲内の核酸は、参照配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、かつ特定の生物学的活性（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ＥＴＡ　ｄＩＩの細胞質トランスロケーションドメイン）を有するポリペプチドをコードするＤＮＡを含む。さらなる例としては、以下が挙げられる：その免疫原性組成物の第１のドメインをコードする第１のＤＮＡによってコードされるポリペプチドの生物学的活性は、ＡＰＣに結合し得、第２のＤＮＡによってコードされるペプチドの生物学的活性は、細胞質トランスロケーションドメインであり得、そして第３のＤＮＡによってコードされるペプチドの生物学的活性は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合し得る。このＤＮＡは、参照配列に対して、少なくとも約７５％の同一性、約８５％の同一性、約９０％の同一性、約９５％の同一性、または約９９％の同一性、または１００％の同一性を有し得る。
【００４７】
配列同一性を計算するために、ヌクレオチドおよびアミノ酸の比較を、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアパッケージ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して行う。使用したＭｅｇＡｌｉｇｎモジュールは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｖ方法（Ｈｉｇｇｉｎｓら、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ５（２）：１５１−１５３）であった。使用したパラメーターは、ギャップペナルティー１０、ギャップ長ペナルティー１０であった。
【００４８】
あるいは、参照配列（上記）を有するＤＮＡの鎖またはその相補体に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし、かつ特定の生物学的活性を有するポリペプチドをコードする免疫原性組成物をコードするキメラ核酸（ＤＮＡ）が、本発明の範囲内にある。ハイブリダイゼーションは、標準的な条件（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，１９８９）に記載のような技術）を使用して行う。「高いストリンジェンシー」とは、高温かつ低塩濃度によって特徴付けられる核酸ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件（すなわち、約０．１×ＳＳＣの塩濃度、６５℃での洗浄条件）をいう。「低い」または「中程度の」ストリンジェンシーとは、低温かつ高塩濃度によって特徴付けられるＤＮＡハイブリダイゼーションおよび洗浄条件（すなわち、少なくとも１．０×ＳＳＣの塩濃度、６０℃未満での洗浄条件）をいう。例えば、高いストリンジェンシー条件は、約４２℃かつ約５０％ホルムアミドでのハイブリダイゼーション；約６５℃、約２×ＳＳＣかつ１％　ＳＤＳでの１回目の洗浄；その後の、約６５℃かつ約０．１％×ＳＳＣでの２回目の洗浄、を含み得る。参照遺伝子または参照配列に約５０％の配列同一性を有するＤＮＡ配列を検出するために適切な低いストリンジェンシー条件は、ホルムアミド非存在下での約４２℃でのハイブリダイゼーション；約４２℃、約６×ＳＳＣかつ約１％　ＳＤＳでの１回目の洗浄；および約５０℃、約６％×ＳＳＣかつ約１％　ＳＤＳでの２回目の洗浄、によって検出する。
【００４９】
本発明は、哺乳動物において抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導する方法を包含し、この方法は、この哺乳動物に、上記の免疫原性組成物をコードするキメラ核酸、またはキメラポリペプチドを投与することによる。１つの実施形態において、この組成物は、裸のＤＮＡとして投与される。この組成物（例えば、ＤＮＡ、ポリペプチド、ベクターなど）はまた、標的細胞によるＤＮＡまたはポリペプチドの取り込みを増強する薬剤の存在下（例えば、リン脂質処方物（例えば、リポソーム））で投与され得る。
【００５０】
この方法は、病原体による感染に対して哺乳動物をワクチン接種するために有用である。１つの実施形態において、本発明のキメラポリペプチド（およびそれらをコードするキメラ核酸）は、この病原体（例えば、ウイルスまたは細菌）由来の抗原を含む。この方法はまた、哺乳動物における癌の発生の予防または既存の癌の処置に有用である。特定の型の癌を発症する危険性がある哺乳動物は、公知の方法（例えば、遺伝子スクリーニング）を使用して同定される。癌を発症する危険性があるかまたは癌を罹患している個体は、その（例えば、第３の）ＤＮＡドメインの抗原ドメインが癌（腫瘍）関連抗原（例えば、子宮頸癌に関連するＨＰＶ　Ｅ７）をコードする組成物を投与することによって、処置される（その状態が、「改善される」）。
【００５１】
本発明はまた、哺乳動物に直接導入された場合に、その哺乳動物内でのコードされたポリペプチドの発現、および次いで、そのコードされたポリペプチドに特異的なＣＤ８＋免疫応答をインビボで誘導する、ポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、生きた脊椎動物細胞に導入された際に、この細胞が、このポリヌクレオチドによってコードされた翻訳産物を産生し得るような、必須の調節エレメント（例えば、転写または翻訳調節エレメント（例えば、プロモーター））を含む核酸であり得る。例えば、このポリヌクレオチドは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメイン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）配列、あるいはそれらの組み合わせまたはフラグメントをコードする、ポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）であり得る。
【００５２】
それに対する免疫応答が所望される抗原性ポリペプチドをコードするキメラ核酸（ＤＮＡ）は、転写プロモーターに作動可能に連結され得る。いくつかの場合において、このポリヌクレオチドによってコードされる抗原は、その動物には通常には存在せず；これは、病理学的状態にある動物においてのみ存在する（例えば、ウイルスに関連する異種タンパク質）。他の場合、この抗原は、疾患状態または他の状態において誤調節されている自己ポリペプチド（例えば、腫瘍関連抗原）であり得る。キメラ核酸（例えば、ＤＮＡワクチン）によってコードされるこのポリペプチドは、インビボで合成され（すなわち、その動物自身の組織によって産生され）；その発現されたキメラタンパク質は、その細胞によってプロセシングされ、そしてＭＨＣ分子（例えば、クラスＩ　ＭＨＣポリペプチド）によって発現され得る。
【００５３】
抗原含有ポリヌクレオチドをコードするキメラ核酸は、インビボ投与のための適切な構築物（例えば、ポリヌクレオチドワクチンに特別に最適化された発現ベクター）に連結され得る。このキメラポリペプチドコード配列は、調節エレメント（例えば、転写プロモーター、エンハンサー）、免疫原性エピトープ、および免疫増強遺伝子または免疫調節遺伝子（これらは、それら自身の調節エレメント（例えば、プロモーター、転写ターミネーター）を有し得る）をコードするさらなるコード配列（例えば、シストロン）に作動可能に連結され；この構築物はまた、細菌の複製起点および／または抗生物質耐性遺伝子を含み得る。このベクターはまた、ポリシストロニックのｍＲＮＡの発現のための内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。転写ターミネーターには、Ｔ７またはＳＰ６プロモーターのような強力なＲＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれる。
【００５４】
本明細書中に記載のポリヌクレオチドおよびＤＮＡワクチンは、コードされる抗原に対する保護免疫を誘発する。例えば、抗原Ｅ７をコードするＤＮＡ発現ベクターの注入は、腫瘍細胞の死または腫瘍細胞増殖の減少を生じる。腫瘍細胞に対する抗原特異的ＣＴＬは、ワクチン接種後に生成される。
【００５５】
多くの利点は、本発明のキメラ核酸および発現系のインビボ投与ワクチン接種ストラテジーに関連する。多くの公知のＤＮＡワクチンの欠点は、その限定された効力である。標準的なＤＮＡワクチンとは対照的に、本発明のキメラ核酸（ポリヌクレオチド）およびワクチン接種方法は、強力な抗原特異的免疫療法を生じる。本発明のポリヌクレオチドおよびＤＮＡワクチンは、従来のＤＮＡワクチン（例えば、本発明のキメラ核酸（例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ内毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメイン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）配列（あるいは、ＡＰＣ結合ドメインまたは細胞質トランスロケーションドメイン））を含む、第１のポリペプチドドメイン；および抗原性ポリペプチドを含む、第２のポリペプチドドメイン、を含むキメラポリペプチドをコードする配列）を含まない配列）よりも、少なくとも約２倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍または少なくとも約４０倍の、細胞性免疫応答（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答）を誘導し得る。
【００５６】
ワクチンの効力は、本明細書中に記載のように、当該分野で公知の方法によって（例えば、ワクチン接種後に誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体を測定することによって、またはワクチン接種後の病原体（例えば、ウイルス）または腫瘍負荷の減少を測定することによって）決定され得る。本発明は、いかなる特定の作用機構によって限定されないが、ＤＮＡワクチンにコードされるポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ経路に入りそして細胞傷害性Ｔ細胞応答を惹起する能力を、有し得る。１つの実施形態において、詳細には、本発明のキメラ核酸（例えば、ＤＮＡワクチン）は、細胞質トランスロケーションポリペプチドドメイン（「細胞質トランスロケータードメイン」）をコードすることによって、免疫原を、ＭＨＣクラスＩ抗原プロセシング経路に指向するよう設計される。結果として、細胞性Ｔ細胞応答の誘発が、最適化される。
【００５７】
ＤＮＡワクチンの他の利点としては、安全性および大規模生産の簡素化が挙げられる。本発明のワクチンは、家庭用動物または畜産動物、ならびにヒトへの投与に有用である。例えば、裸のプラスミドＤＮＡは、安全であり、低い免疫原性を有し、そして繰り返し投与され得る。ＤＮＡワクチンは、高純度で大規模で容易に調製され、そしてタンパク質および他の生物学的ポリマーよりも高度に安定である。例えば、米国特許第５，５８０，８５９号；同第５，５８９，４６６号；同第５，９１０，４８８号を参照のこと。
【００５８】
ワクチンレシピエントに導入される発現可能なＤＮＡまたは転写されるＲＮＡの量は、使用される転写プロモーターおよび翻訳プロモーターの強度に依存して変化し得る。さらに、免疫応答の大きさは、タンパク質発現のレベルおよび発現される遺伝子産物の免疫原性に依存し得る。一般的に、約１ｎｇ〜５ｍｇの間、１００ｎｇ〜２．５ｍｇの間、または約１μｇ〜約７５０μｇの間、または約１０μｇ〜約３００μｇの間の範囲の有効用量であるＤＮＡが、体の組織（例えば、筋肉組織または皮膚組織）に直接投与される。静脈内投与（ＩＶ）のための１投薬量のＤＮＡは、約１０６〜１０２２コピーのＤＮＡ分子である。皮下注射（ＳＣ）、皮内導入、皮膚を通じた圧痕、および他の投与様式（例えば、腹腔内送達、静脈内送達、または吸入送達）がまた、適している。例えば、ＤＮＡは、例えば、「遺伝子銃」を用いて「バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）」によって投与され得る。ブースター予防接種が、同様の様式で投与され得る。例えば、米国特許第６，００４，２８７号；同第５，７５３，４７７号；同第５，１７９，０２２号を参照のこと。
【００５９】
ＤＮＡワクチンはまた、公知の方法（例えば、Ｐａｎら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５５（２１）：４７７６−４７７９およびＰａｎら、１９９５、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．１（５）：４７１−７に記載される方法）を用いてＬｉｓｔｅｒｉａ　ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓワクチンの一部として送達されるために処方され得る。ポリヌクレオチド免疫原を用いた予防接種後、免疫応答はまた、対応するポリペプチド免疫原を投与することによってブーストされ得る。
【００６０】
キメラ核酸、ベクターまたは他のポリヌクレオチドは、裸であり得、すなわち、レシピエントの免疫系に影響を与えるいずれかのタンパク質、アジュバント、または他の因子と結合していない。裸のＤＮＡは、生理学的受容可能な溶液（例えば、滅菌生理食塩水、または滅菌緩衝化生理食塩水）中で投与される。
【００６１】
あるいは、ＤＮＡは、リポソームと（例えば、レクチンリポソームまたはＤＮＡ−リポソーム混合物として）結合され得る。カルシウムイオンのようなＤＮＡの細胞取り込みを補助する因子（すなわち、トランスフェクション促進因子）がまた、使用され得る。ポリヌクレオチドでコートされた微粒子（例えば、金の粒子）がまた、ワクチンを投与する手段として有用である。小粒子リポソームまたは脂質複合体エーロゾル化合物がまた、使用されて、本発明の核酸を送達し得る（例えば、米国特許第６，０９０，４０７号を参照のこと）。
【００６２】
（免疫原性組成物の機能的成分）：本発明のキメラ核酸は、２または３またはそれより多くの機能ドメインを有するキメラ遺伝子産物を産生するために発現され得る、連続的な核酸配列を含む：第１のポリペプチドドメインは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）配列、またはＡＰＣ結合ドメインを含み；そして第２のポリペプチドドメインは、抗原性ポリペプチド（例えば、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープ）を含む。キメラ核酸はさらに、細胞質トランスロケーションドメインをコードする配列を含み得る。このコードされる遺伝子産物は、強力な免疫応答（特に、細胞傷害性Ｔ細胞応答）を生成する。この応答は、キメラ遺伝子産物を投与するよりも強力であり、そして熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）配列、またはＡＰＣ結合部分を伴わない、抗原（例えば、ＭＨＣクラスＩ制限エピトープ）をコードするＤＮＡワクチン；あるいは、１つの実施において、細胞質トランスロケーション部分を投与するよりも、強力である。
【００６３】
（抗原特異的免疫応答の増強を与えるＨＳＰ７０のドメイン）：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＨＳＰ７０のドメイン構造が、以下の実施例５に詳細に記載されるように決定された。少なくとも３つの機能ドメインが、同定された：ＡＴＰａｓｅドメイン（配列番号９の残基１〜３５６を含む）、基質結合ドメイン（ＳＤ；配列番号の９残基３５７〜５１６を含む）、およびカルボキシ末端ドメイン（ＣＤ；配列番号９の残基５１７〜６２５を含む）（図１６）。このＨＳＰ７０の各ドメインの裸のＤＮＡワクチンの能力に対する寄与が決定された。各ドメインをコードするＤＮＡは、パピローマウイルス抗原Ｅ７をコードするＤＮＡにインフレーム（すなわち、作動可能に）連結される。Ｅ７特異的ＣＤ８　Ｔ細胞免疫応答が、測定された。
【００６４】
この結果は、ＤＮＡワクチン構築物に組み込まれた場合に、ＨＳＰ７０の細胞質ドメイン（ＣＤ）をコードするＤＮＡが、ワクチンによってコードされる標的抗原に対する免疫を生成する際の、このＤＮＡワクチンの能力を増加することを示す。さらに、この細胞質ドメインが、全長ＨＳＰ７０を含むＤＮＡ構築物における抗原特異的ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の増強の大部分の原因である。
【００６５】
（定義）
他に示されない限り、本明細書中に使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有する。本明細書中に使用される場合、以下の用語は、他に具体化されない限り、それらに与えられた意味を有する。
【００６６】
用語「抗原」または「免疫原」は、本明細書中に使用される場合、適切な量（「免疫学的有効量」）（すなわちこれは、細胞性および／または体液性免疫応答を誘発、増加、またはブーストし得る（これはまた、例えば、抑制誘導の場合には、免疫抑制であり得る））で、単独または別の物質と組合わせてか、もしくは結合させてか、もしくは融合されてか（これらは、一度にかまたは数回の間隔にわたって投与され得る）のいずれかで投与される（または核酸（例えば、ＤＮＡワクチン）を投与することによってインビボ発現される）場合に、「抗原性」または「免疫原性」である、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む、化合物または組成物をいう。
【００６７】
用語「発現カセット」は、本明細書中に使用される場合、ヌクレオチド配列と適合性である宿主中で、構造遺伝子の発現に影響を与え得るヌクレオチド配列（すなわち、タンパク質コード配列）をいう。発現カセットは、ポリペプチドコード配列と；および必要に応じて、他の配列（例えば、転写終了シグナル）と作動可能に連結された少なくとも１つのプロモーター含む。発現をもたらす際に必要であるかまたは有用であるさらなる因子（例えば、エンハンサー）がまた、使用され得る。「作動可能に連結された」は、本明細書中に使用される場合、プロモーターがＤＮＡ配列の転写を媒介するような、このＤＮＡ配列から上流のプロモーターの連結をいう。従って、発現カセットはまた、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、任意の形態の組換え「裸のＤＮＡ」ベクターなどを含む。「ベクター」は、細胞を感染、トランスフェクト、一過性もしくは永久的に形質転換し得る核酸を含む。ベクターが裸の核酸、またはタンパク質もしくは脂質と複合体化した核酸であり得ることが、認識される。このベクターは、必要に応じて、ウイルスまたは細菌の、核酸および／またはタンパク質、および／または膜（例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープなど）を含む。ベクターは、ＤＮＡのフラグメントが結合され得、そして複製されるようになるレプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン（以下の実施例６を参照のこと）、バクテリオファージ）を含むが、これに限定されない。従って、ベクターは、ＲＮＡ、自律性自己複製環状ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または自律性自己複製線状ＤＮＡもしくはＲＮＡ（例えば、プラスミド、ウイルスなど（例えば、米国特許第５，２１７，８７９号を参照のこと））を含むが、これらに限定されず、そして発現プラスミドおよび非発現プラスミドの両方を含む。組換え微生物または細胞培養物が「発現ベクター」の宿主になると記載される場合、これらには、染色体外の環状ＤＮＡおよび線状ＤＮＡならびに宿主染色体に組込まれているＤＮＡの両方を含む。ベクターが宿主細胞によって維持される場合、このベクターは、有糸分裂の間に自律構造として細胞によって安定に複製され得るか、または宿主ゲノム中に組込まれるかのいずれかであり得る。
【００６８】
用語「連結された」または「化学的に連結された」は、例えば、本発明の１つの実施形態におけるような（ここで、ＥＲシャペロンポリペプチドは、抗原性ペプチドに化学的に連結される）２つの部分の任意の化学結合をいう。このような化学結合は、組換え産生された融合タンパク質またはインビボ産生された融合タンパク質のペプチド結合を含む。
【００６９】
用語「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、第２のポリペプチドまたはペプチドドメインと結合した、少なくとも１つのポリペプチドまたはペプチドドメインを含む組成物をいう。例えば、１つの実施形態において、本発明は、融合タンパク質（キメラポリペプチド）をコードする単離された核酸分子または組換え核酸分子を提供し、この融合タンパク質は、少なくとも２つのドメインを含み、第１のポリペプチドドメインは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質トランスロケーションドメイン、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）配列を含み、そして第２のポリペプチドドメインは、抗原性ポリペプチドを含む。さらなるドメインは、ポリペプチド、ペプチド、多糖などを含み得る。「融合」は、ペプチド結合、化学連結、荷電相互作用（例えば、静電気的な誘引、例えば塩の架橋、Ｈ−結合など）などによって生成される結合であり得る。ポリペプチドが組換えである場合、「融合タンパク質」は、共通のメッセージから翻訳され得る。あるいは、このドメインの組成物は、任意の化学手段または静電気的な手段によって連結され得る。本発明のキメラ分子はまた、さらなる配列、例えば、リンカー、エピトープタグ、酵素切断認識配列、シグナル配列、分泌シグナルなどを含み得る。あるいは、ペプチドは、簡単にキャリアへ連結されて、キメラポリペプチドの操作または同定／配置を容易にし得る。
【００７０】
用語「抗原性」または「免疫原性」または「免疫原性組成物」は、単独でかまたは別の物質と組合せもしくは連結もしくは融合されてかのいずれかで、「免疫原性」である（すなわち、細胞性および／または体液性免疫応答を、誘発、増加、またはブーストし得る）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を含む、化合物または組成物をいう。免疫原性組成物は、少なくとも約５アミノ酸、１０アミノ酸長のペプチド、１５アミノ酸長のフラグメント、２０アミノ酸長またはこれより長いフラグメントのペプチドであり得る。免疫原は、「キャリア」ポリペプチドおよびハプテン（例えば、別の組成物に融合または連結（化学的かまたは別の方法で）された、融合タンパク質またはキャリアポリペプチド）を含み得る。免疫原は、免疫化ベクターに組換え発現され得、これは、プロモーターに作動可能に連結された免疫原のコード配列を含む単純な裸のＤＮＡ（例えば、単純な発現カセット）であり得る。免疫原は、抗体または（ＭＨＣ分子のペプチド結合部位に結合する場合）Ｔリンパ球レセプター（ＴＣＲ）が結合する、抗原決定基もしくはエピトープを含み；これらのエピトープは、代表的に３〜１０アミノ酸長である。
【００７１】
本明細書中に使用される場合、用語「単離された」は、分子または組成物（例えば、本発明のキメラ核酸またはポリペプチド）をいう場合、この分子または組成物が、少なくとも１つの他の化合物（例えば、タンパク質）、他の核酸（例えば、ＲＮＡ）、または他の夾雑物（これは、インビボまたはその天然に存在する状態において、この分子または組成物が結合されている）から分離されることを意味する。従って、組成物は、この組成物がインビトロまたはインビボで組換え産生されたことに起因して、この組成物が「天然に」結合されているかまたは結合されている任意の他の成分（例えば、細胞抽出液の場合、細胞膜）から単離されている場合、単離されているとみなされる。しかし、単離された組成物はまた、実質的に純粋であり得る。単離された組成物は、均質状態であり得、そして乾燥もしくは水溶液中であり得る。純度および均質性は、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）または高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような分析的な化学手段を用いて決定され得る。従って、本発明の単離された組成物は、そのインサイチュ環境と通常関連する物質を含まない。たとえタンパク質が均質性のバンドまたは優性なバンドに単離されている場合でも、所望の組成物と共に同時精製される微量の夾雑物が存在し得る。
【００７２】
ＨＰＶ−１６　Ｅ７ポリペプチドを含む、句「ＨＰＶポリペプチド」は、当該分野で周知のポリペプチドを記載する；例えば、ＨＰＶ−１６　Ｅ７に関して、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１２５６７３（１９９９年６月１日）は、完全ＨＰＶ−１６ゲノムおよびＨＰＶ−１６　Ｅ７タンパク質を記載することを参照のこと。
【００７３】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」は、改変体が誘導されたポリペプチドに実質的に対応する構造および活性を有する「アナログ」または「保存的改変体」および「模倣物」または「ペプチド模倣物」もまた含む、本発明の組成物を含み、これには、例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素Ａの細胞質トランスロケーションドメイン（ＥＴＡ　ｄＩＩ）、もしくは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）配列が挙げられる。
【００７４】
用語「薬学的組成物」は、被験体における薬学的使用に適した組成物（例えば、ワクチン）をいう。本発明の薬学的組成物は、例えば、本発明の核酸、またはベクター、または細胞を含む薬理学的有効量の組成物ならびに薬学的に受容可能なキャリアを含む処方物である。
【００７５】
用語「プロモーター」は、核酸の転写を指向する核酸制御配列の配列である。本明細書中に使用される場合、プロモーターは、転写開始部位付近の必要な核酸配列（例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメント）を含む。プロモーターまたは、必要に応じて、転写開始部位から数千塩基対ほどに配置され得る遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含む。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境および成長状態下で活性である。「誘導可能な」プロモーターは、環境の調節または成長の調節下で活性である。「組織特異的」プロモーターは、ある生物の特定の組織型で活性であるが、同じ生物由来の他の組織型では活性でない。用語「作動可能に連結された」は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター、転写因子結合部位の配列）と第２の核酸配列との間の機能的連結をいい、ここで、この発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指向する。
【００７６】
用語「組換え」は、合成されたかもしくは他の方法でインビトロで操作されたポリヌクレオチド（例えば、「組換えポリヌクレオチド」）、細胞もしくは他の生物系において遺伝子産物を産生するための組換えポリヌクレオチドを使用する方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（「組換えタンパク質」）をいう。例えば、組換え核酸または組換えポリペプチドは、本明細書中に記載される場合、本発明の方法を実施するために使用され得る。「組換え手段」はまた、種々のコード領域もしくはコードドメインまたは異なる供給源からのプロモーター配列を有する核酸の、本発明の実施に使用されるベクターにおけるポリペプチドコード配列の発現（例えば、誘導可能な発現または構成的発現）のための発現カセットまたは発現ベクターへの連結を含む。
【００７７】
用語「自己複製ＲＮＡレプリコン」は、異種ＲＮＡおよび異種タンパク質の発現を可能にするために操作されたＲＮＡウイルス（例えば、αウイルスゲノムＲＮＡ（例えば、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルスなど））に基づく構築物をいう。これらの組換えベクターは、自己複製し（すなわち、これらは「レプリコン」である）、そして以下により詳細に記載されるように裸のＲＮＡまたは裸のＤＮＡとして細胞に導入され得る。１つの実施形態において、自己複製ＲＮＡレプリコンは、シンドビスウイルス自己複製ＲＮＡベクター　ＳＩＮｒｅｐ５（これは、米国特許第５，２１７，８７９号に詳細に記載される）を含む。
【００７８】
用語「全身投与」は、組成物または薬物（例えば、本発明のＤＮＡワクチンまたは本明細書中に記載されるキメラ核酸およびポリペプチド）の循環系への導入をもたらすような様式での、組成物または薬物の投与をいう。用語「局所投与」は、特定の解剖学的空間（例えば、腹腔内、髄腔内、硬膜下または特定の器官へのなど）への組成物または薬物の投与をいう。例えば、局所投与としては、肝臓への局所投与のための、組成物または薬物の肝臓動脈への投与が挙げられる。用語「局部投与」は、限定されるかまたは限局性の、解剖学的空間（例えば、腫瘍塊への腫瘍内注射、皮下注射、筋内注射など）への組成物または薬物の投与をいう。当業者は、局部投与または局所投与がまた、循環系への組成物または化合物の侵入を引き起こし得ることを理解する。
【００７９】
（核酸の作製および操作）
本発明の方法は、本明細書中に記載されるような融合タンパク質をコードする核酸の投与を提供する。組換え融合タンパク質は、インビトロまたはインビボで合成され得る。これらの組成物をコードする核酸は、「裸のＤＮＡ」の形態であり得るか、またはこれらは、インビボまたはエキソビボ投与のために、プラスミド、ベクター、組換えウイルス（例えば、「レプリコン」）などに組み込まれ得る。本発明の核酸およびベクターは、インビトロまたはインビボで作製および発現され得、これらの遺伝子およびベクターを作製および発現する多様な手段が、使用され得る。当業者は、所望の遺伝子活性が、本発明を実施するために使用されるベクター内で遺伝子および核酸（例えば、プロモーター）の発現または活性を調節することによって得ることができることを、認識する。遺伝子の発現もしくは活性を増加または減少するために記載される公知の方法、またはこの遺伝子の組織特異性に関して記載される公知の方法のいずれかが、本発明のために使用され得る。本発明は、科学文献および特許文献に十分に記載される当該分野で公知の任意の方法またはプロトコールと組合わせて実施され得る。
【００８０】
（一般的な技術）
本発明を実施するために使用され得る核酸配列（ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、組換えウイルス、またはこれらのハイブリッドに関わらず）が、種々の供給源から単離され、遺伝子操作され、増幅され、そして／または組換え発現され得る。任意の組換え発現系が使用され得、これには、細菌細胞に加えて、例えば、哺乳動物細胞発現系、酵母細胞発現系、昆虫細胞発現系、または植物細胞発現系が挙げられる。あるいは、これらの核酸は、例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ（１９８２）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．４７：４１１−４１８；Ａｄａｍｓ（１９８３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０５：６６１；Ｂｅｌｏｕｓｏｖ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３４４０−３４４４；Ｆｒｅｎｋｅｌ（１９９５）Ｆｒｅｅ　Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１９：３７３−３８０；Ｂｌｏｍｍｅｒｓ（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３３：７８８６−７８９６；Ｎａｒａｎｇ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０；Ｂｒｏｗｎ（１９７９）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９；Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９８１）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．２２：１８５９；米国特許第４，４５８，０６６号に記載されるような、インビトロで周知の化学合成技術によって合成され得る。次いで、二本鎖ＤＮＡフラグメントが、相補鎖を合成し、適切な条件下でこれらの鎖を一緒にアニーリングすることによってか、または適切なプライマー配列を用いてＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を付加することによってかのいずれかで、得ることができる。
【００８１】
核酸の操作のための技術（例えば、配列中に変異を発生させる技術、サブクローニングする技術、プローブを標識する技術、スクリーニングする技術、ハイブリダイゼーションする技術など）は、科学文献および特許文献に十分に記載されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ編，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＭＡＮＵＡＬ（第２版），第１〜３巻，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ　ＩＮ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ，Ａｕｓｕｂｅｌ編，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９７）；ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ　ＩＮ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ　ＡＮＤ　ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ　ＢＩＯＬＯＧＹ：ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ　ＷＩＴＨ　ＮＵＣＬＥＩＣ　ＡＣＩＤ　ＰＲＯＢＥＳ，Ｐａｒｔ　Ｉ．Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｔｉｊｓｓｅｎ編．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）を参照のこと）。
【００８２】
核酸、ベクター、カプシド、ポリペプチドなどは、当該分野で周知の任意の数の一般的な手段によって分析および定量され得る。これらの方法には、例えば、生化学的分析方法（ＮＭＲ、分光測定、Ｘ線撮影、電気泳動、キャリラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、およびハイパーディフュージョン（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー）、種々の免疫学的方法（例えば、流体またはゲル沈殿反応、免疫拡散法、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、サザン分析、ノーザン分析、ドットブロット分析、ゲル電気泳動法（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、他の核酸または標的またはシグナル増幅法、放射性同位元素標識法、シンチレーション計数法、およびアフィニティクロマトグラフィ法）が挙げられる。
【００８３】
（核酸の増幅）
オリゴヌクレオチドプライマーを使用して核酸を増幅し、以下に使用するための融合タンパク質をコードする配列を産生する：本発明を実施するため；インビボ投与後のワクチンのレベル（例えば、プラスミドまたはウイルスのレベル）をモニタリングするため；その存在および活性ＣＴＬの表現型を確認するためなど。当業者は、公知の配列（例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメント、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｅｎｏｔｏｘｉｎ　Ａ（ＥＴＡ　ｄＩＩ）の細胞質転座ドメイン、または顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）配列をコードする配列）を使用して、適切なオリゴヌクレオチド増幅プライマーを選択および設計し得る。増幅方法はまた、当該分野で周知であり、これらには、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応ＰＣＲ（ＰＣＲ　ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，Ａ　ＧＵＩＤＥ　ＴＯ　ＭＥＴＨＯＤＳ　ＡＮＤ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ，ｅｄ．Ｉｎｎｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９０）およびＰＣＲ　ＳＴＲＡＴＥＧＩＥＳ（１９９５），ｅｄ．Ｉｎｎｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｕ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４：５６０；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０７７；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ（１９９０）Ｇｅｎｅ　８９：１１７を参照のこと）；転写増幅（例えば、Ｋｗｏｈ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：１１７３を参照のこと）；ならびに自己持続性配列複製（例えば、Ｇｕａｔｅｌｌｉ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：１８７４を参照のこと）；Ｑベータレプリカーゼ増幅（例えば、Ｓｍｉｔｈ（１９９７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３５：１４７７−１４９１を参照のこと），自動Ｑベータレプリカーゼ増幅アッセイ（例えば、Ｂｕｒｇ（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ　１０：２５７−２７１を参照のこと）ならびに他のＲＮＡポリメラーゼ触媒技術（例えば、ＮＡＳＢＡ，Ｃａｎｇｅｎｅ，Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ）；Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３０７−３１６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ；米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；Ｓｏｏｋｎａｎａｎ（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１３：５６４を参照のこと。
【００８４】
（発現カセットのクローニングおよび構築）
発現カセット（プラスミド、組換えウイルス（例えば、以下に記載されるレプリコンのようなＲＮＡウイルス）および本明細書中に記載される融合タンパク質をコードする他のベクター）を使用して、これらのポリペプチドをインビトロおよびインビボで発現させる。種々の従来の技術によって発現された組換え核酸は、科学文献および特許文献にいて十分に記載される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ　（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ　３２８：７３１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＴｉｊｓｓｅｎまたはＡｕｓｕｂｅｌを参照のこと。プラスミド、ベクターなどは、天然供給源から単離されるか、ＡＴＣＣまたはＧｅｎＢａｎｋライブラリのような供給源から入手されるか、または合成もしくは組換え方法によって調製される得る。
【００８５】
本発明を実施するために使用される核酸は、安定的または過渡的に細胞（例えば、エピゾーム発現系）中で発現され得る。選択マーカーは、形質転換された細胞上での選択可能な表現型を与えるために取りこまれ得る。例えば、選択マーカーは、エピゾームの維持および複製のためにコードし得るので、宿主ゲノムへの取り込みは必要とされない。例えば、このマーカーは、抗生物質耐性（例えば、クロラムフェニコール、カナマイシン、Ｇ４１８、ベロマイシン、ハイグロマイシン）または除草剤耐性（例えば、クロロスルフロンまたはＢａｓｔａ）をコードし得、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたこれらの細胞の選択を可能にする（例えば、Ｂｌｏｎｄｅｌｅｔ−Ｒｏｕａｕｌｔ（１９９７）Ｇｅｎｅ　１９０：３１５−３１７；Ａｕｂｒｅｃｈｔ（１９９７）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２８１：９９２−９９７を参照のこと）。
【００８６】
（インビボ核酸投与）
１実施形態において、本発明のキメラ核酸を、インビトロ、エキソビボおよび／またはインビボで、細胞（例えば、ヒトの細胞または他の哺乳動物の細胞）にトランスフェトまたは感染させ得る発現カセット（例えば、プラスミドまたは他のベクター、ウイルス）にクローニングする。任意のアプローチとしては、以下を使用し得る：例えば、脂質またはリポゾームベースの遺伝子送達（例えば、Ｍａｎｎｉｎｏ（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：６８２−６９１；米国特許番号第５，２７９，８３３号を参照のこと）、レトロウイルスゲノムの一部として所望の外来性配列を用いた複製欠損レトロウイルスベクター（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０：４２３９；Ｋｏｌｂｅｒｇ（１９９２）Ｊ．ＮＩＨ　Ｒｅｓ．４：４３；Ｃｏｒｎｅｔｔａ（１９９１）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．２：２１５を参照のこと）。例えばまた、Ｚｈａｎｇ（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ　Ｒｅｖ．１５：３８５−４０１；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：８０８−８１３；Ｎａｂｅｌ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ　１１：２１１−２１７；Ｍｉｔａｎｉ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ　１１：１６２−１６６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，９２６−９３２；Ｄｉｌｌｏｎ（１９９３）ＴＩＢＴＥＣＨ　１１：１６７．１７５；Ｍｉｌｌｅｒ（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ　３５７：４５５−４６０を参照のこと。
【００８７】
発現カセットはまた、ウイルスゲノムから誘導され得る。使用され得るベクターとしては、例えば、バキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科、ピコルナウイルス科、またはアレナウイルス科由来の、組換え改変されたエンベロープＤＮＡおよびＲＮＡウイルスまたは非エンベロープＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが挙げられる。親のベクター特性の各々のアデノウイルスの利点を展開する、キメラベクターがまた使用され得る（例えば、Ｆｅｎｇ（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１５：８６６−８７０を参照のこと）。腫瘍サプレッサ遺伝子を含むように、このようなウイルスゲノムを組換えＤＮＡ技術によって改変し、そして複製欠損、条件付き複製または複製成分になるように遺伝子操作し得る。このベクターは、複製欠損または条件複製であり得る。ベクターは、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたはレトロゲノムから誘導され得る。レトロウイルスとしては、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、シミアン免疫欠乏ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫欠乏ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくアデノウイルスを含み得る。例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（５）２７３１−２７３９；Ｊｏｈａｎｎ（１９９２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（５）：１６３５−１６４０（１９９２）；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．１７６：５８−５９；Ｗｉｌｓｏｎ（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８；Ｍｉｌｌｅｒ（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：２２２０−２２２４を参照のこと。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクターはまた、例えば、核酸およびペプチドのインビトロ産生、ならびにインビボおよびエキソビボ治療手順のために細胞を形質導入するために使用され得る。例えば、Ｏｋａｄａ（１９９６）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒ．３：９５７−９６４；Ｗｅｓｔ（１９８７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６０：３８−４７；Ｃａｒｔｅｒ（１９８９）米国特許第４，７９７，３６８号；ＣａｒｔｅｒらＷＯ　９３／２４６４１（１９９３）；Ｋｏｔｉｎ（１９９４）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　５：７９３−８０１；Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｓｔ．９４：１３５１（ＡＡＶベクターの総説のため）を参照のこと。
【００８８】
（自己複製ＲＮＡレプリコンを使用するインビボ投与）
上記の発現ベクターおよび組換えウイルスに加えて、自己複製ＲＮＡレプリコンを使用して、本発明のタンパク質発現核酸で細胞もしくは組織または全生物を感染し得る。従って、本発明はまた、ＲＮＡウイルス（例えば、アルファウイルスゲノムＲＮＡ（例えば、シンドビスウイルス；セムリキ森林ウイルス；ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスなど））を取り込み、このウイルスは、異種ＲＮＡおよびタンパク質の発現を可能にするように遺伝子操作される。異種配列の高レベルの発現（例えば、本発明の融合タンパク質）は、このウイルス構造遺伝子が同種コード遺伝子によって置換される場合に達成される。
【００８９】
これらの組換えＲＮＡは自己複製し（すなわち、このＲＮＡは「レプリコン」である）、そして裸ＲＮＡまたはＤＮＡとして細胞中に導入され得る。しかし、これらは、パッケージングし、そして感染性ウイルス粒子として細胞から放出するためにトランス相補体を必要とする。この欠損ヘルパーＲＮＡは、複製に必要とされるｃｉｓ−作用配列およびポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームの発現を駆動するＲＮＡプロモーターを含む。このレプリコンと欠損ヘルパーＲＮＡの両方で同時形質転換した細胞において、このレプリコンＲＮＡから翻訳されたウイルス非構造的タンパク質は、この欠損ヘルパーＲＮＡの複製および転写によりビリオン構造タンパク質を産生することを可能にする。例えば、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ（１９９３）Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６７：６４３９−６４４６を参照のこと。
【００９０】
ＲＮＡレプリコンワクチンは、以下のアデノウイルスベクターから誘導され得る：例えば、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルス（トガウイルス科のファミリー）（例えば、Ｘｉｏｎｇ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４３：１１８８−１１９１を参照のこと）、セムリキ森林ウイルス（例えば、Ｙｉｎｇ（１９９９）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：８２３−８２７を参照のこと）またはベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスウイルス（例えば、Ｐｕｓｈｋｏ（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２３９：３８９−４０１を参照のこと）ベクター。これらのワクチンは自己複製および自己制御し、そしてＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかとして投与され得、次いでこれは、トランスフェクトされた細胞でまたはインビボでＲＮＡレプリコンに転写される（例えば、Ｐｕｓｈｋｏ（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　２３９：３８９−４０１を参照のこと）。自己複製ＲＮＡは、多様な範囲の細胞型を感染し、そして目的の抗原の発現を高レベルで可能にする（例えば、Ｈｕａｎｇ（１９９６）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：５３１−５３５を参照のこと）。さらに、自己複製ＲＮＡは、トランスフェクトされた細胞を結果として溶解する。なぜならば、ウイルスレプリコンは、感染した宿主細胞に対して毒性であるからである（例えば、Ｆｒｏｌｏｖ（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：１１８２−１１９０を参照のこと）。従って、これらのベクターは、宿主ゲノムへの裸ＤＮＡワクチンの取り込みに関する重要性を生じない。これは、強力に発癌性であるワクチン展開標的タンパク質（例えば、アデノウイルスＥ７タンパク質）にとって特に重要である。
【００９１】
１実施形態において、この自己複製ＲＮＡレプリコンは、例えば、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３　９−６４４６に詳細に記載されているようなシンドビスウイルス自己複製ＲＮＡベクターＳＩＮｒｅｐ５を含む（例えばまた、Ｈｅｒｒｍａｎｎ（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５３．５２４を参照のこと）。
【００９２】
（薬学的組成物の処方物および投与）
本発明の種々の実施形態において、ポリペプチド、核酸、発現カセット、細胞、および粒子を十分な量の薬理学的組成物として個体に投与して、個人における抗原特異的免疫応答（例えば、ＣＴＬ応答）を生じさせる。
【００９３】
核酸、ペプチドおよびポリペプチドのための薬学的に受容可能なキャリアおよび処方物は、当業者に公知であり、そして科学文献および特許文献において詳細に記載されている（例えば、ｔｈｅ　ｌａｔｅｓｔ　ｅｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｍａａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ」）；Ｂａｎｇａ；Ｐｕｔｎｅｙ（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１５３−１５７；Ｐａｔｔｏｎ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　１６：１４１−１４３；Ｅｄｗａｒｄｓ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７６：１８６８−１８７１；米国特許第５，７８０，４３１号；同第５，７７０，７００号；同第５，７７０，２０１号を参照のこと）。
【００９４】
本発明の方法において使用される核酸およびポリペプチドは、当該分野で公知の任意の手段によって、単独または薬学的組成物として送達され得る：例えば、全身的、局部的、または局所的；皮下、気管内（例えば、エアロゾルによる）または経粘膜（例えば、頬粘膜、膀胱粘膜、膣粘膜、子宮粘膜、直腸粘膜、鼻粘膜）のような、動脈内、くも膜下腔内（ＩＴ）、静脈内（ＩＶ）、非経口、胸膜内管腔、局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与、経口投与、または局所（ｌｏｃａｌ）投与。組成物を送達するための実際の方法は、公知であるか、または当業者に公知であり、そして科学文献および特許文献（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎの文献）に詳細に記載されている。
【００９５】
この薬学的組成物は、任意のプロトコールによって、および種々の単位用量形態で投与され得、投与の方法および経路および頻度、他の薬物が投与されるかどうか、個人の応答などに依存する。代表的な核酸、ペプチドおよびポリペプチドの薬学的組成物の投薬は、当該分野で周知である。このような投薬は、代表的に本質において注意を要し、種々の因子に依存して調節される（例えば、開始応答（例えば、産生された抗原特異的なＣＴＬの量、腫瘍収縮など）、特定の治療状況、患者の健康および耐性）。所望の応答を産生するのに適切な薬学的組成物の量は、「治療的有効量」として規定される。この投薬スケジュールおよびこの使用のための有効量（すなわち、「投薬レジメン」）は、種々の因子（例えば、免疫によって処置または予防される疾患または状態、患者の健康の一般的な状態、患者の身体状態、年齢、薬学的処方物および薬学的組成物の濃度など）に依存する。この投薬レジメンは、薬物動態学（すなわち、吸収、バイオアベイラビリティー、代謝、クリアランスなど（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎを参照のこと））を考慮する。投薬は、例えば、症状の軽減または緩和をアッセイすることによって、または目的の基準（例えば、抗原特異的ＣＴＬの測定レベル）によって経験的に決定され得る。上記のように、単一または複数の投与は、必要とされる場合に用量および頻度に依存して投薬され得、そして患者に耐性である。薬学的組成物は、単独または他の治療学的処置と組合せて、あるいは予防免疫として投与され得る。
【００９６】
（キット）
本発明は、上記のような本発明の薬学的組成物を含むキットを提供し、本発明の方法を実施する。代替の実施形態において、このキットは本発明の組換えまたは合成キメラポリペプチド；またはこれらをコードする核酸（例えば、裸ＤＮＡの形態（プラスミド）、ウイルス（例えば、アデノウイルス誘導「レプリコン」（シンドビスウイルスレプリコンを含む）などの形態）を含み得る。このキットは、方法（例えば、本発明を実施するために使用される組成物を投与する手段、注射する手段または本発明の核酸もしくはポリペプチドで細胞または患者または動物を感染させる手段、得られた免疫応答（ＣＴＬ応答）をモニタリングする手段および組成物が投与された個体の反応を評価するする手段など）を教示する指示書を含み得る。
【００９７】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示の目的のみのためであり、それに照らし合わせた種々の改変または変化は、当業者に示唆され、そして本出願の意図および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解されるべきである。
【００９８】
（実施例）
以下の実施例は、例示のために提供され、本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。
【００９９】
（実施例１：抗原遺伝子のＨＳＰ７０遺伝子への結合によるＤＮＡワクチン能力の増強およびインビボでの腫瘍の処置）
以下の実施例は、本発明の組成物および方法が、抗原特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を増強し、そしてインビボで腫瘍を処置するために有効であることを証明する。
【０１００】
モデル抗原としてＨＰＶ−１６　Ｅ７を使用する、本明細書中に記載されたデータは、熱ショックタンパク質、細胞質転座部分、クラスＩ　ＭＨＣエピトープを有するキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡワクチンより、エピトープに対して強力な免疫特異性が得られることを示す。裸ＤＮＡワクチンによって産生された抗原特異的免疫においてＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）に結合する効果を評価した。
【０１０１】
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨＳＰ７０は、ＨＰＶ−１６　Ｅ７−発現ＤＮＡワクチンの能力を増強する。ＨＰＶ−１６　Ｅ７に融合されたＨＳＰ７０を含むＤＮＡワクチンは、強力なＥ７−特異的細胞免疫（Ｅ７−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体頻度少なくとも３０倍の増加）を惹起し、そして有意なＣＤ８＋Ｔ細胞依存性予防薬およびＨＰＶ−１６　Ｅ７発現腫瘍細胞に対する治療効果を生じた。
【０１０２】
このデータは、ＨＰＳ７０が、こＥ７　ＤＮＡワクチンのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を優先的に増強することを示した。フローサイトメトリーによって、検出可能なＩＦＮ−γ−発現ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導しないこと、およびＥ７−特異的抗体を誘導しないことを実証した。Ｅ７−ＨＳＰ７０誘導遺伝子をコードしないＤＮＡワクチンは、Ｅ７−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を野生型Ｅ７遺伝子を含む（ＨＳＰ７０遺伝子配列を含まない）ワクチンと比較して４０倍増加した。より重要なことには、ＨＳＰ７０遺伝子配列の従来のＤＮＡワクチン（例えば、抗原のみをコードするワクチン）への添加により、構築されたＥ７発現腫瘍に対して低い有効性のワクチンを有意な強度を有するワクチンに変換した。驚くべきことに、Ｅ７−ＨＳＰ７０融合ワクチンは、包括的に標的ＣＤ８＋Ｔ細胞を標的し；免疫性効果および腔腫瘍効果は、完全にＣＤ４非依存性であった。これらの結果は、ＨＳＰ７０の抗原遺伝子への融合が、ＣＤ８依存経路を経由してＤＮＡワクチンの強度を穏やかに増強することを示す。
【０１０３】
ヒトパピローマウイルス（ＨＩＶ）−誘導体化抗原を選択した。なぜならば、ＨＰＶ、特にＨＰＶ−１６は、最も頸部癌に関連するからである。このＨＰＶ発癌性タンパク質（Ｅ６およびＥ７）は、ほとんどのＨＰＶ−含有頚部癌における細胞の形質転換および同時発現の誘導および維持において重要である。Ｅ７および／またはＥ６タンパク質を標的するワクチンまたは免疫治療により、ＨＰＶ−関連頚部悪性腫瘍を予防および処置し得る。このデータは、ＨＳＰコード配列に連結する抗原コードポリヌクレオチド（例えば、全長Ｅ７−コード配列）が、ＤＮＡワクチンの強度を増強することを示す。Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓｉ　ＨＳＰ７０に融合された全長Ｅ７を含むＤＮＡワクチンを有する、野生型ＨＰＶ−１６Ｅ７を含むＤＮＡワクチンを、免疫応答性発生およびＨＰＶ−１６　Ｅ７発現悪性腫瘍に対して動物を保護するための能力について評価した。Ｅ７をコードするＤＮＡを、ＨＳＰ７０をコードするＤＮＡに連結することにより、完全にＣＤ４アームをバイパスする、Ｅ７−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の発現および活性を増加します。この増強したＣＤ８応答は、結果として構築された腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫を生じる。
【０１０４】
以下の材料および方法を使用して、以下に記載されるデータを得た。
【０１０５】
プラスミドＤＮＡ構築物および処方物：Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＨＳＰ７０をコードするＤＮＡフラグメントは、当該分野で公知である（ＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号Ｚ９５３２４　ＡＬ１２３４５６；ヌクレオチド１０６３３−１２５１０コードＨＳＰ７０）。
【０１０６】
（表１：ＨＳＰ７０のアミノ酸配列）
【０１０７】
【表１】
2004500047.tif 000002
（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムのヌクレオチド１０６３３〜１２５１０によってコードされる）。
【０１０８】
（表２：ＨＳＰ７０をコードするヌクレオチド配列）
【０１０９】
【表２】
2004500047.tif 000003
ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号　Ｚ９５３２４　ＡＬ１２３４５６のヌクレオチド１０６３３〜１２５１０。
【０１１０】
ＨＳＰ発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３−ＨＳＰ）の生成のために、ＨＳＰ７０−コードＤＮＡを、ｐＫＳ７０からサイトメガロウイルスプロモーターの下流のｐｃＤＮＡ３．１（−）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の特有のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位にサブクローニングした。ＨＰＶ−１６Ｅ７発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３−Ｅ７）の生成のために、増幅されたフラグメントのそれぞれ５’および３’末端でＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を生成するように設計されたプラスミドを使用して、ＰＣＲによってＥ７　ＤＮＡを増幅した。増幅したＥ７　ＤＮＡを、次いで、ｐｃＤＮＡ３．１の特有のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位にクローニングした。Ｅ７−ＨＳＰ７０キメラ（ｐｃＤＮＡ−Ｅ７−ＨＳＰ７０）の生成のために、増幅されたフラグメントの５’および３’末端の両方でＢａｍＨＩ制限部位を生成するように設計されたプライマーを使用して、Ｅ７　ＤＮＡをＰＣＲによって増幅した。Ｅ７　ＤＮＡを、次いで、ｐｃＤＮＡ３−ＨＳＰの５’末端にサブクローニングした。これらの構築物の精度を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ＨＳＰＥ７またはＥ７−ＨＳＰ７０遺伝子挿入物を有するプラスミドＤＮＡ、および「空の」プラスミドベクターを、サブクローニングに有効なＤＨ５（ＴＭ細胞；Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）にトランスフェクトした。次いで、ＤＮＡを増幅し、そして二重ＣｓＣＬ精製（ＢｉｏＳｅｒｖｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌａｕｒｅｌ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用して精製した。プラスミドＤＮＡの完全性およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＮＡまたはＲＮＡの非存在を、１％アガロースゲル電気泳動を使用して、各調製物について調べた。ＤＮＡの濃度は、２６０ｎｍで測定した光学密度によって決定した。挿入されたＥ７フラグメントの存在は、制限酵素消化およびゲル電気泳動によって確認した。小網およびカルレティキュラム（ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）ポリペプチド（およびそれらをコードするポリヌクレオチド）は、免疫原性組成物のＨＳＰ成分に対して有用な代替物である。
【０１１１】
（表３：ＨＰＶ１６Ｅ７抗原のアミノ酸配列）
【０１１２】
【表３】
2004500047.tif 000004
ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＡＤ３３３５３。
【０１１３】
（表４：ＨＰＶ　Ｅ７をコードするヌクレオチド配列）
【０１１４】
【表４】
2004500047.tif 000005
ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号ＡＦ１２５６７３のヌクレオチド５６２〜８５８。
【０１１５】
ＤＮＡワクチン接種：遺伝子銃粒子媒介性ＤＮＡワクチン接種を、標準的なプロトコルに従って、ヘリウム駆動型遺伝子銃（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して行った。簡単には、２５ｍｇの１．６μｍ金マイクロキャリア（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）および１００μｌの０．０５Ｍ　スペルミジン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を合わせることによって、ＤＮＡコーティング金粒子を調製した。プラスミドＤＮＡ（５０μｇ）および１．０Ｍ　ＣａＣｌ２（１００μｌ）を、渦流により混合しながら、連続的にマイクロキャリアに添加した。この混合物を、室温（ＲＴ）で１０分間沈殿させた。次いで、マイクロキャリア／ＤＮＡ懸濁液を遠心分離し（１０，０００ｒ．ｐ．ｍ．で５秒間）、そして新しい無水エタノールで３回洗浄し、その後、無水エタノール中のポリビニルピロリドン（０．１ｍｇ／ｍｌ）（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）（３ｍｌ）中に再懸濁した。次いで、この溶液をチュービングに充填し、そして４分間静置した。エタノールを穏やかに除去し、そしてこのチューブを回転することによって、このチュービングの内面にこのマイクロキャリア／ＤＮＡ懸濁液を均一に付着させた。次いで、このチューブを、０．４リットル／分の窒素ガス流で乾燥させた。次いで、マイクロキャリア／ＤＮＡでコーティングされた乾燥チュービングを、０．５インチの薬筒に切断し、そしてキャップ付きの乾燥ビン中で４℃で保存した。結果として、各薬筒は、１μｇのプラスミドＤＮＡおよび０．５ｍｇの金を含んだ。ＤＮＡコーティング金粒子（１μｇ　ＤＮＡ／ビュレット）を、ヘリウム駆動型遺伝子銃（Ｂｉｏ−ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を４００ｐ．ｓ．ｉ．の排出圧で使用して、マウスの剃毛した腹部領域に送達した。
【０１１６】
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：標準的なＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して、ＨＰＶ−１６Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出した。９６ウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を、５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中１０μｇ／ｍｌのラット抗マウスＩＦＮ−γ抗体（クローンＲ４−６Ａ２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＤＡ）でコーティングした。４℃で一晩インキュベートした後、このウェルを洗浄し、そして１０％ウシ胎児血清を含む培養液でブロックした。ワクチン接種したマウス群の各々から新しく単離した、異なる濃度の脾細胞（１×１０６／ウェルから始めた）を、１５Ｕ／ｍｌのインターロイキン−２と共にウェルに添加した。細胞を、１μｇ／ｍｌのＥ７特異的Ｈ−２ＤｂＣＴＬエピトープ（Ｅ７、残基４９〜５７；配列番号５）と共にかまたはＥ７特異的Ｈ−２ＤｂＣＴＬエピトープなしで、３７℃で２４時間インキュベートした。培養後、このプレートを洗浄し、次いでこの細胞を、５０μｌのＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのビオチン化ＩＦＮ−γ抗体（クローンＸＭＧ１．２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に、４℃で一晩インキュベートした。６回洗浄した後、５０μｌＰＢＳ中１．２５μ／ｍｌのアビジン−アルカリホスファターゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加し、そして室温で２時間インキュベートした。洗浄後、５０μｌのＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を添加することによって、スポットを発色させ、そして室温で１時間インキュベートした。このスポットを解剖顕微鏡を使用して数えた。
【０１１７】
細胞質内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー：未処置の群のマウスまたはワクチン接種した群のマウス由来の脾細胞を、ＭＨＣクラスＩエピトープを含むＥ７ペプチド（残基４９〜５７；配列番号５）、またはＭＨＣクラスＩＩペプチドを含むＥ７ペプチド（残基３０〜６７；配列番号６）のいずれかと共にインキュベートした。タンパク質またはポリペプチドのどの残基がＭＨＣクラスＩ抗原性エピトープを提示するかを決定する方法は、当該分野で周知である。Ｅ７ペプチドを、２０時間、２μｇ／ｍｌの濃度で添加した。Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体およびＥ７特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞応答を検出するために、それぞれ、ＣＤ８＋ＣＴＬエピトープの残基４９〜５７および残基３０〜６７を使用した。ＧｏｌｇｉｓｔｏｐＴＭ（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を６時間添加し、その後、培養液から細胞を収集した。次いで、細胞をＦＡＣＳＣＡＮ緩衝液で１回洗浄し、そしてフィコエリトリン（ＰＥ）結合したモノクローナルラット抗マウスＣＤ８またはＣＤ４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で染色した。メーカーの使用説明書（Ｐａｒｍｉｎｇｅｎ）に従って、Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍＴＭキットを使用して、細胞を、細胞内サイトカイン染色に供した。ＦＩＴＣ結合抗ＩＦＮ−γまたは抗ＩＬ−４抗体、および免疫グロブリンアイソタイプコントロール抗体（ラットＩｇＧ１）は全てＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから購入した。ＣＥＬＬＱｕｅｓｔＴＭソフトウエアを備えるＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ　ＦＡＣＳｃａｎＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｅｉｗ，ＣＡ）で分析を行った。
【０１１８】
サイトカインのＥＬＩＳＡ：脾細胞（４×１０６）を、最後のワクチン接種の２週間後に収集し、そして２４ウェル組織培養プレート中で、全容量２ｍｌのＲＰＭＩ　１６４０中１０μｇ／ｍｌのＥ７タンパク質（１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎児血清、５０ユニット／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ　非必須アミノ酸を補充）と共に７２時間培養した。上清を収集し、そしてメーカーのプロトコルに従ってＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を使用して、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の存在についてアッセイした。
【０１１９】
抗Ｅ７　ＥＬＩＳＡ：血清中の抗ＨＰＶ　１６Ｅ７抗体を、標準的な直接ＥＬＩＳＡによって決定した。９６μウェルプレートを、１０μ／ｍｌの細菌由来ＨＰＶ−１６Ｅ７タンパク質（１００μｌ）でコーティングし、そして４℃で一晩インキュベートした。次いで、このウェルを、２０％ウシ胎児血清を含有するＰＢＳでブロックした。免疫化後１４日のマウスから血清を調製し、ＰＢＳで連続的に希釈し、ＥＬＩＳＡウェルに添加し、そして３７℃で２時間インキュベートした。０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄した後、このプレートを、１／２０００希釈のペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）と共に室温で１時間インキュベートした。このプレートを６回洗浄し、ＴＭＢ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて発色させ、そして１ｍ　Ｈ２ＳＯ４を用いてとめた。ＥＬＩＳＡプレートを標準的なＥＬＩＳＡ読みとり器を用いて、４５０ｎｍで読みとった。
【０１２０】
マウス腫瘍細胞株：マウス腫瘍細胞株ＴＣ−１を、標準的な組織培養方法を使用して増殖し、維持した。マウスにおける腫瘍細胞株の増殖および形質転換細胞による腫瘍の形成は、ヒト癌の当該分野で認められたモデルである。ＨＰＶ−１６　Ｅ６、Ｅ７およびｒａｓ癌遺伝子を使用して、初代Ｃ５７ＢＬ／６マウス肺上皮細胞を形質転換した。この細胞を、５％　ＣＯ２、３７℃で、ＲＰＭＩ　１６４０（１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎児血清、５０ユニット／ｍｌ　ペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１ｍＭ　ピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ　非必須アミノ酸、および０．４ｍｇ／ｍｌ　Ｇ４１８を補充）中で増殖させた。腫瘍チャレンジの日に、ＴＣ−１細胞をトリプシン処理によって収集し、１Ｘ　Ｈａｎｋｓ緩衝化塩溶液で２回洗浄し、最後に、１Ｘ　Ｈａｎｋｓ緩衝化塩溶液に再懸濁して、注射のために指示された濃度にした。
【０１２１】
マウス：６〜８週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）から購入した。
【０１２２】
インビボ腫瘍保護：マウス（５匹／群）を、遺伝子銃によって、２μｇのＨＳＰ　ＤＮＡ、Ｅ７　ＤＮＡ、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡ、または挿入物を有さない空のプラスミドでワクチン接種した。１週間後、このマウスを初めのワクチン接種と同じレジメンでブーストした。別のセットのマウス（５匹／群）を、１回ワクチン接種した（さらなるブースターなし）。最後のワクチン接種の１週間後、マウスの右脚に、５×１０４細胞／マウスのＴＣ−１腫瘍細胞を皮下にチャレンジし、次いで１週間に２回モニタリングした。
【０１２３】
インビボ腫瘍処置：腫瘍細胞およびＤＮＡワクチンを、上記のように調製した。マウスの右脚に、２×１０４細胞／マウスのＴＣ−１腫瘍細胞を皮下にチャレンジした。ＴＣ−１腫瘍細胞を用いてチャレンジした３日後に、マウスに、２μｇのＨＳＰ　ＤＮＡ、Ｅ７　ＤＮＡ、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡ、または挿入物を有さない空のプラスミドを、遺伝子銃で与えた。１週間後、これらのマウスを最初のワクチン接種と同じレジメンでブーストした。別のセットのマウス（５匹／群）を、１回ワクチン接種し、腫瘍チャレンジ後にさらにブーストしなかった。マウスを１週間に２回モニタリングした。
【０１２４】
インビボ抗体枯渇：インビボ抗体枯渇を、標準的な方法を使用して行った。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、遺伝子銃によって２μｇのＥ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡをワクチン接種し、１週間後にブーストし、そして５×１０４細胞／マウスのＴＣ−１腫瘍細胞でチャレンジした。腫瘍チャレンジの１週間前に枯渇を開始した。ＣＤ−４特異的モノクローナル抗体（例えば、ＭＡｂ　ＧＫ１．５）を、ＣＤ４枯渇のために使用し、ＣＤ８特異的抗体（例えば、ＭＡｂ２．４３）を、ＣＤ８枯渇のために使用し、そしてＮＫ細胞に結合する抗体（例えば、ＭＡｂ　ＰＫ１３６）を、ＮＫ１．１枯渇のために使用した。フローサイトメトリー分析によって、これらの適切なリンパ球サブセットの９５％より多くが枯渇され、他のサブセットは正常なレベルであることが示された。枯渇は、腫瘍チャレンジの４０日後に終結した。
【０１２５】
Ｅ７−ＨＳＰ７０融合体ＤＮＡのワクチン接種はＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を増大する：ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、抗腫瘍エフェクターの中で最も重要な成分の１つである。Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡワクチンによって生成したＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体の頻度を決定するために、酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイおよび細胞内サイトカイン染色を使用した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよび細胞内サイトカイン染色の両方は、単一の細胞レベルでのＩＦＮ−γ産生を測定するために使用される高感度の機能的アッセイであり、従ってこれは、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を定量するために用いられ得る。図１Ａに示されるように、Ｅ７　ＤＮＡワクチン接種マウス由来の脾細胞１０６個あたり、わずか１４個のＥ７（４９〜５７）特異的ＩＦＮ−γスポット形成ＣＤ８＋Ｔ細胞のみが検出されたことと比較して、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡワクチン接種マウス由来の脾細胞１０６個あたり、この免疫優性Ｄｂ制限Ｅ７（４９〜５７；配列番号５）ペプチドに対して特異的な４３５個のＩＦＮ−γスポット形成ＣＤ８＋Ｔ細胞が検出された。ｐｃＤＮＡ−３ベクターのみによって生成されたバックグラウンド（３スポット／１０６の脾細胞）を差し引くと、Ｅ７　ＤＮＡワクチンおよびＥ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡについて、それぞれ、１１個および４３２個のＥ７（４９〜５７）特異的ＩＦＮ−γスポット形成ＣＤ８＋Ｔ細胞が生成された。同様に、Ｅ７（４９〜５７）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体の量はまた、ＣＤ８および細胞内ＩＦＮ−γの二重染色を使用して、フローサイトメトリー分析により決定し得る。このアッセイからの値（図１Ｂ）は、図１Ａに示されるＥＬＩＳＰＯＴの結果と密接に相関した。図１Ｂに示すように、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡをワクチン接種したマウスは、最大数のＥ７特異的ＩＦＮ−γ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体を生成し（フローサイトメトリー分析によると約７２６／１０６脾細胞）、一方、Ｅ７　ＤＮＡをワクチン接種したマウスは、ベクター−ワクチン接種したコントロール以上のシグナルを示さなかった。これらのデータは、ＨＳＰ７０またはそのフラグメントをコードするＤＮＡに作動可能に連結されたＥ７のＭＨＣクラスＩ制限エピトープが、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体の頻度を少なくとも３０倍増加することを示す。
【０１２６】
Ｅ７−ＨＳＰ７０融合体ＤＮＡのワクチン接種はＥ７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性免疫応答を増大しない：Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡワクチンにより生成されるＥ７特異的ＣＤ４＋Ｔ前駆細胞およびサイトカインプロフィールを決定するために、免疫化マウス由来の脾細胞上のＣＤ４表面マーカーおよび細胞内ＩＦＮ−γまたはＩＬ−４の二重染色を行い、続いて、フローサイトメトリー分析を行った。免疫化マウス由来の脾細胞を、Ｅ７ペプチド（残基３０〜６７；配列番号６）と共に、インビトロで一晩培養し、そしてＣＤ４および細胞内ＩＦＮ−γの両方について染色した。Ｅ７ペプチド（残基３０〜６７；配列番号６）は、ＨＰＶ−１６のＥ７オープンリーディングフレーム中の大きいＴヘルパーエピトープを含む。ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を、フローサイトメトリーを使用して分析した。図２に示すように、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡをワクチン接種したマウスは、野生型Ｅ７　ＤＮＡまたはベクターのみをワクチン接種したマウスと比較して、類似の数のＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋二重陽性細胞を産生した。ＨＳＰ７０プラスミドと混合したＥ７　ＤＮＡをワクチン接種したマウスは、わずかに多くのＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋二重陽性細胞を生成したが、ワクチン接種した各群の間のＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋二重陽性細胞数の統計的に有意な差違はなかった。
【０１２７】
Ｅ７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するＣＤ４染色　対　細胞内ＩＦＮ−γ染色の能力に対する陽性コントロールとして、Ｓｉｇ／Ｅ７／ＬＡＭＰ−１（これは、ＭＨＣクラスＩＩ分画にＥ７を標的化する）を発現するＤＮＡワクチンをワクチン接種したマウスの分析は、Ｅ７　ＤＮＡまたはコントロールプラスミドをワクチン接種したマウスと比較して、３倍のＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋二重陽性細胞の増加を示した。様々なＤＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおけるＩＬ−４分泌Ｅ７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞もまた分析した。Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡ、ＨＳＰ７０　ＤＮＡと混合したＥ７　ＤＮＡ、野生型Ｅ７　ＤＮＡ、空のプラスミドＤＮＡを接種されたマウスにおいても、ワクチン接種していないマウスにおいても、有意なＣＤ４＋ＩＬ−４二重陽性細胞は同定され得なかった。ＭＩＣＫ−２　ＩＬ−４分泌細胞（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を陽性コントロールとして使用して、この研究についての首尾良い細胞質内ＩＬ−４染色を確認した。これらのデータは、熱ショックタンパク質の全てかまたは一部をコードするＤＮＡを含む本発明のＤＮＡワクチンが、ＣＤ４＋免疫応答と独立して、そのワクチンによってコードされるエピトープに対するＣＤ８＋免疫応答を引き起こすことを示す。
【０１２８】
Ｅ７−ＨＳＰ７０融合体ＤＮＡのワクチン接種はＥ７特異的抗体を生成しない：ワクチン接種したマウスの血清中の抗ＨＰＶ　１６Ｅ７抗体の量を、最後のワクチン接種の２週間後に、直接酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。抗Ｅ７抗体は、ワクチン接種した群のいずれのマウスの血清においても検出され得なかった（図３）。市販の抗Ｅ７モノクローナル抗体（Ｚｙｍｅｄ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、およびＳｉｇ／Ｅ７／ＬＡＭＰ−１キメラを含むワクチンウイルスをワクチン接種したマウス由来の血清を陽性コントロールとして使用して、この研究のために首尾良い抗Ｅ７　ＥＬＩＳＡを保証した。この結果は、Ｅ７　ＤＮＡまたはＥ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡワクチンのいずれかによる見かけのＥ７特異的ＣＤ４刺激が全くないことと一致した。
【０１２９】
Ｅ７−ＨＳＰ７０融合体ＤＮＡのワクチン接種は腫瘍の増殖に対する保護を増大する：Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡ構築物のワクチン接種がＥ７発現腫瘍からマウスを保護するか否かを決定するために、異なる用量のＤＮＡワクチンを使用して２つのインビボ腫瘍保護実験を行った。第１の実験について、マウスに、２μｇの裸のＤＮＡ／マウスを遺伝子銃でワクチン接種し、そして１週間後に同じ用量の裸のＤＮＡをブーストした。第２の実験について、マウスに、２μｇの裸のＤＮＡ／マウスを遺伝子銃でワクチン接種し、さらなるブーストはしなかった。次いで、最後のワクチン接種の７日後に、このマウスの右脚に、５×１０４ＴＣ−１／マウスを皮下にチャレンジした。ワクチン接種とブースターを受けたマウスについて、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡワクチン接種を受けたマウスの１００％は、ＴＣ−１チャレンジの６０日後において腫瘍を有さないままであり、一方、Ｅ７ＤＮＡ（ＨＳＰコードＤＮＡなし）ワクチン接種を受けたマウスの４０％のみが、腫瘍を有さないままであった。逆に、ワクチン接種していないマウスおよび空のプラスミドまたはＨＳＰ　ＤＮＡを受けたマウスの全ては、腫瘍チャレンジの１５日以内に腫瘍増殖を発症した（図４Ａ）。ブースターなしで一回のワクチン接種を受けたマウスについて、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡワクチン接種を受けたマウスの１００％は、ＴＣ−１チャレンジの６０日後も腫瘍を有さないままであり、一方、ワクチン接種していないマウスおよび空のプラスミド、ＨＳＰ７０　ＤＮＡまたはＥ７　ＤＮＡを受けたマウスの全ては、腫瘍チャレンジの１５日以内に腫瘍増殖を発症した（図４Ｂ）。
【０１３０】
Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡによって生成される抗腫瘍効果が長く継続するか否かを決定するために、これらの腫瘍を有さない動物の右脚に、５×１０４ＴＣ−１細胞／マウスを皮下に再チャレンジした。腫瘍の再チャレンジの３０日後まで、腫瘍増殖は観察されなかった（図４Ａ〜Ｂ）。要約すると、これらの結果は、ＨＳＰポリペプチドをコードするＤＮＡ（例えば、Ｅ７−ＨＳＰ７０融合体ＤＮＡ）に作動可能に連結されたＭＨＣクラスＩ制限抗原性エピトープをコードするＤＮＡ構築物は、クラスＩ制限エピトープを発現する腫瘍（例えば、ＴＣ−１腫瘍）の増殖に対する抗腫瘍免疫性を有意に増大することを示す。抗腫瘍効果は、よりストリンジェントな条件下（ブースターワクチンが投与されない）で試験される場合でさえも観察された。Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡ構築物によって生成される抗腫瘍免疫性は、長く継続した。
【０１３１】
（樹立されたＥ７発現腫瘍を有する、Ｅ７−ＨＳＰ７０融合ＤＮＡ欠損（ｃｕｒｅ）マウスによる治療ワクチン接種）：樹立されたＴＣ−１腫瘍を根絶する際のＤＮＡワクチンの効力を試験するために、インビボ腫瘍処置実験を、種々の用量のＤＮＡワクチンを使用して実施した。ＴＣ−１細胞を、まず、２×１０４細胞／マウスの用量でＣ５７ＢＬ／６マウスに右脚に皮下注射した。３日後、各マウスを、コントロールプラスミドＤＮＡ、ＨＳＰ７０　ＤＮＡ、野生型Ｅ７　ＤＮＡ、またはＥ７−ＨＳＰ７０ＤＮＡのいずれか２μｇを用いて、遺伝子銃を介して皮内処置した。第１の実験について、マウスに、初回免疫（ｐｒｉｍｉｎｇ）の７日後に、同じワクチン用量で追加免疫（ｂｏｏｓｔｅｒ）した。第２の実験について、マウスに、初回刺激後にさらなる追加免疫を与えなかった。図５Ａに示されるように、追加免疫ＤＮＡワクチン接種を受けたマウスについて、ＴＣ−１腫瘍は、このＥ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡワクチン接種を受けたマウスの８０％から排除されたが、ワクチン接種しなかったマウスおよび空のプラスミド、ＨＳＰ７０　ＤＮＡもしくはＥ７　ＤＮＡを受けたマウスのすべてが、腫瘍チャレンジ後２０日以内に、腫瘍増殖を発症した。追加免疫を伴わず１回ワクチン接種を受けたマウスについて、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡワクチン接種を受けたものの６０％が、ＴＣ−１チャレンジの７０日後に腫瘍を有さないままであったが、ワクチン接種しなかったマウスおよび空のプラスミド、ＨＳＰ７０　ＤＮＡもしくはＥ７　ＤＮＡを受けたマウスのすべてが、腫瘍チャレンジ後２０日以内に、腫瘍増殖を発症した（図５Ｂ）。要約すれば、これらの結果は、（ＨＳＰポリペプチドをコードするＤＮＡの非存在下での）野生型Ｅ７　ＤＮＡでのワクチン接種は、マウスにおける以前に接種されたＥ７発現腫瘍を根絶しなかったが、ＨＳＰポリペプチドをコードするＤＮＡと作動可能に連結されたＥ７をコードするＤＮＡ（例えば、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡ）でのワクチン接種は、樹立されたＥ７発現腫瘍を根絶したことを示した。これらのデータは、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡが抗腫瘍免疫を有意に増強すること、およびＤＮＡワクチン構築物中のＨＳＰポリペプチドをコードするＤＮＡの存在が、このＤＮＡワクチンにより生じる抗腫瘍免疫を、従来のＤＮＡワクチン（すなわち、ＨＳＰポリペプチドをコードするＤＮＡを含まないワクチン）により生じる免疫のレベルと比較して増強することを、示した。
【０１３２】
（ＨＳＰ７０をコードする配列への抗原性エピトープをコードするＤＮＡの融合は、抗腫瘍免疫の生成に必要である）：ＨＳＰ７０へのＥ７の融合が抗腫瘍免疫に必要であったか否かを決定するために、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡを、ＨＳＰ７０　ＤＮＡと混合されたＥ７−ＤＮＡと比較し、そしてその抗腫瘍免疫を生じる能力を測定した。Ｅ７　ＤＮＡおよびＨＳＰ７０　ＤＮＡの両方を同じ細胞へ送達するのを確実にするため、このＥ７　ＤＮＡを、弾丸（ｂｕｌｌｅｔ）調製前にＨＳＰ７０　ＤＮＡと混合した。従って、単一の弾丸が、Ｅ７　ＤＮＡおよびＨＳＰ７０　ＤＮＡの両方を含む。免疫学的アッセイおよび腫瘍防御実験（ワクチン追加免疫なし）を、上記のように実行した。このデータは、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡのみがＥ７特異的ＣＤ８＋　Ｔ細胞媒介性免疫応答を増強することを示した。ＨＳＰ７０　ＤＮＡをＥ７　ＤＮＡと混合すると、ＣＤ８＋　Ｔ細胞媒介性免疫応答を増強しなかった。腫瘍防御実験について、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡでワクチン接種したマウスのすべてが、腫瘍チャレンジの６０日後に腫瘍を有さないままであった。対照的に、ワクチン接種していないマウスまたはＨＳＰ７０　ＤＮＡと混合したＥ７　ＤＮＡでワクチン接種したマウスのすべてが、腫瘍チャレンジ後１５日以内に腫瘍増殖を発症した（図６）。ＨＳＰ７０　ＤＮＡへのＥ７　ＤＮＡの融合は、抗腫瘍免疫の生成に必須であった。これらの結果は、ＭＨＣクラスＩ拘束抗原性エピトープをコードするＤＮＡを、ＡＰＣ結合エピトープをコードするＤＮＡおよび／または細胞質トランスロケーションポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結しなければならないことを示す。
【０１３３】
（ＣＤ８＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋　Ｔ細胞またはＮＫ細胞ではない）は、ＨＳＰ７０に融合されたＥ７を用いるＤＮＡワクチンにより生じる抗腫瘍効果に必須である）：Ｅ７陽性腫瘍細胞の拒絶に重要であるリンパ球のサブセットを決定するために、インビボ抗体枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）実験を実施した。この抗体枯渇は、腫瘍チャレンジの１週間前に開始し、そして腫瘍チャレンジの４０日後に終了した。図７に示されるように、すべてのナイーブマウスおよびＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇されたマウスすべては、腫瘍チャレンジ後１４日以内に腫瘍を増殖した。対照的に、非枯渇マウスのすべておよびＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇マウスまたはＮＫ１．１細胞枯渇マウスのすべてが、腫瘍チャレンジ５０日後に腫瘍を有さないままであった。これらの結果は、ＤＮＡワクチンが、ＣＤ４非依存性様式でＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化したこと、およびこれらのＣＤ８＋Ｔ細胞が、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡワクチンにより生じる抗腫瘍免疫に必須であることを、示す。
【０１３４】
（ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激する際のＨＳＰの役割）：本発明は、いかなる特定の機構によっても制限されないが、本発明のキメラ核酸およびＤＮＡワクチンのＨＳＰ７０ドメインが、抗原に対する「シャペロン」として作用し得、例えば、このＨＳＰ７０ドメインがＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を最適にするように適切な細胞型にその抗原ペプチドを移動するためのシャペロニンであり得る。銃式ＤＮＡ送達は、皮膚前駆体中にＤＮＡを直接導入する。Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡでトランスフェクトした樹状細胞（ＤＣ）は、ＨＳＰ７０を発現した。ＨＳＰ７０は、タンパク質のフォールディング、輸送および分解において複数の役割を果す、細胞質ゾルＨＳＰである。これは、ＭＨＣクラスＩ拘束抗原のプロセシングに関与する。従って、このＤＮＡワクチンによりコードされるＨＳＰ融合産物を、プロテアソームプロセシングのためにより効率的に標的化し得る。
【０１３５】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、遺伝子銃媒介性Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡワクチン接種において重要な役割を果たし得る。本明細書中に記載されるデータは、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、抗腫瘍免疫のエフェクター段階において必要であることを示した。対照的に、ＣＤ４＋細胞の枯渇またはＮＫ１．１＋細胞の枯渇は、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡにより生じる抗腫瘍免疫を減少しなかった。この知見は、タンパク質ベースのＨＳＰワクチンを使用するアプローチと対照的である。このタンパク質ベースのＨＳＰワクチンを使用するアプローチは、ＣＤ４＋　Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞ならびにＮＫ細胞が、腫瘍細胞由来のｇｐ９６調製物を使用する抗腫瘍免疫のエフェクター段階において必要であることを示した。
【０１３６】
プロフェッショナルＡＰＣにより取り込まれるＨＳＰ複合体は、ＭＨＣ−Ｉ抗原提示経路へとＨＳＰ結合ペプチドを導入することに関与し得る。活性化されたＢ細胞および単核細胞のみが、ＨＳＰ７０を取り込み得るが、活性化Ｔ細胞は、ＨＳＰ７０を輸送しないかもしれない。ＨＳＰのレセプター媒介性取り込みがＨＳＰ／ペプチド複合体タンパク質ワクチンにとって重要であるが、遺伝子銃媒介性Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡワクチンにおける役割を果す見込みがない。このＤＮＡワクチンによりコードされる組換えＥ７−ＨＳＰ融合遺伝子は、遺伝子銃を介してＤＣに直接送達され、レセプター媒介性エンドサイトーシスの必要性を回避した。ＡＰＣの交差初回免疫（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）もまた生じ得る。なぜなら、Ｅ７−ＨＳＰ７０が他の細胞型（例えば、ケラチノサイト（これもまた遺伝子銃ワクチン接種によりトランスフェクトされた））から放出され得、次いでレセプター媒介性エンドサイトーシスを介してＤＣに侵入し得るからである。
【０１３７】
ＨＳＰ７０へのＥ７の融合が必要なことは、おそらくＨＳＰ７０　Ｔ細胞エピトープの付加が原因で、Ｅ７がより免疫原性になることを示唆する。ＨＳＰ７０　ＤＮＡによるワクチン接種は、（病原体への先の曝露に起因して）個体に存在し得るＨＳＰ７０反応性Ｔ細胞のプールを拡大する。これらのＨＳＰ７０反応性Ｔ細胞は、結合体化ペプチドに対して反応する強力なヘルパー効果を発揮し得；これは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより検出されそして細胞内サイトカイン染色により検出された、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体頻度分布の増加をもたらす機構であり得た。この増加は、Ｅ７−ＨＳＰ７０融合遺伝子によりワクチン接種したマウスにおいて観察されたが、ＨＳＰ７０プラスミドと混合したＥ７プラスミドによりワクチン接種したマウスにおいては観察されなかった。
【０１３８】
ＨＳＰは、抗原非依存性機構を介して、インビボおよびインビトロでＴ細胞を直接活性化し得る。抗原ペプチドの非存在下で、ＨＳＰは、抗原特異的ＣＴＬクローンのＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γの選択を誘導し得る。ヒトＨＳＰ−６０は、先天免疫系に対する危険シグナルとして作用し得、そしてＴヘルパー１（ＴＨ１）炎症誘発（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）応答を誘導し得る。しかし、Ｅ７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の数の有意な増加は、ＨＳＰ７０　ＤＮＡ単独でワクチン接種したマウスでもＨＳＰ７０プラスミドと混合したＥ７プラスミドでワクチン接種したマウスでも観察されなかった。このＤＮＡワクチンのＨＳＰ成分により刺激したγδ　Ｔ細胞もまた、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡワクチンにより生じる抗腫瘍効果に関与し得る。
【０１３９】
Ｅ７−ＨＳＰ７０は、増強されたＭＨＣクラスＩ提示を通じて強力なＣＤ８＋　Ｔ細胞応答を生じるが、ＭＨＣクラスＩＩ提示経路に抗原を標的化する他の構築物は、増強されたＣＤ４＋　Ｔ細胞応答を提供し得る。ＭＨＣクラスＩ拘束経路およびＭＨＣクラスＩＩ拘束経路を直接増強するワクチンの投与を、同時投与し得る。例えば、Ｅ７のＭＨＣクラスＩＩ提示経路を増強するためのＬＡＭＰ−１エンドソーム／リソソーム標的化シグナルを第２のＤＮＡがコードするＤＮＡ構築物（例えば、キメラＳｉｇ／Ｅ７／ＬＡＭＰ−１　ＤＮＡワクチン）を、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激するために、本発明の核酸およびワクチンと同時投与し得る。ＭＨＣクラスＩＩ標的化ワクチン（例えば、Ｓｉｇ／Ｅ７／ＬＡＭＰ−１）と組み合わせた、本明細書中に記載されるＥ７−ＨＳＰ７０ワクチンは、相乗様式で免疫系の複数のアーム（ａｒｍ）を活性化し得、有意に増強されたＣＤ４＋　Ｔ細胞応答およびＣＤ８＋　Ｔ細胞応答ならびに強力な抗腫瘍効果をもたらし得る。
【０１４０】
これらの結果は、本発明の例示的キメラ核酸（ＨＳＰ７０およびＨＰＶ−１６　Ｅ７融合タンパク質をコードする、ＤＮＡ融合構築物）は、バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃｓ）により投与されるＤＮＡワクチンの形態で、抗原Ｅ７単独をコードするＤＮＡワクチンよりも強力な、Ｅ７特異的ＣＤ８＋　Ｔ細胞媒介性免疫応答およびＨＰＶ−１６　Ｅ７発現マウス腫瘍に対する抗腫瘍効果を生じ得ることを示す。従って、これらのデータは、抗原遺伝子（またはそのフラグメント）へのＨＳＰ７０配列の融合（および、本明細書中に記載されるような、カルボキシ末端ＨＳＰドメインの融合）が、ＤＮＡワクチンの効力を大いに増強することを示す。このストラテジーは、病理（例えば、感染性疾患）の予防および処置、ならびに腫瘍および癌の系（特に既知の腫瘍特異的抗原を有する系）に対して、適用可能である。
【０１４１】
（実施例２：ＧＭ−ＣＳＦおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素ＡのトランスロケーションドメインをコードするＤＮＡ配列を抗原遺伝子に連結することによるＤＮＡワクチン効力の増強）
以下の実施例は、本発明の組成物および方法が、インビボで抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を増強するためおよび腫瘍を処置するために有効であることを示す研究を記載する。
【０１４２】
免疫原性「融合タンパク質」組成物をコードするキメラ核酸を構築した。そのＤＮＡは、抗原をコードする配列に（作動可能に連結された）ＧＭ−ＣＳＦ（またはそのフラグメント）ドメインをコードした。本発明はいかなる特定の機構によっても限定されないが、生じる融合タンパク質は、その中に含まれる抗原の、ＧＭ−ＣＳＦレセプターを発現する細胞（例えば、プロフェッショナルＡＰＣおよびその前駆体）への標的化を増強し得た。ＥＴＡポリペプチド（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素ＡのドメインＩＩ（ＥＴＡ（ｄＩＩ））（配列番号３）をコードするＤＮＡの存在は、ＭＨＣクラスＩ提示を増強するように、エンドソーム区画／リソソーム区画から細胞質への抗原のトランスロケーションを媒介し得る。
【０１４３】
ＤＮＡキメラ（ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７）を、ＧＭ−ＣＳＦおよびＥＴＡ（ｄＩＩ）をコードするＤＮＡ配列を、モデル抗原Ｅ７の遺伝子に融合することによって作製した。ヒト癌の当該分野で認識されるマウスモデルを、その構築物により惹起される免疫原性および抗腫瘍活性を評価するために使用した。ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７キメラＤＮＡワクチンを使用するマウスの免疫は、筋肉内注射もしくは皮内注射を介して、Ｅ７発現マウス腫瘍細胞株（ＴＣ−１）に対する、Ｅ７特異的なＣＤ８＋　Ｔ細胞免疫応答およびＣＤ４＋　Ｔ細胞免疫応答ならびに有効な抗腫瘍防御および処置を増強した。この劇的な抗腫瘍効果は、他の構築物（特に、ＧＭ−Ｅ７、ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７、またはＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ））をコードするＤＮＡワクチンにおいては観察されなかった。本明細書中に記載されるＤＮＡワクチン接種ストラテジーは、癌および病原性微生物による感染についての抗原特異的免疫療法に有用である。
【０１４４】
（外因性抗原のＭＨＣクラスＩ提示の改善は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素ＡのドメインＩＩ（ＥＴＡ（ｄＩＩ））を使用して試験され得るＤＮＡワクチン効力を増強するためのストラテジーである）：ＥＴＡは、タンパク質合成をブロックする、細菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来の毒素である。ドメインＩＩすなわちＥＴＡ（ｄＩＩ）は、エンドソーム区画／リソソーム区画から細胞質へのトランスロケーションを可能にし、これは、外因性抗原のＭＨＣクラスＩ提示の増強をもたらす。ドメインＩはＬＤＬ結合を担い、そしてドメインＩＩＩはＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼと結合する毒性能力を有し、ＥＴＡのこれら望ましくない部分は置換もしくは欠失される。下記のデータは、ＤＮＡキメラ（ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７）を使用して生成された。ＨＰＶ−１６　Ｅ７を、モデル抗原として使用した。なぜなら、これは、ＨＰＶ関連悪性疾患において広範に発現されそして十分に特徴付けられている、臨床的に関連する腫瘍形成タンパク質であるからである。ＧＭ−ＣＳＦ　ＤＮＡは、種々のＡＰＣに取り込まれ得、樹状細胞（ＤＣ）成熟の増強を誘導する。抗原と連結することにより、ＧＭ−ＣＳＦはまた、ＧＭ−ＣＳＦレセプター（ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ）を発現する細胞（例えば、プロフェッショナルＡＰＣおよびその前駆体）へのその抗原の標的化を増強し得る。ＤＮＡ形態である抗原と連結したＥＴＡ（ｄＩＩ）は、エンドソーム区画／リソソーム区画から細胞質へと抗原をトランスロケートでき得、増強したＭＨＣクラスＩ提示を生じ得る。ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７の例に従って設計されたキメラＤＮＡ構築物によるワクチン接種は、ＭＨＣクラスＩ拘束経路およびＭＨＣクラスＩＩ拘束経路の両方の活性化に必要な能力提供し、増強されたＥ７特異的免疫応答および抗腫瘍効果を生じる。
【０１４５】
以下の材料および方法を、下記のデータを生成するために使用した。
【０１４６】
（プラスミドＤＮＡ構築物および調製）：マウスＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡフラグメントを、５’末端プライマー
【０１４７】
【化１】
2004500047.tif 000006
（配列番号１１）および３’末端プライマー（ＥｃｏＲＩ）
【０１４８】
【化２】
2004500047.tif 000007
（配列番号１２）を用いるＰＣＲにより得た。ＧＭ−ＣＳＦを形質導入したＢ−１６黒色腫細胞から生成したｃＤＮＡを、ＰＣＲのために鋳型として使用した。
【０１４９】
（表５；マウスＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列）
【０１５０】
【表５】
2004500047.tif 000008
（配列番号１）；ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｘ０２３３３。
【０１５１】
（表６：マウスＧＭ−ＣＳＦのｃＤＮＡ配列）
【０１５２】
【表６】
2004500047.tif 000009
（配列番号２）；ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｘ０５９０６；「ａｔｇ」開始部位に下線を付す。
【０１５３】
増幅産物を、その後ｐＳＰ７３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＢｇｌＩＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位にクローニングして、ｐＳＰ７３−ＧＭを生成した。同じストラテジーを、ヒトＧＭ−ＣＳＦ（ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｍ１１２２０）を使用して、ＮＡ構築物を作製するために使用した。あるいは、第１のＤＮＡは、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ、ＣＤ４０リガンド、またはＴＮＦレセプターのすべてはまたＡＰＣ結合フラグメントをコードする。これらのタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、当業者に容易に利用可能である。所定のポリペプチドまたはタンパク質が抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、マクロファージまたはＤＣ）に結合するか否かを決定することはまた、当該分野で公知である。例えば、そのポリペプチド（ならびにＡＰＣに結合しないことが公知であるコントロールポリペプチド）を、検出可能なマーカーで標識し、そしてＡＰＣとともにインキュベートする。その細胞を洗浄した後、（コントロールと比較した）ＡＰＣ上またはＡＰＣ中の標識の検出は、そのポリペプチドがＡＰＣ結合ドメインまたはＡＰＣ結合配列を有することを示す。
【０１５４】
ＥＴＡのドメインＩＩを含むＤＮＡフラグメントを、５’末端プライマー
【０１５５】
【化３】
2004500047.tif 000010
（配列番号１３）および３’末端プライマー
【０１５６】
【化４】
2004500047.tif 000011
（配列番号１４）を用いるＰＣＲにより生成した。
【０１５７】
（表７：ＥＴＡのアミノ酸配列）
【０１５８】
【表７】
2004500047.tif 000012
（配列番号３）；ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｋ０１３９７　Ｍ２３３４８；残基１〜２５＝シグナルペプチド；成熟ペプチドの開始は下線を付した「Ａ」；トランスロケーションドメインは残基２４７〜４１７に広がる。
【０１５９】
（表８：ＥＴＡをコードするｃＤＮＡ）
【０１６０】
【表８】
2004500047.tif 000013
2004500047.tif 000014
（配列番号４）；ＧＥＮＢＡＮＫ登録番号Ｋ０１３９７　Ｍ２３３４８。
【０１６１】
増幅された生成物を、引き続いてｐＳＰ７３−ＧＭのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位へクローニングし、ｐＳＰ７３−ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）を生成する。ＨＰＶ−１６　Ｅ７を含むＤＮＡフラグメントを、５’末端プライマー（５’−ＧＧＧＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴ−３’（配列番号１５））および３’末端プライマー（５’−ＧＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧ−３’（配列番号１６））を用いてＰＣＲによって合成した。プラスミドｐＣＭＶｎｅｏＢａｍＨＩ−Ｅ７を、このＰＣＲ反応についてテンプレートとして使用した。増幅された生成物を、さらにｐＳＰ７３−ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位へクローニングし、ｐＳＰ７３−ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７を生成した。ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７の配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ｐｃＤＮＡ３．１−ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７を、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩ制限酵素を用いるｐＳＰ７３−ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７の消化によって得、そして単離されたＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７フラグメントをサイトメガロウイルスプロモーターの下流のｐｃＤＮＡ３．１（−）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の特有のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位へクローニングした。ｐｃＤＮＡ３．１−ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）を、ＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を用いるｐＳＰ７３−ＧＭ−ＥＴＡ　（ｄＩＩ）−Ｅ７の消化によって生成し、そして単離されたＧＭ−ＥＴＡ　（ｄＩＩ）フラグメントをｐｃＤＮＡ３．１（−）の特有のＢａｍＨＩクローニング部位へクローニングした。ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いるｐＳＰ７３−ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７の消化によって得、そして単離されたＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７フラグメントをｐｃＤＮＡ３．１（−）の特有のＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位へクローニングした。ｐｃＤＮＡ３．１−ＧＭを、ｐＢｇｌＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を用いるｐＳＰ７３−ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７の消化によって生成し、そして単離されたマウスＧＭ−ＣＳＦフラグメントをｐｃＤＮＡ３．１（−）の特有のＢａｍＨＩクローニング部位へクローニングした。ｐｃＤＮＡ３．１−ＥＴＡ（ｄＩＩ）を、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を用いるｐＳＰ７３−ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７の消化によって得、そして単離されたＥＴＡ（ｄＩＩ）フラグメントをｐｃＤＮＡ３．１（−）の特有のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位へクローニングした。ｐｃＤＮＡ３．１−Ｅ７を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素を用いるｐＳＰ７３−ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７の消化によって生成し、そして単離されたＥ７フラグメントをｐｃＤＮＡ３．１（−）の特有のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩクローニング部位へクローニングした。ｐｃＤＮＡ３．１−ＧＭ−Ｅ７の生成について、このＥ７フラグメントを、５’末端プライマー（５’−ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＡＡＴＣＡＴＧＣＡＴＧ−３’（配列番号１７））および３’末端プライマー（５’−ＧＧＧＧＡＡＧＣＴＴＡＴＣＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧ−３’（配列番号１８））を用いてＰＣＲによって合成した。増幅されたＥ７生成物を、ＢｇｌＩＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてさらにｐＳＰ７３−ＧＭのＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位へクローニングした。ＧＭ−Ｅ７フラグメントを、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩでの消化によってｐＳＰ７３−ＧＭ−Ｅ７から単離し、そしてｐｃＤＮＡ３．１（−）の特有のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩ部位へクローニングした。
【０１６２】
これらの構築物の正確さを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。ＧＭ、ＥＴＡ（ｄＩＩ）、Ｅ７、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）、ＥＴＡ（ＤＩＩ）−Ｅ７、ＧＭ−Ｅ７またはＧＭ−ＥＴＡ（ＤＩＩ）−Ｅ７遺伝子挿入部分を有するプラスミドＤＮＡおよび「空」のプラスミドベクターを、サブクローニング有効ＤＨ５（ＴＭ細胞（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＵＳＡ））にトランスフェクトした。ついでこのＤＮＡを増幅し、そして二重ＣｓＣｌ精製（ＢｉｏＳｅｒｖｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｌａｕｒｅｌ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）を使用して精製した。プラスミドＤＮＡの完全性およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＤＮＡまたはＲＮＡの非存在を、１％アガロースゲル電気泳動を使用して各調製物について調べた。ＤＮＡ濃度を、２６０ｎｍでの吸光度測定によって決定した。挿入したＥ７フラグメントの存在を、制限酵素消化およびゲル電気泳動によって確認した。
【０１６３】
（ＤＮＡワクチン接種）：遺伝子銃粒子媒介ＤＮＡワクチン接種を、標準的プロトコールに従ってそして上に記載のようにヘリウム打ち込み遺伝子銃（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して実施した。
【０１６４】
（細胞形質内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー）：ナイーブまたはワクチン接種された群のマウス由来の脾細胞を、ＭＨＣクラスＩエピトープを含むＥ７ペプチド（残基４９〜５７；配列番号５）またはＭＨＣクラスＩＩペプチドを含むＥ７ペプチド（残基３０〜６７）と共にインキュベートした。Ｅ７ペプチドを、２０時間２μｇ／ｍｌの濃度で添加した。Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体およびＥ７特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞応答を検出するように、ＣＤ８＋ＣＴＬエピトープ残基４９〜５７および残基３０から６７をそれぞれ使用した。Ｇｏｌｇｉｓｔｏｐ（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を培養物から細胞を収穫する６時間前に添加した。次いで、細胞をＦＡＣＳＣＡＮ緩衝液中で１回洗浄し、そしてフィコエリトリン（ＰＥ）結合体化モノクローナルラット抗マウスＣＤ８またはＣＤ４抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色した。細胞を、メーカー（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の指示に従ってＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを使用して細胞内のサイトカイン染色に共した。ＦＩＴＣ結合体化抗ＩＦＮ−γまたは抗ＩＬ−４抗体および免疫グロブリンアイソタイプコントロール抗体（ラットＩｇＧ１）は、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎからすべて購入した。分析をＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェアを用いるＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ　ＦＡＣＳｃａｎで行った（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、ＣＡ）。
【０１６５】
（マウスおよびマウス腫瘍細胞）：マウスならびに腫瘍細胞（ＴＣ−１細胞など）の生成および維持は、上の実施例１に記載した。
【０１６６】
（インビボ腫瘍保護）：腫瘍保護実験のため、マウス（グループあたり５匹）を、遺伝子銃を介してＧＭ、ＥＴＡ（ｄＩＩ）、Ｅ７、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）、ＥＴＡ（ＤＩＩ）−Ｅ７、ＧＭ−Ｅ７またはＧＭ−ＥＴＡ（ＤＩＩ）−Ｅ７遺伝子挿入部分および「空」プラスミドベクターを有する２μｇのプラスミドＤＮＡでワクチン接種した。１週間後、マウスを最初のワクチン接種と同じレジメンでブーストした。別のセットのマウス（グループあたり５匹）を、１回ワクチン接種した（さらなるブースト無しに）。最後のワクチン接種１週間後、マウスを右脚に皮下的に５×１０４細胞／マウスＴＣ−１腫瘍細胞でチャレンジし、週２回モニターした。
【０１６７】
（インビボ抗体枯渇）：インビボ抗体枯渇の方法を、上に記載している。簡単には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、遺伝子銃を介して２μｇＧＭ−ＥＴＡＤＩＩ−Ｅ７　ＤＮＡでワクチン接種し、１週間後ブーストし、そして５×１０４細胞／マウスＴＣ−１腫瘍細胞でチャレンジした。枯渇を、腫瘍チャレンジの１週間前に開始した。ＭＡｂ　ＧＫ１．５をＣＤ４枯渇について使用し、ＭＡｂ２．４３をＣＤ８枯渇について使用し、そしてＭＡｂ　ＰＫ１３６をＮＫ１．１枯渇について使用した。フローサイトメトリー分析は、適切なリンパ球サブセットの９５％より多くを、通常レベルの他のサブセットで枯渇することを示した。枯渇を腫瘍チャレンジ後４０日で終了した。
【０１６８】
（ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７融合ＤＮＡワクチンの生成および特徴づけ）：ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）、ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７、ＧＭ−Ｅ７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＴＡ（ｄＩＩ）、およびＥ７の構築物を示す略図を図８に示す。
【０１６９】
（ＧＭ−ＥＴＡ　（ｄＩＩ）−Ｅ７融合ＤＮＡでのワクチン接種は、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介免疫応答を高める）：ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、抗腫瘍エフェクターの間で最も重大な成分の１つである。ＧＭ−ＥＴＡ（ＤＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡワクチンで生成されるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体頻度を決定するように、細胞内サイトカイン染色を使用した。Ｅ７（４９−５７）特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体の量を、ＣＤ８および細胞内ＩＦＮ−γに対する二重染色を使用するフローサイトメトリー分析によって決定した。このアッセイからの値は、示されるＥＬＩＳＰＯＴ結果に近く相関した。図９に示すように、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡでワクチン接種されたマウスは、フローサイトメトリー分析により最も高い数のＥ７特異的ＩＦＮ−γ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体を生成した。一方、Ｅ７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＴＡ（ｄＩＩ）、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）、ＧＭ−Ｅ７、またはＥＴＡ−Ｅ７　ＤＮＡでワクチン接種されたマウスは、ベクターワクチン接種コントロールより大きくシグナルを示さなかった。
【０１７０】
（ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７融合ＤＮＡのワクチン接種もまた、Ｅ７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介免疫応答を高める）：Ｅ７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞前駆体細胞およびＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡワクチンによって生成されるサイトカインプロファイルを決定するように、二重染色を、免疫化マウス由来の脾細胞上のＣＤ４表面カーカーおよび細胞内ＩＦＮ−γに対して実施し、引き続きフローサイトメトリーを実施した。免疫化マウス由来の脾臓細胞をＥ７ペプチド（配列番号７の残基３０から６７）と共にインビトロで一晩培養し、そしてＣＤ４および細胞内ＩＦＮ−γの両方に対して染色した。Ｅ７ペプチド（配列番号７の残基３０から６７）は、ＨＰＶ−１６のＥ７オープンリーディングフレームタンパク質におけるメジャーＴヘルパーエピトープを含む。タンパク質またはペプチドのポリペプチド配列内のＴヘルパー細胞エピトープを決定する方法は、当該分野で周知である。
【０１７１】
ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーを使用して分析した。図１０に示すように、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡでワクチン接種されたマウスは、Ｅ７　ＤＮＡ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＴＡ（ｄＩＩ）、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）、ＥＴＡ−Ｅ７　ＤＮＡまたはベクター単独でワクチン接種されたマウスと比較してより多くの数のＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋二重陽性細胞を生成した。ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡでワクチン接種されたマウスは、類似のレベルのＥ７特異的ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋二重陽性細胞を生成した。これらの結果は、ＧＭ−ＣＳＦが、ワクチン接種されたマウスにおいてＩＦＮ−γ分泌Ｅ７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を高める際に重要な役割を果たすことを示す。これらの結果はまた、標的抗原をコードするＤＮＡに作動可能に連結されたＧＭ−ＣＳＦコード配列を含むＤＮＡワクチンが、抗原コード配列単独を含むワクチンより強力であることを示す。
【０１７２】
（ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７融合ＤＮＡを有するワクチン接種は、ＴＣ−１腫瘍の成長に対するマウスの保護を高める）：ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡ構築物でのワクチン接種が、Ｅ７発現腫瘍に対してマウスを保護するかどうかを決定するように、インビボ腫瘍保護実験を、種々のＤＮＡワクチンを使用して行った。マウスを、遺伝子銃を介して２μｇの裸のＤＮＡ／マウスでワクチン接種し、そして１週間後同じ用量でブーストした。次いでこのマウスを、最後のワクチン接種７日後に右脚に皮下に５×１０４ＴＣ−１／マウスでチャレンジした。ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡワクチン接種を受けた１００％のこれらのマウスのすべては、ＴＣ−１チャレンジ後３０日無腫瘍を維持したが、ワクチン接種されていないマウスおよびＥ７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＴＡ（ｄＩＩ）、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）、ＧＭ−Ｅ７、ＥＴＡ−Ｅ７　ＤＮＡまたは空のプラスミドを受けたマウスは、腫瘍チャレンジ後１５日以内に腫瘍増殖を起こした（図１１）。ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡによって生じた抗腫瘍効果が、長く持続するかどうかを決定するために、これらの無腫瘍動物を、５×１０４ＴＣ−１細胞／マウスで左脚の皮下に再チャレンジした。腫瘍増殖は、腫瘍再チャレンジ後３０日まで観察されなかった。これらの結果は、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７融合ＤＮＡが、有意にＴＣ−１腫瘍の増殖に対する抗腫瘍免疫性を高め、そしてＧＭ−ＥＴＡ（ＤＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡによって生じた抗腫免疫性が、長く持続することを示した。
【０１７３】
（ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡワクチンによって生じる抗腫瘍効果について必須である）：Ｅ７陽性腫瘍細胞の拒絶に重要なリンパ球のサブセットを決定するために、インビボ抗体枯渇実験を行った。抗体枯渇は、腫瘍チャレンジ１週間前に始め、そして腫瘍チャレンジ後図１２に示す日で終了した。図１２に示すように、すべてのナイーブマウスおよびすべてのＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇マウスは、腫瘍チャレンジ後１４日以内に腫瘍を増殖した。対照的に、すべての非枯渇マウスおよびすべてのＣＤ４＋Ｔ細胞またはＮＫ１．１細胞の枯渇マウスは、腫瘍チャレンジ後無腫瘍日を維持した。これらの結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＧＭ−ＥＴＡｄＩＩ−Ｅ７　ＤＮＡワクチンによって生じる抗腫瘍免疫性について必須であることを示す。
【０１７４】
本明細書中で記載されるデータは、本発明のキメラ核酸（ＤＮＡ構築物（ＡＰＣ結合ドメイン、細胞質トランスロケーションドメイン、および抗原エピトープを有するキメラポリペプチドをコードする））が、コードされる抗原エピトープに特異的な強力な免疫応答を誘導することを示す。マウス腫瘍において、この結果は、生成されるキメラにおいてＧＭ−ＣＳＦ（ＧＭ）遺伝子、ＥＴＡ（ｄＩＩ）遺伝子、およびＨＰＶ−１６　Ｅ７遺伝子の融合物が、Ｅ７特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞媒介免疫応答およびＨＰＶ−１６　Ｅ７発現マウス腫瘍に対する抗腫瘍効果高めることを示した。
【０１７５】
ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７キメラを使用するマウスの免疫化は、筋肉内注射又は皮内注射を介するＥ７発現マウス腫瘍細胞株（ＴＣ−１）に対するＥ７特異的免疫応答ならびに効果的抗腫瘍保護および処置を媒介し得た。この劇的な抗腫瘍効果は、他の構築物（特に、ＧＭ−Ｅ７、ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７、またはＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ））をコードするＤＮＡワクチンにおいては観察されなかった。さらに、他の構築物を受けたマウスよりもより多くのＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答をＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７を受けたマウスにおいて観察した。これらの結果は、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７キメラＤＮＡが、選択された抗原（例えば、癌免疫治療における腫瘍抗原、または病原体に関連する病理学を処置または予防するための病原体に対する抗原）に対する細胞媒介応答を高める新規の戦略を表わすことを示した。この結果はまた、ワクチンの成分が、効果のあるＥ７特異的免疫応答および抗腫瘍効果の発生において重要であることを示す。
【０１７６】
この結果は、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子が、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７およびＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡ構築物の比較によって示されるように、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７融合タンパク質において重要な成分であることを示した。ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７構築物は、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７のＧＭ−ＣＳＦ成分が欠けていた。このことが、高められたＥ７特異的ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞媒介免疫応答および抗腫瘍効果の不足を説明し得る。
【０１７７】
ＧＭ−ＣＳＦは、顆粒球およびＡＰＣの生成を誘導し、そして樹状細胞（ＤＣ）に対して免疫刺激性シグナルとして作用する。さらに、ＧＭ−ＣＳＦはプロフェッショナルＡＰＣを標的としそしてその分化を促進する。これは、ＡＰＣが、ＧＭ−ＣＳＦレセプターを有しているからである。本発明は、いかなる特定の機構によっても限定されないが、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７融合タンパク質は、ＭＨＣならびにＤＣおよび他のＡＰＣ上の同時刺激分子発現において、ＧＭ−ＣＳＦドメインに起因する変化を誘導し得る。その結果、ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７において観察されない体液性および細胞媒介免疫応答を高める。これらの観察は、樹状細胞上のＧＭ−ＣＳＦドメインの免疫促進効果が、免疫応答の発生およびＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７融合タンパク質の抗腫瘍効果に対して重大な成分であることを示した。
【０１７８】
本発明は、いかなる特定の機構によっても限定されないが、本発明の抗原特異的免疫治療アプローチは、ＤＣの表面分子を標的にし得る。このことが、抗原をプロセシングおよび表示のためにＤＣへ方向付け得る。免疫原性組成物のＡＰＣ結合成分として使用し得る他のポリペプチドとして、Ｆｌｔ−３リガンド（ＦＬ）、ＣＤ４０リガンド、ＴＮＦα、および４１ＢＢが挙げられる。このようなポリペプチドをコードするＤＮＡは、本発明の免疫原性組成物またはＤＮＡワクチンの第１のＤＮＡ成分として有用である。Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３−ｌまたはＦＬ）は、インビボで樹状細胞の機能および量を増大し得る。Ｆｌｔ３（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３）は、当該分野で公知のマウスチロシンキナーゼレセプターであり、そしてＦｌｔ３を使用して対応するリガンド、Ｆｌｔ３−Ｌを同定し、引き続きクローニングした（Ｈａｎｎｕｍら、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ．３６８：６４３−６４８；Ｍａｒａｓｋｏｖｓｋｙら、Ｊ．ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄ．，（１９９６）１８４：１９５３−１９６２；１９９６３８）。ＣＤ４０リガンド（ＣＤ１５４）もまた、有用である；ＤＣに対する効果のためワクチン潜在性を高め得る。ＴＮＦ−αは、ワクチン潜在性を高めるための別のストラテジーを示す；ＴＮＦ−αは、リンパ様の組織へのＤＣの移動ならびにランゲルハンス細胞の分化および発生を促進し得る。ワクチン潜在性を高める別のストラテジーは、４−１ＢＢＬ（４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）に結合する腫瘍壊死因子ファミリーのサイトカイン）の使用である。４−１ＢＢとの相互作用に続くＤＣ上の４−１ＢＢＬ発現は、ＣＤ２８レセプターを介するシグナル送達に依存せずに増殖開始のためＴ細胞へ第２の同時刺激シグナルを提供する。ワクチン性剤性を高めるこれらのストラテジーは、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７中のＧＭ−ＣＳＦと類似の様式でＤＣ表面分子を使用し、ＤＣに対する抗原の標的化、その後のＤＣ分化の誘導ならびに抗原プロセシングおよび表示の増進を可能にする。
【０１７９】
Ｄｉｐｔｈｅｒｉａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（テタヌス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ（コレラ）またはＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ毒素は、治療適用を有し得る細菌由来分子を示す。このような分子は、本発明のＤＮＡワクチンにコードされる融合ポリペプチドにおけるＥＴＡドメインの分子と同様の様式で機能し得る。これらのドメインは、エンドソーム／リソソーム区画から細胞質への抗原のトランスロケーションを介するＭＨＣクラスＩ表示の増進を生じ得る（特に、毒素をコードする遺伝子の毒性ドメインが、変異されるかまたは欠失される場合）。
【０１８０】
所定のポリペプチドまたはタンパク質フラグメントが、細胞質トランスロケート活性を有しており、従って本発明の融合タンパク質の中のドメインとして本発明の範囲内に入るかどうかの決定は、以下のように決定した。炭疽毒素致死因子（ＬＦ）を、外来タンパク質を真核生物細胞のサイトゾルへトランスロケートするように示した。これはＤｉｐｈｔｅｒｉａ毒素の機構に似ている。Ｙｅｒｓｉｎｉａｅ細胞毒ＹｏｐＥおよびＹｏｐＨは、トランスロケーションドメインとして有用であり、そして宿主細胞膜を横切りマクロファージのサイトゾルへの抗原の内面化に有用である。Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓアデニル化毒素（ＣｙａＡ）は、細胞膜を介してサイトゾルへ直接トランスロケートし、従ってＭＨＣクラスＩ抗原ハンドリングを高める。従って、本発明の融合タンパク質およびワクチン（例えば、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７融合タンパク質におけるＥＴＡ（ｄＩＩ）ドメイン）によって使用されるワクチン潜在性を高めるためのストラテジーは、これらの細菌毒のトランスロケーションドメインの生物学的機構と同様であり得る。これらのドメインは、抗原がエンドソーム／リソソーム区画からサイトゾルへ逃げることを可能にし得、ＭＨＣクラスＩ表示の増進を生じる。
【０１８１】
（実施例３：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素ＡのトランスロケーションドメインをコードするＤＮＡの抗原遺伝子との連結によるＤＮＡワクチン潜在性の増進）
次の実施例は、本発明の組成物および方法が、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を高めるおよびインビボで腫瘍を処置するために有効であることを示す研究を記載する。
【０１８２】
本発明は、いかなる特定の機構によっても限定されないが、ＥＴＡドメインおよびＨＰＶ−１６　Ｅ７抗原を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡワクチンは、特に遺伝子銃で皮内に投与された核酸についてＥＴＡコード配列を有しないワクチンよりも多くの数の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対してＥ７の分布を導き得る。ポリペプチドドメインＥＴＡ（ｄＩＩ）は、他の細胞による取り込みのためタンパク質を放出し得る。
【０１８３】
免疫学的アッセイは、ＥＴＡ（ｄＩＩ）へ融合されたＥ７を用いるワクチン接種が、Ｅ７特異的ＣＤ４または抗体の優位な増加を伴わずにＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体頻度または抗体増進において３０倍の増加を導くことを示した。インビトロの研究は、ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡでトランスフェクトされた細胞が、野生型Ｅ７　ＤＮＡでトランスフェクトされた細胞よりも有効な様式でＭＨＣクラスＩ経路を介してＥ７抗原を与えることを示した。さらに、ＥＴＡ融合タンパク質でパルスされた骨髄由来樹状細胞は、野生型Ｅ７タンパク質でパルスされた樹状細胞よりも有効な様式でＭＨＣクラスＩ経路を介してＥ７抗原を与えた。ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介免疫性の驚くほどの増進は、効力ある皮下腫瘍保護および肺転移の処置を導いた。これらのデータは、本発明の組成物および方法が、発現された抗原の広がりの増加によって抗原特異的ＤＮＡワクチン潜在性を高め得ることを示唆する。例えば、ＥＴＡ抗原融合タンパク質またはキメラをコードするＤＮＡワクチンの投与は、融合タンパク質（抗原を含むがＥＴＡドメインを欠いているポリペプチドをコードする同様のＤＮＡワクチンに関連する）において発現される抗原の細胞内広がりを増加し得る。
【０１８４】
（実施例４：抗原コード配列のＦＬ（Ｆｌｔ−３リガンド）配列への連結によるＤＮＡワクチン効力の増強）
以下の実施例は、本発明の組成物および方法が、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を増強し、インビボでの腫瘍の処置に効果的であることを示す研究を記載する。
【０１８５】
Ｆｌｔ３−リガンド（ＦＬ）は、専門的な抗原提示細胞（特に樹状細胞）の産生において重要なサイトカインである。本発明は任意の特定の機構によって限定されないが、Ｆｌｔ３リガンドドメインが、免疫が望ましい抗原に連結する組換え分子（ＦＬおよび抗原を含む融合タンパク質）が、抗原をＡＰＣ（例えば、樹状細胞）に標的化し得る。
【０１８６】
抗原としてＨＰＶ−１６　Ｅ７を使用して、裸のＤＮＡワクチンによって産生される抗原特異的な免疫の効力に対する、Ｆｌｔ３−リガンド（ＦＬ）抗原構築物（図１９）の効果を評価した。配列番号２５の残基１〜１８９は、ＦＬ由来であり、残基１９０−２８７は、Ｅ７由来である（配列番号２５の２８８位の「Ｚ」は、終止を示す）。ＦＬ−Ｅ７融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を、遺伝子銃によって皮内に投与した。キメラＦＬ／Ｅ７融合遺伝子を含むワクチンは、ＦＬコード配列の非存在下で、野生型Ｅ７遺伝子を含むワクチンと比較してＥ７特異的ＣＤ＋８Ｔ細胞の頻度を劇的に増加することが見出された。
【０１８７】
インビトロ研究は、ＦＬ／Ｅ７　ＤＮＡをトランスフェクトされた細胞が、野生型Ｅ７　ＤＮＡをトランスフェクトされた細胞よりも効率的な様式で、ＭＨＣクラスＩ経路を介するＥ７抗原を提示したことを示した。さらに、ＦＬ／Ｅ７融合タンパク質をパルスされた骨髄由来樹状細胞は、野生型Ｅ７タンパク質をパルスされた樹状細胞よりも効率的な様式で、ＭＨＣクラスＩ経路を介するＥ７抗原を提示した。より重要なことには、この融合は、あまり効率的ではないワクチンを、樹立されたＥ７発現転移性腫瘍に対して有意な効力を有するワクチンに変換した。興味深いことに、ＦＬ／Ｅ７融合ワクチンは、主に、ＣＤ８＋Ｔ細胞を標的とし、そして抗腫瘍効果は、完全にＣＤ４非依存性であった。これらのデータは、抗原をコードするものへのＦｌｔ３−リガンドＤＮＡの融合がＣＤ８依存性経路を介するＤＮＡワクチンの効力を増強することを示した。
【０１８８】
（実施例５：抗原特異的免疫応答の増強を与えるＨＳＰ７０のドメイン）
以下の実施例は、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）のカルボキシ末端フラグメントを含む第１ポリペプチドドメインを含むキメラポリペプチドをコードする本発明のキメラ核酸が、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を増強し、インビボでの腫瘍の処置に効果的であることを示す研究を記載する。
【０１８９】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＨＳＰ７０のドメイン構造を決定した。少なくとも３つの機能的ドメインを同定した：ＡＴＰａｓｅドメイン（配列番号９の残基１〜３５６を含む）、基質結合ドメイン（ＳＤ；配列番号９の残基３５７〜５１６を含む）、およびカルボキシ末端ドメイン（ＣＤ；配列番号９の残基５１７〜６２５を含む）（図１６）。裸のＤＮＡワクチンの効力に対するこのＨＳＰ７０の各ドメインの寄与を決定した。各ドメインをコードするＤＮＡは、インフレームで、すなわち作動可能に、パピローマウイルス抗原Ｅ７をコードするＤＮＡに連結された。Ｅ７特異的ＣＤ８Ｔ細胞免疫応答を測定した。
【０１９０】
標準的な遺伝子銃ＤＮＡ送達法を使用して、（ｉ）ＨＳＰ７０遺伝子；（ｉｉ）野生型ＨＰＶ−１６　Ｅ７遺伝子；（ｉｉｉ）ＨＳＰ７０のＡＴＰａｓｅドメインに融合したＨＰＶ−１６　Ｅ７遺伝子（Ｅ７−ＡＴＰ）；（ｉｖ）ＨＳＰ７０の基質結合ドメイン（ＳＤ）に融合したＨＰＶ−１６　Ｅ７遺伝子（Ｅ７−ＳＤ）；または（ｖ）ＨＳＰ７０の細胞質ドメイン（ＣＤ）に融合したＨＰＶ−１６　Ｅ７遺伝子（Ｅ７−ＣＤ）を含むＤＮＡワクチンで、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを皮内的にワクチン接種した。キメラＥ７／熱ショックタンパク質構築物のすべてを、サイトメガロウイルスプロモーターの下流に、ｐｃＤＮＡ３．１（−）発現ベクターの複数クローニング部位にクローン化した（図１７）。インビボ抗腫瘍免疫応答を、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介免疫を評価するために、Ｅ７特異的ＭＨＣクラスＩペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ；配列番号７のアミノ酸４９〜５７）を使用して細胞内サイトカイン染色によって分析した。
【０１９１】
図１８Ａは、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体頻度を示す代表的なＦＡＳＣＡＮである。ワクチン接種されたマウス由来の脾細胞を、一晩、Ｅ７ペプチド（配列番号７のアミノ酸４９〜５７）でインビトロで培養し、そしてＣＤ８発現と細胞内ＩＦＮ−γとの両方について染色した。種々のＤＮＡ構築物（Ｅ７−ＨＳＰ７０、Ｅ７−ＡＴＰ、Ｅ７−ＳＤ、Ｅ７−ＣＤ、またはＥ７のみ）で免疫されたマウスにおけるＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体の数を、フローサイトメトリーを使用して分析した。Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡをワクチン接種されたマウスが、最も多い数のＥ７特異的ＣＤ８＋前駆体を生成した。Ｅ７−ＣＤは、二番目に多い量のＥ７特異的ＣＤ８＋前駆体を生成し、Ｅ７−ＨＳＰ７０のみに匹敵し得た（Ｅ７−ＳＤ、Ｅ７−ＡＴＰ、および野生型Ｅ７より大きい）。
【０１９２】
ＩＦＮ−γ−産生Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均数は、図１８Ｂに示される。細胞の数は、Ｅ７抗原ペプチド（配列番号７の残基４９〜５７）の存在下（黒塗り棒）および非存在下（白抜き棒）でフローサイトメトリーによって決定した。データは、３×１０５個の脾細胞当たりのＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞の平均数±ＳＥＭとして表した。結果は、ＤＮＡワクチン構築物に組み込まれる場合、ＨＳＰ７０の細胞質ドメインをコードするＤＮＡは、ＤＮＡワクチンによってコードされる標的抗原に対して免疫を生成する際におけるそのＤＮＡワクチンの効力を増加することを示す。さらに、全長ＨＳＰ７０を含むＤＮＡワクチンにおける抗原特異的ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の増強の大部分を説明する。
【０１９３】
例えば、全長ＨＳＰ７０に融合されたＥ７を用いるワクチン接種は、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体頻度において３０倍増加を導いた（３×１０５個の脾細胞当たり約３６５個）（図１８Ａ〜Ｂ）。ＨＳＰ７０のＡＴＰドメインに融合したＥ７でのワクチン接種は、わずかに増加したＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体頻度を生成した（３×１０５個の脾細胞当たり約５８個）。同様に、ＨＳＰ７０のＳＤドメインに融合したＥ７でのワクチン接種は、３×１０５個の脾細胞当たり約８５個のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体を生成した。対照的に、ＨＳＰ７０のＣＤドメインに融合したＥ７でのワクチン接種は、３×１０５個の脾細胞当たり約２９６個のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体（全長ＨＳＰ７０に融合されたＥ７をワクチン接種されたマウスから得られる量に類似する量）を生成する。これらの結果は、ＨＳＰ７０のＣＤドメインが、ＤＮＡワクチンにおける増強された抗原特異的ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答の大部分を与えることを示す。
【０１９４】
これらのデータは、全長ＨＳＰ７０またはＨＳＰ７０のＣＤドメイン（ＨＳＰ７０の他の部分をコードするＤＮＡの非存在下）の、抗原ペプチド（例えば、ＨＰＶ−１６Ｅ７）への融合をコードするＤＮＡは、抗原に対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を非常に増強することを示す。免疫応答の増強は、ＣＴＬ応答を刺激する際に重要であると考えられたＡＴＰａｓｅドメインの領域（例えば、配列番号９の残基１６１〜３７０）においてより多くのＮ末端配列を欠く構築物において観測された。このデータは、ＨＳＰのＣＤドメインをコードする構築物を含むＤＮＡワクチンが、他のＨＳＰ配列の不在下でさえ、ＤＮＡワクチンによってコードされる標的抗原に対する抗原特異的ＭＨＣクラスＩ制限ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強したことを示す。
【０１９５】
（実施例６：本発明の融合タンパク質を発現する自己複製ＲＮＡウイルスの投与が、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答の生成を増強する）
１つの実施形態において、本発明は、本発明のキメラタンパク質（熱ショックポリペプチドを含む第１ポリペプチドドメインおよび少なくとも１つの抗原性ペプチドを含む第２ポリペプチドドメインを含むタンパク質）を発現し得る自己複製ＲＮＡレプリコンを提供する。以下の実施例は、本発明の方法を使用して、これらの構築物が、インビボで抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を増強するのに効果的であることを示す研究を記載する。モデル系として、ＨＰＶ−１６　Ｅ７およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＨＳＰ７０を含む融合タンパク質を、シンドビスウイルス自己複製ＲＮＡベクター、ＳＩＮｒｅｐ５においてインビボで発現させた。このベクターにより作り出される抗原特異的免疫の効力を決定した。これらの結果はまた、シンドビスウイルス自己複製ＲＮＡベクター中インビボで発現される熱ショックポリペプチドおよび抗原性ペプチドを含む融合タンパク質が、インビボで抗原特異的ＣＴＬ応答を増強するのに効果的であることを示す。
【０１９６】
これらの実験は、Ｅ７／ＨＳＰ７０融合遺伝子を含むＲＮＡレプリコンワクチンがワクチン接種されたマウスにおける野生型Ｅ７遺伝子を含むワクチンよりも有意に高いＥ７特異的Ｔ細胞媒介免疫応答を産生することを示した。さらに、インビトロ研究は、Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡレプリコントランスフェクトアポトーシス細胞由来のＥ７抗原が、骨髄由来樹状細胞により取り込まれ得、そして野生型Ｅ７　ＲＮＡレプリコントランスフェクトアポトーシス細胞よりも効率的にＭＨＣクラスＩ経路を介して提示され得ることを示した。より重要なことには、ＨＳＰ７０のＥ７への融合は、あまり効果的でないワクチンをＥ７発現腫瘍に対して有意な効力を有するワクチンに変換した。この抗腫瘍効果は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に依存した。これらの結果は、ＨＳＰ７０の抗原遺伝子への融合が、自己複製ＲＮＡワクチンの効力を大きく増強したことを示した。これらの結果は、Ｅ７をＨＳＰ７０に連結するシンドビスＲＮＡワクチンが、完全にＣＤ４アームを迂回して、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖および活性化を劇的に増加し、そしてＥ７発現腫瘍に対する強力な抗腫瘍免疫を生じたことを示した。
【０１９７】
抗腫瘍効果を促進するためのシンドビスＲＮＡワクチンの機構がさらに調査された。シンドビスＥ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡワクチンが宿主細胞のアポトーシス死を誘導し得、そして樹状細胞がこれらの細胞に食作用することを促進し得、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖および活性化を劇的に増加し得る。この増強されたＣＤ８応答は、Ｅ７発現腫瘍細胞株に対する強力な抗腫瘍性免疫を生じる。
【０１９８】
ＨＰＶ−１６　Ｅ７を、ワクチン開発に対するモデル抗原として選択した。なぜなら、ＨＰＶ、特にＨＰＶ−１６は、上記のように、大部分の頚部癌と関連するからである。
【０１９９】
（プラスミドＤＮＡ構築物および調製）：ベクターｐｃＤＮＡ３−ＨＳＰ７０、ｐｃＤＮＡ３−Ｅ７、およびｐｃＤＮＡ３−Ｅ７／ＨＳＰ７０が、Ｃｈｅｎ（２０００）上記によって記載されるように作製された。シンドビスウイルスＲＮＡレプリコンベクター、ＳＩＮｒｅｐ５は、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６４３９−６４４６によって記載されている。ベクターＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、およびＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０は、ｐｃＤＮＡ３−ＨＳＰ７０、ｐｃＤＮＡ３−Ｅ７、およびｐｃＤＮＡ３−Ｅ７／ＨＳＰ７０をそれぞれ、Ｘｂａ　ＩおよびＰｍｅ　Ｉ制限酵素で切断することによって、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＨＳＰ７０、ＨＰＶ−１６　Ｅ７およびキメラＥ７／ＨＳＰ７０を単離することによって作製された。消化された産物を、ゲルを使用して単離した。これらの単離されたＤＮＡフラグメントは、さらに、ＳＩＮｒｅｐ５ベクターの対応するＸａｂＩおよびＰｍｌ　Ｉ部位にクローン化して、ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、およびＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０構築物を作製した。これらの構築物の正確さを、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０２００】
（インビトロＲＮＡ調製）：ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０およびＳＩＮｒｅｐ５からのＲＮＡ転写物の作製は、Ｍａｎｄｌ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ　４：１４３８−１４４０によって記載されるプロトコルを使用して実行された。ＳｐｅＩを使用して、ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０およびＳＩＮｒｅｐ５からのＲＮＡレプリコンの合成のためのＤＮＡ鋳型を線形化した。ＲＮＡワクチンを、インビトロで転写し、そして販売業者のマニュアルに従って標準的なインビトロ転写キット（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）からのＳＰ６　ＲＮＡポリメラーゼおよびキャッピングアナログを使用してキャッピングした。合成の後に、ＤＮＡを、ＤＮａｓｅ　Ｉで消化することによって枯渇した。合成されたＲＮＡを変性ホルムアルデヒドアガロースゲルを使用して定量化し、分析した（例えば、Ｍａｎｄｌ（１９９８）上記を参照のこと）。精製されたＲＮＡを、アリコートに分割して、動物のワクチン化のためおよびＢＨＫ２１細胞株のトランスフェクションのために使用した。転写物のタンパク質発現を、エレクトロポレーションを使用して、ＲＮＡのＢＨＫ２１細胞へのトランスフェクションによって評価した。
【０２０１】
（細胞株）：乳児のハムスター腎臓（ＢＨＫ２１）細胞を、ＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から得、そして５％ＦＢＳ、１０％トリプトースホスフェートブロス、２ｍＭグルタミン、および抗生物質で増殖させた。細胞を３７℃で加湿された５％ＣＯ２雰囲気下で維持し、そして二日毎に継代させた。ＴＣ−１細胞の産生および維持を、Ｌｉｎ（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５６：２１−２６によって記載されるように行った。腫瘍チャレンジの日に、ＴＣ−１細胞を、トリプシン処理によって収穫し、１×Ｈａｎｋｓ緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）で２回洗浄し、最後に、１×ＨＢＳＳ中で再懸濁して注射のために設計した濃度に再懸濁した。
【０２０２】
（ＳＩＮｒｅｐ５　ＲＮＡワクチンのＥ７タンパク質発現についてのＥＬＩＳＡ）：ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７およびＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡからのＥ７タンパク質の発現を、間接的なＥＬＩＳＡ法によって決定した。Ｅ７タンパク質の量を、ＳＩＮ５ｒｅｐ−Ｅ７またはＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０トランスフェクトＢＨＫ２１細胞からの細胞溶解物を使用して決定した。簡単に言うと、１０００万個のＢＨＫ２１細胞が、Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ（１９９１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：４１０７−４１１３によって記載されるように、エレクトロポレーションを介してそれぞれ、４μｇのＳＩＮｒｅｐ５、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０またはＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０のＲＮＡ転写物をトランスフェクトされた。トランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞を、エレクトロポレーションの１６〜２０時間後に回収した。９６マイクロウェルプレートを、最終容積１００μｌで種々のＳＩＮｒｅｐ５　ＲＮＡをトランスフェクトされたコートされたＢＨＫ２１細胞溶解物であり、４℃で一晩インキュベートした。細菌由来ＨＰＶ−１６　Ｅ７タンパク質を、ポジティブコントロールとして使用した。次いで、ウェルを２０％ウシ胎仔血清を含むＰＢＳでブロックした。希釈した抗Ｅ７Ａｂ（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を、ＥＬＩＳＡウェルに加え、そして３７℃で２時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄した後に、プレートを、１時間室温（ＲＴ）で、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）の１／２０００希釈物とともにインキュベートした。プレートを洗浄し、１−ＳｔｅｐＴＭ　Ｔｕｒｂｏ　ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で展開し、１Ｍ　Ｈ２ＳＯ４で停止させた。ＥＬＩＳＡプレートを、４５０ｎｍで標準的なＥＬＩＳＡリーダーで読んだ。次いで、細胞溶解物のＥ７タンパク質の量を、標準化されたＥ７タンパク質と比較することによって、計算し、決定した。
【０２０３】
（マウス）：Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）からの６〜８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウスを購入し、そしてＪｏｈｎｓ　Ｈｏｐｋｉｎｓ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）の腫瘍学動物施設で飼育した。全ての動物の手順を、許可されたプロトコルに従い、実験動物の適切な使用および注意についての推奨に従って行った。
【０２０４】
（ＲＮＡワクチン接種）：全てのＳＩＮｒｅｐ５　ＲＮＡワクチンを、上記のようにインビトロ転写を使用して作製した。ＲＮＡ濃度を、２６０ｎｍで測定した光学密度によって決定した。ＲＮＡ転写物の完全性および量を、さらに、変性ゲル電気泳動を使用してチェックした。マウスに、筋肉内で、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０（これは、０．１、１および１０μｇの量で投与される）を除いて、１０μｇの種々のＳＩＮｒｅｐ５　ＲＮＡを右後肢にワクチン接種した。
【０２０５】
（Ｅ７抗体についてのＥＬＩＳＡ）：血清中の抗ＨＰＶ１６Ｅ７抗体を、Ｗｕ（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：１１６７１−１１６５によって記載されるように直接的なＥＬＩＳＡによって決定した。９６マイクロウェルプレートを、１００μｌの５μ／ｍｌ細菌由来ＨＰＶ−１６　Ｅ７タンパク質でコートし、そして４℃で一晩インキュベートした。次いで、ウェルを２０％ウシ胎仔血清を含むＰＢＳでブロックした。血清を、免疫の１４日後にマウスから調製し、連続的にＰＢＳで希釈し、ＥＬＩＳＡウェルに加え、そして３７℃で２時間インキュベートした。０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄した後に、プレートを、１時間室温（ＲＴ）で、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｚｙｍｅｄ、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）の１／２０００希釈物とともにインキュベートした。プレートを洗浄し、１−ＳｔｅｐＴＭ　Ｔｕｒｂｏ　ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で展開し、１Ｍ　Ｈ２ＳＯ４で停止させた。ＥＬＩＳＡプレートを、４５０ｎｍで標準的なＥＬＩＳＡリーダーで読んだ。
【０２０６】
（ＩＮＦ−γについての酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ））：脾細胞を、ワクチン接種の２週間後に収穫し、ＭＨＣクラスＩエピトープを含むＥ７ペプチド（ａａ４９〜５７）（Ｆｅｌｔｋａｍｐ（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２２４２−２２４９を参照のこと）またはＭＨＣクラスＩＩペプチドを含むＥ７ペプチド（例えば、Ｔｉｎｄｌｅ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：５８８７−５８９１を参照のこと）とともに、２４ウェル組織培養プレート中の１０％（容積／容積）ウシ胎仔血清、５０単位／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシン、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ非必須アミノ酸を補充した総容積２ｍｌのＲＰＭＩ　１６４０中で６日間、培養した。上清を集め、製造業者のプロトコルに従って、ＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）を使用してＩＦＮ−γの存在についてアッセイした。
【０２０７】
（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイ）：ＣＴＬアッセイを、Ｃｏｒｒ（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：４７２１−４７２７によって記載されるように、９６ウェル丸底プレートで行った。細胞溶解を、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の定量的測定によって決定した（例えば、Ｃｏｒｒ（１９９９）上記を参照のこと）。脾細胞を、ＲＮＡワクチン接種の２週間後に集め、そしてＥ７ペプチド（ａａ４９〜５７）とともに、２４ウェル組織培養プレート中の１０％（容積／容積）ウシ胎仔血清、５０単位／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ非必須アミノ酸を補充した総容積２ｍｌのＲＰＭＩ　１６４０中で６日間、エフェクター細胞として培養した。ＴＣ−１腫瘍細胞を標的細胞として使用した。ＴＣ−１細胞を種々のエフェクター／標的（Ｅ／Ｔ）比で脾細胞とともに混合した。５時間３７℃でのインキュベーションの後に、５０μｌの培養培地を、ＣｙｔｏＴｏｘＴＭアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の製造業者のプロトコルに従って、培養培地におけるＬＤＨの量を評価するために回収した。溶解の割合を、以下の式から計算した：１００×（Ａ−Ｂ）／（Ｃ−Ｄ）。ここで、Ａは、実験エフェクターシグナル値の読みであり、Ｂは、エフェクター自発バックグラウンドシグナル値であり、Ｃは、標的細胞からの最大シグナル値であり、Ｄは、標的自発バックグラウンドシグナル値である。
【０２０８】
（細胞質内サイトカイン染色およびフローサイトメトリー分析）：ネイティブまたはワクチン接種したマウス由来の脾細胞を、Ｅ７特異的ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞前駆体を検出するために、ＭＨＣクラスＩＩペプチド（Ｔｉｎｄｌｅ（１９９９）上記）を含むＥ７ペプチド（ａａ３０〜６７）とともにインキュベーションした。Ｅ７ペプチドを、２０時間１０μｇ／ｍｌの濃度で加えた。ＧｏｌｇｉｔｏｐＴＭ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、培養物からの細胞を収集する６時間前に加えた。次いで、細胞を、ＦＡＣＳｃａｎＴＭ緩衝液中で１回洗浄し、そしてフィコエリトリン（ＰＥ）結合モノクローナルラット抗マウスＣＤ４抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色した。細胞を、製造業者（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）の指示に従って、Ｃｙｔｏｆｉｘ／ＣｙｔｏｐｅｒｍＴＭ　キットを使用する細胞内サイトカイン染色に供した。ＦＩＴＣ結合抗ＩＦＮ−γ抗体および免疫グロブリンアイソタイプ制御抗体（ｒａｔ　ＩｇＧ１）を、すべてＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから購入した。分析を、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔＴＭソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳｃａｎＴＭで行った。
【０２０９】
（インビボ腫瘍保護実験）：腫瘍保護実験のために、異なった用量のＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０および空のＳＩＮｒｅｐ５　ＲＮＡワクチンを使用して、マウス（１群当り５匹）を筋肉内注射（ＩＭ）して免疫した。免疫１４日後、マウスを尻尾の静脈における１×１０４細胞／マウスＴＣ−１腫瘍細胞を使用して、静脈内注射（ＩＶ）した。３週間後、マウスを安楽死させた。各マウスにおける肺重量および肺小結節の数を、ブラインド様式の実験によって評価および計測した。
【０２１０】
（インビボ抗体枯渇実験）：インビボ抗体枯渇のための手順は、例えば、Ｌｉｎ（１９９６）前出；Ｗｕ（１９９５）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１４１５−１４２１によって以前に記載されている。簡潔には、マウスを１μｇの自己複製するＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ＲＮＡを使用して筋肉内にワクチン接種し、そして、尻尾の静脈注射を介して１×１０４細胞／マウスＴＣ−１腫瘍細胞を使用してチャレンジさせた。枯渇を腫瘍チャレンジの前１週間で開始した。ＭＡｂＧＫ１．５（Ｄｉａｌｙｎａｓ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２４４５）をＣＤ４枯渇のために使用し、ＭＡｂ２．４３　Ｓａｒｉｍｉｅｎｔｏ（１９８０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：２６６５）をＣＤ８枯渇のために使用し、そして、ＭＡｂ　ＰＫ１３６（Ｋｏｏ（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３７４２）をＮＫ１．１枯渇のために使用した。フローサイトメトリー分析は、９５％を超える適切なリンパ球サブセットが、他のサブセットの正常なレベルを有して枯渇される。腫瘍チャレンジ後２１日目に枯渇が終了し得る。
【０２１１】
（細胞表面マーカー染色およびフローサイトメトリー分析）：ネイティブなまたはワクチン接種されたマウスの群から取り出された脾細胞を、Ｊｉ（１９９９）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１０：２７２７−２７４０に記載されるような細胞表面マーカー染色を使用してすぐに処置した。次いで細胞を、ＦＡＣＳＣＡＮＴＭ緩衝液およびＰＥ結合体化モノクローナルラット抗マウス−ＮＫ１．１抗体およびＦＩＴＣ結合体化モノクローナルラット抗マウスＣＤ３抗体（Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して１回洗浄した。ＮＫ細胞の集団を、抗ＮＫ１．１抗体を用いて染色し、そして抗ＣＤ３抗体を用いて染色されていなかった。種々の自己複製するＲＮＡワクチンで免疫化したマウスのＮＫ細胞の割合を、フローサイトメトリーを使用して分析した。
【０２１２】
（骨髄由来の樹状細胞（ＤＣ）の産生および培養）：ＤＣを、Ｌｕ（２０００）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：５４１−５５０によって記載されるようにＧＭＣ−ＳＦの存在中で、骨骨髄細胞の培養によって生成した。簡単には、骨髄は、マウスの頚骨から選択される。赤血球が溶解され、そして、残りの細胞を、ナイロンメッシュを通して、骨および残渣の小さな部分を枯渇し得る。この細胞を回収し、そして、１×１０６細胞／ｍｌをＲＭＰＩ１６４０中（５％ＦＣＳ、２ｍＭβ−メルカプトエタノール、１％非必須アミノ酸、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）および１００Ｕ／ｍｌ　ＧＭ−ＣＳＦ（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で充填した）の２４ウェルプレートにプレートした。培地のツーハイブリッドシステムを２日毎に交換し、そして、非粘着性細胞を７日目に収穫した。回収された細胞をフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によってＤＣマーカーについて特徴付けた。
【０２１３】
（Ｅ７−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞株の産生）：Ｅ７−特異的ＣＤ８＋細胞株の産生を、Ｓｉｇ／Ｅ７／ＬＡＭＰ−１ワクシニアの腹腔内注射によって、雌マウスＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウスを免疫することによって行なった。脾細胞を８日目に収穫した。最初のインビトロ刺激のために、６日間、２０Ｕ／ｍｌの濃度のＩＬ−２および１μＭ　Ｅ７ペプチド（アミノ酸４９−５７）を使用してパルスした。Ｅ７特異的ＣＴＬ細胞株の増殖を２４ウェルプレート中でＥ７特異的なＣＴＬを含む１×１０６脾細胞を３×１０６の照射された脾細胞と混合（２ｍｌ／ウェル）することによって、そして、２０Ｕ／ｍｌの濃度のＩＬ−２および１μＭ　Ｅ７ペプチド（アミノ酸４９−５７）と共にそれらをパルスすることによって行なった。この手順を６日毎に反復した。Ｅ７　ＣＴＬ株をＣＴＬアッセイによって特徴付けた。フローサイトメトリーを行なって、ＣＤ８マーカーの発現を実証した。
【０２１４】
（インビトロ細胞死分析）：以前に記述されるように、１０００万個のＢＨＫ２１細胞を４μｇのＳＩＮｒｅｐ５、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０またはＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡ転写産物とトランスフェクトした。ネイティブなＢＨＫ２１細胞またはＳＩＮｒｅｐ５　ＲＮＡなしでエレクトロポレーションしたＢＨＫ２１細胞をコントロールとして使用した。ＢＨＫ２１細胞を回収し、そして、２４時間毎に、７２時間まで評価した。アポトーシスのおよび壊死のＢＨＫ２１細胞の割合を、製造業者のプロトコルに従って、アネキシンＶアポトーシス検出キット（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を使用して分析し、フローサイトメトリーを後に続けた。
【０２１５】
（標的細胞としてアポトーシス細胞を用いてパルス化されたＤＣを使用するＣＴＬアッセイ）：標的細胞としてアポトーシス細胞でパルス化されたＤＣを使用するＣＴＬアッセイが、改変を用いて、Ａｌｂｅｒｔ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ３９２：８６−８９；Ａｌｂｅｒｔ（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：１３５９−１３６８によって記載されるプロトコルと同様のプロトコルを使用して行なわれる。簡潔には、１０００万個のＢＨＫ２１細胞を、エレクトロポレーションを介して、４μｇの種々の自己複製ＳＩＮｒｅｐ５　ＲＮＡとトランスフェクトした。ＢＨＫ２１細胞をエレクトロポレーション後１６〜２０時間で回収した。ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、またはＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡ転写産物でトランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞におけるＥ７タンパク質発現のレベルは、ＥＬＩＳＡによって決定される場合、類似していた。次いで、３×１０５トランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞を、４８時間、３７℃で、１×１０５の骨髄由来ＤＣと同時インキュベートした。次いで、これらの調製されたＤＣを標的細胞として使用し、そして、Ｄｂ制限されたＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。ＣＴＬアッセイを、最終容量２００μｌで、種々の比率（１：１、３：１、９：１、および２７：１）で共に混合したエフェクター細胞および標的細胞（ウェル当り１×１０４）を用いて行なった。３７℃で５時間インキュベートした後、５０μｌの培養培地を回収して、上記のように、培養培地中のＬＤＨの量を評価した。トランスフェクトされていないＢＨＫ２１細胞、トランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞単独、未処理のＤＣ単独、およびＣＤ８＋Ｔ細胞株単独と同時インキュベートすることは、ネガティブコントロールとして含まれる。
【０２１６】
（自己複製するＲＮＡ構築物の構築および特徴付け）：プラスミドＤＮＡ構築物の作製および引き続く自己複製するＳＩＮｒｅｐ５　ＲＮＡ構築物の調製を上記のように行なった。ＳＩＮｒｅｐ５ベクターは、ＳｉｎｄｉｂｉｓウイルスＲＮＡレプリカーゼおよびＳＰ６プロモーターをコードする遺伝子を含む（例えば、Ｂｒｅｄｅｎｂｅｅｋ（１９９３）前出）。ＳＩＮｒｅｐ５、ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＤＮＡ構築物を図２０Ａに示す。さらに、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを使用するこれらのＤＮＡ構築物由来のＲＮＡ転写産物の概略図である。メチル化されたＭ７Ｇ「キャップ」は、ｍＲＮＡの５’末端に位置し、自己複製（レプリカーゼ）についての原因のある配列、目的の遺伝子（すなわち、ＭＨＣクラスＩペプチドエピトープ、Ｅ７、ＨＳＰ７０、Ｅ７／ＨＳＰ７０など）、およびポリアデニル化末端（ＡＡＡＡ）が後に続く。ＥＬＩＳＡを行なって、種々の自己複製ＲＮＡ構築物でトランスフェクトされたＢＨＫ細胞による、Ｅ７タンパク質の発現を実証する。ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７およびＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０は、類似の量のＥ７タンパク質を発現した。
【０２１７】
（自己複製するＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡを用いるワクチン接種は、Ｅ７特異的細胞障害性免疫応答を増強する）：ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、抗腫瘍免疫性を誘導するための最も重要なエフェクターの１つである。ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡワクチンによって産生されるＥ７特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞反応の量を決定するために、ＣＴＬアッセイが使用される。マウスを、筋肉内注射を介して、種々のＳＩＮｒｅｐ５自己複製ＲＮＡワクチンで免疫した。脾細胞および血清サンプルを１４日後に回収した。細胞障害性アッセイを行なうために、種々の自己複製ＳＩＮｒｅｐ５　ＲＮＡワクチンからの脾細胞を、エフェクター細胞として、ＭＨＣクラスＩエピトープを含むＥ７ペプチド（ａａ４９−５７）を使用して６日間培養した。ＴＣ−１腫瘍細胞は標的細胞として存在する。ＴＣ−１細胞を、種々のＥ／Ｔ（エフェクター／標的率）で脾細胞と混合した。細胞融解をＬＤＨの定量的な測定によって、決定した。本明細書中にも示されているＣＴＬアッセイは、２つの行なわれた実験の１つの代表的な実験である。
【０２１８】
自己複製ＲＮＡ　Ｅ７／ＨＳＰ７０ワクチンは、他のＲＮＡワクチンと比較する場合、特異的な溶解の有意により高い割合を生じた（＊：Ｐ＜０．００１、一方向のＡＮＯＶＡ）。自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０は、他のＳＩＮｒｅｐ５　ＲＮＡワクチン（Ｐ＜０．００１、一方向のＡＮＯＶＡ）でワクチン接種されたマウスと比較して特定の溶解の有意により高い割合を生成した。ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡの特定の溶解を生成する能力は、自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７ＲＮＡ（３２．７％対８．８％、Ｅ／Ｔ率４５／１、Ｐ＜０．００１）の溶解性の約４倍であることが見出されている。
【０２１９】
（自己スプライシングＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡを用いるワクチン接種は、高レベルのＩＮＦ−γを分泌するためのＥ７特異的ＣＤ８＋を増強する）：自己複製するＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡによって産生されるＥ７特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の免疫学的応答の程度を決定するために、ＥＬＩＳＡが使用し、培養された脾細胞の上清におけるＩＮＦ−γの濃度を検出する。マウスを、筋肉内注射を介して、種々のＳＩＮｒｅｐ５自己複製ＲＮＡワクチンで免疫した。脾細胞および血清サンプルを１４日後に回収した。種々の自己複製ＲＮＡワクチンからの脾細胞を、６日間、ＭＨＣクラスＩエピトープを含む（かまたはいずれのペプチドも使用しない）Ｅ７ペプチド（ａａ４９−５７）を使用してインビトロで培養した。ネガティブコントロールとして、ＥＬＩＳＡをまた、ペプチドなしで行なった。培養培地における上清を回収し、ＥＬＩＳＡを使用して、ＩＮＦ−γ濃度を検出する。
【０２２０】
Ｅ７ペプチド（ａａ４９−５７）を使用して刺激された自己複製Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡ群由来の脾細胞は、他のＲＮＡワクチン（Ｐ＜０．００１、一方向ＡＮＯＶＡ）と比較して、最も高い濃度のＩＮＦ−γを分泌した。これらの結果はまた、ＨＳＰ７０のＥ７への融合が、ＩＮＦ−γ−分泌Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性を有意に増強する。従って、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｅ７のＭＨＣクラスＩによって誘導され得る。注意：Ｅ７ペプチド（ａａ４９−５７）を用いて刺激した、自己複製Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡ群から、群脾細胞は、他のＲＮＡワクチン（＊：Ｐ＜０．００１、一方向ＡＮＯＶＡ）と比較して、最も高いＩＮＦ−γの濃度を分泌した。
【０２２１】
（自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ　ＲＮＡを用いるワクチン接種は、有意なＥ７特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介免疫応答を生成しない）：これらのＲＮＡワクチンのそれぞれによるＥ７特異的ＣＤ４＋Ｔ前駆体細胞およびサイトカインプロフィールの生成を調べるために、当業者らは、免疫されたマウスから得られた脾細胞上のＣＤ４表面マーカーおよび細胞内ＩＦＮ−γについての二重染色を行ない、フローサイトメトリー分析を続けた。この脾細胞をＥ７ペプチド（ａａ３０−６７）を使用して一晩中インビトロで培養し、そして、ＣＤ４および細胞内ＩＦＮ−γの両方について染色した。Ｅ７ペプチド（ａａ３０〜６７）は、ＨＰＶ−１６のＥ７オープンリーディングフレームタンパク質における主なＴヘルパーエピトープを含む（例えば、Ｔｉｎｄｌｅ（１９９１）前出）ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の割合は、フローサイトメトリーを使用して分析される。
【０２２２】
ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡを使用してワクチン接種したマウスは、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７　ＲＮＡ（１５／３×１０５脾細胞対１２／３×１０５脾細胞、ｐ＞０．０５）または他のＲＮＡ群を用いてワクチン接種したマウスと比較した類似した多数のＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋二重陽性細胞を作製した。空のプラスミド、Ｅ７、ＨＳＰ７０、またはＥ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡを使用してワクチン接種したネイティブなマウスを染色するフローサイトメトリーを使用して観察される多数のＥ７特異的なＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋細胞における有意な差異はない。ワクチン接種したＳｉｇ／Ｅ７／Ｌａｍｉ−１　ＤＮＡマウス（Ｊｉ（１９９９）前出）由来の脾細胞は、細胞内ＩＦＮ−γ、この研究のために細胞内ＩＦＮ染色のためのポシティブコントロールとして使用され得る。
【０２２３】
ワクチン接種されたマウスの血清における抗ＨＰＶ１６Ｅ７抗体の質を、種々の希釈（１：０００、１：５００、１：１０００）でのワクチン接種後２週間で、直接酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して決定した。ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０は、他のＲＮＡワクチン構築物によって産生される抗体に比較してワクチン接種されたマウスの血清におけるＥ７特異的抗体のより高い力価を生じなかった。
【０２２４】
（ＴＣ−１腫瘍の増殖に対する自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ／ＨＳＰ７０　ＲＮＡを使用するワクチン接種）：自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡを使用するワクチン接種が、Ｅ７発現腫瘍に対して、マウスを保護するか否か決定するために、インビボ腫瘍保護実験は、右後脚において筋肉内投与された、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ＲＮＡの異なった用量を使用して行なった。マウスを同様に、１０μｇの自己複製ＳＩＮｒｅｐ５、ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０、およびＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７ＲＮＡでワクチン接種される。異なった用量の自己複製ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ＲＮＡ（０．１μｇ、１μｇおよび１０μｇを含む）はまたマウスに注射された。ワクチン接種１週間後、マウスを、２×１０４細胞／マウスの用量で、静脈内尻尾静脈注射を介して、ＴＣ−１腫瘍細胞でチャレンジさせた。マウスを１週間に２回モニターし、そして、腫瘍チャレンジ後、２１日目に屠殺した。この肺小結節を、腫瘍チャレンジ２１日後に評価した。空のＳＩＮｒｅｐ５（１０μｇ）、ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０（１０μｇ）、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７（１０μｇ）およびＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡ（０．１μｇ、１μｇ、または１０μｇ）を使用してワクチン接種した後、３５日後に肺をマウスから解剖した。肺小結節の平均数は、ＨＰＶ−１６Ｅ７発現腫瘍増殖を制御する際に、種々の自己複製ＲＮＡワクチンの効果の測定として使用した。
【０２２５】
自己複製Ｅ７／ＨＳＰ７０ＲＮＡワクチン（０．１μｇ、１μｇ、および１０μｇ）でワクチン接種したマウスの平均肺小結節を、他のＲＮＡワクチン（Ｐ＜０．００１、１方向ＡＮＯＶＡ）を使用してワクチン接種したマウスと比較すると、非常に低かった。これらの結果は、自己複製ＲＮＡ　ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０ワクチンが、０．１μｇの低用量でさえ、静脈内腫瘍チャレンジからマウスを保護することを実証したが、インサートなしで１０μｇのＳＩＮｒｅｐ５からのＲＮＡでワクチン接種したが、１０μｇのＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、または１０μｇのＳＩＮｐｒｅｐ５−ＨＳＰ７０は、ＴＣ−１腫瘍チャレンジから多数の肺小結節を発症する。
【０２２６】
（ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡワクチンを用いるワクチン接種によって抗腫瘍効果が産生されるのに重要である）：Ｅ７発現腫瘍細胞に対する保護のために重要であるリンパ球のタイプを決定するために、インビボ抗体枯渇（ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の）実験を行なった（自己複製ＲＮＡワクチンで免疫したマウスの脾細胞由来のＮＫ細胞の割合は、免疫しないものよりも高く、そして、種々の自己複製ＲＮＡワクチンの間のＮＫ細胞の割合の間には有意な差異はみなれなかった）。この抗体枯渇は、腫瘍チャレンジの前１週間で始まり、腫瘍チャレンジ後の２１日目に終了する。
【０２２７】
ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ１．１細胞が枯渇したマウスの平均肺小結節は、非枯渇群のそれよりも有意に大きかった。さらに、ＮＫ１．１細胞の枯渇は、ＣＤ８＋枯渇マウス由来の肺小結節腫瘍のより高い平均数を生じた。
【０２２８】
比較すると、ＣＤ４＋Ｔが枯渇したマウス由来の平均肺小結節は、非枯渇のマウスから得られた結果と類似し、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、この効果を生成する際に重要でないことを示す。これらの結果は、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡワクチンによって産出された抗原特異的抗癌免疫に必須であること、ＮＫ細胞（ここで、Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡワクチンに制限されない）が、同様に重要な役割を果たしていることを示唆する。
【０２２９】
ＮＫ細胞の効果がＥ７／ＨＳＰ７０ワクチンに限定され得るか否か、またはそれが使用されるベクターの結果であるか否かがまた調べられた。ＣＤ３（−）、ＮＫ１．１（＋）細胞のフローサイトメトリー分析は、それらの存在が天然のマウスに比較した全ての構築物（Ｅ７／ＨＳＰ７０、Ｅ７、ＨＳＰ７０、およびコントロールプラスミド）におけるそれらの存在が顕著な増加するか否かを開示し、ＮＫ細胞が、Ｅ７／ＨＳＰ７０ワクチンに制限されない抗腫瘍効果の重要なエフェクターであることを示す。
【０２３０】
（自己複製ＲＮＡワクチン誘導アポトーシス）：種々のプラスミドＳＩＮｒｅｐ５ＲＮＡワクチンからインビトロでのＲＮＡ転写は、エレクトロポレ−ションを介して、ＢＨＫ２１細胞へトランスフェクトされる。ＲＮＡおよび不要なＢＨＫ２１を有さないエレクトロポレ−ションされたＢＨＫ２１細胞は、コントロールとして使用される。アポトーシスおよび壊死ＢＨＫ２１細胞は、アネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）によって染色され、フローサイトメトリー分析が後に続く。
【０２３１】
アポトーシス性ＢＨＫ２１細胞の割合は、ＳＩＮｒｅｐ５　ＲＮＡワクチンで２４時間〜７２時間（代表的には、ＳＩＮ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　７０．３±３．６％で２４時間、４９．３±４．２％で４８時間、１８．０±３．１％で７２時間、Ｐ＜０．００１、一方向ＡＮＯＶＡ）トランスフェクトされた場合、統計学的減少を開示した。ＳＩＮｒｅｐ５ＲＮＡワクチンでトランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞は、他の２つのコントロール群と比較して２４、４８または７２時間後により高い割合を生じた。統計学的な差異は、種々のＳＩＮｒｅｐ５　ＲＮＡのアポトーシスの割合において見出されなかった。
【０２３２】
（ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／Ｈｓｐ７０　ＲＮＡを使用してトランスフェクトした細胞でパルス化した樹状細胞におけるＭＨＣクラスＩ経路を介してＥ７の増強された提示）：増強されたインビボにおけるＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答についての推定機構は、種々のＥ７構築物を発現する細胞からアポトーシス性体の取り込みによってＭＨＣクラスＩ経路を通る、Ｅ７の提示であり、また「交差プライミング」ともいう。関連プライミング実験は、種々の自己複製ＲＮＡとトランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞からアポトーシス体でパルス化した樹状細胞におけるＥ７を提示するＭＨＣクラスＩを特徴付けるために行なわれる。以前に記載されるように、ＢＨＫ２１細胞は、異なったＥ７含有自己複製ＲＮＡでトランスフェクトした細胞における安定して高いトランスフェクション効率および類似のＥ７発現を有することが示されている。トランスフェクトされたＢＨＫ２１細胞は、骨髄由来のＤＣと同時インキュベートされる。ＤＣは、標的細胞として使用されるが、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、エフェクター細胞として機能する。種々のＥ／Ｔ比率を有するＣＴＬアッセイが行なわれる。
【０２３３】
ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＲＮＡでトランスフェクトしたＢＨＫ２１細胞と同時インキュベートしたＤＣ標的細胞は、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７（Ｐ＜０．００１）でトランスフェクトしたＢＨＫ２１細胞で同時インキュベートしたＤＣと比較して、有意により高い割合の特異的な溶解を生じた。これらの結果は、樹状細胞が、Ｅ７／ＨＳＰ７０融合タンパク質を含むアポトーシス体を用いてパルス化した樹状細胞が、野生型Ｅ７タンパク質を含むアポトーシス体でパルス化された樹状細胞よりもより効率的にＭＨＣクラスＩ経路を介して、Ｅ７抗原を提示することを示唆する。従って、ＨＳＰ７０のＥ７への融合は、Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫応答を増強する；および、本発明は、いずれの特定の機構によっても制限されないが、その増強は「交差プライミング」を介して起こるようである。
【０２３４】
本発明のいくつかの実施形態が記載されている。それにも関わらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変が行なわれ得る。従って、他の実施形態もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０２３５】
種々の図中の同様の参照記号は、同様のエレメントを示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａは、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの結果を示す棒グラフである。ＩＦＮ−γ産生Ｅ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体の数を、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して決定した。スポットの数は、各ワクチン接種をした群における３回の標準誤差の平均である。Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡでワクチン接種したマウスは、最も高いＩＦＮ−γ＋スポット数を生じた。示されたデータは、Ｅ７特異的スポット形成細胞を表す（Ｅ７　ＣＴＬペプチドの非存在下で検出されるスポット数を減算している）。図１Ｂは、フローサイトメトリー分析の結果を示す図である。ワクチン接種したマウス由来の脾臓を、一晩Ｅ７ペプチド（残基４９−５７；ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ；配列番号５）と共にインビトロで培養し、そしてＣＤ８および細胞内ＩＦＮ−γの両方について染色した。種々の組換えＤＮＡワクチンで免疫化したマウス中のＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体の数を標準的なフローサイトメトリーにより分析した。Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡをワクチン接種したマウスは、最も高いＩＦＮ−γ＋ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞を生じた。３×１０５の脾細胞中のＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋二重陽性Ｔ細胞の数を、上段右角に示す。図１Ａ〜Ｂに示されるデータは、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡワクチンで免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウス中のＥ７特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体の頻度を示す。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、遺伝子銃を使用して、ＨＳＰ７０　ＤＮＡ　（Ｅ７＋ＨＳＰ）と混合した、空のプラスミド、（ｐｃＤＮＡ３）、ＨＳＰ７０　ＤＮＡ（ＨＳＰ）、Ｅ７　ＤＮＡ（Ｅ７）、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡ（Ｅ７／ＨＳＰ）もしくはＥ７　ＤＮＡで免疫化するか、またはワクチンを受けさせなかった。ワクチン接種したマウスについて、２μｇのＤＮＡ／マウスを２回与えた。脾細胞を、最後のＤＮＡワクチン接種の１０日後に収集した。
【図２】
図２は、種々の組換えＤＮＡワクチンを接種したマウス中のＩＦＮ−γ分泌Ｅ７特異的ＣＤ４＋細胞のフローサイトメトリー分析の図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、図１Ａ〜１Ｂに記載されるように免疫化した。ワクチン接種したマウス由来の脾細胞を、一晩Ｅ７ペプチド（残基３０〜６７；ＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬ；配列番号６）と共にインビトロで培養し、そしてＣＤ４および細胞内ＩＦＮ−γの両方について染色した。ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を、フローサイトメトリーにより分析した。Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡをワクチン接種したマウスは、野生型Ｅ７　ＤＮＡをワクチン接種したマウスと比較して、匹敵するＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋二重陽性細胞を生成する。３×１０５の脾細胞中のＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋二重陽性Ｔ細胞の数は、上段右角に示される。
【図３】
図３は、種々の組換えＤＮＡワクチンで免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＥ７−特異抗体応答を示す棒グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、遺伝子銃を使用して、コントロールプラスミド（挿入なし）、野生型ＨＳＰ７０、野生型Ｅ７またはＥ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡで免疫化した。ワクチン接種の１４日後に、免疫化したマウスから血清サンプルを得た。Ｅ７−特異的抗体の応答を、血清の連続希釈物を使用して、ＥＬＩＳＡにより検出した。１：８０希釈からの結果を示し、これは、４５０ｎｍＳＥにおける平均吸光度（Ｏ．Ｄ．）を示す。
【図４】
図４Ａおよび４Ｂは、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡを用いるワクチン接種が、ＴＣ−１腫瘍の増殖に対してマウスを保護することを示す線グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、遺伝子銃を使用して、空のプラスミド（ｐｃＤＮＡ３）、ＨＳＰ７０　ＤＮＡ（ＨＳＰ）、Ｅ７　ＤＮＡ（Ｅ７）、またはＥ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡ（Ｅ７／ＨＳＰ）で免疫化した。最後のワクチン接種の１週間後、マウスあたり５×１０４のＴＣ−１細胞を用いて、マウスを右脚において皮下にチャレンジした。このマウスを、１週間に２回、触診法および視診により、腫瘍増殖の証拠についてモニターした。ＴＣ−１チャレンジの６０日後、腫瘍を有さないマウスを、マウスあたり５×１０４のＴＣ−１細胞を、マウスを右脚において皮下に再チャレンジした。図４Ａに示したデータを作成するために、各マウスに２μｇのＤＮＡワクチンを受けさせた。１週間後、このマウスを、１回目のワクチン接種と同じ型かつ同じ量のＤＮＡを再ワクチン接種させた。図４Ｂに示したデータを作成するために、各マウスを、さらなるブースターなしで、２μｇのＤＮＡワクチンの１回の注射のみを受けさせた。
【図５】
図５Ａおよび図５Ｂは、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡを用いるワクチン接種が、既存のＴＣ−１腫瘍細胞を根絶することを示す線グラフである。各マウスを、初めに、２×１０４ＴＣ−１細胞を用いて皮下にチャレンジし、続いて、遺伝子銃を使用して、空のプラスミド（ｐｃＤＮＡ３）、ＨＳＰ７０　ＤＮＡ（ＨＳＰ）、Ｅ７　ＤＮＡ（Ｅ７）、またはＥ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡ（Ｅ７／ＨＳＰ）をＤＮＡワクチン接種させた。このマウスを、１週間に２回、触診法および視診により、腫瘍増殖の証拠についてモニターした。図５Ａに示したデータを作製するために、各マウスに、腫瘍チャレンジの３日後および１０日後に２μｇのＤＮＡワクチンを受けさせ、そして図５Ｂのために、各マウスに、腫瘍チャレンジの３日後のみに２μｇのＤＮＡワクチンを受けさせた。ならなるブースターは与えなかった。
【図６】
図６は、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡにより生成された抗腫瘍免疫性が、Ｅ７遺伝子配列へのＨＳＰ７０　ＤＮＡ配列の融合を必要とすることを示す、線グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、遺伝子銃を使用して、ＨＳＰ７０　ＤＮＡ（Ｅ７＋ＨＳＰ）と混合したＥ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡ（Ｅ７／ＨＳＰ）もしくはＥ７　ＤＮＡで免疫化したか、またはワクチンを受けさせなかった。ワクチン接種したマウスについて、１匹のマウスあたり２μｇのＤＮＡを１回だけ与えた。そのワクチン接種の１週間後、マウスを、１匹のマウスあたり５×１０４のＴＣ−１細胞で、右脚において皮下にチャレンジした。このマウスを、１週間に２回、触診法および視診により腫瘍増殖の証拠についてモニターした。
【図７】
図７は、Ｅ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡワクチンの効力に対するリンパ球サブセット抑制の効果を示す、直線グラフである。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、遺伝子銃を使用して２μｇのＥ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡで免疫化し、そして１週間後、２μｇのＥ７−ＨＳＰ７０　ＤＮＡでチャレンジした。最後のワクチン接種の２週間後、マウスを、１匹のマウスあたり５×１０４のＴＣ−１細胞を用いて、右脚において皮下にチャレンジした。細胞抑制は、腫瘍チャレンジの１週間前に開始し、そして腫瘍チャレンジ後４０日続いた。ＭＡｂ　ＧＫ１．５をＣＤ４抑制のために使用し、ＭＡｂ　２．４３をＣＤ８抑制のために使用し、そしてＭＡｂ　ＰＫ１３６をＮＫ１．１抑制のために使用した。フローサイトメトリー分析は、９５％を越える適切なリンパ球サブセットが他のサブセットの正常なレベルで抑制されたことを明らかにした。このマウスを、一週間に２回、触診法および視診により腫瘍増殖の証拠についてモニターした。
【図８】
図８は、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）、ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７、ＧＭ−Ｅ７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＴＡ（ｄＩＩ）、Ｅ７の構築物の図である。
【図９】
図９は、ＧＭ−ＥＴＡ（ＤＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡワクチンで免疫化したＣ５７ＢＬ／６マウスにおけるＥ７−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体を決定するために行った、細胞内サイトカイン染色を示すフローサイトメトリー分析の図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、遺伝子銃を使用して皮内に、ＧＭ、ＥＴＡ（ｄＩＩ）、Ｅ７、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）、ＥＴＡ（ＤＩＩ）−Ｅ７、ＧＭ−Ｅ７またはＧＭ−ＥＴＡ（ＤＩＩ）−Ｅ７遺伝子挿入物を有するプラスミドＤＮＡまたは「空の」プラスミドベクターで免疫化したか、またはワクチン接種を受けさせなかった。ワクチン接種したマウスについて、１匹のマウスあたり２μｇのＤＮＡを２回与えた。最後のＤＮＡワクチン接種の１０日後に脾臓を収集した。ワクチン接種したマウス由来の非細胞を、Ｅ７ペプチド（残基４９〜５７；配列番号５）と共に一晩インビトロで培養し、そしてＣＤ８および細胞内ＩＦＮ−γの両方について染色した。種々の組換えＤＮＡワクチンで免疫化したマウスにおけるＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋Ｔ細胞前駆体の数を、フローサイトメトリーにより分析した。ＧＭ−ＥＴＡ（ＤＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡをワクチン接種したマウスは、最も高いＩＦＮ−γ＋ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞を生じた。
【図１０】
図１０は、種々の組換えＤＮＡワクチンをワクチン接種したマウスにおけるＩＦＮ−γ分泌Ｅ７−特異的ＣＤ４＋細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、図２について上記するように免疫化した。ワクチン接種したマウス由来の脾細胞を、一晩、Ｅ７ペプチド（残基３０−６７；配列番号６）と共にインビトロで培養し、そしてＣＤ４および細胞内ＩＦＮ−γの両方について染色した。ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞の数を、フローサイトメトリーにより分析した。ＧＭ−ＥＴＡ（ＤＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡをワクチン接種したマウスは、ＧＭ−Ｅ７　ＤＮＡをワクチン接種したマウスと比較して匹敵するＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋二重陽性細胞を生じた。ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７をワクチン接種したマウスは、空のプラスミド（ｐｃＤＮＡ３）、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）、ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７、ＧＭ−Ｅ７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＴＡ（ｄＩＩ）またはＥ７　ＤＮＡで免疫化したマウスよりも多数のＥ７特異的ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋二重陽性細胞を生じた。
【図１１】
図１１は、ＧＭ−ＥＴＡ（ＤＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡでのワクチン接種が、ＴＣ−１腫瘍に対してマウスを防護することを示す線図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、遺伝子銃を使用して、１匹のマウスあたり２μｇの空のプラスミド（ｐｃＤＮＡ３）、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）、ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７、ＧＭ−Ｅ７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＴＡ（ｄＩＩ）、Ｅ７　ＤＮＡまたはＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７　ＤＮＡで免疫化した。１週間後、このマウスを、１回目のワクチン接種と同じ型かつ同じ量のＤＮＡを再ワクチン接種させた。最後のワクチン接種の１週間後、マウスを、１匹のマウスあたり５×１０４ＴＣ−１細胞を用いて、右脚において皮下にチャレンジした。このマウスを、１週間に２回、腫瘍増殖の証拠について、触診法および視診によりモニターした。ＴＣ−１チャレンジの６０日後、腫瘍を有さないマウスを、１匹のマウスあたり５×１０４ＴＣ−１細胞を用いて、右脚において皮下に再チャレンジした。
【図１２】
図１２は、ＧＭ−ＥＴＡｄＩＩ−Ｅ７　ＤＮＡワクチンの効力に対するリンパ球サブセットの抑制の効果を示す、線図である。Ｃ５７ＢＬ／６　マウスを、遺伝子銃を使用して２μｇのＧＭ−ＥＴＡｄＩＩ−Ｅ７　ＤＮＡで免疫化し、そして１週間後、２μｇのＧＭ−ＥＴＡｄＩＩ−Ｅ７　ＤＮＡをブーストした。最後のワクチン接種の２週間後、マウスを、１匹のマウスあたり、５×１０４のＴＣ−１細胞を、右脚において皮下に再チャレンジした。抑制は、腫瘍のチャレンジの１週間前に開始し、そして腫瘍チャレンジ後、示された日数続いた。ＭＡｂ　ＧＫ１．５（Ｄｉａｌｙｎａｓら，１９８３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２４４５−２４５１）を、ＣＤ４について使用し、ＭＡｂ２．４３（Ｓａｒｍｉｅｎｔｏら，１９８０，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５：２６６５−２６７２）をＣＤ８抑制について使用し、そしてＭＡｂ　ＰＫ１３６（Ｋｏｏら，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３７４２−３７４７）をＮＫ１．１抑制について使用した。フローサイトメトリー分析は、適切なリンパ球サブセットの９５％以上が、他のサブセットの正常なレベルに枯渇したことを明らかにした。マウスを、１週間に２回、触診法および視診により、腫瘍増殖の証拠についてモニターした。
【図１３】
図１３は、Ｅ７−ＨＳＰ７０免疫原性構築物のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の図である。
【図１４】
図１４は、ＧＭ−ＥＴＡ（ｄＩＩ）−Ｅ７免疫原構築物のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の図である。この構築物のＧＭ−ＣＳＦ部分、ＥＴＡ（ｄＩＩ）、およびＥ７部分を、ブラケットで示す。
【図１５】
図１５は、ＥＴＡのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の図である（シグナル配列なし）。免疫原構築物を作成する際に使用される残基２４７−４１７（および対応するヌクレオチド配列）に、ブラケットを付す。
【図１６】
図１６は、全長Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓＨＳＰ７Ｏタンパク質（配列番号９）のドメイン構造を示す図である。ＡＴＰａｓｅドメイン（残基１−３５６）に下線を付し；基質結合ドメイン（ＳＤ；残基３５７−５１６）は斜体であり、そしてＣ末端ドメイン（ＣＤ：残基５１７−６２５）は太字である。
【図１７】
図１７は、哺乳動物細胞発現ベクターにおけるプラスミド構築物の図である。キメラＥ７／熱ショックタンパク質構築物のすべて（Ｅ７−ＨＳＰ７Ｏ、Ｅ７−ＡＴＰ、Ｅ７−ＳＤ、Ｅ７−ＣＤおよびＥ７）を、サイトメガロウイルスプロモーターの下流の、発現ベクターのマルチプルクローニング部位へクローン化した。
【図１８】
図１８Ａは、Ｈｓｐフラグメント−抗原キメラ（Ｅ７−ＨＳＰ７Ｏ、Ｅ７−ＡＴＰ、Ｅ７−ＳＤ、Ｅ７−ＣＤおよびＥ７）をコードする核酸構築物を含む組換えＤＮＡワクチンで免疫化したマウス中のＩＦＮ−γ　Ｅ７−特異的ＣＤ８＋細胞のフローサイトメトリー分析の図である。図１８Ｂは、ＩＦＮ−γ産生Ｅ７−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均の数を示す棒グラフである。
【図１９】
図１９は、哺乳動物細胞発現ベクターにおけるプラスミド構築物の図である。
【図２０】
図２０Ａは、ＳｌＮｒｅｐ５、ＳＩＮｒｅｐ５−ＨＳＰ７０、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７、ＳＩＮｒｅｐ５−Ｅ７／ＨＳＰ７０　ＤＮＡ構築物の概略図を示す。図２０Ｂは、上記の実施例６に詳細に記載されるＳＰ６　ＲＡＮポリメラーゼを使用するこれらのＤＮＡ構築物に由来するＲＮＡ転写物の概略図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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