(57)【要約】哺乳動物に効果的な量の効果的な量のＴＡＣＩ薬を投与することを含んで成る、望ましくない細胞増殖に付随する症状について哺乳動物を処置する方法、ここで該薬はＴＡＣＩ薬を投与しない場合と比べて、該哺乳動物の平均余命を約１０％以上延ばす。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
望ましくない細胞増殖に付随する症状について哺乳動物を処置する方法であって、　ＴＡＣＩ　薬を投与しない哺乳動物の平均余命に比べて該哺乳動物の平均余命を延ばすために効果的な量の該　ＴＡＣＩ　薬を該哺乳動物に投与することを含んで成り、該望ましくない細胞増殖が少なくとも１つの充実性腫瘍を含んで成る、上記方法。
【請求項２】
上記　ＴＡＣＩ　薬が、上記哺乳動物の平均余命を約　１５　％まで延ばす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記　ＴＡＣＩ　薬が、上記哺乳動物の平均余命を約　２０　％まで延ばす、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記　ＴＡＣＩ　薬が、上記哺乳動物の平均余命を約　２５　％まで延ばす、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
上記　ＴＡＣＩ　薬が少なくとも２つのセグメントを含んで成る融合タンパク質であり、第１セグメントは実質的に純粋な　ＴＡＣＩ　タンパク質またはそのポリペプチドフラグメントを含んで成り、そして第２セグメントは免疫グロブリンポリペプチドを含んで成る、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項６】
免疫グロブリンポリペプチドが　Ｆｃ　ドメインである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
上記　Ｆｃ　ドメインが　ＩｇＧ　 　Ｆｃ　ドメインである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
上記融合タンパク質の上記第１セグメントが：
（ａ）　ＴＡＣＩ　ポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基１〜　１６６　；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基１〜　１６０　；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基１〜　１１４　；および
（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基　３２　〜　１１４
から成る群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
上記融合タンパク質の上記第１セグメントが：
（ａ）　ＴＡＣＩ　ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも　８０　％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基１〜　１６６　と少なくとも　８０　％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基１〜　１６０　と少なくとも　８０　％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基１〜　１１４　と少なくとも　８０　％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド；および
（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基　３２　〜　１１４　と少なくとも　８０　％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド
から成る群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
望ましくない細胞増殖に付随する上記症状が、腎臓細胞癌、カポジ肉腫、胸部癌、肉腫、卵巣癌腫、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭鱗状細胞癌腫、胃腸管癌、および胃癌から成る群から選択される癌である、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物が、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、マウス、ラットおよびネコから成る群から選択される、請求項１、２、３または４に記載の方法。
【請求項１２】
哺乳動物に効果的な量の　ＴＡＣＩ　薬を投与することを含んで成る、該哺乳動物上または中に位置する充実性腫瘍のサイズを下げる方法であって、該薬が該充実性腫瘍のサイズを約　１０　％以上下げる、上記方法。
【請求項１３】
上記　ＴＡＣＩ　薬が上記充実性腫瘍のサイズを約　１５　％以上下げる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
上記　ＴＡＣＩ　薬が上記充実性腫瘍のサイズを約　２０　％以上下げる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
上記　ＴＡＣＩ　薬が上記充実性腫瘍のサイズを約　２５　％以上下げる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
上記　ＴＡＣＩ　薬が少なくとも２つのセグメントを含んで成る融合タンパク質であり、第１セグメントは実質的に純粋な　ＴＡＣＩ　タンパク質またはそのポリペプチドフラグメントを含んで成り、そして第２セグメントは免疫グロブリンポリペプチドを含んで成る、請求項１２、１３、１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
免疫グロブリンポリペプチドが　Ｆｃ　ドメインである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
上記　Ｆｃ　ドメインが　ＩｇＧ　 　Ｆｃ　ドメインである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記融合タンパク質の上記第１セグメントが：
（ａ）　ＴＡＣＩ　ポリペプチドの細胞外ドメイン；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基１〜　１６６　；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基１〜　１６０　；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基１〜　１１４　；および
（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基　３２　〜　１１４
から成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
上記融合タンパク質の上記第１セグメントが：
（ａ）　ＴＡＣＩ　ポリペプチドの細胞外ドメインと少なくとも　８０　％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号１のアミノ酸残基１〜　１６６　と少なくとも　８０　％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１のアミノ酸残基１〜　１６０　と少なくとも　８０　％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１のアミノ酸残基１〜　１１４　と少なくとも　８０　％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド；および
（ｅ）配列番号１のアミノ酸残基　３２　〜　１１４　と少なくとも　８０　％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド
から成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
発明の分野
本発明は、一般に癌を含む望ましくない細胞増殖に付随する症状について哺乳動物を処置する方法に関する。
【０００２】
発明の背景
サイトカインの腫瘍壊死因子（　ＴＮＦ　）ファミリーの員は、絶えず広がる重要な生物機能の配置が関与する。　ＴＮＦ　ファミリーの各員は、レセプタータンパク質の平行するファミリーの１以上の員、すなわちタンパク質の　ＴＮＦ　レセプターファミリーに結合することにより作用する。次に　ＴＮＦ　レセプターは、細胞内にシグナルを発信して広い範囲の生理学的または発育的応答を誘導する。多くの　ＴＮＦ　レセプターのシグナルが細胞の運命に影響を及ぼし、そしてしばしば最終的な細胞分化を誘発する。細胞分化の例には、増殖、成熟、移動および死を含む。
【０００３】
引用により本明細書に編入する米国特許第　５，９６９，１０２　号明細書では、　ＴＡＣＩ　（膜貫通アクチベーター 　ＣＡＭＬ　 インターアクター タンパク質：　Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒ　　ａｎｅ　 　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ　 　ＣＡＭＬ　 　Ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ　 　ｐｒｏｔｅｉｎ　）である新規な　ＴＮＦ　ファミリーの員のレセプタータンパク質を記載する。しかし　ＴＡＣＩ　に対する対応する　ＴＮＦ　ファミリーの員のリガンドは未知であった。
【０００４】
本発明は、出願人の同時係属国際出願である　ＰＣＴ／ＵＳ９８／１９１９１　に記載されている　ＴＮＦ　ファミリーの員である　ＡＰＲＩＬ　が　ＴＡＣＩ　のリガンドであることを開示する。また　ＴＡＣＩ　薬が、例えば癌を含む望ましくない細胞増殖に付随する症状について、哺乳動物を処置するために特に有用であることも本発明の知見である。
【０００５】
発明の要約
本発明は、効果的な量の　ＴＡＣＩ　薬を哺乳動物に投与することを含んで成る、望ましくない細胞増殖に付随する症状について哺乳動物を処置する方法を対象とする。望ましくない細胞増殖に付随する症状には限定するわけではないが、癌、特に腎臓癌、カポジ肉腫、前立腺癌、胸部癌、肉腫、卵巣癌腫、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭鱗状細胞癌腫、胃腸管癌、および胃癌を含む。
【０００６】
好適な態様では、本発明は望ましくない細胞増殖に付随する症状について哺乳動物を処置する方法に関し、ここでそのような細胞増殖には充実性腫瘍が関係する。特にそのような充実性腫瘍の癌状態には前立腺、肺、胸部、結腸直腸、膀胱、子宮内膜、卵巣、口腔咽頭部／喉頭、頸、胃、膵臓および脳（中枢神経系）の腫瘍を含む。
【０００７】
また哺乳動物に効果的な量の　ＴＡＣＩ　薬を投与することを含んで成る、該哺乳動物上または中に位置する腫瘍のサイズを下げる方法も意図する。好適な態様では、腫瘍は充実性腫瘍である。
【０００８】
本発明の方法には、少なくとも２つのセグメントを含んで成る融合タンパク質の使用を含み、ここで第１セグメントは実質的に純粋な　ＴＡＣＩ　タンパク質またはそれらのポリペプチドフラグメントを含んで成り、そして第２セグメントは免疫グロブリンポリペプチドを含んで成る。免疫グロブリンポリペプチドは好ましくはヒト　ＩｇＧ　 　Ｆｃ　 ドメインである。
【０００９】
前述の一般的記載および以下の詳細な説明は例および説明であると理解され、そして特許請求する本発明のさらなる説明を提供することを意図している。
【００１０】
発明の詳細な説明
本明細書に引用する特許出願、特許および技術文献は当業者の知識を示し、そして引用により全部編入する。引用した技術文献と本開示中の具体的教示の間で一致しない場合は、本開示を優先する。同様に、技術的に理解されている用語の意味と本開示中で具体的に教示する用語の意味の間で一致しない場合は、本開示を優先して解釈する。
【００１１】
今、　ＴＡＣＩ　は　ＡＰＲＩＬ　（増殖誘導リガンド：　Ａ　 　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　 　Ｉｎｄ　　ｕｃｉｎｇ　 　Ｌｉｇａｎｄ　）のレセプターであることが予期せず見い出された。また　ＴＡ　　ＣＩ　薬が望ましくない細胞増殖に付随する症状について哺乳動物を処置するために使用することができることも本発明の予期せぬ知見であり、これは該哺乳動物に効果的な量の　Ｔ　　ＡＣＩ　薬を投与することを含んで成り、ここで該薬は該症状に関して　ＴＡＣＩ　薬を投与しない場合と比較して、該哺乳動物の平均余命を約　１０　％、　１５　％、　２０　％、　２５　％以上延ばす。さらに　ＴＡＣＩ　薬を哺乳動物上または中に位置する腫瘍のサイズを減少させるために使用でき、これは該哺乳動物に効果的な量の　ＴＡＣＩ　試薬を投与することを含んで成り、ここで該薬は、　ＴＡＣＩ　薬を投与しない場合と比較して、該腫瘍のサイズを約　１０　％、　１５　％、　２０　％、　２５　％以上下げるということは、本発明の予期せぬ知見である。
【００１２】
本明細書で使用するように、「処置する、または処置」とは利益または望ましい臨床的結果を得るための取り組みを意味する。本発明の目的に関して、利益または望ましい臨床的結果とは限定するわけではないが、以下の１以上を含む：症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患状態の安定化（例えば悪化しない）、疾患が広がること（例えば転移）の防止、疾患の発生または再発の防止、疾患の進行を遅らせるか、またはゆっくりとさせる、疾患状態の改善、および緩解（部分的または全体的のいずれにしても）。また「処置」には、特に癌を含む望ましくない細胞増殖に付随する症状の病理学的結果の減少を包含する。
【００１３】
本明細書で使用する「哺乳動物」とは、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ラット、マウスおよびネコを含む任意の哺乳動物を意味する。本発明の好適な態様では、哺乳動物はヒトである。
【００１４】
本明細書で使用する「望ましくない細胞増殖に付随する症状」とは、限定するわけではないが癌、特に限定するわけではないが腎臓細胞癌、カポジ肉腫、胸部癌、肉腫、卵巣癌腫、直腸癌、咽頭癌、黒色腫、結腸癌、膀胱癌、肥満細胞腫、肺癌、乳腺癌、咽頭鱗状細胞癌腫、胃腸管癌または胃癌を含む少なくとも１つの充実性腫瘍を含む症状である。好ましくは癌は肥満細胞腫、黒色腫、リンパ腫、乳腺癌、前立腺および胸部癌である。また限定するわけではないが、例えば強皮症、慢性関節リウマチにおけるパンヌス形成、術後瘢痕および肺、肝臓および子宮線維症から成る群から選択される細胞の過剰増殖（過形成）を含む望ましくない細胞増殖に付随する他の症状も意図する。
【００１５】
本明細書で使用するように「投与する」とは、　ＴＡＣＩ　薬を単独で、または他の薬剤と組み合わせて投与することができ、そして生理学的に許容されるそれらのキャリアーと組み合わせることができることを意味する。特定の　ＴＡＣＩ　薬の効果的量および投与法は、個々の哺乳動物および疾患段階および当業者には明らかの他の因子に基づき変動することができる。特定の応用に有用な投与経路（１つまたは複数）は、当業者には明らかである。
【００１６】
投与経路には限定するわけではないが、局所的、経皮的、非経口的、胃腸管、経気道（　ｔ　　ｒａｎｓｂｒｏｎｃｈｉａｌ　）および経肺胞（　ｔｒａｎｓａｌｖｅｏｌａｒ　）を含む。局所的投与は複合オリゴヌクレオチドを含有する局所的に適用するクリーム、ゲル、リンス等を介して行う。経皮的投与は、　ＴＡＣＩ　薬が皮膚を透過し、そして血流に入れるようにすることができるクリーム、リンス、ゲル等の適用により行う。非経口的投与の経路には、限定するわけではないが電気的、あるいは中枢静脈系への直接注射、静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下注射のような直接注射を含む。胃腸管経路の投与には、限定するわけではないが摂取および直腸投与を含む。経気道および経肺胞投与の経路には、限定するわけではないが、口または鼻のいずれかを介する吸入を含む。
【００１７】
本明細書で使用する「効果的量」とは、有益な、または望ましい臨床的結果を得るために十分な量である（　Ｓｔｉｔｅｓ　 　ｅｔ　 　ａｌ．，　基本的および臨床的免疫学（　ＢＡＳＩＣ　 　＆　 　ＣＬＩＮＩＣＡＬ　 　ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ　）、ラング医学出版社（　Ｌａｎｇｅ　 　Ｍｅｄ　　ｉｃａｌ　 　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ　）、ロス アルトス、カリフォルニア、　１９８２　）。効果的な量は本明細書に記載する１以上の投与で投与することができる。本発明の目的に関して、　ＴＡＣＩ　薬の効果的な量は、　ＴＡＣＩ　薬を投与しない場合の平均余命に比べて少なくとも　１０　％まで、あるいは　１５　％、　２０　％または　２５　％まで哺乳動物の平均余命を延ばすために十分な量である。効力の指標の検出および測定は、一般に　ＴＡＣＩ　薬で処置した後に平均余命を上げるような疾患状態に付随する臨床的症状の測定に基づく。
【００１８】
哺乳動物上または中の腫瘍のサイズを下げるための　ＴＡＣＩ　の効果的量は、　ＴＡＣＩ　薬を投与しない場合よりも少なくとも　１０　％、あるいは　１５　％、　２０　％または　２５　％以上、哺乳動物上または中の腫瘍のサイズを下げるために十分な量である。哺乳動物の腫瘍のサイズを測定する方法は当業者には既知であり、そして限定するわけではないが、腫瘍が哺乳動物の外表面上に位置する場合は腫瘍の直径を測定するためのミクロメーターを使用して、非侵襲的　（ｎｏｎ−ｉｎｖａｓｉｖｅ）　手法で測定することができる。あるいは腫瘍が哺乳動物内部に位置する場合、腫瘍の直径を測定するために　ＭＲＩ　を使用することができる。侵襲的　（ｉｎｖａｓｉｖｅ）　手法には哺乳動物から外科的に腫瘍を摘出し、そして腫瘍の重量を計り、そして腫瘍のサイズを　ＴＡＣＩ　薬の処置前と比較することを含む。
【００１９】
本明細書で使用するように、「　ＴＡＣＩ　薬」とは例えば　ＴＡＣＩ　 　ＩｇＧ　 　Ｆｃ　のような　Ｔ　　ＡＣＩ　融合タンパク質を含む　ＴＡＣＩ　へ結合するリガンドを減少させることができる競合的　ＴＡＣＩ　薬を含む、細胞内で　ＴＡＣＩ　シグナルの解釈のされ方に影響を及ぼすことができる薬剤を意味する。また例えば抗　−ＴＡＣＩ　モノクローナル抗体のような抗体の　ＴＡＣ　　Ｉ　への抗体を含む　ＴＡＣＩ　へのリガンド結合を増加させることができる作用性　ＴＡＣＩ　薬も意図する。用語　Ｆｃ　ドメインは、ヒンジ、　ＣＨ２　および　ＣＨ３　ドメインを含んで成るが、抗原結合部位を欠く分子の部分を称する。この用語には　ＩｇＧ　、　ＩｇＭ　および他の抗体アイソタイプの均等な領域を含むことも意味する。
【００２０】
本発明の別の観点は、「アンチセンス」療法において　ＴＡＣＩ　をコードする単離された核酸によりコードされるポリペプチドの使用に関する。本明細書で使用するように「アンチセンス」療法とは、すなわち転写および／または翻訳を阻害することによりコードされたタンパク質の発現を阻害するために、目的のリガンドをコードする細胞性　ｍＲＮＡ　および／または　ＤＮＡ　と細胞内の条件下で特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドまたはそれらの誘導体の投与またはその場での（　ｉｎ　 　ｓｉｔｕ　）生成を称する。この結合は通例の塩基対相補性によるか、または例えば　ＤＮＡ　二本鎖に対する結合については、二重ヘリックスの主溝中での特異的相互作用を介する結合でよい。一般に「アンチセンス」療法とは、当該技術分野で一般的に採用されている範囲の技術を言い、そしてオリゴヌクレオチド配列に対する特異的結合に依存する治療を含む。
【００２１】
本発明のアンチセンス構築物は、例えば細胞中で転写される時に、　ＴＡＣＩ　をコードする細胞性　ｍＲＮＡ　の少なくとも一部に相補的な　ＲＮＡ　を生成する発現プラスミドとして送達することができる。あるいはアンチセンス構築物は、エクスビボで生成されるオリゴヌクレオチドプローブであることができる。そのようなオリゴヌクレオチドプローブは好ましくは、内因性ヌクレアーゼに対して耐性であり、したがってインビボで安定な修飾オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための核酸分子の例は、　ＤＮＡ　のホスホラアミダイト、ホスホチオエートおよびメチルホスホネート同族体である（例えば米国特許第　５，１７６，９９６　号；同第　５，２６４，５６４　号および同第　５，２５６，７７５　号明細書を参照にされたい）。さらにアンチセンス療法に有用なオリゴマーを構築するための一般的取り組みは、例えば　Ｖａｎ　 　Ｄｅｒ　 　Ｋｒｏｌ　 　ｅｔ　 　ａｌ．　　，（１９８８）　 　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　 　６：９５８−９７６　；および　Ｓｔｅｉｎ　 　ｅｔ　 　ａｌ．，（１９８８）　 　Ｃａｎｃｅｒ　 　Ｒｅｓ．４８：２６５９−２６６８　に総説され、これは引用により特に編入する。幾つかの態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは　ＴＡＣＩ　をコードする　ｍＲＮＡ　の調節領域に相補的である。別の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは　ＴＡＣＩ　をコードする　ｍＲＮＡ　の一部をコードするタンパク質に相補的である。本発明の幾つかの態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約　１２　〜約　３５　ヌクレオチド長である。別の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約　１　　５　〜約　２５　ヌクレオチド長である。別の態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは約　１７　〜約　２２　ヌクレオチド長である。
【００２２】
本明細書で使用するように、「平均余命（　ｍｅａｎ　 　ｓｕｒｖｉｖａｌ　 　ｔｉｍｅ　）を延ばす」とは望ましくない細胞増殖に付随する特定の症状を伴う平均余命（　ａｖｅｒａｇｅ　 　ｌｉｆｅ　 　ｅ　　ｘｐｅｃｔａｎｃｙ　）が、平均で増加することを意味する。平均余命は、ヒトでの種々の形態の癌、およびマウスを含む齧歯類での種々の形態の癌を含め、種々の形態の哺乳動物の種々の形態の癌について当業者に知られている。さらに本明細書で使用するように、　ＴＡＣＩ　薬を投与しない場合と比べて例えば平均余命が約　１０　％以上延びるということは、例えば　ＴＡＣＩ　薬を投与しない　３６５　日（約１年）の余命である癌状態のヒト患者について、　ＴＡＣＩ　薬が彼らの平均余命を　３６５　日の約　１０　％以上、全部で約　４０　　０　日の全生存期間に延ばすことを意味する。
【００２３】
「可溶性　ＴＡＣＩ　薬」とは　ＴＡＣＩ　タンパク質またはポリペプチドフラグメントの可溶性状態を意味し、ここで膜貫通ドメインを可溶性とするために、それを標準的な生化学的または組換え　ＤＮＡ　法により開裂または突然変異させた。
【００２４】
別の観点では、本発明は効果的な量の実質的に純粋な、可溶性状態の　ＴＡＣＩ　タンパク質または　ＴＡＣＩ　タンパク質のポリペプチドフラグメントを哺乳動物に投与することを含んで成る、望ましくない細胞増殖に付随する症状について哺乳動物を処置する方法を提供し、ここで　ＴＡＣＩ　タンパク質または　ＴＡＣＩ　タンパク質のポリペプチドフラグメントは、　ＡＰＲＩＬ　の細胞外ドメインに結合し、そしてこれにより異常な細胞成長を阻害する。「タンパク質」または「ポリペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、脂質化、アセチル化またはリン酸化）にかかわらず、ペプチド結合により一緒に連結された２以上のアミノ酸を含んで成る任意の分子を意味する。
【００２５】
本明細書で使用するように、「ポリペプチドフラグメント」とはそれが由来する完全長のタンパク質よりは長さが短いが、１アミノ酸よりは大きいポリペプチドを意味する。したがって　ＴＡＣＩ　タンパク質のポリペプチドフラグメントは、完全長の　ＴＡＣＩ　タンパク質よりも少ないアミノ酸を有する。例えば“　ｈＴＡＣＩ（１−１６０）”　とは、ヒト　ＴＡＣ　　Ｉ　のアミノ酸残基１から　１６０　を含有するヒトの　ＴＡＣＩ　ポリペプチド配列を称する。“　ｈＴＡＣＩ（１−１１４）”　とは、ヒト　ＴＡＣＩ　のアミノ酸残基１から　１２３　を含有するヒトの　ＴＡＣＩ　ポリペプチド配列を称する。“　ｈＴＡＣＩ（３２−１１４）”　とは、ヒト　ＴＡＣＩ　のアミノ酸残基　３２　から　１２３　を含有するヒトの　ＴＡＣＩ　ポリペプチド配列を称する。　ＴＡＣＩ　フラグメントが融合タンパク質として免疫グロブリン分子の部分に連結される態様では、融合タンパク質を示すために“　−Ｉｇ”　が　ＴＡＣＩ　フラグメントの名称の終わりに付加される（例えば、“　ｈＴＡＣＩ（１−１６０）−Ｉｇ”　、“　ｈＴＡＣＩ（１　　−１１４）−Ｉｇ”　および“　ｈＴＡＣＩ（３２−１１４）−Ｉｇ”　）。
【００２６】
ＴＡＣＩ　タンパク質の好適なポリペプチドフラグメントは、　ＴＡＣＩ　の可溶性細胞外ドメインである。例えば　ＴＡＣＩ　タンパク質の好適なポリペプチドフラグメントは、限定するわけではないがアミノ酸１〜約　１６６　（例えば１〜約　１６１　または１〜約　１７１　）、および間の他のアミノ酸である。他の好適なポリペプチドフラグメントは、限定するわけではないがアミノ酸１〜約　１１４　および約　３２　〜約　１１４　のアミノ酸である。　ＴＡＣＩ　の好適なポリペプチドフラグメントは、　ＡＰＲＩＬ　の細胞外ドメインに結合するものである。
【００２７】
特定の態様において特許請求する発明は、　ＡＰＲＩＬ　に結合する能力を有する　ＴＡＣＩ　に由来するペプチドを使用する方法を含む。　ＴＡＣＩ　のフラグメントは、例えば組換え的に、　ＰＣＲ　により、タンパク質溶解的消化または化学合成により幾つかの方法で生成することができる。ポリペプチドの内部または末端フラグメントは、ポリペプチドをコードする核酸の１端または両端から１以上のヌクレオチドを除去することにより生成することができる。突然変異した　ＤＮＡ　の発現は、ポリペプチドフラグメントを生成する。
【００２８】
ポリペプチドフラグメントは、通例の　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　 固相　ｆ−ｍｏｃ　または　ｔ−　　ｂｏｃ　化学のような当該技術分野で既知の技法を使用して化学的に合成することもできる。例えば、本発明のペプチドおよび　ＤＮＡ　配列は、重複したフラグメントを含まない所望の長さのフラグメントに任意に分割するか、または所望の長さの重複したフラグメントに任意に分割することができる。このような方法を以下により詳細に記載する。
【００２９】
ＴＡＣＩ　の可溶性状態はしばしば効果的にシグナルを発信し、したがって今、自然な膜の状態を模する薬剤として投与することができる。本明細書で特許請求する　ＴＡＣＩ　は可溶性サイトカインとして自然に分泌されるが、分泌されない場合は、遺伝子を分泌するように再工作することができる。可溶性の分泌状態の　ＴＡＣＩ　を作成するために、　ＤＮＡ　レベルでＮ　−　末端膜貫通領域および幾らかの柄（　ｓｔａｌｋ　）の領域を除去し、そして選択した発現系で効率的なタンパク質溶解開裂を可能とする　Ｉ　型リーダーまたは　ＩＩ　型リーダー配列と置き換える。技術者は分泌発現構築物中に残す柄の領域の量を変動させて、リガンド結合特性および分泌効率の両方を至適化することができる。例えばすべての可能な柄の長さを含む構築物（すなわち、Ｎ　−　末端短縮物）を調製することができる。特定の態様では、アミノ酸１〜　３２　で出発するタンパク質が生成される。最適な長さの柄の配列は、この種の分析から得られるだろう。
【００３０】
「実質的に純粋」または「実質的に精製された」とは、化合物に自然に付随する成分（例えば、核酸分子、タンパク質、脂質および／または炭水化物）から分離された化合物（例えば核酸分子またはタンパク質）を意味する。水、バッファーおよび他の低分子（例えば、約　１０００　ダルトン未満の分子量を有する分子）は、本発明の実質的に純粋な化合物を付随してよい。好ましくは実質的に精製された化合物はそれに自然に付随する成分を含まない少なくとも　７０　重量％である。より好ましくは実質的に精製された化合物はそれに自然に付随する成分を含まない少なくとも　７５　重量％であり；さらにより好ましくは少なくとも　８０　重量％であり；さらにより一層好ましくは少なくとも　８５　重量％であり；そしてさらにより一層好ましくは自然に付随する成分を含まない少なくとも　９０　重量％である。最も好ましくは、実質的に精製された化合物はそれに自然に付随する成分を含まない少なくとも　９５　重量％である。本発明の第２観点の特定の態様では、　ＴＡＣＩ　タンパク質のポリペプチドフラグメントは、　ＴＡＣＩ　の細胞外ドメイン内に含まれるアミノ酸配列を有する。このフラグメントは、　ＴＡＣＩ　細胞外ドメインよりも小さい任意のサイズでよい。すなわちこのフラグメントは細胞外ドメインの約　２６　％〜約　９９　％を含んでもよく、そしてまた配列番号１のアミノ酸１〜約　１６６　の任意の部分を含んでもよい。例えば本発明のポリペプチドフラグメントは、配列番号１のＮ　−　末端アミノ酸残基１〜約　１６６　を含む。他の態様では、本発明のポリペプチドフラグメントは、配列番号１のＮ　−　末端アミノ酸残基１〜約　１１４　を含む。他の態様では、本発明のポリペプチドフラグメントは、配列番号１のＮ　−　末端アミノ酸残基約　３２　〜約　１１４　を含む。
【００３１】
「　ＴＡＣＩ　細胞外ドメイン」は、　ＴＡＣＩ　の膜貫通および細胞質ドメインを本質的に含まない　ＴＡＣＩ　タンパク質またはポリペプチドの状態を言う。通常、　ＴＡＣＩ　細胞外ドメインはそのような膜貫通および細胞質ドメインの１％未満を有し、そして好ましくはそのようなドメインの　０．５　％未満を有する。好適な態様では、　ＴＡＣＩ　細胞外ドメインは配列番号１のアミノ酸１〜約　１６６　である。当業者は本発明の　ＴＡＣＩ　タンパク質またはポリペプチドフラグメントと同定される膜貫通ドメインがそのような種類の疎水性ドメインを同定するために当該技術分野で日常的に使用される基準に準じて同定されると理解している。膜貫通ドメインの厳密な境界は変動するが、多くても本明細書で具体的に挙げるドメインのいずれかの末端で約５アミノ酸以下であろう。
【００３２】
第２の観点に従い、本発明はプローブとして　ＴＡＣＩ　誘導体、突然変異体、短縮体、および／またはスプライス変異体の配列を使用して、これらの誘導体、突然変異体、短縮体および／またはスプライス変異体が配列番号１と少なくとも　２６　％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも　３０　％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも　５０　％の配列同一性、より好ましくは少なくとも　６５　％の配列同一性、より好ましくは少なくとも　７０　％の配列同一性、より好ましくは少なくとも　７５　％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも　８０　％の配列同一性、そしてより一層好ましくは少なくとも　８５　％の配列同一性、そしてさらにより一層好ましくは少なくとも　９０　％の配列同一性　、　そして最も好ましくは配列番号１と少なくとも　９５　％の配列同一性を共有する限り、　ＴＡＣＩ　のすべての誘導体、突然変異体、短縮体および／またはスプライス変異体を提供する。本明細書で同定する各　ＴＡＣＩ　アミノ酸配列に関する「配列同一性」とは、配列を並べ、そして必要な場合には最大パーセント配列同一性を達成するためにギャップを導入した後、配列同一性の一部として保存的置換を考慮せずに、　ＴＡＣＩ　アミノ酸配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列の同一性の割合を決定する目的の整列は、当該技術分野の技法内の様々な方法、例えばそれらは　ＢＬＡ　　ＳＴ　、　ＡＬＩＧＮ　または　Ｍｅｇａｌｉｇｎ　（　ＤＮＡＳＴＡＲ　）ソウトウェアのような公に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成される。当業者は単離された領域の類似性のみを共有する配列間の関係を検出するために、比較する配列の完全長にわたる最大の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含め、部分的整列を測定するために適切なパラメーターを決定する。（　Ａｌｔｓｃｈｕｌ　 　ｅｔ　 　ａｌ．（１９９０）　 　Ｊ　　．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０　）。
【００３３】
したがって、実質的に均等または改変した活性を表す　ＴＡＣＩ　タンパク質の誘導体、突然変異体、短縮体および／またはスプライス変異体も同様に意図する。これらの変異体は例えば、部位特異的突然変異誘発法を通して得られる修飾のように意図的に、あるいはタンパク質の生産者である宿主中の突然変異を通して得られるような偶然に得ることができる。これらの用語の範囲には、本明細書中で具体的に挙げるタンパク質、ならびにすべての実質的な相同的同族体および対立遺伝子変異を含む。
【００３４】
１つの非限定的な例では、本発明に従い配列番号１のアミノ酸残基１〜約　１６６　またはそれらの可溶性変異体から本質的に成る可溶性の実質的に純粋な　ＴＡＣＩ　タンパク質は、標準的な技法（例えば市販されているペプチド生成設備）に従い化学的に合成される。あるいは可溶性の実質的に純粋な　ＴＡＣＩ　タンパク質またはそれらのポリペプチドフラグメントは、標準的な周知の組換え　ＤＮＡ　法により原核または真核宿主中で合成される。
【００３５】
ＴＡＣＩ　の同族体は、自然に存在する　ＴＡＣＩ　とはアミノ酸配列、または配列が関与しない様式、またはその両方が異なる。非配列的修飾には、　ＴＡＣＩ　のインビボまたはインビトロの化学的誘導化を含む。非配列的修飾には限定するわけではないが、アセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化またはグリコシル化における変化を含む。
【００３６】
好適な同族体は、１以上の保存的アミノ酸置換により、または　ＴＡＣＩ　の活性を完全に破壊しない１以上の非保存的アミノ酸置換、欠失または挿入により配列が配列番号１に与える配列とは異なる　ＴＡＣＩ　、それらの生物学的に活性なフラグメントを含む。保存的置換には典型的には、１つのアミノ酸の類似する特性を持つ別のアミノ酸への置換を含む（例えば、以下の群内の置換：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００３７】
別の観点では、本発明は可溶性状態の　ＴＡＣＩ　タンパク質またはそれらのポリペプチドフラグメントを含んで成る、効果的な量の可溶性の、実質的に純粋な融合タンパク質を投与することを含んで成る哺乳動物の癌の処置法を包含し、ここで融合タンパク質は細胞成長を阻害する。特定の態様では、　ＴＡＣＩ　融合タンパク質は配列番号１の細胞外ドメインを含んで成るアミノ酸配列、または細胞外ドメインの部分を有する。
【００３８】
「融合タンパク質」とは、限定するわけではないが共有結合（例えばペプチド結合）、非共有結合（例えばイオン結合または水素結合）を含む任意の手段により、または化学的架橋物により一緒に連結されたタンパク質またはポリペプチドフラグメントの少なくとも２つのセグメントを含んで成るタンパク質を意味する。また　ＴＡＣＩ　タンパク質の細胞外ドメインのみを持つ種々の融合タンパク質を生成することもできる。非限定的な例には、　Ｔ　　ＡＣＩ　タンパク質の細胞外ドメインおよび例えば免疫グロブリンポリペプチド　ＩｇＧ　を含む免疫グロブリンポリペプチドを含んで成る融合タンパク質を含む。
【００３９】
本発明はまた、特許請求する　ＴＡＣＩ　薬と特異的に反応性の抗体も含む。抗　−　タンパク質／抗　−　ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体は、標準的なプロトコールにより作成することができる（例えば、抗体：ア ラボラトリーマニュアル（　Ａ　 　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　　　ＭＡＮＵＡＬ）　 　Ｈａｒｌｏｗ　 　ａｎｄ　 　Ｌａｎｅ　編集、コールドスプリングハーバー出版、ニューヨーク、　１９８８　を参照にされたい）。マウス、ハムスターまたはウサギのような哺乳動物は、免疫原性状態のペプチドで免疫感作することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与する技法は、キャリアーへの結合、または当該技術分野で周知の他の技法を含む。
【００４０】
ＴＡＣＩ　の免疫原性部分は、アジュバントの存在下で投与することができる。免疫感作の進行は、血漿または血清中の抗体力価を検出することにより監視することができる。標準的な　ＥＬＩＳＡ　または他のイムノアッセイを抗原として免疫原を用いて使用して、抗体のレベルを評価することができる。
【００４１】
好適な態様では、主題の抗体は　ＴＡＣＩ　の抗原決定基、例えば配列番号１のポリペプチドの抗原性決定基、または大変緊密に関連した（例えば　７０　、　８０　または　９０　パーセント相同的、より好ましくは少なくとも　９５　パーセント相同的）ヒトもしくは非ヒト哺乳動物の相同体に免疫特異的である。本発明のさらに好適な態様では、抗　−ＴＡＣＩ　抗体は、例えば配列番号１と　８０　％未満相同的；好ましくは配列番号１と　９０　パーセント未満の相同的；最も好ましくは配列番号１と　９５　パーセント未満相同的であるタンパク質とは実質的に交差反応（すなわち特異的に反応）しない。「実質的に交差反応しない」とは、抗体が非相同的タンパク質に関して、配列番号１のタンパク質に関する結合親和性の　１０　パーセント未満、より好ましくは５パーセント未満、そしてさらに好ましくは１パーセント未満の結合親和性を有することを意味する。
【００４２】
本明細書に使用する用語抗体は、　ＴＡＣＩ　と特異的に反応する抗体のフラグメントを含むことを意図する。抗体は通例の技法を使用して断片化し、そしてフラグメントを全抗体に関して上記と同じ様式で用途についてスクリーニングする。例えば　Ｆ（ａｂ’）２　フラグメントは、抗体をペプシンで処理することにより作成することができる。生成した　Ｆ（ａ　　ｂ’）２　フラグメントを処理してジスルフィド架橋を還元し、　Ｆａｂ’　フラグメントを生成する。本発明の抗体はさらに、抗　−ＴＡＣＩ　活性を有する二重特異的およびキメラ分子を含むことを意図する。すなわち　ＴＡＣＩ　に対する両モノクローナルおよびポリクローナル抗体（　Ａｂ　）、および　Ｆａｂ’　および　Ｆ（ａｂ’）２　のような抗体フラグメントは、　Ｔ　　ＡＣＩ　の作用を遮断するために使用することができる。
【００４３】
様々な形態の抗体は、標準的な組換え　ＤＮＡ　法を使用して作成することもできる。（　Ｗｉ　　ｎｔｅｒ　 　ａｎｄ　 　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９９１）　 　Ｎａｔｕｒｅ　 　３４９：２９３−２９　　９　、引用により本明細書に特に引用する）。例えばキメラ抗体を構築することができ、ここで動物抗体に由来する抗原結合ドメインは、ヒト定常ドメインに連結する（例えば　Ｃａ　　ｂｉｌｌｙ　 　ｅｔ　 　ａｌ．　への米国特許第　４，８１６，５６７　号明細書、引用により本明細書に編入する）。キメラ抗体はヒトの臨床的処置に使用した時、動物抗体により誘導される観察される免疫応答を減少させることができる。
【００４４】
さらに、　ＴＡＣＩ　を認識する組換え体である「ヒト化抗体」を合成することができる。ヒト化抗体は、特異的な抗原−結合の原因である領域が中に挿入されたほとんどのヒト　Ｉｇ　　Ｇ　配列を含んで成るキメラである。動物を所望の抗原により免疫感作し、対応する抗体を単離し、そして特異的抗原結合の原因である可変領域配列の部分を取り出す。動物に由来する抗原結合領域を次いでヒト抗体遺伝子の適切な位置にクローン化し、ここで抗原結合領域は削除されている。ヒト化抗体はヒト抗体におけるヘテロロガスな（すなわち種間）配列の使用を最小とし、したがって処置する個体中の免疫応答を誘導しないようである。
【００４５】
様々な種類の組換え抗体の構築も、異なる種類の免疫グロブリンから単離された可変ドメインおよびヒト定常ドメイン（　ＣＨ１　、　ＣＨ２　、　ＣＨ３　）を含んで成るキメラまたはヒト化抗体を作成することにより達成することもできる。例えば抗原結合部位価が上昇した抗体は、抗体結合部位をヒト重鎖定常領域を持つベクター中にクローン化することにより組換え的に生成することができる（　Ａｒｕｌａｎａｎｄａｍ　 　ｅｔ　 　ａｌ．，（１９９３）　 　Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１４３９−１４５０　、引用により本明細書に編入する）。
【００４６】
加えて、標準的な組換え　ＤＮＡ　技法を使用して抗原結合部位付近のアミノ酸残基を改変させることにより、それらの抗原を用いて組換え抗体の結合親和性を改変することができる。ヒト化抗体の抗原結合親和性は、分子モデリングに基づく突然変異誘発法により上げることができる（　Ｑｕｅｅｎ　 　ｅｔ　 　ａｌ．，（１９８９）　 　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ　　．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　 　８６：１００２９−１００３３）　を引用により本明細書に編入する。
【００４７】
また本発明は、　ＴＡＣＩ　ポリペプチドおよび医薬的に許容される賦形剤を含んで成る医薬組成物を提供する。例えば　ＴＡＣＩ　ポリペプチド用の適当なキャリアーおよびそれらの製剤は、レミングトンの製薬科学（　ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’　 　ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ　 　ＳＣＩＥＮＣＥ　）、第　１６　版、　Ｏｓｌｏ　 　ｅｔ　 　ａｌ．　編集、マック出版社、　１９８０　に記載されている。典型的には、適当な量の医薬的に許容される塩を製剤に使用して製剤を等張性にする。キャリアーの例には塩水のようなバッファー、リンゲル溶液およびデキストロース溶液を含む。溶液の　ｐＨ　は好ましくは約５〜約８％、より好ましくは約　７．４　〜約　７．８　である。さらにキャリアーは、固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスのような徐放性調製物を含み、このマトリックスは成形品の状態、例えばリポソーム、フィルムまたはミクロ粒子である。当業者には例えば投与経路および投与する　ＴＡＣＩ　ポリペプチドの濃度に依存して、特定のキャリアーがより好ましいことが明らかである。
【００４８】
投与は注射により（例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内）、または効果的な状態で血流への送達を確実とする注入のような他の方法により行うことができる。
【００４９】
本発明の別の観点では、本発明は　ＡＰＲＩＬ　タンパク質に特異的に結合する実質的に純粋な結合剤を効果的な量で哺乳動物に投与することを含んで成る、望ましくない細胞増殖に付随する症状について哺乳動物を処置する方法を対象とし、ここで結合剤の　ＡＰＲＩＬ　への結合は望ましくない細胞増殖を阻害する。この観点における結合剤は、配列番号１のアミノ酸残基１〜約　１６６　に少なくとも　２６　％の配列同一性を有するタンパク質である。好ましくは結合剤は、　ＴＡＣＩ　誘導体、突然変異体、短縮体および／またはスプライス変異体をプローブとして使用して、配列番号１と少なくとも　３０　％の配列同一性、より好ましくは少なくとも　５０　％の配列同一性、より好ましくは少なくとも　６５　％の配列同一性、より好ましくは少なくとも　７０　％の配列同一性、より好ましくは少なくとも　７５　％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも　８０　％の配列同一性、さらにより一層好ましくは少なくとも　８５　％の配列同一性、そしてさらにより一層好ましくは少なくとも　９０　％の配列同一性、そして最も好ましくは少なくとも　９５　％の配列同一性を共有する。特定の態様では、　ＡＰＲＩＬ　タンパク質は国際公開第　９９／１２９６５　号明細書に記載されたアミノ酸配列を有する。特に好適な態様では、結合剤は　ＡＰＲＩＬ　タンパク質またはそれらの細胞外ドメインに特異的に結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体あるいは組換え、ヒト化またはキメラ抗体のような抗体、あるいは抗体フラグメントである。
【００５０】
ＴＡＣＩ　薬は当業者に既知の方法により、本明細書に提供される動物データにより容易に推定できる効果的量で投与される　（　例えば体重、体表面積）。さらに望ましくない副作用を生じることなく、所望の効果を達成するために　ＴＡＣＩ　薬の量を増すか、または減らすことは医師の技量の範囲である。
【００５１】
以下の実施例は本発明を具体的に説明するために提供し、そして本発明を限定するものではないと解釈すべきである。
【００５２】
【実施例】
実施例
以下の方法および材料を、これから開示する実施例で使用した。
【００５３】
１．方法および材料
Ａ．ピヒア パストリス（　Ｐｉｃｈｉａ　 　ｐａｓｔｏｒｉｓ）　における　ｍｙｃ−　標識　Ａ８８　マウス　ＡＰＲＩＬ　のクローニングおよび発現
発現ベクター　ｐＣＣＭ２７６　（図４）は、鋳型として　ｐＣＣＭ２１３．１０　（　Ｍｙｃ−　標識　Ｈ８９ｍｕＡＰＲＩＬ　）、前方および逆プライマーとしてそれぞれ合成オリゴヌクレオチド　ＣＤＬ６２０　および　ＬＴＢ６１９　を使用してポリメラーゼ連鎖反応により構築した。前方プライマー　ＣＤＬ６２０　は天然開裂形を表すために、　ＫＥＬ　モチーフに由来する　ＦＡ　　Ｓ　リガンドおよび　ＳａｃＩ　部位と一緒にマウス　ＡＰＲＩＬ　配列の　１０　アミノ酸を戻して付加した。生成した増幅フラグメントは、　ＳａｃＩ　および　ＮｏｔＩ　で消化し、ゲル精製し、そして　ｐＣＣＭ２１３．１０　の同じ制限部位に連結した。この発現構築物は、　ｍｙｃ　エピトープタグに直接融合した酵母シグナル配列であるα交配因子、　ＫＥＬ　モチーフおよびアラニン　８８　で始まるマウス　ＡＰＲＩＬ　を含む。　ｐＣＣＭ２７８６　を　ＳｔｕＩ　で直線化し、　ＧＳ１１５　株　（ｈｉｓ４−）　に電気穿孔し、そしてデキストロースを含有する最少培地にまいた。　ＨＩＳ４　形質転換体は、１つの代表的コロニーをリッチ培地（　ＢＭＧＹ）　に接種し、そして　３０　℃で　４８　時間、密度に成長させることにより発現したタンパク質について分析した。カルチャーを遠心し、そして細胞ペレットは２％メタノールを含有するリッチ誘導培地（　ＢＭＭＹ　）に再懸濁した（１：５）。　３０　℃で２日間誘導した後、上清を　ＳＤ　　Ｓ−ＰＡＧＥ　で泳動し、そして　ｍｕＡＰＲＩＬ　の存在を評価した。クーマーシーブルー染色およびウエスタンブロット（抗　−ｍｙｃ　 　ｍＡＢ９Ｅ１０　を用いる）分析で、グリコシル化　Ａ８８ｍｙｃ−　標識マウス　ＡＰＲＩＬ　の存在を確認した。
Ｂ．　Ｍｙｃ−　マウス　ＡＰＲＩＬ　 　Ａ８８　精製
Ｍｙｃ−　標識マウス　Ａｐｒｉｌ　（　ｍｙｃ−ｍｕＡＰＲＩＬ　）をピー　．　パストリス（　Ｐ．ｐ　　ａｓｔｏｒｉｓ　）で発現させた。タンパク質は約　７．４５　の等電点を有する。　１７５ｍｌ　のピヒア（　Ｐｉｃｈｉａ　）上清は、　３０ｋＤ　カットオフ透析膜を用いて　ＰＢＳ　に一晩透析した。透析物をＱ 　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　カラムに通した。　ｍｙｃ−ｍｕＡＰＲＩＬ　をカラムの素通り中に集め、そして混入物はカラムに結合した。溶出した　ｍｙｃ−ｍｕＡＰＲＩ　　Ｌ　を　２０　倍に濃縮し、そして次いで　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　 　７５　ゲル濾過カラムでカラムクロマトグラフィーを行った。ゲル濾過後、　１．０ＡＵ　の　ＯＤ　−　１ｍｇ　の　ｍｙｃ−ｍｕＡＰＲ　　ＩＬ　を有する８　ｍｇ　の　ｍｙｃ−ｍｕＡＰＲＩＬ　を回収した。クーマシー染色した　ＳＤＳ−　　ＰＡＧＥ　は、約　２２ｋＤ　および　１８ｋＤ　の分子量に移動する２つのバンドを含む均一な　ｍ　　ｙｃ−ｍｕＡＰＲＩＬ　の調製物を示した。マウスのモノクローナル　９Ｅ１０　抗体（抗　−ｍ　　ｙｃ　）を使用したウエスタンブロット分析では、観察された両バンドが免疫反応性であることを示した。精製された　ｍｙｃ−ｍｕＡＰＲＩＬ　の予想されるＮ　−　末端を、ブロットしたタンパク質のエドマン分解により確認した。Ｎ　−　末端シークエンシングおよび　９Ｅ１０　に対する免疫反応性は、　ｍｙｃ　タグが　ｍｙｃ−ｍｕＡＰＲＩＬ　 　Ｎ−　末端に存在することを示した。
Ｃ．　ＦＬＡＧ−　マウス　ＡＰＲＩＬ　精製
プラスミド　ＰＳ７８４　（　ＬＴ０３２　とも呼ばれる）（図７）を用いて、リポフェクチン試薬（ギブコ　（Ｇｉｂｃｏ）　−　ＢＲＬ　）および無血清培地を使用して　２９３Ｔ　細胞を一時的にトランスフェクトした。哺乳動物発現ベクター　ＰＣＲ３　（インビトロゲン　（Ｉｎｖｉｔ　　ｒｏｇｅｎ）　）中に構築したプラスミドは、Ｎ　−　末端　ＦＬＡＧ−　タグを含むマウス　ＡＰＲ　　ＩＬ　の可溶性レセプター−結合ドメインをコードし、細胞培養基に。　ＦＬＡＧ−ＡＰＲＩ　　Ｌ　タンパク質は、抗　−ＦＬＡＧ　 　ｍＡｂ　 　Ｍ２　カラムを使用して製造元（コダック　（Ｋｏｄ　　ａｋ）　）の指示に従い、無血清培地および過剰な精製された　ＦＬＡＧ　ペプチドから精製した。あるいはマウス　ＡＰＲＩＬ　および他の　ＦＬＡＧ　−標識リガンドをコンディショニングした培地から直接分析した。
Ｄ．　ｈＴＡＣＩ（１−１６０）−Ｉｇ　発現
可溶性　ｈＴＡＣＩ　（　１−１６０）−Ｉｇ　（　ＰＳ８８２；　図５）をコードするプラスミドを使用して、　２９３　細胞を一時的にトランスフェクトした。　ｈＴＡＣＩ（１−１６０）−Ｉ　　ｇ　を過剰に発現している　２９３　細胞からのコンディショニングした培地を免疫沈降分析に使用して、　ＡＰＲＩＬ　タンパク質への結合を検出した。
Ｅ．完全長の　ＴＡＣＩ　発現
ｆｌａｇ−　標識した完全長の　ＴＡＣＩ　をコードするプラスミド（　ｐＪＳＴ５５２　；図２）を、　２９３　細胞に一時的にトランスフェクトした。完全長の分子形は細胞表面に保持される。これらのトランスフェクトした細胞を　ＦＡＣＳ　分析に使用して　ＡＰＲＩＬ　タンパク質への結合を検出した。
Ｆ．　ＦＬＡＧ−　ヒト　ＡＰＲＩＬ　生産
プラスミド　ＬＴ０３３　（図９）を使用して、リポフェクチン試薬（ギブコ−　ＢＲＬ　）および無血清培地を使用して　２９３Ｔ　細胞を一時的にトランスフェクトした。哺乳動物発現ベクター　ＰＣＲ３　（インビトロゲン）中に構築したプラスミドは、Ｎ　−　末端　ＦＬＡＧ−　タグを含むヒト　ＡＰＲＩＬ　の可溶性レセプター−結合ドメインをコードし、そして発現したタンパク質が細胞培養基中に分泌される。　ＦＬＡＧ　ヒト　ＡＰＲＩＬ　は、細胞培養上清から直接分析した。
【００５４】
実施例１
細胞上に発現したヒト　ＴＡＣＩ　は、　Ｍｙｃ−　標識したマウス　ＡＰＲＩＬ　と相互反応する
２９３ＥＢＮＡ　細胞を、完全長のＮ　−　末端に　ＦＬＡＧ　標識したヒト　ＴＡＣＩ（ｐＪＳＴ５　　２２　）（図２を参照にされたい）および　ＧＦＰ　マーカー、　（ＡＮ０５０　）を発現するプラスミドでコートランスフェクト　（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）　した。トランスフェクションは　Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ　 　２０００　（ライフテクノロジーズ（　ＬｉｆｅＴｅ　　ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　） を使用して製造元の条件に従い行った。トランスフェクション培地は　１０　％　ＦＢＳ　、４　ｍＭ　 グルタミンおよび　５０　μ　Ｍ　 　Ｚ−ＶＡＤ　（　ＢＡＣＨＥＭ　 バイオサイエンス社　（ＢＡＣＨＥＭ　 　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　 　Ｉｎｃ．　）を補充した　ＤＭＥＭ　であった。細胞は５　ｍＭ　 　ＥＤＴＡ　を補充した　ＰＢＳ　を用いてトランスフェクションから　２４　時間後に回収した。細胞を　ＦＡＣＳ　バッファー（　ＰＢＳ−１０　％　ＦＢＳ　−　０．０２　％ 　ＮａＮ３　）中で洗浄し、そして５×　１０６　細胞／　ｍＬ　の密度に再懸濁した。　ＴＡＣＩ　の発現は　１００　マイクロリットルのトランスフェクトした細胞を抗　−ＦＬＡＧ　 　ｍＡｂ　を５μ　ｇ／ｍｌ　で氷上にて　３０　分間、続いて　１：１００　でロバ抗　−　マウス　ＩｇＧ−ＲＥ　を用いて染色した（ジャクソン イムノリサーチ　（Ｊａｃｋｓｏｎ　 　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃ　　ｈ））　。細胞をそれらが　ＡＰＲＩＬ　に結合する能力について、氷上の　ＦＡＣＳ　バッファー中で　３０　分間インキューベーションすることにより、３μ　ｇ／ｍｌ　から　３００ｎｇ／ｍｌ　の濃度範囲にわたりアッセイした。結合は　Ｒｂ１５３２　（　ｍＡＰＲＩＬ　に対して生成したウサギのポリクローナル　Ａｂ　、　１：１００　）、続いてロバ抗　−　ウサギ　ＩｇＧ−ＰＥ　（　１：　　１００　、ジャクソンイムノリサーチ）を使用して明らかにした。　７−ＡＡＤ　を最終染色　（　　ｔｅｒｍｉｎａｌ　 　ｓｔａｉｎ　）に含め、そして死んだ細胞をゲートアウト（　ｇａｔｅ　 　ｏ　　ｕｔ　）するために使用した。サンプルを　ＦＡＣＳ　により分析し、そしてプロットした（図８）。分析した細胞ゲートを　Ｒ１　で示す。特異的染色は、タンパク質が無い対照と比べて示した　ｍｙｃ−　標識したマウス　ＡＰＲＩＬ　タンパク質を用いた３種の異なる濃度で見られた（図８）。
【００５５】
実施例２
可溶性　ｈＴＡＣＩ（１−１６０）−Ｉｇ　 は　ＦＬＡＧ−　標識したマウス　ＡＰＲＩＬ　と相互反応する
ｈＴＡＣＩ（１−１６０）−Ｉｇ　を含有する　２５０　μ　ｌ　の　Ｏｐｔｉｍｅｍ　を、　ＴＮＦ　ファミリーの種々の　ＦＬＡＧ　リガンドと混合した。幾つかのリガンドは　Ｏｐｔｉｍｅｍ　中にあり、一方他は抗　−ＦＬＡＧ　（　ｍＡｂ　 　Ｍ２　）で精製した。共通の特性は使用した量が経験的に同じであるか（精製したリガンド、すなわち　ｈＢＡＦＦ　、　ｍｕＢＡＦＦ　、　ＴＲＡＩＬ　、　ＦａｓＬ　、　ＥＤＡ　について　５００ｎｇ　）、または　２９３ＥＢＮＡ　細胞中で一時的に発現した（他のすべて　）　。対照レセプター　−Ｆｃ　はプロテインＡカラムで精製した　ＴＮＦＲ１　、　ＯＸ４０　、　ＬＴＢＲ　を除き、　Ｏｐｔｉｍｅｍ　スーパーネート（　ｓｕｐｅｒｎａｔｅ　） として使用した。１μ　ｇ　の精製レセプターを使用した。レセプター　−Ｆｃ　タンパク質（約１μｇ）を、　ＦＬＡＧ−　リガンド（約　５００ｎｇ　）と混合した。容量を　１．２ｍｌ　に　ＰＢ　　Ｓ　で調整し、そして５μ　ｌ　のプロテインＡ　−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　を加えた。インキューベーションは　４２　℃で１時間、ウィール（　ｗｈｅｅｌ　）上で行った。遠心によりビーズを回収し、そしてミニカラム（１　ｍｍ　直径のフリットを持つ黄色いチップ）に乗せた。洗浄はカラムの底から真空を適用して媒質を吸引し、そして　４００　μ　ｌ　の　ＰＢＳ　で２回洗浄することにより行った。乾燥したビーズを　２０　μ　ｌ　のクエン酸塩　−ＮａＯＨ　 　ｐＨ２．７　を用いて溶出し、そして溶出液を ６μ　ｌ　の１　Ｍ　 　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　 　ｐＨ９．０　で中和した。　ＤＴＴ　を加えた　１０　μ　ｌ　 ３×サンプルバッファーを加え、そしてサンプルを煮沸し、そして　２２　μ　ｌ　をウエスタンブロット分析にかけた。膜を連続してポンソーＳで染色し、４％ミルク、　０．５　％ 　Ｔｗｅｅｎ−２０　でブロックし、次いでブロッキングバッファー中１μ　ｇ／ｍｌ　 　Ｍ２　とインキューベーションし、洗浄し、そしてヤギ抗　−　マウス　Ｉｇ−　ペルオキシダーゼ（　１／５０００　ブロックバッファー）で見えるようにした。　ＥＣＬ　を使用してシグナルを発色させた。ペルオキシダーゼ活性をアジドで除去し、膜を洗浄し、そして次いで再度、ロバ抗　−　ヒト　−　ペルオキシダーゼを用いて釣り上げた。
【００５６】
同時免疫沈降のウエスタンの結果は、　ｆｌａｇ−ｍｕＡＰＲＩＬ　のみが　ＴＡＣＩ（１−１　　６０）−Ｉｇ　により同時免疫沈降できることを示す。他の　１４　種の　ｆｌａｇ　標識した可溶性　ＴＮＦ　ファミリーリガンドがいずれも　ＴＡＣＩ（１−１６０）−Ｉｇ　と相互作用できなかったことから、　ＴＡＣＩ（１−１６０）−Ｉｇ　の　ｍｕＡＰＲＩＬ　への結合は特異的であると思われる。
【００５７】
実施例３
腫瘍性および新生物形成性疾患のモディファイヤーとして、誘導化　ＴＡＣＩ　配列、ならびに　ＴＡＣＩ　結合および活性のアンタゴニストおよびアゴニストの使用
腫瘍細胞の成長を評価するために形質転換した細胞の調製および接種の例は、　Ｃｅｌｉｓ　 　ｅｔ　 　ａｌ．　、細胞生物学：ア ラボラトリーハンドブック（　ＣＥＬＬ　 　ＢＩＯＬＯＧＹ，　　Ａ　 　ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ　 　ＨＡＮＤＢＯＯＫ　）、第１巻、アカデミック出版、サンディエゴ、カリフォルニア州、　１９９７　に記載されている。腫瘍細胞は様々な起源に由来し、それらには　ＡＴＣＣ　（ベセスダ、メリーランド州）により維持されている広範囲の腫瘍細胞バンク、不死化細胞系、不死化初代細胞系、安定にトランスフェクトされた細胞系、ヒトを含む哺乳動物起源の腫瘍組織を含む。組織起源が、免疫不全または正常動物の選択の主要な決定物である（　Ｃｅｌｉｓ　 　ｅｔ　 　ａｌ．，ｉｂｉｄ　）。さらに、 発癌性または他の原因（　ｉｎｓｕｌｔｓ）　を使用した種々の動物モデルにおける腫瘍成長の誘導に関する広範な技法がある。
【００５８】
腫瘍生物学に関して、新規リガンドの活性の容易な測定手段として、免疫不全マウスにおける腫瘍の成長を利用するモデル（　Ｈａｈｎｅ　 　ｅｔ　 　ａｌ．（１９８８）　 　Ｊ．Ｅｘｐ．　　Ｍｅｄ．１８８：１１８５−１１９０　）が開発された。両リガンドおよびそれらのアンタゴニストをそのような系、例えば　Ｋａｓｈｉｉ　 　ｅｔ　 　ａｌ．（１９９９）　 　Ｊ．Ｉｍｍｕ　　ｎｏｌ．１６３：５３５８−５３６６；Ｚｈａｉ　 　ｅｔ　 　ａｌ．（１９９９）　 　ＦＡＳＥＢ　 　Ｊ．１３：１８１−１８９）　でアッセイした。　ＴＮＦ　レセプターファミリーの員　（ＬＴＢ　　Ｒ）　に対するアゴニスト　ｍＡｂ　は、腫瘍細胞の成長に顕著な影響を及ぼし、そして生存が示された（　Ｂｒｏｗｎｉｎｇ　 　ｅｔ　 　ａｌ．（１９９６）　 　Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：　　８６７−８７８　）。
【００５９】
腫瘍細胞系を免疫不全マウスの皮下に移植し、そして　ＴＡＣＩ−Ｉｇ　で処置したマウスの腫瘍の成長速度は、約５　ｍｇ／ｋｇ／　週の　ＣＢＥ１１　で処置したマウスの腫瘍の成長速度と同様であり、すなわち対照の処置を与えたマウスの成長速度に比べて大変遅い腫瘍の成長であった。
【００６０】
これらのモデルの別の変更態様は、免疫不全または同系マウスに転移を誘導することが知られている腫瘍供給細胞として使用することであった。例えば　ＡＴＣＣ　（ベセスダ、メリーランド州）は、種々の組織に転移する可能性を持つことが知られている多数のヒト腫瘍系を提供し、そしてこれらの系を使用し　ＴＡＣＩ　活性または拮抗作用が転移に及ぼす効果を調査する。これらのモデルはヒト患者の処置に関する可能性を評価するためにこれまでに使用され、そして現在も使用されている（例えば　ＮＣＩ　により）。
【００６１】
実施例４
可溶性　ＴＡＣＩ　レセプターの生成
ヒトに使用するためのレセプターインヒビターを形成するために、　ＴＡＣＩ　の細胞外ドメインのヒトレセプター　ｃＤＮＡ　配列を使用した（配列番号２）。ヒトの　ｃＤＮＡ　配列を用いて、オリゴヌクレオチドプライマーを設計して、膜貫通および細胞内ドメインの不存在下でレセプターの細胞外ドメインを　ＰＣＲ　増幅した。典型的には通例の技術の１つに、最後のジスルフィド結合した“　ＴＮＦ　ドメイン　”　と膜貫通ドメインとの間のほとんどのアミノ酸を含んだ。あるいは「柄」領域の量を変動させて生成する可溶性レセプターの能力を至適化した。この増幅片は適当な制限部位を含むように工作して種々のＣ　−　末端　ＩｇＧ　融合キメラベクターにクローニングできるようにした。あるいは　Ｉｇ　融合キメラ法の使用に頼らずに、可溶性状態のレセプターを作成するために３　’　末端に停止シグナルを挿入した。生成したベクターは、酵母、昆虫細胞、細菌および哺乳動物細胞を含むバイオテクノロジーで使用するほとんどの系で発現し、そしてすべての種類の発現例が存在する。種々のヒト　Ｆｃ　ドメインを付加して　ＦｃＲ　および相補的相互作用を所望のように至適化または排除した。あるいはこれら　Ｆｃ　ドメインの突然変異した形態を使用して、　ＦｃＲ　または相補的相互作用、またはある種の利点を有する　Ｆｃ　ドメインへの　Ｎ−　連結糖の結合を選択的に除去した。
【００６２】
実施例５
レセプター−リガンド相互作用のインヒビターのスクリーニング
レセプター−　Ｉｇ　融合タンパク質を使用して、レセプターに直接結合する分子についてスクリーニングするように組み合わせライブラリーをスクリーニングする。これらの分子は次いでレセプター−リガンド相互作用を阻害する能力に関して、レセプター−　Ｉｇ　融合タンパク質および可溶性状態のリガンドを使用して　ＥＬＩＳＡ　形式のアッセイで試験する。この　ＥＬＩＳＡ　を直接使用して、阻害化合物について様々な天然産物のライブラリー等をスクリーニングする。レセプターは　ＨＴ２９　系のような細胞系にトランスフェクトし、さら遮断を示すためのスクリーニングアッセイを形成する生物アッセイ（この場合は細胞傷害性）形成する。
【００６３】
実施例６
インビボの腫瘍成長阻害
皮下に　（ｓ．ｃ．）　注射した腫瘍細胞の数は、アンタゴニストを用いた実験を始める前に滴定実験で測定することができる。例えば盛んに成長する　ＳＷ４８０　−結腸腺癌充実性腫瘍系および　ＮＩＨ３Ｔ３　線維肉腫系、それぞれ８×　１０５　細胞および５×　１０５　細胞をヌードマウスに移植することができる。対照または　ＴＡＣＩ−Ｉｇ　タンパク質の投与は移植直前に始めることができ、その後７日毎日投与する。用量は例えば　１００　μ　ｇ／　マウスであることができる。次いで腫瘍の直径をミクロメーターを使用して測定し、そして容量は式　ｖｏｌ　＝　４／３　π　ｒ３　を使用して算出する。
【００６４】
実施例７
インビボの腫瘍成長阻害
免疫不全（　ｎｕ／ｎｕ　）マウスに　ｓ．ｃ．　注射した腫瘍細胞の数は、事前の応答実験で測定した。　ＨＴ２９　を使用した実験には、マウスあたり１×　１０６　細胞を移植した。　ＨＴ２　　９　はヒト結腸腺癌に由来し、そして迅速な腫瘍形成および迅速な腫瘍の成長といった他のヒト結腸腺癌系（例えば　ＳＷ４８０　）の成長特性と類似した成長特性を有する。　ＨＴ２９　細胞が移植されたマウスを移植の日に処置し、そしてその後、毎週、　１００ｕｇｓ　 　ｈＴ　　ＡＣＩ（１−１１４）−ＩｇＧ　を腹腔内に与えた（　ｉ．ｐ．　）。陰性対照には無関係なタンパク質であるポリクローナル　ｈＩｇＧ　および　ｍＡｂ　 　ＭＯＰＣ２１　を含めた。陽性対照には　ＡＰＲＩＬ　結合の別のインヒビターである　ＢＣＭＡ−Ｉｇ　、および腺癌腫の成長を遅くすることが知られている　ｍＬ　 　Ｔｂ−Ｒ　に対する　ｍＡｂ　、　ＣＢＥ１１　を含んだ（　Ｂｒｏ　　ｗｎｉｎｇ　 　ｅｔ　 　ａｌ．（１９９６）　 　Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：８６７−８７８　）。腫瘍の直径をミクロメーターを使用して測定し、そして容量は式　ｖｏｌ　＝　４／３　π　ｒ３　を使用して算出した。
【００６５】
肺癌腫　Ａ５４９　を用いた実験については、我々は１×　１０６　細胞／マウスを移植した。マウスを　１００　μ　ｇ　の　ＴＡＣＩ（１−１１４）−Ｉｇ　、　１００　μ　ｇ　の　ＢＣＭＡ−Ｉｇ　、　１０　　０　μ　ｇ　の　ｈＩｇＧ　または　１００　μ　ｌ　の　ＰＢＳ　で移植の日から初めて、その後毎週処置した。腫瘍の直径をミクロメーターを使用して測定し、そして容量は式　ｖｏｌ　＝　４／３　π　ｒ３　を使用して算出した。
【００６６】
ＨＴ２９　結腸腺癌の腫瘍成長阻害を示す結果は、図１１に示す。　Ａ５４９　の肺癌腫の腫瘍成長阻害を示す結果は、図１２に示す。両実験において、腫瘍成長の有意な遅れが達成された。腫瘍サイズおよび生存は、これらのモデルにおいて直接的に関連し、　ＴＡＣＩ−Ｉ　　ｇ　処置も動物の生存に影響を及ぼす。例えば腫瘍の移植から　９５　日後、　ＴＡＣＩ−ＩｇＧ　処置マウスのわずか　１２．５　％と比べて、　５０　％の　ｈＩｇＧ　処置マウスが末期と採点された。これはこの最終段階の時点で４倍の上昇を表す。
【００６７】
実施例８
ｈＴＡＣＩ（１−１１４）−Ｉｇ　および　ｈＴＡＣＩ（３２−１１４）−Ｉｇ　は、表面に局在する　ＡＰＲＩＬ　に結合する
この実施例は滴定可能な　ＴＡＣＩ−Ｉｇ　融合タンパク質の、　ｍｕＡＰＲＩＬ　をそれらの表面に発現している安定な細胞系への結合を表す。　ｈＴＡＣＩ（１−１１４）−Ｉｇ　、　ｈＴ　　ＡＣＩ（３２−１１４）−Ｉｇ　または　ｈＦＮ１４−Ｆｃ　を発現するプラスミドで一時的にトランスフェクトした　２９３ＥＢＮＡ　細胞からの　２５　μ　ｌ　または５μ　ｌ　のいずれかのコンディショニングした培地を、　５０　μ　ｌ　の最終容量に　ＦＡＣＳ　バッファー中で希釈し、そして表面上に　ｍｕＡＰＲＩＬ　のレセプター結合ドメインを安定に発現している　２．５　×　１０　　５　個の　２９３　細胞と氷上で１時間、インキューベーションした。　ＦＡＣＳ　バッファーで洗浄した後、次いで細胞を抗　−　ヒト　ＩｇＧ−ＰＥ　（　１：１００　希釈、ジャクソンイムノリサーチ　）　と氷上で　３０　分間インキューベーションした。細胞を再度洗浄し、１％パラホルムアルデヒド中で固定し、そして　ＦＡＣＳ　により分析した。図１３は　ＦＬ２　シフトを示し、　ｈＴＡＣＩ（１−１１４）−Ｉｇ　および　ｈＴＡＣＩ（３２−１１４）−Ｉｇ　による表面　ｍ　　ｕＡＰＲＩＬ　の滴定可能な染色を示す。対照は第２段階のみで染色が観察されなかった。対照　−Ｉｇ　、　ＦＮ１４−Ｉｇ　融合タンパク質のいずれの希釈物を用いても染色は観察されず、その両方が第２段階のみでヒストグラムと一緒に移動した。
【００６８】
実施例９
ＥＬＩＳＡ　形式でのマウスおよびヒト　ＡＰＲＩＬ　の　ｈＴＡＣＩ（３２−１１４）−Ｉｇ　への結合
ＥＬＩＳＡ　プレート（コーニング　（Ｃｏｒｎｉｎｇ）　）は、重炭酸バッファー 　ｐＨ　＝　９　　．６　中の５μ　ｇ／ｍｌ　の　ｈＴＡＣＩ（３２−１１４）−Ｉｇ　または　ｍＬ　 　ＴｂＲ−Ｉｇ　対照で一晩被覆し、次いで　ＰＢＳ／０．０５　％ 　Ｔｗｅｅｎ−２０　溶液中で洗浄した後、　Ｐ　　ＢＳ／　２％ウシ血清アルブミン（　ＢＳＡ　）を用いて　３７　℃で２時間ブロッキングした。　Ａ　　ＰＲＩＬ　タンパク質調製物を　０．００４８　〜３μ　ｇ／ｍｌ　の範囲で加え、　ＰＢＳ／　２％　Ｂ　　ＳＡ　で希釈した。特異的な　ＡＰＲＩＬ　結合の検出は、ウサギ抗　−　マウス　ＡＰＲＩＬ　抗血清（　Ｒ１５３２　）およびロバ抗　−　ウサギ　ＨＲＰ　（ジャクソンイムノリサーチ）または　ＨＲＰ　　−　結合抗　−ＦＬＡＧ　 　ｍＡｂ　 　Ｍ２　（コダック）を用いた。標準的プロトコールに従い酵素的発色は　ＴＭＡ　および　Ｈ２Ｏ２　を用いて行い、そして　Ｈ２ＳＯ４　で停止した。発色した黄色の染色はプレートリーダー上で　４５０ｎｍ　で読んだ。結果を図１４に示す。
【００６９】
実施例１０
腫瘍サンプル中の　ＡＰＲＩＬ　の優先発現
ＡＰＲＩＬ　 　ｍＲＮＡ　は腫瘍サンプル中で優先的に発現する。インサイト社（　Ｉｎｃｙｔ　　ｅ　 　Ｉｎｃ．　）により集め、そして表１に示す　ｃＤＮＡ　ライブラリーの分析は、　ＡＰＲＩ　　Ｌ　が多数の充実性腫瘍および新生物サンプル中で広く発現するが、正常な組織サンプル中ではそれほど多くは発現しないことを示す。疾患のある組織での発現は、時々顕著である。
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当業者には種々の修飾および変更が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明の方法で作成できることは明らかである。すなわち本発明は前述の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内にある限り、本発明の修飾および変更を包含することを意図する。
【図面の簡単な説明】
添付の図面は本発明をさらに理解するために提供するために含め、そして本明細書に包含され、そして一部を構成し、本発明の幾つかの態様を具体的に説明し、そして説明と共に本発明の原理を説明するために役立つ。
【図１】
ベクター　ｐＣＡ３３６　にマップしたヒト　ＴＡＣＩ　に関する　ｃＤＮＡ　の核酸配列（配列番号２）、およびそれから誘導されるアミノ酸配列（配列番号１）の図解的表示である。
【図２】
Ｎ　−　末端を　ＦＬＡＧ−　標識化したヒトの完全長　ＴＡＣＩ　をコードする　ｐＪＳＴ５５２　中の核酸挿入物、およびそれから誘導されるアミノ酸配列の図解的表示である。
【図３】
ヒト　ＩｇＧ　 　Ｆｃ　に融合した短縮化された柄領域を含む　ＴＡＣＩ　細胞外ドメインの　ＤＮＡ　配列（配列番号５）およびそれから誘導されるアミノ酸配列（配列番号６）の図解的表示である。これはプラスミド　ｐＪＳＴ５７２　に集成した。マウス　ＩｇＧ−　κ、ヌクレオチド１　−６９　に由来するシグナル配列（アミノ酸１−　２３　）をヌクレオチド　７０　−　４１１　（アミノ酸　２４　−　１３７　）としてのヒト　ＴＡＣＩ　細胞外ドメインに枠内で融合し、これをヌクレオチド　４１２　−　１０９８　（アミノ酸　１３８　−　３６６　）としての　ｈＩｇＧ１　 　Ｆｃ　に枠内で融合した。予想されるシグナルペプチダーゼ開裂部位はアミノ酸　２０　の後である。
【図４】
ヒト　ＩｇＧ　 　Ｆｃ　に融合した第２メチオニンの後に始まる短縮化された柄領域を含む　ＴＡ　　ＣＩ　細胞外ドメインの　ＤＮＡ　配列（配列番号７）およびそれから誘導されるアミノ酸配列（配列番号８）の図解的表示である。これはプラスミド　ｐＪＳＴ５９１　に集成した。マウス　ＩｇＧ−　κ、ヌクレオチド１　−６９　に由来するシグナル配列（アミノ酸１−　２２　）をヌクレオチド　６７　−　３１５　（アミノ酸　２３　−　１０５　）としてのヒト　ＴＡＣＩ　細胞外ドメイン（配列番号１のアミノ酸　３２　−　１１４　）に枠内で融合し、これをヌクレオチド　３１６　−　１　　００２　（アミノ酸　１０６　−　３３４　）としての　ｈＩｇＧ１　 　Ｆｃ　に枠内で融合した。予想されるシグナルペプチダーゼ開裂部位はアミノ酸　２０　の後である。
【図５】
プラスミド　ＰＳ８８２　に集成した、ヒト　ＩｇＧ　 　Ｆｃ　配列に融合した　ＴＡＣＩ　の完全な細胞外ドメインの核酸配列およびそれから誘導されるアミノ酸配列の図解的表示であり、ここで自然なメチオニン　（　アミノ酸　１８　）およびアミノ酸　１７７　（バリン、これは　ＴＡＣＩ　のアミノ酸　１６０　である）を通る　ＴＡＣＩ　細胞外ドメイン配列を含む短い赤血球凝集素　（　　ＨＡ）−　シグナル配列が枠内にあり、この後にヒト　ＩｇＧ−Ｆｃ　構築物が枠内に存在する。
【図６】
プラスミド　ｐＣＭＭ２７６　にマップした、ピヒア　パストリス（　Ｐｉｃｈｉａ　 　ｐａｓｔ　　ｏｒｉｓ　）細胞で発現させるための　ｍｙｃ−　標識したマウス　ＡＰＲＩＬ　構築物の核酸配列（配列番号４）およびそれから誘導されるアミノ酸配列（配列番号３）の図解的表示であり、α交配因子シグナル配列、これは開裂除去され；　ｍｙｃ　エピトープ（シグナル配列後の最初の　１１　アミノ酸残基；下線を付した　）　；短いリンカー領域（次の８アミノ酸）；およびアミノ酸　２０　（これはアラニンである　）　から最初の終止コドンまでのマウス　ＡＰＲＩ　　Ｌ　コード配列の可溶性細胞外ドメイン配列を含む。
【図７】
哺乳動物発現プラスミド　ＰＳ７８４　（　ｌＴ０３２　としても知られている）にマップした、マウス　ＡＰＲＩＬ　の　ＦＬＡＧ−　標識した可溶性細胞外ドメインの核酸配列および対応するアミノ酸配列の図解的表示であり、ここで　ＨＡ−　シグナル配列（箱で囲む）、　ＦＬＡＧ　エピトープ（下線を付す）、短いリンカー配列、次に可溶性マウス　ＡＰＲＩＬ　配列（アラニンで始まる矢印）が存在する。
【図８】
ＴＡＣＩ　トランスフェクト細胞に結合する精製した　ｍｙｃ−　標識したマウス　ＡＰＲＩＬ　の図解的表示である。　２９３ＥＢＮＡ　細胞は、　ＦＬＡＧ　−標識した完全長のヒト　ＴＡＣＩ　を発現する発現プラスミド　ｐＪＳＴ５５２　でトランスフェクトした。細胞は５　ｍＭ　 　ＥＤＴ　　Ａ　を使用して　４８　時間後に回収し、そして種々の濃度の　ｍｙｃ　−標識したマウス　ＡＰＲＩ　　Ｌ　で染色した。タンパク質の対照は検出試薬（ウサギ抗　−　マウス　ＡＰＲＩＬ　およびロバ抗　−　ウサギ　ＰＥ（　ジャクソン イムノリサーチ　））　では染色されなかった。コートランスフェクトした　ＧＦＰ　発現プラスミドによりコードされるタンパク質の　ＦＬ１　中の染色は、発現効率を具体的に説明する。
【図９】
哺乳動物発現ベクター　ＬＴ０３３　にクローン化したヒト　ＡＰＲＩＬ　の　ＦＬＡＧ　標識した可溶性細胞外ドメインの　ＤＮＡ　配列（配列番号９）および対応するアミノ酸配列（配列番号１０　）　の図解的表示である。構築物は　ＨＡ−　シグナル配列タグ（箱で囲む）、　ＦＬＡＧ　エピトープタグ（下線を付す）、および可溶性ヒト　ＡＰＲＩＬ　に融合した短いリンカー配列（アラニンで始まる矢印）を含む。
【図１０】
ヒト　ＴＡＣＩ　（　１−１６０）−Ｉｇ（ｈＴＡＣＩ（１−１６０）−Ｉｇ）　融合タンパク質を使用して、　ＦＬＡＧ　−標識したマウス　ＡＰＲＩＬ　の免疫沈降を表す一連のウエスタンブロットの表示である。図１０Ａは、リガンドに関するタンパク質付加のポンソーＳ染色を示すウエスタンブロットの表示である。図１０Ｂは、　ＩｇＧ−Ｆｃ　部分を暴露することによる免疫沈降で使用した　ｈＴＡＣＩ（１−１６０）−Ｉｇ　の量を示すウエスタンブロットの表示である。図１０Ｃは、　ＦＬＡＧ　タグにより明らかにされるように、　ＡＰＲＩＬ　のみが　ｈＴＡＣＩ（１−１６０）−Ｉｇ　と免疫沈降したことを示すウエスタンブロットの表示である。
【図１１】
ｈＴＡＣＩ（１−１１４）−Ｉｇ　による　ＨＴ２９　結腸腺癌細胞のインビボ腫瘍成長阻害の結果を示す。
【図１２】
ｈＴＡＣＩ（１−１１４）−Ｉｇ　による　Ａ５９４　肺癌腫細胞のインビボ腫瘍成長阻害の結果を示す。
【図１３】
表面マウス　ＡＰＲＩＬ　を安定に発現している細胞への　ｈＴＡＣＩ（１−１１４）−Ｉｇ　および　ｈＴＡＣＩ（３２−１１４）−Ｉｇ　の結合のヒストグラムオーバーレイを示す。
【図１４】
マウスおよびヒト　ＡＰＲＩＬ　の　ｈＴＡＣＩ（３２−１１４）−Ｉｇ　への結合を表す　ＥＬＩ　　ＳＡ　分析のプロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004513876.tif 000062
【国際調査報告】
2004513876.tif 000063
2004513876.tif 000064
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