(57)【要約】本発明は、支持物質およびその中に組み込まれた細胞培養物から３次元環状筋肉体を作製するための装置であって、細胞培養皿（１）と、前記細胞培養皿（１）内に配置された少なくとも１つのエレメント（２）とを備える装置に関する。本発明は、３次元環状筋肉体を作製するための、並列および／または直列に配置された多数の装置から構成されるマルチウェルプレートにもまた関するものである。本発明はさらに、哺乳類心筋細胞を培養するための溶液、細胞培養物を培養する方法、細胞培養物の等尺性力パラメータを測定する装置、および支持物質中に組み込まれた細胞組織の収縮を測定可能な方法で追跡する方法に関する。最後に、本発明は、人工的に作製した３次元筋肉組織、特に心臓の筋肉組織に関する。
2004500093.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持物質およびその中に組み込まれた細胞培養物から３次元環状筋肉体を作製する装置であって、前記装置が以下の構成要素：
ａ）細胞培養皿（１；１９；１０１）と、
ｂ）前記細胞培養皿中に配置される少なくとも１つのエレメント（２；２０；１０２）と、により特徴づけられる装置。
【請求項２】
前記細胞培養皿（１；１９；１０１）の中央に配置される、わずか１つのエレメント（２；２０；１０２）が存在することを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記エレメント（２；２０；１０２）を、前記細胞培養皿（１；１９；１０１）から取り出すことができることを特徴とする、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
細胞培養皿（１；１９；１０１）中に配置される少なくとも１つのエレメント（２；２０；１０２）を、細胞培養皿の底部に固定することができることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記の少なくとも１つのエレメント（２；２０；１０２）が、それによって、ねじを受け入れるユニットの内側および外側へ前記エレメントを取り付けることが可能なねじを有し、かつ前記細胞培養皿（１；１９；１０１）の底部に配置されることを特徴とする、請求項４に記載の装置。
【請求項６】
前記の少なくとも１つのエレメント（２；２０；１０２）を、細胞培養皿（１；１９；１０１）底部のくぼみ中に差し込むことができることを特徴とする、請求項４に記載の装置。
【請求項７】
前記細胞培養皿（１；１９；１０１）に配置されるエレメント（２；２０；１０２）が、細胞培養皿（１；１９；１０１）の一体形構成要素であることを特徴とする、請求項１または２のいずれかに記載の装置。
【請求項８】
前記エレメント（２；２０；１０２）の高さＥＨが、前記細胞培養皿（１；１９；１０１）中の液体の高さＦＨよりも高いことを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
前記エレメント（２；２０；１０２）の高さＥＨが、前記細胞培養皿（１；１９；１０１）の外周高さＲＨよりも高いことを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
前記細胞培養皿（１；１９；１０１）中に配置される、前記の少なくとも１つのエレメント（２；２０；１０２）が、円柱形に設計されることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１１】
前記の少なくとも１つのエレメント（２；２０；１０２）が、永久軟質材料から作製されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１２】
前記の永久軟質材料が、ラテックスまたはシリコーンであることを特徴とする、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
前記の少なくとも１つのエレメント（２；２０；１０２）が、固体の非弾性材料から構成されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
前記固体の非弾性材料が、テフロンまたはデルリンであることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
円柱形に設計された前記エレメント（２；２０；１０２）の直径が、３〜８ｍｍであることを特徴とする、請求項１０から１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
円柱形に設計された前記エレメント（２；２０；１０２）の直径が、５ｍｍであることを特徴とする、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記細胞培養皿（１；１９；１０１）が円形であることを特徴とする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１８】
前記細胞培養皿（１；１９；１０１）の直径が、１０〜２０ｍｍであることを特徴とする、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
前記細胞培養皿（１；１９；１０１）の直径が、１５ｍｍであることを特徴とする、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記細胞培養皿（１；１９；１０１）が、楕円形に設計されることを特徴とする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２１】
前記楕円形細胞培養皿（１；１９；１０１）の長軸が１０〜３０ｍｍであり、かつ前記楕円形細胞培養皿（１；１９；１０１）の短軸が５〜２０ｍｍである（但し、長軸が常に、短軸よりも長い）ことを特徴とする、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
前記楕円形細胞培養皿（１；１９；１０１）の長軸が２５ｍｍであり、かつ／または前記楕円形細胞培養皿（１；１９；１０１）の短軸が１５ｍｍであることを特徴とする、請求項２１に記載の装置。
【請求項２３】
前記支持物質が、コラーゲンであることを特徴とする、請求項１から２２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２４】
前記の組み込まれた細胞培養物が、筋肉細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏで筋肉細胞に分化することが可能な幹細胞を含有することを特徴とする、請求項１から２３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２５】
前記筋肉細胞が、心筋細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞に分化することが可能な幹細胞であることを特徴とする、請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記心筋細胞が、哺乳類心筋細胞、特にラットまたはマウス心筋細胞であることを特徴とする、請求項２５に記載の装置。
【請求項２７】
支持物質およびその中に組み込まれた支持培養物から、複数の３次元環状筋肉体を作製するためのマルチウェルプレートであって、並列および／または直列に配置された、請求項１から２６のいずれか一項に記載の複数の装置を有することを特徴とするマルチウェルプレート。
【請求項２８】
２４個またはその倍数個の装置が、並列に配置されることを特徴とする、請求項２７に記載のマルチウェルプレート。
【請求項２９】
Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍からの細胞外マトリックス（マトリゲル）を含有することを特徴とする、支持物質中で哺乳類心筋細胞を培養するための溶液。
【請求項３０】
前記溶液が、マトリゲルを少なくとも５容積％含有することを特徴とする、請求項２９に記載の溶液。
【請求項３１】
前記溶液が、マトリゲルを少なくとも５〜１５容積％含有することを特徴とする、請求項３０に記載の溶液。
【請求項３２】
前記溶液が、マトリゲルを少なくとも１０容積％含有することを特徴とする、請求項３１に記載の溶液。
【請求項３３】
前記溶液がさらに、ダルベッコ改変基本最小培地（１×ＤＭＥＭ）、１０％ウマ血清、２％ニワトリ胎仔抽出物、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌおよびペニシリンＧ１００Ｕ／ｍｌを含有することを特徴とする、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項３４】
前記哺乳類心筋細胞が、ラット心筋細胞であることを特徴とする、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項３５】
支持物質溶液と、細胞懸濁液と、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍の細胞外マトリックス（マトリゲル）を含有する栄養溶液とを、支持物質溶液と、細胞懸濁液と、栄養溶液との完全な混合物が、３次元人工細胞組織を作製するのに十分な濃度でマトリゲルを含有するような方法で、混合することを特徴とする、支持物質中で細胞培養物を培養する方法。
【請求項３６】
支持物質溶液と、細胞懸濁液と、栄養溶液との完全な混合物が、マトリゲルを少なくとも５容積％含有することを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
支持物質溶液と、細胞懸濁液と、栄養溶液との完全な混合物が、マトリゲルを少なくとも５〜１５容積％含有することを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
支持物質溶液と、細胞懸濁液と、栄養溶液との完全な混合物が、マトリゲルを少なくとも１０容積％含有することを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記支持物質が、コラーゲンであることを特徴とする、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞懸濁液が、心筋細胞を含有することを特徴とする、請求項３５から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記心筋細胞が、哺乳類心筋細胞であることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記哺乳類心筋細胞が、ラット心筋細胞であることを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
細胞培養物の等尺性力パラメータを測定する装置であって、以下の構成要素：
ａ）細胞培養皿（１９）と、
ｂ）前記細胞培養皿に配置される少なくとも１つのエレメント（２０）と、
ｃ）圧力変換器ユニット（１６；２１）と、
ｄ）圧力変化を記録するユニットと、によって特徴づけられる装置。
【請求項４４】
さらなる構成要素として、増幅器ユニットを有することを特徴とする、請求項４３に記載の装置。
【請求項４５】
さらなる構成要素として、伸張ユニット（２４ａ、２４ｂ）を有することを特徴とする、請求項４３または４４のいずれかに記載の装置。
【請求項４６】
前記伸張ユニットが、伸張ロッドであることを特徴とする、請求項４５に記載の装置。
【請求項４７】
前記圧力変換器ユニットが、ストレインゲージ（２１）であることを特徴とする、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４８】
前記圧力変換器ユニットが、チップカテーテル（１６）であることを特徴とする、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４９】
前記細胞培養皿（１９）中に配置された少なくとも１つのエレメント（２０）が、細胞培養皿の一体形構成要素であることを特徴とする、請求項４３から４８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５０】
前記細胞培養皿（１９）中に配置された少なくとも１つのエレメント（２０）が、円柱形に設計される、請求項４３から４９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５１】
前記の少なくとも１つのエレメント（２０）が、永久軟質材料から作製される、請求項４３から５０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５２】
前記の永久軟質材料が、ラテックスまたはシリコーンであることを特徴とする、請求項５１に記載の装置。
【請求項５３】
前記の少なくとも１つのエレメント（２０）が、非弾性材料から作製される、請求項４３から５０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５４】
前記非弾性材料が、デルリンまたはテフロンであることを特徴とする、請求項５３に記載の装置。
【請求項５５】
円柱形に設計された前記エレメント（２０）の直径が、３〜８ｍｍであることを特徴とする、請求項４３から５４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５６】
円柱形に設計された前記エレメント（２０）の直径が、５ｍｍであることを特徴とする、請求項５５に記載の装置。
【請求項５７】
前記細胞培養皿（１９）が、円形であることを特徴とする、請求項４３から５６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５８】
前記細胞培養皿（１９）の直径が、１０〜２０ｍｍであることを特徴とする、請求項５７に記載の装置。
【請求項５９】
前記細胞培養皿（１９）の直径が、１５ｍｍであることを特徴とする、請求項５８に記載の装置。
【請求項６０】
前記細胞培養皿（１９）が、楕円形に設計されることを特徴とする、請求項４９から５９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６１】
前記楕円形細胞培養皿（１９）の長軸が１０〜３０ｍｍであり、かつ／または前記楕円形細胞培養皿（１９）の短軸が５〜２０ｍｍである（但し、長軸が常に、短軸よりも長い）ことを特徴とする、請求項６０に記載の装置。
【請求項６２】
前記楕円形細胞培養皿（１９）の長軸が２５ｍｍであり、かつ／または前記楕円形細胞培養皿（１９）の短軸が１５ｍｍであることを特徴とする、請求項６１に記載の装置。
【請求項６３】
前記細胞培養物が、支持物質中に包埋されることを特徴とする、請求項４３から６２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６４】
前記支持物質が、コラーゲンであることを特徴とする、請求項６３に記載の装置。
【請求項６５】
前記細胞培養物が、筋肉細胞、特にラットまたはマウス筋肉細胞を含有することを特徴とする、請求項４３から６４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６６】
前記筋肉細胞が、心筋細胞であることを特徴とする、請求項６５に記載の装置。
【請求項６７】
前記心筋細胞が、哺乳類心筋細胞であることを特徴とする、請求項６６に記載の装置。
【請求項６８】
前記哺乳類心筋細胞が、ラット心筋細胞であることを特徴とする、請求項６７に記載の装置。
【請求項６９】
以下の段階：
ａ）細胞培養皿およびその細胞培養皿中に配置される少なくとも１つのエレメントを提供する段階；
ｂ）支持物質溶液および細胞懸濁液を、その中に配置されたエレメントを含む細胞培養皿中に導入する段階；
ｃ）栄養溶液を添加する段階であって、段階ｄ）のインキュベーション前または後にその溶液を添加することが可能な段階；
ｄ）細胞培養皿の内容物が凝固するまで、段階ｂ）またはｃ）に従ってチャージされた細胞培養皿をインキュベーター内でインキュベートする段階；
ｅ）その細胞培養皿を１日以上さらにインキュベートする段階；
ｆ）細胞培養皿中で凝固している、かつキャリアー物質と、細胞組織と、栄養溶液とを含有するマトリックス体を、伸張ユニットによって適切に予備伸張する段階；
ｇ）圧力変換器ユニットを用いて、細胞組織により発生した等尺性力を決定する段階；
ｈ）データ記録ユニットを用いて、発生した等尺性力を記録する段階；を含む、支持物質中に組み込まれた細胞組織の収縮の測定可能な追跡方法。
【請求項７０】
支持物質が、コラーゲンであることを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
一方では段階ｂ）で添加される支持物質溶液と、他方では段階ｃ）で添加される栄養溶液との比が、約１：１であることを特徴とする、請求項６９または７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
段階ｃ）で添加される栄養溶液が、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍の細胞外マトリックス（マトリゲル）を含有することを特徴とする、請求項６９から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
支持物質と、細胞と、栄養溶液との完全な混合物が、マトリゲルを少なくとも５容積％含有することを特徴とする、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記の完全な混合物が、マトリゲルを５〜１５容積％含有することを特徴とする、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記の完全な混合物が、マトリゲルを１０容積％含有することを特徴とする、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記の完全な混合物がさらに、１×ダルベッコ改変基本最小培地（１×ＤＭＥＭ）、１０％ウマ血清、２％ニワトリ胎仔抽出物、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌおよびペニシリンＧ１００Ｕ／ｍｌを含有することを特徴とする、請求項６９から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞組織が、筋肉組織であることを特徴とする、請求項６９から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記筋肉組織が、心筋組織であることを特徴とする、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記心筋組織が、哺乳類心筋組織であることを特徴とする、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記哺乳類心筋組織が、ラット心筋組織であることを特徴とする、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
段階ｄ）のインキュベーションが、１〜２時間で行われることを特徴とする、請求項６９から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
段階ｄ）のインキュベーションが、約３７℃で行われることを特徴とする、請求項６９から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
段階ｅ）のインキュベーションが、２〜１５日、好ましくは５〜１２日、特に８〜１０日行われることを特徴とする、請求項６９から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
段階ｆ）の予備伸張が、マトリックス体の元の長さに対して３〜２０％に達することを特徴とする、請求項６９から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記予備伸張が、１０％に達することを特徴とする、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記マトリックス体が、ＥＨＴであることを特徴とする、請求項８４または８５のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
前記予備伸張が、１〜７日間行われることを特徴とする、請求項項６９から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記予備伸張が、４〜６日間行われることを特徴とする、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
支持物質溶液と栄養溶液との混合物を調製し、その混合物を中和し、その混合物にＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍からの細胞外マトリックス（マトリゲル）と筋肉細胞懸濁液とを添加し、続いて、人工３次元筋肉組織が生成するような条件下にて、その混合物をインキュベートすることによって得られる、支持物質および筋肉細胞を含有する、人工的に作製された３次元筋肉組織。
【請求項９０】
前記筋肉組織が、哺乳類筋肉組織であることを特徴とする、請求項８９に記載の人工的に作製された３次元筋肉組織。
【請求項９１】
前記筋肉組織が、心筋組織であることを特徴とする、請求項８９または９０のいずれかに記載の人工的に作製された３次元筋肉組織。
【請求項９２】
疾患のある筋肉組織を補助するための、請求項８９から９１のいずれか一項に記載の人工的に作製された３次元筋肉組織の使用。
【請求項９３】
疾患のある筋肉組織を交換するための、請求項８９から９１のいずれか一項に記載の人工的に作製された３次元筋肉組織の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、３次元マトリックスまたは筋肉体を作製する装置、複数の３次元マトリックスまたは筋肉体を作製するのに用いるマルチウェルプレート、哺乳類心筋細胞を培養するための溶液、細胞培養物を培養する方法、等尺性力のパラメータを測定する装置、収縮の測定可能な追跡方法、および人工的に作製した３次元筋肉組織に関する。
【０００２】
心不全は、西欧では罹患率および死亡率の主な要因の一つであり、推定有病率は人口の１．５〜２％である。心不全は常に、結果として、主に心臓に対するストレスの増大、または心筋の細胞（心筋細胞）の破壊もしくは損傷のいずれかを生じ、心臓の全体的な収縮性能への体の要求が依然として同じである限り、残存する損傷を受けていない心筋細胞に対するストレスが二次的に増大する。
【０００３】
これは、考慮すべき２つの結果を有する。一方では、ストレスが増大すると、残存する損傷を受けていない心筋細胞のサイズの成長、つまり肥大が生じる。他方では、遺伝子発現、つまり残存する損傷を受けていない心筋細胞の疾患特異的表現型における多くの定量的変化がある。遺伝子発現のこれらの特異的変化および心筋細胞機能に対するそれらの結果は、わずか一部のみが分かっている。現在まで、これに関して明らかな点は、欠陥のある心臓の個々の細胞（単に心臓臓器全体ではなく）は、健康な心臓とは異なるということのみである。
【０００４】
現在、心不全の治療に対する治療努力は本質的に、特に疾患のある心臓に対する血行動態的負荷を軽減することと、遺伝子発現の変化および肥大（交感神経系、レニン‐アンギオテンシン‐アルドステロン系などの神経系、エンドセリン、成長因子、炎症メディエーターの活性化）を引き起こすと認識されているメカニズムを薬理学的に抑制することに向けられている。この方法で、この疾患の自然な進行を遅らせることが実際に可能である。これに関しては、一方で、上述のプロセスの活性化は確実に感覚の順応を意味し、それによって疾患のある心臓がストレスの増大に反応することを考慮に入れなければならない。しかしながら他方では、それは、最終的に心筋細胞の破壊を増大する原因となり、したがって、心不全を患う患者の悪い予後を説明する悪循環を引き起こす同一メカニズムである。
【０００５】
したがって、心不全の治療に対する新規な治療的取り組みは、心臓機能の低下または心筋細胞破壊の割合の増大を排他的もしくは主に引き起こす、心臓における特定の標的を同定することと、これらのプロセスを、むしろ疾患のある心臓の感覚の順応を意味するプロセスと区別することに向けられている。この目的のため、欠陥のあるヒトの心臓および健康なヒトの心臓の遺伝子発現における違いを調べるために、過去に様々な製薬会社が、系統的遺伝子スクリーニング法を用いてきた（サブトラクティブな方法）。ＤＮＡチップ技術の導入によって、ヒトゲノムプロジェクトと共に、近い将来、未知の機能および病態生理学的有意性を有する新規な遺伝子の数が急速に増えるだろう。
【０００６】
このため、迅速かつ効率的に標的を確認することを可能にする方法が非常に必要とされている。これは、その要望が、未知の遺伝子もしくは心筋細胞においてほとんど知られていない遺伝子の遺伝子発現における定量的変化の機能上の有意性についての情報を比較的速く得て、これに続いて、これらの遺伝子の産物への効果を示す物質の影響を試験することであることを意味している。
【０００７】
ドイツ特許ＤＤ　２９９　４３９　Ａ５には、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した哺乳類、特にマウスからの細胞群集上で薬剤を検査する方法が記載されている。この方法では、分化された脈動する心筋細胞に対するこれらの医薬品の効果を、観察によって調べる。かかる多能性の細胞系、自発的に脈動する心筋細胞に分化することが可能な胚幹細胞をこの目的に使用する。胚様体を胚幹細胞から適切な手法で培養し、次いでそれを調べるべき活性物質にさらすことが可能であり、もはやｉｎ ｖｉｖｏで調べる必要がなくなる。しかしながら、ＤＤ  ２９９  ４３９  Ａ５に記載の手順では、検査する活性物質の心筋細胞の収縮力に対する効果について記載していない。ストップウォッチを用いて、単に、脈拍数の変化が調べられる。
【０００８】
ドイツ公開特許明細書ＤＥ  １９５  ００  ４９８  Ａ１には、等尺性力のパラメータおよびその影響を測定することが可能であるような方法で、どのように組織細胞を培養することができるかについて初めて記載されている。この目的のために、前述の公開特許明細書によって、並行に配置され、かつクランピング装置および測定装置中に吊るすことができる、２つのプレート状保持部品を有するマトリックスまたは筋肉体と、クランピング装置と測定装置との間に固定され、かつ凝固したコラーゲンゲルからなるマトリックスと、そのコラーゲンゲル中に包埋され、かつ培養により作製される筋肉組織とが示されており、そのマトリックスは保持部品に連結されている。その２つのプレート状保持部品は、非多孔性材料からなり、中実または中空のいずれかである。クランピングおよび測定装置中に保持部品を吊るすことを可能にするために、管状エレメントをその上に形成する。マトリックスと保持部品との間に高い抗張力を有する連結を得るために、保持部品の表面に自己フック（ｓｅｌｆ−ｈｏｏｋｉｎｇ）部品を設ける。さらに、その保持部品間にスペーサーを設け、これらによって、マトリックス体を作製する際に保持部品の距離が一定に保たれ、細胞組織の等尺性力パラメータを測定するために、取り外すことができる。ＤＥ  １９５  ００  ４９８  Ａ１には、コラーゲンゲル中で心筋細胞を培養する方法、特に心筋細胞の収縮の測定可能な追跡方法、およびコラーゲンゲルと、それに組み込まれた細胞培養物とから構成されるマトリックスを作製する装置もまた開示されている。
【０００９】
ＤＥ  １９５  ００  ４９８  Ａ１に記載の装置および方法を用いて、ニワトリ心筋細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで復元して、人工３次元心筋組織（いわゆる、工学心臓組織「ＥＨＴ」）を得ることが初めて可能となった。これによって、３次元の高度に架橋した、電気的に接続された構造が得られ、したがって、ほとんどｉｎ ｖｉｖｏでの生理学的条件になった。この前に、心筋細胞をプラスチック製皿中の単層で培養した（いわゆる３次元培養）。
【００１０】
さらに、ＤＥ  １９５  ００  ４９８  Ａ１に開示の装置および方法を用いて、血清存在下において、繊維芽細胞および成長因子により心筋細胞の過成長を抑制することが可能である。これによって、細胞増殖抑制剤を使用する必要なく、実質上生理学的な成長および分化条件が可能となる。標準２次元培養では、繊維芽細胞、平滑筋細胞および内皮細胞を能動的に分けることによって、分けることができない心筋細胞の通常広範な過成長がある。従来の２次元培養では、通常、血清を除去し、細胞増殖抑制剤を添加することによって、これを抑制する。
【００１１】
ＤＥ  １９５  ００  ４９８  Ａ１に開示の装置を用いて、等尺性条件下にて、心筋細胞における力、回数（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、収縮動態および収縮張力を確実かつ再現可能に測定することもまた可能である。これによって、新生児もしくは新しく単離された成人心筋細胞について可能であったろう評価よりも、かなり分化され、かつ有効な心筋機能の評価が可能となった。例えば、新生児心筋細胞の２次元培養では、ごく限られた範囲で回数を測定することが可能であり、力は全く測定することができない。成人の新鮮に単離された心筋細胞の場合、比較的確実に短縮の程度を、６時間、最大で２４時間以内に等張力のパラメータとして測定することが可能である。しかしながら、心筋細胞は通常、組織に組み込まれているため、収縮は全く等張性ではないが、少量の等張性成分を有して、通常は主に等尺性である。このように、無処置の標本および単離細胞と比較すると、３次元細胞集合の利点は、その状態が数日ないしは数週間安定であることであり、この利点は遺伝子操作には特に重要である。
【００１２】
さらに、ＤＥ  １９５  ００  ４９８  Ａ１に記載の装置および方法によって、無処置の標本とは異なり、原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）での、かつ組織染色後の良好な微視的到達性（ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）が可能となる。
【００１３】
最後に、引用したドイツ公開特許明細書に開示のＥＨＴが、アデノウイルス（生細胞１００％）で優れた遺伝子導入効率を示すことを証明することもまた可能である。
【００１４】
２次元培養と比較した、上述の利点および進歩にもかかわらず、ＤＥ  １９５  ００  ４９８  Ａ１に開示の３次元細胞集合はそれでもなお、数多くの不利な点を示している。このように現在までのところ、哺乳類心筋細胞からではなく、ニワトリ心筋細胞からのみ３次元人工心臓組織を作製することが可能である。さらに、最初に金属製ブラケットを用いてチューブを組み立て、次いでフックおよびループテープでチューブを固定し、細胞培養皿のウェル中にそれらを配置する必要があり、次いでコラーゲン／細胞混合物をウェル中にピペッティングする必要があることから、ＤＥ  １９５  ００  ４９８  Ａ１に記載の装置を用いたＥＨＴの作製は比較的面倒である。最大で５回使用した後に、その装置は廃棄しなければならない。ＤＥ  １９５  ００  ４９８  Ａ１に開示されている装置の個々の部品は手作業で組み立てるため、多少ばらつきを生じやすく、測定結果がその影響を受ける。さらに、フックおよびループテープと心臓組織との間の接合部は、生理学的条件に一致しない。最後に、前述のドイツ公開特許明細書に開示されている装置は、操作が比較的複雑であり、その設計は、一定の最低値を下回るサイズが不可能であるような設計である。
【００１５】
このように、本発明が基礎とする目的は、上述の不利な点を持たない装置および方法を提供することである。本発明の目的は特に、容易に組み立てることができ、容易に操作することができ、小型化可能であり、きわめてわずかしか設計のばらつきを生じず、場合によっては無期限に再利用することができ、３次元細胞組織を作製するための生理学的条件に可能な限り近くなる装置を製造することである。さらに、本発明に従って、その条件下にて、３次元細胞培養組織として哺乳類心筋細胞を培養することができる条件を示すことを意図する。最後に、等尺性条件下にて、細胞培養物中の筋肉組織の力パラメータを測定することを可能にする装置および方法を説明することもまた意図する。
【００１６】
驚くべきことに、細胞培養皿に配置された少なくとも１つのエレメントを用いて、細胞培養皿中で適切な条件下にて培養される筋肉細胞が、このエレメントの周りに３次元筋肉細胞組織を形成することが現在見出されている。この筋肉細胞組織は非常に安定であるため、必要な場合には、手作業で取り出し、生理学的、薬理学的および／または生物工学的実験にかけること、あるいは移植することさえ可能である。
【００１７】
したがって、本発明が基礎とする目的は、独立請求項１に記載の装置、独立請求項２７に記載のマルチウェルプレート、独立請求項２９に記載の培養用溶液、独立請求項３５に記載の方法、独立請求項４３に記載の装置、独立請求項６９に記載の方法、および独立請求項８９に記載の人工的に作製された３次元筋肉組織によって達成することが可能である。本発明のさらに有利な発展、態様および詳細は、独立請求項、概説から説明、実施例および図面に示す。
【００１８】
支持物質およびその中に組み込まれる細胞培養物から、３次元環状筋肉体を作製するための本発明の装置は、細胞培養皿と、細胞培養皿に配置される少なくとも１つのエレメントとを有する。これによって、ＤＥ １９８ ００ ４９８ Ａ１に記載のように、連続するリングとして以外は、フックおよびループテープにより２本のチューブに取り付けられた両凹体として、細胞集合（例えばＥＨＴ）がもはや作製されないという結果となる。組織の環状形状は単に、支持物質と細胞との混合物が、少なくとも１つのエレメントが配置された細胞培養皿中に注がれるという事実に起因する。次いで、ＥＨＴは連続テープとして、またはエレメントの周りで成長する。エレメントを細胞培養皿の中央に配置する、かつ／または取り外し可能に配置することが特に好ましい。例えば、細胞培養皿の底部にねじでエレメントを取り付けるか、あるいは特に好ましい実施形態では、皿の底部に単に差し込むことがさらに可能である。
【００１９】
３次元環状筋肉体または筋肉のリングを、細胞培養皿で形成することを可能にするためには、どの場合にも、エレメントが支持物質と細胞と（状況によっては、栄養分の溶液と）の混合物の充填レベルを超えるほうがよい。さらに、エレメントの長さまたは高さもまた、細胞培養皿の外周部分よりも高い場合には、皿の充填レベルに関係なく、どの場合にも、本発明の装置内で３次元環状筋肉体を確実に形成することができる。したがって、細胞培養皿中に挿入することができる、あるいは後者に一体的に連結するエレメントは、細胞培養皿中に存在する、支持物質と、細胞と、適切な場合には栄養液との混合物の充填レベルＦＨよりも大きい長さまたは高さＥＨを有することが好ましい。エレメントの高さＥＨが、細胞培養皿の外周部分の高さＲＨよりも高いこともまた特に好ましい。
【００２０】
支持物質と細胞との混合物を細胞培養皿中に注ぐ際、その混合物は後者中で広がる。混合物は、少なくとも１つのエレメントが配置された箇所では広がることはできない。人工細胞組織がそのエレメントの周りに形成される。次いで、完成した人工細胞組織を細胞培養皿から取り出すことができる。エレメントを取り外すことができる場合、人工細胞組織をエレメントと共に皿から取り出すことができる。このことは、以前の操作と比較して、（ＤＥ  １９５  ００  ４９８  Ａ１に記載のように）数多くの利点を有する。
【００２１】
（１）含まれる全作業は、以下の段階：金属製ブラケットを用いたチューブの組み立て、フックおよびループテープを用いたチューブの固定、細胞培養皿における予め作製されたウェル中への装置の整列、およびこれらのウェル中への支持物質と細胞との混合物の厄介なピペッティングを省略しているため少なくなっている。これによって、大量の試験シリーズ（ｔｅｓｔ ｓｅｒｉｅｓ）を作製する複雑さが減り、したがって費用効果もまた高くなる。
【００２２】
（２）本発明の装置は、時間的に無制限に使用することができるが、フックおよびループテープで固定したチューブは摩耗し、最大５回使用することが可能であり、次いで破棄して、新しいチューブと交換しなければならない。
【００２３】
（３）本発明の装置は、機械によって、かつきわめて僅かな許容差で製造することができるため、環状構造物の均一性を容易に完全にすることができるが、これに対してＤＥ  １９５  ００  ４９８  Ａ１に記載の装置の部品は、手社業で組み立てなければならず、したがって、わずかならぬばらつきが生じる。前記の公開特許明細書に開示されている装置を使用すると、試験シリーズの再現性がこの影響を受ける。
【００２４】
（４）フックおよびループテープを用いた細胞組織の非生理学的接合が省かれているため、本発明の装置を使用することによって得られる環状構造物は、以前の細胞組織よりも安定であり、かつ天然の心臓と生物学的に類似している。
【００２５】
（５）検査のための環状構造物の操作は、以前に得られた細胞組織（フックおよびループテープ／チューブを用いて）の場合よりも、簡単かつ容易である。
【００２６】
（６）環状構造物は、以前に得られた細胞組織（フックおよびループテープ／チューブを用いて）の場合よりも容易に小型化することができる。
【００２７】
細胞培養皿中に配置するエレメントは、細胞培養皿とワンピース（一体形）であるように設計することもまた可能である。しかしながら、皿から構造物をさらに容易に取り出すことを可能にするためには、エレメントおよび培養皿が互いに分離できることが好ましい。
【００２８】
細胞培養皿中に配置された少なくとも１つのエレメントを、円柱形に有利に設計し、その結果、細胞培養皿の形状が適切な場合には、その中心に円形の開口部を有する環状構造物（３次元環状筋肉体）が得られる。円柱形エレメントの直径は、３〜８ｍｍ、特に約５ｍｍであることが好ましい。エレメントのさらに特に適切な形状は、円錐台または楕円錐台である。エレメントを構成するのに特に適切な材料は、一体形に設計された細胞培養皿の場合には、ラテックスもしくはシリコーンなどの永久軟質材料であることが分かっている。エレメントを皿から取り外すことができる場合、エレメントは、テフロンもしくはデルリンなどの非粘着の、加圧滅菌に耐える、固体の非弾性材料から有利に製造される。テフロンはポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）であり、ＤｕＰｏｎｔ社の登録商標である。デルリンも同様に登録商標であり、ＤｕＰｏｎｔ社から購入することができる。デルリンは、無水ホルムアルデヒドを重合することによって得られる、非常に優れた機械抵抗、耐熱性および耐薬品性を有するポリアセタールプラスチック（ポリオキシメチレン）である。
【００２９】
本発明によれば、円形または楕円形（長円形）細胞培養皿が特に適している。というのは、それを用いて円形（環状）細胞組織集合を最も容易に作製するのが可能だからである。円形細胞培養皿の場合には、その直径は、１０〜２０ｍｍ、特に１５ｍｍであるのが有利である。楕円形（長円形）細胞培養皿の場合には、長軸は常に短軸よりも長く、長軸が１０〜３０ｍｍ、特に２５ｍｍであり、短軸が５〜２０ｍｍ、特に１５ｍｍであるのが有利である。
【００３０】
本発明の装置は、人工３次元筋肉組織、特に心臓組織（ＥＨＴ）の作製に著しく適している。この目的には、支持物質としてコラーゲン、細胞として筋肉細胞、詳細には心筋細胞を使用することが好ましい。特に、以降に記載する特定の溶液を使用する場合には、哺乳類筋肉細胞集合、特に哺乳類心筋細胞集合を本発明の装置で培養することもまた可能である。適切な哺乳類の例は、ラットおよびマウスである。さらに、出発材料として、筋肉細胞、特に心筋細胞を直接使用するか、または筋肉細胞、特に心筋細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏで分化することができる幹細胞を使用することが可能である。後者の代わりの例は、多能性のマウス胚幹細胞から懸滴法（ドイツ特許ＤＤ  ２９９  ４３９  Ａ５の具体例としての実施形態に記載の方法）を用いて得られる細胞、および成体マウス幹細胞から得られる細胞であり、その各細胞は筋肉細胞または心筋細胞に分化することができる。
【００３１】
本発明の装置のさらなる重要な利点は、並列かつ／または直列に複数の装置を直接並べることができる可能性である。原則的に、かなりの数の装置を並列に並べることが考えられる。しかしながら、２４個の装置（４×６）またはその倍数個の装置を、いわゆるマルチウェルプレートに組み合わせるのが有利であると判明している。これらのマルチウェルプレートを用いて、多くの人工細胞組織（特にＥＨＴ）を同時に作製すること、つまりそれらを注ぎ、それらを同時に成熟させることが可能である。次いで、その他の操作を行うことなく、成熟した細胞集合をさらなる検査にかけることができる；例えば、ＥＨＴの場合には、オンラインの力測定を行うことができる。この目的に適切な装置を、以降にさらに詳細に説明する。
【００３２】
ＥＨＴの作製および測定に用いるマルチウェルプレートの開発は、最も広い意味で、薬物のハイスループットを有するスクリーニング法（「ハイスループットスクリーニング」）でＥＨＴを使用するための、極めて重要な段階を表す。古典的な化学化合物の影響に加えて、心筋細胞機能に対する、例えば組換えアデノウイルスを用いた遺伝子導入の影響、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの影響を調べることも可能である。
【００３３】
本発明はさらに、支持物質中の哺乳類心筋細胞を培養するための溶液、およびこの溶液を用いて、支持物質中の細胞培養物を培養する方法に関する。既に最初に述べたように、哺乳類心筋細胞が３次元組織を形成する培地を提供することは、以前は不可能であった。したがって、以前の実験はニワトリ心筋細胞で行われていた。哺乳類心筋細胞を培養するための本発明の溶液は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍（略して、「マトリゲル」と呼ばれる）の細胞外マトリックスを一部含有する。このマトリゲルは、例えばＢｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社，Ｔｅｂｕ，フランクフルト（ＦＲＧ）から入手可能である。その溶液は、再構成混合物（つまり、支持物質溶液（例えばコラーゲン溶液など）と、細胞懸濁液（例えば、ラット心筋細胞懸濁液など）と、栄養溶液との完全な混合物）中に存在するマトリゲルを少なくとも５容積％、特に５〜１５％容積の濃度で含有する。マトリゲルが濃度約１０％で再構成混合物中に存在する場合には、非常に良好な結果が得られる。これは、例えば以下の方法で達成することができる。支持物質溶液と栄養培地との混合物中での栄養培地の最終濃度が、１×ＤＭＥＭ、１０％ウマ血清、２％ニワトリ胎仔抽出物、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌおよびペニシリンＧ１００Ｕ／ｍｌとなるように、２倍に濃縮された栄養培地（２×ダルベッコ改変基本最少培地（２×ＤＭＥＭ）、２０％ウマ血清、４％ニワトリ胎仔抽出物、ストレプトマイシン２００μｇ／ｍｌ、およびペニシリンＧ２００Ｕ／ｍｌを、容積部５０：５０の比で支持物質溶液（例えば、コラーゲン溶液）と混合する。次いで、その混合物を少量のアルカリ（例えば、０．１Ｎ  ＮａＯＨ）で中和する。マトリゲル溶液約１５容積％を、中和した混合物約８５容積％に添加する。最後に、支持物質溶液、栄養培地、およびマトリゲルを含有する混合物を、細胞懸濁液と約７０：３０の容積％比で混合する。次いで、最終混合物（再構成混合物）は、マトリゲルを約１０容積％含有する。
【００３４】
再構成混合物における濃度が、哺乳類心筋細胞を含有する３次元人工組織の成長を生じさせるのに十分高いことが確実である限り、対応する混合物は他の濃度のマトリゲルもまた含むことが可能であることは自明である。
【００３５】
上述のマトリゲル含有溶液を用いて、支持物質（コラーゲンマトリックス）中、ラット胎仔からの心筋細胞で３次元人工心臓組織を形成することが初めて可能となった。
【００３６】
ニワトリＥＨＴを超えるラットＥＨＴの利点は、ラットＥＨＴは哺乳類細胞に由来するという事実である。これによって、人で得られる結果の比較性が向上する。さらなる利点は、ラットＥＨＴははっきりと、具体的には２〜３回、ニワトリＥＨＴよりも強く拍動する。最終的に、能動的に発生した力と受動的な基本張力との比は、ニワトリよりもラットのほうが大きい（ラットでは１：２〜１：１、ニワトリでは＜１：１０）。
【００３７】
本発明はさらに、細胞培養物の等尺性力パラメータを測定する装置に関する。この装置は、細胞培養組織、細胞培養皿に配置された少なくとも１つのエレメント、圧力記録ユニット、および圧力変化を記録するためのユニットを含む。さらに、細胞培養物は細胞培養皿中に直接培養することが可能であり、力を測定するために、もはや培養容器から測定容器中に培養物を移動する必要はない。ＤＥ  １９５  ００  ４９８  Ａ１に開示の方法における主な操作段階、すなわち、皿および器官浴（ｏｒｇａｎ ｂａｔｈ）中の懸濁液からの比較的脆弱な細胞培養物（例えば、ＥＨＴ）の取り出しは、冗長となる。さらに、実験の変数、すなわち器官浴中での予備伸張の程度（最初に注ぎ込まれた形状とのパーセンテージ差の意味での予備伸張）を排除する。前述のドイツ公開特許明細書に開示の装置を用いた測定は、最高でも数時間のみ可能であったが、本発明の装置を用いて、継続して力の連続測定を行うことも可能である。さらに、本発明の装置によって、栄養培地において、つまり通常の成長および成熟条件下での力の測定が可能となるが、器官浴中で測定するために、アミノ酸、タンパク質、成長因子等を含まない水溶液が従来の装置で使用される。最後に、機器の複雑性が、公知の装置よりも本発明の新規な装置ではかなり低く、相当な費用の節減もまた達成される。
【００３８】
さらに、前述の構成要素の他に、測定信号を増幅する増幅器ユニットを有することが、等尺性力パラメータを測定するための本発明の装置に有利である可能性がある。適切な圧力変換器ユニットは、例えばストレインゲージまたはチップカテーテル（例えば、Ｍｉｌｌａｒチップカテーテル）である。
【００３９】
等尺性力パラメータの測定に用いる、本発明の装置の第１実施形態において、細胞培養皿およびその中に配置されたエレメントは、ワンピースであること、つまりエレメントが細胞培養皿の一体形構成要素であることが好ましい。装置の主要な利点の一つが、測定のために異なる容器中に細胞培養物を移動する必要がもはやないことであることから、そのエレメントを培養皿から細胞培養物と共に取り出し可能である必要もない。
【００４０】
３次元マトリックスまたは筋肉体を作製する装置について既に上述のように、細胞培養皿に配置されるエレメントは、中央に（中心に）配置することが好ましい。エレメントの形状に関しては、好ましくは円柱形もしくは円錐台であるか、または長円形（楕円形）の断面を有するほうがよい。円柱形デザインの場合には、エレメントは範囲３〜８ｍｍ、特に約５ｍｍの直径を有することが好ましい。このエレメントに特に適切な材料は、例えばラテックスもしくはシリコーンなどの永久軟質材料である。
【００４１】
細胞培養物の等尺性力パラメータを測定するのに使用する、本発明の装置の第２実施形態において、収縮力の測定前にＥＨＴの予備伸張を行うことが可能となる。この場合、エレメントは細胞培養皿から取り外し可能であり、かつ例えばテフロンもしくはデルリンなどの固体の非弾性材料から製造するほうがよい。テフロンおよびデルリンに適用される材料は、非粘着性および加圧滅菌可能であることもまた好ましい。
【００４２】
等尺性力パラメータを測定するのに使用する、本発明の装置の細胞培養皿は、直径１０〜２０ｍｍ、特に約１５ｍｍを有する円形であることが好ましい。長円形（楕円形）の細胞培養皿もまた特に適しており、この場合、その長軸は常に短軸よりも長く、楕円の長軸は１０〜３０ｍｍ、特に２５ｍｍが好ましく、短軸は５〜２０ｍｍ、特に１５ｍｍが好ましい。
【００４３】
培養するべき細胞培養物の構造を改善するために、それは、支持物質を含有することが好ましい。細胞培養物中の細胞が筋肉細胞である場合には、支持物質としてコラーゲンが特に適切である。本発明の装置において、具体的には哺乳類心筋細胞について、生きているような（ｌｉｆｅ ｌｉｋｅ）条件下で発生した力の長期間にわたる調査を行うことが可能である。
【００４４】
さらに、本発明は、支持物質に組み入れられた細胞組織の収縮を測定可能に追跡する方法にも関するものである。これは最初に、その中に配置されるエレメントを有し、支持物質と細胞組織懸濁液との混合物が次いで導入される、細胞培養物の準備を必要とする。次いで、細胞培養皿の内容物が凝固するまで、支持体および細胞で充填した細胞培養皿をインキュベーター内でインキュベートする。このインキュベート段階前または後に、栄養溶液を細胞培養皿に添加する。次の段階では、支持物質と細胞組織との凝固混合物と共に、その細胞培養皿をさらに数日間インキュベートする。次いで、細胞組織によって発生した等尺性力を、圧力変換器ユニットを用いて決定し、データ記録ユニットによって記録することが可能である。
【００４５】
調査すべき細胞が哺乳類心筋細胞である場合には、栄養溶液は、十分な量のＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒ腫瘍の細胞外マトリックス（マトリゲル）を含有するほうがよい。適切な栄養溶液は既に上述した。その完全な混合物は、マトリゲルを少なくとも５容積％、特に５〜１５容積％、詳細には約１０容積％含有することが好ましい。ダルベッコ改変基本最少培地（１×ＤＭＥＭ）、１０％ウマ血清、２％ニワトリ胎仔抽出物、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌおよびペニシリンＧ１００Ｕ／ｍｌも混合物中に存在する場合が有利であることも判明している。
【００４６】
前記方法は、例えば心筋細胞などの筋肉細胞組織の力を測定するのに適している。本発明の方法を用いて、支持物質としてコラーゲンと、先に記載の溶液とを組み合わせて、人工的に作製された哺乳類の３次元心筋細胞組織で等尺性力の測定を初めて行うことが可能である。
【００４７】
支持物質と細胞懸濁液との混合物の凝固を生じさせるための第１インキュベーション段階は通常、１〜２時間続く。第１インキュベーション段階の温度は約３７℃であることが好ましい。第２インキュベーション段階は、使用する細胞培養物の種類に応じて、２〜１５日、好ましくは５〜１２日、特に哺乳類心筋細胞の場合には６〜１０日続く。
【００４８】
ＤＥ  １９５  ００  ４９８  Ａ１に記載の技術を利用可能である前に、完全な単離心臓標本（例えば、ラット、モルモットまたはカエルの）または外植された動物の心臓についてのみ確実に、心臓の最も重要な機能、つまり収縮の力を測定することが可能であった。前記公開特許明細書における装置および方法によって、動物実験を省くことが可能となり、特に収縮力を調節する、心筋細胞中の個々のタンパク質の重要性をより良く調査することが可能である。しかしながら、以前は、哺乳類心筋細胞を培養することは不可能であった。ニワトリ心筋細胞で以前に得られた結果は、哺乳類、特にヒトに、非常に限られた範囲でしか適用できなかった。
【００４９】
ここで、本発明によって、自発的かつ一貫的（ｃｏｈｅｒｅｎｔｌｙ）な拍動関連性が得られるような方法で、組織培養において哺乳類心筋細胞を培養することが初めて可能となる。現在、このモデルを用いて、培養中の哺乳類心臓中の個々のタンパク質の機能を非常に具体的に操作し、かつこの方法で操作された細胞についての収縮力を測定することが可能である。
【００５０】
さらに、本発明によって、哺乳類の心臓における様々な種類の細胞の収縮力に対する相互作用を正確に調査することもまた初めて可能となる。心臓細胞の８０％は非筋肉細胞、つまり例えば結合組織細胞、血管細胞または神経細胞であることが知られている。これらの細胞が、哺乳類の心臓で発生する力に対してどのような影響を有するかはまだ分かっていない。現在、本発明により示されるシステムにおいて、様々な割合で多様な細胞集団を混合し、かつこれが、収縮力に対してどのような影響を有するかを調べることが可能である。
【００５１】
さらに、本発明から得られるシステムによって、哺乳類の心臓が拡張（肥大）するメカニズムを調べることが可能である。これに関連して、細胞培養組織を異なる時間かつ異なる程度に予備伸張すること、または特定の薬物でそれをインキュベートすることを考えることが可能である。これによって、個々の心筋細胞の拡張が生じる。ここで、本発明において、実験条件下にて、哺乳類の心臓拡張の機能効果を簡単かつ直接に測定することも初めて可能である。
【００５２】
このように、本発明によって、哺乳類胎仔心筋細胞、さらに一般的に述べれば、生物体から分離された、培養した哺乳類筋肉組織についての収縮の等尺性力を測定することが初めて可能となる。したがって、本発明によって、哺乳類筋肉細胞への特定の操作の影響、または収縮力への哺乳類心筋拡張の影響を調べることが特に可能となる。かかる問題は、多くの実験研究、つまり
‐根本的な心臓血管の研究
‐心筋不全症および心不整脈の治療に用いられる、心臓に作用する新規な薬物を開発することを目的とする応用研究
の中心にある。
【００５３】
現時点で、循環系疾患は西欧における死亡の大分部の原因であることが再度強調されるべきである。心筋不全症は、ドイツ人口の約３％の実例を有する、すべての疾患のうちで最も一般的な疾患の一つである。治療の選択肢は改善されている。にもかかわらず、５年死亡率は現在もなお５０％を超える。これは、心筋不全症を改善することが可能な薬物の開発が、健康政策の優先的目標を表し続けていることを意味する。本発明の利点は、特にこれに関して理解されるはずである。
【００５４】
本発明のさらなる態様は、本発明により、例えば心筋梗塞後に、人工ラット心臓組織を組織代替物として作製することが可能となることである。本発明に従って作製した環状ＥＨＴは心臓に付着し、疾患のある心臓自体の収縮をおそらく補助することができるという有望な初期のデータがある。これは、特定の状況において、心臓疾患の治療に前例のない見通しを提供するだろう。
【００５５】
このように、本発明は、支持物質と筋肉細胞を含有する、人工的に作製した３次元筋肉組織にもまた関するものである。人工的に作製した３次元筋肉組織は、支持物質と栄養溶液との混合物を調製し、その混合物を中和し、マトリゲルおよび筋肉細胞懸濁液を中和した混合物に添加し、続いて３次元筋肉組織を作製することができる条件下で、その混合物をインキュベートすることによって得ることができる。原則的に、どの種類の筋肉細胞も使用することが可能であるが、心筋細胞を使用することが特に好ましい。筋肉細胞の起源は重要ではない。特に、ヒト心臓疾患に関する情報を得ることに関しては、例えばラットまたはマウスからの哺乳類筋肉細胞を使用することが特に好ましい。これに関しては、出発材料として、特に分化した筋肉細胞、例えば心筋細胞または他には、既に上述した、自発的に拍動する心筋細胞に分化することが可能なマウスの多能性胚幹細胞（ＤＤ  ２９９  ４３９  Ａ５を参照）を利用することが可能である。再度確認すると、好ましい支持物質は、特に心筋細胞または心筋細胞に分化することが可能な細胞を用いる場合、コラーゲンである。他のパラメータ（栄養および栄養溶液の濃度、支持物質の濃度、中和剤の濃度、マトリゲルの濃度および筋肉細胞懸濁液の濃度、インキュベーション段階の持続時間および温度等）は、特許請求の範囲、本明細書の導入から説明、および実施例での記載に一致することが好ましい。
【００５６】
以降に、図および実施例によって、本発明をさらに詳細に説明する。
図１には、中心に配置された円柱形エレメント２を備える、本発明の円形細胞培養皿１を示す。細胞培養皿１は、隆起した外周領域と、支持物質、懸濁液、栄養培地の混合物を受け入れることができる、くぼみ領域とを有する。細胞培養皿１の直径は１５ｍｍであり、中心に配置された円柱形エレメントの直径は５ｍｍである。図１から明らかなように、
中央のエレメント２は、細胞培養皿１の隆起した外周領域３を超えて突出している。したがって、エレメントの高さもしくは長さＥＨは、細胞培養皿１の外周部分の高さＲＨよりも高く、その結果、どの場合にも、３次元環状または円形筋肉細胞組織を確実に、細胞培養皿中で形成することができる。
【００５７】
図１に示す細胞培養皿３つは、図２に示すように、より大きな皿ユニット５中に配置される。皿ユニット５は、直径１０ｃｍの市販のプラスチック製ペトリ皿である。かかる皿ユニット５中に、細胞培養皿１を５つまで収容することができる。細胞懸濁液／コラーゲン混合物を細胞培養皿１中にピペッティングするのに使用するピペット６もまた、図２に示す。
【００５８】
図３には、コラーゲンと、ラット心筋細胞懸濁液と、マトリゲルと、栄養培地との混合物で充填された細胞培養皿１中で、約８日間インキュベートした後に得られた人工３次元環状心臓組織７を示す。ＥＨＴは、２本の保持ワイヤー８、９の間で伸張しており、したがって、元の円形形状を失っている。図３に示すＥＨＴは、比較的長い平行なセクション７ａと、狭い、湾曲したセクション７ｂとを有し、セクション７ｂは保持ワイヤー８、９の周りで伸張している。
【００５９】
図４には、それを用いて図３に示す環状ＥＨＴについて圧力測定を行うことが可能なマルチウェルプレートの断面図を示す（図４の参照番号１８で示す）。個々のＥＨＴは栄養培地３０中に存在する。参照番号１０は、マルチウェルプレートのベースプレートとしての役割を果たす、いわゆるデルリン製支持体を示し、参照番号１１はテフロン製マスクを表す。ステンレス鋼製ねじ１２を用いて、テフロン製マスク１１をデルリン製支持体１０上に取り付ける。ラテックスから製造された、永久的に軟質な円柱形エレメント１３を、細胞培養皿１の中央に配置する。エレメント１３は、中空体の形状を有する。支持体１４はこの中空体中に存在し、かつ中空体形状を安定に保持する。さらに、圧力変換器ユニットとして換気ニードル１５およびＭｉｌｌａｒチップカテーテル１６を、デルリン支持体１０を介して、中空エレメント１３中に下から導入する。リード１７は、図示されていない増幅器を介して、チップカテーテルから、同様に図示されていない記録ユニット（パーソナルコンピューター）へ渡る。
【００６０】
他の実施形態に従って、本発明により作製したＥＨＴについて、発生する圧力の測定ではなく、等尺性力の測定を直接行う。この目的のために、ＥＨＴのリング１８を、図５に示す細胞培養皿１９中のエレメント２０の周りに注ぐ。そのエレメントは円柱形の形状を有し、細胞培養皿１９の中央に配置され、かつ固体の、非弾性材料（テフロン）からなる。ＥＨＴの形成後、円柱形エレメント２０は、上方に引き上げることによって細胞培養皿１９から取り除くことができる。図６には、円柱形エレメント２０を含まない細胞培養皿１９を示す。ここで、２つの保持ワイヤー８および９によって、ＥＨＴを保持する（図３、５および６を参照のこと）。２つの保持ワイヤー８および９が存在するにもかかわらず、円柱形エレメント２０の外形が滑らかな円柱形壁に一致するように、円柱形エレメント２０中の２つのくぼみにＥＨＴを注ぎ、かつ成長させる際に、保持ワイヤー８および９を配置する。
【００６１】
図５には、それを用いてＥＨＴにより発生する収縮の力を測定することができるユニットを示す。このユニットは、保持ワイヤーの中央領域８ａに配置され、かつケーブル接続２２および図示されていない増幅器を介して、同様に図示されていない記録ユニットに接続されたストレインゲージ２１を有する。保持ワイヤー８は、軟質部分（中央領域８ａ）により共に連結されている、安定な（硬質の）下方および上方領域８ｂ、８ｃを有する。保持ワイヤー８の軟質中央部分８ａは、永久軟質材料（本ケースでは、永久的に軟質なばね鋼）と、ステンレス鋼の保持ワイヤー８の安定な（硬質の）上方および下方セクション８ｂ、８ｃとからなる。ストレインゲージ２１は、保持ワイヤーの軟質中央部分８ａに接続され、細胞の収縮によって生じる、保持ワイヤーの軟質部分の屈曲を記録する。
【００６２】
図５の参照番号２３は、伸張ロッド２４ａ上にある、保持ワイヤーのための留め具を示す。この仕組みの場合には、ＥＨＴの収縮力を直接決定することが可能である。以前は必要であったように（ＤＥ  ９１５  ００  ４９８  Ａ１を参照のこと）、ＥＨＴを培養皿から取り出し、測定のために器官浴中にそれを移動する必要なく、ＥＨＴが作製される。
【００６３】
本発明のこの実施形態をマルチウェルプレート形状で設計することもまた可能なように、図５に示す複数の細胞培養皿を直列に、かつ／または並列に配置することができる。この場合にもまた、２４（４×６）個またはその倍数個の細胞培養皿が、並列および直列に配置されることが好ましい。
【００６４】
既に上述のように、図５には、細胞培養皿１９中の円柱形エレメント２０の周りにＥＨＴリング１８を注いだ後の状況を示す。次いで、ＥＨＴを数日間（約３〜４日間）成熟させることができる。この後、図６から明らかなように、円柱形エレメント２０を取り外し、次いでＥＨＴリングを保持ワイヤーによって内側に保持する。次いで、図３に示すように、並行に配置された２つの領域７ａを有するＥＨＴリング７が、長い楕円形として伸張するのに十分に、２つの保持ワイヤーは互いに間隔があけられている。この位置において、ＥＨＴにより生じる力を、保持ワイヤー８を屈曲することによって直接測定することが可能である（記載の実施例では、保持ワイヤー８によって、上述のように力を測定する）。この目的のために、増幅器測定ブリッジ（図示せず）を介して記録機器（パーソナルコンピューター、同様に図示せず）に連結されるストレインゲージに、保持ワイヤー８をその中央の軟質領域８ａで接続する。このように、軟質領域８ａによって、個々のＥＨＴについて力の測定を行うことが可能となる。
【００６５】
最適な仕事率（ｐｏｗｅｒ ｙｉｅｌｄｓ）を得るために、その収縮力を測定する前に、ＥＨＴを予め伸張させることが必要である。対応する伸張モーターを図７に示す。近年、ＥＨＴの慢性的な伸張により、個々の心筋細胞の組織発生が著しく増大し、サイズが増大し、かつ予め伸張されていないＥＨＴの収縮力の３〜５倍まで収縮力が増大することが明らかとなってきた。したがって、ＥＨＴを成熟させた直後には、力の測定を直接行わないことがさらに好ましい。予備伸張の有利な効果は、わずか約２４時間後に現れる。７日間を超えて続く予備伸張は、収縮力のさらなる増大とは実質的に関係ないため、予備伸張は通常、約１〜約７日間の期間で行われる。予備伸張の程度は、最初の長さに対して約３〜約２０％の範囲であるほうがよく、約１０％の予備伸張が特に好ましい。
【００６６】
電動式予備伸張が好ましい。ＥＨＴを注ぎ、電動式に予備伸張する状態では、保持ワイヤー８および９がそれに取り付けられる伸張ロッド２４ａ、２４ｂは、低位置にある。力を測定する状態では、軟質部分８ａで保持ワイヤー８がそれに取り付けられる伸張ロッド２４ａは、高い状態にあり（図８）、そこに、保持ワイヤーの上部安定（硬質）部分８ｃが予備ロッド２４ａに取り付けられ、軟質（中央）部分８ａは自由に移動できる。
【００６７】
図７に示す状態（伸張ロッド２４ａが低位置にある）では、ＥＨＴを所望の期間（ラットＥＨＴの場合には通常、１〜７日間）にわたり伸張することができる。この段階において、伸張ロッド２４ａは、保持ワイヤー８の軟質部分８ａの下に連結するように低位置のままであり、このため、保持ワイヤーの軟質部分に力が作用しない。図８において、伸張ロッド２４ａは、保持ワイヤー８の軟質部分８ａより上に上げられており、その結果、保持ワイヤーの軟質部分がゆるめられ、ＥＨＴにより生じた力を後者により測定することができる（ストレインゲージ２１で軟質部分８ａを屈曲する）。原則的に、伸張段階（ロッド２４ａを下へ伸張する）と測定段階（ロッド２４を上で伸張する）との間で前後に、所望の回数変更することが可能である。試験物質、ウイルス、オリゴヌクレオチド等の適用を、どちらの段階でも行うことができる。
【００６８】
マルチウェルプレートの場合には、十分な記録容量が利用可能である限り、個々のすべての培養皿中で（つまり、すべてのチャネルで）力の測定を同時に行うことが可能である。記憶容量が低いか、または技術の複雑性を低減することを意図する場合には、一部のチャネル（例えば４〜８）のみを同時に測定することも常に可能であり、適切なソフトウェアによって、完全なマルチウェルプレートの個々のチャネル間で切り替えることが可能である。これによって、特定のギャップで、すべてのチャネルを所望の期間にわたり連続して記録することが可能となる。
【００６９】
図９には再度、保持ワイヤー８を詳細に示す。保持ワイヤー８は低い領域でピンと伸びており、すべりを防ぐために固定手段２６が設けられている。保持ワイヤー８は、ストレインゲージ２１が配置されている保持ワイヤー領域で軟質である。そのセクションを介して増幅器および記録ユニットへのケーブル接続２２が延びる、ピンと伸びたセクションは、再度軟質セクションを超えて続く。
【００７０】
実施例１
具体的には、ウェブスター（Ｗｅｂｓｔｅｒ）ＫＡ、ディッシェ（Ｄｉｓｃｈｅｒ）ＤＪ、ビショプリック（Ｂｉｓｈｏｐｒｉｃ）ＮＨにより、Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｓ ａｎｄ ｊｕｎ ｐｒｏｔｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｓ ｉｎ ｈｙｐｏｘｉｃ ｃａｒｄｉａｃ ｍｙｏｃｙｔｅｓ， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：１６８５２−１６８５８，１９９３年に記述されている方法の修正形態によって、生後０〜３日の新生仔ラット（個体動物合計２５６０匹）の心臓から心筋細胞を得た。１０％ウシ胎児血清中でその細胞を１〜２時間、予めプレーティングし、非付着細胞をピペッティングし、培地（ダルベッコ改変基本最少培地（ＤＭＥＭ）、１０％ウマ血清、２％ニワトリ胎仔抽出物、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌおよびペニシリンＧ１００Ｕ／ｍｌ）中に懸濁した。ＥＨＴを注ぐ細胞密度は１０×１０６細胞数／ｍｌであった。主要な技術は既に、エシェンハーゲン（Ｅｓｃｈｅｎｈａｇｅｎ）Ｔ、フィンク（Ｆｉｎｋ）Ｃ、ショルツ（Ｓｃｈｏｌｚ）Ｈ、ワットヒョウ（Ｗａｔｔｃｈｏｗ）Ｊ、ウェイル（Ｗｅｉｌ）、チンメルマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ）Ｈ、ドーメン（Ｄｏｈｍｅｎ）ＨＨ、シェーファー（Ｓｃｈａｆｅｒ）Ｈ、ビショプリック（Ｂｉｓｈｏｐｒｉｃ）Ｎ、ワカツキ（Ｗａｋａｔｓｕｋｉ）Ｔ、エルソン（Ｅｌｓｏｎ）ＥＬ著， Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ａ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｍａｔｒｉｘ， １９９７： Ａ ｎｅｗ ｈｅａｒｔ ｍｕｓｃｌｅ ｓｙｓｔｅｍ． ＦＡＳＥＢ Ｊ １１：６８３−６９４に記述されている。
【００７１】
ラットのＥＨＴを培養するのに適切な条件を定義可能にするために、以下のパラメータを調べた：
（１）細胞単離法（トリプシン、様々なコラゲナーゼの種類、ディスパーゼ）
（２）細胞密度（０．８  〜１．３  ×  １０６／ＥＨＴ）
（３）コラーゲン濃度（０．８  〜１．３  ｍｇ／ｍｌ）
（４）Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍からの細胞外マトリックス（Ｈａｒｂｏｒ  Ｂｉｏ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社，Ｔｅｂｕ，フランクフルト（ＦＲＧ）；これ以降マトリゲルと呼ぶ）およびニワトリ胎仔および／または哺乳類からの血清補体による、細胞／コラーゲン再構成混合物の交換
【００７２】
細胞／コラーゲン混合物原液を８ＥＨＴの標準法により調製し、注ぐまで氷の上に保存した。Ｉ型コラーゲン（ラット尾部からの；０．１％酢酸中に３．６ｍｇ／ｍｌ；Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ニューヨーク州レークプラシッド）１．３３ｍｌを、２×濃縮培地（２×ＤＭＥＭ、２０％ウマ血清、４％ニワトリ胎仔抽出物、ストレプトマイシン２００μｇ／ｍｌ、およびペニシリンＧ２００Ｕ／ｍｌ）１．３３ｍｌと混合し、０．１Ｍ  ＮａＯＨ１８２μｌで中和した。マトリゲル０．４８ｍｌをこの混合物に添加し、総細胞数１５×１０６に相当する細胞懸濁液１．４８ｍｌを混合物に添加した。
【００７３】
細胞／コラーゲン混合物１ｍｌを、直径１５ｍｍの細胞培養皿（デルリン）中で振とうした。その皿の中央に配置された円柱形エレメントは直径５ｍｍを有し、ねじを用いることによって、細胞培養皿の底部に固定することができた。次いで、その混合物を、ゼラチン状固形物になるまで、３７℃で６０分間インキュベートした。次いで、培地２０ｍｌを添加した。さらに一晩インキュベートした後、その培地を交換し、次いで毎日交換した。
【００７４】
さらなる調査によって、マトリゲルの添加が、自発的かつ一貫的に拍動するラットＥＨＴの形成をもたらし、この効果は、ニワトリ胎仔抽出物を添加することによりさらに強化されたことが明らかとなっている。これに関して、図１０に、再構成混合物中のマトリゲルの次第に高くなる濃度の影響を示す。次第に高くなる濃度のマトリゲルの非存在下（０％）および存在下（再構成混合物に対して５％、１０％、１５％）にて、ラットＥＨＴを作製した。９日間培養した後、等尺性力伝達ユニットを用いることによって、Ｌｍａｘ（生じた最大力の長さ）に調節した後に収縮の振幅（収縮の力）を決定した。マトリゲルを含まないラットＥＨＴは、一貫的に拍動せず、したがって測定可能な収縮振幅を生じなかった。したがって、一貫的に拍動するＥＨＴを得るために、再構成混合物にマトリゲルを添加することが必要であった。図１０に示すダイアグラムから明らかなように、収縮振幅は、マトリゲル濃度が高くなるに従って増大した。このダイアグラムにおいて、収縮力は縦軸にｍＮで示し、再構成混合物中のマトリゲルの割合％は横軸に示す。柱の上にある星印は、標準偏差Ｐ＜０．０５（５％近く）を示す。柱または上記の星印に示す数は、調査した、独立したＥＨＴに相当する。
【００７５】
実施例２
この実施例では、ＥＨＴにより生じた収縮力について続けて６日間伸張した影響を記述することを意図する。
【００７６】
ＥＨＴを上述のように４日間培養し、次いでモーターによって、自動伸張を６日間行った。伸張の程度は、ＥＨＴの元の長さに対して１〜２０％であり、ＥＨＴの他の伸張していない群は、対照群としての目的を果たすために同一条件下で維持した。伸張ユニットの回転の振動数は１．５Ｈｚであった。完全な装置をＣＯ２インキュベーター内で３７℃に維持した。培地を毎日交換した。
【００７７】
図１１から明らかなように、収縮力の著しい増大は、３％を超える伸張のみで見られ、５％の伸張で最大に達する。
【００７８】
実施例３
図１２Ａには、中央に配置された円柱形エレメント１０２を備える、本発明の円形細胞培養皿１０１を示す。テフロンから製造された細胞培養皿１０１は、隆起した外周領域１０３と、支持物質、細胞懸濁液および栄養培地の混合物を受け入れることができるくぼみ領域１０４とを有する。培養皿に適切な他の材料は、例えばシリコーンまたは他のプラスチックである。細胞培養皿の直径は１５ｍｍであり、中央に配置された円柱形エレメントの直径は５ｍｍである。
【００７９】
円柱形エレメント１０２は、固形プラスチックからなり、穴１０５と、その外側に開いており、かつ液体で満たされる空洞１０６とを含む。円柱形エレメント１０２の下方セクションでは、液体に不浸透性であるが弾性である管状膜１０７をエレメント１０２の周りに引き寄せ、外側に対して開いている空洞１０６を密封する。その弾性膜はシリコーンから製造されている。弾性膜に適切な他の材料は、例えばラテックスである。円柱形エレメント１０２の下方領域の矢印によって、膜１０７の弾性を図１２Ａに示す。その膜は、締付け具１０８によって円柱形エレメント１０２にしっかりと連結されている。液体は、低粘度および低密度を有する。
【００８０】
参照番号１０９は、約８日間インキュベートした後に、細胞培養皿１０１中の円柱形エレメント１０２の周りに形成された人工環状心臓組織（ＥＨＴ）を示し、その細胞培養皿は、コラーゲンと、ラット心筋懸濁液と、マトリゲルと、栄養培地との混合物で満たされている。穴１０５および膜１０７により閉じられた空洞１０６は、穴に適合するチューブまたは非弾性管状材料１１０と共に水圧系を形成する。非弾性管状材料１１０における矢印は、液体の流れの方向を示す。そのシステムはさらに、遮断弁１１と、圧力測定装置１１２と、圧力生成装置１１３とを備える。
【００８１】
圧力生成装置１１３は、例えば図１２Ｂに図示する水圧ポンプであることが可能である。その水素発生装置１１３は、モーター２０１と、力伝達ユニット２０２と、回転ローラーシステム２０３と、軟質管状材料２０４と、アバットメント２０５と、その端に閉鎖（ｃｌｏｓｕｒｅ）２０７が設けられている非弾性管状材料２０６とを有する。非弾性管状材料の代わりにチューブを使用することもまた可能である。図１２Ｂのカーブした矢印は、ローラーシステム２０３の回転の方向を示す。
【００８２】
そのシステム（モデル）は以下の方法で機能する。管状材料系１１０の流出（図１２Ａの左側に図示される）アームの遮断弁１１１が閉じており、一方右のアームの弁が開いている場合には、圧力生成装置１１３によって、水圧系において、圧力を生成することが可能であり、膜１０７の拡張が引き起こされ、その結果空洞１０７の液体密着閉鎖が形成される。したがって、筋肉リング１０９は、律動的な圧力生成によって過度に伸張することができる。
【００８３】
流入（図１２Ａの右側に図示される）アームの遮断弁１１１が閉じており、流出（右）アームの弁が開いている場合には、収縮する筋肉リング（ＥＨＴ）１０９の力を、空洞１０６の容積の減少によって、圧力測定装置１１２中で定量的に測定することが可能である。
【００８４】
このように、このシステム（モデル）は、１つのかつ同一の装置で注入チャンバから、過度伸張もしくは測定用チャンバに筋肉リングを移動する必要なく、筋肉リングの作製および過度の伸張と、力の測定とを行うことができる。
【００８５】
筋肉リングが２つのフック間で楕円形としてピンと伸び、かつその結果、筋肉リングの端に位置する細胞が伸張するか、または過度伸張／測定の方向に、垂直に収縮する配置とは異なり、筋肉リングの完全に環状の配置によって、各細胞を伸張し、かつリングの容積の減少をもたらすことが可能である。したがって、得られた筋肉リングはさらに均質であり、その結果、天然の筋肉を反映する傾向がある。従来の装置と比較すると、第一に、リング中のさらに多くの（理想的なケースではすべての）細胞の収縮を測定することが可能であり、第二に、測定方向に対して垂直に収縮する細胞の収縮を測定することが可能であり、このため好ましくない変動が生じるのを避けることができるため、この力の測定はより正確である。
【００８６】
本発明の配置は小型化することが可能であり、複数の配置を、例えば２４ウェルもしくは４８ウェル細胞培養皿中で組み合わせることができる。かかる配置を平行に連結することによって、または直列に連結することによって、測定信号を平均すること、かつ／または増幅することが可能である。
【００８７】
特定の実施形態において、膜１０７は、収縮の際、力に比例し、その結果電極を用いることによって測定することができる電圧を誘導するピエゾフィルムであることが可能である。この種類の力の測定は、水圧による測定と比較して、感度および慣性に関して利点を有する。
【００８８】
他の可能性は完全に、電極によって印加し、かつ測定することが可能な、加えた電圧の関数として変化する筋肉体（ｂｏｄｙ）を、空洞１０６の代わりに配置することによって、変化する水圧システムを交換することである。筋肉リングの過度伸張は、筋肉リングの方向に筋肉体の拡張を引き起こす電圧を律動的に印加することによって生じる。次に、容積の減少によって誘導される電圧を測定することによって、力の測定が行われる。この種類のシステムはさらに小型化することが可能であり、現在使用されているシステムよりも製造するのが簡単であり、かつ再使用するのに優れている。
【００８９】
筋肉細胞を電気的に収縮させるのに使用することができる電極１１４をさらに取り付けることが可能である。心筋細胞の場合には、筋肉リングを成熟させるために、機械的過度伸張の代わりに、例えば電気刺激を用いることができる。心筋細胞と異なり、骨格筋細胞および平滑筋細胞は、自発的に収縮しないため、筋肉リングを成熟させるため、かつ収縮を誘導するために、電気刺激を用いることができる。次いで、上述のように、力の測定を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】その中に配置されたエレメントを備える、本発明の細胞培養皿を示す図である。
【図２】図１に示す本発明の細胞培養皿を複数含む、さらに大きい皿ユニットを示す図である。
【図３】図１に示す細胞培養皿を用いて得られた、環状人工３次元心臓組織（ＥＨＴ）を示す図である。
【図４】力を測定するための装置を有する、本発明のマルチウェルプレートの実施形態の断面図である。
【図５】ＥＨＴを注いだ瞬間に示される、収縮の力を測定する装置を備える本発明の細胞培養皿の他の実施形態の断面図である。
【図６】プレースホルダーを除去した後の、図５に示す本発明の細胞培養皿を示す図である。
【図７】ＥＨＴを伸張する電動式ユニットを備える、図５に示す本発明の細胞培養皿を示す図である。
【図８】ＥＨＴの収縮力を測定するユニットを備える、図５に示す本発明の細胞培養皿を示す図である。
【図９】図８に使用された、収縮力を測定するユニットを示す図である。
【図１０】再構成混合物中のマトリゲル濃度へのラットＥＨＴ形成の依存性を明らかにする図である。
【図１１】ＥＨＴの予備伸張への、ＥＨＴの収縮力の依存性を示す図である。
【図１２】図１２Ａは、筋肉体の等尺性力パラメータを測定する装置を備える、３次元環状筋肉体を作製するのに用いる複合装置の実施形態の断面図である。図１２Ｂは、圧力を発生させる装置の断面図である。
【図１】
2004500093.tif 000003
【図２】
2004500093.tif 000004
【図３】
2004500093.tif 000005
【図４】
2004500093.tif 000006
【図５】
2004500093.tif 000007
【図６】
2004500093.tif 000008
【図７】
2004500093.tif 000009
【図８】
2004500093.tif 000010
【図９】
2004500093.tif 000011
【図１０】
2004500093.tif 000012
【図１１】
2004500093.tif 000013
【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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2004500093.tif 000016
2004500093.tif 000017
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2004500093.tif 000059
2004500093.tif 000060
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500093.tif 000061
【手続補正書】
【提出日】平成14年1月28日(2002.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持物質およびその中に組み込まれた細胞培養物から３次元環状筋肉体を作製する装置であって、前記装置が以下の構成要素：
ａ）細胞培養皿（１；１９；１０１）と、
ｂ）前記細胞培養皿（１；１９；１０１）の中央に配置され、かつエレメント（２；２０；１０２）の高さＥＨが、前記細胞培養皿（１；１９；１０１）中の液体の高さＦＨよりも高い１つのエレメント（２；２０；１０２）と、
により特徴づけられる装置。
【請求項２】
前記エレメント（２；２０；１０２）を、前記細胞培養皿（１；１９；１０１）から取り出すことができることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
細胞培養皿（１；１９；１０１）中に配置される１つのエレメント（２；２０；１０２）を、細胞培養皿の底部に固定することができることを特徴とする、請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記１つのエレメント（２；２０；１０２）が、それによって、ねじを受け入れるユニットの内側および外側へ前記エレメントを取り付けることが可能なねじを有し、かつ前記細胞培養皿（１；１９；１０１）の底部に配置されることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記の少なくとも１つのエレメント（２；２０；１０２）を、細胞培養皿（１；１９；１０１）底部のくぼみ中に差し込むことができることを特徴とする、請求項３に記載の装置。
【請求項６】
前記細胞培養皿（１；１９；１０１）に配置されるエレメント（２；２０；１０２）が、細胞培養皿（１；１９；１０１）の一体形構成要素であることを特徴とする、請求項１に記載の装置。
【請求項７】
前記エレメント（２；２０；１０２）の高さＥＨが、前記細胞培養皿（１；１９；１０１）の外周高さＲＨよりも高いことを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項８】
前記細胞培養皿（１；１９；１０１）中に配置される、前記１つのエレメント（２；２０；１０２）が、円柱形に設計されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項９】
前記の少なくとも１つのエレメント（２；２０；１０２）が、永久軟質材料から作製されることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１０】
前記の永久軟質材料が、ラテックスまたはシリコーンであることを特徴とする、請求項９に記載の装置。
【請求項１１】
前記の少なくとも１つのエレメント（２；２０；１０２）が、固体の非弾性材料から構成されることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１２】
前記固体の非弾性材料が、テフロンまたはデルリンであることを特徴とする、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
円柱形に設計された前記エレメント（２；２０；１０２）の直径が、３〜８ｍｍであることを特徴とする、請求項８から１２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１４】
円柱形に設計された前記エレメント（２；２０；１０２）の直径が、５ｍｍであることを特徴とする、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
前記細胞培養皿（１；１９；１０１）が円形であることを特徴とする、請求項１から１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１６】
前記細胞培養皿（１；１９；１０１）の直径が、１０〜２０ｍｍであることを特徴とする、請求項１５に記載の装置。
【請求項１７】
前記細胞培養皿（１；１９；１０１）の直径が、１５ｍｍであることを特徴とする、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
前記細胞培養皿（１；１９；１０１）が、楕円形に設計されることを特徴とする、請求項１から１４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１９】
前記楕円形細胞培養皿（１；１９；１０１）の長軸が１０〜３０ｍｍであり、かつ前記楕円形細胞培養皿（１；１９；１０１）の短軸が５〜２０ｍｍである（但し、長軸が常に、短軸よりも長い）ことを特徴とする、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
前記楕円形細胞培養皿（１；１９；１０１）の長軸が２５ｍｍであり、かつ／または前記楕円形細胞培養皿（１；１９；１０１）の短軸が１５ｍｍであることを特徴とする、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記支持物質が、コラーゲンであることを特徴とする、請求項１から２０のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２２】
前記の組み込まれた細胞培養物が、筋肉細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏで筋肉細胞に分化することが可能な幹細胞を含有することを特徴とする、請求項１から２１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２３】
前記筋肉細胞が、心筋細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏで心筋細胞に分化することが可能な幹細胞であることを特徴とする、請求項２２に記載の装置。
【請求項２４】
前記心筋細胞が、哺乳類心筋細胞、特にラットまたはマウス心筋細胞であることを特徴とする、請求項２３に記載の装置。
【請求項２５】
支持物質およびその中に組み込まれた支持培養物から、複数の３次元環状筋肉体を作製するためのマルチウェルプレートであって、並列および／または直列に配置された、請求項１から２４のいずれか一項に記載の複数の装置を有することを特徴とするマルチウェルプレート。
【請求項２６】
２４個またはその倍数個の装置が、並列に配置されることを特徴とする、請求項２５に記載のマルチウェルプレート。
【請求項２７】
Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍からの細胞外マトリックス（マトリゲル）を含有することを特徴とする、支持物質中で哺乳類心筋細胞を培養するための溶液。
【請求項２８】
前記溶液が、マトリゲルを少なくとも５容積％含有することを特徴とする、請求項２７に記載の溶液。
【請求項２９】
前記溶液が、マトリゲルを少なくとも５〜１５容積％含有することを特徴とする、請求項２８に記載の溶液。
【請求項３０】
前記溶液が、マトリゲルを少なくとも１０容積％含有することを特徴とする、請求項２９に記載の溶液。
【請求項３１】
前記溶液がさらに、ダルベッコ改変基本最小培地（１×ＤＭＥＭ）、１０％ウマ血清、２％ニワトリ胎仔抽出物、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌおよびペニシリンＧ１００Ｕ／ｍｌを含有することを特徴とする、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項３２】
前記哺乳類心筋細胞が、ラット心筋細胞であることを特徴とする、請求項２７から３１のいずれか一項に記載の溶液。
【請求項３３】
支持物質溶液と、細胞懸濁液と、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍の細胞外マトリックス（マトリゲル）を含有する栄養溶液とを、支持物質溶液と、細胞懸濁液と、栄養溶液との完全な混合物が、３次元人工細胞組織を作製するのに十分な濃度でマトリゲルを含有するような方法で、混合し、支持物質溶液と、細胞懸濁液と、栄養溶液との完全な混合物が、マトリゲルを少なくとも５容積％含有することを特徴とする、支持物質中で細胞培養物を培養する方法。
【請求項３４】
支持物質溶液と、細胞懸濁液と、栄養溶液との完全な混合物が、マトリゲルを少なくとも５〜１５容積％含有することを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
支持物質溶液と、細胞懸濁液と、栄養溶液との完全な混合物が、マトリゲルを少なくとも１０容積％含有することを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記支持物質が、コラーゲンであることを特徴とする、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞懸濁液が、心筋細胞を含有することを特徴とする、請求項３３から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記心筋細胞が、哺乳類心筋細胞であることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記哺乳類心筋細胞が、ラット心筋細胞であることを特徴とする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
細胞培養物の等尺性力パラメータを測定する装置であって、以下の構成要素：
ａ）細胞培養皿（１９）と、
ｂ）前記細胞培養皿に配置される少なくとも１つのエレメント（２０）と、
ｃ）圧力変換器ユニット（１６；２１）と、
ｄ）圧力変化を記録するユニットと、によって特徴づけられる装置。
【請求項４１】
さらなる構成要素として、増幅器ユニットを有することを特徴とする、請求項４０に記載の装置。
【請求項４２】
さらなる構成要素として、伸張ユニット（２４ａ、２４ｂ）を有することを特徴とする、請求項４０または４１のいずれかに記載の装置。
【請求項４３】
前記伸張ユニットが、伸張ロッドであることを特徴とする、請求項４２に記載の装置。
【請求項４４】
前記圧力変換器ユニットが、ストレインゲージ（２１）であることを特徴とする、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４５】
前記圧力変換器ユニットが、チップカテーテル（１６）であることを特徴とする、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４６】
前記細胞培養皿（１９）中に配置された少なくとも１つのエレメント（２０）が、細胞培養皿の一体形構成要素であることを特徴とする、請求項４０から４５のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４７】
前記細胞培養皿（１９）中に配置された少なくとも１つのエレメント（２０）が、円柱形に設計される、請求項４０から４６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４８】
前記の少なくとも１つのエレメント（２０）が、永久軟質材料から作製される、請求項４０から４７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４９】
前記の永久軟質材料が、ラテックスまたはシリコーンであることを特徴とする、請求項４８に記載の装置。
【請求項５０】
前記の少なくとも１つのエレメント（２０）が、非弾性材料から作製される、請求項４０から４７のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５１】
前記非弾性材料が、デルリンまたはテフロンであることを特徴とする、請求項５０に記載の装置。
【請求項５２】
円柱形に設計された前記エレメント（２０）の直径が、３〜８ｍｍであることを特徴とする、請求項４０から５１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５３】
円柱形に設計された前記エレメント（２０）の直径が、５ｍｍであることを特徴とする、請求項５２に記載の装置。
【請求項５４】
前記細胞培養皿（１９）が、円形であることを特徴とする、請求項４０から５３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５５】
前記細胞培養皿（１９）の直径が、１０〜２０ｍｍであることを特徴とする、請求項５４に記載の装置。
【請求項５６】
前記細胞培養皿（１９）の直径が、１５ｍｍであることを特徴とする、請求項５５に記載の装置。
【請求項５７】
前記細胞培養皿（１９）が、楕円形に設計されることを特徴とする、請求項４０から５６のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５８】
前記楕円形細胞培養皿（１９）の長軸が１０〜３０ｍｍであり、かつ／または前記楕円形細胞培養皿（１９）の短軸が５〜２０ｍｍである（但し、長軸が常に、短軸よりも長い）ことを特徴とする、請求項５７に記載の装置。
【請求項５９】
前記楕円形細胞培養皿（１９）の長軸が２５ｍｍであり、かつ／または前記楕円形細胞培養皿（１９）の短軸が１５ｍｍであることを特徴とする、請求項５８に記載の装置。
【請求項６０】
前記細胞培養物が、支持物質中に包埋されることを特徴とする、請求項４０から５９のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６１】
前記支持物質が、コラーゲンであることを特徴とする、請求項６０に記載の装置。
【請求項６２】
前記細胞培養物が、筋肉細胞、特にラットまたはマウス筋肉細胞を含有することを特徴とする、請求項４０から６１のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６３】
前記筋肉細胞が、心筋細胞であることを特徴とする、請求項６２に記載の装置。
【請求項６４】
前記心筋細胞が、哺乳類心筋細胞であることを特徴とする、請求項６３に記載の装置。
【請求項６５】
前記哺乳類心筋細胞が、ラット心筋細胞であることを特徴とする、請求項６４に記載の装置。
【請求項６６】
以下の段階：
ａ）細胞培養皿およびその細胞培養皿中に配置される少なくとも１つのエレメントを提供する段階；
ｂ）支持物質溶液および細胞懸濁液を、その中に配置されたエレメントを含む細胞培養皿中に導入する段階；
ｃ）栄養溶液を添加する段階であって、段階ｄ）のインキュベーション前または後にその溶液を添加することが可能な段階；
ｄ）細胞培養皿の内容物が凝固するまで、段階ｂ）またはｃ）に従ってチャージされた細胞培養皿をインキュベーター内でインキュベートする段階；
ｅ）その細胞培養皿を１日以上さらにインキュベートする段階；
ｆ）細胞培養皿中で凝固している、かつキャリアー物質と、細胞組織と、栄養溶液とを含有するマトリックス体を、伸張ユニットによって適切に予備伸張する段階；
ｇ）圧力変換器ユニットを用いて、細胞組織により発生した等尺性力を決定する段階；
ｈ）データ記録ユニットを用いて、発生した等尺性力を記録する段階；を含む、支持物質中に組み込まれた細胞組織の収縮の測定可能な追跡方法。
【請求項６７】
支持物質が、コラーゲンであることを特徴とする、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
一方では段階ｂ）で添加される支持物質溶液と、他方では段階ｃ）で添加される栄養溶液との比が、約１：１であることを特徴とする、請求項６６または６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
段階ｃ）で添加される栄養溶液が、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍の細胞外マトリックス（マトリゲル）を含有することを特徴とする、請求項６６から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
支持物質と、細胞と、栄養溶液との完全な混合物が、マトリゲルを少なくとも５容積％含有することを特徴とする、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記の完全な混合物が、マトリゲルを５〜１５容積％含有することを特徴とする、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記の完全な混合物が、マトリゲルを１０容積％含有することを特徴とする、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記の完全な混合物がさらに、１×ダルベッコ改変基本最小培地（１×ＤＭＥＭ）、１０％ウマ血清、２％ニワトリ胎仔抽出物、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌおよびペニシリンＧ１００Ｕ／ｍｌを含有することを特徴とする、請求項６６から７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞組織が、筋肉組織であることを特徴とする、請求項６６から７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記筋肉組織が、心筋組織であることを特徴とする、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記心筋組織が、哺乳類心筋組織であることを特徴とする、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記哺乳類心筋組織が、ラット心筋組織であることを特徴とする、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
段階ｄ）のインキュベーションが、１〜２時間で行われることを特徴とする、請求項６６から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
段階ｄ）のインキュベーションが、約３７℃で行われることを特徴とする、請求項６６から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
段階ｅ）のインキュベーションが、２〜１５日、好ましくは５〜１２日、特に８〜１０日行われることを特徴とする、請求項６６から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
段階ｆ）の予備伸張が、マトリックス体の元の長さに対して３〜２０％に達することを特徴とする、請求項６６から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記予備伸張が、１０％に達することを特徴とする、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記マトリックス体が、ＥＨＴであることを特徴とする、請求項８１または８２のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
前記予備伸張が、１〜７日間行われることを特徴とする、請求項項６６から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記予備伸張が、４〜６日間行われることを特徴とする、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
支持物質溶液と栄養溶液との混合物を調製し、その混合物を中和し、その混合物にＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍からの細胞外マトリックス（マトリゲル）と筋肉細胞懸濁液とを添加し、続いて、人工３次元筋肉組織が生成するような条件下にて、その混合物をインキュベートすることによって得られる、支持物質および筋肉細胞を含有する（但し、支持物質溶液と、細胞懸濁液と、栄養溶液との完全な混合物が、マトリゲルを少なくとも５容積％含有する）人工的に作製された３次元筋肉組織。
【請求項８７】
前記筋肉組織が、哺乳類筋肉組織であることを特徴とする、請求項８６に記載の人工的に作製された３次元筋肉組織。
【請求項８８】
前記筋肉組織が、心筋組織であることを特徴とする、請求項８６または８７のいずれかに記載の人工的に作製された３次元筋肉組織。
【請求項８９】
疾患のある筋肉組織を補助するための、請求項８６から８８のいずれか一項に記載の人工的に作製された３次元筋肉組織の使用。
【請求項９０】
疾患のある筋肉組織を交換するための、請求項８６から８９のいずれか一項に記載の人工的に作製された３次元筋肉組織の使用。
【国際調査報告】
2004500093.tif 000062
2004500093.tif 000063
2004500093.tif 000064
2004500093.tif 000065
2004500093.tif 000066
2004500093.tif 000067