(57)【要約】移植器官の拒絶反応から生ずる機能障害の治療用および予防用薬剤を製造するための、（Ｒ）−イブプロフェンメタンスルホンアミドの使用について記載する。特に、移植腎の拒絶反応の予防および治療のための、（Ｌ）−リジン塩のような（Ｒ）−イブプロフェンメタンスルホンアミドの無毒性塩の使用について記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
虚血／再灌流障害の予防用または治療用薬剤を製造するための、（Ｒ）−イブプロフェンメタンスルホンアミドまたはその無毒性塩の使用。
【請求項２】
移植器官の拒絶反応から生ずる機能障害の予防用または治療用薬剤を製造するための、（Ｒ）−イブプロフェンメタンスルホンアミドまたはその無毒性塩の使用。
【請求項３】
該無毒性塩がＬ−リジン塩またはＤＬ−リジン塩である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
該無毒性塩がＬ−リジン塩である、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
該移植器官が移植腎である、請求項２に記載の使用。
【請求項６】
（Ｒ）−イブプロフェンメタンスルホンアミドまたはその無毒性塩を、許容される担体に混合した形で含有する、移植器官の拒絶反応から生ずる機能障害を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項７】
（Ｒ）−イブプロフェンメタンスルホンアミドまたはその無毒性塩を、許容される担体に混合した形で含有する、虚血／再灌流障害を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項８】
該無毒性塩がＬ−リジン塩である、請求項６または７に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、移植器官の拒絶反応から生ずる機能障害の治療用および予防用薬剤を製造するための、（Ｒ）−イブプロフェンメタンスルホンアミドおよびその無毒性塩の使用に関する。
発明の背景
器官移植、特に腎臓タイプの移植は、改良された免疫抑制剤摂取、器官保存および手術前後ケアの導入により、この数十年で相当な進歩を遂げた。それにも関わらず、特に長期間の予後を改善する点については改善の余地がある。器官の回復、保存および移植に二次的に生ずる初期の虚血／再灌流障害は、続いて起こる悪化および移植障害に関係している。腎移植において、同種移植片の即時機能の欠如は、移植後第１週の間における透析の必要性として一般に広く定義されている遅延移植機能（ＤＧＦ）として知られている。遅延移植機能は移植直後期間における最も一般的な同種移植合併症で、初期は死体腎移植の５０％までが罹っている（Ｏｊｏ  ＡＯ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｅｌａｙｅｄ  ｇｒａｆｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ：ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｒｅｎａｌ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ６３、１１：１６２０−１６２８、１９９７）。異なる病因が移植した同種移植片のＤＧＦを生じさせ得るが、蓄積された実験および臨床上の証拠は、虚血後再灌流の同種移植片への障害がＤＧＦ発生の原因となる主な事象であることを示唆している。ＤＧＦと早期拒絶の組合せが乏しい移植片生存率の厳しい指標であり、ＤＧＦの発生が急性拒絶増加の危険性をもたらすというのが一致した合意である（Ｃａｒｍｅｌｌｉｎｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｅｌａｙｅｄ  ｇｒａｆｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｄｖｅｒｓｅｌｙ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｏｎｅ−ｙｅａｒ  ｇｒａｆｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｃａｄａｖｅｒｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ  ２８、１：３５９−３６０、１９９６）。虚血／再灌流障害の病因は、現在はサイトカインおよび特に表面接着分子が関与することが知られており、その発現が炎症細胞の付着を開始させる。急性腎虚血を生じた実験動物からの証拠では、細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）が障害後急速に上方制御され、好中球、Ｔ細胞およびマクロファージの浸潤が続いて生ずることを示している。多形核細胞（ＰＭＮ）に対し強力な走化性効果を有するサイトカインであるインターロイキン−８（ＩＬ−８）は、再灌流に続く上皮細胞の活性化により生じ、最終的に虚血／再灌流障害による遅延移植機能に導く複雑な事象の一因となり得る。近年、ＩＬ−８の生物的活性を選択的に阻害する新規化合物が発見されている。その中でも、Ｒ（−）−Ｎ−［２−（４−イソブチルフェニル）プロピオニル］−メタンスルホンアミド（以後、（Ｒ）−イブプロフェンメタンスルホンアミドと称する）およびそのリジン塩（以後、ＤＦ１６８１Ｂと称する）が、国際特許出願ＷＯ００／２４７１０号に、ＩＬ−８により誘導される好中球の走化性の生体外での選択的阻害剤として記載されており、したがって好中球依存性病理の治療に望ましく好適である。
【０００２】
現在では、ＤＦ１６８１Ｂはマウスモデルの生体中で走化性を阻害し、マウスおよびラットの虚血／再灌流障害の異なるモデルにおいてＰＭＮ浸潤を阻害することが示されている。
【０００３】
実際は、最近の技術水準によれば、ＩＬ−８誘導走化性を選択的に阻害することは、移植した器官を機能障害から保護するには充分な条件ではない。事実、科学文献には移植腎の機能回復遅延の病因に関与する多くの因子が同定されており、その因子の中でＩＬ−８は確かに最も重要な因子ではないようである：例えば、ＩＬ−８はＩＬ−３および可溶性ＣＤ２３（Ｋｕｔｕｋｃｕｌｅｒ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１９９５、５９（３）、３３３−４０）と共に、とにかく拒絶現象が全くない移植患者においてもこれらのマーカーが高レベルで存在している場合は、器官拒絶の診断には使用できないと報告されている。その上、科学文献には、ＩＬ−３、ＩＬ−８およびＣＤ２３に加えて、例えばＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１などのような、移植器官の機能回復遅延の可能性ある病因因子として、種々の他の可能性ある後炎症性分子が同定されている。文献データから、炎症反応または少なくとも白血球の漸増加の特異的阻害剤が、器官移植おける再灌流障害、特に腎臓における障害の阻害には必要であると思われる。
発明の説明
上で検討した先行技術からの予想に反して、驚くべきことに、（Ｒ）−イブプロフェンメタンスルホンアミドおよびそのリジン塩（Ｌ−リジンまたはＤＬ−リジン）は器官移植、特に腎臓移植における器官障害からの保護において効果的であることを発見した。更に、同じ化合物が虚血／再灌流障害の予防において活性であることが示された。
【０００４】
その活性は、以下に詳細に開示されるラットにおける腎移植実験モデルで示され、ＤＦ１６８１Ｂが同系腎移植に続く虚血／再灌流障害直後の腎機能保存において活性であり、また、虚血後再灌流に続いて起こる移植における白血球浸潤を予防することが証明された。
【０００５】
成熟雄性Ｌｅｗｉｓラット（ＲＴ１１）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｃａｌｃｏ  Ｉｔａｌｉａ  Ｓ．ｐ．Ａ、イタリア）を用いた。全ての動物は飼料および水を自由摂食できるようにした。このようなラットをドナーおよび移植片レシピエントとして使用した同系腎移植モデルにおいて研究を行った。ドナー動物をレプトフェンで麻酔した。左腎は尿管を付着物から外して調製した。腎動脈を腎静脈から切開して分離した。ドナー腎臓および尿管を「一括して」取除き、ヘパリン１０００Ｕ／ｍｌを含有するＢｅｌｚｅｒ（ＵＷ）をざっとかけた。それから腎臓を氷冷したＢｅｌｚｅｒ（ＵＷ）溶液中に移植まで４〜６時間（冷虚血）放置した。レシピエントは左腎を除去して調製した。ＤＦ１６８１Ｂによる動物処理を以下にまとめた。腎移植片を移植前に食塩溶液で洗浄した。レシピエントおよびドナー腎動脈間並びに腎静脈間を末端−末端吻合により吻合した。血管のクランプは３０分後に解放した（温虚血）。ドナーおよびレシピエントの尿管を末端−末端付着した。その後もとのままの右腎を除去した。腎機能回復の指標として毎日の尿排出を測定するために、動物を個々の代謝ケ−ジに入れた。１６および２４時間後に腎機能を血漿クレアチニン濃度で評価した。腎移植２４時間後、動物を屠殺した。腎移植片を除去し、スライスして、光学顕微鏡による従来の組織学的分析用にＤｕｂｏｓｑ−Ｂｒａｚｉｌ溶液中に置いた。その上、さらなる腎臓片を液体窒素中で冷凍し、炎症細胞浸潤の免疫組織化学的分析用に用いた（多形核細胞、ＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞）。
【０００６】
以下の動物実験群について考察した：
第１群（ｎ＝３）  ４時間冷虚血に曝し、ＩＬ−８阻害剤ＤＦ１６８１Ｂで処理した腎移植片のラットレシピエント。
第２群（ｎ＝３）  ４時間冷虚血に曝し、賦形剤で処理した腎移植片のラットレシピエント。
第３群（ｎ＝３）  ６時間冷虚血に曝し、ＩＬ−８阻害剤ＤＦ１６８１Ｂで処理した腎移植片のラットレシピエント。
第４群（ｎ＝３）  ６時間冷虚血に曝し、賦形剤で処理した腎移植片のラットレシピエント。
【０００７】
レシピエントは実験前日に前処理を行った（１５ｍｇ／ｋｇ  皮下注射）。当該動物は、移植腎の再灌流直前にＤＦ１６８１Ｂ（１５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射を受けた。当該化合物（１５ｍｇ／ｋｇ  皮下注射）の追加投与を移植の２時間後に実施した。対照動物には、ＤＦ１６８１Ｂで処理した動物と同じ投与方法を用いて同じ時間に賦形剤を与えた。
【０００８】
加えて、腎同種異系移植に続く虚血／再灌流障害の直後の腎機能保存においてＤＦ１６８１Ｂが活性であることを証明した。以下の動物実験群について考察した：
第１群（ｎ＝９）  ６時間の冷虚血に曝し、賦形剤で処理したＬｅｗｉｓラットの腎移植片のＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットレシピエント。
第２群（ｎ＝５）  ６時間の冷虚血に曝し、ＩＬ−８阻害剤ＤＦ１６８１Ｂで処理したＬｅｗｉｓラットの腎移植片のＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットレシピエント。
【０００９】
レシピエントは実験前日に前処理を行った（２０ｍｇ／ｋｇ  皮下注射）。当該動物は、移植腎の再灌流直前にＤＦ１６８１Ｂ（２０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射を受けた。当該化合物（２０ｍｇ／ｋｇ  皮下投与）の追加投与を移植の２時間後に実施した。対照動物には、ＤＦ１６８１Ｂで処理した動物と同じ投与方法を用いて同じ時間に賦形剤を与えた。
【００１０】
デ−タは、多重比較ではノンパラメトリックなＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定、またはＴｕｋｅｙ−Ｃｉｃｃｈｅｔｔｉ検定を用いて解析した。
結果
図１および表１は、４および６時間冷虚血に曝し、同系腎移植を受けた後１６および２４時間におけるＬｅｗｉｓラットの血漿クレアチニン濃度を示す。４時間の虚血腎を受けた動物では血漿クレアチニンが術後増加し、１６および２４時間で非虚血同系腎移植を受けた動物の対照群に見られる値より顕著に高い値に達した。ＤＦ１６８１Ｂ処理により動物は腎機能低下から保護され、２４時間での血漿クレアチニン値が非虚血同系腎移植を受けた動物の値とかなり近似していた（表２）。４時間虚血後の同系腎移植を受けた動物より顕著に高い血漿クレアチニンレベルにより立証されるように、予想通り、６時間虚血はより重症な腎機能障害を誘発した（図１および表１）。ＤＦ１６８１Ｂは顕著に血漿クレアチニン濃度を減少させたが、依然として非虚血同系腎移植を受けた動物で測定したより相当高いレベルであった。
【００１１】
移植後２４時間において検討した移植腎における白血球浸潤の詳細な免疫組織学的評価を表２にまとめる。４時間冷虚血を受けた腎臓においては、多数の顆粒球が間質で、それより少ない範囲で糸球体内部および周囲領域において見られた。当該化合物はＰＭＮの浸潤を低減させ、虚血／再灌流で引き起こされる尿細管の変形を減ずる。糸球体内部領域での顆粒球の計測は数値的に行ったが、ＩＬ−８阻害剤で顕著には低下しなかった。細胞浸潤は、４時間虚血後の値と比較して、６時間虚血後では必ずしも増加しなかった。一方で、間質性炎症細胞はＤＦ１６８１Ｂにより有意に低下した（ｐ＜０．０１）。好中球に関しては、ＭＨＣクラスＩＩ細胞の数は４および６時間虚血後の移植腎でより少なかった。細胞は主に間質で検出されたが（表３）、それらの数はＩＬ−８阻害剤では影響されなかった。
【００１２】
４および６時間冷虚血後に移植した腎臓から得た切片で観察し、移植２４時間後に検討した糸球体、間質および尿細管障害の組織化学的スコアを表４に示す。光学顕微鏡により、移植腎には尿細管上皮細胞の退行性変化、特に近位尿細管の細胞腫脹、空胞化および壊死により現される特徴がみられた（表４）。ＤＦ１６８１Ｂは、虚血４時間後の尿細管変化を低減するが正常化はしなかった。加えて、尿細管円柱が全ての腎臓で見られた。局所的虚血変化が６時間虚血に曝された腎臓にのみ糸球体で検出され、それはＤＦ１６８１Ｂで妨げられた。
【００１３】
したがってＤＦ１６８１Ｂは冷虚血に次ぐ腎機能障害を予防することができる。当該化合物は細胞浸潤の数を減少させ、虚血により誘発される尿細管変化を減少させる。デ−タは他の動物で確認された。６時間虚血は非常に重度の腎機能障害を誘発する。
【００１４】
Ｌｅｗｉｓラットから同種異系腎移植を受けた後１６および２４時間のＢｒｏｗｎ  Ｎｏｒｗａｙラットにおける血清クレアチニン濃度に対するＤＦ１６８１Ｂの効果を表５に示す。血清クレアチニンレベル増加の顕著な防止は２０ｍｇ／ｋｇの処置を受けた全てのラットで一貫して観察された。
【００１５】
上記のデ−タは（Ｒ）−イブプロフェンメタンスルホンアミドまたはそのリジン塩（Ｌ−リジンまたはＤＬ−リジン）が、どのように医療の実践において有利に使用できるかを明確に示している。
【００１６】
この目的のために、（Ｒ）−イブプロフェンメタンスルホンアミドまたはそのリジン塩は、移植手術の前および後に経口、非経口、直腸または局所経路で投与される医薬組成物に好適に製剤化されるであろう。好適な製剤には、カプセル、錠剤、座薬、シロップ、ドロップ、懸濁液、乳濁液、注射用滅菌溶液、注射用の滅菌凍結乾燥粉末のバイアル、放出制御製剤、経皮性製剤、軟膏などが含まれる。このような製剤の製造に使用される手法および担体は全体的には慣用されるものであり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ、ＸＶＩＩ  Ｅｄ．に記載されるようなものである。
【００１７】
医薬製剤は好ましくは１〜５００ｍｇ、より好ましくは１０〜１００ｍｇの（Ｒ）−イブプロフェンメタンスルホンアミドまたは等量のそのリジン塩を含有する単位剤形で投与される。より多用量のものも状況に応じて考えられる。投与は単回投与または好適な時間間隔、通常は手術の数日前から数週間後までに亘り複数回投与することができる。（Ｒ）−イブプロフェンメタンスルホンアミド、またはリジン塩のようなその許容できる塩は、必要であれば他の補助的な薬剤または、ともかく有用な作用の例えば抗炎症剤、免疫抑制剤、鎮痛剤、抗血栓剤と組合せて投与できる。
【実施例１】
【００１８】
Ｒ−イブプロフェン−メタンスルホンアミドの製造
塩化チオニル（７．４ｍＬ）中のＲ（−）−２−（４−イソブチルフェニル）−プロピオン酸（Ｒ−イブプロフェン、４ｇ、０．０１９ｍｏｌ）の懸濁液を４時間還流した；それから自然に冷却するまで室温で放置した。過剰の塩化チオニルは減圧下で蒸発させた。
【００１９】
塩化チオニルの最後の痕跡を数滴の乾燥ジオキサンで残留物を２回洗浄して除去し、減圧下で溶媒を蒸発させた。Ｒ（−）−２−（４−イソブチルフェニル）−プロピオニルクロリド４．６６ｇ（０．０１９ｍｏｌ）が黄色油状物として得られ、それを数ｍｌの無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に溶解した。
【００２０】
別に、メタンスルホンアミド（２．３ｇ、０．０２４３ｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（２８ｍＬ）中のカリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２．７３ｇ、０．０２４４ｍｏｌ）の懸濁液に加え、混合物を室温で３０分間攪拌した。その後、上で得たＲ（−）−２−（４−イソブチルフェニル）−プロピオニルクロリド（４．６６ｇ、０．０１９）溶液を攪拌しながら加え、反応混合物を室温で一晩攪拌した。
【００２１】
分離した無機塩をろ過して除去し、溶媒は減圧下で蒸発させ、油状残留物をＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）およびリン酸１ナトリウム飽和溶液の間で分配した。有機相は水（２×１０ｍＬ）で洗浄し、水相はＣＨ２Ｃｌ２（２×１０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物はＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒は蒸発させ、それから無水ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中の油状残留物溶液に濃硫酸２小滴を加えて未反応Ｒ（−）−２−（４−イソブチルフェニル）−プロピオン酸の痕跡をメチルエステル化した。混合物を一晩室温に保ち、溶媒は減圧下で注意深く蒸発させ、残留物は水（１０ｍＬ）および塩化メチレン（２５ｍＬ）間で分配した。水相は廃棄し、有機相はＮａＨＣＯ３飽和溶液（２×２０ｍＬ）で抽出した。塩基性相を合わせ、濃塩酸で酸性にしてＣＨ２Ｃｌ２（３×１５ｍＬ）で抽出した。通常の洗浄で中性とした後、合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させると、１．８６ｇ（０．００６６ｍｏｌ）のＲ（−）−Ｎ−［２−（４−イソブチルフェニル）プロピオニル］−メタンスルホンアミドが得られた：融点１０３〜１０５℃（分解）；［α］Ｄ＝−６８（ｃ＝１；ＣＨ３ＯＨ）；
【００２２】
【化１】
2004517948.tif 000002
【実施例２】
【００２３】
Ｒ−イブプロフェン−メタンスルホンアミド  Ｌ（＋）−リジン塩（ＤＦ１６８１Ｂ）の製造
水（１．３ｍＬ）中のＬ（＋）−リジン（１２９ｍｇ；０．８８ｍｍｏｌ）の溶液を、メタノール（１ｍｌ）中のＲ（−）−Ｎ−［２−（４−イソブチルフェニル）プロピオニル］−メタンスルホンアミド（２５０ｍｇ；０．８８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。溶媒を蒸発させ、残留物をエチルエーテル（５ｍＬ）と合わせ、一晩室温で攪拌した。分離した結晶性で、強吸湿性の物質を窒素雰囲気下で素早くろ過し、フィルター上にて無水エチルエーテルで洗浄し、減圧下５０℃で２時間乾燥すると、Ｒ（−）−Ｎ−［２−（４−イソブチルフェニル）プロピオニル］−メタンスルホンアミドのＬ（＋）−リジン塩が淡黄色粉末として３６０ｍｇ得られた。［α］Ｄ＝−１７．３°（ｃ＝１．１５；ＣＨ３ＯＨ）；
【００２４】
【化２】
2004517948.tif 000003
【００２５】
【表１】
2004517948.tif 000004
【００２６】
【表２】
2004517948.tif 000005
【００２７】
【表３】
2004517948.tif 000006
【００２８】
【表４】
2004517948.tif 000007
【００２９】
【表５】
2004517948.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】データは平均±ＳＤで示す。□は虚血に曝していない（対照非虚血）同系移植片を受けた対照動物における血清クレアチニンの対照範囲を示す。
【図１】
2004517948.tif 000009
【国際公開パンフレット】
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2004517948.tif 000011
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2004517948.tif 000024
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004517948.tif 000027
2004517948.tif 000028