(57)【要約】【解決手段】血小板活性化が、特定の抗凝固剤組成物を用いて、懸濁血液血小板の平均血小板成分（ＭＰＣ）を測定することによって決定される。この組成物は、少なくとも少なくとも１つの血小板球状化を行う成分（例えば、ＥＤＴＡ）と、少なくとも１つの血小板拮抗物質（例えば、テオフィリン、アデノシンおよびジピリダモールの少なくとも１つ、好ましくは３つ全て）を含むものである。
2004513369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの血小板球状化を行う成分と、少なくとも１つの血小板拮抗物質とを有する組成物中に懸濁された血小板の平均屈折率を測定することからなる、血小板活性の測定方法。
【請求項２】
前記１ないしそれ以上の血小板拮抗物質が、
ａ）　テオフィリン、
ｂ）　アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、
ｃ）　ジピリダモール、および
ｄ）　クエン酸塩
のうちの１ないしそれ以上を含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１ないしそれ以上の血小板拮抗物質が、
ａ）　テオフィリン、
ｂ）　アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、
ｃ）　ジピリダモール、および
ｄ）　クエン酸塩
のうちの２ないしそれ以上を含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１ないしそれ以上の血小板拮抗物質が、
ａ）　テオフィリン、
ｂ）　アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、
ｃ）　ジピリダモール、および
ｄ）　クエン酸塩
のうちの３ないしそれ以上を含むものである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記１ないしそれ以上の血小板拮抗物質が、
ａ）　テオフィリン、
ｂ）　アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、
ｃ）　ジピリダモール、および
ｄ）　クエン酸塩
を含むものである請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記１ないしそれ以上の血小板球状化を行う成分が、キレート剤を含むものである請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
前記キレート剤が、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの一方または双方である請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記組成物がＥＤＴＡとＣＴＡＤの混合物を有するものである請求項１ないし７のいずれか１つに記載の血小板活性の測定方法。
【請求項９】
平均屈折率が、入射光ビームに対して２つの異なる角度で光散乱を計測することにより測定されるものである請求項１ないし８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
前記２つの異なる角度が、入射光ビームの方向に対して２〜３°の角度と５〜１５°の角度である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記屈折率測定が、瀉血後３０〜６０分の時間に行われるものである請求項１ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
瀉血と測定との間、抗凝固化血液試料が０℃〜１０℃の温度に保持されるものである請求項１ないし１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
１ないしそれ以上の血小板球状化を行う成分と、２ないしそれ以上の血小板拮抗物質とを有する血液抗凝固組成物であって、前記２ないしそれ以上の血小板拮抗物質が、
ａ）　テオフィリン、
ｂ）　アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、
ｃ）　ジピリダモール、および
ｄ）　クエン酸塩
のうちの２ないしそれ以上を含むものである血液抗凝固組成物。
【請求項１４】
前記２ないしそれ以上の血小板拮抗物質が、
ａ）　テオフィリン、
ｂ）　アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、
ｃ）　ジピリダモール、および
ｄ）　クエン酸塩
のうちの３ないしそれ以上を含むものである請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記２ないしそれ以上の血小板拮抗物質が、
ａ）　テオフィリン、
ｂ）　アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、
ｃ）　ジピリダモール、および
ｄ）　クエン酸塩
を含むものである請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記１ないしそれ以上の血小板球状化を行う成分がキレート剤を含むものである請求項１３ないし１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記キレート剤が、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの一方または双方である請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
ＥＤＴＡとＣＴＡＤの混合物を有するものである請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
瀉血と血小板活性の測定との間に血液試料を抗凝固状態に保持するための、請求項１３ないし１８のいずれか１つに記載の血液抗凝固組成物の使用。
【請求項２０】
請求項１３ないし１８のいずれか１つに記載の血液抗凝固組成物中に懸濁された白血球の白血球活性化指標を計測することからなる、白血球活性を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、血小板活性の測定に関し、特に、いわゆる「平均血小板成分（ｍｅａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」を測定することにより行われる、このような測定に関するものである。
【０００２】
複数の研究は、血小板活性の指標の測定が、血栓性およびその他の疾患からの危険性から患者を臨床的に評価するにおいて、利点を提供するであろうことを示唆している（Ｍａｃｅｙ， Ｍ． Ｇ．， Ｃａｒｔｙ， Ｅ．， Ｗｅｂｂ， Ｌ．， Ｃｈａｐｍａｎ， Ｅ． Ｓ．， Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ Ｄ．， Ｏｋｒｏｎｇｌｙ， Ｄ．， Ｒａｍｐｔｏｎ， Ｄ． Ｓ．， Ｎｅｗｌａｎｄ， Ａ． Ｃ． （１９９９） ”Ｕｓｅ ｏｆ ｍｅａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ＡＤＶＩＡ １２０ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍ” Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， ３８，２５０−２５５．； Ｍｏｄｙ， Ｍ．， Ｌａｚａｒｕｓ， Ａ． Ｈ．， Ｓｅｍｐｌｅ， Ｊ． Ｗ． Ｆｒｅｅｄｍａｎ， Ｊ． （１９９９） ”Ｐｒｅ−ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ： ｃｈｏｉｃｅ ｏｆ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ．” Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９， １４７−１５４）。
【０００３】
平均血小板成分（”ＭＰＣ”）は、バイエル　アクチエンゲゼルシヤフト（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）によって製造された、一般的に用いられているＡＤＶＩＡ　１２０ＴＭ　ヘマトロジーシステム（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍ）のような、標準的研究室用血液学分析機によって測定することができるパラメーターである。ＭＰＣは血小板の平均屈折率の尺度であり、そして血小板活性の尺度としてのその値は、上記に言及したマーシー（Ｍａｃｅｙ）らの論文において既に提唱されている。ウシ　トロンビンによる全血中の正常血小板の生体外刺激は、ＣＤ６２Ｐ（活性の尺度である）の増大した血小板発現、およびＭＰＣにおける夾雑物減少を導く、活性化という結果となる。この応答は、投薬量および時間依存性である。
【０００４】
ＡＤＶＩＡ　１２０　ヘマトロジーシステムは、レーザーダイオード、フローセルおよび検出器部品群からなるレーザー光学作業台を有している。レーザーダイオードは、前記フローセル上へと集束された単色光を形成するために用いられるものである。光のミー散乱理論によると、均一均質球体によってある特定の角度で散乱された単色光の強度は、その容積および該球体とこの球体が懸濁された媒体との間の平均屈折率（ＲＩ）の差にのみ依存するものである。このことは、２つの未知数、容積およびＲＩ、のみの関数である、与えられた角度間隔内での単色散乱光の強度に関する方程式を与える。２つの適当な異なる角の間隔で光散乱を測定することで、光が数値的に解き得る２つの未知数を有する２つの式を得ることができる。これが、ＡＤＶＩＡ　１２０　ヘマトロジーシステムの赤血球および血小板測定値の基礎である（Ｔｙｃｋｏ， Ｄ． Ｈ．， Ｍｅｔｚ， Ｍ． Ｈ．， Ｅｐｓｔｅｉｎ， Ｅ． Ａ．， Ｇｒｉｎｂａｕｍ， Ａ． （１９８５）”Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ ａｎｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．”Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ， ２４，１３５５−１３６０； Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ， Ｄ．， Ｃｏｌｅｌｌａ， Ｇ． Ｍ．， Ｈｅｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎ， Ｅ． Ｊ．， Ｃｈａｐｍａｎ， Ｓ． Ｅ．， Ｐａｓｅｌｔｉｎｅｒ， Ｌ． （１９９８）”Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｕｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ．”ＵＳ−Ａ− ８１７，５１９； Ｋｕｎｉｃｋａ， Ｊ． Ｅ．， Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｇ．， Ｍｕｒｐｈｙ， Ｊ． ａｎｄ Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ， Ｄ． （２０００）”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｌａｓｅｒ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ．”Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １１４，２８３２８９）。
【０００５】
ＡＤＶＩＡ　１２０はまた、細胞１つごとに基づく、血小板の量およびＲＩを測定する。それらが光学フローセルを通過する際に、血小板はフォトダイオードによって発されるモノクロの６７５±１０ｎｍレーザー光の入射光を遮断する。システムは、２〜３°および５〜１５°の範囲において散乱する光の強度を計測する。この一対の散乱光強度値は、均一な球形の分子のためのミー散乱理論に基づくルックアップ表を参照することで分子量およびＲＩ値に変換される。ＲＩからの水（１．３３３）の屈折率を減じ、平均屈折率増加（０．００１８ｄＬ／ｇ）によって、差を割ることによって、血小板ＲＩ値は、平均血小板成分（Ｍｅａｎ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ：　ＭＰＣ）濃度に変換される（Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。この定数は、血小板の主な構成要素、すなわちタンパク質、脂質および炭水化物に関する加重平均屈折率増加から導き出される（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｓ． Ｈ．， Ｂｕｄｋａ， Ｍ． Ｊ． Ｅ．， Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｋ． Ｃ．， Ｈａｓｓｏｎ， Ｍ． １９４７） ”Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｔｈｅ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｃｅｒｔａｉｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ６９，１７４７−１７５３； Ｂａｒｅｒ， Ｒ．， Ｊｏｓｅｐｈ， Ｓ． （１９５４） ”Ｒｅｆｒａｃｔｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．”Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ９５，３９９−４２３； Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。最近の証拠も、血小板密度（分散勾配によって分離された）（Ｃｏｒａｓｈ， Ｌ．， Ｔａｎ， Ｈ．， Ｇｒａｌｎｉｃｋ， Ｈ． （１９９７）”Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｕｂ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ． Ｉ． Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｕｏｙａｎｔ ｄｅｎｓｉｔｙ， ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ， ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．”Ｂｌｏｏｄ， ４９，７１−８７）とＭＰＣ （Ｃｈａｐｍａｎ， Ｅ． Ｓ．， Ｌｅｒｅａ， Ｋ． Ｍ．， Ｋｉｒｋ， Ｒ．， Ｓｏｒｅｔｔｅ， Ｍ． Ｐ．， Ｓａｎｊａｙ， Ｎ． Ｓ．， Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ， Ｄ． （１９９８） ”Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｅｘ ｖｉｖｏ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ ｇｒａｎｕｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ， ｄｅｎｓｉｔｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ， ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （ＭＰＣ）．”Ｂｌｏｏｄ， ９２， Ｓｕｐｐｌ． １，６８Ｂ， Ａｂｓｔｒａｃｔ ３２７３）との間の正比例関係を示している。
【０００６】
平均血小板質量（ＭＰＭ、ｐｇ）は平均ＰＶ（ＭＰＶ）およびＭＰＣから算出される。各パラメータに関する平均値が表にされると共に、個々の血小板に関するデータが細胞所見おいて提示される（（Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ， Ｄ．， Ｃｏｌｅｌｌａ， Ｇ． Ｍ．， Ｈｅｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎ， Ｅ． Ｊ．， Ｃｈａｐｍａｎ， Ｅ． Ｓ．， Ｐａｓｅｌｔｉｎｅｒ， Ｌ． （１９９８）”Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｕｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ”．　ＵＳ−Ａ５８１７５１９）。
【０００７】
静脈切開においてすみやかにないしは直後に、血小板活性化が起こり、そして血小板のこの特徴は生体外分析を困難とする。しかしながら、この生体外での活性化の程度は、血液が採取されたところに添加される抗凝固剤に依存する（（Ｋｕｈｎｅ， Ｔ．， Ｈｏｒｎｓｔｅｉｎ， Ａ．， Ｓｅｍｐｌｅ， Ｊ．， Ｃｈａｎｇ， Ｗ．， Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ， Ｖ．， Ｆｒｅｅｄｍａｎ， Ｊ． （１９９５）”Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ＥＤＴＡ ｖｓ． Ｄｉａｔｕｂｅ Ｈ， ａ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ， ａｄｅｎｏｓｉｎｅ， ａｎｄ ｄｉｐｙｒｉｄａｍｏｌｅ．”Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ５０， ４０−４５）。単純化および経済的理由のため、理想的な抗凝血剤は、血小板活性化における情報を全血プロフィールの一部として得ることを可能としたものであろう。
【０００８】
その有効性および調製の容易さという点から、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）がその液状三カリウム塩の形態で、抗凝固剤として一般的に用いられている（Ｐｅｒｒｏｔｔａ， Ｇ．， Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｌ．， Ｇｌａｚｉｅｒ， Ｊ．， Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ， Ｈ． Ｒ． （１９９８）”Ｕｓｅ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｆｏｒ ｒｏｕｔｉｎｅ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ＣＥＬＬ−ＤＹＮＯ ４０００ ： Ａｎ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ４， １５６−１６２）。それは、また、その細胞保存特性ゆえに全血球計数および白血球分画のための好適な抗凝血剤であって、臨床研究所規格委員会によってこれらの目的の上で推薦されている抗凝血剤である（ＮＣＣＬＳ； ｓｔａｎｄａｒｄ Ｈ１−Ａ４）。
【０００９】
生体外での血小板活性化を観察する場合、主な必要条件は、自発的な血小板活性化を最小にする静脈穿刺手順を使用すること、およびサンプルが分析されることができるまで、凝固を防止するのみならず、血小板の活性化状況をも保存し得る媒体に、血液を採集することである （Ｇｅｏｒｇｅ ＪＮ， Ｔｈｉｏ ＬＬ， Ｍｏｒｇａｎ ＲＫ （１９８１）”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ；ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｗａｓｈｉｎｇ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．” Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３，６９−７７； Ｈａｗｉｇｅｒ Ｊ （１９８９）”Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙｓ： ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６９，１９１１９５； Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ ＡＤ （１９９６）”Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ： ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｅｓｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａ ｒｅｖｉｅｗ．”Ｂｌｏｏｄ ８７，４９２５−４９３６； Ｗｕ ＫＫ （１９９４） ”Ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｒｔｅｒｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．”Ｌａｎｃｅｔ ３４４，９９１９９５）。
【００１０】
血小板調査に関して、ＥＤＴＡは、これが、時間とともに増加する、血小板の膨張および自己活性化を起すものであるゆえに好ましくない （Ｋｕｈｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｓ． Ｒ．， ＆ Ｃａｒｔｅｒ， Ｊ． Ｍ． （１９９３） ”Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅ：
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．”Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ７，１０４−１１３； ＭｃＳｈｉｎｅ， Ｒ． Ｌ．， Ｄａｓ， Ｆ． Ｐ． Ｃ．， Ｓｉｂｌｉｎｇａ， Ｃ． Ｓ．， Ｂｒｏｚｏｖｉｃ， Ｂ． （１９９０）”Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＥＤＴＡ ａｎｄ ｃｉｔｒａｔｅ ａｎｔｉ−ｃｏａｇｕｌａｎｔｓ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｕｎｔ ａｎｄ ｍｅａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅ．”Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ， １２，２７７−２８５； Ｐｉｄａｒｄ， Ｄ．， Ｄｉｄｒｙ， Ｄ．， Ｋｕｎｉｃｋｉ， Ｔ． Ｊ．， Ｎｕｒｄｅｎ， Ａ． Ｔ． （１９８６） ”Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＥＤＴＡ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＩＩｂ／ＩＩＩａ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｂｉｌｉｔｙ．”Ｂｌｏｏｄ， ６７，６０４−６１１）。血小板の漸進的な膨張は、ＥＤＴＡによって引き起こされる原形質膜の変容によるものであり、そして、光学密度の低下および平均血小板量（ＭＰＶ）の増大をもたらす。光学密度における低下は、ＡＤＶＩＡ　１２０　システム（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）において、平均血小板成分（ＭＰＣ）における変化として観察され得る（Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ＥＤＴＡはまた、血小板本来のつきの楕円状の形から球形のものへと血小板の形態を変容させる。血小板形状変化は、走査型電子顕微鏡のような形態学的方法、あるいは血小板凝集計において起こる光学密度の増加を見ることによって測定できる急速な反応である。光学的技術は、ＡＤＰによって誘発された形状変化が、２．５秒で半最大光学密度変化に達することを示している。血小板形状変化は、通常の円盤状の形（直径２〜４μｍおよび厚さ約０．５μｍ）形から、多くの長い、薄い糸状偽足を有しているとげ状の球への形態的変化によって特徴づけられる。この形状変化は、前記抗凝血剤への露曝直後に始まり、２時間以内に最大となる（Ｊａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ， １９９３）。
これらの変化は、ＡＤＶＩＡ　１２０によって３０分後に検出可能である。さらに、ある個体からの血液がＥＤＴＡで血液凝固を阻止された場合、血小板は凝集して、記録されるべき明白な血小板減少症を引き起す（Ｏｋａｄａ Ｔ （１９９９）”ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｒｉＷ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｅｒｓ．”Ｓｙｓｍｅｘ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ９，５２−５７）。
【００１１】
このため、血小板研究に関して、クエン酸三ナトリウムが、血小板研究のために選択される抗凝血剤として確立されている （Ｐｅｒｒｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
クエン酸含有抗凝血剤は、ＥＤＴＡより低いＭＰＶを引き起こすこと、そして、通常の円盤状の形態の保存により部分的に説明される形質が証明されている（Ｊａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ， １９９３）。血液がクエン酸塩中に採集された場合、初期においては血小板形状および量にほとんどあるいは全く変化がない。しかしながら、クエン酸塩において、血小板はゆっくりと球形状となり（Ｍａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、そしてＥＤＴＡにおける場合と同様に、１〜２時間かけて漸進的に膨張する（クエン酸ナトリウムの濃度に依存するインピーダンス法での容積における３〜１０％の増加（Ｂａｔｈ， ＰＷＭ （１９９３）”Ｔｈｅ ｒｏｕｔｉｎｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｉｚｅ ｕｓｉｎｇ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ａｌｏｎｅ ａｓ ｔｈｅ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ．”Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ７０，６８７−６９０； Ｔｈｒｅａｔｔｅ ＧＡ， Ａｄｒａｄｏｓ Ｃ， Ｅｂｂｅ Ｓ， Ｂｒｅｅｃｈｅｒ Ｇ． （１９８４）”Ｍｅａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅ．
Ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ．”Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． ８１：
７６９７２））。これらの理由から、クエン酸塩は元々血小板量の測定に役立たないと考えられていた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＢ， Ｄｉａｚ ＤＤ， Ｑｕｉｎｎ ＰＧ， Ｌａｐｉｎｓ Ｍ， Ｋｕｒｔｚ ＳＲ， Ｖａｌｅｒｉ ＣＲ． （１９８３）．”Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅｓ．” Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １８０：３２７−３２）。
【００１２】
クエン酸塩を主成分とする抗凝血剤が、ＡＤＶＩＡ　１２０における血小板パラメータの測定のために用いられている （Ｍａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。しかしながら、ＭＰＣの標準偏差（血小板構成成分分布幅（ＰＣＤＷ）として記録される）は、ＥＤＴＡにおけるよりクエン酸塩における方が最初は大きい。これは、円盤状の血小板の光散乱特性は、球状の場合とは異なり、これらの配向性に依存するためである（Ｍａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９；　Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。以前の研究において、クエン酸ナトリウム（Ｍａｕｒｅｒ−Ｓｐｕｒｅｊ， Ｅ．， Ｐｆｉｅｆｅｒ， Ｇ． Ｍａｕｒｅｒ， Ｎ．， Ｌｉｎｄｅｒ， Ｈ．， Ｇｌａｔｔｅｒ， Ｏ．， Ｄｅｖｉｎｅ， Ｄ． Ｖ． （２００１） ，”Ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ”． Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８１，５８１−５９２）または酸性クエン酸ブドウ糖（ＡＣＤ）（Ｏｌｉｖｅｒ， Ａ． Ｅ．， Ｔａｂｌｉｎ， Ｆ．， Ｗａｌｋｅｒ， Ｎ． Ｊ．， Ｃｒｏｗｅ， Ｊ． Ｈ． （１９９９）”Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｈｉｌｌｉｎｇ”． Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １４１６，３４９−３６０）のいずれかによって抗凝固化された血液がそれぞれ２０℃および５℃に冷却された場合、該血小板は、偽足を有する活性化された球状であることが見出されている。我々は、４℃でインキュベートされたクエン酸ナトリウムで抗凝固化された血液において、血小板におけるＣＤ６２Ｐ発現において時間依存性で増加すること、およびＰＬＡ形成の顕著な増加があることを示した（未発表のデータ）。
【００１３】
ＡＢＯＴＴ ＣＥＬＬ−ＤＹＮ ４０００（商標名）血液システムを使用した予備的研究は、更正が異なる希薄因子を考慮するために実行されると仮定するならば、クエン酸塩は、基礎的な全血球計数のために、ＥＤＴＡの代わりに用いられることができることを示している。
【００１４】
オ　マレイら（Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．） （”Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ ｍｉｘｔｕｒｅｓ”， Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ７ （４）， １９９６，４３１−４３６）は、平均血小板量を測定するためにＥＤＴＡおよびテオフィリンを含んでいる抗凝血剤が用いられることを開示している。
【００１５】
Ｄｉａｔｕｂｅ−Ｈ（商品名）という市販名を付けられた比較的新しい抗凝血剤が、血小板活性化を阻止し、そして血漿ヘパリン値および活性化された血小板から放出される血小板因子４およびβ−トロンボグロブリンを計測するために用いられている（Ｋｕｈｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。Ｄｉａｔｕｂｅ−Ｈ（商品名）の主な構成成分は、クエン酸塩、テオフィリン、アデノシンおよびジピリダモールであり、そして、それは非公式にＣＴＡＤと呼ばれる。テオフィリンおよびジピリダモールは、血小板サイクリックＡＭＰの増加および血小板活性を導く、ホスホジエステラーゼ活性を阻止することを示した。アデノシンも、トロンビンによって誘発された血小板凝集および細胞内でのカルシウムの放出を阻止する（Ｋｕｈｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。ジピリダモールは光過敏性であるという欠点を有しており、従ってＣＴＡＤ抗凝固剤を収容した管体は適当に格納されなければならない。ミー理論を適用するため、および細胞１つづつを基準とする正確な容積およびＭＰＣ量を得るために、ＥＤＴＡ中の血小板は均質な球状に近づく（Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。しかしながら、ＥＤＴＡの血小板活性化特性ゆえに、患者の血小板活性化状態を測定するために用いる抗凝固剤としてはきわめて不適当であると一般的に考えられている。
【００１６】
好中球活性の測定は、臨床においてまた重要である。全部の血液凝固を阻止された血液において静脈切開直後の抗凝固処理全血において分析された場合、好中球は活性化（例えば、ＣＤ１１ｂ発現に関するこれらの値による）の証拠をほとんどないしは全く示さない。あいにく、ＥＤＴＡおよびクエン酸塩は、血漿のＣａ２＋濃度を減少させ、従ってＣａ２＋依存性エピトープ（例えばＣＤ１１ｂ）の抗原性に影響を及ぼす。別の試薬として、全血の保存のために推奨されている、Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ（商品名）（Ｓｔｒｅｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国ネブラスカ州オマハ）は、リンパ球および好中球における抗原発現を安定化させるが、しかし血小板におけるそれの影響はまだほとんど知られていない。
【００１７】
我々は、驚くべきことに、このような適用に不適であると一般的に考えられていたＥＤＴＡおよび同様の抗凝固剤が、例えば、ＣＴＡＤにおいて用いられていたもの、のような適当な血小板拮抗剤と共に用いられたとすれば、血小板活性化の研究に用いられ得るものであることを見出したものである。
【００１８】
我々は、また、このような混合物で抗凝固処理された血液を低温で保つことは、雰囲気温度で試料を保持した場合と比較して、かなりの時間にわたり血小板活性化を低減することができるということを発見した。
【００１９】
更に、我々はこのような混合物が、抗凝固処理された血液における好中球活性化を効果的に阻止するということを発見した。
【００２０】
従って、本発明は、血小板球状化（たとえば、キレート試薬（例えばＥＤＴＡまたは ［エチレン−ビス（オキシエチレンニトリロ）］四酢酸（ＥＧＴＡ））をもたらす成分と、血小板拮抗剤とを有する血液抗凝固剤を提供するものである。
【００２１】
血小板球状化をもたらす成分および血小板拮抗剤は、血液試料に添加する前に混合されるか、成分の１つを血液試料に添加後に混合されることができる。
【００２２】
血小板拮抗剤は、好ましくは、クエン酸塩、テオフィリン、アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、並びにジピリダモールの２ないしそれ以上、より好ましくは、３ないしそれ以上、特に好ましくは、クエン酸塩、テオフィリン、アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、並びにジピリダモールのすべてを含む。クエン酸塩、テオフィリン、アデノシン、並びにジピリダモールの好ましい濃度は、概して、コンタントら（Ｃｏｎｔａｎｔ ｅｔ ａｌ） （Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１： ｐｐ３６５−３７４，１９８３）の論文に述べられたようなものであり、そして特に、次の範囲：
テオフィリン　７．５〜２２．２ ｍＭ、
アデノシン　０． ０１ｍＭ〜３．７ｍＭ、
ジピリダモール　０．００１−２ｍＭ、好ましくは約０．０２ｍＭ、
クエン酸塩　０．１ Ｍ〜０．２５８ Ｍ、好ましくは約０．１１Ｍ
である。
【００２３】
該組成物のｐＨは、好ましくは、４．５〜６．４、特に約５．０である。
【００２４】
血小板拮抗剤は、好ましくはキレート試薬を含有することができる。キレート試薬は、好ましくはＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの一方または双方を含むものである。
【００２５】
血液抗凝固剤蘇生物は好ましくは、ＥＤＴＡおよびＣＴＡＤを有するものである。
【００２６】
本発明はまた、少なくとも１つの血小板球状化を行う成分と、少なくとも１つの血小板拮抗物質とを有する組成物中に懸濁された血小板の平均屈折率を測定することからなる、血小板活性の測定方法を提供するものである。
【００２７】
屈折率を介してのＭＰＣの測定方法は、本質的は周知であり、例えば、前記したマーシーら（Ｍａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．）の１９９９年の論文、ならびにその他の文献においておいて述べられている。屈折率測定は、２つの異なる角度、より好ましくは２〜３°の角度と５〜１５°の角度で、光散乱を測定することにより好ましく行われる。
【００２８】
本発明の方法において、屈折率測定は好ましくは、瀉血後３０〜６０分の時間に行われるもの行われるものである。
【００２９】
本発明の方法において、好ましくは、瀉血と測定との間、抗凝固化血液試料が０℃〜１０℃の温度に保持されるものである。抗凝固化血液試料がこの温度範囲に保持された場合、屈折率測定は、瀉血後６時間まで、好ましくは瀉血後３時間まで行うことができる。
【００３０】
本発明はまた、本明細書において述べるような血液抗凝固組成物の、瀉血と血小板活性の測定との間に血液試料を抗凝固状態に保持するための使用を提供するものである。
【００３１】
本発明はさらに、少なくとも１つの血小板球状化を行う成分と、少なくとも１つの血小板拮抗物質とを有する本明細書において述べたような組成物中に懸濁された白血球の白血球活性化指標を計測することからなる、白血球活性を測定する方法を提供するものである。
【００３２】
本発明の好適な実施態様は、以下の実施例群に記載されている。
【００３３】
【実施例】
実施例１：
ＥＤＴＡおよびＣＴＡＤを用いたＥ／Ｃの比較
材料および方法
材料：　タイロード塩溶液（ＴＳ）は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（ＣａＣｌ　２Ｈ２０　０．２６５ｇ／Ｌ、　ＭｇＣｌ　６Ｈ２Ｏ　０．２１４ｇ／Ｌ、　ＫＣ１　０．２ｇ／Ｌ、　ＮａＨ２ＣＯ２　１．０ｇ／Ｌ、　ＮａＣｌ　８．０ｇ／Ｌ、　ＮａＰ０４　０．０５ｇ／Ｌ、ブドウ糖１．０ｇ／Ｌ）からのものである。Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商品名）コンテナ中のＥＤＴＡおよびＣＴＡＤは、ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）からのものである。後者は、遮光箱に格納し、使用の直前に取り除かれた。
【００３４】
抗血清：　ＩｇＧｌ−ＦＩＴＣ、ＩｇＧｌ−ＰＥ、ＣＤ６２Ｐ−ＦＩＴＣおよびＣＤ４５−ＲＰＥは、イムノテック（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）からのものである。マウスＩｇＧ２ａ−ＦＩＴＣおよびＣＤ４２ａ−ＦＩＴＣはベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）からのものである。
【００３５】
血液試料：　正常血液試料（ｎ＝６）。平均年齢３５歳、男４人、女２人。
【００３６】
ＡＤＶＩＡ　１２０上での血小板活性の評価：　全血試料は、ＥＤＴＡ、ＣＴＡＤ、またはＥＤＴＡおよびＣＴＡＤの混合物（Ｅ／Ｃ）のいずれかを入れたＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商品名）コンテナ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に採取された。試料は、瀉血直後、および３０、６０、１２０および１８０分の時間間隔で分析された。、血小板数（ＰＬＴ）、平均血小板量（ＭＰＶ）、平均血小板成分（ＭＰＣ）および平均血小板成分幅（ＰＣＤＷ）の分析は、ＡＤＶＩＡ　ＴＥＳＴポイント血液比較対照試薬（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州テリータウン）を用いて予め較正されたＡＤＶＩＡ　１２０血液システム（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州テリータウン）を使用して実行された。
【００３７】
発現ＣＤ６２Ｐおよび白血球血小板凝集体（ＰＬＡ）の数の測定：　抗凝固処理された血液（５μｌ）は、９０μｌのＴＳ中の、ＦＩＴＣ　ＣＤ６２Ｐ（５μ１）またはＦＩＴＣイソタイプ比較対照（５μｌ）、あるいは、ＰＥ　ＣＤ４５（５μ１）およびＦＩＴＣ　イソタイプ比較対照（５μｌ）またはＦＩＴＣ　ＣＤ４２ａ（５μ１）およびＰＥ　ＣＤ４５（５μ１）で、室温にて５分間インキュベートされた。試料はＴＳを用いて１ｍｌまで希釈され、直ちに血球計算機（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）にて分析された。。
【００３８】
血球計算機：血液細胞は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェアを有するＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国オックスフォード）において分析された。この血球計算機は、使用前に、蛍光クロム標識ビーズ（Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（商品名）、Ｄａｋｏ）を用いて較正されていた。
【００３９】
ＣＤ４２ａの分析に関して、発現データは、前方光散乱（ＦＬＳ）対数関数的スケール（縦座標）および、横光拡散（ＳＬＳ）対数関数的スケール（横座標）の二重のパラメータヒストグラムにおいて設定された第１ゲートにおいて、リアルタイムに得られた。これは、血液内での血小板の識別を容易にして、ＣＤ４２ａ発現（図１）の分析によって確かめられた。バックグラウンド蛍光は、ＦＩＴＣ接合イソタイプ比較対照抗体で標識された血小板を用いて評価された。カーソルは頻度（縦座標）および緑色蛍光強度（横座標）の単一パラメータヒストグラムにセットされ、血小板の１％未満しか比較対照抗体で陽性に染色されないようにされた。ＣＤ６２Ｐ発現における変化（緑色蛍光対数関数的スケール）は、ＦＬＳおよびＳＬＳのそれらを一緒にし、ゲートされた血小板において記録された。
【００４０】
血小板−白血球凝集（図２）の分析に関して、細胞は、横の散乱（対数関数的なスケール縦座標）およびオレンジ色蛍光（対数関数的なスケール横座標）のヒストグラムにおいて分析された。ＰＥ　ＣＤ４５での陽性の染色によって識別される白血球は、緑色蛍光（対数関数的なスケール縦座標）およびオレンジ色蛍光（対数関数的なスケール横座標）のヒストグラムへとゲートされた。緑色およびオレンジ色の双方であった事象は、血小板白血球凝集とみなされ、そして、合計１０，０００のゲート化白血球のパーセンテージとして記録された。
【００４１】
統計の分析：血小板ＣＤ６２Ｐ発現、血小板−白血球凝集、およびＭＰＣは、末端ｐ値を用いたパラメータの統計（学生の対ｔ−試験）を使用して比較された。
結果
ＣＤ６２Ｐ陽性の血小板のパーセンテージ
【００４２】
【表１】
2004513369.tif 000003
６人の検体におけるＣＤ６２Ｐ陽性の血小板のパーセンテージは、０分においては低いものであった　（１．１０±０．２４％、平均±標準誤差）。１８０時間では、ＣＤ６２Ｐ陽性の血小板のパーセンテージは、３つの全ての抗凝血剤（ｐ＜　０．０２）において顕著に上昇したが、ＥＤＴＡにおいてはより大きいものとなった（２３．０５±２．７９％）。ＣＴＡＤ抗凝固化血液において、最小の活性化が観測された（４．１４±０．６１％）、一方、Ｅ／Ｃ抗凝固化血液は中間の血小板活性化（８．４５±０．７９％）を有していた。６０分後における、ＥＤＴＡ抗凝固化血液中でのＣＤ６２Ｐの発現は、ＣＴＡＤ抗凝固化血液中でのものより、顕著に高い（ｐ＜　０．０１）ものであった。
【００４３】
血小板−白血球凝集体形成
【００４４】
【表２】
2004513369.tif 000004
０秒での血小板−白血球凝集体（ＰＬＡ）は、全ての検体において検知でき、そしてこれらは、Ｅ／Ｃ抗凝固化血液におけるもの（２．８２±０．６７％）よりも、ＥＤＴＡ抗凝固化血液中（３．５０±０．５０％、平均±標準偏差）およびＣＴＡＤ抗凝固化血液中（３．９５±０．７３％）のものがより多い数存在していた。ＣＴＡＤ抗凝固化血液中のＰＬＡのパーセンテージは、１８０秒で増加し（１８．８８±３．３８％）、そして、これは、ＥＤＴＡ中（１３．５０±２．４１％、ｐ＜０．０５）およびＥ／Ｃ（７．８１±１．５２％、ｐ＜０．０２）に採取された血液中で検出された数よりも顕著に多いものであった。
【００４５】
血小板数（ＰＬＴ）
【００４６】
【表３】
2004513369.tif 000005
検体に関するＥＤＴＡ抗凝固化血液の全血小板数は、平均±標準偏差が２３５±１２を有して、正常な範囲にあった。１８０分にわたり、血小板数における顕著な変化は認められなかった。希釈のために補正された際、ＥＤＴＡおよびＥ／Ｃで抗凝固化された血液中において、血小板が数えられた。（それぞれ、希釈因子＝１．１１および１．２５）が、ＥＤＴＡ抗凝固化血液におけるそれらと同様に見出された。
【００４７】
平均血小板量（ＭＰＶ）
【００４８】
【表４】
2004513369.tif 000006
３つの異なる抗凝固剤のそれぞれにおいて０分から３０分間の間において、ＭＰＶ値が低下した。このことは、血小板球化はこの期間の間に起こるゆえ、瀉血後３０分以内でのＡＤＶＩＡ１２０での全血中の血小板測定は安定でないということを反映している。ＭＰＶは、３０ないし６０分間の間に最も安定していて、それから全ての３つの抗凝血剤において少ない量づつ１８０分間まで増加した。Ｅ／Ｃ抗凝固化血液における血小板量は、９．０±０．２４ｆＬから９．２±０．２８ｆＬ（平均±標準偏差）に、ＥＤＴＡにおいては８．０±０．３７ｆＬから８．１±０．２１ｆＬ、そしてＣＴＡＤにおいては９．１±０．２４ｆＬから９．２±０．２０ｆＬにそれぞれ増加した。
【００４９】
平均血小板成分（ＭＰＣ）
【００５０】
【表５】
2004513369.tif 000007
ＥＤＴＡは最も高いＭＰＣ値を引き起こした、そして、１８０分にわたるＭＰＣの減少はまた、この抗凝血剤を有する血液において最も大きかった（２８．０±０．８７ｇ／ｄｌから２７．１±０．３６ｇ／ｄｌ、平均±標準偏差）。
【００５１】
最も低いＭＰＣ値は、Ｅ／Ｃ抗凝固化血液において、各時間間隔で観測された。
ＣＴＡＤ抗凝固化血液において、０分から１８０分の間、平均ＭＰＣの変化がなく（それぞれ２５．２±０．６２ｇ／ｄｌおよび２５．２±０．４０ｇ／ｄｌ）、ＭＰＣは最も安定していた。平均ＭＰＣ値は、０から３０分まで増加して、それからその後全ての３つの抗凝血剤において減少した。
３０分での値より低い６０分でのＭＰＣ値が全ての抗凝血剤において観測されたが、しかし、これはＣＴＡＤ（２７．１±０．４０ｇ／ｄｌから２６．７±０．４０ｇ／ｄｌ）において最も目立った。
【００５２】
血小板成分分布幅（ＰＣＤＷ）
【００５３】
【表６】
2004513369.tif 000008
このパラメータは、抗凝血剤の間で変化した。ＣＴＡＤは、より高いＰＣＤＷ値を与え、そして１８０分にわたりこの抗凝血は、ＰＣＤＷの小さい増加を引き起こした（７．４１±０．１３ｇ／ｄｌから７．８０±０．１１ｇ／ｄｌ、平均±標準偏差）の小さい増加が生じた。
【００５４】
対照的に、ＥＤＴＡおよびＥ／Ｃ抗凝固化血液に関する平均の値は時間にわたって減少するものであった。但し、Ｅ／Ｃ（７．３５±０．２１から６．９７±０．４３）より非常に大きい減少がＥＤＴＡ（４．８０±０．０８ｇ／ｄｌに対する５．８５±０．２８ｇ／ｄｌ）であった。
【００５５】
結果は、ＣＴＡＤが、ＥＤＴＡのような血小板活性化剤が存在している場合であっても、血小板活性の非常に良好な抑制剤であることを示した。ＣＤ６２Ｐ発現は、他の抗凝血剤とは対照的に、ＣＴＡＤへの露曝で３時間以上にわたって増加しなかった。６０〜１２０分間の間、ＣＤ６２Ｐ発現は、ＣＴＡＤにおいて低下した；その理由は、明白でなはないが、血小板表面からのＣＤ６２Ｐの消失または、チューブ壁にまたは血中の他の白血球に活性化した血小板の粘着によるものであると思われる。後者の理論は、ＥＤＴＡまたはＥ／Ｃのそれらと比較してＣＴＡＤ抗凝固化血液において測定された血小板−白血球凝集の著しい増加、および、ＣＴＡＤ抗凝固化血液における血小板数のわずかな減少が観測されたことによって指示される。その理由は直ちに明らかではないが、クエン酸塩よりよいカルシウムのキレート化剤であるＥＤＴＡの存在、そして、カルシウムは血小板活性化が生じるために必要である、ということに関するように思われる。血小板は非常に多量のアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を含む。そして、それはカルシウムの存在下で活性化において放出される；ＡＤＰは、白血球によってアデノシンに低下されることができる（Ｆａｉｎｔ， Ｒ． Ｗ． （１９９２） Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｔｈｅｉｒ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ． Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ６，８３−９１）、これはそして血小板および好中球の双方の活性化における阻止効果を有する （Ｓｅｉｓ， Ｗ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ， ６９，５８−６５）。白血球および脈管内皮が、流れる血液中の循環するヌクレオチドの多くがｔ愛車されっるのに十分なエクトヌクレオチターゼを発現する （Ｃｏａｄｅ， ＳＢ．， Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｊ． Ｄ． （１９８９） Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６５， ５３１−５３７）が、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商品名）コンテナの静的条件下では、この代謝は、ＡＤＰの正常値よりも大きな存在をもたらす最適状態に及ばないものであってもよい。ＡＤＰが血小板の膨張を引き起こし、そして血小板膜が互いに付着することをもたらすことは公知であり（Ｆａｉｎｔ， １９９２）、したがって、多量のＡＤＰが血小板および白血球の凝集する能力を高める可能性がある。したがって、ＣＤ６２Ｐ発現によって測定される血小板活性化の明らかな抑制が、活性化血小板が白血球に付着しているゆえに、存在はするが、検出されないという事実によって、人為結果となるものであるかもしれない。
【００５６】
ＥＤＴＡは血液中において人為結果を引き起こすことは公知である、そして、室温で、ＥＤＴＡ抗凝固化血液においてＭＰＶが平均して２３％、対応するクエン酸塩抗凝固化血液より大きかったことが示された（Ｔｈｒｅａｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９８４）。この研究はまた、ＥＤＴＡ抗凝固化血液のＭＰＶの最も大きい増加が露曝の数分以内で起こることを示した。しかし、我々はＥＤＴＡ、ＣＴＡＤおよびＥＤＴＡとＣＴＡＤとの混合物におけるＭＰＶが０〜３０分間に低下したことを示した。これらの結果は前の発見とは逆であり、そして、これは血液が分析された方法に関するものであると思われる。この研究において、ＡＤＶＩＡ １２０血液システム（Ｂａｙｅｒ， Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ， Ｎ． Ｙ．）が使われ、そして、血小板によって高および低角度に散乱された光を測定する。前者は、血小板の屈折率、すなわち、粒化または血小板活性の度合いの測定に関するものであり、後者は、細胞の容積に左右されるものである（Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ところが、Ｕｌｔｒａ−Ｆｌｏ １００全血血小板アナラアイザ（Ｃｌａｙ−Ａｄａｍｓ， Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， Ｎ． Ｊ．）を用いたセアッテら（Ｔｈｒｅａｔｔｅ ｅｔ ａｌ）（それは電導性希釈剤中に懸濁された細胞によって発生する小さな電流変化の発見を許す半自動の計測器である）は、これらが、開口を通じて流れると述べている（Ｇｕｔｈｒｉｅ， Ｄ． Ｌ．， Ｌａｍ， Ｋ． Ｔ．， Ｐｒｉｅｓｔ， Ｃ． Ｊ． （１９８０） Ｕｌｔｒａ−Ｆｌｏ １００ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｕｎｔｅｒ−ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｕｎｔｉｎｇ．　 Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ２，２３１−２４２）。臨床のおよびＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２，２３１−２４２）。
【００５７】
上述したメイシーらの１９９９年の論文は、全血の試験管内的刺激が増加するＣＤ６２Ｐ発現およびＭＰＣにおける並行する減少に至ることを示している。上記の結果はＭＰＣがＥＤＴＡにおいて、ＣＴＡＤまたはＥＤＴＡおよびＣＴＡＤの混合物におけるよりもより減少したことを明らかに示している。そして、ＥＤＴＡによって血小板活性化が引き起こすことを示している。ＣＴＡＤ抗凝固化血液において、平均ＭＰＣ値が時間にわたって変化しなかった。それゆえに、血小板は安定であり、蛍光流量細胞計数器によって測定された安定なＣＤ６２Ｐ発現と整合したものであった。ＣＴＡＤおよびＥＤＴＡとＣＴＡＤの混合物で抗凝固化された血液は、１８０分間にわたってＭＰＣ値は同様のものであった。
【００５８】
ＥＤＴＡとＣＴＡＤの混合物を用いた試料中での高いＭＰＶと低いＭＰＣは、血小板が脱顆粒化を起こすことなしに、ＭＰＣ測定が満足できるように十分な程度まで、球状化されることを示している。このことは、ＥＤＴＡ／ＣＴＡＤ混合物抗凝固化血液中の血小板における低い量のＣＤ６２Ｐ発現によって確かめられる。そして、それはＣＴＡＤのみで抗凝固処理された血液の血小板におけるものと同等だった。これに対して、ＥＤＴＡ抗凝固化血液における血小板は、高いＭＰＶと高いＣＤ６２Ｐ発現を有し、これはこれらが膨張し、脱顆粒化を起こしていることを示した。この後者の発見は、以前の論文に、一致するものであった（ＭｃＳｈｉｎｅ ｅｔ ａｌ， １９９０； Ｋｕｈｎｅ ｅｔ ａｌ， １９９５；
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｃ． Ｂ．， Ｄｉａｚ， Ｄ． Ｄ．， Ｑｕｉｎｎ， Ｐ． Ｇ．， Ｌａｐｉｎｓ， Ｍ．， Ｋｕｒｔｚ， Ｓ． Ｒ．， Ｖａｌｅｒｉ， Ｃ． Ｒ． （１９８３） Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅｓ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ８０，３２７−３３２；
ａｎｄ Ｍａｃｅｙ ｅｔ ａｌ， １９９９）。
実施例２：Ｅ／Ｃの、 ＥＤＴＡ／クエン酸， ＥＤＴＡ／アデノシン， ＥＤＴＡ／ジピリダモールおよびＥＤＴＡ／テオフィリンとの比較
材料および方法
血小板活性化制御薬が０．１１Ｍクエン酸（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）と組み合わせて用いられた：これらは、次の通りだった；３．７ｍＭアデノシン（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、０．１９８ｍＭジピリダモール（Ｓｉｇｍａ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）および１５ｍＭテオフィリン。各溶液のｐＨは、必要ならｐＨ ５．０に調整された。溶液はフィルター殺菌され、必要であるまで、−２０℃で格納された。抗凝固剤ＣＴＡＤ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ， ＵＫ）は、遮光箱に格納され、使用の直前に取り除かれた。
材料
実施例１と同様。
抗血清
実施例１と同様。
血液採取
血液は、２１−ゲージ針を使用して、４つのＥＤＴＡ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒｗコンテナ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ， ＵＫ）に、５人のボランティア（平均年齢３８歳、女３人、男２人）の肘前の静脈から採血された。３つのＥＤＴＡ試料は、アデノシンまたはジピリダモールまたはテオフィリンをクエン酸と含んでいるＶａｃｕｔａｉｎｅｒｗコンテナに加えられた。最後のＥＤＴＡ試料は、抗凝血剤ＣＴＡＤを含んでいるＶａｃｕｔａｉｎｅｒｗに加えられた。
ＡＤＶＩＡ　１２０上での血小板活性の評価
全血試料は、ＥＤＴＡを含みそして前記血小板拮抗剤と混合されている、または、ＣＴＡＤと混合されている（この混合物をＥ／Ｃと呼ぶ。）Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商品名）コンテナ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に採取された。試料は実施例１におけると同様にして分析された。
発現ＣＤ６２Ｐおよび白血球血小板凝集体（ＰＬＡ）の数の測定
実施例１と同様。
血球計算機
実施例１と同様。
統計的分析
対ｔ−試験が、４つの抗凝固剤混合物の間の違いを測定するために適用された。結果
血小板数
【００５９】
【表７】
2004513369.tif 000009
血小板数は、いずれも類似しており、各々の４つの抗凝血剤の組合せにおいて、正常な範囲内であった。
平均血小板量
【００６０】
【表８】
2004513369.tif 000010
Ｅ／Ｃで抗凝固処理された血液においては、最初の３０分間の間において、ＭＰＶ値が低下し、その後増加した。これに対して、Ｅ／Ａ、Ｅ／Ｄ、およびＥ／Ｔで抗凝固処理された血液においては、最初の６０分間の間において、ＭＰＶ値が低下し、その後は安定にとどまった。
平均血小板成分
【００６１】
【表９】
2004513369.tif 000011
Ｅ／Ｃで抗凝固処理された血液においては、最初の３０分間の間において、ＭＰＣが増加し、その後低下した。これに対して、Ｅ／ＤおよびＥ／Ｔで抗凝固処理された血液においては、瀉血６０分後まで、ＭＰＶが上昇を続け、Ｅ／Ａで抗凝固処理された血液においては、瀉血１２０分後まで、ＭＰＶが上昇を続けた。
平均血小板量
【００６２】
【表１０】
2004513369.tif 000012
ＭＰＭの経時変化は、全ての４つの抗凝血剤組合せにおいて非常に類似していた。
ＣＤ６２Ｐ陽性の血小板のパーセンテージ
【００６３】
【表１１】
2004513369.tif 000013
ＣＤ６２Ｐ陽性の血小板のパーセンテージは、１８０分間にわたりすべての４つの抗凝血剤において、経時増加した。
血小板−白血球凝集体形成
【００６４】
【表１２】
2004513369.tif 000014
血小板−白血球凝集体の数は、すべての４つの抗凝血剤の組合せで抗凝固処理された血液において経時増加した。１８０分での最も低い血小板−白血球凝集体のパーセンテージは、Ｅ／Ｃで抗凝固処理された血液に見出された。
結論
Ｅ／Ｃで抗凝固処理された血液において、ＭＰＶの減少および瀉血後の最初３０分におけるＭＰＣの増加があった。これらの変化は、血小板の球状化に関連すると思われる。同様の変化は、Ｅ／Ａ、Ｅ／ＴおよびＥ／Ｄで抗凝固処理された血液においても起きたが、より延長化された時間において起きた。血小板の球状化はＡＤＶＩＡ １２０でのＭＰＶおよびＭＰＣ測定に必要であるので、これが可能な限り瀉血後早くに起こることが望ましい。したがって、Ｅ／Ｃの使用は、Ｅ／Ａ、Ｅ／ＴおよびＥ／Ｄより好ましい。
実施例３−予備混合成分、低温での効果、全血液計数
材料および方法
材料：　タイロード塩溶液（ＴＳ）は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（ＣａＣｌ　２Ｈ２０　０．２６５ｇ／Ｌ、　ＭｇＣｌ　６Ｈ２Ｏ　０．２１４ｇ／Ｌ、　ＫＣ１　０．２ｇ／Ｌ、　ＮａＨ２ＣＯ２　１．０ｇ／Ｌ、　ＮａＣｌ　８．０ｇ／Ｌ、　ＮａＰ０４　０．０５ｇ／Ｌ、ブドウ糖１．０ｇ／Ｌ）からのもの、また、ヒトトロンビン（１０単位）はシグマ（Ｐｏｏｌｅ， Ｄｏｒｓｅｔ， ＵＫ）からのものである。Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商品名）コンテナ中のＫ３ＥＤＴＡおよびＣＴＡＤは、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ）（Ｃｏｗｌｅｙ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ）らのものである。後者は、遮光箱に格納し、使用の直前に取り除かれた。
抗血清
実施例１と同様。
血液試料
血液は、アスピリンまたはアスピリン含有製品を４８時間前までに摂取していない、７人の健常人（平均年齢３５歳）の肘前の静脈から採血された。
ＡＤＶＩＡ　１２０上での血小板活性の評価
全血試料は、Ｋ３ＥＤＴＡ、ＣＴＡＤまたはＫ３ＥＤＴＡとＣＴＡＤの混合物（Ｅ／Ｃ）のいずれかをＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商品名）コンテナに採取された。後者に関しては、血液は最初にＫ３ＥＤＴＡに採取され、それから直ちにＣＴＡＤを含んでいるＶａｃｕｔａｉｎｅｒへ移された。試料は雰囲気温度に保持され、瀉血直後、および３０、６０、１２０および１８０分後に分析された。血小板数（ＰＬＴ）、平均血小板量（ＭＰＶ）および平均血小板成分濃度（ＭＰＣ）の分析は、ＡＤＶＩＡ０１２０血液システム（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ， ＮＹ）を使用して行われた。ＣＴＡＤおよびＥ／Ｃで抗凝固処理された血液での血小板計数は、希釈のために補正された（それぞれ、希釈因子は１．１１および１．２５である。）。 装置は、使用前に、ＡＤＶＩＡ　ＳＥＴポイント血液比較対照試薬、およびＡＤＶＩＡ　ＯＰＴＩポイント血液比較対照試薬（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてそれぞれ較正され、標準化された。実験（ｎ ＝ ４）の１つの連続において、これらの分析は、Ｅ／Ｃで抗凝固処理された血液試料において実行されるが、血小板活性化における冷却効果を調査するために雰囲気温度および４℃で調査された。
【００６５】
発現ＣＤ６２Ｐおよび付着血小板を有する白血球（白血球血小板凝集体）のパーセンテージの測定
実施例１と同様。
【００６６】
血球計算機
実施例１と同様。白血球血小板凝集体は、ついで、横の散乱（対数関数的なスケール縦座標）およびオレンジ蛍光（対数関数的なスケール横座標）のヒストグラム（Ｃ）に、白血球がＰＬＡを形成している、これらの特徴のあるＳＬＳによって、同定のために、ゲートされることができる。
【００６７】
トロンビン活性化血小板におけるＣＴＡＤの阻害効果の調査
実験（ｎ ＝ ３）の１つの連続において、ヒトトロンビンの最適状態に及ばない濃度（予め滴定によって決定）でインキュベートされたＫ３ＥＤＴＡ抗凝固化血液において血小板活性化におけるＣＴＡＤの効果が調査された。ＣＤ６２Ｐ発現によって定まる血小板活性化の低レベルを刺激するために、トロンビンの濃度が選ばれた。トロンビン（１５μｌ）は、０．００１２のＵ／ｍｌの最終的な濃度を与えるＫ３ＥＤＴＡで抗凝固処理された血液（２１０μｌ）に加えられ、そしてＦＩＴＣ−ＣＤ６２Ｐ（２５μｌ）とともに雰囲気温度でインキュベートされた。１０分で、試料（４０のμｌ）が除去され、ＣＴＡＤ（５μｌ）が添加され、さらに２０分間インキュベートされた。比較対照血液試料は、トロンビンが添加されなかったＫ３ＥＤＴＡまたはＣＴＡＤで抗凝固処理され、そして同様に、ＦＩＴＣ−ＣＤ６２Ｐ（２５μｌ）とともに雰囲気温度でインキュベートされた。血液のアリコート（５μｌ）が、各反応管から、０、１０、２０、４０、および６０分で除去され、ＴＳ（９９５μ１）で希釈され、直ちに血球計算機によって分析された。
統計的分析
血球計算機およびＡＤＶＩＡ １２０血液システムからの結果は、対ｔ−試験を用いて、異なる時間で分析された同じ試料間の有意差を調べるために、比較された。ｐ ＜ ０．０１の多数の比較値を考慮に入れることは、重大であるとみなされた。結果はまた、手段の間の有意差を見つけるため、偏差（ＡＮＯＶＡ）の分析のために比較された。そして、ｈｏｃ Ｓｃｈｅｆｆｅ試験が多重比較のために使用された。
結果
血小板数
瀉血直後における全ての３つの抗凝血剤における血小板数に有意差はなく、そして正常の通常の範囲内であった。血小板数の有意差は、雰囲気温度（表１）で異なる抗凝血剤とともに保持された血液あるいは、Ｅ／Ｃで抗凝固された血液が４℃で保たれた場合でも１８０分にわたって、生じなかった。
【００６８】
【表１３】
2004513369.tif 000015
【００６９】
【表１４】
2004513369.tif 000016
ＭＰＶに関する値は、まず最初に全ての抗凝血剤において下がり、それから再び上がった。血液が雰囲気温度に保持された場合、全ての抗凝血剤で３０分が底であったが、Ｅ／Ｃで抗凝固された血液が４℃で保たれた場合６０分であった。雰囲気温度に保持した場合、すべての時間でのＭＰＶ値は、Ｋ３ＥＤＴＡ抗凝固化血液において、ＣＴＡＤまたはＥ／Ｃ抗凝固化血液におけるよりも有意（ｐ ＜ ０．０４）に低かった。
平均血小板成分
【００７０】
【表１５】
2004513369.tif 000017
ＭＰＶ値（上記の）の結果との正比例して、ＭＰＣ値は、まず最初に上がって、それから下がった。血液が雰囲気温度に保持された場合、全ての抗凝血剤で最大値は３０分で達し、Ｅ／Ｃで抗凝固された血液が４℃で保たれた場合６０分で達した。雰囲気温度に保持した場合、すべての時間での平均血小板成分値は、Ｋ３ＥＤＴＡ抗凝固化血液において、ＣＴＡＤ（ｐ ＜ ０．０４）またはＥ／Ｃ（ｐ ＜ ０．０２）におけるよりも有意に高かった。
血小板におけるＣＤ６２Ｐ発現
【００７１】
【表１６】
2004513369.tif 000018
瀉血直後にＣＤ６２Ｐを発現した血小板は低いパーセンテージ（Ｋ３ＥＤＴＡ， ＣＴＡＤ および Ｅ／Ｃについてそれぞれ、１．１０±０．６１％， １．２２±０．６２ および １．２８±０．８５、（平均±標準偏差））であったが、血液が雰囲気温度に保持された場合上昇した。１８０分での上昇は、Ｋ３ＥＤＴＡ抗凝固化血液（２３．０５±１．５４％）でＥ／Ｃ抗凝固化血液（８．４５５±０．７９％）より大きく、ＣＴＡＤ抗凝固化血液で最低であった（４．１４±０．７９ ％）。
１８０分でのＫ３ＥＤＴＡ抗凝固化血液におけるＣＤ６２Ｐ陽性血小板のパーセンテージは、ＣＴＡＤまたはＥ／Ｃ抗凝固化血液におけるよりも有意（ｐ ＜ ０．０１）に高かった。Ｅ／Ｃ抗凝固化血液が４℃で保持された場合、ＣＤ６２Ｐ陽性血小板のパーセンテージに関して、０分での０．５３±０．１２ ％から１８０分での １．０７±０．５７ ％ までの、最小の、有意でない増加があるのみであった。
血小板−白血球凝集体形成
【００７２】
【表１７】
2004513369.tif 000019
瀉血直後において、それがどの抗凝血剤であった関わらず、提供者からの全ての血液において見出される血小板と関連した白血球の少ないパーセンテージがあった（Ｋ３ＥＤＴＡ， ＣＴＡＤ および Ｅ／Ｃについてそれぞれ、３．５０±０．７１ ％、３．９５±．９７ ％、そして、Ｋ３ＥＤＴＡ、ＣＴＡＤおよびＥ／Ｃのそれぞれ２．８２±１．０５ ％（平均±標準偏差））。
全ての抗凝血剤において、血液が雰囲気温度で保たれるときに、血小板−白血球凝集体のパーセンテージは著しく上がった。１８０分での上昇は、ＣＴＡＤ抗凝固化血液（１８．８８±２．０６ ％）でＫ３ＥＤＴＡ抗凝固化血液（１３．５０±１．７４％）より大きく、Ｅ／Ｃ抗凝固化血液（７．８１±１．４３％）で最低であった。しかし、Ｅ／Ｃ抗凝固化血液が４℃でインキュベートされた場合、１８０分にわたり血小板−白血球凝集体のパーセンテージの最小の増加だけがあった。
トロンビン活性化血小板におけるＣＴＡＤの効果
すでに拮抗剤に遭遇した血小板によって、ＣＴＡＤが効果的に更なる反応を阻害すうかどうかを確かめるために、Ｋ３ＥＤＴＡに採取された血液が単独でインキュベートされる、または、トロンビンの最適状態に及ばない濃度とインキュベートされた。
１０分後、トロンビン刺激された血液のアリコートは、ＣＴＡＤに加えられた。血小板活性化（ＣＤ６２Ｐ発現によって観察）は、ＣＴＡＤの追加によって完全に阻止されたが、Ｋ３ＥＤＴＡのみで抗凝固化された血液においてはさらなる活性化が起き、そして、期待通り、これらの試料においてトロンビンが加えられた場合の方が、それが省略された場合よりも大きかった。
使用の前に混合された場合におけるＥＤＴＡおよびＣＴＡＤの安定性の調査
結果は、単独では血小板研究のための抗凝血剤としてＥ／ＣがＫ３ＥＤＴＡまたはＣＴＡＤより良好な抗凝固剤であろうことを今までの結果で示唆したので、２つの成分を使用前に混合する効果を調査した。血液は、１４日前または直前に調製されたＫ３ＥＤＴＡおよびＣＴＡＤの混合物中に採取され、あるいは、Ｋ３ＥＤＴＡにおいて集められ次いでＣＴＡＤと混合された（そのことは、以前に研究の全体にわたってされた）。
全てのサンプルが、その後４℃に保持された。瀉血直後にＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０で測定された基礎血液的および血小板活性化パラメータの値は、２つの抗凝固剤が先に混合されていても、採血後に混合されたかにかかわらず同様であった。さらに、値は、３、６および２４時間で分析され多場合にも、本質的に不変のままだった。免疫蛍光検査法は、白血球と凝集体において含まれる血小板のパーセンテージが２４時間にわたり全ての試料（結果を示さず）においてわずかに上がる（２４時間で＜５％の増加）ことを示した。
【００７３】
Ｋ３ＥＤＴＡ、ＣＴＡＤおよびＥ／Ｃで抗凝固処理された血液におけるＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０血液学の比較
Ｅ／Ｃで抗凝固処理された血液が、血液学パラメータの基礎的分析のために使われてもよいかどうか調査するために、Ｋ３ＥＤＴＡ、ＣＴＡＤおよびＥ／Ｃで抗凝固処理された７つの比較対照試料からＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０において得られた結果が比較された。３つの抗凝固剤で処理された血液において、白血球数（ＷＢＣ）、赤血球数（ＲＢＣ）およびヘモグロビン（ＨＧＢ）濃度の測定値に、有意差はなかった。しかしながら、
しかし、ヘマトクリット値および血小板パラメータ値は、ＥＤＴＡで抗凝固処理された血液におけるものと、ＣＴＡＤおよびＥ／Ｃで抗凝固処理された血液におけるものとでは有意（ｐ ＜ ０．０１）に差があった（表２）。
【００７４】
【表１６】
2004513369.tif 000020
議　論
データは、ＥＤＴＡ中に前記ＭＰＶが存在することを、ここに明らかに示しており、ＣＴＡＤとＥ／Ｃは、０〜３０分の間で低下したが、再び上昇した。ＥＤＴＡのための結果は、主に、ＭＰＶが光学的手順によって決定されたとする以前の研究のそれらと一致している（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ、Ｅ．Ａ、Ｒｅａｒｄｏｎ、Ｄ．Ｍ．Ｄ、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、Ｄ．、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ、Ｃ著（１９９５年）「血小板の量の通常の測定法。光拡散と開口インピーダンス技術の比較。」Ｃｌｉｎ．　Ｐｈｙｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ　６．２２１〜２３６）。
最近のレポートと一致して、ＣＴＡＤは、Ｋ３ＥＤＴＡによって血液凝固が防止される雰囲気温度に１８０分間保存された結晶分に起こるＣＤ６２Ｐの現れの増加を抑制する（Ｋｕｈｎｅほか、１９９５年；Ｍａｃｅｙほか１９９９年；Ｍｏｄｙほか、１９９９年）。さらに、Ｋ３ＥＤＴＡによって血液凝固を阻止された血液がトロンビンに刺激された場合、ＣＴＡＤの次の追加は、血小板顆粒減少抑制し、一方、血液中で起こったＣＤ６２Ｐの現れの増加はちょうどＫ３ＥＤＴＡとともに保たれた。我々は、Ｋ３ＥＤＴＡの試験管内刺激は、未処理の血液の血液凝固を阻止させ、ＣＤ６２Ｐの現れの増加は、並行してＭＰＣ（Ｍａｃｅｙほか１９９９年）の減少を伴うことを以前に証明した。現在、我々は、ＣＴＡＤやＥ／Ｃよりも前記ＭＰＣが減少する雰囲気温度において、ＥＤＴＡによって活性化血小板が生じることを確認していることを示す。ＣＴＤＡやＥ／Ｃによって血液凝固を阻止される血液のＭＰＣの価値は、１８０分以上では類似しており、Ｋ３ＥＤＴＡ中よりもかなり低かった。一緒に採取された、雰囲気温度でのＭＰＶとＭＰＣの変化の価値は、Ｅ／Ｃによって血液凝固を阻止される血液において、血小板は、（たぶん、最大限ではないにしろ）顆粒減少を経ることなく、球状にされる。これは、Ｅ／Ｃで血液凝固を阻止された血液の血小板のＣＤ６２Ｐの現れの低いレベルによって確かめられ、そして、ＣＤＴＡのみによって血液凝固を阻止される血液の血小板上のそれと同等だった。
今までのところ、なぜ、雰囲気温度において、ＣＤＴＡによって血液凝固を阻止される血液中のＣＤ６２Ｐを表している血小板のパーセンテージが、６０〜１２０分の間で僅かに減少氏なのかは明確ではないが、しかし、いくつかの活性化された血小板が、血液中の他の白血球や管壁に付着したということは、説明可能である。実際、ＣＴＡＤによって血液凝固を阻止される血液は、Ｋ３ＥＤＴＡやＥ／Ｃによって血液凝固を阻止された血液よりも、高い血小板−白血球総数を示す。その理由は、直ちに明白にはならないが、ＥＤＴＡの存在に依存しているようである。いくぶん逆説的には、ＥＤＴＡは、顆粒分泌物や集合体を減らすよりはむしろ、強化する方法における、血小板膜結合レセプターに影響を及ぼすことを示している。（Ｇｏｌａｎｓｋｉ、Ｊ．、Ｐｉｅｔｒａｃｈａ、Ｔ．、Ｂａｊ、Ｚ．、Ｇｒｅｇｅｒ、Ｊ．、Ｗａｔａｌａ、Ｃ．（１９９６年）「抗凝血剤中の分子洞察−未処理血液中での血小板の自然発生的に誘発された活性化−様々な抗凝血剤は等しくない」血栓症調査　８３、１９９〜２１６）。しかしながら、外部のＣａ２＋は、集合体のために必要であり、ＥＤＴＡが、クエン酸塩よりも優れたＣａ２＋のキレート化剤であるように、それは、これらの点において大きな抑制効果を有することができる。この説明が真実の場合、活性化された血小板が存在するが、検知されていないままであるように、ＣＴＤＡが完全にＣＤ６２Ｐの現れの増加を抑制しないかもしれない可能性がある。なぜなら、それらは、白血球に付着しているからである。これらの結果は、血小板−白血球の集合形成が、未処理の血液中において、血小板活性の研究の間、観察されなければならないことを示唆しており、更に、生体外の血小板−白血球の集合形成が抗凝血剤に依存するという事実を目立たせている。この研究の重大な発見は、血液が、Ｅ／Ｃによって血液凝固を阻止されて、４℃に保たれた場合、少なくとも１８０分の間には、血小板活性のパラメータに最小の変化しかないことであるこの発見は、臨床の研究にとって重要である。なぜなら、病室や診療所で採取されたサンプルが、分析のために研究室に到着するために、３時間は充分な時間でだからである。実際、事前の研究は、この時間が、多分問題なく６時間まで延長されるであることを示唆している。多分、細胞内のカルシウム移動度におけるＣＴＡＤの抑制効果は、微粒放出と、これに続くＰＬＡ形成を防止する。
血液が雰囲気温度に保たれた場合、ＣＴＤＡにおける血小板拮抗剤の抑制効果は、３〜４時間で消え始めることが知られており、そして、必要であれば、保存時間は、おそらく、それらの濃縮（２）Ｍｏｄｙ他、１９９９年）を増加することによって延長することができる。ここに記載されている条件（時間および温度）で、Ｅ／Ｃは、同時に顆粒減少を引き起こすことなしで、効果的に血小板を球状にし、そして、このことにより、前記ＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０においてＭＰＣの正確な測定ができる。また、生体外で血小板−白血球の集合形成を抑制するためのＥ／Ｃの能力は、この結合された抗凝血剤が、臨床研究においてこれらの相互作用の調査のために適していることを示している。実際に、Ｅ／Ｃによって血液凝固を阻止された血液サンプルにおいて、炎症性腸の患者（ｎ＝６２）の血液中には、通常のコントロール（ｎ＝２０）（３．４３±０．８２、平均±標準偏差、ｐ＝０．０３）よりも、血小板−白血球集合体（５．１６±１．４８、平均±標準偏差）がかなり多く存在する。（未発表のデータ、図３に示される実施例）。結合された抗凝血性Ｅ／Ｃは、ＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０における大多数の血液学パラメータの通常の分析に適しているように見える。しかしながら、臨床の見解から、第１のＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）中に血液を注入し、第２へそれを注ぐか、第２のＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）コンテナーの内容物を混合することは、現実的ではない。この理由のために、両方の抗凝血剤を含んでいる管が好ましい。
結論として、上記の結果は、ＣＴＤＡ／ＥＤＴＡ混合物が、生体外の血小板活性の測定と、生体外の白血球活性の測定のために重大な利点を有していることを示している。
［図面の簡単な説明］
参照は、添付の図面を伴う実施例群において行われる、ここで：
実施例１
【図１】は、全血における血小板の分析を示す。領域Ｒ１の血小板は、これらの低い前方および横の散乱特性（ヒストグラムＡ）によって識別され、そしてＣＤ４２ａの結合と関連する緑色の蛍光の分析（ヒストグラムＢ）によって確かめられた。
【図２】は、全血における血小板白血球凝集の分析を示す。白血球は、横の散乱（対数関数的なスケール縦座標）対オレンジ色蛍光におけるプロットにおいて識別される（ヒストグラムＡ）。非白血球事象がゲートされた（ヒストグラムＢ）。ＰＥ　ＣＤ４５で陽性に染色されることによって識別された白血球は、緑色の蛍光（対数関数的なスケール縦座標）およびオレンジ色蛍光（対数関数的なスケール横座標）のヒストグラムにゲートされた（ヒストグラムＣ）。緑色およびオレンジ色の双方であった事象は、血小板白血球凝集であると見なされた。
実施例３
【図３】は、全血の血小板白血球凝集の分析を示す。血液は、フィコエリトリン接合ＣＤ４５およびフルオロセインイソシアネート接合ＣＤ４２ａで染色された。白血球は、横の散乱（対数関数的なスケール縦座標）対オレンジ蛍光（対数関数的なスケール横座標）においてＰＥ　ＣＤ４５に対する陽性の染色によって同定（領域Ｒ１）され（ドットプロットＡ）、そして、緑色の蛍光（対数関数的なスケール縦座標）およびオレンジ蛍光（対数関数的なスケール横座標）のプロット線において表示された（ドットプロットＢ）。緑（ＣＤ４２ａ）およびオレンジ（ＣＤ４５）の双方である事象（領域Ｒ２）は、血小板白血球凝集とみなされた。横の散乱（対数関数的なスケール縦座標）対オレンジ蛍光（対数関数的なスケール横座標）のプロット（ドットプロットＣ）に、これらの事象をバックゲートすることは、凝集の大部分が、顆粒白血球および単球の横の光散乱特徴を有していることを示した。正常な比較対照からの血液において行われる分析の例は、上方のパネルにおいて図示され、そして炎症性腸疾患の患者からの血液において行われる分析の例は下方のパネルにおいて図示される。
［特許請求の範囲］
【請求項１】少なくとも１つの血小板球状化を行う成分と、少なくとも１つの血小板拮抗物質とを有する組成物中に懸濁された血小板の平均屈折率を測定することからなる、血小板活性の測定方法。
【請求項２】前記１ないしそれ以上の血小板拮抗物質が、
ａ）　テオフィリン、
ｂ）　アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、
ｃ）　ジピリダモール、および
ｄ）　クエン酸塩
のうちの１ないしそれ以上を含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記１ないしそれ以上の血小板拮抗物質が、
ａ）　テオフィリン、
ｂ）　アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、
ｃ）　ジピリダモール、および
ｄ）　クエン酸塩
のうちの２ないしそれ以上を含むものである請求項１に記載の方法。
【請求項４】前記１ないしそれ以上の血小板拮抗物質が、
ａ）　テオフィリン、
ｂ）　アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、
ｃ）　ジピリダモール、および
ｄ）　クエン酸塩
のうちの３ないしそれ以上を含むものである請求項３に記載の方法。
【請求項５】前記１ないしそれ以上の血小板拮抗物質が、
ａ）　テオフィリン、
ｂ）　アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、
ｃ）　ジピリダモール、および
ｄ）　クエン酸塩
を含むものである請求項４に記載の方法。
【請求項６】前記１ないしそれ以上の血小板球状化を行う成分が、キレート剤を含むものである請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】前記キレート剤が、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの一方または双方である請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記組成物がＥＤＴＡとＣＴＡＤの混合物を有するものである請求項１ないし７のいずれか１つに記載の血小板活性の測定方法。
【請求項９】平均屈折率が、入射光ビームに対して２つの異なる角度で光散乱を計測することにより測定されるものである請求項１ないし８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】前記２つの異なる角度が、入射光ビームの方向に対して２〜３°の角度と５〜１５°の角度である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】前記屈折率測定が、瀉血後３０〜６０分の時間に行われるものである請求項１ないし１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】瀉血と測定との間、抗凝固化血液試料が０℃〜１０℃の温度に保持されるものである請求項１ないし１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】１ないしそれ以上の血小板球状化を行う成分と、２ないしそれ以上の血小板拮抗物質とを有する血液抗凝固組成物であって、前記２ないしそれ以上の血小板拮抗物質が、
ａ）　テオフィリン、
ｂ）　アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、
ｃ）　ジピリダモール、および
ｄ）　クエン酸塩
のうちの２ないしそれ以上を含むものである血液抗凝固組成物。
【請求項１４】前記２ないしそれ以上の血小板拮抗物質が、
ａ）　テオフィリン、
ｂ）　アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、
ｃ）　ジピリダモール、および
ｄ）　クエン酸塩
のうちの３ないしそれ以上を含むものである請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】前記２ないしそれ以上の血小板拮抗物質が、
ａ）　テオフィリン、
ｂ）　アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、
ｃ）　ジピリダモール、および
ｄ）　クエン酸塩
を含むものである請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】前記１ないしそれ以上の血小板球状化を行う成分がキレート剤を含むものである請求項１３ないし１５に記載の組成物。
【請求項１７】前記キレート剤が、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの一方または双方である請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】ＥＤＴＡとＣＴＡＤの混合物を有するものである請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】瀉血と血小板活性の測定との間に血液試料を抗凝固状態に保持するための、請求項１３ないし１８のいずれか１つに記載の血液抗凝固組成物の使用。
【請求項２０】請求項１３ないし１８のいずれか１つに記載の血液抗凝固組成物中に懸濁された白血球の白血球活性化指標を計測することからなる、白血球活性を測定する方法。
［発明の詳細な説明］
本発明は、血小板活性の測定に関し、特に、いわゆる「平均血小板成分（ｍｅａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」を測定することにより行われる、このような測定に関するものである。
【００７５】
複数の研究は、血小板活性の指標の測定が、血栓性およびその他の疾患からの危険性から患者を臨床的に評価するにおいて、利点を提供するであろうことを示唆している（Ｍａｃｅｙ， Ｍ． Ｇ．， Ｃａｒｔｙ， Ｅ．， Ｗｅｂｂ， Ｌ．， Ｃｈａｐｍａｎ， Ｅ． Ｓ．， Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ Ｄ．， Ｏｋｒｏｎｇｌｙ， Ｄ．， Ｒａｍｐｔｏｎ， Ｄ． Ｓ．， Ｎｅｗｌａｎｄ， Ａ． Ｃ． （１９９９） ”Ｕｓｅ ｏｆ ｍｅａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｔｏ ｍｅａｓｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ＡＤＶＩＡ １２０ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍ” Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， ３８，２５０−２５５．； Ｍｏｄｙ， Ｍ．， Ｌａｚａｒｕｓ， Ａ． Ｈ．， Ｓｅｍｐｌｅ， Ｊ． Ｗ． Ｆｒｅｅｄｍａｎ， Ｊ． （１９９９） ”Ｐｒｅ−ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ： ｃｈｏｉｃｅ ｏｆ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ．” Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ９， １４７−１５４）。
【００７６】
平均血小板成分（”ＭＰＣ”）は、バイエル　アクチエンゲゼルシヤフト（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）によって製造された、一般的に用いられているＡＤＶＩＡ　１２０ＴＭ　ヘマトロジーシステム（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍ）のような、標準的研究室用血液学分析機によって測定することができるパラメーターである。ＭＰＣは血小板の平均屈折率の尺度であり、そして血小板活性の尺度としてのその値は、上記に言及したマーシー（Ｍａｃｅｙ）らの論文において既に提唱されている。ウシ　トロンビンによる全血中の正常血小板の生体外刺激は、ＣＤ６２Ｐ（活性の尺度である）の増大した血小板発現、およびＭＰＣにおける夾雑物減少を導く、活性化という結果となる。この応答は、投薬量および時間依存性である。
【００７７】
ＡＤＶＩＡ　１２０　ヘマトロジーシステムは、レーザーダイオード、フローセルおよび検出器部品群からなるレーザー光学作業台を有している。レーザーダイオードは、前記フローセル上へと集束された単色光を形成するために用いられるものである。光のミー散乱理論によると、均一均質球体によってある特定の角度で散乱された単色光の強度は、その容積および該球体とこの球体が懸濁された媒体との間の平均屈折率（ＲＩ）の差にのみ依存するものである。このことは、２つの未知数、容積およびＲＩ、のみの関数である、与えられた角度間隔内での単色散乱光の強度に関する方程式を与える。２つの適当な異なる角の間隔で光散乱を測定することで、光が数値的に解き得る２つの未知数を有する２つの式を得ることができる。これが、ＡＤＶＩＡ　１２０　ヘマトロジーシステムの赤血球および血小板測定値の基礎である（Ｔｙｃｋｏ， Ｄ． Ｈ．， Ｍｅｔｚ， Ｍ． Ｈ．， Ｅｐｓｔｅｉｎ， Ｅ． Ａ．， Ｇｒｉｎｂａｕｍ， Ａ． （１９８５）”Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｒｅｄ ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ ａｎｄ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．”Ａｐｐｌｉｅｄ Ｏｐｔｉｃｓ， ２４，１３５５−１３６０； Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ， Ｄ．， Ｃｏｌｅｌｌａ， Ｇ． Ｍ．， Ｈｅｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎ， Ｅ． Ｊ．， Ｃｈａｐｍａｎ， Ｓ． Ｅ．， Ｐａｓｅｌｔｉｎｅｒ， Ｌ． （１９９８）”Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｕｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ．”ＵＳ−Ａ− ８１７，５１９； Ｋｕｎｉｃｋａ， Ｊ． Ｅ．， Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｇ．， Ｍｕｒｐｈｙ， Ｊ． ａｎｄ Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ， Ｄ． （２０００）”Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｌａｓｅｒ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒ．”Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ １１４，２８３２８９）。
【００７８】
ＡＤＶＩＡ　１２０はまた、細胞１つごとに基づく、血小板の量およびＲＩを測定する。それらが光学フローセルを通過する際に、血小板はフォトダイオードによって発されるモノクロの６７５±１０ｎｍレーザー光の入射光を遮断する。システムは、２〜３°および５〜１５°の範囲において散乱する光の強度を計測する。この一対の散乱光強度値は、均一な球形の分子のためのミー散乱理論に基づくルックアップ表を参照することで分子量およびＲＩ値に変換される。ＲＩからの水（１．３３３）の屈折率を減じ、平均屈折率増加（０．００１８ｄＬ／ｇ）によって、差を割ることによって、血小板ＲＩ値は、平均血小板成分（Ｍｅａｎ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ：　ＭＰＣ）濃度に変換される（Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。この定数は、血小板の主な構成要素、すなわちタンパク質、脂質および炭水化物に関する加重平均屈折率増加から導き出される（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ， Ｓ． Ｈ．， Ｂｕｄｋａ， Ｍ． Ｊ． Ｅ．， Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｋ． Ｃ．， Ｈａｓｓｏｎ， Ｍ． １９４７） ”Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｓｅｒｕｍ ａｎｄ ｐｌａｓｍａ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｔｈｅ ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｃｅｒｔａｉｎ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｏｃｉｅｔｙ， ６９，１７４７−１７５３； Ｂａｒｅｒ， Ｒ．， Ｊｏｓｅｐｈ， Ｓ． （１９５４） ”Ｒｅｆｒａｃｔｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ．”Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ９５，３９９−４２３； Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。最近の証拠も、血小板密度（分散勾配によって分離された）（Ｃｏｒａｓｈ， Ｌ．， Ｔａｎ， Ｈ．， Ｇｒａｌｎｉｃｋ， Ｈ． （１９９７）”Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｕｂ−ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ． Ｉ． Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｂｕｏｙａｎｔ ｄｅｎｓｉｔｙ， ｃｅｌｌ ｖｏｌｕｍｅ， ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．”Ｂｌｏｏｄ， ４９，７１−８７）とＭＰＣ （Ｃｈａｐｍａｎ， Ｅ． Ｓ．， Ｌｅｒｅａ， Ｋ． Ｍ．， Ｋｉｒｋ， Ｒ．， Ｓｏｒｅｔｔｅ， Ｍ． Ｐ．， Ｓａｎｊａｙ， Ｎ． Ｓ．， Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ， Ｄ． （１９９８） ”Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｅｘ ｖｉｖｏ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ： ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｌｐｈａ ｇｒａｎｕｌｅ ｒｅｌｅａｓｅ， ｄｅｎｓｉｔｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ， ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｄｈｅｓｉｏｎ ａｎｄ ｍｅａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ （ＭＰＣ）．”Ｂｌｏｏｄ， ９２， Ｓｕｐｐｌ． １，６８Ｂ， Ａｂｓｔｒａｃｔ ３２７３）との間の正比例関係を示している。
【００７９】
平均血小板質量（ＭＰＭ、ｐｇ）は平均ＰＶ（ＭＰＶ）およびＭＰＣから算出される。各パラメータに関する平均値が表にされると共に、個々の血小板に関するデータが細胞所見おいて提示される（（Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ， Ｄ．， Ｃｏｌｅｌｌａ， Ｇ． Ｍ．， Ｈｅｔｈｅｒｉｎｇｔｏｎ， Ｅ． Ｊ．， Ｃｈａｐｍａｎ， Ｅ． Ｓ．， Ｐａｓｅｌｔｉｎｅｒ， Ｌ． （１９９８）”Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｎｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｕｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ｓａｍｐｌｅｓ”．　ＵＳ−Ａ５８１７５１９）。
【００８０】
静脈切開においてすみやかにないしは直後に、血小板活性化が起こり、そして血小板のこの特徴は生体外分析を困難とする。しかしながら、この生体外での活性化の程度は、血液が採取されたところに添加される抗凝固剤に依存する（（Ｋｕｈｎｅ， Ｔ．， Ｈｏｒｎｓｔｅｉｎ， Ａ．， Ｓｅｍｐｌｅ， Ｊ．， Ｃｈａｎｇ， Ｗ．， Ｂｌａｎｃｈｅｔｔｅ， Ｖ．， Ｆｒｅｅｄｍａｎ， Ｊ． （１９９５）”Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎｔｏ ＥＤＴＡ ｖｓ． Ｄｉａｔｕｂｅ Ｈ， ａ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ， ａｄｅｎｏｓｉｎｅ， ａｎｄ ｄｉｐｙｒｉｄａｍｏｌｅ．”Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ５０， ４０−４５）。単純化および経済的理由のため、理想的な抗凝血剤は、血小板活性化における情報を全血プロフィールの一部として得ることを可能としたものであろう。
【００８１】
その有効性および調製の容易さという点から、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）がその液状三カリウム塩の形態で、抗凝固剤として一般的に用いられている（Ｐｅｒｒｏｔｔａ， Ｇ．， Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｌ．， Ｇｌａｚｉｅｒ， Ｊ．， Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ， Ｈ． Ｒ． （１９９８）”Ｕｓｅ ｏｆ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ｆｏｒ ｒｏｕｔｉｎｅ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｎ ｔｈｅ ＣＥＬＬ−ＤＹＮＯ ４０００ ： Ａｎ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．”Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ４， １５６−１６２）。それは、また、その細胞保存特性ゆえに全血球計数および白血球分画のための好適な抗凝血剤であって、臨床研究所規格委員会によってこれらの目的の上で推薦されている抗凝血剤である（ＮＣＣＬＳ； ｓｔａｎｄａｒｄ Ｈ１−Ａ４）。
【００８２】
生体外での血小板活性化を観察する場合、主な必要条件は、自発的な血小板活性化を最小にする静脈穿刺手順を使用すること、およびサンプルが分析されることができるまで、凝固を防止するのみならず、血小板の活性化状況をも保存し得る媒体に、血液を採集することである （Ｇｅｏｒｇｅ ＪＮ， Ｔｈｉｏ ＬＬ， Ｍｏｒｇａｎ ＲＫ （１９８１）”Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ；ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｗａｓｈｉｎｇ ａｎｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｄｅｎｓｉｔｙ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．” Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２３，６９−７７； Ｈａｗｉｇｅｒ Ｊ （１９８９）”Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐａｔｈｗａｙｓ： ａｎ ｏｖｅｒｖｉｅｗ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １６９，１９１１９５； Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ ＡＤ （１９９６）”Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ： ａ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｅｓｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａ ｒｅｖｉｅｗ．”Ｂｌｏｏｄ ８７，４９２５−４９３６； Ｗｕ ＫＫ （１９９４） ”Ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｒｔｅｒｉａｌ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．”Ｌａｎｃｅｔ ３４４，９９１９９５）。
【００８３】
血小板調査に関して、ＥＤＴＡは、これが、時間とともに増加する、血小板の膨張および自己活性化を起すものであるゆえに好ましくない （Ｋｕｈｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５； Ｊａｃｋｓｏｎ， Ｓ． Ｒ．， ＆ Ｃａｒｔｅｒ， Ｊ． Ｍ． （１９９３） ”Ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅ：
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．”Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ７，１０４−１１３； ＭｃＳｈｉｎｅ， Ｒ． Ｌ．， Ｄａｓ， Ｆ． Ｐ． Ｃ．， Ｓｉｂｌｉｎｇａ， Ｃ． Ｓ．， Ｂｒｏｚｏｖｉｃ， Ｂ． （１９９０）”Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＥＤＴＡ ａｎｄ ｃｉｔｒａｔｅ ａｎｔｉ−ｃｏａｇｕｌａｎｔｓ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｕｎｔ ａｎｄ ｍｅａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅ．”Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ， １２，２７７−２８５； Ｐｉｄａｒｄ， Ｄ．， Ｄｉｄｒｙ， Ｄ．， Ｋｕｎｉｃｋｉ， Ｔ． Ｊ．， Ｎｕｒｄｅｎ， Ａ． Ｔ． （１９８６） ”Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＥＤＴＡ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ＩＩｂ／ＩＩＩａ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｇｇｒｅｇａｂｉｌｉｔｙ．”Ｂｌｏｏｄ， ６７，６０４−６１１）。血小板の漸進的な膨張は、ＥＤＴＡによって引き起こされる原形質膜の変容によるものであり、そして、光学密度の低下および平均血小板量（ＭＰＶ）の増大をもたらす。光学密度における低下は、ＡＤＶＩＡ　１２０　システム（Ｂａｙｅｒ ＡＧ）において、平均血小板成分（ＭＰＣ）における変化として観察され得る（Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ＥＤＴＡはまた、血小板本来のつきの楕円状の形から球形のものへと血小板の形態を変容させる。血小板形状変化は、走査型電子顕微鏡のような形態学的方法、あるいは血小板凝集計において起こる光学密度の増加を見ることによって測定できる急速な反応である。光学的技術は、ＡＤＰによって誘発された形状変化が、２．５秒で半最大光学密度変化に達することを示している。血小板形状変化は、通常の円盤状の形（直径２〜４μｍおよび厚さ約０．５μｍ）形から、多くの長い、薄い糸状偽足を有しているとげ状の球への形態的変化によって特徴づけられる。この形状変化は、前記抗凝血剤への露曝直後に始まり、２時間以内に最大となる（Ｊａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ， １９９３）。
これらの変化は、ＡＤＶＩＡ　１２０によって３０分後に検出可能である。さらに、ある個体からの血液がＥＤＴＡで血液凝固を阻止された場合、血小板は凝集して、記録されるべき明白な血小板減少症を引き起す（Ｏｋａｄａ Ｔ （１９９９）”ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｒｉＷ ｐｒｏｂｌｅｍｓ ｏｆ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｓｅｒｓ．”Ｓｙｓｍｅｘ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ９，５２−５７）。
【００８４】
このため、血小板研究に関して、クエン酸三ナトリウムが、血小板研究のために選択される抗凝血剤として確立されている （Ｐｅｒｒｏｔｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
クエン酸含有抗凝血剤は、ＥＤＴＡより低いＭＰＶを引き起こすこと、そして、通常の円盤状の形態の保存により部分的に説明される形質が証明されている（Ｊａｃｋｓｏｎ ａｎｄ Ｃａｒｔｅｒ， １９９３）。血液がクエン酸塩中に採集された場合、初期においては血小板形状および量にほとんどあるいは全く変化がない。しかしながら、クエン酸塩において、血小板はゆっくりと球形状となり（Ｍａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９）、そしてＥＤＴＡにおける場合と同様に、１〜２時間かけて漸進的に膨張する（クエン酸ナトリウムの濃度に依存するインピーダンス法での容積における３〜１０％の増加（Ｂａｔｈ， ＰＷＭ （１９９３）”Ｔｈｅ ｒｏｕｔｉｎｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｉｚｅ ｕｓｉｎｇ ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ ａｌｏｎｅ ａｓ ｔｈｅ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ．”Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ７０，６８７−６９０； Ｔｈｒｅａｔｔｅ ＧＡ， Ａｄｒａｄｏｓ Ｃ， Ｅｂｂｅ Ｓ， Ｂｒｅｅｃｈｅｒ Ｇ． （１９８４）”Ｍｅａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅ．
Ｔｈｅ ｎｅｅｄ ｆｏｒ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ．”Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． ８１：
７６９７２））。これらの理由から、クエン酸塩は元々血小板量の測定に役立たないと考えられていた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＣＢ， Ｄｉａｚ ＤＤ， Ｑｕｉｎｎ ＰＧ， Ｌａｐｉｎｓ Ｍ， Ｋｕｒｔｚ ＳＲ， Ｖａｌｅｒｉ ＣＲ． （１９８３）．”Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅｓ．” Ａｍ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐａｔｈｏｌ １８０：３２７−３２）。
【００８５】
クエン酸塩を主成分とする抗凝血剤が、ＡＤＶＩＡ　１２０における血小板パラメータの測定のために用いられている （Ｍａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９； Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。しかしながら、ＭＰＣの標準偏差（血小板構成成分分布幅（ＰＣＤＷ）として記録される）は、ＥＤＴＡにおけるよりクエン酸塩における方が最初は大きい。これは、円盤状の血小板の光散乱特性は、球状の場合とは異なり、これらの配向性に依存するためである（Ｍａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９９９；　Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。以前の研究において、クエン酸ナトリウム（Ｍａｕｒｅｒ−Ｓｐｕｒｅｊ， Ｅ．， Ｐｆｉｅｆｅｒ， Ｇ． Ｍａｕｒｅｒ， Ｎ．， Ｌｉｎｄｅｒ， Ｈ．， Ｇｌａｔｔｅｒ， Ｏ．， Ｄｅｖｉｎｅ， Ｄ． Ｖ． （２００１） ，”Ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｃｔｉｖａｔｅｓ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ”． Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ８１，５８１−５９２）または酸性クエン酸ブドウ糖（ＡＣＤ）（Ｏｌｉｖｅｒ， Ａ． Ｅ．， Ｔａｂｌｉｎ， Ｆ．， Ｗａｌｋｅｒ， Ｎ． Ｊ．， Ｃｒｏｗｅ， Ｊ． Ｈ． （１９９９）”Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃａｌｃｉｕｍ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｃｈｉｌｌｉｎｇ”． Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １４１６，３４９−３６０）のいずれかによって抗凝固化された血液がそれぞれ２０℃および５℃に冷却された場合、該血小板は、偽足を有する活性化された球状であることが見出されている。我々は、４℃でインキュベートされたクエン酸ナトリウムで抗凝固化された血液において、血小板におけるＣＤ６２Ｐ発現において時間依存性で増加すること、およびＰＬＡ形成の顕著な増加があることを示した（未発表のデータ）。
【００８６】
ＡＢＯＴＴ ＣＥＬＬ−ＤＹＮ ４０００（商標名）血液システムを使用した予備的研究は、更正が異なる希薄因子を考慮するために実行されると仮定するならば、クエン酸塩は、基礎的な全血球計数のために、ＥＤＴＡの代わりに用いられることができることを示している。
【００８７】
オ　マレイら（Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．） （”Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅ ｕｓｉｎｇ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉｐｌａｔｅｌｅｔ ｍｉｘｔｕｒｅｓ”， Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ７ （４）， １９９６，４３１−４３６）は、平均血小板量を測定するためにＥＤＴＡおよびテオフィリンを含んでいる抗凝血剤が用いられることを開示している。
【００８８】
Ｄｉａｔｕｂｅ−Ｈ（商品名）という市販名を付けられた比較的新しい抗凝血剤が、血小板活性化を阻止し、そして血漿ヘパリン値および活性化された血小板から放出される血小板因子４およびβ−トロンボグロブリンを計測するために用いられている（Ｋｕｈｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。Ｄｉａｔｕｂｅ−Ｈ（商品名）の主な構成成分は、クエン酸塩、テオフィリン、アデノシンおよびジピリダモールであり、そして、それは非公式にＣＴＡＤと呼ばれる。テオフィリンおよびジピリダモールは、血小板サイクリックＡＭＰの増加および血小板活性を導く、ホスホジエステラーゼ活性を阻止することを示した。アデノシンも、トロンビンによって誘発された血小板凝集および細胞内でのカルシウムの放出を阻止する（Ｋｕｈｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。ジピリダモールは光過敏性であるという欠点を有しており、従ってＣＴＡＤ抗凝固剤を収容した管体は適当に格納されなければならない。ミー理論を適用するため、および細胞１つづつを基準とする正確な容積およびＭＰＣ量を得るために、ＥＤＴＡ中の血小板は均質な球状に近づく（Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。しかしながら、ＥＤＴＡの血小板活性化特性ゆえに、患者の血小板活性化状態を測定するために用いる抗凝固剤としてはきわめて不適当であると一般的に考えられている。
【００８９】
好中球活性の測定は、臨床においてまた重要である。全部の血液凝固を阻止された血液において静脈切開直後の抗凝固処理全血において分析された場合、好中球は活性化（例えば、ＣＤ１１ｂ発現に関するこれらの値による）の証拠をほとんどないしは全く示さない。あいにく、ＥＤＴＡおよびクエン酸塩は、血漿のＣａ２＋濃度を減少させ、従ってＣａ２＋依存性エピトープ（例えばＣＤ１１ｂ）の抗原性に影響を及ぼす。別の試薬として、全血の保存のために推奨されている、Ｃｙｔｏ−Ｃｈｅｘ（商品名）（Ｓｔｒｅｃｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国ネブラスカ州オマハ）は、リンパ球および好中球における抗原発現を安定化させるが、しかし血小板におけるそれの影響はまだほとんど知られていない。
【００９０】
我々は、驚くべきことに、このような適用に不適であると一般的に考えられていたＥＤＴＡおよび同様の抗凝固剤が、例えば、ＣＴＡＤにおいて用いられていたもの、のような適当な血小板拮抗剤と共に用いられたとすれば、血小板活性化の研究に用いられ得るものであることを見出したものである。
【００９１】
我々は、また、このような混合物で抗凝固処理された血液を低温で保つことは、雰囲気温度で試料を保持した場合と比較して、かなりの時間にわたり血小板活性化を低減することができるということを発見した。
【００９２】
更に、我々はこのような混合物が、抗凝固処理された血液における好中球活性化を効果的に阻止するということを発見した。
【００９３】
従って、本発明は、血小板球状化（たとえば、キレート試薬（例えばＥＤＴＡまたは ［エチレン−ビス（オキシエチレンニトリロ）］四酢酸（ＥＧＴＡ））をもたらす成分と、血小板拮抗剤とを有する血液抗凝固剤を提供するものである。
【００９４】
血小板球状化をもたらす成分および血小板拮抗剤は、血液試料に添加する前に混合されるか、成分の１つを血液試料に添加後に混合されることができる。
【００９５】
血小板拮抗剤は、好ましくは、クエン酸塩、テオフィリン、アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、並びにジピリダモールの２ないしそれ以上、より好ましくは、３ないしそれ以上、特に好ましくは、クエン酸塩、テオフィリン、アデノシンおよび／または２−クロロアデノシン、並びにジピリダモールのすべてを含む。クエン酸塩、テオフィリン、アデノシン、並びにジピリダモールの好ましい濃度は、概して、コンタントら（Ｃｏｎｔａｎｔ ｅｔ ａｌ） （Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１： ｐｐ３６５−３７４，１９８３）の論文に述べられたようなものであり、そして特に、次の範囲：
テオフィリン　７．５〜２２．２ ｍＭ、
アデノシン　０． ０１ｍＭ〜３．７ｍＭ、
ジピリダモール　０．００１−２ｍＭ、好ましくは約０．０２ｍＭ、
クエン酸塩　０．１ Ｍ〜０．２５８ Ｍ、好ましくは約０．１１Ｍ
である。
【００９６】
該組成物のｐＨは、好ましくは、４．５〜６．４、特に約５．０である。
【００９７】
血小板拮抗剤は、好ましくはキレート試薬を含有することができる。キレート試薬は、好ましくはＥＤＴＡおよびＥＧＴＡの一方または双方を含むものである。
【００９８】
血液抗凝固剤蘇生物は好ましくは、ＥＤＴＡおよびＣＴＡＤを有するものである。
【００９９】
本発明はまた、少なくとも１つの血小板球状化を行う成分と、少なくとも１つの血小板拮抗物質とを有する組成物中に懸濁された血小板の平均屈折率を測定することからなる、血小板活性の測定方法を提供するものである。
【０１００】
屈折率を介してのＭＰＣの測定方法は、本質的は周知であり、例えば、前記したマーシーら（Ｍａｃｅｙ ｅｔ ａｌ．）の１９９９年の論文、ならびにその他の文献においておいて述べられている。屈折率測定は、２つの異なる角度、より好ましくは２〜３°の角度と５〜１５°の角度で、光散乱を測定することにより好ましく行われる。
【０１０１】
本発明の方法において、屈折率測定は好ましくは、瀉血後３０〜６０分の時間に行われるもの行われるものである。
【０１０２】
本発明の方法において、好ましくは、瀉血と測定との間、抗凝固化血液試料が０℃〜１０℃の温度に保持されるものである。抗凝固化血液試料がこの温度範囲に保持された場合、屈折率測定は、瀉血後６時間まで、好ましくは瀉血後３時間まで行うことができる。
【０１０３】
本発明はまた、本明細書において述べるような血液抗凝固組成物の、瀉血と血小板活性の測定との間に血液試料を抗凝固状態に保持するための使用を提供するものである。
【０１０４】
本発明はさらに、少なくとも１つの血小板球状化を行う成分と、少なくとも１つの血小板拮抗物質とを有する本明細書において述べたような組成物中に懸濁された白血球の白血球活性化指標を計測することからなる、白血球活性を測定する方法を提供するものである。
【０１０５】
本発明の好適な実施態様は、以下の実施例群に記載されている。
【０１０６】
【実施例】
実施例１：
ＥＤＴＡおよびＣＴＡＤを用いたＥ／Ｃの比較
材料および方法
材料：　タイロード塩溶液（ＴＳ）は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（ＣａＣｌ　２Ｈ２０　０．２６５ｇ／Ｌ、　ＭｇＣｌ　６Ｈ２Ｏ　０．２１４ｇ／Ｌ、　ＫＣ１　０．２ｇ／Ｌ、　ＮａＨ２ＣＯ２　１．０ｇ／Ｌ、　ＮａＣｌ　８．０ｇ／Ｌ、　ＮａＰ０４　０．０５ｇ／Ｌ、ブドウ糖１．０ｇ／Ｌ）からのものである。Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商品名）コンテナ中のＥＤＴＡおよびＣＴＡＤは、ベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）からのものである。後者は、遮光箱に格納し、使用の直前に取り除かれた。
【０１０７】
抗血清：　ＩｇＧｌ−ＦＩＴＣ、ＩｇＧｌ−ＰＥ、ＣＤ６２Ｐ−ＦＩＴＣおよびＣＤ４５−ＲＰＥは、イムノテック（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ）からのものである。マウスＩｇＧ２ａ−ＦＩＴＣおよびＣＤ４２ａ−ＦＩＴＣはベクトンディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）からのものである。
【０１０８】
血液試料：　正常血液試料（ｎ＝６）。平均年齢３５歳、男４人、女２人。
【０１０９】
ＡＤＶＩＡ　１２０上での血小板活性の評価：　全血試料は、ＥＤＴＡ、ＣＴＡＤ、またはＥＤＴＡおよびＣＴＡＤの混合物（Ｅ／Ｃ）のいずれかを入れたＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商品名）コンテナ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に採取された。試料は、瀉血直後、および３０、６０、１２０および１８０分の時間間隔で分析された。、血小板数（ＰＬＴ）、平均血小板量（ＭＰＶ）、平均血小板成分（ＭＰＣ）および平均血小板成分幅（ＰＣＤＷ）の分析は、ＡＤＶＩＡ　ＴＥＳＴポイント血液比較対照試薬（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州テリータウン）を用いて予め較正されたＡＤＶＩＡ　１２０血液システム（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニューヨーク州テリータウン）を使用して実行された。
【０１１０】
発現ＣＤ６２Ｐおよび白血球血小板凝集体（ＰＬＡ）の数の測定：　抗凝固処理された血液（５μｌ）は、９０μｌのＴＳ中の、ＦＩＴＣ　ＣＤ６２Ｐ（５μ１）またはＦＩＴＣイソタイプ比較対照（５μｌ）、あるいは、ＰＥ　ＣＤ４５（５μ１）およびＦＩＴＣ　イソタイプ比較対照（５μｌ）またはＦＩＴＣ　ＣＤ４２ａ（５μ１）およびＰＥ　ＣＤ４５（５μ１）で、室温にて５分間インキュベートされた。試料はＴＳを用いて１ｍｌまで希釈され、直ちに血球計算機（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）にて分析された。。
【０１１１】
血球計算機：血液細胞は、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）ソフトウェアを有するＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国オックスフォード）において分析された。この血球計算機は、使用前に、蛍光クロム標識ビーズ（Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅｓ（商品名）、Ｄａｋｏ）を用いて較正されていた。
【０１１２】
ＣＤ４２ａの分析に関して、発現データは、前方光散乱（ＦＬＳ）対数関数的スケール（縦座標）および、横光拡散（ＳＬＳ）対数関数的スケール（横座標）の二重のパラメータヒストグラムにおいて設定された第１ゲートにおいて、リアルタイムに得られた。これは、血液内での血小板の識別を容易にして、ＣＤ４２ａ発現（図１）の分析によって確かめられた。バックグラウンド蛍光は、ＦＩＴＣ接合イソタイプ比較対照抗体で標識された血小板を用いて評価された。カーソルは頻度（縦座標）および緑色蛍光強度（横座標）の単一パラメータヒストグラムにセットされ、血小板の１％未満しか比較対照抗体で陽性に染色されないようにされた。ＣＤ６２Ｐ発現における変化（緑色蛍光対数関数的スケール）は、ＦＬＳおよびＳＬＳのそれらを一緒にし、ゲートされた血小板において記録された。
【０１１３】
血小板−白血球凝集（図２）の分析に関して、細胞は、横の散乱（対数関数的なスケール縦座標）およびオレンジ色蛍光（対数関数的なスケール横座標）のヒストグラムにおいて分析された。ＰＥ　ＣＤ４５での陽性の染色によって識別される白血球は、緑色蛍光（対数関数的なスケール縦座標）およびオレンジ色蛍光（対数関数的なスケール横座標）のヒストグラムへとゲートされた。緑色およびオレンジ色の双方であった事象は、血小板白血球凝集とみなされ、そして、合計１０，０００のゲート化白血球のパーセンテージとして記録された。
【０１１４】
統計の分析：血小板ＣＤ６２Ｐ発現、血小板−白血球凝集、およびＭＰＣは、末端ｐ値を用いたパラメータの統計（学生の対ｔ−試験）を使用して比較された。
結果
ＣＤ６２Ｐ陽性の血小板のパーセンテージ
【０１１５】
【表１】
2004513369.tif 000021
６人の検体におけるＣＤ６２Ｐ陽性の血小板のパーセンテージは、０分においては低いものであった　（１．１０±０．２４％、平均±標準誤差）。１８０時間では、ＣＤ６２Ｐ陽性の血小板のパーセンテージは、３つの全ての抗凝血剤（ｐ＜　０．０２）において顕著に上昇したが、ＥＤＴＡにおいてはより大きいものとなった（２３．０５±２．７９％）。ＣＴＡＤ抗凝固化血液において、最小の活性化が観測された（４．１４±０．６１％）、一方、Ｅ／Ｃ抗凝固化血液は中間の血小板活性化（８．４５±０．７９％）を有していた。６０分後における、ＥＤＴＡ抗凝固化血液中でのＣＤ６２Ｐの発現は、ＣＴＡＤ抗凝固化血液中でのものより、顕著に高い（ｐ＜　０．０１）ものであった。
【０１１６】
血小板−白血球凝集体形成
【０１１７】
【表２】
2004513369.tif 000022
０秒での血小板−白血球凝集体（ＰＬＡ）は、全ての検体において検知でき、そしてこれらは、Ｅ／Ｃ抗凝固化血液におけるもの（２．８２±０．６７％）よりも、ＥＤＴＡ抗凝固化血液中（３．５０±０．５０％、平均±標準偏差）およびＣＴＡＤ抗凝固化血液中（３．９５±０．７３％）のものがより多い数存在していた。ＣＴＡＤ抗凝固化血液中のＰＬＡのパーセンテージは、１８０秒で増加し（１８．８８±３．３８％）、そして、これは、ＥＤＴＡ中（１３．５０±２．４１％、ｐ＜０．０５）およびＥ／Ｃ（７．８１±１．５２％、ｐ＜０．０２）に採取された血液中で検出された数よりも顕著に多いものであった。
【０１１８】
血小板数（ＰＬＴ）
【０１１９】
【表３】
2004513369.tif 000023
検体に関するＥＤＴＡ抗凝固化血液の全血小板数は、平均±標準偏差が２３５±１２を有して、正常な範囲にあった。１８０分にわたり、血小板数における顕著な変化は認められなかった。希釈のために補正された際、ＥＤＴＡおよびＥ／Ｃで抗凝固化された血液中において、血小板が数えられた。（それぞれ、希釈因子＝１．１１および１．２５）が、ＥＤＴＡ抗凝固化血液におけるそれらと同様に見出された。
【０１２０】
平均血小板量（ＭＰＶ）
【０１２１】
【表４】
2004513369.tif 000024
３つの異なる抗凝固剤のそれぞれにおいて０分から３０分間の間において、ＭＰＶ値が低下した。このことは、血小板球化はこの期間の間に起こるゆえ、瀉血後３０分以内でのＡＤＶＩＡ１２０での全血中の血小板測定は安定でないということを反映している。ＭＰＶは、３０ないし６０分間の間に最も安定していて、それから全ての３つの抗凝血剤において少ない量づつ１８０分間まで増加した。Ｅ／Ｃ抗凝固化血液における血小板量は、９．０±０．２４ｆＬから９．２±０．２８ｆＬ（平均±標準偏差）に、ＥＤＴＡにおいては８．０±０．３７ｆＬから８．１±０．２１ｆＬ、そしてＣＴＡＤにおいては９．１±０．２４ｆＬから９．２±０．２０ｆＬにそれぞれ増加した。
【０１２２】
平均血小板成分（ＭＰＣ）
【０１２３】
【表５】
2004513369.tif 000025
ＥＤＴＡは最も高いＭＰＣ値を引き起こした、そして、１８０分にわたるＭＰＣの減少はまた、この抗凝血剤を有する血液において最も大きかった（２８．０±０．８７ｇ／ｄｌから２７．１±０．３６ｇ／ｄｌ、平均±標準偏差）。
【０１２４】
最も低いＭＰＣ値は、Ｅ／Ｃ抗凝固化血液において、各時間間隔で観測された。
ＣＴＡＤ抗凝固化血液において、０分から１８０分の間、平均ＭＰＣの変化がなく（それぞれ２５．２±０．６２ｇ／ｄｌおよび２５．２±０．４０ｇ／ｄｌ）、ＭＰＣは最も安定していた。平均ＭＰＣ値は、０から３０分まで増加して、それからその後全ての３つの抗凝血剤において減少した。
３０分での値より低い６０分でのＭＰＣ値が全ての抗凝血剤において観測されたが、しかし、これはＣＴＡＤ（２７．１±０．４０ｇ／ｄｌから２６．７±０．４０ｇ／ｄｌ）において最も目立った。
【０１２５】
血小板成分分布幅（ＰＣＤＷ）
【０１２６】
【表６】
2004513369.tif 000026
このパラメータは、抗凝血剤の間で変化した。ＣＴＡＤは、より高いＰＣＤＷ値を与え、そして１８０分にわたりこの抗凝血は、ＰＣＤＷの小さい増加を引き起こした（７．４１±０．１３ｇ／ｄｌから７．８０±０．１１ｇ／ｄｌ、平均±標準偏差）の小さい増加が生じた。
【０１２７】
対照的に、ＥＤＴＡおよびＥ／Ｃ抗凝固化血液に関する平均の値は時間にわたって減少するものであった。但し、Ｅ／Ｃ（７．３５±０．２１から６．９７±０．４３）より非常に大きい減少がＥＤＴＡ（４．８０±０．０８ｇ／ｄｌに対する５．８５±０．２８ｇ／ｄｌ）であった。
【０１２８】
結果は、ＣＴＡＤが、ＥＤＴＡのような血小板活性化剤が存在している場合であっても、血小板活性の非常に良好な抑制剤であることを示した。ＣＤ６２Ｐ発現は、他の抗凝血剤とは対照的に、ＣＴＡＤへの露曝で３時間以上にわたって増加しなかった。６０〜１２０分間の間、ＣＤ６２Ｐ発現は、ＣＴＡＤにおいて低下した；その理由は、明白でなはないが、血小板表面からのＣＤ６２Ｐの消失または、チューブ壁にまたは血中の他の白血球に活性化した血小板の粘着によるものであると思われる。後者の理論は、ＥＤＴＡまたはＥ／Ｃのそれらと比較してＣＴＡＤ抗凝固化血液において測定された血小板−白血球凝集の著しい増加、および、ＣＴＡＤ抗凝固化血液における血小板数のわずかな減少が観測されたことによって指示される。その理由は直ちに明らかではないが、クエン酸塩よりよいカルシウムのキレート化剤であるＥＤＴＡの存在、そして、カルシウムは血小板活性化が生じるために必要である、ということに関するように思われる。血小板は非常に多量のアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を含む。そして、それはカルシウムの存在下で活性化において放出される；ＡＤＰは、白血球によってアデノシンに低下されることができる（Ｆａｉｎｔ， Ｒ． Ｗ． （１９９２） Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ：Ｔｈｅｉｒ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ． Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ， ６，８３−９１）、これはそして血小板および好中球の双方の活性化における阻止効果を有する （Ｓｅｉｓ， Ｗ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ． Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗ， ６９，５８−６５）。白血球および脈管内皮が、流れる血液中の循環するヌクレオチドの多くがｔ愛車されっるのに十分なエクトヌクレオチターゼを発現する （Ｃｏａｄｅ， ＳＢ．， Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｊ． Ｄ． （１９８９） Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｏｆ ａｄｅｎｉｎｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ． Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ６５， ５３１−５３７）が、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商品名）コンテナの静的条件下では、この代謝は、ＡＤＰの正常値よりも大きな存在をもたらす最適状態に及ばないものであってもよい。ＡＤＰが血小板の膨張を引き起こし、そして血小板膜が互いに付着することをもたらすことは公知であり（Ｆａｉｎｔ， １９９２）、したがって、多量のＡＤＰが血小板および白血球の凝集する能力を高める可能性がある。したがって、ＣＤ６２Ｐ発現によって測定される血小板活性化の明らかな抑制が、活性化血小板が白血球に付着しているゆえに、存在はするが、検出されないという事実によって、人為結果となるものであるかもしれない。
【０１２９】
ＥＤＴＡは血液中において人為結果を引き起こすことは公知である、そして、室温で、ＥＤＴＡ抗凝固化血液においてＭＰＶが平均して２３％、対応するクエン酸塩抗凝固化血液より大きかったことが示された（Ｔｈｒｅａｔｔｅ ｅｔ ａｌ．， １９８４）。この研究はまた、ＥＤＴＡ抗凝固化血液のＭＰＶの最も大きい増加が露曝の数分以内で起こることを示した。しかし、我々はＥＤＴＡ、ＣＴＡＤおよびＥＤＴＡとＣＴＡＤとの混合物におけるＭＰＶが０〜３０分間に低下したことを示した。これらの結果は前の発見とは逆であり、そして、これは血液が分析された方法に関するものであると思われる。この研究において、ＡＤＶＩＡ １２０血液システム（Ｂａｙｅｒ， Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ， Ｎ． Ｙ．）が使われ、そして、血小板によって高および低角度に散乱された光を測定する。前者は、血小板の屈折率、すなわち、粒化または血小板活性の度合いの測定に関するものであり、後者は、細胞の容積に左右されるものである（Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。ところが、Ｕｌｔｒａ−Ｆｌｏ １００全血血小板アナラアイザ（Ｃｌａｙ−Ａｄａｍｓ， Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， Ｎ． Ｊ．）を用いたセアッテら（Ｔｈｒｅａｔｔｅ ｅｔ ａｌ）（それは電導性希釈剤中に懸濁された細胞によって発生する小さな電流変化の発見を許す半自動の計測器である）は、これらが、開口を通じて流れると述べている（Ｇｕｔｈｒｉｅ， Ｄ． Ｌ．， Ｌａｍ， Ｋ． Ｔ．， Ｐｒｉｅｓｔ， Ｃ． Ｊ． （１９８０） Ｕｌｔｒａ−Ｆｌｏ １００ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｕｎｔｅｒ−ａ ｎｅｗ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｏｕｎｔｉｎｇ．　 Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ２，２３１−２４２）。臨床のおよびＬａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、２，２３１−２４２）。
【０１３０】
上述したメイシーらの１９９９年の論文は、全血の試験管内的刺激が増加するＣＤ６２Ｐ発現およびＭＰＣにおける並行する減少に至ることを示している。上記の結果はＭＰＣがＥＤＴＡにおいて、ＣＴＡＤまたはＥＤＴＡおよびＣＴＡＤの混合物におけるよりもより減少したことを明らかに示している。そして、ＥＤＴＡによって血小板活性化が引き起こすことを示している。ＣＴＡＤ抗凝固化血液において、平均ＭＰＣ値が時間にわたって変化しなかった。それゆえに、血小板は安定であり、蛍光流量細胞計数器によって測定された安定なＣＤ６２Ｐ発現と整合したものであった。ＣＴＡＤおよびＥＤＴＡとＣＴＡＤの混合物で抗凝固化された血液は、１８０分間にわたってＭＰＣ値は同様のものであった。
【０１３１】
ＥＤＴＡとＣＴＡＤの混合物を用いた試料中での高いＭＰＶと低いＭＰＣは、血小板が脱顆粒化を起こすことなしに、ＭＰＣ測定が満足できるように十分な程度まで、球状化されることを示している。このことは、ＥＤＴＡ／ＣＴＡＤ混合物抗凝固化血液中の血小板における低い量のＣＤ６２Ｐ発現によって確かめられる。そして、それはＣＴＡＤのみで抗凝固処理された血液の血小板におけるものと同等だった。これに対して、ＥＤＴＡ抗凝固化血液における血小板は、高いＭＰＶと高いＣＤ６２Ｐ発現を有し、これはこれらが膨張し、脱顆粒化を起こしていることを示した。この後者の発見は、以前の論文に、一致するものであった（ＭｃＳｈｉｎｅ ｅｔ ａｌ， １９９０； Ｋｕｈｎｅ ｅｔ ａｌ， １９９５；
Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｃ． Ｂ．， Ｄｉａｚ， Ｄ． Ｄ．， Ｑｕｉｎｎ， Ｐ． Ｇ．， Ｌａｐｉｎｓ， Ｍ．， Ｋｕｒｔｚ， Ｓ． Ｒ．， Ｖａｌｅｒｉ， Ｃ． Ｒ． （１９８３） Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｖｏｌｕｍｅｓ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， ８０，３２７−３３２；
ａｎｄ Ｍａｃｅｙ ｅｔ ａｌ， １９９９）。
実施例２：Ｅ／Ｃの、 ＥＤＴＡ／クエン酸， ＥＤＴＡ／アデノシン， ＥＤＴＡ／ジピリダモールおよびＥＤＴＡ／テオフィリンとの比較
材料および方法
血小板活性化制御薬が０．１１Ｍクエン酸（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）と組み合わせて用いられた：これらは、次の通りだった；３．７ｍＭアデノシン（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）、０．１９８ｍＭジピリダモール（Ｓｉｇｍａ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）および１５ｍＭテオフィリン。各溶液のｐＨは、必要ならｐＨ ５．０に調整された。溶液はフィルター殺菌され、必要であるまで、−２０℃で格納された。抗凝固剤ＣＴＡＤ （Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ， ＵＫ）は、遮光箱に格納され、使用の直前に取り除かれた。
材料
実施例１と同様。
抗血清
実施例１と同様。
血液採取
血液は、２１−ゲージ針を使用して、４つのＥＤＴＡ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒｗコンテナ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ， ＵＫ）に、５人のボランティア（平均年齢３８歳、女３人、男２人）の肘前の静脈から採血された。３つのＥＤＴＡ試料は、アデノシンまたはジピリダモールまたはテオフィリンをクエン酸と含んでいるＶａｃｕｔａｉｎｅｒｗコンテナに加えられた。最後のＥＤＴＡ試料は、抗凝血剤ＣＴＡＤを含んでいるＶａｃｕｔａｉｎｅｒｗに加えられた。
ＡＤＶＩＡ　１２０上での血小板活性の評価
全血試料は、ＥＤＴＡを含みそして前記血小板拮抗剤と混合されている、または、ＣＴＡＤと混合されている（この混合物をＥ／Ｃと呼ぶ。）Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商品名）コンテナ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に採取された。試料は実施例１におけると同様にして分析された。
発現ＣＤ６２Ｐおよび白血球血小板凝集体（ＰＬＡ）の数の測定
実施例１と同様。
血球計算機
実施例１と同様。
統計的分析
対ｔ−試験が、４つの抗凝固剤混合物の間の違いを測定するために適用された。
結果
血小板数
【０１３２】
【表７】
2004513369.tif 000027
血小板数は、いずれも類似しており、各々の４つの抗凝血剤の組合せにおいて、正常な範囲内であった。
平均血小板量
【０１３３】
【表８】
2004513369.tif 000028
Ｅ／Ｃで抗凝固処理された血液においては、最初の３０分間の間において、ＭＰＶ値が低下し、その後増加した。これに対して、Ｅ／Ａ、Ｅ／Ｄ、およびＥ／Ｔで抗凝固処理された血液においては、最初の６０分間の間において、ＭＰＶ値が低下し、その後は安定にとどまった。
平均血小板成分
【０１３４】
【表９】
2004513369.tif 000029
Ｅ／Ｃで抗凝固処理された血液においては、最初の３０分間の間において、ＭＰＣが増加し、その後低下した。これに対して、Ｅ／ＤおよびＥ／Ｔで抗凝固処理された血液においては、瀉血６０分後まで、ＭＰＶが上昇を続け、Ｅ／Ａで抗凝固処理された血液においては、瀉血１２０分後まで、ＭＰＶが上昇を続けた。
平均血小板量
【０１３５】
【表１０】
2004513369.tif 000030
ＭＰＭの経時変化は、全ての４つの抗凝血剤組合せにおいて非常に類似していた。
ＣＤ６２Ｐ陽性の血小板のパーセンテージ
【０１３６】
【表１１】
2004513369.tif 000031
ＣＤ６２Ｐ陽性の血小板のパーセンテージは、１８０分間にわたりすべての４つの抗凝血剤において、経時増加した。
血小板−白血球凝集体形成
【０１３７】
【表１２】
2004513369.tif 000032
血小板−白血球凝集体の数は、すべての４つの抗凝血剤の組合せで抗凝固処理された血液において経時増加した。１８０分での最も低い血小板−白血球凝集体のパーセンテージは、Ｅ／Ｃで抗凝固処理された血液に見出された。
結論
Ｅ／Ｃで抗凝固処理された血液において、ＭＰＶの減少および瀉血後の最初３０分におけるＭＰＣの増加があった。これらの変化は、血小板の球状化に関連すると思われる。同様の変化は、Ｅ／Ａ、Ｅ／ＴおよびＥ／Ｄで抗凝固処理された血液においても起きたが、より延長化された時間において起きた。血小板の球状化はＡＤＶＩＡ １２０でのＭＰＶおよびＭＰＣ測定に必要であるので、これが可能な限り瀉血後早くに起こることが望ましい。したがって、Ｅ／Ｃの使用は、Ｅ／Ａ、Ｅ／ＴおよびＥ／Ｄより好ましい。
実施例３−予備混合成分、低温での効果、全血液計数
材料および方法
材料：　タイロード塩溶液（ＴＳ）は、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（ＣａＣｌ　２Ｈ２０　０．２６５ｇ／Ｌ、　ＭｇＣｌ　６Ｈ２Ｏ　０．２１４ｇ／Ｌ、　ＫＣ１　０．２ｇ／Ｌ、　ＮａＨ２ＣＯ２　１．０ｇ／Ｌ、　ＮａＣｌ　８．０ｇ／Ｌ、　ＮａＰ０４　０．０５ｇ／Ｌ、ブドウ糖１．０ｇ／Ｌ）からのもの、また、ヒトトロンビン（１０単位）はシグマ（Ｐｏｏｌｅ， Ｄｏｒｓｅｔ， ＵＫ）からのものである。Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商品名）コンテナ中のＫ３ＥＤＴＡおよびＣＴＡＤは、ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ）（Ｃｏｗｌｅｙ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ）らのものである。後者は、遮光箱に格納し、使用の直前に取り除かれた。
抗血清
実施例１と同様。
血液試料
血液は、アスピリンまたはアスピリン含有製品を４８時間前までに摂取していない、７人の健常人（平均年齢３５歳）の肘前の静脈から採血された。
ＡＤＶＩＡ　１２０上での血小板活性の評価
全血試料は、Ｋ３ＥＤＴＡ、ＣＴＡＤまたはＫ３ＥＤＴＡとＣＴＡＤの混合物（Ｅ／Ｃ）のいずれかをＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商品名）コンテナに採取された。後者に関しては、血液は最初にＫ３ＥＤＴＡに採取され、それから直ちにＣＴＡＤを含んでいるＶａｃｕｔａｉｎｅｒへ移された。試料は雰囲気温度に保持され、瀉血直後、および３０、６０、１２０および１８０分後に分析された。血小板数（ＰＬＴ）、平均血小板量（ＭＰＶ）および平均血小板成分濃度（ＭＰＣ）の分析は、ＡＤＶＩＡ０１２０血液システム（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ， ＮＹ）を使用して行われた。ＣＴＡＤおよびＥ／Ｃで抗凝固処理された血液での血小板計数は、希釈のために補正された（それぞれ、希釈因子は１．１１および１．２５である。）。 装置は、使用前に、ＡＤＶＩＡ　ＳＥＴポイント血液比較対照試薬、およびＡＤＶＩＡ　ＯＰＴＩポイント血液比較対照試薬（Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いてそれぞれ較正され、標準化された。実験（ｎ ＝ ４）の１つの連続において、これらの分析は、Ｅ／Ｃで抗凝固処理された血液試料において実行されるが、血小板活性化における冷却効果を調査するために雰囲気温度および４℃で調査された。
【０１３８】
発現ＣＤ６２Ｐおよび付着血小板を有する白血球（白血球血小板凝集体）のパーセンテージの測定
実施例１と同様。
【０１３９】
血球計算機
実施例１と同様。白血球血小板凝集体は、ついで、横の散乱（対数関数的なスケール縦座標）およびオレンジ蛍光（対数関数的なスケール横座標）のヒストグラム（Ｃ）に、白血球がＰＬＡを形成している、これらの特徴のあるＳＬＳによって、同定のために、ゲートされることができる。
【０１４０】
トロンビン活性化血小板におけるＣＴＡＤの阻害効果の調査
実験（ｎ ＝ ３）の１つの連続において、ヒトトロンビンの最適状態に及ばない濃度（予め滴定によって決定）でインキュベートされたＫ３ＥＤＴＡ抗凝固化血液において血小板活性化におけるＣＴＡＤの効果が調査された。ＣＤ６２Ｐ発現によって定まる血小板活性化の低レベルを刺激するために、トロンビンの濃度が選ばれた。トロンビン（１５μｌ）は、０．００１２のＵ／ｍｌの最終的な濃度を与えるＫ３ＥＤＴＡで抗凝固処理された血液（２１０μｌ）に加えられ、そしてＦＩＴＣ−ＣＤ６２Ｐ（２５μｌ）とともに雰囲気温度でインキュベートされた。１０分で、試料（４０のμｌ）が除去され、ＣＴＡＤ（５μｌ）が添加され、さらに２０分間インキュベートされた。比較対照血液試料は、トロンビンが添加されなかったＫ３ＥＤＴＡまたはＣＴＡＤで抗凝固処理され、そして同様に、ＦＩＴＣ−ＣＤ６２Ｐ（２５μｌ）とともに雰囲気温度でインキュベートされた。血液のアリコート（５μｌ）が、各反応管から、０、１０、２０、４０、および６０分で除去され、ＴＳ（９９５μ１）で希釈され、直ちに血球計算機によって分析された。
統計的分析
血球計算機およびＡＤＶＩＡ １２０血液システムからの結果は、対ｔ−試験を用いて、異なる時間で分析された同じ試料間の有意差を調べるために、比較された。ｐ ＜ ０．０１の多数の比較値を考慮に入れることは、重大であるとみなされた。結果はまた、手段の間の有意差を見つけるため、偏差（ＡＮＯＶＡ）の分析のために比較された。そして、ｈｏｃ Ｓｃｈｅｆｆｅ試験が多重比較のために使用された。
結果
血小板数
瀉血直後における全ての３つの抗凝血剤における血小板数に有意差はなく、そして正常の通常の範囲内であった。血小板数の有意差は、雰囲気温度（表１）で異なる抗凝血剤とともに保持された血液あるいは、Ｅ／Ｃで抗凝固された血液が４℃で保たれた場合でも１８０分にわたって、生じなかった。
【０１４１】
【表１３】
2004513369.tif 000033
【０１４２】
【表１４】
2004513369.tif 000034
ＭＰＶに関する値は、まず最初に全ての抗凝血剤において下がり、それから再び上がった。血液が雰囲気温度に保持された場合、全ての抗凝血剤で３０分が底であったが、Ｅ／Ｃで抗凝固された血液が４℃で保たれた場合６０分であった。雰囲気温度に保持した場合、すべての時間でのＭＰＶ値は、Ｋ３ＥＤＴＡ抗凝固化血液において、ＣＴＡＤまたはＥ／Ｃ抗凝固化血液におけるよりも有意（ｐ ＜ ０．０４）に低かった。
平均血小板成分
【０１４３】
【表１５】
2004513369.tif 000035
ＭＰＶ値（上記の）の結果との正比例して、ＭＰＣ値は、まず最初に上がって、それから下がった。血液が雰囲気温度に保持された場合、全ての抗凝血剤で最大値は３０分で達し、Ｅ／Ｃで抗凝固された血液が４℃で保たれた場合６０分で達した。雰囲気温度に保持した場合、すべての時間での平均血小板成分値は、Ｋ３ＥＤＴＡ抗凝固化血液において、ＣＴＡＤ（ｐ ＜ ０．０４）またはＥ／Ｃ（ｐ ＜ ０．０２）におけるよりも有意に高かった。
血小板におけるＣＤ６２Ｐ発現
【０１４４】
【表１６】
2004513369.tif 000036
瀉血直後にＣＤ６２Ｐを発現した血小板は低いパーセンテージ（Ｋ３ＥＤＴＡ， ＣＴＡＤ および Ｅ／Ｃについてそれぞれ、１．１０±０．６１％， １．２２±０．６２ および １．２８±０．８５、（平均±標準偏差））であったが、血液が雰囲気温度に保持された場合上昇した。１８０分での上昇は、Ｋ３ＥＤＴＡ抗凝固化血液（２３．０５±１．５４％）でＥ／Ｃ抗凝固化血液（８．４５５±０．７９％）より大きく、ＣＴＡＤ抗凝固化血液で最低であった（４．１４±０．７９ ％）。
１８０分でのＫ３ＥＤＴＡ抗凝固化血液におけるＣＤ６２Ｐ陽性血小板のパーセンテージは、ＣＴＡＤまたはＥ／Ｃ抗凝固化血液におけるよりも有意（ｐ ＜ ０．０１）に高かった。Ｅ／Ｃ抗凝固化血液が４℃で保持された場合、ＣＤ６２Ｐ陽性血小板のパーセンテージに関して、０分での０．５３±０．１２ ％から１８０分での １．０７±０．５７ ％ までの、最小の、有意でない増加があるのみであった。
血小板−白血球凝集体形成
【０１４５】
【表１７】
2004513369.tif 000037
瀉血直後において、それがどの抗凝血剤であった関わらず、提供者からの全ての血液において見出される血小板と関連した白血球の少ないパーセンテージがあった（Ｋ３ＥＤＴＡ， ＣＴＡＤ および Ｅ／Ｃについてそれぞれ、３．５０±０．７１ ％、３．９５±．９７ ％、そして、Ｋ３ＥＤＴＡ、ＣＴＡＤおよびＥ／Ｃのそれぞれ２．８２±１．０５ ％（平均±標準偏差））。
全ての抗凝血剤において、血液が雰囲気温度で保たれるときに、血小板−白血球凝集体のパーセンテージは著しく上がった。１８０分での上昇は、ＣＴＡＤ抗凝固化血液（１８．８８±２．０６ ％）でＫ３ＥＤＴＡ抗凝固化血液（１３．５０±１．７４％）より大きく、Ｅ／Ｃ抗凝固化血液（７．８１±１．４３％）で最低であった。しかし、Ｅ／Ｃ抗凝固化血液が４℃でインキュベートされた場合、１８０分にわたり血小板−白血球凝集体のパーセンテージの最小の増加だけがあった。
トロンビン活性化血小板におけるＣＴＡＤの効果
すでに拮抗剤に遭遇した血小板によって、ＣＴＡＤが効果的に更なる反応を阻害すうかどうかを確かめるために、Ｋ３ＥＤＴＡに採取された血液が単独でインキュベートされる、または、トロンビンの最適状態に及ばない濃度とインキュベートされた。
１０分後、トロンビン刺激された血液のアリコートは、ＣＴＡＤに加えられた。血小板活性化（ＣＤ６２Ｐ発現によって観察）は、ＣＴＡＤの追加によって完全に阻止されたが、Ｋ３ＥＤＴＡのみで抗凝固化された血液においてはさらなる活性化が起き、そして、期待通り、これらの試料においてトロンビンが加えられた場合の方が、それが省略された場合よりも大きかった。
使用の前に混合された場合におけるＥＤＴＡおよびＣＴＡＤの安定性の調査
結果は、単独では血小板研究のための抗凝血剤としてＥ／ＣがＫ３ＥＤＴＡまたはＣＴＡＤより良好な抗凝固剤であろうことを今までの結果で示唆したので、２つの成分を使用前に混合する効果を調査した。血液は、１４日前または直前に調製されたＫ３ＥＤＴＡおよびＣＴＡＤの混合物中に採取され、あるいは、Ｋ３ＥＤＴＡにおいて集められ次いでＣＴＡＤと混合された（そのことは、以前に研究の全体にわたってされた）。
全てのサンプルが、その後４℃に保持された。瀉血直後にＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０で測定された基礎血液的および血小板活性化パラメータの値は、２つの抗凝固剤が先に混合されていても、採血後に混合されたかにかかわらず同様であった。さらに、値は、３、６および２４時間で分析され多場合にも、本質的に不変のままだった。免疫蛍光検査法は、白血球と凝集体において含まれる血小板のパーセンテージが２４時間にわたり全ての試料（結果を示さず）においてわずかに上がる（２４時間で＜５％の増加）ことを示した。
【０１４６】
Ｋ３ＥＤＴＡ、ＣＴＡＤおよびＥ／Ｃで抗凝固処理された血液におけるＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０血液学の比較
Ｅ／Ｃで抗凝固処理された血液が、血液学パラメータの基礎的分析のために使われてもよいかどうか調査するために、Ｋ３ＥＤＴＡ、ＣＴＡＤおよびＥ／Ｃで抗凝固処理された７つの比較対照試料からＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０において得られた結果が比較された。３つの抗凝固剤で処理された血液において、白血球数（ＷＢＣ）、赤血球数（ＲＢＣ）およびヘモグロビン（ＨＧＢ）濃度の測定値に、有意差はなかった。しかしながら、
しかし、ヘマトクリット値および血小板パラメータ値は、ＥＤＴＡで抗凝固処理された血液におけるものと、ＣＴＡＤおよびＥ／Ｃで抗凝固処理された血液におけるものとでは有意（ｐ ＜ ０．０１）に差があった（表２）。
【０１４７】
【表１６】
2004513369.tif 000038
議　論
データは、ＥＤＴＡ中に前記ＭＰＶが存在することを、ここに明らかに示しており、ＣＴＡＤとＥ／Ｃは、０〜３０分の間で低下したが、再び上昇した。ＥＤＴＡのための結果は、主に、ＭＰＶが光学的手順によって決定されたとする以前の研究のそれらと一致している（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ、Ｅ．Ａ、Ｒｅａｒｄｏｎ、Ｄ．Ｍ．Ｄ、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、Ｄ．、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ、Ｃ著（１９９５年）「血小板の量の通常の測定法。光拡散と開口インピーダンス技術の比較。」Ｃｌｉｎ．　Ｐｈｙｓ．Ｐｈｙｓｉｏｌ　６．２２１〜２３６）。
最近のレポートと一致して、ＣＴＡＤは、Ｋ３ＥＤＴＡによって血液凝固が防止される雰囲気温度に１８０分間保存された結晶分に起こるＣＤ６２Ｐの現れの増加を抑制する（Ｋｕｈｎｅほか、１９９５年；Ｍａｃｅｙほか１９９９年；Ｍｏｄｙほか、１９９９年）。さらに、Ｋ３ＥＤＴＡによって血液凝固を阻止された血液がトロンビンに刺激された場合、ＣＴＡＤの次の追加は、血小板顆粒減少抑制し、一方、血液中で起こったＣＤ６２Ｐの現れの増加はちょうどＫ３ＥＤＴＡとともに保たれた。我々は、Ｋ３ＥＤＴＡの試験管内刺激は、未処理の血液の血液凝固を阻止させ、ＣＤ６２Ｐの現れの増加は、並行してＭＰＣ（Ｍａｃｅｙほか１９９９年）の減少を伴うことを以前に証明した。現在、我々は、ＣＴＡＤやＥ／Ｃよりも前記ＭＰＣが減少する雰囲気温度において、ＥＤＴＡによって活性化血小板が生じることを確認していることを示す。ＣＴＤＡやＥ／Ｃによって血液凝固を阻止される血液のＭＰＣの価値は、１８０分以上では類似しており、Ｋ３ＥＤＴＡ中よりもかなり低かった。一緒に採取された、雰囲気温度でのＭＰＶとＭＰＣの変化の価値は、Ｅ／Ｃによって血液凝固を阻止される血液において、血小板は、（たぶん、最大限ではないにしろ）顆粒減少を経ることなく、球状にされる。これは、Ｅ／Ｃで血液凝固を阻止された血液の血小板のＣＤ６２Ｐの現れの低いレベルによって確かめられ、そして、ＣＤＴＡのみによって血液凝固を阻止される血液の血小板上のそれと同等だった。
今までのところ、なぜ、雰囲気温度において、ＣＤＴＡによって血液凝固を阻止される血液中のＣＤ６２Ｐを表している血小板のパーセンテージが、６０〜１２０分の間で僅かに減少氏なのかは明確ではないが、しかし、いくつかの活性化された血小板が、血液中の他の白血球や管壁に付着したということは、説明可能である。実際、ＣＴＡＤによって血液凝固を阻止される血液は、Ｋ３ＥＤＴＡやＥ／Ｃによって血液凝固を阻止された血液よりも、高い血小板−白血球総数を示す。その理由は、直ちに明白にはならないが、ＥＤＴＡの存在に依存しているようである。いくぶん逆説的には、ＥＤＴＡは、顆粒分泌物や集合体を減らすよりはむしろ、強化する方法における、血小板膜結合レセプターに影響を及ぼすことを示している。（Ｇｏｌａｎｓｋｉ、Ｊ．、Ｐｉｅｔｒａｃｈａ、Ｔ．、Ｂａｊ、Ｚ．、Ｇｒｅｇｅｒ、Ｊ．、Ｗａｔａｌａ、Ｃ．（１９９６年）「抗凝血剤中の分子洞察−未処理血液中での血小板の自然発生的に誘発された活性化−様々な抗凝血剤は等しくない」血栓症調査　８３、１９９〜２１６）。しかしながら、外部のＣａ２＋は、集合体のために必要であり、ＥＤＴＡが、クエン酸塩よりも優れたＣａ２＋のキレート化剤であるように、それは、これらの点において大きな抑制効果を有することができる。この説明が真実の場合、活性化された血小板が存在するが、検知されていないままであるように、ＣＴＤＡが完全にＣＤ６２Ｐの現れの増加を抑制しないかもしれない可能性がある。なぜなら、それらは、白血球に付着しているからである。これらの結果は、血小板−白血球の集合形成が、未処理の血液中において、血小板活性の研究の間、観察されなければならないことを示唆しており、更に、生体外の血小板−白血球の集合形成が抗凝血剤に依存するという事実を目立たせている。この研究の重大な発見は、血液が、Ｅ／Ｃによって血液凝固を阻止されて、４℃に保たれた場合、少なくとも１８０分の間には、血小板活性のパラメータに最小の変化しかないことであるこの発見は、臨床の研究にとって重要である。なぜなら、病室や診療所で採取されたサンプルが、分析のために研究室に到着するために、３時間は充分な時間でだからである。実際、事前の研究は、この時間が、多分問題なく６時間まで延長されるであることを示唆している。多分、細胞内のカルシウム移動度におけるＣＴＡＤの抑制効果は、微粒放出と、これに続くＰＬＡ形成を防止する。
血液が雰囲気温度に保たれた場合、ＣＴＤＡにおける血小板拮抗剤の抑制効果は、３〜４時間で消え始めることが知られており、そして、必要であれば、保存時間は、おそらく、それらの濃縮（２）Ｍｏｄｙ他、１９９９年）を増加することによって延長することができる。ここに記載されている条件（時間および温度）で、Ｅ／Ｃは、同時に顆粒減少を引き起こすことなしで、効果的に血小板を球状にし、そして、このことにより、前記ＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０においてＭＰＣの正確な測定ができる。また、生体外で血小板−白血球の集合形成を抑制するためのＥ／Ｃの能力は、この結合された抗凝血剤が、臨床研究においてこれらの相互作用の調査のために適していることを示している。実際に、Ｅ／Ｃによって血液凝固を阻止された血液サンプルにおいて、炎症性腸の患者（ｎ＝６２）の血液中には、通常のコントロール（ｎ＝２０）（３．４３±０．８２、平均±標準偏差、ｐ＝０．０３）よりも、血小板−白血球集合体（５．１６±１．４８、平均±標準偏差）がかなり多く存在する。（未発表のデータ、図３に示される実施例）。結合された抗凝血性Ｅ／Ｃは、ＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０における大多数の血液学パラメータの通常の分析に適しているように見える。しかしながら、臨床の見解から、第１のＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）中に血液を注入し、第２へそれを注ぐか、第２のＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）コンテナーの内容物を混合することは、現実的ではない。この理由のために、両方の抗凝血剤を含んでいる管が好ましい。
結論として、上記の結果は、ＣＴＤＡ／ＥＤＴＡ混合物が、生体外の血小板活性の測定と、生体外の白血球活性の測定のために重大な利点を有していることを示している。
【図面の簡単な説明】
参照は、添付の図面を伴う実施例群において行われる、ここで：
実施例１
【図１】は、全血における血小板の分析を示す。領域Ｒ１の血小板は、これらの低い前方および横の散乱特性（ヒストグラムＡ）によって識別され、そしてＣＤ４２ａの結合と関連する緑色の蛍光の分析（ヒストグラムＢ）によって確かめられた。
【図２】は、全血における血小板白血球凝集の分析を示す。白血球は、横の散乱（対数関数的なスケール縦座標）対オレンジ色蛍光におけるプロットにおいて識別される（ヒストグラムＡ）。非白血球事象がゲートされた（ヒストグラムＢ）。ＰＥ　ＣＤ４５で陽性に染色されることによって識別された白血球は、緑色の蛍光（対数関数的なスケール縦座標）およびオレンジ色蛍光（対数関数的なスケール横座標）のヒストグラムにゲートされた（ヒストグラムＣ）。緑色およびオレンジ色の双方であった事象は、血小板白血球凝集であると見なされた。
実施例３
【図３】は、全血の血小板白血球凝集の分析を示す。血液は、フィコエリトリン接合ＣＤ４５およびフルオロセインイソシアネート接合ＣＤ４２ａで染色された。白血球は、横の散乱（対数関数的なスケール縦座標）対オレンジ蛍光（対数関数的なスケール横座標）においてＰＥ　ＣＤ４５に対する陽性の染色によって同定（領域Ｒ１）され（ドットプロットＡ）、そして、緑色の蛍光（対数関数的なスケール縦座標）およびオレンジ蛍光（対数関数的なスケール横座標）のプロット線において表示された（ドットプロットＢ）。緑（ＣＤ４２ａ）およびオレンジ（ＣＤ４５）の双方である事象（領域Ｒ２）は、血小板白血球凝集とみなされた。横の散乱（対数関数的なスケール縦座標）対オレンジ蛍光（対数関数的なスケール横座標）のプロット（ドットプロットＣ）に、これらの事象をバックゲートすることは、凝集の大部分が、顆粒白血球および単球の横の光散乱特徴を有していることを示した。正常な比較対照からの血液において行われる分析の例は、上方のパネルにおいて図示され、そして炎症性腸疾患の患者からの血液において行われる分析の例は下方のパネルにおいて図示される。
【図１】
2004513369.tif 000039
【図２】
2004513369.tif 000040
【図３】
2004513369.tif 000041
【国際公開パンフレット】
2004513369.tif 000042
2004513369.tif 000043
2004513369.tif 000044
2004513369.tif 000045
2004513369.tif 000046
2004513369.tif 000047
2004513369.tif 000048
2004513369.tif 000049
2004513369.tif 000050
2004513369.tif 000051
2004513369.tif 000052
2004513369.tif 000053
2004513369.tif 000054
2004513369.tif 000055
2004513369.tif 000056
2004513369.tif 000057
2004513369.tif 000058
2004513369.tif 000059
2004513369.tif 000060
2004513369.tif 000061
2004513369.tif 000062
2004513369.tif 000063
2004513369.tif 000064
2004513369.tif 000065
2004513369.tif 000066
2004513369.tif 000067
2004513369.tif 000068
2004513369.tif 000069
2004513369.tif 000070
2004513369.tif 000071
2004513369.tif 000072
2004513369.tif 000073
2004513369.tif 000074
2004513369.tif 000075
2004513369.tif 000076
2004513369.tif 000077
2004513369.tif 000078
2004513369.tif 000079
2004513369.tif 000080
2004513369.tif 000081
2004513369.tif 000082
2004513369.tif 000083
2004513369.tif 000084
2004513369.tif 000085
2004513369.tif 000086
2004513369.tif 000087
2004513369.tif 000088
2004513369.tif 000089
【国際調査報告】
2004513369.tif 000090
2004513369.tif 000091
2004513369.tif 000092