(57)【要約】生体試料中のＳ−ニトロソチオール（例えば、Ｓ−ニトロソグルタチオン（ＲＮ＝５７５６４−９１−７））の定量法は、アルカリ溶液（ｐＨ＞１０．５）中でＳ−ニトロソチオールを硝酸に変換する工程と、一酸化窒素をスピントラップ（例えば、３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルホン酸（ＤＢＮＢＳ）またはＮ−メチル−Ｄ−グルカミンジチオカルバメート（ＭＧＤ）またはジエチルカルバメート（ＤＥＴＣ）の鉄（ＩＩ）複合体）と反応させて常磁性付加物を生成する工程と、ＥＰＲ分光測定方法を使用して常磁性付加物を定量する工程とを含む。第２の方法では、チイルラジカルと反応することができるスピントラップ（例えば、５−（ジエトキシホスホリル）−５−メチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシドまたは５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシド）を使用する。Ｓ−ニトロソチオールの定量的測定に基づく診断法も記載する。
2004507738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）Ｓ−ニトロソチオール部分を変換する前に試料のｐＨを少なくとも約１０．５に調整し、一酸化窒素と反応することのできるスピントラッピング剤で試料を処理してＥＰＲシグナルが特徴的な常磁性付加物を生成し、試料中のＳ−ニトロソチオール部分を一酸化窒素に変換する工程と、
ｉｉ）常磁性付加物の存在および量を電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光測定方法を使用して検出し、試料中のＳ−ニトロソチオール部分の濃度を計算する工程とを含む、
試料中のＳ−ニトロソチオール部分の濃度を測定する方法。
【請求項２】
ｉ）Ｓ−ニトロソチオール部分を変換する前に試料のｐＨを少なくとも約１０．５に調整し、一酸化窒素と反応することのできるスピントラッピング剤で患者由来の体液試料を処理してＥＰＲシグナルが特徴的な常磁性付加物を生成し、試料中のＳ−ニトロソチオール部分を一酸化窒素に変換する工程と、
ｉｉ）常磁性付加物の存在および量を電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光測定方法を使用して検出し、試料中のＳ−ニトロソチオール部分の濃度を計算する工程とを含む、
患者のＳ−ニトロソチオールレベルに影響を受ける疾患もしくは病態の進行もしくは治療を診断もしくはモニタリングする方法、またはＳ−ニトロソチオールレベルに影響を受ける薬物療法の有効性もしくは毒性をモニタリングもしくは評価する方法。
【請求項３】
ＥＰＲ分光測定による検出前に常磁性付加物を有機溶媒中に抽出する、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
一酸化窒素へ変換する前にＳ−ニトロソチオール部分を有機溶媒中に抽出するさらなる工程をさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
遊離チオール基と反応してＳ−ニトロソチオール化合物の再形成を防止する化合物を試料に添加する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
スピントラッピング剤が、ニトロソ化合物、ニトロメタン、またはこれらの任意の類似体もしくは誘導体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
スピントラッピング剤が、３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルホン酸（ＤＢＮＢＳ）、その任意の類似体または誘導体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
類似体が重水素標識誘導体、１５Ｎ標識誘導体、または１５Ｎおよび重水素の二重標識誘導体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
スピントラッピング剤がニトロメタンであり、反応混合物中に約０．４Ｍの濃度で存在する、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
スピントラッピング剤がニトロソ化合物であり、反応混合物中に約０．２Ｍの濃度で存在する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｓ−ニトロソチオールを遷移金属イオンでの処理によって一酸化窒素に変換する、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
遷移金属イオンが、銅（Ｉ）イオンまたは銅（ＩＩ）イオンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
スピントラッピング剤がジチオカルバメートの鉄（ＩＩ）複合体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
スピントラッピング剤がＮ−メチル−Ｄ−グルカミンジチオカルバメート（ＭＧＤ）の鉄（ＩＩ）複合体またはジエチルジチオカルバメート（ＤＥＴＣ）の鉄（ＩＩ）複合体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
スピントラピング剤が反応混合物中に約２５〜５０ｍＭの濃度で存在する、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
スピントラピング反応を嫌気性条件下で行う、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
Ｓ−ニトロソチオールを酸化還元循環系を介して一酸化窒素に変換する、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
酸化還元循環系がヒドロキノン／キノン系である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｓ−ニトロソチオールを照射によって一酸化窒素に変換する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
チイルラジカルをスピントラッピング剤でトラッピングして各チイルラジカルに特徴的なシグナルを得る工程をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ｉ）チイル（ｔｈｉｙｌ）ラジカルと反応することのできるスピントラッピング剤で試料を処理してＥＰＲシグナルが特徴的な常磁性付加物を生成し、試料を照射して試料中のＳ−ニトロソチオール部分を一酸化窒素およびチイルラジカルに変換する工程と、
ｉｉ）常磁性付加物の存在および量を電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光測定方法を使用して検出し、試料中のＳ−ニトロソチオール部分の濃度を計算する工程とを含む、
試料中の異なるＳ−ニトロソチオール部分の濃度を測定する方法。
【請求項２２】
ＥＰＲ分光測定方法による測定前に常磁性付加物を有機溶媒中に抽出する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
一酸化窒素およびチイルラジカルへの変換前にＳ−ニトロソチオール部分を有機溶媒中に抽出するさらなる工程をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
チイルラジカルのスピントラップが、５−（ジエトキシホスホリル）−５−メチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシドまたは５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシドである、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
試料が、ヒトまたは動物の全血、血清、血漿、滑液、尿、脳脊髄液、腹水、歯肉溝滲出液、または任意の他の組織もしくは細胞外液、または細胞培養培地もしくは化学系である、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
試料が血液製剤であり、試料の回収時または回収直後にキレート剤を添加する、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、Ｓ−ニトロソチオールの検出アッセイ法に関する。特に、本発明は、生体試料中のＳ−ニトロソチオールの検出に電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光測定方法を使用するアッセイ方法に関する。
【０００２】
比較的最近まで、一酸化窒素（ＮＯ）は、環境汚染物質であると単純に考えられていた。しかし、より最近では、生理学的意味および病理学的意味の両方において生物学的に重要である分子であることが明らかとなっている。一酸化窒素は、全身血圧、呼吸、血小板凝固、および脳血流の調節を含めた生物学的過程に関係し、ならびにマクロファージ、おそらく好中球の抗菌活性および殺腫瘍活性に寄与している。
【０００３】
しかし、水溶液中で約１０〜３０秒間および全血中で約０．４６ミリ秒と半減期の短い遊離ラジカルとして存在するため、一酸化窒素レベルの測定は困難である（Ｆｅｅｌｉｓｈ，Ｍ、Ｓｔａｍｐｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｎｉｔｒｉｃ　Ｏｘｉｄｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、第１版、４９〜６５、１９９６）。
【０００４】
したがって、種々の生理学的過程および多数の疾患状態におけるＮＯに関する多くの報告がＮＯ代謝物の測定に基づいている。これらの代謝物には、亜硝酸塩、硝酸塩、およびＳ−ニトロソチオールが含まれる。ヒトの血液では、ＮＯはいくつかの中間体を介して酸化されて、安定な最終生成物である硝酸塩および亜硝酸塩を形成する。これらの代謝物は、ＮＯ生成を関連付ける多数の実験で測定されている。
【０００５】
しかし、本発明は、Ｓ−ニトロソチオールの測定に関連する。Ｓ−ニトロソチオールは、チオール含有タンパク質およびペプチド（アルブミンおよびヘモグロビンなど）のＮＯ依存性Ｓ−ニトロソ化によってインビボで形成されることが既知である（Ｓｔａｍｐｌｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５８（５０９０）、１８９８〜１９０２、１９９２およびＪｉａら、Ｎａｔｕｒｅ、３８０（６５７１）、２２１〜２２６、１９９６）。チオールのＳ−ニトロソ化により酸化が加速して、種々の官能基との反応における反応性が増加する。しかし、Ｓ−ニトロソチオールは、ＮＯよりも非常に安定であるため、Ｓ−ニトロソチオールによりＮＯの生物学的利用能の調節法が得られ、および／またはその作用範囲は拡大しうる。例えば、ＮＯはヘモグロビンと同時に存在することができず、Ｓ−ニトロソチオールは、血液中で血管弛緩を担う（Ｈｏｕら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２２８（１）、８８〜９３、１９９６）。Ｓ−ニトロソチオールはまた、強力な抗微生物特性を有する宿主防御機構を介した炎症に関連する可能性が高いが、ＮＯは抗微生物特性を有さない（Ｄｅ Ｇｒｏｏｔｅら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．、９２（１４）、６３９９〜６４０３（１９９５））。さらに、タンパク質中のＳ−ニトロソチオール基は、ＮＯ代謝と、ＮＯ基を特定のチオール調節エフェクター部位（酵素およびシグナル伝達タンパク質を含む）へ輸送および標的するような細胞機能の調節に重要であることが提示されている。さらに、Ｓ−ニトロソチオールは、血管拡張および血小板凝集の阻害などのＮＯ●と類似の機能を惹起する。
【０００６】
Ｓ−ニトロソチオールが生理学的過程においてＮＯの輸送および調節で重要であると推定される一方で、形成および機能上の重要性に関する多くの疑問が残されている。Ｓ−ニトロソチオールに関する情報が欠如している１つの理由は、Ｓ−ニトロソチオールがＮＯ●よりも安定であるにもかかわらず、現在、生体試料中のＳ−ニトロソチオールの簡単で感度の高い特異的定量法が存在しない点にある。
【０００７】
これは、生体液中のＳ−ニトロソチオールの測定に利用可能なデータが限られていることを反映している。気道Ｓ−ニトロソチオールは、重症喘息患者で測定されており（Ｇａｓｔｏｎら、Ｌａｎｃｅｔ、３５１（９１１２）、１３１７〜１３１９、１９９８）、Ｓ−ニトロソタンパク質は慢性関節リウマチ患者から採取した血清および滑液中で検出されている（Ｈｉｌｌｉｑｕｉｎら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．、４０（８）、１５１２〜１５１７、１９９７）。後者の場合、Ｈｉｌｌｉｑｕｉｎらは、正常なコントロール血清中のＳ−ニトロソタンパク質濃度は、以前に報告されている値（ＦｅｅｌｉｓｃｈおよびＳｔａｍｐｌｅｒ、１９９６、前出）の１００倍であることを見出した。
【０００８】
非生体試料中のＳ−ニトロソチオールの測定について記載されているいくつかの方法を使用して、いくつかの生体試料をアッセイすることにより、この方法が生体液中のＳ−ニトロソチオールを測定できると証明される。例えば、Ｍａｒｚｉｎｚｉｇら（Ｎｉｔｒｉｃ Ｏｘｉｄｅ、１（２）、１７７〜１８９、１９９７）は、サビル（Ｓａｖｉｌｌｅ）反応に基づいた方法を使用して敗血症性ショック患者から採取した血清および尿中のＳ−ニトロソチオールを測定した。
【０００９】
現在、Ｓ−ニトロソチオールレベルの定量に利用可能な方法は、分光測定方法、化学発光、キャピラリーゾーン電気泳動、および高速液体クロマトグラフィーなどの技術を使用している（ＦｅｅｌｉｓｃｈおよびＳｔａｍｐｌｅｒ、１９９６、前出）。一般に、これらの方法は、生体試料中のＳ−ニトロソチオール測定に必要な感度を欠く。報告された方法の大部分は、Ｓ−ニトロソチオールを直接測定しておらず、むしろ、ニトロソチオールの分解生成物を測定している。例えば、サビル反応では、水銀イオンを使用してＳ−ニトロソチオールを分解して芳香族アミンと反応するニトロニウムイオンを得て高度に呈色された色素を分光測定方法によって測定する。化学発光は、以下の式
ＲＳＮＯ→ＲＳ−＋ＮＯ●
に従ってＳ−ニトロソチオールが分解してＮＯおよびチイルアニオンを形成する場合にＳ−ニトロソチオールから放出されるＮＯを測定するために使用されている。
【００１０】
生理学的条件下でのＳ−ニトロソチオールの安定性は、ＮＯ基が結合するチイル基（ＲＳ）の性質を含む種々の因子に依存することが既知である。ＲＳ基の例には、グルタチオン、システイン、アルブミン、およびヘモグロビン残基が含まれ、例えば、ニトロソシステインは、ニトロソグルタミンよりも安定性が低く、より早く分解する。Ｓ−ニトロソチオールの安定性に影響を与える他の因子には、ｐＨ、酸素分圧、酸化還元状態、および微量遷移金属の存在が含まれる。
【００１１】
しばしば銅イオンを使用して、Ｓ−ニトロソチオールを円滑に分解してＮＯが得られている（Ｆａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、２５２（３）、５３５〜５４０、１９９８）。他の方法は、酸化還元系、アルカリｐＨ、および高温を使用してＳ−ニトロソチオールを分解している（Ｓａｍｏｕｉｌｏｖら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５８、３２２〜３３０、１９９８）。
【００１２】
本発明は、定量的で生体試料での使用に十分な感度のＳ−ニトロソチオールのアッセイ法に関する。
【００１３】
本発明の方法では、亜硝酸塩を分解しない条件下でアッセイ法が行われていることを確認することが特に重要である。これは、Ｓ−ニトロソチオールと同様に、亜硝酸塩はまた分解されて一酸化窒素を形成することができるためであり、勿論、一酸化窒素が亜硝酸塩またはＳ−ニトロソチオールに由来するかどうかを区別することはできない。
【００１４】
したがって、本発明の第１の局面では、
ｉ）Ｓ−ニトロソチオール部分を変換する前に試料のｐＨを少なくとも約１０．５に調整し、一酸化窒素と反応することのできるスピントラッピング剤で試料を処理してＥＰＲシグナルが特徴的な常磁性付加物を生成し、試料中のＳ−ニトロソチオール部分を一酸化窒素に変換する工程と、
ｉｉ）常磁性付加物の存在および量を電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光測定方法を使用して検出し、試料中のＳ−ニトロソチオール部分の濃度を計算する工程とを含む、
試料中のＳ−ニトロソチオール部分の濃度を測定する方法を提供する。
【００１５】
この方法が行われる高ｐＨでは、試料中に存在する任意の亜硝酸塩が分解して一酸化窒素が得られる可能性はないことが確認される。したがって、Ｓ−ニトロソチオール濃度の代わりまたはそれに加えて亜硝酸塩濃度が同定される可能性はない。
【００１６】
この方法が行われる高ｐＨのさらなる利点は、アルカリ条件下で一酸化窒素に対して不安定なＳ−ニトロソチオールの分解を補助することである。
【００１７】
高ｐＨでスピントラッピング反応およびＥＰＲ分光測定方法を行うことは通常ではなく、従来のスピントラッピング反応は約ｐＨ７．４で行う傾向がある。
【００１８】
ＥＰＲ分光測定方法は周知の分光技術であるにもかかわらず、臨床系へのその適用は未熟である。ＥＰＲ分光測定方法では、スピントラッピング剤が目的のラジカルと反応して常磁性であるため、ＥＰＲ分光測定方法で検出することができるより安定なラジカル付加物が生成される。形成されたスピン付加物を、試料中で直接測定するか、測定前に有機相に抽出することができる。
【００１９】
ＥＰＲ分光測定方法をスピントラッピング（好ましくは、３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼン（ＤＢＮＢＳ）などのニトロソスピントラッピング剤を使用する）と組み合わせて使用して、ＮＯおよび他のラジカル種が測定されている（Ａｒｒｏｙｏら、Ｆｒｅｅ　Ｒａｄｉｃ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１４、１４５〜１５５、１９９１およびＰｒｏｎａｉら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０２（３）、９２３〜９３０、１９９１）。しかし、ＤＢＮＢＳの使用は問題が多く、Ｐｏｕら（Ｂｉｏｃｅｈｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１２０１（１）、１１８〜１２４、１９９４）は、ＮＯとＤＢＮＢＳとの間の反応の結果形成される常磁性種は人工生成物であると提示した。
【００２０】
ＥＰＲ分光測定方法を使用した一酸化窒素の検出に関する論争は解決されていないが、Ｎａｚｈａｔら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１４２７、２７６〜２８６、１９９９）は、亜硝酸塩由来の一酸化窒素検出技術を使用していた。
【００２１】
亜硝酸塩は、通常、Ｓ−ニトロソチオールよりも有意に大量に生体液中に存在する。多数の刊行物により、ヒト血液中のＳ−ニトロソチオール濃度は、２×１０−８から３×１０−６Ｍの範囲であることが示唆される（ＦｅｅｌｉｓｃｈおよびＳｔａｍｐｌｅｒ（１９９６）、Ｈｉｌｌｉｑｕｉｎら、（１９９７））。これにより、ＥＰＲ分光測定方法は約１０−６Ｍの検出限度であると以前から考えられているため、Ｓ−ニトロソチオール検出感度は不十分であることが示唆される（ＦｅｅｌｉｓｃｈおよびＳｔａｍｐｌｅｒ、１９９６；ＭｃＮａｍｍｅ、「食物分析、原理と技術、ＩＩ：物理化学的技術（Ｆｏｏｄ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ． ＩＩ Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」中の「電子常磁性共鳴分光測定方法（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）」、ＧｒｕｅｎｗｅｄｅｌおよびＷｈｉｔａｋｅｒ編、Ｍａｒｃｈｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８４、３４３、３８６；Ｆｉｓｃｈｅｒ、「フリーラジカル、１／２（Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ， １／２）」の「ＥＳＲ分光測定方法における構造およびフリーラジカル（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌｓ ｉｎ ＥＳＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）」、Ｊ．Ｋ．Ｋｏｃｈｉ編、「反応中間体有機化学シリーズ（ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、Ｇ．Ａ．Ｏｌａｈ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７３、４３５〜４９１）。意外にも、本発明者らは、ＥＰＲ分光測定方法を実際に使用して血液および他のヒト細胞外液中のＳ−ニトロソチオールを検出することができることを見出した。
【００２２】
Ｓ−ニトロソチオールの一酸化窒素への変換前に試料のｐＨを少なくとも１０．５に調整する場合、スピントラップの添加およびＳ−ニトロソチオールの一酸化窒素への変換工程を任意の順番で行うことができる。通常、少なくともｐＨ１０．５に緩衝化したスピントラップ溶液を試料に添加し、その後試料を処理してＳ−ニトロソチオールを一酸化窒素に変換する。
【００２３】
常磁性付加物の存在および量を検出する工程と、試料をＥＰＲ分光測定方法に供するか、常磁性付加物を有機溶媒に抽出するか、有機溶液をＥＰＲ分光測定方法に供することのいずれかによって行うことができる。当業者は、この有機溶媒の選択は使用するスピントラップおよび形成される付加物の性質に依存することを承知している。
【００２４】
あるいは、いくつかのスピントラップについては、スピンのラップの前にＳ−ニトロソチオールを有機溶媒中に抽出して、一酸化窒素およびチイルラジカルに変換するさらなる工程を含むことが有利であり得る。これは、有機溶媒および水性溶媒中で複合体を形成することができるジチオカルバメートの鉄（ＩＩ）複合体などのスピントラップで特に良好に作用する。同様に、この有機溶媒の選択は、スピントランプの性質および形成される付加物の性質に依存する。
【００２５】
本発明の方法を、試料への遊離チオール基と反応する化合物の付加によって改良することができる。これにより、Ｓ−ニトロソチオールが再形成される逆反応を起こすことなく試料混合物由来のチオールアニオン生成物が有効に除去される。したがって、反応平衡が一酸化窒素生成に移動して、検出に利用可能な遊離ＮＯ量を増加させる。
【００２６】
遊離チオール基と反応する任意の化合物（例えば、アルキル化剤およびグリコシル化剤）を使用することができる。多数の異なるアルキル化剤およびグリコシル化剤が既知であり、アルキル化剤の例には、マレイミド、Ｎ−アルキルマレイミド、Ｎ−アルキルフタルイミド、ヨードアセテート、ヨードアセトアミド、イミノピロリドン（４−イミノ−１，３−ジアゾビシクロ−（３，１０）−ヘキサン−２−オン（イメキソン）など）、アルカンチオスルホネート（特に、メタンチオスルホネート）、フルオロ置換アルキルフェノール（４−トリフルオロメチルフェノールなど）、およびエトペプチジルエポキシドが含まれる。Ｎ−Ｃ１−Ｃ４アルキル誘導体、特に、Ｎ−メチル、Ｎ−エチル、およびＮ−プロピルマレイミド、ならびにフタルイミドが好ましい。
【００２７】
本発明での使用に適切なスピントラッピング剤には、ラジカル生成物ＤＢＮＢＳ−ＮＯに変換されるニトロソ化合物（３，５−ジブロモ−４−ニトロソベンゼンスルホン酸（ＤＢＮＢＳ）など）が含まれる。ＤＢＮＢＳ誘導体および他のニトロソ化合物も使用することができ、これらには、重水素標識ＤＢＮＢＳ（ＤＢＮＢＳ−ｄ２）、１５Ｎ標識ＤＢＮＢＳ（ＤＢＮＢＳ−１５Ｎ）、ならびに重水素および１５Ｎの二重標識ＤＢＮＢＳ（ＤＢＮＢＳ−ｄ２−１５Ｎ）が含まれる。あるいは、ＤＢＮＢＳと類似の様式で重水素および／または１５Ｎで標識することができるＤＢＮＢＳのニトロソベンゼン類似体を使用することが可能である。ＮＯをトラップすることができる任意の他のスピントラッピング剤（例えば、ニトロメタン）を使用することもできる。
【００２８】
特に適切なスピントラッピング剤の群は、ジチオカルバメートの鉄（ＩＩ）複合体（Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミンジチオカルバメート（ＭＧＤ）またはジエチルジチオカルバメート（ＤＥＴＣ）など）である。これらの鉄（ＩＩ）複合体は、それぞれＭＧＤ２−Ｆｅ２＋およびＤＥＴＣ２−Ｆｅ２＋である。
【００２９】
これらの化合物は、多くの他のスピントラッピング剤よりも感度が高いため、非常に低濃度で存在する作用因子（Ｓ−ニトロソチオールなど）の定量的検出に良好に適用されることが有利である。さらに、ジチオカルバメート−鉄（ＩＩ）複合体の一酸化窒素との反応についての速度定数は、一酸化窒素とほとんどの他のスピントラッピング剤との反応についての速度定数よりはるかに高い。例えば、ＭＧＤ２−Ｆｅ２＋の一酸化窒素との反応についての速度定数は、１．２８×１０６Ｍ−１Ｓ−１である。他の生体酸化剤（Ｏ２●−およびＯ２など）と反応する前にＳ−ニトロソチオールから放出された一酸化窒素が迅速にトラップされることを確実にするほど速度定数が高いことが重要である。
【００３０】
しかし、本発明の方法で使用した高ｐＨによりチオカルバメート−鉄（ＩＩ）複合体が不安定化されると予想されるほど有効にジチオカルバメート複合体が作用することはいくらかの驚きである。
【００３１】
さらに、先の研究者らは、亜硝酸塩と反応してＥＰＲ分光測定によって一酸化窒素を含む生成物と区別可能な生成物を生成するジチオカルバメート−鉄（ＩＩ）複合体の特異性に伴う問題を経験している。しかし意外にも、反応が行われる高ｐＨおよび先の調査によって使用された高濃度のかわりに生体濃度のみの亜硝酸塩が試料中に存在するため、本発明者らは、ジチオカルバメート−鉄（ＩＩ）複合体の特異性に伴う問題を抱えていなかった。さらに、本発明者らは、以前の実験よりも非常に短時間後に試料を分析しており、これは結果に影響を与え得る。したがって要約すると、本発明の方法が成功した理由は完全に明らかではないにもかかわらず、上記で概説されるように種々の可能性が存在する。しかし、本方法の成功は、本分野の以前の研究者の経験から予想されないことが明白である。
【００３２】
スピントラッピング剤は、反応混合物中に約１０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度で存在する。しかし、至適濃度は、使用した特定のスピントラップに依存する。
【００３３】
一般に、スピントラップとしてニトロメタンを使用する場合、濃度は約０．１Ｍ〜０．５Ｍ、典型的には約０．４Ｍである。
【００３４】
ＤＢＮＢＳなどのニトロソスピントラップを、通常、約０．０５〜０．４Ｍ、好ましくは約０．２Ｍの濃度で使用する。
【００３５】
ＭＧＤおよびＤＥＴＣなどのジチオカルバメートを、約１５〜７０ｍＭ、好ましくは約２５〜５０ｍＭの濃度で使用することができる。
【００３６】
ジチオカルバメートの鉄（ＩＩ）複合体を使用する場合、モル過剰のジチオカルバメートが存在し、典型的には、ジチオカルバメート：鉄は約５：１であることを確実にすることも重要である。
【００３７】
スピントラップとしてジチオカルバメート複合体を使用する場合、スピントラッピング反応を、嫌気性条件下で行って、鉄（ＩＩ）イオンの鉄（ＩＩＩ）への酸化を防止しなければならない。したがって、通常、ジチオカルバメート複合体の添加前に、反応混合物を脱気する。
【００３８】
ニトロソチオール部分の一酸化窒素およびチイルアニオンへの種々の変換法（例えば、遷移金属イオン（特に、銅（Ｉ）および銅（ＩＩ）イオン）との反応、酸化還元循環、および照射）が既知である。しかし、使用される方法は、使用されるスピントラッピング剤に依存する。
【００３９】
スピントラップがＭＧＤ２−Ｆｅ２＋またはＤＥＴＣ２−Ｆｅ２＋などのジチオカルバメートである場合、銅（Ｉ）または銅（ＩＩ）イオンを使用して試料中のＳ−ニトロソチオールを一酸化窒素に変換することは好ましくない。これは、ジチオカルバメート鉄（ＩＩ）複合体がＮＯと反応する時、ＭＧＤ２−Ｆｅ２＋−ＮＯまたはＤＥＴＣ２−Ｆｅ２＋−ＮＯなどのジチオカルバメート−鉄（ＩＩ）−ＮＯ生成物が生成されるためである。この生成物型から得られたＥＰＲシグナルを、銅イオンから得られたＥＰＲシグナル（実際に、Ｓ−ニトロソチオールを一酸化窒素に変換するために使用することができる他の遷移金属の常磁性イオンのＥＰＲシグナル）と分離することができない。
【００４０】
したがって、スピントラップがジチオカルバメート鉄（ＩＩ）複合体である時、酸化還元循環系（例えば、ｐＨ＞１０．５でのヒドロキノン／キノン系）を使用してＳ−ニトロソチオールを一酸化窒素に変換することが好ましい。これは、ＳａｍｏｕｉｌｏｖおよびＺｗｅｉｅｒ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５８、３２２〜３３０、１９９８）に記載の系に類似するにもかかわらず、本発明者らは、ＭＧＤなどのジチオカルバメートがＳ−ニトロソチオールの分解を減少させるようであるため、試料の加熱は必要ないことを見出した。
【００４１】
ヒドロキノン／キノン系は、酸化還元状態の変化によってニトロソチオールを分解する酸化還元循環系である。ヒドロキノンの酸化には２つの電子が必要であるが、一電子伝達によってセミキノンラジカルを形成することができる。さらに、ヒドロキノンとキノンとの混合物は、キンヒドロンを形成する。これは、ヒドロキノンが電子供与体として作用し、キノンが電子受容体として作用する電荷移動複合体である。これはまた、ニトロソチオールの分解を補助することができる。
【００４２】
ヒドロキノン／キノン系などの酸化還元循環系がジチオカルバメート−鉄（ＩＩ）複合体中の鉄の酸化状態を干渉し、これにより複合体の一酸化窒素のトラッピングを防止すると予想されるだろう。しかし意外にも、これは事実と異なり、酸化還元循環系はスピントラップに影響を与えることなくＳ−ニトロソチオールの分解を補助するようである。
【００４３】
逆に、スピントラップがＤＢＮＢＳなどのニトロソ化合物である場合、系によって生成されたセミキノンラジカルがＤＢＮＢＳ−ＮＯ生成物（またはニトロソスピントラップ−ＮＯ生成物）由来のＥＰＲシグナルを干渉するため、キノン／ヒドロキノン系は試料中のニトロソチオール部分の分解に適切ではない。
【００４４】
したがって、ニトロソスピントラップについて、試料を遷移金属イオンで処理してＮＯを発生させることが好ましい。任意の遷移金属を使用することができるが、一般に銅イオンが使用されており、銅（Ｉ）イオンは特に有効であることが認められている。Ｓ−ニトロソチオールの分解は、以下の反応を介して進行する。
ＲＳＮＯ＋Ｃｕ＋＋Ｈ＋→ＲＳＨ＋ＮＯ＋Ｃｕ２＋
【００４５】
上記のように、ニトロソチオールの一酸化窒素への変換を、ｐＨのまたは系の酸素分圧の調整によって行うことができる。Ｓ−ニトロソチオールはアルカリ条件下で不安定であるため、本発明の方法を、上記のように、少なくともｐＨ１０．５で行い、これによりその分解が補助される。または、Ｓ−ニトロソチオールの一酸化窒素への変換は酸化還元反応であるため、反応混合物中に存在する酸素量の減少により、ＮＯ生成が増加する。これは、スピントラッピング剤がジチオカルバメート−鉄（ＩＩ）複合体である場合に、これらの薬剤でのスピントラッピングは上記のように嫌気性条件下で行われるため、特に有意である。
【００４６】
Ｓ−ニトロソチオールの一酸化窒素へのさらなる変換方法は照射であり、上記の任意のスピントラップに使用することができる（Ａｒｎｅｌｌｅら、Ｎｉｔｒｉｃ　Ｏｘｉｄｅ、１（１）、５６〜６４、１９９７）。この方法では、チイルアニオンの代わりにチイルラジカルが生成され、スピントラッピング剤を使用してＮＯの代わりにまたはＮＯに加えてこのラジカルがトラップされて、チイルラジカルの特徴的なシグナルが得られる。右スピントラップを選択した場合、常磁性種は異なるチイルラジカルと区別可能なＥＰＲシグナルを発生する。例えば、システイン、アルブミン、ヘモグロビン、およびグルタチオンラジカルについての異なるシグナルが得られる。したがって、本方法を一酸化窒素のトラッピングに加えてまたはその代わりに使用して、試料中に存在する異なるＳ−ニトロソチオールを区別および定量することができる。
【００４７】
したがって、本発明のさらなる局面では、
ｉ）チイルラジカルと反応することのできるスピントラッピング剤で試料を処理してＥＰＲシグナルが特徴的な常磁性付加物を生成し、試料を照射して試料中のＳ−ニトロソチオール部分を一酸化窒素およびチイルラジカルに変換する工程と、
ｉｉ）常磁性付加物の存在および量を電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光測定方法を使用して検出し、試料中のＳ−ニトロソチオール部分の濃度を計算する工程とを含む、
試料中の異なるＳ−ニトロソチオール部分の濃度を測定する方法を提供する。
【００４８】
チイルラジカルに特に適切なスピントラップには、５−（ジエトキシホスホリル）−５−メチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシドおよび５，５−ジメチル−１−ピロリン−Ｎ−オキシドが含まれる。
【００４９】
本発明の第１の局面と同様に、常磁性付加物の存在および量の検出工程を、試料をＥＰＲ分光測定方法に供するか、常磁性付加物を有機溶媒中に抽出して、有機溶媒をＥＰＲ分光測定方法に供することによって行うことができる。当業者は、有機溶媒の選択は、使用するスピントラップおよび形成される付加物の性質に依存することを認識すると思われる。
【００５０】
あるいは、本発明の第１の局面にも記載されるように、いくつかのスピントラップと共にスピントラップの付加および一酸化窒素およびチイルラジカルへの変換前にＳ−ニトロソチオール部分を抽出するさらなる工程を含むことが有利であり得る。
【００５１】
各ニトロソチオール種の別の濃度測定法は、本発明の第１の局面の方法とさらなる分離技術（例えば、ＨＰＬＣなどのクロマトグラフ法またはキャピラリー電気泳動などの電気泳動法）を組み合わせることである。このような方法を、スピントラップ添加前後に行うことができる。
【００５２】
本発明の方法を使用して、任意の型の化学的または生物学的流動物のニトロソチオール含有量を評価することができるが、特に、Ｓ−ニトロソチオール濃度が低く既知の方法で定量できない生体試料の使用に適切である。本発明の方法は、１０−８Ｍほどの濃度のＳ−ニトロソチオールを定量することができる。
【００５３】
したがって、本方法を使用して、例えば、ヒトもしくは動物の全血、血清、血漿、滑液、尿、脳脊髄液、腹水、歯肉溝滲出液、またはヒトもしくは動物起源の任意の他の組織もしくは細胞外液Ｓ−ニトロソチオール濃度を同定することができる。あるいは、他の生体培養液（細胞培養液など）または化学系中のＳ−ニトロソチオール濃度を同定することができる。
【００５４】
試験試料が血液製剤である場合、回収時または回収直後に試料にキレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）を添加して、試料調製および保存の間にＳ−ニトロソチオールと反応し得る過剰な遷移金属イオンをキレート化することが好ましい。
【００５５】
ニトロソチオールレベルが広範な種々の疾患および病態の患者に影響を与えるため、本発明の方法は、これらの疾患の診断、適切な治療の同定、ならびに治療のおよび有効性のモニタリングに有用であり得る。
【００５６】
ニトロソチオールレベルが影響を受ける疾患および病態には、敗血症ショック、腎疾患、心血管疾患、喘息、慢性関節リウマチ、全身性細菌感染（結核など）、糖尿病、炎症性関節疾患、脳虚血などが含まれる。
【００５７】
さらに、アンギナ治療に使用したいくつかの薬物（有機硝酸塩など）はＮＯを発生し、それによりＳ−ニトロソチオールレベルに影響を与え得る。したがって、本発明の方法は、このような治療、特に「硝酸塩抵抗性」の場合特に有用であり得る。さらに、ニトロシル化非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含む開発中の一定の薬物は、ニトロソチオール基を含み、本発明の方法をこのような薬物の代謝および胃腸毒性の評価に使用することができる。
【００５８】
したがって、本発明のさらなる局面では、
ｉ）Ｓ−ニトロソチオール部分を変換する前に試料のｐＨを少なくとも約１０．５に調整し、一酸化窒素と反応することのできるスピントラッピング剤で患者由来の体液試料を処理してＥＰＲシグナルが特徴的な常磁性付加物を生成し、試料中のＳ−ニトロソチオール部分を一酸化窒素に変換する工程と、
ｉｉ）常磁性付加物の存在および量を電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光測定方法を使用して検出し、試料中のＳ−ニトロソチオール部分の濃度を計算する工程とを含む、
患者のＳ−ニトロソチオールレベルに影響を受ける疾患もしくは病態の進行もしくは治療を診断もしくはモニタリングする方法、またはＳ−ニトロソチオールレベルに影響を受ける薬物療法の有効性もしくは毒性をモニタリングもしくは評価する方法を提供する。
【００５９】
試料は、患者から採取した全血、血清、血漿、滑液、尿であり得る。
【００６０】
好ましい条件は、本発明の第１の局面に記載されている。
【００６１】
本発明を本明細書中に以下の非限定的な実施例および図面を参照してより詳細に記載する。
【００６２】
実施例１
血液および滑液試料を、慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者から得た。全ての試料を簡素なガラスチューブに取り、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。血清および滑液を取り出し、分析まで−７０℃で保存した。
【００６３】
０．０１Ｍ　１，４−ベンゾキノンおよび０．１Ｍヒドロキノン溶液を、ｐＨ＞１０．５に調整したＴｒｉｓ−ＨＣＬ緩衝液中に調製した。ｐＨ＞１０．５に調整したＴｒｉｓ−ＨＣＬ溶液を、窒素ガスを使用して１５分間脱気した。次いで、脱気緩衝液を使用して、１０ｍＭ硫酸第一鉄溶液を調製した。次いで、バキュティナー中で硫酸第一鉄アンモニウム溶液をＭＧＤ粉末に添加して、ＭＧＤ２−Ｆｅ２＋複合体（ＭＧＤの最終濃度は５０ｍＭであった）を形成させた。ガスタイトシリンジを使用してＭＧＤ２−Ｆｅ２＋溶液（１００μＬ）を取り出し、バキュティナー中で１００μＬヒドロキノン／キノン系に添加した。次いで、ニトロソグルタチオン（３００μＬ）（最終濃度５μＭ）溶液を添加した。検量線を構築するために、ニトロソグルタチオン濃度を変化させて、最終濃度２．５、１．２５、０．６１２５、および０．３１２５μＭを得た。慢性関節リウマチ（ＲＡ）患者由来の滑液または血清（３００μＬ）を、ニトロソグルタチオンのかわりに系に添加した。全ての試料を、ニトロソグルタチオン添加または試料添加から５分後にＥＰＲ分光測定方法によって試験した。
【００６４】
ＥＳ−ＵＣＸ２円筒形モードＸバンドキャビティを具備するＪＥＯＬ ＪＥＳ−ＲＥ１Ｘ分光光度計（Ｊｅｏｌ（ＵＫ）Ｌｔｄ．、Ｗｅｌｙｗｎ Ｇａｒｄｅｎ Ｃｉｔｙ、Ｅｎｇｌａｎｄ）からＥＰＲスペクトルを得た。試料を室温のＷＧ−ＬＣ−１１石英フラットセル（Ｗｉｌｍａｄ Ｇｌａｓｓ、Ｂｕｅｎａ、ＮＪ）中で分析した。装置パラメータは以下の通りである：マイクロ波振動数９．４５ＧＨｚ、マイクロ波出力２０ｍＶ、センターフィールド３３０．０ｍＴ、探索幅±５ｍＴ、探索時間２５０秒、測定点数８１９２、時定数１秒、変調周波数１００ｋＨｚ、レシーバ増幅２〜１００００、変調幅０．４ｍＴ。
【００６５】
系に添加したニトロソグルタチオンが分解され、スピントラップが遊離ＮＯと反応して、常磁性複合体（ＭＧＤ）２−Ｆｅ２＋−ＮＯが得られる。ＥＰＲ分光測定方法によって（ＭＧＤ）２−Ｆｅ２＋−ＮＯの特徴的な３ラインシグナルが検出された。系に添加したニトロソグルタチオン濃度に対する（ＭＧＤ）２−Ｆｅ２＋−ＮＯシグナルのピーク域のプロッティングによって検量線を構築した。線形回帰係数０．９９７４が計算された（図１）。血清および滑液試料中に存在するＳ−ニトロソチオール（ＲＳＮＯ）が分解されて、ＭＧＤ２−Ｆｅ２＋−ＮＯの形態で放出ＮＯを測定した（図２ａおよびｂ）。
【００６６】
本実施例では、ヒドロキノン／キノン系をｐＨ＞１０．５で使用して、存在するＲＳＮＯを分解した。ＳａｍｏｕｉｌｏｖおよびＺｗｅｉｅｒ（１９９８）は、この系を使用し、且つ試料を６０℃に加熱した場合に１０〜３０分以内にＲＳＮＯの分解を促進することができることを示した。本発明者らの実験は、図２に示す機構により、ＭＧＤはＲＳＮＯの分解を減少させるようであるため、試料の加熱は必要ないことを示唆している。ＭＧＤ２−Ｆｅ２＋はＲＳＮＯを分解することは未だ示されていないにもかかわらず、Ａｒｎｅｌｌｅら（１９９７）は、ジエチルジチオカルバメート（ＤＥＴＣ）（別のジチオカルバメート）がこの機構によって分解を促進することを示していた。通常、銅などの金属イオンを使用してＲＳＮＯを分解する。あいにく、銅（ＩＩ）は常磁性であり、そのＥＰＲシグナルをＭＧＤ２−Ｆｅ２＋−ＮＯのＥＰＲシグナルから分離することができないため、ここでこれらを使用することはできない。
【００６７】
実施例２
ＤＢＮＢＳ溶液（０．２Ｍ）を、ｐＨ＞１０．５に調整したＴｒｉｓ−ＨＣｌ中で調製した。ＤＢＮＢＳ溶液をニトロソ−グルタチオンに添加して、最終濃度をＤＢＮＢＳで０．１Ｍ、ニトロソグルタチオンで０．５ｍＭとした。次いで、硫酸銅（最終濃度１００μＭが得られる）を反応混合物に添加した。直後および２４時間後に、混合物をＥＰＲ分光測定方法で試験した。
【００６８】
ＥＳ−ＵＣＸ２円筒形モードＸバンドキャビティを具備するＪＥＯＬ ＪＥＳ−ＲＥ１Ｘ分光光度計（Ｊｅｏｌ（ＵＫ）Ｌｔｄ．、Ｗｅｌｙｗｎ Ｇａｒｄｅｎ Ｃｉｔｙ、Ｅｎｇｌａｎｄ）からＥＰＲスペクトルを得た。試料を室温のＷＧ−ＬＣ−１１石英フラットセル（Ｗｉｌｍａｄ Ｇｌａｓｓ、Ｂｕｅｎａ、ＮＪ）中で分析した。装置パラメータは以下の通りである：マイクロ波振動数９．４５ＧＨｚ、マイクロ波出力４ｍＶ、センターフィールド３３６．０ｍＴ、探索幅±５ｍＴ、探索時間１２０秒、測定点数８１９２、時定数０．１秒、変調周波数１００ｋＨｚ、レシーバ増幅１６００〜１００００、変調幅０．０７９ｍＴ。
【００６９】
系に添加したニトロソグルタチオンが分解され、スピントラップが遊離ＮＯと反応して、常磁性生成物ＤＢＮＢＳ−ＮＯが得られる。ＥＰＲ分光測定方法によってＤＢＮＢＳ−ＮＯの特徴的な３ラインシグナルが検出された。２９時間後に試料を再試験した場合、ＤＢＮＢＳ−ＮＯシグナルは最初に測定したシグナルの高さと比較して高かった（図４）。ＤＢＮＢＳ−ＮＯ生成物の蓄積がこの時点で最も高いと考えられるため、２９時間後に試料を再試験した。
【００７０】
本実施例では、スピントラップとしてＤＢＮＢＳを使用し、アルカリ性のｐＨで銅（ＩＩ）イオンを使用してＲＳＮＯを分解する。これは、ＤＢＮＢＳ−ＮＯ生成物のｇ値が高く、シグナルが重複しないため可能である。系によって生成されたセミキノンラジカルがＤＢＮＢＳ−ＮＯ生成物由来のＥＰＲシグナルを干渉するため、ヒドロキノン／キノン系をＤＢＮＢＳと共に使用することができない。高ｐＨではＲＳＮＯの安定性が大きく低下するため、アルカリ性条件を全ての場合に使用した。
【００７１】
実施例３−試料のアルキル化剤とのプレインキュベーション
アッセイの結果を改良するために、生体液（７００μＬ）を、スピントラップおよび分解混合物の添加前に１０μＬの２５０ｍＭ Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）と２０分間インキュベートした。ＮＥＭは、遊離基をアルキル化することにより（Ｍｅａｄら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、３４（６）、１２７５〜１２８０（１９９９））、再形成されたＲＳＮＯから放出されたＮＯ●のＲＳＮＯへの再形成を防止することが既知である。したがって、スピントラップとの反応に利用可能な遊離ＮＯ●の量が増加する。以下の実験を行った：
１）２５０ｍＭ ＮＥＭ（１０μＬ）を５００μＬの脱イオン水に添加する；
２）２５０ｍＭ ＮＥＭ（１０μＬ）を５００μＬの１．２５ｍＭニトロソグルタチオン溶液に添加する；および
３）２５０ｍＭ ＮＥＭ（１０μＬ）を１０００ｎＭニトロソグルタチオンを添加した５００μＬのＲＡ滑液に添加する。
【００７２】
実験１〜３では、試料を０．２Ｍ ＣＡＰＳ緩衝液中で調製した５００μＬの５０ｍＭ （ＭＧＤ）２−Ｆｅ２＋（５０ｍＭ ＭＧＤ、１０ｍＭ Ｆｅ２＋）と混合し、ＥＰＲ分光測定によって試験した。各実験を脱イオン水と置換したＮＥＭで繰り返した。全ての実験を２連で行い、結果を図５および６に示す。
【００７３】
図５から認められるように、標準溶液（２）および滑液添加試料（３）中に存在するＲＳＮＯが測定された場合に検出される（ＭＧＤ）２−Ｆｅ２＋−ＮＯ●シグナルのシグナルの高さの増加に起因するＮＥＭの存在を測定した。滑液試料では、おそらくアルビミンなどの多数のタンパク質チオールが存在するという事実によってＮＥＭの効果はより明白である。重要なことには、この結果はまた、ＮＥＭは、硫黄原子によるアルキル化によって（ＭＧＤ）２−Ｆｅ２＋複合体を不安定化せず、鉄イオンと反応してスピントラッピング複合体を形成することを示した。実験１では、ＮＥＭがブランク試料中で時折認められる少量の（ＭＧＤ）２−Ｆｅ２＋−ＮＯ●シグナルの生成を防止できることが示された（図６）。２５０ｍＭ ＮＥＭ溶液を分析した時、ＥＰＲスペクトル中に小さく明白な一重項が存在し、これは（ＭＧＤ）２−Ｆｅ２＋−ＮＯ●シグナルの第１のラインと重複する。これを可能とするために、全てのデータ分析をＥＰＲシグナルの中央線上から行った。
【００７４】
最後に、方法によって変化するため、アッセイ精度を繰り返した。滑液試料を、１０００ｎＭニトロソグルタチオンでスパイクした。次いで、試料（０．７ｍＬ）を、分析前に２５０ｍＭ ＮＥＭ（１０μＬ）と２０分間インキュベートした。試料（１００μＬ）を、ｐＨ１０．５の０．２Ｍ ＣＡＰＳ緩衝液中で調製した１００μＬ ５０ｍＭ （ＭＧＤ）２−Ｆｅ２＋（５０ｍＭ ＭＧＤ、１０ｍＭ Ｆｅ２＋）に添加した。本方法で５試料を調製し、ＥＰＲ分光測定方法によって分析した。％ＲＳＤを計算し、４．６５％であった。
【００７５】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＥＰＲ分光測定方法によって検出された（ＭＧＤ）２−Ｆｅ２＋−ＮＯシグナルのピーク域に対するニトロソグルタチオン濃度を示す検量線を示す図である。回帰計数は、実験法が線形であることを示す。
【図２】ａ）レシーバ増幅１００００で得られた血清およびｂ）レシーバ増幅５０００で得られた滑液由来の（ＭＧＤ）２−Ｆｅ２＋および０．０１Ｍ １，４−ベンゾキノン／０．１ＭヒドロキノンのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液（ｐＨ＞１０．５）を使用したニトロソチオールから放出されたＮＯの測定を示すスペクトル組を示す図である。装置のパラメータは以下の通りであった：マイクロ波振動数９．４５ＧＨｚ、マイクロ波出力２０ｍＶ、センターフィールド３３０．０ｍＴ、探索幅±５ｍＴ、探索時間１２０秒、測定点数８１９２、時定数１秒、変調周波数１００ｋＨｚ、変調幅０．４ｍＴ。
【図３】ＤＥＴＣによるＳ−ニトロソチオール分解の推奨される機構を示す図である（Ａｒｎｅｌｌｅら、Ｎｉｔｒｉｃ　Ｏｘｉｄｅ、１（１）、５６〜６４、１９９７から抜粋）。
【図４】１００μＭ Ｃｕ（ＩＩ）ＳＯ４を含むＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＞１０．５）中に調製したニトロソグルタチオン（０．５ｍＭ）から放出されたＮＯの測定を示す図である。成分を組み込んでから２９時間後にＥＰＲスペクトルを得た。シグナル（ａ）はＤＢＮＢＳ−ＳＯ３−付加物に相当し、シグナル（ｂ）はＤＢＮＢＳ−ＮＯ生成物に相当する。装置パラメータは以下の通りである：マイクロ波振動数９．４５ＧＨｚ、マイクロ波出力１０ｍＶ、センターフィールド３３６．０ｍＴ、探索幅±５ｍＴ、探索時間１５０秒、測定点数８１９２、時定数０．３秒、変調周波数１００ｋＨｚ、レシーバ増幅５００、変調幅０．２ｍＴ。
【図５】ＲＳＮＯアッセイ法で測定した（ＭＧＤ）２−Ｆｅ２＋−ＮＯ●シグナルに対するＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）の効果を示す図である。ＲＳＮＯから放出されたＮＯ●を、ＮＥＭの存在下または非存在下での１．２５ｍＭニトロソグルタチオン標準水溶液（Ａ）および１０００ｎＭニトログルタチオン（Ｂ）をスパイクしたＲＡ滑液試料中で測定した。２つの値は１０％未満で変化した。
【図６】（ＭＧＤ）２−Ｆｅ２＋調製物中で時折認められる（ＭＧＤ）２−Ｆｅ２＋−ＮＯ●シグナルに対するＮＥＭの効果を示す図である。スペクトルＡは、（５０ｍＭ ＭＧＤ、１０ｍＭＦｅ２＋、５００μＬ）、２５０ｍＭ ＮＥＭ（１０μＬ）、および脱イオン水（４９０μＬ）を含む溶液由来のＥＰＲスペクトルを示す。スペクトルＢは、ＮＥＭを脱イオン水にかえた以外はスペクトルＡと同一である。装置パラメータは以下の通りである：マイクロ波振動数９．４５ＧＨｚ、マイクロ波出力２０ｍＶ、センターフィールド３３０．０ｍＴ、探索幅±４ｍＴ、探索時間８０秒、測定点数８１９２、時定数１秒、変調幅１ｍＴ、レシーバ増幅１０００。ＥＰＲスペクトル５スキャンの平均であった。図６Ｂ中の３つの黒四角は、時折認められる（ＭＧＤ）２−Ｆｅ２＋−ＮＯ●に割り当てた３つのラインシグナルの位置を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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