(57)【要約】本発明は、大腸菌のＯｍｐＦタンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター、前記発現ベクターで形質転換された微生物、および前記形質転換された微生物を用いて目的タンパク質を菌体外へ生産する方法に関する。本発明の組み換え発現ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子、ＯｍｐＦプロモーターおよびＯｍｐＦ遺伝子を含む。ＯｍｐＦプロモーターを用いた構成的発現により、細胞の増殖と同時にＯｍｐＦ融合タンパク質の分泌生産が開始され、また、細胞濃度が高まるにつれ、前記タンパク質の分泌生産される量も連続的に増加するというように、本発明に従うと、従来の方法に比べてより簡単な方法で目的タンパク質を菌体外へ生産することができ、これにより、目的タンパク質を高濃度細胞培養で大量生産することが可能となる。
2004521656.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンピシリン耐性遺伝子、ＯｍｐＦプロモーターおよびＯｍｐＦ遺伝子を含み、図２の遺伝子地図で表される、発現ベクターｐＯｍｐＦ６。
【請求項２】
請求項１に記載の発現ベクターｐＯｍｐＦ６によって形質転換された大腸菌ＢＬ１０１／ｐＯｍｐＦ６ （ＫＣＴＣ １０２６ＢＰ）。
【請求項３】
発現ベクターｐＯｍｐＦ６を用いて目的タンパク質を菌体外へ生産させる方法であって、
（ｉ）請求項１に記載の発現ベクターｐＯｍｐＦ６に、タンパク質分解酵素によって認識および切断されるオリゴペプチドをコードする遺伝子と、目的タンパク質をコードする遺伝子とを導入し、目的タンパク質を菌体外へ生産する組み換え発現ベクターを作製する工程、
（ｉｉ）前記組み換え発現ベクターによってＯｍｐＦ遺伝子欠損宿主微生物を形質転換して形質転換微生物を得る工程、
（ｉｉｉ）前記形質転換微生物を培養して培地からＯｍｐＦ−融合タンパク質を得る工程、および
（ｉｖ）前記融合タンパク質をタンパク質分解酵素で処理して目的タンパク質を回収する工程、
を含んでなる、上記方法。
【請求項４】
タンパク質分解酵素が、Ｘａ因子、エンテロキナーゼ、ゲネナーゼ、ＩｇＡプロテアーゼ、インテイン、トロンビン、トリプシン、ペプシン、ズブチリシン、またはプラスミンであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
目的タンパク質が、ＯｍｐＦと融合可能な、ペプチド、酵素または抗体であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
目的タンパク質がβ−エンドルフィンであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
組み換え発現ベクターがｐＯｍｐＦ６βＥであることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
宿主微生物がエシェリキア属またはサルモネラ属の微生物であることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の属する技術分野
本発明は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の外膜タンパク質Ｆ（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｆ： ＯｍｐＦ）を用いて目的タンパク質を菌体外へ生産させる方法に関する。さらに具体的には、本発明は、ＯｍｐＦおよび目的タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター、前記発現ベクターによって形質転換された大腸菌、ならびにＯｍｐＦを用いて目的タンパク質を菌体外へ生産させる方法に関する。
【０００２】
従来の技術
大腸菌における目的タンパク質の菌体外生産は、大腸菌のタンパク質分解酵素による分解から分泌タンパク質が保護されるという点、分泌過程を通して目的タンパク質の正しい折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）が誘導され、不溶性封入体の形成が防止されるという点、および、分泌過程でＮ−末端の分泌シグナルペプチドが目的タンパク質から除去されるため、天然に存在するものと同一のアミノ酸配列が保持されるという点で、極めて効果的な方法であることがよく知られている。また、この方法は、高濃度培養法および連続培養法により目的タンパク質の大量生産を可能にする。さらに、細菌タンパク質が培地中にほとんど分泌されないことから、この方法は目的タンパク質の精製にも役立つ。
【０００３】
このように菌体外生産はいくつもの利点を有することから、大腸菌において目的の異種タンパク質を生産するために、菌体外生産方法に関する様々な研究が積極的に行われてきた。今までに開発された菌体外生産方法は次のように３種類のカテゴリーに分類できる。すなわち、１番目の方法は、分泌シグナル配列および目的の異種タンパク質の組み換えによる菌体外生産方法である。例えば、Ｔｏｋｓｏｙらは、分泌シグナル配列とマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）との融合タンパク質を用いて、細胞表面上にＴａｑＩタンパク質を生産し、Ｌｏらは、大腸菌の細胞表面上に枯草菌由来のβ−１，４−エンドグルカナーゼを生産し、またＮａｇａｈａｒｉらは、ＯｍｐＦ分泌シグナルペプチドおよびＯｍｐＦのＮ−末端８アミノ酸の組み換えにより、大腸菌の細胞表面上にβ−エンドルフィンを生産した。さらに、Ｙａｍａｍｏｔｏらは、ＯｍｐＦ分泌シグナル配列を用いてハーベイマウス肉腫ウイルス由来のｐ２１タンパク質の菌体外生産を試みた。しかしながら、ｐ２１タンパク質は細胞表面上に生産されずに封入体中に蓄積されていることが判明した（参照： Ｔｏｋｓｏｙ Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １３： ８０３−８０８， １９９９； Ｌｏ Ａ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ５４：２２８７−２２９２， １９８８； Ｎａｇａｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， ４： ３５８９−３５９２， １９８５； および、Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ３５：６１５−６２１， １９９１）。２番目の方法は、大腸菌の分泌タンパク質および目的タンパク質の組み換えによる菌体外生産方法である。例えば、Ｂａｎｅｙｘらは、大腸菌の膜タンパク質であるＴｏｌＡＩＩＩを一緒に用いて、細胞表面上にＯｍｐＡ−ＴＥＭ−β−ラクタマーゼ融合タンパク質を生産し、Ｒｏｂｂｅｎｓらは、ｋｉｌ遺伝子を用いてインターロイキン−２を生産し、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌらは、リポタンパク質ＢＲＰ（バクテリオシン放出タンパク質）を用いて、細胞表面上にβ−ラクタマーゼを生産し、また、Ａｒｉｓｔｉｄｏｕらは、培地内へグリシンを添加することにより、ＢＲＰを用いた菌体外生産の収率を増加させた（参照： Ｂａｎｅｙｘ Ｆ．および Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｍ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．， １４：１３−２２， １９９８； Ｒｏｂｂｅｎｓ Ｊ．ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．， ６：４８１−４８６， １９９５； ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌ Ｆ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ６４：３９２−３９８， １９９８； および、Ａｒｉｓｔｉｄｏｕ Ａ．Ａ．ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．， １５：３３１−３３６、１９９３）。３番目の方法は、外膜のない大腸菌、すなわち、外膜とペリプラズムがなく内膜のみをもつ突然変異大腸菌Ｌ型株による菌体外生産方法である。Ｌ型株の培養物中での異種タンパク質の菌体外生産は、発現したタンパク質が内膜のみを通過し培地中に分泌されるため、従来の方法に比べてより簡単である。例えば、Ｋｕｊａｕらは、Ｌ型突然変異体ＲＶ３０８株を用いて、細胞表面上にミニ抗体（ｍｉｎｉＡｂ）を生産した（参照： Ｋｕｊａｕ Ｍ． Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４９： ５１−５８， １９９８）。
【０００４】
上記説明のとおり、大腸菌の細胞表面上に目的の異種タンパク質を生産させるための様々な方法が開発されてきた。しかしながら、これら先行技術による方法のほとんどは、細菌のタンパク質分解酵素により異種タンパク質が部分的に分解され、それにより精製過程が複雑となり、高濃度細胞培養が不可能となるという点において、あまり満足のいくものではないことがわかった。さらに、大腸菌Ｌ型株を使用する菌体外生産は、この大腸菌株が環境ストレスに対して抵抗力が弱く、またライフサイクルも短いことから、高濃度培養法には不向きであるという難点を有する。
【０００５】
このような状況のもと、大腸菌の細胞表面上に目的の異種タンパク質を生産させる別の方法の探索・開発が強く望まれている。
【０００６】
これに対して、本発明者らが大腸菌の細胞表面上に目的の異種タンパク質を菌体外生産する方法を開発するために鋭意努力した結果、大腸菌の外膜タンパク質Ｆ（ＯｍｐＦ）および目的タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターによって形質転換された組み換え大腸菌の培地中に、この融合タンパク質を効率よく分泌させることができ、また、目的タンパク質は、融合タンパク質からＯｍｐＦを除去することにより、単純な方法で精製され得ることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】
発明の概要
従って、本発明の主な目的は、大腸菌のＯｍｐＦをコードする遺伝子および目的の異種タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記発現ベクターによって形質転換された微生物を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに他の目的は、前記形質転換された微生物を培養し、それにより目的タンパク質を菌体外へ生産させる方法を提供することである。
【００１０】
前述した本発明の目的および構成は添付した図面および下記の説明によって明らかになるであろう。
【００１１】
発明の開示
本発明の発現ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子、ＯｍｐＦプロモーターおよびＯｍｐＦ遺伝子を含む。
【００１２】
発現ベクターを用いて目的タンパク質を菌体外へ生産させる方法は、前記発現ベクターｐＯｍｐＦ６に、タンパク質分解酵素によって認識および切断されるオリゴペプチドをコードする遺伝子と、目的タンパク質をコードする遺伝子を導入し、目的タンパク質を菌体外へ生産させる組み換え発現ベクターを作製する工程と、前記組み換え発現ベクターによってＯｍｐＦ遺伝子欠損宿主微生物を形質転換させて、形質転換された微生物を得る工程と、前記形質転換微生物を培養して、培地からＯｍｐＦ−融合タンパク質を得る工程と、前記融合タンパク質をタンパク質分解酵素で処理して、目的タンパク質を回収する工程とを含む。この際、タンパク質分解酵素としては、Ｘａ因子、エンテロキナーゼ（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）、ゲネナーゼ（ｇｅｎｅｎａｓｅ）（Ｈｉｓ−ＴｙｒまたはＴｙｒ−Ｈｉｓ）、ＩｇＡプロテアーゼ（Ｐｒｏ／Ｓｅｒ−Ａｒｇ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ／Ａｌａ−Ｐｒｏ）、インテイン、トロンビン、トリプシン、ペプシン、ズブチリシンまたはプラスミンを使用できるが、Ｘａ因子を使用することが望ましい。目的タンパク質としては、ＯｍｐＦと融合可能な、ペプチド、酵素、抗体などを使用できるが、β−エンドルフィンを使用することが望ましい。宿主微生物としては、特に限定するものではないが、エシェリキア属またはサルモネラ属の微生物を使用することが望ましい。
【００１３】
以下、本発明をさらに詳しく説明する。
【００１４】
本発明者らは、６種類の大腸菌株（ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＭＣ４１００、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、およびＷ３１１０）を培養し、各培養物より分離した外膜タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、ＢＬ２１（ＤＥ３）株でＯｍｐＦタンパク質が過剰発現されていることを確認した。本発明者らは、大腸菌のＯｍｐＦ遺伝子、ＯｍｐＦプロモーターおよびアンピシリン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐＯｍｐＦ６を作製した。ＯｍｐＦ遺伝子とＯｍｐＦプロモーターは、鋳型としての大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）から単離したゲノムＤＮＡおよび特異的プライマーを用いてＰＣＲを行うことによりクローニングした。前記発現ベクターｐＯｍｐＦ６によって大腸菌ＢＬ１０１株を形質転換し、得られた形質転換体を大腸菌ＢＬ１０１／ｐＯｍｐＦ６と命名した。この得られた形質転換体を２００１年６月１日付けにて韓国大田広域市儒城区魚隠洞５２番地（郵便番号３０５−３３３）に所在の国際寄託機関である韓国生命工学研究院遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託番号ＫＣＴＣ１０２６ＢＰとして寄託した。
【００１５】
次に、本発明者らは、前記発現ベクターｐＯｍｐＦ６を用いた融合タンパク質の菌体外生産の一例を示すために、組み換え発現ベクターｐＯｍｐＦ６βＥを作製した。この組み換え発現ベクターは、β−エンドルフィンをコードするｃＤＮＡ、ＯｍｐＦタンパク質をコードする遺伝子、ＯｍｐＦプロモーター、ＯｍｐＦタンパク質とβ−エンドルフィンとの間に挿入された、Ｘａ因子によって認識および切断されるオリゴペプチドをコードする遺伝子、およびアンピシリン耐性遺伝子を含む。本発明者らは、前記組み換え発現ベクターｐＯｍｐＦ６βＥによって大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｃｏ．、アメリカ）を形質転換し、この組み換え大腸菌株を培養することにより、細胞表面上にＯｍｐＦ−β−エンドルフィン融合タンパク質を生産させ、培地から融合タンパク質を回収した。回収した融合タンパク質は、初めに、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製した。次いで、Ｘａ因子を用いて融合タンパク質からＯｍｐＦタンパク質を除去することにより、β−エンドルフィンタンパク質を回収した。
【００１６】
従来の細胞表面ディスプレイ系においては、この融合タンパク質が大腸菌のタンパク質分解酵素によって分解されることから、高濃度培養法は事実上不可能であった。ＯｍｐＦプロモーターを用いた構成的発現により、細胞の増殖と同時にＯｍｐＦ融合タンパク質の分泌生産が開始され、また、細胞濃度が高まるにつれ、前記タンパク質の分泌生産される量も連続的に増加するというように、本発明に従うと、従来の方法に比べてより簡単な方法で目的タンパク質を菌体外へ生産させることができ、これにより、目的タンパク質を高濃度細胞培養で大量生産することが可能となる。
【００１７】
以下の実施例により、本発明をさらに説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものであると解釈されるべきではない。
【００１８】
実施例
実施例１： ＯｍｐＦを過剰発現する大腸菌株の選択
組み換えタンパク質生産に幅広く用いられる６種類の大腸菌株を選択して、それぞれの大腸菌株から菌体外膜タンパク質を精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行うことにより相互に比較した。このように選択された６種類の大腸菌株は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）［Ｆ− ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ− ｍＢ−）ｇａｌ ｄｃｍ（ＤＥ３）、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を担持するプロファージ］（Ｎｏｖａｇｅｎ Ｃｏ．、アメリカ）、ＨＢ１０１ ［Ｆ− ｈｓｄ２０ （ｒｋ−， ｍｋ−） ｒｅｃＡ１３ ａｒａ−１４ ｐｒｏＡ２ ｌａｃＹ１ ｇａｌＫ２ ｒｐｓＬ２０（ｓｔｒ） ｘｙｌ１−５ ｍｔｌ−１ ｓｕｐＥ４４ λ−］ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、アメリカ）、ＪＭ１０１ ［ｓｕｐＥ ｔｈｉ−１ Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ） ［Ｆ’ｔｒａＤ３６ ｐｒｏＡＢ ｌａｃＩｑＺ ΔＭ１５］］ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏ．、アメリカ）、ＭＣ４１００ ［Ｆ− ａｒａＤ１３９ Δ（ａｒｇＦ−ｌａｃ）Ｕ１６９ ｒｐｓＬ１５０（ｓｔｒｒ） ｒｅｌＡ１ ｆｌｂＢ５３０１ ｄｅｏＣ１ ｐｔｓＦ２５ ｒｂｓＲ］ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏ．、アメリカ）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ ［ＳｕｐＥ４４ ｈｓｄＲ１７ ｒｅｃＡ１ ｅｎｄＡ１ ｇｙｒＡ９６ ｔｈｉ ｒｅｌＡ１ ｌａｃＦ（ｐｒｏＡＢ＋ ｌａｃＩｑ ｌａｃＺＭ１５ Ｔｎ１０（ｔｅｔｒ）］ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｏ．、アメリカ）、およびＷ３１１０ ［Ｋ−１２から誘導、λ−、Ｆ−、原栄養菌株］（ＫＣＴＣ２２２３）であった。これらの大腸菌株をそれぞれ、５０ｍＬのＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５ｇ／Ｌ）中、３７℃で培養した。
【００１９】
それぞれの培養物から細菌細胞を回収し、各大腸菌の外膜タンパク質を次のような方法で分画した。培養物３ｍＬを４℃にて３，５００ ｘ ｇで５分間遠心分離することにより細菌細胞の１回目の回収を行った。回収した細菌細胞を、１ｍＬ Ｎａ２ＨＰＯ４ （ｐＨ７．２）緩衝溶液で洗浄し、再び４℃にて３，５００ ｘ ｇで５分間遠心分離し、回収した細菌細胞をＮａ２ＨＰＯ４ （ｐＨ７．２）緩衝溶液０．５ｍＬ中に懸濁した。次いで、細菌細胞懸濁液を超音波処理（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）し、室温にて１０，０００ ｘ ｇで２分間遠心分離することにより細胞破片を除去した。上清を室温にて１０，０００ ｘ ｇで３０分間遠心分離し、得られたペレットを、０．５％（ｗ／ｖ） サルコシル（ｓａｒｃｏｓｙｌ）を含む１０Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）緩衝溶液０．５ｍＬに懸濁することにより、外膜タンパク質画分を調製した。
【００２０】
前記画分を、３７℃で３０分間インキュベートし、４℃にて１０，０００ ｘ ｇで３０分間遠心分離した。得られたペレットを、１０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ７．２）緩衝溶液で洗浄し、５０μｌのＰＢＳ （０．２４７Ｍ ＮａＣｌ、０．０４１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０４７Ｍ ＫＨ２ＰＯ４、０．００５Ｍ ＫＣｌ、ｐＨ７．４）に懸濁することにより、タンパク質分析のための外膜タンパク質サンプル画分を調製した（参照： Ｐｕｅｎｅｔｅ， Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １５６：１−９， １９９５）。それぞれのサンプル画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したところ、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株で多量のＯｍｐＦタンパク質が産生されていることが判明した。
【００２１】
実施例２： ＯｍｐＦ遺伝子欠損大腸菌株の作製
バクテリオファージのレッドオペロン（ｒｅｄ ｏｐｅｒｏｎ）（ｅｘｏ−ｂｅｔａ−ｇａｍ）を用いて、以下のとおり、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のＯｍｐＦ遺伝子を欠失させた。まず初めに、鋳型としてのバクテリオファージＤＮＡ、およびプライマー１： ５’−ＣＧＣＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＴＡＡＴＡＣＴＧＡＡＡＣＴＧＡＧＡＴＣＡＡＧＣ−３’（配列番号１）とプライマー２： ５’−ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＧＣＣＡＴＴＧＣＴＣＣＣＣＡＡＡＴＡＣ−３’（配列番号２）のプライマー対を用いて、ＰＣＲを行った。増幅ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル上で電気泳動によって分離することにより、２．２ｋｂのＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断した。一方、ｔｒｃプロモーターを含む発現プラスミドｐＴｒｃ９９Ａ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｃｏ．、アメリカ）を制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩで切断して、同じ制限酵素で切断したＰＣＲ産物と連結させることにより、組み換え発現ベクターｐＴｒｃＥＢＧを作製した。次に、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を発現ベクターｐＴｒｃＥＢＧで形質転換し、形質転換体を５０μｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢプレートでスクリーニングした（参照：図１）。図１は組み換え発現ベクターｐＴｒｃＥＢＧの遺伝子地図を表す。次いで、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を前記組み換え発現ベクターｐＴｒｃＥＢＧで形質転換し、形質転換体を５０μｇ／Ｌ アンピシリンを含むＬＢプレートでスクリーニングした。この形質転換体をＯ．Ｄ．６００が０．３に到達するまで５００ｍＬのＬＢ培地中で培養した後、ＩＰＴＧ（最終濃度１ｍＭ）を培地に添加してｅｘｏ−ｂｅｔａ−ｇａｍ遺伝子の発現を誘導した。１時間の培養後、細菌細胞を遠心分離して回収し、脱イオン蒸留水２５０ｍＬで洗浄した。回収した細胞を１０％（ｗ／ｖ）グリセロール１０ｍＬに懸濁し、遠心分離した後に−８０℃で保存した。
【００２２】
一方、鋳型としての大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノムＤＮＡ、およびプライマー３： ５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＧＧＡＴＴＡＴＡＣＣＧＡＣＧＣＡＧ−３’（配列番号３）とプライマー４： ５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＡＣＴＧＧＴＡＡＡＣＧＡＴＡＣ−３’（配列番号４）のプライマー対を用いてＰＣＲを行ったところ、２，１６０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩで切断してｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ、アメリカ）に挿入することにより発現ベクターｐＯｍｐＦ６を作製した。次に、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株をこの発現ベクターで形質転換し、形質転換体を５０μｇ／Ｌ アンピシリンを含むＬＢプレートでスクリーニングした（参照：図２）。図２は発現ベクターｐＯｍｐＦ６を示す遺伝子地図を表す。さらに、鋳型としての発現ベクターｐＡＣＹＣ１７７（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、アメリカ）、およびプライマー５： ５’−ＣＧＣＴＧＣＡＧＴＴＡＧＡＡＡＡＡＣＴＣＡＴＣＧＡＧＣＡＴＣ−３’（配列番号５）とプライマー６： ５’−ＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＧＴＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＡＡ−３’（配列番号６）を用いてＰＣＲを行ったところ、９４０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡ断片を制限酵素ＰｓｔＩで切断して、ＰｓｔＩで切断したプラスミドｐＯｍｐＦ６と連結させることにより、組み換え発現ベクターｐＳＫＯｍｐＦＫｍを作製した。次に、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株をこの組み換え発現ベクターで形質転換し、そこからカナマイシン耐性遺伝子を含む組み換え発現ベクターｐＳＫＯｍｐＦＫｍを得た（参照：図３）。図３は組み換え発現ベクターｐＳＫＯｍｐＦＫｍの遺伝子地図を表す。図３に示すように、組み換え発現ベクターｐＳＫＯｍｐＦＫｍは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に由来するＯｍｐＦ遺伝子およびそのプロモーターを含んでおり、また、カナマイシン耐性遺伝子がＯｍｐＦプロモーターとＯｍｐＦ遺伝子の５’末端との間に挿入されていることにより、ＯｍｐＦ遺伝子の発現は起こらない。鋳型としての前記組み換え発現ベクターｐＳＫＯｍｐＦＫｍ、およびプライマー３と４を用いてＰＣＲを行ったところ、ＯｍｐＦ遺伝子、そのプロモーターおよびそれらの間に挿入されたカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡ断片を、ｐＴｒｃＥＢＧで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に導入し、形質転換体をアンピシリンとカナマイシンを含むＬＢプレートでスクリーニングした。形質転換体から発現ベクターｐＴｒｃＥＢＧを取り除くため、アンピシリンを含まないＬＢ培地で２日間５回継代培養を行い、次いで、カナマイシンを含むＬＢプレートに塗抹してインキュベートすることにより、この培地では増殖しない形質転換体をスクリーニングした。次いで、選別された当該大腸菌のゲノムＤＮＡを精製して、ＯｍｐＦプロモーターとＯｍｐＦ遺伝子の間にカナマイシン遺伝子が挿入されているかどうかを確認した。すなわち、鋳型としてのこの精製したゲノムＤＮＡ、およびプライマー３とプライマー８： ５’−ＧＡＴＣＧＧＡＡＴＴＧＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＣＣ−３’（配列番号８）��プライマー対を用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片について配列決定を行った。次に、鋳型としての前記精製ゲノムＤＮＡ、およびプライマー７： ５’−ＣＣＡＣＡＧＣＡＡＣＧＧＴＧＴＣＧＴＣＴＧ−３’（配列番号７）とプライマー９： ５’−ＡＴＣＴＴＴＡＴＣＴＴＴＧＴＡＧＣＡＣＴＴＴＣＡＣ−３’（配列番号９）のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、増幅したＤＮＡ断片について配列決定を行った。両ＤＮＡ断片の配列決定によって、カナマイシン遺伝子がＯｍｐＦプロモーターとＯｍｐＦ遺伝子の間に位置していることを確認した。前記形質転換菌株を「大腸菌ＢＬ１０１」と命名した。
【００２３】
実施例３： ＯｍｐＦ遺伝子発現系の開発
実施例２において作製した組み換え大腸菌株大腸菌ＢＬ１０１においてＯｍｐＦタンパク質を発現させるために３種類の組み換え発現ベクターをそれぞれ作製した。
【００２４】
第１に、強力な誘導発現プロモーターであるＴ７プロモーターを用いたＯｍｐＦ遺伝子発現ベクターを作製した。鋳型としての大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムＤＮＡ、およびプライマー４とプライマー１０： ５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＴＧＡＡＧＣＧＣＡＡＴＡＴＴＣＴＧ−３’（配列番号１０）を用いてＰＣＲ反応を行った。増幅ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断して、発現ベクターｐＥＴ２１ｃ （Ｎｏｖａｇｅｎ、アメリカ）中にクローニングして、組み換え発現ベクターｐＥＤＯｍｐＦ３を作製した。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株をｐＥＤＯｍｐＦ３で形質転換し、そこから組み換え発現ベクターｐＥＤＯｍｐＦ３を得た（参照：図４）。図４は組み換え発現ベクターｐＥＤＯｍｐＦ３の遺伝子地図を表す。
【００２５】
第２に、誘導発現プロモーターであるＴｒｃプロモーターを用いたＯｍｐＦ遺伝子発現ベクターを作製した。鋳型としての大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノムＤＮＡ、およびプライマー４とプライマー１１： ５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＴＧＧＴＧＡＡＧＣＧＣＡＡＴＡＴＴＣＴＧＧＣＡＧ−３’（配列番号１１）を用いてＰＣＲ反応を行った。増幅ＰＣＲ産物を制限酵素ＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断して、発現ベクターｐＴｒｃ９９Ａ中にクローニングすることにより、組み換え発現ベクターｐＴｒｃＯｍｐＦ４を作製した。大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株をｐＴｒｃＯｍｐＦ４で形質転換し、そこから組み換え発現ベクターｐＴｒｃＯｍｐＦ４を得た（参照：図５）。図５は組み換え発現ベクターｐＴｒｃＯｍｐＦ４の遺伝子地図を表す。
【００２６】
第３に、実施例２で作製したＯｍｐＦプロモーターを含む発現ベクターｐＯｍｐＦ６をＯｍｐＦ遺伝子発現ベクターとして用いた。
【００２７】
上記３種類の組み換え発現ベクター（ｐＥＤＯｍｐＦ３、ｐＴｒｃＯｍｐＦ４、およびｐＯｍｐＦ６）を用いて、実施例２において作製した大腸菌ＢＬ１０１株を形質転換した。カナマイシンとアンピシリンを含むＬＢプレートで形質転換された組み換え菌株をスクリーニングした。次いで、細胞表面上にＯｍｐＦタンパク質を生産する最も効率的な分泌系を選択するため、形質転換されたそれぞれの組み換え大腸菌株を５０ｍＬ Ｒ／２培地｛（ＮＨ４）２ＨＰＯ４ ２ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４ ６．７５ｇ／Ｌ、クエン酸０．８５ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．７ｇ／Ｌ、５Ｍ ＨＣｌ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２．２５ｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ １ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．５ｇ／Ｌ、Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ ０．２３ｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ ２ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）６ＭＯ７Ｏ２４ ０．１ｇ／Ｌ、ブドウ糖１０ｇ／Ｌ｝で３７℃の温度で培養した。
【００２８】
組み換え発現ベクターｐＥＤＯｍｐＦ３とｐＴｒｃＯｍｐＦ４を有する形質転換体の培地のＯ．Ｄ．６００が０．７に到達した時、１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトシド、最終濃度）を添加してＯｍｐＦ遺伝子の発現を誘導した。また、対照群として大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）と大腸菌ＢＬ１０１を同一の条件下で培養した。菌体外膜タンパク質画分は、実施例１に記載の方法で各菌株の培養物から調製し、これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析することによりＯｍｐＦタンパク質の発現レベルを比較した。ｐＯｍｐＦ６ベクターで形質転換された大腸菌ＢＬ１０１株は、外膜にＯｍｐＦタンパク質を産生・蓄積し、その発現レベルは親株である大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）と類似するものであった。この結果から、ＯｍｐＦ融合タンパク質の発現のためには、ＯｍｐＦプロモーターが最適であることが明らかとなった。
【００２９】
本発明者らは、組み換え発現ベクターｐＯｍｐＦ６で形質転換された大腸菌ＢＬ１０１を「大腸菌ＢＬ１０１／ｐＯｍｐＦ６」と命名し、これを２００１年６月１日付けにて韓国大田広域市儒城区魚隠洞５２番地（郵便番号３０５−３３３）所在の国際寄託機関である韓国生命工学研究院遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託番号ＫＣＴＣ １０２６ＢＰとして寄託した。
【００３０】
実施例４： ＯｍｐＦ−β−エンドルフィン発現ベクターの作製
β−エンドルフィンタンパク質は３１個のアミノ酸で構成されており、β−エンドルフィンをコードする遺伝子は９３個のヌクレオチドで構成されている（参照：Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｈ．ｅｔ ａｌ．、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、１３５： ９７−１０２、１９８１）。
【００３１】
β−エンドルフィンをコードする遺伝子を調製するため、プライマー１２： ５’−ＡＣＣＧＣＣＡＴＡＣＣＴＴＣＣＣＴＣＧＡＴＧＡＡＣＴＧＧＴＡＡＡＣＧＡＴＡ−３’（配列番号１２）、プライマー１３： ５’−ＧＧＡＡＧＧＴＡＴＧＧＣＧＧＴＴＴＣＡＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＧＣＣＡＧＡＣ−３’（配列番号１３）、プライマー１４： ５’−ＣＧＣＧＴＴＴＴＴＡＡＡＣＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＧＣＧＧＧＧＴＣＴＧＧＣＴＴＴＴＴＴＣＧＣ−３’（配列番号１４）、プライマー１５： ５’−ＣＣＣＴＧＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧＣＧＡＴＣＡＴＣＡＡＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＡＡＡＡＡＡＧ−３’（配列番号１５）およびプライマー１６： ５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＴＡＴＴＣＧＣＣＴＴＴＴＴＴＡＴＡＣＧＣＧＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号１６）をそれぞれ合成し、ＰＣＲに使用した。また、鋳型としての大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムＤＮＡ、およびプライマー１０と１２を用いてＰＣＲを行った。上記ＰＣＲにより増幅した両ＤＮＡ断片を、プライマー１０および１６と混合し、次いで、再びＰＣＲを行ったところ、Ｘａ因子によって認識および切断される４個のアミノ酸をコードする遺伝子と、ＯｍｐＦ遺伝子と融合したβ−エンドルフィン遺伝子とを含むＰＣＲ断片が得られた。前記ＰＣＲ断片を制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｂａＩで切断し、発現ベクターｐＯｍｐＦ６中に連結することにより、組み換え発現ベクターｐＯｍｐＦ６βＥを作製した。その後、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ株を、組み換え発現ベクターｐＯｍｐＦ６βＥで形質転換し、そこから組み換え発現ベクターｐＯｍｐＦ６βＥを得た（参照：図６）。図６は組み換え発現ベクターｐＯｍｐＦ６βＥの作製スキームおよび遺伝子地図を表す。前記組み換え発現ベクターｐＯｍｐＦ６βＥ中のｏｍｐＦ遺伝子と融合したβ−エンドルフィン遺伝子のヌクレオチド配列は、５’−ＴＡＴＧＧＣＧＧＴＴＴＣＡＴＧＡＣＣＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＧＣＣＡＧＡＣＣＣＣＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＣＴＧＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧＣＧＡＴＣＡＴＣＡＡＡＡＡＣＧＣＧＴＡＴＡＡＡＡＡＡＧＧＣＧＡＡＴＡＡ−３’（配列番号１８）であり、これはＴｙｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｇｌｕ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ａｌａ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｈｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ａｓｎ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｌｙｓ Ｌｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ｓｔｏｐ（配列番号１７）を発現する。
【００３２】
大腸菌ＢＬ１０１株を、前記組み換え発現ベクターｐＯｍｐＦ６βＥで形質転換し、形質転換体をアンピシリンとカナマイシンを含むＬＢプレートで培養してスクリーニングした。
【００３３】
実施例５： ＯｍｐＦ−β−エンドルフィン融合タンパク質の菌体外生産
実施例４において作製した大腸菌形質転換体を１．８ＬのＲ／２培地に接種し、３７℃にて流加式培養法で培養した。この際、供給基質液の組成はブドウ糖７００ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ２０ｇ／Ｌであった。培地ｐＨが６．８８を超えて上昇したときは、供給基質液を培地中に１０ｍＬ／分の速度で導入して培地内のブドウ糖濃度を０．７ｇ／Ｌに維持した。培地内の溶存酸素量が４０％（ｖ／ｖ）に維持されるように、空気と酸素を自動的に供給した。１７．５時間の培養後、培養物の６００ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）は１５０．５であり、細胞乾燥重量は５４．１ｇ／Ｌであった。融合タンパク質の量を測定するため、一定の時間間隔で回収した培地を遠心分離し、上清を電気泳動により分析したところ、約４０ｋＤａのＯｍｐＦ−β−エンドルフィン融合タンパク質が培地中に分泌蓄積され、培養時間に応じてＯｍｐＦ−β−エンドルフィン融合タンパク質の蓄積量が増加することが判明した。ＯｍｐＦ−β−エンドルフィン融合タンパク質の最終的な量は４．６４ ｇ／Ｌであり、これは培地中の全タンパク質の４５％に相当した。
【００３４】
実施例６：  菌体外へ生産されたβ−エンドルフィンの精製
実施例５において培地中に蓄積したＯｍｐＦ−β−エンドルフィン融合タンパク質を精製した。まず初めに、５０ｍＬの培地を遠心分離して細菌細胞を除去した。次に、上清から陰イオン交換クロマトグラフィー法を用いてＯｍｐＦ−β−エンドルフィン融合タンパク質を精製した。この際、陰イオン交換樹脂としてはＱ２−カラム（ＢＩＯ−ＲＡＤ Ｃｏ．、アメリカ）を使用し、移動相としては５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝溶液を使用し、移動相の流速は１ｍＬ／分とした。ＯｍｐＦ−β−エンドルフィン融合タンパク質は、０〜１Ｍの直線勾配のＮａＣｌで溶出された。０．４５ＭのＮａＣｌで溶出されたＯｍｐＦ−β−エンドルフィン融合タンパク質の全量は８９．１ｍｇであった。ＯｍｐＦ−β−エンドルフィン融合タンパク質溶液に含有されるＮａＣｌは透析により除去した。ＯｍｐＦ−β−エンドルフィン融合タンパク質からＯｍｐＦタンパク質を除去するために、Ｘａ因子とＯｍｐＦ−β−エンドルフィン融合タンパク質を１：２００（ｗ／ｗ）の比率で混合し、２３℃で１２時間インキュベートした。次いで、β−エンドルフィンタンパク質を逆相ＨＰＬＣにより精製した。この際、ＨＰＬＣカラムとしてはＭｉｃｒｏｓｏｒｂ−ＭＶ Ｃ１８カラム（４．６ ｘ ２５０ｍｍ、Ｖａｒｉａｎ、アメリカ）を使用し、移動相としては０．１％（ｖ／ｖ） ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）溶液を使用し、流速は１ｍＬ／分とした。タンパク質の溶出を、紫外線検出器を使用して波長２８０ｎｍでモニターした（参照：表１）。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
上記表１に示した通り、ＨＰＬＣ技法によりβ−エンドルフィン２．８ｍｇが精製された。さらに、精製されたβ−エンドルフィンのＮ−末端アミノ酸配列決定を行ったところ、アミノ酸配列はＴｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓであって、これはβ−エンドルフィンのＮ−末端と一致することが明らかとなった。
【００３７】
以上明確に例示し説明した通り、本発明は、ＯｍｐＦおよび目的タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクター、前記発現ベクターにより形質転換された大腸菌、およびそれを用いて目的タンパク質を菌体外へ生産させる方法を提供する。本発明の組み換え発現ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子、ＯｍｐＦプロモーターおよびＯｍｐＦ遺伝子を含む。ＯｍｐＦプロモーターを用いた構成的発現により、細胞の増殖と同時にＯｍｐＦ融合タンパク質の分泌生産が開始され、また、細胞濃度が高まるにつれ、前記タンパク質の分泌生産される量も連続的に増加するというように、本発明に従うと、従来の方法に比べてより簡単な方法で目的タンパク質を菌体外へ生産することができ、これにより、目的タンパク質を高濃度細胞培養で大量生産することが可能となる。
【００３８】
以上、本発明の内容を特定の実施形態に関して示し説明したが、当業者にとって、本明細書中に示した本発明の精神または範囲から逸脱することなく、本発明に一定の改変または修飾を加えうることは明らかであろう。
【００３９】
【表２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
組み換え発現ベクターｐＴｒｃＥＢＧの遺伝子地図を示す。
【図２】
発現ベクターｐＯｍｐＦ６の遺伝子地図を示す。
【図３】
組み換え発現ベクターｐＳＫＯｍｐＦＫｍの遺伝子地図を示す。
【図４】
組み換え発現ベクターｐＥＤＯｍｐＦ３の遺伝子地図を示す。
【図５】
組み換え発現ベクターｐＴｒｃＯｍｐＦ４の遺伝子地図を示す。
【図６】
組み換え発現ベクターｐＯｍｐＦ６βＥの作製スキームおよび遺伝子地図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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