(57)【要約】本発明は、ＡＴＰ結合カセットトランスポーター様（ＡＢＣＬ）ポリペプチドおよびそれらをコードする核酸分子を提供する。本発明はまた、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞、およびＡＢＣＬポリペプチドを産生するための方法を提供する。本発明はさらに、ＡＢＣＬポリペプチドに関連した疾患、障害、および状態を診断、処置、改善、および／または予防するための薬学的組成物および方法を提供する。ＡＢＣＬポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物もまた、本発明に含まれる。ＡＢＣＬ核酸分子は、ＡＢＣＬポリペプチドの発現およびＡＢＣＬポリペプチドのレベル増加（これは、循環レベルの増加を含み得る）を可能にする様式で、動物中に導入される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号１、配列番号４、または配列番号７のいずれかに示される、ヌクレオチド配列；
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１０９、ＰＴＡ−３１１０、またはＰＴＡ−３１１１のＤＮＡインサートの、ヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；
（ｄ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；および、
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的な、ヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含有する、核酸分子。
【請求項２】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドに少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ここで、該コードされたポリペプチドが、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号４、または配列番号７のいずれかに示されるヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１０９、ＰＴＡ−３１１０、またはＰＴＡ−３１１１のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、あるいは（ａ）のヌクレオチド配列の、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号４、または配列番号７のいずれかのヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１０９、ＰＴＡ−３１１０、またはＰＴＡ−３１１１のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、あるいは、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列の領域であり、ここで、該ポリペプチドフラグメントが、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるコードされたポリペプチドの活性を有するか、あるいは該ポリペプチドフラグメントが抗原性である、領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号４、または配列番号７のいずれかのヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１０９、ＰＴＡ−３１１０、またはＰＴＡ−３１１１のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、あるいは、（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の、領域；
（ｅ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；および、
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的な、ヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含有する、核酸分子。
【請求項３】
単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ここで、該コードされたポリペプチドが、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ここで、該コードされたポリペプチドが、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ここで、該コードされたポリペプチドが、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端切断および／またはＮ末端切断を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、ここで、該コードされたポリペプチドが、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）少なくとも１つの改変を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であり、該少なくとも１つの改変が、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端切断、およびＮ末端切断からなる群より選択され、ここで、該コードされたポリペプチドが、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｇ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに、
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的な、ヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含有する、核酸分子。
【請求項４】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子を含有する、ベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含有する、宿主細胞。
【請求項６】
真核細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
原核細胞である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ＡＢＣＬポリペプチドを産生するプロセスであって、以下：
該ポリペプチドを発現させるのに適切な条件下で、請求項５に記載の宿主細胞を培養する、工程；および、
必要に応じて、該培養物から該ポリペプチドを単離する、工程、
を包含する、プロセス。
【請求項９】
請求項８に記載のプロセスによって産生される、ポリペプチド。
【請求項１０】
前記核酸分子が、ＡＢＣＬポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結された、ネイティブＡＢＣＬポリペプチドに対するプロモーターＤＮＡではないプロモーターＤＮＡを含有する、請求項８に記載のプロセス。
【請求項１１】
同一性％が、コンピュータープログラムを使用して決定され、該コンピュータープログラムが、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択される、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
化合物がＡＢＣＬポリペプチド活性またはＡＢＣＬポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、以下：
請求項５、６、または７のいずれかに記載の細胞を該化合物に曝露する、工程；および、
該細胞におけるＡＢＣＬポリペプチド活性またはＡＢＣＬポリペプチド産生を測定する、工程、
を包含する、プロセス。
【請求項１３】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示される、アミノ酸配列；および、
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１０９、ＰＴＡ−３１１０、またはＰＴＡ−３１１１のＤＮＡインサートによってコードされる、アミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。
【請求項１４】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）必要に応じて、アミノ末端メチオニンをさらに含む、配列番号３または配列番号６のいずれかに示される、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのオルトログの、アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列であり、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであり、ここで、該フラグメントが、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、あるいは該フラグメントが抗原性である、フラグメント；および、
（ｅ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１０９、ＰＴＡ−３１１０、またはＰＴＡ−３１１１のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、あるいは（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の、対立遺伝子改変体またはスプライス改変体の、アミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。
【請求項１５】
単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であり、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であり、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であり、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端切断および／またはＮ末端切断を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であり、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに、
（ｅ）少なくとも１つの改変を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該少なくとも１つの改変が、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端切断、およびＮ末端切断からなる群より選択され、ここで、該ポリペプチドが、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号２，配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされる、単離されたポリペプチド。
【請求項１７】
同一性％が、コンピュータープログラムを使用して決定され、該コンピュータープログラムが、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムからなる群より選択される、請求項１４に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合する、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項１９】
配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドあるいはそれらのフラグメントに特異的に結合する、請求項１８に記載の選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項２０】
抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２１】
ヒト化抗体である、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２２】
ヒト抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２３】
ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２４】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２５】
キメラ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２６】
ＣＤＲ移植抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２７】
抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２８】
可変領域フラグメントである、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項２９】
ＦａｂフラグメントまたはＦａｂ’フラグメントである、請求項２８に記載の可変領域フラグメント。
【請求項３０】
配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、選択的結合因子またはそのフラグメント。
【請求項３１】
検出可能な標識に結合されている、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３２】
ＡＢＣＬポリペプチドの生物学的活性を拮抗させる、請求項１８に記載の選択的結合因子。
【請求項３３】
ＡＢＣＬポリペプチドに関連した疾患、状態、または障害を、処置、予防，または改善するための方法であって、有効量の請求項１８に記載の選択的結合因子を患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３４】
配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫することによって産生される、選択的結合因子。
【請求項３５】
請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドに結合し得る選択的結合因子を産生する、ハイブリドーマ。
【請求項３６】
請求項１８に記載の抗ＡＢＣＬ抗体またはフラグメントを使用して、ＡＢＣＬポリペプチドの量を検出または定量化する、方法。
【請求項３７】
請求項１８に記載の選択的結合因子を備える、生物学的サンプル中のＡＢＣＬポリペプチドの量を検出または定量化するための、キット。
【請求項３８】
請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドおよび薬学的に受容可能な処方剤を含有する、組成物。
【請求項３９】
前記薬学的に受容可能な処方剤が、キャリア、アジュバント、可溶化剤、安定剤または酸化防止剤である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが、配列番号３または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列を含有する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドの誘導体を含有する、ポリペプチド。
【請求項４２】
水溶性ポリマーで共有結合により改変されている、請求項４１に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
請求項４２に記載のポリペプチドであって、ここで、前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングルコール、デキストラン、セルロース、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニルアルコールからなる群より選択される、ポリペプチド。
【請求項４４】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子および薬学的に受容可能な処方剤を含有する、組成物。
【請求項４５】
前記核酸分子がウイルスベクター中に含まれる、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子を含有する、ウイルスベクター。
【請求項４７】
異種アミノ酸配列に融合された、請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のペプチドを含有する、融合ポリペプチド。
【請求項４８】
前記異種アミノ酸配列がＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメントである、請求項４７に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４９】
医学的状態を処置、予防、または改善するための方法であって、請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチド、あるいは請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸によってコードされるポリペプチドを患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５０】
被験体の病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下：
（ａ）サンプル中の請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドあるいは請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子によってコードされるポリペプチドの存在あるいは発現量を決定する、工程；および、
（ｂ）該ポリペプチドの存在または発現量に基づいて病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する、工程；
を包含する、方法。
【請求項５１】
デバイスであって、以下：
（ａ）移植に適切な、膜；および、
（ｂ）請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のタンパク質を分泌する、該膜でカプセル化された、細胞、
を備えるデバイスであり、そして、
該膜が、該タンパク質に対して透過性であり、かつ該細胞に有害な物質に対して不透過性である、
デバイス。
【請求項５２】
ＡＢＣＬポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、以下：
（ａ）請求項１３、１４または１５のいずれかに記載のポリペプチドを化合物と接触させる、工程；および、
（ｂ）該化合物へのＡＢＣＬポリペプチドの結合の程度を決定する、工程、
を包含する、方法。
【請求項５３】
前記化合物に結合された場合に、前記ポリペプチドの活性を決定する工程をさらに包含する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
動物におけるポリペプチドのレベルを調節する方法であって、請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子を該動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５５】
請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子を含有する、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項５６】
化合物がＡＢＣＬポリペプチド活性またはＡＢＣＬポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、以下：
請求項５５に記載のトランスジェニック哺乳動物を該化合物に曝露する、工程；および、
該哺乳動物におけるＡＢＣＬポリペプチド活性またはＡＢＣＬポリペプチド産生を測定する、工程、
を包含する、プロセス。
【請求項５７】
固体支持体に結合している、請求項１、２または３のいずれかに記載の核酸分子。
【請求項５８】
請求項１、２または３のいずれかに記載の少なくとも１つの核酸分子を含有する、核酸分子のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、２０００年１１月２８日付けで出願された米国仮特許出願番号６０／２５３，５２０からの優先権の利益を主張する。この米国仮特許出願の開示は、明白に、本明細書中において参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＡＴＰ−結合カセット輸送体様（ＡＴＰ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−Ｌｉｋｅ）（ＡＢＣＬ）ポリペプチドおよびこれをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、ＡＢＣＬポリペプチドを産生するための、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞および方法に関する。本発明はさらに、ＡＢＣＬポリペプチドと関連する疾患、障害および状態の診断、処置、改善、および／または予防のための薬学的組成物および方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
核酸分子の同定、クローニング、発現、および操作における技術進歩ならびにヒトゲノムの解読は、新規治療因子の発見を大きく加速した。現在、高速核酸配列決定技術は、前例のない速度で配列情報を生成し得、そしてコンピュータ分析と組み合わされて、ゲノムの一部および全体への重複配列の集合ならびにポリペプチドコード領域の同定を可能にする。既知アミノ酸配列のデータベース編集物に対する推定アミノ酸配列の比較は、以前に同定された配列および／または構造の目印に対する相同性の程度を決定することを可能にする。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造分析および機能分析のためのポリペプチド産物を提供する。核酸分子およびコードされるポリペプチドの操作は、治療因子として使用するための生成物に有利な特性を付与し得る。
【０００４】
過去１０年間にわたるゲノム研究における顕著な技術進歩にも関わらず、ヒトゲノムに基づく新規治療因子の開発に対する可能性は、未だ広く実現化されてはいない。潜在的に有利なポリペプチド治療因子をコードする多くの遺伝子またはこれらがコードするポリペプチド（これらは、治療分子に対する「標的」として作用し得る）は、未だ同定されていない。従って、診断的な利点または治療的な利点を有する、新規ポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子を同定することが、本発明の目的である。
【０００５】
ＡＴＰ−結合カセット（ＡＢＣ）輸送体スーパーファミリーは、生体膜を横切る分子の移動を選択的に媒介するタンパク質の広範かつ多様なグループを構成する。１００個を超えるＡＢＣ輸送体が同定されており、これらの輸送体の大半は、原核生物のタンパク質である。このスーパーファミリーの大半のメンバーは、特定の基質または関連の基質の群に対していくらかの特異性を有するが、このスーパーファミリーの異なるメンバーによって輸送される基質の数および型は、広範に変動する。例えば、タンパク質、糖、ペプチド、ポリサッカリド、アミノ酸、および無機イオンに対する基質特異性を有するＡＢＣ輸送体が同定されている。さらに、いくつかのＡＢＣ輸送体は、基質を搬入するように機能するが、他のＡＢＣ輸送体は、基質を搬出するように機能する。
【０００６】
ＡＢＣ輸送体は、４つの「コア」ドメイン：２つの膜貫通ドメインおよび２つのＡＴＰ結合ドメインから構成される共通の構成を共有する。４つすべてのドメインは、同じ多重ドメインタンパク質に存在し得るか、またはこれらのドメインは、別個のポリペプチドとして発現され得る。６回膜をまたぐヘリックスを各々構成する膜貫通ドメインは、基質が膜を横切って通過する経路を形成する。ＡＴＰ結合ドメイン、またはヌクレオチド結合フォールド（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｏｌｄ）（ＮＢＦ）は、膜の細胞質ゾル側に位置する。ＮＢＦドメインはさらに、ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ＡおよびＢモチーフを含む。このウォーカーＡおよびＢモチーフは、特定のＡＢＣ輸送体の基質特異性とも起源の種とも無関係に、ＡＢＣ輸送体の間で保存されている。特定の輸送体の基質特異性は、究極的には、膜貫通ドメインによって決定され、そして基質を輸送するために必要とされるエネルギーは、ＡＴＰ結合部位でのＡＴＰ加水分解によって与えられる。
【０００７】
いくつかのＡＢＣ輸送体は、疾患の病因に関連付けられている。嚢胞性線維症は、外分泌組織からの液体分泌を調節する塩素イオンチャネルをコードする嚢胞性線維症膜内外コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子における変異によって引き起こされる。腫瘍細胞における多剤耐性の現象は、腫瘍細胞から毒性薬物を除去し得るエネルギー依存性流出ポンプをコードするｍｄｒ１遺伝子と関連付けられている。タンジアー病は、特定の細胞からの非エステル化コレステロールおよびリン脂質の輸送を担うタンパク質をコードすることが示されている、ＡＢＣ１遺伝子における変異と関連付けられている（Ｈｉｇｇｅｎｓ、１９９２、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：６７−１１３；ＹｏｕｎｇおよびＦｉｅｌｄｉｎｇ、１９９９、Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２２：３１６−１８；ＨｏｌｌａｎｄおよびＢｌｉｇｈｔ、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：３８１−９９を参照のこと）。
【０００８】
（発明の要旨）
本発明は、新規ＡＢＣＬの核酸分子およびコードされるポリペプチドに関する。
【０００９】
本発明は、単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）１、配列番号４、または配列番号７のいずれかに示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１０９、ＰＴＡ−３１１０またはＰＴＡ−３１１１中のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体に、少なくとも中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列；および
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子
を提供する。
【００１０】
本発明はまた、単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドに少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１、配列番号４、または配列番号７のいずれかに示されるヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１０９、ＰＴＡ−３１１０もしくはＰＴＡ−３１１１中のＤＮＡインサート、または（ａ）のヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号１、配列番号４、または配列番号７のいずれかのヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１０９、ＰＴＡ−３１１０またはＰＴＡ−３１１１中のＤＮＡインサート、あるいは（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列の領域であって、ここで、上記ポリペプチドフラグメントは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１、配列番号４、または配列番号７のいずれかのヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１０９、ＰＴＡ−３１１０またはＰＴＡ−３１１１中のＤＮＡインサート、または（ａ）〜（ｃ）いずれかのヌクレオチド配列の領域；
（ｅ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子
を提供する。
【００１１】
本発明はさらに、単離された核酸分子であって、以下；
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｇ）少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子
を提供する。
【００１２】
本発明は、単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列；および
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１０９、ＰＴＡ−３１１０またはＰＴＡ−３１１１中のＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド
を提供する。
【００１３】
本発明はまた、単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）必要に応じてさらにアミノ末端メチオニンを含む、配列番号３または配列番号６のいずれかに示されるアミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）のアミノ酸配列；
（ｃ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、上記フラグメントは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、フラグメント；ならびに
（ｅ）配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１０９、ＰＴＡ−３１１０またはＰＴＡ−３１１１中のＤＮＡインサート、あるいは（ａ）〜（ｃ）のいずれかのアミノ酸配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド
を提供する。
【００１４】
本発明はさらに、単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド
を提供する。
【００１５】
また、ＡＢＣＬアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドも提供される。
【００１６】
本発明はまた、本明細書中に示されるような単離された核酸分子を含む発現ベクター、本明細書中に示されるような組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、およびＡＢＣＬポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、この宿主細胞を培養する工程、および必要に応じてそのように産生されたポリペプチドを単離する工程を包含する。
【００１７】
ＡＢＣＬポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物もまた、本発明に含まれる。ＡＢＣＬ核酸分子は、ＡＢＣＬポリペプチドの発現およびＡＢＣＬポリペプチドのレベル増加（これは、循環レベルの増加を含み得る）を可能にする様式で、動物中に導入される。あるいは、ＡＢＣＬ核酸分子は、内因性ＡＢＣＬポリペプチドの発現を阻害する様式で動物に導入される（すなわち、ＡＢＣＬポリペプチド遺伝子ノックアウトを保有するトランスジェニック動物を作製する）。トランスジェニック非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）である。
【００１８】
本発明のＡＢＣＬポリペプチドの誘導体もまた、提供される。
【００１９】
さらに、本発明のＡＢＣＬポリペプチドに特異的に結合し得る選択的結合因子（例えば、抗体およびペプチド）が提供される。このような抗体およびペプチドは、アゴニスト性であってもアンタゴニスト性であってもよい。
【００２０】
本発明のヌクレオチド、ポリペプチド、もしくは選択的結合因子と、１つ以上の薬学的に受容可能な処方剤とを含む薬学的組成物もまた、本発明に含まれる。薬学的組成物は、治療有効量の本発明のヌクレオチドまたはポリペプチドを提供するように使用される。本発明はまた、このポリペプチド、核酸分子、および選択的結合因子を使用する方法に関する。
【００２１】
本発明のＡＢＣＬポリペプチドおよびＡＢＣＬ核酸分子は、疾患および障害（本明細書中に列挙されるものを含む）を処置、予防、改善、および／または検出するために使用され得る。
【００２２】
本発明はまた、ＡＢＣＬポリペプチドに結合する試験分子を同定するために、試験分子をアッセイする方法を提供する。この方法は、ＡＢＣＬポリペプチドを試験分子と接触させて、この試験分子のこのポリペプチドに対する結合の程度を決定する工程を包含する。この方法はさらに、このような試験分子が、ＡＢＣＬポリペプチドのアゴニストであるのかまたはアンタゴニストであるのかを決定する工程を包含する。本発明はさらに、ＡＢＣＬポリペプチドの発現またはＡＢＣＬポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法を提供する。
【００２３】
ＡＢＣＬポリペプチドの発現を制御する方法およびＡＢＣＬポリペプチドのレベルを調節（すなわち、増加または減少）する方法もまた、本発明に含まれる。１つの方法は、ＡＢＣＬポリペプチドをコードする核酸分子を動物に投与する工程を包含する。別の方法では、ＡＢＣＬポリペプチドの発現を制御または調節するエレメントを含む核酸分子が、投与され得る。これらの方法の例としては、本明細書中にさらに記載されるように、遺伝子治療、細胞治療、およびアンチセンス治療が挙げられる。
【００２４】
ＡＢＣＬポリペプチドは、そのリガンドを同定するために使用され得る。種々の形態の「発現クローニング」が、レセプターに対するリガンドをクローニングするために使用されている（例えば、Ｄａｖｉｓら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８７：１１６１−６９を参照のこと）。これらおよび他のＡＢＣＬリガンドクローニング実験は、本明細書中においてより詳細に記載される。ＡＢＣＬリガンドの単離は、ＡＢＣＬシグナル伝達経路の新規なアゴニストおよび／またはアンタゴニストの同定または開発を可能にする。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、ＡＢＣＬリガンド、抗ＡＢＣＬリガンド抗体、およびそれらの誘導体、低分子、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、これらの任意のものが、１つ以上の疾患または障害（本明細書中に開示されるものを含む）を潜在的に処置するために使用され得る。
【００２５】
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される節の表題は、構成上の目的のみのためであり、そして記載される内容を限定するようには解釈されるべきではない。本願において列挙される全ての参考文献は、明確に本明細書中に参考として援用される。
【００２６】
（定義）
用語「ＡＢＣＬ遺伝子」または「ＡＢＣＬ核酸分子」あるいは「ＡＢＣＬポリヌクレオチド」は、配列番号１、配列番号４、または配列番号７のいずれかに示されるヌクレオチド配列、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３１０９、ＰＴＡ−３１１０またはＰＴＡ−３１１１におけるＤＮＡインサートのヌクレオチド配列、および本明細書中で定義される核酸分子を含むか、またはこれらからなる核酸分子をいう。
【００２７】
用語「ＡＢＣＬポリペプチド対立遺伝子改変体」は、生物体または生物体の集団の染色体の所定の遺伝子座を占める遺伝子の、天然に存在する可能ないくつかの代替形態のうちの１つをいう。
【００２８】
用語「ＡＢＣＬポリペプチドスプライス改変体」は、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるＡＢＣＬポリペプチドアミノ酸配列のＲＮＡ転写物中のイントロン配列の選択的プロセシングによって生成される、核酸分子（通常はＲＮＡ）をいう。
【００２９】
用語「単離された核酸分子」は、（１）総核酸が供給源細胞から単離される場合に、これが天然で一緒に見出されるタンパク質、脂質、炭水化物、または他の物質のうち少なくとも約５０パーセントから分離された本発明の核酸分子、（２）「単離された核酸分子」が天然で連結しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に連結していない本発明の核酸分子、（３）天然では連結していないポリヌクレオチドに作動可能に連結した本発明の核酸分子、または（４）より大きなポリヌクレオチド配列の一部として天然には存在しない本発明の核酸分子をいう。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、いかなる他の混入核酸分子も、その天然の環境において見出される他の混入物（これらは、ポリペプチド産生におけるその使用、またはその治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用を妨害する）も実質的に含まない。
【００３０】
用語「核酸配列」または「核酸分子」は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をいう。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのいずれかから形成される分子を含み、例えば、以下であるがこれらに限定されない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン（ｐｓｅｕｄｏｉｓｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−エチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキュエオシン、５’−メトキシカルボニル−メチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キュエオシン、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
【００３１】
用語「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を移すために使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）をいうために使用される。
【００３２】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適切であり、そして挿入された異種核酸配列の発現を、指示および／または制御する核酸配列を含むベクターをいう。発現としては、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロンが存在する場合）のようなプロセスが挙げられるがこれらに限定されない。
【００３３】
用語「作動可能に連結された」は、本明細書中で、隣接配列の配置をいうために使用され、ここで、このように記載される隣接配列は、その通常の機能を行うように構成または構築されている。従って、コード配列に作動可能に連結した隣接配列は、このコード配列の複製、転写および／または翻訳を行い得る。例えば、コード配列は、プロモーターがこのコード配列の転写を指示し得る場合に、このプロモーターに作動可能に連結されている。隣接配列は、正確に機能する限り、コード配列と連続する必要はない。したがって、例えば、介在性の翻訳はされないが転写はされる配列が、プロモーター配列とコード配列との間に存在し得、そしてこのプロモーター配列はなお、このコード配列に「作動可能に連結」されているとみなされ得る。
【００３４】
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換されたか、または形質転換され得、次いで目的の選択された遺伝子を発現し得る細胞をいうために使用される。この用語には、選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態学または遺伝子構造において本来の親と同一であろうとなかろうと、親細胞の子孫を含む。
【００３５】
用語「ＡＢＣＬポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、および関連するポリペプチドをいう。関連ポリペプチドとしては、ＡＢＣＬポリペプチドフラグメント、ＡＢＣＬポリペプチドオルソログ、ＡＢＣＬポリペプチド改変体、およびＡＢＣＬポリペプチド誘導体が挙げられ、これらは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を保有する。ＡＢＣＬポリペプチドは、本明細書中で定義される成熟ポリペプチドであり得、そしてこれらが調製される方法に依存して、アミノ末端メチオニン残基を有しても有さなくてもよい。
【００３６】
用語「ＡＢＣＬポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）での短縮化および／またはカルボキシ末端での短縮化を含むポリペプチドをいう。用語「ＡＢＣＬポリペプチドフラグメント」はまた、ＡＢＣＬポリペプチドオルソログ、ＡＢＣＬポリペプチド誘導体、またはＡＢＣＬポリペプチド改変体のアミノ末端短縮化および／またはカルボキシ末端短縮化、あるいはＡＢＣＬポリペプチド対立遺伝子改変体またはＡＢＣＬポリペプチドスプライシング改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端短縮化および／またはカルボキシ末端短縮化をいう。ＡＢＣＬポリペプチドフラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシング、またはインビボプロテアーゼ活性から生じ得る。ＡＢＣＬポリペプチドの膜結合形態もまた、本発明によって意図される。好ましい実施形態において、短縮化および／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１００より多くのアミノ酸を含む。このように生成されるポリペプチドフラグメントは、約２５個連続したアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸、または約２００より多くのアミノ酸、を含む。このようなＡＢＣＬポリペプチドフラグメントは、必要に応じて、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。このようなフラグメントは、例えば、ＡＢＣＬポリペプチドに対する抗体を生成するために使用され得ることが理解される。
【００３７】
用語「ＡＢＣＬポリペプチドオルソログ」は、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるＡＢＣＬポリペプチドアミノ酸配列に対応する、別の種由来のポリペプチドをいう。例えば、マウスおよびヒトのＡＢＣＬポリペプチドは、互いにオルソログであるとみなされる。
【００３８】
用語「ＡＢＣＬポリペプチド改変体」は、配列番号２、配列番号５、または配列番号８（リーダー配列を有するかまたは有さない）のいずれかに示されるＡＢＣＬポリペプチドアミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（例えば、内部欠失および／またはＡＢＣＬポリペプチドフラグメント）、および／または付加（例えば、内部付加および／またはＡＢＣＬ融合ポリペプチド）を有するアミノ酸配列を含むＡＢＣＬポリペプチドをいう。改変体は、天然に存在する（例えば、ＡＢＣＬポリペプチド対立遺伝子改変体、ＡＢＣＬポリペプチドオルソログ、およびＡＢＣＬポリペプチドスプライシング改変体）か、または、人工的に構築され得る。このようなＡＢＣＬポリペプチド改変体は、配列番号１、配列番号４、または配列番号７のいずれかに示されるＤＮＡ配列から応じて変化するＤＮＡ配列を有する、対応する核酸分子から調製され得る。好ましい実施形態において、この改変体は、１〜３、または１〜５、または１〜１０、または１〜１５、または１〜２０、または１〜２５、または１〜５０、または１〜７５、または１〜１００、または１００より多くのアミノ酸の置換、挿入、付加、および／または欠失を有し、ここで、この置換は、保存的、または非保存的、あるいはその任意の組み合わせであり得る。
【００３９】
用語「ＡＢＣＬポリペプチド誘導体」は、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチド、本明細書中で定義されるＡＢＣＬポリペプチドフラグメント、ＡＢＣＬポリペプチドオルソログ、またはＡＢＣＬポリペプチド改変体をいい、これらは、化学的に修飾されている。用語「ＡＢＣＬポリペプチド誘導体」はまた、本明細書中で定義されるＡＢＣＬポリペプチド対立遺伝子改変体またはＡＢＣＬポリペプチドスプライシング改変体によってコードされるポリペプチドをいい、これは化学的に修飾されている。
【００４０】
用語「成熟ＡＢＣＬポリペプチド」は、リーダー配列を欠失したＡＢＣＬポリペプチドをいう。成熟ＡＢＣＬポリペプチドはまた、他の修飾（例えば、アミノ末端（リーダー配列を有するかまたは有さない）および／またはカルボキシ末端のタンパク質分解性プロセシング、より大きな前駆体からのより小さなポリペプチドの切断、Ｎ結合型および／またはＯ結合型のグリコシル化など）を含み得る。例示的な成熟ＡＢＣＬポリペプチドは、配列番号３および配列番号６のアミノ酸配列により示される。
【００４１】
用語「ＡＢＣＬ融合ポリペプチド」は、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチド、本明細書中で定義されるＡＢＣＬポリペプチドフラグメント、ＡＢＣＬポリペプチドオルソログ、ＡＢＣＬポリペプチド改変体、またはＡＢＣＬ誘導体のアミノ末端またはカルボキシ末端での、１つ以上のアミノ酸の融合（例えば、異種タンパク質またはペプチド）をいう。用語「ＡＢＣＬ融合ポリペプチド」はまた、本明細書中で定義されるＡＢＣＬポリペプチド対立遺伝子改変体またはＡＢＣＬポリペプチドスプライシング改変体によってコードされるポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端での、１つ以上のアミノ酸の融合をいう。
【００４２】
用語「生物学的に活性なＡＢＣＬポリペプチド」とは、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドの、少なくとも１つの活性特徴を有するＡＢＣＬポリペプチドをいう。さらに、ＡＢＣＬポリペプチドは、免疫原としての活性を有し得る；すなわち、このＡＢＣＬポリペプチドは、抗体が惹起され得る少なくとも１つのエピトープを含む。
【００４３】
用語「単離されたポリペプチド」とは、（１）供給源細胞から単離される場合に、天然で一緒に見出されるポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の物質の少なくとも約５０％から単離された本発明のポリペプチド、（２）「単離されたポリペプチド」が天然で連結するポリペプチドの全てまたは一部に連結しない（共有結合的または非共有結合的な相互作用によって）、本発明のポリペプチド、（３）天然には連結しないポリペプチドに作動可能に連結（共有結合的または非共有結合的な相互作用によって）する、本発明のポリペプチド、あるいは（４）天然には存在しない本発明のポリペプチドをいう。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、任意の他の混入ポリペプチドまたは天然の環境において見出される他の混入物（これは、その治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用に干渉する）を実質的に含まない。
【００４４】
用語「同一性」とは、当該分野で公知のように、配列の比較によって決定される、２つ以上のポリペプチド分子または２つ以上の核酸分子の配列間の関係をいう。当該分野において、「同一性」はまた、場合に応じて、２つ以上のヌクレオチドまたは２つ以上のアミノ酸配列間の一致によって決定されるように、核酸分子またはポリペプチドの間の配列関連性の程度を意味する。「同一性」は、２つ以上の配列のうち小さなものと、特定の数理的モデルまたはコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって焦点をあてられたギャップ整列（存在する場合）との間の一致の同一パーセントを評価する。
【００４５】
用語「類似性」は、概念に関するが、「同一性」とは対照的に、「類似性」は、同一的一致および保存的置換の一致の両方を含む関連性の基準をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば１０／２０個同一のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換である場合、同一性パーセントおよび類似性パーセントは、どちらも５０％である。同じ例において、保存的置換がある場合にさらに５つの位置が存在し、よって同一性パーセントは５０％のままであるが、類似性パーセントは７５％（１５／２０）である。したがって、保存的置換が存在する場合、２つのポリペプチド間の類似性パーセントは、これらの２つのポリペプチド間の同一性パーセントよりも高い。
【００４６】
用語「天然に存在する」または「ネイティブの」は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的材料と関連して使用される場合、天然において見出され、そしてヒトによって操作されていない材料をいう。同様に、「天然に存在しない」または「ネイティブではない」は、本明細書中で使用される場合、天然で見出されないか、またはヒトによって構造的に改変もしくは合成された材料をいう。
【００４７】
用語「有効量」および「治療有効量」は、各々、本明細書中に示されるＡＢＣＬポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支持するために使用されるＡＢＣＬポリペプチドまたはＡＢＣＬ核酸分子の量をいう。
【００４８】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「生理学的に受容可能なキャリア」は、本明細書中で使用される場合、薬学的組成物としてのＡＢＣＬポリペプチド、ＡＢＣＬ核酸分子、またはＡＢＣＬ選択的結合因子の送達の達成または増強に適切な１つ以上の処方材料をいう。
【００４９】
用語「抗原」とは、選択的結合因子（例えば、抗体）により結合され得、そしてさらに動物において使用されて、その抗原のエピトープに結合し得る抗体を産生し得る分子または分子の一部をいう。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
【００５０】
用語「選択的結合因子」とは、ＡＢＣＬポリペプチドに対する特異性を有する分子をいう。本明細書中で使用される場合、用語「特異的」および「特異性」とは、選択的結合因子の、ヒトＡＢＣＬポリペプチドに結合し、かつヒトの非ＡＢＣＬポリペプチドに結合しない能力をいう。しかし、選択的結合因子がまた、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載されるようなポリペプチドのオルソログ（すなわち、その種間変形（例えば、マウスＡＢＣＬポリペプチドおよびラットＡＢＣＬポリペプチド））に結合し得ることが、理解される。
【００５１】
用語「形質導入」とは、通常はファージによる１つの細菌から別の細菌への遺伝子の伝達をいうために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスによる真核生物細胞配列の獲得および伝達をいう。
【００５２】
用語「トランスフェクション」は、細胞による異種または外因性のＤＮＡの取り込みをいうために使用され、そして細胞は、外因性ＤＮＡが細胞膜内に導入された場合には「トランスフェクトされ」ている。多数のトランスフェクション技術は、当該分野で周知であり、そして本明細書中に開示される。例えば、Ｇｒａｈａｍら，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）；およびＣｈｕら，１９８１，Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照のこと。このような技術を使用して、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入し得る。
【００５３】
本明細書中で使用される場合、用語「形質転換」とは、細胞の遺伝的特徴における変化をいい、そして細胞は、新しいＤＮＡを含有するように改変された場合に形質転換されている。例えば、細胞は、それがそのネイティブな状態から遺伝的に改変される場合に形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入に続いて、ＤＮＡの形質転換は、細胞の染色体に物理的に組み込むことにより細胞のＤＮＡと組換わり得るか、複製されることなしにエピソームエレメントとして一過性に維持され得るか、またはプラスミドとして独立的に複製し得る。ＤＮＡが細胞分裂と共に複製される場合に、細胞は、安定に形質転換されたとみなされる。
【００５４】
（核酸分子および／またはポリペプチドの関連性）
関連した核酸分子が、配列番号１、配列番号４、または配列番号７のいずれかの核酸分子の対立遺伝子改変体またはスプライシング改変体を包含すること、および上記のヌクレオチド配列のいずれかに相補的である配列を包含することが理解される。関連した核酸分子はまた、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかにおいて示されるポリペプチドと比較して、１以上のアミノ酸残基の置換、改変、付加および／または欠失を含むかまたは本質的にこれらからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を包含する。このような関連したＡＢＣＬポリペプチドは、例えば、１以上のＮ結合型もしくはＯ結合型のグリコシル化部位の付加および／もしくは欠失、または１以上のシステイン残基の付加および／もしくは欠失を含み得る。
【００５５】
関連した核酸分子はまた、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのＡＢＣＬポリペプチドの少なくとも約２５個連続したアミノ酸、または約５０個のアミノ酸、または約７５個のアミノ酸、または約１００個のアミノ酸、または約１５０個のアミノ酸、または約２００個のアミノ酸、または２００個より多くのアミノ酸残基のポリペプチドをコードする、ＡＢＣＬ核酸分子のフラグメントを包含する。
【００５６】
さらに、関連したＡＢＣＬ核酸分子はまた、本明細書中で定義される中程度または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１、配列番号４、もしくは配列番号７のいずれかのＡＢＣＬ核酸分子、またはポリペプチドをコードする分子の十分に相補的な配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子を包含し、このポリペプチドは、配列番号２、配列番号５、もしくは配列番号８、または本明細書中に定義される核酸フラグメント、または本明細書中に定義されるポリペプチドをコードする核酸フラグメントのいずれかに示されるアミノ酸配列を含む。ハイブリダイゼーションプローブを、本明細書中に提供されるＡＢＣＬ配列を用いて調製して、ｃＤＮＡライブラリー、ゲノムＤＮＡライブラリーまたは合成ＤＮＡライブラリーを関連した配列についてスクリーニングし得る。ＡＢＣＬポリペプチドのＤＮＡ配列および／またはアミノ酸配列のうちの、既知配列に対して顕著な同一性を示す領域は、本明細書中に記載される配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてこれらの領域を用いて、スクリーニングのためのプローブを設計し得る。
【００５７】
用語「高度にストリンジェントな条件」とは、配列が非常に相補的であるＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを許容し、かつ顕著に不一致のＤＮＡのハイブリダイゼーションを排除するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、温度、イオン強度および変性剤（例えば、ホルムアミド）の濃度によって主に決定される。ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての「高度にストリンジェントな条件」の例は、６５〜６８℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは４２℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび５０％ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  第４章（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５８】
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミドまたは他の変性剤）もまた用いられ得るが、ハイブリダイゼーションの速度が影響される。他の薬剤が、非特異的および／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少させる目的のために、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液中に含まれ得る。例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム、ＮａＤｏｄＳＯ４、（ＳＤＳ）、ｆｉｃｏｌｌ、デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）およびデキストラン硫酸であるが、他の適切な薬剤もまた用いられ得る。これらの添加剤の濃度および種類は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施される；しかし、代表的なイオン強度の条件では、ハイブリダイゼーションの速度は、ｐＨからほぼ独立する。Ａｎｄｅｒｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  第４章（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
【００５９】
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基組成、長さおよび塩基対の不一致程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの変動要因を適応させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にするために当業者によって調整され得る。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の方程式によって評価され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中でのナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中での（グアニン＋シトシン）塩基の百分率である。不完全に一致したハイブリッドについては、融解温度は、１％の不一致毎に約１℃下げられる。
【００６０】
用語「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が形成され得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、５０〜６５℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムまたは３７〜５０℃での０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウムおよび２０％ホルムアミドである。例示として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中での５０℃という「中程度にストリンジェントな条件」は、約２１％の不一致を可能にする。
【００６１】
「高度にストリンジェントな条件」と「中程度にストリンジェントな条件」との間に絶対的な区別が存在しないことが当業者によって認識される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）では、完全に一致した長さのＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃で（同じイオン強度で）の洗浄を用いると、このことは、約６％の不一致を可能にする。より遠く関連した配列を捕獲するために、当業者は、単純に、温度を低くし得るかまたはイオン強度を高くし得る。
【００６２】
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについての１Ｍ  ＮａＣｌ＊中での融解温度の良好な評価は、以下によって与えられる：
Ｔｍ＝Ａ−Ｔ塩基対あたり２℃  ＋  Ｇ−Ｃ塩基対あたり４℃
＊６×塩クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのナトリウムイオン濃度は、１Ｍである。Ｓｕｇｇｓら，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ６８３（ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ編，１９８１）を参照のこと。
【００６３】
オリゴヌクレオチドについての高度ストリンジェンシー洗浄条件は通常、６×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中でのそのオリゴヌクレオチドのＴｍよりも０℃〜５℃低い温度においてである。
【００６４】
別の実施形態では、関連した核酸分子は、配列番号１、配列番号４、もしくは配列番号７のいずれかに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０パーセント同一であるヌクレオチド配列を含むかもしくはこれからなる。好ましい実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号４、もしくは配列番号７のいずれかに示されるヌクレオチド配列に対して約７５パーセント、または約８０パーセント、または約８５パーセント、または約９０パーセント、または約９５、９６、９７、９８、または９９パーセント同一である。関連した核酸分子は、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を保有するポリペプチドをコードする。
【００６５】
核酸配列における相違は、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸配列の保存的改変および／または非保存的改変をもたらし得る。
【００６６】
配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列に対する保存的改変（およびコードするヌクレオチドに対する、対応する改変）は、ＡＢＣＬポリペプチドの機能的特徴および化学的特徴と類似の機能的特徴および化学的特徴を有するポリペプチドを生じる。対照的に、ＡＢＣＬポリペプチドの機能的特徴および／または化学的特徴における実質的な改変は、以下を維持することに対するその影響が顕著に異なる、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列における置換を選択することによって達成され得る：（ａ）例えば、シートもしくはヘリックスコンホメーションのような、置換領域における分子骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさ。
【００６７】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置でのアミノ酸残基の極性にも電荷にもほとんどまたは全く影響がないような、ネイティブでない残基によるネイティブなアミノ酸残基の置換を含み得る。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」について以前に記載されたように、アラニンによって置換され得る。
【００６８】
保存的アミノ酸置換はまた、生物学的系における合成によるよりむしろ、化学的なペプチド合成によって代表的に組み込まれる、天然には存在しないアミノ酸残基を含む。これらとしては、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転形態または反転形態が挙げられる。
【００６９】
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、複数のクラスに分割され得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００７０】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの、別のクラス由来のメンバーに対する交換を包含し得る。このような置換された残基は、非ヒトＡＢＣＬポリペプチドと相同なヒトＡＢＣＬポリペプチドの領域またはこの分子の非相同領域に導入され得る。
【００７１】
このような変化を行う際に、アミノ酸のヒドロパシー指数が考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性特性および電荷特性に基づいて、ヒドロパシー指数を割り当てられている。ヒドロパシー指数は、以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００７２】
タンパク質に対する相互作用的な生物学的機能を確認する際の、ヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当該分野において一般的に理解されている（Ｋｙｔｅら、１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−３１）。特定のアミノ酸が類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸の代わりに置換され得、そして依然として類似の生物学的活性を維持し得ることが、公知である。ヒドロパシー指数に基づいて変化を起こす際に、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。
【００７３】
類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得る（特に、これによって作製された生物学的機能的に等価なタンパク質またはペプチドが、この場合においてと同様に、免疫学的実施形態における使用に関して考慮される場合）こともまた、当該分野において理解されている。タンパク質の最も大きな局所的平均親水性は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される場合に、その免疫原性および抗原性、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性に相関する。
【００７４】
以下の親水性の値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性の値に基づいて変化を行う際に、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±ｌ以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好ましい。アミノ酸一次配列から、エピトープをまた、親水性に基づいて同定し得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」と呼ばれる。
【００７５】
所望のアミノ酸置換（保存的であれ非保存的であれ）は、当業者によって、このような置換が所望される時点で決定され得る。例えば、アミノ酸置換を使用して、ＡＢＣＬポリペプチドの重要な残基を同定し得るか、または本明細書中に記載されるＡＢＣＬポリペプチドの親和性を増加もしくは減少させ得る。例示的なアミノ酸置換は、表Ｉに記載される。
【００７６】
（表Ｉ）
【００７７】
【表１】
2004520083.tif 000002
当業者は、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のポリペプチドの適切な改変体を、周知の技術を使用して、決定し得る。生物学的活性を破壊することなく変化され得る分子の適切な領域を同定するために、当業者は、活性のために重要であるとは考えられない領域を標的化し得る。例えば、同じ種由来かまたは他の種由来の、類似の活性を有する類似のポリペプチドが既知である場合には、当業者は、ＡＢＣＬポリペプチドのアミノ酸配列を、このような類似のポリペプチドと比較し得る。このような比較を用いて、類似のポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を同定し得る。このような類似のポリペプチドと比較して保存されていない、ＡＢＣＬ分子の領域における変化が、ＡＢＣＬポリペプチドの生物学的活性および／または構造にさほど不利に影響を与えるようではないことが、理解される。当業者にはまた、比較的保存された領域においてさえ、化学的に類似のアミノ酸を、活性を維持ながら天然に存在する残基と置換し得ることが公知である（保存的アミノ酸残基置換）。従って、生物学的活性または構造のために重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することなく、またはポリペプチド構造に不利に影響を与えることなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
【００７８】
さらに、当業者は、活性または構造のために重要である、類似のポリペプチドにおける残基を同定する、構造−機能研究を再調査し得る。このような比較の観点において、類似のポリペプチドにおける活性または構造のために重要なアミノ酸残基に対応する、ＡＢＣＬポリペプチド中のアミノ酸残基の重要性を予測し得る。当業者は、ＡＢＣＬポリペプチドのこのような予測された重要なアミノ酸残基に対する化学的に類似のアミノ酸置換を、選択し得る。
【００７９】
当業者はまた、類似のポリペプチドにおける三次元構造およびその構造に関するアミノ酸配列を分析し得る。このような情報の観点において、当業者は、ＡＢＣＬポリペプチドのアミノ酸残基のアライメントを、その三次元構造に関して予測し得る。当業者は、そのタンパク質の表面に存在すると予測されるアミノ酸残基に対する急激な変化を起こさないように、選択し得る。なぜなら、このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、単一のアミノ酸置換を各アミノ酸残基に含む、試験改変体を生成し得る。これらの改変体は、当業者に公知の活性アッセイを使用して、スクリーニングされ得る。このような改変体は、適切な改変体に関する情報を集めるために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が破壊された活性、所望でなく減少した活性、または所望でない活性を生じることを発見した場合には、このような変化を有する改変体は、回避される。換言すれば、このような慣用的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が、単独でかまたは他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を、容易に決定し得る。
【００８０】
多数の科学刊行物が、二次構造の推定に充てられてきた。Ｍｏｕｌｔ，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：４２２−２７；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２−４５；Ｃｈｏｕら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１３：２１１−２２；Ｃｈｏｕら、１９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５−４８；Ｃｈｏｕら、１９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら、１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７−８４を参照のこと。さらに、コンピュータープログラムが、二次構造の推定を補助するために、現在利用可能である。二次構造を推定する１つの方法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％より大きな配列同一性または４０％より大きな類似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、しばしば、類似の構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の近年の成長は、二次構造（ポリペプチドまたはタンパク質の構造における可能な折り畳みの数を含む）の強化された推定性を提供してきた。Ｈｏｌｍら、１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２４４−４７を参照のこと。所定のポリペプチドまたはタンパク質において制限された数の折り畳みが存在すること、および一旦、構造の臨界数が解析されると、構造推定は劇的により正確となることが、示唆されてきた（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３６９−７６）。
【００８１】
二次構造を推定するさらなる方法としては、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１５−１９）、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５３：１６４−７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：１４６−５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４３５５−５８）、および「進化学的連鎖」（Ｈｏｌｍら、前出、およびＢｒｅｎｎｅｒら、前出を参照のこと）が挙げられる。
【００８２】
好ましいＡＢＣＬポリペプチド改変体としては、グリコシル化部位の数および／または型が配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して変化している、グリコシル化改変体が挙げられる。１つの実施形態において、ＡＢＣＬポリペプチド改変体は、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列より多いかまたはより少ない数のＮ連結グリコシル化部位を含む。Ｎ連結グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘと印されるアミノ酸残基は、プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミノ酸残基の置換は、Ｎ連結炭水化物鎖の付加のための潜在的な新たな部位を提供する。あるいは、この配列を排除する置換は、存在するＮ連結炭水化物鎖を除去する。１つ以上のＮ連結グリコシル化部位（代表的に、天然に存在するグリコシル化部位）が排除され、そして１つ以上の新たなＮ連結部位が作製される、Ｎ連結炭水化物鎖の再配列もまた、提供される。さらなる好ましいＡＢＣＬ改変体としては、１つ以上のシステイン残基が、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリン）で置換されている、システイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、ＡＢＣＬポリペプチドが、例えば不溶性の封入体の単離の後に、生物学的に活性なコンフォメーションにリフォールディングされなければならない場合に、有用である。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン残基を有し、そして代表的には同数のシステイン残基を有し、対合していないシステインから生じる相互作用を最小にする。
【００８３】
別の実施形態において、ＡＢＣＬポリペプチド改変体は、少なくとも１つのアミノ酸挿入を有し、そしてポリペプチドが配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むか、あるいは少なくとも１つのアミノ酸欠失を有し、ここでポリペプチドが配列番号２、配列番号５、またた配列番号８のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。ＡＢＣＬポリペプチド改変体はまた、ポリペプチドがカルボキシル末端および／またはアミノ末端の短縮を有し、そしてさらにここで、このポリペプチドが、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。ＡＢＣＬポリペプチド改変体さらにはまた、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシル末端短縮、およびアミノ末端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を含み、そしてここで、ポリペプチドが配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む。
【００８４】
さらなる実施形態において、ＡＢＣＬポリペプチド改変体は、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列に少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態において、ＡＢＣＬポリペプチド改変体は、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列に少なくとも７５％、または約８０％、または約８５％、または約９０％、あるいは約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のパーセントであるアミノ酸配列を含む。ＡＢＣＬポリペプチド改変体は、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のポリペプチドの少なくとも１つの活性を保有する。
【００８５】
さらに、配列番号２、配列番号５、または配列番号８、あるいは他のＡＢＣＬポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、同種ポリペプチドに融合してホモダイマーを形成し得るか、あるいは異種ポリペプチドに融合してヘテロダイマーを形成し得る。異種のペプチドおよびポリペプチドとしては、以下が挙げられるが、それらに限定されない：ＡＢＣＬ融合ポリペプチドの検出および／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通レセプタータンパク質またはその一部（例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン）；膜貫通レセプタータンパク質に結合する、リガンドまたはその一部；触媒的に活性である、酵素またはその部分；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたはペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；安定性を増加させるポリペプチドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）；ならびに配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは別のＡＢＣＬポリペプチドとは異なる治療活性を有するポリペプチド。
【００８６】
融合は、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＡＢＣＬポリペプチドの、アミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、なされ得る。融合は、リンカーもアダプター分子も用いずに直接であっても、リンカーもしくはアダプター分子を介してであってもよい。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基であり得、代表的に、約２０〜約５０アミノ酸残基である。リンカーまたはアダプター分子はまた、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼまたはプロテアーゼに対する切断部位を有して設計されて、融合した部分の分離を可能にし得る。一旦構築されると、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載の方法に従って誘導体化され得ることが、理解される。
【００８７】
本発明のさらなる実施形態において、配列番号２、配列番号５、または配列番号８のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＡＢＣＬポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合される。抗体は、以下の２つの機能的に独立した部分を含む；抗原を結合する「Ｆａｂ」として公知の可変ドメイン、ならびに補体活性化および食作用細胞による攻撃のようなエフェクター機能に関与する、「Ｆｃ」として公知の定常ドメイン。Ｆｃは、長い血清半減期を有し、一方でＦａｂは、短寿命である。Ｃａｐｏｎら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：５２５−３１。治療タンパク質と一緒に構築される場合には、Ｆｃドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはＦｃレセプター結合、プロテインＡ結合、補体結合、およびおそらくさらに胎盤移入のような機能を組み込み得る。同書。表ＩＩは、当該分野において公知の特定のＦｃ融合物の使用を要約する。
【００８８】
【表２】
2004520083.tif 000003
一例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、当業者に公知の方法を使用して、ＡＢＣＬポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合され得る。別の例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、ＡＢＣＬポリペプチドフラグメント（例えば、ＡＢＣＬポリペプチドの推定細胞外部分）のアミノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合され得る。
【００８９】
得られるＡＢＣＬ融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラムの使用によって、精製され得る。Ｆｃ領域に融合したペプチドおよびタンパク質は、融合していない対応物より実質的に長いインビボでの半減期を示すことが見出された。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量化／多量体化を可能にする。Ｆｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であり得るか、または治療品質、循環時間、もしくは減少した凝集のような特定の品質を改善するよう変更され得る。
【００９０】
関連する核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法によって容易に計算される。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｄ．Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ（Ｐａｒｔ  １，Ａ．Ｍ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９９４）；Ｇ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｌｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｍ．ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  １９９１）；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、１９８８，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間での最大の適合を与えるように、設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公共に利用可能なコンピュータープログラムにおいて記載されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための、好ましいコンピュータープログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０）を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、前出）から公共に利用可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決定するために使用され得る。
【００９２】
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアライメントスキームは、これら２つの配列の短い領域のみの適合を生じ得、そしてこの小さな整列領域は、２つの全長配列間に有意な関連がない場合でさえも、非常に高い配列同一性を有し得る。従って、好ましい実施形態において、選択された整列方法（ＧＡＰプログラム）は、特許請求されるポリペプチドの少なくとも５０の連続するアミノ酸にわたる整列を生じる。
【００９３】
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一性の百分率が決定されるべき２つのポリペプチドが、それらのそれぞれのアミノ酸の最適な適合（アルゴリズムによって決定される「適合したスパン」）のために、整列される。ギャップオープニングペナルティ（ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、平均対角の３倍として計算される：「平均対角」とは、使用される比較行列（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ）の対角の平均である；「対角」とは、特定の比較行列によって各完全なアミノ酸適合に対して割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップエクステンションペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）（これは通常、キャップオープニングペナルティーの０．１倍である）、ならびにＰＡＭ  ２５０またはＢＬＯＳＵＭ  ６２のような比較行列が、このアルゴリズムと組み合わせて使用される。標準的な比較行列もまた、このアルゴリズムによって使用される（Ｄａｙｈｏｆｆら、５  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（補遺３  １９７８）（ＰＡＭ２５０比較行列）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１９（ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較行列）を参照のこと）。
【００９４】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは、以下を含む：
Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３；
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ  ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、前出）；
Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ：１２
Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ：４
Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｏｆ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ：０。
このＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較（末端ギャップに対してはペナルティーがないこととともに）のためのデフォルトパラメータである。
【００９５】
核酸分子配列比較のための好ましいパラメータは、以下を含む：
Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，前出；
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｍａｔｒｉｘ：ｍａｔｃｈｅｓ＝＋１０，ｍｉｓｍａｔｃｈ＝０
Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｙ：５０
Ｇａｐ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｅｎａｌｔｙ：３。
このＧＡＰプログラムはまた、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータは、核酸分子比較のためのデフォルトパラメータである。
【００９６】
Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に記載されるものを含む、他の例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティ、ギャップエクステンションペナルティ、比較行列および類似性の閾値が使用され得る。なされるべき特定の選択は、当業者に明らかであり、そしてなされるべき特定の比較（例えば、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡ）；ならびにさらに、その比較が所定の対の配列間（この場合には、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）であるか、１つの配列と配列の大きなデータベースとの間（この場合には、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるかに依存する。
【００９７】
（核酸分子）
ＡＢＣＬポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子は、種々の様式（化学合成、ｃＤＮＡもしくはゲノムのライブラリーのスクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはｃＤＮＡのＰＣＲ増幅が挙げられるが、これらに限定されない）で容易に得られ得る。
【００９８】
本明細書中において使用される組換えＤＮＡ法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．およびＷｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９４）に記載されている。本発明は、本明細書中に記載され得ような核酸分子、およびこのような分子を得るための方法を提供する。
【００９９】
ＡＢＣＬポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が１つの種から同定された場合には、この遺伝子の全てまたは一部を、同じ種由来のオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）または関連する遺伝子を同定するためのプローブとして使用し得る。このプローブまたはプライマーを使用して、ＡＢＣＬポリペプチドを発現すると考えられる種々の組織供給源由来のｃＤＮＡをスクリーニングし得る。さらに、配列番号１、配列番号４、または配列番号７のいずれかに記載されるような配列を有する核酸分子の部分または全てを使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングし、ＡＢＣＬポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定および単離し得る。代表的に、中程度または高いストリンジェンシーの条件が、スクリーニングのために使用されて、このスクリーニングから得られる偽陽性の数を最小にする。
【０１００】
ＡＢＣＬポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子もまた、発現されたタンパク質の特性に基づいて陽性クローンの検出を使用する発現クローニングによって、同定され得る。代表的に、核酸ライブラリーは、抗体または他の結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）を、宿主細胞表面において発現および提示されたクローン化タンパク質に結合させることによって、スクリーニングされる。抗体または結合パートナーは、所望のクローンを発現する細胞を同定するために、検出可能な標識で改変される。
【０１０１】
以下に記載される説明に従って実施される組換え発現技術に従って、これらのポリヌクレオチドを産生し得、そしてコードされたポリペプチドを発現し得る。例えば、ＡＢＣＬポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切なベクターに挿入することによって、当業者は、多量の所望のヌクレオチド配列を容易に生成し得る。次いで、これらの配列を使用して、検出プローブまたは増幅プライマーを生成し得る。あるいは、ＡＢＣＬポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入し得る。発現ベクターを適切な宿主に導入することによって、コードされたＡＢＣＬポリペプチドが、多量に生成され得る。
【０１０２】
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。この方法において、ｃＤＮＡは、酵素逆転写酵素を使用して、ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製される。次いで、２つのプライマー（代表的には、ＡＢＣＬポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの２つの別個の領域に対して相補的である）が、ＴａｑポリメラーゼのようなポリメラーゼとともにこのｃＤＮＡに添加され、そしてこのポリメラーゼが、このｃＤＮＡのこれら２つのプライマー間の領域を増幅する。
【０１０３】
ＡＢＣＬポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら、１９８９，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．２８：７１６−３４によって記載されるもののような、当業者に周知の方法を使用する、化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのリン酸トリエステル、ホスホルアミダイト、およびＨ−ホスホネート方法が挙げられる。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を使用する、ポリマーにより支持される合成である。代表的に、ＡＢＣＬポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用して、いくつかのフラグメントとして合成され得る。次いで、これらのフラグメントが一緒に連結されて、ＡＢＣＬ遺伝子の全長ヌクレオチド配列を形成し得る。通常、このポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、ＡＴＧを有し、これは、メチオニン残基をコードする。このメチオニンは、宿主細胞において産生されたポリペプチドがその細胞から分泌されるよう設計されるか否かに依存して、ＡＢＣＬポリペプチドの成熟形態で存在してもそうでなくてもよい。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１０４】
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるＡＢＣＬポリペプチドの最適な発現のために変更されたコドンを含む。特定のコドン変更は、ＡＢＣＬポリペプチドおよび発現のために選択される宿主細胞に依存する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって（例えば、所定の宿主細胞において高度に発現される遺伝子における使用に好ましいコドンを選択することによって）実施され得る。高度に発現された細菌遺伝子のコドン優先性のための「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」のようなコドン頻度表を組み込むコンピュータアルゴリズムが使用され得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。他の有用なコドン頻度表としては、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ．」が挙げられる。
【０１０５】
いくつかの場合において、ＡＢＣＬポリペプチド改変体をコードする核酸分子を調製することが所望であり得る。改変体をコードする核酸分子は、プライマーが所望の点変異を有する部位指向型変異誘発、ＰＣＲ増幅、または他の適切な方法を使用して生成され得る（変異誘発技術の記載に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。Ｅｎｇｅｌｓら、前出によって記載される方法を使用する化学合成もまた、このような改変体を調製するために使用され得る。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
【０１０６】
（ベクターおよび宿主細胞）
ＡＢＣＬポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入する。ベクターは、代表的に、使用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、ベクターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じ得るように、宿主細胞機構と適合性である）。ＡＢＣＬポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫（バキュロウイルス系）宿主細胞および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細胞の選択は、ＡＢＣＬポリペプチドが翻訳後修飾（例えば、グリコシル化および／またはホスホリル化）されるか否かに一部依存する。そうである場合、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説について、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，ｖｏｌ．１８５（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９０）を参照のこと。
【０１０７】
代表的に、任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミド維持のためならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のために配列を含む。このような配列（集合的に、「隣接配列」と呼ばれる）は、特定の実施形態において、代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、ならびに選択マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論される。
【０１０８】
必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、ＡＢＣＬポリペプチドコード配列の５’末端または３’末端に配置されるオリゴヌクレオチド分子）を含み得；オリゴヌクレオチド配列は、ｐｏｌｙＨｉｓ（例えば、ｈｅｘａＨｉｓ）、別の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス））または市販の抗体が存在するｍｙｃをコードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からの、ＡＢＣＬポリペプチドのアフィニティ精製のための手段として役立ち得る。アフィニティ精製は、例えば、アフィニティーマトリクスとしてタグに対して抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。必要に応じて、タグは、続いて、切断のために特定のペプチダーゼを使用するような種々の手段によって、精製されたＡＢＣＬポリペプチドから除去され得る。
【０１０９】
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または系統由来）であり得るか、異種（すなわち、宿主細胞種または系統以外の種由来）であり得るか、ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）であり得るか、または合成であり得るか、あるいは隣接配列は、ＡＢＣＬポリペプチド発現を調節するように正常に機能するネイティブ配列であり得る。このように、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生物または無脊椎生物、あるいは任意の植物であり得、但し、その隣接配列は、宿主細胞の機構において機能的であり、そして宿主細胞の機構によって活性化され得る。
【０１１０】
本発明のベクターにおいて有用な隣接配列は、当該分野において周知であるいくつかの方法のいずれかによって得られ得る。代表的には、ＡＢＣＬ遺伝子隣接配列以外の、本明細書中で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合において、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は、公知であり得る。ここで、この隣接配列は、核酸合成または核酸クローニングのための本明細書中で記載される方法を使用して合成され得る。
【０１１１】
その隣接配列の全てまたは一部のみが公知である場合、ＰＣＲを使用してか、そして／あるいは適切なオリゴヌクレオチドおよび／または同じ種もしくは別の種由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって、得られ得る。その隣接配列が公知でない場合、隣接配列を含むＤＮＡのフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子さえをも含み得る大きなＤＮＡ片から単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するための制限エンドヌクレアーゼ消化、続くアガロースゲル精製を使用する単離、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、または当業者に公知の他の方法によって達成され得る。この目的を達成するための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
【０１１２】
複製起点は、代表的には、商業的に購入された原核生物発現ベクターの一部であり、この起点は、宿主細胞においてベクターの増幅を補助する。特定のコピー数までへのベクターの増幅は、いくつかの場合において、ＡＢＣＬポリペプチドの最適な発現に重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含まない場合、複製起点が、公知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベクターに連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）由来の複製起点は、大部分のグラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶまたはＢＰＶのようなパピローマウイルスの起点）は、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターのために有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクターには必要ではない（例えば、ＳＶ４０起点は、ただそれが初期プロモーターを含むという理由のためだけに、しばしば、使用される）。
【０１１３】
転写終結配列は、代表的には、ポリペプチドコード領域の末端の３’側に位置し、そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列は、Ｇ−Ｃリッチフラグメント、続いてポリＴ配列である。この配列は、ライブラリーから容易にクローン化され得るか、またはベクターの一部として商業的に購入されるが、この配列はまた、本明細書中に記載されるような核酸合成のための方法を使用して、容易に合成され得る。
【０１１４】
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるタンパク質か；（ｂ）その細胞の栄養要求性の欠損を補うタンパク質か；あるいは（ｃ）複合培地から利用可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質を、コードする。好ましい選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
【０１１５】
他の選択遺伝子が、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生により大きく要求される遺伝子が、連続世代の組換え細胞の染色体内でタンデムに反復されるプロセスである。哺乳動物細胞に関する適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、形質転換体のみが、ベクターに存在する選択遺伝子によって生存するように唯一適合される、選択圧下に配置される。選択圧は、培地中の選択因子の濃度が連続的に変化し、それによって選択遺伝子とＡＢＣＬポリペプチドをコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養することによって課される。結果として、増加した量のＡＢＣＬポリペプチドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
【０１１６】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてシャイン−ダルガーノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的に、発現されるＡＢＣＬポリペプチドのプロモーターの３’側かつコード配列の５’側に位置する。シャイン−ダルガーノ配列は、可変であるが、代表的には、ポリプリンである（すなわち、高いＡ−Ｇ含有量を有する）。多くのシャイン−ダルガーノ配列が、同定されており、そのそれぞれが、本明細書中に記載の方法を使用して容易に合成され得、原核生物ベクターにおいて容易に使用され得る。
【０１１７】
リーダー配列、またはシグナル配列は、宿主細胞の外へとＡＢＣＬポリペプチドを指向させるために使用され得る。代表的には、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列は、ＡＢＣＬ核酸分子のコード領域に位置するか、またはＡＢＣＬポリペプチドコード領域の５’末端に直接位置する。多くのシグナル配列が同定されており、選択された宿主細胞において機能性であるシグナル配列のいずれかが、ＡＢＣＬ核酸分子と組み合わせて使用され得る。従って、シグナル配列は、ＡＢＣＬ核酸分子に対して同種（天然に存在する）または異種であり得る。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載される方法を使用して化学的に合成され得る。ほとんどの場合において、シグナルペプチドの存在を介する宿主細胞からのＡＢＣＬポリペプチドの分泌は、分泌されたＡＢＣＬポリペプチドからのシグナルペプチドの除去を生じる。このシグナル配列は、ベクターの成分であり得るか、またはベクターに挿入されたＡＢＣＬ核酸分子の一部であり得る。
【０１１８】
ＡＢＣＬポリペプチドコード領域に結合されたネイティブＡＢＣＬポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、またはＡＢＣＬポリペプチドコード領域に結合された異種シグナル配列をコードするヌクレオチド配列のいずれかの使用が、本発明の範囲内である。選択された異種シグナル配列は、宿主細胞によって認識され、プロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）ものであるべきである。ネイティブＡＢＣＬポリペプチドシグナル配列を認識せず、プロセシングしない原核生物宿主細胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼリーダー、ペニシリナーゼリーダー、または熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌について、ネイティブＡＢＣＬポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、ネイティブシグナル配列が申し分ないが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
【０１１９】
グリコシル化が真核生物宿主細胞発現系において望ましい場合のような、いくつかの場合において、グリコシル化または収量を改善するように、種々のプレ配列（ｐｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプロ配列（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を付加し得、これはまた、グリコシル化に影響し得る。最後のタンパク質産物は、（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）−１位に、発現に付随して１つ以上のさらなるアミノ酸を有し得、これは、完全には除去されないかもしれない。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合される、ペプチダーゼ切断部位において見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、いくつかの酵素切断部位の使用は、その酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断される場合、所望のＡＢＣＬポリペプチドの少し短縮した形態を生じ得る。
【０１２０】
多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の１つ以上のイントロンの存在によって増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺乳動物宿主細胞）において産生される場合、特に当てはまる。使用されるイントロンは、特に使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである場合、ＡＢＣＬ遺伝子内に天然に存在し得る。イントロンが遺伝子内に天然に存在しない（大部分のｃＤＮＡについての）場合、イントロンは、別の供給源から得られ得る。隣接配列およびＡＢＣＬ遺伝子に対するイントロンの位置は、そのイントロンが効果的に転写されなければならないので、一般的に重要である。従って、ＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ分子が転写される場合、イントロンの好ましい位置は、転写開始部位の３’側で、かつポリＡ転写終止配列の５’側である。好ましくは、イントロンは、コード配列を中断しないように、ｃＤＮＡの一方の側面またはもう一方の側面（すなわち、５’側または３’側）に配置される。任意の供給源（ウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む）由来の任意のイントロンを使用して本発明を実行し得るが、但し、このイントロンは、挿入される宿主細胞に適合性である。合成イントロンもまた、ここに含まれる。必要に応じて、１つより多くのイントロンがベクター内で使用され得る。
【０１２１】
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、宿主生物によって認識され、かつＡＢＣＬポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結された、プロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ）の開始コドンに対して上流（すなわち、５’側）に位置する非転写配列である。プロモーターは、従来、２つの種類（誘導プロモーターおよび構成的プロモーター）の一方にグループ化される。誘導プロモーターは、培養条件におけるいくらかの変化（例えば、栄養素の存在または非存在、あるいは温度の変化）に応答して、そのプロモーターの制御下にあるＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始する。他方、構成的プロモーターは、遺伝子産物の連続的産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対して遺伝子をほとんど制御しないかまたは制御しない。多数のプロモーター（種々の潜在的な宿主細胞によって認識される）が周知である。適切なプロモーターは、供給源のＤＮＡからそのプロモーターを制限酵素消化によって取り出し、そして所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、ＡＢＣＬポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブＡＢＣＬプロモーター配列は、ＡＢＣＬ核酸分子の増幅および／または発現を指向させるために使用され得る。しかし、ネイティブプロモーターと比較して発現タンパク質の多くの転写および高収量を可能にする場合、そして使用のために選択された宿主細胞系と適合性である場合、異種プロモーターが好ましい。
【０１２２】
原核生物宿主との使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼプロモーター；トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた、適切である。これらの配列は、公開されており、その結果、当業者は、任意の有用な制限部位を供給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを使用して、所望のＤＮＡにそれらの配列を連結し得る。
【０１２３】
酵母宿主との使用に適切なプロモーターもまた、当該分野において周知である。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターとの使用に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞との使用に適切なプロモーターは周知であり、限定しないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）のようなウイルスのゲノムから得られる、プロモーターが挙げられる。他の適切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
【０１２４】
ＡＢＣＬ遺伝子発現を制御する際に関心があり得るさらなるプロモーターとしては、限定しないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’長末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−４５）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）；またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５）。組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写制御領域もまた、関心がある：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性なインシュリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−２２）；リンパ球において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−４４）；精巣、乳房、リンパ球、および肥満細胞において活性なマウス乳癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−９５）；肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，１９８７，ＧｅｎｅｓおよびＤｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓において活性なα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１）；骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳の稀突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−８６）；ならびに視床下部において活性な性腺刺激ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−７８）。
【０１２５】
エンハンサー配列は、高等真核生物による本発明のＡＢＣＬポリペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加するように、ベクターに挿入され得る。エンハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは、比較的、方向および位置に依存しない。これらは、転写単位に対して５’側および３’側に見出された。哺乳動物遺伝子（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインシュリン）から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が公知である。しかし、代表的には、ウイルス由来のエンハンサーが、使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーは、ＡＢＣＬ核酸分子に対して５’側または３’側でベクター中にスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから５’側の位置に位置する。
【０１２６】
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような開始ベクターから構築され得る。このようなベクターは、所望な隣接配列すべてを含んでも良いし、含まなくても良い。本明細書中に記載される隣接配列の１つ以上がまだベクター内にない場合、それらの隣接配列は、個々に得られ得、ベクターに連結され得る。隣接配列のそれぞれを得るために使用される方法は、当業者に周知である。
【０１２７】
本発明を実行するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞と適合性のベクター、昆虫宿主細胞と適合性のベクター、および哺乳動物宿主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとしては、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−ａｌｐｈａ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９０／１４３６３）ならびにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が挙げられる。
【０１２８】
さらなる適切なベクターとしては、限定しないが、コスミド、プラスミド、または改変ウイルスが挙げられるが、これらのベクター系は、選択された宿主細胞と適合性でなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、限定しないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数のＣｏｌＥｌベースのファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯＴＭ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（登録商標）プラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにバキュロウイルス発現系のような哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはウイルスベクター（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。
【０１２９】
ベクターが構築され、そしてＡＢＣＬポリペプチドをコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後に、この完成したベクターが、増幅および／またはポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入され得る。選択された宿主細胞中へのＡＢＣＬポリペプチド発現ベクターの形質転換は、トランスフェクション、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、または他の公知の技術のような方法を含む、周知の方法によって達成され得る。選択される方法は、部分的に、使用される宿主細胞の型の関数である。これらの方法および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記）に記載される。
【０１３０】
宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であり得る。宿主細胞は、適切な条件下で培養された場合、ＡＢＣＬポリペプチドを合成し、このＡＢＣＬポリペプチドは、その後、（宿主細胞がそのポリペプチドを培地に分泌する場合は）培養培地から収集され得るか、（そのポリペプチドが分泌されない場合）そのポリペプチドを産生する宿主細胞から直接収集される。適切な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性（例えば、グリコシル化またはホスホリル化）に望ましいかまたは必要であるポリペプチド修飾、および生物学的に活性な分子に折り畳まれる容易さなどの、種々の因子に依存する。
【０１３１】
多くの適切な宿主細胞が当該分野において公知であり、多くが、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能である。例としては、限定しないが、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：４２１６−２０）、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞、あるいは３Ｔ３細胞のような、哺乳動物細胞が挙げられる。適切な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物生成、および精製のための方法が、当該分野において公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞株、およびＣＶ−１細胞株である。さらなる例示的な哺乳動物宿主細胞としては、霊長動物細胞株および齧歯類動物細胞株（形質転換細胞株を含む）が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物から誘導される細胞菌株、ならびに初代外植片もまた適切である。候補細胞は、選択遺伝子を遺伝子型的に欠き得るか、または優先的に作用する選択遺伝子を含み得る。他の適切な哺乳動物細胞株としては、限定しないが、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓマウス由来の３Ｔ３、Ｂａｌｂ−ｃマウス由来の３Ｔ３株またはＮＩＨマウス由来の３Ｔ３株、ＢＨＫハムスター細胞株またはＨａＫハムスター細胞株が挙げられる。これらの細胞株のそれぞれは、タンパク質発現の当業者によって公知であり入手可能である。
【０１３２】
同様に、細菌細胞が、本発明に適切な宿主細胞として有用である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１）の種々の菌株は、生物工学の分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．，他のＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．などの種々の菌株もまた、本方法において使用され得る。
【０１３３】
当業者に公知の酵母細胞の多くの菌株はまた、本発明のポリペプチドの発現のため宿主細胞として入手可能である。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓが挙げられる。
【０１３４】
さらに、望ましい場合、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−７２；およびＬｕｃｋｌｏｗら，１９９３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−７９に記載される。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
【０１３５】
グリコシル化ＡＢＣＬポリペプチドを発現するために、トランスジェニック動物もまた使用し得る。例えば、トランスジェニック乳産生動物（例えば、雌ウシまたはヤギ）を使用し、本発明のグルコシル化ポリペプチドを動物の乳中に得ることができる。ＡＢＣＬポリペプチドを産生するために植物もまた使用し得るが、しかし、一般的に、植物において生じるグリコシル化は、哺乳動物細胞において産生されるものとは異なり、ヒト治療に適切ではないグリコシル化産物を生じ得る。
【０１３６】
（ポリペプチド産生）
ＡＢＣＬポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を使用して培養され得る。この培地は、通常、細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養分を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するための適切な培地としては、例えば、Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細胞を培養するための適切な培地としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地１６４０（ＲＰＭＩ  １６４０）、最小必須培地（ＭＥＭ）および／またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これらの全ては、培養される特定の細胞株に必要な血清および／または増殖因子を補充され得る。昆虫細胞についての適切な培地は、必要に応じて、イーストレート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物、および／またはウシ胎仔血清を補充した、グレース培地である。
【０１３７】
代表的に、トランスフェクトされた細胞または形質転換された細胞の選択的な増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、培地に補充物質として加えられる。使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されたプラスミド中に存在する選択マーカーエレメントによって、示される。例えば、選択マーカーエレメントがカナマイシン耐性である場合、培養倍地に加えられる化合物は、カナマイシンである。選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリン、およびネオマイシンが挙げられる。
【０１３８】
宿主細胞によって産生されるＡＢＣＬポリペプチドの量は、当該分野において公知の標準的な方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限定しないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫沈降、および／またはＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイのような活性アッセイが、挙げられる。
【０１３９】
ＡＢＣＬポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計される場合、ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地中で見出され得る。しかし、ＡＢＣＬポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、そのＡＢＣＬポリペプチドは、細胞質および／または核（真核宿主細胞について）に、あるいは、細胞質ゾル（グラム陰性細菌宿主細胞について）に存在する。
【０１４０】
宿主細胞の細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）に位置するかまたは細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に位置するＡＢＣＬポリペプチドについて、細胞内物質（グラム陰性細菌についての封入体を含む）は、当業者に公知の任意の標準的な技術を使用して宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿主細胞は、フレンチプレス、ホモジナイゼーション、および／または超音波処理、続く遠心分離によって、ペリプラズム／細胞質の中身を放出するように溶解され得る。
【０１４１】
ＡＢＣＬポリペプチドが細胞質ゾル内に封入体を形成した場合、この封入体は、しばしば、細胞内膜および／または細胞外膜に結合され得、従って、主に、遠心分離後のペレット物質において見出される。次いで、このペレット物質は、ｐＨ極値で処理され得るか、あるいはジチオトレイトールのような還元剤の存在下で、アルカリ性のｐＨで、またはトリスカルボキシエチルホスフィンの存在下で酸性のｐＨで、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体のようなカオトロピック剤で処理して、封入体を放出させ、分断させ、そして溶解させ得る。次いで、溶解されたＡＢＣＬポリペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降などを使用して分析され得る。ＡＢＣＬポリペプチドを単離することが望ましい場合、単離は、本明細書中およびＭａｒｓｔｏｎら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−７５に記載される方法のような標準的な方法を使用して、達成され得る。
【０１４２】
いくつかの場合、ＡＢＣＬポリペプチドは、単離の際、生物学的に活性でなくても良い。「再折り畳みする」、つまり、ポリペプチドをその三次構造に変換し、ジスルフィド連結を生成するための種々の方法を使用して、生物学的活性を回複し得る。このような方法は、溶解されたポリペプチドをあるｐＨ（通常７より上）および特定の濃度のカオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の存在下に曝露する工程を包含する。カオトロピック剤の選択は、封入体溶解に使用される選択に非常に類似するが、通常、カオトロピック剤は低い濃度で使用され、溶解に使用されるカオトロピック剤と必ずしも同一ではない。多くの場合、再折り畳み／酸化溶液はまた、還元剤、または特定の比の還元剤およびその酸化形態を含んで、特定の酸化還元電位を生成し、タンパク質のシステイン架橋の形成を生じるジスルフィドシャフリングを可能にする。通常使用される酸化還元対のいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化銅（ＩＩ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、および２，２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂ（ＭＥ）が挙げられる。多くの場合において、共溶媒が、使用され得るか、または再折り畳みの効率を増加するのに必要であり得、この目的のために使用されるより一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、アルギニンなどが挙げられる。
【０１４３】
封入体がＡＢＣＬポリペプチドの発現において有意な程度まで形成されない場合、ポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後に上清中に見出される。ポリペプチドは、さらに、本明細書中に記載されるような方法を使用して上清から単離され得る。
【０１４４】
溶液からのＡＢＣＬポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成され得る。ポリペプチドが、ヘキサヒスチジン（ＡＢＣＬポリペプチド／ヘキサＨｉｓ）のようなタグまたは他の小さなペプチド（例えば、ＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をそのカルボキシ末端またはアミノ末端のいずれかにおいて含むように合成された場合、そのカラムマトリクスがタグに対する高い親和性を有するアフィニティーカラムに溶液を通すことによって一工程で精製され得る。
【０１４５】
例えば、ポリヒスチジンは、ニッケルに対して大きな親和性および特異性を有して結合する。従って、ニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）は、ＡＢＣＬポリペプチド／ポリＨｉｓの精製のために使用され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  §  １０．１１．８（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  １９９３）を参照のこと。
【０１４６】
さらに、ＡＢＣＬポリペプチドは、ＡＢＣＬポリペプチドを特異的に認識し得、そしてＡＢＣＬポリペプチドに結合し得るモノクローナル抗体の使用によって精製され得る。
【０１４７】
精製のための他の適切な手段はとしては、限定しないが、アフィニティークロマトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、電気泳動（ネイティブゲル電気泳動を含む）およびその後のゲル溶出、および分取用等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」機器／技術、Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）が挙げられる。いくつかの場合において、２つ以上の精製技術が、増加した純度を達成するために組み合わせられ得る。
【０１４８】
ＡＢＣＬポリペプチドはまた、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、１９６３，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９８５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５１３２；ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．１９８４）に記載されるような当該分野で公知の技術を使用する、化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）によって調製され得る。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを有するかまたは有さないで合成され得る。化学的に合成されたＡＢＣＬポリペプチドは、これらの参考文献に記載される方法を使用して酸化されて、ジスルフィド結合を形成し得る。化学的に合成されたＡＢＣＬポリペプチドは、組換え的に産生されるかまたは天然の供給源から精製される対応するＡＢＣＬポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると期待され、従って、組換えまたは天然のＡＢＣＬポリペプチドと相互交換可能に使用され得る。
【０１４９】
ＡＢＣＬポリペプチドを得る別の手段は、ＡＢＣＬポリペプチドが天然に見出される供給源の組織および／または流体のような生物学的サンプルからの精製による。このような精製は、本明細書中に記載されるようなタンパク質精製のための方法を使用して行われ得る。精製の間、ＡＢＣＬポリペプチドの存在が、例えば、組換え的に産生されたＡＢＣＬポリペプチドまたはそのペプチドフラグメントに対して調製される抗体を使用してモニターされ得る。
【０１５０】
核酸およびポリペプチドを産生するための多くのさらなる方法は、当該分野において公知であり、この方法は、ＡＢＣＬポリペプチドに対して特異性を有するポリペプチドを産生するために使用され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら、１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２２９７−３０３を参照のこと。これは、ｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの間の融合タンパク質の産生を記載する。Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ  ３：２６８−７３もまた参照のこと。さらに、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドを得るための方法を記載する。この手順は、オリゴヌクレオチドの異種プールを生成する工程を包含し、それぞれが、５’ランダム化配列、中心の予め選択された配列、および３’ランダム化配列を有する。得られる異種プールは、所望の生物学的活性を示さない細胞の集団に導入される。次いで、細胞の亜集団を、所定の生物学的機能を示すものについてスクリーニングする。その亜集団から、所望の生物学的機能を実行し得るオリゴヌクレオチドが単離される。
【０１５１】
米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２３，３２３号；および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチドを産生するためのプロセスを記載する。これは、確率論的遺伝子またはそのフラグメントを産生し、次いで、確率論的遺伝子によってコードされた１以上のタンパク質を産生する宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって達成される。次いで、この宿主は、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生する、これらのクローンを同定するためにスクリーニングされる。
【０１５２】
ペプチドまたはポリペプチドを産生するための別の方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ，Ｉｎｃ．によって出願された国際公開番号ＷＯ９９／１５６５０（「Ｒａｎｄｏｍ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（ＲＡＧＥ−ＧＤ）として知られている）に記載されており、このプロセスは、インサイチュ組換え方法によって、内因性遺伝子の発現の活性化または遺伝子の過剰発現を含む。例えば、内因性遺伝子の発現は、非相同性組換えまたは非正統的組換えによって、遺伝子の発現を活性化し得る標的細胞中に、調節配列を組み込むことによって、活性化または増加される。この標的ＤＮＡは、まず、放射線に供せられ、そして遺伝子プロモーターが挿入される。このプロモーターは、最終的に遺伝子の前方の切れ目に配置され、遺伝子の転写を開始する。これは、所望のペプチドまたはポリペプチドの発現より生じる。
【０１５３】
これらの方法はまた、包括的なＡＢＣＬポリペプチド発現ライブラリーを作製するために使用され得、これは、続いて、種々のアッセイ（例えば、生化学的アッセイ、細胞アッセイおよび生物全体でのアッセイ（例えば、植物、マウスなど））において、ハイスループット表現型スクリーニングのために使用され得る。
【０１５４】
（合成）
本明細書中に記載される核酸およびポリペプチド分子が、組換えおよび他の手段によって産生され得ることは、当業者によって理解される。
【０１５５】
（選択的結合因子）
用語「選択的結合因子」とは、１以上のＡＢＣＬポリペプチドに対して特異性を有する分子をいう。適切な選択的結合因子としては、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに小分子が挙げられるが、これらに限定されない。適切な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。本発明の例示的なＡＢＣＬポリペプチド選択的結合因子は、ＡＢＣＬポリペプチドの特定の部分を結合し得、これにより、ポリペプチドのＡＢＣＬポリペプチドレセプターへの結合を阻害する。
【０１５６】
ＡＢＣＬポリペプチドと結合する抗体および抗体フラグメントのような選択的結合因子は、本発明の範囲内である。この抗体は、ポリクローナル抗体（単一特異的なポリクローナル抗体を含む）；モノクローナル抗体（ＭＡｂ）；組換え抗体；キメラ抗体；ヒト化（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植化）抗体；ヒト抗体；単鎖抗体；および／または二特異的抗体；ならびにフラグメント；改変体；またはそれらの誘導体であり得る。抗体フラグメントとしては、ＡＢＣＬポリペプチド上のエピトープに結合する抗体のこれらの一部が挙げられる。このようなフラグメントの例としては、全長抗体の酵素学的切断によって産生されたＦａｂおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメントとしては、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含む、組換えプラスミドの発現）によって産生されたフラグメントが挙げられる。
【０１５７】
ＡＢＣＬポリペプチドに対するポリクローナル抗体は、一般に、ＡＢＣＬポリペプチドおよびアジュバンドの複数回の皮下注射または腹腔内注射によって動物（例えば、ウサギまたはマウス）において産生される。ＡＢＣＬポリペプチドをキャリアタンパク質に結合体化させることは、有用であり得、このタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターのように、免疫される種において免疫原性である。また、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答を増強させるために使用される。免疫後、この動物は採血され、そして血清を、抗ＡＢＣＬ抗体力価についてアッセイする。
【０１５８】
ＡＢＣＬポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、培地中の連続細胞株による抗体分子の産生を提供する、任意の方法を使用して産生される。モノクローナル抗体を調製するために適切な方法の例としては、Ｋｏｈｌｅｒら、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７のハイブリドーマ法、およびヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７））が挙げられる。ＡＢＣＬポリペプチドと反応する、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株がまた、本発明によって提供される。
【０１５９】
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤として使用するために、改変され得る。１実施形態は、「キメラ」抗体であり、ここで、この重鎖（Ｈ）および／または軽鎖（Ｌ）の一部が、特定の種から誘導されるか、または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同性であり、一方、この鎖の残りは、別の種から誘導されるか、または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同性である。抗体のフラグメントが所望の生物学的活性を示す限り、これらの抗体のフラグメントも含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：６８５１−５５を参照のこと。
【０１６０】
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第５，５８５，０８９号および５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された１以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、当該分野（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−３６）で記載される方法を使用して、げっ歯類の相補的決定領域の少なくとも一部をヒトの抗体の対応する領域と置換することによって、実施され得る。
【０１６１】
ＡＢＣＬポリペプチドと結合するヒト抗体もまた、本発明によって包含される。内因性の免疫グロブリンの産生の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを産生し得る、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、このような抗体は、ＡＢＣＬポリペプチド抗原（すなわち、少なくとも６個の連続アミノ酸を有する）での免疫することによって産生され、必要に応じて、キャリアに結合される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９０：２５５１−５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，１９９３，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３を参照のこと。１つの方法において、このようなトランスジェニック動物は、本明細書中の重鎖および軽鎖免疫グロブリンをコードする内因性遺伝子座を無能にし、そしてヒトの重鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノムに挿入することによって産生される。次いで、部分的に改変された動物（改変体の完全未満の相補体を有する動物）は、所望の免疫系の改変体の全て有する動物を得るために交配される。免疫原が投与される場合、これらのトランスジェニック動物が、ヒト（例えば、マウスではない）アミノ酸配列（このアミノ酸配列は、これらの抗原に対して免疫特異性である改変領域を含む）を有する抗体を産生する。例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８およびＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９２６を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５およびＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１および５４６０７３Ａ１に記載される。ヒト抗体はまた、宿主細胞中の組換えＤＮＡの発現によってか、または本明細書中に記載されるようなハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【０１６２】
代替の実施形態において、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリから産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１）。これらのプロセスは、糸状のバクテリオファージの表面上の抗体レパートリーのディスプレイを介した免疫選択、およびそれに続く、選択した抗原への結合によるファージの選択を模倣する。１つのこのような技術は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９８／１７３６４に記載されており、これには、このようなアプローチを使用して、ＭＰＬ−およびｍｓｋ−レポーターについて、高い親和性および機能的にアンタゴニスト性の抗体の単離が記載される。
【０１６３】
キメラ抗体、ＣＤＲ移植化抗体、およびヒト化抗体は、代表的に組換え方法によって産生される。抗体をコードする核酸は、宿主細胞中に導入され、そして本明細書中に記載される物質および手順を使用して発現される。好ましい実施形態において、この抗体は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中で産生される。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、本明細書中に記載されるように、宿主細胞中での組換えＤＮＡの発現またはハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
【０１６４】
本発明の抗ＡＢＣＬ抗体は、ＡＢＣＬポリペプチドの検出および定量のために、任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイ）において使用され得る（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７））。これらの抗体は、使用されるアッセイ方法に対して適切である親和性で、ＡＢＣＬポリペプチドと結合する。
【０１６５】
診断適用のために、特定の実施形態において、抗ＡＢＣＬ抗体は、検出可能な部分で標識され得る。この検出可能な部分は、直接的または間接的のいずれかで、検出可能なシグナルを産生し得る任意の部分であり得る。例えば、検出可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、または６７Ｇａ）；蛍光化合物または化学的蛍光化合物（フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフェリン）、または酵素（アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る（Ｂａｙｅｒら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−６３）。
【０１６６】
競合結合アッセイは、標識した標準（例えば、ＡＢＣＬポリペプチド、またはその免疫学的に反応性の部分）の能力に依存し、限定された量の抗ＡＢＣＬ抗体との結合について、試験サンプル分析物（ＡＢＣＬペプチド）と競合する。試験サンプル中のＡＢＣＬポリペプチドの量は、抗体と結合する標準の量と反比例する。結合する標準の量を決定するのを容易にするために、これらの抗体は、競合前または後に、代表的に不溶化され、この抗体と結合する標準および分析物は、結合しないままの標準および分析物から好都合に分離され得る。
【０１６７】
サンドイッチアッセイは、代表的に、２つの抗体の使用を含み、これらの各々は、検出および／または定量されるべきタンパク質の異なる免疫原性部分またはエピトープに結合し得る。サンドイッチアッセイにおいて、この試験サンプル分析物は、代表的に、固体支持体上に固定される第１の抗体によって結合され、その後、第２の抗体が、この分析物に結合し、不溶性の３部分の複合体を形成する。例えば、米国特許第４，３７６，１１０を参照のこと。第２の抗体は、それ自体で、検出可能な部分で標識されるか（直接的なサンドイッチアッセイ）、または検出可能な部分で標識される抗免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接的なサンドイッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの型は、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）（この場合、検出可能な部分は、酵素である）である。
【０１６８】
抗ＡＢＣＬ抗体を含む、選択的結合因子はまた、インビボ画像化のために有用である。検出可能な部分で標識した抗体は、動物に、好ましくは、血流に投与され得、宿主中の標識した抗体の存在および位置がアッセイされ得る。この抗体は、核磁気共鳴、放射線学、または当該分野で公知の他の検出手段のいずれかによって動物中で検出可能である、任意の部分で標識され得る。
【０１６９】
抗体を含む、本発明の選択的結合因子は、治療剤として使用され得る。これらの治療剤は、一般に、アゴニストまたはアンタゴニストであり、これらは、ＡＢＣＬポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を、それぞれ増強または減少させるかのいずれかである。１実施形態中において、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＡＢＣＬポリペプチドに特異的に結合し得、そしてインビボまたはインビトロでＡＢＣＬポリペプチドの機能活性を阻害または排除し得る、抗体またはその結合フラグメントである。好ましい実施形態において、選択的結合因子（例えば、アンタゴニスト抗体）は、少なくとも約５０％、および好ましくは、少なくとも約８０％、ＡＢＣＬポリペプチドの機能活性を阻害する。別の実施形態において、選択的結合因子は、ＡＢＣＬポリペプチド結合パートナー（リガンドまたはレセプター）と相互作用し得、これにより、インビトロまたはインビボにおいてＡＢＣＬポリペプチド活性を阻害または排除し得る、抗ＡＢＣＬポリペプチド抗体であり得る。アゴニストおよびアンタゴニスト抗ＡＢＣＬポリペプチド抗体を含む、選択的結合因子は、当該分野で周知であるスクリーニングアッセイによって同定される。
【０１７０】
本発明はまた、ＡＢＣＬ選択的結合因子（例えば、抗体）および生物学的サンプル中でＡＢＣＬポリペプチドレベルを検出するために有用である他の試薬を備えるキットに関する。このような試薬としては、検出可能な標識、遮断血清（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｓｅｒｕｍ）、ポジティブおよびネガティブコントロールサンプル、および検出試薬が挙げられ得る。
【０１７１】
（マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、本発明に従って利用され得ることが理解される。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置された核酸の小型高密度アレイである。このアレイ内の各細胞またはエレメントは、相補的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）とハイブリダイゼーションするための標的として作用する、単一の核酸種の複数のコピーを含む。ＤＮＡマイクロアレイ技術を使用する発現プロフィールにおいて、ｍＲＮＡが、最初に、細胞または組織サンプルから抽出され、次いで、酵素標識されたｃＤＮＡを蛍光標識されたｃＤＮＡに変換される。この材料は、マイクロアレイにハイブリダイズされ、そして未結合のｃＤＮＡは、洗浄により除去される。次いで、このアレイ上に示された個々の遺伝子の発現は、各々核酸分子を標的するために特異的に結合される、標識されたｃＤＮＡの量を定量することによって視覚化される。この方法において、数千の遺伝子の発現が、生物学的材料の単一サンプルから、ハイスループットの並行様式で定量され得る。
【０１７２】
このハイスループット発現プロフィールは、本発明のＡＢＣＬ分子に関連して広範の適用を有し、これには、以下が挙げられるが、これに限定されない：治療のための標的としての、ＡＢＣＬ疾患関連遺伝子の同定および確認；関連するＡＢＣＬ分子およびそのインヒビターの分子毒性；臨床試験のための代理マーカーの集団および産生の階層化；ならびにハイスループットスクリーニングにおいて選択化合物の同定を援助することによる、関連するＡＢＣＬポリペプチド小分子薬物発見の増強。
【０１７３】
（化学的誘導体）
ＡＢＣＬポリペプチドの化学的に改変された誘導体は、この開示が、本明細書中に記載された場合、当業者によって調製され得る。ＡＢＣＬポリペプチド誘導体は、このポリペプチドに天然で結合した分子の型または位置のいずれかで、異なる様式で改変される。誘導体は、１以上の天然で結合した化学的な基の欠失によって形成される分子を含み得る。配列番号２、配列番号５もしくは配列番号８、または他のＡＢＣＬポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、１以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、代表的に水溶性であり、その結果、それが結合するタンパク質は、水性環境（例えば、生理学的な環境）下で沈殿しない。ポリマーの混合物が、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、目的産物の調製物の治療学的使用のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
【０１７４】
このポリマーの各々は、任意の分子量を有し得、そして分枝または非分枝であり得る。このポリマーの各々は、代表的に、約２ｋＤａと約１００ｋＤａとの間の平均分子量を有する（この用語「約（およそ）」は、水溶性ポリマーの調製の際に、いくつかの分子が、その示される分子量より多い、いくらか少ない重量を有することを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約５０ｋＤａの間、より好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａとの間、そして最も好ましくは、約２０ｋＤａと約３５Ｄａとの間である。
【０１７５】
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ−連結型またはＯ−連結型炭水化物、糖、リン酸、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（これは、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）ポリエチレングリコール、アルコキシポリエチレングリコール、またはアリールオキシポリエチレングリコールを含む、タンパク質を誘導体化するために使用されたＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン（例えば、低分子量（例えば、約６ｋＤのデキストラン））、セルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコール。共有結合したＡＢＣＬポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性架橋分子もまた、本発明に含まれる。
【０１７６】
一般に、化学的誘導体化は、活性化したポリマー分子とタンパク質を反応させるために使用される任意の適切な条件下で、実施され得る。ポリペプチドの化学的誘導体を調製するための方法は、一般に、以下の工程を包含する：（ａ）配列番号２、配列番号５もしくは配列番号８、または他のＡＢＣＬポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドが、１以上のポリマー分子に結合する条件下で、活性化したポリマー分子（例えば、ポリマー分子の反応性エステル誘導体またはアルデヒド誘導体）とポリペプチドを反応させる工程、ならびに（ｂ）反応生成物を得る工程。最適の反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ポリマー分子のタンパク質に対する比が大きくなるほど、結合したポリマー分子の割合も大きくなる。１実施形態において、ＡＢＣＬポリペプチド誘導体は、アミノ末端の単一ポリマー分子部分を有し得る。例えば、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと。
【０１７７】
ポリペプチドのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、当該分野で公知の任意のペグ化反応を使用して特異的に実施され得る。このような反応は、例えば、以下の参考文献に記載されている：Ｆｒａｎｃｉｓら，１９９２，Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ３：４−１０；欧州特許第０１５４３１６号および０４０１３８４号；ならびに米国特許第４，１７９，３３７号。例えば、ペグ化は、本明細書中に記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。アシル化反応のために、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有さなければならない。還元的アルキル化について、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有さなければならない。例えば、反応性アルデヒドポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであり、これは、水溶性、またはモノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
【０１７８】
別の実施形態において、ＡＢＣＬポリペプチドは、ビオチンに化学的に連結され得る。次いで、このビオチン／ＡＢＣＬポリペプチド分子は、アビジンに結合され得、その結果、４価のアビジン／ビオチン／ＡＢＣＬポリペプチド分子が得られる。ＡＢＣＬポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合され得、そして得られた結合体は、抗ＤＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭと共に沈殿し、１０価の十量体の結合体を形成する。
【０１７９】
一般に、本発明のＡＢＣＬポリペプチド誘導体の投与によって、緩和または調節され得る状態は、ＡＢＣＬポリペプチドについて本明細書中に記載される状態を含む。しかし、本明細書中に開示されるＡＢＣＬポリペプチド誘導体は、非誘導体化分子と比較した場合、さらなる活性、増強または減少した生物学的活性、または他の特性（例えば、増加または減少した半減期）を有し得る。
【０１８０】
（遺伝子操作した非ヒト動物）
マウス、ラット、または他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜のような非ヒト動物が、さらに本発明の範囲内に含まれ、ここで、ネイティブなＡＢＣＬポリペプチドをコードする遺伝子は破壊（すなわち「ノックアウト」）され、その結果、ＡＢＣＬポリペプチドの発現レベルは、有意に減少するか、または完全に消滅される。このような動物は、米国特許第５，５５７，０３２号に記載されるような技術および方法を使用して調製され得る。
【０１８１】
本発明は、マウス、ラット、または他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜のような非ヒト動物をさらに含み、この動物のＡＢＣＬ遺伝子のネイティブな形態または異種ＡＢＣＬ遺伝子のいずれかが、この動物によって過剰発現され、これによって、「トランスジェニック」動物を作製する。このようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号および国際公開番号ＷＯ９４／２８１２２号に記載されるような周知の方法を使用して調製され得る。
【０１８２】
本発明は、非ヒト動物をさらに含み、ここで、本発明の１以上のＡＢＣＬポリペプチドのプロモーターは、（例えば、相同組換え方法を使用することによって）活性化されるか、または不活性化され、１以上のネイティブなＡＢＣＬポリペプチドの発現のレベルを改変する。
【０１８３】
これらの非ヒト動物は、薬物候補物スクリーニングのために使用され得る。このようなスクリーニングにおいて、動物に対する薬物候補物の影響が測定され得る。例えば、薬物候補物は、ＡＢＣＬ遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、産生されるＡＢＣＬポリペプチドの量は、動物を薬物候補物に曝露した後に測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物に対する薬物候補物の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、疾患状態または病理学的状態を生じ得るか、または疾患状態または病理学的状態と関連し得る。このような場合において、遺伝子の発現を減少させるための薬物候補物の能力または病理学的状態を防止または阻害するための能力を試験し得る。別の例において、ポリペプチドのフラグメントのような、特定の代謝産物の産生は、疾患状態または病理学的状態を生じ得るか、または疾患状態または病理学的状態と関連し得る。このような場合において、このような代謝産物の産生を減少させるための薬物候補物の能力または病理学的状態を防止または阻害するための能力を試験し得る。
【０１８４】
（ＡＢＣＬポリペプチド活性の他のモジュレーターについてのアッセイ）
いくつかの状態において、ＡＢＣＬポリペプチドの活性のモジュレーターである分子（すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト）を同定することが所望され得る。ＡＢＣＬポリペプチドを調節する天然または合成の分子は、本明細書中に記載されるように、１以上のスクリーニングアッセイを使用して同定され得る。このような分子は、エキソビボ様式またはインビボ様式のいずれかで、注射、または経口送達、移植デバイスなどによって投与され得る。
【０１８５】
「試験分子」とは、ＡＢＣＬポリペプチドの活性を調節する（すなわち、増加または減少させる）能力について評価される分子を言う。最も一般的に、試験分子は、ＡＢＣＬポリペプチドと直接的に相互作用する。しかし、試験分子はまた、例えば、ＡＢＣＬ遺伝子発現に影響を与えることによって、またはＡＢＣＬポリペプチド結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）に結合することによって、ＡＢＣＬポリペプチド活性を間接的に調節し得ることもまた意図される。１実施形態において、試験分子は、少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは、約１０−８Ｍ、より好ましくは、約１０−９Ｍ、そしてさらにより好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）でＡＢＣＬポリペプチドと結合する。
【０１８６】
ＡＢＣＬポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本発明によって包含される。特定の実施形態において、ＡＢＣＬポリペプチドは、試験分子とＡＢＣＬポリペプチドとの相互作用が可能な条件下で、試験分子と共にインキュベートされ、そして相互作用の程度が測定される。試験分子は、実質的に精製された形態または粗製の混合物中でスクリーニングされ得る。
【０１８７】
特定の実施形態において、ＡＢＣＬポリペプチドアゴニストまたはＡＢＣＬポリペプチドアンタゴニストは、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量の分子であり得、これは、ＡＢＣＬポリペプチドと相互作用して、その活性を調節する。ＡＢＣＬポリペプチドの発現を調節する分子は、ＡＢＣＬポリペプチドをコードする核酸に対して相補的であるか、またはＡＢＣＬポリペプチドの発現を指示または制御する核酸配列に対して相補的である核酸分子、および発現のアンチセンス制御因子として作用する核酸分子を含む。
【０１８８】
一旦、試験分子が、ＡＢＣＬポリペプチドと相互作用すると同定されると、この分子は、ＡＢＣＬポリペプチド活性を増加または減少させる能力についてさらに評価され得る。試験分子とＡＢＣＬポリペプチドとの相互作用の測定は、いくつかの形態で実施され得、これには、細胞ベースの結合アッセイ、膜結合アッセイ、液相アッセイ、および免疫アッセイが挙げられる。一般に、試験分子は、特定の期間、ＡＢＣＬポリペプチドと共にインキュベートされ、そしてＡＢＣＬポリペプチド活性が、生物学的活性を測定するために１以上のアッセイによって決定される。
【０１８９】
試験分子とＡＢＣＬポリペプチドとの相互作用はまた、免疫アッセイにおいて、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して直接的にアッセイされ得る。あるいは、本明細書中に記載されるようなエピトープタグを含むＡＢＣＬポリペプチドの改変形態は、溶液および免疫アッセイ中で使用され得る。
【０１９０】
ＡＢＣＬポリペプチドが、結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）との相互作用を介して、生物学的活性を示す場合において、種々のインビトロアッセイが、対応する結合パートナー（例えば、選択的結合因子、レセプター、またはリガンド）へのＡＢＣＬポリペプチドの結合を測定するために使用され得る。これらのアッセイは、その結合パートナーに対するＡＢＣＬポリペプチドの結合の速度および／または程度を増加または減少させる能力について試験分子をスクリーニングするために使用され得る。１アッセイにおいて、ＡＢＣＬポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェル中に固定化される。次いで、放射標識したＡＢＣＬポリペプチド結合パートナー（例えば、ヨウ素標識化したＡＢＣＬポリペプチド結合パートナー）および試験分子は、このウェルに、一つずつ（いずれかの順序で）または同時にのいずれかで添加され得る。インキュベーション後に、このウェルを洗浄し、そしてシンチレーション計数器を使用して、放射活性を計数し、結合パートナーがＡＢＣＬポリペプチドに結合する程度を決定し得る。代表的に、分子は、ある濃度範囲にわたって試験され、そして試験アッセイの１以上の要素を欠く一連のコントロールウェルは、結果の評価の正確性のために使用され得る。この方法の代替としては、タンパク質の「位置」を逆にすること（すなわち、マイクロタイタープレートウェルに対してＡＢＣＬポリペプチド結合パートナーを固定化すること）、試験分子および放射標識したＡＢＣＬポリペプチドをインキュベートすること、そしてＡＢＣＬポリペプチド結合の程度を決定することを包含する。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８章（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．ならびにＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ  １９９５）を参照のこと。
【０１９１】
放射性標識に対する代替として、ＡＢＣＬポリペプチドまたはその結合パートナーは、ビオチンと結合体化され得、そしてビオチン化されたタンパク質の存在が、次いで、酵素（例えば、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはアルカリホスファターゼ（ＡＰ））に結合したストレプトアビジン（これらは、比色定量的に検出されるか、またはストレプトアビジンの蛍光タグ化によって検出され得る）を使用して検出され得る。ＡＢＣＬポリペプチドまたはＡＢＣＬポリペプチド結合パートナーに対する抗体（これらは、ビオチンに結合されている）はまた、ＡＰまたはＨＲＰに連結した酵素連結ストレプトアビジンとの複合体のインキュベーションに続いて、検出の目的のために使用され得る。
【０１９２】
ＡＢＣＬポリペプチドまたはＡＢＣＬポリペプチド結合パートナーはまた、アガロースビーズ、アクリルビーズ、または他の型のこのような不活性な固体相基材への付着によって固定化され得る。基材−タンパク質複合体は、相補性タンパク質および試験化合物を含む溶液内に配置され得る。インキュベーション後、これらのビーズは、遠心分離によって沈澱され得、そしてＡＢＣＬポリペプチドとその結合パートナーとの間の結合の量が、本明細書中に記載の方法を使用して評価され得る。あるいは、基材−タンパク質複合体は、カラム内に固定化され得、試験分子および相補性タンパク質が、このカラムを通過する。ＡＢＣＬポリペプチドトその結合パートナーとの間の複合体の形成が、次いで、本明細書中に記載の技術（例えば、放射性標識または抗体結合）のいずれかを使用して評価され得る。
【０１９３】
ＡＢＣＬポリペプチド結合タンパク質とＡＢＣＬポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる試験分子を同定するために有用な別のインビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴検出器システム（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））である。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、製造業者によって指定されるように利用される。このアッセイは、本質的に、ＡＢＣＬポリペプチドまたはＡＢＣＬポリペプチド結合パートナーのいずれかの、デキストランでコートされたセンサーチップ（これは、検出器に存在する）への共有結合を含む。次いで、この試験化合物および他の相補性タンパク質が、同時にかまたは連続的にかのいずれかで、センサーチップを含むチャンバーに注入され得る。結合する相補性タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコート側面に物理的に結合する分子の質量の変化に基づいて評価され得、この分子の質量の変化は、検出器システムによって測定される。
【０１９４】
いくつかの場合において、２つ以上の試験化合物を一緒に、ＡＢＣＬポリペプチドとＡＢＣＬポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させるそれらの能力について評価することが所望され得る。これらの場合において、本明細書中に記載のアッセイは、第一の試験化合物と同時にかまたはそれに続いてのいずれかで、このようなさらなる試験化合物を添加することによって容易に改変され得る。このアッセイにおける残りの工程は、本明細書中に記載される。
【０１９５】
インビトロアッセイ（例えば、本明細書中に記載されるもの）は、ＡＢＣＬポリペプチドとＡＢＣＬポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成に対する効果について、多数の化合物をスクリーニングするために、有利に使用され得る。これらのアッセイは、ファージディスプレイ、合成ペプチド、および化学合成ライブラリーにおいて生成された化合物をスクリーニングするために、自動化され得る。
【０１９６】
ＡＢＣＬポリペプチドとＡＢＣＬポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増加または減少する化合物はまた、ＡＢＣＬポリペプチドまたはＡＢＣＬポリペプチド結合パートナーのいずれかを発現する細胞および細胞株を使用して、細胞培養物においてスクリーニングされ得る。細胞および細胞株は、任意の哺乳動物から得られ得るが、好ましくは、ヒト、または他の霊長類、イヌ類またはげっ歯類の供給源由来である。ＡＢＣＬポリペプチドの、ＡＢＣＬポリペプチド結合パートナーを発現する細胞への、その細胞表面での結合は、試験分子の存在または非存在下で評価され、そして結合の程度が、例えば、ＡＢＣＬポリペプチド結合パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフローサイトメトリーによって決定され得る。細胞培養アッセイは、本明細書中に記載されるタンパク質結合アッセイにおいて、陽性であるとスコア付けされる化合物をさらに評価するために有利に使用され得る。
【０１９７】
細胞培養物はまた、薬物候補の影響をスクリーニングするために使用され得る。例えば、薬物候補は、ＡＢＣＬ遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の実施形態において、生成されるＡＢＣＬポリペプチドまたはＡＢＣＬポリペプチドフラグメントの量は、細胞培養物の薬物候補への曝露の後に測定され得る。特定の実施形態において、細胞培養物に対する薬物候補の実際の影響が検出され得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物に対する特定の影響を有し得る。このような場合に、遺伝子の発現を増加または減少させる薬物候補の能力、または細胞培養物に対する特定の影響を予防または阻害するその能力が試験され得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチドのフラグメントなど）の生成が、疾患または病的状態を生じ得るか、またはそれらと関連し得る。このような場合、細胞培養物におけるこのような代謝産物の生成を減少させる薬物候補の能力が試験され得る。
【０１９８】
（内部移行タンパク質）
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶ由来）が、タンパク質を細胞内に内部移行させるために、使用され得る。例えば、Ｆａｌｗｅｌｌら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６６４−６８を参照のこと。例えば、ＨＩＶ  ｔａｔタンパク質の１１アミノ酸の配列（Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１３）（「タンパク質形質導入ドメイン」、またはＴＡＴ  ＰＤＴと称される）は、細胞の細胞質膜および核膜を横切る送達を媒介するとして記載されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９−７２；およびＮａｇａｈａｒａら，１９９８，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１４４９−５２を参照のこと。これらの手順において、ＦＩＴＣ構築物（ＦＩＴＣ標識Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号１４）（これは、腹腔内投与後に組織を貫通する）が調製され、そしてこのような構築物の細胞への結合が、蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）分析によって検出される。ｔａｔ−β−ｇａｌ融合タンパク質で処理された細胞は、β−ｇａｌ活性を示す。注入に続いて、このような構築物の発現が、多くの組織（肝臓、腎臓、肺、心臓および脳組織を含む）において検出され得る。このような構築物は、細胞に入るために幾分かの変性を受け、そしてそれ自体、細胞内への移入後に、再折り畳みを必要とし得ると考えられる。
【０１９９】
従って、ｔａｔタンパク質配列は、所望のポリペプチドを細胞に内部移入させるために使用され得ることが理解される。例えば、ｔａｔタンパク質配列を使用して、ＡＢＣＬアンタゴニスト（例えば、抗ＡＢＣＬ選択的結合因子、低分子、可溶性レセプター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ＡＢＣＬ分子の活性を阻害するために、細胞内投与され得る。本明細書中で使用される場合、用語「ＡＢＣＬ分子」は、本明細書中に記載されるような、ＡＢＣＬ核酸分子およびＡＢＣＬポリペプチドの両方をいう。所望ならば、ＡＢＣＬタンパク質自体はまた、これらの手順を使用して、細胞に内部投与され得る。Ｓｔｒａｕｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１４６６−６７をまた参照のこと。
【０２００】
（ＡＢＣＬポリペプチドを使用する細胞供給源の同定）
本発明の特定の実施形態に従って、ＡＢＣＬポリペプチドと関連する特定の細胞型の供給源を決定することを可能とすることが有用であり得る。例えば、適切な治療を選択する際の補助として、疾患または病的状態の起源を決定することが有用であり得る。特定の実施形態において、ＡＢＣＬポリペプチドをコードする核酸は、プローブとして使用されて、このようなプローブを用いて細胞の核酸をスクリーニングすることによって、本明細書中に記載の細胞を同定し得る。他の実施形態において、抗ＡＢＣＬポリペプチド抗体を使用して、細胞におけるＡＢＣＬポリペプチドの存在について試験し得、これにより、このような細胞が本明細書中に記載される型の細胞か否かを決定し得る。
【０２０１】
（ＡＢＣＬポリペプチド組成物および投与）
治療組成物は、本発明の範囲内である。このようなＡＢＣＬポリペプチド薬学的組成物は、治療有効量のＡＢＣＬポリペプチドまたはＡＢＣＬ核酸分子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物中に、含み得る。薬学的組成物は、治療有効量の１以上のＡＢＣＬポリペプチド選択的結合因子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物中に、含み得る。
【０２０２】
受容可能な処方物材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。
【０２０３】
薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、等張性、におい、無菌性、安定性、解離または放出の速度、吸着、または浸透を改変、維持または保存するための処方物材料を含み得る。適切な処方物材料としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｓｕｌｆｉｔｅ））、緩衝液（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、または他の有機酸）、充填剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、複合体化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、増量剤、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着色剤、味付け剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、表面活性剤または湿潤剤（例えば、プルオニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルビテート（例えば、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０またはｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））、安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、張度増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、またはマンニトール、ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的なアジュバント。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  １９９０）を参照のこと。
【０２０４】
最適な薬学的組成物は、当業者によって、例えば、意図される投与経路、送達形式、および所望の投薬量に依存して決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出を参照のこと。このような組成物は、ＡＢＣＬ分子の、物理的な状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボクリアランスの速度に影響し得る。
【０２０５】
薬学的組成物における主要なビヒクルまたはキャリアは、本来水性または非水性のいずれかであり得る。例えば、注入のための適切なビヒクルまたはキャリアは、水、生理食塩水溶液、または人工脳脊髄液であり得、おそらく非経口投与のための組成物において一般的なタンパク質の材料で補充されている。中性の緩衝化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含み、これはさらに、ソルビトールまたは適切な置換物を含み得る。本発明の１つの実施形態において、ＡＢＣＬポリペプチド組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、任意の処方薬剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出）と混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。さらに、ＡＢＣＬポリペプチド産物は、スクロースのような適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方され得る。
【０２０６】
このＡＢＣＬポリペプチド薬学的組成物は、非経口送達のために選択され得る。あるいは、これらの組成物は、吸入または消化管を介する送達（例えば、経口的に）のために、選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の技術内にある。
【０２０７】
処方成分が、投与の部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液は、生理学的ｐＨまたはそれよりわずかに低いｐＨ（典型的に、約５〜約８のｐＨ範囲内）にこの組成物を維持するために使用される。
【０２０８】
非経口投与が意図される場合、本発明における使用のための治療組成物は、薬学的に受容可能なビヒクルに所望のＡＢＣＬ分子を含む発熱物質を含まない非経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注入のために特に適切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、ここで、ＡＢＣＬ分子が、無菌の等張溶液として処方され、適切に保存される。なお別の調製物は、所望の分子と、薬剤（例えば、注入可能なミクロスフェア、生体侵食（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソーム）との処方物に関係し得、これは、次いで蓄積注射を介して送達され得る産物の制御されたまたは持続された放出を提供する。ヒアルロン酸がまた、使用され得、そしてこれは、循環において、維持された持続時間を促進する効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段は、移植可能な薬物送達デバイスを含む。
【０２０９】
１つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例えば、ＡＢＣＬポリペプチドは、吸入のための乾燥粉末として処方され得る。ＡＢＣＬポリペプチドまたは核酸分子の吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧剤と共に処方され得る。なお別の実施形態において、溶液は、噴霧され得る。肺投与が、国際公開番号ＷＯ９４／２００６９にさらに記載され、これは化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
【０２１０】
特定の処方物が、経口投与され得ることがまた意図される。本発明の１つの実施形態において、このよう様式で投与されるＡＢＣＬポリペプチドが、固体投薬形態（例えば、錠剤またはカプセル）の調合において慣用的に使用されるキャリアを用いてかまたは用いずに処方され得る。例えば、カプセルは、バイオアベイラビリティーが最大化され、そして前全身分解が最小化される場合、胃腸管内の地点で処方物の活性部分を放出するように設計され得る。さらなる薬剤が、ＡＢＣＬポリペプチドの吸収を容易にするために含まれ得る。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、およびバインダーがまた、使用され得る。
【０２１１】
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤との混合物中に、有効量のＡＢＣＬポリペプチドを含み得る。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することによって、溶液が、単位用量形態で調製され得る。適切な賦形剤は以下を含むが、これらに限定されない：不活性な希釈剤（炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、あるいはリン酸カルシウム）；または結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアラビアゴム）；あるいは潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）。
【０２１２】
さらなるＡＢＣＬポリペプチドの薬学的組成物は、当業者に明らかであり、持続または制御送達処方物中にＡＢＣＬポリペプチドを含む処方物を含む。種々の他の持続または制御送達手段（例えば、リポソームキャリア、生体侵食マイクロスフェアあるいは多孔性ビーズおよび蓄積注射）を処方するための技術はまた、当業者に公知である。例えば、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９（これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー性微粒子の制御放出を記載する）を参照のこと。
【０２１３】
徐放性調製物のさらなる例としては、成形された物品の形態（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリックスを含む。徐放性マトリックスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許第０５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）が挙げられ得る。徐放性組成物はまた、リポソームを含み得、これは、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８−９２；および欧州特許第０３６６７６号、同第０８８０４６号、および同第１４３９４９号を参照のこと。
【０２１４】
インビボ投与のために使用されるＡＢＣＬ薬学的組成物は、代表的に無菌でなければならない。このことは、滅菌濾過膜を介する濾過によって達成され得る。組成物が、凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前に、またはそれに続いてのいずれかで実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥された形態または溶液で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアル）内に配置される。
【０２１５】
一旦、薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水和粉末または凍結乾燥粉末として保存され得る。このような処方物は、すぐに使用できる形態または投与の前に再構成を必要とする形態（凍結乾燥された形態）のいずれかで保存され得る。
【０２１６】
特定の実施形態において、本発明は、単一用量投与単位を生成するためのキットに関する。このキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水性処方物を有する第二の容器の両方を含み得る。また、本発明の範囲内には、単一チャンバーおよび多チャンバーの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含むキットが含まれる。
【０２１７】
治療的に使用されるＡＢＣＬの薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の内容および目的に依存する。当業者は、処置のための適切な投薬レベルが、このように、送達される分子、ＡＢＣＬ分子が使用されている適応症、投与の経路、および患者のサイズ（体重、体表面、または器官の大きさ）および状態（年齢および全身的な健康状態）に、部分的に依存して変化することを理解する。従って、医師は、最適な治療効果を得るために、投薬量を力価決定し（ｔｉｔｅｒ）、投与経路を改変し得る。代表的な投薬量は、上記の因子に依存して、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上までの範囲であり得る。他の実施形態において、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまで；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲であり得る。
【０２１８】
投薬の頻度は、使用される処方物中でのＡＢＣＬ分子の薬物動態パラメータに依存する。典型的に、医師は、所望の効果を達成する投薬量に達するまで組成物を投与する。従って、組成物は、単一用量として、長期にわたって２以上の用量（これは、同量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい）として、あるいは移植デバイスまたはカテーテルを介する連続的な注入として、投与され得る。適切な投薬量のさらなる改良は、当業者によって慣用的になされ、そしてそれらによって慣用的に実施される課題の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量−応答データの使用を介して確認され得る。
【０２１９】
薬学的組成物の投与経路は、公知の方法に従って行われる（例えば、経口；静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内または創傷内の経路による注射を介して；徐放系によって；または移植デバイスによる）。所望の場合、この組成物は、ボーラス注射によるかもしくは注入により連続的に、または移植デバイスにより投与され得る。
【０２２０】
あるいはまたはさらに、この組成物は、所望の分子が吸収またはカプセル化された膜、スポンジまたは他の適切な材料の移植を介して局所的に投与され得る。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織または器官に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、徐放性ボーラスを介して、または連続投与よってであり得る。
【０２２１】
いくつかの場合では、ＡＢＣＬポリペプチド薬学的組成物をエキソビボ様式で使用することが好ましくあり得る。このような場合、患者から取り出された細胞、組織または器官は、ＡＢＣＬポリペプチド薬学的組成物に曝露され、この後、この細胞、組織または器官は、続いてこの患者に移植して戻される。
【０２２２】
他の場合において、ＡＢＣＬポリペプチドは、本明細書中に記載される方法のような方法を用いて遺伝子操作された特定の細胞を移植してＡＢＣＬポリペプチドを発現および分泌させることによって送達され得る。このような細胞は、動物またはヒトの細胞であり得、そして自己、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であり得る。必要に応じて、これらの細胞は、不死化され得る。免疫学的応答の機会を減少させるために、これらの細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するためにカプセル化され得る。カプセル化された材料は、代表的に、生体適合性で、半透過性のポリマー封入物または膜であり、これは、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系によるかまたは周囲組織からの他の悪性因子による細胞の破壊を予防する。
【０２２３】
本明細書中で議論されるように、単離された細胞集団（例えば、幹細胞、リンパ球、赤血球細胞、軟骨細胞、神経細胞など）を、１つ以上のＡＢＣＬポリペプチドで処理することが所望され得る。このことは、細胞膜に対して透過性である形態である場合、単離された細胞にこのポリペプチドを直接曝露することによって達成され得る。
【０２２４】
本発明のさらなる実施形態は、治療的ポリペプチドのインビトロ産生のため、および遺伝子治療または細胞治療による治療ポリペプチドの産生および送達のための両方のための細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）に関する。相同組換え法および他の組換え法を使用して、通常は転写的にサイレントなＡＢＣＬ遺伝子または過少発現する遺伝子を含む細胞を改変し得、それにより治療有効量のＡＢＣＬポリペプチドを発現する細胞を産生させ得る。
【０２２５】
相同組換えは、転写的に活性な遺伝子における変異を誘導または矯正するために遺伝子を標的化するためにもともと開発された技術である。Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，Ｐｒｏｇ．ｉｎ  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．＆Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，３６：３０１，１９８９。基本的な技術は、哺乳動物ゲノムの特定の領域に特定の変異を導入するための方法として開発された（Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４４：４１９−４２８，１９８６；Ｔｈｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ，５１：５０３−５１２，１９８７；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，８５：８５８３−８５８７，１９８８）か、または欠損遺伝子内の特定の変異を矯正するための方法として開発された（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６−５７８，１９８７）。例示的な相同組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１；欧州特許第９１９３０５１号，および同第５０５５００号；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、国際公開番号ＷＯ９１／０９９５５）に記載されている。
【０２２６】
相同組換えにより、ゲノムに挿入されるべきＤＮＡ配列は、目的の遺伝子を標的化ＤＮＡに付着させることによって目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。標的化ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡの領域に相補的（相同）であるヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に相補的である標的化ＤＮＡの小片は、ＤＮＡ複製プロセスの間に親の鎖と接触するようにおかれる。これは、ハイブリダイズするように細胞中に挿入され、ゆえに有する相同領域を通じて内因性ＤＮＡの他の片と組換わる、ＤＮＡの一般的特性である。この相補鎖が、変位あるいは異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに付着される場合、この相補鎖もまた、組換えの結果として、新たに合成される鎖へと組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、ＤＮＡの新たな配列がテンプレートとして機能することが可能となる。従って、移入されたＤＮＡがゲノムに組み込まれる。
【０２２７】
標的化ＤＮＡのこれらの片に付着されるのは、ＡＢＣＬポリペプチドの発現と相互作用し得るかまたは制御し得るＤＮＡの領域である（例えば、隣接（フランキング）配列））。例えば、プロモーターエレメント／エンハンサーエレメント、サプレッサー、または外因性の転写調節エレメントは、意図される宿主細胞のゲノムに、所望のＡＢＣＬポリペプチドをコードするＤＮＡの転写に影響するに十分近位および方向で挿入される。制御エレメントは、宿主細胞ゲノムに存在するＤＮＡの一部を制御する。従って、所望されるＡＢＣＬポリペプチドの発現は、ＡＢＣＬ遺伝子自身をコードするＤＮＡのトランスフェクションによってではなく、むしろＡＢＣＬ遺伝子の転写のために認識可能なシグナルを内因性遺伝子配列に提供する、ＤＮＡ調節セグメントと組み合わされた標的化ＤＮＡ（目的の内因性遺伝子と相同性の領域を含む）の使用によって達成され得る。
【０２２８】
例示方法において、細胞における所望される標的化遺伝子（すなわち、所望の内因性細胞遺伝子）の発現は、少なくとも制御配列、エキソンおよびスプライシングドナー部位を含むＤＮＡの導入によって、予め選択された部位での細胞性ゲノム中への相同組換えを介して変更される。これらの成分は、染色体（ゲノム）ＤＮＡに、実際これが新たな転写単位の生産を生じるような様式で導入される（ここで、このＤＮＡ構築物に存在する調節配列、エキソンおよびスプライシングドナー部位は、内因性遺伝子に作動可能に連結されている）。染色体ＤＮＡへのこれらの成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変更される。
【０２２９】
本明細書において記載される場合、変更された遺伝子発現は、得られた細胞において通常サイレント（発現されていない）な遺伝子を活性化すること（または発現が生じること）、ならびに得られる細胞において生理学的に有意なレベルで発現されない遺伝子の発現を増強することを包含する。この実施形態は、さらに、得られる細胞において生じる調節または導入のパターンとは異なるような調節または導入のパターンを変化させること、ならびに得られる細胞において発現される遺伝子の発現を減少させる（消去することを含む）ことを包含する。
【０２３０】
相同組換えを使用して、細胞の内因性ＡＢＣＬ遺伝子から、ＡＢＣＬポリペプチド生産を増強または生じさせ得る１つの方法は、第一に、相同組換えを用いて部位特異的組換え系からの組換え配列（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ，ＦＬＰ／ＦＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−５２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）を、細胞の内因性ゲノムＡＢＣＬポリペプチドコード領域の上流（すなわち５’側）に配置することを包含する。ゲノムＡＢＣＬポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された部位と相同な組換え部位を含むプラスミドは、適切なリコンビナーゼ酵素とともに改変された細胞株に導入される。このリコンビナーゼは、細胞株においてゲノムＡＢＣＬポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置される組換え部位に、プラスミドの組換え部位を介して、プラスミドが組み込まれるようにさせる（Ｂａｕｂｏｎｉｓ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２０２５−２０２９；Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５１：１３５１−１３５５）。転写を増強することが知られる任意の隣接配列（例えば、エンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー）は、このプラスミドに適切に配置されるとき、細胞の内因性ＡＢＣＬ遺伝子から、デノボでまたは増強されたＡＢＣＬポリペプチド産生を生じる、新たなまたは改変された転写単位を作製するような様式で組み込まれる。
【０２３１】
部位特異的組換え配列が細胞の内因性ゲノムＡＢＣＬポリペプチドコード領域の直ぐ上流に配置された細胞株を使用するさらなる方法は、細胞株ゲノムにおいてこの他の場所で第二の組換え部位に導入するように相同組換えを用いることである。次いで、適切なリコンビナーゼ酵素は、２つの組換え部位の細胞株へと導入され、組換え事象が生じ（欠失、反転および転座）（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５：５２１−５２７；Ｓａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：８９０−９００）、これは、細胞の内因性のＡＢＣＬ遺伝子からデノボのまたは増強されたＡＢＣＬポリペプチド産生を生じる新たなまたは改変された転写単位を生じる。
【０２３２】
細胞の内因性のＡＢＣＬ遺伝子からのＡＢＣＬポリペプチドの発現を増強させるためまたは生じさせるためのさらなるアプローチは、細胞の内因性ＡＢＣＬ遺伝子からデノボまたは増強されたＡＢＣＬポリペプチド産生を生じるような様式で、遺伝子（例えば、転写因子）の発現を増強または生じさせることおよび／または遺伝子（例えば、転写リプレッサー）の発現を減少させることを包含する。この方法は、天然には存在しないポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに融合された部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）を、細胞に導入し、その結果、細胞の内因性のＡＢＣＬ遺伝子からデノボまたは増強されたＡＢＣＬポリペプチドの産生が生じることを包含する。
【０２３３】
本発明はさらに、標的遺伝子の発現を変更する方法において有用なＤＮＡ構築物に関する。特定の実施形態において、例示的なＤＮＡ構築物は、（ａ）１つ以上の標的配列；（ｂ）調節配列；（ｃ）エキソン；および（ｄ）対でないスプライシングドナー部位、を含む。ＤＮＡ構築物における標的配列は、エレメント（ａ）〜（ｄ）を細胞内の標的遺伝子に組み込み、その結果、エレメント（ｂ）〜（ｄ）が内因性標的配列の配列に作動可能に連結されることを指向する。別の実施形態において、このＤＮＡ構築物は、（ａ）１つ以上の標的配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライシングドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライシングアクセプター部位、を含む。ここで、標的配列は、エレメント（ａ）〜（ｆ）を組み込んで、その結果、（ｂ）〜（ｆ）のエレメントが内因性遺伝子に作動可能に連結されることを指向する。標的配列は、相同組換え生じる細胞性染色体ＤＮＡにおいて予め選択される部位と相同である。この構築物において、エキソンは、概して調節配列の３’側であり、そしてスプライシングドナー部位は、エキソンの３’側である。
【０２３４】
特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書において示されるＡＢＣＬポリペプチドをコードする核酸配列）が公知である場合、この遺伝子の選択された領域に相補的なＤＮＡの片を、合成しても他の方法で入手してもよい（例えば、目的の領域に結合する特定の認識部位での、ネイティブなＤＮＡの適切な制限による）。この片は、この細胞への挿入の際に標的配列として作用し、そしてこのゲノム内のこの相同領域にハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションがＤＮＡ複製の間に生じる場合、このＤＮＡの片およびそれに付随する任意の他のさらなる配列は、Ｏｋａｚａｋｉフラグメントとして作用し、そしてＤＮＡの新たに合成された娘鎖中に取り込まれる。従って、本発明は、ＡＢＣＬポリペプチドをコードするヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、標的配列として使用され得る。
【０２３５】
ＡＢＣＬポリペプチド細胞治療（例えば、ＡＢＣＬポリペプチドを産生する細胞の移植）もまた、企図される。この実施形態は、ＡＢＣＬポリペプチドの生物学的に活性な形態を合成および分泌し得る細胞を移植する工程を包含する。このようなＡＢＣＬポリペプチド産生細胞は、ＡＢＣＬポリペプチドの天然のプロデューサーである細胞であり得るか、あるいは組換え細胞であり得、ＡＢＣＬポリペプチドを産生するこの組換え細胞の能力が、所望のＡＢＣＬポリペプチドをコードする遺伝子またはＡＢＣＬポリペプチドの発現を増強する遺伝子で形質転換されることによって増強されている。このような改変は、この遺伝子の送達のために、ならびにこの遺伝子の発現および分泌を促進するために適切なベクターによって達成され得る。外来種のポリペプチドの投与とともに生じ得るような、ＡＢＣＬポリペプチドが投与される患者において潜在的な免疫学的反応を最小化するために、ＡＢＣＬポリペプチドを産生する天然の細胞がヒト起源のものであって、そしてヒトＡＢＣＬポリペプチドを産生することが好ましい。同様に、ＡＢＣＬポリペプチドを産生する組換え細胞は、ヒトＡＢＣＬポリペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが好ましい。
【０２３６】
移植された細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するためにカプセル化され得る。ヒトまたは非ヒト動物の細胞は、ＡＢＣＬポリペプチドの放出を可能にするが患者の免疫系または周囲組織からの他の悪性因子による細胞の破壊を予防する生体適合性の半透過性ポリマー封入物または膜中で、患者に移植され得る。あるいは、ＡＢＣＬポリペプチドをエキソビボで産生するように形質転換された患者自身の細胞は、このようなカプセルなしで患者に直接移植され得る。
【０２３７】
生存細胞のカプセル化のための技術は、当該分野において公知であり、そしてカプセル化された細胞の調製および患者へのこの細胞の移植は、慣用的に達成され得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（国際公開番号ＷＯ９５／０５４５２；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の効果的な送達のために遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。カプセルは、生体適合性であり、そして容易に取り出し可能である。カプセルは、組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化する。この分子は、哺乳動物宿主中に移植される際にインビボで下方制御に供されないプロモーターに作動可能に連結された、生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列を含む。このデバイスは、レシピエント内の特定の部位に生存細胞からの分子の送達を提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号、同第５，０１１，４７２号および同第５，１０６，６２７号を参照のこと。生存細胞をカプセル化するための系は、国際公開番号ＷＯ９１／１０４２５（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）に記載される。国際公開番号ＷＯ９１／１０４７０（Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｗｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１１３：３２２−３２９、Ａｅｂｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．１９９１，１１１：２６９−７５；ａｎｄ  Ｔｒｅｓｃｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，ＡＳＡＩＯ，３８：１７−２３もまた参照のこと。
【０２３８】
ＡＢＣＬポリペプチドのインビボおよびインビトロの遺伝子治療送達もまた、企図される。遺伝子治療技術の１つの例は、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターに制御可能に連結されて「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成し得る、ＡＢＣＬポリペプチドをコードするＡＢＣＬ遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡのいずれか）を使用することである。プロモーターは、この構築物が挿入される細胞型または組織型において活性である限り、内因性ＡＢＣＬ遺伝子に対して同種または異種であり得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分としては、必要に応じて、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ分子（例えば、相同組換えに有用な内因性配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサーもしくはサイレンサー、親細胞よりも選択的な利点を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子（例えば、細胞標的化のために）、細胞特異的内部移行因子、ベクターからの発現を増強する転写因子、およびベクター産生を可能にする因子が挙げられる。
【０２３９】
次いで、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターを使用して、細胞に（エキソビボまたはインビボのいずれかで）導入され得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの手段は、本明細書中に記載されるようなウイルスベクターによってである。特定のベクター（例えば、レトロウイルスベクター）は、このＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、そしてこの遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。他のベクターは、エピソームとして機能し、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質中に残る。
【０２４０】
さらに他の実施形態において、調節エレメントは、標的細胞中でのＡＢＣＬ遺伝子の制御された発現のために包含され得る。このようなエレメントは、適切なエフェクターに対する応答においてスイッチオンされる。この方法において、所望される場合、治療ポリペプチドが、発現され得る。１つの慣用的な制御手段は、低分子結合ドメインおよび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性化タンパク質）をダイマー化するために使用される低分子ダイマー化剤またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）の使用を包含する（国際公開番号ＷＯ９６／４１８６５；ＷＯ９７／３１８９８およびＷＯ９７／３１８９９を参照のこと）。このタンパク質のダイマー化を使用して、導入遺伝子のための転写を開始し得る。
【０２４１】
代替の調節技術は、目的の遺伝子から発現されるタンパク質を、凝集体またはクラスターとして細胞内に貯蔵する方法を使用する。目的の遺伝子は、条件付き凝集ドメインを含む誘導タンパク質として発現され、これは、小胞体内での凝集したタンパク質の保持を生じる。貯蔵されたタンパク質は、細胞内で安定かつ不活性である。しかし、このタンパク質は、条件付き凝集ドメインを除去し、それにより凝集体またはクラスターから離して特異的に分離する薬物（例えば、低分子リガンド）を投与することにより放出され得、その結果、このタンパク質がこの細胞から分泌され得る。Ａｒｉｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８１６−８１７，ａｎｄ  Ｒｉｖｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：８２６−８３０を参照のこと。
【０２４２】
他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、本明細書中に記載される系が挙げられるがそれらに限定されない。ミフェプリストン（ＲＵ４８６）は、プロゲステロンアンタゴニストとして使用される。改変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインのプロゲステロンアンタゴニストへの結合が、２つの転写因子のダイマーを形成し、次いでこれが核に入りＤＮＡに結合することによって、転写を活性化する。このリガンド結合ドメインは、このレセプターが天然のリガンドに結合する能力を除去するように改変される。改変されたステロイドホルモンレセプター系は、さらに米国特許第５，３６４，７９１号；ならびに国際公開番号ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７／１０３３７に記載される。
【０２４３】
さらに別の制御系は、エクジソン（ショウジョウバエ（ｆｒｕｉｔ  ｆｌｙ）ステロイドホルモン）を使用する。これは、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合し、そしてエクジソンレセプターを活性化する。次いで、このレセプターは、核に移行し、特定のＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子からのプロモーター）に結合する。エクジソンレセプターは、転写を開始するためのトランス活性化ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインを含む。エクジソン系は、さらに、米国特許第５，５１４，５７８号；ならびに国際公開番号ＷＯ９７／３８１１７；ＷＯ９６／３７６０９；およびＷＯ９３／０３１６２に記載される。
【０２４４】
別の制御手段は、陽性のテトラサイクリン制御可能なトランスアクチベーターを使用する。この系は、転写を活性化するポリペプチドに連結された、変異されたｔｅｔリプレッサータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆にテトラサイクリン制御されたトランスアクチベータータンパク質を生じる変異されたｔｅｔ−Ｒ−４アミノ酸変異。すなわち、これは、テトラサイクリンの存在下でｔｅｔオペレーターに結合する）を含む。このような系は、米国特許第５，４６４，７５８号；同第５，６５０，２９８号および同第５，６５４，１６８号に記載される。
【０２４５】
さらなる発現制御系および核酸構築物は、Ｉｎｎｏｖｉｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃに対する米国特許第５，７４１，６７９号および同第５，８３４，１８６号に記載される。
【０２４６】
インビボ遺伝子治療は、ＡＢＣＬポリペプチドをコードする遺伝子を、ＡＢＣＬ核酸分子の局所注入を介して、または他の適切なウイルス送達ベクターもしくは非ウイルス送達ベクターによって、細胞中に導入することによって達成され得る。Ｈｅｆｔｉ，１９９４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５：１４１８−１４３５。例えば、ＡＢＣＬポリペプチドをコードする核酸分子は、標的化された細胞に送達するためにアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）中に含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，国際公開番号ＷＯ９５／３４６７０；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８を参照のこと）。組換えＡＡＶゲノムは代表的に、機能的プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結された、ＡＢＣＬポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接するＡＡＶ反転末端反復を含む。
【０２４７】
代替の適切なウイルスベクターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルスおよびパピローマウイルスのベクター。米国特許第５，６７２，３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含むインビボウイルス媒介遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、インビトロで治療タンパク質をコードするＤＮＡセグメントが挿入されるように処理されたヒト細胞の送達によって治療タンパク質を患者に提供するためのプロセスの例を提供する。遺伝子治療技術の実施のためのさらなる方法および材料は、以下に記載される：米国特許第５，６３１，２３６号（アデノウイルスベクターを含む）；同第５，６７２，５１０号（レトロウイルスを含む）；および同第５，６３５，３９９号（サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む）。
【０２４８】
非ウイルス送達方法としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：リポソーム媒介性移入、裸のＤＮＡ送達（直接注射）、レセプター媒介性移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃）。遺伝子治療の材料および方法はまた、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ配列、親の細胞よりも選択的利点を提供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブ選択系および発現制御系（安全な測定）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のため）、細胞特異的内部移行因子、およびベクターによる発現を増強するための転写因子ならびにベクター製造の方法をも包含し得る。遺伝子治療技術の実施のためのこのようなさらなる方法および材料は、以下に記載されている：米国特許第４，９７０，１５４号（エレクトロポレーション技術を含む）；同第５，６７９，５５９号（遺伝子治療のためのリポタンパク質含有系を記載する）；同第５，６７６，９５４号（リポソームキャリアを含む）；同第５，５９３，８７５号（リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を含む）；同第４，９４５，０５０号（ここでは、生物学的に活性な粒子は、この粒子が細胞の表面に浸透し、そしてこの細胞の内部へと取り込まれるようになる速度で細胞に噴霧されるプロセスを記載する）；ならびに国際公開番号ＷＯ９６／４０９５８（核リガンドを含む）。
【０２４９】
ＡＢＣＬ遺伝子治療または細胞治療がさらに、同一または異なる細胞における１つ以上のさらなるポリペプチドの送達を含み得ることもまた、企図される。このような細胞は、患者に別々に導入され得るか、またはこの細胞は、単一の移植可能なデバイス（例えば、上記のカプセル化膜）中に含まれ得るか、またはこの細胞は、ウイルスベクターによって別個に改変され得る。
【０２５０】
遺伝子治療を介した、細胞における内因性ＡＢＣＬポリペプチド発現を増強するための手段は、ＡＢＣＬポリペプチドプロモーター中に１つ以上のエンハンサーエレメントを挿入することである。ここで、このエンハンサーエレメントは、ＡＢＣＬ遺伝子の転写活性を増強するように働き得る。使用されるエンハンサーエレメントは、選択される組織中でプロモーター活性化を付与することが知られる遺伝子−エンハンサーエレメントを活性化することが所望される組織に基づいて、選択される。例えば、ＡＢＣＬポリペプチドをコードする遺伝子がＴ細胞において「スイッチオン」されるべき場合、ｌｃｋプロモーターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、加えられるべき転写エレメントの機能的部分は、標準的なクローニング技術を用いてＡＢＣＬポリペプチドプロモーターを含むＤＮＡフラグメント中に挿入され得る（そして、必要に応じて、ベクターならびに／または５’隣接配列および／もしくは３’隣接配列中に挿入される）。次いで、「相同組換え構築物」として知られるこの構築物は、エキソビボまたはインビボでのいずれかで所望の細胞中に導入され得る。
【０２５１】
遺伝子治療はまた、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することによってＡＢＣＬポリペプチド発現を減少させるために使用され得る。このような改変は、代表的に、相同組換え法を介して達成される。例えば、不活化について選択されたＡＢＣＬ遺伝子のプロモーターの全てまたは一部を含むＤＮＡ分子は、操作されて、転写を調節するプロモーターの片を除去および／または置き換え得る。例えば、ＴＡＴＡボックスおよび／またはプロモーターの転写アクチベーターの結合部位は、標準的な分子生物学的技術を用いて欠失され得る。このような欠失は、プロモーター活性を阻害し得、それにより対応するＡＢＣＬ遺伝子の転写を抑制することができる。プロモーター中のＴＡＴＡボックスまたは転写アクチベーター結合部位の欠失は、ＡＢＣＬポリペプチドプロモーター（制御されるべきＡＢＣＬ遺伝子と同じまたは関連する種由来）の全てまたは関連する部分を含むＤＮＡ構築物を作製することによって達成され得る。ここで、１つ以上のＴＡＴＡボックスおよび／または転写アクチベーター結合部位のヌクレオチドが、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入によって変異されている。結果として、ＴＡＴＡボックスおよび／またはアクチベーター結合部位は、活性が減少しているか、または完全に不活化されている。この構築物はまた、代表的に、改変されたプロモーターセグメントに隣接するネイティブの（内因性の）５’ＤＮＡ配列および３’ＤＮＡ配列に対応するＤＮＡの少なくとも約５００塩基を含み、この構築物は、直接または本明細書に記載されるウイルスベクターを介してのいずれかで、適切な細胞中に（エキソビボまたはインビボのいずれかで）導入され得る。代表的に、この細胞のゲノムＤＮＡへのこの構築物の組み込みは、相同組換えを介する。ここで、プロモーター構築物における５’ＤＮＡ配列および３’ＤＮＡ配列は、内因性染色体ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションを介して改変されたプロモーター領域への組み込みを補助するように働き得る。
【０２５２】
（治療的使用）
ＡＢＣＬの核酸分子、ポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストは、本明細書中に記載される疾患、障害または状態を含む、多くの疾患、障害または状態を処置、診断、改善または予防するために使用され得る。
【０２５３】
ＡＢＣＬポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストとしては、ＡＢＣＬポリペプチド活性を調節し、そしてＡＢＣＬポリペプチドの成熟形態の少なくとも１つの活性を増加または減少される、アゴニスト分子およびアンタゴニスト分子が挙げられる。アゴニストまたはアンタゴニストは、ＡＢＣＬポリペプチドと相互作用し、それによってそのＡＢＣＬの活性を調節する、補因子（例えば、タンパク質、ペプチド、糖質、脂質または低分子量分子）であり得る。潜在的なポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストとしては、ＡＢＣＬポリペプチドの可溶性形態または膜結合形態のいずれかと反応する抗体が挙げられ、これらの形態は、ＡＢＣＬタンパク質の細胞外ドメインの全てまたは一部を含む。ＡＢＣＬポリペプチド発現を調節する分子としては、代表的に、発現のアンチセンス調節因子として作用し得る、ＡＢＣＬポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。
【０２５４】
ＡＢＣＬポリペプチドは、ＡＢＣトランスポータースーパーファミリーの他のメンバーと構造的相同性を共有するので（実施例１を参照のこと）、ＡＢＣＬポリペプチドは、生体膜を横切る溶質のＡＴＰ依存性トランスロケーションにおいて役割を果たすようである。ＡＢＣＬポリペプチドの発現のパターン（実施例３を参照のこと）はまた、種々の疾患状態におけるＡＢＣＬポリペプチドについての役割も示唆する。
【０２５５】
ＡＢＣＬポリペプチドのＡＢＣＡ１ポリペプチドに対する構造類似性は、ＡＢＣＬのポリペプチドが脂質の輸送に関与し得ることを示唆する。従って、ＡＢＣＬ核酸分子、ポリペプチド、それらのアゴニストおよびアンタゴニストは、損なわれた脂質輸送に関与する疾患および状態の、診断および／または処置において役割を果たし得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：心臓血管疾患、高トリグリセリド血症、アテローム性動脈硬化症、高コレステロール血症、低コレステロール血症、ＨＤＬ欠乏症候群、タンジアー病、ならびに他の異脂質血症および異脂質血症関連状態。損なわれた脂質輸送に関与する他の疾患および状態は、本発明の範囲に含まれる。ＡＢＣＬポリペプチドはまた、コレステロール媒介神経毒の診断および処置に有用であり得る。
【０２５６】
ＡＢＣＬポリペプチドとＡＢＣトランスポータースーパーファミリーの他のメンバーとの間の構造類似性に起因して、ＡＢＣＬの核酸分子、ポリペプチド、それらのアゴニストおよびアンタゴニストはまた、脂質以外の分子の輸送に関与する疾患および状態の、診断および／または処置において役割を果たし得る。例えば、ＡＢＣＬのポリペプチドは、ＤＨＥＡおよびプロゲステロンのような神経ステロイドの輸送に関与し得る。従って、ＡＢＣＬの核酸分子、ポリペプチド、アゴニストおよびアンタゴニストは、神経系の機能的障害および栄養性障害に関与する疾患および状態の、診断および／または処置において役割を果たし得る。ＡＢＣＬポリペプチドの発現に関与し得る疾患の他の例としては、シュタルガルト病、変性網膜症、炎症性網膜症、嚢胞性線維症および多剤耐性に関与する状態が挙げられるが、これらに限定されない。脂質以外の分子の輸送に関与する、他の疾患および状態は、本発明の範囲に含まれる。
【０２５７】
胸腺および脾臓でのＡＢＣＬポリペプチドの発現は、ＡＢＣＬポリペプチドが、これらの組織の発達および機能ならびにこれらの組織に関連する細胞プロセスにおいて役割を果たし得ることを示唆する。従って、ＡＢＣＬの核酸分子、ポリペプチド、それらのアゴニストおよびアンタゴニストは、リンパ系細胞および骨髄性細胞に関与する疾患および状態の、診断および／または処置において役割を果たし得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：免疫応答の調節、ＡＩＤＳ、リンパ腫、白血病、好中球減少症、貧血、および自己免疫疾患。造血細胞に関与する他の疾患は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２５８】
甲状腺でのＡＢＣＬポリペプチドの発現は、ＡＢＣＬポリペプチドが、この組織の発達および機能において役割を果たし得ることを示唆する。従って、ＡＢＣＬ核酸分子、ポリペプチド、それらのアゴニストおよびアンタゴニストは、甲状腺に関与する疾患および状態の、診断および／または処置において役割を果たし得る。このような疾患の例としては、甲状腺機能低下症および甲状腺機能亢進症が挙げられるが、これらに限定されない。甲状腺に関与する他の疾患は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２５９】
視床下部でのＡＢＣＬポリペプチドの発現は、ＡＢＣＬポリペプチドが、この組織の発達および機能において役割を果たし得ることを示唆する。従って、ＡＢＣＬ核酸分子、ポリペプチド、それらのアゴニストおよびアンタゴニストは、視床下部に関与する疾患および状態の、診断および／または処置において役割を果たし得る。このような疾患の例としては、肥満症、糖尿病、生殖障害およびエネルギーバランス障害が挙げられるが、これらに限定されない。視床下部に関与する他の疾患は、本発明の範囲内に含まれる。
【０２６０】
知覚神経節、交感神経節、および副交感神経節でのＡＢＣＬポリペプチドの発現は、ＡＢＣＬポリペプチドが、これらの組織の発達および機能において役割を果たし得ることを示唆する。従って、ＡＢＣＬの核酸分子、ポリペプチド、それらのアゴニストおよびアンタゴニストは、髄鞘障害および軸索障害を含む末梢神経障害の、診断および／または処置において役割を果たし得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：シャルコー−マリー−ツース病、ドゥジュリーヌ−ソッタ症候群、ギヤン−バレー症候群、および糖尿病性ニューロパシー。神経系に関与する自己免疫疾患および炎症性疾患（多発性硬化症が挙げられるが、これに限定されない）の、診断および処置もまた含む。
【０２６１】
ＡＢＣＬポリペプチド機能のアゴニストまたはアンタゴニストは、処置される状態に適切であるように、１以上のサイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤、および／または化学療法剤と組み合わせて（同時にまたは連続的に）使用され得る。
【０２６２】
ＡＢＣＬポリペプチドの所望でないレベルによって生じるかまたは媒介される他の疾患または障害は、本発明の範囲内に包含される。所望でないレベルには、ＡＢＣＬポリペプチドの過剰なレベルおよびＡＢＣＬポリペプチドの正常未満のレベルが含まれる。
【０２６３】
（ＡＢＣＬ核酸およびＡＢＣＬポリペプチドの使用）
本発明の核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）を使用して、ＡＢＣＬ遺伝子および関連する遺伝子の位置を染色体上にマッピングし得る。マッピングは、当該分野で公知の技術（例えば、ＰＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション）により行われ得る。
【０２６４】
ＡＢＣＬ核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む）は、哺乳動物の組織または体液サンプル中のＡＢＣＬ核酸分子の存在について、定性的または定量的のいずれかで試験するための、診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。
【０２６５】
他の方法はまた、１つ以上のＡＢＣＬポリペプチドの活性を阻害することが所望される場合に使用され得る。このような阻害は、発現制御配列（三重らせん形成）またはＡＢＣＬ  ｍＲＮＡに相補的でありかつ発現制御配列（三重らせん形成）またはＡＢＣＬ  ｍＲＮＡにハイブリダイズする核酸分子によりもたらされ得る。例えば、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子（これらは、ＡＢＣＬ遺伝子の少なくとも一部に相補的である配列を有する）が、細胞中に導入され得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示されるＡＢＣＬ遺伝子の配列を使用して、利用可能な技術により設計され得る。代表的には、このようなアンチセンス分子の各々は、選択された各ＡＢＣＬ遺伝子の開始部位（５’末端）に相補的である。このアンチセンス分子が、次いで、対応するＡＢＣＬ  ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、このｍＲＮＡの翻訳は、妨げられるかまたは減少する。アンチセンスインヒビターは、細胞または生物におけるＡＢＣＬポリペプチドの減少または非存在に関連する情報を提供する。
【０２６６】
あるいは、遺伝子治療を使用して、１つ以上のＡＢＣＬポリペプチドのドミナントネガティブインヒビターを作製し得る。この状況において、各選択されたＡＢＣＬポリペプチドの変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡが調製され得、そして本明細書中に記載されるウイルスまたは非ウイルスの方法のいずれかを使用して患者の細胞中に導入され得る。このような変異体の各々は、代表的に、その生物学的役割において内因性ポリペプチドと競合するように設計される。
【０２６７】
さらに、ＡＢＣＬポリペプチドは、生物学的に活性であっても活性でなくても、免疫原として使用され得、すなわち、これらのポリペプチドは、それに対して抗体が惹起され得る、少なくとも１つのエピトープを含有する。ＡＢＣＬポリペプチドに結合する選択的結合因子（本明細書中に記載されるような）は、インビボおよびインビトロでの診断目的のために使用され得、これらの目的としては、体液サンプルまたは細胞サンプル中のＡＢＣＬポリペプチドの存在を検出するための標識された形態での使用を含むが、これに限定されない。これらの抗体もまた、本明細書中に列挙される疾患および障害を含む、多数の疾患および障害を、予防、処置または診断するために使用され得る。これらの抗体は、ＡＢＣＬポリペプチドに特有の少なくとも１つの活性を低減またはブロックするようにＡＢＣＬポリペプチドに結合し得るか、またはポリペプチドに結合してＡＢＣＬポリペプチドに特有の少なくとも１つの活性を増加し得る（ＡＢＣＬポリペプチドの薬物動態を増加させることによるものを含む）。
【０２６８】
ＡＢＣＬポリペプチドは、「発現クローニング」ストラテジーを使用して、ＡＢＣＬリガンドをクローニングするために使用され得る。放射性標識（１２５ヨウ素）したＡＢＣＬポリペプチドまたは「アフィニティ／活性−タグ化」ＡＢＣＬポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合体またはアルカリホスファターゼ融合体）を結合アッセイにおいて使用して、ＡＢＣＬリガンドを発現する細胞型、細胞株または組織を同定し得る。次いで、このような細胞または組織から単離されたＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換し、哺乳動物発現ベクターにクローニングし、そして哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳまたは２９３細胞）にトランスフェクトして発現ライブラリーを作製し得る。次いで、放射性標識化またはタグ化ＡＢＣＬポリペプチドを、アフィニティ試薬として使用して、ＡＢＣＬリガンドを発現する、このライブラリー中の細胞のサブセットを同定および単離し得る。次いで、ＤＮＡを、これらの細胞から単離しそして哺乳動物細胞にトランスフェクトして、二次発現ライブラリー（ここで、ＡＢＣＬリガンドを発現する細胞の割合は、元のライブラリーよりも何倍も高い）を作製する。この富化プロセスは、ＡＢＣＬリガンドを含む単一の組換えクローンが単離されるまで、繰り返し反復され得る。ＡＢＣＬリガンドの単離は、ＡＢＣＬシグナル伝達経路の新規なアゴニストおよびアンタゴニストを同定または開発するために有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、ＡＢＣＬリガンド、抗ＡＢＣＬリガンド抗体、低分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
【０２６９】
本発明のヒトＡＢＣＬ核酸はまた、対応する染色体ＡＢＣＬポリペプチド遺伝子を単離するための有用なツールである。ヒトＡＢＣＬゲノムＤＮＡは、遺伝性の組織変性疾患を同定するために使用され得る。
【０２７０】
マウスおよびヒトのＡＢＣＬポリペプチドならびにヒトＡＢＣＬ１５５０をコードするｃＤＮＡの寄託（登録番号ＰＴＡ−３１０９、ＰＴＡ−３１１０、またはＰＴＡ−３１１１を有する）を、２００１年２月２３日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９に行った。
【０２７１】
以下の実施例は、例示目的のみが意図され、本発明の範囲をいずれにも限定するとは解釈されるべきではない。
【０２７２】
（実施例１：ヒトＡＢＣＬポリペプチド遺伝子のクローニング）
一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるような材料および方法を使用して、ヒトＡＢＣＬポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングおよび分析した。
【０２７３】
ヒトＡＢＣＬポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を単離するために、Ｃｅｌｅｒａ  ＯＲＦ（Ｃｅｌｅｒａ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）およびＡｍｇｅｎｅｓｉｓ（Ａｍｇｅｎ，Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ，ＣＡ）データベースの検索を、問い合わせ配列としてヒトＡＢＣＡ１およびＡＢＣＲを使用して実施した。Ｃｅｌｅｒａ  ＯＲＦデータベースからの多数のクローンが、ＡＢＣ１スーパーファミリーの新規なメンバー（ＡＢＣＬ）についての、全長核酸配列の一部を含むことを見出した。Ａｍｇｅｎｅｓｉｓデータベースからのクローン（ｚｈｇｂ−ａｌ１３７４８１）はまた、全長ＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ配列の一部を含むことも見出した。全長ＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ配列を、３つの部分のｃＤＮＡクローン（ＲＤＳ＃２０００２００２６、ＲＤＳ＃２０００１５７７７、およびＲＤＳ＃２０００１６６２８）から構築した。
【０２７４】
クローンＲＤＳ＃２０００２００２６は、以下のように産生した。ヒトの全脳ｃＤＮＡライブラリー（Ｅｄｇｅ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）のサブプールを、ヒトＡＢＣＬ遺伝子の第１のＡＴＰ結合カセットに対応する増幅プライマーを使用してＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲを、増幅プライマー２４７６−８４（５’−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−３’；配列番号１５）および２４７６−８５（５’−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｇ−３’；配列番号１６）ならびにＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｔａｑポリメラーゼキットを使用して実施した。反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）９６００または２４００サーマルサイクラーにより、９４℃で２分を１サイクル；９４℃で２０秒および７２℃で１分を３５サイクル；ならびに７２℃で５分間を１サイクルで実施した。増幅後、反応物を、１％アガロースゲルで分析した。約２００ｂｐのＰＣＲ産物を生じる、ヒト全脳ｃＤＮＡライブラリーのサブプールを、ＰＣＲによる第２のスクリーニングのために選択した。
【０２７５】
二次スクリーニングにおいて、ｃＤＮＡライブラリーの選択されたサブプールを、増幅プライマー２５２１−１２（５’−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−３’；配列番号１７）および２５０８−６６（５’−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−３’；配列番号１８）を使用して、上記のように分析した。増幅後、反応を、１％アガロースゲルで分析した。二次スクリーニングで約１ｋｂのＰＣＲ産物を生じた１つのサブプール（２Ｅ８）を、さらなる増幅実験のために選択した。
【０２７６】
クローンＲＤＳ＃２０００２００２６を、ヒトＡＢＣＬ遺伝子の第１のＡＴＰ結合ドメインに対応するＡＢＣＬプローブ（５９０２）を使用して、このサブプールから単離した。このプローブを、増幅プライマー２４７６−８４および２４７６−８５ならびにＡｄｖａｎｔａｇｅ２ＴＭ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、ヒト胃ＭａｒａｔｈｏｎＴＭｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）からＰＣＲによって生成した。反応を、９４℃で１分、１サイクル；９４℃で３０秒および７２℃で２分、５サイクル；９４℃で３０秒および７０℃で２分、５サイクル；ならびに９４℃で３０秒および６８℃で２分、２５サイクルで、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ２４００サーマルサイクラーで行った。増幅後、反応物を、１％アガロースゲルで分析した。約２００ｂｐのＰＣＲ産物を、アガロースゲルから切り出し、Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｗｏｒｔｈ、ＣＡ）を使用して精製し、次いで、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）に連結した。ＤＨ５α細胞を、この連結反応液で形質転換し、そして一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミニプレッププロトコルを使用して、この細菌宿主細胞から単離し、次いで、ＥｃｏＲＩでの消化によって分析した。約２００ｂｐのインサートを含むクローンを配列決定し、ヒトＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ配列の存在を確認した。このプローブを、ＥｃｏＲＩでのこのクローンの消化によって単離し、そしてＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用してフラグメントを精製した。このプローブを、ＲｅｄｉＰｒｉｍｅランダムプライム化反応キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、α−３２Ｐ−ｄＣＴＰ（ＲｅｄｉＶｕｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）で標識し、次いで、サイズ排除クロマトグラフィー（５Ｐｒｉｍｅ−３Ｐｒｉｍｅ、Ｂｏｕｌｄｅｒ、ＣＯ）によって精製した。
【０２７７】
この５９０２プローブを使用して、０．５μｌのサブプール２Ｅ８で形質転換しそしてアンピシリン含有ＬＢプレートで一晩増殖させたＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント細胞を、スクリーニングした。コロニーをナイロンフィルターに移し、そしてフィルターを、標識したプローブを含有する６０ｍｌのＲａｐｉｄＨｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中、６５℃で２時間ハイブリダイゼーションに供した。ハイブリダイゼーション後、フィルターを、２×ＳＳＣおよび０．０５％ＳＤＳ中、室温で４０分間、２回洗浄し、次いで、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、６５℃で４０分間、２回洗浄した。次いで、フィルターを、Ｘ線フィルムに４時間曝した。８つのポジティブコロニーの各々のプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミニプレッププロトコルを使用して単離し、次いで、ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化した。３つのコロニーが、約７ｋｂのインサートを含むことが見出された。これらのクローンのうちの１つ（ＲＤＳ＃２０００２００２６）を配列決定し、ＡＢＣＬ核酸配列を含むことが見出された。しかし、この配列の分析は、第１の膜貫通ドメイン中の約３５０ｂｐの挿入（これは、２つの終止コドンを導入する）および第２の膜貫通ドメイン中の約２７０ｂｐの欠失（これは、１５５０アミノ酸の短縮型ＡＢＣＬタンパク質（ヒトＡＢＣＬ１５５０）を産生する）を明らかにした。
【０２７８】
クローンＲＤＳ＃２０００１５７７７を、ヒト胃ＭａｒａｔｈｏｎＴＭｃＤＮＡライブラリー、増幅プライマー２５０８−６３（５’−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−３’；配列番号１９）および２４７７−２９（５’−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−３’；配列番号２０）、およびＡｄｖａｎｔａｇｅ２ＴＭ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットを使用してＰＣＲによって生成した。反応を、９４℃で１分、１サイクル；９４℃で３０秒および７２℃で４分、５サイクル；９４℃で３０秒および７０℃で４分、５サイクル；ならびに９４℃で３０秒および６８℃で４分、５サイクルで、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ２４００サーマルサイクラーで行った。増幅後、反応物を、１％アガロースゲルで分析した。約２ｋｂのＰＣＲ産物を、ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して精製し、次いで、ｐＣＲ２．１に連結した。ＤＨ５α細胞を、この連結反応液で形質転換し、そして一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミニプレッププロトコルを使用して、この細菌宿主細胞から単離し、次いで、ＥｃｏＲＩでの消化によって分析した。約２ｋｂのインサートを含むクローン（ＲＤＳ＃２０００２００２６）を配列決定し、ヒトＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ配列の存在を確認した。このクローンに含まれるＡＢＣＬ核酸配列は、クローンＲＤＳ＃２０００２００２６に同定された第１の膜貫通ドメインにわたり、そしてそのクローンに同定された挿入を欠いていることが見出された。
【０２７９】
クローンＲＤＳ＃２０００１６６２８を、ヒトＭａｒａｔｈｏｎＴＭｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、増幅プライマー（ａｍｐｌｉｍｅｒ）２４７６−８４および２５２０−２４（５’−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−３’；配列番号２１（クローンｚｈｇｂ−ａｌｌ３７４８１由来）、およびＡｄｖａｎｔａｇｅ２ＴＭ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットを使用してＰＣＲによって生成した。反応を、９４℃で１分、１サイクル；９４℃で３０秒および７２℃で５分、５サイクル；９４℃で３０秒および７０℃で５分、５サイクル；ならびに９４℃で３０秒および６８℃で５分、５サイクルで、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ２４００サーマルサイクラーで行った。増幅後、反応物を、１％アガロースゲルで分析した。約３．５ｋｂのＰＣＲ産物を、ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して精製し、次いで、ｐＣＲ２．１に連結した。ＤＨ５α細胞を、この連結反応液で形質転換し、そして一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミニプレッププロトコルを使用して、この細菌宿主細胞から単離し、次いで、ＥｃｏＲＩでの消化によって分析した。約３．５ｋｂのインサートを含むクローン（ＲＤＳ＃２０００１６６２８）を配列決定し、ヒトＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ配列の存在を確認した。このクローンに含まれるＡＢＣＬ核酸配列は、クローンＲＤＳ＃２０００２００２６に同定された第２の膜貫通ドメインにわたり、そしてそのクローンに同定された欠失を欠いていることが見出された。
【０２８０】
ヒトＡＢＣＬ遺伝子配列の全長配列を、クローンＲＤＳ＃２０００２００２６のＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ配列から切り出したＮｈｅＩ−ＣｌａＩフラグメントを、クローンＲＤＳ＃２０００１５７７７のＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ配列から単離したＮｈｅＩ−ＣｌａＩフラグメントと置き換え（従って、クローンＲＤＳ＃２０００２００２６の第１の膜貫通ドメイン内に含まれる挿入配列を除去する）、次いで、クローンＲＤＳ＃２０００２００２６のＡＢＣＬ  ｃＤＮＡから切り出したＨｉｎｄＩＩ−ＨｉｎｄＩＩフラグメントを、クローンＲＤＳ＃２０００２１６６２８のＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ配列から単離したＨｉｎｄＩＩ−ＨｉｎｄＩＩフラグメントと置き換える（従って、クローンＲＤＳ＃２０００２００２６の第２の膜貫通ドメインから欠失された配列を置き換える）ことによって得た。さらなる配列差異が、第２６３０位にてこれらのクローン間で検出されたが（ここで、塩基は、ＡまたはＣのいずれかであり得る）、この差異は、得られたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。
【０２８１】
全長ヒトＡＢＣＬ  ｃＤＮＡクローンを生成するために、クローンＲＤＳ＃２０００２００２６由来のＡＢＣＬ  ｃＤＮＡインサートを、以下のように、ｐＣＲ２．１に移した。クローンＲＤＳ＃２０００２００２６を、ＥｃｏＲＩ、ＮｏｔＩおよびＳａｌＩで消化し、そして１％アガロースゲルで電気泳動した。約７ｋｂの単一のバンドを、ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して精製し、次いで、ｐＣＲ２．１（ＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化した）に連結した。ＤＨ５α細胞を、この連結反応液で形質転換し、そして一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミニプレッププロトコルを使用して、この細菌宿主細胞から単離し、次いで、ＮｈｅＩおよびＣｌａＩでの消化によって分析した。次いで、ＮｈｅＩおよびＣｌａＩで消化したプラスミドＤＮＡを、１％アガロースゲルで電気泳動し、そして約１０ｋｂの単一のバンドを、ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して精製した。
【０２８２】
クローンＲＤＳ＃２０００１５７７７を、ＮｈｅＩおよびＣｌａＩで消化し、そして１％アガロースゲルで電気泳動した。約１ｋｂの単一のバンドを、ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して精製し、次いで、上記のプラスミド（ＮｈｅＩおよびＣｌａＩで消化した後）に連結した。ＤＨ５α細胞を、この連結反応液で形質転換し、そして一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミニプレッププロトコルを使用して、この細菌宿主細胞から単離し、次いで、ＨｉｎｄＩＩでの消化によって分析した。次いで、ＨｉｎｄＩＩで消化したプラスミドＤＮＡを、１％アガロースゲルで電気泳動し、そして約１０ｋｂの単一のバンドを、ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して精製した。
【０２８３】
クローンＲＤＳ＃２０００１６６２８を、ＨｉｎｄＩＩで消化し、そして１％アガロースゲルで電気泳動した。約１ｋｂの単一のバンドを、ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して精製し、次いで、上記のプラスミド（ＨｉｎｄＩＩで消化した後）に連結した。ＤＨ５α細胞を、この連結反応液で形質転換し、そして一晩増殖させた。ヒトＡＢＣＬ遺伝子の全長配列を含むプラスミドＤＮＡ（ｐＣＲ２．１−ｈｕＡＢＣＬ）を、Ｑｉａｇｅｎミニプレッププロトコルを使用して、この細菌宿主細胞から単離した。
【０２８４】
ヒトＡＢＣＬポリペプチドの推定ｃＤＮＡ配列の配列分析は、この遺伝子が、２１４６アミノ酸のタンパク質をコードする６４３８ｂｐのオープンリーディングフレームを含むことを示した（図２Ａ〜２Ｋ；推定シグナルペプチドを下線付して示す）。配列分析は、ＡＢＣＬポリペプチドが、ＡＢＣトランスポータースーパーファミリーのＡＢＣＡサブファミリーに、より特異的に関連することを示した。図５Ａ〜５Ｅは、ヒトＡＢＣ１ポリペプチド（ｈｕＡＢＣ１；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ８６２７６；配列番号１１）、ヒトＡＢＣＲポリペプチド（ｈｕＡＢＣＲ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＡ７５７２９；配列番号１２）およびヒトＡＢＣＬポリペプチド（ｈｕＡＢＣＬ；配列番号５）のアミノ酸配列アライメントを示す。
【０２８５】
ヒトＡＢＣＬポリペプチドの短縮形態（ＡＢＣＬ１５５０）の推定ｃＤＮＡ配列の配列分析は、この遺伝子が、１５５０アミノ酸のタンパク質をコードする４６５０ｂｐのオープンリーディングフレームを含むことを示した（図３Ａ〜３Ｈ）。
【０２８６】
ＡＢＣＬは、ＡＢＣ１サブファミリーのＡＢＣトランスポーターに類似し、このサブファミリーは、ＡＢＣ１、ＡＢＣ２、ＡＢＣ−ＣおよびＡＢＣＲを含む。ＡＢＣＬは、ＡＢＣＬ１（これは、５４％のアミノ酸配列同一性を共有する）およびＡＢＣＲ（これは、４９％のアミノ酸配列同一性を共有する）に最も密接に関連する。
【０２８７】
Ｂｒｏｃｃａｒｄｏら（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １４６１：３９５−４０４（１９９９））は、脾臓で優先的に発現され、そして他のリンパ器官でより一般的に発現される、ＡＢＣトランスポータータンパク質を教示する。この著者らはまた、ＡＢＣトランスポータースーパーファミリーのこのメンバーをコードする遺伝子の染色体位置（１０Ｂ４−Ｃ１）を教示する。最後に、Ｂｒｏｃｃａｒｄｏらは、ＡＢＣトランスポータースーパーファミリーのこのメンバーをコードする遺伝子が、３７個より多いエキソンを含むことを教示する。しかし、この著者らは、このポリペプチドをコードする核酸配列を教示しない。Ｂｒｏｃｃａｒｄｏらは、ＡＢＣトランスポータースーパーファミリーのこのメンバーをＡＢＣＡ７、ＡＢＣ４およびＡＢＣＸと称するが、この著者らが教示する遺伝子は、ＡＢＣＬポリペプチドといくらかの類似性を共有する。
【０２８８】
ＳｃｈｍｉｔｚおよびＫｌｕｃｋｅｎ（ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／１８９１２）は、ＡＢＣトランスポータータンパク質をコードする約６．５ｋｂのｍＲＮＡ転写物を教示する。この著者らはまた、ＡＢＣトランスポータースーパーファミリーのこのメンバーをコードする遺伝子が、Ｃｈ  １９ｐ１３にマップすることを教示する。ＳｃｈｍｉｔｚおよびＫｌｕｃｋｅｎはさらに、コレステロール負荷によるＡＢＣトランスポータースーパーファミリーのこのメンバーの上方調節およびコレステロール枯渇によるこのタンパク質の下方調節を教示する。最後に、ＳｃｈｍｉｔｚおよびＫｌｕｃｋｅｎは、ＡＢＣトランスポータータンパク質の一部（この著者らが、ＡＢＣＡ８またはＡＢＣ−ｎｅｗと称する）をコードする２９１１ｂｐのｃＤＮＡフラグメントを教示するが、ＳｃｈｍｉｔｚおよびＫｌｕｃｋｅｎは、このポリペプチドをコードする核酸配列全体を教示しない。この著者らによって教示されたｃＤＮＡ転写物は、このＡＢＣトランスポータータンパク質の約半分をコードする（この部分配列は、本明細書中に開示されるＡＢＣＬ遺伝子と配列同一性を共有する）。これらの研究者らは、Ｋｌｕｃｋｅｎら、２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：８１７−２２に同様の教示を提供するが、この著者らは、そのＡＢＣトランスポータータンパク質をＡＢＣＡ７およびＡＢＣ４と称する。
【０２８９】
ＳｃｈｒｉｍｌおよびＤｅａｎ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６４：２４〜３１（２０００））は、ＡＢＣＡ７ポリペプチドの一部をコードする８６３ｂｐの発現配列タグ（ＥＳＴ）配列（ＥＳＴ６６５１４６）を教示する。これらの著者らはまた、ＡＢＣＡ７（これらの著者らは、Ａｂｃ５１とも呼ぶ）が、単球およびマクロファージにおいて発現されることを教示する。ＳｃｈｍｉｔｚおよびＫｌｕｃｋｅｎと同様に、ＳｃｈｒｉｍｌおよびＤｅａｎは、コレステロール充填によるＡＢＣＡ７のアップレギュレーションおよびコレステロール枯渇によるＡＢＣＡ７のダウンレギュレーションを教示する。これらの著者らは、マウスにおけるコレステロール胆石の形成が、第１０染色体のＬｉｔｈ１領域に関連付けられ得ること、およびＡＢＣＡ７遺伝子がこの染色体のこの領域（Ｃｈ  １０  ４４ｃＭ）に位置付けられることを、さらに教示する。
【０２９０】
Ｋａｍｉｎｓｋｉら（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７３：５３２−３８（２０００））は、ＡＢＣトランスポータータンパク質（著者らは、ＡＢＣＡ７と示す）についての核酸配列を教示する。これらの著者らはまた、このタンパク質をコードする約６．８ｋｂのｍＲＮＡ転写物を教示する。Ｋａｍｉｎｓｋｉらは、ＡＢＣＡ７ポリペプチドが、最も高い配列同一性を、ヒトコレステロールおよびリン脂質エクスポーターＡＢＣＡ１と（５４％）、ならびにヒト網膜トランスポーターＡＢＣＲと（４９％）共有することをさらに教示する。最後に、これらの著者らは、ＡＢＣＡ７  ｍＲＮＡが、骨髄性リンパ組織において主に検出され、末梢白血球、胸腺、脾臓および骨髄において最も高い発現を検出したことを教示する。
【０２９１】
（実施例２：マウスＡＢＣＬポリペプチド遺伝子のクローニング）
一般的に、上記のＳａｍｂｒｏｏｋらに記載される材料および方法を使用して、マウスＡＢＣＬポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングおよび分析した。
【０２９２】
マウスＡＢＣＬポリペプチドをコードするｃＤＮＡ配列を単離するために、Ａｍｇｅｎｅｓｉｓデータベースの検索を、マウスＡＢＣＡ１  ｃＤＮＡ照会配列およびヒトＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ照会配列を使用して実行した。クローンｓｍｂｏ２−９０−ｈ５は、マウスＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ配列の一部を含むことが見出され、そしてクローンｓｒｐｇ２−３６−ｈ３は、ラットＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ配列の一部を含むことが見出された。クローンｓｍｂｏ２−９０−ｈ５を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を使用して、ＨＥＣＲ１  ＯＰＧ＋マウス由来のマウス骨（臀部から足首）から調製された、指向性（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）オリゴ−ｄＴプライムドｃＤＮＡから単離した。配列分析は、このクローンが、マウスＡＢＣＬ遺伝子の一部（第１膜貫通ドメインの後半半分〜ポリＡテールに渡る）をコードする５ｋｂの挿入物を含んだことを示した。クローンｓｒｐｇ２−３６−ｈ３を、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ラット松果体から調製された、指向性ランダムプライムドｃＤＮＡライブラリーから単離した。配列分析は、このクローンが、（この遺伝子の５’末端から）ラットＡＢＣＬ遺伝子の一部をコードする２ｋｂの挿入物を含んだことを示した。
【０２９３】
全長マウスＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ配列を、４つの部分ｃＤＮＡクローン（ＲＤＳ＃２０００１９ｌ８２、ＲＤＳ＃２０００１９１８３、ＲＤＳ＃２０００１９１８４、およびＲＤＳ＃２０００１９１８５）から構築した。クローンＲＤＳ＃２０００１９ｌ８２およびクローンＲＤＳ＃２０００１９ｌ８３を、マウスＥ１７  ＭａｒａｔｈｏｎＴＭ  ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、アンプリマー２５３３−６９（５’−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−３’；配列番号２２；クローンｓｒｐｇ２−３６−ｈ３から誘導される）および２５０７−２７（５’−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−３’；配列番号２３；クローンｓｍｂｏ２−９０−ｈ５から誘導される）ならびにＡｄｖａｎｔａｇｅ２ＴＭ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットを使用するＰＣＲによって、作製した。反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ２４００熱サイクラーで、９４℃で１分間を１サイクル；９４℃で３０秒間および７２℃で５分間を５サイクル；９４℃で３０秒間および７０℃で５分間を５サイクル；ならびに９４℃で３０秒間および６８℃で５分間を２５サイクルを行った。増幅に続いて、１％アガロースゲル上で反応物を分析した。しかし、ＰＣＲ産物は、検出されなかった。
【０２９４】
アンプリマー２５３３−６９およびアンプリマー２５０７−２８（５’−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｇ−３’；配列番号２４；クローンｓｍｂｏ２−９０−ｈ５から誘導される）を使用する混合物の再増幅において、約３．５ｋｂで移動する単一のバンドを獲得した。このバンドを、ゲル電気泳動によって分離し、ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して精製し、次いで、ｐＣＲ２．１に連結した。ＤＨ５α細胞を、連結反応物を用いて形質転換し、そして一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミニプレッププロトコルを使用して、細菌宿主細胞から単離し、次いで、Ｅｃｏ  ＲＩを用いる消化によって分析した。約３．５ｋｂの挿入物を含む２つのクローンを配列決定し、そしてこれらがマウスＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ配列の５’末端を含むことを見出した。
【０２９５】
クローンＲＤＳ＃２０００１９１８４およびクローンＲＤＳ＃２０００１９１８５を、マウス肺ＭａｒａｔｈｏｎＴＭｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、アンプリマー２５３３−６９およびアンプリマー２５０７−２７、ならびにＡｄｖａｎｔａｇｅ２ＴＭ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇキットを使用するＰＣＲによって作製した。反応を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ２４００熱サイクラーで、９４℃で１分間を１サイクル；９４℃で３０秒間および７２℃で５分間を５サイクル；９４℃で３０秒間および７０℃で５分間を５サイクル；ならびに９４℃で３０秒間および６８℃で５分間を２５サイクルを行った。増幅に続いて、反応物を１％アガロースゲル上で分析した。しかし、ＰＣＲ産物は、検出されなかった。
【０２９６】
アンプリマー２５３３−６９およびアンプリマー２５０７−２８を使用する混合物の再増幅において、約３．５ｋｂで移動する単一のバンドを獲得した。このバンドを、ゲル電気泳動によって分離し、ゲルから切り出し、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキットを使用して精製し、次いで、ｐＣＲ２．１に連結した。ＤＨ５α細胞を、連結反応物を用いて形質転換し、そして一晩増殖させた。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎミニプレッププロトコルを使用して、細菌宿主細胞から単離し、次いで、Ｅｃｏ  ＲＩを用いる消化によって分析した。約３．５ｋｂの挿入物を含む２つのクローンを配列決定し、そしてこれらがマウスＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ配列の５’末端を含むことを見出した。
【０２９７】
クローンＲＤＳ＃２０００１９ｌ８２、クローンＲＤＳ＃２０００１９１８３、クローンＲＤＳ＃２０００１９１８４、およびクローンＲＤＳ＃２０００１９１８５から作製されたコンセンサス配列を、マウスＡＢＣＬ遺伝子の５’末端配列のために使用した。第１膜貫通ドメインの末端近くに、ＰＣＲ作製された配列とクローンｓｍｂｏ２−９０−ｈ５配列との間の重なりを観測した。クローンｓｍｂｏ２−９０−ｈ５配列の配列がマウスＡＢＣＬ遺伝子の第１膜貫通ドメインからこの遺伝子のポリＡテールまで延びるので、マウスＡＢＣＬの全長配列を、クローンｓｍｂｏ２−９０−ｈ５の部分マウスＡＢＣＬ  ｃＤＮＡを用いたＰＣＲ増幅から作製されたフラグメントを集合することによって構築した。
【０２９８】
マウスＡＢＣＬポリペプチドについての推定ｃＤＮＡ配列の配列分析は、この遺伝子が２１６７アミノ酸のタンパク質をコードする６５０１ｂｐのオープンリーディングフレームを含むことを示した（図１Ａ〜１Ｋ；推定シグナルペプチドが、下線によって示される）。図４Ａ〜４Ｅは、マウスＡＢＣ１ポリペプチド（ｍｕＡＢＣ１；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ ０３８４８２；配列番号９）、マウスＡＢＣＲポリペプチド（ｍｕＡＢＣＲ；ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＰ ０３１４０４；配列番号１０）、およびマウスＡＢＣＬポリペプチド（ｍｕＡＢＣＬ；配列番号２）のアミノ酸配列アライメントを示す。
【０２９９】
（実施例３：ＡＢＣＬ  ｍＲＮＡ発現）
複数のヒトおよびマウス組織ノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、適切なアンプリマーを使用して、ヒトＡＢＣＬ  ｃＤＮＡまたはマウスＡＢＣＬ  ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって作製されたプローブを用いてハイブリダイズした。プローブを、製造業者の指示に従って、Ｒｅｄｉ−Ｐｒｉｍｅ  ＩＩキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して放射標識した。ノーザンブロットを、Ｒａｐｉｄ−Ｈｙｂ緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で、６５℃で３０分間、プレハイブリダイズし、次いで、放射標識プローブを含むＲａｐｉｄ−Ｈｙｂ緩衝液中で、６５℃で９０分間、ハイブリダイゼーションオーブン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）においてハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションに続いて、ブロットを、室温で、２×ＳＳＣおよび０．０５％ＳＤＳで２回洗浄し、次いで、６５℃で１時間、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで２回洗浄した。ハイブリダイズしたブロットを、ホスホイメージ（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒｙ）によって調べた。
【０３００】
ヒト組織のノーザンブロット分析は、ＡＢＣＬ  ｍＲＮＡが胸腺において高度に発現されたことを示した。バックグランドより上の発現レベルはまた、ヒトの甲状腺および視床下部においても観測された。マウス組織のノーザンブロット分析は、ＡＢＣＬ  ｍＲＮＡがマウスの脾臓、脳、および肺において発現されたことを示した。低いレベルの発現もまた、心臓および精巣でマウスにおいて観測された。
【０３０１】
ＡＢＣＬ  ｍＲＮＡの発現を、インサイチュハイブリダイゼーションによって位置付けた。正常なマウス胚組織ならびにマウス成体組織およびサル成体組織の一群を４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン中に包埋し、そして５μｍに分けた。切片組織を、０．２Ｍ  ＨＣｌ中にて透過させ、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋを用いて消化し、そしてトリエタノールアミンおよび無水酢酸を用いてアセチル化した。切片を、ハイブリダイゼーション溶液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１×デンハルト溶液、０．２％ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．２５ｍｇ／ｍｌ  ｔＲＮＡ、２５μｇ／ｍｌ  ポリＡ、２５μｇ／ｍｌポリＣおよび５０％ホルムアミド）中で、６０℃で１時間プレハイブリダイズし、次いで、１０％デキストランおよびマウスＡＢＣＬ遺伝子（マウス組織切片の分析のため）またはヒトＡＢＣＬ遺伝子（サル組織切片の分析のため）のいずれかに相補的な２×１０４ｃｐｍ／μｌの３３Ｐ標識アンチセンスリボプローブを含む同じ溶液中で、６０℃で一晩ハイブリダイズした。標準的な技術を使用して、適切なＡＢＣＬ  ｃＤＮＡ配列を含むクローンのインビトロ転写物によって、このリボプローブを獲得した。
【０３０２】
ハイブリダイゼーションに続いて、切片をハイブリダイゼーション溶液でリンスし、ハイブリダイズしていないプローブを消化するためにＲＮａｓｅＡを用いて処理し、次いで、５５℃で３０分間、０．１×ＳＳＣで洗浄した。次いで、切片をＮＴＢ−２エマルジョン（Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）中に浸し、４℃で３週間暴露し、発色させ、そしてヘマトキシリンおよびエオシンを用いて対比染色した。組織形態およびハイブリダイゼーションシグナルを、脳（１つの矢状方向切片および２つの冠状切片）、胃腸管（食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、近位結腸、および遠位結腸）、下垂体、肝臓、肺、心臓、脾臓、胸腺、リンパ節、腎臓、副腎、膀胱、膵臓、唾液腺、雄性生殖器および雌性生殖器（雌性の卵巣、卵管、および子宮；ならびに雄性の精巣、精巣上体、前立腺、精嚢、および精管）、ＢＡＴおよびＷＡＴ（皮下、腎周囲（ｐｅｒｉ−ｒｅｎａｌ））、骨（大腿骨）、皮膚、乳房、ならびに骨格筋について、暗視野照明および標準照射によって、同時に分析した。
【０３０３】
ＡＢＣＬ  ｍＲＮＡの発現を、マウス交感神経節およびマウス副交感神経節ならびにサル交感神経節およびサル副交感神経節の両方で検出した。マウス胚において、脊髄神経節、上頸神経節、およびらせん神経節においてポジティブシグナルが見出された。いかなる１つの特定の細胞型にも起因しないシグナルはまた、両方の種の胸腺、脾臓、リンパ節、および肺において見出された。
【０３０４】
（実施例４：ＡＢＣＬポリペプチドの産生）
（Ａ．細菌におけるＡＢＣＬポリペプチドの発現）
ＰＣＲを用いて、ＡＢＣＬポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、この配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。増幅したＤＮＡ産物を改変して、発現ベクター内への挿入を可能にするために制限酵素部位を含むようにし得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組み換えＤＮＡ方法論を用いて発現ベクター中に挿入する。ｌｕｘプロモーターおよびカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含むｐＡＭＧ２１（ＡＴＣＣ番号９８１１３）のような代表的ベクターを、挿入したＤＮＡの方向性クローニングのために、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩを用いて消化する。連結した混合物を、エレクトロポレーションによってＥ．ｃｏｌｉ宿主株中に形質転換し、そして形質転換体をカナマイシン耐性について選択する。選択したコロニー由来のプラスミドＤＮＡを、単離し、そしてＤＮＡ配列決定に供してインサートの存在を確認する。
【０３０５】
形質転換した宿主細胞を、誘導前に、３０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する２×ＹＴ培地中で３０℃でインキュベートする。Ｎ−（３−オキソヘキサノイル）−ｄｌ−ホモセリンラクトンの最終濃度３０ｎｇ／ｍＬまでの添加、それに続く３０℃かまたは３７℃での６時間のインキュベーションによって、遺伝子発現を誘導する。ＡＢＣＬポリペプチドの発現を、培養物の遠心分離、細菌ペレットの再懸濁物および溶解物、ならびに、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による宿主細胞タンパク質の分析によって、評価する。
【０３０６】
ＡＢＣＬポリペプチドを含有する封入体を、以下の通り精製する。細菌細胞を遠心分離によってペレットにし、そして水に再懸濁する。この細胞懸濁液を超音波処理によって溶解し、そして１９５，０００×ｇでの５〜１０分間の遠心分離によってペレット化する。上清を廃棄し、そしてペレットを洗浄してホモジナイザーに移す。このペレットを、均一に懸濁されるまで、５ｍＬのＰｅｒｃｏｌｌ溶液（７５％液体Ｐｅｒｃｏｌｌ、および０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）中でホモジナイズし、次いで希釈して２１，６００×ｇで３０分間遠心分離する。封入体を含む勾配画分を回収してプールする。単離した封入体をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０３０７】
Ｅ．ｃｏｌｉが産生したＡＢＣＬポリペプチドに相当する、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の単一のバンドを、ゲルから切り出し、そしてＮ末端アミノ酸配列を、本質的にＭａｔｓｕｄａｉｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１０〜３５（１９８７）に記載のように決定する。
【０３０８】
（Ｂ．哺乳動物細胞におけるＡＢＣＬポリペプチドの発現）
ＰＣＲを用いて、ＡＢＣＬポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。このＰＣＲには、この配列の５’および３’末端に対応するプライマーを用いる。増幅したＤＮＡ産物を改変して、発現ベクター内への挿入を可能にするために制限酵素部位を含むようにし得る。ＰＣＲ産物をゲル精製し、そして標準的組み換えＤＮＡ方法論を用いて発現ベクター中に挿入する。エプスタイン−バーウイルス複製起点を含む代表的な発現ベクターであるｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、２９３−ＥＢＮＡ−１細胞におけるＡＢＣＬの発現のために用い得る。増幅およびゲル精製したＰＣＲ産物を、ｐＣＥＰ４ベクターに連結し、そしてリポフェクチンによって２９３−ＥＢＮＡ細胞中に導入する。トランスフェクトした細胞を、１００μｇ／ｍＬのハイグロマイシン中で選択し、そして得られた薬物耐性培養物をコンフルエンスになるまで増殖する。次いで、この細胞を無血清培地中で７２時間培養する。馴化培地を取り出し、ＡＢＣＬポリペプチド発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析する。
【０３０９】
ＡＢＣＬポリペプチド発現は、銀染色によって検出し得る。あるいは、ＡＢＣＬポリペプチドを、ペプチドタグに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析によって検出可能である、エピトープタグ（例えば、ＩｇＧ定常ドメインまたはＦＬＡＧエピトープ）との融合タンパク質として生成する。
【０３１０】
ＡＢＣＬポリペプチドをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し得るが、またはＡＢＣＬ融合タンパク質を、エピトープタグへのアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、そして、本明細書に記載されるように、Ｎ末端アミノ酸配列分析に供した。
【０３１１】
（Ｃ．哺乳動物細胞におけるＡＢＣＬポリペプチドの発現および精製）
リポフェクチンまたはリン酸カルシウムプロトコールのいずれかを用いて、２９３  ＥＢＮＡ細胞またはＣＨＯ細胞中に、ＡＢＣＬポリペプチド発現構築物を導入した。
【０３１２】
生成されるＡＢＣＬポリペプチドに対する機能的研究を行うため、ハイグロマイシン選択２９３  ＥＢＮＡクローニングのプールから大量の馴化培地を生成した。この細胞を５００ｃｍ  Ｎｕｎｃ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｆｌａｓｋｓ中で、８０％コンフルエンスになるまで培養し、その後、培地を回収する１週間前に無血清培地に切り換えた。馴化培地を回収し、そして精製まで−２０℃に凍結した。
【０３１３】
馴化培地を下記のとおり、アフィニティークロマトグラフィーによって精製する。この培地を解凍し、次いで０．２μｍフィルターに通した。プロテインＧカラムをＰＢＳでｐＨ７．０に平衡化し、次いで濾過した培地をロードした。このカラムをＡ２８０の吸収がベースラインに達するまでＰＢＳで洗浄した。０．１Ｍ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌを用いてｐＨ２．７でＡＢＣＬポリペプチドを、カラムから溶出し、直ちに１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを用いてｐＨ８．５で中和した。ＡＢＣＬポリペプチドを含有する画分をプールし、ＰＢＳ中で透析し、そして−７０℃で貯蔵した。
【０３１４】
ヒトＡＢＣＬポリペプチド−Ｆｃ融合ポリペプチドの第Ｘａ因子切断について、アフィニティークロマトグラフィー精製したタンパク質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２中でｐＨ８．０で透析する。制限プロテアーゼ第Ｘａ因子を、透析したタンパク質に１／１００（ｗ／ｗ）で添加し、そしてこのサンプルを室温で一晩消化した。
【０３１５】
（実施例５：抗ＡＢＣＬポリペプチド抗体の生成）
ＡＢＣＬポリペプチドに対する抗体を、生物学的合成または化学的合成によって生成した、精製タンパク質またはＡＢＣＬペプチドを用いて免疫することによって獲得し得る。抗体を生成するための適切な手順は、ＨｕｄｓｏｎおよびＢａｙ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第二版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｉｌｉｃａｔｉｏｎ）に記載の手順を含む。
【０３１６】
抗体生成のための１つの手順において、動物（代表的には、マウスまたはウサギ）に、ＡＢＣＬ抗原（例えば、ＡＢＣＬポリペプチド）を注射し、そして、ハイブリドーマ産生のため、ＥＬＩＳＡによって決定した十分な血清力価レベルを有する動物を、選択する。免疫した動物の脾臓を回収し、そして単一細胞懸濁液として調製し、これから脾臓細胞を回収する。脾臓細胞をマウスミエローマ細胞（例えば、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４細胞）に融合し、ＤＭＥＭ（２００Ｕ／ｍＬペニシリン、２００μｇ／ｍＬ硫酸ストレプトマイシン、および４ｍＭグルタミン含有）中でまずインキュベートし、次いで、ＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン）中でインキュベートする。選択後、組織培養上清を各融合ウェルから取り出し、そしてＥＬＩＳＡによって、抗ＡＢＣＬ抗体産生について試験する。
【０３１７】
抗ＡＢＣＬ抗体を得るため、別の手順をまた、使用し得る。この手順は例えば、ヒト抗体の生成のためのヒトＩｇ遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスの免疫、および合成抗体ライブラリー（例えば、抗体可変ドメインの変異誘発によって生成されるライブラリーなど）のスクリーニングである。
【０３１８】
（実施例６：トランスジェニックマウスにおけるＡＢＣＬポリペプチドの発現）
ＡＢＣＬポリペプチドの生物学的活性を評価するため、肝臓特異的ＡｐｏＥプロモーターの制御下で、ＡＢＣＬポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質をコードする構築物を調製する。この構築物の送達により、ＡＢＣＬポリペプチドの機能に関して情報を与える、病理的変化を生じることが期待される。同様に、βアクチンプロモーターの制御下で、全長ＡＢＣＬポリペプチドを含む構築物を調製する。この構築物の送達により、遍在性発現を生じることが期待される。
【０３１９】
これらの構築物を生成するために、ＰＣＲを用いて、所望の配列の５’末端および３’末端に対応し、そして発現ベクター内への増幅産物の挿入を可能にするために制限酵素部位を組み込むプライマーを用いてＡＢＣＬポリペプチドをコードするテンプレートＤＮＡ配列を増幅する。増幅後、ＰＣＲ産物をゲル精製し、適切な制限酵素で消化し、そして標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて発現ベクター中に連結する。例えば、増幅したＡＢＣＬポリペプチド配列を、Ｇｒａｈａｍら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１７：２７２〜７４およびＲａｙら，１９９１  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．５：２２６５〜７３に記載のように、ヒトβアクチンプロモーターの制御下で発現ベクター中にクローニングし得る。
【０３２０】
連結（ライゲーション）後、反応混合物を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主株をエレクトロポレーションによって形質転換し、そして形質転換体を、薬物耐性について選択する。選択したコロニー由来のプラスミドＤＮＡを単離して、ＤＮＡ配列決定に供し、適切なインサートの存在および変異が存在しないことを確認する。ＡＢＣＬポリペプチド発現ベクターを、２回のＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を通じて精製し、適切な制限酵素で切断し、そして、ＡＢＣＬポリペプチド導入遺伝子を含有する直線フラグメントを、ゲル電気泳動によって精製する。精製したフラグメントを、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）および０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、２ｍｇ／ｍＬの濃度で、再懸濁する。
【０３２１】
ＢＤＦ１×ＢＤＦ１交配マウス由来の単一細胞胚を、記載（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／２３６１４）のように注射する。胚を、ＣＯ２インキュベーター中で一晩培養し、そして１５〜２０の２細胞胚を偽妊娠ＣＤ１雌性マウスの卵管に移す。マイクロインジェクションした胚の着床から得た子孫を、以下のように、ゲノムＤＮＡサンプル中に組み込まれた導入遺伝子のＰＣＲ増幅でスクリーニングする。耳切片を２０ｍＬの耳緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ、および５００ｍｇ／ｍＬ  プロテイナーゼＫ）中で、５５℃で一晩消化する。次いで、このサンプルを２００ｍＬのＴＥで希釈し、そして２ｍＬの耳サンプルを、適切なプライマーを用いるＰＣＲ反応中で用いる。
【０３２２】
８週齢で、トランスジェニック創始動物およびコントロール動物を、剖検および病理分析のため、屠殺する。脾臓の一部を取り出し、そしてＴｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、脾臓から、総細胞ＲＮＡを単離し、そして導入遺伝子発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって決定する。脾臓から回収したＲＮＡを、以下のように、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＰｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を用いてｃＤＮＡに変換する。適切なプライマー（発現ベクター配列に位置し、そしてＡＢＣＬポリペプチド導入遺伝子の３’側である）を用いて、導入遺伝子転写物からｃＤＮＡ合成をプライムする。トランスジェニック創始動物およびコントロール由来の１０ｍｇの総脾臓ＲＮＡを、１ｍＭのプライマーとともに、１０分間７０℃でインキュベートし、そして氷上に置く。次いで、反応物に、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．１ｍＭ  ＤＴＴ、および２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素を補充する。４２℃で５０分間のインキュベーション後、７２℃で１５分間加熱することによって反応を停止し、２ＵのＲＮａｓｅ  Ｈを用いて２０分間３７℃で消化する。次いで、サンプルをＡＢＣＬポリペプチドに特異的なプライマーを用いるＰＣＲによって増幅する。
【０３２３】
（実施例７：トランスジェニックマウスにおけるＡＢＣＬポリペプチドの生物学的活性）
安楽死の前に、トランスジェニック動物を計量し、イソフルオロラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）によって麻酔し、そして心臓穿刺によって採血する。サンプルを、血液学および血清化学分析に供する。Ｘ線撮影を、最終的な放血後に行う。肉眼での解剖の際に、主な内臓器官を、重量分析に供する。
【０３２４】
肉眼での解剖後、組織（すなわち、肝臓、脾臓、膵臓、胃、胃腸管全体、腎臓、生殖器官、皮膚および乳腺、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺、副腎、膀胱、リンパ節および骨格筋）を取出し、そして１０％緩衝化Ｚｎ−ホルマリン中で組織学的検査のために固定する。固定後、組織をパラフィンブロック中で処理し、そして３ｍｍの切片を得る。全ての切片を、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、次いで組織学的分析に供する。
【０３２５】
トランスジェニックマウスおよびコントロールマウスの両方の脾臓、リンパ節およびパイアー斑を、以下の通りにＢ細胞特異的抗体およびＴ細胞特異的抗体による免疫組織学的分析に供する。ホルマリンで固定したパラフィン包埋切片を脱パラフィン処理し、そして脱イオン水中で水和する。切片を３％過酸化水素でクエンチし、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｐｓｈａｗ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）でブロックし、そしてラットモノクローナル抗マウスＢ２２０およびＣＤ３（Ｈａｒｌａｎ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）中でインキュベートする。抗体結合を、色素原（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）としてＤＡＢ（ＢｉｏＴｅｋ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を用いて、ビオチン化ウサギ抗ラット免疫グロブリンおよびペルオキシダーゼ結合体化ストレプトアビジン（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）によって検出する。切片を、ヘマトキシリンで対比染色する。
【０３２６】
剖検後、トランスジェニック動物およびコントロールの同腹仔由来の脾臓および胸腺のＭＬＮおよび切片を取出す。シリンジの平らな末端を用いて１００ｍｍナイロン性細胞ストレーナー（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）の底に対してこの組織を穏やかに粉砕することによって単細胞懸濁物を調製する。細胞を２回洗浄し、計数し、次いで各組織由来の約１×１０６細胞を、２０μＬ容量において０．５μｇ  ＣＤ１６／３２（ＦｃγＩＩＩ／ＩＩ）Ｆｃブロックで１０分間インキュベートする。次いで、サンプルを、ＦＩＴＣまたはＰＥに結合体化した、ＣＤ９０．２（Ｔｈｙ−１．２）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）、Ｇｒ−１、ＣＤ４またはＣＤ８に対するモノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の０．５μｇ抗体を有する、１００μＬ容量のＰＢＳ（Ｃａ＋およびＭｇ＋を欠く）、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．０１％アジ化ナトリウム中で２〜８℃で３０分間染色する。抗体結合後、細胞を洗浄し、次いでＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でのフローサイトメトリーによって分析する。
【０３２７】
本発明を好ましい実施形態に関して記載してきたが、変更および改変が当業者に思い浮かぶことが理解される。それゆえ、添付の特許請求の範囲が、特許請求される本願発明の範囲内に入る全てのこのような等価な変更物を包含することが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ〜１Ｋは、マウスＡＢＣＬ遺伝子（配列番号１）のヌクレオチド配列、およびこの遺伝子によってコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を例示する。推定シグナルペプチドを示す（下線）。
【図２】
図２Ａ〜２Ｋは、ヒトＡＢＣＬ遺伝子（配列番号４）のヌクレオチド配列、およびこの遺伝子によってコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号５）を例示する。推定シグナルペプチドを示す（下線）。
【図３】
図３Ａ〜３Ｈは、ヒトＡＢＣＬ１５５０遺伝子（配列番号７）のヌクレオチド配列、およびこの遺伝子によってコードされるポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号８）を例示する。
【図４】
図４Ａ〜４Ｅは、マウスＡＢＣ１ポリペプチド（ｍｕＡＢＣ１；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３８４８２；配列番号９）、マウスＡＢＣＲポリペプチド（ｍｕＡＢＣＲ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０３１４０４；配列番号１０）、およびマウスＡＢＣＬポリペプチド（ｍｕＡＢＣＬ；配列番号２）のアミノ酸配列アラインメントを例示する。
【図５】
図５Ａ〜５Ｅは、ヒトＡＢＣ１ポリペプチド（ｈｕＡＢＣ１；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＦ８６２７６；配列番号１１）、ヒトＡＢＣＲポリペプチド（ｈｕＡＢＣＲ；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＡ７５７２９；配列番号１２）、およびヒトＡＢＣＬポリペプチド（ｈｕＡＢＣＬ；配列番号５）のアミノ酸配列アラインメントを例示する。
【国際公開パンフレット】
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2004520083.tif 000244
2004520083.tif 000245
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520083.tif 000246
【国際調査報告】
2004520083.tif 000247
2004520083.tif 000248
2004520083.tif 000249