(57)【要約】本発明は、植物アレンオキシドシクラーゼ（ＡＯＣ）をコードする核酸に関する。新規ｃＤＮＡクローンの提供によって、バイオテクノロジー手段による、大量かつ高純度のジャスモン酸の産生が初めて可能になる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下より選択される、ジャスモネート生合成由来のアレンオキシドシクラーゼの活性を伴うタンパク質をコードする核酸：
ａ）　プローブによる植物遺伝子バンクのスクリーニングおよびアレンオキシドシクラーゼ陽性クローンの選択により、入手可能である核酸；
ｂ）　配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６から選択される配列を有する、タンパク質をコードする核酸；
ｃ）　ｂ）に記載の核酸とハイブリダイズする核酸；
ｄ）　遺伝暗号の縮重を考慮して、ｂ）に記載の核酸とハイブリダイズしうる核酸；
ｅ）　１個または複数の塩基の置換、付加、逆位および／または欠失により得られる、ａ）からｄ）のいずれか１つに記載の核酸誘導体；
ｆ）　配列番号：１に記載の核酸のコード領域と少なくとも５３％、好ましくは少なくとも７０％の同一性を有する核酸；
ｇ）　ａ）からｆ）の群の１つの核酸と相補的な核酸。
【請求項２】
配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５の１つから選択される配列、またはそれらに由来する１個または複数の塩基の置換、付加、逆位および／または欠失による誘導体の１つに記載のコード配列を含むことを特徴とする、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６の１つから選択される、タンパク質配列をコードすることを特徴とする、請求項１または２のいずれか１項記載の核酸。
【請求項４】
ＤＮＡ、好ましくはｃＤＮＡであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか１項記載の核酸。
【請求項５】
少なくとも１０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも５０個のヌクレオチド、および特に好ましくは少なくとも２００個のヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項記載の核酸の断片。
【請求項６】
宿主細胞におけるアレンオキシドシクラーゼの発現を、プロモーターに対してアンチセンス方向で、阻害することができることを特徴とする、請求項５記載の断片。
【請求項７】
発現調節エレメント、好ましくはプロモーターの制御下にある、請求項１から４のいずれか１項記載の核酸および／または請求項５または６のいずれか１項記載の断片を含む構築体。
【請求項８】
核酸または断片が調節エレメントに対してアンチセンス方向に位置することを特徴とする、請求項７記載の構築体。
【請求項９】
プラスミドとして存在することを特徴とする、請求項７または８のいずれか１項記載の構築体。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれか１項記載の核酸および／または請求項５または６のいずれか１項記載の断片および／または請求項７から９のいずれか１項記載の構築体を含む、宿主細胞。
【請求項１１】
細菌、酵母細胞、植物細胞、動物細胞および／またはヒト細胞から選択されることを特徴とする、請求項１０記載の宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１から４のいずれか１項記載の核酸および／または請求項５または６のいずれか１項記載の断片および／または請求項７から９のいずれか１項記載の構築体を含む、植物細胞および／または植物組織および／または植物器官および／または種子および／または植物。
【請求項１３】
核酸または断片または構築体が、野生型における天然の位置に対応しないゲノムの位置に組み込まれていることを特徴とする、請求項１０から１２のいずれか１項記載の宿主細胞および／または種子および／または植物細胞および／または植物組織および／または植物器官および／またはトランスジェニック植物。
【請求項１４】
宿主細胞における請求項１から４のいずれか１項記載の核酸の発現により得られるタンパク質。
【請求項１５】
請求項１４記載のタンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１５記載のタンパク質の融合パートナーが、以下のジャスモネート生合成経路から選択される、請求項１５記載の融合タンパク質：
ａ）アレンオキシド合成酵素および
ｂ）還元酵素。
【請求項１７】
請求項１４から１６のいずれか１項記載のタンパク質と反応する抗体。
【請求項１８】
以下の段階を含む、トランスジェニック植物および／または植物細胞および／または植物組織および／または植物器官を産生する過程：
植物細胞に、請求項１から４のいずれか１項記載の核酸および／または請求項５または６のいずれか１項記載の断片を導入する段階；ならびに
形質転換された植物細胞から、植物および／または植物細胞および／または植物組織および／または植物器官を再生する段階。
【請求項１９】
以下の段階を含む、植物細胞、種子および／または植物組織および／または植物器官および／または植物のアレンオキシドシクラーゼ活性に影響を及ぼす過程：
植物細胞および／または種子および／または植物組織および／または植物器官および／または植物に、請求項１から４のいずれか１項記載の核酸および／または請求項５または６のいずれか１項記載の断片を導入する段階。
【請求項２０】
以下の段階を含む、ジャスモン酸生合成における９Ｓ／１３Ｓ（シス（＋））−１２−オキソフィトジエン（ｏｘｏｐｈｙｔｏｄｉｅｎｉｃ）酸の選択的産生過程：
適当な宿主細胞において、請求項１から４のいずれか１項記載の核酸を導入し、かつ発現させる段階；
適当な宿主細胞において、請求項１から４のいずれか１項記載の核酸を、リポオキシゲナーゼおよびアレンオキシド合成酵素をコードする核酸と共に導入し、かつ発現させる段階。
【請求項２１】
以下の段階を含む、ジャスモン酸の産生過程：
請求項２０記載の前駆体分子９Ｓ／１３Ｓ（シス（＋））−１２−オキソフィトジエン酸産生。
【請求項２２】
植物全体を産生するための、請求項１１記載の植物細胞の使用。
【請求項２３】
植物から相同配列を単離するための、請求項１から４のいずれか１項記載の核酸の使用。
【請求項２４】
原核および／または真核細胞においてアレンオキシドシクラーゼを発現させるための、請求項１から４のいずれか１項記載の核酸の使用。
【請求項２５】
原核および／または真核細胞におけるアレンオキシドシクラーゼの発現を阻害するための、アンチセンス方向で調節エレメントの制御下にある、請求項１から４のいずれか１項記載の核酸の使用。
【請求項２６】
改変された特性が特に以下から選択される、改変された特性を有するトランスジェニック作物植物を産生するための、請求項１から４のいずれか１項記載の核酸の使用：
ａ）増大された病原体防御力；
ｂ）植草動物に対する増大された防御性；
ｃ）最適化された植物−益虫−害虫の相互作用；
ｄ）増大されたバイオマス形成；
ｅ）改変された炭水化物平衡；
ｆ）改変された窒素平衡；
ｇ）二次的天然物質、特にアルカノイドおよび／またはフィトアレキシンの増大された形成；
ｈ）最適化されたＵＶ保護性；
ｉ）改変された雄性不稔；
ｊ）特に花の発生および／または種子形成および／または発芽における、改変された発生過程。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、植物のアレンオキシドシクラーゼをコードする核酸および生化学的手段によるジャスモン酸産生のための核酸の使用に関する。
【０００２】
ジャスモン酸（ＪＡ）およびそのメチルエステル（ＪＡＭＥ）は、まとめてジャスモネートとも称されるが、これらは酢酸およびペンテニル側鎖が付加したシクロペンタノン環からなる。これらの側鎖は、シス（３Ｒ／７Ｓ）型またはトランス（３Ｒ／７Ｒ）型のいずれかで存在する。加えて、通常植物において発見された非常に多数の構造的関連化合物が説明されている（Ｈａｍｂｅｒｇ， Ｍ．およびＧａｒｄｎｅｒ， Ｈ． Ｗ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ、１１６５：１−１８（１９９２））。ＪＡにおいて発見された第一の生理的機能は、植物成長の阻害であり、これは１９７１年に発見された（Ａｌｄｒｉｄｇｅ， Ｄ． Ｃ．ら、Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１６２３ １６２７（１９７１））。その時以来、ジャスモネートは、生物的および非生物的ストレスに対する応答として、および同じく植物発生時の特異的発生過程のシグナルとして、様々な植物における改変された遺伝子発現のシグナルとみなされた（Ｃｒｅｅｌｍａｎ， Ｒ． Ａ．およびＭｕｌｌｅｔ， Ｊ． Ｅ．、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、４８：３５５−３８１（１９９７）；Ｗａｓｔｅｒｎａｃｋ， Ｃ．およびＰａｒｔｈｉｅｒ， Ｂ．、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２：３０２−３０７（１９９７））。１９９０年にＦａｒｍｅｒおよびＲｙａｎより、ＪＡが、トマトの葉に対する植物捕食者（ｅａｔｅｒ）による攻撃の結果としての傷害誘導性シグナルカスケートの重要な中間産生物であることが発見された（Ｆａｒｍｅｒ， Ｅ． Ｅ．およびＲｙａｎ， Ｃ． Ａ．、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８７：７７１３−７７１６（１９９０））。ジャスモネートは、病原性感染症または非生物的ストレスの存在下における植物の多くの防御機構の引き金として同定された。プロテイナーゼインヒビターのような防御遺伝子の発現以外に、フィトアレキシン、アルカロイドおよび誘臭物質（ｓｍｅｌｌ ａｔｔｒａｃｔａｎｔ）の合成が、ＪＡに対する最も重要な反応であり、これはほとんどの場合、特異酵素のアップレギュレーションにより生じる（Ｅｌｌａｒｄ−Ｉｖｅｙ， Ｍ．およびＤｏｕｇｌａｓ， Ｃ． Ｊ．、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１２：１８３−１９２（１９９６）；Ｆｅｕｓｓｎｅｒ， Ｉ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、７：９４９−９５７（１９９５））。ジャスモネートに対する反応は、ジャスモネート非感受性変異体およびジャスモネート欠損変異体による、ジャスモネートが欠失したトランスジェニック植物による、または内在性ジャスモネートの増加による、および阻害試験による、特異遺伝子の改変された発現により特徴付けられた。ようやく最近になって、ＪＡ前駆体である１２−オキソフィトジエン酸（ＯＰＤＡ）がＪＡ反応の好ましいシグナルであることがわかった。発生過程において、花粉の成熟および播種生育は、ＪＡ−依存型である。
【０００３】
ＪＡの生合成は、オキシリピン生合成経路を介して生じ、これはリポキシゲナーゼにより触媒されるリノレン酸の１３位への分子酸素の取込みにより始まる。次に形成された脂肪酸過酸化物（１３（Ｓ）−ヒドロペルオキシ−９（Ｚ），１１（Ｅ），１５（Ｚ）−オクタデカトリエン酸、１３−ＨＰＯＴ）は、アレンオキシド合成酵素（ＡＯＳ）により脱水され、アレンオキシドを形成する（Ｈａｍｂｅｒｇ， Ｍ．およびＧａｒｄｎｅｒ， Ｈ． Ｗ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．、１１６５：１−１８（１９９２））。次にこのアレンオキシドは、アレンオキシドシクラーゼ（ＡＯＣ）により環化され、９（Ｓ），１３（Ｓ）−ＯＰＤＡを産生する。還元酵素により触媒された、環内の二重結合の還元後、β酸化が３回行われ、（＋）−７−ｉｓｏ−ＪＡ、例えば３（Ｒ），７（Ｓ）−ＪＡが産生される。著者のＶｉｃｋおよびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎは、１９８３年に同様の逆の生合成経路を提唱したが、ＯＰＤＡの産生は、単独酵素、いわゆるヒドロペルオキシドシクラーゼからの１３−ＨＰＯＴにより触媒されると推定された（Ｖｉｃｋ， Ｂ． Ａ．およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ， Ｄ． Ｃ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１１１：４７０−４７７（１９８３））。１９８８年に、Ｈａｍｂｅｒｇは、この段階が２種の酵素活性により進行することを示した。これらの酵素の一方は、膜結合活性を発揮しかつ後にＡＯＳとして特徴付けられ、これは、不安定なアレンオキシドの形成を触媒し、化学的加水分解により半減期２５秒と直ぐに分解しα−およびγ−ケトールならびにラセミ体ＯＰＤＡを産生する（図１）。これに関連して、ＯＰＤＡは、分解産物総量のわずかに１０〜１５％の量に相当し、かつシス異性体９（Ｓ）１３（Ｓ）および９（Ｒ）１３（Ｒ）からなるラセミ混合物である。
【０００４】
加えて、リポキシゲナーゼにより産生された産生物は、ジビニルエーテル合成酵素、還元酵素、ペルオキシゲナーゼおよびヒドロペルオキシドリアーゼにより転化される（Ｂｌｅｅ， Ｅ．、Ｐｒｏｇ． Ｌｉｐｉｄ． Ｒｅｓ．、３７：３３−７２（１９９８））。ＡＯＳによるこれらの反応機会および非特異的ケトール結合によって、ＡＯＣは、高度に特異的にジャスモネート合成を行う第一の酵素とみなすことができる。
【０００５】
今日までに、リポキシゲナーゼ、アレンオキシド合成酵素およびＯＰＤＡ還元酵素の多くの形が、植物からクローニングされ、生化学的に特徴決定され、かつそれらの生理的重要性に関して調べられている（Ｒｏｓａｈｌ， Ｓ．、Ｚ． Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．、５１ｃ：１２３−１３８（１９９６）：Ｓｏｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０：８５１９−８５２３（１９９３）；Ｌａｕｄｅｒｔ， Ｄ．およびＷｅｉｌｅｒ， Ｅ．Ｗ．、Ｐｌａｎｔ Ｊ．、１５：６７５−６８４（１９９８））。
【０００６】
本発明の目的は、ＪＡ生合成経路から、前述の立体異性体シス−（＋）−ＯＰＤＡを高度に特異的に産生するための手法を可能にするような、核酸およびそれらの断片を提供することである。
【０００７】
本発明に従って、この課題は、アレンオキシドシクラーゼの活性を持つタンパク質をコードし、かつ以下の配列から選択される配列を含む核酸により解決される：
ａ）　プローブによる植物遺伝子バンクのスクリーニングおよびアレンオキシドシクラーゼ陽性クローンの選択により、入手可能である核酸；
ｂ）　配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６から選択される配列を有するタンパク質をコードする核酸；
ｃ）　ｂ）に記載の核酸とハイブリダイズする核酸；
ｄ）　遺伝暗号の縮重を考慮し、ｂ）に記載の核酸とハイブリダイズする核酸；
ｅ）　１個または複数の塩基の置換、付加、逆位および／または欠失により得られる、ａ）からｄ）に記載の核酸の誘導体；
ｆ）　配列番号：１の核酸のコード領域と少なくとも５３％、好ましくは少なくとも７０％の同一性を有する核酸；
ｇ）　ａ）からｆ）の群の１つの核酸と相補的な核酸。
【０００８】
今回、本ＡＯＣクローンを使用し、ＪＡ生合成経路に関する集中的な生理学的研究を初めて行い、さらにバイオテクノロジー的手段によるＪＡおよびその誘導体を初めて産生することを可能にした。特異的ジャスモネート合成の限定された段階は、現在まで１２−オキソフィトジエン酸の（９Ｓ）（１３Ｓ）（シス（＋））立体異性体の特異的産生の可能性を欠いている。
【０００９】
「アレンオキシドシクラーゼ」とは、図１に示したような、基質１２，１３−ＥＯＴからのシス（＋）ＯＰＤＡの合成を触媒する酵素を意味する。
【００１０】
「プローブ」とは、遺伝子バンクの検索に適した核酸を意味する。しかしこの用語は、さらに発現産物アレンオキシドシクラーゼの存在を示すことができる作用物質、好ましくはタンパク質も意味すると理解される。これらは、とりわけ、抗アレンオキシドシクラーゼ抗体を含んでいる。
【００１１】
特定の核酸間の特異的「ハイブリダイゼーション」条件の決定は、技術的に可能な範囲内である。以下の条件下での、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６の配列から選択される配列、好ましくは配列番号：１に記載の配列を有するタンパク質の配列の１つとのハイブリダイゼーション、好ましくは少なくとも３０分間の、配列番号：１の配列との２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃でのハイブリダイゼーションが好ましい。若干よりストリンジェントな同様に好ましいハイブリダイゼーションは、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で行う。特に好ましいのは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（ＵＳＡ）により製造されるＥｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂ（商標）ハイブリダイゼーション溶液中でのハイブリダイゼーションであり、ハイブリダイゼーションは、６０℃で１８時間行われ、その後２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃、３０分間、引き続き１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃、３０分間洗浄される。
【００１２】
本発明に従って、発現「％同一な」は、例えばコンピュータを用いた配列比較のような、公知の方法により決定することができる核酸レベルの同一性を意味する（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ、Ｓ． Ｆ． Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０（１９９０））。
【００１３】
当業者には周知の発現「％同一性」は、配列間の一致により決定される、２個またはそれ以上の核酸分子の間の関連性（ｒｅｌａｔｅｄｎｅｓｓ）の程度と示される。「同一性」の割合（％）は、ギャップおよび他の配列の特徴を考慮した２種またはそれ以上の配列内の、同一領域の割合（％）から得られる。
【００１４】
関連した核酸分子の相互の同一性は、公知の方法により決定することができる。原則的に、特別な必要要件を考慮したアルゴリズムを備える特別なコンピュータプログラムが使用される。同一性を決定する好ましい方法は、最初に被験配列間の最大の一致を産生する。２種の配列間の同一性を決定するコンピュータプログラムは、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１２（１２）：３８７（１９８４）、遺伝子コンピューターグループ、ウィスコンシン大学、マディソン（ＷＩ））；ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら、Ｊ． Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３／４１０（１９９０））を含むＧＣＧプログラムパッケージを含むが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴ Ｘプログラムは、バイオテクノロジー情報国立センター（ＮＣＢＩ）および他の供給源（ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら、ＮＣＢ ＮＩＨ、ベセスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、ＭＤ ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ．ら、Ｊ． Ｍｏｌ．、２１５：４０３／４１０（１９９０））から入手することができる。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性の決定に使用することができる。
【００１５】
核酸配列比較のための好ましいパラメータは、以下を含む：
アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）
比較マトリックス：マッチ＝＋１０
ミスマッチ＝０
ギャップペナルティ：５０
ギャップ長ペナルティ：３
このＧＡＰプログラムはさらに、前述のパラメータと共に使用することが適している。前述のパラメータは、核酸配列比較のためのデフォルトのパラメータである。
【００１６】
ウィスコンシン（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パッケージ、Ｖｅｒ．９（１９９７年９月）のプログラムマニュアルに具体化されたものを含むその他の実験アルゴリズム、ギャップオープニングペナルティ、ギャップイクステンションペナルティ、比較マトリックスを使用することができる。この選択は、実施されるべき比較によって、ならびに比較が好ましいＧＡＰまたは「ベストフィット（ｂｅｓｔ ｆｉｔ）」により配列対の間で、および好ましいＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴにより配列および伸長配列データベースの間で、実施されるかどうかによっても決まる。
【００１７】
好ましい態様において、本発明の核酸は、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、好ましくは配列番号：２の配列に示された配列を伴うタンパク質をコードする。特異的配列由来のタンパク質変異体は、核酸配列の変化（１個または複数の塩基の置換、付加、逆位または欠失によるような）により、常法を用いて産生することができる。新たなタンパク質変異体が依然として望ましいアレンオキシドシクラーゼ活性を示すかどうかは、以下に詳述するような適当な酵素試験の助けを借りて容易に明らかにすることができる。
【００１８】
別の好ましい態様において、核酸はｃＤＮＡであるが、ゲノムＤＮＡも、アレンオキシドシクラーゼをコードする核酸として適している。
【００１９】
以下の表は、本発明の方法により配列番号：１の本発明のＤＮＡにより単離されたクローンの一覧を提供している。
2004506406.tif 000003
【００２０】
使用される核酸の本発明の断片は、これらを前述の核酸と特異的にハイブリダイズすることができる点を特徴としている。「特異的ハイブリダイゼーション」とは、この状況において、当業者は、断片がハイブリダイゼーション後にのみ前述の核酸によりシグナルを産生し、かつ同じく試料中に存在するその他の核酸とはシグナルを産生しないようなハイブリダイゼーション条件を選択することができることを意味している。このような断片は、ＰＣＲ手段による本発明の核酸の特異的増幅にも使用することができる。
【００２１】
別の好ましい態様において、宿主細胞におけるアレンオキシドシクラーゼの発現は、断片の助けを借りて阻害することができ、これは、例えばプロモーターに対するアンチセンス方向の断片により行うことが可能である。しかしセンス方向の断片によるアレンオキシドシクラーゼの発現の阻害も可能である。本発明の核酸を含む「構築体」は、前述の本発明の核酸および本発明の核酸が当然連結していないようなその他の核酸との組合せである。従って、構築体は、ＡＯＣコード配列を、例えば調節配列、ベクター配列または融合パートナーの配列と共に含む。特に好ましい構築体において、本発明の配列はプラスミド内に存在する。
【００２２】
本発明の核酸を含む本発明の宿主細胞は、これらが従ってその宿主型には存在しないようなコピー量／数の核酸を含むことを特徴としている。または、宿主細胞は、その野生型は本発明の核酸を含まないが核酸の組込み後にはそれを示すような細胞であることもできる。
【００２３】
本発明の核酸は、細菌、ならびに植物細胞、昆虫細胞を含む動物細胞、およびヒト細胞を含むいずれかの細胞に、通常の形質転換技術により導入することができる。
【００２４】
特に好ましいのは、本発明の核酸の植物細胞、例えば植物組織または植物器官への導入である。
【００２５】
好ましい態様において、宿主細胞または細胞ユニットは、ゲノムに組込まれた核酸を含む。原則として、組込み部位は、野生型が存在する場合に、これがアレンオキシドシクラーゼ遺伝子を含んでいるような位置ではないであろう。
【００２６】
当業者には周知の、核酸の発現を制御する適当なエレメントの制御下での本発明の配列の組込みが、大量かつ高純度のＡＯＣ［ｓｉｃ］で説明されている。宿主細胞からのタンパク質の発現および単離の技術は、当業者には周知である。
【００２７】
別の好ましい態様において、タンパク質は、アレンオキシドシクラーゼまたはそれらの断片を含む融合タンパク質、ならびに非アレンオキシドシクラーゼタンパク質配列である。好ましい融合パートナーは、ジャスモネート生合成経路において認められるような、アレンオキシド合成酵素および還元酵素由来の配列である。特に好ましいのは、完全長アレンオキシド合成酵素またはＯＰＤＡ還元酵素に結合した完全長アレンオキシドシクラーゼである。
【００２８】
本発明のタンパク質に対する抗体の産生は、当業者には周知である。本発明のタンパク質による宿主生物の免疫感作後の抗血清の採取およびポリクローナル抗体の産生が、これに関して考察されている。または、しかしモノクローナル抗体の産生にはハイブリドーマ技術も使用することができる。
【００２９】
現在、本発明の核酸の助けにより、新規トランスジェニック植物および植物の一部を、最初に形質転換された植物細胞からまさに再生される植物全体まで、出発植物細胞およびより複雑な植物組織に導入される本発明の核酸により、初めて産生することができる。これに必要な技術は、当業者は利用可能である。
【００３０】
植物またはその一部におけるアレンオキシドシクラーゼの活性も、本発明の核酸により影響され得る。植物または植物細胞におけるアレンオキシドシクラーゼ活性は、例えば強力なプロモーターを伴う核酸の導入により増大させることができる。この作用はさらに、アレンオキシドシクラーゼのコード配列のコピー数の増大によっても達成することができる。他方で、アレンオキシドシクラーゼ遺伝子の内在性発現は、本発明の核酸を、例えばプロモーターに対しアンチセンス方向で導入することにより、低下または完全に阻害することさえもできる。その後これは、対応する植物の一部におけるアレンオキシドシクラーゼ活性の低下につながる。
【００３１】
最後に、本発明の方法は、大量の代謝産物９，１３−シス−（＋）−１２−オキソフィトジエン酸の高度に選択的な産生を初めて可能にする。この代謝産物は、天然の鏡像異性体型で大量のジャスモン酸産生の本質的かつ決定的出発段階である。前駆体分子１２，１３−ＥＯＴからシス−（＋）−ＯＰＤＡを選択的に産生する可能性はなかったため、該代謝産物は、これまでは事実上入手できなかった。様々な代謝産物の混合物のみが入手可能であった。これらの代謝産物の混合物は、次に大量かつ高純度のジャスモネートの合成を阻害した。
【００３２】
ＡＯＣをコードする遺伝子は入手できるので、例えばα−リノレン酸からの大量かつ高純度のジャスモン酸産生のための全ての手段は、現在では当業者の自由裁量に任せられている。現在完全な生合成経路が、組換えＤＮＡ技術により宿主生物において完全に確立されている。大量のジャスモン酸のバイオテクノロジーによる産生を可能にする、現時点で決定的に重要な段階は、本発明の核酸の供給である。これは、さらなるジャスモン酸生合成のための出発材料として、高純度かつ大量の利用可能なシス−（＋）−ＯＰＤＡの産生を初めて可能にした。
【００３３】
本発明の核酸は同じく、改変された特徴を有する新規トランスジェニック作物の産生も可能にしている。この新規特徴は、植物の病原菌防御または病原菌耐性の増大を含む。植物材料中へ本発明の核酸を導入した後の、ＡＯＣの発現増大の結果として、病原体防御に関連した代謝産物の増加が生じる。植草動物に対する防御への備えの増加も、同じ方法でもたらすことができる。この作用は、植物材料における本発明の核酸の導入および発現後の増加した傷害反応の誘導を基にしている。本発明の核酸は、植物−益虫−害虫の相互作用を最適化することもできる。これは、特に誘引される植物にとって有害な昆虫の除去を補助する昆虫（三者栄養関係（ｔｒｉｔｒｏｐｈｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ））による、植物における改変された臭気放出スペクトルにつながるような、植物における本発明の核酸の発現を基にしている。さらに改変された植物によるバイオマス形成は、植物材料への本発明の核酸の導入により増大することができる。これは、本発明の核酸の発現に対する反応として根の菌根能力の最適化を基にしている。
【００３４】
さらに植物の炭水化物平衡は、本発明の核酸により修飾することができる。これは、ジャスモネートにより調節される同化分配（ａｓｓｉｍｉｌａｔｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）に関連した酵素（例えばインベルターゼ）を基にしている。従って改変されたジャスモネートレベルは、該酵素の活性を変更する。同化シフトは、この方法で実現され、貯蔵器官内の蓄積の増加および種子の熟成を可能にする。
【００３５】
最後に、窒素平衡は、特に本発明の核酸が栄養貯蔵器官において発現される場合に、本発明の核酸により修飾され得る。例えばダイズに存在するような栄養貯蔵タンパク質は、窒素およびタンパク質の貯蔵型を表している。これらのタンパク質の発現は、傷害およびジャスモネートにより誘導される。従って増大したジャスモネート産生により増大したＡＯＣ発現は、栄養貯蔵器官におけるタンパク質含量の増加をもたらす。
【００３６】
さらに、植物のＵＶ保護を、本発明の核酸の助けにより最適化することができる。アントシアン産生は、ジャスモネートにより誘導可能である。増大したＡＯＣ発現の結果としての、例えば表皮細胞における標的化された内在性ジャスモネートレベルの増加は、これらの細胞におけるアントシアン量の増加につながることがある。またアントシアンはＵＶ保護剤として知られている。従って、表皮組織中のアントシアン含量が増加した植物は、ＵＶストレスに対する感受性が低くなる。
【００３７】
さらに、花の花粉形成組織への本発明の核酸の導入による、雄性不稔の生成が可能である。核酸は、この状況において、調節エレメント下でアンチセンス方向で使用され、その結果ＡＯＣの内部発現が減少されることが好ましい。導入された核酸の組織特異的発現も、組織特異的プロモーターにより実現することができる。
【００３８】
最後に、植物における発生過程、特に花の発生も、本発明の核酸により改変することができる。花の発生において、α−リノレン酸は重要な役割を果たしている。α−リノレン酸は、花の花粉形成組織であるタペータム（ｔａｐｅｔｕｍ）中のジャスモン酸の前駆体であり、その点で不飽和脂肪酸のみを表している。α−リノレン酸産生における混乱を伴う変異体は、ジャスモネート欠失である。これらの変異体も、ジャスモネート非感受性変異体同様、雄性不稔を示す。このことから雄性不稔を示す株を、ＡＯＣ発現の低下を介してジャスモネート産生を阻害することにより産生することができる。花、例えばトマトの花は、特異的インベルターゼの高度の発現およびジャスモネート高含量を示すので、これらの花の特徴は、改変されたジャスモネート含量により影響を受け得る。
【００３９】
以下の実施例は、本発明を説明している。
【００４０】
ＡＯＣ遺伝子のゲノム解析
サザンブロット分析のために、トマトからのゲノムＤＮＡを、制限酵素ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＰｓｔＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶおよびＥｃｏＲＩＩで消化した（図５Ａ）。最初の２種の酵素による切断後、３本のバンドを検出した。これらの酵素は挿入断片中に２個の切断部位を示すので、トマトゲノムのＡＯＣは、いわゆる「単一コピー」遺伝子として存在すると推定することができる。この推定はさらに、その他の酵素による制限切断により得られたバンドパターンにより裏付けられた。ＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる制限切断の場合、２本のバンドが検出され、これらの酵素は各々ｃＤＮＡ挿入断片中１個の切断部位を示したのに対し、１本のみのバンドは、このｃＤＮＡ挿入断片においては制限切断部位を示さない最後の３種の酵素により検出された。切断の結果は図５Ａに示している。これらは、ＡＯＣについて２番染色体上の遺伝子位置が検出された（図５Ｂ）地図データに対応している。
【００４１】
ＡＯＣ発現の生理学
ＪＡの蓄積が、傷害反応におけるシグナル伝達鎖の重要な部分を形成することが幾度も示された。トマトにおいて、クロロプラスチドリポキシゲナーゼは、植物が傷を受けた場合にアップレギュレーションされるが、特異的クロロプラスチドリポキシゲナーゼによる同時抑制により阻害されるようなシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）植物は、傷を受けた後の傷害反応としてのＪＡ濃度の増加を示さなかった。加えて、生合成経路の２番目の酵素ＡＯＳの厳密な空間的および時間的調節は、シロイヌナズナにおける傷害反応時の、ＪＡの蓄積におけるＪＡ生合成に対応する酵素活性化の重要性を強調している。ＡＯＣは、「正確な」天然の立体異性体型が形成されるようなＪＡ生合成の段階を触媒する酵素であるので、ＡＯＣの発現が、傷を受けた後のＪＡ濃度の増加に寄与しているかどうかを知ることは興味深い。図６に示したように、トマト葉内のＡＯＣ ｍＲＮＡのレベルは、トマト葉の傷害後３０分間上昇する。最大誘導は、２時間後に認められ、かつ対照の量は８時間後に再度得られた。この知見は、傷害後に測定されたＪＡ量に密に関連しており、かつこれはさらに１時間後に増加する一過性の蓄積を示している。この知見は、トマト植物における傷害反応時のＪＡ濃度の調節における、ＡＯＣの重要な生理的機能を示している。
【００４２】
別のＡＯＣの極めて重要な機能は、花器官の発生に対する影響にあるように思われる。高度の発現が、めしべ組織、成熟花弁、赤色果実において、かつより少ない程度がおしべにおいて検出された。他方で、幼若な発生途中の芽においては発現は検出されなかった。シロイヌナズナ、ｃｏｉ１またはｆａｄ３−２ ｆａｄ７−２ ｆａｄ８変異体のようなＪＡシグナル伝達鎖が欠損している変異体は、雄性不稔を示す。これは、花発生におけるＪＡの重要性を示している。これは同じく、ＡＯＳ遺伝子（合成酵素遺伝子）がシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）の花器官において強力に発現されることも示し、このことはＪＡがおそらく花において合成されることを示唆している。維管束における、およびますます驚くべきことであるが、幼若なトマト花の胚珠における、ＡＯＣ遺伝子の組織特異的発現も、免疫細胞化学的分析によって示された。花の発生におけるＡＯＣおよびＪＡの役割は、本質的にＡＯＣ発現とＪＡレベルの上昇の間の厳密な関係を基にしている。ＪＡ生合成に関連したその他の酵素も、ＶｉｃｋおよびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎならびにＨａｍｂｅｒｇの知見により同定されている（Ｖｉｃｋ， Ｂ． Ａ．およびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ， Ｄ． Ｃ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１１１：４７０−４７７（１９８３）；Ｈａｍｂｅｒｇ， Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．、１５６：５４３−５５０（１９８８））。最近１０年間に、これらの酵素の特徴決定およびクローニングが良好に進行し、かつＬＯＸ（Ｒｏｓａｈｌ， Ｓ．、Ｚ． Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ．、５１ｃ：１２３−１３８（１９９６））、ＡＯＳ（Ｓｏｎｇ， Ｗ． Ｃ．およびＢｒａｓｈ， Ａ Ｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：７８１−７８４（１９９１）；Ｌａｕｄｅｒｔ， Ｄ．、Ｐｆａｎｎｓｃｈｍｉｄｔ， Ｕ．、Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ， Ｆ．、Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ−Ｃｚｙｔｋｏ， Ｈ．およびＷｅｉｌｅｒ， Ｅ． Ｗ．、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３１：３２３−３３５（１９９６））およびＯＰＤＡ還元酵素（Ｓｃｈａｌｌｅｒ， Ｆ．およびＷａｉｌｅｒ， Ｅ． Ｗ．、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７２：２８０６６−２８０７２（１９９７）；Ｂｉｅｓｇｅｎ， Ｃ．およびＷｅｉｌｅｒ， Ｅ． Ｗ．、Ｐｌａｎｔａ、２０８：１５５−１６３（１９９９））のクローンが、現在利用可能である。本発明において説明されているＡＯＣをコードするｃＤＮＡクローンの単離により、第一の生理学的活性を持つシクロペンテノンであるＯＰＤＡをもたらす全ての酵素が現在クローニングされている。加えてこの酵素は、シクロペンタノンの立体化学を確実に決定し、かつジャスモネートの生合成につながる可能性のあるオキシリピン生合成経路の１つの制御において、重要な役割を果たすので、特に重要であるように思われる。ＡＯＣクローンおよびその他の酵素を用い、ジャスモネート生合成経路に関するバイオテクノロジー的用途と共に、集中的に生理的研究を行うことが現在可能である。
【００４３】
植物材料
ＡＯＣをコードする遺伝子を同定するために、様々な材料を用いた。オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｖｕｌｇａｒｅ Ｌ．ｃｖ． Ｓａｌｏｍｅ）およびトマト（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｒｔｕｍ Ｍｉｌ． ｃｖ． Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）由来の植物材料を、温室条件下土壌において、光照明下１６時間（最小強度１３０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ）２５℃で栽培した。オオムギ植物の初生葉を、発芽の７日後に収穫し、長さ５ｃｍの切片に切断し、葉の先端から１ｃｍ下から測定した。これらの葉断片を、ペトリ皿で１ｍｏｌソルビトール溶液中でインキュベーションした。トマト植物は８週間栽培し、二次葉（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｌｅａｄ）を切断し、標準の市販の歯車で傷を付け、その後蒸留水中で連続白色光（強度１２０μｍ／ｍ２／ｓ）下でインキュベーションした。
【００４４】
内在性ＪＡおよびＯＰＤＡ量の分析
エステル化されていない１２−オキソ−ＰＤＡおよびリノレン酸の濃度を定量的に決定しかつ１２−オキソ−ＰＤＡの立体分析を行うために、トマト植物の無傷の葉（１５ｇ〜２０ｇ）またはあらかじめ傷を付けた葉（３ｇ〜５ｇ）を、出発材料として用いた。この組織を、液体窒素内で急速凍結し、次にエタノールで抽出した。重水素標識した１２−オキソ−ＰＤＡ（［２Ｈ５］−１２−オキソ−ＰＤＡ）および重水素標識したリノレン酸（［２Ｈ５］−リノレン酸）を、抽出物に少量添加した。次に１２−オキソ−ＰＤＡおよびリノレン酸の量を、質量スペクトル法により決定した。標識物質が添加されていない抽出物の残りの部分に、固相抽出を施し、かつＲＰ−ＨＰＬＣにより分離した。こうして単離された１２−オキソ−ＰＤＡは、立体分析に供した。ＪＡ量は、Ｋｒａｍｅｌｌらの論文（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．、４１４：ｐ１９７（１９９７））に記されたような方法で決定した。
【００４５】
酵素アッセイ法
ＡＯＳ活性は、総容量１ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．７）中で決定した。脂肪酸ヒドロペルオキシドを添加することにより反応を開始し、かつ吸収の減少を２３５ｎｍで測定した。トウモロコシのＡＯＳの反応速度論的パラメータを決定するために、反応の初速を、基質毎に５μｍ〜９０μｍの範囲の１４種の濃度について測定した。ＫｍおよびｖＭａｘ値は、ミカエリス−メンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ）の式を用いて直接算出し、イーディ−ホフスティー（Ｅａｄｉｅ−Ｈｏｆｓｔｅｅ）図に従いプロットした。
【００４６】
アレンオキシドの環化産生物の分析
脂肪酸ヒドロペルオキシド（１５０μｍ）を、リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．７）０．１ｍおよび硫酸アンモニウム／２０ｍｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中のＡＯＣ調製液２．５ｍｌ中のトウモロコシ種皮（ｓｅｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（０．５ｍｇタンパク質；基質として１３（Ｓ）−ＨＰＯＴを使用し、２８ ｎｃａｔ）の懸濁液０．５ｍｌと共に、０℃で１０分間攪拌した（総アッセイ容量：５ｍｌ）。トウモロコシおよびこのアッセイ法に追加したジャガイモのＡＯＣの活性は、ＲＰ−Ｒａｄｉｏ ＨＰＬＣを基にした方法により測定したところ、１７８ｎｍｏｌ ＰＤＡまたは１５６ｎｍｏｌ ＰＤＡと同等であった。ＡＯＣ溶液をリン酸カリウム緩衝液と交換した対照を並行して行った。インキュベーションを、１０ｍｌエタノールを添加して終了し、反応産生物を、ジエチルエーテルにより抽出し、メチル化し、かつＴＬＣに供した（溶媒系：酢酸エチル／トルエン１５：１８容量／容量）。バンドを、ＵＶ光下に置き、次に２−６−ジクロロフルオレセインを噴霧して可視化し、かつシクロペンテノン（１２−オキソ−ＰＤＡのメチルエステルおよびその相同体および類似体）バンドのＲｆ値を記録した。シクロペンテノンのメチルエステル、ヒドロキシ脂肪酸およびα−ケトールを基にしたバンドを含むシリカゲルの広幅ゾーンを掻取り、酢酸エチルで希釈した。この材料のアリコートを、トリメチルシリル化し、ＧＬＣおよびＧＣ−ＭＳにより分析した。材料の残りの部分を、シクロペンテノンの立体分析に使用した（Ｈａｍｂｅｒｇ， Ｍ．およびＦａｈｌｓｔａｄｉｕｓ， Ｐ．、Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．、２７６：ｐｐ５１８−５２６（１９９０）およびＨａｍｂｅｒｇ， Ｍ．ら、Ｌｉｐｉｄｓ、２３：ｐｐ５２１−５２４（１９８８）参照）。
【００４７】
アレンオキシドシクラーゼの過剰発現
開始コドンおよびヌクレオチド２３５位で始まる、前記クローンの５’−欠失体（ｖｅｒｓｉｏｎ）の両方を含む全体のコード領域（図２）を、ＰＣＲにより増幅し、各々、５’ＮｄｅＩ−および３’ＥｃｏＲＩ制限境界面（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）を提供し、かつ各々発現ベクターｐＪＣ２０およびｐＪＣ４０にクローニングした（ＣｌｏｓおよびＢｒａｎｄａｕ、Ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ．、５：ｐ１３３（１９９４））。得られたプラスミドを、細菌株ＢＬ２１ＤＥ３（ｐＬｙｓＳ）に形質転換した。ＬＢ培地中での細菌培養を、ＯＤ ６００ｎｍで測定した最大値が０．５となるまで行った。この細菌懸濁液を、１ｍＭ ＩＰＴＧにより４時間誘導し、その後遠心し、２回凍結融解サイクルに供し、次に２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．１％トゥイーン ２０および１０％グリセロール中で超音波により溶解した。さらに遠心した後、ＡＯＣ活性の測定にさらに上清を使用した。酵素活性は一方で、以下により詳細に説明した方法に従う放射能アッセイ法、およびＯＰＤＡの鏡像異性体組成の決定により測定した。ハイブリダイゼーション条件は以下であった：Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（ＵＳＡ）により製造されたＥｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂ（商標）ハイブリダイゼーション溶液の使用、６０℃で１８時間のハイブリダイゼーション、次に洗浄を２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５０℃で３０分間行い、引き続き１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで５０℃で３０分間行った。発現ベクターｐＪＣ４０により発現された組換えタンパク質を、Ｎｉ−ニトリロトリ酢酸アガロース（ＮｉＮＴＡ、Ｑｉａｇｅｎ社）上での親和性クロマトグラフィーにより精製した。このタンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により管理した。次に精製した組換えＡＯＣ酵素を使用し、ポリクローナルウサギ抗体を産生した。
【００４８】
ノーザンおよびサザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、Ｍａｎｉａｔｉｓら（「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ（１９８９））に従い、１回のトレースにつき１０μｇの総ＲＮＡで行った。得られたブロットを、完全長ｃＤＮＡ配列からなるトマトＡＯＣ−ｃＤＮＡクローンの放射標識した試料と６５℃で１６時間ハイブリダイズした（図２参照）。配列番号：１の配列との、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃での、好ましくは少なくとも３０分間のハイブリダイゼーションが好ましい。若干よりストリンジェントな、同様に好ましいハイブリダイゼーションを、１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で行った。特に好ましいハイブリダイゼーションは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社（ＵＳＡ）により製造されたＥｘｐｒｅｓｓ Ｈｙｂ（商標）ハイブリダイゼーション溶液を使用し、６０℃で１８時間ハイブリダイゼーションを行い、その後洗浄を、２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で１８時間、引き続き１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃で３０分間行うものである。試料の均一なゲル装填は、リボソームＲＮＡの臭化エチジウム染色により調節した。
【００４９】
サザンブロット分析については、ゲノムＤＮＡ １０μｇを指示された制限酵素により消化し、かつゲル電気泳動により分離した。ナイロン膜に真空下で移した後、ハイブリダイゼーションを先にノーザンブロットについて説明したように行った。
【００５０】
免疫細胞化学
幼若な葉の小片を、Ｈｕｓｅらの論文（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、３７：６４１−６４９（１９９６））に従い固定し、ＰＥＧ中に充填し、かつ切断した。厚さ２μｍの切片を、ウサギの抗ＡＯＣ抗体で処理した（１：２０００希釈）。ヤギの抗ウサギＩｇＧ抗体と共にさらにインキュベーションを行い、ＢＯＤＩＰＹ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、ユージーン、ＯＲ）と結合させた。免疫標識後、切片をＣｉｔｉｆｌｕｏｒ／グリセロール中でインキュベーションした。対照実験は、免疫化前の血清により行った。免疫−標識したＡＯＣ酵素の蛍光は、対応するフィルターの組合せを用いる、Ｚｅｉｓｓ「アキシオスコープ（Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ）」外部蛍光（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡により視認した。
【００５１】
ＡＯＣのクローニング
ＲＮＡを単離する目的で、内在性ＪＡ濃度が誘導を基に蓄積している組織を使用した。従って、オオムギのソルビトールでストレスを加えた葉（Ｌｅｈｍａｎｎら、Ｐｌａｎｔａ、１９７：１５６（１９９５））および傷つけたトマト葉（Ｐｅｎａ−Ｃｏｒｔｅｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ、４１０６（１９９５））を、さらなるＲＮＡ単離の出発材料として使用した。特異的ＰＣＲ産物は、オオムギについては得られなかったが、約９００ｂｐ断片サイズの弱いバンドを、傷ついたトマト葉からのＲＮＡによるＲＴ−ＰＣＲに従い増幅した。このＰＣＲ産物を、トマトｃＤＮＡバンクの検索のためのプローブとして使用し、これは１ｋｂの大きさのｃＤＮＡクローンの単離をもたらした。このサイズはおおまかに、ノーザンブロット分析で検出されたシグナルの大きさに相当している。このことにより、この単離は完全長クローンに関連していることが結論付けられた。最初の開始コドンは４７位に位置し、かつこれは１６位の停止コドンに先行されている。タンパク質−コード領域は、アミノ酸２４４個のタンパク質をコードする７３２ｂｐを含み、計算上の分子量２６ｋＤａである（図２）。トマトから誘導したタンパク質の分子量についておよそ４ｋＤａの逸脱が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により決定され、かつこれは少なくとも一部は、トマトタンパク質のＮ末端のアミノ酸の翻訳後除去の結果であろう。
【００５２】
ＡＯＣの過剰発現
ＡＯＣタンパク質として説明された核酸によりコードされた、本発明において説明されたタンパク質を同定するために、ＡＯＣ活性を測定する過剰発現実験を行った。まず最初に、発現ベクターｐＪＣ２０中のメチオニン開始コドンを伴わない全コード領域をクローニングし、かつさらなる精製のためにヒスチジン尾部を持つベクターｐＪＣ４０に導入した。存在しないメチオニンを、５’Ｎｄｅｌ制限切断境界面により補充した。ＩＰＴＧによる誘導後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に、組換えタンパク質の弱い発現のみを認めた。しかし、ヒスチジン尾部を持つタンパク質のカラムクロマトグラフィー精製（ＮｉＮＴＡ）後には、ほぼ２６ｋＤａのバンドを検出した。しかし、細菌の生抽出物もこの精製されたタンパク質も、ＡＯＣ活性を示さなかった。トマトからの完全長クローンにおける酵素活性の欠如は、細菌における偽翻訳後修飾の結果でありうる。この可能性についてさらに調べるために、アミノ酸ラジカル６４で始まる切断型タンパク質をコードするトマト配列の断片を増幅した。ここでもまた、開始コドンを、Ｎｄｅｌ制限切断境界面により補充した。対応する細菌の誘導後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を行い、２２ｋＤａに透明なバンドを検出したが、これは空ベクターによってのみ形質転換された対照細菌においては検出されなかった（図３）。同じバンドは誘導していない細菌においても検出したが、これは誘導分子が存在しない細菌発現システムの不適切な抑制に起因するものであると考えられる。その後細菌抽出物を、ＡＯＣ活性について分析した。以下に示す表１に示したように、対照細菌において活性は検出されなかったが、誘導された形質転換細菌においてはほぼ１５０００ｎＭｏｌのＯＰＤＡ／ｍｇタンパク質といった高レベルの特異的活性が検出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのタンパク質試料について予想されるように、誘導されない細菌もＡＯＣ活性を示した；しかし、これは誘導された細菌の１０分の１であった。組換えタンパク質のＡＯＣ活性は、プロテイナーゼＫ消化に対し感受性があり、かつ特異的ＡＯＣインヒビターである１２，１３−エポキシオクタデセン酸により阻害されることが可能であり、このことはさらに組換えタンパク質の特異性を裏付けた。ＡＯＣ反応の特異的特徴は、不安定なアレンオキシド基質の化学開裂の間の競合反応であり、これはＯＰＤＡのラセミ混合物を生じ、かつ鏡像異性体ＯＰＤＡへの酵素的転換をもたらす。結果として、特異的鏡像異性体９（Ｓ），１３（Ｓ）−ＯＰＤＡが形成されかつ検出された場合にのみ、タンパク質をＡＯＣとして最終的に同定することができる。
【００５３】
反応産生物の立体分析により、この組換えタンパク質は、事実上、該ＯＰＤＡの９（Ｓ），１３（Ｓ）鏡像異性体のみを形成したことを明らかにした。プロテイナーゼＫの消化および１２，１３−エポキシオクタデセン酸の付加を行うことにより、このＯＰＤＡ鏡像異性体の濃度が低下し、これはまた、不安定なアレンオキシドの化学的開裂後にも観察された。全般的に見て、ＡＯＣ活性測定値の結果は、トマトから単離されたクローンはＡＯＣをコードすることを示した。興味深いことに、ヒスチジン尾部を持つＮ末端タンパク質の特異的活性は、同様に分析されたヒスチジン尾部を伴わないタンパク質の活性の約２０分の１であった。切断型タンパク質のみが高レベルの活性を示すという知見と考え合わせると、おそらくＮ末端の追加のアミノ酸は該タンパク質二量体の形成を妨害する可能性が高いと思われる。
【００５４】
ＡＯＣの細胞内局在
オキシリピン生合成経路のほとんどの酵素は、葉緑体に局在していることが報告されている。オオムギから（Ｖｏｒｏｓら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２５１：３６（１９９８））、シロイヌナズナから（Ｂｅｌｌら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６７５（１９９５））およびトマトから（Ｈｅｉｔｚら、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１４：ｐ１０８５（１９９７））クローニングされたＬＯＸのＮ末端アミノ酸配列分析ならびに同じく葉緑体において一部実行された重要な研究は、推定されるクロロプラスチドシグナルペプチドの存在および機能の両方を示した。亜麻から（Ｓｏｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ、９０：ｐ８５１９（１９９３））およびシロイヌナズナから（Ｌａｕｄｅｒｔら、Ｐｌａｎｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、３１：ｐ３２３（１９９６））のＡＯＳも、クロロプラスチドシグナルペプチドの可能性を示し、かつオオムギからのＡＯＳ同様に、葉緑体と共に精製した。ＬＯＸ、ヒドロペルオキシドリアーゼ、およびＡＯＳの酵素活性は、葉緑体の包膜（ｏｕｔｅｒ ｃｏａｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ）の生化学的データにより検出した（ＢｌｅｅおよびＪｏｙａｒｄ、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１１０：４４５（１９９６））。ＡＯＳおよびＬＯＸの場合、それらのクロロプラスチドの位置も、免疫細胞化学的に確認された。トマトからのＡＯＣのＮ末端領域の研究も、クロロプラスチドシグナルペプチドに関する追加の構造的データをもたらした。これは、セリン残基が豊富であり（最初の５０個のアミノ酸の２６％）、メチオニンの開始コドンにアラニン残基が続き、かつ最初の１０個のアミノ酸は帯電したアミノ酸残基を有さない。Ｃｈｌｏｒｏｐ Ｖ１．１プログラムを使用する最初の１００個のアミノ酸のコンピュータ解析は、９３位と９４位の間に推定開裂部位を有するタンパク質における可能性のあるクロロプラスチド局在を生じた。しかし、この推定開裂部位は、非常に似ていない様々な領域（ｇｒｏｕｎｄ）にある。その他の誘導された可能性のある開裂部位は、４１位、５３位および６０位のアミノ酸残基を表していると考えられる。ＡＯＣの位置を実験的に決定するために、組換えＡＯＣに対する抗体による免疫細胞化学的実験を行った。トマト葉の断面を、この目的のためにこの抗体と共にインキュベーションし、葉緑体中に顕著な蛍光が示された（図４）。葉緑体の自己蛍光は、一次抗体で処理しなかった組織断面に示された。このことにより、ＡＯＣはクロロプラスチドタンパク質であることを示した配列分析から得られたデータを確認される。葉緑体の包膜に位置するＡＯＳとは異なり、ＡＯＣは可溶性タンパク質である。この基質は高度に不安定であるので、９（Ｓ），１３（Ｓ）−ＯＰＤＡへの十分な基質転換を確実にするために、ＡＯＣはＡＯＳ近傍に位置すると仮定することは妥当であるように思われる。加えて、ケトールもラセミ体ＯＰＤＡも今のところ植物においては検出されておらず、このことはアレンオキシドの化学的崩壊はインビボにおいては生じないことを示唆している。この点をさらに調べるために、トマト葉の内在性１２−オキソ−ＰＤＡの量および立体配置を決定した。無傷の葉を用いる代��的実験において、エステル化されていない１２−オキソ−ＰＤＡおよびリノレン酸の濃度は、各々、２ｎｇ／ｇおよび２０６ｎｇ／ｇ生重量と決定された。立体分析は、ＯＰＤＡ量が事実上完全に（＞９９％）、天然の９（Ｓ），１３（Ｓ）鏡像異性体から生じることを明らかにした。ＯＰＤＡおよびリノレン酸の量は、機械的に組織を傷害後３０分および１８０分で、各々、１８７ｎｇ／ｇ（９０倍）および１８１３ｎｇ／ｇ（９倍）に上昇した。傷が誘導したＯＰＤＡの立体分析は、９（Ｓ），１３（Ｓ）立体異性体の独占的形成（＞９９％）を明らかにした。このことから、ＡＯＳおよびＡＯＣは、葉緑体において空間的に非常に接近して位置するか、またはさらに葉緑体において緩く会合しているかのいずれかであることが結論づけられるであろう。
【００５５】
ＡＯＣ酵素活性の測定
反応バッチは、７ｎｃａｔのＡＯＳ活性を伴う、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中に再懸濁された分析された組織ホモジネートのペレット１００，０００ｇおよび試験されるべき試料からなる。この容量を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）により６２５μｌとし、および酵素反応を、１０ｍＭ［１−１４Ｃ］１３（Ｓ）−ＨＰＯＴ（最終濃度４１μＭ；０．８３ｋＢｑ［０．０２２μＣｉ］）２．６μｌの添加により開始した。このバッチを、氷上で１０分間インキュベーションした。この反応を、７５０μｌ ＭｅＯＨを添加することにより停止し、反応混合液を２Ｎ ＨＣｌで酸性とし、かつ産生物をジエチルエーテル４ｍｌにより抽出した。有機相を蒸発させ、残渣を１１０μｌのアセトニトリル／Ｈ２Ｏ／ＨＯＡｃ（５５／４５／０．０２容量／容量／容量）中に吸収させた。反応産生物を、Ｅｕｒｏｓｐｈｅｒ １００ Ｃ１８カラム（５μｍ、２００ｘ４．６ｍｍ；Ｋｎａｕｅｒ社、ベルリン）において、流量１ｍｌ／分で定組成ＨＰＬＣ分離した（アセトニトリル／Ｈ２Ｏ／ＨＯＡｃ　５５／４５／０．０２容量／容量／容量）。この産生物の定量を、固相シンチレーター（ケイ酸イットリウム０．４ｍｌ、ＲＳＭ １００ Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｙ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ａｎａｌｙｓｅｒ、Ｒａｙｔｅｓｔ Ｉｓｏｔｏｐｅｎｍｅｒｓｇｅｒａｔｅ ＧｍｂＨ、ストラスブルグ）に充填されたフローセルによる放射能測定により行った。ＯＰＤＡ量を、最初にクロマトグラム上に現れたα−ケトールのピーク面積と比較し、および二番目に全てのピーク面積の合計と比較し、かつＡＯＣ活性は以下の式により算出した：
【数１】
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式中、「Ｘ」は、試験に使用したヒドロペルオキシド量（ｍｍｏｌ）であり、および「合計」は、クロマトグラム上に現れた全てのピークの合計を表す。この式の結果、酵素により産生されたＯＰＤＡ量、およびその結果としてのユニットでのＡＯＣ活性の値［ｎｍｏｌ ＯＰＤＡ］を得た。
【００５６】
ＯＰＤＡの異性体および鏡像異性体の組成を決定するために、ＡＯＣ酵素試験を非放射性に標識した１３（Ｓ）−ＨＰＯＴにより行った。ＯＲＤＡのシス／トランス異性体比を決定するために、メチル化反応産生物を、ＳＰＢ−１カラム上のＧＣ（３０ｍ、０．２５ｍｍ、被覆厚０．２５μｍ；Ｓｕｐｌｅｃｏ社、ダイセンホーフェン）により分離した。注入温度は１００℃であり、これを１５℃／分で１７５℃まで上昇させた。１７５℃で２分経過後、温度を、２．５℃／分で２３０℃へ上昇させた。
【００５７】
ＯＰＤＡの鏡像異性体比を決定するために、抽出した反応産生物を、最初に１９０℃で１０分間加熱し、かつエーテル性ジアゾメタン１ｍｌの添加によりメチルエステルに転化した。メチル化産生物の分離は、Ｍｅｇａｄｅｘ−５ ＧＣカラム（１２ｍ、０．２５ｍｍ、被覆厚０．２５μｍ）上の、ＨＰ ６８９０ ＧＯシステム（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ社）により、ヘリウム流量２ｍｌ／分で行った。注入温度は１５０℃であり、これを最初の１５分間一定に維持し、その後１℃／分で２００℃へ上昇した。
【００５８】
【表１】組換えＡＯＣにより得られたＯＰＤＡのＡＯＣ活性および組成
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【図面の簡単な説明】
【図１】ジャスモネート生合成の概略を示す。
【図２】トマトのアレンオキシドシクラーゼｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列およびそれに由来するアミノ酸配列を示す。太線で印刷した矢印は、ＲＴ−ＰＣＲに使用した配列を示す。破線矢印は、過剰発現アッセイ法において使用されたアレンオキシドシクラーゼの切断型をコードする、断片の増幅に使用した配列を示す。コンピュータプログラムＣｈｌｏｒｏＰ Ｖ１．１を用いて推定したクロロプラスチドシグナルペプチドの推定制限境界面は、二重下線で示した。
【図３】翻訳が６４位のアミノ酸ラジカルで始まる細菌における、切断型トマトＡＯＣタンパク質の過剰発現を示している。対応する部分的ｃＤＮＡを、ベクターｐＪＣ２０でサブクローニングし、かつタンパク質の精製のためにヒスチジン尾部を持つベクターｐＪＣ４０でクローニングした。トランスフェクションには、Ｅ． ｃｏｉｌ株ＢＬ２１ＤＥ３（ｐＬｙｓＳ）を用いた。ＩＰＴＧ存在下（＋）または非存在下（−）のいずれかにおいて、ベクターｐＪＣ４０単独で形質転換された細菌の抽出物、および部分的ＡＯＣ−ｃＤＮＡ（ベクターｐＪＣ４０内）で形質転換された細菌の抽出物の両方を誘導し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動により分離した。このゲルは、クーマシーブルー（Ａ）で染色するか、または対応するブロットを抗ＡＯＣ抗体（Ｂ）で標本化した。矢印は、ＡＯＣタンパク質を示している。
【図４】免疫細胞化学的同定後の、トマトの葉中のＡＯＣタンパク質を示している。葉の断面を、５０μｍｏｌ ＪＡＭＥ中で２４時間インキュベーションし、免疫化前血清（Ａ）、または精製されたトマトの組換えＡＯＣタンパク質に対する抗ＡＯＣ抗体（Ｂ）のいずれかにより処理し、引き続きＢＯＤＩＰＹ標識された二次抗体による第二の処理を行った。免疫化前血清による処理後の黄色−褐色の自己蛍光（ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）とは異なり、Ｂの葉緑体において発生される透明な蛍光は、ＡＯＣタンパク質の存在を示した。非蛍光領域としてＢにおいて視認可能な葉緑体中のデンプン粒は、微分干渉コントラクト（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｎｔｒａｃｔ）（著作権）により視認することができた。スケールはμｍで示す。
【図５】トマトからのゲノムＤＮＡのサザンブロット分析（Ａ）およびＡＯＣ遺伝子座のＲＦＬＰ分析（Ｂ）を示している。様々な制限酵素による切断は、単一コピーとしてＡＯＣ遺伝子が存在することを示している。
【図６】傷がついたトマト葉におけるＡＯＣ−ｍＲＮＡの蓄積のノーザンブロット分析を示している。トレース毎に、総ＲＮＡ １０μｇを装填した。これらは、実験開始後異なる時点で回収した、無傷（水）または傷ついた葉に由来している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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