(57)【要約】卵１個当たり適当な投与レベルでの、生弱毒化ＴＲＴＶ株のインオボ投与にて、許容される安全性および効率的な態様を有し、かつさらに、常套に投与されたワクチンよりもワクチン予防された鳥においてより高い力価値を提供する、有効かつ効率的なワクチン予防を提供するための、七面鳥の鼻気管炎ウイルスおよび／またはＴＲＴもしくはＳＨＳ呼吸困難から鳥類宿主（七面鳥およびニワトリなど）を保護するための方法および組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約１０３.２ＴＣＩＤ５０/卵〜約１０４.５ＴＣＤＩ５０/卵の範囲にある、免疫原的有効量の七面鳥鼻気管炎ウイルスの生弱毒化株を含むワクチンを、鳥類宿主の胚を含有する受精卵にインオボにて投与することを含むＴＲＴおよび／またはＴＲＴもしくはＳＨＳ関連呼吸困難から鳥類を保護する方法であって、該ワクチンをインキュベーション第２４日またはそれ以前に投与するところの方法。
【請求項２】
免疫原的有効量が、約０.０５〜０.１ｍｌ／卵の適当なビヒクルにて投与されるものである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
免疫原的有効量が約１０３.２ＴＣＩＤ５０/卵である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
免疫原的有効量が約１０４.２ＴＣＩＤ５０/卵である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
鳥類の宿主が七面鳥またはニワトリの胚である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
投与を、インキュベーション第１８日（ニワトリ）あたりまたはインキュベーション第２４日（七面鳥）あたりで行う、請求項５記載の方法。
【請求項７】
鳥類の宿主が七面鳥の胚またはニワトリの胚である、請求項３記載の方法。
【請求項８】
鳥類の宿主が七面鳥の胚である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
鳥類の宿主がニワトリの胚である、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
七面鳥の鼻気管炎ウイルス毒性株への暴露から七面鳥およびニワトリを保護する方法であって、卵１個当たり、免疫原的有効量の生弱毒化株の七面鳥鼻気管炎ウイルスを含むワクチンを受精卵にインオボにて投与し、その投与が孵化する卵の百分率を約２％未満で減少させることを含む方法。
【請求項１１】
免疫原的有効量が約１０３.２ＴＣＩＤ５０/卵〜約１０４.２ＴＣＩＤ５０/卵の範囲内である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
毒性七面鳥鼻気管炎ウイルスに対する暴露から七面鳥および／またはニワトリを保護するための、卵１個当たり、約１０３.２ＴＣＩＤ５０/卵〜約１０４.２ＴＣＩＤ５０/卵の免疫原的有効量にて七面鳥鼻気管炎ウイルスの生減毒化株を含む緩衝溶液を含んでいるところのインオボワクチン。
【請求項１３】
免疫原的有効量が、毒性七面鳥鼻気管炎ウイルスに対する七面鳥および／またはニワトリのその後の孵化後の暴露に対して有効であり、および、インキュベーション期間終了と同時に孵化するインオボワクチン予防七面鳥および／またはニワトリ卵の百分率に実質上の低下を生じない、請求項１１記載のワクチン。
【請求項１４】
免疫原的有効量が約１０４.２ＴＣＩＤ５０である、請求項１３記載のワクチン。
【請求項１５】
七面鳥の鼻気管炎に対して家禽を予防接種するための方法であって、医薬上許容されるキャリア中約１０３.２ＴＣＩＤ５０/卵〜約１０４.２ＴＣＩＤ５０/卵の範囲内の、ＴＲＴウイルスの生減毒化株の免疫原的有効量をインオボ投与することを含む方法。
【請求項１６】
ＴＲＴと共に、ニューカッスル病ワクチンおよび伝染性気管支炎ワクチンから成る群から選択される少なくとも一つの他のワクチンを投与することをさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
伝染性気管支炎ワクチンおよびマレック病ワクチンから成る群から選択される少なくとも一つの他のワクチンを投与することをさらに含む請求項１６記載の方法であって、該ワクチンをインオボ後に投与するものであるところの方法。
【請求項１８】
インオボ後のワクチンが約１日齡にて投与されるものである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
孵化する卵の数に実質上の低下を生じない、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
孵化する卵の百分率に約５％未満の低下を生じる、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
孵化する卵の百分率に約１％未満の低下を生じる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
減毒化したＴＲＴＶ抗原のインオボワクチンを処方すること、次いで該ワクチンを、約０.０５〜０.１ｍＬ/卵のビヒクル内約１０３.２〜約１０４.５/卵の範囲にてＴＣＩＤ５０を提供するように投与することを含む、ＴＲＴＶに対して高まった力価を提供する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０００年１１月２１日に出願され、その全内容を出典明示により組み込む、共に係属中の仮出願出願番号６０／２５２１６２からの優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、七面鳥の鼻気管炎（ＴＲＴ）および／または七面鳥およびニワトリなどの鳥類の宿主における「頭部腫脹症候群」（ＳＨＳ）に対するインオボ保護を提供するのに有用な方法を指向する。より詳細には、ＴＲＴに対するワクチンが、本明細書に開示するような鳥類の宿主に対する適当なインオボ投与に際し、安全かつ有効であることがわかった。
【背景技術】
【０００３】
ＴＲＴは、呼吸ウイルスにより引き起こされる七面鳥の上気道感染である。それは全年齢の七面鳥を冒す高い感染性の急性疾患である。ＴＲＴ感染の臨床症状には、特徴的な、しばしば泡状の鼻漏、ラッセル、スニッキング(snicking)、くしゃみ、および首振り(head shaking)が含まれる。眼やにまたは眼窩下洞腫脹(swollen infraorbital sinuses)も、感染した七面鳥において認められ得る。
【０００４】
ＴＲＴウイルス（ＴＲＴＶ）に対する抗体は、頭部腫脹症候群（ＳＨＳ）に冒されているいくらかのニワトリの群れ（ブロイラーおよびブロイラー／ブリーダーの両方）において検出されている。ＴＲＴＶは、ＳＨＳおよび関連する呼吸器疾患の病因において役割を果たすと仮定されている。
【０００５】
ＴＲＴに対する市場入手可能なワクチンは、インオボ投与されていない。むしろ、それらは種々の形式で孵化後に投与される。典型的には、そのようなワクチンは、噴霧器（例えば、手動噴霧器、背負い噴霧器、または自動噴霧器）という労力を要する方法により、または滴薬（眼または鼻）にて投与される。
以下により完全に記載するような、インオボ使用のために変更された、ＴＲＴワクチンを用いるインオボ投与法により、現在利用できる投与の、不便でかつ時間を消費する孵化後の方法よりも際立った利益が提供される。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、本発明のインオボ投与法に適合した市場入手可能なＴＲＴワクチンを用いる。実験結果により、七面鳥およびニワトリに対するこれらのワクチンのインオボ投与の安全性および有効性が、適当な投与パラメーターを用いて確証される。
本発明の方法を用いて、そのようなワクチンのインオボ投与により、ＴＲＴ、および／またはＴＲＴもしくはＳＨＳ関連呼吸器疾患から、鳥類の宿主を保護することができる。
【０００７】
つまり、鳥の大群に用いるのに簡単かつ安価なインオボワクチン予防法を用いて、ＴＲＴおよび／またはＴＲＴもしくはＳＨＳ関連呼吸器疾患から鳥類宿主を保護する方法を提供することが、本発明の目的である。
さらに、孵化した鳥類宿主において適当な免疫反応を提供する投与量にてワクチンを用いて、孵化率に望ましくない影響を与えることなく、そのようなインオボワクチン予防を提供することが、本発明の目的である。
【０００８】
インオボ投与に適合させたＴＲＴワクチンを用いて、ＳＨＳ関連呼吸器疾患に対する保護を提供することが、本発明のいっそうさらなる目的である。
より少量のワクチン抗原を用いてコストを節約して、常套的にワクチン予防した鳥と比較してＴＲＴＶに対して高まった力価を提供する、ＴＲＴおよび／またはＴＲＴもしくはＳＨＳ呼吸器疾患に対して鳥類宿主をワクチン予防する方法を提供することが本発明のさらなる別の目的である。
【０００９】
本発明により、ＴＲＴＶに対して鳥類宿主をインオボで免疫化し、およびこうしてＴＲＴおよび／またはＴＲＴおよびＳＨＳ呼吸器疾患に対する保護を提供するための方法が提供される。本発明の方法に用いられるワクチンは、市場入手可能なＴＲＴワクチンから都合よく調製することができる。本発明における使用に特に適しているのは、市場入手可能な、Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, lowa or Weesp, The Netherlandsから入手可能なPoulvac(登録商標)TRTワクチンである。Poulvac(登録商標)TRTの市販製剤は、１回投与あたり１０３.２ＴＣＩＤ５０以上の力価を有する減毒化されたＴＲＴＶ、Ｋ株を含み、インオボ投与には認可または指定されていない。本願を通して、「ＴＣＩＤ５０」は５０％組織培養感染価を意味する。
【００１０】
典型的には、ワクチンは、約１０３.２〜約１０４.５の範囲のＴＣＩＤ５０を提供するように適当なビヒクル中に再懸濁し、そして免疫化される鳥類の種によって、卵あたり約０.０５〜０.１ｍｌの量で投与する。投与は手によるものでよいが、Embrex, Inc., North Carolinaから入手可能な装置のような市場入手可能な卵注入装置を用いることにより、より典型的かつ経済的に投与する。投与する正確な投与量は、ワクチンを送達する鳥類の種に依存するものであり、例えば、小さな鳥ほど必要とされる投与量は少ない。ワクチンの投与は典型的には、インキュベーションの第２４日において、またはそれ以前になすが（例えば、七面鳥）、他のインオボワクチン予防時間、例えばインキュベーション第１８日にてまたはそれ以前（例えばニワトリ）が本発明の範囲内である。
【００１１】
本発明のワクチンおよび方法が企図される鳥類の宿主には、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ガチョウ、チャボ、ウズラ、およびハトが含まれる。好ましい鳥類種は、ニワトリ、アヒルおよび七面鳥などの市場において重要な飼鳥類である。
ワクチン予防のインオボ法は、投与するのに安全かつ簡単であるのみならず、この方法で免疫化された鳥類宿主においてより高力価が認められることが、驚くべきことに見出された。
【００１２】
加えて、該ワクチンおよび投与法により、実質上同一の対照（非ワクチン予防）群と比較した場合に、インオボワクチン予防の後で孵化する卵の割合は実質上低下しない。好ましくは、この低下は対照群において孵化する割合に対して約１０％未満であり、およびより好ましくは約５％未満である。よりいっそう望ましいことには、約１−２％未満の低下である。いくらかの具体例において、本発明のワクチンおよび方法により、孵化する卵の割合が実質上増加し、時に、約１−２％だけまたはそれ以上まで増加する。つまり、該ワクチンは、ニワトリおよび七面鳥などの鳥類の種に投与するのに安全かつ有効である。
【００１３】
以下の実施例により、本発明の例証となる方法および技術を詳細に示す。材料および方法の両方の多くの変更が、本開示の目的および意図から離れることなくなされてよいことが当業者には明らかであろう。
【００１４】
実施例
実施例１−七面鳥におけるインオボ投与の安全性に関する試験
七面鳥の孵化用受精卵を、ＴＲＴＶに感染していないことが分かっており、そしてＴＲＴに対してこれまでにワクチン予防されていない親七面鳥の群から得た。これらの卵を無作為に２つの別個の群に割り当てた。
【００１５】
７６個の受精卵の第一群に、インキュベーション第２４日においてワクチンをインオボ投与した。インキュベーションの１日目は、第０日と見なす。卵はインキュベーション前約２−７日横たえる。Poulvac(登録商標)TRT（バッチTR015、有効期限１９９７年６月２４日、１０７.５ＴＣＩＤ５０の力価を保持している）を用いてインオボワクチンを調製した。市販製品の３つのバイアルをそれぞれ１０ｍｌの滅菌塩水に再懸濁し、０.１ｍｌ当たりのワクチンに関して１０５.５ＴＣＩＤ５０の力価を有する結果としての懸濁液を得る。混合／貯蔵した中身は、以後実施例１において「ＩＯＶ」と指定し直す。
【００１６】
インオボ投与は卵当たり、１０５.５ＴＣＩＤ５０の力価を保持している０.１ｍｌのＩＯＶを用い、７６個の受精卵のそれぞれの羊水に注入した。その後、これらの卵をすぐにインキュベーターに入れ（回転させない）、次いで隔離した檻の中で孵化させ、その中でそれらを飼育した。これらの卵/孵化したばかりの雛を、ワクチン予防した鳥と呼ぶ。
【００１７】
６６個の受精卵の第二群はワクチン予防せず、そして第二の隔離檻の中で同様の条件下に孵化させた。これらの卵／孵化したばかりの雛は、ネガティブ対照の鳥と呼ぶ。
【００１８】
ワクチン予防した鳥およびネガティブ対照の鳥の両方に関して、孵化は、インキュベーション第２７、第２８、および第２９日に記録された。表１は検査において認められた孵化能百分率を示す。孵化能に関して、本発明のインオボワクチン予防により、ネガティブ対照の卵の孵化の９２.４％に対してワクチン予防した卵の孵化に関して９３.４％にて優れた結果を得た。
【００１９】
【表１】
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【００２０】
孵化後、各群（即ち、ワクチン予防した鳥およびネガティブ対照の鳥）からの２５羽の雛を無作為に選択し、次いでそれぞれの隔離檻のそれぞれにおいて、剃毛に際して床の上に置いた。各群からの残りの鳥は間引いた。
各群内で、各鳥を毎日臨床症状に関して２１日間検査した。鼻の滲出液の存在を、くちばしを強く握ることにより評価した。臨床症状の重篤度を表２に従い得点付けした。
【００２１】
【表２】
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【００２２】
鳥の群のトータルの毎日のスコアを、その日の各鳥の個々のスコアを合わせることにより算定した。表３は、検査により認められた臨床徴候を表２の相対スコアリングシステムを用いて示すものである。
【００２３】
【表３】
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【００２４】
【表４】
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【００２５】
ネガティブ対照の鳥を同様に、いずれかの臨床徴候に関して検査したが、異常は全く認められなかった。すなわち、全て０のスコアを有した。
前記の観察の結果により、本発明のインオボワクチン予防法の安全性が確証される。６日齡の鳥に関する最高の平均スコア/鳥（即ち、０.３６）により、安全性に関する妥当な限界が提供され、そして、ＴＲＴの軽微な／穏やかな症状のみが示された。
【００２６】
血清学的分析も、卵を受け取った日後６１／２週の親の七面鳥群内の１０羽から採集した血液を集めることにより行った。血液を、さらに以下の鳥の４セットから回収した。：（ａ）１日齡の、２０羽のネガティブ対照の鳥から；（ｂ）２１日齡の、２１羽のネガティブ対照の鳥から；（ｃ）１日齡の、２０羽のワクチン予防した鳥から；および（ｄ）２１日齡の、２０羽のワクチン予防した鳥から。
【００２７】
個々の血液サンプルの血清学的分析は、ＴＲＴＶに対する抗体の力価を示した。この分析はＡ型抗原を用いる酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）法を用い、そして２ｌｏｇ力価として表した。検査において測定された２ｌｏｇ力価＞６.０の力価をポジティブとして採用した。検査において測定された力価の幾何学的平均（ＧＭ）および標準偏差（ＳＤ）も算定した。力価分析により以下の結果が確証された。親の七面鳥群は、ＴＲＴＶに感染していなかった[＞６.０のポジティブなカットオフ値との比較におけるＧＭ＝５.０４を参照されたい。]。１０羽の鳥の中で、１羽が７.７の高い力価を有した。さらに、１日齡のネガティブ対照の鳥およびワクチン予防した鳥のＧＭ力価はほとんど同一、即ちそれぞれ４.０５および４.０６であった。しかし、ワクチン予防した鳥の中の２羽は、ポジティブな力価を有した[７.１および８.１の力価−それぞれ＞６.０を参照されたい]。これに対して、ネガティブ対照の鳥の中で＞６.０の力価を有したものはいなかった。ネガティブ対照の鳥およびワクチン予防した鳥のＳＤは、それぞれ０.８２および１.４６であった。
【００２８】
２１日齡の血液サンプリング試験はさらに、検査において測定された力価に関して明らかな差を示した。ネガティブ対照の鳥に関して、ＧＭは３.５３へと低下し、およびＳＤは０.４６へと低下した。直接比較して、ワクチン予防した鳥に関して、ＧＭは１０.５３へと増加し、およびＳＤは０.８５へと増加した。従って、ワクチン予防した鳥はＴＲＴＶに対して非常に高まった力価を有した。
【００２９】
ワクチン予防した鳥において、２１日齡での血清反応は非常に高かった。この反応は、１日齡の鳥に関して同じ投与を（点眼ワクチン予防により）用いて典型的に遭遇した値よりもいっそう高かった。ＧＭ＝１０.５を有するＴＲＴＶ抗体力価は、通常、ＴＲＴＶの毒性株を用いた攻撃後にのみ認められる。比較のために、１０５.５のＴＣＩＤ５０Poulvac(登録商標)TRTでの、感染しやすい七面鳥の雛（１日齡）に対する点眼ワクチン予防を用いる２つの試験により、２１日齡で回収した血液サンプルに関して、それぞれ８.３および８.７の平均抗体力価を得た。
【００３０】
表４は、親七面鳥群、ネガティブ対照の鳥、およびワクチン予防した鳥の、この血清試験を支持するデータを示すものである。
【００３１】
【表５】
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【００３２】
【表６】
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【００３３】
つまり、本発明のＩＯＶの１０５.５ＴＣＩＤ５０にての七面鳥受精卵に対するインオボ投与（インキュベーション第２４日における）により、孵化能力および臨床徴候に関し、必要な安全性ならびに常套的に投与されたワクチンよりも高い免疫反応が提供される。
【００３４】
実施例２：ニワトリにおけるインオボ投与の安全性に関する試験
特定の、病原体を含まない（以下、「ＳＰＦ」）白色レグホン種の卵を市場入手した(Broekman Instituut BV, Someren, The Netherlands)。１２０個のＳＰＦ卵をインキュベーターに入れ、そしてインキュベーションの１８日後、卵を明かりにすかして調べた。これにより、５個の非受精卵を拒絶し、１１５個を適切とした。適切とした卵の１１５個の中で、１００個をインオボワクチン予防のために無作為に選択した。これらの１００個の卵を以下のように３つのグループに分けた。
【００３５】
グループ１の卵／孵化したばかりの雛を、数を記入した橙色の羽根で、同定のために標識付けした。グループ１は、３０個の卵から成り、これらは以下に記載するように、１０５.５ＴＣＩＤ５０の力価の卵当たりの算定投与量にてインオボにワクチンを受容した。
【００３６】
グループ２の卵／孵化したばかりの雛を、数を記入した緑色の羽根で、同定のために標識付けした。グループ２は、４０個の卵から成り、これらは以下に記載するように、グループ１の卵に対して注射したワクチンと等容積の塩水溶液をインオボに受容した。
【００３７】
グループ３の卵／孵化したばかりの雛は、標識付けしなかった。グループ３は、３０個の卵から成り、これらはインオボ投与を（ワクチンも塩水溶液もいずれも）全く受容しなかった。
【００３８】
羽根標識上の数は、雛がＴＲＴまたはＳＨＳいずれかの臨床徴候を示した場合にのみ用いた。
グループ１および２両方の雛は、それらが孵化した同じ動物室で飼育した。適当な条件（例えば、給餌、飲水、寝床の材料としての木くず、温度、相対湿度など）を維持した。
【００３９】
この実験のタイムスケジュールは以下のようであった。グループ１、２、および３の卵のインキュベーションの１日目をインキュベーション第０日と名づけた。ワクチンおよび塩水溶液それぞれの、グループ１およびグループ２の卵へのインオボ投与の日は、インキュベーション第１８日であった。算定孵化日は、インキュベーション第２１日に対応した。試験は、インキュベーション第４６日に相当する孵化後の日に行った。
【００４０】
インオボ投与のためのワクチンを調製するために、バイアル当たり２０００投与量を含む、Fort Dodge Animal Health in Fort Dodge, Iowa or Weesp, The Netherlandsから入手可能な市販ワクチン、Poulvac(登録商標)TRTを用いた。投与量当たりの基準に基き、このワクチンは１０４.２ＴＣＩＤ５０の力価を有した。このワクチンの１２個（１２）バイアルをリン酸緩衝塩水（以下、「ＰＢＳ」）中、ワクチンのバイアルあたり５ｍｌのＰＢＳを用いて再懸濁した。生じた内容物をよく混合し、そして保存した。再懸濁した材料は、１０５.５ＴＣＩＤ５０の算定力価と６０ｍｌのトータル容積を有した。このワクチンを、以下「ＩＯＶ」と呼ぶ。
【００４１】
インキュベーション第１８日に、ＩＯＶワクチンを、Embrex, Inc., North Carolinaからの市場入手可能なInovoject(登録商標)卵注射器を用いてインオボ注射にて、グループＩの卵に投与した。ＩＯＶの卵注射投与は、常套法に従い行った。同様の方法で、Bieffle Medital SpA, Italyからの市販塩水溶液、CLEAR-FLEX(登録商標)INFUSIEVLOESISTOFをグループ２の卵に投与した。
表５は、グループ１、２、および３内での卵の処置を示すものである。
【００４２】
【表７】
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【００４３】
グループ１、２、および３からの卵の孵化能百分率を、検査において観察および算定した。簡単に、以下の例外に注意した。脊椎披裂骨格異常（インオボワクチン予防のいずれの副作用の原因でもない）のために、グループ１からの２羽の雛を、それらが孵化した直後で、それらを同定している羽根標識で標識付けする前に、試験から外した。これらの２羽の雛は、グループ１の孵化能百分率から除外した。さらにグループ１からは、１羽の雛が足を損傷し、そしてそれに標識付けした後に試験から外した。この雛の死後の試験は、ＴＲＴの徴候も、いずれかの他の疾患のいずれの徴候も示さなかった。この１羽の雛は同様に、グループ１の算定される孵化能百分率から除外した。グループ２の卵/孵化したばかりの雛に関して、１羽の雛は、孵化後、同定羽根標識で標識付けする前に死んだ。この雛は、グループ２の算定孵化能百分率から同様に除外した。
【００４４】
計画したように、グループ１およびグループ２両方の孵化したばかりの雛を試験し、２５日の観察期間、検査した。この期間中、雛のいずれもＴＲＴまたはＳＨＳいずれの臨床徴候も示さなかった。グループ３の全３０個の卵が孵化した。それらが孵化した日に、全３０羽の雛を後に記載するような血液サンプリングおよびその後の分析のためにのために断頭した。
【００４５】
表６は、グループ１、２、および３のそれぞれに関して検査において認められた孵化能および死亡結果を示す。これらの結果により、本発明のインオボワクチン予防が、孵化能およびＴＲＴおよび／またはＳＨＳの臨床徴候の両方に関して安全であることが確証された。
【００４６】
【表８】
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【００４７】
グループ１（ワクチン）およびグループ２（塩水）両方からの雛の体重を第２５日に得た。グループ１の雛の平均体重は、２０９グラムで、２２.１の標準偏差を有した。グループ２の雛に関して、平均体重は２１７グラムで、２４.８の標準偏差を有した。グループ１および２の体重は、２−側面スチューデントｔ試験を用いて統計学的に決定されるように、有意には差がなかった（Ｐ＝０.１８）。これらの結果により、本発明のインオボワクチン予防が、生理的塩水溶液のインオボ注射にて得られるものと比較して、（産業上重要な）結果としての第２５日の体重を損なわないことが確証された。
【００４８】
グループ１、２、および３にて用いたＳＰＦ卵のＴＲＴに感染していない状態を確認するために、グループ３の卵が孵化した日に、雛を断頭により殺し、そして血液サンプルを回収し、次いで分析した。ＥＬＩＳＡ試験はＴＲＴＶに対するいずれの抗体も検出しなかったが、これにより、この試験で用いたＳＰＦ卵のＴＲＴ非感染状態が確認される。
本試験により、ＳＰＦのニワトリの卵に対するインオボワクチン予防が、孵化能、死亡率、ＴＲＴおよび／またはＳＨＳの臨床徴候、および第２５日の体重に関して安全であることが確証された。
【００４９】
実施例３：インオボＳＰＦニワトリワクチンの効能試験
本試験の目的は、１８日齡のニワトリ胚のインオボワクチン予防が、３または６週齡での毒攻撃後のＴＲＴおよび／またはＳＨＳ疾患を予防するのに有効かどうかを確認することであった。以下に確証するように、感染しやすい１８日齡のＳＰＦニワトリ受精卵の１０４.２ＴＣＩＤ５０でのインオボワクチン予防は安全であり、一方、１０３.２ＴＣＩＤ５０の投与量が、臨床疾患に対して有効である。
【００５０】
孵化用受精卵は、Whickham Laboratories, United Kindomから購入したＳＰＦの白色レグホン親群から得た。
Fort Dodge Animal Health in Fort Dodge, Iowa or Weesp, The Netherlandsから入手可能な市販のＴＲＴワクチン、Poulvac(登録商標)TRTを得た。本発明のインオボワクチンは、以下のようにこのPoulvac(登録商標)TRTから調製する。１０７.５ＴＣＩＤ５０の力価を保持している市販ワクチンの３つの（３）バイアルをそれぞれ４ｍｌの滅菌水に再懸濁し、次いでよく混合し、そして貯蔵した。ついで、０.４ｍｌをとり出し、次いで１９.６ｍｌの滅菌ＰＢＳに添加し、バイアル当たり２００ｍｌに等しい最終希釈および０.１ｍｌ当たり１０４.２ＴＣＩＤ５０のワクチンの力価を含んでいる結果としての懸濁液を得た。このワクチンを、２ｍｌを取り出し、そして１８ｍｌの滅菌ＰＢＳをそれに添加することにより希釈して、０.１ｍｌ当たり１０３.２ＴＣＩＤ５０の結果としての懸濁液を得た。
【００５１】
攻撃ウイルスは以下のように調製した。Dr. R. C. Jones at Liverpool University (U.K.)により単離されたＵＫ株ＢＵＴ８５４４からのＴＲＴＶを、気管の器官培養（以下、「ＴＯＣ」）にて２３回、雛にて１回継代し、再度単離し、次いで１回以上ＴＯＣ中で継代した。この攻撃ウイルスの力価は、ｍｌ当たり１０４.５ＴＣＩＤ５０であった。
【００５２】
インキュベーションの１８日後、７０個の受精卵の第１のセット（以下、「セット１」）を前記のように１０３.２ＴＣＩＤ５０を保持している０.１ｍｌの再構成したＴＲＴワクチンでインオボ接種した。７０個の卵の第２のセット（以下、「セット２」）を同様に、前記のように１０４.２ＴＣＩＤ５０を保持している０.１ｍｌの再構成したＴＲＴワクチンで予防接種した。卵をすぐにインキュベーターに入れ（回転はさせない）、そして、それらを檻の中で孵化させ、その中で飼育した。セット１および２の卵は同種の隔離檻の中で別々に飼育した。７０個の受精卵の第３のセットはインオボ投与を全く受けなかった（以下、「セット３」）。セット３は以下、ネガティブ対照の鳥と呼んだ。これらの卵を第３の檻の中で飼育した。
【００５３】
孵化はインキュベーション後の第２０、第２１、第２２および第２３日に記録された（第０日はインキュベーション１日目である）。孵化後、多くの鳥を１日齡で選択し、セット当たり５０羽の鳥を残した。セット１、２、および３に関して、検査において記録した孵化能百分率は、それぞれ、９１％、９４％、および９２％であった。これにより、１０３.２ＴＣＩＤ５０および１０４.２ＴＣＩＤ５０の力価でのインオボワクチン予防が孵化能に関して安全であったことが確証される。
【００５４】
３週齡にて、各ワクチン予防群（即ち、セット１および２）、およびネガティブ対照の鳥（即ち、セット３）からの１０羽の鳥を羽根にて標識付けし、次いで第４の隔離檻に移した。各鳥についで前記の攻撃ウイルスを、０.１ｍｌ中１０３.５ＴＣＩＤ５０の（毒性）ＴＲＴＶの投与量を含む点眼により投与した。６週齡にて、さらに１０羽の鳥を同様に、ＴＲＴＶの毒性株にて攻撃した。しかし、これらの鳥の増加した年齢のために、攻撃投与量は鳥当たりの基準において０.２ｍｌ中１０３.８ＴＣＩＤ５０（毒性）ＴＲＴＶに増した。
【００５５】
攻撃した鳥を、１４日間実験的にモニターし、その後、それらから採血し、次いで殺した。認められた徴候を、実施例１に用いたような表２の臨床スコアリングシステムを用いて記録した。鳥のグループのトータルの毎日スコアを、その日の各鳥の個々のスコアを合わせることにより算定した。累積スコアは、第３−第８日の平均毎日スコアの合計である。ｘ２試験を用いてデータを分析した。第３-８日からの２のワクチン予防グループ（セット１および２）において認められるトータルの臨床徴候を、３週および６週攻撃の両方に関して同日に（セット３）ポジティブ対照において認められたものと比較した。このモニタリングにより、以下の結果が確証された。
【００５６】
１０３.５ＴＣＩＤ５０の力価の毒性ＴＲＴＶ株での３週の攻撃に関して、セット３の非ワクチン予防対照の鳥の９０％が臨床徴候を示した。直接比較において、セット１および２のワクチン予防した鳥のより少ない割合が臨床徴候を示した。（卵当たり１０３.２ＴＣＩＤ５０の力価でワクチン予防した）セット１に関して、鳥の５０％のみが臨床徴候を示した。（卵当たり１０４.２ＴＣＩＤ５０の力価でワクチン予防した）セット２に関しては、鳥の３０％のみが臨床徴候を示した。セット３においては、１羽の鳥のみが臨床徴候を完全に示さなかった。これに対して、セット１からの５羽の鳥およびセット２からの７羽の鳥が臨床症状を全く示さなかった。
【００５７】
１０３.８ＴＣＩＤ５０の力価の毒性のＴＲＴＶ株での６週攻撃に関しては、セット３の非ワクチン予防対照鳥の８０％が臨床徴候を示した。直接比較にて、セット１およびセット２のワクチン予防鳥のより少ない割合が臨床徴候を示した。（卵当たり１０３.２ＴＣＩＤ５０の力価でワクチン予防した）セット１に関して、鳥の２０％のみが臨床徴候を示した。（卵当たり１０４.２ＴＣＩＤ５０の力価でワクチン予防した）セット２に関しては、鳥の１０％のみが臨床徴候を示した。
【００５８】
ｘ２統計学的分析により、６週攻撃に関して、鳥（セット１および２）のワクチン予防群の両方において検査において認められた臨床徴候が、セット３の非ワクチン予防ネガティブ対照の鳥において記録されたものよりも重篤度が有意に低いことが確証された（Ｐ＜０.０１を参照されたい）。
表７、８、および９は、それぞれ、３週攻撃、６週攻撃、および前記カイ二乗統計分析に対する結果を示すものである。
【００５９】
【表９】
2004536780.tif 000010
【００６０】
【表１０】
2004536780.tif 000011
【００６１】
【表１１】
2004536780.tif 000012
【００６２】
【表１２】
2004536780.tif 000013
【００６３】
【表１３】
2004536780.tif 000014
【００６４】
ＴＲＴの臨床徴候に関してセット１、２、および３の鳥をモニターすることに加えて、鳥を血清分析にも供したが、ここで個々の血液サンプルにおけるＴＲＴＶに値する抗体を、Ａ型抗原を用いるＥＬＩＳＡ法により決定し、そして２ｌｏｇ力価として表した。２ｌｏｇ力価＞６.０の抗体力価をポジティブとして採用した。結果を、非対データに関してスチューデントｔ−試験を用いて統計学的に分析した。表１０および１１は、３週攻撃および６週攻撃それぞれに関してセット１、２、および３の攻撃鳥を用いて得られた血清学的結果を示すものである。表１０および１１において、「ＰＣ」は攻撃後を意味し、「ＧＭ」は幾何学的平均を意味し、および「ＳＤ」は標準偏差を意味する。簡単には、全グループ（即ち、セット１、２、および３）は攻撃後７日で抗体力価に有意な上昇を、およびＰＣ１４日にて抗体力価に更なる上昇を示した。
【００６５】
【表１４】
2004536780.tif 000015
【００６６】
【表１５】
2004536780.tif 000016
【００６７】
【表１６】
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【００６８】
【表１７】
2004536780.tif 000018
【００６９】
同様の血清学的分析を、ＴＲＴＶの毒性株で攻撃しなかった全３グループ（即ち、セット１、２、および３）に関してさらに行った。１日齡〜８１／２週齡の対照の鳥（セット３）から、およびワクチン予防した鳥の２グループ（セット１および２）からの平均抗体力価を測定した。期待通り、対照の鳥の抗体力価は本試験を通して低いままであった。対照の鳥の力価を、同じ齡のワクチン予防した鳥のものと統計学的に比較した。表１２は、インオボ送達後に測定した平均抗体力価を示す。個々の結果は、表１２に示す実験結果を支持するのに利用できる（データは示していない）。表１２において、「ｎ」は鳥の数を意味し、そして「ＳＤ」は標準偏差を意味する。
【００７０】
【表１８】
2004536780.tif 000019
【００７１】
検査において得られた測定、結果、および対応する統計学的分析を含む実施例３の結果の分析は、ワクチンのより低い投与量（感染しやすい１８日齡のＳＰＦニワトリ受精卵に対してインオボ送達した１０３.２ＴＣＩＤ５０ＴＲＴＶ）が、それが６週齡におけるＴＲＴＶの毒性株での攻撃に対して有意な保護を提供する点で有効であったことを示す。３週齡においても保護が認められたが、鳥の数を考慮して、提供された保護に関して検査において認められた差は、有意なレベルにわずかに及ばなかった。卵当たり１０４.２ＴＣＩＤ５０のＴＲＴＶの増加したワクチン予防投与量にて（約１ｌｏｇ１０のオーダーの増加）、３週および６週攻撃に関して、ＴＲＴＶの毒性株への暴露に対して有意な保護が認められた。
【００７２】
Poulvac(登録商標)TRT由来のワクチンのインオボ投与は、ワクチン予防／予防接種鳥におけるＴＲＴＶ−特異的抗体の産生と明らかに関連した。この関連は、投与量依存性であることが明らかであった。インオボワクチンのより高投与量により、ネガティブ対照の鳥のものよりも有意に高いレベルへの、および６.０のカットオフ値のすぐ下のレベルへの、３週齡平均抗体力価に関する増加が引き起こされた。卵当たり１０４.２ＴＣＩＤ５０のより高投与量でのインオボワクチン予防に対する循環抗体反応は、時間の割合と共に増加するようであり、最大は、６週齡にて得られ、およびその後は、力価は８１／２週齡まで一定に留まった。
【００７３】
高ワクチン予防投与量に関して前に論じた結果と比較して、卵当たり１０３.２ＴＣＩＤ５０の低投与量を与えられた鳥は、ワクチン予防に対して遅延した抗体反応を経験するようである。力価は８１／２週齡にて増し始め、この時、対照の鳥の力価よりも有意に高いレベルに達した。この時（即ち、８１／２週）において、低ワクチン鳥（セット１）の力価は、３週齡の高ワクチン鳥（セット２）のものと同様のレベルであった。８１／２週を越す更なる時間の経過と共に、抗体力価は６.０を超すレベルへと増すようであった。
【００７４】
抗体力価とＴＲＴの臨床徴候の低下の間には関連があると考えられる。抗体力価が対照の鳥の力価よりも有意に高いが、６.０のポジティブなカットオフ値未満の鳥の各グループ分けにおいて、ＴＲＴの臨床徴候において認められた低下は統計学的に有意であった。
【００７５】
感染し易い１８日齡のＳＰＦニワトリ受精卵に対する、卵当たり少なくとも１０３.２ＴＣＩＤ５０〜卵当たり少なくとも１０４.２ＴＣＩＤ５０のおおよその範囲の投与量での、および特に卵当たり約１０４.２ＴＣＩＤ５０の投与量でのインオボワクチン予防は、ＴＲＴＶの毒性株での攻撃から通常期待される臨床症状に対して安全かつ有効であると考えられた。
【００７６】
実施例４：インオボ市販ニワトリワクチンの効能試験
本試験の目的は、市販のブロイラーの親群からのインキュベートした１８日齡のニワトリ受精卵のインオボワクチン予防が、４週または６週齡の毒性攻撃後のＴＲＴおよび／またはＳＨＳ疾患を予防するのに有効であるかどうかを確認することであった。以下に確証されるように、ＴＲＴＶ−抗体ポジティブ親からの感染しやすい１８日齡の受精卵の、卵当たり１０３.２ＴＣＩＤ５０にての、Puovac(登録商標)TRT由来のワクチンでのインオボワクチン予防は、臨床ライノ鼻気管炎疾患に対して有効である。
【００７７】
孵化用の受精卵を、１０週齡にて生ＴＲＴワクチンで、および１８週齡で死んだＴＲＴワクチンで前もってワクチン予防した３７週齡の市販のブロイラー親の群から得た。これらの卵は、Mossbank breeder flock, Marshall Agriculture, Whitburn, Scotlandから得た。
【００７８】
Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, Iowa or Weesp, The Netherlandsから入手可能な市販ＴＲＴワクチン、Poulvac(登録商標)TRTを用いて、本発明のインオボワクチンを調製した。１０７.５ＴＣＩＤ５０の力価を保持しているこの市販ワクチンの３つのバイアルをそれぞれ５ｍｌの滅菌水に再懸濁し、そして、内容物を十分に混合し、次いで保存した。ワクチンをさらに滅菌リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）に希釈し、０.１ｍｌ当たり１０３.２ＴＣＩＤ５０の結果としての懸濁液を得た。
【００７９】
攻撃ウイルスを以下のように調製した。ＵＫ株ＢＵＴ８５４４からのＴＲＴＶ（１２頁を参照されたい）を、気管の器官培養にて（以下、「ＴＯＣ」）２３回、雛において１回継代し、再度単離し、次いでもう一度ＴＯＣにて継代した。この攻撃ウイルスの力価はｍｌ当たり１０４.５ＴＣＩＤ５０であった。
【００８０】
インキュベーションの１８日後、５７個の受精卵を、前記のように１０３.２ＴＣＩＤ５０を保持している復元したＴＲＴワクチンの０.１ｍｌでインオボ接種した。卵をすぐにインキュベーター中に入れ（回転はさせない）、そして隔離檻にて孵化させ、その中で飼育した。孵化後、４０羽の鳥をインキュベーターから取りだし、そして毛剃りに際して床に置いた。
【００８１】
多くの受精卵（１１０）を、ワクチン予防／予防接種をせず、および放置して別個に孵化させた。孵化翌日、４０羽の鳥をネガティブ対照の鳥として第二の隔離檻にて飼育した。攻撃対照鳥をポジティブ対照の鳥と呼んだ。
【００８２】
第２０、第２１、第２２、および第２３（予防接種日−０）において、孵化が記録された。孵化後、過剰の鳥を人力で殺し、または血液採取のために用いた。ワクチン予防しなかった卵およびワクチン予防した卵の孵化能百分率は、それぞれ８９％および９１％であり、これにより、１０３.２ＴＣＩＤ５０の力価でのワクチン予防が、孵化能に関して安全であることが確証された。
【００８３】
４週齡にて、ワクチン予防群からの１０羽の鳥およびネガティブ対照からの１０羽の鳥を、羽根で標識付けし、そして第３の隔離檻に移した。各鳥に次いで、前記の攻撃ウイルスを、１０３.５ＴＣＩＤ５０（毒性）のＴＲＴＶを０.１ｍｌ中に含んでいる点眼により投与した。６週齡にて、さらなる１４羽の鳥を同様にＴＲＴＶの毒性株で攻撃した。しかし、３羽の鳥の年齢の増加のために、攻撃投与量は、鳥１羽当たり、０.２ｍｌ中１０３.８ＴＣＩＤ５０（毒性）のＴＲＴＶに増した。
【００８４】
攻撃した鳥を１４日間、実験的にモニターし、その後、採血し、そして殺した。認められた徴候を、表１３の改定臨床スコアリングシステムを用いて記録した。表１３のシステムは、前記の実施例１にて既に記載した表２のシステムと類似するが、同一ではなかった。
【００８５】
【表１９】
2004536780.tif 000020
【００８６】
鳥のグループのトータルの毎日スコアを、その日の各鳥の個々のスコアを合わせることにより算定した。累積スコアは、平均毎日スコアの合計である。ｘ２試験を用いてデータを分析した。セット１ワクチン予防グループにおいて認められたトータルの臨床徴候を、４週および６週攻撃の両方に関して同日にセット２のポジティブ対照にて認められたものと比較した。このモニタリングにより、以下の結果が確証される。
【００８７】
１０３.５ＴＣＩＤ５０の力価の毒性ＴＲＴＶ株での４週攻撃に関して、臨床徴候は第６および第７日にのみ認められ、最大の徴候は両グループ（即ち、セット１および２）において第６日に認められた。ワクチン予防グループ（セット１）において、鳥のわずか３０％のみが攻撃後に臨床徴候を示し、そして、鳥当たりの累積平均スコアは０.６であった。セット１において、１０羽の鳥の中の７羽は完全に臨床徴候を示さなかった。ワクチン予防した鳥において認められたトータルの臨床徴候を、ポジティブ対照の鳥のものと統計学的に比較した。ワクチン予防した鳥は、ポジティブ対照の鳥のものよりも少ない重篤度の臨床徴候を示したが、これらの結果は統計学的に有意ではなかった（０.２＜Ｐ＜０.３）。
【００８８】
１０３.８ＴＣＩＤ５０の力価の毒性ＴＲＴＶ株での６週攻撃に関して、より低投与量での４週の攻撃後よりも長期間、臨床徴候がポジティブ対照鳥にて認められた。しかし、ワクチン予防した鳥において、臨床徴候は１日間だけ認められた。ポジティブ対照鳥の中で、５７％が臨床徴候を示し、そして鳥当たりの累積スコアは１.３５であった。このグループの１４羽の鳥の中で、６羽が完全に臨床徴候を示さなかった。１羽の鳥は観察期間の第５日および第６日に重篤な臨床徴候を示し、そしてその後、攻撃後９日で死亡した。この鳥の死後の試験により、膨張した右心室、鬱血性心臓静脈、肺充血、気管における過剰な痰、および肝臓における繊維性の滲出物が明らかであった。死亡について考えられる原因は、右心室不全および肝炎の可能性であった。比較により、鳥のワクチン予防グループの１４％のみが攻撃後に臨床徴候を示し、そして、鳥当たりの累積スコアは０.１４であった。このグループの１４羽の鳥の中で、１２羽が完全に臨床徴候を示さなかった。ワクチン予防グループ（セット１）におけるトータルの臨床徴候を、ポジティブ対照の鳥（セット２）において認められるものに対して、ｘ２分析を用いて統計学的に比較した。この分析により、ワクチン予防グループにおいて認められた臨床徴候がポジティブ対照の鳥において認められたものよりも有意に重篤度が低いことが確証された（０.０２＜Ｐ＜０.０５）。
【００８９】
表１４、１５、および１６は、それぞれ、４週攻撃、６週攻撃、および前記のｘ２統計学的分析に対する結果を示す。
【００９０】
【表２０】
2004536780.tif 000021
【００９１】
【表２１】
2004536780.tif 000022
【００９２】
【表２２】
2004536780.tif 000023
【００９３】
【表２３】
2004536780.tif 000024
【００９４】
ＴＲＴの臨床徴候に関してセット１および２の鳥をモニターすることに加えて、鳥をさらに、個々の血液サンプル中のＴＲＴＶに対する抗体をLeahurst, Liverpool, (U.K.)により開発されたＥＬＩＳＡ法により、Ａ型抗原を用いて測定する血清学的分析に供し、そして２ｌｏｇ力価として表した。２ｌｏｇ力価＞６.０の抗体力価をポジティブとして採用した。結果を、非対データに関するスチューデントｔ検定を用いて統計学的に分析した。表１７および１８は、それぞれ４週攻撃および６週攻撃に関して、セット１および２の攻撃鳥にて得られた血清学的結果を示す。表１７および１８において、「ＰＣ」は攻撃後を意味する。
【００９５】
【表２４】
2004536780.tif 000025
【００９６】
【表２５】
2004536780.tif 000026
【００９７】
同様の血清学的分析を、ＴＲＴＶの毒性株で攻撃しなかったこれらの鳥に関して、２５および４１週齡のMossbank親ブリーダー群（Marshalls Agriculture)の５の異なる領空のそれぞれからの鳥から採取した１０の血清サンプルを用いてさらに行った。表１９は、親ブリーダー群からのこれらの鳥の平均抗体力価を示す。
【００９８】
【表２６】
2004536780.tif 000027
【００９９】
非攻撃ワクチン予防鳥および非攻撃ネガティブ対照の鳥の両方に関して、血液を１日齡および４、６、および８週齡にて回収した。表２０は、非攻撃鳥に関する平均抗体力価を示す。
【０１００】
【表２７】
2004536780.tif 000028
【０１０１】
攻撃ワクチン予防鳥および攻撃ポジティブ対照の鳥の両方に関して、血液を４週および６週の攻撃／グループのそれぞれに関して攻撃１４日後に回収した。表２１は、これら２グループにおける攻撃鳥のこの平均抗体力価を示す。
【０１０２】
【表２８】
2004536780.tif 000029
【０１０３】
個々の結果は、表１４−２１にて前に示したデータを支持するのに利用できる。前記の血清学的分析に基いて、以下の結論をなした。１日齡のワクチン予防鳥およびネガティブ対照の鳥の両方に関して、これらの鳥はＴＲＴＶに対してマターナルな抗体（ＭＡ）を有した。４週齡までに、ネガティブ対照の鳥における抗体レベルはネガティブな範囲へと低下し、そして実験の残りを通じて低いままであった。１０３.２ＴＴＣＩＤ５０の力価のPoulvac(登録商標)TRT由来のワクチンでのインオボ投与の後で、平均抗体力価はネガティブな範囲（即ち、６.０のポジティブなカットオフ値未満）のままであったが、年齢と共に増加した。４、６、および８週齡にて、ワクチン予防した鳥は、ネガティブ対照の鳥の平均抗体力価レベルよりも統計学的に有意に高い平均抗体力価レベルを有した。４週齡から、ワクチン予防した鳥の２０％〜２２％がポジティブな力価を有した。攻撃鳥に関して、全鳥は攻撃後１４日にて血清変換を示した。４週および６週攻撃試験の両方に関して、ワクチン予防したグループの平均力価はポジティブ対照の鳥の平均力価よりも高く、そしてこの差は統計学的に有意であった（Ｐ＜０.０５）。
【０１０４】
検査において得られた測定、結果および対応する統計学的分析を含む実施例４の全体の分析は、卵当たり１０３.２ＴＣＩＤ５０の投与力価にてのPoulvac(登録商標)TRTからのワクチンでの、１８日のインキュベーションにてのマターナル−抗体−ポジティブ（ＭＡ＋）な市販のブロイラー卵のインオボワクチン予防が孵化能に悪影響を与えず、そして、信頼性のある、効率的な、そして有効なワクチン投与の方法が提供されることを示す。このワクチン予防は、６週齡のＴＲＴＶの毒性株での攻撃に対して有意な保護を提供し、この場合、認められる臨床徴候は有意に低下した。４週齡にてある程度の保護が認められたが、非ワクチン予防ポジティブ対照鳥においても、この時、認められる臨床徴候はそれほど重篤ではなかった。従って、存在しているとしても、４週での攻撃に対して与えられる保護は、統計学的に有意ではなかった。
【０１０５】
この実施例４にて示されるデータは、前記の実施例１−３のデータと組み合わせて、ニワトリがＴＲＴワクチンにほとんど感受性がないことを確証した。ポジティブな平均抗体力価（６.０のポジティブなカットオフ値を超す）は、インオボワクチン予防後に認められなかった。しかし、ワクチン予防群のレベルは、ネガティブ対照において認められるものよりも有意に高かった。ワクチン予防した鳥の約４分の１が４週齡後にポジティブな力価を有した。それゆえ、攻撃の時点において、約６.０を超すＥＬＩＳＡレベルに対する全血清変換は、インオボワクチン予防により実際に提供される保護の優れた指標ではない可能性がある。局所免疫が誘導された保護と検査において測定された力価の間の相互作用に役割を果たしている可能性がある。
【０１０６】
前記実施例１−４の分析の前には、マターナルな抗体の存在はワクチンの有効性に逆効果であると仮定されていた。それにも関わらず、および驚くべきことに、実施例４は、卵当たり１０３.２ＴＣＩＤ５０の力価のＴＲＴワクチンのインオボ投与がＭＡ＋であるニワトリの臨床ＴＲＴ疾患を減じるのに有効であったことを確証する。実施例４により、前記の実施例３にて達した結論、すなわち、インオボワクチン予防したＳＰＦ（ＭＡ−）ニワトリが臨床疾患の低下を同様に経験したことが補強および拡張される。
【０１０７】
実施例５：他の雛ワクチンと組み合わせたＴＲＴワクチンの試験
以下の省略を本試験にて用いる。
ＡＨＳ：Animal Health Service, Deventer, The Netherlands
ＢＣ：Biochek, Gouda, The Netherlands
ＣＶＬ：Central Veterinary Laboratory, Weybridge, UK
ＥＩＤ５０：50%卵感染投与量
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＡＴ：蛍光抗体試験
ＨＩ：血球凝集阻害
ＩＢ：感染性気管支炎
ＩＢＤ：伝染性気管支炎
ｉ.ｍ.：筋肉内（の）
ＭＤ：マレック病
ＮＤ：ニューカッスル病
Ｐ：確立
ＴＣＩＤ５０：５０％の組織培養感染価
ＴＲＴ：七面鳥鼻気管炎
【０１０８】
以下のワクチン材料を本試験に用いた。
投与量当たりそれぞれ１０４.１および１０４.１ＴＣＩＤ５０のＴＲＴウイルスを含んでいるPoulvac(登録商標)TRT、バッチTR02100およびTR02200
バイアル当たり１０３.９のＥＩＤ５０ＮＤウイルス（バイアル当たり５０００投与量）を含んでいるPoulvac(登録商標)Ovoline ND、バッチBB010
バイアル当たり５０００投与量を含んでいるBursamune IN OVO、バッチ61640
ＭＤウイルス、株ＦＣ１２６（バイアル当たり１０００投与量）を含んでいるPoulvac(登録商標)Marek HVT Iyo、バッチ350129
【０１０９】
Poulvac(登録商標)NDW、バッチBL03200およびBL04302
Poulvac(登録商標)IBプライマー、投与量当たり（バイアル当たり１０００投与量）１０５.０ＥＩＤ５０ ＩＢウイルス、血清型Ｍ４１およびＤ２０７（Ｄ２７４クローン）を含んでいるバッチCX02301
Poulvac(登録商標)Bursa Plus、バイアル当たり（バイアル当たり２０００投与量）１０３.２ＥＩＤ５０ＩＢＤウイルスを含んでいるバッチ62481
Bursamune IN OVOを除く全ワクチンは、Fort Dodge Animal Health Benelus, Weesp, The Netherlandsにより供給された。Bursamune IN OVOは、Fort Dodge Animal Health, Australiaから得た。
【０１１０】
ワクチンバッチは、使用日まで０−８℃にて保存し、光から保護し、そして、製造業者の仕様書に従い用いた。復元後、ワクチンは２時間以内に用いた。以下のワクチン希釈物を調製した。
グループ１のインオボワクチン予防のためのワクチン希釈物、Poulvac(登録商標)TRT、バッチTR02100、Poulvac(登録商標)Ovoline NDおよびBursamune IN OVOを復元し、そしてPoulvac(登録商標)Marek diluent、バッチC8109中にさらに希釈した。最終希釈物は、０.０５ｍｌ中に各ワクチンの１市販量を含んだ。
【０１１１】
ＭＤに対する筋肉内（ｉ.ｍ.）ワクチン予防グループ１および２のためのワクチン希釈物
Poulvac(登録商標)Marek HVT Iyoを復元し、そして、Poulac(登録商標)Marek diluent、バッチC8109中にさらに希釈した。希釈物は、０.５ｍｌ当たりの１市販投与量を含んだ。
きめの粗いスプレーによるワクチン予防群１のためのワクチン希釈物、Poulvac(登録商標)IBプライマーを復元し、次いで２.２リットルの脱塩水中にさらに希釈した。最終希釈物は０.５ｍｌ当たり１市販投与量を含んだ。
【０１１２】
ＩＢＤに対するワクチン予防グループ２のための飲料水中のワクチン希釈物。
３バイアルのPoulvac(登録商標)Bursa Plusを復元し、次いでさらに飲料水中に希釈した。
AtomistスプレーによるNDに対するワクチン予防グループ１および２のためのワクチン希釈物。Poulvac(登録商標)NDW、バッチBL03200を復元し、次いで最終希釈物が０.５ｍｌ当たり１市販投与量を含むまで、脱塩水にさらに希釈した。
【０１１３】
Pronk, Meppel, The Netherlandsから得たブロイラー製造のために飼育したCobbの１４８９５個の市販の卵を、Fort Dodge AHH, Muiden, The Netherlandsの試験農場のMUK-5/6にある１インキュベーター中に入れた。全卵をインキュベーションの１７日後に明かりにすかして調べた。非受精卵または死んだ胚を含む卵は除いた。
グループ１と指定した６００１個の卵を、インキュベーションの１８日後、卵当たり１投与量のPoulvac(登録商標)TRT、Poulvac(登録商標)Ovoline NDおよびBursamune IN OVO を含んでいる０.０５ｍｌの希釈物にて、Embrex Inovoject卵注射器を製造業者の指示に従い用いて予防接種した。グループ２と指定する６０２８個の卵は予防接種せずに置いた。
【０１１４】
予防接種（グループ１）および非予防接種（グループ２）卵を、Fort Dodge AHH, Muiden, The Netherlandsの試験農場にあるインキュベーター１および４それぞれの中での孵化まで、さらにインキュベートした（回転はさせない）。孵化後、４４５２羽（予防接種、グループ１）および５２４８羽（非予防接種、グループ２）の雛をそれぞれ試験に含めた。雛を、Fort Dodge AHH, Muiden, The Netherlandの試験農場の同じ家畜小屋にある動物施設中の木くず上にてグループ飼育した。グループ１の雛はＭＵＬ−Ｌにて飼育し、次いでグループ２の雛はＭＵＬ−Ｒ中で飼育した。全雛に市販のブロイラーペレットを無制限に給餌し、そしてベルドリンカーにて提供される飲料水を自由に利用できるようにした。
【０１１５】
ワクチン予防スケジュールを表２２に示す。１日齡にて、グループ１の雛をPoulvac(登録商標)IBプライマーにてワクチン予防した。１市販投与量をガーデンスプレイヤー（Gardena)を雛あたり０.５ｍｌ用いてきめの粗いスプレーにより投与した。１日齡にて、グループ２の雛をPoulvac(登録商標)TRT、Poulvac(登録商標)NDWおよびPoulvac(登録商標)IBプライマーにてワクチン予防した。各ワクチンの１市販投与量を、グループ１のように雛当たり０.５ｍｌの１容積にてきめの粗いスプレーにより投与した。きめの粗いスプレーによるワクチン予防前、雛をニワトリ箱に入れ、そしてその中に、ワクチン予防後３時間まで放置した。
【０１１６】
全雛をPoulvac(登録商標)Marek HVT Iyo、雛当たり１市販投与量を１日齡にてワクチン予防した。ワクチンは太腿に、Pullet Injection Gun(Veterinary Supplies, Mijdrecht, The Netherlands)を０.５ｍｌのプリセット容積にて用いて適用した。
【０１１７】
グループ２の雛をPoulvac(登録商標)Bursa Plusで、２週齡の雛当たり、飲料水中１市販投与量にてワクチン予防した。ワクチンは２時間以内に消費される若干の水に分散させた。ニワトリから２時間の間、飲料水を奪い、その後、ワクチンを投与した。
【０１１８】
全雛を、Poulvac(登録商標)NDWにて４週齡にてワクチン予防した。雛当たり０.５ｍｌ中１市販投与量を噴霧器により適用した。
【０１１９】
【表２９】
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【０１２０】
血液サンプルを１日齡にて断頭後、各グループの３０羽の雛から採取した。各グループの１０羽の雛のサンプルを、ＡＨＳにての血清学的試験のために用いた。各グループの１０羽の他の雛のサンプルを、Central Veterinary Laboratory, Weybridge, UK (CVL)にての血清学的試験のために用いた。残る１０サンプルを、ＢＣにての血清学的試験のために用いた。血液サンプルを、２、３、４、５および６週齡のグループにつき２４羽の最大数までの雛の翼状部静脈から回収した。
【０１２１】
ＮＤ、ＩＢ Ｍ４１およびＩＢ Ｄ２７４抗原に対する抗体力価をＨＩ試験を用いて測定した。ＨＩ試験の検出限界は、ＮＤ抗原に関して２ｌｏｇＨＩ力価＝１．０に、およびＩＢ抗原に関して２ｌｏｇＨＩ力価値＝３.０に対応する。幾何学的平均ＨＩ力価を算定した。ＴＲＴおよびＩＢＤウイルスの抗体力価を、ＥＬＩＳＡ法（ＩＤＥＸＸ）を製造業者の指示に従い用いて測定し、そして平均力価を算定した。これらの試験はＡＨＳにて行った。
【０１２２】
ＮＤ、ＩＢ、ＴＲＴおよびＩＢＤウイルスに対するＥＬＩＳＡ法を用いる抗体力価測定を、BCにより行った。１１５９および８３４またはそれ以上の、ＮＤおよびＩＢウイルスに対するＥＬＩＳＡ抗体力価はそれぞれポジティブとみなす。ＮＤ（３９６またはそれ以上にてポジティブとみなす）およびＩＢウイルスに対する抗体力価を、ＩＤＥＸＸ試験キットを用いてさらに測定した。平均力価を、ＢＣ９９ソフトウェアを用いて算定した。
【０１２３】
ＡＨＳおよびＣＬＶにて得られた結果を統計学的に分析した。２のグループをスチューデントの２側面ｔ試験を用いて抗体力価に関して比較した。ＩＢＤ、ＴＲＴおよびＭＤに対するＥＬＩＳＡ抗体力価を、分析前にｌｏｇ変換した（ｌｏｇ［ｘ＋１］。ＭＤ測定値＞１６００およびｎｅｇ.を算定にてそれぞれ１６００および２５にそれぞれ置き換えた。Ｐ＜０.０５の確率を、統計学的に有意な差と見なした。
【０１２４】
結果：ＮＤ、ＩＢ、ＩＢＤおよびＴＲＴ抗原に対する、ＡＨＳおよびＢＣにより測定された平均抗体力価を表２３および２４に示す。
【０１２５】
【表３０】
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【０１２６】
【表３１】
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【０１２７】
特異的蛍光を示している平均血清希釈を表している、ＭＤウイルスに対する平均ＦＡＴ力価を表２５に示す。統計学的に有意なより高いＦＡＴ力価が、２、３、および４週齡のグループ２において認められ、より若い歳の鳥においてより高い免疫反応を示している。
【０１２８】
【表３２】
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【０１２９】
実施例５−考察
両グループの雛は、ＮＤ、ＩＢ、ＩＢＤ、ＴＲＴおよびＭＤウイルスに対してＭＡを有した。ＮＤおよびＩＢに対する血清反応が、1日齡でのワクチン予防後に観察された。これらの抗原に対する力価の増加は、両グループにおいて正常の範囲内であった。Poulvac(登録商標)NDWでの第２のワクチン予防により、両グループにおいて血清反応が誘導された。両グループは、ＩＢＤ、ＴＲＴおよびＭＤウイルスに対する抗体力価を増加させた。
【０１３０】
多くの場合において、グループ間で抗体力価に関して一定の差が認められた。ＮＤに対する抗体力価は、６週齡におけるものを除く全ての場合においてグループ１（予防接種された卵から孵化した雛）においてより高かった。ＴＲＴに対する抗体力価も、全場合においてグループ１において高く、これらの差は６週齡での差を除いて統計学的に有意であった。ＭＤに対する血清反応はグループ１において幾分緩慢であったが、５週齡にてグループ２と同じレベルに達した。ＩＢおよびＩＢＤ抗原に対する平均的な抗体力価に関してグループ間に明白な差は認められなかった。ほとんどの場合に、ＢＣにてなされた力価測定の結果は、ＡＨＳにて得られたものと同じパターンに従い、ＩＢＤおよびＴＲＴに対するＥＬＩＳＡ力価に関してより高い値を有した。ＩＢＤに対する血清反応は３週齡におけるＢＣ試験により示され、これは、ＩＤＥＸＸ試験にてそれが示された１週前である。ＢＣ ＥＬＩＳＡ試験は、ＨＩ法よりもＮＤに対する平均抗体力価を測定するのに、より感受性があるようである。ＢＣ ＥＬＩＳＡ試験は、３週齡から、ＨＩ法よりもＩＢウイルスに対してより著しい反応を示した。
【０１３１】
１日齡でのPulvac IBプライマーおよびPoulvac(登録商標）HVTでのワクチン予防を後に行う、インキュベーション１８日後のPoulvac(登録商標)TRT、Poulvac(登録商標)Ovoline NDおよびBursamune IN OVOの１市販投与量を用いた、ブロイラー産生用市販卵のインオボワクチン予防は、生存１日目におけるPoulvac TRT、Poulvac(登録商標)NDW、Poulvac(登録商標)IBプライマーおよびPoulvac(登録商標)Marek HVT Iyoの市販投与量での、および２週齡でのPoulvac(登録商標)Bursa Plusでの孵化した雛のワクチン予防と有効性に関して矛盾がない。
【０１３２】
ＢＣ ＥＬＩＳＡ試験キットは、ＮＤ、ＩＢ、ＩＢＤおよびＴＲＴウイルス抗原の抗体力価レベルを測定するのに、ＮＤ、ＩＢ Ｍ４１およびＩＢ Ｄ２７４に対するＨＩ試験、またはＩＢＤもしくはＴＲＴに対するＩＤＥＸＸ試験キットに比べて好ましいと考えられる。
表２６〜３５は、更なる抗体力価の結果を提供するものである。
【０１３３】
【表３３】
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【０１３４】
【表３４】
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【０１３５】
【表３５】
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【０１３６】
【表３６】
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【０１３７】
【表３７】
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【０１３８】
【表３８】
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【０１３９】
【表３９】
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【０１４０】
【表４０】
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【０１４１】
【表４１】
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【０１４２】
【表４２】
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【０１４３】
本発明を前にかなり詳細に記載したが、出願人は、前記の教示を引用しつつ、しかし、いかなる特定の開示された具体例にも制限されずに、そしていかなる場合にも本出願の意図および範囲に矛盾することなく、本明細書中に記載する請求項により規定および決定されるごとくに可能な特許保護の全範囲を希望する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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