(57)【要約】本発明は、ＮＫＧ２Ｄレセプター複合体の細胞外エピトープを特異的に認識する結合部位を含む第１のドメインおよびレセプターまたはリガンド機能を有する第２のドメインを含む多機能ポリペプチドに関する。さらに、本発明は、多機能ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むベクター、該ポリヌクレオチドまたは該ベクターを含む細胞に関する。この発明は、上述の分子のいずれかを単独または組み合わせ含む組成物、また、この発明の多機能ポリペプチドの特定の医薬用途にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄレセプター複合体の細胞外エピトープを特異的に認識する結合部位を含む第１のドメイン、および、
（ｂ）レセプターまたはリガンド機能を有する第２のドメイン、
を含む多機能ポリペプチド。
【請求項２】
該結合部位が免疫グロブリン鎖の結合部位である請求項１記載の多機能ポリペプチド。
【請求項３】
該結合部位が該レセプター複合体の天然ＮＫＧ２Ｄ−リガンドである請求項１記載の多機能ポリペプチド。
【請求項４】
該天然ＮＫＧ２Ｄ−リガンドが、ＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、ＵＬＢＰ−１およびＵＬＢＰ−２からなる群より選ばれる請求項３記載の多機能ポリペプチド。
【請求項５】
該結合部位がＮＫＧ２ＤまたはＤＡＰ１０の細胞外エピトープを特異的に認識する請求項１ないし４記載の多機能ポリペプチド。
【請求項６】
該レセプターまたはリガンド機能が、
（ｉ）腫瘍関連抗原、
（ｉｉ）感染性因子の抗原、または
（ｉｉｉ）該腫瘍関連抗原や表面マーカーと相互作用する識別抗原（ＣＤ抗原）、天然リガンドもしくはレセプター、これらのフラグメント、または、これらの修飾体のような細胞の分集団の表面マーカー、
に対する抗体、フラグメント、または、これらの誘導体の抗原結合部位であり、好ましくは、（ｉ）腫瘍関連抗原のｅｒｂＢ−２、−３および−４に結合するヘレグリン、（ｉｉ）ＨＩＶ感染細胞のｇｐ  １２０と相互作用するＣＤ４、または（ｉｉｉ）メラノサイトおよびこれら由来の腫瘍（悪性黒色腫）のＭＳＨレセプターに結合するメラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）もしくは相当するケモカインレセプターに結合するケモカインまたはあらかじめ定義された特異性を有するＴ細胞レセプターに結合するペプチドと複合体を形成するＭＨＣ分子やこれらのフラグメントであり従ってあらかじめ定義されたＭＨＣペプチド複合体やインフルエンザウイルスの血球凝集素（ＨＡ）と相互作用するＮＫｐ４６と特異的に相互作用する特定のＴ細胞分集団やＴ細胞レセプターの抗原結合部位を認識するものである、
請求項１ないし５記載の多機能ポリペプチド。
【請求項７】
該腫瘍関連抗原が、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、Ｍｕｃ−１、ｅｒｂＢ−２、−３および−４、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥＧＦ−レセプター（例えばＥＧＦＲ  タイプＩまたはＥＧＦＲ  タイプＩＩ）、ＥＧＦＲ欠失ネオエピトープ、ＣＡ１９−９、Ｍｕｃ−１、ＬｅＹ、ＴＦ−、Ｔｎ−およびｓＴｎ−抗原、ＴＡＧ−７２、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ１９およびＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、Ｉｇ−αおよびＩｇ−β、Ａ３３およびＧ２５０、ＣＤ３０、ＭＣＳＰおよびｇｐ１００、ＣＤ４４−ｖ６、ＭＴ−ＭＭＰｓ、（ＭＩＳ）レセプター  タイプＩＩ、カーボアンハイドラーゼ９、Ｆ１９−抗原、Ｌｙ６、デスモグレイン４、ＰＳＣＡ、Ｗｕｅ−１、ＧＤ２およびＧＤ３、および、ＴＭ４ＳＰ−抗原（ＣＤ６３，Ｌ６，ＣＯ２９，ＳＡＳ）または胎児型アセチルコリンレセプター（ＡＣｈＲ）のアルファおよびガンマサブユニット、からなる群より得らればれる請求項６記載の多機能ポリペプチド。
【請求項８】
感染細胞に対する該表面マーカーが、ヒトレトロウイルス（ＨＴＬＶＩおよびＩＩ、ＨＩＶ１および２）またはヒトヘルペスウイスル（ＨＳＶ１および２、ＣＭＶ，ＥＢＶ）等のウイルスエンベロープ抗原；インフルエンザウイルスＡ、ＢまたはＣ等の血球凝集素；風疹ウイルスの糖タンパク質Ｅ１およびＥ２、または、狂犬病ウイルスのＲＧＰ；からなる群より選ばれる請求項６記載の多機能ポリペプチド。
【請求項９】
二重特異性抗体である請求項１ないし８いずれかに記載の多機能ポリペプチド。
【請求項１０】
該多機能ポリペプチドが合成、キメラおよびヒト化抗体からなる群より選ばれる請求項９記載の多機能ポリペプチド。
【請求項１１】
単鎖である請求項１ないし１０いずれかに記載の多機能ポリペプチド。
【請求項１２】
該２つのドメインがポリペプチドリンカーにより結合されている請求項１ないし１０いずれかに記載の多機能ポリペプチド。
【請求項１３】
該第１および／または第２のドメインが天然抗体のＶＨおよびＶＬ領域を真似たものもしくはこれらに相当するものである請求項１ないし１２いずれかに記載の多機能ポリペプチド。
【請求項１４】
該ドメインの少なくとも１つが抗体の可変領域の単鎖フラグメントである請求項１ないし１３いずれかに記載の多機能ポリペプチド。
【請求項１５】
該ドメインがＶＬＮＫＧ２Ｄ−ＶＨＮＫＧ２Ｄ−ＶＨＴＡ−ＶＬ−ＴＡまたはＶＬＴＡ−ＶＨＴＡ−ＶＨＮＫＧ２Ｄ−ＶＬＮＫＧ２Ｄの順で並び、ここで、ＴＡが標的抗原を示すものである、請求項１ないし１４いずれかに記載の多機能ポリペプチド。
【請求項１６】
該標的抗原がＬｅｗｉｓ  Ｙ、Ｍｕｃ−１、ｅｒｂＢ−２、−３および−４、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥＧＦ−レセプター（例えばＥＧＦＲ  タイプＩまたはＥＧＦＲ  タイプＩＩ）、ＥＧＦＲ欠失ネオエピトープ、ＣＡ１９−９、Ｍｕｃ−１、ＬｅＹ、ＴＦ−、Ｔｎ−およびｓＴｎ−抗原、ＴＡＧ−７２、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ１９およびＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、Ｉｇ−αおよびＩｇ−β、Ａ３３およびＧ２５０、ＣＤ３０、ＭＣＳＰおよびｇｐ１００、ＣＤ４４−ｖ６、ＭＴ−ＭＭＰｓ、（ＭＩＳ）レセプター  タイプＩＩ、カーボアンハイドラーゼ９、Ｆ１９−抗原、Ｌｙ６、デスモグレイン４、ＰＳＣＡ、Ｗｕｅ−１、ＧＤ２およびＧＤ３、および、ＴＭ４ＳＰ−抗原（ＣＤ６３，Ｌ６，ＣＯ２９，ＳＡＳ）、胎児型アセチルコリンレセプター（ＡＣｈＲ）のアルファおよびガンマサブユニット、からなる群より選ばれる請求項１５記載の多機能ポリペプチド。
【請求項１７】
該ポリペプチドリンカーが複数のグリシン、セリンおよび／またはアラニン残基を含む請求項１２ないし１６いずれかに記載の多機能ポリペプチド。
【請求項１８】
該ポリペプチドリンカーが複数のアミノ酸配列の連続した複製を含む請求項１２ないし１７いずれかに記載の多機能ポリペプチド。
【請求項１９】
該ポリペプチドリンカーが、１から５、５から１０、または１０から１５のアミノ酸残基を含む請求項１２ないし１８いずれかに記載のポリペプチド。
【請求項２０】
該ポリペプチドリンカーが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒのアミノ酸配列を含む請求項４ないし１９いずれかに記載の多機能ポリペプチド。
【請求項２１】
少なくとも１つの更なるドメインを含む請求項１ないし２０いずれかに記載の多機能ポリペプチド。
【請求項２２】
該更なるドメインが共有結合または非共有結合により結合している請求項２１記載の多機能ポリペプチド。
【請求項２３】
該少なくとも１つの更なるドメインが、生物学的活性に適した立体配座であり、イオンを封鎖したり固体担体やあらかじめ選択された決定基に選択的に結合する能力のある立体配座を有するエフェクター分子を含む請求項２１または２２記載の多機能ポリペプチド。
【請求項２４】
該更なるドメインが、補助刺激機能および／または補助活性化機能を付与する請求項２１ないし２３いずれかに記載の多機能ポリペプチド。
【請求項２５】
該補助刺激機能がＣＤ２８−リガンドまたはＣＤ１３７−リガンドにより媒介される請求項２４記載の多機能ポリペプチド。
【請求項２６】
該ＣＤ２８−リガンドまたはＣＤ１３７−リガンドが、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、アプタマ−、抗体、またはこれらの機能性フラグメントもしくは機能性誘導体である請求項２５記載の多機能ポリペプチド。
【請求項２７】
発現により請求項１ないし２６いずれかに記載の多機能ポリペプチドおよび／または多機能ポリペプチドの機能性部分をエンコードするポリヌクレオチド。
【請求項２８】
請求項２７記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２９】
請求項２７記載のポリヌクレオチドまたは請求項２８記載のベクターをトランスフェクションした細胞。
【請求項３０】
請求項２９記載の細胞を培養し、請求項１ないし２６いずれかに記載の多機能ポリペプチドもしくはこれらの機能部分を培養物から分離することを含む、該多機能ポリペプチドおよび／または多機能ポリペプチドの部分の調製方法。
【請求項３１】
請求項１ないし２６いずれかに記載のポリペプチド、請求項２７に記載のポリヌクレオチド、または請求項２８に記載のベクターを含む組成物。
【請求項３２】
補助刺激機能および／または補助活性化機能を付与する分子を更に含む請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
該補助刺激機能がＣＤ２８−リガンドまたはＣＤ１３７−リガンドにより媒介される請求項３１記載の組成物。
【請求項３４】
該ＣＤ２８−リガンドまたはＣＤ１３７−リガンドが、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、アプタマ−、抗体、またはこれらの機能性フラグメントもしくは機能性誘導体である請求項３１記載の組成物。
【請求項３５】
医薬組成物であって、任意に医薬的に許容可能なキャリアーを更に含む請求項３１ないし３４いずれかに記載の組成物。
【請求項３６】
診断組成物であって、任意に検出に適した手段を更に含む請求項３１ないし３５いすれかに記載の組成物。
【請求項３７】
癌、感染および／または自己免疫状態、癌、即ち、悪性（充実性）腫瘍；造血癌形態（白血病およびリンパ腫）；良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、甲状腺や他の内分泌腺の自律性腺腫または結腸の腺腫のような良性腫瘍；悪性腫瘍の初期段階；ウイルス、バクテリア、真菌、原虫や蠕虫による感染性疾患；疾患を起こす免疫細胞の分集団の削減が要求される自己免疫疾患；移植による拒絶反応やアレルギーの防止、の治療に用いる医薬組成物の調製のための請求項１ないし２６いずれかに記載の多機能ポリペプチド、請求項２７記載のポリヌクレオチドまたは請求項２８記載のベクターの使用。
【請求項３８】
該感染がウイルス、バクテリアまたは真菌感染であり、該癌が頭部および頸部の癌、胃癌、食道癌、胃癌、結腸直腸癌、結腸癌腫、肝臓および肝臓内の胆管の癌、膵臓癌、肺癌、小細胞肺癌、喉頭癌、乳癌、乳癌腫、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、肉腫、横紋筋肉腫、リンパ腫、濾胞性非ホジキンリンパ腫、白血病、Ｔ−またはＢ−細胞白血病、ホジキンリンパ腫、Ｂ−細胞リンパ腫、卵巣腫瘍、子宮癌、頸部の癌、前立腺癌、生殖器の癌、腎臓癌、精巣癌、甲状腺癌、膀胱癌、プラスマ細胞腫または脳腫瘍であり、該自己免疫状態が強直性脊髄炎、急性前部ブドウ膜炎、グッドパスチャー症候群、多発性硬化症、グレーヴズ病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、インシュリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチ、尋常性天疱瘡、橋本甲状腺炎または自己免疫性肝炎である、請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
遺伝子治療の組成物の調製のための請求項２７記載のポリヌクレオチドまたは請求項２８記載のベクターの使用。
【請求項４０】
請求項１ないし２６いずれかに記載のポリペプチド、請求項２７記載のポリヌクレオチド、請求項２８記載のベクター、請求項３５記載の組成物を悪性疾患や疾患を受けた哺乳動物に導入することを含む癌、感染または自己免疫状態の治療方法。
【請求項４１】
請求項１ないし２６いずれかに記載のポリペプチド、請求項２７記載のポリヌクレオチド、請求項２８記載のベクターまたは請求項３５記載の組成物を病的状態にある哺乳動物に導入することを含む病的状態を遅らせる方法。
【請求項４２】
該哺乳動物がヒトである請求項４０または４１記載の方法。
【請求項４３】
請求項１ないし２６いずれかに記載の多機能ポリペプチド、請求項２７記載のポリヌクレオチド、請求項２８記載のベクター、請求項２９記載の細胞または請求項３１ないし３６いずれかに記載の組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＮＫＧ２Ｄレセプター複合体の細胞外のエピトープを特異的に認識する結合部位を含む第１のドメインと、レセプターまたはリガンド機能を有する第２のドメインを含む多機能ポリペプチドに関する。更に、本発明は、多機能ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチド、該ポリペプチドを含むベクター、該ポリヌクレオチドまたは該ベクターを含む細胞に関する。この発明は、また、上述したいずれかの分子を単独または組み合わせて含む組成物に関し、また、この発明の多機能ポリペプチドの特定の医療用途にも関する。
いくつかの文献が、本明細書の本文の中で引用される。これらの文献のそれぞれの開示された内容は（製造者の説明書や手順書等を含む）、本明細書の一部としてここに引用する。
先行技術文献に記載された多数の多機能ポリペプチド化合物は、悪性または感染標的細胞に対する免疫エフェクター細胞を再標的化するために開発された様々な分子形態の二重特異性抗体であり、血液循環からの病原体や自己抗体を除去し、投薬治療を補強し、または、ワクチンや放射性同位体等の担体とするものである。  標的細胞に対する免疫エフェクター細胞の細胞毒活性を再誘導するために設計された二重特異性抗体は、通常は、標的細胞上の腫瘍に関連したまたはウイルスの抗原を認識する結合部位およびエフェクター細胞上の引き金となる分子と相互作用する第２の結合部位を含む。二重特異性抗体アプローチとして先行技術文献に採用されたエフェクター細胞としては、Ｔ−リンパ球、ＮＫ細胞、単球および多形核好中球であった。二重特異性抗体の引き金分子は、通常、ＣＤ６４，  ＣＤ１６、α／β−Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）およびＣＤ３からなる細胞表面レセプターの群から選ばれ、また、ＣＤ２，  ＣＤ８９，  ＣＤ３２，  ＣＤ４４，  ＣＤ６９  およびＴＣＲ−ゼータ鎖のような他の引き金分子も評価されていた。細胞毒性Ｔ−リンパ球（表現型：ＣＤ３＋／ＣＤ５６−／ＣＤ８＋）を標的細胞に再誘導する能力のある二重特異性抗体は、いずれもＴＣＲ、ＣＤ３、ゼータ鎖またはＣＤ２への結合部位を含んでいる。しかし、ＴＣＲ−複合体それ自身のいずれのエピトープも影響を受けるので（ＴＣＲ，ＣＤ３またはゼータ鎖）、またはその細胞質テールと関連してｓｒｃ関連タンパク質チロシンキナーゼｌｃｋと、ＴＣＲ−複合体との凝集によりＴＣＲ−シグナルに直接寄与する分子であるＣＤ２の場合は、これらの引き金分子と結びつけることにより、ＴＣＲ−複合体を経由する抗原特異的シグナル伝達は妨害される。
【０００２】
従って、技術的課題は、それらの細胞溶解性リンパ球のレセプター特異性および／または機能を妨害することなく疾患関連細胞の直ぐ近傍においてリンパ球の特異的活性を増強する多機能ポリペプチドを提供することであった。
【０００３】
該技術的課題の解決は、特許請求の範囲に特徴付けられる態様として提供することによりなされる。
【０００４】
従って、本発明は、ＮＫＧ２Ｄレセプター複合体の細胞外エピトープを特異的に認識する結合部位を含む第１のドメインと、レセプターまたはリガンド機能を有する第２のドメインを含む多機能ポリペプチドに関する。
【０００５】
本発明に関連して「多機能ポリペプチド」の用語は、３つ、４つ、５つまたは６つの異なった生物学的機能のように少なくとも２つの以上のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ状態などの病理学を含めた生理学的などに適した状態（ｉｎ  ｖｉｔｒｏも含む）下で効果を有するポリペプチドを意味する。生理学的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ状態には、ｐＨ範囲が５から９のリン酸バッファー溶液のようなバッファー溶液を含み、また添付の実施例からも更に導き出されるものである。これらの機能は、以下に更に特定される。これらは、特定されたドメインと、ここで更に特定される分子との結合を含む。結合は、その後、カスケードの開始、レセプターへの結合、シグナル伝達経路または遺伝子発現の調整および／またはアポトーシス的な細胞死への影響などの、更なる生物学的機能の引き金となるであろう。異なる生物学的機能を付与する少なくとも２つのこれらのドメイン、好ましくはここで特定される２つのドメインは、自然に一緒に発生するものではなく、即ち、この立体配置または同一のポリペプチド、タンパク質またはタンパク質複合体のいずれも自然には、発生しないものである。
【０００６】
「レセプターまたはリガンド機能」の用語は、好ましくは適合リガンドを有する細胞表面に位置する自然に発生するレセプターのような、分子の自然に発生するかまたは自然に発生しない結合機能のことを言う。このようなレセプター／リガンド対の例としては、抗体／抗原、Ｉｇスーパーファミリーの他のメンバーおよびこれらに相当するリガンド、ホルモンレセプター／ホルモンまたは炭水化物／レクチン相互作用がある。リガンドは、一般的に、しかし排他的にではなく、自然の結合相手を有する分子を意味する。上記に対応して、これらは、抗原またはホルモンでもよい。しかし、これらは、非天然の立体配置や由来のものでもよい。上述したようなレセプター／リガンドは、天然由来、組換え体または（半）合成由来のものでもよい。
【０００７】
ＮＫＧ２Ｄは、ＤＡＰ１０とともにＮＫＧ２Ｄレセプター複合体を形成する（Ｗｕ（１９９９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５；７３０）Ｃ型レクチン様ＮＫ細胞レセプターである（Ｈｏｕｃｈｉｎｓ（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：  １０１７）。ＤＡＰ１０は、その細胞質ドメイン中のＰｌ３−キナーゼの活性配列モチーフを運び、その細胞質ドメイン中にシグナル伝達モチーフを欠いたＮＫＧ２Ｄへのシグナル導入モジュールとして働く。このレセプター複合体の結びつけは、ＮＫ細胞の細胞毒性を誘発するシグナル伝達カスケードの引き金となる。他のＮＫ細胞レセプターのように、ＮＫＧ２Ｄレセプター複合体は、特定のＴ細胞サブセット中、主にγ／δ−Ｔ細胞、ＣＤ８＋α／β−Ｔ細胞および減少する小数のＣＤ４＋α／β−Ｔ細胞中で、発現していることも見出されている（Ｂａｕｅｒ（１９９９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：７２７）。
【０００８】
ＮＫ細胞は、体液性免疫反応の優勢なエフェクターであり、これは、これらの表面Ｆｃγ−レセプターＣＤ１６へのＩｇＧ−抗体の結合を通じて抗原特異性を獲得する。従って、ＣＤ１６は、抗体武装ＮＫ細胞が抗原特異性により標的細胞を破壊できるようにする特異的抗原レセプターとして働く。
【０００９】
Ｔ−リンパ球は、細胞性免疫反応のエフェクターであり、これは、特異的抗原レセプターとしてＴＣＲ−複合体を運ぶものである。ＴＣＲ−複合体は、クローン型抗原特異性を付与する２つの可変鎖とともに、ＣＤ３−複合体およびゼータ鎖を含むいくつかの不変鎖により構成される。ＴＣＲ−複合体中に見出される可変鎖の型に依存して（α−およびβ−鎖であるかγ−およびδ−鎖であるかのいずれか）、Ｔ−リンパ球は、α／β−およびγ／δ−Ｔ細胞に分類することができる。細胞毒性Ｔ−リンパ球、即ち、ＣＤ８＋α／β−Ｔ細胞およびγ／δ−Ｔ細胞によるＴＣＲに媒介される標的細胞の認識は、通常、標的細胞の溶解につながる。
【００１０】
既知のリンパ球誘導の二重特異性抗体の主要なものは、ＮＫ細胞またはＴ細胞のいずれかのみをリクルートする。ＮＫ細胞は、通常、Ｆｃγ−レセプターＩＩＩＡ複合体の主要な細胞外部分を形成しながら、ＣＤ１６との結びつけを通じてリクルートされる。一方、Ｔ細胞のリクルートは、通常、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）の不変多重鎖部分において、ＣＤ３との結びつけを通じて媒介される。Ｔ細胞のＴＣＲと同様に、ＮＫ細胞のＣＤ１６に関連したゼータ鎖において誘導される二重特異性抗体は、エフェクターリンパ球の双方の型を結びつける能力を有する（ＷＯ００／０３０１６）。しかし、ＣＤ３において誘導されるもののように、ゼータ鎖において誘導される二重特異性抗体は、非細胞毒性ＣＤ４＋Ｔ細胞も活性化し、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏで異なったＣＤ８＋Ｔ細胞が望ましくない副作用の一因となるものである。例えば、これは、標的細胞の細胞毒性による除去に基本的に寄与することなく、全身的にサイトカインを放出すことによるものである。
【００１１】
この発明のＮＫＧ２Ｄ特異的多機能分子は（これは、好ましい態様の、上述した第１と第２のドメインを含む二重機能性分子である）、先行技術で知られたリンパ球誘導の二重特異性抗体とは対照的に、通常細胞毒性ではないＣＤ４＋α／β−Ｔ細胞のような他の細胞型には基本的には触れずに、例外的な正確さをもって、細胞毒性の表現型を自然に運ぶリンパ球の全範囲、即ち、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋α／β−Ｔ細胞およびγ／δ−Ｔ細胞、をリクルートする能力を有する。
【００１２】
本発明に用いられる「細胞毒性リンパ球のリクルート」の用語は、再誘導された溶解のみに限定されず、細胞毒性とＴ細胞プライミングの補強も含むものである。
【００１３】
従って、この発明のＮＫＤ２Ｄ誘導の分子は、徹底的かつ排他的にすべての等価の細胞毒性リンパ球をリクルートするという正確さのために、独特のものである。先行技術で知られているリンパ球誘導の二重特異性抗体との更なる相違として、本発明の多機能分子は、対応するシグナル伝達カスケードの上流の細胞質の段階などの、細胞毒性リンパ球の特異的抗原レセプターと直接および間接のいずれでも結びつかない。即ち、この発明の多機能ポリペプチドがこれらに結合しないため、Ｔ細胞レセプター複合体の機能が損なわれることはない。Ｔ細胞レセプターにより付与されるシグナルのシグナル伝達カスケードの下流は、このため、この発明の多機能ポリペプチドとの相互作用により影響されることはない。その結果、細胞毒性リンパ球の活性化および／または増殖は選択的に支援され、これは、その抗原レセプター特異性のために、この発明の多機能分子により認識される標的細胞に対する特異的免疫反応に結び付けられるものである。
【００１４】
Ｔ−およびＮＫ−細胞の該上流シグナル伝達カスケードは、下流シグナル伝達カスケードのエフェクター分子のリクルートを担うＩＴＡＭポリペプチド、Ｓｒｃキナーゼ、ＺＡＰ−７０／ＳｙｋおよびＬＡＴとＳＬＰ−７６のようなアダプタータンパク質を含むものである。下流シグナル伝達カスケードは、ＰＬＣγ、Ｇｒｂ２、Ｖａｖ、ＣｂｌおよびＮｃｋと同様にＰｌ３キナーゼのような分子を含むものである。
【００１５】
特異的抗原レセプターとの結びつきおよび／または対応するシグナル伝達カスケードの上流の細胞質段階を避けることにより、この発明の多機能ポリペプチドは、ＮＫ細胞のＦｃγレセプター複合体のＣＤ１６やＴリンパ球のＴＣＲ複合体のＣＤ３成分に結合するなどの、先行技術で知られた他のリンパ球誘導の二重特異性抗体よりも、特異的抗原認識の小さい度合いで有利に作用する。特に、標的細胞の特異的免疫反応により媒介されるリンパ球エフェクターの機能は、先行技術の二重特異性抗体による特異的抗原レセプターとの結びつきおよび／または対応するシグナル伝達カスケードの上流の細胞質段階を通じて、支配されうる。一方、ＮＫＧ２Ｄレセプター複合体により結びつけられるこの発明の多機能分子は、特異的抗原レセプターおよび細胞質のシグナル伝達カスケードの上流段階のいずれにも直接に関連付けられるものではないが、特異的抗原レセプターを通じて同じ標的細胞を認識する細胞毒性リンパ球の活性化を補強することができる。
【００１６】
これは、添付の実施例に記載されている驚くべき結果を説明するものである。そして、その実施例とは、
【００１７】
（ｉ）抗原特異的Ｔ細胞レセプター複合体との結びつきを通じて媒介される強いプライミングシグナル、および
（ｉｉ）第２のＴ細胞シグナルの優勢な媒体であるＢ７−１により供給される最高の補助刺激、
の存在にもかかわらず、ＮＫＧ２Ｄに媒介されるシグナルは、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングを加速することができるというものである。
【００１８】
更に、ＴＣＲ−複合体またはＣＤ１６との結びつきによりそれぞれ引き起こされるＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の細胞毒性が、ＮＫＧ２Ｄに媒介されるシグナルを通じて補強されるという驚くべき発見もある（実施例６）。
【００１９】
しかし、最も驚くべきことに、Ｔ−細胞のプライミングと同様にＮＫ−およびＴ−細胞の細胞毒性は、ＮＫＧ２Ｄ誘導の抗体分子によってでさえ補強され、これら自身では実施的に再誘導された溶解は引き起こされない（実施例５および６）。
【００２０】
従って、細胞毒性リンパ球をリクルートする異なった性質を有するこの発明の多機能ＮＫＧ２Ｄ誘導ポリペプチドは、異なった目的に有利に選択されるであろう。例えば、純粋な免疫調節が必要な場合、ＮＫＧ２Ｄ誘導の分子が好まれ、これは、それ自身による再誘導の溶解を引き起こさない。しかし、リンパ球細胞毒性を直接引き起こす多機能ＮＫＧ２Ｄ誘導ポリペプチドが用いられたときに、標的細胞の除去がより明確になるであろう。しかも、多機能ＮＫＧ２Ｄ誘導ポリペプチドは、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＮＫ細胞を別々にリクルートするものであり、ある特定の応用にも好ましいものとなりうる。
【００２１】
本発明の方法の好ましい態様として、該結合部位は、免疫グロブリン鎖の結合部位である。
【００２２】
本発明の方法の他の好ましい態様として、該結合部位は、該レセプター複合体の天然ＮＫＧ２Ｄリガンドである。
【００２３】
本発明の方法の特に好ましい態様として、該天然ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＭＩＣ−Ａ、ＭＩＣ−Ｂ、ＵＬＢＰ１およびＵＬＢＰ２からなる群より選ばれる。
【００２４】
本発明の方法の他の好ましい態様として、該結合部位は、ＮＫＧ２ＤまたはＤＡＰ１０の細胞外エピトープを特異的に認識する。
【００２５】
更に、本発明の方法の好ましい態様として、該レセプターまたはリガンド機能は、腫瘍関連抗原、感染性因子の抗原、または、該腫瘍関連抗原や表面マーカーと相互作用する識別抗原（ＣＤ抗原）、天然リガンド、レセプター、これらのフラグメントまたはこれらの修飾体のような細胞の分集団の表面マーカー、に対する抗体、フラグメントまたはこれらの誘導体の抗原結合部位であり、好ましくは、腫瘍関連抗原のｅｒｂＢ−２、−３、−４に結合するヘレグリン、ＨＩＶ感染細胞のｇｐ  １２０と相互作用するＣＤ４、メラノサイトおよびこれら由来の腫瘍（悪性黒色腫）のＭＳＨレセプターに結合するメラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）もしくは相当するケモカインレセプターに結合するケモカインまたはあらかじめ定義された特異性のＴ細胞レセプターに結合するペプチドと複合体を形成するＭＨＣ分子やこれらのフラグメントであり従ってあらかじめ定義されたＭＨＣペプチド複合体やインフルエンザウイルスの血球凝集素（ＨＡ）と相互作用するＮＫｐ４６と特異的に相互作用する特定のＴ細胞分集団やＴ細胞レセプターの抗原結合部位を認識するものである。
【００２６】
インフルエンザウイルスの血液凝集素が、ＮＫ細胞を直接活性化するのと同様に、ＮＫ細胞によるウイルス感染標的細胞の溶解を補強することが、これまでの報告に示された  （Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｅ，  Ａｄｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４７  （１９８９），  １８７−３７６  ａｎｄ  Ａｌｓｈｅｉｋｈｌｙ，  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １７  （１９８３），  １２９−３８  ａｎｄ  Ａｌｓｈｅｉｋｈｌｙ，  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２２  （１９８５），  ５２９−３８）。ＮＫｐ４６の細胞外ドメインと免疫グロブリン（Ｉｇ）のＦｃ部からなる融合タンパク質が、一時的にトランスフェクションされた２９３細胞の細胞表面に発現した血液凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質に直接結合することが、ごく最近示された（Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９  （２００１），  １０５５−６０）。健康なドナーの抹消血液リンパ球由来のＮＫ系であるＮＫ  Ｇａｌ細胞の添加は、非トランスフェクションの細胞より少なくとも４倍以上のＨＮ−トランスフェクション２９３Ｔ細胞の溶解を引き起こした（Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０９  （２００１），  １０５５６０）。同様の結果が、インフルエンザウイルス感染の標的細胞でも得られた。これらのデータは、ＮＫｐ４６と血液凝集素との直接の相互作用があることを示し、更に、ＮＫ細胞によるインフルエンザウイルス感染細胞の除去の機構が、ウイルス感染細胞上に表出した血液凝集素（ＨＡ）とＮＫ細胞表面に表出したＮＫｐ４６との相互作用によるものであることを示すものである。
【００２７】
インフルエンザウイルスの血液凝集素（ＨＡ）と結合できる該レセプターまたはリガンド機能は、例えば以下のようなモノクローナル抗体由来のものである。
【００２８】
ａ）インフルエンザＡウイルス株Ｈ３の１５５，１５９，１８８，１８９，１９３，１９８，１９９，２０１残基に結合するモノクローナル抗体ＩＩＢ４（Ｋｏｓｔｏｌａｎｓｋｙ，  Ｊ  Ｇｅｎ  ８１  （２０００），  １７２７−３５）。
【００２９】
ｂ）Ｈ３Ｎ２インフルエンザＡ株のＨＡを認識するインフルエンザウイルスＡ／Ａｉｃｈｉ／２／６８、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３／７５およびＡ／Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅｓ／２／８２（すべてＨ３Ｎ２）からのブロメライン−切断血液凝集素（ＢＨＡ）により順次免疫されたマウス由来のモノクローナル抗体ＬＭＢＨ６（Ｖａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔ，  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７９  （１９９８），  １７８１−９１）。
【００３０】
ｃ）ＨＡ−Ｈ２のステム領域に誘導されたモノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）Ｃ１７９（Ｌｉｐａｔｏｖ，  Ａｃｔａ  Ｖｉｒｏｌ．  ４１  （１９９７），  ３３７−４０）。
【００３１】
この態様において、該第２のドメインは、ひとつの好ましい態様として、癌、ウイルス感染または自己免疫状態等のヒトの疾患の病的進行に伴う細胞表面分子の細胞外部分である抗原を示すものである。このような標的細胞の除去や機能的沈静化は、この発明の二重機能分子のｉｎ  ｖｉｖｏへの応用により容易にでき、従って、治療における利益を与えるものとなろう。
【００３２】
該抗体の「フラグメント」は、完全な抗体の結合特異性を保持し、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントを含むものである。該抗体の「誘導体」も、結合特異性を保持し、ｓｃＦｖフラグメントを含むものである。更なる情報としては、ＭａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｍｍａｌ”  ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １９８８を参照のこと。
【００３３】
ヒト癌疾患は、例えば、乳癌腫、乳癌、結腸癌、膵臓癌、卵巣癌、腎臓細胞および頸部の癌腫、黒色腫、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭部および頸部の癌、胃癌、横紋筋肉腫、前立腺癌、濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、ＴおよびＢ細胞白血病およびホジキンリンパ腫のような癌である。
【００３４】
腫瘍関連抗原は、ＣＥＡ（Ｓｕｎｄｂｌａｄ  Ｈｕｍ．Ｐａｔｈｏｌ．２７，  （１９９６）２９７−３０１，ｌｌａｎｔｚｉｓ  Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．７６（１９９７），７０３−１６）、ＥＧＦＲタイプＩ（Ｎｏｕｒｉ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．６（２０００），４９５−５００）およびＥｐＣＡＭ  （１７−１Ａ／ＫＳＡ／ＧＡ７３３−２，Ｂａｌｚａｒ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７（１９９９），６９９−７１２）のような汎癌膜抗原を含む。ＥＧＦＲタイプＩはグリオーム、結腸癌腫のＥｐＣＡＭ、ＭＲＤ（最小残留疾患）、結腸癌腫で特に過剰発現する。ＥＧＦＲタイプＩＩ（Ｈｅｒ−２，ＥｒｂＢ２，Ｓｕｇａｎｏ  Ｉｎｔ．Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８９（２０００），３２９−３６）は、乳癌腫で調整され、ＴＡＧ−７２糖タンパク質（ｓＴＮ  抗原，Ｋａｔｈａｎ  Ａｒｃｈ．  ａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１２４（２０００），２３４−９）は、乳癌で発現するのが見出されている。ＥＧＦＲ欠失ネオエピトープは、腫瘍関連抗原としても働くであろう（Ｓａｍｐｓｏｎ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７（２０００），７５０３−８）。抗原Ａ３３（Ｒｉｔｔｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２３６  （１９９７），  ６８２−６），  Ｌｅｗｉｓ−Ｙ  （ＤｉＣａｒｌｏ  Ｏｎｃｏ．  ｌ  Ｒｅｐ．８  （２００１），  ３８７−９２）、Ｃｏｒａ抗原（ＣＥＡ−関連細胞吸着分子ＣＥＡＣＡＭ  ６，ＣＤ６６ｃ，  ＮＣＡ−９０，  Ｋｉｎｕｇａｓａ  ｆｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ７６  （１９９８），  １４８−５３）およびＭＵＣ−１  （ムチン）は、結腸癌腫に関連する（ｌｉｄａ  Ｏｎｃｏｌ．  Ｒｅｓ．  １０  （１９９８），  ４０７−１４）。Ｔｈｏｍｓｅｎ  Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ−抗原（ＴＦ，  Ｇａｌ１  −３ＧａｌＮＡｃａ１−Ｏ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）は、結腸癌腫のみならず（Ｂａｌｄｕｓ  Ｃａｎｃｅｒ  ８２  （１９９８），  １０１９−２７）、乳癌においても見出されている（Ｇｌｉｎｓｋｙ  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｒｅｓ．  ６０  （２０００），  ２５８４−８）。頭部および頸部の癌でのＬｙ−６およびデスモグレイン４の過剰発現（Ｅｓｈｅｌ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７５  （２０００），  １２８３３−４０）、および、胃癌腫でのＥ−カドヘリンネオオピトープの過剰発現が、記載されている（Ｆｕｋｕｄｏｍｅ  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８８  （２０００），  ５７９−８３）。前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ，  Ｌａｐｉｄｕｓ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ４５  （２０００），  ３５０−４）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ，  Ｇｕ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １９１  （２０００）  ２８８−９６）およびＳＴＥＡＰ  （Ｈｕｂｅｒｔ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９６  （１９９９），  １４５２３−８）は、前立腺癌に関連する。胎児型アセチルコリンレセプター（ＡＣｈＲ）のアルファおよびガンマサブユニットは、横紋筋肉腫の特異的な免疫組織化学的マーカーである（ＲＭＳ，Ｇａｔｔｅｎｌｏｈｎｅｒ  Ｄｉａｇｎ．  Ｍｏｌ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ３  （１９９８），  １２９−３４）。
【００３５】
ＣＤ２０と濾胞性非ホジキンリンパ腫との関連（Ｙａｔａｂｅ  Ｂｌｏｏｄ  ９５  （２０００），  ２２５３−６１，  Ｖｏｓｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  （Ｈｕｎｔｉｎｇｔ）  ２  （２００１）  １４１−７）、ＣＤ１９とＢ−細胞リンパ腫との関連（Ｋｒｏｆｔ  Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．  １１５  （２００１），  ３８５−９５）、Ｗｕｅ−１プラスマ細胞抗原と多発性骨髄腫との関連（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  ４３７  （２０００），  ３７２−９）、ＣＤ２２とＢ細胞白血病との関連（ｄＡｒｅｎａ  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏ．  ６４  （２０００），  ２７５−８１）、ＣＤ７とＴ細胞白血病との関連（Ｐｏｒｗｉｔ−ＭａｃＤｏｎａｌｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １４  （２０００），  ８１６−２５）およびＣＤ２５と特定のＴおよびＢ細胞白血病との関連が、記載されている（Ｗｕ  Ａｒｃｈ．  Ｐａｔｈｏｌ．  Ｌａｂ．  Ｍｅｄ．  １２４  （２０００），  １７１０−３）。ＣＤ３０は、ホジキンリンパ腫と関連付けられた（Ｍｉｒ  Ｂｌｏｏｄ  ９６  （２０００），  ４３０７−１２）。黒色腫のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ，  Ｅｉｓｅｎｍａｎｎ  Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ８  （１９９９），  ５０７−１３）とガングリオシドＧＤ３の発現が、黒色腫で観察された（Ｗｅｌｔｅ
Ｅｘｐ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ２  （１９９７），  ６４−９）。一方、ＧＤ３が、小細胞肺癌でも見出されている（ＳＣＬＣ，  Ｂｒｅｚｉｃｋａ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  １  （２０００），  ２９−３６）。ガングリオシドＧＤ２の発現が、ＳＣＬＣおよび神経芽細胞腫でも調整されていた（Ｃｈｅｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １０  （１９８６），  ５１１２−８）。卵巣癌は、ミューレリアン阻害基質（ＭＩＳ）レセプタータイプＩＩと関連し（Ｍａｓｉａｋｏｓ  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １１  （１９９９），  ３４８８−９９）、腎臓癌は、頸部癌と同様にカーボアンハイドラーゼ９の発現と関連していた（ＭＮ／ＣＡＩＸ，Ｇｒａｂｍａｉｅｒ  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８５  （２０００）  ８６５−７０）。ＣＡ１９−９の上昇した発現レベルが、膵臓癌で見出された（Ｎａｚｌｉ  Ｈｅｐａｔｏｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ４７  （２０００），  １７５０−２）。
【００３６】
本発明の方法の最も好ましい態様として、該腫瘍関連抗原は、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、  ＣＥＡ，Ｍｕｃ−１、ｅｒｂＢ−２、−３および−４、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、ＥＧＦ−レセプター（例えば、ＥＧＦＲタイプＩまたはＥＧＦＲタイプＩＩ）、ＥＧＦＲ欠失ネオエピトープ、ＣＡ１９−９、Ｍｕｃ−１、ＬｅＹ、ＴＦ−、Ｔｎ−およびｓＴｎ−抗原、ＴＡＧ−７２、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ１９およびＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、Ｉｇ−αおよびＩｇ−β、Ａ３３およびＧ２５０、ＣＤ３０、ＭＣＳＰおよびｇｐ１００、ＣＤ４４−ｖ６、ＭＴ−ＭＭＰｓ、（ＭＩＳ）レセプタータイプＩＩ、カーボアンハイドラーゼ９、Ｆ１９−抗原、Ｌｙ６、デスモグレイン４、  ＰＳＣＡ、Ｗｕｅ−１、ＧＤ２およびＧＤ３、および、ＴＭ４ＳＦ−抗原（ＣＤ６３、Ｌ６、ＣＯ−２９、ＳＡＳ）または胎児型アセチルコリンレセプター（ＡＣｈＲ）のアルファおよびガンマサブユニット、からなる群より選ばれる。
【００３７】
インフルエンザＡ、ＢおよびＣは、すべてセグメント化されたゲノムを有しているが、特定のインフルエンザＡサブタイプとインフルエンザＢのみが、ヒトに対する重症の疾患の原因となる。インフルエンザの２つの主要なタンパク質は、表面糖タンパク質−血液凝集素（ＨＡ）とノイラミニダーゼ（ＮＡ）である。血液凝集素（ＨＡ）は、宿主細胞レセプターとの結合およびウイルス粒子の膜融合に関連し、抗体の中和の主要な標的を示す。インフルエンザの感染力は、特定の宿主のプロテアーゼによるＨＡの切断に依存する。ここで、ＮＡは、細胞からの子孫ウイルス粒子の放出に関連する。自然のインフルエンザの宿主である鳥では、ウイルスは、胃腸感染の原因となり、排泄物−経口ルートを通じ伝染する。哺乳動物では、インフルエンザサブタイプの複製は、呼吸性上皮細胞に限られているが、全身的な合併症も起こりうる。
【００３８】
風疹ウイルス（ＲＶ）は、はしかとして知られる疾患の原因物質である。風疹は、小児期に多い疾患であり、世界中にわたって風土性のものである。風疹の自然感染は、ヒトにおいてのみ起こり通常は軽いものであるが、大人では多発性関節痛などの合併症が起こることがある。妊娠期間の最初の３分の１の間での女性へのＲＶの感染は、先天性風疹症候群（ＣＲＳ）として知られる、新生児の種々の先天性欠陥を引き起こす。ＲＶ感染が奇形発生に結びつくという経路は、解明されてはいない。感染した胎児組織についての細胞病理学は、器官形成に伴う前駆体細胞の細胞分化の阻害とともに、ネクローシスおよび／またはアポトーシスが起こることを示唆している。風疹ウイルス（ＲＶ）粒子は、２つの糖化膜タンパク質、Ｅ１およびＥ２を含んでおり、これは、ヘテロダイマーとして存在し、ウイルス粒子表面にウイルススパイク複合体を形成する。Ｅ１−Ｅ２ヘテロダイマーの形成は、細胞内輸送と、Ｅ１およびＥ２双方の細胞表面での発現に不可欠のものである（Ｙａｎｇ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２  （１９９８），  ８７４７−８７５５）。風疹ウイルス感染細胞で発現する糖タンパク質Ｅ１およびＥ２は、この発明の多機能ポリペプチドが結合する標的分子である。
【００３９】
狂犬病は、野生生物にとり重大な疾患であり、犬における狂犬病は世界の多くの開発途上国で今もなお主要な公衆衛生の問題である。狂犬病ウイルスは、動物が噛むことによる唾液を通じて伝染する。ごく最近、しばしば暴露したと気がつかないうちに、こうもりがヒトへの狂犬病を伝染することが発見された。この古典的な形態では、狂犬病はよく知られているが、ランドリー−ギャン−バレー症候群と診断されるこれに似た症例の麻痺性の疾患の場合、疑わしい問題が残る。狂犬病に暴露した後は、非免疫患者の場合、創傷部位の洗浄、狂犬病ワクチンおよびヒト狂犬病−特異的免疫グロブリンの投与により、狂犬病を防ぐことができる。
【００４０】
狂犬病糖タンパク質ＲＧＰは、狂犬病ウイルス感染の生物学的および病理学的に重要な５０５アミノ酸のタイプＩの膜透過糖タンパク質である。ＲＧＰは、宿主による中和抗体の発生も刺激する。Ｎ−架橋糖化は、免疫原性およびＧＲＰの細胞表面の発現に必要なものである（Ｗｏｊｃｚｙｋ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４  （１９９５），  ２５９９−２６０９）。感染細胞表面に発現した狂犬病ウイルスのＲＧＰは、この発明の多機能ポリペプチドが結合する標的分子である。
【００４１】
本発明の方法の他の最も好ましい態様として、感染細胞の該表面マーカーは、ヒトレトロウイルス（ＨＴＬＶ  ＩおよびＩＩ、ＨＩＶ１および２）やヒトヘルペスウイルス（ＨＳＶ１および２、ＣＭＶ、ＥＢＶ）等のウイルスエンベロープ抗原、インフルエンザウイルス（インフルエンザＡ、ＢまたはＣ）等の血液凝集素、風疹ウイルスの糖タンパク質Ｅ１およびＥ２や狂犬病ウイルスの糖タンパク質ＲＧＰ、からなる群より選ばれる。
【００４２】
本発明の方法の他の好ましい態様として、該多機能ポリペプチドは、二重特異性分子、好ましくは二重特異性抗体である。二重特異性抗体の構造および世代についての更なる情報は、ＷＯ／００／０６６０５を参照のこと。
【００４３】
本発明の方法の特に好ましい態様として、該多機能ポリペプチドは、合成、キメラおよびヒト化抗体からなる群より選ばれる。
【００４４】
本発明の方法の更に好ましい態様として、該多機能ポリペプチドは、単鎖である。
【００４５】
本発明の方法の更なる好ましい態様として、該２つのドメインは、ポリぺプチドリンカーにより結合されている。
【００４６】
本発明の方法の他の好ましい態様として、該第１および／または第２のドメインは、天然抗体のＶＨおよびＶＬ領域を真似たものもしくはこれに相当するものである。このような抗体の例には、ヒト、ネズミ、ラット、らくだの抗体；不朽化Ｂ−細胞（例えばハイブリドーマ細胞）、コンビナトリアル抗体ライブラリーのｉｎ  ｖｉｔｒｏ部分（例えばプラージュディスプレイによる）またはＩｇトランスジェニックマウス由来の抗体が含まれる。
【００４７】
本発明の方法の更に好ましい態様として、該ドメインの少なくともひとつは、該抗体の可変領域の単鎖のフラグメントである。
【００４８】
本発明の方法の更なる好ましい態様として、該ドメインは、ＶＬＮＫＧ２Ｄ−ＶＨＮＫＧ２Ｄ−ＶＨＴＡ−ＶＬ−ＴＡまたはＶＬＴＡ−ＶＨＴＡ−ＶＨＮＫＧ２Ｄ−ＶＬＮＫＧ２Ｄの順で並ぶものであり、ここでＴＡは標的抗原を示す。
【００４９】
本発明の方法の特に好ましい態様として、該腫瘍関連抗原は、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＣＥＡ、Ｍｕｃ−１、ｅｒｂＢ−２、−３および−４、Ｅｐ−ＣＡＭ、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、ＥＧＦ−レセプター（例えばＥＧＦＲ  タイプＩまたはＥＧＦＲ  タイプＩＩ）、ＥＧＦＲ欠失ネオエピトープ、ＣＡ１９−９、Ｍｕｃ−１、ＬｅＹ、ＴＦ−、Ｔｎ−およびｓＴｎ−抗原、ＴＡＧ−７２、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ、Ｃｏｒａ抗原、ＣＤ７、ＣＤ１９およびＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、Ｉｇ−αおよびＩｇ−β、Ａ３３およびＧ２５０、ＣＤ３０、ＭＣＳＰおよびｇｐ１００、ＣＤ４４−ｖ６、ＭＴ−ＭＭＰｓ、（ＭＩＳ）レセプタータイプＩＩ、カーボアンハイドラーゼ９、Ｆ１９−抗原、Ｌｙ６、デスモグレイン４、ＰＳＣＡ、Ｗｕｅ−１、ＧＤ２およびＧＤ３、および、ＴＭ４ＳＰ−抗原（ＣＤ６３，Ｌ６，ＣＯ−２９，ＳＡＳ）、胎児型アセチルコリンレセプター（ＡＣｈＲ）のアルファおよびガンマサブユニット、からなる群より選ばれる。
【００５０】
本発明の方法の他の好ましい態様として、該ポリペプチドリンカーは、複数のグリシン、セリンおよび／またはアラニン残基を含む。
【００５１】
本発明の方法の更に特に好ましい態様として、該ポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列の複数の連続した複製を含む。
【００５２】
更に、本発明の方法の特に好ましい態様として、該ポリペプチドリンカーは、１から５、５から１０、または１０から１５のアミノ酸残基を含む。
【００５３】
本発明の方法の最も好ましい態様として、該ポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒのアミノ酸配列を含む。
【００５４】
本発明の方法の更に好ましい態様として、該多機能ポリペプチドは、少なくとも１つの更なるドメインを含む。
【００５５】
標的細胞に特異的な免疫反応は、この発明の二重特異性分子と、標的細胞に補助刺激または補助活性化特性を付与する因子との併用によりさらに支援されうる。
【００５６】
追加的な因子との併用の１つの選択肢として、この発明の分子がそれ自身追加的な機能のドメインを備えており、これは例えば他のアミノ酸リンカーを通じて結合するものである。これらの追加的なドメインは、例えばＣＤ２８−やＣＤ１３７−の結びつけを媒介しうる（下記参照）。さらに、この発明の二重特異性分子の誘導体が１以上の追加的機能ドメインを含んで構成されてもよいと考えられる。
【００５７】
あるいは、この発明の分子は、例えばＣＤ２８を結びつける該分子の１つとＣＤ１３７を結びつける他の１つのように、組成物中の１以上の追加的因子とも併用されるであろう。
【００５８】
上述のこれらの因子は、例えば標的細胞を特異的に認識する結合部位と、Ｔ−およびＮＫ−細胞上でＣＤ２８と相互作用するＢ７−１（ＣＤ８０）またはＢ７−２（ＣＤ８６）の細胞外ドメインとからなりうる。あるいは、Ｂ７−１またはＢ７−２は、ＣＤ２８−特異的抗体の結合部位に置き換わりうる。Ｔ−リンパ球上では、ＣＤ２８は補助刺激分子として働き、これは抗原特異的ＴＣＲの結びつけを通じて主要なＴ細胞活性化の間に（＝第１のシグナル）、いわゆる第２のシグナルを媒介するために絶対必要なものである。ＮＫ細胞上では、ＣＤ２８は、ＣＤ２８リガンドを発現する標的細胞に対する細胞毒性の誘発に寄与する（Ｃｈａｍｂｅｒｓ  （１９９６）  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５：  ３１１）。この発明の二重特異性分子と優先的に併用されうる他の因子としては、標的細胞を特異的に認識する結合部位と、ＣＤ１３７−特異的抗体やＣＤ１３７−リガンドの細胞外部分の結合部位とからなりうる。
【００５９】
本発明の方法の最も好ましい態様として、該更なるドメインは、共有結合または非共有結合にて結合している。
【００６０】
本発明の方法の他の最も好ましい態様として、該少なくとも１つの更なるドメインは、生物学的活性に適した立体配座であり、イオンを封鎖したり固体担体やあらかじめ選択された決定基に選択的に結合する能力のある立体配座を有するエフェクター分子を含む。
【００６１】
本発明の方法の更に最も好ましい態様として、該更なるドメインは、補助刺激機能および／または補助活性化機能を付与する。
【００６２】
本発明の方法の特に好ましい態様として、該補助刺激機能は、ＣＤ２８−リガンドまたはＣＤ３７−リガンドにより媒介される。
【００６３】
本発明の方法の更に特に好ましい態様として、該ＣＤ２８−リガンドまたはＣＤ３７−リガンドは、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、アプタマー、抗体、またはこれらの機能性フラグメントもしくは機能性誘導体である。
【００６４】
抗体の「機能性フラグメント」の用語は、該抗体の結合特異性を保持した抗体のフラグメントとして定義される（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”  ＬＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８８を参照）。このようなフラグメントの例としては、ＦａｂとＦ（ａｂ）２フラグメントがある。該抗体の「機能性誘導体」は、該抗体の結合特異性を保持もしくは実質的に保持している。該誘導体の例としては、ｓｃＦｖフラグメントがある。
【００６５】
この発明はまた、その発現によりこの発明の多機能ポリペプチドおよび／または多機能ポリペプチドの機能性部分をエンコードするポリヌクレオチドにも関連する。「機能性部分」の用語は、この発明の多機能ポリペプチド構造の第１、第２または更なるドメインの特定の機能を付与する部分として、この発明に従って定義される。
【００６６】
ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは、ＰＮＡ等のこれらの誘導体でよい。好ましくは、該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。
【００６７】
さらに、この発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関連する。
【００６８】
多数の適したベクターが分子生物学の当業者に知られており、その選択は、必要とする機能に依存し、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージおよび遺伝子工学で汎用されている他のベクターを含む。当業者によく知られた方法を用いて、種々のプラスミドとベクターを構築することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （１９８９）  Ｎ．  Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｎ．  Ｙ．  （１９８９），  （１９９４）に記載された技術を参照のこと。この発明のベクターは、標的細胞に輸送するためにリポソームに再構成することができる。
【００６９】
ベクターは、例えばファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスベクターでよい。レトロウイルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損でよい。後者では、ウイルス増殖は、一般的に宿主細胞の補完によってのみ起こるであろう。
【００７０】
ポリヌクレオチドは、宿主中の増殖のための選択可能なマーカーを含むベクターと結合されてもよい。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿のような沈殿中や、荷電した脂質との複合体中に導入される。ベクターがウイルスの場合は、適当なパッケージング細胞系を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏでパッケージングし、宿主細胞にトランスフェクションすればよい。
【００７１】
ポリヌクレオチド挿入は、いくつかの例を挙げると、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌のｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０の早期および晩期プロモーター、およびレトロウイルスＬＴＲｓのプロモーターのような適当なプロモーターに有効に結合するべきである。他の適したプロモーターは、当業者に知られるであろう。発現構築物は、さらに転写開始、終了のための部位、および、転写された領域には、翻訳のためのリボソーム結合部位を含みうる。構築物に発現した転写のコード部分は、好ましくは翻訳されるポリペプチドの最初に翻訳開始コドンを、終わりに適当に位置した終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含みうる。
【００７２】
すでに示したように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択可能なマーカーを含みうる。このようなマーカーは、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸還元酵素、Ｇ４１８またはネオマイシン耐性、大腸菌や他のバクテリア中での培養のためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。適当な宿主の代表的な例としては、これに限定されないが、大腸菌、ストレプトマイセスおよびチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞のようなバクテリア細胞；酵母細胞のような真菌細胞；ショウジョウバエＳ２およびスポドペテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３およびボウズ（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫細胞のような動物細胞；植物細胞が含まれる。上述の宿主細胞の適当な培地および条件は、この技術分野で知られている。
【００７３】
バクテリアに好ましく用いられるベクターとしては、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能なｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が含まれる。
【００７４】
好ましい真核細胞のベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩおよびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。一般的に、典型的なクローニングベクターには、ｐＢｓｃｐｔ  ｓｋ、ｐＧＥＭ、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２２およびｐＧＢＴ９が含まれる。典型的な発現ベクターには、ｐＴＲＥ、ｐＣＡＬ−ｎ−ＥＫ、ｐＥＳＰ−１、ｐＯＰ１３ＣＡＴが含まれる。他の適したベクターも、当業者にとって非常に明白である。
【００７５】
さらに、例えば、上述したようにポリペプチドをエンコードする核酸分子をゲノム中にすでに含む哺乳動物細胞も使用できるが、弱いプロモーター等のために同様のものを発現しないか、または、適切に発現しない。従って、同様のものの発現を誘発するように、哺乳動物細胞の該ポリペプチドをエンコードする内因性の核酸分子の直ぐ近傍に強いプロモーターのような調節塩基配列を導入すればよい。
【００７６】
この文脈において「調整塩基配列」の用語は、エンコードする遺伝子の直ぐ近傍での細胞のゲノムへの組込により、ポリペプチドの発現を増加させるために用いることができる核酸分子を意味する。このような調整塩基配列は、プロモーター、エンハンサー、不活性化サイレンサーイントロン配列、３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲコード領域、タンパク質および／またはＲＮＡ安定化要素、調節タンパク質をエンコードする核酸分子を含み、例えば、転写因子、遺伝子発現を誘発するまたは引き金となることができるもの、または、遺伝子発現を活性化および／または遺伝子産物量を増加させるものとして知られている他の遺伝子発現制御要素などである。該調整塩基配列の導入は、ポリペプチドの発現の増加および／または誘発を導き、結果として細胞中のポリペプチド量の増加をもたらす。従って、本発明は、新規のおよび／または増加したポリペプチドの発現を提供することを目的とする。
【００７７】
この発明は、さらに、本発明のポリヌクレオチドをトランスフェクションした細胞に関する。
【００７８】
この発明の細胞は、真核細胞（例えば、酵母、昆虫または哺乳動物）または原核細胞でよい。もっとも好ましくは、この発明の細胞は、例えばＣＨＯ−細胞、ＣＯＳ、２９３またはボウズ（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫細胞等の細胞系の仲間のヒト細胞のような哺乳動物のものである。
【００７９】
宿主細胞への構造の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン性脂質−媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によりなされるであろう。このような方法は、Ｄａｖｉｓ、Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８６）のような、多くの標準的な研究マニュアルに記載されている。実際、ポリペプチドが組み替えベクターを欠いた宿主細胞により発現することは、特に予想されることである。
【００８０】
本発明は、さらに、添付の実施例やここに記載されるように、この発明の多機能ポリペプチドおよび／または多機能ポリペプチドの機能性部分の発現をエンコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供するものである。アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ３および４に相当するヌクレオチド（ｎｔ）６４〜４６２および（ｎｔ）１２３〜４６２からのヒトＮＫＧ２Ｄの２つの異なるフラグメントの核酸配列は、図１に示すｃＤＮＡ−テンプレートからのＰＣＲ−増幅により得られた。得られたプラスミドＶＶ１−ＮＫＧ２−Ｄ（ｎｔ６４〜４６２）およびＶＶ１−ＮＫＧ２−Ｄ（ｎｔ１２３〜４６２）を用いて、添付の実施例に示すように６〜８週齢の３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫した。得られたリンパ球は、添付の実施例に示すようにハイブリドーマの選択を行うためにＳＰ２／０マウスミエローマ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＵＳＡ）と融合した。１１Ｂ２、８Ｇ７および６Ｅ５と指定された３つのハイブリドーマは、ヒトＣＤ８＋Ｔ−リンパ球およびＮＫ−細胞双方の表面の天然ＮＫＧ２Ｄと反応するモノクローナル抗体を産生することが示された（より詳細には、添付の実施例を参照）。サブクローン１１Ｂ２Ｄ１０、８Ｇ７Ｃ１０および６Ｅ５Ａ７の上清は、（添付の実施例に示されるように）ＣＤ５６＋ＮＫ−およびＣＤ８＋Ｔ−細胞上のＮＫＧ２Ｄと反応することが示された。これらのサブクローンはブダペスト条約の規定に従い、２００１年３月２３日にＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｉｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，  Ｍａｓｃｈｅｒｏｄｅｒ  Ｗｅｇ  １ｂ，  ３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託され、取得番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２４９６，ＤＳＭ  ＡＣＣ２４９７、ＤＳＭ  ＡＣＣ２４９８をそれぞれ得た。
【００８１】
さらに、この発明は、例えばＭａｃｋ，１９９５，ＰＮＡＳ，９２，７０２１に記載されているように、本発明の細胞を培養し多機能ポリペプチドまたはそれらの機能性部分を培養物から単離することを含むこの発明の多機能ポリペプチドおよび／または多機能ポリペプチドの部分を調製する方法に関する。
【００８２】
ポリペプチドは、硫酸アンモニウムやエタノールによる沈殿、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイロドキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーなどのよく知られた方法により、組み換え細胞培地から回収し、精製することができる。もっとも好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が精製に用いられる。
【００８３】
組み換え産物の製造に用いられた宿主に依存して、ポリペプチドはグリコシル化されているか、またはグリコシル化されていないことがある。さらに、ポリペプチドは、ある場合には宿主に媒介されるプロセスの結果として初期の（修飾された）メチオニン残基を含んでいることもある。従って、翻訳開始コドンとしてエンコードされたＮ−末端メチオニンが、一般的には真核細胞内で翻訳後にいずれのタンパク質からも高い効率で除去されることは、この技術分野でよく知られたことである。ほとんどの原核細胞においてもほとんどのタンパク質のＮ−末端メチオニンが効率的に除去される一方、いくつかのタンパク質では、Ｎ−末端メチオニンが共有結合的に結合しているアミノ酸の性質に依存して、この原核細胞での除去プロセスは効率的ではない。
【００８４】
例えばこの技術分野で知られたｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳アッセイを用いることにより、細胞を必要としない系においてもタンパク質が発現されることも理解される。
【００８５】
「発現」の用語は、細胞におけるタンパク質またはヌクレオチド配列の産生を意味する。しかし、該用語は、細胞を必要としない系におけるタンパク質の発現も含むものである。それは、その産物をエンコードするＤＮＡからＲＮＡ産物への転写、転写後修飾および／またはタンパク質産物またはポリペプチドへの翻訳、また、起こりうる翻訳後修飾を含む。前掲を参照のこと。用いられた特異的な構造と状態に依存し、タンパク質は細胞、培地またはこれらの両方から回収されうる。この出願において「タンパク質」および「ポリペプチド」の用語は、相互に交換可能なものである。「ポリペプチド」は、アミノ酸のポリマー（アミノ酸配列）を意味し、特定の分子鎖長を意味するものではない。従って、ペプチドおよびオリゴペプチドは、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などポリペプチドの翻訳後修飾をも意味しまたは含むものである。前掲を参照のこと。その定義に含まれるものとしては、例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸アナログ（例えば、非天然アミノ酸等を含む）を含むポリペプチド、置換された結合を有するポリペプチド、また、自然に起こるもしくは自然に起こらない双方のこの技術分野で知られた他の修飾がある。例えば、天然タンパク質を発現するのみならず、融合ポリペプチドとしてのタンパク質を発現したり、例えば培地へのタンパク質の分泌に耐えるためなど、宿主細胞の特異的な区画にタンパク質を向わせるシグナル配列を付加することが可能であることは、当業者によく知られたことである。この発明のタンパク質は、タンパク質精製を容易にするために付加された１（のポリペプチド）またはそれ以上の付加ポリペプチドドメインを有する組み換えタンパク質として発現することもありうる。このような精製を容易にするドメインには、これに限定されないが、固定化金属での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリンでの精製を可能にするプロテインＡドメイン、ＦＬＡＧＳエクステンション／アフィニティ精製系（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ，  Ｓｅａｔｔｌｅ  ＷＡ）に利用されるドメインなどが含まれる。ファクターＸＡやエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）のような切断可能なリンカー配列を、精製ドメインと目的のタンパク質との間に包含することは、精製を容易にするために有用である。このような発現ベクターは、細胞周期相互作用タンパク質とコンプロマイズした融合タンパク質の発現を提供し、チオレドキシンに続く６つのヒスチジン残基をエンコードする核酸および、エンテロキナーゼ切断部位を含んでいる。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、Ｐｏｒａｔｈ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３  （１９９２），  ２６３−２８１に記載されている）での精製を容易にする一方、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からのタンパク質の精製手段を提供する。組み換え産物に加え、この発明のタンパク質のフラグメントは、固相技術を用いた直接ペプチド合成により産生されうる（Ｓｔｅｗａ���ｔ  ｅｔ  ａｌ  （１９６９）  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８５  （１９６３），  ２１４９−２１５４参照）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのタンパク質合成は、手動操作もしくは自動操作の技術によってなされうる。自動合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ  （Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）を用いて、製造者から提供される説明書に従って行うことができる。この発明のポリペプチドの種々のフラグメントは、完全長の分子を生産するために化学的方法を用いて個別にまたは組み合わせて、化学的に合成および／または修飾されうる。一旦発現または合成されると、本発明のタンパク質は、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などのこの技術分野で標準的な手順に従って精製されうる（Ｓｃｏｐｅｓ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと）。医薬用途には、少なくとも約９０から９５％の均質性を有する実質的に純粋なタンパク質が好ましく、９８から９９％またはそれ以上の均質性のものがもっとも好ましい。一旦精製されると、部分的にまたは望む均質性で、タンパク質は、治療（体外的なものも含め）に用いられ、または、アッセイ手順の発展および実行のために用いられうる。
【００８６】
この発明はまた、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを含む組成物に関する。
【００８７】
本発明の組成物の好ましい態様として、該組成物は、補助刺激機能および／または補助活性化機能を付与する分子をさらに含む。
【００８８】
この態様では、組成物は、上記に定義したように該更なるドメインを含むかまたは含まない多機能ポリペプチドを含みうる。もし、多機能ポリペプチドが補助刺激機能および／または補助活性化機能を付与する更なるドメインを含む場合は、この発明の組成物に含まれる該更なる分子は同一かまたは異なる補助刺激機能および／または補助活性化機能を有しうる。
【００８９】
該組成物では、含有される成分は、以下でさらに特定されるように、好ましくは無菌状態で、任意にバッファーまたは水溶液中で、バイアル瓶などの１またはそれ以上の容器に個別に包装され、一緒にされる。
【００９０】
本発明の組成物の特に好ましい態様として、該補助刺激機能は、ＣＤ２８−リガンドまたはＣＤ１３７−リガンドにより媒介される。
【００９１】
本発明の組成物の他の特に好ましい態様として、該ＣＤ２８−リガンドまたはＣＤ１３７−リガンドは、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、アプタマー、抗体、またはこれらの機能性フラグメントもしくは機能性誘導体である。
【００９２】
本発明の組成物のさらに好ましい態様として、該組成物は、医薬に許容されるキャリアーを任意にさらに含む医薬組成物である。
【００９３】
組成物はまた、望む処方に依存して、医薬に許容され、通常は無菌の、無毒のキャリアーや希釈剤を含むことができ、そしてこれらは、動物やヒトに投与する医薬組成物を処方するのに通常用いられる賦形剤として定義される。希釈剤は、組み合わせによる生物学的活性に影響しないように選択される。このような希釈剤の例としては、蒸留水、生理的食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、ハンクス液がある。さらに、医薬組成物または処方は、他のキャリアー、アジュバント、または、非毒性、非治療性、非免疫性の安定剤なども含みうる。治療に効果的な投与量は、症状や状態を改善するタンパク質、抗体、アンタゴニストまたは阻害剤の量による。
【００９４】
これらの化合物の治療効果および毒性は、細胞培養や、例えば、ＥＤ５０（母集団の５０％に治療効果のある投与量）およびＬＤ５０（母集団の５０％に致死となる投与量）などの動物実験による標準的な医薬開発手順により決定することができる。治療効果および毒性の投与量比は、治療の指標であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表現することができる。
【００９５】
適した医薬キャリアーの更なる例は、この技術分野でよく知られており、また、リン酸バッファー溶液、水、油／水エマルジョンのようなエマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などを含む。このようなキャリアーを含む組成物は、よく知られた通常の方法で処方することができる。これらの医薬組成物は、適した投与量で患者に投与することができる。適した組成物の投与は、例えば、静脈内、腹膜内、皮下、筋肉内、局所的または皮内の投与などの異なった方法により実施されうる。投薬計画は、医師の参加の下に臨床要因により決定される。医療分野でよく知られているように、患者それぞれへの投与は、患者の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および投与経路、一般的な健康状態、同時に投与される他の医薬などの多くの要因に依存する。典型的な投与量は、例えば、０．００１から１０００μｇの範囲（または、この範囲での発現または発現阻害のための核酸の範囲）であり、しかし、この例示の範囲を下回るもしくは上回る投与量も、特に前述の要因を考慮して想定されている。一般的には、医薬組成物の通常の投与としての投薬計画では、１日当たり１μｇから１０ｍｇ単位の範囲となる。もし、投薬計画が継続的注入の場合は、体重１ｋｇに対し１分当たり０．１μｇから１０ｍｇ単位の範囲となる。
【００９６】
日々の経口投与計画では、総体重につき約０．１から８０ｍｇ／ｋｇが好ましく、より好ましくは０．２から３０ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは０．５から１５ｍｇ／ｋｇである。日々の非経口投与計画では、総体重につき約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは約０．３μｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１μｇ／ｋｇから１ｍｇ／ｋｇである。日々の局所的な投与計画では、好ましくは０．１ｍｇから１５０ｍｇを１日に１から４回、好ましくは２から３回投与することとなる。日々の吸入による投与計画では、好ましくは、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇとなる。
【００９７】
周期的な評価によって、経過を観察できる。投与量は変化するものであるが、ＤＮＡの静脈内投与の好ましい投与量は、ＤＮＡ分子の約１０６から１０１２コピーである。ＤＮＡは、例えば、内部または外部の標的部位への生物的（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）輸送や動脈の部位にカテーテルを挿入することにより、標的部位に直接投与することもできる。例えば、ポリヌクレオチド、核酸分子、ポリペプチド、抗体、化合物医薬、医薬前駆体またはこれらの医薬に許容される塩を含む組成物は、経口的、局所的、非経口的または吸入など、通常医薬投与に用いられるいかなる経路によっても適切に投与しうる。許容される塩には、酢酸、メチルエステル、ＨＣｌ、硫酸、塩化物などが含まれる。医薬は、通常の手順に従い医薬と標準的な医薬キャリアーとを組み合わせて調製した通常の投与形状で投与される。本発明に従って特定され、得られる医薬および医薬前駆体は、既知の第２の治療活性化合物と組み合わせて通常の投与量により投与されうる。このような治療活性化合物には、例えば、上述したものが含まれる。これらの手順には、望まれる調製物が適切に得られるようにその成分を、混合、粒状化、圧縮または溶解することが含まれうる。医薬に許容されるキャリアーまたは希釈剤の形状および性質が、組み合わされる活性成分の量、投与経路、および他のよく知られた変数により指示されることは、正しく認識されるであろう。キャリアーは、処方中の成分と両立できるという意味において「許容可能」であり、その投与者に有害でないことが必要である。使用される医薬キャリアーは、例えば、個体または液体のいずれでもよい。個体キャリアーの例としては、ラクトース、石膏、蔗糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸などがある。液体キャリアーの例としては、リン酸バッファー溶液、シロップ、ピーナッツオイルやオリーブオイルなどの油、水、エマルジョン、様々なタイプの湿潤剤、無菌溶液などがある。同様に、キャリアーや希釈剤は、モノステアリン酸グリセロールやジステアリン酸グリセロールを単独またはワックスとともに用いるなど、この技術分野でよく知られた遅延物質を含みうる。広く種々の医薬形状を用いることができる。従って、固体キャリアーが用いられる場合は、調製物は錠剤、粉末またはペレット形状でハードゼラチンカプセルに収められたもの、または、トローチやロゼンジの形状のものがある。個体キャリアーの量は、大きく変化するものであるが、好ましくは、約２５ｍｇから約１ｇとなる。液体キャリアーが用いられる場合は、調製物はシロップ、エマルジョン、ソフトゼラチンカプセル、アンプルのような無菌注射可能溶液、または、非水溶性液体サスペンジョンの形状となる。
【００９８】
組成物は局所的にも投与され、これは、非全身的投与となる。これは、表皮や口腔への外的な適用およびこのような化合物を耳、眼または鼻にしみこませ、血流に著しく入らないようにすることも含まれる。対照的に、全身投与は、経口、静脈内、腹膜内および筋肉内投与により行われる。
【００９９】
局所投与に適した処方は、皮膚を通って炎症部位にしみこむのに適したリニメント剤、ローション、クリーム、軟膏またはペーストなどの液状または半液状調製物を含み、また、眼、耳または鼻に投与するのに適したドロップも含む。有効成分は、局所投与のためには、０．００１％から１０％ｗ／ｗ、例えば処方の重量に対して１％から２％含まれうる。これは処方の１０％ｗ／ｗの量を含みうるが、好ましくは５％ｗ／ｗ以下、より好ましくは０．１％から１％ｗ／ｗである。
【０１００】
本発明によるローションは、例えば、ＵＶ防御のために用いるのに適した皮膚や眼に適用するのに適したものも含まれる。眼のローションは、任意に殺菌剤を含んだ無菌水溶液を含み、ドロップの調製と同様の方法により調整できる。皮膚に適用するローションやリニメント剤は、アルコールやアセトンのような皮膚の乾燥を促進し、冷やす物質を含み、および／またはグリセリンなどの保湿剤やひまし油やラッカセイ油などの油を含みうる。
【０１０１】
本発明によるクリーム、軟膏またはペーストは、外用のための有効成分の半個体処方である。これらは、高度の分離されたまたは粉末化された形状で有効成分が混合され、適した機械の助けを借りて、脂肪もしくは非脂肪の基剤とともに、単独か、溶液または水もしくは非水溶性液体中へのサスペンジョンとして調製されうる。基剤には、プロピレングリコールやマクロゲルなどのアルコールとともに、固体、軟質または液体パラフィンのような炭化水素、グリセリン、ビーズワックス；金属石けん；粘滑薬；アーモンド、トウモロコシ、ラッカセイ油、ひまし油、オリーブオイルのような天然由来の油；羊毛脂肪またはその誘導体またはステアリン酸、オレイン酸などの脂肪酸が含まれる。処方は、アニオン、カチオンまたはソルビタンエステルやそれらのポリオキシエチレン誘導体などの非イオン性界面活性剤、などのいずれの適した界面活性剤も組み込むことができる。天然ゴム、セルロース誘導体またはシリカのような無機物質、ラノリンのような他の成分、等の分散剤も含みうる。
【０１０２】
本発明によるドロップは、無菌溶液、油性溶液、またはサスペンジョンを含み、殺菌性のおよび／または殺真菌性の薬剤および／または他の適した防腐剤を、好ましくは界面活性剤を含めて、適切な水溶液に有効成分を溶解することにより調製できる。得られた溶液は、濾過により浄化し、適切な容器に移され、密閉され、オートクレーブや９８−１００℃で３０分間保持することにより殺菌されうる。あるいは、溶液は、濾過により殺菌され、無菌技術により容器に移される。ドロップに包含するのに適した殺菌剤および殺真菌剤の例としては、硝酸または酢酸フェニル水銀（０．００２％）、塩化ベンザルコニウム（０．０１％）、酢酸クロロヘキシジン（０．０１％）がある。油性溶液の調製に適した溶媒には、グリセリン、希釈アルコールおよびプロピレングリコールが含まれる。本発明による組成物は、非経口的に投与でき、これは静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内、腸内、膣内または腹膜内の投与によるものである。非経口投与の中で、皮下および筋肉内の形態が一般的には好ましい。このような投与の適切な投与形態は、通常の技術により調製することができる。組成物は、吸入によっても投与でき、これは、鼻孔内および経口吸入投与によるものである。このような投与の適切な投与形態は、エアロゾル処方や定量吸入器などのものであり、通常の技術により調製することができる。
【０１０３】
本発明の組成物の異なった好ましい態様として、該組成物は、検出のために適した手段を任意にさらに含む診断組成物である。
【０１０４】
該検出のための手段には、例えば、発色団、蛍光色素、放射性ヌクレオチド、ビオチンまたはＤＩＧがある。これらのラベル化手段は、ヌクレオチドアナログに結合しうる。増幅されたｃＤＮＡのラベル化は、添付の実施例、または、特にＳｐｉｒｉｎ（１９９９），Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｏｐｔｈａｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４０、３１０８−３１１５に記載されているように行うことができる。
【０１０５】
本発明は、本発明の多機能ポリペプチド、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを、癌、感染および／または自己免疫状態、癌、即ち、悪性（充実性）腫瘍；造血癌形態（白血病、リンパ腫）；良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、甲状腺や他の内分泌腺の自律性腺腫、結腸の腺腫のような良性腫瘍；悪性腫瘍の初期段階；ウイルス、バクテリア、真菌、原虫や蠕虫による感染性疾患；疾患を起こす免疫細胞の分集団の削減が要求される自己免疫疾患；移植による拒絶反応やアレルギーの防止、の治療に用いる医薬組成物の調製に用いるものにも関する。
【０１０６】
本発明を用いる好ましい態様として、該感染がウイルス、バクテリアまたは真菌感染であり、該癌が頭部および頸部の癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、食道癌（ｏｅｓａｐｈａｇｕｓ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、結腸直腸癌、結腸癌、肝臓および肝臓内の胆管の癌、膵臓癌、肺癌、小細胞肺癌、喉頭癌、乳癌、乳癌腫、悪性黒色腫、多発性骨髄腫、肉腫、横紋筋肉腫、リンパ腫、濾胞性非ホジキンリンパ腫、白血病、Ｔ−またはＢ−細胞白血病、ホジキンリンパ腫、Ｂ−細胞リンパ腫、卵巣腫瘍、子宮癌、頸部の癌、前立腺癌、生殖器の癌、腎臓癌、精巣癌、甲状腺癌、膀胱癌、プラスマ細胞腫または脳腫瘍であり、該自己免疫状態が強直性脊髄炎、急性前部ブドウ膜炎、グッドパスチャー症候群、多発性硬化症、グレーヴズ病、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、インシュリン依存性糖尿病、慢性関節リウマチ、尋常性天疱瘡、橋本甲状腺炎または自己免疫性肝炎のものである。
【０１０７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドまたは本発明のベクターを、遺伝子治療のための組成物の調製に用いるものにも関する。
【０１０８】
上述のホスホトニンペプチドやポリペプチドをエンコードする種々のポリヌクレオチドおよびベクターが、単独または標準的なベクターおよび／または遺伝子輸送系を用い、また、任意に医薬に許容可能なキャリアーや賦形剤とともに、これらのいかなる組み合わせによってでも投与されることは、本発明で予定されていることである。例えば、この発明のポリヌクレオチドは、例えば、上述の障害に関連した疾患の遺伝子治療や遺伝子診断のために、細胞中において単独またはこの発明の（ポリ）ペプチドを発現するためのベクターの一部として用いることができる。この発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、順次（ポリ）ペプチドを産生する細胞に導入される。投与に次いで、該ポリヌクレオチドまたはベクターは、検体のゲノムに安定的に統合されうる。一方、ウイルスベクターは、ある特定の細胞または組織に特異的に用いられ、その細胞中で維持されうる。適した医薬キャリアーおよび賦形剤は、この技術分野でよく知られている。この発明に従って調製されるポリヌクレオチドまたはベクターは、上述の疾患の異なった種類のものを予防し、治療しまたは遅らせるために用いることができる。
【０１０９】
上述の態様として、本発明のベクターは、好ましくは遺伝子転移または標的ベクターとなる。遺伝治療は、治療遺伝子の導入に基づいており、例えば、ｅｘ−ｖｉｖｏやｉｎ  ｖｉｖｏ技術による細胞へのワクチン接種は、遺伝子転移の最も重要な適用の一つである。ｉｎ−ｖｉｔｒｏやｉｎ−ｖｉｖｏでの遺伝子治療のために適したベクター、方法または遺伝子輸送系は、文献に記載されており、また、当業者に知られている。例えば、Ｇｉｏｒｄａｎｏ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２  （１９９６），  ５３４−５３９；  Ｓｃｈａｐｅｒ，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ７９  （１９９６），  ９１１９１９；  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６  （１９９２），  ８０８−８１３，  Ｉｓｎｅｒ，  Ｌａｎｃｅｔ  ３４８  （１９９６），  ３７０−３７４；  Ｍｕｈｌｈａｕｓｅｒ，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ７７  （１９９５），  １０７７−１０８６；  Ｏｎｏｄｕａ，  Ｂｌｏｏｄ  ９１  （１９９８），  ３０−３６；  Ｖｅｒｚｅｌｅｔｔｉ，  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９  （１９９８），  ２２４３−２２５１；  Ｖｅｒｍａ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３８９  （１９９７），  ２３９２４２；  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３９２  （Ｓｕｐｐ．  １９９８），  ２５−３０；  Ｗａｎｇ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４  （１９９７），  ３９３４００；  Ｗａｎｇ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２  （１９９６），  ７１４−７１６；  ＷＯ  ９４／２９４６９；  ＷＯ  ９７／００９５７；  ＵＳ−Ａ５，５８０，８５９；  ＵＳ−Ａ−５，５８９，４６６；  ＵＳ−Ａ−４，３９４，４４８、または、Ｓｃｈａｐｅｒ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７  （１９９６），  ６３５−６４０、および、これらに引用されている文献を参照のこと。
【０１１０】
この発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、細胞に直接導入またはリポソームまたはウイルスベクター（例えばアデノウイルス、レトロウイルス）を介した導入のために設計されうる。好ましくは、該細胞は生殖系細胞；胎児性細胞、卵細胞またはこれら由来の誘導物であり、もっとも好ましい細胞は幹細胞である。上述したように、適した遺伝子輸送系は、リポソーム、レセプター媒介輸送系、裸のＤＮＡおよびヘルペスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルスなどのウイルスベクターを含みうる。遺伝子治療のための体内の特定部位への核酸の輸送は、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  （Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８８  （１９９１），  ２７２６−２７２９）に記載されているようなバイオリスティック輸送系を用いることによっても達成されうる。導入されたポリヌクレオチドおよびベクターは、該細胞に導入された後に遺伝子産物を発現し、好ましくは該細胞の生存期間中にはこの状態のまま維持されることが理解される。例えば、適切な調節塩基配列による制御の下にポリヌクレオチドを安定的に発現する細胞系は、当業者によく知られた方法によって作製することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いる代わりに、本発明のポリヌクレオチドと選択マーカーを同一かまたは異なるプラスミドを用いて宿主を形質転換することもできる。外来ＤＮＡの導入に続き、作製された細胞は、培地中で１−２日間成長し、選択媒地に移される。組み換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、プラスミドが染色体中に安定的に統合された細胞の選択を可能にし、順次クローン化し細胞系に拡散する細胞増殖巣を形成するように成長する。このような作製された細胞系は、例えばリン酸摂取の活性化や刺激に関与する化合物の検出のスクリーニング方法にも特に有用である。
【０１１１】
これらに限定されないが、例えばｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞それぞれにおける、ヘルペス単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，  Ｃｅｌｌ  １１  （１９７７），  ２２３）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４８  （１９６２），  ２０２６）またはアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，  Ｃｅｌｌ  ２２  （１９８０），  ８１７）など、多数の選択系が使用できる。また、抗代謝産物耐性剤も選択の基礎として用いることもでき、メトトレキサート耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７  （１９８０），  ３５６７；  Ｏ’Ｈａｒｅ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８  （１９８１），  １５２７）、  ミコフェノール酸耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７８  （１９８１），  ２０７２）、アミノグリコサイドＧ−４１８耐性を付与するｎｅｏ  （Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５０  （１９８１），  １）、  ハイグロマイシンの耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ，  Ｇｅｎｅ  ３０  （１９８４），  １４７）、または、ピューロマイシン（ｐａｔ，ピューロマイシン  Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）などを用いることができる。他の選択可能な遺伝子として、例えば、細胞にトリプトファンの位置でインドールを利用させるｔｒｐＢ；細胞にヒスチジンの位置でヒスチノールを利用させるｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５  （１９８８），  ８０４７）；および、オルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤耐性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）、２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン、ＤＦＭＯ（ＭｃＣｏｎｌｏｇｕｅ，  １９８７，  Ｉｎ  ：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｅｄ．）、が記載されている。
【０１１２】
この発明はさらに、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターまたは本発明の組成物を該悪性腫瘍や疾患により影響を受けている哺乳動物に導入することを含む、癌、感染または自己免疫状態の治療方法に関する。
【０１１３】
投与に適した経路および投与量等は、上記にあるようにこの発明の医薬組成物と関連して述べた。
【０１１４】
さらに、本発明は、本発明のポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクターまたは本発明の組成物を該病的状態により影響を受けている哺乳動物に導入することを含む、病的状態の進行を遅らせる方法に関する。
【０１１５】
本発明の１つの方法の好ましい態様として、該哺乳動物はヒトである。
【０１１６】
最後に、この発明は、本発明の多機能ポリペプチド、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の細胞または本発明の組成物を含むキットに関する。
【０１１７】
本発明のキットまたは診断組成物の構成要素は、任意にバッファーおよび／または溶液中で、バイアル瓶のような容器に包装されたものでありうる。適当な場合には、該構成要素の１またはそれ以上は、１つの同一の容器に包装されうる。さらに、または、あるいは、該構成要素の１またはそれ以上は、例えばニトロセルロースフィルターやナイロン膜のような固体担体、または、マイクロタイタープレートのウェルに取り込まれうる。
【０１１８】
【実施例】
＜実施例１：組み換えＮＫＧ２Ｄの作製＞
ＮＫＧ２Ｄ抗原の細胞外部分をコードするＤＮＡ配列を得るために、逆転写による末梢血液単核細胞のＲＮＡ由来のｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のテンプレートとして使用した。
全ＲＮＡは、標準的なプロトコール（Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｉｅｎｃｅ  １９９１）に従いフィコール密度遠心分離により全血液サンプルから分離した末梢血液単核細胞より調製した。
ＲＮＡ調製は、市販の調製キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用い製造者の説明書に従い行った。
ｃＤＮＡ合成は、標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｃｋ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）に従って行った。
ＰＣＲでは、次の配列を有する２つのプライマーを用いた。
フォーワードプライマー：  ５’−ＡＧＧＴＧＴＡＣＡＣＴＣＣＴＴＡＴＴＣＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＡＴＴＣＣ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ８７）
リバースプライマー  ：  ５’−ＴＣＡＴＣＣＧＧＡＣＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＧＡＴＧ−３’  （ＳＥＱ  ＩＤ  ８８）
ＮＫＧ２Ｄ  ｃＤＮＡテンプレートへの配列のハイブリダイズに加え、ＰＣＲ増幅産物をクローニングできるように、フォーワードプライマーはＢｓｒＧＩ−部位を含み、リバースプライマーはＢｓｐＥＩ−部位を含む。
ＰＣＲ反応の産物は、アガロースゲル電気泳動により単離し、市販のキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて製造者の説明書に従い精製し、標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｃｋ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ  １９８９，  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）を用いて制限酵素ＢｓｒＧＩおよびＢｓｐＥＩとともにインキュベートした。その後最終精製工程を行った。
図１に示すように、ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインのコード配列は、ＢｓｒＧＩを介してネズミＩｇ−重鎖リーダー配列に融合し、また、ＢｓｐＥＩ部位は、Ｘｍａｌ部位と融合し、これにより終止コドンに続くポリヒスチジン標識のコード配列に結合する（ＳＥＱ  ＩＤ  １  ａｎｄ  ２）。
Ｎ−末端リーダーペプチドのコード配列、ＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインおよびＣ−末端ヒスチジン−標識からなる図１に示されるＥｃｏＲＩ／Ｓａｌｌ−ＤＮＡフラグメントは、同じく制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳａｌｌにより消化されることにより調製されるプラスミドベクターｐＦａｓｔＢａｃｌ中にクローンされた。このプラスミドは、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃバキュロウイルス発現系の一部である（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，製造者の説明書はインターネットサイトにより入手可能である：  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．  ｌｉｆｅｔｅｃｈ．  ｃｏｍ／ｃａｔａｌｏｇ／ｔｅｃｈｌｉｎｅ／ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ／Ｍａｎｕａｌｓ  ＰＰＳ／ｂａｃ．  ｐｄｆ。特に断らない限り、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  バキュロウイルス発現系に関連するすべての手順は、これらの説明書に従い行った。）。
１ｎｇの正確なプラスミドクローンのＤＮＡを、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞に導入した（Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ発現系）。この大腸菌株は、（ｉ）Ｔｎ７転移機能を提供するヘルパープラスミド（ｐＭＯＮ７１２４）と（ｉｉ）バキュロウイルスシャトルベクターであるいわゆるバックミド（ｐＭＯＮ１４２７２）の２つの他のプラスミドをすでに有している。これらの細胞に第３のプラスミドを導入した後、ｐｆａｓｔＢａｃｌに挿入されたコード配列は、転移のための特異的標的部位を含むバックミド中に転移により移される。これは、ＬａｃＺコード配列の除去をもたらし、これにより製造者の説明書に従ってＢｌｕｏ−ｇａｌ、ＩＰＴＧおよび抗体の組み合わせを含む寒天プレート上での青白選択による組み換えバックミドを用いてコロニーを選択する可能性を提供できる。
溶解性のＮＫＧ２Ｄ配列を有する組み換えバックミドを含む白のコロニーを選択し、１晩培養した。製造者により提供される特別のプロトコールを用いて、これらの１晩の培養物からバックミドＤＮＡを調製した。
バックミドＤＮＡは、製造者の説明書に従いＣｅｌｌＦｅｃｔｉｎ試薬（Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ発現系）を用いてＳＦ−９昆虫細胞をトランスフェクトするために用いた。トランスフェクションから３日後、トランスフェクトした細胞の培地上清の組み換えバキュロウイルスを採取した。この上清は、低力価（１ミリリッター当たり約２×１０７プラーク形成単位（ｐｆｕ））、小スケール（２ｍｌ）のウイルスストックである（昆虫細胞培地の説明書、バキュロウイルスおよびバキュロウイルス発現系でのタンパク質の発現の宣伝は、インターネットサイトで入手可能である：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．  ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．  ｃｏｍ／ｍａｎｕａｌｓ．  ｈｔｍｌ。特に断らない限り、昆虫細胞培地およびタンパク質発現に関連するすべての手順は、これらの説明書に従い行った。）。タンパク質発現のためには、高力価で大スケールのウイルスストックが必要であった。そのようなウイルスストックを得るために、以下の工程を行った。
２×１０６のＳＦ９細胞をそれぞれ接種した２つの２５ｃｍ２の組織培養フラスコを、それぞれ３０μｌの初期ウイルスストックで感染させた。１０日後培養地上清を小スケール−高力価ウイルスストックとして採取した。そして、１ミリリッター当たり２．０×１０６細胞密度のＳＦ９細胞の分散培養物５００ｍｌを、５ｍｌの第２のウイルスストックに感染させた。感染の進行を、トリパンブルー除去法による細胞活性の測定によりモニターした。細胞活性が１０％以下となったところで、ウイルスストックを採取し、遠心分離により細胞からウイルス上清を分離した。この大スケールストックのウイルス力価を測定した。この目的では、ＳＦ−９細胞を、ウェル当たり１×１０４細胞の密度で９６−ウェル組織培養プレートに加えた。全部で２４ウェルを以下の希釈の高力価ストックの１つにそれぞれ感染させた。１０μｌのウェル当たり１：１０５希釈、１０μｌのウェル当たり１：１０６希釈および１０μｌのウェル当たり１：１０７希釈である。体積は、ウェル当たり１２０μｌに調整した。１４日後細胞活性を、トリパンブルー除去法により測定した。この希釈により、活性細胞を有するウェルと有しないウェルのバランス関係から、予測した充分に正確なウイルス力価は１×１０８から１×１０９ｐｆｕ／ｍｌと見積もられた。
タンパク質発現の時間経過を、２．３×１０６細胞／ｍｌでＳＦ９細胞の２つのサスペンション培地による感染実験で、細胞当たり５ｐｆｕから１０ｐｆｕのＭＯＩ（感染の多重性）により測定した。感染した培地のサンプルは、感染後２４、４８、７２および９６時間後に引き抜いた。これらのサンプルは、標準プロトコールにしたがいウエスタンブロットにより分析した。溶解性ＮＫＧ２Ｄは、ペルオキシダーゼコンジュゲート抗−ヒスチジン−標識抗体により検出した。
従って、最適のＭＯＩおよび感染後の最適のインキュベーション時間を用いて、５００ｍｌの培地体積で多重サスペンション培地での大スケールでのタンパク質の発現を行った。
溶解性のＮＫＧ２Ｄを、Ｍａｃｋ  （１９９５）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：  ７０２１に記載されているように、Ｎｉ−ＮＴＡ−カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーによるＣ−末端ヒスチジン標識を介して、培地上清から精製した。
【０１１９】
＜実施例２：ヒトリンパ球の天然ＮＫＧ２Ｄに対するモノクローナル抗体の発生＞
ｂａｌｂ／ｃ×Ｃ５７ブラックのかけあわせの１０週齢Ｆ１マウスを抗原ＮＫＧ２Ｄの溶解性細胞外ドメインにより免疫した。抗原は、濃度１００μｇ／ｍｌで０．９％ＮａＣｌに溶解した。溶液は、次に完全フロイントアジュバントで１：２に乳化し、５０μｌを個々のマウスに注射した。完全フロイントアジュバントを不完全フロイントアジュバントに置き換えた以外は同様の方法によって、４、８および１２週後に追加免疫をマウスに行った。最初の追加免疫から１０日後に、血液サンプルを採取し、ＮＫＧ２Ｄ抗原に対する抗体血清力価をＥＬＩＳＡにより調べた。血清力価は、免疫されている動物については、免疫されていないものより１０００倍以上高かった。２回目のの追加免疫の３日後に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｂｅｒ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９２）に記載されているような標準のプロトコールに従い、ハイブリドーマ細胞系を発生させるために、脾臓細胞をＰ３×６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ−１５８０）と融合した。ＰＥＧ融合の後、細胞をマイクロタイタープレートのウェル当たり１００．０００の細胞で接種し、１０％ウシ胎児血清、３００単位／ｍｌの組み換えヒトインターロイキン６および選択のためのＨＡＴ添加物の補給の下、２００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地で育成した。密に成長したウェルからの培地上清を以下のＥＬＩＳＡにて調べた。
９６Ｕ底プレート（Ｎｕｎｃ，ｍａｘｉｓｏｒｂ）のウェルを、濃度５μｇ／ｍｌで組み換えＮＫＧ２Ｄ抗原とともに４℃で一晩被覆      した。被覆したウェルを、洗浄バッファー（０．ｌＭ  ＮａＣＩ，  ０．０５Ｍ  Ｎａ２ＨＰ０４  ｐＨ７．  ３，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，０．０５％  ＮａＮ３）にて３回洗浄し、次に洗浄バッファーに分散させた２％のスキムミルク粉末を２００μｌ／ウェルにて室温で１時間インキュベートすることを通じてブロックした。次の工程として、ハイブリドーマの上清を希釈せずおよび数回希釈して室温にて２時間インキュベートした。さらに３回の洗浄工程の後、結合したモノクローナル抗体を、マウス免疫グロブリンに対するホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートポリクローナル抗体により検出した。５回の洗浄の後、ＥＬＩＳＡをＴＭＢ置換溶液（テトラメチルベンジジン、Ｒｏｃｈｅ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の添加により最後に現像した。着色した沈殿を、１５分後にＥＬＩＳＡリーダーを用い４０５ｎｍで測定した。
強いＥＬＩＳＡシグナルを示す１０クローンからの上清を、次の分析のために選択した。これらのハイブリドーマクローンを同定するために、そしてこれはインタクトなＮＫ細胞およびＴリンパ球の天然ＮＫＧ２Ｄ抗原と反応しうるモノクローナル抗体を産生するものであるが、以下のフローサイトメトリー分析を行った。
１×１０６のＰＢＭＣを５０μｌの希釈していないハイブリドーマ上清とともに氷上で３０分間インキュベートし、結合したモノクローナル抗体をＰＢＳで１：１００に希釈したウサギ抗−マウスＩｇ抗体（Ｄａｋｏ  Ｈａｍｂｕｒｇ，  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．  Ｆ０３１３）のフルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲートＦ（ａｂ’）２フラグメントにより検出した。次の工程として、細胞結合ＦＩＣＴコンジュゲート抗体の自由価は、１：１０に希釈した５０μｌのマウス血清（Ｓｉｇｍａ  ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，  Ｍ−５９０５）とともに３０分間細胞をインキュベートすることによりブロックした。ＮＫ細胞とＴ細胞とを区別するために、ラベル化したＰＢＭＣをここで分けた。半量を１：１００に希釈したＴ細胞特異的３色コンジュゲート抗−ＣＤ８抗体（Ｃａｌｔａｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ  ；  ＵＳＡ，  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＭＨＣＤ０３０６）により染色し、他の半量を１：２５に希釈したＮＫ細胞特異的フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗−ＣＤ５６抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ３４７７４７）で染色した。ＮＫ細胞またはＴ細胞をそれぞれ特異的に染色するラベル化されていない抗−ＣＤ１６および抗−ＣＤ６抗体を、最初のラベル化工程のポジティブコントロールとして用い、組み換えＮＫＧ２Ｄと反応するハイブリドーマ上清の代わりに特異性を持たないネズミのモノクローナル抗体をネガティブコントロールとして用いた。
細胞は、ＦＡＣＳスキャン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）のフローサイトメトリーにより分析した。ＦＡＣＳ染色と蛍光強度による測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｂｅｒ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９２）に記載されているように行った。
２色蛍光分析は、ＣＤ８＋およびＣＤ５６＋細胞でそれぞれポジティブゲートを適用して行い、これによりＣＤ８＋Ｔリンパ球およびＮＫ細胞それぞれ別個にＦＩＴＣ媒介蛍光を検出できる。参照コントロール抗体とともにＣＤ８＋Ｔリンパ球とＮＫ細胞の区別された染色を比較したところ、ハイブリドーマ細胞系８Ｒ２３の上清は、ＮＫ細胞およびＴ細胞両方に強い反応性を示し、一方、２つの更なる上清は、両方のリンパ球サブセットに弱い反応性しか示さなかった。
あるいは、ヒトＮＫＧ２Ｄに対するモノクローナル抗体は、マウスの遺伝子による免疫により発生させた。この目的のため、アミノ酸配列ＳＥＱ  ＩＤ  ３および４に相当するヌクレオチド（ｎｔ）６４から４６２およびｎｔ１２３から４６２由来のヒトＮＫＧ２Ｄの異なるフラグメントを、図１に示すｃＤＮＡテンプレートからＰＣＲ増幅を行った。なお、このｃＤＮＡテンプレートは、アスパラギン（Ｎ）およびバリン（Ｖ）、または、トリプトファン（Ｗ）およびバリン（Ｖ）のそれぞれ側面に位置する細胞外ＮＫＧ２Ｄセグメントをエンコードする。ＰＣＲプライマーとして以下のオリゴヌクレオチドを用いた。
ｎｔ１２３−４６２のＮＫＧ２Ｄフラグメントの増幅には、ＮＫＧ２Ｄ−ｓｈｏｒｔ−ｆ  （５’−ＡＴＣＡＡＧＣＴＴＧＴＧＧＡＴＡＴＧＴＴＡＣＡＡＡＡＡＴＡＡＣＴ−３’）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ８０）およびＮＫＧ２Ｄ−ｓｔｏｐ−ｒ  （５’−ＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＧＣＡＴＧ−３’）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ８２）を、ｎｔ６４−４６２のＮＫＧ２Ｄフラグメントの増殖には、  ＮＫＧ２Ｄ−ｆ  （５’−ＡＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＡＣＣＡＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＡＴＴＣＣ−３’）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ８１）およびＮＫＧ２Ｄ−ｓｔｏｐ−ｒ  （５’−ＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＡＣＡＧＴＣＣＴＴＴＧＣＡＴＧ−３’）  （ＳＥＱ  ＩＤ  ８２）を用いた。
遺伝子による免疫のためのプラスミドは、図４に示すようにベクターＶＶ１（ＧＥＮＯＶＡＣ  ＡＧ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）の制限エンドヌクレアーゼ部位  ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｏｔＩにこれらのＰＣＲ産物をフレーム単位でそれぞれクローニングすることにより構築した。
得られたプラスミドＶＶ１−ＮＫＧ２−Ｄ（ｎｔ  ６４−４６２）およびＶＶ１−ＮＫＧ２−Ｄ（ｎｔ  １２３−４６２）は、Ｎ−末端にｍｙｃエピトープにより標識された溶解性細胞外ＮＫＧ２−Ｄフラグメントを分泌する。ｍｙｃエピトープは、溶解性ＮＫＧ２−Ｄフラグメントの発現を確認するために用いた。この目的のため、構築物は、一時的トランスフェクションによりＢＯＳＣ−２３細胞中（Ｏｎｉｓｈｉ  （１９９６）  Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２４：  ３２４）に発現され、Ｃｙｔｏｐｅｒｍ／Ｃｙｔｏｆｉｘ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の添加によりパーフォレートされた。ｍｙｃに標識されたＮＫＧ２−Ｄフラグメントは、ポリクローナルフィコエリトリンラベル化のウサギ抗−マウス免疫グロブリン抗体に続くネズミ抗−ｍｙｃモノクローナル抗体（９Ｅ１０，  ＡＴＣＣ，  ＣＲＬ−１７２９）との反応後のＦＡＣスキャン分析により細胞間で染色した。
公表されている手順（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  （１９９８）  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １７：  ５６９）に従いヘリオス遺伝子銃  （Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＶＶ１−ＮＫＧ２−Ｄ  （ｎｔ  １２３−４６２）により３回免疫した後、６から８週齢の３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスをＶＶ１−ＮＫＧ２−Ｄ  （ｎｔ  ６４−４６２）により６回免疫し、２匹のマウスをＶＶ１−ＮＫＧ２−Ｄ  （ｎｔ  ６４−４６２）  により３回免疫した。免疫プラスミドの最後の適用の１週間後に、それぞれのマウスは、ＤＮＡ適用部位にＭｇ２＋およびＣａ２＋イオンを含まないリン酸バッファー中で５０μｇ／ｍｌの濃度で組み換えヒトＮＫＧ２−Ｄタンパク質（実施例１を参照）の３００μｌを皮内注射により追加した。
４日後、マウスを殺しそのリンパ球をポリエチレングリコール（ＨｙｂｒｉＭａｘ；  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＳＰ２／０マウスミエローマ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  ＵＳＡ）と融合し、９６ウェルマイクロタイタープレートでウェル当たり１００，０００の細胞で接種して１０％ウシ胎児血清およびハイブリドーマ選択のためのＨＡＴ添加剤（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  （１９９８）
Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １７：  ５６９）を補給した２００μｌのＤＭＥＭ媒地で成長させた。
密に成長したウェルからの培地上清を上述のように固定化組み換えＮＫＧ２ＤのＥＬＩＳＡにより調べた。陽性のＥＬＩＳＡシグナルを示す１２２のクローンからの上清を、更なる分析のために選択した。これらのハイブリドーマクローンを同定するために、そしてこれはインタクトなＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の天然ＮＫＧ２Ｄ抗原と反応しうるモノクローナル抗体を産生するものであるが、細胞を以下のＦＡＣＳスキャン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）のフローサイトメトリー分析を行った。
健康なドナーの末梢血液からの単核細胞（ＰＢＭＣ）を、フィコール密度勾配遠心分離により単離した。マイクロタイタープレートのそれぞれのウェルで、２００．０００のＰＢＭＣを希釈しないハイブリドーマ上清とともにインキュベートした。氷上での３０分間のインキュベーションの後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次にヤギ抗−マウスＩｇＧおよびＩｇＭ抗体のフルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲートＦ（ａｂ’）２フラグメント（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．  Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，  ＵＳＡ，  Ｃｏｄｅ  １１５−０９６０６８；  １：  １００）により氷上で３０分間染色した。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、次に２つの異なる抗体ラベル混合物により染色した。ＣＤ８＋Ｔ細胞の染色には、１００．０００のＰＢＭＣをフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートＣＤ１６抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．  ３４７６１７）および３色コンジュゲートＣＤ８抗体（Ｃａｌｔａｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＵＳＡ，  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．  ＭＨＣＤ０８０６）とともに３０分間さらにインキュベートした。ＮＫ細胞の染色には、もう一方の半量のＰＢＭＣをフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲートＣＤ５６抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．  ３４７７４７）および３色コンジュゲートＣＤ３抗体（Ｃａｌｔａｃ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＵＳＡ，  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．  ＭＨＣＤ０３０６）とともに３０分間さらにインキュベートした。ラベル混合物中の異なる抗体間での交差反応をさけるために、マウス血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＵＳＡ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  ０５４Ｈ−８９５８）は、１：１０の最終希釈で添加した。
３色蛍光分析を、ＣＤ８＋（３色）に対してポジティブゲートおよびＣＤ１６＋（ＰＥ）細胞に対してネガティブゲートを適用することにより行い、ＣＤ８＋ＮＫ−細胞からのいなかる汚染シグナルを受けることなく、ＣＤ８＋Ｔリンパ球（表現型：ＣＤ８＋、ＣＤ１６−）にのみ排他的に帰属するＦＩＴＣ媒介の蛍光を検出することができた。同様に、３色蛍光分析を、ＣＤ５６＋（ＰＥ）に対してポジティブゲートおよびＣＤ３＋細胞（３色）に対してネガティブゲートを適用することにより行い、ＣＤ５６＋Ｔリンパ球からのいなかる汚染シグナルを受けることなく、ＮＫ−細胞（表現型：ＣＤ５６＋、ＣＤ３−）にのみ排他的に帰属するＦＩＴＣ媒介の蛍光を検出することができた。図５に示すように、１１Ｂ２、８Ｇ７および６Ｅ５として示されたハイブリドーマの上清は、ヒトＣＤ８＋Ｔリンパ球およびＮＫ細胞両方の表面の天然ＮＫＧ２Ｄと反応するモノクローナル抗体を含んでいた。ハイブリドーマの上清の染色において、１０Ｈ９は固定化組み換えＮＫＧ２Ｄと反応する多くのモノクローナル抗体の代表例として示すものであり、しかしこれは、インタクトな細胞の天然ＮＫＧ２Ｄレセプター複合体に結合する能力を有しないものである。ＦＡＣＳ染色と蛍光強度の測定は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｂｅｒ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９２）に記載されているように行った。
ＣＤ５６＋ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞のＮＫＧ２−Ｄと反応する抗体を産生するハイブリドーマを、９６ウェルマイクロタイタープレート上で限られた希釈により１度サブクローニングした。ポジティブサブクローンを、細胞成長を示すウェルから採取した上清とともにインキュベートしたＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫＬ細胞（Ｂａｕｅｒ  （１９９９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：  ７２７）のフローサイトメトリーにより同定した。細胞結合モノクローナル抗体は、ウサギ抗−マウスＩｇ抗体（Ｄａｋｏ  Ｈａｍｂｕｒｇ，  Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．  Ｆ０３１３）のフルオレセイン（ＦＩＴＣ）コンジュゲートＦ（ａｂ’）２フラグメントにより検出した。サブクローン１１Ｂ２Ｄ１０、８Ｇ７Ｃ１０および６Ｅ５Ａ７を、ＮＫＧ２Ｄ誘導二重特異性抗体の構築のためにさらに用いた（実施例３参照）。
【０１２０】
＜実施例３：抗−ＮＫＧ２Ｄ×抗−ＥｐＣＡＭ二重特異性単鎖抗体の構築＞
二重特異性抗体を図２に示すように構築した。ハイブリドーマ１１Ｂ２Ｄ１０  （ＳＥＱ  ＩＤ  ７−１６），  ８Ｇ７Ｃ１０  （ＳＥＱ  ＩＤ  ２７−３６），  ６Ｅ５Ａ７  （ＳＥＱ  ＩＤ  ３７−４６）および６Ｈ７Ｅ７  （ＳＥＱ  ＩＤ  １７−２６）から増幅された可変領域のＰＣＲフラグメントをＴＡクローニングベクターＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ａ１３６０）に直接クローニングしたことを除いて、Ｏｒｌａｎｄｉ  （１９８９）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６：  ３８３３に記載されているように、インタクトな細胞の天然ＮＫＧ２Ｄに結合する抗体の可変領域ＶＬおよびＶＨを、対応するハイブリドーマ細胞系の全ＲＮＡからクローニングした。次に、クローニングしたＶＬおよびＶＨ領域を、ｓｃＦｖフラグメントをドメイン配置ＶＬ／ＶＨに一致させるための２段階融合ＰＣＲのテンプレートとして用いた。この目的に用いられるＶＬ特異的プライマーペアは、５’ＶＬＢ５ＲＲＶ（５’ＡＧＧ  ＴＧＴ  ＡＣＡ  ＣＴＣ  ＣＧＡ  ＴＡＴ  ＣＣＡ  ＧＣＴ  ＧＡＣ  ＣＣＡ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  Ａ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ８３））および  ３’ＶＬＧＳ１５（５’ＧＧＡ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＧＣＣ  ＡＧＡ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＣＴＣ  ＧＡＧ  ＣＴＴ  ＧＧＴ  ＣＣＣ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ８４））のオリゴヌクレオチドからなり、ＶＨプライマーペアは、５’ＶＨＧＳ１５  （５’ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＧＧＣ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＧＧＴ  ＴＣＴ  ＣＡＧ  ＧＴ  （ＧＣ）  （ＡＣ）  Ａ  （ＡＧ）  ＣＴＧ  ＣＡＧ  （ＧＣ）  ＡＧ  ＴＣ  （ＡＴ）  ＧＧ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ８５））および３’ＶＨＢｓｐＥＩ  （５’ＡＡＴ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＣＧ  ＧＴＧ  ＡＣＣ  ＧＴＧ  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＴＧＧ  ＣＣＣ  ＣＡＧ  ３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ８６））のオリゴヌクレオチドからなる。最初のＰＣＲの工程として、ＶＨおよびＶＬ増幅産物を以下のＰＣＲプログラムにより得た。第１のサイクルとして９４℃で５分間変成、３７℃で２分間アニーリング、７２℃で１分間伸長；９４℃で１分間変成、３７℃で２分間アニーリング、７２℃で１分間伸長を６サイクル；９４℃で１分間変成、５５℃で１分間アニーリング、７２℃で４５秒間伸長を１８サイクル；７２℃で２分間末端延長を行った。融合ＰＣＲの第２の工程として、ＶＨおよびＶＬ−ＰＣＲフラグメントをアガロースゲルから精製し、オリゴヌクレオチドプライマー５’ＶＬＢ５ＲＲＶおよび３’ＶＨ  ＢｓｐＥｌと混合し、以下のＰＣＲプログラムを行った。９４℃で５分間１回変成；９４℃で１分間変成、５５℃で１分間アニーリング、７２℃で１．５分間伸長を８サイクル；７２℃で２分間末端延長を行った。抗−ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ−フラグメントをエンコードするＶＬ／ＶＨ融合産物を、アガロースゲルから精製し、制限酵素ＢｓｒＧＩ／ＢｓｐＥＩにより消化した。ＷＯ０００３０１６の図１０に記載されたＥｃｏＲＩ／ＳａｌｌクローンニングＤＮＡフラグメントを含む哺乳動物発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲ（Ｍａｃｋ  （１９９５）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：  ７０２１）を、制限酵素ＢｓｒＧＩ／ＢｓｐＥ���により消化し７５０ｂｐフラグメントを放出させ、残ったベクターフラグメントを精製し、抗−ＮＫＧ２Ｄ  ｓｃＦｖ−フラグメントのクローニングに用いた。
従って、得られた哺乳動物発現ベクターの誘導体ｐＥＦ−ＤＨＤＲは、Ｍａｃｋ  （１９９５）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：  ７０２１に記載されたように二重特異性単鎖抗体をエンコードするＥｃｏＲＩ／Ｓａｌｌ−ＤＮＡ挿入を含み、これはＮＫＧ２ＤおよびＥｐＣＡＭに対して誘導される。ＥｐＣＡＭは、多くの上皮腫瘍により発現され、ネズミモノクローナル抗体とともに切除された結腸直腸癌のアジュバント処理のための標的抗原としてすでに用いられている。
抗−ＮＫＧ２Ｄ×抗−ＥｐＣＡＭ二重特性単鎖抗体の発現プラスミド（ＳＥＱ  ＩＤ  ４７−４９）を、エレクトロポレーションによりＤＨＦＲ−欠失ＣＨＯ−細胞にトランスフェクトし、安定なトランスフェクション体の選択、遺伝子増幅およびタンパク質生産をＭａｃｋ  （１９９５）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：  ７０２１に記載されたように行った。二重特異性抗体を、Ｍａｃｋ  （１９９５）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：  ７０２１に記載されたようにＮｉ−ＮＴＡ−カラムを用いたＣ−末端ヒスチジン標識を介して培地上清から精製した（図３参照）。
【０１２１】
＜実施例４：ＤＡＰ−１０の細胞外ドメインに誘導される抗体＞
ＮＫＧ２Ｄレセプター複合体の細胞外ドメインと反応する抗体も、以下のプロトコールにより得ることができる。
６から８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを３０のアミノ酸（ＳＥＱ  ＩＤ  ５，  ＱＴＴＰＧＥＲＳＳＬＰＡＦＹＰＧＴＳＧＳＣＳＧＣＧＳＬＳＬＰ）またはその一部を含むヒトＤＡＰ−１０の完全細胞外ドメインに相当するペプチドにより免疫することにより得られ（Ｗｕ  （１９９９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：  ７３０）、それぞれキャリアータンパク質とコンジュゲートされうる。例えば、ＤＡＰ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ６，  ＱＴＴＰＧＥＲＳＳＬＰＡＦＹＰＧＴＳＧＳＣ）の細胞外ドメインのＮ−末端の２１のアミノ酸を含むペプチドは、Ｃ−末端システインのメルカプト基を介して直接マレインイミド活性ＫＬＨに結合しうる。コンジュゲートしたものは、１００μｇ／ｍｌの濃度で０．９％ＮａＣｌに溶解され、次に完全フロイントアジュバント１：２で乳化され、マウス当たり５０μｌを個々に感染されうる。完全フロイントアジュバントを不完全フロイントアジュバントに置き換える以外は同様にして、マウスは、最初の免疫の４、８および１２週後に追加免疫を受けうる。最初の追加免疫の１０日後、血液サンプルを採取し、ＫＬＨのために上述したように２１重合ＤＡＰ−１０ペプチドとコンジュゲートした固定化ＢＳＡのＥＬＩＳＡにより抗体血清力価を調べることができる。第２の追加免疫の３日後、陽性血清力価を有するマウスからの脾臓細胞を、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｂｅｒ，  Ｗｉｌｅｙｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  １９９２）に記載される標準プロトコールに従いハイブリドーマ細胞系を発生させるためにＰ３×６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）と融合しうる。ＰＥＧ融合の後、細胞をマイクロタイタープレート中でウェル当たり１００．０００の細胞で接種し、１０％ウシ胎児血清、３００単位／ｍｌの組み換えヒトインターロイキン６および選択のためのＨＡＴ添加剤を補給した２００μｌのＲＰＭＩ１６４０媒地で成長させうる。密に成長したウェルからの培地上清を、以下のＥＬＩＳＡによるＤＡＰ１０ペプチドとの反応性により調べることができる。
９６Ｕ底プレート（Ｎｕｎｃ，ｍａｘｉｓｏｒｂ）のウェルを、濃度５μｇ／ｍｌでペプチド−ＢＳＡ−コンジュゲートとともに４℃で一晩被覆する。被覆したウェルを、洗浄バッファー（０．ｌＭ  ＮａＣｌ，  ０．０５Ｍ  Ｎａ２ＨＰ０４ｐＨ７．３，０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０，０．０５％  ＮａＮ３）にて３回洗浄し、次に洗浄バッファーに分散させた２％のスキムミルク粉末を２００μｌ／ウェルにて室温で１時間インキュベートすることを通じてブロックする。次の工程として、ハイブリドーマの上清を希釈せずおよび数回希釈して室温にて２時間インキュベートする。さらに３回の洗浄工程の後、結合したモノクローナル抗体を、マウス免疫グロブリンに対するホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲートポリクローナル抗体により検出できる。５回の洗浄の後、ＥＬＩＳＡをＴＭＢ置換溶液（テトラメチルベンジジン、Ｒｏｃｈｅ）の添加により最後に現像できる。着色した沈殿を、１５分後にＥＬＩＳＡリーダーを用い４０５ｎｍで測定する。
これらのペプチド−反応性ハイブリドーマクローンを同定するために、そしてこれはインタクトなＮＫ−細胞とＣＤ８＋Ｔリンパ球のＮＫＧ２Ｄレセプター複合体のＤＡＰ−１０に結合する能力のあるモノクローナル抗体を産生するものであるが、ＰＢＭＣの３色蛍光分析を実施例２に示すように行いうる。
インタクトなＮＫ−細胞およびＣＤ８＋Ｔリンパ球を染色するモノクローナル抗体の可変領域を、対応するハイブリドーマ細胞系からクローニングし、実施例３に記載されたように二重特異性単鎖抗体を構築するために用いることができる。
【０１２２】
＜実施例５：ＮＫＧ２Ｄ誘導の抗体による天然ＣＤ８＋Ｔ細胞の補強したプライミング＞
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのプライミング実験として、ナイーブヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、以下のように単離した。
健康なドナーから得た５００ｍｌの末梢血液からフィコール密度遠心分離により単核細胞（ＰＢＭＣ）を調製した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、市販の細胞分離キット（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＨＣＤ８Ｃ−１０００）を用いたネガティブ選択により単離した。ＣＤ８＋Ｔ細胞カラムに２×１０８のＰＢＭＣを流した。なおこれは、カラム当たり１μｇのモノクローナル抗−ＣＤ１１ｂ抗体（Ｃｏｕｌｔｅｒ  ０１９０）を補給した製造者の抗体カクテルとともにプレインキュベートされたものである。プライムされた非増殖の細胞毒性ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球とＣＤ４５ＲＡ＋／ＲＯ−表現型を共有するので、元のＴ細胞サブセットを取り除くために追加的細胞精製マーカーとしてＣＤ１１ｂを導入した。従って、ＣＤ１１ｂ−／ＣＤ８＋Ｔ細胞のみがＣＤ４５−アイソフォームに基づく精製工程に入って最終的にナイーブＣＤ８＋Ｔリンパ球を得ることとなり、これは、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＤ４５ＲＡ＋／ＲＯ−表現型を運ぶようなものである。ＣＤ８＋Ｔ細胞の精製は、抗−ＣＤ８抗体による単染色後のフローサイトメトリーにより制御した。ＣＤ１１ｂ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞はいつもＣＤ２８陰性となり逆もまた同様であるため、ＣＤ８＋Ｔ細胞調製物からのＣＤ１１ｂ＋細胞の欠落を抗−ＣＤ２８抗体による単線色により確認した。
ポリクローナルヒツジ抗−マウスＩｇ抗体（Ｄｙｎａｌ，１１０．０１）とコンジュゲートしたマグネティックビーズに続いてネズミモノクローナル抗−ＣＤ４５ＲＯ抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，ＵＣＨＬ−１，３１３０１）とのインキュベーションを通じ、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞を精製したＣＤ８＋Ｔ細胞から取り出した。残っているナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の純度は、抗−ＣＤ４５ＲＡ／抗−ＣＤ４５ＲＯによる二重染色後のフローサイトメトリーによる測定により、＞９５％であることを確認した。末梢血液５００ｍｌ当たりのナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の平均収率は、５×１０６（ＣＤ８）であった。
ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞によるｉｎ  ｖｉｔｒｏのプライミング実験は、以下のようにして行った。
ウェル当たり２５．０００のＥｐＣＡＭでトランスフェクトされたＣＨＯ−細胞を９６ウェル平底培地プレートで２時間インキュベートした。なおこのプレートは、ＰＢＳで１：１０００に希釈されたポリクローナルウサギ抗−マウスＩｇＧ１抗体（Ｄａｋｏ，Ｚ００１３）により一晩被覆されたものである。細胞がプラスチックに吸着した後、１４．０００ｒａｄで放射線照射した。その後、ウェル当たり５０．０００の精製ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０％ヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−バッファー、１×非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）および５０μＭ  β−メルカプトエタノールを補給したＲＰＭＩ１６４０培地に加えた。ＷＯ９９２５８１８（実施例７）に記載されたＥｐＣＡＭ特異的Ｂ７−１／４−７単鎖構築物を５００ｎｇ／ｍｌで、１μｇ／ｍｌのネズミＩｇＧ１アイソタイプコントロール（Ｓｉｇｍａ，Ｍ−７８９４）、および、２５０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌの二重特異性単鎖抗体（ｂｓｃ）ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３（Ｍａｃｋ  （１９９５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ．  ９２：  ７０２１）あるいは二重特異性単鎖抗体なしで、これらに加えた。５００ｎｇ／ｍｌのＢ７−１／４−７単鎖構築物は、ＣＤ８＋Ｔ細胞上でのＣＤ４５−アイソフォームの発現にそれ自身影響を与えない最大濃度であった。平行した実験として、ＩｇＧ１アイソタイプコントロールを、最終濃度１μｇ／ｍｌでネズミＮＫＧ２Ｄ特異的ＩｇＧ１抗体ＢＡＴ２２１を含む希釈した、イタリアジェノバのＤｒ．Ｍｏｒｅｔｔａから親切にも提供されたハイブリドーマ上清に置き換えたことを除いては、同一濃度および同一の組み合わせのｂｓｃＥｐＣＡＭ×ＣＤ３およびＢ７−１／４−７単鎖構築物を用いた。あるいは、ＮＫＧ２Ｄ特異的モノクローナル抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ４７−４９および７２−７９のようにＮＫＧ２ＤおよびＥｐＣＡＭに結合する二重特異性抗体に置き換えることができる。モノクローナル抗体と対照的に、二重特異性抗体は、固体担体上に固定化されない。
すべての実験は、同じウェルにて３回行った。さらに、２つの同じ９６ウェルプレートの組を、３日および６日目にフローサイトメトリーに利用するのに充分な細胞を得るために調製した。３日目に、１つの９６ウェルプレートから上清を採取し、市販のＥＬＩＳＡキット（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，２６００ＫＫ）を用いてＴＮＦ−α濃度を測定した。細胞を同様に採取し、ＣＤ４５アイソフォーム発現のフローサイトメトリー分析を行った。さらに、上清の半分を第２の９６ウェルプレートのそれぞれのウェルから取り出し、Ｂ７−１／４−７単鎖構築物、ｂｓｃＥｐＣＡＭ×ＣＤ３、ＢＡＴ２２１および／またはアイソタイプコントロールの濃度に一致するように調製した新しい培地に置き換えた。６日目に、この９６ウェルプレートの細胞を採取し、そのＣＤ４５アイソフォーム発現パターンをフローサイトメトリーにより分析した。一般的には、３つの同じウェルからの細胞および上清（３倍量）をそれぞれフローサイトメトリーおよびサイトカイン分析のためにプールした。
フローサイトメトリーをＦＡＣスキャン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて行った。ＣＤ４５アイソフォーム発現のフローサイトメトリー分析を、ＰＥ−コンジュゲートモノクローナル抗−ＣＤ４５ＲＡ抗体（Ｃｏｕｌｔｅｒ，２Ｈ４，６６０３９０４）およびＦＩＴＣ−コンジュゲートモノクローナル抗−ＣＤ４５ＲＯ抗体（ＤＡＫＯ，ＵＣＨＬ１，Ｆ０８００）で１×１０５の細胞を氷上で３０分間二重染色することより行った。Ｔ細胞精製のフローサイトメトリーによるモニターを、３色−コンジュゲートモノクローナル抗−ＣＤ８抗体（Ｍｅｄａｃ，ＭＨＣ０８０６）およびＦＩＴＣ−コンジュゲートモノクローナル抗−ＣＤ２８抗体（Ｍｅｄａｃ，ＭＨＣＤ２８０１）による単染色により同様に行った。
これらのプライミング実験では、主要シグナルは、二重特異性単鎖抗体（ｂｓｃＡｂ）ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３により媒介され、従ってＴ−細胞レセプター（ＴＣＲ）を通じた特異的抗原認識を模倣しており、第２のまたは補助刺激シグナルは、Ｔ−細胞のＣＤ２８の結びつけを通じたＥｐＣＡＭ−特異的Ｂ７−１／４−７単鎖構築物により媒介された。従って、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のプライミングのＮＫＧ２Ｄ−誘導の抗体の影響を測定することができ、これは、ＴＣＲ様および補助刺激シグナルを通じて活性化されるものである。ＥｐＣＡＭ−特異的構築物を備えた非−ヒト刺激細胞を、バックグラウンドシグナルを避けるために用い、これは、補助刺激レセプターを付帯的に発現するヒト刺激細胞をもたらしうる。Ｔ細胞プライミングの動態は、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ４５ＲＯの発現を測定することと同時に３日目および６日目にフローサイトメトリーによりモニターした。図６に示すように、ナイーブＴ細胞のほぼ全量は、Ｂ７−１／４−７単鎖構築物（５００ｎｇ／ｍｌ）およびｂｓｃＡｂ  ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３（２５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で６日のうちに、ＣＤ４５−表現型がプライムされたＴ細胞、即ち、ＣＤ４５ＲＡ−／ＲＯ＋に変化した。従って、中間状態が３日目に観察された。驚くべきことに、ＮＫＧ２Ｄ−誘導の抗体のさらなる存在は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖とプライミングをさらに加速させた。ナイーブＴ細胞がＴＣＲ様および補助刺激シグナル単独を通じて刺激された場合に少ない割合でシグナルを受けるのに比べて、さらなるＮＫＧ２Ｄ−シグナルを細胞が受けた場合には、図６Ｂの右下象限の３日目におかれたＣＤ８＋Ｔ細胞の高い割合から、このことが結論づけられる。ＴＮＦ−αは、通常はプライムされたＣＤ８＋Ｔ細胞から産生され、それらのナイーブ対応物から産生されるのではないから、補強されたＴ細胞プライミングの効果は、ＮＫＧ２Ｄ−誘導の抗体の不存在下でプライムされたものと比較してＮＫＧ２Ｄ−シグナルを受けるＣＤ８＋Ｔ細胞の上清の３日目に測定されるＴＮＦ−αの高い濃度により確認することができる（図７）。
６日目のフローサイトメトリーの結果でさえ（図６ＣおよびＥ）、プライミングの工程がほぼ完結した場合は、ＮＫＧ２Ｄに媒介されるＴ細胞プライミングのサポートを示している。６日間のうちでのＣＤ４５ＲＡ−発現の損失は、図６Ｃの右下に位置するＣＤ８＋Ｔ細胞の高い割合で測定されるように、ＮＫＧ２Ｄに媒介されるシグナルの不存在下よりも存在下において、より大きいことが確認された。
【０１２３】
＜実施例６：ＮＫＧ２Ｄ誘導の抗体は、ＴＣＲ−またはＦｃγＲＩＩＩ−複合体それぞれとの結びつけを通じて引き金となるＣＤ８＋Ｔ細胞とＮＫ細胞の細胞毒性を補強する。＞
細胞毒性リンパ球、即ち、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞のＮＫＧ２Ｄ誘導抗体によるリクルートを検査するために、我々は、標的としてネズミＦｃγＲ陽性Ｐ８１５細胞系および、エフェクターとしてＭｅｌａｎ−Ａ特異的ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞クローン（Ｍｅｌａｎ−Ａ細胞）またはＮＫＬ細胞（Ｂａｕｅｒ  （１９９９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：  ７２７）のいずれかを用いた５１Ｃｒ放出分析を行った。細胞の細胞毒性を測定する５１Ｃｒ放出分析は、Ｍａｃｋ  （１９９５）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：  ７０２１に記載されているものにわずかな修正を加えて行った。１０．０００の５１Ｃｒラベル化Ｐ８１５細胞を、丸底マイクロタイタープレートのウェル当たり５０．０００のＭｅｌａｎ−Ａ細胞または２００．０００のＮＫＬ細胞のいずれかと混合した。ＮＫＬ細胞を、５μｇ／ｍｌのＣＤ１６抗体（３Ｇ８）、および／または、ネズミＮＫＧ２Ｄ特異的モノクローナル抗体ＢＡＴ２２１を含む希釈したハイブリドーマ上清の存在下で、４時間インキュベートした。Ｍｅｌａｎ  Ａ細胞は０．２μｇ／ｍｌのＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）および／または希釈したＢＡＴ２２１上清の存在下で、４時間インキュベートした。最大の５１Ｃｒ放出は、Ｍａｌｙバッファー（２％ＳＤＳ／０．３７％ＥＤＴＡ／０．５３％Ｎａ２ＣＯ３）を用いた標的細胞の溶解により測定した。自然の５１Ｃｒ放出は、エフェクター細胞および抗体の不存在下でインキュベートした標的細胞により測定した。抗体の不存在下でエフェクター細胞とともにインキュベートした標的細胞は、ネガティブコントロールとして用いた。特異的分解は、［（ｃｐｍ、実測放出量）−（ｃｐｍ、自然放出量）］／［（ｃｐｍ、最大放出量）−（ｃｐｍ、自然放出量）］により算出した。細胞毒性分析は、３つのサンプルにより行った。図８に示すように、ＢＡＴ２２１は、公表されたＮＫＧ２Ｄ抗体（Ｂａｕｅｒ  （１９９９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：  ７２７）とは対照的に、それ自身実質的に標的細胞溶解を引き起こすことはなかった。予期されたように、ＣＤ１６−およびＣＤ３−抗体は、ＮＫＬ細胞およびＭｅｌａｎ  Ａ細胞それぞれにより再誘導された標的細胞溶解を引き起こした。しかし、それ自身細胞毒性ではないが、ＢＡＴ２２１は、Ｍｅｌａｎ  Ａ細胞のＴＣＲ−複合体およびＮＬＫ細胞のＦｃγＲＩＩＩ−複合体との結びつけによって引き金となる標的細胞の細胞毒性を驚くほどに補強した。あるいは、Ｐ８１５細胞は、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ４７−４９および７２−７９のようにＮＫＧ２ＤおよびＥｐＣＡＭに結合する二重特異性抗体と交換したＥｐＣＡＭ陽性Ｋａｔｏ−細胞およびＮＫＧ２Ｄ特異的モノクローナル抗体に置き換えることができる。ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲ−複合体は、ＣＤ３および標的細胞の表面抗原に結合する二重特異性抗体や、処理されたＭＨＣ  Ｉ−複合標的細胞抗原の特異的ＴＣＲ−認識によって、結びつけられうる。ＮＫ細胞のＦｃγＲＩＩＩ−複合体は、ＣＤ１６および標的細胞の表面抗原に結合する二重特異性抗体や、例えばそのＦｃ部分を介してＦｃγＲＩＩＩに結合したヒトＥｐＣＡＭ抗体のような標的細胞特異的モノクローナル抗体によって、結びつけられうる。
【０１２４】
＜実施例７：標的結合部位のＣ−末端に位置するＮＫＧ２Ｄ結合部位を有する二重特異性単鎖抗体＞
５匹のＢａｌｂ／ｃマウスを、実施例２に記載されたようにヒトＮＫＧ２Ｄにより遺伝子的に免疫した。ＮＫＧ２Ｄ−レセプター複合体の発現パターンに似せてヒトリンパ球表面の血清抗体反応性によりマウスを同定するために、実施例２に記載されたようにＰＢＭＣの３色蛍光分析を、１：１０、１：２０および１：４０に希釈されたマウス血清を用いて行った。図９に示すように、わずか１つのマウス血清（Ｎｏ．４）が、ＣＤ８＋Ｔリンパ球およびＮＫ細胞の双方に対して強い染色を示した。このマウスの脾臓細胞を、ＷＯ９９２５８１８（実施例６）に記載されているようにコンビナトリアル抗体ライブラリーの構築のための免疫グロブリンレパートリーとして用いた。クローニングされた抗体レパートリーは、二重特異性単鎖抗体の抗原結合部位に相当するＣ−末端部分を真似て、Ｎ２−ＶＨ−ＶＬ−融合タンパク質として繊維状ファージに表出した。ＮＫＧ２Ｄ反応性ｓｃＦｖ−フラグメントの選択は、ＮＫＧ２Ｄ陽性ＮＫＬ細胞の３回のパニングに続く１７−１Ａ−またはＥｐＣＡＭ−抗原のためにＷＯ９９２５８１８に記載されているように、固定化組み換えＮＫＧ２Ｄタンパク質の２回のライブラリーパニングを通じて行った。細胞パニングは、４℃での４５分間の穏やかな振とうに続く５００μｌのファージサスペンション中で２−５×１０６のＮＫＬ細胞を再分散することによりＰＢＳ／１０％ＦＣＳ中で行った。その後、細胞および結合したファージ粒子は、卓上遠心分離器にて２５００ｒｐｍで２分間遠心分離した。そして、得られたペレットを、再遠心分離に続いて１ｍｌのＰＢＳ／１０％ＦＣＳで再分散することにより２回洗浄した（３回目のパニング）。４回目のパニングの間に３回の洗浄工程を、５回目のパニングの間に５回の洗浄工程を行った。特異的に結合したファージ粒子を、再分散および、３０μｌの２ＭＴｒｉｓ−塩基（ｐＨ１２）での中和に続く５００μｌのＨＣｌ−グリシンでの１０分間インキュベーションにより、ＮＫＬ細胞から溶出した。溶出物は、新規の感染していないＥ．ｃｏｌｉＸＬ１ブルー培地の感染に用いた。５回のファージ産生およびこれに続く抗原結合性ｓｃＦｖ−表出ファージの選択の後、Ｅ．ｃｏｌｉ培地からのプラスミドＤＮＡを、４回目および５回目のパニングに対応して単離した。Ｎ−末端にＮ２ドメインを運ぶ溶解性ｓｃＦｖ−抗体フラグメントの産生のために、遺伝子ＩＩＩ−産物のＣＴ−ドメインをエンコードするＤＮＡフラグメントを、Ｓｐｅｌ／ＮｏｔＩにて切除し、Ｎ−末端Ｉｇ−ヒンジ領域およびＣ−末端フラッグ−エピトープ（図１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ５０および５１）の側面に位置するヒトｐ５３の４分裂ドメイン（Ｒｈｅｉｎｎｅｃｋｅｒ  （１９９６）  Ｊ  ｉｍｍｕｎｅ）．  １５７：  ２９８９）に置き換えた。ライゲーションの後、得られたプラスミドＤＮＡのプールを、１００μｌの熱ショックコンピテントＥ．ｃｏｌｉＸＬ１ブルー細胞に形質導入し、カーベニシリンＬＢ−寒天に配置した。単一のコロニーを、クローニングされたＶＨ−とＶＬ−領域およびＷＯ９９２５８１８（実施例６）に記載されているように溶解性抗体フラグメントのペリプラズムでの発現のためのインタクトな可変領域の完全性のために、スクリーニング−ＰＣＲにより確認した。ペリプラズム調製物は、固定化組み換えＮＫＧ２Ｄおよびペルオキシダーゼ−コンジュゲート抗−Ｆｌａｇ  Ｍ２抗体（Ｓｉｇｍａ，Ａ−８５９２）で検出される特異的に結合するＮ２−ｓｃＦｖ−ｐ５３−融合タンパク質のＥＬＩＳＡにより調べた。図１１に示すように、４回目および５回目のパニングからの多くのＮＫＧ２Ｄ反応性クローンが同定できた。陽性クローンのｓｃＦｖ−エンコードフラグメントは、ファージ表出ベクターからＢｓｐＥＩにより切除し、仔牛腸ホスファターゼの脱リン酸化に続くＢｓｐＥＩおよびＸｍａｌの消化により調製されたプラスミドベクターＢＳ−ＣＴＩ（ＷＯ００−０６６０５、図２を参照）中にサブクローンした。ｓｃＦｖ−フラグメントの正しい配向は、制限酵素ＢｓｐＥＩおよびＳｐｅｌによる分析的消化により確認した。ＢＳ−ＣＴＩへの挿入により、ｓｃＦｖ−エンコードフラグメントは、フレーム単位でＨｉｓ６−標識（ＳＥＱ  ＩＤ  ５２−７１）に融合した。次の工程として、ｓｃＦｖ−フラグメントは、ＢＳ−ＣＴＩからＢｓｐＥＩおよびＳａｌｌにより切除し、ＥｐＣＡＭ−特異的モノクローナル抗体Ｍ７９のｓｃＦｖ−フラグメントをＥｐＣＡＭに高い親和性で結合する（＝ｂｓｃ３Ｂ１０×ＣＤ３）モノクローナル抗体３Ｂ１０に置き換えたことを除き、Ｍａｃｋ  （１９９５）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：  ７０２１に記載されたようにＥｐＣＡＭ−特異的、ＣＤ３−誘導の二重特異的単鎖抗体を含む哺乳動物発現ベクターｐＥＦ−ＤＨＦＲ中にＢｓｐＥＩ／Ｓａｌｌをサブクローンした。従って、ＣＤ３−特異的ｓｃＦｖ−フラグメントは、ＮＫＧ２Ｄ−反応性ｓｃＦｖ−フラグメントに置き換えられ、その結果ＥｐＣＡＭ−特異的、ＮＫＧ２Ｄ−誘導の二重特異性単鎖抗体を得た（ＳＥＱ  ＩＤ  ７２−７９）。
ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞を、抗体様分子の一時的発現のために選んだ。細胞のトランスフェクションは、製造者のプロトコールに従いＴｒａｎｓＦａｓｔトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を用いて行った。要約すると、トランスフェクションの２０時間前にウェル当たり２．５×１０５の細胞を６ウェルプレートに接種した。トランスフェクション混合物は、抗体配列またはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む６μｇのプラスミドＤＮＡを、補給なしの１ｍｌＭＥＭアルファ培地に添加することにより調製した。混合の後、３０μｌのＴｒａｎＦａｓｔ試薬を加えた。混合物をボルテックスし、室温で１５分間インキュベートした。そして、培地を細胞から除去し、トランスフェクション混合物と置き換えた。３７℃での１時間のインキュベーションの後、トランスフェクション混合物を吸引し、新しい完全ＭＥＭアルファを細胞に添加した。タンパク質産物を、トランスフェクションの４から５日後にＦＡＣＳ分析により分析した。上清を４から５日後に採取した。細胞破片を取り除くために、上清を遠心分離した。抗体の機能を、ＫａｔｏＩＩＩ細胞の抗−ＥｐＣＡＭ特異的部分の結合試験により分析した。サンプル当たり、４×１０５の細胞を、２５μｌのＦＡＣＳバッファー（１％熱不活化ＦＢＳ、ＰＢＳ中０．０５％Ｎａ３Ｎ）で希釈した７５μｌのトランスフェクト細胞上清中でインキュベートした。サンプルは、４℃で３０分間インキュベートした。２００μｌのＦＡＣＳバッファーで細胞を２回洗浄した後、細胞を２μｇ／ｍｌの抗−Ｐｅｎｔａ．Ｈｉｓ抗体（ＱＩＡＧＥＮ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）とともに４℃で３０分間インキュベートした。その後、細胞を再び洗浄し、ヒツジ抗−マウスＦＩＴＣコンジュゲート（ＳＩＧＭＡ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）とともに３０分間インキュベートした。結合を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により検出した（図１２）。ｂｓｃ３Ｂ１０×Ｐ４−３およびｂｓｃ３Ｂ１０×Ｐ５−２によって一時的にトランスフェクトされたＣＨＯ−細胞の上清は、固定化組み換えＮＫＧ２Ｄ−抗原の陽性ＥＬＩＳＡシグナルを示した（図１３）。
ＮＫＧ２Ｄの代わりとして、実施例４に記載されたＤＡＰ１０−ペプチド−コンジュゲートをマウスを免疫するために用いることができる。そして、このマウスの脾臓細胞は、この実施例に記載されているようなコンビナトリアル抗体ライブラリー構築のための免疫グロブリンレパートリーの供給源となりうる。従って、二重特異性単鎖抗体の標的結合部位のＣ−末端に位置している場合でさえ、ＣＤ８＋Ｔリンパ球およびＮＫ細胞のＮＫＧ２Ｄ−レセプター複合体を認識するＤＡＰ１０反応性抗体結合部位は、固定化ペプチド−コンジュゲートおよび／またはＮＫＧ２Ｄ−レセプター複合体を発現している細胞のライブラリーパニングを通じて選択することができる。
【０１２５】
＜実施例８：二重特異性単鎖抗体による標的結合部位のＣ−末端に位置するＮＫＧ２Ｄ−結合部位とのＣＤ８＋ＴおよびＮＫエフェクター細胞のリクルート＞
ＮＫＧ２Ｄ−誘導の二重特異性抗体による細胞毒性リンパ球、即ち、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞のリクルートの検査のために、我々は、標的として胃癌細胞系Ｋａｔｏを、エフェクターとしてＭｅｌａｎ−Ａ特異的ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞クローン（Ｍｅｌａｎ−Ａ細胞）、ＮＫＬ細胞（Ｂａｕｅｒ  （１９９９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５  ：  ７２７）または健康なドナーからの非刺激ＰＢＭＣのいずれかを用いた５１Ｃｒ放出分析を行った。
ＥｐＣＡＭ陽性Ｋａｔｏ細胞に対して再誘導された細胞の細胞毒性を測定する５１Ｃｒ放出分析を、Ｍａｃｋ  （１９９５）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：  ７０２１に記載されているものにわずかな修正を加えて行った。丸底マイクロタイタープレートのウェル当たり１０．０００の５１Ｃｒ−ラベル化Ｋａｔｏ細胞を、５０．０００のＭｅｌａｎ−Ａ、２００．０００のＮＫＬ細胞またはＰＢＭＣのいずれかと混合し、実施例８に記載の異なるＥｐＣＡＭ−特異的、ＮＫＧ２Ｄ誘導の二重特異性単鎖抗体（３Ｂ１０×Ｐ４−３，３Ｂ１０×Ｐ４−１４，３Ｂ１０×Ｐ５−２および３Ｂ１０×Ｐ５−２３）によりトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からの培地上清の１：２希釈物の存在下で、４時間（Ｍｅｌａｎ  ＡおよびＮＫＬ細胞）または１８時間（ＰＢＭＣ）インキュベートした。最大の５１Ｃｒ放出は、Ｍａｌｙバッファー（２％ＳＤＳ／０．３７％ＥＤＴＡ／０．５３％Ｎａ２ＣＯ３）を用いた標的細胞の溶解により測定した。自然の５１Ｃｒ放出は、エフェクター細胞および二重特異性抗体の不存在下でインキュベートした標的細胞により測定した。抗体の不存在下でエフェクター細胞とともにインキュベートした標的細胞は、ネガティブコントロールとして用いた。特異的溶解は、［（ｃｐｍ、実測放出量）−（ｃｐｍ、自然放出量）］／［（ｃｐｍ、最大放出量）−（ｃｐｍ、自然放出量）］により算出した。細胞毒性分析は、３つのサンプルにより行った。図１４に示すように、ＮＫＧ２Ｄ−誘導の二重特異性単鎖抗体３Ｂ１０×Ｐ４−３により一時的にトランスフェクトされたＣＨＯ−細胞の上清は、４回目の５１Ｃｒ放出試験でＭｅｌａｎ−ＡおよびＮＫＬ細胞双方でＥｐＣＡＭ陽性Ｋａｔｏ細胞の、弱いが再現性があり滴定可能な細胞溶解を引き起こした。さらに、ＮＫＧ２Ｄ誘導の二重特異性単鎖抗体３Ｂ１０×Ｐ４−３、３Ｂ１０×Ｐ４−１４，３Ｂ１０×Ｐ５−２および３Ｂ１０×Ｐ５−２３によりそれぞれ一時的にトランスフェクトされたＣＨＯ−細胞の上清は、１８回目の５１Ｃｒ放出分析でＰＢＭＣで実質的な標的細胞の溶解を引き起こした（図１５）。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、Ｃ−末端ヒスチジン−標識を含む溶解性ＮＫＧ２Ｄのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。クローニングに用いた制限部位は、ヌクレオチド配列の最初（ＥｃｏＲＩ）および最後（Ｓａｌｌ）に示す。
【図２】
図２は、ＤＮＡレベル（パネルＡ）およびタンパク質レベル（パネルＢ）におけるＮＫＧ２Ｄ誘導の二重特異性単鎖抗体の分子設計を示す。二重特性抗体の機能の様式も、パネルＢに示す。
【図３】
図３は、抗−ＮＫＧ２Ｄ（８Ｒ２３）×抗−ＥｐＣＡＭ（４−７）の二重特異性単鎖抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥである（右レーン）。左レーンは、分子量マーカーを示す。
【図４】
図４は、遺伝子により免疫性を付与するのに用いられる分泌されたヒトＮＫＧ２−Ｄのカルボキシル基−末端フラグメントをエンコードする発現ベクターを示す。
図示されたベクターからのＮＫＧ２−Ｄフラグメントの発現は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即時―早期プロモーターにより制御される。ＮＫＧ２−Ｄフラグメントは、ヒトｍｙｃエピトープに続く、ネズミ免疫グロブリンカッパ軽鎖由来のリーダーペプチドからなる。ＮＫＧ２−Ｄのコード配列は、そのコグネート終止コドンにより終了する。ＢＧＨポリアデニル化部位は牛成長ホルモンポリアデニル化部位を、ａｍｐはアンピシリン耐性遺伝子を、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉｇｉｎは、ＣｏｌＥ１複製起点を示す。
【図５】
図５は、ＮＫＧ２−Ｄ陽性標的細胞に特異的に結合するハイブリドーマの選択を示す。
ＣＤ８−陽性Ｔ細胞（Ａ）またはＣＤ５６−陽性ナチュラルキラー細胞いずれかのハイブリドーマ上清６Ｅ５、８Ｇ７および１１Ｂ２の３つの別個のモノクローナル抗体の結合が、ＦＡＣＳ分析により示されている。６Ｅ５は６Ｅ５／Ａ７の、８Ｇ７は８Ｇ７／Ｃ１０の、１１Ｂ２は１１Ｂ２／Ｄ１０の略号である。
１０Ｈ９は、ＮＫＧ２−Ｄ結合活性を欠いたハイブリドーマ上清のコントロールである。種々の検出抗体が図に示されている。
【図６】
図６は、ナイーブＴ細胞のプライミングにおけるＮＫＧ２−Ｄに対して誘導されるモノクローナル抗体の補強効果を示す。
マーカーＣＤ４５ＲＡ（Ａ）を発現しているナイーブＴ細胞は、ＦＡＣＳスキャンの左上の区画に示される。ナイーブＴ細胞は、Ｂ７−１×抗−ＥｐＣＡＭ融合タンパク質と単鎖二重特異性抗−ＥｐＣＡＭ×抗−ＣＤ３分子（Ｂ−Ｅ）の組み合わせにより、ＥｐＣＡＭ−発現標的細胞系（ＥｐＣＡＭ／１７−１Ａ−トランスフェクトＣＨＯ細胞）の存在下でプライムされた。なお、ＢＡＴ２２１と呼ばれるＮＫＧ２−Ｄに対するモノクローナル抗体の不存在下の場合をＤおよびＥに、存在下の場合をＢおよびＣに示す。マーカーＣＤ４５ＲＯを発現したプライムされたＴ細胞は、右下の区画に現れている。数字は、先にナイーブＴ細胞であったものがプライムされた割合を示す。蛍光１は、ＦＩＴＣ−ラベル化抗−ＣＤ４５ＲＯ、蛍光２は、フィコエリトリン−コンジュゲート抗−ＣＤ４５ＲＡである。
【図７】
図７は、Ｔ細胞により産生されるＴＮＦのＮＫＧ２−Ｄに対して誘導されるモノクローナル抗体の補強効果を示す。
ナイーブＴ細胞は、Ｂ７−１×抗−ＥｐＣＡＭ融合タンパク質と単鎖二重特異性抗−ＥｐＣＡＭ×抗−ＣＤ３分子の（図示したように）濃度増加との組み合わせにより、ＥｐＣＡＭ−発現標的細胞系（ＥｐＣＡＭ／１７−１Ａ−トランスフェクトＣＨＯ細胞）の存在下でプライムされた。ＴＮＦ産物は、ＢＡＴ２１１と呼ばれるＮＫＧ２−Ｄに対するモノクローナル抗体の存在下（Ａ）および不存在下（Ｂ）で、市販のＴＮＦ―αＥＬＩＳＡにより測定した。
【図８】
図８は、それぞれモノクローナル抗体ＣＤ１６（５μｇ／ｍｌ）およびＣＤ３（０．２μｇ／ｍｌ）を組み合わせてＮＫＧ２ＤハイブリドーマＢＡＴ２１１の上清を数回希釈することによりＰ８１５に対して再誘導されたＭｅｌａｎ  Ａ細胞およびＮＫＬ細胞の細胞毒性を示す。２００．０００のＮＫＬ細胞または５００００のＭｅｌａｎ  Ａ細胞は、希釈された抗体の存在下でクロム−５１でラベル化された１０．０００のＫａｔｏＩＩＩ細胞に総体積２００μｌとなるように加えられた。バックグラウンドコントロール（Ｅ＋Ｔ）は、抗体希釈をしないエフェクター細胞と標的細胞を含む。マイクロタイタープレートは、５％ＣＯ２下、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの後、５０μｌの上清をそれぞれのウェルから取り、ガンマ線カウンターにより放出された５１Ｃｒを分析した。
【図９】
図９は、ヒトＮＫＧ２−Ｄの分泌されたＣ−末端フラグメントをエンコードする発現ベクターにより免疫されたマウスでの特異的な免疫反応の検出を示す。
ヒトＣＤ８＋Ｔリンパ球およびヒトＮＫ細胞に対して免疫された５匹のマウスの１：３０に希釈された血清の結合活性を、フローサイトメトリーにより分析した。健康なドナーの末梢血液から得た２００．０００の単核細胞を、５匹のマウスの希釈血清とともにインキュベートした。結合したネズミの抗体が、ＰＢＳで１：１００に希釈されたフルオレセイン（ＦＩＴＣ）−コンジュゲート  ヤギ−抗−ラットＩｇ（ＩｇＧ＋ＩｇＭ）抗体により検出された。３色蛍光分析を、ＣＤ８＋（３色）に対してポジティブゲートおよびＣＤ１６＋（ＰＥ）に対してネガティブゲートを適用することにより行い、ＣＤ８＋−ＮＫ−細胞からのいなかる汚染シグナルを受けることなく、ＣＤ８＋Ｔリンパ球（表現型：ＣＤ８＋、ＣＤ１６−）にのみ排他的に帰属するＦＩＴＣ媒介の蛍光を検出することができた。同様に、３色蛍光分析を、ＣＤ５６＋（ＰＥ）に対してポジティブゲートおよびＣＤ３＋細胞（３色）に対してネガティブゲートを適用することにより行い、ＣＤ５６＋Ｔリンパ球からのいなかる汚染シグナルを受けることなく、ＮＫ−細胞（表現型：ＣＤ５６＋、ＣＤ３−）にのみ排他的に帰属するＦＩＴＣ媒介の蛍光を検出することができた。ネガティブコントロールとして免疫されていないマウスの代表的な血清を用いた（免疫前血清）。細胞は、ＦＡＣＳスキャンを備えたフローサイトメーターにて分析した（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。
【図１０】
図１０は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムでのＮ−末端ブロック単鎖抗体の発現に用いたファージミドの設計を示す。
Ｐは細菌のプロモータ；ｏｍｐＡはペリプラズム輸送のためのリーダー配列；Ｎ２は代理Ｎ−末端ブロックドメイン；ＶＨはｓｃＦｖの可変重鎖ドメイン；ＶＬはｓｃＦｖの可変軽鎖ドメイン；ｐ５３は転写因子ｐ５３の４分裂ドメイン；Ｆｌａｇ−標識はインフルエンザウイルスエピトープ標識を示す。種々の制限酵素部位の位置は、上方に示す。基本的なコード配列は、黒の箱として示す。
【図１１】
図１１は、ＮＫＧ２−Ｄ特異的な、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズムで産生されるＮ−末端ブロック単鎖Ｆｖフラグメントの検出を示す。
感度を増すために、単鎖Ｆｖ抗体の結合アビディティを、転写因子ｐ５３の４分裂ドメインとＮ−末端ブロックｓｃＦｖｓのカルボキシル末端とを融合することにより増加させた。４分裂化したｓｃＦｖｓは、捕捉のための溶解性の組み換えＮＫＧ２−Ｄと検出のためのペロオキシダーゼ−コンジュゲート抗−ＦＬＡＧ抗体を用いたＥＬＩＳＡによりペリプラズム分画中で検出された。種々のクローンのＥＬＩＳＡシグナルが描かれる。＞０．０５のシグナルを有するすべてのクローンは、さらに分析された。
【図１２】
図１２は、ＮＫＧ２−Ｄを標的とした４つの二重特性性分子へのＥｐＣＡＭの一時的な発現と結合を示す。
ＣＨＯ／ｄｈｆｒ−細胞は、４つの異なる単鎖二重特異性分子をエンコードする発現ベクターによって一時的にトランスフェクトされた。Ａにおいて、ベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子は、ネガティブコントロールとしてトランスフェクトした。種々の二重特異性分子は、Ｂが３Ｂ１０×Ｐ４−３、Ｃが３Ｂ１０×Ｐ４―１４、Ｄが３Ｂ１０×Ｐ５−２、Ｅが３Ｂ１０×Ｐ５−２３である。細胞培地上清は、５日後に採取し、ヒト胃癌腫細胞系ＫａｔｏＩＩＩへのＥｐＣＡＭ特異的結合のＦＡＣＳ分析により二重特異性抗体の発現を調べた。細胞に結合した二重特異性分子は、ＦＩＴＣ−ラベル化ヤギ−抗−マウス抗体により検出した。ＦＡＣＳヒストグラムブロットを示す。
【図１３】
図１３は、ＥＬＩＳＡによるＮＫＧ２−Ｄ特異的結合の２つの単鎖二重特異性抗体の特徴付けを示す。
２つの二重特異性抗体３Ｂ１０×Ｐ４−３および３Ｂ１０×Ｐ５−２は、ＣＨＯ細胞培地上清で一時的に発現させた。被覆した溶解性のものに結合して、組み換えＮＫＧ２−Ｄは、ヘキサヒスチジン−標識をつけた二重特性抗体の検出のためにペルオキシダーゼ−コンジュゲート×抗−ヘキサヒスチジン抗体を用いたＥＬＩＳＡにより調べた。２つの異なる濃度で調べた。培地上清をＡは１：１希釈、Ｂは１：２希釈とした。コントロールとして、ＥｐＣＡＭ特異的３Ｂ１０×抗−ＣＤ３二重特異性抗体の結合を用いた。この非特異的コントロールにより得られた値は、示された読みとり値から差し引いた。
【図１４】
図１４は、二重特異性３Ｂ１０×Ｐ４−３抗体によりＥｐＣＡＭ−陽性Ｋａｔｏ細胞に対して再誘導されたＭｅｌａｎ  Ａ細胞（Ａ）およびＮＫＬ細胞（Ｂ）の細胞毒性を示す。２００．０００のＮＫＬ細胞または５００００のＭｅｌａｎ  Ａ細胞は、数回希釈された二重特異性抗体の存在下でクロム−５１でラベル化された１０．０００のＫａｔｏＩＩＩ細胞に総体積２００μｌとなるように加えられた。バックグラウンドコントロール（Ｅ＋Ｔ）は、抗体希釈をしないエフェクター細胞と標的細胞を含む。マイクロタイタープレートは、５％ＣＯ２下、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの後、５０μｌの上清をそれぞれのウェルから取り、ガンマ線カウンターにより放出された５１Ｃｒを分析した。
【図１５】
図１５は、ＮＫＧ２−Ｄを介して末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣｓ）をリクルートする４つの単鎖抗体による特異的標的細胞の溶解を示す。
モノクローナル抗体３Ｂ１０由来の単鎖Ｆｖによりヒト胃癌腫細胞系ＫａｔｏＩＩＩのＥｐＣＡＭ標的を認識する４つの二重特異性抗体は、ＮＫ／ＣＤ８−特異的レセプターＮＫＧ２−Ｄに特異的な４つの区別されたｓｃＦｖｓからすべて作製した。４つの二重特異性抗体をエンコードする発現ベクターを、ＣＨＯ細胞に一時的な発現のためにトランスフェクトし、上清を集めた。示された希釈における分泌された二重特異性抗体を有する上清は、ヒト免疫エフェクター細胞（ＰＢＭＣｓ）の存在下でＫａｔｏＩＩＩ細胞の特異的溶解のための細胞毒性分析により調べた。ＣＨＯ上清不存在下では、ＰＢＭＣｓの存在下でＫａｔｏＩＩＩ細胞の標的細胞溶解は観察されなかった。示されたデータは、３回の測定の平均である。ＰＢＭＣの細胞毒性は、二重特異性抗体３Ｂ１０×Ｐ４−３、３Ｂ１０×Ｐ４−１４、３Ｂ１０×Ｐ５−２および３Ｂ１０×Ｐ５−２３により数回の希釈でＥｐＣＡＭ−陽性Ｋａｔｏ細胞に対して再誘導した。２００．０００のＰＢＭＣｓは、希釈された二重特異性抗体の存在下で１０．０００のクロム−５１でラベル化されたＫａｔｏＩＩＩ細胞に総体積２００μｌとなるように加えられた。ネガティブコントロールは、抗体希釈をしないＰＢＭＣｓと標的細胞を含む。マイクロタイタープレートは、５％ＣＯ２下、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの後、５０μｌの上清をそれぞれのウェルから取り、ガンマ線カウンターにより放出された５１Ｃｒを分析した。
【図１６】
図１６は、添付の実施例に記載された配列のまとめである。
ヌクレオチド配列は、通常の５’−３’方向で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【図１６−６】
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【図１６−７】
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【図１６−８】
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【図１６−９】
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【図１６−１０】
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【図１６−１１】
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【図１６−１２】
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【図１６−１３】
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【図１６−１４】
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【図１６−１５】
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【図１６−１６】
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【図１６−１７】
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【図１６−１８】
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【図１６−１９】
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【図１６−２０】
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【図１６−２１】
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【図１６−２２】
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【図１６−２３】
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【図１６−２４】
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【図１６−２５】
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【図１６−２６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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