(57)【要約】本発明は、ＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質がミトコンドリアの内膜タンパク質ＡＮＴ（アデニンヌクレオチド輸送体、これはまたアデニンヌクレオチドトランスロカーゼまたはＡＤＰ／ＡＴＰキャリアとも呼ばれる）と物理的および機能的に相互作用することによるミトコンドリア膜透過化の誘導に関する。ＡＮＴに対するＶｐｒの結合、ミトコンドリア膜透過化およびアポトーシスを誘導および／または阻害するための試薬および方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶｐｒとＡＮＴとの相互作用を妨げる方法であって、
（ａ）全長のＶｐｒがＡＮＴに結合することを妨げることができる分子を提供すること、および
（ｂ）該分子をＡＮＴフラグメントと接触させること
を含み、該分子が、該ＡＮＴフラグメントとＶｐｒとの相互作用を妨げる、方法。
【請求項２】
ミトコンドリア膜におけるチャンネル形成を妨げる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ミトコンドリア膜の透過化を妨げる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
細胞死を妨げる、請求項１記載の方法。
【請求項５】
アポトーシスによる細胞死を妨げる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
該分子が、Ｂｃｌ−２またはそのフラグメントである、請求項１記載の方法。
【請求項７】
ＡＮＴに対するＶｐｒのＣ末端部分の結合と競合する分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＡＮＴに結合し得るＶｐｒフラグメントを提供すること、
（ｂ）試験分子の存在下および非存在下において、該Ｖｐｒフラグメントを、Ｖｐｒに結合し得るＡＮＴフラグメントと接触させること、および
（ｃ）試験分子の存在下および非存在下における該ＡＮＴフラグメントに対する該Ｖｐｒフラグメントの結合を検出すること
を含む方法。
【請求項８】
該フラグメントが、全長のＶｐｒを含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
該フラグメントが、ＨＩＶ−１Ｖｐｒのアミノ酸５２〜９６を含む、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
ＡＮＴと物理的に相互作用し得るその能力においてＶｐｒまたはＶｐｒフラグメントを模倣する分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＡＮＴと相互作用し得るＶｐｒまたはＶｐｒフラグメントを提供すること、
（ｂ）試験分子の存在下または非存在下において、該ＶｐｒまたはＶｐｒフラグメントを、ＶｐｒまたはＶｐｒフラグメントと相互作用し得るＡＮＴフラグメントと接触させること、および
（ｃ）試験分子の存在下または非存在下における該ＡＮＴフラグメントに対する該ＶｐｒまたはＶｐｒフラグメントの結合を検出すること
を含む方法。
【請求項１１】
ミトコンドリア膜の透過化を妨げ、かつＡＮＴに対するＶｐｒの結合を妨げるペプチド性または非ペプチド性の分子。
【請求項１２】
ミトコンドリア膜の透過化を生じさせ、かつＡＮＴに対するＶｐｒの結合を増強させるペプチド性または非ペプチド性の分子。
【請求項１３】
請求項１１または１２記載の分子を含む、医薬組成物または診断用組成物。
【請求項１４】
ミトコンドリア膜の透過化を生じさせるか、または妨げるための方法であって、請求項１３記載の組成物を患者に投与することを含む方法。
【請求項１５】
ヒトにおける３つのＡＮＴアイソフォームの発現または構造における遺伝子的またはエピジェネティックな変化をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＡＮＴに結合し得るＶｐｒのフラグメントを、ヒトＡＮＴを含むサンプルとともに提供すること、
（ｂ）該フラグメントを、ヒトＡＮＴを含む生物学的サンプルと混合すること、
（ｃ）該フラグメントを、ヒトＡＮＴを含む対照サンプルと混合すること、
（ｄ）該生物学的サンプルおよび該対照サンプルにおけるＡＮＴに対するＶｐｒの結合を検出すること、
（ｅ）結合の差をＡＮＴの遺伝子的またはエピジェネティックな変化と相関させること、および
（ｆ）場合により、リポソームまたは平面脂質二重層においてチャンネルを形成するＡＮＴの能力の差を検出すること
を含む方法。
【請求項１６】
細胞における３つのヒトＡＮＴアイソフォームのレベルを定量する方法であって、
（ａ）Ｖｐｒを、ＡＮＴに結合するために効果的な量で、ＡＮＴを含む生物学的サンプルと混合すること、および
（ｂ）ＡＮＴに対するＶｐｒの結合レベルを定量すること
を含む方法。
【請求項１７】
ＡＮＴによる致死性細孔の形成を誘導するか、または妨げることを目的とする活性な分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）精製されたＡＮＴを人工的な脂質二重層またはリポソームにおいて提供すること、
（ｂ）スクリーニングされるべき目的の分子を該ＡＮＴと接触させること、および
（ｃ）標識された基質の放出を測定することによって致死性細孔の形成を検出すること
を含む方法。
【請求項１８】
アンチポート機能を妨げることなく、致死性細孔の形成を阻害する目的とする活性な分子のスクリーニング方法であって、
（ａ）精製されたＡＮＴを含む組成物を、致死性細孔の形成を誘導する分子とともに、人工的な脂質二重層またはリポソームにおいて提供すること、
（ｂ）試験分子の存在下または非存在下で該組成物を接触させること、
（ｃ）アンチポート機能の存在を蛍光によって検出すること、および
（ｄ）致死性細孔の形成を阻害する試験分子を別の蛍光によって検出すること
を含む方法。
【請求項１９】
工程ａ）において、致死性細孔の形成を誘導する活性な分子が、Ｖｐｒ、ＶｐｒのフラグメントまたはＶｐｒの変異体である、請求項１８記載の目的とする活性な分子のスクリーニング方法。
【請求項２０】
工程ａ）において、致死性細孔の形成を誘導する活性な分子が、アトラクチロシド、マストパラン、テルブチルまたはジアミドを含む群より選択される、請求項１８記載の目的とする活性な分子のスクリーニング方法。
【請求項２１】
工程ａ）において、致死性細孔の形成を誘導する活性な分子が、Ｂｃｌ−２ファミリーの前アポトーシス性分子の群より選択される、請求項１８記載の目的とする活性な分子のスクリーニング方法。
【請求項２２】
工程ａ）において、致死性細孔の形成を誘導する活性な分子が、Ｂｃｌ−２ファミリーの前アポトーシス分子の群より選択されるＢＡＸ分子である、請求項１８記載の目的とする活性な分子のスクリーニング方法。
【請求項２３】
配列ＤＲＨＫＱＦＷＲＹＦＡＧＮを有する単離または精製されたペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、米国暫定特許出願第６０／２３１，５３９号（２０００年９月１１日出願）および米国暫定特許出願第６０／２３２，８４１号（２０００年９月１５日出願）の利益を主張し、これらはともに参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ＨＩＶ−１によりコードされる前アポトーシス性タンパク質Ｖｐｒが、ミトコンドリア内膜タンパク質ＡＮＴ（アデニンヌクレオチド輸送体、これはまたアデニンヌクレオチドトランスロカーゼまたはＡＤＰ／ＡＴＰキャリアとも呼ばれる）とのその物理的および機能的な相互作用によりミトコンドリア膜透過化を誘導するという発見に関連する。ＨＩＶ−１ウイルスタンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）は、透過性遷移細孔複合体（ＰＴＰＣ）と相互作用して、ＡＮＴ細孔形成および／またはミトコンドリア膜透過化（ＭＭＰ）、そしてその結果としての細胞死（アポトーシスによる細胞死、または細胞死の何らかの関連する機構による細胞死）を引き起こす。
【０００３】
（発明の背景）
現在、ミトコンドリアが、細胞の生存および死（アポトーシス）を制御することにおいて重要な役割を果たしていることが認められている（ＫｒｏｅｍｅｒおよびＲｅｅｄ、２０００）。したがって、ますます多くの分子がシグナル変換に関与し、そして多くの代謝産物（およびある種のウイルスエフェクター）がミトコンドリアに作用し、ミトコンドリア膜の透過化に影響を及ぼしているようである。また、かなりの数の実験的な抗ガン薬は、ミトコンドリア膜に対して直接的に作用することによって細胞を殺す（Ｒａｖａｇｎａｎら、１９８９； Ｌａｒｏｃｈｅｔｔｅら、１９９９； Ｍａｒｃｈｅｔｔｉら、１９９９； Ｆｕｌｄａら、１９９９； Ｂｅｌｚａｃｑら、２０００）。したがって、ミトコンドリアに対する特異的な前アポトーシス剤の使用は、抗ガン化学療法における新しい概念であると考えられる（参考については、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉら、２０００）。可能な結果は、過度なアポトーシスに関連する病気（ＡＩＤＳ、神経変性疾患など）を処置するために、細胞保護分子を、ミトコンドリア膜を安定化させるそれらの能力に基づいて使用することであり得る。この背景に対して、ミトコンドリア膜の透過性を制御するそのような分子成分の同定（作用様式）は生物医学における主要なテーマになっている。
【０００４】
ＭＭＰは、膜間腔からのカスパーゼ活性化因子およびカスパーゼ非依存性死エフェクターの放出、内側トランスメンブランポテンシャル（ΔΨｍ）の消失、ならびに酸化的リン酸化の乱れを伴うアポトーシス性細胞死の重要な事象である。Ｇ．Ｋｒｏｅｍｅｒ、Ｎ．Ｚａｍｚａｍｉ、Ｓ．Ａ．Ｓｕｓｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１８、４４〜５１（１９９７）； Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ、Ｊ．Ｃ．Ｒｅｅｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１、１３０９〜１３１２（１９９８）； Ｊ．Ｊ．Ｌｅｍａｓｔｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１３６６、１７７〜１９６（１９９８）； Ｄ．Ｃ．Ｗａｌｌａｃｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８３、１４８２〜１４８８（１９９９）； Ｍ．Ｇ．Ｖａｎｄｅｒ Ｈｅｉｄｅｎ、Ｃ．Ｂ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１、Ｅ２０９〜Ｅ２１６（１９９９）； Ａ．Ｇｒｏｓｓ、Ｊ．Ｍ．ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ、Ｓ．Ｊ．Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３、１９８８〜１９１１（１９９９）； Ｇ．Ｋｒｏｅｍｅｒ、Ｊ．Ｃ．Ｒｅｅｄ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６、５１３〜５１９（２０００）。Ｂｃｌ−２ファミリーの前アポトーシス性メンバーおよび抗アポトーシス性メンバーは、アデニンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ；内膜（ＩＭ）において）との相互作用、電位依存性アニオンチャンネル（ＶＤＡＣ；外膜（ＯＭ）において）との相互作用、および／または自律的なチャンネル形成活性によって内側および外側のＭＭＰを調節する。Ｇ．Ｋｒｏｅｍｅｒ、Ｎ．Ｚａｍｚａｍｉ、Ｓ．Ａ．Ｓｕｓｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１８、４４〜５１（１９９７）； Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ、Ｊ．Ｃ．Ｒｅｅｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１、１３０９〜１３１２（１９９８）； Ｊ．Ｊ．Ｌｅｍａｓｔｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１３６６、１７７〜１９６（１９９８）； Ｄ．Ｃ．Ｗａｌｌａｃｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８３、１４８２〜１４８８（１９９９）； Ｍ．Ｇ．Ｖａｎｄｅｒ Ｈｅｉｄｅｎ、Ｃ．Ｂ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１、Ｅ２０９〜Ｅ２１６（１９９９）； Ａ．Ｇｒｏｓｓ、Ｊ．Ｍ．ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ、Ｓ．Ｊ．Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３、１９８８〜１９１１（１９９９）； Ｇ．Ｋｒｏｅｍｅｒ、Ｊ．Ｃ．Ｒｅｅｄ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６、５１３〜５１９（２０００）； Ｉ．Ｍａｒｚｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１、２０２７〜２０３１（１９９８）； Ｓ．Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ｍ．Ｎａｒｉｔａ、Ｙ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３９９、４８３〜４８７（１９９９）； Ｓ．Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ａ．Ｋｏｎｉｓｈｉ、Ｔ．Ｋｏｄａｍａ、Ｙ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、３１００〜３１０５（２０００）； Ｓ．Ｄｅｓａｇｈｅｒら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４４、８９１〜９０１（１９９９）。
【０００５】
ＡＮＴおよびＶＤＡＣは、２つのミトコンドリア膜が並置する部位において組織化されるポリタンパク質構造体である透過性遷移細孔複合体（ＰＴＰＣ）の主要な成分である。Ｇ．Ｋｒｏｅｍｅｒ、Ｎ．Ｚａｍｚａｍｉ、Ｓ．Ａ．Ｓｕｓｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１８、４４〜５１（１９９７）； Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ、Ｊ．Ｃ．Ｒｅｅｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１、１３０９〜１３１２（１９９８）； Ｊ．Ｊ．Ｌｅｍａｓｔｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１３６６、１７７〜１９６（１９９８）； Ｄ．Ｃ．Ｗａｌｌａｃｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８３、１４８２〜１４８８（１９９９）； Ｍ．Ｇ．Ｖａｎｄｅｒ Ｈｅｉｄｅｎ、Ｃ．Ｂ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１、Ｅ２０９〜Ｅ２１６（１９９９）； Ａ．Ｇｒｏｓｓ、Ｊ．Ｍ．ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ、Ｓ．Ｊ．Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３、１９８８〜１９１１（１９９９）； Ｇ．Ｋｒｏｅｍｅｒ、Ｊ．Ｃ．Ｒｅｅｄ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６、５１３〜５１９（２０００）； Ｍ．Ｃｒｏｍｐｔｏｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３４１、２３８〜２４９（１９９９）。
【０００６】
アデニンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ）は、ミトコンドリア膜の透過化およびその結果としてのアポトーシスを引き起こすプロセスにおいて重要な役割を果たしている（Ｍａｒｚｏら、１９９８； Ｂｒｅｎｎｅｒら、２０００）。細胞環境において、ＡＮＴはミトコンドリアの内膜に挿入され、２つの対立する機能を有する。一方では、ＡＮＴは、細胞の生物エネルギー学に不可欠なアンチポートであり、ＡＴＰおよびＡＤＰに対して特異的である。他方では、ＡＮＴは、ミトコンドリアの電気化学的勾配を除去するいくつかのリガンド（天然または外因性）の作用によって非特異的な致死性細孔を形成し得る。
【０００７】
ＨＩＶ−１の調節タンパク質Ｖｐｒは、ウイルス複製および細胞の増殖、分化、サイトカイン産生、そしてＮＦ−κＢ媒介の転写に対して多面的効果を有する。Ｍ．Ｅｍｅｒｍａｎ、Ｍ．Ｈ．Ｍａｌｉｍ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８０、１８８０〜１８８４（１９９８）； Ａ．Ｄ．Ｆｒａｎｋｅｌ、Ｊ．Ａ．Ｔ．Ｙｏｕｎｇ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７、１〜２５（１９９８）； Ｍ．Ｂｕｋｒｉｎｓｋｙ、Ａ．Ａｄｚｈｕｂｅｉ、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．９、３９〜４９（１９９９）。さらに、Ｖｐｒはミトコンドリアに局在化し得る。Ｉ．Ｇ．Ｍａｃｒｅａｄｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、２７７０〜２７７４（１９９５）； Ｉ．Ｇ．Ｍａｃｒｅａｄｉｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１０、１４５〜１４９（１９９７）； Ｋ．Ｍｕｔｈａｍｉ、Ｌ．Ｊ．Ｍｏｎｔａｎｅｒ、Ｖ．Ａｙｙａｖｏｏ、Ｄ．Ｂ．Ｗｅｉｎｅ、ＤＮＡ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９、１７９〜１８８（２０００）； Ｅ．Ｊａｃｏｔｏｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１、３３〜４５（２０００）。Ｖｐｒの全長形態（Ｖｐｒ１〜９６）または合成された短縮型形態はＰＴＰＣに作用して、ΔΨｍの喪失ならびにシトクロームｃおよびアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）の放出を含むアポトーシスのミトコンドリア特徴のすべてを誘導し得る。Ｅ．Ｊａｃｏｔｏｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１、３３〜４５（２０００）。ＶｐｒのＭＭＰ誘導活性は、そのＣ末端成分（Ｖｐｒ５２〜９６）において、種々の病原性ＨＩＶ−１単離体で強く保存されているいくつかの重要なアルギニン（Ｒ）残基（Ｒ７３、Ｒ７７、Ｒ８０）を含む１２個のアミノ酸（Ｖｐｒ７１〜８２）から成るαらせんモチーフ内にある。Ｌ．Ｇ．Ｍａｃｒｅａｄｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、２７７０〜２７７４（１９９５）； Ｉ．Ｇ．Ｍａｃｒｅａｄｉｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１０、１４５〜１４９（１９９７）； Ｅ．Ｊａｃｏｔｏｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１、３３〜４５（２０００）。
【０００８】
アポトーシス性の刺激に依存して、透過化は、一定しない様式でＯＭおよびＩＭに影響を及ぼすことがあるが、透過化には、マトリックスの膨潤が付随することがあり、または付随しないことがある。Ｇ．Ｋｒｏｅｍｅｒ、Ｎ．Ｚａｍｚａｍｉ、Ｓ．Ａ．Ｓｕｓｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１８、４４〜５１（１９９７）； Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｅｎ、Ｊ．Ｃ．Ｒｅｅｄ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１、１３０９〜１３１２（１９９８）； Ｊ．Ｊ．Ｌｅｍａｓｔｅｒｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１３６６、１７７〜１９６（１９９８）； Ｄ．Ｃ．Ｗａｌｌａｃｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８３、１４８２〜１４８８（１９９９）； Ｍ．Ｇ．Ｖａｎｄｅｒ Ｈｅｉｄｅｎ、Ｃ．Ｂ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１、Ｅ２０９〜Ｅ２１６（１９９９）； Ａ．Ｇｒｏｓｓ、Ｊ．Ｍ．ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ、Ｓ．Ｊ．Ｋｏｒｓｍｅｙｅｒ、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１３、１９８８〜１９１１（１９９９）； Ｇ．Ｋｒｏｅｍｅｒ、Ｊ．Ｃ．Ｒｅｅｄ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．６、５１３〜５１９（２０００）。人工膜に再構成された精製ミトコンドリアまたは精製タンパク質で行われたインビトロ実験により、ＭＭＰの少なくとも２つの競合するモデルが示唆される。一方において、ＡＮＴによる細孔形成が、ＩＭの透過化、浸透圧によるマトリックスの膨潤、およびその結果としてのＯＭの破裂（これは、その折り畳まれたクリスタを有するＩＭの表面積がＯＭの表面積を超えるために生じる）を説明するために提案されている。この仮説を裏付けて、Ｂａｘ、アトラクチロシド、Ｃａ２＋およびチオール酸化剤などの前アポトーシス性分子は、（通常の場合には非常に特異的なＡＤＰ／ＡＴＰアンチポーターである）ＡＮＴに非特異的な細孔を形成させる（Ｉ．Ｍａｒｚｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１、２０２７〜２０３１（１９９８）； Ｎ．Ｂｒｕｓｔｏｖｅｔｓｋｙ、Ｍ．Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５、８４８３〜８４８８（１９９６）； Ｃ．Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９、３２９〜３３６（２０００））。他方では、ＶＤＡＣが、ＩＭに影響を及ぼさない最初のＯＭ透過化を説明するために示唆されている。Ｓ．Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ｍ．Ｎａｒｉｔａ、Ｙ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３９９、４８３〜４８７（１９９９）； Ｓ．Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ａ．Ｋｏｎｉｓｈｉ、Ｔ．Ｋｏｄａｍａ、Ｙ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、３１００〜３１０５（２０００）。この仮説を支持して、スクロースまたはシトクロームｃに対するＶＤＡＣ含有リポソームの透過化が、インビトロにおいて、Ｂａｘによって高められ、Ｂｃｌ−２によって阻害される。Ｓ．Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ｍ．Ｎａｒｉｔａ、Ｙ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３９９、４８３〜４８７（１９９９）； Ｓ．Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ａ．Ｋｏｎｉｓｈｉ、Ｔ．Ｋｏｄａｍａ、Ｙ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、３１００〜３１０５（２０００）。
【０００９】
近年の研究により、ミトコンドリアに作用するいくつかのウイルス性アポトーシス阻害剤の存在が明らかにされている。例えば、アデノウイルス、エプスタイン・バールウイルス、ヘルペスウイルス（ｓａｉｍｉｒｉ）およびカポジ肉腫関連ヒトヘルペスウイルス８は、アポトーシスを抑制し得るＢｃｌ−２ホモログを産生する。Ｅ．Ｈ．−Ｙ．Ｃｈｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４、６９０〜６９４（１９９７）； Ｊ．Ｈ．Ｈａｎ、Ｄ．Ｍｏｄｈａ、Ｅ．Ｗｈｉｔｅ、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１７、２９９３〜３００５（１９９８）； Ｔ．Ｄｅｒｆｕｓｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２、５８９７〜５９０４（１９９８）； Ｗ．Ｌ．Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３、５１８１〜５１８５（１９９９）。さらに、いくつかのウイルスは、Ｂｃｌ−２／Ｂａｘファミリーに対する明らかな相同性を全く有しないＰＴＰＣ相互作用タンパク質をコードする。サイトメガロウイルスのアポトーシス阻害剤ｐＵＬ３７ｘ（Ｖ．Ｓ．Ｇｏｌｄｍａｃｈｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６、１２５３６〜１２５４１（１９９９））およびＶｐｒ（ＨＩＶ−１によりコードされるアポトーシス誘導因子）はＡＮＴに選択的に結合する。ＨＴＬＶ−１のＸ−ＩＩのＯＲＦに由来する前アポトーシス性ｐ１３（ＩＩ）タンパク質もまた、Ｖｐｒのミトコンドリア毒性ドメインに対する構造的類似性を有するペプチドモチーフを介してミトコンドリアに標的化される。Ｖ．Ｃｉｍｉｎａｌｅら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１８、４５０５〜４５１４（１９９９）。さらに、前アポトーシス性のＭＭＰ誘導性のＢ型肝炎ウイルスタンパク質ＸはＶＤＡＣと相互作用する。Ｚ．Ｒａｈｍａｎｉ、Ｋ．Ｗ．Ｈｕｈ、Ｒ．Ｌａｓｈｅｒ、Ａ．Ｓｉｄｄｉｑｕｉ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４、２８４０〜２８４６（２０００）。したがって、ＶＤＡＣおよびＡＮＴはともに、ウイルスのアポトーシス調節の主要な標的として、そしておそらくは、アポトーシス調節異常に関連するウイルス性病因および／または他の病理（すなわち、ガン、虚血、神経変性疾患など）に対する薬理学的介入のための標的として明らかになる。アポトーシスは、いくつかの期で現れるプロセスである：（１）開始期、これは極めて不均一であり、この期間中に、プロセスに関与する生化学的経路がアポトーシス誘導剤により決定される；（２）決定期、これは種々のタイプのアポトーシスに共通しており、この期間中に、細胞は、自殺することを「決定」する；および（３）共通した分解期、これは、異化性ヒドロラーゼ（カスパーゼおよびヌクレアーゼ）の活性化を特徴とする。カスパーゼ（アスパラギン酸〔Ａｓｐ〕残基において切断するシステインプロテアーゼ）およびヌクレアーゼの活性化は、完全なアポトーシス的形態学の獲得には必要であるが、そのような酵素の阻害は、多数の異なる開始剤（Ｂａｘ、Ｂａｋ、ｃ−Ｍｙｏ、ＰＭＬ、ＦＡＤＤ、グルココルチコイド受容体占有、腫瘍壊死因子、増殖因子ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ、ＣＸＣＲ４架橋剤、および化学療法剤（エトポシド、カンプトテシンまたはシスプラチンなど））によって誘導される細胞死を阻害しないことが明らかであるようである。カスパーゼが活性化されない場合、細胞は、全体的なクロマチン凝縮、オリゴヌクレオソームのＤＮＡ断片化、およびアポトーシス体の形成などの進行したアポトーシスの特徴を有しない遅れた細胞溶解を示す。しかし、細胞溶解の前に、細胞は、内側のトランスメンブランポテンシャル（ΔΨｍ）の消失および／または外膜を介したアポトーシス生成性タンパク質（シトクロームｃおよびアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）など）の放出を伴う両方のミトコンドリア膜の透過化を示す。これらの結果は、カスパーゼの活性化が、アポトーシスによる細胞死が生じるために常に必要であるという仮説を無効にしている。むしろ、細胞死は、ミトコンドリア膜の透過化と密接に関連する。
【００１０】
アポトーシスの理解は、無細胞系の開発によって、最近、容易になっている。細胞をブラックボックスと見なす代わりに、細胞レベル以下の様々な画分（例えば、ミトコンドリア、核および細胞質）が、インビトロにおいてプロセスの本質的な段階を繰り返すことによってアポトーシス現象を再構成する目的で一緒に混合される。アポトーシス誘導剤にその性質が依存する前アポトーシス性の二次メッセンジャーが開始期のときに細胞質に蓄積するようである。これらの因子は、その後、ミトコンドリア膜の透過化を誘導し、これにより、細胞を決定期に進入させる。ミトコンドリアのアポトーシス的変化は、ΔΨｍの消失、ミトコンドリアマトリックスの一時的な膨潤、巨大なタンパク質の永続的な細孔による外膜の機械的破裂および／またはその非特異的な透過化、そして外膜を通り抜ける可溶性の膜間タンパク質（ＳＩＭＰ）の放出にある。ミトコンドリア膜のバリア機能が失われると、いくつかの因子、例えば、生物エネルギー学的レベルでの代謝的結果、酸化還元恒常性の喪失、およびイオン恒常性の乱れが細胞死の一因になる。ＳＩＭＰによるプロテアーゼ（カスパーゼ）およびヌクレアーゼの活性化が、アポトーシス的形態学の獲得には必要である。この後半の期は、アポトーシスプロセスを逆戻りさせない点を超えた分解段階に対応する。種々のＳＩＭＰにより、ミトコンドリア膜の透過化と異化性ヒドロラーゼの活性化との分子的連携がもたらされる：（シトクロームｃ（カスパーゼの活性化に関与するヘムタンパク質）、ある種のプロカスパーゼ（特にプロカスパーゼ２および９、これらは、いくつかの細胞タイプではミトコンドリアに選択性に濃縮される）、およびＡＩＦ）。ＡＩＦは、カスパーゼ非依存性の周縁のクロマチン凝縮および５０キロ塩基対フラグメントへのＤＮＡの分解がＡＩＦにより誘導される核に移動する核コードの膜間フラボタンパク質である。
【００１１】
ミトコンドリア膜の透過化の機構は完全には理解されていない。一部の研究者は、自律的な様式で、すなわち、他のミトコンドリア膜タンパク質との相互作用を必要とすることなく、Ｂｃｌ−２ファミリーの前アポトーシス性メンバーがオリゴマー化して、シトクロームｃの永続的な細孔を形成する外膜に、そのようなメンバーが挿入されるという仮説を好む。しかし、Ｂａｘ誘導による膜透過化が、透過性遷移細孔（または「メガチャンネル」）の２つの形成阻害剤、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）およびボンクレキン酸（ＢＡ）によって阻害される。このことは、固着性のミトコンドリアタンパク質（ＣｓＡおよびＢＡの標的）がこのプロセスに関与することを示唆している。透過性遷移細孔は、内膜と外膜との接触部位において形成されるポリタンパク質構造を有する。透過性遷移細孔複合体（ＰＴＰＣ）の重要なタンパク質の１つがアデニンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ）である。ＡＮＴはＢＡの標的であるが、最も豊富に存在する内膜タンパク質である。ＡＮＴは、通常、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）およびアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の交換のための特異的なキャリアタンパク質として機能するが、非特異的な細孔になり得る。
【００１２】
ＰＴＰＣの興味深い性質は、内側および／または外側のミトコンドリア膜の透過化により、細胞の生物エネルギー学的平衡が損なわれるということである（例えば、ＰＴＰＣは、還元型ＮＡＤＰＨおよびグルタチオンの酸化、ＡＴＰの減少、ΔΨｍの消失を引き起こし、そして（例えば、マトリックスからＣａ２＋を放出させることによって）細胞内イオンの恒常性をもたらす）。興味深いことに、これらの変化そのものはすべて、ＰＴＰＣが開口する可能性を増大させる。このことは２つの重要な意味を有する。第１に、ＰＴＰＣが開口することの結果そのものは、同じ細胞内のミトコンドリア間の致死性応答を調整する自己増幅ループでのＰＴＰＣの開口に有利である。第２に、このことは、ＰＴＰＣが開口する最終的な結果が、様々な生化学的変化の型にはまった全体的効果であって、その効果は、それが特異的な前アポトーシス性シグナル変換カスケードであるか、またはエネルギーレベルもしくは酸化還元レベルにおける非特異的な損傷であるとしても、開始刺激に依存しないことを意味する。
【００１３】
化学療法は、主にアポトーシスを誘導することによってガン細胞を特異的に根絶することを目的とする。遺伝子治療では、Ｂａｘ送達ベクターを用いることができ、それにより、ミトコンドリアを間接的に標的化して、アポトーシスを誘導することができる。そのようなタンパク質とは対照的に、ある種のペプチドは原形質膜を容易に突き抜け、したがって真の薬理学的薬剤として使用することができる。マストパラン（ハチ毒液から単離されたペプチド）は、ＣｓＡにより阻害可能な機構を介してミトコンドリア膜の透過化を誘導すること、そして無傷な細胞に添加されたとき、ミトコンドリアの作用を介してアポトーシスを誘導することが知られている最初のペプチドである。このペプチドはαらせん構造を有し、らせんの片側に分布するいくつかの正電荷を有する。類似するペプチド（ＫＬＡＫＬＡＫＫＬＡＫＬＡＫ、すなわち（ＫＬＡＫＬＡＫ）２（Ｋ＝リシン、Ｌ＝アミン、およびＡ＝ロイシン））が、精製されたミトコンドリアに添加されたとき、ミトコンドリア膜を破壊することが最近見出されたが、この作用機構はまだ解明されていない（Ｅｌｌｅｒｂｙ，Ｈ．Ｍ．ら、標的化された前アポトーシス性ペプチドの抗ガン活性、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５、１０３２〜１０３８（１９９９））。
【００１４】
ヒト免疫不全症ウイルス−１に由来する前アポトーシス性の９６アミノ酸のタンパク質のウイルスタンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）は、類似する構造モチーフ（ａａ７１〜８２）、すなわち、らせんの同じ側に集中するいくつかのカチオン電荷を有するαらせんを含む。Ｖｐｒ、ならびにこの「ミトコンドリア毒性」ドメインを含有するＶｐｒ誘導体は、ΔΨｍのＣｓＡおよびＢＡにより阻害される迅速な消失、ならびにシトクロームｃまたはＡＩＦなどのアポトーシス生成性タンパク質のミトコンドリア放出を生じさせる。細胞を殺すことに関連する同じ構造モチーフは、Ｖｐｒのミトコンドリア毒性作用の原因であると考えられる。Ｖｐｒは、精製されたＰＴＰＣを含有する人工膜、またはＢａｘと一緒にされたＡＮＴなどの明らかにされたＰＴＰＣ成分を含有する人工膜の透過化に有利であるが、この作用は、組換えＢｃｌ−２の添加によって阻害される。表面プラスモン共鳴研究によれば、ＶｐｒのＣ末端は、精製されたＡＮＴと、ナノモル濃度の範囲で高い親和性で結合する。Ｅ．Ｊａｃｏｔｏｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１、３３〜４５（２０００）：これは参照として本明細書に特に組み入れられる。さらに、ビオチン化されたＶｐｒ由来ペプチド（Ｖｐｒ５２〜９６）は、ＡＮＴおよびＶＤＡＣを含有するミトコンドリア分子複合体を特異的に精製するためのおとりとして用いることができる。ＡＮＴまたはＶＤＡＣを有しない酵母株は、Ｖｐｒにより誘導される殺傷に対する感受性が対照細胞よりも小さい。このように、Ｖｐｒは、ミトコンドリアＰＴＰＣに対する直接的な作用を介してアポトーシスを誘導する。Ｖｐｒと同様に、ＨＴＬＶ−１のＸ−ＩＩオープンリーディングフレームに由来するｐ１３（ＩＩ）タンパク質はミトコンドリアに標的化され、ΔΨｍの消失およびミトコンドリアの膨潤を生じさせることができる。このタンパク質のミトコンドリア標的化は、αらせん内に非対称的に分布するいくつかのＡｒｇ残基を含有するデカペプチド配列にマッピングされている。しかし、ｐ１３（ＩＩ）のミトコンドリア毒性ドメイン内のＡｒｇ−Ａｌａ置換は、ｐ１３のミトコンドリア標的化を無効にしない。
【００１５】
致死性ペプチドは、ミトコンドリアに対して、より具体的には、少なくともＶｐｒの場合にはＰＴＰＣに対して標的化することができる。Ｅｌｌｅｒｂｙらは、最近、ミトコンドリア毒性の（ＫＬＡＫＬＡＫ）２モチーフを、内皮細胞と相互作用する標的化ペプチドに融合した。そのような融合ペプチドは内在化され、そして血管形成性内皮細胞におけるミトコンドリア膜の透過化を誘導し、そしてヌードマウスに移植されたＭＤＡ−ＭＤ−４３５乳ガン異種移植片を死に至らしめる。同様に、Ｂａｘに融合したインターロイキン２（ＩＬ−２）タンパク質を含有する組換えキメラタンパク質は、インビトロにおいて、ＩＬ−２受容体保有細胞に選択的に結合して、これを死に至らしめる。したがって、表面受容体を標的化する特異的な細胞傷害性薬剤は、細胞質に輸送され、アポトーシスをミトコンドリア膜の透過化によって誘導し、ガンを処置することにおいて有用であり得る。
【００１６】
従来の化学療法剤に関する再発問題は、化学療法剤が、ｐ５３の突然変異、増大した抗酸化活性、ＣＤ９５／ＣＤ９５Ｌ経路の遮断、Ｂｃｌ−２様タンパク質の過剰発現などの変化によって損なわれ得る内因性のアポトーシス誘導経路を利用するということである。細胞死を行わせるための可能な方法の１つは、共通するアポトーシス経路の下流の事象を引き起こすことである。したがって、カスパーゼのアデノウイルス媒介移入が、どのような調節をも上回る細胞死を誘導するための１つの方法として提案されている。代わりの方法は、上流の制御機構に関わりなく、そしてカスパーゼおよび内因性のカスパーゼ阻害剤の状態に関わりなく細胞死を誘導するミトコンドリア毒性剤を使用することである。一例として、ＬＮＤ、亜ヒ酸塩またはＣＤ４３７は、カスパーゼ阻害剤により影響を受けない経路によって、ｐ５３の状態とは無関係に細胞死を誘導する。同様に、ベツリン酸およびＶｐｒは、ＣＤ９５（Ａｐｏ−１／Ｆａｓ）およびｐ５３に依存しないアポトーシスを引き起こし、そして両者とも、カスパーゼ非依存性様式でミトコンドリア膜の透過性を増大する。その結果、これらのタイプの薬剤は、通常の場合には抵抗性の細胞を殺すことにおいて非常に有用であることが明らかにされ得る。そのうえ、腫瘍治療の将来は、ミトコンドリア膜のＢｃｌ−２媒介による安定化に打ち勝つ薬剤の設計から、そして両親媒性ペプチドまたはペプチド模倣物を規定された細胞集団または組織に標的化することから利益を受けることになるかもしれない。
【００１７】
ミトコンドリアに特異的な薬剤の使用によって形質転換細胞を選択的に根絶することは効果的であるはずである。１つの方法は、表面受容体の特異的な発現に基づいて、選択された細胞タイプに毒性薬剤を標的化することである。今後開発される別の方法は、正常な細胞と腫瘍細胞との間におけるＰＴＰＣの組成または調節の差を利用することを目指す。今後の研究により、（レトロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターの使用、インテグリン特異的ドメインの使用などによる）細胞標的化、および／またはＰＴＰＣにおける腫瘍特異的変化の標的化が、ガン治療において、そしてまたミトコンドリアの機能不全に関係すると考えられる神経変性疾患（すなわち、フリードライヒ運動失調症、遺伝性痙性対麻痺、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病）の処置、およびＭＭＰのレベルで作用する調節事象を伴い得る急性臓器不全（すなわち、虚血）の処置において、どの程度、有用であることが明らかにされる（Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．ら、細胞死のミトコンドリア制御、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．第６巻第５号、５１３〜５１９（１９９９））。
【００１８】
したがって、ミトコンドリア透過化およびアポトーシスを調節するための方法および試薬が当技術分野では求められている。
【００１９】
（発明の要約）
本発明は、ミトコンドリア膜の透過性を増大させ、かつアポトーシスによる細胞の死を生じさせるように機能する、Ｖｐｒとアデニンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ）との物理的および機能的な相互作用に関する。好ましい態様において、本発明は、ＶｐｒとＡＮＴの３つのヒトイソタイプ（これらはまた、ＡＮＴ１、ＡＮＴ２およびＡＮＴ３と呼ばれる）との物理的および機能的な相互作用に関する。本発明には、ミトコンドリア膜の透過性を増大させるためにこの新規な機構を利用する方法が包含される。本発明にはさらに、アポトーシスによる細胞死を生じさせる方法が包含される。
【００２０】
本発明にはまた、ＶｐｒがＡＮＴに結合することを変化させるか、または妨げる方法が包含される。本発明にはさらに、ＶｐｒがＡＮＴと会合することによりチャンネル形成を変化させるか、または妨げる方法が包含される。本発明にはまた、ミトコンドリア膜の透過化を生じさせるか、または妨げる方法が包含される。本発明にはまた、アポトーシスによる細胞死を生じさせるか、または妨げる方法が包含される。
【００２１】
本発明にはまた、ＶｐｒがＡＮＴに結合することを変化させるか、または防げる分子についてスクリーニングする方法が包含される。本発明にはさらに、ＶｐｒがＡＮＴと会合することによりチャンネル形成を変化させるか、または防げる分子についてスクリーニングする方法が包含される。本発明にはまた、ミトコンドリア膜の透過化を生じさせるか、または妨げる分子についてスクリーニングする方法が包含される。本発明にはまた、アポトーシスによる細胞死を生じさせるか、または妨げる分子についてスクリーニングする方法が包含される。
【００２２】
本発明にはまた、ＶｐｒのＣ末端成分（ＨＩＶ−１についてはｖｐｒ５２〜９６）がＡＮＴに結合することと競合する分子についてスクリーニングする方法が包含される。本発明にはまた、ＶｐｒのＣ末端成分（ＨＩＶ−１についてはｖｐｒ５２〜９６）がＡＮＴに結合することを促進させる分子についてスクリーニングする方法が包含される。本発明にはまた、ＶｐｒのＣ末端成分（ＨＩＶ−１についてはｖｐｒ５２〜９６）がＡＮＴに結合することを変化させるか、または防げる分子についてスクリーニングする方法が包含される。本発明にはさらに、ＶｐｒのＣ末端成分（ＨＩＶ−１についてはｖｐｒ５２〜９６）がＡＮＴと会合することによりミトコンドリア膜の透過化を変化させるか、または防げる分子についてスクリーニングする方法が包含される。本発明にはさらに、ＶｐｒのＣ末端成分（ＨＩＶ−１についてはｖｐｒ５２〜９６）がＡＮＴと会合することによりアポトーシスを変化させるか、または防げる分子についてスクリーニングする方法が包含される。
【００２３】
本発明にはまた、ＶｐｒがＡＮＴに結合することを変化させるか、または防げるペプチド性分子または非ペプチド性分子が包含される。本発明にはまた、ＡＮＴと物理的または機能的に相互作用し得るその能力においてＶｐｒまたはＶｐｒフラグメントを模倣するペプチド性分子または非ペプチド性分子が包含される。本発明にはさらに、ＶｐｒがＡＮＴと会合することによりチャンネル形成を変化させるか、または防げるペプチド性分子または非ペプチド性分子が包含される。本発明にはまた、ミトコンドリア膜の透過化を生じさせるか、または防げるペプチド性分子または非ペプチド性分子が包含される。本発明にはまた、アポトーシスによる細胞死を生じさせるか、または防げるペプチド性分子または非ペプチド性分子が包含される。本発明にはさらに、これらの分子を含む医薬組成物および診断用組成物、ならびにミトコンドリア膜の透過化またはアポトーシスを生じさせるか、または妨げるための、これらの組成物の使用が包含される。
【００２４】
本発明にはさらに、ＶｐｒのＣ末端成分（ＨＩＶ−１についてはｖｐｒ５２〜９６）を模倣し、ミトコンドリア膜の透過化を調節するペプチド性分子または非ペプチド性分子が包含される。本発明にはまた、ＶｐｒのＣ末端成分（ＨＩＶ−１についてはｖｐｒ５２〜９６）がＡＮＴに結合することと競合するペプチド性分子または非ペプチド性分子が包含される。本発明にはまた、ＶｐｒのＣ末端成分（ＨＩＶ−１についてはｖｐｒ５２〜９６）がＡＮＴに結合することを促進させるペプチド性分子または非ペプチド性分子が包含される。本発明にはさらに、これらの分子を含む医薬組成物および診断用組成物、ならびにミトコンドリア膜の透過化またはアポトーシスを生じさせるか、または妨げるための、これらの組成物の使用が包含される。
【００２５】
本発明にはまた、ヒトにおける３つのＡＮＴイソタイプの発現または構造における遺伝子的またはエピジェネティックな変化についてスクリーニングする方法が包含される。本発明にはさらに、種々の患者における３つのＡＮＴイソタイプがＶｐｒと相互作用して、ミトコンドリア膜の透過化、チャンネル形成および／またはアポトーシスを促進させる能力の違いに対するスクリーニングおよび診断が包含される。
【００２６】
本発明にはまた、アポトーシスを誘導することによって細胞を特異的に殺すための方法が包含される。
【００２７】
本発明にはまた、ＡＮＴのチャンネル特性を変化させる分子をスクリーニングするための方法が包含される。
【００２８】
本発明にはさらに、ＡＮＴ−Ｂｃｌ２相互作用を変化させることができるか、または妨げることができる活性な分子をスクリーニングする方法が包含される。
【００２９】
ＨＩＶ−１のＶｐｒタンパク質の細胞傷害性を研究することによって、本発明者らは、ＶｐｒがＡＮＴと直接的に相互作用して、ミトコンドリア膜の透過化ならびにアポトーシスを引き起こすことを発見した。最初に、Ｖｐｒは、ミトコンドリアのタンパク質（これはまた、「電位依存性アニオンチャンネル」：ＶＤＡＣとも呼ばれる）を使用して外側のミトコンドリア膜を通り抜け、その後、自身を、その主要な標的であるＡＮＴに、強い親和性（ＫＤ＝１ｎＭ）で結合させる。ＡＮＴ／Ｖｐｒ複合体は、内側のミトコンドリア膜の透過化、ミトコンドリアマトリックスの膨潤、そして最終的には外膜の破壊、したがって、アポトーシスを実行する様々な因子（例えば、ＡＩＦ、シトクロームｃおよびいくつかのプロカスパーゼ）の放出を引き起こす高コンダクタンスのチャンネルを形成する。本発明者らは、Ｖｐｒ（１４Ｋｄ；９６ａａ）について、ＡＮＴとＶｐｒとの相互作用部位を同定した：ＡＮＴに対する結合部位には、７１ＨＦＲＩＧＣＲＨＳＲＩＧ８２のパターン（最小の毒性パターン）がＶｐｒ５２〜９６の（アミノ酸５２〜８３の間のαらせん状の）線状構造の中心部において利用されている。ＡＮＴ１（３０ｋｄ；２９８ａａ）の場合、Ｖｐｒに対する結合部位には、１０４ＤＲＨＫＱＦＷＲＹＦＡＧＮ１１６のパターンが第２のＡＮＴ環（ａａ９２〜１１６）の中央部において利用されている。
【００３０】
ＶｐｒとＡＮＴとの物理的および機能的な相互作用ならびに相互作用部位の少なくとも１つを本発明者らが発見したことにより、本発明者らは、ＡＮＴを含有するタンパク質複合体（透過性遷移細孔；ＰＴＰＣ）と相互作用し得るＶｐｒの該毒性パターンのアナログを組み立てるに至っている。これらの分子は、インビトロまたはインビボでガン性細胞を破壊するために、Ｖｐｒの前アポトーシス性作用をまねるために役立ち得る。これらの分子はペプチド分子または非ペプチド分子のいずれかであり、単離または精製された形態で得られる。
【００３１】
本発明は、レトロウイルスＨＩＶの調節タンパク質Ｖｐｒと、アポトーシスによる細胞死の制御に関係する膜結合型受容体であるミトコンドリアのアデニンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ）との新規なタンパク質／タンパク質相互作用に関する。本発明はまた、ＶｐｒがＡＮＴに結合すること（またはこの結合によるチャンネル形成）を変化させ、および／または妨げる能力を有するペプチド性分子または非ペプチド性分子に関する。本発明の別の局面は、ＡＮＴと結合し、そしてＡＮＴと共同してミトコンドリア膜の透過性を増大させる（したがって、細胞を殺す）その能力において、ＶｐｒのＣ末端成分（ＨＩＶ−１についてはＶｐｒ５２〜９６）を模倣する能力を有するペプチド性分子または非ペプチド性分子に関する。本発明はまた、ＶｐｒがＡＮＴに結合すること（および／またはチャンネル形成などのこの結合の立体配座的結果）を変化させ、および／または妨げる分子の効果的な量を含有する医薬組成物および診断用組成物（したがって、そのような組成物は細胞保護的である）に関し、そしてまたそのような医薬組成物または診断用組成物を使用する治療方法または診断方法に関する。さらに、本発明はまた、ＡＮＴと結合し、そしてＡＮＴと共同してミトコンドリア膜の透過性を増大させる（したがって、細胞を殺す）その能力において、ＶｐｒのＣ末端成分を模倣することができる分子の効果的な量を含有する医薬組成物および診断用組成物に関し、そしてまたそのような医薬組成物または診断用組成物を使用する治療方法または診断方法に関する。本発明はまた、ＶｐｒがＡＮＴに結合すること（またはこの結合によるチャンネル形成）を変化させ、および／または妨げる能力を有するか、またはＡＮＴと結合し、そしてＡＮＴと共同してミトコンドリア膜の透過性を増大させる（したがって、細胞を殺す）その能力において、ＶｐｒのＣ末端成分（ＨＩＶ−１についてはＶｐｒ５２〜９６）を模倣する能力を有する新しい活性な分子（内因性または外因性）をスクリーニングする方法に関係する。最後に、本発明は、ヒトにおける３つのＡＮＴイソタイプの発現または構造における遺伝子的またはエピジェネティックな変化（ガンに冒された個体における特定の変化など）をスクリーニングする方法に関する。
【００３２】
したがって、本発明は、ＶｐｒとＡＮＴとのタンパク質対タンパク質の相互作用、そして潜在的にはＶｐｒとＶＤＡＣとのタンパク質対タンパク質の相互作用に関する。これは、細胞保護因子として活性である治療分子（ＡＮＴ／Ｖｐｒ相互作用の阻害剤）、または細胞毒として活性である治療分子（ＡＮＴおよび／またはＶＤＡＣとの相互作用に関してＶｐｒのアナログ）をスクリーニングするために利用することができる。これに関して、本発明者らは、Ｖｐｒに対するＡＮＴの結合を阻害し得るＶｐｒリガンドおよび分子に対する新しいＥＬＩＳＡスクリーニング試験を確立した。
【００３３】
したがって、本発明の目的の１つは、個体（具体的には、ガンに冒されている人）の細胞（または特定の細胞）においてＡＮＴに結合させることによってＶｐｒをまねることができるペプチド分子または非ペプチド分子に関する。
【００３４】
本発明はまた、Ｖｐｒ／ＡＮＴの相互作用またはＶｐｒ／ＶＤＡＣの相互作用を阻止することにおいて効果的である構造的または機能的な阻害剤、したがって、１）ＨＩＶによる感染をインビトロまたはインビボで阻害する構造的または機能的な阻害剤、および２）何らかのＡＮＴリガンド（天然、内因性、外因性）の細胞傷害作用を阻害し、したがって、過度なアポトーシスに関連する疾患に冒されている患者において細胞保護作用を生じさせる構造的または機能的な阻害剤に関する。
【００３５】
したがって、本発明にはまた、一方では、Ｖｐｒ（これは、細胞内、細胞外液、またはレトロウイルス感染者のＨＩＶ粒子において見出される）またはＶｐｒのアナログ（内因性〔例えば、Ｂｃｌ−２もしくはこのタンパク質の部分領域〕または外因性）と、他方では、ミトコンドリア膜レベルで細胞内に見出されるＡＮＴのイソタイプの少なくとも１つとの相互作用を変化させることができる成分が包含される。ＡＮＴに由来する分子、またはＶｐｒとの相互作用パターンに由来する分子（例えば、ＡＮＴ１０４〜１１６）もまた、本発明の一部を形成する活性な分子と見なされる。
【００３６】
本発明はまた、薬学的化合物の活性成分としてより以前に定義された化合物および阻害剤の使用に関する。１つの可能な具体的な適用は、Ｖｐｒパターン（例えば、５２〜９６、７１〜８２または７１〜９６のパターン）に由来するか、またはＶｐｒのアナログに由来するＶｐｒを、インビボで腫瘍をスクリーニングすることができる分子とカップリングすることであると考えられる。したがって、本発明には、Ｖｐｒパターン（例えば、５２〜９６、７１〜８２または７１〜９６のパターン）の使用が包含される。
【００３７】
本発明にはまた、Ｖｐｒの細胞傷害作用および／またはミトコンドリア作用（具体的には、ＡＮＴおよび／またはＶＤＡＣとのその相互作用）をまねることができる分子をスクリーニングするための手段が包含され、そして一方では、Ｖｐｒ（これは、細胞内、細胞外液、またはレトロウイルス感染者のＨＩＶ粒子において見出される）またはＶｐｒのアナログ（内因性または外因性）と、他方では、ミトコンドリア膜レベルで細胞内に見出されるＡＮＴのイソタイプの少なくとも１つとの相互作用を変化させることができる分子（細胞保護的）をスクリーニングするための手段が包含される。
【００３８】
したがって、本発明には、ＡＮＴのアゴニスト（Ｖｐｒの構造的または機能的なアナログ）またはアンタゴニスト（Ｖｐｒ／ＡＮＴ相互作用の阻害剤、またはＶｐｒに応答する「致死性細孔」立体配座の選定、またはＶｐｒの構造的もしくは機能的なアナログ）をスクリーニングする方法が包含される。したがって、本発明には、下記の少なくとも２つのスクリーニング試験が含まれる：
・Ｖｐｒ（または例えば、パターン７１〜８２を含有するＶｐｒ由来ペプチド）に対するＡＮＴ（または例えば、ＡＮＴのパターン１０４〜１１６を含有するＡＮＴ由来ペプチド）の結合試験。この試験のプロトコールは、ＡＮＴまたはパターン１０４〜１１６を含有するＡＮＴペプチドが結合させられ、次いでさらされるＶｐｒ５２〜９６を９６ウェルプレートの底に結合させる場合、既に確立されている。
・ＡＮＴの特異的なアンチポート機能および非特異的な致死性細孔機能を同時に評価する、ＡＮＴについて機能的な「二重試験」と呼ばれる試験。この試験原理および詳細なプロトコールは実施例５に記載される。
【００３９】
（態様の説明）
本発明は、ＨＩＶ−１によりコードされる前アポトーシス性タンパク質Ｖｐｒが、ミトコンドリアの内膜タンパク質ＡＮＴ（アデニンヌクレオチド輸送体、これはまたＡＤＰ／ＡＴＰキャリアとも呼ばれる）とのその物理的および機能的な相互作用を介してミトコンドリア膜の透過化を誘導するという発見に関連する。これは、様々な異なる技術を使用して、例えば、表面プラスモン共鳴、電気生理学、合成プロテオリポソーム、精製されたミトコンドリアに関する研究（呼吸測定、電子顕微鏡、オルガネラ蛍光測定）、ならびに無傷な細胞の顕微注入を使用して示される。Ｂｃｌ−２の作用様式は、Ｖｐｒにより媒介されるミトコンドリア作用を妨げるようにＡＮＴに作用する。
【００４０】
本発明は、Ｖｐｒが主として、インビトロで、ＯＭではなく、ＩＭの透過性に影響を及ぼすという発見に関連する。Ｖｐｒは、ＡＮＴの立体配座に依存した様式でＡＮＴと結合し（図１および図２）、そしてＡＮＴと共同してチャンネルを形成し（図３）、このチャンネルは、ＯＭがシトクロームｃに対して透過性になる前にＩＭの透過性を増大させる（図４および図５）。２つの独立した観測結果に基づいて、Ｂｃｌ−２はこの作用を中和する。第１に、その作用様式は、ＶＤＡＣ阻害剤ＰＡ１０の作用様式とは明らかに異なる（図６および７）。第２に、Ｂｃｌ−２は、合成されたＶＤＡＣ非含有システムにおいて、物理的および機能的なＡＮＴ−Ｖｐｒ相互作用に影響を及ぼし得る（図８）。これらのデータは、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−１ファミリーの他のメンバーが、比較的大きい球状タンパク質（ＮＭＲによって解明されたＶｐｒ５２〜９６の線状の主にαらせん構造（Ｗ．Ｓｃｈｕｌｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８５、２１０５〜２１１７（１９９９））とは対照的に、シトクロームｃについて１４．５ｋＤａ）に対するＶＤＡＣの透過性を調節するという可能性を排除しないが、少なくともこの特定のモデルでは、ＡＮＴを介して、Ｂｃｌ−２がその膜保護的なミトコンドリア作用を発揮することを示している。
【００４１】
ＨＩＶ−１ウイルスタンパク質Ｒ（Ｖｐｒ）は透過性遷移細孔複合体（ＰＴＰＣ）と相互作用して、ミトコンドリア膜透過化（ＭＭＰ）およびその結果としてのアポトーシスを引き起こす。Ｖｐｒは、内側のミトコンドリア膜タンパク質であるアデニンヌクレオチド輸送体（ＡＮＴ）に結合する。Ｅ．Ｊａｃｏｔｏｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１、３３〜４５（２０００）。ＶｐｒがＡＮＴに結合するとき、Ｖｐｒは共同して、合成膜において大きいコンダクタンスのチャンネルを形成する。精製されたミトコンドリアに加えられたとき、Ｖｐｒは呼吸鎖と脱共役して、シトクロームｃに対する外側のＭＭＰに先行する迅速な内側のＭＭＰを誘導し、Ｖｐｒ誘導によるマトリックス膨潤、そしてプロトンおよびＮＡＤＨに対する内側のＭＭＰが、精製されたミトコンドリアを組換えＢｃｌ−２タンパク質とプレインキュベーションすることによって妨げられる。Ｋｏｎｉｇｓポリアニンとは対照的に、電位依存性アニオンチャンネル（ＶＤＡＣ）の特異的な阻害剤であるＢｃｌ−２は、Ｖｐｒが外側のミトコンドリア膜を横断することを妨げることができない。Ｂｃｌ−２はＡＮＴ−Ｖｐｒ相互作用を低下させ、ＡＮＴ−Ｖｐｒ複合体によるチャンネル形成を無効にする。したがって、ＶｐｒおよびＢｃｌ−２はともに、ＡＮＴとの直接的な相互作用によってＭＭＰを調節する。
【００４２】
ＶｐｒがＡＮＴに結合することを変化させるか、または妨げる方法
ＶｐｒがＡＮＴと物理的および機能的に相互作用することの発見により、ＶｐｒがＡＮＴに結合することを変化させるか、または妨げる方法が可能になる。実施例１〜４に例示されるように、ＡＮＴに対するＶｐｒの相互作用は、様々な異なるアッセイシステムで検出し、調節することができる。例えば、Ｂｃｌ−２は、ＶｐｒのＡＮＴとの物理的および機能的な相互作用を調節する。同様に、Ｂｃｌ−２の結合モチーフと第２のＡＮＴループとの重なり部に対応するペプチドのＡＮＴ１０４〜１１６はＡＮＴ−Ｖｐｒ結合を阻害する。したがって、これらの分子は、ＶｐｒがＡＮＴに結合することを変化させ、または妨げるために使用することができる。他のペプチド性分子または非ペプチド性分子を、この結合を同様に阻害するために設計することができる。
【００４３】
Ｖｐｒ−ＡＮＴ結合を同定することにより、アポトーシスを調節し得る分子の作製が可能になる。実施例に示される方法および他の従来の技術は、Ｖｐｒ、Ｂｃｌ−２もしくはＡＮＴ変異体、またはＶｐｒ−ＡＮＴ結合に影響を及ぼす他のポリペプチドもしくは分子をスクリーニングするために適合化させることができる。これにより、Ｖｐｒ−ＡＮＴ結合を増強または阻害し得る分子の作製が可能になる。これらの分子の活性は、競合的結合アッセイによって評価することができる。例えば、様々な分子を、実施例に記載される結合アッセイを使用して、ＡＮＴ−Ｖｐｒ結合を阻害するそれらの能力について評価することができる。当業者は、多くの他の技術が同様に使用され得ることを理解する。同定された分子はさらに、従来の技術によってアポトーシス活性について評価することができる。さらに、ＡＮＴに結合することが明らかにされたＶｐｒ分子の構造に基づいて、構造的に類似する分子を、Ｖｐｒ活性を模倣するために、またはこの活性を阻害するために設計することができる。
【００４４】
１つの態様において、可溶型のＶｐｒポリペプチドまたはＡＮＴポリペプチドを、アポトーシスの誘導を増強または阻害するために細胞とインキュベーションすることができる。１つの態様において、これらのポリペプチドは、アポトーシスを妨害する変異を含む。別の態様において、これらのポリペプチドは、アポトーシスを増強する変異を含む。１つの態様において、これらのポリペプチドは合成される。別の態様において、これらのポリペプチドは組換え技術によって製造される。
【００４５】
Ｖｐｒ−ＡＮＴ結合、ミトコンドリア膜透過化またはアポトーシスを阻害または増強するＶｐｒポリペプチドおよびＡＮＴポリペプチドならびに９アミノ酸より多いのペプチドは、少なくとも１０個〜２０個のアミノ酸、２０個〜３０個のアミノ酸、３０個〜５０個のアミノ酸、５０個〜１００個のアミノ酸および１００個〜３６５個のアミノ酸のサイズのペプチドと同様に、本発明の態様である。これらのポリペプチドおよびペプチドをコードするＤＮＡフラグメントは、本発明により包含される。
【００４６】
合成ポリペプチドおよび合成ペプチドは、様々な従来の技術によって作製することができる。そのような技術には、Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２８９：３〜１３、１９９７； Ｈ．ＢａｌｌおよびＰ．Ｍａｓｃａｇｎｉ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．４８：３１〜４７、１９９６； Ｆ．Ｍｏｌｉｎａら、Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．９：１５１〜１５５、１９９６； Ｊ．Ｆｏｘ、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：２４９〜２５８、１９９５； ａｎｄ Ｐ．Ｌｅｐａｇｅら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１３：４０〜４８、１９９３に記載される技術が含まれる。
【００４７】
別の態様において、ペプチドは、所望するペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を、所望するペプチドを製造するための発現ベクターにサブクローニングすることによって調製することができる。ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、好適なリーダーペプチドまたはシグナルペプチドをコードする配列に都合よく連結される。または、ＤＮＡフラグメントは、従来の技術を使用して化学合成することができる。ＤＮＡフラグメントはまた、知られている制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（１９９７年カタログ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（１９９７年カタログ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（１９９７年カタログ））を使用するＤＮＡ（例えば、ＨＩＶ−１）のクローン体の制限エンドヌクレアーゼ消化によって作製することができ、そしてアガロースゲル電気泳動などによる従来の手段によって単離することができる。
【００４８】
別の態様において、十分に知られているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手法を、所望するタンパク質フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離および増幅するために用いることができる。ＤＮＡフラグメントの所望する末端を規定するオリゴヌクレオチドが５’プライマーおよび３’プライマーとして用いられる。オリゴヌクレオチドは、増幅されたＤＮＡフラグメントの発現ベクターへの挿入を容易にするために制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むことができる。ＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：４８７（１９８８）； Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｌｏｇｙ（Ｗｕら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、１９８９）、ｐｐ１８９〜１９６； ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９０）に記載される。当然のことではあるが、多くの技術が、ポリペプチドフラグメントおよびＤＮＡフラグメントを調製するために使用され得ること、そしてこの態様は決して本発明の範囲を限定しないことが理解される。
【００４９】
ＶｐｒおよびＡＮＴを用いたスクリーニング方法
ＶｐｒポリペプチドまたはＡＮＴポリペプチドは、アポトーシスを媒介するそれらの能力、ならびにＶｐｒにより媒介されるアポトーシスを阻止するそれらの能力について評価することができる。例えば、Ｖｐｒのフラグメントを、従来の力価測定実験によって、ＡＮＴに対する天然Ｖｐｒの結合を阻止するその能力について評価することができる。
【００５０】
１つの態様において、表面プラスモン共鳴が、本明細書に記載されるようにＡＮＴに対するＶｐｒの結合を評価するために使用される。別の態様では、電気生理学が、本明細書に記載されるようにＡＮＴに対するＶｐｒの結合を評価するために使用される。別の態様では、精製されたミトコンドリアが、本明細書に記載されるようにＡＮＴに対するＶｐｒの結合を評価するために使用される。別の態様では、合成されたプロテオリポソームが、本明細書に記載されるようにＡＮＴに対するＶｐｒの結合を評価するために使用される。別の態様では、生細胞の顕微注入が、本明細書に記載されるようにＡＮＴに対するＶｐｒの結合を評価するために使用される。当然のことではあるが、多くの技術が、ＡＮＴに対するＶｐｒの結合を評価するために使用され得ること、そしてこれらの態様は決して本発明の範囲を限定しないことが理解される。
【００５１】
別の態様において、ＳＵＮＹにおいて開発された酵母のツーハイブリッドシステム（これは、米国特許第５，２８３，１７３号（Ｆｉｅｌｄｓら）；Ｊ．ＬｕｂａｎおよびＳ．Ｇｏｆｆ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：５９〜６４、１９９５； Ｒ．ＢｒａｃｈｍａｎｎおよびＪ．Ｂｏｅｋｅ、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：５６１〜５６８、１９９７； Ｒ．ＢｒｅｎｔおよびＲ．Ｆｉｎｌｅｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３１：６６３〜７０４、１９９７； Ｐ．ＢａｒｔｅｌおよびＳ．Ｆｉｅｌｄｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２５４：２４１〜２６３、１９９５に記載される）を、下記のようにＶｐｒ−ＡＮＴ相互作用の阻害剤についてスクリーニングするために使用することができる。Ｖｐｒまたは相互作用に関わるその部分をＧａｌ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、そしてＧａｌ４転写活性化ドメインに融合されたＡＮＴ分子と一緒に、ヒスチジン非含有平板における増殖がＧａｌ４活性に依存する菌株に導入することができる。ＶｐｒポリペプチドがＡＮＴ分子と相互作用することにより、両方の分子を含む酵母の生育が可能になり、そしてこの相互作用を阻害するか、または変化させる分子に対するスクリーニング（すなわち、増殖を阻害または増大することによるスクリーニング）が可能になる。
【００５２】
代わりの態様において、検出可能なマーカー（例えば、β−ガラクトシダーゼ）を、酵母のツーハイブリッドシステムにおける結合を測定するために使用することができる。
【００５３】
さらに、ＶｐｒをＡＮＴ結合分子として同定することにより、細胞におけるＡＮＴの発現を検出し、定量する方法が可能になる。例えば、標識されたＶｐｒポリペプチドを、ＡＮＴを含有する生物学的サンプルと接触させて、Ｖｐｒ−ＡＮＴ複合体を検出することにより、ＡＮＴのレベルを明らかにすることができる。
【００５４】
精製されたＡＮＴポリペプチド（これには、タンパク質、ポリペプチド、フラグメント、変異体、オリゴマーおよび他の形態が含まれる）は、従来の結合アッセイなどの任意の好適なアッセイで、Ｖｐｒと結合する能力について試験することができる。同様に、Ｖｐｒポリペプチド（これには、タンパク質、ポリペプチド、フラグメント、変異体、オリゴマーおよび他の形態が含まれる）は、ＡＮＴと結合する能力について試験することができる。例示するために、Ｖｐｒポリペプチドは、検出可能な試薬（例えば、放射性ヌクレオチド、発色基、比色測定反応または蛍光測定反応を触媒する酵素など）で標識することができる。標識されたポリペプチドは、ＡＮＴを発現する細胞と接触させられる。その後、細胞は、結合していない標識されたポリペプチドを除くために洗浄され、そして細胞と結合した標識の存在が、標識の性質に従って選ばれた好適な技術によって測定される。
【００５５】
または、Ｖｐｒポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントの結合性質は、ＶｐｒポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントがＡＮＴ発現細胞に結合することをＦＡＣＳ分析および／または免疫蛍光により分析することによって明らかにすることができる。これにより、ＶｐｒポリペプチドおよびＡＮＴポリペプチドならびにポリペプチドフラグメントの結合を特徴づけることができ、そしてＡＮＴに結合するＶｐｒポリペプチドおよびポリペプチドフラグメントの相対的能力を識別することができる。ＶｐｒおよびＡＮＴを用いたインビトロ結合アッセイも同様に、Ｖｐｒ−ＡＮＴ結合活性を特徴づけるために使用することができる。
【００５６】
別のタイプの好適な結合アッセイは競合的結合アッセイである。例示するために、変異体の生物学的活性は、ＶｐｒまたはＡＮＴに結合することに対して天然タンパク質と競合する変異体の能力についてアッセイすることによって測定することができる。
【００５７】
様々な競合的結合アッセイを従来の方法論によって行うことができる。競合的結合アッセイにおいて用いられ得る試薬には、放射能標識されたＶｐｒ、およびＡＮＴ（内因性または組換え）を発現する無傷な細胞が含まれる。例えば、放射能標識されたＶｐｒフラグメントを、細胞におけるＡＮＴに対する結合に対して可溶性のＶｐｒ変異体と競合させるために使用することができる。無傷な細胞の代わりに、固相に結合させたＡＮＴタンパク質が代用され得る。
【００５８】
別のタイプの競合的結合アッセイでは、放射能標識されたＶｐｒおよび単離されたミトコンドリアが用いられる。定量的な結果を、オートラジオグラフィーによる競合的プレート結合アッセイによって得ることができるが、スキャッチャードプロット（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０、１９４９）を、定量的な結果を得るために利用することができる。
【００５９】
ＡＮＴに対するＶｐｒの相互作用に影響を及ぼすか、またはＡＮＴと相互作用するその能力を模倣するペプチド性分子または非ペプチド性分子
変異体
本発明には、その結合活性が変化しているＶｐｒまたはＡＮＴの変異体が包含される。本明細書に示される変異体ポリペプチドには、天然の生物学的活性を保持する天然ポリペプチドの変異体またはその実質的な等価体が含まれる。一例として、天然型が結合するのと本質的に同じ結合親和性で結合する変異体が挙げられる。結合親和性は、従来の手法によって、例えば、米国特許第５，５１２，４５７号に記載されるように、そして下記に示されるように測定することができる。
【００６０】
変異体はまた、増大した親和性で結合することができる。１つの態様において、変異体は、ＡＮＴの生物学的活性に対する天然型Ｖｐｒのアゴニストである。別の態様では、変異体は、ＡＮＴの生物学的活性に対する天然型Ｖｐｒのアンタゴニストである。アゴニスト活性またはアンタゴニスト活性は、本明細書に記載される手法によって容易に測定することができる。
【００６１】
変異体には、天然型に対して実質的に相同的であるが、１個以上の欠失、挿入または置換のために天然型のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。具体的な態様には、天然の配列と比較したとき、アミノ酸残基の１個〜１０個の欠失、挿入または置換を含むポリペプチドが含まれるが、このようなポリペプチドに限定されない。
【００６２】
特定のアミノ酸を、例えば、類似する生理化学的特性を有する残基で置換することができる。そのような保存的置換の例には、脂肪族残基相互（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａなどの相互）の置換、極性残基相互（例えば、ＬｙｓとＡｒｇとの間、ＧｌｕとＡｓｐとの間、またはＧｌｎとＡｓｎとの間など）の置換、または芳香族残基相互（Ｐｈｅ、ＴｒｐまたはＴｙｒなどの相互）の置換が含まれる。他の保存的置換、例えば、類似する疎水性特性を有する領域全体の置換を伴う保存的置換がよく知られている。変異体は、ランダム突然変異誘発法または部位特異的突然変異誘発法を含む従来の技術を使用して作製することができる。
【００６３】
抗体
本発明の局面において、ＶｐｒポリペプチドおよびＡＮＴポリペプチド、ならびにＶｐｒおよびＡＮＴのアミノ酸配列に基づくペプチドは、ＶｐｒポリペプチドおよびＡＮＴポリペプチドに特異的に結合する抗体を調製するために利用することができる。本発明のポリヌクレオチドとの免疫反応性を有する抗体が本明細書に提供される。本発明のこの局面において、ＶｐｒおよびＡＮＴのアミノ酸配列に基づくポリペプチドは、ＶｐｒおよびＡＮＴに特異的に結合する抗体を調製するために利用することができる。そのような抗体は、（非特異的な結合とは対照的に）抗体の抗原結合部位を介してポリペプチドに特異的に結合する。したがって、上記に示されるようなポリペプチド、フラグメント、変異体、融合タンパク質などは、それらとの免疫反応性を有する抗体を製造する際の免疫原として用いることができる。より具体的には、ポリペプチド、フラグメント、変異体、融合タンパク質などは、抗体の形成を誘発する抗原性決定基またはエピトープを含む。
【００６４】
これらの抗原性決定基またはエピトープは、線状または立体配座的（不連続）のいずれかであり得る。線状のエピトープはポリペプチドのアミノ酸の単一部分から構成されるが、立体配座的または不連続なエピトープは、タンパク質が折り畳まれるときに非常に接近するポリペプチド鎖の種々の領域に由来するアミノ酸部分から構成される（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．およびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：９（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．、第２版、１９９６））。折り畳まれたタンパク質は複雑な表面を有するので、利用できるエピトープの数は実に多数である。しかし、タンパク質の立体配座および立体的な障害のために、実際にエピトープに結合する抗体の数は、利用できるエピトープの数よりも少ない（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ，Ｊｒ．およびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２：１４（Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．、第２版、１９９６））。エピトープは、当技術分野において知られている方法のいずれかで同定することができる。
【００６５】
したがって、本発明の１つの局面は、本発明のポリペプチドの抗原性エピトープに関する。そのようなエピトープは、下記に詳しく記載されるように、抗体（特に、モノクローナル抗体）を製造するために有用である。さらに、本発明のポリペプチドに由来するエピトープは、アッセイにおいて、そして培養されたハイブリドーマから得られるポリクローナル血清または上清などの物質から特異的な結合性抗体を精製するために研究試薬として使用することができる。そのようなエピトープまたはその変異体は、ポリペプチドの固相合成、化学的切断もしくは酵素切断などの当技術分野においてよく知られている技術を使用して、または組換えＤＮＡ技術を使用して製造することができる。
【００６６】
本発明のポリペプチドのエピトープにより誘発され得る抗体に関して、エピトープが単離されているか、またはポリペプチドの一部を残存しているとしても、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を、下記に記載されるような従来の技術によって調製することができる。
【００６７】
用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、それらのフラグメント、具体的には、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦａｂフラグメントなどの抗原結合性のフラグメント、ならびに任意の組換え製造される結合性パートナーを含むことが意味される。抗体は、抗体が約１０７Ｍ−１以上または同等のＫａで結合する場合に特異的に結合することが定義される。結合性パートナーまたは抗体の親和性は、従来の技術を使用して、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０（１９４９）により記載される技術を使用して容易に測定することができる。
【００６８】
ポリクローナル抗体は、様々な供給源から、例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウスまたはラットから、当技術分野においてよく知られている手法を使用して容易に作製することができる。一般に、適切にコンジュゲート化される精製されたＶｐｒ（もしくはＡＮＴ）、または適切にコンジュゲート化される、Ｖｐｒ（もしくはＡＮＴ）のアミノ酸配列に基づくペプチドが、宿主動物に、典型的には非経口注射によって投与される。Ｖｐｒ（またはＡＮＴ）の免疫原性を、アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント）の使用によって高めることができる。追加抗原刺激による免疫化の後、少量の血液サンプルが採取され、ＶｐｒポリペプチドまたはＡＮＴポリペプチドに対する反応性について試験される。そのような測定に有用な様々なアッセイの例には、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、１９８８）に記載されるアッセイ；ならびにカウンターカレント免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、放射免疫アッセイ、放射免疫沈殿、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ドットブロットアッセイおよびサンドイッチアッセイなどの手法が含まれる。米国特許第４，３７６，１１０号および同第４，４８６，５３０号を参照のこと。
【００６９】
モノクローナル抗体は、十分に知られている様々な手法を使用して容易に調製することができる。例えば、米国再発行特許第３２，０１１号、米国特許第４，９０２，６１４号、同第４，５４３，４３９号および同第４，４１１，９９３号；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｋｅｎｎｅｔｔ、ＭｃＫｅａｍおよびＢｅｃｈｔｏｌ（編）、１９８０）に記載される手法を参照のこと。簡単に記載すると、マウスなどの宿主動物に、単離および精製されたＶｐｒ（またはＡＮＴ）、コンジュゲート化されたＶｐｒ（またはＡＮＴ）ペプチドが、場合によりアジュバントの存在下で、少なくとも１回、好ましくは、約３週間の間隔で少なくとも２回、腹腔内に注射される。その後、マウスの血清が、どの動物が融合に最も良いかを決定するために、従来のドットブロット技術または抗体捕捉（ＡＢＣ）によってアッセイされる。約２週間後〜３週間後、マウスは、Ｖｐｒ（もしくはＡＮＴ）ペプチドまたはコンジュゲート化Ｖｐｒ（もしくはＡＮＴ）ペプチドの静脈内追加抗原刺激が施される。その後、マウスは屠殺され、脾臓細胞が、確立されたプロトコールに従って、Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ）などの市販のミエローマ細胞と融合される。簡単に記載すると、ミエローマ細胞は、培地で数回洗浄され、そして約３：１の脾臓細胞対ミエローマ細胞の比でマウスの脾臓細胞に融合される。融合剤は、当技術分野において使用される任意の好適な薬剤であり得る（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。融合物は、融合した細胞の選択的な増殖を可能にする培地を含む平板に置床される。その後、約８日間、融合細胞は増殖させることができる。得られたハイブリドーマに由来する上清が集められ、ヤギ抗マウスＩｇで最初にコーティングされたプレートに添加される。洗浄後、１２５Ｉ−Ｖｐｒ（または１２５Ｉ−ＡＮＴ）などの標識がそれぞれのウェルに加えられ、その後、インキュベーションされる。その後、陽性のウェルをオートラジオグラフィーによって検出することができる。陽性のクローンを大量培養で増殖させることができ、その後、上清がプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で精製される。
【００７０】
本発明のモノクローナル抗体は、Ａｌｔｉｎｇ−Ｍｅｅｓら、「モノクローナル抗体発現ライブラリー：ハイブリドーマの迅速な代替法」、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：１〜９（１９９０）（これは参照として本明細書に組み入れられる）により記載される技術などの代わりの技術を使用して製造することができる。同様に、様々な結合性パートナーを、特異的な結合性抗体をコードする遺伝子の可変領域を取り込むために組換えＤＮＡ技術を使用して構築することができる。そのような技術は、Ｌａｒｒｉｃｋら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７：３９４（１９８９）に記載される。
【００７１】
本発明のモノクローナル抗体には、キメラ抗体、例えば、マウスモノクローナル抗体のヒト化体が含まれる。そのようなヒト化抗体は、知られている技術によって調製することができ、そして抗体がヒトに投与されたとき、低下した免疫原性の利点を提供する。１つの態様において、ヒト化モノクローナル抗体は、ネズミ抗体の可変領域（またはちょうどその抗原結合部位）と、ヒト抗体に由来する定常領域とを含む。または、ヒト化抗体フラグメントは、ネズミモノクローナル抗体の抗原結合部位と、ヒト抗体に由来する可変領域フラグメント（これは抗原結合部位を有しない）とを含むことができる。キメラなモノクローナル抗体およびさらに操作されたモノクローナル抗体を製造するための手法には、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ、３３２； ３２３、１９８８）、Ｌｉｕら（ＰＮＡＳ、８４：３４３９、１９８７）、Ｌａｒｒｉｃｋら（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７：９３４、１９８９）、およびＷｉｎｔｅｒおよびＨａｒｒｉｓ（ＴＩＰＳ、１４：１３９、１９９３年５月）に記載される手法が含まれる。抗体を遺伝子導入によって作製するための手法は、英国特許第２，２７２，４４０、米国特許第５，５６９，８２５号および同第５，５４５，８０６号、ならびにそれらからの優先権を主張する関連特許（これらはすべて参照として本明細書に組み入れられる）に見出すことができる。
【００７２】
一旦、単離および精製されると、ＶｐｒおよびＡＮＴに対する抗体、ならびに他のＶｐｒ結合性タンパク質およびＡＮＴ結合性タンパク質に対する抗体は、確立されたアッセイプロトコールを使用して、サンプル中のＶｐｒおよびＡＮＴの存在を検出するために使用することができる。さらに、本発明の抗体は、ＶｐｒまたはＡＮＴに結合させ、その活性をインビボで阻害するために治療的に使用することができる。
【００７３】
ＶｐｒまたはＡＮＴおよび他のＶｐｒ結合性タンパク質またはＡＮＴ結合性タンパク質に対する抗体は、ＶｐｒおよびＡＮＴの生物学的活性を調節するために使用することができる。これらの抗体の１つのクラスはミトコンドリア膜透過化およびアポトーシスをもたらす。対照的に、これらの抗体の別のクラスはミトコンドリア膜透過化およびアポトーシスを阻害することができる。
【００７４】
Ｖｐｒ−ＡＮＴ結合をさらに阻止し得るそのような抗体は、そのような結合から生じる生物学的活性を阻害するために使用することができる。そのような阻止抗体は、任意の好適なアッセイ手法を使用して、例えば、ＶｐｒがＡＮＴに結合することを阻害する能力について抗体を試験することなどによって同定することができる。または、阻止抗体は、Ｖｐｒが細胞においてＡＮＴに結合することから生じる生物学的作用を阻害する能力に対するアッセイで同定することができる。
【００７５】
そのよう抗体は、インビトロでの方法において用いることができ、または抗体を生じさせた物質によって媒介される生物学的活性を阻害するためにインビボで投与することができる。様々な障害が、ＶｐｒのＡＮＴとの相互作用によって（直接的または間接的に）引き起こされるか、または（直接的または間接的に）悪化する。治療方法には、ＡＮＴにより媒介されるアポトーシスを阻害することにおいて効果的な量で阻止抗体を哺乳動物にインビボ投与することが含まれる。モノクローナル抗体は、一般に、そのような治療方法における使用に好ましい。１つの態様において、抗原結合性の抗体フラグメントが用いられる。
【００７６】
抗体は、アゴニスト（すなわち、リガンドを模倣する）性質についてスクリーニングすることができる。そのような抗体は、ＡＮＴに結合したとき、ＶｐｒがＡＮＴに結合したときに誘導される生物学的作用に類似する生物学的作用（例えば、アポトーシス）を誘導する。アゴニスト抗体は、細胞のＡＮＴ媒介のアポトーシスを誘導するために使用することができる。
【００７７】
ＶｐｒまたはＡＮＴに対する抗体と、生理学的に許容される希釈剤、賦形剤またはキャリアとを含む組成物が本明細書に提供される。そのような組成物の好適な成分は、ＶｐｒまたはＡＮＴを含有する組成物について上記に記載される通りである。
【００７８】
本明細書にはまた、抗体に結合させられた、検出可能な（例えば、診断）治療薬剤を含むコンジュゲート化体が提供される。そのような薬剤の様々な例が上記に示されている。そのようなコンジュゲート化体は、インビトロまたはインビボでの様々な手法で使用される。
【００７９】
他の分子
本発明にはまた、ＶｐｒのＡＮＴに対する結合と競合する分子、またはＶｐｒのＡＮＴに対する結合を増強する分子が包含される。そのような分子は、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイによって、または例えば、Ｖｐｒ−ＡＮＴ結合の分子モデリングを使用して構造に基づく設計によって同定することができる。
【００８０】
医薬組成物および診断用組成物
本発明の組成物は、天然タンパク質、変異体、誘導体、オリゴマーおよび生物学的に活性なフラグメントなどのペプチド性分子または非ペプチド性分子を任意の形態で含有することができる。具体的な態様において、組成物は、可溶性のポリペプチド、または可溶性のＶｐｒ、Ｂｃｌ−２もしくはＡＮＴのポリペプチドもしくはフラグメントを含むオリゴマーを含む。
【００８１】
本発明の分子の効果的な量を、生理学的に許容される希釈剤、キャリアまたは賦形剤などの他の成分との組合せで含む組成物が本明細書に提供される。分子は、薬学的に有用な組成物を調製するために使用される知られている方法に従って配合することができる。分子は、薬学的に許容される希釈剤（例えば、生理的食塩水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩およびリン酸塩緩衝化溶液）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン類）、乳化剤、可溶化剤、アジュバントおよび／またはキャリアととともに、単独の活性な物質として、または所与の適用に好適な他の知られている活性な物質とともに混合状態で一緒にすることができる。医薬組成物について好適な配合物には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版、１９８０年、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ）に記載される配合物が含まれる。
【００８２】
さらに、そのような組成物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体化させることができ、またはポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストランなどのポリマー化合物に配合することができ、またはリポソーム、マイクロエマルション、ミセル、単層ベシクルもしくは多層ベシクル、赤血球ゴーストもしくはスフェロブラストに配合することができる。そのような組成物は、物理的状態、溶解性、安定性、インビボ放出速度およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼし、したがって、意図された適用に従って選ばれる。
【００８３】
本発明の組成物は、任意の好適な様式で、例えば、局所的に、非経口的に、または吸入によって投与することができる。用語「非経口的」には、例えば、皮下経路または静脈内経路または筋肉内経路による注射が含まれ、そしてまた、例えば、疾患部位または傷害部位における局所的な投与も含まれる。インプラントからの持続した放出もまた考えられる。当業者は、好適な投薬量が、処置される障害の性質、患者の体重、年齢および全身状態、ならびに投与経路のような要因に依存して変化することを認識する。予備的な用量を動物試験に従って決定することができ、そしてヒトへの投与に対する投薬量の見積もりが、当技術分野において認められている実施法に従って行われる。
【００８４】
核酸を生理学的に許容される配合物に含む組成物もまた考えられる。ＤＮＡを、例えば、注射のために配合することができる。
【００８５】
ＡＮＴの変化に対するスクリーニング方法
本発明はまた、ヒトにおける３つのＡＮＴイソタイプの発現または構造における遺伝子的またはエピジェネティックな変化についてスクリーニングする方法を提供する。
【００８６】
本発明は、異常なＡＮＴ発現に関連する疾患の診断を提供する。例えば、ある種のガンでは、ＡＮＴの特定の変化がガンに関連することがある。そのようなガンの診断を、例えば、本明細書に記載されるように、Ｖｐｒを使用して、またはＡＮＴに対する結合を保持し得るＶｐｒのフラグメントを結合アッセイにおいて使用して達成することができる。それにより、患者における３つのＡＮＴイソタイプの発現または構造を明らかにすることができ、診断が達成され得る。
【００８７】
特異的に細胞を殺すための方法
Ｖｐｒまたはその生物学的に活性なフラグメント（ｖｐｒ５２〜９６など）は、細胞におけるアポトーシスを誘導するために使用することができる。１つの態様において、ｖｐｒ５２〜９６ポリペプチドは、特定の細胞タイプに標的化するために分子に融合され、そのような細胞タイプにおけるアポトーシスを誘導する。さらなる態様において、Ｖｐｒ標的化分子のコンジュゲート化体はガン細胞を特異的に殺す。その方法論は、Ｂａｘに融合したインターロイキン２（ＩＬ−２）タンパク質を含有する組換えキメラタンパク質を使用して、ＩＬ−２受容体保有細胞をインビトロで選択的に殺すことに成功したことと非常に類似し得る。Ｒ．Ａｑｅｉｌａｎ、Ｓ．ＹａｒｋｏｎｉおよびＨ．Ｌｏｒｂｅｒｂｏｕｍ−Ｇａｌｓｋｉ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５７：２７１〜６（１９９９）。
【００８８】
他の態様において、生物学的に活性なＶｐｒ標的化分子のコンジュゲート化体は、疾患に関与する他の細胞タイプを特異的に標的化して、そのような細胞を殺すために使用することができる。
【００８９】
二重試験
アポトーシスにおけるＡＮＴの役割、より詳細には、ミトコンドリア膜の透過化におけるＡＮＴの役割（Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０００； Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０００）を研究するために、本発明者らは、ＡＮＴのアンチポート（生命維持）機能および細孔（致死性）機能を人工的な脂質二重層またはリポソームにおいて同時に測定することを可能にする機能的な二重試験を開発している。
【００９０】
この機能的な二重試験の原理は、リポソームにおけるＡＮＴの再構成、プロテオリポソームの内部における種々の基質（蛍光性基質およびＡＴＰ）のカプセル化、リポソームの外側への酵素およびＡＤＰの添加、そして、ＡＮＴにより形成される細孔を介して基質が塩析することの蛍光による測定、そして同時に、外因性ＡＤＰに応答して輸送されるＡＴＰの発光による測定に基づく。ＡＮＴのこの２つの機能に対するその影響を明らかにするために、任意のペプチド化合物または非ペプチド化合物が、リポソームの形成時にＡＮＴとともに再構成され得る（例えば、Ｂａｘ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘ（Ｌ））か、またはリポソーム内にカプセル化され得るか、または外因的な様式でプロテオリポソームに添加され得る（例えば、ペプチド分子〔例えば、Ｖｐｒ、Ｖｐｒ５２〜９６〕、Ｂｌｄなどの添加）か、またはされ得ない（アトラクチロシド、カルシウム、ｔ−ＢＨＰ、ジアミド、ＢＡ、シクロスポリンＡ、ベルテポルフィンなど）。定量的な測定を固定点または速度論的様式で行うことができる。この試験は９６ウェルのマイクロプレートで行われ、ＨＴＳ（ハイスループットスクリーニング）に適合させることができる。
【００９１】
この機能的な二重試験により、アポトーシスを誘導もしくは阻害する分子のスクリーニング、ＡＮＴから細孔への変換を変換もしくは促進し得るＡＮＴパートナー分子のスクリーニング、またはＡＮＴの特定の機能的形態（生命維持機能および／または致死的機能の変化、ＡＮＴイソタイプの比率の変化）の診断が可能になる。アンチポート機能試験により、ＡＮＴの生命維持機能に対して分子の毒性を評価することが可能になる。
【００９２】
本明細書は、参照として本明細書に組み入れられる、本明細書に引用される参考文献の教示を考慮して非常に十分に理解される。本明細書内の態様および実施例は、本発明の様々な態様の例示を示しているが、本発明の範囲を限定するために解釈すべきではない。当業者は、多くの他の態様が本発明によって包含されることを容易に認識する。
【００９３】
実施例１
ＶｐｒとＡＮＴとの物理的および機能的な相互作用
表面プラスモン共鳴測定は、精製された界面活性剤可溶化ＡＮＴタンパク質が、固定化ＶｐｒのＣ末端成分ビオチン−Ｖｐｒ５２〜９６に、ナノモル濃度の範囲の親和性で、（変異型のビオチン−Ｖｐｒ５２〜９６〔Ｒ７３，８０Ａ〕にはかなり小さい程度で）結合することを示す（図１ＡおよびＢ）。この相互作用は、ＡＮＴの立体配座に異なるように影響を及ぼす２つのＡＮＴリガンドによって調節される（Ｍ．Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｂｉｏｌ．５６、９７〜１０５（１９８０））：すなわち、Ｖｐｒの結合に有利なＰＴＰＣ活性化因子のアトラクチロシド（Ａｔｒ）、およびＶｐｒの結合を低下させるＰＴＰＣ阻害剤のボンクレキン酸（ＢＡ）（図１Ｃ）。膜に対するＶｐｒ５２〜９６の結合は、タンパク質を含まないリポソームと比較したとき、ＡＮＴが再構成されているリポソーム内で大きく促進される（図２Ａ）。このＡＮＴ作用はＢＡによって阻害される（図２Ｂ）。Ｖｐｒ５２〜９６（ＶｐｒのＮ末端成分〔Ｖｐｒ１〜５１〕または変異型Ｖｐｒ５２〜９６（これは、アルギニン７７がアラニンにより置換されている；Ｖｐｒ５２〜９６〔Ｒ７７Ａ〕）ではない）もまた、ＡＮＴプロテオリポソームの透過化を生じさせる（図２Ｃ）が、リポソーム単独に対する作用を有していない。
【００９４】
Ｂｃｌ−２様のタンパク質がＡＮＴのモチーフ（ａａ１０５〜１５５）に結合し（Ｉ．Ｍａｒｚｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１、２０２７〜２０３１（１９９８））、アポトーシスの制御におけるその関与がＡＮＴの欠失マッピングによって確認されている（Ｍ．Ｋ．Ａ．Ｂａｕｅｒ、Ａ．Ｓｃｈｕｂｅｒｔ、Ｏ．Ｒｏｃｋｓ、Ｓ．Ｇｒｉｍｍ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４７、１４９３〜１５０１（１９９９））。このモチーフは、膜間腔に露出する調節ドメインである第２のＡＮＴループ（ａａ９２〜１１６）と部分的に重なる（Ｇ．Ｂｒａｎｄｏｌｉｎ、Ａ．Ｌｅ−Ｓａｕｘ、Ｖ．Ｔｒｅｚｅｇｕｅｔ、Ｇ．Ｊ．Ｌａｕｑｕｉｎｎ、Ｐ．Ｖ．Ｖｉｇｎａｉｓ、Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２５、４９３〜５０１（１９９３）； Ｍ．Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２５、４４７〜４５７（１９９３））。Ｂｃｌ−２結合モチーフとこのループとの重なりに対応するペプチド（ＡＮＴ１０４〜１１６）は、おそらくはＶｐｒ５２〜９６との直接的な会合（図１Ｄにおける挿入図）を介して、ＡＮＴとＶｐｒとの相互作用を阻害した（図１Ｃ）。
【００９５】
ヒトリン酸キャリアに由来するトポロジー的に関連するペプチドモチーフまたはＡＮＴ１０４〜１１６の変異型およびスクランブル型（図１Ｃにおける対照ペプチド）はいずれもそのような阻害作用を有していなかった。（対照ペプチドではなく）ＡＮＴ１０４〜１１６もまた、Ｖｐｒ５２〜９６により誘導されるＡＮＴプロテオリポソームの膜透過化を妨げた（図２Ｃ）。このことは、脂質二重層の状況では、Ｖｐｒの作用は、ＡＮＴとの直接的な相互作用を伴ったことを示している。平面状の脂質二重層では、低用量のＶｐｒ５２〜９６（＜１ｎＭ）は、ＡＮＴが存在しない限り、チャンネルを形成することができなかった。
【００９６】
ＡＮＴおよびＶｐｒ５２〜９６は共同して、そのコンダクタンス（１９０±２ｐＳ）（図３）が、高用量（１８０ｎＭ）のＶｐｒ５２〜９６単独（５５±２ｐＳ）により形成されるチャンネルよりもはるかに大きい異なるチャンネルを形成することに協力した（図３、およびＳ．Ｃ．Ｐｉｌｌｅｒ、Ｇ．Ｄ．Ｅｗａｒｔ、Ａ．Ｐｒｅｍｋｕｍａｒ、Ｇ．Ｂ．Ｃｏｘ、Ｐ．Ｗ．Ｇａｇｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、１１１〜１１５（１９９６））が、Ｃａ２＋処理されたＡＮＴにより形成されるチャンネルの範囲内であった（Ｎ．Ｂｒｕｓｔｏｖｅｔｓｋｙ、Ｍ．Ｋｌｉｎｇｅｎｂｅｒｇ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３５、８４８３〜８４８８（１９９６）； Ｃ．Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９、３２９〜３３６（２０００））。これらの生物物理実験は、ＡＮＴおよびＶｐｒが膜内で直接的に相互作用して、機能的に能力を有するチャンネル形成ヘテロ（ポリ）マーを形成することを明らかにしている。
【００９７】
実施例２
Ｖｐｒにさらされた精製ミトコンドリアの酸化的性質
未処理のオルガネラ（図４Ａ、軌跡ａ）と比較したとき、Ｖｐｒ５２〜９６とプレインキュベーションされた精製ミトコンドリア（図４Ａ、軌跡ｂ）は、呼吸制御（ＲＣ）が著しく不完全であった。Ｖｐｒは、ＡＤＰ添加に先行するコハク酸の酸化を増大させ、そしてオリゴマイシン（特異的なＡＴＰａｓｅ阻害剤）の阻害作用と、プロトノホアカルバモイルシアニドｍ−クロロフェニルヒドラゾン（ＣＣＣＰ）による脱共役の刺激作用との両方を無効にした。したがって、（Ｖｐｒ１〜５１ではなく）Ｖｐｒ５２〜９６は、ＲＣ（オリゴマイシン対ＣＣＣＰでの酸素消費比）を、対照ミトコンドリアにおける５．３と比較して、１．１の値に低下させた（図４Ｂ）。完全なＶｐｒタンパク質（Ｖｐｒ１〜９６）、およびＶｐｒの最小「ミトコンドリア毒性」モチーフに対応する短いペプチド（Ｖｐｒ７１〜８２）（Ｌ．Ｇ．Ｍａｃｒｅａｄｉｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２、２７７０〜２７７４（１９９５）； Ｉ．Ｇ．Ｍａｃｒｅａｄｉｅら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１０、１４５〜１４９（１９９７）； Ｅ．Ｊａｃｏｔｏｔら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１、３３〜４５（２０００））もまたＲＣ値を低下させた（図４Ｂ）。注目すべきことに、Ｖｐｒにより誘導されるＲＣの喪失は、酸化速度の著しい低下と関連しなかった（図４Ａ）。このことは、膜結合型シトクロームｃの大きい喪失が、Ｖｐｒ５２〜９６との短時間のインキュベーションを行ったときに生じなかったことを示唆している。したがって、コハク酸を酸化するＶｐｒ５２〜９６処理ミトコンドリアへのシトクロームｃの添加は、酸素の取り込み速度を刺激しなかった（図４Ａ、軌跡ｂ）。呼吸鎖のＶｐｒ媒介による脱共役が観測されたことにより、本発明者らは、ＩＭ透過化を誘導するその能力を試験することに駆り立てられた。ＩＭはＮＡＤＨに対して本質的には不透過性である（Ｐ．Ｒｕｓｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１、１４７８５〜１４７９０（１９９６））ので、ＮＡＤＨが対照ミトコンドリアに添加されたとき、有意な酸素取り込みを測定することができなかった（図５Ａ、軌跡ａ）。しかし、Ｖｐｒ５２〜９６の添加により、ＮＡＤＨ刺激された著しい酸素消費が促進された（図５Ａ、軌跡ｂ）。このことは、Ｖｐｒが、プロトン（これは脱共役をもたらす；図４Ａ、軌跡ｂ）およびＮＡＤＨ（図５Ａ、軌跡ｂ）の両方に対してＩＭの透過性を増大させたことを示している。
【００９８】
ＮＡＤＨおよびシトクロームｃに対する内側および外側のＭＭＰの差のある速度論をぞれぞれ評価した（図５Ｂ）。Ｖｐｒ５２〜９６が添加されたミトコンドリアによるＮＡＤＨ酸化が１０分後に最大になることが見出された（図５Ｂ）。同様な条件のもとで、Ｖｐｒ５２〜９６は、シトクロームｃオキシダーゼに対するシトクロームｃの十分とはいえない接近を誘導しただけであった（図５Ｂ）。さらに、ΔΨｍの喪失が、シトクロームｃの放出が免疫ブロットによって検出され得る前に十分に生じていた（図５Ｃ）。したがって、Ｖｐｒ５２〜９６は、ＯＭが外因性のシトクロームｃに対して透過性になる前に十分に内側のＭＭＰを生じさせている。これにより、超構造的レベル（下記参照、図６Ｃ）において、Ｖｐｒ５２〜９６で処理されたミトコンドリアは、ＯＭの破裂が明らかになる前にマトリックスの膨潤を示した。
【００９９】
実施例３
ミトコンドリアに対するＶｐｒ作用のＢｃｌ−２媒介による阻害
無傷な細胞に対するＶｐｒの細胞外からの添加は、核の凝縮が生じる前に、迅速なΔΨｍの喪失を誘導した。これらの作用は、組換えＢｃｌ−２を細胞質に顕微注入することによって妨げられた（図６Ａ）。精製されたミトコンドリアを組換えＢｃｌ−２（またはＡＮＴリガンドのＢＡ）とプレインキュベーションすることによってもまた、ＮＡＤＨに対するＶｐｒ媒介による内側ＭＭＰが妨げられた（図６Ｂ）。付随的には、Ｖｐｒ誘導によるマトリックス膨潤（図６Ｃ）およびΔΨｍ喪失（図６ＤおよびＥ）の両方が、（Ｂｃｌ−２Δα５／６（仮想的な細孔形成性のα５らせんおよびα６らせんを有しない欠失変異体、Ｓ．Ｓｃｈｅｎｄｅｌ、Ｍ．Ｍｏｎｔａｌ、Ｊ．Ｃ．Ｒｅｅｄ、Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ．５、３７２〜３８０（１９９８）ではなく）Ｂｃｌ−２によって、そしてＰＴＰＣの２つの薬理学的阻害剤（ＢＡおよびシクロスポリンＡ；ＣｓＡ）によって、ならびに特異的なＶＤＡＣ阻害剤のＫｏｅｎｉｇｓポリアミン（ＰＡ１０； Ｓ．Ｓｔａｎｌｅｙ、Ｊ．Ａ．Ｄｉａｓ、Ｄ．Ｄ’Ａｒｃａｎｇｅｌｉｓ、Ｃ．Ａ．Ｍａｎｎｅｌｌａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０、１６６９４〜１６７００（１９９５））によって阻害された。顕微注入されたＰＡ１０はまた、無傷な細胞に対するＶｐｒ５２〜９６の作用を阻害する（図６Ａ）。精製されたミトコンドリアに対するＶｐｒ５２〜９６の結合は、オルガネラをＰＡ１０とプレインキュベーションすることによって完全になくなり、ＢＡにより部分的に低下したが、ＣｓＡでは影響されなかった（図７Ｂ）。したがって、Ｖｐｒは、ＶＤＡＣを介してミトコンドリアに近づくに違いない。
【０１００】
Ｂｃｌ−２は、（ＶＤＡＣのＢｃｌ−２媒介による閉鎖に基づいて）ＶｐｒがＶＤＡＣを介してＯＭを横断することを妨げること（Ｓ．Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ｍ．Ｎａｒｉｔａ、Ｙ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ、Ｎａｔｕｒｅ、３９９、４８３〜４８７（１９９９）； Ｓ．Ｓｈｉｍｉｚｕ、Ａ．Ｋｏｎｉｓｈｉ、Ｔ．Ｋｏｄａｍａ、Ｙ．Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９７、３１００〜３１０５（２００１））、および／または（ＡＮＴとのその物理的および機能的な相互作用に基づいて）ＡＮＴに対するＶｐｒ作用を阻害すること（Ｉ．Ｍａｒｚｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１、２０２７〜２０３１（１９９８）； Ｃ．Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９、３２９〜３３６（２０００）； Ｍ．Ｎａｒｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５、１４６８１〜１４６８６（１９９８））が予想され得る。組換えＢｃｌ−２は、Ｖｐｒ５２〜９６誘導のマトリックス膨潤（図６Ｃ）およびΔΨｍ喪失（図６ＤおよびＥ）を強く低下させたが、精製されたミトコンドリアに対するＶｐｒ５２〜９６の結合を損なうことができなかった（図７Ｂ）。Ｖｐｒ−ＡＮＴ相互作用に対するＰＡ１０およびＢｃｌ−２の差のある阻害作用が異なる実験系で確認された。ＰＡ１０は、ビオチン化Ｖｐｒ５２〜９６を使用するＡＮＴの親和性媒介による精製を完全に無効にした（図７Ｃ）。ただし、その作用は、無傷なミトコンドリアに対して評価された（この場合、Ｖｐｒ５２〜９６は、ＡＮＴに達するためにはＯＭを横断しなければならない）。対照的に、ＰＡ１０は、トリトン可溶化ミトコンドリアからのＡＮＴのＶｐｒ５２〜９６媒介による精製に影響を及ぼさなかった（この場合、ＡＮＴはＶｐｒ５２〜９６に容易に接近することができる）。同じ条件のもとでは、無傷なミトコンドリアまたは可溶化されたミトコンドリアへのその添加にも関わらず、Ｂｃｌ−２は、ＡＮＴのＶｐｒ５２〜９６媒介による回収を低下させた（図７Ｃ）。したがって、Ｂｃｌ−２は、Ｖｐｒ５２〜９６がＯＭを通過することを可能にする、（ＰＡ１０により阻害される）ＶＤＡＣ媒介の溝を妨害しない。
【０１０１】
実施例４
Ｖｐｒ−ＡＮＴ相互作用のＢｃｌ−２媒介による阻害
さらに一連の実験により、Ｂｃｌ−２がＡＮＴとのＶｐｒの物理的および機能的な相互作用を調節することが示された。（Ｂｃｌ−２　Δα５／６ではなく）組換えＢｃｌ−２は、可溶性ＡＮＴ（図８Ａ）または膜結合型ＡＮＴ（図８Ｂ）に対するＶｐｒ５２〜９６の結合を低下させた。Ｂｃｌ−２はＶｐｒ５２〜９６と結合しなかったので、Ｖｐｒ／ＡＮＴ結合の阻害は、直接的なＢｃｌ−２／ＡＮＴ相互作用のためであると考えられる（Ｉ．Ｍａｒｚｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８１、２０２７〜２０３１（１９９８）； Ｃ．Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９、３２９〜３３６（２０００））。これにより、Ｂｃｌ−２は、ＡＮＴ含有脂質二重層におけるＶｐｒ５２〜９６誘導によるチャンネルの形成を無効にした。対照的に、同じ条件において、Ｂａｘは、Ｖｐｒ５２〜９６−ＡＮＴチャンネルのコンダクタンスを、（何らさらに添加されていないＶｐｒ５２〜９６−ＡＮＴに対する１９０±２と比較したとき）２４５±２Ｓの平均値に悪化させた（図８Ｃ）。
【０１０２】
実施例５
二重試験のプロトコール
１．ＡＮＴの精製。ＡＮＴは、Ｂｒｅｎｎｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、２０００、によって記載されるプロトコールに従って、ラットの心臓から精製され、リポソームにおいて再構成された。
【０１０３】
２．リポソームにおけるＡＮＴの再構成。ＡＮＴ（０．０３ｍｇ／ｍｌ）を、ｎ−オクチル−β−Ｄ−ピラノシド０．３％の存在下、ホスファチジルコリンおよびカルジオリピンから構成されるリポソーム（ＰＣ：ＣＬ；４５：１；Ｗ；ｗ；および脂質１ｍｇあたりＡＮＴ３００ｎｇ）に、室温で２分間取り込ませた。必要な場合、他のタンパク質または化合物が、取り込み時のこの段階で加えられた（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂａｘ）。その後、界面活性剤が、リポソームをＨＥＰＥＳ　１０ｍＭ、スクロース１２５ｍＭ、ｐＨ７の緩衝液（例えば、リポソーム１ｍｌ対して緩衝液約１ｌ）に対して４℃で一晩透析することによって除かれた。
【０１０４】
３．細孔機能試験。リポソームに、超音波処理（５０Ｗ、２２秒）により、ＫＣｌ　１０ｍＭにおいて４−ＵＭＰ　１ｍＭ（４−メチルウンベリフェリルホスファート）を担荷した。その後、プロテオリポソームをＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５カラムで分離して、カプセル化されなかった化合物を除いた。溶出は、ＨＥＰＥＳ　１０ｍＭ、スクロース１２５ｍＭ、ｐＨ７の緩衝液を室温で使用して行われた。９６ウェルマイクロプレートにおいて、リポソーム２５μｌをそれぞれのウェルに入れた。
【０１０５】
試験される生成物の２５μｌを添加し、室温で種々の化合物とともに３０分間〜６０分間インキュベーションした（例えば、Ｖｐｒ５２〜９６については３０分；非ペプチド化合物については６０分）。その後、アルカリホスファターゼ（５Ｕ／ｍｌ）およびＨＥＰＥＳ　１０ｍＭ、スクロース１２５ｍＭ、ＭｇＣｌ２　０．５ｍＭ、ｐＨ７．４の反応緩衝液１５０μｌを添加した。プレートを、４−ＵＭＰの４−ウンベリフェロン（４−ＵＭ）への酵素変換を行わせるために３７℃で振とうしながら１５分間インキュベーションした。反応を、停止緩衝液１５０μｌ（１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ−ＮａＯＨ、２００ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ１０）の添加により停止させた。４−ＵＭの蛍光測定による測定を行った（励起：３６５ｎｍ；放射：４５０±５ｎｍ）。それぞれの実験において、リポソームの非処理サンプル、４−ＵＭＰのカプセル化サンプル、および４−ＵＭＰの最大塩析サンプルを作製して、これらにより、結果を、塩析された４−ＵＭＰの百分率として表すことができる。
【０１０６】
４　アンチポート機能試験。リポソームに、超音波処理（５０Ｗ、２２秒）により、ＫＣｌ　１０ｍＭにおいてＡＴＰ　１ｍＭ（４−メチルウンベリフェリルホスファート）を担荷した。その後、プロテオリポソームをＳｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ２５カラムで分離して、カプセル化されなかった化合物を除いた。溶出は、少量のＨＥＰＥＳ緩衝液溶液１０ｍＭ、スクロース１２５ｍＭ、ｐＨ７、を用いて室温で行われた。９６ウェルマイクロプレートにおいて、リポソーム２５μｌをそれぞれのウェルに入れた。
【０１０７】
試験される生成物の２５μｌを加え、室温で３０分間〜６０分間インキュベーションした（例えば、Ｖｐｒ５２〜９６については３０分；非ペプチド化合物については６０分）。その後、ルシフェラーゼ２５μｌ（ＨＳ ＩＩ Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒキット）を添加し、放射光を直ちに測定した。結果は、リポソームの外側への４００μｌの添加に応答してさらされた最大ＡＴＰに対する比較による百分率として表される。
【０１０８】
５．備考。細孔機能を測定する目的で４−ＵＭＰおよびＫＣｌが担荷されたプロテオリポソームは−２０℃で凍結されるが、輸送体機能を測定するためにＡＴＰおよびＫＣｌが負荷されたプロテオリポソームは凍結されない。
【０１０９】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１は、ＶｐｒとＡＮＴとの物理的および機能的な相互作用を表す。
Ａ．Ｖｐｒ５２〜９６、Ｖｐｒ５２〜９６〔Ｒ７３Ａ，８０Ａ〕または無関係な対照（Ｃｏ）とのＡＮＴの相互作用のプラスマ表面共鳴センサーグラム。Ｖｐｒ５２〜９６との相互作用のセンサーグラムだけが、時間の関数としての結合の増大、および解離期（ｏｆｆ）の開始時における正のシグナルを示す。相互作用の計算されたＫＤ（ＫＤ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）は９．７±６．４ｎＭ（Ｘ±ＳＤ、ｎ＝５）である。
【図１Ｂ】
図１は、ＶｐｒとＡＮＴとの物理的および機能的な相互作用を表す。
Ｂ．ブランクを差し引くことによって補正されたセンサーグラムにおけるＡＮＴの種々の濃度で測定されたラングミュア等温式（センサーグラムはＶｐｒ５２〜９６〔Ｒ７３Ａ，８０Ａ〕で得られた）。
【図１Ｃ】
図１は、ＶｐｒとＡＮＴとの物理的および機能的な相互作用を表す。
Ｃ．ＡＮＴリガンドおよびＡＮＴ由来ペプチドによるＶｐｒ５２〜９６−ＡＮＴ相互作用の調節。測定は、ボンクレキン酸（ＢＡ、２５０μＭ）、アトラクチロシド（Ａｔｒ、５０μＭ）、ＡＮＴ１０４〜１１６ペプチドまたは３つの対照ペプチド（すべて５μＭ）の非存在下（φ）または存在下においてＡのように行われた。ＡＮＴ−２由来ペプチドのＡＮＴ１０４〜１１６〔ＤＫＲＴＱＦＷＲＹＦＡＧＮ〕および対照ペプチド（Ｃｏ．Ｉ：スクランブル型ＡＮＴ１０４〜１１６〔ＦＱＮＹＷＧＨＫＲＦＲＤＡ〕；Ｃｏ．ＩＩ：変異型ＡＮＴ１０４〜１１６〔ＤＧＨＫＱＦＷＧＹＦＡＧＮ〕；Ｃｏ．ＩＩＩ：ＡＮＴ関連のヒトリン酸輸送体タンパク質に由来するトポロジー的に等価なペプチド（ａａ１４９〜１６１）〔ＳＮＭＬＧＥＥＮＴＹＬＷＲ〕。活性化または阻害は、（１−ｋ０ａ／ｋ０）ｘ１００として計算された（式中、ｋ０ａおよびｋ０はそれぞれ、薬剤の存在下または非存在下における初速度である）。
【図１Ｄ】
図１は、ＶｐｒとＡＮＴとの物理的および機能的な相互作用を表す。
Ｄ．ビオチン化Ｖｐｒ５２〜９６に対するＡＮＴ１０４〜１１６の結合に関するラングミュア等温式（Ａで測定されたとき）。相互作用の計算されたＫＤは３５μＭである。
【図１Ｅ】
図１は、ＶｐｒとＡＮＴとの物理的および機能的な相互作用を表す。
Ｅ．ＡＮＴおよびＡＮＴ−２由来ペプチドＡＮＴ１０４〜１１６のトポロジーを示す概略図である。
【図２Ａ】
図２は、ＶｐｒとＡＮＴ含有リポソームとの物理的相互作用（Ａ、Ｂ）および機能的相互作用（Ｃ）を表す。
Ａ．ＡＮＴ−リポソームおよびリポソーム単独に対するＦＩＴＣ標識Ｖｐｒ５２〜９６結合の用量応答曲線。
【図２Ｂ】
図２は、ＶｐｒとＡＮＴ含有リポソームとの物理的相互作用（Ａ、Ｂ）および機能的相互作用（Ｃ）を表す。
Ｂ．ＢＡ（５０μＭ）の存在下または非存在下でのリポソーム単独、ＡＮＴ−プロテオリポソームに対するＦＩＴＣ−Ｖｐｒ５２〜９６（２μＭ）の結合。
【図２Ｃ】
図２は、ＶｐｒとＡＮＴ含有リポソームとの物理的相互作用（Ａ、Ｂ）および機能的相互作用（Ｃ）を表す。
Ｃ．ＶｐｒによるＡＮＴプロテオリポソームの透過化（Ｘ±ＳＤ、ｎ＝３）。リポソームは、４−メチルウンベリフェリルホスファート（４−ＭＵＰ）が負荷され、そしてＢＡ（５０μＭ）、ＡＤＰ（８００μＭ）および／または示されたペプチド（Ｂの場合と同じ、０．５μＭ、Ｖｐｒ５２〜９５と５分間プレインキュベーションされる）の存在下または非存在下、Ａｔｒ（２００μＭ）または示されたＶｐｒ由来ペプチド（１μＭ）に８０分間さらされた。その後、アルカリホスファターゼが加えられ、リポソームから放出された４−ＭＵＰを蛍光色素の４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵ）に変換し、Ｖｐｒ由来ペプチドにより誘導された４−ＭＵＰ放出の割合を「材料および方法」に記載されるように計算した。
【図３Ａ】
図３は、平面状脂質二重層におけるＶｐｒ５２〜９６およびＡＮＴの電気生理学的性質を表す。Ｖｐｒ５２〜９６（８０ｎＭ、＋１５０ｍＶ）、Ｖｐｒ５２〜９６（０．４ｎＭ、＋１００ｍＶ）、ＡＮＴ（１ｎＭ、＋１１０ｍＶ）およびＶｐｒ５２〜９６＋ＡＮＴ（０．４：１ｎＭ、＋１１５ｍＶ）の電流変動、ならびにコンダクタンスレベルの関連するヒストグラム（右）が示される。
Ａ．単一チャンネルレベルでのＡＮＴとＶｐｒ５２〜９６との共同的作用。合成膜内に取り込まれた後における、Ｖｐｒ５２〜９６（８０ｎＭ、＋１５０ｍＶ）、Ｖｐｒ５２〜９６（０．４ｎＭ、＋１００ｍＶ）、ＡＮＴ（１ｎＭ、＋１１０ｍＶ）およびＶｐｒ５２〜９６＋ＡＮＴ（０．４：１ｎＭ、＋１１５ｍＶ）の電流変動。単一チャンネルでの記録が、「Ｔｉｐ−Ｄｉｐ」技術を使用して行われた。示される記録は、少なくとも３回の独立した測定に対する代表例である。
【図３Ｂ】
図３は、平面状脂質二重層におけるＶｐｒ５２〜９６およびＡＮＴの電気生理学的性質を表す。Ｖｐｒ５２〜９６（８０ｎＭ、＋１５０ｍＶ）、Ｖｐｒ５２〜９６（０．４ｎＭ、＋１００ｍＶ）、ＡＮＴ（１ｎＭ、＋１１０ｍＶ）およびＶｐｒ５２〜９６＋ＡＮＴ（０．４：１ｎＭ、＋１１５ｍＶ）の電流変動、ならびにコンダクタンスレベルの関連するヒストグラム（右）が示される。
Ｂ．Ａで得られたコンダクタンスの統計学的分析。結果は、種々の電圧における電流変動として表された。コンダクタンス（γ；ピコシーメンス（ｐＳ）単位で）が、電流を電圧で除することによって計算される。
【図４Ａ】
図４は、Ｖｐｒにさらされた精製ミトコンドリアの酸化的性質を示す。
Ａ．示された薬剤を添加した後における酸素消費曲線。軌跡ａ：対照ミトコンドリア（前処理なし）。軌跡ｂ：１μＭのＶｐｒ５２〜９６で１０分間にわたり前処理されたミトコンドリア。軌跡に沿った数字は、１分あたり１ｍｇのタンパク質について消費されたＯ２のｎｍｏｌである。
【図４Ｂ】
図４は、Ｖｐｒにさらされた精製ミトコンドリアの酸化的性質を示す。
Ｂ．１μＭのＶｐｒ由来ペプチドを添加した１０分後のＣＣＣＰ存在下での酸素消費を、オリゴマイシンを用いて測定された酸素消費（Ａのように測定）で除することによって計算された呼吸制御（ＲＣ）値（３回の測定値の平均値）。
【図５Ａ】
図５は内側対外側のミトコンドリア膜透過化を示す。
Ａ．ＮＡＤＨおよびＶｐｒ５２〜９６（１μＭ）を添加した後で行われた呼吸測定。軌跡に沿った数字は、１分あたり１ｍｇのタンパク質について消費されたＯ２のｎｍｏｌである。Ｖｐｒにより刺激されたＮＡＤＨ非依存性のＯ２消費がロテノンに対して完全に感受性であったことに留意すること。
【図５Ｂ】
図５は内側対外側のミトコンドリア膜透過化を示す。
Ｂ．ＮＡＤＨに対するＶｐｒ５２〜９６誘導の内膜透過化の速度論、および低下したシトクロームｃに対する外膜透過化の速度論。酸素消費が、２ｍＭのＮＡＤＨの存在下（黒四角）でＡの場合（軌跡Ｃ〜Ｄ）のように測定され、そしてシトクロームｃ（１５μＭ）の酸化（白丸）が、記載（Ｒｕｓｔｉｎら、１９９４）のように分光蛍光測定法によって測定された。シトクロームｃ酸化の１００％値は２．５ｍＭのラウリルマルトシドの添加によって測定された。
【図５Ｃ】
図５は内側対外側のミトコンドリア膜透過化を示す。
Ｃ．Ｖｐｒ５２〜９６により誘導されるΔΨｍ喪失およびシトクロームｃ放出の速度論。精製されたミトコンドリアを１μＭのＶｐｒ５２〜９６で処理し、ΔΨｍ感受性蛍光色素ＪＣ−１を使用して、低いΔΨｍを有するミトコンドリアの割合の細胞蛍光測定法による測定に供した。同時に、シトクロームｃがミトコンドリアの上清において免疫検出された。
【図６Ａ】
図６は、ミトコンドリアに対するＶｐｒ作用のＢｃｌ−２媒介の阻害を示す。
Ａ．無傷な細胞において誘導されるＶｐｒ５２〜９６誘導のΔΨｍ消失。ＣＯＳ細胞は、組換えヒトＢｃｌ−２（１０μＭ）、Ｋｏｎｉｇｓポリアニオン（ＰＡ、２μＭ）またはＰＢＳのみが顕微注入され、次いで１μＭのＶｐｒ５２〜９６の非存在下（Ｃｏ．）または存在下で３時間インキュベーションされ、そしてΔΨｍ感受性色素ＪＣ−１（２μＭ；ΔΨｍが高いミトコンドリアの赤色蛍光、ΔΨｍが低いミトコンドリアの緑色蛍光）で染色された。
【図６Ｂ】
図６は、ミトコンドリアに対するＶｐｒ作用のＢｃｌ−２媒介の阻害を示す。
Ｂ．ＮＡＤＨに対してＶｐｒ誘導される内側のＭＭＰに対するＢｃｌ−２の作用。ミトコンドリアは未処理（Ｃｏ．）のままにされるか、またはＢｃｌ−２（０．８μＭ）もしくはＢＡ（１０μＭ）で（１０分）前処理された。精製されたミトコンドリアの酸素消費が、示されるようにコハク酸塩＋ＣＣＣＰまたはＮＡＤＨを添加した後、図５のように測定された。
【図６Ｃ】
図６は、ミトコンドリアに対するＶｐｒ作用のＢｃｌ−２媒介の阻害を示す。
Ｃ．単離されたミトコンドリアに対するＶｐｒの超構造的作用。電子顕微鏡写真は、０．８μＭのＢｃｌ−２または２μＭのＰＡ１０とのプレインキュベーション（５分間）を行った後、３μＭのＶｐｒ５２〜９６と５分間または１５分間にわたってミトコンドリアをインキュベーションした後に得られた。
【図６Ｄ】
図６は、ミトコンドリアに対するＶｐｒ作用のＢｃｌ−２媒介の阻害を示す。
Ｄ．精製されたミトコンドリアにおけるＶｐｒ５２〜９６誘導によるΔΨｍ消失に対するＢｃｌ−２およびＰＡ−１０の作用。単離されたミトコンドリア（２００μｇタンパク質／ｍｌ）を、示された阻害剤（５μＭのＣｓＡ、５０μＭのＢＡ、０．８μＭのＢｃｌ−２、２μＭのＰＡ１０；５分〜１０分）とプレインキュベーションし、洗浄（１０分、６８００ｇ、２０℃）して、ΔΨｍ感受性色素ＪＣ−１（２００ｎＭ、１０分）とインキュベーションし、そしてＶｐｒ５２〜９８（３μＭ、５分）にさらして、蛍光（５７０ｎｍ〜５９５ｎｍ）および粒子サイズ（ＦＳＣ）のフローサイトメトリー測定に供した。数字は、約１０４イベントの中でのＪＣ−１高ミトコンドリアおよびＪＣ−１低ミトコンドリアの割合を示す。
【図６Ｅ】
図６は、ミトコンドリアに対するＶｐｒ作用のＢｃｌ−２媒介の阻害を示す。
Ｅ．種々のＶｐｒ由来ペプチドとインキュベーションした後のＪＣ−１低ミトコンドリアの頻度の定量（Ｘ±ＳＤ、ｎ＝５）。精製されたミトコンドリアを、ＰＴ緩衝液において、Ｂｃｌ−２（０．８μＭ）、Ｂｃｌ−２Δα５／６（０．８μＭ）またはＢＡ（１０μＭ）の存在下または非存在下で１０分間プレインキュベーションし、そしてΔΨｍ感受性色素ＪＣ−１（２００ｎＭ、１０分）とインキュベーションし、その後、３μＭのＶｐｒ５２〜９６（ｗｔ、示されるようなビオチン化体または修飾型）と５分間、または５μＭ〜１０μＭのＶｐｒ１〜９６、Ｖｐｒ１〜５１、Ｖｐｒ７１〜９６、Ｖｐｒ７１〜８２（ｗｔまたは示されるような修飾型）と１０分間インキュベーションし、最後に、Ｄのようにフローサイトメトリー分析に供した。
【図７Ａ】
図７は、Ｖｐｒ５２〜９６がミトコンドリアに結合することに対するＢｃｌ−２およびＰＡ−１０の差のある作用を表す。
Ａ．Ｖｐｒ５２〜９６は、ΔΨｍ喪失を誘導する前にミトコンドリアと結合する。ミトコンドリアは染色されないままにされた（Ｃｏ．における挿入図）か、またはΔΨｍ非感受性ミトコンドリア色素ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）グリーン（７５ｍＭ）に、単独（ＭＴＧ）で、もしくは０．５μＭのＦＩＴＣ−Ｖｐｒ５２〜９５（緑色蛍光）とともに、ΔΨｍ感受性ミトコンドリア色素ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標）レッド（ＣＭＸＲｏｓ；赤色蛍光）と組み合わせてさらされ、その後、フローサイトメトリーによる二色分析が行われた。数字は、それぞれ四連におけるミトコンドリアの割合を示す。
【図７Ｂ】
図７は、Ｖｐｒ５２〜９６がミトコンドリアに結合することに対するＢｃｌ−２およびＰＡ−１０の差のある作用を表す。
Ｂ．Ｂｃｌ−２でなく、ＰＡ−１０が、ミトコンドリアに対するＶｐｒ５２〜９６の結合を阻害する。ミトコンドリアを示された阻害剤と１０分間プレインキュベーションして、ＦＩＴＣ−Ｖｐｒ５２〜９６で標識されたミトコンドリアの割合がＡのように測定される。Ｃ．ビオチン化Ｖｐｒ５２〜９６によるＡＮＴのアフィニティー精製に対するＢｃｌ−２の阻害作用。ミトコンドリアを、示された阻害剤とインキュベーションし、その後、５μＭのビオチン化Ｖｐｒ５２〜９６とともにＲＴで３０分間さらした。ミトコンドリアを、材料および方法に記載されるようにＴｒｉｓ／ＨＣｌとともに、ビオチン化Ｖｐｒ５２〜９６とのインキュベーション後（上段）またはインキュベーション前（下段）に溶解した。そのミトコンドリアリガンドとの複合体を形成したビオチン化Ｖｐｒ５２〜９６がアビジン−アガロースに保持され、ＡＮＴの免疫ブロット検出に供された。
【図７Ｃ】
図７は、Ｖｐｒ５２〜９６がミトコンドリアに結合することに対するＢｃｌ−２およびＰＡ−１０の差のある作用を表す。
【図８Ａ】
図８は、Ｖｐｒ−ＡＮＴ相互作用のＢｃｌ−２媒介による阻害を表す。
Ａ．Ｖｐｒ５２〜９６と精製された天然ＡＮＴとの相互作用のＢｃｌ−２媒介による阻害のプラスモン表面共鳴測定。相互作用は、示された濃度の組換えＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−２Δα５／６または組換えＢｉｄを添加した後に測定された。データ（Ｘ±ＳＤ、ｎ＝３）は図１のように計算された。
【図８Ｂ】
図８は、Ｖｐｒ−ＡＮＴ相互作用のＢｃｌ−２媒介による阻害を表す。
Ｂ．ＶｐｒがＡＮＴプロテオリポソームに結合することに対するＢｃｌ−２の作用。８００ｎＭのＢｃｌ−２または２μＭのＰＡ１０とプレインキュベーションされたＡＮＴプロテオリポソームにおけるＦＩＴＣ標識Ｖｐｒ５２〜９６の保持（Ｘ±ＳＤ、ｎ＝３）が図２Ａのように評価された。
【図８Ｃ】
図８は、Ｖｐｒ−ＡＮＴ相互作用のＢｃｌ−２媒介による阻害を表す。
Ｃ．平面状脂質二重層におけるＶｐｒ−ＡＮＴチャンネルの形成に対するＢｃｌ−２の作用。Ｖｐｒ５２〜９６＋ＡＮＴ＋Ｂａｘ（０．４：１：０．３ｎＭ）およびＶｐｒ５２〜９６＋ＡＮＴ＋Ｂｃｌ−２（０．４：１：１ｎＭ）の単一チャンネル記録（＋７５ｍＶ）ならびに対応する振幅ヒストグラムが示される。Ｖｐｒ５２〜９６＋ＡＮＴ単独に対する対照値は図１ｅ（示されず）の場合と同様である（ｃ、閉鎖、ｏ、開放）。
【図９】
図９はＶｐｒ／ＰＴＰＣ相互作用のモデルを表す。ＶｐｒはＶＤＡＣを通って外膜を横断するが、これは、Ｋｏｅｎｉｇｓポリアニンによって阻害される。Ｖｐｒは、その後、ＡＮＴと相互作用する。Ｂｃｌ−２およびＡＮＴリガンド（ボンクレキン酸塩）は、ＶｐｒがＡＮＴに結合することを阻害し、これに対して、ＣｓＡは、シクロフィリンＤ（Ｃｙｐ−Ｄ）に対するその作用を介してＡＮＴの細孔形成機能に間接的に影響を及ぼす。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004508385.tif 000097
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