(57)【要約】毛の成長および／または毛の密生を調節する方法。本方法は、ＶＥＧＦ活性を調節する段階、例えばＶＥＧＦ遺伝子の発現を調節する段階、ならびに／またはＶＥＧＦタンパク質の産生および／もしくは活性を調節する段階を含み、毛の成長および／または毛の密生を調節する。本方法を、対象における毛の成長または毛の密生の促進あるいは阻害のいずれかのために用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における毛の密生（ｈａｉｒ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）を促進する方法であって、以下の段階を含む方法：
毛の密生の促進が必要である対象を同定する段階；および
対象におけるＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させ、これにより対象における毛の密生を促進する段階。
【請求項２】
ＶＥＧＦポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体を対象に投与することによってＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＶＥＧＦを誘導する化合物を対象に投与することによってＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
化合物がＶＥＧＦの発現を増加させるポリペプチドである、請求項３記載の方法。
【請求項５】
化合物が遷移金属である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
化合物が局所的に投与される、請求項３記載の方法。
【請求項７】
ＶＥＧＦポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列を対象に投与することにより、ＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ＶＥＧＦポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列をケラチノサイトに投与する、請求項７記載の方法。
【請求項９】
ＶＥＧＦポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列を対象から得られた細胞に投与する、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
細胞がケラチノサイトである、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
対象における毛の成長（ｈａｉｒ ｇｒｏｗｔｈ）を促進する方法であって、以下の段階を含む方法：
毛の成長の促進が必要である対象を同定する段階；および
対象におけるＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させ、これにより対象における毛の成長を促進する段階。
【請求項１２】
ＶＥＧＦポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体を対象に投与することによってＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ＶＥＧＦを誘導する化合物を対象に投与することによってＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
化合物がＶＥＧＦの発現を増加させるポリペプチドである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
化合物が遷移金属である、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
化合物が局所的に投与される、請求項１３記載の方法。
【請求項１７】
ＶＥＧＦポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列を対象に投与することにより、ＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる、請求項１１記載の方法。
【請求項１８】
ＶＥＧＦポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列をケラチノサイトに投与する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
ＶＥＧＦポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列を対象から得られた細胞に投与する、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
細胞がケラチノサイトである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
対象における毛の成長または毛の密生を阻害する方法であって、以下の段階を含む方法：
毛の成長または毛の密生の阻害が必要である対象を同定する段階；および
対象におけるＶＥＧＦ活性を減少させ、これにより対象における毛の成長または毛の密生を阻害する段階。
【請求項２２】
ＶＥＧＦを阻害する化合物を対象に投与することによって、ＶＥＧＦ活性を低下させる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
化合物がポリペプチドである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
化合物が、ＶＥＧＦ発現の低下をもたらすヌクレオチド配列である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
化合物が局所的に投与される、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
化合物が抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
対照と比較した対象におけるＶＥＧＦ発現の低下が対象における抜け毛リスクの指標となる、対象が抜け毛（ｈａｉｒ ｌｏｓｓ）のリスクを有するか否かを評価する方法であって、以下の段階を含む方法：
対象から細胞または組織試料を提供する段階；および
対象のＶＥＧＦ遺伝子における発現異常（ｍｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を検出する段階。
【請求項２８】
細胞が毛包（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ）ケラチノサイトである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
毛の成長または毛の密生を調節する化合物を選択する方法であって、以下の段階を含む方法：
被検化合物を提供する段階；および
化合物がＶＥＧＦ活性を調節する場合にはこれが選択される、被検化合物がＶＥＧＦ活性を調節する能力を評価し、これにより毛の成長または毛の密生を調節する化合物を選択する段階。
【請求項３０】
被検化合物がＶＥＧＦ活性を調節する能力を評価する段階が以下の段階を含む、請求項２９記載の方法：
細胞、組織、または対象を提供する段階；
被検化合物で、細胞、組織、または対象を処理する段階；および
対照と比較して細胞、組織、または対象におけるＶＥＧＦ活性のレベルを決定する段階。
【請求項３１】
細胞がケラチノサイトである、請求項３０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
毛包は、休止期（ｔｅｌｏｇｅｎ）から、毛包ケラチノサイトの急速な増殖、および毛幹（ｈａｉｒ ｓｈａｆｔ）の伸長および密生を伴う発育期（ａｎａｇｅｎ）へと終生変化し続ける。発育期の後に、毛包の退化（ｔｅｌｏｇｅｎ）をもたらす退縮期（ｃａｔａｇｅｎ）続き、これは次の発育期の際に既存の毛包に新しい毛幹が生成されるまで続く（Ｈａｒｄｙら（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：５５−６１）。このような周期的変化は、毛包における上皮および真皮の両方の構成要素の急速なリモデリング（ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を伴う。
【０００２】
発明の概要
本発明は、毛包周囲における血管新生の増加が毛の成長を促進する、および毛包ケラチノサイトによるＶＥＧＦの発現によって毛包周囲における血管新生の増加が起こる、という発見に、部分的には基づいている。さらに、ＶＥＧＦの発現レベルを上昇させると、毛の再成長が促進され毛包のサイズが大きくなるり、これにより毛の密生がもたらされることが明らかになった。また、ＶＥＧＦレベルを阻害することにより毛の成長および毛の密生が抑制されうることも見出された。
【０００３】
従って、一局面において、本発明は毛の成長および／または毛の密生を調節する方法を特徴とする。本方法は、ＶＥＧＦタンパク質を調節する段階、例えばＶＥＧＦ遺伝子の発現を調節する段階、ならびに／またはＶＥＧＦタンパク質の産生および／もしくは活性を調節する段階を含み、これにより毛の成長および／または毛の密生を調節する。
【０００４】
別の局面において、本発明は対象における毛の成長を促進する方法を特徴とする。本方法は、ＶＥＧＦ活性を上昇させる段階、例えばＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる段階、例えばＶＥＧＦ遺伝子の発現レベルを上昇させる段階、ならびに／またはＶＥＧＦタンパク質産生および／もしくは活性を上昇させる段階を含み、これにより毛の成長を促進する。
【０００５】
好ましい態様において、ＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる薬剤を投与することによってＶＥＧＦ活性を増加させる。ＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる薬剤は、以下のうち一つまたは複数であることができる：ＶＥＧＦポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体；ＶＥＧＦポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列；ＶＥＧＦ核酸発現を増加させる薬剤、例えば遷移金属イオン、またはＶＥＧＦのプロモーター領域に結合する低分子。
【０００６】
好ましい態様において、ＶＥＧＦポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列を対象の特定の細胞、例えばケラチノサイト、例えば毛包ケラチノサイトに投与する、例えば導入することによってＶＥＧＦを増加させる。ヌクレオチド配列は、ゲノム配列であってもｃＤＮＡ配列であってもよい。ヌクレオチド配列としては、以下のものが含まれる：ＶＥＧＦのコード領域；プロモーター配列（例えばＶＥＧＦ遺伝子または別の遺伝子に由来するプロモーター配列）；エンハンサー配列（例えば、例えばＶＥＧＦ遺伝子または別の遺伝子に由来する５’ＵＴＲなどの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、および、例えばＶＥＧＦ遺伝子または別の遺伝子に由来する３’ＵＴＲなどの３’ＵＴＲ）；ポリアデニル化部位；インシュレーター配列。
【０００７】
別の好ましい態様において、薬剤はＶＥＧＦの発現を増加させる化合物、例えば低分子である。例えば分子は遷移金属イオン、例えばマンガン、コバルト、ニッケル、またはそれらの組合せであってもよい。別の好ましい態様において、薬剤はＶＥＧＦの発現を増加させるＶＥＧＦ以外のポリペプチドである。例えば薬剤は、例えばインターロイキン−１などのサイトカイン、または、例えばトランスフォーミング成長因子α、上皮成長因子などの成長因子であってもよい。
【０００８】
別の好ましい態様において、内在性ＶＥＧＦのコード配列の発現レベルを上昇させることにより、例えばＶＥＧＦのコード配列の転写を上昇させることにより、ＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる。好ましい態様において、内在性ＶＥＧＦ遺伝子の調節配列を変化させることによって、例えば正の調節エレメント（例えば転写活性化因子のエンハンサーまたはＤＮＡ結合部位等）の付加；負の調節エレメント（転写抑制因子に関するＤＮＡ結合部位等）の欠失、および／または、内在性調節配列またはその内部のエレメントの別の遺伝子のものとの置換等によって、ＶＥＧＦ遺伝子の転写を上昇させ、それによりＶＥＧＦ遺伝子のコード領域をより効率的に転写させる。
【０００９】
別の好ましい態様において、本方法は、細胞、例えばＶＥＧＦタンパク質を発現し、好ましくはＶＥＧＦタンパク質を分泌する細胞を対象に導入する段階を含んでもよい。好ましい態様において、細胞はＶＥＧＦタンパク質、その断片もしくは類似体、またはＶＥＧＦのレベルを上昇させるＶＥＧＦ以外のタンパク質を発現するように遺伝的に改変されている。細胞は、自己由来、同種由来、または異種由来の細胞であってもよいが、好ましくは自己由来である。好ましい態様において、細胞は、例えば対象へと導入されるゲルまたは生体適合性のメッシュ内に封入されている。細胞は、任意の細胞型、例えば線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、内皮細胞であってよい。好ましくは、細胞はケラチノサイト、例えば毛包ケラチノサイトである。細胞をＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる目的で対象に導入することができる。
【００１０】
好ましい態様において、例えば薬剤の局所的投与、薬剤の全身投与、薬剤の経口投与、または、好ましくは経皮的もしくは皮下的な、薬剤の注射により、ＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる薬剤を投与する。好ましい態様において、化合物は好適な送達ビヒクル、例えば界面活性剤または皮膚において浸透性を増加させる薬剤、例えばＳＤＳもしくはＤＭＳＯ含有製剤を用いて投与される。好ましくは、薬剤は、局所適用のための組成物に含まれるものであり、例えば組成物はゲル、クリームまたは液剤である。好ましい態様において、薬剤は持続投与により投与される、例えばＶＥＧＦタンパク質レベルに対する効果が決められた期間、例えば１０日、２０日、３０日、５０日、９０日、１８０日、３６５日またはそれ以上、持続するのに十分な頻度で薬剤が投与される。別の好ましい態様において、薬剤投与が繰り返し実施され、例えば少なくとも１回、２回、３回、５回、１０回、２０回またはそれ以上繰り返される。
【００１１】
好ましい態様において、対象の頭皮、対象の顔面において毛の成長が促進され、例えば顎髭および／または口髭等の顔面における毛の成長が促進される。
【００１２】
好ましい態様において、対象の毛量または毛の成長速度は不十分である。好ましい態様において、対象は、遺伝性のはげ（ｂａｌｄｎｅｓｓ）に罹患しているか、毛の成長を低下させるホルモン異常に罹患しているか、例えば放射線照射または化学治療法、もしくは毛の成長を阻害する薬剤等の治療を受けているか、もしくは、毛の成長を必要とする、例えば皮膚移植等の手術を受けている。
【００１３】
別の局面において、本発明は毛の密生を増大させる方法を特徴とする。本方法は、ＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる段階、例えばＶＥＧＦ遺伝子の発現レベルを上昇させる段階、ならびに／またはＶＥＧＦタンパク質の産生および／もしくは活性を増加させ、これにより毛の密生を促進する段階を含む。
【００１４】
好ましい態様において、ＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる薬剤を投与することによってＶＥＧＦ活性を促進する。ＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる薬剤は、以下のうち一つまたは複数であることができる：ＶＥＧＦポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体；ＶＥＧＦポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列；ＶＥＧＦ核酸発現を増加させる薬剤、例えば遷移金属イオン、またはＶＥＧＦのプロモーター領域に結合する低分子。
【００１５】
好ましい態様において、ＶＥＧＦポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列を対象の特定の細胞、例えばケラチノサイト、例えば毛包ケラチノサイトに投与する、例えば導入することによってＶＥＧＦを増加させる。ヌクレオチド配列は、ゲノム配列であってもｃＤＮＡ配列であってもよい。ヌクレオチド配列としては、以下のものが含まれる：ＶＥＧＦのコード領域；プロモーター配列（例えばＶＥＧＦ遺伝子または別の遺伝子に由来するプロモーター配列）；エンハンサー配列（例えば、例えばＶＥＧＦ遺伝子または別の遺伝子に由来する５’ＵＴＲなどの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、および、例えばＶＥＧＦ遺伝子または別の遺伝子に由来する３’ＵＴＲなどの３’ＵＴＲ）；ポリアデニル化部位；インシュレーター配列。
【００１６】
好ましい態様において、薬剤はＶＥＧＦの発現を増加させる化合物、例えば低分子である。例えば分子は遷移金属イオン、例えばマンガン、コバルト、ニッケル、もしくはそれらの組合せ、または反応性酸素種の誘導物質であってもよい。別の好ましい態様において、薬剤はＶＥＧＦの発現を増加させるＶＥＧＦ以外のポリペプチドである。例えば薬剤は、例えばインターロイキン−１などのサイトカイン、または、例えばトランスフォーミング成長因子α、上皮成長因子などの成長因子であってもよい。
【００１７】
別の好ましい態様において、内在性ＶＥＧＦ遺伝子の発現レベルを上昇させることにより、例えばＶＥＧＦ遺伝子の転写を上昇させることにより、ＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる。好ましい態様において、内在性ＶＥＧＦ遺伝子の調節配列を変化させることによって、例えば正の調節エレメント（例えば転写活性化因子のエンハンサーまたはＤＮＡ結合部位等）の付加；負の調節エレメント（転写抑制因子に関するＤＮＡ結合部位等）の欠失、および／または、内在性調節配列またはその内部のエレメントの別の遺伝子のものとの置換等によって、ＶＥＧＦ遺伝子の転写を上昇させ、それによりＶＥＧＦ遺伝子のコード領域をより効率的に転写させる。
【００１８】
別の好ましい態様において、本方法は、細胞、例えばＶＥＧＦタンパク質を発現し、好ましくはＶＥＧＦタンパク質を分泌する細胞を対象に導入する段階を含んでもよい。好ましい態様において、細胞はＶＥＧＦタンパク質、またはその断片もしくは類似体を発現するように遺伝的に改変されている。細胞は、自己由来、同種由来、または異種由来の細胞であってもよいが、好ましくは自己由来である。細胞は、任意の細胞型、例えば線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、内皮細胞であってよい。細胞は、例えばゲルまたは生体適合性のメッシュ内に封入されている。好ましくは、細胞はケラチノサイト、例えば毛包ケラチノサイトである。細胞をＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる目的で対象に導入することができる。
【００１９】
好ましい態様において、例えば薬剤の局所的投与、薬剤の全身投与、薬剤の経口投与、または、好ましくは経皮的もしくは皮下的な、薬剤の注射により、ＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させる薬剤を投与する。好ましい態様において、化合物は好適な送達ビヒクル、例えば界面活性剤または皮膚において浸透性を増加させる薬剤、例えばＳＤＳもしくはＤＭＳＯ含有製剤を用いて投与される。好ましくは、薬剤は、局所適用のための組成物に含まれるものであり、例えば組成物はゲル、クリームまたは液剤である。好ましい態様において、薬剤は持続投与により投与される、例えばＶＥＧＦタンパク質レベルに対する効果が決められた期間、例えば１０日、２０日、３０日、５０日、９０日、１８０日、３６５日またはそれ以上、持続するのに十分な頻度で薬剤が投与される。別の好ましい態様において、薬剤投与が繰り返し実施され、例えば少なくとも１回、２回、３回、５回、１０回、２０回またはそれ以上繰り返される。
【００２０】
好ましい態様において、対象の頭皮、対象の顔面、例えば顎髭および／または口髭において毛の密生が促進される。
【００２１】
好ましい態様において、対象の毛質は細くて柔らかく、量が不十分であり、かつ毛の成長速度が不十分である。
【００２２】
別の局面において、本発明は対象における毛の成長を阻害する方法を特徴とする。本方法は、対象におけるＶＥＧＦの活性レベルを阻害する段階、例えばＶＥＧＦタンパク質のレベルを阻害する段階、ＶＥＧＦ遺伝子の発現レベルを減少させる段階、ならびに／またはＶＥＧＦタンパク質産生および／もしくは活性を低下させる段階を含む。
【００２３】
好ましい態様において、ＶＥＧＦを阻害する薬剤を投与することによってＶＥＧＦを阻害する。ＶＥＧＦを阻害する薬剤は、以下のうち一つまたは複数であることができる：細胞性ＶＥＧＦ核酸配列に結合できるＶＥＧＦ核酸分子（例えばｍＲＮＡ）およびタンパク質の発現を阻害できるＶＥＧＦ核酸分子（例えばアンチセンス分子またはＶＥＧＦリボザイム）；ＶＥＧＦタンパク質に特異的に結合する抗体、例えばＶＥＧＦの本来の細胞性標的への結合能を消失させる抗体；ＶＥＧＦ遺伝子の発現を低下させる薬剤、例えばＶＥＧＦのプロモーターに結合する低分子。
【００２４】
別の好ましい態様において、内在性のＶＥＧＦ遺伝子の発現レベルを低下させる（例えばＶＥＧＦ遺伝子の転写を低下させる）ことによって、ＶＥＧＦ活性を阻害する。好ましい態様において、内在性ＶＥＧＦ遺伝子の調節配列を変化させる、例えば負の調節配列（転写リプレッサーに対するＤＮＡ結合部位等）を付加することによって、ＶＥＧＦ遺伝子の転写を低下させることができる。
【００２５】
別の好ましい態様において、薬剤はＶＥＧＦを阻害することが分かっている化合物であり、例えば低分子、例えば遷移金属である。
【００２６】
好ましい態様において、例えば薬剤の局所的投与、薬剤の全身投与、薬剤の経口投与、または、好ましくは経皮的もしくは皮下的な、薬剤の注射により、ＶＥＧＦ発現を阻害する薬剤を投与する。好ましい態様において、化合物は好適な送達ビヒクル、例えば界面活性剤または皮膚において浸透性を増加させる薬剤、例えばＳＤＳもしくはＤＭＳＯ含有製剤を用いて投与される。好ましくは、薬剤は、局所適用のための組成物に含まれるものであり、例えば組成物はゲル、クリームまたは液剤である。好ましい態様において、薬剤は持続投与により投与される、例えばＶＥＧＦタンパク質レベルに対する効果が決められた期間、例えば１０日、２０日、３０日、５０日、９０日、１８０日、３６５日またはそれ以上、持続するのに十分な頻度で薬剤が投与される。別の好ましい態様において、薬剤投与が繰り返し実施され、例えば少なくとも１回、２回、３回、５回、１０回、２０回またはそれ以上繰り返される。
【００２７】
好ましい態様において、対象の頭皮、対象の顔面において毛の成長が阻害され、例えば顎髭および／または口髭または眉毛等の顔面における毛の成長が阻害され、対象の体毛の成長が阻害される。例えば対象の背部、脚部、胸部、腋窩における毛の成長が阻害される。
【００２８】
好ましい態様において、本方法はさらに、例えば引き抜き、剃毛または脱毛剤の塗布による毛の除去を含む。好ましい態様において、ＶＥＧＦの発現の阻害に続いてまたは同時に、毛を除去する。好ましくは、ＶＥＧＦの発現を阻害する前に、毛を除去する。
【００２９】
別の局面において、本発明は毛の密生を減少させる方法を特徴とする。本方法は、対象におけるＶＥＧＦタンパク質のレベルを阻害する段階、例えばＶＥＧＦ遺伝子発現のレベルを減少させる段階、ならびに／またはＶＥＧＦタンパク質の産生および／もしくは活性を低下させる段階を含む。
【００３０】
好ましい態様において、ＶＥＧＦを阻害する薬剤を投与することによってＶＥＧＦを阻害する。ＶＥＧＦを阻害する薬剤は、以下のうち一つまたは複数であることができる：細胞性ＶＥＧＦ核酸配列に結合できるＶＥＧＦ核酸分子（例えばｍＲＮＡ）およびタンパク質の発現を阻害できるＶＥＧＦ核酸分子（例えばアンチセンス分子またはＶＥＧＦリボザイム）；ＶＥＧＦタンパク質に特異的に結合する抗体、例えばＶＥＧＦの本来の細胞性標的への結合能を消失させる抗体；ＶＥＧＦ遺伝子の発現を低下させる薬剤、例えばＶＥＧＦのプロモーターに結合する低分子。
【００３１】
別の好ましい態様において、内在性のＶＥＧＦ遺伝子の発現レベルを低下させる（例えばＶＥＧＦ遺伝子の転写を低下させる）ことによって、ＶＥＧＦを阻害する。好ましい態様において、内在性ＶＥＧＦ遺伝子の調節配列を変化させる、例えば負の調節配列（転写リプレッサーに対するＤＮＡ結合部位等）を付加することによって、ＶＥＧＦ遺伝子の転写を低下させることができる。
【００３２】
別の好ましい態様において、薬剤はＶＥＧＦを阻害することが分かっている化合物、例えば低分子である。
【００３３】
好ましい態様において、例えば薬剤の局所的投与、薬剤の全身投与、薬剤の経口投与、または、好ましくは経皮的もしくは皮下的な、薬剤の注射により、ＶＥＧＦ発現を阻害する薬剤を投与する。好ましい態様において、化合物は好適な送達ビヒクル、例えば界面活性剤または皮膚において浸透性を増加させる薬剤、例えばＳＤＳもしくはＤＭＳＯ含有製剤を用いて投与される。好ましくは、薬剤は、局所適用のための組成物に含まれるものであり、例えば組成物はゲル、クリームまたは液剤である。好ましい態様において、薬剤は持続投与により投与される、例えばＶＥＧＦタンパク質レベルに対する効果が決められた期間、例えば１０日、２０日、３０日、５０日、９０日、１８０日、３６５日またはそれ以上、持続するのに十分な頻度で薬剤が投与される。別の好ましい態様において、薬剤投与が繰り返し実施され、例えば少なくとも１回、２回、３回、５回、１０回、２０回またはそれ以上繰り返される。
【００３４】
好ましい態様において、対象の頭皮、対象の顔面、例えば顎髭および／または口髭または眉毛、対象の全身、例えば対象の背部、脚部、胸部、腋窩等において、毛の密生が減少される。
【００３５】
好ましい態様において、本方法はさらに、例えば引き抜き、剃毛または脱毛剤の塗布による毛の除去を含む。好ましい態様において、ＶＥＧＦの発現の阻害に続いてまたは同時に、毛を除去する。好ましくは、ＶＥＧＦの発現を阻害する前に、毛を除去する。
【００３６】
別の局面において、本発明は対象における毛の成長／抜け毛の状態を評価する方法を特徴とする。本方法は、ＶＥＧＦ遺伝子における遺伝的病変の有無を評価する段階、例えば検出する段階、または、ＶＥＧＦ遺伝子の発現異常を評価する段階、例えば検出する段階を含む。
【００３７】
一態様において、本方法は対象が抜け毛のリスクを有するか否かを評価する段階を含む。本方法は、ＶＥＧＦ遺伝子における遺伝的病変を評価する段階、例えば検出する段階、または、ＶＥＧＦ遺伝子の不十分な発現レベル（ｕｎｄｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を評価する段階、例えば検出する段階を含み、これにより対象が抜け毛リスクを有するかどうかを判定する。
【００３８】
好ましい態様において、本方法は、対象から得た細胞試料において、遺伝的病変の有無を、例えばＶＥＧＦタンパク質をコードする遺伝子における突然変異を評価する段階を含む。遺伝的病変の存在は、対象における抜け毛リスクの指標である。細胞試料は任意の細胞型、例えば線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、リンパ球、骨髄細胞、および筋細胞であってよい。
【００３９】
別の好ましい態様において、本方法は、対象の細胞試料（例えばケラチノサイト、例えば毛包ケラチノサイトの試料）において、ＶＥＧＦの発現レベルの低下を評価して不十分な発現を判定する段階を含む。ＶＥＧＦの不十分な発現は抜け毛リスクの指標となり得る。
【００４０】
好ましい態様において、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な核酸プローブ（例えば標識プローブ）を試料に接触させることによって、遺伝的病変を評価する。別の好ましい態様において、ＶＥＧＦタンパク質に結合可能な抗体、例えば標識抗体を用いて、ＶＥＧＦの発現を評価する。
【００４１】
別の態様において、本方法は対象における毛の成長を評価する段階を含む。本方法は、ＶＥＧＦ遺伝子における遺伝的病変の有無を評価する段階、例えば検出する段階、または、ＶＥＧＦ遺伝子の過剰発現を評価する段階、例えば検出する段階を含み、これにより対象において毛の成長の可能性があるかどうかを評価する。
【００４２】
好ましい態様において、本方法は、対象から得た細胞試料において、遺伝的病変の有無を、例えばＶＥＧＦタンパク質をコードする遺伝子における突然変異を評価する段階を含む。遺伝的病変が存在しないことは、毛の成長の可能性の指標でありうる。細胞試料は任意の細胞型、例えば線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、リンパ球、骨髄細胞、および筋細胞であってよい。
【００４３】
別の好ましい態様において、本方法は、対象の細胞試料（例えばケラチノサイト、例えば毛包ケラチノサイトの試料）において、ＶＥＧＦの発現レベルの低下を評価して不十分な発現を判定する段階を含む。ＶＥＧＦの通常レベルの発現および過剰発現は毛の成長の可能性の指標となり得る。
【００４４】
好ましい態様において、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な核酸プローブ（例えば標識プローブ）を試料に接触させることによって、遺伝的病変を評価する。別の好ましい態様において、ＶＥＧＦタンパク質に結合可能な抗体、例えば標識抗体を用いて、ＶＥＧＦの発現を評価する。
【００４５】
別の局面において、本発明はケラチノサイトが対象において毛の成長または抜け毛を誘導する能力を評価する方法を特徴とする。本方法は、ＶＥＧＦ遺伝子における遺伝的病変の有無を評価する段階、例えば検出する段階、またはＶＥＧＦ遺伝子の発現異常を評価する段階、例えば検出する段階を含む。
【００４６】
好ましい態様において、ケラチノサイトをインビトロで評価する。
【００４７】
一態様において、本方法はケラチノサイトの抜け毛を誘導する能力を評価する段階を含む。本方法は、ＶＥＧＦ遺伝子における遺伝的病変を評価する段階、例えば検出する段階、または、ＶＥＧＦ遺伝子の不十分な発現レベルを評価する段階、例えば検出する段階を含む。
【００４８】
好ましい態様において、本方法はケラチノサイト、例えば毛包ケラチノサイトの試料を、遺伝的病変の有無、例えばＶＥＧＦタンパク質をコードする遺伝子における突然変異の有無について評価する段階を含む。遺伝的病変の存在は対象における抜け毛リスクの指標となる。
【００４９】
別の好ましい態様において、本方法は、対象のケラチノサイト、例えば毛包ケラチノサイトの試料を、ＶＥＧＦの発現レベルについて評価し、不十分な発現レベルを判定する段階を含む。ＶＥＧＦの不十分な発現レベルは抜け毛リスクの指標となる。
【００５０】
好ましい態様において、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な核酸プローブ（例えば標識プローブ）を試料に接触させることによって、遺伝的病変を評価する。別の好ましい態様において、ＶＥＧＦタンパク質に結合可能な抗体、例えば標識抗体を用いて、ＶＥＧＦの発現を評価する。
【００５１】
別の態様において、本方法は、ケラチノサイトが毛の成長を誘導する能力を評価する段階を含む。本方法は、ＶＥＧＦ遺伝子における遺伝的病変の有無を評価する段階、例えば検出する段階、またはＶＥＧＦ遺伝子の過剰発現を評価する段階、例えば検出する段階を含む。
【００５２】
好ましい態様において、本方法は、対象由来のケラチノサイト、例えば毛包ケラチノサイトの試料において、遺伝的病変の有無、例えばＶＥＧＦタンパク質をコードする遺伝子における突然変異について評価する段階を含む。遺伝的病変が無いことは毛の成長の可能性の指標となる。
【００５３】
別の好ましい態様において、本方法は、対象のケラチノサイト、例えば毛包ケラチノサイトの試料を、ＶＥＧＦの発現レベルについて評価する段階を含み、発現を判定する。ＶＥＧＦの正常レベルの発現、またはＶＥＧＦの過剰発現は、毛の成長の可能性の指標となる。
【００５４】
好ましい態様において、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡにハイブリダイズ可能な核酸プローブ（例えば標識プローブ）を試料に接触させることによって、遺伝的病変を評価する。別の好ましい態様において、ＶＥＧＦタンパク質に結合可能な抗体、例えば標識抗体を用いて、ＶＥＧＦの発現を評価する。
【００５５】
別の局面において、本発明は、候補化合物を評価する方法を特徴とする。本方法は、毛の成長および／または密生を調節するために利用できる化合物、例えばＶＥＧＦポリペプチド、またはその断片または類似体の同定に有用である。例えばＶＥＧＦ遺伝子の発現、またはＶＥＧＦタンパク質の活性を増加させることにより、化合物がＶＥＧＦ活性を増強する能力を、本方法により評価することができる。本方法は、細胞、組織、または対象を提供する段階、候補化合物で細胞もしくは組織、または対象を処理する段階、およびＶＥＧＦ ＲＮＡ、ＶＥＧＦ ＤＮＡまたはＶＥＧＦタンパク質のレベルを決定する段階を含む。本方法は、例えば候補化合物で処理されていない同一の細胞などの対照の細胞、組織または対象を評価する段階をさらに含んでもよい。化合物で処理した細胞、組織または対象におけるＶＥＧＦ活性量の増加を対照と比較して、有用化合物（例えば毛の成長および／または密生の増大に有用な化合物）の指標とする。
【００５６】
好ましい態様において、化合物はＶＥＧＦの断片、または類似体である。
【００５７】
好ましい態様において、細胞はケラチノサイト、例えば毛包ケラチノサイトである。
【００５８】
また本発明は、ＶＥＧＦタンパク質と相互作用する化合物を同定する方法を特徴とする。好ましい態様において、本方法は、化合物がＶＥＧＦタンパク質と結合して複合体を形成するのを可能にする条件下でＶＥＧＦタンパク質を化合物と接触させる段階、および複合体中の化合物の存在により化合物のＶＥＧＦタンパク質への結合能が示されるようなＶＥＧＦタンパク質と化合物との複合体形成を検出する段階を含みうる。このような方法を用いれば、例えば毛の成長および／または毛の密生を調節する、例えば促進または阻害する化合物を同定できる。化合物または薬剤を同定する方法を、例えば無細胞アッセイ系を用いて実施することができる。例えばＶＥＧＦが基質に結合するのを可能にする融合タンパク質、例えばグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／ＶＥＧＦ融合タンパク質を用いて、ＶＥＧＦを適当な基質、例えばグルタチオンセファロースビーズまたはグルタチオンをコーティングしたマイクロタイタープレートに固定化することができる。
【００５９】
好ましい態様において、化合物はＶＥＧＦの断片、または類似体である。
【００６０】
好ましい態様において、化合物は遷移金属イオンである。
【００６１】
好ましい態様において、本方法は、細胞、組織、または対象を提供する段階、同定した化合物で細胞もしくは組織、または対象を処理する段階、ＶＥＧＦ ＲＮＡ、ＶＥＧＦ ＤＮＡまたはＶＥＧＦタンパク質のレベルを決定する段階をさらに含む。好ましい態様において、細胞は、ケラチノサイト、例えば毛包ケラチノサイトである。
【００６２】
別の態様において、ＶＥＧＦタンパク質と相互作用する化合物を細胞系アッセイ法によって同定することができる。これらの方法は、ＶＥＧＦの生物活性を促進する能力に基づいて化合物を同定する段階を含む。好ましい態様において、化合物はＶＥＧＦの生物活性を調節する。例えば化合物は毛包周囲における血管新生を調節する。好ましい態様において、化合物はＶＥＧＦの断片、または類似体である。
【００６３】
別の局面において、本発明はＶＥＧＦ核酸発現を高める化合物を同定する方法を特徴とする。好ましい態様において、核酸の発現を、ＶＥＧＦ核酸分子（例えばＶＥＧＦ ｍＲＮＡ）にハイブリダイズ可能な核酸プローブ（例えば標識プローブ）を用いて評価することができる。別の好ましい態様において、ＶＥＧＦ核酸発現、例えばＤＮＡの発現を、化合物をＶＥＧＦ核酸分子、例えばＶＥＧＦ核酸分子の調節配列に接触させ、かつインビトロまたはインビボでのＶＥＧＦの転写を評価することによって評価できる。例えば、例えば抗体（例えば標識抗体）を用いてＶＥＧＦタンパク質の産生を検出することにより、または、例えばＶＥＧＦの調節配列と融合されたマーカー遺伝子（例えばｌａｃＺ遺伝子または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子）を用いて細胞活性を決定し、マーカーの産生を追跡することにより、ＶＥＧＦの転写を評価することが可能である。
【００６４】
好ましい態様において、化合物はＶＥＧＦの断片、または類似体である。
【００６５】
好ましい態様において、化合物は遷移金属イオンである。
【００６６】
好ましい態様において、細胞、例えばケラチノサイト、例えば毛包ケラチノサイトにおけるＶＥＧＦの転写を評価する。
【００６７】
本明細書に記載されている「治療」とは、任意の治療的処理を含み、例えば治療用薬剤または物質、例えば医薬品の投与を含む。
【００６８】
本明細書に記載されている「対象」という用語は、動物、例えば哺乳動物、例えばヒトを指す。哺乳動物はヒトでも非ヒト哺乳動物でもよく、例えばブタ、トリ、ネコ、イヌ、サル、ヤギ、または齧歯類、例えばラット、またはマウスが挙げられる。対象は、トランスジェニック動物、例えばトランスジェニック齧歯類、例えばトランスジェニックラットまたはマウスでもよい。
【００６９】
「調節配列」とは、遺伝子発現を制御するいずれかの、または全てのＤＮＡ配列を指す。調節配列の例としては、プロモーター、正の制御配列エレメント（例えば転写活性化因子のエンハンサーまたはＤＮＡ結合部位等）、負の調節エレメント（転写抑制に関するＤＮＡ結合部位等）、および、インシュレーターが挙げられる。
【００７０】
「異種性」とは、異なる種に由来するＤＮＡまたは組織を指す。
【００７１】
「異種性調節配列」とは、遺伝子の通常の調節配列ではない配列を指す。
【００７２】
本明細書に記載されている「異常発現」とは、ＲＮＡレベルまたはタンパク質レベルでの非野生型の遺伝子発現パターンを表し、以下を含む：非野生型レベルの発現（すなわち、過剰発現または不十分発現）；遺伝子が発現する時間またはステージに関して野生型とは異なる発現パターン（例えばあらかじめ決定された発生時期またはステージにおける（野生型と比較した）発現の増加または減少）；あらかじめ決定された細胞の種類または組織の種類において（野生型と比較して）低発現である点で野生型とは異なる発現パターン；発現したポリペプチドのスプライシングサイズ、アミノ酸配列、翻訳後修飾、または生物活性に関して野生型とは異なる発現パターン；環境刺激または細胞外刺激が遺伝子発現に与える効果に関して野生型とは異なる発現パターン、例えば増加または減少した刺激強度の存在下で（野生型と比較して）増加または減少した発現パターン。
【００７３】
本明細書において「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は互換的に用いられる。
【００７４】
本明細書に記載されている「低分子」という用語は、分子量２，０００未満、好ましくは１，０００未満の、ペプチド、ペプチド模倣物、または、有機分子などの非ペプチド化合物を含む。
【００７５】
本発明のその他の特徴および利点については、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであると考えられる。
【００７６】
本発明は、毛包ケラチノサイトが適切なタイミングでＶＥＧＦを発現することにより、毛包が急速かつ活発な代謝を達成し、これによって毛包周囲における血管新生の増加を惹起させる機構を提供するとの発見に、部分的には基づいている。
【００７７】
毛包は、急速なサイズと形態の周期的変化によって特徴付けられる。マウスの毛周期では、発育期（ａｎａｇｅｎ）に毛包周囲における新生血管の劇的な増加がみられ、その後、退縮期（ｃａｔａｇｅｎ）および休止期（ｔｅｌｏｇｅｎ）には血管新生は完全に退化する。毛包周囲の血管形成は、毛包ケラチノサイトによる血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）のｍＲＮＡ発現の顕著な上方制御と時間的空間的に相関する。トランスジェニックマウスの毛包における部位特異的なＶＥＧＦの過剰発現は、毛包周囲における血管新生を強く誘導し、抜け毛後の毛の成長を促進し、毛包サイズを増加させた。逆に、抗ＶＥＧＦ中和抗体を全身投与してＶＥＧＦを遮断すると、毛の成長遅延、さらには毛包サイズの低下がみられた。これらの結果は、血管新生の改善により毛の成長、および毛包サイズの増加が促進される、およびＶＥＧＦの過剰発現、例えばケラチノサイトにおけるＶＥＧＦの部位特異的過剰発現によって血管形成を改善することが可能であることを示している。
【００７８】
毛包の発達と周期に関する形態形成分析
生後の毛包の正常発達および背部皮膚の切片を用いた、脱毛により誘導された成体毛に関する形態計測学的コンピューター分析により、血管形成が初めて研究された（Ｓｔｒｅｉｔら（１９９９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６：１４８８８−１４８９３を参照のこと）。生後の毛周期を調べるために、生後１日目、３日目、４日目、８日目、１２日目、１８日目および２２日目のＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）を屠殺した。背部皮膚を椎骨傍線と平行に採取し、皮膚試料を液体窒素で急速凍結するか、またはデトマー（Ｄｅｔｍａｒ）ら（１９９８）のＪ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １１１：１−６に記載の方法で４％のパラフォルムアルデヒドで固定した。パウス（Ｐａｕｓ）らの（１９９０）Ｂｒ． Ｊ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １２２：７７７−７８４に記載に従って、８週齢の雌マウスの背部皮膚を脱毛処理して毛周期を誘導した。これによって発育期毛包の発達を同期させた。上記と同一時期に組織を採取した。
【００７９】
背部切片の染色には、ＰＥＣＡＭ−１（ＣＤ３１）、およびデジャマ（Ｄｅｊａｎａ）ら（１９９５）ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９：９１０−９１８に記載の内皮接着分子（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）を用い、発育早期から休止期までのマウスの毛周期を網羅する２２日間にわたって切片を作製した。簡単に述べると、ＣＤ３１の免疫組織化学的染色は、Ｓｔｒｅｉｔら（上記）の方法により５μｍの凍結切片をラット抗マウスＣＤ３１モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて染色した。各時期について３匹のマウスから代表的切片を得て、顕微鏡ニコンＥ６００（ニコン）で分析した。画像はスポットデジタルカメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で撮像し、形態計測学的分析にはＩＰ−ＬＡＢソフトウェア（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）を用いた。各々の切片について異なる三カ所の視野を６０倍の拡大率で調べ、個々の毛包の距離が３０μｍの領域内で、平方ミリメーター当たりの血管数、平均血管サイズおよび血管が占める相対面積をＳｔｒｅｉｔら（上記）の方法で決定した。
【００８０】
図１に示すように、成獣の毛周期における発育期では、毛包周囲における血管サイズに関し劇的な４倍を越える増加が観察された。これは退縮期および休止期では発育期前のサイズにまで完全に減少した。毛包周囲領域における血管の占有率は、発育期には４．１％から１５．９％まで増加したが、休止期では２．９％まで低下した。生後の正常な体毛発達の場合にも、同様のデータが得られた。これらの結果から、雌の生殖系に加えて、成獣体毛の毛包が血管形成の生理学的調節に関する研究が可能な第二の器官と見なされている（Ｌｒｕｅｌａ−Ａｒｉｓｐｅら（１９９７）ＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓおよびＨａｅｍｏｓｔａｓｉｓ ７８：６７２−６７７）。血管の全量が４倍を越えて増加した後、血管形成は完全に退化するのは２２日という短い期間であり、そのため血管形成を対照する分子機構の研究におけるモデル系として、毛周期は最適である。
【００８１】
血管形成と毛包サイズおよび毛の密生の関係
次に、発育期に観察される血管リモデリングが毛包サイズまたは表皮、真皮、および皮下組織の毛の密生の増加と時間的に関連するか否かについて調べた。簡単に述べると、新生仔における体毛の発達の研究で得られた組織および誘導による若い時期の毛周期で得られた組織について、５μｍのパラフィン切片でヘマトキシリン・エオシン染色を行った。各々の時期において代表的な５枚の切片を、顕微鏡ニコンＥ６００を使用して分析した。表皮、真皮、および皮下における厚みをデジタル画像からＩＰ−ＬＡＢソフトウェアを用いて測定した。５０個の毛包の長さを測定して個々の毛包から平均長を決定した。長さの測定は各時期で、表皮上限から毛包の最下端までとした。毛根の厚さは最大直径を測定した。
【００８２】
表皮における毛包間の厚さは、１日目から有意に増加し５日目で最大５４．５μｍに達し、その後、発育中期から発育後期にかけて急激に下降し休止期ではさらに減少した。対照的に、真皮および皮下における厚さでは、発育早期から着実に増加し発育後期でピークに達し、退縮期および休止期では下降した。これは、図１に示すように、毛包長および毛根の直径の周期的変化に一致する。毛包長、真皮および皮下（上皮では異なる）での厚さ、および毛包周囲における血管新生の周期的変化の正確な時間的一致は、この刺激が毛周期に関連した、毛包それ自体、または周囲の真皮および皮下組織に由来するが、毛包間の表皮に由来するものではない血管形成を促すことを示唆する。
【００８３】
毛周期の血管形成におけるＶＥＧＦの役割
毛周期の血管形成におけるＶＥＧＦの役割を明らかにするために、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの毛周期における空間的時間的発現パターンをインサイチューハイブリダイゼーションで調べた。簡単に述べると、インサイチューハイブリダイゼーションは、公知の全ＶＥＧＦスプライス変種を認識する３９３ ｂｐのラットＶＥＧＦ ｃＤＮＡ断片から調製した３５Ｓ標識一本鎖アンチセンスおよびセンスＲＮＡプローブを用いて、デトマー（Ｄｅｔｍａｒ）ら（１９９５）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｅｔ． １８０：１１４１−１１４６の方法で５μｍのパラフィン切片により実施した。ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）らの（１９９０）Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １０４：７４４−７４９に記載の方法で、毛包ケラチノサイトの画像上の個々のグレインを計数して、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現を定量した。生検のスコア付けは、陰性（細胞当たりのグレイン数０；スコア＝０）、弱陽性（細胞当たりのグレイン数２〜５；スコア＝１）、中程度の陽性（細胞当たりのグレイン数６〜１０；スコア＝２）、または強陽性（細胞当たりのグレイン数＞１０；スコア＝３）とした。データは最高スコアに対する率（％）で表した。
【００８４】
発育早期（１日目）の毛包または毛包間上皮ケラチノサイトではほとんどＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現が検出されなかったが、発育中期（５〜８日目）の毛包ケラチノサイト、毛包周囲における血管リモデリングが最も盛んな、主に毛包の中心部三分の一ではＶＥＧＦ ｍＲＮＡは高発現であった。対照的に、周囲の真皮、皮下組織、および真皮乳頭細胞ではＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現は、ほとんどあるいは全く検出されなかった。これらの結果は、発育期においてＶＥＧＦの主たる供給源は毛包ケラチノサイトであることを示唆した。ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの周期的発現のレベルを毛包周囲における血管新生の周期的変化と比較した結果、ＶＥＧＦの発現制御は３〜４日間隔の血管の変化に先立っておこり、図２に示すように、発育後期、退縮期および休止期にかけてＶＥＧＦの発現が顕著に減少することが明らかになった。これらの所見は、生後の毛包発達において得られた結果が同一であることにより確認された。これは、脱毛によって誘導された成獣の毛周期における血管形成の増加が脱毛後の創傷応答によるものではないことを示している。従って、毛包のＶＥＧＦ発現と毛包周囲における血管形成における密接な空間的時間的関係は、毛に関連した血管新生の制御にＶＥＧＦが重要な役割を担っていることを強く示唆した。
【００８５】
さらに、ＣＤ３１で染色した切片のデータに関する３次元再構成実験は、毛の成長がリモデリング型の血管形成に関連することを示唆する。このような血管形成では、個々の毛包の数が顕著に増加するよりも、むしろ既存の血管の肥厚と伸長がおこる。
【００８６】
毛の成長および毛包サイズに対するＶＥＧＦの発現のインビボ分析
毛包におけるＶＥＧＦの発現が毛の成長と血管新生を直接促進するか否かを調べるために、トランスジェニックマウスのモデルにおける毛周期について、ケラチン１４のプロモーターカセットを用いて、基底表皮ケラチノサイト、および毛包の外毛根鞘ケラチノサイトにおけるＶＥＧＦの部位特異的過剰発現を調べた。マウスＶＥＧＦ１６４を基底表皮ケラチノサイト、および、毛包の外毛根鞘ケラチノサイトにおいて部位特異的に発現させるケラチン１４のプロモーター発現カセットを用いて、ＶＥＧＦトランスジェニックマウスを作製した。ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの形質上の特徴付けは、以前にデトマー（Ｄｅｔｍａｒ）ら（（１９９８）Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １１１：１−６）が報告している。８週齢のＶＥＧＦトランスジェニックマウス５匹、および野生型の５匹の同腹子について、上記と同様にして誘導した毛周期を調べた。脱毛１０日後、ＶＥＧＦ過剰発現マウスでは、野生型ＦＶＢ同腹子と比較して毛の成長の促進がみられた。１１日後では、この差はさらに顕著になり、ＶＥＧＦトランスジェニックマウスでは毛はより長く太くなった。組織学的分析により、ＶＥＧＦトランスジェニックマウスの毛包は野生型対照より大型であり、毛根レベルで最も顕著であることが分かった。毛包サイズの増加は、主に上皮構成要素の厚みの増加による。図３に示すように、オージェの臨界線のレベルでの毛根の画像解析（毛根の最大直径のレベル）から、ＶＥＧＦトランスジェニックマウスでは３０％よりさらに直径が増加していることが明らかとなった。図２に示すように、ＶＥＧＦを過剰発現する周囲の毛包において、血管サイズおよび全血管量が有意に４０％超の増加を示すことが観察された。さらに、ＶＥＧＦトランスジェニックマウスでは毛幹の直径も増大していた（図４）。これらの所見は、毛の成長促進がＶＥＧＦ媒介性の血管形成によるものであることを強く示唆する。
【００８７】
次に、ＶＥＧＦ媒介性の血管形成が発育期における適切なタイミングでの毛包の生長に必須であるか否かを調べた。まず、成獣Ｃ５７ＢＬ／６マウスを抗ＶＥＧＦ中和抗体で全身的に処理し、第一回目の抗体処理を実施した次の日に、脱毛により毛周期を誘導した。簡単に述べると、８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを脱毛により発育期を誘導した。脱毛の１日前に、８匹のマウス各々に、５０μｇのヤギ抗マウスＶＥＧＦ中和抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、または５０μｇの正常ヤギＩｇＧを腹腔内投与し、その後も週二回投与を行った。マウスを、１、５、８、１２および１８日後に屠殺し、上記と同様に組織を処理した。用いた抗ＶＥＧＦ抗体の中和活性は、モルモットおよびマウスの皮膚におけるＶＥＧＦ誘導性の微小血管の漏れに対する完全阻害能によって確認した。既にセンガー（Ｓｅｎｇｅｒ）らが（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１９：９８３−９８５で報告している方法を用い、マウスおよびモルモットのマイルズアッセイ法を実施した。５０μｇの抗ＶＥＧＦ抗体または５０μｇのヤギＩｇＧを腹腔内投与し、２４時間経過した後、マウスを麻酔しエバンス青（マウス一匹当たりＰＢＳで１％にしたものを１００μｌ；Ｓｉｇｍａ）を尾静脈に注入した。１０分後、マウスＶＥＧＦ１６４（リン酸緩衝性食塩水５０μｌに５０または１００ｎｇ）を背部の皮膚に皮内注射し、タンパク質を結合した色素が注射部位周囲の背部皮膚の内面へ漏れ出るのを、青色スポットとして検出した。モルモットの場合には、５０ｎｇマウスＶＥＧＦ１６４単独、または様々な量の抗ＶＥＧＦ抗体（１．５μｇ、５μｇ、１５μｇ）と予め混合したもの、抗体単独、またはリン酸緩衝性食塩水を皮内注射した。
【００８８】
脱毛後最初の８日間は、抗ＶＥＧＦ処理マウスで可視的には皮膚の状態に差はみられなかった。その後、ＶＥＧＦ抗体処理マウスでは毛の成長が遅延した。１２日後、抗体処理した対照マウスでは完全な毛の成長が起こったが、抗ＶＥＧＦ抗体で処理したマウスでは依然として抜け毛スポットが残っており、全体的に毛の成長が低下していた。組織学的分析によれば、抗ＶＥＧＦ処理マウスにおける発育期の毛包は、毛根の直径が３０％を超える減少を示し、細くなっていた。これは主に、毛包周囲における血管新生が４０％を超える有意な減少を示し、それに伴って毛包上皮の厚みが減少したことによる（図５）。これらのデータから、ＶＥＧＦが媒介する血管形成の阻害が毛の成長遅延、および毛包サイズの顕著な減少を引き起こすことが分かる。
【００８９】
理論に縛られるわけではないが、毛包の急速かつ活発な代謝を可能とする分子機構は、毛包ケラチノサイトによるＶＥＧＦの適切なタイミングでの発現によって達成され、これによって毛包周囲における血管新生の増加が可能になると考えることができる。マウスの毛周期が正確に２２日であり、また実験的に好都合であることから、毛包は血管形成の実験的研究の重要な新規モデル系となる。さらに、毛包ケラチノサイトにおけるＶＥＧＦの部位特異的過剰発現が毛の成長を促進するという所見は、血管形成を誘起することによって毛の成長が促進される証拠を提供する。ＶＥＧＦの阻害により毛の成長が低下し、また毛包サイズも小さくなる事実と共に、これらの所見は、正常な毛の成長がＶＥＧＦ依存性であることを明確に示している。癌その他の疾患について全身性の抗血管形成療法が、ヒトの正常な毛周期および毛包サイズ、または多剤化学療法後の毛の成長を阻害するか否かについては、調べられていない。
【００９０】
毛包における血管新生の低下は、脱毛症が遺伝的素因による毛包の消失または周期消失ではなく微小化を原因とする雄性脱毛症（雄性型抜け毛）を含む抜け毛によって特徴付けられる障害の病理に重要な役割を担っていることが以前から示唆されている（例えばＬｅｖｙ−Ｆｒａｎｋｅｌ（１９３１）Ａｎｎ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １０：３２２−３２７；Ｃｏｒｍｉａら（１９６１）Ａｒｃｈ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． ８４：７７２−７７８を参照のこと）。上記で開示された知見に基づけば、このような障害にも、毛包の血管を増加させる目的の治療法の潜在的な標的となりうるものがあると考えられる。
【００９１】
マウス触毛の器官培養系
触毛パッドは三匹の５週齢の雌Ｃ５７／ＢＬマウスから単離し、７０％エタノールを含むリン酸緩衝性食塩水（ＰＢＳ）中に短時間浸漬した後、１０分間、４００Ｕ／ｍｌペニシリン、４００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１．０μｇ／ｍｌファンギゾン（いずれもＧｉｂｃｏＢＲＬから購入）を含むウィリアムＥ培地でインキュベートした。発育期の触毛の毛包は、顕微鏡下で切り出して単離し、上皮表面にのびている触毛の毛幹部分を切り取った。次に、ミリポア膜上で触毛の毛包をウィリアムＥ培地単独（ｎ＝８）、５０ｎｇ／ｍｌの組換え体マウスＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ｎ＝６）を含む培地、または５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ｎ＝８）を含む培地で培養した。２日後、培地を新鮮な培地で置換し、さらに毛包を培養し、培養期間は全体で４日間であった。４日後、伸びた毛の毛幹長を顕微鏡ニコンＥ６００で撮影したデジタル写真による画像解析で測定した。対照の毛包（毛の平均成長は、１．９６３±０．１０１ｍｍ）とＶＥＧＦ処理した毛包（毛の平均成長は、１．９５９±０．０８６ｍｍ）間において毛幹長に有意な差は無かったが、５％ＦＢＳで培養した毛包では毛幹長に有意な増加がみられた（毛の平均成長は、２．３２７±０．１１５ｍｍ）（ｐ＜０．００ｌ、スチューデントｔ検定）（図６）。このデータによれば、毛の器官培養の条件下では、機能的な血管系の非存在下において、ＶＥＧＦは毛の成長に影響を与えなかった。このことはＶＥＧＦの効果が毛包周囲における血管形成の誘導によるものであることを示唆する。
【００９２】
さらに、上記の方法で触毛の毛包を単離し、培養した。７個の毛包を５μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＶＥＧＦ中和抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で処理し、８個の毛包を５μｇ／ｍｌの正常ヤギＩｇＧで処理した。培養４日後では、抗ＶＥＧＦ処理した毛包（毛の平均成長は、２．００５±０．３８１ｍｍ）と対照のヤギＩｇＧで処理した毛包（毛の平均成長は、２．０５１±０．３９８ｍｍ）間で、毛の成長に有意な差はみられなかった（図６）。このデータによれば、毛の器官培養の条件下では、機能的な血管系の非存在下において、ＶＥＧＦの阻害は毛の成長に影響を与えなかった。
【００９３】
ＶＥＧＦポリペプチドおよびＶＥＧＦをコードする核酸配列
ＶＥＧＦポリペプチドは、ＶＥＧＦの単離または遺伝子工学的方法によるＶＥＧＦをコードする配列の発現等、いくつかの方法で得ることができる。例えばＶＥＧＦを組換えにより産生する方法は、公知であり、例えば欧州特許第０ ４８４ ４０１号、欧州特許第０ ４７１ ７５４号および米国特許第５，３３２，６７１号等に記載がある。各種の生物種に由来するＶＥＧＦタンパク質に対応するヌクレオチド配列は公知である。例えば欧州特許第０ ５０６４７７号、米国特許第５，１９４，５９６号、米国特許第５，３３２，６７１号、米国特許第５，８４０，６９３号、米国特許第５，９２８，９３９号、米国特許第５，９９４，３００号を参照のこと。
【００９４】
ＶＥＧＦの類似体
類似体とは、アミノ酸配列が天然のＶＥＧＦとは異なるもの、または配列以外に相違点があるもの、あるいはその両方を含むものであり得る。配列以外の修飾としては、ＶＥＧＦのインビボまたはインビトロでの化学的修飾を含む。配列以外の修飾としては、アセチル化、メチル化、リン酸化、カルボキシル化、または糖鎖付加等の変化が挙げられる。
【００９５】
好ましい類似体としては、１カ所以上の保存性のアミノ酸置換またはＶＥＧＦの生物活性を消失させない１カ所以上の非保存性のアミノ酸置換、欠失、または挿入によって野生型の配列とは異なる配列を含むＶＥＧＦ（または生物学的に活性なその断片）が挙げられる。保存性置換は、通常、アミノ酸を性質の類似した別のもので置換することであり、例えば以下の基のうちいずれかの置換である：バリン、グリシン；グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。その他の保存性置換に関しては、下記の表に従って選ぶことができる。
【００９６】
【表１】保存的アミノ酸置換
2004500409.tif 000002
【００９７】
本発明の範囲に含まれる他の類似体は、ペプチドの安定性を増加させる修飾を含むものである。このような類似体は、例えばペプチド配列中で１カ所以上の非ペプチド結合（ペプチド結合の代わりに）を含んでいてもよい。また、天然のＬ−アミノ酸以外の残基を含む類似体であってもよい。例えばＤ−アミノ酸または非天然型または合成アミノ酸、例えばβまたはγアミノ酸；および環状類似体であってもよい。
【００９８】
断片および類似体の産生
断片の生成
ＶＢＧＦの各種の断片が公知であり、例えば米国特許第５，９３５，８２０号に記載されている。
【００９９】
タンパク質の断片は、複数の方法、例えば遺伝子組換え、タンパク質分解消化、または化学合成で産生することができる。ポリペプチドの内部または末端の断片は、ポリペプチドをコードする核酸の一方の端（末端の断片を得る）または両端（内部断片を得る）の１残基以上のヌクレオチドを除去することによって調製できる。変異ＤＮＡを発現させることによってポリペプチド断片を産生することができる。従って、「末端を少しずつ減らす（ｅｎｄ−ｎｉｂｂｌｉｎｇ）」エンドヌクレアーゼによる消化では、断片群をコードするＤＮＡを調製することができる。タンパク質断片をコードするＤＮＡは、ランダムな切断、制限酵素消化または上記の方法の組合せによっても調製することができる。
【０１００】
断片は、通常のメリフィールド固相ｆ−Ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学等の当技術分野において公知の技術を利用して化学合成することもできる。例えば本発明のペプチドは断片の重複がない所望の長さを有する任意の断片に分けることができ、また重複を有する所望の長さ断片に分けることもできる。
【０１０１】
類似体の生成：ランダム法による改変ＤＮＡおよびペプチド配列の調製
タンパク質のアミノ酸配列の変種は、タンパク質またはタンパク質の特定ドメインまたは領域をコードするＤＮＡからランダム突然変異誘発法によって調製できる。利用可能な方法としては、ＰＣＲによる突然変異誘発法および飽和突然変異誘発法が挙げられる。縮重オリゴヌクレオチド配列のセットを合成することによって、ランダムなアミノ酸配列の変種ライブラリーを作製することもできる。（変種ライブラリー中のタンパク質のスクリーニング法については、本明細書の別の箇所に記載する。）
【０１０２】
ＰＣＲ突然変異誘発法
ＰＣＲ突然変異誘発法では、正確度の低下したＴａｑ ポリメラーゼを利用して、クローンＤＮＡ断片にランダムな突然変異を導入する（Ｌｅｕｎｇら、１９８９、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １：１１−１５）。この方法は、非常に強力で、比較的迅速にランダムな突然変異を導入することが可能な方法である。突然変異を導入するＤＮＡ領域をＤＮＡ合成の正確度を低下させる条件下でＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。例えばｄＧＴＰ／ｄＡＴＰ比を５とし、Ｍｎ２＋を添加してＰＣＲ反応を実施する。増幅したＤＮＡ断片のプールを適当なクローニングベクターに挿入し、ランダムな変異体のライブラリーを調製する。
【０１０３】
飽和突然変異誘発法
飽和突然変異誘発法では、迅速にクローン化したＤＮＡ断片に単一塩基置換を数多く導入することができる（Ｍａｙｅｒｓら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：２４２）。この技術には、例えばインビトロで一本鎖ＤＮＡを化学的処理する、または照射し、相補的ＤＮＡ鎖を合成することによる突然変異の生成が含まれる。突然変異の頻度は、処理の強度を調節することによって調節可能であり、本質的に可能な塩基をすべて置換することができる。この方法は変異体断片の遺伝的選択を含まないので、中性置換、および機能的に変化したものの両方が得らる。点突然変異の分布において、保存性のエレメントに対するバイアスを有してはいない。
【０１０４】
縮重オリゴヌクレオチド
相同体のライブラリーは、縮重オリゴヌクレオチド配列のセットから調製することもできる。縮重配列の化学合成は自動ＤＮＡ合成機によって実施可能であり、次に合成遺伝子を適当な発現ベクターに連結する。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当技術分野で公知である（例えばＮａｒａｎｇ， ＳＡ （１９８３） Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８１） Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ， Ｐｒｏｃ ３ｒｄ Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ Ｓｙｍｐｏｓ． Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ＡＧ Ｗａｌｔｏｎ編、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ： Ｅｌｓｅｖｉｅｒ ｐｐ２７３−２８９；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４） Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １１：４７７を参照のこと）。このような技術は、他のタンパク質の進化工学でも利用されている（例えばＳｃｏｔｔら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０；Ｒｏｂｅｒｔｓら（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：２４２９−２４３３；Ｄｅｖｌｉｎら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｉａら（１９９０）ＰＮＡＳ ８７： ６３７８−６３８２；および米国特許第５，２２３，４０９号、第５，１９８，３４６号および第５，０９６，８１５号を参照のこと）。
【０１０５】
類似体の生成：部位特異的突然変異誘発法による改変ＤＮＡおよびペプチド配列の調製
非ランダム突然変異誘発法または部位特異的突然変異誘発法を用いて、特定の領域に特異的な配列または変異を導入できる。これらの技術を用いて、例えば既知タンパク質のアミノ酸配列中の残基に欠失、挿入または置換を含む変種を作製することができる。変異部位を個々に改変することも、連続的に改変することもできる。これは、例えば（１）まず、保存性のアミノ酸で置換を行い、次に、得られた結果に応じてさらに性質の異なるアミノ酸を選択する、（２）標的残基を欠失させる、または（３）同一または異なる群に属する残基を当部位の隣接部位に挿入する、または（１）〜（３）の選択肢の組み合わせによって実施する。
【０１０６】
アラニンスキャニング突然変異誘発法
アラニンスキャニング突然変異誘発法は、所望のタンパク質の変異誘発にとって好ましい位置またはドメインの特定残基または領域を同定するために有用な方法である（ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ 、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５、１９８９）。アラニンスキャニング法では、単一残基または標的残基の群を同定し（例えばＡｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、および Ｇｌｕ等の荷電性残基）、中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）で置換する。アミノ酸の置換は、細胞内外における周囲の水和環境とアミノ酸との相互作用に影響を与える。次に、付加的または別の変異を置換部位に導入することにより、置換に対して機能的感受性を示すドメインをさらに絞り込む。このように、アミノ酸配列の変異を導入する部位は前もって決められるが、変異それ自体の性質をあらかじめ決める必要はない。例えば与えられた部位における変異の効果を最適化するために、標的コドンまたは標的領域においてアラニンスキャニング突然変異誘発法またはランダム突然変異誘発法を実施し、発現させた所望のタンパク質サブユニットの変異種をスクリーニングし、所望の活性に最適な組合せを得る。
【０１０７】
オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法
オリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法は、置換、欠失、および挿入ＤＮＡ変異種の調製に用いることができる（例えばＡｄｅｌｍａｎら、ＤＮＡ ２：１８３、１９８３を参照のこと）。簡単に述べると、変異をコードするオリゴヌクレオチドをＤＮＡ鋳型とハイブリダイズさせることにより所望のＤＮＡを改変する。ここで、鋳型は所望のタンパク質の非改変または天然型ＤＮＡ配列を含むプラスミドまたはバクテリオファージ由来の一本鎖である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼを用いて、鋳型の相補的な第二鎖を合成する。このようにして、オリゴヌクレオチドプライマーが組み込まれ、その結果所望のタンパク質のＤＮＡは選択した改変をコードするようになる。通常、長さが少なくとも２５ヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを利用する。最適なオリゴヌクレオチドは、鋳型において変異をコードするヌクレオチドのいずれか一方の側に完全に相補的な１２〜１５ヌクレオチドのヌクレオチドである。これにより、オリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子に対して適切にハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチドは、クレア（Ｃｒｅａ）ら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（１９７８）ＵＳＡ、７５：５７６５）に記載の方法等、当技術分野において公知の技術を利用して容易に合成できる。
【０１０８】
カセット突然変異誘発法
変異種を調製する別の方法としては、カセット突然変異誘発法があり、これは、ウェルズ（Ｗｅｌｌｓ）ら（Ｇｅｎｅ、３４：３１５［１９８５］）が記載の技術に基づくものである。出発材料は、変異を導入するタンパク質サブユニットのＤＮＡを含むプラスミド（またはその他のベクター）である。変異を導入するタンパク質サブユニットのＤＮＡのコドンを決める。選択した変異部位の両側に独自の制限酵素部位が必要である。制限酵素部位がなければ、上記のオリゴヌクレオチド媒介突然変異誘発法を用いて、所望のタンパク質サブユニットをコードするＤＮＡ中の適当な位置に制限酵素部位を導入することもできる。制限酵素部位をプラスミドに導入した後、プラスミドを直鎖状に変換するため、これら制限酵素部位で切断する。制限酵素部位間の所望の変異を含むＤＮＡ配列をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを常法に従い合成する。両鎖を別々に合成し、常法に従い互いにハイブリダイズさせる。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットと呼ぶ。このカセットは、直鎖状プラスミドの末端と３’および５’端で接着可能に設計されており、従ってプラスミドに直接連結することができる。このように、プラスミドは、変異を含む所望のタンパク質サブユニットをコードするＤＮＡ配列を含むことになる。
【０１０９】
組合せ突然変異誘発法
組合せ突然変異誘発法を利用して、変異体を調製することもできる。例えば相同体またはその他の関連タンパク質の群についてアミノ酸配列を並列させ、好ましくは最も相同性が高くなるように並列させる。並列配列中の与えられた位置にあるアミノ酸をすべて選択し、組合せ配列の縮重セットを作製することができる。変異種の多様化ライブラリーを核酸レベルの組合せ突然変異誘発法で作製し、これは多様化遺伝子ライブラリーによってコードされるものである。例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することができ、これによって、可能な配列の縮重セットは個々のペプチドとして発現可能となる、あるいは、縮重配列のセットを含むより大きい融合タンパク質のセットとして発現可能となる。
【０１１０】
ペプチド断片または相同体のライブラリーのスクリーニングに用いる一次ハイスループット法
生成した変異体遺伝子産物をスクリーニングする各種技術は当技術分野で公知である。大規模遺伝子ライブラリーのスクリーニング技術では、複製可能な発現ベクターに遺伝子ライブラリーをクローン化し、得られたライブラリーベクターで適当な細胞を形質転換し、所望の活性、三量体分子への会合、天然リガンドへの結合（例えば受容体または基質）の検出によって、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が比較的容易になる条件下で遺伝子を発現させることが多い。以下に記載の個々の技術を利用すれば、例えばランダム突然変異誘発法で作製された大規模配列スクリーニングのハイスループット分析が可能である。
【０１１１】
ツーハイブリッド系
ツーハイブリッド（相互作用トラップ）アッセイ法を用いて、ＶＥＧＦと相互作用するタンパク質を同定することができる。これらはアゴニスト、スーパーアゴニスト、およびアンタゴニストを含む。（対象タンパク質およびそれが相互作用するタンパク質を餌タンパク質（ｂａｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）および魚タンパク質（ｆｉｓｈ ｐｒｏｔｅｉｎ）として利用する）。これらアッセイ法は、餌タンパク質によるタンパク質−タンパク質相互作用によって媒介される機能性転写活性化因子の再構成を検出することからなる。特に、このアッセイ法では、ハイブリッドタンパク質を発現するキメラ遺伝子を利用する。第一のハイブリッドは、餌タンパク質と融合したＤＮＡ結合ドメインからなる。餌タンパク質としては、例えばＶＥＧＦ分子またはその断片が挙げられる。第二のハイブリッドタンパク質は、「魚」タンパク質と融合した転写活性化ドメインを含む。魚タンパク質としては、例えば発現ライブラリーが挙げられる。魚タンパク質および餌タンパク質が相互作用可能であるときには、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化因子ドメインが互いに隣接する。この隣接により、ＤＮＡ結合ドメインによって認識される転写制御部位と発現可能に連結したレポーター遺伝子の転写が可能となる。検出可能なマーカー遺伝子の発現を用いて餌タンパク質と別のタンパク質との相互作用を評価することができる。
【０１１２】
表出（ｄｉｓｐｌａｙ）ライブラリー
候補ペプチドを細胞またはウイルス粒子の表面に表出させ、特定の細胞またはウイルス粒子の表出産物を介した適当な受容体タンパク質に対する結合能を「パニングアッセイ法」で検出するスクリーニング法もある。例えば遺伝子ライブラリーを菌体の表面膜タンパク質の遺伝子にクローン化し、得られた融合タンパク質をパニングで検出する（Ｌａｄｎｅｒら、ＷＯ ８８／０６６３０；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７１；およびＧｏｗａｒｄら（１９９２）ＴＩＢＳ １８：１３６−１４０）。同様に、検出可能に標識したリガンドを利用し、潜在的に機能を有するペプチド相同体を評価する。蛍光標識リガンド、例えば受容体を用い、リガンド結合活性を保持した相同体を検出することができる。蛍光標識リガンドを利用することにより、細胞を可視的に調べ、蛍光顕微鏡下で分離、または細胞の形態に依存して蛍光セルソーターで分離することもできる。
【０１１３】
遺伝子ライブラリーをウイルス粒子表面に融合タンパク質の形態で発現することが可能である。例えば繊維状ファージの系において、外来性ペプチド配列を、感染性ファージ表面に発現させることができる。これにより重要な恩典が２つ付与される。第一に、ミリリットル当たり１０１３個以上のファージ濃度で親和性マトリックスにファージを添加できるので、多数のファージを一度にスクリーニングできる。第二に、各々の感染性ファージが表面に遺伝子産物を表出しているので、親和性マトリックスから特定のファージを低回収率で回収した場合であっても、以降の感染でファージを増幅することができる。ほとんど同一の大腸菌繊維状ファージからなる群に属する、Ｍ１３、ｆｄ、およびｆｌはファージ表出ライブラリーに最も多用されている。ファージｇＩＩＩまたはｇＶＩＩＩ外殻タンパク質のいずれかを利用して、ウイルス粒子の最終的なパッケージングを阻害することなく融合タンパク質を産生させることができる。外来性エピトープをｐＩＩＩのＮ末端に発現させ、このエピトープをもたない大過剰のファージの中から、このようなエピトープを有するファージを回収する（Ｌａｄｎｅｒら、国際公開公報第ＷＯ９０／０２９０９号；Ｇａｒｒａｒｄら、国際公開公報第ＷＯ９２／０９６９０号；Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１６００７−１６０１０；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；および Ｂａｒｂａｓら（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：４４５７−４４６１）。
【０１１４】
常法では、大腸菌のマルトース受容体（外膜タンパク質、ＬａｍＢ）をペプチド融合パートナーとして利用する（Ｃｈａｒｂｉｔら（１９８６）ＥＭＢＯ ５、３０２９−３０３７）。オリゴヌクレオチドを、ＬａｍＢ 遺伝子をコードするプラスミドに挿入し、タンパク質の細胞外ループの１つに融合したペプチドを産生する。これらペプチドは、例えば抗体等のリガンドへの結合に利用することができ、細胞を動物に投与した場合に免疫応答を惹起することが可能である。他の細胞表面タンパク質、例えばＯｍｐＡ（Ｓｃｈｏｒｒら（１９９１）Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９１、ｐｐ． ３８７−３９２）、ＰｈｏＥ（Ａｇｔｅｒｂｅｒｇら（１９９０）Ｇｅｎｅ ８８、３７−４５）、およびＰＡＬ（Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ ９、１３６９−１３７２）も細菌の大型の表面構造物と同様に、ペプチド表出の担体として利用されている。重合して、細菌間での遺伝情報交換に関わる繊毛を形成するタンパク質であるピリンとペプチドとを融合することもできる（Ｔｈｉｒｙら（１９８９）Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５５、９８４−９９３）。他の細胞と相互作用する機能があるので、線毛はペプチドを細胞外環境に提示するための有用な支持体を提供する。ペプチド表出に利用できる別の大型の表面構造物としては、細菌の移動器官である鞭毛がある。ペプチドをサブユニットタンパク質フラジェリンと融合させることによって、ペプチドを多コピーで高密度に宿主細胞上に配置することができる（Ｋｕｗａｊｉｍａら（１９８８）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ． ６、１０８０−１０８３）。他の細菌の表面タンパク質もペプチド融合パートナーとして用いられている。そのような例としては、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ のプロテインＡおよびＮｅｉｓｓｅｒｉａの外膜プロテアーゼＩｇＡ（Ｈａｎｓｓｏｎら（１９９２） Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７４、４２３９−４２４５ および Ｋｌａｕｓｅｒら（１９９０） ＥＭＢＯＪ． ９、１９９１−１９９９）が挙げられる。
【０１１５】
上記の繊維状ファージ系およびＬａｍＢ系では、表面にペプチドを有する粒子（細胞またはファージ）内部にＤＮＡを保持させることによって、ペプチドとそれをコードするＤＮＡ間の物理的結合を形成させることができる。ペプチドを捕捉することで、粒子とそれに含まれるＤＮＡを捕捉できる。別の方法ではＤＮＡ結合タンパク質ＬａｃＩを利用し、ペプチドとＤＮＡ間に結合を形成させる（Ｃｕｌｌら（１９９２）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９）。この系では、３’端のクローン部位にオリゴヌクレオチドを有するＬａｃＩ遺伝子を含むプラスミドを利用する。アラビノース制御下でＬａｃＩ−ペプチド融合タンパク質を産生する。この融合物は、ＬａｃＩが本来有している、ＬａｃＯオペレーター（ＬａｃＯ）として知られる短いＤＮＡ配列に対して結合能を有している。発現プラスミドＬａｃＯを２コピー配置し、これをコードするプラスミドにＬａｃＩ−ペプチド融合物を強固に結合させる。各々の細胞のプラスミドは単一のオリゴヌクレオチド配列のみを含み、各々の細胞は単一ペプチド配列のみを発現するので、合成を指令するＤＮＡ配列にペプチドが特異的かつ安定に結合する。ライブラリーの細胞を、緩やかに溶解し、ペプチド−ＤＮＡ複合体を受容体固定化マトリックスに接触させて、活性ペプチドを含む複合体を回収する。次に、結合したプラスミドＤＮＡを細胞に導入して増幅し、ＤＮＡヌクレオチド配列を調べてペプチドリガンドの同定を行う。本法の有用性を実際に示すものとして、ドデカペプチドの大規模ランダムライブラリーが作製されており、オピオイドペプチドであるダイノルフィンＢに対するモノクローナル抗体の選択が行われた。一群のペプチドが回収されたが、いずれもダイノルフィンＢの６残基部分に相当するコンセンサス配列に関連があった（Ｃｕｌｌら、（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９−１８６９）。
【０１１６】
この方法は、「プラスミド上のペプチド」と呼ばれることもあり、ファージ表出法とは２つの重要な点で異なる。第一に、ペプチドは融合タンパク質のＣ末端に結合し、その結果、ライブラリーの構成員はカルボキシ末端が自由なペプチドとして表出される。繊維状ファージ外殻タンパク質である、ｐＩＩＩおよびｐＶＩＩＩは、いずれもそれぞれのＣ末端でファージに結合しており、ゲストペプチドは、外側に伸びたＮ末端ドメインに配置される。ファージが表出したペプチドは融合タンパク質のちょうどアミノ末端部に位置するように設計されている場合もある（Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７、６３７８−６３８２）。第二の相違点は、実際にライブラリーに存在するペプチド集団に影響を与える一群の生物学的バイアスである。ＬａｃＩ融合分子は宿主細胞の原形質に閉じこめられる。翻訳中には短い時間ファージの外殻融合物が原形質に接するが、内膜から細胞周辺腔へと急速に分泌される、この場合でもなおＣ末端の疎水性ドメインにより膜に結合したままであり、ペプチドを含むＮ末端は、ファージ粒子が構築されるまで細胞周辺腔へ突出した状態である。ＬａｃＩおよびファージのライブラリーにおけるペプチドの大きな相違点は、異なるタンパク質分解活性に曝されることであると考えられる。ファージの外殻タンパク質は、ファージに組み込まれる前に内膜を通じた輸送とシグナルペプチダーゼによるプロセッシングを必要とする。これらの過程において有害効果を示すためライブラリーにおける存在率が低くなるペプチドもある（Ｇａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７（９）： １２３３−１２５１）。これら特異的なバイアスは、ＬａｃＩ表出系では問題とならない。
【０１１７】
組換え体ランダムライブラリーでは、膨大な数の小型ペプチドが利用可能である。１０７〜１０９種の異なるクローンからなるライブラリーは容易に調製できる。１０１１からなる組換え体ライブラリーも作製されてはいるが、このサイズは事実上クローンライブラリーの上限値に近いものである。このようなライブラリーサイズの限界は、ランダムなセグメントを含むＤＮＡの宿主細菌細胞への形質転換の段階に起因する。この限界を克服するために、ポリソーム複合体に初期ペプチドを表出させるインビトロ系が最近開発された。この表出ライブラリー法では、現在利用可能なファージ／ファージェミドまたはプラスミドライブラリーと比較して３〜６桁程度規模の大きいライブラリーを調製できる可能性がある。さらに、ライブラリー構築、ペプチド発現およびスクリーニングがすべて無細胞系で実施できる。
【０１１８】
この方法のある使用例においては（Ｇａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３７（９）：１２３３−１２５１）、１０１２個のデカペプチドをコードするＤＮＡ分子ライブラリーが構築され、ライブラリーの発現は大腸菌Ｓ３０を利用したインビトロの転写／翻訳複合系で行われる。ｍＲＮＡ上にリボゾームを配置するように選択した条件は、大部分のリボゾームがＲＮＡに蓄積した状態を実現し、初期ペプチドを含む複合体が得られる。ペプチドはこれをコードするＲＮＡに結合したままである。ポリソームは十分強固であるため、この方法と比べより一般的に用いられている組換え体ペプチドの表出ライブラリーのスクリーニングとほぼ同様に、固定化受容体上で親和性による精製が可能である。結合した複合体からＲＮＡを回収し、ｃＤＮＡに変換する。これをＰＣＲで増幅し、次回の合成およびスクリーニングで用いる鋳型を調製する。ポリソーム表出法は、ファージ表出系と組み合わせて用いることもできる。スクリーニングを複数回実施した後、ポリソームの濃縮プールからｃＤＮＡをファージェミドベクターにクローン化する。このベクターは、外殻タンパク質と融合したペプチドを表出するペプチド発現ベクターおよびペプチドの同定に利用するＤＮＡヌクレオチド配列決定用ベクターとして、いずれにも用いることができる。ポリソーム由来のペプチドをファージ上に発現させることにより、この形態のまま親和性選択法をさらに実施する、またはファージＥＬＩＳＡにより個々のクローン上のペプチドを結合活性に関してアッセイする、または競合ファージＥＬＩＳＡにより結合特異性に関してアッセイする、のうちのいずれかを選択することができる（Ｂａｒｒｅｔら（１９９２）Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０４、３５７−３６４）。活性ペプチドの配列を同定するために、ファージェミド宿主が産生したＤＮＡを配列決定する。
【０１１９】
二次スクリーニング
上記のハイスループットなアッセイ法を実施した後、例えば当業者が、アゴニストかアンタゴニストかを識別可能な生物活性についてさらに同定を進める目的で、二次スクリーニングを実施することができる。試験を必要とする所望の活性に応じて、二次スクリーニングの種類は異なる。例えば目的のタンパク質と対応する個々のリガンドとの間の相互作用に対する阻害能を利用して、上記の一次スクリーニングで単離されたペプチド断片群からアンタゴニストを同定可能なアッセイ法を開発することができる。
【０１２０】
このように、断片および類似体を調製する方法、ならびにその活性を試験する方法は、当技術分野で公知である。目的の主たる配列が同定されれば、当業者は常法により断片および類似体を得ることができる。
【０１２１】
ペプチド模倣物
本発明はまた、対象のＶＥＧＦポリペプチドのタンパク質結合ドメインを短くして模倣物（例えばペプチドまたは非ペプチド性薬剤）を調製する方法を提供する。例えば「レチノブラストーマ遺伝子のタンパク質に結合するヒトパピローマウイルスタンパク質に対するペプチド阻害剤」欧州特許第０ ４１２ ７６２号および第０ ０３１ ０８０号を参照のこと。
【０１２２】
重要な残基に関する非加水分解性ペプチド類似体は、以下のいずれかを用いて調製できる。すなわち、ベンゾジアゼピン（例えばＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒらｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： ＣｈｅｍｉｓｔｒｙおよびＢｉｏｌｏｇｙ、Ｇ．Ｒ． Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ： Ｌｅｉｄｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８を参照のこと）、アゼピン（例えばＨｕｆｆｍａｎら ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： ＣｈｅｍｉｓｔｒｙおよびＢｉｏｌｏｇｙ， Ｇ．Ｒ． Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ： Ｌｅｉｄｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８を参照のこと）、置換γラクタム環（Ｇａｒｖｅｙらｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： ＣｈｅｍｉｓｔｒｙおよびＢｉｏｌｏｇｙ， Ｇ．Ｒ． Ｍａｒｓｈａｌｌ編、ＥＳＣＯＭ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ Ｌｅｉｄｅｎ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、１９８８）、ケトメチレン偽ペプチド（Ｅｗｅｎｓｏｎら（１９８６） Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２９：２９５；およびＥｗｅｎｓｏｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： ＳｔｒｕｃｔｕｒｅおよびＦｕｎｃｔｉｏｎ （Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ ９ｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ） Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＩＬ、１９８５）、βターンジペプチドコア（Ｎａｇａｉら（１９８５）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２６：６４７；ａｎｄ Ｓａｔｏら（１９８６）Ｊ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ １：１２３１）、およびβアミノアルコール（Ｇｏｒｄｏｎら（１９８５）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎｌ２６：４１９；およびＤａｎｎら（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １３４：７１）である。
【０１２３】
融合タンパク質
ＶＥＧＦタンパク質のレベルを調節するポリペプチドは、別のタンパク質またはその一部と融合してもよい。例えばＶＥＧＦタンパク質またはその一部を別のポリペプチド部分と発現可能に連結し、可溶性を高めることができる。ＶＥＧＦまたはその一部と融合することのできるタンパク質の例としては、ＶＥＧＦの血中半減期を改善できるプラズマタンパク質またはその断片が挙げられる。例えば融合タンパク質は、ＶＥＧＦ配列が免疫グロブリンスーパーファミリーに由来する配列と融合したＶＥＧＦ−免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質であってもよい。細胞表面の糖タンパク質の細胞外ドメインが免疫グロブリンの定常領域Ｆ（ｃ）と融合した可溶性融合タンパク質の構築物が、数多く開示されている（例えばＣａｐｏｎら（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３３７（９）：５２５−にはＣＤ４と免疫グロブリン（ＩｇＧ１）を融合させてより持続性の高いＣＤ４類似体を作製する指針が示されている）。また、カポン（Ｃａｐｏｎ）らの米国特許第５，１１６，９６４号および第５，４２８，１３０号（ＣＤ４−ＩｇＧ融合構築物）；リンスレー（Ｌｉｎｓｌｅｙ）らの米国特許第５，４３４，１３１号（ＣＴＬＡ４−ＩｇＧｌおよびＢ７−ＩｇＧｌ融合構築物）；リンスレー（Ｌｉｎｓｌｅｙ）ら（１９９１）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７４：５６１−５６９（ＣＴＬＡ４−ＩｇＧｌ融合構築物）；およびリンスレー（Ｌｉｎｓｌｅｙ）ら（１９９１）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ １７３：７２１−７３０（ＣＤ２８−ＩｇＧｌおよびＢ７−ＩｇＧｌ融合構築物）を参照のこと。このような融合タンパク質は、受容体−リガンド相互作用を調節し、インビボでの炎症を軽減する有用なタンパク質であることが明らかにされている。例えば細胞表面の腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）タンパク質の細胞外ドメインが免疫グロブリンの定常領域（Ｆｃ）と融合した融合タンパク質は、インビボで使用されている（例えばＭｏｒｅｌａｎｄら（１９９７）Ｎ． Ｅｎｇｌ Ｊ． Ｍｅｄ． ３３７（３）：１４１−１４７；およびｖａｎ ｄｅｒ Ｐｏｌｌら（１９９７）Ｂｌｏｏｄ ８９（１０）：３７２７−３７３４を参照のこと）。
【０１２４】
抗体
本発明はさらに、対象のＶＥＧＦポリペプチドに特異的に反応する抗体を含む。抗タンパク質／抗ペプチド抗血清またはモノクローナル抗体は、通常のプロトコールにより本明細書の記載に従って作製することができる（例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（編集；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ： １９８８）を参照のこと）。
【０１２５】
ＶＥＧＦタンパク質、またはその一部、あるいは断片を免疫原として利用し、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の標準的な作製技術を用いてＶＥＧＦに結合する抗体を調製することができる。免疫原としては、全長ＶＥＧＦタンパク質を用いることも、あるいはＶＥＧＦの抗原性ペプチド断片を用いることもできる。
【０１２６】
通常、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦペプチドを用いて、適当な対象、（例えばウサギ、ヤギ、マウスまたはその他の哺乳動物）を免疫原で免疫化し抗体を作製する。適当な免疫原調製物は、例えば組換え体ＶＥＧＦペプチド、または化学合成ＶＥＧＦペプチドを含む（例えば米国特許第５，４６０，９５９号および同時継続出願の米国特許出願第０８／３３４，７９７号；米国特許出願第０８／２３１，４３９号；米国特許出願第０８／３３４，４５５号；および米国特許出願第０８／９２８，８８１号を参照のこと。これらは、参照としてその全文が本明細書に組み入れられる。）ＶＥＧＦのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は公知である。調製物は、さらにフロインド完全アジュバントまたはフロインド不完全アジュバント、あるいは同様な免疫刺激性薬剤等のアジュバントを含むことができる。適当な対象の免疫原性ＶＥＧＦ調製物による免疫は、ポリクローナルな抗ＶＥＧＦ抗体応答を惹起する。
【０１２７】
抗ＶＥＧＦ抗体またはその断片を用いて、ＶＥＧＦタンパク質のレベルを阻害することができる。抗ＶＥＧＦ抗体断片の例としては、ペプシン等の酵素で処理した抗体から生じるＦ（ｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２等の断片が挙げられる。本明細書に記載されている「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、ＶＥＧＦの特定のエピトープと免疫反応可能な１種類の抗原結合部位のみを含む抗体分子の集団を指す。従って、モノクローナル抗体組成物は、通常、免疫反応する特定のＶＥＧＦタンパク質に対して単一の結合親和性を示す。
【０１２８】
さらに、通常の組換えＤＮＡ技術を用いて作成可能なヒトおよび非ヒト部分の双方を含むキメラおよびヒト化モノクローナル抗体等の、遺伝子工学的方法を利用して調製した抗ＶＥＧＦ抗体を用いることも可能である。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、例えば以下に記載の方法を用いて当技術分野において公知の通常の組換えＤＮＡ技術を利用した遺伝子工学的方法によって、産生することができる。すなわち、ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）らの国際公開公報ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；アキラ（Ａｋｉｒａ）らの欧州特許１８４，１８７号；タニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ）、Ｍ．の欧州特許第１７１，４９６号；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）らの欧州特許第１７３，４９４号；ニューベルガー（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ）らの国際公開公報第ＷＯ８６／０１５３３号；カビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）らの米国特許第４，８１６，５６７号；カビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）らの欧州特許第１２５，０２３号；ベター（Ｂｅｔｔｅｒ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３、１９８８；リウ（Ｌｉｕ）ら、ＰＮＡＳ ８４：３４３９−３４４３，１９８７；リウ（Ｌｉｕ）ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３９：３５２１−３５２６、１９８７；サン（Ｓｕｎ）ら、ＰＮＡＳ ８４：２１４−２１８、１９８７；ニシムラ（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ）ら、Ｃａｎｃ． Ｒｅｓ． ４７：９９９−１００５、１９８７；ウッド（Ｗｏｏｄ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４４６−４４９、１９８５；およびショー（Ｓｈａｗ）ら、Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８０：１５５３−１５５９、１９８８）；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ），Ｓ． Ｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２−１２０７、１９８５；オイ（Ｏｉ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４、１９８６；Ｗｉｎｔｅｒ の米国特許第５，２２５，５３９号；ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５５２−５２５、１９８６；ベルホーヤン（Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４、１９８８；およびバイドラー（Ｂｅｉｄｌｅｒ）ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：４０５３−４０６０、１９８８等の方法である。
【０１２９】
さらに、ＶＥＧＦに対するヒトモノクローナル抗体は通常の技術を用いて作成可能である。例えばヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニックマウスまたは抗体を産生するヒト細胞を植え込んだ免疫欠損マウスで作製することができる。このようなマウスを作製する方法は、例えばウッド（Ｗｏｏｄ）らの国際公開公報第ＷＯ９１／００９０６号、クチャラパティー（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）らの国際公開公報第ＷＯ９１／１０７４１号；ロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）らの国際公開公報第ＷＯ９２／０３９１８号；カイ（Ｋａｙ）らの国際公開公報第ＷＯ９２／０３９１７号；カイ（Ｋａｙ）らの国際公開公報第ＷＯ９３／１２２２７号；カイ（Ｋａｙ）らの国際公開公報第９４／２５５８５号；ラジョースキー（Ｒａｊｅｗｓｋｙ）らの国際公開公報第ＷＯ９４／０４６６７号；ジツリオ（Ｄｉｔｕｌｌｉｏ）らの国際公開公報第ＷＯ９５／１７０８５号；ロンバーグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ），Ｎ．ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６−８５９；グリーン（Ｇｒｅｅｎ），Ｌ．Ｌ．ら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ７：１３−２１；モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ），Ｓ．Ｌ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６８５１−６８５５；ブルッグマン（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ）ら、（１９９３）Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７：３３−４０；チョイ（Ｃｈｏｉ）ら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ４：１１７−１２３；ツアイロン（Ｔｕａｉｌｌｏｎ）ら（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：３７２０−３７２４；ブルッグマン（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ）ら（１９９１）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２１：１３２３−１３２６）；ドゥコサ（Ｄｕｃｈｏｓａ）らの国際公開公報第ＷＯ９３／０５７９６号；米国特許第５，４１１，７４９号；マックカーン（ＭｃＣｕｎｅ）ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１６３２−１６３９）、カメル−レイド（Ｋａｍｅｌ−Ｒｅｉｄ）ら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１７０６；スパノポーロー（Ｓｐａｎｏｐｏｕｌｏｕ）（１９９４）Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ８：１０３０−１０４２；シンカイ（Ｓｈｉｎｋａｉ）ら（１９９２） Ｃｅｌｌ ６８：８５５−８６８に記載されている。ヒト抗体に関するトランスジェニックマウス、またはヒト抗体を産生する細胞または組織を移植した免疫欠損マウスは、ＶＥＧＦまたは抗原性ＶＥＧＦペプチドで免疫化し、これら免疫マウスから取り出した脾細胞を用いてハイブリドーマを作製することができる。ハイブリドーマ作製法は公知である。
【０１３０】
対象のリンパ球に由来するｍＲＮＡから調製した免疫グロブリンの軽鎖および重鎖ｃＤＮＡを用いてＦａｂファージ表出ライブラリーまたはｓｃＦｖファージ表出ライブラリー等の組合せ免疫グロブリンライブラリーを構築することによっても、ＶＥＧＦに対するヒトモノクローナル抗体を調製することができる（例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらの国際公開公報第ＷＯ９２／０１０４７号；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７；ａｎｄ Ｇｒｉｆｆｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５−７３４を参照のこと）。さらに、抗体可変領域の組合せライブラリーは、公知のヒト抗体に変異を導入して作製することもできる。例えばＶＥＧＦに結合することが分かっているヒト抗体の可変領域に、例えばランダム変異を導入して改変したオリゴヌクレオチドを用いて、変異を導入し、スクリーニング可能なＶＥＧＦに結合する変異可変領域のライブラリーを作製することができる。免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖のＣＤＲ領域内にランダム変異を導入する方法、ランダムな重鎖および軽鎖を会合させて対を作らせる方法、およびスクリーニング法については、例えばバルバス（Ｂａｒｂａｓ）らの国際公開公報第ＷＯ９６／０７７５４号；バルバス（Ｂａｒｂａｓ）ら（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：４４５７−４４６１等に記載がある。
【０１３１】
免疫グロブリンのライブラリーを一群の表出パッケージ、好ましくは繊維状ファージに由来する表出パッケージに発現させ、抗体表出ライブラリーを作製する。特に抗体表出ライブラリーの調製に利用できる方法および試薬の例としては、例えば以下の文献に記載がある。すなわち、ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）らの米国特許第５，２２３，４０９号；カン（Ｋａｎｇ）らの国際公開公報第ＷＯ９２／１８６１９号；ドーワー（Ｄｏｗｅｒ）らの国際公開公報第ＷＯ９１／１７２７１号；ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）らの国際公開公報第ＷＯ９２／２０７９１号；マークランド（Ｍａｒｋｌａｎｄ）らの国際公開公報第ＷＯ９２／１５６７９号；ブライトリング（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ）らの国際公開公報第ＷＯ９３／０１２８８号；マクカッフェルティー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）らの国際公開公報第ＷＯ９２／０１０４７号；ガラード（Ｇａｒｒａｒｄ）らの国際公開公報第ＷＯ９２／０９６９０号；ラドナー（Ｌａｄｎｅｒ）らの国際公開公報第ＷＯ９０／０２８０９号；フチュス（Ｆｕｃｈｓ）ら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７０−１３７２；ハイ（Ｈａｙ）ら（１９９２） Ｈｕｍ Ａｎｔｉｂｏｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ ３：８１−８５；フーズ（Ｈｕｓｅ）ら（１９８９） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１；グリフィンス（Ｇｒｉｆｆｉｎｓ）ら（１９９３）上記；ホーキンス（Ｈａｗｋｉｎｓ）ら（１９９２）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２６：８８９−８９６；クラックソン（Ｃｌａｃｋｓｏｎ）ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８；グラム（Ｇｒａｍ）ら、（１９９２）ＰＮＡＳ ８９：３５７６−３５８０；ガラード（Ｇａｒｒａｒｄ）ら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１３７３−１３７７；フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら（１９９１）Ｎｕｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９：４１３３−４１３７；およびバルバス（Ｂａｒｂａｓ）ら（１９９１）ＰＮＡＳ ８８：７９７８−７９８２に記載がある。抗体ライブラリーが表出パッケージ（例えば繊維状ファージ）の表面に表出されれば、抗体ライブラリーをスクリーニングし、ＶＥＧＦに結合する抗体を発現するパッケージを同定および単離する。好ましい態様において、ライブラリーの第一スクリーニングにおいて、固定化ＶＥＧＦでパニングし、固定化ＶＥＧＦに結合した抗体を発現する表出パッケージを選択する。
【０１３２】
アンチセンスＶＥＧＦの核酸配列
ＶＥＧＦをコードするヌクレオチドに対するアンチセンスである核酸分子を、ＶＥＧＦ発現阻害剤として用いることができる。「アンチセンス」核酸としては、ＶＥＧＦをコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的またはｍＲＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列が挙げられる。従って、アンチセンス核酸は、センス核酸と水素結合を形成しうる。アンチセンス核酸は、ＶＥＧＦのコード鎖全域にわたって相補的であってもよく、その一部に相補的であってもよい。例えばアンチセンスがＶＥＧＦをコードするヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対するものであるアンチセンス核酸分子を用いることもできる。
【０１３３】
ＶＥＧＦをコードするコード鎖の配列は公知である。ＶＥＧＦをコードするコード鎖の配列が与えられれば、アンチセンス核酸はワトソン−クリックの塩基対の規則に従って設計することができる。アンチセンス核酸分子は、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡのコード領域全体に対して相補的であってもよいが、アンチセンスがＶＥＧＦ ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部に対するものであるオリゴヌクレオチドがより好ましい。例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの翻訳開始部位周囲の領域に相補的であってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０個のヌクレオチド長であってもよい。アンチセンス核酸は、当技術分野で公知の方法を用いた化学合成および酵素的ライゲーション反応によって構築されうる。天然のヌクレオチドまたは、分子の生物学的安定性が向上するように、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸間で形成された二重鎖の物理的安定性が向上するように設計された、各種の修飾ヌクレオチドを用いて、例えばアンチセンス核酸（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）を化学合成することができ、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換したヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸の調製に利用できる修飾ヌクレオチドの例としては、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルクエオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミン−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミンプリンが挙げられる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向（すなわち、目的の標的核酸にアンチセンス方向で挿入した核酸から転写されたＲＮＡ）でサブクローンされた発現ベクターを用いて生物学的に産生することもできる。
【０１３４】
投与
ＶＥＧＦタンパク質の発現レベルを調節する薬剤は、通常の方法で対象に投与することができる。例えば薬剤は、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば吸入）、経皮（局所的）および経粘膜等の複数の異なる経路のいずれで投与してもよい。一態様において、ＶＥＧＦを調節する薬剤は局所的に投与することができる。
【０１３５】
ＶＥＧＦタンパク質のレベルを調節する薬剤、例えば核酸分子、ＶＥＧＦポリペプチド、断片または類似体、ＶＥＧＦ調節剤、および抗ＶＥＧＦ抗体（本明細書において「活性化合物」と記載する）を配合して、対象、例えばヒトに投与する適当な薬学的組成物とする。このような組成物としては、通常、核酸分子、ポリペプチド、調節剤、または抗体、および薬学的に許容される担体を含む。本明細書に記載されている「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬的投与に適合する溶媒、分散培地、コーティング剤、抗菌剤と抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等のいずれかまたはすべてを意味するものである。薬学的に活性な物質のこのような媒体および薬剤に関する用途は公知である。どのような既知の媒体および薬剤も、活性化合物に不適合でないかぎり、媒体は本発明の組成物に用いることができる。補助的な活性化合物を組成物に添加することも可能である。
【０１３６】
所望の投与経路に合わせて薬学的組成物を処方することができる。非経口、皮内、または皮下に投与する液剤または懸濁剤は、以下の成分を含む。すなわち、注射水等の滅菌希釈液、食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤；酢酸、クエン酸またはリン酸等の緩衝剤、および塩化ナトリウムまたはブドウ糖等の浸透圧調節剤を含む。ｐＨは塩酸または水酸化ナトリウム等の酸または塩基で調節する。非経口製剤は、アンプル、使い捨てシリンジまたはガラス製またはプラスチック製の複数用量のバイアルに詰めることができる。
【０１３７】
注射可能な用途に好適な薬学的組成物は、滅菌水溶液（水溶性）または懸濁液、滅菌済みの注射可能な溶液または懸濁液の即時調合剤のための滅菌済み粉末を含む。静脈内投与に好適な担体としては、生理食塩水、制菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（登録商標）（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝性食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。任意の場合も、組成物は、滅菌が必要であり、シリンジで容易に操作可能な液体でなくてはならない。産生および保存の条件下で安定なものである必要があり、細菌および真菌等の微生物の混入を防ぐ必要がある。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）およびそれらの適当な混合物等の溶媒または分散媒であってもよい。例えばレクチン等のコーティング剤を利用することによって、分散媒の場合には所望の粒子サイズを維持することによって、また界面活性剤を利用することによって、適切な流動性を維持することができる。微生物作用を防止するためには、各種の抗菌剤と抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等を利用することができる。任意の場合にも、等張化薬剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトール等のポリアルコール、塩化ナトリウムを組成物中に添加しておくのが好ましい。組成物中に、例えばアルミニウムモノステアリン酸およびゼラチン等の吸収遅延剤を添加しておくことによって、注射可能な組成物の吸収を持続させることができる。
【０１３８】
適当な溶媒に所望の量の活性化合物（例えばＶＥＧＦポリペプチドまたは抗ＶＥＧＦ抗体）を、必要に応じて、単独または上記の成分の組み合わせで添加し、これを濾過滅菌することによって、滅菌済みの注射可能な溶液を調製することができる。通常、分散剤は、活性化合物を、基本分散媒と上記に挙げたものから選択した所望の他の成分を含む滅菌済み担体に添加して調製する。滅菌済み注射可能な溶液に配合する滅菌済み粉末の場合の好ましい製剤法としては、活性成分および前もって濾過滅菌した溶液中の所望の付加的成分を粉末にする真空乾燥およびフリーズドライが挙げられる。
【０１３９】
一般に、経口用の組成物は不活性な希釈液または食用の担体を含む。これらは、ゼラチンカプセルに封入する、または圧縮して錠剤にすることができる。治療目的の経口投与では、活性化合物を賦形剤と混合して錠剤、トローチ、またはカプセルの形態で使用する。経口用の組成物は、うがい薬用途の液性担体を用いて調製することもでき、液性担体中の化合物を経口的に使用し、含嗽し、はき出す、または嚥下する。薬学的に適合性の結合剤、および／または補助剤を組成物の一部として含むことができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチ等は、以下の成分、または同様の性質を有する化合物のいずれを含んでいてもよい。すなわち、微小結晶のセルローズ、トラガカントゴムまたはゼラチン等の結合剤；デンプンまたは乳糖等の賦形剤；アルギン酸、プリモゲルまたはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ等の滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；ショ糖またはサッカリン等の甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジ人工甘味料等の香味剤である。
【０１４０】
全身投与は、経粘膜的または経皮的手段で実施することもできる。経粘膜または経皮投与では、適当な障壁を浸透可能な浸透剤を配合する。このような浸透剤は、一般に公知であり、例えば経粘膜投与では、界面活性剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻内噴霧または坐剤を用いて実施できる。経皮投与では、活性化合物を当技術分野で公知の軟膏剤、軟膏薬、ゲルまたはクリームに配合する。このような経皮製剤は、毛の成長を促進または阻害する目的で皮膚に塗布する。
【０１４１】
一態様において、（植え込みおよびマイクロカプセル化送達系を含む制御放出剤等の）体からの活性化合物の急速除去を防ぐことのできる担体と共に化合物を調製する。エチレン酢酸ビニル、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル類およびポリ乳酸等の生体内分解が可能であり、生体適合性のポリマーを用いることができる。このような剤形の製剤法は当業者に公知である。原料もＡｌｚａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ および Ｎｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．等で市販している。リポゾーム懸濁剤（感染細胞を標的とした、ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を含むポゾームを含む）も薬学的に許容される担体として利用することができる。これらは、例えば米国特許第４，５２２，８１１号に記載の方法等の、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０１４２】
本明細書に記載されている核酸分子をベクターに挿入し、遺伝子治療用ベクターとして利用することができる。遺伝子治療用ベクターは、例えば静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）または定位投与（例えばＣｈｅｎら、ＰＮＡＳ ９１：３０５４−３０５７、１９９４を参照のこと）により対象に送達可能である。遺伝子治療用ベクターの薬学的製剤としては、許容される希釈液中の遺伝子治療用ベクター、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている徐放性マトリックスが挙げられる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え体細胞から無傷の状態で産生される（例えばレトロウイルスベクター）のであれば、薬学的製剤は遺伝子送達系を産生する１個以上の細胞を含むことができる。
【０１４３】
薬学的組成物は、投与に関する説明書と共に容器、パックまたは分注器に入れることができる。
【０１４４】
ＶＥＧＦタンパク質のレベルを調節する薬剤は、例えば局所的投与により局所に投与することもできる。薬剤は単回投与することもでき、また連続投与することも可能である。例えばＶＥＧＦタンパク質のレベルに対する効果が決められた期間（例えば５、１０、２０、３０、５０、９０、１８０、３６５日以上）持続する頻度で、薬剤を投与する。ＶＥＧＦタンパク質のレベルを調節する、例えば増加させるまたは阻害する薬剤（例えばＶＥＧＦポリペプチドまたは抗ＶＥＧＦ抗体）の投与を繰り返し実施することもできる。
【０１４５】
遷移金属
遷移金属イオンはＶＥＧＦ遺伝子の発現を促進し、ＶＥＧＦタンパク質のレベルを上昇させることが分かっている（米国特許第５，４８０，９７５号を参照のこと）。従って、一局面において、遷移金属イオンを用いて、ＶＥＧＦの発現を上昇させ、毛の成長および／または毛の密生増加を促進することができる。
【０１４６】
遷移金属は期間表の第４、第５および第６のレベルの群に属し、そのｄ軌道は充填されている。遷移金属の元素としては、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｖ、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｍｏ等が挙げられる。用いることのできる好ましい候補金属イオンは、マンガン、コバルトおよびニッケルである。
【０１４７】
他の適当な金属イオンの選択は、どのようなレベルでイオンがＶＥＧＦ発現を誘導するかを調べることを含む。特に全身投与の場合には、選択の際に毒性についての評価も含まれる。下記の米国特許第５，４８０，７９５号に、このような決定に対して好適な方法が示されている。好ましいイオンとは、ＶＥＧＦの誘導と毒性との間がかなり広い範囲のイオンである。
【０１４８】
遷移金属は、塩または遊離イオンの形態で、生体適合性の錠剤またはカプセル、ゲルまたは液剤として、体内に（全身性または局所投与）投与できる、あるいは生体適合性の散剤、軟膏、液剤、または経皮的貼剤として体外に投与することもできる。組成物は生理学的に許容される、塩化物、硫酸塩等の陰イオンを含んでいてもよい。
【０１４９】
実質的に全身性効果を与えることなく標的組織に効果をもたらすように、適当な放出速度と用量を決定することができる。例えばこのようなパラメータは米国特許第５，４８０，７９５号に記載されている方法で決定することができる。
【０１５０】
遺伝子治療
本発明の遺伝子構築物を遺伝子治療のプロトコールの一部として用い、アゴニスト型またはアンタゴニスト型のＶＥＧＦポリペプチドのいずれかをコードする核酸を送達する。本発明は、ポリペプチドが異常発現する細胞においてＶＥＧＦポリペプチドの機能を再構成する、あるいは機能を中和するためのインビボトランスフェクション用の発現ベクターおよび特定の細胞でＶＥＧＦポリペプチドの発現を特徴とする。ＶＥＧＦポリペプチドの発現構築物は、生物学的に効果のあるいずれかの担体、例えばＶＥＧＦ遺伝子を細胞にインビボで効果的に送達することの可能ないずれかの製剤または組成物とともに投与してもよい。この方法は、組換え体レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルス−ｌ、または組換え体細菌型または真核細胞型プラスミドを含むウイルスベクターに対象遺伝子を挿入することを含む。ウイルスベクターは直接、細胞にトランスフェクトする。例えば陽イオン性リポゾーム（リポフェクチン）またはその誘導体（例えば抗体を結合したもの）、ポリリジン接合体、グラミシジンＳ、人工ウイルスエンベロープ、またはその他の同様な細胞内担体、遺伝子構築物の直接注入またはインビボで実施するリン酸カルシウム沈殿法によって、プラスミドＤＮＡを送達することができる。
【０１５１】
核酸の細胞へのインビボ導入の好ましい方法には、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸、例えばｃＤＮＡを含むウイルスベクターを利用する。ウイルスベクターを細胞に感染させることは、核酸を受け取ることのできる標的細胞の比率が高いという利点がある。さらに、ウイルスベクター内で、例えばウイルスベクター中のｃＤＮＡがコードする分子は、ウイルスベクターの核酸を取り込んだ細胞で効率よく発現する。
【０１５２】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを、特にヒトへ外来性遺伝子をインビボ導入する組換え遺伝子送達系としてを用いることができる。これらベクターは、細胞への効率よい遺伝子送達を提供し、導入核酸は安定に宿主染色体ＤＮＡに挿入される。複製欠損レトロウイルスのみを産生する特殊化した細胞株（「パッケージング細胞」と呼ぶ）の開発によって、遺伝子治療におけるレトロウイルスの有用性が高まった。また、遺伝子治療としての遺伝子導入に利用する目的で、欠損レトロウイルスの特徴付けが行われている（総説としてはＭｉｌｌｅｒ、ＡＤ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１を参照のこと）。標準的技術によりヘルパーウイルスを用いて、標的細胞への感染に用いることのできるビリオンに複製欠損レトロウイルスをパッケージすることができる。組換え体レトロウイルスの産生、およびこれらウイルスの細胞へのインビトロまたはインビボ感染のプロトコールについては、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、（編）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、Ｓｅｃｔｉｏｎｓ ９．１０−９．１４ 、および他の標準的な実験マニュアルに記載されている。好適なレトロウイルスの例としては、当業者に公知のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよび ｐＥＭ 等が挙げられる。エコトロピックおよびアンホトロピックなレトロウイルス系それぞれを作成するために好適なパッケージングウイルス株の例としては、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡｍが挙げられる。各種の遺伝子を、上皮細胞を含む異なる多数種類の細胞に、インビトロおよび／またはインビボで導入する用途で、レトロウイルスが利用されている（例えばＥｇｌｉｔｉｓら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３９５−１３９８；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：６４６０−６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏａ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：３０１４−３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６１４１−６１４５；Ｈｕｂｅｒら、（１９９１）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８０３９−８０４３；Ｆｅｒｒｙら（１９９１）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：８３７７−８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら、（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２−１８０５；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら、（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７６４０−７６４４；Ｋａｙら（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１−６４７；Ｄａｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０８９２−１０８９５；Ｈｗｕら（１９９３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：４１０４−４１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；国際公開広報第ＷＯ８９／０７１３６号；国際公開広報第ＷＯ８９／０２４６８号；国際公開広報第ＷＯ８９／���５３４５号；および国際公開広報第ＷＯ９２／０７５７３号を参照のこと）。
【０１５３】
本発明において有用な別のウイルス遺伝子送達系では、アデノウイルス由来のベクターを用いる。アデノウイルスのゲノムを操作して、目的の遺伝子産物をコードし発現するが、正常な溶解ウイルス生活環における複製能は不活性化することが可能である（例えばＢｅｒｋｎｅｒら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４；および Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５を参照のこと）。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄｌ３２４またはその他のアデノウイルス株に由来する好適なアデノウイルスベクター（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）は、当業者に公知である。組換え体アデノウイルスは、非分裂細胞に感染可能な状況下において好適であり、上皮細胞を含む各種の細胞への感染に用いることができる（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）上記）。さらに、ウイルス粒子は相対的に安定であり、上記のように精製および濃縮を行うことができる。また、改変して、感染範囲を変化させることもできる。さらに、導入したアデノウイルスＤＮＡ（および、それに含まれる外来性ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムに挿入されず、エピゾーマルな状態を保つので、導入したＤＮＡ（例えばレトロウイルスＤＮＡ）が宿主ゲノムに挿入することによるインサイチューでの挿入変異の結果として起こり得る潜在的な悪影響を回避することができる。さらに、アデノウイルスゲノムが運ぶことのできる外来性ＤＮＡの大きさは、他の遺伝子送達ベクターに比べて大きい（最高８Ｋ塩基）（Ｂｅｒｋｎｅｒら上記；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５７：２６７）。
【０１５４】
対象遺伝子の送達に有用な、さらに別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および増殖生活環を達成するために、アデノウイルスまたは疱疹ウイルス等の、ヘルパーウイルスの役目を果たす別のウイルスを必要とする天然の欠損ウイルスである（総説としては、Ｍｕｚｙｃｚｋａら（１９９２）Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏおよびｌｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７−１２９を参照のこと）。また、これは非分裂細胞にＤＮＡを挿入する数少ないウイルスの一つであり、安定挿入の頻度が高い（例えばＦｌｏｔｔｅら（１９９２）Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：３８２２−３８２８；および ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８９）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６２：１９６３−１９７３を参照のこと））。３００塩基対程度の短いＡＡＶを含むベクターは、パッケージ可能であり、また挿入可能である。外来性ＤＮＡに割り当てることのできるサイズは、最大で、約４．５ｋｂである。トラッシュイン（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ）ら（（１９８５）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：３２５１−３２６０）が報告しているようなＡＡＶベクターを利用して、ＤＮＡを細胞に導入することができる。ＡＡＶベクターを用いて様々な核酸が多種の細胞に導入されている（例えばＨｅｒｍｏｎａｔら（１９８４）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら（１９８８）Ｍｏｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． ２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５１：６１１−６１９；および Ｆｌｏｔｔｅら（１９９３）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：３７８１−３７９０を参照のこと）。
【０１５５】
上記で例示したウイルス導入法に加え、ウイルスを利用しない方法を用いることによっても、動物組織でＶＥＧＦポリペプチドを発現させることができる。ウイルスを利用しない遺伝子導入法は、通常、高分子を取り込み細胞内で輸送する哺乳動物細胞の本来有するメカニズムを利用する。好ましい態様において、本発明の非ウイルス遺伝子送達系は、標的細胞における対象ＶＥＧＦ遺伝子の取り込みに関する細胞内経路に依存するものである。このような遺伝子送達系の例としては、リポゾームによる系、ポリリジン接合体、および人工ウイルスエンベロープが挙げられる。他の態様としては、Ｍｅｕｌｉら（２００１）Ｊ． Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ． １１６（１）：１３１−１３５；Ｃｏｈｅｎら（２０００）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７（２２）： １８９６−９０５；またはＴａら（２０００）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ７（２１）： １８６７−７４等に記載のプラスミド注入系が挙げられる。
【０１５６】
代表的な態様において、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする遺伝子は、表面が陽性の荷電を有し、（選択的に）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体を結合したリポゾーム（例えばリポフェクチン）に封入することができる（Ｍｉｚｕｎｏら（１９９２）Ｎｏ Ｓｈｉｎｋｅｉ Ｇｅｋａ ２０：５４７−５５１；国際公開公報第Ｗ０９１／０６３０９号；日本国特許出願第１０４７３８１号；および欧州特許第ＥＰ−Ａ−４３０７５号）。
【０１５７】
臨床的状況においては、治療用ＶＥＧＦ遺伝子の遺伝子送達系を、複数の方法（いずれも当技術分野で公知である）のいずれかにより、患者に導入することができる。例えば遺伝子送達系の薬学的製剤を、例えば静脈内注射により全身的に導入することが可能であり、標的細胞におけるタンパク質の形質導入は、主に遺伝子送達ビヒクルによるトランスフェクションの特異性、受容体遺伝子の発現を制御する転写調節配列に基づく細胞の種類または組織の種類に特異的な発現、あるいはその組み合わせによって起こる。他の態様において、組換え遺伝子の初期送達はさらに、動物への非常に局在化された導入に限られる。例えば遺伝子送達ビヒクルはカテーテルにより導入されうり（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）、または、定位注射により導入されうる（例えばＣｈｅｎら、（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：３０５４−３０５７）。
【０１５８】
遺伝子治療用構築物の薬学的製剤は、許容される希釈液で希釈された遺伝子送達系から本質的になっていてもよく、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれている徐放性マトリックスを含んでもよい。あるいは、完全な遺伝子送達系が無傷の状態で組換え体細胞（例えばレトロウイルスベクター）から産生されうる場合には、薬学的製剤は遺伝子送達系を産生する細胞を１個または複数個含むものであってもよい。
【０１５９】
細胞治療
例えば線維芽細胞または毛包ケラチノサイト等のケラチノサイトの、細胞への、たとえば以下などのＶＥＧＦの産生を調節するヌクレオチド配列の導入によって、対象においてＶＥＧＦを増加させることもできる：ＶＥＧＦポリペプチドまたはその機能的断片もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列；プロモーター配列、例えばＶＥＧＦ遺伝子または別の遺伝子に由来するプロモーター配列；エンハンサー配列、例えば５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、例えばＶＥＧＦ遺伝子もしくは別の遺伝子に由来する５’ＵＴＲ、および３’ＵＴＲ、例えばＶＥＧＦ遺伝子もしくは別の遺伝子に由来する３’ＵＴＲ；ポリアデニル化部位；インシュレーター配列、またはＶＥＧＦの発現を調節する別の配列。次に、細胞を対象に導入することができる。
【０１６０】
遺伝子操作されるべき第一世代および第二世代の細胞は、各種の組織から得られうり、培養物中で維持および増殖が可能な細胞型を含みうる。例えば第一世代および第二世代の細胞としては、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞（例えば乳腺上皮細胞、腸上皮細胞）、内皮細胞、グリア細胞、神経細胞、血液系の固形成分（ｆｏｒｍｅｄ ｅｌｅｍｅｎｔｓ）（例えばリンパ球、骨髄細胞）、筋肉細胞（筋原細胞）およびこれら体細胞種の前駆細胞が挙げられる。第一世代の細胞は好ましくは、遺伝子操作された第一の細胞または第二世代が細胞を投与される個体から得られる。しかし、第一世代の細胞は（レシピエント以外の）同一種のドナーまたはその他の種（例えばマウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、トリ、ヒツジ、ヤギ、ウマ）のドナーから得られうる。
【０１６１】
「第一世代の細胞」という用語は、（播種される前に、すなわちシャーレまたはフラスコ等の組織培養用の培養器に添加される前に）脊椎動物組織供給源から単離された細胞の懸濁液中に存在する細胞、はじめに播種された、以前の細胞型両方の組織由来の外植片に存在する細胞、およびこれらの播種された細胞に由来する細胞懸濁液を含む。「第二世代の細胞」または「細胞株」という用語は、以降の培養段階すべてにおける細胞を指す。すなわち、まず、播種された第一世代の細胞を培養器から取り出し、再び播種する（継代する）が、本明細書において、以降に継代するすべての細胞を、第二世代の細胞と呼ぶ。第二世代の細胞は一回または複数回継代された第二世代の細胞からなる細胞株である。細胞株は以下のような第二世代の細胞からなる：（１）一回または複数回継代され；（２）培養物における有限回の平均集団倍加（ｍｅａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｄｏｕｂｌｉｎｇｓ）を示し；（３）接触阻害性の足場依存性増殖の性質を示し（足場依存性は懸濁培養物中で増殖する細胞には適用しない）；かつ（４）不死化されない。「クローン細胞株」とは、単一の初代細胞に由来するクローン細胞株と定義される。「異種細胞株」とは、２種以上の初代細胞に由来するクローン細胞株と定義される。
【０１６２】
脊椎動物、特に哺乳動物に由来する第一世代または第二世代の細胞は、シグナルペプチド、および／または異種性の核酸配列（例えばＶＥＧＦをコードする核酸配列）をコードする核酸配列を含む、外来性の核酸配列でトランスフェクションされうり、長期にわたりインビトロおよびインビボでコードする産物を安定かつ持続的に産生することができる。異種性アミノ酸は、調節配列、例えば発現を達成するプロモーター（例えば内在性のＶＥＧＦ配列の誘導性発現または発現上昇を達成するプロモーター）であってもよい。外来性の核酸配列を、相同組換えで第一世代または第二世代の細胞に導入することができる（例えば米国特許第５，６４１，６７０号に記載の方法を用いる。本文献の内容は参照として本明細書に組み入れられる）。
【０１６３】
トランスフェクションされた第一世代または第二世代の細胞は、同定および単離を容易にする選択可能な形質を付与する選択可能マーカーをコードするＤＮＡを含んでよい。外来性の合成ＤＮＡを安定に発現するトランスフェクションされた第一世代および第二世代の細胞、そのようなトランスフェクションされた細胞のクローン細胞株および異種細胞株を産生する方法；クローン異種細胞株を産生する方法；およびトランスフェクションされた第一世代または第二世代の細胞集団により異常または望ましくない状態を治療または予防する方法も、本発明に含まれる。
【０１６４】
クローン細胞株または異種細胞株の第一世代または第二世代の細胞のトランスフェクション
脊椎動物の組織を、ねじ切り生検（ｐｕｎｃｈ ｂｉｏｐｓｙ）またはその他の目的の第一世代細胞の供給源組織を得る外科的方法等の標準的な方法を用いて得ることができる。例えばねじ切り生検を用いて、線維芽細胞またはケラチノサイトの供給源としての皮膚を得ることができる。第一世代の細胞の混合物は、酵素消化または外移植等の公知の方法を用いて組織から得る。酵素消化を利用する場合には、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、ジスパーゼ、プロナーゼ、トリプシン、エラスターゼおよびキモトリプシン等の酵素を用いることができる。
【０１６５】
得られた第一世代の細胞の混合物を、直接トランスフェクションすることもできるし、あるいは、まず培養し、培養シャーレから取り出した後に、トランスフェクションを実施することもできる。第一世代の細胞または第二世代の細胞を、外来性の核酸配列と混合され、トランスフェクションされ、例えばゲノムに安定挿入される。外来性の核酸配列は選択的に、選択可能マーカーをコードするＤＮＡを含んでいてもよい。外来性の核酸配列および選択可能マーカーをコードするＤＮＡは、異なる構築物上にあってもよいし、単一の構築物上にあってもよい。安定トランスフェクションで、外来性ＤＮＡを含み適切に発現する細胞を少なくとも１個得られる適切な量のＤＮＡを用いる。一般的には、おおよそ０．１μｇから５００μｇのＤＮＡを用いる。
【０１６６】
本明細書に記載されている「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウム沈殿法または塩化カルシウム沈殿法、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥデキストランによるトランスフェクション、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを含む、細胞に外来性核酸を導入する各種技術を含む。
【０１６７】
エレクトロポレーションは、適当な電圧および静電容量（および相当する時定数）で実施し、第一世代または第二世代の細胞にＤＮＡ構築物を導入する。エレクトロポレーションは、広い範囲の電圧（例えば５０から２０００Ｖ）および相当する静電容量で実施可能である。全ＤＮＡは一般におおよそ０．１から５００μｇを用いる。
【０１６８】
リン酸カルシウム沈殿法、改変型リン酸カルシウム沈殿法およびポリブレン沈殿法、リポソーム融合法および受容体媒介遺伝子送達法等の方法を用いて、細胞をトランスフェクションすることができる。マイクロインジェクションを用いて、第一世代または第二世代の細胞をトランスフェクションすることもできる。次に、安定トランスフェクションされた細胞を単離し、安定トランスフェクションされた第二世代の細胞が増殖し、トランスフェクションされた第二世代の細胞のクローン細胞株が得られる培養条件下および十分な時間で培養および継代することができる。あるいは、一個以上のトランスフェクションされた細胞を培養および継代し、異種細胞株を得る。
【０１６９】
トランスフェクションされた第一世代または第二世代の細胞を十分増殖させて、効果を発揮できる量の治療用タンパク質を個体に提供しうる数のクローン細胞株または異種細胞株を得る。通常、例えば０．ｌｃｍ２の皮膚を生検し、これは１，０００，０００個の細胞を含むと考えられる。１個の細胞を用いてクローン細胞株を作成すると、おおよそ２７回分裂して１億個のトランスフェクションされた第二世代の細胞が得られる勘定になる。おおよそ１，０００，０００個の細胞からなるトランスフェクションされた元々の細胞集団から異種細胞株を得るのであれば、たかだか１０回分裂すれば１億個のトランスフェクションされた細胞が得られる。
【０１７０】
トランスフェクションされたクローン異種細胞株に必要な細胞数は、様々な要素に依存して異なる。様々な要素としては、トランスフェクションされた細胞の用途、トランスフェクションされた細胞における外来性ＤＮＡの機能的レベル、トランスフェクションされた細胞の体内埋め込み部位（例えば利用可能な細胞の数は体内埋め込みの解剖学的部位によって異なる）、および患者の年齢、体表面積、および臨床的症状が挙げられるが、これらのみに限定されるものではない。これらの要素を考慮に入れて、治療的な量のヒト生長ホルモンを、体重１０ｋｇの患者であって生長ホルモン単独欠損症である以外は健康な患者に供給しようとおもえば、おおよそ１億〜５億個のトランスフェクションされた線維芽細胞が必要となる（この場合の細胞の容量は、おおよそ患者の親指の先端程度となる）。
【０１７１】
トランスフェクションされた第二世代の細胞由来のクローン細胞株または異種細胞株の移植
トランスフェクションされた細胞、例えば本明細書の記載のようにして産生した細胞を、産物が送達される個体に導入することができる。次に、クローン細胞株または異種細胞株を個体に導入する。各種投与経路および各種投与部位（例えば副腎、皮下、中枢神経系（クモ膜下を含む）、血管内、肝内、内臓内、腹腔内（大網内を含む）、筋肉内への体内移植）を用いることができる。個体内に移植すると、トランスフェクションされた細胞は、異種性ＤＮＡによってコードされる産物を産生する、または異種性ＤＮＡそれ自体によって影響を受ける。例えば抜け毛に苦しむ個体は、ＶＥＧＦを産生する細胞の体内移植に関する候補である。
【０１７２】
個体は小規模の皮膚生検を受けることができる。これは外来患者にも実施可能な簡単な方法である。例えば腋窩から皮膚片を取り、要する時間は約１分である。試料を処理して患者の細胞（例えば線維芽細胞）を単離し、遺伝子組換えにより、あるいはＶＥＧＦ産生を誘導する別のタンパク質または分子を産生する。患者の年齢、体重、および臨床的症状に応じて、大量培養により細胞の必要数を殖やす。全段階には４〜６週間を必要とし、最後に遺伝子操作された細胞を適当な数、個体に導入し（例えば患者の皮膚、例えば頭皮または顔面に注入して患者に戻す）、これが終われば、患者また通院するだけでよい。こうして、患者は抜け毛症状を軽減できるＶＥＧＦを産生することができるようになる。
【０１７３】
これはただ１回きりの治療で済む場合もあるし、また複数回の細胞治療法を必要とする場合もある。
【０１７４】
この例が示唆するように、用いる細胞は、通常、患者特異的に遺伝子操作された細胞である。しかしながら、同種の別の個体に由来する細胞、または異種の細胞であってもよい。このような細胞を利用する場合には、免疫抑制剤の投与、組織適合抗原の改変、または移植細胞の拒絶を予防する障壁装置の使用等が必要となることがある。
【０１７５】
トランスフェクションされた第一世代または第二世代の細胞は単独で投与してもよく、あるいは対象レシピエントにおける細胞に対する免疫応答を阻害する障壁または薬剤と組み合わせて投与してもよい。例えば対象における正常応答を阻害または抑制する目的で、免疫抑制剤を対象に投与することができる。好ましくは、免疫抑制剤は、対象におけるＴ細胞またはＢ細胞の活性を阻害する免疫抑制剤である。このような免疫抑制剤の例としては、市販のものがあげられる（例えばＳａｎｄｏｚ Ｃｏｒｐ． Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪから市販されているサイクロスポリンＡ）。
【０１７６】
例えば医薬品等の免疫抑制剤は、所望の治療効果（例えば細胞の拒絶阻害）を達成可能な用量で対象に投与することができる。免疫抑制剤の用量の範囲については、当技術分野で公知である（例えばＦｒｅｅｄら（１９９２）Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２７：１５４９；Ｓｐｅｎｃｅｒら（１９９２）Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２７：１５４１；Ｗｉｄｎｅｒら（１９９２）Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２７：１５５６を参照のこと）。用量の値は、個体の病態、年齢、性別、および体重等の因子に依存して異なる。
【０１７７】
対象においてＴ細胞の活性を阻害する目的で利用可能な別の薬剤は、抗体、またはその誘導体の断片である。インビボでＴ細胞を減少または抑制可能な抗体は、当技術分野で公知である。ポリクローナル抗血清、例えば抗リンパ球抗血清を用いることができる。あるいは、１種類以上のモノクローナル抗体を用いることができる。Ｔ細胞を減少させる好ましい抗体としては、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＤ４０、細胞表面のリガンドに結合するモノクローナル抗体が挙げられる。このような抗体は、当技術分野で公知であり、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから市販されている。ヒトＴ細胞上のＣＤ３に結合する好ましい抗体は、ＯＫＴ３（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８００１）である。
【０１７８】
対象レシピエントのＴ細胞を減少、抑制あるいは阻害する抗体は、移植した細胞の拒絶を阻害する適当な期間ある用量で投与することができる。抗体は薬学的に許容される担体の希釈液（例えば生理食塩水）にて静脈内投与することが好ましい。
【０１７９】
対象レシピエントにおける細胞に対する免疫応答を抑制または阻害する別の方法は、免疫障壁を利用することである。本明細書に記載されている「免疫障壁」とは、投与した細胞と対象における免疫応答に関わる細胞間の障壁の役割を果たす装置を指す。例えば細胞を植え込み装置に投与することができる。植え込み装置は、半透性障壁、すなわち、栄養分と産物は障壁を越えて核酸できるが、より大きい免疫系の構成要素（例えば抗体または補体）の流入を防ぐ半透性障壁内に細胞を含む。植え込み装置は、通常、マトリックス、例えば細胞を入れるハイドロゲル、生体適合性のメッシュ、またはコアを含む。選択的に半透性コーティングでゲルを包むこともできる。ゲルコア内に配置される場合には、投与された細胞は、免疫系の細胞から隔絶され、宿主の細胞および細胞障害性抗体はアクセスできない。好ましくは、ＰＬＬまたはＰＬＯ等の透過選択性コーティングを利用する。コーティングは、レシピエントの免疫系の構成要素が植え込み装置内の細胞に近づき破壊するのを防ぐ細孔を有していることが多い。
【０１８０】
細胞を封入する方法は当技術分野で多数知られている。例えば産生用に細胞を封入する半透性の水溶性ゲルを作成するための水溶性ゴムを用いた封入、および、その他の封入法は、米国特許第４，３５２，８８３号に開示されている。利用可能な他の植え込み装置については、米国特許第５，０８４，３５０号、米国特許第５，４２７，９３５号、１９９５年７月２７日に公開された国際公開公報第ＷＯ９５／１９７４３号、米国特許第５，５４５，４２３号、米国特許第４，４０９，３３１号、米国特許第４，６６３，２８６号および欧州特許第３０１，７７７号等に開示されている。
【０１８１】
トランスフェクションされた細胞、または第二世代の細胞を利用する利点は、個体に導入する細胞数を調節することによって、身体に送達されるタンパク質の量を調節できることである。また、産物が不必要になったトランスフェクションされた細胞を取り除くことが可能な場合もある。本発明のトランスフェクションされた第一世代のまたは第二世代の細胞を利用した治療の他の利点としては、亜鉛、ステロイドまたはタンパク質、産物または核酸産物の転写、または核酸産物の安定性に影響する薬剤の投与等によって、治療用産物の産生を制御できることが挙げられる。
【０１８２】
その他の態様
本発明は詳細な説明に記載されるが、上記の記載は、本発明の範囲について例を示すことが目的であり、これらに限定されるものではなく、本明細書の特許請求の範囲内で本発明が定義される。他の局面、利点および改変については添付の特許請求の範囲内に含まれる。
【０１８３】
本明細書に引用した全ての特許および参考文献はその全文が参照として本明細書に組み入れられる。他の態様については添付の特許請求の範囲内に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】誘導されたマウスの毛周期における血管の変化を示す。図１Ａは、発育早期（ＥＡ）（１日目）、発育中期（ＭＡ）（５日目）、発育後期（ＬＡ）（１２日目）、退縮期（Ｃ）（１８日目）および休止期（Ｔ）（２２日目）における血管が占める相対面積を示すグラフである。図１Ｂおよび１Ｃは、毛周期における血管のサイズ（図１Ｂ）および血管密度（図１Ｃ）の変化を示す同様のグラフである。図１Ｄ〜図１Ｆは、発育期の１日目〜１２日目（Ｄ１〜Ｄ１２）における表皮性密生（図１Ｄ）、毛包の直径（図１Ｅ）および真皮性密生（図１Ｆ）の変化を示す。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側独立スチューデントｔ検定（Ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔｓ ｔ ｔｅｓｔ）。
【図２】誘導された成獣の毛周期での毛包におけるＶＥＧＦｍＲＮＡの発現レベル（黒丸）と毛包周囲における血管形成の時間的相関（Ａ）、および生理学的に生後初めての毛周期（Ｂ）を示す。相対血管面積（白丸）を、発育後期の最大血管面積に対する割合として表す。
【図３】１２日目（Ａ、Ｂ、Ｃ）および１５日目（Ｄ、Ｅ、Ｆ）の、野生型の同腹子と比較したＶＥＧＦトランスジェニックマウスにおける毛根サイズ（ＡおよびＢ）、毛包周囲における血管新生（ＢおよびＥ）、および血管面積（ＣおよびＦ）の測定を示す。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側独立スチューデントｔ検定。
【図４】野生型のマウスと比較して最大径において測定したＶＥＧＦトランスジェニックマウス（ＴＧ）の毛幹の直径の定量的分析を示す。データは平均＋標準偏差（各々の遺伝子型につき、ｎ＝５０）、＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側独立スチューデントｔ検定。
【図５】抗ＶＥＧＦ抗体で全身的に処理したＣ５７ＢＬマウスにおける毛の再成長の遅延を示す。図５Ａは、対照処理した、および抗ＶＥＧＦ処理した、脱毛後１２日目のマウスの毛根の直径を示す。図５Ｂは、対照処理した、および抗ＶＥＧＦ処理したマウスにおける毛包周囲における血管サイズのグラフである。図５Ｃは、対照処理した、および抗ＶＥＧＦ処理したマウスにおける血管の占める相対面積を指すグラフである。＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側独立スチューデントｔ検定。
【図６】血管系の非存在下ではマウス触毛（ｖｕｂｒｉｓｓａｅ）の器官培養において、ＶＥＧＦが毛の成長に対し何らの効果も示さないことを表している。未処理対照（Ｃ１）と比較してＶＥＧＦによる処理（Ｖ）は、インビトロでの毛の成長に影響を与えなかった。対照抗体で処理した毛包（Ｃ２）と比較して、抗ＶＥＧＦ中和抗体による処理（Ｖａｂ）もまた、インビトロでの毛の成長に影響を与えなかった。陽性対照として５％ＦＢＳ（Ｐ）を添加した。ｎｓ＝有意な差なし；＊＊＊Ｐ＜０．００１、両側独立スチューデントｔ検定。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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