(57)【要約】基板１の調製法が開示されている。分子プローブの反応性基との反応性の部位を有する基板の調製方法であって、式Iの活性化されたエチレン性不飽和二重結合を有する１つまたはそれ以上の反応性部位を含む物質を基板表面に施す段階を含み：式I中、ｎ＝０、ｍ＝１、Ｘ3が炭素、かつＸ1が窒素であるとき、それらの間の結合は三重結合であり、Ｒ4は存在せず；ｎ＝１、ｍ＝１、Ｘ3が炭素、かつＸ1が酸素または硫黄であるとき、それらの間の結合は二重結合であり、Ｘ2は酸素または硫黄または有機置換体で置換された窒素であり；ｎ＝１、ｍ＝１または２、Ｘ3が硫黄、かつＸ1が酸素であるとき、それらの間の結合は二重結合であり、Ｘ2は有機置換体で置換された窒素であり；Ｒ1とＲ2はそれぞれ独立に水素、ヒドロキシルまたは有機性の基を示し、Ｒ3とＲ4はそれぞれ独立に水素または場合によってシリコン原子を含む有機性の基を示し、Ｒ1とＲ2はＲ4と結合していない。及び、更なる段階において、式１を有する反応部位の活性化されたエチレン性の不飽和二重結合に、分子プローブの反応性基を共有結合することを含む調製方法。好ましい活性化された不飽和部分は（メタ）アクリレート部分のような不飽和エステル部分を含む。好ましいプローブはその上にアミノ基を含む。好ましい強い結合は共有結合である。好ましい結合反応はＭｉｃｈａｅｌの付加反応である。その上に置かれたプローブを有する基板を標的との相互作用に使用し得る。本発明の他の態様は、そのように調製された基板および多反応系（例えばマイクロアレイ）;その使用、それから得られる製品および情報である。
2004534866.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分子プローブの反応性基と反応性である部位をその上に有する基板を調製する方法であって、式Ｉの活性化されたエチレン性不飽和二重結合を有する１つ又はそれ以上の反応性部位を含む物質を、基板表面に適用する段階：
2004534866.tif 000007
（式中、ｎ＝０、ｍ＝１、Ｘ3が炭素、かつＸ1が窒素であるとき、それらの間の結合は三重結合であり、Ｒ4は存在せず；
ｎ＝１、ｍ＝１、Ｘ3が炭素、かつＸ1が酸素又は硫黄であるとき、それらの間の結合は二重結合であり、Ｘ2は酸素又は硫黄又は有機置換体で置換された窒素であり；
ｎ＝１、ｍ＝１又は２、Ｘ3が硫黄、かつＸ1が酸素でるとき、それらの間の結合は二重結合であり、Ｘ1は有機置換体で置換された窒素であり；
Ｒ1とＲ2はそれぞれ独立に水素、ヒドロキシル又は有機性の基を示し、Ｒ3とＲ4はそれぞれ独立に水素又は場合によってシリコン原子を含む有機性の基を示し、Ｒ1とＲ2はＲ4と結合していない。）
及び、更なる段階において、式Ｉを有する反応部位の活性化されたエチレン性の不飽和二重結合に分子プローブの反応性基を共有結合させることを含む、方法。
【請求項２】
式Ｉの物質がアクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、アクリロニトリル、ビニル性スルホンアミド、ビニル性スルホン、ビニル性スルホキシド及びＣ1-4アルキルシランのアクリレートを含む群から選ばれる、請求項１の方法。
【請求項３】
該基板がナイロン、ポリスチレン、ガラス、シリコンウエハ、ラテックス、ポリプロピレン、ポリカーボネート及びポリエステルを含む群から選ばれる、請求項１及び請求項２のいずれかの方法。
【請求項４】
該分子プローブがＤＮＡ、ＲＮＡ、ビオチン、トキシン、除草剤、殺虫剤、炭水化物、薬物標的、抗生物質、細胞毒、ステロイド、ペプチド、ヌクレオチド、ペプチド核酸、結合パートナー、蛋白及びハプテンを含む群から選ばれる、請求項１から請求項３までのいずれかの方法。
【請求項５】
該反応部位の二重結合と反応する該分子プローブの反応性基がアミノ基である、請求項１から請求項４までのいずれかの方法。
【請求項６】
該分子プローブの反応性基によって更に反応される、未反応の活性化された不飽和二重結合を残すように、式Ｉの反応性部位が基板上で熱又は照射により重合される、請求項１から請求項５までのいずれかの方法。
【請求項７】
ポリマー前駆体が基板上で重合され未反応の機能性基を残し、該未反応の機能性基は、それと反応できる基（活性化された不飽和二重結合以外）を有する式Ｉの反応性部位と反応させられ、該活性化された不飽和二重結合はさらに分子プローブの反応性基と反応させられる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
該分子プローブとの反応の前に、該ポリマーがポリウレタン（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル（メタ）アクリレート、ポリエステル（メタ）アクリレート、エポキシ（メタ）アクリレート、樹状及び／又は高度分枝ポリエステル（メタ）アクリレート及び又はポリウレタンアクリレート、シリコーン（メタ）アクリレート及び／又は（メタ）アクリル化アミンからなる群から選ばれる、請求項７の方法。
【請求項９】
式Iの反応性基がヒドロキシ基を有する基板に直接、式Iのヒドロカルビルハロゲノシランアクリレートのハロゲノシラン基との反応によって付着され、活性化された不飽和二重結合が分子プローブの反応性基とさらに反応させられる、請求項１から請求項８までのいずれかの方法。
【請求項１０】
請求項１から請求項９までのいずれかによるマイクロアレイの方法であって、該マイクロアレイが、膜、ミクロウェル、遠心管、フィルム及びスライドからなる群から選ばれる物質の上に支持されている方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応性基板の改良に関し、それは、例えば標的分子と相互作用する多反応系において使用するための、基板に結合されたプローブを有する機能化された基板を形成するために利用できる。本発明の態様は基板の表面をその上の分子（例えば分子プローブ）の共有結合のために化学的に修飾する方法；該方法によって得られる及び／又は得られ得る基板；該基板を使用して多反応系を調製する更なる方法；該方法によって得られる及び／又は得られ得る多反応系；該多反応系の分析及び／又は合成における使用；該多反応系を使用して直接及び／又は間接的に合成された製品；及び／又は該多反応系から得られた情報の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本明細書中の実施形態において、該多反応系はマイクロアレイ（例えばバイオチップとしても知られているＤＮＡマイクロアレイ）であってもよい。プローブはＤＮＡ配列及び／又はオリゴヌクレオチドであってもよく、そのように得られた情報は（生）化学及び／又は生物学的情報であってもよい。本発明の多反応系の他の使用にはハイスループットスクリーニングが含まれる。
【０００３】
マイクロアレイは多反応系の１例であって、少容量のサンプルと試薬を使用して何千もの検出と分析の実験を平行して実施できる強力な道具である。そのような大規模の平行技術は、例えばスクリーニングの目的で多くの実験をしたい時及び／又は複雑な過程を分析及び／又は理解したい時、科学者にとって魅力的である。
【０００４】
そのような使用の１つは、ＤＮＡ配列の同定と遺伝子発現の分野にある。ＤＮＡバイオチップが利用できるようになるまでは、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に基づいた古典的な技術では、一度に１つの遺伝子の発現を検出又は試験できるだけだった。そのような技術は“Ｌｅ  Ｔｅｃｈｎｏｓｃｏｐｅ  ｄｕ  Ｂｉｏｆｕｔｕｒ，  １７１，ｐｐ．３−９（１９９７）の”Ｌ“Ａｖｅｎｉｒ  ｄｅ  ｌａ  ＰＣＲ：Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｅｔ  ｄｅｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ“に記載されており、引用によりその開示を本明細書に組込む。これと比べて、ＤＮＡチップは一度に数十万の遺伝子の分析を可能にする。
【０００５】
「多反応系」、「マイクロアレイ」、「チップ」及び／又は「バイオチップ」などの用語は、本明細書中で、同じ又は類似した構造及び／又は基本原理を有する系及び／又は装置を指すために使用され、互換性をもって使用されていることを理解すべきである。バイオチップは生物学的に活性な分子とともに使用するチップを指す。ＤＮＡ  マイクロアレイ、ＤＮＡバイオチップ及びＤＮＡチップはすべて、その上のプローブがＤＮＡ配列又はオリゴヌクレオチドに基づいているチップを指す。本明細書中では、大部分の例はＤＮＡチップを指し、接頭語ＤＮＡを省略する場合がある。
【０００６】
マイクロアレイのような多反応系を可能にする基本原理は、１つ又は一連の基板上に、任意によりその上のパターン内に、選択的かつ永続的に種々の化学分子種（例えばプローブ分子）を結合する能力である。そのような基板は、結合した分子種が基板に強固に結合したまま、更にその環境と相互作用できる用途に使用できる。これらの基板は、基板（及び／又は一連の基板）に結合している一連の全体の分子種について、関心のある所与の性質を測定及び／又は分析（適切な装置を用いて）するのに使用し得る。
【０００７】
これはＤＮＡバイオチップにより使用されるハイブリッド形成過程によってより詳細に示されている。この過程で、単鎖ＤＮＡ断片とその相補的配列が同時に存在する時は、単鎖ＤＮＡ断片は、その相補的配列と選択的に結合する。実際のＤＮＡバイオチップは捕獲プローブとも呼ばれる数十万にものぼる単鎖ＤＮＡ配列の規則的な配列で覆われた表面を含む。単鎖ＤＮＡ断片は、オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ又はＤＮＡ断片であってよい。ついで、チップは標的とも呼ばれる未知であるが標識されたＤＮＡ配列の懸濁液に曝露される。標識された標的は、それがチップ上にあれば、捕獲プローブ中のそれらの相補的な配列と結合する。従って、注意深い洗浄の後、標識は標的サンプルからの断片がその相補的な捕獲プローブを見つけた部位だけに標識が見られる。各捕獲プローブの配列（従ってその相補的標的の配列）はその位置から決定できるので、標的サンプルの遺伝的内容についての情報を収集することが可能である。前述の原理に基づいたＤＮＡチップは多くの異なった用途に使えるようにデザインできる。例えば、個体が所与の物質に曝露されるにつれて、遺伝子発現がどのように変化するかを決定することが可能である。そのような実験は新薬の潜在的副作用を決定するために医薬品産業で興味のあることである。ＤＮＡチップは、例えば感染の原因になっている細菌の正確な株を決定する診断の道具として使え、最適の抗生物質が患者に与えられる。そのような用途にデザインされたＤＮＡチップは現在使用されているあらゆる試験に比べてより早くより特異的であることが判る。ＤＮＡマイクロアレイはまた、遺伝子の複雑なパターンが時に単に１つの塩基対によって識別される、遺伝疾患の分野で役に立つ。より基礎的な研究での応用において、マイクロアレイは引き続き、遺伝子配列決定の研究及び他の生物学の分野において、細胞の一生を支配している複雑な過程を詳細に理解するために選択される道具であり続けるであろう。
【０００８】
ハイブリッド形成は分子間で行いうる単に１つの型の相互作用であり、数千の平行実験を実施するコンセプトは他の領域に応用できる。例えば、ＤＮＡチップはある物質に曝露された細胞内で何が進行しているかについて洞察を与えることができるが、ある種の情報は遺伝子発現の研究から得られない。例えばｍＲＮＡ又は蛋白レベルで生じる因子は事を複雑にする。従って、蛋白レベルの用量変化を、直接同定するために使用される蛋白チップは興味深い。
【０００９】
非生物学的分子を使用する他の型のプローブもまた興味深い。例えば、ハイスループットスクリーニングに使用されるために、マイクロアレイは選択された活性化学物質で覆われ、ついでその種々の性質及び／又はサンプルとの種々の化学的及び物理的相互作用を研究できる。
【００１０】
現在特にＤＮＡバイオチップとして有用なマイクロアレイを作る２つの異なる方法があるが、いずれにも欠点がる。
【００１１】
ＤＮＡチップを作るために使用された最初の方法の１つはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘによって開発され、ａｒｒａｙを形成するすべての分子の合成をｉｎ  ｓｉｔｕで逐次（例えばオリゴヌクレオチドについて塩基ごとに行う）に行うことに基づいている。用いられた技術は、半導体製造産業から借り、マイクロアレイに曝露される次の塩基が、その隙間に適合するかしないかによって各位置を選択的に活性化するためにフォトリソグラフィーを使用する。そのような技術は約２０塩基対よりも長いオリゴヌクレオチド及び／又はＤＮＡに関して使用される限定されたサイズのプローブだけを許容し、製造の各段階で導入される組み合わされた誤差のために信頼性のある製品を作ることが困難になる。更にこの技術は厄介で、時間がかかり、通常の実験室の環境での再現が困難で、高価で及び／又は柔軟性がない。マイクロアレイの非ＤＮＡ利用には更に、写真平板は特に不適切である。それは、光保護基には、通常使用される（単量体を含む）化学試薬及び／又はプローブ上の光の影響を受けやすい基を保護することが要求されるからである。光から保護された構築ブロックの広範な組を作ることは有機化学工程において実際的でない。
【００１２】
マイクロアレイを調製する第二の方法は、最近有名になった所謂デリバリー法である。デリバリー法では、プローブ又はＤＮＡ断片は基板に直接移植される。これらは最初適切な担体媒体に懸濁され、適切な方法で基板上の所望の位置に小さな液滴として置かれる。通常の液滴の容積はナノリットル（１ｘ１０-9ｌ）又はピコリットル（１ｘ１０-12ｌ）でさえある。液滴を置く適切な手段は直接の接触（例えばミイクロスポティング）及び／又はインクジェット印刷等である。小さな液滴を置くことは有利であるが、機能的マイクロアレイを達成するには、小さな液滴が蒸発するに要する時間内にＤＮＡプローブが、基板に反応する（好ましくは共有結合によって）ことを確実にするように基板が調製されることが重要である。デリバリー法の詳細はＥａｔｏｎ出版（Ｎａｔｉｃｋ，  ＭＡ，ＵＳＡ）発行のＭａｒｋ  Ｓｃｈｅｎａ著Ｍｉｃｒｏ−ａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙに記載されている。引用によりその内容を本明細書に組込む。
【００１３】
マイクロアレイを調製するために用いられる方法にかかわらず、適切に機能するためには、マイクロアレイ上のプローブが十分強固にマイクロアレイ基板に結合していることが重要である。不動化されたプローブは異なった加工段階（例えばＤＮＡプローブとともに使用されるハイブリッド形成、洗浄及び／又は分析段階）の間、脱着してはならない。これらの要求を満たすために、基板とプローブの間の共有結合が結合の様式として好ましい。プローブが強固に結合しているマイクロアレイは、プローブを更なる加工段階（例えばＤＮＡハイブリッド形成）に付し易いので、マイクロアレイの感度を改善するので有利である。
【００１４】
このような理由から、プローブをマイクロアレイの基板に共有結合で結合する多くの試みがなされてきた。例えば、Ｎ．Ｚａｍｍａｔｅｏ等（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２８０，  ｐｐ．  １４３−１５，２０００）はガラス基板の特殊な場合に使用される現行の技術を比較した。試験された系はアミノ化されたガラスに結合されたリン酸化ＤＮＡ；カルボキシル化されたガラスに結合されたアミノ化されたＤＮＡ；アルデヒド機能性ガラスに結合されたアミノ化されたＤＮＡ等である。著者等はアミノ化されたＤＮＡをアルデヒドで修飾した表面に固定することがカップリング剤の非存在下でのカップリング収率と反応速度の点でＤＮＡマイクロアレイを形成する最良のカップリング手順であると結論した。アルデヒド機能性基板のアミノ化されたプローブとの反応は、効果的ではあるが、形成された炭素―窒素結合を安定化するための余分な還元段階を要する欠点がある。アルデヒド基とアミノ基間の初期反応でプローブを表面に強固に結合するイミン基（Ｃ＝Ｎの二重結合からなる）が形成されるが、この反応は使用されるマイクロアレイで経験される多くの条件下で可逆的である。従って、基板にプローブを共有結合で結合し、より不可逆に結合するために、イミン基は更なる段階でアミン基（より耐性であるＣ−Ｎ単結合を含む）へと還元されなければならない。更なる問題は、典型的なアルデヒド官能基が長期の貯蔵及び使用の間に、基板上での安定性が不十分であることである。従ってアルデヒドで機能化した基板は多数の加工段階を要し、プローブをグラフトし、抵抗性のある基板を提供するために必要な安定性と反応性の間の最適のバランスを欠く。改良された結合系が今尚望まれている。既存のマイクロアレイには多くの他の問題が残っている。向上した機能及び／又は反応部位密度及び／又はグラフト密度を有するマイクロアレイを得ることは困難である。マイクロアレイの感度を改善するためには、マイクロアレイは単位面積あたり、できるだけ多くのプローブを有することが望ましい。基板上の反応部位及び／又は機能性は再現性があり、適合性のある方法で得られることもまた重要である。
【００１５】
いかなる機構にも束縛されることを望まずに、上述の問題の幾つか又は全部を解決する１つの方法は、その中にプローブが使用されている担体の媒体が乾燥する時間を持つ前に、プローブと基板の間の結合（好ましくは共有結合）が十分に早く形成されるように、それに曝露されるプローブと十分な速度で化学的に反応することができる機能化された基板を提供することであると考えられている。この問題は、プローブが、担体の媒体の小さな液滴で表面に適用される場合の特別な問題である。なぜなら、そのような液滴は非常に早く乾燥するからである。適切な基板は、使用中に基板が経験する条件下で実質的に不可逆な方法でプローブと反応しなければならない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明によって任意により取り扱うことができる更に１つの問題は、プローブの化学物質（例えば今日使用されている通常のＤＮＡプローブ）と基板の化学物質の間の正しい組み合わせを提供することである。それによって両者を機能化することが可能である。本発明によって解決される他の任意の問題は、初期の加工段階及び／又はプローブの結合に先立つ環境中の正常な貯蔵条件下で、安定である機能化された及び／又は反応性の基板を提供することである。従って、プローブに対する高い反応性と貯蔵又は使用中の安定性の間の適正なバランスを有する基板を見つけることは容易ではない。従って本発明の他の任意の目的は、プローブが共有結合で強固に結合できる表面を有し、プローブが取り付けられる前後とも、貯蔵及び使用の条件下で安定な基板を有するマイクロアレイを提供することである。そのような基板が周知の方法によって製造されるならば、すべての方法がすべての基板と適合する訳ではないので、使用できる基板の材料には厳格な制限がある。現在使用されている大部分のマイクロアレイはガラスの基板でできている。ガラスには多くの有利な性質があるが、例えばガラスは容易に所望の形状に製造できない欠点がある。チップ上の集積実験室（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）のような開発及び／又はミクロ液体技術との使用には、ガラスよりも幅広い性質を有する基板が必要である。高分子は、例えば成型によって任意の所望の形状に容易に加工できるので、そのような用途には選択対象になる基板である。従って非ガラス基板との使用に適した方法を提供することは、マイクロアレイの改善に繋がるので任意により望まれる。従って本発明の他の任意の目的は高分子基板上に、本明細書中に述べた幾つかの又は全部の利点を有するマイクロアレイを提供することである。
【００１７】
本発明の他の任意の目的は、結合したプローブ（任意によりＤＮＡ）の密度（即ちグラフト密度）が非常に高いマイクロアレイを提供することである。再現性のある方法で得られ、使用者のニーズによって容易に修正できるグラフト密度が向上した基板を提供することもまた本発明の任意の目的である。機能化された及び／又は反応性の基板はミクロ液体系とともに使用してもよく、従ってそのような系に適した基板を提供することは、本発明の更なる任意の目的である。
【００１８】
従って、従来の技術のマイクロアレイに確認された前述の問題の幾つか又は全部を取り扱うことが、本発明の最も幅広い態様の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
従って、本発明に従って、分子プローブの反応性基と反応性の部位をその上に有する基板の調製方法であって、式Ｉの活性化されたエチレン性不飽和二重結合を有する１つ又はそれ以上の反応性部位を含む物質を基板表面に施す段階：
2004534866.tif 000003
（式中、ｎ＝０、ｍ＝１、Ｘ3が炭素かつＸ1が窒素であるとき、それらの間の結合は三重結合であり、Ｒ4は存在せず；
ｎ＝１、ｍ＝１、Ｘ3が炭素かつＸ1が酸素又は硫黄であるとき、それらの間の結合は二重結合であり、Ｘ2は酸素又は硫黄又は有機置換基で置換された窒素であり；
ｎ＝１、ｍ＝１又は２、Ｘ3が硫黄、Ｘ1が酸素であるとき、それらの間の結合は二重結合であり、Ｘ2は有機置換基で置換された窒素であり；
Ｒ1とＲ2はそれぞれ独立に水素、ヒドロキシル又は有機性の基を示し、Ｒ3とＲ4はそれぞれ独立に水素又は場合によってシリコン原子を含む有機性の基を示し、Ｒ1とＲ2はＲ4と結合していない。）
及び、更なる段階において、式１を有する反応部位の活性化されたエチレン性の不飽和二重結合に分子プローブの反応性基を共有結合する段階を含む調製方法、が提供される。
【００２０】
本発明に従って、基板上に位置する反応部位と分子プローブの間の結合反応は少なくとも下記の特徴の１つを有する。
（ｉ）結合反応は十分速く、使用される方法の条件下で反応は実質的に完全である；
（ｉｉ）反応は一回の段階で分子種と基板の間に強い結合を形成する；及び／又は
（ｉｉｉ）分子種と基板の間の結合は、基板の使用条件下で実質的に不可逆である。
【００２１】
本明細書中で使用しているように、「反応性基板」はその表面上に置かれた式Iの遊離反応性部位の有効濃度を有する基板を示す。基板は任意によりマイクロアレイのような多反応系における使用に適している。
【００２２】
本明細書中で使用しているように、分子プローブはＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白、ビオチン、毒素、除草剤、殺虫剤、炭水化物、薬物標的、抗生物質、細胞毒、ステロイド、ペプチド、ヌクレオチド、ペプチド核酸、結合相手、ハプテン、その他のような生物学的分子である。本発明の１つの実施態様において、多反応系において使用される最終的なプローブは、基板上の反応部位に結合した第一のプローブに連続した（例えば鎖で）仕方で結合した１つ又はそれ以上の様々な他の分子種を含むことができる。このような仕方で、任意の所望の性質を有するプローブを、たとえそれらが基板上の反応部位への直接の結合に適さない（及び／又はそのように修飾できない）場合でも、使用できる。
【００２３】
担体の媒体は任意により、例えば分子プローブが分散できる液体のような、液体である。
【００２４】
該液体及び／又は分子種は液滴の形で適用されるのが好ましく、マイクロスポッティング及び／又はインクジェットプリンティング、（例えば熱及び／又はピエゾインクジェットプリンティング、例えばピエゾ）の様な方向付けられた方法で、例えば１ナノリッター以下の平均液滴容量で適用されるのがより好ましい。
【００２５】
結合反応は、任意により担体の液体が蒸発する前に実質的に終了するような十分に早い方法で起きる（例えば、担体の液体が液滴として適用される場合）。
【００２６】
「強固に結合」及び／又は「強固に取り付く」と言う用語は本明細書に使用されているように、マイクロアレイ及び／又は基板が使用される条件下で（及び他の試薬を用いる場合）除去に対して実質的に抵抗性であることを意味する。これは好ましくは分子プローブが共有結合で反応部位と結合していること、より好ましくはプローブ結合に対する反応部位あたり平均で少なくとも一つの共有結合を介していることを意味する。そのように形成された結合がマイクロアレイの使用条件下で実質的に不可逆であり及び／又は実質的に不可逆な反応によって形成されることがより好ましい。好ましい共有結合は炭素−炭素及び／又は炭素−窒素結合であり、例えばＣ−Ｎの一重結合のような飽和結合がより好ましい。
【００２７】
反応部位は基板表面自身に本来備わっているものであることができ、その場合本発明の方法における基板の使用に対して前処理の必要はない。替わりに、又は同様に、反応部位はそのような反応部位を含む他の物質の形で加えられてもよく、それは基板上に、例えばコーティングとして加えられる。反応部位を含む物質を使用する利点は基底支持基板の選択の幅をはるかに広げることが可能になることである。
【００２８】
従って、方法が更に基板に反応部位を含む物質を施し、固定する段階を含むことが好ましい。その物質がコーティング組成物及び／又はゲルであることがより好ましい。その物質が重合可能であり、基板上でｉｎ  ｓｉｔｕにその物質を重合しその上にコーティングを形成する段階があることがより好ましい。そのコーティングが重合過程で生き残る反応部位を含むことが好ましく、マイクロアレイのような多反応系での使用に、十分な分子プローブをそれに強固に結合する十分な濃度であることが最も好ましい。
【００２９】
本発明はまた、本発明の製法中で処理されるのに適した基板を含み、そのような基板はその上に本来備わっている反応性部位を含む基板及び／又はその上の反応部位を含む物質を含む基板である。
【００３０】
本明細書中に使用されているように、基板は任意の適切な支持体を示し、本明細書中に記載されているように、それに結合した分子種を支持できる任意の適切な物質を含み、平坦、粗い、及び/又は湾曲のような任意の適切な形状であってよい。そのような支持体は例えば膜、マイクロウェル、多ウェルプレート、遠心分離管、フィルム、顕微鏡スライドであってもよい。
【００３１】
本発明の基板は実質的に平坦な、自己支持型シートのような２次元であることができる。しかし、例えば２−Ｄの外表面及び／又は適切な物質の任意の製品上のその部分のような、他の適切な非平坦な基板もまた使用できる。
【００３２】
基板はまた、表面が製品及び／又はその一部の外部空間における及び／又は内部空間内の任意の曝露した表面と考えられるべき３次元であってもよく、例えば多孔性物質の製品及び／又は製品上の多孔性コーティングである（例えば焼結ガラス）。多孔性は、製品がその曝露したその表面（その空間及び／又は隙間）を機能化するために、本明細書に記載した適切な担体成分で容易に含浸できるようでなければならない。使用できる他の３−Ｄ基板は、例えばヒドロゲル及び／又はアエロゲルのような、分散相としてガスを有するディスパージョンのような非常に開いた及び／又は表面積が大きい物理的な形状中の物質（基板自体として及び／又はこの上のコーティングとして）を含む。３-Ｄ基板では、外部面積の単位の替わりに、単位体積又は単位表面積あたりのグラフト密度（脱着のような任意の技術により測定される）を測定することが好ましい。
【００３３】
本明細書中に記載した所望の平行性は多数の方法で達成できる。多反応系の用語は本明細書中に使用されているように、平行して処理できる一連の多数の反応部位を提供し、例えばしばしば化学的に類似した反応を同時に行うのに使用できる系を広く示す（例えば大きな平行系）。したがって、広義には多反応系は下記の少なくとも２つの異なった型の系を包含する。本明細書中に使用しているように、本発明の最も広義の態様では、「マイクロアレイ」の用語は適切ならば、「多反応系」の用語で置き換えてもよい。広義には、同じ調製技術及び化学品（本発明のマイクロアレイに関連して本明細書中に記載したようなもの）を当業者に理解できる任意の修正をして、本発明の任意の多反応系に使用できる。
【００３４】
本発明の多反応系の第一の型は、例えば、その上に離れているが一緒に結合した及び／又は近接した部位（それは多機能及び／又は不均一に機能化され及び／又はその上にパターン化されている）を多数含むマイクロアレイのような単一の装置の一部として機能化された基板を含む。例えばアレー中のパターンにおけるその場所から部位の性質に関する情報が得られる。この型の系の特別な例は、予め配列されたパターンで、その上に固定されたプローブを有する異なった部位の格子を、その表面上に含む平坦なシート（例えばガラス又は高分子のスライド）である。次いで、標的となる種が、格子全体に暴露される。
【００３５】
本発明の多反応系は、その系が、各基板（及び／又はその群）が反応部位及び／又はプローブ及び／又は特別な組み合わせ及び／又はその混合物の性質のために、環境と異なる反応をすることができる多数の（好ましくは小さな又はミクロサイズの）機能化された一連の基板（任意により非平坦な表面が機能化された種類）を含む及び／又はそれら一連の基板から形成される系である第二の型を含むことができる。例えば各基板は、各基板（又は基板の各群）は異なるが、その上に固定された単一の部位及びプローブ（均一な反応性）を含むことができる。選択された性質を有する分子種の統計解析及び／又は分離によって情報が得られる（例えばある性質を有する分子種の数及び／又は分散を測定でき、及び／又はある性質を有する分子種を集めることができる）。そのような基板の混合物はｉｎ  ｓｉｔｕで調製されることによって一緒に形成でき及び／又は別に調製され、その後、使用前に所望の割合で混合できる、複数の基板を含むことができる。
【００３６】
従って、多反応系の有用性は、その環境に異なった相互作用をする多数の成分を含み、従って実質的に同時に（平行して）実施される多くの実験を可能にすることである。上に記載したように、これはその上の定められた位置に異なった性質を有するマイクロアレイにより及び／又はその上でそれぞれ均一に機能化されているが各々が異なる性質を有する、分子種の集団によって例示される２つ型の系によって達成できる。
【００３７】
マイクロアレイは、基板の表面を含む及び／又は基板の表面に施される物質（例えばコーティング又はゲル）から調製され、該物質は反応性部位を含む。該反応性部位と反応性の化学基を含む有機プローブは、その後、適切な反応によって該物質と強固に結合（好ましくは共有結合によって）できる。その物質は、重合後、それに有機プローブを強固に結合する十分な反応性部位が残っているように、それが結合する（又はそれが形成する）基板上で重合されることが好ましい。その物質が該反応性部位を含む分子を含むことも可能である。その物質は基板にグラフトされることができ及び／又は基板の表面の一部を形成しても良い（即ち、基盤は更にコーティングする必要なく、反応性部位を固有に含む）。
【００３８】
最初と同じか異なっていてもよい同一の位置で、他の反応部位を形成するために、多機能性（好ましくは２機能性の）結合分子種と反応できる基板上に反応部位を持つことが可能である。例えば、基板上のヒドロキシ基の機能性部位はイソシアナト（メタ）アクリレートと反応して、結合しているウレタン（メタ）アクリレートを介して、基板の表面に、その上で結合している遊離（メタ）アクリレート部分を有する新しい反応性部位を与える。このような方法で機能化された基板はまた本発明を構成し本明細書に記載したように使用できる。
【００３９】
基板は先ず、活性化された不飽和部分を含む重合可能な組成物でコーティングされる。コーティングは第二の段階で、活性化された不飽和部分がコーティング上に残るように重合される。第三の段階では、活性化されたエチレン的に不飽和な二重結合と反応性の基を含む有機プローブと付加反応で反応するためにコーティングされた基板が作られる。
【００４０】
本発明の他の態様は、分子プローブをその上に有する本明細書に記載した１つ又はそれ以上の機能化された基板を含む多反応系を提供する。
【００４１】
本発明の更なる態様は多反応系を使用する製法であって、その製法が本明細書に記載した１つ又はそれ以上の機能化された基板に、任意により１つ又はそれ以上の担体媒体に分散された標的分子を適用する段階を含む製法を提供する。
【００４２】
標的は、標的及び／又はそれが由来する媒体及び／又は多反応系が曝露されている及び／又は曝露されていた環境に関する情報を提供するために使用できる。
【００４３】
多反応系が単一の基板（例えば、マイクロアレイ）を含み、その活性化不飽和部分及び／又はその補体がその上に、例えば２-Ｄ格子のような事前に選択されたパターンでデポジットされていることが好ましい。
【００４４】
本明細書に記載したように、得られる及び／又は得られ得る多反応系（例えば、マイクロアレイ）は本明細書に記載したような基板に強固に結合した分子に対し相補な有機分子に関する情報（例えば、構造、濃度、及び/又はその他の有用な化学的、生化学的、及び/又は生物学的情報）の測定に使用できる。マイクロアレイはまた、マイクロアレイが曝露されている液体中の１つ又はそれ以上の選択された分子種に、選択的に結合するために使用できる。これは、例えば生物活性分子種（例えばプローブが生物活性抗体を有する場合）を不活性化又は標的化することが望まれる場合に有用である。
【００４５】
本発明の他の非制限的実施態様（本明細書中の何処かに示されたもの）は、本発明の基板及び/又は多反応系の、以下の分野及びその可能な組み合わせを含む使用のいずれか及び/又はすべてにおける使用を含む。
【００４６】
本発明の基板はｃＤＮＡ及びオリゴヌクレオチドチップ、生化学的免疫アッセイ、プロテオミクス、遺伝子発現、薬物標的同定、薬理遺伝学、薬物／毒素活性予想、治療標的の発見及び薬物治療の改善、生物学的試料の分析、蛋白―蛋白相互作用、蛋白薬物標的の化学物質のスクリーニングのような用途に用いられる。
【００４７】
他の用途は、下記のものの（存在及び/又は濃度についての）検出及び/又はアッセイである：
不純物、混入物、反応副産物、ミクロフローラ、 ミクロフアウナ、病原体及び/又は望ましくない成分である。例えばミルク又は肉のような食品において、遺伝子組換物質、抗生物質及び/又はホルモンのような物質を検出することは望ましい。従って、本発明は品質保証の改良及び/又は製品中の成分の標識の提供に使用できる。
【００４８】
更に他の用途は、動物及び/又はヒトでの病気及び/又は障害のような生物学的、医薬品的及び/又は動物学的状態の検出及び/又は検査に；及び/又は診断手段、治療、そのための治療及び/又は予防の提供に；及び/又は任意の医薬品及び/又は動物用途及び/又は例えばＤＮＡ−ＲＮＡ及び/又はＲＮＡ−ペプチド相互作用研究に有用である。
【００４９】
本発明の他の態様は基板の調製方法であって、基板が１つ又はそれ以上の活性化された不飽和部分を含む重合可能な組成物でコーティングされ；ついで活性化された不飽和部分がコーティング上に残るような方法でコーティングが重合され；更なる段階で、コーティングされた基板が、付加反応により、活性化された不飽和部分と反応性のある基を含む有機プローブと反応してもよい、上記方法を提供する。
【００５０】
本発明の他の態様は、マイクロアレイを調製する方法であって、コーティング組成物が基板の表面に堆積されてもよく；ついでコーティング組成物をｉｎ  ｓｉｔｕで重合し、重合後活性化された不飽和部分を含むコーティングをその上に形成でき；その後活性化された不飽和部分と反応性の化学基を含む有機プローブをそれに付加反応で共有結合的に結合してもよい、方法を提供する。
【００５１】
本発明の他の態様は、その表面に活性化された不飽和付加反応によって強固に結合した有機プローブを含む基板であって、該有機プローブが基板上でパターン及び/又はマイクロアレイとして配列及び/又は置かれている有機プローブ基板を提供する。この明細書を通して「活性化された不飽和部分」は、少なくとも１つの活性化部分に化学的に近接した少なくとも１つの炭素―炭素二重結合を含む種を示すために使われる。この種は式１により表される。活性化部分は適切な求電子基によって、エチレン性不飽和二重結合を、その上に付加が生じるように活性化する任意の基を含むことが好ましい。便宜的に、活性化部分はオキシ、チオ、（任意により有機置換された）アミノ、チオカルボニル、及び/又はカルボニル基（任意によりチオ、オキシ、又は（任意により有機置換された）アミノ基で置換された後者の２つの基））。それらはまたスルフォンアミド、スルフォン及びスルフォキシド基を含む。より便利な活性化部分は（チオ）エーテル、（チオ）エステル及び/又は（チオ）アミド部分である。最も便利な「活性化された不飽和部分」は１つ又はそれ以上の「ヒドロカルビルイデニル（チオ）カルボニル（チオ）オキシ」及び/又は１つ又はそれ以上の「ヒドロカルビルイデニル（チオ）カルボニル（有機）アミノ」基及び/又は類縁体及び/又は（メタ）アクリル官能及び/又はその誘導体を含む誘導部分、を示す「不飽和エステル部分」を含む。「不飽和エステル部分」は任意により置換された一般のαβ不飽和酸、エステル及び/又はそのチオ誘導体及びその類縁体を含む他の誘導体を任意により含んでもよい。
【００５２】
活性化された不飽和部分は式１で表されるものである。
2004534866.tif 000004
（式中、ｎ＝０、ｍ＝１、Ｘ3が炭素、かつＸ1が窒素であるとき、それらの間の結合は三重結合であり、Ｒ4は存在せず；
ｎ＝１、ｍ＝１、Ｘ3が炭素、かつＸ1が酸素又は硫黄であるとき、それらの間の結合は二重結合であり、Ｘ2は酸素又は硫黄又は有機置換基で置換された窒素であり；
ｎ＝１、ｍ＝１、Ｘ3は炭素、かつＸ1は酸素又は硫黄であるとき、それらの間の結合は二重結合であり、Ｘ2は酸素又は硫黄又は有機置換基で置換された窒素であり；
ｎ＝１、ｍ＝１又は２、Ｘ1が硫黄、かつＸ1が酸素であるとき、それらの間の結合は二重結合であり、Ｘ2は有機置換基で置換された窒素であり；
Ｒ1とＲ2はそれぞれ独立に水素、ヒドロキシル又は有機性の基を示し、Ｒ3とＲ4はそれぞれ独立に水素又は場合によってシリコン原子を含む有機性の基を示し、Ｒ1とＲ2はＲ4に結合していない。
【００５３】
本明細書中、式Ｉは個々の化学種（例えば、化合物、イオン、遊離基、オリゴマー及び/又はポリマー）及び/又はその任意の部分であってもよいと理解される。従って式Ｉはまた多価（好ましくは二価）ラジカルを表しても良い。従って本明細書中でＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5について与えた選択肢は、対応した二価又は多価ラジカルも任意により包含する。
【００５４】
式Ｉ（その異性体及び混合物を含む）のより好ましい部分はｎ＝１であり、Ｘ1がOであり、Ｘ2がＯ、Ｓ又はＮＲ5、Ｘ3が炭素であるものである。Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立に水素、任意の置換基及び任意により置換されたＣ1-10のヒドロカルボから選ばれ、及びＲ5は水素及び任意により置換されたＣ1-10のヒドロカルボから選ばれる。
【００５５】
最も好ましくはｎ＝１であり、Ｘ1がＯ、Ｘ2がＯ又はＳ、Ｘ3が炭素であり、Ｒ1、Ｒ2
、Ｒ3及びＲ4はそれぞれ独立に水素、ヒドロキシ及び/又は任意により置換されたＣ1-6の
ヒドロカルビルである。Ｒ4はまたＣ1-6のヒドロカルビルアルコキシシランであってもよい。
【００５６】
例えば、ｎ＝１、Ｘ1及びＸ2がいずれもＯであり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は独立にＨ、ＯＨ及び/又はＣ1-4アルキル又はＲ4はＣ1-4アルキルシランである。
【００５７】
ｎ＝１であり、Ｘ1及びＸ2がともにＯであり、Ｘ3が炭素である式Ｉの部分に関し：（Ｒ1とＲ2）の１つがＨであり、またＲ3もＨであるとき、式Ｉはアクリレート（Ｒ1とＲ2がともにＨである場合）及びその誘導体（Ｒ1とＲ2のいずれかがＨでない場合）を包含するアクリレート部分を表す。同様に（Ｒ1とＲ2）の１つがＨであり、またＲ3もＣＨ3であるとき、式Ｉはメタクリレート（Ｒ1とＲ2がともにＨである場合）及びその誘導体（Ｒ1とＲ2のいずれかがＨでない場合）を包含するメタアクリレート部分を表す。
【００５８】
式Ｉの部分は、ｎ＝１であり、Ｘ1及びＸ2がともにＯであり、Ｘ3が炭素であり、Ｒ1及びＲ2がそれぞれ独立して水素、メチル又はＯＨであり、Ｒ3がＨ又はＣＨ3であるのが都合がよい。
【００５９】
式１の部分は、ｎ＝１であり、Ｘ1及びＸ2がともにＯであり、Ｘ3が炭素であり、Ｒ1がＯＨであり、Ｒ2がＣＨ3であり、Ｒ3がＨであり、及び／又はその互変異性体(例えばアセトアセトキシ官能性分子種)であるものがより都合がよい。
【００６０】
最も都合のよい不飽和エステル部分は−ＯＣＯ−ＣＨ＝ＣＨ2；−ＯＣＯ−Ｃ（ＣＨ3）＝ＣＨ2；アセトアセトキシ、−ＯＣＯ−ＣＨ＝Ｃ（ＣＨ3）(ＯＨ)及びそのすべての適切な互変異性体である。式１で表される他の反応性部分のような任意の適切な部分は本発明の内容において使用できる。
【００６１】
本明細書で使用される「任意の置換基」及び「任意により置換された」という用語は（他の置換基のリストが付いていない場合は）、次の基（又はこれらの基による置換）の１つ又はそれ以上を示す：カルボキシ、スルホ、ホルミル、ヒドロキシ、アミノ、イミノ、ニトリロ、メルカプト、シアノ、ニトロ、メチル、メトキシ及び/又はその組み合わせ。これらの任意の基は先に示した基の複数（好ましくは２つ）の同じ部分における化学的に可能なすべての組み合わせ（例えば、もしも相互に直接結合した場合はアミノ及びスルホニルはスルファモイルラジカルを示す）を含む。好ましい任意の置換基はカルボキシ、スルホ、ヒドロキシ、アミノ、メルカプト、シアノ、メチル及び/又はメトキシを含む。
【００６２】
本明細書で使用されている「有機置換基」及び「有機基」（本明細書で「有機（オルガノ）」とも省略される）は１つ又はそれ以上の炭素原子及び任意により１つ又はそれ以上のヘテロ原子を含む任意の一価又は多価の部分（任意により１つ又はそれ以上の部分に結合している）を示す。有機基は炭素を含む一価の基を含むオルガノヘテリル基（オルガノエレメント基とも云う）を含んでもよく、従ってそれは有機であるが、炭素以外の原子に遊離価を有する（例えば有機チオ基）。有機基は替わりに又は追加して、官能の型にかかわらず、炭素原子に１つの遊離価を有する任意の有機置換基を含む有機基を含んでもよい。有機基はまたヘテロ環の任意の環原子から水素原子を除くことによって形成される一価の基を含んでもよい。（この場合は炭素である、少なくとも２つの異なった元素を環員原子として有する環状化合物）。この有機基の非炭素原子は水素、リン、窒素、酸素、シリコン及び/又は硫黄から選ばれることが好ましく、水素、窒素、酸素、リン及び/又はシリコンから選ばれることがより好ましい。
【００６３】
最も好ましい有機基は、次の炭素を含む部分の１つ又はそれ以上を含む：アルキル、アルコキシ、アルカノイル、カルボニル、カルボキシ、カルボニル、ホルミル及び/又はその組み合わせ；次のヘテロ原子を含む部分の１つ又はそれ以上との任意の組み合わせ：オキシ、チオ、スルフィニル、スルホニル、アミノ、イミノ、ニトリロ及び/又はその組み合わせ。有機基は先に述べた炭素含有及び/又はヘテロ原子部分の複数の同一部分における化学的に可能なすべての組み合わせを含む（例えば、もしも相互に直接結合しているならば、アルコキシ及びカルボニルはアルコキシカルボニル基を示す。）。本明細書に使われているように、「ヒドロカルボ基」は有機基の下位集合で、１つ又はそれ以上の水素原子及び１つ又はそれ以上の炭素原子からなり、飽和、不飽和及び/又は芳香族部分を含むいかなる一価又は多価の部分（任意により１つ又はそれ以上の部分に結合している）を示す。ヒドロカルボ基は次の基の１つ又はそれ以上を含んでも良い。ヒドロカルビル基は炭化水素から水素原子を除くことによって形成される一価の基を含む。ヒドロカルビレン基は炭化水素から２つの水素原子を除くことによって形成され、その遊離価が二重結合に関係していない二価の基を含む。ヒドロカルビリデン基は炭化水素の同じ炭素原子から２つの水素原子を除くことによって形成される二価の基（Ｒ2Ｃ＝によって表される）を含み、その遊離価は二重結合に関与している。ヒドロカルビリダイン（hydrocarbylidyne）基は炭化水素の同じ炭素原子から３つの水素原子を除くことによって形成され、その遊離基が三重結合に関与している、三価の基（ＲＣoで表される）を含む。ヒドロカルボ基は飽和炭素−炭素一重結合；不飽和二重結合及び/又は炭素−炭素三重結合（例えばそれぞれアルケニル及び/又はアルキニル基）及び/又は芳香族基（例えばアリール）を含んでも良く、指示されている場合は他の官能基で置換されてもよい。
【００６４】
本明細書で使用されているように、「アルキル」又はその同意語（例えば「アルク」）は適切であれば、また文脈から明らかにそれとは異なることが示されていない限り、例えば本明細書に記載されている（例えば二重結合、三重結合、芳香族部分（例えばそれぞれアルケニル、アルキニル及び/又はアリール）及び/又はその組み合わせ（例えばアラルキル）及び２つ又はそれ以上の部分が結合した多価ヒドロカルボ種（例えばアルキレンのような二価のヒドロカルビレンラジカル））のような任意のその他のヒドロカルボ基を包含する用語によって容易に置き換えることができる。
【００６５】
本明細書に挙げたラジカル基又は部分（例えば置換基として）は断らない限り、又は文脈が明らかに別のものを示さない限り、多価又は一価のラジカルであってよい（例えば２つの他の部分を結合したヒドロカルビレン部分）。しかし、本明細書に指示されている場合は、そのような一価又は多価の基は更に任意の置換基を含んでも良い。３つ又はそれ以上の原子の鎖を含む基は、鎖が全部又は一部が直鎖状、分枝状及び/又は環状（スピロ及び/又は縮合した環）の基を示す。一定の置換基に対して、一定の原子の数は、例えば、Ｃ1-N有機は１からＮの炭素原子を含む有機部分を示す、というように特定されている。本明細書で、すべての式は、もしも１つ又はそれ以上の置換基が部分の特別な原子に（例えば鎖又は環の特別な場所上に）結合していることが指示されていなければ、その置換基は任意のＨを置き換え及び/又は化学的に適切又は有効な部分上の任意の利用できる位置に置くことができる。
【００６６】
本明細書に挙げられた任意の有機基は１から３６の炭素原子を含むことが好ましく、１から１８であることがより好ましい。有機基の炭素原子数は１から１０、特に１から４（４を含む）であることが特に好ましい。
【００６７】
本明細書に使用されているように、括弧内に示した、例えば（アルキル）アルキレート、（メタ）アクリレート及び/又は（コ）ポリマーのような特徴を含む化学用語（特に指示された化合物のＩＵＰＡＣ名以外）は括弧内のその部分が、文脈が指示するように任意であり、従って例えば用語（メタ）アクリレートはメタアクリレート及びアクリレートを示す。
【００６８】
文脈が明らかに別のことを指示しないならば、本明細書に使用されているように、複数形の用語は単数形を含むものとして解釈されるべきであり、逆の場合も同じである。
【００６９】
本明細書に使用されているように、用語「含む」はそれに続くリストが全てではなく、例えば１つ又はそれ以上の特徴（複数でもよい）、要素（複数でもよい）、成分（複数でもよい）及び/又は置換基（複数でもよい）のような他の追加的な適切な用語を含むか又は含まない。
【００７０】
用語「有効」（例えば本発明の製法、用途、製品、物質、化合物、モノマー、オリゴマー、ポリマー前駆体及び/又はポリマー）は、つぎの１つ又はそれ以上用途及び/又は応用での有用性を示すと理解される：（好ましくは化学分析及び/又は合成の目的のための）マイクロアレイ装置及び/又は機能化された基板等のその構成要素の調製及び/又は使用及び/又は製品の使用及び/又はそれから直接及び/又は間接に得られる結果の使用；及び/又は本明細書に記載した使用。
【００７１】
物質が先に挙げた使用に対する要求特性を有する場合は、その利用は直接的であり、及び/又は物質が直接の有用性のある物質の調製における合成中間体及び/又は診断の道具として使用される場合は、その利用は間接的である。本明細書に使われているように、用語「適切な」は官能基が有効な製品の製造に適合性があることを示す。繰り返し単位上の置換基は、それらが先に示した使用のために配合及び／又は組み入れられるポリマー又は樹脂と物質との相容性を改善するために選択してもよい。従って置換基のサイズと長さは樹脂とのもつれ又はインターロケーションを最適化するために選んでも良く、又はそれらはそのような他の樹脂と化学的に反応し、及び/又は架橋することができる、他の反応性物質を含んでもよく、又は含まなくてもよい。
【００７２】
本明細書に記載した本発明の一部又は全部に含まれ及び/又は使用される、部分、分子種、基、繰り返し単位、化合物、オリゴマー、ポリマー、物質、混合物、組成物及び/又は配合は、次の全てではないリストに挙げられている内の任意の1つ又はそれ以上の異なる形態として存在し得る：立体異性体（例えばエナンチオマー（例えばＥ及び/又はＺの形））、ジアステレオアイソマー及び/又は幾何学的アイソマー）；互変異性体（例えばケト及び/又はエノール形）、コンフォーマー、塩、二価イオン、錯体（例えばキレート、クラスレート、隙間の化合物、配位子錯体、有機金属錯体、非化学量論的錯体、溶媒和及び/又は水和物）；同位元素置換形、ポリマー形状［例えばホモ又はコポリマー、ランダム、グラフト又はブロックポリマー、直鎖状又は分枝ポリマー（例えば星状及び/又は側鎖分枝）、架橋及び/又は網状ポリマー、二価及び/又は三価の繰り返し単位から得られるポリマー、デンドリマー、立体特異性が異なるポリマー（例えばアイソタクティック、シンジオタクティック又はアタクティック、多形（例えば隙間の形、結晶形及び/又はアモルファス形）、異相、固溶液；その組み合わせ及び/又はその混合物）］。本発明は有効なすべての形態を含み及び/又は使用する。
【００７３】
本発明の1つの特徴は、基板上にＤＮＡ及び/又は他の生体分子を結合するために、その中に活性化された不飽和部分を有するコーティングである。実用的観点から、コーティング中に増加した活性化された不飽和部分を導入するための多くの方法がある。本発明によれば、そのような機能がコーティングの表面で利用できるようにするすべたの製法及び方法は適切である。
【００７４】
遊離の活性化された不飽和部分を含むコーティングを得るために、本発明として、本発明において及び/又は本発明と共に、使用される２つの好ましい方法を開示する。
【００７５】
これらの方法の１つで、本発明として、本発明において及び/又は本発明と共に、使用されるコーティングは、活性化された不飽和部分を唯一の重合可能な基として含む１つ又はそれ以上のポリマー前駆体を含む組成物から得られる及び/又は得ら得るものである。ポリマー前駆体は任意のモノマー、オリゴマー及び/又はプレポリマーを、単独及び/又は混合物として含んでもよい。これらの組成物は、機能化されたコーティングとして有用な遊離の（即ち反応性の）活性化された不飽和部分の十分な数を、それらを含むポリマーに与える任意の適切な方法で硬化してもよい。
【００７６】
本発明として、本発明において及び/又は本発明と共に、使用されるコーティングを調製するために使用してもよい代替法は、活性化された不飽和部分（例えば（メタ）アクリレート部分）を含む化合物の他の官能基と反応できる反応性基を有するポリマー前駆体を含む。例えば、ヒドロキシル基を含むポリマー前駆体はアクリロイルクロライドと反応でき、又はカルボン酸基を含むポリマー前駆体はグリシジル（メタ）アクリレートと反応できる。（メタ）アクリレート部分を唯一の化学的に重合可能な部分として含むポリマー前駆体は、重合後に遊離の（メタ）アクリレート部分を含むポリマーを与える方法で硬化してもよい。
【００７７】
ポリウレタン（メタ）アクリレート、（メタ）アクリル（メタ）アクリレート、ポリエステル（メタ）アクリレート、エポキシ（メタ）アクリレート、樹状及び/又は分枝度の大きいポリエステル（メタ）アクリレート、及び/又はポリウレタンアクリレート、シリコン（メタ）アクリレート、及び/又は（メタ）アクリル化アミンの任意の１つ及び/又はその任意の混合物、そのコポリマー及び/又は同じ分子種でのその混合物のような多数の異なったポリマーが本発明として、本発明において、及び/又は本発明と共に、使用されるポリマー前駆体として及び/又はポリマーコーティングとして適切である。
【００７８】
適切なポリマー（例えば本明細書に記載したような）を製造できる組成物は、従来の技術で周知であり、放射線硬化可能な（ｒａｄｃｕｒｅ）組成物として知られる技術分野に属していることが好ましい。有効な組成物は、例えば分散液、溶液及び/又は例えば連続相として水及び/又は有機溶剤を含むエマルジョン及び/又は水又は有機溶剤を含まない組成物（例えば混合物及び/又はポリマー前駆体の固体溶液）のような任意の適切な物理的形態で存在できる。エマルジョンは任意の適切な連続相を含むことができ（例えば油中水（Ｗ／Ｏ）、水中油（Ｏ／Ｗ）エマルジョン）、分散層は任意によりエマルジョンを含んでもよい（例えば水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）及び油中水中油（Ｏ／Ｗ／Ｏ）エマルジョン）。
【００７９】
更に適切なポリマー及び/又は組成物は“Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”ＶｏｌｕｍｅＩＩ−Ｐｒｅｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｄｉｌｕｅｎｔｓ−Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＵＶ  ａｎｄ  ＥＢ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｏａｔｉｎｇｓ，Ｉｎｋｓ  ａｎｄ  Ｐａｉｎｔｓ，  ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｇ．Ｗｅｂｓｔｅｒ  ａｎｄ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｗｉｌｅｙ（１９９７）に挙げられているものを含む。
【００８０】
重合は、遊離活性化不飽和部分を含むコーティングのような本発明として、本発明において及び/又は本発明と共に、使用されるポリマーコーティングを得るために使用できる適切な方法によって開始できる。熱及び/又は照射（ＵＶ又は電子線等）の２つの好ましい重合開始方法がある。熱重合に適した組成物は熱開始剤を含んでよい。重合は紫外線照射下でも起こり、ついで光開始剤が一般に重合を助けるために組成物中に存在する。電子線もまた使用できる。
【００８１】
残りの未反応の遊離活性化不飽和部分（例えば遊離（メタ）アクリレート）の量は、例えばＫｉｎｅｔｉｃ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｕｌｔｒａｆａｓｔ  Ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、Ｃ．Ｄｅｃｋｅｒ，  Ｂ．  Ｅｌｚａｏｕｋ，  Ｄ．Ｄｅｃｋｅｒ，  Ｊ．Ｍ．Ｓ．−Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．  Ｃｈｅｍ．，  Ａ（３３）ｐｐ．１７３−１７９０（１９９６）に記載されているように、温度、照射線量、開始剤の型と量等の重合条件で制御し得る。
【００８２】
本発明の基板を調製するために使用し得る他の経路では、少なくとも１つがそれに付加重合できる化学反応性基を少なくとも一つ含む任意のポリマー前駆体（例えばモノマー、オリゴマー及び/又はプレポリマー）の単独又は混合物を含むコーティング組成物を使用する。これらのポリマー前駆体の少なくとも１つに、活性化された不飽和部分が存在してもよい。替わりに、それに付加重合できる化学反応性基を含むポリマー前駆体を反応させて、実質的に（メタ）アクリレート部分を含まないが、ついで他の活性化不飽和部分と反応し得る反応性基を依然として含むポリマー前駆体を形成してもよい。
【００８３】
例えば、ポリオールとポリイソシアネートを反応させて、ポリウレタンポリマー（例えば溶剤及び/又は水懸濁物中のもの）を調製してもよい。従って、遊離の（メタ）アクリレート部分を、例えばイソシアネート末端ポリマー前駆体（それは任意により全部又は部分的に鎖を延ばしてもよい）のエンドキャッピングによって、（メタ）アクリル化アルコール及び/又は（メタ）アクリル化ポリオールとして及び/又はポリマー前駆体自身（これもまた任意により全部又は部分的に鎖を延ばしてもよい）の成分としてポリマー中に組み入れてもよい。
【００８４】
複数の（メタ）アクリレート部分を含む、樹状及び/又は分枝度が大きいヒドロキシ化合物（例えばアルコール及び/又はポリオール）の調製に、本明細書に記載した同じ及び/又は類似の方法を用いてもよい。ポリウレタン中のそのようなヒドロキシ化合物を組み入れることによって、高濃度の遊離の（メタ）アクリレート部分を有するコーティングが製造できる。
【００８５】
本発明の実施態様において、式Ｉの活性化された不飽和部分は、Ｒ4がアルコキシ又はハロゲノシリコン含有置換基を表す場合は、支持体に直接結合できる。このためには、例えばガラス又はシリコンウエハのようなヒドロキシ基を有する支持体を選ばなければならない。ヒドロキシ基又はハロシラン基は、活性化された不飽和部分を支持体に直接結合している支持体の表面上に存在するヒドロキシ基と反応する。
【００８６】
本明細書に記載したように、本発明の任意の適切な基板は、本発明によるマイクロアレイを作るために使用できる。好ましい基板は、ガラス及び/又はポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエステル（ＰＥ）、ポリオレフィン（たとえばポリプロピレン（ＰＰ））、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ナイロン、ポリスチレン、シクロオレフィン共重合体（ＣＯＣ）及び/又は活性化されたセルロース又はそれらの混合物のようなプラスチックを含む。そのような基板は、接着を促進するために（例えば高電圧コロナ放電による処理によって）任意により前処理し、次いで本明細書に記載のように処理してもよい。好ましい分子ポローブは、１つ又はそれ以上の異なったヒドロキシ及び/又はアミノ基、より好ましくはアミノ基を含む。
【００８７】
いかなる機構にも束縛されることを望まずに、プローブは、活性化された不飽和部分と、好ましくは付加反応によって、容易に共有結合する化学基含むと考えられている。活性化された不飽和部分が不飽和エステルを含む場合は、適切な付加反応は周知のＭｉｃｈａｅｌ付加反応を含んでもよい。そのような反応は、マイクロアレイの製造工程中に室温で起こるのが好ましい。そのような反応は、例えば基板上に置かれたアミノ基を含む分子種と、機能化された基板の表面において利用できる不飽和エステル部分（例えば（メタ）アクリレート）の不飽和（ヒドロカルビリデン）基との間で起きるのがより好ましい。
【００８８】
好ましい有機プローブは生体分子であり、ＤＮＡがより好ましく、アミノ基を含むものが最も好ましい。アミノ基は生体分子上に典型的に見られる広く普及した反応性基である。本発明の方法の１例では、予め決められたパターンで配列された不飽和（メタ）アクリレート部分と反応するために、アミン末端ＤＮＡ配列を任意の適切な方法（例えばマイクロスポティング及び/又はインクジェット印刷）で基板上に置いてもよい。
【００８９】
本発明の主な利点は次のいずれか及び/又は全部を含む：任意の基板を、ＤＮＡバイオチップ及び/又は類似の用途に使用できるように、適切に配合されたコーティングによって処理できる。アクリレートの高い密度を達成して、対応するプローブの単位面積あたりの高い密度を得ることができる。アクリレート部分の反応性が、基板表面上のプローブの速い不動化と機能化された基板の良好な貯蔵性の競合的要求の間の良好なバランスを提供する。アルデヒド機能化基板（これまでに入手可能な最良の機能化された基板と考えられる）に比べて、広く知られるデリバリー技術を用いて適切な機能化された基板を製造するために必要な工程段階の数が減る。したがって、本発明のアクリレート機能化基板では、たとえ優れてはいないにしても同等な反応性を保ちながら、還元段階を除くことができる。本発明で使用される方法は多数の物質に適しているので、これまでのマイクロアレイの設計に対する制約を減らし、一体化されたチップ上の実験室（ラボ−オン−ア−チップ系）の製造を容易にする。本発明の機能化された基板は、特に放射線硬化可能な物質を使用する時は、良好な化学的及び/又は機械的抵抗性を有する。より具体的には、例えばＣＤ−ＲＯＭ上に見られる銀表面のような金属表面上に、放射線硬化可能な物質を使用する時は、下地の金属層に対してコーティングの良好な結合性と非常に良好な耐食性を組み合わすために、コーティングを配合できる。まだ本明細書に記載していない、本発明の他の態様及び/又は好ましい特徴を請求項に記載する。
【００９０】
本発明は添付の図面により例証することができる。
以下、本発明を、単なる例証である非制限的な実施例及び試験によって説明する。実施例は、２種類の配合物（熱硬化又は放射線硬化）を含み、それらは一定のアクリル化基板を、マイクロアレイ（例えばバイオチップ）での使用に関し実証し、評価するものである。これらの実施例において、基板を調製する手順は、基板を評価するのに使用した結果と別に記載する。本実施例において：ＮＣＯ値又は濃度（本明細書でＩNCOとも記される）は、任意の適切な標準的方法（例えばＡＳＴＭ  Ｄ２５７２−８７に記載されている方法）で測定する；ヒドロキシル値又は濃度（本明細書でＩOHとも記される）は適切な標準的方法（例えばＥ２２２−７３に記載されている方法）を用いて測定される；酸値又は濃度（本明細書でＩH+とも記される）は任意の適切な標準的方法（例えばＡＳＴＭ  Ｄ９７４−６４に記載されている方法）を用いて測定する；及び/又は遊離アクリレート値又は濃度（本明細書中ＩACRとも記される）は当業者に周知の任意の適切な標準的方法を用いて測定する。
【００９１】
基板の調製
コーティング用のポリマーの合成
実施例１
ヒドロキシ−機能性ウレタンアクリレートの合成
予熱された５−イソシアナト−１−イソシアナトメチル−１，３，３−トリメチルシクロヘキサン（ＩＰＤＩとしても知られ、Ｄｅｇｕｓｓａ−Ｈｕｅｌｓ、ドイツから商業的に入手できる）の４４４ｇの量を攪拌器、温度計、水冷却コンデンサー及び滴下漏斗を備えた、２ｌの四首丸底フラスコに導入した。混合物を４５℃で加熱し、ついでジブチル錫ジラウレート（ＤＢＴＬとしても知られる、Ａｋｃｒｏｓから商業的に入手できる）０．３７ｇを触媒として加えた。滴下漏斗から２３２ｇのヒドロキシエチルアクリレートと０．９２５ｇのヒドロキノンモノメチルエーテルを、反応混合物の温度を最高６５℃に保ちながら、ゆっくりと加えた。その混合物をINCOが２．９６ｍｅｑ／ｇに達するまで１時間この温度で保持した。ついで２５０ｇのジトリメチロールプロパン（ＩOHは８９８ｍｇＫＯＨ／ｇ）を、INCOが０．０５ｍｅｑ／ｇ未満に低下するまで、反応を65℃で加熱しながら加えた。オリゴマーを４０℃に冷やし、９２７ｇのブチルアセテートで希釈して、２５℃の粘度が１３５ｍＰａｓ；IOHが６０ｍｇＫＯＨ／ｇ及び遊離アクリレート１．０７８ｍｅｑ／ｇ（固体製品のＩOHが１２１ｍｇＫＯＨ／ｇ）の生成ウレタンアクリレートの５０%有機溶液を得た。
【００９２】
実施例２
ポリオールの合成
１，６ヘキサンジオール（１，１４４．２ｇ）及びアジピン酸（１，１３５．６ｇ）（いずれもＢＡＳＦから商業的に入手できる）をＤＢＴＬ触媒（０．０２ｇ）とともに、攪拌器、充填カラム、コンデンサー、温度計及び不活性ガス導入口を備えた３ｌの反応容器中で混合した。反応容器に不活性ガスを流し、エステル化で生じる水を除去しながら、反応物を１９５℃から２００℃の温度に加熱した。ＩH+が５ｍｇＫＯＨ／ｇ、ＩOHが１１７ｍｇＫＯＨ／gになるまで５時間反応を続け、Ｍnが１０００及び最終のＩOHが１１２ｍｇＫＯＨ／gのポリオールを生成物として得た。このポリオールを下記の配合物に直接使用した。
【００９３】
配合物及び基板のコーティング
基板
本発明の機能化された基板は、１０μｍの厚さの非硬化配合物のフィルムを基板上に堆積するバーコーターを用いて、本例に記載した配合物の１つのトップコートでコーティングしたコンパクトディスク（ＩＳＰ，ベルギーから商業的に入手できるコーティングされていない裸のポリカーボネートＣＤ）から作られた。使用できる他の適切な基板は：商業的なコーティングされたポリカーボネートＣＤ（ＩＳＰ，ベルギーから商業的に入手できる）及び/又はＡ４サイズの1ｍｍ厚のポリカーボネートシート（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ，米国から商業的に入手できる）である。本発明の機能化された基板はついで周知の標準的な方法とプロトコールに従って試験し、本発明のマイクロアレイの性質が証明された（例えばグラフト能へのアクリレート濃度の影響−図1参照）。
【００９４】
コーティング配合物
３つの型の配合物が試験された。２つはポリマー骨格（照射及び熱硬化）に基いており、１つはシラン化学に基づいている。
【００９５】
照射硬化配合物
ＵＶで硬化された本発明の配合物（実施例３＆４）を下表１に記載する。硬化されたコーティングの遊離アクリレート含量は、ＵＶ照射後に存在する未反応不飽和基に由来する。下表１の配合物は２０ｍ／分の速度で、８０Ｗ／ｃｍの中圧水銀ランプの下を４回通してＵＶ硬化した。表１の成分は光開始剤を除いてすべてＵＣＢ Chemicalsから得られた（括弧内は商品名を示す）。
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【００９６】
熱硬化配合物
本発明の幅広い種類の熱硬化配合物は、最終の基板中で望まれる遊離のアクリレートの濃度が、配合物の中のヒドロキシ機能性ウレタンアクリレート（例えば実施例１）の濃度の増減によって調整できることから、本明細書に記載したように調製することができる。例えば実施例１のウレタンアクリレート上の２つのアクリレート基は熱誘導による重合（架橋）に関与せず、架橋後に利用できる。下記の表２の配合物（実施例５から８）は６０℃でオーブン中３時間熱硬化した。表２の配合物はＢａｙｅｒから商品名Ｄｅｓｍｏｄｕｒ  Ｎ３３００で商業的に入手できる脂肪族ポリイソシアネート９重量％；実施例２のポリオールの（９１-Ｘ）％及び実施例１のウレタンアクリレートのＸ％（ここでＸの値は表２に示す）を含んでいた。
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【００９７】
シランベース系
活性化された不飽和部分による表面の活性化はシラン化で行うことができる。先ずガラススライドを室温で３０分間１：１メタノール：塩酸溶液に入れて清浄する。ついで、スライドをシュリーレン線が観察されなくなるまで、脱イオン水で洗浄する。洗浄後、スライドを活性化する。これはスライドを１時間（３−アクリロキシプロピル）シランの１０-3モルの無水トルエン溶液中に浸漬することで達成される。試料のアレテンは激しい攪拌下で新鮮なトルエンに浸して、物理吸着した過剰の分子を除去し、ついで１２０℃で１０分間オーブン中で乾燥した。
【００９８】
バイオチップの調製
ＤＮＡ捕獲プローブの調製
本明細書に記載した試験における捕獲プローブとして使用するヌクレオチドを調製するのに使用する鋳型のＤＮＡ配列は、Ａｎａｌｙｔｉｃ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２５３，ｐｐ１８０−１８９（１９９７）にＺａｍｍａｔｅｏ等が記載した方法とプルトコールに従って合成したサイトメガロウイルスのＤＮＡ配列である。そのように使用されたＭＩＥ４プライマーは２５７塩基対のアンプリコン長さを有する５‘端で、アミン基を含んだ。ＤＮＡ配列は従来の方法でＰＣＲを使用して増幅し、ついで高純度ＰＣＲ製品精製キット（Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙから商業的に入手可能）上でのクロマトグラフィーによって、組み込まれていないヌクレオチドとプライマーから分離した。ＤＮＡ濃度を２６０ｎｍでの吸収で測定した。そのように得られたアミン化した捕獲プローブを緩衝剤溶液に加え、プローブ上のアミノ基の実質的な部分がプロトン化していない状態に（即ちＮＨ2として）保った。ＤＮＡプローブを含む緩衝剤溶液（本明細書中でプリント緩衝剤として知られる）は、下に記載するようにマイクロアレイ上に置いた。ここで使用された異なる各プリント緩衝剤中のＤＮＡプローブの濃度は１００ｎＭであった。
【００９９】
標識した標的ＤＮＡの調製
サイトメガロウイルスのＤＮＡ配列（先に示した参考資料に記載したように調製された）は、また標的ＤＮＡ産生のための鋳型として使用した。標的ＤＮＡは４３７の長さの塩基対を有し、ＰＣＲ増幅中にDNA対標識モル比１：１までビオチン−１６−ｄＵＰＴを用いて標識した。ＤＮＡ濃度は２６０ｎｍの吸収で測定した。
【０１００】
バイオチップの調製
プリント緩衝剤中のＤＮＡ捕獲プローブをマイクロアレイヤー（micro-arrayer）（ＷＯＷ，Ｂｅｉｇｉｕｍから商業的に入手可能）を用いて、本発明の機能化された樹脂基板上に分配した。このプリント緩衝剤の液滴を、相互の間隔が約８００μｍである約４００μｍの直径のスポットを得るために、適切な方法を用いてチップ上に置いた。バイオチップ（即ちＤＮＡ捕獲プローブを有する基板）は２３℃で１時間インキュベートし、ついで０．２重量％のドデシル硫酸ナトリウム（本明細書でＳＤＳとして言及され、Ｍｅｒｃｋから商業的に入手できる）の水溶液で１回洗浄し、ついで水で2回洗浄した。バイオチップは、ついで沸騰水中でさらに３０分間インキュベートし、ヌクレオチド配列の一本鎖が表面に強固に結合したことを確認した。
【０１０１】
ハイブリッド形成
標識化した標的ＤＮＡ（上に記載したように調製した）を４%ＳＤＳを含むｐＨ７の０．３５Ｍ燐酸緩衝剤の溶液（例えばＡＡＴ、ベルギーから商業的に入手できる緩衝剤の溶液）中に１０ｎｍの濃度で含むハイブリッド形成溶液を調製した。ハイブリッド形成溶液（７０μ）をハイブリッド形成チャンバー（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡから商業的に入手できる）に加えた。そのチャンバーをマイクロアレイ上にはめて、カバースリップでシールし、溶液をバイオチップと接触させ、ついでそれを５０℃まで２時間加熱した。その後バイオチップを洗浄溶液（０．１％Ｔｗｅｅｎを含むｐＨ７．５の１０ｍMのマレイン酸塩緩衝剤）で４回洗浄し、ついでストレプトアジビン金接合体（Ｓｉｇｍａ，ＭＯ，米国から商業的に入手できる）と４５分間インキュベートした。ついでバイオチップを更に５回同じ洗浄溶液（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｂｌｕｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎの商品名でＡＡＴ，Ｂｅｌｇｉｕｍから商業的に入手できる）で洗浄し、最後に別のインキュベート溶液中で１０分間インキュベートした。
【０１０２】
結果
本明細書に記載したように調製された本発明のマイクロアレイの評価は、周知の標準的方法とプロトコールに従って実施し、以下に記載し、
図１及び２に示した。
【０１０３】
図１
グラフト能に対するアクリレート濃度の影響を証明するために、実施例５から８で作られた本発明の機能化された基板を試験した。これらの結果を図１に示し、遊離のアクリレート含量がＤＮＡグラフト効率にどのように影響するかを示す。図１の横軸はそれぞれ実施例５から８で調製した樹脂で試験したコーティング配合物におけるｍｅｑ／ｇの単位での遊離アクリレートの濃度を示す。図１の縦軸は相対的ＤＮＡ表面濃度として測定した相対的グラフト効率を示す。これはそれぞれの例で測定した信号強度を最高の遊離アクリレート含量（０．９８ｍｅｑ／ｇ）を有する、最も濃縮されたＤＮＡ分散液（２００ｎＭ、実施例８）に対して測定した信号強度と比較して計算した。従って縦軸値は正規化され、次元はない。図１の３つのプロットはＮＨ２−ＤＮＡプローブの異なった濃度で実施された試験に対応している。：２５ｎＭ（下の線、データを▲で示す）、５０ｎＭ(中段の線、データを◇で示す)及び２００ｎＭ(上の線、データを■で示す)。これらの結果は本発明の基板について、遊離のアクリレート濃度の増加効果はそれに対応したグラフト効率の増加を起こすことを明らかに示す。
【０１０４】
図２
種々の異なったプリント緩衝剤中で、その上に置かれた本明細書に示す実施例４の配合物でコーティングされたＡ４サイズの１ｍｍの厚みのポリカーボネートシート上で一連の実験を行った。図２はプローブの組成物のためのプリント緩衝剤を、本明細書に記載したように組成とｐＨにおいて変化させた場合の、比色計マイクロアレイ読み取り（ＷＯＷ，ベルギーから商業的に入手できる）から得られたマイクロアレイの写真を示す。各実験は本明細書に記載の標準手順に従い実施した。図２の結果は各実験の機能に従って別々に解釈された。図２で、番号で指示された矢は種々のプリント緩衝剤を示し：“１”はｐＨ８の０．１Ｍ硼酸緩衝剤を示す。
“２” は１Ｍ ＮａCｌ及び０．１％ＳＤＳを含むｐＨ８の０．１Ｍ硼酸塩緩衝剤を示す。
“３” は０．１％ＳＤＳを含むｐＨ９の０．１Ｍ炭酸塩緩衝剤を示す。
“４” は０．１％ＳＤＳを含むｐＨ８の０．１Ｍ硼酸塩緩衝剤を示す。
“５” は０．１％ＳＤＳを含むｐＨ７の０．１Ｍ燐酸塩緩衝剤を示す。
図２で文字で指示されたカラムは実験の機能を示す：“Ａ”（ｘ2）は固定コントロール；“Ｂ”（ｘ2）は陰性ハイブリッド形成コントロール；“Ｃ”（ｘ2）は陽性ハイブリッド形成コントロールである。これらの実験をより詳細に下に記載する。
ＨＩＶ由来のＤＮＡ配列をこれらの試験に使用した。ＨＩＶ由来の捕獲プローブを作るために使用したプライマーはＮＨ2−ＧＡＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＧＧＧ及びＧＧＴＣＣＴＴＧＴＣＴＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＴＧに対応する。これらのアンプリコンはＨＩＶの“ＧＡＧ”遺伝子からの２４７塩基のＤＮＡを従来のＰＣＲで増幅して得た。ついでアンプリコンを「High Pure ＰＣＲ」精製キットで精製し、アガロースゲル上で定量した。ついで捕獲プローブを本明細書に記載したように異なったプリント緩衝剤中で３００ｎＭの濃度で、本発明の基板上にスポットとして置いた。
【０１０５】
固定コントロール（Ａ）
この実験は固定段階を分離し、捕獲プローブが基板上に固定されたことを測定するためにデザインした。ビオチン標識を有する捕獲プローブを用いて、異なるプリント緩衝剤溶液を調製した（本明細書に記載したように）。陽性反応はマイクロアレイ上で暗いスポットとして示され、標識捕獲プローブの存在を示した。
【０１０６】
陽性ハイブリッド形成コントロール（Ｂ）
この実験は系全体が働くことを確認するために、標準的なマイクロアレイ手順に従って実施した。陽性反応はマイクロアレイ上で暗いスポットを示し、非標識捕獲プローブが基板に結合し、ついでそれらの相補的な標識された標的配列によって、ハイブリッド形成した。
【０１０７】
陰性ハイブリッド形成コントロール（Ｃ）
この実験は、実験Ａ又はＢ中の偽陽性の有無を検出するために行った。ハイブリッド形成溶液中に存在する標的配列のいずれにも対応しない捕獲プローブをプリント緩衝剤中に作り、ついで、それを適切な方法（例えばインクジェットプリンター）により、スポットで基板上にプリントした。実験の終了時に、そのスポット上でハイブリッド形成は起きず、従って暗いスポットは、デザイン不良の基板上での標識化標的配列の非特異結合のような問題を示している。
【０１０８】
結果の解釈
図２で、プリント緩衝剤組成物（表２の列“１”から“５”）、固定コントロール（Ａ）
及び陽性ハイブリッド形成コントロール（Ｂ）の実験はすべて陽性の結果（即ち適切なカラム中の暗スポット）を示した。従って、実施例４を用いてコーティングされた基板は、アミノ化されたＤＮＡ捕獲プローブを結合し、適正に働くマイクロアレイ（バイオチップ）を与える。陰性ハイブリッド形成コントロール実験（Ｃ）はすべての例で陰性の結果を与え（即ちカラムＣに暗いスポットはない）、実施例４を用いてコーティングされた機能化された基板は、この実験で偽陽性を全く与えなかったことを示している。
図２から、陽性の結果があった暗いスポットの形とサイズに若干の変動があったので、使用したプリント緩衝剤による若干の差を認めることができる。イメージ解析ソフトウェアーが典型的に結果の読み取りに使用されるので、これは重要であり、スポットの幾何学的形状の変動が読み取りを変え得る。いかなる機構にも束縛されることを望まずに、この変動はコーティングによる表面エネルギーの差による可能性が考えられる。これは実質的に試験に影響せず、本発明のマイクロアレイが種々の形状のスポットを作らせない方法で、プリント緩衝剤を変更することによって補完されると考えられている。本願において、図１と２に示した結果は、適正に働くマイクロアレイを製造するために、本明細書で調製した配合物（実施例４から８）は任意の適切な基板上にコーティィングできることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】本発明の基板のＤＮＡグラフト効率と遊離アクリレートの機能性の関係を示すプロットである。
【図２】本明細書に記載したように、各種の固定とハイブリッド形成実験で試験された本発明のマイクロアレイの写真である。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004534866.tif 000044
【国際調査報告】
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2004534866.tif 000046
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