(57)【要約】この発明は、潜在的なグリコシルトランスフェラーゼのインヒビターを提供する。グリコシルトランスフェラーゼインヒビターは、グリコシドの生成を阻害するのに有用である。従って、グリコシルトランスフェラーゼインヒビターは、例えば、グリコシドを介した細胞接着に関与する生物学的過程の改変において用途を見出す。本発明はまた、好適には、酵素基質の炭水化物部分またはその産物、およびグリコシルトランスフェラーゼ間における疎水性相互作用に基づくグリコシルトランスフェラーゼ活性のインヒビターを提供する。多くの生体反応過程に関わる炭水化物合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼの活性を阻害するために、本発明のインヒビターを使用し得る。また、グリコシルトランスフェラーゼインヒビターを調製する方法ならびに適切な候補を同定するための様々なスクリーニングアッセイ方法もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシルトランスフェラーゼを阻害する方法であって、該方法は、該グリコシルトランスフェラーゼを非炭水化物化合物と接触させる工程を包含し、該非炭水化物化合物は、該グリコシルトランスフェラーゼにより認識される糖の疎水性構造を模倣する、方法。
【請求項２】
前記糖が、アクセプター基質上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糖が、ドナー基質上に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記化合物が、アリールまたはヘテロアリール部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ヘテロアリール部分が、チオフェン、ピリジン、イソキサゾール、フタルイミド、ピラゾール、インドール、キノリン、フェノチアジン、カルバゾール、ベンゾピラノンおよびフラン基からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記化合物が、アリール部分を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、フコシルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、シアリルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、Ｎ−アセチルグルコサミリニルトランスフェラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、細胞内に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記接触工程がインビトロで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
グリコシルトランスフェラーゼインヒビターを同定する方法であって、該方法は、グリコシルトランスフェラーゼ、アクセプター基質およびドナー基質を非炭水化物試験化合物と接触させる工程、および該グリコシルトランスフェラーゼの活性が該試験化合物の存在下で阻害される程度を決定する工程を包含し、該試験化合物は、該グリコシルトランスフェラーゼにより認識される糖の疎水性構造を模倣する、方法。
【請求項１３】
前記糖が、アクセプター基質上に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記糖が、ドナー基質上に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、ここで前記グリコシルトランスフェラーゼの活性は、抗体を使用して決定され、該抗体は、該グリコシルトランスフェラーゼにより触媒される反応の生成物と特異的に免疫反応性である、方法。
【請求項１６】
ＥＬＩＳＡ形式である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、組換え細胞中で発現される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記ドナー基質またはアクセプター基質が標識される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記標識が放射活性標識である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記標識が蛍光標識である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
放射活性カラムアッセイである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、フコシルトランスフェラーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、シアリルトランスフェラーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
前記化合物が、ヘテロアリール部分を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
前記ヘテロアリール部分が、チオフェン、ピリジン、イソキサゾール、フタルイミド、ピラゾール、インドール、キノリン、フェノチアジン、カルバゾール、ベンゾピラノンおよびフラン基からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物が、アリール部分を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２８】
薬学的に受容可能な賦形剤および非炭水化物化合物を含む薬学的組成物であって、該化合物は、グリコシルトランスフェラーゼにより認識される糖の疎水性構造を模倣する、組成物。
【請求項２９】
前記糖が、アクセプター基質上に存在する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記糖が、ドナー基質上に存在する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
前記化合物が、ヘテロアリール部分を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ヘテロアリール部分が、チオフェン、ピリジン、イソキサゾール、フタルイミド、ピラゾール、インドール、キノリン、フェノチアジン、カルバゾール、ベンゾピラノンおよびフラン基からなる群より選択される、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３３】
前記化合物が、アリール部分を含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３４】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、フコシルトランスフェラーゼである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３５】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、シアリルトランスフェラーゼである、請求項２８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
この出願は、本明細書中で参考として援用される２０００年５月２４日に提出されたＵＳＳＮ  ６０／１３６、１５０に対する優先権をされる主張する。
（本発明の分野）
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼインヒビターの分野に属する。グリコシルトランスフェラーゼを阻害する化合物を同定する方法ならびにその阻害化合物をも提供する。また、グリコシルトランスフェラーゼを阻害する方法およびグリコシル化と関連のある生物学的過程を調節する方法をも提供する。
（本発明の背景）
炭化水素は植物界、動物界全体にわたり広く分布する。その構造は、多くの生物学的過程において、多くの重要な役割を果たすことが公知である。例えば、炭水化物は、哺乳動物細胞における細胞間認識に関与する。菌類および植物において、炭水化物は細胞壁の重要な構造的成分である。炭水化物は、典型的に、活性化糖ヌクレオチドから、糖蛋白質、糖脂質またはポリサッカリドで見られるアクセプターオリゴサッカリドへ、モノサッカリドを転移させる酵素のグループであるグリコシルトランスフェラーゼなどの酵素によって、合成される。生物系においてグリコシル化は重要であることから、グリコシルトランスフェラーゼおよび他の炭水化物代謝に関連する酵素に対する効果的なインヒビターの開発が強く要求される。近年、グリコシルトランスフェラーゼインヒビターの開発に対する注目度が高まっている一方で、未だに治療化合物として所望される特徴に合う、報告されたグリコシルトランスフェラーゼインヒビターはない。
【０００２】
現在までに、グリコシルトランスフェラーゼに関して行われた研究のほとんどが、その基質の親水性類似体およびこれらの酵素のアクセプター基質に焦点を合わせたものである（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ６２：１９１４−１９１５（１９９７）；Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、Ｊ  Ｓｙｎｔｈ  Ｏｒｇ  Ｃｈ  Ｊａｐａｎ  ５５，３２５−３３３（１９９７）；Ｍｕｌｌｅｒら、Ａｎｇｅｗａｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ３７：２８９３−２８９７（１９９８）；Ａｍａｎｎら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４：１１０６−１１１５（１９９８）；Ｍｕｒｒａｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：８２３−８３１（１９９７）；Ｋｉｍら、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １２１：５８２９−５８３０（１９９９），Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ３：１７４７−１７５０（１９９３）；Ｍｉｕｒａら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ６：１４８１−１４８９（１９９８）；およびＰａｌｃｉｃら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：１７１７４−１７１８１（１９８９））。最も良いインヒビターは一般的にμＭの範囲であるが、シアリルトランスフェラーゼに対するインヒビターでは、最も良いもので１４ｎＭまでのインヒビターが既に得られている（Ｍｕｌｌｅｒら、前出）。典型的に、インヒビターは陰性に荷電しており、従って、適切なプロドラッグ形態が確認されない限り、経口的に利用されそうむない。
【０００３】
アクセプター基質を基にしたインヒビターのほとんどは、酵素に結合する合成ジ−またはトリサッカリドアクセプターであるが、通常転移が起こるヒドロキシル基が除去されている（デオキシ−）または置換されている（例えば、アミノ基）Ｋａｊｉｈａｒａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ  ２４７：１７９−１９３（１９９３）；Ｓｔｕｌｔｓら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ９：６６１−６６８（１９９９）；Ｌｕら、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４：２０１１−２０２２（１９９６）；Ｌｏｗａｒｙら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ  ２５１：３３−６７（１９９４）；Ｋｈａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８：２４６８−２４７３（１９９３）。一般的に、インヒビターのＫｉ値は、それらが置換したアクセプター基質のＫｍ値の範囲にある。しかしながら、α―ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗａｒｙら、前出）およびＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＶ（Ｋｈａｎら、前出）に対するインヒビターにおいて、１０μＭのオーダーのＫｉ値が報告されている。
【０００４】
１つのクラスとして、先行技術である、オリゴサッカリドに基づくインヒビターは、細胞膜を通過するとは予想されず、そして治療に用いる候補としてはあまり適さないとみなされる。しかしながら、いくつかのグループによって、疎水性アグリコンおよび／または酢酸エステルで適切に修飾されたジサッカリドアクセプター基質が容易に細胞内に入り、ゴルジ画分（ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）に到達することが示されている。従って、分泌されるジサッカリド基質の競争的グリコシル化に起因して、細胞表面の糖蛋白質の末端グリコシル化が阻害され得、次いで、ジサッカリド基質は分泌される（Ｎｅｖｉｌｌｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３０７：７９１−７９７（１９９５）；Ｋｕｒａｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４：１９２７１−１９２７７（１９８９）；Ｓａｒｋａｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：３３２３−３３２７（１９９５）；Ｓａｒｋａｒら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：２５６０８−２５６１６（１９９７））。
【０００５】
Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン（ＮＢ−ＤＮＪ）およびＮ−ブチルデオキシガラクトノジリマイシン（ＮＢ−ＤＧＮＪ）のような他の化合物は、グルコシルセラミドシンターゼのインヒビターであることが示されている。Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシンは、グルコシダーゼインヒビターとして周知であるが、これはグルコースをセラミドに付着させることによりグルコシルセラミドの合成を開始する酵素を阻害することが見出された（Ｐｌａｔｔら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：８３６２−８３６５（１９９４）および、Ｐｌａｔｔら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９：２７１０８−２７１１４（１９９４））。ＮＢ−ＤＮＪは、マウスにおいて糖脂質合成を減少することが示されてきた（Ｐｌａｔｔら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１９３６５−１９３７２（１９９７）；Ｊｅｙａｋｕｍａｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：６３８８−６３９３（１９９９）；およびＡｎｄｅｒｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５９：８２１−８２９（２０００））。
【０００６】
上記に基づいて、特異的に、特定のグリコシルトランスフェラーゼの活性改変する化合物が、いくつもの生物学的過程を制御するために有用であり得るということは、明白である。従って、グリコシルトランスフェラーゼの非常に効率的なインヒビターに対する必要性が存在する。本発明はこのような目的での必要性およびその他の必要性を満たす。
【０００７】
（本発明の要旨）
本発明は、好適には、酵素基質の炭水化物部分またはその産物、およびグリコシルトランスフェラーゼ間における疎水性相互作用に基づくグリコシルトランスフェラーゼ活性のインヒビターを提供する。多くの生体反応過程に関わる炭水化物合成に関与するグリコシルトランスフェラーゼの活性を阻害するために、本発明のインヒビターを使用し得る。また、グリコシルトランスフェラーゼインヒビターを調製する方法ならびに適切な候補を同定するための様々なスクリーニングアッセイ方法もまた開示される。
【０００８】
これらの化合物の治療用途および他の用途もまた、提供される。例えば、インビトロでグリコシルトランスフェラーゼ活性を制御するために、本発明のインヒビターを使用し得る。例えば、所望の炭化水素構造物を調製するために用いられる細胞培養において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を阻害するために本インヒビターを使用し得る。このインヒビターはまた、インビボで選択的に所望のグリコシルトランスフェラーゼを阻害することによって、疾患の動物モデルを作成するために都合よく使用され得る。さらに、本発明の方法は、疾患に関連する炭水化物を変化させるために治療的に使用され得る。
【０００９】
特に、本発明は、グリコシルトランスフェラーゼインヒビターの設計方法を提供する。この方法は、グリコシルトランスフェラーゼの活性部位における疎水性部分（例えば、アミノ酸残基）と相互作用する非炭水化物試験化合物を提供することを含む。この試験化合物は、グリコシルトランスフェラーゼによるドナー基質からアクセプター基質へのモノサッカリドの転移に適切な条件下でグリコシルトランスフェラーゼと接触する。この後、酵素活性がその試験化合物の存在下でどの程度減少したかを決定するために、グリコシル化された産物の定量的検出が行われる。
【００１０】
通常、試験化合物は、アクセプター基質のピラノース環、ドナー基質または反応産物を模倣する環状構造を含む。典型的に、環は平面環状構造である。例えば、試験化合物には、芳香環、複素環式芳香族環または脂肪族環構造が含まれ得る。
【００１１】
真核生物（例えば、哺乳動物、昆虫、植物または菌類）または原核生物（例えば、細菌）のいずれかに由来するいくつものグリコシルトランスフェラーゼもまたアッセイに使用し得る。例えば、フルコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＦＴＶＩＩ、ＦＴＩＶ、またはＦＴＩＩＩ）、シアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ６Ｇａｌ１またはＳＴ３Ｇａｌ１）およびガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、α（１，３）Ｇａｌ  Ｔ）を使用し得る。アッセイ方式に基づいて、いくつもの形のアッセイにおいて、グリコシルトランスフェラーゼが提示され得る。例えば、トランスジェニック細胞において酵素が発現され得るか、または正常細胞において酵素が恒常的に発現し得る。
【００１２】
アッセイにおいて、その産物を検出する手段は、１つに定められたものではなく、アッセイ方式に依存するものであろう。例えば、酵素基質の１つがラベル（例えば、放射性ラベル、蛍光ラベルなど）され得、そしてラベル産物を検出する。あるいは、産物に対して特異的に免疫反応性である抗体を用いてその産物を検出し得る。好適なアッセイ方式には、ＥＬＩＳＡ方式、放射性カラムアッセイおよび細胞アッセイを基にした、高処理能力処理するアッセイが含まれる。
【００１３】
上記のように、アッセイに使用される試験化合物は典型的に、標的グリコシルトランスフェラーゼの活性部位における疎水性残基と相互作用するように設計される。この目的に適した構造を持つ化合物またはその類似体を好適には使用する。本明細書中で記述したアッセイによる試験が行われた場合、理想的には、その化合物は、ナノモーラーオーダーのＩＣ５０を持つことが期待される。従って、インヒビターは通常、およそ１００μＭ未満の、通常は、およそ１０μＭ未満、時にはおよそ１００ｎＭ未満のＩＣ５０を持つ。
【００１４】
（定義）
本明細書中で使用されている糖なる語は、１つ以上のサッカリド単位を含む炭水化物化合物（通常多価アルコール（具体的には５価および６価アルコール）のアルデヒドまたはケトン誘導体）を意味する。サッカリド構造および命名法に関する説明は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖａｒｋｉら編、第２節（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９９９）参照。例示的な糖およびそのそれらの通常使用される略号は次のとおりである。
Ａｒａ＝アラビノース；
Ｆｒｕ＝フルクトース；
Ｆｕｃ＝フコース；
Ｇａｌ＝ガラクトース；
ＧａｌＮＡｃ＝Ｎ−アセチルガラクトサミン；
Ｇｌｃ＝グルコース；
ＧｌｃＮＡｃ＝Ｎ−アセチルグルコサミン；
Ｍａｎ＝マンノース；および
ＮｅｕＡｃ＝Ｎ−アセチルノイラミン酸；
Ｓｉａ＝シアル酸。
【００１５】
糖の他の例には、グルコサミン、ガラクトサミン、ラムノース、リボース、グルクロン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸およびキシロースが含まれる。この語は、デオキシ誘導体、無水ウロン酸、塩化誘導体、フッ化誘導体およびアミノ糖（例えば、Ｎ−ブチルデオキシノジリマイシン）などの様々な糖誘導体を包含する。
【００１６】
還元末端におけるサッカリドが実際に還元糖であるか否かに関わらず、オリゴサッカリドは還元末端および非還元末端を持つと考えられている。受け入れられている命名法に従って、オリゴサッカリドは本明細書中で、左側に非還元末端そして右側に還元末端が示される。
【００１７】
本明細書中で記述される全てのオリゴサッカリドは、非還元サッカリドについての名称または略号（例えば、Ｇａｌ）で記述され、続いて、グリコシル結合の立体配置（αまたはβ）、環状結合、結合に関する還元サッカリドの環状結合、次いで環の位置（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）、その還元サッカリドの名称または略号（例えば、ＧｌｃＮＡｃ）で記述される。二つの糖の間の結合は、例えば、２，３、２→３または（２，３）のように、表現され得る。それぞれのサッカリドはピラノースである。
【００１８】
化学化合物の記述において、語は一般的に、その標準的意味に従って使用される。“アルキル”なる語は、分岐または非分岐、飽和または不飽和、一価または二価、１〜８の炭素原子の低級アルキルを含む１から２０の炭素原子を持つ炭化水素基（ｒａｄｉｃａｌ）（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ブチル、ｎ−へキシルなど）、シクロアルキル（３−７炭素原子）、シクロアルキルメチル（４−８炭素原子）およびアリールアルキルのような、を意味する。
【００１９】
“アルコキシ”なる語は、酸素により分子の他の部分に結合しているアルキル基（例えば、エトキシ、メトキシ、またはｎ−プロピルオキシなど）意味する。
【００２０】
“アシル”なる語は、ヒドロキシル基の除去により生じる有機酸由来の基を意味する。例の中には、アセチル、プロピオニル、オレオイル、ミリストイルが含まれる。
【００２１】
“アリール”なる語は、単環（例えばフェニル）または多重縮合環（例えば、ナフチル）を持つ芳香族一価炭素環状基を意味する。それらの環はまた、独立して、アルキル、低級アルキル、シクロアルキル、ヒドロキシ低級アルキル、アミノ低級アルキル、ヒドロキシル、チオール、アミノ、ハロ、ニトロ、低級アルキルチオ、低級アルコキシ、モノ−低級アルキルアミノ、ジ−低級アルキルアミノ、アシル、ヒドロキシカルボニル、低級アルコキシカルボニル、ヒドロキシスルホニル、低級アルコキシスルホニル、低級アルキルスルホニル、低級アルキルスルフィニル、トリフルオロメチル、シアノ、テトラゾイル、カルバモイル、低級アルキルカルバモイル、およびジ−低級アルキルカルバモイルで必要に応じてモノ−、ジ−またはトリ−に置換され得る。あるいは、芳香環の二つの隣接する位置をメチレンジオキシまたはエチレンジオキシ基で置換し得る。
【００２２】
本明細書中で使用されている “ヘテロアリール”なる語は、芳香環の１つ以上の炭素原子が、窒素、酸素または硫黄のようなヘテロ原子で置換されている芳香環を意味する。ヘテロアリールは、一重芳香環（ｓｉｎｇｌｅ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｒｉｎｇ）、多重芳香環（ｍｕｌｔｉ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｒｉｎｇ（ｓ））または１つ以上の芳香環（これは、１つ以上の非芳香環と結合している）であり得る構造を意味する。多重環を持った構造において、環は、共に融合、共有結合、またはメチレンまたはエチレン部分などの共通基（ｃｏｍｍｏｎ  ｇｒｏｕｐ）と結合し得る。共通結合基はまた、フェニルピリジルケトンの場合、カルボニルであり得る。本明細書中で使用されているチオフェン、ピリジン、イソキサゾール、フタルイミド、ピラゾール、インドール、フランなど、または、これらの環のベンゾ融合類似体が“ヘテロアリール”なる語により定義される。この目的に適切な構造を持つそれらの化合物または類似体は都合よく使用される。
【００２３】
ヘテロアリール環構造を持つ適切な化合物類の例には、キノリン、アリールスルホンアミド、フェノチアジン、カルバゾール、ベンズアミドおよびベンゾピラノンが含まれるが、これらに限定されない。
【００２４】
（詳細な説明）
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼインヒビターの同定のための方法を提供する。グリコシルトランスフェラーゼは、糖ヌクレオチド、ドナー基質からアクセプター基質へのモノサッカリドの転移を触媒する。アクセプター基質は本質的にグリコシル残基を受容し得る任意の他の基でもあり得る。そのアクセプター基質には、グリコシル残基、ポリペプチドおよび脂質が含まれるが、これに限定されない。適切な基質の選択は、典型的に、トランスフェラーゼの特異性に依存する。一般的に、Ｂｅｙｅｒら、Ａｄｖ．ｉｎ  Ｅｎｚｙｍ．５２：２４（１９８１）参照。
【００２５】
現在知られているグリコシルトランスフェラーゼインヒビターの構造は、主として、ドナー基質で見られる親水性構造モチーフ（すなわち、ヒドロキシル基の整列）を基にしたものである。対照的に、本発明のインヒビターは、酵素のアクセプターまたはドナー基質の炭水化物部分において、そしてまた酵素反応の産物においても見られる疎水性構造モチーフを基にしたものである（例として、Ｂｏｕｒｎｅら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３，６８１−６８６（１９９３）およびＧａｂｉｕｓら、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ  １５，２３−３０（１９９８）参照。）。従って、本発明のインヒビターおよびアッセイ方法は、グリコシルトランスフェラーゼによるアクセプター基質の認識に関与する疎水性相互作用を利用する。結果として、本発明のインヒビターは好適に、疎水性特性を持ち、そして標的酵素の活性部位において疎水性アミノ酸と相互作用し、アクセプターまたはドナー基質あるいはその産物と競合する非炭水化物化合物である。理論と結び付けられるまでもなく、活性部位の疎水性残基は、天然のアクセプター基質または酵素反応産物の認識に有意に寄与すると考えられている。特に、大きい芳香族残基（たとえば、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｈｅ）または脂質性残基（たとえば、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＶａｌ）は、アクセプター基質または産物中の糖の疎水性表面と相互作用する（図１参照）。
【００２６】
本発明のインヒビターは、少なくとも部分的に、疎水性相互作用を通して糖がグリコシルトランスフェラーゼの活性部位と相互作用するという認識に基づくものである（例えば、図１Ｃ参照）。図１Ｃで見られるように、ヒドロキシル基の配向に基づいて、糖は典型的に、蛋白質の疎水性アミノ酸残基と相互作用する疎水性構造モチーフを持つ。本発明のインヒビターは疎水性相互作用または糖基質の構造を模倣する。
【００２７】
従って、活性部位において疎水性残基と相互作用するアクセプターもしくはドナー基質、および／または酵素産物のこれらの部分を模倣する性能により、本発明の非炭水化物インヒビターを選択する。本明細書中で提供される開示を用いて、当業者は、広範囲にわたる種々の潜在的なグリコシルトランスフェラーゼインヒビターを設計および試験し得る。典型的に、ドナーまたはアクセプター基質における１つ以上の糖のピラノース環の構造および整列を模倣する性能によりインヒビターが選択される。例えば、アクセプター基質が１つを超える糖を含む場合、基質または産物における糖の間の空間的配向性を模倣するようにインヒビターが設計され得る。
【００２８】
本発明のインヒビターは、酵素との疎水性相互作用を基にしているため、候補化合物の相対的疎水性を予想することでインヒビターの設計を促進し得る。化合物の疎水性測定手段は周知である。典型的に、疎水性は、Ｈａｎｓｃｈ定数という語で表される。Ｈａｎｓｃｈ定数とは、オクタノ−ルと水との間の、溶質の分布に関する分配係数Ｐに基づいた疎水性相互作用に関する溶質の能力の目安となるものである。Ｐを適用する最も一般的な方法は、ｌｏｇＰとして与えることである。
【００２９】
試験化合物の疎水性に影響を与えるコア構造に置換基を付加することにより、特定のグリコシルトランスフェラーゼに対するインヒビターの選択性および／または増加したアフィニティーが達成される。置換基定数、πを用いて、様々な置換基の挙動を定量し得る。様々なπのスケールが存在し、それは参考として使用するコア構造に依存する。置換基についてのπ定数を提供する表を利用することができる（例として、ＨａｎｓｃｈおよびＬｅｏら、（１９７９）、“Ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｈａｎｓｃｈら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０：３０４（１９７７），Ｈａｎｓｃｈら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１６：１２０７（１９７３）参照）。この情報を用いて、異なる置換基の相対的疎水性が明らかにされ得そして、本発明のインヒビターの設計に使用され得る。
【００３０】
本発明のインヒビターは、典型的に、１つ以上の疎水基を含む。通常、本化合物は、芳香族環、複素環式芳香環、多重芳香環または脂質環の構造物、または、活性部位において疎水性残基と相互作用する任意の疎水性基を含む。上記の疎水性相互作用および上記の置換基定数を基にして、当業者は、これらの基準に合う多くの試験化合物を同定または合成し得る。インヒビターを同定するために、試験化合物を、都合よく、選択された酵素の性能を阻害する活性を決定する標準的アッセイでスクリーニングし得る。
【００３１】
当業者は、最適な効力を持たせるために、様々な疎水性または電荷をもつ基を持つようにインヒビターがさらに改変され得ることを認識するであろう。例えば、化合物の活性、溶解性、バイオアベイラビリティーまたは他の薬力学的な面を最適化するために、これらの構造部分が使用され得る。
【００３２】
本発明のインヒビターを使用して、炭水化物の合成に関与する任意の生物由来の酵素の活性を阻害し得る。例えば、適切な菌類、細菌類、昆虫および植物酵素には、キチンシンターゼ、スクロースシンターゼ、インベルターゼ、および炭水化物代謝および生合成に関与する他の酵素が含まれる。代表的な生合成経路には、細胞壁生合成、ポリサッカリド生合成およびリポポリサッカリド生合成が含まれる（例として、Ａｌｂｅｒｔｓら、編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ第２版、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｎｄｏｎ  １９８９；Ｄｅｙら編、Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  １９９７参照）。
【００３３】
哺乳動物および他の生物において、グリコシルトランスフェラーゼは、転移された糖残基の種類を基にしてファミリーに分類される。例えば、シアル酸を転移する酵素はシアリルトランスフェラーゼ（ｓｉａｌｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）と呼ばれ、フコースを転移する酵素は、フコシルトランスフェラーゼと呼ばれ、そしてガラクトースを転移する酵素はガラクトガラクトシルトランスフェラーゼと呼ばれる。それぞれのファミリーにおいて、典型的に、動物細胞の糖蛋白質および糖脂質で見られる多様な炭水化物構造を創りあげるために必要な１０から１５の異なる酵素が存在する。それぞれの酵素は、酵素が利用するドナーおよびアクセプター基質および転移反応において形成されるアノマー結合に基づく、定められた構造を生成する。
【００３４】
多くのフコシルトランスフェラーゼが当業者に公知である。簡潔に言うと、フコシルトランスフェラーゼには、ＧＤＰ−フコースからアクセプター基質の水酸基位置にＬ−フコースを転移させるどのような酵素も含まれる。いくつかの実施形態において、例えば、アクセプター糖は、オリゴサッカリドグリコシド体の、Ｇａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃ基におけるＧｌｃＮＡｃである。この反応に適切なフコシルトランスフェラーゼには、ヒト乳から得られる既知のＧａｌβ（１→３，４）ＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ−ＩＩＩ  Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）（例として、Ｐａｌｃｉｃら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１９０：１−１１（１９８９）；Ｐｒｉｅｅｌｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：１０４５６−１０４６３（１９８１）；およびＮｕｎｅｚら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．５９：２０８６−２０９５（１９８１）参照）、およびヒト血清にて見出されるβＧａｌ（１→４）βＧｌｃＮＡｃα（１→３）フコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ−ＩＶ，ＦｕｃＴ−Ｖ，ＦｕｃＴ−ＶＩおよびＦｕｃＴ−ＶＩＩ，Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６５）が含まれる。βＧａｌ（１→３，４）βＧｌｃＮＡｃα（１→３，４）フコシルトランスフェラーゼの組換え体もまた、利用可能である（Ｄｕｍａｓら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １：４２５−４２８（１９９１）および、Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：１２８８−１３０３（１９９０）参照）。他の例示的なフコシルトランスフェラーゼには、α１，２フコシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．６９）、α１，３フコシルトランスフェラーゼＩＸ（ヒトおよびマウスＦｕｃＴ−ＩＸのヌクレオチド配列は、Ｋａｎｅｋｏら、（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４５２：２３７−２４２に、そしてヒト遺伝子の染色体座はＫａｎｅｋｏら、（１９９９）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．Ｃｅｌｌ．Ｇｅｎｅｔ．８６：３２９−３３０に記述されている）が含まれる。最近報告された、アクセプター基質としてＮ−結合ＧｌｃＮＡｃを使用する、カタツムリＬｙｍｎａｅａ  ｓｔａｇｎａｉｌｓ  由来およびマングマメ由来のα１，３−フコシルトランスフェラーゼは、ｖａｎ  Ｔｅｔｅｒｉｎｇら、（１９９９）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４６１：３１１−３１４およびＬｅｉｔｅｒら、（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２１８３０−２１８３９にそれぞれ記載されている。さらに、Ｒａｓｋｏら、（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：４９８８−９４に記述されているように、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉのα（１，３／４）フコシルトランスフェラーゼ、ならびにＨ．Ｐｙｌｏｒｉのα１，２−フコシルトランスフェラーゼ（Ｗａｎｇら、（１９９９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４５：３２４５−５３のような細菌性フコシルトランスフェラーゼがある。また、本発明において有用なグリコシルトランスフェラーゼの記載については、Ｓｔａｕｄａｃｈｅｒ，Ｅ．（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：３９１−４０８を参照のこ���。
【００３５】
例示的なガラクトシルトランスフェラーゼには、α１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ．Ｎｏ．２．４．１．１５１、例として、Ｄａｂｋｏｗｓｋｉら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２５：２９２１（１９９３）およびＹａｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：２２９−２３３（１９９０），ウシ（ＧｅｎＢａｎｋ  ｊ０４９８９）、Ｊｏｚｉａｓｓｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２９０−１４２９７（１９８９）、マウス（ＧｅｎＢａｎｋ  ｍ２６９２５）、Ｌａｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８２２７−８２３１（１９８９）、ブタ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｌ３６１５２）、Ｓｔｒａｈａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４１：１０１−１０５（１９９５）参照）が含まれる。別のα１，３−ガラクトシルトランスフェラーゼは、血液型Ｂ抗原の合成に関与する（ＥＣ  ２．４．１．３７）、Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１４６−１１５１（１９９０）、（ヒト）。他には、例として、ＥＣ２．４．１．９０（ＬａｃＮＡｃ  シンターゼ）およびＥＣ２．４．１．２２（ラクトースシンターゼ）（ウシ（Ｄ’Ａｇｏｓｔａｒｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８３：２１１−２１７（１９８９））、ヒト（Ｍａｒｓｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５７：６５７−６６３（１９９８））、マウス（Ｎａｋａｚａｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：１６５−１６８（１９８８））ならびにＥ．Ｃ．２．４．１．３８およびセラミドガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．１．４５、Ｓｔａｈｌら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３８：２３４−２４２（１９９４））を含むα１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼが含まれる。他の適切なガラクトシルトランスフェラーゼには、例えば、α１，２−ガラクトシルトランスフェラーゼ（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｃｈａｐｅｌｌら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ  ５：５１９−５２８（１９９４）由来）が含まれる。
【００３６】
哺乳動物セリン／スレオニン−結合オリゴサッカリド（Ｏ−グリカン）は、通常、ゴルジ酵素コア２β−１，６−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｃ２  ＧｌｃＮＡｃＴ）を用いて合成される。コア２  Ｏ−グリカンは、ムチン産物およびセレクチンリガンド生合成に必須であるという仮説が立てられている。Ｃ２ＧｌｃＮＡｃＴを欠くマウスにおいて、好中球増加およびセレクチンリガンドの部分的欠損を伴う特定の表現型が現れる。研究によって、コア２オリゴサッカリド生合成がセレクチンの生理的役割を遮断することが示され、骨髄ホメオスタシスおよび炎症における、Ｃ２ＧｌｃＮＡｃＴについての機能が明らかになっている。Ｅｌｌｉｅｓら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９：８８１−９０（１９９８）ＷＯ９９／２７４６５。
【００３７】
シアリルトランスフェラーゼには、ＳＴ３ＧａｌＩＩＩ、ＳＴ３ＧａｌＩＶ、ＳＴ３ＧａｌＩ、ＳＴ６ＧａｌＩ、ＳＴ３ＧａｌＶ、ＳＴ６ＧａｌＩＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩ、ＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩおよびＳＴ６ＧａｌＮＡｃＩＩＩ（Ｔｓｕｊｉら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：ｖ−ｘｉｖ（１９９６）にて記載されているような、本明細書中で使用されるシアリルトランスフェラーゼの命名法）が含まれる。例示的なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．６）は、Ｇａｌβ１→４ＧｌｃＮＡｃジサッカリドまたはグリコシドの非還元末端Ｇａｌにシアル酸を転移する。Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｉｊｎｄｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５６：３１５９（１９８１）、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：１３８４５（１９８２）およびＷｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２１０１１（１９９２）を参照のこと。別の例示的なα２，３−シアリルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．９９．４）は、シアル酸を、Ｇａｌβ１→３ＧａｌＮＡｃジサッカリドまたはグリコシドの非還元末端Ｇａｌへ転移させる。Ｒｅａｒｉｃｋら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４：４４４４（１９７９）およびＧｉｌｌｅｓｐｉｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：２１００４（１９９２）を参照のこと。さらなる例示的な酵素には、Ｇａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃα−２，６シアリルトランスフェラーゼ（Ｋｕｒｏｓａｗａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１９：３７５−３８１（１９９４））が含まれる。
【００３８】
いくつかの免疫反応が、部分的に、２，６−シアリルガラクトシドおよび２，３−シアリルガラクトシドにより媒介される。これらのシアリルガラクトシドは、例えば、ＣＤ２２などの、細胞間接着およびシグナルト伝達に関与する細胞表面分子のリガンドである。２，６−シアリルガラクトシドは、典型的に、Ｂ細胞を介した細胞反応の変化に関係し、その一方、２，３−シアリルガラクトシドは、一般的に、Ｔ細胞を介した免疫反応（例として、ＷＯ９８／５４３６５を参照）に関与する。
【００３９】
他のグリコシルトランスフェラーゼには、例えば、Ａｌｇ８（Ｓｔａｇｌｊｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５９７７（１９９４））またはＡｌｇ５（Ｈｅｅｓｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２４：７１（１９９４））などのグルコシルトランスフェラーゼ、例えばβ（１，３）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ、β（１，４）−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（米国特許第５，６９１，１８０；Ｎａｇａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１２０８２−１２０８９（１９９２）およびＳｍｉｔｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１５１６２（１９９４））およびポリペプチド  Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Ｈｏｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２６０９（１９９３））などのＮ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼが含まれる。適切なＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼには、ＧｎＴＩ（２．４．１．１０１、Ｈｕｌｌら、ＢＢＲＣ  １７６：６０８（１９９１））、ＧｎＴＩＩおよびＧｎＴＩＩＩ（Ｉｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：６９２（１９９３））、ＧｎＴＶ（Ｓｈｏｒｅｉｂａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１５３８１（１９９３））、Ｏ結合型Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（Ｂｉｅｒｈｕｉｚｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３２６（１９９２））、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェートトランスフェラーゼ（Ｒａｊｐｕｔら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２８５：９８５（１９９２））およびヒアルロン酸シンターゼが含まれる。
【００４０】
また、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＩ（ＥＣ２．４．１．１７４）のような、プロテオグリカン合成に関与する酵素および、Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＥＣ２．４．１．１７５）のようなコンドロイチン硫酸合成に関与する酵素にも関心がある。適切なマンノシルトランスフェラーゼには、α（１，２）マンノシルトランスフェラーゼ、α（１，３）マンノシルトランスフェラーゼ、β（１，４）マンノシルトランスフェラーゼ、Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎシンターゼ、ＯＣｈ１およびＰｍｔ１が含まれる。キシロシルトランスフェラーゼには、例えば、蛋白質キシロシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．４．２．２６）が含まれる。
【００４１】
現在好適なインヒビターは、ＦＴＩＩＩ、ＦＴＶＩＩ、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＳＴ６ＧａｌＩ、ＳＴ３ＧａｌＩ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、α（１，３）ＧａｌトランスフェラーゼおよびＵＤＰＭｕｒＮＡｃトランスフェラーゼ、ＵＤＰＧｌｃＮＡｃ：ＭｕｒＮＡｃトランスフェラーゼから選択される酵素に対して働く。
【００４２】
（本発明のグリコシルトランスフェラーゼインヒビター）
上記のように、本発明により、グリコシルトランスフェラーゼを阻害する方法が提供される。本方法には、グリコシルトランスフェラーゼと、グリコシルトランスフェラーゼによって認識される糖の疎水性構造モチーフを模倣したインヒビターとの（例えば、アクセプターまたはドナー基質における）接触、および、これによるグリコシルトランスフェラーゼの阻害が含まれる。好適な局面において、インヒビターは、グリコシルトランスフェラーゼの活性部位の疎水性アミノ酸残基と相互作用する非炭水化物疎水性化合物である。
【００４３】
インヒビターは通常、環状炭素（脂肪族または芳香族の）構造を含む。典型的に、本インヒビターは、疎水性構造または糖の面を模倣したアリールまたはヘテロアリール部分を含む。アリールまたはヘテロアリール部分は、アクセプター基質またはドナー基質の疎水性構造を模倣し得る。典型的に、インヒビターの環は、糖構造の環状構造と同程度の大きさである。ある実施形態において、本発明のインヒビターは、キノリン、フェニルスルホンアミド、フェノチアジン、カルバゾール、ベンズアミドおよびベンゾピラノン、またはこれらの誘導体を含むがこれに限定されない、ヘテロアリール基を含む。さらに好適なヘテロアリール部分には、カルバゾールおよびフェノチアジン、またはそれらの誘導体が含まれる。他の本発明のインヒビターは、チオフェン、ピリジン、イソキサゾール、フタルイミド、ピラゾール、インドールおよびフラン、またはそれらの誘導体のようなヘテロアリール部分を含む。
【００４４】
多くのヘテロアリール誘導体は当業者に公知である。これらの基には、例えば、２−アザナフタレニル、ベゾキサゾイル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾイル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾイル、プリニル、２−ベンズイミダゾイル、５−インドリル、１−イソキノリル。５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、６−キノリル、チオベンゾキサゾリル、チオベンゾチアゾリルおよびチオベンズイミダゾリル誘導体が含まれる。このヘテロアリール基は、共有結合で他の官能基と結合し得、アクセプター基質を模倣した疎水性構造モチーフを生じ得る。
【００４５】
当業者に対して、ある局面において、相補的官能基を用いて本発明のヘテロアリール誘導体を調製し得るということが明白である。これら二つの官能基の反応（一つはヘテロアリール基およびもう一方は他の誘導体における反応）によって、所望の結合が提供される。例えば、ヘテロアリール基は、アミン官能基を持つことが可能であり、誘導体の官能基は、塩化アシルまたはＮＨＳエステルのような、活性化されたカルボキシル基であり得る。二つの相補的な官能基を一緒に反応させることによって、ヘテロアリール基および誘導体の間でアミド結合が形成される。反応基の適切な選択によって、所望するヘテロアリール誘導体のカップリングが得られ得る。
【００４６】
ある局面において、そのインヒビターのｌｏｇＰ値によって本発明のインヒビターを選択する。インヒビターに対するオクタノ−ル−水分配係数は、経験的に決定または当業者によって周知のソフトウエアプログラムを用いて予想され得る。ある局面において、Ａｄｖａｎｃｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ＡＣＤ）から入手できるソフトウェアを使用する。例えば、ＡＣＤプログラムにより、正確なＬｏｇＰ（オクタノール／水分配係数）が±０．３ＬｏｇＰ単位以内で計算される（ｗｗｗ．ａｃｄｌａｂｓ．ｃｏｍを参照）。ある好適な実施形態において、グリコシルトランスフェラーゼおよびインヒビター化合物の天然アクセプター基質のｌｏｇＰは、それぞれのおよそ３単位以内および、好適にはそれぞれおよそ１単位からおよそ２単位である。
【００４７】
一般的に、酵素インヒビターは通常、この酵素によって触媒される反応速度を遅くするように基質と酵素との相互作用に関与する。インヒビターは、いくつかの基準によって分類され得る。例えば、それらは可逆的または不可逆的であり得る。不可逆的インヒビターは、共有結合または非共有結合のいずれかにより、非常に固く酵素と結合しているので、その標的酵素から多少なりとも非常にゆっくりと解離する。可逆的インヒビターは、対照的に、解離し得る酵素−インヒビター複合体を含む。
【００４８】
インヒビターは、また、競合的、非競合的、または不競合的インヒビターのどれにあてはまるかということで分類され得る。１つの基質と関わる速度論的に単純な系に対する競合的インヒビターにおいて、酵素は、基質またはインヒビターのどちらかと結合し得るが両方と結合することはない。典型的に、競合的インヒビターは基質またはその産物と類似しており、酵素活性部位と結合するため、従って、基質の活性部位との結合を妨害する。競合的インヒビターは、効果的に、酵素に対する基質のアフィニティーを減少させることによって触媒速度を減少させる。典型的には、平衡を考慮に入れると、その酵素反応自身の産物により酵素を競合的に阻害し得る。酵素が触媒として働くことから、原則的に、前進またはもとに戻る方向で反応を加速し得る。現在の好適な実施形態において、本発明酵素インヒビターはアクセプター基質に対して競合的である。
【００４９】
非競合的インヒビターは、酵素が基質に結合し得ると同時に、インヒビターに結合することを可能にする。不競合的インヒビターは、遊離酵素の割合を減少させることよりも、むしろ、酵素のターンオーバー数を減少させることにより働く。別の可能なインヒビターのカテゴリーは、インヒビターが結合部位に影響し、そして酵素のターンオーバー数も変化させる、混合型または不競合的インヒビターである。グリコシルトランスフェラーゼの場合の、１つを超える基質を含む速度論的複雑系の酵素阻害は、Ｓｅｇｅｌ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ（Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．１９７５）に記載されている。
【００５０】
（アッセイ）
化合物を合成または同定した後、それらを、それぞれの化合物が阻害する標的グリコシルトランスフェラーゼの活性の程度を決定するために、標準的アッセイにより試験する。グリコシルトランスフェラーゼ活性およびその阻害を、典型的に、標準的な酵素活性を決定するための方法に従ってアッセイする。酵素アッセイの一般的記載に関しては、Ｒｏｓｓｏｍａｎｄｏ，「Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ」Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，第１８２巻，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０）およびＦｅｆｓｈｔ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ（第２版、１９８５）を参照のこと。
【００５１】
グリコシルトランスフェラーゼ活性に対するアッセイには、典型的に、生理的ｐＨに調整する緩衝溶液、２価カチオンの供給源、ドナー基質、アクセプター基質、グリコシルトランスフェラーゼおよび試験化合物が含まれる。２３ｏＣまたは３７ｏＣにて所定の時間経過後、反応を停止し、そして反応産物を単離し、そして標準的方法に従って定量する。例えば、容易に逆相ＨＰＬＣで分離し、そしてＵＶ分光光度計を用いて定量し得るＵＶ標識産物を得るＵＶ標識アクセプターを用いるグリコシルトランスフェラーゼアッセイは、Ｓｃｈａｕｂら、（１９９８）Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｊ．１５：３４５−３５４に記載されている。また、Ｋａｊｉｈａｒａら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２６４：Ｃ１−Ｃ５（１９９４）；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：５７３２−５７３５（１９９５）も参照のこと。
【００５２】
阻害活性を持つ試験化合物の効果的な同定を補助するために、多数の試験化合物を迅速に分析するアッセイ方式が好適である。例えば、ＥＬＩＳＡ方式を基にした高処理能力アッセイを使用し得る（図２）。これらのアッセイにおいて、アッセイの化合物の１つ（通常はアクセプター糖）を固体表面（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）に固定化する。例えば、アクセプター糖を含む糖蛋白質が都合よく使用され得る。他の成分を添加し、そして混合物の存在を最終産物の生成に適した状態でインキュベートする。最終産物を検出するために、最終産物に対して特異的反応性を持つ標識抗体が使用される。標識抗体によって産生されたシグナルを定量するための標準的手順が使用され得る。
【００５３】
あるいは、放射性カラムアッセイが都合よく使用され得る（図３）。これらの方法において、ドナーまたはアクセプター糖のどちらか一方を放射性標識（例えば、１４Ｃまたは３Ｈを用いて）する。他の成分を添加し、そして適切な状態でインキュベートする。次に、カラムクロマトグラフィー（例えば、大きさまたは電荷により分離する）を用いて、産物を未反応糖より分離する。生成された産物の量を決定するために、最終産物を含む分画の放射性を測定する。
【００５４】
いくつかの実施形態において、細胞を基にしたアッセイを使用し得る（図４）。これらのアッセイにおいて、天然にはその酵素反応の最終産物を産生しない細胞を、所望するグリコシルトランスフェラーゼをコードした核酸でトランスフェクトする。細胞により提供されない残りの成分を添加し、そして典型的には、標識抗体を用いて、細胞の最終産物産生能を決定する。所望するグリコシルトランスフェラーゼの組換え的な発現のための手段および、細胞表面における新たな炭水化物の存在を検出するための方法は公知である（米国特許第５，３２４，６６３号および同第５，５９５，９００号を参照）。
【００５５】
インビトロ細胞アッセイまたは実験動物において、好ましい阻害特性を示す試験化合物を、さらに、様々な反応（例えば、免疫または炎症）を阻害するそれらの性能を試験し得る。他のタイプの免疫反応に対する、そのグリコシルトランスフェラーゼインヒビターの効果を試験するために適したアッセイには、例えば、Ｂ細胞増殖アッセイ、ＣＴＬ活性化アッセイなどが含まれる。このようなアッセイは、例えば、Ｈｅｎｎｅｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ，Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４５０４−４５０９（１９９８）にて記載されている。さらに、その化合物の吸収、分布、代謝および排出に関して体内での薬物のタイムコースをアッセイするように設計された試験（ＡＤＭＥ）など、他の試験が行われ得る。このような試験に関する様々な方法は周知である。
【００５６】
（グリコシルトランスフェラーゼインヒビターの使用）
本発明はまた、グリコシルトランスフェラーゼと本発明の化合物とを接触させることにより、グリコシルトランスフェラーゼにより触媒される特定のグリコシドの合成を阻害する方法を提供する。多くの関係において、グリコシルトランスフェラーゼ活性を変化させるために、本方法を使用し得る。本発明のインヒビターを使用して、例えば、インビトロでグリコシルトランスフェラーゼの活性を制御し得る。例えば、所望する炭水化物構造を調製するために用いる細胞培養物においてグリコシルトランスフェラーゼ活性を阻害するために、このインヒビターを使用し得る。また、インビボにおいて、選択的に所望するグリコシルトランスフェラーゼを阻害することによって疾患の動物モデルを作製することを目的として、本インヒビターを都合よく使用し得る。
【００５７】
多くの生物学的過程が、特異的な炭水化物構造の存在または非存在に依存する。例えば、細菌、菌類および酵母などの病原生物におけるグリコシルトランスフェラーゼ活性を阻害するために本化合物を抗生物質として使用し得る。グリコシルトランスフェラーゼは多くのヒトの疾患に関連している。多くの疾患（例えば、炎症または免疫応答）が特定のオリゴサッカリドを含む細胞表面レセプターを介する細胞間認識に関与する。例えば、ＳＴ６Ｇａｌシアリルトランスフェラーゼにより、レクチンＣＤ２２のリガンドであるＮ結合型シアロシド産生が制御される。ＳＴ６Ｇａｌシアリルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をノックアウトしたトランスジェニックマウスを用いた研究において、Ｂリンパ球活性化および免疫機能を促進するために、この酵素の活性および対応するオリゴサッカリド産生が不可欠であるということが示唆されている（Ｈｅｎｎｅｔら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（８）：４５０４−９（１９９８））。ＦＴＩＩＩ、ＦＴＶＩＩ、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼ、ＳＴ６ＧａｌＩ、ＳＴ３ＧａｌＩ、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、ＵＤＰＭｕｒＮＡｃトランスフェラーゼ、ＵＤＰＧｌｃＮＡｃ：ＭｕｒＮＡｃトランスフェラーゼなどの他のグリコシルトランスフェラーゼが同じように疾患過程に関連している。
【００５８】
同じように、フコース残基付加グリカンの広範囲かつ特異的な生物学的役割が報告されている。例えば、セレクチンと名付けられたレクチン分子に対する炭水化物リガンドはフコシル化されている（Ｅｔｚｉｏｎｉ，Ａら、Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ４：３０７−３０８（１９９３））。セレクチンは、Ｅ−、Ｌ−またはＰ−セレクチンのいずれかを生成する３つの遺伝子によりコードされる。それらは初め、それらの好発現部位、つまり内皮（Ｅ−セレクチン）、白血球（Ｌ−セレクチン）および血小板（Ｐ−セレクチン）と関連して定義された。セレクチンは、特定の細胞および組織表面の糖蛋白質および、おそらく糖脂質に存在するシアリルＬｅｗｉｓＸと名付けられた特定のグリカンと結合する。この構造には、特異的結合パターンの外側末端におけるフコースおよびシアル酸両方の存在が必要である。さらに、ＡＢＯ式血液型分類の関係におけるある種の血液型で、フコースの上皮および消化管での発現がある疾患および病原菌感受性と関連する。血液型Ａの個体では、胃癌罹患率がわずかではあるが有意に増加しており、血液型Ｏ型の個体は、消化性潰瘍罹病率が他の血液型の場合よりも少し高い。これらの疾患の両方がスピロヘータＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉが関与する感染と関連している。
【００５９】
胃上皮におけるフコシルトランスフェラーゼ活性が、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉに対して接着機能を提供し得ることが示されている。従って、消化管上皮のフコース残基付加は、人内のこの病原生物の接着およびコロニー形成を調整する。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉは、調査されたヒトのうち、少なくとも半分の人の胃でコロニーを形成している。Ｈ．ｐｙｌｏｒｉに罹患しているヒトの分集団は、胃および小腸での潰瘍形成が進行している。どのようにして細菌が宿主細胞に付着するのかということについては特に力を入れるべき課題である。候補の中で腸の炎症性疾患と関連のある候補接着アクセプターは、フコシル化炭水化物である、Ｌｅｗｉｓ  ｂ（Ｉｌｖｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７９：３７３−３７７（１９９８））である。Ｌｅｗｉｓ  ｂ（Ｆｕｃα１，２Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃ−Ｒ）は２つのフコシルトランスフェラーゼ（ＦｕｃＴ−ＩＩおよびＦｕｃＴ−ＩＩＩ）の産物である（Ｆａｌｋら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：１５１５−１５１９（１９９５）およびＧｕｒｕｇｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：３９２５−３９３０（１９９８））。
【００６０】
さらに、血管形成において特定の炭水化物が結び付けられてきた（ＷＯ９８／４８８１７）。従って、これらの構造生成の制御を利用して、ガンおよび他の疾患に関する血管形成を処置し得る。同じように、抗菌化合物としてグリコシルトランスフェラーゼのインヒビターを使用し得る。例えば、ラモプラニンおよびバンコマイシンなど、既知の抗菌化合物が炭水化物合成に関係する酵素を阻害することは、公知である。従って、ヒトの疾患を処置するための治療化合物、抗生物質、殺虫剤などとして、本発明の化合物を使用し得る。ある好適な実施形態において本発明に化合物を疾患の治療的処置に使用し得る。
【００６１】
本発明の組成物および方法は、治療的適用および診断的適用の両方における用途を見出す。例えば、基質アナログとして働き得るグリコシルトランスフェラーゼインヒビターを、特定の目的のグリコシルトランスフェラーゼを発現する細胞のインビボ診断（例えば、癌細胞）のために使用する。さらに、α（１，３）ガラクトシルトランスフェラーゼインヒビターを、異種移植片の拒絶を遅延あるいは予防するために使用し得る。次いで、生物学的に有効量の薬剤に対する細胞の応答を決定し得る。
【００６２】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼインヒビター化合物はまた、治療的に、様々な免疫応答に関連するグリコシルトランスフェラーゼ活性を選択的に阻害するための用途を見出す。例えば、本発明のインヒビターは、自己免疫疾患、移植片拒絶およびアレルギーに関連する有害な免疫反応を阻害するために使用され得る。免疫系の不適切な活性化は、自己免疫反応、同種移植片拒絶およびアレルギー反応のような、多数の免疫性疾患のうちの１つの要素である。代表的な自己免疫疾患には、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、狼瘡、強皮症および重症筋無力症が含まれる。アレルギー反応には、様々な花粉、粉塵ダニなどが含まれる。さらに、外来感染症によって、免疫性疾患（例えば、ライム病、肝炎、ＬＣＭＶ、連鎖球菌感染後心内膜炎、または糸球体腎炎）が引き起こされ得る。セリアック病およびクローン病、ならびに他のアレルギー疾患のような食物過敏症が、不適切な免疫反応と関連しているか、または自己免疫成分を有することが疑われている。
【００６３】
本発明の組成物により処置し得る他の疾患には、例えば、慢性関節リウマチ、虚血後白血球性組織障害（再還流障害）、急性白血球媒介肺障害（例えば、成人呼吸困難症候群）、敗血症性ショック、および、アトピー性皮膚炎および乾癬などを含む急性および慢性炎症が含まれる。再還流障害の場合、理想的には、手術後回復を促進するために心臓手術の前に予防的にブロック剤が使用される。さらに、循環する癌細胞の接着を阻害することによって腫瘍転移を予防し得る。この例の中には、結腸癌およびメラノーマが含まれる。
【００６４】
治療適用において、本発明のグリコシルトランスフェラーゼインヒビターを、既に不適切な、および不必要な免疫反応が引き起こされていることに対して投与する。グリコシルトランスフェラーゼインヒビターを含む組成物を、不必要な免疫反応を阻害するために、および、症状および（または）合併症を治療するため、少なくとも部分的に抑制するために、十分な量で患者に投与する。これを遂行するために十分な量を「治療的に有効な適用量」と定義する。この治療的に有効な適用量は、例えば、インヒビター組成物、投与方法、処置を行う疾患の進行状態および重症性、患者の体重および全体的な健康状態および担当医の判断に依存する。
【００６５】
注意しなければいけない点は、本発明の組成物が、生命の危機に瀕した、あるいは危機に瀕する可能性がある重症の病態において用いられ得ることである。これらの場合、外来物質を最小に見積もっており、また比較的無毒性であるというインヒビター特性の見地から、治療担当医師によって、これらの組成物を過剰量投与することが可能であり、必要であると考え得る。
【００６６】
炎症性疾患治療のための本発明のグリコシルトランスフェラーゼインヒビターの適用量は、例えば、特定のインヒビター、投与方法、処置される特定の疾患およびその重症性、患者の全身的状態および状態、ならびに担当医の判断に従って、変化する。
【００６７】
薬学的組成物が、予防的および／または治療的処置のために、非経口、表面的、経口または局所的に（例えば、エアロゾルによってまたは経皮的に）意図される。表面的適用のために、非噴霧形、局所適用に合致した担体から成る、および水よりも好適に動的粘性が大きい、半固形の粘性のある形または固形が好適には使用される。適した剤形には、溶液、懸濁液、エマルジョン、クリーム、軟膏、粉剤、塗布剤、サーブ（軟膏）、エアロゾルなどが含まれるが、これらに限定されない。これらは、所望の場合、滅菌されるか、または補助剤（例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝材または浸透圧を調整する塩など）と混合される。
【００６８】
エアロゾル適用のために、界面活性剤およびプロペラントとともに細かく分割した形で本化合物を好適に供給する。ブロック剤の典型的なパーセンテージは、重量の０．１％から１０％、好適には、１％から５％である。界面活性剤は、もちろん、無毒性であり、および好適にはプロペラントに可溶でなければならない。これらの薬剤の代表的なものは、例えばエチレングリコール、グリセロール、エリスリトール、マンニトール、ソルビトール、ソルビトール由来のヘキシトール無水物および、これらのエステルのポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレン誘導体などの脂肪族多価アルコールまたはその環状無水性を有するカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレイン酸、オレステリン酸およびオレイン酸などの６から２２の炭素原子を含むエステルまたは脂質の部分的エステルである。混合または天然グリセリドなどの、混合エステルを使用し得る。界面活性剤は、組成物重量の０．１％から２０％、好適には０．２５％から５％を構成し得る。本組成物のバランスは通常プロペラントである。液性プロペラントは、典型的に、室温にて気化し、圧縮濃縮される。ブタンおよびプロパンなどの５炭素以下の低級アルカンは、適切な液性プロペラントの１つである。また、好適にはフッ化またはフッ化塩化アルカンである。上記の混合物をまた、使用し得る。エアロゾルに調製する場合、適切な体積を備える容器に細かく分割した化合物および界面活性剤を含む適切なプロペラントを満たす。
【００６９】
本発明はまた受容可能な担体、好適には水性キャリアに溶解または懸濁したグリコシルトランスフェラーゼインヒビター溶液を含む静脈内投与用の組成物をも提供する。例えば、水、緩衝液、０．４％食塩水のような様々な水性キャリアを用い得る。これらの組成物は、通常の周知の滅菌技術により滅菌され得るか、またはフィルター滅菌され得る。得られた水性溶液をそのままで、または凍結乾燥して使用するためにパッケージされ得、この凍結乾燥した調製物は、投与の前に滅菌した水性溶液と合わせられる。組成物には、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなど、ｐＨ調整剤および緩衝剤、浸透圧調整剤、湿潤剤など、生理学的状態に近づけるために必要とされるような薬学的に受容可能な補助物質を含み得る。
【００７０】
ある一定の状態下で「カクテル」の形に組み合わせられるグリコシルトランスフェラーゼインヒビターの濃度は、薬学的剤形において効果を増大させるために広範に変化し得る。つまり重量のおよそ０．０５％以下、通常または少なくともおよそ１％から１０％までは当然のこと、さらに３０％まで含まれることもあり得るし、まず、選択した投与方式に従って、流体体積、粘性などを考慮して選択されるであろう。
【００７１】
従って、静脈注射のための、典型的な薬学的組成は、２５０ｍｌの滅菌リンゲル液および２〜２，０００ｍｇの化合物を含む単位投与量を含むように調製され得る。非経口投与化合物を調製する実際の方法は当業者にとって公知のものまたは明らかであるだろう。また、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，（レミントンの製剤科学）第１８版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９０）で詳細に記載されている。固形組成物調製のために、通常の無毒性固形担体を使用し得る。これには、例えば、製剤グレードのマンニトール、ラクト−ス、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。経口投与のために、薬学的に受容可能な無毒性組成物を、通常使用される添加剤（例えば、以前に列挙した担体など）を組み込むことによって形成する。また、通常、１０〜９５％の、好適には１５％の１つ以上の本発明グリコシルトランスフェラーゼインヒビター活性成分を含む。
【００７２】
本発明のグリコシルトランスフェラーゼインヒビターはまた、リポソームを介して投与され得、これは、リンパ系組織または選択的に標的とする感染細胞のような特異的な組織に結合体を標的化するために、およびペプチド組成物の半減期を延長するために与えられる。リポソームには、エマルジョン、泡、ミセル、不溶性単分子層、脂質結晶、リン脂質分散系、ラメラ層などが含まれる。これらの調製において、送達されるペプチドは、単独で、または例えば、ＣＤ４５抗原と結合するモノクローナル抗体のような、リンパ細胞の中いたるところにあるレセプターなどの結合分子または治療組成物もしくは免疫原性組成物ともに、リポソームの一部と組み合わされる。従って、所望のペプチドまたは本発明の結合体で満たされたリポソームを、リンパ球の部位に方向付け得、次いで、このリポソームは、選択されたグリコシルトランスフェラーゼインヒビター組成物を送達する。本発明において使用するリポソームは、通常中性または負に荷電したリン脂質およびステロール（例えば、コレステロール）を含む、標準的ベシクル形成脂質から形成される。脂質の選択は通常、例えば、リポソームの大きさ、血流でのリポソームの酸不安定性および安定性を考慮に入れて進められる。リポソームを調製するために、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）；米国特許第４，２３５，８７１号および第４，５０１，７２８号および第４，８３７，０２８号で記載されているような様々な方法が利用可能である。
【００７３】
様々なターゲティング剤を用いたリポソームのターゲティングが、当該分野において周知である（例として、米国特許第４，９５７，７７３号および第４，６０３，０４４号を参照）。免疫細胞に標的を絞るために、リポソームに組み合わされるリガンドには、例として、所望する免疫系細胞の細胞表面決定因子に特異的な抗体または断片が含まれる。ペプチドまたは結合体を含むリポソーム懸濁液を、とりわけ、投与方法、送達された結合体、および処置を行う疾患の進行度に従った様々な適用量で、静脈内、局所的、表面的方法などで投与し得る。
【００７４】
予防として、および／または治療として、本発明の化合物を含む組成物を投与し得る。治療的適用において、上記のように、治療、または少なくとも部分的に疾患の症状およびその合併症を改善する十分な量で、既に発病している患者に対して組成物を投与する。これを遂行するために十分な量を「治療的に効果のある有効量」と定義する。この使用目的において効果的な単位投薬量は、例えば、インヒビター組成物、投与方法、処置を行う疾患重症性、患者の体重および全体的な健康状態に依存するであろうが、一般的には、７０ｋｇの患者に対しておよそ０．５ｍｇから１０ｇの範囲のグリコシルトランスフェラーゼインヒビター、通常はおよそ１０ｍｇから５ｇ、好適にはおよそ２ｍｇから１ｇの間で投与する。疾患の最初の兆候が見られたとき、または、免疫性障害の場合は、検出または診断のすぐ後に治療的投与を開始し得る。この後しばしば少なくとも症状が本質的に治まるまで、またその後しばらく投与を繰り返す。これらの用量でその後、患者の反応および状態に応じて数週間または数ヶ月に渡って投与を繰り返す。
【００７５】
予防的適用において、ある特定の疾患に感受性のある、またはリスクを有する患者に本発明の化合物を含む組成物を投与する。そのような量を、「予防に有効な的効果のある適用量」と定義する。予防的使用の目的のために、リスクを有するグループに対して本インヒビター化合物を投与する。この使用目的において、適正な量は、インヒビター組成物、投与方法、処置を行う疾患重症性、患者の体重および全体的な健康状態に依存するであろうが、一般的には、７０ｋｇの患者に対しておよそ０．５ｍｇから１０ｇの範囲のグリコシルトランスフェラーゼインヒビター、通常はおよそ１０ｍｇから５ｇ、好適にはおよそ２ｍｇから１ｇの間で投与する。
【００７６】
担当医師によって選択された用量レベルおよび適用パターンで本化合物の単回または複数回投与を行い得る。どのような場合においても、薬学的調剤により、患者を効果的に処置するために十分な量の本発明のインヒビターの量を与えられるべきである。
【００７７】
患者から採取した試料中の産物グリコシドのレベルを検出することによって、本発明グリコシルトランスフェラーゼインヒビター投与の効果を追うことができる。これは、所望する炭水化物構造を検出する標準的方法に従って、インヒビター効果を試験することができる。例えば、リガンドに対して増加する特異的レクチンまたは抗体を使用し得る。特定のレクチンは周知であり市販されている（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯから）。
【００７８】
グリコシルトランスフェラーゼそれ自体、特にグリコシルトランスフェラーゼのアクセプター結合ドメインは、本発明の診断的アッセイにおける結合部分として、また有用である。ある特定のグリコシルトランスフェラーゼがない状態において、例えば、アクセプター部分の濃度が増加する傾向がある。例としては、ＳＴ６Ｇａｌシアルリルトランスフェラーゼの欠損によって、Ｂ細胞における末端ガラクトース残基の劇的な増加（つまり、Ｇａｌβ，４ＧｌｃＮＡｃ−）が引き起こされる。従って、ＳＴ６Ｇａｌが細胞内で欠損しているか否かを調べるために、ＳＴ６Ｇａｌシアリルトランスフェラーゼを、検出部分として使用し得る。ＳＴ３Ｇａｌトランスフェラーゼもまた、同じように、検出部分として使用し得る。
【００７９】
典型的な実施形態において、検出部分を検出可能なラベルで標識する。検出可能なラベルは、（ラベルが直接検出できる要素で構成されているか、または、直接検出できる要素を産生する）一次的ラベルまたは、（免疫的標識と同じように、検出するラベルが一次的ラベルと結合する）二次的ラベルであり得る。ラベルの導入、ラベル操作およびラベルの検出は、ＰｏｌａｋおよびＶａｎ  Ｎｏｏｒｄｅｎ（１９９７）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（免疫細胞学入門），第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹおよび、Ｈａｕｇｌａｎｄ（１９９６）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（蛍光プローブおよび研究化学物質ハンドブック），Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲによって出版されたハンドブックとカタログを組み合わせた参考図書にて見出される。一次的および二次的ラベルには、検出要素とともに非検出要素が含まれ得る。本発明における、有用な一次的および二次的ラベルには、蛍光色素のようなスペクトル的ラベル（例えば、蛍光物質および誘導体（例えば、テキサスレッド、テトラローダミン、イソチオネート（ＴＲＩＴＣ）およびオレゴングリーンなど）、ジゴキシゲニン、ビオチン、フィコエリスリン、ＡＭＣＡ、ＣｙＤｙｅｓＴＭのようなもの）、放射性ラベル（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐなど）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、金コロイドまたはカラーグラスまたはプラスティック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズなどの分光学的比色ラベルが含まれ得る。当該分野において周知の方法に従って、ラベルを直接または間接的に、検出アッセイ（例えば、検出試薬など）の成分と組み合わせ得る。上記のように、必要な感受性、化合物の標識の容易度、安定要求性、使用できる装置および処分規定を基にラベルを選択し、幅広く様々なラベルを使用し得る。
【００８０】
好適なラベルには、１）上記のように、分解産物として光子を産生する基質を用いる化学発光（西洋ワサビペルオキシダーゼまたはルシフェラーゼを用いた）（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ，およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ；２）カラー産生（発色沈殿を産生する基質とともに西洋ワサビペルオキシダーゼの使用の両方および／またはアルカリホスファターゼを用いる（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬおよびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手できるキット）；３）例えば、アルカリホスファターゼおよび基質ＡｔｔｏＰｈｏｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）または蛍光物質を産生する他の基質を使用する半蛍光法、４）蛍光（例えば、Ｃｙ−５（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いる）、フルオレセインおよび他の蛍光タグ）、５）放射能が含まれる。ラベルおよび検出の他の方法は容易に当業者に明白である。
【００８１】
本発明の検出試薬に標識し得る好適な酵素には、例えば、ルシフェラーゼ、および西洋ワサビペルオキシダーゼが含まれる。ルシフェラーゼの化学蛍光物質は、ルシフェリンである。アルカリホスファターゼ基質の実施形態には、分光光度計で検出できるｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、可視的に検出される５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）およびファーストレッド／ナフトール  ＡＳ−ＴＲホスフェート、および蛍光光度計にて検出される４−メトキシ−４−（３−ホスホノフェリル）スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２‘−アダマンタン］が含まれる。西洋ワサビペルオキシダ−ゼ基質の実施形態には、分光光度計にて検出できる２，２’アジノ−ビス（３−エチルベンズチアゾリン−６スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸（５ＡＳ）、ｏ−ジアニシジン、およびｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、および可視的に検出できる３，５，５，５‘−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’ジアミノベンジジド（ＤＡＢ）、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）４−クロロ−１−ナフトール（４Ｃ１Ｎ）が含まれる。他の適切な基質は当業者により既知である。
【００８２】
一般的に、ラベルを検出するために、特定のラベルをモニターする検出器を使用する。典型的な検出器には、分光光度計、光電管および光ダイオード、顕微鏡、シンチレーションカウンター、カメラ、フィルムなどと同時に、それらを組み合わせたものが含まれる。適切な検出器の例は、当業者により公知の幅広い商業的ソースから広く使用できる。一般に、標識部分の結合を含む基質の光学的イメージは、測定後のコンピューターアッセイのためにデジタル化される。
【００８３】
治療法の有効性は、患者から採取した試料中のグリコシド産物の実質的な減少として表される。あるいは、特異的グリコシルトランスフェラーゼ活性レベルの検出方法を使用し得る。ＳＴ６ＧａｌおよびＳＴ３ＧａｌＩのようなグリコシルトランスフェラーゼの標準的アッセイ方法は、当業者に公知である。さらに、治療の有効性は、特定のグリコシルトランスフェラーゼ活性における実質的な減少により表される。本明細書中で使用されているように、適切なシアリルガラクトシドレベルまたはグリコシルトランスフェラーゼ活性における「実質的な減少」とは、試験試料において、非免疫性不全コントロールと比較して少なくともおよそ３０％減少していることを意味する。好適には、少なくともおよそ５０％、より好適には、少なくとも７５％、最も好適には、未処置コントロールと比較して、処置哺乳動物から採取した試料のシアリルガラクトシドレベルまたはグリコシルトランスフェラーゼ活性レベルが少なくともおよそ９０％減少する。
【００８４】
（実施例）
次の実施例は、本発明の代表的なアッセイプロトコールを提供する。
【００８５】
（ＦＴＶＩＩアッセイプロトコール）
Ｆｌｕｏｒｏｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒｐｌａｔｅ  プレート（Ｎｕｎｃ  Ｃａｔ＃  ４３７９５８）を、１００μｌ／ウェルのアクセルター基質、Ｓｉａｌｙｌ−ＬＮｕｎｔ  ＢＳＡ（１０μｇ／ｍｌ  ｉｎ  ＰＢＳ）で、４ｏＣで一晩、または３７ｏＣで２時間のいずれかで、コート処理した。次に、プレートを１００μｌ／ウェルのＰＢＳで洗い、さらにＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃａｔ＃  ３７５３５）（２００μｌ／ウェル）で、１時間、室温にてブロッキングを行った。次にプレートを２００μｌ／ウェルのＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ＋Ｔｗｅｅｎ：２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０，０．０２％アジ化ナトリウム，ｐＨ７．５）で洗った。
【００８６】
2004517030.tif 000002
アッセイ混合液（１００μｌ／ウェル）を添加し、プレートを９０分間、３７ｏＣにてインキュベーションを行った。インキュベーション後、ＴＢＳ：Ｔｗｅｅｎで２回、ＴＢＳ−１０Ｂ（Ｈ２０＋０．２５％ＢＳＡ、０．０２％  Ｔｗｅｅｎ２０で１０倍希釈したＴＢＳ）で１回、プレートを洗浄した。さらに、ＴＢＳ−１０Ｂで１：３０希釈した産物特異的な抗体（ＣＳＬＥＸ抗体）を添加し、１時間、室温にてインキュベーションを行った。次に、プレートを再び３回、２００μ／ウェルのＴＴＢＳ−１０Ｂで洗浄した。ＴＴＢＳ−１０Ｂで１０００倍希釈したペルオキシダ−ゼ標識抗マウスＩｇＭをプレートに添加（１００μｌ／ウェル）し、プレートを１時間、室温にてインキュベーションを行った。そして、ＴＴＢＳ−１０Ｂ（１００μｌ／ウェル）でプレートを、６回洗浄した。ＴＭＢ基質（１００μｌ／ウェル）をプレートに添加し、室温にて、１５分間、発色反応を進めた。リン酸（１Ｍ）をプレートに添加（１００μｌ／ウェル）し、ペルオキシダ−ゼ反応を停止し、混合した後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【００８７】
（ＳＴ６ＧＡＬＩアッセイプロトコール）
Ｉｍｍｕｎｏ４  ＥＬＩＳＡプレート（９６ウェル、Ｄｙｎｅｘ  Ｃａｔ＃Ｇ２４０２−９５８）を、ＰＢＳ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，６．７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、０．０２％  ＮａＮ３  ｐＨ７．４）中の２０μｇ／ｍｌ（１００μｌ／ウェル）アクセプター基質、アシアロ−フェチュイン（ａｓｉａｌｏ−ｆｅｔｕｉｎ）でコート処理し、４ｏＣで一晩、アクセプター基質をプレートに接着させた。コート処理液を吸出して除去し、ウェルを３回、２００μｌのＰＢＳで洗った。さらにＰＢＳ＋１％  ゼラチン（２００μｌ／ウェル）で、４５−６０分間、室温にてブロッキングを行った。プレートをＰＢＳで３回洗浄後、反応バッファー（５０ｍＭ  ＭＥＳ，ｐＨ６．０，１００μＭ  ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）中に２５０μＵｎｉｔｓ／ｍｌのＳＴ６ＧａｌＩを含むアッセイ混合液１００μｌを各ウェルに添加し、４５分間、３７ｏＣにてインキュベーションを行った。ウェルの内容物を吸出し、除去して、酵素インキュベーションを停止した。次に、３回、２００μｌの０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）でウェルを洗浄した。ユーロピウム標識Ｓａｍｂｕｃｕｓ  ｎｉｇｒａアグルチニン（ＳＮＡ）により、α２，６シアリ酸付加産物を検出した。ＰＢＳＴ中での１００μｌの１μｇ／ｍｌ  ＳＮＡ、４５分間、室温にてウェルを被覆した後、１００μｌのＰＢＳＴで４回洗浄した。ユーロピウム増強試薬（ナフトイルトリフルオロアセトン＋０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を、５０μｌ／ウェルを添加し、室温にて３０分間インキュベーションを行った後、プレートを、励起光３４０±３５ｎｍおよび発光６１５±１０ｎｍで、ＢＭＧ  Ｆｌｕｏｓｔａｒ  プレートリーダーを用いて測定した。検出試薬の有効性を確認するために、２０μｇ／ｍｌのフェチュインをコントロールとして使用する。
【００８８】
本明細書中で述べた実施例および実施形態は、説明することのみを目的としたものであり、本明細書中において様々な改変および変更が当業者に対して示唆され、それらはこの出願および添付の特許請求の範囲の精神および範囲の中に含まれるべきものであることが理解される。本明細書中で引用したすべての刊行物、特許、および特許出願は、全ての目的にために本明細書中で参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１にて、グリコシルトランスフェラーゼの活性部位における、アクセプター基質の疎水性面と疎水性残基の相互作用が示される。図１Ａでは、モノサッカリドとグリコシルトランスフェラーゼの活性部位との間の相互作用を示す。
【図１Ｂ】
図１にて、グリコシルトランスフェラーゼの活性部位における、アクセプター基質の疎水性面と疎水性残基の相互作用が示される。図１Ｂでは、オリゴサッカリドとグリコシルトランスフェラーゼの活性部位との間の相互作用を示す。
【図１Ｃ】
図１にて、グリコシルトランスフェラーゼの活性部位における、アクセプター基質の疎水性面と疎水性残基の相互作用が示される。図１Ｃでは、グリコシルトランスフェラーゼへのジサッカリドの結合を示す。
【図１Ｄ】
図１にて、グリコシルトランスフェラーゼの活性部位における、アクセプター基質の疎水性面と疎水性残基の相互作用が示される。図１Ｄでは、本発明のインヒビターの設計概念を示す。
【図１Ｅ】
図１にて、グリコシルトランスフェラーゼの活性部位における、アクセプター基質の疎水性面と疎水性残基の相互作用が示される。図１Ｅでは、インヒビター−グリコシルトランスフェラーゼの相互作用を示す。
【図２】
図２にて、本発明におけるＥＬＩＳＡ方式アッセイの手順を示す。
【図３】
図３にて、本発明の放射性カラムアッセイの工程を示す。
【図４】
図４にて、本発明の細胞をベースにしたアッセイの手順が示される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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