(57)【要約】ヘアピン領域、及びα鎖の4個のクリングル領域(kringle regions)、及び全体で約20から40KDaの分子量を有するポリエチレン・グリコール基から成る肝細胞増殖因子(HGF/SF)のN-末端断片を含む接合体は、特性が改良され、腫瘍治療として療法的に有益な医薬剤である。
2004521139.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘアピン領域、及びα鎖の4個のクリングル領域(krin
gle regions)から成る肝細胞増殖因子(HGF/SF)のN-末端断片、及び約20から40KDaの分子量を有する単一のポリエチレン・グリコール基を含む接合体。
【請求項２】
前記ポリエチレン・グリコール基が次の化学式を有し；
−ＣＯ−（ＣＨ２）Ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍＯＲ
そして、前記−ＣＯ基が、肝細胞増殖因子におけるN-末端断片のアミノ基の1つとアミド結合を形成し、その時Xは2又は3、ｍは約450から約950、Rは(C1-C6)のアルキルであることを特徴とする請求項1記載の接合体。
【請求項３】
前記ポリエチレン・グリコール基が次の化学式を有し；
【化１】
2004521139.tif 000017
そして、前記−ＣＯ基が、肝細胞増殖因子におけるN-末端断片のアミノ基の1つとアミド結合を形成し、その時Yは1乃至10、n及びpは、共に約450から約950、そしてRは(C1-C6)のアルキルであることを特徴とする請求項1記載の接合体。
【請求項４】
ポリエチレン・グリコール基が約30から40kDaの分子量を有することを特徴とする請求項1から3のいずれか1項記載の接合体。
【請求項５】
単一又は複数の前記ポリエチレン・グリコール基が、単一又は複数のモノメトキシポリエチレン・グリコール基であることを特徴とする請求項1から4のいずれか1項記載の接合体。
【請求項６】
請求項1から5のいずれか1項記載の接合体、及び医薬的に受け入れ可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項７】
請求項6記載の医薬組成物を調製するための方法。
【請求項８】
ガン治療に有益な医薬剤の調製のため請求項1から5のいずれか1項記載の接合体の使用。
【請求項９】
請求項6記載の医薬組成物を、それが必要な患者に投与する工程を含む、ガン疾患を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエチレン・グリコール(PEG)と肝細胞増殖因子(NK4)のN-末端の4個のクリングル(kringle)構造を含む断片との接合体、その医薬組成物、その製造方法、及び使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞増殖因子(HGF/SF)は、Nakamura，T.らのBiochem.Biophys.Res.Commun.22(1984)1450-1459に記載されるように同定、精製されたペプチドである。さらに、肝細胞増殖因子が、細胞分散因子(SF)と同一であり、Weidner,K.M.らの、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)7001-7005を参照。HGFは、増殖性、有糸分裂の生成源、分岐チューブの形成、及び腫瘍細胞の例における侵入及び転移を含む、多くの表現型細胞の生成に関与し、分子量約100kDaの糖タンパク質である。
【０００３】
このことに関しては、Stuart,K.A.らのInternational Journal of Experimental Pathology 81(2000)17-30を参照。ラットのHGFとヒトのHGFが共に配列決定され、クローン化された、(Miyazawa,Kらの、Biochem.Biophys.Res.Comm.163(1989)967-973;Nakamura,T.らの、Nature 342(1989)440-443;Seki,T.らの、Biochem.and Biophys.Res.Comm.172(1990)321-327;Tashiro,K.らの、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87(1990)3200-3204;Okajima,A.らの、Eur.J.Biochem.193(1990)375-381)を参照。最初、5N-末端アミノ酸(dHGF)を欠損するHGFの薬学動態的及び医薬的な効果が、Uematsu,Y.らにより研究され、J.Pharm.Sciences88(1999)131-135に記載されている。dHGFの血清濃度が急激に減少し、そのため注入には、投与経路として注射にて用量を注入することが好ましい。
【０００４】
米国特許番号第5,977,310では、PEGにより修飾されたHGFが記載されている。こうしたPEGにより修飾されたHGFが、in vivoにおける伸張された隙間(clearance)を有し、HGFと同じ生理的活性を有す。しかしながら、米国特許番号第5,977,310によれば、HGFの半減期をそれぞれ59.2分から76.7分又は95.6分に延長することのみ可能である(米国特許番号第5,977,310の実施例5を参照)。さらにモル量のPEG試薬が、HGFのモル重量の5から100倍の範囲から選択できることが、この特許において示唆されている。リシン又はタンパク質のN末端のアミノ基を修飾する場合に、PEG試薬の好ましいモル範囲が、HGFのモル重量の10から25倍である。
【０００５】
結合されたPEG鎖のモル重量が、約10kDaであった。さらにPEG及びHGF等のポリペプチドから成る接合体の合成方法が、WO 94/13322に記載されている。記載者によれば、これらの接合体が、治療として又は診断として所望される活性作用を介在する分子領域に高分子成分を導入する様、無作為な接合先導剤として、所定の位置にたがいに結合される。その結果その分子では、in vivoにおける半減期が延長され、そして異種のタンパク質の例では免疫原性が減少されるが、所望の生物活性作用を有意的又は完全に欠失するという犠牲をはらう必要がある(たとえば、Kitamura,K.らのCancer Res.51(1991)4310-4315 and Maiti,P.K.らのInt.J.Cancer Suppl.3(1988)17-22を参照)。たとえばPEG化されたIFN-αは、PEG化されていないIFN-αと比較して7%の効能しか示さなかった(Bailon,P.,Bioconjugate Chem.12(2001)195-202)。
【０００６】
N-末端のヘヤピン領域及びHGF/SFの4個のKringle領域から成る、NK4と称するHGF/SF断片が、HGF/SFと完全に異なる薬理的特性を有し、そして結腸ガン細胞の運動性及び侵入性に及ぼすHGF/SFの影響に対しアンタゴニストであり、さらに腫瘍の増殖及び転移を抑制する血管形成阻害剤である(WO 93/23541;Parr,C.らのInt.J.Cancer85(2000)563-570;Kuba,K.らのCancer Res.60(2000)6737-6743;Date,K.らのFEBS Letters 420(1997)1-6;Date,K.らのOncogene 17(1989)3045-3054;Tomioka,D.らのCancer Res.61(2001)7518-7524)。
【０００７】
Kuba,K.らのCancer Res.60(2000)6737-6743から明らかなように、動物実験において、肺転移に及ぼすNK4の影響を検出するには、NK4を2週間、継続して注入する必要があった。
【０００８】
特定ポリペプチドに重合体を結合させると、こうした血清の半減期が増大できることが知られている。たとえばこれは、PEG化されたインターロイキン-6(EP 0 442 724)又はインターロイキン-2(WO 90/07938)、及びエリスロポエチン(WO 01/02017)として見出された。しかしながら、ポリエチレン・グリコール及び他の重合体との結合は、これらの血清半減期の延長化に必ずしも誘導に必須とするものでなかった。たとえば、インターロイキン-8、G-CSF、及び他のインターロイキンに異なるポリエチレン・グリコールを結合させると、特性に傷害のある分子を産生することになる(Mehvar,R.,J.Pharm.Sci.3(1)(2000)125-136)。
【０００９】
したがってポリペプチドのPEG化の結果は、極めて予測が難しい。Gaertner ,H.F.,and Offord,R.E.,Bioconjugate Chem.7(1996)38-44では、タンパク質のアミノ末端にPEGを部位特異的に結合することが記載されている。Gaertnerら(すでにWO 94/13222に言及されているように、上記参照）の記載によれば、結合部位が正確に制御できない場合に、PEG化は、大きな問題を提示し、そのことが、タンパク質の安定性及び機能として重要な関連性を有する可能性がある。
【００１０】
Francis,G.E.らのInt.J.Hematol.68(1998)1-18では、サイトカイン及び他の治療用タンパク質におけるPEG化の概要が記載されている。Francisらの記載によれば、主要なPGE化方法により、実質的な生物活性の減少(典型的に20-95%)を報告されている。Francisらによる、タンパク質のPEG化は、良くトライ・アンド・エラーに基づき、実際にこうしたPEG化パラメータの全てが、産生物の機能性に驚くべき、そして極めて大きな効果を有することができる。Tsutsumi,Y.らのThromb.Haemost.77(1997)168-173により、インターロイキン-6のPEG化が記載されている。Tsutsumiらによれば、IL-6の約54%のリシンアミノ基が、PEG基(groups)当り5kDaの分子量のPEGにて結合された。
【００１１】
Tsutsumiらのin Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)8548-8553により、PEGによる免疫毒性の化学的修飾が記載されている。無作為のPEG化では、特異的細胞毒性の活性作用の有意的な損失が伴うため、Tsutsumiらは、PEGの結合に用いられる1又は2つの追加システインを伴う免疫毒性変異体を使用することによって、部位特異的PEG化を行う。Heinzerling,L.らのDermatol.201(2000)154-157により、分子量5kDaのインターフェロン-αとPEGとの結合が記載されている。Tsutsumi,Y.らのin J.Pharmacol.Exp.Ther.278(1996)1006-1011により、TNF-αをPEGの修飾が記載され、その場合使用されるPEG基の分子量が、再度5kDaである。適用されるPEG化TNF-αが、少なくとも84kDaの分子量(TNF-αの分子量が17kDaであることにより）を有するため、TNF-αに結合されるPEG基が少なくとも135kDaある。
【００１２】
タンパク質のPEG化、及びその医薬効果が、Reddy,K.R.,Ann.Pharmacotherapy 34(2000)915-923記載によっても再検討されている。さらに治療タンパク質のPEG化を慎重に評価しなければならないことが、記載されている。Reddyらによれば、それぞれのタンパク質が相違し、異なる最適な化学処理が必要で、従ってPEG化の効果を予測することができない。
【００１３】
本発明の目的は、1週当りほんのわずかの用量(bolus)を負荷するか、及び／又は極めて少量の用量として投与することができ、そして腫瘍の増殖、血管形成、及び転移を抑制できる、NK4活性を伴う改良されたポリペプチド、及びその医薬組成物を見出すことである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
約20-40kDaの1つのポリエチレン・グリコ−ル(PEG)基に共有結合しているNK4から成り、好ましくはNK4リシンのε-アミノ基、又はN-末端アミノ基を介するNK4接合体(モノPEG化NK4)を提供する。最も好ましくは、NK4が、NK4リシンのε-アミノ基、及びN-末端アミノ基から成る群から１つのアミノ基に無作為にPEG化されることである。驚いたことに、本発明によるモノPEG化NK4が、NK4又はPEG化されたNK4に関する治療適用可能性に関して極めて優れた特性を有することが見出された。
【００１５】
さらに本発明は、本発明によるモノPEG化されたNK4の生成方法を含む。
【００１６】
さらに本発明は、モノPEG化されたNK4を含む医薬組成物を含む。
【００１７】
さらに本発明は、モノPEG化されたNK4を含む医薬組成物を製造する方法を含む。
【００１８】
さらに本発明は、モノPEG化されたNK4の医薬的な有効量は、それが必要な患者に１週当り1乃至7の用量(bolus)を適応して投与されることを特徴とするヒトのガン(たとえば胸部、肺、前立腺、すい臓、又は結腸ガン)の治療方法を含む。
【００１９】
驚くべきことに、治療期間中に適用される本発明による無作為のPEG化K4の全量が、PEG化されないNK4と比較し、かなり低いことが見出された。従って、医薬治療に使用されるPEG化されたNK4の量が、PEG化されないNK4の必要量の約50%以下、好ましくは約20%以下、及び最も好ましくは約10%以下である。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
ヒトHGFは、2硫化物に結合した異種2量体で、それをアミノ酸R494とV495との間を切断することにより、463アミノ酸のα-サブユニット及び234アミノ酸のβ-サブユニットに切断することができる。α鎖のN-末端が、メチオニン基から開始される31アミノ酸により進行される。この断片には、31アミノ酸のシグナル配列が含まれる。α鎖は、アミノ酸32にて開始し、4個のクリングル (Kringle)領域を含む。いわゆる、「ヘヤピン領域」が、アミノ酸70-96から成る。クリングル1(Kringle 1)領域が、アミノ酸128-206から成る。クリングル2(Kringle 2)領域が、α鎖の約アミノ酸211-288から成り、クリングル3(Kringle 3)領域が、アミノ酸305-383から成り、そしてクリングル4(Kringle 4)領域が、アミノ酸391-469から成る。これらの配列の変異体、特にNK4の生物的作用に影響を与えない変異体が存在し(HGFに対しそのアンタゴニステック活性、及びその抗アンタゴニステック活性に特に影響を与えない)、その変異体が、たとえば、WO 93/23541に記載されている。さらにNK4の長さが、その生物特性が影響されないかぎり、わずかなアミノ酸の範囲にて変化することができる。
【００２１】
NK4が、HGF/SFα-鎖のN末端447アミノ酸から構成され、それには、上記ヘアピン領域及び4個のクリングル(Kringle)領域を含む。それが、組み換え型ヒトHGF/SFの産生及びエラスターゼによる消化(Date,K.,FEBS Letters 420(1997)1-6)か、あるいは下記のように適切な宿主細胞におけるNK4をコードする核酸の組み換え体の発現のいずれかによって、組み換え体的に産生することができる。NK4糖タンパク質は、分子量が約57kDa(ポリペプチド部分だけでは52kDa)にて、腫瘍増殖、血管形成及び／又は転移の阻害を起こすというin vivoにおける生物的な活性を有する。
【００２２】
従って、本明細書に使用される「モノPEG化NK4(MonoPEGlated NK4)」は、分子量が20から40kDaのポリエチレン・グリコール基と共有的に結合していることを意味する。この基が、好ましいくはNK4の異なる部位に無作為に、しかしながら最も反応性の高い部位、たとえばリシン側鎖及びN末端アミノ酸にて結合できることが好ましい。モノPEG化NK4(MonoPEGlated NK4)(従って、NK4リシンのεアミノ基及びN末端アミノ基である異なる部位にてPEG化された、好ましくはモノPEG化NK4分子の混合物である)は、調製物の少なくとも90%、そして最も好ましくはその調製物の92%以上である。従って本発明によるモノPEG化NK4(MonoPEGlated NK4)の調製物は、均質な調製物としての利点を表す、たとえば医薬的な適用において実質的に十分な均質性がある。
【００２３】
本明細書に用いられる「実質的均一性」は、生成、含有、又は使用されるPEG-NK4接合体分子だけが、1個の結合されるPEG基を有することを意味する。この調製が、未反応(すなわちPEG基のない)タンパク質を含むことができる。ペプチドのマッピング、及びN-末端の配列決定により確かめられるように、下記の一例としては、少なくとも90%のモノPEG-NK4の接合体、及び最大で2%の未処理タンパク質のある調製物が提供される。
【００２４】
本発明により用いられたPEG重合体分子は、分子量が約20から40kDaであり、これにより20、30、又は40kDaのPEG重合体が、(本明細書に用いられる「分子量」とは、PEGの分子量の意味で、「約」という語は、前記PEG調製におけるある種の分子が、記載の分子量より多いか、幾分少ない分子量となる)ことを理解すべきである。
【００２５】
本発明による「PEG又はPEG基」は、重要部分としてのポリ(エチレン・グリコール)を含む残基の意味である。こうしたPEGが、結合反応に必要な、分子の化学合成から生ずる、又は分子を最適な距離とするスペーサであるさらなる化学基を含むことができる。
【００２６】
さらにこうしたPEGは、互いに結合される１又は複数のPEG側鎖から成ることができる。2本以上PEG鎖のPEGが、マルチアーム(multiarmed)又は分岐PEGと呼ばれる。たとえば、分岐PEGが、グリセロール、ペンタエリスリオール、及びソルビトールを含む種々のポリオールに、ポリエチレン・オキサイドを加えることにより調製することができる。たとえば、4個のアームを有する分岐PEGが、ペンタエリスリオール、及びポリエチレン・オキサイドから調製することができる。分岐PEGが、たとえばEP-A 0 474 084及び米国特許番号第5,932,462号に記載されている。特に好ましいのは、リシンの一級アミノ基を介して結合された2個のPEG側鎖(PEG2)を有するPEGである(Monfardini,C.らのBioconjugate Chem.6(1995)62-69)。分子量20-30kDaの直鎖PEG分子を有するPEGポリマーが好まれ、そして分子量が30kDa以上、特に40kDaのPEG重合体としての分岐PEGが好ましい。同様、PEG40kDAの2本アームPEG(PEG2)が、特に好ましい。
【００２７】
本発明による方法は、実質的に均一なモノPEG化NK4を産生するために提供される。NK4のPEG化は、先行技術記載の方法により、たとえば求電子的に活性化されるPEG反応により行うことができる(supplier:Shearwater Corp.,USA,www.shearwatercorp.com)。好ましいPEG試薬は、たとえば、N-ヒドロキシスクシンイミジール・プロピオネート(PEG-SPA)又はブタノエイト(butanoates)、又はmPEG2-NHS(Monfardini,C.らのBioconjugate Chem.6(1995)62-69)などの分岐したN-ヒドロキシスクシンイミドである。こうした方法の結果、NK4リシンのε-アミノ基、又はN-末端アミノ基にて無作為にPEG化されるNK4ポリペプチドとなる。無作為ではない、N-末端PEG化NK4は、WO 94/01451に基づいて生成することができる。
【００２８】
本発明の好ましい例における、前記NK4は、化学式における1個のポリ(エチレン・グリコール)群に共有結合する。
−ＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲ
この場合NK4のアミノ基とアミド結合を形成するポリ(エチレン・グリコール)基の−ＣＯ(すなわちカルボニル)、Rは低級アルキル、xは2又は3、mは、約450から約950、そしてｎ及びｍが、結合部の分子量からNK4タンパク質を引いて、約20から40kDaとなるように選択される。NK4のアミノ基としてNK4リシンε-アミノ基が利用可能な(遊離)アミノ基である。
【００２９】
より詳細には、上記接合体を化学式(I)にて表すことができる。
Ｐ−ＮＨＣＯ−（ＣＨ２）ｘ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲ    (I)
この場合Ｐは、本明細書に記載されたNK4タンパク質のクループ、(すなわち、化学式(I)にて示されるカルボニル基とアミド結合を形成する単一のアミノ基又は複数のアミノ基ではなく)、そしてRが低級アルキル、ｘは2又は3、ｍが約450から約950、接合体の分子量よりNK4タンパク質引き20から40kDaと成るように選択される。本明細書に使用されるように、所定の範囲の「m」が単に位置付けの意味を有しているだけである。「m」範囲が、いずれの場合においても正確にPEGグループの分子量によって決定される。
【００３０】
さらに本発明の好ましい例において、前記NK4が、化学式の1個のポリ(エチレン・グリコール)に共有結合する。
【００３１】
【化１】
2004521139.tif 000003
【００３２】
この場合ｙは1から4である。好ましくは4である。ｎ及びｐは共に、接合体の分子量からNK4タンパク質を引き約20から40kDaで、好ましくは40kDaであり、n及びpは、25%以下だけ異なり、好ましくは10%以下、そして最も好ましくは同一であり、Rは低級アルコールである。
【００３３】
本明細書に用いられるように、「低級アルキル」とは、1から6個の炭素原子((Ｃ１−Ｃ６）のアルキル）を有する直鎖又は分岐アルキル基の意味である。低級アルキル基の例は、メチル、エチル及びイソプロピルを含む。Rは、任意の低級アルキルである。Rはメチルである接合体が好ましい。
【００３４】
符号「m」は、ポリ(エチレン・オキサイド)基におけるエチレン・オキサイド基(ＯＣＨ２ＣＨ２）の数を表している。エチレン・オキサイドの1個のPEGサブユニットが、約44ダルトン(daltons)の分子量を有す。従って接合体の分子量(NK4の分子量を除く)が、数「m」に依存する。本発明の接合体における「m」が、約450から約950である(約20kDaから約40 kDaの分子量に相当)。数mは、得られる本発明の接合体が、未修飾NK4と比較可能な生理的活性を有するように選択され、その活性が、未修飾NK4の対応する活性と同じか、それより多いか、又はその1画分を表すことができる。分子量の「約」のある特定数は、従来の分析技術により決定されるその数が適切な範囲内にあることを意味する。数「m」は、NK4タンパク質に共有結合されるポリ(エチレン・グリコール)基のそれぞれの分子量が、約20kDaから約40kDaとなるように選択される。
【００３５】
化学式(I)の化合物が、たとえば周知の活性化された重合体の材料から調製することができ；
【００３６】
【化２】
2004521139.tif 000004
【００３７】
式中R及びmは、化学式IIの化合物を、NK4タンパク質により縮合することにより上記のようである。化学式(II)のxが3である化合物は、ポリ(エチレン・グリコール)のα-低級アルコキシ酪酸・スクシンイミジルエステル(低級アルコキシ-PEG-SPA)である。アミドを形成するためのアミンと活性化エステルとを反応させる従来の方法を利用することができる。上記反応において明示されているスクシンイミジルエステルが、アミド形成により生ずる残基である。タンパク質による結合を形成する、たとえば化学式IIの化合物であるスクシンイミジルエステルの使用が、1997年9月30日に発行(Harrisら)の米国特許番号第5,672,662に開示されている。
【００３８】
ヒトNK4は、30リシン残基の30遊離ε-アミノ基を含む。PEG化試薬が、化学式IIのSBA化合物に結合されると、モノ-、ジ-、及び微量のトリ-PEG化された細片が、タンパク質濃度を5から10mg/ml、pHを7.0から8.0、タンパク質とPEGとの比を約1:3、そして反応温度を20-25℃にて、生成されることが見出された。タンパク質とPEGの比が、約1:1又は1:2(たとえば、30kDaのPEG-SBAに対し約1:2、そして40kDaのPEG2-NHSに対して約1:5が好ましい)である時、主にモノPEG化された細片が生成された。操作する反応条件(たとえば、試薬の比率、pH、温度、タンパク質濃度、反応時間など）により、異なるモノPEG化種の相対量を、最適化することができる。限定されないが、典型的である条件は、約8から12mg/mlのNK4、0.3Mの燐酸カリウム、ｐH8、25℃、反応時間1時間である。30kDaのPEG-SBAを用いるこうした条件下にて、収率が、約38%のモノPEG化NK4である。
【００３９】
さらにモノPEG化されたNK4は、WO 94/01451に記載された方法により生成することができる。WO 94/01451では、修飾された末端アミノ酸のα-炭素反応基による、組み換え型ポリペプチドの調製方法が記載されている。上記方法の工程では、組み換え型ポリペプチドを形成させ、そしてN-末端のαアミン及びC-末端のαカルボニルにて1又は複数の生物的に付加される保護基にて、それを保護することに関与している。さらにポリペプチドは、反応性側鎖基を選択的に保護するための化学保護剤と反応することができ、それにより側鎖基が修飾されないように防止する。
【００４０】
さらにそのペプチドを、生物的保護基に対し特異的な切断試薬により切断し、未保護の末端アミノ酸α-炭素反応基を形成する。上記未保護の末端アミノ酸α-炭素反応基を、化学修飾剤により修飾する。さらに側鎖が保護された末端修飾の1本鎖複製ポリペプチドが、側鎖基にて脱保護され、末端にて修飾される組み換え型1本鎖複製ポリペプチドを形成する。この方法における工程の数及び順序を、ポリペプチドのN-及び／又はC-末端のアミノ酸に選択的に修飾を行うように変えることができる。
【００４１】
さらに本発明による好ましい接合体は、NK4のアミノ基とアミド結合を形成するリンカーのC(O)(上記のように、リシン残基のε-アミノ基が利用できる)と、化学式-C(O)-X-S-Yのリンカーを介して低級アルコキシ・ポリ(エチレン・グリコール)基に共有結合されているNK4タンパク質から成り、Xが-(ＣＨ２）ｋ−又は−ＣＨ２（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｋ−、ｋは、１から10、Yは；
【００４２】
【化３】
2004521139.tif 000005
【００４３】
ポリ(エチレン・グルコール)成分の平均分子量が、約20kDaから約40kDaで、そしてNK4のポリペプチドが52kDaの分子量に対し、接合体の分子量が約72kDaから約92kDaであり、又はNK4糖タンパク質が57kDaの分子量に対し約77kDaから約97kDaである。
【００４４】
さらにNK4のこうした種類を、化学式(III)にて表すことができる。
Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−Ｓ−Ｙ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍ−ＯＲ      （III)
式中Rは、任意のアルキル、メチル、エチル、プロピルなど１から6個までの炭素原子を有する直鎖又は分岐アルキル基を意味する。好ましいアルキルは、メチルである。Xは、−（ＣＨ２）ｋ又は−ＣＨ２（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｋ−、この場合ｋは1から10である。好ましくは、ｋは1から4、より好ましくは、ｋが1又は2、最も好ましくは、Xは−（ＣＨ２）である。
【００４５】
化学式IIIにおけるYは；
【００４６】
【化４】
2004521139.tif 000006
【００４７】
好ましくは；
【００４８】
【化５】
2004521139.tif 000007
【００４９】
より好ましくは；
【００５０】
【化６】
2004521139.tif 000008
【００５１】
化学式(III)における、数値ｍは、化学式(III)から得られた接合体が、未修飾NK4と比較し生理学的活性を有するように選択され、その活性が、未修飾NK4の対応する活性と等しいか、有意的に多いか、あるいはその画分か、を表すことができる。ｍは、PEG単位体におけるエチレン・オキサイド鎖の数を表している。単一のPEGサブユニットである−（ＯＣＨ２ＣＨ２）−は、分子量が約44ダルトン(daltons)である。従って、接合体の分子量(NK4の分子量を除いて)が、数mに依存する。「約(about)」のある特定数値の分子量は、従来の分析技術により決定される数が適切な範囲内にあることを意味する。従ってmは、450から950(20から40kDAの分子量に相当)の範囲の整数である。
【００５２】
化学式（III)の好ましいNK4タンパク質は次の化学式により表される。
【００５３】
【化７】
2004521139.tif 000009
【００５４】
最も好ましいNK4タンパク質産生物は、以下の化学式により表される。
【００５５】
【化８】
2004521139.tif 000010
【００５６】
これらNK4タンパク質が、以下によって調製することができる。
【００５７】
(a)    遊離アミノ基、好ましくはNk4タンパク質のリシンアミノ酸のε−アミノ基又は化学式によるＰ−ＮＨ２として表されるN-末端アミノ基に、化学式Ｚ−ＣＯ−Ｘ−Ｓ−Ｑとして表される二官能基試薬と共有的に反応させ、次の化学式にて表されるアミド連鎖による中間体を形成する。
Ｐ−ＮＨ−ＣＯ−Ｘ−Ｓ−Ｑ
式中Pは、アミド連鎖を形成するアミノ基を有意的に少ないNK4タンパク質である；Zは、反応基、たとえばカルボキシル-NHSのエステル、Xは、−（ＣＨ２）ｋ−又は−ＣＨ２（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｋであり、式中ｋは1から約10、Qはアルカノイルのような保護基、たとえばアセチル基である。
【００５８】
(b)  工程(a)からのアミド連鎖による中間体と、化学式Ｗ−［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｍ−にて表される活性化ポリエチレン・グリコール誘導体とを共有的に反応させて、次の化学式にて表されるNK4タンパク質生成物を形成する。
【００５９】
【化９】
2004521139.tif 000011
【００６０】
式中Wは、Yのスルフヒドリル反応形状で、mは、約450から約950の範囲の整数で、Rは低級アルキル、そしてYは上に明示されている。
【００６１】
この例における、二官能基試薬は、N-スクシンイミジル-S-アセチルチオプロピオネート、又はN-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテートが好ましく、Zは、N-ヒドロキシ-スクシンイミドが好ましく、そして活性化ポリエチレン・グリコール誘導体  Ｗ−［ＯＣＨ２ＣＨ２］ｍ−ＯＲは、ヨード-アセチル-メトキシ-PEG、メトキシ-PEG -ビニルスルフォン、及びメトキシ-PEG-マレイミドからなる群から選択されることが好ましい。
【００６２】
より詳細には、化学式(III)のNK4タンパク質を、NK4にチオ基を共有結合(「活性化」)することより調製することができ、そして得られた活性化NK4にポリ(エチレン・グルコール）(PEG)誘導体を結合させることができる。本発明によるモノPEG化NK4の調製のための第一の工程は、NK4のNH2基を介してチオール基を共有結合させることを含む。NK4のこうした活性作用は、活性化エステル(たとえば、スクシンイミジルエステル)、無水物、硫酸のエステル、カルボン酸のハロゲン化物、及びスルホン酸などそれぞれから、保護されたチオール基、及び付加反応基を運ぶ二官能基試薬により行われる。チオール基が、技術的に周知な基、たとえばアセチル基により保護される。これらの二官能基試薬が、アミドを形成することによりアミノ基と反応することができる。
【００６３】
好ましい例における、アミノ基の活性化が、スクシンイミジル成分を有する、二官能基試薬を用いた反応により、実現される。二官能基試薬が、異なるスペーサ成分(species)、たとえば、-(CH2-)k-又は-CH2-(O-CH2-CH2-)k-を運ぶことができ、式中kは、1から約10、好ましくは1から約4、そしてより好ましくは1又は2、そして最も好ましくは1である。これら試薬の試料としては、上に明記したようにN-スクシンイミジル-S-アセチルチオプロピオネート(SATP)及びN-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート(SATA)がある。
【００６４】
【化１０】
2004521139.tif 000012
【００６５】
二官能基試薬の調製は、技術的に周知である。2-(アセチルチオ)-(エトキシ)k-酢酸-NHSエステルがDE-39224705に記載されており、アセチルチオ化合物に対する誘導体化が、March,J.,Advanced Organic Chemistry(1977)375-376に記載されている。SATAは、商業的に入手できる(Molecular Probes,Eugene,OR,USA and Pierce,Rockford,IL)。
【００６６】
NK4分子にチオール基を1だけの添加は、反応パラメータを調整することにより、すなわちタンパク質(NK4)濃度、及びタンパク質/二官能基試薬の比により選択することができる。
【００６７】
反応は、たとえば、水性緩衝溶液にて、pH6.5-8.0、たとえば10又は100mMのリン酸カリウム、300mMのNaClを用いる場合、用いない場合、pH7.3にて行われる。二官能基試薬をDMSOに加えることができる。反応が完了した後好ましくは30分後に、リシンを加えることによりその反応を停止させる。過剰な二官能基試薬を、技術的に周知な方法、たとえば透析又はカラム濾過により分離することができる。NK4に加えられたチオール基の平均数は、Grasetti,D.R,.and Murray,J.F.in J.Appl.Biochem.Biotechnol.119(1967)41-49に記載された光度測定法により、決定することができる。
上記反応の後に、活性化ポリエチレン・グリコール(PEG)誘導体を共有結合させる。適切なPEG誘導体が、約20から約40kDaの平均分子量のPEG分子に活性化される。
【００６８】
活性化されたPEG誘導体が技術的に周知であり、たとえば,Morpurgo,M.らのJ.Bioconj.Chem.7(1996)363 ff for PEG-vinylsulfoneに記載されている。直鎖及び分岐鎖PEG成分(species)は、化学式Iの化合物の調製には適切である。反応性PEG試薬の試料としては、ヨード-アセチル-メトキシ-PEG及びメトキシ-PEG-ビニルスルフォンがる。
【００６９】
【化１１】
2004521139.tif 000013
【００７０】
これらのヨード活性化物質を使用することは、技術的に周知であり、たとえばHermanson,G.T.,in Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego(1996)p.147-148に記載されている。
【００７１】
最も好ましくは、PEG成分(species)が、メトキシ-PEG-マレイミド(MW 20,000から40,000;Shearwater Polymers,Inc.)などのマレイミド(アルコキシ-PEG-マレイミド)の使用により活性化される。アルコキシ-PEG-マレイミドの構造は、以下の通りである。
【００７２】
【化１２】
2004521139.tif 000014
【００７３】
好ましくは式中RR、及びmは、上に明示された通りである。
【００７４】
【化１３】
2004521139.tif 000015
【００７５】
アルコキシ-PEG-マレイミドとの結合反応が、水性緩衝溶液中、たとえば10mMのリン酸カリウム、300mMのNaCl、2mMのEDTA、pH6.2におけるチオール保護基のin sutu切断後に行う。保護基の切断は、たとえば、DMSO、25℃、pH6.2、約90分間ヒドロキシルアミンにより行うことができる。PEG修飾には、活性化NK4/アルコキシ-PEG-マレイミドのモル比が、約1:1から約1:6にすべきである。その反応を、システインの付加、及び2硫化物の結合状態を形成できるN-メチルマレイミド又は他の適切な化合物と残っているチオール(-SH)との反応により停止することができる。N-メチルマレイミド又は他の適切な保護基などの保護基と残っている活性チオール基と反応することから、本発明の結合におけるNK4タンパク質が、こうした保護基を含むことができる。一般的に本明細書に記載される方法は、異なる数の保護基により保護され、数が変わっているチオールを有する分子の混合物を生成することになり、それがPEG-マレイミドに結合されないタンパク質に対する活性化チオール基の数に依存する。
【００７６】
N-メチルマレイミドが、PEG化されたタンパク質に残っているチオール基を停止させるために用いられる場合と同じ型の共有結合を形成するが、二硫化化合物が、分子間による硫化物/二硫化物の交換反応を起こして、停止試薬の二硫化物の架橋接合体となる。この種の停止反応に対する好ましい停止試薬は、酸化グルタチオン(GSSG)、システイン、及びシスタミンである。システインが付加されない場合、正味の電荷が、PEG化タンパク質に導入されるが、停止試薬GSSG又はシスタアミンを使用すると、付加的に負に電荷、又は正に電荷することになる。
【００７７】
さらにジ-、トリ-及び複数のPEG化されたNK4の種(species)からモノ-のPEG化されたNK4種(species)を分離することを含む、化学式(III)の化合物の精製は、技術的に周知の方法、たとえばカラム・クロマトグラフィにより行うことができる。モノ-PEG接合体の割合が、化合物中モノ-PEGの割合を減少させるための溶離ピーク近辺を有意的に広い画分として、又は化合物中モノ-PEGの割合を増加させるための狭い画分として、プールすることにより制御することができる。約90%のモノ-PEG接合体が、収率と活性の均衡が適切である。たとえば、接合体の少なくとも92%、又は少なくとも96%がモノ-PEG種(species)である組成物が、要望される。本発明の例における、モノ-PEG接合体の百分率は、90%から96%である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７８】
医薬剤の生成
本発明の化合物は、当業者に知られた医薬組成物を調製する方法により生成することができる。こうした組成物の生成には、本発明によるモノPEG化NK4を、医薬的に受け入れ可能な担体と混合状態にて組み合わせる。こうした受け入れ可能な担体は、たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences,18th edition,1990,Mack Publishing Company,edited by Osloら(e.g.pp.1435-1712)に記載されている。典型的な化合物は、本発明による物質の有効量、たとえば適切な量の担体と共に約0.1から100mg/mlを含む。その組成物を非経口的に投与することができる。
【００７９】
さらに本発明は、本明細書に記載された接合体を含む医薬組成物を提供し、そのモノ-PEG接合体の百分率が、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも92%である。
【００８０】
本発明による医薬生成物は、技術的に周知な方法により調製することができる。通常、モノ-PEG化されたNK4の溶液が、医薬組成物に使用されるよう意図される緩衝液に透析され、そして所望の最終タンパク質濃度は、濃縮又は希釈により調整される。
【００８１】
こうした医薬組成物は、注射にて投与するため使用することができ、医薬的に受け入れ可能な希釈剤、防腐剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント及び／又は担体と共に、モノ-PEG化NK4の有効量を含んでいる。こうした組成物は、種々の緩衝液の希釈剤としての溶液(たとえばアルギニン、酢酸、リン酸）、pH及びイオン強度、洗剤及び安定剤(たとえばツイーン80/ポリソルベート(Tween 80/polysorbate)，プルロニックF68(pluronic F68)、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム)、抗酸化剤(たとえばアスクロビン酸、L-メチオニン)、防腐剤(チマゾール(Timersol)、ベンジルアルコール）、及びバルキング物質(たとえば多糖類、マニトール)などの添加物を含む、ポリ酪酸、ポリグリコール酸などの重合化合物の特定調製物に又はリポゾームにその物質を組み入れる。こうした組成物が、本発明によるモノPEG化NK4の放出及び浄化の生理的状態の安定率に影響を及ぼす。
【００８２】
用量及び医薬剤の濃度
典型的に標準的なガン治療の形態において、患者を、所定の期間、1日から約30日又はそれ以上続けて、1日当り、kg当りモノPEG化NK4を1から30mg範囲の用量にて治療する。医薬剤が、ml当り0.1から100mgのモノPEG化NK4を含む医薬生成物を、日１回の皮下又は静脈注射による用量として適用される。この療法は、標準療法の前、療法中、療法後にモノPEG化NK4を適用することにより、任意の標準治療(たとえば化学療法)と組み合わせることができる。このことは、標準療法だけと比較して改良された結果となっている。
【００８３】
いずれかの症例における本発明の投与されるPEG化NK4の全体の容量は、同じ治療に対するNK4の量よりかなり低い。
【００８４】
以下の例として、文献及び配列リストが、本発明の理解を支援するために提供され、その真の範囲が添付の請求項において説明されている。その変更が本発明の精神から逸脱することなく、説明の過程において行うことができることが、理解されよう。
【実施例１】
【００８５】
組み換え型のNK4を生成
治療に使用するNK4は、細菌又は真核生物の発現系を用いる組み換え型の手段により生成することができる。適切な真核生物の発現系は、たとえば遺伝子操作されたHeLa,BHK又は好ましいCHO細胞である。NK4の生成に遺伝子操作される細胞は、適切な培地にて培養される。典型的には、1乃至5リッターの細胞培養液が、10リッターの醗酵液に対する接種として使用される。3乃至5日後、10リッターの醗酵液の培養液を、100リッターの製造醗酵液に対する接種として使用することができる。醗酵液に付加したさらに3乃至5日後、この培養液を1000リッターの醗酵液に対する接種として使用することができる。3乃至4日後、細胞を、濾過又は遠心分離により取り出し、そして廃棄する。NK4含有の上清液が濾過、収集され、そして精製期間中に精製処理される。この精製処理は、以下の実施例に記載されている。
【実施例２】
【００８６】
精製
ヘパリン-セファローズ(Heparin-Sepharose)は、ヘパリンが共有結合する表面に対するセファローズ ビーズ(Sepharose beads)から成る。NK4がヘパリンに高い親和性を示すことから、それを、このカラムに保持し、高濃度の塩にて溶離することができ、一方タンパク質汚染物質及び他の不純物が、低濃度の塩にて結合しないかあるいは溶離されない。50mMのHepes、pH7.5における約0.7乃至1.1MのNaClにて溶離するNK4含有の画分が、収集されさらにヒドロキシアパタイト・カラム(hydrokyapatite column)に負荷される。NK4が、約0.4乃至0.7Mのリン酸カリウム、pH7.5にて溶離する。得られる画分には、汚染タンパク質が実質的に存在しなく、さらにS-セファローズ・クロマトグラフィにより精製することができる。
【実施例３】
【００８７】
モノPEG化NK4の生成
上記方法により精製されたNK4が、PEG化反応として用いられる。上記3種の適切な方法を例示的に記載する。
【００８８】
a)    mPEG-SBAによるNK4のPEG化
数滴のNK4を、メトキシ-PEG-SBA(比較のためそれぞれ5kDa、20ｋDa、及び30kDa；Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville Alabama)と反応させる。反応を、試薬に対するタンパク質の比を1:1と1:5との間、約2時間、室温にて(20及び30kDaのPEGを使用する場合、1:2の比が好ましい)行った。その反応を、10mMのトリス緩衝液、又はアルギニンHCl、pH8、を添加することにより停止させ、そしてその試料を、平衡化及び溶離のため緩衝溶液500mmol/lのリン酸カリウム、pH6.8として使用し、SDS-PAGE又はセファローズ6カラム(Pharmacia)にサイズ排除クロマトグラフィにより分析した。その反応を、試薬に対するタンパク質の比、pH、時間及び温度を変えて、良好なモノPEG化NK4を得るために最適化した。
【００８９】
こうした条件は、たとえば：
Nk4の濃度：            8-12mg/ml
緩衝液系/pH：          0.3Mのリン酸カリウム、pH8
温度：                  25℃
反応時間：              １時間
モル比(Molar ratios)(タンパク質：試薬)：        1:2
収率
モノPEG化NK4：        38%
ジPEG化NK4：          17%
未PEG化NK4：          45%
b)    mPEG-SPAによるNK4のPEG化
数滴のNK4(0.3Mの燐酸カリウム、pH8におけるタンパク質濃度8乃至12mg/ml)を、メトキシ-PEG-SPA(比較のためそれぞれ5kDa及び20kDa、Shearwater Polymers,Inc.,Huntsville Alabama)と反応させた。反応は、試薬に対するタンパク質の比を1:2、約2時間、室温にて行った。その反応を、10mMのトリス緩衝液、又はアルギニンHClを添加することにより停止させ、そしてその試料を、平衡化及び溶離化のため緩衝溶液500mmol/lのリン酸カリウム、pH6.8として使用し、SDS-PAGE、逆相HPLC又はセファローズ6カラム(Pharmacia)におけるサイズ排除クロマトグラフィにより分析した。その反応を、試薬に対するタンパク質の比、pH、時間及び温度を変えて、ジ-及びトリ-PEG化NK4に比較して良好なモノPEG化NK4を得るため最適化した。
【００９０】
c)    mPEG2-NHSによるNK4のPEG化
PEG-SPAmPEG2-NHS(リシン・リンカーを介して分岐される、40kDaのPEG)に換え、モル比が1:5(タンパク質：PEG試薬）にて使用されたことを除き、実施例3cに記載されたように行われた。
【実施例４】
【００９１】
モノPEG化NK4の分離
モノPEG化NK4が、平衡化及び溶離化のため、緩衝溶液500mmol/lのリン酸カリウム、pH6.8として使用し、準備したサイズ排除クロマトグラフィ(たとえばSuperose 6又はSuperdex 200;Phamacia)、又はイオン交換クロマトグラフィにかけることにより、未PEG化NK4、ジ-及びトリ-PEG化NK4から分離することができる。精製されたタンパク質には、極めて良好なモノPEG化された種が含まれる。画分を収集し、SDS-PAGE及び逆相クロマトグラフィにより分析した。
【実施例５】
【００９２】
モノPEG化NK4の分子特性
a)    サイズ排除クロマトグラフィ
モノPEG化種は、サイズ排除クロマトグラフィ(たとえば、Superose 6又はSuperdex 200;Phamacia;平衡化及び溶離化のため、緩衝溶液500mmol/lのリン酸カリウム、pH6.8として使用)においては、未修飾の形状体と比較して容易に溶離する。これは、分子の水素運動半径の増大によるものである。
【００９３】
b)    SDS-PAGE
SDS-PAGEにおけるタンパク質が、これらの分子量により分離される。PEG化によって分子量が増大することにより、モノPEG化TK4が、未修飾NK4と比較して移動距離が短くなることを示す。この移動は、PEG成分の鎖の長さ、及びNK4分子当り結合されるPEG基の数と逆の相関関係にある。
【００９４】
c)    ペプチドの作図
配列に特異的なエンド-プロテナーゼ(たとえばLysC又はトリプシン)によりモノPEG化TK4を消化させると、ペプチドの特徴的な地図となる。得られるペプチドを、逆相クロマトグラフィにより分離し、さらにマススペクトロメトリー及び／又はN-末端シーケンシングにより分析することができる。これは、NK4分子内のPEG修飾基の決定を可能にする。
【００９５】
d)    逆相クロマトグラフィ
さらにモノPEG化NK4は、逆相クロマトグラフィによっても特徴付けることができる。NK4をPEG化すると、未修飾NK4と比較して保持時間が変化することになる。
【実施例６】
【００９６】
モノPEG化NK4、未PEG化NK4、及び複数のPEG化NK4の比較
この実施例において、未PEG化NK4、PEG5kDa、PEG20kDa、PEG30kDa、PEG40kDaを伴うモノPEG化されたNK4及び複数のPEG化されたNK4(2以上のPEG鎖によりPEG化されたNK4)を使用した。
【００９７】
a)    分散アッセイ(Scatter assay)
MDCK細胞を、組織培養プレートにおいてサブ密集成長(subconfluently grown)させる。細胞を、HGF(10ng/ml)、又はHGFとNK4を組み合わせて処理した。これらの実験におけるHGFにて誘発される細胞の分散処理が、10乃至1000倍の過剰なモルのNK4を添加することにより阻害され、それがPEG化されたNK4の機能的な活性を示している。in vitroにおけるモノPEG化5kDa-PEG-NK4、20kDa-PEG-NK4、30kDa-PEG-NK4、及び40kDa-PEG-NK4の活性は、未PEG化NK4と類似していることが見出された。さらに、2以上のPEG鎖(20乃至40kDa)を添加すると、in vitroにおける活性(表1)を有意的に失うことになることが見出された。
【００９８】
【表１】
2004521139.tif 000016
【００９９】
HGF(10ng/ml)にて誘発されるMDCK細胞の分散を阻害することにおけるNK4のPEG化された種々の形状の相対的な効能が、評価された。＋＋が完全な阻害を意味し、＋が阻害することを意味し、＋/−は、弱い阻害を意味し、そして−は、阻害しないことを意味する。
【０１００】
b)    HUVEC増殖アッセイ
NK4によるHGFの分裂促進活性を阻害することが、T.らのNature 342(1989)440-443に記載されたように、培地におけるHUVECの増殖を測定することにより決定された。これらの実験におけるHGFに誘発される細胞の増殖が、10乃至1000倍の過剰なモルのNK4を添加することにより阻害され、それがモノPEG化NK4(図1及び2)の機能的な活性を示している。
【０１０１】
別の選択肢として、HUVEC増殖アッセイを、NK4によるｂFGF(塩基性繊維芽増殖因子）の分裂促進活性を阻害することにより行った。その阻害は、Kuba,K.らのCancer Res.60(2000)6737-6743に記載されたように、培地におけるHUVECの増殖を測定することにより決定された。これらの実験におけるFGFに誘発される細胞の増殖が、10乃至1000倍の過剰なモルのNK4を添加することにより阻害され、それがモノPEG化NK4(図3）の機能的な活性を示している。
【０１０２】
c)    逆アッセイ
このアッセイにおける腫瘍細胞の逆効能が分析された。このアッセイが、特にHT115細胞を使用してAlbini,A.らの(1987)に記載されたように行われた。さらにHGFにて誘発される(10ng/ml)細胞の逆アッセイが、PEG化されたNK4の10乃至1000倍の過剰なモルにより阻害することが可能であり、それがモノPEG化NK4の機能的な活性を示している。
【実施例７】
【０１０３】
in vivoにおける活性
モデル：Panc Tu1ヒトすい臓ガン正常位のSCIDマウス・モデル(Alves,F.らのPancreas 23(2001)227-235)
処理：8日後に、それを21日間にわたりモノPEG化NK4を日々1回の適用。
【０１０４】
容量：  16mg/kg/日
4mg/kg/日
1mg/kg/日
Placebo
結果：モノPEG化NK4による処理は、1次腫瘍増殖及び細胞分裂の促進の容量依存による阻害を示しているが、一方でPlacebo処理クループにおいては、効果が全く見受けられなかった。
【実施例８】
【０１０５】
医薬組成物
適切な医薬組成物は、たとえば：
1乃至30mg/mlのモノPEG化NK4
150mMのNaCl
10mMのリン酸ナトリウム、pH7.2
：
1ｘ-乃至30mg/mlのモノPEG化NK4
150mMのNaCl
0.01Tween 80又はTween 20又はpluronic F68
10mMのリン酸ナトリウム、pH7.2
：
1乃至30mg/mlのモノPEG化NK4
50mMのNaCl
3%のマニトール(mannitol)
10mMのリン酸ナトリウム、pH7.2
：
1乃至30mg/mlのモノPEG化NK4
50mMのNaCl
3%のマニトール(mannitol)
0.01%のTween 80又はTween 20又はpluronic F68
10mMのリン酸ナトリウム、pH7.2
：
モノPEG化NK4を上記緩衝溶液(マニトール(mannitol)を有する場合、又は有しない場合)に透析された組成物が調製される。タンパク質濃度を、濃縮又は緩衝溶液にて希釈することにより調整される。洗剤及びNaClが10%のストック溶液から付加される。
【実施例９】
【０１０６】
NK4、30kDa-モノ-PEG-NK4及び40kDa-モノ-PEG-NK4の医薬動態的分析
成人のマウス(グループ当り4匹)が、単独にてNK4、30kDa-モノ-PEG-NK4及び40kDa-モノ-PEG-NK4(注射の容量0.25ml中4mg/kg)をそれぞれ静脈(i.v.)又は皮下(s.c.)のボルス(bolus)注射を受けた。時間による採取とし血液試料を採取し、ELISAによるNK4、30kDa-モノ-PEG-NK4及び40kDa-モノ-PEG-NK4の含まれるものとして分析した。時間-濃度曲線を計算し、図4に示した。これらのデータでは、30kDa-モノ-PEG-NK4及び40kDa-モノ-PEG-NK4が、in vivoにいける安定性が有意に改良され、得られた結果が、未修飾NK4と比較して血漿の半減期が有意に増加していることを示した。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
文献一覧
Albini,A.,et al.,Cancer Res.47(1987)3239-3245
Alves,F.,et al.,Pancreas 23(2001)227-235
Bailon,P.,Bioconjugate Chem.12(2001)195-202
Date,K.,et al.,FEBS Letters 420(1997)1-6
Date,K.,et al.,Oncogene 17(1989)3045-3054
Ep 0 442 724
EP-A 0 473 084
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Gaertner,H.F.,and Offord,R.E.,Bioconjugate Chem.7(1996)38-44
Grasetti,D.R.,and Murray,J.F.,J.Appl.Biochem.Biotechnol.119(1967)41-49
Heinzerling,L.,et al.,Dermatol.201(2000)154-157
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WO 01/02017
WO 90/07938
WO 93/23541
WO 94/01451
WO 94/13322
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】図1は、NK4、20kDaのモノ-PEG-NK4及び30kDaのモノ-PEG-NK4によりHGFにより誘発されるHUVECの増殖の阻害を示している。
【図２】図2は、NK4、及び40kDaのモノ-PEG-NK4によりHGFにより誘発されるHUVECの増殖の阻害を示している。
【図３】図3は、NK4、30kDaのモノ-PEG-NK4及び40kDaのモノ-PEG-NK4によりbFGFにより誘発されるHUVECの増殖の阻害を示している。
【図４】図4は、静脈(i.v.)(図4A)又は皮下(s.c.)(図4B)注射後の血清中のNK4、30kDaのモノ-PEG-NK4及び40kDaのモノ-PEG-NK4による時間-濃度曲線を示している。
【配列の説明】
【０１０９】
配列ID番号第1は、NK4のDNA及びポリペプチド配列を示す。
【０１１０】
配列ID番号第2は、NK4のポリペプチド配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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