(57)【要約】蛍光性タンパク質の２つ以上のモノマーを機能できる形で結合させることにより形成されるか、または蛍光性タンパク質がオリゴマー化する能力を低下させるかまたは排除する少なくとも１つの突然変異を有する蛍光性タンパク質から誘導される、非オリゴマー化蛍光性タンパク質が提供される。非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、天然に存在する緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光性タンパク質、もしくは他の蛍光性タンパク質、またはこれらの関連する蛍光性タンパク質から誘導することができる。また、少なくとも１つの目的のポリペプチドに結合した非オリゴマー化蛍光性タンパク質を含む融合タンパク質が提供される。さらに、非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供され、少なくとも第２のポリヌクレオチドに機能できる形で結合した非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子も提供される。そのようなポリヌクレオチドを含有するベクターおよび宿主細胞も提供され、１つ以上の非オリゴマー化蛍光性タンパク質、またはこれらから誘導されるコードポリヌクレオチドもしくは構築体も提供される。さらに、これらのタンパク質およびポリヌクレオチドを作成し使用する方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
蛍光性タンパク質がオリゴマー化する能力を低下させるかまたは排除する少なくとも１つの突然変異を含有する蛍光性タンパク質を含む、非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項２】
蛍光性タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（GFP）、赤色蛍光性タンパク質（RFP）、またはGFPもしくはRFPに関連した蛍光性タンパク質である、請求項１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項３】
蛍光性タンパク質は、ディスコソマ（Discosoma）RFP、またはディスコソマ（Discosoma）RFPに関連した蛍光性タンパク質である、請求項１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項４】
蛍光性タンパク質は、エクオレア(Aequorea)GFP、レニラ（Renilla GFP、フィアリジウム（Phialidium）GFP、またはエクオレア(Aequorea)GFP、レニラ（Renilla）GFP、またはフィアリジウム（Phialidium）GFPに関連した蛍光性タンパク質である、請求項１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項５】
エクオレア(Aequorea)GFPに関連した蛍光性タンパク質は、シアン蛍光性タンパク質（CFP）、または黄色蛍光性タンパク質（YFP）、またはCFPもしくはYFPのスペクトル変異体である、請求項４の非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項６】
エクオレア(Aequorea) GFPに関連した蛍光性タンパク質は、増強GFP（EGFP；配列番号４）、増強CFP（ECFP；配列番号６）、EYFP-V68L/Q69K（配列番号10）、または増強YFP（EYFP；配列番号８）である、請求項４の非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項７】
蛍光性タンパク質がオリゴマー化する能力を低下させるかまたは排除する突然変異は、配列番号２のA206、L221、F223に対応するアミノ酸残基の突然変異、もしくはこれらの組合せである、請求項１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項８】
突然変異は、配列番号２のA206K突然変異、L221K突然変異、F223R突然変異、またはL221KとF223R突然変異に対応する、請求項７の非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項９】
突然変異は、配列番号６もしくは配列番号10のA206K突然変異、L221K突然変異、F223R突然変異、またはL221KとF223R突然変異である、請求項８の非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項１０】
ディスコソマ（Discosoma）RFPはDsRedであり、配列番号12に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３の非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項１１】
蛍光性タンパク質がオリゴマー化する能力を低下させるかまたは排除する突然変異は、I125R突然変異である、請求項１０の非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項１２】
少なくとも１つの目的のポリペプチドに機能できる形で結合した、請求項１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項１３】
非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、ペプチド結合を介して目的のポリペプチドに結合している、請求項１２の融合タンパク質。
【請求項１４】
非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、リンカー分子を介して目的のポリペプチドに結合している、請求項１２の融合タンパク質。
【請求項１５】
少なくとも１つの目的のポリペプチドはペプチドタグを含む、請求項１２の融合タンパク質。
【請求項１６】
ペプチドタグはポリヒスチジンペプチドである、請求項１５の融合タンパク質。
【請求項１７】
目的のポリペプチドは細胞性ポリペプチドである、請求項１２の融合タンパク質。
【請求項１８】
目的のペプチドは、酵素、Ｇタンパク質、増殖因子受容体、または転写因子である、請求項１２の融合タンパク質。
【請求項１９】
目的のポリペプチドは、会合して複合体を形成する２つ以上のタンパク質の１つである、請求項１２の融合タンパク質。
【請求項２０】
請求項１の少なくとも１つの非オリゴマー化蛍光性タンパク質を含むキット。
【請求項２１】
複数の異なる非オリゴマー化蛍光性タンパク質を含む、請求項２０のキット。
【請求項２２】
非オリゴマー化蛍光性タンパク質は融合タンパク質を含む、請求項２０のキット。
【請求項２３】
請求項１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
請求項９の非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項２３のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２６】
請求項２３のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２３の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項２８】
少なくとも第２のポリヌクレオチドに機能できる形で結合した請求項２３のポリヌクレオチドを含む、組換え核酸分子。
【請求項２９】
少なくとも第２のポリヌクレオチドは、転写制御要素または翻訳制御要素を含む、請求項２８の組換え核酸分子。
【請求項３０】
少なくとも第２のポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードする、請求項２８の組換え核酸分子。
【請求項３１】
請求項２８の組換え核酸分子を含むベクター。
【請求項３２】
ベクターは発現ベクターである、請求項３１のベクター。
【請求項３３】
請求項２８の組換え核酸分子を含有する宿主細胞。
【請求項３４】
請求項２８の少なくとも１つの組換え核酸分子を含むキット。
【請求項３５】
少なくとも第２のポリヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位またはリコンビナーゼ認識部位を含む、請求項３４のキット。
【請求項３６】
少なくとも第２のポリヌクレオチドは目的のポリペプチドをコードする、請求項３４のキット。
【請求項３７】
少なくとも第２のポリヌクレオチドはペプチドタグをコードする、請求項３６のキット。
【請求項３８】
複数の異なる組換え核酸分子を含む、請求項３４のキット。
【請求項３９】
タンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質構築体であって、
非オリゴマー化蛍光性タンパク質を含むドナー、非オリゴマー化蛍光性タンパク質を含むアクセプター、およびドナーとアクセプターとを機能できる形で結合するペプチドリンカー部分とを含み、
ここで、ドナーの環化アミノ酸は該ドナーに特徴的な光を発し、
ここで、ドナーとアクセプターは、ドナーが励起されると蛍光共鳴エネルギー移動を行い、リンカーは、アクセプターを励起する光を実質的に発しない、上記構築体。
【請求項４０】
サンプルのpHを測定する方法であって：
サンプルに請求項１の第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質を接触させ、ここで、pHがpH５〜pH10まで変化すると、第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質の発光強度は変化し、
指示物質を励起し；そして
第１の波長での第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質が発する光の強度を測定することを含み、ここで、第１の蛍光性タンパク質の発光強度はサンプルのpHを示す、上記方法。
【請求項４１】
第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２のS65G/S72A/T203Y/H231Lに対応する突然変異を含む、請求項４０の方法。
【請求項４２】
第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２のS65G/V68L/Q69K/S72A/T203Y/H231Lに対応する突然変異を含む、請求項４０の方法。
【請求項４３】
第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２のK26R/F64L/S65T/Y66W/N146I/M153T/V163A/N164H/H231Lに対応する突然変異を含む、請求項４０の方法。
【請求項４４】
第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２のH148Gに対応する突然変異を含む、請求項４０の方法。
【請求項４５】
サンプルは生物組織である、請求項４０の方法。
【請求項４６】
サンプルは細胞またはその画分である、請求項４０の方法。
【請求項４７】
請求項４０の方法であって：
サンプルに、第２の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を接触させ
ここで、pHが５〜pH10まで変化すると、第２の非オリゴマー化蛍光性タンパク質の発光強度は変化し、
ここで、第２の非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、第１の波長とは異なる第２の波長で発光し；
非オリゴマー化蛍光性タンパク質を励起し；
第２の波長で非オリゴマー化蛍光性タンパク質が発する光の強度を測定し；そして
第２の波長での蛍光を第１の波長での蛍光と比較することをさらに含む、上記方法。
【請求項４８】
非オリゴマー化蛍光性タンパク質は標的配列を含む、請求項４０の方法。
【請求項４９】
標的配列は、細胞コンパートメント化ドメインを含む、請求項４８の方法。
【請求項５０】
細胞コンパートメント化ドメインは、細胞中の第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質を、サイトゾル、小胞体、ミトコンドリアマトリックス、葉緑体腔、中間トランスゴルジ扁平嚢、リソソームの内腔、またはエンドソームの内腔に標的化する、請求項４９の方法。
【請求項５１】
細胞コンパートメント化ドメインは、ヒトII型膜固定タンパク質であるガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸残基１〜81、またはサイトクロームｃオキシダーゼのサブユニットIVのプレ配列のアミノ酸１〜12を含む、請求項４９の方法。
【請求項５２】
サンプルが酵素を含有するかどうかを測定する方法であって：
サンプルに、請求項３９のタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質を接触させ；
ドナーを励起し、そして
サンプル中の蛍光特性を測定し、
ここで、サンプル中の酵素の存在は、蛍光共鳴エネルギー移動の程度を変化させる、ことを含む上記方法。
【請求項５３】
細胞中の酵素の活性を測定するための方法であって：
請求項３９のタンデム蛍光性タンパク質構築体を発現する細胞を提供し、
ここでペプチドリンカー部分は、ドナーとアクセプターを結合させる酵素に特異的な切断認識アミノ酸配列を含み、
ドナーを励起し、そして
細胞中の蛍光共鳴エネルギー移動の程度を測定し、
ここで、細胞中の酵素活性の存在は、蛍光共鳴エネルギー移動の程度を変化させる、ことを含む上記方法。
【請求項５４】
サンプル中の分子の存在を同定する方法であって：
分子に請求項１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質を機能できる形で結合させ、そして
分子を含有するすることが疑われるサンプル中の非オリゴマー化蛍光性タンパク質による蛍光を検出し、こうしてサンプル中の分子の存在が同定される、ことを含む上記方法。
【請求項５５】
分子はポリペプチドである、請求項５４の方法。
【請求項５６】
ポリペプチドは、抗体、酵素、または受容体である、請求項５５の方法。
【請求項５７】
分子はポリヌクレオチドである、請求項５４の方法。
【請求項５８】
サンプルは生物サンプルである、請求項５４の方法。
【請求項５９】
生物サンプルは、細胞、組織サンプル、または細胞もしくは組織サンプルの抽出物を含む、請求項５８の方法。
【請求項６０】
検出は、インタクトな細胞または組織サンプルで行われる、請求項５９の方法。
【請求項６１】
機能できる形の結合は、タンパク質を分子に結合させるのに適した条件下で、非オリゴマー化蛍光性タンパク質に分子を接触させることを含む、請求項５４の方法。
【請求項６２】
機能できる形の結合は、分子をコードするポリヌクレオチドに機能できる形で結合した非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を発現させることを含む、請求項５４の方法。
【請求項６３】
発現制御配列の活性を制御する物質または条件を同定する方法であって：
発現制御配列に機能できる形で結合した請求項１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を、発現制御配列からのポリヌクレオチドの発現を制御できると疑われる物質または条件に暴露し、そして
該暴露による非オリゴマー化蛍光性タンパク質の蛍光を検出し、こうして発現制御配列の発現を制御する物質または条件を同定することを含む上記方法。
【請求項６４】
発現制御配列は転写制御要素である、請求項６３の方法。
【請求項６５】
転写制御要素はプロモーターである、請求項６４の方法。
【請求項６６】
発現制御配列は翻訳制御要素である、請求項６３の方法。
【請求項６７】
条件は、細胞中で発現されるタンパク質への暴露を含む、請求項６３の方法。
【請求項６８】
第１の分子と第２の分子の特異的相互作用を同定する方法であって：
ドナーである第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質に機能できる形で結合した第１の分子と、アクセプターである非オリゴマー化蛍光性タンパク質に機能できる形で結合した第２の分子とを、第１の分子と第２の分子の特異的相互作用を可能にする条件下で接触させ、
ドナーを励起し、そして
ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動を検出し、こうして、第１の分子と第２の分子の特異的相互作用を同定することを含む、上記方法。
【請求項６９】
第１の分子は第１の細胞性タンパク質であり、第２の分子は第２の細胞性タンパク質である、請求項６８の方法。
【請求項７０】
第１の細胞性タンパク質と第２の細胞性タンパク質は同じである、請求項６８の方法。
【請求項７１】
第１の分子はポリヌクレオチドであり、第２の分子はポリペプチドである、請求項６８の方法。
【請求項７２】
ポリヌクレオチドは転写制御要素であり、ポリペプチドは推定の転写因子である、請求項７１の方法。
【請求項７３】
蛍光性タンパク質の少なくとも第２のモノマーに機能できる形で結合した蛍光性タンパク質の第１のモノマーを含み、ここでタンデム蛍光性タンパク質がオリゴマー化する傾向は、蛍光性タンパク質のモノマーと比較して低下または阻害されている、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質。
【請求項７４】
蛍光性タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（GFP）、赤色蛍光性タンパク質（RFP）、またはGFPもしくは赤色蛍光性タンパク質に関連した蛍光性タンパク質である、請求項７３の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質。
【請求項７５】
蛍光性タンパク質は、ディスコソマ（Discosoma）RFPまたはディスコソマ（Discosoma）RFPに関連した蛍光性タンパク質である、請求項７４の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質。
【請求項７６】
ディスコソマ（Discosoma）RFPはDsRedであり、これは配列番号12に記載のアミノ酸配列または配列番号12の変異体を含む、請求項７５の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質。
【請求項７７】
ディスコソマ（Discosoma）RFPはDsRedの変異体であり、これは、配列番号12に記載のアミノ酸配列を含む、I125R突然変異をさらに含む、請求項７５の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質。
【請求項７８】
蛍光性タンパク質は、エクオレア（Aequorea）GFP、レニラ（Renilla）GFP、フィアリジウム（Phialidium）GFP、またはエクオレア（Aequorea）GFP、レニラ（Renilla）GFP、およびフィアリジウム（Phialidium）GFPに関連した蛍光性タンパク質である、請求項７４の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質。
【請求項７９】
エクオレア（Aequorea）GFPに関連した蛍光性タンパク質は、シアン蛍光性タンパク質（CFP）、または黄色蛍光性タンパク質（YFP）、またはCFPもしくはYFPのスペクトル変異体である、請求項７８の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質。
【請求項８０】
エクオレア（Aequorea）GFPに関連した蛍光性タンパク質は、増強CFP（EGFP；配列番号４）、増強CFP（ECFP；配列番号６）、EYFP-V68L/Q69K（配列番号10）、または増強YFP（EYFP；配列番号８）である、請求項７８の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質。
【請求項８１】
蛍光性タンパク質は、配列番号２のA206、L221、もしくはF223に対応するアミノ酸残基の突然変異、またはこれらの組合せをさらに含む、請求項７３の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質。
【請求項８２】
突然変異は、配列番号２のA206K突然変異、L221K突然変異、F223R突然変異、またはL221KとF223R突然変異に対応する、請求項８１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質。
【請求項８３】
突然変異は、配列番号６または配列番号10のA206K突然変異、L221K突然変異、F223R突然変異、またはL221KとF223R突然変異に対応する、請求項８１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質。
【請求項８４】
第１のモノマーと第２のモノマーは、ペプチドリンカーを使用して機能できる形で結合している、請求項７３の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質。
【請求項８５】
蛍光性タンパク質はDsRedであり、これは配列番号12に記載のアミノ酸配列を含む、請求項８４の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質。
【請求項８６】
ペプチドリンカーは、配列番号26のアミノ酸配列を有する、請求項８５の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質。
【請求項８７】
第１のモノマーまたは第２のモノマーに機能できる形で結合した、蛍光性タンパク質の少なくとも第３のモノマーをさらに含む、請求項７３の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質。
【請求項８８】
少なくとも１つの目的のポリペプチドに機能できる形で結合した、請求項７３の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を含む融合タンパク質。
【請求項８９】
非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質は、ペプチド結合を介して目的のポリペプチドに結合した、請求項８８の融合タンパク質。
【請求項９０】
非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質は、リンカー分子を介して目的のポリペプチドに結合した、請求項８９の融合タンパク質。
【請求項９１】
少なくとも１つの目的のポリペプチドはペプチドタグを含む、請求項８８の融合タンパク質。
【請求項９２】
ペプチドタグはポリヒスチジンペプチドである、請求項９１の融合タンパク質。
【請求項９３】
目的のポリペプチドは細胞性ポリペプチドである、請求項８８の融合タンパク質。
【請求項９４】
目的のポリペプチドは、酵素、Ｇタンパク質、増殖因子受容体、または転写因子である、請求項８８の融合タンパク質。
【請求項９５】
目的のポリペプチドは、会合して複合体を形成する２つ以上のタンパク質の１つである、請求項８８の融合タンパク質。
【請求項９６】
請求項７３の少なくとも１つの非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を含むキット。
【請求項９７】
複数の異なる非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を含む、請求項９６のキット。
【請求項９８】
非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質は融合タンパク質を含む、請求項９６のキット。
【請求項９９】
請求項７３の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１００】
請求項７６の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０１】
請求項９９のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０２】
請求項９９のポリヌクレオチドを含有する宿主細胞。
【請求項１０３】
請求項９９の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むキット。
【請求項１０４】
少なくとも第２のポリヌクレオチドに機能できる形で結合した請求項９９のポリヌクレオチドを含む、組換え核酸分子。
【請求項１０５】
少なくとも第２のポリヌクレオチドは、転写制御要素または翻訳制御要素を含む、請求項１０４の組換え核酸分子。
【請求項１０６】
少なくとも第２のポリヌクレオチドは目的のポリペプチドをコードする、請求項１０４の組換え核酸分子。
【請求項１０７】
請求項１０４の組換え核酸分子を含むベクター。
【請求項１０８】
ベクターは発現ベクターである、請求項１０７のベクター。
【請求項１０９】
請求項１０４の組換え核酸分子を含有する宿主細胞。
【請求項１１０】
請求項１０４の少なくとも１つの組換え核酸分子を含むキット。
【請求項１１１】
少なくとも第２のポリヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼ認識部位またはリコンビナーゼ認識部位を含む、請求項１１０のキット。
【請求項１１２】
少なくとも第２のポリヌクレオチドは目的のポリペプチドをコードする、請求項１１０のキット。
【請求項１１３】
少なくとも第２のポリヌクレオチドはペプチドタグをコードする、請求項１１２のキット。
【請求項１１４】
複数の異なる組換え核酸分子を含む、請求項１１０のキット。
【請求項１１５】
以下を含むタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質：
第１の蛍光性タンパク質を含むドナー、
第２の蛍光性タンパク質を含むアクセプター、および
ドナーとアクセプターとを機能できる形で結合させるペプチドリンカー部分とを含み
ここで、第１の蛍光性タンパク質と第２の蛍光性タンパク質は異なり、
ここで、少なくとも第１の蛍光性タンパク質または第２の蛍光性タンパク質は、請求項７３の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質であり、
ここで、ドナーの環化アミノ酸は、ドナーに特徴的な光を発し、そして
ここで、ドナーが励起された時ドナーとアクセプターは蛍光共鳴エネルギー移動を示し、リンカー部分は、アクセプターを励起する光を実質的に発しない。
【請求項１１６】
第１の蛍光性タンパク質と第２の蛍光性タンパク質のそれぞれは、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質である、請求項１１５のタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項１１７】
非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質はディスコソマ（Discosoma）RFPまたはディスコソマ（Discosoma）RFPに関連した蛍光性タンパク質を含む、請求項１１５のタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項１１８】
ディスコソマ（Discosoma）RFPはDsRedであり、これは、配列番号12に記載のアミノ酸配列または配列番号12の変異体を含む、請求項１１７のタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項１１９】
ディスコソマ（Discosoma）RFPはDsRedの変異体であり、これは、配列番号12に記載のアミノ酸配列を含む、I125R突然変異をさらに含む、請求項１１７の非オリゴマー化タンダム蛍光性タンパク質。
【請求項１２０】
第１の蛍光性タンパク質は非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質であり、第２の蛍光性タンパク質は非オリゴマー化蛍光性タンパク質である、請求項１１５のタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項１２１】
非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、配列番号２のA206、L221、F223に対応するアミノ酸残基の突然変異、またはこれらの組合せを含む、請求項１２０のタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項１２２】
突然変異は、配列番号２のS65G/S72A/T203Y/H231Lに対応する、請求項１２１のタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項１２３】
突然変異は、配列番号２のS65G/V68L/Q69K/S72A/T203Y/H231Lに対応する、請求項１２１のタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項１２４】
突然変異は、配列番号２のK26R/F64L/S65T/Y66W/N146I/M153T/V163A/N164H/H231Lに対応する、請求項１２１のタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項１２５】
突然変異は、配列番号２のH148Gに対応する、請求項１２１のタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質。
【請求項１２６】
サンプルのpHを測定する方法であって：
サンプルに請求項７３の第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を接触させ、ここで、pHがpH５〜pH10まで変化すると、第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質の発光強度は変化する、
指示物質を励起し；そして
第１の波長での第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質が発する光の強度を測定することを含み、ここで、第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質の発光強度はサンプルのpHを示す、上記方法。
【請求項１２７】
第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質は、ディスコソマ（Discosoma）RFPまたはディスコソマ（Discosoma）RFPに関連した蛍光性タンパク質を含む、請求項１２６の方法。
【請求項１２８】
ディスコソマ（Discosoma）RFPはDsRedであり、これは、配列番号12に記載のアミノ酸配列または配列番号12の変異体を含む、請求項１２７の方法。
【請求項１２９】
配列番号12の変異体はI125R突然変異を含む、請求項１２８の方法。
【請求項１３０】
サンプルは生物組織である、請求項１２６の方法。
【請求項１３１】
サンプルは細胞またはその画分である、請求項１２６の方法。
【請求項１３２】
請求項１２６の方法であって：
サンプルを非オリゴマー化蛍光性タンパク質に接触させ、
ここで、非オリゴマー化蛍光性タンパク質は第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質とは異なり、
ここで、pHが５〜pH10まで変化すると、非オリゴマー化蛍光性タンパク質の発光強度は変化し、そして
ここで、非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、第１の波長とは異なる第２の波長で発光する；
非オリゴマー化蛍光性タンパク質を励起し；
第２の波長で非オリゴマー化蛍光性タンパク質が発する光の強度を測定し；そして
第２の波長での蛍光を第１の波長での蛍光と比較する、
ことをさらに含む上記方法。
【請求項１３３】
非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、第２の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質である、請求項１３２の方法。
【請求項１３４】
第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質は標的化配列を含む、請求項１２６の方法。
【請求項１３５】
標的化配列は細胞コンパートメント化ドメインを含む、請求項１３４の方法。
【請求項１３６】
細胞コンパートメント化ドメインは、細胞中の第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を、サイトゾル、小胞体、ミトコンドリアマトリックス、葉緑体腔、中間トランスゴルジ扁平嚢、リソソームの内腔、エンドソームの内腔に標的化する、請求項１３５の方法。
【請求項１３７】
細胞コンパートメント化ドメインは、ヒトII型膜固定タンパク質であるガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸残基１〜81、またはサイトクロームｃオキシダーゼのサブユニットIVのプレ配列のアミノ酸残基１〜12を含む、請求項１２６の方法。
【請求項１３８】
サンプルが酵素を含有するかどうかを測定する方法であって：
サンプルを請求項１１５のタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質に接触させ；
ドナーを励起し、そして
サンプル中の蛍光特性を測定することを含み、
ここで、サンプル中の酵素の存在は、蛍光共鳴エネルギー移動の程度を変化させる、上記方法。
【請求項１３９】
細胞中の酵素の活性を測定する方法であって：
請求項１１５のタンデム非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を発現する細胞を提供し、
ここでペプチドリンカー部分は、ドナーとアクセプターを結合させる酵素に特異的な切断認識アミノ酸配列を含み、
ドナーを励起し、そして
細胞中の蛍光共鳴エネルギー移動の程度を測定することを含み、
ここで、細胞中の酵素活性の存在は、蛍光共鳴エネルギー移動の程度を変化させる、上記方法。
【請求項１４０】
サンプル中の分子の存在の同定する方法であって：
請求項７３の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を分子に機能できる形で結合させ、そして
分子を含有することが疑われるサンプル中の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質による蛍光を検出し、こうしてサンプル中の分子の存在を同定することを含む、上記方法。
【請求項１４１】
分子はポリペプチドである、請求項１４０の方法。
【請求項１４２】
ポリペプチドは、抗体、酵素、または受容体である、請求項１４１の方法。
【請求項１４３】
分子はポリヌクレオチドである、請求項１４０の方法。
【請求項１４４】
サンプルは生物サンプルである、請求項１４２の方法。
【請求項１４５】
生物サンプルは、細胞、組織サンプル、または細胞もしくは組織サンプルの抽出物を含む、請求項１４４の方法。
【請求項１４６】
検出は、インタクトな細胞または組織サンプルで行われる、請求項１４５の方法。
【請求項１４７】
機能できる形の結合は、タンパク質を分子に結合するのに適した条件下で、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質に分子を接触させることを含む、請求項１４０の方法。
【請求項１４８】
機能できる形の結合は、分子をコードするポリヌクレオチドに機能できる形で結合した非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を発現することを含む、請求項１４０の方法。
【請求項１４９】
発現制御配列の活性を制御する物質または条件を同定する方法であって：
発現制御配列に機能できる形で結合した請求項７３の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を、発現制御配列からのポリヌクレオチドの発現を制御できると疑われる物質または条件に暴露し、そして
該暴露による非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質の蛍光を検出し、こうして発現制御配列の発現を制御する物質または条件を同定することを含む上記方法。
【請求項１５０】
発現制御配列は転写制御要素である、請求項１４９の方法。
【請求項１５１】
転写制御要素はプロモーターである、請求項１５０の方法。
【請求項１５２】
発現制御配列は翻訳制御要素である、請求項１４９の方法。
【請求項１５３】
条件は、細胞中で発現されるタンパク質への暴露を含む、請求項１４９の方法。
【請求項１５４】
第１の分子と第２の分子の特異的相互作用を同定する方法であって：
ドナーである第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質に機能できる形で結合した第１の分子と、アクセプターである非オリゴマー化蛍光性タンパク質に機能できる形で結合した第２の分子とを、第１の分子と第２の分子の特異的相互作用を可能にする条件下で接触させ、
ここで、第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質と非オリゴマー化蛍光性タンパク質は異なり；
ドナーを励起し、そして
ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動を検出し、こうして、第１の分子と第２の分子の特異的相互作用を同定することを含む、上記方法。
【請求項１５５】
非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、第２の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質である、請求項１５４の方法。
【請求項１５６】
第１の分子は第１の細胞性タンパク質であり、第２の分子は第２の細胞性タンパク質である、請求項１５４の方法。
【請求項１５７】
第１の細胞性タンパク質と第２の細胞性タンパク質は同じである、請求項１５４の方法。
【請求項１５８】
第１の分子はポリヌクレオチドであり、第２の分子はポリペプチドである、請求項１５９の方法。
【請求項１５９】
ポリヌクレオチドは転写制御要素であり、ポリペプチドは推定の転写因子である、請求項１５４の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に蛍光性タンパク質に関し、さらに詳しくは、非結合蛍光性タンパク質モノマーと比較してオリゴマー化する傾向が低下したタンデム蛍光性タンパク質ホモダイマーに関し、そのような非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を作成しかつ使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
種々の生物（海洋生物を含む）の蛍光性タンパク質の同定と単離は、分子生物学の有用な手段を与えている。例えば、オワンクラゲ（Aequorea victoria）の緑色蛍光タンパク質（GFP）は、種々の細胞プロセス（遺伝子発現の制御、細胞性タンパク質の局在化と相互作用、細胞内コンパートメントのpH、および酵素の活性を含む）を調べるための、一般的に使用されるレポーター分子となっている。
【０００３】
種々の有用な蛍光特性を有するタンパク質を得ようとして、エクオレア(Aequorea)GFPの有用性から、多くの他の蛍光性タンパク質が同定されている。さらに、エクオレア(Aequorea)GFPのスペクトル変異体が作成されており、こうして、異なる波長で、異なる時間、および異なる条件下で、励起されるか蛍光を発するタンパク質が得られている。ディスコソマ（Discosoma）からの赤色蛍光性タンパク質（dsRed）の同定とクローニングは、赤色の波長で蛍光を発する能力のために、重大な関心が寄せられている。そのような蛍光性タンパク質が利用できることは、そのタンパク質が使用できる研究、従って細胞の構造と機能についての我々の理解を大幅に向上させる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
多様な天然に存在する蛍光性タンパク質とそのタンパク質のスペクトル変異体が利用できることは、大きな進歩を可能にしたが、蛍光性タンパク質の使用に対する制限がまだ存在する。特にGFPとそのスペクトル変異体、ならびに他の天然に存在する蛍光性タンパク質（例えば、dsRed）は、生理学的条件下で自己会合して、ダイマー、テトラマーなどを生成する傾向がある。従って、ある結果が、研究中の２つのタンパク質の特異的相互作用によるものか、または観察された相互作用が、研究中の２つのタンパク質のそれぞれに結合した蛍光性タンパク質のオリゴマー化により引き起こされたアーティファクトなのかを、決定することが困難な場合がある。
【０００５】
実質的に低下したオリゴマー化活性を有するGFPの変異体およびそのスペクトル変異体の設計において、大きな進歩がなされている。また、オリゴマーを形成する傾向が低下したdsRed変異体、およびダイマーのみを形成するdsRed変異体が開発されている。しかし、ダイマー形成を防止するためにdsRedを修飾する従来の試みにより、非蛍光性タンパク質が形成されている。すなわち、dsRedのような赤色蛍光性タンパク質が自己会合する傾向を低下させる方法に対するニーズが存在する。本発明は、このニーズを満足させ、追加の利点を与える。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、蛍光性タンパク質の少なくとも第２のモノマーに機能できる形で結合した蛍光性タンパク質の第１のモノマーを含む、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質に関し、ここでタンデム蛍光性タンパク質がオリゴマー化する傾向は、蛍光性タンパク質のモノマーと比較して、低下しているかまたは阻害されている。非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質の蛍光性タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（GFP）、赤色蛍光性タンパク質（RFP）、またはGFPもしくはRFPに関連した蛍光性タンパク質でもよい。
【０００７】
ある実施形態において蛍光性タンパク質は、ディスコソマ（Discosoma）RFP、またはディスコソマ（Discosoma）RFPに関連した蛍光性タンパク質、例えば配列番号12に記載のアミノ酸配列を有するDsRedタンパク質、または配列番号12の変異体、例えばI125R突然変異を有する配列番号12である。別の実施形態において蛍光性タンパク質は、エクオレア(Aequorea)GFP、レニラ（Renilla）のGFP、フィアリジウム（Phialidium）のGFP、またはエクオレア(Aequorea)GFP、レニラ（Renilla）GFP、およびフィアリジウム（Phialidium）GFPに関連した蛍光性タンパク質、例えば、シアン蛍光性タンパク質（CFP）、または黄色蛍光性タンパク質（YFP）、またはCFPもしくはYFPのスペクトル変異体、または増強GFP（EGFP；配列番号４）、増強CFP（ECFP；配列番号６）、EYFP-V68L/Q69K（配列番号10）、または増強YFP（EYFP；配列番号８）であり、それぞれがエクオレア(Aequorea) GFPに関連している。さらに別の実施形態において、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質の蛍光性タンパク質は、配列番号２のA206、L221、F223に対応するアミノ酸残基の突然変異、もしくはこれらの組合せ、例えば配列番号２のA206K突然変異、L221K突然変異、F223R突然変異、またはL221KとF223R突然変異に対応する突然変異、または配列番号６もしくは配列番号10のA206K突然変異、L221K突然変異、F223R突然変異、またはL221KとF223R突然変異に対応する突然変異を含む。
【０００８】
非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質の第１のモノマーと少なくとも第２のモノマーは、分子内オリゴマーが形成されて、蛍光性タンパク質が分子間オリゴマーを形成する傾向を低下させるかまたは阻害するように、機能できる形で結合している。第１のモノマーと少なくとも第２のモノマーは、蛍光性タンパク質の蛍光特性を破壊しない任意の結合またはリンカーを使用して、機能できる形で結合している。ある実施形態において、第１のモノマーと少なくとも第２のモノマーは、ペプチドリンカーを使用して機能できる形で結合しており、例えばペプチドリンカーは、配列番号26に記載のアミノ酸配列を有する。例えば、蛍光性タンパク質は、配列番号12に記載のアミノ酸配列を有し、ペプチドリンカーは、配列番号26に記載のアミノ酸配列を有するか、または蛍光性タンパク質は、実質的に配列番号12に記載のアミノ酸配列（I125R突然変異を含む）を有し、ペプチドリンカーは配列番号26に記載のアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、第１のモノマーと少なくとも第２のモノマーは、ポリヌクレオチド配列、ペプチド模倣物、または他の合成リンカー（例えば、合成ポリマー）を使用して、機能できる形で結合している。
【０００９】
非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質はさらに、蛍光性タンパク質の少なくとも第３のモノマーを有し、これは、第１のモノマーまたは第２のモノマーに機能できる形で結合している。非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質の３つ以上のモノマーを機能できる形で結合させるためのリンカーは、同じまたは異なるリンカーでもよい。
【００１０】
本発明はまた、少なくとも１つの目的のポリペプチドに機能できる形で結合した非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を含む、融合タンパク質に関する。非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質は、任意のリンカーまたは結合（例えば、ペプチド結合、ペプチドリンカー、または他のリンカー分子を含む）を使用して、目的のポリペプチドに結合することができる。目的のポリペプチドは、任意のポリペプチド（例えばポリヒスチジンペプチドのようなペプチドタグ；酵素、Ｇタンパク質、増殖因子受容体、または転写因子のような細胞性ポリペプチド；または検出可能なシグナルを与えるか、もしくはレポーターポリペプチドをを含有する融合タンパク質を単離するための手段を与える受容体ポリペプチドを含む）である。目的のポリペプチドはまた、会合して複合体を形成する２つ以上のタンパク質の１つでもよい。
【００１１】
本発明はさらに、本発明の少なくとも１つの非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を含有し、複数の異なる非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を含有することができるキットに関する。所望であれば、キットの１つ以上の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質は、融合タンパク質でもよい。
【００１２】
本発明はまた、本発明の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ならびに、少なくとも第２のポリヌクレオチドに機能できる形で結合した本発明のポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子とに関する。少なくとも第２のポリヌクレオチドは、例えば転写もしくは翻訳制御要素でもよく、または目的のポリペプチドをコードしてもよく、または制限エンドヌクレアーゼ認識部位もしくはリコンビナーゼ認識部位を含有してもよい。また、本発明のポリヌクレオチドまたは組換え核酸分子を含有するベクター、ならびに、そのようなポリヌクレオチドまたはベクターを含有する宿主細胞が提供される。さらに、本発明の少なくとも１つのポリヌクレオチドまたは組換え核酸分子を含有するキットが提供される。ある実施形態においてキットは、複数の異なるポリヌクレオチドもしくは組換え核酸分子、またはこれらの組合せを含有する。
【００１３】
本発明はさらに、第１の蛍光性タンパク質を含むドナー、第２の蛍光性タンパク質を含むアクセプター、およびドナーとアクセプターとを機能できる形で結合させるペプチドリンカー部分とを含む、タンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質に関する。そのようなタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質において、第１の蛍光性タンパク質と第２の蛍光性タンパク質は異なり、少なくとも第１の蛍光性タンパク質または第２の蛍光性タンパク質は、本発明の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質である。さらに、ドナーの環化アミノ酸は、ドナーに特徴的な光を発し、ドナーが励起された時ドナーとアクセプターは蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer）を示し、リンカー部分は、アクセプターを励起する光を実質的に発しない。
【００１４】
ある実施形態において、第１の蛍光性タンパク質と第２の蛍光性タンパク質のそれぞれは、本発明のタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質中の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質である。例えば、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質は、ディスコソマ（Discosoma）RFP、またはディスコソマ（Discosoma）RFPに関連した蛍光性タンパク質、例えば配列番号12に記載のアミノ酸配列を有するDsRedタンパク質もしくはI125R突然変異を含有する配列番号12のような突然変異DsRedタンパク質でもよい。
【００１５】
別の実施形態において第１の蛍光性タンパク質は、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質であり、第２の蛍光性タンパク質は非オリゴマー化蛍光性タンパク質である。非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、配列番号２のA206、L221、F223に対応するアミノ酸残基の突然変異、もしくはこれらの組合せ、例えば配列番号２のS65G/S72A/T203Y/H231Lに対応する突然変異；配列番号２のS65G/V68L/Q69K/S72A/T203Y/H231Lに対応する突然変異；配列番号２のK26R/F64L/S65T/Y66W/N146I/M153T/V163A/N164H/H231Lに対応する突然変異；または配列番号２のH148Gに対応する突然変異を含有することができる。
【００１６】
本発明はまた、サンプルのpHを測定する方法に関する。そのような方法は、例えばサンプルに第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を接触させ（ここで、pHがpH５〜pH10まで変化すると、第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質の発光強度は変化して、指示物質を励起する）、そして第１の波長での第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質が発する光の強度を測定することにより行われ、ここで、第２の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質の発光強度はサンプルのpHを示す。サンプルは任意のサンプルでよく、例えば細胞またはその画分のような生物組織でよい。
【００１７】
サンプルのpHを測定する方法には、サンプルに、第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質とは異なる非オリゴマー化蛍光性タンパク質を接触させ（ここで、pHが５〜pH10まで変化すると、非オリゴマー化蛍光性タンパク質の発光強度は変化し、第１の波長とは異なる第２の波長で発光する）；非オリゴマー化蛍光性タンパク質を励起し；第２の波長で非オリゴマー化蛍光性タンパク質が発する光の強度を測定し；そして第２の波長での蛍光を第１の波長での蛍光と比較することを含む。
【００１８】
非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、第２の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質でもよい。さらに、第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質または非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、標的化配列（例えば、サイトゾル、小胞体、ミトコンドリアマトリックス、葉緑体腔、中間トランスゴルジ扁平嚢、リソソームの内腔、またはエンドソームの内腔への、細胞中の蛍光性タンパク質の局在化を指令することができる細胞コンパートメント化ドメイン）を、含有してもよい。ある実施形態において、細胞コンパートメント中の標的化配列は、ヒトII型膜固定タンパク質であるガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸残基１〜81、またはサイトクロームオキシダーゼのサブユニットIVのプレ配列のアミノ酸１〜12を含む。
【００１９】
本発明はまた、サンプルが酵素を含有するかどうかを測定する方法に関する。そのような方法は、例えば、サンプルにタンデム非オリゴマー化蛍光性タンパク質を接触させ；ドナーを励起し、そしてサンプル中の蛍光特性を測定することにより行われ、ここで、サンプル中の酵素の存在は、蛍光共鳴エネルギー移動の程度を変化させる。また、細胞中の酵素の活性を測定するための方法が提供される。そのような方法は、例えばタンデム非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を発現する細胞を提供し（ここでペプチドリンカー部分は、ドナーとアクセプターを結合させる酵素に特異的な切断認識アミノ酸配列を含む）、ドナーを励起し、細胞中の蛍光共鳴エネルギー移動の程度を測定することにより行われる（ここで、細胞中の酵素活性の存在は、蛍光共鳴エネルギー移動の程度を変化させる）。
【００２０】
本発明はまた、サンプル中の分子の存在を同定する方法に関する。そのような方法は、例えば非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を分子に機能できる形で結合させ、そして分子を含有することが疑われるサンプル中の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質による蛍光を検出することにより行われ、こうしてサンプル中の分子の存在が同定される。分子は、ポリペプチド（例えば、抗体、酵素、または受容体）；ポリヌクレオチド；または任意の他の目的の分子でよい。サンプルは、任意のサンプルであり、例えば細胞、組織サンプル、または細胞もしくは組織サンプルの抽出物のような生物サンプルがある。従って、検出工程は、インタクトな細胞または組織サンプルで行うことができる。非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質は、タンパク質を分子に結合するのに適した任意の条件下で、分子に機能できる形で結合することができる。例えば、タンパク質と分子は、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質と分子とをコードする組換え核酸分子を発現することにより、機能できる形で結合することができる。
【００２１】
本発明はさらに、発現制御配列の活性を制御する物質または条件を同定する方法に関する。そのような方法は、例えば、発現制御配列に機能できる形で結合した非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を、発現制御配列からのポリヌクレオチドの発現を制御できると疑われる物質または条件に暴露し、該暴露による非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質の蛍光を検出することにより行われ、こうして発現制御配列の発現を制御する物質または条件が同定される。発現制御配列は、転写制御要素（例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、またはインシュレーター）、または翻訳制御要素（例えば、内部リボゾーム侵入部位）でもよい。この物質または条件は、任意の物質または条件であり、例えば細胞中で発現されるタンパク質への暴露がある。
【００２２】
本発明はさらに、第１の分子と第２の分子の特異的相互作用を同定する方法に関する。そのような方法は、例えば、ドナーである第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質に機能できる形で結合した第１の分子と、アクセプターである非オリゴマー化蛍光性タンパク質に機能できる形で結合した第２の分子とを、第１の分子と第２の分子の特異的相互作用を可能にする条件下で接触させ（ここで、第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質と非オリゴマー化蛍光性タンパク質とは異なる）、ドナーを励起し、そしてドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動を検出することにより行われ、こうして、第１の分子と第２の分子の特異的相互作用が同定される。そのような方法において、非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、第２の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質でも、任意の他の非オリゴマー化蛍光性タンパク質でもよい。
【００２３】
ある実施形態において、第１の分子は第１の細胞性タンパク質であり、第２の分子は第２の細胞性タンパク質であり、ここで第１の細胞性タンパク質と第２の細胞性タンパク質は同じかまたは異なる。別の実施形態において、第１の分子はポリヌクレオチドであり、第２の分子はポリペプチド（例えば、転写制御要素および推定の転写因子）である。
【００２４】
本発明はまた、蛍光性タンパク質がオリゴマー化する能力を低下させるかまたは排除する少なくとも１つの突然変異を含有する非オリゴマー化蛍光性タンパク質に関する。非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、オリゴマー化することが知られている任意の蛍光性タンパク質から誘導することができ、例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、例えば、オワンクラゲ（Aequorea victoria）GFP、レニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）GFP、フィアリジウム・グレガリウム（Phialidium gregarium）GFP；赤色蛍光性タンパク質（RFP）、例えば、ディスコソマ（Discosoma）RFP；またはGFPもしくはRFPに関連した蛍光性タンパク質がある。すなわち、非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、シアン蛍光性タンパク質（CFP）、黄色蛍光性タンパク質（YFP）、増強GFP（EGFP）、増強CFP（ECFP）、もしくは増強YFP（EYFP）、またはそのような蛍光性タンパク質の変異体でもよく、これらは、オリゴマー化する傾向を低下させるかまたは排除する１つ以上の突然変異の存在が無いと、オリゴマー化する。そのような突然変異は、例えば、エクオレア(Aequorea)GFP（配列番号２）のアミノ酸残基A206、L221、もしくはF223の１つまたは組合せの突然変異、または配列番号２のA206、L221、もしくはF223の突然変異に対応する別の蛍光性タンパク質の突然変異でもよい。そのような突然変異は、本明細書において、A206K、L221K、F223R突然変異、またはECFP（配列番号６）およびEYFP-V68L/Q69K（配列番号10）の突然変異またはL221KとF223R突然変異により例示され、これらはエクオレア(Aequorea)GFPのスペクトル変異体である。
【００２５】
本発明はまた、目的の１つ以上のポリペプチドに結合した非オリゴマー化蛍光性タンパク質を含む融合タンパク質に関する。融合タンパク質のポリペプチドは、ペプチド結合を介して結合するか、または非オリゴマー化蛍光性タンパク質が、リンカー分子を介して目的のポリペプチドに結合することができる。目的のポリペプチドは、任意のポリペプチドであり、例えば、ポリヒスチジンペプチドのようなペプチドタグ；酵素、Ｇタンパク質、増殖因子受容体、または転写因子のような細胞性ポリペプチド；および、会合して複合体を形成することができる２つ以上のタンパク質の１つでもよい。ある実施形態において融合タンパク質は、タンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質構築体であり、これは、ドナーである非オリゴマー化蛍光性タンパク質、アクセプターである非オリゴマー化蛍光性タンパク質、および該ドナーと該アクセプターとを結合させるペプチドリンカー部分を含み、ここでドナーの環化アミノ酸は、ドナーに特徴的な光を発し、ドナーが励起された時ドナーとアクセプターは蛍光共鳴エネルギー移動を示し、リンカー部分は、ドナーを励起する光を実質的に発しない。
【００２６】
本発明はさらに、非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含有するベクター、およびポリヌクレオチドまたはベクターを含有する宿主細胞とに関する。さらに本発明は、１つ以上の他のポリヌクレオチドに機能できる形で結合した非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子に関する。１つ以上の他のポリヌクレオチドは、例えば転写制御要素（例えばプロモーター、ポリアデニル化シグナル配列）、または翻訳制御要素（例えば、リボゾーム結合部位）でもよい。そのような組換え核酸分子は、ベクター中に含有され、これは発現ベクターでもよく、核酸分子またはベクターは宿主細胞中に含有されることができる。
【００２７】
本発明はまた、本発明の１つ以上の組成物（例えば、融合タンパク質の一部でもよい１つもしくは複数の非オリゴマー化蛍光性タンパク質、またはタンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチド）を含有するキットに関する。本発明のキットはまた、１つまたは複数の組換え核酸分子を含有することができ、これは一部は非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードし、これは同じかまたは異なり、例えば制限エンドヌクレアーゼ認識部位もしくはリコンビナーゼ認識部位を含有するかコードする機能できる形で結合した第２のポリヌクレオチド、または目的の任意のポリペプチドをさらに含む。
【００２８】
本発明はさらに、サンプル中の分子の存在の同定法に関する。そのような方法は、例えば機能できる形で非オリゴマー化蛍光性タンパク質を分子に結合させ、そして分子を含有することが疑われるサンプル中の非オリゴマー化蛍光性タンパク質による蛍光を検出することにより行われ、こうしてサンプル中の分子の存在が同定される。検出すべき分子は、任意の分子であり、ポリペプチド（例えば、抗体、酵素、または受容体）、またはポリヌクレオチドでよい。さらにサンプルは、任意のサンプルであり、例えば細胞（培養物中の細胞または生物から単離された細胞でもよい）、組織サンプル、または細胞もしくは組織サンプルの抽出物のような生物サンプルがある。ある実施形態においてこの方法は、完全な細胞または組織サンプルを使用して行われ、ここで生きた細胞中の目的の分子の存在を同定することができる。
【００２９】
分子への非オリゴマー化蛍光性タンパク質の結合は、ポリペプチド−分子複合体が暴露される条件下で安定な結合を使用して行うことができ、化学反応を使用して行うことができ、または結合した複合体をコードする組換え核酸分子の発現の結果でもよい。すなわち、結合は、分子へのタンパク質の結合に適した条件下で、非オリゴマー化蛍光性タンパク質に分子を接触させることにより行われ、そのような条件は、例えば分子の化学的性質と所望の結合のタイプに依存し、この結合は直接結合でも、またはリンカー部分に仲介されてもよい。分子がポリペプチドである場合、結合は、分子をコードするポリヌクレオチドに機能できる形で結合した非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を発現させることにより行ってもよい。
【００３０】
本発明はまた、発現制御配列の活性を制御する物質または条件を同定する方法に関する。そのような方法は、例えば、発現制御配列に機能できる形で結合した非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組換え核酸分子を、発現制御配列からのポリヌクレオチドの発現を制御できることが疑われる物質または条件に暴露し、そしてそのような暴露による非オリゴマー化蛍光性タンパク質の蛍光を検出することにより行われ、こうして発現制御配列の発現を制御する物質または条件が同定される。発現制御配列は任意の配列であり、例えば、プロモーターのような転写制御要素またはリボゾーム結合部位のような翻訳制御要素がある。さらに、この物質は任意の物質であり、例えばペプチド、ポリヌクレオチド、小有機分子などがある。同様に条件は任意の条件であり、例えば細胞中で発現されるタンパク質への暴露があり、従って方法は、転写因子、翻訳因子など（組織特異的因子を含む）を同定するのに使用することができる。
【００３１】
本発明はまた、第１の分子と第２の分子との特異的相互作用を同定する方法に関する。そのような方法は、例えば、ドナーである第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質に結合した第１の分子と、アクセプターである第２の非オリゴマー化蛍光性タンパク質に結合した第２の分子とを、第１の分子と第２の分子の特異的相互作用を可能にする条件下で接触させ；ドナーを励起し；そしてドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動を検出することにより行われ、こうして第１の分子と第２の分子との特異的相互作用が同定される。第１の分子と第２の分子は、同じかまたは異なる細胞性タンパク質でもよく、またはポリヌクレオチドおよびポリペプチドでもよく、こうして、例えば、細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質と特異的に相互作用するタンパク質を同定するための、または転写因子に特異的に結合する転写制御要素を同定するための、手段を提供する。
【００３２】
本発明はまた、サンプルが酵素を含有するかどうかを測定する方法に関する。そのような方法は、例えば、サンプルに本発明のタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質構築体を接触させ；ドナーを励起し；そしてサンプル中の蛍光特性を測定することにより行われ、ここで、サンプル中の酵素の存在は、蛍光共鳴エネルギー移動の程度を変化させる。同様に本発明は、細胞中の酵素の活性を測定する方法に関する。そのような方法は、例えばタンデム非オリゴマー化蛍光性タンパク質構築体を発現する細胞を提供し（ここでペプチドリンカー部分は、ドナーとアクセプターを結合させる酵素に特異的な切断認識アミノ酸配列を含む）；ドナーを励起し；細胞中の蛍光共鳴エネルギー移動の程度を測定することにより行われる（ここで、細胞中の酵素活性の存在は、蛍光共鳴エネルギー移動の程度を変化させる）。
【００３３】
本発明はさらに、サンプルのpHを測定する方法に関する。そのような方法は、例えばサンプルに第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質を接触させ（ここで、pHがpH５〜pH10まで変化すると、第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質の発光強度は変化する）；指示物質を励起し；そして、第１の波長での第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質が発する光の強度を測定することを含む（ここで、第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質の発光強度はサンプルのpHを示す）。この方法または本発明の任意の方法で有用な第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列、または、例えば配列番号２に関してS65G/S72A/T203Y/H231Lを有するか、または配列番号２に関してS65G/V68L/Q69K/S72A/T203Y/H231Lを有するか、配列番号２に関して突然変異K26R/F64L/S65T/Y66W/N146I/M153T/V163A/N164H/H231Lを有するこれと実質的に同一の配列か、または配列番号２に関してH148GまたはH148Qに対応する突然変異をさらに有する上記非オリゴマー化蛍光性タンパク質のいずれかを有する。
【００３４】
サンプルのpHを測定する方法で使用されるサンプルは、任意のサンプルであり、例えば生物組織サンプル、または細胞またはその画分である。さらにこの方法は、サンプルに第２の非オリゴマー化蛍光性タンパク質を接触させ（ここで、pHがpH５〜pH10まで変化すると、第２の非オリゴマー化蛍光性タンパク質の発光強度は変化し、第２の非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、第１の波長とは異なる第２の波長で発光する）；第２の非オリゴマー化蛍光性タンパク質を励起し；第２の波長で第２の非オリゴマー化蛍光性タンパク質が発する光の強度を測定し；そして、第２の波長での蛍光を第１の波長での蛍光と比較することを、さらに含む。第１（または第２）の非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、標的化配列、例えば細胞コンパートメント化ドメイン、および細胞中の非オリゴマー化蛍光性タンパク質をサイトゾル、小胞体、ミトコンドリアマトリックス、葉緑体腔、中間トランスゴルジ扁平嚢、リソソームの内腔、エンドソームの内腔に標的化するドメインを含有することができる。例えば、細胞コンパートメント化ドメインは、ヒトII型膜固定タンパク質であるガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸残基１〜81、またはサイトクロームｃオキシダーゼのサブユニットIVのプレ配列のアミノ酸残基１〜12を含むことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明は、オリゴマー化可能な蛍光性タンパク質から誘導される非オリゴマー化蛍光性タンパク質を提供する。本明細書に開示されるように、本発明の非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、天然に存在する蛍光性タンパク質またはそのスペクトル変異体もしくは突然変異体から誘導でき、蛍光性タンパク質がオリゴマー化する能力を低下させるかまたは排除する少なくとも１つの突然変異を含有する。
【００３６】
本発明の非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、オリゴマー化することが知られている任意の蛍光性タンパク質から誘導でき、例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、例えば、オワンクラゲ（Aequorea victoria）GFP、レニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）GFP、フィアリジウム・グレガリウム（Phialidium gregarium）GFP；赤色蛍光性タンパク質（RFP）、例えば、ディスコソマ（Discosoma）RFP；またはGFPもしくはRFPに関連した蛍光性タンパク質が挙げられる。すなわち、非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、シアン蛍光性タンパク質（CFP）、黄色蛍光性タンパク質（YFP）、増強GFP（EGFP）（EGFP；配列番号４）、増強CFP（ECFP；配列番号６）、増強YFP（EYFP；配列番号８）、DsRed蛍光性タンパク質（配列番号12）、またはこのような蛍光性タンパク質の突然変異体もしくは変異体でもよい。
【００３７】
本明細書に開示のように、本発明の非オリゴマー化蛍光性タンパク質がオリゴマー化する傾向は、低下させられるか排除される。一実施形態において、非オリゴマー化蛍光性タンパク質がオリゴマー化する傾向は、蛍光性タンパク質の第１のモノマーを蛍光性タンパク質の少なくとも第２のモノマーに、機能的に連結させ、こうして分子内「ダイマー」、「トリマー」などを形成させることにより、低下させられるか排除される。そのような機能的に連結したホモポリマー（本明細書において、「非オリゴマー化タンデムダイマー」と呼ぶ）は、分子間オリゴマーを形成する能力が実質的に低下している。そのような非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質は本明細書において、ペプチドリンカー（配列番号26）により機能的に連結したDsRed（配列番号12）の２つのモノマーにより、および配列番号26のペプチドリンカーにより機能的に連結した突然変異体DsRed（配列番号12のアミノ酸配列を有し、I125R突然変異を含む）の２つのモノマーにより例示される。
【００３８】
別の実施形態において、非オリゴマー化蛍光性タンパク質がオリゴマー化する傾向は、蛍光性タンパク質中の１つ以上の突然変異の存在のために、低下するかまたは排除される。そのような突然変異は、エクオレア（Aequorea）GFP（配列番号２）のアミノ酸残基A206、L221、もしくはF223の１つまたは組合せの突然変異、または配列番号２のA206、L221、もしくはF223の突然変異に対応する別の蛍光性タンパク質の突然変異、例えばGFP（配列番号２）の突然変異A206K、L221K、F223R、またはECFP（配列番号６）とEYFP-V68L/Q69K（配列番号10）（これらは、エクオレア（Aequorea）GFPのスペクトル変異体である）の突然変異L221KとF223Rにより例示される。
【００３９】
本明細書において使用する用語「非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質」は、機能的に連結しており、特徴的な蛍光発光スペクトルと蛍光励起スペクトルを示す、蛍光性タンパク質の２つ以上のモノマーの組成物を意味する。本明細書に開示されるように、本発明の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質の分子内「オリゴマー化」性は、蛍光性タンパク質が分子間オリゴマー化を受ける傾向を低下させるかまたは排除する。
【００４０】
本明細書において用語「非オリゴマー化蛍光性タンパク質」は、対応する非改変蛍光性タンパク質と比較して、オリゴマー化する傾向が低下するように改変されている蛍光性タンパク質を意味するためにより広く用いられる。従って、特に明記しない場合は、用語「非オリゴマー化蛍光性タンパク質」は、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質、ならびに蛍光性タンパク質がオリゴマー化する傾向を低下させるかまたは排除する１つ以上の突然変異を含有する蛍光性タンパク質を包含する。
【００４１】
本明細書において使用する用語「タンデム非オリゴマー化蛍光性タンパク質」は、アクセプター蛍光性タンパク質に機能的に連結したドナー蛍光性タンパク質を含む、２つの異なる蛍光性タンパク質（ここで、少なくとも１つの蛍光性タンパク質は非オリゴマー化蛍光性タンパク質である）を含有する組成物を意味する。従って、その蛍光性タンパク質成分に関して、「タンデム非オリゴマー化蛍光性タンパク質」は、ヘテロポリマーに類比でき、一方、「非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質」はホモポリマーに類比できる。
【００４２】
エクオレア（Aequorea）GFPは、宿主タンパク質と融合して後者を蛍光性にすることができるタンパク質モジュールとして、細胞生物学で広く使用されている（Tsien, Ann. Rev. Biochem. 67:509-544, 1998、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。例えばGFPは、GFPが融合されるタンパク質の細胞小器官局在化と移動性の性状解析に一般的に使用される。さらにGFPのスペクトル変異体（CFPとYFP、およびその変異体を含む）は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）による宿主タンパク質の会合性を測定するために使用されている。CFPとYFPの間のFRETはまた、カルシウムイオンのバイオセンサーを作製、および増殖因子受容体とＧタンパク質共役受容体の会合性を測定するのに、使用されている。
【００４３】
GFPスペクトル突然変異体であるCFPとYFPおよびその変異体（例えば、ECFP（配列番号６）とEYFP-V68L/Q69K（配列番号10））は、良好なFRETパートナーに必要な好ましい性質のほとんどを有するが、これらのタンパク質はホモ親和性を示し、ダイマーを形成する。従ってGFPとそのスペクトル変異体は、ある結晶構造中で、溶液中で、および細胞内の多くの条件下で、ダイマー化する顕著な傾向を示す。そのようなダイマー化は、GFP（または変異体）に融合した宿主タンパク質が誘導されてダイマー化し、こうしてその機能を混乱させ、異なる色のGFPスペクトル変異体の間のFRETを使用して、タンパク質−タンパク質相互作用を評価する時、アーティファクトが生じることを意味する。従って、蛍光性タンパク質の他の性質に悪い影響を与えることなく、すべての色のGFPスペクトル変異体がダイマー化する傾向を排除できる突然変異を同定することが好ましいであろう。本明細書に開示されるように、突然変異A206K、L221K、およびF223Rは単独または組合せで、ECFP（配列番号６）およびEYFP-V68L/Q69K（配列番号10）中で、GFPとそのスペクトル変異体がダイマー化する傾向を低下させるかまたは排除する。すなわち、ダイマー化が積極的に所望の場合以外は、これらの突然変異の１つ以上は、GFP変異体中にルーチンに取り込まれ、こうしてアーチファクトダイマー化を誘導するその能力が低下するか排除することができる。
【００４４】
エクオレア（Aequorea）GFPは細胞生物学者にとって非常に価値のあるツールであることがわかったが、細胞中で比較的低発現レベルでGFPがダイマー化する傾向は、新しくより優れたアッセイ（特に、宿主タンパク質の局在化とその会合性の測定のためのアッセイ）の開発を制限してきた。本発明は、GFPのような蛍光性タンパク質がオリゴマー化する能力を実質的に低下させるかまたは排除するための手段を提供し、こうして従来は実施不可能であったアッセイの開発に関連する問題を解決しかつこれを可能にする。
【００４５】
他の制限は、青、シアン、および黄緑色の発光をするGFP変異体が設計されているが、すべては、529nmより短い発光極大を有する。最近、エクオレア（Aequorea）GFP（配列番号２）と26〜30％の同一性を有する６つの花虫綱（サンゴ）蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、Matzら（Nature Biotechnol. 17:969-973, 1999、これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）によりクローン化された。ほとんどのサンゴ蛍光性タンパク質は、GFPまたはその変異体によりカバーされる範囲内に発光極大を有するが、ディスコソマ（Discosoma）種の赤色部分から単離された１つのサンゴタンパク質drFP583（「DsRed」、配列番号12）は、それぞれ558と583nmに励起極大と発光極大を有し、これらは、野生型の天然の蛍光性タンパク質について報告された最も長いものであった（Matzら、同上、1999）。GFPとの比較的低い配列同一性にもかかわらず、充分な配列類似性が保存されており、サンゴタンパク質は、GFPと類似の11鎖のβバレルを形成するであろうことを示唆した。さらに、GFPの発色団に寄与する２つの重要な残基（Tyr66とGly67）および発色団に接触する一部の重要な極性残基（例えばArg96とGlu222）が、サンゴタンパク質中で保存されていた。DsRedでは、これらのGFP残基に対応するアミノ酸は、それぞれTyr67、Gly68、Arg95、およびGlu215と番号が付けられ、オリゴマー化に関与できる追加のアミノ酸は、Ｘ線結晶解析法を使用して同定することができる（実施例３を参照）。
【００４６】
ディスコソマ（Discosoma）からの赤色蛍光性タンパク質（DsRed）のクローニングは、細胞生物学の進歩のためのツールとしての大きな可能性のために、大きな関心が持たれるようになった。しかし、このタンパク質の性質を注意深く調べると、DsRedが、エクオレア（Aequorea）GFPやその青色、シアン、および黄色変異体（これらは、遺伝子発現を追跡するための遺伝的にコードされた指示物質として、および蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）のドナー／アクセプター対として広く使用されるようになった）のようには広く受けいられることを妨げるいくつかの問題が明らかになった。利用可能な色のスペクトルを赤色の波長に拡大すると、融合タンパク質の多色追跡のための明確に新しい標識物を提供し、GFPとともに現在好適なシアン／黄色対より優れた新しいFRETドナー／アクセプター対を提供するであろう。
【００４７】
28kDaのDsRedの持つ２つの最も緊急の問題は、そのオリゴマー化の強い傾向と成熟の遅さである。種々の技法を使用して、DsRedがin vitroとin vivoの両方で真正のテトラマーであることが決定されている。多くの理由により、DsRedのオリゴマー状態は、目的のタンパク質と融合して、この目的のタンパク質の移動または相互作用を追跡する応用において問題である。精製されたタンパク質を使用して、DsRedが、極大の赤色蛍光の＞90％に達するのに48時間以上必要であることが示された（下記を参照）。成熟過程の間、緑色の中間体がまず蓄積し、ゆっくり最終的な赤色型に変換される。しかし、緑色成分の変換は最後まで進まず、従って古いDsRedの一部が緑色のまま残る。成熟の不完全さの主な欠点は、テトラマー内の緑色と赤色分子種の間のエネルギー移動による、励起スペクトルの緑色波長への大きな拡大である。これは、GFPのような可能性があるFRETパートナーの励起スペクトルと重複するため、特に重大な問題である。
【００４８】
DsRedのクローニングの初期の報告は、発生１週間後のアフリカツメガエル（Xenopus）割球の運命を特色づけるin vivo応用を提供した。本明細書に開示されるようにDsRedは、赤色蛍光が現れる時間、発色団のpH感受性、発色団が如何に強く光を吸収し蛍光を発するか、タンパク質は如何に速く光でブリーチ(photobleaches)されるか、およびタンパク質は溶液中で通常モノマーまたはオリゴマーとして存在するかについて特性付けられている（実施例２を参照）。結果は、DsRedがGFPとそのスペクトル突然変異体の有用な相補体または代替物を提供することを証明している。さらに非蛍光性であるか、または緑色から赤色発光への変換が阻止されているかまたは遅いDsRed突然変異体は、特性付けられており、最終蛍光が、野生型DsRedから実質的に赤色にシフトしている突然変異体が含まれていた（実施例２を参照；また、Bairdら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:11984-11989, 2000；Grossら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:11990-11995, 2000も参照されたい、これらはそれぞれ、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００４９】
本明細書に開示されるように、GFPスペクトル変異体に導入されるものに類似の突然変異がDsRedに導入され、例えば配列番号12（実施例３を参照）に記載のDsRedのDsRed-I125R突然変異体を含む、オリゴマー化活性が低下したDsRed突然変異体が同定された。DsRed突然変異体を産生するストラテジーは、ダイマー接触部分（A-BまたはA-C、図１を参照）を妨害することが予測された突然変異をDsRed中に導入することを含み、こうしてテトラマーの形成を防いだ。このストラテジーにより、例えばイソロイシン125をアルギニン（I125R）で単一置換することを用いて、A-C接触部分を破壊して、テトラマー形成傾向が低下したDsRed突然変異体が産生された。
【００５０】
A-B接触部分はより弾力的であることが示されており、この接触部分を破壊しうる可能性のある突然変異は無効であり、非蛍光性タンパク質が得られた。本明細書に開示されるように、新規方法を使用して、ＡサブユニットのＣ末端をＢサブユニットのＮ末端に、可撓性のあるテザーを通じて連結し、タンデムダイマーを産生することにより、DsRedの分子間オリゴマー化傾向を克服した。DsRedの結晶構造に基づき、18残基のリンカー（Whitlowら、Prot. Eng. 6:989-995, 1993、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）は、ＡサブユニットのＣ末端からＢサブユニットのＮ末端（約30Å）に延長するのに充分長いと予測されたが、ＣサブユニットのＮ末端から（70Åより大きい）は不充分であった。従って、タンデムダイマー中の「オリゴマー化」は、分子内であり、すなわち、例えばDsRedのタンデムダイマー（tDsRed）は、単一のポリペプチド鎖によりコードされる。さらに、tDsRedとI125R突然変異体との組合せ（tDsRed-I125R）は、モノマー性赤色蛍光性タンパク質を与え、これはオリゴマー問題を有効に解決した（実施例４）。このストラテジーは、１つのタンパク質のＮ末端とダイマーパートナーのＣ末端との距離が既知である任意のタンパク質系に一般的に適用可能であり、適切な長さを有するリンカーを使用してモノマーを機能的に連結することができる。特に、このストラテジーは、興味深いスペクトル性を有するが、本明細書に開示の標的化突然変異誘発法を使用して破壊することが困難な真正のダイマーを形成する他の蛍光性タンパク質を改変するのに有用でありうる。
【００５１】
GFPの広範な種々の色の「スペクトル突然変異体」が利用できることは、FRETを介してタンパク質の会合性を追跡するための手段の可能性を提供する。FRETは、２つの蛍光発色団の間の放射線の無いエネルギー移動の量子力学的現象であり、これは、ドナーとアクセプターの正しいスペクトル重複、互いの距離、および発色団遷移双極子の相対的配向に依存する。標準的分子生物学技法を使用して、目的のタンパク質と蛍光性タンパク質のスペクトル突然変異体との間で融合体を形成でき、次いで、これは、ドナーおよびアクセプターFRETパートナーとして有効に機能することができる。上記に示したように、GFPスペクトル突然変異体は、ホモ親和性とダイマー化の傾向以外は、有用なFRETパートナーとして機能するのに必要なほとんどの性質を持っている。すなわち、GFPとその変異体を使用するFRETに基づくアッセイの数は増加している（例えば、Mitraら、Gene 173:13-17, 1996；HartmanとVale, Science 286:782-785、 1999；Zachariasら、Curr. Opin. Neurobiol. 10:416-421, 2000）が、GFP関連蛍光性タンパク質が互いに会合する傾向は、FRETにより報告されたタンパク質会合の性状解析を複雑にしうり、これは、単に連結される蛍光発色団からの参加が無いタンパク質の相互作用によるものであろう。
【００５２】
ダイマー化が宿主タンパク質相互作用を遮蔽または模倣して、データが解釈できないため、GFPスペクトル変異体を使用するFRETアッセイは失敗しうる。例えば、CFPまたはYFPのダイマー化が、介在ペプチドまたはタンパク質のコンフォメーション変化より勝る時またはこれを妨害する時、または蛍光性タンパク質のダイマー化のために２つ以上の宿主タンパク質の解離が不可能な時もしくは妨害される時、FRETの変化は遮蔽されうる。同様に、CFPおよびYFPが単一の融合タンパク質中に存在する時、これらのタンパク質の間のダイマー相互作用が生じ、カメレオンの仮説のオリゴマー化に類似の、単一の融合タンパク質内で起きうる変化を検出する能力が排除されうる。すなわち、GFPまたはGFPスペクトル突然変異体のダイマー化が、本来は２つの宿主タンパク質の間で起きると考えられている相互作用を模倣する時、FRETの変化が模倣される状態が起きうる。
【００５３】
FRET分析を妨害する以外に、蛍光性タンパク質（例えば、DsRed、GFPおよびその変異体）のオリゴマー化は、その有用性を限定する別の問題を引き起こす。例えば、これらのタンパク質の別の重要かつ一般的な応用は、生きた細胞で、蛍光性タンパク質が融合しているタンパク質の細胞小器官局在化または分布を観察するための、蛍光性標識物としてである。蛍光性タンパク質が融合したタンパク質の局在化と天然に存在するオリゴマー状態に依存して、蛍光性タンパク質は、細胞中の局所的濃度がダイマー化に必要とされる濃度より上回り、こうしてその融合パートナーの空間分布または機能を改変することになりうる。
【００５４】
蛍光性マーカータンパク質のダイマー化に関連する何らかの問題が、特定のアッセイの結果を無効にするか否かを、あらかじめ決定することは困難である。しかし、蛍光性タンパク質が、種々の細胞小器官の位置、例えば原形質膜（PM）を標的とする時、または細胞質中で遊離で発現される時さえも、分子内相互作用の模倣（ここでは、なにも存在せず、例えば２つの別のタンパク質に融合したCFPとYFPとの間のFRET）が起きる場合がある（MiyawakiとTsien, Meth. Enzymol. 327:472-500, 2000、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。そのようなアーチファクトは、検出し証明することが困難でありうるため、蛍光性タンパク質のダイマー化を避けることができるなら、大きな利点となるであろう。本明細書に開示されるように本発明は、蛍光性タンパク質がダイマー化する傾向を実質的に低下させるかまたは排除する手段を提供し、こうして細胞中の宿主タンパク質の会合性と分布の正確な追跡を可能にする（蛍光性タンパク質のオリゴマー化により引き起こされる誤ったFRET、ならびにそのようなオリゴマー化に関連したタンパク質局在化のような他の問題を含む）。
【００５５】
GFPとそのいくつかの変異体の結晶構造が解決されている（例えば、Ormoら、Science 273:1392-1395, 1996；Yangら、Nature Biotechnol. 14:1246-1251, 1996；Wachterら、Biochemistry 36:9759-9765, 1997；Palmら、Nature Struct. Biol. 4:361-365, 1997を参照、これらはそれぞれ参照することにより本明細書に組み込まれる）。結晶を形成するのに使用される実験条件に依存して、結晶学的な単位細胞は、頭-尾(head-to-tail)、並列(side-by-side)のダイマーである（Phillips,「Green Fluorescent Protein: Properties, Applications and Protocols」（ChalfieとKain編、1998）第77〜96頁中、これは参照することにより本明細書に組み込まれる；また、Yangら、前述、1996；Tsien、前述、1998を参照）。結晶を形成させるために、GFPは非常に濃縮しなければならない。従って結晶中のGFPの構造は、溶液中のタンパク質の状態を示さないかもしれない。しかし、他の証拠は、GFPとその変異体が溶液中でダイマーを形成することができ、細胞生物学的条件で通常存在する濃度と条件で、ダイマー化が起きうることを示す（Wardら、「Green Fluorescent Protein: Properties, Applications and Protocols」（ChalfieとKain編、1998）第45〜75頁中、これは参照することにより本明細書に組み込まれる；また、Phillips、前述、1998を参照）。
【００５６】
１つの結晶構造で同定される接触部位には、２つのモノマーと多くの可能性のある親水性接触のそれぞれからの疎水性側鎖の核が含まれていた（Yangら、前述、1996）。この疎水性側鎖の部分は、GFPとCa2+-感受性光タンパク質であるクラゲのエクオリン（aequorin）との会合に、ある役割を果たすことが示唆されている。GFPが溶液中の時または細胞中で外因性に発現される時、残基A206、L221、およびF223は、モノマーの間の接触を生じる妥当な候補のようであった（Yangら、前述、1996；Phillips、前述、1998）。生理学的条件下で１つ以上のこれらの残基がダイマー化に影響を与えるかどうかを決定するために、陽性荷電の側鎖を有するアミノ酸残基を置換した突然変異を導入し、突然変異誘発モノマー間の相互作用を調べた。高度に精製したECFP（配列番号６）とEYFP-V68L/Q69K（配列番号10）、およびそこから誘導される「ダイマー突然変異体」を分析用超遠心分離（これは、自己会合性タンパク質間の会合の程度を非常に正確に測定することができる）（McRorieとVoelker、「Self-associating systems in the analytical ultracentrifuge 」(Beckman Instruments 1993)中）に供して、ダイマー親和性の定量的測定を行った。同様に、原形質膜を標的としたECFP（配列番号６）とEYFP-V68L/Q69K（配列番号10）、およびこれらのGFP変異体から誘導されるダイマー突然変異体を、種々のタンパク質の自己会合性挙動を測定するために特異的に設計された細胞生物学的実験で使用した。
【００５７】
本明細書に開示されるように、GFPのアミノ酸残基A206、L221、およびF223（例えば、配列番号２を参照）は、溶液中と生きた細胞中で比較的低濃度のGFPとそのスペクトル変異体のダイマー化を誘導するのに十分であり、A206、L221、およびF223の単独または組合せの陽性に荷電した残基への突然変異により、溶液および生きた細胞中のモノマーの相互作用を実質的に低下させるかまたは排除した。ECFP（配列番号６）とEYFP-V68L/Q69K（配列番号10）、および実質的にすべての他のGFP関連突然変異体は、これらの３つの位置で野生型GFP（Prasherら、Gene 111:229-233, 1992、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）と同じ残基組成を有するため、本結果は、実質的に同じ一般的構造を有する他の蛍光性タンパク質（GFPスペクトル変異体およびRFP、DsRedを含む）の対応する突然変異は、同様にタンパク質がオリゴマー化する能力を低下させるかまたは排除できることを示す（実施例１と３を参照）。
【００５８】
オリゴマー化する傾向を低下させるかまたは排除するように本発明の方法に従って改変できる他のエクオレア（Aequorea）GFPに関連した蛍光性タンパク質は、当該技術分野で周知であり、突然変異F64L、S65T、Y66W、F99S、またはV163A（ここでアミノ酸残基は、配列番号２に関して記載される）を有するものにより例示され、国際公報第WO 00/71565 A2号（2000年11月30日に公表）（これは参照することにより本明細書に組み込まれる）に開示のその変異体が含まれる。本明細書に記載のGFPアミノ酸の番号付けは、未変性のエクオレア（Aequorea）GFP（配列番号２）に一致し、リボゾーム開始を最適化するためにバリン（アミノ酸番号1a）が挿入されていても、最初のセリンは、アミノ酸番号２である。例えば、F64Lは、開始メチオニンの後の、アミノ酸64位におけるロイシンによるフェニルアラニンの置換を意味する。
【００５９】
CFPとYFP以外にGFPスペクトル変異体の例には、例えば増強GFP（EGFP；配列番号４；F64L/S65T/H231L）；EYFP（配列番号８；S65G/S72A/T203Y/H231L）；EYFP-V68L/Q69K（配列番号10；S65G/V68L/Q69K/S72A/T203Y/H231L）；ECFP（配列番号６；K26R/F64L/S65T/Y66W/N146I/M153T/V163A/N164H/H231L）など；および、突然変異H148GまたはH148Qを有するこれらのGFP関連蛍光性タンパク質の変異体（ここで、記載の突然変異は配列番号２についてのものである）（国際公報第WO 00/71565 A2号、前述、2000を参照）が挙げられる。オリゴマー化傾向を低下させるかまたは排除するように改変できる蛍光性タンパク質の追加の例には、DsRedとその変異体が挙げられ、これは本明細書に開示されるように、未変性のDsRed（実施例２と３を参照）、ビブリオ・フィスチェリ（Vibrio fischeri）Y-1株由来の黄色蛍光性タンパク質、シネココッカス（Synechococcus）のような海洋シアノバクテリアからの渦鞭毛藻類シンビオジニウム・フィコビリプロテインズ（Symbiodinium phycobiliproteins）由来のペリジニン−クロロフィルａ結合タンパク質（例えば、フィコエリトリンとフィコシアニン）、またはフィコエリスロビリンを用いて再構築したオートムギ由来のオートムギフィトクロムと比較して、好ましい蛍光特性を有しうる（Baldwin、Biochemistry 29:5509-5515, 1990；Morrisら、Plant Mol. Biol. 24:673-677, 1994；Wilbanksら、J. Biol. Chem. 268:1226-1235, 1993；Liら、Biochemistry 34:7923-7930, 1995；MurphyとLagarias、Curr. Biol. 7:870-876, 1997を参照。これらはそれぞれ、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００６０】
特に明記しない場合は、本明細書で使用されるすべての専門用語と科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されているものと同じ意味を有する。さらに、本発明の実施において、本明細書に記載の方法または材料と類似のまたは同等のいずれの方法または材料が使用できる。本発明の目的において、以下の用語を定義する。
【００６１】
用語「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」は、１本鎖または２本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを意味し、特に明記しない場合は、天然に存在するヌクレオチドと同様に機能することができる天然に存在するヌクレオチドの既知の類似体を含有するポリヌクレオチドを包含する。核酸分子がDNA配列により示される時、これは、また対応するRNA配列を有するRNA分子（ここで、「Ｕ」（ウリジン）が「Ｔ」(チミジン)に代わる）も含む。
【００６２】
用語「組換え核酸分子」は、２つ以上の連結したポリヌクレオチド配列を含有する天然に存在しない核酸分子を意味する。組換え核酸分子は、組換え法、特に遺伝子操作技法により産生されるか、または化学合成法により産生できる。組換え核酸分子は、融合タンパク質、例えば目的のポリペプチドに連結した本発明の非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードすることができる。用語「組換え宿主細胞」は、組換え核酸分子を含有する細胞を意味する。従って、組換え宿主細胞は、未変性（非組換え）型の細胞中には見いだされない「遺伝子」からポリペプチドを発現することができる。
【００６３】
ポリペプチドを「コードする」ポリヌクレオチドに対する言及は、ポリヌクレオチドの転写とそこから産生されるmRNAの翻訳により、ポリペプチドが産生されることを意味する。コーディングポリヌクレオチドは、コード鎖（そのヌクレオチド配列はmRNAと同一である）とその相補鎖の両方を含むとみなされる。コーディングポリヌクレオチドは、同じアミノ酸残基をコードする縮重ヌクレオチド配列を含むとみなされることが認識されるだろう。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、イントロンならびにコーディングエキソンを含有するポリヌクレオチドを含むことができる。
【００６４】
用語「発現制御配列」は、そこに機能的に連結した、ポリヌクレオチドの転写または翻訳、またはポリペプチドの局在化を調節するヌクレオチド配列を意味する。発現制御配列は、ヌクレオチド配列の転写かつ適宜翻訳（すなわち、それぞれ転写または翻訳制御エレメント）、または細胞の特異的コンパートメントに対するコードされるポリペプチドの局在化を、制御または調節する時、発現制御配列は「機能的に連結されている」。すなわち、発現制御配列は、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、開始コドン（ATG）、イントロン切断のためのスプライシングシグナルと正しい読みとり枠の維持、終止コドン、リボソーム結合部位、またはポリペプチドを特定の位置に標的化する配列（例えば、ポリペプチドを、サイトゾル、核、原形質膜、小胞体、ミトコンドリア膜もしくはマトリックス、葉緑体膜もしくは葉緑体腔、中間トランスゴルジ扁平嚢、リソソーム、またはエンドソームに標的化することができる細胞コンパートメント化シグナル）であってよい。細胞コンパートメント化ドメインは、当該技術分野で周知であり、例えば、ヒトII型膜固定タンパク質であるガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸残基１〜81、またはシトクロムｃオキシダーゼのサブユニットIVのプレ配列のアミノ酸残基１〜12を含有するペプチドが挙げられる（またHancockら、EMBO J. 10:4033-4039, 1991；Bussら、Mol. Cell. Biol. 8:3960-3963, 1988；US Patent No. 5,776,689を参照。それぞれは参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００６５】
用語「機能的に連結された」はまた、本発明の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質のモノマー性蛍光性タンパク質成分、ならびに非オリゴマー化蛍光性タンパク質を含む融合タンパク質の成分に関して使用され、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質および目的のポリペプチドを含む。非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質に関して、用語「機能的に連結された」は、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質が、特徴的な蛍光発光スペクトルおよび励起スペクトルを有することを意味する。非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質の蛍光発光スペクトルおよび励起スペクトルは、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を含む蛍光性タンパク質のモノマー型のスペクトルと同じスペクトルでもよく、またはモノマー性蛍光性タンパク質のスペクトルと異なるスペクトルでもよい。非オリゴマー化蛍光性タンパク質を含む融合タンパク質に関して、用語「機能的に連結された」は、融合タンパク質のポリペプチド成分が、それぞれがその機能（非オリゴマー化蛍光性タンパク質の蛍光特性、およびそこに連結するポリペプチドに特徴的なもしくは特定の目的の機能を含む）を維持するように連結していることを意味する。同様に、用語「機能的に連結された」は本明細書において、本発明のタンデム非オリゴマー化蛍光性タンパク質の成分について言及するのに使用され、これは、第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質（これは、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質であってよい）と第２の蛍光性タンパク質（これは、非オリゴマー化蛍光性タンパク質であってよいが、必ずしもそうでなくてもよい）を含み、ここで、第１の蛍光性タンパク質と第２の蛍光性タンパク質は、それぞれがその蛍光活性を維持するように連結されている。
【００６６】
用語「オリゴマー」は、２つ以上のポリペプチドの特異的相互作用により形成される複合体を意味する。「特異的相互作用」または「特異的会合」は、特定の条件下（例えば、生理学的条件下）で比較的安定なものである。タンパク質がオリゴマー化する「傾向」に対する言及は、そのタンパク質が特定の条件下で、ダイマー、トリマー、テトラマーなどを形成できることを示す。一般に、GFPやDsRedのような蛍光性タンパク質は、生理学的条件下でオリゴマー化する傾向を有するが、本明細書に開示されるように、蛍光性タンパク質はまた、例えば生理学的条件以外のpH条件下でもオリゴマー化する場合がある。蛍光性タンパク質がオリゴマー化するかまたはオリゴマー化する傾向を有する条件は、本明細書に開示（実施例１と３を参照）される周知の方法、または当該技術分野で公知の他の方法を使用して測定することができる。
【００６７】
用語「プローブ」は、他の物質（「標的」）に特異的に結合する物質を意味する。プローブには、例えば、抗体、ポリヌクレオチド、受容体とそのリガンドが含まれ、プローブが特異的に結合した分子を同定または単離する手段を提供するために、一般的に標識することができる。用語「標識物」は、装置を用いてまたは無しで、例えば視覚的検査、分光法、または光化学、生化学的、免疫化学、または化学反応により検出可能な組成物を意味する。有用な標識物には、例えばリン−32、蛍光性色素、蛍光性タンパク質、電子密度試薬、酵素（例えば、ELISAで通常使用されるもの）、小分子（例えば、ビオチン）、ジゴキシゲニン、または他のハプテンもしくはペプチド（これに対して、抗血清もしくは抗体（モノクローナル抗体であってよい）が利用できる）が挙げられる。本発明の非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、これ自体が検出可能なタンパク質であるが、それにもかかわらず、それ自体の蛍光以外の手段、例えば発現されたタンパク質のそれぞれ発現と単離中にタンパク質の同定を促進するように、例えば放射性核種標識物もしくはペプチドタグをタンパク質中に組み込むことにより、検出できるように標識することができることが認識されるだろう。本発明の目的に有用な標識物は一般的に、測定可能なシグナル（例えば、放射性シグナル、蛍光、酵素活性など）を生成し、いずれも、例えばサンプル中の非オリゴマー化蛍光性タンパク質の量を定量するために使用することができる。
【００６８】
用語「核酸プローブ」は、第２の（標的）核酸分子の特異的ヌクレオチド配列またはサブ配列に結合するポリヌクレオチドを意味する。核酸プローブは一般に、相補的塩基対合を介して標的核酸分子に結合するポリヌクレオチドである。核酸プローブは、プローブ配列と完全ではない相補性を有する標的配列に特異的に結合することができ、その結合特異性は、一部はハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存するであろうことは、理解されるであろう。核酸プローブは、放射性核種、発色団、ルミフォア(lumiphore)、またはクロモゲン、蛍光性タンパク質、または、例えばビオチン（これ自体は、例えばストレプトアビジン複合体により結合することができる）のような小分子を用いて標識することができ、こうしてプローブ（プローブにより特異的に結合される標的核酸分子を含む）を単離する手段を提供する。プローブの存在または不在をアッセイすることにより、標的配列またはサブ配列の存在または不在を検出することができる。用語「標識核酸プローブ」は、プローブに結合した標識物の存在を検出することによりプローブの存在が同定できるように、直接またはリンカー分子を介して、および共有結合もしくは安定な非共有結合（例えば、イオン結合、ファンデルワールス結合または水素結合）により、標識物に結合した核酸プローブを意味する。
【００６９】
用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、２つ以上のアミノ酸残基のポリマーを意味する。この用語は、１つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。用語「組換えタンパク質」は、組換えDNA分子から、タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の発現により産生されるタンパク質を意味する。
【００７０】
用語「単離された」または「精製された」は、自然界では未変性の状態でその物質に通常伴う成分を、実質的にまたは本質的に含まない物質を意味する。純度または均一性は一般に、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技法を使用して測定される。ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、調製物中で主に存在する分子種である時は、単離されたとみなされる。一般に単離されたタンパク質または核酸分子は、調製物中に存在する巨大分子種の80％を超え、しばしば存在するすべての巨大分子種の90％を超え、通常巨大分子種の95％を超えて示され、特にそのような分子の純度を測定するための従来法を使用して調べると、唯一の検出される分子種であるように本質的に均一まで精製されているポリペプチドまたはポリヌクレオチドである。
【００７１】
用語「天然に存在する」は、天然に存在するタンパク質、核酸分子、細胞、または他の物質を意味するのに使用される。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列。天然に存在する物質は、天然に存在するような型であってよく、また例えば単離された型であるように、ヒトの手により改変することができる。
【００７２】
用語「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされるポリペプチドまたはその抗原結合性フラグメントを意味し、これは、アナライト（抗原）に特異的に結合し、認識する。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。抗体は、完全な免疫グロブリン、および十分に特性付けられた抗体の抗原結合性フラグメント（これは、ペプチダーゼを用いて消化することにより産生されるか、または組換えDNA法を使用して産生することができる）としても存在する。抗体のそのような抗原結合性フラグメントには、例えば、Fv、Fab'、およびＦ(ab')2フラグメントが挙げられる。本明細書において用語「抗体」は、抗体全体の改変により産生される抗体フラグメント、または組換えDNA法を使用して新たに合成されるものを含む。用語「イムノアッセイ」は、アナライトに特異的に結合する抗体を利用するアッセイを意味する。イムノアッセイは、アナライトを単離、標的化、および／または定量するために、特定の抗体の特異的結合性を使用することを特徴とする。
【００７３】
用語「同一」は、２つ以上のポリヌクレオチド配列または２つ以上のポリペプチド配列について使用される時、最大の一致が得られるようにアライメントした場合に、同じである配列中の残基を意味する。配列同一性パーセントがポリペプチドについて使用される時、本来は同一ではない１つ以上の残基位置が、保存的アミノ酸置換により異なることができ、ここで第１のアミノ酸残基は、類似の化学的性質（例えば、同様の電荷または疎水性または親水性）を有し、従ってポリペプチドの機能性を変化させない別のアミノ酸残基に置換されることが認識される。ポリペプチド配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントは、上方に調整されて、置換の保存的性質を補正することができる。そのような調整は、周知の方法を使用して行われ、例えば保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的ミスマッチとしてスコアし、従って配列同一性パーセントを上昇させることができる。すなわち、例えば、同一のアミノ酸にスコア１が与えられ、非保存的置換にゼロのスコアを与えられる時、保存的置換は、ゼロと１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコア付けは、任意の周知のアルゴリズムを使用して計算できる（例えば、MeyersとMiller, Comp. Appl. Biol. Sci. 4:11-17, 1988；SmithとWaterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981；NeedlemanとWunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970；PearsonとLipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)；HigginsとSharp, Gene 73:237-244, 1988；HigginsとSharp, CABIOS 5:151-153, 1989；Corpetら、Nucl. Acids Res. 16:10881-10890, 1988；Huangら、Comp. Appl. Biol. Sci. 8:155-165, 1992；Pearsonら、Meth. Mol. Biol., 24:307-331, 1994を参照）。アライメントはまた、単純な視覚的検査および配列の用手的アライメントにより行うことができる。
【００７４】
用語「保存的に改変された変化」は、特定のポリヌクレオチド配列について使用される時、同一のもしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする異なるポリヌクレオチド配列を意味するか、またはポリヌクレオチドがアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を意味する。遺伝コードの縮重のために、多数の機能的に同一のポリヌクレオチドが、ある所定のポリペプチドをコードする。例えば、コドンCGU、CGC、CGA、CGG、AGA、およびAGGはすべて、アミノ酸アルギニンをコードする。すなわち、アルギニンがコドンにより特定されるすべての位置で、そのコドンは、コードされるポリペプチドを改変することなく記載の対応するコドンのいずれかに改変することができる。そのようなヌクレオチド配列変化は、「サイレント変異」であり、これは、「保存的に改変された変化」の１つであるとみなすことができる。従って、非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするとして本明細書に開示の各ポリヌクレオチド配列はまた、すべての可能なサイレント変異を記載すると認識されるであろう。また、ポリヌクレオチド中の各コドン（通常はメチオニンの唯一のコドンであるAUGと、通常はトリプトファンの唯一のコドンであるUUGを除く）を、標準的技法により改変して、機能的に同一の分子を与えることができることも理解されるであろう。従って、コードされるポリペプチドの配列を変化させないポリヌクレオチドの各サイレント変異は、本明細書において暗示的に記載される。さらに、コードされた配列中の単一のアミノ酸もしくは小さい割合のアミノ酸（典型的には、５％未満、および一般的には１％未満）を改変、付加、または削除する各置換、欠失、または付加は、保存的に改変された変化とみなすことができる（ただし、改変は、化学的に類似のアミノ酸でアミノ酸を置換するものとする）ことが認識されるだろう。機能的に類似のアミノ酸を与える保存的アミノ酸置換は、当該技術分野で周知であり、以下の６つの群が挙げられ、その各々は、互いの保存的置換と見なされるアミノ酸を含有する：
1)アラニン（Ala, A）、セリン（Ser, S）、スレオニン（Thr, T）；
2)アスパラギン酸（Asp, D）、グルタミン酸（Glu, E）；
3)アスパラギン（Asn, N）、グルタミン（Gln, Q）；
4)アルギニン（Arg, R）、リジン（Lys, K）；
5)イソロイシン（Ile, I）、ロイシン（Leu, L）、メチオニン（Met, M）、バリン（Val, V）；および
6)フェニルアラニン（Phe, F）、チロシン（Tyr, Y）、トリプトファン（Trp, W）。
【００７５】
２つ以上のアミノ酸配列または２つ以上のヌクレオチド配列は、そのアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列が互いに、または参照配列と所定の比較ウィンドウにわたって、少なくとも80％の配列同一性を共有するなら「実質的に同一」または「実質的に類似」であると見なされる。すなわち、実質的に類似の配列は、例えば少なくとも85％の配列同一性、少なくとも90％の配列同一性、少なくとも95％の配列同一性、または少なくとも99％の配列同一性を有するものを含む。
【００７６】
対象のヌクレオチド配列の相補体が参照ヌクレオチド配列と実質的に同一である場合、その対象のヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列と「実質的に相補的」であると見なされる。用語「ストリンジェントな条件」は、核酸ハイブリダイゼーション反応で使用される温度とイオン性条件についていう。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、異なる環境パラメータにより異なる。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度とpHで、特定の配列の熱融点（Tm）より約５℃〜20℃低くなるように選択される。Tmは、標的配列の50％が完全に一致したプローブとハイブリダイズする規定されるイオン強度とpH下での温度である。
【００７７】
用語「対立遺伝子変異体」は、特定の遺伝子座での遺伝子の多型、ならびに遺伝子のmRNA転写産物から誘導されるcDNA、およびこれらにコードされるポリペプチドを意味する。用語「好適な哺乳動物コドン」は、以下のリストから選択されるような、哺乳動物細胞で発現されるタンパク質で最もしばしば使用されるアミノ酸をコードするコドンのセットからのコドンのサブセットを意味する：Gly（GGC, GGG）；Glu（GAG）；Asp（GAC）；Val（GUG, GUC）；Ala（GCC, GCU）；Ser（AGC、UCC）；Lys（AAG）；Asn（AAC）；Met（AUG）；Ile（AUC）；Thr（ACC）；Trp（UGG）；Cys（UGC）；Tyr（UAU, UAC）；Leu（CUG）；Phe（UUC）；Arg（CGC, AGG, AGA）；Gln（CAG）；His（CAC）；およびPro（CCC）。
【００７８】
蛍光性分子は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）で有用であり、これは、ドナー分子とアクセプター分子とが関与する。ドナー分子とアクセプター分子との間のFRETの効率と検出能を最適化するために、いくつかの要因のバランスを取る必要がある。重複積算値を最大にするために、ドナーの発光スペクトルは、アクセプターの励起スペクトルとできるだけ重複しなければならない。またドナー部分の量子収率とアクセプターの吸光係数は、RO（これは、エネルギー移動効率が50％である距離を表す）を最大にするためにできるだけ高くなければならない。しかし、アクセプターの直接励起から生じる蛍光は、FRETから生じる蛍光と区別するのが難しい場合があるため、アクセプターを直接励起することなくドナーを効率的に励起できる波長領域を見つけることができるように、ドナーとアクセプターの励起スペクトルは、できるだけ重複してはならない。同様に、２つの発光が明確に区別できるように、ドナーとアクセプターの発光スペクトルは、できるだけ重複してはならない。アクセプターからの発光は、単一の読み値としてまたは発光比率の一部として測定される場合、アクセプター部分の高蛍光量子収率が好ましい。ドナーとアクセプター対を選択する時に考慮すべき１つの要因は、これらの間の蛍光共鳴エネルギー移動の効率である。好ましくは、ドナーとアクセプターの間のFRETの効率は、少なくとも10％、さらに好ましくは少なくとも50％、およびさらにより好ましくは少なくとも80％である。
【００７９】
用語「蛍光特性」は、適切な励起波長でのモル吸光係数、蛍光量子効率、励起スペクトルまたは発光スペクトルの形、励起波長極大と発光波長極大、２つの異なる波長での励起振幅の比、２つの異なる波長での発光振幅の比、励起状態寿命、または蛍光異方性を意味する。野生型エクオレア（Aequorea）GFPとスペクトル変異体又はその突然変異体との間のこれらの性質のうちのいずれか1つにおける測定可能な差異が有用である。測定可能な差異は、任意の定量的蛍光特性（例えば、特定の波長での蛍光の量、または発光スペクトルにわたる蛍光の積算値）を測定することにより決定できる。比率測定(ratioing)プロセスは、内部標準を与え、励起源の絶対的明るさ、検出器の感度、およびサンプルによる光分散またはクエンチングの変動を消去するため、２つの異なる波長での励起振幅または発光振幅の比の測定（それぞれ、「励起振幅比率測定」と「発光振幅比率測定」）は、特に有利である。
【００８０】
本明細書において使用する用語「蛍光性タンパク質」は、蛍光が化学的タグによる化学的タグ付きタンパク質を除いて、適切な電磁放射線で励起すると蛍光を発することができる任意のタンパク質を意味し、および紫外線に暴露した時に蛍光を発するトリプトファンまたはチロシンのような特定のアミノ酸の存在のよってのみ蛍光を発するポリペプチドは、本発明の目的において蛍光性タンパク質とは見なされない。一般に、本発明の組成物の調製に有用な蛍光性タンパク質または本発明の方法で使用される蛍光性タンパク質は、自己触媒的に発色団を形成することからその蛍光が誘導されるタンパク質である。蛍光性タンパク質は、天然に存在するかまたは設計されたアミノ酸配列（すなわち、変異体または突然変異体）を含有することができる。蛍光性タンパク質に関して使用される時、用語「突然変異体」または「変異体」は、参照タンパク質とは異なるタンパク質を意味する。例えば、エクオレア（Aequorea）GFPのスペクトル変異体は、天然に存在するGFPから、参照GFPタンパク質中にアミノ酸置換のような突然変異を設計することにより、誘導することができる。例えばECFPは、GFPに関して置換を含有するGFPのスペクトル変異体である（配列番号２と６を比較）。
【００８１】
多くの刺胞動物は、緑色蛍光タンパク質を生物発光においてエネルギー移動アクセプターとして使用する。用語「緑色蛍光タンパク質」は本明細書において広い意味で使用され、緑色光の蛍光を発するタンパク質を意味し、例えばエクオレア（Aequorea）GFP（配列番号２）である。GFPは、北西太平洋クラゲ（Pacific Northwest jellyfish）であるオワンクラゲ（Aequorea victoria）、ウミシイタケであるレニラ・レニホルミス（Renilla reniformis）、およびフィアリジウム・グレガリウム（Phialidium gregarium）から単離されている（Wardら、Photochem. Photobiol. 35:803-808, 1982；Levineら、Comp. Biochem. Physiol. 72B:77-85, 1982、これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる）。同様に、本明細書において赤い蛍光を発する「赤色蛍光性タンパク質」、シアンブルーの蛍光を発する「シアン蛍光性タンパク質」などが言及される。例えばRFPは、ディスコソマ（Discosoma）から単離されている（Matzら、前述、1999）。
【００８２】
有用な励起および発光スペクトルを有する種々のエクオレア（Aequorea）GFP関連蛍光性タンパク質が、A. victoria由来の天然に存在するGFPのアミノ酸配列を改変することにより設計されている（Prasherら、Gene 111:229-233, 1992；Heimら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91:12501-12504, 1994；U.S. Serial No. 08/337,915（1994年11月10日出願）；国際出願 PCT/US95/14692、それぞれは参照することにより本明細書に組み込まれる）。本明細書において使用する「関連蛍光性タンパク質」への言及は、参照蛍光性タンパク質と比較すると、実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛍光性タンパク質を意味する。一般に、関連蛍光性タンパク質は、参照蛍光性タンパク質配列と比較すると、参照蛍光性タンパク質と少なくとも約85％の配列同一性を共有する少なくとも約150アミノ酸の連続的配列を有し、および特に、参照蛍光性タンパク質と少なくとも約95％の配列同一性を共有する少なくとも約200アミノ酸の連続的配列を有する。すなわち、本明細書において、A. victoriaのGFP（配列番号２）と実質的に同一のアミノ酸配列を有する種々のスペクトル変異体とGFP突然変異体により例示される「エクオレア（Aequorea）関連蛍光性タンパク質」または「GFP関連蛍光性タンパク質」、DsRed（配列番号12）のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有する種々の突然変異体により例示される「ディスコソマ（Discosoma）関連蛍光性タンパク質」または「DsRed関連蛍光性関連タンパク質」など（例えば、レニラ（Renilla）関連蛍光性タンパク質またはフィアリジウム（Phialidium）関連蛍光性タンパク質）が言及される。
【００８３】
用語「突然変異体」または「変異体」はまた本明細書において、蛍光性タンパク質に関して使用され、対応する野生型蛍光性タンパク質に対して突然変異を含有する蛍光性タンパク質を意味する。さらに本明細書において、蛍光性タンパク質の「スペクトル変異体」または「スペクトル突然変異体」について言及され、これは、対応する野生型蛍光性タンパク質に特徴的な異なる蛍光を有する突然変異体蛍光性タンパク質を示す。例えば、CFP、YFP、ECFP（配列番号６）、EYFP-V68L/Q69K（配列番号10）などは、GFPスペクトル変異体である。
【００８４】
エクオレア（Aequorea）GFP関連蛍光性タンパク質には、例えば野生型（未変性）オワンクラゲ（Aequorea victoria）GFP（Prasherら、前述、1992；また、配列番号２も参照）、配列番号２の対立遺伝子変異体、例えばQ80R置換を有する変異体（Chalfieら、Science 263:802-805, 1994、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）；およびGFPのスペクトル変異体、例えばCFP、YFP、およびその増強型および他の改変型（U.S. Pat. Nos. 6,150,176；6,124,128；6,077,707；6,066,476；5,998,204；および5,777,079、これらはそれぞれ、参照することにより本明細書に組み込まれる）が挙げられ、１つ以上の折り畳み突然変異を有するGFP関連蛍光性タンパク質、および蛍光性であるこれらのタンパク質の断片、例えば２つのＮ末端アミノ酸残基が除去されているA. victoria GFPを含む。これらの蛍光性タンパク質のいくつかは、特定の発色団内に異なる芳香族アミノ酸を含有し、野生型GFP種より明らかに短い波長で蛍光を発する。例えば、P4とP4-3と呼ばれる設計されたGFPタンパク質は、他の突然変異以外に置換Y66Hを含有し、W2とW7と呼ばれる設計されたGFPタンパク質は、他の突然変異以外にY66Wを含有する。
【００８５】
エクオレア（Aequorea）GFP関連蛍光性タンパク質中の折り畳み突然変異は、蛍光性タンパク質が高温で折り畳みをする能力を改良し、哺乳動物細胞中で発現された時、より蛍光性になるが、励起と発光のピーク波長への影響はほとんどまたは全く無い。所望であれば、これらの突然変異を、GFPのスペクトル性に影響を与える追加の突然変異と組合せて、スペクトル性と折り畳み性が改変され、特に蛍光性タンパク質がオリゴマー化する傾向が低下させるかまたは排除する突然変異を有するタンパク質を産生することができる。配列番号２に関して折り畳み突然変異には、置換F64L、V68L、S72A、T44A、F99S、Y145F、N146I、M153T、M153A、V163A、I167T、S175G、S205T、およびN212Kが含まれる。
【００８６】
用語「ループドメイン」は、β−バレル（β-barrel）の11の鎖または中央のα-らせん（残基56-72）の２次構造に関与するアミノ酸を連結する、エクオレア（Aequorea）関連蛍光性タンパク質のアミノ酸配列を意味する。蛍光性タンパク質に関して使用される時、用語「蛍光性タンパク質部分」は、蛍光性タンパク質基質のアミノ酸配列が、天然に存在する蛍光性タンパク質のアミノ酸配列と最適にアライメントされた時に、天然に存在する蛍光性タンパク質のアミノ酸配列のアミノ末端アミノ酸とカルボキシ末端アミノ酸の間にあり、かつ適切な波長の光への暴露下で蛍光を発する発色団を含む、蛍光性タンパク質のアミノ酸配列の部分を意味する。
【００８７】
標的タンパク質に融合した蛍光性タンパク質は、組換えDNA法を使用して調製することができ、産生される標的タンパク質の位置と量を同定するためのマーカーとして使用される。従って、本発明は、非オリゴマー化蛍光性タンパク質部分と目的のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。目的のポリペプチドは、任意の長さでよく、例えば約15アミノ酸残基、約50残基、約150残基、または最大約1000アミノ酸残基またはそれ以上であってよいが、ただし、融合タンパク質の蛍光性タンパク質成分が、蛍光を発することができるか、または適切な波長の電磁放射線に暴露された時に蛍光を発するように誘導することができるものとする。目的のポリペプチドは、例えば、ペプチドタグ、例えばポリヒスチジン配列、c-mycエピトープ、FLAGエピトープなどでもよく；酵素を含む融合タンパク質を発現する細胞中で機能させるために使用することができるか、または融合タンパク質を含有する細胞を同定するために使用することができる酵素でもよく；細胞中の１つ以上の他のタンパク質と相互作用する能力について試験されるタンパク質、または本明細書に開示のまたは所望の任意の他のタンパク質でもよい。
【００８８】
本明細書に開示されるようにディスコソマ（Discosoma）（サンゴ）赤色蛍光性タンパク質DsRedは、GFPまたはそのスペクトル変異体の相補体もしくは代替物として使用することができる。GFPのアミノ酸残基に対応するDsRedのアミノ酸残基が同定されており、対応する構造の知識に基づき、選択されたアミノ酸残基の突然変異が、野生型DsRedと比較して異なる蛍光特性を有するDsRed突然変異体の同定を可能にした（実施例２を参照）。さらにDsRedは、GFPで起きるダイマー化と同様に、オリゴマー化する傾向を有することが示されている。従って、DsRed中で突然変異を作製することができ、GFP中に導入されたものに対応する同定された突然変異体は、GFPのダイマー化を低下させるかまたは排除する（実施例１と３）。さらにDsRedのＸ線結晶解析法とコンピューター処理を使用して、調製されたエクオレア（Aequorea）GFP（U.S. Pat. No. 6,124,128を参照）の結晶構造モデルと同様に、オリゴマー化を低下させるかまたは排除する突然変異について、最適なアミノ酸残基が選択されていることを確認することができる。さらに本明細書に開示されるように、非オリゴマー化タンデムDsRed蛍光性タンパク質を構築することができ、タンデムDsRedタンパク質を設計するのに使用されたストラテジーは、他の蛍光性タンパク質に応用することができる（実施例４を参照）。
【００８９】
エクオレア（Aequorea）GFP関連蛍光性タンパク質の蛍光特性は、一部は発色団の電子的環境に依存する。一般に発色団の約0.5nm以内にあるアミノ酸は、発色団の電子的環境に影響を与える。従って、そのようなアミノ酸の置換は、変化した蛍光特性を有する蛍光性タンパク質を産生することができる。励起状態において、電子密度は、発色団のフェノラートからカルボニル末端にシフトし易い。従って、発色団のカルボニル末端近辺に増加する陽性電荷を置くと、励起状態のエネルギーが低下し、タンパク質の吸収と発光波長極大の赤色側へのシフトを起こしやすい。発色団のカルボニル末端近辺の陽性電荷を低下させると、反対の効果があり、タンパク質の波長が青色側へのシフトを起こしやすい。同様に、改変された蛍光特性を有する突然変異体を産生するために、DsRed中に突然変異が導入されている（実施例２を参照）。
【００９０】
荷電したアミノ酸（イオン化D、E、K、およびR）、双極性アミノ酸（H、N、Q、S、T、および荷電していないD、EおよびK）、および分極側鎖基を有するアミノ酸（例えば、C、F、H、M、WおよびY）は、蛍光性タンパク質がオリゴマー化する能力を改変するのに有用であり、特に、それらが荷電していない非極性または非分極性側鎖を有するアミノ酸を置換する時、有用である（実施例１と３を参照）。本明細書に開示されるように、GFPの自己会合に関与すると予測された疎水性残基を陽性荷電残基で置換すると、ダイマー化が低下したかまたは排除された。しかし、他の非保存的アミノ酸置換もまた、同様にまたはタンパク質の相互作用領域の近傍の位置に導入することができ、こうしてタンパク質の局在化構造が破壊されるが、ただし、置換は、タンパク質の蛍光特性に望ましくない影響を与えないものとする。従って、本発明は、非オリゴマー化蛍光性タンパク質を提供する。
【００９１】
また目的の１つ以上のポリペプチドに機能的に連結した、非オリゴマー化蛍光性タンパク質（例えば、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質）を含む融合タンパク質が、提供される。融合タンパク質のポリペプチドは、ペプチド結合を介して連結することができるか、または非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、リンカー分子を介して、目的のポリペプチドに連結することができる。一実施形態において融合タンパク質は、１つ以上の目的のポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチドに機能的に連結した、非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する組換え核酸分子から、発現される。
【００９２】
目的のポリペプチドは、任意のポリペプチドであり、例えば、ポリヒスチジンペプチドのようなペプチドタグ、または酵素、Ｇタンパク質、増殖因子受容体、もしくは転写因子のような細胞性ポリペプチドを含むポリペプチドでもよく、および会合して複合体を形成することができる２つ以上のタンパク質の１つでもよい。一実施形態において融合タンパク質は、タンデム非オリゴマー化蛍光性タンパク質構築体であり、これは、ドナー非オリゴマー化蛍光性タンパク質、アクセプター非オリゴマー化蛍光性タンパク質、および該ドナーと該アクセプターとをカップリングするペプチドリンカー部分とを含み、ここでドナーの環化アミノ酸は該ドナーに特徴的な光を発し、ドナーとアクセプターは、ドナーが励起されると蛍光共鳴エネルギー移動を示し、リンカー部分は、ドナーを励起する光を実質的に発しない。従って、本発明の融合タンパク質は、直接または間接的に連結することができる、２つ以上の機能的に連結した非オリゴマー化蛍光性タンパク質を含むことができ、目的の１つ以上のポリペプチドをさらに含むことができる。
【００９３】
タンデム非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、第１の蛍光性タンパク質を含むドナー、第２の蛍光性タンパク質を含むアクセプター、およびドナーとアクセプターとを機能的に連結するペプチドリンカー部分を含む。そのようなタンデム非オリゴマー化蛍光性タンパク質において、第１の蛍光性タンパク質と第２の蛍光性タンパク質は異なり、少なくとも第１の蛍光性タンパク質または第２の蛍光性タンパク質は、本発明の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質である。さらに、ドナーの環化アミノ酸は、ドナーに特徴的な光を発し、ドナーが励起されると、ドナーとアクセプターは蛍光共鳴エネルギー移動を示し、リンカー部分は、アクセプターを励起する光を実質的に発しない。
【００９４】
「第１の」蛍光性タンパク質または「第２の」蛍光性タンパク質などへの言及は、特定のタンパク質を便宜上参照するためだけに使用されるものであり、決してタンパク質の順序または重要性を示すものではないことは理解されるべきである。従って、例えば第１の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質と第２の非オリゴマー化蛍光性タンパク質が言及される場合、第１または第２の蛍光性タンパク質のいずれかが、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質または非オリゴマー化蛍光性タンパク質でもよいことは理解されるだろう。
【００９５】
一実施形態において、第１の蛍光性タンパク質と第２の蛍光性タンパク質のそれぞれは、本発明のタンデム非オリゴマー化蛍光性タンパク質中の非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質である。例えば、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質は、２つ以上のディスコソマ（Discosoma）RFPまたはディスコソマ（Discosoma）RFPに関連した蛍光性タンパク質（例えば、配列番号12に記載のアミノ酸配列を有するDsRedタンパク質、またはI125R突然変異を含有する配列番号12のような突然変異体DsRedタンパク質）を含むことができる。別の実施形態において、第１の蛍光性タンパク質は非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質であり、第２の蛍光性タンパク質は非オリゴマー化蛍光性タンパク質である。非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、配列番号２のA206、L221、F223に対応するアミノ酸残基の突然変異、またはこれらの組合せ、例えば配列番号２のS65G/S72A/T203Y/H231Lに対応する突然変異を含有することができる。
【００９６】
本発明はまた、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質でもよい非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ならびにそのようなポリヌクレオチドを含有するベクター、およびポリヌクレオチドもしくはベクターを含有する宿主細胞を提供する。また、１つ以上の他のポリヌクレオチドに機能的に連結した非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードする、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、組換え核酸分子が提供される。１つ以上の他のポリヌクレオチドは、例えば転写調節エレメント（例えば、プロモーターまたはポリアデニル化シグナル配列）または翻訳調節エレメント（例えば、リボソーム結合部位）でもよい。そのような組換え核酸分子は、ベクター中に含有され、これは、発現ベクターでもよく、核酸分子またはベクターは宿主細胞中に含有されてよい。
【００９７】
ベクターは一般に、所望される場合、原核生物宿主系または真核生物宿主系または両方での複製に必要なエレメントを含有する。プラスミドベクターおよびウイルスベクター（例えば、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、およびアデノ関連ウイルスベクター）を含むそのようなベクターは、周知であり、市販品を購入することができる（Promega, Madison WI； Stratagene, La Jolla CA；GIBCO/BRL, Gaithersburg MD）か、または当業者が構築することができる（例えば、Meth. Enzymol., Vol. 185, Goeddel編（アカデミックプレス社（Academic Press Inc.）, 1990）；Jolly, Canc. Gene Ther. 1:51-64, 1994；Flotte, J. Bioenerg. Biomemb. 25:37-42, 1993；Kirshenbaumら、J. Clin. Invest. 92:381-387, 1993；これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【００９８】
非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターでもよく、プラスミドベクター、ウイルスベクターなどでもよい。一般にベクターは、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるものに依存しない選択マーカーを含有し、さらに転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントを含有し、そこに機能的に連結したポリヌクレオチドの組織特異的発現を与えることができるプロモーター配列を含み、これは、必要とされないが、非オリゴマー化蛍光性タンパク質（例えば、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質）をコードするポリヌクレオチドでよく、こうして、導入されたベクターとそこに含有される組換え核酸分子を含有する細胞の混合集団の中から、特定のタイプの細胞を選択する手段を提供する。
【００９９】
ベクターがウイルスベクターである場合、これは、比較的高い効率で１つまたは数個の特異的細胞タイプを感染する能力に基づいて選択することができる。例えばウイルスベクターはまた、目的の生物の特定の細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞のような脊椎動物宿主細胞）に感染するウイルスから誘導できる。特定の宿主系（特に、哺乳動物系）で使用するためのウイルスベクターが開発されており、例えば、レトロウイルスベクター、例えばヒト免疫不全症ウイルス（HIV）に基づくものなどの他のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどが挙げられる（MillerとRosman、Bio Techniques 7:980-990, 1992；Andersonら、Nature 392:25-30, 補遺、1998；VermaとSomia、Nature 389:239-242, 1997；Wilson、New Engl. J. Med. 334:1185-1187 (1996)を参照、これらのそれぞれは、参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１００】
非オリゴマー化蛍光性タンパク質（これは、融合タンパク質の成分でもよい）の組換え産生は、ポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドを発現することを含む。非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、有用な出発物質である。蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるかまたは当該技術分野で公知であり、ルーチン法を使用して得られ、次に、コードされる蛍光性タンパク質がオリゴマー化傾向が欠如するように、改変することができる。例えば、GFPをコードするポリヌクレオチドは、エクオレア（Aequorea）GFP（配列番号２）のDNA配列に基づくプライマーを使用して、A. victoriaからのcDNAのPCRにより単離することができる。PCR法は周知であり、当該技術分野でルーチンに行われている（例えば、U.S. Pat. No. 4,683,195；Mullisら、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987；Erlich編、「PCR Technology」（ストックトンプレス（Stockton Press）、NY、1989）を参照）。次に、蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発により、または0.1mM MnCl2と不均衡なヌクレオチド濃度を用いて元々のポリヌクレオチドのPCRのエラー率を上昇させることにより引き起こされるランダム突然変異誘発により、蛍光性タンパク質の非オリゴマー化型を作製することができる（実施例１；またU.S. Pat. No. 6,066,476を参照）。同様に、例えば、蛍光性タンパク質の第１のモノマーと少なくとも第２のモノマーを機能的に連結させる、ペプチドリンカーをコードすることができるプライマーを使用するPCRにより調製されるポリヌクレオチドから、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を発現することができる（実施例４を参照）。
【０１０１】
発現ベクターの構築とトランスフェクトした細胞中のポリヌクレオチドの発現には、また当該技術分野で周知の分子クローニング技法を使用することが含まれる（Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）1989）；「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubelら編；グリーンパブリッシングアソーシエーツインク（Greene Publishing Associates, Inc.）およびジョンワイリーアンドサンズインク（John Wiley and Sons, Inc.）1990および補遺を参照）。発現ベクターは、例えば上記に示す非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードする目的のポリヌクレオチド配列に、機能的に連結した発現制御配列を含有する。発現ベクターは、適切なプロモーター、複製配列、マーカーなどを含めることにより、原核生物または真核生物中で機能するように適合させることができる。発現ベクターは、非オリゴマー化蛍光性タンパク質の発現のために組換え宿主細胞中にトランスフェクトすることができ、宿主細胞は、例えば単離したタンパク質を大量に得るために高レベルの発現について選択することができる。宿主細胞は、細胞培養で維持することができるか、または生物中のin vivoの細胞でもよい。非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、大腸菌（E. coli）のような宿主細胞中でタンパク質をコードするポリヌクレオチドから発現することにより産生することができる。エクオレア（Aequorea） GFP関連蛍光性タンパク質は、例えば、約15℃〜30℃で培養した細胞により最適に発現されるが、より高温（例えば、37℃）を使用することもできる。合成後、蛍光性タンパク質はより高温で安定であり、そのような温度でのアッセイに使用することができる。
【０１０２】
発現された非オリゴマー化蛍光性タンパク質（これは、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質でもよく、目的の第１のポリペプチドに機能的に連結してもよい）は、目的の第２のポリペプチド、例えばペプチドタグ（これは、そこに連結した任意の他のポリペプチドを含む、非オリゴマー化蛍光性タンパク質の単離を容易にするのに使用することができる）に、さらに連結することができる。例えば、６つのヒスチジン残基を含有するポリヒスチジンタグを、非オリゴマー化蛍光性タンパク質のＮ末端またはＣ末端で取り込み、次にこれを、ニッケル−キレートクロマトグラフィーを使用して単一の工程で単離することができる（実施例１を参照）。任意のペプチドエピトープ（または、エピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性フラグメント）を含む追加のペプチドタグ（c-mycペプチド、FLAGエピトープ、または任意のリガンド（または同族の受容体）を含む）は、当該技術分野で周知であり、同様に使用することができる（例えば、Hoppら、Biotechnology 6:1204 (1988)；U.S. Pat. No. 5,011,912を参照、これらのそれぞれは参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１０３】
本発明の組成物とその使用を促進し、所望であれば標準化するために、キットも提供される。キットは、１つ以上の本発明の組成物、例えば１つまたは複数の非オリゴマー化蛍光性タンパク質（これは融合タンパク質の一部でもよい）または１つまたは複数のポリヌクレオチド（これはポリペプチドをコードする）を含有することができる。非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、オリゴマー化する傾向が低下した突然変異蛍光性タンパク質でもよく、または非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質でもよく、キットは、複数の非オリゴマー化蛍光性タンパク質を含有する場合、複数は、複数の突然変異非オリゴマー化蛍光性タンパク質または非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質またはこれらの組合せでもよい。
【０１０４】
本発明のキットはまた、１つまたは複数の組換え核酸分子を含有することができ、これは一部は非オリゴマー化蛍光性タンパク質（これは同じかまたは異なってよい）をコードし、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位またはリコンビナーゼ認識部位、または任意の目的のポリペプチドを含有するかもしくはコードする、機能的に連結した第２のポリヌクレオチドを、さらに含むことができる。さらにキットは、キットの成分を使用するための、特にキットに含有される本発明の組成物を使用するための、説明書を含むことができる。
【０１０５】
当業者は、特定の応用に好ましい蛍光特性を有する１つ以上のタンパク質を便利に選択することができるため、そのようなキットは、複数の異なる非オリゴマー化蛍光性タンパク質を提供できる場合に特に有用でありうる。同様に、異なる非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードする複数のポリヌクレオチドを含有するキットは、多くの利点を提供する。例えば、ポリヌクレオチドは、便利な制限エンドヌクレアーゼまたはリコンビナーゼ認識部位を含有するように設計され、こうして調節エレメントへの、または目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドへの、ポリヌクレオチドの機能的連結を促進するか、または所望であれば互いに非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードする２つ以上のポリヌクレオチドを機能的に連結することができる。
【０１０６】
本発明の非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、蛍光性タンパク質を利用する任意の方法で有用である。すなわち、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質を含む非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、蛍光性マーカーがすでに使用される多くの方法（例えば、イムノアッセイもしくはハイブリダイゼーションアッセイのような検出アッセイで使用するための、または細胞中のタンパク質の移動を追跡するための、抗体、ポリヌクレオチドまたは他の受容体への、非オリゴマー化蛍光性タンパク質のカップリング）で蛍光性マーカーとして有用である。細胞内追跡試験のために、非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードする第１の（または他の）ポリヌクレオチドを、目的のタンパク質をコードする第２の（または他の）ポリヌクレオチドに融合させ、所望であれば、構築体を発現ベクター中に挿入することができる。細胞内で発現すると、タンパク質の局在化が、融合タンパク質の蛍光性タンパク質成分のオリゴマー化により引き起こされたアーティファクトであることを心配せずに、蛍光に基づき目的のタンパク質を局在化することができる。この方法の一実施形態において、２つの目的のタンパク質は独立に、異なる蛍光特性を有する２つの非オリゴマー化蛍光性タンパク質と融合される。
【０１０７】
本発明の非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、転写の誘導を検出するための系において有用である。例えば、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、目的のプロモーターまたは他の発現制御配列（これは、発現ベクター中に含有されることができる）に融合することができ、構築体は細胞中にトランスフェクトすることができ、そして蛍光の存在または量を検出することによりプロモーター（または他の調節エレメント）の誘導を測定することができ、こうして、受容体からプロモーターへのシグナル伝達経路の応答性を観察するための手段が可能になる。
【０１０８】
本発明の非オリゴマー化蛍光性タンパク質はまた、FRETを含む応用において有用であり、これは、蛍光性ドナーとアクセプターの、互いに向かうまたは互いに離れる動きの関数として事象を検出することができる。ドナー／アクセプター対の１つまたは両方は、非オリゴマー化蛍光性タンパク質でもよく、例えばT203I突然変異を有するドナーGFPと突然変異T203Xを有するアクセプターGFP（ここで、Xは芳香族アミノ酸であり、例えばT203Y、T203W、またはT203Hである）でもよい（U.S. Pat. No. 6,124,128と6,066,476を参照）。別の有用なドナー／アクセプター対は、突然変異S72A、K79R、Y145F、M153AおよびT203I（395nmの励起ピークと511nmの発光ピークを有する）を有するドナーと、突然変異S65G、S72A、K79R、およびT203Yを有するアクセプターを含む。そのようなドナー／アクセプター対は、ドナーの励起ピークと発光ピークの間の広い分離を提供し、ドナー発光スペクトルとアクセプター励起スペクトルの間の良好な重複を提供する。本明細書に開示の他の非オリゴマー化赤色蛍光性タンパク質または赤色シフト突然変異体もまた、そのような対でアクセプターとして使用することができる。
【０１０９】
FRETは、ドナーを有する基質であって切断部位の反対側にアクセプターが結合した該基質の切断を検出するために、使用することができる。基質が切断されると、ドナー／アクセプター対は物理的に分離し、FRETが排除される。例えば、基質をサンプルに接触させ、FRETの定性的または定量的変化を測定することにより、そのようなアッセイを行うことができる（例えば、US Patent No. 5,741,657を参照、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。非オリゴマー化蛍光性タンパク質ドナー／アクセプター対はまた、タンパク質分解性切断部位を有するペプチドにより結合した融合タンパク質の一部でもよい（例えば、US Patent No. 5,981,200を参照、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。FRETはまた、膜を横切る電位の変化を検出するために使用することができる。例えば、ドナーとアクセプターを膜の反対側に置き、電圧変化に応答して膜を横切って移動するようにすると、それにより測定可能なFRETが産生される（例えば、US Patent No. 5,661,035を参照、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１１０】
本発明の非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、プロテインキナーゼの蛍光性基質を作製するのに有用である。そのような基質は、プロテインキナーゼにより認識可能なアミノ酸配列を取り込み、さらにリン酸化によりその非オリゴマー化蛍光性タンパク質が蛍光性に変化を生じる。そのような基質は、基質のトランスフェクションと発現により、細胞サンプル中のプロテインキナーゼ活性を検出および測定するのに有用である。好ましくは、キナーゼ認識部位は、非オリゴマー化蛍光性タンパク質の末端の約20アミノ酸内、またはタンパク質のループドメイン内に置かれる（U.S. Serial No. 08/680,877（1996年７月16日出願）、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。同様に、プロテアーゼ認識部位もまた、切断されると、測定可能な方法の点で蛍光特性が変化するように、ループドメイン中に導入することができる。
【０１１１】
サンプル中の蛍光は一般に、蛍光計を使用して測定されるが、ここで、第１の波長を有する励起源からの励起放射線は、励起光学系を通過し、これによって励起放射線がサンプルを励起するようになる。これに応答して、サンプル中の非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、励起波長とは異なる波長を有する放射線を発する。そして集光系が、サンプルからの発光を集める。この装置は、スキャンしている間サンプルを特定の温度に維持するための温度コントローラーを含んでもよく、さらに異なるウェルが暴露されるように配置するための、複数のサンプルを保持するマイクロタイタープレートを動かす多軸移動ステージを有していてもよい。多軸移動ステージ、温度コントローラー、自動焦点機能、およびイメージングとデータ収集に関連する電子機器は、適切にプログラムされたデジタルコンピューターで管理することができ、これは、アッセイの際に収集されたデータを、提示のための別のフォーマットに変換する。このプロセスを小型化および自動化して、高速大量処理様式での何千という化合物のスクリーニングを可能にすることができる。蛍光性物質によるアッセイを行うこれらの方法および他の方法は、当該分野で周知である（例えば、Lakowicz、「蛍光分光法の原理（"Principle of Fluorescence Spectroscopy"）」(プレナムプレス（Plenum Press）1983）；「培養物中の生細胞の蛍光顕微鏡検査（"Fluorescence Microscopy of Living Cells in Culture"）」 パートＢ中のHerman,「共鳴エネルギー移動顕微鏡検査（"Resonance energy transfer microscopy"）」, Meth. Cell Biol. 30:219-243（TaylorとWang編；アカデミックプレス（Academic Press）1989）；Turro, 「現代の分光光化学（"Modern Molecular Photochemistry"）」（Benjamin/Cummings Publ. Co.,Inc. 1978）、296−361頁を参照、これらのそれぞれは参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１１２】
従って、本発明は、サンプル中の分子の存在を同定する方法を提供する。そのような方法は、例えば本発明の非オリゴマー化蛍光性タンパク質を分子に結合し、その分子を含有することが疑われるサンプル中の非オリゴマー化蛍光性タンパク質による蛍光を検出することにより行われる。検出される分子は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または任意の他の分子（例えば、抗体、酵素、受容体）でもよく、非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質でもよい。
【０１１３】
調べられるサンプルは、任意のサンプルであり、生物サンプル、環境サンプル、またはその中に特定の分子が存在するかどうかを決定することが好ましい任意の他のサンプルでもよい。好ましくはサンプルは、細胞またはその抽出物を含む。細胞は、脊椎動物（ヒトのような哺乳動物を含む）、または非脊椎動物から得ることができ、植物または動物からの細胞でもよい。細胞は、そのような細胞の培養物（例えば細胞株）から得られ、生物から単離することができる。従って、細胞は組織サンプル中に含有されるものでもよく、これは、生物から、組織サンプルを得るために通常使用される任意の手段（例えば、ヒトの生検）により得ることができる。無傷の生細胞または新たに単離された組織もしくは臓器サンプルを使用して方法を実施する場合には、生細胞中の目的分子の存在を同定することにより、例えばその分子の細胞内分布を測定する手段が提供される。そのような目的のための本発明の非オリゴマー化蛍光性タンパク質の使用は、蛍光性タンパク質のオリゴマー化による異所的な同定または局在の可能性を大幅に低下させる点で、大きな利点を与える。
【０１１４】
非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、直接または間接的に、タンパク質−分子複合体が暴露される条件下で安定な任意の結合を使用して、その分子に結合することができる。すなわち、蛍光性タンパク質と分子は、タンパク質とその分子上に存在する反応性基間の化学反応により結合してもよいし、またはその結合をリンカー部分（これは、蛍光性タンパク質とその分子に特異的な反応性基を含有する）により仲介させてもよい。非オリゴマー化蛍光性タンパク質と分子を結合させるための適切な条件は、例えばその分子の化学的性質と所望の結合タイプに依存して選択される。目的の分子がポリペプチドである場合、非オリゴマー化蛍光性タンパク質と分子を結合させる便利な手段は、組換え核酸分子（これは、例えばポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチドに機能できる形で結合した非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む）から、これらを融合タンパク質として発現させることによるものである。
【０１１５】
発現制御配列の活性を制御する物質または条件を同定する方法もまた提供される。そのような方法は、例えば、組換え核酸分子（発現制御配列に機能できる形で結合した非オリゴマー化蛍光性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む）を、発現制御配列からのポリヌクレオチドの発現を制御することができると疑われる物質または条件に暴露し、そのような暴露に起因する非オリゴマー化蛍光性タンパク質の蛍光を検出することにより、行われる。そのような方法は、発現制御配列からの発現を制御することができる化学物質または生物学的物質（細胞性タンパク質を含む）（制御要素からの組織特異的発現に関与する細胞因子を含む）を同定するのに有用である。従って、発現制御配列は、転写制御要素（例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、イントロンスプライシング認識部位、ポリアデニル化部位など）、または翻訳制御要素（例えば、リボゾーム結合部位）でもよい。
【０１１６】
本発明の非オリゴマー化蛍光性タンパク質もまた、第１の分子と第２の分子の特異的相互作用を同定する方法において有用である。そのような方法は、例えば、ドナーである第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質に結合した第１の分子と、アクセプターである第２の非オリゴマー化蛍光性タンパク質に結合した第２の分子とを、第１の分子と第２の分子との特異的相互作用を可能にする条件下で接触させ；ドナーを励起し；ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動を検出し、それにより第１の分子と第２の分子の特異的相互作用を同定することにより実施することができる。そのような相互作用の条件は、分子が特異的に相互作用することができると予測されるかまたは疑われる任意の条件である。特に、調べるべき分子が細胞性分子である場合、その条件は一般に生理学的条件である。従ってこの方法は、生理学的条件を模倣する、バッファー、pH、イオン強度などの条件を使用してin vitroで実施してもよいし、またはその方法は、細胞もしくは細胞抽出物中で実施してもよい。
【０１１７】
第１の分子と第２の分子は細胞性タンパク質であって、それらのタンパク質が特異的に相互作用するかを判定するために、またはそのような相互作用を確認するために、調べられるものであってよい。そのような第１の細胞性タンパク質と第２の細胞性タンパク質は、例えばオリゴマー化する能力について調べる場合には、同一のものでもよく、例えば細胞内経路に関与する特異的結合パートナーとして調べる場合には、それらタンパク質が異なっていてもよい。第１の分子と第２の分子はまた、ポリヌクレオチドとポリペプチドでもよく、例えば転写制御要素活性が知られているかまたはそれについて調べるべきポリヌクレオチドと、転写因子活性について知られているかまたはそれについて調べられるポリペプチドでもよい。例えば、第１の分子が、転写制御要素活性について試験すべき複数のヌクレオチド配列（これは、ランダムでもまたは既知の配列の変異体でもよい）を含み、かつ第２の分子が、転写因子である場合もあり、そのような方法は、好ましい活性を有する新規転写制御要素を同定するのに有用である。
【０１１８】
本発明はまた、サンプルが酵素を含有するかどうかを判定する方法を提供する。そのような方法は、例えばサンプルに本発明のタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質を接触させ；ドナーを励起し、そしてサンプル中の蛍光特性を測定することにより実施されるが、この場合サンプル中の酵素の存在により、蛍光共鳴エネルギー移動の程度が変化する。同様に本発明は、細胞中の酵素の活性を測定する方法に関する。そのような方法は、例えばタンダム非オリゴマー化蛍光性タンパク質構築体を発現する細胞を提供し（ここで、ペプチドリンカー部分が、ドナーとアクセプターを結合する、その酵素に特異的な切断認識アミノ酸配列を含む）；該ドナーを励起し、そして細胞中の蛍光共鳴エネルギー移動の程度を測定することにより行われるが、この場合、細胞中の酵素活性の存在により、蛍光共鳴エネルギー移動の程度が変化する。
【０１１９】
また、サンプルのpHを測定するための方法が提供される。そのような方法は、例えば、サンプルに第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質（これは、非オリゴマー化タンデム蛍光性タンパク質でもよい）を接触させ（ここで第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質の発光強度は、pHがpH５〜pH10の間で変化するにつれて変化する）；指示物質を励起し；そして第１の波長での第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質が発する光の強度を測定することにより行われる（ここで、第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質の発光強度は、サンプルのpHを示す）。この方法または本発明の他の任意の方法で有用な第１の非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、例えば、配列番号26のアミノ酸配列を有するペプチドに機能できる形で結合した、配列番号12に記載の２つのDsRedモノマー、もしくはその変異体（例えばI125R変異体）を含んでもよいし；配列番号２のアミノ酸配列、あるいはこれと実質的に同一の配列、例えば、配列番号２について突然変異S65G/S72A/T203Y/H231Lを有する配列、もしくは配列番号２について突然変異S65G/V68L/Q69K/S72A/T203Y/H231Lを有する配列；配列番号２について突然変異K26R/F64L/S65T/Y66W/N146I/M153T/V163A/N164H/H231Lを有する配列；または配列番号２についてH148GもしくはH148Qに対応する突然変異をさらに有する上記突然変異型非オリゴマー化蛍光性タンパク質のいずれか、を有していてもよい。そのような非オリゴマー化蛍光性タンパク質は同様に、本発明の種々の開示した方法にとって、単独または組合せで有用であることは認識されるであろう。
【０１２０】
サンプルのpHを決定する方法で使用されるサンプルは、任意のサンプルであってよく、例えば、生物組織サンプル、または細胞もしくはその画分が含まれる。さらに、この方法では、サンプルに、第２の非オリゴマー化蛍光性タンパク質を接触させ（ここで、pHが５から10に変化するにつれて第２の非オリゴマー化蛍光性タンパク質の発光強度が変化し、第２の非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、第１の波長とは明らかに異なる第２の波長で発光する）；第２の非オリゴマー化蛍光性タンパク質を励起し；第２の波長での第２の非オリゴマー化蛍光性タンパク質が発する光の強度を測定し；そして、第２の波長での蛍光を、第１の波長での蛍光と比較する。第１（または第２）の非オリゴマー化蛍光性タンパク質は、標的化配列、例えば、細胞コンパートメント化ドメイン、例えば細胞中の非オリゴマー化蛍光性タンパク質を、サイトゾル、小胞体、ミトコンドリアマトリックス、葉緑体腔、内側トランスゴルジ嚢、リソソーム腔、またはエンドソーム腔に標的化するドメインを含んでもよい。例えば、細胞コンパートメント化ドメインは、ヒトII型膜固定タンパク質であるガラクトシルトランスフェラーゼのアミノ酸残基１〜81、またはチトクロームｃオキシダーゼのサブユニットIVのプレ配列のアミノ酸残基１〜12を含むものでありうる。
【０１２１】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図するものであって、これを限定するものではない。
【実施例１】
【０１２２】
非オリゴマー化蛍光性タンパク質の調製と性状解析
この実施例は、タンパク質がオリゴマー化する能力を低下させるかまたは排除する突然変異を、GFPスペクトル変異体に導入できることを示す。
【０１２３】
ダイマー接触部分でのECFP（配列番号６）とEYFP-V68L/Q69K（配列番号10）を、細菌発現ベクターpRSETB（インビトロゲン（Invitrogen Corp.）、ラホヤ（La Jolla）、カリフォルニア州）中にサブクローニングし、ECFP（配列番号６）とEYFP-V68L/Q69K（配列番号10）のＮ末端にHis6タグを作製して、ニッケル−アガロース（キアゲン（Qiagen））アフィニティカラム上での細菌により発現されるタンパク質の精製を可能にした。クイックチェンジ（QuickChange）突然変異誘発キット（ストラタジーン（Stratagene））を使用する部位特異的突然変異誘発により、cDNA中のすべてのダイマー関連突然変異を作製して、次に、同様の方法で発現させ精製した。すべてのcDNAを配列決定して、所望の突然変異のみが存在することを確認した。
【０１２４】
クイックチェンジ（QuickChange）キット（ストラタジーン（Stratagene））を使用して、EYFP-V68L/Q69K（配列番号10）について突然変異誘発を行った。重複する突然変異誘発プライマーを、5'プライマーについては「上側」と呼び、3'プライマーについては「下側」と呼んで、導入された個々の突然変異に従って命名した（表１を参照）。すべてのプライマーは、70℃を超える融解温度を有していた。突然変異は、できるだけプライマーの中央近くに作製し、すべてのプライマーは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。プライマーを、5'から3'の方向に、突然変異誘発したコドンに下線を引いて示す（表１）。
【表１】
2004530423.tif 000002
タンパク質発現のために、種々のEYFP-V68L/Q69K（配列番号10）変異体のcDNAを含有するプラスミドを、大腸菌（E. coli）JM109株中に形質転換し、100μg/mlのアンピシリンを含有するLB中でOD600が0.6になるまで増殖させ、この時点で、これらを１mMのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドで誘導した。室温で６〜12時間、次に４℃で一晩、細菌によってタンパク質を発現させ、次に細菌を遠心分離してペレットとし、それをリン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）に再懸濁し、フレンチプレスで溶菌させた。細菌溶解物を、30,000×ｇで30分遠心分離して清澄化した。清澄化した溶解物中のタンパク質を、Ni-NTA-アガロース（キアゲン（Qiagen））でアフィニティ精製した。
【０１２５】
これらの実験で使用したすべてのGFPは、238アミノ酸の長さであった。GFPをコードするcDNAをpRSETB中にサブクローニングして、追加の33アミノ酸をGFPのＮ末端に融合させた。このタグの配列は、MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDP（配列番号21）である。すなわち、このcDNAから発現されたEYFP-V68L/Q69K（配列番号10）変異体の全長は、271アミノ酸であった。His6タグをEKMax（インビトロゲン（Invitrogen））を使用して除去して、GFPについて測定された会合特性が、Ｎ末端His6タグの存在により影響を受けるかどうかを調べた。酵素とHis6タグ付加GFPの希釈系列を作製して、His6タグの完全な除去に必要な条件を決定した。すべての発現され精製されたタンパク質の純度を、SDS-PAGEにより分析した。すべての場合に、発現されたタンパク質は純度が高く、有意に検出される混入タンパク質は無く、すべてが正しい分子量のものであった。さらに、His6タグの除去は非常に効率的であり、そのことはHis6-EYFP-V68L/Q69Kより小さい分子量にて移動する単一のバンドの存在により示された。
【０１２６】
精製したタンパク質の分光学的解析により、EYFP-V68L/Q69K（配列番号10；「wtEYFP」；表２）について、これらのタンパク質の発色団変性（Ward、前述、1998）により測定される吸光係数にも、または量子収率（EYFP-V68L/Q69Kとそれから誘導された変異体について使用した標準はフルオレセインである）にも、大きな変化は無いことが確認された。蛍光スペクトルはFluorolog分光蛍光光度計を使用して得た。タンパク質の吸収スペクトルは、Cary UV-Vis分光光度計を使用して得た。吸光係数は、変性発色団法（Ward、前述、1998）により測定した。
【表２】
2004530423.tif 000003
ダイマーのホモ親和性の程度を測定するために、wtEYFPとそれから誘導されたダイマー変異体を、沈降平衡分析用超遠心分離に付した。精製した組換えタンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）に対して充分透析し、50μM〜700μMの範囲の濃度の125μlのタンパク質サンプルを、EPONセンターピースを有する６チャネルの遠心分離セルに入れた。対応する透析バッファーをサンプルのブランクとした。Beckman Optima XL-1分析用超遠心分離機で20℃で、514nmでの放射吸収度を測定しながら、沈降平衡実験を行った。各サンプルを、以下の速度のうちの３つ以上で調べた：8,000rpm、10,000rpm、14,000rpm、および20,000rpm。各速度での定期的吸収測定により、サンプルは各速度で平衡に達したことが確認された。
【０１２７】
データを、ベックマン（Beckman）によって供給されたソフトウェアパッケージ（Origin）を使用して、非線形最小自乗解析により、すべてのローター速度で包括的に解析した。適合の良好性を、実験データと理論曲線の差として表した誤差の大きさとランダム性に基づいて、また物理学的妥当性について各適合パラメータをチェックして、評価した。Sedenterp v1.01を使用して、各タンパク質の分子量と部分比体積を測定し、そのデータをホモ親和性の測定式に導入した（表３）。さらに、分析用超遠心分離により得られたデータから誘導された解離定数（Kd）を、いくつかのタンパク質について示す（表４）。
【表３】
2004530423.tif 000004
【表４】
2004530423.tif 000005
生細胞での実験のために、原形質膜（PM）に標的化されるECFP（配列番号６；「wtECFP」）とEYFP-V68L/Q69K（配列番号10；「wtEYFP」）を、哺乳動物発現ベクターであるpcDNA3（インビトロゲン（Invitrogen Corp.））中にサブクローニングし、上記したように突然変異誘発して配列決定した。PMへのGFP変異体の標的化は、アシル化および／またはプレニル化（翻訳後脂質修飾）のためのコンセンサス配列を含有する短いペプチドへの、GFP変異体のＮ末端またはＣ末端融合体を作製することにより行った。PMを標的とするGFP変異体のcDNAをトランスフェクトし、HeLa細胞またはMDCK細胞中で発現させ、その発現パターンと会合の程度を、蛍光顕微鏡を使用して測定した。FRET効率を測定して、PM-ECFPとPM-EYFP-V68L/Q69Kの相互作用の程度を測定した。FRETドナー−脱クエンチ法（MiyawakiとTsien、前述、2000）による相互作用の解析は、wtECFPとwtEYFPが、wtECFPとwtEYFPの会合に依存する様式で相互作用すること、さらにこの相互作用が、疎水性接触部分のアミノ酸を、突然変異A206K、L221K、およびF223Rの任意の１つまたは組合せに変化させることにより、有効に排除されることを証明した。
【０１２８】
これらの結果は、エクオレア（Aequorea） GFPとそのスペクトル変異体およびこれらから誘導されるダイマー突然変異体の溶液オリゴマー状態が、分析用超遠心分離により正確に測定されたことを証明する。ECFP（配列番号６）とEYFP-V68L/Q69K（配列番号10）GFPスペクトル変異体は、約113μMのかなり高い親和性を有するホモダイマーを形成した。部位特異的突然変異誘発を使用して、ダイマー化とこれに関連する細胞生物学的問題を有効に排除するように、アミノ酸組成を改変した。すなわち、改変した蛍光性タンパク質は、改変CFPまたはYFPに融合させた宿主タンパク質の会合特性を測定するようにFRETを使用する手段を提供する。GFPのダイマー化による宿主タンパク質の細胞小器官での分布または局在の間違った同定の可能性とともに、ECFP（配列番号６）とEYFP-V68L/Q69K（配列番号10）のダイマー化に関連する擬陽性のFRET結果のあいまいさと可能性が、有効に排除されている。
【０１２９】
レニラ（Renilla）GFPとディスコソマ（Discosoma）赤色蛍光性タンパク質（実施例２を参照）は、溶液中では真正のオリゴマーである。エクオレア（Aequorea）GFPはまた、溶液中でダイマー化すると一般に考えられており、かつ、GFPはダイマーとして結晶化するため、本研究は、GFPのオリゴマー状態を性状解析するように計画した。２つのモノマー間の結晶接触面は、多くの親水性接触部分ならびにいくつかの疎水性接触部分を含有した（Yangら、前述、1996）。しかし、各タイプの相互作用が溶液中のダイマーの形成にどの程度寄与しているかは、直接明らかではなかった。
【０１３０】
本明細書に開示されるように、GFP自己会合の程度は、沈降平衡、分析用超遠心分離（これは、同様の分子（自己会合性ホモ複合体）および異種分子（ヘテロ複合体；LaueとStafford, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 28:75-100, 1999）の両方のオリゴマー挙動を測定するのに非常に有用である）を使用して調べた。Ｘ線結晶解析法に比較して、分析用超遠心分離実験で使用した実験条件は、細胞の生理学的条件とよく似ていた。マルチマー複合体内のＸ線結晶解析法により同定されるモノマー接触部位は、溶液中のものと必ずしも同じではない。また、分析用超遠心分離と比較して、Ｘ線結晶解析法のみでは、複合体の親和性について決定的な情報が得られない。この研究の結果は、in vitroの分析用超遠心分離と無傷の細胞中のFRETの濃度依存性の分析により測定されるとおり、疎水性残基A206、L221、F223を、陽性荷電側鎖を含有する残基で置換することにより（A206K、L221K、およびF223R）、ダイマー化が排除されることを証明した。
【実施例２】
【０１３１】
サンゴ赤色蛍光性タンパク質DsRedとその突然変異体の性状解析
この実施例は、DsRedとDsRed突然変異体の生化学的および生物学的性状解析を記載する。
【０１３２】
DsRedのコード配列を、pDsRed-N1（クロンテクラボラトリーズ（Clontech Laboratories））から、PCRプライマー（これは、開始Metコドンの上流にＮ末端BamHI認識部位を加え、終止コドンの下流にＣ末端EcoRI部位を加える）を用いて増幅した。制限消化後、PCR産物を、pRSETB（インビトロゲン（Invitrogen））のBamHIとEcoRI部位の間にクローン化し、得られたベクターを、DH5α細菌中で増幅させた。得られたプラスミドを、誤りがちな（error-prone）PCR（HeimとTsien, Curr. Biol. 6:178-182, 1996、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）の鋳型として使用して、DsRedコード配列のすぐ上流および下流に位置するプライマーを使用することにより、理論的にはすべてのコード塩基（開始Metを含む）の突然変異を可能にした。突然変異誘発したPCR断片を、EcoRIとBamHIで消化し、pRSETB中に再クローン化した。あるいは、クイックチェンジ（Quick-Change）突然変異誘発キット（ストラタジーン（Stratagene））を使用して、pRSETB-DsRedプラスミド上に指向的突然変異を作製した。
【０１３３】
ランダムおよび指向的突然変異誘発実験の両方で、突然変異誘発プラスミドライブラリーをJM109細菌中へとエレクトロポレーションし、アンピシリン含有LBプレート上に播き、デジタルイメージング装置でスクリーニングした（Bairdら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:11242-11246, 1999、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。この装置は、150ワットのキセノンアークランプからの光を、帯域通過励起フィルターでフィルターをかけ、２つの光ファイバー束でプレートに指向させて、そのプレートを照射した。プレートからの蛍光発光は、冷却CCDカメラを備えた干渉フィルターを通して画像化した。異なる波長で採取した画像は、MetaMorphソフトウェア（Universal Imaging）を使用してデジタル拡大して、スペクトルシフト突然変異体が同定できるようにした。選択した後、その突然変異体コロニーを手動で採取してLB/Amp培地中に入れ、次にその培養物を使用して、タンパク質調製またはプラスミド調製を行った。DsRed突然変異体配列を、色素−ターミネータージデオキシシークエンシングを用いて分析した。
【０１３４】
pRSETB発現ベクター（Bairdら、前述、1999参照）により提供されたＮ末端ポリヒスチジンタグ（配列番号21；実施例１を参照）を使用して、DsRedとその突然変異体を精製した。分光学的性状解析のために、Microcon-30（アミコン（Amicon））を使用して、このタンパク質を微量濃縮し、バッファーを10mMトリス（pH8.5）に交換した。あるいは、微量濃縮により大きなタンパク質凝集物が生成するので、オリゴマー化研究のためにそのタンパク質を10mMトリス（pH7.5）に対して透析した。タンパク質成熟の光感受性について試験するため、培養フラスコをホイルで包んで合成全体を暗所で繰り返し、さらにすべての精製は、赤色光の灯った薄暗い部屋で行った。タンパク質を明所または暗所で調製した場合に、タンパク質収量または色に差はなかった。
【０１３５】
アミノ酸の番号付けは、drFP583の野生型の配列（DsRed；Matzら、前述、1999）に一致し、残基66〜68のGln-Tyr-Glyは、GFPの発色団形成残基（65〜67、Ser-Tyr-Gly）と相同である。開始Metが「1a」と番号付けされた後にクロンテク（Clontech）により導入された追加のアミノ酸とＮ末端ポリヒスチジンタグの残基は、-33〜-1と番号付けされた。
【０１３６】
蛍光スペクトルは、Fluorolog分光蛍光光度計を使用して得た。タンパク質の吸収スペクトルは、Cary UV-Vis分光光度計を使用して得た。量子収率測定については、リン酸緩衝化生理食塩水中のDsRedまたはDsRed K83Mの溶液の蛍光を、同等な吸収を示すローダミンBとローダミン101のエタノール中溶液と比較した。量子収率算出においては、エタノールと水の間の屈折率の差異について補正を行った。吸光係数測定のために、未変性のタンパク質の吸光度を分光光度計で測定し、タンパク質濃度は、BCA法（ピアス（Pierce））により測定した。
【０１３７】
DsRedのpH感受性は、96ウェルフォーマットで、弱緩衝化溶液中に希釈したDsRed 100μlを強緩衝化pH溶液100μlに添加する（全部で200μl／ウェル）ことを、pH３〜pH12について３回行うことにより測定した。各ウェルの蛍光は、525〜555nm帯域通過励起フィルターと575nmロングパス発光フィルターを使用して測定した。96ウェルの蛍光計測定値を得た後に、100μlの各pH緩衝化DsRed溶液を分光蛍光光度計で分析して、pH依存的なスペクトル形の変化を観察した。DsRed成熟のタイムトライアルについて、新たに合成し精製したDsRedの希釈溶液を10mMトリス（pH8.5）中に作製し、この溶液を、栓をしたキュベット（気密ではない）で室温にて保存し、定期的にスペクトルを測定した。突然変異体成熟データについて、合成および精製の直後に、そして４℃または室温で２ヶ月以上保存した後に、蛍光発光スペクトル（475nmまたは558nmで励起）を得た。
【０１３８】
光破壊に関する量子収率は、顕微鏡ステージまたは分光蛍光光度計で別々に測定した。顕微鏡スライド上で油の下にDsRed水溶液の微小液滴を作製し、525〜555nmの帯域通過フィルターを通した1.2 W/cm2の光でブリーチ（bleach）した。蛍光を、同じフィルターと563〜617nm発光フィルターを使用して経時的にモニターした。比較のために、EGFP（突然変異F64L、S65Tを含有する；配列番号６）とEYFP-V68L/Q69K（これも、突然変異S65G、S72A、T203Yを含有する；配列番号10）微小液滴に、同様に、460〜490nmで1.9 W/cm2によってブリーチし、それぞれ515〜555nmと523〜548nmでモニターした。
【０１３９】
分光蛍光光度計ブリーチング実験のために、DsRedの溶液を、長方形のマイクロキュベット中に調製し、油を重層し、全50μlのタンパク質溶液が0.25cm×0.2cm×１cmの照射体積として存在するようにした。このタンパク質溶液に、558nmを中心とする（帯域幅５nm）モノクロメータからの0.02 W/cm2の光を照射した。蛍光を、558nmの励起（帯域幅1.25nm）と583nmの発光で経時的に測定した。光ブリーチングに関する量子収率（Φ）は、式Φ＝（ε・Ｉ・t90%）-1（ここで、εは吸光係数（cm2mol-1）、Ｉは入射光の強度（アインシュタイン・cm-2s-1）であり、t90%は、蛍光団が90％ブリーチされるのにかかる時間（秒）である（Adamsら、J. Am. Chem. Soc. 110:3312-3320, 1988, これは、参照することにより本明細書に組み込まれる）から導かれる。
【０１４０】
ポリヒスチジンタグ付加DsRed、DsRed K83Mおよび野生型のエクオレア（Aequorea） GFP（配列番号２）を、非変性の15％ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。変性を防ぐために、タンパク質溶液（10mMトリス塩酸、pH7.5中）を２×SDS-PAGEサンプルバッファー（200mMのジチオスレイトールを含有）と１：１で混合し、沸騰させずに直接ゲルにロードした。あらかじめ染色してある広範囲分子量マーカーセット（バイオラッド（BioRad））を、サイズ標準物質として使用した。次に、Epson1200 Perfectionフラットベッドスキャナーで、ゲルをイメージングした。
【０１４１】
精製した組換えDsRedを、リン酸緩衝化生理食塩水（pH7.4）または10mMトリス、１mM EDTA（pH7.5）に対して充分透析した。Beckman Optima XL-1分析用超遠心分離機で、558nmの吸光度を半径の関数として測定しながら、20℃で沈降平衡実験を行った。3.57μM DsRedの125μlのサンプル（0.25吸光度単位）を、６チャネルのセルにロードした。Originソフトウェアパッケージ（ベックマン（Beckman））を使用して、非線形最小自乗解析により、10,000rpm、14,000rpm、および20,000rpmでのデータを包括的に解析した。適合の良好性を、実験データと理論曲線の間の差として表した誤差の大きさとランダム性に基づいて、また物理学的妥当性について各適合パラメータをチェックすることにより、評価した。
【０１４２】
未成熟型緑色DsRedと成熟型赤色DsRedとの間のFRETを、哺乳動物細胞で調べた。ベクターpcDNA3中のDsRedを、リポフェクチンを使用してHeLa細胞中にトランスフェクトし、24時間後、細胞を蛍光顕微鏡でイメージングした。未成熟型緑色種（励起465〜495nm、505nm二色性、発光523〜548nm）および成熟型赤色タンパク質（励起529〜552nm、570nm二色性、発光563〜618nm）の蛍光を、冷却CCDカメラで測定した。累積継続時間３、６、12、24、および49分間にわたり、570nm二色性のみでフィルターをかけたキセノンランプからの光を照射して、赤色成分の選択的光ブリーチングを行った後に、これらの測定を繰り返した。最終時間までに、約95％の初期赤色発光が消失し、一方緑色発光は大幅に増強された。
【０１４３】
酵母２ハイブリッドアッセイも行った。pGAD GHとpGBT9ベクター（クロンテク（Clontech））中の、それぞれGal4活性化ドメイン（「餌」；アミノ酸残基768〜881）とDNA結合ドメイン（「獲物」；アミノ酸残基１〜147）の下流に、DsRedコード領域をイン・フレームでクローン化した。これらのDsRed ２ハイブリッドプラスミドを、Ｓ.セレビシエ（S. cerevisiae）のHF7C株（これは、Gal4断片に融合させた上記タンパク質の間の相互作用が無い場合、ヒスチジンを合成できない）中に形質転換した。DsRed−餌プラスミドとDsRed−獲物プラスミドの両方を含有する酵母を、ヒスチジン欠如培地上にストリークし、プレートを視覚的に検査して増殖を測定した。あるいは酵母を、トリプトファンとロイシンが欠如したプレート上に置いたフィルター上で増殖させて、餌プラスミドと獲物プラスミドについて選択した。一晩増殖後、プレートからフィルターを取り出し、液体窒素中で凍結し、融解し、X-gal中で30℃で一晩と４℃で２日間インキュベートして、β−ガラクトシダーゼ活性（青色の発色により測定）について試験した。β−ガラクトシダーゼとヒスチジン増殖アッセイの両方で、陰性対照は、餌と獲物プラスミドを含有するが、その餌または獲物のいずれかだけがDsRedに融合されている酵母からなっていた。
【０１４４】
驚くべきことに、DsRedは完全な赤色蛍光に達するのに室温で数日を要した。室温では、精製タンパク質のサンプルは、初め、主要成分として緑色蛍光（励起極大と発光極大はそれぞれ475nmと499nm）のを示し、これは約７時間で強度がピークに達し、２日間でほとんどゼロになった。一方、赤色蛍光は、約27時間後にその最大蛍光の半分に達し、最大蛍光の90％を超えるまでに達するのに48時間以上を要した（Bairdら、前述、2000参照）。
【０１４５】
完全に成熟したDsRedは、その558nmの吸収極大で75,000M-1cm-1の吸光係数と、蛍光量子収率0.7を有し、これは、従来報告されている（Matzら、前述、1999）22,500M-1cm-1および0.23という値よりはるかに大きい。これらの性質は、波長と光度の点で成熟型DsRedを、ローダミン色素と極めて似たものにしている。多くのGFP変異体と異なりDsRedは、pH５〜12での吸光度または蛍光のpH依存性は無視できる程度（＜10％）であった（Bairdら、前述、2000）。しかし、pH４〜4.5への酸性化は、526nmでのより短い波長ショルダーと比較して、558nmでの吸光度と励起の両方を抑制したが、一方発光スペクトルの形は変化させなかった。DsRedはまた、光ブリーチングに対して比較的抵抗性であった。顕微鏡ステージ中で1.2 W/cm2の約540nmの光線に暴露すると、油の下のDsRedの微小液滴は90％をブリーチするのに１時間を要し、一方分光蛍光光度計のマイクロキュベット中で20 mW/cm2の558nmの光では、90％をブリーチするのに83時間を要した。顕微鏡測定と蛍光計測定は、それぞれ1.06×10-6と4.8×10-7（平均7.7×10-7）の光ブリーチ量子効率をもたらした。EGFP（S65T；配列番号６）とEYFP-V68L/Q69K（配列番号10；Q69Kを含む）の同様の顕微鏡測定は、それぞれ３×10-6と５×10-5をもたらした。
【０１４６】
赤色発色団の性質を調べて生物学的指示物質として有用なDsRed変異体を同定するために、DsRedをランダムに、そしてGFPによる配列アラインメントにより発色団の近傍と予測される特定の部位について、突然変異誘発を行った。よりゆっくり成熟するかまたは全く成熟しない多くの変異体が同定されたが、DsRedより速く成熟するものは同定されなかった。ランダム突然変異体のスクリーニングにより、緑色または黄色を示す突然変異体が同定され、これは、置換K83E、K83R、S197T、およびY120Hによるものであることが判明した。緑色蛍光は、励起極大と発光極大がそれぞれ475nmと500nmを有する突然変異種によるものであり、一方黄色は、中間の波長での単一の分子種によるものではなく、この緑色種とDsRed様物質の混合物によるものであった。
【０１４７】
DsRed K83R突然変異体は、赤への変換パーセントが最も低く、DsRedの未成熟な発緑色蛍光形態の安定な種類として非常に有用であることがわかった（Bairdら、前述、2000）。K83のさらなる指向的突然変異誘発は、より多くの緑色突然変異体および黄色突然変異体を生成したが、これらは発色団成熟が障害されていた。成熟がゆっくりで不完全なK83突然変異体の多くは、赤色のピークは、DsRedより長い波長であった。K83Mの最終型赤色発蛍光種は、602nmの発光極大を示し、残存緑色蛍光が比較的少なく量子収率が0.44とかなりあるため特に興味深い。しかしその成熟は、野生型DsRedより遅かった。Y120Hは、K83Mに似た赤色シフトを有し、より明るい色の細菌コロニーを産生するようであったが、はるかに多くの残存緑色蛍光を維持していた。
【０１４８】
DsRed突然変異体の分光学的データを、表５に示す。タンパク質の「成熟」とは、タンパク質合成後の２日間にわたる赤色蛍光が現れる速度を意味する。一部の成熟は合成と精製（これは１〜２日要する）の際に起きるため、数字による定量は正確ではない。単純な＋／−評価法を使用し、ここで（−−）は、ほとんど変化無し、（−）は、赤色蛍光における２〜５倍の増強、（＋）は、５〜20倍の増強、および（＋＋）は、野生型の増強（約40倍）を示す。タンパク質合成の２ヶ月後に、同じサンプルからの558nm励起で得られたピーク発光蛍光を、475nm励起で得られた499nm蛍光で除算し、赤色／緑色比率を決定した。２つの分子種の間の吸光係数または量子収率における差について、またはその２つの分子種が巨大分子複合体中にある場合にはそれらの間のFRETの可能性について２つの分子種のモル比の補正は行わないので、前記値はその２つの分子種のモル比を表すものではない。
【表５】
2004530423.tif 000006
Lys70またはArg95がGFP様発色団（Tsien, Nature Biotechnol. 17:956-957, 1999参照）のカルボニル末端とイミンを形成することができるかどうかを調べるために、DsRed突然変異体K70M、K70R、およびR95Kを作製した。K70Mは、赤色成分を有さず完全に緑色のままであり、一方、K70Rはゆっくり成熟してわずかに赤色にシフトした赤色種になった。K70Rと野生型DsRedとのスペクトルの類似性は、いずれかのアミノ酸が発色団中に共有結合的に取り込まれるものではないことを示す。R95Kからは可視波長での蛍光は検出されなかったが、これは、Arg95はGFPのArg96（これは、今日までに性状解析されているすべての蛍光性タンパク質中で保存されている（（Matzら、前述、1999））と相同的であるため、予測されたことであろう。R95Kが緑色発色団を形成しなかったために、Arg95が赤色化にも必要かどうかの試験はしなかった。
【０１４９】
エクオレア（Aequorea） GFPが溶液中に高濃度でかつ何らかの結晶形でダイマーを形成している傾向があること、およびレニラ（Renilla） GFPが真正のダイマー（Ward、前述、1998）を形成している可能性があることを考慮して、DsRedがオリゴマー化する能力を調べた。発現されたタンパク質のSDS-PAGEによる最初の試験では、ポリヒスチジンタグ付加タンパク質DsRedとDsRed K83Rが、200mMのDTTと混合し、ゲルにのせる前に加熱しなかった場合に、110kDaより大きい見かけの分子量で、それぞれ赤色バンドと黄色−緑色バンドとして移動したことから、凝集物が形成されたことが示唆された（Bairdら、前述、2000）。これと比較して、エクオレア（Aequorea） GFPは、同様に処理すると、その予測されるモノマー分子量である30kDaに近い蛍光緑色バンドとして移動した。サンプルを、電気泳動前に短時間加熱すると、この高分子量のDsRedバンドは観察されなかった（Grossら、前述、2000）。これらの条件下では、予測されたモノマー分子量である30kDaに近いバンドが優勢であり、これはクーマシー染色を行わなければ無色であった。
【０１５０】
オリゴマー化状態をより厳密に測定するために、DsRedタンパク質を分析用平衡遠心分離（LaueとStafford、前述、1999）に付した。平衡化したDsRedの放射状スキャンから測定された吸光度データの全体的曲線あてはめにより、低塩濃度および生理学的塩濃度の両方で、DsRedは溶液中で真正のテトラマー（Bairdら、前述、2000）として存在することが示された。単一分子種のテトラマーでデータをモデル化する場合、適合させた分子量は119,083Daであったが、これは、ポリヒスチジンタグ付加DsRedのテトラマーについての理論分子量の119,068Daによく一致している。モノマーからペンタマーへの別の化学量論に曲線をあてはめる試みは、収束しないかまたは浮動変数と大きな非ランダム誤差について不適切な値を与えた。テトラマー適合についての誤差ははるかに小さく、よりランダムに分布していたが、真正のテトラマーがダイマー化して８量体になりうるようにモデルを拡大適用することによりさらにいくぶん改善されて、適合させた解離定数が39μMとなった。すなわち、558nmで吸収する分子種は、in vitroで14nM〜11μMのモノマー濃度範囲にわたってテトラマーであるようである。超遠心分離セル中で達成されたテトラマーの最高濃度でも、適合させた解離定数より１桁以上小さかったため、最も高濃度での８量体形成の徴候は示唆されているにすぎない。
【０１５１】
DsRedが生細胞中でもオリゴマー化するかどうかを確認するために、哺乳動物細胞と酵母細胞における２ハイブリッドアッセイで、FRET分析を行った。HeLa細胞が未成熟型緑色中間体と最終型赤色形態の混合物を含有する場合には、HeLa細胞を野生型DsRedでトランスフェクトし、24時間後にイメージングを行った。49分間にわたって強いオレンジ光を照射して赤色種を選択的に光ブリーチングする前およびその際に、緑色蛍光を断続的にモニターした。２つのタンパク質が会合していない場合、赤色種のブリーチングは、緑色蛍光に何の影響も無いだろうと予測された。しかし実際は、異なる細胞中で、緑色蛍光が2.7〜5.8倍に増加し、これはFRET効率の63％〜83％に対応していた。これらの値は、亜鉛イオン飽和亜鉛フィンガードメイン（MiyawakiとTsien、前述、2000）により結合したシアン蛍光性タンパク質と黄色蛍光性タンパク質についての、GFP突然変異体の間でこれまで観察された最も高いFRET効率である68％と等しいかまたはそれを超えるものである。
【０１５２】
in vivoオリゴマー化の追加の証拠は、指向的酵母２ハイブリッドスクリーニングにより提供される。Gal4 DNA結合ドメインと活性化ドメインへのDsRed融合体をHF7C酵母中で発現させると、その酵母は、his+表現型を示し、ヒスチジンの補充無しで増殖することができたが、このことは２ハイブリッド相互作用が起きていたことを示す。いずれの融合構築体も（DsRed-DNA結合ドメイン、またはDsRed-活性化ドメイン）単独では、his+表現型を産生せず、これはすなわち、非特異的DsRed-Gal4相互作用ではなく、DsRed-DsRed相互作用がその陽性の結果を引き起こすことを示している。さらに、his+酵母は、溶解しX-galとともにインキュベートすると青くなり、これはすなわち、DsRed-DsRed相互作用がまた、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の転写をも指令していることを示唆している。すなわち、酵母２ハイブリッドアッセイの２つの別個の転写測定により、DsRedがin vivoで会合することが確認された。
【０１５３】
DsRedのこの研究は、DsRedが、GFPを相補する上でまたはそのDNA代替物として有用である点で、好ましい性質ならびにいくつかの最適ではない性質を有することを明らかにした。同定された最も好ましい性質は、DsRedが、従来報告されているよりはるかに高い吸光係数と蛍光量子収率（0.7）を有することであり、それにより、成熟した充分折り畳まれたタンパク質の蛍光の明るさは、ローダミン色素および最適なGFPに匹敵する。
【０１５４】
DsRedはまた、分光蛍光光度計（mW/cm2）またはアークランプ照射と干渉フィルターを有する顕微鏡（W/cm2）に典型的な強度による光ブリーチングに対して非常に抵抗性であり、光ブリーチング量子収率が両方の形態で７×10-7のオーダーである。この値は、２つの最も一般的な緑色と黄色のGFP特異的変異体であるEGFP（３×10-6）とEYFP-V68L/Q69K（５×10-5）のものより著しく良好である。光ブリーチング前に単一の分子が発する光子の平均数は、蛍光と光ブリーチング量子収率の比率であり、すなわちDsRed、EGFP、およびEYFP-V68L/Q69Kについて、それぞれ１×106、２×105、および1.5×104である。ただし、分子を、例えばそこから蛍光を回収できるようなトリプレットや互変異性体のような暗い状態にすることができるなら、見かけの光ブリーチング量子収率は、強い光強度と短時間では大きく上昇するであろう。GFPは通常、ある範囲の暗い状態を示すので（Dicksonら、Nature 388:355-358, 1997；Schwilleら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:151-156, 2000)、DsRedがいくらかでもより純粋になることを期待する理由は無い。本明細書に記載の光ブリーチング測定は、数分〜数時間にわたって行われ、そのような回収のために充分な時間を含む。これに対して、蛍光相関分光測定とフローサイトメトリーは、マイクロ秒からミリ秒内に、集束レーザービームによって分子の単一の通過をモニターするので、通過時間より長く継続する一時的な暗い状態は、光ブリーチングとして計測され、ブリーチングの見かけの量子収率が上昇する。同定される分子が繰り返しスキャンされるレーザースキャニング共焦点顕微鏡のような技術は、照射と回収の時間スケールに依存して中間程度の光ブリーチングを示す。
【０１５５】
DsRedの別の好ましい特徴は、広範囲（pH4.5〜12）にわたる、pH変化に対するその感受性の小ささである。現在利用可能なより明るいGFP突然変異体は、酸性pHによってDsRedより急速にクエンチされる。そのようなpH感受性は、特に細胞小器官または他の特定の区画内で（Llpisら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6803-6808, 1998）、pH変化を感知するために、制御された条件下で利用することができるが、この特徴は、一部の適用では人為的結果を引き起こすことがある。
【０１５６】
K83MのようなDsRed変異体は、DsRedを、充分な量子効率（0.44）を保持しながら、より長波長（564nmと602nmの励起極大および発光極大）に近づけることができることを証明する。６nmと19nmの深色へのシフトは、191cm-1と541cm-1のエネルギーに対応し、これは、発色団を修飾しない単一のアミノ酸変化にとって、かなり大きい。最近イソギンチャクからクローン化されたDsRedの相同体は、572nmに吸収極大、595nmに量子収率＜0.001の極めて弱い発光を有し、１つの変異体は610nmに発光ピークを有するが、非常に暗く成熟が遅かった（Lukyanovら、J. Biol. Chem. 275:25879-25882, 2000、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）。
【０１５７】
DsRedのあまり好ましくない特徴には、その遅くて不完全な成熟と、オリゴマー化する能力がある。数日のオーダーの成熟時間は、短期間の遺伝子発現研究や、短い世代時間または速い成長を示す生物で融合タンパク質を追跡することを目的とする応用において、DsRedをレポーターとして使用することをはばんでいる。GFPの成熟は、突然変異誘発（Heimら、Nature 373:663-664, 1995、これは参照することにより本明細書に組み込まれる）により大きく加速されるため、DsRedを同様に突然変異誘発して、より速い成熟時間を有する変異体を単離することができる。
【０１５８】
Lys83変異体はすべて、少なくともある程度の成熟が可能になったことから、一級アミンがこの残基について直接の触媒的役割を果たす可能性は低く、この示唆は、化学的に最も保存的な置換（LysからArg）が、赤色の発色を大幅に妨害したという観察結果により支持される。Ser197は、最も保存的な可能な置換（SerからThr）が同様に、成熟を有意に遅らせたという点で、同様の結果を与えた。Lys83部位とSer197部位の突然変異は、別個のランダムな突然変異誘発実験で独立して数回現れ、そして興味深いことに、同じディスコソマ（Discosoma）種からの高度に相同なシアン蛍光性タンパク質であるdsFP483では、Lys83とSer197はそれぞれLeuとThrにより置換されている。後者の２つの突然変異のいずれかは、なぜdsFP483が決して赤色にならないかを説明できるかも知れない。Lys83とSer197以外の残基もまた、赤色への成熟に影響を与えた。
【０１５９】
DsRedのマルチマー性は、４つの別個の方向性の証拠により証明され、それらは、SDS-PAGE上のあらかじめ沸騰させない限りは遅い移動、分析用超遠心分離、哺乳動物細胞の未成熟型緑色形態から最終型赤色形態への強いFRET、およびHIS3およびLacZレポーター遺伝子を使用する酵母中の指向的２ハイブリッドアッセイである。分析用超遠心分離は、測定したモノマー濃度の全範囲（10-8〜10-5）にわたって、４つの真正の化学量論に最も明瞭な証拠を提供した。さらに、生細胞中の試験は、典型的な使用条件下で凝集が起きること、サイトゾルの還元性環境と未変性のタンパク質の存在を含むことが確認された。
【０１６０】
DsRedのオリゴマー化は、遺伝子発現のレポーターとしてのその使用を妨げないが、これは、例えば細胞中の宿主タンパク質の追跡または相互作用について調べるためにDsRedが宿主タンパク質に融合している場合に適用すると、人為的結果を与えることがありうる。それ自体の凝集傾向をもたない質量Mの宿主タンパク質について、DsRedとの融合は、少なくとも４つ（M+26kDa）の複合体の形成を引き起こすことがある。さらに、シグナル伝達における多くのタンパク質は、オリゴマー化により活性化されるので、DsRedへの融合およびその結果としての会合は、構成的シグナル伝達を引き起こすことがある。オリゴマー性の宿主タンパク質に関しては、DsRedへの融合により、化学量論の不一致、四次構造の立体障害、または大きな凝集物中の架橋を引き起こすことがある。実際、赤色カメレオン、すなわちシアン蛍光性タンパク質、カルモジュリン、およびカルモジュリン結合ペプチドの融合体、ならびにDsRedは、DsRedの代わりに黄色蛍光性タンパク質を有する対応する黄色カメレオンより、目に見える斑点を哺乳動物細胞中ではるかに形成し易い（Miyawakiら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:2135-2140, 1999）。
【０１６１】
上記実施例１に開示した結果は、DsRedの変異体を、GFPの変異体と同様に蛍光性タンパク質がオリゴマー化する傾向を低下させるかまたは排除するように、産生することができることを示す。非凝集性突然変異体（実施例１）を同定し単離するために、例えば酵母２ハイブリッドまたは他の同様のアッセイを使用して、非オリゴマー化DsRed変異体を構築して調べることができる。さらに、DsRedのＸ線結晶構造を調べて、DsRedの非オリゴマー化形態が生成されるように最適なアミノ酸残基が改変されていることを確認し、さらにオリゴマー化を低下させるかまたは排除するように修飾することが可能な追加の残基を同定することができる。
【実施例３】
【０１６２】
オリゴマー化傾向が低下したDsRed変異体
この実施例は、オリゴマー化を低下させるかまたは排除するようにGFP変異体中に導入されたものに対応する突然変異を、DsRedがテトラマーを形成する傾向を低下させるために、DsRed中に作製することもできることを示す。
【０１６３】
実施例１に記載の結果を考慮し、かつDsRed結晶構造を指針として、アミノ酸残基がDsRedオリゴマー化に関与する可能性があることを確認された。これらのアミノ酸の１つであるイソロイシン-125（I125）を選択したが、その理由は、オリゴマー中で、各サブユニットのI125残基が、互いに対になる様式で近くに存在しており、すなわち、ＡサブユニットのI125の側鎖は、ＣサブユニットのI125の側鎖から約４オングストロームであり、ＢサブユニットとＤサブユニットのI125残基も同様に位置している（図１参照）ためである。さらに、エクオレア（Aequorea） GFP変異体で同定されたものと同様に、I125側鎖が有する疎水性を示す領域は、サブユニット間相互作用に関与することが証明された（実施例１を参照）。これらの観察結果に基づき、I125について、陽性荷電アミノ酸である、Lys(K)とArg(R)の置換を含有するDsRed突然変異体を作製した。
【０１６４】
突然変異誘発の鋳型として、発現ベクターpRSETB（インビトロゲン（Invitrogen））中にサブクローニングしたDsRed cDNA（配列番号11；クロンテク（Clontech））を使用し、クイックチェンジ（QuickChange）突然変異誘発キット（実施例１参照）を使用してDsRed I125KとI125Rを調製した。突然変異誘発用のプライマー（突然変異コドンに下線を引いた）は以下の通りである：
I125K（順方向） 5'-TAC AAG GTG AAG TTCAAGGGC GTG AAC TTC CCC-3' （配列番号22）；
I125K（逆方向） 5'-GGG GAA GTT CAC GCCCTTGAA CTT CAC CTT GTA-3' （配列番号23）；
I125R（順方向） 5'-TAC AAG GTG AAG TTCCGCGGC GTG AAC TTC CCC-3' （配列番号24）；および
I125R（逆方向） 5'-GGG GAA GTT CAC GCCGCGGAA CTT CAC CTT GTA-3' （配列番号25）。
【０１６５】
突然変異タンパク質を標準的方法に従って調製し、記載のように（Bairdら、前述、2000）ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した。さらなる分析のために、DsRed I125RをPBSで十分に透析し、次に558nmの溶液の吸光度が0.1になるまでPBS中に希釈した。この溶液をBeckman XL-1分析用超遠心分離機でPBS中で10,000rpm、12,000rpm、14,000rpm、および20,000rpmで遠心分離した。558nmでの吸光度 対 半径を決定し、野生型テトラマーDsRedの対照（Bairdら、前述、2000）と比較した。
【０１６６】
DsRed I125Kは、赤色蛍光性になり、かつ未変性のタンパク質を非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析することにより示される通り、ダイマーとテトラマーの混合物であるタンパク質を生成した。DsRed I125Rの同様の分析により、このタンパク質がもっぱらダイマーであることが明らかになった。DsRed I125Rのダイマー状態を、分析用超遠心分離で確認したところ、残存テトラマーは検出されなかった。これらの結果は、Ａ：ＣサブユニットとＢ：Ｄサブユニットの間の相互作用を破壊することができ、それによりDsRed変異体がオリゴマー化する傾向を低下させることができることを示している（図１を参照）。Ａ：ＢとＣ：Ｄの接触部分を破壊する試みはしなかった。これらの結果は、実施例１に記載のGFP変異体のオリゴマー化を低下させるかまたは排除する方法が、オリゴマー化傾向を有する他の蛍光性タンパク質に一般的に適用できることを示す。
【実施例４】
【０１６７】
非オリゴマー化タンデムDsRedの調製と性状解析
この実施例は、タンデムDsRedタンパク質が、２つのDsRedモノマーを結合することにより形成されること、およびそのようなタンデムDsRedタンパク質が、DsRedに特徴的な発光スペクトルおよび励起スペクトルを維持するが、オリゴマー化はしないことを示す。
【０１６８】
tDsRedを構築するために、3'プライマー 5'-CCGGATCCCCTTTGGTGCTGCCCTCTCCGCTGCCAGGCTTGCCGCTGCCGCTGGTGCTGCCAAGGAACAGATGGTGGCGTCCCTCG-3'（配列番号27）を設計した。このプライマーは、DsRed（クロンテク（Clontech）のベクターpDsRed-N1から誘導される）の最後の25bpと重複し、リンカー配列GSTSGSGKPGSGEGSTKG（配列番号26）をコードしており、それに続いてpRSETB（インビトロゲン（Invitrogen））のBamHI部位とイン・フレームになるようにBamHI制限部位を有する。後に、上記プライマー配列が重複領域中に３つのミスマッチを含有し、哺乳動物発現については最適ではないいくつかのコドンを含有することが、確認された。従って、新しい3'プライマー 5'-CCGGATCCCCCTTGGTGCTGCCCTCCCCGCTGCCGGGCTTCCCGCTCCCGCTGGTGCTGCCCAGGAACAGGTGGTGGCGGCCCTCG-3'（配列番号28）も使用した。5'プライマー 5'-GTACGACGATGACGATAAGGATCC-3'（配列番号29）も、BamHI制限部位をpRSETBのBamHI部位とイン・フレームとなるように含有した。
【０１６９】
新しいリンカーを有するDsRedとDsRed I125RとのPCR増幅を、Taq DNAポリメラーゼ（ロシュ（Roche））とアニーリングプロトコール（40℃で２サイクル、43℃で５サイクル、45℃で５サイクル、および52℃で15サイクルを含む）を用いて行った。生じたPCR産物をアガロースゲル電気泳動で精製し、BamHI（ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs））で消化した。BamHIおよびウシ小腸ホスファターゼ（ニューイングランドバイオラボズ（New England Biolabs））処理ベクターを、His-6タグとイン・フレームであり、かつ5' BamHI認識部位と3' EcoRI認識部位の間に挿入されたDsRedまたはDsRed I125Rを有するpRSETBから、調製した。
【０１７０】
消化したPCR産物とベクターとをT4 DNAリガーゼ（NEB）でライゲーションした後、その混合物を使用して、熱ショックにより大腸菌（E. coli）DH5αを形質転換した。形質転換したコロニーを、抗生物質アンピシリンを補足したLB寒天プレート上で増殖させた。コロニーをランダムに採取し、標準的ミニプレップ法（キアゲン（Qiagen））によりプラスミドDNAを単離した。DNA配列決定を使用して、挿入配列の正しい配向を確認した。
【０１７１】
タンパク質を発現させるために、単離し配列決定したベクターを使用してコンピテントな大腸菌（E. coli）JM109(DE3)を形質転換した。LB寒天／アンピシリン上で増殖させた単一コロニーを使用して、１リットルのLB／アンピシリン培養液に接種し、次に225rpmで37℃で振盪しながら、そのブロスのOD600が0.5〜1.0になるまで増殖させた。IPTGを最終濃度100mg/lになるまで加え、培養物を、37℃で５時間（tDsRed）または室温で24時間（RT；tDsRed I125R）のいずれかにわたり、増殖させた。遠心分離（10分、5000rpm）して細胞を回収し、そのペレットを50mMトリス（pH7.5）中に再懸濁し、細胞をフレンチプレスに通す一回の通過によって溶解させた。製造業者により記載されたようにして、タンパク質をNi-NTA（キアゲン（Qiagen））クロマトグラフィーにより精製し、溶出バッファー中に保存したかまたは50mMトリス（pH7.5）中へ透析した。
【０１７２】
tDsRedとtDsRed I125Rの励起スペクトルと発光スペクトルならびに成熟時間について、タンパク質は、そのつながれていない相手のタンパク質と同様に挙動した。予測されるように、tDsRedは、RTで約12時間以内に可視蛍光を発するが、一方tDsRed I125Rは、有意な赤色が出現するのに数日を要した。tDsRed I125Rの成熟は最大約10日間続いた。励起極大と発光極大は、それぞれ558nmと583nmで一定であった。
【０１７３】
タンパク質をSDS-ポリアクリルアミド電気泳動で分析すると、タンデムダイマーにおける差が明らかになった。テトラマーの高い安定性のために、沸騰させなかったDsRedは、見かけの分子量約110kDaとして移動した。さらに、DsRedテトラマーに対応するゲル上のバンドは、その赤色蛍光を保持し、各モノマーの厳密なバレル構造が完全であることを示した。サンプルをロードする前に沸騰させると、DsRedは非蛍光性であり、かつおそらく変性しているため、約32kDaのモノマーとして泳動された。
【０１７４】
SDS-PAGE分析により、発現された赤色蛍光性タンパク質、tDsRedおよびtDsRed I125Rのタンデム構造を確認した。沸騰させていないtDsRedは、沸騰させていない正常DsRedと同じ見かけの分子量（約110kDa）として移動した。サンプルをゲルにロードする前に沸騰（変性）させた場合にのみ、その分子構造における差が明らかであった。沸騰させたtDsRedは見かけの分子量約65kDaとして移動し、これは、２つのDsRedモノマーの分子量とほぼ同じであり、一方、沸騰させたDsRedは、モノマーの分子量32kDaとして移動した。
【０１７５】
DsRed-I125RとtDsRed-I125Rについて、同様の比較を行った。これらをSDS-PAGEの前に沸騰しなかった場合、tDsRed-I125RとDsRed-I125Rは両方とも、見かけの分子量約50kDaのダイマーとして移動した。沸騰させなかったDsRed-I125Rはまた、変性したようと思われる大きな成分を有するが、ダイマー（50kDa）の蛍光バンドがはっきりと認められた。tDsRed-I125Rもまた、完全な蛍光性分子種よりゆっくり移動する変性成分（50kDaに対して65kDa）を有していた。しかし、沸騰させると、tDsRed-I125Rは２つのモノマーとほぼ同じ分子量（65kDa）で移動し、一方DsRed-I125Rは32kDaのモノマー分子量で移動した。
【０１７６】
これらの結果は、２つのDsRedモノマーを結合して分子内結合したタンデムダイマーを形成させると、赤色蛍光性タンパク質の発光スペクトルまたは励起スペクトルに影響を与えることなく、分子間オリゴマーの形成が防げられることを示す。
【０１７７】
本発明を上記実施例を参照して説明したが、その改変態様や変更態様も本発明の着想および範囲に包含されることは理解されるであろう。従って、本発明は、以下の請求項によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】DsRedのテトラマー型を例示する（PDB識別コード1G7K）。A-CとB-D接触部分は同等であり、A-BとC-D接触部分と同様である。サブユニットの標識は任意であり、従ってこの図で使用される表記は1G7Kとは異なるが、PDB提出の1GGKと一致する。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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