(57)【要約】本発明は、ＲＮＡ又はＤＮＡの選択された配列と特異的にハイブリダイズするオリゴマーであって、該オリゴマーの少なくとも１つのヌクレオシド部分がグアニジニウム基を含むように修飾されたオリゴマーを提供する。これらオリゴマーは、診断、治療及び研究目的に有用である。
2004500330.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：
【化１】
2004500330.tif 000019
（式中：
Ｂｘはヘテロ環式塩基であり；
Ｔ１ は、ＯＨ又は保護化ヒドロキシル基であり；
Ｔ２ は、活性化リン基であるか又は固形支持体へ付いた連結部分であり；
Ｔ３ は、Ｈ、ＯＨ、保護化ヒドロキシル又は糖置換基である。）
のモノマーであって、前記モノマーは、少なくとも１つの基Ｒ１ をそのなかにさらに含んでなり；前記Ｒ１ 基が、少なくとも１つのＴ１ 、Ｔ２ 又はＴ３ の所にか又は少なくとも１つのＢｘ上の置換基として存在し；前記Ｒ１ 基が、式：
【化２】
2004500330.tif 000020
（式中：
それぞれのＺは、独立して、単結合、Ｏ、Ｎ又はＳであり；
それぞれのＲ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は、独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ５ 、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基又はコンジュゲート基であって、該置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択され；
又は、Ｒ３ 及びＲ４ は、一緒にＲ７ となり、Ｒ３’及びＲ４’は、一緒にＲ７’となり；
それぞれのＲ５ は、独立して、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールであり；
それぞれのＲ７ 及びＲ７’は、独立して、水素であるか又はそれが付いた窒素原子とともにフタルイミド部分を形成し；
それぞれのｍは、独立して、０又は１であり；及び
それぞれのｎは、独立して、１〜約６の整数である。）
の１つを有するモノマー。
【請求項２】
Ｔ１ がＯ−ジメトキシトリチルである、請求項１に記載のモノマー。
【請求項３】
Ｔ１ がＯ−モノメトキシトリチルである、請求項１に記載のモノマー。
【請求項４】
Ｔ２ がホスホロアミダイトである、請求項１に記載のモノマー。
【請求項５】
Ｔ２ がスクシニルＣＰＧである、請求項１に記載のモノマー。
【請求項６】
Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’の少なくとも１つがＣ（Ｏ）Ｒ５ であり、Ｒ５ がシアノエチルオキシである、請求項１に記載のモノマー。
【請求項７】
Ｒ３ 及びＲ３’がＣ（Ｏ）Ｒ５ であり、Ｒ５ がシアノエチルオキシである、請求項１に記載のモノマー。
【請求項８】
Ｔ３ がＲ１ である、請求項１に記載のモノマー。
【請求項９】
Ｂｘがピリミジンヘテロ環式塩基である、請求項１に記載のモノマー。
【請求項１０】
Ｒ１ がＢｘの４位でアミノ基に共有結合している、請求項９に記載のモノマー。
【請求項１１】
Ｒ１ がＢｘのＣ５に共有結合している、請求項９に記載のモノマー。
【請求項１２】
Ｂｘがプリンヘテロ環式塩基である、請求項１に記載のモノマー。
【請求項１３】
Ｒ１ がＢｘの２位でアミノ基に共有結合している、請求項１２に記載のモノマー。
【請求項１４】
Ｒ１ がＢｘの６位でアミノ基に共有結合している、請求項１２に記載のモノマー。
【請求項１５】
前記ヘテロ環式塩基が７−デアザプリンである、請求項１に記載のモノマー。
【請求項１６】
Ｒ１ がＢｘの７−デアザ位で共有結合している、請求項１５に記載のモノマー。
【請求項１７】
Ｂｘがジアミノプリンヘテロ環式塩基である、請求項１に記載のモノマー。
【請求項１８】
Ｒ１ がＢｘの６位でアミノ基に共有結合している、請求項１７に記載のモノマー。
【請求項１９】
式：
【化３】
2004500330.tif 000021
（式中：
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基であり；
それぞれのＴ１ 及びＴ２ は、独立して、ＯＨ、保護化ヒドロキシル、ヌクレオチド、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドであり；
Ｔ３ は、Ｈ、ＯＨ、保護化ヒドロキシル又は糖置換基である。）
のヌクレオチド単位を複数含んでなるオリゴマーであって、前記オリゴマーは、少なくとも１つの基Ｒ１ をそのなかにさらに含んでなり；前記Ｒ１ 基が、少なくとも１つのＴ３ の所にか又は少なくとも１つのＢｘ上の置換基として３’ 末端、５’ 末端に存在し；前記Ｒ１ 基が、式：
【化４】
2004500330.tif 000022
（式中：
それぞれのＺは、独立して、単結合、Ｏ、Ｎ又はＳであり；
それぞれのＲ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は、独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ５ 、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基又はコンジュゲート基であって、該置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択され；
又は、Ｒ３ 及びＲ４ は、一緒にＲ７ となり、Ｒ３’及びＲ４’は、一緒にＲ７’となり；
それぞれのＲ５ は、独立して、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールであり；
それぞれのＲ７ 及びＲ７’は、独立して、水素であるか又はそれが付いた窒素原子とともにフタルイミド部分を形成し；
それぞれのｍは、独立して、０又は１であり；及び
それぞれのｎは、独立して、１〜約６の整数である。）
の１つを有するオリゴマー。
【請求項２０】
Ｒ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’が水素である、請求項１９に記載のオリゴマー。
【請求項２１】
Ｒ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’が水素であり、ｍが０であり、ｎが２である、請求項１９に記載のオリゴマー。
【請求項２２】
前記Ｒ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’の少なくとも１つがコンジュゲート基である、請求項１９に記載のオリゴマー。
【請求項２３】
前記コンジュゲート基が、コントラスト試薬、切り離し剤、細胞標的指向性物質、ポリエチレングリコール、コレステロール、リン脂質、ビオチン、フェナントロリン、フェナジン、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、ピレン、レチナール又はシアニン色素である、請求項２２に記載のオリゴマー。
【請求項２４】
Ｔ３ がＲ１ である、請求項１９に記載のオリゴマー。
【請求項２５】
Ｂｘがピリミジンヘテロ環式塩基である、請求項１９に記載のモノマー。
【請求項２６】
Ｒ１ がＢｘの４位でアミノ基に共有結合している、請求項２５に記載のオリゴマー。
【請求項２７】
Ｒ１ がＢｘのＣ５に共有結合している、請求項２５に記載のオリゴマー。
【請求項２８】
Ｂｘがプリンヘテロ環式塩基である、請求項１９に記載のオリゴマー。
【請求項２９】
Ｒ１ がＢｘの２位でアミノ基に共有結合している、請求項２８に記載のオリゴマー。
【請求項３０】
Ｒ１ がＢｘの６位でアミノ基に共有結合している、請求項２８に記載のオリゴマー。
【請求項３１】
Ｂｘがジアミノプリンヘテロ環式塩基である、請求項１９に記載のオリゴマー。
【請求項３２】
Ｒ１ がＢｘの６位でアミノ基に共有結合している、請求項３１に記載のオリゴマー。
【請求項３３】
Ｒ１ がＢｘの２位でアミノ基に共有結合している、請求項３１に記載のオリゴマー。
【請求項３４】
Ｂｘが７−デアザプリンである、請求項１９に記載のオリゴマー。
【請求項３５】
Ｒ１ がＢｘの７−デアザ位で共有結合している、請求項３４に記載のオリゴマー。
【請求項３６】
オリゴマーを製造する方法であって：
（ａ）式：
【化５】
2004500330.tif 000023
（式中：
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基であり；
Ｔ１ は、ＯＨ又は保護化ヒドロキシル基であり；
Ｔ２ は、固形支持体へ付いた連結部分であり；
Ｔ３ は、Ｈ、ＯＨ、保護化ヒドロキシル又は糖置換基である。）
のモノマーであって、前記モノマーは、少なくとも１つの基Ｒ１ をそのなかにさらに含んでなり；前記Ｒ１ 基が、少なくとも１つのＴ１ 、Ｔ２ 又はＴ３ の所にか又は少なくとも１つのＢｘ上の置換基として存在し；
但し、Ｔ２ がＲ１ である場合、Ｔ３ は、固形支持体に付いた連結部分であり；
前記Ｒ１ 基が、式：
【化６】
2004500330.tif 000024
（式中：
それぞれのＺは、独立して、単結合、Ｏ、Ｎ又はＳであり；
それぞれのＲ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は、独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ５ 、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基又はコンジュゲート基であって、該置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択され；
又は、Ｒ３ 及びＲ４ は、一緒にＲ７ となり、Ｒ３’及びＲ４’は、一緒にＲ７’となり；
それぞれのＲ５ は、独立して、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールであり；
それぞれのＲ７ 及びＲ７’は、独立して、水素であるか又はそれが付いた窒素原子とともにフタルイミド部分を形成し；
それぞれのｍは、独立して、０又は１であり；及び
それぞれのｎは、独立して、１〜約６の整数である。）
の１つを有するモノマーを選択する工程；
（ｂ）５’ 位の保護化ヒドロキシル基を脱保護化して、脱保護化モノマーを形成する工程；
（ｃ）前記脱保護化モノマーを、式：
【化７】
2004500330.tif 000025
（式中：
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基であり；
Ｔ１ は、ＯＨ又は保護化ヒドロキシル基であり；
Ｔ２ は、活性化リン基であり；
Ｔ３ は、Ｈ、ＯＨ、保護化ヒドロキシル又は糖置換基である。）
の第二のモノマーであって、前記モノマーは、少なくとも１つの基Ｒ１ をそのなかにさらに含んでなり；前記Ｒ１ 基が、少なくとも１つのＴ１ 、Ｔ２ 又はＴ３ の所にか又は少なくとも１つのＢｘ上の置換基として存在し；
但し、Ｔ２ がＲ１ である場合、Ｔ３ は、活性化リン基であり；
前記Ｒ１ 基が、式：
【化８】
2004500330.tif 000026
（式中：
それぞれのＺは、独立して、単結合、Ｏ、Ｎ又はＳであり；
それぞれのＲ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は、独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ５ 、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基又はコンジュゲート基であって、該置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択され；
又は、Ｒ３ 及びＲ４ は、一緒にＲ７ となり、Ｒ３’及びＲ４’は、一緒にＲ７’となり；
それぞれのＲ５ は、独立して、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールであり；
それぞれのＲ７ 及びＲ７’は、独立して、水素であるか又はそれが付いた窒素原子とともにフタルイミド部分を形成し；
それぞれのｍは、独立して、０又は１であり；及び
それぞれのｎは、独立して、１〜約６の整数である。）
の１つを有する第二モノマーとカップリングさせる工程であって、前記カップリングが活性化剤の存在下で起こってカップルした化合物を形成させる工程；
（ｄ）前記カップルした化合物をキャッピング試薬でキャッピングして、ヌクレオチド間連結を有するキャップされた化合物を形成する工程；
（ｅ）前記ヌクレオチド間連結を酸化試薬で酸化する工程；及び
（ｆ）工程（ｂ）〜（ｅ）を繰り返してオリゴマーを形成する工程
を含んでなる方法。
【請求項３７】
（ｇ）前記オリゴマーを切り離し試薬で開裂させる工程
をさらに含んでなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記切り離し試薬が水性塩基である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記水性塩基の濃度が１０〜８０％である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記塩基が、ピペリジン、モルホリン、ピペラジン、ジエチルアミン又はメチルアミンである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記塩基が５０％水性ピペリジンである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記活性化試薬が、テトラゾール、トリフルオロ酢酸ピリジニウム又はジシアノイミダゾールである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記キャッピング試薬が、無水酢酸及びＮ−メチルイミダゾールである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
前記酸化試薬が、ヨウ素、カンファースルホニルオキサジリジン、過酸化ｔ−ブチル水素又はＢｅａｕｃａｇｅ試薬である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
式：
【化９】
2004500330.tif 000027
（式中：
それぞれのＸは、独立して、シアノエチルオキシ、ベンジルオキシ、ｔ−ブトキシ、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、トリフルオロメチル、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールである。）
の化合物。
【請求項４６】
Ｘがシアノエチルオキシである、請求項４５に記載の化合物。
【請求項４７】
Ｘがフェニルである、請求項４５に記載の化合物。
【請求項４８】
Ｘがｔ−ブチルである、請求項４５に記載の化合物。
【請求項４９】
式：
【化１０】
2004500330.tif 000028
（式中：
Ｘは、Ｃ３ 〜Ｃ１０アルキル、Ｃ６ 〜Ｃ２４アリール、Ｃ６ 〜Ｃ２４ヘテロアリール、Ｃ４ 〜Ｃ２０脂肪族環、少なくとも１つのヘテロ原子、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを有するＣ４ 〜Ｃ２０脂肪族環であり；
Ｙ１ は、ヒドロキシル保護基であり；
Ｙ２ は、活性化リン基であるか又は固形支持体へ付いた連結部分であり；
それぞれのＲ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は、独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ５ 、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基又はコンジュゲート基であって、該置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択され；
又は、Ｒ３ 及びＲ４ は、一緒にＲ７ となり、Ｒ３’及びＲ４’は、一緒にＲ７’となり；
それぞれのＲ５ は、独立して、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールであり；
それぞれのＲ７ 及びＲ７’は、独立して、水素であるか又はそれが付いた窒素原子とともにフタルイミド部分を形成し；及び
ｎは１〜約６の整数である。）
の１つを有する化合物。
【請求項５０】
Ｙ１ がジメトキシトリチルである、請求項４９に記載の化合物。
【請求項５１】
Ｙ１ がモノメトキシトリチルである、請求項４９に記載の化合物。
【請求項５２】
Ｙ２ がホスホロアミダイトである、請求項４９に記載の化合物。
【請求項５３】
Ｙ２ が固形支持体に付いた連結部分である、請求項４９に記載の化合物。
【請求項５４】
Ｙ２ がスクシニルＣＰＧである、請求項４９に記載の化合物。
【請求項５５】
式：
【化１１】
2004500330.tif 000029
（式中：
それぞれのＲ６ 及びＲ６’は、独立して、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールである。）の化合物。
【請求項５６】
式：
【化１２】
2004500330.tif 000030
（式中：
それぞれのＲ６ 及びＲ６’は、独立して、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールである。）の化合物。
【請求項５７】
オリゴマーを一本鎖の核酸とハイブリダイズすることを含んでなる遺伝子発現をモジュレートする方法であって、前記オリゴマーが式：
【化１３】
2004500330.tif 000031
（式中：
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基であり；
それぞれのＴ１ 及びＴ２ は、独立して、ＯＨ、保護化ヒドロキシル、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドであり；
Ｔ３ は、Ｈ、ＯＨ、保護化ヒドロキシル又は糖置換基である。）
のヌクレオチド単位を複数含んでなるオリゴマーであって、前記オリゴマーは、少なくとも１つの基Ｒ１ をそのなかにさらに含んでなり；前記Ｒ１ 基が、少なくとも１つのＴ３ の所にか又は少なくとも１つのＢｘ上の置換基として３’ 末端、５’ 末端に存在し；前記Ｒ１ 基が、式：
【化１４】
2004500330.tif 000032
（式中：
それぞれのＺは、独立して、単結合、Ｏ、Ｎ又はＳであり；
それぞれのＲ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は、独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ５ 、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基又はコンジュゲート基であって、該置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択され；
又は、Ｒ３ 及びＲ４ は、一緒にＲ７ となり、Ｒ３’及びＲ４’は、一緒にＲ７’となり；
それぞれのＲ５ は、独立して、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールであり；
それぞれのＲ７ 及びＲ７’は、独立して、水素であるか又はそれが付いた窒素原子とともにフタルイミド部分を形成し；
それぞれのｍは、独立して、０又は１であり；及び
それぞれのｎは、独立して、１〜約６の整数である。）
の１つを有する方法。
【請求項５８】
オリゴマーを二本鎖の核酸とハイブリダイズすることを含んでなる遺伝子発現をモジュレートする方法であって、前記オリゴマーが式：
【化１５】
2004500330.tif 000033
（式中：
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基であり；
それぞれのＴ１ 及びＴ２ は、独立して、ＯＨ、保護化ヒドロキシル、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドであり；
Ｔ３ は、Ｈ、ＯＨ、保護化ヒドロキシル又は糖置換基である。）
のヌクレオチド単位を複数含んでなるオリゴマーであって、前記オリゴマーは、少なくとも１つの基Ｒ１ をそのなかにさらに含んでなり；前記Ｒ１ 基が、少なくとも１つのＴ３ の所にか又は少なくとも１つのＢｘ上の置換基として３’ 末端、５’ 末端に存在し；前記Ｒ１ 基が、式：
【化１６】
2004500330.tif 000034
（式中：
それぞれのＺは、独立して、単結合、Ｏ、Ｎ又はＳであり；
それぞれのＲ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は、独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ５ 、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基又はコンジュゲート基であって、該置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択され；
又は、Ｒ３ 及びＲ４ は、一緒にＲ７ となり、Ｒ３’及びＲ４’は、一緒にＲ７’となり；
それぞれのＲ５ は、独立して、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールであり；
それぞれのＲ７ 及びＲ７’は、独立して、水素であるか又はそれに付いた窒素原子とともにフタルイミド部分を形成し；
それぞれのｍは、独立して、０又は１であり；及び
それぞれのｎは、独立して、１〜約６の整数である。）
の１つを有する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【関連出願データ】
本特許出願は、１９９９年７月７日に出願された特許出願第０９／３４９，０４０号の一部継続出願であり、その内容は参照により本明細書に組込まれる。
【０００２】
【発明の分野】
本発明は、グアニジニウム部分を含有するモノマー及びオリゴマーとそのようなオリゴマーを製造する方法に関する。本発明のオリゴマーは研究及び治療の目的に使用される。
【０００３】
【発明の背景】
哺乳動物の身体状態のほとんどは、たいていの病的状態を含め、タンパク質により影響されることがよく知られている。一般に、典型的な治療様式は、タンパク質の疾患起因又は疾患増悪機能を緩和する努力において、そのようなタンパク質との相互作用に集中してきた。しかしながら、最近は、細胞内ＲＮＡのような、タンパク質の合成を指令する分子との相互作用によりそのようなタンパク質の実際の産生を緩和するための試みがなされている。タンパク質の産生に干渉することによって、最大の治療効果と最少の副作用が実現されるかもしれない。所望されないタンパク形成につながる遺伝子発現に干渉するか又は他のやり方でモジュレートすることがそのような治療アプローチの一般的な目的である。
【０００４】
特定の遺伝子発現を阻害する１つの方法は、オリゴヌクレオチドの使用である。オリゴヌクレオチドは、今日、大変有望な治療薬剤として受入れられている。オリゴヌクレオチドは、一本鎖のＤＮＡ又はＲＮＡ分子にハイブリダイズすることが知られている。ハイブリダイゼーションとは、標的ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の核酸塩基に対する、オリゴヌクレオチドの核酸塩基の配列特異的な塩基対の水素結合である。そのような核酸塩基対は互いに相補的であると言われる。標的ＲＮＡ分子に対するオリゴヌクレオチドの配列特異的な結合の使用を介して遺伝子発現を阻害するという概念は、アンチセンス阻害としても知られていて、生きている細胞を含む多種多様な系において証明されてきた（例えば、Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ （１９９３） ２６０： １５１０−１５１３； Ｍｉｌｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， （１９９３） ３６： １９２３−３７； Ｕｈｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｒｅｖｉｅｗｓ， （１９９０） ９０： ５４３−５８４； Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， （１９８８） ４８： ２６５９−２６６８を参照のこと）。
【０００５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドにより核酸機能の破壊を提供する事象（Ｃｏｈｅｎ， Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ： Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， （１９８９）ＣＲＣプレス社、ボカラトン、ＦＬ）には２つのタイプがあると考えられている。第一の、ハイブリダイゼーションアレストは、オリゴヌクレオチド阻害剤が標的核酸に結合し、それにより、単純な立体障害によって、必須タンパク質、ほとんどたいていはリボソームの核酸への結合を阻害するという終止の事象を示す。メチルホスホネートオリゴヌクレオチド（Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｔｓ’Ｏ， Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， １９８７， ２： １１７−１２８）とα−アノマーオリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションアレストにより核酸機能を破壊すると考えられている、２種の最も詳しく研究されたアンチセンス薬剤である。
【０００６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドについての第二のタイプの終止事象は、細胞内ＲＮアーゼＨによる標的ＲＮＡの酵素的開裂に関する。２’ −デオキシリボフラノシルオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド類似体は標的ＲＮＡとハイブリダイズし、この二重鎖がＲＮアーゼＨ酵素を活性化してＲＮＡ鎖を開裂し、それによりこのＲＮＡの正常な機能を破壊する。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、このタイプのアンチセンス終止事象により作動するアンチセンス薬剤の最も有名な事例である。
【０００７】
オリゴヌクレオチドはまた、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ 塩基対合を介した配列特異的なやり方で二重鎖核酸とも結合し、三重鎖複合体を形成する（Ｂｅａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， （１９９１） ２５１： １３６０−１３６３； Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （１９９１） ８８： １００２３−１００２６）。アンチセンスと三重らせんのいずれの治療戦略も、病的状態を確定するか又は維持するのに関与するか又はその原因となる核酸配列に対して向けられる。そのような標的核酸配列は、細菌、酵母、真菌、原生動物、寄生虫、ウイルスを含む病原生物のゲノムに見出し得るか、又は自然界に内在している可能性がある。病的状態の確定、維持、又は消失に重要な遺伝子にハイブリダイズし、その発現を変化させることによって、対応する病態が治癒、予防、又は改善される可能性がある。
【０００８】
相補的な核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度を決定する場合、相補的な核酸に結合するオリゴヌクレオチドの相対能力は、特定のハイブリダイゼーション複合体の溶融温度を定量することによって比較し得る。溶融温度（Ｔｍ ）は、二重らせんに特徴的な物理特性であり、ヘリカル（ハイブリダイズしている）とコイル（ハイブリダイズしていない）の形態がそれぞれ５０％存在している温度（摂氏）である。Ｔｍ を測定するには、ＵＶスペクトルを用いて、ハイブリダイゼーション複合体の形成及び分解（溶融）を定量する。ハイブリダイゼーションの間に起こる塩基のスタッキングに伴って、ＵＶ吸収は減少する（浅色効果）。従って、ＵＶ吸収の減少は、Ｔｍ がより高いことを示す。Ｔｍ がより高ければ、鎖間の結合強度はより大きい。
【０００９】
オリゴヌクレオチドはまた、細胞内又は細胞外のポリペプチド、タンパク質、又は酵素のような非核酸生物分子に結合する場合にも治療価値があり得る。そのようなオリゴヌクレオチドは、しばしば“アプタマー”と呼ばれ、それらは典型的にタンパク質標的の機能に干渉する（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， （１９９３）， ８１： ３２７１−３２７６； Ｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， （１９９２） ３５５： ５６４−５６６）。
【００１０】
オリゴヌクレオチドとその類似体は診断目的、治療応用のため、及び研究試薬として開発され、使用されてきた。治療薬としての使用には、オリゴヌクレオチドは細胞膜を通して輸送されるか、又は細胞によって吸収され、標的ＤＮＡ又はＲＮＡに適切にハイブリダイズしなければならない。上記の緊要な機能はヌクレアーゼ分解に対するオリゴヌクレオチドの最初の安定性に依存する。治療目的の標的ＤＮＡ又はＲＮＡとのハイブリダイゼーション可能性に影響を及ぼす非修飾オリゴヌクレオチドの由々しき欠点は、ヌクレアーゼと言われる多種多様な細胞内及び細胞外の普遍的な核酸分解酵素により、投与されたオリゴヌクレオチドが酵素分解されることである。オリゴヌクレオチドが治療薬又は診断薬として有用であるためには、オリゴヌクレオチドは相補的な標的核酸に対して強められた結合親和性を示し、好ましくは、合理的にもヌクレアーゼに対して安定で、分解に抵抗すべきである。研究試薬のような細胞外の使用では、オリゴヌクレオチドは必ずしもヌクレアーゼ安定性を保有する必要はない。
【００１１】
標的ＤＮＡ又はＲＮＡに対する結合親和性を増やしてヌクレアーゼ分解に抵抗するために、数多くの化学修飾がオリゴヌクレオチドへ導入されてきた。
ヌクレアーゼに対する抵抗性を増すためにリボースリン酸骨格に対して様々な修飾がなされている。これらの修飾には、メチルホスホネート、ホスホロチオエート及びホスホロジチオエートのような連結の使用、及び２’ −Ｏ−アルキルリボースのような修飾糖部分の使用が含まれる。他のオリゴヌクレオチド修飾には、取込み及び細胞分布をモジュレートするためになされるものが含まれる。ヌクレオチド間連結の性質を劇的に変化させる数多くの修飾も文献に報告されている。これらには、非リン連結、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及び２’ −５’ 連結が含まれる。通常、診断及び研究の応用のオリゴヌクレオチドに対するもう１つの修飾は、非同位体標識、例えばフルオレセイン、ビオチン、ジゴキシゲニン、アルカリホスファターゼ、又は他のリポーター分子を用いた標識である。
【００１２】
多種多様な修飾リン含有連結が、オリゴヌクレオチドにおける天然の、容易に開裂されるホスホジエステル連結に代わるものとして研究されている。一般に、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホネート及びホスホロジチオエートのような、それらのほとんどは相補的な標的に対する低下した結合性と減少したハイブリッド安定性を有するオリゴヌクレオチドをもたらす。従って、有効な治療薬をつくるためには、このアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合性及びハイブリッド安定性が改良される必要がある。
【００１３】
つくられて研究されてきた数多くの修飾の中では、発見及び開発を終えて臨床評価に値するほどに進展したものはほとんどない。この根底にある理由には、合成の難しさ、標的核酸への乏しい結合性、標的核酸に対する特異性の不足、ヌクレアーゼに対する乏しい ｉｎ ｖｉｔｒｏ 及び ｉｎ ｖｉｖｏ安定性、及び乏しい薬物動態が含まれる。いくつかのホスホロチオエートオリゴヌクレオチドと誘導体がアンチセンス薬剤として様々な病的状態の治療についてのヒト臨床試験において今日使用されている。１つのアンチセンス薬、Ｆｏｍｉｖｉｒｕｓｅｎ （フォミビルセン）のヒトにおけるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）網膜炎を治療するための使用についての承認申請が米国とヨーロッパの規制当局に対して最近提出された。
【００１４】
化学的に修飾された核酸の構造及び安定性はアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計にとって大変重要である。この１０年間にわたり、多種多様な合成の修飾がヌクレアーゼ抵抗性を増すためか、又はアンチセンス鎖のその標的ｍＲＮＡへの親和性を強めるために提唱されてきた（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｄ． Ｒｅｓ． Ｒｅｖ．， １９９６， １６， ３１９−３４４； ＤｅＭｅｓｍａｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｃｃ． Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ．， １９９５， ２８， ３６６−３７４）。二重鎖形成を改善する修飾のタイプについては大量の情報が収集されているが、改善された親和性が観察される構造上の基礎についてはほとんど知られていない。
【００１５】
ＲＮＡが“Ａフォーム”幾何学と名づけられるものにおいて存在する一方、ＤＮＡは“Ｂフォーム”幾何学において存在する。一般に、ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ二重鎖より安定であるか、又はより高い溶融温度（Ｔｍ）を有する（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， １９８４， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ； Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ．； Ｌｅｓｎｉｋ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９５， ３４， １０８０７−１０８１５； Ｃｏｎｔｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９７， ２５， ２６２７−２６３４）。ＲＮＡの増加した安定性は、いくつかの構造特性、最も注目すべきはＡフォーム幾何学から生じる改善された塩基スタッキング相互作用に帰せられている（Ｓｅａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９３， ２１， ２０５１−２０５６）。ＲＮＡにおける２’ ヒドロキシルの存在は、Ｃ３’ エンドプッカー（ｅｎｄｏ ｐｕｃｋｅｒ ）、即ちノーザンプッカーとしても明示されるものの方へその糖を偏向させ、それにより二重鎖をＡフォーム幾何学に選好させる。一方、デオキシ核酸はＣ２’ エンド糖プッカー、即ちサザンプッカーとしても知られるものを選好し、このことがより安定でないＢフォーム幾何学を分与すると考えられている（Ｓａｎｇｅｒ， Ｗ． （１９８４） Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ； Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ ）。さらに、ＲＮＡの２’ ヒドロキシル基は、ＲＮＡ二重鎖を安定化するのに役立つ水介在性の水素結合ネットワークを形成し得る（Ｅｇｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９６， ３５， ８４８９−８４９４）。
【００１６】
しかしながら、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二重鎖は、通常、純粋なＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖よりも安定ではなく、その配列に依存して、ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖より安定であるか又は安定でないかのいずれかであり得る（Ｓｅａｒｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９３， ２１， ２０５１−２０５６）。ハイブリッド二重鎖の構造はＡ−及びＢ−フォーム幾何学の中間であり、乏しいスタッキング相互作用をもたらす可能性がある（Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １９９３， ２１５， ２９７−３０６； Ｆｅｄｏｒｏｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９３， ２３３， ５０９−５２３； Ｇｏｎｚａｌｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９５， ３４， ４９６９−４９８２； Ｈｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９９６， ２６４， ５２１−５３３）。ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドの安定性がアンチセンス療法にとって重要であるのは、この機序が修飾されたＤＮＡ鎖のｍＲＮＡ鎖への結合を必要とするからである。ｍＲＮＡを有効に阻害するためには、アンチセンスＤＮＡはｍＲＮＡと非常に高い結合親和性を有するべきである。さもないと、ＤＮＡと標的ｍＲＮＡ鎖との所望される相互作用は稀にしか発生せず、それによりアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を減少させる。
【００１７】
増加したヌクレアーゼ抵抗性とヌクレオチドに対する非常に高い結合親和性を分与する１つの合成２’ −修飾は、２’ −メトキシエトキシ（ＭＯＥ，２’ −ＯＣＨ２ ＣＨ２ ＯＣＨ３ ）側鎖である（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， １９９７， ２７２， １１９４４−１２０００； Ｆｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９７， ２５， ４４２９−４４４３）。ＭＯＥ置換の直接的な利点の１つは結合親和性における改善であり、これはＯ−メチル、Ｏ−プロピル、及びＯ−アミノプロピルのような多くの類似の２’ 修飾よりも大きい（Ｆｒｅｉｅｒ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎｎ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， （１９９７） ２５： ４４２９−４４４３）。２’ −Ｏ−メトキシエチル置換はまた、ｉｎ ｖｉｖｏ 使用に有望な特性を有する遺伝子発現のアンチセンス阻害剤でもあることが示されている（Ｍａｒｔｉｎ， Ｈｅｌｖ． Ｃｈｉｍ． Ａｃｔａ， １９９５， ７８， ４８６−５０４； Ａｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｉｍｉａ， １９９６， ５０， １６８−１７６； Ａｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ．， １９９６， ２４， ６３０−６３７；及び Ａｌｔｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９７， １６， ９１７−９２６ ）。ＤＮＡに比較して、それらは改善されたＲＮＡ親和性とより高いヌクレアーゼ抵抗性を示す。２’ −Ｏ−メトキシエチル−リボヌクレオシドウィングと中央のＤＮＡ−ホスホロチオエートウィンドウを有するキメラオリゴヌクレオチドもまた動物モデルにおける腫瘍の増殖を低用量で効果的に低減させることが示されている。ＭＯＥ置換オリゴヌクレオチドはいくつかの病態においてアンチセンス薬剤として抜群の有望性を示した。１つのそのようなＭＯＥ置換オリゴヌクレオチドがＣＭＶ網膜炎の治療に現在利用されている。
【００１８】
２’ −Ｏ−メトキシエチル修飾の使用を含む、既知のオリゴヌクレオチドへの修飾は診断薬、治療薬における使用と研究試薬としての使用についてのオリゴヌクレオチドの開発に貢献してきたが、当技術分野には、強められたハイブリッド結合親和性及び／又は増加されたヌクレアーゼ抵抗性を有するオリゴヌクレオチドへのさらなる修飾へのニーズが依然として存在する。
【００１９】
【発明の要旨】
本発明によれば、グアニジニウム基を含有するオリゴマーが提供される。本発明は、式：
【００２０】
【化１７】
2004500330.tif 000003
【００２１】
（式中：
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基であり；
Ｔ１ は、ＯＨ又は保護化ヒドロキシル基であり；
Ｔ２ は、活性化リン基であるか又は固形支持体へ付いた連結部分であり；
Ｔ３ は、Ｈ、ＯＨ、保護化ヒドロキシル又は糖置換基である。）
のモノマーであって、前記モノマーは、少なくとも１つの基Ｒ１ をそのなかにさらに含んでなり；前記Ｒ１ 基は、少なくとも１つのＴ１ 、Ｔ２ 又はＴ３ の所にか又は少なくとも１つのＢｘ上の置換基として存在し；前記Ｒ１ 基は、式：
【００２２】
【化１８】
2004500330.tif 000004
【００２３】
（式中：
それぞれのＺは、独立して、単結合、Ｏ、Ｎ又はＳであり；
それぞれのＲ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は、独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ５ 、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基又はコンジュゲート基であって、該置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択され；
又は、Ｒ３ 及びＲ４ は、一緒にＲ７ となり、Ｒ３’及びＲ４’は、一緒にＲ７’となり；
それぞれのＲ５ は、独立して、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールであり；
それぞれのＲ７ 及びＲ７’は、独立して、水素であるか又はそれに付いた窒素原子とともにフタルイミド部分を形成し；
それぞれのｍは、独立して、０又は１であり；及び
それぞれのｎは、独立して、１〜約６の整数である。）
の１つを有するモノマーを提供する。
好ましい組成物には、構造：
【００２４】
【化１９】
2004500330.tif 000005
【００２５】
（式中：
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基であり；
それぞれのＴ１ 及びＴ２ は、独立して、ＯＨ、保護化ヒドロキシル、ヌクレオチド、ヌクレオシド又はオリゴヌクレオチドであり；
Ｔ３ は、Ｈ、ＯＨ、保護化ヒドロキシル又は糖置換基である。）
のヌクレオチド単位を複数含んでなるオリゴマーであって、前記オリゴマーは、少なくとも１つの基Ｒ１ をそのなかにさらに含んでなり；前記Ｒ１ 基は、少なくとも１つのＴ３ の所にか又は少なくとも１つのＢｘ上の置換基として３’ 末端、５’ 末端に存在し；前記Ｒ１ 基は、式：
【００２６】
【化２０】
2004500330.tif 000006
【００２７】
（式中：
それぞれのＺは、独立して、単結合、Ｏ、Ｎ又はＳであり；
それぞれのＲ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は、独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ５ 、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基又はコンジュゲート基であって、該置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択され；
又は、Ｒ３ 及びＲ４ は、一緒にＲ７ となり、Ｒ３’及びＲ４’は、一緒にＲ７’となり；
それぞれのＲ５ は、独立して、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールであり；
それぞれのＲ７ 及びＲ７’は、独立して、水素であるか又はそれに付いた窒素原子とともにフタルイミド部分を形成し；
それぞれのｍは、独立して、０又は１であり；及び
それぞれのｎは、独立して、１〜約６の整数である。）
の１つを有するオリゴマーが含まれる。
【００２８】
好ましい態様では、Ｒ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は水素である。もう１つの好ましい態様では、Ｒ１ 、Ｒ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は水素であり、ｍは０であり、ｎは２である。
本発明は、また、オリゴマーを製造する方法であって：
（ａ）式：
【００２９】
【化２１】
2004500330.tif 000007
【００３０】
（式中：
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基であり；
Ｔ１ は、ＯＨ又は保護化ヒドロキシル基であり；
Ｔ２ は、固形支持体へ付いた連結部分であり；
Ｔ３ は、Ｈ、ＯＨ、保護化ヒドロキシル又は糖置換基である。）
のモノマーであって、前記モノマーは、少なくとも１つの基Ｒ１ をそのなかにさらに含んでなり；前記Ｒ１ 基が、少なくとも１つのＴ１ 、Ｔ２ 又はＴ３ の所にか又は少なくとも１つのＢｘ上の置換基として存在し；
但し、Ｔ２ がＲ１ である場合、Ｔ３ は、固形支持体に付いた連結部分であり；
前記Ｒ１ 基が、式：
【００３１】
【化２２】
2004500330.tif 000008
【００３２】
（式中：
それぞれのＺは、独立して、単結合、Ｏ、Ｎ又はＳであり；
それぞれのＲ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は、独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ５ 、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基又はコンジュゲート基であって、該置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択され；
又は、Ｒ３ 及びＲ４ は、一緒にＲ７ となり、Ｒ３’及びＲ４’は、一緒にＲ７’となり；
それぞれのＲ５ は、独立して、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールであり；
それぞれのＲ７ 及びＲ７’は、独立して、水素であるか又はそれが付いた窒素原子とともにフタルイミド部分を形成し；
それぞれのｍは、独立して、０又は１であり；及び
それぞれのｎは、独立して、１〜約６の整数である。）
の１つを有するモノマーを選択する工程；
（ｂ）５’ 位の保護化ヒドロキシル基を脱保護化して、脱保護化モノマーを形成する工程；
（ｃ）前記脱保護化モノマーを、式：
【００３３】
【化２３】
2004500330.tif 000009
【００３４】
（式中：
Ｂｘは、ヘテロ環式塩基であり；
Ｔ１ は、ＯＨ又は保護化ヒドロキシル基であり；
Ｔ２ は、活性化リン基であり；
Ｔ３ は、Ｈ、ＯＨ、保護化ヒドロキシル又は糖置換基である。）
の第二のモノマーであって、前記モノマーは、少なくとも１つの基Ｒ１ をそのなかにさらに含んでなり；前記Ｒ１ 基が、少なくとも１つのＴ１ 、Ｔ２ 又はＴ３ の所にか又は少なくとも１つのＢｘ上の置換基として存在し；
但し、Ｔ２ がＲ１ である場合、Ｔ３ は、活性化リン基であり；
前記Ｒ１ 基が、式：
【００３５】
【化２４】
2004500330.tif 000010
【００３６】
（式中：
それぞれのＺは、独立して、単結合、Ｏ、Ｎ又はＳであり；
それぞれのＲ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は、独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ５ 、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基又はコンジュゲート基であって、該置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択され；
又は、Ｒ３ 及びＲ４ は、一緒にＲ７ となり、Ｒ３’及びＲ４’は、一緒にＲ７’となり；
それぞれのＲ５ は、独立して、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールであり；
それぞれのＲ７ 及びＲ７’は、独立して、水素であるか又はそれが付いた窒素原子とともにフタルイミド部分を形成し；
それぞれのｍは、独立して、０又は１であり；及び
それぞれのｎは、独立して、１〜約６の整数である。）
の１つを有する第二モノマーとカップリングさせる工程であって、前記カップリングが活性化剤の存在下で起こってカップルした化合物を形成させる工程；
（ｄ）前記カップルした化合物をキャッピング試薬でキャッピングして、ヌクレオチド間連結を有するキャップされた化合物を形成する工程；
（ｅ）前記ヌクレオチド間連結を酸化試薬で酸化する工程；及び
（ｆ）工程（ｂ）〜（ｅ）を繰り返してオリゴマーを形成する工程
を含んでなる方法を提供する。
【００３７】
本発明の１つの態様では、本方法は、オリゴマーを切り離し試薬で切り離す追加の工程を包含する。
好ましい活性化試薬には、テトラゾール、トリフルオロ酢酸ピリジニウム及びジシアノイミダゾールが含まれる。無水酢酸及びＮ−メチルイミダゾールがキャッピング試薬であることが好ましい。好ましい酸化試薬には、ヨウ素、カンファースルホニルオキサジリジン、過酸化ｔ−ブチル水素及びＢｅａｕｃａｇｅ試薬が含まれる。
本発明は、また、式：
【００３８】
【化２５】
2004500330.tif 000011
【００３９】
（式中：
Ｘは、シアノエチルオキシ、ベンジルオキシ、ｔ−ブトキシ、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、トリフルオロメチル、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールである。）
の化合物も提供する。
本発明の１つの態様では、Ｘはシアノエチルオキシである。もう１つの態様ではＸはフェニルである。さらにもう１つの態様では、Ｘはｔ−ブチルである。
本発明は、また非核酸モノマーと少なくとも１つのそのような非核酸モノマーを含んでなるオリゴマーとに向けられる。本発明には、式：
【００４０】
【化２６】
2004500330.tif 000012
【００４１】
（式中：
Ｘは、Ｃ３ 〜Ｃ１０アルキル、Ｃ６ 〜Ｃ２４アリール、Ｃ６ 〜Ｃ２４ヘテロアリール、Ｃ４ 〜Ｃ２０脂肪族環、少なくとも１つのヘテロ原子、ヌクレオシド、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドを有するＣ４ 〜Ｃ２０脂肪族環であり；
Ｙ１ は、ヒドロキシル保護基であり；
Ｙ２ は、活性化リン基であるか又は固形支持体へ付いた連結部分であり；
それぞれのＲ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は、独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ５ 、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基又はコンジュゲート基であって、該置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択され；
又は、Ｒ３ 及びＲ４ は、一緒にＲ７ となり、Ｒ３’及びＲ４’は、一緒にＲ７’となり；
それぞれのＲ５ は、独立して、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールであり；
それぞれのＲ７ 及びＲ７’は、独立して、水素であるか又はそれが付いた窒素原子とともにフタルイミド部分を形成し；及び
ｎは、１〜約６の整数である。）
の非核酸モノマーが含まれる。
【００４２】
好ましい態様では、Ｙ１ はジメトキシトリチルである。もう１つの好ましい態様では、Ｙ１ はモノメトキシトリチルである。なおもう１つの好ましい態様では、Ｙ２ はホスホロアミダイトである。さらなる態様では、Ｙ２ は固形支持体に付いた連結部分である。Ｙ２ はスクシニルＣＰＧであることが好ましい。
【００４３】
【好ましい態様の詳細な説明】
本発明は、２’ 位にか又はヘテロ環式塩基上の置換基として位置しているグアニジニウム官能基を含んでなるモノマーを提供する。本発明はまた、複数のヌクレオチド単位を含有するオリゴマーを提供し、前記ヌクレオチド単位の少なくとも１つは、３’ 末端、５’ 末端、２’ 位にか、又はヘテロ環式塩基上の置換基としてグアニジニウム基を担う。さらに提供されるのは、そのようなオリゴマーを製造する方法である。
本明細書で使用されるように、“グアニジニウム基”又は“グアニジニウム官能基”は、式：
【００４４】
【化２７】
2004500330.tif 000013
【００４５】
（式中：
Ｚは、単結合、Ｏ、Ｎ又はＳであり；
それぞれのＲ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は、独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒ５ 、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基又はコンジュゲート基であって、該置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択され；
又は、Ｒ３ 及びＲ４ は、一緒にＲ７ となり、Ｒ３’及びＲ４’は、一緒にＲ７’となり；
それぞれのＲ５ は、独立して、置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールであり；
それぞれのＲ７ 及びＲ７’は、独立して、水素であるか又はそれが付いた窒素原子とともにフタルイミド部分を形成し；
ｍは、０又は１であり；及び
ｎは、１〜約６の整数である。）
のいずれか一方の基を示す。
【００４６】
本発明の１つの態様では、ＺはＯであり、Ｒ２ 、Ｒ３ 、Ｒ３’、Ｒ４ 及びＲ４’は水素であり、ｎは１であり、ｍは０である。オリゴマーに存在する、この２−Ｏ−グアニジニウムメチル修飾は、標的に対するオリゴマーの結合親和性を有意に増加させる。結合親和性におけるこの増加が向上するのは、追加のグアニジニウム修飾がオリゴマーの内部に分散される場合である。グアニジニウム官能化オリゴマーは二本鎖の核酸部分と三重らせんを形成するのに有用である。
グアニジニウム基は強塩基性で約１２．５のｐｋａ を有し、４つの原子全体に非局在化した陽電荷を有する十分安定化したカチオンである。グアニジニウム基は、核酸のリン酸基とタンパク質及びペプチドとの接触を促進すると理解されている。特に、グアニジニウム基は、主要な溝においてグアニン残基とのイオン相互作用を形成するか、又は副溝に局在するリン酸部分と結合すると示唆されている。
本発明には、ヌクレオチドモノマーだけでなく、非核酸モノマーも含有するオリゴマーが含まれる。例えば、本発明には、下式：
【００４７】
【化２８】
2004500330.tif 000014
【００４８】
（式中、それぞれのＲ６ 及びＲ６’は、独立して、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソブチリル、フェニル又はアリールである。）
の化合物、並びにその式のモノマー化合物を少なくとも１つ有するオリゴマーが含まれる。
【００４９】
本発明に従ったヘテロ環式塩基には天然に存在する及び天然には存在しない両方の核酸塩基及びヘテロ環式塩基が含まれる。ヘテロ環式塩基は、ピリミジン、プリン又はジアミノプリン塩基であることができる。代表的リストには、アデニン、グアニン、シトシン、ウリジン及びチミン、ならびにキサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、５−ハロウラシル及びシトシン、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、オキサ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、７−メチルグアニン、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシンが含まれる。さらに別のヘテロ環式塩基には、米国特許第３，６８７，８０８号；Ｃｏｎｃｉｓｅ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ａｎｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，８５８〜８５９頁，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，編，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，１９９０；及びＥｎｇｌｉｓｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に記載されているものが含まれる。
【００５０】
本発明のオリゴマー中のヘテロ環式塩基は、Ｒ１ 基へ共有結合していてもよい。好ましい態様において、Ｒ１ 基はピリミジンヘテロ環式塩基のＣ５又は４位のアミノ基へ共有結合していてもよい。別の好ましい態様においては、Ｒ１ 基はプリンヘテロ環式塩基の２位又は６位のアミノ基へ共有結合していてもよい。Ｒ１ 基はさらにジアミノプリンヘテロ環式塩基の６位のアミノ基へ結合されていてもよい。
本発明のモノマーは活性化リン酸基及び活性化亜リン酸基のような適当な活性化リン含有基を含むことができる。本明細書で使用される場合、活性化リン酸基及び活性化亜リン酸基という用語は、別のモノマー又はオリゴマー化合物のヒドロキシル基と反応性であって、リン含有ヌクレオチド間連結を形成する、活性化モノマー又はオリゴマーを意味している。そのような活性化リン含有基は、ＰＩＩＩ 又はＰＶ 原子価状態の活性化リン原子を含んでいる。そのような活性化リン原子は本分野では既知であり、ホスホロアミダイト、Ｈ−ホスホナート及びリン酸トリエステルが含まれるがこれらに限定されるわけではない。好ましい固相合成は、活性化リン酸としてホスホロアミダイトを利用する。ホスホロアミダイトはＰＩＩＩ 化学を利用する。この中間体亜リン酸エステル化合物は、続いて既知の方法を用いてＰＶ 状態へ酸化され、好ましい態様においては、ホスホジエステル又はホスホロチオエートヌクレオチド間結合が得られる。別の活性化リン酸及び亜リン酸はＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎリポート番号３０９（Ｂｅａｕｃａｇｅ　ａｎｄ　Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４３，２２２３〜２３１１）に記載されている。
【００５１】
本発明の文脈において、用語“オリゴヌクレオチド”とは、リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はその模倣体を指している。この用語は、天然に存在する核酸塩基、糖及び共有結合ヌクレオシド間（主鎖）連結から成るオリゴヌクレオチドならびに、機能的に同様であるが天然には存在しない部分を持っているオリゴヌクレオチドを含んでいる。そのような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、例えば、高められた細胞取り込み、核酸標的に対する高められた親和性及びヌクレアーゼ存在下における高められた安定性のような望ましい特性のため、しばしば天然形よりも好ましい。
【００５２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンス化合物の好ましい形であるが、本発明はオリゴヌクレオチド模倣体を含むがこれに限定されるわけではない別のオリゴマーアンチセンス化合物を含んでいる。本発明に従ったオリゴマーは好適には約８から約３０核酸塩基から成っている（即ち、約８から約３０の連結されたヌクレオシド）。特に好ましいオリゴマーは、アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、さらに好ましいものは約１２から約２５の核酸塩基を含んでいるものである。本分野では既知のように、ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、ヘテロ環式塩基である。そのようなヘテロ環式塩基の２つの最も普通の種類はプリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分へ共有結合で結合されたリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについては、リン酸基は糖の２’、３’か又は５’ヒドロキシル部分へ結合できる。オリゴヌクレオチド形成において、リン酸基はお互いに隣接するヌクレオシドへ共有結合で連結され、直鎖状ポリマー化合物を形成する。次に、このポリマー構造の各々の末端はさらに連結できて環状構造が形成される。開いた線状構造が一般的に好適である。オリゴヌクレオチド構造内において、リン酸基はオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間主鎖を形成していると通常称される。ＲＮＡ及びＤＮＡの正常な連結又は主鎖は３’から５’へのホスホジエステル連結である。
【００５３】
本発明で有用である好ましいアンチセンス化合物の特別の例には、修飾された主鎖又は非天然ヌクレオチド間連結を含んでいるオリゴヌクレオチドが含まれる。本明細書で定義したように、修飾された主鎖を持っているオリゴヌクレオチドには、主鎖中にリン原子を保持しているもの及び主鎖中にリン原子を持っていないものが含まれる。本発明の文脈において、及び本分野でしばしば称されるように、ヌクレオチド間主鎖にリン原子を持っていない修飾オリゴヌクレオチドもまたオリゴヌクレオシドと考えられる。
好ましいオリゴヌクレオチド主鎖には、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホナート及びキラルホスホナートを含むメチル又は他のアルキルホスホナート、ホスフィン酸エステル、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル及び正常な３’−５’連結を持っているボラノ−リン酸、それらの２’−５’連結類似体、及びヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’から５’−３’又は２’−５’から５’−２’で連結されている逆の極性を持っているものが含まれる。
【００５４】
上記リン含有連結の調製を教示している代表的米国特許には、米国特許第３，６８７，８０８；４，４６９，８６３；４，４７６，３０１：５，０２３，２４３；５．１７７，１９６；５，１８８，８９７；５，２６４，４２３；５，２７６．０１９；５．２７８．３０２；５，２８６，７１７；５，３２１，１３１；５，３９９，６７６；５，４０５，９３９；５，４５３，４９６；５，４５５，２３３；５．４６６，６７７；５．４７６，９２５；５．５１９，１２６；５，５３６，８２１：５，５４１，３０６；５，５５０，１１１；５，５６３，２５３；５，５７１，７９９；５，５８７，３６１；及び５．６２５，０５０号が含まれ（これらに限定されるわけではない）、この内のいくつかは本出願と共通して所有されており、これらの各々は、参照により本明細書中に組み込まれる。
【００５５】
その中にリン原子を含んでいない好ましい修飾オリゴヌクレオチド主鎖は、短鎖アルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキル又はシクロアルキルヌクレオシド間連結、又は一つ又はそれ以上の短鎖ヘテロ原子性又はヘテロ環式ヌクレオシド間連結により形成されている主鎖を持っている。これらの連結には、モルホリノ連結（ヌクレオシドの糖部分から一部形成されている）；シロキサン主鎖；スルフィド、スルホキシド及びスルホン主鎖；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル主鎖；アルケン含有主鎖；スルファメート主鎖；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ主鎖；スルホナート及びスルホンアミド主鎖；アミド主鎖；及び、混合されたＮ、Ｓ及びＣＨ２ 成分を持っているその他のものが含まれる。
【００５６】
上記オリゴヌクレオシドの調製を教示している代表的米国特許には、米国特許第５，０３４，５０６；５，１６６，３１５；５，１８５，４４４；５，２１４，１３４；５，２１６，１４１；５，２３Ｓ，０３３；５，２６４，５６２；５，２６４，５６４；５，４０５，９３８；５，４３４，２５７；５，４６６，６７７；５，４７０，９６７；５，４８９，６７７；５，５４１，３０７；５，５６１，２２５；５，５９６，０８６；５，６０２，２４０；５，６１０，２８９；５，６０２，２４０；５，６０８，０４６；５，５１０，２８９；５，６１８，７０４；５，６２３，０７０；５，６６３，３１２；５，６３３，３６０；５，６７７，４３７；及び５，６７７，４３９号が含まれ（これらに限定されるわけではない）、この内のいくつかは本出願と共通して所有されており、これらの各々は、本明細書に組み込まれる。
【００５７】
別の好ましいオリゴヌクレオチド模倣体において、糖及びヌクレオシド間連結、即ちヌクレオチド単位の主鎖、は新しい基により置き換えられている。塩基単位は適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持されている。一つのそのようなオリゴマー化合物（優れたハイブリダイゼーション特性を持つことが示されているオリゴヌクレオチド模倣体）はペプチド核酸（ＰＮＡ）と称されている。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖−主鎖はアミド含有主鎖、特にアミノエチルグリシン主鎖に置き換えられている。核酸塩基は保持されており、主鎖のアミド部分のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合されている。ＰＮＡの製造を教えている代表的米国特許には、米国特許第５，５３９，０８２；５．７１４，３３１及び５．７１９，２６２号が含まれ（これらに限定されるわけではない）、これらの各々は、本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物に関するさらなる教えはＮｉｅｌｓｅｎ，ｅｔ　ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７〜１５００）に見ることができる。
【００５８】
本発明の一つの態様において、ホスホロチオエート主鎖を持つオリゴヌクレオチドが好適である。前に参照した米国特許第５，４８９，６７７号のヘテロ原子主鎖、特に−ＣＨ２ −ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２ −、−ＣＨ２ −Ｎ（ＣＨ３ ）−Ｏ−ＣＨ２ −［メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ主鎖として知られている］、−ＣＨ２ −Ｏ−Ｎ（ＣＨ３ ）−ＣＨ２ −、−ＣＨ２ −Ｎ（ＣＨ３ ）−Ｎ（ＣＨ３ ）−ＣＨ２ −及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３ ）−ＣＨ２ −ＣＨ３ −［ここで天然のホスホジエステル主鎖は−Ｏ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ２ −として表される］、及び前に参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド主鎖を持つオリゴヌクレオチドも好適である。前に参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ主鎖構造を持っているオリゴヌクレオチドもまた好適である。
【００５９】
本発明に従った方法は液相技術か又は自動化合成プロトコルを利用して種々の伝統的な溶媒中で実施される。本分野では自動化オリゴヌクレオチド合成並びに液相オリゴヌクレオチド合成のための多くの溶媒が知られている。好ましい溶媒にはＤＭＦ、ＤＭＳＯ、ＴＨＦ、ＴＨＰ及びＣＨ３ ＣＮが含まれる。
オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体合成のための標準液相及び固相法は当業者にはよく知られている。これらの複雑な化合物を合成するために必要とされる時間及び費用を減少させるようにこれらの方法は常に改良されている。代表的液相技術は１９９３年５月１１日に公開され、本発明と共通して譲渡されている米国特許第５，２１０，２６４号に記載されている。標準ホスホロアミダイト化学を利用するオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体合成に用いられる代表的固相技術は　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　Ｆｏｒ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　Ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｓ，Ａｇｒａｗａｌ，Ｓ．，Ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，１９９３、に記載されている。
【００６０】
天然に存在するオリゴヌクレオチド、並びにホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのような天然には存在しない（又は修飾された）オリゴヌクレオチド製造のために選択される好ましい方法は固相合成を経るものであり、ここでオリゴヌクレオチドは制御孔ガラス（ＣＰＧ）；オキザリル−制御孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１９９１，１９，１５２７を参照されたい）；ＴＥＮＴＡＧＥＬ支持体（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　１９９３，３４，３３７３を参照されたい）；又はＰＯＲＯＳ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能なポリスチレン樹脂のようなポリマー支持体上で製造される。そのような合成のための装置は例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含むいくつかの発売元から市販品として入手可能である。本分野で知られているそのような合成のための他の手段を追加的に又は代替的に用いてもよい。自動化合成技術を含む適した固相技術はＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ
ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されている。
【００６１】
固相合成は、成長オリゴヌクレオチド鎖の一つの末端へのヌクレオチドの連続的添加に依存している。典型的には、第一のヌクレオシド（存在する環外アミン官能性に保護基を持っている）が適切なガラスビーズ支持体へ結合される。活性化亜リン酸エステル化合物（典型的にはヌクレオチドホスホロアミダイト、適正な保護基も持っている）が段階的に加えられ、成長オリゴヌクレオチドが伸張する。固相合成のための別の方法は米国特許第４，４１５，７３２；４，４５８，０６６；４，５００，７０７；４，６６８，７７７；４，９７３，６７９；５，１３２，４１８；４，７２５，６７７号及びＲｅ．３４，０６９に見ることができる。
【００６２】
本発明に従った化学官能基の代表的リストには、Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２ 〜Ｃ２５アルケニル、置換Ｃ２ 〜Ｃ２５アルケニル、Ｃ２ 〜Ｃ１５アルキニル、置換Ｃ２ 〜Ｃ１５アルキニル、Ｃ４ 〜Ｃ７ 炭素環式アルキル、置換炭素環式アルキル、アルケニル炭素環、置換アルケニル炭素環、アルキニル炭素環、置換アルキニル炭素環、Ｃ６ 〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ６ 〜Ｃ２０アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、窒素、酸素又は硫黄含有ヘテロ環、置換窒素、酸素又は硫黄含有ヘテロ環、混合ヘテロ環が含まれ、ここで前記置換基はアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、ニトロ、チオール、チオアルキル、チオアルコキシ又はハロゲン基から選択される；又は、Ｌは、フタルイミド、２から１０の炭素原子及び１から４の酸素又は硫黄原子を持っているエーテル、金属配位基、コンジュゲート基、ハロゲン、ヒドロキシル、チオール、ケト、カルボキシル、ＮＲ１ Ｒ２ 、ＣＯＮＲ１ 、アミジン（Ｃ（＝ＮＨ）ＮＲ２ Ｒ３ ）、グアニジン（ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＲ２ Ｒ３ ）、グルタミル（Ｒ１ ＯＯＣＣＨ（ＮＲ２ Ｒ３ ）（ＣＨ２ ）２ Ｃ（＝Ｏ）、硝酸、ニトロ、ニトリル、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、ＮＨ−アルキル、Ｎ−ジアルキル、Ｏ−アラルキル、Ｓ−アラルキル、ＮＨ−アラルキル、アジド（Ｎ３ ）、ヒドラジノ（ＮＨＮＨ２ ）、ヒドロキシルアミノ（ＯＮＨ２ ）、スルホキシド（ＳＯ）、スルホン（ＳＯ２ ）、スルフィド（Ｓ−）、ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）、シリル、ヌクレオシド塩基、アミノ酸側鎖、炭化水素、薬剤又は水素結合できる基であり、式中、各々のＲ１ 及びＲ２ は独立して、Ｈ、ハロアルキル、Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニル、又はＣ６ 〜Ｃ１４アリールであり；及びＲ３ は、独立して、単結合、ＣＨ＝ＣＨ、Ｃ≡Ｃ、Ｏ、Ｓ、ＮＲ６ 、ＳＯ２ 、Ｃ６ 〜Ｃ１４アリール、置換Ｃ６ 〜Ｃ１４アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、窒素、酸素又は硫黄含有ヘテロ環、置換窒素、酸素又は硫黄含有ヘテロ環、混合ヘテロ環又は置換混合ヘテロ環であり、ここで前記置換基はヒドロキシル（ＯＨ）、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ（ＮＯ２ ）、チオール（ＳＨ）、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニル基から選択される。
【００６３】
多くの官能基が本発明の化合物内に保護された形で導入でき、続いて脱保護できて最終的な望まれる化合物が形成される。一般に、保護基は分子の化学官能性を特定の化学条件に対して不活性にし、その後分子の残りの部分を実質的に損傷させることなくそのような分子の官能性から取り除くことができる（Ｇｒｅｅｎ　ａｎｄ　Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．第２版，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９１）。例えば、アミノ基はフタルイミド、９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、トリフェニルメチルスルフェニル、ｔ−ＢＯＣ又はベンジル基として保護できる。カルボキシル基はアセチル基として保護できる。
【００６４】
代表的なヒドロキシル保護基はＢｅａｕｃａｇｅ　ｅｔ　ａｌ．（Ｔｅｔｒａｂｅｄｒｏｎ　１９９２，４８，２２２３）により記載されている。好ましいヒドロキシル保護基はトリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、９−フェニルキサンチン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）及び９−（ｐ−メトキシフェニル）−キサンチン−９−イル（ＭＯＸ）のように酸不安定性である。化学官能性基はまたそれらを前駆体形に含ませることによっても“保護”できる。従って、アジド基は容易にアミンに変換されるので、アジド基はアミンの“保護”形であると考えることができる。オリゴヌクレオチド合成で利用される別の代表的保護基はＡｇｒａｗａｌ　ｅｔ　ａｉ．，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ，Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４．ｖｏｌ．２６，ｐｐ．１〜７２で議論されている。
【００６５】
本発明の文脈において、“へテロ環”とはＮ、Ｏ又はＳのようなヘテロ原子を少なくとも一つ含んでいる環状化合物である。“混合ヘテロ環”とはＮ、Ｏ又はＳのようなヘテロ原子を少なくとも二つ含んでいる環状化合物である。“へテロアリール”化合物はＮ、Ｏ又はＳのようなヘテロ原子を少なくとも一つ含んでいるヘテロ環であり、完全には飽和されていない、例えば、部分的又は完全飽和の状態である。“へテロアリール”はまた融合系も意味しており、ヘテロ原子を含んでいない一つ又はそれ以上の融合環を持つ系を含んでいる。窒素ヘテロ環を含んでいる本発明のヘテロ環には、イミダゾール、ピロール、ピラゾール、インドール、１Ｈ−インダゾール、α−カルボリン、カルバゾール、フェノチアジン、フェノキサジン、テトラゾール、ピロリジン、ピペリジン、ピペラジン及びモルホリノ基が含まれるが、これらに限定されるわけではない。窒素ヘテロ環としてより好ましい基にはイミダゾール、ピロール、インドール及びカルバゾール基が含まれる。
【００６６】
本明細書で使用される場合、“連結部分”とは本発明のモノマー及びオリゴマーを固相支持体へ連結するヒドロカルビル鎖を指している。好ましい連結部分はスクシニル基である。別の連記部分には置換又は未置換Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、又は置換又は未置換Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニルが含まれるが、これらに限定されるわけではなく、ここで置換基はヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択される。
【００６７】
本発明に従った“コンジュゲート基”には本分野で既知のものが含まれる。本発明に従ったコンジュゲート基の代表的リストには、インターカレーター、リポーター分子、コントラスト試薬、切り離し剤、細胞標的指向性物質、シアニン色素、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコールを含むポリエーテル、及び薬力学特性又は薬動学特性を促進するために本分野で既知である他の部分が含まれる。典型的なコンジュゲート基にはＰＥＧ基、コレステロール、リン脂質、ビオチン、フェナンスロリン、フェナジン、ピレン、レチナール、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン及び色素が含まれる。
【００６８】
本発明の目的には、用語“リポーター分子”は、分光学法、放射能、比色アッセイ、蛍光及び特異的結合のような物理的特性を利用し、ゲル、液体、全細胞系、破壊された細胞系などにおける同定を可能にする物理的及び化学的特性を持つ分子又は酵素を含んでいる。リポーター分子として特に有用であるのは発蛍光団、発色団及び放射性標識含有部分である。
発蛍光団は蛍光分光法により検出可能な分子である。好ましい発蛍光団の例はフルオレセイン及びローダミン色素及びアクリジンである。“テキサスレッド”及びその他の類似のフルオレセインを含む市販品として入手可能な多くの発蛍光団があり、ローダミンはＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ、から入手可能である。
【００６９】
発色団とは可視又は紫外（ＵＶ−ＶＩＳ）吸収分光法により検出可能な分子である。発色団の例はアントラセン、ペリレン、ピレン、ローダミン及びクリセンのような多核芳香族である。
本明細書で使用される場合、放射性標識−含有部分とは、少なくとも一つの３ Ｈ又は１４Ｃのような放射活性原子を取り込んでいる分子であり、それにより検出を可能にしている。
リポーター酵素は上記の任意の方法により、直接的に又はその酵素反応生成物を通して検出される。リポーター酵素として特に有用であるのはアルカリ性ホスファターゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼである。
【００７０】
インターカレーターとは、正常ワトソン−クリック塩基対形成に影響を及ぼすことなく隣接する塩基対間に挿入できる多環式芳香族基であり、フォトヌクレアーゼ／インターカレーターリガンド６−［［［９−［［６−（４−ニトロベンズアミド）ヘキシル］アミノ］アクリジン−４−イル］カルボニル］アミノ］ヘキサノイルペンタフルオロフェニル　エステルのようなハイブリッド　インターカレーター／リガンドを含んでいる。この化合物は二つの注目すべき特色を持っている：アクリジン部分はインターカレーターであり、ｐ−ニトロベンズアミド基はフォトヌクレアーゼである。他の代表的インターカレーターはＭａｎｏｈａｒａｎ，Ｍ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｏｏｋｅ　ａｎｄ　Ｌｅｂｌｅｕ，編，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，１９９３に記載されている。
【００７１】
本発明の文脈において、“ハイブリダイゼーション”とは相補的ヘテロ環式塩基間の水素結合形成（それはワトソン−クリック、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ 又は逆 Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合であり得る）を意味している。本明細書で使用される場合、“相補的”とは二つのヘテロ環式塩基間の正確な対形成の能力を指している。例えば、アデニン及びチミンは相補的塩基であり、水素結合の形成を通して対を形成する。本明細書で使用される場合、“相補的”及び“特異的にハイブリダイズ可能”とはヌクレオシドサブユニットを含んでいる第一及び第二の核酸様オリゴマー間の正確な対形成又は配列相補性を指している。例えば、もし第一の核酸のある位置の塩基が第二の核酸の同じ位置のヘテロ環式塩基と水素結合できるならば、第一の核酸及び第二の核酸はその位置でお互いに相補的であると考えられる。各々の分子で十分な数の対応する位置が、お互いに水素結合できる塩基で占められている場合、第一及び第二の核酸はお互いに相補的である。従って、“特異的にハイブリダイズ可能”及び“相補的”とは本発明の化合物及び標的核酸分子間で安定で及び特異的な結合が起こるように、十分な程度の相補性を示すために使用される用語である。本発明のオリゴマーは特異的にハイブリダイズ可能であるべきその標的核酸と１００％相補的である必要はないことを理解されたい。標的核酸へのオリゴマーの結合が標的の正常機能を妨害して有用性の損失を起こし、及び特異的結合が望まれる条件下、即ち、インビボアッセイ又は治療処置の場合は生理学的条件下、又はインビトロアッセイの場合はアッセイが実施される条件下、で非標的配列へのオリゴマーの非特異的結語を避けるために十分な程度の相補性が存在する場合、オリゴマーは特異的にハイブリダイズ可能である。
【００７２】
本発明の文脈において、“モジュレートする”とは改変又は修飾を意味し、増加する又は減少することを含んでいる。従って、遺伝子発現のモジュレートとは遺伝子発現を増加させる又は減少させることを含んでいる。本発明の一つの様相において、遺伝子発現をモジュレートするとは遺伝子発現を減少させることを意味している。
【００７３】
本明細書で使用される場合、用語“糖置換基”又は“２’−置換基”とは酸素原子を持つ又は持たない、リボシル部分の２’位へ結合された基を含んでいる。本発明に従った２’−糖修飾はフルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアルコキシ、保護Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルアミノアルキル、Ｏ−アルキルイミダゾール及び式（Ｏ−アルキル）ｍ （式中、ｍは１から約１０である）のポリエーテルを含んでいる。これらのポリエーテルの内で好適であるのは、クラウンエーテル及びその他の報告されている置換基のような直線状及び環状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＰＥＧ含有基である。Ｏｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．，Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　１９９２，９，９３；Ｒａｖａｓｉｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９１，５６，４３２９；及びＤｅｌｇａｒｄｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｉ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　ｉｎ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　１９９２，９，２４９を参照されたい。前記の文献の各々は全体が、本明細書に組み込まれる。さらなる糖置換基はＣｏｏｋ（Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ，１９９１，６，５８５〜６０７）により記載されている。フルオロ、Ｏ−アルキル、Ｏ−アルキルアミノ、Ｏ−アルキルイミダゾール、Ｏ−アルキルアミノアルキル及びアルキルアミノ置換基は“２’及び５’置換を持つピリミジンヌクレオチドを含んでいるオリゴマー化合物”と題して１９９５年５月６日に出願された米国特許出願第０８／３９８．９０１（その全体が、本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００７４】
本発明に従う追加の２’糖修飾には２’−ＳＲ及び２’−ＮＲ２ 基が含まれ、式中、各々のＲは独立して水素、保護基又は置換又は未置換アルキル、アルケニル又はアルキニルである。２’−ＳＲヌクレオシドは１９９７年９月２３日に公開された米国特許第５，６７０，６３３号に開示されている（その全体が、本明細書に組み込まれる）。２’−ＳＲモノマーの取り込みはＨａｍｍ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９７，６２，３４１５〜３４２０、に記載されている。２’−ＮＲ２ ヌクレオシドはＧｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｍ．，Ｊ，Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，６１，６２７３〜６２８１；及びＰｏｌｕｓｈｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．，１９９６，３７，３２２７〜３２３０、に記載されている。本発明に従うさらに別の代表的な２’−Ｏ−糖修飾には、式Ｉ又はＩＩ：
【００７５】
【化２９】
2004500330.tif 000015
【００７６】
（式中：
Ｅは、Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５ ）又はＮ＝Ｃ（Ｒ４） （Ｒ５ ）であり；
Ｒ４ 及びＲ５ の各々は、独立して、Ｈ、Ｃ１ 〜Ｃ１０アルキル、窒素保護基、又はＲ４ 及びＲ５ は一緒になって窒素保護基であるか又はＮ及びＯから選択される少なくとも一つの追加のヘテロ原子を含む環構造に結び付けられ；
Ｒ３ はＯＸ、ＳＸ又はＮ（Ｘ）２ であり；
各々のＸは、独立して、Ｈ、Ｃ１ 〜Ｃ８ アルキル、Ｃ１ 〜Ｃ８ ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｚ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚ又はＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｚであり；
ＺはＨ又はＣ１ 〜Ｃ８ アルキルであり；
Ｌ１ 、Ｌ２ 及びＬ３ は約４から約７の炭素原子を持っているか又は約３から約６の炭素原子及び１又は２のヘテロ原子を持っている環系から成り、前記ヘテロ原子は、酸素、窒素及び硫黄から選択され、ここで前記環系は、脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族又は飽和又は不飽和ヘテロ環式である；
ＹはＣ１ 〜Ｃ１０アルキル又はハロアルキル、Ｃ２ 〜Ｃ１０アルケニル、Ｃ２ 〜Ｃ１０アルキニル、Ｃ６ 〜Ｃ１４アリール、Ｎ（Ｒ４） （Ｒ５ ）、ＯＲ４ 、ハロ、ＳＲ４ 又はＣＮであり；
各々のｑ１ は、独立して、２から１０の整数であり；
各々のｑ２ は０又は１であり；
ｐは１から１０の整数であり；そして
ｒは１から１０の整数である。
但し、ｐが０である場合、ｒは１より大きい。）
のうちの１つを有するものが含まれる。
【００７７】
式Ｉの代表的２’−Ｏ−糖置換基は、その全体が本明細書に組み込まれる“キャップ化２’−オキシエトキシオリゴヌクレオチド”と題する１９９８年８月７日に出願された米国特許出願第０９／１３０，９７３に開示されている。
式ＩＩの代表的環状２’−Ｏ−糖置換基は、その全体が本明細書に組み込まれる“コンホメーション的に前もって形が与えられているＲＮＡ標的化２’−修飾オリゴヌクレオチド”と題する１９９８年７月２７日に出願された米国特許出願第０９／１２３，１０８に開示されている。
本発明の文脈において、“アルキル”とは炭素原子が単結合により連結されている置換又は未置換炭化水素基を意味している。“アルケニル”は少なくとも一つの二重結合を持っている置換又は未置換ヒドロカルビル部分を意味している。“アルキニル”は少なくとも一つの三重結合を持っている置換又は未置換ヒドロカルビル部分を意味している。
【００７８】
本発明に従ったオリゴマー化合物を製造するために使用された別の修飾にはロックされた核酸（ＬＮＡ）が含まれ、それは２’−Ｏ、４’−Ｃ−メチレンＬＮＡモノマーを含んでいる新規なコンホメーション的に制限されたオリゴヌクレオチド類似体である（Ｓｉｎｇｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５〜４５６を参照されたい）。ＬＮＡ及びＬＮＡ類似体は相補的ＤＮＡ及びＲＮＡと非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３から＋１０℃）、３’−エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、及び良好な溶解特性を示す。
ＬＮＡモノマーであるアデニン、シトシン、グアニン、５−メチルシトシン、チミン及びウラシルの合成、それらのオリゴマー化、及び核酸認識特性が報告されている（Ｋｏｓｈｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７〜３６３０を参照されたい）。不適正配列の研究は、対応する非修飾対照鎖と比較してＬＮＡはワトソン−クリック塩基対形成則に従い、一般的に改良された選択性を持っていることを示している。
【００７９】
ＬＮＡを含んでいる強力で無毒なアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ：　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０００，９７．５６３３〜５６３８）。著者はＬＮＡはいくつかの望ましい特性をアンチセンス剤に与えることを示している。ＬＮＡ／ＤＮＡコポリマーは血液血清及び細胞抽出物中で簡単には分解されない。ＬＮＡ／ＤＮＡコポリマーは、生きているラット脳及び大腸菌リポーター遺伝子中でＧ蛋白質共役レセプターのように異なって、アッセイ系において強力なアンチセンス活性を示した。
ＬＮＡのコンホメーションは２Ｄ　ＮＭＲ分光法により決定され、ｓｓＬＮＡ及び二重鎖の両方におけるＬＮＡヌクレオチドのロックされたコンホメーションは、Ｎ型コンホメーションのより高い比率を誘導するようにリン酸主鎖を組織している（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．，２０００，１３，４４〜５３）。これらのコンホメーション変化は核酸塩基の改良されたスタッキングに関連している（Ｗｅｎｇｅｌ　ｅｔ　ａｌ．．Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．１９９９，１８．１３６５〜１３７０）。
【００８０】
ＬＮＡは高い熱親和性で、相補的ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＬＮＡと二重鎖を形成する。ＣＤスペクトルは、完全に修飾されたＬＮＡを含んでいる二重鎖（特にＬＮＡ：ＲＮＡ）は構造的にＡフォームＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖に似ていることを示している。ＬＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＮＭＲ実験からＬＮＡモノマーの３’−末端コンホメーションが確認された。二本鎖ＤＮＡの認識が示され、ＬＮＡによる鎖進入が示唆されている。生きているヒト乳癌細胞内へのリポフェクチン仲介によるＬＮＡの有効な送達が達成されている。
【００８１】
核酸ポリメラーゼの基質としてのロックされたヌクレオシド含有オリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖の調製が報告されている（Ｗｅｎｇｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，ＰＣＴ国際出願ＷＯ　９８−ＤＫ３９３　１９９８０９１４を参照されたい）。ＬＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの新規なタイプ、ならびにＬＮＡそれ自体が広範囲の診断応用ならびに治療的応用で有用である。それらの中でも、アンチセンス応用、ＰＣＲ応用、鎖置換オリゴマー、核酸ポリメラーゼの基質として及びヌクレオチドに基づいた薬剤として有用である。
ＬＮＡは、非常に安定なＬＮＡ：ＬＮＡ二重鎖を形成することが示されている　（Ｋｏｓｈｋｉｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９８，１２０，１３２５２〜１３２５３）。ＬＮＡ：ＬＮＡハイブリダイゼーションは最も熱的に安定な核酸型二重鎖系であることが示されており、ＬＮＡのＲＮＡ模倣特性が二重鎖レベルで確立されている。３ＬＮＡモノマー（Ｔ又はＡ）の導入は、ＤＮＡ相補体に対して融点の著しい増加（Ｔｍ＝＋１５／＋１１）を誘導した。ＬＮＡ仲介ハイブリダイゼーションの普遍性は非常に安定なＬＮＡ：ＬＮＡ二重鎖の形成により強調されている。ＬＮＡのＲＮＡ模倣はモノマーのＮ型コンホメーション制限及びＬＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の二次構造に関して反映されている。
【００８２】
２’−アミノ−ＬＮＡ、ハンドル（Ｈａｎｄｌｅ）を持つ新規コンホメーション制限高親和性オリゴヌクレオチド類似体の合成が示されている（Ｓｉｎｇｈ
ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５〜１００３９を参照されたい）。
２’−アミノ−及び２’−メチルアミノ−ＬＮＡが製造され、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ鎖との二重鎖の熱安定性が前に報告されている。同様に、ＬＮＡの最初の類似体、ホスホロチオエート−ＬＮＡ及び２’−チオ−ＬＮＡが製造されている（Ｋｕｍａｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９〜２２２２を参照されたい）。
【００８３】
本明細書で使用する場合、“脂肪族環式”とは炭素原子が単結合で連結されている飽和環構造を持っているヒドロカルビル基を意味している。本発明に従った脂肪族環式基はまた、環構造内に又は環外置換基の一部としてある種のヘテロ原子を含んでいてもよい。
さらに、本発明の文脈において、“アリール”（一般的にはＣ６ 〜Ｃ２４）は置換及び未置換芳香族ヒドロカルビル基が含まれるが、それに限定されるわけではない。アラルキル基（一般的にはＣ７ 〜Ｃ２５）はベンジル及びキシリル基のようなアリール及びアルキル官能性の両方を持っている基が含まれるが、それに限定されるわけではない。好ましいアリール及びアラルキル基には、フェニル、ベンジル、キシリル、ナフチル、トルオイル、ピレニル、アントラシル、アズリル、フェネチル、シンナミル、ベンズヒドリル及びメジチルが含まれるが、これらに限定されるわけではない。置換のための典型的な置換基には、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル又はアルキニル基が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００８４】
本発明の化合物を利用する治療組成物の処方及び続いての投与は当業者の範囲内にあると信じられている。投与量は処置されるべき疾患状態の重度及び応答性に依存しており、処置過程は数日から数ヶ月、又は治療が達成されるまで、又は疾患状態の減退が達成されるまで永続する。至適投与スケジュールは、患者体内の薬剤蓄積を測定することから計算できる。当業者は容易に至適投与量、投与方法及び反復率を決定できる。至適投与量は個々のオリゴマーの相対的効力に依存して変化するであろうが、一般的に、インビトロ及びインビボ動物モデルで有効であると観察されたＥＣ５０に基づいて見積もることができる。一般に、投与量は体重ｋｇ当たり０．０１μｇから１００ｇであり、日、週、月又は年に一度又はそれ以上、さらには２から２０年に一度投与されることができる。当業者は体液又は組織において測定された薬剤の滞留時間及び濃度に基づいて、投与の反復率を容易に推定できる。処置が成功したら、疾患状態の再発を予防するために患者に維持療法を行うことが望ましく、そこではオリゴマーは、体重ｋｇ当たり０．０１μｇから約１０ｇ、日に一度又はそれ以上から２０年に一度の維持投与量で投与される。
【００８５】
本発明の追加の目的、利点及び新しい特色が以下の実施例の審査により当業者には明らかになるであろう。以下の実施例は本発明の例示であり、本発明を制限することを意図しているものではない。当業者は本明細書に説明されている特定の物質、組成物及び方法の多くの均等物を認識、又はルーチンの実験を通して確認できるであろう。そのような均等物は本発明の範囲内にあると考えられる。
【００８６】
【実施例】
全ての試薬及び溶媒は、特に断らない限り、供給業者から購入された。２−シアノエタノール、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（ＤＳＣ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ）フタルイミド、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトライソプロピルホスホロジアミダイト、６−アミノヘキサノール、及び２−メチル−２−チオプソイド尿素硫酸塩は、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｉｎｃ． （Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ， ＷＩ） から得られた。ＤＮＡ合成装置用の試薬は、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ） から購入された。２，２’−アンハイドロ−５−メチルウリジンは、味の素（東京，日本）から購入された。フラッシュクロマトグラフィーは、シリカゲル （Ｂａｋｅｒ，４０μｍ）で行なわれた。薄層クロマトグラフィーは、Ｅ． Ｍｅｒｃｋからの Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌガラスプレートで行なわれ、そしてＵＶ光及びｐ−アニスアルデヒド／硫酸／酢酸スプレーをしてからの炭化で可視化された。
本明細書に記載された全ての誘導体化について、誘導体化された物質は、更に精製されることなく得られたままで使用されることができる。
【００８７】
実施例１
Ｎ−（２−シアノエトキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（ＣＥＯＣ−Ｏ−スクシンイミド）（１）の合成
３００ｍＬの無水ＣＨ３ ＣＮ中の２−シアノエタノール（７．２３ｇ，１０２ミリモル）の攪拌溶液に、アルゴン雰囲気下、Ｎ，Ｎ’−ジスクシンイミジルカーボネート（３４．０ｇ，１３３ミリモル）を加えてからピリジン（１１．３ｍＬ，１４０ミリモル）を加えた。その懸濁液は、約１時間後に澄明溶液になった。この溶液は更に６時間攪拌されてから減圧濃縮された。残渣はジクロロメタン（２００ｍＬ）中に溶解され、飽和ＮａＨＣＯ３ 溶液（３×５０ｍＬ）、次いで飽和ＮａＣｌ溶液（３×５０ｍＬ）で抽出された。有機層は乾燥されてから（無水Ｎａ２ ＳＯ４ ）濃縮されて白色固体を与えた。痕跡のピリジンが乾燥アセトニトリルとの共濃縮により除かれた。その白色固体は一晩減圧乾燥されてからエーテル（１５０ｍＬ）中で磨り潰されて、２０．２３ｇ（９４％）の１が無色非晶質粉末として得られた。この物質は、デシケーター中で室温で長期間（１〜２年）安定である。プロトン及びカーボンＮＭＲスペクトルで、この段階でさえ均質な物質であることが明らかになった。この物質は、ＣＨ２ Ｃｌ２ ：ＥｔＯＡｃ（５０：５０）を使用するシリカゲルでのクロマトグラフィーにより更に精製されて、白色結晶性化合物（１８．７２ｇ，８７％）を与えた；Ｒｆ＝０．２１；ｍｐ１０５．５℃。
１Ｈ ＮＭＲ （４００Ｍ Ｈｚ， ＣＤＣｌ３） ：２．８５ （ｔ， Ｊ ＝ ６．６２ Ｈｚ， ２Ｈ）， ２．８６ （ｓ， ４Ｈ）， ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．９６ Ｈｚ） ； １３Ｃ ＮＭＲ （８０ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）：１７．３３， ２５．３９， ６５．８６， １１７．９１， １５０．９１， １６９．８２ ；ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）：Ｃ８Ｈ９Ｎ２Ｏ５＋ の計算値：２１３．０５１１， 実測値：２１３．０５０９；元素分析：Ｃ８Ｈ８Ｎ２Ｏ５の計算値：Ｃ， ４５．２９； Ｈ， ３．８０； Ｎ， １３．２０；　実測値：Ｃ， ４５．１９； Ｈ， ３．４５； Ｎ， １３．０２ 。
【００８８】
実施例２
２’−Ｏ−フタルイミドエチル−５−メチルウリジン（２）の合成
Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）フタルイミド（２７７ｇ，１．４５モル）が、テトラヒドロフラン中のボランの溶液（１Ｍ，６００ｍＬ）に攪拌しながらゆっくり加えられた。固体が溶解するにつれて水素が発生した。ガス発生が止まると、その溶液は、２Ｌステンレススチールボンベに入れられた。２，２’−アンハイドロ−５−メチルウリジン（６０ｇ，０．２５モル）及び重炭酸ナトリウム（１２０ｍｇ）が加えられ、そしてそのボンベは閉められた。３０分後、ボンベは通気されて油浴に入れられ１５０℃の内温に２４時間加熱された。ボンベは室温まで冷やされて開けられた。ＴＬＣ（酢酸エチル：メタノール；９５：５）で、出発原料の消失が明らかになった。その粗製溶液は濃縮され、そして、残渣は、過剰のフタルイミド試薬を除くために酢酸エチルで始めてから２を溶出させるために酢酸エチル−メタノール（９５：５）で溶離させるシリカゲルでのクロマトグラフィーにより精製された（２２．２ｇ，２０．６％）。
１Ｈ ＮＭＲ （２００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： １．８ （ｓ， ３Ｈ）， ３．４−４．２ （ｍ， ６Ｈ）， ５．０−５．２ （ｍ， ２Ｈ）， ５．８ （ｄ，， Ｊ ＝ ５．１ Ｈｚ， １Ｈ）， ７．６５ （ｓ， １Ｈ）， ７．８−８．０ （ｍ， ４Ｈ）， １１．２ （ｓ， １Ｈ） 。
【００８９】
実施例３
２’−Ｏ−（２−フタルイミドエチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−メチルウリジン（３）の合成
２’−Ｏ−フタルイミドエチル−５−メチルウリジン（２，２２．２ｇ，０．０５３モル）が、ピリジン（２×７５ｍＬ）と共濃縮されてから、１００ｍＬのピリジン中に溶解された。塩化ジメトキシトリチル（２７ｇ，０．０８０モル）が攪拌しながら少しずつ加えられた。１時間後、ＴＬＣ（酢酸エチル−ヘキサン５０：５０）で、反応の完結が示された。メタノール（１０ｍＬ）が反応を停止させるために加えられた。その混合液は濃縮され、そして残渣は酢酸エチルと飽和重炭酸ナトリウム溶液（各々１５０ｍＬ）に分けられた。有機層が濃縮され、残渣は最小量のジクロロメタンに溶解され、そしてシリカゲルカラムにかけられた。その化合物は酢酸エチル−ヘキサン−トリエチルアミン（５０：５０：１から８０：２０：１）で溶離され、３（２６．１ｇ，６８％）が白色泡状物として得られた。
１Ｈ ＮＭＲ （２００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）：１．３３ （ｓ， ３Ｈ）， ３．０５ （ｄ， Ｊ ＝ ８．４ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．４９ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８ （ｓ， ６Ｈ）， ３．９−４．１ （ｍ， ４Ｈ）， ４．１８−４．２６ （ｍ， １Ｈ）， ４．４７ （ｍ， １Ｈ）， ５．８８ （ｓ， １Ｈ）， ６．８４ （ｄ， Ｊ ＝ ８．７８ Ｈｚ， ４Ｈ）， ７．２２−７．４３ （ｍ， ９Ｈ）， ７．６９−７．８８ （ｍ， ５Ｈ）， ８．２６ （ｓ， １Ｈ）；ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）： Ｃ４１Ｈ３９Ｎ３Ｏ１０Ｎａ ＋ の計算値： ７５６．２５３３， 実測値： ７５６．２５５３。
【００９０】
実施例４
２’−Ｏ−（２−アミノエチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−メチルウリジン（４）の合成
２’−Ｏ−フタルイミドエチル−５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウリジン（３，２１．１ｇ，０．０２９モル）がメタノール（５００ｍＬ）中に溶解された。無水ヒドラジン（４．９ｍＬ，０．１５モル）が加えられ、その溶液は還流まで加熱された。３時間後のＴＬＣで反応の完結が示された。残渣は、メタノール、次いでメタノール−水酸化アンモニウム（９８：２）を使用するシリカゲルでのクロマトグラフィーにより精製されて、４（１２．４ｇ，７０％）を与えた。この物質は、塩化メチレン中に完全に溶解したので、カラムの浸出物からのシリカの痕跡がこの段階の濾過により除去され、そしてその溶液が濃縮された。
１Ｈ ＮＭＲ （２００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １．３９ （ｓ， ３Ｈ）， ２．９８ （ｔ， Ｊ ＝ ３．４８ Ｈｚ， ２Ｈ）， ３．４５ （ｄ， Ｊ ＝ ２．５６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５３ （ｄ， Ｊ ＝ １．９６ Ｈｚ， １Ｈ）， ３．５６−３．６８ （ｍ， ２Ｈ）， ３．８１ （ｓ， ６Ｈ）， ３．９９ （ｍ， １Ｈ）， ４．１ （ｔ， Ｊ ＝ ４．５６ Ｈｚ， １Ｈ）， ４．１７ （ｍ， １Ｈ）， ４．４５ （ｔ， Ｊ ＝ ５．０６ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．０６ （ｄ， Ｊ ＝ ４．１２ Ｈｚ， １Ｈ）， ６．８６ （ｄ， Ｊ ＝ ８．９ Ｈｚ， ４Ｈ）， ７．２５−７．４６ （ｍ， ９Ｈ） ， ７． ６７ （ｓ， ＩＨ）； １３Ｃ （５０ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １１．７１， ４０．５５， ４５．７６， ５５．０３， ６２．４７， ６９．１５， ７０．６５， ８２．６４， ８３．４９， ８６．６２， ８７．１０， １１０．９８， １１３．０９， １２６．９１， １２７．７７， １２７．９７， １２９．９５， １３５．３５， １４４．２５， １５１．２７， １５８．４６， １６４．９７； ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）： Ｃ３３Ｈ３７Ｏ８Ｎ３Ｎａ ＋の計算値： ６２６．２４７８， 実測値： ６２６．２５０１。
【００９１】
実施例５
Ｎ，Ｎ’−ビス−ＣＥＯＣ−２−メチル−２−チオプソイド尿素（５）の合成
２−メチル−２−チオプソイド尿素・１／２Ｈ２ ＳＯ４ （５．２９ｇ，３８．０ミリモル）がＣＨ２ Ｃｌ２ （２５０ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３ 溶液（２５０ｍＬ）中に懸濁された。シアノエトキシカルボニルオキシスクシンイミド１（２０．２ｇ，９５．３ミリモル）が加えられて、反応液は２時間攪拌された。有機相が分液された。水相がＤＣＭ（２×２００ｍＬ）で抽出され、合わされた有機相が乾燥（Ｎａ２ ＳＯ４ ）され、濾過され、そして濃縮された。この粗生成物は、溶離液としてのＡｃＯＥｔ／ＤＣＭ（９５：５）でのフラッシュクロマトグラフィーにより精製され、５（３．７８ｇ，３５％）を白色固体として与えた。
１Ｈ ＮＭＲ （２００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １１．８０ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ４．３９ （ｑ， ４Ｈ）， ２．８０ （ｔ， ４Ｈ）， ２．４５ （ｓ， ３Ｈ） 。
【００９２】
実施例６
Ｎ，Ｎ’−ビス−ベンゾイル−２−メチル−２−チオプソイド尿素（６）の合成　この化合物は、Ｄｅｒｏｃｑｕｅ ｅｔ ａｌ． （Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｄｅ ｌａ Ｓｏｃｉｅｔｅ Ｃｈｉｍｉｑｕｅ ｄｅ Ｆｒａｎｃｅ， １９６８， ５， ２０６２−２０６６） により記載された通りに調製された。
【００９３】
実施例７
Ｎ，Ｎ’−ビス−ピバロイル−２−メチル−２−チオプソイド尿素（７）の合成　２−メチル−２−チオプソイド尿素・１／２Ｈ２ ＳＯ４ （１．０ｇ，３．６０ミリモル）が乾燥ピリジン（１４．４ｍＬ）中に懸濁された。塩化ピバロイル（１．７７ｍＬ，１４．４ミリモル）が加えられて、その反応混合液は一晩攪拌された。反応は、５％ＮａＨＣＯ３ 水溶液（１００ｍＬ）の添加により止められ、そしてジクロロメタン（２×５０ｍＬ）で抽出された。有機相が乾燥（Ｎａ２ ＳＯ４ ）され、濾過され、そして濃縮された。この粗生成物は、溶離液としてのＡｃＯＥｔでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製され、７（１．２７ｇ，６８％）を与えた。
１Ｈ ＮＭＲ （２００ ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ６）： １３．１０ （ｓ， １Ｈ）， ２．３９ （ｓ， ３Ｈ）， １．２２ （ｓ， １８Ｈ）； ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）： Ｃ１２Ｈ２３Ｎ２Ｏ２Ｓ ＋の計算値 ２５９．４８０， 実測値： ２５９．１４８５。
【００９４】
実施例８
２’−Ｏ−〔（Ｎ，Ｎ’−ビス−ＣＥＯＣ−グアニジウム）エチル〕−５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウリジン（８）の合成
化合物５（０．２７ｇ，０．９５ミリモル）が無水ＤＭＦ（３ｍＬ）中に室温で溶解された。これに、化合物４（０．５２ｇ，０．８６ミリモル）、次いでトリエチルアミン（０．１２ｍＬ，０．８６ミリモル）が加えられ、そしてその反応液は、室温で４時間攪拌された。その反応は５％ＮａＨＣＯ３ 溶液（４０ｍＬ）の添加によって止められ、ＡｃＯＥｔ（２×６０ｍＬ）で抽出され、合わされた有機相は乾燥（Ｎａ２ ＳＯ４ ）され、濾過され、そして濃縮された。この粗生成物は、溶離液としてのＡｃＯＥｔでのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製され、８（０．４８０ｇ，６６％）を与えた。
１Ｈ ＮＭＲ （２００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １１．７０ （ｓ， １Ｈ）， ８．６０ （ｔ， １Ｈ）， ８．５１ （ｓ， １Ｈ）， ７．６６ （ｓ， １Ｈ）， ７．３９−７．２７ （ｍ， ９Ｈ）， ６．８４ （ｄ， ４Ｈ）， ５．９７ （ｄ， １Ｈ）， ４．５０−３．７０ （ｍ， １６Ｈ）， ３．５０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７３ （ｍ， ４Ｈ）， １．３７ （ｓ， ３Ｈ）； １３Ｃ−ＮＭＲ （８０ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １６４．５０， １６２．９２， １５８．７０， １５６．０６， １５３．０２， １５０．８３， １４４．４３， １３５．４６， １３５．２９， １３０．１５， １２８．０６， １２７．７２， １２７．１８， １１７．５０， １１６．８８， １１３．３２， １１１．０９， ８７．１４， ８６．８２， ８３．５０， ８２．４０， ６９．１９， ６８．９４， ６２．３５， ６１．０９， ５９．８９， ５５．２９， ４０．８８， １８．０５， １７．９２， １１．８７； ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）： Ｃ４２Ｈ４５Ｎ７Ｏ１２Ｎａ ＋ の計算値 ８６２．３０２４，実測値： ８６２．２９９１。
【００９５】
実施例９
２’−Ｏ−〔（Ｎ，Ｎ’−ビス−ＣＥＯＣ−グアニジウム）エチル〕−５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−〔（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル〕ホスホロアミダイト（９）の合成
化合物８（０．３９ｇ，０．４６ミリモル）及びジイソプロピルアミンテトラゾリド（０．０８ｇ，０．４６ミリモル）が、無水ＭｅＣＮとの共濃縮により乾燥された。残渣は無水ＭｅＣＮ（３ｍＬ）中に溶解された。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．２７ｍＬ，０．８７ミリモル）が加えられ、そしてその反応混合液は、アルゴン気流下、室温で５時間攪拌された。溶媒が留去され、そして粗生成物は、溶離液としてのＡｃＯＥｔ／ヘキサンでのフラッシュクロマトグラフィーにより精製され、９（０．３１０ｇ，６４％）を与えた。
３１Ｐ ＮＭＲ （８０ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １５０．８７ 及び １５０．７８； ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）： Ｃ５１Ｈ６３Ｏ１３Ｎ９ＰＣｓ ＋ の計算値 １１７２．３２５９， 実測値： １１７２．３２０３ 。
【００９６】
実施例１０
２’−Ｏ−〔２−（Ｎ，Ｎ’−ビス−ベンゾイル−グアニジウム）エチル〕−５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウリジン（１０）の合成
化合物６（０．５ｇ，１．６６ミリモル）が無水ＤＭＦ（３ｍＬ）中に溶解された。ヌクレオシド４（０．５ｇ，０．８３ミリモル）及びトリエチルアミン（０．１２ｍＬ，０．８３ミリモル）が加えられた。その反応混合液は室温で５時間攪拌された。その反応混合液は食塩水（５０ｍＬ）に加えられ、そして酢酸エチル（２×５０ｍＬ）で抽出された。有機相は、無水Ｎａ２ ＳＯ４ で乾燥され、濃縮されて、黄色固体を与えた。この粗生成物は、溶離液としてのＡｃＯＥｔ−ヘキサン（１：１）でのフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製され、１０（０．６６ｇ，９３％収率）を与えた。
１Ｈ ＮＭＲ （２００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １４．５０ （ｓ， １Ｈ）， ９．７９ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ９．１９ （ｓ， １Ｈ）， ８．２５ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．６２ Ｈｚ）， ８．０５ （ｄ，． ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．９４ Ｈｚ） ， ７．６９ （ｓ， １Ｈ）， ７．６３−７．２５ （ｍ， １５Ｈ）， ６．８０ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ８．８ Ｈｚ）， ５．９９ （ｓ， １Ｈ）， ４．９２ （ｍ， ｌＨ）， ４．２８ （ｍ， １Ｈ）， ４．１８−３．８０ （ｍ， ６Ｈ）， ３．７８ （ｓ， ６Ｈ）， ３．５０ （ｍ， ２Ｈ）， ２．８６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ９．０１ Ｈｚ）， １．３５ （ｓ， ３Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ （５０ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １７８．６７， １６８．４３， １６４．１５， １５８．７３， １５７．１３， １５０．５６， １４４．４２， １３５．４９， １３５．３６， １３５．１２， １３３．６５， １３２．１１， １３１．８７， １３０．１７， １２９．９３， １２９．５１， １２９．１２， １２８．０６， １２７．１４， １１３．３２， １１１．０７， ８７．８５， ８６．８３， ８３．１９， ８２．５９， ６８．９６， ６１．７０， ５５．２６， ４０．８８， １１．８９； ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）： Ｃ４８Ｈ４８Ｎ５Ｏ１０の計算値 ８５４．３４０， 実測値： ８５４．３３８１。
【００９７】
実施例１１
２’−Ｏ−〔２−（Ｎ，Ｎ’−ビス−ベンゾイル−グアニジウム）エチル〕−５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−〔（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル〕ホスホロアミダイト（１１）の合成
化合物１１は、実施例９に記載された操作に従って、化合物１０から調製された。収率：１．４９ｇ（７０％）。
１Ｈ ＮＭＲ （２００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １４．４６ （ｓ， １Ｈ）， ９．７３ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．６４ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．２５ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．６３ Ｈｚ）， ８．０２ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．９４ Ｈｚ）， ７．６９ （ｓ， １Ｈ）， ７．６３−７．２３ （ｍ， １５Ｈ）， ６．８０ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ８．７４ Ｈｚ）， ６．０６ 及び ６．０１ （２ ｘ ｄ， １Ｈ）， ４．６０−３．３０ （ｍ， １７Ｈ）， ２．５５ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．６ Ｈｚ）， ２．３５ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．５ Ｈｚ）， １．４０−０．８０ （ｍ， １５Ｈ）； ３１Ｐ ＮＭＲ （８０ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １５０．８３及び １５０．５８； ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）： Ｃ５７Ｈ６４Ｎ７Ｏ１１ＰＣｓ ＋ の計算値 １１８６．３４５６， 実測値： １１８６．３４１０ 。
【００９８】
実施例１２
２’−Ｏ−〔２−（Ｎ，Ｎ’−ビス−ピバロイルグアニジウム）エチル〕−５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウリジン（１２）の合成
化合物１２は、実施例８に記載された操作に従って、化合物４及び７から調製された。収率：０．９８ｇ（７３％）。
１Ｈ ＮＭＲ （２００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １３．３９ （ｓ， １Ｈ）， ９．５０ （ｓ， １Ｈ）， ９．４０ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ７．６７ （ｓ， １Ｈ）， ７．４４−７．２０ （ｍ， ９Ｈ）， ６．８３ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ８．８４ Ｈｚ）， ５．９５ （ｓ， １Ｈ）， ４．５０ （ｍ， １Ｈ）， ４．２０−４．００ （ｍ， ２Ｈ）， ３．９０−３．６０ （ｍ， ４Ｈ）， ３．７８ （ｓ， ６Ｈ）， ３．５５ （ｍ， ２Ｈ）， ２．７８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ８．８８ Ｈｚ）， １．３７ （ｓ， ３Ｈ）， １．２６ （ｓ， ９Ｈ）， １．１８ （ｓ， ９Ｈ）； １３Ｃ： ＮＭＲ （５０ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １９３．８２， １８１．７３， １６４．１２， １５８．７５， １５６．５７， １５０．４２， １４４．３９， １３５．４９， １３５．３４， １３５．１６， １３０．１７， １２８．２２， １２８．０４， １２７．１５， １１３．３２， １１１．０３， ８７．７６， ８６．８５， ８３．１７， ８２．４６， ６８．９４， ６１．７３， ６０．４２， ５５．２６， ４２．０１， ４０．４２， ２７．９０， ２７．０９， １１．８７； ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）： Ｃ４４Ｈ５５Ｎ５Ｏ１０　の計算値
１４．４０２７，実測値： ８１４．４０５４。
【００９９】
実施例１３
２’−Ｏ−〔２−（Ｎ，Ｎ’−ビス−ピバロイルグアニジウム）エチル〕−５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−〔（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル〕ホスホロアミダイト（１３）の合成
化合物１３は、実施例９に記載された通りに、化合物１２から調製された。収率：０．８４０ｇ（７２％）。
１Ｈ ＮＭＲ （２００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １３．３５ （ｓ， １Ｈ）， ９．３１ （ｓ， １Ｈ）， ８．９５ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ７．７２ 及び ７．６５ （２ ｘ ｓ， １Ｈ）， ７．４５−７．２０ （ｍ， ９Ｈ）， ６．８６ （ｍ， ４Ｈ）， ６．００及び ５．９５ （２ ｘ ｄ， １Ｈ）， ４．６０−３．２０ （ｍ， １７Ｈ）， ２．６３ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．７２ Ｈｚ）， ２．３７ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ７．２ Ｈｚ）， １．４０−０．８０ （ｍ， ３３Ｈ）； ３１Ｐ ＮＭＲ （８０ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １５０．７３ 及び １５０．５５； ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）： Ｃ５３Ｈ７２Ｎ７Ｏ１１ＰＣｓ ＋ の計算値 １１４６．４０８２， 実測値： １１４６．４０３４ 。
【０１００】
実施例１４
５−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−〔２−メトキシエチル〕−５−（３−アミノ−１−プロピン）ウリジン（１４）の合成
２’−Ｏ−メトキシエチルウリジン（米国特許第５，７６０，２０２号に記載された操作に従って合成されたもの）が、過剰のピリジン／塩化ベンゾイルで処理されて、定量的収率で３’，５’−ジベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチルウリジンを与えた。この化合物は、溶媒としてのアセトニトリル中で、ヨウ化リチウム（１当量）及び硝酸セリウムアンモニウム（３当量）で処理された。一晩攪拌した後、ＴＬＣで、５−ヨード−３’−５’−ジベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチルウリジンの生成が示された。アセトニトリルが留去され、残渣はＣＨ２ Ｃｌ２ 中に溶解され、そして飽和ＮａＨＣＯ３ 溶液で抽出された。有機層は乾燥され（Ｎａ２ ＳＯ４ ）濃縮乾固された。残渣は、シリカカラムで精製され、そしてＥｔＯＡｃ／ヘキサン（７：３）で溶出された。生成物を含有する画分が一緒にプールされて濃縮された。Ｎ−トリフルオロアセチルプロパルギルアミン（３当量）が、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）〔（Ｐｈ３ Ｐ）４Ｐｄ〕、ヨウ化銅、トリエチルアミン及びＤＭＦと一緒に、この化合物に加えられて、Ｃ−５−（Ｎ−トリフルオロアセチル）プロパルギルアミン誘導体が与えられた。この化合物をメタノール中でナトリウムと処理して、３’−５’−ビス−ヒドロキシルペアレント化合物が与えられた。この化合物は、５’−ジメトキシトリチル化された。そのトリフルオロアセチル基は、ＮＨ４ ＯＨ／ピリジンでの処理により脱保護された。
【０１０１】
実施例１５
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−〔２−（メトキシ）エチル〕−５−〔３−（Ｎ，Ｎ’−ビス−ＣＥＯＣ−グアニジウム）−１−プロピン〕ウリジン（１５）の合成
化合物１５は、実施例８に記載された操作に従って、化合物５及び１４から調製された。収率：０．５４ｇ（１７％）。
１Ｈ ＮＭＲ （２００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １１．６１ （ｓ， １Ｈ）， ９．８０ （ｂｒ ｓ， １Ｈ） ， ８．１３ （ｄ．， ２Ｈ）， ７．４５−７．２０ （ｍ， ９Ｈ）， ６．８３ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ８．８２ Ｈｚ）， ５．９３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．４８ Ｈｚ）， ４．４５ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ４．１６−３．９６ （ｍ， ６Ｈ）， ３．７７ （ｓ， ６Ｈ）， ３．８２−３．３９ （ｍ， ６Ｈ）， ３．３７ （ｓ， ３Ｈ）， ２．７３ （ｑ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ６．３ Ｈｚ）； １３Ｃ ＮＭＲ （５０ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １６２．０７， １６１．７７， １５８．５３， １５５．０３， １５２．６７， １４９．６０， １４９．３９， １４４．６４， １４３．２２， １３６．２５， １３５．６２， １３５．４０， １３０．０３， １２８．０８， １２７．９０， １２６．８８， １２３．７７， １１７．０７， １１６．２０， １１３．３８， ９９．２７， ８８．０５， ８６．９６， ８３．９７， ８３．１２， ７４．８４， ７１．８４， ７０．３９， ６２．３５， ６０．８６， ６０．４４， ６０．０８， ５９．０２， ５５．３２， ３１．７１， １８．１ 。
【０１０２】
実施例１６
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−〔２−（メトキシ）エチル〕−５−〔３−（Ｎ，Ｎ’−ビス−ＣＥＯＣ−グアニジウム）−１−プロピン〕ウリジン−３’−Ｏ−〔（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル〕ホスホロアミダイト（１６）の合成
化合物１６は、実施例９に記載された操作に従って、化合物１５から調製された。収率：０．２４ｇ（３５％）。
３１Ｐ ＮＭＲ （８０ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １５０．９１ 及び １５０．１５； ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）： Ｃ５４Ｈ６４Ｏ１４Ｎ９ＰＮａ ＋ の計算値 １１１６．４２０８， 実測値： １１１６．４２４３ 。
【０１０３】
実施例１７
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−〔２−（メトキシ）エチル〕−５−〔３−（Ｎ，Ｎ’−ビス−ベンゾイルグアニジウム）−１−プロピン〕ウリジン（１７）の合成
化合物１７は、実施例８に記載された操作に従って、化合物６及び１４から調製された。収率：０．８６ｇ（３８％）。
１Ｈ ＮＭＲ （２００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １４．３４ （ｓ， １Ｈ）， ９．５７ （ｂｒ ｓ， １Ｈ） ， ９．２９ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ４．８８ Ｈｚ）， ８．２４ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６． ６２ Ｈｚ）， ８．２０ （ｓ， １Ｈ）， ８．０２ （ｄ， ２Ｈ， Ｊ ＝ ６．７２ Ｈｚ）， ７．６３−７．１９ （ｍ， １５Ｈ）， ６．８２ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ８． ８４ Ｈｚ）， ５．９５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．３ Ｈｚ）， ４．４７ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ４．２６−４．００ （ｍ， ５Ｈ）， ３．８４−３．３７ （ｍ， １４Ｈ）， ２．１０ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）； １３Ｃ　ＭＲ （５０　Ｈｚ， ＣＤＣｌ３） ： １７８．６２， １６７．８３， １６１．６５， １５８．６０， １５６．０６， １４９．４３， １４４．７２， １４０．７５， １３７．４１， １３５．６０， １３５．３７， １３３．５５， １３２．１２， １３１．９３， １３０．０５， １２９．６５， １２９．１０， １２８．００， １２６．８８， １１３．３５， ９９．６６， ８８．７１， ８８．１１， ８６．９５， ８３．９３， ８３．０８， ７４．５４， ７１．３７， ７０．３２， ６９．０６， ６２．２８， ５８．９６， ５５．１９， ３１．６２； ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）： Ｃ５１Ｈ４９Ｏ１１Ｎ５　の計算値 ９０８．３５０７，実測値： ９０８．３５４６。
【０１０４】
実施例１８
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−〔２−（メトキシ）エチル〕−５−〔３−（Ｎ，Ｎ’−ビス−ベンゾイルグアニジウム）−１−プロピン〕ウリジン−３’−Ｏ−〔（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル〕ホスホロアミダイト（１８）の合成
化合物１８は、実施例９に記載された操作に従って、化合物１７から調製された。収率：０．７２ｇ（８６％）。
３１Ｐ ＮＭＲ （８０ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １５０．９３ 及び １５０．２１； ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）： Ｃ６０Ｈ６６Ｎ７Ｏ１２Ｐ ＋ の計算値 １１０８．４５８５， 実測値： １１０８．４５４８ 。
【０１０５】
実施例１９
５−（３−フタルイミド−１−プロピニル）−２’−デオキシウリジン（１９）の合成
１０ｍＬのＣＨ２ Ｃｌ２ 中の５−ヨード−２’−デオキシウリジン（２ミリモル）の懸濁液に、トリフルオロ無水酢酸（５ミリモル）を室温で加えた。この混合液を一晩攪拌した。この混合液は濃縮された後、室温で減圧乾燥されて、３’，５’−ジ−Ｏ−トリフルオロアセチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジンの泡状固体を与えた。３’，５’−ジ−Ｏ−トリフルオロアセチル−５−ヨード−２’−デオキシウリジン（５ミリモル）とＮ−１−フタルイミド−１−プロピン（１０ミリモル）との混合物に、１０ｍＬのＤＭＦ中のテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．２ミリモル）、ヨウ化銅（Ｉ）（０．３ミリモル）及びトリエチルアミン（６ミリモル）を加えた。この混合液は、室温で１８時間攪拌されてから減圧濃縮された。その濃縮物に、ＡＧ−１ｘ８アニオン交換樹脂（ＨＣＯ３ − 型，３当量）、２０ｍＬのメタノール及び２０ｍＬのＣＨ２ Ｃｌ２ が加えられ、その懸濁液は１時間攪拌された。残渣は、シリカゲルクロマトグラフィーにより精製されて、５−（３−フタルイミド−１−プロピニル）−２’−デオキシウリジン（１９）を与えた。
【０１０６】
実施例２０
５’−Ｏ−ＤＭＴ−５−（３−フタルイミド−１−プロピニル）−２’−デオキシウリジン（２０）の合成
５−（３−フタルイミド−１−プロピニル）−２’−デオキシウリジン（１９）が、０．１当量のジメチルアミノピリジンを含有するピリジン中で、１．２当量の塩化４，４’−ジメトキシトリチルで処理された。４時間攪拌した後、ピリジンが留去され、残渣は塩化メチレン中に溶解され、飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄され、無水硫酸ナトリウムで乾燥され、そして濃縮された。残渣は、酢酸エチル−ヘキサンを使用するシリカカラムクロマトグラフィーで精製されて、５’−Ｏ−ＤＭＴ誘導体（２０）を生成した。
【０１０７】
実施例２１
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−５−〔３−（アミノ）−１−プロピン〕ウリジン（２１）の合成
上記のフタルイミド化合物（２０）は、実施例４に記載した操作に従ったヒドラジン処理でアミノ化合物２１を生成した。
【０１０８】
実施例２２
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−５−〔３−（Ｎ，Ｎ’−ビス−ＣＥＯＣ−グアニジウム）−１−プロピン〕ウリジン（２２）の合成
化合物２２は、実施例８に記載された操作に従って、化合物２１から調製された。収率：３．４７ｇ（６３％）。
１Ｈ ＮＭＲ （２００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １１．５９ （ｓ， １Ｈ）， ９．８０ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．２２ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ８．１１ （ｓ， １Ｈ）， ７．４３−７．２０ （ｍ， ９Ｈ）， ６．８２ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝ ８．６８ Ｈｚ）， ６．２８ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ６． １５ Ｈｚ）， ４．５０ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ４．２９ （ｍ， ４Ｈ）， ４．１１ （ｍ， ３Ｈ）， ３．７５ （ｓ， ６Ｈ）， ３．４０ （ｍ， ３Ｈ）， ２．６９ （ｍ， ４Ｈ）， ２．５０ （ｍ， １Ｈ）， ２．３０ （ｍ， １Ｈ）； １３Ｃ ＮＭＲ （５０ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １６２．９２， １６２．２４， １５８．８２， １５５．４１， １５２．８８， １４９．６０， １４４．８９， １４３．８７， １３５．７９， １３５．６８， １３０．２８， １２８．２６， １２７．２０， １１７．４３， １１６．６４， １１３．５４， ９９．４０， ８８．２７， ８７．２０， ８６．８８， ８６．０８， ７５．１７， ７２．２８， ６３．８３， ６１．０９， ６０．２９， ５５．５４， ４１．７５， ３１．９９， １８．３０， １８．１１； ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）： Ｃ４２Ｈ４２Ｎ７Ｏ１１　の計算値 ８２０．２９４２，　実測値： ８２０．２９１８。
【０１０９】
実施例２３
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−デオキシ−５−〔３−（Ｎ，Ｎ’−ビス−ＣＥＯＣ−グアニジウム）−１−プロピン〕ウリジン−３’−Ｏ−〔（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル〕ホスホロアミダイト（２３）の合成
化合物２３は、実施例９に記載された操作に従って、化合物２２から調製された。収率：１．４３ｇ（５８％）。
３１Ｐ ＮＭＲ （８０ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １４９．５６ 及び １４９．２６； ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）： Ｃ５１Ｈ５８Ｎ９Ｏ１２ＰＮａ ＋ の計算値 １０４２．３８４０， 実測値： １０４２．３８０８ 。
【０１１０】
実施例２４
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−〔２−（Ｎ，Ｎ’−ＣＥＯＣ−グアニジウム）エチル〕−３−Ｏ−スクシニル−５−メチルウリジン（２４）の合成
化合物８（０．２５２ｇ，０．３０ミリモル）が無水アセトニトリルと共濃縮された。これに、無水スクシン酸（０．６ｇ，０．６ミリモル）、ＤＭＡＰ（０．０１８ｇ，０．１５ミリモル）、無水ピリジン（０．０４８ｍＬ，０．６ミリモル）及びＣＨ２ Ｃｌ２ （１ｍＬ）が加えられ、そして、室温で不活性雰囲気下で４時間攪拌された。この反応混合液は、ＣＨ２ Ｃｌ２ （２５ｍＬ）で希釈され、そして冷１０％クエン酸水溶液（２０ｍＬ）及び食塩水（２５ｍＬ）で洗浄された。有機相は、無水Ｎａ２ ＳＯ４ で乾燥され濃縮されて、化合物２２（０．２４８ｇ，８８％）を泡状物として与えた。Ｒｆ（０．２５，ＣＨ２ Ｃｌ２ 中の５％ＭｅＯＨ）。
１Ｈ ＮＭＲ （２００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： １．３４ （ｓ， ３Ｈ）， ２．２−２．５ （ｍ， ８Ｈ）， ３．４５ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ５．４ Ｈｚ）， ３．６４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ １１．６２ Ｈｚ）， ３．７２−４ （ｍ， １０ Ｈ）， ４．１５ （ｂｒ ｓ， １Ｈ）， ４．２６−４．３８ （ｍ， ６Ｈ）， ５．４０ （ｄ， １Ｈ， Ｊ　 ４．４ Ｈｚ）， ５．９３ （ｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ２．１２ Ｈｚ）， ６．８３ （ｄ， ４Ｈ， Ｊ ＝７．２２ Ｈｚ）， ７．２４−７．４ （ｍ， ９Ｈ）， ７．７７ （ｓ， １Ｈ）， ８．５７ （ｓ， １Ｈ）， １０．５１ （ｓ， １Ｈ）； ＨＲＭＳ （ＦＡＢ）： Ｃ４６Ｈ５０Ｎ７Ｏ１５ の計算値 ９４０．３３６５，実測値： ９４０．３３４６。
【０１１１】
実施例２５
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−〔２−（Ｎ，Ｎ’−ＣＥＯＣ−グアニジウム）エチル〕−５−メチルウリジン−３’−Ｏ−スクシニル−ＣＰＧ（２５）の合成
化合物２４（０．２２７ｇ，０．２４ミリモル）がＰ２ Ｏ５ で一晩４０℃で減圧乾燥された。無水ＤＭＦ（０．６２ｍＬ）が加えられ、続いて２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（０．０７７ｇ，０．２４ミリモル）及びＮ−メチルモルホリン（５３ｍＬ，０．４８ミリモル）が加えられた。この反応混合液が緩く攪拌されて澄明溶液が得られた。この溶液に、無水ＤＭＦ（２．３８ｍＬ）及び活性化ＣＰＧ（１．０３ｇ，１１５．２ミリモル／ｇ，粒度１２０／２０００，平均孔径５２０オングストローム）が加えられた。次いで、この反応混合液は、震盪機で１８時間震盪された。アリコートを取って負荷量が見積もられた。官能化されたＣＰＧが濾取され、そしてＤＭＦ、ＣＨ３ ＣＮ及びＥｔ２ Ｏで徹底的に洗浄された。次いで、一晩減圧乾燥された。次いで、官能化されたＣＰＧ（２３）は、キャッピング溶液（ＴＨＦ中の無水酢酸／ルチジン／Ｎ−メチルイミダゾール， ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．） 中に懸濁され、そして、震盪機で２時間震盪された。次いで、官能化されたＣＰＧが濾取され、ＣＨ３ ＣＮ及びＥｔ２ Ｏで洗浄され、減圧乾燥され、そして標準的操作により負荷量が測定された。最終負荷量は３２．８モル／ｇであった。
【０１１２】
実施例２６
２’−Ｏ−〔２−（グアニジウム）エチル〕修飾を含有するオリゴヌクレオチドの合成及び新規な操作を用いるＣＥＯＣ基の脱保護
アミダイト９が無水アセトニトリル中に溶解されて０．１Ｍ溶液が得られ、そして、オリゴヌクレオチドを合成するために、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ核酸合成システム （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ８９０９） に入れられた。カップリング効率は９８％を越えた。修飾アミダイト（９）のカップリングについては、カップリング時間が１０分間に延長され、そしてこの工程は２回行なわれた。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ により供給されたプロトコルにおける全ての他の工程は、そのまま使用された。合成完了後、ＣＰＧは、水中の５０％ピペリジン中に懸濁され、そして室温で２４時間保持されてグアニジノ基上のＣＥＯＣ保護基が脱保護された。同じ条件下で、諸オリゴヌクレオチドがＣＰＧから切り離される。次いで、溶媒が留去され、そして、そのＣＰＧは、環外アミノ保護基の脱保護を完全にするためにアンモニア水溶液（３０重量％）で５５℃で６時間処理された。これは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ，Ｗａｔｅｒｓ， Ｃ−４， ７．８×３００ ｍｍ，Ａ＝５０ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウム，ｐＨ＝７，Ｂ＝アセトニトリル，５５分間は５〜６０％Ｂ， 流速２．５ｍＬ／分，λ＝２６０ｎｍ）によって精製された。８０％酢酸水溶液での脱トリチル化と濃縮、その後の Ｗａｔｅｒｓ Ｃ−４ カラムでのＨＰＬＣによる脱塩で、２’−修飾オリゴヌクレオチドが得られた（表Ｉ）。オリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣ、ＣＧＥ及び質量スペクトルにより分析された。
【０１１３】
【表１】
2004500330.tif 000016
【０１１４】
【表２】
2004500330.tif 000017
【０１１５】
２’−デオキシＰ＝Ｓに比較したΔＴｍ／修飾は、最後の縦列に示された値に０．８を加えることにより得られる。他の修飾に比較したこの値は、図２及び３に示されている。２’−Ｏ−グアニジウムエチル修飾は、これまで研究されてきた２’−修飾の中で最高の結合親和性変化（ΔＴｍ／修飾）を示す。このことは図２に描かれている。
図３から分かるように、ΔＴｍ／修飾はカチオン性修飾の配置の性質に依存する。カチオン性基が相互に近接するとき、電荷反発作用があるのかも知れない。
【０１１６】
実施例２７
Ｎ４ −ベンゾイル−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジン（２６）の合成
２’−デオキシシチジン（５．８２ｇ，２５．６ミリモル）が留去により乾燥され、そして乾燥ピリジン（１００ｍＬ）中に吸収された。この懸濁液に、塩化トリメチルシリル（１１．５ｍＬ，９０．６ミリモル）が加えられ、この混合液は周囲温度で２時間攪拌された。この反応混合液は、氷水浴で冷却され、そして塩化ベンゾイル（４．６０ｍＬ，３９．６ミリモル）がゆっくり導入された。氷水浴が外され、混合液は室温で更に２時間攪拌された。メタノール（１５ｍＬ）を加えることにより反応が止められ、元の容量の半分に濃縮され、そして濾過された。その濾液に、水（３０ｍＬ）が加えられ、その溶液はオイルまで濃縮された。更に水（３×３０ｍＬ）と濃縮してピリジンを除去し、そして得られた残渣は水と酢酸エチルに分割された。激しく攪拌した後、生成物が水性層から結晶化した。生成物結晶は冷たい水と酢酸エチルで洗浄され、更に精製することなく次工程に使用された。粗製Ｎ４ −ベンゾイル−２’−デオキシシチジンは、乾燥ピリジン（３×５０ｍＬ）との濃縮により乾燥されてから、同じ溶媒（１００ｍＬ）中に溶解された。塩化４，４’−ジメトキシトリチル（７．４ｇ，２２ミリモル）がこの反応混合液に少しずつ加えられ、そして一晩周囲温度で攪拌が続けられた。反応混合液は濃縮されてオイルを与え、そしてジクロロメタン（１００ｍＬ）中に溶解された。有機相が、飽和ＮａＨＣＯ３ 水溶液（５０ｍＬ）及び水（３×１００ｍＬ）で洗浄され、そして無水Ｎａ２ ＳＯ４ で乾燥された。トルエンと共濃縮したあと、残渣はシリカゲルカラムにかけられ、ＭｅＯＨの濃度勾配を有するＣＨ２ Ｃｌ２ （０〜８％ＭｅＯＨ）で溶出された。生成物（２５）が、２’−デオキシシチジンから出発して６５％収率（９．０ｇ）で得られた。
１Ｈ ＮＭＲ （２００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３）： ８．３０ （ｓ， １Ｈ， ｄ， Ｊ ＝ ７．６）， ７．４５−７．１０ （ｍ， ９Ｈ）， ６．８４ （ｍ， ４Ｈ）， ７．９０−７．４０ （ｍ， ５Ｈ）， ６．３１ （ｔ， １Ｈ， Ｊ ＝ ５．９ Ｈｚ）， ４．５５ （ｍ， １Ｈ，）， ４．１９ （ｍ， １Ｈ）， ３．７８ （ｓ， ６Ｈ）， ３．４９ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．２ 及び １１．０ Ｈｚ）， ３．４２ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ ＝ ３．９　及び １０．８ Ｈｚ） ， ２．７７ （ｍ， １Ｈ）。
【０１１７】
実施例２８
２’−デオキシ−Ｎ４ −〔２−（アミノ）エチル〕−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）シチジン（２７）の合成
２−プロパノール（１０ｍＬ）中のエチレンジアミン（９６．９ミリモル）の溶液が化合物２５（２．６１ｇ，４．１２ミリモル）に加えられ、その混合液が澄明になるまで攪拌される。１，５，７−トリアザビシクロ〔４．４．０〕−５−デセン（ＴＢＤ，２．４０ｇ，１７．２ミリモル）が加えられ、そしてその反応混合液は周囲温度で４８時間攪拌される。反応混合液は濃縮されてオイルを与え、ＣＨＣｌ３ （１００ｍＬ）中に溶解され、そして０．１モルＬ−１ＮａＯＨ水溶液（２×５０ｍＬ）及び水（４×５０ｍＬ）で抽出される。有機相は、無水Ｎａ２ ＳＯ４ で乾燥され、濃縮され、ＣＨ２ Ｃｌ２ 中に溶解される。シリカゲルカラム精製で、純粋な生成物２７が得られる。
【０１１８】
実施例２９
２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル−Ｎ４ −〔２−（Ｎ，Ｎ’−ビス−ＣＥＯＣ−グアニジウム）エチル〕シチジン（２８）の合成
化合物２７は、試薬５での処理で、実施例８に記載された化合物２８を与える。
【０１１９】
実施例３０
２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル−Ｎ４ −〔２−（Ｎ，Ｎ’−ビス−ＣＥＯＣ−グアニジウム）エチル〕シチジン−３’−Ｏ−〔（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル〕ホスホロアミダイト（２９）の合成
化合物２９（０．２９ミリモル）が乾燥アセトニトリル（３×２０ｍＬ）と共に濃縮され、そして最終的に３０分間減圧濃縮される。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’テトライソプロピルホスホロジアミダイト（０．１２ｍＬ，０．３８ミリモル）及び乾燥アセトニトリル（１．０ｍＬ）が加えられ、そしてその混合液は全ての物質が溶解するまで攪拌される。１Ｈ−テトラゾール（ＭｅＣＮ中０．４５モルＬ−１，０．６４ｍＬ，０．２９ミリモル）が加えられ、そしてその反応混合液は震盪される。周囲温度で１時間が経過した後、１００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３ 水溶液がその反応混合液に加えられ、そして得られた溶液は、酢酸エチル（２×４０ｍＬ）で抽出される。有機相が無水Ｎａ２ ＳＯ４ で乾燥され、そして濃縮乾固されて、純粋な化合物２９を与える。
【０１２０】
実施例３１
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５−（３−アミノ−１−プロピニル）−Ｎ４ −ベンゾイル−２’−デオキシシチジン（３３）の合成
１５ｍＬの乾燥ＤＭＦ中の５−ヨード−２’−デオキシシチジン（５ミリモル）、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．５ミリモル）、ヨウ化銅（Ｉ）（１ミリモル）及びＮ−１−フタルイミド−３−プロピン（１２ミリモル）に、１０ミリモルのトリエチルアミンが加えられる。１８時間攪拌した後、ＡＧ−１ｘ８アニオン交換樹脂（ＨＣＯ３ − 型，３当量）、２０ｍＬのメタノール及び２０ｍＬのＣＨ２ Ｃｌ２ が加えられ、そしてその懸濁液は１時間攪拌される。その反応液は、焼成ガラス漏斗で濾過され、そしてＤＭＦが減圧留去される。フラッシュクロマトグラフィーで、生成物（３０）が生成する。この化合物は乾燥ピリジン中の無水安息香酸（１当量）で処理されて、Ｎ４ −ベンゾイル誘導体（３１）を与える。Ｎ４ −ベンゾイル誘導体と塩化４，４’−ジメトキシトリチルの混合物に、乾燥ピリジンが加えられて、５’−ジメトキシトリチル誘導体（３２）が得られ、次いで、これは、実施例４に記載された操作に従ってアミノ化合物３３に転化される。
【０１２１】
実施例３２
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−〔２−（Ｎ，Ｎ’−ビス−ＣＥＯＣ−グアニジウム）エチル〕アミノ−２’−デオキシアデノシン−３’−Ｏ−〔（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル〕ホスホロアミダイト（３４）の合成
２−フルオロアデノシンは、Ｋｒｏｌｉｋｉｅｗｉｃｚ　及び Ｖｏｒｂｒｕｇｇｅｎ （Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３， ６７３， １９９４） に記載された操作に従って合成される。エチレンジアミン（２−メトキシエタノール中５当量）が２−フルオロアデノシンに加えられて１００℃に加熱される。次いで、得られる２−（アミノエチル）誘導体は、実施例８に記載された通りに、試薬５で２−（２−グアニジウム）エチル誘導体に転化される。次いで、これは、一時的保護化条件下で塩化ベンゾイルで処理され、次いで、５’位でジメトキシトリチル化される。次いで、得られた化合物は、上記の操作に従って亜リン酸化されて、２位が官能化されたアデノシン誘導体３６を与える。
【０１２２】
実施例３３
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−〔２−（ビス−Ｎ，Ｎ’−ＣＥＯＣ−グアニジウム）エチル〕−２’−デオキシグアノシン−３’−Ｏ−〔（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル〕ホスホロアミダイト（３４）の合成
２−フルオロイノシンが、Ｋｒｏｌｉｋｉｅｗｉｃｚ　及び Ｖｏｒｂｒｕｇｇｅｎ （Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １３， ６７３， １９９４） に記載された操作に従って合成される。エチレンジアミン（２−メトキシエタノール中５当量）が２−フルオロイノシンに加えられて１００℃に加熱される。このフリーのアミンは、実施例８に記載された試薬５での処理により、２位における側鎖上でグアニル化される。その生成物は、まず５’位でジメトキシトリチル化され、次いで上記の操作に従って亜リン酸化されて、２位が官能化されたグアノシン誘導体（３７）を与える。
【０１２３】
実施例３４
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ２ −イソブチリル−Ｎ６ −〔２−（ビス−Ｎ，Ｎ’−ＣＥＯＣ−グアニジウム）エチル〕−２−アミノアデノシン−３’−Ｏ−〔（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル〕ホスホロアミダイト（３５）の合成
ピリジンとの共濃縮により乾燥され、４０ｍＬのピリジン中に懸濁され、そしてアルゴン気流下氷浴中で冷却された２’−デオキシグアノシン（２ミリモル）に、トリフルオロ無水酢酸（１６ミリモル）が、Ｋｕｎｇ　と Ｊｏｎｅｓ （Ｔｅｔｒａｈｅｒｏｎ Ｌｅｔｔ．， ３２， ３９１９， １９９１） の操作に従って加えられる。４０分後、エチレンジアミン（３０ミリモル）が加えられ、そして室温で２４時間攪拌される。この反応混合物は濃縮され、そしてシリカカラムクロマトグラフィーにより精製される。この生成物は、実施例８に記載された試薬５でグアニル化され、無水イソ酪酸での処理によりＮ２ 位がイソブチリル基で保護され、５’位で５’−ジメトキシトリチル化され、そして精製される。得られた化合物は、塩化ベンゾイルで処理されて（Ｎ６ 保護）から、上記の操作に従って亜リン酸化されて、６位が官能化された２，６−ジアミノプリン誘導体（３５）を与える。
【０１２４】
実施例３５
２’−Ｏ−〔２−（グアニジウム）エチル〕オリゴヌクレオチド（配列番号３：ＩＳＩＳ１０９９９０、ＩＳＩＳ１０９９８９、及びＩＳＩＳ１０９９７３）のヌクレアーゼ安定性アッセイ
これらオリゴマーの安定性が、それらを、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ホスホジエステラーゼＩ，ＵＳＢ＃２０２４０）、つまり非配列特異性３’−エキソヌクレアーゼと共にインキュベートすることにより試験された。
典型的なヌクレアーゼ消化：
７０μＬナノ純度の水
１０μＬ　１μＭ　３２Ｐ標識オリゴヌクレオチド
１０μＬ　１０×緩衝液
１０μＬ　ＳＶＰＤ＠５×１０−２ユニット／ｍＬ
１００μＬ
最終反応条件：
緩衝液：　５０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．０
７５ｍＭ　ＮａＣｌ
１４ｍＭ　ＭｇＣｌ２
オリゴマー濃度：　１００ｎＭ
酵素濃度：　５×１０−３ユニット／ｍＬ
【０１２５】
反応液は、３７℃でインキュベートされた。アリコート（５μＬ）が設定時間コースで取り出され、ホルムアミド中に２×ＴＢＥを含有し痕跡量のブロモフェノールブルーを有する試験管に移され、次いで、分析まで−４℃で冷凍された。それら反応液は、ＰＡＧＥ／ホスホロイメージングにより分析された。特定時点におけるサンプルは、それらサンプルが沈殿分離するように短時間遠心分離にかけられ、次いで、２０％アクリルアミドゲル上に充填された。泳動後、ゲルは露光され、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ で読み取られた（図４）。各々のレーンのオリゴマーの完全長％（Ｎ）が計算された。
図４に示されるように、グアニジウム残基の配置が、エキソヌクレアーゼ分解に対してオリゴヌクレオチドホスホジエステルヌクレオチド間連結を保護している。置換基の数が増加するにつれて、ヌクレアーゼ抵抗性も増加している。１９量体中の３’末端における４つのグアニジウム置換基の配置が、そのオリゴマーを十分に保護している。
【０１２６】
実施例３６
三重鎖形成のための２’−Ｏ−（２−グアニジウム）エチルオリゴヌクレオチドの合成
ピリミジンオリゴヌクレオチドによる二重鎖ＤＮＡの配列特異的認識は、ＤＮＡ標的上の塩基とピリミジン第３鎖の間の Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合によって安定化される三重らせん構造の形成を包含する。（Ｎｅｉｄｅｌ， Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ． １２， ４３３−４４２， １９９７； Ｇｉｏｖａｎｎａｎｇｅｌｉ ａｎｄ Ｈｅｌｅｎｅ， Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｌｃｅｌｃ Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． ７， ４１３−４２１， １９９７； Ｍａｈｅｒ， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ． １４， ６６−８２， １９９６．）
ＲＮＡ第３鎖との三重らせんの分子モデルを検討すると、ＲＮＡの２’−ヒドロキシル基とＤＮＡ第２鎖のホスフェート基が密接に近接することが分かる。（Ｈｅｌｅｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． ２１， ５５４７−５５５３， １９９３）。２’−アミノエトキシ修飾オリゴヌクレオチドは、三重らせん形成を安定化させる。（Ｃｕｅｎｏｕｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ．， ３７， １２８８−１２９１， １９９８） 。２’−グアニジノエチル修飾オリゴヌクレオチドは、その安定化された複数箇所の荷電部位のおかげで、三重らせん形成を安定化させるであろう。続いて、二重鎖ＤＮＡが、三重鎖形成のための第３鎖として使用された２’−グアニジウムエチル修飾オリゴヌクレオチド（配列番号４：ＩＳＩＳ１１３２５４、ＩＳＩＳ１１３９２９、及びＩＳＩＳ１１３２５５）で標的にされる。
配列番号５
鎖２　５’−ＧＣＴ ＡＡＡ ＡＡＧ ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＧＡ ＴＣＧ−３’
配列番号６
鎖１　５’−ＣＧＡ ＴＴＴ ＴＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ ＡＧＣ−５’
【０１２７】
実施例３７
化合物４０及び４１の合成
化合物３７が、Ｂｅｈｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ により記載された操作（Ｂｉｏｏｒｇ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． Ｌｅｔｔ．， １９９５， ５， １７８５） に従って合成される。化合物３７は、実施例８に記載された試薬５を使用して、グアニジウム誘導体３８に転化される。次いで、化合物３８が、１当量の塩化４，４’−ジメトキシトリチルとピリミジンで処理されて化合物３９を形成し、これは、次いで、亜リン酸化されて化合物４０を生成する。化合物４０を使用するオリゴマーの合成は、５’末端にグアニジウム基を有するオリゴマーをもたらす。
化合物３９も、スクシニル化されかつ制御孔ガラス（ＣＰＧ）にカップリングされて化合物４１を生成する。化合物４１を使用するオリゴマーの合成は、３’末端にグアニジウム基を有するオリゴマーをもたらす。
【０１２８】
実施例３８
化合物４９及び５６の合成
（図１９〜２３）
化合物４２が、報告された操作 （Ｍｉｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９６， ２６， ３３１７−３３２２ を参照のこと） に従って合成される。以前に報告された操作 （Ｒａｍａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．，Ｉ， １９８９， ２３７５−２３８４） に従う４２のクロロ糖４３でのグリコシル化で、ヌクレオシド４４が得られ、次いで、これがＮ２ 位でアシル化されて、完全に保護されたヌクレオシド４５を与える。次いで、化合物４５は、パラジウムと５０ｐｓｉの水素ガスとの存在下で７−アミノメチル誘導体４６に還元される。ＤＭＦ中でのグアニル化試薬５とトリエチルアミンでのグアニル化で４８が得られ、これは、次いで、脱シリル化、５’位で選択的トリチル化、及び３’位で亜リン酸化に付されて、化合物４９を与える。
化合物５０（Ｐｏｒｃａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ， １９９９， １８， １５３−１５９の操作に従って調製されたもの）が、ピリジン中で Ｍａｒｋｏｖｉｃｋ試薬でシリル化されて化合物５１を与える。次いで、化合物５１は、環外アミノ基の４位において塩化ベンゾイルとピリジンでアシル化されてビスベンゾイル誘導体を与え、これは、アンモニア水溶液での処理によってモノベンゾイル誘導体、つまり化合物５２に転化される。５２のその２’位における脱酸素で化合物５３が得られる。パラジウム及び水素の存在下での５３の接触還元で化合物５４が得られ、これは、５について使用された操作に従ってグアニジノ誘導体５５に転化される。化合物５５は、脱シリル化、５’位でのトリチル化、及び３’位での亜リン酸化で、化合物５６を与える。
【０１２９】
実施例３９
【表３】
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【０１３０】
オリゴマーＩＩ、ＩＩＩ 及びＩＶの各々は、種々の基が種々の２’位に付いた配列番号４（ＴＴＴ ＴＴＣ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ） を有する（（２’−Ｈ；２’−Ｏ−アミノエチル（２’−Ｏ−ＡＥ）；２’−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）；及び２’−グアニジウムエチル（２’−Ｏ−ＧＥ））。オリゴマーＩＩは、１、３及び５位で修飾されており （Ｔ＊ＴＴ＊ ＴＴ＊Ｃ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ） ；オリゴマーＩＩＩ は、２、５、９及び１２位で修飾されており （ＴＴ＊Ｔ ＴＴ＊Ｃ ＴＣＴ＊ ＣＴＣ Ｔ＊ＣＴ）；そしてオリゴマーＩＶは、１〜５位で修飾されている （Ｔ＊Ｔ＊Ｔ＊ Ｔ＊Ｔ＊Ｃ ＴＣＴ ＣＴＣ ＴＣＴ） 。
検討の結果は、２’−Ｏ−ＧＥ修飾がより高い結合親和性を得られた修飾オリゴマーに付与することを示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】
２’ −Ｏ−［２−（グアニジニウム）エチル］修飾の構造を示す。
【図２】
２’ −Ｏ−ＭＯＥ（メトキシエチル）、２’ −Ｏ−ＤＭＡＯＥ（ジメチルアミノオキシエチル）、２’ −Ｏ−ＤＥＡＯＥ（ジエチルアミノオキシエチル）、２’ −Ｏ−ＩＰＭＡＯＥ（イソプロピルメチルアミノオキシエチル）、２’ −Ｏ−イミダゾイルエチル（ＩＥ）及び２’ −アミノプロピル（ＡＰ）のような他の既知の２’ −修飾に比較した、２’ −Ｏ−［２−（グアニジニウム）エチル］修飾の結合親和性／修飾を示す。
【図３】
２’ −Ｏ−［２−（グアニジニウム）エチル］修飾オリゴヌクレオチドの、２’ −アミノプロピル及び２’ −Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ（ジメチルアミノエチルオキシエチル）に比較した、配置の位置を関数とする結合親和性を示す。
【図４】
２’ −Ｏ−［２−（グアニジニウム）エチル］修飾オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ抵抗性を示す電気泳動図を示す。
【図５】
化合物１の合成を示す。
【図６】
化合物４の合成を示す。
【図７】
化合物５〜７の構造を示す。
【図８】
化合物８〜１３の合成を示す。
【図９】
化合物１５〜１８の合成を示す。
【図１０】
化合物２０〜２１の合成を示す。
【図１１】
化合物２２〜２３の合成を示す。
【図１２】
化合物２４〜２５の合成を示す。
【図１３】
化合物２６〜２９の合成を示す。
【図１４】
化合物３０〜３３の合成を示す。
【図１５】
化合物３４の合成を示す。
【図１６】
化合物３５の合成を示す。
【図１７】
化合物３６の合成を示す。
【図１８】
化合物４０及び４１の合成を示す。
【図１９】
化合物４５の合成を示す。
【図２０】
化合物４９の合成を示す。
【図２１】
化合物５３の合成を示す。
【図２２】
化合物５６の合成を示す。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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