(57)【要約】本発明は、フラビウイルスのキャッピング酵素（ＣＥＦ）からなるグアニルトランスフェラーゼ及びメチルトランスフェラーゼとして作用可能な、単離して精製したポリペプチドに関する。本発明は、また、フラビウイルス感染症から生じる病気の治療あるいは予防に用いることが可能な、生物学的に活性な分子を識別するための、このようなポリペプチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フラビウイルスのキャッピング酵素（ＣＥＦ）からなるグアニルトランスフェラーゼ及びメチルトランスフェラーゼとして機能することが可能な、単離して精製したポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、Ｎ末端モジュール（サブドメイン１）、ＳＡＭ結合コア（サブドメイン２）、そしてサブドメイン１と２との間に位置して狭い間隙の底部を形成するＣ末端配列（サブドメイン３）からなる、請求項１による単離して精製したポリペプチド。
【請求項３】
前記サブドメイン１が、螺旋Ａ１−捻り−螺旋Ａ２モチーフの条を持つ、請求項２による単離して精製したポリペプチド。
【請求項４】
前記サブドメイン２が、七つのβ鎖と五つの螺旋からなるねじれて混合したβシートから構成される、請求項２あるいは３のいずれかによる単離して精製したポリペプチド。
【請求項５】
前記サブドメイン３が正の電荷を持つ、請求項２から４のいずれかによる単離して精製したポリペプチド。
【請求項６】
前記ＣＥＦが、アペンディックス内の配列リストの配列ＩＤ番号２からなるポリペプチドである、請求項１から５のいずれかによる単離して精製したポリペプチド。
【請求項７】
前記ＣＥＦが、アペンディックス内の配列リストの配列ＩＤ番号１からなるポリペプチドである、請求項１から５のいずれかによる単離して精製したポリペプチド。
【請求項８】
前記ＣＥＦが、アペンディックス内の配列リストの配列ＩＤ番号３からなるポリペプチドである、請求項１から５のいずれかによる単離して精製したポリペプチド。
【請求項９】
フラビウイルスのキャッピング酵素（ＣＥＦ）からなるグアニルトランスフェラーゼ及びメチルトランスフェラーゼとして作用する能力があるポリペプチドのためのコード化核配列からなる、あるいは構成される核酸分子。
【請求項１０】
請求項１から８のいずれかによるポリペプチドに対して向けられたポリクローンあるいはモノクローン抗体、前記抗体の誘導体あるいは断片。
【請求項１１】
適合コントロール配列に有利に関連づけた、請求項９による核酸の少なくとも一つの分子からなるベクター。
【請求項１２】
請求項９による核酸の一分子によって変換した細胞ホスト。
【請求項１３】
請求項１１によるベクターによって変換した細胞ホスト。
【請求項１４】
請求項９による核酸の一分子から準備した核プローブあるいはオリゴヌクレオチド・プローブ。
【請求項１５】
ＧＴＰの競合的な抑制因子として作用する生物学的に活性な化合物の抑制力を判定するための方法であって、
ａ）放射標識ＧＴＰと一緒にＣＥＦを温置すること、
ｂ）選択した異なる濃度の、前記生物学的に活性な化合物を加えること、
ｃ）前記温置から生成した結果である放射標識ＣＥＦ−ＧＴＰ複合体を分析すること、
ｄ）前記分析から生じた放射標識ＣＥＦ−ＧＴＰ複合体の量を数量化すること、
ｅ）前記量を、ＣＥＦへのＧＴＰの結合親和定数に比較すること、そして
ｆ）前記生物学的に活性な化合物の前記抑制力を判定することからなる方法。
【請求項１６】
前記温置を行う濃度が、５２μＭのＧＴＰである、請求項１５による方法。
【請求項１７】
ＧＴＰの前記選択した異なる濃度が、０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、５００μＭ及び８００μＭである、請求項１５あるいは１６のいずれかによる方法。
【請求項１８】
前記分析が、α−３２Ｐ−ＧＴＰのＣＥＦへのＵＶ架橋からなる、請求項１５から１７のいずれかによる方法。
【請求項１９】
請求項１５から１８のいずれかによる抗ウイルス性医薬剤としてＧＴＰへのＣＥＦ結合を低下させることが可能な、抑制的な、生物学的に活性な化合物を選ぶための方法であって、さらに、ＧＴＰのＣＥＦへの結合親和定数よりも高い結合親和性を持つ生物学的に活性な化合物を選択することからなる方法。
【請求項２０】
生物学的に活性な化合物が、ヌクレオシドあるいはヌクレオシド類似体である、請求項１５から１９のいずれかによる方法。
【請求項２１】
フラビウイルス感染症から生じる病気の治療あるいは予防に有用な薬の準備のための、アシクロビル５’−トリホスフェート、あるいはアシクロビル５’−モノホスフェートのベクター形態の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ウイルス分子生物学の分野に関し、特に、フラビウイルスのキャッピング酵素と競合してポリペプチドに結びつくヌクレオシド類似体に関する。
【０００２】
このキャップは、ウイルスの、そして細胞の真核ｍＲＮＡ（１）の５’末端に見られる独特な構造であり、発現中におけるｍＲＮＡの安定と、リボソームへの結合とに重要である。ｍＲＮＡキャッピングは、一連の三つの化学反応（２）から生じる共転写性変異である。ｍＲＮＡの５’−トリホスフェートは、まず、ＲＮＡトリホスファターゼによってジホスフェートに変質する。第二の反応は、グアニルトランスフェラーゼ（キャッピング酵素）による、Ｇ５’−ｐｐｐ５’−Ｎをもたらすための、ＧＴＰから５’−ジホスフェートＲＮＡへのＧＭＰ成分の転送である。概して、この反応は、ＧＴＰのａ−ホスフェートの、リシン残基のｅ−ＮＨ２グループへの共有結合を伴い、ホスホルアミド（Ｐ−Ｎ）結合をもたらし、同時にピロリン酸塩を放出する。メチル供与体としてＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニンを用いる第三の反応では、転送グアノシン成分が、そのＮ７位置において、メチルトランスフェラーゼによってメチル基を導入され、７ＭｅＧ５’−ｐｐｐ５’−Ｎ（キャップ０構造）が生じる。いくつかの例においては、第二のメチル転送反応が、第一のヌクレオチド３’の２’−ＯＨにメチル基を導入してトリホスフェート・ブリッジを形成して、７ＭｅＧ５’−ｐｐｐ５’−Ｎ２’０Ｍｅ（キャップ１構造）をもたらす。これは、ｍＲＮＡデング熱ウイルスのケースである。
【背景技術】
【０００３】
多くのウイルスは、真核ホストの細胞質内で複製する。細胞ＲＮＡキャッピングが核内における局所的なものであるため、これらのウイルスは、しばしば、遺伝子発現をホストの翻訳機構に依存しながら、それら自身のキャッピング酵素をコード化する。キャッピング装置の物理的な組織は、細胞の、そしてウイルスのシステム内に分岐しているが、真核細胞の、そしてＤＮＡウイルスのグアニルトランスフェラーゼは、構造的な、そして機構的な特徴（３）に基づいて、共有結合形ヌクレオチジルトランスフェラーゼの上科に分類されている。ＧＴＰとの複合体としてのＤＮＡウイルスＰＢＣＶ−１（クロレラ・ウイルス）グアニルトランスフェラーゼの結晶構造から、この酵素系統群（４）におけるグアニリル転送の構造的な、そして機構的な決定要素が解明されている。ＧＭＰの酵素への共有結合は、この系統群におけるグアニルトランスフェラーゼ活性の特徴である。しかしながら、ＤＮＡウイルスとは異なり、ＲＮＡウイルス・グアニルトランスフェラーゼの分類及び機構は捉え難い。共有結合形ヌクレオチジルトランスフェラーゼとの、明白なアミノ酸配列ホモロジーを共有しないため、ＲＮＡウイルスからは僅かに少数のグアニルトランスフェラーゼ活性が、ウイルス・タンパクに割り当てられているだけである。構造的に定義したＲＮＡウイルス・グアニルトランスフェラーゼの唯一の例は、λ２サブユニット（５）からなる、３.６Åの分解能におけるレオウイルス・コアの結晶構造である。しかしながら、これは、二重鎖ＲＮＡウイルスであり、一本鎖ＲＮＡウイルスではない。ＲＮＡキャッピングは、いくつかのウイルス（６）に対しては不可欠であるため、抗ウイルス・デザインにおける潜在的目標である。
【０００４】
グアノシン類似体、リバビリンは、約３０年前に発見された、広域スペクトル抗ウイルス剤である（７）。その活性メカニズムは、未だに物議をかもしている（８）。たいていのヌクレオシド類似体のように、リバビリンは、細胞内へ侵入すると、その５’位置がリン酸化される。リバビリン５’−モノホスフェートは、細胞酵素イノシン５’−モノホスフェート・デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰ−ＤＨ）の強力な抑制因子である。この抑制は、ウイルス及び細胞に起因する、キャッピング酵素及び重合酵素を提供する細胞内グアノシン・ヌクレオチド・プールを枯渇させる。その結果、リバビリン抑制グアノシン・ヌクレオチド・プールは、ウイルス酵素がグアノシン・ヌクレオチドを求めて細胞酵素と有利に競合できないであろうから、間接型の抗ウイルス効果を及ぼすのかもしれない。さらに、リバビリン・ヌクレオチドは、（（８）で再検討した）観察できる抗ウイルス効果をもたらす、ＲＮＡキャッピング等のウイルス標的を持つのかもしれないが、このメカニズムの直接的な証拠が欠けていた。リバビリン活性メカニズムの解明は、直接的な、そして間接的なメカニズムの両方が関わっている可能性があるため困難であった。
【０００５】
フラビウイルス科のウイルスはリバビリンに敏感である（９及び１０）。フラビウイルス属は、西ナイル、デング熱及び黄熱病ウイルス等の重要なヒト病原体からなる。これらの蚊が媒介するウイルスは、現在、世界中に広がりつつある。北アメリカへの西ナイル・ウイルスの侵入は、ニューヨーク地域（１１）での最近の発生が例示するように、このウイルスの進化の歴史における重要な出来事である。フランスのカマルグ（Camargue）地域では、４０年ぶりに、馬の西ナイル・ウイルス感染症が再確認されている。同様に、出血熱をもたらすデング熱ウイルスも、世界中の熱帯地域で、毎年５千万人以上の人々を感染させ、感染率を増加させている。フラビウイルスの一本鎖ＲＮＡゲノムは、プラスの極性を持ち、キャップ１構造（１２）でキャップされている。グアニルトランスフェラーゼは、まだ識別されていない。ウイルスＲＮＡキャッピング及びその抑制への構造的な洞察は、リバビリンの推定標的を明らかにし、フラビウイルスに対する抑制因子の識別及びデザインを促進するかもしれない。識別できれば、そのような抑制因子は、フラビウイルス感染症から生じる病気の治療に有用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明は、フラビウイルスのキャッピング酵素（ＣＥＦ）からなる、グアニルトランスフェラーゼ及びメチルトランスフェラーゼとしての活性能力がある、単離そして精製されたポリペプチドを開示する。本発明のポリペプチドは、Ｎ末端モジュール（サブドメイン１）、ＳＡＭ結合コア（サブドメイン２）、そしてサブドメイン１及び２の間に位置して狭い間隙の底部を形成するＣ末端配列（サブドメイン３）からなる。本発明のポリペプチドのサブドメイン１は、螺旋Ａ１−捻り−螺旋Ａ２モチーフの条を持つ。本発明のサブドメイン２ポリペプチドは、七つのβ鎖（β１からβ７）と五つの螺旋（α１からα５）からなるねじれて混合したβシートから構成され、そのサブドメイン３は正の電荷を持つ。
【０００７】
本発明のポリペプチドは、デザインしたＣＥＦ（フラビウイルスのキャッピング酵素）である。本発明はＣＥＦの一般的な構造を提供する。デング熱ウイルス、西ナイル・ウイルス及び黄熱病ウイルスのための、三つのＣＥＦのアミノ酸配列も開示される。これらの配列は、各々、アペンディックス内の配列リストの配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２及び配列ＩＤ番号３によって表される。本発明は、アミノ酸配列が、アペンディックス内の配列リストの配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２あるいは配列ＩＤ番号３によって表されるポリペプチドに相同なポリペプチドに関する。特に、本発明は、アペンディックス内の配列リストの配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２あるいは配列ＩＤ番号３によって表されるアミノ酸配列と、少なくとも約９５％のホモロジーを持つポリペプチドに関する。
【０００８】
本発明は、フラビウイルスのキャッピング酵素（ＣＥＦ）からなる、グアニルトランスフェラーゼ及びメチルトランスフェラーゼとして作用可能なポリペプチドのためのコード化核配列からなる、あるいは構成される核酸分子に関する。本発明は、また、上記配列から、例えば遺伝情報の退化から得た核酸配列に関する。これらは、ＣＥＦの特徴及び特性を提示するタンパク質のためにコード化する。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、本発明のポリペプチドに対して向けたポリクローンあるいはモノクローン抗体、これらの誘導体あるいは断片である。これらの抗体は、この文献内で説明する方法によって準備することができる。これらの抗体は、新しいＣＥＦあるいは、フラビウイルス属の他のウイルス内でこの酵素の同族体を探すのに有用である。
【００１０】
本発明は、また、本発明のＣＥＦの細胞ホストあるいはそれの断片内における生成あるいは発現プロセスと、適合コントロール配列とに有利に関連づけた、上記核酸の少なくとも一つの分子からなるベクターに関する。これらのベクターの準備、また、本発明のタンパク質ホスト内における生成あるいは発現は、本技術の熟練者がよく知っている、分子生物学及び遺伝子工学の技術で行うことができる。
【００１１】
フラビウイルスのキャッピング酵素（ＣＥＦ）からなるグアニルトランスフェラーゼ及びメチルトランスフェラーゼとして作用可能なポリペプチドのためのコード化核酸分子、あるいは本発明によるベクターは、また、動物を変える、そして一連の遺伝子導入動物を確立するために用いることができる。用いるベクターは、これを転送すべきホストの機能として選択する。それは、プラスミド等のどんなベクターでもよい。したがって、本発明は、また、前述のプロセスに従って得た、フラビウイルスのキャッピング酵素（ＣＥＦ）からなる、グアニルトランスフェラーゼ及びメチルトランスフェラーゼとして作用可能なポリペプチドを発現する細胞ホストに関する。
【００１２】
本発明は、また、本発明に従って核酸の分子から準備した、核プローブ及びオリゴヌクレオチド・プローブに関する。有利に標識したこれらのプローブは、フラビウイルス属の他のウイルス内でのＣＥＦのハイブリダイゼーション検出に役立つ。従来の技術によれば、これらのプローブは生物学的試料に接触させるものである。また、ドット−ブロット・ハイブリダイゼーションあるいは複製ハイブリダイゼーション（サザーン技術）あるいは他の技術（ＤＮＡチップ）等の、異なるハイブリダイゼーション技術を用いることができる。このようなプローブは、フラビウイルス属の異なるウイルスのコード化遺伝子内で、素早く同様な配列を検出することを可能にするツールを構成する。オリゴヌクレオチド・プローブは、例えば診断の目的で、ＰＣＲ実験に役立つ。
【００１３】
本発明は、また、ＧＴＰの競合的な抑制因子として作用する生物学的に活性な化合物の抑制力を判定するための方法に有用である。この方法は、
ａ）放射標識ＧＴＰと一緒にＣＥＦを温置すること、
ｂ）選択した異なる濃度の、前記生物学的に活性な化合物を加えること、
ｃ）前記温置から生成し、結果として生じた放射標識ＣＥＦ−ＧＴＰ複合体を分析すること、
ｄ）前記分析から生じた放射標識ＣＥＦ−ＧＴＰ複合体の量を数量化すること、
ｅ）前記量を、ＧＴＰのＣＥＦへの結合親和定数と比較すること、そして
ｆ）前記生物学的に活性な化合物の前記抑制力を判定することからなる。
【００１４】
特に、本発明の方法における温置ステップは、５２μＭのＧＴＰで行い、そしてＧＴＰの異なる選択濃度は、０μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、３００μＭ、５００μＭ及び８００μＭである。本発明の方法における分析は、α−３２Ｐ−ＧＴＰのＣＥＦへのＵＶ架橋からなる。
【００１５】
本発明は、抗ウイルス性医薬剤として、ＧＴＰへのＣＥＦ結合を低下させることが可能な、抑制的な、生物学的に活性な化合物を選択するための方法に関する。この方法は、ＣＥＦへのＧＴＰの結合親和定数よりも高い結合親和性を持つ、生物学的に活性な化合物を選択することからなる。
【００１６】
本発明の方法で用いることができる生物学的に活性な化合物は、ヌクレオシド、ヌクレオシド類似体あるいは非ヌクレオシド分子である。
【００１７】
出願者は、アシクロビルのトリホスフェート形態と、アシクロビル５’−モノホスフェートのベクター形態は、ＣＥＦ酵素の優れた抑制因子であることを示した。本発明は、フラビウイルス感染症から生じる病気の治療あるいは予防に有用な薬の準備のための、アシクロビル５’−トリホスフェート、あるいはアシクロビル５’−モノホスフェートのベクター形態の使用に関する。用語「ベクター形態」は、感染細胞等の特定な細胞へアシクロビル５’−モノホスフェートを移送して、前記細胞内にアシクロビル５’−モノホスフェートを導入するのに有能なすべてのベクターに言及する。本技術の熟練者に既知であるすべての種類のベクターは、本発明で用いることが可能である。
【００１８】
本発明の他の利点及び特性は、添付図面を参照しながら、フラビウイルス・キャッピング酵素、その構造及びその活性の識別に関する次の例を読むことによって明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
図１は、ゲル電気泳動の一対の写真である。図１Ａは、α−３２Ｐ−ＧＴＰのＣＥＦへのクロスリンクを示す。２μｇのＣＥＦを、５０ｍＭトリスｐＨ７.６、５ｍＭのＤＴＴ内で、５ｍＭのＭｇ２＋の存在（レーン１、そして３から６）あるいは欠如（レーン２）の状態で、５０μＭ（１μＣｉ）のα−３２Ｐ−ＧＴＰ（レーン１、２、５及び６）あるいはα−３２Ｐ−ＡＴＰ（レーン３及び４）と共に温置した。この試料を、ＵＶ照射（２５４ｎｍ）を用いて架橋し、５分間沸騰させ、そして変性ゲル電気泳動にさらした。産物を光刺激板と富士イメージャとを用いて分析し、数量化した。バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼは、正の制御として役立った（レーン５）。ＣＥＦのＦ２５Ａ変異体を、野生型ＣＥＦのものと同じ条件下で精製した。上側パネルがコマスィーブルー（comassie-blue）染色ゲルを、下側パネルが、対応する放射能写真分析を示す。図１Ｂは、ＣＥＦへの共有結合に対する、ＧＴＰとリバビリン５’−トリホスフェートとの比較である。ＣＥＦを、１０分間、リバビリン５’−トリホスフェートの濃度を増加させて（レーン１から６、各々０、５０、２５０、５００、７５０、１０００μＭ）温置し、反応混合物にα−３２Ｐ−ＧＴＰを加え、さらに２０分間定温放置した。その混合物を、５分間沸騰させ、変性ゲル電気泳動にさらし、そのゲルを分析して、パネルＡのように数量化した。上側パネルがコマスィーブルー染色ゲルを示し、下側パネルは、対応する放射能写真分析を示す。リバビリンは、リバビリン５’−トリホスフェートであり、Ｌｉｇは、バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼである。
【００２０】
図２Ａは、ＳＡＨＣ及びＧＤＰＭＰとの複合体としてのＣＥＦの結晶構造を概略的に表す。両ＳＡＨＣ及びＧＤＰＭＰ分子に対してはボールとスティックの表現を用い、ＣＥＦはリボンとして描かれている。ＣＥＦのコア（７１から２２２の残基、金色）は、五つの螺旋（ａ１からａ５）に囲まれた、７捩りのｂシート（ｂ１からｂ７）からなる。この捩れは、複数のＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼによって共有される。コアのＮ終端に付加されるのが、ＧＴＰ類似体の付着を担う（赤色）７０残基のモジュラー延長である。ヌクレオチドの塩基及びリボースとの実際の相互作用は、螺旋−捻り−螺旋のモチーフ（螺旋Ａ１及びＡ２）によって生じる。ＣＥＦのＣ末端の部分（残基２２３から２６４、青緑色）は、（螺旋Ａ５がＡ１に反して巻き、そして鎖Ｂ４がＢ１と水素結合する）Ｎ末端領域に反して折り畳む。図は、ＭＯＬＳＣＲＩＰＴ（２８）を用いて生成し、ＲＡＳＴＥＲ３Ｄ（２９）を用いてレンダリングした。
【００２１】
図２Ｂは、三つのフラビウイルスのＣＥＦの、三つの配列リストである。特に、Ｄ２Ｖと符号を付けた四つのラインが配列ＩＤ番号１であり、ＷＮＶと符号を付けた四つのラインが配列ＩＤ番号２であり、そしてＹＦＶと符号を付けた四つのラインが配列ＩＤ番号３である。配列リストは、また、特に次のようになる。
配列ＩＤ番号１−デング熱ウイルス・タイプ２
GTGNIGETLGEKWKSRLNALGKSEFQIYKKSGIQEVDRTLAKEGIKRGETDHHAVSRGSAKLRWFVERNLVTPEGKVVDLGCCRGGWSYYCGGLKNVREVKGLTKGGPGHEEPIPMSTYGWNLVRLQSGVDVFFIPPERCDTLLCDIGESSPNPTVEAGRTLRVLNLVENWLSNNTQFCVKVLNPYMSSVTEKMEALQRKFGGALVRNPLSRNSTHEMYWVSNASGNIVSSVNMISRMLINRFTMRHKKATYEPDVDLGSGTRN
配列ＩＤ番号２−西ナイル・ウイルス
RGGAKGRTLGEVWKERLNEMTKEEFTRYRKEAIIEVDRSAAKHARREGNITGGHPVSRGTAKLRWLVERRFLEPVGKVVDLGCGRGGWCYYMATQKRVQEVKGYTKGGPGHEEPQLVQSYGWNIVTMKSGVDVFYRPSEASDTLLCDIGESSSSAEVEEHRTVRVLEMVEDWLHRGPKEFCIKVLCPYMPKVIEKMEILQRRYGGGLIRNPLSRNSTHEMYWVSHASGNIVHSVNMTSQVLLGRMEKKTWKGPQFEEDVNLGSGTRA
配列ＩＤ番号３−黄熱病ウイルス
RGSANGKTLGEVWKRELNLLDKRQFELYKRTDIVEVDRDTARRHLAEGKVDTGVAVSRGTAKLRWFHERGYVKLEGRVIDLGCGRGGWCYYAAAQKEVSGVKGFTLGRDGHEKPMNVQSLGWNIITFKDKTDIHRLEPVKCDTLLCDIGESSSSSVTEGERTVRVLDTVEKWLACGVDNFCVKVLAPYMPDVLEKLELLQRRFGGTVIRNPLSRNSTHEMYYVSGARSNVTFTVNQTSRLLMRRMRRPTGKVTLEADVILPIGTRS。
【００２２】
ＣＥＦのリボン表現に従って彩色した構造に基づく整合。デング熱ウイルス・タイプ２ニューギニア単離物（Ｄ２Ｖ）、西ナイル・ウイルス・ニューヨーク単離物（ＷＮＶ）、そして黄熱病１７Ｄ（ＹＦＶ）からのＣＥＦドメインを、ＣＬＵＳＴＡＬＷを用いて整列させ、ＥＳＰｒｉｐｔを用いてレンダリングした。サブドメイン１、２及び３の第二の構造（ａ螺旋及びｂ鎖）を、配列の上に示し、各々、赤色、金色及び青緑色を施した。螺旋及び鎖を、コア・ドメイン内にギリシャ文字（サブドメイン２）で命名し、その外にローマ文字（サブドメイン１及び３）で命名する。ヌクレオシド５’−トリホスフェート結合に関与するアミノ酸を、整合配列の下に星印で示す（テキストを参照）。
【００２３】
図２Ｃは、ＣＥＦの表面の可能性を概略的に表す。負の、そして正の有効電荷を示す表面の領域を、各々、赤色及び青色にした。この図は、ＧＲＡＳＰ（３０）を用いて生成した。ＳＡＨＣ及びＧＤＰＭＰの両方は、ＣＥＦの表面を二分する間隙内にスティックとして表す。しかし、キャップがない基質ｐｐｐＡＣＣＣＣＣに対してはそうはしない。キャップを持つＲＮＡへのメチル転送は、グアニンのＮ７−位置に既にメチル基が導入されていても起こる。
【００２４】
メタノール変性ヌクレオシドを特徴づけるために、反応混合物を、ＲＮＡとキャップ構造との両方を裂くホスホジエステラーゼで処理し、そしてヌクレオシド構成要素をレンダリングするアルカリ・ホスファターゼで処理した。薄層クロマトグラフィを用いた反応生成物の分離は、放射能の大部分が、２’−Ｏ−メタノール変性アデノシン（Ａ２’０Ｍｅ）と共に移動するが、Ｎ７−メタノール変性グアノシン（７ＭｅＧ）と共には移動しないことを示す（図６Ｂ）。これらの結果は、私たちの実験条件の下で、メチル化が第二のヌクレオチドの２’−Ｏ−位置において独占的に起こることを示す。しかしながら、これらは、生体内の複製複合体内に見られる条件下で、ＮＳ５ＭＴａｓｅＤＶによって、グアニンのＮ７−位置にメチル基が導入されることを除外しない。私たちは、ＮＳ５ＭＴａｓｅＤＶが、デング熱ウイルスの２’ＯＭＴａｓｅであると結論する。このドメインの重合酵素ドメインへの物理的な結合は、ゲノムの（＋）ＲＮＡ合成及びＲＮＡキャッピングの開始の調整に関連すべきである。
【実施例】
【００２５】
ＩＩＩ．ＣＥＦの構造
【００２６】
ＣＥＦの結晶構造を、結合Ｈｇイオンを異常散乱体（表１）として用いる、マルチ波長異常分散（ＭＡＤ）法によって測定した。
【００２７】
【表１】
2004536592.tif 000002
【００２８】
Ｒｓｙｍ＝Ｓ｜Ｉ−＜Ｉ＞｜／ＳＩ。Ｒｃｕｌｌｉｓ＝Ｓ｜Ｅ｜／Ｓ｜ＤＦ｜。
【００２９】
整相出力＝（ｒｍｓＦｈ）／（ｒｍｓＥ）。この場合、Ｆｈは重原子構造振幅であり、そしてＥは残留性閉鎖欠如である。
【００３０】
Ｒｃｒｙｓｔ＝Ｓ｜｜Ｆｏｂｓ｜−｜Ｆｃａｌｃ｜｜／Ｓ｜Ｆｏｂｓ｜。すべてのデータは、シグマ・カットオフなしで用いた。
【００３１】
Ｒｆｒｅｅ＝Ｓ｜｜Ｆｏｂｓ｜−｜Ｆｃａｌｃ｜｜／Ｓ｜Ｆｏｂｓ｜。この場合、Ｆｏｂｓは、精製に用いない試験セット振幅（データの５％）である。
【００３２】
結晶を懸滴内で室温において成長させた。１μｌのタンパク質溶液（１２ｍｇ／ｍｌ）を、０.１Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ５.８、１.２Ｍリチウム硫酸塩及び０.５Ｍ硫酸アンモニウムを含む１μｌの貯留溶液と混合し、１週間、蒸気拡散によって平衡化させた。結晶を、２０％のグリセロールを含む同じ溶液内で、凍結に対して保護し、そして窒素流で瞬時に凍らせた。結晶は、空間群Ｐ３１２１（ａ＝１１１．５Å、ｃ＝５６．３Å）内に成長した。データは、電荷結合素子検出器（ＡＤＳＣＱ４あるいはＭＡＲ１６５）を用いて、ビームラインＩＤ１４−２、ＩＤ１４−３及びＢＭ１４上のＥＳＲＦにおいて採取した。イメージを、ＤＥＮＺＯ（２２）を用いて処理し、そして輝度をＳＣＡＬＡ（２３）と統合した。ＭＡＤデータ・セットを、Ｈｇ（ＣＮ）２で浸漬した結晶を用いて採取した。位相をＭＬＰＨＡＲＥ（２３）を用いて計算した。溶媒平たん化、そして２.４Åへの位相拡張を、ＤＭ（２４）を用いて行った。残基１０から２６１を構築して、初期濃度マップに明瞭に割り当てることができた。ＣＮＳ（２５）及びＴＵＲＢＯ（２６）を用いて、低速冷却ねじり分子動力学的精製及びモデル改良を数回繰り返した。Ｒｆｒｅｅ（２７）を、５％のユニークなデータを用いて計算した。
【００３３】
残基７から２６４を構造内に定義し、デング熱ＮＳ５配列ナンバリングを用いて、最終的なモデルを形成した。ＣＥＦは、（図２Ａ及び２Ｂに示すように）三つのサブドメインから形成された、全体的に球形な構造を示す。それらは、Ｎ末端モジュール（サブドメイン１、残基１から７０）、ＳＡＭ結合コア（サブドメイン２、残基７１から２２２）、そしてサブドメイン１と２との間に位置して狭い間隙の底部を形成するＣ末端配列（サブドメイン３、残基２２３から２６４）である。サブドメイン１は、フラビウイルスからの既知の同族体を持たないし、また、ＤＡＬＩサーバー（１５）を用いて判定したタンパク質データバンク（Protein Data Bank）内に蓄えられたタンパク質構造に共通する構造的な特徴を全く持たない。螺旋Ａ１−捻り−螺旋Ａ２モチーフで始まり、ＣＥＦのコアドメインからサブドメイン１を分離する間隙の一側を形成する。コア・サブドメイン２は、レオウイルスλ２（５）及びワクシニア・ウイルスＶＰ３９酵素（１６）のドメインに一致する、典型的なＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼ・ドメインのように折れる。このコアは、七つのβ鎖（β１からβ７）と五つの螺旋（α１からα５）とがねじれて混じったｂ−シートからなる。この構造的なホモロジーは、ＳＡＭとｍＲＮＡキャップ（１７）との両方との複合体において、ＣＥＦのコアを、関連するＶＰ３９ヌクレオシド−２’−０−メチルトランスフェラーゼ・ドメインに重ねることを可能にする。間隙の近くのＣＥＦサブドメイン２内にもう一つの密集が、差フーリエ・マップで見つかった。ＶＰ３９とＣＥＦとの重ね合わせは、この密集がＶＰ３９メチルトランスフェラーゼのＳＡＭ結合ポケット内に位置することを示した。それを、おそらく大腸菌から生じてＣＥＦと共に精製された、メチル転送反応の産物である、結合Ｓアデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨＣ）分子として識別して精製した。ＳＡＨＣ分子のアデニン塩基は、他のＳＡＭ依存メチルトランスフェラーゼ内に見られるように、四つのｂ鎖によって内側が覆われたポケット内にしっかりと保持される。ＳＡＨＣの硫黄原子は間隙に向かっている。ＣＥＦ間隙は、ＶＰ３９ヌクレオシド−２’−０−メチルトランスフェラーゼ構造内に観られるＲＮＡ結合間隙と同じ位置を占拠する。表面電位分析は、ＣＥＦ間隙の底部が正の電荷を持つことを示し、（図２Ｃに示すように）５’−ｍＲＮＡ末端の、負の電荷を持つホスフェートを収容する可能性を示している。出願者は、この表面電位と、ＶＰ３９との位相の類似が、ＣＥＦが、キャップ１構造を生成するように作用するヌクレオシド−２’−０−メチルトランスフェラーゼであるかもしれないということを支持することを論証した。
【００３４】
結晶パッキングの試験によって、結晶内には、ヌクレオチド等の小さな分子を拡散するための十分なスペースがあることが分かった。加水分解抵抗性ＧＴＰ類似体であるｂ，ｇ−メチレンＧＴＰ（ＧＤＰＭＰ）を含む溶液内に浸漬したとき、結晶パッキング内に明白な転位は起こらなかった。計算差フーリエ・マップは、（図３Ａに示すように）サブドメイン１に結合したＧＴＰ類似体分子に対応するもう一つの密度を示した。塩基、リボース・ヒドロキシル、そしてＧＴＰ類似体のａ−ホスフェート成分は、主に螺旋Ａ１及びＡ２に接触する。奇妙にも、Ａ１とＡ２との間の捻りの配列は、典型的なヌクレオチド結合モチーフ（１８）であるＰループのそれと７９％のホモロジーを共有する。しかしながら、このループへのＧＴＰ結合モードは、ＧＴＰのホスフェートがループに接触しないため、Ｐループへのヌクレオチドのそれとは全く異なる。代わりに、ホスフェートは、ループから離れて間隙に向かって、間隙の底に位置するコア・ドメインに属する残基に相互作用する。リボースはノーザン構成（Northern configuration）を採り、リボヌクレオチドの特殊性は、フラビウイルスの間で保持される、Ｌｙｓ１４及びＡｓｎ１８側鎖を巻き込む２’−ＯＨとの二つの水素結合によって達成される。ａ−ホスフェートに最も近いアミノ酸側鎖は、Ｌｙｓ２９及びＳｅｒ１５０のものである。ＣＥＦに対応する西ナイル・ウイルス・タンパク質ドメイン（６７％のアミノ酸同一性と、２９６の残基の８７％の類似）は、（図２Ｂに示すように）位置２９に保存アルギニンを持つため、グアニルトランスフェラーゼ反応の化学機構は、未確定なままである。Ｓｅｒ１５０側鎖は、ａ−及びｂ−リン酸基の両方からの酸素原子に接触する。Ｓｅｒ１５０は、ｂ４を螺旋ａ６に結合する鎖に属し、これに反してサブドメイン１のＧＴＰ結合部位が曲がる。
【００３５】
ＩＶ．ＣＥＦ構造の有意性
【００３６】
ＧＴＰ結合部位の構造的な構成は注目に値する。これは、保存ＳＡＭあるいはＲＮＡ結合ドメイン（残基７１から２２２）のモジュラー延長（残基７から７０）と見なすことができる。このＮ末端の付属肢は、これまで報告のないホールド（fold）の、新奇なＧＴＰ結合部位を生じ、ＣＥＦを既知の最も小さな二機能性キャッピング酵素にし、レオウイルス１２グアニルトランスフェラーゼと、共有結合形ヌクレオチジルトランスフェラーゼ系統群に属するものとの両方とは全く別のタイプのグアニルトランスフェラーゼを形成する。グアニルトランスフェラーゼ及びメチルトランスフェラーゼ活性の近い関連は、多くのウイルス性キャッピングシステムの特色であるため、ＳＡＭあるいはＲＮＡ結合ドメインのこのタイプのモジュラー延長は、グアニルトランスフェラーゼがまだ識別されていない他のウイルス（６）においても見いだせるかもしれない。
【００３７】
ＣＥＦには、プリン塩基による接触によって例示される、既知のヌクレオチド結合部位構造とは異なる、多くの独創的な構造的な特徴がある。グアニンの特殊性は、（図３Ｂに示すように）グアニンの２−アミノ基を持つ主鎖カルボニル基の、三つの特定な相互作用を介して達成される。これらの相互作用のいずれも、アデニンでは不可能であろう。したがって、グアニン対アデニン結合の特殊性は、Ｃ６プリン置換基を持つタンパク質の特定な相互作用を伴わない。このタイプのヌクレオチド識別は、新奇であるように思われる。グアニンのＮ７位置は、溶媒に向かい、どの残基にも接触しない。これは、アルキル化塩基が結合特殊性の決定要素であるＶＰ３９酵素とは異なる（１９）。
【００３８】
リバビリン５’−トリホスフェートは、ＧＴＰ類似体に用いるものと同じ条件下でＣＥＦへ結合し、（図４Ａに示すように）ＧＴＰ類似体と同じように接触する。興味深いことに、リバビリンのカルボニル基は、どの残基とも相互作用しないが、ＮＨ２基は、ＧＴＰ類似体のＮＨ２として、Ｌｅｕ１７、Ａｓｎ１８及びＬｅｕ２０のカルボニル基を水素結合する（図３Ａと４Ｂとを比較）。したがって、リバビリンは、構造的に識別されるようではない。リバビリンの、グアノシンとの構造的な類似は、１−及び６−位置の両方の空間位置から生じるが、この模倣は、リバビリンの結合モードとは調和しない（図３Ｂと４Ｂとを比較）。グアニンの２−アミノ基の位置と空間的に同等な位置を採るのは、リバビリンのＮＨ２であって、そのカルボニル基ではない。
【００３９】
リバビリン５’−トリホスフェートは、ＧＴＰのそれに同様な、ＣＥＦ結合類似性を示す（図１）。リバビリンで処理した細胞では、リバビリン５’−トリホスフェートの濃度は、ＧＴＰ（２０）のそれよりも少なくとも十分の一の規模で低い。したがって、リバビリンの抗ウイルス効果は、リバビリン５’−モノホスフェートによるＩＭＰ−ＤＨの抑制を介する、細胞内ＧＴＰプールのダウンレギュレーションなしに説明することはできない。ＲＮＡキャッピングは、種々のウイルスに不可欠である（６）ため、ここに示すＲＮＡキャッピングのリバビリン抑制の構造的なメカニズムは、フラビウイルスに対するリバビリンの抗ウイルス活性を明らかにするかもしれないが、追加のウイルス酵素作用の抑制を除外するものではない。例えば、リバビリン５’−トリホスフェートは、ウイルスのＲＮＡ重合（２１）中にポリオウイルスへ組み込まれる。しかし、インターフェロンがない状態では、リバビリン・ヌクレオチドは、ＲＮＡキャッピング活性を全く持たない、フラビウイルス科Ｃ型肝炎ウイルスに対して抗ウイルス活性を及ぼさない。したがって、フラビウイルスに対するリバビリンの抗ウイルス活性は、抑制細胞ＩＭＰ−ＤＨ、そして少なくともウイルス・キャッピングに依存するのかもしれない。
【００４０】
アデニン／グアニン特殊性と共に、リバビリン結合モードは、薬剤デザインにおいて二つの重要な結果を招く。第一に、タンパク質データバンク内のヌクレオチド結合タンパク質構造の試験は、（図３Ｂに示すように）プリン２−位置のみを持つＧＴＰの特定な認識がこれまで報告されていないことを示す。細胞のＮＴＰ結合酵素は、少なくとも二つのプリン１−、２−、あるいは６−位置に接触するようである。もしこれが真であるならば、私たちの結果は、リバビリン・ヌクレオチドの、細胞ＧＴＰ結合タンパク質に対する有意義な親和性の明らかな欠如を説明する。この観察結果はリバビリンの抗ウイルス選択性と一貫している。第二の問題は、薬剤抵抗についてである。リバビリン結合には主鎖接触のみが伴うため、ＧＴＰに対するリバビリンの識別に直接関与するアミノ酸側鎖の単なる置換はありそうにない。従って、このような直接的なメカニズムによる薬剤抵抗もありそうにない。これらの構造的な特徴は、フラビウイルスが適時の例である、ウイルス起源の多くのヒト病原体に対して合理的に薬剤をデザインするためのユニークな基礎を提供する。
【００４１】
Ｖ．抗ウイルス特性を持つ薬剤の試験プロセス
【００４２】
ＣＥＦタンパク質は、そしてその、リバビリン５’−トリホスフェート等のヌクレオチド類似体への結合能力は、抑制因子を探るために用いることができる。識別抑制因子は、フラビウイルス感染症による病気の処理に有用である。抑制因子としてのアシクロビル５’−トリホスフェートの選択を下記に例示する。
【００４３】
アシクロビルは、ヘルペスウイルス感染症の治療に用いるヌクレオシド類似体である。これらのウイルスは、アシクロビルをアシクロビル５’−モノホスフェートへリン酸化することが可能な、それら自身のヌクレオシド・キナーゼをコード化する。ヘルペスウイルスに感染した細胞は、その後、このリン酸化反応を行うことができるが、非感染細胞ではそうではないため、薬剤活性化の優れた選択性をもたらす。細胞キナーゼは、アシクロビル５’−モノホスフェートを、ヘルペスウイルス重合酵素の優れた抑制因子であるアシクロビル５’−トリホスフェートへとリン酸化することが可能である。
【００４４】
（ヘルペスウイルス以外の）ほとんどのウイルスは、ウイルス性ヌクレオシド・キナーゼを所有しないため、アシクロビルをモノホスフェート状態へと活性化することはできないので、ウイルスの成長を抑制するために、アシクロビル５’−トリホスフェートを生成することは不可能である。したがって、アシクロビルは、これらのウイルスに対しては不活性な薬剤であるが、これらのウイルスのキャッピング酵素等の、他のウイルス酵素あるいは重合酵素を、アシクロビル５’−トリホスフェートによって抑制できるかどうかは未知である。
【００４５】
ＣＥＦタンパク質、そしてそのＧＴＰを結合する能力は、グアノシン類似体アシクロビル５’−トリホスフェート等の、ＧＴＰの競合的な抑制因子として作用するヌクレオシドの潜在的な抑制力を判定するための容易な方法を提供する。
【００４６】
ＣＥＦへのＧＴＰの結合親和定数は、図１Ａに示すように、ＣＥＦの固定濃度を用いて、そして放射標識ＧＴＰの濃度を増加させて容易に測定することができる。ＣＥＦ−ＧＴＰ複合体をＵＶ架橋を用いて分析し、ＧＴＰ濃度の関数としてプロットした。この複合体は、５２μＭの結合親和定数Ｋｄが判定可能な双曲線飽和関数に従って、高ＧＴＰ濃度において飽和する。
【００４７】
ＧＴＰのそれに対して、アシクロビル５’−トリホスフェートの結合親和性を判定するために、まず、５２μＭのＧＴＰと共にＣＥＦを温置し、この反応にアシクロビル５’トリホスフェートを、濃度を増加させながら加える。それから、ＣＥＦ−ＧＴＰ複合体を、上記のようなＵＶ架橋を用いて分析する。アシクロビル５’−トリホスフェートが、ＣＥＦ活性部位に対して、放射標識ＧＴＰと競合する場合、アシクロビル５’−トリホスフェートは、活性部位内でＧＴＰに取って代わる。アシクロビル５’−トリホスフェートが標識されていないため、放射標識ＣＥＦ−ＧＴＰ複合体の量の減少が観察できる。これから、ＣＥＦへのアシクロビル５’−トリホスフェート結合に対して、７９μＭの相対結合親和定数を判定できる（図１Ｂ参照）。
【００４８】
この場合、この試験から、アシクロビルが任意のウイルスに対して活性でなくとも、アシクロビルのトリホスフェート形態は、ＣＥＦ酵素の優れた抑制因子であるという重要な情報が得られる。したがって、この試験から得た情報は、ヘルペスウイルスへの抗ウイルス活性を制限する、第一のヌクレオシド・キナーゼ活性化ステップを回避するかもしれないアシクロビル５’モノホスフェートのベクター形態が、細胞内で生成されたアシクロビル５’−トリホスフェートを持つという結果をもたらすべきであるということである。アシクロビル５’−トリホスフェートは、それから、ＣＥＦ−アシクロビル５’−トリホスフェート結合実験によって判定したように、ＣＥＦ等の不可欠な酵素を持つウイルスを抑制すべきである。
【００４９】
この種類の分析法は、ＧＴＰ結合部位内でＣＥＦに結合するどの分子（ヌクレオシドあるいは非ヌクレオシド）でも用いることができることは明らかである。単純性、安定性、そして単一試験管でこの分析法を行うことができるという事実は、このＣＥＦ結合分析法が、ＣＥＦタンパク質等の酵素の潜在的抑制因子を素速く効率的に選別するために用いることができることを示している。
【００５０】
（参考文献）
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【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１Ａ】ゲル電気泳動の写真であり、α−３２Ｐ−ＧＴＰのＣＥＦへのクロスリンクを示す。
【図１Ｂ】ゲル電気泳動の写真であり、ＣＥＦへの共有結合に対する、ＧＴＰとリバビリン５’−トリホスフェートとの比較である。
【図２Ａ】ＳＡＨＣ及びＧＤＰＭＰとの複合体としてのＣＥＦの結晶構造を概略的に表す。
【図２Ｂ】三つのフラビウイルスのＣＥＦの、三つの配列リストである。
【図２Ｃ】ＣＥＦの表面の可能性を概略的に表す。
【図３Ａ】ＧＴＰ類似体分子に対応する密度を示す計算差フーリエ・マップである。
【図３Ｂ】グアニンの２−アミノ基を持つ主鎖カルボニル基の化学式である。
【図４Ａ】リバビリン５’−トリホスフェートのＣＥＦへの結合を表す。
【図４Ｂ】ＮＨ２としてカルボニル基を水素結合したＧＴＰ類似体の化学式である。
【図５Ａ】ＣＥＦ酵素に対するＫｄ（ＧＴＰ）の値を示すグラフである。
【図５Ｂ】ＣＥＦ酵素に対するＫｄ（アシクロビル−ＴＰ）の値を示すグラフである
【図６Ａ】３Ｈ−メチル統合に対する時間を示すグラフである。
【図６Ｂ】３Ｈ−メチル統合に対する原点からの距離を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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