(57)【要約】本発明は、遺伝子治療に有用な改良されたベクターに関し、特にこの改良点は、安全性の向上に存する。上記ベクターに由来する転写物の二量体形成を促進する遺伝子治療用ベクター内に配列を組み込むことによって、本改良が達成される。好ましい態様において、このような配列は自己相補的なパリンドローム配列または非パリンドローム配列である。2004533827.tif 000057
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型状態では存在しない、修飾された異種性二量体化配列または合成二量体化配列を少なくとも一つ有するレトロウイルスベクターを少なくとも一つ含むレトロウイルスベクター系であって、該修飾によって、配列修飾の転写物を含有する該ベクターの転写物と、ベクターを含有する細胞中に存在する少なくとも一つの異なるレトロウイルスの転写物のうち少なくとも一つとの間の組換え頻度が減少し、該減少が、野生型レトロウイルスベクター由来の対応する転写物の組換え頻度の減少の少なくとも2倍である、レトロウイルスベクター系。
【請求項２】
第一および第二のレトロウイルスベクターを含む系であって、第一ベクターには、第二ベクターに存在する逆転写用の開始部位が欠けている、請求項1記載の系。
【請求項３】
ベクターの形質導入力価が、該ベクターの起源である野生型ベクターの力価の少なくとも25％である、請求項1記載の系。
【請求項４】
二つのベクターが細胞中に1：9〜9：1の範囲の割合で存在する場合、該ベクターの形質導入力価が、該ベクターの起源である野生型ベクターの形質導入力価の少なくとも1％である、請求項2記載の系。
【請求項５】
ベクターにより、該ベクターの転写物と、ベクターを含有する細胞中に存在する異なるレトロウイルスの転写物のうち少なくとも一つとの間の組換え頻度が少なくとも5倍減少することが示される、請求項1または3のいずれか一項記載の系。
【請求項６】
ベクターにより、配列修飾を含む該ベクターの転写物と、該ベクターが存在する細胞中に存在する一つまたは複数の異なるレトロウイルスの極めて多数の転写物との間の組換え頻度が減少することが示される、請求項1〜5のいずれか一項記載の系。
【請求項７】
ベクターにおける配列修飾が、一つまたは複数の塩基の置換、欠失または付加である、請求項1〜6のいずれか一項記載の系。
【請求項８】
ベクターにおける配列修飾が、配列における一つまたは複数の塩基の再編成または転座である、請求項1〜7のいずれか一項記載の系。
【請求項９】
ベクターの修飾が、種々の同種性または異種性の二量体化配列の置換または挿入である、請求項1〜8のいずれか一項記載の系。
【請求項１０】
二量体化配列がパリンドローム構造またはキッシングループ構造である、請求項9記載の系。
【請求項１１】
ベクターにおける修飾が、MLV、ALV、HaSV、HIV-1、HIV-2、コクサッキーBウイルスおよびブタアルテリウイルス（Arterivirus）中で同定されたキッシングループ構造からなるキッシングループ配列群より選択される少なくとも一つのキッシングループ構造による、キッシングループ構造の置換である、請求項7記載の系。
【請求項１２】
機能欠損型および/または複製欠損型の第一および第二のレトロウイルスベクターを含む系であって、上記二つのベクターの二量体化配列が異なる、請求項1から11のいずれか一項記載の系。
【請求項１３】
二つの異なる配列が、以下からなる配列対の群から選択される対である、請求項12記載の系：
プラスミド起源の配列である、ColE1（RNAIおよびRNAII）、IncF（copA RNAおよびrepA mRNA）、IncI（inc RNAおよびrepZ mRNA）、ColE2（cop RNAおよびrep mRNA）、R1162（ct RNAおよびrep1 mRNA）、R6K（サイレンサーおよびアクチベーター）、pT181（RNAIおよびrepC mRNA）、IncF（finP RNAおよびtraJ mRNA）、IncFII（sok RNAおよびhok mRNA）；ファージ起源の配列である、λ（aQ RNAおよびQ mRNA）、λ（oop RNAおよびcII mRNA）、P22（sar RNAおよびant mRNA）、P1（c4リプレッサーおよびant mRNA）、P7（c4リプレッサーおよびant mRNA）；トランスポゾン起源の配列である、IS10（RNA-OUTおよびtnp mRNA）；ならびに細菌起源の配列である、大腸菌（micF RNAおよびompF mRNA）および大腸菌（tic RNAおよびcrp mRNA）。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか一項記載の系のレトロウイルスベクターのうち少なくとも一つがトランスフェクトされた細胞。
【請求項１５】
請求項1〜13のいずれか一項記載の系のレトロウイルス転移ベクターの少なくとも一つの複製にトランスに必要なウイルスタンパク質を産生するための情報を保持する一つまたは複数のDNA配列の挿入によって形質転換された哺乳動物細胞または鳥類細胞である、該レトロウイルス転移ベクターのうち少なくとも一つの複製のためのパッケージング細胞。
【請求項１６】
請求項1〜13のいずれか一項記載のウイルスベクター系の転写物を少なくとも一つ含有するウイルス粒子。
【請求項１７】
少なくとも一つの配列修飾を二量体化配列に導入する段階を含む、レトロウイルスベクター系を調製する方法であって、該修飾によって、配列修飾の転写物を含有する該ベクターの転写物と、ベクターを含有する細胞中に存在する少なくとも一つの異なるレトロウイルスの転写物のうち少なくとも一つとの間の組換え頻度が減少し、該減少が、野生型レトロウイルスベクター由来の対応する転写物の組換え頻度の減少の少なくとも2倍である方法。
【請求項１８】
請求項1〜16のいずれか一項記載のレトロウイルスに基づくベクター系の使用を含む、遺伝子治療用ベクター系の安全性を向上させる方法。
【請求項１９】
二つの同一または異なる配列を含有する配列対が、レトロウイルスベクター系に由来する転写物のホモ二量体形成および/またはヘテロ二量体形成を促進する能力を測定する方法であって、該ベクター系のレトロウイルスベクターのうち少なくとも一つを宿主細胞内に導入する段階ならびに生じた特定の組換え事象の相対数を定量することによって該ベクター系に由来する転写物のホモ二量体形成および/またはヘテロ二量体形成の頻度を評価する段階を含む方法（ここで、該特定の組換え事象の数は、以下の段階を含む方法によって得られる：
a）該配列対を選択する段階；
b）選択マーカー遺伝子および非機能性プライマー結合部位（PBS）を含有する一つのレトロウイルスベクター内に、該配列対のメンバーの一方を挿入し、かつ、機能性プライマー結合部位（PBS）を含有するが上記ベクターと同一の選択マーカー遺伝子を含有しない別のレトロウイルスベクター内に、該配列対のメンバーのもう一方を挿入する段階；
c）段階（b）の該二つのレトロウイルスベクターの両方からの情報を含む感染性レトロウイルス粒子の形成を可能にするために必要な手段を提供する適切なパッケージング細胞内に、段階（b）の二つのレトロウイルスベクターを同時導入する段階；
d）培地を含むウイルスを回収し、かつ、段階（b）の非機能性プライマー結合部位を含有する該一方のレトロウイルスベクターの選択マーカー遺伝子を含有しない、適切な宿主細胞の培養液に感染させる段階；
e）段階（d）のトランスフェクト宿主細胞を、段階（d）の該選択マーカー遺伝子を含有するウイルス粒子による感染を受けた細胞だけにコロニーを形成させるという選択手段に供する段階；および
f）得られた耐性コロニーの数から特定の組換え事象の数を定量する段階）。
【請求項２０】
遺伝子治療に有用な組成物を調製するための、請求項1〜13のいずれか一項記載のレトロウイルスベクター系または請求項16記載のウイルス粒子の使用。
【請求項２１】
遺伝子治療用医薬品を製造するための、請求項1〜13のいずれか一項記載のレトロウイルスベクター系または請求項16記載のウイルス粒子の使用。
【請求項２２】
医薬品を製造するための、請求項14または15記載の細胞の使用。
【請求項２３】
請求項1〜13のいずれか一項記載のベクター系および/または請求項16記載のウイルス粒子を含有する、薬学的製剤。
【請求項２４】
請求項16記載のウイルス粒子または該ウイルス粒子の一部を含有する、ワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、遺伝子治療に有用な改良されたベクター、特に改良点が安全性向上に存するようなベクターに関する。本発明はさらに、このような改良されたベクターを調製する方法および遺伝子治療におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
技術的背景及び先行技術
治療用遺伝子を罹患生物内に導入することによって病気を治療するために、多数の異なるプロトコールが開発されてきた。これらのプロトコールのうちの多くは、所望の治療用遺伝子を生物内に導入するための媒体としてウイルスベクター系を用いている。このようなベクターは、たとえば、修飾されたアデノウイルスゲノムまたはレトロウイルスゲノムなどに基づく。遺伝子治療プロトコールの主要な課題の一つはその安全性であり、特に、標的細胞または産生細胞における組換え事象の結果としての、完全に機能性ウイルスゲノムの産生を避けることである。このような組換えによって完全に複製可能なウイルスゲノムが生じる可能性があり、これはその後、最終的にはガンに至る、制御不能なウイルス複製をレシピエントの体内で引き起こし得ることが、過去の論文で報告されている。ウイルスに基づく遺伝子治療用ベクターの安全性を向上させるために、多数の異なるアプローチが存在する。これらのアプローチはすべて、治療対象の生物内で自己複製可能ウイルスの出現を最小化すべきであるという共通点を有する。これらのアプローチのほとんどが、ウイルスの複製またはパッケージングに必要な情報を全く含まない非機能性ウイルスゲノムを利用する。このようなアプローチの一つにおいて、レトロウイルスベクターのプライマー結合部位（PBS）は、tRNAプライマーと強い塩基対を形成できない配列へと修飾される。ウイルス複製を開始するために必須の要素であるプライマー結合部位がもはや機能しないため、このような修飾レトロウイルスは複製できないはずである。しかしながら、機能性ウイルス粒子を産生する能力を有する産生細胞またはパッケージング細胞が必要である。一般的に、このような産生細胞は、患者への導入が意図されるウイルスゲノムの欠損を補うことのできる手段を必ず含有している。上記産生細胞には、産生細胞内での組換え事象によって、非機能性ウイルスゲノムがウイルス粒子内にパッケージングされるだけでなく、組換え事象によってゲノムが完全に複製可能になる、というリスクを有する。
【０００３】
遺伝子治療プロトコールにおいて広く用いられているベクター系は、鳥類および哺乳動物に由来する遺伝子転移媒体であるレトロウイルスベクターであり、これは、感染効率の高さ、および標的細胞染色体内のウイルス伝達性情報の同一線上の（colinear）組み込みの安定性などの、レトロウイルス複製の特色を利用したものである。レトロウイルスベクターは、基礎研究、バイオテクノロジーおよび遺伝子治療における重要なツールになりつつある。
【０００４】
現在用いられているほとんどのレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（MLV）に由来する。多様な細胞型におけるこのウイルスの転写のパターンが十分に文書で立証されていることや、比較的単純なモジュール的遺伝子構造であることから、MLVはベクターとして特に適している。このレトロウイルスの構造は、たとえば、米国特許第6037172号に詳細に開示されている。
【０００５】
レトロウイルスは、プロウイルスDNAとして宿主ゲノム内に安定的に組み込まれる二本鎖DNA中間体を経由して複製する。生殖細胞の感染時に、生殖系を経由してプロウイルスが伝達され、遺伝子の実体およびメンデルの遺伝子として、多世代にわたってゲノム内に存続しうる。このようなゲノム要素（通常は内在性レトロウイルス（ERV）と呼ばれる）は、突然変異の蓄積により複製欠損型である場合が多く、かつ、拡散するためには、ヘルパーウイルスの随伴性複製に依存する。したがって、ERVのパッケージングシグナル内の構造的シス要素がヘルパーウイルスRNAのキャプシド形成機構による認識を促進するという条件では、ERVに由来するRNAが、宿主細胞から放出されたウイルス粒子に便乗する可能性がある。公知のマウスERVのパネルの中で、マウス白血病ウイルス（MLV）関連ファミリーおよびVL30 ERVファミリーのメンバーが、MLVビリオン内に選択的に含まれる。
【０００６】
出芽レトロウイルス粒子内への二つのゲノムRNA分子のキャプシド形成によって、感染細胞の細胞質に内在化されたウイルスのコア粒子内部での逆転写の際の組換えが可能となる。まず最初に、新生-鎖DNAの鋳型スイッチングによって、レトロウイルスの組換えが起こる。外因性起源のおよび内因性起源のレトロウイルスRNAの共存および不定期の同時パッケージングによって、両者の親の元々の配列を有する組換えプロウイルスの産生が可能になる。このようなシナリオにおいて、DNA合成中の鋳型スイッチング事象は、同時パッケージングされた内在性ウイルスに由来する機能的配列パッチを有するゲノムの欠陥部分の置換によって、ウイルス突然変異の組換えパッチ修復を促進しうる。ERVに基づく組換え復帰変異（recombinational reversion）の既知の例には、（i）インテグラーゼ付着部位の修飾、（ii）pol遺伝子のIN領域およびPR領域内の欠失、および（iii）プライマー結合部位（PBS；Mikkelsenら、J.Virol.70：1439-1447、1996およびJ.Virol.72：6967-6978、1998）の欠陥を有するウイルス変異体のパッチ修復が含まれる。加えて、パッケージング構築物およびERV由来RNAの両方を含む組換え事象がレトロウイルスベクターの「パッチ修復」をもたらすことが見出されたが、これは、レトロウイルスに基づく遺伝子転移の応用において、有害な自己複製可能ウイルスの発生をもたらす。
【０００７】
RNA二量体化およびキャプシド形成は、強く結びついたレトロウイルス複製事象である。レトロウイルスRNAの同時パッケージングが組換えの必要条件であることが証明されているのに対して、RNA二量体化がパッケージングおよび/または同時パッケージングされたRNA間の遺伝的相互作用に必要かどうかは未だ結論の出ない問題のままである。検討されたすべてのレトロウイルスについて、RNA二量体化およびキャプシド形成の第一の決定要因が、PBSの下流側かつgag開始コドンの上流側に位置する5'非翻訳領域（5'UTR）内のパッケージングシグナルにマッピングされている。5'UTR中の特定のステムループ構造は、保存されたパリンドロームループモチーフの分子間「キッシング（kissing）」を介してインビトロでの合成RNA二量体形成を促進する（Cleverら、1996；Fosseら、Biochemistry 35：16601-16609、1996；Girardら、Biochemistry 34：9785-9794、1995；Haddrickら、J.Mol.Biol.259：58-68、1996；LaughreaおよびJette、Biochemistry 33：13464-13474、1994；Paillartら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：Biochemistry 35：16601-16609、1996、1997）。5'UTRの組換えウィンドウ内において、このキッシングループ配列は、ベクタードナーRNAと内在性ウイルス由来アクセプターRNA鋳型との間の新生-鎖DNA鋳型のスイッチングが活発な部分である（Mikkelsenら、1996、1998b）。キッシングループ配列における突然変異が、感染性および鋳型シフトに与える影響は、Mikkelsenら、（2000）J.Virol.74、600-610によって分析されている。
【０００８】
また、レトロウイルスにおける組換え事象に関するさらなる情報は、MikkelsenおよびPedersen（2000）、J.Biomedical Sci.第7巻、77〜99頁中にも与えられている。
【０００９】
遺伝子治療用のレトロウイルスベクターの安全性を向上させるために多数の方法が試みられてきたのに対して、レトロウイルスベクターと内因性ウイルスまたは混入した外因性ウイルスとの間の望ましくない組換えという課題の大部分が未解決と考えられる。極めてまれではあるが、このような組換え事象が、完全な複製可能ウイルス粒子内にパッケージングされた機能性ウイルスゲノムの形成につながる可能性がある。治療上重要な遺伝子の担体としてのレトロウイルスベクターの潜在能力を十分に活用するために、このような組換えの可能性を最小化することによって、このような望ましくない組換え事象の弊害を最小限にするように努めなければならない。本発明は、望ましくない組換えの頻度を最小化するための方法および手段を開示する。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明の基礎をなす課題とは、遺伝子治療プロトコールにおいて有用かつ安全性が向上したベクター、および、このようなベクターを調製する方法を提供することであった。
【００１１】
修飾された異種性二量体化配列または合成二量体化配列を少なくとも一つ含有するレトロウイルスに基づくベクター系によって、本課題を解決する。このような系は、系に由来する転写物の二量体形成を促進し、ベクターの転写物と、細胞中に存在する異なるレトロウイルスの転写物との間の組換え頻度の減少をもたらす。
【００１２】
本明細書中において「二量体化を促進する外因性配列」という用語または「修飾された異種性二量体化配列または合成二量体化配列」という用語を互換的に用いることができる。「修飾された異種性二量体化配列または合成二量体化配列」とは、この文脈において、生物学的供給源に由来するのかまたは人工的配列であるのかが問題となっている配列が、本発明のベクター系を構築するために用いられた野生型核酸分子中の同じ位置には見られないこと、および、その配列が二量体化配列であることを意味する。たとえば、5'UTRと関心対象の遺伝子との間の領域が、配列の組み込みによって修飾される場合、組み込まれたこのような配列は、たとえそれが同一のウイルスゲノムに由来するが異なる領域に由来するものであっても、「修飾された異種性二量体化配列または合成二量体化配列」である。しかしながら、典型的には、「修飾された異種性二量体化配列または合成二量体化配列」とは、本発明のベクター系を構築するために用いられた野生型核酸分子とは異なる起源から得られる。非修飾開始レトロウイルスゲノムと、本発明にしたがって修飾されたゲノムとの配列比較によって、任意のこのような「修飾された異種性二量体化配列または合成二量体化」配列を簡単に検出することができる。
【００１３】
本発明の文脈において、「異なるレトロウイルス」という用語は、特定のレトロウイルスに基づくベクター系の転写物をコードする少なくとも一つのレトロウイルスゲノムとは異なるゲノムを含有するレトロウイルスを規定する。
【００１４】
発明の詳細な説明
上に説明されているように、レトロウイルスの生活環には、ウイルス複製の際の二量体形成段階が含まれる。さらに、同様に上述されているように、関心対象の遺伝子を保持するレトロウイルス由来ベクターはウイルス複製および/またはパッケージングの必須要素を欠くことから、遺伝子治療プロトコールにおける使用のためのウイルスベクターの産生および複製には、完全なウイルス粒子を産生するための機構を供給する特定の産生細胞が必要である。パッケージング細胞において生じうる問題とは、遺伝子治療用ベクターとパッケージング細胞の内因性配列との間の組換え事象、および/またはパッケージング細胞の内因性配列による遺伝子治療用ベクターの同時パッケージングが、機能性ウイルスゲノムを含有するウイルス粒子の産生を導きうるということであるが、これが遺伝子治療により治療される患者内の標的細胞に入って内部で複製した場合、患者に有害な結果がもたらされる（たとえば図1を参照すること）。
【００１５】
したがって、本発明の基礎をなす概念とは、本発明のベクター系から産生される転写物は互いに対して高い親和性を示すという知見に基づくものであり、この発見は、内在性ウイルスゲノムの転写物を含有する二量体と比べて、パッケージング細胞内に導入される遺伝子治療用ベクターの転写物に由来する二量体が形成される可能性の方がずっと高いことを意味するものである。
【００１６】
基本的には、二量体形成を促進するために遺伝子治療用ベクター内に導入される配列を、RNAに転写されるベクターの任意の部分に挿入することが可能である。
【００１７】
しかしながら、レトロウイルスゲノムの5'UTR領域の周辺領域に、好ましくは5'UTR領域と患者に導入される関心対象の遺伝子との間に、上記配列を挿入することが好ましい。たとえば、RNAIIおよびRNAIが、二量体形成促進配列である、図4、および実施例4および実施例6を参照すること。
【００１８】
好ましい態様において、ベクター系は単一ベクターであり、たとえば、異種性起源、好ましくは非ウイルス性起源の一連のヌクレオチドを含有し、かつ自己相補的なパリンドローム配列または非パリンドローム配列から選択される配列要素を含有する、遺伝子治療に用いられる従来型のレトロウイルスベクターである。このような種類の配列によって、上記単一ベクター由来の二つの転写物の間でのハイブリダイゼーションが可能となり、次いで、このハイブリダイゼーションが転写物の二量体形成を促進する。このようなアプローチを、たとえば図7に示す。本発明の一つのベクターは図7に示されるレトロウイルスベクターであり、これは、関心対象の治療用遺伝子および、合成配列の自己親和性の高さによってホモ二量体形成を促進する合成RNAモチーフとを含有する。その結果、これは、内因性転写物間よりも本発明のベクターに由来する転写物間の二量体化の助力となる。前者は、組換えによって完全なかつ機能性のレトロウイルスゲノムが作製されるというリスクのため、望ましくない。合成RNAによりホモ二量体形成が促進されると、ホモ二量体性ベクターRNAの封入の程度が増大される。上記RNAは標的細胞内では複製できないが、関心対象の治療用遺伝子を標的細胞ゲノム内へと導入することはできる。
【００１９】
さらに好ましい態様によれば、一つの遺伝子治療用ベクターのみに由来する転写物の間でホモ二量体が形成される。
【００２０】
さらに好ましい態様において、本発明のベクター系は、第一ベクターおよび第二ベクターを含有する。このような2ベクター系を図2bに示すが、ここで、本発明のベクター系は、レスキューベクターおよび、関心対象の治療用遺伝子を含有するレトロウイルスベクターを含有する。この系において、第一ベクター（たとえばレトロウイルスベクター）は第一配列要素を含有し、第二ベクター（たとえばレスキューベクター）は第二配列要素を含有する。第一配列要素および第二配列要素は互いに高い親和性を示し、レトロウイルスベクターおよびレスキューベクターに由来する転写物の間でのヘテロ二量体形成を促進する。さらにこの系においても、第一ベクターおよび第二ベクターの間での二量体形成が、他の考えられる競合ヘテロ二量体（たとえば本発明のレトロウイルスベクターの転写物と、内因性パッケージング細胞由来の転写物との間に形成される二量体など）形成に対比してと比べて促進される。後者は、ウイルス粒子内へのパッケージングにとっては望ましいものではない。上記2ベクターの態様において、第一ベクター（たとえば関心対象の治療用遺伝子を有するレトロウイルスベクター）の転写物と第二ベクター（たとえばレスキューベクター）の転写物との間にヘテロ二量体が形成されることが好ましい。このレスキューベクターは主に、関心対象の治療用遺伝子を保持する転写物と一緒にパッケージングされるべき、さらなる転写物の供給源として機能する。
【００２１】
本発明の2ベクター系において、互いに高い親和性を示す配列の任意の対によって、二量体化を促進させることが可能である。自然界に存在する相補的配列（たとえばColE1 RNAI配列およびColE1 RNAII配列）から、レトロウイルスのいわゆる「キッシングループ」配列から、または第一ベクター内に導入される第一の配列が、第二ベクター内に挿入される第二の配列と強力にハイブリダイズするように設計された合成配列から、このような配列を選択することが可能である。実施例中に説明されかつ図8に示されるように、所与の合成配列または配列対が二量体形成を促進できるかどうかについて試験を行うことが可能であり、これは、以下でより詳細に説明されている。
【００２２】
特に好ましい本発明のベクター系において、ベクターは、すでに当技術分野において十分確立されているレトロウイルスベクター（たとえば米国特許第6037172号を参照すること）を基礎としている。
【００２３】
さらに好ましい態様において、本発明のベクター系は、少なくとも一つの関心対象の治療用遺伝子をレシピエント内に導入するのに有用である。関心対象の遺伝子は、たとえば、レシピエント内で置換されるべきまたは補充されるべき遺伝子であってもよい。あるいは、治療用遺伝子は、宿主内での遺伝子の活性を阻害するおよび/または弱めるのに適した配列である。さらに、治療用遺伝子は、免疫反応などの生物学的反応に影響しうる産物をコードすることも可能である。したがって、この遺伝子は、たとえばレシピエントのある免疫反応に対して望ましい抗原をコードする。
【００２４】
本発明の転写物は、レトロウイルスベクターの従来の転写物のいずれであってもよい。しかしながら、本転写物は、産生細胞中での複製の間に転写物の二量体形成を促進する、追加の配列を含有する。転写物の好ましい形態とは、パッケージング細胞中で産生されるようなそのホモ二量体型である。さらに好ましい態様において、本発明の第一ベクターおよび第二ベクターから二つの異なる転写物が産生され、それぞれの転写物は、上記二種の転写物のヘテロ二量体形成を促進する配列要素を含有する。
【００２５】
本発明のさらなる態様は、本発明の遺伝子治療用ベクターに由来する転写物のパッケージングのためのパッケージング細胞に関する。本発明のベクター系を受け入れるのに有用なパッケージング細胞を、Ψ2（Mannら、1983、Cell 33：153-159）、BOSC23（Pearら、1993、PNAS 90：8392-8396）、PA317（MillerおよびButtimore、1986、Mol.Cell.Biol.6：2895-2902）、GP+envAm12（Markowitzら、1988、Virology 167：400-406）、PG13（Millerら、1991、J.Virol.65：2220-2224）、および関連するパッケージング細胞系から選択することが可能である。
【００２６】
本発明はさらに、本発明のベクター系から産生される転写物を含有する新規ウイルス粒子に関する。好ましいウイルス粒子は、単一ベクターに由来する転写物のホモ二量体を含有する。次いで、このようなウイルス粒子を標的細胞に感染させて、そして本発明のレトロウイルスベクターのゲノムを標的細胞内に組み込むことが可能である。本発明のウイルス粒子が感染した標的細胞によって、そのゲノム内にウイルス粒子に由来する関心対象の治療用遺伝子が組み込まれるが、複製および/またはパッケージングに不可欠な要素を欠いているため、ウイルスゲノムは複製されない。
【００２７】
本発明はさらに、本発明のベクター系またはウイルス粒子を含有する薬学的製剤またはワクチンに関する。このような組成物は、ベクターまたはウイルス粒子の安定化および/または投与に必要な、従来の添加物を含んでもよい。
【００２８】
本発明はまた、その中に本発明のベクター系に由来する配列が組み込まれたゲノムを有する細胞に関する。
【００２９】
本発明はさらに、本発明のベクター系を調製する方法に関する。上記方法によれば、上記ベクターに由来する転写物の二量体形成を促進する配列の少なくとも一つを挿入することによって、従来のレトロウイルスベクターが修飾される。この配列を、たとえば合成することができ、または天然の有用配列から単離することもできる。このような配列を所与のベクター系内に導入することは、当業者の能力の範囲内である。
【００３０】
本発明の方法において用いられる好ましい配列は、以下を含む、自己相補的配列から選択される：
（i）レトロウイルスのキッシングループのパリンドローム配列および合成非パリンドローム配列、（ii）プラスミド起源の配列である、ColE1（RNAIおよびRNAII）；IncF（copA RNAおよびrepA mRNA）；IncI（Inc RNAおよびrepZ mRNA）；ColE2（cop RNAおよびrep mRNA）；R1162（ct RNAおよびrep1 mRNA）；R6K（サイレンサーおよびアクチベーター）；pT181（RNAIおよびrepC mRNA）；IncF（finP RNAおよびtraJ mRNA）；IncFII（sok RNAおよびhok mRNA）、（iii）細菌中のプラスミド複製に関する、CopA/CopT由来配列、（iv）ファージ起源の配列である、λ（aQ RNAおよびQ mRNA）；λ（oop RNAおよびcII mRNA）；P22（sar RNAおよびant mRNA）；P1、P7（c4リプレッサーおよびant mRNA）、（v）トランスポゾン起源の配列である、IS10（RNA-OUTおよびtnp mRNA）、ならびに（vi）細菌起源の配列である、大腸菌（micF RNAおよびompF mRNA）；大腸菌（tic RNAおよびcrp mRNA）および翻訳調節に関する細菌のfinOPアンチセンスRNA認識系。さらに、好ましい配列には、（vii）アンチセンス認識を効果的に促進することが知られている相補的な非ウイルス性配列または合成配列が含まれる。
【００３１】
基本的に、ウイルス産生のためにベクターが挿入されている産生細胞の機構によって上記位置が転写される限り、レトロウイルス内の任意の位置に配列を挿入することができる。
【００３２】
5'UTRと、遺伝子治療用ベクター中に含まれる関心対象の遺伝子の5'部位との間に配列を挿入することが好ましい。
【００３３】
上記方法によって特に、産生細胞によって、望ましくないゲノムがウイルス粒子内にパッケージングされるというリスクが減少するという点で、遺伝子治療プロトコールにおいて得られるベクターの安全性がより高くなる。
【００３４】
本発明はさらに、遺伝子治療用レトロウイルスベクターに由来する転写物のホモ二量体および/またはヘテロ二量体の形成を促進する配列の能力を測定する方法に関し、本方法は、このような配列を含有するベクター系を産生細胞内に導入する段階、ならびに上記ベクター系に由来する転写物のホモ二量体および/またはヘテロ二量体の形成比率を測定する段階を含む。このような方法の一つのインビボにおける機構を、二重ベクター系についての図8aおよび図8bに示す。より詳細には、示された例において、配列要素RNAIIおよび機能性プライマー結合部位（PBS）を含有するがR領域を欠く第一ベクター、ならびに、配列要素RNAIを含有するが非機能性プライマー結合部位（PBSX3）を有しかつR領域を含有する第二ベクターを、細胞内に導入する。RNAIIおよびRNAIは、第一ベクターの転写物と第二ベクターの転写物との間の二量体形成を促進する配列対の一例である。この系において、示されたようなヘテロ二量体が形成される場合にのみ、完全かつ機能性の転写物が産生される。R領域を欠くことから、第一ベクターは機能性の転写物を産生することができない。しかしながら、第一ベクターの5'末端のU5配列およびR配列が付着しているtRNA用の鋳型として、本領域は必要である。本部分的逆転写物が完全であるならば、第二ベクターの3'末端へのストランドスイッチによってのみ、これが達成され得る。というのは、第二ベクターだけが、鋳型として用いることができるR領域を含有するからである。しかしながら、図2aに説明されるようなヘテロ二量体が形成される場合にのみ、このようなストランドスイッチが起こり得る。非機能性PBS部位のせいで第二ベクターもまた複製できないことにも留意されたい。このヘテロ二量体形成およびその逆転写の結果、G418耐性を真核細胞に与えるネオマイシン耐性遺伝子（Neo）を含有する転写物（図2a）、または図8aおよび図8bにおける黄色蛍光タンパク質（YFP）を含有する転写物が、マーカー遺伝子として形成される。このような遺伝子は、各レトロ転写物を内部に組み込んだこれらの細胞を標識する。したがって、多数のG418耐性細胞または黄色に染色された細胞によって、効果的なヘテロ二量体形成が示され、したがってこれは、このような二量体形成を促進する有用な配列の指標である。このような配列（第一ベクターにおけるRNAIIおよび第二ベクターにおけるRNAI）が無い場合、ヘテロ二量体形成が不十分であるまたはほとんど起こらないことから、黄色に染色された細胞の比率は極めて小さいことが予想され、かつしたがって、YFP遺伝子を含有するレトロ転写産物の比率は極めて小さい。
【００３５】
単一ベクター系についても同様のアプローチを用いることが可能であり、ここでは、配列のホモ二量体形成能を測定する。このような系においては、産生細胞中でホモ二量体が効率的に形成される場合にのみ、DNAがパッケージングされる。このような系においても同じく、合成配列は、ホモ二量体パッケージングの頻度上昇をもたらすホモ二量体形成を有意に促進し、それによって、次に、たとえばYFPなどのマーカー遺伝子を含有するそれぞれの転写物をゲノム内に保持する細胞の比率が高められる。黄色に染色された細胞を得ることによって、被験配列が、パッケージングのためのホモ二量体形成を促進するのに有用であることが再度示される。
【００３６】
本発明はさらに、遺伝子治療に有用な組成物を調製するための、本発明のベクター系の使用に関する。薬学的製剤としてまたはワクチンとして、本発明のベクター系を、治療対象の生物に投与することが可能である。遺伝子治療を目的とする、異種性DNAまたは合成DNAを宿主生物内に導入するための多数の異なるプロトコールを、当業者は十分承知している。あるいは、産生細胞によって産生されるウイルス粒子を、治療対象の生物に投与することが可能である。
【００３７】
本発明は、外因性配列に由来する転写物のホモ二量体またはヘテロ二量体の形成を促進するような、外因性配列を含有することを特徴とする、遺伝子治療に有用なレトロウイルスに基づくベクター系に関する。特に、本発明は、野生型状態では存在しない、修飾された異種性二量体化配列または合成二量体化配列を少なくとも一つ有するレトロウイルスベクターを少なくとも一つ含むレトロウイルスベクター系を有するが、ここで配列修飾の転写物を含有する上記ベクターの転写物と、ベクターを含有する細胞中に存在する少なくとも一つの異なるレトロウイルスの転写物のうち少なくとも一つとの間の組換え頻度が、上記修飾によって減少し、上記減少が、野生型レトロウイルスベクター由来の対応する転写物の組換え頻度の減少の少なくとも2倍である、レトロウイルスベクター系に関する。本明細書の文脈において、ベクター系の転写物と、細胞中に存在する異なるレトロウイルスの転写物の少なくとも一つとの間の組換え頻度が減少することを、Akv-MLVに由来する、キッシングループ領域内に修飾を受けているベクターと、擬似内在性ウイルスとについての実施例2に記載されているようにして測定する。
【００３８】
好ましい態様において、ベクター系は、一連のヌクレオチド配列を含有する単一ベクターである。ここで、そのヌクレオチド配列は、RNA-RNA認識を促進することが知られている、非ウイルス性の内容物中の自己相補的な配列から選択される配列要素を含有する。特に、本発明は、系におけるベクターの形質導入力価が、その起源である野生型ベクターの力価の少なくとも25％である系に関する。
【００３９】
さらに好ましい態様において、ベクター系は、産生細胞内でホモ二量体を形成する転写物を産生する。
【００４０】
さらに好ましい態様において、ベクター系は第一ベクターおよび第二ベクターを含み、ここで第一ベクターには、第二ベクターに存在する逆転写用の開始部位が欠けている。
【００４１】
さらに好ましい態様において、第一ベクターは第二ベクターの配列と相補的な配列を含有する。
【００４２】
さらに好ましい態様において、2ベクター系は、産生細胞中にヘテロ二量体を形成する転写物を産生するが、この二量体は、第一ベクターの転写物および第二ベクターの転写物から成る。二つのベクターのヘテロ二量体の直接形成を達成するための本発明の一つの態様は、第一および第二のレトロウイルスベクターを含む系であって、ここで第一ベクターには、第二ベクターに存在する逆転写用の開始部位が欠けている。
【００４３】
さらに好ましい態様において、二量体形成を促進すると考えられる相補的配列は、以下から選択される：
（i）レトロウイルスのキッシングループのパリンドローム配列および合成非パリンドローム配列、（ii）プラスミド起源の配列である、ColE1（RNAIおよびRNAII）；IncF（copA RNAおよびrepA mRNA）；IncI（inc RNAおよびrepZ mRNA）；ColE2（cop RNAおよびrep mRNA）；R1162（ct RNAおよびrep1 mRNA）；R6K（サイレンサーおよびアクチベーター）；pT181（RNAIおよびrepC mRNA）；IncF（finP RNAおよびtraJ mRNA）；IncFII（sok RNAおよびhok mRNA）、（iii）細菌中のプラスミド複製に関する、CopA/CopT由来配列、（iv）ファージ起源の配列である、λ（aQ RNAおよびQ mRNA）；λ（oop RNAおよびcII mRNA）；P22（sar RNAおよびant mRNA）；P1、P7（c4リプレッサーおよびant mRNA）、（v）トランスポゾン起源の配列である、IS10（RNA-OUTおよびtnp mRNA）、ならびに（vi）細菌起源の配列である、大腸菌（micF RNAおよびompF mRNA）；大腸菌（tic RNAおよびcrp mRNA）および、翻訳調節に関する細菌finOPアンチセンスRNA認識系。さらに、好ましい配列には、（vii）アンチセンス認識を効果的に促進することが知られている相補的な非ウイルス性配列または相補的な合成配列が含まれる。
【００４４】
第一ベクターおよび第二ベクターを含有する態様において、得られる形質導入力価は、細胞中での二つのベクターの存在比に極めて大きく依存する。特に本発明は、二つのベクターが細胞中に1：9〜9：1の範囲の割合で存在する場合、それらのベクターの形質導入力価が、それらのベクターの起源である野生型ベクターの形質導入力価の少なくとも1％である、という態様に関する。
【００４５】
さらに好ましい態様において、ベクター系は関心対象の治療用遺伝子を少なくとも一つ含有する。この治療用遺伝子は、治療対象のレシピエントの疾患を治療および/または予防するために、またはレシピエントを免疫化するために用いられる。
【００４６】
本発明はさらに、本発明のベクター系に由来する転写物に関する。
【００４７】
好ましい態様において、転写物は、パッケージング細胞内でホモ二量体を形成することができる。
【００４８】
さらに好ましい態様において、転写物は、パッケージング細胞内でヘテロ二量体を形成することができる。
【００４９】
本発明はさらに、本発明のベクター系に由来する転写物を含有することに特徴を有する、新規ウイルス粒子に関する。
【００５０】
本発明はさらに、遺伝子治療用ベクターをパッケージングするためのパッケージング細胞に関し、このパッケージング細胞は、本発明のベクター系を含有することにより特徴づけられる。さらなる態様において、本発明は、系のレトロウイルス転移ベクターの少なくとも一つの複製のためのパッケージング細胞が、少なくとも一つの上記レトロウイルス転移ベクターの複製にトランスで必要なウイルスタンパク質を産生するための情報を保持する一つまたは複数のDNA配列の挿入によって形質転換された哺乳動物細胞または鳥類細胞であることに関する。
【００５１】
本発明はさらに、それに由来する転写物のホモ二量体形成を促進する配列の少なくとも一つを、遺伝子治療に有用なベクターの少なくとも一つの中に組み込む段階を含む、遺伝子治療に有用なベクター系を調製する方法に関する。さらなる本発明の態様においては、少なくとも一つの配列修飾を二量体化配列に導入する段階を含むレトロウイルスベクター系を調製する方法に関し、配列修飾の転写物を含有する上記ベクターの転写物と、ベクターを含有する細胞中に存在する少なくとも一つの異なるレトロウイルスの転写物のうち少なくとも一つとの間の組換え頻度が、上記修飾によって減少し、かつ上記減少が、野生型レトロウイルスベクター由来の対応する転写物の組換え頻度の少なくとも2倍である。
【００５２】
好ましい態様において、二量体化配列は非ウイルス性起源の自己相補的配列（ColE1 RNAIおよびColE1 RNAII、CopA/CopT、finOP、非パリンドローム性キッシングループ配列、合成アンチセンス系など）から選択されるが、本発明によれば、その他の二量体化配列も意図される。さらに本発明の局面は、二つの同一または異なる配列を含有する配列対が、レトロウイルスベクター系に由来する転写物のホモ二量体および/またはヘテロ二量体の形成を促進する能力を測定する方法であって、該ベクター系のレトロウイルスベクターのうち少なくとも一つを宿主細胞内に導入する段階ならびに生じた特定の組換え事象の相対数を定量することによって該ベクター系に由来する転写物のホモ二量体形成および/またはヘテロ二量体形成の頻度を評価する段階を含む方法を提供する（ここで、該特定の組換え事象の数は、以下の段階を含む方法によって得られる：
a）該配列対を選択する段階；
b）選択マーカー遺伝子および非機能性プライマー結合部位（PBS）を含有する一つのレトロウイルスベクター内に、該配列対のメンバーの一方を挿入し、かつ、機能性プライマー結合部位（PBS）を含有するが上記ベクターと同一の選択マーカー遺伝子を含有しない別のレトロウイルスベクター内に、該配列対のメンバーのもう一方を挿入する段階；
c）段階（b）の該二つのレトロウイルスベクターの両方からの情報を含む感染性レトロウイルス粒子の形成を可能にするために必要な手段を提供する適切なパッケージング細胞内に、段階（b）の二つのレトロウイルスベクターを同時導入する段階；
d）培地を含むウイルスを回収し、かつ、段階（b）の非機能性プライマー結合部位を含有する該一方のレトロウイルスベクターの選択マーカー遺伝子を含有しない、適切な宿主細胞の培養液に感染させる段階；
e）段階（d）のトランスフェクト宿主細胞を、段階（d）の該選択マーカー遺伝子を含有するウイルス粒子による感染を受けた細胞だけにコロニーを形成させるという選択手段に供する段階；および
f）得られた耐性コロニーの数から特定の組換え事象の数を定量する段階）。
【００５３】
さらに好ましい態様において、本方法は遺伝子治療に有用なベクター系を調製するために適用され、かつ最適機能性を提供することが示唆される領域に、好ましくは5'UTRと関心対象の治療用遺伝子のリーダー配列との間の領域に、二量体形成を促進する配列が組み込まれる。
【００５４】
本発明はさらに、遺伝子治療に有用な少なくとも一つのベクター内への配列の少なくとも一つを遺伝子治療に有用なベクター系内に導入する段階を含む、遺伝子治療用ベクター系の安全性を向上させる方法に関する。ここで、本発明の配列によって、配列修飾の転写物を含む上記ベクターの転写物と、少なくとも一つの異なるレトロウイルスの転写物の少なくとも一つとの間の組換え頻度が減少する。
【００５５】
本発明はさらに、配列が、遺伝子治療用ベクターに由来する転写物のホモ二量体および/またはヘテロ二量体の形成を促進する能力を測定する方法に関する。ここで、本方法は、このような配列を含有するベクター系を宿主細胞内に導入する段階、および上記ベクター系に由来する転写物のホモ二量体化および/またはヘテロ二量体化の比率を測定する段階を含む。
【００５６】
本発明はさらに、遺伝子治療に有用な組成物を調製するための、本発明のベクター系または本発明のウイルス粒子の使用に関する。
【００５７】
本発明はさらに、本発明のベクター系および/または本発明のウイルス粒子を含有する薬学的製剤またはワクチンに関する。
【００５８】
本発明はさらに、本発明のベクター系またはベクター粒子に感染した標的細胞に関する。
【００５９】
実施例
以下の実施例により、本発明がさらに説明される。
【００６０】
実施例1：遺伝子治療において用いられるパッケージング細胞からの複製可能ウイルスの作製
遺伝子治療において用いられるウイルス粒子を作製するための従来のプロトコールにおいて、レトロウイルスのゲノムの複製及びパッケージングのための機構を提供する産生細胞が用いられる（図1参照）。示される実施例において、パッケージング細胞は、gag遺伝子及びpol遺伝子を含む内在性レトロウイルスのRNAを含む。
【００６１】
パッケージング構築物として、env遺伝子を含む構築物が用いられる。標的細胞への導入のために設計されたベクターは、この場合、SV40プロモーター及びneo遺伝子を含む。このような構築物は本来、複製やパッケージングができないものである。しかし、もし、パッケージング構築物のRNAと内在性レトロウイルスのRNAの間で組換えが生じた場合には、受容細胞において複製及び成長が制御されないため受容細胞にとって有害となりうる、十分に機能性組換えウイルスが作製される。
【００６２】
実施例2：Akvに基づくベクターにおける代替的パリンドロームの存在は組換えを減少させる
代替的パリンドロームの挿入によりキッシングループ領域において修飾されたAkv-MLV誘導ベクターは、疑似内在性ウイルスとの組換えを減らし得ることが、本実験により示される。
【００６３】
序論：
インビボの状態において、ベクターRNAは、内在性ウイルスの転写物と同時パッケージングされうり、また、逆転写の過程における組換えを通して、内在性ウイルスは、機能性配列を与えうる。結局、これにより、複製可能ウイルス（実施例1参照）の作製がもたらされる。マウス細胞（Psi2細胞系）において、PBS変異型Akv誘導ベクターは、おそらく内在性ウイルスの低い発現のため、内在性マウス白血病ウイルス（MLEV）（Mikkelsenら、J.Virol.70:1439-47、1996）との組換え事象をほとんどおこさないことが示された。定量的な研究を行うため、およびさらにベクターと内在性ウイルスの両方の配列を修飾するために、ヒトの細胞系システムが確立された。内在性ウイルスのリーダーは、ベクター構築物にクローニングされ、ヒトのパッケージング細胞系はMLEV誘導ベクター及びAkv誘導ベクターで同時にトランスフェクションされた。したがって、内在性ウイルス配列を有するベクター構築物の発現は、そのような内在性ウイルスの発現に似ている。そのうえ、部位特異的変異は、AkvベクターとMLEV誘導ベクターの両方に導入されることができた。ヒト細胞系バックグラウンドにおいて、どの内在性ウイルスもAkv誘導ベクターと組換えしないことが見出されたので、天然内在性ウイルスの組換えは除かれた。以下に記載されかつ、図2aに示されるように、逆転写の過程を通して鋳型スイッチングが起こる可能性を研究するための2ベクター強制組み換え系として、本実験はヒトのパッケージング細胞系（BOSC23；Pearら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.、90:8392-6、1993）において行われた。
【００６４】
あるベクターは、野生型PBS（例えば、PMLEVleader Akv-pac）を含むベクターと同時トランスフェクションされる非機能性変異型PBS（PBSmut）（例えばpPBSMut476 Psi Akv-neo）を有していた。ヘテロ二量体を、2つのベクターに起因する2つのRNA転写物の間に形成してもよく、ウイルス粒子の中に同時パッケージングしてもよい。逆転写の間、第一鎖の合成は、完全なPBSを有する鎖から開始される。ベクター構築物は相同的R領域を含むので、第一鎖の転移により各鎖の転移が起こる。鎖環での転移（他方の鎖への鎖の転移）の場合には、第一鎖の合成は、選択遺伝子を介して進行するであろう。しかし、第二鎖の転移のための個々のPBS領域間の相補に必要であるため、鋳型の移入（組換え）は、第一鎖の合成の際にいくつかの部位で生じなければならない。標的細胞はPBS変異構築物と共に含まれる遺伝子によって与えられる耐性について選択されるので、組換えは、コード領域外側のリーダー領域へと進む（図2b参照）。したがって、完全なPBSを有するベクターはPBS変異型ベクターを補完しうるので、レスキューベクターと呼ばれている。
【００６５】
PBS以外の領域からの第一鎖合成開始を通じて起こりうる、「バックグラウンド」レベルのレスキューのために、レスキューベクターが不足している場合でさえも標的細胞の形質導入が生うる。しかし、レスキューベクターを含有することにより、形質導入効率が著しく向上する。レスキュー力価の増加規模は、2つのベクターがどれだけ効率的に組換えを行うかに依存するが、これはおそらく、ベクターRNAがヘテロ二量体化する能力に著しく影響される。いくつかの実験において、二量体化がパッケージングのための前提条件であり、したがってヘテロ二量体化は、組換えの前提条件であることが示される（HuおよびTemin、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87：1556-1560、1990）。
【００６６】
ベクター構築物の説明：
キッシングループの二量体化配列の修飾物を含有する転移ベクターのパネルは、476bpのパッケージング領域Psi（U5/PBSとleader/gagの連結部に介在する領域）を含む野生型Akv-MLV5'リーダー領域を有するAkv MLVに基づくレトロウイルスベクターに由来した。このベクターはプラスミドの形態ではpPBSPro476Psi Akv-neoと呼ばれ、Akv-MLVの長い末端反復、プロリンtRNAに対応するプライマー結合部位（PBS）、及び、5'リーダー領域よりも上流、かつ3'非翻訳領域を含む480bp Akv-MLV配列より下流に隣接するネオマイシン耐性遺伝子（neo）を含む（図2c参照）。
【００６７】
簡潔にいえば、neoを有するPBSノックアウトベクターおよびピューロマイシン耐性遺伝子（pac）を有するレスキューベクターは、次のようにして作製される。pac遺伝子は、BamHIおよびBsmIの制限酵素部位を各々含む以下のプライマーによりpPUR（Clontech Laboratories, Inc.）からPCR増幅された：
FW Pac ampli
2004533827.tif 000002
Rev Pac ampli
2004533827.tif 000003
。増幅された634bpの断片は、標準的なクローニングの手法により、BamHI-BsmIで切断された（neoに隣接する制限酵素部位）pPBSPro476Psi Akv-neoおよびpPBSMut476Psi Akv-neoに挿入されたが、後者は、以前に記述されたとおり（PBS-Umu、Mikkelsenら、J.Virol.72:6967-78、1998 generating pPBSPro476PsiAkv-pac and pPBSMut47PsiAkv-pac）、欠失したプライマー結合部位を含む。
【００６８】
MLEV、即ち、以前に記述されたMLV様内在性ウイルス（GenBankアクセッション番号AF041383；Mieleら、J.Virol.、70:944-51、1996）の465bpのパッケージング領域は、元のMLEVリーダー配列（Mikkelsenら、J.Virol.、74:600-10、2000）の一部分である、機能性グルタミンPBSを有するpPBSGln465MLEVPsiAkv-neoから、以下のプライマーを用いてPCR増幅された：
Fw MLEV ampli
2004533827.tif 000004
及びRev MLEV ampli
2004533827.tif 000005
。MLEV-Psi断片は、重複伸長（overlap extension）および、Akv LTRを含む断片を用いたPCRにより結合された。Akv LTR PCR断片は、プライマー：
Akv U5 fw
2004533827.tif 000006
及びAkv rev
2004533827.tif 000007
を用いたPCR、及び、プライマー：
Overlap fw
2004533827.tif 000008
及びOverlap rev
2004533827.tif 000009
を用いた重複反応から誘導された。重複伸長反応により、pMLEVleaderAkv-pacを作製するpPBSPro476 Psi Akv-pacの適切な位置にクローニングされた、Akv-MLEVのキメラ断片（U5領域にあるAkv-MLEV連結部）が生じた（図2c参照）。
【００６９】
代替的パリンドロームであるループモチーフ（代替的パリンドロームであるキッシングループに対応するKL-altpal）は、Akvに対応する以下のセンスオリゴヌクレオチド、または、対応する、MLEVの291-330位（Van Beverenら、In "RNA tumor viruses" [N. Weiss、H. Teich、H. Varmus、およびJ.M. Coffin編]、第2巻、Cold Spring Harbor Press、Cold Spring Harbor、N.Y、1985）を用いたPCR媒介性変異導入によって、pPBSPro476PsiAkv-neo、pPBSMut476PsiAkv-neo、及びpMLEVleaderAkv-pacのキッシングループ配列に導入された（pPBSPro476PsiAkv-neo KL-altpal、pPBSMut476PsiAkv-neo KL-altpal、pMLEVleaderAkv-pac KL-altpalが産生される）：
代替的パリンドローム5'-ATCGAT-3'を導入するON1
2004533827.tif 000010
（改変されたループ配列は下線）
。Akv-Psi
2004533827.tif 000011
又はMLEV-Psi
2004533827.tif 000012
のいずれかの最も3'側の部分（617位〜638位）に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドと共に、363bpのPCR断片が作製され、隣接するSpeIとBamHIの制限酵素部位の中で切断され、各々のベクターの適切な部位にクローニングされた。pPBSMutMLEVleaderAkv-pacを作製するために、PBSMutおよび465bpのMLEV-Psiを含むBstBI-BamHI切断PCR断片は、PBSMut配列中のBstBI及び、Psiからすぐ下流のBamHIを含む、pPBSMut476PsiAkv-pacにクローニングされた。
【００７０】
インビボ解析：
一般的な細胞培養、トランスフェクション及び形質導入の手法は、Lovmandら、Growth and purification of Murine Leukemia Virus. In "Cell Biology：A Laboratory Handbook" Academic Press, Inc.、1994）に記載されている。概説すると、リン酸カルシウム沈殿法を用いて、10μgのベクタープラスミドの混合物、及び1μgのpEGFPを、トランスフェクションの1日前に7.1×104 細胞/cm2で播種されたBOSC23パッケージング細胞（Pearら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90：8392-6、1993）にトランスフェクションされた。トランスフェクション効率はフローサイトメトリーによりモニタリングされた。ウイルスを含む培養液は連続的に希釈され、6μg/mLのポリブレン（Sigma Chemical Co.、St. Louise、U.S.A.）の存在下、NIH3T3標的細胞に転移された。形質導入された標的細胞を選択するために、トランスフェクションの48時間後にG418又はピューロマイシンを含む培地がNIH3T3細胞に加えられた。耐性コロニーは、トランスフェクションの約16日後に計数され、上清1mlあたりのコロニー形成単位（CFU/ml）として力価が得られた。
【００７１】
結果：
（表１）キッシングループにおける代替的パリンドロームを有するベクターの形質導入効率
2004533827.tif 000013
【００７２】
開始ベクターであるpPBSpro476PsiAkv-neo及びpMLEVleaderAkv-pacの野生型パリンドロームであるキッシングループは、代替的パリンドローム（KL-altpal）で置換され、修飾されたベクターの形質導入効率が試験された。代替的パリンドロームを含有するベクターの形質導入効率はわずか約半分まで減少した（表1）。
【００７３】
（表２）レスキューベクターの同時トランスフェクションにおけるPBS変異型構築物の力価の増加
2004533827.tif 000014
【００７４】
上記に述べた方法において、レスキュー力価の組換えは、2つのベクターが結合及びヘテロ二量体化する能力を反映している。しかし、実験のばらつきのため、比較ができるように、実験を並行して行うことが必要である。したがって、図2に列挙された実験は並行して行われた。
【００７５】
図2に示されるように、pPBSMut476PsiAkv-neoは、pMLEVleaderAkv-pacベクターの同時トランスフェクションによってレスキューされうる。レスキュー力価は、バックグラウンドレベルに比べて、即ち、構築物Aとして列挙された構築物の個々の力価測定値に比べて、44倍増加する。レスキューベクターとPBS変異型ベクターのパリンドロームの間の相補性が最大であるならば、レスキュー力価は高い（バックグラウンドレベルに比べ42倍〜91倍に増加、図2）。しかし、Akv由来PBS変異型ベクターの野生型パリンドロームが、代替的パリンドローム（pPBSMut476Psi Akv-neo KL-altpal）に置換される場合、内在性ウイルス（pMLEVleaderAkv-pa）の相補性は破壊（一致：0/6）され、レスキュー力価はわずか17倍しか増加しない。Akv誘導ベクターの代替的パリンドロームに対応させるために、レスキューベクターにおけるパリンドローム配列を再構築すると、バックグラウンドレベルの42倍までレスキュー力価が回復する。
【００７６】
結論：
本方法において、MLEVリーダー領域をベクター構築物に挿入することにより、内在性マウス白血病ウイルス（MLEV）の発現が模倣される。組換えを通して、ベクター構築物はAkv由来PBS変異型ベクターを高い効率でレスキューすることができる。しかし、Akvキッシングループ配列を代替的パリンドロームで置換することは、レスキュー効率の減少をもたらす。したがって、パリンドローム配列を有するベクターは、高い効率で標的細胞に形質導入できるように設計され、かつ、設計されたベクターは、対応するパリンドロームを有するベクターを用いるような内在性レトロウイルスを模倣するベクターほど頻繁には組換えを行わない。
【００７７】
実施例3：キッシングループ領域（DIS2）への非パリンドローム配列の導入
序論：
非パリンドローム配列を用いて、レトロウイルスベクターのヘテロ二量体化を行うことができるかどうか試験するために、以下の実験を行った。
【００７８】
ベクター構築物の説明：
pPBSMutKL-nonpalAkv-neo及びpMLEVleaderKL-nonpalAkv-pac：
非パリンドロームであるループモチーフ（KL-nonpal）は、Akvに対応する以下のセンスオリゴヌクレオチドを用いたPCR媒介性変異導入により、pPBSMut476Psi Akv-neo及びpMLEVleaderAkv-pac（実施例2参照）のキッシングループ配列に挿入された：
非パリンドローム配列5'-TAGGAT-3'を、Akv-Psi
2004533827.tif 000015
、又は、MLEV-Psi
2004533827.tif 000016
のいずれかの最も3'側の部分（617位〜638位）に対応するアンチセンスオリゴヌクレオチドと一緒に導入する、ON4
2004533827.tif 000017
（代替的ループ配列に下線を付した）。363bpのPCR断片が作製され、隣接するSpeI及びBamHIの制限酵素部位内で切断されて、各々の適当な部位にクローニングされ、pPBSMutKL-nonpalAkv-neo及びpMLEVleaderKL-nonpalAkv-pacが得られた。
【００７９】
pMLEVleader KL-matchnonpalAkv-pac：
pMLEVleader KL-matchnonpalAkv-pacは、pPBSMutKL-nonpalAkv-neoのKL-nonpal配列に相補的な非パリンドロームループ配列である5'-ATCCTA-3' KL-(matchnonpal）の導入のために、ON7
2004533827.tif 000018
及びON9を用いて構築された。
【００８０】
インビボ解析：
インビボ解析は実施例2に記載されたように行われた。構築物はBOSC23細胞に同時トランスフェクションされ、力価の実験は実施例2に記載されたように行われた。
【００８１】
結果：
（表３）レスキュー力価データの要約
2004533827.tif 000019
【００８２】
本方法の全体的な説明としては、実施例2及び図2cを参照されたい。最初の実験（表3）においては、ベクターの2つのキッシングループの間に相補性は存在しない。これにより、バックグラウンドレベルと比べて、即ち、構築物Aとして列挙された構築物の個々の力価測定値に比べて、レスキュー力価の増加が比較的小さくなる（68倍）。レスキューベクター（構築物B）を同時トランスフェクションしたときに実験2（表3）におけるキッシングループ間の十分な相補性が回復された場合、レスキュー力価は増加する（147倍）。
【００８３】
結論：
PBS変異型ベクターのレスキューに関する測定値は、関連ベクターのキッシングループ領域内の配列間で相補的である。したがって、非パリンドローム配列をキッシングループ領域に導入することはまた、レトロウイルスベクターのヘテロ二量体化の指示のために用いられうる。
【００８４】
実施例4：RNAI及びRNAIIのAkv-MLV誘導ベクターとの互換性
序論：
遺伝子の転移（遺伝子治療）のためにレトロウイルスベクターを扱うことの主な安全上の問題点は、ベクターと内在性ウイルス間での組換えの危険性であり、これにより複製可能ウイルスの望ましくない形成が起こりうる。伝統的なマウス白血病誘導ベクター（例えば、pPBSPRO 240Akv neo）は、標的細胞を高い効率で形質導入するが、内在性ウイルスと組換えを起こす傾向がある。実施例4の基本原理とは、ベクターRNAと内在性ウイルス由来のRNA間でのヘテロ二量体化の障害になると考えられる異種性RNA要素の挿入によって、組換えのリスクを減らすことである。形質導入効率に強い影響を与えることなく、異種性RNA要素をベクターに挿入できることが要求される。以下に記載する実験において、Akvに基づくベクター内の領域は、異種起源のRNA要素の挿入用と規定されている。規定部位では、被験RNA要素の挿入は形質導入効率に影響しない。示された実験で挿入された配列は細菌性ColE1プラスミドに由来するが、結果により、異種起源の配列も挿入され得ることが示された。
【００８５】
ベクター構築物の説明：
pPBSPRO 240 Akv neo：
pPBSPRO 240 Akv neoは、Lundら、J.Virol. 67：7125-7130、1993において詳しく記載されている。このベクターは、Akvマウス白血病ウイルスに基づいており、5'LTR及び3'LTRに加えて、プライマー結合部位（PBS）、リーダー領域の最初の240ヌクレオチド（nt）及びneoマーカー遺伝子を含有している。
【００８６】
pPBSPRO 1230 linker Akv neo：
ColE1要素であるRNAI又はRNAIIをベクターに挿入する前に、pPBSpro linker 1230 Akv Neoベクターが構築された（図3A）。マルチクローニング部位（MCS）が設計され、pPBSPRO linker 1230 Akv Neo構築物のAkv誘導リーダー領域の下流に隣接して挿入される。さらに7ヌクレオチドがリーダー領域の5'末端から欠失され、これにより、リーダー領域が233ヌクレオチドに減少された。これは、以下の2つのPCR断片を作製することによって達成された。
A：pPBSPRO240 Akv neo鋳型上の、上流プライマー
2004533827.tif 000020
及び下流プライマー
2004533827.tif 000021
B：pPBSPRO244ψAkv-Neo鋳型上の上流プライマー
2004533827.tif 000022
及び下流プライマー
2004533827.tif 000023
2つの断片は混合され、断片A由来の上流プライマーおよび断片B由来の下流プライマーを用いて、重複伸長産物が作製された。リーダー領域のSpeI部位とneo遺伝子のBclI部位を用いる標準的な技術を用いて、断片がpPBSPRO240 Akv-Neoにクローニングされ、その結果、pPBSPRO 1230-linker Akv neoが作製された。
【００８７】
pPBSPRO RNAI 108 Akv Neo、pPBSPRO RNAII 112 Akv Neo、及びpPBSPRO RNAII 201 Akv Neo：
ColE1要素であるRNAI又はRNAIIを、pPBSpro linker 1230 Akv Neoベクターに挿入し、pPBSPRO RNAI 108 Akv Neoベクター、pPBSPRO RNAII 112 Akv Neoベクター及びpPBSPRO RNAII 201 Akv Neoベクターを得た。RNA要素（図3）108、112及び201に添えられた番号は、挿入要素の大きさを示す。RNAI 108断片は、ColE1プラスミド（アクセッション番号J01566）由来の完全長RNAI転写物からなる。RNAII-l12及びRNAII-201は、ColE1プラスミド由来のRNAII転写物の最初の112ヌクレオチド及び201ヌクレオチドからそれぞれなる。
【００８８】
pPBSPRO RNAII 112 Akv neo及びpPBSPRO RNAII 201 Akv neoを作製するために、以下の3つのPCR断片を作製した。
断片C：pBR322鋳型（アクセション番号J01749）上の、pBR322鋳型（アクセッション番号J01749）上の上流プライマー
2004533827.tif 000024
及び下流プライマー
2004533827.tif 000025
断片D：pBR322鋳型（アクセッション番号J01749）上の、上流プライマー
2004533827.tif 000026
及び下流プライマー
2004533827.tif 000027
断片E：pBR322鋳型上の、上流プライマー
2004533827.tif 000028
及び下流プライマー
2004533827.tif 000029
3つのPCR断片はゲル精製され、XhoI（プライマーの上流に局在）及びNotI（プライマーの下流に局在）により切断される。これらの部位はまた、pPBSPRO-1230-1inker Akv neoにおける新たに作製されたリンカーのMCS内に存在し、断片は、標準的なクローニング手法によって、このベクターにクローニングされた。したがって、断片Cのクローニングにより、pPBSPRO RNAII 201 Akv neoが作製され、断片Dのクローニングにより、pPBSPRO RNAII 112 Akv neoが作製され、断片Eのクローニングにより、pPBSPRO RNAI 108 Akv neoが作製された。
【００８９】
pPBSPRO RNAI 108 Akv pac、pPBSPRO RNAII 112 Akv pac、pPBSPRO RNAII 201 Akv pac及びpPBSPRO 1230 linker Akv pac：
これらは、ネオマイシン耐性遺伝子（neo）がピューロマイシン耐性遺伝子（pac）に置換されていることを除けば、上述のpPBSPRO Akv neoベクターと類似している。pac遺伝子は、G418耐性を与えるneo遺伝子と同様な様式で、安定に形質転換された哺乳動物細胞を選択するための主要な選択マーカーとして用いられ得る。pac遺伝子は、NotI制限酵素部位を含むプライマー
2004533827.tif 000030
及びBsmI制限酵素部位を含むプライマー
2004533827.tif 000031
を用いて、pPUR（Clontech Laboratories, Inc.)(アクセッション番号U07648）からPCR増幅された。増幅された644bpのPCR産物は、NotI及びBsmIで切断され、NotI-BsmIで切断された（neoに隣接した制限酵素部位）pPBS PRO linker 1230 Akv neo、pPBSPRO RNAI 108 Akv neo、pPBSPRO RNAII 112 Akv neo、及びpPBSPRO RNAII 201 Akv neoに挿入された。これにより、pPBSPRO 1230 linker Akv pac構築物、pPBSPRO RNAI 108 Akv pac構築物、pPBSPRO RNAII 112 Akv pac構築物及びpPBSPRO RNAII 201 Akv pac構築物が作製された。
【００９０】
インビボ機構：
一般的な細胞培養条件、トランスフェクション及び形質導入の手法は、Lovmandら、Growth and purification of Murine Leukemia Virus. In "Cell Biology：A Laboratory Handbook" Academic Press, lnc.、1994に記載されている。概説すると、10μgのベクタープラスミド混合物を、リン酸カルシウム沈殿法を用いて、トランスフェクションの1日前に7.1×104 細胞/cm2で播種したBOSC23細胞（Pearら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90：8392-6、1993）にトランスフェクションした。ウイルスを含む培養液は連続的に希釈され、6μg/mLのポリブレン（Sigma Chemical Co.、St. Louise、U.S.A.）の存在下、NIH3T3標的細胞に転移された。形質導入された標的細胞の選択のために、トランスフェクションの48時間後、G418又はピューロマイシンを含む培地がNIH3T3に加えられた。耐性コロニーを、トランスフェクションから約16日後に計数した。
【００９１】
結果：
（表４）RNAI及びRNAII要素を有するベクター構築物の形質導入力価（CFU/ml）
2004533827.tif 000032
【００９２】
RNAI及びRNAII要素を、Akvリーダー配列の下流のpPBSPRO 240 Akv neoベクターに挿入し、pPBS PRO linker 1230 Akv neo構築物、pPBSPRO RNAI 108 Akv Neo構築物、pPBSPRO RNAII 112 Akv Neo構築物及びpPBSPRO RNAII 201 Akv Neo構築物を作製した。これらのベクターは、標準的なインビボ手法（Lovmandら、Growth and purification of Murine Leukemia Virus. In "Cell Biology：A Laboratory Handbook" Academic Press, Inc.、1994）により、形質導入効率について試験された。neoベクターを含む全被験RNAI及びRNAIIは、開始ベクターであるpPBSPRO 240 Akv neoと同等又はそれ以上の、高い形質導入力価を有していた。neo含有ベクターと同様に、pac遺伝子含有ベクターもまた作製される：pPBSPRO 1230 linker Akv pac、pPBSPRO RNAI 108 Akv pac、pPBSPRO RNAII 112 Akv pac、及びpPBSPRO RNAII 201 Akv pac。これらは、標的細胞を高い効率で形質導入することが示されたが、力価は、RNAI及びRNAII要素の挿入によって影響を受けなかった（表4）。
【００９３】
結論：
ColE1 RNA二量体化要素であるRNAI及びRNAIIを有するAkv誘導ベクターは、開始ベクターと比べて、ベクターの形質導入効率に影響を与えることなく構築される。
【００９４】
実施例5：RNA要素がベクターRNAのヘテロ二量体化を促進する能力を測定するためのアッセイ
序論：
今後のレトロウイルスベクターの構築において、2つの異なるRNAゲノムを含むウイルス粒子を作製することが関心対象となる可能性がある。これにより、逆転写の鋳型として両方の鎖を用いたより大きな遺伝子の形質導入が可能になりうる。ヘテロ二量体RNAを含むウイルス粒子を作製するために、ベクターは高い効率のヘテロ二量体化を促進する要素を有していなければならない。さらに、ヘテロ二量体の作製はまた、ウイルス二量体化要素が非ウイルス要素で置換され得るような、標準的なレトロウイルスベクター系においても用いられる。したがって、ベクターのヘテロ二量体化は、非ウィルス起源の外因性配列を通してのみ促進される。ヘテロ二量体化を促進する外因性配列の挿入は、ベクターヘテロ二量体化要素と内在性ウイルスで見られる二量体化要素の間の類似性に優先すると考えられる。したがって、ベクターは、ベクターRNAのヘテロ二量体化特性により、標的細胞だけを形質導入するように設計されうり、これによって内在性又は外因性のウイルス由来のRNA転写物とベクターRNAが同時パッケージングされるリスクが著しく減少又は消失される。
【００９５】
このような二量体化要素を活用するためには、ヘテロ二量体化効率を測定することが必要である。ヘテロ二量体RNA（異種接合型ゲノム）を含むウイルス粒子に形質導入が依拠するような、以下に記載のアッセイは、この目的を達成しうる。
【００９６】
鎖転移アッセイ−ヘテロ二量体の選択：
機構は、図4において概説されている。図中、ヘテロ二量体化要素は、RNAI及びRNAII要素により例示されている（実施例4及び実施例6参照）が、ヘテロ二量体化を促進する任意の2つの配列はベクターに挿入されうる。ベクターが逆転写プロセスを進行させるためには、機能性PBS領域が必要である。PBSの5'末端の3ヌクレオチド（ΔTGGベクター）の欠失により、形質導入力価が、約1/105に低下する（補足結果である実施例5参照）が、これは、逆転写開始の阻害によって引き起こされる。最初の鎖転移については、R領域間の相補性が必要であるが、これは、2つのR領域の間のわずか3ヌクレオチドの相同性が形質導入力価を1/20まで低下させるという、DangおよびHu、J.Virol. 75：809-820、2001により行われた実験により示された。
【００９７】
提示されたアッセイにおいて、ベクターは、PBS欠失（ΔTGGベクター）又は3'R領域欠失（Δ3'Rベクター）のいずれかを有するように構築されるが、これは、形質導入能の損傷をもたらすと考えられる。しかしながら、2つのベクター（各種変異を有するベクター1つずつ）を用いてパッケージング細胞を同時トランスフェクションすると、ベクターRNAはビリオンに同時パッケージングされる。したがって、ビリオンは逆転写開始のための完全なPBS1つと、第一鎖転移のための完全なR領域1つを含む。第一鎖の合成が完全なPBSを有する鎖上で開始される場合、もう一方の鎖は完全な3'R領域を有するため、第二鎖の転移は分子間で起こらねばならない。第一鎖の合成はこの鎖上で進行し、最終的にはΔTGG-PBSを逆転写する。ΔTGG-PBSは、第一鎖の合成開始を促進できないが、PBSから転写された18ヌクレオチドのうちの15ヌクレオチドと相補的であるため、第二鎖の転移を促進することはできる。したがって、実施例2記載のアッセイに記載されるアッセイに関する場合のように、第一鎖の合成（組換え）の際に鋳型の鎖間移動は必要ではない。したがって、ヘテロ二量体（ヘテロ接合性）ゲノムを含むウイルス粒子は、ホモ接合性ゲノムを含むウイルスよりも高い効率で標的細胞を形質導入できる。したがって、選択遺伝子を含むΔTGGベクターの形質導入力価とは、ベクターが一緒に誘導されてヘテロ二量体として同時パッケージングされる効率の定量的な測定値である。
【００９８】
アッセイ系は、ヘテロ二量体化を指示する任意のRNA要素のヘテロ二量体化の試験において行われうる。
【００９９】
補足結果：
ΔTGGベクターを、インビボ系における構築で試験した。BOSC23細胞における構築は実施例2で記載され、ベクターの構築は実施例6で記載されている。
【０１００】
（表５）pPBSΔTGG Akv neoの形質導入効率
2004533827.tif 000033
【０１０１】
実施例6：RNAI及びRNAIIを含む構築物−特異的パッケージングの指示
序論：
実施例4では、異種性RNA要素が、形質導入効率に影響することなく、Akv誘導ベクターの所与の位置に挿入されうることが示された。実施例5の序論に記載されたように、ヘテロ二量体化によって形質導入するベクターを構築することが関心対象となる。ヘテロ二量体化を促進する要素を設計する場合、ヘテロ二量体形成を行う能力を、生物学的な系において評価することが必要である。実施例5では、ヘテロ二量体化を通して形質導入効率が測定されるアッセイが記載される。より直接的なアッセイは本実施例において示され、ここではウイルス粒子のRNA含有量が測定される。
【０１０２】
全レトロウイルスはウイルス粒子中に、レトロウイルスゲノムのパッケージングに必要なRNA要素（PSI要素）を含む。パッケージングシグナルをベクターから除去した場合、少量のRNAのみがパッケージングされる。しかしながら、もしパッケージングシグナルを欠失しているRNAが二量体の状態で2番目のRNAに連結されるなら、パッケージングシグナルを欠失しているRNAは、他のRNA鎖に含まれるパッケージングシグナルに依存しうる。パッケージングシグナルを欠失したRNAを、パッケージングシグナルを含むRNAとパッケージングするこの方法は、これらがヘテロ二量体を形成する能力の測定方法である。そのようなアッセイは、RNAI及びRNAIIが特異的ヘテロ二量体化を行う能力を評価するために用いられる。RNAI要素は、パッケージングシグナル欠失ベクターに挿入され、RNAII要素は、パッケージングシグナルを含むベクターに挿入される。
【０１０３】
ベクター構築物の説明：
pPBSproΔTGG Akv neo：
変異型PBS配列の次のクローニングを容易にするために、Srf1及びNru1の制限酵素部位が、pPBSpro内の952位及び1018位にそれぞれ形成され、この部位にはSrf1部位及びNru1部位の半分が存在する。Srf1及びNru1の制限酵素部位を含むDNA断片は、二段階PCR及び重複伸長によって得られた。150ngのpPBS proがPCR反応（PCR1）のための鋳型として用いられたが、ここでは25pmolのプライマー148760
2004533827.tif 000034
及び25pmolのプライマーA6600
2004533827.tif 000035
が、標準的なPCR反応条件（15サイクル：94℃で1分間；60℃で1分間；73℃で2分間、次に73℃で5分間）下で用いられた。PCR2については、プライマーが25pmolのプライマー147654
2004533827.tif 000036
及び25pmolのプライマー137599
2004533827.tif 000037
に置換されたことを除いて、同一のPCR条件であった。PCR1及びPCR2により、各々、930bp及び720bpの産物が得られた。1.25UのPfu1を含む標準的PCR条件下において、各々200ngのPCR産物1及び2を用いた重複伸長反応によって、2つのPCR断片が結合された。次のサイクルパラメーターが用いられた：73℃で5分間、ならびに、94℃で1分間；60℃で2分間；73℃で2分間を5サイクル、その後、73℃で5分間。エンドプライマーA6600及び135799の各10pmolが、反応及び反復サイクルに加えられた。得られた1650bpの産物はゲル電気泳動により精製され、抽出された。産物は、EcoRI及びBamHIにより切断されて、EcoRI及びBamHIにより切断されたpPBSproに標準的ライゲーションにより挿入され、これによりpPBSpro Srf1/Nru1構築物が得られた。TGG配列が欠失したPBSを含むDNA断片は、オリゴヌクレオチド150500
2004533827.tif 000038
及び150501
2004533827.tif 000039
の各100pmolを混合することにより得られた。オリゴヌクレオチドは95℃で5分間加熱され、ゆっくりと室温まで冷やすことで再アニーリングされた。PBSpro Srf1/Nru1は、Srf1及びNru1で切断された。最終濃度0.5mM dATPの存在下、T4DNAポリメラーゼの3'→5'エキソヌクレアーゼ活性によって、切断されたベクターの3'末端配列が除去された（Sampathら、Gene 190：5-10、1997；Aslanidis and Jong、Nucl.Acids.Res. 18：6089-74、1990に記載）。DNA断片は標準的ライゲーションによりベクターに挿入され、これによりpPBSproΔTGG Akv neoが得られた。
【０１０４】
pPBSΔTGG linker 1230 Akv neo、pPBSΔTGG RNAI 108 Akv neo：
これらは、ベクター構築物であるpPBSPRO linker 1230 Akv neo、pPBSΔTGG RNAI 108 Akv neo、及びpPBSΔTGG Akv neoに基づくものである（実施例4参照）。修飾されたPBSΔTGGを有する732bpのDNA断片は、pPBSΔTGG Akv neoのEcoRI及びSpeIによる切断後に単離され、EcoRI及びSpeIにより切断されたpPBSPRO linker 1230 Akv neo及びpPBSΔTGG RNAI 108 Akv neoにクローニングされた。これにより、pPBSΔTGG linker 1230 Akv neo及びpPBSΔTGG RNAI 108 Akv-neoベクターが作製された。
【０１０５】
pPBSΔTGGΔPsi linker 1230 Akv neo、pPBSΔTGGΔPsi RNAI 108 Akv neo：
pPBSΔTGG linker 1230 Akv neo及びpPBSΔTGG RNAI 108 Akv neoは、SpeI及びXhoIで切断された。DNAは、突出部を満たすためにdNTP及びKlenow酵素と共にインキュベートされ、続いてT4 DNAリガーゼにより再ライゲーションされた。これにより、パッケージングシグナルの核である89ヌクレオチドの欠失をもたらした。したがって、文献により、効率的なパッケージングのために必要な配列が除去された（MougelおよびBarklis、J.Virol.71：8061-5、1997）。
【０１０６】
pPBSPRO RNAII 112 Akv pac、pPBSPRO RNAII 201 Akv pac及びpPBSPRO 1230 linker Akv pac：
これらのベクターの構築については実施例4で述べた。
【０１０７】
ベクター構築物のインビボ解析：
Plat-Eパッケージング細胞（Moritaら、Gene Ther. 7：1063-6、2000）に、表6に示される構築物A及びB、各10μgを二重トランスフェクションさせた。トランスフェクション効率をモニタリングするために、1μgのEGFPが同時トランスフェクションされ、EGFPの発現レベルがフローサイトメトリーにより測定された。トランスフェクションされた細胞からウイルス上清を回収し、Lovmandら、Growth and purification of Murine Leukemia Virus. In "Cell Biology：A Laboratory Handbook" Academic Press, Inc.、1994に記載されるように、ウイルスを単離した。単離されたウイルスは2つのプールに分けられた：プールA：逆転写アッセイによるウイルス量の定量用ウイルス（Lovmandら、Growth and purification of Murine Leukemia Virus. In "Cell Biology：A Laboratory Handbook" Academic Press, Inc.、1994）；プールB：ビリオン全体のドットブロットアッセイ用ウイルス（Nelsonら、Hum.Gene Ther. 9：2401-5、1998）。
【０１０８】
ドットブロット分析によるビリオンRNA含有量の解析：
ウイルス粒子のRNA内容物はフィルターに結合する（Zeta-Probe、Biorad、Hercules、U.S.A.）。ドットブロットフィルターはその後、パッケージングシグナル欠失ベクター由来のRNAを定量するために、Neoプローブにより検索された。（RT分析（Lovmandら、Growth and purification of Murine Leukemia Virus. In "Cell Biology：A Laboratory Handbook" Academic Press, Inc.、1994）により測定された）ウイルス量に標準化することにより、RNAI及びRNAIIがパッケージングを指示する程度が測定された。データの要約は表6に示されている。
【０１０９】
ドットブロットフィルターのハイブリダイゼーションシグナルの定量は、面積（CNT mm2）を乗じた強度単位として行われ、従ってパッケージング生データを示す。RT活性は、[H3]dTTPの結合として測定され、各々の実験において解析されたウイルス量で示された。相対的パッケージングは、最も右側の欄に示されている。相対的パッケージングは、ウイルス粒子量に対する実際のRNA含有量として計算される。
【０１１０】
（表６）
2004533827.tif 000040
【０１１１】
結果：
実験1は、RNAI及びRNAII要素がまだ挿入されていないベクター構築物のデータを示す、対照実験である。したがって、(1.0)と測定されたパッケージングは、試験系におけるバックグラウンドパッケージングの結果である。また、実験2は、RNAII要素だけがベクターのうちの一つに挿入された対照である。しかし、この挿入は、pPBSΔTGGΔPsi linker 1230 Akv neo(0.3)のパッケージングを行うのに十分でない。実験3及び実験4では、ベクターは、相対的パッケージングを増加させる相補的なRNAI及びRNAII配列を含む（各々、2.7倍及び3.3倍）。
【０１１２】
結論：
2つのベクターに挿入された相補的なRNAI及びRNAII要素は、特異的なパッケージング及び二量体化を導くことができる。
【０１１３】
実施例7：コアパッケージングシグナルの上流に位置する潜在的なキッシングループ配列における代替的パリンドロームを有する完全長ウイルスは複製可能である
序論：
モロニーマウス白血病ウイルス（Mo-MLV）はそれぞれ、204位〜228位及び283位〜298位における二量体開始部位（DIS）であるDIS1及びDIS2として知られている2つのRNAステムループを含む。DIS1及びDIS2を規則的に変異させる研究により、2つのDIS要素が一緒にウイルスで二量体の集合の開始を補助する二連（bipartite）組織を形成することを明らかにした（LyおよびParslow、J.Virol. 76：3135-3144、2002）。Akvマウス白血病ウイルスにおいては、Mo-MLV内で同定されたDIS1に相同的な10 ntのパリンドローム領域（pal-1）は、pal-2（DIS2類似体）を含むコアパッケージングシグナル及び2つのGACGステムループから上流の209位〜218位に存在する。DIS1とDIS2に関して示唆されるように、キッシングループの機構を介して、pal-1は、潜在的に二量体化に関与している。本実験では、潜在的なキッシングループ配列であるpal-1（DIS1）に挿入された代替的パリンドロームの効果が研究された。
【０１１４】
ウイルス構築物の説明：
PCR変異導入は、AkvBにおけるDIS1様パリンドローム領域（pal-1）を修飾するために行われた。AkvBは、CAの110位で修飾されたAkv-MLVのB-トロピック誘導体であり、かつこれは、AkvBU3-EGFPのU3領域のCellII部位に位置するIRES-EGFPカセットを欠失していることを除いては、AkvBU3-EGFP（Aagaardら、J.Gen.Virol.、83:439-442、2002）と同質遺伝子型である。Akv/AkvBにおける209位〜218位のパリンドローム
2004533827.tif 000041
は、中心部位の6個において、代替的パリンドローム
2004533827.tif 000042
（変異に下線を付した）に、以下のように修飾された。
上流プライマーA
2004533827.tif 000043
（Akvゲノムに対して-1140位における骨格に位置し、-747位のAsnIの上流に位置する）及び、下流プライマーB
2004533827.tif 000044
（Akvの242位〜193位に及び、下線の付されたpal-1領域における6ヌクレオチドのミスマッチを有する）を用いて、AkvBプラスミドから増幅された1382bpのPCR断片は、プライマーA及びDを用いるPCR反応において、上流プライマーC
2004533827.tif 000045
（Akvの219位〜242位に及び、プライマーBと24 ntの重複を有する）及び、下流プライマーD
2004533827.tif 000046
（Akvの403-379の範囲に位置し、302位のSpeI部位から下流に位置する）を用いてAkvBから増幅された184bpのPCR断片によるPCR重複伸長反応に用いられた。得られた1542 bp PCR破片およびAkvBプラスミドは、AsnI及びSpeIで切断され、その後、得られた断片は、標準的なクローニングの手法を用いて、AkvB-altpalを作製するために、線状化されたAkvBプラスミドにクローニングされた。
【０１１５】
インビボ解析：
複製可能なウイルスをコードしているプラスミド10μgを、リン酸カルシウム沈殿法により、BOSC23パッケージング細胞（Pearら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90：8392-6、1993）にトランスフェクションされた。得られたウイルスの上清は、1mlあたり6μgのポリブレン（Sigma Chemical Co.、St.Louise、U.S.A.）の存在下、感染の1日前に1cm2あたり1000細胞で播種されたBALB/c繊維芽細胞（ATCC CCL 163）を感染させるために用いられた。感染後日数（dpi）2日目で、感染細胞の数は、特定のラット抗エンベロープモノクローナル抗体（83A25、Sitbonら、Virol 141:110-118、1985）を用いて、及び、エンベロープを発現する細胞を検出するためにヤギ抗ラット免疫グロブリン（Harlan Sera-Lab LTD、Loughborough、England）と接合したフィコエリスリン（PE）を用いて、フローサイトメトリーにより定量された。非感染BALB/c細胞は、バックグラウンドPEシグナルの陰性対照としてはたらいた。BALB/c細胞の並行培養物は、コンフルエントになる（5 dpi）まで分割されており、感染細胞の数が再定量された。2dpiから5dpiの感染細胞の数（割合として測定される）における相対的増加は、複製速度測定値として用いられる。
【０１１６】
結果：
209位〜218位の代替的パリンドローム配列を含むAkvB-altpalウイルスを、親（野生型）ウイルスAkvBと共に、マウスBALB/c繊維芽細胞における複製能について試験した。表7に示されるように、AkvBとAkvB-altpalの間の複製能力における有意な相違は検出されなかった。相対的増加が2つの実験の間で異なっていることに注意されたい。これは、個々の実験の際の細胞分裂数の合計、およびそれによる、細胞分裂の欠如によって阻止されるまえにウイルスが行いうる複製サイクル数の違いに起因する可能性が最も高い。
【０１１７】
（表７）代替的pal-1配列を含むAkvBウイルスの複製速度：感染後日数（dpi）2日目ないし5日目における感染細胞の割合を、相対的増加と共に示す。
2004533827.tif 000047
【０１１８】
結論：
Akvマウス白血病ウイルスの209位〜218位に相当するpal-1を、ウイルスの複製能力に影響することなく、代替的パリンドローム配列で置換してもよい。LyおよびParslow、J.Virol.76:3135-3144、2002及びOroudjevら、J.Mol.Biol.291:603-13、1999に提示されたデータから、pal-1配列が二量体の形成を促進することは明らかである。したがって、複製に影響を与えることなく、Akvの野生型パリンドロームを代替的パリンドロームに置換することは、代替的pal-1がホモ二量体化を促進することを強く示唆する。
【０１１９】
実施例8：二量体化促進要素における複数修飾を有するベクターの構築
序論：
実施例2において、キッシングループ領域（DIS2）に代替的パリンドローム配列が挿入されたAkv誘導ベクターにおいて、形質導入効率を損なうことなく、特定の内在性レトロウイルス配列による組換えが減少することが示された。また、ベクター及び完全長のウイルス両方が類似のパロンドローム配列（pal-1/DIS1）中で修飾されること、および、修飾された配列がパリンドロームを保存している場合、ベクター（Mo-MLV由来、LyおよびParslow、J.Virol. 76：3135-3144、2002）及び完全長ウイルス（Akv-MLV、実施例7）の両方が、野生型に近いレベルで複製することも示された。修飾された領域（DIS1）は、インビトロ実験において、二量体化を伴うことがさらに示された（LyおよびParslow、J.Virol. 76：3135-3144、2002ならびにOroudjevら、J.Mol.Biol. 291：603-13、1999）。
【０１２０】
ひとつの二量体化シグナルが修飾された場合、ベクター由来のRNAは、ベクターおよび内在性ウイルスRNAの両方に含まれる、残存している天然二量体化シグナルの相互作用を通じて、内在性ウイルスのRNA転写物とヘテロ二量体化しうる。したがって、DIS2領域において修飾されるだけでなく、DIS1領域のような二量体化領域を保存している、実施例2に記載されたベクターと類似したベクターを設計することが可能と考えられる。実施例2及び実施例7に提示されたデータから、そのような複数修飾されたベクターは標的細胞を効率的に形質導入しうる。重要なことに、内在性または外因性のウイルス内の天然二量体化要素との類似性が低下するように2つ以上の二量体化シグナルを修飾することにより、ホモ二量体化への特異性は増加すると考えられる。
【０１２１】
実施例9に記載されたレスキュー系において、新規なDIS1及びDIS2の二重修飾ベクターは、おそらく、（野生型ベクター配列由来の）非修飾ベクター又は（実施例2由来のDIS2修飾ベクターのような）単一修飾ベクターと同じ程度にはレスキューされないと考えられる。同様に、実施例2に記載された2ベクター系において、PBSが損傷した二重修飾ベクター（DIS1+DIS2）は、非修飾ベクター又は単一修飾DIS2ベクターよりもずっとレスキュー力価を低下させると考えられる。
【０１２２】
レンチウイルスのような、他の群のレトロウイルス由来のレトロウイルスベクターについて、二量体化を伴う複数のモチーフにおける修飾を有するベクターを設計することも同様に、関心対象であり得る。
【０１２３】
実施例9：ヘテロ二量体化を通して完全長ウイルスにより達成される、PBS変異型ベクター構築物の可動化のための組換えレスキューアッセイ
序論：
レトロウイルスRNAの逆転写は、細胞質由来のtRNA分子から開始されるが、この分子は、ウイルスのプライマー結合部位（PBS）に特異的に結合する。PBS修飾ベクターの逆転写が阻害されると、標的細胞の形質導入は劇的に減少する（Lundら、J.Virol. 71:1191-1195、1997；Hansenら、J.Virol. 75：4922-4928、2001、ならびに、米国特許第5.886.166号、同第5.866.411号、同第6.037.172号、及び同第6.107.478号、これら全ては本明細書に参考文献として組み入れられる）。しかしながら、パッケージング細胞において、変異型プライマー結合部位に対応する人工tRNAを共発現することにより、標的細胞の形質導入が、野生型とほぼ同じレベルに維持される（Lundら、J.Virol. 71:1191-1195、1997；Hansenら、J.Virol.75：4922-4928、2001）。組換えを通して複製可能ベクターの形成のリスクが減少するので、逆転写の開始を制御する、記載されたtRNA相補化システムは、レトロウイルスベクターの安全な使用を促進するために、最近のレトロウイルスベクター系において用いられうる。しかしながら、遺伝子転移とは別に、標的細胞が複製可能なウイルスに感染するならば、標的細胞において、導入されたベクターは修復されうる。
【０１２４】
概説すると、パッケージング細胞は、neo遺伝子含有ベクター、及び、標的細胞を形質導入するために用いられるウイルス含有上清でトランスフェクションされる。PBS損傷ベクターの形質導入のために、相補的合成tRNAを、パッケージング細胞に同時トランスフェクションさせる。形質導入細胞は、選択され再播種される。再播種されたベクター含有細胞は、複製可能な完全長Akvマウス白血病ウイルスに感染される。これらの細胞の上清は選択に供された標的細胞に形質導入される。PBS変異型ベクターの場合、現れた細胞コロニーは、Akv-MLVが機能性PBSを提供するので、neoベクター及び完全長ウイルスRNAの同時パッケージングの結果であるだけでなく、逆転写を完了するための、PBS修飾ベクター及びAkvとの間の組換えの結果でもある。用いられたベクターの代替的二量体化要素を用いることにより、ヘテロ二量体化及び同時パッケージングを誘導することは、新規で安全な特性を示しうる。この組換えレスキューアッセイにより、内在性又は外因性のレトロウイルスによる組換えレスキューのリスクにおける、このような代替的二量体化要素の影響力の定量的評価が可能となる。さらに、減少した組換えレスキューを引き起こすPsi修飾を有する、このようなPBS修飾ベクターは、安全性プロフィールの改良により、直接適用性を有しうる。
【０１２５】
ベクターの説明：
pPBSx2MLEVPsi Akv-neo：
pPBSx2MLEVPsi Akv-neoは、実施例2で記載されたpPBSGlnMLEVPsi Akv-neoから構築される。2つのPCR産物が作製された。PCR産物A：pPBSGlnMLEVPsi Akv-neo鋳型上で、プライマーON1
2004533827.tif 000048
及びON2
2004533827.tif 000049
を用いた。PCR産物B：Lundら、J. Virol.71:1191-1195、1997に記載された、pPBSx2 Akv-neo鋳型上で、プライマーON3
2004533827.tif 000050
及びON4
2004533827.tif 000051
を用いた。PCR産物A及びBは、ゲルで精製された。第三のPCR産物Cは、PCR産物A及びBの混合物からなる鋳型において、ON5
2004533827.tif 000052
及びON6
2004533827.tif 000053
を用いて、重複PCRにより作製された。PCR産物Cは、精製され、制限酵素EcoRI及びBarnHIで切断され、標準的なクローニングの手法により、EcoRI及びBarnHIで切断されたpPBSProAkvΔPsiプラスミド（Mikkelsen、J.Gen.Virol. 80:2957-67.1999に開示）にクローニングされた。これにより、修飾PBS及びMLEVパッケージングシグナルを有するpPBSx2MLEVPsi Akv-neoプラスミドが作製された。
【０１２６】
pPBSGlnMLEVPsi Akv-neo：
構築は、実施例2で説明されたとおりである。
【０１２７】
インビボ解析：
ベクター構築物各10μgは、リン酸カルシウム沈殿法を用いて、BOSC23パッケージング細胞（Pearら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90：8392-6、1993）にトランスフェクションさせた。pPBSx2MLEV Akv-neoベクターについては、5μgのpUC19（相補性なし）又は、人工tRNAをコードする5μgのptRNAx2（Lundら、J.Virol.71:1191-1195、1997に記載の相補性）のいずれかを追加してトランスフェクションを行ったが、pPBSGlnMLEVPsi Akv-neoの場合には、5 μgのpUC19は、トランスフェクション混合物に含有されていた。上清はNIH3T3繊維芽細胞を形質導入するために用いられ、G418耐性コロニーはつづいて、Lovmandら（1994）に開示されるように、計数されて、選択された。pPBSx2MLEV Akv-neoで形質導入されたNIH細胞については、6つの別々のコロニーを選択して播種したが、一方でpPBSGlnMLEVPsi Akv-neoベクターを含む耐性コロニーをプールした。プール由来のNIH細胞及び6個のクローンは、細胞5000個/cm2で再播種され、1mlあたり6μgのポリブレン（Sigma Chemical Co.、St.Louise、U.S.A.）の存在下、複製可能な完全長のAkvウイルス（Etzerodtら、J.Virol.134:196-207、1984）で重感染された。感染後日数（dpi）7日目に、コンフルエントな細胞由来の上清が回収され、neo力価は、新しいNIH細胞の形質導入により測定された。pPBSx2MLEV Akv-neoの可動化後に生じるneo遺伝子を含むNIHコロニーを別々に選択して播種した。PBSリーダー領域に隣接するプライマー（上流プライマーU3
2004533827.tif 000054
、及び、下流プライマーneo
2004533827.tif 000055
）を用いるPCR及び配列決定のために、ゲノムDNAを調製した（DNAzol、Molecular Reserch Center Inc、Cincinnati、U.S.A.）。
【０１２８】
結果：
pPBSx2MLEVPsi Akv-neoは、力価が〜2 CFU/mlと低いが、NIH細胞は、BOSC23細胞において産生されたpPBSGlnMLEVPsi Akv-neoベクターで、高い効率（力価5×105CFU/ml）により形質導入された。しかし、PBS変異型ベクターの形質導入の低さは、人工tRNA（ptRNAx2）を用いた同時トランスフェクションによってほとんど完全に回復できた。力価は、6500倍から1.3×104 CFU/mlに増加した。
【０１２９】
（表８）完全長のAkvマウス白血病ウイルスを用いた感染におけるNIH繊維芽細胞から可動化されたベクターの形質導入力価
pPBSGlnMLEVPsi Akv-neo細胞はポリクローナルであるが、pPBSx2MLEVPsi Akv-neo細胞由来の力価は、6個のクローンの平均を示していることに留意されたい。
2004533827.tif 000056
【０１３０】
表8によると、完全なベクターであるpPBSGlnMLEV Akv-neoは、Akvウイルス粒子へのパッケージングを経て、非形質導入細胞に効率的にレスキューされた。効率は低いが、PBS変異型ベクターであるpPBSx2MLEV Akv-neoも同様にレスキューされる。PBS欠損ベクターのレスキューは、同時パッケージング、及びAkv-MLVとの組換えに起因する。
【０１３１】
可動化されたPBS変異ベクターの配列分析により、形質導入された全プロウイルスは、pPBSx2MLEV Akv-neoベクターとAkvウイルスとの間の組換え事象の結果もたらされたことが示された。組換え接合部位の解析は、pal-2（DIS2）領域と46%（16/35）一致することを示す。これは、Akv誘導ベクター及び内在性レトロウイルスRNA（Mikkelsenら、J.Virol. 70;1439-47、1996）との間の組換えが活発な部位についての先の報告と一致し、さらに、可動化がヘテロ二量体化を伴うことを立証するものである。
【０１３２】
結論：
組換えレスキュー分析は、PBS欠損ベクターの可動化の効率を測定するため、およびしたがってリーダー修飾ベクターがヘテロ二量体化する能力および、同時パッケージングする能力、ならびに、複製可能ウイルスとの組換えの能力を評価するために用いられうる。
【０１３３】
実施例10：ホモ二量体とヘテロ二量体の形成の解析のためのウイルス粒子からのレトロウイルスRNA二量体の親和的精製
序論：
パッケージング細胞で発現されるRNAベクター転写物は、同一細胞で発現された内在性ウイルスとヘテロ二量体を形成しうる。そのようなヘテロ二量体の形成は、内在性ウイルスとベクター構築物との同時パッケージングという結果をもたらすので、これは主要な安全性の論点となる。ヘテロ二量体RNAの逆転写の際、組換えが起こって、新規な複製可能ウイルスの作製が起こりうる。内在性ウイルスとの組換えのリスクを減らすベクターを開発する場合、内在性ウイルス由来のRNA転写物を用いてヘテロ二量体化するために、修飾ベクターの能力を生物学的システムにおいて評価できるアッセイを用いることが重要である。加えて、それは、非ウイルス配列（例えばColE1）がホモ二量体及びヘテロ二量体を形成する能力の試験にも適用され得る。
【０１３４】
オリゴ標識分析：
パッケージング細胞系は、関心対象の2つの構築物でトランスフェクションされる。2つの構築物を区別するためには、それらは固有の長い配列を含有しなければならない。2つのトランスフェクション構築物は、通常、二量体化シグナル及び/又は内在性ウイルス起点の配列において修飾されたベクターである。しかし、任意の関心対象の配列2つを、ビリオンにおいてヘテロ二量体を形成する能力について試験することができる。簡単には、以下の実施例は、(A）neo選択遺伝子を有するAkv誘導レトロウイルスベクター、及び、(B）pac選択遺伝子（図5）を有するMLEV誘導ベクターを用いた実験について記載されている（図5）。A+Bトランスフェクションパッケージング細胞由来のウイルス含有培養液を回収し、非変性条件下でウイルスRNAを単離する。単離されたRNA二量体は、次の組み合わせの二量体の集合を構成する：A+A、B+B及びA+B。二量体RNAに、Aにおける配列を特異的に認識するオリゴが追加される。このオリゴは、リンカー（例えばビオチン）に共有結合する。オリゴがハイブリダイズする二量体は、次にカラム（例えばアビジン）に固定されうる。このカラムの材質を、適当な緩衝液で数回洗浄し、最終的にRNAは加熱変性により溶出される。溶出したRNAはプールに分配される。両プールを、ドットブロット法又はそれと同等な方法により、プロービングフィルター（probing filter）に結合させる。ドットブロット1由来のフィルターを、次にAを認識するプローブでプロービングする。ドットブロット2由来のフィルターを、Bを認識するプローブでプロービングする。ホスフォイメージャー（PhosphoImager）を用いて、ドットブロット1niyori、プール内でのA+A及びA+Bの二量体量（I1）の定量的測定が行われし、ドットブロット2により、A+Bの二量体量である、I2の定量的測定が行われる。比Rhetero=I2/I1はヘテロ二量体化効率の測定値と考えられる。Rheteroが低いことは、ヘテロ二量体形成の総量が小さいことと等しく、その逆も真である。対照として、RNAは、A及びBで単一トランスフェクションされたパッケージング細胞から産生されたウイルスから単離されることになる。これは、A+A及びB+Bからなり、ヘテロ二量体であるA+Bを含まない、RNAホモ二量体をもたらす。ホモ二量体であるA+A、B+Bは、その後混合され、上述と同じ解析に供される。対照のRheteroは、二重トランスフェクション細胞で測定されたどのRheteroよりも著しく大きく、これによりオリゴ精製の際にヘテロ二量体は形成されないことが確認された。
【０１３５】
結論：
このアッセイを、異なる配列がホモ二量体化及び/又はヘテロ二量体化を行う能力を比較するために用いることができる。
【０１３６】
実施例11：対応する非パリンドローム配列対を通じたヘテロ二量体化により促進された、レトロウイルスベクターの固定化
以下に記載されかつ図6に示されるように、レトロウイルスベクターへの二量体化配列の挿入により達成されるヘテロ二量体化により、レトロウイルスベクターのさらなる安全性特性を提供することができる。
【０１３７】
2つのレトロウイルスベクターは、パッケージング細胞系に同時トランスフェクションされる。一方のベクターは非パリンドローム二量体化配列を含むように設計され、第二のベクターの設計は、第一のベクターの非パリンドローム性要素に対応する非パリンドローム配列の挿入により特徴づけられる。二量体化配列の非パリンドローム性のため、ヘテロ二量体は各ベクター転写物のホモ二量体よりも高頻度で形成されるので、パッケージング細胞から放出されたウイルス粒子は、2つのベクター転写物のRNAヘテロ二量体を主に含むと考えられる。非パリンドローム配列、及び、対応する非パリンドローム配列は、実施例3に記載された、KL-nonpal及びKL-matchnonpalにより各々例示されうる。得られるウイルス粒子は標的細胞を形質導入するために用いられる。RNA二量体の逆転写プロセスから得られた唯一のプロウイルスは宿主細胞ゲノムに組み込まれると考えられる。したがって、プロウイルスは独立した感染事象（Paludanら、J.Virol.63:5201-7、1989）に起因しているため、標的細胞中のプロウイルスの数は、Poisson分布に従うと考えられる。よって、プロウイルスとして組み込まれたベクターの種類にかかわらず、組み込まれたレトロウイルス配列の転写物は、移動したり宿主細胞から出ることはできないと考えられる。
【０１３８】
実施例12：単一ベクター系に基づくホモ二量体の形成
単一ベクター系においては、遺伝子治療に用いられかつ関心対象の治療用遺伝子を有するベクターは、gag遺伝子及びpol遺伝子を一方の構築物が、env遺伝子をもう一方の構築物が有するような、2つのパッケージング構築物を含む産生細胞に導入される。細胞はさらに内在性ウイルス配列（図7参照）を含む。遺伝子治療用ベクターにより産生されたホモ二量体が細胞内パッケージングにより選択されるように、ベクターは治療用遺伝子上流の合成RNAモチーフを含み、このモチーフはベクター由来の転写物間のハイブリダイゼーションを促進する。この系では、遺伝子治療用ベクター由来の転写物と、パッケージング構築物及び内在性配列由来の転写物それぞれを含む二量体との間に、もっと多くのホモ二量体が形成されるので、形成されたウイルス粒子は通常、遺伝子治療用ベクター配列の所望の二量体を含む。
【０１３９】
実施例13：2つのベクター系の安全性の向上
上記の実施例12との主要な違いは、遺伝子治療用ベクターに加えて、いわゆる「レスキューベクター」が用いられるという事実にある。この遺伝子治療ベクターは、治療用遺伝子上流のColE1 RNAI配列を含み、レスキューベクターは、対応する位置にColE1 RNAII配列を含む。ColE1 RNAI要素及びColE1 RNAII要素の中の相補的な配列のために、これらの2つの配列は、レスキューベクター転写物とレトロウイルスベクター転写物との間の二量体形成を促進する。またこの場合、遺伝子治療ベクターの転写物及びレスキューベクターの転写物の間の二量体形成は、他のどの二量体形成よりも好ましく、これは、所望の二量体パッケージングの可能性が増加することを意味する。このように産生されたウイルス粒子は治療対象の患者の細胞に導入され、所望の治療用遺伝子は標的細胞のゲノムに組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１４０】
【図１】遺伝子治療に用いられるパッケージング細胞からの自己複製可能ウイルスの産生を示す。
【図２Ａ】ヘテロ二量体化を促進し、かつ内在性ウイルス転写物による組換えを減少させる、インビボにおける2ベクター強制組換え系を示す。
【図２Ｂ】組換え事象を引き起こす、RNA二量体の逆転写の際の鋳型シフトの概略を示す。
【図２Ｃ】非パリンドローム配列をキッシングループ領域内に導入してヘテロ二量体化を導くための機構において用いられるレトロウイルスベクターを示す。
【図３】異種性配列を含むレトロウイルスベクターの例、および形質導入効率性として測定された挿入効果のインビボ測定値を示す。
【図４】RNA要素がRNAのヘテロ二量体化を促進する能力を測定するためのアッセイの概要を示す。
【図５】任意の二つの配列がビリオン内でヘテロ二量体を形成する可能性について試験するためのオリゴタギングアッセイを示す。詳細については実施例10を参照すること。
【図６】非パリンドローム配列に一致する対を介したヘテロ二量体化によって促進されるレトロウイルスベクターの固定化についての概略モデルを示す。
【図７】本発明の単一ベクター系を示す。ここで、単一ベクターは、ホモ二量体形成二量体化配列の挿入により修飾されている。
【図８】図8aおよび図8bは、遺伝子治療用ベクターに有用な配列を、ホモ二量体およびヘテロ二量体を形成する能力について試験するためのインビボ機構を示す。
【図１】
2004533827.tif 000058
【図２Ａ】
2004533827.tif 000059
【図２Ｂ】
2004533827.tif 000060
【図２Ｃ】
2004533827.tif 000061
【図３】
2004533827.tif 000062
【図４】
2004533827.tif 000063
【図５】
2004533827.tif 000064
【図６】
2004533827.tif 000065
【図７】
2004533827.tif 000066
【図８Ａ】
2004533827.tif 000067
【図８Ｂ−１】
2004533827.tif 000068
【図８Ｂ−２】
2004533827.tif 000069
【国際公開パンフレット】
2004533827.tif 000070
2004533827.tif 000071
2004533827.tif 000072
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2004533827.tif 000125
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533827.tif 000126
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533827.tif 000127
【国際調査報告】
2004533827.tif 000128
2004533827.tif 000129
2004533827.tif 000130
2004533827.tif 000131