(57)【要約】本発明は、ＨＬＡ−Ａ２．１対立遺伝子によってコードされる糖タンパク質を特異的に結合し得、そしてこのＡ２．１対立遺伝子によって拘束されるＴ細胞におけるＴ細胞活性化を誘導し得る、免疫原性ペプチドおよび免疫原性ペプチド組成物を選択するための手段および方法を提供する。このペプチドは、所望の抗原に対して免疫応答を惹起するために有用である。本発明は、ウイルス疾患および癌のような多くの病理学的状態を予防、処置または診断するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、選択された主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合し得、そして免疫応答を誘導し得る新規なペプチドを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＬＡ−Ａ２．１結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含む組成物であって、該免疫原性ペプチドが配列番号１〜１９１からなる群から選択される、組成物。
【請求項２】
前記免疫原性ペプチドがＢ型肝炎ウイルス由来の配列を有し、かつ配列番号７７である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記免疫原性ペプチドがＣ型肝炎ウイルス由来の配列を有し、かつ配列番号７８〜８１からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記免疫原性ペプチドがヒト免疫不全ウイルス由来の配列を有し、かつ配列番号８２〜９７からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記免疫原性ペプチドがＨｅｒ２／ｎｅｕ由来の配列を有し、かつ配列番号９８〜９９からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記免疫原性ペプチドがＣＥＡ由来の配列を有し、かつ配列番号１００〜１０６からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫原性ペプチドがｐ５３由来の配列を有し、かつ配列番号７１〜７４からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記免疫原性ペプチドがＭＡＧＥ由来の配列を有し、かつ配列番号７０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
薬学的に受容可能な賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドが第二の分子に混合されるか、または連結される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
リポソームをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ペプチドが、抗原提示細胞上に存在するＨＬＡ−Ａ２．１分子と複合体を形成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＨＬＡ−Ａ２．１結合モチーフを有する免疫原性ペプチドをコードする組換え核酸配列であって、該免疫原性ペプチドが、配列番号１〜１９１からなる群から選択される、組換え核酸配列。
【請求項１４】
ＨＬＡ−Ａ２．１分子を発現する患者において、予め選択される抗原に対して細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導するための組成物であって、該組成物が、配列番号１〜１９１からなる群より選択される免疫原性ペプチドを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、ＵＳＳＮ０８／５８９，１０８の一部係属であり、そして以下の特許出願：ＵＳＳＮ６０／０１３，９８０、ＵＳＳＮ０８／４５４，０３３およびＵＳＳＮ０８／３４９，１７７（これは、ＵＳＳＮ０８／０２７，１４６の一部係属であるＵＳＳＮ０８／０７３，２０５の一部係属である、ＵＳＳＮ０８／１５９，１８４の一部係属である）に関連する。本出願はまた、ＵＳＳＮ０８／２０５，７１３およびＵＳＳＮ０８／７５３，６２２に関連する。上記全ての出願は本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の背景）
本発明は、ウイルス疾患および癌のような多くの病理学的状態を予防、処置または診断するための組成物および方法に関する。特に、本発明は、選択された主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合し得、そして免疫応答を誘導し得る新規なペプチドを提供する。
【０００３】
ＭＨＣ分子は、クラスＩ分子またはクラスＩＩ分子のいずれかとして分類される。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子は、免疫応答の開始および持続に関与する細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、マクロファージなど）上で主に発現される。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子は、ヘルパーＴリンパ球によって認識され、そしてヘルパーＴリンパ球の増殖および提示される特定の免疫原性ペプチドに対する免疫応答の増幅を誘導する。クラスＩ  ＭＨＣ分子は、ほぼ全ての有核細胞上で発現され、そして細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）によって認識され、これは、次いで、抗原保持細胞を破壊する。ＣＴＬは特に、腫瘍拒絶およびウイルス感染との闘いにおいて重要である。
【０００４】
ＣＴＬは、インタクトな外来抗原自体よりむしろＭＨＣクラスＩ分子に結合するペプチドフラグメントの形態である抗原を認識する。この抗原は、通常、細胞によって内因的に合成されねばならず、このタンパク質抗原の一部は、細胞質中で小さいペプチドフラグメントに分解される。これらの小さいペプチドのいくつかは、プレゴルジ（ｐｒｅ−Ｇｏｌｇｉ）区画に移行し、そしてクラスＩ重鎖と相互作用して、適切な折り畳みおよびサブユニットβ２ミクログロブリンとの会合を容易にする。次いで、このペプチド−ＭＨＣクラスＩ複合体は、発現および特異的ＣＴＬによる潜在的認識のために細胞表面に移動する。
【０００５】
ヒトＭＨＣクラスＩ分子である、ＨＬＡ−Ａ２．１の結晶構造の研究は、ペプチドが結合する溝が、クラスＩ重鎖のα１およびα２ドメインの折り畳みによって作製されることを示す（Ｂｊｏｒｋｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：５０６（１９８７））。しかし、この研究において、溝に結合するペプチドの正体は決定されなかった。
【０００６】
Ｂｕｕｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：１０６５（１９８８）は、ＭＨＣからの結合ペプチドの酸溶出の方法を最初に記載した。続いて、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅおよび共同研究者（Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：２９０（１９９１））は、クラスＩ分子に結合する天然でプロセシングされたペプチドを特徴付けするためのアプローチを開発した。他の研究者らは、Ｂ型のクラスＩ分子から溶出されたペプチドの従来の自動配列決定法（Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：３２６（１９９１））およびＡ２．１型のクラスＩ分子から溶出されたペプチドの質量分析法（Ｈｕｎｔら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５：１２６１（１９９２））によって、種々のＨＰＬＣ画分中のより大量のペプチドの直接的なアミノ酸配列決定を首尾よく達成した。ＭＨＣクラスＩの天然でプロセシングされたペプチドの特徴付けの概論は、ＲｏｔｚｓｃｈｋｅおよびＦａｌｋ（ＲｏｅｔｚｓｃｈｋｅおよびＦａｌｋ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １２：４４７（１９９１））によって示されている。
【０００７】
Ｓｅｔｔｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：３２９６（１９８９）は、ＭＨＣ対立遺伝子特異的モチーフを使用してＭＨＣ結合能力を予測し得ることを示した。Ｓｃｈａｅｆｆｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４６４９（１９８９）は、ＭＨＣ結合が免疫原性に関連することを示した。何人かの著者（Ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２１：２９６３−２９７０（１９９１）；Ｐａｍｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５３：８５２−９５５（１９９１））は、クラスＩ結合モチーフが、動物モデルにおける潜在的な免疫原性ペプチドの同定に適用され得るという予備的証拠を提供した。所定のクラスＩアイソタイプの多くのヒト対立遺伝子に特異的なクラスＩモチーフは、まだ記載されていない。これらの異なる対立遺伝子の合わせられた頻度が、大きな画分またはおそらく大半のヒト非近交系集団をカバーするに非常に十分に高くあるべきであることが所望される。
【０００８】
当該分野における発展にもかかわらず、先行技術はまだ、本研究に基づく有用なヒトペプチドベースのワクチンまたは治療剤を提供していない。本発明は、これらおよび他の利点を提供する。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、ＨＬＡ−Ａ２．１分子に対する結合モチーフを有する免疫原性ペプチドを含む組成物を提供する。適切なＭＨＣ対立遺伝子に結合する、この免疫原性ペプチドは、好ましくは、９〜１０残基長であり、そして２位および９位のような特定の位置で保存された残基を含む。さらに、これらのペプチドは、９アミノ酸長のペプチドの場合に１位、３位、６位および／または７位、ならびに１０アミノ酸長のペプチドの場合に１位、３位、４位、５位、７位、８位および／または９位のような他の位置で、本明細書中で定義されるようなネガティブな結合残基を含まない。本発明は、ＨＬＡ  Ａ２．１に効率的に結合するペプチドの選択を可能にするモチーフ内の位置を定義する。
【００１０】
多くの免疫原性標的タンパク質上のエピトープは、本発明のペプチドを使用して同定され得る。適切な抗原の例としては、前立腺癌特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎コア抗原および表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ１）、カポージ肉種ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ラッサウイルス、ヒト型結核菌（ＭＴ）、ｐ５３、ＣＥＡ、トリパノソーマ表面抗原（ＴＳＡ）およびＨｅｒ２／ｎｅｕが挙げられる。従って、このペプチドは、インビボ治療剤およびエキソビボ治療剤の両方ならびに診断適用のための薬学的組成物に有用である。
【００１１】
（定義）
用語「ペプチド」は、本明細書中で「オリゴペプチド」と交換可能に用いられ、代表的に、隣接するアミノ酸のα−アミノ基およびカルボニル基との間のペプチド結合によって互いに結合する、一連の残基（代表的に、Ｌ−アミノ酸）という。本発明のオリゴペプチドは、約１５残基長未満であり、そして通常、約８〜約１１の残基からなり、好ましくは、９または１０残基からなる。
【００１２】
「免疫原性ペプチド」は、このペプチドがＭＨＣ分子に結合し、そしてＣＴＬ応答を誘導するような、対立遺伝子特異的モチーフを含むペプチドである。本発明の免疫原性ペプチドは、適切なＨＬＡ−Ａ２．１分子に結合し得、そしてこの免疫原性ペプチドが由来する抗原に対して細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘導し得る。
【００１３】
免疫原性ペプチドは、本発明のアルゴリズムを使用して簡便に同定される。このアルゴリズムは、免疫原性ペプチドの選択を可能にするスコアを生じる数学的手順である。代表的に、「結合閾値」を有するアルゴリズムスコアを使用して、特定の親和性で結合する高い確率を有し、そしてそれは免疫原性であろうペプチドの選択を可能にする。このアルゴリズムは、ペプチドの特定の位置の特定のアミノ酸のＭＨＣ結合に対する効果またはモチーフ含有ペプチド中の特定の置換の結合に対する効果のいずれかに基づく。
【００１４】
「保存された残基」は、ペプチドの特定の位置で、ランダムな分布によって期待されるよりも有意により高頻度で存在するアミノ酸である。代表的に、保存された残基は、ＭＨＣ構造が免疫原性ペプチドとの接触点を提供し得る残基である。少なくとも１〜３個またはそれより多い（好ましくは２個）、定義された長さのペプチド内に保存された残基は、免疫原性ペプチドについてのモチーフを規定する。これらの残基は、代表的に、ペプチドが結合する溝と緊密に接触し、ここで、これらの側鎖は、この溝自体の特定のポケットに埋まっている。代表的に、免疫原性ペプチドは、３つまでの保存された残基、より通常は、２つの保存された残基を含む。
【００１５】
本明細書中で使用される場合、「ネガティブな結合残基」は、特定の位置（例えば、９マーの位置１、３、および／または７）に存在する場合、結合しないか、結合の乏しいペプチドであり、次いで免疫原性にならない（すなわち、ＣＴＬ応答を誘導しない）ペプチドを生じるアミノ酸である。
【００１６】
用語「モチーフ」とは、定義された長さ（通常約８〜約１１アミノ酸）のペプチドにおける残基のパターンをいい、これは特定のＭＨＣ対立遺伝子によって認識される。このペプチドモチーフは、代表的には、各ヒトＭＨＣ対立遺伝子で異なり、そして高度に保存された残基およびネガティブな残基のパターンにおいて異なる。
【００１７】
対立遺伝子についての結合モチーフは、正確さの程度の増加を伴い定義され得る。１つの場合、全ての保存残基は、ペプチドの正確な位置に存在し、そして位置１、３および／または７でネガティブな残基は存在しない。
【００１８】
句「単離された」または「生物学的に純粋」とは、そのネイティブな形態に見出されるようにそれに通常付随する成分を実質的または本質的に含まない物質をいう。従って、本発明のペプチドは、そのインサイチュの環境に通常会合する物質（例えば、抗原提示細胞上のＭＨＣ  Ｉ分子）を含まない。タンパク質が均質にまたは優位なバンドに単離されている場合でさえ、天然タンパク質の５〜１０％の範囲で所望のタンパク質と同時に精製された微量の混入物が存在する。本発明の単離されたポリペプチドは、内因性の同時精製されたようなタンパク質を含まない。
【００１９】
用語「残基」とは、アミド結合またはアミド結合模倣物によって、オリゴペプチド中に組み込まれるアミノ酸またはアミノ酸模倣物をいう。
【００２０】
（好ましい実施形態の説明）
本発明は、ヒトクラスＩ  ＭＨＣ（時折、ＨＬＡと称される）対立遺伝子サブタイプについての対立遺伝子特異的ペプチドモチーフ（特にＨＬＡ−Ａ２．１対立遺伝子により認識されるペプチドモチーフ）の決定に関する。次いで、これらのモチーフは、潜在的な抗原または自己抗原標的のアミノ酸配列が公知である、任意の所望の抗原（特に、ヒトウイルス疾患、癌または自己免疫疾患に関連する抗原）由来のＴ細胞エピトープを規定するために使用される。
【００２１】
多くの潜在的な標的タンパク質上のエピトープは、この様式で同定され得る。適切な抗原の例としては、前立腺癌特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｂ型肝炎コア抗原および表面抗原（ＨＢＶｃ、ＨＢＶｓ）、Ｃ型肝炎抗原、エプスタイン−バーウイルス抗原、メラノーマ抗原（例えば、ＭＡＧＨ−１）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原、ラッサウイルス、ヒト型結核菌（ＭＴ）、ｐ５３、ＣＥＡ、トリパノソーマ表面抗原（ＴＳＡ）およびＨｅｒ２／ｎｅｕが挙げられる。
【００２２】
これらの抗原由来のエピトープを含むペプチドを合成し、次いで、例えば、免疫蛍光染色およびフロー微量蛍光測定、ペプチド依存性クラスＩアセンブリアッセイ、およびペプチド競合によるＣＴＬ認識の阻害による、例えば、精製クラスＩ分子および放射性ヨウ化ペプチド、ならびに／または空のクラスＩ分子を発現する細胞を使用するアッセイにおいて、適切なＭＨＣ分子へ結合するそれらの能力を試験する。クラスＩ分子に結合するこれらのペプチドは、感染または免疫された個体に由来するＣＴＬに対する標的として機能するそれらの能力について、ならびに潜在的な治療剤として、ウイルス感染した標的細胞または腫瘍細胞と反応し得るＣＴＬ集団を生じさせ得る、初期のインビトロまたはインビボのＣＴＬ応答を誘導するそれらの能力について、さらに評価される。
【００２３】
ＭＨＣクラスＩ抗原は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ遺伝子座によりコードされる。ＨＬＡ−Ａ抗原およびＨＬＡ−Ｂ抗原は、適切な等密度で細胞表面に発現されるが、ＨＬＡ−Ｃの発現は、有意により低い（おそらく、１０倍程度低い）。これらの遺伝子座の各々は、多くの対立遺伝子を有する。本発明のペプチド結合モチーフは、各々の対立遺伝子サブタイプに比較的特異的である。
【００２４】
ペプチドベースのワクチンについて、本発明のペプチドは、好ましくは、ヒト集団において広範な分布を有するＭＨＣ  Ｉ分子によって認識されるモチーフを含む。ＭＨＣ対立遺伝子は、異なる民族群および人種内で異なる頻度で存在するので、標的ＭＨＣ対立遺伝子の選択は、その標的集団に依存し得る。表１は、異なる人種間のＨＬＡ−Ａ遺伝子座の種々の対立遺伝子産物の頻度を示す。例えば、大半のコーカソイド集団は、４つのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子サブタイプ（特に、ＨＬＡ−Ａ２．１、Ａ１、Ａ３．２およびＡ２４．１）に結合するペプチドによってカバーされ得る。同様に、大半のアジア集団は、第５の対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ１１．２へのペプチド結合を加え、包含される。
【００２５】
【表１】
2004517609.tif 000002
2004517609.tif 000003
ＤｕＰｏｎｔ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ＨＬＡ，第Ｉ巻、Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  １９８７、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９より編集された表
＊Ｎ−ネグロイド；Ａ＝アジア人；Ｃ＝コーカソイド。括弧内の数は、本分析に含まれる個体の数を表す。
【００２６】
ペプチド化合物を記載するために使用される命名法は、アミノ基が各アミノ酸残基の左（Ｎ末端）に、そしてカルボキシル基が各アミノ酸残基の右（Ｃ末端）に表される、従来の慣行に従う。本発明の選択された特定の実施形態を表す式において、アミノ末端基およびカルボキシル末端基は、具体的に示されないが、他で特定されない限り、生理学的ｐＨ値で想定される形態にある。アミノ酸の構造式において、各残基は、標準的な３文字または１文字表記によって一般的に表される。アミノ酸残基のＬ型は、大文字の１文字表記または３文字記号の最初の文字の大文字表記によって表され、そしてＤ形態を有するこれらのアミノ酸に対するＤ形態は、小文字の１文字表記または小文字の３文字表記によって表される。グリシンは、不斉炭素原子を有さず、単に「Ｇｌｙ」またはＧと称する。
【００２７】
本発明のペプチドを同定するために使用される手順は、一般に、Ｆａｌｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：２９０（１９９１）（本明細書中で参考として援用される）に開示の方法に従う。要するに、この方法は、代表的に、免疫沈降またはアフィニティークロマトグラフィーによる、適切な細胞または細胞株からのＭＨＣクラスＩ分子のラージスケールでの単離を含む。当業者に等しく周知の、所望のＭＨＣ分子を単離するための他の方法の例としては、イオン交換クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、高速液体（ｌｉｇａｎｄ）クロマトグラフィー、および上記の技術の全ての組み合わせを含む。
【００２８】
代表的な場合、免疫沈降を使用して、所望の対立遺伝子を単離する。多くのプロトコルが、使用する抗体の特異性に依存して使用され得る。例えば、対立遺伝子特異的ｍＡｂ試薬は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ１、およびＨＬＡ−Ｃ分子のアフィニティー精製のために使用され得る。ＨＬＡ−Ａ分子の単離のためのいくつかのｍＡｂ試薬が、利用可能である。モノクローナルＢＢ７．２は、ＨＬＡ−Ａ２分子の単離のために適切である。標準的な技術を使用してこれらのｍＡｂで調製されるアフィニティーカラムは、それぞれのＨＬＡ−Ａ対立遺伝子産物を精製するために首尾よく使用される。
【００２９】
対立遺伝子特異的ｍＡｂに加え、広範な反応性の抗ＨＬＡ−Ａ，Ｂ，Ｃ  ｍＡｂ（例えば、Ｗ６／３２およびＢ９．１２．１）、および１つの抗ＨＬＡ−Ｂ，Ｃ  ｍＡｂである、Ｂ１．２３．２は、以前の適用において記載された代替的なアフィニティー精製プロトコルにおいて使用され得る。
【００３０】
単離されたＭＨＣ分子のペプチド結合溝に結合したペプチドは、代表的には、酸処理を用いて溶出される。ペプチドはまた、種々の標準的な変性手段（例えば、熱、ｐＨ、界面活性剤、塩、カオトロピック剤、またはそれらの組合せ）によってクラスＩ分子から解離され得る。
【００３１】
ペプチド画分は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってＭＨＣ分子からさらに分離され、そして配列決定される。ペプチドは、当業者に周知の種々の他の標準的な手段（濾過、限外濾過、電気泳動、サイズクロマトグラフィー、特異的抗体を用いる沈降、イオン交換クロマトグラフィー、等電点電気泳動などを含む）によって分離され得る。
【００３２】
単離されたペプチドの配列決定は、エドマン分解（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  Ｍ．Ｗ．ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．９１，３９９（１９８３））のような標準的な技術に従って実施され得る。配列決定のために適切な他の方法は、以前に記載された通りの個々のペプチドの質量分析配列決定（本明細書中に参考として援用される、Ｈｕｎｔら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５：１２６１（１９９２））を含む。種々のクラスＩ分子由来の大量の不均質なペプチド（例えば、プールされたＨＰＬＣ画分）のアミノ酸配列決定は、代表的には、各クラスＩ対立遺伝子について特徴的な配列モチーフを示す。
【００３３】
種々のクラスＩ対立遺伝子について特異的なモチーフの定義は、アミノ酸配列が公知である抗原性タンパク質由来の可能性のあるペプチドエピトープの同定を可能にする。代表的には、可能性のあるペプチドエピトープの同定は、モチーフの存在について所望の抗原のアミノ酸配列を走査するためにコンピューターを用いて最初に実施される。次いで、エピトープ配列が合成される。ＭＨＣクラス分子への結合能が、種々の異なる方法で測定される。１つの手段は、上記の関連出願に記載される通りのクラスＩ分子結合アッセイである。文献に記載される他の代替手段としては、抗原提示の阻害（Ｓｅｔｔｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：３８９３（１９９１））、インビトロアセンブリアッセイ（Ｔｏｗｎｓｅｎｄら，Ｃｅｌｌ  ６２：２８５（１９９０））、および変異させた細胞（ｅｌｌｓ）（例えば、ＲＭＡ．Ｓ）を用いる、ＦＡＣＳに基づくアッセイ（Ｍｅｌｉｅｆら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２９６３（１９９１））が挙げられる。
【００３４】
次いで、ＭＨＣクラスＩ結合アッセイにおいてポジティブであると試験されるペプチドが、これらのペプチドの、インビトロで特異的ＣＴＬ応答を誘導する能力についてアッセイされる。例えば、ペプチドとともにインキュベートされた抗原提示細胞は、応答細胞集団においてＣＴＬ応答を誘導する能力についてアッセイされ得る。抗原提示細胞は、末梢血単核細胞または樹状細胞のような正常細胞であり得る（Ｉｎａｂａら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１８２（１９８７）；Ｂｏｏｇ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：２１９（１９８８））。
【００３５】
あるいは、クラスＩ分子を、内部でプロセシングされたペプチドとともに負荷する能力を欠損する変異体哺乳動物細胞株（例えば、マウス細胞株ＲＭＡ−Ｓ（Ｋａｅｒｒｅら，Ｎａｔｕｒｅ，３１９：６７５（１９８６）；Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：２９６３−２９７０（１９９１））、およびヒト体細胞Ｔ細胞ハイブリッド、Ｔ−２（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４５：４４９−４５２（１９９０））であって、適切なヒトクラスＩ遺伝子でトランスフェクトされた変異体哺乳動物細胞株は、ペプチドをこれらの細胞に添加する場合、このペプチドがインビトロで一次ＣＴＬ応答を誘導する能力について試験するために便利に用いられる。用いられ得る他の真核生物細胞株としては、蚊の幼生（ＡＴＣＣ細胞株ＣＣＬ  １２５、１２６、１６６０、１５９１、６５８５、６５８６）、カイコ（ＡＴＴＣ  ＣＲＬ  ８８５１）、アワヨトウムシ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １７１１）、蛾（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ８０）、およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞株（例えば、シュナイダー細胞株（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．２７：３５３−３６５（１９２７）を参照のこと））のような種々の昆虫細胞株が挙げられる。
【００３６】
末梢血リンパ球は、正常なドナーまたは患者の静脈穿刺または白血球除去血輸血の後に便利に単離され、そしてＣＴＬ前駆体の応答細胞供給源として用いられる。１つの実施形態では、適切な抗原提示細胞は、１０μＭ〜１００μＭのペプチドとともに無血清培地中で４時間、適切な培養条件下でインキュベートされる。次いで、ペプチドを負荷した抗原提示細胞は、応答細胞集団とともにインビトロで７日間〜１０日間、最適化された培養条件下でインキュベートされる。ポジティブなＣＴＬ活性化は、培養物を、特異的なペプチドをパルスした標的、ならびにこのペプチド配列が誘導された内因的にプロセシングされた形態の関連のウイルスまたは腫瘍抗原を発現する標的細胞の両方の、放射性標識された標的細胞を殺傷するＣＴＬの存在についてアッセイすることにより決定され得る。
【００３７】
ＣＴＬの特異性およびＭＨＣ拘束は、適切または不適切なヒトＭＨＣクラスＩを発現する種々のペプチド標的細胞に対して試験することにより決定される。ＭＨＣ結合アッセイにおいてポジティブと試験され、そして特異的ＣＴＬ応答を生じるペプチドは、本明細書中で免疫原性ペプチドと呼ばれる。
【００３８】
この免疫原性ペプチドは、合成によって、または組換えＤＮＡ技術によって、または天然の供給源（例えば、ウイルス全体または腫瘍全体）から調製され得る。これらのペプチドは、好ましくは、他の天然に存在する宿主細胞タンパク質およびそれらのフラグメントを実質的に含まないが、いくつかの実施形態では、これらのペプチドは、合成によって、天然のフラグメントまたは粒子に対して結合体化され得る。
【００３９】
これらのポリペプチドまたはペプチドは、種々の長さであり得、それらの中性（非荷電）形態または塩である形態のいずれかであり得、そしてグリコシル化、側鎖の酸化、もしくはリン酸化のような改変を含まないか、またはその改変が本明細書中に記載される通りのポリペプチドの生物学的活性を破壊しないことを条件として、これらの改変を含むかのいずれかであり得る。
【００４０】
望ましくは、これらのペプチドは、大きなペプチドの生物学的活性の実質的に全てを依然として維持しながらも、できる限り小さい。可能な場合、本発明のペプチドを、細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子に結合している内因的にプロセシングされたウイルスペプチドまたは腫瘍細胞ペプチドとサイズが釣り合っている、９または１０個のアミノ酸残基の長さに最適化することが所望され得る。
【００４１】
所望の活性を有するペプチドは、所望のＭＨＣ分子に結合し、そして適切なＴ細胞を活性化する、未改変のペプチドの生物学的活性を実質的に全てを増加させながらも、または未改変のペプチドの生物学的活性を実質的に全てを少なくとも維持しながらも、特定の所望の特性（例えば、改善された薬理学的特徴）を提供するように必要に応じて改変され得る。例えば、これらのペプチドは、種々の変更（例えば、保存的または非保存的のいずれかの置換）に供され得、ここで、このような変更は、それらの用途における特定の利点（例えば、改善されたＭＨＣ結合）を提供し得る。保存的置換によって、アミノ酸残基を、生物学的および／または化学的に類似である別のアミノ酸残基で（例えば、ある疎水性残基を別のもので、またはある極性残基を別のもので）置換することが意味される。このような置換としては、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒのような組合せが挙げられる。単一アミノ酸置換の効果はまた、Ｄアミノ酸を用いてプローブされ得る。このような改変は、本明細書中に参考として援用される、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３２：３４１−３４７（１９８６），ＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ＧｒｏｓｓおよびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編（Ｎ．Ｙ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），１−２８４頁（１９７９）；ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，Ｐｉｅｒｃｅ），第２版（１９８４）に記載される通りの周知のペプチド合成手順を用いて行われ得る。
【００４２】
これらのペプチドはまた、この化合物のアミノ酸配列を、例えば、アミノ酸の付加または欠失によって伸長または減少させることにより改変され得る。本発明のペプチドまたはアナログはまた、特定の残基の順番または組成を変更することにより改変され得、生物学的活性に必須の特定のアミノ酸残基（例えば、重要な接触部位のアミノ酸残基または保存された残基）が、一般には生物学的活性に有害な効果を与えずに変更されないかもしれないことは容易に理解される。重要でないアミノ酸は、タンパク質中で天然に存在するアミノ酸（例えば、Ｌ−α−アミノ酸）またはそれらのＤ異性体に制限される必要はなく、非天然のアミノ酸（例えば、β−γ−δ−アミノ酸）ならびにＬ−α−アミノ酸の多くの誘導体をも含み得る。
【００４３】
代表的には、単一アミノ酸置換を有する一連のペプチドは、結合に対する静電荷、疎水性などの効果を決定するために用いられる。例えば、一連の正に荷電したアミノ酸（例えば、ＬｙｓまたはＡｒｇ）または負に荷電したアミノ酸（例えば、Ｇｌｕ）の置換は、種々のＭＨＣ分子およびＴ細胞レセプターに対し異なる感受性パターンを示すペプチドの長さに沿って行われる。さらに、小さな、比較的中性の部分（例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、または類似の残基）を用いる複数の置換が用いられ得る。これらの置換物は、ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーであり得る。置換または付加される残基の数およびタイプは、必須の接触点の間で必要とされる間隔、および求められる特定の機能的特性（例えば、疎水性対親水性）に依存する。ＭＨＣ分子またはＴ細胞レセプターについての、親ペプチドの親和性と比較して増加した結合親和性はまた、このような置換によって達成され得る。とにかく、このような置換は、例えば、結合を破壊し得る立体妨害および電荷妨害を回避するように選択されたアミノ酸残基または他の分子フラグメントを用いるべきである。
【００４４】
アミノ酸置換は、代表的に、単一残基の置換である。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組合せは、最終的なペプチドに到達するように組み合わされ得る。置換改変体は、ペプチドの少なくとも１つの残基が除去され、そして異なる残基がその場所に挿入されている改変体である。このような置換は、一般に、ペプチドの特徴を精巧に調整することが所望される場合には、以下の表２に従って行われる。
【００４５】
【表２】
2004517609.tif 000004
機能（例えば、ＭＨＣ分子またはＴ細胞レセプターに対する親和性）における実質的変更は、表２における置換よりも保存性が低い置換を選択することにより、すなわち、（ａ）置換の領域におけるペプチド骨格の構造（例えば、シートまたはヘリックス構造など）、（ｂ）標的部位の分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のかさを維持することに対するそれらの効果においてより有意に異なる残基を選択することにより行われる。ペプチド特性に最大の変化を生じると一般に期待される置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリル）が疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、またはアラニル）を置換しているもの（または疎水性残基で置換されているもの）；（ｂ）陽性の側鎖を有する残基（例えば、リジル、アルギニル、またはヒスチジル）が陰性残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）を置換しているもの（または陰性残基によって置換されているもの）；あるいは（ｃ）嵩高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が側鎖を有さない残基（例えば、グリシン）を置換しているもの（または側鎖を有さない残基によって置換されているもの）である。
【００４６】
これらのペプチドはまた、免疫原性ペプチドにおける２以上の残基の同配体を有し得る。本明細書中に定義される場合の同配体は、第１の配列の立体的コンホメーションが、第２の配列に特異的な結合部位に適合するので、第２の配列を置換し得る２以上の残基の配列である。この用語は、当業者に周知のペプチド骨格改変を特異的に含む。このような改変としては、アミド窒素、α炭素、アミドカルボニルの改変、アミド結合の完全な置換、伸長、欠失、または骨格の架橋が挙げられる。一般的に、Ｓｐａｔｏｌａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，第ＶＩＩ巻（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編，１９８３）を参照のこと。
【００４７】
種々のアミノ酸模倣物または非天然アミノ酸でのペプチドの改変は、インビボでのペプチドの安定性を増加させる際に特に有用である。安定性は、多数の方法においてアッセイされ得る。例えば、ペプチダーゼおよび種々の生物学的培地（例えば、ヒト血漿および血清）は、安定性を試験するために用いられている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．１１：２９１−３０２（１９８６）を参照のこと。本発明のペプチドの半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを用いて便利に決定される。このプロトコルは、一般に以下の通りである。プールされたヒト血清（ＡＢ型、熱不活化していない）は、使用前に遠心分離によって脱脂（ｄｅｌｉｐｉｄａｔｅ）される。次いで、この血清は、ＲＰＭＩ組織培養培地を用いて２５％になるように希釈され、そしてペプチドの安定性を試験するために用いられる。所定の時間間隔で、少量の反応溶液を取り出し、そして６％トリクロロ酢酸水溶液またはエタノールのいずれかに添加する。濁った反応サンプルを１５分間冷却（４℃）し、次いで回転させて沈澱した血清タンパク質をペレット化する。次いで、ペプチドの存在を、安定性特異的クロマトグラフィー条件を用いる逆相ＨＰＬＣによって決定する。
【００４８】
ＣＴＬ刺激活性を有する本発明のペプチドまたはそれらのアナログは、改善された血清半減期以外の所望の特性を提供するように改変され得る。例えば、このペプチドがＣＴＬ活性を誘導する能力は、Ｔヘルパー細胞応答を誘導し得る少なくとも１つのエピトープを含む配列を連結することにより増強され得る。特に好ましい免疫原性ペプチド／Ｔヘルパー結合体は、スペーサー分子によって連結される。このスペーサーは、代表的に、比較的小さな、中性の分子（例えば、生理学的条件化で実質的に非荷電のアミノ酸またはアミノ酸模倣物）から構成される。スペーサーは、代表的には、例えば、Ａｌａ、Ｇｌｙ、または非極性アミノ酸もしくは中性極性アミノ酸の他の中性のスペーサーから選択される。この必要に応じて存在するスペーサーは同じ残基から構成される必要性はなく、従って、ヘテロオリゴマーまたはホモオリゴマーであり得ることが理解される。存在する場合、このスペーサーは、通常、少なくとも１または２の残基であり、より通常は、３〜６の残基である。あるいは、このＣＴＬペプチドは、Ｔヘルパーペプチドにスペーサーなしで連結され得る。
【００４９】
この免疫原性ペプチドは、Ｔヘルパーペプチドに直接的またはスペーサーを介してのいずれかで、ＣＴＬペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかで連結され得る。免疫原性ペプチドまたはＴヘルパーペプチドのいずれかのアミノ末端は、アシル化され得る。例示的なＴヘルパーペプチドとしては、破傷風トキソイド８３０〜８４３、インフルエンザ３０７〜３１９、マラリアサーカムスポロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）３８２〜３９８および３７８〜３８９が挙げられる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本発明の薬学的組成物中に、ＣＴＬのプライミングを補助する少なくとも１つの成分を含むことが所望され得る。脂質は、インビボでウイルス抗原に対するＣＴＬのプライミングを補助し得る薬剤であると同定されている。例えば、パルミチン酸残基は、Ｌｙｓ残基のαアミノ基およびεアミノ基に結合され得、次いで、例えば、１以上の連結残基（例えば、Ｇｌｙ、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−、Ｓｅｒ、Ｓｅｒ−Ｓｅｒなど）を介して免疫原性ペプチドへと連結され得る。次いで、この脂質化されたペプチドは、リポソーム中に取り込まれるか、またはアジュバント（例えば、不完全フロイントアジュバント）中に乳化されて、ミセル形態で直接注射され得る。好ましい実施形態では、特に有効な免疫原は、Ｌｙｓのαアミノ基およびεアミノ基に結合したパルミチン酸を含み、このＬｙｓは、結合（例えば、Ｓｅｒ−Ｓｅｒ）を介して免疫原性ペプチドのアミノ末端に結合している。
【００５１】
ＣＴＬ応答の脂質プライミングの別の例として、Ｅ．ｃｏｌｉリポタンパク質（例えば、トリパルミトイル−Ｓ−グリセリルシルテイニルセリル（ｇｌｙｃｅｒｙｌｃｙｓｔｅｉｎｌｙｓｅｒｙｌ）−セリン（Ｐ３ＣＳＳ））は、適切なペプチドに共有結合された場合、ウイルス特異的ＣＴＬをプライミングするために用いられ得る。本明細書中に参考として援用される、Ｄｅｒｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：５６１−５６４（１９８９）を参照のこと。本発明のペプチドは、例えば、Ｐ３ＣＳＳに結合され得、そしてこのリポペプチドは個体に投与されて、標的抗原に対するＣＴＬ応答を特異的にプライミングし得る。さらに、中和抗体の誘導はまた、適切なエピトープを提示するペプチドへと結合体化されたＰ３ＣＳＳでプライミングされ得るので、この２つの組成物が合わされて、感染に対する体液性および細胞媒介性の両方の応答をより効率的に惹起し得る。
【００５２】
さらに、さらなるアミノ酸が、ペプチドを１つのものを別のものへと連結することの容易さ、キャリア支持体もしくはより大きなペプチドへと結合すること、ペプチドもしくはオリゴペプチドの物理的もしくは化学的な特性を改変することなどを提供するために、ペプチドの末端に付加され得る。チロシン、システイン、リジン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸などのようなアミノ酸が、ペプチドまたはオリゴペプチドのＣ末端またはＮ末端に導入され得る。いくつかの場合、Ｃ末端での改変は、そのペプチドの結合の特徴を変更し得る。さらに、これらのペプチドまたはオリゴペプチド配列は、末端ＮＨ２アセチル化（例えば、アルカノイル（Ｃ１〜Ｃ２０）またはチオグリコリルアセチル化）、末端カルボキシルアミド化（例えば、アンモニア、メチルアミン）などによって改変されていることによって天然の配列とは異なり得る。いくつかの例では、これらの改変は、支持体または他の分子へと連結するための部位を提供し得る。
【００５３】
本発明のペプチドは、広範な種々の方法において調製され得る。それらが相対的に短いサイズであるので、これらのペプチドは、従来の技術に従って溶液中でまたは固体支持体上で合成され得る。種々の自動合成機が、市販されており、そして公知のプロトコルに従って用いられ得る。例えば、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２版，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（１９８４）（前出）を参照のこと。
【００５４】
あるいは、組換えＤＮＡ技術が用いられ得、ここで、目的の免疫原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現ベクター中に挿入され、適切な宿主細胞中に形質転換またはトランスフェクトされ、そして発現に適切な条件下で培養される。これらの手順は一般に、本明細書中で参考として援用される、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）に一般的に記載される通りに当該分野で公知である。従って、本発明の１以上のペプチド配列を含む融合タンパク質は、適切なＴ細胞エピトープを提示するために用いられ得る。
【００５５】
本明細書中で意図される長さのペプチドについてのコード配列は、化学的技術（例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）のホスホトリエステル法）によって合成され得るので、改変は、適切な塩基でネイティブなペプチド配列をコードする塩基を置換することによって簡便に行われ得る。次いで、このコード配列には、適切なリンカーが提供され得、そして当該分野で市販される発現ベクター中に連結され得、そしてこれらのベクターを用いて適切な宿主を形質転換して所望の融合タンパク質を産生し得る。多数のこのようなベクターおよび適切な宿主系が、現在利用可能である。この融合タンパク質の発現のために、このコード配列には、所望の細胞宿主における発現のための発現ベクターを提供するための、作動可能に連結された開始コドンおよび終止コドン、プロモーター領域およびターミネーター領域、ならびに通常は複製系が提供される。例えば、細菌宿主と適合性のプロモーター配列が、所望のコード配列の挿入のために便利な制限部位を含むプラスミド中に提供される。得られる発現ベクターは、適切な細菌宿主中に形質転換される。もちろん、適切なベクターおよび制御配列を用いる、酵母または哺乳動物細胞宿主もまた用いられ得る。
【００５６】
本発明のペプチドならびにそれらの薬学的組成物およびワクチン組成物は、哺乳動物（特にヒト）へ投与して、ウイルス感染および癌を処置および／または予防するために有用である。本発明の免疫原性ペプチドを用いて処置され得る疾患の例としては、前立腺癌、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＡＩＤＳ、腎臓癌、頚部癌、リンパ腫、ＣＭＶ、および尖圭コンジローム（ｃｏｎｄｌｙｌｏｍａ  ａｃｕｍｉｎａｔｕｍ）が挙げられる。
【００５７】
薬学的組成物について、本発明の免疫原性ペプチドは、癌をすでに罹患しているか、または目的のウイルスに感染している個体に投与される。感染の潜伏期または急性期にある個体は、適切に、免疫原性ペプチドを別々に用いて、または他の処置と組み合わせて処置され得る。治療適用において、組成物は、ウイルスまたは腫瘍抗原に対する有効なＣＴＬ応答を誘発するため、ならびに症状および／または合併症を治癒または少なくとも部分的に停止させるために十分な量で、患者に投与される。これを達成するために適切な量は、「治療有効用量」として規定される。この用途のために有効な量は、例えば、ペプチド組成、投与の様式、処置される疾患の段階および重篤度、患者の体重および一般的な健康状態、ならびに処方医の判断に依存するが、一般的には、最初の免疫（これは、治療的投与または予防的投与のためである）については、７０ｋｇの患者では約１．０μｇ〜約５，０００μｇのペプチドの範囲であり、患者の血液中の特異的ＣＴＬ活性を測定することにより、患者の応答および状態に依存して、数週間から数ヶ月にわたる追加免疫レジメに従う、約１．０μｇ〜約１，０００μｇのペプチドの追加投薬量が続く。本発明のペプチドおよび組成物が、一般的に、重篤な疾患状態（すなわち、生命を脅かす状況または生命を脅かす可能性のある状況）で使用され得ることを心に留めておかなければならない。このような場合において、外来性物質の最小化およびペプチドの比較的非毒性の性質を考慮して、実質的に過剰なこれらのペプチド組成物を投与することが可能であり、そしてこのことは処置医によって望ましいと感じられ得る。
【００５８】
治療用途のために、投与は、ウイルス感染の最初の徴候のとき、または腫瘍の検出もしくは外科的除去のとき、または急性感染の場合は診断のすぐ後に開始すべきである。これには、少なくとも症状が実質的に軽減されるまで、およびその後の期間、追加用量が続く。慢性の感染において、負荷用量、続く追加用量が必要とされ得る。
【００５９】
本発明の組成物での感染個体の処置は、急性感染個体において感染の消散を早め得る。慢性の感染を発症しやすい（または、その素因を有する）個体について、この組成物は、急性から慢性への感染の進行を妨げるための方法において特に有用である。この発症しやすい個体が、感染の前または感染の間に、例えば、本明細書中で記載されるように同定される場合、この組成物は、これらの個体に対して標的化され得、より大きな集団への投与の必要性を最小にし得る。
【００６０】
ペプチド組成物はまた、慢性の感染の処置のため、および免疫系を刺激してキャリアにおけるウイルス感染細胞を排除するために使用され得る。細胞傷害性Ｔ細応答を効果的に刺激するために充分な量の免疫強化ペプチドを処方物および投与態様において提供することが重要である。従って、慢性の感染の処置について、代表的な用量は、１用量あたり７０ｋｇの患者について、約１．０μｇ〜約５，０００μｇ、好ましくは、約５μｇから１，０００μｇの範囲である。免疫用量、その後の例えば、１週間から４週間の確立された間隔をおいての追加免疫用量が、おそらく、個体を効果的に免疫するために延長された期間にわたって必要とされ得る。慢性の感染の場合、投与は、少なくとも臨床的な症状または研究室試験が、ウイルス感染が排除されたかまたは実質的に減少したことを示すまで、およびその後の期間継続されるべきである。
【００６１】
治療的処置のための薬学的組成物は、非経口的、局所的、経口的、または局部的投与が意図される。好ましくは、薬学的組成物は、非経口的に（例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内に）投与される。従って、本発明は、受容可能なキャリア（好ましくは、水性キャリア）中に溶解されたかまたは懸濁された免疫原性ペプチドの溶液を含む、非経口投与のための組成物を提供する。種々の水性キャリア（例えば、水、緩衝化した水、０．８％の生理食塩水、０．３％のグリシン、ヒアルロン酸など）が使用され得る。これらの組成物は、従来の、周知の滅菌技術によって滅菌され得るか、または滅菌濾過され得る。得られる水溶液は、投与の前に滅菌の溶液と合わされる凍結乾燥調製物としての使用のためにパッケージングされ得るかまたは凍結乾燥され得る。この組成物は、生理学的条件に近似するために必要とされる薬学的に受容可能な補助物質（例えば、ｐＨ調整および緩衝化剤、張性調整剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミンなど）を含み得る。
【００６２】
薬学的処方物中の本発明のＣＴＬ刺激ペプチドの濃度は、非常に広く変化し得る。すなわち、約０．１重量％未満、通常は約２重量％から、または少なくとも約２重量％から、２０重量％〜５０重量％以上の程度の高さまでであり、そして選択される特定の投与態様に従って、流体容量、粘度などによって主に選択される。
【００６３】
本発明のペプチドはまた、特定の組織（例えば、リンパ組織）または選択的に標的化された感染細胞に対してペプチドを標的化するようにリポソームを介して投与され得る。リポソームはまた、ペプチド組成物の半減期を増大させる際に有用である。リポソームとしては、乳濁物、発泡体、ミセル、不溶性の単層、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層などが挙げられる。これらの調製物では、送達されるべきペプチドは、リポソームの一部として、単独で、または例えば、リンパ系細胞の中でも一般的なレセプターに結合する分子（例えば、ＣＤ４５抗原に結合するモノクローナル抗体）と組み合わせて、または他の治療用もしくは免疫原性組成物とともに取り込まれる。従って、本発明の所望のペプチドで満たされたかまたは修飾されたリポソームは、リンパ系細胞の部位に対して指向され得、ここで、リポソームは次いで、選択された治療用／免疫原性ペプチド組成物を送達する。本発明での使用のためのリポソームは、標準的なベシクル形成脂質から形成され、これは、一般的に、中性の、および陰性に荷電したリン脂質およびステロール（例えば、コレステロール）を含む。脂質の選択は、一般的には、例えば、リポソームの大きさ、酸不安定性、および血流中のリポソームの安定性の考慮によって導かれる。本明細書中で参考として援用される、例えば、Ｓｚｏｋａら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．９：４６７（１９８０）、米国特許第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、および同第５，０１９，３６９号に記載されるような種々の方法が、リポソームの調製に利用可能である。
【００６４】
免疫細胞を標的化するために、リポソーム中に取りこまれるべきリガンドとしては、例えば、所望の免疫系の細胞の細胞表面決定基に特異的な抗体またはそのフラグメントが挙げられ得る。ペプチドを含有するリポソーム懸濁物が、静脈内、局部的、局所的などで、とりわけ投与様式、送達されるべきペプチド、および処置されるべき疾患の段階に従って変化する用量で投与され得る。
【００６５】
固形の組成物について、従来の非毒性の固形キャリアが使用され得る。この固形キャリアとしては、例えば、薬学的グレードの、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む。経口投与について、薬学的に受容可能な非毒性の組成物が、任意の通常使用される賦形剤（例えば、上記に列挙されるキャリア）、および一般的に１０〜９５％（さらに好ましくは、２５％〜７５％の濃度で）の有効成分（すなわち、本発明の１つ以上のペプチド）を取り込むことによって形成される。
【００６６】
エアロゾル投与について、免疫原性ペプチドは、好ましくは、界面活性剤およびプロペラントとともに、細かく分けられた形態で供給される。ペプチドの代表的なパーセンテージは、０．０１重量％〜２０重量％であり、好ましくは、１重量％〜１０重量％である。界面活性剤は、もちろん、非毒性でなければならず、そして好ましくはプロペラントに可溶性でなければならない。このような薬剤の代表は、６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸のエステルまたは部分的なエステル（例えば、脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物を有する、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレスチン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）、およびオレイン酸）である。混合されたエステル（例えば、混合されたまたは天然のグリセリド）が使用され得る。界面活性剤は、この組成物の０．１重量％〜２０重量％を構成し得、好ましくは、０．２５重量％〜５重量％を構成する。組成物の残りは、通常、プロペラントである。所望される場合は、キャリアもまた、例えば、鼻腔内送達のためにはレシチンを用いるように、含まれ得る。
【００６７】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載の免疫原性ペプチドの免疫学的に有効な量を活性成分として含むワクチンに関する。ペプチドは、宿主（ヒトを含む）に導入され得、それ自体のキャリアに対して個々に連結され得、あるいは、ペプチドは、活性ペプチド単位のホモポリマーまたはヘテロポリマーとして導入し得る。このようなポリマーは、増加した免疫学的反応という利点を有し、そして種々のペプチドを用いてポリマーを作製する場合、ウイルスまたは腫瘍細胞の種々の抗原性決定基と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘導するさらなる能力を有する。有用なキャリアが当該分野で周知であり、そしてこれらのキャリアとしては、例えば、チログロブリン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）、破傷風トキソイド、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−リジン、ポリ−グルタミン酸）、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス組換えワクチンなどが挙げられる。ワクチンは、水または生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水のような生理学的に寛容可能な（すなわち、受容可能な）希釈剤さらに代表的なアジュバントを含み得る。不完全フロイトアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、またはミョウバンのようなアジュバントは、当該分野で周知の物質である。さらに、上記のように、ＣＴＬ応答は、脂質（例えば、Ｐ３ＣＳＳ）に対して本発明のペプチドを結合体化させることによってプライム（ｐｒｉｍｅ）され得る。本明細書中に記載されるようなペプチド組成物を、注射、エアゾール、経口、経皮または他の経路を介して免疫すると、宿主の免疫系は所望の抗原に特異的なＣＴＬを大量に産生することによってワクチンに応答する。そしてこの宿主は後の感染に少なくとも部分的に免疫になるか、または慢性感染を発症することに耐性になる。
【００６８】
本発明のペプチドを含有するワクチン組成物は、ウイルス感染もしくは癌を罹患しやすいか、またはそうでなければウイルス感染もしくは癌の危険性を有する患者に、抗原に対する免疫応答を誘発し、従って患者自体の免疫応答能力を増強するために投与される。このような量は、「免疫原的に有効な用量」として規定される。この用途において、正確な量はさらに、患者の健康状態および体重、投与様式、処方物の性質などに依存するが、一般的には、７０ｋｇの患者あたり約１．０μｇから約５，０００μｇの範囲であり、より一般的には、７０ｋｇの体重あたり約１０μｇから約５００μｇの範囲である。
【００６９】
いくつかの場合、本発明のペプチドワクチンを、目的のウイルス（特に、ウイルスエンベロープ抗原）に対する中和抗体応答を誘導するワクチンと合わせることが所望され得る。
【００７０】
治療または免疫の目的のために、１以上の本発明のペプチドをコードする核酸はまた、患者に投与され得る。多数の方法が、核酸を患者に送達するために従来用いられている。例えば、核酸は、「裸のＤＮＡ」として直接送達され得る。このアプローチは、例えば、Ｗｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５−１４６８（１９９０）ならびに米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号に記載される。核酸はまた、例えば、米国特許第５，２０４，２５３号に記載されるような、バリスティック（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ）送達を使用して投与され得る。ＤＮＡのみから構成される粒子が投与され得る。あるいは、ＤＮＡは、金粒子のような粒子に接着され得る。核酸はまた、カチオン性化合物（例えば、カチオン性脂質）に対して複合体化されて送達され得る。脂質によって媒介される遺伝子送達方法は、例えば、ＷＯ  ９６／１８３７２；ＷＯ  ９３／２４６４０；ＭａｎｎｉｎｏおよびＧｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６（７）：６８２−６９１；Ｒｏｓｅ  米国特許第５，２７９，８３３号；ＷＯ  ９１／０６３０９；ならびにＦｅｌｇｎｅｒら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１４に記載される。本発明のペプチドはまた、弱毒化されたウイルス宿主（例えば、ワクシニアまたは鶏痘）によって発現され得る。このアプローチには、本発明のペプチドをコードするヌクレオチド配列を発現するベクターとしてのワクシニアウイルスの使用を含む。急性または慢性に感染した宿主への導入、または未感染の宿主への導入によって、この組換えワクシニアウイルスは免疫原性ペプチドを発現し、それによって宿主のＣＴＬ応答を誘発する。免疫プロトコールにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法は、例えば、本明細書中で参考として援用される米国特許第４，７２２，８４８号に記載される。別のベクターは、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）である。ＢＣＧベクターは、本明細書中で参考として援用されるＳｔｏｖｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ  ３５１：４５６−４６０（１９９１））に記載される。本発明のペプチドの治療的投与または免疫に有用な広範な種々の他のベクター（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉベクターなど）は、本明細書中の記載から当業者に明らかである。
【００７１】
本発明のペプチドをコードする核酸を投与する好ましい手段は、本発明の複数のエピトープをコードするミニ遺伝子構築物を使用する。ヒト細胞中での発現のための選択されたＣＴＬエピトープをコードするＤＮＡ配列（ミニ遺伝子）を作製するために、このエピトープのアミノ酸配列が逆翻訳される。ヒトのコドン使用表が、各アミノ酸のコドン選択を導くために使用される。これらのエピトープをコードするＤＮＡ配列は、直接的に付加されて、連続するポリペプチド配列を作製する。発現および／または免疫原性を最適化するために、さらなるエレメントが、ミニ遺伝子の設計に取り込まれ得る。逆翻訳され得、そしてミニ遺伝子配列に含まれ得るアミノ酸配列の例としては、以下が挙げられる：ヘルパーＴリンパ球エピトープ、リーダー（シグナル）配列、および小胞体残留シグナル。さらに、ＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示は、合成の（例えば、ポリアラニン）または天然に存在する隣接配列をＣＴＬエピトープに隣接して含むことによって改善され得る。
【００７２】
ミニ遺伝子配列は、ミニ遺伝子のプラス鎖およびマイナス鎖をコードするオリゴヌクレオチドをアセンブリすることによって、ＤＮＡに転換される。重複しているオリゴヌクレオチド（３０〜１００塩基長）が、周知の技術を使用して適切な条件下で合成、リン酸化、精製、およびアニーリングされる。オリゴヌクレオチドの末端は、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して連結される。次いで、ＣＴＬエピトープポリペプチドをコードするこの合成ミニ遺伝子は、所望の発現ベクターにクローニングされ得る。
【００７３】
当業者に周知の標準的な調節配列が、標的細胞中での発現を確実にするためにベクターに含まれる。いくつかのベクターエレメントが必要とされる：ミニ遺伝子の挿入のための下流のクローニング部位を有するプロモーター；効率的な転写の終結のためのポリアデニル化シグナル；Ｅ．ｃｏｌｉ複製起点；およびＥ．ｃｏｌｉ選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはカナマイシン耐性）。多数のプロモーター（例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーター）が、この目的のために使用され得る。他の適切なプロモーター配列については、米国特許第５，５８０，８５９号および同第５，５８９，４６６号を参照のこと。
【００７４】
さらなるベクター改変が、ミニ遺伝子の発現および免疫原性を最適化するために所望され得る。いくつかの場合、イントロンが、効率的な遺伝子発現のために必要とされ、そして１つ以上の合成のまたは天然に存在するイントロンが、ミニ遺伝子の転写領域に取りこまれ得る。ｍＲＮＡ安定化配列を含むこともまた、ミニ遺伝子の発現を増大させるために考慮され得る。免疫刺激配列（ＩＳＳまたはＣｐＧ）がＤＮＡワクチンの免疫原性において役割を果たすことが、近年提唱されている。これらの配列は、免疫原性を増強することが見出される場合、ミニ遺伝子のコード配列の外側に、ベクター中に含まれ得る。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ミニ遺伝子にコードされるエピトープ、および免疫原性を増強するかまたは減少させるために含まれる第２のタンパク質の産生を可能にする二シストロン性（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）発現ベクターが使用され得る。同時発現される場合に免疫応答を有益に増強し得るタンパク質またはポリペプチドの例としては、サイトカイン（例えば、ＩＬ２、ＩＬ１２、ＧＭ−ＣＳＦ）、サイトカイン誘導分子（例えば、ＬｅＩＦ）、または同時刺激性分子が挙げられる。ヘルパー（ＨＴＬ）エピトープは、細胞内標的化シグナルに連結され得、そしてＣＴＬエピトープとは別に発現され得る。このことは、ＣＴＬエピトープとは異なる細胞区画へのＨＴＬエピトープの指向を可能にする。必要とされる場合、このことは、ＭＨＣクラスＩＩ経路へのＨＴＬエピトープのより効率的な進入を促進し得、それによって、ＣＴＬ誘導を改良する。ＣＴＬ誘導とは対照的に、免疫抑制性分子（例えば、ＴＧＦ−β）の同時発現によって免疫応答を特異的に減少させることは、特定の疾患において有益であり得る。
【００７６】
一旦、発現ベクターが選択されると、ミニ遺伝子は、プロモーターの下流のポリリンカー領域にクローニングされる。このプラスミドは、適切なＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換され、そしてＤＮＡは、標準的な技術を使用して調製される。ミニ遺伝子の方向およびＤＮＡ配列、ならびにベクター中に含まれる全ての他のエレメントは、制限マッピングおよびＤＮＡ配列分析を使用して確認される。正確なプラスミドを有する細菌細胞は、マスター細胞バンク（ｂａｎｋ）および作業細胞バンクとして保存され得る。
【００７７】
治療的な量のプラスミドＤＮＡは、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発酵、その後の精製によって産生される。作業細胞バンクに由来するアリコートは、発酵培地（例えば、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）を接種するために使用され、そして周知の技術に従って、振盪フラスコまたはバイオリアクターにおいて飽和するまで増殖される。プラスミドＤＮＡは、Ｑｕｉａｇｅｎより提供される固相アニオン交換樹脂のような、標準的な生物分離技術を使用して精製され得る。必要とされる場合、スーパーコイルＤＮＡは、ゲル電気泳動または他の技術を使用して、開環状および直鎖状の形態から単離され得る。
【００７８】
精製されたプラスミドＤＮＡは、種々の処方物を使用して注射のために調製され得る。これらのうち最も単純なものは、無菌のリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中での凍結乾燥したＤＮＡの再構成である。種々の方法が記載されており、そして新規の技術が利用可能となり得る。上記のように、核酸は、カチオン性脂質とともに好都合に処方される。さらに、防御的、相互作用的、非縮合（ｎｏｎ−ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ）（ＰＩＮＣ）として総称的に呼ばれる糖脂質、フソジェニック（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）リポソーム、ペプチドおよび化合物がまた、安定性、筋肉内分散、または特定の器官もしくは細胞型へのトラフィッキングのような変量に影響を与えるために、精製されたプラスミドＤＮＡに対して複合体化され得る。
【００７９】
標的細胞の感作が、ミニ遺伝子によってコードされるＣＴＬエピトープの発現およびＭＨＣクラスＩ提示についての機能的アッセイとして使用され得る。プラスミドＤＮＡは、標準的なＣＴＬクロム放出アッセイのための標的として適切である、哺乳動物細胞株中に導入される。使用されるトランスフェクション法は、最終的な処方物に依存する。エレクトロポレーションは、カチオン性脂質が直接的なインビトロでのトランスフェクションを可能にするにもかかわらず、「裸の」ＤＮＡについて使用され得る。グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するプラスミドが、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）を使用するトランスフェクトされた細胞の富化を可能にするために、同時トランスフェクトされ得る。次いで、これらの細胞は、クロム−５１で標識され、そしてエピトープ特異的ＣＴＬ株の標的細胞として使用される。５１Ｃｒの放出によって検出される細胞溶解は、ミニ遺伝子によってコードされるＣＴＬエピトープのＭＨＣ提示の産生を示す。
【００８０】
インビボでの免疫原性は、ミニ遺伝子ＤＮＡ処方物の機能的試験のための第２のアプローチである。適切なヒトＭＨＣ分子を発現するトランスジェニックマウスは、ＤＮＡ産物で免疫される。投与の用量および経路は、処方物に依存する（例えば、ＰＢＳ中のＤＮＡについてはＩＭ、脂質複合体化ＤＮＡについてはＩＰ）。免疫の２１日後、脾細胞を回収し、そして試験される各エピトープをコードするペプチドの存在下で１週間再刺激する。これらのエフェクター細胞（ＣＴＬ）は、ペプチドを負荷したクロム−５１標識化標的細胞の細胞溶解について、標準的な技術を使用してアッセイされる。ミニ遺伝子によってコードされるエピトープに対応するペプチドのＭＨＣ負荷によって感作された標的細胞の溶解は、ＣＴＬのインビボ誘導のためのＤＮＡワクチン機能を実証する。
【００８１】
抗原性ペプチドは、ＣＴＬをエキソビボで誘発するために同様に用いられ得る。得られるＣＴＬは、他の従来の形態の治療に応答しないか、またはペプチドワクチンアプローチの治療に応答しない患者における、慢性の感染（ウイルス性または細菌性）または腫瘍を処置するために用いられ得る。特定の病原体（感染性因子または腫瘍抗原）に対するエキソビボでのＣＴＬ応答は、組織培養において、患者のＣＴＬ前駆細胞（ＣＴＬｐ）を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の供給源および適切な免疫原性ペプチドとともにインキュベートすることにより誘導される。適切なインキュベーション時間（代表的には１〜４週間）（このとき、これらのＣＴＬｐが活性化され、そして成熟し、そして増殖してエフェクターＣＴＬになる）の後、これらの細胞は、患者に注入し戻され、ここでこれらはそれらの特異的標的細胞（感染した細胞または腫瘍細胞）を破壊する。
【００８２】
これらのペプチドはまた、診断試薬としての用途を見出し得る。例えば、本発明のペプチドは、ペプチドもしくは関連ペプチドを用いる処置レジメンに対する特定の個体の感受性を決定するために用いられ得、従って、既存の処置プロトコルを改変する際に、または罹患個体についての予後を決定する際に有用であり得る。さらに、これらのペプチドはまた、どの個体が、慢性の感染を発症するかなりの危険にあるかを予測するために用いられ得る。
【００８３】
以下の実施例は、例示のためにのみ提供され、そして限定のために提供されるわけではない。
【００８４】
（実施例１）
クラスＩ抗原の単離を、上記の関連出願に記載されるとおりに実施した。次いで、天然にプロセシングされたペプチドを、上記の関連出願に記載されるとおりに単離および配列決定した。対立遺伝子特異的モチーフおよびアルゴリズムを決定し、そして定量的結合アッセイを実施した。
【００８５】
ＨＬＡ−Ａ２．１対立遺伝子について上記で同定されたモチーフを用いて、多数の抗原由来のアミノ酸配列をこれらのモチーフの存在について分析した。表３〜５は、これらの検索の結果を提供する。
【００８６】
上記の実施例は、本発明の範囲を限定するためではなく、本発明を例示するために提供されている。本発明の他の改変は、当業者には容易に明らかであり、添付の特許請求の範囲に含まれる。本明細書中に引用した全ての刊行物および特許出願は、本明細書中で参考として援用される。
【００８７】
【表３】
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表４に列挙したペプチドを、上に記載するように同定した。そしてこれらのペプチドを、それらが由来した病原体または抗原により分類する。
【００８８】
【表４】
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表５は、目的の抗原のさらなる研究の結果を示す。
【００８９】
【表５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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