(57)【要約】多重診断および遺伝アッセイ法における測定誤差の原因を検出および／または補正するための、内部標準および対照が提供される。内部標準は関心対象の分析物に特異的なリガンド結合パートナーを含む粒子サブセットを含み、ここで各サブセットは異なる既知の量のリガンド結合パートナーを有する。内部対照は高用量フック効果、希釈による直線性、アッセイ妨害因子、または試料もしくは試薬の欠落に関係する情報を提供するよう選択されたリガンド結合パートナーを含む粒子サブセットを含む。
2004500569.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重アッセイ法を内部較正する方法であって、以下の段階を含む方法：
（ａ）少なくとも一つの粒子サブセットのプールされた集団を含む混合物を、少なくとも一つの種類のシグナルリガンドを含む試薬混合物に曝露する段階であり、ここで（ｉ）特定の標的リガンドが、妨害因子および、一つもしくは複数の関心対象の分析物を除く特徴的試料成分とから選択される分析物であるか、（ｉｉ）少なくとも一つのサブセットの粒子が、関心対象の分析物に対応する、フック効果を試験するために選択された既知の濃度の特定のリガンド結合パートナーを含むか、または（ｉｉｉ）一つもしくは複数の粒子サブセット群において、群のサブセット内の粒子が同じトレーサーまたは同じ標的リガンドに対応するリガンド結合パートナーを含むが、その濃度は一つまたは複数の選択された群の各メンバーで変動する既知の濃度であることを条件として、サブセット内の粒子が（ｉ）同程度のサイズであり、（ｉｉ）一つのサブセットの粒子を別のサブセットの粒子から区別する、少なくとも一つの特徴的分類パラメーターを示し、かつ（ｉｉｉ）標的リガンドに特異的なトレーサーまたはリガンド結合パートナーを含み、一つの粒子サブセットに結合したリガンド結合パートナーは別の粒子サブセットに結合したリガンド結合パートナーと同じまたは異なっていてもよく、かつ標的リガンドは試料、トレーサー、および少なくとも一種類のシグナルリガンド中にあることが推測される分析物から選択される段階；
（ｂ）曝露された粒子に検査ゾーンを通過させる段階；ならびに
（ｃ）曝露された粒子が検査ゾーンを通過する際に、（ｉ）シグナル強度のデータを含む各粒子の一つもしくは複数の特徴的分類パラメーター、ならびに（ｉｉ）リガンド結合パートナーと標的リガンドの間で形成された複合体の有無、または（ｉｉｉ）一つまたは複数の選択された群の各メンバーに関連する、一つもしくは複数の特定の関心対象の分析物の見かけ濃度のうち少なくともいずれか一つ、または（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の両方に関係するデータを収集する段階。
【請求項２】
収集段階と実質的に同時に、各粒子をそのサブセットに従って分類する段階、および、標的リガンドが分析物である場合、各サブセットに関連する分析物の量を定量する段階をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
少なくとも一つの粒子サブセットが少なくとも二つの粒子サブセットであり、第一のサブセットの粒子が分析物から選択された標的リガンドに特異的なリガンド結合パートナーを含み、かつ少なくとも第二のサブセットの粒子がシグナルリガンドから選択された標的リガンドに特異的なリガンド結合パートナーを含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
少なくとも一つの粒子サブセットが少なくとも五つの粒子サブセットであり、第二、第三、第四、および第五の粒子サブセットが同じシグナルリガンドに特異的なリガンド結合パートナーを含むが、その濃度は各サブセットで変動する既知の濃度である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
少なくとも一つの粒子サブセットが少なくとも二つの粒子サブセットであり、第一のサブセットの粒子が第一または第二の標的リガンドに結合可能なリガンド結合パートナーを含み、ここで第一の標的リガンドはトレーサーであり、第二の標的リガンドは分析物であり、かつ少なくとも第二のサブセットの粒子が第一の標的リガンドと同等のトレーサーを含む、請求項１記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一つの粒子サブセットが少なくとも五つの粒子サブセットであり、第二、第三、第四、および第五の粒子サブセットの粒子が同じトレーサーを含むが、その濃度は各サブセットで変動する既知の濃度である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
試薬混合物中に試料または試薬が含まれているか、または欠落しているかに関する情報を提供するために、リガンド結合パートナーの同一性を選択する、請求項１記載の方法。
【請求項８】
シグナルリガンドおよびトレーサーが少なくとも一つの蛍光色素を含み、かつシグナル強度が蛍光発光強度である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
各サブセットの粒子が複数の特徴的蛍光発光分類パラメーターを示す、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
一つのサブセットの粒子が別のサブセットの粒子と、少なくとも一つの蛍光発光分類パラメーター強度において異なる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
一つまたは複数の分析物が抗原、抗体、ペプチド、タンパク質、核酸配列、および酵素から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
方法の結果が即時的に表示される、請求項２記載の方法。
【請求項１３】
結果が、一つまたは複数の選択された粒子サブセット群の各メンバーに関連する一つまたは複数の特定の分析物の既知のおよび見かけの濃度を考慮に入れる、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
リガンド結合パートナーが抗体、抗原、合成オリゴヌクレオチド、および捕捉プローブから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
リガンド結合パートナーの同一性または量が高用量フック効果、アッセイ妨害因子、試料もしくは試薬の欠落（ｏｍｉｓｓｉｏｎ）、または希釈による直線性に関係する情報を提供するよう選択される、請求項１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．参照
本出願は、本明細書において参照として組み込まれる、２００１年２月２２日に出願されたマーク Ｒ．チャンドラー（Ｍａｒｋ Ｒ． Ｃｈａｎｄｌｅｒ）およびマイケル Ｄ．スペイン（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｄ． Ｓｐａｉｎ）による「多重アッセイ法のための内部標準（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ａｓｓａｙ）」と題された仮出願に対する優先権の恩典を主張し、また同様に、２０００年２月２５日に出願された仮出願第６０／１８５，１３２号に対する優先権の恩典も主張する。
【０００２】
２．発明の分野
本発明は、一般には、試料の異常を補正する、またはその原因を検出する方法およびそのための製品に関する。本発明は、より具体的には、臨床標本（ｓｐｅｃｉｍｅｎ）の多重診断および遺伝分析の内部アッセイ較正に関する。
【０００３】
３．発明の背景
臨床標本の分析は科学および医学において重要である。標本の定性的および／または定量的特徴を調べるための多重アッセイ法が当技術分野において公知である。例えば、本明細書において参照として組み込まれる、米国特許第５，９８１，１８０号（「第１８０号特許」）は、フローサイトメトリー分析によって液体試料中の複数の分析物を検出するための方法、機器、および製品を開示する。製品はビーズサブセットを含み、ここで各ビーズサブセットはビーズに結合した異なる反応物を有する。個々のサブセットは、サブセット内のビーズが任意の他のサブセット内のビーズと相対的には同一であるが、少なくとも一つの識別特徴においては異なるように調製される。したがって、一つのビーズが属するサブセットを、異なるサブセット由来のビーズをプールした後に、容易に決定することができる。本方法はアッセイ法前に様々に標識されたサブセットをプールする段階、およびプールされたビーズセットを液体試料と混合して、ビーズに結合した様々な反応物と反応性の分析物を試験する段階を含む。
【０００４】
診断および遺伝分析は測定誤差を伴いうる。分析系の標準化におけるアッセイ間の変動は、下流の医療費用を大きく引き上げる原因となることもある。臨床試験値の分布がシフトする原因は、アッセイ法の較正における変化および、試薬製造におけるロット間の差である。例えば、測定誤差につながる要因には次のものが含まれる：機器の較正誤差；アッセイ法を妨害する物質を含む試料；試薬（試料を含む）の欠落；およびフック効果。
【０００５】
４．発明の概要
本発明は、アッセイ変動が最小であり、エラー強さのある（ｒｏｂｕｓｔ）アッセイ系を提供することができる、多重アッセイ法を内部較正する方法、およびそのための製品に関する。「較正する」という用語は、測定誤差を補正すること、および／または測定誤差の原因を検出することを意味することが理解される。「多重アッセイ法」という用語は、複数の標的を検出および／または測定することができるアッセイ法を意味することが理解される。「標的」という用語は一般に、分析物、内部標準、内部対照、またはアッセイ試薬混合物の任意の成分を含む、分析が望まれる任意の物質を意味することが理解される。「分析物」という用語は、試料中に存在することが推測される任意の物質を意味することが理解される。「内部」という用語は、標準または対照と共に、例えば「内部標準」または「内部対照」として用いられるとき、アッセイ試薬混合物または任意の試料中に含まれうることを意味することが理解される。したがって同様に、「内部較正する」という用語はアッセイ法を較正するための内部標準および内部対照の使用を意味すると考えられる。
【０００６】
一つの局面において、本発明は、多重アッセイ法における測定誤差を少なくとも部分的に補正するために用いることができる内部標準を提供する。いくつかの態様において、内部標準とは、検出可能な、較正された量の分析物を含む物質である。いくつかの態様において、内部標準は物質のサブセットを含み、ここで各サブセットは、異なる、検出可能な、較正された量の分析物を含む。他の態様において、内部標準は、「第１８０号特許」に記載の方法において用いるために適合化された粒子サブセットであってよい。粒子は一定量の標的分析物に結合したミクロスフェアまたはビーズを含んでもよい。各サブセットの粒子は、一つのサブセットの粒子を他のサブセットの粒子から区別する、一つまたは複数の特徴的な分類パラメーターを有する。パラメーターは、少なくとも、ミクロスフェアまたはビーズに結合した標的分析物の量であってよい。
【０００７】
別の局面において、本発明は、多重アッセイ法における測定誤差を少なくとも部分的に補正する方法を提供する。いくつかの態様において、この方法は、少なくとも一つの内部標準サブセットを試薬混合物または一つもしくは複数の標的分析物を含むことが推測される試料に加える段階、少なくとも一つの内部標準サブセットを分析して少なくとも一つの較正点を得る段階、ならびに少なくとも一つの較正点を基準として試料中に存在する一つまたは複数の標的分析物の量を測定する段階を含む。いくつかの態様において、本方法は、少なくとも二つの内部標準サブセットを試薬混合物または一つまたは複数の標的分析物を含むことが推測される試料に加える段階、少なくとも二つの内部標準サブセットを分析して内部標準曲線を得る段階、および作成した内部標準曲線を基準として試料中に存在する一つまたは複数の分析物の量を測定する段階を含む。
【０００８】
別の局面において、本発明は多重アッセイ法における測定誤差の原因を検出するために用いることができる内部対照を提供する。いくつかの態様において、内部対照を試料または試薬の欠落を検出するために用いることができる。欠落を検出するための内部対照は、試料または試薬混合物中に存在すると予想される成分と結合可能な少なくとも一つのリガンドを含むことができ、ここで標的成分がリガンドと結合したとき、内部対照は検出されることができる。いくつかの態様において、内部対照を、妨害物質の存在を検出するために用いることができる。妨害物質を検出するための内部対照は、試料または試薬混合物中に存在することが推測される特定の妨害物質と結合可能な少なくとも一つのリガンドを含むことができ、ここで標的妨害物質がリガンドと結合したとき、内部対照は検出されることができるる。いくつかの態様において、内部対照を高用量フック効果を検出するために用いることができる。高用量フック効果を検出するための内部対照は、分析物と結合可能な低濃度の少なくとも一つのリガンドを含むことができ、ここで内部対照は結合した分析物の量に比例した検出可能なシグナルを生成する。いくつかの態様において、内部対照は応答の直線性（ｌｉｎｅａｒｉｔｙ）を検証するために用いることができる。直線性を検証するための内部対照は、少なくとも一つの内部対照サブセットを含むことができ、ここで各サブセットは分析物と結合可能なリガンドを含むことができ、サブセットは結合しうる分析物の量によって少なくとも識別可能であり、かつ内部対照は分析物がリガンドに結合したときに検出可能である。様々な内部対照は、「第１８０号特許」に記載の方法において用いるために適合化された粒子サブセットでありうる。各サブセットの粒子は、一つのサブセットの粒子を他のサブセットの粒子から区別する、一つまたは複数の特徴的な分類パラメーターを有する。したがって、例えば、欠落を検出するための内部対照は、高用量フック効果を検出するための内部対照から区別することができ、したがって両方の内部対照を多重アッセイ法において同時に用いることができる。
【０００９】
別の局面において、本発明は多重アッセイ法における測定誤差の原因を検出する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は試料または試薬の欠落を検出するための内部対照を試薬混合物に加える段階を含む。いくつかの態様において、本方法は妨害物質を検出するための内部対照を試薬混合物に加える段階を含む。いくつかの態様において、本方法は使用者に高用量フック効果の可能性を警告するための内部対照を試薬混合物に加える段階を含む。いくつかの態様において、本方法は応答の直線性を試験するための内部対照を試薬混合物に加える段階を含む。
【００１０】
本発明の特定の態様が前述の局面の一つ、いくつか、またはすべて、ならびにその他の局面に向けられてもよく、また、前述および後述の態様の一つ、いくつか、またはすべて、ならびにその他の態様を含んでいてもよいことが、当業者には明らかであると考えられる。したがって、例えば、本発明の方法の一つは測定誤差を補正するために内部標準を加える段階を含んでいてもよいが、一方で本発明の別の方法は測定誤差を補正するために内部標準を加える段階および、妨害物質の存在を検出するために内部対照を加える段階の両方を含んでいてもよい。
【００１１】
６．特定の態様の詳細な説明
本発明は一般に、内部標準および／または内部対照を用いて多重アッセイ法を内部較正する方法およびそのための製品に関する。本発明のいくつかの態様において、内部標準および／または内部対照は粒子のサブセットである。「粒子」という用語は、例えば、米国特許第５，９８１，１８０号により、フローサイトメトリーによる多重アッセイ法において用いるための、少なくとも一つのリガンドに結合したミクロスフェアまたはビーズを意味する。「粒子サブセット」という用語は、本質的に同じ特徴的分類パラメーターを共有する粒子群を意味する。「本質的に」とは、同じ粒子群に属していると同定されることができ、かつ他の群の粒子と区別されることができる程度に、粒子が類似していることを意味する。「リガンド」という用語は、少なくとも一つの他の物質に結合可能な任意の物質を意味する。
【００１２】
多重アッセイ法を内部較正するための内部標準および／または対照粒子を用いる一般的方法は、以下の段階を含むことができる：
（ａ）少なくとも一つの粒子サブセットのプールされた集団を含む混合物を、少なくとも一つの種類のシグナルリガンドを含む試薬混合物に曝露する段階であり、ここで（ｉ）特定の標的リガンドが、妨害因子および、一つもしくは複数の関心対象の分析物を除く特徴的試料成分とから選択される分析物であるか、（ｉｉ）少なくとも一つのサブセットの粒子が、関心対象の分析物に対応する、フック効果を試験するために選択された既知の濃度の特定のリガンド結合パートナーを含むか、または（ｉｉｉ）一つもしくは複数の粒子サブセット群において、群のサブセット内の粒子が同じトレーサーまたは同じ標的リガンドに対応するリガンド結合パートナーを含むが、その濃度は一つまたは複数の選択された群の各メンバーで変動する既知の濃度であることを条件として、サブセット内の粒子が（ｉ）同程度のサイズであり、（ｉｉ）一つのサブセットの粒子を別のサブセットの粒子から区別する、少なくとも一つの特徴的分類パラメーターを示し、かつ（ｉｉｉ）所望の標的リガンドに結合するように選択されたトレーサーまたはリガンド結合パートナーを含み、一つの粒子サブセットに結合したリガンド結合パートナーは別の粒子サブセットに結合したリガンド結合パートナーと同じまたは異なっていてもよく、かつ標的リガンドは試料、トレーサー、および少なくとも一つのシグナルリガンド中にあることが推測される分析物から選択される段階；
（ｂ）曝露された粒子に検査ゾーンを通過させる段階；
（ｃ）曝露された粒子が検査ゾーンを通過する際に、（ｉ）シグナル、例えば蛍光発光の強度のデータを含む各粒子の一つもしくは複数の特徴的分類パラメーター、ならびに（ｉｉ）リガンド結合パートナーと標的リガンドの間で形成された複合体の有無、または（ｉｉｉ）一つまたは複数の選択された群の各メンバーに関連する、一つもしくは複数の特定の関心対象の分析物の見かけ濃度のうち少なくともいずれか一つ、または（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の両方に関係するデータを収集する段階；ならびに
（ｄ）収集段階と実質的に同時に、各粒子をそのサブセットに従って分類する段階、および標的リガンドが分析物である場合、各サブセットに関連する分析物を定量する段階。
【００１３】
「関心対象の分析物」という用語は、分析されることが望ましい一つまたは複数の分析物を意味する。「シグナルリガンド」という用語は、検出されることが可能なリガンドを意味する。シグナルリガンドは、例えば、それに結合し、蛍光標識または放射性標識された抗体または抗原などの検出可能な標識を有する任意の物質でありうる。「リガンド結合パートナー」という用語は、標的リガンドに結合可能なリガンドを意味する。前述の一般法により、リガンド結合パートナーは典型的には粒子に結合される。しかし、「リガンド結合パートナー」とは、より一般的には、標的リガンドに結合可能なリガンドであってもよい。「標的リガンド」という用語は、リガンド結合パートナーと結合可能な、試薬混合物または試料中の（またはそれに加えられた）リガンドを意味する。例えば、粒子に結合され、試料中の抗原と結合可能な抗体は「リガンド結合パートナー」であり、一方で抗原は「標的リガンド」である。別の例としては、粒子に結合され、シグナルリガンドと結合可能な抗原は「リガンド結合パートナー」であり、一方でシグナルリガンドは「標的リガンド」である。「トレーサー」という用語は、特定のリガンド結合パートナーとの結合に関して標的リガンドと競合するシグナルリガンドを指す。例えば、蛍光標識された抗原「Ａ」およびその未標識の抗原「Ａ」対応物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）の両方が粒子に結合した特定の抗体との結合に関して競合する場合、蛍光標識された抗原は「トレーサー」であり、未標識抗原は「標的リガンド」であり、かつ抗体は「リガンド結合パートナー」である。「妨害因子」という用語は、リガンド結合パートナーと標的リガンドとの結合を妨害し、人為的に低い結果をもたらしうる、試料または試薬混合物中の任意の物質に関する。
【００１４】
前述の一般法によるいくつかの態様は、サンドイッチイムノアッセイ法を実施する際に起こりうる特定の測定誤差を補正する方法に向けられる。これらの態様において、第一のリガンド結合パートナーに結合したビーズまたはミクロスフェアを含む第一の粒子セットを用いて標的リガンドの濃度を測定し、この場合標的リガンドは、患者標本中の関心対象の分析物である。第一のリガンド結合パートナーは関心対象の分析物に結合することができる。様々な濃度の同じ分析物に結合したミクロスフェアまたはビーズを含む一つまたは複数の追加の粒子セットは、内部標準としてはたらく。分析物と結合可能な同じシグナルリガンドおよび同じシグナル測定系を用いて、すべての粒子セットを測定する。粒子セット１に関連する標準曲線のシグナルにほぼ等しいシグナルが得られるように、異なる内部標準粒子セットに結合した分析物の濃度を選択する。内部標準粒子セットで測定したシグナルを第一の粒子セットで測定したシグナルに変換するための係数（ｆａｃｔｏｒ）を、参照法を用いて確定した既知の分析物濃度を有するヒト標本を測定することによって決定する。
【００１５】
図１はサンドイッチイムノアッセイ法の態様に関係する方法の一例を示す概念図である。図１のサブセット１は第一の粒子セットを表している。第一の粒子はミクロスフェアまたはビーズに結合した、ある量の第一のリガンド結合パートナーを含む。本発明のこの態様において、リガンド結合パートナーは標的リガンド分析物に結合可能な捕捉抗体である。図１のセット２は第二の粒子のセットを表している。第二の粒子はミクロスフェアまたはビーズに結合した第一の量のリガンド標準を含む。図１のセット３は第三の粒子のセットを表している。第三の粒子はミクロスフェアまたはビーズに結合した第二の量のリガンド標準を含む。図１のセット４は第四の粒子のセットを表している。第四の粒子はミクロスフェアまたはビーズに結合した第三の量のリガンド標準を含む。図１のセット５は第五の粒子のセットを表している。第五の粒子はミクロスフェアまたはビーズに結合した第四の量のリガンド標準を含む。粒子セット２からセット５におけるリガンド標準は標的リガンド分析物である。図１に示した態様に従い、標的リガンド分析物は抗原である。「抗原」という用語は抗体と複合体を形成しうる任意の物質を意味することが理解される。この態様におけるシグナルリガンドはシグナル抗体である。
【００１６】
粒子セット２からセット５に結合される抗原の量は、シグナルリガンドに結合したときに、標的リガンド分析物およびシグナルリガンドとサンドイッチ複合体を形成するときに粒子セット１により生成されるシグナルに対する標準曲線とほぼ等しいシグナルを生成するよう選択される。粒子セット１により生成されるシグナルに対する標準曲線は一般に、関心対象の標本中、例えば、ヒト体液試料中の標的分析物の典型的濃度に対応する測定値を反映している。したがって、例えば、第二の粒子セットに結合される抗原の量は、第二の粒子−シグナル抗体複合体が標準曲線に沿った測定値にほぼ等しいシグナルを生成するように選択され、第三の粒子セットに結合される抗原の量は、第三の粒子−シグナル抗体複合体が標準曲線に沿った別の測定値にほぼ等しいシグナルを生成するように選択される。
【００１７】
粒子のサブセットを、捕捉抗体−抗原−シグナル抗体のサンドイッチ複合体および内部標準抗原−シグナル抗体の複合体の形成を促進するのに適した条件下で、水性シグナル抗体と共に、標的抗原を含むことが推測される水性標本試料に混合する。次いで、好ましくは捕捉抗体−抗原−シグナル抗体のサンドイッチ複合体および内部標準抗原−シグナル抗体の複合体によって生成するシグナルだけを分析する、フローサイトメトリー多重アッセイ法を用いて複合体を識別し、複合体によって生成されたシグナルを読み取る。内部標準曲線は、内部標準抗原−シグナル抗体の複合体セットによって生成されたシグナルから得られる。次いで、抗原の量を、捕捉抗体−抗原−シグナル抗体のサンドイッチ複合体のセットによって生成されたシグナルを得られた内部標準曲線と比較することにより、決定することができる。
【００１８】
前述の一般原理によるいくつかの態様は、競合イムノアッセイ法を実施する際に起こりうる特定の測定誤差を補正する方法に向けられる。本発明のこの局面に従い、限られた量の第一のリガンド結合パートナーを粒子セット１に固定する。シグナルリガンド（この場合、「トレーサー」としても知られる）および標的リガンド分析物、つまり標本に対して内在性の分析物は、第一のリガンド結合パートナー上の限られた部位への結合に関して競合する。未結合のトレーサー除去後、シグナルを定量し、標準曲線と比較して、標本中の標的リガンド分析物濃度を定量する。ミクロスフェアまたはビーズ上に固定された様々な濃度の同じトレーサーを含む、一つまたは複数の追加の粒子セットを用いて、内部標準曲線を作成する。固定化トレーサーの濃度は、粒子セット１に関連する標準曲線を模倣するよう選択する。標準曲線は、関心対象の標本中、例えば、ヒト体液試料中の標的分析物の濃度に関連する典型的値に対応する測定値を反映している。ここでも、追加の内部標準粒子セットで測定したシグナルを粒子セット１で測定したシグナルに変換するための係数を、参照法を用いて確定した既知の分析物濃度を有する標本、例えば、ヒト由来の標本を測定することによって決定する。
【００１９】
図２は競合イムノアッセイ法の態様に関係する方法の一例を示す概念図である。図２のサブセット１は第一の粒子セットを表している。第一の粒子はミクロスフェアまたはビーズに固定された一定量の第一のリガンド結合パートナーを含む。本発明のこの態様において、第一のリガンド結合パートナーはトレーサーまたは標的分析物のいずれかと競合的な様式で結合可能な一次抗体である。この例において、トレーサーは蛍光標識された抗原であり、標的分析物も抗原である。トレーサー抗原および標的抗原は抗体上の限られた部位への結合に関して競合する。トレーサー抗原および標的分析物抗原は同じ抗原であってもよい。図２のサブセット２は第二の粒子のセットを表している。第二の粒子はミクロスフェアまたはビーズに固定された第一の量の同じトレーサーを含む。図２のサブセット３は第三の粒子のセットを表している。第三の粒子はミクロスフェアまたはビーズに固定された第二の量のトレーサーを含む。サブセット４は第四の粒子のセットを表している。第四の粒子はミクロスフェアまたはビーズに固定された第三の量のトレーサーを含む。図２のサブセット５は第五の粒子のセットを表している。第五の粒子はミクロスフェアまたはビーズに固定された第四の量のトレーサーを含む。この態様に従い、セット２からセット５におけるトレーサーはそれに結合した検出可能な標識を有する抗原である。
【００２０】
粒子セット２からセット５に固定されるトレーサー抗原の量は、トレーサーに結合したときに、粒子セット１により生成されるシグナルに関連する標準曲線に沿った測定値とほぼ等しいシグナルを生成するよう選択される。粒子セット１に関連する標準曲線は一般に、関心対象の標本中、例えば、ヒト体液試料中の標的分析物の濃度に関連する典型的値に対応する測定値を反映している。
【００２１】
粒子のサブセットを、一次抗体−トレーサーおよび一次抗体−標的抗原の複合体を形成させるのに適した条件下で、水性トレーサー抗原と共に、標的抗原を含むことが推測される水性標本試料に混合する。結合していないトレーサーを除去し、次いで、好ましくは一次抗体−トレーサー複合体および粒子セット２からセット５によって生成するシグナルだけを分析する、フローサイトメトリー多重アッセイ法を用いて様々な粒子セットを識別し、様々な粒子セットによって生成されたシグナルを読み取る。内部標準曲線は、粒子セット２からセット５によって生成されたシグナルから得られる。次いで、粒子セット１によって生成されたシグナル測定値を内部標準曲線と比較することにより、これを評価することができる。
【００２２】
前述の一般法によるいくつかの態様は、遺伝子プローブアッセイ法を実施する際に起こる特定の測定誤差を補正する方法に向けられる。遺伝子プローブアッセイ法の方法論は、内部抗原の代わりに合成オリゴヌクレオチドを用い、捕捉およびシグナル抗体の代わりにヌクレオチドプライマーを用いる、図１に例示したサンドイッチイムノアッセイ法の技術に類似しており、より一般的に前述した。オリゴヌクレオチドはビーズ末端への連結のための無関係な配列、およびオリゴヌクレオチド内の別の位置にあるオリゴヌクレオチド検出プローブにハイブリダイズ可能な配列を伴って合成する。これらの配列は特定の試料に対するハイブリダイゼーション効率を制御するために用いることができる。バッチ間の変動を制御するために、無関係の核酸配列に特異的な補足プローブをビーズに連結してもよい。例えば、ヒト由来試料から核酸を検出しようとする場合、植物特異的（無関係な）核酸に対する捕捉プローブの使用を特定のビーズサブセットに連結して、標準化シグナルを作製すると考えられる。バッチ間の試験結果を、無関係の配列から得たシグナルのレベルに基づいて標準化することができる。
【００２３】
前述の一般法の他の態様は、アッセイ系に妨害因子が存在することによって起こりうる誤差を検出する方法に向けられる。イムノアッセイ法において、妨害因子は分析物とリガンド結合パートナーとの間の結合に影響をおよぼしうる。その結果、検出されたシグナルは試料中の分析物の実際の量よりも低い量に対応する。本発明のこの局面に従い、内部対照はアッセイ系中に妨害因子が存在するかどうかを同定するために用いることができる。
【００２４】
図３は妨害因子の検出に関係するアッセイ法の一例を示す概念図である。図３のサブセット６は第六の粒子セットを表している。第六の粒子は妨害因子、すなわち標的リガンドに結合可能なリガンド結合パートナーに結合した、ミクロスフェアまたはビーズを含む。例示的な態様において、妨害因子はヒト異好性抗体である。第六の粒子セットは、ヒト異好性抗体に結合可能なシグナルリガンドと共に、多重アッセイ法のための試薬混合物に含まれていてもよい。リガンド結合パートナー−妨害因子−シグナルリガンドのサンドイッチ複合体が生成するときに、シグナルを検出することができる。したがって、粒子６により生成されたシグナルが多重アッセイ法において検出されるならば、それは妨害因子、特定の例示された態様においてはヒト異好性抗体が試料中に存在することを示す。
【００２５】
前述の一般法の他の態様は、試薬欠落の結果起こりうる測定誤差を明らかにする方法に向けられる。例えば、操作者が不注意で試料を試薬混合物に添加するのを怠った場合、試験は試料中に標的リガンド分析物がないと不正確に示すことになる。本発明のこの局面に従い、内部対照は様々な成分が試薬混合物に加えられたことを検証するために用いることができる。
【００２６】
図４は試薬欠落態様に関係する方法の一例を示す概念図である。図４のサブセット７は第七の粒子セットを表している。第七の粒子はヒトアルブミン、すなわち標的リガンドに結合可能なリガンド結合パートナーに結合した、ミクロスフェアまたはビーズを含む。ヒトアルブミンはほとんどのヒト血液試料中に存在するため、粒子セット７は血中分析物のアッセイ法において血液試料が試薬混合物中に含まれていることを検証するために、対照として用いることができる。
【００２７】
本発明のこの態様に従い、粒子セット７は、ヒトアルブミンに結合可能なシグナルリガンドと共に、ヒト血液中の分析物を検出するために用いられる多重アッセイ法に含まれていてもよい。リガンド結合パートナー−ヒトアルブミン−シグナルリガンドのサンドイッチ複合体が生成するときに、シグナルが検出される。したがって、多重アッセイ法において粒子セット７により生成されたシグナルが検出されるならば、それは試料が試薬混合物に加えられたことを示す。
【００２８】
前述の一般法の他の態様は、フック効果による測定誤差を明らかにする方法に向けられる。これらの態様に従い、内部対照標準はアッセイ法がフック領域で実施されているかどうかを明らかにするために用いることができる。
【００２９】
フック効果は標準のサンドイッチアッセイ法に関連して理解することができる。フック効果は、そのようなアッセイ法において、標的リガンドの濃度が非常に高いときに顕著となる。そのような場合、試料中に存在する標的リガンドが非常に多いために、第一のリガンド結合パートナー上の結合可能な部位、ならびにシグナルリガンド上の結合可能な部位がすべて、利用可能な標的リガンドで占められる。事実、まだ他にも結合していない標的リガンドがありうる。その結果、リガンド結合パートナーおよびシグナルリガンドの一部しか同じ標的リガンドに結合しないと考えられるため、利用可能な過剰の標的リガンドを有する、より少数のサンドイッチ複合体が生成する。したがって、標的リガンド濃度が高くなるにつれ、標的リガンド濃度が非常に高くなって生成するサンドイッチ複合体が少なくなり、それによって曲線が急速に下がって標的リガンド濃度が誤って低くするまで、固定化シグナルリガンドも比例して増加する。
【００３０】
図５はフック効果の検出に関係するアッセイ法の一例を示す概念図である。図５のサブセット８は第八の粒子セットを表している。第八の粒子は既知の量のリガンド結合パートナーを有する、ミクロスフェアまたはビーズを含む。例示された態様において、リガンド結合パートナーは図１の捕捉抗体であり、したがってサブセット８は同じサンドイッチアッセイ法で図１のサブセット２からセット５と共に用いることができる。既知の量はフック効果を試験するために選択される。例えば、この量は低濃度のリガンド結合パートナーであってもよい。低濃度の捕捉抗体と結合したサブセット８は通常、低いシグナルを示す。しかし、非常に高濃度の標的抗原存在下では、このサブセットはより高いシグナルを生成することになる。そのような結果は、ユーザーに潜在的な高用量フック効果を警告するために用いることができる。
【００３１】
別の例として、第八の粒子は単に既知の量の捕捉抗体を含んでいてもよい。第八の粒子のサブセットから測定したシグナルが予想よりも低い、すなわち選択された既知の量に典型的に関連するシグナルよりも低い場合、そのような結果もユーザーに潜在的な高用量フック効果を警告しうる。
【００３２】
前述の一般的態様による他の態様は、反応の直線性を検証する方法に向けられる。図６は直線性を検証することに向けられた方法の一例を示す概念図である。図６に例示する態様において、追加の粒子セット（一つしか例示していないが、複数を用いることができる）が図１のサンドイッチアッセイ法に含まれる。追加の粒子セットは、図１のサブセット１で用いられるのと同じ捕捉抗体を異なる濃度で有する、ミクロスフェアまたはビーズを含む。これらの追加粒子セットを用いることにより、系は標本中の抗原が基準抗原と同じ様式で読み取られることを検証することができる（希釈による直線性）。
【００３３】
本発明の別の局面は、本発明の方法にとって有用な内部標準製品である。そのような製品の態様は前述されており、例えば、各サブセットが異なる濃度の標的分析物に結合した、ミクロスフェアまたはビーズを含む、粒子のサブセットを含む。
【００３４】
本発明の別の局面は、本発明の方法で用いるための内部対照製品である。そのような製品の態様は前述されており、例えば、ヒトアルブミンに結合可能なリガンドに結合したミクロスフェアまたはビーズからなる粒子のサブセットを含む。
【００３５】
本発明の別の局面は、一つまたは複数の分析物の検出または定量のためのキットである。キットは一つまたは複数のリガンド結合パートナーのセットを含んでいてもよく、各セットは他のセットから区別可能である。いくつかの態様において、キットは一つまたは複数の粒子セットを含み、各セットは例えばその蛍光シグネチャ（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）によって他のセットと区別可能である。粒子はリガンド結合パートナーに結合される。粒子は、リガンド結合パートナーとは別に、サイズが直径０．０１マイクロメートルから１０００マイクロメートル（μｍ）の範囲の重合体粒子でありうる。一つの態様において、サイズは０．１μｍ〜５００μｍの範囲である。別の態様において、サイズは１μｍ〜２００μｍの範囲である。別の態様において、サイズは２μｍ〜１２μｍの範囲である。粒子は同程度のサイズでありうる。「同程度のサイズの（ｓｉｍｉｌａｒｙ−ｓｉｚｅｄ）」とは、一つのセット内の粒子間の差が１５％以下であることを意味する。粒子は任意の規則正しい形状の物質でできていてもよい。一つの態様において、形状は球形である。しかし、任意の他の形状の粒子も用いることができる。粒子の形状は付加的な識別パラメーターとしてはたらくことができ、フローサイトメトリー、例えば、高分解能スリットスキャニングによって識別することができる。
【００３６】
キットは内部標準として用いるための粒子セットを含むことができる。さもなければ、キットは対照として用いるための一つまたは複数の粒子セットを含むことができる。さもなければ、キットは内部標準として用いるための粒子セットおよび対照として用いるための一つまたは複数の粒子セットを含むことができる。キットはサンドイッチまたは競合イムノアッセイ法で用いるためのシグナルリガンドも含むことができる。キットは、例えば、抗体、抗原、ビオチン、ハプテン、または分析物との複合体を形成するシグナルリガンドのための結合パートナーも含むことができる。
【００３７】
当業者であれば、前述の態様に、その広い発明的概念から逸脱することなく、変更を加えうることを理解すると思われる。したがって、本発明は開示された特定の態様に限定されないが、本発明の趣旨および範囲内の改変を含むことが意図されると理解される。
【００３８】
例えば、本発明はバックグラウンドシグナルのための内部標準、およびこれらの内部標準を用いる方法も含む。図７に概念図を示したとおり、いくつかのミクロスフェアのセットを、特定の抗体を結合することなく（すなわち、陰性対照としてヒトアルブミンを用いて）、ヒト抗異好性抗体およびミクロスフェアへの非特異的結合などのアッセイ妨害を制御するために用いることもできる。
【００３９】
別の例として、図１に関して前述のとおり、本発明をサンドイッチイムノアッセイ法に適用するとき、リガンド結合パートナーおよびシグナルリガンドは抗体ではなく抗原であってもよく、標的リガンドはしたがって、抗原ではなく抗体であってもよい。より一般的には、リガンド結合パートナーおよびシグナルリガンドは標的分析物に結合可能な任意のリガンドであってもよく、サンドイッチイムノアッセイ法の場合には、リガンド結合パートナーおよびシグナルリガンドは標的分析物に同時に結合可能でなければならない。潜在的な標的分析物の非限定的例には、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質（酵素、糖タンパク質、リポタンパク質およびアビジンなどで、抗体および抗原タンパク質を含む）、ホルモン（チロキシン、トリヨードチロニン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、エストロゲン、ＡＣＴＨおよびＰ物質など）、免疫系調節物質（インターロイキン−１、インターロイキン−６および腫瘍壊死因子など）、腫瘍マーカー（前立腺特異的抗原、ＣＥＡ、ｈＣＧ、ＣＡ−５４９（乳癌抗原）、およびＡＦＰ）、ビタミン、ステロイド、炭水化物（多糖など）、糖脂質、脂質、薬物（ジゴキシン、フェニトイン、フェノバルビタール、モルヒネ、カルバマゼピンおよびテオフィリンなど）、抗生物質（ゲンチミシンなど）、細胞およびウイルスの成分（連鎖球菌種、ヘルペスウイルス、淋菌種、クラミジア種、レトロウイルス、インフルエンザウイルス、プレボテラ種、ポルフィロモナス種、アクチノバチルス属およびミコバクテリウム種など）、核酸（一本鎖および二本鎖オリゴヌクレオチド）、医薬品、ハプテン、レクチン、ビオチン、ならびに当業者には容易に明らかである他の物質が含まれる。したがって、リガンド結合パートナー（または「捕捉」リガンド）およびシグナルリガンドは、それらの関心対象の特定の分析物に結合する能力によって選択される。したがって、例えば、シグナルリガンドは抗体または抗原であってもよいが、ビオチン、アビジン、ハプテン、または分析物であってもよい。
【００４０】
同様に、シグナルに関連する検出可能な標識は、蛍光色素などの蛍光シグナルだけでなく、例えば、酵素、ビオチン、アビジン、同位体、発光色素、コロイド金、コロイド金属ゾル、着色色素、リン光色素、またはＩ１２５などの放射性同位体であってもよい。
【００４１】
したがって同様に、ヒト体液の分析が主に述べられているが、本発明は標的分析物を含む任意の材料の試料を分析する際に用いるために改変することができる。例えば、本発明は空気、水、土壌、または動物、微生物、もしくは植物由来の生体試料を分析するために改変することができる。生体試料には尿、血清、血漿、髄液、痰、全血、唾液、泌尿生殖器分泌物、糞便抽出物、心膜洗浄液、胃洗浄液、腹腔洗浄液、胸膜洗浄液、結腸洗浄液、鼻咽頭洗浄液、呼吸器分泌物、および膣分泌物などの体液試料が含まれる。生体試料の成分には、脂質、タンパク質、ビリルビン、ヘモグロビン、免疫グロビン、ホルモン、薬物、抗原、アレルゲン、毒素、腫瘍マーカー、可溶性細胞分子、核酸などが含まれうる。
【００４２】
したがって、農薬およびそれらのアミノ化代謝物を同定および測定することを目的とした環境試験への適用のために固定化反応物を測定する方法は、本発明の範囲内である。例えば、環境標的分析物はアルドリン、アラクロール、アトラジン、ＢＡＹ ＳＩＲ ８５１４、Ｓ−ビオアレスリン、クロロスルフロン、シアナジン、２，４−Ｄ、ＤＤＴ、ジクロルフォップ−メチル、ジエルドリン、ジフルベンズロン、エンドスルホン、イプロジオン、ケポン、マレインヒドラジド、メタラキシル、オクスフェンダゾール、パラチオン、パラオキソン、パラコート、ペンタクロロフェノール、２，４，５−Ｔ、テルブトリン、トリアジメフォン、ワルファリンでありうる。分析物はまた、ポリ塩素化ビフェニル（ＰＣＢ）、ポリ臭素化ビフェニル（ＰＢＢ）、多核芳香族炭化水素（ＰＡＲ）、芳香族ニトロ化合物、環状ケトン、ＢＴＥＸ（ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、およびキシレン）、ニトロソアミン、ハロアルカン、ダイオキシン、ジベンゾフラン、またはＴＮＴなどの環境汚染物質でありうる。
【００４３】
別のサンドイッチイムノアッセイ法の変法は、標的リガンドと同一ではないリガンド標準（すなわち、内部標準曲線を作成するために有用な追加の粒子サブセット）の使用でありうる。この態様においては、リガンド標準に結合可能なシグナルリガンドもアッセイ法において用いなければならない。好ましくは、リガンド標準粒子サブセットによって生成するシグナルは、標的リガンド濃度を測定するために用いる粒子サブセットの標準曲線に関連するシグナルになおも対応する。
【００４４】
別の例として、リガンド標準を含む粒子サブセットは、使用前に選択的に較正してもよい。較正は、市販の標準を用い、標準をこれに結合可能なシグナルリガンドと反応させ、標準−シグナルリガンド複合体により生成するシグナルを測定することによって、標準曲線を作成することにより達成することができる。アッセイ法で用いるリガンド標準をまずシグナルリガンドと反応させることができる。次いで、リガンド標準−シグナル結合パートナー複合体により生成するシグナルを測定し、市販の標準の測定から誘導した曲線と比較することができる。
【００４５】
また、例示した態様はルミネクス（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって開発された位置づけ可能なミクロスフェア技術の使用のために特に適合化され、例えば、米国特許第５，９８１，１８０号に開示されているが、本発明は任意の多重アッセイ系で用いるために改変することができる。
【００４６】
開示した態様は、高用量フック効果、試料欠落、および異好性抗体以外の異常の原因を検出するために改変することもできる。例えば、マトリックス効果およびリウマチ因子も他の異常の原因である。マトリックス効果または血清効果は試験結果の測定を妨害する試料特異的性質である。マトリックス効果は脂肪血、ビリルビン血、ヘモグロビン血、溶血、脂質、タンパク質、ヘモグロビン、免疫グロビン、ホルモン、薬物、抗原、アレルゲン、毒素、腫瘍マーカー、可溶性細胞分子、および核酸などの体液成分の過剰が原因となりうる。これらの成分は測定シグナルを上昇または低下させ、不正確な結果が出る原因となりうる。本発明の態様による一つまたは複数の内部標準を、試験物質自体と同じ一定部分で用いることができる。抗原検出の場合、一つのミクロスフェアセットが特定の試験物質を有する。例えば、甲状腺刺激ホルモンに対する捕捉−サンドイッチイムノアッセイ法において、一つのミクロスフェアセットはＴＳＨに特異的な捕捉抗体を有し、一方、第二のミクロスフェアセットは既知の量のＴＳＨをその表面に有する。患者試料および特定の標識されたレポーター抗体（ＴＳＨ）を二つの異なるミクロスフェアセットに加える。次いで、分類と測定を行う。特定のアッセイの値をシフトさせるマトリクス効果は、「内部標準」ミクロスフェアセットにも等しい効果を有すると考えられる。内部標準はマトリクス効果がない場合でも既知の量の反応性を有するため、任意の効果の存在が検出され、系は実際の試験結果を効果の存在に応じて「補正」することができる。一つの態様において、それぞれ表面上に異なる量の分析物を有する５つの異なるミクロスフェアセットを用いることによって、すべての試験で５点標準曲線を含むことができる。
【００４７】
同様に、本発明の態様、例えば、図３に関して前述した、妨害因子である異好性抗体に関係する誤差の原因検出を目的とするものは、リウマチ因子および妨害因子の存在に対応する誤差の原因を検出するよう適合化することができる。自己抗体または免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対する抗免疫グロブリンは、慢性関節リウマチに関連しているため、リウマチ因子（ＲＦ）としても知られている。ＲＦはほとんどの結合組織疾患、多くの慢性および亜急性感染症、ならびに様々なその他の障害を有する患者においても、様々な頻度で認められる。加えて、ＲＦは多くの見かけ上健康な人、特に高齢者で見いだされる。アッセイ法のための捕捉抗体がマウスモノクローナルＩｇＧであり、患者の抗体がヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）またはリウマチ因子を有する場合、これらのいずれかは捕捉抗体に結合することができ、したがって、結合部位をブロックし、人為的に低い結果をもたらすことができる。多発関節炎、若年性慢性多発関節炎、強直性脊椎炎、ライター症候群などの自己免疫疾患に多く見られるＲＦに加えて、抗核抗体（ＡＮＡ）、抗ＤＮＡ抗体、抗ヒストン抗体、アセチルコリン受容体抗体、抗赤血球抗体、抗血小板抗体、またはチログロブリン抗体がある。またこれらの化合物はレポーター抗体に結合し、架橋し、かつ基本的に不活化することもできる。本発明の態様の内部標準を用いてこれらの存在を検出するために、表面上に非特異的マウスＩｇＧを有するミクロスフェアセットまたはＲＦに親和性を有するオリゴペプチドを構築することができる。レポーター混合物に含まれるものは、標識ヒトＩｇＧ（ＨＡＭＡはＩｇＧである）およびＩｇＭ（ＲＦはＩｇＭである）抗体である。ＨＡＭＡまたはＲＦの存在がこの非特異的なミクロスフェアセット上に検出可能な標識をもたらすことになる。ヒトウサギ抗体は異なるミクロスフェアセットを用いて、または同じセットにマウスおよびウサギＩｇＧを含めることによって検出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一つの態様の概念を示す図である。
【図２】本発明の別の態様の概念を示す図である。
【図３】本発明の別の態様の概念を示す図である。
【図４】本発明の別の態様の概念を示す図である。
【図５】本発明の別の態様の概念を示す図である。
【図６】本発明の別の態様の概念を示す図である。
【図７】本発明の他の態様の概念を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004500569.tif 000073
【国際調査報告】
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