(57)【要約】本発明は、イヌＰｅｐＴ１（ｃＰｅｐＴ１）をエンコードするか、またはイヌＰｅｐＴ１（ｃＰｅｐＴ１）に対して相補的で、新規な、単離されかつ精製された核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を提供する。本発明はまた、ペプチドのイヌＰｅｐＴ１輸送能力を決定するための方法、または動物において有益な栄養上の特性を有するペプチドを決定するための方法を提供する。本発明はさらに、上述の方法によって同定されたペプチドを含む動物用の食餌性組成物を提供する。
2004533813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドのイヌＰｅｐＴ１−輸送能力を決定する方法であって、
（ａ）不死化した腎臓遠位尿細管上皮（Ｍａｄｉａｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ））細胞、および約２〜約４のアミノ酸を有するペプチドを提供すること、および
（ｂ）該細胞中に輸送された該ペプチドの量を決定すること、
を含み、
ここで該量が該ペプチドのイヌＰｅｐＴ１−輸送能力と相関している当該方法。
【請求項２】
動物にとって有益な栄養上の特性を有するペプチドを同定するための方法であって、
（ａ）不死化した腎臓遠位尿細管上皮（Ｍａｄｉａｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ））細胞、および約２〜約４のアミノ酸を有するペプチドを提供すること、および
（ｂ）該細胞中に輸送された該ペプチドの量を決定すること、
を含み、
ここで該量が有益な栄養上の特性と相関している当該方法。
【請求項３】
前記ＭＤＣＫ細胞へのペプチド輸送量の決定に先立って、ラクトアルブミン加水分解産物を含有する培地中で該ＭＤＣＫ細胞をインキュベートする工程をさらに含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、ジペプチド、トリペプチドまたはテトラペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、ｐＨ約５〜８の培地中にある、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドが、約１０ｎＭ〜約５０ｍＭの濃度で存在する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載の方法によって同定されたペプチドを含む、動物用の食餌性組成物。
【請求項８】
前記ペプチドがジペプチド、トリペプチドまたはテトラペプチドである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１乃至６のいずれかに記載の方法によって同定された少なくとも約１０ｎｍのジペプチド、トリペプチドまたはテトラペプチドを含む食餌性組成物。
【請求項１０】
動物における必須アミノ酸の吸収を変更する過程であって、
（ａ）請求項９に記載の組成物を含有する食餌を該動物に与える工程と、
（ｂ）該組成物が該動物の消化器系によって吸収されることを可能にするに十分な時間に亘り該動物を該食餌で飼育する工程と、
を包含するプロセス。
【請求項１１】
前記動物がイヌである、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記食餌が、約２０％〜約３０％の粗タンパク質、約１０％〜約２０％の脂肪、および約３％〜約１０％の食餌性線維を含む、請求項９または１０に記載の過程。
【請求項１３】
細胞中のＨ+依存性ペプチド輸送を刺激する方法であって、該方法は、ＰｅｐＴ１基質と該細胞とを（インビトロまたはインビボで）接触させる工程を包含する方法。
【請求項１４】
前記ＰｅｐＴ１基質がＧｌｙＳａｒまたはカルノシンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰｅＰＴ１基質がＧｌｙＳａｒである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰｅＰＴ１基質がカルノシンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＰｅｐＴ１基質が、請求項１乃至６のいずれかにおいて同定されたペプチドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記接触が、前記ＰｅＰＴ１基質を動物に対して投与することによって実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
イヌＰｅｐＴ１をコード化するか、またはイヌＰｅｐＴ１に相補的である単離された核酸を含む組成物。
【請求項２０】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
配列番号７〜９、若しくは２０、またはそれらの相補体のうちのいずれか１つに対して穏やかなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
配列番号７〜９、若しくは２０、またはそれらの相補体のうちのいずれか１つに対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせる、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
前記核酸が配列番号７〜９、または２０である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２４】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２５】
配列番号７〜９または２０の核酸によってコード化されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２６】
配列番号１３または２１によってコード化されるアミノ酸配列を有するペプチド。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
イヌのトリプトファンおよびロイシンのような必須アミノ酸を吸収する能力は、細胞代謝に限定される可能性があると考えられる。イヌの腸細胞の刷子縁（管腔に面する）膜のアミノ酸吸収能力を特徴付けるようにデザインされた最近の研究によって、観察される比較的少量の遊離アミノ酸輸送能力を考慮すれば、ペプチド吸収は特に重要であり得るということが示唆される。（Buddington RK, Paulsen DB. Development of the Canine and Feline Gastrointestinal Tract. In: Reinhart GA, Carey DP, eds. Recent Advances in Canine and Feline Nutrition, Vol. II: 1998 Iams Nutrition Symposium Proceedings. Wilmington: Orange Frazer Press, 1998; 195-215）他の単胃の動物における遊離アミノ酸対ペプチドアミノ酸の量的重要性を理解するためにデザインされた研究からの収集データによると、ペプチド結合したアミノ酸は、腸の管腔からの腸細胞によって吸収されるアミノ酸の大部分の割合を占めることと（Matthews, DM. Protein Absorption, Development and Present State of the Subject, New York: Wiley-Liss, 1991）、ペプチド由来のアミノ酸吸収の速度は、等量の遊離アミノ酸の吸収速度よりも速いこと（Ohkohchi N, Andoh T, Ohi R, Mori S.）とを強力に示している。規定された定法の食餌（配合飼料）は、成長中のラットのアミノ酸およびペプチドの腸輸送の特徴を変化させる（J Pediatr Gastroenterol Nutr 1990 May; 10(4):490-6）。
【０００２】
２つのタイプのペプチドトランスポーター（輸送体）が、単胃の動物からクローン化される（Liang R, Fei YJ, Prasad PD, Ramamoorthy S, Han H, Yang-Feng TL, Hediger MA, Ganapathy V, Leibach FH. Human intestinal H+/peptide cotransporter. Cloning, functional expression, and chromosomal localization. J Biol Chem 1995 Mar 24; 270(12):6456-63. Liu W, Liang R, Ramamoorthy S, Fei YJ, Ganapathy ME, Hediger MA, Ganapathy V, Leibach FH. Molecular cloning of PEPT 2, a new member of the H+/peptide cotransporter family, from human kidney. Biochim Biophys Acta 1995 May 4; 1235(2):461-6）。ＰｅｐＴ１は、Ｈ+依存性、低親和性（ｍＭ）、高速のトランスポーターであり、腸の絨毛の成熟腸細胞の刷子縁膜に主に優先的に局在する。ＰｅｐＴ２は、Ｈ+依存性、高親和性（μＭ）、低速のトランスポーターであり、腎近位尿細管上皮細胞の先端膜に最も豊富に発現する。ペプチドトランスポーターの重要な特徴は、異なるペプチドに対してある範囲の相対的親和性を有するにもかかわらず、ほとんどのジペプチドおよびトリペプチドを認識し且つ輸送する能力である。さらに両方のトランスポーターは、βラクタム系抗生物質およびカルボキシ末端改質遊離アミノ酸を認識する。これらのトランスポーターの生理学的な機能は、消化器および血液それぞれからジペプチドおよびトリペプチドを吸収することであると考えられる。分子的な証拠は得られていないが、これらの細胞の側底膜において機能する異なるペプチド輸送タンパク質については、強力な生化学的証拠が存在する（Saito H, Inui KI. Dipeptide transporters in apical and basolateral membranes of the human intestinal cell line Caco-2. Am J Physiol 1993 Aug; 265(2 Pt 1): G289-94. Thwaites DT, Brown CD, Hirst BH, Simmons NL. Transepithelial glycylsarcosine transport in intestinal Caco-2 cells mediated by the expression of H+-coupled carriers at both the apical and basal membranes. J Biol Chem 1993 Apr 15; 268(11):7640-2）。
【０００３】
Ｃａｃｏ−２細胞を用いた研究によって、ＰeｐＴ１トランスポーターのｍＲＮＡ、タンパク質、および活性は、細胞外基質濃度増加の直接効果と一致する様式で増大することが示されている（Walker D, Thwaites DT, Simmons NL, Gilbert HJ, Hirst BH. Substrate upregulation of the human small intestinal peptide transporter, hPepT1. J Physiol 1998 Mar 15; 507(Pt 3):697-706）。腸の研究により必須アミノ酸トランスポーターについてのｍＲＮＡとは対照的に、ペプチドトランスポーターｍＲＮＡの発現は、食餌のタンパク質の増加に応答して増大することが示されている（Erickson RH, Gum JR Jr, Lindstrom MM, McKean D, Kim YS. Regional expression and dietary regulation of rat small intestinal peptide and amino acid transporter mRNAs. Biochem Biophys Res Commun 1995 Nov 2; 216(1):249-57）。同様に、ＰｅｐＴ１のｍＲＮＡおよびタンパク質の腸粘膜における発現は、組織の創傷に応答して増大するが、一方、必須アミノ酸トランスポーターのｍＲＮＡは減少する（Tanaka H, Miyamoto KI, Morita K, Haga H, Segawa H, Shiraga T, Fujioka A, Kuoda T, Taketani Y, Hisano S, Fukui Y, Kitagawa K, Takeda E. Regulation of the PepT1 peptide transporter in the rat small intestine in response to 5-fluorouracil-induced injury. Gastroenterology 1998 Apr; 114(4):714-23）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
イヌが小ペプチドの形態で大量の必須アミノ酸を吸収する能力、並びにその能力が基質の供給によって調節され得るか否かを評価するための研究はほとんど実施されていない。それ故、推定のイヌペプチドトランスポーターによる、ペプチド結合したロイシンおよびトリプトファンの吸収能力を評価する必要性が依然として存在している。さらに、イヌのＰｅｐＴ１をコード化する核酸配列を提供することが望ましい。また、ｃＰｅｐＴ１に相当するｍＲＮＡ転写物を提供することも所望される。ＧｌｙＳａｒ取り込みによってｃＰｅｐＴ１の機能を特徴付けることと、ｃＰｅｐＴ１によって十分認識されるジペプチドおよびトリペプチドを同定することと、そしてイヌＰｅｐＴ１（ｃＰｅｐＴ１）の輸送能力に対するペプチド基質の補充の効果を特徴付けることとがさらに望まれる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、イヌＰｅｐＴ１（ｃＰｅｐＴ１）をコード化するか、またはイヌＰｅｐＴ１（ｃＰｅｐＴ１）に相補的で新規な単離された且つ精製された核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を提供する。この核酸は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、もしくは配列番号２０であってもよく、またはこれらの配列のうちのいずれかに対して穏やかな若しくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせる核酸であってもよい。また、これらの核酸によってコード化されるペプチド、例えば、配列番号１３または配列番号２１も提供される。
【０００６】
本発明はまた、ペプチドのイヌＰｅｐＴ１輸送能力を決定するための方法、または動物における有益な栄養上の特性を有するペプチドを決定するための方法を提供する。この方法は、不死化した腎臓遠位尿細管上皮（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ（ＭＤＣＫ））細胞と、２〜１０アミノ酸を有するペプチドを提供する工程と、この細胞へ輸送されたこのペプチドの量を決定する工程とを包含し、ここで該量が、該ペプチドのイヌＰｅｐＴ１輸送能力に相関する。動物において有益な栄養上の特性を有するペプチドとは、アミノ酸が、ペプチド結合型ではなくむしろ遊離型である場合、そのアミノ酸の吸収速度よりも高速で吸収される少なくとも１つの必須アミノ酸を含むペプチドである。このペプチドは、例えば、ＧｌｙＳａｒ、ＧｌｙＧｌｙ、ＡｌａＨｉｓ、β−ＡｌａＨｉｓ（カルノシン）、ＧｌｎＧｌｎ、ＧｌｙＭｅｔ、ＬｅｕＭｅｔ、ＬｅｕＴｒｐ、ＭｅｔＬｅｕ、ＭｅｔＭｅｔ、ＭｅｔＰｈｅ、ＭｅｔＰｒｏ、ＴｒｐＬｅｕ、ＴｒｐＴｒｐ、ＧｌｎＧｌｕ、ＭｅｔＧｌｕ、ＭｅｔＬｙｓ、ＴｒｐＧｌｙ、ＭｅｔＧｌｙＭｅｔＭｅｔ（配列番号１０）、ＴｒｐＧｌｙＧｌｙ、ＬｅｕＡｒｇ、ＡｒｇＬｅｕ、ＧｌｙＬｅｕ、またはＡｒｇＴｒｐのように、ジペプチドであっても、トリペプチドであっても、またはテトラペプチドであってもよい。本発明の方法で用いられる細胞は、約５〜８のｐＨ；または約５．５〜７．５のｐＨ、または約６〜６．５のｐＨの培地中にあってもよい。このペプチドは、約１０ｎｍ〜約５０ｍＭの濃度で存在することもできる。
【０００７】
不死化されたＭＤＣＫ細胞によるＧｌｙＳａｒ取り込みの特徴づけによって、ＭＤＣＫ細胞がＰｅｐＴ１様活性を表すことが実証され、これによってＭＤＣＫ細胞によるＰｅｐＴ１  ｍＲＮＡ発現の検出、およびイヌＰｅｐＴ１の生化学的機能を特徴付けるためのモデルとしてのＭＤＣＫ細胞の使用が確認される。
【０００８】
本発明のｃＰｅｐＴ１はまた、イヌの栄養に特に重要であるとみなされている必須アミノ酸であるロイシンおよびトリプトファンを含むものが含有する種々のジペプチドおよびトリペプチドを認識し得る。さらに、培養されたＭＤＣＫ細胞における、Ｈ+依存性ペプチド輸送は、少なくとも２つのＰｅｐＴ１基質である、ＧｌｙＳａｒおよびカルノシンによって刺激され得る。さらに、ＭＤＣＫによるＧｌｙＳａｒのＨ+依存性の取り込みは、栄養欠乏およびインスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）に対して高感度である。
【０００９】
本発明はさらに、上述の方法によって同定される少なくとも１つのペプチドを含む、動物の栄養上の利点を改善する食餌性組成物を提供する。
【００１０】
本発明は動物、例えばイヌにおける必須アミノ酸の吸収を変更するためのプロセスを提供する。このプロセスは、上述の食餌性組成物を含む食餌を動物に与える工程と、該組成物が、動物の消化器系によって吸収されることを可能にするのに十分な時間に亘り該動物を該食餌で飼育する工程とを包含する。この食餌は、約２０〜約３０％の粗タンパク質、約１０〜約２０％の脂肪、および約３〜約１０％の食餌性線維を含み得る。
【００１１】
本明細書において用いる用語「ｃＰｅＰＴ１」とは、この輸送タンパク質の改変体、または生物学的に活性もしくは不活性なフラグメントを含む。このポリペプチドの「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、ネイティブなｃＰｅｐＴ１タンパク質に対して完全に同一でないｃＰｅｐＴ１タンパク質である。改変ｃＰｅｐＴ１タンパク質は、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失、または置換によりアミノ酸配列を変更することによって得ることができる。このタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、置換によって改質されて、ネイティブなポリペプチドに比べて実質的に同じかまたは改善した質を有するポリペプチドを生成する。この置換は、保存的置換であってもよい。「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、あるアミノ酸の、類似の側鎖を有する別のアミノ酸での置換である。保存的置換とは、ペプチドの全体が、その空間的構造を保持するが、生物学的活性は変更されるような、アミノ酸の電荷またはアミノ酸の側鎖の大きさ（あるいは、側鎖の化学基の大きさ、電荷、もしくは種類）におけるできるだけ小さい変化を行うアミノ酸での置換である。例えば、通常の保存的変化としては、次を挙げることもできる：ＡｓｐからＧｌｕ、Ａｓｎ、またはＧｌｎ；ＨｉｓからＬｙｓ、Ａｒｇ、またはＰｈｅ；ＡｓｎからＧｌｎ、Ａｓｐ、またはＧｌｕ、およびＳｅｒからＣｙｓ、Ｔｈｒ、またはＧｌｙ。アラニンは、他のアミノ酸の置換に共通して用いられる。２０の通常のアミノ酸は、次のように分類され得る：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、および非極性側鎖を有するメチオニン；グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、および無電荷の極性側鎖を有するグルタミン；酸性側鎖を有するアスパラギン酸およびグルタミン酸；ならびに塩基性側鎖を有するリジン、アルギニン、およびヒスチジン（Stryer, L. Biochemistry (2d edition) W. H. Freeman and Co. San Francisco (1981), p. 14-15;Lehninger, A. Biochemistry (2d ed., 1975), p.73-75）。他の、それほど一般的でないアミノ酸、例えばヒドロキシリジン、または上記に列挙した２０の一般的なアミノ酸のうちいずれか１つの誘導体の輸送もまた、本発明の範囲内であることが当業者に既知である。
【００１２】
改変ポリペプチドが、生物学的活性を改変または改善するために、ポリペプチド構造において、特定のアミノ酸を他のアミノ酸で置換することに基づき、入手し得ることは既知である。例えば、代替的アミノ酸の置換を通して、小さい立体配置上の変化がポリペプチドに与えられ、これが生物学的活性の増大を生じるということがあり得る。あるいは、特定のポリペプチドにおけるアミノ酸置換を用いて、残基を提供し、これが次に、他の分子に連結されて、この出発ポリペプチドの特性を、他の目的に有用であるように十分に保持しているペプチド−分子接合体を提供するということもあり得る。
【００１３】
当業者は、あるポリペプチドに相互作用的な生物学的機能を付与するのに、アミノ酸の疎水親水性インデックスを用いることができる。ここでは、特定のアミノ酸が、類似の疎水親水性インデックスを有する他のアミノ酸で置換され、且つ依然として類似の生物学的活性を保持していることが可能であることが見出される。あるいは、同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいてなされてもよい。置換は、各々のアミノ酸に対して割り当てられた親水性に基づいてなされ得ることに注意すべきである。各々のアミノ酸に対して値を割り当てる親水性インデックス、または疎水親水性インデックスのいずれかを用いて、アミノ酸の置換を値が±２、特に好ましくは±１、そして最も好ましくは±０．５以内で行うことが適切である。
【００１４】
改変体ｃＰｅｐＴ１タンパク質は、少なくとも７つのアミノ酸残基、好ましくは約２０〜約７００のアミノ酸残基、そしてより好ましくは約５０〜約７００のアミノ酸残基を含み、ここで改変体ｃＰｅｐＴ１タンパク質は、対応するネイティブなｃＰｅｐＴ１タンパク質のアミノ酸配列に対して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも約８０％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％、ただし１００％未満の連続するアミノ酸配列相同性または同一性を有する。
【００１５】
改変体ｃＰｅｐＴ１タンパク質のアミノ酸配列は、ネイティブなｃＰｅｐＴ１タンパク質のアミノ酸配列に本質的に対応する。本明細書において用いる「〜に本質的に対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｔｏ）」とは、ネイティブなｃＰｅｐＴ１タンパク質によって刺激された吸収の値と実質的に同じ吸収の値を惹起するポリペプチド配列をいう。このような吸収は、ネイティブなｃＰｅｐＴ１タンパク質によって生じたレベルの少なくとも６０％であり得、そしてネイティブなｃＰｅｐＴ１タンパク質によって生じたレベルの少なくとも８０％でさえあり得る。
【００１６】
本発明の改変体は、対応するネイティブなｃＰｅｐＴ１タンパク質に存在しないアミノ酸残基を含んでもよいし、または対応するネイティブなｃＰｅｐＴ１タンパク質に対して欠失を含んでいてもよい。改変体はまた、対応するネイティブなｃＰｅｐＴ１タンパク質に比べて、短縮された「フラグメント」、すなわち、全長タンパク質の一部のみであってもよい。ｃＰｅｐＴ１タンパク質改変体はまた、少なくとも１つのＤアミノ酸を有するペプチドを含む。
【００１７】
本発明のｃＰｅｐＴ１タンパク質は、ｃＰｅｐＴ１タンパク質をコード化する単離された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の配列から発現され得る。ネイティブなｃＰｅｐＴ１タンパク質から改変体ｃＰｅｐＴ１タンパク質へのアミノ酸変化は、対応する核酸配列のコドンを変化させることによって達成され得る。「組み換え体（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」とは、遺伝子操作のプロセスによって生み出されたペプチドまたは核酸として同定する。遺伝子コードの重剰性に起因して、個々のヌクレオチドは、コドン中で容易に交換され得、それでもなお同一のアミノ酸配列を生じることは当該分野で周知であることに注意すべきである。用語「タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ）」、「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」、および「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、本明細書において交換可能に用いられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（定義）
用語「遺伝子（ｇｅｎｅ）」とは、広義には、生物学的機能に関連した核酸の任意のセグメントをいう。従って、遺伝子は、その発現に必要なコード配列、および／または調節配列を含む。例えば、遺伝子とは、ｍＲＮＡ、機能的ＲＮＡ、または調節配列を含む特異的タンパク質を発現する核酸フラグメントを指す。遺伝子はまた、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する発現されないＤＮＡセグメントを含む。遺伝子は、目的の供給源からのクローン化、または既知の、もしくは予想される配列情報からの合成を含む種々の供給源から入手され得、所望のパラメーターを有するように設計された配列を含むこともできる。
【００１９】
用語「ネイティブな遺伝子（ｎａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ）」とは、形質転換されていない細胞のゲノムに存在する遺伝子をいう。
【００２０】
「天然に存在する（ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｉｎｇ）」とは、人によって人工的に生み出されることとは区別された、天然に見出され得る物体について述べるために用いられる。例えば、生物体（ウイルスを含む）に存在する天然の供給源から単離され得、実験室において人によって意図的に改質されていないタンパク質またはヌクレオチド配列は、天然に存在している。
【００２１】
「マーカー遺伝子（ｍａｒｋｅｒ  ｇｅｎｅ）」は、選択可能な形質、またはスクリーニング可能な形質をコード化する。
【００２２】
用語「キメラ遺伝子（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｇｅｎｅ）」とは、次を含む任意の遺伝子をいう：１）天然には一緒に見出されることはない、調節配列およびコード配列を含むＤＮＡ配列、または２）天然には隣接していないタンパク質部分をコード化する配列、または３）天然には隣接していないプロモーター部分。従って、異なる供給源に由来するキメラ遺伝子は、調節配列およびコード配列を含んでもよいし、または同じ供給源由来であっても天然に見出されるものとは異なった様式で整列された、調節配列およびコード配列を含んでもよい。
【００２３】
「導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」とは、形質転換によってゲノムに導入され、且つ安定に維持されている遺伝子をいう。導入遺伝子は、例えば、形質転換されるべき特定の細胞の遺伝子に対して異種である遺伝子かまたは相同である遺伝子かのいずれかを含むこともできる。さらに、導入遺伝子は、ネイティブでない生物体に挿入されたネイティブな遺伝子、またはキメラ遺伝子を含んでもよい。用語「内因性遺伝子（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｇｅｎｅ）」とは、ある生物体のゲノム中のその天然の位置におけるネイティブな遺伝子をいう。「外来（ｆｏｒｅｉｇｎ）」遺伝子とは、宿主生物体では通常見いだされないが、遺伝子移入によって導入されている遺伝子をいう。
【００２４】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は、本明細書において、交換可能に用いられる。
【００２５】
発現カセットは、目的のヌクレオチド配列に連結された本発明の転写開始領域を含む。このような発現カセットは、調節領域での転写調製下にある目的の遺伝子を挿入するために複数の制限部位によって提供する。この発現カセットは、選択マーカー遺伝子をさらに含んでもよい。
【００２６】
転写カセットは、転写の５’〜３’方向に、転写開始領域および翻訳開始領域、目的のＤＮＡ配列、ならびに転写終止領域および翻訳終止領域を含む。この終止領域は転写開始領域固有であってもよく、目的のＤＮＡ配列固有であってもよく、または別の供給源由来であってもよい。
【００２７】
プロービング（ｐｒｏｂｉｎｇ）または増幅反応における使用のためのオリゴヌクレオチドは、約３０ヌクレオチド長、またはそれより少数のヌクレオチド長（例えば、９、１２、１５、１８、２０、２１、もしくは２４、または９〜３０の任意の数）であってもよい。一般的に特定のプライマーは、１４ヌクレオチド長より長い。最適の特異性およびコスト効果のためには、１６〜２４ヌクレオチド長のプライマーが好ましいかもしれない。当業者は、ＰＣＲのようなプロセスに用いるためのプライマーのデザインに習熟している。必要に応じて、本明細書に開示された遺伝子の制限フラグメントの全体を用いて、プロービングを行い得、ここでは、１００ヌクレオチド長であるか、または１０００ヌクレオチド長でさえよい。
【００２８】
「コード配列（ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、特定のアミノ酸配列をコード化し、且つ非コード配列を除外するＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を指す。これは、「中断されていないコード配列（ｕｎｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ  ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」を構成し得る、すなわち、ｃＤＮＡにおけるように、イントロンを欠いているか、または適切なスプライス結合によって結びついた１つ以上のイントロンを含み得る。「イントロン（ｉｎｔｒｏｎ）」とは、一次転写物に含まれるが、タンパク質に翻訳され得る成熟ｍＲＮＡを生成するために、細胞内のＲＮＡの開裂および再連結を通じて除去されるＲＮＡの配列である。
【００２９】
用語「オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）」および「ＯＲＦ」とは、コード配列の翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間にコード化されたアミノ酸配列を指す。用語「開始コドン」および「終止コドン」とは、タンパク質合成（ｍＲＮＡ翻訳）の開始および鎖のそれぞれの終止を特定する、コード配列における３つの連続するヌクレオチドの単位（「コドン」）を指す。
【００３０】
「機能的なＲＮＡ（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＡ）」とは、翻訳されないアンチセンスＲＮＡ、リボザイム、または他のＲＮＡをいう。
【００３１】
用語「ＲＮＡ転写物（ＲＮＡ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）」とは、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼ触媒転写から生じる産物を指す。ＲＮＡ転写物が、ＤＮＡ配列の完全に相補的なコピーである場合、これは一次転写物と呼ばれるか、または一次転写物の翻訳後プロセッシング由来のＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと呼ばれる。「メッセンジャーＲＮＡ（Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）」（ｍＲＮＡ）とは、イントロンのないＲＮＡであって、細胞によってタンパク質に翻訳され得るＲＮＡをいう。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに相補的であり、且つｍＲＮＡに由来する１本鎖または２本鎖のＤＮＡをいう。
【００３２】
「調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」および「適切な調節配列（ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」はそれぞれがコード配列の上流（５’非コード配列）、コード配列の中、またはコード配列の下流（３’非コード配列）に配置されており、関連するコード配列の転写、ＲＮＡプロセッシングもしくは安定性、または翻訳に影響する、ヌクレオチド配列をいう。調節配列は、エンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化シグナル配列を含む。それらは、天然配列および合成配列、ならびに合成配列および天然配列の組み合わせであり得る配列を含む。上述で注記されるように、用語「適切な調節配列」とは、プロモーターに限定されない。
【００３３】
「５’非コード配列（５’ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、コード配列の５’側（上流）に配置されたヌクレオチド配列をいう。それは、開始コドンの上流の完全にプロセッシングされたｍＲＮＡに存在し、ｍＲＮＡへの一次転写物のプロセッシング、ｍＲＮＡの安定性、または転写効率に影響することもある（Turner et al., Molecular Biotechnology, 3:225 (1995)）。
【００３４】
「３’非コード配列（３’ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、コード配列の３’側（下流）に配置され、且つポリアデニル化シグナル配列、およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響し得る調節シグナルをコード化する他の配列を含む、ヌクレオチド配列をいう。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端に対するポリアデニル酸域の付加に影響することによって特徴付けられる。
【００３５】
用語、「翻訳リーダー配列（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｌｅａｄｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、プロモーターとコード配列との間の遺伝子のＤＮＡ配列部分であって、ＲＮＡに転写され、翻訳開始コドンの上流（５’側）の完全にプロセッシングされたｍＲＮＡに存在する配列をいう。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡへの一次転写物のプロセッシング、ｍＲＮＡ安定性、または翻訳効率に影響する可能性もある。
【００３６】
用語「成熟（ｍａｔｕｒｅ）」タンパク質とは、シグナルペプチドのない、翻訳後プロセッシングされたポリペプチドをいう。「前駆体（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）」タンパク質とは、ｍＲＮＡの翻訳の一次産物をいう。「シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」とは、ポリペプチドのアミノ酸末端伸長であって、前駆体ペプチドを形成するポリペプチドと共に翻訳され、分泌経路への進入に必要であるものをいう。用語「シグナル配列」とは、シグナルペプチドをコード化するヌクレオチド配列をいう。
【００３７】
「細胞内局在配列（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、細胞内標的化シグナルをコード化するヌクレオチド配列をいう。「細胞内標的化シグナル（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ）」とは、タンパク質と共に翻訳され、そしてそれを特定の半細胞区画へ指向するアミノ酸配列である。「小胞体（ＥＲ）終止移行シグナル（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ（ＥＲ）ｓｔｏｐ  ｔｒａｎｓｉｔ  ｓｉｇｎａｌ）」とは、ポリペプチドのカルボキシ末端伸長であって、該ポリペプチドと共に翻訳され、分泌経路に進入するタンパク質をＥＲ中に保持されるようにするものをいう。「ＥＲ停止移行配列（ＥＲ  ｓｔｏｐ  ｔｒａｎｓｉｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、ＥＲ標的化シグナルをコード化するヌクレオチド配列をいう。
【００３８】
「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」とは、ヌクレオチド配列であって、通常そのコード配列の上流（５’側）であり、ＲＮＡポリメラーゼおよび適切な転写に必要な他の因子を認識させることによって、そのコード配列の発現を制御するヌクレオチド配列をいう。「プロモーター」としては、ＴＡＴＡボックスからなる短いＤＮＡ配列である最小プロモーター、および転写開始の部位を特定するように機能する他の配列が挙げられ、これに対して、発現の制御のために調節エレメントが付加される。「プロモーター」とはまた、最小プロモーターにプラスして、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御し得る調節エレメントを含むヌクレオチド配列をいう。このタイプのプロモーター配列は、近位の、およびより遠位の上流のエレメントからなり、後者のエレメントはしばしば、エンハンサーと呼ばれる。従って、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激し得るＤＮＡ配列であり、プロモーターの本来のエレメント、またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を増強するために挿入された異種のエレメントであってもよい。エンハンサーは、両方の配向（正常または反転した配向）で作動可能であり、プロモーターの上流または下流のいずれかに移動した場合でさえ機能し得る。エンハンサーと他の上流のプロモーターエレメントとの両方が、ＤＮＡ結合タンパク質特異的配列に結合し、この配列が効果を媒介する。プロモーターは、ネイティブな遺伝子からその全体が誘導されてもよく、または天然に見出される異なるプロモーター由来の異なるエレメントから構成されてもよく、または合成ＤＮＡセグメントさえからも構成されてもよい。プロモーターは、生理的条件または発生上の条件に応答して転写開始の効率を制御するタンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列を含むこともできる。
【００３９】
「開始部位（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）」とは、転写された配列の一部である第一ヌクレオチドの周囲の位置であって、位置＋１としても規定される。この部位に関しては、遺伝子の全ての他の配列およびその制御領域を番号付けする。下流配列（すなわち、３’方向のさらなるタンパク質コード配列）を、正と呼び、一方、下流配列（５’方向の制御領域のほとんど）を負と呼ぶ。
【００４０】
プロモーターエレメント、特に、不活性であるかまたは上流活性化の非存在下でかなり減少したプロモーター活性を有するＴＡＴＡエレメントは、「最小プロモーターまたはコアプロモーター（ｍｉｎｉｍａｌ  ｏｒ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）」と呼ばれる。適切な転写因子の存在下で、この最小プロモーターは、転写を可能にするように機能する。従って、「最小プロモーターまたはコアプロモーター（ｍｉｎｉｍａｌ  ｏｒ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」は、転写開始に必要な全ての基本のエレメント、例えば、ＴＡＴＡボックス、および／またはイニシエーターのみからなる。
【００４１】
「誘導性プロモーター（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」とは、調節されたプロモーターであって、化学物質、光、ホルモン、ストレス、または病原体などの外部刺激によって、１つ以上の細胞型において興奮され得るプロモーターをいう。
【００４２】
「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ−ｌｉｎｋｅｄ）」とは、一方の機能が、もう一方によって影響されるような単一核酸フラグメント上の核酸配列の会合を指す。例えば、調節性ＤＮＡ配列は、調節性ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響する（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡが、プロモーターの転写制御下にある）ように、２つの配列が配置されている場合、ＲＮＡまたはポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列と「作動可能に連結された」または「会合された（関連した）（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）」という。コード配列は、センス方向またはアンチセンス方向で、調節配列に作動可能に連結され得る。
【００４３】
「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、細胞中の内因性遺伝子または導入遺伝子の転写、および／または翻訳をいう。例えば、アンチセンス構築物の場合においては、発現とは、アンチセンスＤＮＡの転写のみを指すこともできる。さらに、発現とは、センス（ｍＲＮＡ）または機能的ＲＮＡの転写および適切な蓄積をいう。発現はまた、タンパク質の生成を指すこともできる。
【００４４】
事実上全てのプロモーターにおける転写開始位置の分析によって、通常、そこで転写が開始する単一の塩基というのはなく、むしろいくらか集合したセットの開始部位があることが明らかになり、その開始部位の各々がｍＲＮＡのいくつかの開始位置に相当する。この分布は、プロモーターからポロモーターへと変わるので、それぞれの集団におけるレポーターｍＲＮＡの配列は相互に異なる。それぞれのｍＲＮＡ種は多少とも分解する傾向にあるので、異なるレポーターｍＲＮＡについて、単一の分解速度は予測され得ない。種々の真核生物プロモーター配列について、開始部位（「イニシエータ（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）」の周囲の配列が、特定のプロモーターによって指向されるＲＮＡ発現のレベルを決定するのに重要な役割を果たすことが示されている。これは記載された配列の一部をも含む。従って、プロモーターからレポーター配列への直接融合によって、最適状態にかなり及ばないレベルの転写がもたらされる。
【００４５】
発現のパターンおよびレベルを分析するために通常用いられる手順は、細胞におけるタンパク質蓄積の「定常状態」レベルの決定による。当業者に既知のレポーター遺伝子の通常用いられる候補物は、９−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、成長ホルモン（ＧＨ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、および蛍光特性を有するタンパク質、例えば、Ａｅｑｕｏｒａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＧＦＰ）である。しかし、原則的に、より多くのタンパク質が必須の細胞機能を妨害しないという条件で、この目的に適している。局在化の数量化および決定のためには、多数のツールが適している。検出システムは容易に作製されるか、または利用可能であり、これは例えば、免疫化学的、酵素的、蛍光的な検出および数量化に基づく。タンパク質レベルは、細胞抽出物中で、または損なわれていない組織中で、タンパク質発現の原位置分析を用いて決定され得る。
【００４６】
一般に、１つのキメラプロモーターレポーター構築物を有する、個々の形質転換された系統は、レポーター遺伝子の発現のレベルにおいて変化する。また、頻繁に観察されるのは、そのような形質転換体がどのような検出可能な産物（ＲＮＡまたはタンパク質）も発現しないという現象である。発現の可変性は通常、位置の影響に帰せられるが、この不活性の基礎にある分子機構は通常明確ではない。
【００４７】
「非特異的な発現（ｎｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、「調節されたプロモーター（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」からの、所望されない細胞または組織における、構成的発現または低レベルの基礎的な（「リーキー（ｌｅａｋｙ）」）発現をいう。
【００４８】
「アンチセンス阻害（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）」とは、内因性遺伝子または導入遺伝子からのタンパク質の発現を抑制し得るアンチセンスＲＮＡ転写物からの生産物を指す。
【００４９】
「同時抑制（ｃｏ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」および「トランスイッチ（ｔｒａｎｓｗｉｔｃｈ）」はそれぞれ、同一かまたは実質的に同様の導入遺伝子または内因性遺伝子の発現を抑制し得るセンスＲＮＡ転写物からの産物を指す（米国特許第５，２３１，０２０号）。
【００５０】
「に対して相同な（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ）」とは、２つの核酸分子のヌクレオチド配列の間の類似性、または２つのタンパク質分子のアミノ酸配列間の類似性をいう。このような相同性の評価は、当業者によって十分に理解されるように（Haines and Higgins (eds.), Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, U.Kに記載されるように）、ストリンジェンシーな条件下で、ＤＮＡ−ＤＮＡのハイブリダイゼーションもしくはＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーションのいずれかによって、または２つの核酸もしくはタンパク質間の配列類似性の比較によって提供される。
【００５１】
「実質的に同様（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ  ｓｉｍｉｌａｒ）」という用語は、本発明の配列の等価物を表す、ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列をいう。例えば、遺伝子コードの縮重性を単に反映するが、それにもかかわらず本発明のアミノ酸配列に同一のアミノ酸配列をエンコードする、変更したヌクレオチド配列は本発明の配列と実質的に同様である。さらに、本発明の配列と実質的に同様のアミノ酸配列とは、本発明の配列に対して全体的なアミノ酸同一性が９５％以上である配列である。等価なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を生じる、本発明に対する改変は十分に当該分野の慣用的な技術の範囲内である。さらに、当技術者は、本発明によって包含される等価なヌクレオチド配列がまた、本発明の特許請求の語義どおりの範囲内であるヌクレオチド配列と、ストリンジェントな条件下（０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃）でハイブリダイズさせる能力によって同定され得ることを認識する。
【００５２】
「導入遺伝子活性化系（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）」とは、不活性な導入遺伝子およびキメラの部位特異的リコンビナーゼ遺伝子からなる発現系であって、一緒に機能して、調節された様式で導入遺伝子発現をもたらす発現系をいう。組み換えの特異性は、調節されたプロモーターの特異性、および野生型または変異の部位特異的配列の使用によって決定される。この系の両方のエレメントは、染色体に組み込まれ、且つ独立して遺伝され得る。
【００５３】
「標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅ）」とは、所望の標的コード配列、機能的ＲＮＡ、またはタンパク質を発現するレプリコン上の遺伝子をいう。標的遺伝子は、レプリコン複製にとって必須ではない。さらに、標的遺伝子は、ネイティブでない生物体中に挿入されたネイティブな非ウイルス遺伝子、またはキメラ遺伝子を含み得、適切な調節配列の制御下にある。従って、標的遺伝子中の調節配列は、ウイルスを含む任意の供給源に由来してもよい。
【００５４】
「転写停止フラグメント（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｔｏｐ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、転写を終止し得るポリアデニル化シグナル配列のような１つ以上の調節シグナルを含む、ヌクレオチド配列をいう。例としては、ノパリンシンターゼ、およびリブロースビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットをコード化する遺伝子の３’非調節性領域が挙げられる。
【００５５】
「翻訳停止フラグメント（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｔｏｐ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、翻訳を終止させ得る、３つのフレーム全てにおける１つ以上の終止コドンのような１つ以上の調節シグナルを含むヌクレオチド配列をいう。コード配列の５’末端における開始コドンに隣接するかまたはその付近の翻訳停止フラグメントの挿入は、いかなる翻訳、あるいは不適切な翻訳も結果として生じない。部位特異的組み換えによる翻訳停止フラグメントの切除によって、コード配列に部位特異的配列が残るが、これは開始コドンを用いる適切な翻訳を妨害することはない。
【００５６】
「ブロッキングフラグメント（ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、不活性な導入遺伝子を生じるコード配列の転写、および／または適切な翻訳をブロックし得る、部位特異的配列に隣接しているＤＮＡフラグメントをいう。ブロッキングフラグメントが、ポリアデニル化シグナル配列、および転写を終止させ得る調節シグナルをエンコードする他の配列を含む場合、ブロッキングフラグメントは、５’非翻訳領域、すなわち、転写開始部位とＯＲＦとの間に配置される場合、コード配列の転写をブロックし得る。コード配列に挿入された場合、ブロッキングフラグメントは、そのオープンリーディングフレームを中断することによって、適切な翻訳をブロックし得る。部位特異的組み換えによるＤＮＡ再整列によって、転写、および／または適切な翻訳可能性を回復することができる。例えば、部位特異的組み換えによるブロッキングフラグメントの切除によって、部位特異的配列が残されたままになり、これが転写、および／または適切な翻訳可能性を可能にする。転写または翻訳停止フラグメントは、ブロッキングフラグメントであるとみなされる。
【００５７】
「シスの（ｉｎ  ｃｉｓ）」、および「トランスの（ｉｎ  ｔｒａｎｓ）」という用語はそれぞれ、同じＤＮＡ分子上か、または異なるＤＮＡ分子上のウイルスの複製起点およびタンパク質遺伝子複製起点のようなＤＮＡエレメントの存在をいう。
【００５８】
「シス作用配列（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」および「シス作用エレメント（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」という用語は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列であって、その機能は、それらが同じ分子上にあることを要する配列をいう。レプリコン上のシス作用配列の例はウイルス複製起点である。
【００５９】
「トランス作用配列（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」および「トランス作用エレメント（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」という用語は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列であって、その機能は、それらが同じ分子上にあることを要さない配列をいう。
【００６０】
「シス作用ウイルス配列（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｖｉｒａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」とは、ウイルス複製に必要なウイルス配列（例えば、複製起点）であって、且つシス方向のウイルス配列をいう。
【００６１】
「トランス活性化遺伝子（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｇｅｎｅ）」とは、トランス活性化タンパク質をコード化する遺伝子を指す。この遺伝子は、ウイルス複製タンパク質、または部位特異的レプリカーゼをコード化し得る。この遺伝子は、天然の遺伝子、例えば、ウイルス複製遺伝子、またはキメラ遺伝子であり得、例えば、調節配列が部位特異的リコンビナーゼまたはウイルス複製タンパク質のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されている場合である。「トランス活性化遺伝子」は、染色体に組み込まれても、または一過性に発現されてもよい。
【００６２】
「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）」とは、いかなる既知の変異もない、天然に見出される正常な遺伝子、ウイルス、または生物体をいう。
【００６３】
「ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）」とは、生物体の完全な遺伝物質をいう。「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」という用語は、１本鎖型もしくは２本鎖型のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびそれらの重合体であって、プリンまたはピリミジンのいずれかである糖、リン酸、および塩基を含有する単量体（ヌクレオチド）から構成されるものをいう。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と同様の結合特性を有し、そして天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然のヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を包含する。他に示さない限り、特定の核酸配列はまた暗黙のうちに、それらの保存的に改質された改変体（例えば、縮重コドン置換）および相補的な配列、ならびに明白に示された配列を包含する。特に、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの第３位置が、混合された塩基、および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じることによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res., 19, 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260, 2605 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes, 8, 91 (1994)）。「核酸フラグメント（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、所定の核酸分子の画分である。高等動物では、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、遺伝物質であるが、一方リボ核酸（ＲＮＡ）は、ＤＮＡに含まれている情報をタンパク質へ転移することに関与している。「ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）」とは、生物体のそれぞれの細胞内に含まれる遺伝物質の全体である。「ヌクレオチド配列（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、１本鎖であっても、または２本鎖であってもよいＤＮＡまたはＲＮＡの重合体を指す。これには、必要に応じて、ＤＮＡまたはＲＮＡの重合体に組み込み得る、合成の、天然でないかまたは変更されたヌクレオチド塩基を含む。「核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」または「核酸配列（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」という用語は、遺伝子、遺伝子にエンコードされるｃＤＮＡ、ＤＮＡ、およびＲＮＡと交換可能に用いることができる。
【００６４】
本発明は、単離されるかまたは実質的に精製された核酸またはタンパク質組成物を包含する。本発明の状況において、「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」ＤＮＡ分子もしくは「精製された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」ＤＮＡ分子、または「単離された」ポリペプチド、もしくは「精製された」ポリペプチドとは、人の手によって、そのネイティブな環境とは離れて存在し、従って天然の産物ではないＤＮＡ分子、またはポリペプチドである。単離されたＤＮＡ分子またはポリペプチドは、精製された形態で存在してもよいし、または例えば、トランスジェニック宿主細胞のように、ネイティブでない環境に存在してもよい。例えば、「単離された」か、または「精製された」、核酸分子もしくはタンパク質、またはそれらの生物学的に活性な部分は、組み換え技術によって生成された場合は他の細胞物質もしくは培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成された場合は化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。好ましくは、「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」核酸は、その核酸が由来する生物体のゲノムＤＮＡ中の核酸（すなわち、その核酸の５’末端および３’末端に配置された配列）に天然に隣接する配列（好ましくはタンパク質コード配列）を含まない。例えば、種々の実施形態において、単離された核酸分子は、その核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に天然に隣接するヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満を含み得る。細胞物質を実質的に含まないタンパク質は、混入する乾燥したタンパク質の約３０重量％、２０重量％、１０重量％、５重量％未満を有するタンパク質またはポリペプチドの調製物を含む。本発明のタンパク質、またはその生物学的に活性な部分が、組み換え生成される場合、好ましくは、培養培地は、乾燥した化学物質の前駆体または乾燥した目的とする化学物質の非タンパク質約３０％、２０％、１０％、または５％未満である。開示されたヌクレオチド配列のフラグメントおよび改変体、およびそれらによってエンコードされるタンパク質または部分長のタンパク質も本発明によって包含する。「フラグメント」によって、ヌクレオチド配列の一部、またはアミノ酸配列の一部、さらにそれらによってエンコードされるポリペプチドまたはタンパク質の一部を意図する。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なヌクレオチド配列のフラグメントは一般に、生物学的活性を保持するフラグメントタンパク質をエンコードしない。従って、ヌクレオチド配列のフラグメントは、少なくとも約９ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、またはそれ以上の範囲に及んでもよい。
【００６５】
「改変体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、実質的に同様の配列を意図する。ヌクレオチド配列について、改変体は、遺伝子コードの縮重性により、ネイティブなタンパク質のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をエンコードする配列を含む。天然に存在する対立遺伝子改変体は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション技術と同様の周知の分子生物学的技術の使用によって同定され得るものである。改変ヌクレオチド配列はまた、ネイティブなタンパク質をエンコードする、部位特異的な変異誘発性を用いることによって生成された配列などの合成的に誘導されたヌクレオチド配列、およびアミノ酸置換を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。概して、本発明のヌクレオチド配列改変体は、ネイティブなヌクレオチド配列に対して、少なくとも４０％、５０％、６０％〜７０％、例えば、好ましくは７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％〜７９％、一般には少なくとも８０％、例えば、８１％〜８４％、少なくとも８５％、例えば、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％〜９８％の配列同一性を有する。
【００６６】
「改変体」ポリペプチドとは、次によるネイティブなタンパク質由来のポリペプチドを意図する：ネイティブなタンパク質のＮ末端、および／またはＣ末端に対する１つ以上のアミノ酸の欠失（いわゆる短縮）または付加；ネイティブタンパク質における１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失または付加；あるいはネイティブなタンパク質における１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の置換。このような改変体は、例えば、遺伝的多形性から、またはヒトの操作から生じ得る。このような操作の方法は、当該分野で一般に公知である。
【００６７】
従って、本発明のポリペプチドは、アミノ酸の置換、欠失、短縮、および挿入を含む種々の方法で変更され得る。このような操作のための方法は一般に当該分野で公知である。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列改変体は、ＤＮＡ中での変異によって調製され得る。変異誘発およびヌクレオチド配列変更の方法は、当該分野で周知である。例えば、次の参考文献およびそれらに引用される参考文献を参照のこと：Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985); Kunkel et al., Methods in Enzymol., 154, 367 (1987)；米国特許第４，８７３，１９２号；Walker and Gaastra, eds., Techniques in Molecular Biology, MacMillan Publishing Company, New York (1983)。目的のタンパク質の生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換に対する手引きは、本明細書において参考として援用され、次に見出すことができる：Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, Natl. Biomed. Res. Found., Washington, C.D. (1978)。１つのアミノ酸を、同様の特性を有する別のアミノ酸と交換するような保存的置換が好ましい。
【００６８】
従って、本発明の遺伝子およびヌクレオチド配列は、天然に存在する配列および変異体の両方を含む。同様に、本発明のポリペプチドは、天然に存在するタンパク質、ならびにその改変体およびその改質された型の両方を包含する。このような改変体は所望の活性を保有したままである。本明細書に包含されるポリペプチド配列の欠失、挿入、および置換は、このポリペプチドの特徴においてラジカルな変化を生じるとは予想されない。しかし、置換、欠失、または挿入の正確な影響を、事前に予想することが難しい場合、当業者は、その影響が慣用的なスクリーニングアッセイで評価されることを認識するであろう。
【００６９】
本明細書において用いられる「発現カセット」とは、適切な宿主細胞において特定のヌクレオチド配列の発現を指向し得るＤＮＡ配列であって、終止シグナルに作動可能に連結されている、目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含むことを意味する。発現カセットはまた、代表的には、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列を含む。コード領域は通常、目的のタンパク質をコード化するが、また目的の機能的ＲＮＡ、例えば、アンチセンスＲＮＡまたは非翻訳ＲＮＡをセンス方向またはアンチセンス方向でコード化してもよい。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、その成分の少なくとも１つが、その他の成分の少なくとも１つに関して異種であることを意味するキメラであってもよい。この発現カセットはまた、天然に存在するものであってもよいが、異種発現に有用な組み換え型で得られているものであってもよい。発現カセットにおけるヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターの制御下であっても、あるいは宿主細胞がいくつかの特定の外部刺激に曝された時にのみ、転写を開始する誘導性プロモーターの制御下であってもよい。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織もしくは器官、または発生の段階に特異的であり得る。
【００７０】
本発明のタンパク質は、アミノ酸の置換、欠失、短縮、および挿入を含む種々の方法で変更することもできる。このような操作の方法は当該分野で公知である。変異誘発およびヌクレオチド配列変更の方法は、当該分野で周知である。例えば、次の参考文献およびそれらに引用される参考文献を参照のこと：Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492 (1985)；Kunkel et al., Methods in Enzymol. 154:367-382 (1987)；米国特許第４，８７３，１９２号；Walker and Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology Biology (MacMillan Publishing Company, New York)。目的のタンパク質の生物学的活性に影響しない適切なアミノ酸置換に対する手引きは、本明細書において参考として援用される次のモデルに見出され得る：Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.)。１つのアミノ酸を、同様の特性を有する別のアミノ酸と交換するような保存的置換が好ましいこともある。
【００７１】
従って、本発明の遺伝子およびヌクレオチド配列は、天然に存在する配列型および変異体型の両方を含む。同様に、本発明のタンパク質は、天然に存在するタンパク質、ならびにそのバリエーションおよび改変された型の両方を包含する。このような改変体は、所望の疾患耐性活性を保有したままである。明らかに、この改変体をコード化するＤＮＡにおいてなされる変異は、リーディングフレーム以外の配列を置いてはならず、そして好ましくは、二次的なｍＲＮＡ構造を生じ得る相補的な領域を生成しない。例えば、欧州特許出願公開第７５，４４４号を参照のこと。
【００７２】
本明細書に包含されるタンパク質配列の欠失、挿入、および置換は、このタンパク質の特徴においてラジカルな変化を生じるとは予想されない。しかし、置換、欠失、または挿入の正確な効果を前もって予想することが難しい場合、当業者は、その効果が慣用的なスクリーニングアッセイで評価されることを認識するであろう。このような配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実行されることもできる。
【００７３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」および「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗａｓｈ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」とは、サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイゼーション実験の状況では配列依存性であり、異なる環境パラメーターの下では相違する。より長い配列は、高温で特異的にハイブリダイズさせる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引きを次に挙げる：Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, page 1, chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York (1993)。概して、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、ある同定されたイオン強度およびｐＨで、特定の配列についての熱融点（Ｔm）より約５℃低くなるように選択される。代表的には、「ストリンジェントな条件」下では、プローブはその標的配列にハイブリダイズさせるが、他の配列にはハイブリダイズさせない。例えば、「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、プローブが、他の配列よりもその標的配列に対して、検出可能に大きい程度（例えば、バックグラウンドを少なくとも２倍上回る）までハイブリダイズさせる条件を意図する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー、および／または洗浄条件を制御することによって、プローブに１００％相補的である標的配列が同定され得る（相同性プロービング（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｂｉｎｇ））。あるいは、ストリンジェンシー条件を調整して、より低い程度の類似性が検出される（異種性プロービング（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｂｉｎｇ））ように、配列中のいくつかのミスマッチを可能にさせることができる。一般に、プローブは、約１０００ヌクレオチド長未満、好ましくは５００ヌクレオチド長未満である。
【００７４】
代表的に、ストリンジェントな条件とは、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で、１．５Ｍ  Ｎａイオン未満、代表的には０．０１〜０．１Ｍ  Ｎａイオン濃度（または他の塩）であり、温度が、短い（例えば、１０〜５０ヌクレオチドの）プローブについては、少なくとも約３０℃、そして長い（例えば、５０ヌクレオチドより長い）プローブについては、少なくとも約６０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成することもできる。
【００７５】
代表的な低ストリンジェンシー条件は、３７℃で、３０〜３５％のホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝液を用いたハイブリダイゼーション、および５０〜５５℃で、１×ＳＳＣまたは２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０Ｍ  ＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）中の洗浄を含む。代表的な穏やかなストリンジェンシー条件は、３７℃で、４０〜４５％のホルムアミド、１．０Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションと５５〜６０℃で、０．５×ＳＳＣまたは１×ＳＳＣ中の洗浄とを含む。代表的な高ストリンジェンシー条件は、３７℃で、５０％のホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％  ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーションと、６０〜６５℃で、０．１×ＳＳＣ中の洗浄とを含む。
【００７６】
特異性は代表的に、ハイブリダイゼーション後洗浄の関数であり、重要な因子は、最終洗浄溶液のイオン強度および温度である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドについては、Ｔmは、MeinkothおよびWahl(Anal.Biochem.138:267-284(1984))の等式（Ｔm８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ  Ｍ）＋０．４１（ＧＣ％）−０．６１（ｆｏｒｍ％）−５００／Ｌ）から概算され得る；ここでＭは、１価の陽イオンのモル濃度であり、ＧＣ％は、ＤＮＡ中のグアノシンヌクレオチドおよびシトシンヌクレオチドのパーセンテージであり、ｆｏｒｍ％は、ハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージであり、そしてＬは、塩基対中のハイブリッドの長さである。Ｔmは、相補的な標的配列のうち５０％が、完全にマッチしたプローブにハイブリダイズさせる（同定されたイオン強度およびｐＨの下で）温度である。
【００７７】
特定のプローブについてのＴmに等しくなるように、極めてストリンジェントな条件を選択する。サザンブロットまたはノーザンブロットにおけるフィルター上に１００を超える相補的な残基を有する、相補的な核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃で１ｍｇのヘパリンを有する５０％ホルムアミドであり、このハイブリダイゼーションは一晩実行される。高度にストリンジェントな条件の例は、約１５分間７２℃で０．１５ＭのＮａＣｌである。ストリンジェントな洗浄条件の例は、１５分間６５℃の０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（後出）を参照のこと）。しばしば、バックグラウンドのプローブシグナルを取り除くために、高ストリンジェンシーな洗浄に先立って、低ストリンジェンシーな洗浄が行われる。例えば、１００ヌクレオチドを超える２重鎖についての穏やかなストリンジェンシーの例は、４５℃、１５分間の１×ＳＳＣである。例えば、１００ヌクレオチドを超える２重鎖についての低ストリンジェンシーな洗浄の例は、４０℃、１５分間の４〜６×ＳＳＣである。短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）に関しては、ストリンジェントな条件は、代表的に、ｐＨ７．０〜８．３で、約１．０Ｍ  Ｎａイオン未満の塩濃度、代表的に約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（または他の塩）を含み、温度は代表的に少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤の添加によって達成され得る。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて関連のないプローブについて観察されたシグナル対ノイズ比に対して２×（またはそれ以上）のシグナル対ノイズ比は、特定のハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェントな条件下でお互いにハイブリダイズさせない核酸は、それらがエンコードするタンパク質が実質的に同一である場合は、依然として実質的に同一である。これは、例えば、遺伝子コードによって許容される最大のコドン縮重を用いて核酸のコピーが生成される場合に生じる。
【００７８】
次は、本発明の参照ヌクレオチド配列に対して実質的に同一であるクローン相同体（ホモログ）ヌクレオチド配列に対して用いることもできるハイブリダイゼーション条件／洗浄条件のセットの例である：参照ヌクレオチド配列は好ましくは、５０℃で、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で５０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄を伴い；望ましくは、５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄を伴い；なおより望ましくは、５０℃で、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄を伴って；好ましくは、５０℃で、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、５０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄を伴って；より好ましくは、５０℃で、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ  ＮａＰＯ4、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中で、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄を伴って、この参照ヌクレオチド配列にハイブリダイズさせる。
【００７９】
Ｔmは、ミスマッチの１％ごとについて、約１℃ずつ低下する；従って、Ｔm、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄の条件は、所望の同一性の配列に対してハイブリダイズさせるように調整され得る。例えば、９０％を超える同一性を有する配列を探す場合、Ｔmは、１０℃低下され得る。一般に、特定の配列およびその相補体について、所定のイオン強度およびｐＨで、熱融点（Ｔm）よりも約５℃低くなるように、ストリンジェントな条件が選択される。しかし、厳密にストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔm）よりも１、２、３、または４℃低いハイブリダイゼーション、および／または洗浄を利用し得る；穏やかなストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔm）よりも６、７、８、９または１０℃低いハイブリダイゼーション、および／または洗浄を利用し得る；低度にストリンジェントな条件は、熱融点（Ｔm）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低いハイブリダイゼーション、および／または洗浄を利用し得る。これらのパラメーター、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の構成、ならびに所望のＴを用いて、当業者は、ハイブリダイゼーション、および／または洗浄溶液のストリンジェンシーにおけるバリエーションが、本質的に記載されていることを理解するであろう。所望のミスマッチの程度が、４５℃（水溶液）、または３２℃（ホルムアミド溶液）未満のＴを生じる場合、より高い温度が用いられ得るようにＳＳＣ濃度を上昇させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引きは次を参照のこと：Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part 1, Chapter 2 (Elsevier, New York); and Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley - Interscience, New York).  See Sambrook et al. (1989) ) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)。
【００８０】
一般に、特定の配列について、所定のイオン強度およびｐＨで、熱融点（Ｔm）よりも約５℃低くなるように、ストリンジェントな条件が選択される。しかし、ストリンジェントな条件は、本明細書において他の方法で認可したような所望の程度のストリンジェンシーに依存して、約１℃〜約２０℃の範囲の温度を包含する。ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズさせない核酸は、それらがコード化するポリペプチドが本質的に同一である場合、依然として実質的に同一である。これは、例えば、遺伝子コードによって許容される最大のコドン縮重を用いて核酸のコピーが生成される場合に生じることもある。２つの核酸配列が実質的に同一であるというインデックスの１つは、この第一の核酸によってエンコードされるポリペプチドが、第二の核酸によってエンコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性である時である。
【００８１】
「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、とりわけ、２本鎖または１本鎖の直線または環形である任意のプラスミド、コスミド、またはファージを含むと同定され、これらは自己遺伝性であっても移動性であっても、またはそうでなくてもよく、細胞ゲノムへの組み込みかまたは染色体外に存在する（例えば、複製起点を有する自律性複製プラスミド）かのいずれかによって、原核生物宿主または真核生物宿主を形質転換し得る。
【００８２】
特別に含まれるのはシャトルベクターである。シャトルベクターとは、２つの異なる宿主生物体において天然にまたは設計により複製し得るＤＮＡビヒクルを意味する。この宿主生物体は、放線菌類および関連の種、細菌、ならびに真核生物（例えば、高等生物細胞、哺乳動物、酵母、または真菌細胞）から選択されてもよい。
【００８３】
好ましくは、ベクター中の核酸は、微生物、例えば、細菌、または動物の細胞のような、宿主細胞における転写のための適切なプロモーター、または他の調節エレメントの制御下であり且つ作動可能に連結されている。ベクターは、複数の宿主において機能する２機能性の発現ベクターであってもよい。ゲノムＤＮＡの場合、これは、自己のプロモーターまたは他の調節性エレメントを含んでもよく、ｃＤＮＡの場合、これは、宿主細胞における発現のための適切なプロモーターまたは他の調節性エレメントの制御下であってもよい。
【００８４】
「クローニングベクター（ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒ）」は代表的に、外来のＤＮＡ配列が、そのベクターの必須の生物学的機能を損なうことなく、決定可能な様式で挿入され得る１または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位に、ならびにこのクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択における使用に適切なマーカー遺伝子を含む。マーカー遺伝子としては代表的に、テトラサイクリン耐性、ハイグロマイシン耐性、またはアンピシリン耐性を提供する遺伝子が挙げられる。
【００８５】
「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」とは、同じ核酸分子の一部として連結され、転写がプロモーターから開始されるように適切に配置および方向付けされていることを意味する。プロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡは、このプロモーターの「転写開始調節下（ｕｎｄｅｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）」である。
【００８６】
「キメラの（ｃｈｉｍｅｒｉｃ）」は、ベクターまたは遺伝子のようなＤＮＡ配列が、組み換えＤＮＡ技術によって一緒に融合された、異なる起源の１つ以上のＤＮＡ配列から構成され、天然には存在しないＤＮＡ配列を生じることを示すために用いられる。
【００８７】
用語「異種のＤＮＡ配列（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、「外因性ＤＮＡセグメント（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ＤＮＡ  ｓｅｇｍｅｎｔ）」、または「異種の核酸（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）」が本明細書において用いられる場合、それぞれ特定の宿主細胞に対して外来の供給源が起源である配列か、またはもし同じ供給源由来である場合はその元の形態から改質されている配列をいう。従って、宿主細胞中の異種遺伝子としては、特定の宿主細胞に対して内因性であるが、例えば、ＤＮＡシャッフリングの使用によって改変されている遺伝子が挙げられる。この用語はまた、天然に存在するＤＮＡ配列の天然には存在しない複数のコピーを含む。従って、この用語は、細胞に対して外来または異種であるＤＮＡセグメントか、または細胞に対して同種（相同）であるが、宿主細胞核酸内の位置において、そのエレメントが、本来見い出されないＤＮＡセグメントをいう。外因性ＤＮＡセグメントが発現されて、外因性ポリペプチドが生じる。
【００８８】
「同種の（相同な）（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」ＤＮＡ配列とは、それが導入される宿主細胞と天然に関連しているＤＮＡ配列である。
【００８９】
次の用語は、２つ以上の核酸またはポリヌクレオチド間の配列の関係を記載するために用いられる：（ａ）「参照配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」、（ｂ）「比較ウインドウ（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）」、（ｃ）「配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」、（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」、および（ｅ）「実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」。
【００９０】
本明細書において用いる場合、「参照配列」とは、配列比較のための基礎として用いられる同定の配列である。例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子配列として、参照配列は特定の配列のサブセットであってもまたは全体であってもよい。
【００９１】
本明細書において用いる場合、「比較ウインドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続するセグメントおよび特定のセグメントに対する参照を作成する。ここで比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列は、この２つの配列の最適アラインメントのために、参照配列（付加も欠失も含まない）に比べて付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。一般に、比較ウインドウは、少なくとも２０連続するヌクレオチド長であり、任意選択的に３０、４０、５０、１００、またはそれ以上であってもよい。当業者は、ポリヌクレオチド配列におけるギャップの包含に起因して、参照配列に対する高い類似性を回避するために、ギャップペナルティーが代表的には導入され、マッチの数から差引きされることを理解する。
【００９２】
比較のための配列アラインメントの方法は、当該分野で周知である。従って、任意の２つの配列間パーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。好ましくは、このような数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Karlin および AltschulのProc. Nath. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993)で改質されたように、次が挙げられる：Myers および Miller のアルゴリズム、CABIOS 4:11-17 (1988)；Smith et al の局所相同性アルゴリズム、Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)；Needleman および Wunsch の相同性アラインメントアルゴリズム、J. Mol. Biol. 48:443-453(1970)；Pearson および Lipman の類似性検索法（search-for-similarity-method）Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448(1988)；Karlin および Altschul，Proc. Nath. Acad Sci. USA 872264(1990)。
【００９３】
これらの数学的アルゴリズムのコンピューターによる実行は、配列を比較して配列同一性を決定するために利用可能である。このような実行としては、次が挙げられるがこれらに限定されない：ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム中のＣＬＵＳＴＡＬ（Intelligenetics, Mountain View, California から入手可能）；ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）、ならびに the Wisconsin Genetics Software Package, Version 8でのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA から入手可能）。これらのプログラムを用いるアラインメントは、デフォールトパラメーターを用いて実施され得る。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは次により記載されている:Higgins et al. Gene 73:237 244 (1988)；Higgins et al. CABIOS 5:151-153 (1989)；Corpet et al. Nucleic Acids Res. 16；Huang et al. CABIOS 8:155-65 (1992)；および Pearson et al. Meth. Mol. Biol. 24:307-33l (1994)。ＡＬＩＧＮプログラムは、MyersおよびMiller（前出）のアルゴリズムに基づく。AltschulらのＢＬＡＳＴプログラム、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）は、KarlinおよびAltschul（前出）のアルゴリズムに基づく。比較目的でギャップアラインメントを得るために、Altschul et al、Nucleic Acids Res. 25:3389 (1997)に記載のように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０）を利用し得る。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ  ２．０）は、分子の間の遠い関係を検出する反復検索を実施するために用いることができる。Altschulら（前出）を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、各々のプログラムのデフォールトパラメーター（例えば、ヌクレオチド配列についてはＢＬＡＳＴＮ、タンパク質についてはＢＬＡＳＴＸ）を用いることができる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォールトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォールトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10915 (1989)を参照のこと）を使用する。http://www.ncbi.n1m.nih.govを参照されたい。アラインメントはまた、インスペクションによって手動で実施されてもよい。
【００９４】
本発明の目的のために、本明細書に開示される配列同一性パーセントの決定のためのヌクレオチド配列の比較は、好ましくはデフォールトパラメーターまたは任意の等価なプログラムを用いるＢｌａｓｔＮプログラム（バージョン１．４．７またはそれ以降）を用いてなされる。「等価なプログラム」とは、任意の配列比較プログラムであって、問題の任意の２つの配列について、好ましいプログラムによって生成された対応するアラインメントと比べた場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のマッチ、および同一のパーセントの配列同一性を有するアラインメントを生成するプログラムを意図する。
【００９５】
本明細書における、２つの核酸またはポリペプチド配列の文脈で「配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」または「同一性」ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、特定の比較ウインドウにまたがって、そこでの最大の一致を探すために一列に並べる場合、同じになる２つの配列における残基について言及するものである。配列同一性のパーセンテージをタンパク質に関して用いる時、同一でない残基位置はしばしば保存的アミノ酸置換ごとに異なることが認識される。この保存的アミノ酸置換においては、アミノ酸残基が同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、従ってその分子の機能的な特性は変化していない。保存的置換において配列が異なる場合、配列同一性パーセントは、その置換の保存的性質に関して補正するために上方に調整することもできる。このような保存的置換が異なる配列は、「配列類似性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」または「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」を有するといわれる。この調整を行うための方法は当業者には周知である。代表的には、この方法は、保存的置換を、完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてのスコアリングを包含することによって、配列同一性パーセンテージが増大する。従って、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換が０のスコアを与えられる場合、保存的置換は、０と１との間のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（Intelligenetics, Mountain View, California）において実施されるように算出される。
【００９６】
本明細書において用いる「配列同一性のパーセンテージ」とは、比較ウインドウにまたがる２つの最適に整列された配列を比較することによって決定された値を意味する。ここで比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、この２つの配列の最適アラインメントについて参照配列（付加も欠失も含まない）と比較した場合、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。このパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得ること、このマッチした位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で割ること、およびその結果に１００を掛けて配列同一性パーセンテージを得ることによって算出される。
【００９７】
ポリヌクレオチド配列の「実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーターを用いて記載されたアラインメントプログラムの１つを用いて、参照配列と比較し、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、または７９％、好ましくは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。当業者は、これらの値が、コドン縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレーム位置決めなどを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列によってエンコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために適切に調整され得ることを認識するであろう。これらの目的のためのアミノ酸配列の実質的な同一性は通常、少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を意味する。
【００９８】
ヌクレオチド配列が実質的に同一である別のインデックスは、２つの分子がストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズするか否かである。一般に、特定の配列について、同定されたイオン強度およびｐＨで、熱融点（Ｔm）よりも約５℃低くなるように、ストリンジェントな条件が選択される。しかし、ストリンジェントな条件は、本明細書において他の方法で認定したような所望の程度のストリンジェンシーに依存して、約１℃〜約２０℃の範囲の温度を包含する。ストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズしない核酸は、それらがエンコードするポリペプチドが実質的に同一である場合、依然として実質的には同一である。これは、例えば、遺伝子コードによって許容される最大のコドン縮重を用いて核酸のコピーが生成される場合に生じ得る。２つの核酸配列が実質的に同一であるというインデックスの１つは、第一の核酸によってエンコードされるポリペプチドが、第二の核酸によってエンコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性である時である。
【００９９】
ペプチドの文脈において、「実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」という用語は、ペプチドが、特定の比較ウインドウにわたって、参照配列に対して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、または７９％、好ましくは８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、または８９％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、または９４％、なおより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含むことを示す。好ましくは、最適アラインメントは、Needleman および Wunsch(J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970))の相同性アラインメントアルゴリズムを用いて実行する。２つのペプチド配列が実質的に同一であると表示するには、１つのペプチドが、第二のペプチドに対して惹起された抗体と免疫学的に反応性があるということである。従って、例えば、２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、その２つのうちの１つのペプチドは、もう１つの第二のペプチドに対して実質的に同一である。
【０１００】
（発明の詳細な説明）
本発明は、イヌにおけるペプチドアミノ酸吸収に関し、そしてより詳細には、推定のイヌの低親和性、高能力のＨ+／ペプチド輸送タンパク質（ｃＰｅｐＴ１）をエンコードする別々の、全長または部分長の相補的ＤＮＡ、ｃＰｅｐＴ１に対応するｍＲＮＡ転写物、グリシルサルコシン（ＧｌｙＳａｒ）取り込みによるｃＰｅｐＴ１の特徴付け、ｃＰｅｐＴ１によって十分に認識されるジペプチド、トリペプチド、およびテトラペプチドの同定、ならびにｃＰｅｐＴ１の輸送能力に対する補充によるペプチド基質の効果に関する。
【０１０１】
本発明はまた、ＰｅｐＴ１によるアミノ酸の取り込み増強を提供する少なくとも１つのジペプチド、トリペプチド、またはテトラペプチドを含むペット用食物組成物を提供する。本発明における用途のための代表的なイヌの食餌は、例えば、約２０〜約３０％の粗タンパク質、約１０〜約２０％の脂肪、および約１０％の総食餌線維を含んでもよい。しかし、これらおよび他の栄養物の特定の比率またはパーセンテージは必要ではない。
【０１０２】
本発明者らは、実施例２に示されるように、特にラクトアルブミン加水分解産物と共にインキュベートし、且つ播種後最適時間でアッセイした場合、ＰｅｐＴ１によるアミノ酸の輸送を増大するペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド、またはテトラペプチド）を、ＭＤＣＫ細胞を用いて同定するための方法を開発している。
【０１０３】
本発明がさらに容易に理解され得るように、次の実施例を参照として言及するが、実施例は本発明を例示する意図であって、その範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１０４】
（実施例１）
部分長のイヌＰｅｐＴ１  ｃＤＮＡの生成
小腸の上皮からのイヌＰｅｐＴ１（ｃＰｅｐＴ１）の部分的クローニング
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法によって推定のイヌＰｅｐＴ１  ｃＤＮＡを部分的にクローン化する初期の試み（１５０を超える）は失敗した。ｍＲＮＡの供給源は、約６ヶ月間凍結されていたイヌ肝臓組織（Mississippi State University Dr. Randal Buddingtonによって提供された）であり、オリゴマープライマーは、ウサギＰｅｐＴ１配列に基づいていた。実質的に、凍結イヌ「中部」小腸（空腸）組織セグメントが利用可能になり（Dr. Buddingtonによって提供された）、約７８０塩基対（ｂｐ）の部分長ｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによってクローン化した。腸の切片から削り取った空腸上皮から、標準的な酸性フェノール−クロロホルムプロトコールを用いて、総ＲＮＡを単離した。ＰＯＬＹ  Ａ  ＴＲＡＣＴ  ＳＹＳＴＥＭ（登録商標）（Promega, Madison, WI）を用いて、総ＲＮＡから、１μｇのｍＲＮＡを単離し、マウス白血病ウイルス逆転写酵素（Perkin Elmer, Foster City, CA）およびオリゴ（ｄＴ）プライマー（Gibco BRL,Grand Island, N.Y.）を用いて逆転写した。首尾よいＰＣＲ反応物は、５０μＬであり、１μＭ  ＭｇＣｌ2、およびＴａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer）を含んでいた。９４℃１分間、４０℃４５秒間、７２℃１分間の２５回の熱サイクルを用いた。このサイクルに先んじて、９５℃で５５秒のＲＴ産物の変性、それに続いて７２℃でＲＴ−ＰＣＲ産物の１０分間の伸長を行った。このプロトコールを達成するには、１０の異なるプライマーセットを試験する、１５０より多くのＲＴ−ＰＣＲ反応物を必要とした。プライマーセット４を用いて得られたｃＤＮＡ（図１）を、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩベクター（Invitrogen, Carlsbad, CA）中にＴＡクローン化して、ブルー／ホワイトスクリーニングによってプラスミド含有コロニーを選択し、製造業者の指示に従って増幅した。回収されたｐＣＲ（登録商標）ＩＩ／ｃＤＮＡプラスミドの制限分析によって、ｃＤＮＡを含んだ５６のクローンのうち４つが、ウサギＰｅｐＴ１  ｃＤＮＡ（図２）と一致することが明らかになった。
【０１０５】
イヌの組織およびＭＤＣＫ細胞におけるｃＰｅｐＴ１発現のノーザンブロット分析
イヌの腎臓、小腸上皮、および不死化した腎臓遠位尿細管上皮細胞（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｋｉｄｎｅｙ，ＭＤＣＫ）によるｃＰｅｐＴ１  ｍＲＮＡの潜在的な発現を、イヌ空腸上皮由来のｃＤＮＡを用いてノーザン分析によって評価した（図３）。０．０２Ｍホルムアルデヒドの存在下で、ＲＮＡを１％ゲル電気泳動に供し、０．４５μｍのナイロンメンブレン（Hybond-N, Amersham, Arlington Heights, IL）に下向きの毛管現象によって移し、紫外光によって共有結合性に架橋した。キット（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて［32Ｐ］−ＣＴＰと共に、ｃＤＮＡをランダムに標識し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ−５０カラム（Amersham Pharmacia, Piscataway, N.J.））を通して精製して、５６℃で１８時間ブロットとハイブリダイズさせた。次いで、このブロットを５６℃で１５分間、２回、５７℃で１０分間、１回洗浄した。オートラジオグラフを８０℃で２４時間ブロットに曝露し、１８Ｓ（１．９ｋｂ）および２８Ｓ（４．９ｋｂ）のＲＮＡの移動距離に対するハイブリダイズさせたバンドの回帰によって、転写物のサイズを決定した。
【０１０６】
各々のイヌ組織由来ｃＤＮＡ（ＴＡクローン２６、図３Ａ；ＴＡクローン６、図３Ｂ）は、イヌ腎臓、イヌ小腸上皮、およびＭＤＣＫ細胞における３つのｍＲＮＡ種にハイブリダイズさせた。これらのイヌｃＤＮＡによるＰｅｐＴ１  ｍＲＮＡの同定を確認するため、全長ウサギＰｅｐＴ１  ｃＤＮＡを用いて、イヌの腎臓および肝臓組織から単離したＲＮＡを、ＰｅｐＴ１  ｍＲＮＡの発現についてプローブ（探索）した（図４；ウサギＰｅｐＴ１  ｃＤＮＡはMedical College of Georgia, Dr. F. Leibach、およびDr. V. Ganapathyから提供された）。この結果はまた、イヌ組織による同じ３つのＰｅｐＴ１  ｍＲＮＡ種の発現を実証した。このことは、本研究における全長ウサギＰｅｐＴ１  ｃＤＮＡおよびイヌ組織由来のｃＤＮＡが、同じ転写物を同定したことを示す。これらの３つのブロットから算出した転写産物のサイズの平均／ＳＤは、それぞれ、４．２／０．２２ｋｂ、２．７５／０．２６ｋｂ、および１．４６／０．４２ｋｂであった。まとめると、これらのデータによって、肝臓、腸上皮、およびＭＤＣＫ細胞が、同じサイズおよび数のＰｅｐＴ１転写物を発現することが示される。相対的に、ニワトリ、ヒツジ、ウシ、ブタ、ウサギ、ラット、ヒトの種々の組織、およびＣａｃｏ２細胞は、単一の転写物を発現することが報告されている。この転写物は、ニワトリ（１．９）と哺乳動物種（それぞれ、２．８、２．８、２．９、２．９、３．０、３．１、２．９）との間でサイズの本質的な違いを有する。
【０１０７】
ＭＤＣＫ細胞からのイヌＰｅｐＴ１（ｃＰｅｐＴ１）ｃＤＮＡの部分的クローン化および配列同定
ポジティブなノーザン分析を確認するために、つまりイヌ小腸上皮から生成したｃＤＮＡを用いるＰｅｐＴ１  ｍＲＮＡ発現の同定ＲＴ−ＰＣＲ方法論を用いて、ＭＤＣＫ細胞からＰｅｐＴ１  ｃＤＮＡを生成してきた。標的ｃＤＮＡ領域は、イヌ小腸からＲＴ−ＰＣＲによって生成したｃＤＮＡのサブセットであった（ウサギＰｅｐＴ１のｂｐ８３〜８８７）。従って、ウサギＰｅｐＴ１（GenBank口座番号Ｕ０６４６７）のｂｐ２５９〜６１９に相当するＰＣＲプライマーを用いて、ＭＤＣＫ細胞から単離したｍＲＮＡにより部分長の「イヌＰｅｐＴ１」（ｃＰｅｐＴ１）ｃＤＮＡを生成した。ラットテールコラーゲンでコーティングしたシャーレ上に３０，０００ｃｍ2でプレートして、１０％ウシ胎仔血清／ＤＭＥＭ中で３日間培養した細胞から、ＲＮＡを収集した。製造業者（Gibco-BRL）の指示に従って、ランダムプライマーおよびオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて、ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（登録商標）ＩＩ逆転写酵素（Gibco-BRL）によって、５μｇの総ＲＮＡの逆転写を実施した。全てのＰＣＲ反応物は、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2および９４℃２分間、５５℃１分間、および７２℃２分間での３０サイクルを含むＴａｑポリメラーゼを用いる熱サイクルを含んでいた。このサイクルに先立って、９４℃で１０分のＲＴ産物の変性、それに続いて７２℃で１０分のＲＴ−ＰＣＲ産物の伸長を行った。このプロトコールを達成するためには、１００より多いＲＴ−ＰＣＲ反応物を必要とした。
【０１０８】
約３８０ｂｐの得られたｃＤＮＡを、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩベクター（上述のような）の部位中にＴＡクローン化し、増幅し、ブルー／ホワイトスクリーニングによって細菌のコロニーを評価し、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ／ｃＤＮＡプラスミドを、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩ制限分析（上述のような）によって、ｃＤＮＡについて評価した。回収されたプラスミドの制限分析によって、３６のクローンのうち６個が、ウサギＰｅｐＴ１  ｃＤＮＡと一致するｃＤＮＡを含むことが明らかになった。確認したプラスミドのうち２つを細菌中で増幅して回収し、the University of Florida DNA Sequencing Core Facility (Gainesville)による配列決定のために送付した。ＢＬＡＳＴ２．０．１４ソフトウェア（blast@ncbi.nlm.nih.gov）を用いたこの３８０ｂｐのｃＤＮＡ（図５）と他の種のＰｅｐＴ１配列との配列比較によって、イヌの配列は、ウサギのＰｅｐＴ１配列（ｂｐ２５９〜６４０；GenBank口座番号４７３３７５）に対して７９％、ラットのＰｅｐＴ１配列（ｂｐ２１３〜５９３；GenBank口座番号Ｄ５０６６４．１）に対して８３％、マウスのＰｅｐＴ１配列（ｂｐ２１３〜５８９；GenBank口座番号ＡＦ２０５５４０）に対して８３％、そしてヒトのＰｅｐＴ１配列（ｂｐ２８５〜６６５；GenBank口座番号４７３３７５およびＵ１３１７３）に対して８７％の配列相同性を共有することが明らかになった。
【０１０９】
ＭＤＣＫ細胞におけるＰｅｐＴ１様輸送活性の実証
図３および図５に示されるように、ＭＤＣＫ細胞は、哺乳動物ＰｅｐＴ１  ｍＲＮＡのイヌ相同体（ホモログ）を発現する。細胞全体輸送技術、およびモデルジペプチド基質としてグリシルサルコシン（ＧｌｙＳａｒ）を用いて、融合性ＭＤＣＫ細胞による、ＰｅｐＴ１輸送活性（Ｈ+依存性、ジペプチド阻害可能、低親和性ジペプチド輸送）の潜在的な発現を評価した。細胞をラットテールコラーゲンまたはポリ−Ｌ−リジンでコーティングされている２４ウェルのトレイ中に６０，０００細胞／ｃｍ2で播種し、ダルベッコの改質イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium）／１０％ウシ胎仔血清／１％抗菌抗微生物培地からなる媒地中で３日間培養した（３７℃で、９５％Ｏ2：５％ＣＯ2）。２４ウェルクラスタートレイ法および代表シンチレーションカウントを用いて、［3Ｈ］−グリシル−Ｌ−サルコシン（ＧｌｙＳａｒ；６ｍＣｉ／ｍＬ，Moravek Biochemicals, Brea, CA）の吸収（ｐｍｏｌｓ／タンパク質（ｍｇ））を決定した。輸送前に、３７(Ｃで３０分間、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ4、および５ｍＭグルコース（取り込み緩衝液）中で、細胞をインキュベートさせ、細胞内のアミノ酸およびペプチドのプールを正規化した。２．８８μｍ  ＧｌｙＳａｒを含んだ取り込み緩衝液の０．２５ｍＬの添加によって輸送を開始した。３７℃での取り込みの３０分後、４℃の取り込み緩衝液を４×２ｍＬ用いる細胞の素早い洗浄によって輸送を終了した。１０％のトリクロロ酢酸を用いて細胞タンパク質を沈殿させ、そして上清を回収してカウントし、放射能（3Ｈ）含量を決定した。次いで、細胞タンパク質を０．２Ｎ  ＮａＯＨおよび０．２％ＳＤＳに可溶化し、標準物としてウシ血清アルブミンを用いるローリー法によって定量した。吸収されたＨ+依存性ＧｌｙＳａｒの量を、ｐＨ６．０の取り込み緩衝液とｐＨ７．５の取り込み緩衝液との間の取り込みの差異として算出した。競合物の基質阻害可能ＧｌｙＳａｒ取り込みの量を、１００％を乗じた１０ｍＭ競合物基質（ジペプチドまたはアミノ酸）の有無におけるＧｌｙＳａｒ取り込みの商として算出した。
【０１１０】
細胞内のＨ+勾配（細胞外ｐＨ６．０）の存在下でのＧｌｙＳａｒ取り込みは、ｐＨ７．５の培地における取り込みよりも、コラーゲン上にプレートされた細胞中で２．３倍高く、そしてポリ−Ｌ−リジン上で増殖された場合１．７倍高かった（表１）。ＭＤＣＫ細胞によるＧｌｙＳａｒのＨ+依存性取り込みは、それぞれ、コラーゲン上で増殖された場合、１０ｍＭ  ＬｅｕＴｒｐまたはＴｒｐＬｅｕの存在によって、８８％または９２％まで阻害され、ポリ−Ｌ−リジン上で増殖された場合、８７％または９２％まで阻害された（表１）。
【０１１１】
表１  コラーゲンでコーティングされたトレイまたはポリ−Ｌ−リジンでコーティングされたトレイ上で培養されたＭＤＣＫ細胞による［3Ｈ］−グリシルサルコシンの取り込みに対する細胞外ｐＨおよび競合基質の影響。細胞をテキストに記載されるとおり培養して、２．８８［3Ｈ］−グリシルサルコシンを含むｐＨ７．５または６．０の培地中で、３０分間、取り込みを比較した。
【０１１２】
【表１】
2004533813.tif 000003
1ｎａ、適用不能（ｎｏｔ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ）
【０１１３】
ＭＤＣＫ細胞によるペプチド輸送の動態学的なパラメーターを予備的に特徴付けるため、ｐＨ６．０および０．０００６４、０．００２５、０．０１０、０．０４、０．１６０、０．６４０、２．５６、または１０．２ｍＭのＧｌｙＳａｒを含む培地中のＧｌｙＳａｒの取り込みを測定した（図６）。総ＧｌｙＳａｒ取り込みは、相対的に低親和性の機構（約４．０ｍＭの見かけ上のＫm）、および高い取り込み速度によるものであった。まとめると、ＧｌｙＳａｒ取り込みのこれらの特徴は、高い親和性、ＰｅｐＴ２によるＨ+依存性取り込み（μｍＫm）とは相反して、他の種によって発現されたＰｅｐＴ１の機能的活性に一致する。従って、ＭＤＣＫ細胞は、ＲＴ−ＰＣＲ（図１、２、５）およびノーザンブロット分析（図３、４）によるＰｅｐＴ１  ｍＲＮＡの検出と一致して、ＰｅｐＴ１様活性を保有すると結論される。
【０１１４】
実施例１のまとめ
イヌ小腸上皮（ｎ＝２；図１、２）、および不死化したイヌ腎細胞（ＭＤＣＫ細胞、ｎ＝１）からのＲＴ−ＰＣＲ分析によって、別々の部分長のイヌＰｅｐＴ１  ｃＤＮＡ（ｃＰｅｐＴ１）を生成した。ＭＤＣＫ  ｃＤＮＡを配列し（図５）、他の哺乳動物種によって発現されたＰｅｐＴ１  ｍＲＮＡと７９％〜８７％の配列同一性を共有することを見出した。腸上皮由来のＲＴ−ＰＣＲ  ｃＤＮＡを用いるノーザンブロット分析によって、イヌの組織（肝臓、ｎ＝３；腎臓、ｎ＝３；小腸  ｎ＝１）およびＭＤＣＫ細胞（ｎ＝２）によるイヌＰｅｐＴ１（ｃＰｅｐＴ１）の発現を確認した。部分長のイヌ由来ＰｅｐＴ１ｃＤＮＡ（図３）を用いる、ＰｅｐＴ１に相当するｍＲＮＡ転写物の同定を、全長ウサギｃＤＮＡ（図４）に対するハイブリダイゼーションによって確認した。ＭＤＣＫ細胞によるＧｌｙＳａｒ取り込みの特徴づけによって、ＭＤＣＫ細胞が、ＰｅｐＴ１様活性を発現することが実証された（表１、図５）。これによって、ＭＤＣＫ細胞によるＰｅｐＴ１  ｍＲＮＡ発現の検出、およびイヌＰｅｐＴ１の機能を特徴付けるためのモデルとしてのＭＤＣＫ細胞の用途が確認される。
【０１１５】
（実施例２）
ＰｅｐＴ１活性の発現に対する、種々のペプチド、および薬物基質、およびホルモン、および／または増殖因子の効果を評価するためのＭＤＣＫ細胞の実験的モデル
上記の実施例１によって、（１）小腸中部（空腸）の上皮からクローン化されたＰｅｐＴ１（ｃＰｅｐＴ１）ｍＲＮＡのイヌ相同体（ホモログ）が、他のいくつかの種によって発現されたＰｅｐＴ１と高い配列同一性を共有すること、（２）イヌの肝臓、腎臓、および空腸上皮が、同様のパターンのｃＰｅｐＴ１  ｍＲＮＡを発現すること、および（３）ＭＤＣＫ細胞が、Ｈ+依存性ペプチド取り込み可能であること、が示された。従って、ＭＤＣＫ細胞は、ｃＰｅｐＴ１の生物化学的特徴を評価するための適切なモデルである。本研究の特有な目標は、（１）ＭＤＣＫ細胞によって、低親和性Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込み（ＰｅｐＴ１活性）の機能的活性を特徴付けること、および（２）ｃＰｅｐＴ１（ｃＰｅｐＴ１）によって十分に認識されるジペプチドおよびトリペプチド、特にトリプトファンおよびロイシンを含むものを同定することである。
【０１１６】
以前の研究（Brandsch et al., 1994, Biochem J. 299:253-260）によって、遊離のアミノ酸を含む培地（ＤＭＥＭ）に較べて、ラクトアルブミン加水分解産物（ＬＨＭ）を含む培地で細胞が増殖された場合、ＭＤＣＫ細胞によるＨ+依存性ペプチド取り込みが大きいことが簡単に報告された。従って、ＭＤＣＫ細胞におけるペプチド輸送系を評価することが可能な最も鋭敏なモデルを確立するための試みにおいて、ＤＭＥＭ（ペプチド欠損）培地に対するＬＨＭ（ペプチド含有）培地の潜在的な影響、および最初の細胞プレーティング密度のコンフルエントに対するサブコンフルエントの潜在的な影響を比較した。ＭＤＣＫ細胞をＤＭＥＭ中で、６０，０００細胞／ウェル（サブコンフルエント）または１２０，０００細胞／ウェル（コンフルエント）のいずれかに播種し１日後に、１、２、３、または５日間、ＤＭＥＭ培地またはＬＨＭ培地中で培養した。次いで、各ウェルの細胞によって発現された、タンパク質の量（細胞増殖のインデックス）、およびＧｌｙＳａｒ取り込み（ペプチド取り込み能力のインデックス）を決定した。図７に示されるように、細胞タンパク質の量は、播種密度および培地の両方に関して、培養時間と共に増大した（Ｐ＜０．０５）。時間×培地の相互作用が観察され、これは、６日目のＤＭＥＭ中の細胞増殖のタンパク質含量が、ＬＨＭ中でのそれらの増殖に比べて大きいことを反映している。しかし、２日目、３日目、または４日目には、タンパク質含量に差異は観察されなかった。
【０１１７】
図７に記載されたＭＤＣＫ細胞による［3Ｈ］−ＧｌｙＳａｒの取り込み（２．８８μＭ，５μＣｉ／ｍＬ）を、細胞外から細胞内へのＨ+（水素イオン）勾配の有り（ｐＨ６．０の取り込み緩衝液）、および無し（ｐＨ７．４の取り込み緩衝液）において測定した。代表的なグラフ（図８）は、６０，０００／ウェルで播種され、ＬＨＭ中またはＤＭＥＭ中で培養された細胞によるＧｌｙＳａｒの取り込みを比較する。両方の培養培地に関して、ｐＨ６．０の存在下でのＧｌｙＳａｒ取り込みは、ｐＨ７．４の緩衝液における取り込みよりも大きく（Ｐ＜０．０１）、培養の長さに対して二次式の応答を示し（Ｐ＜０．０１）、緩衝液×日数の培養相互作用を反映する（Ｐ＜０．０１）。１２０，０００／ウェルで播種したＤＭＥＭ培養細胞は、６０，０００／ウェルで播種した細胞について記載されたのとほとんど同一の取り込み特徴を示した。対照的に、ＬＨＭ培養した細胞による３日目のｐＨ６．０の緩衝液の存在下でのＧｌｙＳａｒ取り込みは、６０，０００／ウェルで播種されたＤＭＥＭ培養した細胞によって観察された取り込みよりも２８％（定量的に）大きかっただけであった。
【０１１８】
１ウェルあたり、６０，０００細胞または１２０，０００細胞でプレートされたＭＤＣＫ細胞のペプチド輸送能力に対する培地の影響の分析をさらに精緻にするため、Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みを、ｐＨ６．０の緩衝液とｐＨ７．４の緩衝液との取り込み間の算術的な差異として算出した（図９）。３日目に観察された細胞の匹敵するタンパク質含量（図７）にもかかわらず、６０，０００で播種され、且つＬＨＭ培地中で増殖された細胞は、ＤＭＥＭ中での細胞増殖での取り込みよりも、ＧｌｙＳａｒ取り込みについて約６０％大きい能力を示した（図９；日数×培地  相互作用，Ｐ＜０．０１）。細胞のすべてについて、１ｍｇの細胞タンパク質あたりのＧｌｙＳａｒ取り込みの能力は、６日目に低下した。この差異は、ＬＨＭ培養細胞によってｐＨ６．０での取り込みが少なかったことの結果であって、ｐＨ７．４での取り込みがより大きいことの結果ではない。
【０１１９】
この実験の結果によって、細胞を６０，０００／ウェルで播種し、且つＬＨＭ中で２日間培養する場合、ペプチドを含む培地中で細胞を培養することは、増殖速度を上昇させないが、ペプチド取り込みの能力を上昇させることを示す。従って、これらのデータは、ペプチド含有培地での培養によるＰｅｐＴ１発現の誘導と一致しており、イヌＰｅｐＴ１トランスポーターのＨ+依存性ペプチド輸送活性を特徴付けるための培養条件の最適のセットを表している。これらのデータはまた、Brandschら(1994)によって最初に報告された、ペプチド輸送タンパク質ＬＨＭ培地に対するＤＭＥＭ培地の効果を刺激することを確証し、より周到に表している。
【０１２０】
実験３において決定した最大取り込み刺激培養パラメーターを用いて、最大のＧｌｙＳａｒ取り込みが達成され得るが、生理的な条件を複製するｐＨのレベルを決定するためにＧｌｙＳａｒ取り込みに対する細胞外から細胞内へのｐＨ勾配の効果をさらに評価した（図１０）。予想どおり、ｐＨ勾配の存在によって、二次式で（Ｐ＜０．０１）、Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みが刺激された（Ｐ＜０．００１）。ｐＨ５．５または６．０の取り込みは、ｐＨ７．５で達成されるよりも約２．７倍大きかった。これらの結果は、図８および図９のデータ、ならびに哺乳動物ペプチド輸送タンパク質の既知のＨ+依存性と一致している。従って、Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みの特徴づけのために、ｐＨ６．０の緩衝液の使用を、標準的な実験条件中に組み込んだ。
【０１２１】
適切な時間間隔を決定して、ＧｌｙＳａｒ取り込みの最初の（線形の）速度を測定するために、分単位の時間経過実験を実施した。図１１に示されるように、Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ（１００ｕＭ）取り込みは、１時間、直線的に増大し、次いで減速した（二次の応答、Ｐ＜０．０１）。ｐＨ６．０の緩衝液におけるＧｌｙＳａｒの取り込みは、３．７５分、７．５分、１５分、３０分、６０分、および１２０分において、ｐＨ７．４の緩衝液での取り込みよりも、それぞれ、約２倍、２．１倍、２．２５倍、２．６５倍、２．７９倍、および２．６２倍大きかった（Ｐ＜０．００１）。取り込みは、１時間にわたり取り込みの時間に対して比例したので、さらなる実験を３０分の時間間隔を用いて実施した。
【０１２２】
Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みが飽和性であり、従って媒介されることを確認するために、０．０２５ｍＭ、０．１ｍＭ、０．４ｍＭ、１．６ｍＭ、６．４ｍＭ、または２５．６ｍＭのＧｌｙＳａｒを含有する、ｐＨ６．０の取り込み緩衝液、およびｐＨ７．４の取り込み緩衝液からのＧｌｙＳａｒの取り込みを評価した（図１２）。ＧｌｙＳａｒの取り込みは、ｐＨ６．０の緩衝液からの取り込みが全ての濃度で最大であった（Ｐ＜０．００１）。Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みは、飽和性であり、約１．１ｍＭのＧｌｙＳａｒについての見掛けのＫmと一致していた。これらの値は本発明者らの予備試験と一致している。この試験は、ｐＨ６．０の取り込み緩衝液のみを用いてＤＭＣＫ細胞によるＧｌｙＳａｒ取り込みについて１．１ｍＭのＫmを見積もっており、Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みが、完全ではなくても、優勢であることを示すものであり、低親和性（ｍＭ）Ｈ+／ペプチド同時トランスポーター活性（ＰｅｐＴ１）の結果である。比較の値として、ＰｅｐＴ１発現Ｃａｃｏ−２細胞によるＧｌｙＳａｒ取り込みについて報告されたＫmはまた、１．１ｍＭである。ｐＨ勾配のない時（ｐＨ７．４の緩衝液）ＧｌｙＳａｒ取り込みがまた、線形（Ｐ＜０．０１）および二次式（Ｐ＜０．００１）の次の成分を示すことにも注意することが有益である：（１）ｐＨ「７．４」の緩衝液は、実際はわずかに酸性であることを反映する；（２）「逆（ｒｅｖｅｒｓｅ）」に駆動する推定の基底外側のペプチドトランスポーターの活性を示す；または（３）特徴付けられていないペプチド輸送系の存在を示す。本実験の結果として、引き続くＨ+依存性ペプチド輸送試験を、１００μＭのＧｌｙＳａｒ、Ｋmよりもかなり低いが、輸送活性の増大を生じ、従って感受性である値を用いて実施した。
【０１２３】
βラクタム系抗生物質の全てではない、いくつかを認識した結果として、数種の膜小胞を用いて古典的に同定され、さらに最近では、ヒト、ラットおよびウサギのＰｅｐＴ１  ｃＤＮＡを用いた機能的発現研究によって同定された低親和性Ｈ+／ペプチド同時輸送活性の特徴的な特質が認識される。さらに、セファドロキシルのＰｅｐＴ１認識は、低い（ＰｅｐＴ１によるＧｌｙＳａｒ取り込みのセファドロキシル阻害のＫiは、３ｍＭである）が、一方、ＰｅｐＴ２によるセファドロキシルの認識は高い（ＧｌｙＳａｒＰｅｐＴ２輸送のセファドロキシル阻害のＫiは３０μＭである）。ＭＤＣＫ  ｃＰｅｐＴ１活性が、これらの機能的な特徴を共有するか否かを決定するため、ｐＨ７．５の緩衝液およびｐＨ６．０の緩衝液の有無において、ならびにｐＨ６．０の緩衝液、１ｍＭの追加のＧｌｙＳａｒ（自己インヒビターコントロール）、３ｍＭペニシリン−Ｇ、３０μＭセファドロキシル、または３ｍＭセファドロキシルの存在における、１００μＭ  ＧｌｙＳａｒの取り込みを比較した（図１３）。Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みは、ペニシリン−Ｇによっても、３０μＭセファドロキシルによっても阻害されなかったが、３ｍＭセファドロキシルでは約７６％阻害された。予想どおり、１ｍＭ  ＧｌｙＳａｒの存在によって、１００μＭ  ＧｌｙＳａｒ取り込みは６４％まで自己阻害された。これらの結果によって、ＭＤＣＫ細胞によるＧｌｙＳａｒのＨ+依存性取り込みは、ＰｅｐＴ１活性によることが示される。
【０１２４】
ＰｅｐＴ１機能の他の特性は、Ｇｌｙ含有ペプチドの長さに比例する、Ｇｌｙ含有ペプチドがＧｌｙＳａｒを阻害する能力の低下、およびカルノシン（β−Ａｌａ−Ｈｉｓ）による阻害に対する感受性である。ｃＰｅｐＴ１活性が、他のＰｅｐＴ１活性について報告されたように挙動するか否かを決定するため、Ｈ+依存性１００μＭ  ＧｌｙＳａｒを阻害する、１ｍＭ  Ｇｌｙ（［3Ｈ］−Ｇｌｙ遊離アミノ酸コントロール）、ＧｌｙＧｌｙ、［Ｇｌｙ］4、または［Ｇｌｙ］5の相対的な能力を決定した（図１４）。Ｇｌｙ（５．０％）、および［Ｇｌｙ］5（７．３％）は、取り込みに影響しなかったが、ＧｌｙＧｌｙは取り込みを阻害し、［Ｇｌｙ］4は、それぞれ６３％および２３％まで取り込みを阻害する傾向であった。イヌＭＤＣＫ細胞モデルにおけるグリシル残基の数に対して反比例してＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害するＧｌｙ含有ペプチドのこのパターンは、他の種について報告されたＰｅｐＴ１活性と一致している。同様に、ＧｌｙＳａｒ取り込みは、１ｍＭカルノシンによって５０％阻害された（データは示していないが、以降表２に列挙している）。
【０１２５】
全長ウサギｃＤＮＡおよび本発明者らのイヌＲＴ−ＰＣＲ産物を用いる、ＭＤＣＫ細胞におけるＰｅｐＴ１ｍＲＮＡ発現の分子同定（実施例１のデータを参照のこと）と合わせれば、上記の生化学的特徴づけデータによって、ＭＤＣＫ細胞におけるＨ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込み活性が、低親和性、高能力のＰｅｐＴ１輸送タンパク質と一致することが示される。まとめると、上述の実験から培養のための実験レジメンの生成、およびＭＤＣＫ細胞におけるＨ+依存性ペプチド輸送活性の決定が得られ、これによって、イヌＰｅｐＴ１（ｃＰｅｐＴ１）の相対的な基質優先権を評価する。
【０１２６】
従って、次の一般的なレジメンを用いて、ＭＤＣＫ細胞において内因性に発現されたｃＰｅｐＴ１により、候補のジ−（主に）ペプチド、およびトリ−ペプチドがＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害する、相対的能力を評価した一連の実験を実施した。
【０１２７】
１．コラーゲンでコーティングした２４ウェルトレイ中に、６０，０００細胞／ウェルをプレートし、抗生物質を含むＤＭＥＭ／１０％  ＦＣＳ中で、９５％空気／５％ＣＯ2の環境中、３７℃で１日間培養した。
２．その培地を取り除き、細胞をＬＨＭ／１０％  ＦＣＳ／抗生物質中で１日培養した。
３．その培地を取り除き、細胞をＬＨＭ／１０％  ＦＣＳ（抗生物質なし）中で２０時間培養した。
４．その培地を取り除き、枯渇培地（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ  Ｎａｃｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．８ｍＭ  ＭｇＳｏ4および５ｍＭグルコース）中３７℃の空気中において、３０分間、細胞を培養して、細胞内栄養プールを正規化した。
５．取り込み培地（ｐＨ６．０に調整されたか、またはｐＨ７．４に保持された枯渇培地）で枯渇培地を置換することによって、輸送を開始した。この取り込み培地は、１００μＭ  ＧｌｙＳａｒ（総ＧｌｙＳａｒ基質の２．８８％を供給する［3Ｈ］−ＧｌｙＳａｒを有した５μＣｉ／ｍＬの比活性における）および（または）１ｍＭの阻害ペプチドを含んでいた。
【０１２８】
この文献は、ＰｅｐＴ１についての代表的なＫm値が０．５〜５ｍＭの範囲を示しているので、１ｍＭの阻害性基質濃度を選択した。従って、１ｍＭ委インヒビター濃度（取り込みを完全に阻害するとは予期されない）を選択することによって、代表的な５ｍＭのインヒビター濃度（ＧｌｙＳａｒ取り込みの１００％阻害に接近すると期待される）を用いる場合よりも、候補インヒビターの相対的な能力をさらに精密に表すことが、本発明者らの目標であった。候補ペプチドが含有するＴｒｐ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、および（または）Ａｒｇ基質に基づいて、候補ペプチドを選択した。全部で、このプロトコールを用いて、２３の阻害性ペプチドおよび２つの薬物化合物をスクリーニングした。
【０１２９】
ｃＰｅｐＴ１による、ジペプチドとしてのＴｒｐおよびＬｅｕの吸収の可能性を決定するため、１００μＭ  ＧｌｙＳａｒ取り込みを、ＴｒｐＬｅｕジペプチドが阻害する能力対ＬｅｕＴｒｐジペプチドが阻害する能力を評価した（図１５）。ｐＨ６．０の取り込み緩衝液中のＴｒｐＬｅｕまたはＬｅｕＴｒｐのいずれかの存在によって、Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みは、それぞれ１１７％または１１４％まで消滅した。対照的に、ＬｅｕもＴｒｐも、Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みに有意には影響しなかった。これらの結果によって、ｃＰｅｐＴ１による、ＴｒｕＬｅｕおよびＬｅｕＴｒｐの相対的認識を表すには、より低い濃度のインヒビターが必要であることが示される。これらの実験を通じて観察されたＨ+非依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みの機構に関しては、ＴｒｐＬｅｕおよびＬｅｕＴｒｐが、Ｈ+非依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みを、それぞれ３６％および４６％まで阻害したことに注意することは有益である。
【０１３０】
ｃＰｅｐＴ１によってＴｒｐがペプチドの形態で吸収される可能性をさらに評価するために、ＴｒｐＴｒｐ、ＴｒｐＧｌｙ、およびＴｒｐＧｌｙＧｌｙが、ＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害する能力を比較した（図１６）。ＴｒｐＬｅｕについて観察されるように（図１５）、ＴｒｐＴｒｐは、Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みを消滅させ、そしてＨ+非依存性取り込みを約２２％まで阻害した。ＴｒｐＧｌｙは、Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みを消滅させたが、Ｈ+非依存性取り込みには影響しなかった。トリペプチドＴｒｐＧｌｙＧｌｙはまた、ＧｌｙＳａｒ取り込みを有意に阻害したが、ＴｒｐＴｒｐまたはＴｒｐＧｌｙが阻害するよりは少ない程度（７３％）までの阻害であった。
【０１３１】
他のアミノ酸（例えば、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ）がペプチド結合形態で吸収される相対的能力を決定するために、上記のレジメン、および種々の候補ペプチドを１ｍＭ用いて、さらなるＧｌｙＳａｒ競合阻害実験を実施した。これらの実験の結果を表２にまとめる。この表にはまた、図１３、１４、１５、および１６に記載した実験の結果も、比較目的で含んでいる。
【０１３２】
【表２】
2004533813.tif 000004
1ｐｍｏｌ／タンパク質（ｍｇ）／３０分
2３０μＭ
3３ｍＭ
4１００を超える阻害値（％）の部分は、Ｈ+非依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害する能力を示すと思われる。
【０１３３】
１００μＭのＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害する相対能力の順序で、インヒビターがグループ内に列挙される。列挙されたペプチドに加えて、遊離アミノ酸の成分を適切な実験内で試験して、このペプチド結合または遊離アミノ酸が、ＧｌｙＳａｒ取り込みに対する任意の影響についての原因であるか否かを評価した。予想どおり、遊離アミノ酸の１ｍＭの成分の存在は、ＧｌｙＳａｒ取り込みに影響しない。５０％の阻害パーセンテージによって、インヒビター基質は、ＧｌｙＳａｒのＫmが約１ｍＭであることが決定され（図１２）、その基質が１ｍＭで存在するという条件下で少なくともＧｌｙＳａｒが認識されるのと同様に認識されることが示される。評価した１９の処理ペプチドのうち、１１が、Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みを消滅させ、これらのうち７つがまたＨ+非依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害する能力を示す。試験した残りの８つのペプチドのうち、４つが、８０％阻害より大きい阻害を示し、一方、他の４つは、ＧｌｙＳａｒ取り込みを５０％以下まで阻害した。これらの結果によって、栄養上重要なアミノ酸成分の広範な種々のペプチドが、ｃＰｅｐＴ１によって認識されることが示される。
【０１３４】
全体として、ｃＰｅｐＴ１活性は多数の基質に対して感受性であるという観察が、代表的なＰｅｐＴ１機能である。しかし、驚くべきことは、ＧｌｙＳａｒ取り込みを完全に阻害したのは多数のペプチドであった。８０％を超えるまで、ＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害したペプチドの中で、より感受性である相対阻害順序、つまりより正確に認識する能力を確立するため、１４個のペプチドを、それが１００μＭ  ＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害する能力について再スクリーニングした。この再スクリーニングには、同じ細胞培養物および輸送レジメンを用いたが、ただし、前のインヒビター濃度（１００μＭ）のわずか１０％を用いただけであった。１００μＭのＴｒｐ含有ペプチドの能力を直接比較するための実験からのデータを図１７に示す。Ｔｒｐ含有ペプチドの全てがＨ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害した。しかし、ＴｒｐＬｅｕは、ＬｅｕＴｒｐ（５８％）、ＴｒｐＴｒｐ（６２％）、またはＴｒｐＧｌｙ（４５％）が阻害するよりも多くを阻害した（９２％）。これらの値、ならびにＬｅｕ含有ペプチド、Ｍｅｔ含有ペプチド、およびＡｒｇ含有ペプチドの相対能力を比較する他の実験の結果を表３に列挙する。
【０１３５】
【表３】
2004533813.tif 000005
1ｐｍｏｌ／タンパク質（ｍｇ）／３０分
2データは実験ごとにグループ分けしている。
【０１３６】
全体として、ペプチドのうち４つがＧｌｙＳａｒ取り込みを少なくとも８０％まで阻害し、６つが４０％より多く阻害し、４つが４０％未満阻害したことによって、ｃＰｅｐＴ１による認識についての相対的ランキングを確立した。５つのＴｒｐ含有ペプチド（図１７、表３）の中で、ＴｒｐＬｅｕは、ＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害する最大能力を実証した。ＴｒｐＬｅｕはまた、Ｌｅｕ含有ペプチドの中で、ＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害する（９４％）最大能力を実証した。同じ実験内で直接比較したＭｅｔ含有基質の中で、中性のペプチドであるＭｅｔＭｅｔおよびＭｅｔＰｈｅは、陰イオン性（ＭｅｔＣｌｕ）、または陽イオン性（ＭｅｔＬｙｓ）のカルボキシル残基が阻害するよりもＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害した。興味深いことに、Ａｒｇペプチドは、集団として最小の阻害能力を実証した。これは、一見したところ、荷電した残基を有する基質のＰｅｐＴ１による、見かけ上の認識がより少ないことを持続している。しかし、１００μＭ  ＡｒｇＬｅｕが、ＬｅｕＡｒｇが阻害するよりもＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害する、かなり大きい能力を実証したことに注意することは有益である（４９％対８．９％）。
【０１３７】
ＧｌｙＳａｒのＴｒｐＬｅｕ＞ＴｒｐＴｒｐである阻害の相対的ランキングを確認するために（表２および３）、ＩＣ50実験のグラフ分析（図１８）によって、ＴｒｐＬｅｕおよびＴｒｐＴｒｐによるＧｌｙＳａｒ取り込みの基質阻害（Ｋi）のためのミカエリス−メンテン定数を引き出した。１００μＭ−阻害研究において得られた結果を保ちながら、ＴｒｐＬｅｕは、ＴｒｐＴｒｐが阻害するよりも低濃度でＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害した（Ｋi＝０．２μＭ対Ｋi＝０．７５μＭのそれぞれ）。
【０１３８】
まとめると、ＭＤＣＫ細胞を用いたｃＰｅｐＴ１競合阻害試験の結果によって、ＴｒｐＬｅｕは、あらゆる他の試験したペプチドよりも、ｃＰｅｐＴ１によって良好に認識されることが示される。この結果によってまた、多数のＴｒｐ含有ペプチド、Ｌｅｕ含有ペプチド、およびＭｅｔ含有ペプチドがまたｃＰｅｐＴ１によって十分認識されることが示される。最終的に、腸の環境において、これは、トランスポーターによる認識と、管腔結合ペプチダーゼおよび膜結合ペプチダーゼに対するこのペプチドの相対的耐性との組み合わせで、所定のペプチドのどれぐらい多くが吸収されるかを決定する。これに関して、Ｇｌｙ−Ｘペプチドが、特に血液または腎臓ペプチダーゼによって、他のペプチドよりも耐性であることを示唆するいくつかの証拠が存在する。そのような場合は、ＧｌｙＬｅｕは、Ｌｅｕを供給するためには、ＴｒｐＬｅｕよりも良好な候補基質であり得る。同様に、トリペプチダーゼは、集団として、加水分解に対して比較的耐性であると考えられる。従って、より多くのＴｒｐＧｌｙＧｌｙが、ＴｒｐＬｕｅよりも腸によって大量に吸収されることが証明され得る。
【０１３９】
このセットの実験の重要な結果は、ペプチド輸送能力の潜在的な影響を評価するための鋭敏な実験レジメン／モデルを確立したことであった。従って、ＬＨＭにおいて増殖されたＭＤＣＫ細胞の実験的モデルは、ＰｅｐＴ１の発現に対する、種々のペプチドおよび薬物基質、ならびにホルモンおよび（または）増殖因子の効果を評価する機会を与える。
【０１４０】
従って、ＬＨＭ対ＤＭＥＭにおいて、ＭＤＣＫ細胞の培養は、哺乳動物ＰｅｐＴ１様活性と一致する、Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込み（Ｋm＝１．１ｍＭ）の増大を生じる。この刺激されたモデルを用いて、ＰｅｐＴ１による認識のインデックスとして、それらが１００μＭ  ＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害する能力について、細胞外濃度１ｍＭで２３のジペプチドおよびトリペプチドの能力、並びに細胞外濃度１００μＭで１４のジペプチドおよびトリペプチドの能力をスクリーニングした。評価したＴｒｐ含有ペプチド、および（または）Ｌｅｕ含有ペプチドのうち、ＴｒｐＬｅｕ（Ｋi＝０．２μＭ）およびＬｅｕＴｒｐ（Ｋi＝０．７５μＭ）は、ＧｌｙＳａｒ取り込みを阻害する最大の能力を実証し、ＴｒｐＬｅｕは、ＰｅｐＴ１について比較的高い親和性（低Ｋi）を実証していた。評価したＭｅｔ含有ペプチドのうち、４つ（ＭｅｔＭｅｔ、ＭｅｔＰｈｅ、ＬｅｕＭｅｔ、ＭｅｔＬｅｕ）が、ＰｅｐＴ１によって特によく認識されるように見える。対照的に、Ａｒｇ含有ペプチドは、集団として、ＰｅｐＴ１活性の最小の阻害を示した。全体的に、これらの結果によって、ｃＰｅｐＴ１が、ロイシンおよびトリプトファンを含有するようなジペプチドおよびトリペプチドを含む種々のジペプチドおよびトリペプチドを認識し得ることを示す。
【０１４１】
（実施例３）
ＭＤＣＫ細胞によって発現されたＨ+／ペプチド輸送能力が、基質調節に対して感受性であるか否かを決定するための実験モデル
試行１
上記の実施例１および２は、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞が、ＰｅｐＴ１  ｍＲＮＡを発現することを実証し、Ｈ+依存性生化学特性を特徴付けた。従って、ＭＤＣＫ細胞によって発現されたＨ+／ペプチド輸送能力が、基質調節に対して感受性であるか否かを決定するため、ＭＤＣＫ細胞を実験モデルとして選択した。実施例２由来の研究によって、ラクトアルブミン加水分解産物培地（ＬＨＭ）中で増殖したＭＤＣＫ細胞は、ペプチド取り込み能力のレベルが上昇していたことが実証された。従って、ペプチド含有ＬＨＭ、および個々の処理ペプチドの効果を混同する可能性を回避するために、適切な培地としてＤＭＥＭ（ペプチドを含まない）および非ＬＨＭを選択して、ＭＤＣＫ細胞のイヌＰｅｐＴ１機能性能力に対する細胞外ペプチドの影響を試験した。Ｇｌｙｐｈｅは、ＰeｐＴ１の刷子縁膜含量を増大することが報告されているため、基質として、ＧｌｙＰｈｅを選択し、（Shiraga T, Miyamoto K, Tanaka H, Yamamoto H, Taketani Y, Morita K, Tamai I, Tsuji A, Takada E. Cellular and molecular mechanisms of dietary regulation on rat intestinal H+/peptide transporter PepT1. Gastroenterology 1999; 116:354-362）一方、ＰｈｅおよびＧｌｙは、遊離アミノ酸処理コントロール成分として試験された。カルノシンは肉ベースの食餌に高含量であるので選択した。
【０１４２】
細胞培養：全ての細胞をプレート（６０，０００／２ｃｍ2ウェル）し、ダルベッコの改質されたイーグル培地／１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）／１％抗生物質／抗菌溶液（ＡＢＡＭ）（ＤＭＥＭ培地）中で２４時間培養した（９５％空気／５％ＣＯ2、３７℃）。これらの初期の共通培養条件の後、ＤＭＥＭ、または１０ｍＭのカルノシン、ＧｌｙＰｈｅ、Ｐｈｅ、もしくはＧｌｙを含んだＤＭＥＭ中で細胞を培養した。培地を２４時間ごとに交換した。培地処理（ｎ＝８）は次のとおりであった：
ＤＭＥＭ
ＤＭＥＭ＋１０ｍＭ  カルノシン
ＤＭＥＭ＋１０ｍＭ  ＧｌｙＰｈｅ
ＤＭＥＭ＋１０ｍＭ  Ｐｈｅ
ＤＭＥＭ＋１０ｍＭ  Ｇｌ
取り込みの測定：２４ウェルクラスタートレイ法（２４−ｗｅｌｌ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｔｒａｙ  ｍｅｔｈｏｄ）（Kilberg MS. Measurement of amino acid transport by hepatocytes in suspension and monolayer culture. Methods Enzym 1989; 173:564-575. Matthews JC, Aslanian A, McDonald KK, Yang W, Malandro MS, Novak DA, Kilberg MS. An expression system for mammalian amino acid transport using a stably maintained episomal vector. Anal Biochem 1997; 254:208-214）を用いて［3Ｈ］グリサルコシン取り込みの測定を実施し、実施例１および２において使用した。細胞を、枯渇培地（２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ/Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ4、および５ｍＭグルコース）中で、３７℃の空気中において３０分間培養して、輸送前に細胞内栄養物のプールを正規化した。取り込み培地（ｐＨ６．０に調整された枯渇培地）で枯渇培地を置換することによって、輸送アッセイを開始した。この取り込み培地は、１００μＭ  ＧｌｙＳａｒ（５μＣｉ／ｍＬの比活性であって、これには総ＧｌｙＳａｒの２．８８％を供給する［3Ｈ］−ＧｌｙＳａｒを有する）を含んでいた。３０分間のインキュベーション期間の後、４℃の枯渇培地（ｐＨ７．５）の４回のリンスによって、輸送を終了させた。２２０μＬの１０％のトリクロロ酢酸を各々のウェルに添加し、流体シンチレーションカウントによって上清の放射能を定量した。各々のウェルの細胞を、０．２Ｎ  ＮａＯＨ／０．２％  ＳＤＳに可溶化し、標準物としてウシ血清を用いる、改質ローリーアッセイを用いてタンパク質を定量した。すなわち、ペプチド取り込みは、ｐｍｏｌ／タンパク質（ｍｇ）／３０分として報告される。取り込み測定は、処理培地における培養の２４時間、４８時間、および７２時間後に行った。
【０１４３】
結果：ＭＤＣＫ細胞によるＨ+依存性ペプチド輸送を特徴付ける、前の調査（上述の実施例２）によって、輸送速度がタンパク質含量に依存することが明確に示された。従って、ＧｌｙＳａｒ取り込みに対する種々の処理パラメーターの有効な比較を行うために、比較された処理群のタンパク質含量が異なってはならない。従って、ＭＤＣＫ細胞タンパク質に対する培養培地の影響を評価した（図１９）。全ての培地処理細胞増殖を１〜３日間補助し、処理の間でのタンパク質含量に差異は観察されなかった。同様に、処理群の中で、あらゆる培養期間について、取り込み速度（能力）における差異は観察されなかった（図２０）。
【０１４４】
試行２
試行１の結果によって、イヌＰｅｐＴ１は、基質調節には感受性でないか、あるいはその基質および（または）刺激時間が、ＭＤＣＫ細胞におけるＨ+依存性ペプチド取り込みに影響を及ぼすには不十分であったかのいずれかであることが示唆される。この場合もやはり、ＤＭＥＭを基本培地として選択して、ペプチド輸送活性に対する個々のペプチドの効果を評価することを可能にした。後者の２つの可能性を評価するために、９日間の培養期間を含む第二の試行を行った。Ｈ+依存性ペプチドトランスポーター能力の別の潜在的影響因子として、ＧｌｙＳａｒを添加した。なぜなら１０ｍＭのＧｌｙＳａｒは、Ｃａｃｏ−２細胞中で増大したＰｅｐＴ１活性を刺激し得ることが報告されている（Adibi S. The oligopeptide transporter PepT1 in human intestine: biology and function. Gastroenterology 1997; 113:332-340）からである。ＧｌｙＰｒｏは、筋肉組織において高含量であるので添加した。従って肉ベースの食餌には豊富であると考えられる。
【０１４５】
細胞培養：試行１の方法の節に既に記載したとおり、ＭＤＣＫ細胞株を維持した。初期の且つ通常の培養条件の後、細胞をＤＭＥＭ中か、または１０ｍＭのＧｌｙＳａｒ、ＧｌｙＰｒｏ、ＧｌｙＰｈｅ、もしくはカルノシンを含有するＤＭＥＭ中で培養した。培地は２４時間ごとに交換した。培地処理（ｎ＝８）は次のとおりであった：
ＤＭＥＭ
ＤＭＥＭ＋１０ｍＭ  ＧｌｙＳａｒ
ＤＭＥＭ＋１０ｍＭ  ＧｌｙＰｒｏ
ＤＭＥＭ＋１０ｍＭ  ＧｌｙＰｈｅ
ＤＭＥＭ＋１０ｍＭ  カルノシン
取り込みの測定：試行１の方法の節に既に記載したとおり、２４ウェルクラスタートレイ法を用いることによって、［3Ｈ］グリサルコシン取り込みの測定を実施した。ペプチド取り込みは、ｐｍｏｌ／タンパク質（ｍｇ）／３０分として報告される。取り込み測定は、処理培地における培養の４時間、１２時間、２４時間、３６時間、７２時間、１２０時間、１６８時間、および２１６時間後に行った。
【０１４６】
結果：全ての処理群におけるタンパク質含量が、全ての処理群について、培養の４時間〜２１６時間（９日）に直線的に増大した（図２１）。しかし、培養期間内には、処理群のタンパク質含量は異ならなかった。２１６時間の培養期間にわたって、タンパク質は、約４．５倍（約４０〜２２０μｇ／ウェル）に増大した。試行１の結果と対照的に、培地処理は、ＧｌｙＳａｒ取り込み能力に影響した（図２２）。さらに、処理×時間の効果が観察され、この効果は、ＧｌｙＳａｒ取り込み能力の、ＧｌｙＳａｒおよびカルノシン処理刺激に必要な培養の時間の差異を表す。特に、ＤＭＥＭ培養処理を含むＧｌｙＳａｒは、培養時間の２４時間まで、ＤＭＥＭコントロール培地を約３０％上回るＧｌｙＳａｒ取り込み能力の増大を生じた。このレベルの増大は、２１６時間を通じて維持された。対照的に、カルノシン含有培地中の培養は、培養の７２時間までのＤＭＥＭ培養細胞による取り込み能力の増大を上回るＧｌｙＳａｒ取り込み能力の有意な（２３％）増大は生じなかった。次いで、この刺激は、培養の２１６時間にわたって２９１％に着実に増大した。この２つのペプチド基質の間の刺激による取り込みの性質も異なった。すなわち、カルノシン刺激されたＧｌｙＳａｒ取り込みの大きさは、７２時間〜２１６時間本質的に一定であったが、ＧｌｙＳａｒ培養についての取り込みの大きさはこの期間中に減少した。まとめると、これらのデータによって、培養されたＭＤＣＫ細胞におけるＨ+依存性ペプチド輸送は、少なくとも２つのＰｅｐＴ１基質、ＧｌｙＳａｒ、およびカルノシンによって刺激され得ることが示される。
【０１４７】
試行３
試行２のデータによって、栄養供給されたＭＤＣＫ細胞によるＨ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込み能力が、少なくとも２４時間の１０ｍＭＧｌｙＳａｒ、および少なくとも７２時間の１０ｍＭカルノシンの包含によって上方制御（アップレギュレート）され得ることが示される。Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込み能力が、栄養欠乏、および（または）グルココルチコイドによる刺激に対して感受性であるか否かを理解することは等しく有益である。予備的研究によって、絶食が、ラット小腸上皮におけるＰｅｐＴ１の発現を増大させることが示される（Thamotharan M, Bawani S, Zhou X, Adibi S. Functional and molecular expression of intestinal oligopeptide transporter (PepT1) after a brief fast. Metabolism 1999; 48:681-684））。
【０１４８】
ＧｌｙＳａｒ取り込み能力のＭＤＣＫ細胞発現における絶食およびグルココルチコイドの潜在的影響の検討を開始するために、栄養枯渇または栄養供給およびデキサメタゾン（Ｄｅｘ）を用いた培養の７２時間にわたって、ＧｌｙＳａｒのＨ+依存性取り込みを評価し、ＤＭＥＭまたはインスリンを含んだＤＭＥＭ（陰性コントロール）において培養した細胞による取り込みと比較した（試行３Ａ）。「栄養枯渇（nutrient deprived）」処理は実際には、十分な基本的代謝条件を保証するために、５ｍＭグルコースおよび適切な塩を含んでいた。
【０１４９】
ＰｅｐＴ１タンパク質の補充および活性は、Ｃａｃｏ−２−２細胞における細胞質小胞からのインスリン刺激性の補充に対して感受性であると考えられる（Thamotharan M, Bawani S, Zhou X, Adibi S. Hormonal regulation of oligopeptide transporter PepT1 after a brief fast. Am J Physiol 1999; 276:C821-826）が、ＭＤＣＫ細胞は、インスリンレセプターを発現不能であるのと同様に、インスリンに対して非感受性であることが報告されている（Hofmann C, Cretta）M, Bruns P, Hessel P, Hadawi G.  Cellular responses elicited by insulin mimickers in cells lacking detectable plasma membrane insulin receptors. J Cell Biol 1985; 27:401-414）。インスリン感受性の欠如とは対照的に、ＩＧＦ−Ｉは、ＭＤＣＫ細胞においてＤＮＡ合成、および細胞増殖を刺激することが既知である（Sukegawa I, Hizuka N, Takano K, Asakawa K, Shizume K. Characterization of IGF-1 receptors on MDCK cell line. Endocrinol Japan 1987; 34(3):339-346. Mouzon SH, Kahn R.  Insulin-like growth factor-mediated phosphorylation and proto-ontogeny induction in MDCK cells. Mol Endocrinol 1991; 5:51-60）。ＭＤＣＫ細胞が、インスリン刺激に対して明らかに非感受性であるがＩＧＦ−Ｉ刺激に対しては感受性であるという理解は、もし、この両方の基質の超生理学的なレベルを使用し、予測的な研究においてインスリンがＩＧＦ−Ｉレセプターと交差反応する能力が既知であることを考えると、矛盾しているように思われる。従って、同じプレーティングストックのＭＤＣＫによるＨ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みにおける漸増するＩＧＦ−Ｉ濃度の影響を評価するために、別の試行（試行３Ｂ）を実施した。
【０１５０】
試行３Ａ
細胞培養：輸送試行を実施する前に１日に亘ってのみ細胞を培養したことを除けば、試行１に記載したとおりＭＤＣＫ細胞を維持した。初期の且つ通常の培養条件の後、「栄養枯渇した」緩衝液（Ｈｅｐｅｓ／Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５．４ｍＭ  ＫＣｌ、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ2、０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ4）中で細胞を培養した。この緩衝液は、エネルギー源として５ｍＭグルコースを含んだが、アミノ酸源またはビタミン源を欠いていた。対照的に、ＤＭＥＭ中か、または５ｎＭ  Ｄｅｘ、５００ｎＭ  Ｄｅｘ、５ｎＭインスリン、または５００ｎＭインスリンを含有するＤＭＥＭ中で培養した細胞には適切に栄養を与えた。培地処理（ｎ＝４）は次のとおりであった：
栄養枯渇した
ＤＭＥＭ
ＤＭＥＭ＋５ｎＭ  Ｄｅｘ
ＤＭＥＭ＋５００ｎＭ  Ｄｅｘ
ＤＭＥＭ＋５ｎＭ  インスリン
ＤＭＥＭ＋５００ｎＭ  インスリン
取り込みの測定：試行１の方法の節に既に記載したとおり、２４ウェルクラスタートレイ法を用いることによって、［3Ｈ］グリサルコシン取り込みの測定を実施した。ペプチド取り込みは、ｐｍｏｌ／タンパク質（ｍｇ）／３０分として報告される。取り込み測定は、処理培地における培養の３０分後、および４時間後に行った。
【０１５１】
試行３Ｂ
細胞を、ＤＭＥＭ中か、または１ｎＭ  ＩＧＦ−Ｉ、５ｎＭ  ＩＧＦ−１、２５ｎＭ  ＩＧＦ−１、または１００ｎＭ  ＩＧＦ−１を含有するＤＭＥＭ中で培養したことを除けば、試行３Ａに記載したのと同じ様式で試行３Ｂを実施した。取り込み測定は、培養時間の３０分後、および４時間後に行った。培地処理（ｎ＝４）は次のとおりであった：
ＤＭＥＭ（ｐＨ６測定）
ＤＭＥＭ（ｐＨ７．５測定）
ＤＭＥＭ＋１ｎＭ  ＩＧＦ−１
ＤＭＥＭ＋５ｎＭ  ＩＧＦ−１
ＤＭＥＭ＋２５ｎＭ  ＩＧＦ−１
ＤＭＥＭ＋１００ｎＭ  ＩＧＦ−１
結果：試行３Ａまたは３Ｂ内で、処理のタンパク質含量に違いはなかった。しかし４時間の培養後、Ｈ+依存性ペプチド取り込みの能力は、栄養枯渇されたがエネルギーは十分であった細胞においては３５％低下した（図２３）。対照的に、デキサメタゾンは、ＧｌｙＳａｒ取り込みに効果を有さなかった。予想どおり、そしてＭＤＣＫ細胞がインスリン非感受性であるという概念と一致して、インスリンの４時間の存在によって、ＧｌｙＳａｒ取り込み能力に効果はなかった。同様に、ＩＧＦ−Ｉの漸増する量を用いた細胞の培養によって、Ｈ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みの有意な刺激は現れなかった（図２４）。しかし、量的に、１〜２５ｎＭのＩＧＦ−Ｉは、ＧｌｙＳａｒ取り込み能力を１０〜１５％まで上昇させる傾向であった。
【０１５２】
試行３の注記された限定、ならびに試行３Ａおよび３Ｂの観察結果（ｎ＝４）の数の少なさを考慮すれば、ＭＤＣＫによる、ＧｌｙＳａｒのＨ+依存性取り込みは、栄養枯渇に、および恐らくはＩＧＦ−Ｉに感受性であることが示唆される。
【０１５３】
（実施例４）
ＰｅｐＴ１配列
クローン１２（５回；配列番号１１）プライマー対は、ＧＳＰ３−４；標準のＲＴ−ＰＣＲを使用するＧＳＰ３−１Ｒ
【０１５４】
【表４】
2004533813.tif 000006
【０１５５】
【表５】
2004533813.tif 000007
【０１５６】
クローン３７開始（６回；配列番号１２）プライマー対は、ＧＳＰ３−９；ＡＵＡＰ（３’ＲＡＣＥプロトコールを使用）
【０１５７】
【表６】
2004533813.tif 000008
【０１５８】
【表７】
2004533813.tif 000009
【０１５９】
マージ配列（配列番号８）は以下である：
【０１６０】
【表８】
2004533813.tif 000010
【０１６１】
ヌクレオチド全長配列のマルチプルアラインメント
【０１６２】
【表９−１】
2004533813.tif 000011
【０１６３】
【表９−２】
2004533813.tif 000012
【０１６４】
【表９−３】
2004533813.tif 000013
【０１６５】
【表９−４】
2004533813.tif 000014
【０１６６】
【表９−５】
2004533813.tif 000015
【０１６７】
【表９−６】
2004533813.tif 000016
【０１６８】
【表９−７】
2004533813.tif 000017
【０１６９】
【表９−８】
2004533813.tif 000018
【０１７０】
【表９−９】
2004533813.tif 000019
【０１７１】
【表９−１０】
2004533813.tif 000020
【０１７２】
イヌおよびヒトのヌクレオチド全長配列のアラインメント
【０１７３】
【表１０−１】
2004533813.tif 000021
【０１７４】
【表１０−２】
2004533813.tif 000022
【０１７５】
【表１０−３】
2004533813.tif 000023
【０１７６】
【表１０−４】
2004533813.tif 000024
【０１７７】
イヌのタンパク質配列
【０１７８】
【表１１】
2004533813.tif 000025
【０１７９】
アミノ酸配列のマルチプルアラインメント
【０１８０】
【表１２−１】
2004533813.tif 000026
【０１８１】
【表１２−２】
2004533813.tif 000027
【０１８２】
【表１２−３】
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【０１８３】
イヌおよびヒトのアミノ酸配列のアラインメント
【０１８４】
【表１３】
2004533813.tif 000029
タンパク質配列の分析および他種とのアラインメントを実施した後、Genbankへの提出のために下線のイタリック体を取り除いた。
【０１８５】
Ｇｅｎｂａｎｋへ提出する配列（配列番号７）
【０１８６】
【表１４】
2004533813.tif 000030
【０１８７】
イヌPepT1ヌクレオチド配列（配列番号２０）
【０１８８】
【表１５】
2004533813.tif 000031
【０１８９】
イヌPepT1アミノ酸配列（配列番号２１）
【０１９０】
【表１６】
2004533813.tif 000032
【０１９１】
全ての刊行物、特許および特許文書を、個々に参考として援用するとして、本明細書において参考として組み入れる。本発明を、種々の特定の且つ好ましい実施形態および技術への参照として記載してきた。しかし、多くの改質および改変が、本発明の範囲内でなされ得ることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１９２】
【図１】電気泳動ゲルの写真であって、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法によって生成した部分長のイヌＰｅｐＴ１  ｃＤＮＡ反応産物を示す。部分長のイヌＰｅｐＴ１（ｃＰｅｐＴ１、約７８３ｂｐ）ｃＤＮＡは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法によって生成した。イヌ空腸上皮から単離したｍＲＮＡ、および２つの異なるＰＣＲプライマーセットを用いて、ＲＴ−ＰＣＲ反応産物を生成した。ゲルの内容物は次のとおりである：レーン１、１Ｋｂ分子量のＤＮＡラダー；レーン２、陰性コントロールのＰＣＲ反応物（Ｔａｑポリメラーゼを欠く）；レーン３、プライマーセット４を用いたＰＣＲ反応産物（ウサギＰｅｐＴ１の塩基対８３〜８６３に対応する）；レーン４、プライマーセット１０を用いる、プライマーセット１０〜７８０ｂｐ  ｃＤＮＡ産物を用いたＰＣＲ反応産物（ウサギＰｅｐＴ１の塩基対８５〜８６１に対応する）。レーン３および４における約７８０塩基対の反応産物に注意のこと。
【図２】ＡおよびＢはプライマーセット４由来ＲＴ−ＰＣＲ  ｃＤＮＡのＴＡクローン化によって生成されたｐＣＲ（登録商標）ＩＩ／ｃＰｅｐＴ１プラスミドの制限分析の代表的な結果を示す、アガロースゲルの写真である。プライマーセット４由来ＲＴ−ＰＣＲ  ｃＤＮＡのＴＡクローン化によって生成されたｐＣＲ（登録商標）ＩＩ／ｃＰｅｐＴ１プラスミドの制限分析をこれらの図に示す。データは、ブルー／ホワイトスクリーニングによって選択した５６個の「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」の細菌コロニーの全ての代表的な４個のｃＤＮＡ含有プラスミドである。ＴＡクローンを増幅し、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ／ｃＤＮＡベクターを単離し、そしてＸｈｏＩおよびＫｐｎＩのエンドヌクレアーゼ制限産物を、１．２％アガロースゲルを通してサイズ分類した。図２Ａは、ＴＡクローン２６のＰＣＲベース分析の代表的な結果を示すアガロースゲルの写真である。詳細には、ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ／ｃＰｅｐＴ１−２６（ＴＡ−クローン２６）の分析を示す；レーン１、１ＤＮＡサイズ標準物；レーン２、負のエンドヌクレアーゼ制限コントロール（未切断ｐＣＲ（登録商標）ＩＩプラスミド）；レーン３、正の制限コントロール（空のｐＣＲ（登録商標）ＩＩベクターのＸｈｏＩ制限）；レーン４、未切断のｐＣＲ（登録商標）ＩＩ／ｃＰｅｐＴ１−２６（クローン２６）；レーン５、ＸｈｏＩ制限クローン２６およびＫｐｎＩ制限クローン２６。空のｐＣＲ（登録商標）ＩＩベクターは、３．９ｋｂの大きさであり、レーン５は、約７８０塩基対の産物を含むことに注意のこと。図２Ｂは、ＴＡクローン４および６のＰＣＲベース分析の代表的な結果を示すアガロースゲルの写真である。特に、ＴＡクローン４およびＴＡクローン６の分析を示す；レーン１、ＤＮＡサイズ標準物；レーン２、未切断ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ／ｃＰｅｐＴ１−４（ＴＡクローン４）；レーン３、ＸｈｏＩ制限ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ／ｃＰｅｐＴ１−４およびＫｐｎＩ制限ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ／ｃＰｅｐＴ１−４；レーン４、未切断ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ／ｃＰｅｐＴ１−６（ＴＡクローン６）；レーン５、ＸｈｏＩ制限ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ／ｃＰｅｐＴ１−６およびＫｐｎＩ制限ｐＣＲ（登録商標）ＩＩ／ｃＰｅｐＴ１−６。空のｐＣＲ（登録商標）ＩＩベクターは、３．９ｋｂの大きさであり、レーン３は、約７８０塩基対の産物を含まないが、レーン５は含むことに注意のこと。
【図３】ＡおよびＢは、イヌの腸上皮由来ＲＴ−ＰＣＲ  ｃＤＮＡを用いる、イヌ組織およびＭＤＣＫ細胞によるｃＰｅｐＴ１  ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット同定の代表的な結果を示す写真である。両方のブロットにおける、組織ホモジネートまたは細胞ホモジネートから単離されたＲＮＡの配置は次のとおりである：レーン１、腎臓（動物番号１０３１Ａ）；レーン２、腎臓（動物Ｋ−９−１）；レーン３、ＭＤＣＫ細胞；レーン４、空腸上皮（動物Ｋ−９−４）。図３Ａは、［32Ｐ］−ｃＰｅｐＴ１−２６  ｃＤＮＡとハイブリダイズさせたＡ+ＲＮＡ（３μｇ／レーン）のノーザンブロット同定を示す写真である。図３Ｂは、［32Ｐ］−ｃＰｅｐＴ１−６  ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた総ＲＮＡ（２０μｇ／レーン）のノーザンブロット同定を示す写真である。
【図４】全長ウサギＰｅｐＴ１  ｃＤＮＡを用いるイヌ組織におけるｃＰｅｐＴ１  ｍＲＮＡ発現のノーザンブロット同定の代表的な結果を示す写真である。１０μｇの総ＲＮＡ（レーン１）または６μｇＡ+ＲＮＡ（レーン２〜５）は、３匹の動物由来の肝臓組織および腎臓組織から単離した。レーン１、肝臓（動物番号１０４２Ａ）；レーン２、肝臓（動物番号１００８Ａ）；レーン３、腎臓（動物番号１００８Ａ）；レーン４、肝臓（動物番号１０３１Ａ）；レーン５、腎臓（動物番号１０３１Ａ）。
【図５】ＭＤＣＫ細胞からクロー化された、本発明のイヌＰｅｐＴ１  ｃＤＮＡの部分長の核酸配列である（配列番号９）。３８１塩基対のＴＡクローンＰｅｐＴ１−６Ｒ−２０は、ウサギＰｅｐＴ１（Genbank登録番号４７３３７５）の塩基対２５９〜６４０に対して７９％の相同性を共有する。
【図６】ｐＨ６．０の培地中のコンフルエントなＭＤＣＫ細胞によるＧｌｙＳａｒ取り込みに対する細胞外ＧｌｙＳａｒ濃度の影響を示すグラフである。グラフの評価によって、約４ｍＭの見かけ上のＫmが実証された。各々のデータポイントは、５〜６の観察の平均であり、改変の全ての係数が１５％未満であった。
【図７】ＤＭＥＭまたはＬＨＭ中で培養されたＭＤＣＫ細胞のタンパク質含量を図示するグラフである。値は、６０，０００細胞／ウェルまたは１２０，０００細胞／ウェルで播種した後、ＤＭＥＭ中での１日培養、その後、１日、２日、３日、または５日間（それぞれ、２日目、３日目、４日目、および６日目）のＤＭＥＭまたはＬＨＭ中での培養のＭＤＣＫ細胞のウェル（ｎ＝１２）のタンパク質含量の平均±ＳＤである。標準物としてウシ血清アルブミンを用い、ローリー法によって、タンパク質含量を決定した。
【図８】ＤＭＥＭまたはＬＨＭ中で培養したＭＤＣＫ細胞による、ｐＨ６．０の緩衝液またはｐＨ７．４の緩衝液中でのＧｌｙＳａｒ（２．８８μＭ）取り込みを図示するグラフである。細胞外から細胞内へのＨ+勾配の無し（ｐＨ７．４）または有り（ｐＨ６．０）において、取り込みを測定した。
【図９】ＤＭＥＭまたはＬＨＭ中で培養したＭＤＣＫ細胞による、Ｈ+依存性［3Ｈ］−ＧｌｙＳａｒ（２．８８μＭ）取り込みを図示するグラフである。細胞外から細胞内へのＨ+水素イオン勾配の有り（ｐＨ６．０の取り込み緩衝液）および無し（ｐＨ７．４の取り込み緩衝液）において、ＧｌｙＳａｒ取り込みの差異として値を算出した。
【図１０】６０，０００細胞／ウェルで播種され、そしてＬＨＭ中で２日間培養されたＭＤＣＫ細胞によるｐＨ依存性Ｇｌｙ−Ｓａｒ取り込みを図示するグラフである。標準的な条件を用いて培養したＭＤＣＫ細胞によるｐＨ依存性ＧｌｙＳａｒ（２．８８μＭ）取り込み。値は、ｐＨ６．０またはｐＨ７．４の緩衝液の存在下でのＧｌｙＳａｒ取り込みからの相違として算出した、ＭＤＣＫ細胞のウェル（ｎ＝１６）のＨ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込み平均±ＳＤを表す。
【図１１】ＭＤＣＫ細胞によるＧｌｙＳａｒ取り込み（１００μＭ）に対する時間の効果を図示するグラフである。標準的な条件を用いて培養したＭＤＣＫ細胞によるＧｌｙＳａｒ取り込みについての、分単位でみた時間経過。細胞のウェル（ｎ＝６）のＧｌｙＳａｒ取り込み（平均±ＳＤ）を、３．７５分、７．５分、１５分、３０分、６０分、または１２０分で分析評価した。
【図１２】ＬＨＭ中で増殖させた、６０Ｋ／ウェルで播種したＭＤＣＫ細胞に対するＧｌｙＳａｒ濃度の効果を図示するグラフである。このグラフは、ＭＤＣＫ細胞によるＨ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みのＫmの特徴づけ（１．０ｍＭ）を示す。各々の値は、標準的な条件を用いて培養したＭＤＣＫ細胞の、ウェル（ｎ＝８）ごとのＧｌｙＳａｒ取り込みの平均±ＳＤを表す。
【図１３】抗生物質を用いたＭＤＣＫ細胞によるペプチド取り込みの阻害を図示するグラフである。平均±ＳＤは、ＧｌｙＳａｒ（１ｍＭ）、ペニシリン−Ｇ（３ｍＭ）、セファドロキシル（３０μＭ）、またはセファドロキシル（３ｍＭ）の有無におけるＭＤＣＫ細胞のウェル（ｎ＝５〜８）ごとのＧｌｙＳａｒの取り込みである。
【図１４】Ｇｌｙ含有ペプチドを用いたＭＤＣＫ細胞によるペプチド取り込みの阻害を図示するグラフである。指示された競合基質（１ｍＭ）の有無におけるＭＤＣＫ細胞のウェル（ｎ＝７〜８）ごとのＧｌｙＳａｒの取り込みの平均±ＳＤである。
【図１５】水素イオン勾配の無し（ｐＨ７．５）および有り（ｐＨの指定なし）、および指示された基質（１ｍＭ）における１ｍＭのＴｒｐＬｅｕ，ＬｅｕＴｒｐ、Ｌｅｕ、またはＴｒｐによる１００μＭ  ＧｌｙＳａｒ取り込みの阻害を図示するグラフである。値は、ＭＤＣＫ細胞のウェル（ｎ＝７〜８）ごとのＧｌｙＳａｒの取り込みの平均±ＳＤである。
【図１６】水素イオン勾配の無し（ｐＨ７．５）、および有り（ｐＨの指定なし）、および１ｍＭのＴｒｐ含有ペプチドにおける、ＭＤＣＫ細胞による１００μＭのＧｌｙＳａｒ取り込みの阻害を図示するグラフである。値は、ＭＤＣＫ細胞のウェル（ｎ＝７〜８）ごとのＧｌｙＳａｒの取り込みの平均±ＳＤである。
【図１７】水素イオン勾配の無し（ｐＨ７．５）および有り（ｐＨの指定なし）、および１００μＭのＴｒｐ含有ペプチドにおける、ＭＤＣＫ細胞による１００μＭのＧｌｙＳａｒ取り込みの阻害を図示するグラフである。値は、ＭＤＣＫ細胞のウェル（ｎ＝８）ごとのＧｌｙＳａｒの取り込みの平均±ＳＤである。
【図１８】ＴｒｐＬｅｕおよびＴｒｐＴｒｐによるＨ+依存性ＧｌｙＳａｒ取り込みのＩＣ50阻害を図示するグラフである。０、０．０２５、０．１、０．４、または１．６ｍＭのＴｒｐＴｒｐまたはＴｒｐＬｅｕの存在下で、ＭＤＣＫ細胞によるＨ+依存性１００μＭ  ＧｌｙＳａｒ取り込みの阻害について、Ｋi値を決定した。値は、ＭＤＣＫ細胞のウェル（ｎ＝６〜８）ごとのＧｌｙＳａｒの取り込みの平均±ＳＤである。
【図１９】ＤＭＥＭ中で培養したＭＤＣＫ細胞のタンパク質含量の基質（１０ｍＭ）調節を図示するグラフである。詳細には、ＭＤＣＫ細胞のタンパク質含量に対する、ＤＭＥＭの１０ｍＭのカルノシン、グリシルフェニルアラニン（ＧｌｙＰｈｅ）、Ｐｈｅ、またはＧｌｙの補充の影響を測定した。
【図２０】ＤＭＥＭ中で培養したＭＤＣＫ細胞によるＧｌｙＳａｒの取り込みの基質（１０ｍＭ）調節を図示するグラフである。詳細には、ＭＤＣＫ細胞による［3Ｈ］グリシルサルコシン（ＧｌｙＳａｒ）のＨ+依存性取り込みに対する、ＤＭＥＭの１０ｍＭのカルノシン、グリシルフェニルアラニン（ＧｌｙＰｈｅ）、Ｐｈｅ、またはＧｌｙの補充の影響を測定した。
【図２１】ＤＭＥＭ中で培養したＭＤＣＫ細胞のタンパク質含量の基質（１０ｍＭ）調節を図示するグラフである。詳細には、ＭＤＣＫ細胞のタンパク質含量に対する、ＤＭＥＭの１０ｍＭのグリシルサルコシン（ＧｌｙＳａｒ）、グリシルプロリン（ＧｌｙＰｒｏ）、グリシルフェニルアラニン（ＧｌｙＰｈｅ）、またはカルノシンの影響を測定した。
【図２２】ＤＭＥＭ中で培養したＭＤＣＫ細胞によるＧｌｙＳａｒの取り込みの基質（１０ｍＭ）調節を図示するグラフである。詳細には、ＭＤＣＫ細胞による［3Ｈ］グリシルサルコシン（ＧｌｙＳａｒ）のＨ+依存性取り込みに対する、１０ｍＭの、グリシルサルコシン（ＧｌｙＳａｒ）、グリシルプロリン（ＧｌｙＰｒｏ）、グリシルフェニルアラニン（ＧｌｙＰｈｅ）、またはカルノシンの影響を測定した。
【図２３】ＭＤＣＫ細胞による［3Ｈ］グリシルサルコシン（ＧｌｙＳａｒ）のＨ+依存性取り込みに対する、ＤＭＥＭ、栄養枯渇、デキサメサゾン（Ｄｅｘ）、またはインスリン（ｉｎｓ）の影響を図示するグラフである。
【図２４】ＭＤＣＫ細胞による［3Ｈ］グリシルサルコシン（ＧｌｙＳａｒ）のＨ+依存性取り込みに対する、ＩＧＦ−Ｉの影響を図示するグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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2004533813.tif 000058
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