(57)【要約】新規細胞毒性ポリアミンを開示する。これらの類似体は細胞成長及び／又は細胞増殖を阻害するのが望ましい疾患（例えば、ガンや血管形成術後の損傷等）の治療に有用な医薬的薬剤である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ１−Ｘ−Ｒ２の構造をもつ細胞毒性ポリアミン類似体であって、
Ｒ１及びＲ２が独立に、Ｈ、又は、炭素数が１から１０の直鎖若しくは分岐の脂肪族基、脂環式基、一員環若しくは多員環芳香族基、一員環若しくは多員環アリール置換脂肪族基、脂肪族置換一員環若しくは多員環芳香族基、一員環若しくは多員環ヘテロ環式化合物基、一員環若しくは多員環ヘテロ環基置換脂肪族及び脂肪族置換芳香族基、並びに、それらのハロゲン化されたものからなる群から選択された基であり、且つ、
Ｘが−（ＣＨ２）３−ＮＨ−、又は、−ＣＨ２−Ｐｈ−ＣＨ２−の２つで表される末端アミノ基をもつポリアミンから選択されたものであり、
Ｒ１及びＲ２が同時には無置換のベンジル基ではないことを特徴とする類似体。
【請求項２】
Ｘがプトレッシン、スペルミジン及びスペルミンからなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の類似体。
【請求項３】
Ｘがプトレッシンであることを特徴とする請求項２に記載の類似体。
【請求項４】
前記構造が、類似体１３２７、１３５７、１３６１、１３６２、１３５６、１３１３、１３４１、１３０７、１３１２、１３４４、１３５３、１３０８、１３５８、１３４３、１３４２、１３３２、１３１１、１３２６、１３２５、１３１４、１０９９、１１３２、１１３３、１１６８、１２４２、１２５０、１２５８、１２６６、１２７０、１２７６、１２７８、１２８０、１２８２、１２９３、１３００、１３０６、１３２１、１３２２、１３２３、１３２８、１３２９、１３３１、１３３３、１３３５、１３３６、１３３７、１３３８、１３３９、１３４９、１４４５、１４４６、１４４７、１４４８、１４５１、１４５２、１４７３、１４７４、１４９２、１４９３、１４９５、１４９６、及び、１４９７からなる群から選択された構造であることを特徴とする請求項３に記載の類似体。
【請求項５】
前記構造が、Ｏｒｉ１３１３であることを特徴とする請求項３に記載の類似体。
【請求項６】
前記構造が、Ｏｒｉ１３２７であることを特徴とする請求項３に記載の類似体。
【請求項７】
前記プトレッシン、スペルミジン及びスペルミンが、さらに分子内部炭素又は窒素原子に誘導されることを特徴とする請求項２に記載の類似体。
【請求項８】
請求項１記載のポリアミン類似化合物及び医薬的に許容できる賦形剤からなる、細胞成長若しくは細胞増殖を阻害することが望ましい病気又は健康状態の治療に有用な医薬組成物。
【請求項９】
前記の病気又は健康状態を治療するのに有効であるとして知られている添加剤を１種以上さらに含む請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項１記載のポリアミン類似化合物の効果的な量を患者へ投与することからなる、望ましくない細胞成長又は細胞増殖に関わる患者の病気又は健康状態を治療する方法。
【請求項１１】
望ましくない細胞成長又は細胞増殖が、免疫システム細胞の増殖、管新生内膜細胞の増殖、腫瘍細胞の増殖又は望ましくない脈管形成に関係していることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
病気又は健康状態がガン又は血管形成術後の損傷であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本願は、１９９９年９月１５日に出願された米国特許出願０９／３９６，５２３号に関連し、これにより、上記米国特許出願は十分に述べられた参照によって挿入される。
【０００２】
発明の属する技術分野
化学及び生化学に属する本発明は、細胞毒性剤として薬理学及び農学の用途に用いられる新規ポリアミン類似化合物の合成及び使用に関する。薬としてこれらの化合物は望ましくない細胞増殖、初期のガンのような疾患を処置するために、単独又は他の細胞毒性剤又は抗細胞増殖剤との併用により用いられる。
【０００３】
背景技術
細胞プロセスの中でポリアミン、プトレッシン、スペルミジン、及び、スペルミンが果たす細胞活性に関する極めて多くの長年の調査により、生命の中でそれらの果たす役割は大変大きいことが明らかになっている。（コーヘン（Ｃｏｈｅｎ），Ｓ．Ｓ．、「ポリアミン便覧」、１９９８，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。生理的ｐＨにおけるポリカチオンとして、全てのアニオン性細胞成分とポリアミンは密接に結合し、且つ、全てのアニオン性細胞成分の生物活性を強く変化させる。特異的で、且つ、強力な相互作用は、ＤＮＡ及びＲＮＡ、並びに、それらに関連する染色タンパク質に関係している（Ｔａｂｏｒ，Ｈ．ら、「１，４−ジアミノブタン（プトレッシン）、スペルミジン、及び、スペルミン」、Ａｎｎ　Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７６，４５，２８５−３０６；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ｈ．Ｒ．「ポリアミン、クロマチンの構造と転写」、ＢｉｏＥｓｓａｙｓ，１９９３，１５，５６１−５６６）。マルチカチオン性のポリアミンと微小管との特異的な相互作用が、最近明らかにされた（Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．　「オリゴカチオンによる微小間の集合の促進」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，３７，１０７２２−１０７２９；　Ｗｅｂｂ，Ｈ．Ｋ．ら、「１−（Ｎ−アルキルアミノ）−１１−（Ｎ−エチルアミノ）−４，８−ジアザウンデカン：チューブリン重合を特異的に変える、簡便に合成されるポリアミン類似体」、　Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９９，４２（８）：１４１５−２１）。アセチルコリンステラーゼ等の膜境界酵素のアロステリック制御が明らかにされている（Ｋｏｓｓｏｒｏｔｏｗ，Ａ．ら、「膜境界性アセチルコリンステラーゼに対するポリアミンの調節効果」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９７４，１４４，２１−２７）。
【０００４】
また、アポトーシスの誘導におけるポリアミンの含有も報告されている。ステファネリ（Ｓｔｅｆａｎｅｌｌｉ）とその共同研究者らは、ＨＬ６０ヒト白血病細胞を使用することにより（Ｓｔｅｆａｎｅｌｌｉ，Ｃ．ら、「白血病細胞内において、スペルミンはカスパーゼの活性化を誘発する」、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９８，４３７，２３３−２３６）、又は、無細胞モデルを使用することにより（Ｓｔｅｆａｎｅｌｌｉ，Ｃ．ら、「アポトーシスの無細胞モデルにおいて、スペルミンはカスパーゼ−３の活性化を誘発する」、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９９，４５１，９５−９８）、スペルミンを添加するとアポトーシスが誘導されることを報告している。このプロセスは、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出と、プロカスパーゼ−３のｄＡＴＰ依存プロセスの進行とカスパーゼ活性の開始を特徴とする。このカスパーゼの活性化は、坑酸化剤によっても、ＭＤＬ７２５２７によっても妨害されることはない。従ってこの研究者らは、デスメッセージの導入におけるポリアミンの生理学上の役割に関して仮説を立てた。
【０００５】
生理学的なｐＨにおいては正の４価であるために、スペルミンは大部分が細胞成分と結合し、ポリアミンの細胞内含有量が高いにも関わらず細胞内遊離濃度は非常に低い（マートン（Ｍａｒｔｏｎ，Ｌ．Ｊ．）ら、「治療的介入のためのターゲットとしてのポリアミン」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．１９９５，３５，５５−９１）、従って、核酸、膜又は他の貯蔵部位に対して加えられる障害に追従してスペルミンの遊離濃度が即座に上昇する可能性があるから、スペルミンはダメージを検知する性質を有している可能性がある。この増加はダメージの範囲に比例し、ミトコンドリアに対してデスシグナルを導入することができる。
【０００６】
ポリアミンとポリアミン類似体毒性のメカニズムを探索している研究者も他にいる。プーリン（Ｐｏｕｌｉｎ）とその共同研究者は、オルチニンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）が過剰発現しているＬ１２１０細胞におけるポリアミン輸送の統制を解除すればスペルミジンは致死蓄積量になることを示した（Ｐｏｕｌｉｎ，Ｒ．ら、「オルニチンデカルボキシラーゼを過剰生産したＬ１２１０細胞内における過剰なポリアミンの蓄積によるアポトーシスの誘導」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９５，３１１，７２３−７２７）。この致死的な傷害は、アポトーシスの誘導によるものであることが明らかにされている。ポリアミンの酸化は観察されたアポトーシスの原因ではない。ワラス（Ｗａｌｌａｃｅ）とその共同研究者はＢＨＫ−２１／Ｃ１３細胞におけるスペルミンの、類似の非酸化致死的作用を示している（Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｖ．Ｇ．ら、「ｂａｂｙ−ｈａｍｓｔｅｒ　ｋｉｄｎｅｙ（ＢＨＫ）におけるスペルミン毒性のメカニズム」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９１，２８０，１９３−１９８）。彼らはまた、ＭＤＬ７２５２７がスペルミンの毒性効果を悪化させることも示している。
【０００７】
パックハム（Ｐａｃｋｈａｍ）とクリーブランド（Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ）は、３２Ｄ．３ネズミ骨髄細胞中のＯＤＣの強制発現がＩＬ−３投与終了後のアポトーシス的細胞死の原因となることを示している（Ｐａｃｋｈａｍ，Ｇ．ら、「オルニチンデカルボキシラーゼはｃ−ｍｙｃ誘導アポトーシスの媒介である」、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９４，１４，５７４１−５７４７）。ＯＤＣは処方量に依存するような細胞死を誘導し、またＯＤＣの不可逆的阻害剤であるα−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）がＯＤＣ誘導型の細胞死を効果的に抑制する。ガーナー（Ｇｅｒｎｅｒ）とその共同研究者は、ＯＤＣの過剰発現又はポリアミン輸送制御欠如細胞系を用いた一連の実験の中で、ポリアミン輸送系のフィードバック制御の欠如がアポトーシスを誘導するのに十分であることを立証している（Ｘｉｅ，Ｘ．ら、「分子内プトレッシンのプールサイズ制御の欠如がアポトーシスを誘導する」、Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓ．１９９７，２３０，３８６−３９２）。プトレッシン量のタイトなフィードバック制御の統制が欠如していると、細胞はプトレッシン処方量に依存するようなのアポトーシスが進行する。
【０００８】
ヤナガワ（Ｙａｎａｇａｗａ）とその共同研究者らは、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の増殖抑止効果には、ＯＤＣ活性の増加と共に結果として生じる分子内ポリアミン量の増加を経たアポトーシスの誘導が関与していることを示した（Ｙａｎａｇａｗａ，Ｋ．ら、「肝ガン細胞のＨＧＦの増殖抑止効果には分子内ポリアミン量の濃度増加を伴ったアポトーシスの誘導が関与する」、Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．１９９８，５，１８５−１９０）。ＯＤＣ阻害剤のＤＦＭＯの添加によって、ポリアミンの量は減少し、ＨＧＦのアポトーシス効果は阻害される。このアポトーシス効果の阻害は細胞に対する外因性ポリアミンの添加により再び逆転する。上述の報告は、ポリアミンのプール濃度の統制の欠如による明確なアポトーシス効果を示している。この効果は非酸化メカニズムを通して起こることもまた明らかである。
【０００９】
Ｎ１，Ｎ１１−ジエチルノルスペルミン（ＤＥＮＳＰＭとして知られているＢＥ３，３，３）で表される一連の変成スペルミンの類似体は、ポリアミン異化酵素スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ（ＳＳＡＴ）を超誘導することや、部分的に酸化メカニズムを経由して働くことが示されている（Ｃａｓｅｒｏ，Ｒ．Ａ．ら、「スペルミジン／スペルミンＮ１−アセチルトランスフェラーゼ−ポリアミンの代謝におけるターニングポイント」、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．１９９３，７，６５３−６６１）。ポーター（Ｐｏｒｔｅｒ）とその共同研究者はこれら一連の類似体の細胞の反応を調査し、細胞毒性、ＳＳＡＴの誘導、及び、細胞系に対する効果を比較した（Ｋｒａｍｅｒ，Ｄ．Ｌ．ら、「細胞系の進化及びＭＡＬＭＥ−３Ｍヒトメラノーマ細胞に関する新規スペルミン類似体の効果」、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．１９９７，５７，５５２１−５５２７）。彼らは、細胞毒性はスペルミン類似体によるＳＳＡＴの誘導量と相関は無いだろうと結論づけており、更に他のメカニズムが含まれている可能性を示唆している。類似体の構造をほんの少し変えるだけで、細胞系に対する効果に様々な変化が見られる。
【００１０】
関連する類似体を使用して、フー（Ｈｕ）とペグ（Ｐｅｇｇ）は、ポリアミン輸送体によるポリアミン類似体の無統制な摂取はアポトーシスの急速な誘導を引き起こすことを示している（Ｈｕ，Ｒ−Ｈ．ら、「ポリアミン類似体の無統制な摂取によるアポトーシスの急速な誘導」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９７，３２８，３０７−３１６）。
【００１１】
あるジベンジルプトレッシン類似体は、ヒト及びネズミ腫瘍細胞系に対する坑増殖効果を持つことが示されている。フリードマン（Ｆｒｙｄｍａｎ）らは、１，３−ジアミノプロパン、プトレッシン、及び、カダベリンのＮ１，Ｎｘ−ジベンジル類似体の、３つの扁平上皮細胞ガン細胞系（ＳＣＣ−３８，ＳＣＣ−４Ｙ及びＳＣＣ−１３Ｙ）及びラット肝腫瘍細胞系（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ）に対する細胞毒性について述べている（Ａｉｚｅｎｃａｎｇ，Ｇ．ら、「ヒト及びネズミ腫瘍細胞内のＮ１，Ｎ４−ジベンジルプトレッシンの増殖抑制効果」、Ｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，４４（４），６１５−６２５、及び、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ　Ｎｏ．５，６７７，３５０）。１００μＭと３００μＭの間のＩＣ５０値は、この細胞系に対してプトレッシン及びカダベリンのＮ１，Ｎｘ−ジベンジル類似体を使用することでわかる。この調査者達はアポトーシス的細胞死が進行する細胞の古典的なホールマークを示している。例えば、小胞形成、サイズの減少、タイパンブルーによる染色変化及び接着性などである。
【００１２】
フリードマンらはまた、特異的ポリアミンオキシダーゼ阻害剤である、Ｎ１，Ｎ４−ビス（ブタ−２，３−ジエニル）ブタンジアミン（ＭＤＬ７２５２７）との共培養により、類似体の活性が５倍上昇することを立証している。［１，４−１４Ｃ］−プトレッシン摂取の適度な阻害が分かっている（プトレッシンがＫｍａｐｐ＝５．２＋／−０．６μＭであるのに対し、Ｎ１，Ｎ４−ジベンジルプトレッシンを用いるとＫｉａｐｐ＝６．５＋／−１．７μＭである）が、Ｎ１，Ｎ４−ジベンジルプトレッシンに対して１０倍過剰量のプトレッシンでさえ、細胞成長阻害効果を廃することはできない。分子内ポリアミン量の適度な減少は薬の服用後７２時間後に測定された。このポリアミン量の減少は、ポリアミンを涸渇させるようにデザインされた治療的アプローチによって達成される減少と比較すれば重要性は低い（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ　６，１７２，２６１　Ｂ１参照）。
【００１３】
Ｎ１，Ｎ４−ジベンジルプトレッシンを用いたｉｎ　ｖｉｖｏ増殖抑制検討の結果（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ　５，６７７，３５０）から、これらの類似体に対して大きな有望性が提案されている。これらの検討によると、対照の腫瘍と比較して、処置すべき重量のかなり大きな減少が見られる。生後４週間の毛の無いマウスにラット肝腫瘍Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ細胞（１０×１０６個の細胞）又はヒトメラノーマ細胞であるＩＩ−Ｂ−Ｍｅｌ−Ｊ（５×１０６個の細胞）を皮下接種させ、１５から２４日間成長させた。飲み水中の０．１５％　Ｎ１，Ｎ４−ジベンジルプトレッシンを１０日間に渡って投与した結果、動物には何の毒性効果も見られなかった。この実験に関して重要な所見がいくつか得られた。上述したように、Ｎ１，Ｎ４−ジベンジルプトレッシンによる処置は、処置後に肺や肝臓にダメージを示さない。対照動物に見られる転性肺ガンは、治療された動物の中では見られなかった。最も重要なことに、腫瘍の成長は治療動物中では６又は７倍強力に阻害されていた。さらなる検討によれば、治療された動物から得られた腫瘍中のポリアミン量は対照動物と比較して有為な差を示さない。
【００１４】
最近の報告によると、ＭＤＬ７２５２７の存在下において観察される細胞毒性の増加に対する説明が提案されている（Ｄａｉ，Ｈ．ら、「ポリアミンオキシダーゼ阻害剤であるＭＤＬ−７２，５２７はリソソーム向性効果を通して、形質変換された造血細胞のアポトーシスを選択的に誘導する」、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９９，５９，４９４４−４９５４）。比較的無毒性で選択的なポリアミンオキシダーゼ（ＰＡＯ）阻害剤として以前に報告されているこの化合物は、形質変換された造血細胞のアポトーシスを誘導する。興味深いのは、この化合物は一次骨髄原種に対して無毒性であることである。この化合物の細胞の特徴づけにより、上記のジベンジルプトレッシン類似体に対して報告されているものと著しく似通っていることが明らかにされた。この化合物はプトレッシンとスペルミジンの量を減少させる（またＮ１−アセチルスペルミジンの量は増加させる）が、この効果はＰＡＯ阻害剤としての化合物の作用に基づき期待されていたものである。この化合物の細胞毒性効果は外因性のプトレッシン又はスペルミジンと共に処理しても妨害されることはない。この効果はまた、速度決定ポリアミン生合成酵素である、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）の過剰発現又は阻害によって影響されない。特徴が確立されている特異的阻害剤であるＯＤＣ、ＤＦＭＯは、より大きな細胞毒性を導くＭＤＬ７２５２７の摂取量の増加の原因となる。しかし、プトレッシン／ＤＦＭＯ／ＭＤＬ７２５２７で処理すればＭＤＬ７２５２７単独の場合と同じ効果が得られる。
【００１５】
要約すると、Ｎ１，Ｎ４−ジベンジルプトレッシンと他の類似体は、細胞内ポリアミン量の涸渇によって細胞毒性を示さないことをこの報告は示している。特異的で、且つ効力の強いＰＡＯ阻害剤がその活性を高めるという事実は、ポリアミンオキシダーゼが介在する機構が原因ではないことを示している。機構については限られた知見しか無いにも関わらず、この化合物はいくつかの異なるガン細胞系に対して中程度のＩＣ５０の値を示す。また、この化合物はアポトーシスの機構を通して作用する化合物のホールマークを示す。マウス異種移植片坑腫瘍モデルにおいて、Ｎ１，Ｎ４−ジベンジルプトレッシンは大きな有望性を示している。この化合物は経口活性で４０日間の治療後でさえ、毒性を示さない。この化合物の他の利点は簡単で安価な合成法であることである。
【００１６】
ミトコンドリアは、アポトーシスの経路において明らかに重要な役割を担っている。ミトコンドリア膜の電位の減少は、アポトーシスの初期の普遍的な事象である（Ｍｉｇｎｏｔｔｅ，Ｂ．ら、「ミトコンドリアとアポトーシス」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９８，２５２，１−１５）。ミトコンドリアは、多くの刺激への反応において、シトクロムｃを細胞質に放出することによってアポトーシスの初期の段階に加わる。最近の文献の報告によると、治療的に有望ないくつかの薬品を含む多くの分子は、ミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を通してアポトーシスを誘導する。この放出に対する確立したメカニズムは、ミトコンドリアの外部膜／マトリックスの破裂に引き続く内部膜の膨張である。正に帯電したシトクロムｃタンパク質のミトコンドリアからの放出は，アポトーシスと強く繋がっている（Ｇｒｅｅｎ，Ｄ．Ｒ．ら、「ミトコンドリアとアポトーシス」、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８１，１３０９−１３１２）。放出されたシトクロムｃによって最終的にカスパーゼ−３の活性化に終わる複雑な経路が始まる。
【００１７】
タマノイ（Ｔａｍａｎｏｉ）とその共同研究者は、４つの構造的に異なるファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤の組が、ν−Ｋ−ｒａｓ−形質転換ノーマルラット肝臓細胞のミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を誘導することを示している（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｎ．ら、「ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤が形質転換された細胞内においてシトクロムの放出とカスパーゼ３の活性化を選択的に誘導する」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１５３５６−１１５３６１）。彼らは、この放出は結果としてカスパーゼ−３の活性化に終わり、またこの放出は、通常の細胞と比較して、形質変換された細胞内で選択的に確認されたということを示している。
【００１８】
デバチン（Ｄｅｂａｔｉｎ）とその共同研究者はメラノーマ特異的細胞毒性剤であるベツリン酸が、ミトコンドリアからの細胞質ゾルへのシトクロムｃとアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）の放出を経由するＣＤ９５（ＡＰＯ−１／Ｆａｓ）−依存アポトーシス及びｐ５３−依存アポトーシスを引き起こすことを示している（Ｆｕｌｄａ，Ｓ．ら、「ミトコンドリアの活性化とベツリン酸によるミトコンドリアのアポトーシス因子の放出」、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，２７３，３３９４２−３３９４８）。この（ミトコンドリアの直接的効果を経由する）薬剤誘導アポトーシスには２つの共通の抵抗を含んでいないという事実は、ベツリン酸は、いくつかの形態のドラッグレジスタンスをバイパスしている可能性がある（Ｆｕｌｄａ，Ｓ．ら、「ベツリン酸が神経外胚葉腫瘍におけるカスパーゼの活性化を経由するＣＤ９５（ＡＰＯ−１／Ｆａｓ）−及びｐ５３−依存アポトーシスのきっかけとなる」、Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．１９９７，５７，４９５６−４９６４）。
【００１９】
現在フェーズＩＩＩにある転移乳ガン及び卵巣ガンにおいて、添加剤であるロニダミン（１−［（２，４−ジクロロフェニル）メチル］−１Ｈ−インダゾール−３−カルボン酸）もまたミトコンドリアの透過性移動孔へ直接に作用することによりｐ５３とは独立に作用する（Ｒａｖａｇｎａｎ，Ｌ．ら、「ロニダミンがミトコンドリアの透過性移動孔への直接的なＢｃｌ−２阻害効果によってアポトーシスを引き起こす」、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１９９９，１８，２５３７−２５４６）。
【００２０】
初期のアポトーシスの普遍的な事象であるミトコンドリア膜の電位の減少はミトコンドリアの内部膜にある孔が開くことによって起こる可能性がある。この孔は分子量で１５００Ｄａ以下の化合物を膜から通過させ、この内のいくつかは直接的にアポトーシスに関与する。
【００２１】
上記の文書の引用は、前述の記述のどれかが従来の技術にぴったり合っていることを認める、ということを意図したものではないではない。日付に関する全ての記述やこれらの書類の内容に関する表現は出願人が利用できる情報に基づいており、日付やこれらの書類の内容の正確さに関していかなる承認も構成しているものではない。
【００２２】
発明の要約
本発明は、ポリアミン類似体の合成及び成長阻害性、並びに、薬として、農薬として若しくは環境上有用な薬品としてのその用途に関する。好ましくは、その類似体とはスペルミン、スペルミジン、及び、プトレッシンの誘導体、例えば、ジベンジルプトレッシンの誘導体等である。
【００２３】
本発明の類似体にはスペルミン、スペルミジン、及び、プトレッシンの誘導体、並びに、末端（アルファ又はα、及び、オメガ又はω）の片方又は両方の窒素分子の位置が置換されたその類似体が含まれる。好ましい類似体は両方の位置が置換されたものである。置換基は、化学的に同一でも異なっていてもよい。更に、類似体はポリアミン主鎖の一以上の内部窒素及び／又は炭素の位置が低分子量の置換基で置換されていてもよい。
【００２４】
好ましい実施形態は、坑ガン化学治療剤として医薬的に有用な、高い細胞毒性を持った類似体である。そのような類似体は腫瘍細胞に対してミクロモル、又は、サブミクロモルの範囲でＩＣ５０を持っている。そのような活性を持つ好ましい化合物は、この中で述べている化合物１３１３と１３２７を含む。それに加えて好ましい化合物は同一の置換基によって両方の末端の窒素分子が置換されたスペルミン類似体である。
【００２５】
好ましい置換基は細胞毒性を高めるか、そうでなければ細胞成長、増殖、転移、新生の阻害力を高める構造である。そのような付加的な置換基はアジリジン基や他のさまざまな脂肪族多環構造、芳香族多環構造、脂肪族−芳香族が組み合わさった多環構造、又は、ヘテロ環多環構造を含む。
【００２６】
より具体的には、本発明のポリアミン類似体又は誘導体は細胞毒性を有し、次の構造：
Ｒ１−Ｘ−Ｒ２
（式中、Ｒ１及びＲ２は独立にＨ又は直鎖若しくは枝分かれのＣ１−１０脂肪族基、脂肪族環基、単環又は多環の芳香族基、単環又は多環のアリール基で置換された芳香族基、脂肪族基で置換された単環又は多環の芳香族基、単環又は多環のヘテロ環基、単環又は多環のヘテロ環基で置換された脂肪族基及び脂肪族基で置換された芳香族基、並びに、それらのハロゲン基置換体、
及び、
Ｘは、末端アミノ基、−（ＣＨ２）３−ＮＨ−、又は、−ＣＨ２−Ｐｈ−ＣＨ２−を有するポリアミン）
を有する。
【００２７】
好ましくは、ポリアミンは直鎖であるか又はスペルミン、スペルミジン若しくはプトレッシンから選択される。Ｒ１とＲ２は同一でも異なっていても良く、同時には無置換のベンジル基でないのが好ましい。ハロゲンで置換された基はフッ素、塩素、臭素、及び、ヨウ素で置換されたものを含む。
【００２８】
また、Ｘは−（ＣＨ２）３−ＮＨ−、又は、−ＣＨ２−Ｐｈ−ＣＨ２−であり、“Ｐｈ”はフェニル部分を表し、Ｒ１とＲ２は上述と同じである。
【００２９】
二置換のポリアミン（好ましくはリポーター基を含む）はアッセイや生化学的プローブに用いてもよい。
【００３０】
一度細胞毒性ポリアミン類似体が同定されると、その有用性を改良するために他のポリアミン類似体と構造面及び機能面で比較することにより更に容易に最適化することができる。そのような改良の例としては、特に限定される訳ではないが、細胞毒性の向上、代謝安定性の向上、特異性の向上、取扱性や投与性の容易さ、細胞内ポリアミンプールへの非結合性、及び、副作用の減少等である。
【００３１】
本発明は、ポリアミン類似体からなる組成物にも関する。好ましくは、組成物は細胞成長や増殖を阻害することが望ましい疾患、又は、健康状態や状況を治療するための医薬的配合物であって、上述の組成物と医薬的に許容できる賦形剤からなる。上記医薬組成物はＤＦＭＯのような細胞毒性化合物やポリアミン合成阻害剤をさらに含んでもよい。他の組み合わせとして、上述の医薬的組成物と上記の疾患や健康状態を治療するために有用と知られている他の一以上の添加剤の組み合わせがある。
【００３２】
本発明は、細胞と本発明の類似体を接触させる、細胞成長や増殖の阻害方法も提供する。そのような方法においては、望ましくない細胞増殖に関係する患者内の疾患や健康状態を、上述の医薬的組成物の有効量を患者に投与することにより上記患者の疾患や病気を治療する。望ましくない細胞増殖は、免疫系の細胞、新脈管内膜細胞、腫瘍細胞の増殖又は望ましくない血管形成に関係している可能性がある。上述の中で治療するのが好ましい疾患とは、ガンや血管形成術後の損傷等である。
【００３３】
従って、本発明の類似体は、単独でも他の薬品との組み合わせでも、ガンや、血管新生及び損傷後の細胞成長等の望ましくない細胞増殖の疾患の治療に用いられる。好ましくは、細胞成長の阻害、又は、アポトーシスの誘導によってその治療は作用する。上述のように、それらは細胞増殖抑制メカニズム、及び／又は細胞毒性メカニズムによって作用する可能性がある。本発明の類似体は個々に、又は、他の薬剤との併用若しくは併用なしで、高血圧、骨粗鬆症、アルツハイマー病、虚欠症、自己免疫疾患、精神病、鬱病、卒中、心血管疾患、アレルギー、喘息、移植による拒絶反応、並びに、微生物又は寄生体、及び、真菌などの植物病原体の感染の治療のために使用される。本発明の類似体は、坑下痢剤、坑蠕動剤、坑痙攣剤、坑ウィルス剤、坑乾癬剤、及び、殺虫剤としてもまた効きめがある。
【００３４】
本発明は、診断用組成物に有用な一連のポリアミン誘導体にも関する。そのような化合物の合成方法も述べる。
【００３５】
発明の詳細な説明
本発明の発明者らは、ｉｎ　ｖｉｖｏでもｉｎ　ｖｉｔｒｏでも細胞毒性を示す新規ポリアミン類似化合物をデザインした。そのような化合物は多くの疾患、特にガンの薬として有用である。また上記化合物は、例えば（オルニチンデカルボキシラーゼを阻害する）ＤＦＭＯのようなポリアミン合成阻害剤又は他の細胞毒性剤との新規薬剤複合物の成分として使用することができる。本発明の化合物は一般に細胞成長の阻害が望ましい疾患や健康状態に有効であり、その細胞毒性に基づき農業的及び環境的な用途も有している。
【００３６】
本発明の発明者らは、細胞成長及び／又は細胞増殖の阻害剤としてその有利な性質を付与するために様々な化学的置換基を付加させることができることを見出した。
【００３７】
本発明の好ましい態様として、類似体はヒトメラノーマの治療に有効である。ヒトメラノーマは米国や世界の多くの地域において健康問題に発展している。オゾン層の破壊による太陽光への暴露が増加することにより、この疾患は人口の変化や将来の出生に関わる重要な健康の関心事となっている。悪性のメラノーマは坑化学療法性の腫瘍であると考えられており、一般的に用いられている坑ガン剤では転移性疾患の予後を変えることはできない（Ｓｅｒｒｏｎｅ，Ｌ．ら、「ヒト悪性メラノーマの坑化学性」、改訂版Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．１９９９，９，５１−５８）。本発明のポリアミン類似体の好ましい実施形態によればメラノーマ細胞系に劇的な選択性を示すことが分かっている。
【００３８】
定義
ここで使用されるものとして、「ポリアミン」という用語はプトレッシン、スペルミン、スペルミジンのような天然のポリアミンの他に、他の天然のポリアミンとしてカルドペンタミン、ホモカルドペンタミン、Ｎ４−ビス（アミノプロピル）ノルスペルミジン、サーモペンタミン、Ｎ４−ビス（アミノプロピル）スペルミジン、カルドヘキサミン、ホモサーモヘキサミン及びホモカルドヘキサミン、カダベリン、アミノプロピルカダベリン、ホモスペルミジン、カルジン（ノルスペルミジン）、７−ヒドロキシスペルミジン、サーミン（ノルスペルミン）、サーモスペルミン、カナバルミン、アミノプロピルホモスペルミジン、並びに、アミノペンチルノルスペルミジン等が挙げられる。
【００３９】
「ポリアミン」という用語はより長い直鎖ポリアミンと分岐ポリアミン等も包含し、２から約１０の窒素分子を有していても良い。窒素原子は一般的に直鎖伝いの２から６の炭素分子によって離される。この定義の中には、Ｃ分子又は末端若しくは内部Ｎ分子に共有結合した多くの官能基のいずれかを有する基礎ポリアミン鎖を含むポリアミン類似体や誘導体も含む。これらはＮ１−一置換ポリアミン類似体、及び、二級窒素のα位の炭素原子への置換体とポリアミンオキシダーゼによるゆっくりとした分解を受けるアシル化体も含む。ポリアミンの選択的一級一置換体は知られている（クラプチョ（Ｋｒａｐｃｈｏ），Ａ．Ｐ．ら、「アミノ基の一つが保護されたジアミン、α，ω−アルカンジアミン由来のＮ−ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル−α，ω−アルカンジアミン」、Ｓｙｎ．Ｃｏｍｍ．１９９０，２０，２５５９−２５６４；　ブラッグブロー（Ｂｌａｇｂｒｏｕｇｈ），Ｉ．Ｓ．ら、「非対称ポリアミンアミドの実用的な合成」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ．１９９８，３９，４３９−４４２）。別のものとしては、メチル基をスペルミンの末端アミノ基のα位に導入させることができる（ラカネン（Ｌａｋａｎｅｎ），Ｊ．Ｒ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：７２４−７３４，１９９２）。
【００４０】
内部炭素がアルキル化された様々なポリアミンの類似体もまた容易に合成することができる。５−カルボキシスペルミン、テトラ−ｔＢｏｃ−５−カルボキシスペルミン及びその酸クロライドはフーバー（Ｈｕｂｅｒ），Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２７５５６−２７５６３，１９９４．に従って合成する。結果として得られた酸クロライドはその後様々な求核試薬と反応させて次にｔＢｏｃ基を除去し、カルボキシ基置換ポリアミン類似体を製造することができる。別の方法としては、カルボキシ基中間体は莫大な付加類似体を合成するために使われる中間体に還元することができる。
【００４１】
「リポーター部」とは、プローブを検出可能にするプローブの化学的な部分を形成する部分であり（直接的にでも良いし、例えば、酵素的な強化を経由するものでもよい）、よってプローブを局在化させるものである。リポーターはそれ自身が検知可能な信号を発するか、又は、検知可能な、若しくは、リポーターと結合することによって検知可能になる、又は、そうでなければリポーターと反応することによって検知可能になるリポーター特異パートナーとの親和性によるものでもよい。
【００４２】
ここで開示される様々なポリアミン類似化合物は識別番号図によって同定される（４つの１０進法の化合物番号を単独で用いるか、又は“ＯＲＩ”若しくは“Ｏｒｉ”という識別名と組み合わせて用いる）。識別図が使用されているにもかかわらず、識別名は単に含まれている化合物の実際の分子構造のみを表し、その化合物に何の制約を与えるものではない。
【００４３】
ポリアミン類似体の構造と合成
本発明のポリアミン類似体は一般的に既存の又は新規のポリアミンの置換されているか若しくは誘導された形態である。好ましくは、上記類似体はスペルミン、スペルジミン、及び、プトレッシンの誘導体である。より具体的には、基礎となっているポリアミンの末端（アルファ又はα、及び、オメガ又はω）窒素の位置の少なくとも一つ又は両方が置換されている類似体である。好ましくは両方の位置が置換されている類似体である。最も好ましくはミクロモルの範囲（例えば、１から約６００μＭ、１から約３００μＭ、１から約２００μＭ、１から約１００μＭ、１から約５０μＭ、１から約２０μＭ、１から約１５μＭ、１から約１０μＭ、１から約９μＭ、１から約８μＭ、１から約７μＭ、１から約６μＭ、１から約５μＭ、１から約４μＭ、１から約３μＭ、及び、１から約２μＭ）及びサブミクロモルの範囲（例えば、約０．０１から１μＭ、約０．１から１μＭ、約０．２から１μＭ、約０．３から１μＭ、約　０．４から１μＭ、約０．５から１μＭ、約０．６から１μＭ、約０．７から１μＭ、約０．８から１μＭ、約０．８から１μＭ、及び、約０．９から１μＭ）で腫瘍細胞に対してＩＣ５０を有している類似体である。
【００４４】
図１Ａは直鎖の中で二つの末端アミノ基を分離する３、４、又は、５の炭素原子を有する置換ポリアミンの製造のための典型的な反応スキーム１を示す。この反応は極めて直接的な合成法であり、一つの反応容器内で行なえる。４つの炭素原子を持つ典型的なポリアミン反応体はプトレッシンである。プトレッシンを使用した反応の生成物はＮ１，Ｎ４−ジベンジルプトレッシンである。この反応に引き続いて、ポリアミン類似体はカラムクロマトグラフィー又は結晶化によって容易に精製できる。
【００４５】
本発明の類似体を製造するためにスペルミン、スペルミジン、及び、他のポリアミンを用いても同様の反応を行なうことができる。そのような付加的な反応は従来から公知であり、スペルミンやスペルミジンのような大きなポリアミンの構造の中にある官能基を適切に保護する過程を含んでもよい。
【００４６】
図１Ａの反応スキームは、本発明の細胞毒性ポリアミン類似体を生産するために、例示した典型的な芳香族アルデヒド以外のアルデヒドを使用することによって容易に改良できる。従って、環状又は脂肪族部分を含むアルデヒド、及び、その置換体との反応を本発明の付加的な類似体の製造に使用してもよい。本発明の類似体の製造を行なうために、環状部分はもちろん単素環基でもヘテロ環基でも良く、また芳香族基でもアリール基でもかまわない。脂肪族の部分には一つ以上の非炭素のヘテロ原子を含んでもかまわない。
【００４７】
環状の部分の例は、例えば、多環基、多環−単環基及び多重環の頭の基において異なる環構造が付与している結合又は直鎖を含む。環構造の基を共有的に連結するためのそのようなの基の例は、アミド基、スルホンアミド基、エーテル基、チオエーテル基、エステル基、−Ｃ−Ｃ―若しくは―Ｃ−Ｎ−、又は、−Ｎ−Ｎ−結合である。環構造はそれぞれ置換されていてもよい。
【００４８】
ヘテロ環部分の例としては、特に限定されるわけではないが、ピロリジニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、モルホリニル基、ビフェニル基、フラニル基、ピロリル基、１，２−ジアゾイル基、イミダゾイル基、１Ｈ，１，２，３−トリアゾイル基、１Ｈ−１，２，３，４−テトラゾイル基、チアゾイル基、オキサゾイル基、１，３，４−チアゾイル基、ピリジニル基、ピリミジル基、１，２−ジアジニル基、１，４−ジアジニル基、１，３，５−トリジニル基、ジベンゾフラニル基、アクリジニル基、２，１，３−ベンゾチアジアーゾール基、イソキノリニル基、キノリニル基、ベンズフラニル基、イソベンゾフラニル基、１，３−ベンゾジアジニル基、フェナジニル基、フェノキサジニル基、フェノチアジニル基、ピラン、クロメニル基、キサンテニル基、インドリジニル基、イソインドリル基、インドリル基、プリニル基、フタラジニル基、ナフチリジニル基、キノキサリニル基、キナゾリニル基、シノリニル基、プテリシニル基、カルバゾイル基、β−カルボリニル基、フェナンスリジニル基、アクリジニル基、ペリミジニル基、フェナントロリニル基、イソチアゾイル基、フラザニル基、インドリニル基、イソインドリニル基、キヌクリジニル（ｑｕｉｎｕｃｌｉｄｉｎｙｌ）基、及び、ビオチニル基等が挙げられる。
【００４９】
芳香族基としては、特に限定されるわけではないが、フェニル基、ナフチル基、１−，２−，又は，３−ビフェニル基、インデニル基、アセナフチレニル基、アントラセニル基、フェナンスレニル基、フェナレニル基、トリフェニレニルピレニル基、及び、ジフェニルメチレニル基等が挙げられる。
【００５０】
脂肪族基の例としては、特に限定されるわけではないが、直鎖、分岐、及び、環状の炭化水素；炭素数２から１０のアルカン；１から３の不飽和結合を持つ炭素数３から１０のアルケン；１から３の不飽和結合を持つ炭素数３から１０のアルキン；炭素数３から１０の分岐アルカン、アルケン及びアルキン；炭素数３から８のシクロアルキル基、アダマンチル基、カンフォリル基、及び、コレステリル基などの多環脂肪族炭化水素並びにステロイド骨格系等が挙げられる。
【００５１】
更に、図１Ａで例示されている反応と類似の反応において用いられるポリアミン反応体は、直鎖の主鎖上の一つ以上の内部窒素及び／又は炭素の位置が低分子量の置換基によって誘導されていてもよい。そのような部分の例は次のリストにより示される。
ハロゲン、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、ネオペンチル基、シクロペンチル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基、シクロノニル基、シクロデシル基、ヘキシル基、２−ヘキシル基、３−ヘキシル基、アリル基、ビニル基、アセチレニック基、プロパルギリック基、ホモプロパルギリック基、ヒドロキシ基、メトキシ基、
エトキシ基、プロポキシル基、チオ基、メチルチオ基、エチルチオ基、プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ニトロ基、アミノ基、アセトアミド基、ホルムアミド基、カルボン酸基、メチルエステル基、エチルエステル基、プロピルエステル基、イソプロピルエステル基、シアノ基、イソシアナート基、トリフルオロメチル基、トリクロロメチル基、トリブロモメチル基、アジド基、アセトキシ基、カルボキサミド基、Ｎ−メチルカルボキサミド基、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルボキサミド基、Ｎ−エチルカルボキサミド基、Ｎ，Ｎ−ジエチルカルボキサミド基
【００５２】
上記の基の一置換及び多置換の形態もまた本発明に包含される。
【００５３】
好ましいポリアミン類似体及び誘導体
好ましい形態は坑ガン化学治療薬として医薬的に有用な高い細胞毒性を有する類似体である。そのような活性を有する好ましい類似体は、図２に構造を示した化合物１３１３及び１３２７を含む。この類似体はＮ１，Ｎ４−ジベンジルプトレッシンよりも有望であり、低いマイクロモルの濃度でも腫瘍細胞に対し細胞毒性を示し、アポトーシスを誘導し、たった１時間の治療で効果を発揮する。更に、上記類似体は、腫瘍細胞系でアポトーシスを誘導し、予想しなかったことに多剤耐性を発現する腫瘍細胞系の成長を阻害することができる。またこの類似体は、メラノーマ細胞における細胞成長と細胞増殖を阻害する上で特有の特異性と効力も有する。
【００５４】
本発明の付加的な好ましい化合物は、類似体“１１９１”及び“１１９２”を除き、図３で例示されている置換基Ｒを有するプトレッシン類似体である。図３で数字が付されて列挙されている類似体は、それぞれ例示された置換基Ｒが両方の末端窒素分子の位置に存在するプトレッシンの誘導体である。記載のＩＣ５０の値はヒト乳腫瘍細胞系であるＭＤＡ−ＭＢ−２３１（“ＭＤＡ”）及びヒトＰＣ−３前立腺細胞系に対するものである。
【００５５】
さらに、本発明の類似体には１，３−ジアミノプロパン、スペルミン、スペルミジン、及び、図３の置換基Ｒで誘導される他のポリアミンを含んでいる。プトレッシン類似体を含む、上記置換基Ｒを有する全ての直鎖ポリアミンにとって、ポリアミン骨格の両末端における誘導は必要ないが、代わりに片側の末端のみ誘導されていればよい。
【００５６】
本発明の付加的な類似体は図４に示してある。その類似体は上記の様に全て式Ｒ１−Ｘ−Ｒ２であることは容易にわかる。従って、図４の置換基“Ｒ１”及び“Ｒ２”はそれぞれ、限定するわけではないが、１，３−ジアミノプロパン、プトレッシン、スペルミジン、及び、スペルミン等のポリアミンのいずれかの誘導に代わる部分と考えてもよい。
【００５７】
本発明における他の好ましい化合物は図１１と図１２に示してある。この中で、化合物１４４１と１４３６はコアとしての直鎖ポリアミンを含んでいないことについて言及することは意味がある。また、化合物１４２９は更にポリアミンの内部炭素分子に置換基を含む。化合物１３６８、１３６７、１３６６、１３６５、１３６４、及び、１３６３は、コアとして−（ＣＨ２）−ＮＨ−を含む。それらはまた、対称ポリアミン類似体として見ることができる。特に，化合物１３６８及び１３６７は細胞毒性類似化合物の作用のメカニズムに対し、プローブとして用いることもできる。他の非対称ポリアミン類似体には化合物１３１８、１３１７、１３１６、１３１０、１３０３、１３０２、及び、１３０１を含む。
【００５８】
本発明の好ましい類似化合物には、細胞毒性特性に基づく坑ガン化学療法薬、坑ウィルス化学療法薬、坑微生物化学療法薬、坑バクテリア化学療法薬、坑寄生体化学療法薬、及び、坑菌化学療法薬として医薬的有用性のある化合物と並んで、図３、４、１１、及び、１２で例示した化合物の誘導体を含む。
【００５９】
所望の活性を有する化合物のさらなる誘導又は最適化は、本発明のポリアミン類似体及び誘導体と構造的及び機能的な比較をすることにより達成され、最適化された化合物へ他の類似体の特定の構造的要素が組み込まれる。構造的要素は、特に限定されるわけではないが、細胞毒性、代謝安定性、特異性、取扱性と投与性、結合親和力、細胞内ポリアミンプールへの非取込性、及び、副作用の減少等の機能性改善の期待に基づき選択されるであろう。
【００６０】
そのような構造的要素の導入によって変成されて得られた化合物は、例えば本明細書内で定義したポリアミン類似体と誘導体の構造の範囲内のものを含むどのようなものでもよい。言い換えると、得られた化合物は一以上の原子若しくは官能基を有していても良く、及び／又は、最適化後に一以上の原子や官能基を除去しても良く、その結果として、本明細書で定義したポリアミン類似体や誘導体の構造の範囲内でも、又、その構造の範囲を超えていてもよい。
【００６１】
ポリアミン類似体を更に改良する為に、好ましい活性を有する化合物への最適化を何度も繰り返し行なってもよい。
【００６２】
分析及び診断面での用途
本発明のポリアミン類似体と誘導体は、他の薬理学的なターゲットかも知れない細胞因子による局在化を検定するためのリポーター分子及びプローブとして使用することもできる。そのような因子としては、膜、可溶性及び不溶性タンパク質、並びに、核酸がある。
【００６３】
医薬組成物及び治療組成物と応用
本発明のポリアミン類似体と誘導体は、その医薬的に許容できる塩と同様に医薬組成物へ配合することができる。塩基性基を有する本発明の医学的に許容できる酸の塩は、塩基性アミンの存在下、従来公知の方法によって、強い若しくは適度に強い、無毒性の、有機又は無機酸を充てることによって形成される。本発明に含まれる酸の塩の具体例としてはマレイン酸塩、フマル酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、酒石酸塩、クエン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、及び、硝酸塩である。好適な塩を形成する、付け加えて例示すべき酸は、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、及び、リン酸；酢酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アルファ−ケトグルタル酸、アルファ−ケトカプロン酸、アルファ−ケトイソカプロン酸、アルファ−ケトイソ吉草酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、ケイ皮酸、サリチル酸、及び、２−フェノキシ安息香酸；並びに、メタンスルホン酸、及び、２−ヒドロキシメチルスルホン酸等のスルホン酸類等である。オルトリン酸一水素ナトリウムや硫酸水素カリウム等の酸金属塩も包含される。上述のように、本発明の化合物は、多くのどんな疾患や健康状態（最も注目すべきはガン）でも治療するために活用される細胞毒性特性を有している。本発明の組成物は、活性ｐｅｒ　ｓｅでも良く、又は、ｉｎ　ｖｉｖｏで活性な形態に変化する「プロドラッグ」でも良い。
【００６４】
本発明の化合物、及び、その医薬的に許容できる塩はカプセルや浸透オブラート剤、錠剤、又は、注射用調剤等の便利な投薬形状に組み込んでも良い。固体又は液体の医薬的に許容できる担体を使用しても良い。徐放性としてデザインされた医薬組成物を配合しても良い。
【００６５】
必要であれば、組成物には酸化防止剤や界面活性剤及び／又はグリセリドを含んでも良い。酸化防止剤の例としては、特に限定されないが、ＢＨＴ、ビタミンＥ及び／又はＣ等がある。グリセリドの例としては、特に限定されないが、アセチル化された又は無置換のモノグリセリド；油状液体中に見られるような培地連鎖（ｍｅｄｉｕｍ　ｃｈａｉｎ）トリグリセリド；及びカプリロカプロイルマクロゴル−８グリセリド等がある。
【００６６】
好ましくは、本発明の化合物は、例えば注射投与又は経口投与等のように系統的に投与するのが良い。本発明の化合物が使用される場合、注射はどのような公知の経路によるものでも良いが、好ましくは静脈注射、皮下注射、筋肉内注射、頭蓋骨内注射、又は、腹膜内注射である。注射可能薬剤は従来の形態で調剤され、溶液若しくは懸濁液、注射の前に液体中で溶液や懸濁液にするのに好適な固体状、又は、乳剤のいずれでも良い。
【００６７】
固体の担体としては、でんぷん、ラクトース、硫酸カルシウム二水和物、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、及び、ステアリン酸が含まれる。液体の担体としては、シロップ、ピーナツ油、オリーブ油、生理食塩水、水、ブドウ糖、及び、グリセリン等が含まれる。同様に、担体や希釈剤にはモノステアリン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル等の放出を遅らせるいずれかの物質を単独又はワックスと共に含有しても良い。液体の担体を用いる場合、調合剤はシロップ、エリキシル、乳剤、軟質ゼラチンカプセル、液体含有カプセル、アンプル等の無菌の注射可能な液体（例えば溶液等）、又は、水溶性若しくは非水溶性の液体懸濁液等の形態で良い。そのような医薬組成物の一覧は、例えば、レミントン製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ‘ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　Ｅａｓｔｏｎ　Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（Ｇｅｎｎａｒｏ　第１８版、１９９０））などで見ることができる。
【００６８】
医薬調剤は、錠剤として必要な混合、粒化及び圧縮等の工程、又は、成分の適切な混合、充填及び溶解を伴う製薬化学の従来の方法によって作られ、経口又は非経口投与に望ましい生成物となる。他には、局所投与、経皮投与、膣内投与、鼻腔内投与、気管支内投与、頭蓋骨内投与、眼内投与、耳内投与、及び、直腸投与のための調合剤が調合されても良い。医薬組成物は湿化剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤等の少量の無毒性助剤を含んでいても良い。
【００６９】
投与経路は系統的である方が好ましいが、医薬組成物は局所投与若しくは経皮投与（例えば軟膏、クリーム又はジェルとして）、経口投与、直腸投与（例えば坐薬として）、非経口投与（注射投与又は連続点滴投与）、膣内投与、鼻腔内投与、気管支内投与、頭蓋骨内投与、又は、眼内投与でも良い。
【００７０】
局所投与の場合、膏薬又は軟膏等の局所用賦形剤に組み込むこともできる。活性成分の担体は、噴射可能なものでも噴射ができないもののどちらでも良い。噴射ができないものとしては、局所塗布固有の担体からなり、且つ、好ましくは水よりも大きな動的粘性を有する半固体又は固体形状にすることができる。好適な配合としては、特に限定される訳ではないが、溶液、懸濁液、乳液、クリーム、軟膏、粉体、塗布剤、膏薬等がある。所望であれば、これらは助剤（例えば、防腐剤、安定剤、湿化剤、緩衝剤、又は、浸透圧に影響を与える塩等）と共に滅菌又は混合しても良い。噴射ができない局所投与用調合剤としての好ましい賦形剤としては、軟膏基剤（例えばポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）など）、従来のクリーム、ジェル、及び、石油ゼリー等である。
【００７１】
局所投与に好適なものとしては、上記の化合物が、好ましくは固体又は液体の不活性担体物質と組み合わせて、中身をしぼり出せるプラスチック容器に、又は、圧力がかかった揮発性の通常の高圧ガスとの混合物として詰められている噴射可能なエアゾール調合剤である。エアゾール調合剤は本発明の上記の化合物に加え、溶媒、緩衝剤、界面活性剤、香料、及び／又は、酸化防止剤を含んでも良い。
【００７２】
好ましい局所投与として、特に人間に対しては、ターゲットとする領域（例えば肌表面、粘膜、眼等）に対して有効量の化合物を投与することが好ましい。この有効量は、治療面積、症状の重さ、及び、使用する局所薬剤用の賦形剤の性質にもよるが、一般的には一回の塗布当たり約０．００１ｍｇから約１ｇの範囲である。
【００７３】
本発明の組成物は、疾患や健康状態を治療するのに使われる一以上の添加化合物と組み合わせて得られる。ガンを治療するために、ポリアミン類似体と誘導体は　ビンブラスチン等の有糸分裂阻害剤、シクロホスファミド等のアルキル化剤、メトトレキサート、プリトレキシム、若しくは、トリメトトレキサート等の葉酸阻害剤、５−フルオロウラシル及びシトシンアラビノシド等の坑代謝剤、アドリアマイシン及びブレオマイシン等のインターカレーション抗生物質、アスパラギナーゼ等の酵素又は酵素阻害剤、エトポシド等のトポイソメラーゼ阻害剤、又は、インターフェロン等の生体反応変成剤等の坑腫瘍剤と組み合わせて得られる。実際、本発明で開示されているポリアミン類似体及び誘導体と組み合わせる公知のガン治療剤のいずれかからなる医薬組成物は、本発明の範囲内にある。本発明の化合物は、ＤＦＭＯなどのポリアミン合成阻害剤と組み合わせて投与することもできる。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、坑バクテリア薬、坑真菌薬、坑寄生虫薬、坑ウィルス薬、坑コクシジウム剤等を含む坑感染薬等の一以上の他の薬剤を含んでも良い。
【００７５】
本発明の化合物の一回の服用量は具体的にはおおよそ１ｎｇ／ｋｇ体重からおおよそ１ｇ／ｋｇ体重の間である。一回の服用量は好ましくはおおよそ０．０１ｍｇ／ｋｇ体重からおおよそ５００ｍｇ／ｋｇ体重である。局所投与の場合は、服用量は化合物濃度がおよそ０．０１〜２０％の範囲であり、好ましくは１〜５％であることが提案される。一日あたりの全服用量は、経口投与で１〜２００ｍｇの範囲であることが好ましい。しかしながら、上記の範囲は個人の治療の摂生が大きい時には変わり得る値として提案するものであり、推奨する値からの考慮できるずれは予想でき、当業者によって型通りに行なうことができる。
【００７６】
疾患や状態を治療するための化合物の有効量又は有効服用量は、特定の疾患や状態に対して受容されているｉｎ　ｖｉｔｒｏの系やｉｎ　ｖｉｖｏの動物モデルを使って決定することができる。ガンの場合には、多くの従来から認識されているモデルが知られており、ヒトの腫瘍の幅広のスペクトルが代表的である。上記化合物は培養中の腫瘍細胞成長の阻害について、ヒト又はヒト以外の動物を起源とする数多くの腫瘍細胞系のいずれかを用いて標準の検定法でテストすることができる。動物モデル等を含むこれらのアプローチの多くは、ゲラン（Ｇｅｒａｎ），Ｒ．Ｉ．ら、「動物の腫瘍及び他の生物系に対する化学的薬品並びに天然生成物を探索するためのプロトコル（“Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ａｇｅｎｔ　ａｎｄ　Ｎａｔｕｒａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ａｎｉｍａｌ　Ｔｕｍｏｒｓ　ａｎｄ　Ｏｔｈｅｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ”）第三版」、Ｃａｎｃ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．　Ｒｅｐｏｒｔｓ，Ｐａｒｔ　３，　３：１−１１２に詳しく述べられている。
【００７７】
ここまで本発明を一般的に述べてきたが、同様のことは例示によって示される次の実施例の参照を通してより容易に理解できるであろう。しかし、この実施例は特に断りのない限り本発明を限定するものではない。
【００７８】
実施例Ｉ
プトレッシン類似体の細胞毒性
ＯＲＩ１３１３とＯＲＩ１３２７はＳＫ−ＭＥＬ−５とＭＤＡの細胞系に対して有為な細胞毒性活性を示した（図５Ａと図５ＢのＯＲＩ１３２７：−◆−、ＯＲＩ１３１３：−■−、を参照）。簡単に細胞を１ウェル当たり１５００個（ＳＫ−ＭＥＬ−５）又は５０００個（ＭＤＡ）の９６ウェルプレート中で培養し、１日間付着させた。指示した類似体を加えて、細胞を３日間培養し、細胞の成長はＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で評価した。縦軸は薬剤処理制御を行なわない状態での細胞数をａ％として表す。加えて、ＰＣ−３細胞に対する有為な活性が見られる（図４及び１１を参照）。
【００７９】
この二つの薬品は、Ｎ１，Ｎ４−ジベンジルプトレッシンに対する有効性において有為な改善を示している。ＳＫ−ＭＥＬ−５に対するＩＣ５０値はＯＲＩ１３１３、ＯＲＩ１３２７に対してそれぞれ４．１μＭと０．７１μＭであった。データはＯＲＩ１３１３とＯＲＩ１３２７がＭＤＡ乳ガン細胞に対してそれぞれ１２μＭと０．６５μＭのＩＣ５０値を有していることを示している。Ｎ１，Ｎ４−ジベンジルプトレッシンはＭＤＡ細胞に対して試験を行なったときに、１９２μＭのＩＣ５０値を示した。このように、ＯＲＩ１３１３とＯＲＩ１３２７は、ＭＤＡ細胞に対する細胞毒性活性の能力において、Ｎ１，Ｎ４−ジベンジルプトレッシンに対しそれぞれ１６倍、２９５倍の増加を示した。
【００８０】
１，３−ジメチルプロパンのＮ１，Ｎ３−ジベンジル類似体も試験され、ＭＤＡ細胞に対して２８．８μＭのＩＣ５０値を有すると測定された。
【００８１】
実施例ＩＩ
腫瘍細胞におけるポリアミン類似体の細胞毒性の時間推移
たった１時間の処理の後でさえ、ポリアミン類似化合物はＭＤＡ細胞において有為な細胞毒性を示した（図６Ａ及び６Ｂ参照）。
簡単にＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１ウェル当たり５０００個の９６ウェルプレート中で培養し、１日間付着させた。指示した類似体を加えて、細胞を図に示した様々な時間で培養した。細胞は洗浄し、新鮮な類似体を含まない培地を加えた。丸３日後、細胞の成長はＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で評価した。縦軸は薬剤処理制御を行なわない状態での細胞数をａ％として表す。
【００８２】
これらの結果は、ポリアミン類似化合物は長期のポリアミンの涸渇をする必要なしに、細胞毒性を誘導することができ、培地から薬品を除去すると、細胞の回復、又は、再成長ができないことを示している。この結果によればこれらの薬品の臨床上の使用において、重要な潜在的有用性があると思われる。ガン細胞対正常細胞に十分に高い選択性を与えることにより、比較的短い時間類似体の最低水準濃度に接触すれば、類似体の濃度維持の必要なく、腫瘍細胞死を誘導する。
従って、高い、類似体の量の高いレベルでの維持、又は、長期に渡る治療は、これらの化合物を用いた有効な坑腫瘍治療に対しては必要とされない。
【００８３】
実施例ＩＩＩ
細胞毒性ポリアミン類似化合物はアポトーシスを誘発する
細胞系の分析を、ＭＤＡ細胞で処理したポリアミン類似体において蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析を用いて実施した（図７Ａ−７Ｃ参照）。
簡単に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、ＯＲＩ１３１３又はＯＲＩ１３２７の存在下で様々な時間で成長させ、エタノールで固定し、ヨウ化プロピジウムで染色した。ＤＮＡの含有量と細胞系の段階：Ｍ１，Ｇ１；Ｍ２，Ｓ；Ｍ３，Ｇ２／Ｍ；Ｍ４，＜２Ｎ（アポトーシス細胞）を示すヒストグラムの面積を使って、細胞をＦＡＣＳで分析した。図７Ａは処理していない細胞の結果を示し、７Ｂは３２μＭのＯＲＩ１３１３で４８時間処理した結果を示しており、７Ｃは３μＭのＯＲＩ１３２７で１１時間処理した結果を示している。
【００８４】
この分析は、ＯＲＩ１３１３の処理後、高いアポトーシス画分を示し（３２μＭ、１１時間の処理で２１％：２４時間の処理で４９％及び４８時間の処理で３０％＜２Ｎ　ＤＮＡ含有量を得た）、ＯＲＩ１３２７の処理後（３μＭ、１１時間の処理で１５％＜２Ｎ　ＤＮＡ含有量を得た）、中程度のアポトーシス細胞を示した。これらのデータは、上記類似化合物が腫瘍細胞の細胞死器官を有効に誘導することを示している。
【００８５】
実施例ＩＶ
細胞毒性ポリアミン類似体はＭＤＲ腫瘍細胞に対して細胞毒性である
ＯＲＩ１３１３及びＯＲＩ１３２７の細胞の特徴づけの間、多剤耐性（ＭＤＲ）子宮肉腫細胞系ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５に対してＯＲＩ１３１３及びＯＲＩ１３２７が成長阻害活性であったことは、予想できない結果であった（図８Ａ及び８Ｂ参照）。簡単に細胞を９６ウェルプレート中で１ウェル当たり１０００個植え付け、１日間付着させた。指示した類似体を加えて、細胞を３日間培養し、細胞の成長はＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で評価した。縦軸は薬剤処理制御を行なわない状態での細胞数をａ％として表す。
【００８６】
ＭＥＳ−ＳＡ／Ｄｘ５細胞系はドキソルビシンの選択によって発生し、多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ−１）のｍＲＮＡを過剰発現した。従って、細胞は、Ｐ−グリコプロテイン（Ｐ−ｇｐ）を媒介として運ばれた薬品に対してずっと鈍感である。Ｈａｒｋｅｒ，Ｗ．Ｇら、「ヒト肉腫細胞系ＭＥＳ−ＳＡのドキソルビシン選択変異体における多剤（多面発現性の）耐性」、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８５，４５，４０９１−４０９６、を参照。親細胞系及び耐性細胞系（図８Ａ及び８Ｂ参照）に対する近似成長阻害曲線はＯＲＩ１３１３及びＯＲＩ１３２７はＰ−ｇｐ多剤輸送体のための基質ではないことを強く示している。このことは、特にＭＤＲ−１を発現したターゲット細胞が関与する状態において利点がある。
【００８７】
実施例Ｖ
細胞毒性ポリアミン類似化合物は細胞内ポリアミン量を変えない
細胞質ポリアミン量に関するポリアミン類似体の治療の効果を決定する為に、細胞内のポリアミン量を、ＯＲＩ１３１３（３２μＭ）又はＯＲＩ１３２７（３μＭ）で１１時間処理後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で測定した。これらの結果では、薬剤処理後のポリアミン量に関して有為な効果は見られなかった（図９参照）。この結果は、本分野における過去の結果と一致した。さらに、処理された細胞内のＳＳＡＴ活性の測定により、この酵素の誘導は見られなかった（データは示していない）。
【００８８】
引き続いての実験によると５０倍過剰濃度のプトレッシンでの共同処理はＯＲＩ１３１３又はＯＲＩ１３２７処理の細胞毒性効果を阻害しなかったことを示した。１ｍＭのＤＦＭＯで共同処理をしたが、ＯＲＩ１３１３又はＯＲＩ１３２７で見られた結果を変えなかった。有望なポリアミン輸送阻害剤であるＯＲＩ１２０２を使用しての治療（ＭＤＡ細胞内において、３Ｈ−スペルミジン及び３Ｈ−プトレッシンの摂取に対して、それぞれ３２±１５ｎＭ及び２９±９ｎＭのＫｉ値であり、ＤＦＭＯのようなポリアミン生合成阻害剤と組み合わせて使用する際、細胞質プトレッシン及びスペルミジンを有効に涸渇させる）もまた、ＯＲＩ１３１３又はＯＲＩ１３２７による細胞成長の阻害性を変えなかった。
【００８９】
これらのポリアミン類似体の細胞の摂取メカニズムは、その３Ｈ−プトレッシン摂取の阻害性により、さらに調査された。プトレッシンは、以前に、ＭＤＡ細胞の摂取に対し１２．４μＭのＫｍ値を有していることが示されている。ＯＲＩ１３１３は、ＭＤＡ細胞へのプトレッシン摂取に対して、２８．３μＭのＫｉａｐｐを示し、ＰＣ−３細胞への摂取に対しては２４．１μＭを示した。ＯＲＩ１３２７は、ＰＣ−３細胞へのプトレッシン摂取に対して、１４．３μＭのＫｉａｐｐを示した。これらの結果によると、ポリアミン輸送はこれらの類似体を細胞内への摂取する形態として可能性があることを示している。それにもかかわらず、５０倍過剰プトレッシンの共同処理、ポリアミン生合成阻害剤ＤＭＦＯ（以前に、ポリアミン輸送体を媒介としてポリアミン類似化合物の摂取を刺激することが示されている）での共同処理、及び、効力のあるポリアミン輸送阻害剤ＯＲＩ１２０２での共同処理は全て、類似体の効果を変成できないため、二者択一の摂取メカニズムによって、類似体は、細胞の中に入ることができるということがわかる。
【００９０】
腫瘍細胞は、ポリアミンに対して大きな要求があり、この大きな要求は、ポリアミンの摂取及び生合成の増加によって満たされることは確立しているので（Ｈｅｓｔｏｎ，Ｗ．Ｄ．Ｗ．ら、「マウスの前立腺由来の腫瘍によるＣ−１４で標識づけされたポリアミン及びメチルグリオキサル ビス（グアニルヒドラゾン）のｉｎ　ｖｉｖｏ摂取に関するアルファ−ジフルオロメチルオルニチンの特異な効果」、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．１９８４，４４，１０３４−１０４０；Ｍｉｎｃｈｉｎ，Ｒ．Ｆ．ら、「パラコートはポリアミン輸送システムによってはＢ１６腫瘍細胞には蓄積しない」、Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ，１９８９，４５，６３−６９；ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，Ｓ．Ａ．ら、「大腸ガン細胞によるプトレッシンの摂取と放出」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１９８９，２５６，Ｇ８６８−Ｇ８７７；及び、Ｄａｖｅ，Ｃ．ら、「培養された白血病Ｌ１２１０細胞内でのメチルグリオキサール　ビス（グアニルヒドラゾン）の細胞毒性のメカニズムについての検討」、Ａｄｖ．Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ　Ｒｅｓ．１９７８，１，１５３−１７１）、ＯＲＩ１３１３及びＯＲＩ１３２７のポリアミン類似体の性質は、腫瘍細胞に選択的に蓄積される。
Ｂｙｅｒｓとその共同研究者は、抗マラリア性の性質を持つ一連のベンジル化されたスペルミン類似体の摂取は、ポリアミン輸送システムとは別のものであることを示した（Ｂｙｅｒｓ，Ｔ．Ｌ．ら、「ビス（ベンジル）ポリアミン類似体は、ポリアミン輸送システムとは別のものである哺乳動物細胞輸送システムのための基質である」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１９９０，２６９，３５−４０を参照）。
【００９１】
実施例ＶＩ
ポリアミン類似体細胞毒性へのカスパーゼ−３の関与
ＯＲＩ１３１３の作用におけるプロ−アポトティック　カスパーゼ−３酵素の関与は、図１０で表現された実験で示されている。簡単にＰＣ−３細胞を９６ウェルプレート中で１ウェル当たり１０００個植えつけ、１日間付着させた。１０μＭのＯＲＩ１３１３及び０、５、又は、１５μＭのカスパーゼ阻害剤であるＺ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋを加えて、３日間細胞を培養した。細胞の成長はＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で評価した。縦軸は薬剤処理制御を行なわない状態での細胞数をａ％として表す。
【００９２】
１０μＭのＯＲＩ１３１３のみの処理は、ＰＣ−３前立腺ガン細胞の成長を４６％阻害した。細胞を１０μＭのＯＲＩ１３１３及び５もしくは１５μＭのカスパーゼ阻害剤Ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋと一緒に処理したとき、成長阻害は、それぞれ１９％及び１０％まで減少した。
このことは、カスパーゼ酵素の阻害は、ＯＲＩ１３１３の細胞毒性を減少させることを示し、このような酵素はＯＲＩ１３１３の細胞毒性メカニズムの中で役割を果たすことを示す。
【００９３】
別の実験において、カスパーゼ−３プロテアーゼ活性を、ＯＲＩ１３１３（３０μＭ）及びＯＲＩ１３２７（２μＭ）で１４時間処理したＰＣ−３細胞において実験で測定した。ドキソルビシン（５μＭ）は陽性の対照として使用した。クローンテックラボラトリーズのＡｐｏＡｌｅｒｔ　カスパーセ−３アッセイキットは蛋白質分解活性の測定に使用した。処理していない対照細胞は、１０．２±０．３ｕｎｉｔ／２×１０６セルのカスパーゼ−３活性と測定された。ドキソルビシンで処理された細胞は１３．５±０．２ｕｎｉｔ／２×１０６セルの活性を示した。ＯＲＩ１３１３及びＯＲＩ１３２７は、１２．７±１．２ｕｎｉｔ／２×１０６セル及び１１．６±０．８ｕｎｉｔ／２×１０６の活性を示した。これらの結果によってＯＲＩ１３１３又はＯＲＩ１３２７による処理後のＰＣ−３細胞内カスパーゼ−３活性の活性化が確認された。ポリアミン類似体濃度と処理時間を変えると、カスパーセ活性がドキソルビシンに見られたものよりも更に増大した。
【００９４】
理論に縛られなければ、本発明のポリアミン類似体は、ミトコンドリア透過性転移に効果を有し、内側のミトコンドリア細胞膜に影響を及ぼしてシトクロムｃの解放を誘導することによって。アポトーシスメ機構に加わっている可能性がある。このことは、ミトコンドリア透過性転移におけるポリアミンの効果についての最近の報告書との比較を基にしている。もし、本発明のポリアミン類似体がこのようなメカニズムを介して機能するとすれば、他のポリアミン細胞毒性剤と比較して、独特の作用機構を示す。この機構を実験的に確認するには以下の様な方法が利用できる。
１）ＨＰＬＣ分析を使用した上記薬剤の細胞内摂取及び局在化の測定
２）光分散法を使用した、分離されたミトコンドリアのミトコンドリア透過性転移の測定
３）分離したミトコンドリア及び全細胞からのシトクロムｃの放出のウエスタンブロット分析
４）上記薬剤を用いての、アポトーシスへのステップの誘導の流れとタイミングの調査及び通常のアポトーシス誘導剤との比較
これらの実験は、よく確立された文献の手順に基づいており、不当な実験を必要としない。
【００９５】
実施例ＶＩＩ
ポリアミン類似化合物１３１３及び１３２７によるメラノーマ細胞の選択性
ＯＲＩ１３１３及びＯＲＩ１３２７は６０細胞系スクリーンを用いて国立ガン研究所（ＮＣＩ）において評価された。
ＯＲＩ１３１３において、試験された８つのメラノーマ細胞系のうち６つに対して、驚くべき効果が見られ、それは、メラノーマ異種移植動物モデルにおいてＮ１，Ｎ４−ジベンジルプトレッシンを用いた前結果と一致し、（Ｆｒｙｄｍａｎらを参照）少なくともメラノーマ細胞系に対して、劇的な選択性を示した。
本発明者らによって決定されたＩＣ５０値とＮＣＩの比較により、これらのデータが確認される。ＯＲＩ１３１３：ＭＤＡ細胞中１２対２．３μＭ，ＰＣ−３細胞中、２０対１１．２μＭ；ＯＲＩ１３２７：ＭＤＡ細胞中、０．６５対０．００５μＭ，ＰＣ−３細胞中、０．６５対０．８１μＭ
【００９６】
実施例ＶＩＩＩ
ポリアミン類似化合物の溶解度及びｉｎ　ｖｉｔｒｏでの毒性
ＯＲＩ１３１３の二塩酸塩は５％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に少なくとも４０ｍＭ溶解する。ＯＲＩ１３２７はより限られた水への溶解度しか示さない。ＯＲＩ１３２７の乳酸塩の最大溶解度は、５ｍＭである。二塩酸塩はより溶解性が低い。ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（水中で４５％ｗ／ｖＨβＣ）を使用することで、かなり溶解度は向上する。ＯＲＩ１３２７の４０ｍＭ溶液はこのように作られた。
【００９７】
マウスの薬剤治療に対する耐性をＯＲＩ１３１３及びＯＲＩ１３２７で評価した。ＯＲＩ１３１３又はＯＲＩ１３２７の腹膜内（ｉ．ｐ．）注射を一回行なった後の急性毒性はＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて評価された。ＯＲＩ１３１３は９３ｍｇ／ｋｇでは許容された。１８６ｍｇ／ｋｇを動物に投与すると死に至った（マウスは嗜眠状態になり、死ぬ前には毛が逆立った）。ＯＲＩ１３２７は３７ｍｇ／ｋｇでは許容され、７５ｍｇ／ｋｇの投与量で動物は死に至った。慢性の毒性は１日１回連続５日間腹膜内注射を実施し、評価した。ＯＲＩ１３１３及びＯＲＩ１３２７はそれぞれ４０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇでは許容された。致死量はそれぞれ８０及び３０ｍｇ／ｋｇであった。前述のｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験と比較して、これらのデータは上記の化合物の潜在的に効き目のある投与量はマウスでは許容されることを示している。５日間１日１回の腹膜内注射を実施する際のおおよその最大許容量は、ＯＲＩ１３１３では４０ｍｇ／ｋｇで、ＯＲＩ１３２７は７．５ｍｇ／ｋｇである。
【００９８】
実施例ＩＸ
毛の無いマウスにおけるヒト腫瘍異種移植片に対する類似体の細胞毒性
ＢＡＬＢ／ｃの毛のないマウスでメラノーマ腫瘍異種移植腫瘍モデルにおいてＯＲＩを試験した。
ＮＣＩの６０細胞系試験の内の、この系に対する類似体による良好な活性、及び、この細胞系（ＯＲＩ１３１３，４．１μＭ）に対する低いＩＣ５０値により、Ａ３７５ヒトメラノーマ細胞系を選択した。異種移植の効果の検討は、２種の薬剤濃度で実施した。１０匹のマウスのグループを４グループつくった。治療グループには、類似体をそれぞれ最大許容量（ＭＴＤ）もしくは、最大許容量の１／２を与えた。
５％のブドウ糖を与えられた陰性対照グループと比較すると、ＯＲＩ１３１３はＡ３７５メラノーマの成長を阻害し、２５日間で３６％の成長阻害と、６．２日の腫瘍成長の遅れが見られた（図１３を参照）。
その薬剤は７週間まで許容された。７週間の治療後、一過性の皮膚潰瘍及び体重の減少が見られた。ダカルバジンＤＴＩＣ（腹膜内注射で１日１回５日間１８０ｍｇ／ｋｇを投与）で治療された陽性の対照グループはこの腫瘍モデルシステムを確認するために使用した。
【００９９】
重さ２０グラムの雌のＢＡＬＢ／ｃ　ｎｕ／ｎｕ無胸腺マウスをヒト異種移植片の宿主動物とした。投与方法は、検討期間中１日１回、９ｍＭ又は４ｍＭのＯＲＩ１３１３の腹膜内注射であった（対照腫瘍が２０００ｍｇに達した時を終点とした）。デリバリーの形態と投薬スケジュールは、一般的な方法によって更に最適化した。
ＤＩＴＣは、腹膜内注射により１日１回５日間投与された。治療は、腫瘍が５ｍｍ×５ｍｍの大きさ（５０ｍｇ）になった時に開始した。マウスの体重及び腫瘍のサイズを１週間に２回測定した。
カリパスによる腫瘍の測定値は式Ｌ２×Ｗ／２によってｍｇ腫瘍体積に換算した。一旦対照腫瘍が２０００ｍｇに達すると、対照及び治療グループのマウスを測定し、犠牲にして、腫瘍を取り除いた。次に、次式：
％成長阻害＝（平均治療腫瘍の重さ／平均対照腫瘍の重さ×１００）−１００
を使用して、それぞれの類似体によるパーセント成長阻害を計算するために実際の腫瘍の重さを使用した。
【０１００】
ここに引用した全ての関連事項は、以前に具体的に挿入されたか否かに関わらず、全てをここに記載した参照によって挿入される。本文中で使用されている用語“ａ”、“ａｎ”及び“ａｎｙ”はそれぞれ単数形及び複数形を含むものことを意図している。
【０１０１】
本発明をこれまでに完全に記載したが、当業者によって同様の実験が、本発明の真意及び範囲から外れない広範囲の等量パラメーター、濃度、状態で、また不当な実験を含むことなく、行われることは感謝するであろう。
【０１０２】
本発明を、その具体的な実施例と関連づけて述べてきたが、更なる改良が可能であることは理解されるであろう。本願は、一般的に本発明の原則に従い、且つ、本発明に付属している従来技術内の公知又は通例の方法のようなもの、及び、これまでに詳しく述べてきたような本質的な特性に応用できるような本開示から外れているものも含むことによって本発明の全てのバリエーション、用途、適応性を含むことを意図するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは本発明の範囲におけるポリアミン類似体の製造のための反応スキームを示す。
【図２】図１Ｂは一置換及び非対称二置換の類似体を示す。
【図３】図２はＯｒｉ１３１３及びＯｒｉ１３２７のポリアミン類似体の構造を示す。
【図４】図３は本発明の好ましいポリアミンの類似体を含む表であり、類似体の一般構造は表の上に示してある。これには類似体（又は“Ｏｒｉ”）１３１３及び１３２７も含まれる。示されている全ての構造は、特に記載の内限り、プトレッシン（１，４−ジアミノブタン）由来である。
【図５】図３は本発明の好ましいポリアミンの類似体を含む表であり、類似体の一般構造は表の上に示してある。これには類似体（又は“Ｏｒｉ”）１３１３及び１３２７も含まれる。示されている全ての構造は、特に記載の内限り、プトレッシン（１，４−ジアミノブタン）由来である。
【図６】図３は本発明の好ましいポリアミンの類似体を含む表であり、類似体の一般構造は表の上に示してある。これには類似体（又は“Ｏｒｉ”）１３１３及び１３２７も含まれる。示されている全ての構造は、特に記載の内限り、プトレッシン（１，４−ジアミノブタン）由来である。
【図７】図４は本発明の付加的なポリアミン類似体を含む表である。
【図８】図４は本発明の付加的なポリアミン類似体を含む表である。
【図９】図４は本発明の付加的なポリアミン類似体を含む表である。
【図１０】図５Ａと図５Ｂは腫瘍細胞系に対するＯＲＩ１３１３（―■―）とＯＲＩ１３２７（−◆−）の細胞毒性を示す（実施例１を参照）。
【図１１】図６Ａと図６ＢはＯＲＩ１３１３とＯＲＩ１３２７の細胞毒性の時間推移である。
【図１２】図７Ａから７Ｃはポリアミン類似体のＯＲＩ１３１３とＯＲＩ１３２７によるアポトーシスの誘導を示す。
【図１３】図８Ａと図８Ｂはポリアミン類似体ＯＲＩ１３１３とＯＲＩ１３２７による、ＭＤＲ−１を発現する腫瘍に対する細胞毒性を示す。
【図１４】図９はポリアミン類似体ＯＲＩ１３１３とＯＲＩ１３２７は細胞ポリアミン濃度を変えないことを示す。
【図１５】図１０はポリアミン類似体ＯＲＩ１３１３の細胞毒性はカスパーゼ−３が関与することを示す（実施例ＶＩ参照）。
【図１６】図１１はハロゲン化された類似体を含む本発明のポリアミン類似体を記載した表である。
【図１７】図１１はハロゲン化された類似体を含む本発明のポリアミン類似体を記載した表である。
【図１８】図１１はハロゲン化された類似体を含む本発明のポリアミン類似体を記載した表である。
【図１９】図１１はハロゲン化された類似体を含む本発明のポリアミン類似体を記載した表である。
【図２０】図１１はハロゲン化された類似体を含む本発明のポリアミン類似体を記載した表である。
【図２１】図１１はハロゲン化された類似体を含む本発明のポリアミン類似体を記載した表である。
【図２２】図１１はハロゲン化された類似体を含む本発明のポリアミン類似体を記載した表である。
【図２３】図１１はハロゲン化された類似体を含む本発明のポリアミン類似体を記載した表である。
【図２４】図１１はハロゲン化された類似体を含む本発明のポリアミン類似体を記載した表である。
【図２５】図１１はハロゲン化された類似体を含む本発明のポリアミン類似体を記載した表である。
【図２６】図１２はハロゲン化された類似体を含む本発明の付加的な対称ポリアミン類似体を記載した表である。
【図２７】図１３はＯＲＩ１３１３で処理したマウス中のＡ３７５ヒトメラノーマ異種移植片における腫瘍成長の阻害を例示したグラフである（実施例ＩＸを参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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