(57)【要約】本発明は、ノルジヒドログアヤレティク酸（ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体の使用、特に、腫瘍およびウイルス感染の処置のために、天然に存在するアミノ酸の置換物を含む誘導体の使用に関する。動物、特に、哺乳動物、そして最も特に、ヒトの癌性腫瘍および非癌性腫瘍の処置における使用のための、化合物および組成物を提供することが、本発明の一つの目的である。本発明のこの局面に従って、腫瘍の増殖を阻害する、新規なノルジヒドログアヤレティク酸誘導体が提供される。ノルジヒドログアヤレティク酸誘導体は、式（Ｉ）の化合物であって、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、−ＯＨ、ＯＣＨ３、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、またはアミノ酸残基を表すが、各々は、同時に−ＯＨではない化合物である。
2004534025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物の細胞周期におけるサービビンの生成を阻害する方法であって、該方法は、有効量の以下の式の化合物：
【化１】
2004534025.tif 000017
を投与する工程を包含し、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、−ＯＨ、ＯＣＨ３、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、またはアミノ酸残基を表すが、各々は、同時に−ＯＨではない、方法。
【請求項２】
前記細胞が動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞がヒト細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項５】
ＣＤＣ−２およびサービビンを発現する細胞においてアポトーシスを刺激する方法であって、該方法は、有効量の以下の式の化合物：
【化２】
2004534025.tif 000018
を投与する工程を包含し、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、−ＯＨ、ＯＣＨ３、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、またはアミノ酸残基を表すが、各々は、同時に−ＯＨではない、方法。
【請求項６】
前記細胞が動物細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞がヒト細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍を処置するための方法であって、該方法は、有効量の以下の式の化合物：
【化３】
2004534025.tif 000019
の適用を包含し、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、−ＯＨ、ＯＣＨ３、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、またはアミノ酸残基を表すが、各々は、同時に−ＯＨではない、方法。
【請求項１０】
前記腫瘍が哺乳動物中に存在する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍が悪性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍が良性である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍が、乳頭腫、奇形腫および腺腫からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍が形質転換された細胞から誘導される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞がＣ３細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記化合物が、少なくとも１種の薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアとともに投与される、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記賦形剤またはキャリアがジメチルスルホキシドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記誘導体が、テトラ−Ｏ−メチルノルジヒドログアヤレティク酸、またはテトラグリシニルノルジヒドログアヤレティク酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
テトラグリシニルノルジヒドログアヤレティク酸が、少なくとも１つの薬学的に受容可能な賦形剤またはキャリアとともに投与される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中に記載され、そして特許請求される発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＧｒａｎｔ  Ｎｏ．ＡＩ  ３２３０１およびＵ．Ｓ．  Ａｒｍｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒａｎｔ  ＤＡＭＤ  １７−９３−Ｃ３１２２からの財源により一部なされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
（１．発明の分野）
本発明は、ノルジヒドログアヤレティク酸（ｎｏｒｄｉｈｙｄｒｏｇｕａｉａｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）誘導体の使用、特に、腫瘍およびウイルス感染の処置のために、天然に存在するアミノ酸の置換物を含む誘導体の使用に関する。
【０００３】
（２．背景情報）
発癌は、種々の遺伝的因子および後成的因子によって影響される多段階事象であり、そして異なる組織から生じる未制御細胞増殖の発生によって代表される。抗癌研究のための普遍的な目的は、腫瘍増殖の減縮、宿主に対する非毒性に高度に効率的であり、そしてほとんどの患者のために提供可能である、臨床的処置の開発にある。分裂した細胞に対して特有である標的の阻害に焦点を当てた薬物は、実質的な副作用の危険性のない効率的な化学療法剤であるべきである。
【０００４】
細胞が細胞周期を通じて進行する場合、細胞は、多くのチェックポイントを通過する。これらのチェックポイントの各々を通過させるために、特定の基準を満たさなければならない。Ｇ２／Ｍ移行において、ほとんどの本質的なレギュレーターは、サイクリン依存性キナーゼＣＤＣ２である。このキナーゼは、調節性タンパク質サイクリンＢに密に結合し、そして成熟促進因子（ＭＰＦ）とも呼ばれるこの複合体は、細胞が初期前期に入ることを導く種々の事象を刺激することを担う（１）。驚くことではないが、ＭＰＦのいずれかの成分の損失または不活化は、Ｇ２以外の細胞の進行をブロックする。
【０００５】
ＭＰＦの発現および活性は、異なるレベルで調節される。サイクリンＢのタンパク質のレベルは、細胞サイクルのＧ１期およびＳ期を通じてゆっくりと上昇し、Ｇ２期からＭ期への移行の間にピークに達し、そして有糸分裂の間に急激に降下する（２）。一方、このＣＤＣ２タンパク質は、細胞サイクルの間に常に存在するが、そのレベルは、Ｇ２期の最終段階においてわずかに上昇する（３）。タンパク質の活性は、適切なサイクリンとの会合、およびホスファターゼＣＤＣ２５Ｃによる抑制部位のその脱リン酸化に依存する（４，５）。この脱リン酸化の不全は、放射または化学作用によるＤＮＡ損傷に応答してＧ２の停止を開始する。最近の証拠により、任意の残存する活性ＣＤＣ２が、ＤＮＡを損傷後に、核の外側に輸送されることも示唆されている（６）。
【０００６】
多数の天然に存在する植物リグナンノルジヒドログアヤレティク酸（ＮＤＧＡ）誘導体は、ウイルス転写の阻害を介してウイルスの複製をブロックすることが示されている。この初期の研究は、ＮＤＧＡ誘導体（Ｌａｒｒｅａ  Ｔｒｉｄｅｎｔａｔａから元々単離され、続いて化学的に合成される）は、それらのＳｐ１依存性プロモーターの脱活性による、ＨＩＶ（７，８）、ＨＳＶ（９）およびＨＰＶ転写（１０）の産生を阻害し得る。予想外に、これらの誘導体の一つ（テトラ−Ｏ−メチルＮＤＧＡ）はまた、哺乳動物の細胞株における細胞周期の停止を誘導するようである。本明細書の以下に示される証拠は、Ｍ４Ｎが、毒性が検出されることなく、哺乳動物細胞中でＧ２停止を誘導し得ることを実証し、そしてこの停止が、サイクリン依存性キナーゼＣＤＣ２の阻害に起因するという見方を支持する。
【０００７】
ヒト乳頭腫ウイルス属（ＨＰＶ）感染は、多くの型の扁平上皮細胞において未調節の細胞増殖を生じさせ、良性のパリオマエ（ｐａｌｌｉｌｏｍａｅ）癌（いぼ）から子宮頚癌、陰茎癌および口腔癌までの範囲の苦痛を生じる。これらの癌とＨＰＶとの強力な会合および感染の広範な発生は、抗ＨＰＶ治療の開発の重要性を示す。
【０００８】
全てではないが、これらの複製活性変異体を含むほとんどのウイルスは、宿主依存性である。これらは、ウイルス増殖を支持するための特定の細胞因子の関与を必要とする。宿主細胞因子（ウイルスタンパク質ではない）は、変異圧力下にはなく、一般的に構造的に不変である。従って、ウイルスのライフサイクルの異なる段階において、これらの細胞因子の利用をブロックする化合物は、変異不感受性抗ウイルス薬物として良好な候補物であるようである。ＨＩＶ−１の阻害に対する代替の標的として細胞因子を使用する種々の研究が、概説されている（１１）。
【０００９】
本出願人は、Ｃｒｅｏｓｏｔｅブッシュ（Ｌａｒｒｅａ  ｔｒｉｄｅｎｔａｔａ）から単離された３’−０−メチル化ＮＤＧＡ（すなわち、Ｍａｌ．４）が、ヒト細胞培養物中の、基礎のＨＩＶ転写、Ｔａｔ−調節トランス活性化、およびＨＩＶ複製を特異的にブロックし得ることを、以前に報告している（８、１２、１３）。Ｍａｌ．４は、転写因子Ｓｐ１のＨＩＶプロウイルステンプレートのプロモーターへの結合に干渉することによって、その影響を及ぼす。Ｍａｌ．４の標的を、ヌクレオチド−８７〜−４０、ＨＩＶ長末端リピート（ＬＴＲ）のＳｐ１結合部位にマッピングする。未改変ＮＤＧＡは、インビトロで、ＨＩＶ転写を阻害せず、そしてＳｐ１結合上において影響を有さない（８）。
【００１０】
しかし、植物リグナンの単離および精製は、労働集約的であり、コストがかかる。ヒトにおけるＳｐ１により調節されたウイルスおよび腫瘍増殖の制御において、植物リグナンの可能な臨床学的使用を見越して、９種の異なるメチル化ＮＤＧＡ活性体を、親基質として非メチル化ＮＤＧＡを化学的に使用して、低いコストで大量に合成した（７）。３０μＭ未満の薬物濃度において、テトラ−Ｏ−メチルＮＤＧＡは、Ｓｐ１により調節されたプロウイルス転写およびトランス活性化の阻害を介した複製ＨＩＶの制御において最も有効であることが見出された（７）。この研究は、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）の増殖の制御に拡大されて以来である（９）。単純疱疹最初期（ＩＥ）ＩＣＰ４遺伝子は、ＨＳＶ複製のために必要不可欠である（１４）。そのプロモーター領域は、８つのＳｐ１コンセンサス結合部位（１５）を有し、それらの５つは、ＩＣＰ４遺伝子発現のために必要とされる。従って、ＩＣＰ４遺伝子は、このような試験のための良好な候補物となる。本出願人は、３−Ｏ−メチルＮＤＧＡ（Ｍａｌ．４）とテトラ−Ｏ−メチルＮＤＧＡ（Ｍ４Ｎ）との両方が、電気泳動移動シフトアッセイによって示されるように、ＩＣＰ４プロモーターに結合するＳｐ１タンパク質のブロッキングを介した、Ｖｅｒｏ細胞中でのＨＳＶ  ＩＣＰ４遺伝子発現のための効率的な転写インヒビターであることを見出した（９）。
【００１１】
Ｍ４ＮおよびＭａｌ．４の抗ＨＳＶ活性を試験して、そして感染されたＶｅｒｏ細胞中のアシクログアノシン（アシクロビル、ＡＣＶ）の活性と比較したとき、本出願人は、ＨＳＶ−１の１０回の継代およびＨＳＶ−２の４回の継代に関して、より高い薬物濃度の必要性のための明確な上昇傾向なしに、Ｍ４ＮのＩＣ５０が、１１．７μＭと４μＭとの間で変化することを観察した。しかし、ＡＣＶのＩＣ５０は、７μＭ（１回目のウイルス継代）〜４４４μＭ（ＨＳＶ−１の１０回目の継代）、そして８８μＭを超える（ＨＳＶ−２の４回目の継代）まで増加し、Ｖｅｒｏ細胞におけるＡＣＶに対する薬物耐性の迅速な構築を示した。結果として、選択インデックスＳ．Ｉ．（ＴＣ５０／ＩＣ５０）は、Ｍ４Ｎに対して比較的安定なままであるが、ＡＣＶに関するＳ．Ｉ．は、６０倍落ちて、続いてウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞中で継代される（９）。従って、Ｍ４Ｎは、変異非感受性薬物である。このＭ４Ｎは、ＡＣＶ耐性ＨＳＶを効率的に阻害し得る（９）。
【００１２】
Ｓｐ１が重要な細胞転写因子であるという事実（１６）に起因して、Ｓｐ１により制御された細胞遺伝子の発現における化合物のこのクラスの可能な阻害効果が、取り組まれるべきである。一旦、Ｍａｌ．４が、この結合部位に安定に結合されると、Ｍａｌ．４は、Ｓｐ１を置換し得ない（８）。従って、ＮＤＧＡ誘導体は、静止細胞中のＳｐ１により調節されたハウスキーピング遺伝子の発現よりも、増殖細胞中でのＳｐ−１により調節された遺伝子においてより効果を有するようであった。前者の場合、この薬物は、ＤＮＡ合成の間に、遺伝子プロモーターのＳｐ１部位に対してＳｐ１タンパク質と競合し得るが、後者の場合、この薬物は、ハウスキーピング遺伝子の転写クロマチン上において、それらのプロモーターに既に安定に結合したＳｐ１タンパク質とほとんど影響を有し得ない。実際に、このことは、この場合に示されている。以下に示されるように、９６００発現遺伝子を用いた遺伝子アレイ研究を使用することによって、本出願人は、ほとんどのＳｐ１によって調節された遺伝子の産物が、類似レベルのままであり、そして培養物中での子宮頚癌細胞Ｃ３の薬物処理によって影響されないことを見出した（図５）。それでさえ、Ｍ４Ｎの比較的低い選択インデックスは、この薬物が全身に使用されなければならない場合、最も低い有効濃度まで、その使用が確実に制限される。一方、ヒトの乳頭腫ウイルスは、最初に、ＨＰＶ  Ｅ６Ｅ７遺伝子のＳｐ１により調節された発現を介して、固形の子宮頚腫瘍および経口腫瘍を誘導する（１７）。本出願人は、薬物がインサイチュで送達され得、そして腫瘍領域のみで保持され得る場合、高濃度の薬物を使用して、患者にほとんど損傷なしで、腫瘍を効率的に破壊し得ると判断した。
【００１３】
サービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）は、正常な成人のヒト組織中ではなく、多くのヒトの癌において大量に発現されるアポトーシスのインヒビターであり（３５）、そして細胞死／細胞の生存の最終のエフェクター期の可能なモジュレーターと考えられる（３６）。サービビンは、細胞周期依存性様式においてＧ２−Ｍにおいて発現され、紡錘体の微小管に直接結合する。Ｔｈｒ３４上のサービビンのリン酸化は、細胞分裂（３７）において細胞の生存度を維持するために必要とされ得るようであり（３７）、そしてリン酸化−不完全サービビン変異体の発現により、数種のヒト黒色腫細胞株におけるアポトーシスを引き起こすことが示されている（３８）。リン酸化サービビンは、カスパーゼ経路上で作用し、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−９の形成を抑制し、これによってアポトーシスを阻害する（参考文献３９、第１０頁には、アポトーシスシグナル伝達経路の概略が示されている）。従って、サービビンの発現を減少させる化合物が、アポトーシスおよび細胞死の割合を増加させると予想される。ＣＤＣ−２は、サービビンのリン酸化のために必要とされることが示されている（３７）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、動物、特に、哺乳動物、そして最も特に、ヒトの癌性腫瘍および非癌性腫瘍の処置における使用のための、化合物および組成物を提供することが、本発明の一つの目的である。本発明のこの局面に従って、腫瘍の増殖を阻害する、新規なノルジヒドログアヤレティク酸誘導体が提供される。
【００１５】
ノルジヒドログアヤレティク酸誘導体は、以下の構造の化合物：
【００１６】
【化４】
2004534025.tif 000003
を意味し、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、−ＯＨ、−ＯＣＨ３、−Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ３、またはアミノ酸残基を表すが、各々は、同時に−ＯＨではない。アミノ酸置換基は、特に、以下を含むことが意図される：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパルテート、システイン、グルタメート、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、５−ヒドロキシリジン、４−ヒドロキシプロリン、チロキシン、３−メチルヒスチジン、ε−Ｎ−メチルリジン、ε−Ｎ、Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、アミノアジピン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン、Ｎ−メチルアルギニン、およびＮ−アセチルリジン。
【００１７】
本発明に従う使用のための特に好ましい化合物は、Ｍ４ＮおよびＧ４Ｎであり、これらは、図１に示される。
【００１８】
これらの新規の誘導体の使用によって、および当該分野で公知だが、腫瘍の処置のために以前に使用されたことがない類似の誘導体によって、癌性腫瘍および非癌性腫瘍を処置するための方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。この方法は、サイクリン依存性キナーゼＣＤＣ２を含む、迅速に増殖する細胞型に対して、特に有用である。真核生物、特に、動物の細胞、より特に、哺乳動物の細胞、および最も特に、ヒトの細胞の細胞周期において、ＣＤＣ２を阻害する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００１９】
処置されるべき腫瘍としては、本発明の方法に従って使用される上記の化合物に感受性である任意の腫瘍が挙げられる。特に、これには、サイクリン依存性キナーゼＣＤＣ２サイクルの阻害に対して感受性である、迅速に分裂する癌性腫瘍および良性腫瘍が挙げられる。
【００２０】
用語「癌性腫瘍」とは、転移を受けても受けなくてもよい任意の悪性腫瘍を含むことが意図される。用語「非癌性腫瘍」とは、任意の良性腫瘍を含むことが意図される。これらの当業者によって通常理解されるような用語が、使用される。
【００２１】
本発明の組成物および方法によって処置され得る、良性腫瘍および悪性腫瘍の例は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｒａｙｍｏｎｄ  Ｗ．Ｒｕｄｄｏｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ，１９９５（本明細書中で参考として援用される））の表１−１に見出され得る。処置される腫瘍としては、ウイルス起源である公知の腫瘍、およびウイルス起源でない腫瘍が挙げられる。本発明の組成物および方法は、固形腫瘍の処置において特に有用であることが期待される。
【００２２】
サイクリン依存性キナーゼＣＤＣ２サイクルを阻害する方法を提供することが、本発明のなお別の目的である。この方法は、細胞の増殖、特に迅速に分裂する細胞型の増殖を阻害するのに有用である。
【００２３】
好ましい実施形態において、本明細書中に記載される化合物および組成物は、ＨＰＶ誘導腫瘍の処置において使用される。ＨＰＶ誘導腫瘍としては、特に、ＨＰＶ感染に関連する、子宮頚（ｃｅｒｖｉｃａｌ）癌、経口癌、陰茎癌、頭部癌および頚部（ｎｅｃｋ）癌が挙げられるが、これらに限定されない。この方法は、癌性および非癌性のＨＰＶ誘導腫瘍に対する、ノルジヒドログアヤレティク酸誘導体、特に、テトラ−Ｏ−メチルノルジヒドログアヤレティク酸（Ｍ４Ｎ）およびテトラグリシナルノルジヒドログアヤレティク酸（Ｇ４Ｎ）の局所適用が挙げられる。
【００２４】
アミノ酸置換基を含む式Ｉの化合物の投与によって、ウイルスの複製および増殖を阻害する方法を提供することが、本発明のなお別の目的である。この方法における使用のために、アミノ酸置換基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が同一である化合物が、好ましい。
【００２５】
サービビンを発現する細胞、特に癌細胞中で、真核細胞周期におけるサービビンの生成を阻害する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。本発明者らは、本発明のノルジヒドログアヤレティク酸誘導体がサービビンｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを下方制御し、ＣＤＣ−２経路とカスパーゼ経路との両方を活性化し、これによって、サービビンが発現される細胞集団におけるアポトーシスのレベルを増加させることを見出した。この方法は、サービビンの発現を抑制または排除し、これによってアポトーシスの速度を増大させることによって、サービビンが発現される、腫瘍の処置を提供する。
【００２６】
Ｍ４Ｎ、Ｇ４Ｎおよび他の誘導体が、一般的に薬学的に受容可能な希釈剤、賦形剤およびキャリアと共に、腫瘍への局部注射により投与されることが企図される。好ましい実施形態において、Ｍ４Ｎは、ＤＭＳＯ溶液の形態で腫瘍に注射され、そしてＧ４Ｎは、ＰＢＳ溶液で投与される。Ｇ４Ｎの使用は、特に大きな腫瘍（＞２ｃｍ３）において、Ｍ４Ｎの使用を補い、その水溶性に起因して、腫瘍のより広い領域に広がることを可能にする。他の水溶性ノルジヒドログアヤレティク酸誘導体および水に不溶性のノルジヒドログアヤレティク酸誘導体は、本発明に従って、同様に使用され得る。当該分野で公知であり、かつ使用されるように、これらはまた、全身送達のための脂質ベースの処方物において使用され得る。
【００２７】
薬学的に受容可能な希釈剤、賦形剤およびキャリアとは、Ｍ４Ｎ、Ｇ４Ｎおよび他の誘導体と適合性であり、かつ本発明に従うヒトまたは他の哺乳動物への局部投与に適切であると当業者に理解されるような化合物を意味する。本明細書以下の実施例は、局部注射による投与を記載するが、他の局部投与手段（例えば、局所適用または腫瘍部位への標的化された送達）もまた使用され得る。
【００２８】
所望の処置効果を得るために投与される化合物の量は、変動するが、当業者により容易に決定され得る。投薬量、投与の頻度および処置の長さは、状況、主に腫瘍の大きさおよび型に依存する。しかし、毎日から毎週の間隔またはより少ない頻度で、Ｍ４Ｎ単独かまたは同様の量のＧ４Ｎと共に腫瘍重量１グラムあたり１０ｍｇ〜２０ｍｇの投薬量は、例示の目的で記述され得る。単独かまたはＧ４Ｎと組み合わせて、２００ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯ中に溶解された５０μｌ〜１００μｌのＭ４Ｎの投与は、１〜１．５ｃｍ３の腫瘍の多くの場合に有効であると予測される。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
実験方法
ＮＤＧＡ誘導体を、化学的に合成した［７］。細胞株Ｃ３は、Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ  Ｋａｓｔ  ｏｆ  Ｌｏｙｏｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．により提供されたＣ５７  ＢＬ／６ｋｈ起源の、ＨＰＶ１６Ｅ＋Ｌおよび活性化Ｒａｓ形質転換細胞株である。これは、Ｇｒｅｅｎｓｔｏｎｅら（１８）およびＦｅｌｔｋａｍｐら（１９，２０）に記載されるように、維持され、そして培養される。
【００３０】
Ｇ４Ｎの合成：
ｍｅｓｏ−１，４−ビス［３，４―（ジメチルアミノアセトキシ）フェニル］−（２Ｒ，３Ｓ）−ジメチルブタン塩酸塩テトラグリシニルＮＤＧＡ（Ｇ４Ｎ）の調製についての標準的な手順。ＮＤＧＡ（１２．８ｇ、４２．３ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＮ、Ｎ，−ジメチルグリシン（２６．２ｇ、２５４ｍｍｏｌ、６．０当量）を含有するジクロロメタン（２５０ｍｌ）溶液に、ＤＣＣ（５２．４ｇ、２５４ｍｍｏｌ、６．０当量）およびＤＭＡＰ（２．３２ｇ、１８．９ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。この反応混合物を２４時間窒素下にて室温で攪拌した。この反応混合物を濾過した後、この溶液を減圧下で濃縮した。次いで、反応フラスコにアセトン（２５０ｍｌ）を添加し、そしてその溶液に過剰のＨＣｌ（ｇ）をバブリングした。水溶性の沈殿物を、Ｈ２Ｏに溶解し、そして室温でアセトンから２回再沈殿させて、（１）（２９．２ｇ、３６．８ｍｍｏｌ）を、白色固体として収率８７％で得た。プロトンＮＭＲスペクトルを、Ｄ２Ｏ溶媒およびＴＳＰを内部標準として使用することによりＶａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ−４００（４００ＭＨｚ）分光計で得た。炭素−１３  ＮＭＲスペクトルを、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ  ４００（４００ＭＨｚ）で、Ｄ２Ｏを溶媒として使用することにより得た。炭素−１３化学シフトは、ＴＳＰ一重線（δ０．０ｐｐｍ）を参照する。
【００３１】
この合成をスキーム１に示す。
【００３２】
【化５】
2004534025.tif 000004
一般的手順。他に示さない限り、全ての反応を、オーブンで乾燥したガラス器具（１２０℃）中で窒素雰囲気下にて行った。アセトン、ジクロロメタン、１，４−ジオキサン、酢酸エチル、ヘキサンおよびテトラヒドロフランを、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏから購入した。アセトンを、４Ａモレキュラーシーブで乾燥して蒸留した。ジクロロメタン、酢酸エチル、およびヘキサンを乾燥し、そしてＣａＨ２から蒸留した。１，４−ジオキサンおよびテトラヒドロフランを、ナトリウムおよびベンゾフェノンから窒素雰囲気下で蒸留することにより乾燥した。ノルジヒドログアヤレティク酸を、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏから購入した。Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、モルホリン、トリエチルアミン、および炭酸カリウムを、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｃから購入した。１−ブロモ−３−クロロプロパン、Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン、およびメチルホスホロジクロリデートをＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏから購入した。
【００３３】
分析用薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を、Ｍｅｒｃｋ  Ｉｎｃから購入したプレコートプレート（ｓｉｌｉｃａｇｅｌ  ６０  Ｆ−２５４）で行った。ガスクロマトグラフィー分析を、２５−ｍ架橋メチルシリコーンゴムキャピラリーカラム（内径０．３２ｍｍ）を備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ機器で行った。窒素ガスをキャリアガスとして使用し、そして流量を１４．０ｍｌ／分に一定に保った。保持時間（ｔＲ）を、以下の条件下で測定した：インジェクター温度２６０℃、等温カラム温度２８０℃。ガスクロマトグラフィーおよび低分解能質量分析を、Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ５９７１Ａ質量選択的検出器およびキャピラリーＨＰ−１カラムを備えたＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ５８９０  Ｓｅｒｉｅｓ  ＩＩ機器で行った。中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）による分離を、Ｊａｓｃｏ  Ｍｏｄｅｌ  ８８０−ＰＵインテリジェントＨＰＬＣポンプを使用することにより１２０ｍｌ／ｈの流量で行った。ＭＰＬＣ充填材であるＲｅｖｅｒｓｅｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  Ｃ１８（粒径０．０３５〜０．０７０ｍｍ）を、Ｋｎａｕｅｒ  Ｃｏから購入した。Ｍｅｒｅｋ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  ６０  （粒径０．０６３〜０．２００ｍｍ、７０−２３０ｍｅｓｈ  ＡＳＴＭ）を使用することにより、重力カラムクロマトグラフィーによる精製を行った。
【００３４】
赤外（ＪＲ）スペクトルを、Ｂｏｍｅｍ  Ｍｉｃｈｅｌｓｏｎ  Ｓｅｒｉｅｓ  ＦＴ−ＩＲ分光計で測定した。報告される波数は、ポリスチレンの１６０１ｃｍ−１の吸収を基準とする。吸収強度を、以下の略語により記す：ｓ、強い；ｍ、中程度；ｗ、弱い。プロトンＮＭＲスペクトルを、Ｄ２Ｏを溶媒として使用し、そして３−（トリメチルシリル）プロピオン酸ナトリウム塩を内部標準として使用することにより、Ｖａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ−４００（４００ＭＨｚ）分光計で得た。炭素−１３  ＮＭＲスペクトルを、Ｄ２Ｏを溶媒として使用することによりＶａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ−４００（１００ＭＨｚ）分光計で得た。炭素−１３化学シフトは、３−（トリメチルシリル）プロピオン酸ナトリウム塩の一重線（６０．０ｐｐｍ）の中心を基準とする。多重度を、以下の略号により記録する：ｓ、一重線；ｄ、二重線；ｔ、三重線；ｑ、四重線；ｍ、多重線；Ｊ．結合定数（ヘルツ）。高分解能質量スペクトルを、ＪＥＯＬ  ＪＭＳ−ＨＸ１１０質量分析計により得た。ｍｅｓｏ−１，４−ビス［３，４−（ジメチルアミノアセトキシ）フェニル  ３Ｓ−ジメチルブタン（ｍｅｓｏ−１，４Ｂｉｓ［３，４（ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｍｉｎｏａｃｅｔｏｘｙ）ｐｈｅ  ３Ｓ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｂｕｔａｎｅ）塩酸塩（２）。ＮＤＧＡ（１，１２．８１ｇ、４２．３７ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＮ，Ｎ−ジメチルグリシン（２６．２１ｇ、２５４．２ｍｍｏｌ、６．０当量）のジクロロメタン（２５０ｍｌ）溶液に、ＤＣＣ（５２．４５ｇ、２５４．２ｍｍｏｌ、６．０当量）およびＤＭＡＰ（５．１７６ｇ、４２．３７ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加した。この反応混合物を２４時間窒素下で室温にて攪拌した。この反応混合物中のジシクロヘキシル尿素を濾別した後、得られた溶液を減圧下で濃縮した。次いで、アセトン（２５０ｍｌ）を残渣に加え、そして得られた溶液を過剰のＨＣｌ（ｇ）でバブリングした。沈殿物を水に溶解し、そして室温でアセトンを使用することにより再沈殿させて、２（２８．９７ｇ、３６．８６ｍｍｏｌ）を白色固体として収率８７％で得た：
【００３５】
【数１】
2004534025.tif 000005
他のＮ，Ｎ−ジメチル置換アミノ酸の適切な置換により、本発明のさらなるアミノ酸置換化合物が合成され得ることが理解される。
【実施例】
【００３６】
（実施例１）
（ＳＰ１調節ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７プロモーター活性についてのＭ４Ｎおよびいくつかの他のＮＤＧＡ誘導体の効果）
ＳＰ１調節ＨＰＶ  Ｅ６Ｅ７プロモーター活性についてのＭ４Ｎおよびいくつかの他のＮＤＧＡ誘導体の効果を、レポーターとしてルシフェラーゼを使用して調べた。このアッセイは、リン酸カルシウム方法による、Ｃ３３Ａ細胞中への、ルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合されたＨＰＶ１６ＬＣＲ（Ｐ９７プロモーター）のＤＮＡトランスフェクションに依存する。Ｃ３３Ａは、任意の組み込まれたＨＰＶ  ＤＮＡを含まないが、ＨＰＶ初期遺伝子プロモーターの強い（ｒｏｂｕｓｔ）発現に必要な転写因子を有する、頸部腫瘍細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＨＴＢ−３１）である。ＤＮＡトランスフェクションの１日後、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を用いて溶解された種々の薬物濃度を、この細胞に添加した。薬物処理の３０時間後（その結果、このアッセイは、一過性トランスフェクション実験に標準的な４８時間以内に完了する）、この細胞を溶解し、そして特異的なルシフェラーゼ活性を決定した（Ｌｕｃｉｆｅｒａｚｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｐｒｏｍｅｇａ、米国特許第５，２８３，１７９号）。Ｍ４Ｎ薬物濃度が増加するにつれて、特異的なルシフェラーゼ活性は、減少した。
【００３７】
結果（図２に示される）は、Ｍ４Ｎが、ルシフェラーゼアッセイにおいて、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７プロモーターにおけるＳｐ１調節転写開始を劇的に減少することを実証する。
【００３８】
（実施例２）
（Ｍ４Ｎ処理に続く、Ｅ６／Ｅ７ｍＲＮＡ合成の阻害）
Ｍ４Ｎ処理に続く、Ｅ６／Ｅ７ｍＲＮＡ合成の阻害を、頸部細胞株Ｃ３において、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。相対的ＲＴ−ＰＣＲを、計数された細胞数に対して正規化した全細胞ＲＮＡの量を用いて実施した。ＲＴ−ＰＣＲ産物を、２％アガロースゲルで分析した。この結果を図３に示す。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、Ｅ７（３２１ｂｐ）およびＥ６（２０４ｂｐ）についての予期されたサイズの増幅されたｃＤＮＡが、増幅のサイクル２２という早さで、ＤＭＳＯ処理された細胞において検出されたことを示した。これらの同じ産物は、増幅の３０サイクルに続いて、薬物処理されたＲＮＡ抽出物において、ほとんど検出可能でなかった。増幅された産物は、テンプレート無しＰＣＲコントロールについても、ＨＰＶ１６ネガティブＣ３３ａ細胞株の全ＲＮＡ抽出物からも、検出されなかった。
【００３９】
（実施例３）
（Ｍ４Ｎ処理による頸部Ｃ３細胞増殖の阻害）
ＨＰＶ−１６形質転換不死化マウス上皮細胞（Ｃ３細胞）を、１バイアル当たり１０５個の細胞密度でプレートした。２４時間後、バイアルの１／２に、１％ＤＭＳＯ中に溶解された４０μＭ  Ｍ４Ｎを含む増殖培地を与え、一方、他の半分に、１％ＤＭＳＯのみを含む増殖培地を与えた。この結果を図４Ａに示す。２４時間以内に、薬物処理されたＣ３細胞とコントロールＣ３細胞との間の細胞形態学的差異が観測された。薬物処理された細胞の増殖および分裂は、未処理コントロールと比較して顕著に減少し、一方、全細胞数と比較した生存可能な細胞の割合は、薬物処理された細胞とＤＭＳＯのみのコントロール細胞との両方について一定のままであった。これは、Ｍ４Ｎが細胞分裂を劇的に減少することを示す。
【００４０】
培地からのＭ４Ｎの除去に続くＣ３増殖の効果もまた、調べた。Ｃ３細胞を、１つのバイアル当たり１０４個の細胞の密度でプレートした。時間＝０において、バイアルの２／３に、１％ＤＭＳＯ中４０μＭのＭ４Ｎを補充した増殖培地を与えた。残りのバイアルに、１％ＤＭＳＯのみを含む増殖培地を与えた。７３時間後、増殖培地においてＭ４Ｎを与えられたバイアルの１／２を洗浄し、そして１％ＤＭＳＯのみを含む培地を加えた。この細胞バイアルの他の２／３を洗浄し、そして以前に投与された培地と同じ培地で置換した。この結果（図４Ｂに示される）は、細胞増殖の速度が、薬物を含まない培地への変化に続くＭ４Ｎ処理サンプルにおいて、顕著に増加しなかったことを示し、このことは、細胞外膜環境からの除去後でさえ、Ｍ４Ｎが細胞分裂を有意に減少し続けることを示す。
【００４１】
（実施例４）
（薬物処理前および薬物処理の７２時間後の、Ｃ３細胞における細胞遺伝子発現の分析）
９６００遺伝子アレイを用いた遺伝子発現を研究した（図５）。７２時間Ｍ４Ｎ（４０μｍ）処理（Ｃ３  Ｍ４Ｎ）および未処理（Ｃ３  ＤＭＳＯ）からのそれぞれ５μｇのポリＡ＋ＲＮＡを、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ５１、３１３−３２４  １９９８に記載される手順に従って、一対のヒト９６００遺伝子アレイハイブリダイゼーション研究において使用した。ハイブリダイゼーション画像を、Ｎｉｋｏｎ  ５５ｍｍ  ＡＦミクロＮｉｋｏレンズを備えるカラービデオカメラによって撮り、そしてＭａｃｉｎｔｏｓｈ  ＬＣ６３０コンピュータによってデジタル化した。単一カラーモードまたは２重カラーモードのいずれかでの色形成酵素の酵素基質反応によるこのような検出は、再現可能であり、そして非常に感受性である（１０７個の細胞から、ＲＮＡを用いて、１細胞当たり５未満のコピーの転写物を検出し得る）。
【００４２】
差示的に発現された遺伝子（Ｃ３  Ｍ４Ｎ／Ｃ３  ＤＭＳＯ＞１０およびＣ３  ＤＭＳＯ／Ｃ３  Ｍ４Ｎ＞１０）を示すコンピュータープリントアウトを、試験のために列挙する。ＴＩＦＦ形式の画像ファイルおよびＭＳエクセル形式のデータファイルは、ＺＩＰディスケットで保持される。遺伝子名およびクローンＩＤ番号は、将来のノザンブロット確認のための画像クローンを得るために利用可能である。
【００４３】
Ｍ４Ｎ処理の７２時間後、アップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされるかのいずれかである遺伝子の群のうち、以下は、細胞分裂およびアポトーシスに特に関連する遺伝子である。いくつかの他の細胞周期関連遺伝子はまた、Ｍ４Ｎに応答して非常にアップレギュレートされる。サイクリン依存性キナーゼＣＤＣ２（実施例１１）に加えて、例えば、以下である：
2004534025.tif 000006
【００４４】
以下の細胞周期関連遺伝子は、Ｍ４Ｎに応答して、非常にダウンレギュレートされる：
2004534025.tif 000007
【００４５】
より初期の時点（例えば、薬物処理の１時間後）で、Ｅ６／Ｅ７レベルは、コントロール細胞のＥ６／Ｅ７レベルと類似することが見出されたが、一方、４．５時間後、Ｅ６／Ｅ７は、ＲＴ−ＰＣＲによってもはや検出可能でなかった（１０）。９６００遺伝子アレイを用いる遺伝子発現は、薬物の最初の細胞効果をさらに抑えるために、これらの短時間処理細胞（１時間および５時間）から単離されたＲＮＡを用いて繰り返され得る。
【００４６】
（実施例５）
（Ｍ４Ｎの局所注入によるマウスにおけるＣ３腫瘍増殖の標的化）
３６匹のＣ５７ｂｌ−１６ＮＣＲマウスに、マウスの背側の肩の間に、５×１０５個のＣ３細胞を注射した。２４匹のマウスが、２０日以内に腫瘍を発生した。毎日の注射（５０μｌ〜１００μｌのＭ４ＮまたはＭ４Ｎ／Ｇ４Ｎ）（ＤＭＳＯ中、２００ｍｇ／ｍｌ  Ｍ４Ｎ、ＰＢＳ中２００ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４Ｎ）は、表１および表２、図６および図７に示されるように、動物における腫瘍増殖において顕著な効果を示した。
【００４７】
（表１．マウスにおいて発生された単一腫瘍の増殖に対するＭ４ＮおよびＧ４Ｎの効果）
【００４８】
【表１−１】
2004534025.tif 000008
【００４９】
【表１−２】
2004534025.tif 000009
＊ＤＭＳＯ＝薬物に対するビヒクル
＊＊１５日目に取られた
＊＊＊病変は、ほとんど壊死した細胞を含み、これはまた、マウス６、７、１１、１４、１５、１７、１９、２１、２８、１９（図６、７）からの病変において見出された。薬物処理の後、マウス番号１１および２２には、病変は残っていなかった。コントロールマウス番号１、２、３、４に見出された腫瘍は、増殖している細胞を含んだ（図２）。
【００５０】
（実験手順）：
３６匹のＣ５７ｂｌ−１６ＮＣＲマウスに、５×１０５  Ｃ３細胞／マウスを注射した。注射は、１００μＬであり、マウスの背側の肩の間に皮下的に行った。細胞を低塩ＨＢＳＳ中に懸濁させ、そして懸濁均一性を、穏やかにボルテックスすることによって維持した。
【００５１】
２４匹のマウスが腫瘍を発生した。それらの病変サイズを、ダイアルカリパーによって測定した。これらのマウスを剃毛し、体重を量り、そして処理を開始した（１日目）。４匹のマウスを、コントロールとして隔離した。コントロールマウスは、腫瘍内に毎日５０μｌのＤＭＳＯを注射された。実験マウス（１０）は、ＤＭＳＯ（２００ｍｇ／ｍＬ）中に溶解された５０μｌ  Ｍ４Ｎを投与された。さらなる１０匹のマウスは、８日間のＭ４Ｎ処理に続いて、８日間毎日のＧ４Ｎ処理（５０μｌ、ＰＢＳ中２００ｍｇ／ｍｌ）を投与された。注射を、腫瘍のいくつかの領域に行った。マウスを、注射の前に、エーテルまたはメタファンを用いて麻酔した。
【００５２】
（表２．複数の腫瘍を有するマウスにおける、処理された病変の増殖に対する、Ｍ４ＮおよびＧ４Ｎの効果）
【００５３】
【表２】
2004534025.tif 000010
＊ＤＭＳＯ中の薬物を、腫瘍領域に直接注射した。
＊＊薬物を取り除いた隣接腫瘍から。
【００５４】
（表３．マウスにおけるＧ４Ｎの毒性研究）
【００５５】
【表３】
2004534025.tif 000011
ＮＣＩからのＣ５７ＢＬ−１６ＮＣＲ雌性マウスを、この実験に使用した。テトラグリシナル（ｔｅｔｒａｇｌｙｃｉｎａｌ）ＮＤＧＡ（Ｇ４Ｎ）を、毎日、ＰＢＳ中で、７５ｍｇ／ｍｌの濃度で新たに作製した。処理当たり、群１について、０．０５ｍｌ、群２および４について０．１ｍｌ、そして群３について０．２ｍｌの注射を、６日間行った。実験は、７日間続いた。体重を、注射前および注射の６日後に決定した。有意な体重変化は、実験期間の間、観察されなかった。
【００５６】
全ての処理されたマウス、コントロール（マウス番号１〜４）および実験マウス（マウス番号６、７、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１７のＭ４Ｎ、番号１８〜２２、２４、２６〜２９のＭ４Ｎ／Ｇ４Ｎ）は、腫脹を示した。病変サイズの測定を、ダイアルカリパーによって行った。いくつかのマウスは、注射に起因して穏やかな出血を経験した。処理レジメンおよび結果は、以下の通りであった：
１０日目：マウスの体重を再び測定した。全てのマウスが、２ｇまでの増加を示した。
１２日目：処理を行わなかった。
１３日目：全てのマウスは、非常に異なる程度で、ふくらんだ皮膚を有する。１つのＭ４Ｎ処理マウス（番号７）の皮膚は、「乾いた腫瘍（ｄｒｉｅｄ−ｏｕｔ  ｔｕｍｏｒ）」が出る裂け目を有する。
１４日目：注射容積を１００μｌに増加させた。
１５日目：１匹のＭ４Ｎ処理されたマウス（番号１７）は、麻酔の過量／操作に起因して死亡した。番号１７の病変部位の皮膚は、裂け、「乾いた腫瘍」を示す。このマウスを解剖し、病変を切除し、重さを量った。１６日目：さらに４匹のＭ４Ｎ処理マウス（番号６、１４、１５、１６）、３匹のＭ４Ｎ／Ｇ４Ｎ処理マウス（番号１９、２１、２８）および１匹のコントロールマウス（番号２）を安楽死させ、解剖し、そして重さを量った。残りのコントロールマウス（番号１、３、４）を、非侵襲的に試験し、そして腫瘍を持っていた。
２１日目：コントロールマウスからの腫瘍サイズを、ダイアルカリパーによって測定した。観測：マウス番号１０および番号１２の病変部位の皮膚（Ｍ４Ｎ処理領域）は、裂けており、「乾いた腫瘍」を示す。
２４日目：マウス番号７の皮膚を、完全に回収した。実験をこの日に終えた。全ての残りのマウス、Ｍ４Ｎ処理（番号７、９、１０、１１、１２）およびＭ４Ｎ／Ｇ４Ｎ処理（番号１８、２０、２４、２６、２９）を安楽死させ、解剖し、試験し、そして重さを量った。
【００５７】
マウスにおけるＣ３腫瘍増殖に対するＭ４ＮおよびＭ４Ｎ／Ｇ４Ｎの効果を、表１および２ならびに図５および６に要約する。表１は、単一の腫瘍を有するマウスのＣ３細胞増殖に対する薬物の効果を示す。コントロール群の４つの切除された腫瘍の平均重量は、１．４８ｇであったが、一方、Ｍ４Ｎ処理およびＭ４Ｎ／Ｇ４Ｎ処理からの病変の重量は、それぞれ、０．１４２ｇおよび０．５１ｇであった。薬物処理病変は、主に、乾いた壊死細胞からなった（図６）。コントロール群からの腫瘍は、均一なようであり、そして活性に増殖する細胞を含んだ。表２は、複数の腫瘍を有するマウスにおけるＣ３腫瘍増殖に対する薬物効果を示す。この研究において、薬物を腫瘍の１つに注射した。未処理腫瘍の平均重量は、１．７７ｇであったが、一方、Ｍ４Ｎ処理病変の平均重量は、０．１５ｇであった。類似の結果が、Ｍ４Ｎ／Ｇ４Ｎ注射に続いて得られた−未処理腫瘍の平均重量は、１．２７ｇであり、一方、薬物処理病変の平均重量は、たった０．１０３ｇであった。実験期間全体の間の全てのマウスの体重変化は、有意ではなかった（表１および２）。
【００５８】
（実施例６）
２つの群のマウスからの薬物処理（Ｍ４Ｎ）腫瘍およびＤＭＳＯビヒクル処理腫瘍または未処理腫瘍（ＣＯＮ）を、組織学的試験のために調製した。切除された腫瘍を、すぐに固定し、次いで、リン酸緩衝化生理食塩水中の４％ホルムアルデヒド中で保存した。次いで、固定された組織を一連の段階的なアルコールおよびキシレンによって脱水し、そしてパラフィンに埋め込んだ。パラフィン組織ブロックを薄く切り出し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンを用いて顕微鏡のために染色した。組織学的研究は、コントロール腫瘍が、ＤＭＳＯ処理によって影響されず、そして増殖し続けることを示した。これらは、高い核／細胞質比、多形性核変化、高い有糸核分裂像、紡錘体様肉腫形状、および癌細胞に特徴的な周りの組織への浸潤を示す。対照的に、Ｍ４Ｎ処理を受けた腫瘍は、処理の開始後すぐに、増殖を中断した。これらは、有意な壊死を示し、そしてもはや生存可能ではない。より高倍率において可視の少量の薬物沈殿があり、そして病巣領域は、慢性の炎症および線維症を示す。この治癒効果は、この領域から、これらの減少した腫瘍細胞の発散を導く。同じ結果が、Ｍ４Ｎ処理単独と同様のＭ４Ｎ／Ｇ４Ｎ処理で見られる。しかし、Ｇ４Ｎが水溶性であるので、Ｍ４Ｎよりも腫瘍のより広い領域に拡散し得る。Ｍ４Ｎとともに相乗的に使用される場合、Ｇ４Ｎは、大きなサイズの腫瘍（すなわち、２ｃｍ３より大きい）を処置するのにより有効であり得る。
【００５９】
（実施例７）
（モルモットにおけるＨＳＶ−１皮膚感染に対するＭ４Ｎの作用）
薬物Ｍ４Ｎをまた、モルモットにおける皮膚感染でのＨＳＶ−１複製の阻害について試験した。モルモットの皮膚をニードルでつまみ、そしてＨＳＶ−１抑制剤を各々突き刺した領域に感染させるために局所的に塗布した。次いで、６日間毎日感染させた後に、Ｍ４Ｎを、突き刺した感染領域に塗布した。
【００６０】
モルモットの裸の背中の皮膚の６つの領域を、５＝ＤＩＮニードルで無菌的に穿孔した。２つの領域を、ＨＳＶ−１（ＨＳＶ−Ｃ、培養上清、または生理食塩水中の単離したＨＳＶ、ＨＳＶ−ＳＣ）で感染させた。他の４つの領域を、ＨＳＶ−ＳＣで感染させた。感染の１５分後、３０μｌの試験化合物（ＤＭＳＯ中６０ｍｇ／ｍｌのＡＢＤＳ１、ＡＢＤＳ２、ＡＣＶおよびＭ４Ｎ（４Ｎ））を、１日あたり５回で６日間、領域の各々穿孔した感染領域に塗布した。ＡＢＤＳ１およびＡＢＤＳ２を、ネガティブコントロールとして含んだ。図８における写真を６日目に撮り、そして薬物（ＨＳＶ−Ｃ、ＨＳＶ−ＳＣ）の非存在下、効力のない薬物（ＨＳＶ−ＡＢＤＳ１、ＨＳＶ−ＡＢＤＳ２）の存在下、および有効な薬物（ＨＳＶ−Ｍ４ＮおよびＨＳＶ−ＡＣＶ）の存在下でのＨＳＶ−１複製の程度を示す。６つの大きなコンフルエントな疱疹は、ＨＳＶ−Ｃ、ＨＳＶ−ＳＣ、ＨＳＶ−ＡＢＤＳ１、ＨＳＶ−ＡＢＤＳ２によって処理した領域において発生したが、疱疹は、Ｍ４Ｎ（４Ｎ）処理およびＡＣＶ処理の後の感染領域では観察されなかったことが見出され得る。皮膚損傷の消失によって、および薬物処理４日後のウイルス発散がないことによって、示されるように、Ｍ４ＮがＨＳＶ複製をブロックし得るという明確な結果を、このモデル系において得た。初期の動物研究もまた、Ｍ４Ｎが、マウスに対して、腹腔内に投与された場合、３００ｍｇ／ｋｇほどの高さの濃度で、そして皮下またはＩＶのいずれかによって投与された場合、３７５ｍｇ／ｋｇほどの高さの濃度で、非毒性であることを示した（表３）（６）。
【００６１】
（実施例８）
（インサイチュ注射を用いる臨床処置についてのＭ４Ｎ）
薬物送達経路として、腫瘍へのＭ４Ｎの直接的な投与は、いくつかの特有な利点を提供する。１）Ｍ４Ｎは、疎水性化合物であり、そしてＤＭＳＯに非常に可溶性（２００ｍｇ／ｍｌ）である。従って、有効投薬量の薬物を達成するために、ほんのわずかな容量の薬物溶液が、注射について必要とされる。上記実施例５で記述されるマウス研究においては、数日間の５０μｌ〜１００μｌの毎日の注射が、マウスにおける腫瘍増殖の完全な停止に十分であった。疾患を処置するために大用量のＤＭＳＯ（処置あたり３０ｍｌ  ＩＶ）の使用に関するいくつかのこれまでの研究が存在する（２１）。これらの結果は、確証的ではなかった（２２）。しかし、数千万の人々が、過去において世界的に大量のＤＭＳＯで安全に試験されているので、ＤＭＳＯは、ほんのわずかな容量のＤＭＳＯが使用される場合、薬物送達のためのビヒクルとして安全であると考えられる（２３）。２）インサイチュで注射することによって、大多数の薬物残渣が、不溶性のままであり、腫瘍領域で濃縮され、そして循環系に入らず、従って全身毒性が避けられる。さらに、十分な薬物が、その増殖を抑制するように腫瘍内に残存するので、薬物の連続注射は、比較的わずかな処置後に不要である。実施例５のマウス研究において、Ｍ４Ｎ注射の中断後でさえも、腫瘍細胞は、死滅し続けた。従って、薬物が直接標的化される場合、腫瘍サイズが、投与されるべき薬物の必要量についての決定因子となる。ヒトの全体重とマウスの全体重との差は、無関係である。マウス腫瘍研究において、１０日間の２０ｍｇ／日は、腫瘍を排除するために十分すぎるほどであった。匹敵するサイズのヒトの腫瘍（１〜１．５ｃｍ３）を処置するためにこれよりも高い投薬量を使用する必要は存在しないはずである。このことは、ヒト試験における危険性を相当に減少させる。
【００６２】
（実施例９）
（細胞のＭ４Ｎ処理が細胞性増殖をブロックする）
Ｍ４Ｎに関する本発明者らのこれまでの研究は、Ｓｐ１−依存性プロモーターの不活性化によって、ウイルス性転写を阻害し得ることを示した。多くの哺乳動物細胞周期遺伝子もまた、重要なＳｐ１プロモーターを含み、従ってＭ４Ｎは、これらの転写をブロックし得る。この仮説を、多数の異なる細胞株に対するＭ４Ｎの抗増殖性作用を試験することによって試験した。低濃度（１０μＭ）の親化合物ＮＤＧＡは、哺乳動物細胞においてアポトーシスを誘導することがこれまでに示されてきた（２４）。しかし、この作用は、カテコール酸素の１つをブロックすることによってか、またはＮＤＧＡへの親水性基の添加によって、回避され得る（２５）。漸増量のＮＤＧＡ誘導体Ｍ４Ｎを、増殖を阻害するために必要とされる最適濃度を決定するために、ＨＰＶ−１６／ｒａｓ形質転換Ｃ３細胞株（２６）の培養物に対して試験した（図９ａ）。この細胞は、Ｍ４Ｎに十分に応答し、４０〜６０μＭの濃度範囲にわたって７２時間後に分裂を停止する。これらの濃度での３日後、細胞数が、処理の開始での計数と等しく残存した（０日目、図９）。細胞増殖におけるより緩やかな減少を、より低濃度の薬物で観察し、そしていくつかの細胞死を、６０μＭより高い濃度で観察した。
【００６３】
Ｃ３細胞株に対するＭ４Ｎの抗増殖性作用は、Ｓｐ１−依存性ＨＰＶ−１６  Ｅ６／Ｅ７癌遺伝子プロモーターを不活性化する薬物の能力に単に起因せず、同様な増殖阻害を、ＨＰＶ−１６で形質転換されたＴＣ−１細胞株（Ｅ６／Ｅ７癌遺伝子が非Ｓｐ１依存性レトロウイルス性プロモーターの制御下である（２７））において観察した（図９ｄ）。Ｃ３３ａ細胞株（図９ｃ）、ＨＰＶ−ネガティブヒト子宮頸癌細胞株、およびＣＥＭ−Ｔ４株（図９ｂ）の増殖に加えて、ヒト白血病細胞株（２８）もまた、Ｍ４Ｎを用いる処理によってブロックされた。この薬物を用いて処理された４つの細胞株において、ほとんど全て（９５％を超える）の分裂停止細胞は、Ｍ４Ｎの濃度が、「閾値」の値（Ｃ３細胞について６０μＭ、ＴＣ−１細胞について４０μＭなど）を超えるまで生存可能であった。これらの濃度を超えると、生存可能な細胞の百分率は、急激に減少する。興味深いことに、分裂停止細胞は、薬物に対する延長された曝露後でさえも９５％を超える生存度を維持した。Ｃ３細胞は、４０μＭ  Ｍ４Ｎを用いる処理の８日後に細胞死において増加を示さなかった（図９ｅ）。
【００６４】
（実施例１０）
（Ｍ４Ｎを用いて処理された細胞がＧ２期において停止する）
一旦、Ｍ４Ｎを用いて処理された細胞が、生存可能なままで増殖を中止することが確立されると、細胞性ＤＮＡ含量の分析および細胞構造の蛍光試験は、細胞が停止する細胞周期における点を決定するために使用された。７２時間Ｍ４Ｎに対して曝された細胞は、コントロールに対して増加したＧ２／Ｍ  ＤＮＡ含量を示した（図１０ａ〜ｄ）。最も極度な応答は、Ｃ３細胞株およびＣＥＭＴ４細胞株から観察され、ここで、９０％を超える細胞が、Ｇ２／Ｍ  ＤＮＡ含量を示す。
【００６５】
Ｇ２における停止と有糸分裂ブロックとの間を区別するために、αチューブリン（緑）およびγチューブリン（赤）に対する抗体を、７２時間のＭ４Ｎ処理後のＣ３細胞株における中心体の状態を決定するために使用した。図１１ａに示されるように、Ｍ４Ｎで処理した細胞の中心体は、複製されるが、細胞の核において互いに隣接して位置するままである。中心体は、初期の前期の間に分離しているので、これらの細胞が、有糸分裂を開始してないと結論付けられ得る。対照的に、コントロール細胞を染色するγチューブリンは、Ｇ１期またはＳ期に特徴的な拡散パターンを有する（２９）。Ｍ４Ｎ処理細胞におけるクロマチン凝縮の欠如をまた、ＤＡＰＩ染色を用いて観察し（図１２ｂ）、これは、この細胞がＧ２期より前方へ移動していないさらなる証拠である（３０）。
【００６６】
（実施例１１）
（ＣＤＣ２の産生が４０μＭ  Ｍ４Ｎによって阻害される）
Ｇ２からの細胞の進行は、ＭＰＦの産生に依存するので、そのタンパク質成分の状態を、４０μＭ  Ｍ４Ｎを用いて処理したＣ３細胞において試験した。非同期性細胞を、１％  ＤＭＳＯ中のＭ４Ｎ、または１％  ＤＭＳＯ単独のいずれかを含有する培地中で２４時間または７２時間増殖させた。この細胞を収集し、そして等量の全細胞性タンパク質を、ウエスタンブロットによって分析した。ＣＤＣ２の量の顕著な減少を、Ｍ４Ｎを用いる処理の７２時間後に観察した（図１２ａ）。しかし、同一の膜をはがし再調査することによって検出されたサイクリンＢのレベルは、変化しないことが見出された。これらの結果は、これらの条件下で、停止がｐ５３に対する応答ではなさそうなことを示す。なぜなら、ｐ５３の過剰発現は、サイクリンＢの減少を導くことが示されているからである（３１、３２）。ウエスタン分析の結果と一致して、ＣＤＣ２キナーゼ活性を、Ｍ４Ｎ処理の７２時間まで排除した（図１２ａ）。これらの実験は、この薬物がＣＤＣ２タンパク質の産生を阻害することによって作用しＭＰＦの活性の損失をもたらすという考えを支持する。
【００６７】
Ｓｐ１−依存性ウイルス性転写をブロックするＭ４Ｎの能力を実証する本発明者らのこれまでの研究は、ＣＤＣ２タンパク質の減少についての考えられる機構として、ＣＤＣ２  ｍＲＮＡレベルの減少を示唆する。このことは、サイクリンＢタンパク質（この遺伝子は、その発現についてＳｐ１を必要としない）が、正常なレベルで産性されるが、ＣＤＣ２タンパク質（この遺伝子は、そのプロモーターにおいて２つの重要なＳｐ１部位を有する）が、量において実質的に減少するという知見を支持する。この仮説を試験するために、ノザンブロット分析を、４０μＭ  Ｍ４Ｎを用いて５〜７２時間処理されたＣ３細胞から収集したＲＮＡに対して実施した。図１２ｂに示されるように、ＣＤＣ２  ｍＲＮＡの量は、Ｍ４Ｎで処理してわずか２４時間後に減少し、そして７２時間後にほとんど除去される。非Ｓｐ１調節性ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの産生を、ＲＮＡロードコントロールとして使用し、そしてそのレベルは、４０μＭ  Ｍ４Ｎまで影響されなかった。
【００６８】
Ｃ３細胞株の使用は、本発明者らにＭ４Ｎ媒介性細胞周期停止の機構の分析のためのさらなるコントロールを可能にする。なぜなら、他のＳｐ１−依存性遺伝子プロモーターはまた、Ｍ４Ｎ処理によって阻害されるようであるからである。この可能性を、Ｓｐ１依存性ＨＰＶ−１６  Ｅ６／Ｅ７プロモーターからの転写に対するＭ４Ｎの作用を分析することによってＣ３細胞を試験した。４０μＭ  Ｍ４Ｎで５〜７２時間処理したＣ３細胞から単離したＲＮＡのｒｔＰＣＲ分析は、Ｅ７転写物のレベルの明確な減少を示した（図１２ｃ）。ＧＡＰＤＨをまた、この実験における内部コントロールとして再び使用し、そしてそのレベルは、薬物処理によって影響されなかった。これらの結果は、Ｍ４ＮがＳｐ１調節性プロモーターの転写を減少させるというさらなる証拠を提供する。
【００６９】
（実施例１２）
（ゲル移動度分析におけるＧ４ＮによるＳｐ１結合活性の阻害）
Ｓｐ１ファミリータンパク質は、結合の際にＤＮＡの主溝の方に曲げを誘導する（３３）。Ｓｐ１タンパク質のジンクフィンガードメインは、ＧＣボックス配列５’−ＧＧＧＧＣＧＧＧＧ−３’の結合を担っている。コンピュータ分析から、Ｇ４Ｎ（ＮＤＧＡのアミノエステル誘導体）が、主溝におけるこのような配列と安定な複合体を形成し得ることを決定した。Ｇ４Ｎが、Ｓｐ１ブロッカーおよびＳｐ１ディスプレーサー（ｄｉｓｐｌａｃｅｒ）として機能を果たし得るか否かを決定するために、本発明者らは、試験のためにＳｐ１のＤＮＢ結合ドメインのみを用いるゲル移動度シフト分析によって、Ｇ４Ｎの存在または非存在下において、Ｓｐ１／エンハンサー相互作用研究を実施した。ブロック化実験において、異なる濃度のＧ４Ｎを、最初に、結合緩衝液中で３２Ｐ−標識化ＤＮＡとともに２５℃で３０分間インキュベートした。次に、組換えＳｐ１タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン（Ｓｐ１−１６７Ｄ）を添加し、そして大過剰のＢＳＡタンパク質の存在下でさらに３０分間インキュベートした。置換研究において、この組換えＳＰ１−１６７Ｄを、最初に、ＤＮＡに結合させ、次いでＧ４Ｎを、インキュベーションの第２工程で添加した。Ｇ４Ｎ濃度およびＳｐ１−１６７Ｄ濃度ならびにインキュベーション条件およびゲル電気泳動条件は、両方の研究において同一であった（実験項）。図１３に示されるように、いずれの場合においても、Ｇ４Ｎは、ＤＮＡをＳｐ１−１６７Ｄタンパク質との相互作用をさせなくし得ることが見出された。Ｓｐ１単独のＤＮＡ結合ドメインのみが試験された場合、Ｇ４Ｎは、ゲル移動度シフト分析によって示されるように（図１３、Ａ、Ｂ、Ｄ）、エンハンサーに対する結合からＳｐ１をブロック化するよりも、結合Ｓｐ１の置換においてより効率的であると考えられた。本発明者らはまた、結合Ｇ４ＮがＳｐ１−１６７Ｄによって置換され得るか否かを試験した。この研究において、Ｇ４ＮによるＳｐ１−１６７Ｄ結合の阻害は、移動度シフト分析によって初めて確立された（図１３Ｃ、レーン２およびレーン５）。Ｇ４Ｎ結合テンプレートが、付加的なＳｐ１−１６７Ｄとチャレンジされた場合、本発明者らは、Ｓｐ１−１６７Ｄ／ＤＮＡ複合体のバンド強度の投薬量依存的な増加を観察し（図６Ｃ、レーン６、レーン７）、このことは、Ｓｐ１−１６７ＤによるテンプレートからのＧ４Ｎの置換を示した。
【００７０】
（実施例１３）
（Ｇ４ＮによるＨＩＶプロモーター活性のＳｐ１調節性Ｔａｔ−トランス活性化の阻害）
これまでに報告されるように、メチル化ＮＤＧＡ誘導体は、種々のウイルス性プロモーター（ＨＩＶ、ＨＳＶのＩＣＰ４、ＨＰＶのＥ６／Ｅ７遺伝子を含む）のエンハンサー部位に対するＳｐ１結合をブロックし得る（８、９、１０）。本発明者らは、これまでに記載されるように、ＳＥＡＰアッセイによってＣｏｓ細胞におけるＨＩＶプロモーター活性のＴａｔ−トランス活性化に対するＧ４Ｎ作用をさらに試験した。ＨＩＶ  ＬＴＲ駆動ＳＥＡＰ発現の基底レベルは、Ｃｏｓ細胞においてほとんど検出可能でないことがこれまでに見出された。Ｃｏｓ細胞がＣＭＶプロモーター駆動Ｔａｔ遺伝子とともに同時トランスフェクトされた場合、ＳＥＡＰ発現において６０倍以上増加した（８）。このようなＨＩＶ  ＬＴＲプロモーター活性のＴａｔ駆動性トランス活性化は、Ｓｐ１調節性であることがこれまでに示されてきた（７、８）。Ｇ４Ｎの存在下で、本発明者らは、用量依存的様式でＨＩＶトランス活性化の阻害を観察した（図１４）。Ｇ４Ｎについての平均値ＩＣ５０値３６μＭは、３−Ｏ−メチルＮＤＧＡの値（Ｍａ１．４（ＩＣ５０２５μＭ））に匹敵し、そしてテトラ−メチルＮＤＧＡの値（Ｍ４Ｎ（ＩＣ５０１１μＭ））よりも幾分高かった。これらの違いは、おそらく、細胞に取り込む薬物に影響する試験化合物の化学的性質に起因する。
【００７１】
（実施例１４）
（Ｇ４Ｎによる細胞培養物中のＳＩＶ−１産生およびＨＩＶ−１産生の阻害）
ＨＩＶ−１およびＳＩＶの両方は、これらの複製を完了するために宿主ゲノムへの組込みを必要とするレトロウイルスである。両方は、これらのプロウイルスの転写のための宿主転写因子に依存している。Ｓｐ１は、ほとんど同一な様式の転写調節を共有するこれら２つのウイルスにおけるこのような発現について中心的な役割を果たしている。Ｇ４Ｎの抗ウイルス作用を試験するための動物モデルとして、ＳＩＶ感染アカゲザルを使用することを見越して、本発明者らは、１７４×ＣＥＭ細胞におけるＳＩＶ阻害におけるＧ４Ｎ作用を研究し、そしてＨ９細胞におけるＨＩＶのものと比較した。これら２つの細胞株におけるＧ４Ｎの細胞毒性もまた試験した。ＳＩＶ阻害研究について、１０７  １７４×ＣＥＭ細胞を、ＳＩＶｍａｃ２３９の高力価ストックと３７℃で２時間混合し、次いで冷ＰＢＳ緩衝液で２回洗浄して、吸収されていないウイルスを除去した。細胞懸濁液を、３つの９６ウェルプレートの各々のウェル中に等分した。種々の濃度のＧ４Ｎ溶液を、新たに調製したストックから作り、別個にかつ各々、１つの９６ウェルプレートの列の６ウェルに等分した。培養上清を、感染後４日毎に収集した。適切な濃度の薬物を含有する（Ｐ．Ｉ．）および新たな培地を、上清の収集に続いて培養物に添加した。ウイルス産生を、示されるように、改変ｐ２７コア抗原捕捉ＥＬＩＳＡによってアッセイした（図１５）。ＳＩＶ産生は、５ＣＩＭを超える濃度でＧ４Ｎを使用して検出されなかった。２．５ＣＩＭ未満のＧ４Ｎ濃度にて、ＳＩＶ産生を、薬物の非存在下でのウイルス産生と比較して、感染後の培養物の４日目および８日目の培養上清において検出した（図１５）。Ｇ４Ｎ（２５０μＭ以下）は、ＭＴＴアッセイによって決定されるように、感染されていない１７４×ＣＥＭ細胞に対して毒性作用を示さなかった（３４）。
【００７２】
同様な実験をまた、Ｈ９細胞においてＧ４Ｎによって、ＨＩＶ−１の阻害の研究について実施した。このＨ９細胞を、１×１０５／ｍｌで継代培養し、そしてＨＩＶ−１（ＨＩＶ−１ＲＴＭＦ）のＡＺＴ耐性株を用いて感染させた。異なる濃度のＧ４Ｎを、感染２時間後に添加した。新鮮な培地交換を、４日間毎に行った。Ｇ４Ｎの存在下での細胞増殖を、９日の実験期間の間注意深くモニターした。ウイルス産生を、ｐ２４コア抗原捕捉ＥＬＩＳＡによってアッセイした。示されるように（図１６）、８０ＣＩＭのＧ４Ｎ濃度は、Ｈ９細胞においてＨＩＶ複製を完全に阻害した。ＨＩＶ−１  ＲＴＭＦの阻害について、１２μＭ  ＣＩＭ  Ｇ４ＮのＩＣ５０が見出された。さらに、アッセイの範囲内（および２５０μＭ未満）で、感染されていないＨ９細胞に対する検出可能な毒性は、存在しなかった。
【００７３】
（実施例１５）
（Ｃ３細胞におけるサービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）遺伝子発現に対するＭ４Ｎ処理の作用）
（材料および方法）
細胞培養物。Ｃ３細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）を補充したＩｓｃｏｖｅ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）中で単層として増殖させ、そして５％  ＣＯ２環境下、３７℃で湿性インキュベーター中で維持した。
【００７４】
Ｍ４Ｎ処理。Ｃ３細胞（５×１０６）を、１５０−ｍｍプレートに播種し、そしてこのプレートに付着させた。播種から２４時間後、培養物をＰＢＳで２回洗浄し、そして増殖培地と混合した１％  ＤＭＳＯ中に溶解したＭ４Ｎで処理した。
【００７５】
細胞抽出物および免疫ブロット。細胞を、溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＤＴＴ、および５０μｌ／ｍｌプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ）を含有する）中で溶解させた。抽出物のタンパク質濃度を、ブラッドフォードアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって決定し、次いで５０μｇのタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてニトロセルロース膜に電気的に移動（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａｎｓｆｅｒ）（ＥＣＬ）した。膜を、サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびカスパーゼ（ｃａｓｐａｓｅ）−３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対する一次抗体とともにインキュベートした。次いで、ブロットを、抗ウサギビオチン結合体化二次抗体とともに、次いでＡｖｉｄｘ−ＡＰＴＭストレプトアビジン−アルカリホスファターゼとともに、インキュベートし、ＣＳＰＤ（登録商標）基質（Ｔｒｏｐｉｘ）を用いて検出した。
【００７６】
ＲＴ−ＰＣＲ分析。ｍＲＮＡを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇに記載されるように、グアニジニウムチオシアネートおよびフェノールの方法によって、培養細胞から単離した（４０）。３４３−塩基対ＲＴ−ＰＣＲ産物を、サービビンセンスオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＧＣＡＴＣＧＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＣＣＣ−３’およびサービビンアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマー５’−ＣＧＧＧＴＡＧＴＣＴＴＴＧＣＡＧＴＣＴＣＴＴＣＡＡＡＣＴＣ−３’を用いることによって生成した。ＧＡＰＤＨセンスプライマー５’−ＧＡＡＴＣＴＡＣＴＧＧＣＧＴＣＴＴＣＡＣＣ−３’およびＧＡＰＤＨアンチセンスプライマー５’−ＧＴＣＡＴＧＡＧＣＣＣＴＴＣＣＡＣＧＡＴＧＣ−３’を、コントロールとして２３８−塩基対ＲＴ−ＰＣＲ産物を生成するために使用した。ｍＲＮＡアリコートを、２０μｌ反応緩衝液（１ＵのｒＲＮＡｓｉｎおよびＤＮＡｓｅを含有する）中で７５℃で５分間インキュベートし、続いてＭＭＬＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて逆転写反応させた。得られたｃ−ＤＮＡ産物を、以下のＰＣＲ条件下で増幅させた：５５℃で５５秒間、６０℃で５５秒間、および７２℃で１分間の３０サイクル。このＰＣＲ産物を、エチジウムブロマイドを含有する１．８％アガロースゲル上の電気泳動によって分離し、そしてＵＶ下で撮影した。バンドを、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅによって定量化し、そしてサービビンＰＣＲ反応産物のシグナル強度を、ＧＡＰＤＨ  ＰＣＲ産物のシグナル強度に対して規格化して、サービビン遺伝子のダウンレギュレーショングラフを作成した。
【００７７】
Ｃ３細胞においてＳｐ１調節性サービビン遺伝子発現が、Ｍ４Ｎ処理によって減少されるか否かを決定するために、本発明者らは、４０μＭ  Ｍ４Ｎを用いて２４時間および７２時間細胞を処理した。図１に示されるように、Ｍ４Ｎを用いる細胞の処理は、時間依存的な様式でサービビン遺伝子発現の有意な減少を生じた。４０μＭ  Ｍ４Ｎを用いる２４時間および７２時間の処理は、それぞれ、６５％および８０％のサービビン発現の減少を生じた。未処理細胞は、サービビン遺伝子発現においていずれの減少も示さなかった。
【００７８】
サービビンタンパク質はまた、Ｍ４Ｎ処理の７２時間までにダウンレギュレーションされることが免疫ブロットによって示された。このダウンレギュレーションは、投薬量依存性であった（図２）。
【００７９】
（実施例１６）
（Ｍ４Ｎ処置でのアポトーシスの誘導）
本発明者らのデータは、Ｍ４Ｎが、サービビンのｍＲＮＡおよびタンパク質の減少を示したので、本発明者らは、この減少がアポトーシスを誘導するか否かを研究した。なぜなら、サービビンは、抗アポトーシス機能を有するからである。カスパーゼ−３の免疫ブロットによって示されるように（図３）、７２時間のＭ４Ｎの処理は、カスパーゼ−３の活性化をもたらした。この活性化は、Ｍ４Ｎで処理した細胞におけるアポトーシスの増加を生じることが予想される。
【００８０】
本明細書中で引用される参考文献は、便宜のために以下に列挙され、そして本明細書により参考として援用されている。
【００８１】
【表４−１】
2004534025.tif 000012
【００８２】
【表４−２】
2004534025.tif 000013
【００８３】
【表４−３】
2004534025.tif 000014
【００８４】
【表４−４】
2004534025.tif 000015
【００８５】
【表４−５】
2004534025.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】Ｍ４ＮおよびＧ４Ｎの構造。
【図２】図２Ａ。Ｅ６／Ｅ７プロモーター（ｐＰＶ１６Ｐ９７）の領域およびＳｐ１タンパク質の結合部位を示すＨＰＶ−１６  ＬＣＲ。図２Ｂ。Ｃ−３３Ａ細胞におけるＥ６／Ｅ７プロモーター活性に対するＭ４Ｎの効果（異なる濃度のＭ４Ｎによる、Ｅ６／Ｅ７プロモーター駆動ルシフェラーゼ遺伝子転写の阻害）。
【図３Ａ】４０μＭ  Ｍ４Ｎによるウイルス性Ｅ６およびＥ７ＲＮＡ転写物の阻害。４０μＭのＭ４ＮまたはＤＭＳＯのみのいずれかで増殖培地中にて７１時間処理されたＣ３細胞から単離された全ＲＮＡを、相対ＲＴＰＣＲに供した。このＲＴＰＣＲサンプルを、増幅の増加するサイクルの後に取り出し、そしてアガロースゲルに溶かす。ゲル写真（３Ａおよび３Ｂ）は、これらのサイクル、増殖培地中のＭ４Ｎの存在（＋）または非存在（−）およびサイズマーカーとして使用されるｐＧＭＴベクターの２つの消化物を示す。
【図３Ｂ】４０μＭ  Ｍ４Ｎによるウイルス性Ｅ６およびＥ７ＲＮＡ転写物の阻害。４０μＭのＭ４ＮまたはＤＭＳＯのみのいずれかで増殖培地中にて７１時間処理されたＣ３細胞から単離された全ＲＮＡを、相対ＲＴＰＣＲに供した。このＲＴＰＣＲサンプルを、増幅の増加するサイクルの後に取り出し、そしてアガロースゲルに溶かす。ゲル写真（３Ａおよび３Ｂ）は、これらのサイクル、増殖培地中のＭ４Ｎの存在（＋）または非存在（−）およびサイズマーカーとして使用されるｐＧＭＴベクターの２つの消化物を示す。
【図３Ｃ】４０μＭ  Ｍ４Ｎによるウイルス性Ｅ６およびＥ７ＲＮＡ転写物の阻害。４０μＭのＭ４ＮまたはＤＭＳＯのみのいずれかで増殖培地中にて７１時間処理されたＣ３細胞から単離された全ＲＮＡを、相対ＲＴＰＣＲに供した。このＲＴＰＣＲサンプルを、増幅の増加するサイクルの後に取り出し、そしてアガロースゲルに溶かす。増幅マップ（２Ｃ）は、初期ウイルスＲＮＡ転写物の交互スプライシングから得られる２つの予測されるサイズの増幅産物を示す。
【図４Ａ】Ｍ４ＮによるＣ３細胞成長の阻害。
【図４Ｂ】Ｍ４Ｎの除去後のＣ３細胞成長の阻害。
【図５】図５Ａ〜５Ｂ。遺伝子アッセイ分析により試験された場合のＣ３細胞における遺伝子発現に対するＭ４Ｎの効果。５Ａ。ＤＭＳＯ処理の＞２時間後のＣ３細胞において発現された遺伝子（Ｃ３  ＤＭＳＯ）。５Ｂ。溶媒としてＤＭＳＯを使用するＭ４Ｎ処理の＞２時間後のＣ３細胞において発現される遺伝子（Ｃ３  Ｍ４Ｎ）。
【図６】Ｍ４Ｎ処置後の腫瘍保有マウスの視覚的観察。６Ａ。単一の腫瘍を保有するマウスを、ＤＭＳＯ（＃３）またはＭ４Ｎ（＃７）のインサイチュ注射で処置した。Ｍ４Ｎのインサイチュ注射をまた、マウス＃９において成長させた２つの腫瘍のうちの１つに作製した。６Ｂ。同じマウスからの未処理の腫瘍および表２に記載されるようにＭ４Ｎ処置された腫瘍（白色瘢痕）。
【図７】マウスにおける腫瘍成長に対するＭ４ＮおよびＭ４Ｎ／Ｇ４Ｎの組織病理学効果。このパネルの１つめのカラムは、マウス＃１２、１０、２７および２０由来の比較的小さな薬物処置された（Ｍ４ＮまたはＭ４Ｎ／Ｇ４Ｎ）病変（Ｍ４Ｎ）と比較した場合の、ＤＭＳＯ処置（ＣＯＮ）後の、マウス＃４、１０、１２由来の大きなサイズの腫瘍を示す。続く写真は、１００倍の倍率で試験されたこれらの腫瘍の例である（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤＭＳＯ処置されたマウス、Ｄ、未処置のマウス、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｍ４ＮまたはＭ４Ｎ／Ｇ４Ｎ処置されたマウス）（表１および表２）。
【図８】薬物（ＨＳＶ−Ｃ、ＨＳＶ−ＳＣ）の非存在下、無効な薬物（ＡＢＤＳｌ  ［「ＨＳＶ−ＡＢＤＳ１」］、ＡＢＤＳ２［「ＨＳＶ−ＡＢＤＳ２」］）の存在下、有効な薬物（Ｍ４Ｎ［「ＨＳＶ−４Ｎ」］およびＡＣＶ［「ＨＳＶ−ＡＣＶ」］）の存在下でのＨＳＶ−１複製。
【図９Ａ】Ｍ４Ｎは、哺乳動物細胞における成長停止を引き起こす。（ａ〜ｄ）Ｃ３細胞、ＣＥＭ−Ｔ４細胞、Ｃ３３ａ細胞およびＴＣ−１細胞を、異なる濃度のＭ４Ｎで処理した。この実験の開始時に存在する細胞の数は、０日目として示される。３日後、生存細胞の数を計数し、そしてＭ４Ｎ濃度に対してプロットした。
【図９Ｂ】Ｍ４Ｎは、哺乳動物細胞における成長停止を引き起こす。（ａ〜ｄ）Ｃ３細胞、ＣＥＭ−Ｔ４細胞、Ｃ３３ａ細胞およびＴＣ−１細胞を、異なる濃度のＭ４Ｎで処理した。この実験の開始時に存在する細胞の数は、０日目として示される。３日後、生存細胞の数を計数し、そしてＭ４Ｎ濃度に対してプロットした。
【図９Ｃ】Ｍ４Ｎは、哺乳動物細胞における成長停止を引き起こす。（ａ〜ｄ）Ｃ３細胞、ＣＥＭ−Ｔ４細胞、Ｃ３３ａ細胞およびＴＣ−１細胞を、異なる濃度のＭ４Ｎで処理した。この実験の開始時に存在する細胞の数は、０日目として示される。３日後、生存細胞の数を計数し、そしてＭ４Ｎ濃度に対してプロットした。
【図９Ｄ】Ｍ４Ｎは、哺乳動物細胞における成長停止を引き起こす。（ａ〜ｄ）Ｃ３細胞、ＣＥＭ−Ｔ４細胞、Ｃ３３ａ細胞およびＴＣ−１細胞を、異なる濃度のＭ４Ｎで処理した。この実験の開始時に存在する細胞の数は、０日目として示される。３日後、生存細胞の数を計数し、そしてＭ４Ｎ濃度に対してプロットした。
【図９Ｅ】Ｍ４Ｎは、哺乳動物細胞における成長停止を引き起こす。（ｅ）Ｃ３細胞を、１つのフラスコあたり５×１０３個の細胞でＴ−２５フラスコに分割し、そして倍地中１％のＤＭＳＯ中のＭ４Ｎまたは倍地中１％のＤＭＳＯ単独のいずれかを与えた（第１の培地変化）。３日後、Ｍ４Ｎ処理された細胞の半分に、同じ条件を有する新鮮な培地を与えた（第２の培地変化）。これらの細胞を、毎日計数し、そして処理時間に対してプロットした。
【図１０】Ｍ４Ｎで処理された細胞は、Ｇ２／Ｍで停止する。Ｃ３細胞（ａ）、Ｃ３３ａ細胞（ｂ）、ＣＥＭ−Ｔ４細胞（ｃ）、およびＴＣ１細胞（ｄ）を、１％  ＤＭＳＯまたはＭ４Ｎを含む１％  ＤＭＳＯ（Ｍ４Ｎ）のいずれかを含有する培地中で３日間成長させた。これらの細胞をトリプシン処理し、エタノールで固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、続けてフローサイトメトリーで分析した。データを、細胞数（３〜５×１０４個の全細胞）対ヨウ化プロピジウム染色強度として示す。細胞周期の示された段階は標識されそして染色強度により決定した場合の相対的細胞ＤＮＡ全量（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）に対応する。
【図１１Ａ】４０μＭ  Ｍ４Ｎで処理されたＣ３細胞は、Ｇ２細胞構造を実証する。Ｃ３細胞を、１％ＤＭＳＯ（コントロール）または４０μＭのＭ４Ｎを含む１％ＤＭＳＯ（Ｍ４Ｎ）のいずれかを含有する培地中で３日間カバースリップ上で成長させた。サンプルをエタノールで固定し、そしてα（緑色）チューブリンおよびγ（橙色）チューブリンに対する抗体（ａ）またはＤＡＰＩ  ＤＮＡ染料（ｂ）と共にインキュベートした。細胞を、蛍光顕微鏡により試験した。
【図１１Ｂ】４０μＭ  Ｍ４Ｎで処理されたＣ３細胞は、Ｇ２細胞構造を実証する。Ｃ３細胞を、１％ＤＭＳＯ（コントロール）または４０μＭのＭ４Ｎを含む１％ＤＭＳＯ（Ｍ４Ｎ）のいずれかを含有する培地中で３日間カバースリップ上で成長させた。サンプルをエタノールで固定し、そしてα（緑色）チューブリンおよびγ（橙色）チューブリンに対する抗体（ａ）またはＤＡＰＩ  ＤＮＡ染料（ｂ）と共にインキュベートした。細胞を、蛍光顕微鏡により試験した。
【図１２】ＣＤＣ２およびウイルスオンコジーンは、Ｍ４Ｎにより減少する。Ｃ３細胞を、１％  ＤＭＳＯ（Ｄ）または４０μＭ  Ｍ４Ｎを含む１％  ＤＭＳＯ（Ｍ）のいずれかを含有する培地中で異なる量の時間（数字は、時間である）成長させた。特定の時間の後、全タンパク質または全ＲＮＡを、これらの細胞から単離した。ウエスタンブロット（上二つのパネル）を、同じにトロセルロースフィルターを用いてＣＤＣ２に対する抗体またはサイクリンＢに対する抗体を使用して実行した。キナーゼアッセイ（ａ−下二つのパネル）を、サイクリンＢに対する抗体を用いる免疫沈降の後、γ−３２Ｐ  ＡＴＰおよびヒストンＨ１とのインキュベーションにより実行した。ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色は、負荷についてのコントロールとして含まれる。２４時間および７２時間の薬物処理についてのキナーゼアッセイを、別々に行った。ノーザンブロット（ｂ）を、全ＲＮＡ抽出物に対して行った。フィルターを、ランダムプライム３２Ｐ標識ＤＮＡと共にＣＤＣ２またはＧＡＰＤＨについて一晩インキュベートし、洗浄し、そして３日間フィルムに写した。同じフィルターを使用して、ＣＤＣ２およびＧＡＰＤＨ  ＲＮＡを試験した。ｒｔＰＣＲ分析（ｃ）を、ＨＰＶ−１６  Ｅ７またはＧＡＰＤＨのいずれか内の領域にハイブリダイズしているプライマーを用いて全ＲＮＡ抽出物に対して行った。両方のプライマー対を、同じ反応に使用し、そしてその産物を、アガロースゲル電気泳動により分析した。
【図１３Ａ】ＨＩＶ  Ｓｐｌ結合部位（−８７〜−４９）とのＧ４Ｎ相互作用の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）。（Ａ）３２Ｐ標識ＨＩＶ  Ｓｐｌ  ＤＮＡテンプレートに対するＳｐｌ−１６７Ｄの結合のＧ４Ｎ阻害。レーン１、テンプレートのみ；レーン２、テンプレートおよび０．１μｇのＳｐｌ−１６７Ｄ；レーン３〜９、増加する濃度のＧ４Ｎ（０．１  μｇ  Ｓｐｌ−  １６７Ｄの添加前、０．２５〜１．７５ｍＭ）と共にインキュベートされたテンプレート。
【図１３Ｂ】ＨＩＶ  Ｓｐｌ結合部位（−８７〜−４９）とのＧ４Ｎ相互作用の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）。（Ｂ）ＨＩＶテンプレートに結合したＳｐｌ−１６７ＤのＧ４Ｎ置換。レーン１、テンプレートのみ；レーン２、テンプレートおよび０．１μｇのＳｐｌ−１６７Ｄおよび１００倍過剰の非標識テンプレート；レーン３、テンプレートおよび０．１μｇのＳｐｌ−１６７Ｄ；レーン４〜１０、増加する濃度のＧ４Ｎ（０．２５〜１．７５ｍＭ）でチャレンジしたＳｐｌ／ＤＮＡ複合体；レーン１１、１．７５ｍＭのＧ４Ｎを含有する反応緩衝液中でインキュベートしたテンプレート。
【図１３Ｃ】ＨＩＶ  Ｓｐｌ結合部位（−８７〜−４９）とのＧ４Ｎ相互作用の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）。（Ｃ）テンプレートに結合したＧ４ＮのＳｐｌ−１６７Ｄ置換。レーン１、テンプレートのみ；レーン２〜４、テンプレートおよび増加する量のＳｐｌ−１６７Ｄ（０．０７５、０．１５０、０．３００μｇ）；レーン５〜８、１．２ｍＭのＧ４Ｎを含有する反応緩衝液中でインキュベートし、次いで増加する量のＳｐｌ−１６７Ｄ（０．０７５、０．１５０、０．３００μｇ）でチャレンジしたテンプレート、レーン８、Ｓｐｌ−１６７Ｄ投与なし。
【図１３Ｄ】ＨＩＶ  Ｓｐｌ結合部位（−８７〜−４９）とのＧ４Ｎ相互作用の電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）。（Ｄ）使用される（Ａ）…・…および（Ｂ）―・―における増加する濃度のＧ４Ｎに応じて減少するＳｐｌ−１６７Ｄ／ＤＮＡ複合体バンド強度のプロット。使用されるゲルは、５％非変性ポリアクリルアミドであり、各レーンは、実験項および参考文献［１］に記載されるとおりそれぞれ５μｌの反応容積を受容する。
【図１４】Ｃｏｓ細胞におけるＨＩＶ  Ｔａｔ調節トランス活性化（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）のＧ４Ｎによる阻害。
【図１５】Ｇ４Ｎの存在下でのＳＩＶ産生。１０７個の１７４ｘ細胞（ヒトＴ細胞リンパ腫細胞株）を、ＳＩＶ  ｍａｃ  ２３９の２４時間収穫ストック（４ｎｇのｐ２７）と２時間３７℃で混合した。細胞を再懸濁し、そして１００μｌの培地中の１×１０５個の細胞を、３つの９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。新たに作製したストックからの種々の濃度のＧ４Ｎを調製し、そして６つの設計したウェルの各々に添加した。培養上清を４日後および８日後にウイルス産生分析のために収集した。ウイルス産生を、実験項に記載されるように、改変ｐ２７カプシドタンパク質抗原捕捉ＥＬＩＳＡによりアッセイした。
【図１６】Ｈ９細胞におけるＨＩＶ  ｐ２４抗原産生のＧ４Ｎによる阻害。阻害パーセントを、ＡＺＴ耐性ＨＩＶ株であるＨＩＶ−１ＲＴＭＦを用いたウイルス感染後９日目の、Ｇ４Ｎ処理されたＨ９細胞およびＧ４Ｎ処理していないＨ９細胞の２つの２連培養物の平均からｐ２４レベルを比較することにより計算した。
【図１７】サービビン（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ）遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲ分析。（ａ）上：それぞれの２４時間および７２時間（レーン３および４）４０μＭのｍ４Ｎで処理されたＣ３細胞、ならびに未処理のコントロール（レーン１および２）におけるサービビン遺伝子発現。下：対応するＧＡＰＤＨコントロール。バンド強度は、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅを用いて定量した。（ｂ）サービビンＲＴ−ＰＣＲ産物シグナルを、ＧＡＰＤＨコントロールのシグナルに対して正規化し、プロットした。
【図１８】サービビン（ｓｕｒｖｉｖｉｎ）タンパク質の薬物濃度依存性下方調節。（ａ）Ｃ３細胞を、種々の濃度のＭ４Ｎと共に７２時間インキュベートし、そして全細胞溶解物を、サービビンに対して免疫ブロットした。（ｂ）相対バンド強度を、Ｓｃｉｏｎ  Ｉｍａｇｅにより定量し、そしてＭ４Ｎ濃度に対してプロットした。
【図１９】Ｍ４Ｎで７２時間処理されたＣ３細胞におけるカスパーゼ−３切断の免疫ブロット分析。（ａ）カスパーゼ−３のウエスタンブロットは、３２ｋＤのプロカスパーゼ−３の切断および活性な２０ＫＤの切断された産物の形成を示した。（ｂ）バンド強度を定量し、そしてＭ４Ｎ濃度に対してプロットした。
【図１】
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【図２】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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