(57)【要約】レトロウイルスの逆転写酵素と相互作用する核酸分子。当該核酸分子は、本質的に、２つのステムループ構造と２つのステム間の短いブリッジとで構成されたヌクレオチド配列を含み、逆転写酵素との相互作用を目的とした当該分子は、哺乳動物のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のジヒドロウリジン（Ｄ）−ステムループおよびアンチコドン（Ａ）−ステムループに類似する。必要であれば、核酸分子において、通常のホスホジエステルヌクレオシド結合のいくつかまたは全部がホスホロチオエート結合で置換されている。本発明はさらに、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の逆転写酵素とｔＲＮＡＬｙｓ３との相互作用を阻害する薬剤を製造するための、前記核酸分子の使用に関する。
2004507244.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レトロウイルスの逆転写酵素と相互作用する核酸分子であって、本質的に２つのステムループ構造と２つのステム間の短いブリッジとで構成されたヌクレオチド配列を含み、逆転写酵素との相互作用を目的とした当該分子は、哺乳動物のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のジヒドロウリジン（Ｄ）−ステムループおよびアンチコドン（Ａ）−ステムループに類似しており、少なくとも以下の構造要素：Ｄ−ステム鎖１、Ｄ−ループ、Ｄ−ステム鎖２、１〜３塩基のブリッジ、Ａ−ステム鎖１、Ａ−ループ、Ａ−ステム鎖２の部分を含み、必要であれば、当該分子において、通常のホスホジエステルヌクレオシド結合のいくつかまたは全部がホスホロチオエート結合で置換されている、前記核酸分子。
【請求項２】
配列は、哺乳動物のｔＲＮＡに類似しており、以下の５′末端からの構造：Ｄ−ステム鎖１、Ｄ−ループ、Ｄ−ステム鎖２、１〜３塩基のブリッジ、Ａ−ステム鎖１、Ａ−ループ、Ａ−ステム鎖２を有する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
配列は、Ａ−ステム鎖２の末端に結合した対になっていない塩基をさらに含む、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項４】
ＲＮＡ分子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項５】
Ｄ−ステム鎖１、Ｄ−ステム鎖２およびＡ−ステム鎖１における少なくとも１つのヌクレオチドにおいて、リボースが２′−Ｏ−メチルリボースで置換される、請求項４に記載のＲＮＡ分子。
【請求項６】
Ｄ−ステム鎖１、Ｄ−ステム鎖２およびＡ−ステム鎖１における全てのヌクレオチドにおいて、全てのリボースが２′−Ｏ−メチルリボースで置換される、請求項５に記載のＲＮＡ分子。
【請求項７】
１〜３塩基のブリッジにおいても、全てのリボースが２′−Ｏ−メチルリボースで置換される、請求項５または６に記載のＲＮＡ分子。
【請求項８】
配列番号２に示され、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の逆転写酵素と相互作用する、請求項４〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子。
【請求項９】
配列番号３に示され、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の逆転写酵素と相互作用する、請求項４〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子。
【請求項１０】
配列番号４に示され、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の逆転写酵素と相互作用する、請求項５〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子。
【請求項１１】
配列番号５に示され、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の逆転写酵素と相互作用する、請求項５〜７のいずれか一項に記載のＲＮＡ分子。
【請求項１２】
医薬として使用される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１３】
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の逆転写酵素とｔＲＮＡＬｙｓ３との相互作用を阻害する医薬として使用される、請求項１２に記載の核酸分子。
【請求項１４】
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の逆転写酵素とｔＲＮＡＬｙｓ３との相互作用を阻害する医薬を製造するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子の使用。
【請求項１５】
ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の逆転写酵素とｔＲＮＡＬｙｓ３との相互作用を阻害する方法であって、このような治療が必要なヒトに、阻害に有効な量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載の核酸分子を投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
配列番号６に示され、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２逆転写酵素と相互作用し、そしてｔＲＮＡＰｒｏにおける塩基番号１０〜４３に対応する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項１７】
医薬として使用される、請求項１６に記載の核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、レトロウイルスの逆転写酵素と相互作用する新規の核酸分子に関する。当該核酸分子は、本質的に、２つのステムループ構造と２つのステム間の短いブリッジとで構成された配列を含み、逆転写酵素との相互作用を目的とした当該分子は、哺乳動物のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のジヒドロウリジン（Ｄ）−ステムループおよびアンチコドン（Ａ）−ステムループと類似する。また本発明は、医薬としての新規の核酸分子の使用、同様に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の逆転写酵素とｔＲＮＡＬｙｓ３との相互作用を阻害する医薬を製造するためのこれら分子の使用に関する。本発明はさらにＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の逆転写酵素とｔＲＮＡＬｙｓ３との相互作用を阻害する方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
世界的に、レトロウイルスは、全てのヒト悪性腫瘍の約１．６〜２パーセントを引き起こすと考えられている（Ｂｌａｔｔｎｅｒ， Ｗ．Ａ．， Ｐｒｏｃ． Ａｓｓｏｃ． Ａｍ． Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ （１９９９） １１１（６）， ５６３−７２）。レトロウイルスは、複雑なメカニズムを用いて、それらのＲＮＡゲノムを二本鎖ＤＮＡに逆転写し、続いて、宿主細胞のゲノムＤＮＡに挿入させる。第一段階において、一本鎖ＲＮＡゲノムは、逆転写酵素（ＲＴ）と呼ばれるウイルスがコードする酵素を用いて、一本鎖ＤＮＡに複製される。このポリメラーゼは、ウイルスゲノムのＲＮＡ鎖（ＲＮＡｖ）とｔＲＮＡ分子との両方と相互作用し、三重複合体を形成する能力があり、当該三重複合体は、ＲＮＡｖの逆転写を開始する。２種のＲＮＡ分子（ＲＮＡｖおよびｔＲＮＡ）は、ＲＴ分子の異なる単位と相互作用する。重合は、ＲＮＡｖのプライマー結合部位（ＰＢＳ）にハイブリダイズしたｔＲＮＡ部分から開始される。用いるｔＲＮＡは、侵入した宿主から獲得する。ｔＲＮＡの３′末端の初めの１８個のヌクレオチドは、ＲＮＡｖのＰＢＳに相補的である。当該ｔＲＮＡの３′末端は、重合の開始部位であり、ヌクレオチドを取り込むことによってＲＮＡｖの５′末端へ進行する。ＲＮＡｖ鎖の一部に相補的なＤＮＡ鎖が最初に得られる。
【０００３】
ヒトに感染することがわかっている外来レトロウイルスに加えて、特徴付けられた内在性レトロウイルスが存在する。これらのレトロウイルスは、ゲノムに取り込まれ、次世代に繁殖するが、これらはヒトゲノムの約０．５％を構成すると考えられている（Ｂｉｅｄａ， Ｋ．， Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ａ．， Ｂｏｌｌｅｒ， Ｋ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． （２００１）， ８２（３）， ５９１−６）。他のレトロウイルスが研究されており、それらに関して、それらが外来性が内在性かはわかっていない。その一つの例は、いくつかのヒトの乳癌におけるプロウイルス構造であって、これらは、マウス乳腺癌ウイルスであるＭＭＴＶと９５％の相同性を有する９．９ｋｂのプロウイルスである（Ｌｉｕ， Ｂ．， Ｗａｎｇ， Ｙ．， Ｍｅｌａｎａ， Ｓ．Ｍ．， Ｐｅｌｉｓｓｏｎ， Ｉ．， Ｎａｊｆｅｌｄ， Ｖ．， Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｊ．Ｆ．， Ｐｏｇｏ， Ｂ．Ｇ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （２００１）， ６１， １７５４−１７５９）。
【０００４】
最も研究されたレトロウイルスの一つは、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）である。その理由は、深刻な疾患であるＡＩＤＳを治癒するための薬物を見出すためであり、ＡＩＤＳはレトロウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２により引き起こされ、レトロウイルスＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２は特定の型のＴリンパ球（ＣＤ４＋）、樹状細胞およびマクロファージに感染し、それらを死滅させる。今日、ＨＩＶウイルスのＲＮＡ／ＤＮＡ転写メカニズムの知見に基づき、数種のいわゆるＡＺＴ型のヌクレオチド類似体が阻害薬物として用いられる。化学的に、これらのヌクレオチドは、ＤＮＡ合成中、次に続くヌクレオチドの取り込みに必要な３′のヒドロキシ基を欠いている。このようなヌクレオチドが配列中に組み込まれる場合、重合が停止し、ウイルスＤＮＡは形成されない。感染が中断する。ＨＩＶ逆転写酵素は、多くの他のポリメラーゼに組み込まれているプルーフリーディングの様式を欠く。これは、重合中の変異頻度が極めて高いことを意味し、それにより類似体の取り込みを防ぐ新しい変異ＲＴ分子が生じる。類似体への耐性が得られ、従って薬物への耐性が得られる。このタイプの療法において、次に、同時に数種の異なるヌクレオチド類似体を用いて、耐性の危険を最小化することが必要である。現在の療法は、活発なＨＩＶ感染中に死滅するＣＤ４＋Ｔリンパ球を再生させるのに効果的である。３〜１２ヶ月の治療期間中に、９０〜９９％のリンパ球が再生可能である。しかしながら、成長するマクロファージや樹状細胞のような細胞中でもＨＩＶが複製され、従ってウイルスは非常にゆっくり複製されるため、治療を中断することができない。次に、これらの細胞は、ウイルスの貯蔵庫的な役割を果たし、治療を中断すると、迅速に患者の血液が高いウイルス含量状態に戻ってしまい、その後、再生したＣＤ４＋Ｔリンパ球プールが枯渇する。従って、遅いウイルス複製を特徴とする細胞にも効果的な治療は、多大な必要性を有する。
【０００５】
ヌクレオシド類似体阻害剤、同様に、非ヌクレオシド類似体阻害剤に対して耐性なＲＴの数種の変異体が生じ、ＡＩＤＳ治療を妨げることがわかっている（Ａｎｔｉｖｉｒａｌｓ Ａｇａｉｎｓｔ ＡＩＤＳ， ｅｄｓ Ｕｎｇｅｒ， Ｒ．Ｅ．， Ｋｒｅｕｔｅｒ， Ｊ．， Ｒｕｂｓａｍｅｎ−Ｗａｉｇｍａｎｎ， Ｈ．， （２０００） Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｂａｓｅｌ， ｐ８０）。従って、現在利用可能な療法中に起こる変異に効果的な阻害剤が必要である。
【０００６】
このような耐性を回避するためのアプローチの一つは、ｔＲＮＡとＲＴ分子との間の特異的な相互作用をブロックすることである。逆転写酵素は、それらＲＴのアミノ酸残基と相互作用可能なブロッキング剤（他の方法でプライマーｔＲＮＡ分子と特異的に結合する）によって阻害されるが、それらの残基が変異することによって、ブロッキング剤のみに耐性となり、同時にｔＲＮＡと結合するその能力を失うので、もはや機能できなくなる。言い換えれば、ＲＴ分子がブロッキング剤の阻害を回避するような変異はまた、ＤＮＡ合成のためのプライマーとしてｔＲＮＡを用いるＲＴ分子の能力も奪う。
【０００７】
多くの研究における主題は、ポリメラーゼＲＴ、およびそのＲＮＡｖとｔＲＮＡとの複合体にある。特に、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２のＲＴ、およびその同種のｔＲＮＡ、すなわちｔＲＮＡＬｙｓ３との安定な複合体が、集中的に研究されてきた。ＨＩＶ−１ＲＴ存在および非存在下で、膵臓リボヌクレアーゼでプライマーを消化することによって、ＨＩＶ−１ＲＴとｔＲＮＡＬｙｓ３との間の相互作用に関与するｔＲＮＡＬｙｓ３の領域が研究されてきた。それによれば、酵素ＨＩＶ−１ＲＴは、ｔＲＮＡＬｙｓ３の、アンチコドンループのテトラヌクレオチドとジヒドロウリジンループのトリヌクレオチドとを保護することが示された（Ｓａｒｉｈ−Ｃｏｔｔｉｎ， Ｌ．， Ｂｏｒｄｉｅｒ， Ｂ．， Ｍｕｓｉｅｒ−Ｆｏｒｓｙｔｈ， Ｋ．， Ａｎｄｒｅｏｌａ， Ｍ−Ｌ．， Ｂａｒｒ， Ｐ．Ｊ．， Ｌｉｔｖａｋ， Ｓ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｌｏｌ． （１９９２） ２２６， １−６）。同じ参考文献において、ｔＲＮＡＬｙｓ３のアンチコドンステムおよびループまたはジヒドロウリジンステムおよびループに対応した異なる合成オリゴリボヌクレオチドがそれぞれ製造されており、これらヌクレオチドはＨＩＶ−１ＲＴを阻害し、これらｔＲＮＡ領域とＨＩＶ−ＲＴとの間の相互作用を示すことがわかった。
【０００８】
他の研究において、ｔＲＮＡＬｙｓ３アクセプターステムまたはアンチコドンステムおよびループに対応する配列を有するホスホロチオエート形態のＤＮＡ断片によるＨＩＶ−ＲＴの阻害が調査された（Ｅｌ Ｄｉｒａｎｉ−Ｄｉａｂ， Ｒ．， Ｓａｒｉｈ−Ｃｏｔｔｉｎ， Ｌ．， Ｄｅｌｏｒｄ， Ｂ．， Ｄｕｍｏｎ， Ｂ．， Ｍｏｒｅａｕ， Ｓ．， Ｔｏｕｌｍｅ， Ｊ−Ｊ．， Ｆｌｅｕｒｙ， Ｈ．， Ｌｉｔｖａｋ， Ｓ．， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， （１９９７）， ４１， Ｎｏ．１０， ２１４１−２１４８）。通常のＤＮＡヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの両方を、ホスホロチオエート形態で製造した。いずれの場合においても、ヌクレオチド配列はぞれぞれ、ｔＲＮＡＬｙｓ３の異なる２次構造要素に対応していた。参考文献によれば、通常のＤＮＡヌクレオチドが用いられた場合、４０μＭもの高い濃度で用いられたとしても、阻害は観察されなかった。ホスホロチオエート形態のＤＮＡヌクレオチドを用いた場合、ＨＩＶ−１ＲＴの阻害が観察された。
【０００９】
これまで、これらの発見に基づいた療法は利用されていない。従って、本発明の目的は、レトロウイルスの逆転写酵素との相互作用に対して高い親和性を有する核酸分子を提供することである。他の目的は、レトロウイルスの逆転写酵素へのプライマー分子の接近をブロックする十分に高い能力を有する核酸分子を提供することである。特に、本発明の目的は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の逆転写酵素と相互作用する分子である。
【００１０】
本発明の他の目的は、医薬として用いるために、レトロウイルスの逆転写酵素と相互作用する核酸分子である。
さらなる本発明の目的は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の逆転写酵素とｔＲＮＡＬｙｓ３との相互作用を阻害する医薬を製造するための、レトロウイルスの逆転写酵素と相互作用する核酸分子の使用である。
【００１１】
【発明の要約】
本発明の目的は、特許請求の範囲で請求されたような核酸分子によって達成される。本発明によれば、レトロウイルスの逆転写酵素と相互作用する核酸分子が提供され、当該分子は、本質的に２つのステムループ構造と２つのステム間の短いブリッジとで構成されるヌクレオチド配列を含み、逆転写酵素との相互作用を目的とした当該分子は、哺乳動物のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のジヒドロウリジン（Ｄ）−ステムループおよびアンチコドン（Ａ）−ステムループ配列と類似する。前記配列は、以下のｔＲＮＡ構造要素：Ｄ−ステム鎖１、Ｄ−ループ、Ｄ−ステム鎖２、１〜３塩基のブリッジ、Ａ−ステム鎖１、Ａ−ループ、Ａ−ステム鎖２の少なくともいくつかを示す。前記核酸分子の主鎖において、正常なホスホジエステル結合のいくつかまたは全部が、ホスホロチオエート結合で置換されてもよい。本発明の好ましい核酸分子は、哺乳動物のｔＲＮＡと類似して、前記構造要素を、５′末端から、Ｄ−ステム鎖１、Ｄ−ループ、Ｄ−ステム鎖２、１〜３塩基のブリッジ、Ａ−ステム鎖１、Ａ−ループ、Ａ−ステム鎖２の順番で有する。
好ましくは、当該核酸分子は、最後の塩基として対になっていない塩基を有する。
【００１２】
本発明の他の観点によれば、上記で定義された核酸分子は、医薬として用いられる。
本発明のさらなる観点は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の逆転写酵素とｔＲＮＡＬｙｓ３との相互作用を阻害する医薬を製造するために同定された核酸分子の使用である。
【００１３】
また、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の逆転写酵素とｔＲＮＡＬｙｓ３との相互作用を阻害する方法を示す。当該方法は、上記で定義したような核酸分子の阻害に有効な量をこのような治療が必要なヒトに投与することを含む。
【００１４】
複製することが知られている全てのレトロウイルスは、それらのＲＮＡゲノム上でＤＮＡ合成をプライミングするために、宿主細胞のｔＲＮＡを利用することができるメカニズムを共有する。全ての哺乳動物のｔＲＮＡは、同じ塩基のフォールディングを共有し、共通の二次元的なワトソン−クリック塩基対合パターンの表示は、「クローバー葉」構造として知られており、これは７３〜９３個のリボヌクレオチドを含む。遺伝子配列は種間で高度に保存されており、ｔＲＮＡＬｙｓ３遺伝子の配列は、ウサギやヒトの多岐にわたる生物間で同一である。上記クローバー葉構造／塩基対合パターンは、哺乳動物のｔＲＮＡで高度に保存されている。その結果、ｔＲＮＡアンチコドンおよびジヒドロウリジンステムループと相互作用する逆転写酵素の表面を遮断する方法（メカニズム）は、哺乳動物のｔＲＮＡのＤ−ステムループおよびＡ−ステムループと類似した配列および／または構造を有し、正しく分離したループを有し、天然のｔＲＮＡループの保存された塩基を含む核酸分子を、上記表面と相互作用させることによって、一般的に適用できる。
【００１５】
当業界の現状と比較して、本発明の分子は、既知のより短い断片が１個である代わりに、２個の主要な逆転写酵素への結合部分を有するのに十分長い分子であるという利点を有する。
核酸分子、特に、ＲＮＡ分子は、非常に不安定であることがよく知られている。また本発明によれば、驚くべきことに、リボヌクレオチドの結合のいくつかまたは全部のリン酸基をホスホロチオエート基で置換することによって、Ｄ−ステムループとＡ−ステムループとの両方を含む長い、安定なＲＮＡ分子を合成することが可能なことが見出された。
【００１６】
【発明の詳述】
本発明に係る核酸分子は、好ましくは、３４〜３５個のヌクレオチドを含むが、より短い変異型またはより長い変異型も可能である。上記で定義したような核酸分子に関する命名法は、天然のｔＲＮＡに関する通常の命名法と類似する（図１を参照）。名前付けは、ステムの第一鎖を含む５′末端から始まり、ジヒドロウリジンループへと続く。これは、Ｄ−ステム鎖１である。次に、ジヒドロウリジンループへと続き、その後Ｄ−ステム鎖２に続く。そのＤ−ステム鎖２は、１〜３塩基のブリッジによってステムの第一鎖に連結し、アンチコドンループへと続く。この後半の鎖は、Ａ−ステム鎖１と名付けられる。次に、アンチコドンループとＡ−ステム鎖２とが続く。当該配列の末端に、対になっていない塩基が存在しうる。好ましい実施形態において、この塩基は、ＤＮＡ塩基である。
【００１７】
本発明は、ＤＮＡ、同様にＲＮＡ分子を扱っており、さらに、いくつかの塩基がＤＮＡであり、他がＲＮＡであるキメラオリゴヌクレオチドも扱う。本発明のオリゴヌクレオチドの主鎖は、それら全体において、多くは標準的なホスホジエステル結合からなるが、好ましい実施形態において、これらのいくつかまたは全部がホスホロチオエート結合で置換される（以下参照）。本発明に従ってオリゴヌクレオチドを設計する際の論理的根拠は、酵素による分解に対する分子の安定性および耐性、同様に、当該分子のその逆転写酵素標的に対する結合ジオメトリーのなどの要素を考慮することである。これらを考慮することにより、ＤＮＡ／ＲＮＡ含量、および、ホスホジエステル／ホスホロチオエート結合の割合の両方の点で異なる組成を有するオリゴヌクレオチドが得られる。本発明に従って改変された主鎖を有する適切なキメラＲＮＡ／ＤＮＡ分子の製造は、本発明の原理が明確になれば、十分に当業者の理解の範囲内である。
【００１８】
本発明の目的のために、本発明の核酸分子とウイルス性の逆転写酵素との相互作用に必要なこれら構造要素またはその部分は、前記核酸分子が十分な安定性を保持する程度に含まれていればよい、ということを特筆する。それゆえに、本発明はまた、変異型を含むことを想定しており、当該変異型において、２つのステムループ要素または連結するブリッジのヌクレオチドの数は、必ずしも天然のｔＲＮＡにおける数とは限らない。当該核酸分子が上述した２つのステムループ構造と同等の機能を示してさえいれば、当該核酸分子は本発明の範囲内に含まれる。本発明の実施形態とみなされる変異型はまた、例えば、本明細書で説明された核酸分子の環状の配列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を含み、当該環状の配列において、異なるステム−ループ配列の順番が改変されているが、２次構造は変化することなく保持される。その上、本発明はまた、Ａ−ステム鎖２への伸長が上述したブリッジにおける１以上の塩基に相補的である変異型を含むことも想定される。
【００１９】
本発明の分子は、レトロウイルスの逆転写酵素の相互作用を阻害するのに有用である。本明細書の文章において、「レトロウイルス」は、外来性および内在性レトロウイルスの両方を含むものとする。
本発明の核酸分子と逆転写酵素との「相互作用」は、互いの分子の安定な結合を含むことを意味し、同様に、いずれの２種が、相互作用の結果として開裂または崩壊を起こす相互作用のいずれをも含むことを意味する。
【００２０】
ｔＲＮＡの特色の特徴付けは、ｔＲＮＡが通常でない塩基、例えば、アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）の誘導体を含むことにある。本発明の好ましい実施形態によれば、これらの天然に存在する誘導体は、本発明の核酸分子の興味のあるｔＲＮＡ要素への類似を最大化するのに用いられる。しかしながら、このような通常でない誘導体を含む分子の合成は、もっぱら「典型的な」塩基であるＡ、Ｃ、Ｇ、Ｕ／Ｔからなる分子の合成より複雑で、費用がかかる。従って、特定の場合において、合成の経済性または簡単さの理由で、このような典型的な塩基を用いることが好ましい。
【００２１】
本発明に係る核酸分子をさらに安定させるために、この分子がＲＮＡ分子である場合、Ｄ−ステム鎖１、Ｄ−ステム鎖２およびＡ−ステム鎖１における１以上のヌクレオチド中のリボースが、２′−Ｏ−メチルリボースで置換されることが好ましい。その上、Ｄ−ステム鎖２とＡ−ステム鎖１とを連結するブリッジ中のリボースが、２′−Ｏ−メチルリボースで置換されることが好ましい。このＲＮＡ分子の特に好ましい実施形態において、Ｄ−ステム鎖１、Ｄ−ステム鎖２およびＡ−ステム鎖１における全てのヌクレオチド中のリボースが、２′−Ｏ−メチルリボースで置換され、ブリッジ中も同様である。上記の位置にメチル基を付加することによって、当該分子の加水分解に対する感受性を低くする。興味深いことに、かつ驚くべきことに、これら特定の位置へ２′−Ｏ−メチルリボースを導入して補強することにより、分解に対して特に有益な様式で耐性を有する分子が生産される。
【００２２】
本発明は、特に、ｔＲＮＡＬｙｓ３に適用でき、ｔＲＮＡＬｙｓ３は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の逆転写酵素によるＤＮＡ重合の開始のプライミングに用いられるｔＲＮＡである。天然のｔＲＮＡＬｙｓ３の全体の配列は、７６個の塩基を含み、配列リストの配列番号１に示される。本発明の実施形態によれば、ｔＲＮＡＬｙｓ３における塩基番号１０〜４４に相当する３５個の塩基のＲＮＡ分子が得られるが、全てのホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート結合で置換される。このＲＮＡ分子の配列は、配列番号２に示される。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、ｔＲＮＡＬｙｓ３における塩基番号１０〜４３に相当するＲＮＡ分子が製造され、当該ＲＮＡ分子において、ホスホロチオエート結合のそばで、天然に存在するヌクレオチド誘導体が、対応する改変されていないＡ、Ｇ、ＣおよびＵヌクレオチドで置換されている。この分子の配列は、配列番号３に示される。他の好ましい実施形態は、配列番号４に示され、配列番号３に示されるような分子において、通常のリボースが２′−Ｏ−メチルリボースで置換するような方法で、塩基１〜４および１３〜２１で改変される。配列番号４における配列の番号付けは、配列番号３における塩基番号１から始まる。メチル化塩基は、Ｄ−ステム１および２における塩基、ブリッジの塩基およびＡ−ステム１における塩基である。配列番号４に示されるような配列においては、さらに対になっていない塩基が付加されており、当該塩基はデオキシリボース塩基であり、従ってこのヌクレオチドはＤＮＡヌクレオチドである。配列番号３および配列番号４の配列を有する２種の分子が、下記の実験セクションＡでの結合実験で用いられる。
【００２４】
本発明に係る特に好ましい分子は、配列において配列番号４に類似する分子であるが、当該分子は、ｔＲＮＡＬｙｓ３により類似させるために、いくつかの天然に存在するヌクレオチド誘導体が取り込まれている。その上、この分子において、１８位の２′−Ｏ−メチルリボースが、通常のリボースに戻されている。この分子の配列は配列番号５に示され、下記の実験セクションＢの比較実験で用いられる。
【００２５】
本発明に従って、配列番号６に示されるような、ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２逆転写酵素と相互作用するＲＮＡ分子も提供される。この配列は、天然のｔＲＮＡＰｒｏにおける塩基１０〜４３に対応するが、ホスホロチオエート結合を有する。
【００２６】
本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
Ａ．本発明の核酸分子とＨＩＶ−１ＲＴのＲＮアーゼＨ不活性変異体との複合体形成の研究
実験方法
実施例Ａ１
初めに、ＨＩＶ−１から精製したＲＴと相互作用し、生化学的な方法で可視化するのに十分安定な複合体を形成すべき合成分子を製造する。
化学法
配列において、ＲＴと相互作用するｔＲＮＡＬｙｓ３の配列に類似しているが同一でないＲＮＡ（３４−ｍｅｒ）を合成するのに、ホスホアミダイト化学法を用いる。トランスファーＲＮＡ分子は、多数の改変ヌクレオチドを含み、当該改変ヌクレオチドは通常の非改変ヌクレオチドの誘導体である。ｔＲＮＡＬｙｓ３の配列と合成の３４−ｍｅｒとを比較すると、当該改変ヌクレオチドは、以下のように置換されている：１位（ｔＲＮＡＬｙｓ３においてはＮ２−メチル−グアノシン、３４−ｍｅｒにおいてはグアノシン）；７位および１１位（ｔＲＮＡＬｙｓ３においてはジヒドロウリジン、３４−ｍｅｒにおいてはウリジン）；１８位および３０位（ｔＲＮＡＬｙｓ３においてはプソイドウリジン、３４−ｍｅｒにおいてはウリジン）；２５位［ｔＲＮＡＬｙｓ３においては５（メトキシカルボニルメチル）−２−チオウリジン、３４−ｍｅｒにおいてはウリジン］；および最後に、２８位［ｔＲＮＡＬｙｓ３においてはＣ２−メチルチオ−Ｎ６−（スレオニンカルボニル）−アデノシン、３４−ｍｅｒにおいてはアデノシン］。
【００２７】
合成
合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（ＡＢＤ）のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーモデル３９４を用いて、１．０μｍｏｌの合成スケールで行う。粗オリゴヌクレオチドの最終収率は、２３２ｎｍｏｌである。全ての単量体ヌクレオチドは、Ｆｐｍｐで保護された２′−水酸基を有するリボヌクレオチドである（Ｒｅｅｓｅ， Ｃ．Ｂ．， Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｅ．Ａ．， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ． １ （１９８８）， ２２８１）。ヌクレオシドであるリボアデノシンおよびリボシチジンにおける環外のアミンはベンゾイル（ｂｚ）基で保護され、それに対し、リボグアノシンにおけるアミノ基はイソブチリル（ｉｓｏｂｕ）で保護される。リボウリジンヌクレオシドは、保護が必要ないかなるアミノ基も有さない。全ての単量体ヌクレオチドは、それらの５′−水酸基においてジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基により保護され、リン原子はシアノエチル基で保護される。合成された配列は配列番号３に示される。
ヌクレオチド間の通常のホスホジエステル結合は、全てホスホロチオエート結合で置換され、従って、リン原子上の酸素原子の一つは、硫黄原子で置換される。このようなオリゴヌクレオチド主鎖の改変により、多くのリボヌクレアーゼに対して耐性にすることができ、それにより、オリゴヌクレオチドを用いた実験作業を簡便にする。
【００２８】
合成は、３′から５′の方向へ、固形支持体である制御細孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｐｏｒｅ Ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ；孔サイズは１０００Å）に共有結合した末端の３′リボアデノシンヌクレオチドを用いて行われる。それぞれの合成工程に以下の追加の試薬が用いられる。
（ｉ）５′ＤＭＴ保護基の除去は、無水（＜５０ｐｐｍの水）ジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解させた３％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）での処理によって達成される。この溶液（ＤＣＡ／ＤＣＭ）を、ＣＰＧを含むカラムに５〜８×１２秒で送り、配送の間に５秒の待機工程を設ける。当該反応を、無水（＜１０ｐｐｍの水）アセトニトリルでの集中的なリンスによって中断する。
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドの伸長（カップリング反応）は、正しいホスホアミダイトヌクレオチド（無水アセトニトリル中、１００ｍＭの濃度）および活性化剤の５−エチル−チオ−１Ｈ−テトラゾール（無水アセトニトリル中、５００ｍＭの濃度）とを同時に添加することによって行われる。ＣＰＧ結合ヌクレオチドに対してアミダイトのモルは２０倍過剰である。活性化剤／アミダイト溶液を、４００秒の待機工程をはさんで２回に分けて反応させ、続いて２００秒のさらなる待機工程を設けた。当該反応をアルゴンガスリンスで停止させ、続いて無水アセトニトリルで集中的にリンスする。
【００２９】
（ｉｉｉ）リン原子の酸化は、無水アセトニトリル中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬の５０ｍＭ溶液を用いた反応によりなされる。再び、反応をアルゴンガスリンスで停止させ、続いて無水アセトニトリルで集中的にリンスする。
（ｉｖ）加えられた最後の塩基にカップリングしなかったオリゴヌクレオチド鎖の終結は、無水酢酸／ピリジン／テトラヒドロフランおよびＮ−メチルイミダゾール／テトラヒドロフランの混合物との反応によってなされる（キャッピング反応）。当該反応は、アルゴンガスリンスの１２秒後に停止され、続いて無水アセトニトリルで集中的にリンスする。
上述の反応工程は、「合成サイクル」を構成し、オリゴヌクレオチドの全部の配列が得られるまで繰り返される。
【００３０】
開裂および脱保護は、オリゴヌクレオチドが結合したＣＰＧを、テフロンで被覆したねじ蓋を有するガラス管に移送することによって行われる。アンモニア溶液（３５％）を加え（１．０ｍｌ）、６０〜９０分、室温（２０〜２５℃）で上記ＣＰＧからオリゴヌクレオチドを開裂させる。次に、そのバイアルを５５〜６０℃のオーブンに移送し、塩基の保護基（ｂｚおよびｉｓｏｂｕ）を除去するためにさらに１２〜１８時間インキュベートする。
その溶液を＋４℃に冷却し、０．１％ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ水）を含むＭｉｌｌｉＱ１８．２ＭΩ水で平衡化したセファデックスＧ−２５（ＤＮＡグレード）によるゲルろ過によって、低分子量の分子が分離される。当該オリゴヌクレオチドを４．５ｍｌポリプロピレン管に溶出させ、１２〜１８時間凍結乾燥する。
その乾燥物を１．０ｍｌの低ｐＨ緩衝液（水／ピリジン／ギ酸；ｐＨ２〜３）に再懸濁して、２′−Ｆｐｍｐ保護基を除去する。当該リボオリゴヌクレオチドはこの溶液には溶解しないが、脱保護されるまで沈殿を形成する。このようにして、２′−Ｆｐｍｐ基の除去により、当該リボオリゴヌクレオチドを可溶性にする。その混合物を高回転でボルテックス混合し、沈殿が完全に溶解するまで反応させる（２４〜３６時間）。その溶液を２００μｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウムの添加により中和し、直ちに、ＤＥＰＣ水で平衡化したセファデックスＧ−２５（ＤＮＡグレード）によるゲルろ過で低分子量の分子を分離する。当該オリゴヌクレオチドを、ＤＥＰＣ水中でリンスし５５〜６０℃に加熱したコハク色のガラスバイアルに１．８ｍｌ溶出させる。アリコートを分取し、Ａ２６０測定用および当該リボオリゴヌクレオチドの最終量の測定用に希釈する。
残りのリボオリゴヌクレオチドを乾燥状態になるまで１６〜２４時間凍結乾燥する。
水ベースの緩衝液中に再溶解させた後、当該リボオリゴヌクレオチドをＨＩＶ−１ウイルスのＲＴへの結合実験に用いる。
【００３１】
実施例Ａ２：
この実施例において、ヒトｔＲＮＡＬｙｓ３分子の部分と配列相同性を有する３５−ｍｅｒのキメラＲＮＡ／２′−Ｏ−メチル−ＲＮＡ／ＤＮＡ分子を合成する。
粗合成混合物中に存在する非完全長分子の混雑を排除または最小化するため、標的の３５−ｍｅｒ分子を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ；以下参照）で精製する。
化学法
実施例Ａ１で説明したのと本質的に同じ化学が３５−ｍｅｒの合成に用いられる（実施例Ａ１の化学法参照）。しかしながら、合成の質を向上させるために以下の重要な変更がなされる。
（ｉ）合成は、上記と同じ器具で行われるが、合成スケールは１５．０μｍｏｌである。
（ｉｉ）用いられる活性化剤は、４，５−ジシアノイミダゾールであり、無水アセトニトリル中、０．８Ｍの濃度である。
（ｉｉｉ）ＣＰＧ結合ヌクレオチドに対して、ホスホアミダイトヌクレオチドのモルは、１０倍だけ過剰である。
（ｉｖ）デオキシグアノシンヌクレオチドは、３′末端に付加される。
（ｖ）以下の２′−ヒドロキシルＲＮＡヌクレオチド、すなわち１〜４および１３〜２１は、それらの２′−Ｏ−メチル対応物で置換される。当該配列は、配列番号４に示される。
上記のように、全てのヌクレオチド間の結合は、ホスホロチオエート結合である。
【００３２】
合成サイクルは、合成スケールにおける１．０〜１５．０μｍｏｌの増加に従って変化させる。詳細を以下に記す。
（ｉ）５′ＤＭＴ保護基の除去は、無水（＜５０ｐｐｍの水）ジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解させた３％ジクロロ酢酸（ＤＣＡ）での処理によってなされる。この溶液（ＤＣＡ／ＤＣＭ）を、４×３０秒、および３×２０秒でＣＰＧを含むカラムに送る。配送間の待機工程は設けない。当該反応を、無水（＜１０ｐｐｍの水）アセトニトリルの集中的なリンスによって中断させる。
（ｉｉ）オリゴヌクレオチドの伸長（カップリング反応）は、正しいホスホアミダイトヌクレオチド（無水アセトニトリル中、１００ｍＭの濃度）および活性化剤の４，５−ジシアノイミダゾール（無水アセトニトリル中、８００ｍＭの濃度）を同時に添加することによって行われる。ＣＰＧ結合ヌクレオチドに対するアミダイトのモルは１０倍過剰である。活性化剤／アミダイト溶液を、１０秒の待機工程をはさんで５回に分けて７秒で反応させ、続いて、最後の反応の後に２００秒の待機工程を設ける。当該反応をアルゴンガスリンスで停止させ、続いて、無水アセトニトリルで集中的にリンスする。
（ｉｉｉ）リン原子の酸化は、無水アセトニトリル中のＢｅａｕｃａｇｅ試薬の５０ｍＭ溶液を４×２０秒で配送することによってなされる。再び、当該反応をアルゴンガスリンスで停止させ、続いて無水アセトニトリルで集中的にリンスする。
（ｉｖ）加えられた最後の塩基にカップリングしなかったオリゴヌクレオチド鎖の終結は、無水酢酸／ピリジン／テトラヒドロフランおよびＮ−メチルイミダゾール／テトラヒドロフランの混合物を用いた反応によって得られる（キャッピング反応）。当該反応は、２０秒の待機工程をはさんだ２×３０秒の配送によって行われ、アルゴンガスリンスで停止させ、続いて無水アセトニトリルで集中的にリンスする。
【００３３】
開裂および脱保護は、オリゴヌクレオチドが結合したＣＰＧを、テフロンで被覆したねじ蓋を有する５０ｍｌのガラス瓶に移送することによって行われる。アンモニア溶液（３５％）を加え（１５．０ｍｌ）、６０〜９０分、室温（２０〜２５℃）で上記ＣＰＧからオリゴヌクレオチドを開裂させる。次に、そのバイアルを５５〜６０℃のオーブンに移送し、塩基の保護基（ｂｚおよびｉｓｏｂｕ）を除去するために１４〜１８時間インキュベートする。
その溶液を＋４℃に冷却し、０．１％ジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ水）を含むＭｉｌｌｉＱ１８．２ＭΩ水で平衡化したセファデックスＧ−２５（ＤＮＡグレード）によるゲルろ過によって、低分子量の分子が分離される。
当該オリゴヌクレオチドの溶出は、分画（それぞれ４．０ｍｌ）を分取し、それぞれからの１０μｌをＡ２６０測定および陰イオン交換ＨＰＬＣによって分析することによってなされる。
【００３４】
実質的な量の標的のオリゴヌクレオチドを含む分画をプールし（トータル３２．０ｍｌになる）、５０ｍｌのファルコンチューブに、等量で２つに分配する。その材料を３６〜４８時間凍結乾燥。
乾燥リボオリゴヌクレオチドを含む２つのチューブのうち１つを４．０ｍｌの低ｐＨ緩衝液（水／ピリジン／ギ酸；ｐＨ２〜３）に再懸濁し、２′−Ｆｐｍｐ保護基を除去する。その混合物を高回転でボルテックス混合し、４８時間反応させる。その溶液を１．０ｍｌの０．５Ｍ炭酸ナトリウムの添加により中和し、直ちに、ＤＥＰＣ水で平衡化したセファデックスＧ−２５（ＤＮＡグレード）によるゲルろ過によって、低分子量の分子を分離する。当該オリゴヌクレオチドを、ＤＥＰＣ水中でリンスし５５〜６０℃に加熱したコハク色のガラスバイアルに６．０ｍｌ溶出させる。アリコートを分取し、Ａ２６０測定用に希釈し、最終量は９１８ ｎｍｏｌと測定される。これを乾燥状態になるまで２４時間凍結乾燥する。
精製は、Ｗａｔｅｒｓ社のデルタ４０００システムを用いた逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって行われる。当該リボオリゴヌクレオチド材料を、ＤＥＰＣ処理ＭｉｌｌｉＱ１８．２ＭΩ水中の５０ｍＭトリエチルアミンアセテート（ＴＥＡＡ）（ｐＨ８．０）に溶解させ、コハク色のカラム（ＣＧ３００ｓ；２５×２５０ｍｍ）で分画する。その分画プロフィールを図２に示す。分画の収集は、時間１９．４５から始め、注入後３８．４５分で停止する。溶出は、緩衝液Ａ（０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０）およびＢ（０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．０、８０％アセトニトリル）によって行われる。
約６０個の分画（分画あたり５．０ｍｌ）が集められ、その分画の２０〜５１は、主要なピークをカバーしている。
【００３５】
分析は、ＲＰ−ＨＰＬＣ（カラム　Ｗａｔｅｒｓ社製のμＢｏｎｄａｐａｋ　Ｃ１８、３．９×１５０ｍｍ）によってなされる。標的分子を含む分画からのアリコートを異なる組み合わせでプールし、これらのプールをそれぞれの分画と同じ方法で分析する。分画２４〜３３が最も高い純度を有することがわかり、これらの分画がプールされる。このプールの分析により、図３に示すように、純度９９．７％を有するほとんど対称的なピークが得られた。ホスホロチオエートのように、ヌクレオチド間の結合は、２つの代替形態で（以下参照）リン原子に位置する硫黄原子を有する可能性があり、クロマトグラフィーにおいてピークが完全に対称に現れる可能性は低い。
【化１】
2004507244.tif 000003
またあるいは、
【化２】
2004507244.tif 000004
【００３６】
得られたリボオリゴヌクレオチド量を、コハク色の１０ｍｌバイアルに、５個の等量に分配し、それぞれ５００μｇ含み、凍結乾燥する。その乾燥製品をアルゴン下で密封する。
以下のデータは、このオリゴヌクレオチドに関して計算されたものである。
【００３７】
分子量：１１９１８．３８μｇ／μｍｏｌ
吸光係数：３０．６６μｇ／Ａ２６０単位・ｍｌ、３８８．７３Ａ２６０単位／μｍｏｌ
精製後の最終収率：２６５ｎｍｏｌ（３１５８．３７μｇに相当する）
ＲＰ−ＨＰＬＣによる純度：９９．７％。
６５８．３７μｇを含む保存物（ｒｅｔａｉｎ）は−２０℃で凍結したままである。
【００３８】
実施例Ａ３：
この実施例において、本発明に係る一連の３５−ｍｅｒまたは３４−ｍｅｒのキメラＲＮＡ／２′−Ｏ−メチル−ＲＮＡ／ＤＮＡ分子が示される。これらのうちいくつかは、天然のヒトｔＲＮＡＬｙｓ３分子の配列に存在する真正のヌクレオチドに対応する改変ヌクレオチドを含む。
化学法
ｔＲＮＡＬｙｓ３分子は、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡで普通見出されない多数の通常でないリボヌクレオチドを含む。これらの改変ヌクレオチドは、通常のヌクレオチドの誘導体である。以下の本発明に係る分子がこのような改変ヌクレオチドを含むような場合において、実施例Ａ２で説明したのと同じタイプの化学に有用であるように、改変リボヌクレオチドをホスホアミダイトの形態で合成することができる。全体で、本発明に係る８個の異なる分子が示され、それぞれ特有の構造を有する。
【００３９】
・３５−ｍｅｒであって、Ｄ−ステム鎖１、ジヒドロウリジンループ、Ｄ−ステム鎖２、Ａ−ステム鎖１、アンチコドンループおよびＡ−ステム鎖２が、ホスホロチオエート主鎖を有するＲＮＡである。Ｄ−ステム鎖２とＡ−ステム鎖１との間のブリッジ配列は、ホスホロチオエート主鎖を有するＤＮＡである。
・３５−ｍｅｒであって、Ｄ−ステム鎖１、ジヒドロウリジンループ、アンチコドンループおよびＡ−ステム鎖２が、ホスホロチオエート主鎖を有するＲＮＡである。Ｄ−ステム鎖２、Ｄ−ステム鎖２とＡ−ステム鎖１との間のブリッジ配列、およびＡ−ステム鎖１が、ホスホロチオエート主鎖を有するＤＮＡである。
・３４−ｍｅｒであって、Ｄ−ステム鎖１、Ｄ−ステム鎖２、Ａ−ステム鎖１との間のブリッジ配列、Ａ−ステム鎖１およびＡ−ステム鎖２が、ホスホロチオエート主鎖を有するＤＮＡである。ジヒドロウリジンループおよびアンチコドンループが、ホスホロチオエート主鎖を有するＲＮＡである。
・３５−ｍｅｒであって、Ｄ−ステム鎖１、ジヒドロウリジンループ、Ｄ−ステム鎖２、Ｄ−ステム鎖２とＡ−ステム鎖１との間のブリッジ配列、およびＡ−ステム鎖１が、ホスホロチオエート主鎖を有するＤＮＡである。アンチコドンループおよびＡ−ステム鎖２が、ホスホロチオエート主鎖を有するＲＮＡである。
・３５−ｍｅｒであって、Ｄ−ステム鎖１、Ｄ−ステム鎖２、Ａ−ステム鎖１およびＡ−ステム鎖２がＤＮＡである。Ｄ−ステム鎖２とＡ−ステム鎖１との間のブリッジ配列、そのジヒドロウリジンループおよびアンチコドンループが、ホスホロチオエートＤＮＡである。
・３５−ｍｅｒであって、全体の分子が、ホスホロチオエート主鎖を有するＤＮＡである。７位および１１位が、ジヒドロウリジンであり、１８位および３０位がプソイドウリジンである。
【００４０】
・Ｄ−ステム鎖１、ジヒドロウリジンループ、Ｄ−ステム鎖２、Ａ−ステム鎖１、アンチコドンループおよびＡ−ステム鎖２が、ホスホロチオエート主鎖を有するＲＮＡである分子である。Ｄ−ステム鎖２とＡ−ステム鎖１との間のブリッジ配列は、２′−Ｏ−メチル改変ホスホロチオエートＲＮＡである。
・Ｄ−ステム鎖１、ジヒドロウリジンループ、アンチコドンループおよびＡ−ステム鎖２が、ホスホロチオエート主鎖を有するＲＮＡである分子である。Ｄ−ステム鎖２、Ａ−ステム鎖１、および、Ｄ−ステム鎖２とＡ−ステム鎖１との間のブリッジ配列が、２′−Ｏ−メチル改変ホスホロチオエートＲＮＡである。７位および１１位が、ジヒドロウリジンであり、１８位および３０位が、プソイドウリジンである。２５位が、５−（メトキシカルボニルメチル）−２−チオ−ウリジンであり、２８位が、Ｃ２−メチルチオ−Ｎ６−（スレオニンカルボニル）−アデノシンである。
【００４１】
改変リボヌクレオチドの合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（ＡＢＤ）のＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーモデル３９４を用いて、実施例Ａ２で説明したのと同じ条件下で行うことができる。１５．０μｍｏｌの合成スケールが適切である。
精製は、実施例Ａ２で説明したようなＷａｔｅｒｓ社製のデルタ４０００システムを用いた逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）で行うことができる。精製および分析方法は、本質的に実施例Ａ２で説明したのと同じであり、適切である。
【００４２】
合成された核酸分子の結合試験
以下の実験において、「３４−ｍｅｒ」および「３５−ｍｅｒ」という用語は、それぞれ、配列番号３（上記の実施例Ａ１で製造された）および配列番号４（上記の実施例Ａ２で製造された）を意味する。上記で合成された核酸分子がＨＩＶ−１の逆転写酵素と相互作用することを示すために、２種の異なる実験を行う。天然のＲＴ分子は、正常にＲＮＡ分子を開裂させるＲＮアーゼＨ活性を有する。この問題を回避するために、ＨＩＶ−１ＲＴのＲＮアーゼＨ不活性変異体を実験に用いる。この変異体は、Ｓｃｈａｔｚ， Ｏ．， Ｃｒｏｍｍｅ， Ｆ． Ｖ．， Ｇｒｕｎｉｎｇｅｒ−Ｌｅｉｔｃｈ， Ｆ． ａｎｄ Ｌｅ Ｇｒｉｃｅ， Ｓ．Ｆ．Ｊ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒ． Ｖｏｌ．２５７， Ｎｏ．２ ｐ．３１１−３１４で示される方法に従って製造される。このＲＴ変異体は、さらにＭｕｔ１と呼ばれる。以下の実験が行われる。
１．ＳＭＡＲＴシステムでのゲルろ過を用いて、過量の３４−ｍｅｒから複合体Ｍｕｔ１−３４−ｍｅｒ（実施例Ａ１から）を分離することによる結合試験。
２．ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）実験におけるゲルの移動度のシフト。
【００４３】
実施例Ａ１の３４−ｍｅｒの試験：
１．Ｍｕｔ１を、過量の３４−ｍｅｒと、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）と共に４℃で約９０分インキュベートする。次に、その混合物をＳＭＡＲＴ（登録商標）タイプシステムのゲルろ過カラムにアプライし、当該カラムは、同時に２種の異なる波長で登録することができる。その結果を図４ａおよび４ｂに示す。図４ａは、Ｍｕｔ１単独に関する吸収を示し、２６０ｎｍでの吸収（下の曲線）は、２８０ｎｍでの吸収（上の曲線）より低く、Ａ２６０／Ａ２８０＝０．５０は、タンパク質に関する予想値である。
図４ｂは、Ｍｕｔ１および３４−ｍｅｒの混合物に関する吸収を示す。
開始量は、Ｍｕｔ１＝２１０ｐｍｏｌ、３４−ｍｅｒ＝６３０ｐｍｏｌである。左のピークが複合体Ｍｕｔ１−３４−ｍｅｒである。この場合、２６０ｎｍでの吸収（上の曲線）は、２８０ｎｍでの吸収（下の曲線）より高く、Ａ２６０／Ａ２８０＝１．１３である。右のピークは過量の３４−ｍｅｒであり、これは核酸に関して特徴的な吸収率を有し、Ａ２６０／Ａ２８０＝２．０１である。過量の３４−ｍｅｒに関するピークを統合し（図４ｂ参照）、３４−ｍｅｒのみを処理した場合のピークに対して検定することによって、複合体中に存在する３４−ｍｅｒの量を測定することができる。その結果は、複合体中、３４−ｍｅｒ：Ｍｕｔ１＝０．９：１．００であった。Ｍｕｔ１＝２１０ｐｍｏｌおよび３４−ｍｅｒ＝１３５０ｐｍｏｌ（６．５：１の過量）の開始量を用いた場合、複合体は、約１．００：１．００の割合で３４−ｍｅｒ：Ｍｕｔ１を含んでいた。
【００４４】
２．Ｍｕｔ１の３４−ｍｅｒへの結合は、そのままの（ｎａｔｉｖｅ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて示された。
ａ）そのままの２０％ＰＡＧＥゲルを４〜５℃で泳動した。サンプルを、５０ｍＭのｈｅｐｅｓ緩衝液および５ｍＭ塩化マグネシウム中で４℃でインキュベートし、以下に指示するように塩濃度を変える。
レーン１：３４−ｍｅｒ
レーン２：１．５Ｍ硫酸アンモニウムおよび０．３Ｍ塩化カリウム中の３４−ｍｅｒ
レーン３：１．５Ｍ硫酸アンモニウムおよび０．３Ｍ塩化カリウム中のＭｕｔ１
レーン４：１．５Ｍ硫酸アンモニウムおよび０．３Ｍ塩化カリウム中の、３４−ｍｅｒを有するＭｕｔ１
レーン５：１．６Ｍ硫酸アンモニウム中の、３４−ｍｅｒを有するＭｕｔ１
レーン６：１．５Ｍ硫酸アンモニウムおよび０．３Ｍ塩化カリウム中の、３４−ｍｅｒを含むＭｕｔ１
レーン７：１．６Ｍ硫酸アンモニウム中の、３４−ｍｅｒを含むＭｕｔ１
レーン８：３４−ｍｅｒを含むＭｕｔ１。
サンプルを４℃で９０分インキュベートし、さらに硫酸アンモニウムおよび／またはＫＣｌと共に４℃で１０分インキュベーションする。レーン４および５にアプライされたサンプルは、他のサンプルに関して用いられた３４−ｍｅｒの量の２倍を含む。
図５ａで示すように（レーン４は３４−ｍｅｒを含み、レーン３は含まない）、３４−ｍｅｒとの複合化したＭｕｔ１は、Ｍｕｔ１単独より速く移動する。
【００４５】
ｂ）そのままの２０％ＰＡＧＥゲルを４〜５℃で泳動する。サンプルを、５０ｍＭのｈｅｐｅｓ緩衝液および５ｍＭ塩化マグネシウム中で、硫酸アンモニウム濃度を変えながら、４℃でインキュベートする。
レーン１：３４−ｍｅｒ
レーン２：１．６Ｍ硫酸アンモニウム中の３４−ｍｅｒ
レーン３：１．６Ｍ硫酸アンモニウム中の、３４−ｍｅｒを含むＭｕｔ１
レーン４：０．８Ｍ硫酸アンモニウム中の、３４−ｍｅｒを含むＭｕｔ１
レーン５：３４−ｍｅｒを含むＭｕｔ１
レーン６：１５−ｍｅｒを含むＭｕｔ１
レーン７：０．８Ｍ硫酸アンモニウム中の、１５−ｍｅｒを含むＭｕｔ１
レーン８：１．６Ｍ硫酸アンモニウム中の、１５−ｍｅｒを含むＭｕｔ１
３４−ｍｅｒを伴う分解産物は、ｔＲＮＡＬｙｓ３アンチコドンステムおよびループの塩基配列を有するホスホロチオエート１５−ｍｅｒ（配列番号７）と類似したゲル移動度を有することが示された（図５ｂ）。高い塩濃度では、１５−ｍｅｒ（アンチコドンステムおよびループ）は、Ｍｕｔ１から解離し、一方で３４−ｍｅｒ（アンチコドンステムおよびループ＋ジヒドロウリジンステムおよびループ）はＭｕｔ１との複合体のままである。
【００４６】
実施例Ａ２の３５−ｍｅｒの試験：
１．Ｍｕｔ１を、過量の３５−ｍｅｒ、５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む緩衝液Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）と共に４℃で約２時間インキュベートする。次に、その混合物をＳＭＡＲＴ（登録商標）タイプのシステムのゲルろ過カラムにアプライし、これは、２種の異なる波長で同時に登録することができる。その結果を図６ａ、６ｂおよび６ｃに示す。図６ａは、Ｍｕｔ１単独に関する吸収を示す。２６０ｎｍでの吸収（下の曲線）は、２８０ｎｍでの吸収（上の曲線）より低く、Ａ２６０／Ａ２８０＝０．６３であり、これはタンパク質に関する予想値である。
図６ｂにおいて、Ｍｕｔ１および３５−ｍｅｒの混合物に関する吸収が示される。
開始量は、Ｍｕｔ１＝２１０ｐｍｏｌ、３５−ｍｅｒ＝６３０ｐｍｏｌである。３５−ｍｅｒ：Ｍｕｔ１の割合は、３：１である。
左のピークは、複合体Ｍｕｔ１−３５−ｍｅｒである。２６０ｎｍでの吸収（上の曲線）は、この場合、２８０ｎｍでの吸収より高く、Ａ２６０／Ａ２８０＝１．２２である。右のピークは、過量の３５−ｍｅｒであり、これは核酸に関して特徴的な吸収率を有し、Ａ２６０／Ａ２８０＝２．０５である。
【００４７】
対応する測定が、０〜６．５の範囲の一連の３５−ｍｅｒ：Ｍｕｔ１の割合に関して行われた（図６ｃ参照）。図６ｃから、開始量３５−ｍｅｒ：Ｍｕｔ１の関数としてのＡ２６０／Ａ２８０はプラトーに達し、すなわち、３５−ｍｅｒ：Ｍｕｔ１の開始量が約３：１で飽和状態になったことは明白である。
過量の３５−ｍｅｒに関するピークを統合し（図６ｂ参照）、３５−ｍｅｒのみを処理した場合のピークに対して校正することによって、複合体中に存在する３５−ｍｅｒの量を測定することができる。その結果は、相対的な開始量３５−ｍｅｒ：Ｍｕｔ１が３：１である場合、複合体中、３５−ｍｅｒ：Ｍｕｔ１＝１．０５：１．００であった。これによれば、殆ど飽和した第一の部位と共に、３５−ｍｅｒに関する少量の第二の部位が示され、これはまた、ゲル移動度のシフトからも観察される（以下参照）
【００４８】。
２．Ｍｕｔ１の３５−ｍｅｒへの結合は、そのままのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いて示された。
そのままの２０％ＰＡＧＥゲルを、４〜５℃で泳動する。サンプルを、５０　ｍＭのｈｅｐｅｓ緩衝液、１５ｍＭの硫酸マンガン、１ｍＭのＥＤＴＡおよび０．２５ｍＭのＥＧＴＡ中で、４℃でインキュベートする。
サンプルを室温で１０分インキュベートし、その後４℃で６０分インキュベートする。１レーンあたり１μｌのサンプル溶液をアプライする。電気泳動を約４℃に冷却しながら４００ボルトまで行う。０．２０９ｋＷｈの後、そのゲルを銀染色する。
レーン１：Ｍｕｔ１（１．５ｐｍｏｌ／μｌ）
レーン２：３５−ｍｅｒ（１５．０ｐｍｏｌ／μｌ）
レーン３：Ｍｕｔ１（１．５ｐｍｏｌ／μｌ）、３５−ｍｅｒ（１．２６ｐｍｏｌ／μｌ）を含む、モル比１：０．８４
レーン４：Ｍｕｔ１（１．５ｐｍｏｌ／μｌ）、３５−ｍｅｒ（２．５２ｐｍｏｌ／μｌ）を含む、モル比１：１．６８
レーン５：Ｍｕｔ１（１．５ｐｍｏｌ／μｌ）、３５−ｍｅｒ（３．３６ｐｍｏｌ／μｌ）を含む、モル比１：２．２４
レーン６：Ｍｕｔ１（１．５ｐｍｏｌ／ｐｌ）、３５−ｍｅｒ（５．０４ｐｍｏｌ／μｌ）を含む、モル比１：３．３６
レーン７：Ｍｕｔ１（１．５ｐｍｏｌ／μｌ）、３５−ｍｅｒ（６．７２ｐｍｏｌ／μｌ）を含む、モル比１：４．４８
レーン８：Ｍｕｔ１（１．５ｐｍｏｌ／μｌ）、３５−ｍｅｒ（８．４０ｐｍｏｌ／μｌ）を含む、モル比１：５．６０。
【００４９】
３５−ｍｅｒとの複合体中のＭｕｔ１は、図７に示すように、Ｍｕｔ１単独よりも速く移動する。高濃度の３５−ｍｅｒ開始量（３５−ｍｅｒ：Ｍｕｔ１＞＝２．２５：１）で、上記タンパク質の低分子量の分画はいっそう速く移動し、すなわち低い親和性の３５−ｍｅｒ相互作用に関する第二の部位を示す。これにより、逆転写酵素が、ｔＲＮＡアンチコドン認識に加えてＲＮＡｖおよびＤＮＡとも相互作用しているはずであり、同様に、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを認識かつ消化し、それらの伸長に続いてｔＲＮＡプライマーを解離させる、ということが予想される。
【００５０】
Ｂ．本発明の核酸分子による、プライマーの逆転写酵素への結合の阻害
この一連の実験において、本発明に係る核酸分子の阻害作用が証明された。その上、以前から既知のｔＲＮＡ類似体断片に関する核酸分子の阻害作用、および、既知の抗ＨＩＶ薬の阻害作用との比較が行われた。本発明の核酸分子は、配列番号５に示される配列を有する３５−ｍｅｒのＲＮＡ分子であり、当該分子は、下記の実施例で識別するために、「化合物１９９」と表示された。１５−ｍｅｒのＲＮＡ分子は、配列番号７に示される配列を有し、「化合物１９８」と表示された。化合物１９８および１９９は、上記セクションＡに記載された方法に従って合成された。用いられた既知の抗ＨＩＶ薬はネビラピン（Ｎｅｖｉｒａｐｉｎｅ）であり、これは逆転写酵素の非ヌクレオシド阻害剤であり、ジピリドジアゼピノン（ｄｉｐｙｒｉｄｏｄｉａｚｅｐｉｎｏｎｅ）の化合物の化学クラスの一つである。
その阻害剤物質を組換えＨＩＶ−１ＲＴ：ｓのパネルに対して試験し、当該パネルの一つは参照として提供され、それ以外は、既知の阻害剤に対する異なるタイプの耐性を与える変異を表示した（下記の実施例Ｂ１を参照）。
【００５１】
方法
ＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合を決定する方法
Ｃａｖｉｄｉ Ｔｅｃｈ社（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から市販されている蛍光測定ＲＴ分析（Ｃａｖｉｄｉ（登録商標）Ｌｅｎｔｉ　ＲＴ活性キット）を、ＲＴ活性の決定に用いた。簡単に説明すると、９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルに共有結合したポリ（ｒＡ）が、３３℃での逆転写工程における５−ブロモデオキシウリジン５′−三リン酸（ＢｒｄＵＴＰ）の取り込みのためのテンプレートとして提供された。ＤＮＡに取り込まれたブロモデオキシウリジン一リン酸（ＢｒｄＵＭＰ）の量を、アルカリホスファターゼ（Ａｐ）が結合した抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体を用いて検出する。最終的に、Ａｐ基質、４−メチルウンベリフェリルホスフェートを、蛍光測定産物の検出に用いる。
【００５２】
レトロウイルスＲＴによる第二の鎖のＤＮＡ合成の検出に有用なＤＮＡポリメラーゼ分析の方法
用いられた蛍光測定ＤＮＡポリメラーゼ分析は、Ｃａｖｉｄｉ Ｔｅｃｈ社（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）のものが利用できる。当該分析は、ｔＲＮＡＬｙｓ３配列の部分に類似した短いＤＮＡプライマーに基づく。テンプレートは、上記プライマーに相補的な配列の部分を有する一本鎖デオキシリボヌクレオチドテンプレートである。酵素反応は、全ての４種のデオキシリボヌクレオチド塩基に依存する。しかしながら、チミジン三リン酸は、ＢｒｄＵＴＰで置換される。ポリメラーゼ反応中にＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵＭＰの量は、アルカリホスファターゼ（Ａｐ）が結合した抗ＢｒｄＵモノクローナル抗体で検出される。最終的に、Ａｐ基質、４−メチルウンベリフェリルホスフェートを、蛍光測定産物の検出に用いる。
【００５３】
ＲＴ活性の阻害剤感受性を決定する方法
（ｉ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合の阻害を決定する方法：阻害に関する研究は、改変Ｌｅｎｔｉ　ＲＴ分析により行われた。阻害剤を５段階で連続して希釈し、その後酵素希釈液を加え、酵素／阻害剤混合物を３３℃で３０分間インキュベートした。酵素／阻害剤混合物の１００μｌのアリコートを、マイクロタイタープレートの各ウェル（ウェルあたり１００μｌのＲＴ反応混合物を含む）に添加することにより酵素反応を開始した。ポリメラーゼ反応を３３℃で３時間進行させ、その後、プレートを洗浄することにより反応を停止させた。そのＩＣ５０値を、調査されるポリメラーゼ活性の５０％阻害を与える阻害剤濃度と定義した。用いられたＲＴの量を、ウェルあたり９０〜１３０ｐｇ（７〜１０×１０−１６ｍｏｌ）の参照ＨＩＶ−１ＲＴに相当する活性に標準化した。
【００５４】
（ｉｉ）可変的な ＤＮＡテンプレートにおける第二の鎖の合成の阻害を決定する方法：阻害の研究は、改変ＤＮＡポリメラーゼ分析によって行われた。阻害剤を５段階で連続して希釈し、酵素希釈液を加え、酵素／阻害剤混合物を３３℃で３０分間インキュベートした。７５μｌの酵素／阻害剤混合物のアリコートを、マイクロタイタープレートの各ウェル（ウェルあたり７５μｌのＤＮＡポリメラーゼ反応混合物を含む）に添加することにより、酵素反応を開始した。ポリメラーゼ反応を３３℃で３時間進行させ、その後、プレートを洗浄することにより反応を停止させた。そのＩＣ５０値を、調査されるポリメラーゼ活性の５０％阻害を与える阻害剤濃度と定義した。用いられたＲＴの量を、ウェルあたり４０〜６０ｐｇ（３．３〜５．０×１０−１６ｍｏｌ）の参照ＨＩＶ−１ＲＴに相当する活性に標準化した。
【００５５】
（ｉｉｉ）ＲＴ結合阻害（ＢＩＣ）分析の方法：この研究は、改変ＤＮＡポリメラーゼ分析によって行われた。阻害剤を５段階で連続して希釈し、酵素希釈液を加え、酵素／阻害剤混合物を３３℃で３０分間インキュベートした。酵素／阻害剤混合物のアリコートをマイクロタイタープレートの各ウェル（固定化プライマー、またはプライマー／テンプレートのいずれかを含む）に移送した。上記酵素を、９０分３３℃で上記固定化ポリマーに結合させた。用いられたＲＴの量を、ウェルあたり４０〜６０ｐｇ（３．３〜５．０×１０−１６ｍｏｌ）の参照ＨＩＶ−１ＲＴに相当する活性に標準化した。次に、プレートを洗浄して未結合の酵素を除去し、その後、重合に適した反応溶液（すなわち、プライマー結合を研究するためのプライマーを含まない反応溶液、および、プライミングされたテンプレートへの結合を研究するためのプライマーおよびテンプレートのいずれも含まない反応溶液）を添加することにより、結合酵素の量を測定した。ポリメラーゼ反応を３３℃で３時間進行させ、その後、プレートを洗浄することにより反応を停止させた。そのＢＩＣ５０値を、調査されるポリメラーゼ活性の結合の５０％阻害を与える阻害剤濃度として定義した。
【００５６】
【実施例】
実施例Ｂ１：物質１９９はＨＩＶ−１ＲＴ逆転写の阻害剤である
示された物質が組換えＨＩＶ１サブタイプＢ　ＲＴのパネルにおいて酵素を阻害する能力を、「ＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合の阻害を決定する方法」に従って研究した（上記の方法（ｉ））。ウェルあたり、最終的なヌクレオチド基質（ＢｒｄＵＴＰ）濃度は０．３５μＭであり、プライマー（ｏｄＴ２２）の量は０．０３ｎｇであった。表１に示すように、物質１９９は、調査された３種の阻害剤のうち最も低いＩＣ５０値を示した。研究された全てのＲＴに関して阻害プロフィールは類似していた（ＩＣ５０は６．０〜１２ｎＭ）。従って、物質１９９は、ヌクレオシド（Ｔ２１５Ｙ）および非ヌクレオシド（Ｌ１００Ｉ、Ｋ１０３Ｎ、Ｌ１０１／Ｋ１０３Ｎ）ＲＴ阻害剤に対する耐性に関連することがわかっているアミノ酸置換を有するＲＴを阻害し、同様に、野生型ＲＴ（参照ＲＴおよびＥ４７８Ｑ）を阻害するため効率的である。物質１９８で見出されたＩＣ５０値は、より可変的であり、物質１９９で見出されたＩＣ５０値より５０〜１００倍高い（３４０〜１１００ｎＭ）（表１参照）。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
さらに、ＲＴパネルに関する物質１９９の効果を、阻害剤をＲＴ反応混合物に直接添加する代替法に従って試験した。得られた結果は、標準的な方法で得られた結果とそれほど異なっていなかった。このことは、物質１９９は、まったくプレインキュベーション期間を設けなくても効率よく第一鎖の合成を阻害することを示す。
【００５９】
実施例Ｂ２：物質１９９はＨＩＶ　ＲＴの第二の鎖ＤＮＡ合成の阻害剤である
組換えＨＩＶ１サブタイプＢ　ＲＴのパネルにおいて示された物質が各酵素を阻害する能力は、「可変的なＤＮＡテンプレートにおける第二の鎖合成の阻害を決定する方法」に従って研究した（上記方法（ｉｉ））。その結果は、表２にまとめられ、むしろ逆転写の阻害に関して得られた結果（表１）に類似していた。調査された４種の酵素は全て、周知の非ヌクレオシドＲＴ阻害剤であるネビラピン（当該実験においてコントロールとして用いられる）での阻害に対して著しく異なる感受性を示した。物質１９９は、調査された３種の阻害剤のうち最も低いＩＣ５０値を示した。この阻害剤に関する阻害プロフィールは、研究された全てのＲＴに関して実質的に同一であった（ＩＣ５０が３６〜５１ｎＭ）。物質１９８で見出されたＩＣ５０値はより可変的であり、少なくとも１桁さらに高かった（５５０〜１０００ｎＭ）。
【００６０】
【表２】
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【００６１】
実施例Ｂ３：物質１９９は、ＨＩＶ　ＲＴのプライマー／テンプレートへの結合を阻害する
示された物質が、組換えＨＩＶ１サブタイプＢ　ＲＴのパネルのプライマーまたはプライミングされたＤＮＡテンプレートへの結合を阻害する能力は、「ＲＴ結合阻害（ＢＩＣ）分析の方法」に従って研究した（上記方法（ｉｉｉ））。その結果を表３に記載する。物質１９９は、プライマー単独またはプライミングされたテンプレートのいずれかへのＲＴ結合を妨害する能力を有し、それに対して、物質１９８のＲＴ結合を妨害する能力は顕著に低かった。その上、物質１９９は、物質１９８よりかなり低い濃度で活性であった。物質１９９に関するＢＩＣ５０値は、２ｎＭ（参照ＲＴのプライマーへの結合に関して）から、１６ｎＭ（ＲＴ　Ｌ１００Ｉのプライミングされたテンプレートへの結合に関して）に変化した。物質１９８に対応する数値は、１００および＞１０００ｎＭであった。物質１９９に関する全てのＢＩＣ５０値は、第二の鎖ＤＮＡ合成の阻害に対応するＩＣ５０値（表２）より顕著に低いことを特筆する。周知の非ヌクレオシドＲＴ阻害剤であるネビラピンは、研究された全ての条件においてＲＴ結合を妨害することができなかった。
【００６２】
【表３】
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【００６３】
実施例Ｂ４：物質１９９の阻害効果はｄＮＴＰ基質の濃度に依存しない
物質１９９で見出されたＩＣ５０値を、「ＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合の阻害を決定する方法」に従って、酵素、プライマー（ｏｄＴ）またはｄＮＴＰ基質（ＢｒｄＵＴＰ）いずれかの濃度を変化させて測定した（上記の方法（ｉ））。用いられたＲＴ反応時間は３時間であり、その結果を図８（ａ〜ｃ）に記載した。
８ａ）示された濃度のＲＴ　Ｅ４７８Ｑを、物質１９９の連続した一組の希釈液と共に３３℃で３０分間インキュベートした。１００μｌの物質／酵素混合物をＲＴ反応混合物（１６μＭのＢｒｄＵＴＰおよび３ｎＭのｏｄＴを含む）を含むマイクロタイタープレートに添加することにより、酵素反応を開始した。
８ｂ）ＲＴ　Ｅ４７８Ｑ（濃度２．５ｐＭ）を、物質１９９の連続した一組の希釈液と共に３３℃で３０分間インキュベートした。１００μｌの物質／酵素混合物サンプルを、ＲＴ反応混合物（示された濃度のｏｄＴプライマーおよび０．３５μｍのｄＮＴＰ基質（ＢｒｄＵＴＰ）を含む）の一組の希釈液を含むマイクロタイタープレートに添加することにより、酵素反応を開始した。
８ｃ）ＲＴ　Ｅ４７８Ｑ（濃度２．５ｐＭ）を、物質１９９の連続した一組の希釈液と共に３３℃で３０分間インキュベートした。１００μｌの物質／酵素混合物サンプルを、ＲＴ反応混合物（示された濃度のｄＮＴＰ基質（ＢｒｄＵＴＰ）および２４ｐＭのｏｄＴを含む）の一組の希釈液を含むマイクロタイタープレートに添加することにより、酵素反応を開始した。
図８から、物質１９９の阻害効果は、酵素およびプライマーの濃度に影響を受けるが（図８ａおよび８ｂ）、ｄＮＴＰ基質の濃度には影響を受けない（図８ｃ）ことが結論付けられる。
【００６４】
Ｃ．結論
本発明を例示するために製造された合成核酸分子は、先行技術に記載のｔＲＮＡＬｙｓ３に相当するそのような断片に比べて、数々の利点を有する。本発明の分子は、かなり長い断片であり、正しい結合ジオメトリーを有する。当該分子は、３４〜３５−ｍｅｒであり、重要な結合領域であるアンチコドンループおよびステムの両方を含み、同様に、ジヒドロウリジンループおよびステムを含む。当該分子は、ヌクレアーゼによる加水分解に対して良好な安定性を有するホスホロチオエート分子である。その上、ホスホロチオエート形態の核酸は、相当する通常の核酸よりもかなり良好にタンパク質に結合する。本発明に係る１２または１３位のヌクレオチドにおいて２′−Ｏ−メチルリボースを有するＲＮＡ分子は、加水分解に対して特に安定である。この製品は、ゲルろ過カラムに適用した場合、ほとんど対称的なピークを示す。
【００６５】
上記セクションＢで行われた実験において、本発明に係る分子は、ホスホロチオエートを含む１５−ｍｅｒのＲＮＡアンチコドンステムループ構造に対応する値よりも約５０〜１００倍低いＩＣ５０およびＢＩＣ５０値を有する。この１５−ｍｅｒ（配列番号７に相当する）は、以前に説明されたＤＮＡを含むアンチコドンステムループ構造に類似する。しかしながら、この比較に用いられた１５−ｍｅｒはＲＮＡホスホロチオエートであり、それゆえに、先行技術のＤＮＡ構造よりもｔＲＮＡに似ている。
【００６６】
上述したように、ｔＲＮＡとＲＴとの相互作用に特異的な部分のブロックに関して提示されたメカニズムは、他のレトロウイルスに対しても用いることができる多大な可能性を有する。他の重要なレトロウイルス群は、ヒトＴ細胞白血病ウイルスであるＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２であり、これらはヒトにおいて白血病と神経障害を引き起こす。天然のプライマーｔＲＮＡＰｒｏのＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２への結合を効果的にブロックし得る医薬は、医薬的に非常に重要である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
天然のｔＲＮＡＬｙｓ３のクローバー葉構造である。
【図２】
図１におけるヌクレオチド１０〜４４に対応する粗合成の３５−ｍｅｒのホスホロチオエートリボヌクレオチド（配列番号４）のＲＰ−ＨＰＬＣ分画プロフィールである。
【図３】
配列番号４のプールされた分画のＲＰ−ＨＰＬＣによる分析である。
【図４ａ】
ＳＭＡＲＴＴＭシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でのゲルろ過を用いた配列番号３のＭｕｔ１への結合の試験であり、Ｍｕｔ１単独に関する。
【図４ｂ】
ＳＭＡＲＴＴＭシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）でのゲルろ過を用いた配列番号３のＭｕｔ１への結合の試験であり、Ｍｕｔ１と配列番号３との混合したものに関する。
【図５ａ】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製のＰｈａｓｔＧｅｌシステムを用いたＰＡＧＥ）で示された、Ｍｕｔ１の配列番号３への結合である。
【図５ｂ】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製のＰｈａｓｔＧｅｌシステムを用いたＰＡＧＥ）で示された、Ｍｕｔ１の配列番号３への結合である。
【図６ａ】
ＳＭＡＲＴＴＭシステムでのゲルろ過を用いたＭｕｔ１の配列番号４への結合であり、Ｍｕｔ１単独に関する。
【図６ｂ】
ＳＭＡＲＴＴＭシステムでのゲルろ過を用いたＭｕｔ１の配列番号４への結合であり、Ｍｕｔ１と配列番号４との混合したものに関する。
【図６ｃ】
ＳＭＡＲＴＴＭシステムでのゲルろ過を用いたＭｕｔ１の配列番号４への結合であり、配列番号４：Ｍｕｔ１の一連の割合に関する、０〜６．５の範囲の対応する測定である。
【図７】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製のＰｈａｓｔＧｅｌシステムを用いたＰＡＧＥ）で示された、Ｍｕｔ１の配列番号４への結合である。
【図８ａ】
配列番号５に関するＩＣ５０値であり、酵素を様々な濃度を用いて測定した。用いられたＲＴ反応時間は、３時間であった。
【図８ｂ】
配列番号５に関するＩＣ５０値であり、プライマー（ｏｄＴ）を様々な濃度を用いて測定した。用いられたＲＴ反応時間は、３時間であった。
【図８ｃ】
配列番号５に関するＩＣ５０値であり、ｄＮＴＰ基質（ＢｒｄＵＴＰ）を様々な濃度を用いて測定した。用いられたＲＴ反応時間は、３時間であった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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