(57)【要約】本発明は、本発明のＤＰＩＶ−阻害剤およびそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩の、ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素によって仲介される状態、例えば癌および腫瘍を治療するための新規な使用を提供するものである。より好ましい態様では、本発明の化合物は転移および腫瘍転移増殖の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ（ＤＰＩＶ）またはＤＰＩＶ様酵素活性の少なくとも１種の阻害剤の、癌または関連疾患治療用医薬組成物製造のための使用であって、該阻害剤がジペプチド化合物、トリ−、テトラ−およびペンタペプチドを含むペプチド化合物、ペプチジルケトン、アミノケトン誘導体並びに側鎖修飾されたＤＰＩＶ阻害剤よりなる群から選択される上記の使用。
【請求項２】
関連疾患が転移である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
関連疾患が腫瘍転移増殖である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ様酵素が、線維芽細胞活性化たんぱく質α、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶβ、ジペプチジルアミノぺプチダ−ゼ様たんぱく質、Ｎ−アセチル化α−結合酸性ジぺプチダ−ゼ、休止細胞プロリンジぺプチダ−ゼ、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＩ、アトラクチンおよびジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ関連たんぱく質（ＤＰＰ８）、ジペプチジルぺプチダ−ゼ９（ＤＰＰ９）、ＤＰＲＰ１、ＤＰＲＰ２、ＤＰＲＰ３またはＫＩＡＡ１４９２よりなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ様酵素の構造が未知である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
阻害剤が、アミノ酸およびチアゾリジンまたはピロリジン基から形成されるジペプチド化合物、並びにその塩である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
ジペプチド化合物が、Ｌ−トレオ−イソロイシルピロリジン、Ｌ−アロ−イソロイシルチアゾリジン、１−アロ−イソロイシルピロリジン、Ｌ−グルタミニルチアゾリジン、Ｌ−グルタミニルピロリジン、Ｌ−グルタミン酸チアゾリジン、Ｌ−グルタミン酸ピロリジンおよびそれらの塩よりなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
阻害剤が、一般式
【化１】
2004521149.tif 000029
（式中、
Ａは、Ｄ−アミノ酸以外のアミノ酸であり、
Ｂは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸およびピペコリン酸から選択されるアミノ酸であり、
Ｃは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸、ピペコリン酸以外およびＮ−アルキル化アミノ酸、例えばＮ−メチルバリンおよびサルコシン以外のいずれかのアミノ酸であり、
Ｄは、いずれかのアミノ酸であるか、または欠けており、そして
Ｅは、いずれかのアミノ酸であるか、または欠けており、
あるいは、
Ｃは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸、ピペコリン酸以外、Ｎ−アルキル化アミノ酸、例えば、Ｎ−メチルバリンおよびサルコシン以外およびＤ−アミノ酸以外のいずれかのアミノ酸であり、
Ｄは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸およびピペコリン酸から選択されるいずれかのアミノ酸であり、そして
Ｅは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸、ピペコリン酸以外およびＮ−アルキル化アミノ酸、例えばＮ−メチルバリンおよびサルコシン以外のいずれかのアミノ酸である）
で表されるジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ触媒作用の拮抗調節に有用なペプチド化合物である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
阻害剤が、あらゆる立体異性体および薬学的に許容される塩を含めた、一般式
【化２】
2004521149.tif 000030
（式中、
Ａは、
【化３】
2004521149.tif 000031
から選択され、ここで、
Ｘ１は、Ｈまたはアシルもしくはオキシカルボニル基またはアミノ酸もしくはペプチド残基であり、
Ｘ２は、Ｈ、−（ＣＨ）ｎ−ＮＨ−Ｃ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（ｎ＝２〜４）またはＣ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（２価ピリジル残基）であり、Ｙは、Ｈ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ２またはＣＮから選択され、
Ｘ３は、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていない、フェニルまたはピルジル残基であり、
Ｘ４は、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていない、フェニルまたはピルジル残基であり、
Ｘ５は、Ｈ、またはアルキル、アルコキシもしくはフェニル残基であり、
Ｘ６は、Ｈまたはアルキル残基であり、
ｎ＝１である場合、
Ｘは、Ｈ、ＯＲ２、ＳＲ２、ＮＲ２Ｒ３、Ｎ＋Ｒ２Ｒ３Ｒ４から選択され、ここで、
Ｒ２は、１、２もしくはそれ以上のアルキル、シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール残基で置換されたもしくは置換されていないアシル残基、あるいはあらゆるアミノ酸およびペプチド残基、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール残基で置換されたもしくは置換されていないアルキル残基を表し、
Ｒ３はアルキルおよびアシル官能基を表し、ここで、Ｒ２およびＲ３は飽和および不飽和炭素環式または複素環式構造の１つ以上の環構造の一部でもよく、
Ｒ４はアルキル残基を表し、ここで、Ｒ２およびＲ４またはＲ３およびＲ４は飽和および不飽和炭素環式または複素環式構造の１つ以上の環構造の一部でもよく、
ｎ＝０である場合、
Ｘは、
【化４】
2004521149.tif 000032
（式中、
Ｂは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ５を表し、ここで、Ｒ５は、Ｈ、アルキリデンまたはアシルであり、
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈは、非置換および置換アルキル、オキシアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、カルボニルアルキル、アシル、カルバモイル、アリールおよびヘテロアリール残基から独立して選択される）
から選択され、そして
ｎ＝０およびｎ＝１である場合、
Ｚは、Ｈ、またはＣ１−Ｃ９の分枝鎖もしくは単鎖アルキル残基、またはＣ２−Ｃ９の分枝鎖もしくは単鎖アルケニル残基、Ｃ３−Ｃ８のシクロアルキル残基、Ｃ５−Ｃ７のシクロアルケニル残基、アリール−もしくはヘテロアリール残基、またはあらゆる天然アミノ酸もしくはその誘導体のあらゆる側鎖より選ばれる側鎖から選択される）
で表されるペプチジルケトンである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
阻害剤が、あらゆる立体異性体および薬学的に許容される塩を含めた、一般式５、６、７、８、９、１０および１１
【化５】
2004521149.tif 000033
（式中、
Ｒ１は、Ｈ、分枝もしくは線状Ｃ１−Ｃ９アルキル残基、分枝もしくは線状Ｃ２−Ｃ９アルケニル残基、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル−、Ｃ５−Ｃ７シクロアルケニル−、アリール−もしくはヘテロアリール残基、または天然アミノ酸もしくはその誘導体の側鎖であり、
Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノまたはハロゲンから独立して選択され、
Ａは、Ｈまたは炭酸のイソスター、例えばＣＮ、ＳＯ３Ｈ、ＣＯＮＨＯＨ、ＰＯ３Ｒ５Ｒ６、テトラゾール、アミド、エステル、無水物、チアゾールおよびイミダゾールから選択される官能基であり、
Ｂは
【化６】
2004521149.tif 000034
（式中、
Ｒ５は、Ｈ、−（ＣＨ）ｎ−ＮＨ−Ｃ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（ｎ＝２〜４）およびＣ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（２価ピリジル残基）であり、Ｙ＝Ｈ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ２またはＣＮであり、
Ｒ１０は、Ｈ、アシル、オキシカルボニルまたはアミノ酸残基であり、
Ｗは、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていないフェニルまたはピリジル残基であり、
Ｗ１は、Ｈ、アルキル、アルコキシまたはフェニル残基であり、
Ｚは、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていないフェニルまたはピリジル残基であり、
Ｚ１は、Ｈまたはアルキル残基である）
から選択され、
Ｄは、１、２もしくはそれ以上のアルキル基または環式４〜７員へテロアルキルまたは環式４〜７員へテロアルケニル残基で置換されたもしくは置換されていない環式Ｃ４−Ｃ７アルキル、Ｃ４−Ｃ７アルケニル残基であり、
Ｘ２は、Ｏ、ＮＲ６、Ｎ＋（Ｒ７）２、またはＳであり、
Ｘ３〜Ｘ１２は、ＣＨ２、ＣＲ８Ｒ９、ＮＲ６、Ｎ＋（Ｒ７）２、Ｏ、Ｓ、ＳＯおよびＳＯ２から独立して選択され、あらゆる飽和および不飽和構造を含み、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、Ｈ、分枝もしくは線状Ｃ１−Ｃ９アルキル残基、分枝もしくは線状Ｃ２−Ｃ９アルケニル残基、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル残基、Ｃ５−Ｃ７シクロアルケニル残基、アリールもしくはヘテロアリール残基から独立して選択され、
ただし、
式６：ＡがＨでなければ、Ｘ６はＣＨであり、
式７：ＡがＨでなければ、Ｘ１０はＣであり、
式８：ＡがＨでなければ、Ｘ７はＣＨであり、
式９：ＡがＨでなければ、Ｘ１２はＣである）
で表されるアミノケトン誘導体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素活性の阻害剤が、あらゆる立体異性体および薬学的に許容される塩を含めた、一般式
【化７】
2004521149.tif 000035
（式中、
Ａは、側鎖に少なくとも１つの官能基を有するアミノ酸であり、
Ｂは、Ａの側鎖の少なくとも１つの官能基に共有結合した化合物、特に、
−  ２０以下のアミノ酸の鎖長を有するオリゴペプチド、または
−  ２０，０００ｇ／ｍｏｌ以下の分子量を有するポリエチレングリコール、
−  ８〜５０の炭素原子を有する置換されていてもよい有機アミン、アミド、アルコール、酸または芳香族化合物
であり、そして
Ｃは、Ａにアミド結合したチアゾリジン、ピロリジン、シアノピロリジン、ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリンまたはピペリジン基である）
で表される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
Ａが、アミノ酸、好ましくはα−アミノ酸、特に、トレオニン、チロシン、セリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステインよりなる群から選択される、側鎖に少なくとも１つの官能基を有する天然α−アミノ酸である、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
阻害剤が、薬学的に許容される担体または希釈剤および治療に有効な量の阻害剤またはその薬学的に許容される酸付加塩を含む医薬組成物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１４】
阻害剤（単数または複数）が、薬学的に許容される担体および／または希釈剤と組み合わせて用いられる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶおよびジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ様酵素活性の阻害剤、さらに詳しくは、該化合物を含有する医薬組成物、並びに癌および腫瘍を治療するための該化合物の使用に関する。本発明は転移および腫瘍転移増殖の抑制方法を特に提供する。
【０００２】
背景
ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ（ＤＰＩＶ）は、好ましくは、端から２番目の位置にプロリン残基を含む、ペプチド鎖からＮ−末端ジペプチドを切り取るセリンプロテアーゼである。哺乳動物組織におけるＤＰＩＶの生物学的役割は完全に確立されていないが、神経ペプチド代謝、Ｔ−細胞活性化、およびＨＩＶのリンパ細胞への進入において重要な役割を演じると考えられる。
【０００３】
同様に、ＤＰＩＶが、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、およびガストリック・インヒビトリー・ペプチド（ＧＩＰ）としても公知のグルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチドの不活性化を招くことは見出されている。ＧＬＰ−１は膵臓インスリン分泌の主な刺激物質であり、グルコース処理に直接有利に作用するので、ＷＯ９７／４０８３２およびＵＳ６，３０３，６６１では、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性の阻害が非インスリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）の治療に魅力的な対処法を提示することが示された。
【０００４】
本発明は、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素の阻害によって仲介される状態を予防および治療するための、特に、癌および腫瘍を予防および治療するためのＤＰＩＶ阻害剤の新規な使用、並びに、例えばＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素の阻害に有用な、医薬組成物、並びに該酵素活性を阻害する方法を提供する。
【０００５】
本発明は、治療法、特に、癌、腫瘍、転移および腫瘍転移増殖の予防および治療法、並びにそのような方法に用いるための組成物に関する。ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ（ＤＰＩＶ）は腎臓、肝臓および腸を含めた体の様々な組織に見られるポスト−プロリン（より少ない程度ではポスト−アラニン、ポスト−セリンまたはポスト−グリシン）切断セリンプロテアーゼである。
【０００６】
ＤＰＩＶ阻害剤がグルコース耐性障害および真性糖尿病の治療に有用であることは知られている〔国際特許出願、公開番号ＷＯ９９／６１４３１、ペデルソン  ピーエー（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ ＰＡ）等、ダイアビーティーズ（Ｄｉａｂｅｔｅｓ）、１９９８年８月；４７（８）： １２５３−８およびパウリー  アールピー（Ｐａｕｌｙ ＲＰ）等、メタボリズム（Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）  １９９９年３月；４８（３）： ３８５−９〕。特にＷＯ９９／６１４３１には、アミノ酸残基およびチアゾリジンまたはピロリジン基を含むＤＰＩＶ阻害剤、並びにその塩、特にＬ−トレオ−イソロイシルチアゾリジン、Ｌ−アロ−イソロイシルチアゾリジン、Ｌ−トレオ−イソロイシルピロリジン、Ｌ−アロ−イソロイシルチアゾリジン、Ｌ−アロ−イソロイシルピロリジン、およびそれらの塩が開示されている。
【０００７】
低分子量ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ阻害剤の別の例としては、テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキサミド誘導体、Ｎ−置換２−シアノピロールおよび−ピロリジン、Ｎ−（Ｎ´−置換グリシル）−２−シアノピロリジン、Ｎ−（置換グリシル）−チアゾリジン、Ｎ−（置換グリシル）−４−シアノチアゾリジン、アミノ−アシル−ボロノ−プロリル−阻害剤、シクロプロピル縮合ピロリジンおよび複素環式化合物等の薬剤がある。ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶの阻害剤は、ＵＳ６，３８０，３９８；ＵＳ６，０１１，１５５；ＵＳ６，１０７，３１７；ＵＳ６，１１０，９４９；ＵＳ６，１２４，３０５；ＵＳ６，１７２，０８１；ＷＯ９５／１５３０９；ＷＯ９９／６１４３１；ＷＯ９９／６７２７８；ＷＯ９９／６７２７９；ＤＥ  １９８  ３４  ５９１；ＷＯ９７／４０８３２；ＤＥ  １９６  １６  ４８６  Ｃ２；ＷＯ９８／１９９９８；ＷＯ００／０７６１７；ＷＯ９９／３８５０１；ＷＯ９９／４６２７２；ＷＯ９９／３８５０１；ＷＯ０１／６８６０３；ＷＯ０１／４０１８０；ＷＯ０１／８１３３７；ＷＯ０１／８１３０４；ＷＯ０１／５５１０５；ＷＯ０２／０２５６０およびＷＯ０２／１４２７１に記載されており、これらの教示は、特に、これらの阻害剤、それらの定義、使用およびそれらの製造に関するそれらの全てを参照することによってここに記載されたものとする。
【０００８】
用語ＤＰＩＶ様酵素は、ＤＰＩＶ／ＣＤ２６関連酵素たんぱく質〔セド（Ｓｅｄｏ）およびマリック（Ｍａｌｉｋ）、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ様分子；相同性たんぱく質または相同性活性  クエスチョンマーク（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｑｕｅｓｔｉｏｎ ｍａｒｋ）  バイオキミカ  エト  バイオフィジカ  アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）２００１、３６５０６： １−１０〕に構造的および／または作用的に関係がある。本質的に、酵素のこの小さな基は進化の間、進化して、オリゴ−またはポリペプチドのＮ−末端からＨ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−ジペプチドおよびＨ−Ｘａａ−Ａｌａ−ジペプチドを放ってきた。それらは、Ｐｒｏ−位置にＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、およびＧｌｙまたはＶａｌのような小さい疎水性側鎖を有する他のアミノ酸も受け入れるという共通の特徴を示す。加水分解効果は、Ｐｒｏ＞Ａｌａ≫Ｓｅｒ，Ｔｈｒ≫Ｇｌｙ，Ｖａｌである。同じたんぱく質は、ポスト−Ｐｒｏまたはポスト−Ａｌａ開裂のみが認められるような少量で利用されるのみであった。たんぱく質：ＤＰＩＶ、ＤＰ  ＩＩ、ＦＡＰα（Ｓｅｐｒａｓｅ）、ＤＰ６、ＤＰ８およびＤＰ９は構造的に関係があり、高い配列同族性を示すが、アトラクチンは、類似の活性および阻害パターンを特徴とする非常に官能的なＤＰＩＶ様酵素である。
【０００９】
別のＤＰＩＶ様酵素は、ＷＯ０１／１９８６６、ＷＯ０２／０４６１０、ＷＯ０２／３４９００およびＷＯ０２／３１１３４に開示されている。ＷＯ０１／１９８６６には、ＤＰＩＶおよび線維芽細胞活性化たんぱく質（ＦＡＰ）に類似の構造および機能を有する新規なヒトジペプチジルアミノぺプチダ−ゼ（ＤＰＰ８）が開示されている。ＷＯ０２／３４９００には、ＤＰＩＶおよびＤＰＰ８のアミノ酸配列にかなりの同族性を示す新規なジペプチジルぺプチダ−ゼ９（ＤＰＰ９）が開示されている。ＷＯ０２／３１１３４には、３つのＤＰＩＶ様酵素、ＤＰＲＰ１、ＤＰＲＰ２およびＤＰＲＰ３が開示されている。配列分析から、ＤＰＲＰ１はＷＯ０１／１９８６６に記載のようなＤＰＰ８と同一であること、ＤＰＲＰ２はＤＰＰ９と同一であること、そしてＤＰＲＰ３はＷＯ０２／０４６１０に記載のようなＫＩＡＡ１４９２と同一であることが分かった。
【００１０】
免疫生理学および癌におけるＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＩＶ；ＥＣ  ３．４．１４．５；ＣＤ２６）ＣＤ２６は、多くの組織で発現される多くのさまざまな機能性を有するＭｒ１１０，０００表面糖たんぱく質であり、これらには上皮細胞および白血球サブセットが含まれる〔メントレイン（Ｍｅｎｔｌｅｉｎ）、１９９９〕。さらに、それは、細胞外領域で活性を示し、且つ端から２番目の位置にＬ−プロリンまたはＬ−アラニンのいずれかを有するポリペプチドからＮ−末端ジペプチドを切断することができる、膜結合表面ペプチダーゼである。
【００１１】
癌病態メカニズム
癌は、体内における異常細胞の抑制されない成長を特徴とする１５０を越える疾患のグループである。正常な細胞が放射線または特定の薬剤もしくは化学物質のような発癌物質にさらされると、正常細胞は異常になりうる。正常な細胞があるウイルスに攻撃されると、またはまだ十分に分かっていないある内部信号が生じると、悪性（癌性）になりうる。いったん細胞が悪性になると、それらは通常よりも急速に増加する。その後、それらは組織近くに侵入しそして正常な身体機能を妨げる腫瘍と呼ばれる塊を形成することがよくある。癌細胞はまた身体の他の部分に広がる傾向があり、そこでそれらは第２の腫瘍を形成しうる。
【００１２】
転移のメカニズム
癌転移の結果は標的組織内の多くの相互作用によって決まり、そして細胞付着分子、ケモカイン（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ）、または流体力学効果および多くの他の要因によって決まる。さらに、腫瘍部位における白血球の非常に急速な引力および特異な細胞反応は、癌に対する初期の宿主防御において重要な役割を果たす。これらの初期変化は転移疾患の結果に対して決定的に重要なものとなり、そして転移に対する宿主の抵抗力を知ることにもつながる。
【００１３】
ＷＯ９９／４７１５２には、癌細胞に、ジペプチジルペプチダーゼＩＶたんぱく質または線維芽細胞活性化たんぱく質−αをコードするかなりの量の核酸を導入し、これによって癌の悪性表現型を抑制することを含む、患者における悪性表現型を抑制するまたは癌細胞のアポプトシスを誘導する方法が記載されている。ＷＯ９９／４７１５２にはまた、ジペプチジルペプチダーゼＩＶまたは線維芽細胞活性化たんぱく質−αの患者の癌細胞における発現を誘導する方法も記載されており、その方法は、患者に、治療に有効な量の、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ遺伝子または線維芽細胞活性化たんぱく質−α遺伝子の転写を活性化することができる薬剤、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含有する医薬組成物を投与することを含む。
【００１４】
癌および腫瘍細胞付着の現在の治療
現在の癌の治療法には、手術、化学療法、放射線療法、および免疫療法を含めた他の治療法が含まれる。免疫療法は、癌と戦う本来備わっている身体メカニズム（たいていの場合は免疫メカニズム）を用いたりまたは調節することからなる。化学療法は、薬剤またはホルモンを用いることによって癌細胞を殺す。化学療法薬は経口または注射によって投与して、広範囲な癌の治療に用いられる。それらは単独であるいは手術もしくは放射線照射または両者と組み合わせて用いうる。化学療法は広がったおよび身体に循環している検出困難な癌細胞を破壊するための確立された方法である。貧血（赤血球数が少ない）は化学療法においてたびたび起きる副作用であり、過度の倦怠、めまい、または息切れなどの症状を引き起こす。エポエチンアルファ〔プロクリット（Ｐｒｏｃｒｉｔ、登録商標）、エポゲン（Ｅｐｏｇｅｎ、登録商標）〕（赤血球生成を刺激する組換えエリトロポイエチン）は化学療法に関係する貧血の治療に用いられる処方薬である。
【００１５】
免疫療法は、癌細胞を破壊するために身体自体の免疫系または生体の他の部分を用いる。この治療形態は臨床試験で今もなお徹底的に研究されている；これはまだ多くの癌患者に広く利用されていない。用いられるさまざまな免疫学的薬剤には、身体によって生成される物質（例えば、インターフェロン、インターロイキンおよび腫瘍壊死因子）および実験室で生成される物質（例えば、モノクローナル抗体およびワクチン）がある。免疫学的薬剤はさまざまな方法で作用し、独立してまたは他の治療形態と組み合わせて用いることができる。
【００１６】
免疫療法における抗転移薬としての脈管形成阻害剤
脈管形成阻害剤は、新しい血管の形成を妨げる薬剤である。固形腫瘍は新しい血管の形成を誘導することなく成長することはできない。新しい血管の形成が妨害されると、腫瘍への酸素および栄養物の供給は遮断される。
いくつかの脈管形成阻害剤は人において現在試験されている。癌組織において、腫瘍は新しい血管の形成なしで成長したりまたは広がる（転移する）ことはできない。血管は、生存および成長に必要な酸素および栄養物を組織に供給する。
【００１７】
発明の概要
本発明は、式１〜１２のＤＰＩＶ阻害剤およびそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形の、癌および腫瘍を予防および治療するための新規な使用を提供する。より好ましい態様では、本発明の化合物は転移および腫瘍転移増殖の予防および抑制に有用である。
【００１８】
ＤＰＩＶ酵素活性および発現が欠如している突然変異体Ｆ３４４ラットの肺におけるエクトペプチダーゼＤＰＩＶの発現の減少およびＤＰＩＶ様活性の欠如は、結果として癌細胞の付着力の減少および肺転移の減少を招く。Ｆ３４４ラット同系乳腺癌ＭＡＤＢ１０６の生体内細胞付着および成長を、生体内ＤＰＩＶ−リガンドでの短時間および長時間にわたる治療後のＦ３４４ラットにおいて調べた。ＤＰＩＶ酵素活性が欠如している突然変異体Ｆ３４４亜系統および野生型様Ｆ３４４を試験した。２週間にわたる浸透ミニポンプによるイソロイシルシアノピロリジンＴＦＡおよびイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の長時間にわたる胃内注入は、癌に起因する体重減および肺表面における腫瘍コロニー数を投与依存的に減少させた。このように、ＭＡＤＢ１０６の転移は、異なるＤＰＩＶ阻害剤（イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩；イソロイシルシアノピロリジンＴＦＡ）を用いる長時間にわたる治療によって減少して、２つの異なるＤＰＩＶ阻害剤／リガンドによる保護に似た種類の効果を示す。おそらく、イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩およびイソロイシルシアノピロリジンＴＦＡは、保護に似た効果を間接的に仲介する、細胞付着プロセスとの相互作用、細胞宿主防御メカニズムの調節、脈管形成の調節、癌細胞における直接効果、またはＤＰＩＶ基質のレベル増加のいずれかにより、転移から保護する。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明はジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ（ＤＰＩＶ）阻害剤の分野、さらに詳しくは、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性の阻害剤の、癌および腫瘍を予防および治療するための、特に転移および腫瘍転移増殖を予防および抑制するための新規な使用、並びに該化合物を含有する医薬組成物に関する。
【００２０】
本技術分野において提案されている他の方法に対して、本発明は特に、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶの低分子量阻害剤での経口治療を提供するものである。本発明は、癌および転移疾患を予防および治療するための新規な対処法を示す。これは使用者に都合がよく、商業的に有用であり、そして特に人の疾患に関する療法で用いるのに適している。
【００２１】
Ｆ３４４ラットの亜系統に見られるＤＰＩＶ遺伝子の突然変異は、腫瘍付着および転移増殖におけるＤＰＩＶの役割の研究用モデルを提供する。Ｆ３４４ラットにおける変異は、ＤＰＩＶ酵素活性の欠如を生じ、ドイツ（ＧＥＲ）および日本（ＪＡＰ）からの亜系統に見られる〔トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）等、１９９１；ツジ（Ｔｓｕｊｉ）等、１９９２〕が、これに対して、ＵＳＡブリーダーからのラットは有意な酵素活性を示す。Ｆ３４４ＪＡＰラットでは、ＤＰＩＶたんぱく質におけるＧ６３３Ｒ置換が突然変異不活性酵素の発現の著しい減少を招く〔チェン（Ｃｈｅｎｇ）等、１９９９；ツジ等、１９９２〕が、これに対して、他のＤＰＩＶ陰性Ｆ３４４ＧＥＲ亜系統は不活性突然変異酵素を発現する（トンプソン等、１９９１）。
これらの発見に基づいて、本発明による癌におけるＤＰＩＶ発現および酵素活性の役割の研究から、ＤＰＩＶ阻害剤の経口投与が肺転移および転移増殖を減少させることが分かった。
【００２２】
本発明の目的は、高い生物学的利用能を示すジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ阻害剤および／またはリガンドの開発である。別の好ましい態様では、本発明は、標的組織において正確に予測可能な活性時間を有するＤＰＩＶ阻害剤を提供する。
【００２３】
標的特異的で経口使用可能な低分子量薬剤の例は、一般式Ａ−Ｂ−Ｃの安定および不安定ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ阻害剤のプロドラッグであり、ここで、Ａはアミノ酸を表し、ＢはＡとＢとの間の化学結合またはアミノ酸を表し、そしてＣはジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶの不安定なまたは安定な阻害剤を表す。これらはＷＯ９９／６７２７８およびＷＯ９９／６７２７９に記載されており、プロドラッグの規定、定義、使用および製造に関するそれらの教示は、それらの全てを参照することによってここに記載されたものとする。特に、Ａ、ＢおよびＣの詳細な定義は、参照することによってここに記載されたものとする。
【００２４】
本発明は新規な方法に関し、その方法では、酵素ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＩＶまたはＣＤ２６）の活性またはＤＰＩＶ様酵素活性の減少、あるいはＤＰＩＶ特異的リガンドの結合場所が、酵素のエフェクターによって誘導される哺乳動物の生体における腫瘍抑制または免疫刺激効果を発揮し、その結果として、癌細胞の成長または付着の減少をもたらす。そのような治療は癌細胞付着（転移）または腫瘍成長の減少または遅延をもたらす。その結果、癌を有する哺乳動物はＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素活性の阻害剤での治療から恩恵を受ける。
【００２５】
癌および関連疾患の予防および治療を必要とする人を含めた哺乳動物における癌および関連疾患を予防および治療するための本発明の方法および使用は、ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素の阻害剤またはリガンドを用いる、結合によるまたはＤＰＩＶもしくは関連酵素活性の阻害による、抗癌効果を含む。ＤＰＩＶ阻害剤の経口投与はたいていの場合において好ましい。
【００２６】
生体内癌細胞付着分析（実施例１３）および癌転移増殖分析（実施例１４）におけるＤＰＩＶ様活性および／または結合を減少させる抗癌様および抗転移様作用に焦点を合わせた次の実施例を参照して本発明を説明する。
【００２７】
１つの態様では、本発明は、アミノ酸およびチアゾリジンまたはピロリジン基から形成されるジペプチド化合物およびジペプチド化合物の類似化合物、並びにそれらの塩に関する。これらの化合物は以後、ジペプチド化合物と呼ぶ。好ましくは、アミノ酸およびチアゾリジンまたはピロリジン基はアミド結合で結合している。
【００２８】
本発明の目的に特に適したものは、アミノ酸が天然アミノ酸、例えば、ロイシン、バリン、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、イソロイシン、アスパラギンおよびアスパラギン酸から好ましくは選択されるジペプチド化合物である。
本発明で用いられるジペプチド化合物は１０μＭの（ジペプチド化合物の）濃度で、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶまたはＤＰＩＶ類似酵素の活性を少なくとも１０％、特に少なくとも４０％減少させる。少なくとも６０％または少なくとも７０％の活性減少も、しばしば必要とされる。好ましいエフェクターは最高２０％または３０％の活性減少を示す。
【００２９】
好ましい化合物は、Ｌ−アロ−イソロイシルチアゾリジン、Ｌ−トレオ−イソロイシルピロリジンおよびそれらの塩、特にフマル酸塩、並びにＬ−アロ−イソロイシルピロリジンおよびそれらの塩である。特に好ましい化合物は、式１および２：
【化８】
2004521149.tif 000002
のグルタミニルピロリジンおよびグルタミニルチアゾリジンである。さらに好ましい化合物は以下に示す。
ジペプチド化合物の塩は、１：１または２：１のジペプチド（−類似体）成分対塩成分モル比で存在しうる。そのような塩は、例えば、（Ｉｌｅ−Ｔｈｉａ）２フマル酸塩である。
【００３０】
さらに好ましいジペプチド化合物の構造
2004521149.tif 000003
【００３１】
別の好ましい態様では、本発明は、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ触媒作用の拮抗調節に有用な式３：
【化９】
2004521149.tif 000004
のペプチド化合物を提供するものであり、式中、
Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは独立して、たんぱく質原性アミノ酸、非たんぱく質原性アミノ酸、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸を含めたアミノ酸部分であり、ここで、Ｅおよび／またはＤは以下に詳記するような追加条件では不在でもよい。
【００３２】
式３の追加条件：
Ａは、Ｄ−アミノ酸以外のアミノ酸であり、
Ｂは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸およびピペコリン酸から選択されるアミノ酸であり、
Ｃは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸、ピペコリン酸以外およびＮ−アルキル化アミノ酸、例えばＮ−メチルバリンおよびサルコシン以外のいずれかのアミノ酸であり、
Ｄは、いずれかのアミノ酸であるか、または欠けており、そして
Ｅは、いずれかのアミノ酸であるか、または欠けており、
あるいは、
Ｃは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸、ピペコリン酸以外、Ｎ−アルキル化アミノ酸、例えば、Ｎ−メチルバリンおよびサルコシン以外およびＤ−アミノ酸以外のいずれかのアミノ酸であり、
Ｄは、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸およびピペコリン酸から選択されるいずれかのアミノ酸であり、そして
Ｅは、Ｐｒｏ、Ｈｙｐ、アセチジン−（２）−カルボン酸、ピペコリン酸以外およびＮ−アルキル化アミノ酸、例えばＮ−メチルバリンおよびサルコシン以外のいずれかのアミノ酸である。
【００３３】
本発明で用いうるアミノ酸の例は、ＬおよびＤ−アミノ酸、Ｎ−メチル−アミノ−酸；ＩｌｅおよびＴｈｒのアロ−およびトレオ−形であり、これらは、例えばα−、β−またはω−アミノ酸であることができ、それらの中でα−アミノ酸が好ましい。
【００３４】
請求項および説明におけるアミノ酸の例を以下に示す：
アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アルギニン（Ａｒｇ）、リシン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、グリシン（Ｇｌｙ）、セリン（Ｓｅｒ）およびシステイン（Ｃｙｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アラニン（Ａｌａ）、プロリン（Ｐｒｏ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ベータ−アラニン（ベータ−Ａｌａ）、２−アミノオクタン酸（Ａｏａ）、アゼチジン−（２）−カルボン酸（Ａｃｅ）、ピペコリン酸（Ｐｉｐ）、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸等、アルファ−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、サルコシン（Ｓａｒ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモアルギニン（Ｈａｒ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ブチル−Ａｌａ）、ｔ−ブチルグリシン（ｔ−ブチル−Ｇｌｙ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−Ｍｅｌｌｅ）、フェニルグリシン（Ｐｈｇ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、システイン酸（Ｃｙａ）およびメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）、アセチル−Ｌｙｓ、装飾アミノ酸、例えばホスホリル−セリン（Ｓｅｒ（Ｐ））、ベンジル−セリン（Ｓｅｒ（Ｂｚｌ））およびホスホリル−チロシン（Ｔｙｒ（Ｐ））、２−アミノ酪酸（Ａｂｕ）、アミノエチルシステイン（ＡＥＣｙｓ）、カルボキシメチルシステイン（Ｃｍｃ）、デヒドロアラニン（Ｄｈａ）、デヒドロアミノ−２−酪酸（Ｄｈｂ）、カルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）、ホモセリン（Ｈｓｅ）、ヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、シス−ヒドロキシプロリン（ｃｉｓＨｙｐ）、トランス−ヒドロキシプロリン（ｔｒａｎｓＨｙｐ）、イソバリン（Ｉｖａ）、ピログルタミン酸（Ｐｙｒ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、２−アミノ安息香酸（２−Ａｂｚ）、３−アミノ安息香酸（３−Ａｂｚ）、４−アミノ安息香酸（４−Ａｂｚ）、４−（アミノメチル）安息香酸（Ａｍｂ）、４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（４−Ａｍｃ）、ペニシラミン（Ｐｅｎ）、２−アミノ−４−シアノ酪酸（Ｃｂａ）、シクロアルカン−カルボン酸。
【００３５】
ω−アミノ酸の例は、例えば、５−Ａｒａ（アミノ吉草酸）、６−Ａｈｘ（アミノヘキサン酸）、８−Ａｏｃ（アミノオクタン酸）、９−Ａｎｃ（アミノノナン酸）、１０−Ａｄｃ（アミノデカン酸）、１１−Ａｕｎ（アミノウンデカン酸）、１２−Ａｄｏ（アミノドデカン酸）である。
【００３６】
別のアミノ酸は、インダニルグリシン（Ｉｇｌ）、インドリン−２−カルボン酸（Ｉｄｃ）、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸（Ｏｉｃ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）、ナフチルアラニン（１−Ｎａｌ）、（２−Ｎａｌ）、４−アミノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−ＮＨ２））、４−ベンゾイルフェニルアラニン（Ｂｐａ）、ジフェニルアラニン（Ｄｉｐ）、４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｂｒ））、２−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（２−Ｃｌ））、３−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｃｌ））、４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｃｌ））、３，４−クロロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３，４−Ｃｌ２））、３−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｆ））、４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｆ））、３，４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３，４−Ｆ２））、ペンタフルオロフェニルアラニン（Ｐｈｅ（Ｆ５））、４−グアニジノフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−グアニジノ））、ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）、３−ヨードフェニルアラニン（Ｐｈｅ（３−Ｊ））、４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｊ））、４−メチルフェニルアラニン（Ｐｈｅ（４−Ｍｅ））、４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｈｅ−４−ＮＯ２）、ビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）、４−ホスホノメチルフェニルアラニン（Ｐｍｐ）、シクロヘキシルグリシン（Ｇｈｇ）、３−ピリジニルアラニン（３−Ｐａｌ）、４−ピリジニルアラニン（４−Ｐａｌ）、３，４−デヒドロプロリン（Ａ−Ｐｒｏ）、４−ケトプロリン（Ｐｒｏ（４−ケト））、チオプロリン（Ｔｈｚ）、イソニペコチン酸（Ｉｎｐ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）、プロパルギルグリシン（Ｐｒａ）、６−ヒドロキシノルロイシン（ＮＵ（６−ＯＨ））、ホモチロシン（ｈＴｙｒ）、３−ヨードチロシン（Ｔｙｒ（３−Ｊ））、３，５−ジヨードチロシン（Ｔｙｒ（３，５−Ｊ２））、ｄ−メチル−チロシン（Ｔｙｒ（Ｍｅ））、３−ＮＯ２−チロシン（Ｔｙｒ（３−ＮＯ２））、ホスホチロシン（Ｔｙｒ（ＰＯ３Ｈ２））、アルキルグリシン、１−アミノインダン−１−カルボン酸、２−アミノインダン−２−カルボン酸（Ａｉｃ）、４−アミノ−メチルピロール−２−カルボン酸（Ｐｙ）、４−アミノ−ピロリジン−２−カルボン酸（Ａｂｐｃ）、２−アミノテトラリン−２−カルボン酸（Ａｔｃ）、ジアミノ酢酸（Ｇｌｙ（ＮＨ２））、ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、１，３−ジヒドロ−２Ｈ−イソイノール−カルボン酸（Ｄｉｓｃ）、ホモシクロヘキシルアラニン（ｈＣｈａ）、ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅまたはＨｏｆ）、トランス−３−フェニルアゼチジン−２−カルボン酸、４−フェニル−ピロリジン−２−カルボン酸、５−フェニル−ピロリジン−２−カルボン酸、３−ピリジルアラニン（３−Ｐｙａ）、４−ピリジルアラニン（４−Ｐｙａ）、スチリルアラニン、テトラヒドロイソキノリン−１−カルボン酸（Ｔｉｑ）、１，２，３，４−テトラヒドロノルハルマン−３−カルボン酸（Ｔｐｉ）、β−（２−チエニル）−アラニン（Ｔｈａ）である。
【００３７】
遺伝コードにコードされる他のアミノ酸置換基も本発明の範囲のペプチド化合物に含めることができ、これらはこの一般式の中に入るものとして分類しうる。
たんぱく質原性アミノ酸は天然たんぱく質由来α−アミノ酸として定義される。非たんぱく質原性アミノ酸は他の全てのアミノ酸として定義され、これらは一般的な天然たんぱく質の構成単位ではない。
【００３８】
得られるペプチドは遊離Ｃ−末端酸としてまたはＣ−末端アミド形として合成されうる。遊離酸ペプチドまたはアミドは側鎖修飾によって変えうる。そのような側鎖修飾は、例えば、これらに限定されないが、ホモセリン形成、ピログルタミン酸形成、ジスルフィド結合形成、アスパラギンまたはグルタミン残基の脱アミド化、メチル化、ｔ−ブチル化、ｔ−ブチルオキシカルボニル化、４−メチルベンジル化、チオアニシル化、チオクレシル化、ベンシロキシメチル化、４−ニトロフェニル化、ベンシロキシカルボニル化、２−ニトロベンコイル化、２−ニトロスルフェニル化、４−トルエンスルホニル化、ペンタフルオロフェニル化、ジフェニルメチル化、２−クロロベンジルオキシカルボニル化、２，４，５−トリクロロフェニル化、２−ブロモベンジルオキシカルボニル化、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル化、トリフェニルメチル化、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル化、ヒドロキシル化、メチオニンの酸化、ホルミル化、アセチル化、アニシル化、ベンシル化、ベンコイル化、トリフルオロアセチル化、アスパラギン酸またはグルタミン酸のカルボキシル化、ホスホリル化、硫酸化、システイニル化、ペントース、デオキシヘキソース、ヘキソサミン、ヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソサミンでのグリコール化、ファルネシル化、ミリストール化、ビオチニル化、パルミトイル化、ステアロイル化、ゲラニルゲラニル化、グルタチオニル化、５´−アデノシル化、ＡＤＰ−リボシル化、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ピリドキサルホスフェート、リポ酸、４´−ホスホパンテテイン、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドでの修飾である。
【００３９】
式（３）の化合物において、アミノ酸部分Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、標準命名法によると、通常のように、アミド結合によって隣接部分にそれぞれ結合しており、その結果、アミノ酸（ペプチド）のアミノ末端（Ｎ−末端）は左側に引っ張られ、アミノ酸（ペプチド）のカルボキシル末端（Ｃ−末端）は右側に引っ張られる。
【００４０】
出願人による本発明までに、試験管内のプロリン特異的セリンプロテアーゼジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶのペプチド基質として、トリペプチドジプロチンＡ（Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ）、ジプロチンＢ（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ）およびジプロチンＣ（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ）が知られている。出願人は、ここに記載の化合物が、哺乳動物において、生体内のジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶの基質として作用すること、およびこれらが、薬理学的投与量で、拮抗触媒作用によって内因性基質の生理学的転換を阻害することを意外にも見出した。
【００４１】
ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素のモジュレーターとして有用な本発明の特に好ましい化合物には、ウイスターラットにｉ．ｖ．および／またはｐ．ｏ．投与した後の生体内ＤＰＩＶ阻害において効果的にＤＰＩＶ結合するためのＫｉ値 を示す化合物が含まれる。
【００４２】
さらに好ましい化合物は式４：
【化１０】
2004521149.tif 000005
のペプチジルケトンであり、式中、
Ａは、
【化１１】
2004521149.tif 000006
から選択され、
Ｘ１は、Ｈ、またはあらゆるアミノ酸およびペプチド残基を含めたアシルもしくはオキシカルボニル基であり、
Ｘ２は、Ｈ、−（ＣＨ）ｎ−ＮＨ−Ｃ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（ｎ＝２〜４）またはＣ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（２価ピリジル残基）であり、Ｙは、Ｈ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ２またはＣＮから選択され、
Ｘ３は、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていない、フェニルまたはピルジル残基であり、
Ｘ４は、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていない、フェニルまたはピルジル残基であり、
Ｘ５は、Ｈ、またはアルキル、アルコキシもしくはフェニル残基であり、
Ｘ６は、Ｈまたはアルキル残基であり、
ｎ＝１である場合、
Ｘは、Ｈ、ＯＲ２、ＳＲ２、ＮＲ２Ｒ３、Ｎ＋Ｒ２Ｒ３Ｒ４から選択され、ここで、
Ｒ２は、１、２もしくはそれ以上のアルキル、シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール残基で置換されたもしくは置換されていないアシル残基、あるいはあらゆるアミノ酸およびペプチド残基、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、シクロアルキル、アリールまたはヘテロアリール残基で置換されたもしくは置換されていないアルキル残基を表し、
Ｒ３はアルキルおよびアシル官能基を表し、ここで、Ｒ２およびＲ３は飽和および不飽和炭素環式または複素環式構造の１つ以上の環構造の一部でもよく、
Ｒ４はアルキル残基を表し、ここで、Ｒ２およびＲ４またはＲ３およびＲ４は飽和および不飽和炭素環式または複素環式構造の１つ以上の環構造の一部でもよく、
ｎ＝０である場合、
Ｘは、
【化１２】
2004521149.tif 000007
（式中、
Ｂは、Ｏ、Ｓ、ＮＲ５を表し、ここで、Ｒ５は、Ｈ、アルキリデンまたはアシルであり、
Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈは、非置換および置換アルキル、オキシアルキル、チオアルキル、アミノアルキル、カルボニルアルキル、アシル、カルバモイル、アリールおよびヘテロアリール残基から独立して選択される）
から選択され、そして
ｎ＝０およびｎ＝１である場合、
Ｚは、Ｈ、またはＣ１−Ｃ９の分枝鎖もしくは単鎖アルキル残基、またはＣ２−Ｃ９の分枝鎖もしくは単鎖アルケニル残基、Ｃ３−Ｃ８のシクロアルキル残基、Ｃ５−Ｃ７のシクロアルケニル残基、アリール−もしくはヘテロアリール残基、またはあらゆる天然アミノ酸もしくはその誘導体のあらゆる側鎖より選ばれる側鎖から選択される。
【００４３】
さらに、本発明では式５、６、７、８、９、１０および１１の化合物、並びにそれらの全ての立体異性体および薬学的に許容される塩が開示されており、これらを用いることができる。
【００４４】
【化１３】
2004521149.tif 000008
式中、
Ｒ１は、Ｈ、分枝もしくは線状Ｃ１−Ｃ９アルキル残基、分枝もしくは線状Ｃ２−Ｃ９アルケニル残基、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル−、Ｃ５−Ｃ７のシクロアルケニル−、アリール−もしくはヘテロアリール残基、または天然アミノ酸もしくはその誘導体の側鎖であり、
Ｒ３およびＲ４は、Ｈ、ヒドロキシ、アルキル、アルコキシ、アリールオキシ、ニトロ、シアノまたはハロゲンから独立して選択され、
Ａは、Ｈまたは炭酸のイソスター、例えばＣＮ、ＳＯ３Ｈ、ＣＯＮＨＯＨ、ＰＯ３Ｒ５Ｒ６、テトラゾール、アミド、エステル、無水物、チアゾールおよびイミダゾールから選択される官能基であり、
Ｂは
【化１４】
2004521149.tif 000009
（式中、
Ｒ５は、Ｈ、−（ＣＨ）ｎ−ＮＨ−Ｃ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（ｎ＝２〜４）およびＣ５Ｈ３Ｎ−Ｙ（２価ピリジル残基）であり、Ｙ＝Ｈ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｉ、ＮＯ２またはＣＮであり、
Ｒ１０は、Ｈ、アシル、オキシカルボニルまたはアミノ酸残基であり、
Ｗは、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていないフェニルまたはピリジル残基であり、
Ｗ１は、Ｈ、アルキル、アルコキシまたはフェニル残基であり、
Ｚは、Ｈ、あるいは１、２もしくはそれ以上のアルキル、アルコキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノまたはカルボキシ残基で置換されたもしくは置換されていないフェニルまたはピリジル残基であり、
Ｚ１は、Ｈまたはアルキル残基である）
から選択され、
Ｄは、１、２もしくはそれ以上のアルキル基または環式４〜７員へテロアルキルまたは環式４〜７員へテロアルケニル残基で置換されたもしくは置換されていない環式Ｃ４−Ｃ７アルキル、Ｃ４−Ｃ７アルケニル残基であり、
Ｘ２は、Ｏ、ＮＲ６、Ｎ＋（Ｒ７）２、またはＳであり、
Ｘ３〜Ｘ１２は、ＣＨ２、ＣＲ８Ｒ９、ＮＲ６、Ｎ＋（Ｒ７）２、Ｏ、Ｓ、ＳＯおよびＳＯ２から独立して選択され、あらゆる飽和および不飽和構造を含み、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９は、Ｈ、分枝もしくは線状Ｃ１−Ｃ９アルキル残基、分枝もしくは線状Ｃ２−Ｃ９アルケニル残基、Ｃ３−Ｃ８シクロアルキル残基、Ｃ５−Ｃ７シクロアルケニル残基、アリールもしくはヘテロアリール残基から独立して選択され、
ただし、
式６：ＡがＨでなければ、Ｘ６はＣＨであり、
式７：ＡがＨでなければ、Ｘ１０はＣであり、
式８：ＡがＨでなければ、Ｘ７はＣＨであり、
式９：ＡがＨでなければ、Ｘ１２はＣである。
【００４５】
説明および請求項において、「アシル」という表現は、Ｃ１−２０アシル残基、好ましくはＣ１−８アシル残基、特に好ましくはＣ１−４アシル残基を意味し、「シクロアルキル」はＣ３−１２シクロアルキル残基、好ましくはＣ４、Ｃ５またはＣ６シクロアルキル残基を意味し、「炭素環式」はＣ３−１２炭素環式残基、好ましくはＣ４、Ｃ５またはＣ６炭素環式残基を意味する。「ヘテロアリール」はアリール残基として定義され、１〜４、好ましくは１、２または３個の環原子がＮ、ＳまたはＯのような複素原子に取って代わられている。「複素環式」はシクロアルキル残基として定義され、１、２または３個の環原子がＮ、ＳまたはＯのような複素原子に取って代わられている。「ペプチド」は、ジペプチドないしデカペプチドから選択され、好ましいのはジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドおよびペンタペプチドである。「ペプチド」を形成するためのアミノ酸は、上に挙げたものから選択することができる。
【００４６】
たんぱく質は体内に広く分布しており、そしてＤＰＩＶ、ＤＰＩＶ活性およびＤＰＩＶ関連たんぱく質がかかわる様々なメカニズムがあるため、ＤＰＩＶ阻害剤での全身的治療（腸内または非経口投与）は一連の望ましくない副作用を招き得る。
さらに、解決すべき課題は、局部的に限定された病態生理学的および生理学的過程に標的を絞って影響を与えるために用いうる化合物を提供することであった。本発明の課題は特に、局部活性基質の活性の調節を標的介入するためにＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様活性を局部的に限定阻害することにある。
【００４７】
この課題は、一般式（１２）
【化１５】
2004521149.tif 000010
（式中、
Ａは、側鎖に少なくとも１つの官能基を有するアミノ酸であり、
Ｂは、Ａの側鎖の少なくとも１つの官能基に共有結合した化合物であり、そして
Ｃは、Ａにアミド結合したチアゾリジン、ピロリジン、シアノピロリジン、ヒドロキシプロリン、デヒドロプロリンまたはピペリジン基である）
の化合物により本発明に従って解決される。
【００４８】
これらの化合物は免疫、自己免疫または中枢神経系関連疾患の緩和に用いることができる。
本発明の好ましい態様では、一般式（１２）の少なくとも１種の化合物および作用部位に適した少なくとも１種の通常の補助薬を含む医薬組成物が用いられる。
【００４９】
好ましくは、Ａはα−アミノ酸、特に、側鎖に１、２またはそれ以上の官能基を有する天然α−アミノ酸、好ましくは、トレオニン、チロシン、セリン、アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはシステインである。
好ましくは、Ｂは、２０以下のアミノ酸の鎖長を有するオリゴペプチド、分子量が２０，０００ｇ／ｍｏｌ以下のポリエチレングリコール、８〜５０個の炭素原子を有する置換されていてもよい有機アミン、アミド、アルコール、酸または芳香族化合物である。
【００５０】
説明および請求項において、「アルキル」は、Ｃ１−５０アルキル基、好ましくはＣ６−３０アルキル基、特にＣ８−１２アルキル基を意味し；例えば、アルキル基は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルまたはブチル基である。例えば「アルコキシ」および「アルカノイル」に含まれるアルキルは「アルキル」で定義したとおりであり；芳香族化合物は好ましくは置換されたまたは任意に置換されていないフェニル、ベンジル、ナフチル、ビフェニルまたはアントラセン基であり、好ましくは少なくとも８個の炭素原子を有し；「アルケニル」はＣ２−１０アルケニル基、好ましくはＣ２−６アルケニル基を意味し、望ましい位置に二重結合を有し、そして置換されていても置換されていなくてもよく；「アルキニル」はＣ２−１０アルキニル基、好ましくはＣ２−６アルキニル基を意味し、望ましい位置に三重結合を有し、そして置換されていても置換されていなくてもよく；「置換されている」または置換基は、１つ以上、好ましくは１つまたは２つの、アルキル、アルケニル、アルキニル、モノ−もしくは多価アシル、アルカノイル、アルコキシアルカノイルまたはアルコキシアルキル基による望ましい置換を意味し；上記の置換基は１つ以上（好ましくはゼロ）のアルキル、アルケニル、アルキニル、モノ−もしくは多価アシル、アルカノイル、アルコキシアルカノイルまたはアルコキシアルキル基を側基として有していてもよく；それぞれ８〜５０個、好ましくは１０〜２０個の炭素原子を有する有機アミン、アミド、アルコールまたは酸は、式（アルキル）２Ｎ−またはアルキル−ＮＨ−、−ＣＯ−Ｎ（アルキル）２または−ＣＯ−ＮＨ（アルキル）、−アルキル−ＯＨまたは−アルキル−ＣＯＯＨを有しうる。
【００５１】
側鎖機能を拡大したにもかかわらず、式（１２）の化合物は酵素ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶおよび類似酵素の活性中心に依然として結合することができるが、ペプチド輸送体ＰｅｐＴ１によってもはや活性的に輸送されることはない。本発明による化合物の、結果的に減少または大きく制限された輸送性は、理想的に、局所的なまたは部位が指示されたＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性阻害をもたらす。
【００５２】
式（１２）の化合物または本発明に従って用いられる他の化合物およびプロドラッグは、それぞれ、ラセミ化合物の形でまたは光学的対掌的に純粋な化合物の形で、好ましくは式（１２）の部分Ａに対してＬ−トレオまたはＬ−アロ形で存在または使用することができる。
【００５３】
側鎖修飾の拡大／延長、例えば炭素原子数７を越えることによって、輸送性を劇的に減少させることが可能である（実施例１２参照）。表１２．１の実施例から明らかなように、側鎖の空間的な大きさを増加させるにつれて、物質の輸送性は減少する。側鎖を空間的におよび立体的に拡大することによって、例えばモノ置換フェニル基、ヒドロキシルアミン基またはアミノ酸残基の原子基より大きくすることによって、標的物質の輸送性を調節したりまたは抑制することは本発明により可能である。
【００５４】
本発明によると、式（１２）の化合物は、哺乳動物の体内において、部位特異的に、ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様活性を阻害する。従って、効果的にかつ副作用を劇的に減少させて、局所的生理学的および病態生理学的状態（炎症、乾癬、関節炎、自己免疫疾患、アレルギー、癌、転移）に影響を及ぼすことが可能である。
【００５５】
式（１２）の好ましい化合物は、オリゴペプチドが３〜１５、特に４〜１０のアミノ酸の鎖長を有し、および／またはポリエチレングリコールが少なくとも２５０ｇ／ｍｏｌ、好ましくは少なくとも１５００ｇ／ｍｏｌで１５，０００ｇ／ｍｏｌ以下の分子量を有し、および／または任意に置換された有機アミン、アミド、アルコール、酸または芳香族化合物が少なくとも１２個そして好ましくは３０個以下の炭素原子を有する化合物である。
【００５６】
本発明の化合物は酸付加塩、特に薬学的に許容される酸付加塩に変換することができ、そしてそれらのまま使用することができる。薬学的に許容される塩は、アミノ酸塩基性側鎖が無機または有機酸でプロトン化されている形を一般にとる。代表的な有機または無機酸には、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、シュウ酸、パモエ酸、２−ナフタレンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、糖酸またはトリフルオロ酢酸が含まれる。式（１）〜（１２）の化合物のあらゆる薬学的に許容される酸付加塩形は本発明の範囲に包含される。
遊離化合物とそれらの塩の形の化合物との間の近い関係を考慮すると、化合物がこの文脈で示されているときはいつでも、その状況下で可能または適切ならば、相当する塩も意味する。
【００５７】
本発明はさらに、本発明の化合物のプロドラッグをその範囲に含める。一般に、そのようなプロドラッグは、望ましい治療活性化合物に生体内で容易に変換しうる化合物の機能性誘導体である。従って、これらの場合、本発明の使用は、１種以上の請求化合物のプロドラッグ変形体での、記載されている各種疾患の治療を包含し、これらの化合物は患者に投与した後に生体内で上記特定化合物に変換する。適したプロドラッグ誘導体の選択および製造の一般的な方法は、例えば、「プロドラッグの設計（Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ）」、編集  エイチ．ブンドガード（Ｈ． Ｂｕｎｄｇａａｒｄ）、エルセヴィア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、１９８５ ならびに特許出願ＤＥ  １９８  ２８  １１３およびＤＥ  １９８  ２８  １１４（参照することによってここに記載されたものとする）に記載されている。
【００５８】
本発明の化合物またはプロドラッグが少なくとも１つのキラル中心を有する場合、それらは光学的対掌体として存在しうる。本発明の化合物またはプロドラッグが２つ以上のキラル中心を有する場合、それらはさらにジアステレオマーとして存在しうる。そのような異性体およびそれらの混合物の全てが本発明の範囲に入ることは無論のことである。さらに、化合物またはプロドラッグの結晶形のいくつかは多形体として存在し、それらは本発明に含まれる。さらに、いくつかの化合物は水との溶媒和物（すなわち水和物）または一般的な有機溶媒との溶媒和物を形成する。そのような溶媒和物も本発明の範囲に包含される。
化合物（それらの塩を含む）はそれらの水和物の形でも得ることができ、あるいはそれらには結晶化に用いられた他の溶媒が含まれていてもよい。
【００５９】
上記のように、本発明の化合物およびプロドラッグ、並びにそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形は、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性の阻害に有用である。本発明の化合物およびプロドラッグ、並びにそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形が、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性を阻害する能力は、実施例７および８に記載のように、試験管内でのＫｉ値およびＩＣ５０値を測定するＤＰＩＶ活性分析を用いて証明し得る。
本発明の化合物、およびそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形が、生体内でＤＰＩＶを阻害する能力は、実施例１１に記載のように、ウイスターラットへの経口または血管内投与によって証明し得る。本発明の化合物は、ウイスターラットへ経口および血管内投与した後、生体内でＤＰＩＶ活性を阻害する。
【００６０】
ＤＰＩＶは広範囲な哺乳動物器官および組織、例えば、腸刷毛子縁〔グトシュミット  エス．（Ｇｕｔｓｃｈｍｉｄｔ Ｓ．）等、「イン  シトゥ（Ｉｎ ｓｉｔｕ）」−ラット空腸絨毛に沿った領域の腸刷毛子縁におけるたんぱく質含有量の測定および４種の酵素活性とそれらとの相関性、組織化学（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） １９８１年、７２ （３）、４６７−７９〕、外分泌上皮、肝細胞、尿細管、内皮、筋線維芽細胞〔フェラー  エー．シー．（Ｆｅｌｌｅｒ Ａ． Ｃ．）等、ヒト組織におけるジペプチジルペプチダーゼＩＶを検出するモノクロナール抗体、ヴィールチョウズ  アルク．エー．パソール．アナト．ヒストパソール．（Ｖｉｒｃｈｏｗｓ Ａｒｃｈ． Ａ． Ｐａｔｈｏｌ． Ａｎａｔ． Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ．）１９８６年； ４０９ （２）： ２６３−７３〕、神経細胞、特定の胚上皮、例えばファローピウス管、子宮の外膜、および、例えば小胞腺上皮の管腔細胞質中、およびブルンナー腺の粘膜細胞中の小胞腺〔ハーテル  エス．（Ｈａｒｔｅｌ Ｓ．）等、ラット器官におけるジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ）ＩＶ、免疫組織化学と活性組織化学との比較、組織化学（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１９８８年； ８９ （２）： １５１−６１〕、生殖器官、例えば精巣上体尾および膨大部、精嚢およびそれらの分泌物〔アグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）およびヴァンハ−ペルトゥラ（Ｖａｎｈａ−Ｐｅｒｔｔｕｌａ）、ウシ属の再生器官および分泌物におけるジペプチジルペプチダーゼ、イント．ジェー．アンドロール．（Ｉｎｔ． Ｊ． Ａｎｄｒｏｌ．）１９８６年、９ （６）： ４３５−５２〕に存在する。ヒトの血清中には、ジペプチジルぺプチダ−ゼの２分子形が存在する〔クレペラ  イー．（Ｋｒｅｐｅｌａ Ｅ．）等、通常のヒト血清におけるジペプチジルペプチダーゼＩＶの２分子形の証明、フィジオール．ボヘモソルブ．（Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂｏｈｅｍｏｓｌｏｖ．）１９８３年、 ３２ （６）： ４８６−９６〕。ＤＰＩＶの血清高分子量形は活性化Ｔ細胞表面で発現される〔ドゥーク−コハン  ジェー．エス．（Ｄｕｋｅ−Ｃｏｈａｎ Ｊ． Ｓ．）等、血清高分子量ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＣＤ２６） は活性Ｔ細胞から放出される新規抗原ＤＰＰＴ−Ｌに類似している。ジェー．イミュノール（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ）１９９６年、１５６ （５）： １７１４−２１〕。
【００６１】
本発明の化合物およびプロドラッグ、並びにそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩は、生体内でＤＰＩＶを阻害することができる。本発明の１つの態様では、あらゆる哺乳動物の組織および器官からのＤＰＩＶの全ての分子形、同族体およびエピトープ、そしてさらにまだ発見されていないこれらのものは、本発明の範囲に入る。
【００６２】
プロリン特異的プロテアーゼのまれなグループの中で、ＤＰＩＶは、ポリペプチド鎖のアミノ末端のペナルティメート残基として、プロリンに特異的な唯一の膜結合酵素であると初めは考えられた。しかしながら、ＤＰＩＶと構造的に非同族体であっても相当する酵素活性を有する他の分子が最近確認された。これまでに確認されているＤＰＩＶ様酵素は、例えば、線維芽細胞活性化たんぱく質α、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶβ、ジペプチジルアミノぺプチダ−ゼ様たんぱく質、Ｎ−アセチル化α−結合酸性ジぺプチダ−ゼ、休止細胞プロリンジぺプチダ−ゼ、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＩ、アトラクチンおよびジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ関連たんぱく質（ＤＰＰ８）であり、これらはセド（Ｓｅｄｏ）およびマリック（Ｍａｌｉｋ）の報告論文〔セドおよびマリック、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ様分子；相同性たんぱく質または相同性活性  クエスチョンマーク（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｓｅ ＩＶ−ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ： ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｑｕｅｓｔｉｏｎ ｍａｒｋ）、バイオキミカ  エト  バイオフィジカ  アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ）２００１， ３６５０６： １−１０〕に記載されている。別のＤＰＩＶ様酵素は、ＷＯ０１／１９８６６、ＷＯ０２／０４６１０およびＷＯ０２／３４９００に開示されている。ＷＯ０１／１９８６６には、ＤＰＩＶおよび線維芽細胞活性化たんぱく質（ＦＡＰ）に類似の構造および機能を有する新規なヒトジペプチジルアミノぺプチダ−ゼ８（ＤＰＰ８）が開示されている。ＷＯ０２／０４６１０のジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ様酵素は本技術分野で周知である。ジーンバンク（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ）データベースには、この酵素はＫＩＡＡ１４９２として登録されている。本発明の別の好ましい態様では、あらゆる哺乳動物の組織および器官からの、ＤＰＩＶ様酵素活性を有するたんぱく質である、全ての分子形、同族体およびエピトープ、そしてさらにまだ発見されていないこれらのものは、本発明の範囲に入る。
【００６３】
本発明の化合物およびプロドラッグ、並びにそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形のＤＰＩＶ様酵素を阻害する能力は、実施例９に記載のように、試験管内でのＫｉ値を測定する酵素活性分析を用いて証明しうる。ブタのジペプチジルぺプチダ−ゼＩＩに対する本発明の化合物のＫｉ値は、例えば、グルタミニルピロリジンについてはＫｉ＝８．５２＊１０−５Ｍ±６．３３＊１０−６Ｍ、グルタミニルチアゾリジンについてはＫｉ＝１．０７＊１０−５Ｍ±３．８１＊１０−７Ｍであった。
【００６４】
別の態様では、本発明の化合物およびプロドラッグ、並びにそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形の非ＤＰＩＶおよび非ＤＰＩＶ様プロリン特異的酵素に対する阻害活性はないかほんのわずである。実施例１０に記載のように、例えばグルタミニルチアゾリジンおよびグルタミニルピロリジンについては、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩおよびプロリルオリゴぺプチダ−ゼの阻害は見られなかった。プロリダーゼに対しては、両化合物ともＤＰＩＶと比較して著しく低い効果を示した。プロリダーゼに対するＩＣ５０値は、グルタミニルチアゾリジンについてはＩＣ５０＞３ｍＭ、グルタミニルピロリジンについてはＩＣ５０＝３．４＊１０−４Ｍ±５．６３＊１０−５と測定された。
【００６５】
本発明は、ＤＰＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素活性の調節によって仲介される状態を予防または治療する方法であって、その必要のある患者に、本発明の化合物またはその医薬組成物を、その状態の治療に有効な量および投与方式で投与することを含む方法を提供する。さらに、本発明は、本発明の化合物およびプロドラッグ、並びにそれらの相当する薬学的に許容される酸付加塩形の、患者におけるＤＰＩＶ活性の調節によって仲介される状態の予防または治療用の薬剤製造のための使用が含まれる。化合物は、これらに限定されないが、静脈内、経口、皮下、筋肉内、経皮、非経口およびこれらの組み合わせを含めた一般的な投与ルートによって、患者に投与しうる。
【００６６】
実例となる別の態様では、本発明は、式１〜１２の化合物、並びにそれらの相当する薬学的に許容されるプロドラッグおよび酸付加塩形のための配合物を医薬組成物の形で提供する。
【００６７】
ここで用いるように、「患者」という用語は、治療、観察または実験の対象である動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくは人を指す。
ここで用いるように、「治療に有効な量」という用語は、研究者、獣医、医者または他の臨床医によって求められる、組織系、動物または人において、治療すべき病気または障害の症状の緩和を含めた生物学的または医学的反応を引き出す活性化合物または薬剤の量を意味する。
ここで用いるように、「組成物」という用語は、治療に有効な量の請求化合物を含む生成物、並びに請求化合物の組み合わせから直接または間接的に得られる生成物を包含する。
【００６８】
本発明で用いられる医薬組成物を製造するには、１種以上の式１〜１２の化合物、またはそれらの相当する薬学的に許容されるプロドラッグもしくは酸付加塩形を、活性成分として、一般的な薬剤配合技術により薬学的担体と均質に混合する。担体は、投与（例えば、経口投与または筋肉内のような非経口投与）に望ましい製剤の形により、広範囲な形をとりうる。経口投与形の組成物の製造には、あらゆる通常の薬学的媒質を用いうる。従って、液体経口製剤、例えば懸濁液、エリキシルおよび溶液の場合、適した担体および添加剤には、有利には、水、グリコール、油、アルコール、フレーバー剤、防腐剤、着色剤等が含まれ；固体経口製剤、例えば粉剤、カプセル、ゲルキャップおよび錠剤の場合、適した担体および添加剤には、デンプン、糖、希釈剤、粒状化剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤等が含まれる。投与のしやすさから、錠剤およびカプセルが最も有利な経口投与単位形であり、それらの場合、固体の薬学的担体が用いられる。望ましいならば、錠剤を標準技術で糖コーティングしたり、または腸用コーティングしてもよい。非経口投与の場合、担体は、例えば、可溶性を助けるためにまたは防腐のために、他の成分を通して滅菌水を通常含む。
【００６９】
注射用懸濁液も製造しうる。これらの場合、適当な液体担体、懸濁化剤等を用いうる。ここにおける医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉剤、注射、茶匙１杯の量等のような投与単位当たり、上記のような有効投与量を投与するのに必要な量の活性成分を含む。ここにおける医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉剤、注射、座薬、茶匙１杯の量等のような投与単位当たり、約０．０１〜約１０００ｍｇ（好ましくは約５〜約５００ｍｇ）の活性成分を含み、約０．１〜約３００ｍｇ／ｋｇ体重／日（好ましくは１〜５０ｍｇ／ｋｇ／日）の投与量で与えてもよい。しかしながら、投与量は、患者の要件、治療すべき状態の重症度および使用化合物によって変化する。投与は毎日でもまたは周期後でもよい。一般に、投与量は、患者の特性、状態および望ましい治療効果に基づいて医者が調節する。
【００７０】
好ましくは、これらの組成物は、経口、非経口、鼻内、舌下もしくは直腸投与の場合、または吸入もしくは注入による投与の場合、錠剤、ピル、カプセル、粉末、顆粒、滅菌非経口溶液もしくは懸濁液、計量エーロゾルもしくは液体スプレー、ドロップ、アンプル、自己注射器デバイスまたは座薬のような単位投与形になっている。あるいは、組成物は、週に１回または月に１回の投与に適した形で提供してもよい。例えば、デカン酸塩のような活性化合物の不溶性塩を、筋肉内注射用のデポー製剤としてもよい。錠剤のような固体組成物を製造する場合、主活性成分を、理想的には、薬学的な担体、例えば、コーンスターチ、ラクトース、サッカロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガム、および水のような他の薬学的希釈剤と混合して、本発明の化合物またはその薬学的に許容される塩の均質混合物を含有する固体予備配合物を形成する。これらの予備配合物が均質であるというとき、それは、活性成分が組成物中に理想的に均一分散されており、その結果、組成物を錠剤、ピルおよびカプセルのような等しく有効な投与形に容易に小分けしうることを意味する。この固体予備配合物はその後、約０．０１〜約１０００ｍｇ、好ましくは約５〜約５００ｍｇの本発明の活性成分を含有する上記タイプの単位投与形に小分けしうる。
【００７１】
新規組成物の錠剤またはピルは、被覆したりまたは別の方法で配合して、長期作用性の利点をもたらす投与形にしてもよい。例えば、錠剤またはピルは内部投与成分および外部投与成分からなり、後者が前者を包む形にしてもよい。２つの成分は、胃での崩壊に耐えるように作用し、そして内部成分が損なわれずにそのまま十二指腸へ通過することができたり、または放出を遅らせることができる腸内分解性層によって分けることができる。様々な物質がそのような腸内分解性層またはコーティングに用いることができる。そのような物質には、セラック、セチルアルコールおよびセルロースアセテートのような物質を有する多くの高分子量酸が含まれる。
【００７２】
経口または注射で投与するために本発明の新規組成物を有利に混合しうるこの液体形には、水溶液、適当に風味をつけたシロップ、水性もしくは油性懸濁液、および綿実油、ごま油、ココナッツ油もしくはピーナッツ油のような食用油で風味をつけたエマルジョン、並びにエリキシルおよび類似の薬学的賦形剤が含まれる。水性懸濁液に適した分散剤もしくは懸濁化剤には、合成および天然ガム、例えばトラガカント、アカシア、アルギン酸塩、デキストラン、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンが含まれる。
【００７３】
本発明の化合物の製造過程で立体異性体混合物が生じる場合、これらの異性体は調製用クロマトグラフィーのような一般的な技術によって分離しうる。化合物はラセミ形で製造しても、個々の光学的対掌体を光学対掌特異的合成または分割のいずれかによって製造してもよい。例えば、化合物は、（−）−ジ−ｐ−トルオイル−ｄ−酒石酸および／または（＋）−ジ−ｐ−トルオイル−ｌ−酒石酸のような光学的に活性な酸で塩を形成し、その後、分別結晶化および遊離塩基の再生によって、ジアステレオマー対を形成するような標準技術によって、それらの成分の光学的対掌体に分割しうる。化合物はまた、ジアステレオマーエステルまたはアミドを形成し、その後、クロマトグラフィー分離およびキラル助剤の除去を行なうことによって分割しうる。あるいは、化合物は、キラルＨＰＬＣカラムを用いて分割してもよい。
【００７４】
本発明の化合物の製造工程中、必要に応じておよび／または望ましくは、関係分子の敏感なまたは反応性の基を保護する。これは、一般的な保護基、例えば、「有機化学における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」、編集  ジェー．エフ．ダブリュ．マコーミー（ Ｊ． Ｆ． Ｗ． ＭｃＯｍｉｅ）、プレナム  プレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、１９７３年；およびティー．ダブリュ．グリーン（Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ）およびピー．ジー．エム．ウッツ（Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ）、「有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、ジョン  ウィリー（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ）およびサンズ（Ｓｏｎｓ）、１９９１年（参照することによってここに記載されたものとする）に記載のような一般的な保護基によって行いうる。保護基は、本技術分野で公知の方法を用いて都合のよいその後の段階で除去しうる。
【００７５】
本発明に記載のジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶおよびＤＰＩＶ様酵素によって調節される状態の治療法は、ここで定義される１種以上の化合物および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を用いて実施してもよい。医薬組成物は約０．０１〜約１０００ｍｇ、好ましくは約５〜約５００ｍｇの化合物を含み、そして選択される投与方式に適したどのような形にしてもよい。担体には、必要なかつ不活性な薬学的賦形剤、例えば、これらに限定されないが、結合剤、懸濁化剤、潤滑剤、風味剤、甘味剤、防腐剤、染料、およびコーティングが含まれる。経口投与に適した組成物には、固体形、例えば、ピル、錠剤、キャプレット、カプセル（それぞれ、即時放出、時間限定放出および持続放出製剤がある）、顆粒、および粉末、並びに液体形、例えば、溶液、シロップ、エリキシル、エマルジョン、および懸濁液が含まれる。非経口投与に有用な形には、滅菌溶液、エマルジョンおよび懸濁液が含まれる。
【００７６】
有利なことには、本発明の化合物は１日に１回の投与でも、あるいは１日の合計投与量を１日に２、３または４回に分けて投与してもよい。さらに、本発明の化合物は、適した鼻腔内賦形剤の局所使用、または本技術分野における当業者に周知の経皮パッチによって鼻腔内形で投与してもよい。経皮送達系の形で投与するには、もちろん、投与の間、断続的ではなく、連続的に投与し、そして投与濃度は望ましい治療効果が得られるように適宜調節する必要がある。
【００７７】
より好ましくは、錠剤またはカプセルの形で経口投与する場合、活性薬剤成分は経口非毒性の薬学的に許容される不活性担体、例えば、エタノール、グリセロール、水等と組み合わせてもよい。さらに、望ましいまたは必要なときには、適した結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤を混合物に混入させてもよい。適した結合剤には、これらに限定されないが、デンプン、ゼラチン、天然の糖、例えば、グルコースまたはベータラクトース、コーン甘味剤、天然および合成ガム、例えばアカシア、トラガカントまたはオレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が含まれる。崩壊剤には、これらに限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムおよび本技術分野で公知の他の成分が含まれる。
【００７８】
液体形は風味をつけた懸濁化剤または分散剤、例えばトラガカント、アカシア、メチルセルロース等のような合成および天然ガムの形が適している。非経口投与の場合、滅菌懸濁液および溶液が望ましい。静脈内投与が望ましいときには、適当な防腐剤を一般に含む等張性製剤が用いられる。
【００７９】
本発明の化合物はリポソーム送達系、例えば小さい単ラメラ小胞、大きい単ラメラ小胞、および多重ラメラ小胞の形で投与することもできる。リポソームは、本技術分野において十分に説明されている方法を用いて、様々なリン脂質、例えばコレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンから形成することができる。
【００８０】
本発明の化合物は、標的に向けられる薬剤担体としての可溶性ポリマーと結合してもよい。そのようなポリマーには、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリシンが含まれる。さらに、本発明の化合物は薬剤の放出の調整に有用なある種の生分解性ポリマー、例えば、ポリアクチック酸（ｐｏｌｙａｃｔｉｃ ａｃｉｄ）、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、およびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマーに結合しうる。
【００８１】
本発明の化合物は、上記疾患の治療が必要なときはいつでも、本技術分野で確立された投与方式に従ってどのような上記組成物の形でも投与しうる。
【００８２】
生成物の１日の投与量は成人で１日当たり０．０１〜１．０００ｍｇの広い範囲で変えうる。経口投与の場合、組成物は、治療を受ける患者への投与量を症状によって調節するために、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、１５０、２００、２５０、５００および１０００ｍｇの活性成分を含有する錠剤の形で提供するのが好ましい。薬剤の有効な量は約０．１〜約３００ｍｇ／ｋｇ体重／日の投与レベルで通常供給される。約１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲が好ましい。化合物は１日当たり１〜４回投与しうる。
【００８３】
最適投与量は、本技術分野に熟知した者であれば容易に決定でき、使用される個々の化合物、投与方式、製剤の濃度、投与方式による生物学的利用能、および病気状態の進行で変わる。さらに、治療される個々の患者に伴う要因、例えば患者の年齢、体重、食事および投与時間を、投与量の調整の際に一般に考慮すべきである。
【００８４】
本発明の化合物または組成物は、食前、食事中または食後にとりうる。
食事中にとる場合、本発明の化合物または組成物は食物に混ぜてもよく、あるいは上記のような別個の投与形でとってもよい。
【００８５】
実施例
実施例１：ジペプチド化合物の合成
１．１  イソロイシルチアゾリジン塩の一般的な合成
Ｂｏｃ保護アミノ酸ＢＯＣ−Ｉｌｅ−ＯＨを酢酸エチルの中に入れ、バッチを約−５℃に冷却する。Ｎ−メチルモルホリンを滴加し、ピバル酸塩化物（実験室スケール）または塩化ネオヘキサノイル（パイロットプラントスケール）を一定温度で滴加する。活性化するため、反応混合物を数分間、攪拌する。Ｎ−メチルモルホリン（実験室スケール）およびチアゾリジン塩酸塩（実験室スケール）を連続滴加し、チアゾリジン（パイロットプラントスケール）を加える。実験室での仕上げは、塩溶液を用いる一般的な方法で行い、パイロットプラントスケールではバッチをＮａＯＨおよびＣＨ３ＣＯＯＨ溶液を用いて精製する。
【００８６】
ＢＯＣ保護基の除去はＨＣｌ／ジオキサン（実験室スケール）またはＨ２ＳＯ４（パイロットプラントスケール）を用いて行う。実験室では、塩酸塩をＥｔＯＨ／エーテルから結晶化する。
パイロットプラントスケールでは、遊離アミンをＮａＯＨ／ＮＨ３を加えることによって製造する。フマル酸を熱エタノールに溶解し、遊離アミンを滴加し、そして（Ｉｌｅ−Ｔｈｉａ）２フマル酸塩（Ｍ＝５２０．７１ｇｍｏｌ−１）を沈殿させる。異性体および光学的対掌体の分析は電気泳動によって行う。
【００８７】
１．２  グルタミニルピロリジン遊離塩基の合成
アシル化：
Ｎ−ベンジル−オキシカルボニルグルタミン（２．０２ｇ、７．２１ｍｍｏｌ）を３５ｍｌのＴＨＦに溶解し、−１５℃にした。その混合物にＣＡＩＢＥ（イソブチルクロロホルミエート）（０．９３７ｍｌ、７．２１ｍｍｏｌ）および４−メチルモルホリン（０．７９５ｍｌ、７．２１ｍｍｏｌ）を加え、溶液を１５分間攪拌した。混合無水物の形成をＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）によりチェックした。−１０℃に温めた後、ピロリジン（０．５９６ｍｌ、７．２１ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温にし、一晩攪拌した。
【００８８】
仕上げ：
形成された沈殿を濾過し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物を酢酸エチル（２０ｍｌ）にとり、硫酸水素ナトリウム飽和溶液で、次いで、炭酸水素ナトリウムの飽和溶液、水およびブラインで洗浄した。有機層を分離、乾燥および蒸発させた。得られた生成物はＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）により純度をチェックした。
収量：１．１８ｇ、ワックス状固体
【００８９】
切断：
１．１８ｇの得られた固体Ｚ−保護化合物を４０ｍｌの無水エタノールに溶解した。溶液に約２０ｍｇのＰｄ担持炭（１０％、ＦＬＵＫＡ）を加え、懸濁液を水素雰囲気下で３時間振とうした。反応の進行はＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）でモニターした。反応完了後、溶媒を除去して遊離塩基を得た。
収率：９９％
純度はＴＬＣでチェックした：ｎ−ブタノール／ＡｃＯＨ／水／酢酸エチル：１／１／１／１、Ｒｆ＝０．４。反応生成物の同定はＮＭＲ分析で行った。
【００９０】
１．３  グルタミニルチアゾリジン塩酸塩の合成
アシル化：
Ｎ−ｔ−ブチル−オキシカルボニルグルタミン（２．０ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）を５ｍｌのＴＨＦに溶解し、−１５℃にした。その混合物にＣＡＩＢＥ（イソブチルクロロホルミエート）（１．０６ｍｌ、８．１２ｍｍｏｌ）および４−メチルモルホリン（０．８９５ｍｌ、８．１２ｍｍｏｌ）を加え、溶液を１５分間攪拌した。混合無水物の形成はＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）によりチェックした。−１０℃に温めた後、さらに等量の４−メチルモルホリン（０．８９５ｍｌ、８．１２ｍｍｏｌ）およびチアゾリジン塩酸塩（１．０２ｇ、８．１２ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温にし、一晩攪拌した。
【００９１】
仕上げ：
形成された沈殿を濾過し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物をクロロホルム（２０ｍｌ）にとり、硫酸水素ナトリウム飽和溶液で、次いで、炭酸水素ナトリウム飽和溶液、水およびブラインで洗浄した。有機層を分離、乾燥および蒸発させた。得られた生成物はＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）により純度をチェックした。
収量：１．６４ｇ、固体
【００９２】
切断：
６４０ｍｇの得られた固体Ｂｏｃ−保護化合物を３．１ｍｌの氷冷したジオキサン中のＨＣｌ（１２．９８Ｍ、２０当量）に溶解し、氷上で放置した。反応の進行はＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）によりモニターした。反応完了後、溶媒を除去し、得られた油状物をメタノールに取り、再び蒸発させた。その後、得られた油状物をリン−Ｖ−オキシド上で乾燥し、ジエチルエーテル中で２回粉砕した。純度はＨＰＬＣでチェックした。
収量：０．２６５ｇ
純度はＨＰＬＣでチェックした。反応生成物の同定はＮＭＲ分析でチェックした。
【００９３】
１．４  グルタミニルピロリジン塩酸塩の合成
アシル化：
Ｎ−ｔ−ブチル−オキシカルボニルグルタミン（３．０ｇ、１２．１８ｍｍｏｌ）を７ｍｌのＴＨＦに溶解し、−１５℃にした。その混合物にＣＡＩＢＥ（イソブチルクロロホルミエート）（１．６ｍｌ、１２．１８ｍｍｏｌ）および４−メチルモルホリン（１．３ｍｌ、１２．１８ｍｍｏｌ）を加え、溶液を１５分間攪拌した。混合無水物の形成をＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）によりチェックした。−１０℃に温めた後、１当量のピロリジン（１．０ｍｌ、１２．１８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温にし、一晩攪拌した。
【００９４】
仕上げ：
形成された沈殿を濾過し、溶媒を蒸発させた。得られた油状物をクロロホルム（２０ｍｌ）にとり、硫酸水素ナトリウム飽和溶液で、次いで、炭酸水素ナトリウム飽和溶液、水およびブラインで洗浄した。有機層を分離、乾燥および蒸発させた。得られた生成物はＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）により純度をチェックした。
収量：２．７ｇ、固体
【００９５】
切断：
２．７ｇの得られた固体を１３．０ｍｌの氷冷したジオキサン中のＨＣｌ（１２．９８Ｍ、２０当量）に溶解し、氷上で放置した。反応の進行はＴＬＣ（溶離剤：ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ：９／１）によりモニターした。反応完了後、溶媒を除去し、得られた油状物をメタノールに取り、再び蒸発させた。その後、得られた油状物をリン−Ｖ−オキシド上で乾燥し、ジエチルエーテル中で２回粉砕した。
収量：９８０ｍｇ
純度はＨＰＬＣでチェックした。反応生成物の同定はＮＭＲ分析でチェックした。
【００９６】
実施例２：選択されたジペプチド化合物の化学特性決定
２．１  融点測定
融点はライカ社のコルファ（Ｋｏｆｌｅｒ）加熱プラットフォーム顕微鏡で測定した。値は未補正であるか、またはＤＳＣ装置〔ヒューマン−ファルマ（Ｈｅｕｍａｎｎ−Ｐｈａｒｍａ）〕での値である。
【００９７】
２．２  旋光性
回転値はパーキン−エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）社の「ポラリメーター（Ｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ） ３４１」またはそれ以上で様々な波長にて記録した。
【００９８】
２．３  質量分光分析の測定条件
質量スペクトルは、ピーイー  サイエックス（ＰＥ Ｓｃｉｅｘ）社の「ＡＰＩ  １６５」または「ＡＰＩ  ３６５」でのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によって記録した。操作はｃ＝１０μｇ／ｍｌのおおよその濃度で行い、物質はＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ  ５０：５０、０．１％ＨＣＯ２Ｈにとり、注入はスプレーポンプを使用して行う（２０μｌ／分）。測定はポジティブモード［Ｍ＋Ｈ］＋で行い、ＥＳＩ電圧はＵ＝５６００Ｖである。
【００９９】
２．４  結果
２．４．１  イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩（異性体）の試験
【表１】
2004521149.tif 000011
ＩＴ＊Ｆ＝イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩
ＮＭＲおよびＨＰＬＣデータは問題の物質が同一であることを裏づけている。
【０１００】
２．４．２  他のイソロイシルチアゾリジン塩の試験
【表２】
2004521149.tif 000012
【０１０１】
実施例３：  Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｙａａトリペプチドの合成
合成はいずれもＦｍｏｃ／ｔＢｕ法を用いるペプチド合成器ＳＰ  ６５０〔ラボルテック（Ｌａｂｏｒｔｅｃ）社〕で行った。保護アミノ酸はノババイオケム（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）社またはバケム（Ｂａｃｈｅｍ）社から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）はメルク（Ｍｅｒｃｋ）社から購入し、トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）はフルカ（Ｆｌｕｋａ）社から購入した。
【０１０２】
Ｐｒｅ−を含むＦｍｏｃ−Ｙａａ−Ｗａｎｇ樹脂（２．８ｇ／置換レベル０．５７ｍｍｏｌ／ｇ）を２０％ピペリジン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＤ）を用いて脱保護した。ＤＭＦで洗浄した後、２当量（１．１ｇ）のＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨをＤＭＦ（１ｇの樹脂当たり溶媒１２ｍｌ）に溶解した。２当量（１．０４ｇ）の２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロ硼酸塩（ＴＢＴＵ）および４当量（１．１１ｍｌ）のＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を加え、反応容器に入れた。混合物を室温で２０分間振とうした。次に、カップリングサイクルを繰り返した。その後、ＤＭＦ、ジクロロメタン、イソプロパノールおよびジエチルエーテルで洗浄した後、得られたＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｗａｎｇ樹脂を乾燥し、次に、６部に分け、その後、最後のアミノ酸誘導体をカップリングした。
【０１０３】
Ｆｍｏｃ保護基は上記のように除いた。その後、ＤＭＦ中の、Ｂｏｃ−アミノ酸０．５４ｍｍｏｌ、ＴＢＴＵ０．５４ｍｍｏｌおよびＤＩＥＡ０．１０８ｍｍｏｌを２０分間振とうした。カップリングサイクルを繰り返した。最後に、ペプチド樹脂を上記のように洗浄し、乾燥した。
ペプチドは、２．５時間、次のスカベンジャーを含有するトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）混合物を用い、樹脂から切り取った：ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）＝９．５／０．２５／０．２５。
粗製ペプチドの収率は平均８０〜９０％であった。粗製ペプチドは、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルの濃度を６ｍｌ／分で上げながら（４０分で５％から６５％へ）、０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏの線勾配を用いて、ヌクレオシルＣ１８カラム（７μｍ、２５０＊２１．２０ｍｍ、１００Ａ）上でＨＰＬＣにより精製した。
凍結乾燥によって純粋なペプチドが得られた。これはエレクトロスプレー質量分析およびＨＰＬＣ分析で同定した。
【０１０４】
３．１  結果  −  化学合成後のＸａａ−Ｐｒｏ−Ｙａａトリペプチドの同定
【表３】
2004521149.tif 000013
【０１０５】
１［Ｍ＋Ｈ＋］はプラスイオン化モードでのエレクトロスプレー質量分析によって測定した。
２ＲＰ−ＨＰＬＣ条件：
カラム：  ＬｉＣｈｒｏｓｐｈｅｒ １００ ＲＰ １８ （５μｍ）、１２５×４ｍｍ
検出（ＵＶ）：  ２１４ｎｍ
勾配系：  アセトニトリル（ＡＣＮ）／Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）
１５分で５％（ＡＣＮ）から５０％へ
流量：  １ｍｌ／分
ｋδ＝（ｔｒ−ｔ０）／ｔ０
ｔ０＝１．１６分
【０１０６】
ｔ−ブチル−Ｇｌｙは次のように定義する：
【化１６】
2004521149.tif 000014
Ｓｅｒ（Ｐ）およびＳｅｒ（Ｂｚｌ）はホスホリルセリンおよびベンジルセリンと定義する。Ｔｙｒ（Ｐ）はホスホリルチロシンと定義する。
【０１０７】
実施例４：  ペプチジルケトンの合成
【化１７】
2004521149.tif 000015
【０１０８】
Ｈ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ＊ＨＣｌ  ２
Ｂｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ（３．００ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解し、−１５℃に冷却した。混合物にＣＡＩＢＥ（１．８０ｍｌ、１３．８ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（１．５２ｍｌ、１３．８ｍｍｏｌ）を加え、混合無水物の形成が完了するまで溶液を攪拌した。次に、混合物を−１０℃にし、ＮＭＭ（１．５２ｍｌ、１３．８ｍｍｏｌ）、次いで、Ｈ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ＊ＨＣｌ（２．２９ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温にし、一晩放置した。溶媒を除去し、そして通常の仕上げをした後、得られたエステル１を特性決定せずに得た。エステル１をＨＣｌ／ＨＯＡｃ（５ｍｌ、６Ｎ）に溶解し、Ｂｏｃ基の除去が完了するまで０℃で放置した。次に、溶媒を除去し、得られた油状物をジエチルエーテルで処理して、白色固体２を得た。
収量：  ２．５ｇ、８０％
【０１０９】
Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＭｅ  ３
Ｚ−ＡｌａＯＨ（３．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）および２（４．１８ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）を１について上記したのと同じ方法で処理して、３を白色固体として得た。
収量：  ４．２ｇ、６４％
【０１１０】
Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ  ４
３（４．２ｇ、９．６ｍｍｏｌ）を３０ｍｌの水／アセトン（１／５ ｖ／ｖ）に溶解し、１１．６ｍｌのＮａＯＨ（１Ｎ）を加えた。反応完了後、有機溶媒を蒸発によって除去し、得られた溶液を１５ｍｌのＮａＨＣＯ３溶液（飽和）で希釈した。次に、混合物を１０ｍｌの酢酸エチルエステルで３回抽出した。その後、ＨＣｌ（水中の１５％）を加えることによって溶液をｐＨ２にした。得られた混合物を３０ｍｌの酢酸エチルエステルで３回抽出した。有機層を分離し、ブラインで３回洗浄し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして蒸発させた。
収量：  ３．５ｇ、８７％
【０１１１】
Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ２−Ｂｒ  ５
４（２．００ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）を１５ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解し、ＣＡＩＢＥ（０．６２３ｍｌ、４．７６ｍｍｏｌ）およびＮＭＭ（０．５２５ｍｌ、４．７６ｍｍｏｌ）を用いて、混合無水物（化合物１参照）に変えた。形成された沈殿を濾過し、−１５℃に冷却した。次に、ジアゾメタン（３０ｍｌエーテル中の２３．８ｍｍｏｌ）をアルゴン雰囲気下で溶液に滴加した。混合物を０℃で１時間放置した後、１．２７ｍｌのＨＢｒ（ＡｃＯＨ中の３３％）を加え、溶液を室温で３０分間攪拌した。その後、７０ｍｌのエーテルを加え、混合物を２０ｍｌの水で洗浄した。有機層を分離し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして蒸発させた。
収量（未精製）：  １．８ｇ、８０％
【０１１２】
Ｚ−保護アシルオキシメチレンケトン
酸（２当量）をＤＭＦに溶解し、等モル量のＫＦを加えた。懸濁液を室温で１時間攪拌した。次に、ブロムメチレン（１当量）を加え、溶液を一晩攪拌した。その後、溶媒を真空下で除去し、得られた油状物をクロロホルムに溶解し、ブラインで洗浄した。次に、有機層を分離し、乾燥し（Ｎａ２ＳＯ４）、そして溶媒を除去した。生成物は、シリカゲルおよびヘプタン／クロロホルムを用いるカラムクロマトグラフィーで精製した。
【０１１３】
Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ３  ６
酢酸（２３０μｌ、４．０２ｍｍｏｌ）、ＫＦ（０．２３４ｇ、４．０２ｍｍｏｌ）、５（１．００ｇ、２．０１ｍｍｏｌ）
収量：  ０．３５１ｇ、３６％
Ｚ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｐｈ  ７
安息香酸（０．２７５ｇ、２．２５ｍｍｏｌ）、ＫＦ（０．１３１ｍｇ、２．２５ｍｍｏｌ）、５（０．５６ｇ、１．１３ｍｍｏｌ）
収量：  ０．３４ｇ、５６％
【０１１４】
脱保護
Ｚ−保護化合物をＨＢｒ／ＡｃＯＨに溶解し、攪拌した。反応完了後、エーテルを加え、形成された白色沈殿を濾過し、乾燥した。
【０１１５】
Ｈ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３＊ＨＢｒ  ８
６（０．３５１ｇ、０．７３ｍｍｏｌ）
収量：  ０．２５２ｇ、９８％
Ｈ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＣＨ２Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｐｈ＊ＨＢｒ  ９
７（０．３４ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）
収量：  ０．２５１ｇ、９９％
【０１１６】
実施例５：  シクロアルキルケトンの合成
【化１８】
2004521149.tif 000016
【０１１７】
Ｂｏｃ−イソロイシナール  ２
塩化オキサリル（７１４μｌ、８．２８ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの乾燥ジクロロメタンに溶解し、−７８℃にした。次に、ＤＭＳＯ（８１７μｌ、８．２８ｍｍｏｌ）を滴加した。溶液を−７８℃で２０分間攪拌した。次に、１（１．００ｇ、４．６ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２０分間攪拌した。その後、ＴＥＡ（２．５８ｍｌ、１８．４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温にした。混合物をヘキサン／酢酸エチル（２／１ ｖ／ｖ）で希釈し、１０ｍｌのＨＣｌ（水中の１０％）を加えた。有機層を分離し、水性層を２０ｍｌの塩化メチレンで抽出した。全ての有機層を集め、ブライン、次いで水で洗浄し、乾燥した。生成物は、シリカゲルおよびヘプタン／クロロホルムを用いるカラムクロマトグラフィーによって精製した。
収量：  ０．５２ｇ、５２％
【０１１８】
ｔ−ブチル  Ｎ−１−［シクロペンチル（ヒドロキシ）メチル］−２−メチルブチルカルバメート  ３
２（０．５２ｇ、２．４２ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの乾燥ＴＨＦに溶解し、０℃に冷却した。次に、シクロペンチルマグネシウムブロミド（２Ｍ溶液の１．４５ｍｌ）を加えた。反応完了後、水（２ｍｌ）を加え、水性ＨＣｌを加えることによって溶液を中和した。次に、塩化メチレンを加え、有機層を分離し、乾燥した（Ｎａ２ＳＯ４）。蒸発させた後、さらなる特性決定することなく、得られた油状物を用いた。
【０１１９】
ｔ−ブチル  Ｎ−［１−（シクロペンチルカルボニル）−２−メチルブチル］カルバメート  ４
３（０．６１ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）を、塩化オキサリル（３３３μｌ、３．８７ｍｍｏｌ）、ＤＭＳＯ（３８２μｌ、５．３７ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（１．２ｍｌ、８．５９ｍｍｏｌ）を用いて、１のように処理した。
収量：  ０．１８０ｇ、３０％
【０１２０】
１−シクロペンチル−３−メチル−１−オキソ−２−ペンタナミニウムクロリド  ５
４（０．１８ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を２ｍｌのＨＣｌ（ジオキサン中の７Ｎ）に溶解した。反応完了後、溶媒を除去し、得られた油状物を、クロロホルム／メタノール／水勾配を用いるシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。得られた油状物はエーテル中で粉砕した。
収量：  ０．０６０ｇ、５４％
【０１２１】
実施例６：  側鎖修飾されたＤＰＩＶ阻害剤の合成
６．１  Ｂｏｃ−グルタミル−チアゾリジン（Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｈｉａ）の合成
方法Ｂ（方法については６．４の項を参照）によるＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−ＯＨとＴｈｉａ＊ＨＣｌとの反応、方法ＧによるＢｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＭｅ）−Ｔｈｉａの加水分解
【０１２２】
６．１．１  Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｈｉａの分析データ
【表４】
2004521149.tif 000017
【０１２３】
１ 薄層クロマトグラフィー
系Ａ：クロロホルム／メタノール  ９０：１０
系Ｂ：ベンゼン／アセトン／酢酸  ２５：１０：０．５
系Ｃ：ｎ−ブタノール／ＥＡ／酢酸／Ｈ２Ｏ  １：１：１：１
２ ＨＰＬＣ分離条件
カラム：ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）  Ｃ−１８、７μ、２５０ｍｍ×２１ｍｍ
溶離剤：無勾配、４０％ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ
流量：６ｍｌ／分
λ＝２２０ｎｍ
【０１２４】
６．２  側鎖修飾されたＢｏｃ−グルタミルチアゾリジン
Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｈｉａを、様々な大きさの基を導入することによってγ−カルボン酸官能基において修飾した。基はγ−カルボン酸官能基にアミド結合を形成することによってアミノ基を経て結合させた。基によって様々なカップリング法が用いられる。次のアミノ成分を、記載の方法を用いて、Ｂｏｃ−Ｇｌｕ−Ｔｈｉａに結合した：
【０１２５】
【表５】
2004521149.tif 000018
【０１２６】
下記の２つの場合、反応生成物の精製は合成の一般的な記載とは異なる。
Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（Ｇｌｙ５）−Ｔｈｉａ
生成物は一晩の攪拌で混合物からすでに沈殿している；それをその後ろ過し、０．１Ｎ  ＨＣｌおよび多量の水で洗浄し、真空中、Ｐ４Ｏ１０上で乾燥する。
Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＰＥＧ）−Ｔｈｉａ
一般的な手順とは対照的に、合成のための出発物質を５００倍過剰のＤＭＦに溶解する。反応完了後、ＤＭＦを真空中で完全に除去し、残留物を多量のメタノールに溶解する。エーテルを注いで、上層が形成された後、生成物は未反応ＰＥＧと共に沈殿する。精製は、ゲル濾過カラム〔ファルマジア（Ｐｈａｒｍａｚｉａ）、 セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ） Ｇ−２５、９０μｍ、２６０〜１００ｍｍ〕での調製用ＨＰＬＣ分離によって行った。
分離条件：  溶離剤：水；流量：５ｍｌ／分；λ＝２２０ｎｍ
【０１２７】
６．２．２  側鎖修飾されたＢｏｃ−グルタミルチアゾリジンの合成データ
【表６】
2004521149.tif 000019
【０１２８】
２ ＨＰＬＣ分離条件
カラム：ヌクレオシル  Ｃ−１８、７μ、２５０ｍｍ×２１ｍｍ
溶離剤：無勾配、４０％ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ
流量：６ｍｌ／分
λ＝２２０ｎｍ
【０１２９】
６．３  側鎖修飾されたグルタミルチアゾリジン
Ｎ−末端Ｂｏｃ保護基は、方法Ｆを用いて表６．２．２に記載の化合物から切断した。Ｇｌｙ誘導体で修飾された物質は調製用ＨＰＬＣ分離によって精製した。これらはトリフルオロアセテートとして存在する。Ｈ−Ｇｌｕ（ＰＥＧ）−ＴｈｉａはＢｏｃ保護先駆体と同じようにゲル濾過カラムで精製した。
【０１３０】
６．３．１  側鎖修飾されたグルタミルチアゾリジンの合成データ
【表７】
2004521149.tif 000020
【０１３１】
３ ＨＰＬＣ分離条件
カラム：ヌクレオシル  Ｃ−１８、７μ、２５０ｍｍ×２１ｍｍ
溶離剤：ＡＣＮ／水／０．１％ＴＦＡ
勾配：３０分間で２０％ＡＣＮ→９０％ＡＣＮ
流量：６ｍｌ／分
λ＝２２０ｎｍ
ｎ．ｄ．ｍ．  −  測定せずまたは測定不可
【０１３２】
６．４  一般的な合成手順
方法Ａ：  活性化試薬としてＣＦＩＢＥを用いる混合無水物法によるペプチド結合の取り付け
１０ｍｍｏｌのＮ−末端保護アミノ酸またはペプチドを２０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解する。溶液を−１５℃±２℃に冷却する。いずれの場合も攪拌しながら、１０ｍｍｏｌのＮ−ＭＭおよび１０ｍｍｏｌのクロロギ酸イソブチルエステルを連続して加える。記載の温度範囲は厳守する。約６分後、１０ｍｍｏｌのアミノ成分を加える。アミノ成分が塩であるとき、さらに１０ｍｍｏｌのＮ−ＭＭを反応混合物に加える。次に、反応混合物を冷えた状態で２時間、そして室温で一晩攪拌する。
回転蒸発器を用いて反応混合物を濃縮し、ＥＡにとり、５％ＫＨ２ＳＯ４溶液、飽和ＮａＨＣＯ３溶液およびＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＮａＳＯ４上で乾燥する。真空中で溶媒を除去した後、化合物をＥＡ／ペンタンから再結晶する。
【０１３３】
方法Ｂ：  活性化試薬としてピバル酸塩化物を用いる混合無水物法によるペプチド結合の取り付け
１０ｍｍｏｌのＮ−末端保護アミノ酸またはペプチドを２０ｍｌの無水ＴＨＦに溶解する。溶液を０℃に冷却する。いずれの場合も攪拌しながら、１０ｍｍｏｌのＮ−ＭＭおよび１０ｍｍｏｌのピバル酸塩化物を連続して加える。記載の温度範囲は厳守する。約６分後、混合物を−１５℃に冷却し、より低い温度に達したら、１０ｍｍｏｌのアミノ成分を加える。アミノ成分が塩であるとき、さらに１０ｍｍｏｌのＮ−ＭＭを反応混合物に加える。次に、反応混合物を冷えた状態で２時間、そして室温で一晩攪拌する。
さらなる仕上げは方法Ａにおけるように行う。
【０１３４】
方法Ｃ：  活性化試薬としてＴＢＴＵを用いるペプチド結合の取り付け
１０ｍｍｏｌのＮ−末端保護アミノ酸またはペプチドおよび１０ｍｍｏｌのＣ−末端保護アミノ成分を２０ｍｌの無水ＤＭＦに溶解する。溶液を０℃に冷却する。いずれの場合も攪拌しながら、１０ｍｍｏｌのＤＩＰＥＡおよび１０ｍｍｏｌのＴＢＴＵを連続して加える。反応混合物を０℃で１時間、そして室温で一晩攪拌する。ＤＭＦを真空中で完全に除去し、生成物を方法Ａに記載のように仕上げる。
【０１３５】
方法Ｄ：  活性エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）の合成
１０ｍｍｏｌのＮ−末端保護アミノ酸またはペプチドおよび１０ｍｍｏｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを２０ｍｍｏｌの無水ＴＨＦに溶解する。溶液を０℃に冷却し、攪拌しながら１０ｍｍｏｌのジシクロヘキシルカルボジイミドを加える。反応混合物を０℃でさらに２時間、そして室温で一晩攪拌する。得られたＮ，Ｎ´−ジシクロヘキシル尿素を濾過し、溶媒を真空中で除去し、残留生成物をＥＡ／ペンタンから再結晶する。
【０１３６】
方法Ｅ：  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いるアミド結合の取り付け
１０ｍｍｏｌのＣ−末端非保護アミノ成分をＮａＨＣＯ３溶液（２０ｍｌの水中の２０ｍｍｏｌ）に導入する。室温で攪拌しながら、１０ｍｌのジオキサンに溶解した１０ｍｍｏｌのＮ−末端保護Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをゆっくり滴加する。反応混合物の攪拌を一晩続け、その後、溶媒を真空中で除去する。
さらなる仕上げは方法Ａにおけるように行う。
【０１３７】
方法Ｆ：  Ｂｏｃ保護基の切断
３ｍｌの１．１Ｎ  ＨＣｌ／氷酢酸（方法Ｆ１）または３ｍｌの１．１Ｎ  ＨＣｌ／ジオキサン（方法Ｆ２）またはＤＣＭ中の５０％ＴＦＡ３ｍｌ（方法Ｆ３）を１ｍｍｏｌのＢｏｃ保護アミノ酸ピロリジド、チアゾリジドまたはペプチドに加える。室温での切断はＴＬＣによってモニターする。反応完了（約２時間）後、無水ジエチルエーテルを用いて化合物を塩酸塩の形で沈殿させ、吸引で単離し、真空中、Ｐ４Ｏ１０上で乾燥する。メタノール／エーテルを用い、生成物を再結晶または再沈殿させる。
【０１３８】
方法Ｇ：  加水分解
１ｍｍｏｌのペプチドメチルエステルを１０ｍｌのアセトンおよび１１ｍｌの０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液に溶解し、室温で攪拌する。加水分解の経過はＴＬＣによってモニターする。反応完了後、アセトンを真空中で除去する。ｐＨ２〜３に達するまで、濃縮ＫＨ２ＳＯ４溶液を用いて残留水溶液を酸性にする。次に、ＥＡを用いて生成物を数回抽出する。一緒にした酢酸エチルフラクションを飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、ＮａＳＯ４上で乾燥し、溶媒を真空中で除去する。ＥＡ／ペンタンから結晶化する。
【０１３９】
実施例７：  Ｋｉ−測定
Ｋｉ測定には、３７．５Ｕ／ｍｇのグリシルプロリル−４−ニトロアニリンおよび１．４１ｍｇ／ｍｌストック溶液の酵素濃度に対して特異的活性を有するブタの腎臓からのジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶを用いた。
【０１４０】
分析混合物：
濃度範囲１＊１０−５Ｍ〜１＊１０−８Ｍの１００μｌ試験化合物を異なる濃度（０．４ｍＭ、０．２ｍＭ、０．１ｍＭ、０．０５ｍＭ）のグリシルプロリル−４−ニトロアニリン５０μｌおよびＨＥＰＥＳ（４０ｍＭ、ｐＨ７．６；イオン強度＝０．１２５）１００μｌと混合した。分析混合物は３０℃で３０分間予備インキュベートした。予備インキュベートの後、２０μｌのＤＰＩＶ（１：６００希釈）を加え、プレートリーダー（ＨＴＳ７０００プラス、アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ドイツ、ヴァイテルスタット）を用いて、４−ニトロアニリン放出による黄色発現の測定を３０℃およびλ＝４０５ｎｍで１０分間行った。
Ｋｉ値は、グラフィット（Ｇｒａｐｈｉｔ）バージョン４．０．１３、４．０．１３および４．０．１５〔エリザカス  ソフトウェア（Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）社、英国〕を用いて計算した。
【０１４１】
７．１  結果  −  ＤＰＩＶ阻害のＫｉ値
【表８】
2004521149.tif 000021
【０１４２】
【表９】
2004521149.tif 000022
【０１４３】
ｔ−ブチル−Ｇｌｙは次のように定義する：
【化１９】
2004521149.tif 000023
Ｓｅｒ（Ｐ）およびＳｅｒ（Ｂｚｌ）はホスホリルセリンおよびベンジルセリンと定義する。Ｔｙｒ（Ｐ）はホスホリルチロシンと定義する。
【０１４４】
実施例８：  ＩＣ５０値の測定
１００μｌの阻害剤ストック溶液を１００μｌの緩衝液（ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６）および５０μｌの基質（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ、最終濃度０．４ｍＭ）と混合し、３０℃で予備インキュベートした。反応は２０μｌの精製したブタのＤＰＩＶを加えることによって開始させた。生成物ｐＮＡの形成は、ＨＴＳ７０００Ｐｌｕｓプレートリーダー（パーキン  エルマー社）を用いて４０５ｎｍで１０分間測定し、勾配を計算した。最終阻害濃度は１ｍＭ〜３０ｎＭの間であった。ＩＣ５０は、グラフィット４．０．１３（エリザカス  ソフトウェア社）を用いて計算した。
【０１４５】
８．１  結果  −  ＩＣ５０値の測定
【表１０】
2004521149.tif 000024
【０１４６】
【表１１】
2004521149.tif 000025
【０１４７】
ｔ−ブチル−Ｇｌｙは次のように定義する：
【化２０】
2004521149.tif 000026
Ｓｅｒ（Ｐ）およびＳｅｒ（Ｂｚｌ）はホスホリルセリンおよびベンジルセリンと定義する。Ｔｙｒ（Ｐ）はホスホリルチロシンと定義する。
【０１４８】
実施例９：  ＤＰＩＶ様酵素−ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＩ−の阻害
Ｎ−末端がプロトン化されていなければ、ＤＰ  ＩＩ（３．４．１４．２）はオリゴペプチドからＮ−末端ジペプチドを放出する〔マクドナルド  ジェー．ケー．（ＭｃＤｏｎａｌｄ， Ｊ． Ｋ．）、エリス  エス．（Ｅｌｌｉｓ， Ｓ．）およびライリー  ティー．ジェー．（Ｒｅｉｌｌｙ．， Ｔ． Ｊ．）、１９６６年、ジェー．バイオール．ケム．（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、 ２４１， １４９４−１５０１〕。Ｐ１−位置のＰｒｏおよびＡｌａは好ましい残基である。酵素活性はＤＰＩＶ様活性と記されているが、ＤＰ  ＩＩの最適ｐＨは酸性である。使用酵素はブタの腎臓から精製した。
【０１４９】
分析：
濃度範囲１＊１０−４Ｍ〜５＊１０−８Ｍの１００μｌのグルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジンを、１００μｌの緩衝溶液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、０．０１５％  Ｂｒｉｊ、１ｍＭ  ＤＴＴ）、５０μｌのリシルアラニルアミノメチルクマリン溶液（５ｍＭ）および２０μｌのブタＤＰ  ＩＩ（緩衝溶液中で２５０倍希釈）と混合した。蛍光測定は、プレートリーダー（ＨＴＳ７０００プラス、アプライド  バイオシステムズ社、 ドイツ、ヴァイテルスタット）を用いて、３０℃およびλ励起＝３８０ｎｍ、λ発光＝４６５ｎｍで２５分間行った。Ｋｉ値は、グラフィット ４．０．１５（エリザカス  ソフトウェア社、英国）を用いて計算し、グルタミニルピロリジンについてはＫｉ＝８．５２＊１０−５Ｍ±６．３３＊１０−６Ｍ、グルタミニルチアゾリジンについてはＫｉ＝１．０７＊１０−５Ｍ±３．８１＊１０−７Ｍと測定された。
【０１５０】
実施例１０：  交差反応酵素
グルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジンを、ジペプチジルぺプチダ−ゼＩ、プロリルオリゴぺプチダ−ゼおよびプロリダーゼに対する交差反応効力について試験した。
【０１５１】
ジペプチジルぺプチダ−ゼＩ（ＤＰ  Ｉ、カテプシンＣ）：
ＤＰ  ＩまたはカテプシンＣは、ジペプチドをそれらの基質のＮ−末端から切断するリソソマールシステインプロテアーゼである〔グートマン  エイチ．アール．（Ｇｕｔｍａｎ， Ｈ． Ｒ．）およびフルトン  ジェー．エス．（Ｆｒｕｔｏｎ， Ｊ． Ｓ．）、１９４８年、ジェー．バイオール．ケム．（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、１７４、８５１−８５８〕。それはシステインプロテアーゼとして分類される。使用酵素はキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（キアゲン社、ドイツ、ヒルデン）から購入した。十分に活性な酵素を得るために、酵素をＭＥＳ緩衝液ｐＨ５．６（４０ｍＭ  ＭＥＳ、４ｍＭ  ＤＴＴ、４ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１５％Ｂｒｉｊ）で１０００倍に希釈し、そして３０℃で３０分間予備インキュベートした。
【０１５２】
分析：
濃度範囲が１＊１０−５Ｍ〜１＊１０−７Ｍのグルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジン５０μｌを、緩衝液−酵素−混合物１１０μｌと混合した。分析混合物は３０℃で１５分間予備インキュベートした。予備インキュベート後、１００μｌのヒスチジルセリル−  −ニトロアニリン（２＊１０−５Ｍ）を加え、そしてプレートリーダー（ＨＴＳ７０００プラス、アプライド  バイオシステムズ社， ドイツ、ヴァイテルスタット）を用いて、β−ニトロアニリン放出による黄色発現の測定を３０℃およびλ励起＝３８０ｎｍ、λ発光＝４６５ｎｍで１０分間行った。
ＩＣ５０値は、グラフィット ４．０．１５（エリザカス  ソフトウェア社、英国）を用いて計算した。グルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジンによるＤＰ  Ｉ酵素活性の阻害は見られなかった。
【０１５３】
プロリルオリゴぺプチダ−ゼ（ＰＯＰ）
プロリルオリゴぺプチダ−ゼ（ＥＣ３．４．２１．２６）は、Ｘａａ−Ｐｒｏ結合のＮ−末端部でペプチドを切り取るセリン型のエンドプロテアーゼである（Ｗａｌｔｅｒ， Ｒ．， Ｓｈｌａｎｋ， Ｈ．， Ｇｌａｓｓ， Ｊ． Ｄ．， Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｉ． Ｌ．， ＆ Ｋｅｒｅｎｙｉ， Ｔ． Ｄ．， １９７１， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １７３， ８２７−８２９）。基質は分子量が３０００Ｄａ以下のペプチドである。使用酵素は組換えヒトプロリルオリゴペプチダーゼであった。組換え発現は、本技術の現状で記載されているような標準条件下においてＥ． ｃｏｌｉで行った。
【０１５４】
分析：
濃度範囲が１＊１０−４Ｍ〜５＊１０−８Ｍのグルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジン１００μｌを、緩衝液（４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、０．０１５％  Ｂｒｉｊ、１ｍＭ  ＤＴＴ）１００μｌおよびＰＯＰ溶液２０μｌと混合した。分析混合物は３０℃で１５分間予備インキュベートした。予備インキュベート後、５０μｌのグリシルプロリルプロリル−４−ニトロアニリン溶液（０．２９ｍＭ）を加え、そしてプレートリーダー〔サンライズ（ｓｕｎｒｉｓｅ）， テカン（Ｔｅｃａｎ）、ドイツ、クライルシャイム）を用いて、４−ニトロアニリン放出による黄色発現の測定を３０℃およびλ＝４０５ｎｍで１０分間行った。ＩＣ５０値は、グラフィット４．０．１５（エリザカス  ソフトウェア社、英国）を用いて計算した。グルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジンによるＰＯＰ活性の阻害は見られなかった。
【０１５５】
プロリダーゼ（Ｘ−Ｐｒｏジぺプチダ−ゼ）
プロリダーゼ（ＥＣ  ３．４．１３．９）はベルグマン（Ｂｅｒｇｍａｎ）およびフルトン（Ｆｒｕｔｏｎ）〔ベルグマン  エム．およびフルトン  ジェー．エス．、１９３７年、ジェー．バイオール．ケム．（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．） １８９−２０２〕によって最初に報告された。プロリダーゼはＸａａ−ＰｒｏジぺプチドからＮ−末端アミノ酸を放出し、最適ｐＨは６〜９である。
ブタの腎臓からのプロリダーゼ〔アイシーエヌ  バイオメディカルズ（ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）社、ドイツ、エシュベーグ〕を分析緩衝液（２０ｍＭ  ＮＨ４（ＣＨ３ＣＯＯ）２、３ｍＭ  ＭｎＣｌ２、ｐＨ７．６）に溶解した（１ｍｇ／ｍｌ）。十分に活性な酵素を得るために、溶液を室温で６０分間インキュベートした。
【０１５６】
分析：
濃度範囲が５＊１０−３Ｍ〜５＊１０−７Ｍのグルタミニルピロリジンまたはグルタミニルチアゾリジン４５０μｌを、緩衝液（２０ｍＭ  ＮＨ４（ＣＨ３ＣＯＯ）２、ｐＨ７．６）５００μｌおよびＩｌｅ−Ｐｒｏ−ＯＨ（分析混合物中の０．５ｍＭ）２５０μｌと混合した。分析混合物は３０℃で５分間予備インキュベートした。予備インキュベート後、７５μｌのプロリダーゼ（分析緩衝液中で１：１０に希釈）を加え、そしてＵＶ／Ｖｉｓ光度計、ＵＶ１〔サーモ  スペクトロニック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）社、英国、ケンブリッジ〕を用いて、測定を３０℃およびλ＝２２０ｎｍで２０分間行った。
ＩＣ５０値は、グラフィット ４．０．１５（エリザカス  ソフトウェア社、英国）を用いて計算した。これらの測定値は、グルタミニルチアゾリジンについてはＩＣ５０＞３ｍＭ、グルタミニルピロリジンについては３．４＊１０−４Ｍ±５．６３＊１０−５Ｍであった。
【０１５７】
実施例１１：  ウイスターラットへの血管内および経口投与後のＤＰＩＶ阻害活性の測定
動物
体重２５０〜３５０ｇのオスのウイスターラット（Ｓｈｏｅ： Ｗｉｓｔ（Ｓｈｏ））はティルツヒト  シェーンヴァルデ（Ｔｉｅｒｚｕｃｈｔ Ｓｃｈｏｎｗａｌｄｅ）社（ドイツ、シェーンワルデ）から購入した。
収容条件
動物は、１２／１２時間の明／暗サイクル（ＡＭ６：００に明るくする）で温度調整（２２±２℃）した一般的な条件下で１つのケージに入れた。標準のペレット状の餌〔スニフ（ｓｓｎｉｆｆ、登録商標）、ゾースト（Ｓｏｅｓｔ）、ドイツ〕およびＨＣｌで酸性にした水道水は自由に摂取させた。
【０１５８】
頚動脈へのカテーテル挿入
収容条件に適応させて１週以上経過後、カテーテルを一般的な麻酔（０．２５ｍｌ／ｋｇ ｂ．ｗ． ロンプン（Ｒｏｍｐｕｎ、登録商標）［２％］、バイエル  バイタル（ＢａｙｅｒＶｉｔａｌ社、 ドイツおよび０．５ｍｌ／ｋｇ ｂ．ｗ． ケタミン（Ｋｅｔａｍｉｎ）１０、アタロスト（Ａｔａｒｏｓｔ）社、ドイツ、ツイストリンゲンのｉ．ｐ．注射）の下でウイスターラットの頚動脈に埋め込んだ。動物の回復を１週間待った。カテーテルをヘパリン−食塩水（１００ＩＵ／ｍｌ）で週３回洗った。カテーテルが機能不良の場合、第２のカテーテルを各ラットの反対側の頚動脈に挿入した。手術から１週間回復させた後、この動物を研究に再び組み入れた。第２のカテーテルが機能不良の場合、動物は研究から除いた。新しい動物を補充し、実験を手順どおりに続け、カテーテル植え込み後、少なくとも７日で開始した。
【０１５９】
実験計画
カテーテルの機能が損なわれていないラットに、偽薬（１ｍｌ食塩水、０．１５４ｍｏｌ／Ｌ）または試験化合物を経口および血管内（動脈内）ルートにより投与した。
一晩絶食させた後、ヘパリン化動脈血試料１００μｌを−３０、−５、および０分で集めた。試験物質を１．０ｍｌ食塩水に新たに溶解し（０．１５４ｍｏｌ／ｌ）、供給管（７５ｍｍ；ファイン・サイエンス・ツール社、ドイツ、ハイデルベルグ）を通じて経口でまたは血管内ルートのいずれかにより０分で投与した。経口投与の場合、さらに追加食塩水１ｍｌを動脈カテーテルに注入した。動脈内投与の場合、カテーテルを３０μｌの食塩水で直ちに洗い、さらに追加の食塩水１ｍｌを供給管により口から与えた。
【０１６０】
偽薬または試験物質を与えた後、動脈血試料を意識のある非抑制ラットの頚動脈カテーテルから、２．５、５、７．５、１０、１５、２０、４０、６０および１２０分で採取した。全ての血液試料を、血漿ＤＰＩＶ活性測定のために、１０μｌの１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．０）で満たされた氷冷エッペンドルフ管〔エッペンドルフ−ネザラー−ヒンツ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ−Ｎｅｔｈｅｌｅｒ−Ｈｉｎｚ）社， ドイツ、ハンブルグ〕に集めた。エッペンドルフ管を直ちに遠心分離した（２分間１２０００ｒｐｍ、ヘティヒ  ツェントリフューゲ（Ｈｅｔｔｉｃｈ Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅ）ＥＢＡ １２、ドイツ、チューリンゲン）：血漿フラクションは分析まで氷上で貯蔵するか、あるいは分析まで−２０℃で冷凍した。全ての血漿試料を次のデータで標識した：
・コード番号
・動物番号
・試料採取日
・試料採取時間
【０１６１】
分析法
血漿ＤＰＩＶ活性測定用分析混合物は、８０μｌの試薬および２０μｌの血漿試料からなる。基質グリシルプロリル−４−ニトロアニリンからの黄色生成物４−ニトロアニリン形成の動的測定は、３０℃で２分間予備インキュベートした後、３０℃で１分間３９０ｎｍで行った。ＤＰＩＶ活性はｍＵ／ｍｌで表した。
【０１６２】
統計法
統計的評価およびグラフ作成はプリズム（ＰＲＩＳＭ、登録商標）３．０２〔グラフパッド  ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）社〕で行った。全てのパラメーターは平均およびＳＤを含めて記載の方法で分析した。
【０１６３】
１１．１  結果  −  ｔｍａｘでの生体内ＤＰＩＶ阻害
【表１２】
2004521149.tif 000027
【０１６４】
実施例１２：  非即輸送性ＤＰＩＶ阻害剤としての側鎖修飾されたグルタミルチアゾリジンの作用
構造Ｈ−Ｇｌｕ（Ｘ）−Ｔｈｉａを有する側鎖修飾されたグルタミルチアゾリジンを、Ｘとして用いられる様々な鎖長のポリエチレングリコールまたはグリシンオリゴマ−を用いて合成した（合成の説明の実施例における方法Ａを参照）。これらの誘導体の結合特性およびペプチド輸送体ＰｅｐＴ１によるそれらの輸送性を調べた。
意外なことに、側鎖修飾は化合物のＤＰＩＶへの結合特性をわずかに変えるだけであることが分かった。これに対して、阻害剤がペプチド輸送体によって輸送される能力は、側鎖修飾によって劇的に小さくなる。
従って、ＤＰＩＶまたはＤＰＩＶ様酵素の側鎖修飾された阻害剤は、体内でＤＰＩＶの部位指向阻害を行うのに十分に適している。
【０１６５】
１２．１  結果  −  選択されたＤＰＩＶ阻害剤の輸送性
【表１３】
2004521149.tif 000028
１ ３Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ａｌａ（８０ｍＭ）のＰｅｐＴ１−発現Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞への結合を５０％まで阻害する化合物の有効濃度（ＥＣ５０値）
２ Ｘ． ｌｅａｖｉｓのＰｅｐＴ１発現卵母細胞における輸送特性  −  ２電極電圧クランプ法、Ｉ＝輸送によって生じた内部電流
【０１６６】
実施例１３：  生体内癌細胞付着分析
この実施例では、生体染料標識腫瘍細胞、および標的組織中の原位置（ｉｎ ｓｉｔｕ）でのそれらの検出を利用する、新規な生体内付着分析〔フォン  ホルステン（ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ）等、２０００〕を用いて、ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞の生体内付着が、ＤＰＩＶにおいて、治療された野生型Ｆ３４４ラットとＤＰＩＶ遺伝子の突然変異を有するＦ３４４亜系統とに差があるかどうかを調べる。
【０１６７】
動物、腫瘍細胞の注入および肺の経過
Ｆ３４４ＵＳＡ、Ｆ３４４ＪＡＰおよびＦ３４４ＧＥＲ亜系統をドイツのハノーバー・メディカル・スクールにあるセントラル・アニマル・ラボラトリーのブリーディングコロニーから得た。全ての亜系統は１世代飼育し、餌および水が自由に得られる特異的病原菌を含まない施設で２５℃にて明暗各１２時間サイクル（７時に点灯）の下で育てた。実験ごとに用いる動物の正確な数はＦ値で示し、状態および時点当たり少なくとも４匹の動物を用いた。
細胞培養、腫瘍細胞の注入、動物の解剖および免疫組織化学は前記のとおりに行った（フォン  ホルステン等、２０００）。要するに、腫瘍成長の対数期から誘導した１×１０６ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞を、外側尾静脈を経て注入し、その後、肺を異なる時点で取り出した。注入後の早い時点（３０分）での腫瘍細胞の原位置での定量のために、注入前に、フルオレセイン誘導体５−（および−６）−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を用いて、細胞を生体染料染色した。遅い時点（腫瘍細胞接種後２週）での肺表面コロニーの定量には、ｅｎ−ｂｌｏｃ解剖肺および心臓に８ｍｌのボウリン（Ｂｏｕｉｎ）の溶液（７２％飽和ピクリン酸溶液、２３％ホルムアルデヒド、および５％氷酢酸）を注入し、肺表面小結節がカウントされるまで同じ溶液に固定した（下記参照）。
【０１６８】
実験
３つの実験を行った：
イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩（２ｍｇ ｉ．ｖ．＋イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩２ｍｇ ｉ．ｐ．）の単一注射の、Ｆ３４４ＵＳＡ野生型ラットの肺腫瘍転移増殖における効果；
イソロイシルシアノピロリジン（０．１ｍｇ ｉ．ｖ．＋０．１ｍｇ ｉ．ｐ．）の単一注射の、Ｆ３４４ＵＳＡ野生型ラットの肺への腫瘍細胞付着における効果；
バリルピロリジンフマル酸塩（０．１ｍｇ ｉ．ｖ．＋０．１ｍｇ ｉ．ｐ．）の単一注射の、Ｆ３４４ＵＳＡ野生型ラットの肺への腫瘍細胞付着における効果；
【０１６９】
肺のＣＦＳＥ標識腫瘍細胞の免疫組織化学
ＣＦＳＥ標識ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞の免疫染色は、細胞内ＣＦＳＥ抗原（抗ＣＦＳＥ；ｍＡｂ  ＤＥ１、ドイツ、ベーリンガー・マンハイム社；マウス、１：１００）を特徴づけるｍＡｂを用いて行った。免疫組織化学のために、前に記載のように１つまたは２つの連続ＡＰＡＡＰ染色を行った（フォン  ホルステン等、２０００）。１つまたは両一次抗体が省かれた対照切片を含めた。
【０１７０】
腫瘍標的の定量：生体内／原位置での細胞付着分析
ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞の生体染料（カルボキシフルオレセイン；ＣＦＳＥ）標識によって、原位置でのステレオロジーによる肺組織の厚い切片中の腫瘍細胞およびＮＫ細胞の定量が可能となる（フォン  ホルステン等、２０００）。ここでの調査では、同じ肺の薄い切片（８μｍ）（ｎ＝１０）をつくり、ＤＥ１陽性細胞の画像分析による顕微鏡カウントをさらに行った。これは、先に確立されたステレオロジー的定量技術をさらに簡単にするために行った。従って、ここでの調査では、腫瘍接種後３０分の異なる亜系統からの肺組織のＤＥ１陽性腫瘍細胞の評価は、画像分析法を用いて実施した。接眼レンズ上の格子内の全てのＣＦＳＥ標識ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞および白血球サブセットをカウントした〔ツァイス（Ｚｅｉｓｓ）Ｋｐｌ−Ｗ １２．５×；格子０．７５×０．７５ｍｍ＝０．５６２５ｍｍ２／格子、ツァイス  ネオフラー（Ｚｅｉｓｓ Ｎｅｏｆｌｕａｒ）対物レンズ、×１０、ＮＡ＝０．３）。肺の各右上葉をランダムに選んだ６ヶ所の非隣接位置で切断して切片を得た。各レベルから、３つの切片を評価した。平均して、動物当たり３．０４ｃｍ２の領域となる、切片当たり３０格子数を検査した（すなわち、０．５６２５ｍｍ２／格子×３０格子×３切片×６レベル）。
【０１７１】
肺におけるマクロ転移の定量
遅い時点（腫瘍細胞接種後２週）での肺表面コロニーの定量には、ｅｎ−ｂｌｏｃ解剖肺および心臓に８ｍｌのボウリンの溶液（７２％飽和ピクリン酸溶液、２３％ホルムアルデヒド、および５％氷酢酸）を注入し、肺表面小結節がカウントされるまで同じ溶液に固定した。ヴェクスラー（Ｗｅｘｌｅｒ）の方法（ヴェクスラー、１９６６）に従って、肺当たり３つの領域をゲージ（１ｃｍ２）を用いて調べ、肺表面コロニー数を平均／ｃｍ２で表した。
【０１７２】
統計分析
生体内付着分析からのデータを、適切ならば、１元ＡＮＯＶＡおよびフィッシャーのＰＬＳＤポストｈｏｃ試験によって分析した。星印はフィッシャーのＰＬＳＤによって得られた食塩水（ＳＨＡＭ）治療対照に対して有意なポスト−ｈｏｃ効果を示す。全てのデータは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。
【０１７３】
結果
Ｆ３４４ＵＳＡラットの肺腫瘍転移増殖におけるイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の単一注射効果
ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞注入後２週のＦ３４４ラットに単一イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩を投与した後の肺表面腫瘍コロニーの数を図１に示す。１要因ＡＮＯＶＡはコロニー数において有意な効果を示さなかった（Ｆ（１，１２）＝３．２；ｐ＝０．１ｎ．ｓ．）。実験ラットにおけるコロニー数の減少傾向は明らかであった。
【０１７４】
Ｆ３４４ＵＳＡラットの腫瘍付着におけるイソロイシルシアノピロリジンＴＦＡの単一注射効果
イソロイシルシアノピロリジンＴＦＡで治療した後の、ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞接種後３０分の肺組織中のＣＦＳＥ陽性細胞の平均数を、図２に示す。ＡＮＯＶＡは「治療」の有意な効果を示さなかった（Ｆ（１，１８）＝０．１；ｐ＝０．８ｎ．ｓ．）。
【０１７５】
Ｆ３４４ＵＳＡラットの腫瘍付着におけるバリルピロリジンフマル酸塩の単一注射効果
バリルピロリジンフマル酸塩で治療した後の、ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞接種後３０分の肺組織中のＣＦＳＥ陽性細胞の平均数を、図３に示す。ＡＮＯＶＡは「治療」の有意な効果を示さなかった（Ｆ（１，１８）＝０．６；ｐ＝０．５ｎ．ｓ．）。
【０１７６】
考察
腫瘍細胞付着および転移増殖は、突然変異体Ｆ３４４亜系統においてのみイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の単一注射によって有意に調節され、これはリガンドと突然変異体ＤＰＩＶおよび腫瘍細胞との相互作用を示唆している。リガンドは野生型Ｆ３４４ＵＳＡラットにおける腫瘍付着に有意に影響を及ぼさなかったので、これは、化合物がＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞の結合部位と相互に作用しないことを示しているのかもしれない。
【０１７７】
実施例１４：  癌転移増殖分析
前の実施例では、ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞付着は突然変異体Ｆ３４４亜系統においてのみイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の単一注射によって有意に調節されるが、野生型ＤＰＩＶ発現Ｆ３４４ＵＳＡラットではそのようなことがないことを証明した。ＤＰＩＶ阻害剤／リガンドは腫瘍転移の成長と相互に作用して、化学療法化合物および／または免疫療法化合物と類似の性質を示す。それに対して、この実施例では、ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞の腫瘍転移増殖が、長時間にわたってＤＰＩＶ阻害剤治療した野生型Ｆ３４４ラットにおいて異なるかどうかを調べる。
【０１７８】
動物、腫瘍細胞の注入および肺の経過
Ｆ３４４ＵＳＡラットをドイツのハノーバー・メディカル・スクールにあるセントラル・アニマル・ラボラトリーのブリーディングコロニーから得た。全てのラットは少なくとも１世代飼育し、餌および水が自由に得られる特異的病原菌を含まない施設で２５℃にて明暗各１２時間サイクル（７時に点灯）の下で育てた。実験ごとに用いる動物の正確な数はＦ値で示し、状態および時点当たり少なくとも４匹の動物を用いた。
細胞培養、腫瘍細胞の注入、動物の解剖および免疫組織化学は前記のとおりに行った（フォン  ホルステン等、２０００）。要するに、腫瘍成長の対数期から誘導した１×１０６ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞を、外側尾静脈を経て注入し、その後、肺を異なる時点で取り出した。注入後の早い時点（３０分）での腫瘍細胞の原位置での定量には、注入前に、フルオレセイン誘導体５−（および−６）−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を用いて、細胞を生体染料染色した。遅い時点（腫瘍細胞接種後２週）での肺表面コロニーの定量には、ｅｎ−ｂｌｏｃ解剖肺および心臓に８ｍｌのボウリンの溶液（７２％飽和ピクリン酸溶液、２３％ホルムアルデヒド、および５％氷酢酸）を注入し、肺表面小結節がカウントされるまで同じ溶液に固定した（下記参照）。
【０１７９】
実験
２つの実験を行った：
異なる投与量のイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩を長時間にわたって注入した（０ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．４ｍｇ、４ｍｇ／植込み浸透ミニポンプによる２４時間胃内注入）ときのＦ３４４ＵＳＡ野生型ラットの体重変化および肺腫瘍転移増殖における効果
イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩（４ｍｇ／植込み浸透ミニポンプによる２４時間胃内注入）、イソロイシルシアノピロリジンＴＦＡ（０．１ｍｇ／植込み浸透ミニポンプによる２４時間胃内注入）およびバリルピロリジンフマル酸塩（０．１ｍｇ／植込み浸透ミニポンプによる２４時間胃内注入）を長時間にわたって注入したときのＦ３４４ＵＳＡ野生型ラットの肺腫瘍転移増殖における効果
【０１８０】
化合物の長時間にわたる胃内注入のための浸透ミニポンプの植込み
食塩水またはＤＰＩＶ阻害剤のいずれかを無菌状態で予め満たしておいた、さまざまな化合物を一定供給投与する浸透ミニポンプ〔アルツェット（Ａｌｚｅｔ）モデル２ＭＬ４；流量２．５μｌ／時間；アルザ（Ａｌｚａ）社〕を、腹部の皮下に配置した。ミニポンプはポリエチレン管を経てカニューレに取り付けた。胃の管腔内にカニューレの加熱誘導拡張先端がある状態でカニューレを胃内に植込んだ。
【０１８１】
肺におけるマクロ転移の定量
遅い時点（腫瘍細胞接種後２週）での肺表面コロニーの定量には、ｅｎ−ｂｌｏｃ解剖肺および心臓に８ｍｌのボウリンの溶液（７２％飽和ピクリン酸溶液、２３％ホルムアルデヒド、および５％氷酢酸）を注入し、肺表面小結節がカウントされるまで同じ溶液に固定した。ヴェクスラーの方法（ヴェクスラー、１９６６）に従って、肺当たり３つの領域をゲージ（１ｃｍ２）を用いて調べ、肺表面コロニー数を平均／ｃｍ２で表した。
【０１８２】
統計分析
生体内体重増加および肺表面腫瘍コロニー数からのデータを、適切ならば、一元ＡＮＯＶＡおよびフィッシャーのＰＬＳＤポストｈｏｃ試験によって分析した。星印はフィッシャーのＰＬＳＤによって得られた食塩水（ＳＨＡＭ）治療対照に対して有意なポスト−ｈｏｃ効果を示す。全てのデータは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表す。
【０１８３】
結果
イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の長時間にわたる注入（０ｍｇ、０．０４ｍｇ、０．４ｍｇ、４ｍｇ／２４時間）の肺腫瘍転移増殖における効果
ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞注入後２週のＦ３４４ラットに異なる投与量のイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩を長時間にわたって注入した後の体重変化を図４に示す。１要因ＡＮＯＶＡは体重において有意な効果を示し（Ｆ（３，２２）＝３．５；ｐ＝０．０３）、これは０．４ｍｇおよび４ｍｇ投与量のポスト−ｈｏｃ分析で有意となった。
ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞注入後２週のＦ３４４ラットに異なる投与量のイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩を長時間にわたって注入した後の肺表面腫瘍コロニーの数を図５に示す。１要因ＡＮＯＶＡはコロニーの数において有意な効果を示し（Ｆ（３，２２）＝３．８；ｐ＝０．０３）、これは４ｍｇ投与量のポスト−ｈｏｃ分析で有意となった。
【０１８４】
イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩、イソロイシルシアノピロリジンＴＦＡ、およびバリルピロリジンフマル酸塩の長時間にわたる注入の肺腫瘍転移増殖における効果
ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞注入後２週のＦ３４４ラットにイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩、イソロイシルシアノピロリジンＴＦＡ、およびバリルピロリジンフマル酸塩を長時間にわたって注入した後の肺表面腫瘍コロニーの数を図６に示す。１要因ＡＮＯＶＡはコロニーの数において有意な効果を示し（Ｆ（３，２０）＝３．８；ｐ＝０．０３）、これはイソロイシルシアノピロリジンＴＦＡおよびイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩化合物のポスト−ｈｏｃ分析で有意となった。
【０１８５】
考察
ＭＡＤＢ１０６の転移は、異なるＤＰＩＶ阻害剤（イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩、イソロイシルシアノピロリジンＴＦＡ）を用いる長時間にわたる治療によって減少し、これは保護のような種類の効果を示唆している。イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩およびイソロイシルシアノピロリジンＴＦＡは細胞付着プロセスとの相互作用または細胞宿主防御メカニズムの調節のいずれかにより転移から保護するのかもしれない。ＤＰＩＶ阻害剤治療が細胞増殖抑制効果を示すことも考えられる。これらの抗転移効果は、癌および転移疾患を治療するためのＤＰＩＶ阻害剤の生物学的性質を立証している。
【０１８６】
引例
チェン  エイチシー（Ｃｈｅｎｇ ＨＣ）、アブデル−ガニー  エム（Ａｂｄｅｌ−Ｇｈａｎｙ Ｍ）、チャン  エス（Ｚｈａｎｇ Ｓ）、パウリ  ビーユー（Ｐａｕｌｉ ＢＵ）（１９９９）   フィッシャー３４４／ＣＲＪラットは、乳癌のジペプチジルペプチダーゼＩＶ仲介肺転移のたんぱく質ノックアウトモデルか（クエスチョンマーク）  クリン  エクスプ  メタスタシス（Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ） １７： ６０９−６１５
メントレイン  アール（Ｍｅｎｔｌｅｉｎ Ｒ）（１９９９）  ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ（ＣＤ２６）−  調節ペプチドの不活性化における役割、レギュル  ペプト（Ｒｅｇｕｌ Ｐｅｐｔ） ８５： ９−２４
トンプソン  エヌエル（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ＮＬ）、ヒクソン  デーシー（Ｈｉｘｓｏｎ ＤＣ）、カラナン  エイチ（Ｃａｌｌａｎａｎ Ｈ）、パンジカ  エム（Ｐａｎｚｉｃａ Ｍ）、フラナガン  デー（Ｆｌａｎａｇａｎ Ｄ）、ファリス  アールエー（Ｆａｒｉｓ ＲＡ）、ホング  ダブリュジェー（Ｈｏｎｇ ＷＪ）、ハーテル−シェンク  エス（Ｈａｒｔｅｌ−Ｓｃｈｅｎｋ Ｓ）、ドイル  デー（Ｄｏｙｌｅ Ｄ）（１９９１）  ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶ活性が欠如したフィッシャーラット亜系統は正常な定常状態のＲＮＡレベルおよび変性たんぱく質をつくる。肝細胞移植モデルとしての使用。バイオケム  ジェー（Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ）２７３：４９７−５０２
ツジ  イー（Ｔｓｕｊｉ Ｅ）、ミスミ  ワイ（Ｍｉｓｕｍｉ Ｙ）、フジワラ  ティー（Ｆｕｊｉｗａｒａ Ｔ）、タカミ  エヌ（Ｔａｋａｍｉ Ｎ）、オガタ  エス（Ｏｇａｔａ Ｓ）、イケハラ  ワイ（Ｉｋｅｈａｒａ Ｙ）（１９９２）  ジペプチジルぺプチダ−ゼＩＶの活性部位突然変異（Ｇｌｙ６３３→Ａｒｇ）はその維持および小胞体の急速な変性を招く。バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ） ３１： １１９２１−１１９２７
フォン  ホルステン  エス（ｖｏｎ Ｈｏｒｓｔｅｎ Ｓ）、ヘルフリッツ  エー（Ｈｅｌｆｒｉｔｚ Ａ）、クルマン  エス（Ｋｕｈｌｍａｎｎ Ｓ）、ネイブ  エイチ（Ｎａｖｅ Ｈ）、チェリンク  ティ（Ｔｓｃｈｅｒｎｉｇ Ｔ）、パブスト  アール（Ｐａｂｓｔ Ｒ）、ベン−エリヤフ  エス（Ｂｅｎ−Ｅｌｉｙａｈｕ Ｓ）、メイヤー  デー（Ｍｅｙｅｒ Ｄ）、シュミット  アールイー（Ｓｃｈｍｉｄｔ ＲＥ）、シュミッツ  シー（Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｃ）（２０００）  カルボキシフルオレセイン標識したラットの肺転移のステレオロジー的定量：生体内および原位置でのナチュラルキラー細胞活性および腫瘍付着の新しい評価法。ジェー  イミュノール  メス（Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ） ２３９： ２５−３４
【図面の簡単な説明】
【図１】
イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の単一注射の、Ｆ３４４ラットの肺転移における効果。生体染料（カルボキシフルオレセイン；ＣＦＳＥ）標識ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞は外側尾静脈を経て注入し、接種後３０分で肺を採取した。肺のＣＦＳＥ陽性腫瘍細胞は、免疫組織学および画像分析によって定量化した。データは平均±ＳＥＭで表す；食塩水治療対照に対して有意な差は見られなかった。
【図２】
イソロイシルシアノピロリジンＴＦＡの単一注射の、Ｆ３４４ＵＳＡラットへの注入後３０分の腫瘍細胞付着における効果。ＣＦＳＥ標識ＭＡＤＢ１０６癌細胞は外側尾静脈を経て注入し、接種後３０分で肺を採取した。肺のＣＦＳＥ陽性腫瘍細胞は、免疫組織学および画像分析によって定量化した。データは平均±ＳＥＭで表す；食塩水治療対照に対して有意な差は見られなかった。
【図３】
バリルピロリジンフマル酸塩の単一注射の、Ｆ３４４ＵＳＡラットへの注入後３０分の腫瘍細胞付着における効果。ＣＦＳＥ標識ＭＡＤＢ１０６腺癌細胞は外側尾静脈を経て注入し、接種後３０分して肺を採取した。肺のＣＦＳＥ陽性腫瘍細胞は、免疫組織学および画像分析によって定量化した。データは平均±ＳＥＭで表す；食塩水治療対照に対して有意な差は見られなかった。
【図４】
イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の長時間にわたる胃内注入の、肺転移Ｆ３４４ラットの体重変化（ｇ）における効果。ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞注入後２週のＦ３４４ラットに異なる投与量のイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩を長時間にわたって注入した後の体重減少の投与量依存性減少を説明する。１要因ＡＮＯＶＡは体重において有意な効果を示し、これは０．４ｍｇおよび４ｍｇ投与量でのポスト−ｈｏｃ分析で有意になった。データは平均±ＳＥＭを表す；＊ｐ＜０．０５は、フィッシャーＰＬＳＤで測定された食塩水治療ＳＨＡＭ対照に対して有意な差を示す。
【図５】
イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩の長時間にわたる胃内注入の、Ｆ３４４ラットの肺腫瘍コロニーの数における効果。ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞注射後２週間のＦ３４４ラットに異なる投与量のイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩を長時間にわたって注入した後の肺コロニー数の投与量依存性減少を説明する。１要因ＡＮＯＶＡは体重における有意な効果を示し、４ｍｇ投与量でのポスト−ｈｏｃ分析で有意になった。データは平均±ＳＥＭを表す；＊ｐ＜０．０５は、フィッシャーＰＬＳＤで測定された食塩水治療ＳＨＡＭ対照に対して有意な差を示す。
【図６】
イソロイシルチアゾリジンフマル酸塩、イソロイシルシアノピロリジンＴＦＡ、およびバリルピロリジンフマル酸塩の長時間にわたる胃内注入の、Ｆ３４４ラットの肺腫瘍コロニー数における効果。ＭＡＤＢ１０６腫瘍細胞注入後２週のＦ３４４ラットにイソロイシルチアゾリジンフマル酸塩およびイソロイシルシアノピロリジンＴＦＡを長時間にわたって注入した後の肺コロニー数の有意な減少を説明する。データは平均±ＳＥＭを表す；＊ｐ＜０．０５は、ＡＮＯＶＡおよびフィッシャーＰＬＳＤで測定された食塩水治療ＳＨＡＭ対照に対して有意な差を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004521149.tif 000132
【国際調査報告】
2004521149.tif 000133
2004521149.tif 000134
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