(57)【要約】本発明は、神経変性疾患である脊髄小脳性運動失調１（ＳＣＡ−１）のショウジョウバエモデルに関する。特に、本発明は、ＳＣＡ−１治療のための、正常ヒトアタキシン−１又は伸長したポリグルタミン反復配列を持つ突然変異体ヒトアタキシン−１を発現する遺伝子組換えショウジョウバエに関する。本発明はさらに、ＳＣＡ−１を発症することへの素因の診断に関する。本発明はさらに、ＳＣＡ−１及び他の神経変性疾患の治療薬をスクリーニングするために遺伝子組換えショウジョウバエを使用する方法に関する。本発明はさらに、ＳＣＡ−１及び他の神経変性疾患の治療及び診断用途のため、ならびに治療薬をスクリーニングするための、アタキシン−１の過剰発現によって生じるＳＣＡ−１表現型の変更遺伝子の同定に関する。本発明はさらに、正常アタキシン−１の過剰発現を検出することを含む、ＳＣＡ−１への素因の診断に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
その体細胞と生殖細胞がプロモーターに動作可能なように連結された導入遺伝子を含み、かかる導入遺伝子が正常アタキシン−１（ａｔａｘｉｎ−１）をコードしており、神経系における該導入遺伝子の発現が進行性神経変性への素因を有するショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）を生じる、遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項２】
導入遺伝子が、６−１９個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含むアタキシン−１をコードする、請求項１に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項３】
導入遺伝子が、２０−４０個のグルタミン残基と１−４個のヒスチジン残基を持つポリグルタミン反復配列を含むアタキシン−１をコードする、請求項１に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項４】
その体細胞と生殖細胞がプロモーターに動作可能なように連結された導入遺伝子を含み、かかる導入遺伝子が伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１をコードしており、神経系における該導入遺伝子の発現が進行性神経変性をもたらす、遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項５】
導入遺伝子が、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含むアタキシン−１をコードする、請求項４に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項６】
導入遺伝子がアタキシン−１  ８２Ｑである、請求項４に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項７】
導入遺伝子が異種プロモーターに動作可能なように連結されている、請求項１又は４に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項８】
導入遺伝子が時間的に異種プロモーターによって調節される、請求項７に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項９】
導入遺伝子が空間的に異種プロモーターによって調節される、請求項７に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項１０】
異種プロモーターが熱ショックプロモーターである、請求項７に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項１１】
熱ショックプロモーターがｈｓｐ７０又はｈｓｐ８３遺伝子から誘導される、請求項１０に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項１２】
導入遺伝子がＧａｌ４上流活性化配列（「ＵＡＳ」）に動作可能なように連結されている、請求項７に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項１３】
ＧＡＬ４遺伝子をさらに含む、請求項８に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項１４】
ＧＡＬ４遺伝子が組織特異的プロモーターに連結されている、請求項１３に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項１５】
組織特異的プロモーターが、ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ、ｅｙｅｌｅｓｓ、又はｇｌａｓｓ遺伝子から誘導される、請求項１４に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項１６】
組織特異的プロモーターが、ｄｐｐ、ｖｅｓｔｉｇａｌ、又はａｐｔｅｒｏｕｓ遺伝子から誘導される、請求項１４に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項１７】
組織特異的プロモーターが、ｅｌａｖ、Ａｐｐｌ、又はｎｉｒｖａｎａ遺伝子から誘導される、請求項１４に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項１８】
異種プロモーターがテトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）応答調節エレメントを含む、請求項７に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項１９】
ｔＴＡ遺伝子をさらに含む、請求項１８に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項２０】
ｔＴＡ遺伝子が組織特異的プロモーターに連結している、請求項１９に記載の遺伝子組換えショウジョウバエ。
【請求項２１】
神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）その中枢神経系において伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現する第一遺伝子組換えショウジョウバエを該分子に接触させ、そして
（ｂ）該遺伝子組換えショウジョウバエにおける進行性神経変性が、その中枢神経系において伸張したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現するが、該分子には接触させなかった第二遺伝子組換えショウジョウバエの進行性神経変性よりも重症でないかどうかを決定する
ことを含み、第二ショウジョウバエと比較して第一ショウジョウバエの進行性神経変性の軽減が、分子が神経変性疾患に対して活性を持つことを示す方法。
【請求項２２】
神経変性疾患が、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、加齢性認知機能喪失、老年痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ウィルソン病、脳性麻痺、進行性核上性麻痺、グァム病、レヴィ小体痴呆、プリオン病、タウパシー（ｔａｕｐａｔｈｙ）、海綿状脳障害、クロイツフェルト−ヤコブ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調、運動失調、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、発作障害、てんかん、慢性発作障害、卒中、脳外傷、脊髄損傷、エイズ痴呆、アルコール中毒症、自閉症、網膜虚血、緑内障、自律神経機能障害、高血圧症、神経精神障害、精神分裂病、又は分裂感情障害である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
神経変性疾患がポリグルタミン病である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ポリグルタミン病が、脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ）−１、ＳＣＡ−２、ＳＣＡ−６、ＳＣＡ−７、マチャド−ジョセフ病（ＭＪＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄延髄性筋萎縮（ＳＢＭＡ）、又は歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒｏｐａｌｌｉｄｏｌｕｓｙａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ）（ＤＲＰＬＡ）である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ポリグルタミン病がＳＣＡ−１である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
アタキシン−１が、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１が、アタキシン−１  ８２Ｑである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
第一遺伝子組換えショウジョウバエを発生の幼虫期に分子と接触させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
第一遺伝子組換えショウジョウバエを成虫期に分子と接触させる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
神経変性の判定を発生の幼虫期に行う、請求項２１に記載の方法。
【請求項３１】
神経変性の判定を成虫期に行う、請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
中枢神経系の腹神経索を検査することによって神経変性の判定を行う、請求項２１に記載の方法。
【請求項３３】
核封入体の形成を調べることによって神経変性の判定を行う、請求項２１に記載の方法。
【請求項３４】
アタキシン−１の発現がＧａｌ４  ＵＡＳエレメントの制御下で起こる、請求項２１に記載の方法。
【請求項３５】
第一及び第二ショウジョウバエが、組織特異的プロモーターに動作可能なように連結されたＧＡＬ４遺伝子をさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項３６】
組織特異的プロモーターが、ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ、ｅｙｅｌｅｓｓ、又はｇｌａｓｓ遺伝子から誘導される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
組織特異的プロモーターが、ｄｐｐ、ｖｅｓｔｉｇａｌ、又はａｐｔｅｒｏｕｓ遺伝子から誘導される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）その眼成虫原基において伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現する第一遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫を該分子に接触させ、但しかかる発現は粗眼（ｒｏｕｇｈ  ｅｙｅ）表現型を生じさせ、そして
（ｂ）該第一幼虫から生じる第一成虫ショウジョウバエにおける粗眼表現型が、その眼成虫原基において伸張したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現するが、該分子には接触させなかった第二遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫から生じる第二成虫ショウジョウバエの粗眼表現型よりも重症でないかどうかを決定する
ことを含み、第二成虫ショウジョウバエと比較して第一成虫ショウジョウバエの粗眼表現型の減少が、分子が神経変性疾患に対して活性を持つことを示す方法。
【請求項３９】
神経変性疾患が、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、加齢性認知機能喪失、老年痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ウィルソン病、脳性麻痺、進行性核上性麻痺、グァム病、レヴィ小体性痴呆、プリオン病、タウパシー、海綿状脳障害、クロイツフェルト−ヤコブ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調、運動失調、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、発作障害、てんかん、慢性発作障害、卒中、脳外傷、脊髄損傷、エイズ痴呆、アルコール中毒症、自閉症、網膜虚血、緑内障、自律神経機能障害、高血圧症、神経精神障害、精神分裂病、又は分裂感情障害である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
神経変性疾患がポリグルタミン病である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ポリグルタミン病が、ＳＣＡ−１、ＳＣＡ−２、ＳＣＡ−６、ＳＣＡ−７、ＭＪＤ、ＨＤ、ＳＢＭＡ、又はＤＲＰＬＡである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ポリグルタミン病がＳＣＡ−１である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
アタキシン−１が、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１が、アタキシン−１  ８２Ｑである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
アタキシン−１の発現がＧａｌ４  ＵＡＳエレメントの制御下で起こる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４６】
第一及び第二ショウジョウバエが、眼特異的プロモーターに動作可能なように連結されたＧＡＬ４遺伝子をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
眼特異的プロモーターが、ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ、ｅｙｅｌｅｓｓ、又はｇｌａｓｓ遺伝子から誘導される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
脊椎動物疾病に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）その中枢神経系において該脊椎動物疾病に関連する脊椎動物疾病遺伝子を発現する第一遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫を該分子に接触させ、但し該脊椎動物疾病遺伝子の該発現は行動障害を生じさせ、そして
（ｂ）該第一幼虫から生じる第一成虫ショウジョウバエにおける行動障害が、その中枢神経系において該脊椎動物疾病遺伝子を発現するが、該分子には接触させなかった第二幼虫から生じる第二成虫ショウジョウバエの行動障害よりも重症でないかどうかを決定する
ことを含み、
第二成虫ショウジョウバエと比較して第一成虫ショウジョウバエの行動障害の重症度の軽減が、分子が脊椎動物疾病に対して活性を持つことを示す方法。
【請求項４９】
脊椎動物疾病遺伝子の発現がＧａｌ４  ＵＡＳエレメントの制御下で起こる、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
第一及び第二ショウジョウバエが、組織特異的プロモーターに動作可能なように連結されたＧＡＬ４遺伝子をさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
組織特異的プロモーターが、ｅｌａｖ、Ａｐｐｌ、又はｎｉｒｖａｎａ遺伝子から誘導される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
行動障害が運動低下である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
脊椎動物疾病が哺乳類疾病である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
哺乳類疾病がヒト疾病である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
脊椎動物疾病が神経変性疾患である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
神経変性疾患が、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、加齢性認知機能喪失、老年痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ウィルソン病、脳性麻痺、進行性核上性麻痺、グァム病、レヴィ小体痴呆、プリオン病、タウパシー、海綿状脳障害、クロイツフェルト−ヤコブ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調、運動失調、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、発作障害、てんかん、慢性発作障害、卒中、脳外傷、脊髄損傷、エイズ痴呆、アルコール中毒症、自閉症、網膜虚血、緑内障、自律神経機能障害、高血圧症、神経精神障害、精神分裂病、又は分裂感情障害である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
神経変性疾患がポリグルタミン病である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ポリグルタミン病が、ＳＣＡ−１、ＳＣＡ−２、ＳＣＡ−６、ＳＣＡ−７、ＭＪＤ、ＨＤ、ＳＢＭＡ、又はＤＲＰＬＡである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ポリグルタミン病がＳＣＡ−１である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
脊椎動物疾病遺伝子が、伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１をコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項６１】
脊椎動物疾病遺伝子がタウ（ｔａｕ）、シヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）、プリオンタンパク質、ハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）、又はアタキシン−３をコードする、請求項４８に記載の方法。
【請求項６２】
脊椎動物疾病が増殖性疾患である、請求項４８に記載の方法。
【請求項６３】
増殖性疾患が癌である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
癌が、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、又はＨ鎖病である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
脊椎動物疾病が骨格筋疾患である、請求項４８に記載の方法。
【請求項６６】
骨格筋疾患が、筋ジストロフィー、運動ニューロン疾患、又はミオパシーである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
ＳＣＡ−１の変更遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）その体細胞及び生殖細胞がプロモーターに動作可能なように連結された導入遺伝子を含み、かかる導入遺伝子が伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１をコードしており、神経系における該導入遺伝子の発現が進行性神経変性をもたらす遺伝子組換えショウジョウバエと、その生殖細胞内に１又はそれ以上の突然変異を持つことが疑われる第二ショウジョウバエとの間で交配を生じさせて子孫を産生し、
（ｂ）該交配の子孫が、アタキシン−１導入遺伝子に関連する修飾された表現型を持つかどうかを決定して、アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の修飾が、第二ショウジョウバエがＳＣＡ−１の変更遺伝子内に突然変異を持つことを示唆し、そして
（ｃ）アタキシン−１導入遺伝子に関連する修飾された表現型の原因となる遺伝子を同定することを含み、
段階（ｃ）で同定された遺伝子がＳＣＡ−１の変更遺伝子である方法。
【請求項６８】
アタキシン−１導入遺伝子が、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含むアタキシン−１ポリペプチドをコードする、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
導入遺伝子がアタキシン−１  ８２Ｑである、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
（ｄ）ＳＣＡ−１の該変更遺伝子の哺乳類相同体を同定する
ことをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
該第二ショウジョウバエにおける該突然変異がＥＰエレメントによって引き起こされる、請求項６７に記載の方法。
【請求項７２】
ＥＰエレメントが上流活性化配列を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾が表現型の増強であり、表現型の増強の原因となる該突然変異が機能喪失突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子がＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７４】
アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾が表現型の抑制であり、表現型の抑制の原因となる該突然変異が機能獲得突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子がＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７５】
アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾が表現型の抑制であり、表現型の抑制の原因となる該突然変異が機能喪失突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子がＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７６】
アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾が表現型の増強であり、表現型の増強の原因となる該突然変異が機能獲得突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子がＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７７】
ＳＣＡ−１の変更遺伝子を同定する方法であって、
（ａ）その体細胞及び生殖細胞がプロモーターに動作可能なように連結された導入遺伝子を含み、かかる導入遺伝子が伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１をコードしており、神経系における該導入遺伝子の発現が進行性神経変性をもたらす遺伝子組換えショウジョウバエと、突然変異誘発したショウジョウバエを交配して、子孫を産生し、
（ｂ）段階（ａ）のショウジョウバエの交配の子孫が、アタキシン−１導入遺伝子に関連する修飾された表現型を持つかどうかを決定して、アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の修飾が、突然変異誘発したショウジョウバエがＳＣＡ−１の変更遺伝子内に突然変異を持つことを示唆し、そして
（ｃ）アタキシン−１導入遺伝子に関連する修飾された表現型の原因となる遺伝子を同定することを含み、
段階（ｃ）で同定された遺伝子がＳＣＡ−１の変更遺伝子である方法。
【請求項７８】
アタキシン−１導入遺伝子が、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含むアタキシン−１ポリペプチドをコードする、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
アタキシン−１導入遺伝子がアタキシン−１  ８２Ｑである、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
（ｄ）ＳＣＡ−１の該変更遺伝子の哺乳類相同体を同定する
ことをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項８１】
アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾が表現型の増強であり、表現型の増強の原因となる該突然変異が機能喪失突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子がＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８２】
アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾が表現型の抑制であり、表現型の抑制の原因となる該突然変異が機能獲得突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子がＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８３】
アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾が表現型の抑制であり、表現型の抑制の原因となる該突然変異が機能喪失突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子がＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８４】
アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾が表現型の増強であり、表現型の増強の原因となる該突然変異が機能獲得突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子がＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子である、請求項７７に記載の方法。
【請求項８５】
神経変性疾患を治療する方法であって、
（ａ）そのような治療を必要とする被験者にＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子のアンタゴニストを投与する
ことを含む方法。
【請求項８６】
神経変性疾患を治療する方法であって、
（ａ）請求項７３又は８１に記載の方法に従ってＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子を同定し、そして
（ｂ）そのような治療を必要とする被験者にＳＣＡ−１の該サプレッサー遺伝子のアンタゴニストを投与する
ことを含む方法。
【請求項８７】
神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子に拮抗する分子をスクリーニングすることを含み、
ＳＣＡ−１の該サプレッサー遺伝子に拮抗する分子がＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子である方法。
【請求項８８】
神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項７５又は８３に記載の方法に従ってＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子を同定し、そして
（ｂ）ＳＣＡ−１の該サプレッサー遺伝子に拮抗する分子をスクリーニングすることを含み、
ＳＣＡ−１の該サプレッサー遺伝子に拮抗する分子がＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子である方法。
【請求項８９】
神経変性疾患が、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、加齢性認知機能喪失、老年痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ウィルソン病、脳性麻痺、進行性核上性麻痺、グァム病、レヴィ小体痴呆、プリオン病、タウパシー、海綿状脳障害、クロイツフェルト−ヤコブ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調、運動失調、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、発作障害、てんかん、慢性発作障害、卒中、脳外傷、脊髄損傷、エイズ痴呆、アルコール中毒症、自閉症、網膜虚血、緑内障、自律神経機能障害、高血圧症、神経精神障害、精神分裂病、又は分裂感情障害である、請求項８５、８６、８７、又は８８に記載の方法。
【請求項９０】
神経変性疾患がポリグルタミン病である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
ポリグルタミン病が、ＳＣＡ−１、ＳＣＡ−２、ＳＣＡ−６、ＳＣＡ−７、ＭＪＤ、ＨＤ、ＳＢＭＡ、又はＤＲＰＬＡである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
ポリグルタミン病がＳＣＡ−１である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
アンタゴニストがアンチセンスＲＮＡ又はリボザイムである、請求項８５又は８６に記載の方法。
【請求項９４】
アンタゴニストが抗体、ペプチド、又は小分子である、請求項８５又は８６に記載の方法。
【請求項９５】
神経変性疾患を治療する方法であって、
（ａ）そのような治療を必要とする被験者にＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子のアゴニストを投与する
ことを含む方法。
【請求項９６】
神経変性疾患を治療する方法であって、
（ａ）請求項７５又は８３に記載の方法に従ってＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子を同定し、そして
（ｂ）そのような治療を必要とする被験者にＳＣＡ−１の該エンハンサー遺伝子のアゴニストを投与する
ことを含む方法。
【請求項９７】
神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子のアゴニストとして働く分子をスクリーニングする
ことを含み、
ＳＣＡ−１の該エンハンサー遺伝子のアゴニストとして働く分子がＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子である方法。
【請求項９８】
神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項７３又は８１に記載の方法に従ってＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子を同定し、そして
（ｂ）ＳＣＡ−１の該エンハンサー遺伝子のアゴニストとして働く分子をスクリーニングすることを含み、
ＳＣＡ−１の該エンハンサー遺伝子のアゴニストとして働く分子がＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子である方法。
【請求項９９】
神経変性疾患が、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、加齢性認知機能喪失、老年痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ウィルソン病、脳性麻痺、進行性核上性麻痺、グァム病、レヴィ小体痴呆、プリオン病、タウパシー、海綿状脳障害、クロイツフェルト−ヤコブ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調、運動失調、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、発作障害、てんかん、慢性発作障害、卒中、脳外傷、脊髄損傷、エイズ痴呆、アルコール中毒症、自閉症、網膜虚血、緑内障、自律神経機能障害、高血圧症、神経精神障害、精神分裂病、又は分裂感情障害である、請求項９５、９６、９７、又は９８に記載の方法。
【請求項１００】
神経変性疾患がポリグルタミン病である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
ポリグルタミン病が、ＳＣＡ−１、ＳＣＡ−２、ＳＣＡ−６、ＳＣＡ−７、ＭＪＤ、ＨＤ、ＳＢＭＡ、又はＤＲＰＬＡである、請求項１００に記載の方法。
【請求項７８】
ポリグルタミン病がＳＣＡ−１である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０２】
アゴニストが、ＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子をコードする遺伝子治療ベクターである、請求項９５又は９６に記載の方法。
【請求項１０３】
遺伝子治療ベクターがアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、又はリポソームである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
個体においてＳＣＡ−１への素因を診断する方法であって、
（ａ）該個体からの試料において正常アタキシン−１の発現レベルを測定し、そして
（ｂ）該発現レベルがアタキシン−１の正常発現よりも高いかどうかを判定する
ことを含み、
アタキシン−１のより高い発現レベルがＳＣＡ−１への素因を示す方法。
【請求項１０５】
ＳＣＡ−１への素因を示すアタキシン−１のより高いレベルが、アタキシン−１の正常発現より少なくとも２５％高い、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
ＳＣＡ−１への素因を示すアタキシン−１のより高いレベルが、アタキシン−１の正常発現より少なくとも５０％高い、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
ＳＣＡ−１への素因を示すアタキシン−１のより高いレベルが、アタキシン−１の正常発現より少なくとも７５％高い、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０８】
ＳＣＡ−１への素因を示すアタキシン−１のより高いレベルが、アタキシン−１の正常発現より少なくとも２倍高い、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０９】
アタキシン−１の発現を、アタキシン−１  ＲＮＡを測定することによって測定する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１０】
アタキシン−１の発現を、アタキシン−１タンパク質を測定することによって測定する、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１１１】
（ａ）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物。
【請求項１１２】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアゴニストが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸である、請求項１１１に記載の製薬組成物。
【請求項１１３】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質がシータクラスのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質である、請求項１１２に記載の製薬組成物。
【請求項１１４】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質がシグマクラスのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質である、請求項１１２に記載の製薬組成物。
【請求項１１５】
神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアゴニストを投与することを含む方法。
【請求項１１６】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアゴニストが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸である、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質がシータクラスのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質がシグマクラスのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質である、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１９】
（ａ）Ｓｉｎ３Ａアゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物。
【請求項１２０】
Ｓｉｎ３Ａアゴニストが、Ｓｉｎ３Ａタンパク質をコードする核酸である、請求項１１９に記載の製薬組成物。
【請求項１２１】
神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でＳｉｎ３Ａアゴニストを投与することを含む方法。
【請求項１２２】
Ｓｉｎ３Ａアゴニストが、Ｓｉｎ３Ａタンパク質をコードする核酸である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
（ａ）ＣｔＢＰアゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物。
【請求項１２４】
ＣｔＢＰアゴニストが、ＣｔＢＰタンパク質をコードする核酸である、請求項１１９に記載の製薬組成物。
【請求項１２５】
神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でＣｔＢＰアゴニストを投与することを含む方法。
【請求項１２６】
ＣｔＢＰアゴニストが、ＣｔＢＰタンパク質をコードする核酸である、請求項１２５に記載の方法。
【請求項１２７】
（ａ）Ｔｒａｐ２４０アゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物。
【請求項１２８】
Ｔｒａｐ２４０アゴニストが、Ｔｒａｐ２４０タンパク質をコードする核酸である、請求項１２７に記載の製薬組成物。
【請求項１２９】
神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でＴｒａｐ２４０アゴニストを投与することを含む方法。
【請求項１３０】
Ｔｒａｐ２４０アゴニストが、Ｔｒａｐ２４０タンパク質をコードする核酸である、請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
（ａ）ＫＨドメインタンパク質アゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物。
【請求項１３２】
ＫＨドメインタンパク質アゴニストが、ＫＨドメインタンパク質をコードする核酸である、請求項１３１に記載の製薬組成物。
【請求項１３３】
神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でＫＨドメインタンパク質アゴニストを投与することを含む方法。
【請求項１３４】
ＫＨドメインタンパク質アゴニストが、ＫＨドメインタンパク質をコードする核酸である、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
神経変性疾患が、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、加齢性認知機能喪失、老年痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ウィルソン病、脳性麻痺、進行性核上性麻痺、グァム病、レヴィ小体痴呆、プリオン病、タウパシー、海綿状脳障害、クロイツフェルト−ヤコブ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調、運動失調、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、発作障害、てんかん、慢性発作障害、卒中、脳外傷、脊髄損傷、エイズ痴呆、アルコール中毒症、自閉症、網膜虚血、緑内障、自律神経機能障害、高血圧症、神経精神障害、精神分裂病、又は分裂感情障害である、請求項１１１、１１９、１２３、１２７、又は１３１に記載の製薬組成物。
【請求項１３６】
神経変性疾患がポリグルタミン病である、請求項１３５に記載の製薬組成物。
【請求項１３７】
ポリグルタミン病が、ＳＣＡ−１、ＳＣＡ−２、ＳＣＡ−６、ＳＣＡ−７、ＭＪＤ、ＨＤ、ＳＢＭＡ、又はＤＲＰＬＡである、請求項１３６に記載の製薬組成物。
【請求項１３８】
ポリグルタミン病がＳＣＡ−１である、請求項１３７に記載の製薬組成物。
【請求項１３９】
神経変性疾患が、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、加齢性認知機能喪失、老年痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ウィルソン病、脳性麻痺、進行性核上性麻痺、グァム病、レヴィ小体痴呆、プリオン病、タウパシー、海綿状脳障害、クロイツフェルト−ヤコブ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調、運動失調、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、発作障害、てんかん、慢性発作障害、卒中、脳外傷、脊髄損傷、エイズ痴呆、アルコール中毒症、自閉症、網膜虚血、緑内障、自律神経機能障害、高血圧症、神経精神障害、精神分裂病、又は分裂感情障害である、請求項１１５、１２１、１２５、１２９、又は１３３に記載の方法。
【請求項１４０】
神経変性疾患がポリグルタミン病である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
ポリグルタミン病が、ＳＣＡ−１、ＳＣＡ−２、ＳＣＡ−６、ＳＣＡ−７、ＭＪＤ、ＨＤ、ＳＢＭＡ、又はＤＲＰＬＡである、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】
ポリグルタミン病がＳＣＡ−１である、請求項１４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、国立衛生研究所からの研究許可５  Ｒ０１  ＧＭ５５６８１の下に政府の援助を得て為された。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
（１．発明の分野）
本発明は、神経変性疾患、より特定するとポリグルタミン誘導の神経変性疾患、そしてさらに特定すると脊髄小脳性運動失調１（ＳＣＡ−１）のショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）モデルに関する。特に、本発明は、正常ヒトアタキシン−１又は伸長したポリグルタミン反復配列を持つ突然変異体ヒトアタキシン−１を異所性発現する遺伝子組換えショウジョウバエに関する。本発明はさらに、神経変性疾患の治療、特にＳＣＡ−１を含むがこれに限定されないポリグルタミン誘導の神経変性疾患の治療法をスクリーニングするために遺伝子組換えショウジョウバエを使用する方法に関する。本発明はさらに、神経変性疾患の治療及び診断用途のためならびに神経変性疾患の治療法のスクリーニングのための、アタキシン−１異所性発現の変更遺伝子の同定に関する。本発明はさらに、正常アタキシン−１の過剰発現を検出することを含む、ＳＣＡ−１への素因の診断に関する。
【０００３】
（２．発明の背景）
神経精神病や神経変性疾患が分子レベルで理解され始めている。神経変性疾患は典型的には、神経炎性局面、神経原線維濃縮体（ＮＦＴ）、レヴィ小体、及び核封入体のようないくつかの神経病理学的異常によって特徴付けられる。一般に神経変性疾患に関連する著しく類似した病理が多数の異なる遺伝的機序によって起こりうる。例えば、プリオン遺伝子の病的突然変異は、プリオン病の濃縮体とレヴィ小体病理の両方をもたらす（ＦｅａｎｙとＫｉｃｋｓｏｎ，１９９５、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１３８８）。タウタンパク質における突然変異は、神経原線維濃縮体に加えて前頭側頭性痴呆における痴呆を導く（Ｈｕｔｔｏｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：７０２）；シヌクレインの突然変異はレヴィ小体の存在とパーキンソン病を導く（Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓら、１９９７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：２０４５）。
【０００４】
神経変性疾患に結びつく病理の多くが、関連タンパク質が変化し、細胞に対して毒性となって凝集するという機能獲得機序によって引き起こされる（Ｋａｙｔｏｒ  ＆  Ｗａｒｒｅｎ，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３７５０７−１０）。これらのいわゆる「プロテイノパシー（ｐｒｏｔｅｉｎｏｐａｔｈｉｅｓ）」の中でも特に、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン疾患、及びポリグルタミン病が挙げられる。
【０００５】
アルツハイマー病は高齢者の神経変性疾患で、痴呆をもたらし、最終的には死に至る。発症した個体の脳の物理的変化は、細胞内では１０ｎｍの対のらせん状細線維（ＰＨＦ）から成る神経原線維濃縮体として発現し、細胞外では神経終末を取り巻くアミロイド斑として現われる。他の物理的変化は、微小血管アミロイドーシス及びジストロフィー性皮質神経突起を含みうる（ＡＤの病理学的証拠に関する総説は、Ｓｏｂｏｗ，１９９６，Ｆｏｌｉａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．３４：５５−６２参照）。２つの主要なタイプの病変の成分が知られている。神経原線維濃縮体は、中間体フィラメントタンパク質、タウ（Ｔａｕ）から成る。健常神経組織では、タウは非リン酸化タンパク質であるが、ＰＨＦではリン酸化していることが認められる。老人斑とも呼ばれるアミロイド斑は、アミロイド前駆蛋白質（ＡＰＰ）の開裂産物であるアミロイド−β−ペプチド（Ａβ）から成る。正常個体では、Ａベータの大半は４０個のアミノ酸形態である；加えて、４２個のアミノ酸長のＡβも少量存在する。アルツハイマー病を有する個体では、４２個のアミノ酸形態のＡβが支配的である。神経原線維濃縮体とアミロイド斑が脳内に存在する度合は、アルツハイマー病によって引き起こされる老化の程度に対応する。それ故、アルツハイマー病の病理学における共通のテーマは、健常な脳では通常認められない異常構造の産生である。この観察は、ＰＨＦが、通常は結合分子の分解を導くがアルツハイマー病では分解をもたらさない、ユビキチンに結合するという所見によって裏付けられる。
【０００６】
トリプレット反復病としても知られるポリグルタミン反復配列病は、それぞれのタンパク質内でのグルタミンをコードする不安定なＣＡＧ反復配列の伸長によって引き起こされる。これらの疾患−脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ）１、２、６及び７、マチャド−ジョセフ病（ＭＪＤ、ＳＣＡ３としても知られる）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄延髄性筋萎縮（ＳＢＭＡ）、及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ｄｅｎｔａｔｏｒｕｂｒｏｐａｌｌｉｄｏｌｕｓｙａｎ  ａｔｒｏｐｈｙ）（ＤＲＰＬＡ）に関与するタンパク質は、それらがすべてポリグルタミン反復配列を含むことを除いて、互いに関連するかどうかは不明である。さらに、それらは典型的には、特定サブセットのニューロンにおいてのみ変性を引き起こす（Ｚｏｇｈｂｉ  ＆  Ｏｒｒ，２０００，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：２１７−２４７）。
【０００７】
ＳＣＡ−１、ＳＣＡ−３、ハンチントン、及びＤＲＰＬＡのマウスモデル系の開発はポリグルタミン病についての我々の理解に大きく貢献した。それらは、病因が伸長した導入遺伝子の発現に続くものであり、正常タンパク質の機能欠如の結果ではないことを確認した（Ｂｕｒｒｉｇｈｔら、１９９５，Ｃｅｌｌ  ８２：９３７−４８；Ｉｋｅｄａら、１９９６，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １３：１９６−２０２；Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉら、１９９６，Ｃｅｌｌ  ８７：４９３−５０６；Ｍａｔｉｌｌａら、１９９８，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １８：５５０８−１６；Ｌｉｎら、１９９９，Ｎｅｕｒｏｎ  ２４：４９９−５０２；Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇら、１９９９，Ｎｅｕｒｏｎ  ２４：２７５−８６）。さらに、ポリグルタミンタンパク質は核に毒性作用を及ぼすと思われる；アタキシン−３の場合のように、正常タンパク質が細胞質であるときでも、核内輸送は病因と相関する。この発想は、核局在シグナルに突然変異を担う伸長したアタキシン−１タンパク質を産生する遺伝子組換えマウスにおいて試験された（Ｋｉｅｍｅｎｔら、１９９８，Ｃｅｌｌ  ９５：４１−５３）。タンパク質は核に侵入することを妨げられ、それ故ＳＣＡ−１の病因を開始させることはできなかった。細胞モデルでのハンチンチンのＮ末端フラグメントに核外輸送シグナルを付加する実験は、ハンチンチン毒性の核局在の重要性を明らかにした（Ｓａｕｄｏｕら、１９９８，Ｃｅｌｌ  ９５：５５−６６）。
【０００８】
マウス試験は、ポリグルタミン病のもう１つの共通する特徴、核封入体（ＮＩ）−伸長したタンパク質の凝集物、又は一部の場合には、伸長したポリグルタミン路を含む開裂産物の形成への洞察をもたらした。最初はＮＩがＳＣＡ−１の原因であると考えられたが、その自己結合ドメインに欠失を持つ伸長アタキシン−１を有するＳＣＡ−１マウスモデルは、ＮＩを形成することなくＳＣＡ−１病態を発現した（Ｋｉｅｍｅｎｔら，１９９８，Ｃｅｌｌ  ９５：４１−５３）。この所見は、ＮＩ形成が疾患の開始には必要でないことを示唆し、ハンチンチンの細胞培養アッセイからも同様の結論が引き出された（Ｓａｕｄｏｕら、１９９８，Ｃｅｌｌ  ９５：５５−６６）。突然変異体タンパク質の蓄積に加えて、ＮＩはまた分子シャペロン、ユビキチン及びプロテアソーム（ＫａｙｔｏｒとＷａｒｒｅｎ、１９９９，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：３７５０７−１０において検討されている）を蓄積する。この発見は、ＮＩが全く病原性ではないかもしれず、むしろ変化したタンパク質から自由になろうとする細胞の努力を反映していることを示唆した。タンパク質分解経路の崩壊が疾患に寄与する可能性を調べるため、ＳＣＡ−１マウスを、ユビキチン−タンパク質リガーゼを欠如したマウスと交配した。子孫はより少ないＮＩを有していたが、病態は大きく加速されていた（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、１９９９，Ｎｅｕｒｏｎ  ２４：８７９−９２）。これらの所見は、ＮＩが変性していないニューロンにおいても生じうるという観察と合わせて、ＮＩが実際には毒性タンパク質を分離することによって細胞に恩恵を及ぼすと考えられることを示唆している。
【０００９】
マウスモデルの成功にもかかわらず、ショウジョウバエは、機能獲得機序によって引き起こされる神経変性疾患の適切なモデルとなりうるいくつかの利点を備えている。ＧＡＬ４／ＵＡＳ系（ＢｒａｎｄとＰｅｒｒｉｍｏｎ，１９９３，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：４０１−４１５）は、導入遺伝子発現の制御を可能にする。サイレントである（すなわちそれ自体では毒性導入遺伝子を発現しない）遺伝子組換え系統を作製し、種々の細胞型あるいはさらに特定ニューロンに発現を指令する様々なＧＡＬ４ドライバー系統と交配することができる。さらに、培養温度を変化させて所与の遺伝子組換え系統の発現量を調節する。正常な発生と疾患状態に関わる遺伝経路の大部分がショウジョウバエと哺乳類の間で保存されている。ショウジョウバエにおける神経変性の機序は、それ故、おそらくヒトにおける神経変性に関連することが証明されるであろう。この発想の裏づけとして、ポリグルタミン又はＭＪＤ及びハンチントンタンパク質のトランケートされたポリペプチドを使用したショウジョウバエモデルは（Ｗａｍｃｋら、１９９８，Ｃｅｌｌ  ９３：９３９−４９；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９８，Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：６３３−４２；Ｋａｚｅｍｉ−ＥｓｆａｒｊａｎｉとＢｅｎｚｅｒ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１８３７−４０；Ｍａｒｓｈら、２０００，Ｈｕｍ  Ｍｄ  Ｇｅｎｅｔ  ９：１３−２５）、ＮＩ形成に続く特徴的な進行性神経変性を示す（Ｗａｍｃｋら、１９９８，Ｃｅｌｌ  ９３：９３９−４９；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９８，Ｎｅｕｒｏｎ  ２１：６３３−４２）。ショウジョウバエ系の価値は、Ｈｓｐ７０とＨｓｐ４０分子シャペロンの過剰産生がポリグルタミン誘導の神経毒性を抑制することを明らかにしたことによって理解された（Ｗａｒｒｉｃｋら、１９９９，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２３：４２５−８；Ｋａｚｅｍｉ−ＥｓｆａｒｊａｎｉとＢｅｎｚｅｒ，２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１８３７−４０）。この所見は、シャペロンの過剰発現が凝集を軽減することを示した組織培養でのこれまでの実験に続くものであったが、これが病因に何らかの影響を及ぼすのかどうかは不明であった（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、１９９８，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９：１４８−５４）。
【００１０】
この発明までは、しかしながら、ポリグルタミンを含むタンパク質フラグメントではなく完全長タンパク質を使用したポリグルタミン神経変性疾患のハエモデルは記述されていなかった。これらのフラグメントは完全長タンパク質よりも毒性が強い傾向があり、これらの疾患の特徴である細胞型特異的神経変性を誘発しないので（Ｌｉｎら、１９９９，Ｎｅｕｒｏｎ  ２４：４９９−５０２）、それらの活性は、関連してはいるが異なると考えられる。発明者による、完全長アタキシン−１を発現する遺伝子組換えハエの作製は、高いレベルの伸長していない野生型ヒトアタキシン−１  ３０Ｑが、より低レベルの伸長アタキシン−１  ８２Ｑによって産生されるものに類似した神経変性表現型を創造できることを明らかにした。
【００１１】
ここでの参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明の先行技術であることを是認するものと解釈されるべきではない。
【００１２】
（３．発明の要約）
下記の第６章で述べるように、発明者は、ＳＣＡ−１におけるポリグルタミン誘導の変性が、一部には、タンパク質クリアランスの障害によって引き起こされることを示した。表現型の重症度は、伸長したポリグルタミン反復配列を持つ突然変異体アタキシン−１の発現レベルと強く相関する；十分に高いレベルの野生型アタキシン−１もＳＣＡ−１の病因を生じさせる；さらに、タンパク質の折りたたみ及びタンパク質分解機構の１又はそれ以上の成分の活性の変化はＳＣＡ−１表現型を改変する。ＳＣＡ−１ハエの神経変性表現型の微妙な修飾を検出することの容易さがそれらをインビボでの薬理学的スクリーニングのための貴重なツールにしている。ＧＳＴを介した細胞の解毒、転写調節及びＲＮＡプロセシングに関与するＳＣＡ−１変更因子の発見は、ＳＣＡ−１におけるさらなる病理学的機序を明らかにする。下記に述べるように、これらの変更因子はＳＣＡ−１に関する治療薬及び診断薬として、またＳＣＡ−１を阻害する化合物のスクリーニングのためのツールとして使用できる。そのような化合物はＳＣＡ−１を治療するために有用であるのみならず、多くの神経変性疾患の基礎となる機序は類似しているので、かかる化合物は様々な神経変性疾患の治療においても有用である。
【００１３】
本発明は、その体細胞と生殖細胞がプロモーターに動作可能なように連結された導入遺伝子を含み、かかる導入遺伝子が正常アタキシン−１をコードしており、神経系における該導入遺伝子の発現が進行性神経変性への素因を有するショウジョウバエを生じる、遺伝子組換えショウジョウバエを提供する。一部の実施形態では、導入遺伝子は、６−１９個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含むアタキシン−１をコードする。他の実施形態では、導入遺伝子は、２０−４０個のグルタミン残基と１−４個のヒスチジン残基を持つポリグルタミン反復配列を含むアタキシン−１をコードする。
【００１４】
本発明はさらに、その体細胞と生殖細胞がプロモーターに動作可能なように連結された導入遺伝子を含み、かかる導入遺伝子が伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１をコードしており、神経系における該導入遺伝子の発現が進行性神経変性をもたらす、遺伝子組換えショウジョウバエを提供する。本発明の一部の実施形態では、導入遺伝子は、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含むアタキシン−１をコードする。かかる実施形態の好ましい様式では、導入遺伝子はアタキシン−１  ８２Ｑである。
【００１５】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の遺伝子組換えショウジョウバエにおけるアタキシン−１導入遺伝子は異種プロモーターに動作可能なように連結されている。１つの実施形態では、導入遺伝子は時間的に異種プロモーターによって調節される。もう１つの実施形態では、導入遺伝子は空間的に異種プロモーターによって調節される。本発明の特定実施形態では、異種プロモーターは熱ショックプロモーターである。かかる実施形態の好ましい様式では、熱ショックプロモーターはｈｓｐ７０又はｈｓｐ８３遺伝子から誘導される。他の特定実施形態では、アタキシン−１導入遺伝子はＧａｌ４上流活性化配列（「ＵＡＳ」）に動作可能なように連結されている。任意に、アタキシン−１導入遺伝子を含む遺伝子組換えショウジョウバエはＧＡＬ４遺伝子をさらに含む。好ましい実施形態では、ＧＡＬ４遺伝子は組織特異的プロモーターに連結されている。かかる実施形態の好ましい様式では、組織特異的プロモーターは、ｓｅｖｅｎｌｅｓｓ、ｅｙｅｌｅｓｓ、又はｇｌａｓｓ遺伝子から誘導される。かかる実施形態のもう１つの好ましい様式では、組織特異的プロモーターは、ｄｐｐ、ｖｅｓｔｉｇａｌ、又はａｐｔｅｒｏｕｓ遺伝子から誘導される。さらに他の実施形態では、異種プロモーターはテトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）応答調節エレメントを含む。任意に、アタキシン−１導入遺伝子を含む遺伝子組換えショウジョウバエはｔＴＡ遺伝子をさらに含む。
【００１６】
本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）その中枢神経系において伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現する第一遺伝子組換えショウジョウバエを該分子に接触させ、そして（ｂ）該遺伝子組換えショウジョウバエにおける進行性神経変性が、その中枢神経系において伸張したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現するが、該分子には接触させなかった第二遺伝子組換えショウジョウバエの進行性神経変性よりも重症でないかどうかを決定することを含み、第二ショウジョウバエと比較して第一ショウジョウバエの進行性神経変性の軽減が、分子が神経変性疾患に対して活性を持つことを示す方法を提供する。１つの実施形態では、アタキシン−１は、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む。かかる実施形態の好ましい様式では、伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１は、アタキシン−１  ８２Ｑである。好ましい実施形態では、かかる方法はＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子をスクリーニングする。伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現するショウジョウバエの代わりに、神経変性表現型を促進するのに十分なレベルの正常アタキシン−１を発現するショウジョウバエに関してスクリーニングを実施することができる。
【００１７】
本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）その眼成虫原基において伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現する第一遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫を該分子に接触させ、但しかかる発現は粗眼（ｒｏｕｇｈ  ｅｙｅ）表現型を生じさせ、そして（ｂ）該第一幼虫から生じる第一成虫ショウジョウバエにおける粗眼表現型が、その眼成虫原基において伸張したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現するが、該分子には接触させなかった第二遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫から生じる第二成虫ショウジョウバエの粗眼表現型よりも重症でないかどうかを決定することを含み、第二成虫ショウジョウバエと比較して第一成虫ショウジョウバエの粗眼表現型の減少が、分子が神経変性疾患に対して活性を持つことを示す方法を提供する。１つの実施形態では、アタキシン−１は、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む。かかる実施形態の好ましい様式では、伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１は、アタキシン−１  ８２Ｑである。伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現するショウジョウバエの代わりに、粗眼表現型を促進するのに十分なレベルの正常アタキシン−１を発現するショウジョウバエに関してスクリーニングを実施することができる。好ましい実施形態では、かかる方法はＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子をスクリーニングする。
【００１８】
本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）その中枢神経系において伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現する第一遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫を該分子に接触させ、但しかかる発現は運動機能不全及び／又は短命をもたらし、そして（ｂ）該第一幼虫から生じる第一成虫ショウジョウバエにおける運動機能不全及び／又は短命が、その眼成虫原基において伸張したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現するが、該分子には接触させなかった第二幼虫から生じる第二成虫ショウジョウバエの運動機能不全及び／又は短命よりも重症でないかどうかを決定することを含み、第二成虫ショウジョウバエと比較して第一成虫ショウジョウバエの運動機能不全及び／又は短命の減少が、分子が神経変性疾患に対して活性を持つことを示す方法を提供する。１つの実施形態では、アタキシン−１は、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む。かかる実施形態の好ましい様式では、伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１は、アタキシン−１  ８２Ｑである。好ましい実施形態では、かかる方法はＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子をスクリーニングする。伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現するショウジョウバエの代わりに、運動機能不全及び／又は短命表現型を促進するのに十分なレベルの正常アタキシン−１を発現するショウジョウバエに関してスクリーニングを実施することができる。さらに、アタキシン−１の異所性発現は、幼虫期での異所性発現の代わりに、又は幼虫期での異所性発現に加えて、発生のさなぎ及び／又は成虫段階でも実施しうる。
【００１９】
本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）（ｉ）その中枢神経系において伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現し、且つ（ｉｉ）ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子内に機能獲得突然変異を有する又はＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子を異所性発現する、第一遺伝子組換えショウジョウバエを該分子に接触させ、そして（ｂ）該遺伝子組換えショウジョウバエにおける進行性神経変性が、その中枢神経系において伸張したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現し、且つＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子内に機能獲得突然変異を有するか又はＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子を異所性発現するが、該分子に接触させなかった第二ショウジョウバエの進行性神経変性よりも重症でないかどうかを決定することを含み、第二ショウジョウバエと比較して第一ショウジョウバエの進行性神経変性の軽減が、分子が神経変性疾患に対して活性を持つことを示す方法を提供する。１つの実施形態では、アタキシン−１は、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む。かかる実施形態の好ましい様式では、伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１は、アタキシン−１  ８２Ｑである。好ましい実施形態では、かかる方法はＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子をスクリーニングする。伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現するショウジョウバエの代わりに、神経変性表現型を促進するのに十分なレベルの正常アタキシン−１を発現するショウジョウバエに関してスクリーニングを実施することができる。
【００２０】
本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）（ｉ）その眼成虫原基において伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現し、且つ（ｉｉ）ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子内に機能獲得突然変異を有する又はＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子を異所性発現し、かかる発現が粗眼表現型をもたらす、第一遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫を該分子に接触させ、そして（ｂ）該第一幼虫から生じる第一成虫ショウジョウバエにおける粗眼表現型が、その眼成虫原基において伸張したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現し、且つＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子内に機能獲得突然変異を有するか又はＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子を異所性発現するが、該分子に接触させなかった第二幼虫から生じる第二成虫ショウジョウバエの粗眼表現型よりも重症でないかどうかを決定することを含み、第二成虫ショウジョウバエと比較して第一成虫ショウジョウバエの粗眼表現型の減少が、分子が神経変性疾患に対して活性を持つことを示す方法を提供する。１つの実施形態では、アタキシン−１は、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む。かかる実施形態の好ましい様式では、伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１は、アタキシン−１  ８２Ｑである。伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現するショウジョウバエの代わりに、粗眼表現型を促進するのに十分なレベルの正常アタキシン−１を発現するショウジョウバエに関してスクリーニングを実施することができる。好ましい実施形態では、かかる方法はＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子をスクリーニングする。
【００２１】
本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）（ｉ）その神経系において伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現し、且つ（ｉｉ）ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子内に機能獲得突然変異を有するか又はＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子を異所性発現し、かかる発現が運動機能不全及び／又は短命をもたらす、第一遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫を該分子に接触させ、そして（ｂ）該第一幼虫から生じる第一成虫ショウジョウバエにおける運動機能不全及び／又は短命が、その眼成虫原基において伸張したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現し、且つＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子内に機能獲得突然変異を有するか又はＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子を異所性発現するが、該分子に接触させなかった第二幼虫から生じる第二成虫ショウジョウバエの運動機能不全及び／又は短命よりも重症でないかどうかを決定することを含み、第二成虫ショウジョウバエと比較して第一成虫ショウジョウバエの運動機能不全及び／又は短命の減少が、分子が神経変性疾患に対して活性を持つことを示す方法を提供する。１つの実施形態では、アタキシン−１は、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む。かかる実施形態の好ましい様式では、伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１は、アタキシン−１  ８２Ｑである。好ましい実施形態では、かかる方法はＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子をスクリーニングする。伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現するショウジョウバエの代わりに、運動機能不全及び／又は短命表現型を促進するのに十分なレベルの正常アタキシン−１を発現するショウジョウバエに関してスクリーニングを実施することができる。
【００２２】
本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）（ｉ）その中枢神経系において伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現し、且つ（ｉｉ）ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有する第一遺伝子組換えショウジョウバエを該分子に接触させ、そして（ｂ）該遺伝子組換えショウジョウバエにおける進行性神経変性が、その中枢神経系において伸張したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現し、且つＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有するが、該分子に接触させなかった第二ショウジョウバエの進行性神経変性よりも重症でないかどうかを決定することを含み、第二ショウジョウバエと比較して第一ショウジョウバエの進行性神経変性の軽減が、分子が神経変性疾患に対して活性を持つことを示す方法を提供する。１つの実施形態では、アタキシン−１は、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む。かかる実施形態の好ましい様式では、伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１は、アタキシン−１  ８２Ｑである。好ましい実施形態では、かかる方法はＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子をスクリーニングする。伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現するショウジョウバエの代わりに、神経変性表現型を促進するのに十分なレベルの正常アタキシン−１を発現するショウジョウバエに関してスクリーニングを実施することができる。
【００２３】
本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）（ｉ）その眼成虫原基において伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現し、且つ（ｉｉ）ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有しており、かかる発現が粗眼表現型をもたらす、第一遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫を該分子に接触させ、そして（ｂ）該第一幼虫から生じる第一成虫ショウジョウバエにおける粗眼表現型が、その眼成虫原基において伸張したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現し、且つＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有するが、該分子に接触させなかった第二幼虫から生じる第二成虫ショウジョウバエの粗眼表現型よりも重症でないかどうかを決定することを含み、第二成虫ショウジョウバエと比較して第一成虫ショウジョウバエの粗眼表現型の減少が、分子が神経変性疾患に対して活性を持つことを示す方法を提供する。１つの実施形態では、アタキシン−１は、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む。かかる実施形態の好ましい様式では、伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１は、アタキシン−１  ８２Ｑである。伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現するショウジョウバエの代わりに、粗眼表現型を促進するのに十分なレベルの正常アタキシン−１を発現するショウジョウバエに関してスクリーニングを実施することができる。好ましい実施形態では、かかる方法はＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子をスクリーニングする。
【００２４】
本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）（ｉ）その神経系において伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現し、且つ（ｉｉ）ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有しており、かかる発現が運動機能不全及び／又は短命をもたらす、第一遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫を該分子に接触させ、そして（ｂ）該第一幼虫から生じる第一成虫ショウジョウバエにおける運動機能不全及び／又は短命が、その眼成虫原基において伸張したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現し、且つＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有するが、該分子に接触させなかった第二幼虫から生じる第二成虫ショウジョウバエの運動機能不全及び／又は短命よりも重症でないかどうかを決定することを含み、第二成虫ショウジョウバエと比較して第一成虫ショウジョウバエの運動機能不全及び／又は短命の減少が、分子が神経変性疾患に対して活性を持つことを示す方法を提供する。１つの実施形態では、アタキシン−１は、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む。かかる実施形態の好ましい様式では、伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１は、アタキシン−１  ８２Ｑである。好ましい実施形態では、かかる方法はＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子をスクリーニングする。伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現するショウジョウバエの代わりに、運動機能不全及び／又は短命表現型を促進するのに十分なレベルの正常アタキシン−１を発現するショウジョウバエに関してスクリーニングを実施することができる。さらに、アタキシン−１の異所性発現は、幼虫期での異所性発現の代わりに又は幼虫期での異所性発現に加えて、発生のさなぎ及び／又は成虫段階でも実施しうる。
【００２５】
下記の５．１４．６章で述べるように、分子、好ましくは候補薬剤を、アタキシン−１を異所性発現し、且つＳＣＡ−１変更遺伝子内に突然変異を有する又はＳＣＡ−１変更遺伝子を異所性発現するショウジョウバエ動物への作用に関して試験する上述した方法は、アタキシン−１を異所性発現するが、ＳＣＡ−１変更遺伝子内に突然変異を有していない又はＳＣＡ−１変更遺伝子を異所性発現しないショウジョウバエへの該分子の作用と比較するとき、特に有用である。明細には、そのような比較法は、候補薬剤の直接標的を同定するために有用である。さらに、ＳＣＡ−１変更遺伝子を特異的に標的する薬剤を同定するために、アタキシン−１を異所性発現し、且つＳＣＡ−１変更遺伝子内に突然変異を有する又はＳＣＡ−１変更遺伝子を異所性発現するショウジョウバエを用いるスクリーニング方法を、アタキシン−１を異所性発現するが、ＳＣＡ−１変更遺伝子内に突然変異を有していない又はＳＣＡ−１変更遺伝子を異所性発現しないショウジョウバエを用いるスクリーニング方法と平行して実施することができる。
【００２６】
本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有する第一ショウジョウバエを該分子に接触させ、それによってＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子の機能喪失表現型を産生し、そして（ｂ）該ショウジョウバエにおける機能喪失表現型が、ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有するが、該分子に接触させなかった第二ショウジョウバエの機能喪失表現型よりも重症でないかどうかを決定することを含み、第二ショウジョウバエと比較して第一ショウジョウバエの機能喪失表現型の改善が、分子が神経変性疾患に対して活性を持つことを示す方法を提供する。好ましい実施形態では、かかる方法はＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子をスクリーニングする。ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有する動物に関してスクリーニングを実施する代わりに、ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子を異所性発現する又はＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子内に機能獲得突然変異を有する動物に関してスクリーニングを実施することができる。
【００２７】
本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有する第一ショウジョウバエ幼虫を該分子に接触させ、それによってＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子の機能喪失表現型を産生し、そして（ｂ）該第一幼虫から生じる第一成虫ショウジョウバエにおける機能喪失表現型が、ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有するが、該分子に接触させなかった第二幼虫から生じる第二成虫ショウジョウバエの機能喪失表現型よりも重症でないかどうかを決定することを含み、第二成虫ショウジョウバエと比較して第一成虫ショウジョウバエの機能喪失表現型の改善が、分子が神経変性疾患に対して活性を持つことを示す方法を提供する。好ましい実施形態では、かかる方法はＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子をスクリーニングする。ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有する動物に関してスクリーニングを実施する代わりに、ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子を異所性発現する又はＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子内に機能獲得突然変異を有する動物に関してスクリーニングを実施することができる。
【００２８】
本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有する第一ショウジョウバエを該分子に接触させ、それによってＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子の機能喪失表現型を産生し、そして（ｂ）該ショウジョウバエにおける機能喪失表現型が、ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有するが、該分子に接触させなかった第二ショウジョウバエの機能喪失表現型よりも重症であるかどうかを決定することを含み、第二ショウジョウバエと比較して第一ショウジョウバエにおける機能喪失表現型の増悪が、分子が神経変性疾患に対して活性を持つことを示す方法を提供する。好ましい実施形態では、かかる方法はＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子をスクリーニングする。ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有する動物に関してスクリーニングを実施する代わりに、ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子を異所性発現する又はＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子内に機能獲得突然変異を有する動物に関してスクリーニングを実施することができる。
【００２９】
本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有する第一ショウジョウバエ幼虫を該分子に接触させ、それによってＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子の機能喪失表現型を産生し、そして（ｂ）該第一幼虫から生じる第一成虫ショウジョウバエにおける機能喪失表現型が、ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有するが、該分子に接触させなかった第二幼虫から生じる第二成虫ショウジョウバエの機能喪失表現型よりも重症であるかどうかを決定することを含み、第二成虫ショウジョウバエと比較して第一成虫ショウジョウバエにおける機能喪失表現型の増悪が、分子が神経変性疾患に対して活性を持つことを示す方法を提供する。好ましい実施形態では、かかる方法はＳＣＡ−１に対して活性を持つ分子をスクリーニングする。ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子内に機能喪失突然変異を有する動物に関してスクリーニングを実施する代わりに、ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子を異所性発現する又はＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子内に機能獲得突然変異を有する動物に関してスクリーニングを実施することができる。
【００３０】
本発明はさらに、脊椎動物疾病に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）その中枢神経系において該脊椎動物疾病に関連する脊椎動物疾病遺伝子を発現する第一遺伝子組換えショウジョウバエ幼虫を該分子に接触させ、但し該脊椎動物疾病遺伝子の該発現は行動障害を生じさせ、そして（ｂ）該第一幼虫から生じる第一成虫ショウジョウバエにおける行動障害が、その中枢神経系において該脊椎動物疾病遺伝子を発現するが、該分子には接触させなかった第二幼虫から生じる第二成虫ショウジョウバエの行動障害よりも重症でないかどうかを決定することを含み、第二成虫ショウジョウバエと比較して第一成虫ショウジョウバエの行動障害の重症度の軽減が、分子が脊椎動物疾病に対して活性を持つことを示す方法を提供する。１つの実施形態では、脊椎動物疾病は、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、加齢性認知機能喪失、老年痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ウィルソン病、脳性麻痺、進行性核上性麻痺、グァム病、レヴィ小体痴呆、プリオン病、タウパシー、海綿状脳障害、クロイツフェルト−ヤコブ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調、運動失調、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、発作障害、てんかん、慢性発作障害、卒中、脳外傷、脊髄損傷、エイズ痴呆、アルコール中毒症、自閉症、網膜虚血、緑内障、自律神経機能障害、高血圧症、神経精神障害、精神分裂病、又は分裂感情障害を含むがこれらに限定されない、神経変性疾患である。かかる実施形態の好ましい様式では、神経変性疾患は、ＳＣＡ−１、ＳＣＡ−２、ＳＣＡ−６、ＳＣＡ−７、ＭＪＤ、ＨＤ、ＳＢＭＡ、又はＤＲＰＬＡを含むがこれらに限定されない、ポリグルタミン病である。他の実施形態では、脊椎動物疾病遺伝子は、タウ（ｔａｕ）、シヌクレイン（ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）、プリオンタンパク質、ハンチンチン（ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ）、又はアタキシン−３をコードする。
【００３１】
行動スクリーニングアッセイのもう１つの実施形態では、脊椎動物疾病は癌のような増殖性疾患である。かかる実施形態の特定様式では、癌は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、又はＨ鎖病である。
【００３２】
行動スクリーニングアッセイのさらにもう１つの実施形態では、脊椎動物疾病は、筋ジストロフィー、運動ニューロン疾患、又はミオパシーのような骨格筋疾患である。
【００３３】
任意に、ＵＡＳエレメントの制御下で脊椎動物疾病遺伝子を含む、本発明の行動スクリーニングアッセイにおいて使用する遺伝子組換えショウジョウバエは、ＧＡＬ４遺伝子をさらに含む。好ましい実施形態では、ＧＡＬ４遺伝子は組織特異的プロモーターに連結されている。かかる実施形態の好ましい様式では、組織特異的プロモーターは、ｅｌａｖ、Ａｐｐｌ、又はｎｉｒｖａｎａ遺伝子から誘導される。
【００３４】
本発明はさらに、ＳＣＡ−１の変更遺伝子を同定する方法であって、（ａ）その体細胞及び生殖細胞がプロモーターに動作可能なように連結された導入遺伝子を含み、かかる導入遺伝子が伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１をコードしており、神経系における該導入遺伝子の発現が進行性神経変性をもたらす遺伝子組換えショウジョウバエと、その生殖細胞内に１又はそれ以上の突然変異を持つことが疑われる第二ショウジョウバエとの間で交配を生じさせて子孫を産生し、（ｂ）該交配の子孫が、アタキシン−１導入遺伝子に関連する修飾された表現型を持つかどうかを決定して、アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の修飾が、第二ショウジョウバエがＳＣＡ−１の変更遺伝子内に突然変異を持つことを示唆し、そして（ｃ）アタキシン−１導入遺伝子に関連する修飾された表現型の原因となる遺伝子を同定することを含み、段階（ｃ）で同定された遺伝子がＳＣＡ−１の変更遺伝子である方法を提供する。かかる方法は任意に、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子の哺乳類相同体を同定する段階（ｄ）をさらに含む。１つの実施形態では、アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾は表現型の増強であり、表現型の増強の原因となる該突然変異は機能喪失突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子はＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子である。もう１つの実施形態では、アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾は表現型の抑制であり、表現型の抑制の原因となる該突然変異は機能獲得突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子はＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子である。もう１つの実施形態では、アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾は表現型の抑制であり、表現型の抑制の原因となる該突然変異は機能喪失突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子はＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子である。さらにもう１つの実施形態では、アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾は表現型の増強であり、表現型の増強の原因となる該突然変異は機能獲得突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子はＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子である。
【００３５】
本発明はさらに、ＳＣＡ−１の変更遺伝子を同定する方法であって、（ａ）その体細胞及び生殖細胞がプロモーターに動作可能なように連結された導入遺伝子を含み、かかる導入遺伝子が伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１をコードしており、神経系における該導入遺伝子の発現が進行性神経変性をもたらす遺伝子組換えショウジョウバエを、突然変異誘発したショウジョウバエに交配して、子孫を産生し、（ｂ）段階（ａ）の交配の子孫が、アタキシン−１導入遺伝子に関連する修飾された表現型を持つかどうかを決定して、アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の修飾が、突然変異誘発したショウジョウバエがＳＣＡ−１の変更遺伝子内に突然変異を持つことを示唆し、そして（ｃ）アタキシン−１導入遺伝子に関連する修飾された表現型の原因となる遺伝子を同定することを含み、段階（ｃ）で同定された遺伝子がＳＣＡ−１の変更遺伝子である方法を提供する。かかる方法は任意に、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子の哺乳類相同体を同定する段階（ｄ）をさらに含む。１つの実施形態では、アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾は表現型の増強であり、表現型の増強の原因となる該突然変異は機能喪失突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子はＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子である。もう１つの実施形態では、アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾は表現型の抑制であり、表現型の抑制の原因となる該突然変異は機能獲得突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子はＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子である。もう１つの実施形態では、アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾は表現型の抑制であり、表現型の抑制の原因となる該突然変異は機能喪失突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子はＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子である。さらにもう１つの実施形態では、アタキシン−１導入遺伝子に関連する表現型の該修飾は表現型の増強であり、表現型の増強の原因となる該突然変異は機能獲得突然変異であって、ＳＣＡ−１の該変更遺伝子はＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子である。
【００３６】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、（ａ）そのような治療を必要とする被験者にＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子のアンタゴニストを投与することを含む方法を提供する。さらに他の局面では、本発明はさらに、ＳＣＡ−１を治療する又は予防する方法であって、（ａ）ここで述べる方法に従ってＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子を同定し、そして（ｂ）そのような治療を必要とする被験者にＳＣＡ−１の該サプレッサー遺伝子のアンタゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、アンタゴニストはアンチセンスＲＮＡ又はリボザイムである。もう１つの実施形態では、アンタゴニストは抗体、ペプチド、又は小分子である。
【００３７】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、（ａ）そのような治療を必要とする被験者にＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子のアゴニストを投与することを含む方法を提供する。さらに他の局面では、本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、（ａ）ここで述べる方法に従ってＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子を同定し、そして（ｂ）そのような治療を必要とする被験者にＳＣＡ−１の該エンハンサー遺伝子のアンタゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、アゴニストは、ＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子をコードする遺伝子治療ベクターである。かかる実施形態の１つの様式では、遺伝子治療ベクターはアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、又はリポソームである。
【００３８】
本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）ＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子のアゴニストとして働く分子をスクリーニングすることを含み、ＳＣＡ−１の該エンハンサー遺伝子のアゴニストとして働く分子が神経変性疾患に対して活性を持つ分子である方法を提供する。さらに他の局面では、本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）ここで述べる方法に従ってＳＣＡ−１のエンハンサー遺伝子を同定し、そして（ｂ）ＳＣＡ−１の該エンハンサー遺伝子のアゴニストとして働く分子をスクリーニングすることを含み、ＳＣＡ−１の該エンハンサー遺伝子のアゴニストとして働く分子が神経変性疾患に対して活性を持つ分子である方法を提供する。
【００３９】
本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）ＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子に拮抗する分子をスクリーニングすることを含み、ＳＣＡ−１の該サプレッサー遺伝子に拮抗する分子が神経変性疾患に対して活性を持つ分子である方法を提供する。さらに他の局面では、本発明はさらに、神経変性疾患に対して活性を持つ分子をスクリーニングする方法であって、（ａ）ここで述べる方法に従ってＳＣＡ−１のサプレッサー遺伝子を同定し、そして（ｂ）ＳＣＡ−１の該サプレッサー遺伝子に拮抗する分子をスクリーニングすることを含み、ＳＣＡ−１の該サプレッサー遺伝子に拮抗する分子が神経変性疾患に対して活性を持つ分子である方法を提供する。
【００４０】
本発明はさらに、個体においてＳＣＡ−１への素因を診断する方法であって、（ａ）該個体からの試料において正常アタキシン−１の発現レベルを測定し、そして（ｂ）該発現レベルがアタキシン−１の正常発現よりも高いかどうかを判定することを含み、アタキシン−１のより高い発現レベルがＳＣＡ−１への素因を示す方法を提供する。１つの実施形態では、ＳＣＡ−１への素因を示すアタキシン−１のより高いレベルは、アタキシン−１の正常発現より少なくとも２５％高い。もう１つの実施形態では、ＳＣＡ−１への素因を示すアタキシン−１のより高いレベルは、アタキシン−１の正常発現より少なくとも５０％高い。さらにもう１つの実施形態では、ＳＣＡ−１への素因を示すアタキシン−１のより高いレベルは、アタキシン−１の正常発現より少なくとも７５％高い。さらにもう１つの実施形態では、ＳＣＡ−１への素因を示すアタキシン−１のより高いレベルは、アタキシン−１の正常発現より少なくとも２倍高い。アタキシン−１の発現の測定は、アタキシン−１  ＲＮＡ又はアタキシン−１タンパク質を測定することによって実施できる。
【００４１】
本発明はさらに、（ａ）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物を提供する。１つの実施形態では、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアゴニストは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸である。かかる実施形態の１つの様式では、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質はシータクラスのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質である。かかる実施形態のもう１つの様式では、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質はシグマクラスのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質である。
【００４２】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼアゴニストは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質をコードする核酸である。かかる実施形態の１つの様式では、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質はシータクラスのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質である。かかる実施形態のもう１つの様式では、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質はシグマクラスのグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質である。
【００４３】
本発明はさらに、（ａ）Ｓｉｎ３Ａアゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物を提供する。１つの実施形態では、Ｓｉｎ３Ａアゴニストは、Ｓｉｎ３Ａタンパク質をコードする核酸である。
【００４４】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でＳｉｎ３Ａアゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、Ｓｉｎ３Ａアゴニストは、Ｓｉｎ３Ａタンパク質をコードする核酸である。
【００４５】
本発明はさらに、（ａ）ＣｔＢＰアゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物を提供する。１つの実施形態では、ＣｔＢＰアゴニストは、ＣｔＢＰタンパク質をコードする核酸である。
【００４６】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でＣｔＢＰアゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、ＣｔＢＰアゴニストは、ＣｔＢＰタンパク質をコードする核酸である。
【００４７】
本発明はさらに、（ａ）Ｔｒａｐ２４０アゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物を提供する。１つの実施形態では、Ｔｒａｐ２４０アゴニストは、Ｔｒａｐ２４０タンパク質をコードする核酸である。
【００４８】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でＴｒａｐ２４０アゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、Ｔｒａｐ２４０アゴニストは、Ｔｒａｐ２４０タンパク質をコードする核酸である。
【００４９】
本発明はさらに、（ａ）Ｕｂｉ６３Ｅアゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物を提供する。１つの実施形態では、Ｕｂｉ６３Ｅアゴニストは、Ｕｂｉ６３Ｅタンパク質をコードする核酸である。
【００５０】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でＵｂｉ６３Ｅアゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、Ｕｂｉ６３Ｅアゴニストは、Ｕｂｉ６３Ｅタンパク質をコードする核酸である。
【００５１】
本発明はさらに、（ａ）ＵｂｃＤ１アゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物を提供する。１つの実施形態では、ＵｂｃＤ１アゴニストは、ＵｂｃＤ１タンパク質をコードする核酸である。
【００５２】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でＵｂｃＤ１アゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、ＵｂｃＤ１アゴニストは、ＵｂｃＤ１タンパク質をコードする核酸である。
【００５３】
本発明はさらに、（ａ）ｎｕｐ４４Ａアゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物を提供する。１つの実施形態では、ｎｕｐ４４Ａアゴニストは、ｎｕｐ４４Ａタンパク質をコードする核酸である。
【００５４】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でｎｕｐ４４Ａアゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、ｎｕｐ４４Ａアゴニストは、ｎｕｐ４４Ａタンパク質をコードする核酸である。
【００５５】
本発明はさらに、（ａ）ｍｕｂアゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物を提供する。１つの実施形態では、ｍｕｂアゴニストは、ｍｕｂタンパク質をコードする核酸である。
【００５６】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でｍｕｂアゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、ｍｕｂアゴニストは、ｍｕｂタンパク質をコードする核酸である。
【００５７】
本発明はさらに、（ａ）ｃｐｏアゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物を提供する。１つの実施形態では、ｃｐｏアゴニストは、ｃｐｏタンパク質をコードする核酸である。
【００５８】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でｃｐｏアゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、ｃｐｏアゴニストは、ｃｐｏタンパク質をコードする核酸である。
【００５９】
本発明はさらに、（ａ）Ｒｐｄ３アゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物を提供する。１つの実施形態では、Ｒｐｄ３アゴニストは、Ｒｐｄ３タンパク質をコードする核酸である。
【００６０】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でＲｐｄ３アゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、Ｒｐｄ３アゴニストは、Ｒｐｄ３タンパク質をコードする核酸である。
【００６１】
本発明はさらに、（ａ）ｔａｒａアゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物を提供する。１つの実施形態では、ｔａｒａアゴニストは、ｔａｒａタンパク質をコードする核酸である。
【００６２】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でｔａｒａアゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、ｔａｒａアゴニストは、ｔａｒａタンパク質をコードする核酸である。
【００６３】
本発明はさらに、（ａ）ｈｓｒ−ωアゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物を提供する。１つの実施形態では、ｈｓｒ−ωアゴニストは、ｈｓｒ−ωタンパク質をコードする核酸である。
【００６４】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でｈｓｒ−ωアゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、ｈｓｒ−ωアゴニストは、ｈｓｒ−ωタンパク質をコードする核酸である。
【００６５】
本発明はさらに、（ａ）トリソラックス（ｔｒｉｔｈｏｒａｘ）アゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物を提供する。１つの実施形態では、トリソラックスアゴニストは、トリソラックスタンパク質をコードする核酸である。
【００６６】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でトリソラックスアゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、トリソラックスアゴニストは、トリソラックスタンパク質をコードする核酸である。
【００６７】
本発明はさらに、（ａ）ＫＨドメインタンパク質アゴニストと（ｂ）医薬適合性の担体を含有する、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物を提供する。１つの実施形態では、ＫＨドメインタンパク質アゴニストは、ＫＨドメインタンパク質をコードする核酸である。
【００６８】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量でＫＨドメインタンパク質アゴニストを投与することを含む方法を提供する。１つの実施形態では、ＫＨドメインタンパク質アゴニストは、ＫＨドメインタンパク質をコードする核酸である。
【００６９】
本発明はさらに、神経変性疾患の治療又は予防のための製薬組成物であって、（ａ）ｄＵｂｃ−Ｅ２Ｈ、ＤｎａＪ−１  ６４ＥＦ、ｐｕｍ、ｄＹＴ５２１−Ｂ、ｄＳｉｒ２、ＣＧ６７８５、Ｄｓｐ１、ＨｍｇＤ、ＣＧ１０９３４、ＣＧ３４４５、ＣＧ６７８３、Ｘｎｐ、ＣＧ１９１０、ＣＧ５２６１、ＣＧ４８３４、ＣＧ１８４４５、Ｌｉｌｌｉｐｕｔｉａｎ／ＣＧ８８１７、ＣＧ８０６２、Ａｃｔ５Ｃ／ＣＧ４０２７、ＣＧ８２４０、ＣＧ１４４３８、ＣＧ９６５０、ＣＧ７２３３、ｐｉｐｓｑｕｅａｋ、ｅｌｂｏｗ  Ｂ、ＣＧ１０８８２、ＣＧ１４７５７、ＣＧ８２０４、ＣＧ１２８４６、Ｐｋ６１Ｃ、Ｒａｃ２、ＣＧ１４９５９、ＣＧ５１６６、ＣＧ１４３６３、ｂｏｕｌｅ、ＣＧ１２０８４、ＣＧ７５１８、ｖｉｂｒａｔｏｒ／ＣＧ５２６９、ＣＧ９２４６、ＣＧ１１１７１、ｐＫａ−Ｃ１、ＫＥＫ１、ＣＧ６３０１、ｌｅｓｓｗｒｉｇｈｔ、ｓｐｅｎ、ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ、ＣＧ１１２７８／Ｓｙｘ１３、ＣＧ６７６７、ＣＧ５８９１、ＣＧ１０７３３、ｊｕｍｕ、ｐｅｂｂｌｅ、ｓｈａｎｋ、ｈｓｐ８３、ｔａｃｃ、ｇｕｆｔａｇｕ、ＣＧ９９８８、ａｒｉａｄｎｅ−２、又はＧｂｐの遺伝子産物のモジュレーターと、（ｂ）医薬適合性の担体を含有する製薬組成物を提供する。１つの実施形態では、モジュレーターは、ＤｎａＪ−１  ６４ＥＦ  Ｄｓｐ１、ＣＧ１０９３４、ＣＧ３４４５、Ｘｎｐ、ＣＧ１９１０、ＣＧ５２６１、ＣＧ８０６２、Ａｃｔ５Ｃ／ＣＧ４０２７、ＣＧ８２４０、ＣＧ９６５０、ＣＧ７２３３、ｐｉｐｓｑｕｅａｋ、ｅｌｂｏｗ  Ｂ、ＣＧ１４７５７、ＣＧ８２０４、ＣＧ１２８４６、Ｒａｃ２、ＣＧ５１６６、ＣＧ１４３６３、ｂｏｕｌｅ、ＣＧ１２０８４、ＣＧ９２４６、ＣＧ１１１７１、ｐＫａ−Ｃ１、ＣＧ６３０１、ｇｕｆｔａｇｕ、ａｒｉａｄｎｅ−２、又はＧｂｐのアゴニストである。もう１つの実施形態では、モジュレーターは、ｄＵｂｃ−Ｅ２Ｈ、ｐｕｍ、ｄＹＴ５２１−Ｂ、ｄＳｉｒ２、ＣＧ６７８５、ＨｍｇＤ、ＣＧ６７８３、ＣＧ４８３４、ＣＧ１８４４５、Ｌｉｌｌｉｐｕｔｉａｎ／ＣＧ８８１７、ＣＧ１０８８２、Ｐｋ６１Ｃ、ＣＧ１４９５９、ＣＧ７５１８、ｖｉｂｒａｔｏｒ／ＣＧ５２６９、ＫＥＫ１、ｌｅｓｓｗｒｉｇｈｔ、ｓｐｅｎ、ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ、ＣＧ１１２７８／Ｓｙｘ１３、ＣＧ６７６７、ＣＧ５８９１、ＣＧ１０７３３、ｊｕｍｕ、ｐｅｂｂｌｅ、ｓｈａｎｋ、ｈｓｐ８３、ｔａｃｃ、又はＣＧ９９８８のアンタゴニストである。
【００７０】
本発明はさらに、神経変性疾患を治療する又は予防する方法であって、そのような治療又は予防を必要とする個体に、神経変性疾患の治療又は予防のために有効な量で、ｄＵｂｃ−Ｅ２Ｈ、ＤｎａＪ−１  ６４ＥＦ、ｐｕｍ、ｄＹＴ５２１−Ｂ、ｄＳｉｒ２、ＣＧ６７８５、Ｄｓｐ１、ＨｍｇＤ、ＣＧ１０９３４、ＣＧ３４４５、ＣＧ６７８３、Ｘｎｐ、ＣＧ１９１０、ＣＧ５２６１、ＣＧ４８３４、ＣＧ１８４４５、Ｌｉｌｌｉｐｕｔｉａｎ／ＣＧ８８１７、ＣＧ８０６２、Ａｃｔ５Ｃ／ＣＧ４０２７、ＣＧ８２４０、ＣＧ１４４３８、ＣＧ９６５０、ＣＧ７２３３、ｐｉｐｓｑｕｅａｋ、ｅｌｂｏｗ  Ｂ、ＣＧ１０８８２、ＣＧ１４７５７、ＣＧ８２０４、ＣＧ１２８４６、Ｐｋ６１Ｃ、Ｒａｃ２、ＣＧ１４９５９、ＣＧ５１６６、ＣＧ１４３６３、ｂｏｕｌｅ、ＣＧ１２０８４、ＣＧ７５１８、ｖｉｂｒａｔｏｒ／ＣＧ５２６９、ＣＧ９２４６、ＣＧ１１１７１、ｐＫａ−Ｃ１、ＫＥＫ１、ＣＧ６３０１、ｌｅｓｓｗｒｉｇｈｔ、ｓｐｅｎ、ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ、ＣＧ１１２７８／Ｓｙｘ１３、ＣＧ６７６７、ＣＧ５８９１、ＣＧ１０７３３、ｊｕｍｕ、ｐｅｂｂｌｅ、ｓｈａｎｋ、ｈｓｐ８３、ｔａｃｃ、ｇｕｆｔａｇｕ、ＣＧ９９８８、ａｒｉａｄｎｅ−２、及びＧｂｐから成る群より選択される遺伝子又はその遺伝子産物のモジュレーターを投与することを含む方法を提供する。好ましい実施形態では、モジュレーターは、ＤｎａＪ−１  ６４ＥＦ  Ｄｓｐ１、ＣＧ１０９３４、ＣＧ３４４５、Ｘｎｐ、ＣＧ１９１０、ＣＧ５２６１、ＣＧ８０６２、Ａｃｔ５Ｃ／ＣＧ４０２７、ＣＧ８２４０、ＣＧ９６５０、ＣＧ７２３３、ｐｉｐｓｑｕｅａｋ、ｅｌｂｏｗ  Ｂ、ＣＧ１４７５７、ＣＧ８２０４、ＣＧ１２８４６、Ｒａｃ２、ＣＧ５１６６、ＣＧ１４３６３、ｂｏｕｌｅ、ＣＧ１２０８４、ＣＧ９２４６、ＣＧ１１１７１、ｐＫａ−Ｃ１、ＣＧ６３０１、ｇｕｆｔａｇｕ、ａｒｉａｄｏｎｅ−２、またはＧｂｐのアゴニストである。もう一つの好ましい実施形態では、モジュレーターは、ｄＵｂｃ−Ｅ２Ｈ、ｐｕｍ、ｄＹＴ５２１−Ｂ、ｄＳｉｒ２、ＣＧ６７８５、ＨｍｇＤ、ＣＧ６７８３、ＣＧ４８３４、ＣＧ１８４４５、Ｌｉｌｌｉｐｕｔｉａｎ／ＣＧ８８１７、ＣＧ１０８８２、Ｐｋ６１Ｃ、ＣＧ１４９５９、ＣＧ７５１８、ｖｉｂｒａｔｏｒ／ＣＧ５２６９、ＫＥＫ１、ｌｅｓｓｗｒｉｇｈｔ、ｓｐｅｎ、ｍａｓｔｅｒｍｉｎｄ、ＣＧ１１２７８／Ｓｙｘ１３、ＣＧ６７６７、ＣＧ５８９１、ＣＧ１０７３３、ｊｕｍｕ、ｐｅｂｂｌｅ、ｓｈａｎｋ、ｈｓｐ８３、ｔａｃｃ、またはＣＧ９９８８のアンタゴニストである。
【００７１】
本発明の方法及び組成物は、ポリグルタミン病、アルツハイマー病、加齢性認知機能喪失、老年痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ウィルソン病、脳性麻痺、進行性核上性麻痺、グァム病、レヴィ小体痴呆、プリオン病、タウパシー、海綿状脳障害、クロイツフェルト−ヤコブ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調、運動失調、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、発作障害、てんかん、慢性発作障害、卒中、脳外傷、脊髄損傷、エイズ痴呆、アルコール中毒症、自閉症、網膜虚血、緑内障、自律神経機能障害、高血圧症、神経精神障害、精神分裂病、及び分裂感情障害の治療及び予防のため、ならびに上記疾患の治療法を同定するために有用である。本発明の特定局面では、本発明の方法及び組成物は、脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ）−１、ＳＣＡ−２、ＳＣＡ−６、ＳＣＡ−７、マチャド−ジョセフ病（ＭＪＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄延髄性筋萎縮（ＳＢＭＡ）、及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）を含むがこれらに限定されない、ポリグルタミン病の治療又は予防のため、ならびに上記疾患の治療法を同定するために有用である。特に好ましい実施形態では、本発明の方法及び組成物は、ＳＣＡ−１を治療する又は予防するため、そしてＳＣＡ−１の治療法を同定するために使用される。
【００７２】
（３．１．定義）
アタキシン−１遺伝子：正常アタキシン−１タンパク質、伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１タンパク質、又はそのフラグメント又は誘導体。アタキシン−１遺伝子は任意に、調節エレメント、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、又は前記の組合せに動作可能なように連結されている。
【００７３】
遺伝子の異所性発現：ここで使用するとき、対象とする遺伝子（アタキシン−１及びＳＣＡ−１変更因子を含むがこれらに限定されない）の異所性発現は、遺伝子の過剰発現（すなわち、正常レベルより高いレベルの発現）、遺伝子が正常に発現するものとは異なる時間的パターンでの遺伝子の発現、遺伝子が正常に発現するものとは異なる空間的パターンでの遺伝子の発現、又は前記の組合せを包含する。
【００７４】
ＳＣＡ−１表現型：正常アタキシン−１タンパク質の異所性発現又は伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１タンパク質の発現から生じる表現型。ショウジョウバエにおけるＳＣＡ−１表現型は、アタキシン−１異所性発現の空間的及び時間的パラメータに依存して、粗眼、核封入体、神経変性、運動機能不全、及び／又は短命を含む。
【００７５】
ＳＣＡ−１変更遺伝子：その異所性発現又は突然変異がＳＣＡ−１表現型の増強又は抑制をもたらすショウジョウバエ遺伝子、又はその異所性発現又は突然変異がＳＣＡ−１表現型の増強又は抑制をもたらすショウジョウバエ遺伝子の脊椎動物相同体。
【００７６】
ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子：その機能喪失がより重症のＳＣＡ−１病因をもたらす遺伝子。代替的には、ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子は、その異所性発現又は機能獲得がより軽度のＳＣＡ−１病因をもたらすものである。一部の実施形態では、ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子は、その機能喪失がより重症のＳＣＡ−１病因をもたらし、その異所性発現又は機能獲得がより軽度のＳＣＡ−１病因をもたらす遺伝子である。
【００７７】
ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子：その機能喪失がより軽度のＳＣＡ−１病因をもたらす遺伝子。代替的には、ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子は、その異所性発現又は機能獲得がより重症のＳＣＡ−１病因をもたらすものである。一部の実施形態では、ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子は、その機能喪失がより軽度のＳＣＡ−１病因をもたらし、その異所性発現又は機能獲得がより重症のＳＣＡ−１病因をもたらす遺伝子である。
【００７８】
（５．発明の詳細な説明）
ここで述べるように、発明者は、ショウジョウバエモデルを使用して脊髄小脳性運動失調−１（ＳＣＡ−１）を分析する戦略を開発した。ここで述べる方法を用いて、発明者は、ＳＣＡ−１の原因となる遺伝子によってコードされるタンパク質、アタキシン−１の機能の新しい局面を同定した。さらに、アタキシン−１活性を変化させる遺伝子をここで述べるように特性付けた。ＳＣＡ−１のショウジョウバエモデルは、ＳＣＡ−１に関わる細胞経路の機能と調節を探索するための非常に有用なツールであることが明らかになった。ショウジョウバエにおけるこれらの経路の体系的な遺伝学的分析は、ＳＣＡ−１の治療において有用な新しい薬剤標的、治療法（変更遺伝子によってコードされるタンパク質を含むがこれらに限定されない）、ならびにＳＣＡ−１の診断と予後の発見を導くことが期待できる。
【００７９】
本発明を下記の第６章で述べる実施例によって説明するが、かかる実施例は、中でも特に、いずれもショウジョウバエにおいてＳＣＡ−１疾病を生じさせる、正常アタキシン−１タンパク質（アタキシン−１  ３０Ｑ）及び伸長したポリグルタミン反復配列を持つ突然変異体アタキシン−１タンパク質（アタキシン−１  ８２Ｑ）の異所性発現の特性付けを開示する。アタキシン−１表現型の変更因子は、ＳＣＡ−１の新しい薬剤標的、治療法、診断及び予後を提供するであろう。
【００８０】
開示を明瞭にするためであって、限定としてではなく、本発明の詳細な説明を下記の小さな章に分ける。
【００８１】
５．１．アタキシン−１の異所性発現
本発明は、アタキシン−１遺伝子の異所性発現によってショウジョウバエにおいてＳＣＡ−１表現型を産生するための方法、及びアタキシン−１遺伝子を異所性発現する遺伝子組換えショウジョウバエを提供する。ショウジョウバエにおける正常又は変化したアタキシン−１遺伝子の、異所性発現又は過剰発現を含めた異所性発現は、遺伝子機能の分析のための方法である（Ｂｒａｎｄら、１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４４：６３５−６５４；Ｈａｙら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（１０）：５１９５−２００）。
【００８２】
１つの実施形態では、正常アタキシン−１タンパク質は６−１９個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む。かかる実施形態の特定様式では、正常アタキシン−１タンパク質は、６−８個のグルタミン残基、８−１０個のグルタミン残基、１０−１３個のグルタミン残基、１３−１６個のグルタミン残基、又は１６−１９個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む。他の実施形態では、導入遺伝子は、２０−４０個のグルタミン残基と１−４個のヒスチジン残基を持つポリグルタミン反復配列を含むアタキシン−１をコードする。かかる実施形態の特定様式では、正常アタキシン−１タンパク質は、２０−２５個のグルタミン残基、２５−３０個のグルタミン残基、３０−３５個のグルタミン残基、又は３５−４０個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む。かかる実施形態のさらに他の特定様式では、正常アタキシン−１タンパク質は、１個のヒスチジン残基、２個のヒスチジン残基、３個のヒスチジン残基、又は４個のヒスチジン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む。
【００８３】
もう１つの実施形態では、突然変異体アタキシン−１タンパク質は、３９−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む。かかる実施形態の特定様式では、突然変異体アタキシン−１タンパク質は、３９−４５個のグルタミン残基、４５−５５個のグルタミン残基、５５−６５個のグルタミン残基、６５−７５個のグルタミン残基、又は７５−８２個のグルタミン残基を持つポリグルタミン反復配列を含む。さらに他の実施形態では、突然変異体アタキシン−１タンパク質は、８２個以上のグルタミン残基、例えば８３−９０、９１−１０５、１０６−１２５、１２６−１５０又は１５１−２００個のグルタミン残基を持つ。
【００８４】
好ましくはその調節が十分に特性付けられている特異的プロモーターと転写エンハンサー、好ましくは空間的及び／又は時間的に調節される異種プロモーター／エンハンサーに動作可能なように連結されたアタキシン−１遺伝子（ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡからの）のコード領域の遺伝子融合を含む遺伝子組換えショウジョウバエを創造する。そのようなアタキシン−１遺伝子の異所性発現を駆動するために使用できるプロモーター／エンハンサーの例は、温度誘導性発現のために有用な、ｈｓｐ７０及びｈｓｐ８３遺伝子からの熱ショックプロモーター／エンハンサー；眼における発現のために有用な、ｓｅｖｅｎｌｅｓｓプロモーター／エンハンサー（Ｂｏｗｔｅｌｌら、１９８８、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２（６）：６２０−３４）、ｅｙｅｌｅｓｓプロモーター／エンハンサー（Ｂｏｗｔｅｌｌら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８（１５）：６８５３−７）、及びｇｌａｓｓ応答プロモーター／エンハンサー（Ｑｕｉｒｉｎｇら、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６５：７８５−９）のような組織特異的プロモーター／エンハンサー；翅における発現のために有用なｄｐｐ又はｖｅｓｔｉｇａｌ遺伝子から誘導されるプロモーター／エンハンサー（Ｓｔａｅｈｌｉｎｇ−Ｈａｍｐｔｏｎら、１９９４、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．５（６）：５８５−９３；Ｋｉｍら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：１３３−８）；中枢神経系における発現のために有用なｅｌａｖ（ＹａｏとＷｈｉｔｅ，１９９４、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  ６３（１）：４１−５１）、Ａｐｐｌ（Ｍａｒｔｉｎ−ＭｏｒｒｉｓとＷｈｉｔｅ、１９９０、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１０（１）：１８５−９５）、及びｎｉｒｖａｎａ（Ｓｕｎら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１０４３８−４３）遺伝子；そして多様な発生段階特異的及び組織特異的パターンで遺伝子の異所性発現を試験するために有用な、外来性ＤＮＡ調節エレメントと外来性転写活性化因子タンパク質を用いる二元制御系を含むが、これらに限定されない。二元外来性調節系の２つの例は、酵母からのＵＳＡ／ＧＡＬ４系（Ｈａｙら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（１０）：５１９５−２００；Ｅｌｌｉｓら、１９９３、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１９（３）：８５５−６５）と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から誘導される「Ｔｅｔ」系を含み、どちらも下記で述べる。外来性転写活性化因子と同族ＤＮＡ調節エレメントの他のセットに基づくさらなる二元系がＵＳＡ／ＧＡＬ４系及びＴｅｔ系と同様に使用できることは、当業者には容易に明らかである。
【００８５】
特定実施形態では、ＵＡＳ／ＧＡＬ４系を使用する。この系は、酵母ＧＡＬ４転写活性化因子タンパク質によるプロモーターの制御のためにＵＳＡ上流調節配列を用いる、ショウジョウバエにおける異所性発現の十分に確立された強力な方法である（ＢｒａｎｄとＰｅｒｒｉｍｏｎ，１９９３、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８（２）：４０１−１５）。このアプローチでは、異所性発現されるべき対象遺伝子（例えばアタキシン−１遺伝子）がＵＡＳによって制御される適切なプロモーターに動作可能なように融合されている、「標的」系統と称される遺伝子組換えショウジョウバエを作製する。ＧＡＬ４コード領域が、眼、触覚、翅、又は神経系のような特定組織におけるＧＡＬ４活性化因子タンパク質の発現を指令するプロモーター／エンハンサーに動作可能なように融合されている、「ドライバー」系統と称される他の遺伝子組換えショウジョウバエ系統を作製する。対象遺伝子は、対象遺伝子に連結されたプロモーターからの転写を「駆動する」転写活性化因子を欠くため、いわゆる標的系統では発現されない。しかし、ＵＡＳ−標的系統をＧＡＬ４ドライバー系統と交配すると、生じた子孫においてそのＧＡＬ４系統の特徴である特異的パターンで対象遺伝子の異所性発現が誘導される。このアプローチの技術的な単純さゆえに、対象遺伝子を持つ１つの遺伝子組換え標的系統を作製し、その標的系統を一連の既存のドライバー系統と交配することにより、様々な組織において対象遺伝子の指令された異所性発現の影響を調べることが可能となる。非常に多くの特異的ＧＡＬ４ドライバー系統がこれまでに作製されており、この系と共に使用することができる。
【００８６】
上記方法の特定実施形態では、ＲＵ４８６−依存性ＧＡＬ４タンパク質（ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈとしても知られる）のような条件的ＧＡＬ４タンパク質を使用することにより、アタキシン−１遺伝子の発現を時間的及び空間的レベルで制御することができる。ＵＡＳ／ＧＡＬ４系と同様に、ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ系は二元発現系である。このアプローチでは、ＵＡＳ／ＧＡＬ４系二元発現系におけるように、「標的」系統と称される遺伝子組換えショウジョウバエは、異所性発現されるべき遺伝子（例えばアタキシン−１）が、上流活性化配列（ＵＡＳ）によって制御される適切なプロモーターに動作可能なように融合されている導入遺伝子を担う。「標的」系統と称される第二のクラスの遺伝子組換えショウジョウバエは、選択したプロモーターの制御下でＲＵ４８６−依存性ＧＡＬ４を発現する導入遺伝子を担う。ＲＵ４８６−依存性ＧＡＬ４コード領域を、眼、触覚、翅、及び神経系を含むがこれらに限定されない特定組織におけるＲＵ４８６−依存性ＧＡＬ４の発現を指令するプロモーター／エンハンサー配列に動作可能なように融合することができる。代替的には、ＲＵ４８６−依存性ＧＡＬ４コード配列を導入遺伝子内の塩基性プロモーター、例えば熱ショックプロモーターに動作可能なように融合することができ、その後導入遺伝子を、ＲＵ４８６−依存性ＧＡＬ４の発現が導入遺伝子に近接するエンハンサーエレメントの制御下にあるショウジョウバエゲノム内に挿入する。ＲＵ４８６−依存性ＧＡＬ４はその活性化因子ＲＵ４８６（ミフェプリストン）の存在下でのみ転写的に活性であるので、ＲＵ４８６の投与によってＲＵ４８６−依存性ＧＡＬ４活性のタイミングを決定することができる。標的系統をドライバー系統と交配すると、子孫は、発現されるべき遺伝子をコードする導入遺伝子とＲＵ４８６−依存性ＧＡＬ４をコードする導入遺伝子を担う。しかし、ＲＵ４８６（ミフェプリストン）の不在下では対象遺伝子は発現されない。例えば給餌又は「幼虫浴」によって、ＲＵ４８６（ミフェプリストン）を投与した場合にのみ、対象遺伝子の発現が誘導される。発現の時間的及び空間的制御の組合せによって、対象遺伝子の総体的及び／又は連続的発現に結びつく可能性がある生存率の問題を回避することができる。さらに、本発明の一部の実施形態では、特定の発生プロセスだけに干渉するために、発生のある一定の時点で対象遺伝子の発現を開始する又は中止することが有益であると考えられる。
【００８７】
第二の実施形態では、「Ｔｅｔ系」と称される、大腸菌からのテトラサイクリン調節遺伝子発現を利用した、ショウジョウバエにおける指令異所性発現の関連方法を用いる。この場合、テトラサイクリン制御転写活性化因子（ｔＴＡ）のコード領域が、組織特異的及び／又は発生段階特異的にｔＴＡの発現を指令するプロモーター／エンハンサーに動作可能なように融合されている遺伝子組換えショウジョウバエドライバー系統を作製する。また、異所性発現されるべき対象遺伝子（例えばアタキシン−１遺伝子）のコード領域が、ｔＴＡ応答調節エレメントを有するプロモーターに動作可能なように融合されている遺伝子組換えショウジョウバエ標的系統を作製する。ここでもやはり、標的系統と何らかの対象ドライバー系統の交配からの子孫において対象遺伝子の異所性発現を誘導することができる；さらに、二元制御機序としてのＴｅｔ系の使用は、この交配から生じる子孫におけるさらに緊密なレベル制御を可能にする。ショウジョウバエの食餌に十分な量のテトラサイクリンを補足すると、生じる子孫での対象遺伝子の発現を完全に遮断する。単に食餌からテトラサイクリンを除去することによって対象遺伝子の発現を誘導することができる。また、食餌中のテトラサイクリンのレベルを変化させることによって対象遺伝子の発現レベルを調節することができる。それ故、異所性発現のための二元制御機序としてのＴｅｔ系の使用は、空間的制御に加えて、対象遺伝子の異所性発現の度合と時期を制御する手段を提供するという利点を持つ。その結果、対象遺伝子（例えばアタキシン−１遺伝子）が胚又は幼虫期のような発生の早期段階で異所性発現されたとき致死的又は有害な作用を及ぼす場合に、成虫期にのみ異所性発現を誘導するように発生の早期段階の間は食餌にテトラサイクリンを添加し、後期にはテトラサイクリンを除去することにより、Ｔｅｔ系を用いて成虫期における対象遺伝子の機能を評価することができる。
【００８８】
５．２．アタキシン−１を異所性発現するショウジョウバエの作製
遺伝子の修飾された発現を有する遺伝子組換えショウジョウバエの創造と分析のための方法は当業者には周知である（Ｂｒａｎｄら、１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４４：６３５−６５４；Ｈａｙら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４（１０）：５１９５−２００）。正常（例えばアタキシン−１  ３０Ｑ）又は突然変異体（例えばアタキシン−１  ８２Ｑを含むがこれに限定されない）アタキシン−１遺伝子を上述したような所望するプロモーターに動作可能なように融合し、プロモーター−アタキシン−１遺伝子融合を遺伝子組換えハエの作製のために適切なショウジョウバエ形質転換ベクターに挿入することができる。典型的には、そのような形質転換ベクターは十分に特性付けられた転移性要素、例えばＰ因子（ＲｕｂｉｎとＳｐｒａｄｌｉｎｇ，１９８２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１８：３４８−５３）、ｈｏｂｏ因子（Ｂｌａｃｋｍａｎら、１９８９、Ｅｍｂｏ  Ｊ．８（１）：２１１−７、ｍａｒｉｎｅｒ因子（Ｌｉｄｈｏｌｍら、１９９３、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３４（３）：８５９−６８）、ｈｅｒｍｅｓ因子（Ｏ’Ｂｒｏｃｈｔａら、１９９６、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４２（３）：９０７−１４）、Ｍｉｎｏｓ（Ｌｏｕｋｅｒｉｓら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２（２１）：９４８５−９）、又はＰｉｇｇｙＢａｃ因子（Ｈａｎｄｌｅｒら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１３）：７５２０−５）に基づき、これらにおいては、転移に必要なトランスポゾンの末端反復配列が、末端反復配列が対象導入遺伝子（この場合プロモーター−アタキシン−１遺伝子融合）ならびに遺伝子組換え動物を同定するために使用されるマーカー遺伝子に隣接するように形質転換ベクターに組み込まれ、配置されている。ほとんどの場合、ショウジョウバエｗｈｉｔｅ又はｒｏｓｙ遺伝子の誘導体のような、ショウジョウバエの眼の色に影響を及ぼすマーカー遺伝子が使用される；しかし、原則として、遺伝子組換え動物において信頼でき且つ容易に評価できる表現型変化を生じさせるいかなる遺伝子もマーカーとして使用でき、形質転換に使用される他のマーカー遺伝子の例は、剛毛色素沈着に影響を及ぼすマーカーとして使用されるｙｅｌｌｏｗ遺伝子、及び剛毛の形態に影響するマーカーとしてのｆｏｒｋｅｄ遺伝子；Ａｄｈ−系統の形質転換についての選択マーカーとして使用されるＡｄｈ＋遺伝子；Ｄｄｃ１Ｓ２突然変異体菌株を形質転換するために使用されるＤｄｃ＋遺伝子；大腸菌のｌａｃＺ遺伝子；大腸菌トランスポゾンＴｎ５からのｎｅｏｍｙｃｉｎＲ遺伝子；及び様々なプロモーター／エンハンサーエレメント、例えば眼、触覚、翅、脚特異的、又はポリユビキチンプロモーター／エンハンサーエレメントの制御下に置くことができる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ；ＨａｎｄｌｅｒおよびＨａｒｒｅｌｌ、１９９９、Ｉｎｓｅｃｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８：４４９−４５７）を含む。所望する導入遺伝子を導入するためのプラスミド構築物を、導入遺伝子をゲノムＤＮＡに固定するために必要な特異的トランスポザーゼを発現するヘルパープラスミドと共に、適切な遺伝的背景を持つショウジョウバエ胚に同時注入する。注入した胚から生じる動物（Ｇ０成虫）を、マーカー遺伝子表現型の発現に基づいて遺伝子組換えモザイク動物に関して選択するか、又は用手スクリーニングし、その後交配して、対象導入遺伝子（例えばアタキシン−１導入遺伝子）の１又はそれ以上のコピーを安定して担う完全な遺伝子組換え動物（Ｇ１及びその後の世代）を作製する。
【００８９】
５．３．異所性発現表現型の分析
正常（例えばアタキシン−１  Ｑ３０を含むがこれに限定されない）又は突然変異体（例えばアタキシン−１  Ｑ８２を含むがこれに限定されない）アタキシン−１遺伝子を担うショウジョウ蠅を、アタキシン−１の過剰発現を誘導することによって（例えばアタキシン−１遺伝子が熱ショックプロモーターの制御下にある場合には動物を熱ショックに供することによって）分離した後、ショウジョウバエにおけるアタキシン−１遺伝子の機能性を調べるために、発育、形態、生存率、又は行動の異常のような異所性発現表現型に関して動物を検査する。これらの動物からの組織を組織学的に分析して、細胞及び組織レベルでの形態学的異常を決定することができる。特に、プルキンエ細胞層の喪失又は異常の検出によって神経変性を調べることができる。代替的には、核封入体の存在を検査することができ、存在する場合には、下記の第６章で述べるような分子シャペロン、ユビキチン又はプロテアソームの蓄積に関して核封入体を分析することができる。
【００９０】
異所性発現表現型への発現レベルの影響を分析するために、１つの実施形態では、同じアタキシン−１導入遺伝子挿入に関してホモ接合とヘテロ接合であるショウジョウ蠅を作製する。もう１つの実施形態では、あるアタキシン−１遺伝子組換え系統ともう１つの系統との発現レベルは導入遺伝子挿入部位における局所的染色質作用によって変なるので、種々の系統を検定する。代替的には、アタキシン−１遺伝子をＵＡＳエレメントの制御下に置く場合には、この系における発現は温度と共に上昇するので、ＵＡＳ−アタキシン−１標的とＧａｌ４ドライバー系統を有する動物を種々の温度で培養する。例えば、ある系統での低レベルの発現のために、動物を１８℃で培養する；同じ系統での中間レベルの発現のために、動物を２１−２２℃で培養する；そして同じ系統での高レベルの発現のために、動物を２５−２９℃で培養する。他の実施形態では、アタキシン−１遺伝子の発現をＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ系の制御下に置く。ＵＡＳ−アタキシン−１標的導入遺伝子とＲＵ４８６−ＧＡＬ４を担うショウジョウバエを、アタキシン−１の発現を誘導する又は抑制するためにＲＵ４８６（ミフェプリストン）の存在下又は不在下で飼育する（上記第５．１章参照）。もう１つの実施形態では、アタキシン−１遺伝子をｈｓｐ７０のような熱ショック誘導プロモーターの制御下に置く。アタキシン−１遺伝子の過剰発現は、遺伝子組換えハエを３０℃でインキュベートすることによって誘導できる。さらにもう１つの実施形態では、アタキシン−１導入遺伝子をＴｅｔ系の制御下で発現するとき、様々な量のテトラサイクリンを動物の食餌に加える。
【００９１】
さらに、アタキシン−１過剰発現表現型を、それが細胞自律性であるか又は細胞非自律性であるかを決定するために検査することができる。例えば、アタキシン−１遺伝子の異所性発現によって産生される表現型が遺伝子を発現する細胞に限定されるかどうか、あるいはアタキシン−１遺伝子の異所性発現が近接細胞に非自律的作用を及ぼすかどうかを決定するためにクローン分析を使用することができる。ヘテロ接合ハエにおける染色体の有糸分裂組換えの方法を使用して、Ｘ線又は好ましくはＦＬＰ／ＦＲＴを介した組換え（ＸｕとＨａｒｒｉｓｏｎ，１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４４：６５５−６８１；Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，１９７９、Ｆｌｙ  Ｐｕｓｈｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓより、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ニューヨーク，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：ｐ．１０３−１２４）の使用を含む、当業者に周知の遺伝的にホモ接合性の細胞の有糸分裂クローンを作製することができる。これらの有糸分裂組換え手法は、対象とする遺伝子又は導入遺伝子の２コピーを含む又はコピーを全く含まない、細胞のパッチ、有糸分裂クローンを生じる。対象とする遺伝子又は導入遺伝子のコピーを全く含まないクローンにおける細胞内での過剰発現／異所性発現表現型の産生は、作用が細胞自律性ではないことを示す。
【００９２】
５．４．アタキシン−１の経路と表現型の同定
本発明は、正常又は突然変異体アタキシン−１と相互作用するショウジョウバエ遺伝子の同定と特性付けにおいて使用しうる動物モデルを提供する。正常又は突然変異体アタキシン−１と相互作用するショウジョウバエ遺伝子の同定と特性付けは、ＳＣＡ−１をもたらす基礎となる細胞機序を明らかにし、ＳＣＡ−１及び他のポリグルタミン関連疾患についての新しい診断と治療法の根拠を提供することができる。
【００９３】
遺伝的／生化学的経路の成分を定義するための典型的な遺伝的変更因子のスクリーニングに関わる手順は当業者には周知であり、文献において記述されている（例えばＷｏｌｆｎｅｒとＧｏｌｄｂｅｒｇ，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４４：３３−８０；Ｋａｒｉｍら、１９９６、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １４３：３１５−３２９）。
【００９４】
上記第５．１章又は５．２章で述べたような、空間的又は時間的に調節された又は調節可能な制御エレメントの制御下でアタキシン−１導入遺伝子を担う遺伝子組換えショウジョウバエを提供する。１つの実施形態では、アタキシン−１遺伝子組換えショウジョウバエを、その哺乳類相同体がＳＣＡ−１の病因において役割を果たすことが疑われる遺伝子内に突然変異を有する動物に交配する。分子シャペロン及びプロテアソーム成分はＳＣＡ−１の病因において役割を果たすことが疑われるので、ＳＣＡ−１の病因に関与する疑いのあるタンパク質の一部の例は、ｈｓｐ７０分子シャペロン、ユビキチン及びプロテアソームを含む。アタキシン−１  Ｑ８２導入遺伝子を持つ動物とＳＣＡ−１の病因において役割を果たすことが疑われる遺伝子内に突然変異を有する動物の間で交配を行うことができる。適切な突然変異が使用可能でない場合には、下記第５．４．３章で述べるようにして機能喪失表現型を作製することができる。代替的には、アタキシン−１導入遺伝子と、ＳＣＡ−１の病因において役割を果たすことが疑われる遺伝子の異所性発現のための導入遺伝子を有する動物間で交配を行うことができる。そのような交配の子孫を分析して、ＳＣＡ−１の病因が増強又は抑制されたかどうかを決定することができる。第６章に示すように、アタキシン−１  Ｑ８２とＤＦ（３Ｒ）ｋａｒＤ１（ｈｓｐ７０遺伝子のクラスターを取り除く小さな欠失）、ｈｓｃ７０−４（ｈｓｐ７０同族４タンパク質のＡＴＰ結合ドメイン内の点突然変異）及びｐｒｏｓ２６（２０Ｓコアプロテアソームの成分である多機能性エンドペプチダーゼをコードする遺伝子内の点突然変異）の間での交配は、これらの突然変異バックグラウンドでのアタキシン−１  ８２Ｑの異所性発現は、さもなければ正常な遺伝的背景でのアタキシン−１  ８２Ｑの異所性発現によって生じるよりも重症の表現型をもたらすことを明らかにする。また、アタキシン−１と相互作用するタンパク質をコードすることが疑われる他の遺伝子についても同様の交配を実施することができる。
【００９５】
５．４．１．ＳＣＡ−１表現型を修飾する突然変異についてのスクリーニング
本発明の一部の実施形態では、ショウジョウバエにおけるアタキシン−１の異所性発現によって生じるＳＣＡ−１表現型の変更因子を、アタキシン−１導入遺伝子を様々な突然変異と組み合わせるスクリーニングにおいて同定する。
【００９６】
１つの実施形態では、アタキシン−１遺伝子組換えショウジョウバエを突然変異誘発した動物（化学的、放射線又はトランスポゾン突然変異誘発を用いて産生した）に交配する。有効な化学的突然変異原は、ＥＭＳ、ＭＭＳ、ＥＮＵ、トリエチルアミン、ジエポキシアルカン、ＩＣＲ−１７０、及びホルムアルデヒドを含む；有効な放射線突然変異原は、Ｘ線、γ線、及び紫外線を含む。他の実施形態では、アタキシン−１遺伝子組換えショウジョウバエを、下記第６章で述べるように、ランダムに挿入したＰ又はＥＰ因子を持つ動物に交配する。交配の子孫を分析して、ＳＣＡ−１疾患の進行が変化したかどうかを判定する。
【００９７】
アタキシン−１を化学的に突然変異誘発する又は突然変異誘発した動物に交配するパイロットスケールの遺伝的変更因子スクリーニングでは、１０，０００又はそれ以下の突然変異誘発した子孫を検査する；中等度の規模のスクリーニングでは、１０，０００−５０，０００の突然変異誘発した子孫を検査する；そして大規模スクリーニングでは、５０，０００以上の突然変異誘発した子孫を検査する。元の表現型の増強又は抑制のいずれかを示す子孫を直ちに平均体染色体を含む成虫に交配し、安定な遺伝的系統の創始者として使用する。さらに、創始者成虫の子孫を元のスクリーニング条件下で再試験して、表現型の安定性と再現性を確保する。適宜に付加的な二次スクリーニングを用いて、さらなる分析のために各々の新しい変更因子突然変異体系統の適否を確認してもよい。例えば、新たに同定した変更因子突然変異を、上述した方法を用いて、ＳＣＡ−１の病因に含まれる又は関わることが知られている他の対象遺伝子（下記第６章で述べる変更因子スクリーニングにおいて同定されるものを含めて）との相互作用に関して直接試験することができる。また、新しい変更因子突然変異を、一次スクリーニングアッセイで使用したもの以外の組織におけるアタキシン−１との相互作用に関して試験することもできる。例えば、一次スクリーニングアッセイが粗眼表現型を使用する場合、中枢神経系における神経変性を検査することによって表現型を確認することができる。変更因子を、眼のｓｅｖｅｎｌｅｓｓシグナル伝達経路内の遺伝子のような、ＳＣＡ−１疾病に無関係である又は関連性が遠いと思われる他の経路内の遺伝子との相互作用に関して試験することができる。アタキシン−１と特異的な遺伝的相互作用を示すが、無関係な経路内の遺伝子とは相互作用を示さない新しい変更因子突然変異が特に興味深い。さらに、元のアタキシン−１導入遺伝子の不在下で対象とする新しい変更因子突然変異を担う系統を作製して、新しい変更因子突然変異がアタキシン−１の異所性発現とは無関係な固有の表現型を示すかどうかを調べることができ、これは新たに同定された変更遺伝子の正常機能に関してさらなる糸口を提供するであろう。
【００９８】
各々の新たに同定された変更因子突然変異を、典型的には個々の遺伝子に対応する相補グループに分けるために、同じスクリーニングで同定された他の変更因子突然変異と交配することができる（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，１９９７、Ｆｌｙ  Ｐｕｓｈｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓより、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ニューヨーク，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：ｐ．２３−４６）。２つの変更因子突然変異は、両方の突然変異をトランスで担う動物が、各々の突然変異について個々にホモ接合性である動物と基本的に同じ表現型を示す場合、同じ相補グループに属すると称される。
【００９９】
５．４．２．その異所性発現がＳＣＡ−１を修飾する遺伝子についてのスクリーニング
本発明の他の実施形態では、同じ細胞内でアタキシン−１ともう１つ別の遺伝子を異所性発現するショウジョウバエを創造することによってＳＣＡ−１表現型の変更因子を同定することができる。これは、上述したモジュラー異所性発現系を使用することによって、例えば上記のスクリーニングを実施するためのＧＡＬ４／ＵＡＳ系の成分を利用することによって、最も良好に実現される。この場合、ＥＰ因子と称される修飾されたＰ因子を、ＧＡＬ４応答性ＵＡＳ因子とプロモーター、又はｔＴＡ−応答性ｔｅｔ因子とプロモーターを含むように遺伝的に構築し、この構築したトランスポゾンを使用して、挿入突然変異誘発（上述したＰ突然変異誘発の方法と同様の）により遺伝子をランダムに標識する。このようにして、各々が特異的ＵＡＳ−又はｔｅｔ標識遺伝子を含む、ＥＰ系統と称される数千の遺伝子組換えショウジョウバエ系統を作製することができる。このアプローチは、遺伝子の５’末端に挿入するために広く認識されているＰ因子の挿入選択性を利用する。その結果、ＥＰ因子の挿入によって標識された遺伝子の多くがＧＡＬ４又はｔＴＡ調節プロモーターに動作可能なように融合され、それをＧＡＬ４ドライバー遺伝子に交配することによってランダムに標識された遺伝子の高い発現又は異所性発現を誘導することができる（上記第５．１章で述べたように）。
【０１００】
そこで、アタキシン−１の異所性発現によって誘導されるＳＣＡ−１表現型の変更因子に関して機能獲得遺伝子スクリーニングを下記のように実施することができる。二元発現系においてドライバーの標的として機能する調節エレメントの制御下にあるアタキシン−１導入遺伝子を持つショウジョウバエを、同じか又は異なる二元発現系ドライバーの標的として機能する調節エレメントのランダムなゲノム挿入を有する動物に交配する。起こりうる多くの遺伝子交換が、スクリーニングのために必要なすべてのドライバーと標的導入遺伝子を持つ子孫を産生すると考えられる。
【０１０１】
特定実施形態では、数千のショウジョウバエＥＰ系統から成る大きな一群を、異所性発現されたアタキシン−１遺伝子、そしてさらに適切なＧＡＬ４ドライバー導入遺伝子を含む遺伝的バックグラウンドに交配することができる。この交配の子孫をアタキシン−１導入遺伝子の異所性発現によって誘導されるＳＣＡ−１表現型の増強又は抑制に関して検査することができる。ＵＡＳ因子がランダムに挿入されたＥＰ系統内の遺伝子がＳＣＡ−１の病因に関わっている場合には、Ｇａｌ４が存在するＵＡＳ因子の制御下でのその異所性発現はＳＣＡ−１表現型の増強又は抑制をもたらすことになる。ＵＡＳ導入遺伝子は、それが挿入されているＳＣＡ−１変更遺伝子をマッピングし、クローニングするための基礎として使用することができる。アタキシン−１導入遺伝子とのこの遺伝的相互作用の再現性と特異性を確認するために、増強又は抑制された表現型を示す子孫をさらに交配することができる。アタキシン−１と特異的遺伝子相互作用を示すＥＰ挿入は、それ故、アタキシン−１と遺伝的に相互作用する新しい遺伝子を物理的に標識した。ＥＰ因子挿入の位置に隣接するゲノムＤＮＡを分離することができるＰＣＲ又はハイブリダイゼーションスクリーニング法を用いて新しい変更遺伝子を同定し、配列決定することができる。
【０１０２】
他の実施形態では、アタキシン−１導入遺伝子はＵＡＳ因子の制御下にあり、ＥＰ系統の挿入エレメントはｔＴＡ調節エレメントを含む。ＵＡＳ−アタキシン−１導入遺伝子と適切なドライバー系統（例えばＧａｌ４がｇｌａｓｓ遺伝子からの調節エレメントの制御下で発現されるｇｍｒ−Ｇａｌ４）を有する動物を、ｔＴＡ調節エレメントのＥＰ系統を持つ動物に交配する。子孫をテトラサイクリン含有培地で培養して、アタキシン−１とｔＴＡ調節エレメントがランダムに挿入された遺伝子を同時発現させる。ｔＴＡ調節エレメントが挿入された遺伝子がＳＣＡ−１病因に関与している場合には、テトラサイクリンが存在する制御下でのその異所性発現はＳＣＡ−１表現型の増強又は抑制をもたらすであろう。ｔＴＡ導入遺伝子は、それが挿入されているＳＣＡ−１変更遺伝子をマッピングし、クローニングするための基礎として使用することができる。本実施形態では、ドライバーと、これに関しては標的遺伝子であるアタキシン−１導入遺伝子を含めて、対象標的遺伝子を担う系統を、かかる遺伝子を担う動物を交雑育種し、その後、導入遺伝子を含む個々の構築物が内包するマーカーに基づいて所望する導入遺伝子を担う組換え子孫を選択することによって産生することができる。アタキシン−１導入遺伝子とのこの遺伝的相互作用の再現性と特異性を確認するために、増強又は抑制された表現型を示す子孫をさらに交配することができる。アタキシン−１と特異的遺伝子相互作用を示すＥＰ／ｔＴＡ挿入は、それ故、アタキシン−１と遺伝的に相互作用する新しい遺伝子を物理的に標識した。ＥＰ因子挿入の位置に隣接するゲノムＤＮＡを分離することができるＰＣＲ又はハイブリダイゼーションスクリーニング法を用いて新しい変更遺伝子を同定し、配列決定することができる。
【０１０３】
５．４．３．ＳＣＡ−１変更遺伝子の機能喪失表現型の作製
その過剰発現がＳＣＡ−１病因の変化をもたらす遺伝子がひとたび同定されれば、これらの遺伝子の機能喪失表現型とＳＣＡ−１表現型の相互作用を評価することができる。機能喪失表現型はショウジョウバエストックセンターから入手するか又は従来の遺伝的方法によって創造しうる（Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ，１９９７、Ｆｌｙ  Ｐｕｓｈｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓより、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ニューヨーク，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  中を参照）；代替的には、迂回的で労力のかかる突然変異誘発スクリーニングではあるが、遺伝子発現の分子断裂によってそのような遺伝的相互作用の存在に関する情報を得ることができる。ここで述べる分子破壊法はまた、アタキシン−１と、ＳＣＡ−１病因において役割を果たすことが疑われるが遺伝子突然変異が使用できない遺伝子との相互作用を調べるために使用することができる。そのような実験では、ＳＣＡ−１病因の抑制又は増強がアタキシン−１の異所性発現に特異的である度合を調べるために、正常動物とアタキシン−１異所性発現動物において平行して分子断裂法を実施する。
【０１０４】
１つの実施形態では、アンチセンスＲＮＡ法を実施することができる（ＳｃｈｕｂｉｇｅｒとＥｄｇａｒ，１９９４、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４４：６９７−７１３）。アンチセンスＲＮＡ法の１つの形態は、対象とする遺伝子（この場合にはＳＣＡ−１変更遺伝子又は疑わしいＳＣＡ−１変更遺伝子）に、部分的に相同なアンチセンスＲＮＡを有する胚を注入することを含む。もう１つの形態のアンチセンスＲＮＡ法は、一般に動物全体にわたって又は特定組織において、大量のアンチセンスＲＮＡの発現を駆動することができる強力なプロモーターに、対象とする遺伝子の一部をアンチセンス方向に動作可能なように連結することにより、対象遺伝子と部分的に相同なアンチセンスＲＮＡを発現することを含む。このアンチセンスＲＮＡ戦略において使用できる強力なプロモーターの例は、熱ショック遺伝子プロモーター又は上述したようなＧＡＬ４及びｔＴＡなどの強力な外来転写因子によって制御されるプロモーターを含む。アンチセンスＲＮＡが産生する機能喪失表現型は、これまでにｃａｃｔｕｓ、ｐｅｃａｎｅｘ、及びＫｒｕｐｐｌｅを含めたいくつかのショウジョウバエ遺伝子に関して報告されている（ＬａＢｏｎｎｅら、１９８９、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３６（１）：１−１６；ＳｃｈｕｈとＪａｃｋｌｅ，１９８９，Ｇｅｎｏｍｅ  ３１（１）：４２２−５；Ｇｅｉｓｌｅｒら、１９９２、Ｃｅｌｌ  ７１（４）：６１３−２１）。
【０１０５】
第二の実施形態では、共抑制法によって機能喪失表現型を作製する（Ｂｉｎｇｈａｍ，１９９７，Ｃｅｌｌ  ９０（３）：３８５−７；Ｓｍｙｔｈ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．７（１２）：７９３−５；ＱｕｅとＪｏｒｇｅｎｓｅｎ，１９９８、Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２（１）：１００−９）。共抑制は、対象とする遺伝子の部分セグメントに対応するセンス鎖ＲＮＡの発現又は注入によって生じる遺伝子発現低下の現象である。共抑制作用は機能喪失表現型を作製するために植物において広汎に用いられており、ｗｈｉｔｅ−Ａｄｈ導入遺伝子からＡｄｈ遺伝子の発現低下が誘導されたというショウジョウバエでの共抑制の報告がある（Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａら、１９９７、Ｃｅｌｌ  ９０（３）：４７９−９０）。
【０１０６】
第三の実施形態では、二本鎖ＲＮＡ干渉によって機能喪失表現型を生成する。この方法は遺伝子のコード領域から誘導した二本鎖ＲＮＡの干渉特性に基づく。ｄｓＲＮＡｉと称されるこの方法は、線虫Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓの遺伝学的試験において（Ｆｉｒｅら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１参照）、またより最近では、胚形成期（例えばＫｅｎｎｅｒｄｅｌｌら、１９９８、Ｃｅｌｌ  ９５：１０１７−２６参照）及びより後の発生期（ＬａｍとＴｈｕｍｍｅｌ、２０００、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ  １０（１６）：９５７−６３）のショウジョウバエでの遺伝学的試験において大きな有用性を持つことが証明されている。この方法の好ましい実施形態では、対象遺伝子の実質的部分から誘導した相補的センス及びアンチセンスＲＮＡをインビトロで合成する。対象遺伝子（すなわちＳＣＡ−１変更遺伝子）のｃＤＮＡクローンを含むファージミドＤＮＡ鋳型を、Ｔ３とＴ７ファージＲＮＡポリメラーゼについての反対のプロモーターの間に挿入する。代替的には、ＰＣＲ反応に使用するプライマーをファージＴ３とＴ７プロモーターの付加によって修飾する、ＳＣＡ−１変更遺伝子のコード領域から増幅したＰＣＲ産物を使用することができる。生じるセンス及びアンチセンスＲＮＡを注入緩衝液中でアニーリングし、二本鎖ＲＮＡを動物に注入する又は導入する。その後注入した動物の子孫を対象表現型に関して検査する。
【０１０７】
５．５．ショウジョウバエＳＣＡ−１変更遺伝子のクローニング
ひとたびＳＣＡ−１の変更遺伝子が同定されれば、分子分析及び脊椎動物相同体の同定のためにそれをクローン化することができる。
【０１０８】
非Ｐ因子に基づく突然変異に関しては、突然変異を含む領域を正確な遺伝子座にマッピングする。平均体系統（例えばｗＲ１３又はｙｗＲ１３）を用いて最初に突然変異体を特定染色体にマッピングする。ひとたび突然変異を担う染色体が同定されれば、突然変異体系統をその染色体の欠損コレクションに交配して、遺伝子を染色体内の別個の遺伝的領域に位置づける。次にかかる系統をその領域内でＰ因子系統に交配して、ＳＣＡ−１変更遺伝子における突然変異を補完することができないＰ因子突然変異体を同定する。ひとたびそのようなＰ因子系統が同定されれば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法を用いてＳＣＡ−１変更遺伝子をクローン化することができる。
【０１０９】
１つの実施形態では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて所望する配列を増幅する。ＳＣＡ−１変更因子のショウジョウバエＰ因子のゲノムＤＮＡ、又はＳＣＡ−１変更因子ＥＰ系統である場合にはＥＰ因子を、標準的なＤＮＡ抽出手法によって回収することができる。Ｐ又はＥＰ因子に隣接する領域は、ゲノムＤＮＡを適切な制限酵素で消化し、その後結合して、制限フラグメントを環状化することによって回収できる。ＤＨ５αのような適当な細胞系統を、標準手法を用いたエレクトロポレーションによって形質転換することができる。生じるコロニーは、選択マーカー、細菌の複製起点、１個のＰ因子逆方向反復配列、及び可変量の隣接ゲノムＤＮＡを含む環状制限フラグメントを獲得しているはずである。その後Ｐ因子逆方向反復配列に対して設計したプライマーを用いた標準プロトコールにより、プラスミドを配列決定することができる。
【０１１０】
もう１つの実施形態では、逆ＰＣＲを使用することによってＰ又はＥＰ因子に隣接する領域を決定することができる。標準的なＤＮＡ抽出手法を用いて増強又は抑制されたＳＣＡ−１ハエのゲノムＤＮＡを回収することができる。Ｐ又はＥＰ因子に隣接する領域は、ゲノムＤＮＡを適切な制限酵素で消化し、その後結合して、制限フラグメントを環状化することによって回収できる。次にＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＣｅｔｕｓサーマルサイクラーとＴａｑポリメラーゼ（例えばＧｅｎｅ  Ａｍｐ（商標））を使用する標準手法を用いてＰＣＲを実施することができる。その後標準プロトコールによってＰＣＲ産物を配列決定することができる。
【０１１１】
相補されないＰ因子又はＥＰ因子が認められない場合には、減数分裂マッピングのような、しかしこれに限定されない、当業者に既知のいくつかの他の方法を使用して突然変異の位置を同定することができる。ひとたび突然変異がマッピングされれば、突然変異を含む染色体領域のＤＮＡを、例えば細菌人工染色体（例えばＨｏｓｋｉｎｓら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：２２７１−７４参照）、Ｐ１クローン（例えばＫｉｍｍｅｒｌｙら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．６：４１４参照）の形態で、又はもう１つ別の組換え形態で（例えば、ショウジョウバエゲノムの配列決定、特にゲノムＤＮＡを含むプラスミドからの決定について述べている、Ａｄａｍｓら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：２１８５−９５参照）入手することができる。代替的には、対象領域をＰＣＲによって増幅することができる。対象とするゲノム領域に対応するＤＮＡを、ヘテロ二本鎖分析又は一本鎖立体配座多型（「ＳＳＣＰ」）によって分析して、ゲノム内の突然変異の正確なヌクレオチド位置を同定することができる。この目的を達成するために使用できる、突然変異を検出する高流量法は、ヘテロ二本鎖における一塩基対ミスマッチを検出する平行キャピラリー電気泳動（Ｌａｒｓｅｎら、２０００、Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  ３：３９３−４０９）である。
【０１１２】
上述した方法は、ショウジョウバエＳＣＡ−１変更遺伝子のクローンを入手しうる方法についての下記の一般的説明を限定することを意図しない。
【０１１３】
５．６．ショウジョウバエ以外のＳＣＡ−１変更遺伝子のクローニング
本発明はさらに、ＳＣＡ−１の診断薬及び治療薬として使用するため、ならびにＳＣＡ−１を阻害し、神経変性疾患を治療又は予防する上で有用と考えられる化合物をスクリーニングするための、ショウジョウバエにおいて同定されたＳＣＡ−１変更遺伝子の相同体、好ましくは脊椎動物相同体、より好ましくは哺乳類相同体、最も好ましくはヒト相同体を提供する。
【０１１４】
ＳＣＡ−１変更遺伝子の相同体は、ＳＣＡ−１変更因子分子又はそのフラグメントに実質的に相同である領域（例えば、種々の実施形態において、挿入又は欠失を含まない同じ大きさのアミノ酸配列に対して、又は当該技術で既知のコンピュータ相同性プログラムによって整列を行った場合の整列配列と比較したとき、少なくとも６０％又は７０％又は８０％又は９０％又は９５％の同一性）又はそのコードする核酸が高厳密性、中厳密性、又は低厳密性条件下でＳＣＡ−１変更因子タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズすることができる領域を含む分子を包含するが、それらに限定されない。
【０１１５】
ヒトゲノム計画が完了したこと、そしてヒト以外の種から数多くの遺伝子が同定されたことを考慮すると、配列比較に関するコンピュータアルゴリズムを使用した入手可能なデータベースの検索は、ＳＣＡ−１変更遺伝子の脊椎動物相同体の同定を導くであろうと考えられる。
【０１１６】
２つのアミノ酸配列又は２個の核酸のパーセント同一性、例えばショウジョウバエＳＣＡ−１変更遺伝子と他の生物からの配列間のパーセント同一性を決定するためには、至適比較のために配列を整列する（例えば第二アミノ酸又は核酸配列との至適整列のために第一アミノ酸又は核酸配列にギャップを導入することができる）。次に対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第一配列内の位置が第二配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められているとき、分子はその位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数（例えば重複位置）×１００）。１つの実施形態では、２つの配列は同じ長さである。
【０１１７】
２つの配列間のパーセント同一性の決定は数学的アルゴリズムを用いて実施できる。２つの配列の比較のために使用される数学的アルゴリズムの好ましい非制限的な例は、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７において修正された、ＫａｒｌｉｎとＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込む。ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２でＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施して、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３でＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためにギャップ整列を得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２に述べられているようにＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。代替的には、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を実施することができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを使用するときには、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えばＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）が使用できる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．参照。配列の比較のために使用される数学的アルゴリズムのもう１つの好ましい非制限的な例は、ＭｙｅｒｓとＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ（１９８９）のアルゴリズムである。かかるアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウエアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込む。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを使用するときには、ＰＡＭ１２０重量残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティー１２、ギャップペナルティー４を使用することができる。配列分析のためのさらなるアルゴリズムは当該技術において既知であり、ＴｏｒｅｌｌｉｓとＲｏｂｏｔｔｉ，１９９４，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，１０：３−５に述べられているようなＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ；及びＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４−８に述べられているＦＡＳＴＡを含む。ＦＡＳＴＡ内では、ｋｔｕｐが検索の感受性と速度を設定する制御オプションである。ｋｔｕｐ＝２である場合、整列した残基の対を調べることによって比較する２つの配列内の類似領域が発見される；ｋｔｕｐ＝１である場合には、単一整列アミノ酸を調べる。タンパク質配列についてはｋｔｕｐを２又は１に設定することができ、あるいはＤＮＡ配列については１−６に設定することができる。ｋｔｕｐが規定されない場合のデフォルトは、タンパク質については２、ＤＮＡに��いては６である。ＦＡＳＴＡパラメータのさらなる説明に関しては、その内容が参照してここに組み込まれる、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｗｅｂ．ｐａｓｔｅｕｒ．ｆｒ／ｄｏｃｓ／ｍａｎ／ｍａｎ／ｆａｓｔａ．１．ｈｔｍｌ＃ｓｅｃｔ２参照。
【０１１８】
代替的に、Ｈｉｇｇｉｎｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２によって述べられているように、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗアルゴリズムを用いてタンパク質配列の整列を行うことができる。
【０１１９】
２つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容して又は許容せずに、上述したのと同様の手法を用いて決定することができる。パーセント同一性を算定する際には、正確な対合だけを計数する。
【０１２０】
ひとたびコンピュータデータベースにおいてＳＣＡ−１変更遺伝子の相同体が同定されれば、適当な出所から、例えばｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーからＰＣＲ増幅によって相同体をクローン化することができる。
【０１２１】
他の実施形態では、ＳＣＡ−１変更遺伝子の相同体を発現クローニング（当該技術で周知の手法）によってクローン化する。当該技術で既知の何らかの方法によって発現ライブラリーを構築する。例えば、ｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを作製して、それを導入する宿主細胞によって発現されうるように発現ベクター（例えばバクテリオファージ誘導体）に結合する。次に様々なスクリーニングアッセイを使用して、発現されたＳＣＡ−１変更因子産物を選択することができる。１つの実施形態では、ＳＣＡ−１変更遺伝子の産物に対する抗体が選択のために使用できる。
【０１２２】
もう１つの実施形態では、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲを使用して、対象とする種（及び組織）のゲノム又はｃＤＮＡライブラリーから所望する配列を増幅する。好ましくは最小縮重のアミノ酸配列に基づいて、ショウジョウバエのＳＣＡ−１変更因子配列又はＳＣＡ−１変更因子相同体のコンセンサス配列（ショウジョウバエ変更因子と他の種からの相同体の比較から導かれる）であるオリゴヌクレオチドプライマーがＰＣＲにおけるプライマーとして使用できる。
【０１２３】
他の実施形態では、所望する脊椎動物種のゲノム又はｃＤＮＡライブラリーをショウジョウバエＳＣＡ−１変更因子でスクリーニングすることによってＳＣＡ−１変更因子の脊椎動物相同体を同定することができる。ＳＣＡ−１変更因子核酸の相同体を、低、より好ましくは中、最も好ましくは高厳密性ハイブリダイゼーション条件下でショウジョウバエＳＣＡ−１変更因子核酸にハイブリダイズする。
【０１２４】
限定ではなく例として、９０以上のヌクレオチドのハイブリダイゼーションの領域についてそのような低厳密性の条件を用いる手順は次の通りである（ＳｈｉｌｏとＷｅｉｎｂｅｒｇ，１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：６７８９−６７９２も参照のこと）。ＤＮＡを含むフィルターを、３５％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ＰＶＰ、０．１％Ｆｉｃｏｌｌ、１％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液中４０℃で６時間、前処理する。次の修正を加えた同じ溶液中でハイブリダイゼーションを実施する：０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストラン、及び５−２０×１０６ｃｐｍ３２Ｐ−標識プローブを使用する。フィルターをハイブリダイゼーション混合物中４０℃で１８−２０時間インキュベートし、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、及び０．１％ＳＤＳを含む溶液中５５℃で１時間半洗浄する。洗浄液を新鮮溶液と交換し、６０℃でさらに１時間半インキュベートする。フィルターをドライブロットし、オートラジオグラフィーに曝露する。必要に応じて、フィルターを６５−６８℃で３回目の洗浄に供し、フィルムに再曝露する。使用しうる低厳密性の他の条件は当該技術において周知である。
【０１２５】
同様に、限定ではなく例として、９０以上のヌクレオチドのハイブリダイゼーションの領域についてそのような高厳密性の条件を用いる手順は次の通りである。６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡから成る緩衝液中６５℃で８時間から一晩、ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを実施する。１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ及び５−２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ−標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中６５℃で４８時間フィルターをハイブリダイズする。２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌ、及び０．０１％ＢＳＡを含む溶液中３７℃で１時間、フィルターの洗浄を行う。続いて０．１×ＳＳＣ中５０℃で４５分間洗浄した後、オートラジオグラフィーに供する。
【０１２６】
使用しうる高厳密性の他の条件は、核酸の性質（例えばプローブの長さ、プローブのＧＣ含量、等々）、当該種のショウジョウバエとの関連性、既知の相同体の当該技術における入手可能性及びそれらの配列の相互関連性に依存し、当業者によって決定されうる。
【０１２７】
上述した方法は、ショウジョウバエ以外のＳＣＡ−１変更遺伝子のクローンを入手しうる方法についての下記の一般的説明を限定することを意図しない。
【０１２８】
いかなる脊椎動物細胞も、潜在的にＳＣＡ−１変更遺伝子の分子クローニングのための核酸原料として使用できる。ＳＣＡ−１変更因子タンパク質をコードする核酸配列は、哺乳類及び鳥類の源を含めて、脊椎動物から単離しうる。好ましい哺乳類源は、ヒト及び付加的な霊長類源、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、イヌ、等々を含むが、これらに限定されない。ＤＮＡは、化学合成によって、ｃＤＮＡクローニングによって、又は所望する細胞から精製したゲノムＤＮＡ又はそのフラグメントのクローニングによって、クローン化したＤＮＡ（例えばＤＮＡ「ライブラリー」）から当該技術で既知の標準的手順によって入手しうる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク；Ｇｌｏｖｅｒ編集、１９８５、ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＭＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，英国、を参照）。
【０１２９】
５．７．完全長ＳＣＡ−１変更遺伝子の同定
ひとたびショウジョウバエ又はショウジョウバエ以外のＳＣＡ−１変更因子の一部が同定され、適当なクローニングベクター内で増殖されれば、その後完全な遺伝子を決定することができる。部分クローン化配列を使用して、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーのいずれかをスクリーニングすることができる。ｃＤＮＡライブラリーから誘導したクローンはエクソン配列だけを含むのに対し、ゲノムライブラリーから誘導したクローンはコード領域に加えて調節及びイントロンＤＮＡ領域を含む。高厳密性条件下で実施すれば、同一配列を含むＤＮＡフラグメントだけがハイブリダイズする。限定ではなく例として、そのような高厳密性の条件を用いる手順は次の通りである。６×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％ＰＶＰ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡから成る緩衝液中６５℃で８時間から一晩、ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを実施する。１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ及び５−２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ−標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合物中６５℃で４８時間フィルターをハイブリダイズする。２×ＳＳＣ、０．０１％ＰＶＰ、０．０１％Ｆｉｃｏｌｌ、及び０．０１％ＢＳＡを含む溶液中３７℃で１時間、フィルターの洗浄を行う。続いて０．１×ＳＳＣ中５０℃で４５分間洗浄した後、オートラジオグラフィーに供する。使用しうる高厳密性の他の条件は当該技術において周知である。
【０１３０】
ゲノムＤＮＡから誘導したクローンはコード領域に加えて調節及びイントロンＤＮＡ領域を含む；ｃＤＮＡから誘導したクローンはエクソン配列だけを含む。源が何であっても、遺伝子の増殖のために適当なベクター内に遺伝子を分子クローニングしなければならない。
【０１３１】
遺伝子を増殖させるために使用されるクローニングベクターは、プラスミド又は修飾ウイルスを含むがこれらに限定されず、但しベクター系は使用する宿主細胞と適合性でなければならない。そのようなベクターは、λ誘導体のようなバクテリオファージ、又はＰＢＲ３２２又はｐＵＣプラスミド誘導体又はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＵＳＡ、ラホーヤ，カリフォルニア）のようなプラスミドを含むが、これらに限定されない。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的粘着末端を持つクローニングベクターにＤＮＡフラグメントを結合することによって実施できる。しかし、ＤＮＡを断片化するために使用する相補的制限部位がクローニングベクター内に存在しない場合には、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に修飾することができる。代替的には、ヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端に結合することによって所望する部位を創造することができる；これらの結合されるリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的化学合成オリゴヌクレオチドを含みうる。代替的な方法では、開裂したベクターとＳＣＡ−１変更遺伝子をホモポリマーテーリングによって修飾しうる。遺伝子配列の多くのコピーが生成されるように、形質転換、形質移入、感染、エレクトロポレーション、等々によって組換え分子を宿主細胞に導入することができる。
【０１３２】
代替的な方法では、「ショットガン」アプローチにおいて適当なクローニングベクター内に挿入した後、所望する遺伝子を同定し、単離することができる。クローニングベクターに挿入する前に、例えばサイズ分画化法によって、所望する遺伝子の濃縮を行うことができる。
【０１３３】
さらなる実施形態では、「ショットガン」アプローチを「定方向配列決定」アプローチと組み合わせる戦略を用いて適当なクローニングベクター内に挿入した後、所望する遺伝子を同定し、単離することができる。この場合には、例えば、対象とする領域内及びその近傍を分子マッピングするクローンを用いて、配列標識部位（ＳＴＳ）のようなゲノムの特定領域のＤＮＡ配列全体を得ることができる。
【０１３４】
特定実施形態では、ＳＣＡ−１変更遺伝子を組み込んだ組換えＤＮＡ分子、ｃＤＮＡ又は合成ＤＮＡ配列による宿主細胞の形質転換は、遺伝子の多数のコピーの作製を可能にする。それ故、形質転換体を増殖させ、形質転換体から組換えＤＮＡ分子を単離して、必要なときには単離した組換えＤＮＡから挿入遺伝子を回収することによって遺伝子を大量に得ることができる。
【０１３５】
付加的に、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質の誘導体及び類似体をコードする核酸、及びＳＣＡ−１変更因子タンパク質アンチセンス核酸を提供する。容易に明らかなように、ここで使用するとき、「ＳＣＡ−１変更因子タンパク質のフラグメント又は部分をコードする核酸」は、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質の言及されているフラグメント又は部分だけでなく、連続配列としてＳＣＡ−１変更因子タンパク質の他の隣接部分もコードする核酸を指すと解釈される。本発明は、機能的に等しいアミノ酸を有するコードアミノ酸配列、ならびにＳＣＡ−１変更因子誘導体又は類似体をコードするものを含む。
【０１３６】
５．８．ショウジョウバエＳＣＡ−１変更遺伝子の発現
ＳＣＡ−１変更因子タンパク質又はその機能的に活性な類似体又はフラグメント又は他の誘導体（第５．６章参照）をコードするヌクレオチド配列を、適切な発現ベクター、すなわち挿入したタンパク質コード配列の転写と翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入することができる。必要な転写及び翻訳シグナルはまた、天然ＳＣＡ−１変更遺伝子及び／又はその隣接領域によっても供給されうる。タンパク質コード配列を発現するために様々な宿主−ベクター系が使用しうる。これらは、ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、等々）に感染させた哺乳類細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；酵母ベクターを含む酵母のような微生物、あるいはバクテリオファージ、ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡで形質転換した細菌を含むが、これらに限定されない。ベクターの発現エレメントは強度及び特異性が異なる。使用する宿主−ベクター系に依存して、多くの適当な転写及び翻訳エレメントのいずれかが使用できる。さらにもう１つの実施形態では、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質の１又はそれ以上のドメインを含むＳＣＡ−１変更因子タンパク質のフラグメントを発現する。
【０１３７】
ベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入に関してこれまでに記述されている方法のいずれかを使用して、適切な転写／翻訳制御シグナルとタンパク質コード配列から成るキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、インビトロでの組換えＤＮＡ及び合成手法ならびにインビボでの組換え体（遺伝子組換え）を含みうる。ＳＣＡ−１変更因子タンパク質又はペプチドフラグメントをコードする核酸配列の発現は、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質又はペプチドが組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において発現されるように第二核酸配列によって調節されうる。例えば、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質の発現は当該技術において既知の何らかのプロモーター／エンハンサーエレメントによって制御されうる。プロモーター／エンハンサーは相同（すなわち天然）又は非相同（すなわち非天然）でありうる。ＳＣＡ−１変更遺伝子の発現を制御するために使用しうるプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔとＣｈａｍｂｏｎ，１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）、βラクタマーゼプロモーターのような原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、１９７８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）、又はｌａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５；Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０，２４２：７４−９４）、ノパリンシンテターゼプロモーター領域（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９−２１３）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Ｇａｒｄｎｅｒら、１９８１、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：２８７１）、及び光合成酵素リブロースビスリン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１１５−１２０）を含む植物発現ベクター、Ｇａｌ４応答プロモーターのような酵母又は他の真菌からのプロモーターエレメント、ＡＤＣ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、及び組織特異性を示し、遺伝子組換え動物において使用されてきた次の動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら、１９８６、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性な遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）、リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８４、Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、１９８７、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）、精巣、乳房、リンパ系及び肥満細胞において活性なマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５）、肝において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、肝において活性なα−胎児タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら、１９８５、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒら、１９８７、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８）、肝において活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら、１９８７、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら、１９８６、Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）、脳内の乏突起神経膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら、１９８７、Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６）、及び視床下部において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−１３７８）を含むが、これらに限定されない。
【０１３８】
特定実施形態では、ＳＣＡ−１変更遺伝子核酸に動作可能なように連結されたプロモーター、１又はそれ以上の複製起点、及び任意に、１又はそれ以上の選択マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）を含むベクターを使用する。
【０１３９】
特定実施形態では、ＳＣＡ−１変更因子コード配列を３つのｐＧＥＸベクター（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ発現ベクター；ＳｍｉｔｈとＪｏｈｎｓｏｎ，１９８８、Ｇｅｎｅ  ７：３１−４０）の各々のＥｃｏＲＩ制限部位にサブクローニングすることによって発現構築物を作製する。これは、正しい読み枠でのサブクローンからのＳＣＡ−１変更因子タンパク質産物の発現を可能にする。
【０１４０】
ＳＣＡ−１変更遺伝子挿入を含む発現ベクターは３つの一般的アプローチによって同定することができる：（ａ）核酸ハイブリダイゼーション；（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在又は不在；及び（ｃ）挿入配列の発現。最初のアプローチでは、挿入したＳＣＡ−１変更遺伝子に相同な配列を含むプローブを使用する核酸ハイブリダイゼーションによって、発現ベクターに挿入したＳＣＡ−１変更遺伝子の存在を検出することができる。第二のアプローチでは、ＳＣＡ−１変更遺伝子をベクターに挿入することによって引き起こされるある種の「マーカー」遺伝子機能（例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける閉鎖体形成、等々）の存在又は不在に基づいて組換えベクター／宿主系を同定し、選択することができる。例えば、ＳＣＡ−１変更遺伝子をベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入する場合、マーカー遺伝子機能の不在によってＳＣＡ−１変更因子挿入を含む組換え体を同定することができる。第三のアプローチでは、組換え体によって発現されるＳＣＡ−１変更因子産物を検定することによって組換え発現ベクターを同定することができる。そのようなアッセイは、例えば、インビトロアッセイ系におけるＳＣＡ−１変更因子タンパク質の物理的又は機能的特性、例えばアタキシン−１との結合に基づくことができる。
【０１４１】
ひとたび特定組換えＤＮＡ分子が同定され、単離されれば、当該技術において既知のいくつかの方法を使用してそれを増殖することができる。ひとたび適当な宿主系と増殖条件が確立されれば、組換え発現ベクターを多量に増殖させ、調製することができる。先に説明したように、使用しうる発現ベクターは次のベクター又はそれらの誘導体を含むが、これらに限定されない：ワクシニアウイルス又はアデノウイルスのようなヒト又は動物ウイルス；バキュロウイルスのような昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えばλファージ）、及びプラスミド及びコスミドＤＮＡベクター、等々。
【０１４２】
さらに、挿入配列の発現を調節する、又は所望する特定の様式で遺伝子産物を修飾し、プロセシングする宿主細胞系統を選択することができる。ある種のプロモーターからの発現はある種のインデューサーの存在下で上昇しうる；それ故、遺伝的に構築したＳＣＡ−１変更因子タンパク質の発現を制御することができる。さらに、種々の宿主細胞は、翻訳及び翻訳後プロセシングと修飾（例えばグリコシル化、タンパク質のリン酸化）について特徴的で特異的な機序を持つ。発現される外来タンパク質の所望する修飾とプロセシングを確保するために適切な細胞系統又は宿主系を選択することができる。例えば、非グリコシル化コアタンパク質産物を生成するために細菌系での発現が使用できる。酵母における発現はグリコシル化産物を生じる。動物細胞における発現は、非相同タンパク質の「天然」グリコシル化を確実にするために使用できる。さらに、種々のベクター／宿主発現系が種々の度合でプロセシング反応に影響を及ぼしうる。
【０１４３】
他の特定実施形態では、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質、フラグメント、類似体又は誘導体は、融合又はキメラタンパク質産物（ペプチド結合を通して非相同タンパク質配列（異なるタンパク質の）に連結されたタンパク質、フラグメント、類似体又は誘導体を含む）として発現されうる。キメラタンパク質は、第二タンパク質又は少なくともその一部へのＳＣＡ−１変更因子タンパク質、フラグメント、類似体、又は誘導体の融合を含みうるが、かかる一部は該第二タンパク質の１個（好ましくは１０、１５、又は２０個）又はそれ以上のアミノ酸である。第二タンパク質、あるいはその１個又はそれ以上のアミノ酸部分は、異なるショウジョウバエＳＣＡ−１変更因子タンパク質であるか又はショウジョウバエＳＣＡ−１変更因子タンパク質ではないタンパク質からのものでありうる。そのようなキメラ産物は、所望するアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を、当該技術で既知の方法によって正しいコードフレーム内で互いに結合し、当該技術で一般的に知られる方法によってキメラ産物を発現することにより、作製できる。代替的には、タンパク質合成手法によって、例えばペプチドシンセサイザーを使用してそのようなキメラ産物を作製しうる。
【０１４４】
５．９．ＳＣＡ−１変更遺伝子産物の同定と精製
特定局面では、本発明は、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質の抗原決定基を含むか（すなわち抗体によって認識されうる）又はさもなければ機能的に活性であるＳＣＡ−１変更因子タンパク質及びそのフラグメントと誘導体のアミノ酸配列、ならびに前記をコードする核酸配列を提供する。
【０１４５】
特定実施形態では、本発明は、少なくとも１０個のアミノ酸、２０個のアミノ酸、５０個のアミノ酸、又は少なくとも７５個のアミノ酸から成るＳＣＡ−１変更因子タンパク質のフラグメントを提供する。ＳＣＡ−１変更因子タンパク質の前記の領域の一部又は全部を欠くフラグメント又はフラグメントを含むタンパク質も提供する。前記をコードする核酸を提供する。特定実施形態では、前記のタンパク質又はフラグメントは、２５、５０、又は１００個以下の隣接アミノ酸である。
【０１４６】
ひとたびＳＣＡ−１変更遺伝子配列を発現する組換え体が同定されれば、遺伝子産物を分析することができる。これは、産物を放射能標識し、その後ゲル電気泳動、免疫測定法、等々によって分析することを含めて、産物の物理的又は機能的特性に基づくアッセイによって実施される。
【０１４７】
ひとたびＳＣＡ−１変更因子タンパク質が同定されれば、それを単離し、クロマトグラフィー（例えばイオン交換、アフィニティー、及びサイズ分けカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差別溶解度を含めた標準的な方法によって、又はタンパク質の精製のための他の何らかの標準的手法によって精製することができる。機能的特性は適当なアッセイを用いて評価しうる（第５．７章参照）。
【０１４８】
もう１つの代替実施形態では、天然ＳＣＡ−１変更因子タンパク質を、上述したような標準的方法（例えば免疫親和性精製）によって天然の原料から精製することができる。
【０１４９】
本発明の特定実施形態では、組換えＤＮＡ手法又は化学合成法又は天然タンパク質の精製のいずれによって作製されたかにかかわらず、そのようなＳＣＡ−１変更因子タンパク質、ならびにそれに相同なタンパク質を含めて、そのフラグメントと他の誘導体及び類似体。
【０１５０】
５．１０．ＳＣＡ−１変更遺伝子及びタンパク質の構造
ＳＣＡ−１変更遺伝子及びタンパク質の構造は当該技術において既知の様々な方法によって分析することができる。そのような方法の一部の例を下記に述べる。
【０１５１】
５．１０．１．核酸分析
ＳＣＡ−１変更遺伝子に対応するクローン化ＤＮＡ又はｃＤＮＡは、サザンハイブリダイゼーション（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，１９７５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８：５０３−５１７）、ノーザンハイブリダイゼーション（例えばＦｒｅｅｍａｎら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：４０９４−４０９８参照）、制限エンドヌクレアーゼマッピング（Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク）、及びＤＮＡ塩基配列分析を含むがこれらに限定されない方法によって分析することができる。従って、本発明は、ＳＣＡ−１変更遺伝子を認識する核酸プローブを提供する。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；米国特許第４，６８３，２０２号、同第４，６８３，１９５号及び同第４，８８９，８１８号；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｉｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７６５２−７６５６；Ｏｃｈｍａｎら、１９８８、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２０：６２１−６２３；Ｌｏｈら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７−２２０）とそれに続くＳＣＡ−１変更遺伝子特異的プローブによるサザンハイブリダイゼーションは、様々な細胞型からのＤＮＡにおいてＳＣＡ−１変更遺伝子を検出することができる。ＰＣＲ以外の増幅方法は一般的に知られており、同様に使用できる。１つの実施形態では、サザンハイブリダイゼーションを使用してＳＣＡ−１変更遺伝子の遺伝的連鎖を決定することができる。ＳＣＡ−１変更遺伝子の発現を判定するためにはノーザンハイブリダイゼーションが使用できる。発生又は活動の様々な状態にある様々な細胞型、特に中枢神経系の細胞をＳＣＡ−１変更遺伝子発現に関して試験することができる。サザン及びノーザンハイブリダイゼーションのハイブリダイゼーション条件の厳密性は、使用する特異的ＳＣＡ−１変更遺伝子プローブに対して所望する度合の関連性を持つ核酸を確実に検出するように操作することができる。これらの方法の修正や当該技術で一般的に知られる他の方法が使用できる。
【０１５２】
制限エンドヌクレアーゼマッピングは、ＳＣＡ−１変更遺伝子の遺伝的構造を概略的に決定するために使用できる。制限エンドヌクレアーゼ開裂によって導かれる制限地図をＤＮＡ塩基配列分析によって確認することができる。
【０１５３】
ＤＮＡ塩基配列分析は、マクサム・ギルバート法（ＭａｘａｍとＧｉｌｂｅｒｔ、１９８０、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５：４９９−５６０）、サンガージデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４：５４６３）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼの使用（ＴａｂｏｒとＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ，米国特許第４，７９５，６９９号）、又は自動ＤＮＡシークエンサー（例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フォスターシティ，カリフォルニア）を含むがこれらに限定されない、当該技術で既知の何らかの手法によって実施できる。
【０１５４】
５．１０．２．ＳＣＡ−１変更因子タンパク質の分析
ＳＣＡ−１変更因子タンパク質のアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列からの推論によって、又は代替的に、例えば自動アミノ酸シークエンサーによるタンパク質の直接配列決定によって導くことができる。
【０１５５】
ＳＣＡ−１変更因子タンパク質配列を親水性分析によってさらに特徴付けることができる（ＨｏｐｐとＷｏｏｄｓ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：３８２４）。親水性プロフィールを使用して、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質の疎水性及び親水性領域、そしてそのような領域をコードする遺伝子配列の対応する領域を同定することができる。
【０１５６】
構造予測分析（ＣｈｏｕとＦａｓｍａｎ、１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２）も、特異的二次構造を備えたＳＣＡ−１変更因子タンパク質の領域を同定するために実施できる。
【０１５７】
操作、翻訳、及び二次構造予測、オープンリーディングフレームの予測とプロット、ならびに配列相同性の決定はまた、当該技術において使用可能なコンピュータソフトウエアプログラムを用いて実施することもできる。
【０１５８】
構造分析の他の方法も使用できる。これらは、Ｘ線結晶解析（Ｅｎｇｓｔｏｍ，１９７４、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１１：７−１３）、核磁気共鳴分光法（ＣｌｏｒｅとＧｏｎｅｎｂｏｒｎ，１９８９，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：４７９−５６４）及びコンピュータモデリング（ＦｌｅｔｔｅｒｉｃｋとＺｏｌｌｅｒ，１９８６，Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙより，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク）を含むが、これらに限定されない。
【０１５９】
５．１０．３．抗体
本発明に従えば、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質、そのフラグメント又は他の誘導体、又はその類似体は、免疫特異的に免疫原に結合する抗体を産生するための免疫原として使用しうる。そのような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、及びＦａｂ発現ライブラリーを含むが、これらに限定されない。もう１つの実施形態では、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質のドメインに対する抗体を作製する。特定実施形態では、親水性と同定されたＳＣＡ−１変更因子タンパク質のフラグメントを抗体産生のための免疫原として使用する。
【０１６０】
当該技術において既知の様々な手法がＳＣＡ−１変更因子タンパク質又は誘導体又は類似体に対するポリクローナル抗体の産生のために使用しうる。抗体産生のために、ウサギ、マウス、ラット、等々を含むがこれらに限定されない様々な宿主動物を、天然ＳＣＡ−１変更因子タンパク質、又は合成バージョン、又はその誘導体（例えばフラグメント）の注入によって免疫することができる。免疫応答を高めるために、宿主の種に依存して、フロイント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウムのような無機物ゲル、リゾレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（カルメット−ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム・パルヴム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）のような潜在的に有用なヒトアジュバントを含むがこれらに限定されない様々なアジュバントを使用しうる。
【０１６１】
ＳＣＡ−１変更因子タンパク質又はその類似体に対するモノクローナル抗体の調製のために、培養において連続細胞系統による抗体分子の産生を提供するいかなる手法も使用しうる。例えば、最初にＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎによって開発されたハイブリドーマ手法（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）、ならびにトリオーマ手法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ手法（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙより，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）。本発明のさらなる実施形態では、最近のテクノロジーを使用した無菌動物においてモノクローナル抗体を作製することができる（例えばＰＣＴ／ＵＳ９０／０２５４５号参照）。本発明に従えば、ヒト抗体が使用でき、ヒトハイブリドーマを使用することによって（Ｃｏｌｅら、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２０２６−２０３０）又はインビトロでヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスで形質転換することによって（Ｃｏｌｅら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙより，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）入手できる。実際に、本発明に従えば、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質に特異的なマウス抗体分子からの遺伝子を、適切な生物活性を持つヒト抗体分子からの遺伝子と共にスプライシングすることにより、「キメラ抗体」の産生のために開発された手法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１−６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、１９８４、Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−６０８；Ｔａｋｅｄａら、１９８５、Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４５４）が使用できる；そのような抗体は本発明の範囲内である。
【０１６２】
本発明に従えば、一本鎖抗体（米国特許第４，９４６，７７８号）の産生について述べられている手法を、ＳＣＡ−１変更因子特異的一本鎖抗体を産生するように適合させることができる。本発明のさらなる実施形態は、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質、誘導体、又は類似体に対して所望する特異性を持つモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速で容易な同定を可能にする、Ｆａｂ’発現ライブラリーの構築のために述べられている手法（Ｈｕｓｅら、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１）を利用する。
【０１６３】
分子のイディオタイプを含む抗体フラグメントは既知の手法によって作製できる。例えば、そのようなフラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって作製することができるＦ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって作製できるＦａｂ’フラグメント、抗体分子をパパインと還元剤で処理することによって作製できるＦａｂフラグメント、及びＦｖフラグメントを含むが、これらに限定されない。
【０１６４】
抗体の産生において、所望する抗体のスクリーニングは当該技術で既知の手法によって実施できる（例えば酵素結合免疫吸着検定法又はＥＬＩＳＡ）。例えばＳＣＡ−１変更因子タンパク質の特定ドメインを認識する抗体を選択するために、生成されたハイブリドーマを、そのようなドメインを含むＳＣＡ−１変更因子フラグメントに結合する産物に関して検定することができる。第一ＳＣＡ−１変更因子相同体に特異的に結合するが、異なるＳＣＡ−１変更因子相同体には特異的に結合しない抗体の選択については、第一ＳＣＡ−１変更因子相同体への積極的な結合と第二ＳＣＡ−１変更因子相同体への結合の欠如に基づいて選択することができる。
【０１６５】
ＳＣＡ−１変更因子タンパク質のドメインに特異的な抗体も提供する。またＳＣＡ−１変更因子タンパク質のエピトープに特異的な抗体も提供する。
【０１６６】
上記抗体は、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質配列の局在と活性に関連する当該技術で既知の方法において、例えばこれらのタンパク質を画像化するため、適切な生理的試料においてそのレベルを測定するため、診断方法において、等々で使用することができる。
【０１６７】
５．１０．４．ＳＣＡ−１変更因子タンパク質の誘導体及び類似体
本発明はさらに、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質、誘導体（フラグメントを含むがこれに限定されない）、類似体、及びＳＣＡ−１変更因子タンパク質の分子を提供する。ＳＣＡ−１変更因子タンパク質誘導体及びタンパク質類似体をコードする核酸も提供する。１つの実施形態では、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質は、上記第５．１章で述べたＳＣＡ−１変更因子核酸によってコードされる。
【０１６８】
ＳＣＡ−１変更因子タンパク質に関連する誘導体及び類似体の産生と使用は本発明の範囲内である。特定実施形態では、誘導体又は類似体は機能的に活性である、すなわち完全長の野生型ＳＣＡ−１変更因子タンパク質に関連する１又はそれ以上の機能的活性を示すことができる。１つの例として、所望する免疫原性又は抗原性を有するそのような誘導体又は類似体は、免疫測定法において、免疫のために、ＳＣＡ−１変更活性の阻害のために、等々で使用することができる。所望するＳＣＡ−１変更因子タンパク質の対象特性を保持する、又は代替的に欠如する又は阻害する誘導体又は類似体は、それぞれそのような特性及びその生理的相関物の誘導物質、又は阻害因子として使用できる。特定実施形態は、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質に対する抗体によって結合されうるＳＣＡ−１変更因子タンパク質フラグメントに関する。ＳＣＡ−１変更因子タンパク質の誘導体又は類似体を、所望する活性に関して試験することができる。
【０１６９】
特に、ＳＣＡ−１変更因子誘導体は、機能的に等しい分子を提供する置換、付加（例えば挿入）又は欠失によりＳＣＡ−１変更因子配列を変化させることによって作製できる。ヌクレオチドコード配列の縮重により、ＳＣＡ−１変更遺伝子と実質的に同じアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が本発明の実施の際に使用しうる。これらは、配列内の機能的に等しいアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変化したＳＣＡ−１変更遺伝子の全部又は一部を含み、それ故サイレントの変化を生じるヌクレオチド配列を含むが、これらに限定されない。同様に、ＳＣＡ−１変更因子誘導体は、一次アミノ酸配列として、サイレントの変化をもたらす、機能的に等しいアミノ酸残基が配列内の残基を置換している変化した配列を含むＳＣＡ−１変更遺伝子のアミノ酸配列の全部又は一部を含むものを包含するが、これらに限定されない。例えば、配列内の１又はそれ以上のアミノ酸残基は、サイレントの変化をもたらす、機能的等価物として働く同様の極性のもう１つのアミノ酸によって置換されうる。配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスの他の成員から選択しうる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含む。正に荷電した（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン及びヒスチジンを含む。負に荷電した（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。一般にそのような置換が保存的置換であることは明白である。
【０１７０】
本発明の特定実施形態では、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質の少なくとも１０個の（連続する）アミノ酸から成るＳＣＡ−１変更因子タンパク質のフラグメントから成る又はかかるフラグメントを含むタンパク質を提供する。他の実施形態では、フラグメントはＳＣＡ−１変更因子タンパク質の少なくとも２０個又は少なくとも５０個のアミノ酸から成る。特定実施形態では、そのようなフラグメントは３５個、１００個又は２００個以下のアミノ酸である。ＳＣＡ−１変更因子タンパク質の誘導体又は類似体は、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質又はそのフラグメントに実質的に相同である領域（例えば、種々の実施形態において、同じ大きさのアミノ酸配列に対して又は当該技術で既知のコンピュータ相同性プログラムによって整列を行った場合の整列配列と比較したとき、少なくとも６０％又は７０％又は８０％又は９０％又は９５％の同一性）又はそのコードする核酸が高厳密性、中厳密性、又は低厳密性条件下でコードＳＣＡ−１変更遺伝子配列にハイブリダイズすることができる領域を含む分子を包含するが、それらに限定されない。
【０１７１】
ＳＣＡ−１変更因子誘導体又は類似体は、当該技術において既知の様々な方法によって作製することができる。それらの作製をもたらす操作は遺伝子又はタンパク質レベルで行うことができる。例えば、クローン化したＳＣＡ−１変更遺伝子配列を当該技術で既知の多数の戦略のいずれかによって修飾することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク）。配列を適切な部位で制限エンドヌクレアーゼによって開裂し、その後所望する場合にはさらに酵素修飾して、インビトロで単離し、結合することができる。ＳＣＡ−１変更因子タンパク質の誘導体又は類似体をコードする修飾された遺伝子の作製においては、修飾された遺伝子が、所望するＳＣＡ−１変更因子タンパク質活性がコードされている遺伝子領域内で、翻訳終止シグナルによって中断されず、天然タンパク質と同じ翻訳読み枠内のままであることを確保するように注意しなければならない。
【０１７２】
さらに、ＳＣＡ−１変更因子核酸配列を、翻訳、開始、及び／又は終止配列を創造する及び／又は破壊するため、あるいはコード領域に変異を創造するため及び／又は新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成するため又は既存のものを破壊するため、インビトロでの修飾をさらに促進するために、インビトロ又はインビボで突然変異させることができる。化学的突然変異誘発、インビトロでの部位指定突然変異誘発（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９７８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１）、ＴＡＢ（商標）リンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用、突然変異を含むプライマーによるＰＣＲ、等々を含むがこれらに限定されない、当該技術で既知の突然変異誘発のためのいかなる手法も使用できる。
【０１７３】
ＳＣＡ−１変更因子タンパク質配列の操作はまた、タンパク質レベルでも実施しうる。翻訳の間に又は翻訳後に、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基による誘導体化、タンパク質分解、抗体分子又は他の細胞リガンドへの結合、等々によって異なった修飾をされるＳＣＡ−１変更因子タンパク質フラグメント又は他の誘導体又は類似体は本発明の範囲内に包含される。数多くの化学修飾のいずれかを、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝合成、等々による特異的化学開裂を含むがこれらに限定されない既知の手法によって実施しうる。
【０１７４】
さらに、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質の類似体及び誘導体を化学合成することができる。例えば、所望するドメインを含む、又はインビトロで所望する活性を仲介するＳＣＡ−１変更因子タンパク質の部分に対応するペプチドを、ペプチドシンセサイザーを使用して合成することができる。さらに、所望する場合には、非古典的アミノ酸又は化学的アミノ酸類似体を置換基又は付加基としてＳＣＡ−１変更因子配列に導入することができる。非古典的アミノ酸は、普通アミノ酸のＤ異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、及び一般にアミノ酸類似体を含むが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）又はＬ（左旋性）でありうる。
【０１７５】
特定実施形態では、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質誘導体は、ペプチド結合によりそのアミノ又はカルボキシ末端で異なるタンパク質のアミノ酸配列に連結された、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質又はそのフラグメント（好ましくは少なくともＳＣＡ−１変更因子タンパク質の１つのドメイン又はモチーフから成る、又はＳＣＡ−１変更因子タンパク質の少なくとも１０個のアミノ酸から成る）を含むキメラ又は融合タンパク質である。特定実施形態では、異なるタンパク質のアミノ酸配列は、異なるタンパク質又は異なるタンパク質の機能的に活性な部分の少なくとも６個、１０個、２０個又は３０個の連続するアミノ酸である。１つの実施形態では、そのようなキメラタンパク質は、タンパク質をコードする核酸（異なるタンパク質についてのコード配列にインフレーム結合されたＳＣＡ−１変更因子コード配列を含む）の組換え発現によって生成される。そのようなキメラ産物は、所望するアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を、正しいコードフレーム内で、当該技術で既知の方法によって互いに結合し、当該技術で一般的に知られる方法によってキメラ産物を発現することによって生成できる。代替的には、タンパク質合成手法、例えばペプチドシンセサイザーの使用によってそのようなキメラ産物を生成することができる。何らかの非相同タンパク質コード配列に融合したＳＣＡ−１変更遺伝子の部分を含むキメラ遺伝子を構築しうる。特定実施形態は、少なくとも６個のアミノ酸のＳＣＡ−１変更因子タンパク質のフラグメント、又はＳＣＡ−１変更因子タンパク質の１又はそれ以上の機能的活性を示すフラグメントを含むキメラタンパク質に関する。
【０１７６】
５．１１．アタキシン−１の診断用途
野生型アタキシン−１  ３０Ｑの過剰発現がＳＣＡ−１病因を誘導しうる（下記第６．５章）という本発明者の発見により、正常アタキシン−１の診断用途が可能となる。最初は、ＳＣＡ−１表現型は伸長したポリグルタミン反復配列を持つ突然変異体アタキシン−１タンパク質、３９−８２個のグルタミン残基のポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１によってのみ引き起こされるのであろうと考えられた（ＺｏｇｈｂｉとＯｒｒ、２０００、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：２１７−２４７）。しかし、野生型アタキシン−１の過剰発現がＳＣＡ−１疾患の進行を導きうるという発見により、中枢神経系における、例えば患者又は被験者の組織生検又は脳脊髄液におけるアタキシン−１のレベルを検定することによって患者がＳＣＡ−１に対して感受性であるかどうかを判定するための診断手順を開発することができる。
【０１７７】
アタキシン−１核酸及び抗体を使用して正常アタキシン−１の発現を測定することができる。正常アタキシン−１の過剰発現はＳＣＡ−１又はＳＣＡ−１疾患への素因を示すと考えられる。本発明の１つの実施形態では、免疫特異的結合が起こりうるような条件下で患者に由来する試料を抗アタキシン−１抗体と接触させ、抗体による免疫特異的結合の量を検出する又は測定することによって免疫測定法を実施する。１つの実施形態では、抗体は、正常（非伸長）アタキシン−１遺伝子（ポリグルタミン反復配列中に６−４４個のグルタミン残基を持つアタキシン−１タンパク質をコードし、それらの対立遺伝子はポリグルタミン領域（ｔｒａｃｔ）に２０個又はそれ以上のグルタミン残基を持ち、グルタミン反復配列は１−４個のヒスチジン残基によって中断される（ＺｏｇｈｂｉとＯｒｒ、２０００、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：２１７−２４７））に特異的なモノクローナル抗体である、すなわち抗体は、伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１に比べて正常アタキシン−１に対して選択的、より好ましくは特異的結合を示す。
【０１７８】
使用できる免疫測定法は、ウエスタンブロット、免疫組織化学放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集反応測定法、補体固定測定法、免疫ラジオメトリック測定法、蛍光免疫測定法、プロテインＡ免疫測定法、等々のような手法を用いた競合及び非競合アッセイ系を含むが、これらに限定されない。
【０１７９】
相補的配列を含めて、アタキシン−１遺伝子及び関連核酸配列及びサブ配列はまた、ハイブリダイゼーションアッセイにおいても使用できる。少なくとも約８個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１２個のヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１５個のヌクレオチドを含むアタキシン−１核酸配列又はそのサブ配列は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用できる。ハイブリダイゼーションアッセイは、アタキシン−１発現の異常変化に関連する状態、障害、又は疾患状態を検出する、予後判定する、診断する、又は監視するために使用できる。特に、そのようなハイブリダイゼーションアッセイは、ハイブリダイゼーションが起こりうるような条件下で、例えば被験者又は患者からの組織生検から調製したＲＮＡのノーザンブロットにおいて、核酸を含む試料をアタキシン−１ＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させ、生じたハイブリダイゼーションを検出する又は測定することを含む方法によって実施される。
【０１８０】
他の実施形態では、プライマー、好ましくはアタキシン−１遺伝子のポリグルタミン反復配列にわたるプライマーを用いたＰＣＲを、アタキシン−１の発現レベルを測定するため、又は、生じたＰＣＲ産物の大きさに基づいて、被験者又は患者からの試料中のアタキシン−１の発現レベルと伸長したポリグルタミン反復配列の存在を同時に検出するために、定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて使用する（例えばＲｉｅｄｙら、１９９５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８（１）：７０−４、７６）。
【０１８１】
好ましい実施形態では、患者の試料中のアタキシン−１  ｍＲＮＡ又はタンパク質のレベルを、ＳＣＡ−１を有していない被験者からの類似試料中に存在するレベルと比較して検出する又は測定する。
【０１８２】
１又はそれ以上の容器中に、抗アタキシン−１抗体、及び任意に、該抗体に対する標識結合パートナーを含む、診断用途のためのキットも提供する。代替的には、抗アタキシン−１抗体を標識する（検出可能なマーカー、例えば化学発光、酵素、蛍光、又は放射性成分によって）ことができる。１又はそれ以上の容器中に、アタキシン−１  ＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸プローブを含むキットも提供する。特定実施形態では、キットは、１又はそれ以上の容器中に、例えばＰＣＲ（例えばＩｎｎｉｓら、１９９０、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア参照）、リガーゼ連鎖反応（ＥＰ  ３２０，３０８号参照）、Ｑβレプリカーゼの使用、循環的プローブ反応、又は当該技術で既知の他の方法によって、適切な反応条件下でアタキシン−１核酸の少なくとも一部の増幅を開始させることができる、好ましくは各々が８−３０個のヌクレオチドのサイズ範囲内である一対のプライマーを含みうる。アタキシン−１  ＲＮＡの増幅のためのキットは、任意に、増幅手順のためのヌクレオチド及び／又は緩衝液をさらに含みうる。アタキシン−１  ＲＮＡの増幅のためのキットは、任意に、増幅手順における鋳型として使用するために、アタキシン−１  ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するための逆転写酵素をさらに含みうる。キットは任意に、容器中に、例えば定量基準又は対照として使用するための、あらかじめ定められた量の精製アタキシン−１タンパク質又は核酸をさらに含みうる。
【０１８３】
５．１２．ＳＣＡ−１変更遺伝子の診断用途
ここで述べるようなＳＣＡ−１変更因子の同定は、ＳＣＡ−１の病因に寄与する遺伝子の発見を導くであろう。上述したように、ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子は、その機能喪失がより重症のＳＣＡ−１疾病をもたらす遺伝子であるか、あるいはその異所性発現又は機能獲得がより軽度のＳＣＡ−１疾病をもたらす遺伝子である。ひとたびＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子が同定されれば、ＳＣＡ−１遺伝子の発現パターンを分析する。中枢神経系、特にプルキンエ細胞及び歯状核細胞を含む小脳領域において正常に発現されるＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子は、その機能喪失突然変異がＳＣＡ−１に寄与し、診断において使用できる遺伝子の候補である。特に、神経系において正常に発現されるＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子の発現レベル又は活性の低下の分析は、ＳＣＡ−１への素因又は実際の疾患を診断するために使用できる。中枢神経系において正常に発現されるか否かに関わらず、すべてのＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子がＳＣＡ−１治療薬についての候補物質である。特に、本発明は、ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子のアゴニストであるＳＣＡ−１治療薬の使用を包含する。
【０１８４】
逆に、ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子は、その機能喪失がより軽度のＳＣＡ−１疾病をもたらす遺伝子であるか、あるいはその異所性発現又は機能獲得がより重症のＳＣＡ−１疾病をもたらす遺伝子である。ひとたびＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子が同定されれば、ＳＣＡ−１遺伝子の発現パターンを分析する。中枢神経系、特にプルキンエ細胞及び歯状核細胞を含む小脳領域において正常に発現されるＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子は、その機能喪失突然変異がＳＣＡ−１に寄与し、診断及び治療において使用できる遺伝子の候補である。特に、神経系において正常に発現されるＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子の高い発現レベル又は活性の分析は、ＳＣＡ−１への素因又は実際の疾患を診断するために使用できる。中枢神経系において正常に発現される、又はＳＣＡ−１の経過中に神経系で異所性発現されるＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子は、ＳＣＡ−１治療薬についての候補物質である。特に、本発明は、ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子のアンタゴニストであるＳＣＡ−１治療薬の使用を包含する。
【０１８５】
ＳＣＡ−１変更因子タンパク質、ＳＣＡ−１変更因子核酸、及びＳＣＡ−１変更因子抗体は、ＳＣＡ−１疾患を検出する、予後判定する、診断する、又は監視するため、あるいはその治療を監視するために使用しうる。本発明の１つの実施形態では、免疫特異的結合が起こりうるような条件下で患者に由来する試料をＳＣＡ−１変更因子に特異的な抗体と接触させ、抗体による免疫特異的結合の量を検出する又は測定することによって免疫測定法を実施する。特定局面では、組織生検又は脳脊髄液抽出物におけるそのような抗体の結合を使用して、ＳＣＡ−１変更遺伝子の異常発現を検出することができ、ＳＣＡ−１変更遺伝子の異常レベルは疾患状態の指標である。ここで使用するとき、「異常レベル」とは、遺伝子発現の正常レベルと比較してＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子の高レベル又はＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子の低レベルを意味する。
【０１８６】
使用できる免疫測定法は、ウエスタンブロット、免疫組織化学放射免疫測定法、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」免疫測定法、免疫沈降法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集反応測定法、補体固定測定法、免疫ラジオメトリック測定法、蛍光免疫測定法、プロテインＡ免疫測定法、等々のような手法を用いた競合及び非競合アッセイ系を含むが、これらに限定されない。
【０１８７】
相補的配列を含めて、ＳＣＡ−１変更遺伝子及び関連核酸配列及びサブ配列はまた、ハイブリダイゼーションアッセイにおいても使用できる。少なくとも約８個のヌクレオチドを含むＳＣＡ−１変更遺伝子又はそのサブ配列は、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。ハイブリダイゼーションアッセイは、ＳＣＡ−１を検出する、予後判定する、診断する、又は監視するために使用できる。特に、そのようなハイブリダイゼーションアッセイは、ハイブリダイゼーションが起こりうるような条件下で、組織生検又は脳脊髄液から調製した核酸を含む試料を、ＳＣＡ−１変更因子核酸にハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させ、生じたハイブリダイゼーションを検出する又は測定することを含む方法によって実施される。
【０１８８】
特定実施形態では、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質、ＳＣＡ−１変更因子ＲＮＡの高レベルを検出することによって、又はＳＣＡ−１変更遺伝子又はその産物の変化した発現又は活性を生じさせるＳＣＡ−１変更因子ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＳＣＡ−１変更因子タンパク質における突然変異（例えばＳＣＡ−１変更遺伝子のトランスロケーション、ＳＣＡ−１変更遺伝子又はタンパク質におけるトランケーション、それぞれ野生型ＳＣＡ−１変更遺伝子又はタンパク質と比較したヌクレオチド又はアミノ酸配列の変化）を検出することによって、ＳＣＡ−１を診断する、又はその疑わしい存在をスクリーニングする、又はそのような疾患を発現することへの素因を検出することができる。例として、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質のレベルは免疫測定法によって検出することができ、ＳＣＡ−１変更因子ＲＮＡのレベルはハイブリダイゼーションアッセイ（例えばノーザンブロット法、インサイチューハイブリダイゼーション）によって検出することができ、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質活性はインビボ又はインビトロで結合活性を測定することによって検定できる。ＳＣＡ−１変更遺伝子におけるトランスロケーション、欠失及び点突然変異は、サザンブロット法、ＦＩＳＨ、ＲＥＬＰ分析、ＳＳＣＰ、プライマーを用いたＰＣＲ、患者から得たＳＣＡ−１変更因子ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡの塩基配列決定、等々によって検出することができる。好ましい実施形態では、ＳＣＡ−１変更遺伝子に特異的なプライマーを用いたＰＣＲを、ＳＣＡ−１変更遺伝子の発現レベルを測定するための定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて使用する（例えばＲｉｅｄｙら、１９９５、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８（１）：７０−４、７６）。
【０１８９】
１又はそれ以上の容器中に、抗ＳＣＡ−１変更因子タンパク質抗体、及び任意に、標識二次抗体のような、該抗体に対する標識結合パートナーを含む、診断用途のためのキットも提供する。代替的には、抗ＳＣＡ−１変更因子タンパク質抗体自体を標識する（検出可能なマーカー、例えば化学発光、酵素、蛍光、又は放射性成分によって）ことができる。１又はそれ以上の容器中に、ＳＣＡ−１変更因子ＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸プローブを含むキットも提供する。特定実施形態では、キットは、１又はそれ以上の容器中に、例えばＰＣＲ（例えばＩｎｎｉｓら、１９９０、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，サンディエゴ，カリフォルニア参照）、リガーゼ連鎖反応（ＥＰ  ３２０，３０８号参照）、Ｑβレプリカーゼの使用、循環的プローブ反応、又は当該技術で既知の他の方法によって、適切な反応条件下でＳＣＡ−１変更因子核酸の少なくとも一部の増幅を開始させることができる、好ましくは各々が８−３０個のヌクレオチドのサイズ範囲内である一対のプライマーを含みうる。ＳＣＡ−１変更因子ＲＮＡの増幅のためのキットは、任意に、増幅手順のためのヌクレオチド及び／又は緩衝液をさらに含みうる。ＳＣＡ−１変更因子ＲＮＡの増幅のためのキットは、任意に、増幅手順における鋳型として使用するために、ＳＣＡ−１変更因子ｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するための逆転写酵素をさらに含みうる。キットは任意に、容器中に、例えば定量基準又は対照として使用するための、あらかじめ定められた量の精製ＳＣＡ−１変更因子タンパク質又は核酸をさらに含みうる。
【０１９０】
５．１３．ＳＣＡ−１変更遺伝子の治療用途
ここで述べるようなＳＣＡ−１変更因子の同定は、ＳＣＡ−１の治療薬として使用することができる遺伝子の発見を導くであろう。ＳＣＡ−１と他の神経変性疾患に共通する機序とエレメントのゆえに、ここで開示する方法によって同定されるＳＣＡ−１治療は、他のポリグルタミン病ならびに、アルツハイマー病、加齢性認知機能喪失、老年痴呆、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ウィルソン病、脳性麻痺、進行性核上性麻痺、グァム病、レヴィ小体痴呆、プリオン病、タウパシー、海綿状脳障害、クロイツフェルト−ヤコブ病、筋緊張性ジストロフィー、フリードライヒ運動失調、運動失調、ジル・ド・ラ・トゥレット症候群、発作障害、てんかん、慢性発作障害、卒中、脳外傷、脊髄損傷、エイズ痴呆、アルコール中毒症、自閉症、網膜虚血、緑内障、自律神経機能障害、高血圧症、神経精神障害、精神分裂病、又は分裂感情障害のような非ポリグルタミン病の予防又は治療のために有益であると期待される。
【０１９１】
上述したように、ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子は、その機能喪失がより重症のＳＣＡ−１疾病をもたらす遺伝子であるか、あるいはその異所性発現又は機能獲得がより軽度のＳＣＡ−１疾病をもたらす遺伝子である。中枢神経系において正常に発現されるか否かに関わらず、すべてのＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子はＳＣＡ−１治療のための候補物質である。特に、本発明は、ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子のアゴニストである、ＳＣＡ−１治療薬を含むがこれに限定されない神経変性治療薬の使用を包含する。
【０１９２】
ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子は、その機能喪失がより軽度のＳＣＡ−１疾病をもたらす遺伝子であるか、あるいはその異所性発現又は機能獲得がより重症のＳＣＡ−１疾病をもたらす遺伝子である。ひとたびＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子が同定されれば、ＳＣＡ−１遺伝子の発現パターンを分析する。中枢神経系において正常に発現されるか、又はＳＣＡ−１の経過中に神経系で異所性発現されるＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子は、ＳＣＡ−１治療のための候補物質である。特に、本発明は、ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子のアンタゴニストである、ＳＣＡ−１治療薬を含むがこれに限定されない神経変性治療薬の使用を包含する。
【０１９３】
本発明に従えば、ＳＣＡ−１治療薬、すなわちＳＣＡ−１エンハンサーのアゴニスト及びＳＣＡ−１サプレッサーのアンタゴニストを、ＳＣＡ−１を有するヒト患者に投与する。もう１つの実施形態では、組成物及び製剤を、ＳＣＡ−１を有していないヒト被験者に疾患の発症に対する予防措置として投与する。しかし、ここで述べる原理を用いて開発された治療薬は、同様の疾病を有する他の哺乳類、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ及びブタを含めた家畜ならびにネコ及びイヌを含めたペット動物の疾患を治療する上で有用であることが認識される。
【０１９４】
他の実施形態では、本発明の組成物及び製剤を、神経変性疾患を有する又は神経変性疾患を有する疑いがあると診断されたヒト被験者に投与する。本発明に従えば、本発明の治療薬による治療は、何らかの臨床段階の神経変性疾患を有すると既に診断された患者の治療；初期症状及び徴候を有する患者における疾患の予防；神経変性疾患の症状又は徴候の発症又は進行又は増悪又は悪化の遅延；及び／又は症候性患者における神経変性疾患の後退の促進を包含する。
【０１９５】
下記で述べるＳＣＡ−１治療への核酸及び抗体アプローチに代わるものとして、有用なＳＣＡ−１治療薬は、ＳＣＡ−１エンハンサーの小分子アゴニスト及びアタキシン−１及び／又はＳＣＡ−１サプレッサーの小分子アンタゴニストを含む。このために有用な小分子治療薬同定の方法を下記第５．１４章で述べる。
【０１９６】
さらに他の実施形態では、神経変性疾患の治療のための、ＳＣＡ−１変更遺伝子によってコードされるタンパク質に結合する抗体の使用が想定される。そのような抗体は、ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子産物のアゴニスト又はＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子産物のアンタゴニストでありうる。そのような抗体を作製する方法は上記第５．１０．３章に述べられている。
【０１９７】
５．１３．１．ＳＣＡ−１変更遺伝子の抑制
本発明はまた、ＳＣＡ−１変更遺伝子のアンチセンス使用を提供する。特定実施形態では、ＳＣＡ−１変更因子アンチセンス核酸の使用によってＳＣＡ−１変更因子タンパク質機能を阻害する。本発明は、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質又はその部分をコードする遺伝子又はｃＤＮＡに対してアンチセンスである少なくとも６個のヌクレオチドの核酸の使用を提供する。ここで使用するときＳＣＡ−１変更因子「アンチセンス」核酸は、配列相補性によってＳＣＡ−１変更因子ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の配列特異的（すなわち非ポリＡ）部分にハイブリダイズすることができる核酸を指す。アンチセンス核酸はまた、逆相補的核酸と称されることもある。アンチセンス核酸は、ＳＣＡ−１変更因子ｍＲＮＡのコード及び／又は非コード領域に相補的でありうる。そのようなアンチセンス核酸は、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質機能を阻害する上で有用性を持つ。
【０１９８】
アンチセンス核酸は、直接細胞に投与することができる、又は外来導入配列の転写によって細胞内で産生されうる、二本鎖又は一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ又はその修飾又は誘導体であるオリゴヌクレオチドでありうる。好ましい実施形態では、アンチセンス核酸は以前に述べられている二本鎖ＲＮＡである（Ｆｉｒｅら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６−８１１参照）。
【０１９９】
ＳＣＡ−１変更因子アンチセンス核酸は好ましくはオリゴヌクレオチド（８個から約５０個のオリゴヌクレオチドの範囲）である。特定局面では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０個のオリゴヌクレオチド、少なくとも１５個のオリゴヌクレオチド、少なくとも１００個のオリゴヌクレオチド、又は少なくとも２００個のオリゴヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ又はキメラ混合物又はその誘導体又は修飾バージョン、あるいは一本鎖又は二本鎖でありうる。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で修飾することができる。オリゴヌクレオチドは、ペプチドのような他の付加基、又は細胞膜（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：６４８−６５２；１９８８年１２月１５日公開のＰＣＴ特許願公開第ＷＯ８８／０９８１０号参照）又は血液脳関門（例えば１９８８年４月２５日公開のＰＣＴ特許願公開第ＷＯ８９／１０１３４号参照）を横切る輸送を容易にする物質、ハイブリダイゼーションが引き金となる開裂物質（例えばＫｒｏｌら、１９８８、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：９５８−９７６）又はインターカレート剤（例えばＺｏｎ，１９８８，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９）を含みうる。
【０２００】
ＳＣＡ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドは、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、及び２，６−ジアミノプリンを含むがこれらに限定されない群より選択される、少なくとも１個の修飾塩基部分を含みうる。もう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アラビノース、２−フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含むがこれらに限定されない群より選択される、少なくとも１個の修飾糖部分を含む。
【０２０１】
さらにもう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、及びホルムアセタール又はその類似体から成る群より選択される、少なくとも１個の修飾リン酸骨格を含む。
【０２０２】
さらにもう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドはα−アノマーオリゴヌクレオチドである。α−アノマーオリゴヌクレオチドは相補的ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、これは通常のβ−ユニットと異なって、鎖が互いに平行に走る（Ｇａｕｔｉｅｒら、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。オリゴヌクレオチドはもう１つ別の分子、例えばペプチド、ハイブリダイゼーションが引き金となる架橋剤、輸送物質、ハイブリダイゼーションが引き金となる開裂物質、等々に複合しうる。
【０２０３】
オリゴヌクレオチドは当該技術において既知の標準的方法によって、例えば自動ＤＮＡシンセサイザー（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、等々から市販されているような）の使用によって合成しうる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＳｔｅｉｎらの方法によって合成でき（Ｓｔｅｉｎら、１９８８、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９）、メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは細孔性ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）ポリマー保持体の使用によって調製できる（Ｓａｒｉｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：７４４８−７４５１）、等々。
【０２０４】
特定実施形態では、ＳＣＡ−１変更因子アンチセンスオリゴヌクレオチドは触媒ＲＮＡ又はリボザイムを含む（例えば１９９０年１０月４日公開のＰＣＴ特許願公開第ＷＯ９０／１１３６４号；Ｓａｒｖｅｒら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２−１２２５参照）。もう１つの実施形態では、オリゴヌクレオチドは２’−０−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）又はキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅら、１９８７、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）である。
【０２０５】
代替的実施形態では、ＳＣＡ−１変更因子アンチセンス核酸は外来配列からの転写によって細胞内で産生される。例えば、ベクターが細胞によって取り込まれ、かかる細胞内でベクター又はその部分が転写されて、アンチセンス核酸（ＲＮＡ）を生じるように、インビボでベクターを導入することができる。そのようなベクターは、ＳＣＡ−１変更因子アンチセンス核酸をコードする配列を含むことになる。そのようなベクターは、転写されて所望するアンチセンスＲＮＡを生じることができる限り、エピソームのままであるか又は染色体に取り込まれてもよい。そのようなベクターは当該技術において標準的な組換えＤＮＡテクノロジー法によって構築することができる。ベクターは、哺乳類細胞における複製と発現のために使用されるプラスミド、ウイルス、又は当該技術で既知の他のものでありうる。ＳＣＡ−１変更因子アンチセンスＲＮＡをコードする配列の発現は、当該技術で既知の何らかのプロモーターによって実施されうる。そのようなプロモーターは誘導的又は構成的でありうる。そのようなプロモーターは、ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｎｏｉｓｔとＣｈａｍｂｏｎ，１９８１、Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）、ラウス肉腫ウイルスの３’ロングターミナルリピートに含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら、１９８０、Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４１−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら、１９８２、Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）、等々を含むが、これらに限定されない。
【０２０６】
アンチセンス核酸は、ＳＣＡ−１変更遺伝子のＲＮＡ転写産物の少なくとも配列特異的部分に相補的な配列を含む。しかし、絶対的な相補性は、好ましいが、必要ではない。ここで言及するとき「ＲＮＡの少なくとも一部に相補的な」配列は、ＲＮＡとハイブリダイズして安定な二重鎖を形成しうるのに十分な相補性を持つ配列を意味する；二本鎖ＳＣＡ−１変更因子アンチセンス核酸の場合には、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を試験するか、又は三重鎖の形成を検定することができる。ハイブリダイズする能力は、相補性の度合とアンチセンス核酸の長さの両方に依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸が長いほど、それが含みうる、そしてそれでもなお安定な二重鎖（又は場合によって三重鎖）を形成しうる、ＳＣＡ−１変更因子ＲＮＡとの塩基ミスマッチの数が多くなる。当業者は、例えばハイブリダイズした複合体の融点を測定する標準的な手順を使用して、ミスマッチの許容される度合を確認することができる。
【０２０７】
代替的には、中枢神経系の標的細胞においてＳＣＡ−１変更因子の転写を妨げる三重らせん構造を形成するための、ＳＣＡ−１変更遺伝子プロモーター及び／又はエンハンサーを含むがこれらに限定されない、ＳＣＡ−１変更遺伝子の調節領域に相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的することによって、内因性ＳＣＡ−１変更遺伝子発現を低下させることができる（一般に、Ｈｅｌｅｎｅ，１９９１、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．，６（６）、５６９−５８４；Ｈｅｌｅｎｅら、１９９２、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６０、２７−３６；及びＭａｈｅｒ，１９９２、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １４（１２）、８０７−８１５）。
【０２０８】
５．１３．２．ＳＣＡ−１エンハンサーによる遺伝子治療
ＳＣＡ−１変更遺伝子の発現又は活性のレベルを高めることに関して、ＳＣＡ−１変更遺伝子を、例えば遺伝子治療の形態で投与することができる。遺伝子治療とは、被験者への発現された又は発現可能な核酸の投与によって行われる治療を指す。本発明のこの実施形態では、ＳＣＡ−１エンハンサー核酸は、治療作用を仲介するそれらのコードされたタンパク質を産生する。明細には、正常なＳＣＡ−１変更遺伝子機能を示すＳＣＡ−１変更遺伝子産物の産生を指令する正常ＳＣＡ−１変更遺伝子又はＳＣＡ−１変更遺伝子の部分の１又はそれ以上のコピーを、本発明に従って使用できる当該技術で使用可能な遺伝子治療のための方法のいずれかを用いて、患者内の適切な細胞に挿入しうる。例示的な方法を下記に述べる。
【０２０９】
遺伝子治療の方法の全般的総説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら、１９９３、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５；ＷｕとＷｕ，１９９１、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒａｍｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２；ＭｏｒｇａｎとＡｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７；Ｍａｙ，１９９３、ＴＩＢＴＥＣＨ  １、１（５）：１５５−２１５参照。使用できる組換えＤＮＡテクノロジーの当該技術で一般的に既知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ニューヨーク（１９９３）；及びＫｒｉｅｇｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク（１９９０）に述べられている。
【０２１０】
好ましい局面では、治療薬はＳＣＡ−１エンハンサーをコードする核酸配列を含み、該核酸配列は、適当な宿主においてＳＣＡ−１エンハンサー又はそのフラグメント又はキメラタンパク質又は重又は軽鎖を発現する発現ベクターの部分である。特に、そのような核酸配列は、ＳＣＡ−１エンハンサーコード領域に動作可能なように連結されたプロモーターを持ち、該プロモーターは誘導的又は構成的であり、任意に組織特異的である。もう１つの特定実施形態では、ＳＣＡ−１エンハンサーコード配列と他の何らかの所望する配列がゲノム内の所望する部位での相同的組換えを促進する領域によって隣接しており、その結果ＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子の染色体内発現を提供する核酸分子を使用する（ＫｏｌｌｅｒとＳｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８）。
【０２１１】
患者の体内への核酸の供給送達は、直接的であるか、この場合には患者は核酸又は核酸を担うベクターと直接接触する、又は間接的であり、この場合には最初にインビトロで細胞を核酸で形質転換し、その後患者に移植する。これら２つアプローチは、それぞれインビボ又はエクスビボ遺伝子治療として知られる。
【０２１２】
特定実施形態では、核酸配列を直接インビボで投与し、それが発現されてコードされた産物を生じる。これは、当該技術で既知の数多くの方法のいずれかによって、例えば適切な核酸発現ベクターの一部としてそれらを構築し、核酸配列が細胞内に入るようにベクターを投与することによって実施できる。遺伝子治療ベクターは、欠損又は弱毒化レトロウイルス又は他のウイルスベクターを使用する感染（例えば米国特許第４，９８０，２８６号参照）；裸のＤＮＡの直接注入；マイクロパーティクル衝撃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）の使用；脂質又は細胞表面受容体又は形質移入剤による被覆；リポソーム、マイクロパーティクル、又はマイクロカプセル内への被包；核に入り込むことが知られているペプチドへの連結投与；受容体を介したエンドサイトーシスに供されるリガンドへの連結投与（例えばＷｕとＷｕ，１９８７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２）（受容体を特異的に発現する細胞型を標的するために使用できる）；等々によって投与することができる。もう１つの実施形態では、リガンドが、エンドソームを破壊して核酸がリソソーム分解を免れることを可能にする融合原性ウイルスペプチドを含む、核酸−リガンド複合体を形成することができる。さらにもう１つの実施形態では、特異的受容体を標的することにより、細胞特異的取込みと発現のために核酸をインビボで標的することができる（例えばＰＣＴ特許願公開第ＷＯ９２／０６  １８０号；ＷＯ９２／２２６３５号；ＷＯ９２／２０３１６号；ＷＯ９３／１４１８８号、及びＷＯ９３／２０２２１号参照）。代替的には、相同的組換えによって核酸を細胞内に導入し、発現のために宿主細胞ＤＮＡに組み込むことができる（ＫｏｌｌｅｒとＳｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５；Ｚｉｊｌｓｔｒａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８）。
【０２１３】
特定実施形態では、ＳＣＡ−１エンハンサータンパク質をコードする核酸配列を含むウイルスベクターを使用する。例えば、レトロウイルスベクターが使用できる（Ｍｉｌｌｅｒら、１９９３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１−５９９参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングと宿主細胞ＤＮＡへの組込みのために必要な成分を含む。遺伝子治療において使用されるＳＣＡ−１エンハンサーをコードする核酸配列を１又はそれ以上のベクターにクローニングし、それによって患者の体内への遺伝子の送達を容易にする。レトロウイルスベクターについての詳細は、化学療法に対してより抵抗性の幹細胞を作製するために造血幹細胞にｍｄｒ  １遺伝子送達するためのレトロウイルスベクターの使用を述べた、Ｂｏｅｓｅｎら、１９９４、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ６：２９１−３０２に認められる。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を説明している他の参考文献は次の通りである：Ｃｌｏｗｅｓら、１９９４、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４−６５１；Ｋｌｅｉｎら、１９９４、Ｂｌｏｏｄ  ８３：１４６７−１４７３；ＳａｌｍｏｎｓとＧｕｎｚｂｅｒｇ，１９９３、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１２９−１４１；及びＧｒｏｓｓｍａｎとＷｉｌｓｏｎ，１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．３：１１０−１１４。
【０２１４】
遺伝子治療へのもう１つのアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムを介した形質移入、又はウイルス感染のような方法によって細胞培養中の細胞にＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子を導入することを含む。次に細胞を選択下に置き、導入された遺伝子を取り込み、発現している細胞を単離する。その後それらの細胞を患者に送達する。
【０２１５】
この実施形態では、生じる組換え細胞のインビボでの投与に先立ってＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子を細胞に導入する。そのような導入は、形質移入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルス又はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体を介した遺伝子導入、微小核細胞を介した遺伝子導入、スフェロプラスト融合、等々を含むがこれらに限定されない、当該技術において既知の何らかの方法によって実施できる。外来遺伝子の細胞への導入に関しては数多くの手法が当該技術において既知であり（例えばＬｏｅｆｆｌｅｒとＢｅｈｒ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９−６１８；Ｃｏｈｅｎら、１９９３、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８−６４４；Ｃｌｉｎｅ，１９８５、Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．２９：６９−９２参照）、レシピエント細胞の必要な発生及び生理的機能を破壊しないことを条件として、本発明に従って使用しうる。手法は、核酸が細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝性で、その細胞子孫によって発現されうるように、細胞への核酸の安定な導入を提供すべきである。
【０２１６】
生じた組換え細胞は、当該技術で既知の様々な方法によって患者に送達できる。使用に際して想定される細胞の量は所望する効果、患者の状態、等々に依存し、当業者によって決定されうる。
【０２１７】
組換え細胞を遺伝子治療において使用する実施形態では、ＳＣＡ−１エンハンサーをコードする核酸配列を、それらが細胞又はそれらの子孫によって発現されうるように細胞内に導入し、次に組換え細胞を治療効果のためにインビボで投与する。特定実施形態では、神経幹細胞又は前駆細胞を使用する。中枢神経系における神経発生は出生前又は出生直後に停止すると一般に考えられていた。近年、いくつかの試験が、少なくともある程度まで新しいニューロンが成体脊椎動物の脳に付加され続けることを示す証拠を提示した（Ａｌｖａｒｅｚ−ＢｕｙｌｌａとＬｏｉｓ，１９９５，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｄａｙｔ）１３：２６３−２７２）。前駆体は一般に脳質の壁に局在する。これらの増殖領域から、神経前駆物質が標的位置へと移動し、そこでミクロ環境がそれらを分化させると考えられる。脳質下領域からの細胞がインビボならびにインビトロでニューロンを生成できるという試験が報告されており、Ａｌｖａｒｅｚ−ＢｕｙｌｌａとＬｏｉｓ，１９９５，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ（Ｄａｙｔ）１３：２６３−２７２において検討されている。
【０２１８】
成体脳からの神経前駆物質は神経移植のための細胞源として使用できる（Ａｌｖａｒｅｚ−Ｂｕｙｌｌａ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２０７４−２０７７）。神経冠細胞も、長年にわたって、それらが存在するミクロ環境から受け取る指示に従って移動し、種々の神経細胞型へと分化することができる多能性神経細胞であると認識されてきた（ＬｅＤｏｕａｒｉｎとＺｉｌｌｅｒ，１９９３、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１０３６−１０４３）。
【０２１９】
５．１４．ＳＣＡ−１活性を持つ化合物をスクリーニングするためのＳＣＡ−１変更遺伝子の使用
本発明はまた、神経変性疾患、特にＳＣＡ−１のようなポリグルタミン病に対して活性を示す化合物を同定するための方法を包含する。より特定すると、本発明は、本発明の変更因子スクリーニングによって示されるような、ＳＣＡ−１神経変性を含むがこれに限定されない神経変性に寄与する細胞経路の成分と相互作用する化合物の同定、及び治療薬としてのそれらの使用を包含する。明細には、本発明は、神経変性疾患の治療におけるＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子のアゴニスト及びＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子のアンタゴニストの同定と使用を包含する。そのような化合物は、異なる親和性でＳＣＡ−１変更遺伝子又はＳＣＡ−１変更遺伝子産物に結合することができ、ＳＣＡ−１表現型を制御する上で有用な治療適用を持つ、インビボでのＳＣＡ−１変更遺伝子又はＳＣＡ−１変更遺伝子産物の活性の変更因子として使用しうる。
【０２２０】
さらに、本発明は、ＳＣＡ−１病因を阻害する化合物をスクリーニングするために本発明のアタキシン−１遺伝子組換え動物を使用することを含む。機序に関する限定を伴わずに、そのような化合物は、細胞からのアタキシン−１のクリアランスを促進する又はその核局在を妨げることができ、それによってＳＣＡ−１の病因を制御しうる。
【０２２１】
５．１４．１．インビトロスクリーニングアッセイ
本発明は、神経変性疾患の治療薬に関するインビトロスクリーニングアッセイを提供する。本発明の一部の実施形態では、化合物及び組成物を、ＳＣＡ−１変更遺伝子産物への作用の変調に関して試験する。特に、ＳＣＡ−１変更遺伝子産物の安定性、発現、及び／又は活性への作用を変調することに関して化合物及び組成物を試験することができる。本発明の一部の特定実施形態では、試験化合物をＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子産物へのアゴニスト作用に関して試験する。本発明の一部の他の実施形態では、試験化合物をＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子産物へのアンタゴニスト作用に関して試験する。ＳＣＡ−１のモジュレーター、すなわちＳＣＡ−１エンハンサーのアゴニストとＳＣＡ−１サプレッサーのアンタゴニストは、神経変性疾患のための治療薬として使用することができる。
【０２２２】
一部の実施形態では、スクリーニングアッセイは、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質を被験分子に接触させ、被験分子がＳＣＡ−１変更因子タンパク質に結合するかどうかを調べることに基づく。被験分子がＳＣＡ−１変更因子タンパク質に結合すれば、被験分子をＳＣＡ−１変更因子タンパク質へのアゴニスト又はアンタゴニスト作用に関して検定することができる。１つの非制限的な例では、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質を標識し、ペプチドλｇｔｌ１発現ライブラリーに接触させるために使用して、ＳＣＡ−１変更因子が結合するペプチド分子を同定する。
【０２２３】
もう１つの実施形態では、スクリーニングアッセイは、ＳＣＡ−１変更遺伝子とそのコードするタンパク質の機能の性質を考慮して、被験分子がＳＣＡ−１変更因子タンパク質の機能を作動させる又は機能に拮抗する能力に基づく。例えば、ＳＣＡ−１変更遺伝子がＲＮＡ結合タンパク質（ｐｕｍｉｌｉｏ又はキノコ体発現のような）をコードする場合、インビトロで形成されるＳＣＡ−１変更因子タンパク質とそれらのＲＮＡ標的との複合体を被験分子に接触させ、相互作用を阻害する分子を同定することができる。代替的には、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質のＲＮＡ標的部位を被験分子に接触させ、ＲＮＡ標的部位に結合する分子を同定して、それによってＳＣＡ−１変更因子タンパク質の標的部位への結合を模倣することができる。
【０２２４】
ＳＣＡ−１変更遺伝子産物に結合することができる化合物を同定するためのインビトロ系を設計することができる。同定される化合物は、例えば野生型及び／又は突然変異体ＳＣＡ−１変更遺伝子産物の活性を変調させる上で有用であり、ＳＣＡ−１変更遺伝子産物の正常な相互作用を分断する化合物を同定するためのスクリーニングにおいて使用できるか、又はそれら自体がそのような相互作用を分断することができる。
【０２２５】
ＳＣＡ−１変更遺伝子産物に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、ＳＣＡ−１変更遺伝子産物と試験化合物の反応混合物を、２つの成分が相互作用して結合し、その結果複合体を形成しうるのに十分な条件下で十分な時間調製し、かかる複合体を反応混合物から取り出す及び／又は検出することを含む。これらのアッセイは様々な方法で実施することができる。例えば、そのようなアッセイを実施する１つの方法は、特定のＳＣＡ−１変更遺伝子産物又は被験物質を固相に固定し、反応の終了時に固相に固定されたＳＣＡ−１変更遺伝子産物／被験物質複合体を検出することを含む。そのような方法の１つの実施形態では、ＳＣＡ−１変更遺伝子産物を固体表面に固定し、固定されていない被験物質を直接又は間接的に標識することができる。
【０２２６】
実際には、マイクロタイタープレートが固相として好都合に利用できる。固定する成分は、非共有結合又は共有結合によって固定化することができる。非共有結合は、単に固体表面をタンパク質の溶液で被覆し、乾燥することによって実施できる。代替的には、固定化するタンパク質に特異的な固定化された抗体、好ましくはモノクローナル抗体を使用して、タンパク質を固体表面に固定することができる。表面は、前もって調製し、保存しておくことができる。
【０２２７】
アッセイを実施するために、非固定化成分を、固定された成分を含む被覆表面に加える。反応が完了した後、形成された複合体が固体表面に固定されたままであるような条件下で非反応成分を除去する（例えば洗浄によって）。固体表面に固定された複合体の検出はいくつかの方法で実施できる。事前に固定化されていない成分を予備標識しておく場合には、表面に固定された標識の検出が複合体の形態を示す。事前に固定化されていない成分を予備標識しない場合には、間接標識を使用して、例えば事前に固定化されていない成分に特異的な標識抗体（抗体を、今度は、標識した抗Ｉｇ抗体で直接又は間接的に標識することができる）を使用して表面に固定された複合体を検出することができる。
【０２２８】
代替的には、反応を液相において実施し、反応産物を非反応成分から分離して、例えば溶液中で形成された複合体を固定するためのＳＣＡ−１変更因子又は試験化合物に特異的な固定化抗体と、固定された複合体を検出するための、生じうる複合体の他の成分に特異的な標識抗体を使用して、複合体を検出することができる。
【０２２９】
限定ではなく一例として、この章で述べるような手法がＳＣＡ−１変更遺伝子産物に結合する化合物を同定するために利用できる。例えば、ＳＣＡ−１変更遺伝子産物を、ＳＣＡ−１変更遺伝子産物／化合物複合体を形成するのに十分な時間、化合物と接触させ、その後そのような複合体を検出することができる。
【０２３０】
代替的には、化合物を、ＳＣＡ−１変更遺伝子産物／化合物複合体を形成するのに十分な時間、反応混合物中でＳＣＡ−１変更遺伝子産物と接触させ、その後そのような複合体を反応混合物から分離することができる。
【０２３１】
本発明の一部の実施形態では、ＳＣＡ−１変更遺伝子産物の生化学活性を配列の整列と比較によって決定する。タンパク質の一部の生化学活性がそのアミノ酸配列に基づいて測定できることは当業者には周知である。この情報に基づき、生化学アッセイを設計し、このアッセイにおいてＳＣＡ−１変更遺伝子産物の活性への作用を変調させることに関して化合物及び組成物を試験することができる。限定ではなく一例として、対象とするＳＣＡ−１変更遺伝子産物はキナーゼでありうる。アッセイを実施するために、ＳＣＡ−１変更遺伝子産物を反応条件下で適当な基質及びＡＴＰと共に、キナーゼによる基質のリン酸化のために十分な時間インキュベートする。キナーゼ反応の定量のために、例えば放射能標識したＡＴＰが使用できる。インキュベーションに続いて、反応混合物をＳＤＳ  ＰＡＧＥによって分解し、その後ゲルをＸ線フィルムに曝露して、取り込まれた放射能を検出する。シグナルの強度はＳＣＡ−１変更遺伝子産物のキナーゼ活性に比例する。ＳＣＡ−１変更遺伝子産物のモジュレーターを同定するために、種々の化合物と組成物を反応混合物に加えて、キナーゼ活性へのそれらの作用を測定する。
【０２３２】
そのような方法に使用できるＳＣＡ−１変更因子の中でも特に、例えば本出願の表２−４に列挙されている遺伝子、及び天然に生じるそれらの変異体が挙げられる。
【０２３３】
ここで使用するとき「天然に生じる変異体」の語は、例えばＳＣＡ−１変更遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列と同じ染色体位置又はそのような位置とシンテニーの位置に位置づけられるＳＣＡ−１変更因子の対立遺伝子変異体のような、ショウジョウバエ又は異なる種におけるＳＣＡ−１変更遺伝子産物に相同なアミノ酸配列を指す。ここで使用できる対立遺伝子変異体の中でも特に、上述したＳＣＡ−１変更遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列の相補物に厳密条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる対立遺伝子変異体配列が挙げられる。
【０２３４】
上述したインビトロ法に代わるものとして又はそれに加えて、ＳＣＡ−１変更因子の発現又は活性を変調させうる化合物を同定するため、又は既に同定された化合物を改善するために、コンピュータモデリングと検索テクノロジーが使用できる。そのような化合物又は組成物が同定されれば、好ましくは活性部位又は領域を同定する。
【０２３５】
次に、好ましくは活性部位の三次元幾何構造を決定する。これは、完全な分子構造を決定することができるＸ線結晶解析を含めた既知の方法によって実施できる。固相又は液相ＮＭＲも、活性部位内の及び／又はリガンド結合複合体におけるある種の分子内距離を測定するために使用できる。構造決定の他のいかなる実験的方法も、部分的又は完全な幾何構造を得るために使用できる。
【０２３６】
コンピュータに基づく数値モデリングの方法は、構造を完全にするため（例えば不完全な又は正確さが不十分な構造が決定される実施形態において）又はその正確度を改善するために使用できる。タンパク質又は核酸のような特定の生体高分子に特異的なパラメータ化されたモデル、コンピュータ演算分子運動に基づく分子動力学モデル、熱アンサンブルに基づく統計力学モデル、又は混合モデルを含むがこれらに限定されない、当該技術で認識されているいかなるモデリング法も使用しうる。大部分の種類のモデルについては、構成原子と基の間の力を表わす、標準分子力場が必要であり、物理化学において既知の力場から選択できる。当該技術で既知であり、そのような方法において使用できる例示的な力場は、定原子価力場（Ｃｏｎｓｔａｎｔ  Ｖａｌｅｎｃｅ  Ｆｏｒｃｅ  Ｆｉｅｌｄ，ＣＶＦＦ）、ＡＭＢＥＲ力場及びＣＨＡＲＭ力場を含むが、これらに限定されない。不完全な又は正確度の低い実験的構造が、これらのモデリング法によってコンピュータ算定される完全でより正確な構造に対する拘束として使用できる。
【０２３７】
最後に、実験的に、モデリングによって、又はそれらの組合せによって活性部位の構造が決定されれば、化合物をそれらの分子構造に関する情報と共に含むデータベースを検索することによって候補変調化合物を同定することができる。そのような検索は、決定された部位構造に適合し、活性部位を規定する基と相互作用する構造を持つ化合物を探索する。そのような検索は手動でもよいが、好ましくはコンピュータを援用する。この検索から検出されたこれらの化合物は、潜在的な標的又は経路遺伝子産物変調化合物である。
【０２３８】
代替的に、これらの方法を使用して、既に既知である変調化合物又は相互作用タンパク質から改善された変調化合物を同定することができる。既知の化合物の組成物を変化させ、上述した実験的及びコンピュータモデリング法を新しい組成物に適用して、変化の構造的影響を調べることができる。次に変化した構造を化合物の活性部位構造と比較して、改善された適合性又は相互作用がもたらされたかどうかを判定する。このようにして、側鎖基を変化させることによるような組成物における体系的な変化を速やかに評価して、変化した変調化合物又は改善された特異性又は活性のリガンドを得ることができる。
【０２３９】
分子モデリングシステムの例は、ＣＨＡＲＭｍ及びＱＵＡＮＴＡプログラム（Ｐｏｌｙｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）である。ＣＨＡＲＭｍはエネルギーの最小化と分子力学機能を達成する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフィックモデリング及び解析を実施する。ＱＵＡＮＴＡは、分子間の相互作用性構築、修飾、視覚化、及び行動の解析を可能にする。
【０２４０】
Ｒｏｔｉｖｉｎｅｎら、１９８８、Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｅｎｎｉｃａ  ９７：１５９−１６６；Ｒｉｐｋａ，（１９８８年６月１６日）、Ｎｅｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ  ５４−５７；ＭｃＫｉｎａｌｙとＲｏｓｓｍａｎｎ，１９８９、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２９：１１１−１２２；ＰｅｒｒｙとＤａｖｉｅｓ，ＯＳＡＲ：薬剤設計における量的な構造−活性関係  ｐｐ．１８９−１９３（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８９）；ＬｅｗｉｓとＤｅａｎ，１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．２３６：１２５−１４０及び１−１６２のような、多くの文献が特定タンパク質と相互作用する薬剤のコンピュータモデリングを検討しており、また核酸成分についてのモデル受容体に関しては、Ａｓｋｅｗら、１９８９、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：１０８２−１０９０で検討されている。化学物質をスクリーニングし、グラフィックで表わす他のコンピュータプログラムは、ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ，Ｉｎｃ．（パサディナ，カリフォルニア）、Ａｌｌｅｌｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｍｉｓｓｉｓａｕｇａ，Ｏｎｔａｒｉｏ，カナダ）、及びＨｙｐｅｒｃｕｂｅ，Ｉｎｃ．（ケンブリッジ，オンタリオ）のような会社から入手可能である。これらは主として特定タンパク質に特異的な薬剤への適用のために設計されているが、ＤＮＡ又はＲＮＡの領域に対して特異的な薬剤の設計にも、ひとたびその領域が同定されれば、応用することができる。
【０２４１】
５．１４．２．細胞ベースのスクリーニングアッセイ
本発明はさらに、その活性が知られているＳＣＡ−１変更因子についてのＳＣＡ−１治療薬の細胞ベースのスクリーニングアッセイを提供する。これらのアッセイは、化合物ライブラリーに関する一次スクリーニングにおいて又はＳＣＡ−１変更因子タンパク質にインビトロで結合することが同定された分子に関する確認アッセイとして使用できる。下記６．１２章で述べるようにＳＣＡ−１変更遺伝子は様々な異なる機能を持つので、個々の細胞培養アッセイはＳＣＡ−１変更因子の機能に依存する。
【０２４２】
ＳＣＡ−１変更遺伝子がＳｉｎ３Ａ又はＲｐｄ３転写リプレッサーのような転写調節因子をコードする１つの実施形態では、ＳＣＡ−１変更因子の活性をモニターするためにレポーター遺伝子アッセイが使用できる。そのようなアッセイは、転写調節因子の結合部位（又は転写調節因子が成分である複合体の結合部位）をレポーター遺伝子に動作可能なように連結し、細胞を被験分子に接触させて遺伝子発現をモニターすることを必要とする。ＳＣＡ−１変更因子タンパク質によって提供される転写調節の性質に依存して、またＳＣＡ−１変更因子タンパク質のアゴニスト又はアンタゴニストのいずれを探索するかに依存して、レポーター遺伝子の活性化又は抑制をモニターしうる。
【０２４３】
ＳＣＡ−１変更遺伝子によってコードされるタンパク質の多くは多タンパク質複合体の一部である。ＳＣＡ−１変更因子タンパク質と多タンパク質複合体の他の成分との相互作用を阻害する又は増強する分子を同定するためのスクリーニングアッセイを設計することができる。１つの非制限的な例では、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質とその相互作用パートナーを酵母ツーハイブリッドシステムにおいて使用する。ＳＣＡ−１変更因子タンパク質とその相互作用パートナーは、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質又はその相互作用パートナーに融合したＤＮＡ結合ドメインに応答性であるレポーター遺伝子を含む酵母菌株において、転写活性化ドメイン及び転写ＤＮＡ結合ドメインとの融合タンパク質として各々発現される。２つの融合タンパク質とレポーターを発現する酵母のコロニーを被験分子と接触させて、レポーター遺伝子発現のレベルによって測定したとき、ＳＣＡ−１変更因子タンパク質とその相互作用パートナー間の相互作用を低下又は上昇させる分子を同定する。
【０２４４】
さらにもう１つの実施形態では、ＰＣ１２ラット褐色細胞腫細胞（Ｇｒｅｅｎｅら、１９９１、「ＰＣ１２ラット褐色細胞腫細胞系統の培養と実験的使用のための方法論」ｐ．２０７−２２５、Ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ  Ｎｅｒｖｅ  Ｃｅｌｌｓ，Ｔｈｅ  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，ケンブリッジ，Ｍａｓｓ．より）を神経変性疾患についての細胞培養モデルとして使用する。明細には、分化したＰＣ１２からの神経突起外殖の生存率を検定して、神経変性疾患の治療のための物質を同定することができる。
【０２４５】
かかる実施形態の一部の様式では、ＰＣ１２細胞における１又はそれ以上のＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子の活性が分断され（例えばアンチセンス発現又はリボザイムを通して）、それが分化したＰＣ１２細胞の生存率を低下させ、細胞からの神経突起外殖を低下させると予想される。その後細胞を様々な試験化合物と接触させて、細胞の生存率又は神経突起外殖表現型を採点する。ＰＣ１２細胞の生存率又はＰＣ１２細胞からの神経突起外殖を上昇させる化合物は、神経変性疾患のための候補治療薬である。
【０２４６】
逆に、ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子がＰＣ１２細胞において過剰発現されることがあり、これは分化したＰＣ１２細胞の生存率を低下させ、細胞からの神経突起外殖を低下させると予想される。その後細胞を様々な試験化合物と接触させて、細胞の生存率又は神経突起外殖表現型を採点する。ＰＣ１２細胞の生存率又はＰＣ１２細胞からの神経突起外殖を上昇させる化合物は、神経変性疾患のための候補治療薬である。
【０２４７】
５．１４．３．インビボスクリーニングアッセイ
本発明はさらに、ＳＣＡ−１表現型を有する又はＳＣＡ−１表現型を発現する性向を持つショウジョウバエ培養を被験分子と接触させ、被験分子がＳＣＡ−１疾病を低下させる又は予防するかどうかを判定することに基づく、ＳＣＡ−１治療薬のためのインビボスクリーニングアッセイを提供する。
【０２４８】
好ましい実施形態では、アッセイは、正常アタキシン−１（例えばアタキシン−１  ３０Ｑ）又は伸長したポリグルタミン反復配列を持つアタキシン−１（例えばアタキシン−１  ８２Ｑ）を含む遺伝子組換えショウジョウバエ系統を、例えば試験化合物をショウジョウバエ培地に適用することによって１又はそれ以上の試験化合物と接触させ、動物における進行性神経変性が、同じアタキシン−１導入遺伝子を発現する、好ましくは同じ遺伝子組換え系統であるが被験分子に接触させていない対応動物の進行性神経変性よりも軽度であるかどうかを判定することにより、ＳＣＡ−１疾病を予防する分子をスクリーニングするために実施できる。
【０２４９】
極めて好ましい実施形態では、アタキシン−１導入遺伝子を動物の眼組織で発現させ、粗眼表現型を生じさせる。他の実施形態では、神経変性及び核封入体形成のような、但しこれらに限定されない、様々なＳＣＡ−１の症状発現を分析することができる。好ましい実施形態では、それに関して試験化合物をスクリーニングする神経変性表現型は運動機能不全である。もう１つの好ましい実施形態では、神経変性表現型は短命である。ショウジョウバエの寿命は、例えば上記第５．３章で述べたようにアタキシン−１の発現レベルを操作することによって、１０−８０％、例えば約３０％、４０％、５０％、６０％、又は７０％低下させることができる。
【０２５０】
試験化合物はショウジョウバエの発育の種々の段階で適用することができる。好ましくは、幼虫期に、最も好ましくは眼発生が起こる主要幼虫期である第三幼虫齢で、試験化合物をショウジョウバエ培養に加える。
【０２５１】
試験化合物は、発育の様々な段階のショウジョウバエ及び成虫ショウジョウバエに餌として与えることができる。１つの実施形態では、試験化合物をショウジョウバエの食餌に、最も好ましくはショウジョウバエ培養に加えることができる酵母ペーストに混合する。
【０２５２】
アタキシン−１を異所性発現するショウジョウバエについて述べたのと同様のスクリーニングアッセイが、ＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子を異所性発現するショウジョウバエ又はＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子についての突然変異体であるショウジョウバエに関して実施することができ、本発明に包含される。
【０２５３】
本発明のインビボスクリーニング法においては、試験化合物のライブラリーをフィルターストリップに提供することができ、次にそれをスクリーニングのために個別にショウジョウバエ培養バイアルに入れる。
【０２５４】
本発明の特定実施形態では、化合物ライブラリーからの化合物をマイクロインジェクションによって、好ましくは２０００年６月２９日公開のＷＯ００／３７９３８号に述べられているようにショウジョウバエ血液リンパへのマイクロインジェクションによって投与する。
【０２５５】
スクリーニングの効率のために、また個々の試験化合物に関するスクリーニングに加えて、試験化合物を少なくとも５、１０、２０、５０、又は１００化合物のプールとして投与することができる。「ヒット」、すなわちアタキシン−１に関連する表現型の変更因子又はＳＣＡ−１変更遺伝子を同定する際に、プールの個々の成分を独立してアッセイして、対象とする特定化合物を同定することができる。
【０２５６】
ここで述べるスクリーニングアッセイは、正常アタキシン−１又は伸長したグルタミン反復配列を持つアタキシン−１を発現する遺伝子組換えショウジョウバエにおいてＳＣＡ−１病因を抑制することができる、ペプチド及び有機非タンパク質分子を含めた化合物及び組成物を同定するために使用できる。組換え、合成、及び他の外因性化合物が活性を持つ可能性があり、それ故、薬剤のための候補物質でありうる。
【０２５７】
５．１４．４．行動性アッセイ
本発明のインビボスクリーニングアッセイの１つの実施形態では、ショウジョウバエの中枢神経系における脊椎動物疾患遺伝子の異所性発現の結果として、ハエにおいて生じる行動性欠損を変化させる能力に関して試験化合物を検定することができる。好ましい実施形態では、脊椎動物疾患遺伝子は哺乳類疾患遺伝子、最も好ましくはヒト疾患遺伝子である。中枢神経系における神経変性は、運動低下を含むがこれに限定されない行動性欠損を生じさせ、それらを幼虫及び成虫ショウジョウバエにおいて検定し、定量することができる。例えば、標準登上（ｃｌｉｍｂｉｎｇ）アッセイにおいてショウジョウバエ成虫が登上する能力の欠損は（例えばＧａｎｅｔｚｋｙとＦｌａｎｎａｇａｎ，１９７８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  １３：１８９−１９６；ＬｅＢｏｕｒｇとＬｉｎｔｓ，１９９２，Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  ２８：５９−６４参照）定量可能であり、動物が運動低下と神経変性を有する度合の指標である。検定できるショウジョウバエ行動の他の局面は、概日行動リズム、摂食行動、外部刺激に対する慣れ、及びにおい物質条件付けを含むが、これらに限定されない。
【０２５８】
ショウジョウバエ中枢神経系における関連脊椎動物疾患遺伝子の発現によって引き起こされる脊椎動物疾患の治療薬のスクリーニングは、脊椎動物疾患遺伝子の発現によって引き起こされる登上行動欠損を持つ幼虫又は成虫ハエを上述したように試験化合物に接触させ、動物の異常登上行動を軽減する分子を同定することによって実施できる。
【０２５９】
ここで述べる神経変性疾患に加えて、開示する方法は、増殖性疾患、骨格筋疾患、膵臓疾患、心臓及び心臓血管疾患、肺疾患、下垂体関連疾患、副腎疾患、甲状腺疾患、胃、腸及び結腸疾患、肝疾患、腎疾患、脾疾患、骨疾患、骨髄疾患、眼疾患、前立腺疾患、白血球減少症（例えば好中球減少症、単球減少症、リンパ球減少症、及び顆粒球減少症のような白血球疾患、免疫疾患、炎症性疾患、アポトーシス疾患、及び免疫疾患のような他の脊椎動物疾患の変更因子をスクリーニングするために使用できる。
【０２６０】
特定実施形態では、増殖性疾患は癌である。適当な癌は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、又はＨ鎖病である。もう１つの特定実施形態では、増殖性疾患は、筋ジストロフィー、運動ニューロン疾患、又はミオパシーを含むがこれらに限定されない骨格筋疾患である。
【０２６１】
５．１４．５．試験化合物の源
ここで述べるスクリーニングアッセイは、ＳＣＡ−１のための治療薬の候補である小分子、ペプチド又はタンパク質、またそれらの誘導体、類似体又はフラグメントを同定するために使用しうる。
【０２６２】
本発明のスクリーニングアッセイにおいて有用と考えられる化合物は、ランダムなペプチドライブラリーから誘導されるペプチドならびにＤ−及び／又はＬ−立体配置アミノ酸から作製される無作為配列化学由来の分子ライブラリー、ホスホペプチド（ランダムな又は部分縮重指定ホスホペプチドライブラリーの成員を含むがこれらに限定されない；例えばＳｏｎｇｙａｎｇら、１９９３、Ｃｅｌｌ  ７２：７６７−７７８参照）、抗体（ポリクローナル、モノクローナル、ヒューマナイズド、抗イディオタイプ、キメラ又は一本鎖抗体、及びＦＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２及びＦＡｂ発現ライブラリーフラグメント、及びそれらのエピトープ結合フラグメント）、及び低分子量有機又は無機分子を含むが、これらに限定されない。
【０２６３】
本発明の１つの実施形態では、ペプチドライブラリーは、ＳＣＡ−１治療薬をスクリーニングするために使用できる試験化合物の源として使用しうる。ランダム又は無作為配列ペプチド又は非ペプチドライブラリーのような多様なライブラリーを、ＳＣＡ−１表現型を特異的に変化させる分子に関してスクリーニングすることができる。使用できる多くのライブラリーが当該技術において既知であり、例えば化学合成ライブラリー、組換え（例えばファージディスプレイライブラリー）、及びインビトロ翻訳ベースライブラリーが挙げられる。
【０２６４】
化学合成ライブラリーの例は、Ｆｏｄｏｒら、１９９１、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７７３；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６；Ｌａｍら、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４；Ｍｅｄｙｎｓｋｉ，１９９４、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：７０９−７１０；Ｇａｌｌｏｐら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７（９）；１２３３−１２５１；Ｏｈｌｍｅｙｅｒら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０９２２−１０９２６；Ｅｒｂら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−１１４２６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２；Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１６１４−１６１８；Ｓａｌｍｏｎら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１７０８−１１７１２；ＰＣＴ特許願公開第ＷＯ９３／２０２４２号；及びＢｒｅｎｎｅｒとＬｅｒｎｅｒ，１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５３８１−５３８３に述べられている。
【０２６５】
ファージディスプレイライブラリーの例は、Ｓｃｏｔｔ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎら、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１−７１８；Ｌｅｎｓｔｒａ，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２；１４９−１５７；Ｋａｙら、１９９３、Ｇｅｎｅ  １２８：５９−６５；及び１９９４年８月１８日付のＰＣＴ特許願公開第ＷＯ９４／１８３１８号に述べられている。
【０２６６】
非ペプチドライブラリーの例として、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えばＢｕｎｉｎら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４７０８−４７１２参照）を使用に適合させることができる。ペプトイドライブラリー（Ｓｉｍｏｎら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７−９３７１）も使用できる。化学的に形質転換された無作為配列ライブラリーを作製するためにペプチド内のアミド官能基を過メチル化した、使用できるライブラリーのもう１つの例が、Ｏｓｔｒｅｓｈら（１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１１３８−１１１４２）によって述べられている。
【０２６７】
ここで述べる方法によって試験し、同定することができる化合物は、Ａｌｄｒｉｃｈ（ミルウォーキー，ウィスコンシン５３２３３）、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（セントルイス，ミズーリ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ（Ｂｕｃｈｓ，スイス）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．（ロンコンコマ，ニューヨーク）、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（キングスポート，テネシー）、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ（マンハイム，ドイツ）、Ｔａｋａｓａｇｏ（ロックリー，ニュージャージー）、ＳＳＴ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（クリフトン，ニュージャージー）、Ｆｅｒｒｏ（ザカリー，ロサンゼルス  ７０７９１）、Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅＨａｅｎ  Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ（Ｓｅｅｌｚｅ，ドイツ）、ＰＰＧ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ピッツバーグ，ペンシルベニア  １５２７２）を含む市販の原料から入手される化合物を含みうるが、これらに限定されない。さらに、微生物、真菌、植物又は動物抽出物を含めて、いかなる種類の天然産物もここで述べる方法を用いてスクリーニングしうる。
【０２６８】
さらに、小分子試験化合物を含めた試験化合物の多様なライブラリーが使用しうる。例えば、ライブラリーは、Ｓｐｅｃｓ  ａｎｄ  ＢｉｏＳｐｅｃｓ  Ｂ．Ｖ．（ライスワイク，オランダ）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（サンディエゴ，カリフォルニア）、Ｃｏｎｔｒａｃｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ドルゴプルドヌイ，モスクワ地方，ロシア）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（プリンストン，ニュージャージー）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．（コーンウォール  ＰＬ３４  ＯＨＷ，英国）、及びＡｓｉｎｅｘ（モスクワ，ロシア）から市販されているものを入手しうる。
【０２６９】
さらに、次のものを含むがこれらに限定されない、当該技術において既知の無作為配列ライブラリーが使用できる：生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相又は液相ライブラリー；脱回旋を必要とする合成ライブラリー法；「一ビーズ一化合物」ライブラリー法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーのアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、ペプチド、非ペプチドオリゴマー又は小分子ライブラリーの化合物に対して他のアプローチも適用できる（Ｌａｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５）。小分子試験化合物を含めた試験化合物の無作為配列ライブラリーが使用でき、例えばＥｉｃｈｌｅｒ  ＆  Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、１９９５、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ  １：１７４−１８０；Ｄｏｌｌｅ，１９９７、Ｍｏｌ．Ｄｉｖｅｒｓ．２：２２３−２３６；及びＬａｍ，１９９７，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．１２：１４５−１６７に開示されているように作製できる。
【０２７０】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該技術において、例えば、ＤｅＷｉｔｔら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９；Ｅｒｂら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら、１９９４、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｒｅｌｌら、１９９４、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；及びＧａｌｌｏｐら、１９９４、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３に認められる。
【０２７１】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えばＨｏｕｇｈｔｅｎら、１９９２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−４２１）、又はビーズ上（Ｌａｍ、１９９１、Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  ３６４：５５５−５５６）、細菌（米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（米国特許第５，５７１，６９８号；第５，４０３，４８４号；及び第５，２２３，４０９号）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１８６５−１８６９）又はファージ（ＳｃｏｔｔとＳｍｉｔｈ，１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−３９０；Ｄｅｖｌｉｎ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−４０６；Ｃｗｉｒｌａら、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３７８−６３８２；及びＦｅｌｉｃｉ、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）上で提示されうる。
【０２７２】
５．１４．６．薬剤開発
ここで述べるＳＣＡ−１変更因子は、小分子治療薬を含むがこれに限定されない、ＳＣＡ−１治療薬のための第一標的である。それ故、本発明は、薬剤有効性確認試験における、ここで述べる方法によって同定されたＳＣＡ−１変更因子の使用を包含する。所与のＳＣＡ−１変更因子がＳＣＡ−１治療薬の標的であるかどうかを判定するための方法を提供する。そのような方法は、アタキシン−１を異所性発現する動物への薬剤の作用を、アタキシン−１を異所性発現するが、同時にＳＣＡ−１変更因子内に突然変異を有する動物への薬剤の作用と比較することを必要とする。当業者には明白であるように、また下記で述べるように、そのような比較試験は薬剤標的の有効性確認を可能にし、また所望する場合には、そのような方法は、所望に応じて特異的ＳＣＡ−１変更因子を標的するＳＣＡ−１治療薬をスクリーニングするために利用できる。
【０２７３】
本発明の比較スクリーニング法は、ＳＣＡ−１変更因子の発現レベル又は活性を変化させることはアタキシン−１の毒性を変調させることになるという原理を前提とする。例えば、ＳＣＡ−１変更因子がＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子である場合、ＳＣＡ−１変更因子の発現又は活性を高めることはアタキシン−１発現の毒性を改善する。ＳＣＡ−１治療薬がＳＣＡ−１エンハンサー遺伝子産物を標的する場合には、エンハンサー遺伝子産物の過剰発現は薬剤の作用は滴定外となるだろう。そのような状況下で、薬剤は、−行動及び寿命アッセイを含むがこれらに限定されない、上記第５．１４．３及び５．１４．４章で述べた表現型のいずれかによって検定したとき−さもなければ期待されるであろうよりも低い作用を及ぼす。逆に、ＳＣＡ−１治療薬がＳＣＡ−１サプレッサー遺伝子を標的する場合には、アタキシン−１を異所性発現するショウジョウバエにおいてサプレッサー遺伝子の用量を低下させることは（例えばヘテロ接合性機能喪失突然変異を導入することによって）動物を薬剤に対して感作し、従って薬剤は、さもなければ予想されるよりも大きな作用を持つ。第５．１４．３及び５．１４．４章で広汎に述べたように、運動機能不全、短命、粗眼、等々に関して薬剤の作用を検定することができる。
【０２７４】
さらに、ひとたびＳＣＡ−１治療薬、例えば小分子が同定されれば、それを他の神経変性疾患への治療作用に関して検定することができる。好ましい実施形態では、他の神経変性疾患は、脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡ）−１、ＳＣＡ−２、ＳＣＡ−６、ＳＣＡ−７、マチャド−ジョセフ病（ＭＪＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、脊髄延髄性筋萎縮（ＳＢＭＡ）、又は歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）を含むがこれらに限定されない、ポリグルタミン病である。
【０２７５】
５．１５．製剤
本発明に従って使用するための製薬組成物は、１又はそれ以上の生理的に許容される担体又は賦形剤を使用して従来のように製剤することができる。
【０２７６】
例えば、本発明の治療薬（アタキシン−１のアンタゴニスト、ＳＣＡ−１エンハンサーのアゴニスト及びＳＣＡ−１サプレッサーのアンタゴニスト）と生理的に許容される塩又はその溶媒化合物を、吸入又はガス注入（口又は鼻のいずれかを通して）による投与又は経口、口腔内、非経口又は直腸投与用に製剤することができる。
【０２７７】
経口投与については、製薬組成物は、例えば、結合剤（例えば予備ゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶性セルロース又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、滑石又はシリカ）；崩壊剤（例えばジャガイモデンプン又はデンプングリコレートナトリウム）；又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）のような医薬適合性の賦形剤と共に従来の手段によって調製した錠剤又はカプセルの形態をとりうる。錠剤は当該技術において既知の方法によって被覆することができる。経口投与用の液体製剤は、例えば溶液、シロップ又は懸濁液の形態をとるか、又は使用前に水又は他の適当なビヒクルで還元するための乾燥製品として提供されうる。そのような液体製剤は、沈殿防止剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素添加食用脂肪）；乳化剤（例えばレシチン又はアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えばアーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分画植物油）；及び防腐剤（例えばメチル又はプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）のような医薬適合性の添加物と共に従来の手段によって調製しうる。製剤はまた、適宜に緩衝塩、香味料、着色剤及び甘味料を含みうる。
【０２７８】
経口投与用の製剤は、活性化合物の制御された放出をもたらすために適切に製剤しうる。
【０２７９】
口腔内投与については、組成物は、従来のようにして製剤した錠剤又はロゼンジの形態をとりうる。
【０２８０】
吸入による投与については、本発明に従って使用するための本発明の治療薬は、適当な推進薬、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適当なガスを使用して、加圧パック又はネブライザからエーロゾルスプレーの形態で好都合に送達される。加圧エーロゾルの場合には、計量された量を送達するための弁を備えることによって投与単位を測定することができる。化合物とラクトース又はデンプンのような適当な粉末基剤の粉末混合物を含む、吸入器又は注入器において使用するための、例えばゼラチンのカプセル及びカートリッジを製剤しうる。
【０２８１】
本発明の治療薬は、注射、例えばボーラス注射又は持続注入による非経口投与用に製剤しうる。注射用製剤は、防腐剤を添加した単位投与形態、例えばアンプル又は多回投与容器として提供されうる。組成物は、懸濁液、溶液あるいは油性又は水性ビヒクル中の乳剤のような形態をとり、沈殿防止剤、安定剤及び／又は分散剤のような調剤物質を含みうる。代替的に、有効成分は、使用前に適当なビヒクル、例えば無菌発熱物質不含水で還元するための粉末形態をとりうる。
【０２８２】
本発明の治療薬はまた、例えば、ココアバター又は他のグリセリドのような従来の坐薬基剤を含む、坐薬又は停留浣腸のような直腸組成物として製剤しうる。
【０２８３】
先に述べた製剤に加えて、本発明の治療薬はまた、持続性薬剤としても製剤しうる。そのような長時間作用性製剤は、移植によって（例えば皮下又は筋肉内）又は筋肉内注射によって投与しうる。それ故、例えば、本発明の治療薬は、適当な高分子又は疎水性材料（例えば許容される油中の乳剤として）又はイオン交換樹脂と共に、あるいはかろうじて可溶性の誘導体として、例えばかろうじて可溶性の塩として製剤することができる。
【０２８４】
本発明の一部の実施形態では、本発明の治療薬において医薬適合性の担体は水ではない。
【０２８５】
組成物は、所望する場合には、有効成分を含有する１又はそれ以上の単位投与形態を含みうるパック又は配薬装置として提供されうる。パックは、例えばブリスターパックのような金属又はプラスチック箔を含みうる。パック又は配薬装置には、投与のため、好ましくはヒトへの投与のための指示書を添付しうる。
【０２８６】
本発明は、ここで述べる特定実施形態によって範囲を限定されない。実際に、ここで述べるものに加えて本発明の様々な修正が上記の説明及び添付の図面から当業者には明らかになるであろう。そのような修正は付属の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【０２８７】
下記の実施例において本発明をさらに説明するが、これらはいかなる意味においても本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０２８８】
６．実施例：ポリグルタミンが誘導する神経変性疾患についての遺伝子組換えショウジョウバエ
６．１．実験材料及び方法
６．１．１．ショウジョウバエ遺伝学
ハエの培養と交配は、特に異なる記載がない限り２３℃で実施した。それぞれ３０個と８２個のＣＡＧ反復配列を含む２つのヒトＳＣＡ−１  ｃＤＮＡ（Ｂｕｒｒｉｇｈｔら、１９９５、Ｃｅｌｌ  ８２：９３７−４８）をｐＵＡＳＴ形質転換ベクター（ＢｒａｎｄとＰｅｒｒｉｍｏｎ，１９９３、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１８：４０１−４１５）にクローニングして、ＵＡＳ：ＳＣＡ−１  ３０Ｑ及びＵＡＳ：ＳＣＡ−１  ８２Ｑ遺伝子組換えハエを作製した。これらの構築物を記述されているようにｙ１ｗ１１１８系統に注入した（ＲｕｂｉｎとＳｐｒａｄｉｎｇ，１９８２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１８：３４８−３５３）。ＥＰ系統はＣ．ＣａｔｅｒとＧ．Ｒｕｂｉｎより提供された。ｈｓｃ７０−４１９５ハエはＳ．Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓより提供された。ｃｐｏ１及びｃｐｏＬ１はＨ．Ｂｅｌｌｅｎより提供された。ｐａｐ５３及びｐａｐＥＰ１はＤ．Ｃｒｉｂｂｓより提供された。Ｐ系統及び他のすべての系統はＢｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒより提供された。変更因子スクリーニングのために、遺伝子型ｙ１ｗ１１１８ＵＡＳ：ＳＣＡ−１  ８２Ｑ［Ｆ７］；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／ＣｙＯの雌性を、致死的Ｐ挿入のコレクション、ＥＰ挿入のコレクションからの雄性、又は他の選択した系統に交配した。遺伝的スクリーニングの培養と交配は２５℃で実施した。８２Ｑ［Ｆ７］の特徴的表現型の変化を生じた系統を保存し、２３℃、２７℃及び２９℃で再び交配して相互作用を確認した。選択したＥＰ系統の雌性をｙ１ｗ１１１８ＵＡＳ：ＳＣＡＪ８２Ｑ［Ｆ７］；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／ＣｙＯを担う雄性と交配することにより、ＥＰ系統を特異性に関して試験した。ＵＡＳ：ＳＣＡＪ８２Ｑ［Ｆ７］はＸ染色体上にあるので、Ｆ１雄性はこの導入遺伝子を担わず、ＥＰ特異性の対照として使用できる。
【０２８９】
図３及び表１の遺伝子型を作製するために、ＵＡＳ：ｔａｕＧＦＰ；ａｐＶＮＣ／ＣｙＯハエとＵＡＳ：ＳＣＡＪ８２Ｑ［Ｍ６］ハエ又はＵＡＳ：ＬａｃＺ（対照）との交配を行った。成虫ハエは、羽化後標準培地中で加齢させた。
【０２９０】
６．１．２．組織学及び免疫蛍光検査
ＳＥＭ画像：ハエ全体をエタノール中で脱水し、臨界点乾燥して、ＪＥＯＬ  ＪＳＭ  ６１００顕微鏡で分析した。成虫ハエの眼の切片：成虫の頭（０−１日齢）を４％ホルムアルデヒド中に３０分間固定し、洗浄して、１％四酸化オスミウム中に４℃で３時間固定し、エタノール中で脱水して、垂直半薄切片用にＥｐｏｎに包埋し、その後トルイジンブルーで染色した。ＳＣＡ−１−３０Ｑ及びＳＣＡ−１−８２ＱマウスがＢｕｒｒｉｇｈｔら、１９９５、Ｃｅｌｌ  ８２：９３７−４８に述べられている。マウスの小脳切片を先に述べられているように調製し（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、１９９９、Ｎｅｕｒｏｎ  ２４：８７９−９２）、抗カルビンジンモノクローナル抗体（１：１０００、ＣＬ３００  Ｓｉｇｍａ）で染色した。
【０２９１】
眼成虫原基及び唾液腺を１ＸＰＢＳ中で切除し、４％ホルムアルデヒド中に２０分間固定して、１ＸＰＢＳ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で洗浄し、一次抗体と共にインキュベートした。ハエの胸部全体を４％ホルムアルデヒド中に４℃で３時間固定して、成虫腹部神経節を調製した。洗浄後、腹部神経節を切除して、再び室温で２０分間固定し、その後成虫原基として染色した。次の一次抗体を使用した：ウサギ抗アタキシン−１（１１ＮＱ、１：７５０希釈；Ｓｋｉｎｎｅｒら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：９７  １−４）、マウス抗ラミニンＡ（Ｔ４７、１：５０；Ｈａｒｅｌら、１９８９、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  ９４：４６３−７０）、マウス抗ｈｓｐ７０／ｈｓｃ７０（５ＰＡ８２２、１：１００；ＳｔｒｅｓｓＧｅｎ）、マウス抗ユビキチン（Ｕｂｉ−１、１Ｘ；ＺＹＭＩＥＤ）、マウス抗１９５Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ＡＴＰアーゼサブユニット６ｂ（Ｔｈｐ７）（ＰＷ８１７５、１：１００；ＡＦＦＩＮＩＴＩ）。次の二次フルオロクロム複合抗体を使用した：Ａｌｅｘａ４８８（１：４００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）及びＣｙ３（１：５００、Ｊａｃｋｓｏｎ）。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＭＲＣ−１０２４共焦点イメージングシステムで共焦点顕微鏡検査を実施し、Ｌａｓｅｒｓｈａｒｐ  ３．０ソフトウエア（Ｂｉｏ  Ｒａｄ）で画像を収集して、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ４．０（Ａｄｏｂｅ）で修正した。
【０２９２】
６．１．３．種々のＳＣＡ−１遺伝子組換え系統におけるアタキシン−１免疫反応性の比較
遺伝子型又は培養温度が異なる、比較する眼成虫原基を次のように平行して操作した：最初に、１ＸＰＢＳ溶液中で切除し、４％ホルムアルデヒドで固定して、ウサギ抗アタキシン−１抗血清１１ＮＱ（１：７５０希釈、Ｓｋｉｎｎｅｒら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：９７  １−４）中４℃で１４時間インキュベートし、ＰＢＴ（１ＸＰＢＳ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で洗浄して、Ａｌｅｘａ４８８（１：４００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）と複合したヤギ抗ウサギ抗体中でインキュベートした。その後眼成虫原基をＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ）に封入し、検査時まで−２０℃で保存した。４０焦点面の画像シリーズ（総厚さ１６μＭ）を、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．，イサクアー，ワシントン）で各々の成虫原基の中心領域から収集した。飽和ピクセル（すなわち４０９５未満）を含まない画像を得るために至適曝露を経験的に決定し、この曝露をすべての試料に使用した。次にＳｏｆｔＷｏｒｘソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．）を使用して強制反復アルゴリズムによってＺスタック（合併画像）を創造した。領域中のすべてのピクセルの全容量をソフトウエアによって算出した。種々の遺伝子型又は温度条件の数値を比較するために、各々データセット内のより高い値をより低い値で割って、図に示す相対的パーセンテージを算定した。
【０２９３】
６．１．４．Ｐ／ＥＰエレメントの分析
Ｐ及びＥＰエレメントに隣接するゲノムＤＮＡ領域を、標準プラスミドレスキュー及び／又は逆ＰＣＲプロトコール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｉｔｆｌｙ．ｏｒｇ）によって変更因子系統から回収した。回収したＤＮＡを配列決定し、ＢＤＧＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｒｕｔｉｆｌｙ．ｏｒｇ）及びＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖｆＢＬＡＳＴ）内のＢＬＡＳＴ及びＧＥＮＥＦＩＮＤＥＲ（ｈｔｔｐ：／／ｄｏｔ／ｉｍｇｅｎ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ：９３３  １／ｇｅｎｅ−ｆｉｎｄｅｒ）で解析して、ＰＩＥＰエレメントの同一性を確認し、変更遺伝子を同定した。
【０２９４】
ＥＰエレメント内の特定遺伝子の過剰発現を確認するために、ＥＰ領域の下流のコード配列をＰＣＲによって入手し、ｄｐｐＧａｌ４ドライバーと対象ＥＰ挿入を担う幼虫におけるインサイチューハイブリダイゼーション（Ｍａｎｇｉａｒｉｎｉら、１９９６、Ｃｅｌｌ  ８７：４９３−５０６）のためのプローブとして使用した。
【０２９５】
６．２．実施例：野生型ヒトアタキシン−１  ３０Ｑの高い発現は伸長したアタキシン−１  ８２Ｑによって生じるものと類似した神経変性表現型を引き起こす
ＧＡＬ４／ＵＡＳ系を使用して遺伝子組換えハエにおけるＳＣＡ−１構築物の発現を誘導した。ポリグルタミン反復配列の大きさが異なる２つのヒトＳＣＡ−１  ｃＤＮＡをショウジョウバエ形質転換ベクターｐＵＡＳＴにクローニングした。これらの構築物はアタキシン−１  ３０Ｑ（野生型ヒトアイソフォーム）とアタキシン−１  ８２Ｑ（伸長したアイソフォーム）をコードした（図１Ａの上部参照）。６つの８２Ｑと４つの３０Ｑ系統を作製した。
【０２９６】
ｇｍｒ−ＧＡＬ４ドライバーを使用して眼網膜にアタキシン−１の発現を指令した（ＭｏｓｅｓとＲｕｂｉｎ，１９９１、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ５：５８３−９３）。眼は様々な遺伝的経路を検討するための感受性の高い系であり（ＤｉｃｋｓｏｎとＨａｆｅｎ，第ＩＩ巻（Ｂａｔｅ，Ｍ．とＭａｒｔｉｎｅｚ  Ａｒｉａｓ，Ａ．編集）１３２７−１３６２（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９９３）；Ｗｏｌｆｆら（Ｃｏｗａｎ，Ｔ．Ｍ．，Ｊｅｓｓｅｌｌ，Ｔ．Ｍ．及びＺｙｐｕｒｓｋｙ，Ｓ．Ｌ．編集）４７４−５０８（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，１９９７）、ＳＣＡ−１導入遺伝子の作用を種々のポリグルタミン配列長と比較するのに理想的である。様々な遺伝子組換え系統における発現レベルを変化させると表現型を大きく変えることができるので、我々は免疫蛍光検査法（「実験方法」参照）によってすべての遺伝子組換え系統におけるアタキシン−１レベルを評価した。アタキシン−１のレベルはウエスタン分析では正確に定量することができない。タンパク質の分画だけしか回収されないからである：アタキシン−１ＮＩは高温ＳＤＳにおいて不溶性であり、凝集物は完全な抽出に抗して、ゲル内に入り込む（Ｋｏｓｈｙら（Ｗｅｌｌｓ，Ｒ．Ｄ．とＷａｒｒｅｎ，Ｓ．Ｔ．編集）２４１−２４８（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，サンディエゴ，１９９８）及び発明者自身の観察によって確認された）。表現型の重症度は８２Ｑと３０Ｑの両方の遺伝子組換え系統での発現レベルと良好に相関したが、予想されたように、８２Ｑ系統は常にはるかに強い表現型を示した。８２Ｑと３０Ｑ系統の最も重症の眼表現型を図１Ａ−Ｆに示す。これら２つの系統は概ね同様の発現レベルを有していたが（図１Ｈ−Ｉ）、８２Ｑ系統の表現型がはるかに重症であったことに留意しなければならない。
【０２９７】
培養温度を上げることによってアタキシン−１  ３０Ｑの発現を上昇させると、より著名な表現型を導いた（図２Ａ−Ｄ）。導入遺伝子の用量を２倍にしたときにも同様の結果が認められた（示していない）。野生型ヒトＳＣＡ−１導入遺伝子の比較的高い発現が、伸長した対立遺伝子によって生じるのと同様の表現型を導くという所見は予想外であった。野生型ヒトＳＣＡ−１  ３０Ｑ対立遺伝子を発現する遺伝子組換えマウスのこれまでの分析は明らかな病理を示さなかった（Ｂｕｒｒｉｇｈｔら、１９９５、Ｃｅｌｌ  ８２：９３７−４８）が、ノーザン分析により、ＳＣＡＪ  ３０Ｑ  Ａ０２導入遺伝子の発現レベルはＳＣＡ−１  ８２Ｑ  Ｂ０５導入遺伝子の発現レベルのほぼ４分の１であった（Ｋｉｅｍｅｎｔら、１９９８、Ｃｅｌｌ  ９５：４１−５３）。ＳＣＡＪ  ３０Ｑもマウスにおいて神経変性を引き起こしうるかどうかを調べるために、ホモ接合性ＳＣＡＪ  ３０Ｑ  Ａ０２マウスの小脳皮質を検査した。図２Ｅ−Ｈに示すように、これらのマウスにおいて５９週目でプルキンエ細胞層の樹状分枝は明らかに異常であり、ＳＣＡ−１  ８２Ｑ  Ｂ０５遺伝子組換え系統で早期に見られる変性に類似していた。唯一の相違は病理が現れるのに必要な時間の長さであった。それ故、野生型の伸長していないヒトアタキシン−１であっても、高レベルで発現されたときには神経変性表現型を生じさせた。
【０２９８】
６．３．実施例：アタキシン−１はショウジョウバエニューロンにおいて進行性変性を引き起こす
ＳＣＡ−１及び関連疾患における神経変性の重要な特徴は、表現型が患者の年齢と共に悪化することである（ＺｏｇｈｂｉとＯｒｒ，２０００、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３：２１７−２４７）。これはまた、ＳＣＡ−１遺伝子組換えマウスモデル系の特徴でもあった（Ｃｌａｒｋら、１９９７、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １７：７３８５−９５）。そこで我々は、ハエにおけるＳＣＡ−１神経変性もやはり進行性であるかどうかを検討した。
【０２９９】
ａｐＶＮＣＧＡＬ４ドライバーは成虫中枢神経系（ＣＮＳ）の腹神経索において少数の十分に定義された介在ニューロンに対して発現を駆動するので、これを選択した。ａｐｔｅｒｏｕｓ（ａｐ）遺伝子（配列番号：１）からのＣＮＳ特異的エンハンサーを使用してこのドライバーを作製した。これらの介在ニューロンの細胞体と軸索投射路の両方がτ−ＧＦＰレポーター遺伝子で容易に視覚化できる。成虫腹神経索には、ａｐＶＮＣＧＡＬ４エンハンサーによって駆動されるτ−ＧＦＰによって強く標識された、半分節当り２つの大きな介在ニューロン（１つは背側で１つは腹側）が存在する。これらの介在ニューロンは内側及び前方へとそれらの軸索を伸長する（図３Ａ及び３Ｂ）。アタキシン−１  ３０Ｑ又は８２Ｑを発現する野生型及び遺伝子組換えハエにおいて成虫期の１、２５及び４５日目にこれらの介在ニューロンの完全性を評価した。図３Ｃ−Ｄ及び表１に示すように、アタキシン−１  ８２Ｑ発現については加齢と共に細胞体と軸索投射路の進行性排除が認められた。アタキシン−１  ３０Ｑ高度発現系統に関しても、同様であるがより弱い表現型が認められた（示していない）。ハエニューロンにおけるアタキシン−１の発現は、それ故、ＳＣＡ−１患者及び遺伝子組換えマウスで認められた進行性変性と明らかに合致した。
【０３００】
【表１】
2004517634.tif 000002
完全な遺伝子型：（１）ＵＡＳ：ｔａｕＧＦＰ／＋；ａｐｔｅｒｏｕｓＶＮＣ−ＧＡＬ４［ＵＡＳ：ＬａｃＺ；（２）ＵＡＳ：τＧＦＰ／＋；ａｐｔｅｒｏｕｓＶＮＣ−ＧＡＬ４ｆＵＡＳ：ＳＣＡ−１−８２［Ｍ６］。第一及び第二胸節の介在ニューロンだけを分析した（半分節当り２）。対照においては、介在ニューロンをＧＦＰ又はＬａｃＺの発現によって採点した。ＳＣＡ−１発現ニューロンは、抗ＳＣＡ−１抗体での陽性染色によって採点した。
【０３０１】
６．４．実施例：ショウジョウバエにおけるアタキシン−１はユビキチン、プロテアソーム及び分子シャペロンを蓄積する核封入体を形成する
アタキシン−１  ３０Ｑとアタキシン−１  ８２Ｑは、発現レベルが非常に低くない限り、１又は複数のＮＩに蓄積することが発見された。熱ショックプロモーターからのＳＣＡ−１発現後の様々な時点でＮＩを検討することにより、核封入体は動的構造であることが認められた。発現後すぐに可視であった小さな３０Ｑ及び８２Ｑ封入体は、時間と共により大きなＮＩへと凝集した；これは８２Ｑに関して特に明らかであった（示していない）。核封入体の形成には３つの因子が重要であることが認められた：ポリグルタミンドメインの長さ、発現レベル、及び発現の開始からの時間の長さ。
【０３０２】
ＮＩは、光受容細胞（図１Ｈ−１Ｉの挿入図参照）、ＣＮＳのニューロン（図３Ｃ−３Ｄ）、及び成熟唾液腺の細胞を含めて様々な細胞型に蓄積した。これらの有糸分裂後細胞は巨大多糸性核を含み、それ故アタキシン−１  ３０Ｑ及び８２Ｑによって形成されるＮＩの形態と凝集力学を検討するために特に有用である。これらの巨大核において、アタキシン−１  ３０Ｑは通常緻密な楕円形凝集物に蓄積し、一方アタキシン−１  ８２Ｑはいくつかの不規則な形の凝集物に蓄積した（図４参照）。
【０３０３】
我々は、ショウジョウバエにおいてアタキシン−１によって形成される封入体を検討するために分子マーカーを使用し、それらをＳＣＡ−１患者及びＳＣＡ−１マウスモデルで認められる封入体と比較した。おそらく細胞が再度折り畳み、突然変異体アタキシン−１を分解しようとするために、ヒトとマウスの両方においてＮＩはＨｓｐ７０分子シャペロン、ユビキチン及びプロテアソームの成分を蓄積する（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、１９９８、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９：１４８−５４）。図４Ｄ−Ｌは、ショウジョウバエにおけるアタキシン−１  ＮＩがＨｓｐ７０シャペロン、ユビキチン、及びプロテアソームに関して陽性であることを示している。Ｈｓｐ７０と異なって、Ｈｓｐ９０はＳＣＡ−１又は遺伝子組換えマウスモデルのＮＩにおいて蓄積しなかった（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、１９９８、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９：１４８−５４）。我々はＨｓｐ８３（ショウジョウバエＨｓｐ９０の相同分子種）を検討し、それがニューロン又は巨大唾液腺核のＮＩに蓄積しないことを認めた（データは示していない）。
【０３０４】
要するに、ショウジョウバエにおけるアタキシン−１  ＮＩは、蓄積したマーカー及び凝集のパターンの両方に関して、ＳＣＡ−１患者、遺伝子組換えマウス及び形質移入細胞において認められる封入体と非常に類似していた。
【０３０５】
６．５．実施例：分子シャペロン又はプロテアソームの成分のいずれかをコードする遺伝子の活性低下はＳＣＡ−１神経変性を悪化させる
アタキシン−１はユビキチン−プロテアソーム経路によって分解されるので（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、１９９９、Ｎｅｕｒｏｎ  ２４：８７９−９２）、我々は、プロテアソーム活性の低下は神経変性表現型を悪化させるはずであると予想した。同様に、分子シャペロン活性の低下は表現型を悪化させるであろうと予想された。代替的な可能性として、シャペロン自体が、もしそれらが毒性折り畳み中間体を安定化させる働きをしているとすれば、病因に寄与すると考えられた（ＫｒｏｂｉｔｓｃｈとＬｉｎｄｑｕｉｓｔ、２０００、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：１５  ８９−９４）。これが事実であれば、シャペロン活性の軽度の低下は実際に表現型を改善するであろう（ＦｅｒｒｉｇｎｏとＳｉｌｖｅｒ，２０００、Ｎｅｕｒｏｎ  ２６：９−１２）。
【０３０６】
これらの仮説を試験するために、我々は、分子シャペロン又はプロテアソームの成分をコードするショウジョウバエ遺伝子における既存の突然変異を利用した。次の突然変異体を入手した：１）Ｄｆ（３Ｒ）ｋａｒＤ１、ｈｓｐ７０遺伝子のクラスターを取り除く小さな欠失（図５の脚注参照）。２）ｈｓｃ７０−４１９５、ｈｓｐ７０同族４タンパク質のＡＴＰ結合ドメイン内の点突然変異。３）Ｐｒｏｓ２６、２０Ｓコアプロテアソームの成分である多機能性エンドペプチダーゼをコードする遺伝子内の点突然変異。これらの突然変異体を、眼において中間表現型を生じるＳＣＡ−１  ８２Ｑ導入遺伝子を発現するハエと交配した。図５に示すように、これらの突然変異のいずれかについてヘテロ接合性のＳＣＡ−１  ８２Ｑ［Ｆ７］遺伝子組換えハエは、ＳＣＡ−１  ８２Ｑ導入遺伝子だけを担うハエよりも重症の眼表現型を示した。これらの突然変異だけを担う対照ヘテロ接合ハエは野生型眼表現型を示し（図ＳＦ、データは示していない）、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｃ７０又はプロテアソームの活性の部分的低下は眼の神経変性表現型を悪化させることを明らかにした。
【０３０７】
６．６．実施例：アタキシン−１が誘導する神経変性の変更因子の遺伝的スクリーニング
シャペロンとプロテアソーム突然変異体に関する上述した結果は、活性が部分的に低下したときアタキシン−１誘導の神経変性を変化させる遺伝子を同定するためのＦｌ遺伝子スクリーニングを実施することが可能であることを示唆した。
【０３０８】
ＳＣＡ−１誘導の神経変性を変化させることができる新規遺伝子を同定するために、２つの遺伝的スクリーニングを実施した。最初に、１５００致死的Ｐエレメント挿入のコレクションをＵＡＳ：ＳＣＡ−１１［８２Ｑ］Ｆ７；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／ＣｙＯ系統と交配した。これらのハエでは、中等度のレベルのアタキシン−１  ８２Ｑが網膜に蓄積し、２５℃で中間的眼表現型を引き起こした。第二のスクリーニングは、過剰発現したとき、ＳＣＡ−１誘導の神経変性を抑制する又は増強する遺伝子を同定するために実施した。この２番目の場合には、ＵＡＳ：ＳＣＡ−１［８２Ｑ］Ｆ７；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／ＣｙＯ系統の遺伝子組換えハエを３０００ＥＰ挿入のコレクション（Ｒｏｒｔｈら、１９９８、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２５：１０４９−５７）と交配した。初期スクリーニングで検出された推定上の変更因子を、それらの表現型を確認し、特異性を調べるために再び試験した。ＳＣＡ−１遺伝子組換えハエの眼表現型を変化させるが対照同胞ハエの眼表現型は変化させない変更因子をさらに検討した。
【０３０９】
ＰエレメントＦｌスクリーニングはＳＣＡ−１眼表現型の２７個の変更遺伝子を同定し、そのうち７個は、それらの活性がＰエレメント挿入によって５０％に低下したとき、ＳＣＡ−１表現型を抑制し、２０個はＳＣＡ−１表現型を増強した。ＥＰエレメントＦｌスクリーニングは合計３３個のＳＣＡ−１表現型の変更因子を生じ、そのうち１０個がＳＣＡ−１表現型を抑制し、２３個がＳＣＡ−１表現型を増強した。概して、ＥＰエレメントスクリーニングにおける眼表現型の変化は近傍転写ユニットの過剰発現によって引き起こされうるが、挿入突然変異誘発によって生じる機能喪失が一部の変更因子の基礎となる（下記参照、及び表２と３）。
【０３１０】
Ｐ及びＥＰ挿入によって標識した遺伝子を同定するために、挿入に隣接するゲノムＤＮＡ配列をプラスミドレスキュー及び逆ＰＣＲ手法によって回収した。次にこれらの配列をショウジョウバエゲノムデータベースと比較した。Ｐ／ＥＰ挿入によって影響を受ける候補遺伝子の一部はこれまでに特徴付けられていなかった；その他は周知であった。
【０３１１】
同定した変更因子の一部は、タンパク質折り畳み／熱ショック応答又はユビキチン−タンパク質分解経路内の遺伝子であった（表２及び図６）。
【０３１２】
【表２】
2004517634.tif 000003
挿入は、＋１位の推定ＡＴＧに対する挿入位置を指す。ｇＤＮＡ＝ゲノムＤＮＡ配列；ｃＤＮＡ＝ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡ配列；Ｐ＝タンパク質配列。転写ユニットに対するＰ１  ＥＰの方向、Ｓ＝同じ。Ｏ＝反対。ＬＯＦＡ：変更遺伝子の他の機能喪失対立遺伝子。Ｍ：ＬＯＦＡによって生じるＳＣＡ−１眼神経変性の変化。（１）Ｐ１６６６の２つのＥＭＳ誘導体立位。（２）ＵｂｃＤ１５１７８２。（３）ｈｓｒ−ω０５２４１。
【０３１３】
上述したように、これらの経路はポリグルタミン誘導の神経変性に関与することが知られていた。さらに、新規変更因子を回収し、それらの一部は、これまでポリグルタミン誘導の神経変性に関わることが知られていなかった経路を同定する（表３及び図７）。
【０３１４】
【表３】
2004517634.tif 000004
表３．新規経路における変更因子：記号については表２の脚注参照；＝は、機能喪失対立遺伝子（ＬＯＦＡ）によるＳＣＡ−１眼表現型の変化がないことを意味する。（Ａ）〜２８ｋｂイントロンによってＡＴＧから分離された、５’非コードエクソンに２２塩基対を挿入した。（Ｂ）エクソン８とエクソン９の間にイントロンを挿入した。（Ｃ）第一ＡＴＧの〜１６．３ｋｂ下流であるが、第二ＡＴＧに関しては−５５３のイントロンに挿入した。（Ｄ）アイソフォーム１Ａ（＋１６３３５から始まる）を分断し、−５５３から始まるアイソフォーム１Ｂを過剰発現させる。（１）ＥＰ２２３１の不正確な切り出し。（２）ｍｕｂ０４０９３。（３）ｐｕｍ１３。（４）ｃｐｏ１及びｃｐｏＬ１。（５）Ｓｉｎ３ＡｄＱ４及び５ｉｎ３Ａ０８２６９。（６）Ｒｐｄ３０４５５６。（７）ｄＣｔＢＰ８７Ｄｅ−１０。（８）ｐａｐ５３及びｐａｐＥＰ１。（９）ＥＰ３４６３の５つの不正確な切り出し。
【０３１５】
６．７．実施例：タンパク質折り畳み熱ショック応答及びユビキチン−タンパク質分解経路内の変更因子
ユビキチン−タンパク質分解経路内の３個の遺伝子を同定する４つのＳＣＡ−１エンハンサーをＳＣＡ−１変更因子スクリーニングによって単離した。Ｐ１６６６（図６Ｂ）はユビキチンをコードする遺伝子内の挿入であった（Ｕｂｉ６３Ｅ）。Ｐ１６６６の２つのＥＭＳ対立遺伝子が生成され、これらの突然変異も眼表現型のエンハンサーとして働いた（示していない）。ユビキチンの再利用に関わるタンパク質であるユビキチンＣ末端加水分解酵素における突然変異をさらに分析した。この突然変異体（Ｕｃｈ−Ｌ３ｊ２Ｂ８）もＳＣＡ−１眼表現型を増強した（示していない）。Ｐ１７７９（図６Ｃ）及びＥＰ６７４（示していない）は、ヒトＵｂｃＥ２Ｄ２（９３％の同一性）及び酵母Ｕｂｃ４／５（８１％の同一性）に相同なユビキチンコンジュガーゼをコードする遺伝子、ＵｂｃＤ１／ｅｆｆｅｔｅにおける突然変異であった（Ｔｒｅｉｅｒら、１９９２、Ｅｍｂｏ  Ｊ  １１：３６７−７２）。相互作用を確認するためにＵｂｃＤ１／ｅｆｆｅｔｅのもう１つの対立遺伝子を試験した（示していない）。ＥＰ１３０３（図６Ｄ）は、ヒトＵｂｃ２ＥＨ（７２％の同一性）及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｕｂｃ８（５７％の同一性）に最も類似する、ハエではこれまで特徴付けられていなかった、異なるユビキチンコンジュガーゼを同定した。
【０３１６】
さらに２つの変更因子がタンパク質折り畳み／熱ショック応答経路内の遺伝子を同定した。Ｐ２９２は、ｈｓｒ−ωとして知られる、あまりよく理解されていない熱ショック応答因子内の突然変異に関連するエンハンサー（図６Ｅ）である。生存のために必要であり、種間で保存されるこの遺伝子は（ＬａｋｈｏｔｉａとＳｈａｒｍａ，１９９６；ＭｃＫｅｃｈｎｉｅら、１９９８、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５：２４２３−８）、核と細胞質のＲＮＡをコードするがタンパク質はコードしない；ストレスを受けていない細胞で発現されるが、熱ショックによっても速やかに誘導される。ｈｓｒ−ωのもう１つの既存の対立遺伝子を試験し、これもやはりＳＣＡ−１神経変性を増強することが認められた（データは示していない）。ＥＰ４１１（図６Ｈ及び６Ｉを６Ｆ及び６Ｇと比較する）は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ＤＮＡ  Ｊ−１遺伝子（ｄＤｎａＪ−１  ６４ＥＦ）の過剰発現に結びつく；この過剰発現はＳＣＡ−１表現型を抑制する。この遺伝子は、ヒトシャペロンＨＳＰ４０／ＨＤＪ−１に相同なタンパク質（１１７個のアミノ酸にわたって５０％の同一性）をコードする。興味深いことに、ｄＤＮＡＪ−１  ６４ＥＦ過剰発現ハエにおいてＮＩの変化が認められた。図６Ｋに示すように、これらのハエにおけるＮＩはより緻密であり、典型的なアタキシン−１  ８２Ｑ対照ＮＩよりも核のより小さな部分を占める（図６Ｊ）。全体としてそれらはアタキシン−１  ３０ＱのＮＩ特性に類似する（図４Ｂ−Ｃと比較する）。
【０３１７】
６．８．実施例：神経変性に関与する新規遺伝子及び経路
これまで神経変性に関与することが知られていなかった遺伝子と経路を同定する３つの変更因子がＳＣＡ−１変更因子スクリーニングにおいて同定された。
【０３１８】
ＳＣＡ−１表現型を抑制するＥＰ２２３１（図７Ｂ及び７Ｆ）は、シータクラスのヒトＧＳＴに最も類似するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子（Ｇｓｔ５５Ｆ）の過剰産生を引き起こした。ＧＳＴは細胞の解毒において重要な役割を果たす酵素のグループである。それらは様々な毒性化合物と還元グルタチオンの抱合を触媒し、次にそれらの代謝と排泄を促進する（ＷｈａｌｅｎとＢｏｙｅｒ、１９９８、Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  １８：３４５−５８；Ｓａｌｉｎａｓら、１９９９、Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ６：２７９−３０９）。ＥＰ２２３１において過剰発現されるハエＧＳＴ遺伝子は、染色体位置５ＳＦに合計１０個のＧＳＴ遺伝子を含むクラスターの一部である（未発表）。逆に、ＳＣＡ−１表現型を増強する、ＥＰ２２３１の不正確な切り出しが生成された（図７Ｊ）。付加的に、Ｇｓｔ２における２つの機能喪失突然変異（Ｐ１４８０及びＰ８７４）をＳＣＡ−１表現型への作用に関して分析した。Ｇｓｔ２は染色体位置５３Ｆにマッピングされ、ヒトＧＳＴσクラスに最も類似した、異なるＧｓｔ遺伝子である。これらの突然変異もＳＣＡ−１眼表現型を増強した（図７ＫはＰ１４８０を示す；Ｐ８７４は示していない）。
【０３１９】
ＳＣＡ−１表現型を抑制するＥＰ２４１７（図７Ｃ及び７Ｇ）は、発明者がｎｕｃｌｅｏｐｏｒｉｎ−４４Ａ（ｎｕｐ−４４Ａ）と命名した、特徴付けられていないショウジョウバエ遺伝子の過剰発現に関連する。ｎｕｐ４４Ａは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ核膜孔タンパク質ＳＥＨｉに相同なタンパク質（１８５個のアミノ酸にわたって３４％の同一性）をコードする。
【０３２０】
ＳＣＡ−１神経変性の他の新規変更因子の中でも特に、４つの遺伝子が、ＲＮＡ結合ドメインを持つタンパク質を含むことが認められた：
・ＳＣＡ−１表現型を抑制するＥＰ３６２３（図７Ｄ及び７Ｈ）は、脊椎動物ＲＮＡ結合ＫＨ−ドメインタンパク質に類似したタンパク質をコードするｍｕｓｈｒｏｏｍ−ｂｏｄｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ（ｍｕｂ）を過剰発現した。特定ｍＲＮＡに結合して安定化させると思われる（ＧｒａｍｓとＫｏｒｇｅ，１９９８，Ｇｅｎｅ  ２１５：１９１−２０１）。ｍｕｂ機能喪失対立遺伝子は眼表現型を変化させない（示していない）。
【０３２１】
・ＳＣＡ−１表現型を増強するＥＰ３４６１（図７Ｌ）は、ｐｕｍ  ＲＮＡ結合ドメインを含むｐｕｍｉｌｉｏ（ｐｕｍ）転写ユニットのエクソン９−１３を過剰発現する。ｐｕｍ抗体を使用して、Ｐｕｍｉｌｉｏタンパク質の過剰発現を確認した。ｐｕｍは、補因子をそのＲＮＡ結合部位に動員することによって特定ｍＲＮＡの翻訳を調節する（ＳｏｎｏｄａとＷｈａｒｔｏｎ，１９９９，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３：２７０４−１２）。
【０３２２】
・ＳＣＡ−１表現型を増強するＥＰ３３７８（図７Ｍ）はｃｏｕｃｈ  ｐｏｔａｔｏ（ｃｐｏ）に挿入される。ＣＮＳ及びＰＮＳ細胞において発現されるこの遺伝子は核ＲＮＡ結合タンパク質をコードする（Ｂｅｌｌｅｎら、１９９２、Ｇｅｎ．Ｄｅｖ．６：２１２５−２１３６）。Ｃｐｏ特異的抗体を使用して、ＥＰ３３７８におけるｃｐｏの過剰発現（示していない）を確認した。ｃｐｏの機能喪失対立遺伝子はアタキシン−１  ８２Ｑ眼表現型を変化させない（示していない）。
【０３２３】
・ＳＣＡ−１表現型を増強するＥＰ３７２５（図７Ｎ）は、ラットスプライシング因子ＹＴ５２  １−Ｂに相同なタンパク質（２８７個のアミノ酸にわたって３７％の同一性）をコードする、特徴付けられていないショウジョウバエ遺伝子を過剰発現する。
【０３２４】
ＳＣＡ−１表現型を増強する６個のさらなるＥＰエレメントの分析により、転写調節因子として機能するタンパク質が同定された：
・ＥＰ８６６（図７Ｏ）は、マウスＳｉｎ３Ａ及び酵母Ｓｉｎ３ｐコリプレッサーのハエ相同体であるＳｉｎ３Ａにおける機能喪失突然変異である（ＰｅｎｎｅｔｔａとＰａｕｌｉ，１９９８、Ｄｅｖ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｖｏｌ  ２０８：５３  １−６）。他のＳｉｎ３Ａ対立遺伝子もＳＣＡ−１眼表現型を増強した（示していない）。
【０３２５】
・ＥＰ３６７２（図７Ｌ）は、ヒストンデアセチラーゼをコードするＲｐｄ３遺伝子における機能喪失突然変異である（Ｄｅ  Ｒｕｂｅｒｔｉｓら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  ３８４：５８９−５９１）。異なるＲｐｄ３対立遺伝子もＳＣＡ−１表現型を増強する（示していない）。Ｓｉｎ３Ａ及びＲｐｄ３のいずれも、転写抑制に必要な大きなタンパク質複合体の一部である（Ｋａｓｔｅｎら、１９９７、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １７：４８５２−８）。
【０３２６】
・ＥＰ１５９０（図７Ｑ）は、ｄＣｔＢＰコリプレッサーにおける突然変異である（Ｎｉｂｕら、１９９８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１０１−４）。もう１つのｄＣｔＢＰ対立遺伝子はＳＣＡ−１眼表現型を増強する（示していない）。
【０３２７】
・ＥＰ２３００（図７Ｒ）は、サイレンシングに必要なクロマチンリモデリング因子、酵母タンパク質Ｓｉｒ２のハエ相同体である（ＬａｕｒｅｎｓｏｎとＲｉｎｅ，１９９２、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ５６：５４３−６０）。
【０３２８】
・ＥＰ１９８（図７Ｓ）は、ｇｅｎｅ  ｐｏｉｌｓ  ａｕｘｐａｔｔｅｓ（ｐａｐ）内の挿入である。ｐａｐにおける突然変異はｐｒｏｂｏｓｃｉｐｅｄｉａ  Ｈｏｘ転写因子との遺伝子相互作用因子として独立して単離された（Ｄ．Ｌ．Ｃｒｉｂｂｓ、個人的通信）。ｐａｐは、転写調節に関わるＴＲＡＰ／ＳＭＣＣ補因子タンパク質複合体の成分である、ヒトＴｒａｐ２４０のハエ相同体である（Ｉｔｏら、１９９９、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ３：３６１−７０）。ＴＲＡＰ／ＳＭＣＣは、Ｈａｍｐｓｅｙ、１９９８、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ６２：４６５−５０３において総説されている、ＲＮＡポリメラーゼＩＩと相互作用し、コアクチベーターとコリプレッサー機能を持つ酵母Ｍｅｄｉａｔｏｒ複合体に関連する。他のｐａｐ対立遺伝子との相互作用が確認された（示していない）。
【０３２９】
・ＥＰ３４６３（図７Ｔ）は、ｔａｒａｎｉｓ（ｔａｒａ）転写ユニット内の挿入である。ｔａｒａは転写因子のトリソラックス群の成員である（Ｄ．Ｌ．Ｃｒｉｂｂｓ、個人的通信）。ＥＰ３４６３の５つの不正確な切り出しが生成され、それらは同じ重度のＳＣＡ−１眼表現型の増強を生じさせた（示していない）。
【０３３０】
６．９．実施例：神経変性に関与する付加的な遺伝子と経路
ショウジョウバエ粗眼ＳＣＡ−１表現型のさらなる変更因子を下記の表４に列挙する。表４に列挙する変更因子は本発明の方法に従って使用できる。ＳＣＡ−１表現型を変化させる、表４に列挙した各々のＰ又はＥＰエレメントについて、Ｐ又はＥＰエレメント挿入の部位に近接する遺伝子の同一性を列記する。
【０３３１】
【表４】
2004517634.tif 000005
2004517634.tif 000006
2004517634.tif 000007
表４．付加的なＳＣＡ−１変更因子：記号については表２の脚注参照。＊は、受入番号がいくつかの遺伝子を有するゲノムプロジェクト「骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）」を指すことを表わす；しかし、この情報は、どの残基が上記の表に列挙されているＳＣＡ−１変更因子をコードするかを同定するために注釈している。＊＊は好ましい実施形態を示す。
【０３３２】
６．１０．実施例：考察
発明者は、ヒトポリグルタミン病において認められる病因の主たる特徴を再現する、ＳＣＡ−１誘導の神経変性についてのショウジョウバエモデルを作製した。アタキシン−１  ８２Ｑをコードする伸長したヒトＳＣＡ−１導入遺伝子の発現は、ショウジョウバエニューロンの変性とＮＩ形成を導いた。ＳＣＡ−１患者におけるように、種々の年齢での細胞体の完全性と成体介在ニューロンの投射路をモニターすることによって示されたように、ハエでのＳＣＡ−１神経変性は進行性であった（図３及び表１）。
【０３３３】
アタキシン−１  ８２Ｑを産生する遺伝子組換え系統の中で、強い、中間的及び弱い表現型が検出された。表現型は発現レベルと直接相関した。発現レベルが同様であっても、アタキシン−１  ３０Ｑ系統は８２Ｑ系統よりも弱い表現型を生じた。これまで野生型ヒトアイソフォームに関しては神経変性が報告されていなかったので、アタキシン−１  ３０Ｑの過剰発現が軽度の表現型を誘発しうることは幾分予想外であった。ＳＣＡ−１  ３０Ｑ導入遺伝子の２コピーを担うマウスも神経変性を示した。野生型タンパク質が毒性作用を及ぼすのに必要なのは、より高い発現レベルと長期的な接触だけであった。
【０３３４】
それ故、通常ポリグルタミン伸長に結びつくアタキシン−１毒性の獲得は、過剰の野生型タンパク質からも生じうると思われる。これに関して、最近、遺伝子組換えマウスにおける野生型ｃｔ−シヌクレインの過剰発現は、突然変異体α−シヌクレインによって引き起こされるパーキンソン病に類似したユビキチン陽性封入体の形成と神経変性を導くことが報告された（Ｍａｓｌｉａｈら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１２６５−９）。
【０３３５】
アタキシン−１は遺伝子組換えハエにおいて核封入体に蓄積する。これらの凝集物は、ＳＣＡ−１患者において認められる凝集物と非常に類似する：それらはユビキチン、プロテアソーム、及びＨｓｐ７０の非細胞局在を変化させるが、Ｈｓｐ８３の局在は変化させない（Ｃｕｍｍｉｎｇｓら、１９９８、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １９：１４８−５４）（図４）。発明者がここで示したように、Ｈｓｐ７０とＨｓｐ４０シャペロンの過剰産生はポリグルタミン毒性を抑制することができた（Ｗａｒｒｉｃｋら、１９９９、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２３：４２５−８；Ｋａｚｅｍｉ−ＥｓｆａｒｊａｎｉとＢｅｎｚｅｒ、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１８３７−４０も参照のこと）。発明者はまた、Ｈｓｐ４０がＮＩを変化させ、それらをより限定された緻密なものにすることを示した（図６Ｋ）。これらの所見は、高い量のシャペロンが防護的であることを示すものである。シャペロン活性の中等度の低下は疾患の進行に対して防護しうることが示唆されているが（ＦｅｒｒｉｇｎｏとＳｉｌｖｅｒ，２０００、Ｎｅｕｒｏｎ  ２６：９−１２）、発明者は、Ｈｓｐ７０活性を低下させることはＳＣＡ−１表現型を悪化させることを発見した。
【０３３６】
ポリグルタミン誘導の神経変性の変更因子を同定するための遺伝子スクリーニングを用いて、発明者は、部分的機能喪失によって又は遺伝子の過剰発現によってＳＣＡ−１表現型を変化させるサプレッサーとエンハンサーを回収した。これらの変更因子の一部はタンパク質折り畳み又はタンパク質分解に関わっていた。１つのサプレッサーといくつかのエンハンサーがこのクラスに属した。サプレッサーは、ポリグルタミン毒性の抑制に関するスクリーニングで同定された同じ遺伝子、ｄＤＮＡＪ−１  ６４ＥＦの過剰発現に関連する（Ｋａｚｅｍｉ−ＥｓｆａｒｊａｎｉとＢｅｎｚｅｒ、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：１８３７−４０）。エンハンサーは、ユビキチンをコードする構造遺伝子内の機能喪失対立遺伝子、２つのユビキチンコンジュガーゼ（ＵｂｃＤｌとｄＵｂｃ−Ｅ２Ｈ）及びｈｓｒ−ωであった。後者は核ＲＮＡをコードする熱ショック応答因子である。これらの遺伝子の活性を低下させることはＳＣＡ−１神経変性を悪化させるという所見は、タンパク質折り畳み／タンパク質分解機構のこれらの成分がＳＣＡ−１の損傷細胞においては量が限られていることを明らかにし、さらにポリグルタミン病が、少なくとも一部には、タンパク質クリアランスの疾患であるという仮説を裏付けた。
【０３３７】
おそらく最も興味深い変更因子は、これまで神経変性において役割を果たすことが知られていなかった分子経路に関わる遺伝子である。これらの遺伝子の一部は、誤った折りたたみのアタキシン−１がその毒性を仲介する新規経路を同定し、タンパク質クリアランスの障害以外の他の病因機序の性質を示す。このクラスのサプレッサーの１つは、５５Ｆ内のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子の過剰発現に関連する。ＧＳＴは細胞解毒において重要な役割を果たす酵素であり、化学的及び酸化的ストレスの産物を含めた様々な毒素との抱合・還元反応において還元グルタチオンを利用する（ＷｈａｌｅｎとＢｏｙｅｒ，１９９８，Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  １８：３４５−５８；Ｓａｌｉｎａｓら、１９９９、Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ６：２７９−３０９）。異なるＧｓｔ遺伝子（Ｇｓｔ２）における突然変異もＳＣＡ−１表現型を増強する。それ故、これらの所見は、タンパク質折り畳み経路に加えて、アタキシン−１の毒性作用に対抗するために細胞によって利用されるもう１つの経路を明らかにする。第二のサプレッサーは、酵母核膜孔の成分に相同なタンパク質の過剰発現に関連する。核膜孔複合体は多くのタンパク質から成る（Ｂｏｄｏｏｒら、１９９９、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７７：３２  １−９）；１つの成分過剰発現は、それ故、核ポア複合体の形成を損傷し、核内へのアタキシン−１の輸送を妨げると考えられる。この所見は、アタキシン−１及び他のポリグルタミンタンパク質が核内で毒性作用を及ぼすという仮説のさらなる証拠を提供する。
【０３３８】
５つのＲＮＡ結合タンパク質がＳＣＡ−１神経変性を変化させ、そのうち４つが表現型を増強し、１つが表現型を抑制する。さらに、上述したように、熱ショック因子ｈｓｒ−ωは核ＲＮＡをコードする。これらの所見は、ＲＮＡプロセシングの変化がＳＣＡ−１病因に関わっていることを示す。これは、アタキシン−１がインビトロでＲＮＡに結合するという観察と一致し、アタキシン−１がＲＮＡ結合タンパク質そのものであることを示唆する（ＹｕｅとＯｒｒ、未発表データ）。このクラスの変更因子の１つがサプレッサーであることは、ＲＮＡプロセシングに関与する特定分子の活性を変化させることによってＳＣＡ−１神経変性を遅らせることが可能でありうることを示唆する。いくつかの疾患（脆弱Ｘ染色体、フリードライヒ運動失調、筋緊張性ジストロフィー、及びＳＣＡ−８）が非コードトリヌクレオチド反復配列の伸長によって引き起こされることは興味深い。それ故、ＲＮＡプロセシング又は輸送の変化はトリヌクレオチド反復配列疾患において想起されるテーマであると考えられる。
【０３３９】
第二の群のエンハンサーは、転写調節における補因子として機能するタンパク質を同定する。この所見は、病因の付加的な機序として、アタキシン−１と転写機構の異常相互作用の可能性を示唆する。これに関して、Ｌｉｎらは最近、遺伝子発現の変化がＳＣＡ−１疾病の非常に早期に起こることを示した（Ｌｉｎら、２０００、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３：１５７−６３）。アタキシン−１が転写に干渉しうるいくつかの手段があり、次のものを含む：（１）タンパク質分解機構の乱れは、その濃度がタンパク質分解によって調節される重要な転写因子のレベルを変化させうる；（２）突然変異体アタキシン−１は、転写調節にとって重要な核ドメインに干渉しうる（Ｓｋｉｎｎｅｒら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  ３８９：９７  １−４）；そして、（３）アタキシン−１は転写機構のある種の成分と直接相互作用しうる。比較的短いポリグルタミン配列は多くの転写因子において認められる；それ故、ＳＣＡ−１及び他のポリグルタミン病のタンパク質は特定転写調節因子に干渉すると考えられる（Ｗａｒａｇａｉら、１９９９、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ８：９７７−８７）。第三の可能性は、このクラスの変更因子はすべて転写補因子であるが、転写機構の他の成分はそうでないという所見によって裏付けられる。酵母ツーハイブリッドシステムにおいてハンチンチンのＮ末端が核受容体コリプレッサー（Ｎ−ＣｏＲ）と相互作用するという最近の所見もこのモデルを裏付ける（Ｂｏｕｔｅｌｌら、１９９９、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ８：１６４７−５５）。
【０３４０】
本発明は、ここで述べる特定実施形態によって範囲を限定されない。実際に、ここで述べるものに加えて、上記の説明と添付の図面から当業者には本発明の様々な修正が明らかになるであろう。そのような修正は、付属の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【０３４１】
特許出願、特許、核酸及びタンパク質受入番号、及び公表文献を含めて、様々な参考文献を上記で引用しているが、それらの開示はその全体が参照してここに組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａ−Ｇ：ＳＣＡ−１の過剰発現によって生じる強い（アタキシン−１  ８２Ｑ）及び弱い（アタキシン−１  ３０Ｑ）眼表現型。
ショウジョウバエに注入したヒトＳＣＡ−１構築物を上部に示す。上の列：ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋対照（Ａ）、ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋；ＵＡＳ：ＳＣＡ−１  ３０Ｑ［Ｆ６］／＋（Ｂ）、及びｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋；ＵＡＳ．〜ＳＣＡＪ  ８２Ｑ［Ｍ６］／＋（Ｃ）遺伝子組換えハエの走査型電子顕微鏡検査（ＳＥＭ）の眼画像。挿入図は個眼領域の拡大図を示す。中央の列：ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋対照（Ｄ）、ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋；ＳＣＡ−１  ３０Ｑ［Ｆ６］＋（Ｅ）、及びｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋；ＳＣＡ−１  ８２Ｑ［Ｍ６］／＋（Ｆ）遺伝子組換えハエの眼網膜を通る切片。８２Ｑ［Ｍ６］ハエにおける網膜の重度の変性（矢印）と３０Ｑ［Ｆ６］ハエの比較的軽度の表現型に注目しなければならない。下の列：抗アタキシン−１抗血清で染色した第三幼虫齢の眼成虫原基。対照（Ｇ）ではタンパク質は検出されない。アタキシン−１  ３０Ｑ［Ｆ６］（Ｈ）とアタキシン−１  ８２Ｑ［Ｍ６］（Ｉ）遺伝子組換え系統の同様の発現レベルが注目される。箱の中の数字は、８２Ｑ［Ｍ６］と３０Ｑ［Ｆ６］系統における免疫蛍光の相対的量を示す（実験方法参照）。挿入図は、抗ラミニン抗体によって明らかにされたアタキシン−１  ＮＩ（緑色）と核膜（赤色）を示す拡大図である。すべての画像は２３℃で飼育したハエからのものである。
【図２】
図２Ａ−Ｇ：アタキシン−１  ８２Ｑ及び比較的高いレベルのアタキシン−１  ３０Ｑはショウジョウバエとマウスにおいて同様の表現型を引き起こす。
上の列：ＡとＣ、それぞれ１８℃と２９℃で飼育したＵＡＳ：ＳＣＡＪ  ３０Ｑ［ＦＪ］／＋；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋の眼のＳＥＭ画像。ＢとＤ、それぞれ抗アタキシン−１抗血清で染色したＡとＣにおけるような第三幼虫齢の眼成虫原基。免疫蛍光の量によって測定したとき、２９℃でのアタキシン−１発現は１８℃でのアタキシン−１発現と比較してほぼ１５８％である（実験方法参照）。免疫蛍光によって評価したとき発現レベルの５８％上昇によって引き起こされる表現型の悪化に留意しなければならない。下の列は、プルキンエ細胞特異的タンパク質、カルビンジンに対する抗血清で染色したマウス小脳切片を示す。Ｅ、野生型マウス、５１週齢。Ｆ、ヘテロ接合性ＳＣＡ−１  ３０Ｑ［Ａ０２］マウス、５２週齢。Ｇ、ホモ接合性ＳＣＡ−１  ３０Ｑ［Ａ０２］マウス、５９週齢。Ｈ、ヘテロ接合性ＳＣＡ−１  ８２Ｑ［Ｂ０５］マウス、５０週齢。野生型（Ｅ）とＳＣＡ−１  ８２Ｑヘテロ接合マウス（Ｈ）における分子層の厚さ（矢印）を比較して、ＳＣＡ−１  ３０Ｑ［Ａ０２］ホモ接合マウス（Ｇ）の比較的軽度であるが明らかな突然変異表現型に注目すべきである。
【図３】
図３Ａ−Ｃ：ショウジョウバエ介在ニューロンにおけるアタキシン−１  ８２Ｑの発現は進行性変性を引き起こす。
パネルはすべて、成虫ＣＮＳの第一（Ｔｉ）及び第二（Ｔ２）胸節におけるａｐｔｅｒｏｕｓ発現介在ニューロンを示す。ａｐＶＮＣＧＡＬ４ドライバーによって駆動されるτ−ＧＦＰリポーター遺伝子で視覚化される、半分節当り２つの大きな介在ニューロンが存在する。パネルＡは、４５日齢の対照ａｐＶＮＣ−ＧＡＬ４／＋；ＵＡＳ：τ−ＧＦＰ／＋；ＵＡＳ：ｌａｃＺＩ＋ハエのＣＮＳを示す。他の分節内の介在ニューロンからの軸索と束形成している介在ニューロンの強固な軸索投射路に注目すべきである。Ｂは、２つのＴ１と２つのＴ２腹側介在ニューロン及びそれらの軸策投射路を示す、パネルＡの高倍率拡大である。ＣとＤは、１日齢（Ｃ）及び４５日齢（Ｄ）のａｐＶＮＣ−ＧＡＬ４／＋；ＵＡＳ：τ−ＧＦＰ／−ｉ−；ＵＡＳ：ＳＣＡ−１  ８２Ｑ［Ｍ６］／＋ハエの高倍率拡大画像である。アタキシン−１  ８２ＱがＮＩ（赤い標識）に蓄積する。１日目には大部分の細胞体が存在するが、軸索投射路における標識は既に弱い（これらの介在ニューロンは変態より数日早く形成される）。４５日目には、わずかな細胞体しか見えない。数については表１参照。
【図４】
図４Ａ−Ｃ：ショウジョウバエにおけるアタキシン−１は、Ｈｓｐ７０、ユビキチン及びプロテアソームの成分も同時に蓄積する核封入体を形成する。
Ａ−Ｃ：アタキシン−１抗血清で染色した、対照ＵＡＳ：ＳＣＡ−１  ８２Ｑ［Ｆ７］／＋（Ａ）、ＵＡＳ：ＳＣＡ−１  ３０Ｑ［ＦＪ］／＋；ｄｐｐＧＡＬ４／＋（Ｂ）、及びＵＡＳ：ＳＣＡＪ  ８２Ｑ［Ｆ７］／＋；ｄｐｐＧＡＬ４／＋（Ｃ）ハエの唾液腺核。アタキシン−１  ３０Ｑ［Ｆ１］（Ｂ）とアタキシン−１  ８２Ｑ［Ｆ７］ハエ（Ｃ）で形成されたＮＩに注目しなければならない。Ｄ−Ｆ：ＮＩは、緑色で標識されたユビキチンを蓄積する。Ｇ−Ｈ：ＮＩは、プロテアソームの１９Ｓ調節因子ＡＴＰアーゼサブユニット６ｂを蓄積する。Ｊ−Ｌ：ＮＩはＨｓｐ／Ｈｓｃ７０分子シャペロンを蓄積する。すべてのパネルにおいてアタキシン−１を赤色で標識し、ユビキチン、プロテアソームのサブユニット、及びＨｓｐ７０を緑色で標識している。黄色は緑色と赤色標識の重なりを示す。
【図５】
図５Ａ−Ｆ：分子シャペロン又はプロテアソームの成分の活性の低下はアタキシン−１  ８２Ｑ眼表現型を悪化させる。
Ａ：２３℃で育成したＵＡＳ：ＳＣＡＪ  ８２Ｑ［Ｆ７］／＋；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋ハエの眼表現型を示す対照。Ｂ：パネルＡと同様であるが、ヘテロ接合でｈｓｃ７０−４’’’突然変異を担うハエの眼表現型。Ｃ：パネルＡと同様であるが、ｈｓｐ７０遺伝子のクラスター（ｈｓｐ７０Ａｂ、ｈｓｐ７０Ｂａ、ｈｓｐ７０Ｂｂ、及びｈｓｐ７０Ｂｃ）を除去する小さな欠失、Ｄｆ（３Ｒ）ｋａｒＤ１についてもヘテロ接合性であるハエの眼表現型。Ｄ：２７．５℃で育成した対照ＵＡＳ：ＳＣＡＪ  ８２Ｑ［Ｆ７］／＋；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋。Ｅ：パネルＤと同様であるが、Ｐｒｏｓ２６−ＤＴＳについてもヘテロ接合性であるハエの眼表現型。パネルＦは２７．５℃でのＰｒｏｓ２６−ＤＴＳ／＋対照を示す。
【図６】
図６Ａ−Ｋ：タンパク質折り畳み熱ショック応答及びユビキチン−タンパク質分解経路におけるサプレッサーとエンハンサー。
Ａ：２３℃で育成したＵＡＳ：ＳＣＡ−１  ８２Ｑ［Ｆ７］／＋；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋ハエの眼表現型を示す対照。パネルＢ−Ｅにおけるこの表現型の増強に注目しなければならない。これらのパネルは、次の変更を加えた、パネルＡの対照と同じ遺伝子型のハエを示す。Ｂ：Ｐ１６６６についてもヘテロ接合性、Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  ６３Ｅにおける突然変異。Ｃ：Ｐ１７７９についてもヘテロ接合性、ユビキチンコンジュガーゼＵｂｃＤｌにおける突然変異。Ｄ：ＥＰ１３０３についてもヘテロ接合性、ユビキチンコンジュガーゼｄＵｂｃＥ２Ｈにおける挿入。Ｅ：Ｐ２９２についてもヘテロ接合性、熱ショック応答因子ｈｓｒ−ｃｏにおける突然変異。Ｆ（新鮮眼画像）及びＧ（ＳＥＭ眼画像）は、２７℃で飼育したＵＡＳ：ＳＣＡ−１  ８２Ｑ［Ｆ７］／＋；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋対照ハエの眼表現型を示す。Ｇでの粗眼表面と組織崩壊した個眼、そしてＦにおける比較的少ない色素沈着に注目すべきである。Ｈ（新鮮眼画像）及びＩ（ＳＥＭ眼画像）：パネルＦ／Ｇと同様であるが、ＤＮＡ  Ｊ−Ｉ  ６４Ｆを過剰発現するＥＰ４１  ｌも同時に担うハエの表現型。Ｉにおける眼はＧの眼よりもなめらかであり、より組織化された個眼を持つ。また、Ｈの眼はＦの眼よりも色素沈着している；この色素沈着の増大は他のＥＰでは見られない。Ｊ：ＮＩを明らかにするためにアタキシン−１抗血清で染色した、２３℃で育成したＵＡＳ：ＳＣＡＪ  ８２Ｑ［Ｆ７］／＋；ｄｐｐＧＡＬ４／＋ハエの唾液腺。Ｋ：パネルＩと同様であるが、ＤＮＡ  Ｊ−Ｊ  ６４Ｆも過剰発現するハエの唾液腺。より緻密で、侵襲性の低いＮＩに注目すべきである。
【図７】
図７Ａ−Ｓ：新規経路におけるサプレッサーとエンハンサー。
Ａ（新鮮眼画像）及びＥ（ＳＥＭ眼画像）：２７℃で飼育したＵＡＳ：ＳＣＡ−１  ８２Ｑ［Ｆ７］／＋；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋ハエの眼表現型を示す対照。Ａでの比較的少ない色素沈着とＥにおける粗眼及び個眼の組織崩壊に注目すべきである。これらの表現型はパネルＢ−Ｄ及びＦ−Ｈでは部分的に抑制されている。これらのパネルは、次の修正を加えた、対照と同じ遺伝子型のハエを示す：Ｂ（新鮮眼画像）及びＦ（ＳＥＭ眼画像）：ＧｓｔＳ５Ｆを過剰発現するＥＰ２２３  １を同時に担う。Ｃ（新鮮眼画像）及びＧ（ＳＥＭ眼画像）：ｎｕｐ４４Ａを過剰発現するＥＰ２４１７を同時に担う。Ｄ（新鮮眼画像）及びＨ（ＳＥＭ眼画像）：ｍｕｂを過剰発現するＥＰ３６２３を同時に担う。Ｉ：２３℃で飼育した対照（ＵＡＳ：ＳＣＡ−１  ８２Ｑ［Ｆ７］／＋；ｇｍｒ−ＧＡＬ４／＋）の軽度眼表現型を示す対照。パネルＪ−Ｔにおけるこの表現型の増強に注目しなければならない。Ｊ−Ｔパネルの眼はまた、Ｉの対照眼よりも色素沈着比が少ない（示していない）。Ｊ−Ｔパネルは、次の修正を加えた、Ｉと同じ遺伝子型を持つハエの眼を示す：Ｊ：ＥＰ２２３１Ｍ８についてもヘテロ接合性、ＥＰ２２３１の不正確な切り出し。Ｋ：Ｐ１４８０についてもヘテロ接合性、Ｇｓｔ２における突然変異。Ｌ：ｐｕｍを過剰発現するＥＰ３４６１を同時に担う。Ｍ：ｃｐｏを過剰発現するＥＰ３３７８を同時に担う。Ｎ：ｄＹＴ５２Ｊ−Ｂを過剰発現するＥＰ３７２５を同時に担う。Ｏ：ＥＰ８６６についてもヘテロ接合性、Ｓｉｎ３Ａにおける突然変異。Ｐ：ＥＰ３６７２についてもヘテロ接合性、Ｒｐｄ３における突然変異。Ｑ：Ｐ１５９０についてもヘテロ接合性、ｄＣｔＢＰにおける突然変異。Ｒ：ｄＳｉｒ２を過剰発現するＥＰ２３００を同時に担う。Ｓ：Ｐ１９８についてもヘテロ接合性、ｐａｐにおける突然変異。Ｔ：ＥＰ３４６３についてもヘテロ接合性、ｔａｒａにおける突然変異。
【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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