(57)【要約】本発明は、原核生物宿主細胞中においてトリプトファンオペロンＰｔｒｐ制御下に配置された対象の組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現のための構築体に関し、それは、その開始コドンの直下流の配列番号１の核酸配列、及び、この配列下流にあり前記対象の組換えタンパク質をコードする遺伝子を受け取るようにしたマルチクローニングカセットを含み、前記配列番号１のヌクレオチド類の少なくとも１個は前記組換えタンパク質の過剰発現を可能とするべく変異しているかまたは欠失している。本発明はまた、このような構築体を含むベクター、前記ベクターで形質転換された原核生物宿主細胞、ならびに本発明による構築体を用いて対象の組換えタンパク質を製造する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
原核生物宿主細胞中においてトリプトファンオペロンＰｔｒｐ制御下に配置された対象の組換えタンパク質をコードする遺伝子を発現させるための構築体であり、
開始コドンの直下流の配列番号１の核酸配列と、この配列下流にあり前記対象の組換えタンパク質をコードする遺伝子を受け取るマルチクローニングカセットとを含み、
前記配列番号１のヌクレオチドの少なくとも１個は、前記組換えタンパク質の過剰発現を可能とするべく変異または欠失していることを特徴とする構築体。
【請求項２】
前記配列番号１の少なくとも１個のヌクレオチドは欠失している請求項１に記載の構築体。
【請求項３】
変異または欠失しているヌクレオチドが少なくとも配列番号１の配列番号２の断片に位置している請求項１に記載の構築体。
【請求項４】
変異または欠失、好適には変異しているヌクレオチドが少なくとも、配列番号１のコドンＧＴＡ上に位置している請求項１に記載の構築体。
【請求項５】
変異または欠失、好適には変異しているヌクレオチドが少なくとも、配列番号１のコドンＧＣＡ上に位置している請求項１に記載の構築体。
【請求項６】
変異または欠失、好適には変異しているヌクレオチドが少なくとも、配列番号１のコドンＣＴＧに位置している請求項１に記載の構築体。
【請求項７】
少なくとも１個のヌクレオチドが変異しているかまたは欠失している配列番号１は、少なくとも１位、２位および３位においてヌクレオチドＡを有している請求項１に記載の構築体。
【請求項８】
前記配列番号１が完全欠失している請求項１に記載の構築体。
【請求項９】
前記配列番号１の核酸配列と対象の前記組換えタンパク質をコードする遺伝子を受け取るようにされているマルチクローニングカセットの間に位置するヌクレオチドの少なくとも１個、好適には全ての前記ヌクレオチドが、欠失している請求項１〜８の何れか１項に記載の構築体。
【請求項１０】
開始コドンの直上流の核酸配列が配列番号３〜１０までから選択される請求項１〜９の何れか１項に記載の構築体。
【請求項１１】
前記原核生物宿主細胞がグラム陰性菌である請求項１〜１０の何れか１項に記載の構築体。
【請求項１２】
前記原核生物宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉ（大腸菌）である請求項１〜１１の何れか１項に記載の構築体。
【請求項１３】
請求項１〜１２の何れか１項に記載の構築体を含むベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターによって形質転換された原核生物宿主細胞。
【請求項１５】
Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）である請求項１４に記載の原核生物宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１２の何れか１項に記載の構築体を用いて宿主細胞中で対象の組換えタンパク質を製造する方法。
【請求項１７】
前記構築体が原核生物宿主細胞中に導入される請求項１６に記載の対象の組換えタンパク質を製造する方法。
【請求項１８】
前記構築体が請求項１３に記載のベクターを介して原核生物宿主細胞中に導入される請求項１６又は１７記載の対象の組換えタンパク質を製造する方法。
【請求項１９】
下記の行程を含む請求項１６〜１８の何れか１項に記載の対象の組換えタンパク質を製造する方法。
ａ）対象の遺伝子を請求項１３記載のベクター中にクローニングすること；
ｂ）前記対象の組換えタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターによって原核生物細胞を形質転換すること；
ｃ）前記形質転換細胞を組換えタンパク質発現を可能とする培地中で培養すること；
ｄ）前記組換えタンパク質を前記培地からまたは前記形質転換細胞から回収すること。
【請求項２０】
組換えタンパク質を製造するための請求項１〜１２の１項に記載の構築体、請求項１３に記載のベクター、または、請求項１４又は１５記載の細胞の使用。
【請求項２１】
組換えタンパク質が請求項１６〜１９記載の方法を用いて製造されることを特徴とする治療を必要とする患者に投与することを意図した医薬品を調製するための組換えタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、原核生物宿主細胞中においてトリプトファンオペロンＰｔｒｐ制御下に配置された対象の組換えタンパク質をコードする遺伝子を発現させるための構築体に関する。この構築体は、前記開始コドンの直下流の配列番号１の核酸配列、及び、この配列下流にあり前記対象の組換えタンパク質をコードする遺伝子を受け取るように意図したマルチクローニングカセットとを含み、前記組換えタンパク質の過剰発現を可能とするべく前記配列番号１のヌクレオチドの少なくとも１個は変異しているかまたは欠失している。本発明はまた、このような構築体を含むベクター、前記ベクターで形質転換された原核生物宿主細胞、およびまた、本発明による構築体を用いて対象の組換えタンパク質を製造する方法に関する。
【０００２】
配列／機能関係を確立するため短期間に遺伝子をクローニングし、それを生物活性タンパク質の形状で発現させ、その後その変異体を創造するバイオテクノロジー研究者の力により、医療または研究目的のため広範囲の組換えタンパク質が提案できるようになった。多くのヒト疾患は、現在、有用な分子が純粋な形状でかつ許容可能なコストでバイオテクノロジーから得られたことにより、治療されまたは防止されている（Ｋ．Ｋｏｔｈｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，６８１−６８７，１９９５）。
【０００３】
細菌菌細胞は、限定的栄養要求性を有している一方で同時に高成長密度を達成可能であることばかりでなく、更にそれらが過去において対象の変異体および改変プラスミド発現系の製造をもたらした多くの研究の対象であったので、組換えタンパク質発現のための好適な宿主となっている。細菌のなかでも、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ）は、原核生物または真核生物由来のタンパク質のその中での発現に関する非常に多くの文献を考慮すれば、最も汎用されかつ最も特徴解析が進んだ生物である。しかし、種々のレベルで起こりうる種々の問題のために、全てのタンパク質が同一効率でその中で発現されるというわけではない：対象の遺伝子の転写、翻訳、翻訳後の事象は、細菌の細胞質または周縁の環境中の分子に影響を及ぼす（Ｓ．Ｃ．Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，６０，５１２−５３８，１９９６）。
【０００４】
効率的に翻訳されるためには、メッセンジャーＲＮＡが細菌リボゾームの結合を特異的に決定しかつ翻訳開始を可能とする配列を含んでいなければならない。この配列はリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）と称され、開始コドンをカバーする領域に位置している。細菌性ｍＲＮＡ開始ドメインの統計的解析によれば、ヌクレオチド３４個分のウインドウ（３４ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｗｉｎｄｏｗ）が存在することが明らかになっており、その配列はランダム分布と異なっている（Ｌ．Ｇｏｌｄ，Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５７，１９９−２３３，１９８８）。この配列は、＋１位を開始コドンの第１ヌクレオチドとすればｍＲＮＡの−２０位から＋１３位の範囲にあり、リボゾームが“ＲＢＳ様”配列の全てから真の開始ドメインを識別することを手助けすることによってＲＢＳの役割を担っている。そのいくつかの特徴的要素を決定することにより、多くの研究によりＲＢＳに関しての知識を深めることが可能になった：
【０００５】
ｉ）シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列：
１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端の配列決定以降（Ｊ．Ｓｈｉｎｅ ａｎｄ Ｌ．Ｄａｌｇａｒｎｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７１，１３４２−１３４６，１９７４）、この“シャイン−ダルガルノ”配列とは、１６Ｓ ｒＲＮＡの３’末端の配列５’−ＣＣＵＣＣＵＵＡ−３’と相補性を示す開始コドンの５’に位置するｍＲＮＡ領域として定義されている。１６Ｓ ｒＲＮＡとＲＢＳとの間にこのシャイン−ダルガルノ配列によって媒介される相互作用が存在することは、Ｅ．ｃｏｌｉ ｍＲＮＡの天然ＲＢＳの領域［−１２；−７］中においてプリン塩基ＡおよびＧが高度に現れることによって確認されている。こうしたバイアスは、それらのレポータ遺伝子発現促進能のゆえに選択された１５８個の無作為ＲＢＳ群中において見出されている（Ｄ．Ｂａｒｒｉｃｋら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２２，１２８７−１２９５，１９９４）。
【０００６】
ｉｉ）開始コドン：
開始コドンとして好適に使用されるのはＡＵＧコドンであるが、ＧＵＧおよびそれより程度は低いがＵＵＧも時には見られることがある（Ｓ．Ｒｉｎｇｑｕｉｓｔら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，６，１２１９−１２２９，１９９２）。
【０００７】
ｉｉｉ）ＳＤ配列と開始コドンの距離：
Ｈ．Ｃｈｅｎらによる精力的な研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２，４９５３−４９５７，１９９４ａ）により、シャイン−ダルガルノ配列の３’末端と開始コドンを分離する距離には最適距離があることが明らかになった。参考ＳＤ配列としてコンセンサス配列５’−ＵＡＡＧＧＡＧＧＵ−３’を取ると、最大発現レベルを示す距離はヌクレオチド５個分である。ヌクレオチド１個乃至９個分の間隔も依然好適であり、最大レベルの少なくとも５０％に等しい発現レベルを確保する。
【０００８】
ｉｖ）他の主要配列：
翻訳開始に関与する２対が公知である：第１はｍＲＮＡ開始コドンとｔＲＮＡ−ｆＭｅｔの対であり、第２はＳＤ配列と１６Ｓ ｒＲＮＡ３’末端の対である。変異誘発研究や非典型的なｍＲＮＡ（特にリーダー配列を欠失しているｍＲＮＡ）の解析により、開始ドメインの全体としての効率に寄与するであろう新規配列要素が前記ＡＵＧコドン環境内部で同定できるようになった。開始コドン直下流にあるアデニン含量が高いモチーフは、翻訳開始に適している（Ｇ．Ｆ．Ｅ．Ｓｃｈｅｒｅｒら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８，３８９５−３９０７，１９８０；Ｈ．Ｃｈｅｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２４０，２０−２７，１９９４ｂ）。同様に、特に開始コドンが最適からはずれた時、第２コドン位置において最も多く見られるＡＡＡおよびＧＣＵコドン（Ｌ．Ｇｏｌｄ，１９８８）は、翻訳に正の効果をもたらす（Ｓ．Ｒｉｎｇｑｕｉｓｔら，１９９２）。Ｔ７ファージ０．３遺伝子のｍＲＮＡ上で同定された配列は開始コドンに対してその位置が下流にあることから“ダウンストリームボックス”（ＤＢ）と命名され、これは、もうひとつの翻訳促進要素である（Ｍ．Ｌ．Ｓｐｒｅｎｇａｒｔら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１８，１７１９−１７２３，１９９０）。このヌクレオチド１２個分の配列は、１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド１４６９−１４８３と相補性を示し、それは、いくつかの高度発現Ｅ．ｃｏｌｉおよびバクテリオファージ遺伝子の翻訳開始ドメイン上で類似形状として見出されている（Ｍ．Ｌ．Ｓｐｒｅｎｇａｒｔら，１９９０）。この“ダウンストリームボックス”は、ＳＤ配列が不在であっても翻訳開始を可能とする（Ｍ．Ｌ．Ｓｐｒｅｎｇａｒｔら，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１５，６６５−６７４，１９９６）。最近の結果では、当初提言された仮説に反して、このＤＢ配列が１６Ｓ ｒＲＮＡの１４６９−１４８３領域との対形成以外のメカニズムにより作用できることが示唆されている（Ｍ．Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９６，８９７３−８９７８，１９９９）。
【０００９】
ｖ）二次構造：
ＳＤ領域近位のｍＲＮＡの配列は、二次構造を形成することにより翻訳効率に影響を及ぼすことがある。Ｍ． Ｈ． ｄｅ Ｓｍｉｔ ａｎｄ Ｊ． ｖａｎ Ｄｕｉｎ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２３５，１７３−１８４，１９９４）は、ｍＲＮＡ上での分子間対形成が、ｍＲＮＡ／ｒＲＮＡ対形成と競合し正確な翻訳に有害であり、ＳＤ領域の１６Ｓ ｒＲＮＡとの相補性が弱ければ弱いほどなお一層有害である。同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ中におけるプロカイモシンの発現がＳＤを開始コドンに連結する領域の組成に依存していることが明らかになっている：二次構造を限定する配列はＲＢＳのリボゾームへのアクセス可能性を促進し、高翻訳効率を生ずることになる（Ｇ．Ｗａｎｇら，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，６，２８４−２９０，１９９５）。
【００１０】
組換えタンパク質の発現収率に及ぼす翻訳開始段階の重要性を考慮し、細菌発現ベクターのＲＢＳ領域最適化という目的のため、多くの研究が実施されてきた。直感的手法では、最初に、完全コンセンサスＳＤ領域（ＵＡＡＧＧＡＧＧＵ）を対象の遺伝子の上流に配置することによって構成してある（Ｇ．Ｊａｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．，７８，５５４３−５５４８，１９８１）。さらに系統だったこととして、Ｄ． Ｍ． Ｍａｒｑｕｉｓら（Ｇｅｎｅ， ４２，１７５−１８３，１９８６）がこの配列を種々のプロモータ下流および開始コドンから種々の距離（ヌクレオチド５個ないし９個分）に置いたことが挙げられる。モデルとしてＩＬ−２遺伝子を用いた結果は、ヌクレオチド６個分のＳＤ／ＡＵＧ間隔が、試験した全てのプロモータに最適であることを示唆している。しかし、前記コンセンサスＳＤ配列とｌａｃＺ遺伝子のＳＤ配列についての比較研究において、Ｗ． Ｍａｎｄｅｃｋｉら（Ｇｅｎｅ，４３，１３１−１３，１９８６）は、前記コンセンサスＳＤ配列がインビトロでより高い発現を示すがインビボではｌａｃＺのそれよりも２倍ないし２．５倍も低い発現を示すことを明らかにした。独自のＳＤ配列を有するファージ遺伝子に由来する全ＲＢＳ領域は、また、種々の起源（植物、哺乳類細胞、細菌類）のタンパク質発現のためにはコンセンサスＳＤ配列よりも優れていることを証明した（Ｐ．Ｏ．Ｏｌｉｎｓら， Ｇｅｎｅ，７３，２２７−２３５，１９８８）。Ｋ．ＣｕｒｒｙとＣ．Ｓ．Ｃ．Ｔｏｍｉｃｈ（ＤＮＡ，７，１７３−１７９，１９８８）は、トリプトファンプロモータを用いてコンセンサスＳＤ配列の効率とＰｔｒｐに元来存在するものの効率を比較した。彼らの結果では、対象の調べた遺伝子に関して非常に強い依存性が示唆され、全ての非相同遺伝子のために機能する最適ベクターを構築することは不可能であるという結論に至った。Ｍ．Ｋ．Ｏｌｓｅｎら（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９，１７９−１９０，１９８９）は彼ら自身もまたトリプトファンプロモータとコンセンサスＳＤ配列について研究していたのであるが、ＳＤ領域に隣接する配列にヌクレオチドＡおよびＴを高度に含ませることによって非常に高レベルの発現（総タンパク質の２０乃至３０％）を種々の非相同タンパク質（成長ホルモン、ＴＮＦ）について得た。同様の結果がこれまでＨ．Ａ．Ｄｅ Ｂｏｅｒ ら（ＤＮＡ，２，２３１−２３５，１９８３）によって述べられており、彼らは、α−インタフェロンを発現するハイブリッドプロモータＰｔｒｐ／ＰｌａｃＵＶ５という環境においてＳＤ領域下流に配置した塩基ＡおよびＴの正の効果を明らかにした。
【００１１】
これらの結果はすべて、限定された数のパラメータを考慮した実験環境において得られた。公知であれ未知であれ多数の因子が翻訳開始に影響を有しており特に反復的手法において考慮していない因子の相互作用が断定的に無視できない役割を果たしていることに気づいた数名の著者らは、その後、インビボにおける最適合成ＲＢＳを大規模ランダムライブラリーから選択しようとした。Ｂ．Ｓ．Ｗｉｌｓｏｎ ら（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１７，９４４−９５２，１９９４）は、ｌａｃプロモータ／オペレータの制御下においてβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む発現カセット内部で、開始コドン上流１６位において配列縮重体レパートリをスクリーニングした。このような手法によって、３倍高い効率でβ−ラクタマーゼを発現するオリジナル配列が同定識別可能となった。ｓｃＦｖをコードする別の遺伝子によって、オリジナルＲＢＳに対する過剰発現レベルは、約２倍である。
【００１２】
これらの結果を鑑み、最適として記載されているＲＢＳ領域が、対象の遺伝子の配列とそれ自体使用プロモータのタイプに依存しているｍＲＮＡリーダー領域配列の両者が関与する特定環境において確立されている。トリプトファンプロモータ（Ｂ．Ｐ．Ｎｉｃｈｏｌｓ ａｎｄ Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，１５５−１６４，１９８３）は、組換えタンパク質発現で使用される主要系のひとつである（Ｄ．Ｇ．Ｙａｎｓｕｒａ ａｎｄ Ｄ．Ｊ．Ｈｅｎｎｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ （Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）５４−６０，１９９０；Ｄ．Ｇ．Ｙａｎｓｕｒａ ａｎｄ Ｓ．Ｈ．Ｂａｓｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，６２，５５−６２，１９９７）。しかし、そのＲＢＳは、ランダム配列スクリーニングに基づく手法を用いた系統的最適化の対象であることはなかった。
【００１３】
対象のタンパク質に関わらず最大発現を保証する手段を得ることは、工業規模の方法を開発することを切望しているバイオテクノロジー研究者にとって重要である。結果として、組換えタンパク質発現を最適化可能なあらゆる増強に関して、この増強が宿主株により、発現ベクターにより、培養発現方法によりあるいはこれらの因子のあらゆる組み合わせにより導入されていようとも、こうした増強に対して大きな関心が寄せられている。
【００１４】
さらに特に、本発明は、発現ベクターによって運搬されるトリプトファンプロモータ（Ｐｔｒｐ）下流のリボゾーム結合部位（ＲＢＳ）領域中における新規ヌクレオチド配列の利点を明らかにする。
【００１５】
出願人は、開始コドン上流に導入された縮重オリゴヌクレオチドを用いかつその後クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポータ遺伝子を過剰発現するクローンを選択し、新規最適化ＲＢＳ配列を探求した。開始コドンの上流に最適化配列を探索する際、非常に驚くべきことに、開始コドンの直下流に位置する核酸配列が、組換えタンパク質を過剰発現するために変異させることができるかまたは欠失させることができるということがわかった。このようにして得られた配列は、多様な起源の種々の対象遺伝子の発現に関して、増強するという特性を示す。
【００１６】
さらに、品質という現在の制約に関しての大きな現時点での問題は、可能な限り純粋、即ち、組換えタンパク質の上流または下流に移植されたアミノ酸が最小数であり、これらのアミノ酸は使用した構築体由来であるという組換えタンパク質を得ることである。開始コドンと第１クローニング部位の間に位置する核酸配列が組換えタンパク質の過剰発現のために欠失を有していても、この問題は本発明によって解決される。
【００１７】
本発明の主題は、従って、原核生物宿主細胞中においてトリプトファンオペロンプロモータＰｔｒｐ制御下に配置された対象の組換えタンパク質をコードする遺伝子を発現させるための構築体であり、
それは、その開始コドンの直下流の配列番号１の核酸配列と、この配列下流にあり前記対象の組換えタンパク質をコードする遺伝子を受け取るようにしたマルチクローニングカセットとを含み、
前記配列番号１のヌクレオチドの少なくとも１個は、前記組換えタンパク質の過剰発現を可能とするべく変異しているかまたは欠失しているものである。
【００１８】
先行技術は、改変することなくこの配列番号１を使用することを教示しているがゆえに、本発明の主題によって過剰発現を得ることができるのはそれだけ非常に驚くべきことである。この効果に関して、特に、対象のタンパク質を発現させるため開始コドン下流の配列番号１の使用を教示している特許ＵＳ５，７１４，５８９、ＵＳ ５，４６８，８４５、ＵＳ５，４１８，１３５、ＵＳ４，８９１，３１０、ＵＳ４，７８９，７０２、ＷＯ ８８／０９３４４、ＵＳ４，７３８，９２１およびＥＰ ０ ２１２ ５３２を挙げることができる。
【００１９】
“対象の組換えタンパク質”という表現は、遺伝子組換えによって得られかつヒトまたは動物の健康分野、化粧品学の分野、動物栄養分野、農業分野、または化学工業分野のような分野で使用できる全てのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドを意味する。これらの対象のタンパク質のなかでも、限定することはないが特に下記を述べておく：
−  サイトカインおよび特にインターロイキン、インターフェロン、組織壊死因子および成長因子および特に造血成長因子（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ）、ヒト成長ホルモンまたはインシュリン、神経ペプチド；
−  凝固に関与する因子またはコファクターおよび特に第ＶＩＩＩ因子、フォンウィレブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）ファクター、抗トロンビンＩＩＩ ，プロテインＣ、トロンビンおよびヒルジン；
−  酵素および特にトリプシン、リボヌクレアーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ；
−  α１−抗トリプシンおよびウイルス性プロテアーゼ阻害剤のような酵素阻害剤；
−  例えばＰ５３遺伝子のような腫瘍抑制遺伝子の発現産物のような癌の開始または進展を阻害可能なタンパク質；
−  例えばグラム陽性菌膜タンパク質またはその活性断片のような免疫応答を刺激可能なタンパク質すなわち抗原、特に、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）ＯｍｐＡタンパク質またはヒト呼吸器シンシチウムウイルスプロテインＧ；
−  ヒト化されていてもいなくてもよいモノクローナル抗体またはｓｃＦｖのような抗体断片；
−  例えば天然のウイルスタンパク質と競合可能な問題のウイルスの抗原性エピトープまたはウイルスタンパク質の改変変異体のようなウイルス感染またはその進展を阻害可能なタンパク質；
−  サブスタンスＰまたはスーパーオキサイドディスムターゼのような化粧品組成物中に含まれやすいタンパク質；
−  食事性タンパク質および特にアリカメント；
−  化学的または生物化合物の合成を指示可能であるかまたはある有毒化合物を分解可能な酵素；
−  有毒物を産生する微生物に関して毒性を有するあらゆるタンパク質で、特にもしこの微生物が大腸菌であるならば、たとえばＨＩＶ−１ウイルスプロテアーゼ、ＥＣＰタンパク質、“好酸性カチオン性タンパク質”またはポリオウイルスタンパク質２Ｂおよび３Ａのようなタンパク質。
【００２０】
前記“配列番号１のヌクレオチド（核酸）の少なくとも１個が前記組換えタンパク質の過剰発現を可能とするべく変異しているかまたは欠失しているような配列番号１の核酸配列”という表現は、改変されていない配列番号１を用いて得られた前記組換えタンパク質の発現に比較して組換えタンパク質の過剰発現を可能とする配列番号１の少なくとも１個の欠失または変異を含むあらゆる配列を意味する。
【００２１】
“欠失”という用語は、配列番号１の１つ又は種々のヌクレオチド部位における１個又は以上のヌクレオチドの除去を意味する。結果として生成した配列は、もとの配列に比べて短くなっている。
【００２２】
“変異”という用語は、核酸を別のものと置換することを意味する（ＡはＣ，Ｇ又はＴと；Ｃは、Ａ，Ｇ又はＴと；Ｇは、Ａ，Ｃ又はＴと；Ｔは、Ａ、Ｃ又はＧと）。結果として生成した配列は、もともとの配列と同一の長さを有している。
【００２３】
過剰発現、すなわち開始コドン下流における改変なくして得られたものよリも高い発現を得るという事実は、特に、下記の方法を用いて決定できる。
ｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって細菌の総タンパク質を移動させ、クーマシーブルー染色かまたはウェスタンブロッティングによって組換えタンパク質を明らかにすること；
ｉｉ）前記組換えタンパク質を特異抗体を用いる方法（エライザ（Ｅｌｉｓａ） ）によってアッセイすること；
ｉｉｉ）もし前記組換えタンパク質が触媒活性を有しているならば、酵素的アッセイを行うこと。
【００２４】
好適には方法ｉｉ）が使用され、その詳細は実施例ＩＩＩ に述べる。
【００２５】
“マルチクローニングカセット”という表現は、開始コドン下流の対象遺伝子クローニング段階において使用可能な１個以上の制限部位を含むヌクレオチド配列を意味する。
【００２６】
好適には、前記の配列番号１の少なくともヌクレオチドは前記組換えタンパク質の過剰発現を可能とするために欠失している。
【００２７】
本発明はまた、変異または欠失、好適には欠失している、前記少なくともヌクレオチドが配列番号１の配列番号２の断片に位置している本発明による構築体に関する。
【００２８】
本発明の別の主題は、変異または欠失、好適には変異している、前記少なくともヌクレオチドが、配列番号１のコドンＧＴＡおよび／またはコドンＧＣＡおよび／またはコドンＣＴＧ上に位置している構築体に関する。
【００２９】
本発明の好適な態様において、少なくとも１個のヌクレオチドが変異しているかまたは欠失している配列番号１は、少なくとも１位、２位および３位においてヌクレオチドＡを有している。
【００３０】
本発明の好適な態様では、配列番号１の核酸配列と対象の前記組換えタンパク質をコードする遺伝子を受け取るようにされているマルチクローニングカセットの間に位置する前記ヌクレオチドの少なくとも１個、好適には全ての前記ヌクレオチドが、欠失している。
【００３１】
別のさらに好適な本発明の態様では、前記配列番号１は少なくとも１個のヌクレオチドが変異または欠失しており、そして配列番号１の核酸配列とマルチクローニングカセットの間に位置する全ての前記ヌクレオチドが完全に欠失しており、開始コドンがマルチクローニングカセットの直上流になっている。
【００３２】
本発明の好適な態様において、前記構築体は開始コドンの直上流に核酸配列を含み、その配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９および配列番号１０の配列から選択される。
【００３３】
本発明は、本発明による構築体を含み、前記原核生物宿主細胞が、グラム陰性菌、好適には大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）種に属するものを特徴とする。
【００３４】
本発明の別の主題は上述のような構築体を含むベクターに関し、それは、このようなベクターによって形質転換された原核生物宿主細胞、好適には大腸菌種に属するものに関する。
【００３５】
本発明の主題はまた、上述のような構築体を用いて宿主細胞中で対象の組換えタンパク質を製造する方法である。
【００３６】
本発明の主題はまた、本発明による対象の組換えタンパク質を製造する方法であり、前記構築体は、好適には上述のようなベクターを介して原核生物宿主細胞中に導入される。
【００３７】
好適には本発明による対象の組換えタンパク質を製造する方法であり、それは、下記の段階を含むことを特徴とする。
ａ）対象の遺伝子を本発明のベクター中にクローニングすること；
ｂ）前記対象の組換えタンパク質をコードする遺伝子を含むベクターによって原核生物細胞を形質転換すること；
ｃ）前記形質転換細胞を組換えタンパク質発現を可能とする培地中で培養すること；
ｄ）前記組換えタンパク質を前記培地からまたは前記形質転換細胞から回収すること。
【００３８】
本発明はまた、組換えタンパク質を製造するための本発明による構築体、ベクターまたは原核生物細胞の使用を含む。
【００３９】
最後に、本発明は、治療を必要とする患者に投与することを目的とした医薬品を調製するための組換えタンパク質の使用に関し、前記組換えタンパク質は、本発明による対象の組換えタンパク質製造方法を用いて製造されることを特徴とする。
【００４０】
下記の実施例および図面は本発明を例示することを目的としており、いかなる意味でもその範囲を限定することは意図していない。
【００４１】
実施例Ｉ
【００４２】
この実施例では、本発明に至った態様のひとつ、特にＰｔｒｐトリプトファンプロモータおよび開始コドンの無作為変異上流を含むプラスミドベクターのライブラリを構築する方法を示す。起源ベクターを、図１に示した。それは、Ｐｔｒｐプロモータ／オペレータ（１−２９８）とそれに続くＥ．ｃｏｌｉ  ＴｒｐＬリーダー（Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋｙら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９，６６４７−６６６８，１９８１）の最初の７個のアミノ酸をコードする配列をマルチクローニング部位およびＥ．ｃｏｌｉ  ｔｒｐｔ形質転換ターミネータ（Ｃ．Ｙａｎｏｆｓｋｙら，１９８１）によってクローニングしたｐＢＲ３２２（Ｆ．Ｂｏｌｉｖａｒら，Ｇｅｎｅ，２，９５−１１３，１９７７）由来のプラスミドである。ｐＴＥＸｍｐ１８中のＰｔｒｐの３’部分は、ＡＴＧ開始コドン上流のＸｂａＩクローニング部位（図２参照）の存在とＳＤと前記開始コドンの間の長い間隔によって天然の配列と異なっている。
【００４３】
それらのＲＢＳ部分において改変されたベクターの選択を可能とするため、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポータ遺伝子をｐＴＥＸｍｐ１８のＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ部位においてクローニングする。このため、ｃａｔ遺伝子のコード配列を、オリゴヌクレオチドＣＡＴｆｏｒおよびＣＡＴｒｅｖを用いるＰＣＲによって増幅し、それらの配列を下記に示した。
【００４４】
2004500875.tif 000002
【００４５】
ＰＣＲ反応は、マトリックスとしてファージミドｐＢＣ−ＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて実施する。増幅産物をアガロースゲルに載せ、 ＧｅｎｅＣｌｅａｎ法により精製する（Ｂｉｏ１０１，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）。ｐＴＥＸｍｐ１８中への挿入体のクローニングは、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌ存在下Ｅ．ｃｏｌｉ中へ形質転換後ＬＢ寒天培地皿に進展するコロニーの出現によって確認する（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。挿入体の配列は、“ダイ・ターミネータ（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）”キットおよびＤＮＡシークエンサー３７３Ａ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いる自動配列決定によって確認する。得られたベクターをｐＴＥＸＣＡＴと命名する。
【００４６】
縮重配列（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を有するＲＢＳの開始コドン上流への挿入は、ベクターｐＴＥＸＣＡＴのＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位において合成オリゴヌクレオチドを連結することによって実施される。それぞれ−４９位および＋２８位のＳｐｅＩ部位からＥｃｏＲＩ部位にわたる領域は酵素消化によって欠失させ、互いにハイブリッドを形成している２個の部分縮重合成オリゴヌクレオチドによって形成されたヘテロ二本鎖と置換される。２対のオリゴヌクレオチドを用いるが、それぞれ、オリゴヌクレオチドＲａｎＳＤ１／ＲａｎＳＤ２およびＲａｎＳＤ３／ＲａｎＳＤ４が関与し、その配列は下記のようである。
【００４７】
2004500875.tif 000003
【００４８】
前記４個のオリゴヌクレオチドは、各々の縮重のために塩基を等モルづつ確実に分布させる条件下においてＭＷＧ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。ＲａｎＳＤ１／ＲａｎＳＤ２の対は、ＡＴＧコドンに先立つ１６個のヌクレオチド上において完全縮重を導入する（Ｎ＝４ヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｔ、Ｇの混合物）。組み合わせの数（４１６，すなわちおよそ４．３×１０９）は、それらのシャイン―ダルガルノ（ＳＤ）配列の観点およびこのＳＤ領域と開始コドンの間に位置したＳＤ−ＡＴＧ間隔中に位置する配列の観点の両者から最適化されるＲＢＳがスクリーニングできるようにする。このライブラリは、以下の本文では（Ｎ１６）と命名する。ＲａｎＳＤ３／ＲａｎＳＤ４の対は、ＡＴＧに先立つ６個のヌクレオチド上で完全縮重性を導入しかつ上流の７個のヌクレオチド上で部分縮重性を導入する。正鎖上でプリン（Ｒ＝ＡまたはＧ）を独占的に使用しかつ相補鎖上でピリミジン（Ｙ＝ＣまたはＴ）を独占的に使用することにより、ＡＴＧコドンから最適距離において（ヌクレオチド６個分）シャインーダルガルノ型の配列があらわれるようになるのを促進する。この第２ライブラリを（Ｒ７Ｎ６）と命名する。
【００４９】
ベクターｐＴＥＸＣＡＴを直線状にすることおよびそのゲル精製、オリゴヌクレオチドを対としてハイブリッド形成させること、線状ベクターｐＴＥＸＣＡＴに対してこのヘテロ二本鎖を連結すること、およびこのようにして構築したライブラリをＥ．ｃｏｌｉ中に形質転換することは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）により記載された条件下で実施される。従来、ベクター１００ｆｍｏｌと挿入体１０００ｆｍｏｌをＴ４リガーゼ存在下最終容量１５μｌになるように連結反応に添加する。本反応は、１６℃で一晩実施する。その後、製造業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の指示する条件下で連結混合物３μｌによるエレクトロポレーションによって形質転換する。形質転換混合物をアンピシリン２００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天皿上に接種し、３７℃で１６時間インキュベーション後、形質転換コロニーの出現を生じる。
【００５０】
実施例ＩＩ
【００５１】
ＣＡＴ酵素過剰発現コロニーがクロラムフェニコール増強耐性を有するであろうという仮説に基づき、このライブラリをスクリーニングする。このことは実験により検証され、その結果を下記の表１に示した。
【００５２】
【表１】
2004500875.tif 000004
【００５３】
数値（上方）は、３７℃で１８時間インキュベーションした後に計数したコロニー数を示しており、各媒体には細胞およそ１００個を接種した。
【００５４】
下方の指標は、コロニー成長の質的基準である（−＝ゼロ成長から＋＋＋＝最大成長）。
【００５５】
これらの結果は、ベクターｐＴＥＸＣＡＴにより形質転換され種々の濃度のクロラムフェニコールを含有する皿上に接種したＴＯＰ１０　Ｅ．ｃｏｌｉ菌が、クロラムフェニコール３００および６００μｇ／ｍｌの間で進展し、Ｐｔｒｐ脱抑制効果によりインデューサとして作用するトリプトファンアナログである３−βインドールアクリル酸（ＩＡＡ）の存在下においてより強く発育する（Ｒ．Ｑ．ＭａｒｍｏｒｓｔｅｉｎおよびＰ．Ｂ．Ｓｉｇｌｅｒ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２６４，９１４９−９１５４，１９８９）。このことは、最適化ＲＢＳ領域によりＣＡＴを過剰発現するクローンがＭＩＣ（最小阻害濃度）よりも低いクロラムフェニコール濃度において野生型集団よりもより迅速に進展するか、または、野生型集団にとっては致死的であるクロラムフェニコール濃度の存在下において進展するであろうということを意味している。
【００５６】
実施例ＩＩＩ
【００５７】
この実施例では、実施例１の記載に従って構築されたライブラリからのクローンの選択を示す。前記領域中において５８０ｎｍにおいて１の光学密度（ＯＤ）を有する懸濁液を再構成するため、ＬＢ寒天＋アンピシリンの皿上にコロニー層の形態で得られたライブラリを滅菌水に取る。実施例２の結果によれば、この懸濁液を致死量のクロラムフェニコール（６００，７００、８００および９００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ寒天皿にペトリ皿１枚当たり懸濁液１００μｌとして接種する。この皿を３７℃でインキュベーションし、耐性コロニーの出現を観察し、野生型ｐＴＥＸＣＡＴベクターで形質転換した菌ＴＯＰ１０の懸濁液を用いて接種した皿は全く成長を示さないことを同時に確認する。耐性コロニーを単離し、それらの耐性表現型を確認するため選択培地上で数回継代培養する。この段階で選択したクローンをその後一連の分析に供する：（ｉ）プラスミドの抽出（Ｑｉａｇｅｎキット， Ｈｉｄｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＲＢＳをカバーする領域の配列決定、（ｉｉ）三角フラスコ中でＩＡＡによる誘導により培養し、その後、ＥＬＩＳＡアッセイによってＣＡＴ発現レベルを評価すること、（ｉｉｉ） 早期培養物から抽出した総タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動、およびクーマシーブルーによる染色により総細胞内タンパク質の視覚化。ダイ・ターミネータ（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）キットを用いてＡＢＩ  ３７３Ａシークエンサー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）で配列を決定する。三角フラスコ中の培養物は、ＴＳＢＹ培地（トリプシンソヤブロス（ＤＩＦＣＯ）３０ｇ／ｌ＋酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）５ｇ／ｌ培地）２５ｍｌ＋テトラサイクリン８ｍｇ／ｌに皿上のコロニーを接種するかまたは−８０℃で保存した菌懸濁液を接種することによって、調製する。各前記培養物を３７℃で一晩、２００ｒｐｍで振とうしているプラットフォーム上でインキュベーションする。１に等しい当初の光学密度を得るため、分画を同一培地５０ｍｌに移す。ＣＡＴタンパク質誘発のため、ＩＡＡ２５ｍｇ／ｌを前記培地に添加し、その後それを同一条件下で５時間振とうする。前記懸濁液（３×１ｍｌをＯＤ＝０．１に希釈したもの）の分画を遠心分離し、細胞を−２０℃で保存し、ＥＬＩＳＡによってＣＡＴをアッセイする（ＣＡＴ ＥＬＩＳＡキット、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。前記バイオマスの残りは、１０，０００ｇにおいて４℃で１５分間遠心分離して回収する。このバイオマスを、湿潤バイオマス１ｇあたり５ｍｌの割合でＴＥＬ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５００μｇ／ｍｌリゾチーム、ｐＨ８）中に取る。細胞を超音波（マイクロプローブ付属ＶｉｂｒａＣｅｌｌソニケータ、Ｓｏｎｉｃｓ＆Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）によって溶解させる。生成した懸濁液１ｍｌを１２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離する。ペレットをＴＥＬ２００μリットルにより取り上げ、不溶性（Ｉ）分画を得る。上清を“Ｓ”とマークする。ＩおよびＳ分画に含まれる総タンパク質を、変性条件下における電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析し���クーマシーブルーによって染色する。
【００５８】
下記の表２は、前記２個のライブラリ（Ｎ１６）および（Ｒ７Ｎ６）スクリーンニング後に得られた種々のＲＢＳ配列を示している。我々は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬヌクレオチドデータベースに並べた後、種々の単離クローン中においてＡＵＧコドンの直上流に位置する前記の１６−ヌクレオチド（（Ｎ１６）ストラテジー）または１３−ヌクレオチド（（Ｒ７Ｎ６）ストラテジー）配列のいずれも今日まで記載されたことがないと結論できる。
【００５９】
【表２】
2004500875.tif 000005
【００６０】
（＊） 各ヌクレオチド配列（メッセンジャーＲＮＡ）は、開始コドン下流の変異領域を含む。ベクターｐＴＥＸＣＡＴの参考配列は、表の第１行に示してある。ベクターの開始コドン上流および下流の核酸配列は、ＲＮＡ形状での転写後においてこの表に示してある。これらの配列の３’末端におけるマルチクローニング部位の最初のコドン２個すなわちＧＡＡＵＵＣのみが示されている。
【００６１】
したがって、非常に驚くべきことに、表２に示したクローンが、ＡＵＧコドンの直下流に位置するＲＢＳ領域において変異を有することが観察された。このクローンｐＴＥＸＣＡＴ４，ｐＴＥＸＣＡＴ１’，およびｐＴＥＸＣＡＴ３’はコードされたタンパク質のＮ−末端部分のアミノ酸に影響を及ぼす点変異を有している（それぞれ、Ｌｅｕ７Ｐｒｏ、Ａｌａ３ＰｒｏおよびＶａｌ６Ａｌａ）。他のクローンは、それよりも大きい再配置を有している：ｐＴＥＸＣＡＴ２’、ｐＴＥＸＣＡＴ５’およびｐＴＥＸＣＡＴ９’は、それぞれ、領域Ａｌａ３Ｌｅｕ７，Ｉｌｅ４Ｌｅｕ７およびＩｌｅ４Ａｓｎ８の喪失を誘発する欠失を有している。アンピリシン上で選択した（Ｎ１６）ライブラリのクローン１０個の無作為分析（すなわち、クロラムフェニコール選択圧なし）で、ＴｒｐＬペプチドをコードする領域中における改変を全く示さない（データを示さず）ことを考慮すれば、そのことから、ＣＡＴ発現能について選択したクローンで観察されたＴｒｐＬ変異がこの発現になんらかの役割を果たしていると推測される。したがって、我々は、下記の独自性質を実証する：組換えタンパク質の発現に対して、開始コドン下流における変異が正の影響を及ぼす。
【００６２】
図３は、ｐＴＥＸＣＡＴまたはｐＴＥＸＣＡＴ４により形質転換された菌類の総タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している。それは、ＣＡＴ（２８ｋＤａ）について予測される位置に移動する主要タンパク質がＩＡＡ誘発抽出物中で検証され、一方、同一誘発条件下で得られたベクターｐＴＥＸＣＡＴの抽出物は低強度のバンドしか示さないことから、ベクターｐＴＥＸＣＡＴ４の過剰産生特性の確認を示す。
【００６３】
前記過剰産生がＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ部分外部における前記ベクターの改変に起因する可能性を排除するため、前記ベクターｐＴＥＸＣＡＴ４を、ＳｐｅＩ−ＥｃｏＲＩ消化と下記の２個のリン酸化オリゴヌクレオチドによって形成された二本鎖の連結によって、インビトロでｐＴＥＸＣＡＴから再構成した：
【００６４】
2004500875.tif 000006
【００６５】
生成したベクターをｐＴＥＸＣＡＴ−ＳＤ４とマークし、それをその後Ｅ．ｃｏｌｉ　ＴＯＰ１０中に形質転換し、ＣＡＴ酵素発現能の観点からｐＴＥＸＣＡＴ４と比較した。得られた結果は、ｐＴＥＸＣＡＴ４およびｐＴＥＸＣＡＴ−ＳＤ４の発現レベルが互いに匹敵しており、ｐＴＥＸＣＡＴよりも有意に高いことが示唆される。このことは、この特許出願で請求しているクローンで観察された発現増強が、実際には、ＳｐｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間に位置する配列に特異的に起因するという仮説が実証される。
【００６６】
開始コドンの直下流に位置する変異または欠失配列の特異性を実証するため、野生型ベクターｐＴＥＸＣＡＴの第７位にあるロイシンＣＴＧをプロリンＣＴＧと置換して、ベクターｐＴＥＸＣＡＴ−Ｌ７Ｐを作製した。ベクターｐＴＥＸＣＡＴ４の第７位にあるプロリンＣＣＧをロイシンＣＴＧと置換して、ベクターｐＴＥＸＣＡＴ４−Ｐ７Ｌを作製した。この実験結果を下記の表３に示した。
【００６７】
【表３】
2004500875.tif 000007
【００６８】
結果（平均±標準偏差）は、独立した実験２種によって得られた。適宜、レベル１をベクターｐＴＥＸＣＡＴとする。
【００６９】
これらの結果は、開始コドン下流の変異がそれ自体、野生型ベクターに再導入されるとこの変異が同一過剰発現を生ずることが可能となるので、過剰発現に関与していることを示している。
【００７０】
実施例ＩＶ
【００７１】
この実施例では、記載の新規配列の過剰発現効果がそれらの選択に用いたレポータ遺伝子に限定されず、これらの遺伝子は機能的に同一ベクター上でそれらに連結していさえすれば他の遺伝子に転位されることを示す。この効果に対して、ベクターｐＴＥＸＣＡＴおよびｐＴＥＸＣＡＴ４のＣＡＴ遺伝子を、Ｅ．ｃｏｌｉ  β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ遺伝子の配列と置換した。クローニングは、ベクターｐβＧＡＬ−ベーシック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を用いるＰＣＲによってｌａｃＺ配列を増幅することおよび唯一のＢｓｍＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位においてｔｒｐＬ下流にこの配列を挿入することによって実施し、それぞれ、ベクターｐＴＥＸ−βＧＡＬおよびｐＴＥＸ４−βＧＡＬを生成させた。
【００７２】
β−ガラクトシダーゼ発現動態に従い培養目的で、発酵槽中でこの２個のベクターをＥ．ｃｏｌｉ  ＩＣＯＮＥ２００（１９９９年１０月１５日発行フランス特許出願ＦＲ２  ７７７  ２９２）株中に形質転換した。従来、組換え菌ＩＣＯＮＥ２００×ｐＴＥＸ−βＧＡＬおよびＩＣＯＮＥ２００×ｐＴＥＸ４−βＧＡＬは、３７℃で一晩、完全培地（トリプシンソイブロス３０ｇ／ｌ（ＤＩＦＣＯ）、酵母抽出物５ｇ／ｌ（ＤＩＦＣＯ））２００ｍｌ中で培養していた。得られた細胞懸濁液を、無菌的に下記培地（濃度は最終培養物２リットル用）１．８リットルを含む発酵槽（Ｃｈｅｍａｐモデル、ＣＦ３０００、容量３．５リットル）中に移した：グリセロール９０ｇ／ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ５ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ６ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４  ４ｇ／ｌ、Ｎａ３−クエン酸  ２Ｈ２Ｏ  ９ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ  ２ｇ／ｌ、  酵母抽出物１ｇ／ｌ、微量元素類、０．０６％抗発泡剤、テトラサイクリン８ｍｇ／ｌ、トリプトファン２００ｍｇ／ｌ。ｐＨは、アンモニア水を添加することによって７．０に調整する。溶解酸素レベルは、振とう速度のサーボコントロールおよび次に溶解Ｏ２ を測定することによって通気速度をサーボコントロールすることによって、飽和度３０％に保持する。培養物の光学密度が３０と４０の間の値に到達したら、ＩＡＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓｅ、ＭＯ）２５ｍｇ／ｌを添加することによって誘導を実施する。培養物の光学密度（５８０ｎｍにおけるＯＤ）および細胞内β−ガラクトシダーゼ活性の動態分析を実施した。β−ガラクトシダーゼ活性レベルは、試料３０μｌ（Ｓ分画  実施例３参照）、緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５−１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）２０４μｌ、およびＯＮＰＧ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５中４ｍｇ／ｍｌ）６６μｌを混合することによって比色分析によって評価する。反応混合物を３７℃でインキュベーションする。反応を、１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３  ５００μｌを添加することによって停止する。４２０ｎｍにおけるＯＤはインキュベーション時間に関連し、試料中に存在するβ−ガラクトシダーゼ活性に比例する。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＩＣＯＮＥ２００はｌａｃオペロンの完全欠失を有しているので、測定したβ−ガラクトシダーゼ活性は、プラスミドｌａｃＺ遺伝子の発現のみによる。
【００７３】
この比較検討結果は、２個の独立した実験においてベクターｐＴＥＸ４−βＧＡＬがｐＴＥＸ−βＧＡＬよりもおよそ５０倍高いβ−ガラクトシダーゼ活性レベルを付与することを示唆している（図４）。我々は、このことからベクターｐＴＥＸＣＡＴ４のＲＢＳ領域中で単離されたオリジナル配列が、ＣＡＴタンパク質のみではなくたとえばβ−ガラクトシダーゼのような他のタンパク質の発現も賦活すると評価している。我々は、この実施例に基づき、バイオテクノロジーの観点から重要な他のタンパク質も、それらのコード配列を前記変異または欠失配列の下流に本発明に従って導入することによって本発明によるベクターのひとつを用いて発現できることは有益であると結論できる。
【００７４】
実施例Ｖ
ベクターｐＴＥＸｗｔ（本発明の部分ではない）、およびベクターｐＴＥＸ９’，ｐＴＥＸ１０’、ｐＴＥＸ１１’およびｐＴＥＸ１２’によって付与される発現レベルの比較
【００７５】
ベクターｐＴＥＸ１０’、ｐＴＥＸ１１’およびｐＴＥＸ１２’は、ベクターｐＴＥＸ９’に由来しているが、下記の表４に示したように付加的変異を含む：
【００７６】
【表４】
2004500875.tif 000008
【００７７】
（＊） 各ヌクレオチド配列（メッセンジャーＲＮＡ）は、開始コドン下流の変異領域を含む。ベクターｐＴＥＸＣＡＴの参考配列は、表の第１行に示してある。ベクターの開始コドン上流および下流の核酸配列は、ＲＮＡ形状での転写後において、この表に示してある。これらの配列の３’末端におけるマルチクローニング部位の最初コドン２個すなわちＧＡＡＵＵＣのみが示されている。
【００７８】
発現決定方法は、上記実施例で使用したものである。
【００７９】
これらの結果は、開始コドン下流の欠失が野生型ベクターを用いて観察される発現よりも最大２５０倍までの過剰発現を得ることを可能とすることを証明している。
【００８０】
【配列表】
2004500875.tif 000009
【００８１】
2004500875.tif 000010
【００８２】
2004500875.tif 000011
【００８３】
2004500875.tif 000012
【００８４】
2004500875.tif 000013
【００８５】
2004500875.tif 000014
【００８６】
2004500875.tif 000015
【００８７】
2004500875.tif 000016
【００８８】
2004500875.tif 000017
【００８９】
2004500875.tif 000018
【００９０】
2004500875.tif 000019
【００９１】
2004500875.tif 000020
【００９２】
2004500875.tif 000021
【００９３】
2004500875.tif 000022
【００９４】
2004500875.tif 000023
【００９５】
2004500875.tif 000024
【００９６】
2004500875.tif 000025
【００９７】
2004500875.tif 000026
【００９８】
2004500875.tif 000027
【００９９】
2004500875.tif 000028
【０１００】
2004500875.tif 000029
【０１０１】
2004500875.tif 000030
【０１０２】
2004500875.tif 000031
【０１０３】
2004500875.tif 000032
【０１０４】
2004500875.tif 000033
【０１０５】
2004500875.tif 000034
【０１０６】
2004500875.tif 000035
【０１０７】
2004500875.tif 000036
【０１０８】
2004500875.tif 000037
【０１０９】
2004500875.tif 000038
【０１１０】
2004500875.tif 000039
【０１１１】
2004500875.tif 000040
【０１１２】
2004500875.tif 000041
【０１１３】
2004500875.tif 000042
【０１１４】
2004500875.tif 000043
【０１１５】
2004500875.tif 000044
【０１１６】
2004500875.tif 000045
【０１１７】
2004500875.tif 000046
【０１１８】
2004500875.tif 000047
【０１１９】
2004500875.tif 000048
【０１２０】
2004500875.tif 000049
【０１２１】
【図面の簡単な説明】
【図１】
プラスミドベクターｐＴＥＸｍｐ１８と、Ｐｔｒｐプロモータ／オペレータ、ＴｒｐＬリーダー領域、ｍｐ１８マルチクローニング部位および転写テーミネータを含む領域１−４５０の配列番号３９の配列との地図を示す模式図である。
【図２】
ベクターｐＴＥＸｍｐ１８上のＲＢＳ（リボゾーム結合部位）領域（配列番号４０）の制限地図を示す模式図である。
【図３】
ベクターｐＴＥＸＣＡＴ又はｐＴＥＸＣＡＴ４によって形質転換された菌中におけるＣＡＴ発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ上における評価を示す模式図である。
【図４】
ベクターｐＴＥＸ−βＧＡＬおよびｐＴＥＸ４−βＧＡＬを用いるβ−ガラクトシダーゼの発現比較検討（発行槽内の動態）を示す模式図である。
【図１】
2004500875.tif 000050
【図２】
2004500875.tif 000051
【図３】
2004500875.tif 000052
【図４】
2004500875.tif 000053
【国際公開パンフレット】
2004500875.tif 000054
2004500875.tif 000055
2004500875.tif 000056
2004500875.tif 000057
2004500875.tif 000058
2004500875.tif 000059
2004500875.tif 000060
2004500875.tif 000061
2004500875.tif 000062
2004500875.tif 000063
2004500875.tif 000064
2004500875.tif 000065
2004500875.tif 000066
2004500875.tif 000067
2004500875.tif 000068
2004500875.tif 000069
2004500875.tif 000070
2004500875.tif 000071
2004500875.tif 000072
2004500875.tif 000073
2004500875.tif 000074
2004500875.tif 000075
2004500875.tif 000076
2004500875.tif 000077
2004500875.tif 000078
2004500875.tif 000079
2004500875.tif 000080
2004500875.tif 000081
2004500875.tif 000082
2004500875.tif 000083
2004500875.tif 000084
2004500875.tif 000085
2004500875.tif 000086
2004500875.tif 000087
2004500875.tif 000088
2004500875.tif 000089
2004500875.tif 000090
2004500875.tif 000091
2004500875.tif 000092
2004500875.tif 000093
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004500875.tif 000094
【国際調査報告】
2004500875.tif 000095
2004500875.tif 000096
2004500875.tif 000097
2004500875.tif 000098
2004500875.tif 000099
2004500875.tif 000100
2004500875.tif 000101
2004500875.tif 000102