(57)【要約】回転電極の構成によって、ポリイオン感応性メンブレン電極の検出限界が下がる。トリドデシルメチルアンモニウムクロライドおよびカルシウムジノニルナフタレンスルホナートをそれぞれ、可塑化ＰＶＣまたはポリウレタンメンブレン内に取り入れ、またこのような膜のディスクを、ボルタンメトリで用いられるタイプの回転ディスク電極装置内に収容される電極本体上に載置することによって、平面状の電位ポリカチオンおよびポリアニオン感応性メンブレン電極を作製した。このようなセンサは特有の非平衡応答メカニズムを有するため、ポリイオン感応性メンブレン電極を５０００ｒｐｍで回転させることによって、ヘパリン（ポリアニオン）およびプロタミン（ポリカチオン）に対する検出限界が、攪拌バーを用いて対流の物質輸送を実現させることで同じ電極のＥＭＦ応答を評価したときに観察されるものと比べて、少なくとも１桁（ヘパリンに対して０．０１Ｕ／ｍｌまで、プロタミンに対して０．０２Ｕ／ｍｌまで）向上した。ω−１／２（ここでωは回転角周波数）とＣ１／２（ポリイオン種に対する合計最大ΔＥＭＦ応答の半分に対応するポリイオン濃度）との間の直線関係が観察された。また回転ポリカチオンセンサを終点検出器として用いることで、低濃度のヘパリンの測定に対する分析分解能および精度を、このような試料をプロタミンを用いて滴定する場合に非常に高めることができる。
2004525349.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中心軸を通る孔を有する回転可能なほぼ円筒形のハウジングと、
非平衡応答メカニズムを有するポリマーマトリックス材料のポリイオン応答性メンブレンであって、前記ハウジングとともに回転可能となり前記ハウジング内部の基準溶液を密封し前記ハウジング外部の試料溶液と接触するように、前記ハウジングの一端に配置されたポリイオン応答性メンブレンと、
前記ハウジングの前記孔を通って延びる内部基準電極であって、該内部基準電極の一端が内部基準溶液内に置かれるように配置され、前記ハウジングから絶縁された内部基準電極と、
外部電極とを備えることを特徴とするポリイオンメンブレン電極アセンブリ。
【請求項２】
前記ポリイオン応答性メンブレンが、混合状態で、ポリマーマトリックス材料、親油性の陽イオンまたは陰イオン交換材料、および随意に可塑剤を含み、電極メンブレンの混合状態の配合物は、陽イオンまたは陰イオン高分子それぞれに選択的に応答することを特徴とする請求項１記載のポリイオンメンブレン電極アセンブリ。
【請求項３】
前記電極メンブレン混合物が、陽イオン高分子に選択的に応答することを特徴とする請求項２記載のポリイオンメンブレン電極アセンブリ。
【請求項４】
前記陽イオン高分子がプロタミンであることを特徴とする請求項３記載のポリイオンメンブレン電極アセンブリ。
【請求項５】
前記電極メンブレン混合物が、陰イオン高分子に選択的に応答することを特徴とする請求項２記載のポリイオンメンブレン電極アセンブリ。
【請求項６】
前記陰イオン高分子がヘパリンであることを特徴とする請求項５記載のポリイオンメンブレン電極アセンブリ。
【請求項７】
液体媒体中のポリイオン高分子の濃度をその電位応答の関数として測定する方法であって、
（ａ）ポリイオン応答性メンブレン電極を、未知の量のポリイオン高分子検体を含有する液体媒体と接触させるステップであって、ポリイオン応答性メンブレンが、検体に対する非平衡応答メカニズムを有するポリマーマトリックス材料を含むステップと、
（ｂ）前記ポリイオン応答性メンブレンを液体媒体中で回転させるステップと、
（ｃ）前記液体媒体中の検体濃度を示す電位応答を測定するステップとを含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
前記ポリイオン応答性メンブレンを、約５００ｒｐｍ〜６０００ｒｐｍの速度で回転させることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ポリイオン応答性メンブレンを、５０００〜６０００ｒｐｍで回転させることを特徴とする請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（政府の権利）
本発明は、米国立衛生研究所によって授与された契約（契約番号ＧＭ２８８２）の下でなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
（関連発明の相互参照）
本出願は、米国特許出願６０／２５４，４９６（２０００年１２月８日に出願）の継続出願であり、この出願の利益を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
発明の分野
本発明は一般に、ポリイオン感応性メンブレン電極に関し、より詳細には、特有の回転電位ポリイオン感応性メンブレン電極、および非平衡応答メカニズムを有するタイプのメンブレンを用いたその使用方法に関する。
関連技術の説明
最近、特別に配合されたポリマーメンブレンに適切な親油性イオン交換体をドープしたものが、よく知られた無機イオンが生理的濃度で存在する状態でμｇ／ｍｌレベルの種々の生物医学的に重要なポリアニオン（たとえばヘパリン、ＤＮＡ、およびポリリン酸塩）ならびにポリカチオン（たとえばプロタミンおよびポリアルギニン）に対して、再現性のある大きな電位応答を生じることが見出された。このようなポリイオン感応性またはポリイオン応答性のメンブレン電極の例は、米国特許第５，４５３，１７１号、第５，２３６，５７０号、および第５，６０７，５６７号に記載されている。なお、これらの文献の開示は本明細書において参照により取り入れられている。
【０００３】
これらのいわゆるポリイオン感応性メンブレン電極（ＰＳＥ）のＥＭＦ応答は、メンブレン／試料界面で起こる非平衡な定常状態イオン交換プロセスが確立されていることに起因するとされている。この交換が起こる理由は、検体ポリイオンが、親油性イオン交換種との協同イオンペアリングによって有機メンブレン相内に非常に都合よく抽出されるからである。ＰＳＥの基本的な応答メカニズムについての詳細な説明は、ＦｕらによるＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第６６巻、ページ２２５０〜２２５９（１９９４）に見られる。なお、この文献の開示は本明細書において参照により取り入れられている。
【０００４】
ポリアニオン感応性電極デバイスには、多くの有用な生物分析の用途があり、そのいくつかを以下に述べる。たとえば薄めていない全血中の抗擬固性ヘパリンのレベルの正確な測定が、滴定剤としてプロタミンを使用し終点検出器としてポリカチオン感応性メンブレン電極を使用する簡単な電位差滴定によって、実現されている。ポリカチオンおよびポリアニオン感応性メンブレン電極は両方とも、大きなポリイオン基板分子を割って電荷および分子量の小さい小断片にするある種の酵素活性を測定するための検出器として有用であることが分かっている。酵素分析の用途は、これらのデバイスが分子量の小さいポリイオンに対しては非常に小さいＥＭＦ応答を示し、それは分子量の小さいポリイオンとメンブレン相内の親油性イオン交換体との間の協同イオンペアリングの強度が著しく低下するためであるという事実を基にしている。ごく最近、合成ポリカチオニックペプチドを標識として用いる新しい非分離の競合結合測定方式の開発において、ＰＳＥが検出器として用いられている。
【０００５】
ＰＳＥには多くの潜在的な用途があることを考えれば、これらの電気分析デバイスの感度をさらに高めることが望ましい。この点に関して、いくつかの進展がなされている。ポリマーメンブレンマトリックス中の可塑剤の含有量を低くすると、ポリイオン交換体錯体（ｃｏｍｐｌｅｘ）の拡散係数が下がることによってＰＳＥの感度が向上することが、以前に見出されていた。また電極の形状がＰＳＥの感度に影響を及ぼすことも見出されていた。平面状メンブレンの構成よりも円筒形メンブレン電極のデザインの方がわずかに感度が高く、それは平面状の拡散に対して円筒状の拡散により、メンブレン表面へのポリイオンの物質移動が増大するためであることが分かっていた。またたとえば拡散バーを用いて試料溶液を拡散することにより、ＰＳＥに対する検体の感度が無攪拌溶液における感度と比べて向上することも、以前に示されていた。またこれらの各観察結果をひとまとめにして考えれば、ＰＳＥが効力のある非平衡応答メカニズムを有するということをはっきりと結論付ける要因となった。
【０００６】
しかしポリイオンメンブレン電極の感度をさらに向上させることが、要求されている。ＰＳＥが非平衡の応答メカニズムを有するため、メンブレン／試料界面への検体ポリイオンの物質移動を、制御可能な方法でさらに増大させる方法を用いることで、感度を向上させることができる。回転電極ボルタンメトリおよび電流滴定は、検体の物質移動の増大を平面状の作用電極の回転速度の関数としてもたらす十分に確立された流体力学的方法である。しかし回転電極技術はこれまで、電位差測定には適用されていなかった。
【０００７】
したがって本発明の目的は、感度が向上したポリイオン感応性メンブレン電極を提供することである。
本発明の他の目的は、メンブレン／試料界面への検体の物質移動を回転電極を用いて増大させることによって感度が向上した、新しいポリイオン感応性メンブレン電極を提供することである。
【０００８】
（発明の概要）
前述および他の目的は、試料中で電位ポリイオン応答性メンブレン電極を回転させることによって感度が向上したポリイオン感応性メンブレン電極アセンブリを提供する本発明によって達成される。ポリイオン感応性メンブレンが非平衡応答メカニズムを有する場合には、回転によって、メンブレン表面へのポリイオンの物質移動が向上する。比較的低い回転速度（一例として約５００ｒｐｍから最大で約５０００〜６０００ｒｐｍ）によって感度が向上し、観察される感度およびω−１／２（ここでωは回転角周波数）と、Ｃ１／２（ポリイオン種に対する合計最大ΔＥＭＦ応答の半分に対応するポリイオン濃度）との間に、直線関係が見出される。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態では、ポリイオン感応性メンブレンは、ポリマーメンブレンマトリックスの配合に応じて、ポリカチオン高分子たとえばプロタミン、およびポリアニオン高分子たとえばヘパリンに選択的に応答する。一般にポリイオン応答性メンブレンには、混合状態で、ポリマーマトリックス材料、親油性の陽イオンまたは陰イオン交換材料、および随意に可塑剤が含まれる。
【００１０】
本明細書で示す実験で用いられるポリイオン感応性メンブレン以外に、たとえば、好適なプロタミン応答性メンブレン材料が米国特許第５，６０７，５６７号に記載され、好適なヘパリン応答性メンブレンが米国特許第５，２３６，５７０号に記載されている。
一例であるデバイス実施形態では、回転ポリイオンメンブレン電極アセンブリは、一実施形態において、中心軸を通る孔を有する回転可能なハウジングを備える。ポリイオン応答性メンブレンがハウジングの一端に配置され、ハウジングの回転によってメンブレンが回転するようになっている。メンブレンは、ハウジング内部の充填溶液または基準溶液を密封するとともに、ハウジング外部の試料溶液と接触する。内部基準電極は、ハウジングの孔を通って延び、内部基準電極の一端が基準溶液内に置かれるように配置されている。内部基準電極の他端は、高インピーダンスの電圧計に接続されている。外部電極も電圧計に接続されている。
【００１１】
内部基準電極が、ハウジングから絶縁されていることが重要である。絶縁チューブまたはシース、たとえばポリエチルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）管を用いて、高速回転中の電気ノイズを最小限にすることができる。この管によって、内部電極と回転ハウジングの他の要素との間のわずかな電気接触も防止される。また回転子からのわずかな振動結合も回避するために、内部基準電極を回転ハウジングから機械的に隔離する必要がある。
【００１２】
本明細書で説明するデバイス実施形態では、ハウジング全体が、ポリイオン感応性メンブレンを含みながら回転する。しかしハウジングが静止していてポリイオン感応性メンブレンのみが回転するという代替的な実施形態を考えることもできる。
使用方法の実施形態では、液体媒体中のポリイオン高分子の濃度を、その電位応答の関数として以下のように測定する。
【００１３】
（ａ）ポリイオン応答性メンブレン電極を、未知の量のポリイオン高分子検体を含有する液体媒体と接触させる。ポリイオン応答性メンブレンは、検体に対する非平衡応答メカニズムを有するポリマーマトリックス材料を含む。
（ｂ）ポリイオン応答性メンブレンを、液体媒体中で回転させる。
（ｃ）液体媒体中の検体濃度を示す電位応答を測定する。
【００１４】
平衡条件下で動作する従来のイオン選択性メンブレン電極とは対照的に、ＰＳＥのＥＭＦ応答は、メンブレン／試料界面で起こる非平衡な準定常状態イオン交換プロセスによって生じる。この定常状態が起こるのは、試料相からメンブレン表面へ拡散するポリイオンの流速が、メンブレン表面からポリマーメンブレンのバルク内部へ拡散するポリイオン−イオン−交換体のイオン対の流速と等しいときであることが分かっている。ポリイオン濃度が低い場合には、当初のイオン交換体の対イオン（たとえばカルシウムジノニルナフタレンスルホナート系のポリカチオンセンサに対する無機陽イオン、およびトリドデシルメチルアンモニウム（ｔｒｉｄｏｄｅｃｙｌｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）クロライド系ポリアニオンセンサに対する無機陰イオン）のかなりの部分が、有機メンブレンの外面に依然として存在しており、このような条件下で観察されるΔＥＭＦは次のように記述することができる。
【００１５】
【数１】
2004525349.tif 000003
ここで、Ｒτはメンブレン相内でのイオン交換体サイトの全濃度であり、ｚは検体ポリイオンの電荷数であり、ＤａおよびＤｍはそれぞれ水相およびメンブレン相内でのポリイオンの拡散係数であり、δａおよびδｍはそれぞれ水相およびメンブレン相内のポリイオンに対する拡散層厚みであり、Ｃｐｏｌｙ，ｂｕｌｋは試料溶液中のポリイオンのバルク濃度であり、＋はポリアニオン応答の場合で−はポリカチオン応答の場合であり、Ｔはケルビンでの温度であり、ＲおよびＦはそれぞれ気体定数およびファラデー定数である。
【００１６】
式（１）より、同じΔＥＭＦ応答を実現するために、所定のポリイオンに対する検出限界を低くする（すなわちより小さいＣｐｏｌｙ，ｂｕｌｋを実現する）簡単な方法は、水相内の拡散層の厚み（δａ）を小さくする一方で、残りのパラメータを一定に保つことであることが分かる。拡散層の厚みを再現性よく制御し、より小さくするための好適なアプローチの１つは、メンブレン電極を回転させることである。
【００１７】
ディスク電極の場合、δａは角回転周波数ωと以下のように関係する。
【００１８】
【数２】
2004525349.tif 000004
ここで、νは動粘度（通常の粘度ηと溶液の密度ρとの比で定義される）である。式（１）より、同じＥＭＦ応答を得るためには、δａを１０分の１に小さくしたらポリイオン濃度を１０分の１に低くする必要がある。
【００１９】
後述する実験結果において、ポリアニオンおよびポリカチオン感応性メンブレン電極の両方に対してこのコンセプトが正しいことが示されている。
本発明の理解は、添付の図面とともに以下の詳細な説明を読むことによって助けられる。
（発明の詳細な説明）
メンブレンおよびＰＳＥ電極の作製
本発明の具体的な実例である実施形態では、ポリアニオン感応性メンブレン、特にヘパリン感応性メンブレンを、カクテル溶液キャスティング法（ｃｏｃｋｔａｉｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃａｓｔｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて作製した。この方法はたとえば、ＭａｔｈｉｓｏｎらによるＡｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、第７１巻，ページ４６１４−４６２１（１９９９）または本明細書で参照するいずれの特許にも記載されている。カクテル溶液は、適量のメンブレン成分（ポリマー、可塑剤、およびイオン交換体）をテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中へ溶かして作製した。メンブレンは、最終厚みが約１５０μｍとなるように型で成型され、１重量％のトリドデシルメチルアンモニウムクロライド（ＴＤＭＡＣ）、３３重量％のジオクチルセバケート（ＤＯＳ）、および６６重量％のポリ（塩化ビニル）（ＰＶＣ）を含有していた。
【００２０】
具体的な実例である他の実施形態においては、ポリカチオン感応性メンブレン、特にプロタミン感応性メンブレンを、同様の方法で、しかし以下のポリマーメンブレンマトリックス成分を用いて作製した。１重量％のカルシウムジノニルナフタレンスルホナート（ＤＮＮＳ）、４９重量％のニトロフェニルオクチルエーテル（ＮＰＯＥ）、および４９重量％のポリウレタン（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社（ミネアポリス、ＭＮ）から販売されるＭ４８）。
【００２１】
ポリイオン感応性メンブレンのディスクを、コルクボーラを用いて切断した後（外径７．０ｍｍ）、１ｃｍ長のタイゴンブランドのフレキシブルチューブ（内径４．２ｍｍ、外径７．３５ｍｍ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、ＰＡ）の一方の端に接着剤で取り付けて、基準溶液用のハウジングを形成した。
【００２２】
回転ＰＳＥシステム
図１は、本発明による回転ポリイオン感応性電位メンブレン電極１０の実際的な実施形態を示す概略図である。本明細書で記載する具体的な実例である実施形態においては、回転電極（Ｐｉｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社（グローブシティ、ＰＡ）から市販）、ＡＳＲモータコントロールボックス付き分析回転子モデルＡＳＲ（１０００ｒｐｍ／Ｖ、２００〜１００００ｒｐｍレンジ）を改造して、回転可能なハウジング１１を形成した。その際、２ｃｍ長の接続チューブ１３（黒いデルリンプラスチック（ＭｃＭａｓｔｅｒ−Ｃａｒｒ、クリーブランド、ＯＨ）製）を用いて回転子１２と１ｃｍ長のタイゴンチューブ１４とを接続し、ポリイオン感応性メンブレンディスク１５を遠位端に接着剤で取り付けた。デルリンチューブおよびタイゴンチューブの両方に、内部充填材、または基準溶液１６を充填した。この場合、基準溶液１６は、トリス［（ヒドロキシメチル）アミノメタン］（トリス）緩衝液に０．１２ＭのＮａＣｌを加えたものである。内部基準電極１７を回転子１２の中央の空間を通して挿入して、先端部１８がポリイオン感応性メンブレンの内面１９付近まで達するようにした（図１）。内部基準電極１７は、細い銀ワイヤ（外径０．０７６ｍｍ、Ｍｅｄｗｉｒｅ、マウントバーノン、ＮＹ）を絶縁シース２０を通して挿入して作製した。なお絶縁シース２０は、本実施形態ではＰＥＥＫチューブ（内径０．１３ｍｍおよび外径１．６ｍｍ、Ｓｕｐｅｌｃｏ、ベレフォンテ、ＰＡ）である。約０．５ｃｍ長のＡｇワイヤ片を、先端部１８で露出させている。この露出領域を、０．１ＭのＦｅＣｌ３を含有する１ＭのＨＣｌ溶液を用いて、塩素処理した。
【００２３】
高速回転中の電気ノイズを最小限にするために、内部Ａｇ／ＡｇＣｌ電極の周囲の絶縁シース２０を用いなければならない。この管によって、内部Ａｇワイヤと回転子との間のわずかな電気接触も防止される。また回転子からのわずかな振動結合も回避するために、内部基準電極を回転子から機械的に隔離する必要がある。
【００２４】
外部基準電極２１（この具体的な実施形態では、０．１ＭのＦｅＣｌ３を含有する１ＭのＨＣｌ溶液で塩素処理された１ｍｍ径の銀ワイヤ）を、内部電極１７と同様に、電圧計２２に電気的に接続して、電極アセンブリの電位応答を測定するようにする。
実験結果
電位差測定
前述した回転ポリイオン感応性電極のＥＭＦ応答を、周囲温度（〜２３℃）で測定した。測定は、マッキントッシュのＩＩｃｘコンピュータを介して行い、このコンピュータには、ＬＡＢ−ＭＩＯ−１６ＸＬ−４２の１６ビットＡ／ＤのＩ／Ｏボード（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、オースチン、ＴＸ）と、ＶＦ−４電極インターフェースモジュール（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、サラソタ、ＦＬ）とを搭載し、ＬａｂＶｉｅｗ２ソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、オースチン、ＴＸ）で制御した。
【００２５】
連続プロタミン滴定によるヘパリン濃度測定
３ｍｌ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１２ＭのＮａＣｌを含有）中の０．０５Ｕ／ｍｌのヘパリンの滴定を、０．１ｍｇ／ｍｌプロタミン水溶液の連続注入によって行い、シリンジポンプ（モデルＭＤ−１００１、ＢＡＳ社、ウェストラフィエット、ＩＮ）を用いて、注入速度５μｌ／分とした。滴定を、回転（３０００ｒｐｍ）または静止のいずれかのプロタミン感応性電極を用いてモニタした。静止電極の実験では、攪拌バーを用いて回転溶液相の対流を実現した。プロタミン感応性電極（静止および回転する電極）に対するブランク滴定曲線も、同様の実験条件下で緩衝溶液（０Ｕ／ｍｌヘパリン）へ連続プロタミン注入することによって記録した。結果を平均化し、スチューデントのｔ検定を用いて９５％の信頼水準での信頼区間を計算した。
【００２６】
図２（ａ）は、異なる回転速度でトリス緩衝液（５０ｍＭのトリスおよび０．１２ＭのＮａＣｌ）中で回転ヘパリン感応性電極を用いたときに得られた、ポリアニオンヘパリン校正曲線を示すグラフである。また電極は回転させないが（０ｒｐｍ）、試料を従来の攪拌バーを用いて混合したときに観察された応答も示す。明らかに電位応答曲線が、メンブレン電極を回転させることによって、濃度がはるかに低い方へシフトしている。具体的には、回転させない場合、検出下限（ＬＬＯＤ）（バックグラウンドの緩衝液信号から平均のΔＥＭＦ値として±３ｍＶ（＋はポリカチオン測定の場合、−はポリアニオン測定の場合）を生じるポリイオン濃度として定義される）が、約０．１Ｕ／ｍｌである。しかし５０００ｒｐｍで回転させた場合には、ＬＬＯＤは０．０１Ｕ／ｍｌであり、１０倍の向上であった。同様の効果が、プロタミンに対するポリカチオン感応性電極の応答に対して観察された（図３（ａ））。ここでは６０００ｒｐｍでの回転によって、検出限界は０．０２μｇ／ｍｌとなっている。
【００２７】
加えて、合計最大ΔＥＭＦ（最大が生じるのは、ポリイオンの試料濃度が十分に高くて、メンブレン／試料界面において完全な平衡が実現するとき）の半分であるΔＥＭＦに対応するポリイオン濃度をＣ１／２（ＬＬＯＤに比例する）と定義することで、ポリアニオンとポリカチオンとの両方のセンサに対してＣ１／２とω−１／２との間に直線関係が見出された（図２（ｂ）および図３（ｃ））。これらの図は、ヘパリンまたはプロタミンに対して測定されたＣ１／２とω−１／２（ωは回転角周波数）との関係を、それぞれ示すグラフである。
【００２８】
この直線関係は、式（２）を式（１）へ入れることによって、理論的に予測することができる。すなわち回転速度を増加させることによって感度が向上するのは、拡散層の厚みが薄くなった結果であり、激しい流体力学的な対流がもたらすプロタミンまたはヘパリンの３次元構造の考えられる変化（すなわち、ほどけることや広がること）に起因する人為的な結果ではない。
【００２９】
またメンブレン表面へのポリイオンの物質移動を２つの流体力学的な状況（攪拌バーによる対流対電極の回転）に対して直接比較することを、２つの構成において同じＬＬＯＤ値を実現するのに必要な回転速度を求めることによって行うことができる。実際、ポリカチオン感応性メンブレン電極を用いたプロタミン測定の場合、回転電極によるＬＬＯＤが、攪拌によって対流を起こす場合と同じになるのは、回転速度が２５０ｒｐｍのときであることが見出されている（データは図示せず）。試験水溶液に対して動粘度が１０−６ｍ２ｓ−１であり、プロタミンに対する水性層拡散係数が５×１０−７ｃｍ２／秒であると仮定すると、等価な拡散層の厚みは１１．６μｍに一致する。
【００３０】
原理的には、感度（Ｃ１／２で示される）は回転速度によって制御されるため、回転速度をさらに増加させることによってＬＬＯＤをさらに低くできるはずである。しかしＣ１／２が比例するのはω−１自体ではなくω−１／２であるため、回転速度をさらに増加させて６０００ｒｐｍ超にしても、ω−１／２の値は著しくは減少しない。また回転速度が６０００ｒｐｍを超えると機械的ノイズが非常に大きくなる。したがってこの値を超える回転速度で、実例である実施形態のＰＳＥを動作させようと試みても、そのことで得られる分析上の利点はない。
【００３１】
またＰＳＥを回転させることで実現される感度の向上を適用すれば、ポリイオン種の濃度を他の種で滴定したときに、より低い濃度まで検出することができる。実際、ＰＳＥを用いて現実に試料測定することには利点がある。というのは、図２および３に示す定常状態のＥＭＦ応答は、試料溶液中のバックグラウンドの陽イオンまたは陰イオンの活性にも依存するからである。たとえば生物試料の場合には、ポリカチオンセンサでは通常、ナトリウムおよびカリウムイオンが存在し、アニオンセンサでは通常、塩化物イオンが存在する。実際、全血などの複合試料中のポリイオンレベルの測定に対してより信頼性の高い分析結果が、回転ポリイオン感応性電極を用いたこのような電位差滴定を行うことで実現されている。
【００３２】
図４（ａ）は、３ｍｌトリス緩衝液中の０．０５Ｕ／ｍｌヘパリンの少なくとも４回の別個の連続注入滴定を、０．１ｍｇ／ｍｌプロタミンを５ｍｌ／分の速度で用いて行った際の平均（±信頼区間（時間軸に対して９５％水準での））電位差データのグラフであり、記号は以下のとおりである。（△）３０００ｒｐｍ回転のプロタミン感応性電極を用いたブランク滴定（０Ｕ／ｍｌヘパリン）、（○）３０００ｒｐｍのプロタミン感応性電極を指標として用いた０．０５Ｕ／ｍｌヘパリンの滴定、（□）無回転プロタミン感応性電極を用いたブランク滴定（０Ｕ／ｍｌヘパリン）、（◆）無回転プロタミン感応性電極を用いた０．０５Ｕ／ｍｌヘパリンの滴定。
【００３３】
０．０５Ｕ／ｍｌのヘパリンは、無回転ＰＳＥを終点指標として用いることでブランクから統計的に識別することができるが、より感度が高い回転プロタミンＰＳＥを用いることで、はるかに高い精度が滴定データにおいて得られている（図４（ａ））。実際、図４（ｂ）（回転電極に対して図４（ａ）に図示した滴定データを示す拡大時間スケールの図）では、実現された劇的な精度増加がさらに例示されている。この精度向上を考えれば、回転ＰＳＥを指標電極として用いて滴定することによって、０．０１〜０．０２Ｕ／ｍｌまでのレベルのヘパリンをブランクから分離することは容易であると思われる。
【００３４】
加えて、図４（ａ）に示すように、回転ＰＳＥデザインの検出限界が向上しているために、非常に迅速な滴定を行うことができる。対照的に、静止ＰＳＥの滴定速度を増加させるためには、注入プロタミン濃度を１ｍｇ／ｍｌまで（同じ流量を用いて）増加させなければならない。しかしこのように高い滴定濃度では、０．１Ｕ／ｍｌのヘパリンでさえブランクから統計的に識別できないことが分かった（結果は図示せず）。
【００３５】
これまでの電気化学実験では、ヘパリンの手動滴定を行う場合に、中和するためには１単位のヘパリンに対して約１０μｇのプロタミンが必要であると理解されていたことに注意されたい。図４（ａ）および図４（ｂ）に示すように回転電極の構成を用いて行った実験では、総量で０．１５Ｕのヘパリン（３ｍｌの緩衝液中に０．０５Ｕ／ｍｌのヘパリン）の滴定に、０．１ｍｇ／ｍｌのプロタミンが５μｌ／分の速度で用いられた。回転電極の実験では、ブランクの場合のＣ１／２と０．１５Ｕヘパリンを含有する場合のＣ１／２との間の時間差は、１０４．０±５．３秒である。すなわちこの終点での注入プロタミンは、０．１ｍｇ／ｍｌ×５μｌ／分×１０４±５．３秒＝０．８６７±０．０４４μｇプロタミン、または５．７８±０．２９μｇプロタミン／単位ヘパリンである。これは、これまで報告されていたプロタミンとヘパリンとの間の化学量論（〜１０μｇプロタミン／単位のヘパリン）よりも少ない。この違いは、一点での手動滴定と比べてプロタミンの連続注入を用いて滴定を実現していることと、回転電極デザインを用いることで生じる物質移動の増大との組み合わせに起因すると考えられる。実際、プロタミンとヘパリンとの間の結合は、平衡に達するのが、添加されたプロタミンの一部が電気化学的検出器のメンブレン中に抽出されて電位応答を生じる前に起こるほど、速くはない。観察される化学量論へのこの動力学的な効果は、滴定によって検出されるヘパリンの低濃度を増加させても（０．０５〜０．５Ｕ／ｍｌ）不変であるため、回転電極の構成を用いたヘパリンの定量に対して校正することができる。
【００３６】
３ｍｌの試料を用いた前述の実験で明らかになった検出限界および精度の向上の他に、回転ＰＳＥを用いることは、小さい試料体積（＜１ｍｌ）の場合により再現性のよい結果が得られるという観点からも利点がある。小さい試料体積において再現性のあるポリイオン電位応答を、従来の攪拌バーを用いて得ることは非常に難しい。その理由は、攪拌バーの位置によって生じる変動、特にポリイオン物質移動したがって観察されるＥＭＦ応答に影響し得る変動があるからである。しかし試料相のバルクを攪拌するのではなく電極を回転させることで、サブｍｌの体積の測定を非常に容易かつ再現性よく行うことが潜在的に可能である。
【００３７】
要約すれば、本明細書で開示された新しい回転ポリイオン感応性メンブレン電極によって、ＰＳＥの検出限界を著しく下げることができる。１０倍の感度向上が、約５０００〜６０００ｒｐｍの適度な回転速度で容易に実現される。また回転電極の構成において評価された平面状のヘパリンおよびプロタミン感応性メンブレン電極に対する検出限界も、ポリイオンの物質移動を起こすために従来の攪拌とともに使用されたこれまで報告されている円筒形電極のデザインよりも小さい。ポリイオン感応性電極を終点指標として用いる滴定により低濃度の検体ポリイオンを測定すれば、回転ポリイオン感応性電極により、より正確な結果が得られる。これらの結果を考えれば、回転電極の構成は、臨床試料中の低レベルの生物学的に重要なポリイオンを測定するための魅力ある器具である。また小さい試料体積において回転ＰＳＥを使用できるということは、生物学的免疫学的検定法（ｂｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ）たとえば最近開発された非分離の電気化学的免疫学的検定法（抗体および他の試薬（合成ポリイオン標識など）が非常に高価である）において利点がある。
【００３８】
本発明を、具体的な実施形態および用途に関して説明してきたが、当業者であれば、本教示を考慮することによって、特許請求された発明の範囲を越えることなくまたその趣旨から逸脱することもなく、さらなる実施形態を作ることができる。したがって本開示における図面および説明は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の範囲を限定するものと解釈してはならないと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明による回転ポリイオン感応性電位メンブレン電極を示す概略図である。
【図２（ａ）】
回転ヘパリン感応性電極を用いて得られたヘパリン校正曲線を示すグラフである。
【図２（ｂ）】
測定されたＣ１／２（ヘパリンに対する合計最大ΔＥＭＦ応答の半分に対応するポリアニオン濃度）と、ω−１／２（ωは回転角周波数）との間の関係を示すグラフである。
【図３（ａ）】
回転プロタミン感応性電極を用いて得られたプロタミン校正曲線を示すグラフである。
【図３（ｂ）】
測定されたＣ１／２（プロタミンに対する合計最大ΔＥＭＦ応答の半分に対応するポリカチオン濃度）と、ω−１／２（ωは回転角周波数）との間の関係を示すグラフである。
【図４（ａ）】
３ｍｌ緩衝液（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．４、および０．１２ＭのＮａＣｌ）中の０．０５Ｕ／ｍｌヘパリンの連続注入滴定を、０．１ｍｇ／ｍｌプロタミンを５μｌ／分の速度で用いて行った際の電位差データを示すグラフである。（△）３０００ｒｐｍ回転のプロタミン感応性電極を用いたブランク滴定（０Ｕ／ｍｌヘパリン）（４回の滴定の平均±信頼区間）、（○）３０００ｒｐｍのプロタミン感応性電極を指標として用いた０．０５Ｕ／ｍｌヘパリンの滴定（４回の滴定の平均±信頼区間を示す）、（□）無回転プロタミン感応性電極を用いたブランク滴定（０Ｕ／ｍｌヘパリン）（６回の滴定の平均±信頼区間を示す）、および（◆）無回転プロタミン感応性電極を用いた０．０５Ｕ／ｍｌヘパリンの滴定（６回の滴定の平均±信頼区間を示す）。
【図４（ｂ）】
回転プロタミンＰＳＥを用いて行ったブランクおよび０．０５Ｕ／ｍｌヘパリンの滴定に対して図４（ａ）に図示した滴定データを示す拡大時間スケールの図である。
【図１】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｃ）】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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