(57)【要約】本発明は、ヒトにおいて脂肪酸−ＣｏＡリガーゼ４（ＦＡＣＬ４）の活性を調節することにより作用する潜在的な癌化学療法剤および潜在的な化学予防剤のスクリーニング方法を提供する。本発明は、ＦＡＣＬ４遺伝子産物の活性を阻害することにより、遊離アラキドン酸の細胞レベルを引き上げて、アラキドン酸媒介性のアポトーシスを誘発させることにより、癌を治療するためのそのような薬剤の投与方法も提供する。本発明はさらに、大腸癌を含む癌の診断方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
潜在的な癌化学療法剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）ＦＡＣＬ４遺伝子産物を発現または過剰発現している細胞を試験化合物に接触させる工程と、
（ｂ）該細胞におけるＦＡＣＬ４遺伝子産物の機能の阻害を測定する工程であって、ＦＡＣＬ４遺伝子産物の機能を阻害する試験化合物が、潜在的な癌化学療法剤である工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記細胞は上皮細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞は線維芽細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は上皮腫瘍細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は大腸癌細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞は、該細胞中でのＦＡＣＬ４遺伝子産物の発現が抑制された、遺伝子操作された細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞は、ＦＡＣＬ４を過剰発現する、遺伝子操作された細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
潜在的な癌化学療法剤のスクリーニング方法であって、
（ａ）動物に試験化合物を投与する工程と、
（ｂ）動物中でのＦＡＣＬ４遺伝子産物の機能の阻害を測定する工程であって、ＦＡＣＬ４遺伝子産物の機能を阻害する試験化合物が、潜在的な癌化学療法剤である工程と、を含む方法。
【請求項９】
前記動物はマウスである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記動物は、ＦＡＣＬ４対立遺伝子の一方または両方が変異したマウスである請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記動物は、１または複数の組織においてＦＡＣＬ４遺伝子を過剰発現するトランスジェニックマウスである請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記動物は、異種移植腫瘍を有するマウスである請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
ヒトにおいてＦＡＣＬ４活性を阻害する方法であって、ＦＡＣＬ４を阻害する化合物をそのような治療を必要とするヒトに投与することを含む方法。
【請求項１４】
前記化合物はトリアクシンＣである請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヒトにおいてＦＡＣＬ４活性を阻害する方法であって、ＦＡＣＬ４を阻害する化合物をそのような治療を必要とするヒトに投与することを含み、前記化合物の活性はヒトに対して有意な毒性副作用をもたらさない方法。
【請求項１６】
ヒトにおいてＦＡＣＬ４活性を阻害する方法であって、ＦＡＣＬ４を阻害する化合物をそのような治療を必要とするヒトに投与することを含み、前記化合物のＦＡＣＬ４阻害能は、
（ａ）ＦＡＣＬ４遺伝子産物を発現または過剰発現している細胞を試験化合物に接触させる工程と、
（ｂ）該細胞におけるＦＡＣＬ４遺伝子産物の機能の阻害を測定する工程とによって判定される方法。
【請求項１７】
大腸癌に罹患したヒトにおける大腸癌の治療方法であって、ＦＡＣＬ４活性を阻害する化合物をそのような治療を必要とするヒトに投与する工程を含む方法。
【請求項１８】
大腸癌に罹患したヒトにおいて大腸癌を治療する方法であって、
（ａ）ＣＯＸ−２を阻害する化合物を投与する工程と、
（ｂ）ＦＡＣＬ４を阻害する化合物を投与する工程とを含む方法。
【請求項１９】
疑わしい組織の試料中の大腸癌細胞の有無を評価する方法であって、
（ａ）疑わしい組織の試料を単離する工程と、
（ｂ）組織の細胞におけるＦＡＣＬ４発現レベルを評価する工程と、
（ｃ）組織の細胞におけるＦＡＣＬ４発現レベルを、対照細胞におけるＦＡＣＬ４発現レベルと比較する工程とを含む方法。
【請求項２０】
前記組織の細胞におけるＦＡＣＬ４発現レベルを評価する方法は、定量的ＲＴ−ＰＣＲである請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組織の細胞におけるＦＡＣＬ４発現レベルを評価する方法は、免疫染色またはｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーションである請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記組織の細胞におけるＦＡＣＬ４発現レベルを評価する方法は、ウェスタンブロッティングである請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記対照細胞は、非癌性腸細胞系列から選択される請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記対照は、腸上皮系列Ｉｎｔ４０７である請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
大腸癌の診断方法であって、
（ａ）癌性が疑われる組織の部位から試料を単離する工程と、
（ｂ）非癌性と考えられる同様の組織の部位から試料を単離する工程と、
（ｃ）各試料におけるＦＡＣＬ４のレベルを評価する工程と、
（ｄ）前記疑われる組織におけるＦＡＣＬ４のレベルを、疑いのない組織におけるＦＡＣＬ４レベルと比較する工程とを含む方法。
【請求項２６】
前記組織の細胞におけるＦＡＣＬ４発現のレベルを評価する方法は、定量的ＲＴ−ＰＣＲである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記組織の細胞におけるＦＡＣＬ４発現のレベルを評価する方法は、免疫染色である請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記組織の細胞におけるＦＡＣＬ４発現のレベルを評価する方法は、免疫蛍光法である請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
１．発明の属する技術分野
本発明は癌の化学療法治療に関する。より詳細には、本発明はヒトにおいて脂肪酸Ｃｏ−Ａリガーゼ４（「ＦＡＣＬ４」）酵素の活性を調節する癌化学療法剤のスクリーニングアッセイ、そのようなアッセイを用いて発見された薬剤の投与を伴う大腸癌に対する新規な治療、および大腸癌のスクリーニング対象患者から得た組織試料中のＦＡＣＬ４活性レベルを検出することにより大腸癌を診断する新しい方法に関する。
【０００２】
２．技術的背景
癌とは、正常な体細胞に変化がきたされることにより、正常な細胞抑制に関係なく増殖できるようになり、通常は別の細胞によって占められている体の領域に侵入してコロニーを形成するようになる疾病である。Ｂ．アルバーツ（Ａｌｂｅｒｔｓ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅｌｌ、１２５５〜１２９４頁（第３版、１９９４年）を参照のこと。米国癌研究協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｓｏｃｉｅｔｙ）によれば、全アメリカ人男性の半数、および全アメリカ人女性の３分の１が生涯のどこかの時点で癌を発症するとされている。
【０００３】
癌は広がって急激に増殖することができるため、癌性細胞の選択的な殺傷を試みることで癌患者の治療を行うのは困難である。この課題の難しさを、庭の雑草を完全に除去する難しさに喩えた者もいる。雑草と同様に、ほんの少しの癌細胞が処置されずに残されただけで、それらの癌細胞は再び体中に広がって疾病の再発を引き起こす。前掲の文献の１２６７頁を参照のこと。現行の癌治療としては、外科手術や、化学物質や照射を用いた治療法がある。しかしながら、元の腫瘍部位から広がった癌細胞は外科手術や照射によって見逃されたり、癌細胞を殺傷または不能にする薬剤治療は正常な細胞に対しても同様の損傷を引き起こす場合が多く、上記の治療の効果には限界があることも多い。前掲の文献参照。
【０００４】
より優れた癌治療が望まれるなか、正常細胞を癌細胞に変化させる一連の事象である発癌についての理解を深めることに焦点が集まっている。そうした理解は、研究者や医師が癌細胞またはその前駆細胞だけを直接的に治療することにより、健康な体細胞への損傷を回避しながら、癌を阻止または治療する助けとなると期待される。
【０００５】
研究者が発癌について理解しつつある一つの方法に、癌の予防または治療に有用であることが知られている化学物質が、どのようにして体内の癌を防止する作用を及ぼすかを評価する方法がある。そうした研究から、いくつかの癌予防（化学予防）および癌治療（化学治療）剤が細胞内のアラキドン酸を代謝する細胞性酵素に作用するという結果が得られている。最近の研究では、アラキドン酸代謝が癌の発生において重要な役割を果たしていることが示されている。Ｍ．ツジイ（Ｔｓｕｊｉｉ）とＲ．Ｎ．デュボイス（Ｄｕｂｏｉｓ）、Ｃｅｌｌ、第８３巻、４９３〜５０１頁（１９９５年）；Ｈ．シェング（Ｓｈｅｎｇ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、第９９巻、２２５４〜２２５９頁（１９９７年）；およびＳ．Ｍ．プレスコット（Ｐｒｅｓｃｏｔｔ）とＲ．Ｌ．ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）、Ｃｅｌｌ、第８７巻、７８３〜７８６頁（１９９６年）を参照のこと。アラキドン酸（「ＡＡ」；２０：４，ｎ−６）は、細胞内で酸化されてプロスタグランジン類およびロイコトリエン類を含むエイコサノイド類を形成する必須多価不飽和脂肪酸である。
【０００６】
ＡＡを代謝する細胞性酵素の１つにＣＯＸ−２と呼ばれるものがある。ＣＯＸ−２はＡＡからのプロスタグランジン類合成に関与する酵素である。この酵素は大腸での発癌に特異的に関与していることが示されている。他の酵素と同様に、ＣＯＸ−２は化学的にうまく阻害することができる。実際のところ、最近の人口調査では、ＣＯＸ−２を阻害する非ステロイド系抗炎症薬（「ＮＳＡＩＤ」）の常用により、大腸癌のリスクが低下することが示された。Ｍ．Ｊ．ターン（Ｔｈｕｎ）ら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、第３２５巻、１５９３〜１５９６頁（１９９１年）を参照のこと。ＮＳＡＩＤの使用は、動物における発癌物質誘導性の癌の予防にも役立つ。Ｆ．Ｍ．ジャーディエロ（Ｇｉａｒｄｉｅｌｌｏ）ら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｊ．Ｍｅｄ．、第３２８巻、１３１３〜１３１６頁（１９９３年）；およびＣ．Ｓ．ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、第１８巻、７９０８〜７９１６頁（１９９９年）を参照のこと。さらに、ＡＡを代謝する別の酵素である網状赤血球１５型リポキシゲナーゼ（「ＬＯＸ」）と同様に、ＣＯＸ−２は大腸癌においてアップレギュレートされることが示されている。癌細胞におけるいくつかのＡＡ代謝酵素のアップレギュレーションは、発癌の最中に複数のＡＡ代謝経路が活性化されることを示唆している。
【０００７】
いくつかの証拠路線では、細胞中の遊離ＡＡのレベルが、プログラム細胞死のための細胞機構であるアポトーシスを制御しうることが示されている。そのような証拠路線の一つは、腫瘍壊死因子α（「ＴＮＦα」）への暴露による細胞死に対して耐性をもつことが示された変異細胞系列において判明した。ＴＮＦαは癌細胞を選択的に殺すことが示されているタンパク質である。この変異細胞系列では、サイトゾルホスホリパーゼＡ２（「ｃＰＬＡ２」）の活性が著しく低減されており、これによりＡＡ合成のレベルも低減する。このことは、細胞内での内在性ＡＡ放出を阻止して、細胞内の遊離ＡＡのレベルを低く保つことにより、細胞がＴＮＦα殺傷に対して耐性になることを示唆している。Ｍ．ハヤカワ（Ｈａｙａｋａｗａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６８巻、１１２９０〜１１２９５頁（ｌ９９３年）を参照のこと。
【０００８】
さらなる証拠が、ＡＡ生合成に対する律速酵素であるΔ６−不飽和化酵素（デサチュラーゼ）が欠損していることが報告されている、別の系列のＴＮＦα殺傷耐性細胞により提供されている。Ｔ．リード（Ｒｅｉｄ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６６巻、１６５８０〜１６５８６頁（１９９１年）を参照のこと。この欠損も同様に細胞内のＡＡレベルを低く維持してＴＮＦα殺傷を防止すると考えられる。
【０００９】
いかなる特定の理論とも結びつけることなく、上述の結果は、細胞性ＡＡプールの減少によって、ＴＮＦαへの暴露に応答して蓄積しうる内在性ＡＡのレベルが制限されるものと解釈することもできる。遊離の細胞性ＡＡの量に対するそのような制限が細胞死に対する耐性を与えているように思われる。しかしながら、この解釈では、遊離ＡＡ自体の細胞レベルの効果と、エイコサノイドのような下流産物の細胞レベルの効果とが区別されていない。
【００１０】
上記解釈は、リポキシゲナーゼに関する研究によりさらなる裏付けが得られると思われる。この研究は、アラキドン酸からロイコトリエンへの変換に関与するリポキシゲナーゼである１２−ＬＯＸの阻害剤を投与することにより、ラット癌肉腫におけるアポトーシスが誘導されたことを報告した。Ｄ．Ｇ．タン（Ｔａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９３巻、５２４１〜５２４６頁（１９９６年）を参照のこと。同様に、ＮＳＡＩＤの投与によっても、大腸癌細胞系列において同様の反応がもたらされることが示されている。実際のところ、アポトーシスは、単に外来性ＡＡを細胞に添加するだけで誘導することができる。Ｔ．Ａ．チャン（Ｃｈａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９５巻、６８１〜６８６頁（１９９８年）を参照のこと。
【００１１】
アラキドン酸塩−リン脂質のリモデリングをＣｏＡ非依存性トランスアシラーゼ（ＣｏＡ−ＩＴ）の阻害剤によって阻止するとアポトーシスが誘導されることが実証されているものの、上記の阻害剤が細胞死を誘導する機構については完全には理解されていない。このことは、ＣＯＸ−２やＬＯＸの阻害によって起こる細胞性遊離ＡＡの蓄積に相当する。Ｍ．Ｅ．シュレッテ（Ｓｕｒｅｔｔｅ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３５巻、９１８７〜９１９６頁（１９９６年）およびＭ．Ｅ．シュレッテ（Ｓｕｒｅｔｔｅ）ら、Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ、第２０巻、７５７〜７６３頁（１９９９年）を参照のこと。ＡＡ代謝をうまく阻害できれば、細胞内ＡＡの蓄積を容易にすることができ、アポトーシスによる腫瘍細胞死を容易に誘導できると考えられる。
【００１２】
上記の研究は、ＡＡ代謝酵素を阻害する方法をさらに検討する基礎となった。ＣＯＸ−２および他のＡＡ代謝酵素に対する阻害剤が知られている。ヒトにおけるＡＡ代謝酵素の他の研究は、ヒト脂肪酸ＣｏＡリガーゼ４（「ＦＡＣＬ４」）酵素を中心に行われている。ＦＡＣＬ４は、大腸腺癌細胞においてアップレギュレートされる。さらに、他のＡＡ代謝性酵素の場合と同様に、ＦＡＣＬ４の阻害によって大腸腺癌細胞におけるアポトーシスが誘導される。これらの特性から、ＦＡＣＬ４の阻害は予見的癌治療の研究および応用の前途有望な手法と考えられ、癌患者に対して新たな希望を与えるものである。しかしながら、ＦＡＣＬ４を阻害する薬剤についてはあまり知られておらず、現在までに、この経路を用いた癌の治療方法は全く知られていない。癌細胞におけるＦＡＣＬ４発現の上昇を診断方法として利用ものはまだない。
【００１３】
前述のことから、癌細胞においてＡＡ媒介性アポトーシスを制御するためのさらなる効果的方法を提供することは、当該技術分野での大きな前進となると考えられる。具体的には、癌細胞を含む細胞において、ＦＡＣＬ４の活性を調節することにより作用する化学治療剤または化学予防剤をスクリーニングする方法を提供することは、当該技術分野での前進となると考えられる。さらに、そのようなアッセイを用いて発見された化学治療剤または化学予防剤の投与によりＦＡＣＬ４を阻害することを含む、大腸癌の新規な治療を提供することは当該技術分野でのさらなる前進となると考えられる。同様に、組織試料中のＦＡＣＬ４のレベルを検出することにより大腸癌を診断する新たな方法を提供することも、当該技術分野での前進となると考えられる。これらの方法について開示する。
【００１４】
３．発明の簡単な概要
本発明は、癌の化学予防的および化学療法的治療に関する。より詳細には、本発明は、化合物に対して癌の化学療法的活性をスクリーニングする方法に関する。前記スクリーニング方法は、脂肪酸Ｃｏ−Ａリガーゼ４酵素の活性を調節する物質を検出する。
【００１５】
１つの実施形態において、方法は、ＦＡＣＬ４遺伝子産物を発現または過剰発現している細胞を試験化合物と接触させる工程と、その後、該細胞におけるＦＡＣＬ４遺伝子産物の阻害レベルを測定する工程とを含む。遺伝子産物の阻害は、当該技術において知られている様々な方法によって測定され、その一例として、化合物で処理した細胞および非処理細胞においてＦＡＣＬ４によってエステル化された放射性標識ＡＡの割合および量をモニタすること、あるいは、化合物で処理した細胞のアポトーシスの速度を非処理細胞のアポトーシスの速度と比較することなどが挙げられるが、これらに限定されることはない。Ｄ．Ｂ．ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２５７巻、３５１０〜３５１５頁（１９８２年）、およびＹ．チャオ（Ｃａｏ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第４９巻、３２７〜３３０頁（１９９８年）を参照のこと。別の実施形態においては、方法は、ＦＡＣＬ４の発現が抑制されている遺伝子操作細胞を試験化合物に接触させる工程と、該細胞におけるＦＡＣＬ４遺伝子産物の機能の阻害を測定する工程とを含んでいる。ＦＡＣＬ４阻害剤に対する試験は、マウスモデル、たとえば、異種移植腫瘍を保持するマウス、ＦＡＣＬ４を過剰発現するトランスジェニックマウスまたはこれに由来する細胞、あるいは、ＦＡＣＬ４ノックアウトマウスを用いて実施することもできる。本発明の実施形態において、ＦＡＣＬ４遺伝子産物の機能を阻害する試験化合物は、潜在的な癌化学療法剤である。
【００１６】
本発明は、大腸癌に対する新規の治療であって、上で開示したアッセイ方法を用いて発見された化学療法剤または化学予防剤を、そのような治療の必要なヒトに投与することによる治療を提供することにも関する。したがって、大腸癌に対する新規の治療は、ＦＡＣＬ４阻害剤を投与することによりヒトにおけるＦＡＣＬ４を阻害することを含む。特定の実施形態において、上記治療はトリアクシンＣをヒトに投与することを含む。本明細書中、「有効な量」とは、無毒でありながら、任意の治療に付随する正当な利益／リスク比で、所望の局所的または全身的な効果および性能を与えるのに十分な量を意味する。他の実施形態において、上記治療は、ヒトにＦＡＣＬ４阻害性化合物を投与することを含み、化合物の活性はヒトに対して有意な毒性効果をもたらさない。さらに別の実施形態において、上記治療は、ＦＡＣＬ４を阻害する化合物をそのような治療を必要とするヒトに投与することを含み、化合物がＦＡＣＬ４を阻害する能力は、該化合物を、ＦＡＣＬ４遺伝子産物を発現または過剰発現するように遺伝子操作された細胞と接触させ、該化合物がＦＡＣＬ４遺伝子産物を阻害しているかどうかを測定することによって判定される。
【００１７】
さらに、本発明は、組織試料中のＦＡＣＬ４活性レベルを検出することにより大腸癌を診断する新たな方法に関する。いくつかの実施形態では、該方法は、癌性が疑われる組織の試料を単離する工程と、組織の細胞におけるＦＡＣＬ４発現レベルを評価する工程と、このＦＡＣＬ４発現レベルを対照細胞のものと比較する工程とを含んでいる。ＦＡＣＬ４の発現レベルの評価は、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、免疫染色、ｉｎ　ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、免疫蛍光法、ウェスタンブロッティング、または当該技術分野において広く知られている方法によって実施することができる。さらに、上記方法において用いる対照細胞は、当該技術分野において知られる非癌性大腸細胞系列から選択してもよいし、あるいは、単に同一の個体から取り出した正常と考えられる組織試料から得た細胞であってもよい。
本発明の上記および他の特徴および利点は、以下の詳細な説明によってさらに明らかになるであろう。
【００１８】
４．図面の簡単な説明
図１：大腸腺癌および大腸癌細胞系列においてＦＡＣＬ４およびＣＯＸ−２の発現が高められている。（Ａ）大腸腺癌における発現。２４対の大腸腺癌および隣接する正常組織から単離したＲＮＡに対して定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。２人の患者から得た代表的なＲＴ−ＰＣＲの定量結果が示されている。上側のパネルは、ＦＡＣＬ４アンプリコンで増殖させたもの、下側のパネルはＣＯＸ−２アンプリコンで増殖させたものである。ＦＡＣＬ４は、３２および３６サイクルで増殖させ、ＣＯＸ−２は３４および３８サイクルで増殖させた。符号Ｔは大腸腺癌組織を示し、符号Ｎは同一患者からの正常な大腸組織を示す。（Ｂ）大腸癌細胞系列における発現。ゲルの上部の説明はＲＮＡの抽出元となった細胞系列を示している。
【００１９】
図２：トリアクシンＣはアラキドン酸誘導性アポトーシスを感作し（Ａ）、アポトーシスを誘導する際にＮＳＡＩＤと相乗作用する（Ｂ）。ＨＴ２９細胞を９６ウェルにプレーティングした。トリアクシンＣおよびＡＡを添加するか（図Ａ）、あるいは、トリアクシンＣをインドメタシン（Ｉｎｄ）またはスリンダク（Ｓｕｌ）のいずれかとともに示された濃度で添加した（図Ｂ）。インドメタシンとスリンダクはどちらもシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）阻害剤である。アポトーシスは、細胞死ＥＬＩＳＡにより、それぞれ４４時間後（Ａ）および７２時間後（Ｂ）に測定した。対照細胞（以後「Ｃｔｌ」と呼ぶ）は、ＮＳＡＩＤ治療を受けなかった細胞とみなす。示した値は３回の測定の平均である。
【００２０】
図３：アラキドン酸はカスパーゼ３の活性化を介したアポトーシスを誘導する。（Ａ）細胞生存性の測定。ＡＡを示された濃度で２９３細胞に添加し、細胞の生存画分を４４時間後に判定した。示した値は、ＡＡに暴露しなかった細胞の生存率と比較した値である。（Ｂ）ＡＡに暴露した細胞におけるアポトーシスの増加。（Ａ）と同じ条件下で細胞をＡＡ（３００μＭ）またはパルミチン酸（ＰＡ）（３００μＭ）で処理し、ＥＬＩＳＡによってアポトーシスを検出した。３回測定の平均値が示されている。複数回の実験において、細胞の実質的画分においてアポトーシスを誘導するＡＡの濃度は２００μＭ〜３００μＭのあいだで変動した。（Ｃ）アポトーシスのｉｎ　ｓｉｔｕ検出。２９３細胞をＡＡ（３００μＭ；＋ＡＡ）または伝播体のみ（−ＡＡ）で４４時間処理した。核をＤＡＰＩで染色し、個々の細胞におけるＤＮＡ鎖の分断を蛍光ＴＵＮＥＬアッセイによって検出した。上側のパネルは、ＵＶ（左側パネル）およびＦＩＴＣフィルタ（右側パネル）の下で撮影した細胞（−ＡＡ）の同一視野である。下側のパネルは、アポトーシス細胞（＋ＡＡ）を示している。倍率は８０倍である。（Ｄ）抗活性カスパーゼ３抗体による免疫染色。上側のパネルは対照細胞（−ＡＡ）であり、下側のパネルは３００μＭのＡＡに暴露した細胞である。左側のパネルはＤＡＰＩ染色であり、右側のパネルは活性カスパーゼ３に選択的な抗体による免疫染色である。倍率は１００倍である。（Ｅ）カスパーゼ３の阻害によるＡＡ誘導性アポトーシスの阻害。２９３細胞をカスパーゼ阻害剤（ＤＭＱＤ、カスパーゼ３阻害剤、およびカスパーゼ１および４阻害剤であるＹＶＡＤ（ペプチド研究所）を含む）とともに、指示された濃度で１時間前培養し、ＡＡ（３００μＭ）を添加し、４４時間後にアポトーシスを測定した。値は３回測定の平均値である。
【００２１】
図４：ＣＯＸ−２またはＦＡＣＬ４の過剰発現がアポトーシスを阻害する。（Ａ）安定にトランスフェクトされた系列におけるＦＡＣＬ４およびＣＯＸ−２の条件付き発現レベル。細胞をポナステロン（１μｇ／ｍＬ）の共存下（＋）または非共存下（−）で４８時間処理し、それぞれ抗ＦＡＣＬ４および抗ＣＯＸ−２抗体を用いてウェスタンブロッティングを実施した。ローディングは抗βアクチン抗体（ＩＣＮバイオメディカルズ）を標準として行った。（Ｂ）ＣＯＸ−２、ＦＡＣＬ４およびその両方の過剰発現によるＡＡ誘導性アポトーシスの減少。空の対照ベクター（Ｃｔｌ）、ＦＡＣＬ４のｃＤＮＡ、ＣＯＸ−２のｃＤＮＡ、およびＦＡＣＬ４とＣＯＸ−２の両方のｃＤＮＡで安定にトランスフェクトした２９３細胞について、（Ａ）と同様に、過剰発現の誘導を行わないか（−Ｐｏｎ）、に誘導を行う（＋Ｐｏｎ）実験を行った。誘導から２４時間後にＡＡ（３００μＭ）を添加し、４４時間後にアポトーシスを調べた。ＡＡによって誘導されたアポトーシスの増加は、処理を行わなかった細胞におけるシグナルと比較して６倍〜２０倍の間で変動した。プロットは、安定系列のあいだでの相対アポトーシスレベルの比較であり、３回の独立実験の代表的なものを示している。数値は３回測定の平均で示されている。（Ｃ）ＣＯＸ−２媒介性のアポトーシス阻害のための触媒活性に対する要件。細胞に対して上述の過剰発現を誘導を行わないか（−Ｐｏｎ）、誘導を行う（＋Ｐｏｎ）実験を行った。イムノブロッティングで調べたところ、変異ＣＯＸ−２は野生型と同等のレベルで発現されていたが、合成されたプロスタグランジン量に関してはバックグラウンド以上の上昇が見られなかった。示したようにＣＯＸ阻害剤を６時間後に投与した。ＡＡ（３００μＭ）を２時間後に添加し、４４時間後にアポトーシスを調べた。プロットは（Ｂ）と同様に行い、それぞれに３回測定を行う３回の独立した実験の代表的結果である。「Ｗｔ」は野生型、「Ｍｕｔ」は変異型、「Ｍｅｔ」は５０μＭの６−メトキシ−２−ナフチル酢酸、「Ｉｎｄ」は１０μＭインドメタシンを表す。（Ｄ）ＦＡＣＬ４とＣＯＸ−２の共発現によるプロスタグランジン合成の減少。ＣＯＸ−２、ＦＡＣＬ４／ＣＯＸ−２安定細胞、および空のベクターを保持する対照細胞に対して４８時間誘導を行い、洗浄後、２０μＭのＡＡとともに３７℃で３０分間インキュベートした。合成されたＰＧＥ２の量はＥＬＩＳＡによって決定した。さらに４つのＦＡＣＬ４／ＣＯＸ−２二重安定細胞のクローンについて調べたところ、そのどれもがＣＯＸ−２単独安定系列に比べて低いレベル（１６％〜５６％の範囲）でしかＰＧＥ２を分泌しなかった。（Ｅ）安定系列における遊離ＡＡのレベル。上清に放出された［３Ｈ］を測定したが、示されている数値は複数回の実験（ｎ≧４，Ｐ＜０．０５）の平均値である。
【００２２】
図５：遊離アラキドン酸に対する酵素的「シンク」は、ＴＮＦαおよびカルシウムイオノフォア媒介性細胞殺傷を防止する。（Ａ）細胞生存性の判定。細胞を２４時間誘導するか（＋Ｐｏｎ）若しくは誘導せずに（−Ｐｏｎ）、ＴＮＦα（１ｎｇ／ｍＬ）またはカルシウムイオノフォアＡ２３１８７（５μＭ）を添加し、細胞をさらに７２時間インキュベートした。生存画分を判定し、ＴＮＦαまたはＡ２３１８７処理を行わなかった同系列のものと比較するようにプロットした。「Ｃｔｌ」は、空のベクターを保持した対照細胞を表し、ＦＡＣＬ４／ＣＯＸ−２は二重安定系列を表す。（Ｂ）遊離ＡＡの測定。ＦＡＣＬ４／ＣＯＸ−２細胞を［３Ｈ］で予め標識し、誘導を行い、Ａ２３１８７（５μＭ）で刺激し、［３Ｈ］ＡＡの放出を示した時間間隔で測定した。数値は４回の独立した測定を代表する１回の実験のものである。
【００２３】
図６：ＡＡに暴露した細胞では脂質過酸化が増加する。アポトーシスは抗酸化剤およびＢｃｌ−２によって阻害される。（Ａ）脂質酸化生成物のレベル。２９３細胞を指示した濃度で４８時間処理した。示したデータは、２回の独立した実験の代表的な１回の実験のものである。（Ｂ）抗酸化剤によるＡＡ誘導性アポトーシスの減衰。指示濃度の抗酸化剤を２９３細胞に１時間与え、次にＡＡ（２００μＭ）を添加した。アポトーシスは４４時間後に測定し、対照細胞におけるレベルと比較して示されている。（Ｃ）Ｂｃｌ−２によるＡＡ誘導性アポトーシスの阻害。細胞を空のベクター（Ｃｔｌ）またはＢｃｌ−２をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトした後、ＡＡ（３００μＭ）に暴露した。アポトーシスのレベルは４４時間後に決定した。示した数値は対照細胞と比較したアポトーシスレベルであり、３回測定の平均（Ｐ＜０．０５）を表す。Ｂｃｌ−２の発現は、ウェイスタンブロッティングによって判定した。（Ｄ）安定な細胞におけるＢｃｌ−２発現のレベル。安定にトランスフェクトされた細胞をポナステロンで２４時間または４８時間、誘導するか、若しくは誘導を行わなかった。細胞溶解液をＢｃｌ−２に対する抗体に対してブロットした。標準化は抗βアクチン抗体によって行った。
【００２４】
これらの図面は本発明の典型的な実施形態に関する情報を与えているにすぎず、本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。
５．発明の詳細な説明
本発明は、脂肪酸Ｃｏ−Ａリガーゼ４酵素の活性を調節する癌化学療法剤のスクリーニング方法を提供する。本発明は、そのようなアッセイを用いて発見された化学療法剤または化学予防剤の投与によるＦＡＣＬ４の阻害を伴う、大腸癌の新規な治療を提供する。さらに本発明は、組織試料中のＦＡＣＬ４活性レベルを検出することにより大腸癌を診断する新たな方法を提供する。
本願において引用する全ての文献、特許および特許出願は、参照により本願に組み込まれる。
【００２５】
（定義）
「ベクター」は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウィルス、ビリオンなどの任意の遺伝子要素であって、適切な制御要素が伴う場合に複製が可能であり、細胞間で遺伝子配列を移動させることのできる遺伝子要素を意味する。したがって、この用語にはウィルスベクターだけでなくクローニングや発現の伝播体も含まれる。
【００２６】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを言及するために用いられる。外来性ＤＮＡが細胞膜内部に導入されている場合、その細胞は「トランスフェクトされている」ことになる。多くのトランスフェクション技術が当該技術分野において広く知られている。たとえば、グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第５２巻、４５６頁（１９７３年）；サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨーク（１９８９年）；デービス（Ｄａｖｉｓ）ら、Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社（１９８６年）；チュー（Ｃｈｕ）ら、Ｇｅｎｅ、第１３巻、１９７頁（１９８１年）；およびＪ．Ｄ．ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）ら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、２１３〜２３４頁（１９９６年）を参照のこと。このような技術は、ヌクレオチド組み込み型ベクターや他の核酸分子などの１または複数の外来性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入するために用いることができる。この用語は、化学的、電気的ならびにウィルスを媒介したトランスフェクション手法を捕らえるものであり、その例としては、リン酸カルシウム共沈（グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、Ｖｉｏｌｏｇｙ、第５２巻、４５６〜４６７頁（１９７３年））、培養細胞への直接マイクロインジェクション（Ｍ．Ｒ．カペッチ（Ｃａｐｅｃｃｉ）、Ｃｅｌｌ、第２２巻、４７９〜４８８頁（１９８０年））、エレクトロポーレーション（シゲカワ（Ｓｈｉｇｅｋａｗａ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第６巻、７４２〜７５１頁（１９８８年））、リポソーム媒介性遺伝子導入（マンニーノ（Ｍａｎｎｉｎｏ）ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第６巻、６８２〜６９０頁（１９８８年））、脂質媒介性トランスフェクション（フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第８４巻、７４１３〜７４１７頁（１９８７年））、および高速マイクロプロジェクタイルを用いた核酸導入（クライン（Ｋｌｅｉｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、第３２７巻、７０〜７３頁（１９８７年））が挙げられる。
【００２７】
本明細書中で用いる、「細胞系列」という用語は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおいて連続的または長期に亘って増殖し分化できる細胞集団のことをいう。細胞系列は単一の前駆細胞に由来するクローン集団であることが多い。このようなクローン集団を保存または輸送している間に、天然のまたは誘導による核型の変化が起こりうることは当該技術分野において認識されている。したがって、引用された細胞系列に由来する細胞は、祖先の細胞または培養物と正確に一致しているとは限らず、引用された細胞系列はこのような変種も含んでいる。
【００２８】
「ＲＴ−ＰＣＲ」という用語は、当該技術分野において使用され知られている逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を表す。当該技術分野において知られているように、ＲＴ−ＰＣＲは、ポリメラーゼと、所望の標的ＤＮＡ部位の側方に位置するＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチド配列を有するプライマーとを用いた、目的ＤＮＡ分子の基本的な増幅方法の変法である。最初のサイクルで生成された鎖は以後のサイクルにおいて産生のための鋳型として使用できるので、連続的な処理プロセスを用いてＤＮＡの存在量を増加させることができる。ＲＴ−ＰＣＲはこの基本的な方法をｃＤＮＡを形成するためのｍＲＮＡの逆転写と組み合わせたものであり、ｃＤＮＡは上述の手法によって増幅させることができる。Ｒ．Ｃ．キング（Ｋｉｎｇ）、Ａ　Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、オックスフォード大学出版局、ニューヨーク、２６８頁（１９９７年）を参照のこと。
【００２９】
「アンプリコン」という用語は、断片中に見られる遺伝子の機能を阻害する化合物に暴露されると、多数の線状複製物を生成する、遺伝材料の断片を意味するために用いられる。
【００３０】
本明細書中で用いる「過剰発現」という用語は、操作されていない比較細胞または比較細胞組に比べて、高い比率で遺伝子産物を発現するように操作された細胞または細胞組において、所与の遺伝子産物が発現されていることを表す。前記細胞における過剰発現の比率は元のレベルからみて、２倍、５倍、１０倍と様々であるが、１０倍が好ましい。
【００３１】
（一般的方法）
本発明は、ＣＯＸ−２やＬＯＸなどの脂肪酸ＣｏＡリガーゼ４（ＦＡＣＬ４）が大腸腺癌においてアップレギュレートされるという知見に基づいている。Ｙ．チャオ（Ｃａｏ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第４９巻、３２７〜３３０頁（１９９８年）を参照のこと。上記酵素のアップレギュレーションは、大腸癌が遊離ＡＡのレベルを累積的に低下させるＡＡ代謝経路に変化をもたらすことにより、アポトーシスを阻害することを示唆するものである。この仮説を、ＦＡＣＬ４および／またはＣＯＸ−２を安定かつ誘導可能に発現するヒト上皮系列を構築することによって調べた。これらの細胞系列を用いて、ＡＡがアポトーシスに対するシグナルであることを確認した。またこれらの検定から、ＮＳＡＩＤおよび他のＡＡ代謝阻害剤によるアポトーシスの誘導は、ＡＡ代謝物質の阻害によってＡＡが蓄積された結果として起こることも示された。これらの検定からは、大腸癌やおそらくは他の癌においても起こっていると考えられる、ＣＯＸ−２およびＦＡＣＬ４の過剰発現が、ＡＡに対する「シンク」を形成することにより、アポトーシス促進シグナルを除去して発癌を促進することも示された。したがって、遊離ＡＡの細胞レベルを薬理的に操作してアポトーシスを誘導することは、変質細胞を殺傷する一般的なアプローチとなると考えられる。このことは、ＣＯＸ−２やＦＡＣＬ４などの、ＡＡを代謝する酵素を阻害することによって達成されると考えられる。
【００３２】
ＦＡＣＬ４によるＡＡの代謝を阻止する化合物を発見するために、ＦＡＣＬ４、ＣＯＸ−２、およびＦＡＣＬ４とＣＯＸ−２の両者を安定的に誘導可能に発現するヒト上皮細胞系列を構築した。これらの細胞系列は、ＦＡＣＬ４を阻害する化合物のスクリーニング方法において使用した。この方法は、ＦＡＣＬ４遺伝子産物を発現または過剰発現している細胞に試験化合物を接触させる工程と、該化合物によるＦＡＣＬ４遺伝子産物の阻害を、非接触細胞による阻害と比較して測定する工程とを含む。試験化合物によるＦＡＣＬ４遺伝子産物の阻害を測定するために多くの方法を用いることができるが、そうした方法には、ＦＡＣＬ４で処理した細胞と非ＦＡＣＬ４処理細胞における放射性標識したＡＡの代謝を追跡することが含まれる。同様に、実施例５において用いるようなパルス追跡法でも、細胞組において起こるＡＡ代謝の量を対照に対する相対量として求めることができる。さらに、ＡＡプールのアポトーシス誘導効果に基づく方法、たとえば、ＦＡＣＬ４処理細胞におけるアポトーシスの速度を、非ＦＡＣＬ４処理細胞のアポトーシス速度と比較することや、外来性ＡＡに暴露後のＦＡＣＬ４処理細胞と非処理細胞のアポトーシス速度を比較することなどが挙げられる。
【００３３】
さらに、上述のアッセイを用いて発見された化合物は、ヒトにおける大腸癌治療のために用いることが出来る。例えば実施例２に見られるように、トリアクシンＣなどの既知のＦＡＣＬ４阻害剤を用いて、細胞をＡＡ誘導性アポトーシスに感受性にすることができる。実際のところ、図２ｂに見られるように、ＦＡＣＬ４とＣＯＸ−２の両方が阻害された場合には、癌細胞を破壊する相乗作用が認められる。
【００３４】
また、実施例１に見られるように、大腸腺癌は正常な細胞よりもはるかに高いレベルでＦＡＣＬ４を発現している。このことは、疑いのある組織の試料中のＦＡＣＬ４発現のレベルを評価し、これを正常組織、正常細胞系列または他の対照の試料中で認められるレベルと比較することが、大腸癌の診断方法として役立つことを示唆するものである。
【００３５】
本明細書に記載のｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験においてアポトーシスを誘導したＡＡの濃度は、正常な生物流体において測定されている定常状態レベルよりも高いものの、細胞中の濃度は分かっておらず、ｉｎ　ｖｉｖｏの一定の状況下で一時的にそのようなレベルに達するのかもしれない。たとえば、トロンビンで刺激すると１分以内に１０９個の血小板から約５〜２０ｎｍｏｌのＡＡが放出される。Ｅ．Ｊ．ノイフェルド（Ｎｅｕｆｅｌｄ）とＰ．Ｗ．マジェラス（Ｍａｊｅｒｕｓ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２５８巻、２４６１〜２４６７頁（１９８３年）。
【００３６】
アポトーシスの誘導は、オレイン酸やパルミチン酸などの他の脂肪酸が同様の反応を示さないことから、洗浄性の作用ではない。さらに、ＡＡによって開始されるアポトーシスは、ＣＯＸ−２とＦＡＣＬ４を過剰発現させた実験で実証したように、ＡＡを代謝的に除去することによって阻害することができる。
【００３７】
ＣＯＸ−２特異的阻害剤であるＳＣ−５８１２５およびＮＳ３９８は、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２をダウンレギュレートすることにより、大腸および前立腺癌細胞におけるアポトーシスの誘導を増強することが報告されており（Ｈ．シェング（Ｓｈｅｎｇ）ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．、第５８巻、３６２〜３６６頁（１９９８年）、および、Ｘ．Ｉ．リウ（Ｌｉｕ）ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．第５８巻、４２４５〜４２４９頁（１９９８年）を参照のこと）、一方で、１５−ＬＯＸはＢｃｌ−２をアップレギュレートすることにより、アポトーシスを阻害することが分かっている。Ｅ．ニシオ（Ｎｉｓｈｉｏ）とＹ．ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）、Ｂｒ．Ｊ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、第１２２巻、１５１６〜１５２２頁（１９９７年）を参照のこと。我々はＣＯＸ−２および／またはＦＡＣＬ４を過剰発現させると、アポトーシスが阻害されるとともに、Ｂｃｌ−２の発現が上昇することを発見した。さらに、Ｂｃ１−２の過剰発現により、ＡＡによって誘導されるアポトーシスが抑制された。これらの結果は、Ｂｃ１−２の発現が遊離ＡＡのレベルによって制御されていること、および、Ｂｃ１−２依存性経路がＡＡによって指令されるアポトーシスにおける重大な役割を果たしていることを示唆する。
【００３８】
ＡＡ代謝の増加が腫瘍成長の開始剤であるのか腫瘍成長の結果であるのかについては、議論がなされてきた。ＣＯＸ−２とその阻害剤を用いた研究から、ＣＯＸ−２の誘導が発癌および腫瘍の進行における重要な段階であることが強く支持されている。ＣＯＸ−２および他のＡＡ代謝経路を活性化する前新生物形成効果は多く存在するが、１つの重要な機構はアポトーシスの阻害である。大腸の生理的状態からすると、アポトーシスは、腸上皮細胞のライフサイクルを終結させる正常な事象である。大腸癌においては誘導酵素によるＡＡの転流が遊離ＡＡのレベルの低下をもたらし、結果としてアポーシスを減衰させることにより腫瘍の成長が促進される。プロスタグランジン類やロイコトリエン類などのＡＡ代謝の特定のエイコサノイド産物もまた、細胞付着および増殖を増強することにより変質に寄与すると考えられる。それでもなお、ＡＡ代謝「シンク」の協調的活性化によるアポトーシスの阻害は、腫瘍成長を促進するのに極めて重要な機構であり、我々の知見は、ＡＡ代謝経路を標的とした特異的かつ無毒の阻害剤を開発することが治療的インターベンションに対する新規なアプローチとなることを含意するものである。
【００３９】
６．実施例
以下の実施例は、本発明によって実施した様々な実施形態を説明するためのものである。以下の実施例は、本発明に従って製造されうる多様な実施形態を包括または網羅するものではない。
【００４０】
（材料と方法）
腫瘍組織および逆転写ＰＣＲ
全ＲＮＡは、同一の患者から外科的に除去した大腸腺癌および隣接する正常組織から、トリゾール試薬（ライフテクノロジー社）によって調製した。大腸癌細胞系列はＡＴＣＣより得た。ＲＴ−ＰＣＲは、ヒトＦＡＣＬ４またはＣＯＸ−２のコード配列に対応するプライマーと、βアクチンプライマー／コンペチマー（ｃｏｍｐｅｔｉｍｅｒ）混合物（Ａｍｂｉｏｎ社）を用いて行った。ＦＡＣＬ４およびＣＯＸ−２に対して増幅される断片の大きさは、それぞれ４４１ｂｐおよび４８０ｂｐであり、βアクチンプライマーは２９４ｂｐの断片を増幅する。
【００４１】
細胞死検出ＥＬＩＳＡ
細胞を９６ウェルプレート上に１ウェルあたりの細胞数が１×１０４個となるようにプレーティングした。ＡＡを与え、４４時間後に細胞死検出ＥＬＩＳＡ（ベーリンガー・マンハイム社）によってアポトーシス死を判定した。
【００４２】
安定細胞系列
安定エクジソン誘導系（インビトロゲン社）を用いて、ヒトＦＡＣＬ４、ＣＯＸ−２、ＣＯＸ−２変異体、およびＦＡＣＬ４とＣＯＸ−２の両者を過剰発現する安定な系列を構築した。ＣＯＸ−２変異体ｃＤＮＡは、アミノ酸残基が１つだけ変化した触媒的に不活性なＣＯＸ−２（Ｌ５４７Ｋ）を発現する。これらのｃＤＮＡをｐＩＮＤ（ＳＰ１）（ネオマイシン）中にクローン化した。これらのｃＤＮＡ構築物または空のベクターｐＩＮＤ（ＳＰ１）をＥｃＲ２９３細胞にトランスフェクトし、４００μｇ／ｍＬゲネチシンおよび４００μｇ／ｍＬゼオシン中で選択した。多数のシングルコロニーについて、抗ＦＡＣＬ４（Ｙ．チャオ（Ｃａｏ）ら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．第４６７巻、２６３〜２６７頁（２０００年））および抗ＣＯＸ−２抗体（Ｄｒ．Ｊａｃｑｕｅｓ　Ｍａｃｌｏｕｆより寄贈）に対するイムノブロッティングにより、また、ＦＡＣＬ４に対してはＣｏＡリガーゼ活性（Ｄ．Ｂ．ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２５７巻、３５１０〜３５１５頁（１９９２年））、ＣＯＸ−２野生型に対してはＰＦＥ２分泌（ＥＬＩＳＡアッセイ、アッセイデザイン社）を測定することにより、ＦＡＣＬ４、ＣＯＸ−２野生型、およびＣＯＸ−２変異体の過剰発現に対するスクリーニングを実施した。ＦＡＣＬ４ｃＤＮＡをｐＩＮＤ（ＳＰ１）（ヒグロマイシン）ベクター中にクローン化した別のｐＩＮＤ（ＳＰ１）−ＦＡＣＬ４ｃＤＮＡ構築物で、ＣＯＸ−２安定細胞を安定にトランスフェクトすることにより、二重安定系列を作製した。細胞は、４００μｇ／ｍＬゲネチシン、４００μｇ／ｍＬゼオシン、および５０μｇ／ｍＬヒグロマイシンＢ中で選択した。ポジティブコロニーについて、上述のようにしてスクリーニングを実施した。
【００４３】
細胞生存性
細胞生存率はクリスタルバイオレット染色（Ｍ．ハヤカワ（Ｈａｙａｋａｗａ）ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６８巻、１１２９０〜１１２９５頁（１９９３年）を参照）によって判別した。
【００４４】
ｉｎ　ｓｉｔｕ細胞死検出
細胞をポリＬ−リシンで予めコートした８ウェルのガラスチャンバスライドにプレーティングした。ＡＡ（３００μＭ）を添加し、４４時間後に、ｉｎ　ｓｉｔｕ細胞死検出キット（ベーリンガー・マンハイム社）を用いて蛍光ＴＵＮＥＬアッセイを行った。
【００４５】
アラキドン酸の放出
細胞をポリＬ−リシンで予めコートした６ウェルのプレート上に、１ウェルあたり８×１０５個になるようにプレーティングした。次にこれらを［３Ｈ］ＡＡ（０．４μＣｉ／ｍＬ培地）（９１．８Ｃｉ／ｍｍｏ１，１００μＣｉ／ｍＬ，ＮＥＮ）で２４時間予備標識した。洗浄後、１％ＢＳＡ（脂肪酸非含有）を加えた血清を含まないＤＭＥＭを添加した。少量の培地を時間毎に抜き取り、遊離の脂肪酸をイソプロピルアルコール／ヘプタン／２ＭＨ２ＳＯ４（４０：１０：１）カクテルで抽出した（Ｖ．ドール（Ｄｏｌｅ）とＨ．（マイナーツ）Ｍｅｉｎｅｒｔｚ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２３５巻、２５９５〜２５９９頁（１９６０年）を参照のこと）。上側のヘプタン相を回収し、［３Ｈ］標識されたＡＡをシンチレーションカウンタによって測定した。培地は２８時間後に抽出し、ＡＡの放出を再度測定した。ＡＡ放出の百分率（＋Ｐ／−Ｐ）は、まず同一皿中で４時間後に放出されたＡＡ（バックグラウンド）を３２時間後に放出されたＡＡから差し引き、次に同一の安定系列においてポナステロン処理後（＋Ｐ）の放出レベルを対照（−Ｐ）の放出レベルで割ることにより求めた。Ａ２３１８７刺激によるＡＡの放出は、非刺激細胞から放出されたＡＡを、Ａ２３１８７によって刺激された対応物から放出されたＡＡから差し引くことによって求めた。
【００４６】
脂質過酸化アッセイ
細胞をプレーティングし、ＡＡで４８時間処理した。次にこれらの処理細胞を３００μＬのＨ２Ｏ中に懸濁し、凍結解凍を繰り返すことにより細胞溶解液を調製した。細胞性マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）および４−ヒドロキシノネナール（４−ＨＮＥ）のレベルを、脂質過酸化アッセイキット（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いて測定した。
【００４７】
Ｂｃｌ−２ｃＤＮＡ構築物によるトランスフェクション
細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（ライフテクノロジー社）を用いて、ヒトＢｃｌ−２ｃＤＮＡ構築物でトランスフェクトした。２μｇのＢｃ１−２ｃＤＮＡおよび１μｇのルシフェラーゼｃＤＮＡ構築物を４×１０５個までの細胞にトランスフェクトした。４８時間後に細胞を回収し、９８ウェルプレート上に１ウェルあたりの細胞数が１×１０４個となるように再度プレーティングした。トランスフェクタントを３００μＭのＡＡに暴露し、４４時間後にアポトーシスを調べた。トランスフェクタントの一部を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定してトランスフェクション効率をモニタした。Ｂｃ１−２の発現レベルは、イムノブロッティング（ベーリンガー・マンハイム社より入手した抗体）によって調べた。
【００４８】
間接的蛍光免疫染色
細胞をポリＬ−リシンで予めコートした８チャンバスライド中で培養し、３．７％パラホルムアルデヒドで固定した。スライドをブロックし、抗活性カスパーゼ３抗体（１：２００希釈、ファーミンゲン社）を与えた後、ＦＩＴＣ複合化ヤギ抗ウサギ二次抗体（１：２５０希釈，ジャクソン・イムノリサーチ社）とともにインキュベートした。
【００４９】
実施例１：大腸腺癌においてＦＡＣＬ４の発現が増大している。
我々は以前に、ＡＡに対して高い選択性を有し、ＡＡをアラキドノイル補酵素Ａエステルに変換する酵素をコードする脂肪酸ＣｏＡ−リガーゼのヒトアイソフォーム４のクローニングを行った（Ｙ．チャオ（Ｃａｏ）ら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第４９巻、３２７〜３３０頁（１９９８年））。ＦＡＣＬ４とＣＯＸ−２のどちらもＡＡを基質として用いること、ならびにＣＯＸ−２が大腸癌において誘導されることが明らかにされていることから（Ｃ．Ｅ．イーバハート（Ｅｂｅｒｈａｒｔ）ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、第１０７巻、１１８３〜１１８８頁（１９９４年）を参照）、ＦＡＣＬ４もまた大腸腺癌においてアップレギュレートされるのではないかと考えた。ＣＯＸ−２およびＦＡＣＬ４に対して特異的なプライマーを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを行ったところ、大腸腺癌においては、ＣＯＸ−２だけでなくＦＡＣＬ４の発現も、同一患者から得た隣接する正常組織と比較して有意に増大されていることが判明した。２４個の大腸腺癌試料のうちの２３個でＦＡＣＬ４の発現が２〜１４倍に増加しており、２人の患者から得た代表的な結果を図１Ａに示した。また、多くの大腸癌細胞系列が、腸上皮系列Ｉｎｔ４０７におけるよりも有意に高いレベルのＦＡＣＬ４を発現していることが判明した（図１Ｂ）。
【００５０】
実施例２：ＦＡＣＬ阻害剤は、細胞をＡＡ誘導性アポトーシスに対して感受性にするとともに、アポトーシスの誘導においてＮＳＡＩＤと相乗作用を示す。
以前の報告から、形質転換細胞においてＮＳＡＩＤでＣＯＸ−２を阻害すると、アポトーシスが起こることが明らかにされている。我々は、ＦＡＣＬの阻害剤であるトリアクシンＣが同様の効果を有するかどうかを調べた。その結果、トリアクシンＣがＨＴ２９細胞において濃度依存的にアポトーシスを誘導することが分かった。トリアクシンＣは１０μＭで対照細胞に比べて９倍の増加を示した（図２Ａ）。さらに、外来性ＡＡは１００〜３００μＭの濃度でアポトーシスを誘導し、トリアクシンＣは細胞をＡＡ誘導性アポトーシスに感受性にした（図２Ａ）。このことは、トリアクシンＣによるアポトーシスの誘導が、ＦＡＣＬ４経路の不活性化と、その後に起こる細胞内での遊離ＡＡの蓄積とによって媒介されることを示唆する。さらに、これらの２つの代謝経路を同時に阻害すると、アポトーシスに対する相乗作用がもたらされるかどうかも調べた。この結果、ＣＯＸ阻害剤であるインドメタシンを添加すると、ＨＴ２９細胞においては細胞死を引き起こさなかった濃度（２μＭ）のトリアクシンＣがアポトーシスを誘導することが分かった。トリアクシンＣのアポトーシス誘導効果は、別のＣＯＸ阻害剤であるスリンダクの存在下で４〜８倍に増大した（図２Ｂ）。同様の相乗作用は、ヒト腎臓上皮２９３細胞においても検出された（図示せず）。したがって、アポトーシスに対するシグナルは、ＡＡのレベルの増加であり、トリアクシンＣおよびＮＳＡＩＤは、遊離ＡＡの代謝的除去を阻害することによりアポトーシスを促進していると考えられる。
【００５１】
実施例３：アラキドン酸は上皮細胞におけるアポトーシスを誘導し、カスパーゼ３の活性化に関与する。
腫瘍組織においてＡＡを利用する酵素のアップレギュレーションに関与する機構を調べるために、細胞の遊離ＡＡレベルを操作できるようにした細胞モデルを構築した。まず最初に、外来性ＡＡに暴露した２９３細胞の運命について調べたところ、脂肪酸の濃度を増加させると生存性が対照の２３％にまで落ち込むことが分かった（図３Ａ）。アポトーシスに起因すると考えられる細胞死の部分を、モノおよびオリゴヌクレオソームの形成を検出するアッセイにおいて評価した。細胞を３００μＭのＡＡに暴露した場合には高いレベル（対照の１８倍）が検出されたが、パルミチン酸（ＰＡ）に暴露した場合には増加は見られなかった（図３Ｂ）。対照細胞は無傷の核を有していたが、ＡＡで処理した細胞では、核凝縮およびクロマチン断片化および高レベルのＤＮＡ鎖破壊が見られた（図３Ｃ）。このように、ＡＡは濃度依存的にアポトーシスを誘導する。我々は、カスパーゼ１（ＩＣＥ）ではなくカスパーゼ３によって媒介される経路が、内在性ＡＡ放出が刺激されているＴＮＦα処理細胞に含まれていることから、カスパーゼ３の活性化がＡＡ誘導性アポトーシスに関与するのではないかと仮定した。Ｓ．ボーティーレ（Ｂｏｕｒｔｅｅｌｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７３巻、３１２４５〜３１２５１頁（１９９８年）を参照のこと。対照細胞と比較してＡＡ処理細胞において、カスパーゼ３様の活性の時間および濃度依存的に増加が認められ、増加は４．５倍まで１７時間目にピークを示した（図示せず）。個々の細胞におけるカスパーゼ３の活性化は、活性化されたカスパーゼ３に特異的な抗体を用いて検出した。染色パターンから、活性化されたカスパーゼ３のレベルはクロマチン断片化の程度と相関することが判明した（図３Ｄ）。次に、細胞を外来性ＡＡに暴露する前に、カスパーゼ１／４（（ｚ−ＹＶＡＤ−ｆｍｋ）またはカスパーゼ３（ｚ−ＤＭＱＤ−ｆｍｋ）の何れかの阻害剤を細胞に添加した。カスパーゼ３阻害剤はアポトーシスを顕著に阻害したが（いずれの濃度においてもＰ＜０．００１）、カスパーゼ１／４阻害剤ではこのような阻害が見られなかった（図３Ｅ）。このことは、カスパーゼ３の活性化がＡＡによって誘導されるアポトーシスにおいて不可欠な下流の出来事であることを示している。
【００５２】
実施例４：ＡＡを利用する経路の活性化は、細胞の遊離ＡＡのレベルを低減することによりＡＡ誘導性アポトーシスを阻害する。
次に我々は、誘導によってヒトＦＡＣＬ４、ヒトＣＯＸ−２、またはその両方を発現する安定に形質転換された系列を構築した。誘導によるＦＡＣＬ４、ＣＯＸ−２、またはその両方の発現のレベルは、安定系列においてウェスタンブロッティングによって検出した（図４Ａ）。さらに、触媒活性を欠失した変異ＣＯＸ−２（Ｌ５４７Ｋ）を誘導可能に発現する系列を単離した（図示せず）。そして、ＦＡＣＬ４および／またはＣＯＸ−２の過剰発現によってＡＡ誘導性アポトーシスが阻害されるかどうかを調べた。アポトーシスのレベルは、対照細胞に比べてＦＡＣＬ４またはＣＯＸ−２を過剰発現している細胞において減少していた（図４Ｂ）。アポトーシスの減少は、酵素の発現を誘導するために用いた物質であるポナステロンの副作用ではない。とういのも空のベクターを保持した対照細胞が誘導の有無にかかわらず同様のシグナルレベルを示したためである。アポトーシスの減衰は、細胞がＦＡＣＬ４とＣＯＸ−２の両方を過剰発現した場合に、さらに顕著であった（図４Ｂ）。ＦＡＣＬ４またはＣＯＸ−２の過剰発現によってＡＡ誘導性アポトーシスが部分的に阻害され、両酵素を同時に過剰発現させると付加的効果が得られるという結論に至った。
【００５３】
次に、他の多価不飽和脂肪酸がアポトーシスを誘導するかどうかを調べるために、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）およびドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が有効かどうかを調べた。ＤＨＡはＡＡまたはＥＰＡほどに良好ではないものの、上記脂肪酸のいずれもＣＯＸ−２に対する基質である。Ｗ．Ｌ．スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２７１巻、３３１５７〜３３１６０頁（１９９６年）を参照のこと。２００μＭのＡＡ、２００μＭのＥＰＡ、１００μＭのＤＨＡおよび２００μＭのＰＡで処理した後のアポトーシスの増加倍率は、それぞれ、８．５倍、９．１倍、１５．１倍、および４．２倍であった。ＣＯＸ−２の過剰発現を誘導することにより、ＡＡに応答したアポトーシスは３６．７％（ｎ＝３，Ｐ＜０．００１）減少し、ＥＰＡに応答したアポトーシスは３４．０％（ｎ＝３，Ｐ＜０．０１）、ＤＨＡに応答したアポトーシスは１８．５％（ｎ＝３，Ｐ＞０．０５）、ＰＡに応答したアポトーシスは８．１％（ｎ＝３，Ｐ＞０．０５）だけ減少した。したがって、ＣＯＸ−２の過剰発現によるアポトーシスの阻害は、脂肪酸の基質としての適性に相関していた。異なる脂肪酸を用いた結果によって示唆されるように、ＣＯＸ−２の防止効果がその触媒活性を必要とするかを調べるために、野生型ＣＯＸ−２を有した細胞におけるアポトーシスレベルを、不活性変異細胞ＣＯＸ−２（Ｌ５４７Ｋ）を有する細胞におけるレベルと比較した（図４Ｃ）。野生型ＣＯＸ−２の場合とは対照的に、変異ＣＯＸ−２の発現はアポトーシスを阻害しなかった（図４Ｃ）。次に、この応答に対するＮＳＡＩＤの影響を調べたところ、ＣＯＸ−２の選択的阻害剤である６−メトキシ−２−ナフチル酢酸（５０μＭ）が、ＣＯＸ−２によるアポトーシスの阻害を無効にすることが分かった。これとは対照的に、インドメタシンは（ＣＯＸ−１を阻害するがＣＯＸ−２は阻害しない濃度である１０μＭ）（Ｅ．Ａ．ミード（Ｍｅａｄｅ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６８巻、６６１０〜６６１４頁（１９９３年）を参照）アポトーシス応答を変えることはなかった（図４Ｃ）。このように、ＣＯＸ−２の阻害はアポトーシス促進効果を有していた。
【００５４】
アポトーシスからの保護は、遊離ＡＡの徹底的な除去あるいは代謝産物の産生に起因するものであった可能性がある。これらの２つの機構を区別するために、いくつかの実験を行った。まずはじめに、ＣＯＸ−２経路の主要な産物であるＰＧＥ２の分泌を、ＣＯＸ−２単独安定系列およびＦＡＣＬ４／ＣＯＸ−２二重安定系列において比較した。二重安定細胞は、ＣＯＸ−２単独安定細胞と比べて、２８％以下の量のＰＧＥ２しか分泌しなかった（図４Ｄ）。これは、おそらくＣＯＸ−２媒介経路とＦＡＣＬ４媒介経路との間での、遊離ＡＡのプールに対する競争が原因と考えられる。二重安定細胞が遙かに低レベルのプロスタグランジンしか産生しないにもかかわらず、ＣＯＸ−２単独安定細胞よりも効果的にアポトーシスを阻害したことから、上記結果は、産物の生成ではなく、ＡＡの枯渇が阻害の要因であるという解釈の方を強く支持するものである。さらに、ＰＧＥ２（５０μＭ）およびＰＧＪ２（５μＭ）を細胞に直接添加したところ、これらが外来性ＡＡの存在下において細胞の生存率を高めないことが分かった（図示せず）。二重安定細胞において遊離ＡＡの利用性が減少したことから、阻害がＬＯＸ経路を介するＨＥＴＥ合成の変化によるものであるという別の可能性もあった。２９３細胞における１５−ＬＯＸを調べたところ、ＬＯＸ阻害剤であるＮＤＧＡが、以前に報告されているようにアポトーシスを誘導すること（Ｄ．Ｇ．タン（Ｔａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第９３巻、５２４１〜５２４６頁（１９９６年）参照）、さらに１５−ＨＥＴＥを加えても２９３細胞における細胞の生存性に影響がないことが分かった（図示せず）。上記の結果をまとめると、高レベルの遊離ＡＡがアポトーシスの引き金となる一方で、その枯渇がアポトーシスを阻害するという仮説が支持される。直接的な証拠を得るために、次に様々な細胞系列における遊離ＡＡの相対量を培地中への放出量を測定することにより調べた。Ｓ．ジャヤデブ（Ｊａｙａｄｅｖ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６９巻、５７５７〜５７６３頁（１９９４年）を参照。「シンク」の誘導後、ＡＡは、ＦＡＣＬ４、ＣＯＸ−２および二重安定細胞において、誘導を行わなかった対応物と比較してそれぞれ６７％、６１％および２６％まで減少していた（図４Ｅ）。
【００５５】
実施例５：アラキドン酸代謝「シンク」もまたＴＮＦα媒介性殺傷を防止する。
次に、ＡＡに対する「シンク」が、例えばＴＮＦα媒介性殺傷などの他の状況において細胞死を防止するかどうかを調べた。ＴＮＦαは特定の腫瘍細胞に対して細胞毒性および細胞静止作用を及ぼし、ｃＰＬＡ２によるＡＡの放出は明らかにこのプロセスに含まれてる。Ｍ．ハヤカワ（Ｈａｙａｋａｗａ）あら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６８巻、１１２９０〜１１２９５頁（１９９３年）、および、Ｓ．ジャヤデブ（Ｊａｙａｄｅｖ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７２巻、１７１９６〜１７２０３頁（１９９７年）を参照のこと。ＦＡＣＬ４またはＣＯＸ−２を過剰発現した細胞において、ＴＮＦα処理後の細胞の生存性は適度に増大し（図示せず）、ＦＡＣＬ４／ＣＯＸ−２安定細胞においては顕著に上昇し、生存画分は４３．５％から７０．５％へと増大した（ｎ＝３，Ｐ＜０．００１）（図５Ａ）。二重安定細胞における細胞の生存性は、誘導を行わない場合ですら対照細胞よりも良好であることが分かった。おそらくこれは、ｃＤＮＡ構築物のプロモータ制御におけるわずかな漏れに起因すると考えられる。さらに我々は、ｃＰＬＡ２によりＡＡ放出を刺激する、他のアゴニストであるＣａ２＋イオノフォアＡ２３１８７（Ｌ．−Ｌ．リン（Ｌｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８９巻、６１４７〜６１５１頁（１９９２年）を参照）に応答した細胞生存性について調べたところ、生存性は、誘導されたＦＡＣＬ４またはＣＯＸ−２安定細胞において、それらの非誘導対応物に比べて高かった（図示せず）。この向上は、細胞生存性が３７．８％から６７．８％に上昇した（ｔ試験、ｎ＝３、Ｐ＜０．０１）二重安定細胞においてさらに顕著であった（図５Ａ）。我々はＦＡＣＬ４とＣＯＸ−２の両者の過剰発現による相乗作用について繰り返し調べた。その結果、ＣＯＸ−２特異的阻害剤（６−メトキシ−２−ナフチル酢酸）が二重安定細胞における細胞生存性の向上を部分的に無効にすることが判明した（図示せず）。細胞生存性の向上が遊離ＡＡのレベルの減少の結果であるのかどうかをさらに調べるために、パルス追跡実験を行い、Ａ２３１８７処理後に培地中に放出されたＡＡの量を測定した。対照細胞は、Ａ２３１８７に応答して大量のＡＡを放出したが、その放出はＦＡＣＬ４およびＣＯＸ−２の過剰発現によって完全に無効にされた（図５Ｂ）。このことから、代謝経路（シンク）内へのＡＡの転流が、ＡＡ放出に対する強い刺激条件の下ですら低い細胞濃度をもたらすことが実証された。これらの結果は、ＡＡのレベルの上昇がＴＮＦα誘導性およびＡ２３１８７誘導性殺傷における重要なステップであること、および遊離ＡＡが様々な刺激によって開始される細胞死シグナリングを媒介することを支持するものである。
【００５６】
実施例６：ＡＡ誘導性アポトーシスは抗酸化剤およびＢｃｌ−２によって抑制される。
脂質過酸化はアポトーシスの構成要素であることが多いが（Ｄ．Ｍ．ホッケンベリー（Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｙ）ら、Ｃｅｌｌ、第７５巻、２４１〜２５１頁（１９９３年）を参照）、我々は、ＡＡに暴露した細胞においてマロンジアルデヒドおよび４−ヒドロキシ−２（Ｅ）−ノネナールの形成が高められることを観察した（図６Ａ）。さらに、細胞をデフェロキサミン、アスコルビン酸、トロロックス、トコフェロール等の抗酸化剤で前処理した場合、アポトーシスは顕著に低下した（図６Ｂ）。また、膜透過性抗酸化剤であるアポトランスフェリンについても調べたところ、この物質がＡＡ誘導性アポトーシスに変化をもたらさないことが分かった（図示せず）。このように、抗酸化剤は細胞内酸化プロセスを阻止することにより、アポトーシスを部分的に防止している。上記の結果は、おそらくは非酵素的機構を介するＡＡの過酸化を含むかもしれないＡＡ誘導性アポトーシスに、反応性酸素種が関与していることを示唆している。カスパーゼ３阻害剤は過酸化脂質の形成を阻止しなかったことから、過酸化脂質の蓄積はカスパーゼ３活性化の上流に位置づけられる（図示せず）。
【００５７】
Ｂｃｌ−２は抗アポトーシスタンパク質であり、その１つの作用として、脂質過酸化の抑制がある。Ｄ．Ｍ．ホッケンベリー（Ｈｏｃｋｅｎｂｅｒｙ）ら、Ｃｅｌｌ、第７５巻、２４１〜２５１頁（１９９３年）を参照。細胞をＢｃｌ−２のｃＤＮＡでトランスフェクトしたところ、このトランスフェクト細胞がＡＡ誘導性アポトーシスを減少させること、およびこの減少がＢｃｌ−２の発現レベルと相関していることが分かった（図６Ｃ）。このことは、ＡＡシンクを有する細胞において観察されたアポトーシスからの保護が、これらの細胞におけるＢｃｌ−２の発現の増加に起因しているという可能性が持ち上がる。実際のところ、ＦＡＣＬ４および／またはＣＯＸ−２が過剰発現されたときに、Ｂｃｌ−２の発現レベルが適度に上昇するこが判明した（図６Ｄ）。したがって、ＡＡによって開始されるアポトーシス経路は脂質の過酸化を伴い、Ｂｃｌ−２によって抑制可能であるが、ＡＡ代謝酵素の発現によって与えられる防止効果、すなわち、利用可能な遊離のＡＡの量を調節することによる防止効果はこれらの段階の上流にある。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】大腸腺癌における定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図。
【図１Ｂ】大腸癌細胞系列における定量的ＲＴ−ＰＣＲの結果を示す図。
【図２Ａ】トリアクシンＣによるアラキドン酸誘導性アポトーシスの感作を示すグラフ。
【図２Ｂ】アポトーシスを誘導する際のトリアクシンＣのＮＳＡＩＤとの相乗作用を示すグラフ。
【図３Ａ】アポトーシス誘導の際の細胞生存性の測定を示すグラフ。
【図３Ｂ】アラキドン酸に暴露した細胞におけるアポトーシスの増加を示すグラフ。
【図３Ｃ】アポトーシスの蛍光ＴＵＮＥＬアッセイによるｉｎ　ｓｉｔｕ検出。
【図３Ｄ】抗活性カスパーゼ３抗体による免疫染色。
【図３Ｅ】カスパーゼ３の阻害によるＡＡ誘導性アポトーシスの阻害。
【図４Ａ】安定にトランスフェクトされた系列におけるＦＡＣＬ４およびＣＯＸ−２の条件付き発現レベルを示す図。
【図４Ｂ】ＣＯＸ−２、ＦＡＣＬ４およびその両方の過剰発現によるＡＡ誘導性アポトーシスの減少を示すグラフ。
【図４Ｃ】ＣＯＸ−２媒介性のアポトーシス阻害のための触媒活性に対する要件を示すグラフ。
【図４Ｄ】ＦＡＣＬ４とＣＯＸ−２の共発現によるプロスタグランジン合成の減少を示すグラフ。
【図４Ｅ】安定系列における遊離ＡＡのレベルを示すグラフ。
【図５Ａ】遊離アラキドン酸に対する酵素的「シンク」による、ＴＮＦαおよびカルシウムイオノフォア媒介性細胞殺傷の防止を示す、細胞生存性の判定のグラフ。
【図５Ｂ】遊離アラキドン酸に対する酵素的「シンク」による、ＴＮＦαおよびカルシウムイオノフォア媒介性細胞殺傷の防止を示す、遊離ＡＡの測定のグラフ。
【図６Ａ】ＡＡに暴露した細胞での脂質酸化生成物のレベルを示すグラフ。
【図６Ｂ】抗酸化剤によるＡＡ誘導性アポトーシスの減衰を示すグラフ。
【図６Ｃ】Ｂｃｌ−２によるＡＡ誘導性アポトーシスの阻害を示すグラフ。
【図６Ｄ】安定な細胞におけるＢｃｌ−２発現のレベルを示すグラフ。
【図１Ａ】
2004507241.tif 000002
【図１Ｂ】
2004507241.tif 000003
【図２Ａ】
2004507241.tif 000004
【図２Ｂ】
2004507241.tif 000005
【図３Ａ】
2004507241.tif 000006
【図３Ｂ】
2004507241.tif 000007
【図３Ｃ】
2004507241.tif 000008
【図３Ｄ】
2004507241.tif 000009
【図３Ｅ】
2004507241.tif 000010
【図４Ａ】
2004507241.tif 000011
【図４Ｂ】
2004507241.tif 000012
【図４Ｃ】
2004507241.tif 000013
【図４Ｄ】
2004507241.tif 000014
【図４Ｅ】
2004507241.tif 000015
【図５Ａ】
2004507241.tif 000016
【図５Ｂ】
2004507241.tif 000017
【図６Ａ】
2004507241.tif 000018
【図６Ｂ】
2004507241.tif 000019
【図６Ｃ】
2004507241.tif 000020
【図６Ｄ】
2004507241.tif 000021
【国際公開パンフレット】
2004507241.tif 000022
2004507241.tif 000023
2004507241.tif 000024
2004507241.tif 000025
2004507241.tif 000026
2004507241.tif 000027
2004507241.tif 000028
2004507241.tif 000029
2004507241.tif 000030
2004507241.tif 000031
2004507241.tif 000032
2004507241.tif 000033
2004507241.tif 000034
2004507241.tif 000035
2004507241.tif 000036
2004507241.tif 000037
2004507241.tif 000038
2004507241.tif 000039
2004507241.tif 000040
2004507241.tif 000041
2004507241.tif 000042
2004507241.tif 000043
2004507241.tif 000044
2004507241.tif 000045
2004507241.tif 000046
2004507241.tif 000047
2004507241.tif 000048
2004507241.tif 000049
2004507241.tif 000050
2004507241.tif 000051
2004507241.tif 000052
2004507241.tif 000053
2004507241.tif 000054
2004507241.tif 000055
2004507241.tif 000056
2004507241.tif 000057
【国際調査報告】
2004507241.tif 000058
2004507241.tif 000059
2004507241.tif 000060