(57)【要約】本発明は安全性が立証された酵母から由来した抗ストレス、抗疲労、月経前期症候群（ＰＭＳ）及び月経痛緩和の機能及び天然脳神経栄養因子としての機能を有する機能性ペプチド及びその製造方法に係り、良質の蛋白質とミネラル、ビタミンＢ群を多量含有した酵母を最大増殖期まで増殖させた後、高温、超音波、振動、ｐＨ変化などの適切な物理的または化学的ストレスを加えて人体に有益な抗ストレス性物質を多量生成、分泌させた後、自家消化させた後精製することによって製造される。本発明の機能性ペプチドはストレス解消、神経安定、不安除去、緊張緩和、熟睡誘導、疲労回復、自律神経調節機能の回復機能を有するので、抗ストレス製剤、抗疲労製剤、ＰＭＳ及び月経痛緩和製剤、及び天然脳神経栄養剤または前記機能を有する機能性食品の素材として使われうる。
2004521919.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母から抽出されたことを特徴とする抗ストレス機能、抗疲労機能、ＰＭＳ及び月経痛緩和機能及び神経栄養因子としての機能を有する酵母抽出物。
【請求項２】
酵母を３５℃ないし７０℃の温度で自己消化させた、請求項１に記載の酵母抽出物。
【請求項３】
酵母を自己消化させると同時にまたは自己消化させた後に、蛋白質分解酵素で蛋白質を加水分解させた、請求項２に記載の酵母抽出物。
【請求項４】
酵母を加水分解させたものを遠心分離して上澄み液だけを取った、請求項３に記載の酵母抽出物。
【請求項５】
請求項４の上澄み液を限外ろ過して得た、１０，０００Ｄａ以下の分子量の酵母ペプチド。
【請求項６】
グルタミン酸及びアスパラギン酸を１５〜２５モル％含む、請求項５に記載の酵母ペプチド。
【請求項７】
血液脳関門を通過可能な請求項５に記載の酵母ペプチド。
【請求項８】
酵母菌株を最大増殖期まで培養する段階と、
前記培養された酵母を３５℃〜７０℃の温度で自己消化させると同時に蛋白質分解酵素をさらに添加して酵母蛋白質を加水分解させる段階と、
前記加水分解されたものを遠心分離して上澄み液を取る段階と、を含むことを特徴とする抗ストレス機能、抗疲労機能、ＰＭＳ及び月経痛緩和機能及び神経栄養因子としての機能を有する酵母抽出物の製造方法。
【請求項９】
酵母菌株を最大増殖期まで培養する前に、酵母が死滅されない範囲内で高温、超音波、振動、ｐＨ変化などを加えつつ培養して生き残った菌株だけを選別することによって酵母菌株を改良する段階をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の酵母抽出物の製造方法。
【請求項１０】
酵母を自己消化させる前に酵母が死滅されない範囲内で高温、超音波、振動、ｐＨ変化などの適切な物理的または化学的ストレスを加えてストレスに耐えるための代謝物質の分泌を誘導する段階をさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の酵母抽出物の製造方法。
【請求項１１】
遠心分離して得た上澄み液を超微細ろ過用限外ろ過膜を使用してろ過して１０，０００Ｄａ以下の分子量を有するペプチドを取る段階を含むことを特徴とする請求項８ないし１０のうちいずれか１項に記載の抗ストレス機能、抗疲労機能、ＰＭＳ及び月経痛緩和機能及び神経栄養因子としての機能を有する酵母ペプチドの製造方法。
【請求項１２】
遠心分離して得た上澄み液を活性炭と共に水に入れて攪拌した後加圧殺菌する段階と、このように殺菌されたものを減圧ろ過して無色に精製する段階と、を含むことを特徴とする請求項８ないし１０のうちいずれか１項に記載の抗ストレス性、抗疲労性、ＰＭＳ及び月経痛緩和機能を有する神経栄養性機能性飲料の製造方法。
【請求項１３】
請求項１ないし４のうちいずれか１項による酵母抽出物または請求項５ないし７のうちいずれか１項による酵母ペプチドを有効成分として含むことを特徴とする抗ストレス製剤。
【請求項１４】
神経安定、緊張緩和、不安除去または睡眠補助の活性を有することを特徴とする請求項１３に記載の抗ストレス製剤。
【請求項１５】
請求項１ないし４のうちいずれか１項による酵母抽出物または請求項５ないし７のうちいずれか１項による酵母ペプチドを有効成分として含むことを特徴とする抗疲労製剤。
【請求項１６】
請求項１ないし４のうちいずれか１項による酵母抽出物または請求項５ないし７のうちいずれか１項による酵母ペプチドを有効成分として含むことを特徴とする神経栄養剤。
【請求項１７】
請求項１ないし４のうちいずれか１項による酵母抽出物または請求項５ないし７のうちいずれか１項による酵母ペプチドを有効成分として含むことを特徴とする月経前期症候群及び月経痛緩和組成物。
【請求項１８】
前記組成物は酵母抽出物または酵母ペプチドを乾燥させた粉末１０ないし９０重量％、キトサン５ないし８０重量％、及び生薬材料粉末５ないし８０重量％を含むことを特徴とする請求項１７に記載の月経前期症候群及び月経痛緩和用組成物。
【請求項１９】
前記キトサンは、分子量３００，０００Ｄａ以上の水溶性高分子キトサンであることを特徴とする請求項１８に記載の月経前期症候群及び月経痛緩和用組成物。
【請求項２０】
前記生薬材料は、当帰、丹蔘、鬱金、蓬朮、ハッカ、甘草、ショウガ、天麻、白朮、センキュウ（Ｃｎｉｄｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、桂皮及び高麗人参で構成される群から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項１８に記載の月経前期症候群及び月経痛緩和用組成物。
【請求項２１】
請求項１ないし４のうちいずれか１項による酵母抽出物または請求項５ないし７のうちいずれか１項による酵母ペプチドを含むことを特徴とする抗ストレス性、抗疲労性、月経前期症候群及び月経痛緩和機能を有する神経栄養性機能性飲料。
【請求項２２】
酵母抽出物または酵母ペプチド０．１ないし１０重量％、甘味剤及び酸味剤など通常の飲料添加物１０ないし２５重量％、残りの重量％の水を含むことを特徴とする請求項２１に記載の抗ストレス性、抗疲労性、月経前期症候群及び月経痛緩和機能を有する神経機能性飲料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は抗ストレス機能、抗疲労機能、月経前期症候群及び月経痛緩和機能及び天然脳神経栄養因子としての機能を有する酵母由来機能性ペプチド及びその製造方法に係り、より詳細には、蛋白質系健康機能性食品素材として許可されている酵母を加水分解して精製することによって得られる抗ストレス機能、抗疲労機能、月経前期症候群及び月経痛緩和機能及び脳神経栄養剤としての機能を有する機能性ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
現代人は色々なストレスの中で生きているが、このようなストレスにより誘発された多様な感情状態は体内の自律神経系、ホルモン及び免疫機能の変化を起こして健康に影響を及ぼす。
【０００３】
一般的にストレスを受ければ自律神経系のうち交感神経の興奮によりホルモンが分泌されるが、特にアドレナリンの分泌が促進される（Ｃｏｒｒｏｄｉ Ｈ，Ｆｕｘｅ Ｋ，Ｈｏｋｆｅｌｔ Ｔ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｔｒｅｓｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｏｎｏａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｎｅｕｒｏｎ，Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ７：１０８−１１２，１９６８）。人体はこのような不均衡を阻止するために、すなわち、このような継続的な交感神経の興奮を阻止するために自然に副交感神経を興奮させてアセチルコリンを分泌して全体的な自律神経系の均衡を維持しようと努力する。しかし、ストレスを受け続ければ、からだが疲れて交感神経系に蓄積されたストレスエネルギーをこれ以上効果的に管理できなくなって、結局自律神経系の均衡を破るようになり、細胞及び体液免疫機転に直接的な影響を及ぼして免疫機能が落ちる機能的疾患が発生し、このような状態が持続すれば結局器質的に異常が生じる器質的疾患が発生する。
【０００４】
これによって多くの疾患が誘発されるが、このような疾患には消化性潰瘍、高血圧、癌、糖尿病、過敏性大膓炎、心臓病、気管支喘息、緊張性頭痛、関節炎、神経皮膚炎などをあげることができる。また典型的な症状は、疲れやすさ、日常生活でのいらいら、熟睡不能、寒気、発汗、肩こり、圧迫感、喉に何かあるような感じ、目眩い、男性の性欲減退、女性の不妊などである。
【０００５】
従来、前記のようなストレス性疾患の症状を改善させるために、不安緩和剤としてジアゼパム、メプロバメート、メチルペンチノール、及びエチフォキシン；神経弛緩剤としてクロロプロマジン、プロメタジン、及びアザペロン；ベータ−アドレナリン性遮断剤としてブニトロール；抗憂鬱剤として単独で使われたり神経弛緩剤と共に使われる三重環、四重環化合物；精神興奮剤としてカフェイン、アンフェタミンまたはこれらの誘導体；そして鎮静剤及び催眠剤としてフェノバルビタルとコデインとの調合物などの向精神性薬物が従来使用されている（Ｐｏｌｄｉｎｇｅｒ，Ｗ．，Ｓｃｈｍｉｄｌｉｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｗｉｄｅｒ，Ｆ．，Ｉｎｄｅｘ Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｒｕｍ，Ｈ．Ｈｕｂｅｒ，Ｂｅｒｎ）。しかし、これら向精神性剤はストレスの原因に対する病理作用なしに優勢な症状的薬物治療だけを示す短所を有し、これら薬剤はストレスにより引き起こされる慢性損傷を減少させずに、異化作用性再生を通じてストレスに対抗する作用を果たせず、身体適応の正常な（抗ストレス）反応を変形させて多数の逆反応を引き起こす。また、不安緩和剤及び精神興奮剤（アンフェタミン及びカフェインタイプの）はたびたび後天性耐性の影響を受けて薬の量が増加する必要があり、重要な逆反応として精神活性物質に依存してしまう問題点が深刻に存在する。
【０００６】
したがって、ストレス、すなわち自律神経系の不均衡を解消するために、様々な角度から解決方案が摸索されているが、その内容は以下の通りである。すなわち、ストレスは医学的に人体の平衡状態を破る有害な刺激であり、この刺激に対応するために現れる生体の反応には神経伝達物質が関与するが、重要な神経伝達物質には前記のように脂質コレステロールから派生されたアセチルコリンがある。アセチルコリンは弛緩を促進する神経伝達物質であって、自律神経系の副交感神経で発生する。それ以外にも、いままで見つけられた神経伝達物質は約５０種類がある。
【０００７】
このような神経伝達物質は必ず受容体という相補的な対象があって初めてその機能を尽くすことができるが、神経伝達物質が多くても神経伝達物質に相補的に結合されて作用するペプチド構造の受容体がなければその機能を尽くせない。アセチルコリンと結合されるムスカリン性受容体は結合に重要な役割をするアスパラギン酸及びグルタミン酸残基とこれを取り囲む疎水性アミノ酸群を含むペプチドよりなっている（Ｇｅａｒｉｅｎ １９９９）。それで、このようなペプチドを含む神経栄養因子が体内に供給されれば、神経細胞に栄養が供給されて神経細胞の成長が誘導されて、副作用なしにパーキンソン病のような各種神経疾患を治すことができ、合わせて十分な神経伝達物質及び神経伝達物質の受容体生成促進を通じて過度なストレス（刺激）による神経衝撃をよく吸収、伝達して過負荷を防止することによってストレスによる疾患を治せる。したがって、神経系強化のために神経伝達物質をたくさん摂取することも重要であるが、神経伝達物質の受容体生成に役に立つペプチド、すなわち、神経栄養因子をたくさん摂取することも重要である。また、受容体ペプチドは、神経伝達物質本体の量に依存して反応するため、過量投与による副作用は発生しない。
【０００８】
ここで脳神経栄養因子とは、脳と脊髄などの神経組織に栄養物質として作用して神経細胞または神経膠細胞の成長に役に立つ栄養物質として作用する因子を意味する。かつては脳神経細胞は成長しないと信じられていたが、脳に特定栄養分を供給することによって脳神経細胞が成長、分化を維持するという事実が明らかになるにつれて神経栄養物質の重要性が強調され、これにより神経細胞に栄養を供給して神経細胞の成長及び分化を維持調節することを促進するニューロトロフィンが胎児や動物の脳で発見されてそれらのペプチド配列が明らかになった。このように神経組織の成長または増殖を刺激させて神経または神経膠細胞の生存を促進して分化を維持する、ペプチドよりなる神経栄養因子は神経系疾患を解決できる重要な要素であって、神経細胞退化及び神経退化性疾病で発生する機能喪失症状、例えば、パーキンソン病やアルツハイマー病を治療するのに有用に使われると明らかになった（Ｖａｒｏｎ＆Ｂｕｎｇｅ １９９７．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １：３２７：Ｔｈｏｅｎｅｎ＆Ｅｄｇａｒ １９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：２３８参照）。
【０００９】
いままで見つけられた重要な神経栄養因子または向神経性因子には、神経成長因子（ＮＧＦ，ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、脳−由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ，ｂｒａｉｎ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、神経膠細胞−由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ，ｇｌｉａｌｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）及びニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）等があり、これらも蛋白質であってペプチドよりなっている。しかし、新しい神経栄養因子を発見するためには人間の脳や胎児の脳を利用しなければならないが、その栄養因子の量が極微量で検出が難しくて、かつ死亡後に摘出しなければならないために倫理的な問題があり、いままで見つけられた神経栄養因子は少数に過ぎない。そのため、いままで見つけられた神経栄養因子よりさらに多種の神経栄養物質が存在すると推測される。
【００１０】
また、今までは神経栄養因子または神経伝達物質をペプチド合成器やＰＣＲ増幅を通じる遺伝子再組合わせ方法を利用して合成ペプチドや再組合わせペプチドの形態で人為的に製造してきたが、これらは高コストかつ安全性などの問題で商業的に利用し難く、これらの大部分は分子量３０，０００ダルトン以上の巨大分子であって血液脳関門を通過できないために経口投与では脳神経細胞に到達できず、必ず脳に直接注射方式で注入しなければならない短所がある（メディカルリポート１９９８，１，２月号）。
【００１１】
したがって、このような遺伝子再組合わせ方法などの複雑な工程を使用せずに、本発明のように食品等級の酵母から酵母抽出物や酵母ペプチドを製造して比較的少量服用でも人体内の神経系に作用して抗ストレス、抗不安、熟睡誘導などの神経生理活性作用を示し、ストレス抑制を通じた抗疲労効果などを示すならば、これは遺伝子再組合わせを利用して発見された既存の神経栄養因子（ニューロトロフィン、ＮＴ−３、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ等）に比べて商業的有用性面でも優秀であり、遺伝子変異体のような安全性の問題ももたらさない。
【００１２】
酵母は人体に無害なＧＲＡＳ級として認定され、その５０％以上が良質の蛋白質と多量のミネラル、ビタミンＢ群などよりなっていて、酒類や製パン産業用以外にもいろいろな有用物質である蛋白質、核酸、酵素、脂質、ビタミン、ミネラルなどの原料として使われており（Ｒｏｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｏｏｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，２２５，１９９２）、酵母の自己消化酵素とその他の蛋白分解酵素とにより加水分解されて生産される酵母抽出物は微生物発酵培地、調味料、健康食品などの原料として使われてきた（Ｂｉｏｉｎｄｕｓｔｒｙ，１４，５３，１９９７）。しかし、いまだ酵母を加水分解して得た酵母抽出物や酵母由来ペプチド等の機能、および抗ストレス及び脳神経栄養剤（天然神経栄養因子）としての特定用途の使用を実験により測定した報告は無い。また、酵母由来のペプチドを使用した、抗ストレス製剤や抗不安製剤、睡眠補助剤の生産も開示されていない。
【００１３】
さらに、ストレスの症状と類似した症状を示す月経前期症候群や月経痛に対する酵母抽出物の効果も知られていない。
【００１４】
月経前期症候群（ＰＭＳ）とは、女性の月経周期と係り、可妊期女性に排卵後の月経周期間に現れる肉体的かつ精神的異常現象をいう。肉体的症状には腹痛、腰痛、骨盤痛、腹部膨満、下痢、便泌、乳房のシコリなどが現れ、精神的症状には不安、愚痴、憂鬱症、不眠、疲労、集中力喪失、自殺衝動などが現れる。このような症状は一種のストレスの形態と似ていて、女性人口の７０％がこのような症状を有し、２０％は深刻な症状を有していてこれによる女性の活動損失により引き起こされる社会、経済的損失も非常に大きい。
【００１５】
また月経痛は、ＰＭＳと共に大部分の女性が体験するものであって、月経期間あるいは月経前後に軽くまたは激しく現れる下腹部痛みまたは腰痛をいう。月経痛は可妊女性の約５０％で現れるとてもありふれた婦人科疾患の一つである。月経痛は主に若い女性が経験するものであって初経後１〜２年内に現れることが普通であるが、激しい場合は４０代までも持続する。このうち約１０％は毎月１〜３日間日常生活ができないほど痛みを訴えるという。韓国の慶煕医療院漢方病院が調査した結果、月経時に腹痛と腰痛、さらには頭痛などの痛みを訴える女性は４７％、食欲不振と消化不良などの胃腸障害１３％、不快感を感じる女性は８％に現れた。特に女子中高生は６３２人のうち約７０％が生理痛を訴えて約５０％はとても激しい痛みを訴えた。女学生の痛みがさらに激しいことは過度な学業及び受験恐怖が原因であると分析された。しかし、６６％が我慢して２８％は鎮痛剤で解決して９０％以上が根本的な治療をしていないと調査された。
【００１６】
ＰＭＳや月経痛の正確な原因については相当な期間多くの学者が研究してきたが、まだ正確な原因は明らかになっていない状態である。しかし、ＰＭＳや月経痛が月経周期と関連されているという事実から内分泌ホルモンの不均衡と深い関係があるといえる。
【００１７】
ＰＭＳ及び月経痛の原因についてはいろいろな理論があるが、その中には、プロゲステロン欠乏が原因であるという理論、エストロゲン及びアンドロゲンの過剰分泌が原因であるという理論、痛み誘発物質であるプロスタグランジンの過剰分泌が原因であるという理論、そしてビタミンＢ複合体または必須脂肪酸などの栄養欠乏がその原因であるという理論などがあるが、一般的に上記の要因が複合的に作用したり、そこに環境的な要因が加えられてＰＭＳ及び月経痛が発生すると考えられている。
【００１８】
前記理論のうち、最も有力な理論であるプロスタグランジンの過剰分泌によってＰＭＳや月経痛が発生するという理論は、月経周期による女性ホルモンの分泌において、黄体形成ホルモン（プロゲステロン）の分泌が中止すれば痛み誘発物質であるプロスタグランジンが分泌されて子宮筋がひどく縮少されて局所貧血がおきて痛みを感じるということである。したがって、このような痛みやいろいろなＰＭＳ症状を抑制するために次のような方法が使われている。
【００１９】
最も広く使われている方法は、アスピリン、イブプロフェンなどを使用したプロスタグランジンの生成抑制を通じた痛み緩和方法であり、他の方法はベンゾジアゼピンのような抗不安、抗憂鬱症製剤を使用する方法であり、さらに他の方法は月経周期の黄体形成段階でプロゲステロンを投与する方法である。
【００２０】
またさらに他の治療法には、大韓民国特許第０１７１４０８号公報で開示されたメラトニン（Ｎ−アセチル−５−メトキシトリプタミン）を投与する方法、そして大韓民国公開特許公報特２００１−００２４４６２号公報で公開されたセロトニン（５−ヒドロキシトリプタミン）を投与する方法などがある。
【００２１】
前記方法のうちプロゲステロン、メラトニン、セロトニンのようなホルモンや神経伝達物質を黄体形成段階中に投与する方法は、ＰＭＳや月経痛だけでなく全般的な痛み緩和そしてストレス、慢性疲労、憂鬱症などを改善することと知られている。
【００２２】
しかし、前記の方法はホルモンやメラトニン、セロトニンを直接投与するために、その安全性を１００％確信できず、製造コストが高くて容易に常時服用できないという短所があった。
【００２３】
したがって、本発明者は酵母が成長培地の環境によって嫌気的または好気的に反応して環境がよくない時には成長を中止して、異型接合などを通じて外部の劣悪な環境に対処するなど他の微生物とは違って外部の影響に敏感に対応する機能を有しているという点と、あらゆる有機体はストレスを初めて知覚すればストレスに対抗して警告反応を起こして身体資源を動員する生理的覚醒反応を現すが、ストレスが続けば有機体は抵抗段階に入ってストレスに対する対応努力を行うことによって生理的変化は安定化する（Ｓｅｙｌｅ，１９５６）という事実とに着眼して、酵母を最大増殖期まで増殖させた後、酵母が死滅しない範囲内で正常的な成長活動ができない範囲の適切な物理的または化学的ストレス、すなわち、高温、超音波または振動、ｐＨ変化などを成長培地に加えて抗ストレス物質（蛋白質、酵素）を多量生成、分泌させた後、酵母を自己消化や蛋白分解酵素により加水分解して得た酵母抽出物及び、これを限外ろ過膜で精製して得た酵母由来ペプチドが抗ストレス製剤や抗不安製剤、睡眠補助剤などの自律神経疾患治療及び予防剤、そしてストレスの形態と類似した症状を示すＰＭＳ及び月経痛緩和剤、及び脳神経栄養剤（天然神経栄養因子）としての機能があることを新しく見つけて本発明を完成するようになった。
【非特許文献１】タスクフォース オブ ザ ヨーロピアン ソサイエティ オブ カーディオロジー アンド ザ ノースアメリカン ソサイエティ オブ ペーシング アンド エレクトロフィジオロジー（Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｐａｃｉｎｇ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ）著 「ハート レート ヴァリアビリティ スタンダーズ オブ メジャーメント、フィジオロジカル インタープリテーション、アンド クリニカル ユース（Ｈｅａｒｔ ｒａｔｅ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｏｆ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ）」．１９９６年回報９３、ｐ．１０４３−１０６５．
【非特許文献２】アイラクシネン、ケーイー、イリタロ、エー、ニーメラ、エムジェイ、ターヴァナイネン、ケーユー、フイクリ（Ａｉｒａｋｓｉｎｅｎ，Ｋ．Ｅ．，Ｙｌｉｔａｌｏ，Ａ．，Ｎｉｅｍｅｌａ，Ｍ．Ｊ．，Ｔａｈｖａｎａｉｎｅｎ，Ｋ．Ｕ．，ａｎｄ Ｈｕｉｋｕｒｉ）著「エッチ ブイ ハート レート ヴァリアビリティ アンド オカーランス オブ ヴェントリキュラー エイリズミアス デュアリング バルーン オクルージョン オブ ア メジャー コロナリー アーテリー（Ｈ．Ｖ．Ｈｅａｒｔ ｒａｔｅ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｒｒｈｙｔｈｍｉａｓ ｄｕｒｉｎｇ ｂａｌｌｏｏｎ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｍａｊｏｒ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｒｔｅｒｙ）」．１９９９年、アム ジェイ カーヂオール（Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ）８３巻、ｐ．１０００−１００５
【非特許文献３】ブレックマン アイ アイ、ダーディモフ アイ ブイ （Ｂｒｅｋｈｍａｎ Ｉ．Ｉ．，Ｄａｒｄｙｍｏｖ Ｉ．Ｖ．）著「ロイディア（Ｌｌｏｙｄｉａ）」３２巻、１９６９年，ｐ．４６−５１
【非特許文献４】マツモト ケイ、イシハラ ケイ、タナカ ケイ、イノウエ ケイ、フシキ ティー（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｋ．，Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｋ．，Ｔａｎａｋａ Ｋ．，Ｉｎｏｕｅ Ｋ．，Ｆｕｓｈｉｋｉ Ｔ．）著「ジャーナル オブ アプライド フィジオロジー（Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．）」８１巻，１９９６年、ｐ．１８４３−１８４９
【非特許文献５】ホン ティー、マツモト ティー、キヨハラ エッチ、ヤマダ エッチ（Ｈｏｎｇ Ｔ．，Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ Ｔ．，Ｋｉｙｏｈａｒａ Ｈ．，Ｙａｍａｄａ Ｈ．）著「フィトメディスン（Ｐｈｙｔｏｍｅｄｉｃｉｎｅ）」５巻，１９９８年、ｐ．３５３−３６０
【非特許文献６】パゲ ベ、パゲ エム、ノエル セ（Ｐａｇe Ｂ．，Ｐａｇe Ｍ．，Ｎｏeｌ Ｃ．）著「インターナショナル ジャーナル オブ オンコロジー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．）」３巻，１９９３年、ｐ．４７３−４７６
【非特許文献７】ヘルシュコヴィッツ ベー ハー、ホルデン ハー テー、 ベランティ ヨット アー、ガファー アー（Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ Ｂ．Ｈ．，Ｈｏｌｄｅｎ Ｈ．Ｔ．，Ｂｅｌｌａｎｔｉ Ｊ．Ａ．，Ｇｈａｆｆａｒ Ａ．）編「インダクション アンド コレクション オブ ペリトニール エクスウデーツ マクロファージズ（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ Ｅｘｕｄａｔｅｓ Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）」１９８１年ニューヨーク（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）マルセル デッカー社（ Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ Ｉｎｃ．）発行
【非特許文献８】ヒラノ ティー、タガ ティー、ナカノ エヌ、ヤスカワ ケー、カシワムラ エス、シミズ ケー、マカジマ ケー、ピュン ケー エッチ、キシモト ティー（Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．，Ｔａｇａ Ｔ．，Ｎａｋａｎｏ Ｎ．，Ｙａｓｕｋａｗａ Ｋ，Ｋａｓｈｉｗａｍｕｒａ Ｓ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｋ．，Ｍａｋａｊｉｍａ Ｋ．，ＰｙｕｎＫ−Ｈ．、Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ．）著「プロシーディングス オブ ナショナル アカデミー オブサイエンス ユーエスエー（Ｐ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）」８２巻、１９８５年，ｐ．５４９０−５４９４
【非特許文献９】ウォン ジー ジー、ウィテック−ジャヌッティ ジェイ エス、テンプル ピー エー、クリッツ エル、フェレンツ ツェー、ヘヴィック エル エム、クラーク エス シー、イケブチ ケー、オガワ エム（Ｗｏｎｇ Ｇ．Ｇ．，Ｗｉｔｅｋ−Ｇｉａｎｎｏｕｔｉｉ Ｊ．Ｓ．，Ｔｅｍｐｌｅ Ｐ．Ａ．，Ｋｒｉｚ Ｒ．，Ｆｅｒｅｎｚ Ｃ．，Ｈｅｗｉｃｋ Ｒ．Ｍ．，Ｃｌａｒｋ Ｓ．Ｃ．，Ｉｋｅｂｕｃｈｉ Ｋ．，Ｏｇａｗａ Ｍ．）著「ジャーナル オブ イミュノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．）」１４０巻，１９８８年、ｐ．３０４０−３０４４
【非特許文献１０】オカノ エイ、スズキ シー、タカツキ エフ、アキヤマ ワイ、コイケ ケー、オザワ ケー、ヒラノ ティー、キシモト ティー、ナカハラ ティー、アサノ エス（Ｏｋａｎｏ Ａ．，Ｓｕｚｕｋｉ Ｃ．，Ｔａｋａｔｓｕｋｉ Ｆ．，Ａｋｉｙａｍａ Ｙ．，Ｋｏｉｋｅ Ｋ．，Ｏｚａｗａ Ｋ．，Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ．，Ｎａｋａｈａｒａ Ｔ．，Ａｓａｎｏ Ｓ．）著「トランスプランテーション（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」４８巻、１９８９年、ｐ．４９５−４９８
【非特許文献１１】アダムス ディー オー、ハミルトン ティー エー（Ａｄａｍｓ Ｄ．Ｏ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｔ．Ａ．）著「アニュアル レビュー オブ イミュノロジー（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」２巻，１９８４年、ｐ．２８３−３１８
【非特許文献１２】フェラン エム エー、シュライベル エル デー（Ｆａｒｒａｎ Ｍ．Ａ．，Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ Ｒ．Ｄ．）著「アニュアル レビュー オブ イミュノロジー（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」２２巻、１９９３年，ｐ．５７１−６１１
【非特許文献１３】カオ エッチ、ヴォルフ エル ゲー、メルツェル エム エス、クローフォード アール エム（Ｃａｏ Ｈ．，Ｗｏｌｆｆ Ｒ．Ｇ．，Ｍｅｌｔｚｅｒ Ｍ．Ｓ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ Ｒ．Ｍ．）著「ジャーナル オブ イミュノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」１４３，巻、１９８９年、ｐ．３５２４−３５３１
【非特許文献１４】リレス ダブリュー シー、ファン フォルフィス ヴェー ツェー（Ｌｉｌｅｓ Ｗ．Ｃ．，Ｖａｎ Ｖｏｏｒｈｉｓ Ｗ．Ｃ．）著「ジャーナル オブ インフェクシャス ディジーズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）」１７２巻，１９９５年、ｐ．１５７３−１５８０
【非特許文献１５】モスマン ティー、コフマン アール（Ｍｏｓｍａｎｎ Ｔ．，Ｃｏｆｆｍａｎ Ｒ．）著「アニュアル レビュー オブ イミュノロジー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）」７巻，１９８９年、ｐ．１４５−１７３
【非特許文献１６】ロッツ エム、ジリック エフ、カブリディス ピー、ツォーカス シー、ヒラノ ティー、キシモト ティー、カーソン ディー エー（Ｌｏｔｚ Ｍ．，Ｊｉｒｉｋ Ｆ．，Ｋａｂｏｕｒｉｄｉｓ Ｐ．，Ｔｓｏｕｋａｓ Ｃ．，Ｈｉｒａｎｏ Ｔ．，Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｔ．，Ｃａｒｓｏｎ Ｄ．Ａ．）著「ジャーナル オブ エクスペリメンタル メディスン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）」１６７巻，１９８８年、ｐ．１２５３−１２５８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
本発明では酵母を加水分解することによって得られる抗ストレス、抗疲労、ＰＭＳ及び月経痛緩和剤、及び天然脳神経栄養因子としての機能を有する新しい酵母抽出物及び機能性ペプチドを提供することを目的とする。
【００２５】
また、本発明ではストレスによる人体の病気を治して自律神経系の均衡を維持するために、前記酵母抽出物または酵母ペプチドを有効成分として含む複合天然神経栄養因子を提供することを目的とする。
【００２６】
また、本発明ではストレスによって発生する自律神経系疾患を含む神経性疾患の治療のために、前記酵母抽出物または酵母ペプチドを有効成分として含む抗ストレス、抗不安、神経安定、睡眠補助活性を有する抗ストレス剤を提供することを目的とする。
【００２７】
また、本発明ではストレスと密接な関係がある、運動筋肉疲労に対する抗疲労効果を有する酵母抽出物または酵母ペプチドを有効成分として含む疲労回復製剤を提供することを目的とする。
【００２８】
また、本発明ではストレス及び慢性疲労の症状と類似した症状を示すＰＭＳ及び月経痛の緩和効果を有する酵母抽出物または酵母ペプチドを有効成分として含む疲労回復製剤を提供することを目的とする。
【００２９】
また、本発明では、重篤な副作用を有する合成薬由来ではない、安全性が立証された自然由来物質から天然抗ストレス性物質を抽出してこれを含む機能性飲料を提供することによって、容易かつ安全にストレス緩和物質を摂取可能にすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
前記のような目的を達成するために、本発明は酵母から抽出されたことを特徴とする抗ストレス機能、抗疲労機能、ＰＭＳ及び月経痛緩和機能及び神経栄養因子としての機能を有する酵母抽出物を提供する。
【００３１】
本発明の酵母抽出物において、酵母は良質の蛋白質とミネラル、ビタミンＢ群を多量含有しており、その酵母を公知の一般的な抽出方法、例えば自己消化酵素または蛋白質分解酵素を使用して抽出できる。合わせて市販されている既存の酵母抽出物にも本発明による抗ストレス製剤、抗疲労製剤、ＰＭＳ及び月経痛緩和剤及び脳神経栄養剤としての機能があると明らかになった。
【００３２】
また、本発明は酵母を３５℃〜７０℃、望ましくは５０℃〜６０℃の温度で自己消化させたことを特徴とする抗ストレス機能、抗疲労機能、ＰＭＳ及び月経痛緩和機能及び神経栄養因子としての機能を有する酵母抽出物を提供する。
【００３３】
本発明の酵母抽出物は３５℃以上の高温で自己消化させることだけでも有効な抗ストレス活性を有する酵母抽出物を提供できるが、これは高温を加えることによって酵母菌にストレスを与える効果を得、酵母菌は自己消化と同時にストレスに抵抗するためにストレス抵抗物質を分泌するからであると考えられる。さらに、ここに超音波や振動などのストレスを与えることによってストレスに対する抵抗力が強くなった改良菌株を選抜し、この改良菌株に再びストレスを加えてストレス抵抗物質をさらに活発に生産させることによってさらに優秀な抗ストレス活性を有する抽出物を製造できる。
【００３４】
また、本発明は酵母を上記のように自己消化させると同時にまたは自己消化させた後に、蛋白質分解酵素で蛋白質を加水分解させたことを特徴とする抗ストレス機能、抗疲労機能、ＰＭＳ及び月経痛緩和機能及び神経栄養因子としての機能を有する酵母抽出物を提供する。
【００３５】
また、本発明は酵母を上記のように加水分解させたものを遠心分離して上澄み液だけを取ったことを特徴とする抗ストレス機能、抗疲労機能、ＰＭＳ及び月経痛緩和機能及び神経栄養因子としての機能を有する酵母抽出物を提供する。
【００３６】
また、本発明は上記のように遠心分離した上澄み液を限外ろ過して１０，０００以下の分子量だけを取ったことを特徴とする抗ストレス機能、抗疲労機能、ＰＭＳ及び月経痛緩和機能及び神経栄養因子としての機能を有する酵母ペプチドを提供する。
【００３７】
本発明の酵母ペプチドにおいて、分子量１０，０００を境にしたのは、一般的に分子量１０，０００以下のものをペプチドといい、このペプチドが機能性食品素材として多様な生理活性を表す生体調節機能に関与するためであり（２０００新技術動向調査報告書、機能性食品、大韓民国特許庁ｐ４１）、特に脳血管保護のために分子量１５，０００以上の巨大分子は脳血管を通過させない人体内の血液脳関門を容易に通過させるためである。
【００３８】
また、本発明はグルタミン酸及びアスパラギン酸が１５〜２５モル％含まれたことを特徴とする抗ストレス機能、抗疲労機能、ＰＭＳ及び月経痛緩和機能及び神経栄養因子としての機能を有する酵母ペプチドを提供する。
【００３９】
本発明の酵母ペプチドは、アセチルコリンが結合されるムスカリン性受容体を形成できるアミノ酸であるグルタミン酸及びアスパラギン酸を豊富に含んでいるために、ＰＭＳ及び月経痛を含む自律神経系の不均衡によるストレス性疾患に大きい効果がある。
【００４０】
また、本発明は酵母菌株を最大増殖期まで培養する段階と、前記培養された酵母を３５℃〜７０℃の温度で自己消化させると同時に蛋白質分解酵素をさらに添加して酵母蛋白質を加水分解させる段階と、前記加水分解されたものを遠心分離して上澄み液だけを分離して取る段階と、を含むことを特徴とする抗ストレス機能、抗疲労機能、ＰＭＳ及び月経痛緩和機能及び神経栄養因子としての機能を有する酵母抽出物の製造方法を提供する。
【００４１】
本発明の酵母抽出物の製造方法は、望ましくは酵母を最大増殖期まで培養する前に酵母が死滅されない範囲内で高温、超音波、振動、ｐＨ変化などを加えつつ培養して生き残った菌株だけを選別することによって酵母菌株を改良する段階をさらに含むことを特徴とする。
【００４２】
また、本発明の酵母抽出物の製造方法は、望ましくは酵母を自己消化させる前に酵母が死滅されない範囲内で高温、超音波、振動、ｐＨ変化などの適切な物理的または化学的ストレスを加えてストレスに耐えるための代謝物質の分泌を誘導する段階をさらに含むことを特徴とする。
【００４３】
これは、あらゆる生物はストレスを最初に知覚した時に刺激に対抗する警告反応を示し、ストレスが除去されなければストレスに対し活発に抵抗し、ホメオスタシスのための生理学的変化を引き起こす。（Ｓｅｙｌｅ、１９５６）つまり、酵母がストレスを受ければそのストレスに対抗するために各種酵素を分泌するが、その分泌された酵素は低分子量の蛋白質であって、ストレスを受ける人体に有益な神経生理活性製剤として作用するというのに着眼したものである。
【００４４】
本発明の酵母抽出物の製造方法において、酵母の抗ストレス物質の生成、分泌を誘導するために酵母に加える物理的または化学的ストレスとしては酵母が死滅されない範囲内で成長適正温度より高温の３５℃ないし４５℃の高温、超音波または振動、ｐＨ変化などの刺激をあげられる。
【００４５】
本発明の酵母抽出物の製造方法は、より望ましくは酵母菌株に超音波及び振動を加えつつ培養して生き残った菌株だけを選別する菌株改良段階と、前記選別された改良菌株をＹＭ培地に接種して２２℃〜２５℃で対数成長期まで培養した後、遠心分離して菌体を集めた後１％ペプトン緩衝液で希釈する段階と、成長適正温度より高温の３５℃ないし４５℃の高温度及び超音波と振動のストレスを８時間加えて酵母をしてストレスを耐えるための代謝物質を生成分泌させる段階と、５０℃ないし６０℃の温度で自己消化させると同時に蛋白質分解酵素をさらに添加して酵母蛋白質を加水分解させる段階と、上記の加水分解されたものを遠心分離して上澄み液だけを分離して取る段階と、を含むことを特徴とする。
【００４６】
また、本発明は前記酵母抽出物の製造方法で遠心分離して取った上澄み液を限外ろ過して１０，０００以下の分子量を有するペプチドだけを取る段階を含むことを特徴とする抗ストレス機能、抗疲労機能、ＰＭＳ及び月経痛緩和機能及び神経栄養因子としての機能を有する酵母ペプチドの製造方法を提供する。
【００４７】
本発明の酵母ペプチドの製造方法は、前記遠心分離して取った上澄み液をカットオフ１０，０００の超微細ろ過用限外ろ過膜を使用してろ過して１０，０００以下の低分子量のペプチドだけを取ることによって抽出物の効能を落とす他の物質を除去して、人体の吸収がさらに容易であって生体利用率が高い低分子だけを分離精製するだけでなく、特に血液脳関門を容易に通過可能にする。
【００４８】
本発明の酵母抽出物または酵母ペプチドの製造方法は、上記の方法により製造された酵母抽出物または酵母ペプチドを乾燥させて粉末状態にする段階をさらに含むこともできる。
【００４９】
また、本発明は前記の製造方法により製造された酵母抽出物または酵母ペプチドを有効成分として含むことを特徴とする抗ストレス製剤を提供する。
【００５０】
本発明の抗ストレス性製剤は神経安定、緊張緩和、不安除去または睡眠補助などの活性及びＰＭＳ及び月経痛緩和効果を有することを特徴とする。
【００５１】
また、本発明は前記製造方法により製造された酵母抽出物または酵母ペプチドを有効成分として含むことを特徴とする抗疲労製剤（疲労回復剤）を提供する。
【００５２】
また、本発明は前記製造方法により製造された酵母抽出物または酵母ペプチドを有効成分として含むことを特徴とする神経栄養剤（神経栄養因子）を提供する。
【００５３】
また、本発明は前記製造方法により製造された酵母抽出物または酵母ペプチドを有効成分として含むことを特徴とするＰＭＳ及び月経痛緩和組成物を提供する。
【００５４】
また本発明は前記製造方法により製造された酵母抽出物または酵母ペプチドを乾燥させた粉末１０ないし９０重量％、キトサン５ないし８０重量％、及び生薬材料粉末５ないし８０重量％を含むことを特徴とするＰＭＳ及び月経痛緩和用組成物を提供する。この時、キトサンは、分子量３００，０００以上の水溶性高分子キトサンであり、前記生薬材料は、当帰、丹蔘、鬱金、蓬朮、ハッカ、甘草、ショウガ、天麻、白朮、センキュウ（Ｃｎｉｄｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、桂皮及び高麗人参で構成される群から選択される一つ以上でありうる。
【００５５】
また、本発明は前記製造方法により製造された酵母抽出物または酵母ペプチドを含むことを特徴とする抗ストレス性、抗疲労性、ＰＭＳ及び月経痛緩和及び神経栄養性機能性飲料を提供する。
【００５６】
本発明の機能性飲料は安全性が立証された酵母菌にストレスを与えて抗ストレス物質を分泌させ、このように抗ストレス物質を含有するように作られた酵母抽出物または酵母ペプチドで飲料を製造することによって、安全で服用が容易であり、かつ神経安定、緊張緩和及び睡眠補助などの効果を有する抗ストレス性飲料を提供可能にする。
【００５７】
本発明の機能性飲料は、望ましくは酵母抽出物または酵母ペプチド０．１ないし１０重量％、甘味剤及び酸味剤など通常の飲料添加物１０ないし２５重量％、残りの重量％の水を含むことを特徴とする。本発明の機能性飲料において通常的な飲料添加物としては、液状果糖、砂糖、マルトデキストリン、ブドウ糖、クエン酸、ニコチン酸アミド、パントテン酸、安息香酸ナトリウム、風味剤、香味剤などが含まれ、望ましくは梅の実果汁などの果汁をさらに添加して飲料を製造できる。
【００５８】
また、本発明は酵母菌株を最大増殖期まで培養する段階と、前記培養された酵母を３５℃ないし７０℃の温度で自己消化させると同時に蛋白質分解酵素をさらに添加して酵母蛋白質を加水分解させる段階と、前記加水分解されたものを遠心分離して上澄み液だけを分離して取る段階と、前記上澄み液を活性炭と共に水に入れて攪拌した後加圧殺菌する段階と、このように殺菌されたものを減圧ろ過して無色に精製する段階と、を含むことを特徴とする抗ストレス性、抗疲労性、ＰＭＳ及び月経痛緩和及び神経栄養性機能性飲料の製造方法を提供する。
【００５９】
前記抗ストレス物質を含有する酵母抽出物を飲料製剤に作るためには、精製過程を経ることによって酵母特有の臭いを除去しなければならない。このための精製方法には、製造された酵母抽出物を活性炭と共に水と混ぜて攪拌させた後加圧殺菌してろ過する。これはアミノ酸が活性炭にほとんど吸着されない性質（宋ヒョンイク＆申ジュンヒョブ、現代醗酵工学、１９９８、２９３）を利用して脱色及び脱臭を目的に活性炭と混合したものである。
【００６０】
このようにろ過された飲料濃縮物を希釈して抗ストレス性、抗疲労性、ＰＭＳ及び月経痛緩和及び神経栄養性飲料を製造する。飲料は通常的な飲料の製造方法によって製造し、本発明の方法によって製造された酵母抽出物を含むかぎり特別に制限されない。
【００６１】
本発明の機能性飲料の製造方法は、望ましくは酵母が死滅されない範囲内の高温、超音波、振動、ｐＨ変化などを加えつつ培養して生き残った菌株だけを選別することによって酵母菌株を改良する段階と、酵母が死滅されない範囲内の高温、超音波、振動、ｐＨ変化などの適切な物理的または化学的ストレスを加えてストレスに耐えるための代謝物質の分泌を誘導する段階をさらに含むことができる。
【００６２】
本発明の機能性飲料の製造方法において、自己消化温度は５０℃ないし６０℃であることが望ましく、加圧殺菌は約１．５程度の気圧、１００℃ないし１２５℃の温度で１０ないし１５分間行なうことが望ましい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００６４】
自律神経系の不均衡、すなわち、ストレスによる継続的な交感神経の興奮により発生するいろいろな臓器の変化を正常に戻すためには、副交感神経の興奮伝達を円滑にして各臓器に及ぶ変化を正常に戻さなければならない。そのためにはシナプスでの神経伝達物質であるアセチルコリンがよく分泌されねばならず、シナプスでアセチルコリンが次の神経細胞によく伝えられるためにはアセチルコリン受容体が存在しなければならない。アセチルコリンは図１に示したようにムスカリン性受容体と結合する。したがって、シナプスでアセチルコリンがよく伝えられるためにはシナプスにムスカリン性受容体が多くなければならず、かつこのようなムスカリン受容体が多く作られねばならない。ムスカリン受容体は７つの分節よりなる蛋白質で構成されており、受容体には、ムスカリン性活性に重要な、アセチルコリンの４級アンモニウム塩と部位と結合できる陰イオン部位があると推測されている。前記陰イオン部位はアスパラギン酸及びグルタミン酸のような酸性アミノ酸残基に由来すると考えられている。（ガンゴンイル、１９９２、医薬化学入門１０：１３１参照）。
【００６５】
したがって、アセチルコリンの受容体であるムスカリン性受容体を形成できる原材料として使われるペプチド製剤のうちでもアスパラギン酸及びグルタミン酸の酸性アミノ酸の含量が豊富なアミノ酸組成を有するペプチド製剤は、人体においてムスカリン受容体の合成を円滑にして副交感神経のアセチルコリンの効率的な伝達に影響を与えることによって根本的にストレスによる交感神経の継続的な興奮による自律神経系の不均衡を均衡化させるために、ストレスによる精神及び身体の病気を根本的に予防治癒できる。
【００６６】
本発明者は酵母抽出物に上記のようにムスカリン性受容体を形成できるアミノ酸が豊富に含まれていることを明らかにし、これにより酵母抽出物が神経系の不均衡によるストレス性疾患に大きい効果があるという結論を下すことができた。
【００６７】
本発明の酵母抽出物は、下記の実施例４に示したように１８種類の多様なアミノ酸を含んでおり、特にアスパラギン酸及びグルタミン酸はその含量が非常に高いと示された。このアミノ酸らはいずれもマイナス電荷を帯びたＲ基を有しているアミノ酸である。このような結果は、副交感神経系を含むニューロンの神経伝達物質であるアセチルコリンの受容体であるムスカリン受容体に必ず必要なマイナス電荷を帯びたアミノ酸がたくさん含まれていて、アセチルコリン受容体を体内で合成しなければならない時に優秀な原材料として使われうるということを意味する。したがって、本発明の酵母抽出物はストレスを受けた時に興奮する感神経に均衡を合せる副交感神経の神経伝達を円滑にするのに役に立つために抗ストレス機能を有することができる。さらに、ストレスを緩和させる能力はもちろん、ストレスと類似した症状を示すＰＭＳ及び月経痛の緩和にも効果を奏する。
【００６８】
食品等級酵母は人体に無害なＧＲＡＳ級で認定されており５０％以上の良質の蛋白質と多量のミネラル、ビタミンＢ群などを含んでいて前記のような神経伝達物質またはその受容体の原料になるペプチドが豊富なだけでなく、特に酵母に入っているビタミンＢ群及びミネラルは一般的なエネルギー代謝だけでなく脳と神経細胞とを活性化させる作用をするが、ビタミンＢ６（ピリドキシン）はセロトニン、ドパミン、ノルエピネフリン、ＧＡＢＡ、タウリンのような神経伝達物質を合成するのに必須不可欠な栄養素であって、不足すれば焦燥かつ不安になり集中及び記憶力が落ち、ビタミンＢ１（チアミン）が欠乏すれば記憶力障害、無感覚、痴呆などコルサコフ症候群を起こし、Ｂ２は脳の成長に必要な補酵素として作用し、神経学的にとても重要な神経栄養因子として作用できる。
【００６９】
ＰＭＳを有している女性や月経痛が激しい女性の場合に、プロゲステロン欠乏やエストロゲン／プロゲステロンのホルモンの不均衡、塩分及び水分の停滞、プロスタグランジンの欠乏または過剰、プロラクチンの過剰、ビタミンＢ６（ピリドキシン）の欠乏、低血糖、セロトニン欠乏などが見られる。前記のような本発明の酵母抽出物は、各種アミノ酸及びビタミンＢ６をはじめとするビタミンＢ群とカルシウム、マグネシウムのようなミネラルが豊富に含まれているために、これら成分が人体内に吸収される時にホルモン均衡及び新陳代謝を迅速に活性化させてＰＭＳや月経痛を迅速に緩和させうることがわかる。
【００７０】
さらに、酵母には脳神経細胞の成長に重要な、抗酸化酵素の生成に必須不可欠なセレンが比較的多量存在するために、酵母はセレン補給源として優秀な食品である。セレンの欠乏は脳機能に障害を起こして鬱や不安を生じる。特に酵母はセレンを含むクロムなどのミネラルと有機態とのキレーティング結合をなしてミネラル強化酵母の形態として人体に容易に吸収されるミネラル補充源の役割もするが（米国特許第４，５３０，８４６号公報 １９８５．７．２３ セレン酵母製造方法）、このような事実からみれば、酵母は、酵母抽出物や酵母ペプチドの形態で優秀な脳神経栄養物質として作用して、抗ストレス、抗不安、神経安定、ストレスによる睡眠障害解消、疲労回復に優秀な効能を有する機能性食品素材及び天然ペプチド素材といえる。
【００７１】
また、本発明で生成される各種分泌物質は酵母の細胞壁を通じて分泌される物質であるために、酵母の細胞壁が天然メンブレンフィルタとして作用して細胞壁を通過できる程度に低分子量の蛋白質が多量生成されるが、これを摂取する場合に人体に存在する血液脳関門を容易に通過できて脳神経栄養物質として作用できる。
【００７２】
また、酵母は自己消化機能を有していて、酵母が成長できる条件（温度、ｐＨ等）から大きく離れた環境やあるいは栄養素のない飢餓状態に処すれば、自体酵素の作用により酵母の細胞質が加水分解されてこの時に連続的な酵素作用により細胞壁も共に破壊され、既に分解された色々な細胞質は破壊された細胞壁間を通じて細胞の外に湧出されて酵母の生体利用率を高めうる独特な特徴があるが、酵母を通じて低分子量の抗ストレス物質を多量生成させた後、酵母を自己消化させることによって酵母の内部に含まれている各種蛋白質とミネラル、ビタミンＢ群などが溶解されてさらに効率的な神経栄養物質として作用して抗ストレス効果を有する酵母ペプチドが得られる。
【００７３】
酵母抽出物が神経栄養物質として作用してストレス緩和、疲労回復に影響を及ぼすことができる理由は前記の通りであり、さらにＰＭＳ緩和及び月経痛軽減に影響を及ぼすさらに詳細な理由は下記の通りである。
【００７４】
第１に、酵母抽出物に多量含まれていたコリンはビタミンＢ複合体であって、アセチルコリンを生成する前駆物質であるが、アセチルコリンは緊張緩和、弛緩などを促進する神経伝達物質であって、コリンを多量摂取すれば生理時に子宮収縮による筋肉の緊張を緩和させることができ、これにより鎮痛効果を奏することができる。
【００７５】
また、コリンにはいろいろな種類のコリンがあるが、このうちサリチル酸コリンはアスピリンと類似した鎮痛効果があるので、月経痛の鎮痛効果を奏することができる。月経痛の原因はまだ正確に知られていないが、月経痛がある女性は月経痛がない女性より生理時に分泌されるプロスタグランジン量が多いためであると推測される。この時、アセチルサリチル酸（アスピリン）やイブプロフェンのような鎮痛剤がプロスタグランジンが合成されることを妨害してプロスタグランジンの分泌量を減少させて痛みをよく伝達させないことにより痛みを感じさせない役割をする。
【００７６】
第２に、酵母抽出物組成のうちビタミンＢ６はアミノ酸と蛋白質合成及び代謝に非常に重要な役割を担当するが、赤血球及び抗体を作るのに補助の役割をして、各種神経伝達物質を作るのに関与する。したがって、ビタミンＢ６が欠乏すれば貧血になりやすく、皮膚炎と神経障害、けいれん等の症状を表しうるためにＰＭＳ及び月経痛の緩和に必ず必要なビタミンである。このビタミンは生理前期症候群及び月経痛の緩和に効果があるものと既に知られている。
【００７７】
第３に、酵母抽出物組成のうちニコチン酸はＮＡＤ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）とＮＡＤＰ（ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）２種類の補酵素を作る酵素反応に関与するものであって、細胞内のミトコンドリアでエネルギー生成を促進させて脳細胞の機能を促進させる役割をすることによって精神分裂症治療に使用できると知られている。したがってＰＭＳの精神的異常症状に効果的に使用できる。
【００７８】
また、ニコチン酸は必須アミノ酸であるトリプトファンの正常的な代謝産物のうち一つであり、トリプトファンはＰＭＳ及び月経痛治療に使われると知られたセロトニンの前駆物質であるために、トリプトファン及びニコチン酸が多量含まれた酵母抽出物はＰＭＳ及び月経痛の緩和に効果的である。すなわち、セロトニンは生体内で合成される神経伝達物質の一種であるために、これと構造的に類似したニコチン酸が多いということはセロトニンへの転換可能性が多いということを意味し、したがって最終的に痛み、慢性疲労、憂鬱症を処理するための体内自己調節機作を最大化させるといえる。
【００７９】
第４に、酵母抽出物の組成のうちチアミンは心臓及び神経組織の正常化に関与するなど神経系に関与するために、血中チアミン数値が落ちる場合には、憂鬱症、情緒不安、睡眠障害、愚痴、行動過剰症などを誘発し、チアミンを投与すればこのような症状がなくなることが知られている（ニューヨークコロンビア大学ラスハレル教授）。したがって、チアミンの豊富な酵母抽出物の服用を通じて女性のＰＭＳ症状、すなわち、憂鬱、情緒不安、睡眠障害、愚痴などを治療するのに役に立つ。
【００８０】
第５に、酵母抽出物の組成のうちリボフラビンはＦＭＮ（ｆｌａｖｉｎ ｍｏｎｏｎｕｃ−ｌｅｏｔｉｄｅ）、ＦＡＤ（ｆｌａｖｉｎ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｌｅｏｔｉｄｅ）のような補酵素の合成に関与し、これら補酵素は栄養素が酸化されてエネルギーを発生する過程や赤血球及び副腎皮質ホルモン合成に用いられる。したがって、出血がある生理時に必ず必要な栄養素である。
【００８１】
第６に、酵母抽出物にたくさん含まれているミネラルであるセレンは抗酸化効果がビタミンＥよりも１，９００倍以上大きい物質である。すなわち、人体内で生成されたセロトニンをはじめとする神経伝達物質が胃腸管や伝達過程で酸化されてしまえばその効果が落ちるために、このような神経伝達物質の酸化を防止する抗酸化効果が大きいセレンが存在することによって、セロトニンのような神経伝達物質が最大限効果を発揮できるように助ける役割をする。
【００８２】
最後に、月経痛時にはカルシウムやマグネシウムのようなミネラルがたくさん必要であるが、このようなミネラルは食品として吸収して初めて生体への吸収が早く、かつアミノ酸と共に食べれば吸収がさらに容易になる。したがって、酵母抽出物はミネラルとアミノ酸両方とも豊富であるために人体に容易に吸収され、ＰＭＳ及び生理痛緩和に有用な効果を奏する。
【００８３】
前記のようなメカニズムにより、酵母抽出物はＰＭＳ及び月経痛の緩和に非常に効果的であるということがわかる。
【００８４】
本発明のさらに他の態様においては、前記酵母抽出物にキトサンをさらに含むＰＭＳ及び月経痛の緩和効果を有する組成物を提供する。
【００８５】
キトサンは、自己免疫力を増進させてカルシウムの吸収及びコレステロール調節機能を補助する活性物質であることが知られている。カルシウムは女性に必ず必要なミネラルであり、特に月経前症候群と生理時に必要なミネラルである。ところで、キトサンがこのようなカルシウムの吸収を手伝い、かつ異物除去に優れるために月経前症候群及び生理痛の緩和に有用である。本発明で使われるキトサンは、分子量３００，０００以上の水溶性高分子キトサンであることが望ましい。
【００８６】
本発明のさらに他の態様においては、前記酵母抽出物及びキトサンに、当帰、丹蔘、鬱金、甘草、桂皮、ハッカ、ショウガ、高麗人参、天麻、センキュウ（Ｃｎｉｄｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、白朮、蓬朮などの生薬材料をさらに含みうる、ＰＭＳ及び月経痛の緩和効果を有する組成物を提供する。
【００８７】
当帰、丹蔘、甘草、鬱金、ハッカ、高麗人参、桂皮、ショウガ等は女性に良い生薬原料であって、特に血液循環、溢血除去、痛み緩和、食欲促進及び新陳代謝機能を助けるものと知られている（本草学テキスト参照）。月経時には血液循環が円滑でなくて鬱血が生じて月経痛を体験する場合が多いが、このような生薬成分はその月経痛を緩和させうる。
【００８８】
また、天麻、センキュウ（Ｃｎｉｄｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、白朮、蓬朮などは脳の血液循環を手伝って頭を冴えさせるために、神経伝達物質の生成を手伝える。
【００８９】
前記材料はいずれも粉末化して使用するが、その配合比は、酵母抽出物１０ないし９０重量％、キトサン５ないし８０重量％、及び生薬材料５ないし８０重量％であることが望ましい。
【００９０】
酵母抽出物を多量添加する場合に痛みをたくさん感じる患者には良いが、痛みが軽微な患者が服用した場合にはかえってだるく弛緩される場合があるために、その含量を前記範囲内で適切に調節する必要がある。
【００９１】
またキトサンを多量服用する場合、キトサン自体の酸性が体に刺激となり、正常人の場合には副作用はないが、月経痛が激しい患者には激しい刺激（緊張、ストレス）として作用する恐れがある。
【００９２】
しかし、少なくとも酵母抽出物は最低限１０重量％、キトサンは最低限５重量％は含まれて初めてそれぞれの有効成分を活用しつつも酵母抽出物及びキトサンの弛緩と刺激の相互作用を誘導して適切な新陳代謝を誘導できる。
【００９３】
また酵母抽出物及びキトサンの最大含量を各々９０重量％及び８０重量％としたことも、上記の最小重量比の相互作用を起こす条件と同じく酵母抽出物及びキトサンの弛緩と刺激の適切な相互作用を発生させて新陳代謝に効果的な組成物として作用可能にするためである。
【００９４】
合わせて生薬材料の最小重量比を５％にしたことは、女性の生理時に完全に除去されていない溢血を除去する効果を考慮したためである。本発明による、効果的な月経痛及びＰＭＳ緩和用組成物は生薬材料を約５％以上添加することで製造できる。
【００９５】
以下、本発明の酵母抽出物の製造方法をより詳細に説明すれば次の通りである。
【００９６】
本発明の酵母抽出物の製造方法において、酵母に高温、超音波及び振動などのストレスを加えてこれに対抗する物質を酵母が生成するように誘導する段階を添加したことは、酵母菌体の有効成分を利用するために致死温度より高温を加えて酵母が細胞膜の選択的透過能を喪失して酵母自体が有しているプロテアーゼ、リパーゼ、インベルターゼ、マルターゼ、チマーゼの酵素を利用して細胞膜を消失させる自己消化段階を通じて各種呈味物質（グルタミン酸などのアミノ酸、５´−ＡＭＰなどの核酸分解物質など）を分泌させる（宋ヒョングイクと申ジュングヨブ、現代醗酵工学、１９９８．５：１８９参照）と同時に、蛋白質分解酵素であるパパインを添加してさらに効率的な抗ストレス活性、抗疲労活性、そして神経栄養剤を得るためであるが、一般的に温度は酵母の生育及び生存に影響を与える最も重要な媒介変数のうち一つである。大部分の微生物は中温性であって酵母は２０〜４６℃の生育温度制限を有していて、中温性酵母であるサッカロミセスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対する３７℃の弱い熱ショックは致死温度の４８〜５５℃に対する耐性を誘導することもあるが、このような熱耐性細胞は最適生育温度（３５℃）より５℃上昇しただけでも熱ショック反応を誘導してジオーストレハロースと共に１０４、９０、７０、６０ｋＤａの分子量を有する有効な熱ショック蛋白質が合成される（Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ｌ．Ｄｅｅｇｅｎａａｒｓ ａｎｄ Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｗａｔｓｏｎ，１９９８．Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．８月号参照）。したがって、これは酵母が熱に対するストレスに対抗するためにそれに必要な抗ストレス蛋白質を合成するという良い例になりうる。これに着眼して本発明は酵母に高温、超音波及び振動などのストレスを加えてこれに対抗する物質を酵母が生成するように誘導する製造段階を加え、酵母菌を３５℃〜７０℃の高温で自己消化させつつ蛋白質分解酵素をさらに添加して酵母蛋白質を加水分解させる段階と、上記の加水分解されたものを遠心分離して上澄み液だけを分離して取る段階と、を含むことを特徴とする酵母抽出物及び酵母ペプチドを製造した。
【００９７】
本発明の酵母抽出物及び酵母ペプチドに対して神経栄養補給機能を通じた抗ストレス効果があるかどうかを試験するために、下記のようにＢｒｅｋｈｍａｎ＆Ｄａｒｄｙｍｏｖの方法を応用した不動ストレス実験を実施した。一般的にストレスにより発生する生体のいろいろな反応は中枢神経系の外部刺激に対する感知を通じて始まり、このような外部刺激によって副腎皮質ホルモン分泌に変動が生じ、これに対応するためにいろいろな臓器のうち肝臓、胸腺、甲状腺及び脾臟などの重量を変え、免疫細胞を減らし、コルチコステロイドの影響を受けて血中ＬＤＨ（Ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）とＡＬＰ（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）酵素の変化が現れると知られていてこのような指標の変化を抗ストレス評価資料として利用している（Ｃｈｒｉｓｔｉｎａ，Ｊ．，Ｈａｎｓ，Ｗ．ａｎｄ Ｈａｎｓ，Ｍ．：Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｃｕｔｅ ｍｅｎｔａｌ ｓｔｒｅｓｓ，Ｂｒ．Ｊ．Ｈｅａｎａｔ７１：５６４，１９７１／Ｃｏｎｎｅｒ．Ｒ．Ｌ．，Ｖｅｒｎｉｋｏｓ−Ｄａｎｅｌｉｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｌｅｖｉｎｅ，Ｓ．：Ｓｔｒｅｓｓ，ｆｉｇｈｔｉｎｇ ａｎｄ ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２：５６４，１９７１．／Ｍｕｎｃｋ，Ａ．，Ｇｕｙｒｅ，Ｐ．Ｍ．ａｎｄ Ｈｏｌｂｒｏｏｋ，Ｎ．Ｊ．：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ｉｎ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｏｎｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ．，５：２５，１９８４．）。したがって、このような点を勘案して不動ストレスを加えたラットを利用してストレスにより影響を受ける各臓器の重量の変化及び血液生化学的要素の変化を測定した結果、抗ストレス効果があることを確認した。
【００９８】
また、本発明の酵母抽出物及び酵母ペプチドに対する抗ストレス測定実験の一つとして、マウスの水泳運動能力測定を通じた抗疲労効果実験を実施した。ストレスが二極性の情動反応つまり、運動機能及び自律機能に影響を及ぼすと知られているが（黄イワン、心身症、ソウル、杏林出版社、ｐｐ．１７−２８，３３−４９，ｐｐ．２７７，１９８５）、一般的に過度な運動（水泳）はストレスとして見なされ、遊泳プール測定装置を通じて過度な水泳をするように強要された状態で長く耐えられる能力を測定する水泳持久力測定を通じた抗疲労効果実験は抗ストレス効果を測定する望ましい実験といえる。実験の結果、本発明の酵母抽出物及び酵母ペプチドが優秀な抗ストレス効果及び抗疲労効果があることが確認できた。
【００９９】
また、本発明の酵母抽出物及び酵母ペプチドに対する抗ストレス測定実験の一つであって、自律神経調節効果を実験するために、不安症患者を対象に酵母加水分解物２５０ｍｇを１日３回１週間経口投与した後ストレス測定器（ＳＡ−２０００，Ｍｅｄｉｃｏｒｅ，Ｋｏｒｅａ）を通じて自律神経機能調節効果を測定した。自律神経機能調節効果は、ＰＤＳ（ｐｏｗｅｒ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）分析により得た拍動サイクル（心拍の速さの変動）を５分毎のセグメントそれぞれについて分析し、５分間の総パワーを得た。その結果、自律神経調節機能の向上と、ストレス及びその他の痛み誘発物質に対する対応調節能力の強化を確認でき、またストレス及び痛みが主原因である月経前症候群にも効果があると推測できた。
【０１００】
また、本発明においてミネラルの豊富な酵母が他のペプチド素材より優秀な生体活性度を有するということを確認するために、ミネラル強化酵母抽出物に対してマクロファージの活性試験を通じた免疫力を測定した。免疫系においてマクロファージは先天性免疫と適応性免疫の両免疫系ともに関与する免疫細胞であって、体内に流入された外部物質の消化と連続的な分解及び加工によるリンパ球への抗原提供、全体免疫系を調節できるサイトカインのような特定物質疑分泌及び生体に侵入した抗原を殺す能力を有する酸化窒素（ＮＯ）などの生成のような機転を通じて免疫系を活性化させる細胞性免疫系の重要な免疫細胞である。一方、マクロファージはいろいろな刺激物質に露出されたり外部刺激により活性化すれば、活性度によって炎症大食細胞と活性化した大食細胞とに分けられる。炎症大食細胞はチオグリコレートのような炎症誘発物質に露出された場合をいい、この時は食細胞作用、表面付着能、プロスタグランジン分泌増加、プラスミノゲン活性化酵素、エラスターゼ、コラゲナーゼなどいろいろな酵素の蛋白質合成能増加の機能的変化を示し、細胞の大きさ及び色々な細胞分泌物が増加する。
【０１０１】
ＩＦＮ−γ、ＴＮＦなどのサイトカイン類及びグラム陰性菌のＬＰＳにより活性化したマクロファージは抗癌作用、抗微生物作用などを有するが、特に癌細胞に対する細胞毒性作用の機転において活性化したマクロファージにより分泌されたサイトカイン（ＴＮＦ−α，ＩＬ−１，ＩＬ−６，ＩＬ−８，ＩＬ−１２）と過酸化水素、酸化窒素、細胞質溶解プロテアーゼなどが癌細胞に対する細胞毒性を表す物質として提示されてきた。このようにレクチン類や高分子の蛋白二糖体及び多糖類により活性化したマクロファージは、体内で１次的に腫瘍発生を抑制して癌細胞の遷移を抑制して腫瘍細胞と正常細胞とを区別する優秀な能力も有している。マクロファージが認知する標的構造はまだ不明であるが、腫瘍細胞破壊過程は細菌に対する食菌作用とは違って腫瘍細胞と接触してリソソーム酵素などを放出することによって標的腫瘍細胞を溶解させる順序よりなる。しかし、活性化していないマクロファージは細胞毒性が微弱であるために活性化して初めて腫瘍細胞に対して増加した死滅能力を有するようになる。このような事実は、マクロファージの活性化をもたらす免疫療法が効果的な治療法になりうるということを意味する。本発明ではこのような事実に基づいてミネラル強化酵母の抽出物に対するマクロファージ活性を試験することによって免疫増強の効果を確認した。
【０１０２】
また、さらに腸管免疫活性試験を通じて、本発明においてミネラルの豊富な酵母が他のペプチド素材より優秀な生体活性度を有するということを確認するために、ミネラル強化酵母抽出物に対して腸管免疫活性試験を通じた免疫力を測定した。免疫反応に関与する細胞は機能の効果的な遂行のために組織や器官を構成するが、これをリンパ系統という。リンパ系統は実質的にリンパ球を生産する骨髄、胸腺のような１次（あるいは中枢）リンパ組織系と、リンパ球と抗原間の接触とリンパ球間の相互作用を容易にする条件及び環境を提供するリンパ節、脾臟、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）などの２次リンパ組織系とに分類される。特に、ＭＡＬＴは微生物が侵入しやすい部位に位置して粘膜での局所的免疫反応に重要な役割をするためにこれを粘膜免疫系と呼ぶ場合もある。このようなＭＡＬＴは摂取、吸入などにより体内に入った抗原の侵入に対して防御の役割を行うが、大きく３種に分類できる。すなわち、消化管に位置する時はＧＡＬＴ（Ｇｕｔ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）、呼吸管に存在する時はＢＡＬＴ（Ｂｒｏｎｃｈｏｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）、口蓋と鼻とが連結される部位に位置する組織はＮＡＬＴ（Ｎａｓａｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｔｉｓｓｕｅ）という。このうちＧＡＬＴは生体内で最も大きいリンパ組織であって、腸管の粘膜部位に存在して生体防御にあって非常に重要な役割を担当する。特に広い表面積を有する消化管粘膜は外部から多様な多くの微生物、そして植物からの異種蛋白質や化合物と接触し続けて感作される所であって、免疫組織としての意義は非常に高い。
【０１０３】
本発明の下記実験例で使用したバイエル板（Ｐｅｙｅｒ’ｓ ｐａｔｃｈ）はＧＡＬＴの典型的な構造であって、最も容易に観察できるが、これらは小腸粘膜にあるリンパ小節の集合体であって、小腸の腸間膜側に沿って位置しており、回腸で最も明らかである。バイエル板で活性化した免疫細胞はＩＬ−６及びＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）をはじめとする多様なサイトカイン類を生産することによって、骨髄細胞だけでなく白血球や他の造血系細胞の成長、移動、分化などを調節して免疫反応や炎症反応を調節する。このような点に基づいて下記実験例では本発明のミネラル強化酵母の抽出物がバイエル板細胞を活性化させて生産したサイトカイン類が骨髄細胞を増殖させる程度を評価することによって免疫増強活性を決定しようとした。
【０１０４】
一般に、生体におよぶ刺激は一定強度以上になる場合に障害的に作用して、刺激の種類に関係なく緊張性頭痛、偏頭痛、高血圧、消化不良、疲労、頭痛などを起こして、慢性的に持続されれば各種神経症、胃損傷などを誘発させるなどの非特異的な全身的適応症候群を起こす（黄イワン、心身症、ソウル、杏林出版社、ｐｐ．１７−２８，３３−４９，ｐｐ．２７７，１９８５）、ストレス抑制を通じて本発明の酵母抽出物及び酵母ペプチドは神経安定剤、緊張緩和剤などの用途として使用でき、特に神経が鋭敏で眠れない人のための睡眠補助剤としてその利用が大きく期待される。また、このような用途を含む脳、神経栄養物質の機能を有する機能性食品素材として健康補助食品及び特殊栄養食品としても有用に利用できる。
【０１０５】
したがって、このような点から見れば、酵母ペプチド及び酵母抽出物は緊張を緩和して熟睡を誘導するなど自律神経調節に効果があると見なされ、さらに本発明の酵母ペプチド及び酵母抽出物は神経機能を正常化させるにおいて、多量摂取しても副作用がほとんどない、非常に効果的な神経栄養物質であるといえる。
【０１０６】
既存の副作用が多い神経性疾患及びストレス性疾患治療剤（神経安定剤、抗不安剤、睡眠剤など）の代わりに副作用がない抗ストレス効果及び天然神経栄養剤の機能を有する酵母抽出物及び酵母ペプチドを用いて各種ストレス疾患を解決できるようになり、これを通じた自律神経調節機能の回復ができるために神経安定剤、抗不安剤、睡眠補助剤、疲労回復剤、ＰＭＳ及び月経痛緩和剤として使用可能になった。
【０１０７】
本発明の抗ストレス及び神経栄養補給機能としての酵母抽出物及び酵母ペプチドは副作用が多い向精神製剤の代用として医薬品、動物薬品、機能性食品などに多様に利用できる。このように治療用薬剤として利用されるためには薬剤学的分野で公知の方法により製造され、その自体または薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤と混合して粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、または注射剤などの剤形で製造されて使用できる。またこれらは経口または非経口で投与できる。
【０１０８】
本発明による酵母抽出物及び酵母ペプチドを有効成分として投与する投与量は患者の年齢、性別、状態、疾病の症状によって適切に選択でき、望ましくは、成人基準１日５００ｍｇ、不眠症症状がある人の場合２５０ｍｇ粉末カプセルで１日２回投与される。
【０１０９】
本発明の酵母抽出物をＰＭＳ及び月経痛緩和用として投与しようとする場合には、酵母抽出物をいずれも粉末化してカプセルに充填するか、錠の形にしてこれを一日に２〜３回、１回に１〜２カプセル（または錠）ずつ（１カプセル（錠）は１８０ｍｇ）を多量の水と共に摂取すれば女性のＰＭＳ、月経痛、冷症及び月経不純などの治療に効果的である。
【０１１０】
また本発明で製造された酵母抽出物及びそれを含む組成物は健康飲料として製造して摂取可能にすることによって、ＰＭＳ、月経痛、冷え症などの緩和により女性の健康増進に寄与できる。
【０１１１】
以下、本発明を具体的に説明するために実施例をあげて説明するが、発明の理解を助けるために添付図面を参照して詳細に説明する。しかし、本発明による実施例は色々な他の形態に変形でき、本発明の範囲が後述する実施例に限定されると解釈されてはならない。本発明の実施例は当業者に本発明をより完全に説明するために提供されるものである。
【０１１２】
＜実施例１＞
食品等級の酵母菌であるサッカロミセスセレビシエ菌株（ゼニコー株式会社の生イーストを購入して使用）をＹＭ培地で２４℃、酸素供給下で４８時間培養した。
【０１１３】
上記のように培養された培養液を１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄み液を除去して残る沈殿物、すなわち、酵母を１０倍（ｖ／ｖ）滅菌水で２回洗浄、希釈した後、５０℃の高温で酵母が自体的に溶解させる自己消化酵素を利用して自己消化を実施すると同時に、酵母蛋白質をペプチドに分解することを促進するために蛋白質分解酵素（パパイン３０，０００）を１％を添加して初期ｐＨ４．０で４８時間加水分解を行って蛋白質をペプチドに溶解した。
【０１１４】
このように溶解されたものを１５，０００ｒｐｍで遠心分離して水溶液状態の上澄み液だけを分離して本発明の酵母抽出物を収得した。このように収得されたものを凍結乾燥して”試料１”といい、下記の実験例で使用した。
【０１１５】
＜実施例２＞
１）酵母の改良菌株選別
生命工学研究所（ＫＣＴＣ）から分譲された食品等級のサッカロミセスセレビシエ７９０４菌株を４５ｋＨｚの連続的な超音波及び水中ポンプを通じた落差幅を利用して振動を加えるストレス条件下で４８時間培養した後、このストレス条件下で生き残った酵母をＹＭ寒天プレート（酵母抽出物３ｇ、麦芽抽出物３ｇ、ペプトン５ｇ、グルコース１０ｇ、寒天１５ｇ／Ｌ）にスクリーニングしてプレート上で最も速く成長してかつ大きいコロニーを形成するものを改良菌株として選別した。
【０１１６】
２）培養
このように選別された改良菌株をＹＭ培地で２４℃、酸素供給下の醗酵槽で４８時間培養し、その培養液を１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄み液を除去して残る沈殿物である酵母ペーストを１％ペプトン緩衝液で１０倍希釈した後、超音波発生装置及び振動装置が付着された醗酵槽で３５℃〜４５℃の高温で４５Ｋｈｚの超音波を５分間隔で３０秒間加える行為を合計で８時間反復し、水中ポンプを利用して落差を利用した振動を与えつつ酵母がストレスによって分泌する抗ストレス物質の生成を促進しながら８時間培養した。
【０１１７】
３）自己消化及び加水分解
上記の２）で培養された培養液を５０℃の高温で酵母が自体的に溶解させる自己消化酵素を利用して自己消化を実施した。これと共に酵母蛋白質のペプチドへの加水分解を促進するために蛋白質分解酵素（パパイン３０，０００）１％を添加して初期ｐＨ４．０で４８時間加水分解を行って蛋白質をペプチドに溶解した。
【０１１８】
分解後の加水分解率（％）は、上澄み液に存在する蛋白質濃度を総酵母蛋白質濃度で割った値として決定した。蛋白質濃度は、自己消化させたサンプルを遠心分離して上澄み液を回収して希釈した後、この希釈液をチューブに５００μｌ分取して同量の蛋白質定量試薬を入れた後、攪拌して６０℃で６０分反応させた後分光光度計を利用して５６２ｎｍで測定した。実験結果、加水分解率は５５％と現れた。
【０１１９】
４）加水分解物質の分離、精製及び乾燥
前記３）のように自己消化及び加水分解されたものを１５，０００ｒｐｍで遠心分離して水溶液状態の上澄み液だけを分離、収得して”試料２”として下記の実験例で使用し、沈殿物は”試料３”としてやはり下記の実験例で使用した。このように収得された上澄み液及び沈殿物を凍結乾燥させて粉末状の酵母抽出物及び沈殿物を得た。
【０１２０】
＜実施例３＞
前記実施例２と同じ方法で酵母抽出物を製造するが、最終的に得られた上澄み液を超微細ろ過装置により限外ろ過膜（ＭＷＣＯ＝１０，０００）を通過させて分離、精製した後、凍結乾燥させて分子量１０、０００以下の精製された天然酵母ペプチドを製造した。
【０１２１】
前記製造された酵母ペプチドの分子量分布を確認するために、ゲルろ過クロマトグラフィー法を使用して次のような方法で分子量分布を測定した。
【０１２２】
分子量が確認された標準物質の検出時間を測定した後、これと比較してまだ分子量の確認されていない物質の分子量を測定する方法であって、１０，０００分子量を有する物質が４０．１０７分にピークが現れるために、４３分以後に現れるピークは１０，０００以下の分子量を有する物質であると推定できる。
【０１２３】
本発明の酵母ペプチドの分子量を測定した結果を図７に示した。図７で分かるように、大部分のピークが４０分以後に現れるので本発明の酵母ペプチドを構成するペプチドは１０，０００以下の分子量を有していることが分かった。
【０１２４】
さらに、本発明の酵母ペプチド５％溶液を、５，０００ダルトンカットオフメンブレンを利用して分子量５，０００以上と５，０００以下とに分離する限外ろ過を行って本発明の酵母ペプチドの分子量分布を確認した結果、分子量５，０００ダルトン未満が８９．３％存在することが確認できた。
【０１２５】
＜実施例４＞
成分分析
実施例２で製造した酵母加水分解物の一般成分はＡＯＡＣ法によって測定した。水分は１０５℃で熱風循環乾燥法により、粗蛋白質はマイクロケルダール（ｍｉｃｒｏＫｊｅｌｄａｈｌ）法により、粗脂肪はソックスレー（ｓｏｘｈｌｅｔ）抽出法により、粗灰分は５５０℃で灰化して定量した。
【０１２６】
その結果を下記の表１に示した。表１で分かるように、蛋白質が６０．１％で最も多量を占め、炭水化物が２６．９％で比較的多量を占めている。通常の酵母抽出物の蛋白質及び炭水化物の量は４５〜６０％及び３５〜４５％の含量を占めるのに対し、本発明の酵母加水分解物は炭水化物含量が少なくて蛋白質含量が多い特性を示した。
【０１２７】
【表１】
2004521919.tif 000003
【０１２８】
次いで、前記蛋白質中のアミノ酸含量を次のように分析した。
【０１２９】
前記実施例２で収得した酵母抽出物１０ｇを冷却アセトンで脱水させた後６０℃ドライオーブンでろ紙に広げて乾燥させた後、硬質試験管に試料５ｍｇを取って６Ｎ ＨＣｌ ５ｍｌを加えてガス抜きした後、密封して１１０℃で２４時間加水分解させて２〜３回少量の蒸溜水で洗浄した後、濃縮器で５０℃で乾燥させて塩酸を除去し、緩衝液を溶解して、１０ｃｍイオン交換カラム（Ｎｏ．３３８０５１）を装着したアミノ酸自動分析器（Ｄｅｃｋｍａｎ ｓｙｓｔｅｍ６３００，ＵＳＡ）を使用して分析した。アミノ酸組成を分析した結果、本発明の酵母抽出物のアミノ酸組成は下記表２の通りである。
【０１３０】
【表２】
2004521919.tif 000004
【０１３１】
前記表２に示されたように、本発明で製造された酵母ペプチドは１８種類の多様なアミノ酸が含まれており、特に二重アスパラギン酸及びグルタミン酸の含量が非常に高かった。
【０１３２】
前記のように、多様なアミノ酸及びペプチドは神経栄養物質として作用して過度なストレス時に発生する自律神経の不均衡を調節できる抗ストレス物質に有用に利用できる。
【０１３３】
＜実施例５＞
実施例２で収得された上澄み液（試料２）を凍結乾燥させた粉末に、当帰、丹蔘、鬱金、蓬朮、ハッカ、及び高麗人参を各々同一重量の割合で粉末化した後、よく混合して生薬材料を準備した。
【０１３４】
またキトサンは分子量３００，０００ダルトン以上の水溶性高分子キトサン（（株）ザクァングキトサンから購入）を準備した。
【０１３５】
上記のように準備された材料を、酵母抽出物４０重量％、キトサン３０重量％、生薬材料３０重量％の割合で混合した後、カプセルに充填して１８０ｍｇを１カプセルとした。
【０１３６】
＜実施例６＞
飲料の製造
１）ろ過及び精製
前記実施例２で収得された上澄み液を同量の活性炭（上澄み液重量の５％）と混合した後、約２０倍の量の水に入れて攪拌した。このように攪拌されたものを加圧殺菌器に入れて１２１℃で１５分間殺菌した後２回減圧ろ過した。脱色脱臭された無色の精製された酵母抽出物を得た。
【０１３７】
２）飲料組成物の製造
前記１）で製造された酵母抽出物を７０重量部の水に希釈して、ここに液状果糖７重量部、ブドウ糖４重量部、そして梅の実果汁濃縮液５．９重量部を添加して飲料組成物を製造した。
【０１３８】
３）副材料添加効果
酵母抽出物で抗ストレス飲料を製造する時、素材酵母自体はあまり好まれない点を補うために、この好み度を高めるために甘味剤及び酸味剤を添加し、この好み度相乗效果及び適正配合比率の選定のために５段階評点法（１：とてもきらい、３：普通、５：とても良い）で官能検査を実施して下記表３にその結果を表した。
【０１３９】
【表３】
2004521919.tif 000005
【０１４０】
上記のように、添加剤の種類によって配合比率を異にして単一効果を検討し、予備実験に基づいて適正梅の実果汁濃度を５％で配合すると共に、７％の液状果糖を添加した時に総合好み度が最も良く、前もって最適と決定された。ブドウ糖を甘味料として添加した時は４％が最も良かった。色と匂いには差がなかったが、味の好み度に変化があった。また、液状果糖を８％で配合すると共に、梅の実果汁を添加した時に６％及び８％とも同じ総合好み度を表したが、匂いの好み度の差は大きかった。すなわち、液状果糖やブドウ糖を添加した時に味の好み度が上昇し、梅の実果汁を添加した時に匂い及び酸味の増加により清涼感が良くなったと現れた。したがって、官能検査結果を総合的に見れば、甘味剤である液状果糖及びブドウ糖の適性量は７％及び４％であり、酸味剤である梅の実濃縮液の適性量は６〜８％範囲であると判断された。
【０１４１】
＜実験例＞
以下、本発明の酵母抽出の抗ストレス活性、抗疲労活性、自律神経調節機能、ＰＭＳ及び月経痛緩和効果などを試験した。
【０１４２】
＜実験例１＞
抗ストレス活性試験（１）（高麗大学生命工学院金キョンミ博士の実験）
抗ストレス活性試験のための実験動物には約１８０ｇ重量の５周齢のの雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系（以下、ＳＤ）ラット（バイオリンク（株）から購入）を利用し、これを購入した後一週間、照明時間を朝７時から夕方７時まで１２時間にし、室内温度は１８〜２３℃に調節された部屋に適応させた後、本実験に使用した。飼料は固形飼料（動物実験用飼料、（株）第一製糖から購入）を使用して給水は水道水を使用し、飼料及び給水は制限しなかった。試料は３種類を使用したが、一般的な酵母抽出物の製造方法により５０℃の高温下で加水分解させた試料、すなわち、前記実施例１で製造されたものを試料１、超音波及び振動を加えた後に加水分解させたものを遠心分離した上澄み液、すなわち、実施例２の上澄み液を試料２、実施例３で遠心分離後に沈殿された沈殿物を試料３として、試料１、２、３いずれも凍結乾燥させて粉末とした後に実験した。
【０１４３】
上記の雄ＳＤラットに、蒸溜水に溶かした各試料（１ｇ／ｋｇ体重）を毎日１回８日間連続して経口投与した。各試料当りラットは３頭ずつ割り当て、試料投与６日後からラットを幅５ｃｍ、長さ１２ｃｍの円筒カンに入れた後４５℃の傾斜路に固定させて４８時間ストレスを誘発させた。
【０１４４】
最終試料を投与して３時間経過した後ラットをエーテルで軽く麻酔させてから胸腺、脾臟、腎臓及び甲状腺を摘出してその重量を測定した後、ストレスを与えていない正常群とストレスを与えたものの試料を投与していない対照群とを比較した。その結果を下記の表４に表した。
【０１４５】
【表４】
2004521919.tif 000006
正常群から有意的に差がある：* ｐ＜０．０５、** Ｐ＜０．０１
ストレス対照群から有意的に差がある：a Ｐ＜０．１、b Ｐ＜０．０５
【０１４６】
その結果、前記表４に示されたように、ストレスを加えた場合（ストレス対照群）、ストレスホルモン生産及び免疫系に密接な関係がある臓器が正常群に比べて顕著な変動を招いて脾臟、胸腺、甲状腺などの重量が顕著に減少し、腎臓重量の増加が観察された。この時、試料１及び２を投与した場合には、ストレスによる脾臟、胸腺、甲状腺の減少が有意的に抑制されたことが観察され、ストレスによる腎臓の肥大も抑制されたことが観察された。したがって、酵母を一般的な方法により加水分解したものと超音波、振動などにより抗ストレス物質分泌を誘導したものいずれも少しずつ差があるが抗ストレス効果が優秀であることが観察できたが、これは加水分解する過程である高温や生酵母の溶解過程が超音波や振動などのストレスを与えたことと同じ作用をしたと見なされる。
【０１４７】
抗ストレス活性試験（２）（高麗大学生命工学院金キョンミ博士の実験）
また、ストレスを受けた時には脾臟をはじめとするいろいろな免疫機関の肥大及び免疫細胞の減少だけでなくＬＤＨの血中酵素の変化が現れると知られているが、ストレスによる血中コルチコステロイドの増加は脂質代謝に影響を与えて血中コレステロールの数値を高める。このような事実から、本研究でも試料の抗ストレス効果を検討するために血清のうちＬＤＨ、ＧＯＴ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｏｘａｌｏａｃｔａ ｔｅｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、ＧＰＴ（Ｇｌｕｔａｍａｔｅ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、ＡＬＰの活性℃及び総コレステロールを測定した。その結果を下記の表５に表した。
【０１４８】
【表５】
2004521919.tif 000007
正常群から有意的に差がある：* ｐ＜０．０５、** Ｐ＜０．０１
ストレス対照群から有意的に差がある：a Ｐ＜０．０５、b Ｐ＜０．０１
【０１４９】
前記表５によってストレスを与えることによってＬＤＨ、総コレステロールが増加し、試料の投与によって有意的な上昇抑制効果が現れた。血清のうちトランスアミナーゼ活性度を測定した結果、ストレスを与えた時には増加したが、試料１及び２の投与によって有意に減少し、特にＧＯＴにおいては有意的な上昇抑制効果があった。また血清のうちＡＬＰ活性度はストレスを与えた時に有意な減少を示したが、試料１、２及び３の投与によって有意な減少抑制効果が現れた。
【０１５０】
以上の実験結果から試料１及び２が優秀な抗ストレス活性を有し、特に試料２が顕著な抗ストレス活性を有するということがわかった。
【０１５１】
＜実験例２＞
抗疲労効果試験（高麗大学生命工学院金キョンミ博士の実験）
本発明の酵母抽出物の抗ストレス活性度を測定するために抗ストレス因子と密接な関係がある水泳持久力測定を通じた抗疲労効果を測定した。水泳持久力測定にはデータの再現性及び信頼性が高い図４に示されたものと同じマウス用持久力測定装置（流水プール運動装置、松本ら、１９９６）を利用し、実験用マウスとしては約２８ｇ重量の７周齢の雄マウス（Ｍａｌｅ ＩＣＲ ｍｉｃｅ：韓国国際実験動物センターから購入）を利用して一週間、照明時間を朝７時から夕方７時まで１２時間にし、室内温度は２２〜２４℃、湿度５０％に調節された部屋（３３×２３×１２ｃｍ、３頭／部屋）に適応させた後に本実験に使用したが、飼料は固形飼料（第一製糖から購入）を使用して給水は水道水を使用し、飼料及び給水は制限しなかった。本実験では、対照群マウスは固形飼料を経口投与（１ｇ／ｋｇ）し、実験群マウスは５０℃の高温下で加水分解させて得た、実施例１で製造されたものと同じ酵母抽出物を試料として経口投与（１ｇ／ｋｇ）して総９日間３回水泳時間を測定した。対照群及び試験群のマウスは各６頭ずつ使用して、前記マウスの水泳持久力を測定するために図４のアクリルプラスチック水泳場（９０×４５×４５ｃｍ）に３５ｃｍ深さの水を満たして３４℃に維持させ、水の流れはポンプで８Ｌ／ｍに電圧を調節して維持し、流量計（ｔｙｐｅ Ｆ４５５００，Ｂｌｕｅ ｗｈｉｔｅ Ｃｏ，Ｗｅｓｔｍｉｎｓｔｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）で測定して適当な条件を維持させた。
【０１５２】
水泳運動能力測定時にマウスの身体的活動度と実験データとの偏差を最小限に減らすためにあらゆる運動能力測定時刻は午後１時から５時まで実施し、水泳運動時間の限界値はマウスがもう水泳できない時点までに定めたが、これはマウスが水に溺れて７秒が経過するまで水表面に浮かべない状態を肉眼で確認して、水泳開始後この時点までを水泳運動時間と設定した（松本ら、１９９６）。その結果は下記図５に表した。
【０１５３】
図５に示されたように、本発明の酵母抽出物を試料として経口投与した実験群の場合、対照群と比較する時に水泳時間が大きく向上したことが確認できた。この結果により、本発明の酵母抽出物に抗疲労効果及び抗ストレス活性効果があることが確認できた。
【０１５４】
＜実験例３＞
自律神経機能活性実験
抗不安症患者を対象として実施例１で製造した酵母抽出物投与時の自律神経機能検査を実施した。一般的にストレス抑制力は交感神経及び副交感神経の伸縮性と密接な関係があるために、拍動の変化を測定して得たＴＰはストレス抑制指標として重要な意味を有する。ＴＰはＶＬＦ（ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、ＬＦ（ｌｏｗ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）とＨＦ（ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）を含む５分間のあらゆるパワーを意味する。これは基本的な影響因子である交感神経の活動と共に自律神経系の全体的な活動を反映する。このような意味を有する指標を各々測定した結果（図６）、ＳＣＰ−２０経口投与群は確実な自律神経調節機能の効果を表し、擬薬投与時にＴＰの値にはあまり変化がなかった。これは自律神経調節機能の向上を意味することであってストレス及びその他の痛み誘発物質に対する対応調節能力が強化されたことを意味する。またストレス及び痛みが主原因である月経前症候群にも効果があると見なされる。
【０１５５】
＜実験例４＞
バイエル板を通じた骨髄細胞増殖活性
Ｈｏｎｇらの方法により前記活性を測定した。サッカロミセスセレビシエから得られた本発明の酵母加水分解産物を他の投与量でＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（大韓バイオリンク社、韓国）に経口投与し、対照群として前記マウスに蒸溜水を投与した。連続７日間経口投与した後、５％ＦＢＳ（ＲＰＭＩ１６４０−ＦＢＳ）で補強されたＲＰＭＩ １６４０培地内のバイエル板細胞の懸濁液をＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスの小腸から製造した。２００μｌアリコートの細胞懸濁液（２Ｘ１０6細胞／ｍｌ）を５％ＣＯ2−９５％空気の湿った雰囲気、３７℃で５日間培養した。得られた培養上澄み液（５０μｌ）を同じインキュベータで６日間、未処理されたＣ３Ｈ／ＨｅＪマウスから得られた骨髄細胞懸濁液（２．５Ｘ１０5細胞／ｍｌ）と共に培養した。２０μｌのＡｌａｍａ ＢｌｕｅTM溶液を添加した後、前記細胞を５〜２４時間連続培養して、ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒ Ｐｌｕｓ（Ｔｅｃａｎ，Ａｕｓｔｒｉａ）を使用して５４４ｎｍの励起波長及び５９０ｎｍの放出波長で培養中蛍光強度を測定して細胞数を計数した。投与量依存方法により骨髄細胞を増殖させた結果、一日２．０ｇ／ｋｇ以上でほとんど安定水準に到達した（図８）。本発明の酵素加水分解産物（一日２．０ｇ／ｋｇ）がバイエル板細胞を刺激するために使われれば、骨髄細胞の数はＡｌａｍａｒ ＢｌｕｅTM還元試験で測定した結果、２．０倍まで増加した（図８）。このような観察結果を通じていくつの種類の成長因子が増殖反応に寄与することが分かる。通常の活性化Ｔ細胞のようなリンパ球はＩＬ−６のような成長因子を分泌すると知られており、このような成長因子は造血細胞の増殖を刺激して顆粒球またはマクロファージに対する差を誘発する。本発明の酵母加水分解産物がバイエル板細胞からＩＬ−６分泌を増加させるかどうかを調べるために、他の投与量で７日間前記酵母加水分解産物を投与したＣ３Ｈ／ＨｅＪのバイエル板細胞を５日間培養した後、ＩＬ−６のレベルを測定した。前記ＩＬ−６含量はバイエル板細胞に酵母加水分解産物が投与された場合に調節された培地で顕著に増加した（一日２．０ｇ／ｋｇ、２．３倍）（表６）。このような結果を通じてＩＬ−６が骨髄細胞の増殖に部分的に寄与することが分かる。ＩＬ−６が多機能性造血成長因子であるためにこれらは顆粒球造血を刺激する。
【０１５６】
バイエル板細胞及びマクロファージの培養上澄み液においてＩＬ−６に対するサッカロミセスセレビシエから得られた加水分解物の経口投与時の効果
【表６】
2004521919.tif 000008
a 対照群として塩水だけ投与した。
b ７日間異なる投与量でＳＣＰ−２０を供給したＣ３Ｈ／ＨｅＪマウス（ｎ＝４）からバイエル板細胞を得た後、試験管内で５日間４Ｘ１０5細胞／ウェルの密度でプーリング及び培養した。得られた無細胞上澄み液をＩＬ−６に対してＥＬＩＳＡで測定した。
c ７日間異なる投与量でＳＣＰ−２０を供給したＩＣＲマウス（ｎ＝４）からバイエル板細胞を得た後、試験管内で２日間２Ｘ１０5細胞／ウェルの密度でプーリング及び培養した。得られた無細胞上澄み液をＩＬ−６に対してＥＬＩＳＡで測定した。
* ｐ＜０．０５：対照群及び試料間の有意水準
データを４回実験の平均±標準偏差の対照群の百分率で表示した。
【０１５７】
＜実験例５＞
マクロファージ−刺激活性及びＩＬ−６の製造
１）マクロファージ−刺激活性
異なる投与量で本発明の酵母加水分解産物を経口投与したＩＣＲマウス（雄、大韓バイオリンク社、忠▲清▼北道、韓国）をｉ．ｐを通じて１ｍｌの３％チオグリコレート液体培地に無菌的に注入した。腹膜滲出物細胞を５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を含む冷たいＲＰＭＩ−１４６０培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）５ｍｌを注入して培養した。前記細胞懸濁液を１Ｘ１０6細胞／ｍｌに調整した後、湿っているチャンバで３７℃で培養し、前記マクロファージ刺激活性をマクロファージから得られた酸ホスフェートの活性を基準に細胞間リソソーム酵素の試験システムを使用して測定した（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍｏｄｅｌ ３５５０−ＵＶ）。
【０１５８】
２）マクロファージ及びバイエル板細胞培養物の上澄み液におけるＩＬ−６の測定
前記多重抗体サンドウィッチ原理を採用するＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を使用した。５０μｌの重炭酸塩バッファ（ｐＨ８．５）に溶解した２μｇの精製した抗マウスＩＬ−６ ｍＡｂ（モノクローナル抗体）（ｃｌｏｎｅ ＭＰ５−２０Ｆ３，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を９６プレートの各ウェルに接着させた後、接着されていない抗体を０．０５％ツイーン２０（ＰＢＳツイーン（Ｔｗｅｅｎ））を含むＰＢＳで４回洗浄して除去した。試料１００μｌを抗体コーティングされたウェルに加え、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳにおいて各１００μｌのビオチニル化の抗マウスＩＬ−６ｍＡｂ（ＭＰ５−３２Ｃ１１，ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を同じウェルに加えた。前記プレートをＰＢＳツイーンで６回洗浄した後、アルカリ性フォスファターゼ−ラベル付きのストレプトアビジン（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を各ウェルに加えた。各ウェルを１５０μｌの色原体基質溶液（１ｍｌの１０％ジエタノールアミンバッファに溶解した１ｍｇのｐ−ニトロフェニル二ナトリウム塩、ｐＨ９．８）と共に培養した後、４０５ｎｍで吸光度を測定した。
【０１５９】
統計分析：全ての結果を平均±標準偏差として示す。本実験で処理した試料及び対照群間の差をＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−テストにより統計的意義を試験した。Ｐ＜０．０５の値を統計的意義があるものと考慮した。
【０１６０】
３）結果
本発明の酵母加水分解産物を一日０．５、１．０及び２．０ｇ／ｋｇを７日間投与した結果、マクロファージリソソーム酵素の相対活性において投与量の依存的増加を表した（図９）。相対活性における著しい増加は一日０．５ｇ／ｋｇで現れ（塩水対照群の１．３倍）、このような結果を通じて本発明の酵母加水分解産物の経口投与がマクロファージの刺激応答を増加させるということが分かる。また、Ｔ細胞からＩＬ−２生成を増加させて造血細胞の増殖を刺激するＩＬ−６分泌、に対する異なる投与量で本発明の酵母加水分解産物を経口投与した効果をマウスで調べた。本発明の酵母加水分解産物の経口投与は対照群と比較して著しく、かつ投与量を依存的に増加させると明らかになり、本発明の酵素加水分解産物は一日２．０ｇ／ｋｇでＩＬ−６生成を最も大きく刺激した（１．９倍）（表６）。
【０１６１】
マクロファージ機能の活性化のために、少なくとも一つの信号が提供されねばならない。他の信号にマクロファージ反応させる信号はマクロファージ刺激サイトカインＩＦＮ−γにより誘導される。ＩＦＮ−γはＴｈ１、Ｔｃ及び天然キラー細胞により発生する最も特徴的なサイトカインである。マクロファージサイトカイン生成を誘導することではないが、マクロファージサイトカイン生成を調節してＩＬ−１、ＩＬ−６及びＴＮＦの生成を強化させる。マクロファージのサイトカインネットワークは炎症性及び感染反応で重要な役割を行い、特にＩＬ−６は分化で重要な役割を行い、マクロファージの成長因子として重要な役割を行う。
【０１６２】
現在の研究で、サッカロミセスセレビシエで加水分解された本発明の酵素加水分解産物の経口投与はマクロファージでＩＬ−６生成を調節できることを本発明者らは示した。本発明の酵母加水分解物の経口投与によるＩＬ−６、サイトカインの生成増加は本発明の酵母加水分解物がマクロファージの活性化を誘導できることを示す。また、本発明の酵素加水分解物の経口投与がバイエル板細胞から得られる造血成長因子の分泌を増加させることを本発明者らは示した。バイエル板細胞は主にＴ及びＢ細胞よりなり、Ｔ細胞はＣＳＦｓ及びマクロファージなどの多様なサイトカインの供給源として知られているために、本発明の酵母加水分解物の経口投与により誘発されるＴ細胞活性化はバイエル板細胞からＩＬ−６のような造血成長因子の分泌に寄与できる。特に、ＩＬ−６のようなサイトカインが全身性免疫細胞に重要な役割を行うために、本発明の経口投与された酵母加水分解物がバイエル板調節されたメカニズムにより全身性免疫システムを調節すると見なされる。
【０１６３】
したがって、生物学的活性に対する本発明の活性物質である酵母加水分解物の分画及び精製−活性関連性に関する研究は有用な重要情報を提供する。
【０１６４】
＜実験例６＞
臨床実験（黄ウォンジュン神経精神科専門医の臨床実験）
本発明の人体に対する抗ストレス効果を臨床試験するために、１．不眠症がある患者、２．不安症がある患者、３．頭痛がある患者など神経精神科的患者群を対象にベースライン投薬３日後に脳機能検査を行った後（２００１年２月６日）、それぞれの患者に３日間一日に本発明の酵母抽出物５００ｍｇを服用させた後、脳機能検査を実施した（２００１年２月９日）。その結果を図６Ａ及び図６Ｂに図示した。
【０１６５】
図６Ａ及び図６Ｂによれば、ベースライン脳マップの場合にほとんどの領域でシータ波の非対称的な増加が見られた。これは精神活動が増加して精神的緊張状態にあることを意味する。しかし、服用３日後の検査結果によれば、中央−頭頂葉領域でシータ波の対称的分布を示した。これは緊張が弛緩された状態、仮睡眠状態または立眠面状態で見られる様相であって、心理的安定をなした状態を意味する。
【０１６６】
＜実験例７＞
臨床実験（黄ウォンジュン神経精神科専門医の臨床実験）
実施例５により製造されたカプセルを２０〜３５才の女性３０人、特に、ＰＭＳ、月経痛、冷症などがある女性に月経前、または月経痛がある月経中に１回１〜２カプセルずつ、１日２〜３回服用させた。
【０１６７】
その適用結果として現れるいろいろな変化について設問調査を行った。この時、総変化評価表の質問項目は３０つを選択したが、各々身体的症状１０つ、情緒的症状１０つ、行動的症状１０つの項目で構成した。３０個の調査項目は次の通りである。
Ａ）身体症状
１）力がないとか疲労感を感じる。
２）食欲が増加したり減少する。
３）乳房が腫れたり痛い。
４）頭が痛い。
５）むかついたりはく。
６）目眩がする。
７）からだが腫れる。
８）腹が痛いか不便であり、間歇的な腹部けいれんがある。
９）不眠症がある。
１０）性的な活動や興味が変わる。
Ｂ）情緒症状
１）一日にもいろいろな感情の変化が多い。
２）心が不安でそわそわする。
３）神経が鋭敏になったり落ち着かない
４）悲しかったり憂鬱である。
５）ちょっとしたことで小言を言ったり口喧嘩をする。
６）しゃくにさわればヒステリックになる。
７）罪責感を感じる。
８）他人の欠点や間違いが理解できない（または我慢できない）。
９）不愉快な事件についてじっくり考えたり心配する。
１０）むっつりしている。
Ｃ）行動症状
１）行動が鈍くなったりぎこちない。
２）失敗や事故を犯す（倒れたり刀で切ったり偶然に物を破損）
３）死亡や自殺について考える（または寝入って永遠に目覚めたくない）。
４）しゃべりたくなかったり歩き回りたくない。
５）薬物乱用（覚醒剤、鎮静剤など）をする（またはタバコや酒を多く食べる）。
６）乱暴になったりいじめる。
７）家庭や職場での能力発揮や社会的な活動が減少する。
８）社会活動を避けて家の中に一人でいることを願う。
９）家事（清掃、洗濯など）を怠る。
１０）余暇活動（趣味生活、ＴＶ視聴、読書など）で送る時間が少ない。
【０１６８】
上記の項目について、変化が激しい程度によって症状が全くない場合を１、ほとんどない場合を２、少しある場合を３、だいぶある場合を４、かなり激しい場合を５、とても激しい場合を６と答えるようにし、全体的な感じを摂取前及び後に分けて調べ、かつ痛み緩和効果が現れる時間及び持続時間などを調べた。このように個人別に調べた数値を全部合せて平均を出した平均数値を算出してみた。
【０１６９】
その結果、摂取後早くは１０分内、遅くても１時間内には鎮痛緩和の効果が現れ、その持続時間が約４〜６時間に現れ、その変化度は身体、情緒、行動の全領域にわたって月経による症状が改善されたことと現れた。
その平均的な変化度は下の表の通りである。
【０１７０】
【表７】
2004521919.tif 000009
【０１７１】
すなわち、本発明の組成物は月経前、または月経中、痛みが激しくてからだにマヒがきたり食べ物を消化できずに吐く症状にも効果的に作用して好転させ、血液循環を活性化して気分を改善した。本発明の組成物を摂取した女性の大部分は摂取前は悲観的でかつ憂鬱であった気分が摂取後にはなくなったと言った。本発明の組成物は特に月経時の腰痛にも効果的であると明らかになったが、服用後評価設問に参加した女性のうち月経時に特に腰痛で激しい苦労をした女性が本発明の組成物を１回に２カプセル（１８０ｍｇ／カプセル）を摂取した後３０分で腰痛が消え、その後の服用を希望した。また本発明の組成物の服用後、生理痛のせいでよく眠れなかった女性が摂取後安らかに寝ることができたという。さらに、本発明の組成物は既存の鎮痛剤のように感覚が麻痺して無感覚になりつつ鎮痛効果が生じることではなく、一抹の鎮痛は残っているが、気分が悪くない程度であるためにかえって感覚がなくなって鎮痛効果が生じることよりはさらに良いという意見が大部分であった。また本発明の組成物は生理時に手足及び腹部が冷たくなることを緩和させ、これを摂取した女性の大部分は腹部及び手足が暖かくなったと言った。特に本発明の組成物は月経開始前に服用した女性にさらに大きい効果が現れ、痛みが始まった後に服用した場合は平均３〜４時間過ぎてから効果が現れた。また設問に応じた女性の意見中には、鎮痛剤がからだによくないと思っていままで痛みを耐えていたが、本発明の組成物は健康増進効果と共に痛み緩和効果があって既存の鎮痛剤医薬品の代わりに今後は食品である本発明の組成物を摂取するという反応も表れた。
【産業上の利用可能性】
【０１７２】
本発明は、平凡な食品原料としてのみ利用されていた酵母抽出物の抗ストレス及び神経栄養剤としての新しい用途を明らかにすることにより、既存の副作用が多い向精神製剤の代替剤としての医薬品及び機能性食品への活用が可能になった。
【０１７３】
合わせて従来の遺伝子再組合わせ菌株発現などを通じて難しく得た神経栄養因子（ニューロトロフィン）の代わりに食品等級の酵母を加水分解して酵母ペプチドを製造することによって天然の神経栄養剤を容易に製造できるようになっただけでなく、経口服用でも血液脳関門を通過できるように製造し、酵母抽出物の新しい用途として抗ストレス効果及び抗疲労効果、そして天然神経栄養剤を開発し、これにより酵母抽出物を機能性食品だけでなく医薬品原料としても使用可能になった。
【０１７４】
またＰＭＳや月経痛において、医者や薬剤師の処方により投与された医薬品やセロトニン、メラトニンのような特定製品の代わりに、耐性や副作用がなくて安全性が保障された食品としての酵母抽出物を医者や薬剤師の処方なしに簡便に購入、摂取可能にすることによって、普通の女性が毎月経るＰＭＳや月経痛を容易に軽減させうる。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】図１はムスカリン性アセチルコリン受容体マップを概略的に示した図面であり、
【図２】図２は本発明の抗ストレス実験（１）の結果を示したグラフであり、
【図３】図３は本発明の抗ストレス実験（２）結果を示したグラフであり、
【図４】図４は抗疲労効果を測定するためのマウス用持久力測定装置（流水プール運動装置）を示した図面であり、
【図５】図５は本発明の抗疲労実験結果を示したグラフであり、
【図６】図６は本発明の人体に対する抗ストレス効果を臨床試験した結果を示した脳マップであり、
【図７】図７は本発明で製造された酵母ペプチドの分子量分布を確認するためにゲルろ過クロマトグラフィーを行った結果を示したグラフでであり、
【図８】図８は本発明で製造された酵母ペプチドの投与量による骨髄細胞増殖の程度を示したグラフであり、
【図９】図９は本発明で製造された酵母ペプチドの投与量によるマクロファージのリソソーム酵素の比活性を示したグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年8月27日(2003.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵母を３５℃ないし７０℃の温度で自己消化させる段階と、
酵母を自己消化させると同時にまたは自己消化させた後に、蛋白質分解酵素で蛋白質を加水分解させる段階と、
酵母を加水分解させたものを遠心分離して上澄み液だけを取る段階と、
遠心分離した上澄み液を限外ろ過する段階と、を含む工程により得られる１０，０００Ｄａ以下の分子量を有する酵母ペプチド。
【請求項２】
グルタミン酸及びアスパラギン酸を１５〜２５モル％含む、請求項１に記載の酵母ペプチド。
【請求項３】
血液脳関門を通過できる請求項１に記載の酵母ペプチド。
【請求項４】
次の段階を含む酵母抽出物の製造方法：
１）酵母が死滅されない範囲内で高温、超音波、振動、ｐＨ変化などを加えつつ培養して生き残った菌株だけを選別する段階と、
２）前記選別された酵母菌株を最大増殖期まで培養する段階と、
３）前記培養された酵母を３５℃〜７０℃の温度で自己消化させる段階と、
４）前記自己消化と同時に、あるいは後に蛋白質分解酵素をさらに添加して酵母蛋白質を加水分解させる段階と、
５）前記加水分解されたものを遠心分離して上澄み液だけを分離して取る段階。
【請求項５】
酵母を自己消化させる前に酵母が死滅されない範囲内で高温、超音波、振動、ｐＨ変化などの適切な物理的または化学的ストレスを加えてストレスに耐えるための代謝物質の分泌を誘導する段階をさらに含む、請求項４に記載の酵母抽出物の製造方法。
【請求項６】
請求項４または５の方法により得られた酵母抽出物を限外ろ過して１０，０００Ｄａ以下の分子量を有するペプチドを取る段階を含む酵母ペプチドの製造方法。
【請求項７】
請求項４または５の方法により得られた酵母抽出物を活性炭と共に水に入れて攪拌した後加圧殺菌する段階と、このように殺菌されたものを減圧ろ過して無色に精製する段階と、を含む、機能性飲料の製造方法。
【請求項８】
請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の酵母ペプチドを有効成分として含む抗ストレス製剤。
【請求項９】
神経安定、緊張緩和、不安除去または睡眠補助などの活性及びＰＭＳ及び月経痛緩和効果を有する請求項８に記載の抗ストレス製剤。
【請求項１０】
請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の酵母ペプチドを有効成分として含む抗疲労製剤。
【請求項１１】
請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の酵母ペプチドを有効成分として含む神経栄養剤。
【請求項１２】
請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の酵母ペプチドを有効成分として含む月経前期症候群及び月経痛緩和組成物。
【請求項１３】
酵母ペプチドを乾燥させた粉末１０ないし９０重量％、キトサン５ないし８０重量％、及び生薬材料粉末５ないし８０重量％を含む、請求項１２に記載の月経前期症候群及び月経痛緩和用組成物。
【請求項１４】
前記キトサンは、分子量３００，０００Ｄａ以上の水溶性高分子キトサンである、請求項１３に記載の月経前期症候群及び月経痛緩和用組成物。
【請求項１５】
前記生薬材料は、当帰、丹蔘、鬱金、蓬朮、ハッカ、甘草、ショウガ、天麻、白朮、センキュウ（Ｃｎｉｄｉｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｅ）、桂皮及び高麗人参で構成される群から選択される一つ以上である、請求項１３に記載の月経前期症候群及び月経痛緩和用組成物。
【請求項１６】
請求項１ないし３のうちいずれか１項に記載の酵母ペプチドを含む抗ストレス性、抗疲労性、月経前期症候群及び月経痛緩和機能性または神経栄養性機能性飲料。
【請求項１７】
酵母ペプチド０．１ないし１０重量％、甘味剤及び酸味剤など通常の飲料添加物１０ないし２５重量％、残りの重量％の水を含む、請求項１６に記載の抗ストレス性、抗疲労性、月経前期症候群及び月経痛緩和機能性または神経機能性飲料。
【請求項１８】
酵母抽出物を含む抗ストレス性、抗疲労性、月経前期症候群及び月経痛緩和または神経栄養性組成物。
【国際調査報告】
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