(57)【要約】脂質でタグ付けされた対生物活性物質がアルブミンと合体した外因性調合薬が記載されている。アルブミンの脂質残基/脂肪酸残基の比率は低く（アルブミンに対する脂肪酸残基のモル比は０．７より小）、好ましくはアルブミンは脂肪酸を含まない。アルブミンはヒト血清アルブミンの如く天然に抽出され、また組換え操作で製造される。ペプチド、タンパク質、ワクチンなどのような対生物活性物質は、これにタグ付けすることできタグ付けした当該物質をアルブミンと組み合わせて、ヒト用、家畜用、農業用に使用できる。幾つかの抗菌性のペプチドがここに記載される。アルブミンへの結合は、タグ付き対生物活性物質の生物安定性を向上させる。この安定性向上に由来して、モデルリポペプチドの抗菌活性は、脂肪酸を実質的に含まないアルブミンと結合させた際に増強される。従って、アルブミンに結合すると、モデルリポペプチド単独の場合に比較して、低濃度のモデルリポペプチドでも、抗菌性を発揮する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質（脂肪酸）であるタグ付け基(tagging group)が共有結合した対生物活性物質からなり、当該物質がアルブミン１モル当たり０．７モルより少ない比率で脂質残基を当初含有するアルブミンに非共有結合で結合した外因性調合薬。
【請求項２】
脂肪酸と当初アルブミンのモル比が０．５より大きくない請求項１記載の外因性調合薬。
【請求項３】
アルブミンが当初実質的に脂肪を含まない請求項１記載の外因性調合薬。
【請求項４】
ヒトに使用する請求項１〜３の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項５】
獣（家畜）に使用する請求項１〜３の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項６】
アルブミンが血清アルブミンである先行請求項の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項７】
アルブミンがヒト血清アルブミンである先行請求項の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項８】
アルブミンが組換え血清アルブミンである先行請求項の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項９】
対生物活性物質がペプチド又はタンパク質である先行請求項の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項１０】
対生物活性物質が次の群から選ばれるペプチドである請求項９記載の外因性調合薬。
ＦＡＲＫＧＡＬＲＱ（配列アイ・ディーＮＯ．１）
【請求項１１】
対生物活性物質がワクチン抗原である先行請求項の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項１２】
脂質のタグ付け基がＣ４〜Ｃ１６の単鎖脂肪酸である先行請求項の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項１３】
脂質（脂肪酸）であるタグ付け基(tagging group)が共有結合した対生物活性物質からなり、当該物質がアルブミンに非共有結合で結合した外因性組成物を調製するに際し、アルブミン１モル当たり０．７モルより多くない比率で脂質残基を当初含有するアルブミンを使用すること。
【請求項１４】
使用するアルブミンが実質的に脂肪酸残基を含まない請求項１３記載の使用。
【請求項１５】
アルブミン１モル当たり０．７モルより多くない比率で脂質残基を当初含有するアルブミンにリポペプチド又はリポタンパク質を合体させることを包含するリポペプチド又はリポタンパク質とその担体であるアルブミンとに相互安定性を付与する方法。
【請求項１６】
マーカー物質の置換と円二色性分光法でアルブミンの噛合さん含量を測定する方法。
【請求項１７】
配列ＦＡＲＫＧＡＬＲＱ（配列アイ・ディーＮＯ．１）を備えたペプチドの抗菌的使用。
【請求項１８】
ペプチドが次の記すものから選ばれる配列を備えている請求項１７記載のペプチドの使用。
ＫＦＡＲＫＧＡＬＲＱＫＮＫ（配列アイ・ディーＮＯ．２）
ＫＦＡＲＫＧＡＬＲＫＫＮＫ（配列アイ・ディーＮＯ．３）
ＫＦＫＲＫＧＡＬＲＱＫＮＫ（配列アイ・ディーＮＯ．４）
ＤＶＡＮＲＦＡＲＫＧＡＬＲＱＫＮＶＨＥＶＫ（配列アイ・ディーＮＯ．５）
ＥＳＴＶＲＦＡＲＫＧＡＬＲＱＫＮＶＨＥＶＫ（配列アイ・ディーＮＯ．６）
【請求項１９】
ペプチドがＮ末端及び／又はＣ末端及び／又は適当なアミノ酸側鎖で、エステル化又は誘導体を形成した請求項１７又は１８記載のペプチドの使用。
【請求項２０】
ペプチドがＣ末端及び／又は適当なアミノ酸側鎖で、エステル化又は誘導体を形成した請求項１７又は１８記載のペプチドの使用。
【請求項２１】
ヒト用薬剤の調製に請求項１７〜２０の何れかに記載したペプチドの使用。
【請求項２２】
獣（家畜）用薬剤の調製に請求項１７〜２０の何れかに記載したペプチドの使用。
【請求項２３】
農業用に請求項１７〜２０の何れかに記載したペプチドの使用。
【請求項２４】
請求項１７〜２０の何れかに記載したペプチドを含有する製薬用、獣（家畜）用又は農業用組成物。
【請求項２５】
先行請求項の何れかに記載したペプチドを使用して細菌の成長又は増殖を阻害、防止又は阻止する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対生物活性素材の受け渡し方式に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤の有効な投与方式の研究は、調剤研究の分野で、特に、タンパク質、ペプチドワクチン、ペプチド系腫瘍治療剤及びペプチド系抗菌剤のような生物医学的に重要な分子についての調剤研究の分野で、今なお重要な課題である。生体内での吸収と輸送を改善するために、上記の如き薬剤に脂質部分（脂質基）を共有結合で結合させることは、既に提案されている。しかし、この提案は一部でしか成功を収めていない。酵素分解に対する生物安定性が、脂質部分を含有するペプチド系薬剤に、ある問題を提起している。この問題を解決するために、脂質部分を多数上記薬剤に共有結合させると、調剤上の別の問題、すなわち、生体内での溶解度に問題が起こる。
【０００３】
国際特許出願ＷＯ92/01476号には、タンパク質薬剤、すなわち、ペプチド薬剤に脂肪酸残基を共有結合させること（タグ付けすること）が記載されている。このようにタグ付けした薬剤を服用すると、当該薬剤は生体内で循環するアルブミンと非共有で結合する。国際特許出願ＷＯ92/01476号は、アルブミン分子上の結合サイトの有用性をも論じ、これらのサイトに脂肪酸が、疎水的相互作用（疎水結合）で結合することを記している。さらに、この文献は、血漿中では、たとえ他のサイトに脂肪酸が既に結合していても、アルブミン分子には未だ空の結合サイトが存在することを記載している。アルブミン分子に自然に結合した脂肪酸の数は、様々な方法で確かめられており、その数はアルブミン分子１分子当たり1分子又は２分子（過激な運動で４分子に増加）であるとされている。国際特許出願ＷＯ92/01476号の記載によれば、タグ付き薬剤はそのまま投与することができ、その薬剤は直ちに内因性アルブミンと結合するとされている。また、この特許文献では、アルブミンとタグ付き薬剤とを別の存在として、一緒に服用することが目論まれている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
もし、使用するアルブミンに当初含まれる脂肪酸比率が、以前に企図されたよりかなり低ければ、タグ付け（標識化）した生物活性物質を外因的調剤の形でアルブミンとうまく合体できることを、本発明者等は見出した。アルブミンとしては、天然のアルブミン又はその組換え型よりも脂質部分（脂質残基）の比率が当初から低いアルブミンが推奨される。望ましくは、使用するアルブミンに含まれる当初の脂肪酸基の割合は、アルブミン１モル当たり１モルより多くなく、好ましくは１モルより少ない。好適には、脂肪酸基対アルブミンのモル比は、０．７より小さい。最良の結果が得られるのは、使用するアルブミンが実質的に脂肪酸基を含まない場合であって、この場合には、脂肪酸でタグ付けされた薬剤は、脂肪酸を含まないアルブミンの利用可能な結合サイトの全て又は大部分を利用する。
比較的脂質の少ないアルブミンは、商業的に入手できるほか、公知の方法を使用してアルブミンの脂肪酸含量を、所望値に調節することもできる。
【０００５】
アルブミンとして脂肪酸を含まないヒト血清アルブミン（ＨＳＡｆｆ）を使用した場合、ＨＳＡｆｆは、モデルリポペプチドの抗菌活性を向上させることを本発明者らは見出した。このリポペプチドとＨＳＡｆｆとの併用は、リポペプチド単独使用の場合に比較して、あるいは、既に結合した脂肪酸を含有するヒト血清アルブミン（ＨＳＡｆａ）とリポペプチドとの併用の場合に比較して、効果が２倍高い。この効力の違いは、試料を適当な酵素分解条件に置いた時により顕著になる。これは身体内において、消化酵素に対し、リポペプチドに及ぼすＨＳＡｆｆの保護効果と一致する。これらの結果は、脂肪酸を含まないアルブミンＨＳＡｆｆが、他のリポ薬剤の生物活性をその生物安定性の仲介で向上させるための外部成分として使用できることを物語っている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、外因性調合薬を提供するものであって、その調合薬は、脂質（脂肪酸）であるタグ付け基(tagging group)に共有結合した対生物活性物質からなり、このタグ付き物質は、上記したように、当初は脂質残基を低い割合でしか含有しないアルブミンと非共有結合で結合する。好ましくは、脂質であるタグ付け基は、Ｃ４〜Ｃ１６の単鎖脂肪酸である。本発明に係る外因性調合薬は、当初は脂肪酸を実質的に含まないアルブミンを使用することが好ましい。
【０００７】
米国特許第４，０９４，９６５号は、診断組成物に関して、広いｐＨ範囲で安定である放射性同位元素で識別したアルブミンの清澄溶液の調製方法を記載している。第１錫イオンを含有する標準アルブミンの溶液は、濁る傾向にあるが、脂肪を含まないヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、より安定であって、還元剤及び放射性核種を含有する混合物で清澄な溶液を形成する旨も、上記米国特許には記載されている。
【０００８】
本発明は、様々なタイプの対生物活性物質の製剤に応用することができるが、そうした対生物活性物質には、
脂肪残基／脂質残基を含有する天然又は合成の薬剤又は分子、
天然又は合成の脂質残基を含有するペプチド
天然又は合成の脂質残基を含有するペプチドミメティックス、
天然又は合成の脂質残基を含有するタンパク質、
天然又は合成の脂質残基を含有するグリコペプチド、
ワクチンとしての天然又は合成のリポペプチド（Steller et al. Cancer Res 1996, 5087-91; von Herrath et al. Virology 2000, 411-9; Loing et al. J. Immunol 2000, 164,900-7; Wiesmuller et al. Biol Chem 2001, 382, 571-9）
【０００９】
天然から抽出されたアルブミン又は組換え操作で得たアルブミンを含む全ての種類のアルブミンが使用可能である。
【００１０】
アルブミン中の脂肪酸含量の測定
ＨＳＡｆｆ及びＨＳＡｆａ中の脂肪酸の量は、アルブミンの脂肪酸結合サイトにおける結合ダイアゼパムの置換量で確かめられ、円二色性（ＣＤ）分光器にて測定される。、ダイアゼパムとＨＳＡとの間の探知可能な相互作用を示す誘導ＣＤを観察する。これは、アルブミンにダイアゼパムが結合するのを防止する脂肪酸量と一貫性がある。
【００１１】
相互安定化効果
製剤の予備試験として、プロナーゼ（登録商標：エキソペプチターゼとエンドペプチターゼの混合物）の存在下、ＨＳＡｆｆ及びＨＳＡｆａとモデルリポペプチドGS01，RH01，Tric 1.8及びTric 4.8との相互安定化効果を、生体外で確かめた。ＨＳＡｆｆ及びＨＳＡｆａ対モデルリポペプチド対プロナーゼの比率は、ｌ/100ｗ/ｗである。
【００１２】
これらのリポペプチドモデルでは、ダイアゼパムの置換でモニターされるように、タグ付きペプチドがＨＳＡｆｆの脂肪酸結合サイトに結合し、従って、ＨＳＡｆｆは加水分解から保護される。この効果は、タンパク質分解に対するＨＳＡｆｆの安定性を向上させる。これらのペプチドをＨＳＡｆａと共に使用した場合には、タンパク質分解に対する安定性の向上は認められなかった。リポペプチドはＨＳＡｆｆを安定化させ、それ自体はＨＳＡｆｆで安定化させられるので、結果的に相互に安定化する。
【００１３】
最小阻害濃度の決定
製剤の予備試験として、脂肪酸を含まないヒト血清アルブミンの存在下での抗菌性モデルリポペプチドRH01の大腸菌及びブドウ状球菌に対する最小阻害濃度（ＭＩＣ）を、脂肪酸含有ヒト血清アルブミンの存在下での最小阻害濃度と比較して確かめた。
【００１４】
上記のリポペプチドモデルでは、タグ付きペプチドがＨＳＡｆｆの脂肪酸結合サイトに結合して細菌性酵素による加水分解に耐性を示し、低濃度でその抗菌活性を発揮する。このペプチドをＨＳＡｆａと一緒に使用した場合は、ＭＩＣがペプチド単独の場合のそれと同程度であり、これはＨＳＡｆａがペプチドに安定性を付与するものでないことを示している。ペプチドの多くはＨＳＡｆａに結合しないので、RH01は細菌性の酵素分解の影響を受けやすい。
ＨＳＡｆｆ及びＨＳＡｆａを含有するサンプル同士のＭＩＣの差異は、リポペプチドに対するプロナーゼ（登録商標）の濃度をｌ/250ｗ/ｗに増大させると、４倍に増大した。
脂肪酸濃度が異なるサンプルでのＭＩＣは、反対の傾向を示した。
【実施例】
【００１５】
RH01はミリストイル化ノナペプチド(1)であり、GS01はミリストイル化ウンデカペプチド(2)である。RH01はペプチドの固相合成で合成し（例２８参照）、GS01はロンドンのインペリアル カレッジ・アドバンス・バイオテック・センターから購入した。Tric 1.8(3)及びTric 4.8(4)は、Monaco, Formaggio et al, Biopolymers, 1999, 50, 239で報告されているように、液相で合成されたオクチル化ウンデカペプチドである。
ＣＨ３（ＣＨ２）１２ＣＯ−Ｘ
ここで、Ｘは(1)ＦＡＲＫＧＡＬＲＱ
(2)ＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶＲ
ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＯ−Ｘ
ここで、Ｘは(3)Toac-GL-Aib-GGL-Toac-GIL(Me)
(4)Aib-GL-Toac-GGL- Toac-GIL(Me)
Toac＝（2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル-4-アミノ-
4-カルボン酸）
Aib ＝（2-アミノイソ酪酸）
【００１６】
例１：脂肪酸を含まないアルブミン中の脂肪酸含量のダイアゼパム置換による分析
本質的に脂肪酸を含まず（約0.005％、これは0.0002M/Mアルブミンに相当する）、本質的にグロブリンも含まないヒト血清アルブミンＨＳＡｆｆ(lot.32H9300)は、シグマ-アルドリッチ社（英国、ドーセット）から購入した。ＨＳＡｆｆ(1.834mg)を蒸留水(3.057ml)に溶解させた。ダイアゼパム(0.088mg)を蒸留水(0.687ml)中で30分間超音波処理して溶解させた。パルミチン酸ナトリウム(0.827mg)をｐH８．８の水(0.698ml)に、5分間の超音波処理により溶解させた。ＨＳＡｆｆの溶液(2.550ml)を５ｃｍセルに移してＣＤスペクトルを記録した。ダイアゼパム(51μl)を、セル中のＨＳＡｆｆに添加し、数回セルを回転させることにより混合物を穏やかに混合した。この混合物のＣＤスペクトルを記録した。この操作を２度繰り返し、毎回ＣＤスペクトルを記録した。次いで、セルを蒸留水とエタノールで徹底的に洗浄した。しかる後、蒸留水(2.705ml)を５ｃｍセルに注ぎ、ＣＤスペクトルを記録した。
【００１７】
ＣＤスペクトルは、窒素でフラッシュされたＪＡＳＣＯ製の分光偏光計Ｊ600を使用し、時定数４ｓ、スキャンスピード１０nm/分、バンド幅２nmの条件で記録した。結合ダイアゼパムの誘導ＣＤスペクトルは、ＨＡＳ−ダイアゼパム混合物のスペクトルからアルブミンのスペクトルを減算して得た。スペクトルは
Δε＝εＬ−εＲ（Ｍ−１ｃｍ−１）として報告された。
【００１８】
例２：グロブリンを含まないアルブミンのダイアゼパム置換による脂肪酸含量の分析
本質的にグロブリンを含まないヒト血清アルブミン（ＨＳＡｆａ）を、シグマ-アルドリッチ社から購入した(lot.105H9300)。
ＨＳＡｆａ(1.857mg)を蒸留水(3.095ml)に溶解させた。ダイアゼパム(0.088mg)を、蒸留水(0.687ml)中で30分間超音波処理して溶解させた。ＨＳＡｆａ溶液(2.705ml)を５ｃｍセルに移し、ＣＤスペクトルを記録した。ダイアゼパム(55μl)を、セル中のＨＳＡｆａに添加し、数回セルを回転させることにより混合物を穏やかに混合した。次いで、混合物のＣＤスペクトルを記録した。次に、セルを蒸留水とエタノールで徹底的に洗浄し、しかる後、蒸留水(2.705ml)を５ｃｍセルに注ぎ、ＣＤスペクトルを記録した。ＣＤパラメーターは、例1のとおりである。
【００１９】
例３：脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンへのダイアゼパムの結合
本質的に脂肪酸を含ず（約0.005％、これは0.0002M/Mアルブミンに相当する）、本質的にグロブリンも含まないウシ血清アルブミンＢＳＡｆｆ(lot.100K7415)は、シグマ-アルドリッチ社（英国、ドーセット）から購入した。
ＢＳＡｆｆ(1.914mg)を蒸留水(3.19ml)に溶解させ、濃度0.6mg/mlの溶液を得た。ダイアゼパム(0.422mg)を、蒸留水(3.297ml)中で30分間超音波処理し、濃度0.128mg/mlの溶液を得た。ＢＳＡｆｆ溶液(1.05ml)を２ｃｍセルに移し、ＣＤスペクトルを記録した。ダイアゼパム(22μl)をセル中のＢＳＡｆｆ溶液に加え、数回セルを回転させることにより混合物を穏やかに混合し、混合物のＣＤスペクトルを記録した。次に、セルを蒸留水とエタノールで徹底的に洗浄し、しかる後、蒸留水(1.10ml)を２ｃｍセルに注ぎ、ＣＤスペクトルを記録した。ＣＤパラメーターは、例1のとおりである。
【００２０】
上記の例1〜３の結果を以下に示す。
結果
ダイアゼパムと中間鎖脂肪酸が、アルブミンのサイトIIに結合することは知られている（T Peters, All about albumin, Academic Press, 1999, p116）。脂肪酸分子はＣＤ信号を発しないが、ダイアゼパムはアルブミンに結合した時だけＣＤ信号を示す。ここで、脂肪酸及び脂肪酸含有分子のアルブミンへの結合を示すマーカーとしてダイアゼパムを使用する。図1において、ダイアゼパムの誘導ＣＤスペクトルの強度が最も強いのは、脂肪酸を含むアルブミンＨＳＡｆａに結合した時よりも、脂肪酸を含まないアルブミンＨＳＡｆｆに結合した時である。２０６ｎｍでの強度Δεの値は、ＨＳＡｆｆで１１．３であり、ＨＳＡｆａで０．９であって、この値を誘導ＣＤの百分率で示すと、それぞれ１００％及び８％（0.9/11.3×100）に相当する。パルミチン酸は、少なくとも５個の長鎖脂肪酸結合サイトに結合し、その結合サイトの一つは、カリー等(Curry et al.)が報告しているように、アルブミンのサイトII近くに位置する（1998, Nature Structural Biology, 5,827-835）。ＨＳＡｆｆとダイアゼパムとの混合物（1：1）に、パルミチン酸を１モル、２モル及び３モル添加した場合の、ダイアゼパムの誘導ＣＤの百分率は、それぞれ８８．５％、６０．０％及び１８．６％である。アルブミン結合ダイアゼパムのパルミチン酸による置換は、パルミチン酸がサイトIIのリガンドに影響を及ぼすことを示している。図１に示すように、ＨＳＡｆｆ１モル当たり３モルを超えるパルミチン酸の付加させた後は（脂肪酸＞3M/M ＨＳＡｆｆ）、ダイアゼパムは殆ど結合サイトから外れる（図1）。ＨＳＡｆｆに結合したダイアゼパムの、カプリル酸ナトリウム5.4M/Mによる誘導ＣＤ（データの表示なし）が、ＨＳＡｆａに結合したダイアゼパムの誘導ＣＤと同一である事実は、低温殺菌でカプリル酸ナトリウムが5.4M/MでＨＳＡｆａに添加されることと一致する（Peters, All about albumin, Academic Press, 1996, p302）。脂肪酸含有分子の場合、特にRH01では、ダイアゼパムマーカー試験は、脂肪酸を含まないＨＳＡｆｆ-RH01コンプレックスの形成を立証するのに応用される。ＨＳＡｆｆ-ＤＺの１：１混合物（ＤＺはダイアゼパムを示す）に、RH01を異なるモル比で添加すると、誘導ＣＤが減少すること(データの表示なし)で例証されるダイアゼパムの置換は、脂質を含まないＨＳＡの薬剤担体特性を証明するものである。
【００２１】
それぞれの脂肪酸（カプリル酸）の含量を確かめるために、ダイアゼパムマーカー試験をバクスターＨＳＡ（Baxter Healthcare Ltd, Hyland Immuno, Wallingford Road, Compton, Newbury, Berks, RG20 7QW）及び脱脂バクスターＨＳＡに適用する。ダイアゼパムの誘導ＣＤの百分率は、バクスターＨＳＡ（脂肪酸5.4M/M）で８％であり、脱脂バクスターＨＳＡ（データなし）で１００％である。脱脂バクスターＨＳＡに結合したダイアゼパムの誘導ＣＤは、シグマＨＳＡｆｆに結合したダイアゼパムの誘導ＣＤと同一であって、このことは脱脂バクスターＨＳＡの脂肪酸含量が、0.0002M/Mより多くないことを示している。
【００２２】
脂肪酸を含まない組換えＨＳＡに結合したダイアゼパムについての試験では、図1でＨＳＡｆｆ-ＤＺ（１：１）について見られる誘導ＣＤと同様な誘導ＣＤが示されることを確かめた。
また、ダイアゼパムをＢＳＡｆｆ（脂肪酸0M/M）に結合させた試験では、ヒトアルブミンについて図1で見られると同様な誘導ＣＤ特性が認められた。これは脂質を含まないＢＳＡの薬剤担体特性を証明している。
【００２３】
例４：プロナーゼ（登録商標）存在下での脂質無含有アルブミンの、ＣＤによる安定性試験
蒸留水(3.93ml)に脂肪酸を含まないＨＳＡ(2.359mg)を溶かし、濃度0.60mg/mlの溶液を得た。プロナーゼ(0.363mg)を蒸留水(3.93ml)に溶かし、濃度0.60mg/mlの溶液を得た。
脂肪酸を含まないＨＳＡ溶液(0.2ml)を0.05ｃｍセルに収め、そのＣＤを記録した。次いで、セルを蒸留水とエタノールに念入りに洗浄した。脂肪酸を含まないＨＳＡ溶液(2.7ml)をガラス瓶に収め、これにプロナーゼ溶液(27μl)を添加した。混合物を穏やかに混合した後、200μlを0.05ｃｍセルに移した。次いでセルを３７℃でインキュベーション（保温）し、いろいろなインキュベーション時間間隔でＣＤを記録した。
【００２４】
ＣＤスペクトルは、窒素でフラッシュされたＪＡＳＣＯ製の分光偏光計Ｊ600を使用し、時定数４ｓ、スキャンスピード１０nm/分、バンド幅２nmの条件で記録した。ＣＤ信号とスキャニング波長１９０〜２６０ｎｍでＵＶ吸収を調べ、併せてＣＤ信号を得るために、経路長0.05ｃｍのセルを使用した。スペクトルは、アミノ酸の平均分子量１１３を使用し、Δε＝εＬ−εＲ（Ｍ−１ｃｍ−１）として報告された。
【００２５】
例５：プロナーゼ存在下での脂肪酸含有アルブミンの、ＣＤによる安定性試験
脂肪酸含有ＨＳＡ(0.888mg)を蒸留水(1.48ml)に溶かして濃度0.6mg/mlの溶液を得た。
プロナーゼ(0.085mg)を蒸留水(142ml)に溶かして濃度0.6mg/mlの溶液を得た。
例４の実験手順を繰り返した。
【００２６】
例６：プロナーゼ存在下でのミリストイル化ウンデカペプチドによる脂質無含有アルブミンの、ＣＤによる安定性試験
脂肪酸を含まないＨＳＡ(2.063mg)をトリスＨＣｌ 10ｍM緩衝液(0.344ml)に溶かし、濃度0.6mg/mlの溶液を得た。プロナーゼ(0.212mg)をトリスＨＣｌ 10ｍM緩衝液(0.353ml)に溶かし、濃度0.6mg/mlの溶液を得た。GS01(0.194mg)をトリスＨＣｌ 10ｍM緩衝液(231μl)に溶かし、濃度0.84mg/mlの溶液を得た。
脂肪酸を含まないＨＳＡ溶液(275μl)をガラス瓶に注ぎ、これにGS01(11μl)を加え、ゆっくり混合した。その混合物(200μl)を0.05ｃｍセルに移してＣＤスペクトルを記録した。セル中の混合物をガラス瓶に戻した。前記混合物(250μl)を別のガラス瓶に注ぎ、これにプロナーゼ溶液（2.5μl）を添加した。これを穏やかに混合し、その200μlを0.05ｃｍセルに移した。セルを３７℃でインキュベーションし、いろいろなインキュベーション時間間隔でＣＤを記録した。
例４の実験手順を繰り返した。
【００２７】
例７：プロナーゼ存在下でのミリストイル化ノナペプチドによる脂質無含有アルブミンの、ＣＤによる安定性試験
脂肪酸を含まないＨＳＡ(2.063mg)をトリスＨＣｌ 10ｍM緩衝液(0.344ml)に溶かし、濃度0.6mg/mlの溶液を得た。プロナーゼ(0.212mg)をトリスＨＣｌ 10ｍM緩衝液(0.353ml)に溶かし、濃度0.6mg/mlの溶液を得た。RH01(0.184mg)をトリスＨＣｌ 10ｍM緩衝液(153μl)に溶かし、濃度1.206mg/mlの溶液を得た。
脂肪酸を含まないＨＳＡ溶液(275μl)をガラス瓶に注ぎ、これにRH01(5.5μl)を加え、ゆっくり混合した。混合物(200μl)を0.05ｃｍセルに移してＣＤスペクトルを記録した。セル中の混合物をガラス瓶に戻した。前記混合物(250μl)を別のガラス瓶に注ぎ、これにプロナーゼ溶液（2.5μl）を添加した。これを穏やかに混合し、その200μlを0.05ｃｍセルに移した。セルを３７℃でインキュベーションし、いろいろなインキュベーション時間間隔でＣＤを記録した。
例４の実験手順を繰り返した。
【００２８】
例８：プロナーゼ存在下でのミリストイル化ウンデカペプチドによる脂肪酸含有アルブミンの、ＣＤによる安定性試験
脂肪酸含有ＨＳＡ(0.383mg)をトリスＨＣｌ 10ｍM緩衝液(638μl)に溶かし、濃度0.6mg/mlの溶液を得た。プロナーゼ(0.212mg)をトリスＨＣｌ 10ｍM緩衝液(0.353ml)に溶かし、濃度0.6mg/mlの溶液を得た。GS01(0.194mg)をトリスＨＣｌ 10ｍM緩衝液(231μl)に溶かし、濃度0.84mg/mlの溶液を得た。
脂肪酸含有ＨＳＡ溶液(275μl)をガラス瓶に注ぎ、これにGS01(11μl)を加え、ゆっくり混合した。混合物(200μl)を0.05ｃｍセルに移してＣＤスペクトルを記録した。セル中の混合物をガラス瓶に戻した。前記混合物(250μl)を別のガラス瓶に注ぎ、これにプロナーゼ溶液（2.5μl）を添加した。これを穏やかに混合し、その200μlを0.05ｃｍセルに移した。セルを３７℃でインキュベーションし、いろいろなインキュベーション時間間隔でＣＤを記録した。
例４の実験手順を繰り返した。
【００２９】
例９：プロナーゼ存在下でのミリストイル化ノナペプチドによる脂肪酸含有アルブミンの、ＣＤによる安定性試験
脂肪酸含有ＨＳＡ(0.383mg)をトリスＨＣｌ 10ｍM緩衝液(638μl)に溶かし、濃度0.6mg/mlの溶液を得た。プロナーゼ(0.212mg)をトリスＨＣｌ 10ｍM緩衝液(0.353ml)に溶かし、濃度0.6mg/mlの溶液を得た。RH01(0.184mg)をトリスＨＣｌ 10ｍM緩衝液(153μl)に溶かし、濃度1.206mg/mlの溶液を得た。
脂肪酸含有ＨＳＡ溶液(275μl)をガラス瓶に注ぎ、これにRH01(5.5μl)を加え、ゆっくり混合した。混合物(200μl)を0.05ｃｍセルに移してＣＤスペクトルを記録した。セル中の混合物をガラス瓶に戻した。前記混合物(250μl)を別のガラス瓶に注ぎ、これにプロナーゼ溶液（2.5μl）を添加した。これを穏やかに混合し、その200μlを0.05ｃｍセルに移した。セルを３７℃でインキュベーションし、いろいろなインキュベーション時間間隔でＣＤを記録した。
例４の実験手順を繰り返した。
【００３０】
例１０：プロナーゼ存在下でのTric 4.8による脂質無含有アルブミンの、ＣＤによる安定性試験
脂肪酸を含まないＨＳＡ(2.063mg)を水(3.44ml)に溶かして濃度0.6mg/mlの溶液を得た。プロナーゼ(0.212mg)を水10ｍM(0.353ml)に溶かし、濃度0.6mg/mlの溶液を得た。Tric 4.8(0.201mg)をメタノール(1ml)に溶かし、濃度0.20mg/mlの溶液を得た。
脂肪酸を含まないＨＳＡ溶液(300μl)をガラス瓶に注ぎ、これにTric 4.8(18μl)を添加して穏やかに混合した。混合物(200μl)を0.05ｃｍセルに移してＣＤスペクトルを記録した。セル中の混合物をガラス瓶に戻した。前記混合物(250μl)を別のガラス瓶に注ぎ、これにプロナーゼ溶液（2μl）を添加した。これを穏やかに混合し、その180μlを0.05ｃｍセルに移した。セルを３７℃でインキュベーションし、いろいろなインキュベーション時間間隔でＣＤを記録した。
【００３１】
例１１：プロナーゼ存在下でのTric 1.8による脂質無含有アルブミンの、ＣＤによる安定性試験
脂肪酸を含まないＨＳＡ(2.063mg)を水(3.44ml)に溶かして濃度0.6mg/mlの溶液を得た。プロナーゼ(0.212mg)を水10ｍM(0.353ml)に溶かし、濃度0.6mg/mlの溶液を得た。Tric 1.8(0.09mg)をメタノール(0.450ml)に溶かし、濃度0.20mg/mlの溶液を得た。
脂肪酸を含まないＨＳＡ溶液(300μl)をガラス瓶に注ぎ、これにTric 1.8(18μl)を添加して穏やかに混合した。混合物(200μl)を0.05ｃｍセルに移してＣＤスペクトルを記録した。セル中の混合物をガラス瓶に戻した。前記混合物(200μl)を別のガラス瓶に注ぎ、これにプロナーゼ溶液（2μl）を添加した。これを穏やかに混合し、その180μlを0.05ｃｍセルに移した。セルを３７℃でインキュベーションし、いろいろなインキュベーション時間間隔でＣＤを記録した。
例４の実験手順を繰り返した。
【００３２】
例１２：プロナーゼ存在下での市販Bax ＨＳＡ(バクスター・ヘスルセスケアー社製のヒト血清アルブミンの、ＣＤによる安定性試験
臨床用の免疫ヒト血清（Bax ＨＳＡ）の４．５％溶液（英国薬局方）は、上記バクスター社から購入した（Batch 033100I p20263Z）。Bax ＨＳＡは、アルブミンに対し5.4Ｍ／Ｍのカプリル酸塩に相当する3.6ミリモル/lのカプリル酸ナトリウムを含有し、さらに3.6ミリモル/lのアセチルトリプトファンナトリウム(sodium acetyltryptophanate)を含有する。
Bax ＨＳＡ(40μl)を水(2.96ml)に加えて濃度0.6mg/mlの溶液を得た。プロナーゼ(0.135mg)を水10ｍM(215μl)に溶かし、濃度0.6mg/mlの溶液を得た。
濃度0.6mg/mlのBax ＨＳＡ溶液(275μl)をガラス瓶に注ぎ、これにプロナーゼ溶液(2.5μl)を加えた。混合物を穏やかに混合し、その200μlを0.05ｃｍセルに移して３７℃でインキュベーションし、いろいろなインキュベーション時間間隔でＣＤスペクトルを記録した。
例４の実験手順を繰り返した。
【００３３】
例１３：市販の２．２１％脱脂（無脂質）バクスターヒト血清アルブミン（DBax ＨＳＡ）の、プロナーゼ存在下でのＣＤによる安定性試験
４．５％のBax ＨＳＡ(20ml)をビーカー内の０．９％ＮａＣｌ(2000ml)で透析した。０．９％ＮａＣｌ溶液は、２４時間で6回交換した。脱脂バクスターＨＳＡを収集し、参考例としてその濃度を４．５％ＨＳＡｆｆにて２７８ｎｍで分光器により測定した。脱脂バクスターＨＳＡの濃度は、２．２１％と算定された。
２．２１％のDBax ＨＳＡ(81μl)を水(2.9ml)に加えて濃度0.60mg/mlの溶液を得た。プロナーゼ(0.316mg)を水(527μl)に溶かして濃度0.60mg/mlの溶液を得た。
濃度0.60mg/mlのDBax ＨＳＡ溶液(1.2ml)を0.05ｃｍセルに収め、これにプロナーゼ溶液（12μl）を添加した。次いでセルを３７℃でインキュベーションし、いろいろなインキュベーション時間間隔でＣＤスペクトルを記録した。
例４の実験手順を繰り返した。
【００３４】
例１４：市販の２．２１％脱脂（無脂質）バクスターヒト血清アルブミン（DBax ＨＳＡ）とリポペプチドRH01との１：２混合物の、プロナーゼ存在下でのＣＤによる安定性試験
２．２１％のDBax ＨＳＡ(81μl)を水(2.9ml)に加えて濃度0.60mg/mlの溶液を得た。プロナーゼ(0.316mg)を水(527μl)に溶かして濃度0.60mg/mlの溶液を得た。RH01(0.322mg)を水(161μl)に溶かして濃度2mg/mlの溶液を得た。
濃度0.60mg/mlのDBax ＨＳＡ溶液(0.3ml)をガラス瓶に収め、これに濃度2mg/mlのRH01(3.5μl)を加えた。混合物を穏やかに攪拌し、その250μlを0.05ｃｍセルに移してＣＤスペクトルを記録した。セル中の混合物をガラス瓶に戻した。次に混合物(250μl)を別のガラス瓶に移し、これにプロナーゼ溶液（2.5μl）を添加した。この混合物を穏やかに攪拌し、混合物の180μlを0.05ｃｍセルに移した。次いでセルを３７℃でインキュベーションし、いろいろなインキュベーション時間間隔でＣＤスペクトルを記録した
例４の実験手順を繰り返した。
【００３５】
上記の例４〜１４の結果を以下に示す。
結果
プロナーゼ存在下でのインキュベーションでは、アルブミンの遠紫外ＣＤスベクトル強度の全体としての減少が、酵素分解の程度に符合する。この事実は、インキュベーション時間に対して２７８ｎｍでのＣＤ強度をプロットすることで図示することができる（図２参照）。ＣＤスペクトルは時間の関数として１５分毎に記録した。
各実験での酵素分解に対する安定性は、６０分でのΔεの値を、時間ゼロでのΔεの値で除して算出する。
ＨＳＡｆｆ+リポペプチド(Tric 1.8及びTric 4.8)の混合物では、安定性は８８％であり、これは１２％の酵素分解に対応する。
ＨＳＡｆａ+リポペプチド(GS01及びRH01)の混合物での安定性は８８％であり、これは１２％の酵素分解に対応する（１００−８８）。
ＨＳＡｆａについての安定性は８７％であり、酵素分解は１３％である。
ＨＳＡｆｆ+リポペプチド(GS01及びRH01)の混合物での安定性は７８％であり、これは２２％の酵素分解に対応する。
ＨＳＡｆｆについての安定性は５１％であり、これは４９％の酵素分解に相当する。
【００３６】
プロナーゼが存在する(l/100w/w)水中での脂肪酸含有ＨＳＡ及び脂肪酸無含有ＨＳＡ
時間の関数としてプロナーゼを用いたインキュベーションでは、２７８ｎｍでのＣＤの全体的な強度が、ＨＳＡｆａでよりもＨＳＡｆｆで大きく減少することが認められた。プロナーゼ分解に対するＨＳＡｆａの安定性は８７％であり、ＨＳＡｆｆのそれは５１％であって、これはアルブミンに結合した脂肪酸分子が実質的な安定化効果を有するとの知見（（Peters, All about albumin, Academic Press, 1995, p249）と符合する。
【００３７】
プロナーゼが存在する(l/100w/w)トリスＨＣｌ 10ｍM緩衝液中でのGS01(1:2)及びRH01(1:2)が存在するＨＳＡｆａ及びＨＳＡｆｆ並びに水中でのTric 1.8及びTric 4.8が存在するＨＳＡｆｆ
プロナーゼを用いたインキュベーションでは、GS01及びRH01を混合したＨＳＡｆａは、ＨＳＡｆａ単独の場合と同様な分解傾向を示した。この観測結果は、リポペプチドがＨＳＡｆａに対してさらなる安定性を与えていないことを示している。
リポペプチドはGS01及びRH01の両方とも、ＨＳＡｆｆの安定性を５１％から７８％に向上させ、Tric 1.8及びTric 4.8の両方とも、同じく８９％に向上させ、リポペプチド自体はＨＳＡｆｆによって安定化される。このことは、後述の例１５で示すように、リポペプチド含有ＨＳＡｆｆの配合が抗菌活性を向上させることと符合する。
【００３８】
プロナーゼ存在下(l/100w/w)でのバクスターＨＳＡ(Bax ＨＳＡ)と脱脂バクスターＨＳＡ(DBax ＨＳＡ)
４．５％のBax ＨＳＡは、安定剤として3.6mmol/Lのアセチルトリプトファンナトリウムと、3.6mmol/Lのカプリル酸ナトリウムを含有している。時間の関数としてプロナーゼを用いたインキュベーションでは、ＣＤの全体的な強度がBax ＨＳＡよりも脂肪を含まないDBax ＨＳＡで大きく減少することが認められた。こことは脂肪を含まないDBax ＨＳＡよりもBax ＨＳＡの方が、プロナーゼ分解に対して安定であることを意味する。Bax ＨＳＡの酵素分解に対する安定性は、ＨＳＡｆａのそれに類似し、脂肪を含まないDBax ＨＳＡの安定性は、ＨＳＡｆｆのそれに類似する。
【００３９】
プロナーゼ存在下(l/100w/w)での脱脂バクスターＨＳＡ(DBax ＨＳＡ)とRH01(1:2)
リポペプチドRH01は、ＨＳＡｆｆと同じように、脂肪を含まないDBax ＨＳＡを安定化させ、当該ポリペプチド自体はDBax ＨＳＡによって安定化される。
以下の例１５〜２７の結果を例２７の後に示す。
【００４０】
例１５：リポペプチドを含む脂肪無含有アルブミンの抗菌活性
ヒト血清アルブミンをシグマ-アルドリッチ社から購入した(lot.32H9300)。本質的にグロブリンを含まず、脂肪酸も含まないこのヒト血清アルブミンＨＳＡｆｆ(25mg)に、RH01(3mg)を添加した。この混合物に無菌のリン酸塩緩衝塩水ＰＢＳ(1.5ml)を無菌状態で添加した。得られた溶液の抗菌性を、エス・アウレウス(S. aureus)及びイー・コリ(E. coli)にて下記のように検定した。
【００４１】
細菌株検定
細菌スタフィロコッカズ・アウレウスＮＣＴＣオックスフォード及び細菌エッシリア・コリ0111-ＮＣＴＣ8007は、イギリス・コリンデールにあるナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチュアーズ(National Collection of Type Cultures)から得た。各試料のＭＩＣ（最小阻害濃度）は、９６枚のウエルプレートで測定した。ＰＢＳを添加した上記試料を微小滴定ウエル内に収め、これに培地ＲＰＭＩ-1640を逐次添加して、最終容量100μl中のRH01の濃度が２mg/mlから0.00375 mg/mlに、又は１mg/mlから0.00375 mg/mlに、又は0.5 mg/mlから0.00375 mg/mlになるように希釈した。細菌を標準培地内において３７℃で一晩インキュベーションして細菌数を約１０８個／ｍｌとし、その１０μlを各ウエルプレートに添加した。プレートを３７℃で一晩インキュベーションし、細菌の成長をペレットの形成で測定した。各試料のＭＩＣは、細菌の成長を完全に阻害するのに要する濃度として３回測定した。
【００４２】
例１６：アルブミン１モルあたり６モルのリポペプチドRH01を加えた脂肪酸含有アルブミンの抗菌活性
シグマ-アルドリッチ社から購入した、本質的にグロブリンを含まないヒト血清アルブミン(lot.105H9300)ＨＳＡｆａ(25mg)に、RH01(3mg)を添加した。この混合物に無菌のリン酸塩緩衝塩水ＰＢＳ(1.5ml)を無菌状態で添加した。得られた溶液の抗菌性を、エス・アウレウス(S. aureus)及びイー・コリ(E. coli)にて検定した。
使用した菌株は、例１５と同じである。
【００４３】
例１７：リポペプチドRH01自体の抗菌活性
RH01(3mg)をガラス瓶に収めた。これに無菌のリン酸塩緩衝塩水ＰＢＳ(1.5ml)を無菌状態で添加した。この溶液の抗菌性を、エス・アウレウス(S. aureus)及びイー・コリ(E. coli)にて検定した。
使用した菌株は、例１５と同じである。
【００４４】
例１８：アルブミン１モルあたり０．７モル、０．８モル、１モルのパルミチン酸が存在する条件でのリポペプチドRH01を加えた脂肪酸無含有アルブミンの抗菌活性
パルミチン酸ナトリウムＰＡ(0.63mg)をエタノール(439μl)に溶かし、５分間超音波処理した。アルブミンと脂肪酸の混合物中で1時間半インキュベーションすると、脂肪酸は通常、アルブミンと平衡になる。
ＨＳＡｆｆ(5.064mg)をＰＢＳ(560μl)に溶かし、これにＰＡのエタノール溶液(15μl)を加えてゆっくり攪拌し、１．５時間放置した。ＨＳＡｆｆ＋ＰＡ溶液(509μl)を、RH01(0.0491mg)含有ガラス瓶に添加してゆっくり攪拌し、室温で３０分間放置してRH01：ＨＳＡｆｆ：ＰＡのモル比が６：１：１の溶液を得た。同様にして、前記のモル比が６：１：０．７の溶液並びに６：１：０．８の溶液を得た。
エス・アウレウス(S. aureus)及びイー・コリ(E. coli)を使用して各溶液の抗菌活性を例１５と同様に測定した。
【００４５】
例１９：アルブミン１モルあたり２モルのパルミチン酸が存在する条件でのリポペプチドRH01を加えた脂肪酸無含有アルブミンの抗菌活性
パルミチン酸ナトリウムＰＡ(0.63mg)をエタノール(439μl)に溶かし、５分間超音波処理した。
ＨＳＡｆｆ(5.296mg)をＰＢＳ(571μl)に溶かし、これにＰＡのエタノール溶液(31μl)を加えてゆっくり攪拌し、１．５時間放置した。ＨＳＡｆｆ＋ＰＡ溶液(527μl)を、RH01(0.527mg)含有ガラス瓶に添加してゆっくり攪拌し、室温で３０分間放置してRH01：ＨＳＡｆｆ：ＰＡのモル比が６：１：２の溶液を得た。エス・アウレウスを使用してこの溶液の抗菌活性を例１５と同様に測定した。
【００４６】
例２０：アルブミン１モルあたり４モルのパルミチン酸が存在する条件でのリポペプチドRH01を加えた脂肪酸無含有アルブミンの抗菌活性
パルミチン酸ナトリウムＰＡ(0.63mg)をエタノール(439μl)に溶かし、５分間超音波処理した。
ＨＳＡｆｆ(5.695mg)をＰＢＳ(578μl)に溶かし、これにＰＡのエタノール溶液(65μl)を加えてゆっくり攪拌し、１．５時間放置した。ＨＳＡｆｆ＋ＰＡ溶液(591μl)を、RH01(0.591mg)含有ガラス瓶に添加してゆっくり攪拌し、室温で３０分間放置してRH01：ＨＳＡｆｆ：ＰＡのモル比が６：１：４の溶液を得た。エス・アウレウスを使用してこの溶液の抗菌活性を例１５と同様に測定した。
【００４７】
例２１：リポペプチド１モルあたり１モルのパルミチン酸が存在する条件でのリポペプチドの抗菌活性
パルミチン酸ナトリウムＰＡ(0.848mg)をエタノール(586μl)に溶かし、５分間超音波処理した。
RH01(2.171mg)をＰＢＳ(2.171ml)に溶かし、その溶液(600μl)にＰＡのエタノール溶液(15μl)を加えてゆっくり攪拌し、１．５時間放置してRH01：ＰＡのモル比が１：１の混合物を得た。このものの抗菌活性を、例１５と同様、エス・アウレウスを使用して測定した。
【００４８】
例２２：パルミチン酸単独の抗菌活性
パルミチン酸ナトリウムＰＡ(0.63mg)をエタノール(439μl)に溶かし、５分間超音波処理した。
ＰＡのエタノール溶液(60μl)をＰＢＳ(600μl)加えてゆっくり攪拌し、３７℃で２時間放置した。別の試料を調製し、室温で２時間放置した。試料の抗菌活性を例１５と同様、エス・アウレウスを使用して測定した。
【００４９】
例２３：酸単独の抗菌活性
カプリル酸ナトリウムＣＡ(0.344mg)を蒸留水(5.73ml)に溶かした。
ＣＡ(60μl)をＰＢＳ(600μl)加えてゆっくり攪拌し、３７℃で２時間放置した。別の試料を調製し、室温で２時間放置した。試料の抗菌活性を例１５と同様、エス・アウレウスを使用して測定した。
【００５０】
例２４：リポペプチド１モルあたり１モルのカプリル酸を加えたリポペプチドRH01の抗菌活性
RH01(3mg)をカプリル酸ナトリウム(0.107mg)に添加した。これに無菌のＰＢＳ(1.5ml)を無菌状態で加えてRH01：ＣＡのモル比が１：１の溶液を得た。この溶液の抗菌活性を、例１５と同様に、エス・アウレウスとイー・コリを用いて測定した。
【００５１】
例２５：アルブミン１モルあたり６モルのカプリル酸が存在する条件でのリポペプチドRH01を加えた脂肪酸無含有アルブミンの抗菌活性
カプリル酸ナトリウム(0.1mg)とＨＳＡＦＦ(25.3mg)の混合物にRH01(3mg)を添加し、得られた混合物に無菌のＰＢＳ(1.5ml)を無菌状態で加えてRH01：ＨＳＡｆｆ：ＣＡのモル比が６：１：６の溶液を得た。この溶液の抗菌活性を、例１５と同様に、エス・アウレウスとイー・コリを用いて測定した。
【００５２】
例２６：アルブミン１モルあたり６モルのリポペプチドRH01を加えた市販バクスターＨＳＡ（Bax ＨＳＡ）の抗菌活性
RH01(0.338mg)を無菌のリン酸塩緩衝塩水(610μl)に溶かした。４．５％のBax ＨＳＡ(66μl)をRH01溶液に加え、RH01：Bax ＨＳＡのモル比が６：１であり、RH01濃度が0.5mg/mlの溶液を得た。例１５と同様にイー・コリを用いてこの溶液の抗菌活性を測定した。
【００５３】
例２７：アルブミン１モルあたり６モルのリポペプチドRH01を加えた脱脂バクスターＨＳＡ（DBax ＨＳＡ）の抗菌活性
RH01(0.382mg)を無菌のリン酸塩緩衝塩水(611μl)に溶かした。２．２１％のDBax ＨＳＡ(153μl)をRH01溶液に加え、RH01：DBax ＨＳＡのモル比が６：１であり、RH01濃度が0.5mg/mlの溶液を得た。例１５と同様にイー・コリを用いてこの溶液の抗菌活性を測定した。
【００５４】
結果
測定された最小阻害濃度(μＭ)を下の表１に示す。
【表１】
2004521911.tif 000002
【００５５】
イー・コリ及びエス・アウレウスに対する抗菌性RH01の最小阻害濃度は、RH01単独の場合及びＨＳＡｆａと共存する場合に比較して、ＨＳＡｆｆと共存する場合に低い値になる。
この結果は、ＨＳＡｆｆがRH01の抗菌活性を増大させることを示す。このリポペプチドとＨＳＡｆｆとの併用は、リポペプチド単独及びＨＳＡｆａとの併用の場合に比較して、効能が２倍である。このことから、１回の投与量は半分に減少し、脂肪酸を含有する外因性標準アルブミン（ＨＳＡｆａ）が、リポペプチドRH01と組み合わせて使用する際には、効力に有益な影響を及ぼさないことを示している。
【００５６】
【表２】
2004521911.tif 000003
【００５７】
表２には、リポペプチドとＨＳＡｆｆの混合物に脂肪酸（パルミチン酸）を添加した場合、最小阻害濃度が、パルミチン酸濃度の上昇に連れて４倍に増大することを示し、これはRH01の抗菌活性の減少に一致する。ＨＳＡｆｆとRH01の混合物中のＨＳＡｆｆ１モル当たりパルミチン酸をそれぞれ０．７モル、０．８モル及び１モル加えて場合効力が、RH01＋ＨＳＡｆａのそれと同程度であることは重要である。このことは、アルブミン１モル当たり００．７モルより少ない脂肪酸を含有するアルブミンで、最良の結果が達成できることを意味する。
【００５８】
【表３】
2004521911.tif 000004
【００５９】
イー・コリに対する抗菌性RH01の最小阻害濃度は、Bax HAS と共存する場合に比較して、DBax HAS と共存する場合の方が低いことを表３は示している。カプリル酸ナトリウムを含有する市販のバクスターＨＳＡは、脂肪酸を含有するＨＳＡｆａと同様に挙動し、脱脂バクスターＨＳＡは、脂肪酸を含有しないＨＳＡｆｆと同様な挙動を示す。
このことは、表１に示したＨＳＡｆｆとＨＳＡｆａの結果と一致する。
【００６０】
このリポペプチドペプチドモデルの場合、ＨＳＡｆｆ及びDBax HSAの脂肪酸結合サイトに、ペプチドが結合した結果、バクテリア酵素による加水分解に耐性を示し、低濃度でも抗菌活性を発揮することができる。ＨＳＡｆａ及びバクスターＨＳＡと共にペプチドを使用すると、その最小阻害濃度はペプチド単独の場合と同じであり、殆どのペプチドは未結合状態にあって、バクテリアによる酵素分解の影響を受けやすいため、ＨＳＡｆａはペプチドの安定性に貢献しない。脂肪酸パルミチン酸塩を添加すると、結合リポペプチドの置換でサンプルの抗菌活性は減少して、バクテリアによる酵素加水分解により敏感になる。このことは、先に例に示したＨＳＡ上のリポペプチドの相互安定化作用と一致する。
【００６１】
本発明はまた、上述した種類のペプチド及び後述するペプチドの抗菌物質としての使用に関する。
伝染と自己免疫が、最も普通で手におえない原因である。最近の利用可能な治療と薬剤は、治療効力が不充分であることの兆候を示している。病原菌は、既存の薬剤に対する防御機構を、突然変異によってますます進化させつつある。利用可能な既存の殆どの抗生物に対して免疫性のあるスーパー細菌は、既に緊急事態である。この問題を解消できる新種薬剤の開発は、人類の途切れることない幸福にとって極めて重要である。これまでに充分には開発されていなかった薬剤の一種である抗菌性ペプチドが、ここに出現した。
【００６２】
本発明者等は、ここに記したペプチドが抗菌性であって、細菌膜に作用することを見出した。この抗菌機能は、病原菌耐性の変化や突然変異に影響を受け難く、従って、新しい抗菌剤として良好な効力が保証される。これらのペプチドを、アミノ酸に対する標準的な英文字記号で以下に示す。
【００６３】
抗菌活性を有する典型的なペプチドは、次のような配列を持ち、
ＦＡＲＫＧＡＬＲＱ（配列アイ・ディーＮＯ．１）
これには次のものが含まれる。
ＫＦＡＲＫＧＡＬＲＱＫＮＫ（配列アイ・ディーＮＯ．２）
ＫＦＡＲＫＧＡＬＲＫＫＮＫ（配列アイ・ディーＮＯ．３）
ＫＦＫＲＫＧＡＬＲＱＫＮＫ（配列アイ・ディーＮＯ．４）
【００６４】
これらは次のようなアシル化ペプチド又はペプチド誘導体であって差し支えない。
ＲＨ０１、ミリストイル化ＦＡＲＫＧＡＬＲＱ
ＲＨ０２、（Ｐｍ）ＫＦＡＲＫＧＡＬＲＱＫＮＫ（Ｐｍ）―アミド
ＲＨ０３、（Ｐｍ）ＫＦＡＲＫＧＡＬＲＫ（Ｐｍ）ＫＮＫ（Ｐｍ）―アミド
ＲＨ０４、ＫＦＫＲＫＧＡＬＲＱＫＮＫ―アミド
ここで、Ｐｍはパルミトイル基を示す。
【００６５】
ここで抗菌とは、本発明のペプチドが、細菌、真菌、ウイルスなどのような微生物の成長乃至は増殖を阻害、阻止又は潰滅させることを意味ずる。
【００６６】
最小阻害濃度（ＭＩＣ）
本発明において、ペプチドＲＨ０１、ＲＨ０２、ＲＨ０３及びＲＨ０４の最小阻害濃度は、グラム陰性菌エッシリア・コリ及びグラム陽性菌スタフィロコッカス・アウレウスにて評価した。
【００６７】
例２８：ＲＨ０１の合成
上記ペプチドは、tert-ブチロキシカルボニルＢＯＣ/トリフルオロ酢酸ＴＦＡを用いる固相ペプチド合成装置（Applied Biosystems 430A）にて、標準的手法で合成した。クロルメチル化樹脂(Fluka)(0.5mmol)を使用した。合成にはＬ-アミノ酸（２mmol）を、トシル基で保護されたアルギニン及びクロルベンジルオキシカルビノール基で保護されたリシンの各アミノ酸と共に使用した。末端Ｎ−ＢＯＣフェニルアラニン残渣を含有する前記樹脂(0.73g)を、トリフルオロ酸酸のジクロルメタン溶液(50%)(30ml)で脱保護し、1時間攪拌した。この樹脂をロ別し、毎回30mlのジクロルメタンで３回洗浄した。次に樹脂をＮ,Ｎ-ジイソプロピルエタノールアミン、ＤＩＥＡ(30ml)で３回洗浄し、最後にジクロルメタン(30ml)で３回洗浄した。洗浄した樹脂に、ミリスチン酸(0.285g)、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム  ヘキサフルオロホスホネートＢＯＰ(1.1g)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールＨＯＢｔ(0.333g)、ＤＩＥＡ(1.375g,1.85ml)及びＮ−メチルピロリドンＮＭＰ(30ml)を加えて、混合物を２時間攪拌した。次いで樹脂をロ別し、ジクロルメタン(30ml)で洗浄した。無水のフッ化水素ＨＦ(10ml)で粗製のペプチドを樹脂から解放した。
用意のＣ18 ＲＰ−ヌクレオジル・カラムを使用して粗製ペプチドを精製した。採用したＨＰＬＣ分析条件は、0.05％ＴＦＡの０〜１００％の溶媒勾配と、３０分間のアセトニトリル水溶液(50%)であった。２１５ｎｍ    での吸光度をモニターすることでペプチドを検出した。
ペプチドの主たる特性記述は、飛行時間型血漿脱着質量分析法を用いて行った。
【００６８】
例２９：ＲＨ０２の合成
上記ペプチドの合成には、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂と、Boc-Fmoc-リシンと、パルミチン酸を使用し、例２８と同じように固相合成法を採用した。Fmoc-リシンを含有するペプチド樹脂を反応器に収め、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に２０％のピペリジンを溶かした溶液を反応器に加えた。混合物を２０分間反応させた。次いで樹脂をロ別し、ＤＭＦ(30ml)で３回、ＤＣＭ(30ml)で３回洗浄した。洗浄した樹脂に、パルミチン酸(0.128g)。ＢＯＰ(0.354g)、ＨＯＢｔ(0.108g)、ＤＩＥＡ(0.44g,0.6ml)及びＮ−メチルピロリドンＮＭＰ(5ml)をそれぞれ加え、混合物を２時間攪拌した。次に樹脂をロ別し、ジクロルメタン(30ml)で洗浄した。無水のフッ化水素ＨＦ(10ml)により、粗製のペプチドを樹脂から解放した。
【００６９】
例３０：ＲＨ０３の合成
例２８及び例２９のように、固相でペプチドを合成した。
例３１：ＲＨ０４の合成
４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂を用いて例２８のようにペプチドを合成した。
【００７０】
例３２：ＲＨ０１の抗菌活性
無菌条件下にRH01(3mg)を無菌のリン酸塩緩衝塩水ＰＢＳ(1.5ml)に溶かし、３７℃又は２５℃で３０分間放置した。この溶液の抗菌性を、エス・アウレウス(S. aureus)及びイー・コリ(E. coli)にて検定した。
【００７１】
菌株
細菌スタフィロコッカズ・アウレウスＮＣＴＣオックスフォード及び細菌エッシリア・コリ0111-ＮＣＴＣ8007は、イギリス・コリンデールにあるナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カルチュアーズ(National Collection of Type Cultures)から得た。各試料のＭＩＣ（最小阻害濃度）は、９６枚のウエルプレートで測定した。ＰＢＳを添加したRH01を微小滴定ウエル内に収め、これに培地ＲＰＭＩ-1640を逐次添加して、最終容量100μl中のRH01の濃度が２mg/mlから0.00375mg/mlになるように希釈した。細菌を標準培地内において３７℃で一晩インキュベーションして細菌数を約１０８個／ｍｌとし、その１０μlを各ウエルプレートに添加した。プレートを３７℃で一晩インキュベーションし、細菌の成長をペレットの形成で測定した。各試料のＭＩＣは、細菌の成長を完全に阻害するのに要する濃度として３回測定した。
【００７２】
例３３：ＲＨ０２の抗菌活性
無菌条件下にRH02(1.368mg)を無菌のリン酸塩緩衝塩水ＰＢＳ(684μl)に溶かし、３７℃で３０分間放置した。この溶液の抗菌性を、例３２に倣ってエス・アウレウス(S. aureus)及びイー・コリ(E. coli)で検定した。
【００７３】
例３４：ＲＨ０３の抗菌活性
無菌条件下にRH03(1.452mg)を無菌のリン酸塩緩衝塩水ＰＢＳ(726μl)に溶かし、３７℃で３０分間放置した。この溶液の抗菌性を、例３２に倣ってエス・アウレウス(S. aureus)及びイー・コリ(E. coli)で検定した。
【００７４】
例３５：ＲＨ０４の抗菌活性
無菌条件下にRH04(1.716mg)を無菌のリン酸塩緩衝塩水ＰＢＳ(858μl)に溶かし、３７℃で３０分間放置した。この溶液の抗菌性を、例３２に倣ってエス・アウレウス(S. aureus)及びイー・コリ(E. coli)で検定した。
【００７５】
表４の結果は、ペプチドが抗菌性を備えていることを示している。
【表４】
2004521911.tif 000005
【００７６】
上記した以外の有用なペプチドは、下記の配列を有するペプチドである。
ＤＶＡＮＲＦＡＲＫＧＡＬＲＱＫＮＶＨＥＶＫ（配列アイ・ディーＮＯ．５）
ＥＳＴＶＲＦＡＲＫＧＡＬＲＱＫＮＶＨＥＶＫ（配列アイ・ディーＮＯ．６）
これらのペプチドは、Ｃ末端又はＮ末端及び/又は適当なアミノ酸側鎖でアシル化可能である。さらにまた、これらのペプチドは、Ｃ末端及び/又は適当なアミノ酸側鎖でエステル化することもできる。
本発明のペプチドは、１回当たり１ｍｇ〜１ｇの範囲、好ましくは５０ｍｇないしｇの範囲の投与量で、経口的に、吸引式に（口又は鼻を経由）、経皮的に、非経口的に、あるいはその他の粘膜経由（膣、直腸、眼及口内の粘膜）で服用させることできる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】パルミチン酸（ＰＡ）による結合ダイアゼパム（ＤＺ）のアルブミン（ＨＳＡｆｆ及びＨＳＡｆａ）への置換を示すグラフである。
【図２】分解条件下、プロナーゼ（ｌ/100ｗ/ｗ）でインキュベーションされたアルブミン（ＨＳＡｆｆ及びＨＳＡｆａ）に及ぼすリポペプチドGS01，RH01，Tric 1.8及びTric 4.8の影響を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年9月17日(2003.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂質であるタグ付け基（tagging group）が共有結合した対生物活性物質からなり、アルブミン１モル当たり０．５モルより多くない比率で脂質残基を当初含有するアルブミンに、前記のタグ付き対生物活性物質が非共有結合で結合した外因性調合薬。
【請求項２】
アルブミンが当初実質的に脂肪を含まない請求項１記載の外因性調合薬。
【請求項３】
ヒトに使用する請求項１〜２の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項４】
獣（家畜）に使用する請求項１〜２の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項５】
アルブミンが血清アルブミンである先行請求項の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項６】
アルブミンがヒト血清アルブミンである先行請求項の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項７】
アルブミンが組換え血清アルブミンである先行請求項の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項８】
対生物活性物質がペプチド又はタンパク質である先行請求項の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項９】
対生物活性物質が次の群から選ばれるペプチドである請求項９記載の外因性調合薬。
ＦＡＲＫＧＡＬＲＱ（配列アイ・ディーＮＯ．１）
【請求項１０】
対生物活性物質がワクチン抗原である先行請求項の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項１１】
脂質のタグ付け基がＣ４〜Ｃ１６の単鎖脂肪酸である先行請求項の何れかに記載の外因性調合薬。
【請求項１２】
脂質であるタグ付け基（tagging group）に共有結合した対生物活性物質からなり、当該物質がアルブミンに非共有結合で結合した外因性組成物を調製するに際し、アルブミン１モル当たり０．５モルより多くない比率で脂質残基を当初含有するアルブミンを使用すること。
【請求項１３】
使用するアルブミンが実質的に脂肪酸残基を含まない請求項１２記載の使用。
【請求項１４】
アルブミン１モル当たり０．７モルより多くない比率で脂質残基を当初含有するアルブミンにリポペプチド又はリポタンパク質を合体させることを包含するリポペプチド又はリポタンパク質とその担体であるアルブミンとに相互安定性を付与する方法。
【請求項１５】
マーカー物質の置換と円二色性分光法でアルブミンの噛合さん含量を測定する方法。
【請求項１６】
配列ＦＡＲＫＧＡＬＲＱ（配列アイ・ディーＮＯ．１）を備えたペプチドの抗菌的使用。
【請求項１７】
ペプチドが次に記すものから選ばれる配列を備えている請求項１６記載のペプチドの使用。
ＫＦＡＲＫＧＡＬＲＱＫＮＫ（配列アイ・ディーＮＯ．２）
ＫＦＡＲＫＧＡＬＲＫＫＮＫ（配列アイ・ディーＮＯ．３）
ＫＦＫＲＫＧＡＬＲＱＫＮＫ（配列アイ・ディーＮＯ．４）
ＤＶＡＮＲＦＡＲＫＧＡＬＲＱＫＮＶＨＥＶＫ（配列アイ・ディーＮＯ．５）
ＥＳＴＶＲＦＡＲＫＧＡＬＲＱＫＮＶＨＥＶＫ（配列アイ・ディーＮＯ．６）
【請求項１８】
ペプチドがＮ末端及び／又はＣ末端及び／又は適当なアミノ酸側鎖で、エステル化又は誘導体を形成した請求項１６又は１７記載のペプチドの使用。
【請求項１９】
ペプチドがＣ末端及び／又は適当なアミノ酸側鎖で、エステル化又は誘導体を形成した請求項１６又は１７記載のペプチドの使用。
【請求項２０】
ヒト用薬剤の調製に請求項１６〜１９の何れかに記載したペプチドの使用。
【請求項２１】
獣（家畜）用薬剤の調製に請求項１６〜１９の何れかに記載したペプチドの使用。
【請求項２２】
農業用に請求項１６〜１９の何れかに記載したペプチドの使用。
【請求項２３】
請求項１６〜１９の何れかに記載したペプチドを含有する製薬用、獣（家畜）用又は農業用組成物。
【請求項２４】
先行請求項の何れかに記載したペプチドを使用して細菌の成長又は増殖を阻害、防止又は阻止する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
もし、使用するアルブミンに当初含まれる脂肪酸比率が、内因性調剤で以前に企図されたよりかなり低ければ、すなわち、アルブミン１モルに対する割合で０.５モルより多くなければ、タグ付け（標識化）した生物活性物質を外因的調剤の形でアルブミンとうまく合体できることを、本発明者等は見出した。最良の結果が得られるのは、使用するアルブミンが実質的に脂肪酸基を含まない場合であって、この場合には、脂肪酸でタグ付けされた薬剤は、脂肪酸を含まないアルブミンの利用可能な結合サイトの全て又は大部分を利用する。比較的脂質の少ないアルブミンは、商業的に入手できるほか、公知の方法を使用してアルブミンの脂肪酸含量を、所望値に調節することもできる。




【国際調査報告】
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2004521911.tif 000047
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