(57)【要約】本発明は、組織および器官流体との高い適合性を示す新たなクラスの化合物を提供する。係る新たな化合物は、糖構造に共有結合したニトロ基を含む多糖である。特に、本発明は、糖構造に共有結合したニトロ基−ＯＮＯ２を含む、必須にウロン酸および／またはヘキソサミンの単位からなる多糖を提供する。好ましくは、本発明に係る多糖は、主にウロン酸とヘキソサミンとからなる二糖繰り返し単位からなる。特に、これらの化合物は、治療に有効なレベルで生物学的流体／組織中にＮＯを放出することができる。生物活性ＮＯは、生物学的ターゲットに選択的に放出されて、全身的な望ましくない事象の危険性を避けることができる。また、本発明に係る化合物は、ヘパリンの治療的使用に典型的に関与する副作用を顕著に低減する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖構造に共有結合したニトロ基−ＯＮＯ２を含むことを特徴とする、必須にウロン酸とヘキソサミンの単位からなる多糖。
【請求項２】
主にウロン酸とヘキソサミンからなる二糖繰り返し単位からなる、請求項１記載の多糖。
【請求項３】
糖単位の総数が２から１００の間である、請求項１または２記載の多糖。
【請求項４】
糖単位の総数が２（二糖）であり、かつ、その二つの糖の少なくとも一方がウロン酸またはヘキソサミン単位のいずれかである、請求項１記載の多糖。
【請求項５】
ウロン酸およびヘキソサミン単位からなる請求項４記載の二糖。
【請求項６】
糖単位の総数が４から７０の間である、請求項３記載の多糖。
【請求項７】
糖単位とニトロ基との間の当量比が２０：１から２：３である、請求項１ないし６のいずれか一項に記載の多糖。
【請求項８】
糖単位とニトロ基との間の当量比が１０：１から１：１の間である、請求項７記載の多糖。
【請求項９】
ニトロ基が、以下の位置：
ヘキソサミンの６位のＣＨ２ＯＨ、ヘキソサミンとウロン酸の３位のＣＨＯＨ、ウロン酸の６位のカルボキシ基、（脱硫酸化）ウロン酸の２位のＣＨＯＨ、および脱硫酸化または脱アセチル化ヘキソサミンのＮＨ２
の一つの反応により導入される、請求項１ないし８のいずれか一項に記載の多糖。
【請求項１０】
５００から２１０００Ｄの間の分子量を備えたヘパリンまたは解重合ヘパリンである、請求項１ないし９のいずれか一項に記載の多糖。
【請求項１１】
ニトロ基が、ニトロ化混合物を用いた直接的ニトロ化により導入される、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の多糖。
【請求項１２】
ニトロ基が、ポリマー鎖とニトロ基との間のスペーサーとして作用する二価の基Ｒを介して糖構造に共有結合し、ここでＲが、Ｃ２−Ｃ２０脂肪族または芳香族炭化水素、エーテル、ポリエーテル、カルボン酸またはその誘導体である、請求項１ないし１０のいずれか一項に記載の多糖。
【請求項１３】
医薬として使用するための、糖構造に共有結合したニトロ基−ＯＮＯ２を含む、必須にウロン酸および／またはヘキソサミンの単位からなる多糖。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウロン酸とヘキソサミン残基からなる繰り返し単位を含む多糖のニトロ誘導体に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＮＯが、種々の生理学的および病理学的状態において重要な役割を演じ、治療学的応用の可能性を開くことを示す、文献上の多量の証拠が存在する。ＮＯは、心臓血管系、中枢神経系、および免疫系のような種々の生物学的系において生化学的シグナルを伝達するメッセンジャー分子として作用する。しかしながら、その有益な効果にも関わらず、高濃度のＮＯ、またはその非制御条件下での投与は、有害な影響を示し得る（例えば、低血圧、タキフィラキシー、頭痛、細胞毒性など）。それゆえ、制御された量のＮＯを組織に運ぶ一方で、より安全なプロフィールを有する新たな薬剤を開発することが強く求められている。
【０００３】
ヘパリンは、抗凝固および抗血栓薬として多年にわたり臨床的に使用されている。それにも関わらず、入院および通院患者の現行の治療には、出血、骨粗鬆症、および血小板減少症を含む有害な影響の考慮すべきリスクがある。
【０００４】
ヘパリンとＮＯ−放出化合物とを含む組成物は、心臓血管疾患の治療の臨床的診療において用いられている。
更に、最近、Ｊ．Ｅ．Ｓａａｖｅｄｒａら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １０（２０００） ７５１−７５３は、酸化窒素を生成するヘパリン／ジアゼニウムジオラート複合物について記載している。しかしながら、これらの化合物の合成は非常に複雑である。さらに、ヘパリン鎖に導入された特定のＮＯ放出基は種々の欠点を有し、結果的に、これは薬学的応用に適していない。
アルギン硝酸エステルの調製と、セルロイドの製造におけるその使用が、ＧＢ４１７５５６に開示されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するための手段】
本発明は、組織および器官流体との高い適合性を示す新たなクラスの化合物を提供する。係る新たな化合物は、糖構造に共有結合したニトロ基を含む多糖である。特に、本発明は、糖構造に共有結合したニトロ基−ＯＮＯ２を含む、必須にウロン酸および／またはヘキソサミンの単位からなる多糖を提供する。好ましくは、本発明に係る多糖は、主にウロン酸とヘキソサミンとからなる二糖繰り返し単位からなる。
【０００６】
本発明の好ましい実施態様では、これらの化合物は、治療に有効なレベルで生物学的流体／組織中にＮＯを放出することができる。生物活性ＮＯは、生物学的ターゲットに選択的に放出されて、全身的な望ましくない事象の危険性を避けることができる。
本発明の他の好ましい実施態様では、本発明に係る化合物が、ヘパリンの治療的使用に典型的に関与する副作用を顕著に低減する。
【０００７】
特に好ましい実施態様では、両方の効果が同時に存在する。
この結果は、本質的にウロン酸およびまたはヘキソサミンの単位からなる多糖を、−ＯＮＯ２基を含む置換基を用いて官能化することにより達成された。これらの置換基は、共有結合を介して糖構造に結合される。本発明に係る多糖は、好ましくは２から１００単位の間の多数の糖単位からなる。それゆえ、当業者には、多糖の定義の範囲内に二糖およびオリゴ糖が含まれることが明らかである。実際に、二糖およびオリゴ糖のニトロ誘導体は、より高い分子量を有する多糖のニトロ誘導体と同じ利点を示す。二糖の場合、二つの糖の少なくとも一方がウロン酸またはヘキソサミンのいずれかである。好ましくは、本発明に係る二糖は、ウロン酸単位およびヘキソサミン単位からなる。
【０００８】
本発明に係る多糖は、主に、略図１に記載された単位からなる天然グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）から調製されることが好ましい。
【化１】
2004507587.tif 000002
略図１：天然グリコサミノグリカンの一般的な構造
上記略図中、Ｃｈ−４Ｓはコンドロイチン４スルファート（コンドロイチンＣ）を示し、かつｎは通常１０から５０の間であり；Ｃｈ−６Ｓはコンドロイチン６スルファート（コンドロイチンＡ）を示し、かつｎは通常１０から５０の間であり；ＨＡはヒアルロン酸を示し、かつｎは通常１０から２５０の間であり；ＤｅＳはデルマタンスルファート（コンドロイチンＢ）を示し、かつｎは通常１０から１００の間であり；ＨＳはヘパランスルファートを示し、かつｎは通常８から５０の間であり；そしてＨＥＰはヘパリンを示し、かつｎは通常８から３５を示す。
【０００９】
これらのＧＡＧは、本発明に係るニトロ誘導体の調製における出発物質として直接用いることができ、また、これらは当該技術分野で周知の技術に従って化学的に変性させることもできる。
【００１０】
例えば、ＷＯ９９／２７９７６（Ｂａｘｔｅｒ）に記載されているように、ヘキソサミノ残基のＮ−アセチルまたはＮ−スルファート基は、脱硫酸化または脱アセチル化反応を介してアミノ基へと転換することができ；フリーのアミノ基はＮ−アセチル化またはＮ−硫酸化することができ；ウロン酸のスルファート基は脱硫酸化反応を介してエポキシ基を生じることができ；フリーのアミノ基とエポキシ基はポリマー支持体に多糖を固定するために用いることができる。
【００１１】
また、ヘキソサミンの６位の脱硫酸化によるＣＨ２ＯＨ基の生成も知られており；さらに、別の反応位置が脱アミノ反応を介して生成されて解重合をもたらし；このようにして、さらなる反応により新たなＣＨ２ＯＨまたは新たなアミノ基を生じる末端ＣＨＯを示す二糖およびオリゴ糖が得られる。
【化２】
2004507587.tif 000003
【００１２】
解重合反応を、例えば、リアーゼまたはヒドロラーゼを用いた酵素的加水分解、鉱酸（例えば硫酸または塩酸）を用いた化学的解重合、またはスミスの解体反応によって、ヘキソサミン環を変性することなく起こすこともできる。別の可能な化学変性は、ピリジン−三酸化硫黄のアダクトを用いた（Ｋ．Ｎａｇａｓａｗａ；Ｈ．Ｕｃｈｉｙａｍａ；Ｎ．Ｗａｊｉｍａ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１５８（１９８６），１８３−１９０； Ａ．Ｏｇａｍｏ，Ａ．Ｍｅｔｏｒｉ；Ｈ．Ｕｃｈｉｙａｍａ；Ｋ．Ｎａｇａｓａｗａ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１９３（１９８９），１６５−１７２； Ｒ．Ｎ．Ｒｅｙ；Ｋ．Ｇ．Ｌｕｄｗｉｇ−Ｂａｘｔｅｒ；Ａ．Ｓ．Ｐｅｒｌｉｎ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２１０（１９９１），２９９−３１０）、または硫酸とクロロスルホン酸の混合物を用いた（Ｎａｇｇｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６，１８９５−１９００，１９８７）、超硫酸化（ｓｕｐｅｒｓｕｌｆａｔｉｏｎ）である。
【００１３】
上記方法に従って得られる天然ＧＡＧとそれらの誘導体は、他と比較しても、内皮、血小板および白血球に対して非常に高い親和性を示す。ニトロ基のようなＮＯを放出することができる基のキャリアーとしてのそれらの使用は、選択的使用を可能にし、結果として、活性成分の低減された投与を可能にする。好ましい多糖はヘパリン、ヘパランスルファート、コンドロイチンＡ、ＢおよびＣ、並びにこれらの脱硫酸化誘導体である。最も好ましくはヘパリンである。
【００１４】
ニトロ化は、約５００（二糖）から約３００００（高分子量多糖）の間の分子量の多糖の糖単位の種々の位置において起こることができる。ニトロ含有基の導入に好ましい位置は、ヘキソサミンの６位のＣＨ２ＯＨ、ヘキソサミンとウロン酸の３位のＣＨＯＨ、ウロン酸の６位のカルボキシ基、（脱硫酸化）ウロン酸の２位のＣＨＯＨ、および脱硫酸化または脱アセチル化ヘキソサミンのＮＨ２である。
【００１５】
ニトロ基は、直接的に（例えば、糖単位の炭素のニトロ化を介して）、または多糖単位とニトロ基との間のスペーサーとして作用する二価の基を介して、糖構造に共有結合することができる。適切なスペーサーは、Ｃ２−Ｃ２０脂肪族または芳香族炭化水素、エーテル、ポリエーテル、カルボン酸またはその誘導体などから誘導された二価の基である。
【００１６】
以下において、ヘパリンのニトロ誘導体について言及するが、当業者には、類推によって、上記のＧＡＧまたはそれらの誘導体のような、必須にウロン酸および／またはヘキソサミンの単位からなる他のあらゆる多糖のニトロ誘導体を調製可能であることが明らかである。
本発明に係るニトロ誘導体は、チャージした種、すなわちニトロソニウム（ＮＯ＋）またはニトロキシル（ＮＯ−）、または中性種、すなわち酸化窒素（ＮＯ）として酸化窒素を付与、転移、または放出する化合物、および／またはｉｎ ｖｉｖｏにおけるＮＯまたはＥＤＲＦ（内皮由来血管弛緩因子）の内因的産生を刺激する化合物と組み合わせて任意に用いることができる。
【００１７】
本発明に係るニトロ誘導体の調製の第一の経路は、ニトロ化混合物による直接的ニトロ化である。この反応は、種々の基質に対して実施することができる。例えば、ヘパリンナトリウム塩、６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリンおよびＮ−脱アセチル化ヘパリンを用いることができる。この反応は、好ましくは、ニトロ化混合物を最初に調製し、これに予め乾燥したヘパリンを攪拌しながら少量添加することによって実施される。ニトロ化混合物の例は、硫酸−硝酸、リン酸−硝酸、酢酸無水物−硝酸、亜酸化窒素−硫酸である。好ましい混合物は、硫酸−硝酸混合物であって、スルホ−ニトロ混合物（ｓｕｌｆｏ−ｎｉｔｒｉｃ ｍｉｘｔｕｒｅ）とも呼ばれるもの、および酢酸無水物−硝酸混合物である。
【００１８】
可能な解重合反応を制限するのであれば、この反応を、好ましくは、例えば、アイスバスまたは冷凍混合物を用いて低温に温度調節する。スルホ−ニトロ混合物の場合、硫酸と硝酸との間のモル比は広範囲にわたるものとすることができ、かつ、好ましくは５：１から１：２、さらに好ましくは３：１から１：１．２５の間に含まれる。ニトロヘパリンの分子量は、使用する反応条件に従って変化することができるが、好ましくは５００から２００００、最も好ましくは５００から１２０００の間に含まれる。糖単位当たりのニトロ基の量も顕著に多様であるが、糖単位とニトロ基との間の当量比は、好ましくは４０：１から２：３、さらに好ましくは２０：１から２：３、最も好ましくは１０：１から１：１の間に含まれる。
【００１９】
本発明に係る多糖のニトロ誘導体の合成の別の合成経路は、ハロアシル化（ｈａｌｏａｃｙｌａｔｉｏｎ）後のニトロ化によるものである。この場合、Ｎ−脱硫酸化ヘキソサミンを含む多糖を最初に調製することが可能である。次いで、このＮ−脱硫酸化ヘキソサミンを、ヨード酢酸無水物のようなハロ無水物と反応させて、ヘキソサミンの２位に対応するアミドを得る。このヨウ素原子を、次いで、適切な硝酸塩と反応させてニトロ基で置換する。適切な反応条件を用いることにより、Ｎ−脱硫酸化の量、すなわちその結果として、導入されるニトロ基の量を調節することが可能である。適切な硝酸塩の例は、ＡｇＮＯ３およびＮＢｕ４ＮＯ３である。ω−ハロカルボン酸の無水物のようなヨード酢酸無水物とは異なる無水物を用いて、このようにして、異なるスペーサー基を有するニトロ誘導体を得ることも可能である。好ましいハロゲンは、ヨウ素と臭素である。より好ましくはヨウ素である。出発物質がヘパリンとヨード酢酸無水物である場合、反応スキームは以下の通りである。
【化３】
2004507587.tif 000004
【００２０】
脱硫酸化ヘキソサミンの６位をアシル化することも可能である。この場合、式Ｘ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＹ［ここで、Ｘは塩素、臭素、ヨウ素またはトシル；好ましくはＸは臭素であり；Ｙは塩素、メルカプトチアゾール、メルカプトベンゾチアゾール、メルカプトベンゾキサゾール、ｐ−ニトロフェノールである］の化合物を用いることが好ましい。ヘパリンの反応スキームは以下の通りである。
【化４】
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【００２１】
実験セクション
ブタの腸管粘膜由来のヘパリンナトリウム塩（ＨＥＰ）を、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｏ Ｄｅｒｉｖａｔｉ Ｏｒｇａｎｉｃｉから入手した。分析的特徴は以下の通りである：
元素分析：Ｃ：２１．２６％；Ｎ：２．０７％；
糖当たりのＮ原子：０．５。
【００２２】
合成１
５０％Ｎ−脱硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ１）の調製
過剰のピリジンを、予めＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０（Ｈ＋）のカラムから溶出した、２ｇのＨＥＰの水溶液に添加した。この溶液を、減圧下で蒸発させ；得られたヘパリンのピリジン塩を１００ｍｌのＤＭＳＯ／メタノール９５：５混合物に溶解させ、２０℃で２時間攪拌し、約５０％の脱硫酸化度を得た。
次いで、この溶液を等量の蒸留水で希釈した。ｐＨを水酸化ナトリウム１Ｍを添加することにより約１０に調節し、この溶液を膜（カットオフ１０００−２０００Ｄ）中で蒸留水に対して透析した。最終産物を、減圧下で蒸発させて単離した。
ＵＶ：［Ｃ］＝０．７３ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝１．４６９；λ＝１９５ｎｍ。
【００２３】
合成２
１００％Ｎ−脱硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ２）の調製
２時間の代わりに８時間ＨＥＰを反応させて、合成１を繰り返した。１００％のＮ−脱硫酸化ヘパリンを得た。
ＵＶ：［Ｃ］＝０．１１ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝０．３５５；λ＝１９５ｎｍ。
【００２４】
合成３
Ｎ−および１００％の６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ３）の調製
過剰のピリジンを、予めＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０（Ｈ＋）のカラムから溶出した、５ｇのＨＥＰの水溶液に添加した。この溶液を、減圧下で蒸発させ；得られたヘパリンのピリジン塩を５００ｍｌのＤＭＳＯ／メタノール９０：１０混合物に溶解させ、６５℃で８時間攪拌した。次いで、この溶液を等量の蒸留水で希釈し、水酸化ナトリウム１Ｍを添加することにより中和し、限外濾過を介して精製した。最終産物を、減圧下で蒸発させることにより単離した。
【００２５】
合成４
６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ４）の調製
Ｎ−およびＯ−脱硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ３）のＮ−再硫酸化を介して、６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリンを調製した。
予め炭酸水素ナトリウムで飽和させ、５５℃に温度調節した４ｇのＨＥＰ３の水溶液に、９．６ｇの三酸化硫黄トリメチルアミン複合体（ＴＭＡ−ＳＯ３）を添加した。２０時間後、９．６ｇのＴＭＡ−ＳＯ３を添加し、この混合物を５５℃で７時間攪拌した。次いで、この混合物をエタノールに注ぎ、４℃で１５−２０時間後に、粉砕したガラスフィルターで濾過した。沈殿を水に溶解し、膜（カットオフ２０００−１０００Ｄ）において蒸留水に対して透析した。この水溶液を減圧下で蒸発させた。
この産物は以下の特徴を有する。
ＵＶ：［Ｃ］＝１．１ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝１．９７６；λ＝１９５ｎｍ。
０．１１ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝０．２０６；λ＝１９５ｎｍ。
【００２６】
合成５
Ｎ−アセチル化ヘパリン（ＨＥＰ５）の調製
Ｎ−アセチル化ヘパリンを、１００％のＮ−脱硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ２）のＮ−アセチル化により調製した。
６００ｍｇのＨＥＰ２を６ｍｌの蒸留水に溶解させ；この溶液を０℃まで冷却し、炭酸水素ナトリウムで飽和させ；５００μｌの酢酸無水物をこの溶液に添加し、この混合物を０℃で２時間攪拌した。反応中に、ｐＨを炭酸水素ナトリウムを添加することにより約８に調節および維持した。次いで、得られた溶液を、膜（カットオフ２０００−１０００Ｄ）において蒸留水に対して透析した。
この水溶液を減圧下で蒸発させた。
【００２７】
合成６
１００％Ｎ−脱硫酸化した超硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ６）の調製
Ｎａｇｇｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３６，１８９５−１９００，１９８７に記載されている方法に従って調製した超硫酸化（ｓｕｐｅｒｓｕｌｆａｔｅｄ）ヘパリンを出発物質として用いて、合成２を繰り返した。得られた産物を、合成５に記載されているようにアセチル化した。
元素分析：Ｃ：１５．３４％；Ｎ：１．２８％；
糖当たりのＮ原子：０．５
ＵＶ：［Ｃ］＝０．１１ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝０．８３０；λ＝１９５ｎｍ。
電気伝導度滴定：ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝３．７。
【００２８】
合成７
１００％Ｎ−アセチル化した脱硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ７）の調製
Ｎ−アセチル化したほぼ完全にＯ−脱硫酸化したヘパリンを、ほぼ完全にＮ，Ｏ−脱硫酸化ヘパリンのアセチル化により調製した。
過剰のピリジンを、予めＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＩＲ １２０（Ｈ＋）のカラムから溶出した、３ｇのＨＥＰの水溶液に添加した。この溶液を、減圧下で蒸発させ；得られたヘパリンのピリジン塩を１５０ｍｌのＤＭＳＯ／メタノール９０：１０混合物に溶解させ、１００℃で２４時間攪拌し、完全なＮ−脱硫酸化およびほぼ完全なＯ−脱硫酸化を得た。
次いで、この溶液を等量の蒸留水で希釈した。ｐＨを水酸化ナトリウム１Ｍを添加することにより約９に調節し、この溶液を膜（カットオフ１０００−２０００Ｄ）中で蒸留水に対して透析した。最終産物を、減圧下で蒸発させて単離した。
得られた産物を、合成５に記載したようにアセチル化した。
ＵＶ：［Ｃ］＝０．１１ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝１．６６０；λ＝１９５ｎｍ。
電気伝導度滴定：ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．１。
【００２９】
合成８
１００％Ｎ−アセチル化した５０％６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ８）の調製　このヘパリン誘導体を、８時間の代わりに６時間ＨＥＰを反応させて、合成３に記載されている方法に従って、５０％６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリンをアセチル化することにより調製した。
ＵＶ：［Ｃ］＝０．１１ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝１．３５６；λ＝１９５ｎｍ。
電気伝導度滴定：ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．１。
【００３０】
【実施例】
実施例１
スルホ−ニトロ混合物を用いたヘパリン（ＨＥＰ）のニトロ化を介したニトロヘパリンの調製
スルホ−ニトロ混合物を、攪拌しながら、２０ｍｌの硫酸（９６％）に１０ｍｌの硝酸（９０％）を滴下することにより調製し、アイスバスを用いて０℃で冷却した。蒸気が観察されなくなったら、１ｇのＨＥＰを１時間にわたって分配して加えた。次いで、この混合物を室温で１時間攪拌した。
最後に、この混合物を、アセトン／ＣＯ２の槽中で冷却した５００ｍｌのジエチルエーテルに注いだ。この冷却混合物を減圧下で粉砕ガラスフィルターにて濾過した。粘着性の固形分がフィルターに残存し、これを冷却したエーテルで洗浄し、次いで、炭酸水素ナトリウムの水溶液で洗浄することによりこのフィルターから回収した。得られた溶液（ｐＨ８）を減圧下で濃縮し、１０００Ｄの膜において蒸留水に対して透析した。
この水溶液を減圧下で室温において蒸発させた。
この産物は以下の特徴を有する。
ＵＶ：［Ｃ］＝０．１１ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝１．５１３；λ＝１９５ｎｍ。
電気伝導度滴定：ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝３．８。
【００３１】
実施例２
スルホ−ニトロ混合物を用いたヘパリン（ＨＥＰ）のニトロ化を介したニトロヘパリンの調製
スルホ−ニトロ混合物を、攪拌しながら、２０ｍｌの硫酸（９６％）に１０ｍｌの硝酸（９０％）を滴下することにより調製し、アイスバスを用いて０℃で冷却した。蒸気が観察されなくなったら、１ｇのＨＥＰを１時間にわたって分配して加えた。次いで、この混合物を０℃で１時間攪拌した。
最後に、この混合物を、アセトン／ＣＯ２の槽中で冷却した３００ｍｌのジエチルエーテルに注いだ。この冷却混合物を減圧下で粉砕ガラスフィルターにて濾過した。粘着性の固形分がフィルターに残存し、これを冷却したエーテルで洗浄し、次いで、炭酸水素ナトリウムの水溶液で洗浄することによりこのフィルターから回収した。得られた溶液（ｐＨ８）を減圧下で濃縮し、１０００Ｄの膜において蒸留水に対して透析した。
この水溶液を減圧下で室温において蒸発させた。
この産物は以下の特徴を有する。
元素分析：Ｃ：１７．１０％；Ｎ：４．０１％；
糖当たりのＮ原子：１．２
糖当たりのＯＮＯ２：０．７
ＵＶ：［Ｃ］＝０．１１ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝１．５８６；λ＝１９５ｎｍ。
電気伝導度滴定：ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝３．５。
ＭＷ：９１５０。
【００３２】
実施例３
スルホ−ニトロ混合物を用いたヘパリン（ＨＥＰ）のニトロ化を介したニトロヘパリンの調製
スルホ−ニトロ混合物を、攪拌しながら、１３．８ｍｌの硫酸（９８％）に１６．３ｍｌの硝酸（９０％）を滴下することにより調製し、アイスバスにおいて０℃で冷却した。蒸気が観察されなくなったら、１ｇのＨＥＰを１時間にわたって分配して加えた。次いで、この混合物を室温で１時間攪拌した。
最後に、この混合物を、アセトン／Ｎ２の槽中で冷却した５００ｍｌのジエチルエーテルに注いだ。この冷却混合物を減圧下で粉砕ガラスフィルターにて濾過した。粘着性の固形分がフィルターに残存し、これを冷却したエーテルで洗浄し、次いで、炭酸水素ナトリウムの水溶液で洗浄することによりこのフィルターから回収した。得られた溶液（ｐＨ８）を減圧下で濃縮し、１０００Ｄの膜において蒸留水に対して透析した。
この水溶液を減圧下で室温において蒸発させた。
この産物は以下の特徴を有する。
ＵＶ：［Ｃ］＝０．０７３ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝１．３５８；λ＝１９５ｎｍ。
ＭＷ：８０００。
【００３３】
実施例４
スルホ−ニトロ混合物を用いた６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ４）のニトロ化を介したニトロヘパリンの調製
スルホ−ニトロ混合物を、攪拌しながら、２０ｍｌの硫酸（９８％）に１０ｍｌの硝酸（９０％）を滴下することにより調製し、アイスバスを用いて０℃で冷却した。蒸気が観察されなくなったら、１ｇのＨＥＰ４を１時間にわたって分配して加えた。次いで、この混合物を室温で１時間攪拌した。
最後に、この混合物を、アセトン／Ｎ２の槽中で冷却した５００ｍｌのジエチルエーテルに注いだ。この冷却混合物を減圧下で粉砕ガラスフィルターにて濾過した。粘着性の固形分がフィルターに残存し、これを冷却したエーテルで洗浄し、次いで、炭酸水素ナトリウムの水溶液で洗浄することによりこのフィルターから回収した。得られた溶液（ｐＨ８）を減圧下で濃縮し、膜（カットオフ２０００−１０００Ｄ）において蒸留水に対して透析した。
この水溶液を減圧下で室温において蒸発させた。
この産物は以下の特徴を有する。
元素分析：Ｃ：２０．６１％；Ｎ：３．８６％；
糖当たりのＮ原子：１
糖当たりのＯＮＯ２：０．５
ＵＶ：［Ｃ］＝０．１１ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝１．１７６；λ＝１９５ｎｍ。
電気伝導度滴定：ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝３．０。
ＭＷ：２２４００。
【００３４】
実施例５
スルホ−ニトロ混合物を用いた６−Ｏ−脱硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ４）のニトロ化を介したニトロヘパリンの調製
スルホ−ニトロ混合物を、攪拌しながら、１３．８ｍｌの硫酸（９８％）に１６．３ｍｌの硝酸（９０％）を滴下することにより調製し、アイスバスを用いて０℃で冷却した。蒸気が観察されなくなったら、１ｇのＨＥＰ４を１時間にわたって分配して加えた。次いで、この混合物を室温で９５分間攪拌した。
最後に、この混合物を、アセトン／Ｎ２の槽中で冷却した３００ｍｌのジエチルエーテルに注いだ。この冷却混合物を減圧下で粉砕ガラスフィルターにて濾過した。粘着性の固形分がフィルターに残存し、これを冷却したエーテルで洗浄し、次いで、炭酸水素ナトリウムの水溶液で洗浄することによりこのフィルターから回収した。得られた溶液（ｐＨ８）を減圧下で濃縮し、２０００Ｄの膜において蒸留水に対して透析した。
この水溶液を減圧下で室温において蒸発させた。
この産物は以下の特徴を有する。
元素分析：Ｃ：１４．１８％；Ｎ：３．４２％；
糖当たりのＮ原子：１．２５
糖当たりのＯＮＯ２：０．７５
ＵＶ：［Ｃ］＝０．１１ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝１．４８９；λ＝１９５ｎｍ。
【００３５】
実施例６
スルホ−ニトロ混合物を用いたＮ−アセチル化ヘパリン（ＨＥＰ５）のニトロ化を介したニトロヘパリンの調製
スルホニトロ混合物を、攪拌しながら、２．６４ｍｌの硫酸（９８％）に１．３２ｍｌの硝酸（９０％）を滴下することにより調製し、アイスバスにおいて０℃で冷却した。蒸気が観察されなくなったら、１３２ｍｇのＨＥＰ５を１時間にわたって分配して加えた。次いで、この混合物を０℃で２時間攪拌し、アセトン／Ｎ２槽中で冷却した後に、炭酸水素ナトリウムで飽和させた水溶液に注いだ。別の塩基性溶液を、ｐＨ７となるまで添加し、次いでこの溶液を凍結および凍結乾燥させた。固体を膜（カットオフ２０００−１０００Ｄ）において蒸留水に対して透析した。
この水溶液を減圧下で室温において蒸発させた。
この産物は以下の特徴を有する。
元素分析：Ｃ：２１．８９％；Ｎ：４．９５％；
糖当たりのＮ：１．１５
糖当たりのＯＮＯ２：０．６５
ＵＶ：［Ｃ］＝０．０５ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝１．５７４；λ＝１９５ｎｍ。
ＭＷ：１５７００。
【００３６】
実施例７
スルホ−ニトロ混合物を用いたＮ−アセチル化した脱硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ７）のニトロ化を介したニトロヘパリンの調製
スルホニトロ混合物を、攪拌しながら、４．８ｍｌの硫酸（９６％）に２．４ｍｌの硝酸（９０％）を滴下することにより調製し、アイスバスにおいて０℃で冷却した。蒸気が観察されなくなったら、２４０ｍｇのＨＥＰ７を２時間１５分にわたって分配して加えた。次いで、この混合物を０℃で１時間、室温で１０分間攪拌した。アセトン／Ｎ２槽中で冷却した後に、炭酸水素ナトリウムで飽和させた水溶液に注いだ。別の塩基性溶液を、ｐＨ７となるまで添加し、次いでこの溶液を凍結および凍結乾燥させた。固体を膜（カットオフ１０００Ｄ）において蒸留水に対して透析した。
この水溶液を減圧下で室温において蒸発させた。
この産物は以下の特徴を有する。
元素分析：Ｃ：２５．９０％；Ｎ：６．２７％；
糖当たりのＮ：１．４５
糖当たりのＯＮＯ２：０．４５
ＵＶ：［Ｃ］＝０．１１ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝１．９６０；λ＝１９５ｎｍ。
電気伝導度滴定：ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．１。
ＭＷ：１３５００。
【００３７】
実施例８
スルホ−ニトロ混合物を用いたＮ−アセチル化した５０％６−Ｏ−ヘパリン（ＨＥＰ８）のニトロ化を介したニトロヘパリンの調製
スルホニトロ混合物を、攪拌しながら、１０ｍｌの硫酸（９６％）に５ｍｌの硝酸（９０％）を滴下することにより調製し、アイスバスにおいて０℃で冷却した。蒸気が観察されなくなったら、５００ｍｇのＨＥＰ８を１時間にわたって分配して加えた。次いで、この混合物を０℃で１時間、室温で１０分間攪拌した。アセトン／Ｎ２槽中で冷却した後に、この混合物を炭酸水素ナトリウムで飽和させた水溶液に注いだ。別の塩基性溶液を、ｐＨ７となるまで添加し、次いでこの溶液を凍結および凍結乾燥させた。固体を膜（カットオフ１０００Ｄ）において蒸留水に対して透析した。
この水溶液を減圧下で室温において蒸発させた。得られた固体を、ゲルクロマトグラフィーを介して精製した。
この産物は以下の特徴を有する。
元素分析：Ｃ：１７．１６％；Ｎ：３．４２％；
糖当たりのＮ：１．２
糖当たりのＯＮＯ２：０．２
ＵＶ：［Ｃ］＝０．１１ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝１．４２９；λ＝１９５ｎｍ。
電気伝導度滴定：ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．１。
ＭＷ：１２１００。
【００３８】
実施例９
スルホ−ニトロ混合物を用いたＮ−アセチル化ヘパリン（ＨＥＰ５）のニトロ化を介したニトロヘパリンの調製
スルホニトロ混合物を、攪拌しながら、４．２３ｍｌの硫酸（９６％）に４．８９ｍｌの硝酸（９０％）を滴下することにより調製し、アイスバスにおいて０℃で冷却した。蒸気が観察されなくなったら、３００ｍｇのＨＥＰ５を１時間にわたって分配して加えた。次いで、この混合物を０℃で１時間攪拌し、アセトン／Ｎ２槽中で冷却した後に、炭酸水素ナトリウムで飽和させた水溶液に注いだ。別の塩基性溶液を、ｐＨ７となるまで添加し、次いでこの溶液を凍結および凍結乾燥させた。固体を膜（カットオフ１０００Ｄ）において蒸留水に対して透析した。
この水溶液を減圧下で室温において蒸発させた。
この産物は以下の特徴を有する。
元素分析：Ｃ：２２．５８％；Ｎ：４．９１％；
糖当たりのＮ：１．２
糖当たりのＯＮＯ２：０．２
電気伝導度滴定：ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．９。
【００３９】
実施例１０
ニトロ酢酸混合物を用いたＮ−アセチル化ヘパリン（ＨＥＰ５）のニトロ化を介したニトロヘパリンの調製
ニトロ酢酸混合物を、攪拌しながら、２８ｍｌの硝酸（９０％）に１８．５ｍｌの酢酸無水物を４５分間にわたって滴下することにより調製し、Ｎ２／アセトン槽において−２０℃で冷却した。最後に、２５０ｍｇのＨＥＰ５を加えた。温度が安定したら、Ｎ２／アセトン槽をアイスバスに交換し；この混合物を３．５時間０℃で攪拌し、３０分間室温で攪拌した。この混合物を７００ｍｌの冷却した蒸留水に注ぎ、ＮａＯＨ １Ｍを用いて中和した。得られた水溶液を、バイオコンセントレータＭｉｎｉ−Ｐｌａｔｅ（１００００Ｄ）で処理して、凍結乾燥した。
この産物は以下の特徴を有する。
元素分析：Ｃ：２３．７４％；Ｎ：５．０１％；
糖当たりのＮ：１．２５
糖当たりのＯＮＯ２：０．７５
電気伝導度滴定：ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．１。
【００４０】
実施例１１
５０％Ｎ−脱硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ１）のＮ−ヨードアシル化およびニトロ化を介したニトロヘパリンの調製
３８６ｍｇのジヨード酢酸無水物を２００ｍｇのＨＥＰ１の水溶液に添加し、０℃で冷却し、炭酸水素ナトリウムで飽和させた。この混合物を０℃で２時間攪拌し、次いで約８０時間４℃にて放置した。次いで、得られた溶液を膜（カットオフ２０００−１０００Ｄ）において蒸留水に対して透析した。
この溶液に４℃で、２５５ｍｇの硝酸カルシウムと６１２ｍｇの硝酸銀を加えた。この混合物をこの条件で４８時間攪拌し、次いで、減圧下で粉砕したガラスフィルターで濾過した。過剰の硝酸銀を、塩化ナトリウムの添加により塩化銀を沈殿させることによって取り除いた。この溶液を、エタノールに注ぎ、４℃で約７０時間冷却した。この沈殿を濾過し、アセトンとジエチルエーテルを用いて洗浄した。
この産物は以下の特徴を有する。
ＵＶ：［Ｃ］＝０．０７３ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝０．９５４；λ＝１９５ｎｍ。
元素分析：Ｃ：１９．６３％；Ｎ：１．８３％；
糖当たりのＮ：０．５６
糖当たりのＯＮＯ２：０．０６
電気伝導度滴定：ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．１。
【００４１】
実施例１２
１００％Ｎ−脱硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ２）のＮ−ヨードアセチル化およびニトロ化を介したニトロヘパリンの調製
１９３ｍｇのジヨード酢酸無水物を１００ｍｇのＨＥＰ２の水溶液２ｍｌに添加し、４℃で冷却し、炭酸水素ナトリウムで約４８時間飽和させた。この溶液を凍結乾燥させた。得られた固体を６ｍｌの水に懸濁し、中和した。１２８ｍｇの硝酸カルシウムと３０６ｍｇの硝酸銀を、この溶液に４℃で添加した。この混合物をこの条件で２４時間攪拌し、次いで、減圧下で粉砕したガラスフィルターで濾過した。過剰の硝酸銀を、塩化ナトリウムの添加により塩化銀を沈殿させることによって取り除いた。この溶液を、エタノールに注ぎ、４℃で約１８時間冷却した。この沈殿を濾過し、水で可溶化し、この溶液を凍結乾燥させた。
この産物を１３Ｃ ＮＭＲ分光法で分析した。ＣＨ３Ｉ基の存在が１．２ｐｐｍのシグナルで示された。４ｍｌの水に可溶化したこのサンプルを、１２８ｍｇの硝酸カルシウムと３０６ｍｇの硝酸銀を用いて４℃でさらに処理した。この混合物をこの条件で４８時間攪拌し、次いで、減圧下で粉砕したガラスフィルターで濾過した。過剰の硝酸銀を、塩化ナトリウムの添加により塩化銀を沈殿させることによって取り除いた。この溶液を、エタノールに注ぎ、４℃で約１８時間冷却した。この沈殿を濾過し、水で可溶化し、この溶液を凍結乾燥させた。
この産物は以下の特徴を有する。
ＵＶ：［Ｃ］＝０．１ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝１．０６２；λ＝１９５ｎｍ。
元素分析：Ｃ：２０．２２％；Ｎ：１．８９％；
糖当たりのＮ：０．５６
糖当たりのＯＮＯ２：０．０６
電気伝導度滴定：ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．１。
【００４２】
実施例１３
５０％Ｎ−脱硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ１）のＮ−ヨードアセチル化およびニトロ化を介したニトロヘパリンの調製
３８６ｍｇのジヨード酢酸無水物を２００ｍｇのＨＥＰ１の水溶液３ｍｌに添加し、４℃で冷却し、炭酸水素ナトリウムで約７２時間飽和させた。この溶液をエタノール（１５ｍｌ）に注ぎ、４℃で冷却した。この沈殿を濾過し、水で可溶化し、この溶液を凍結乾燥させた。
得られた固体を６ｍｌの水に懸濁し、中和した。２５５ｍｇの硝酸カルシウムと６１２ｍｇの硝酸銀を、この溶液に４℃で添加した。この混合物をこの条件で４８時間攪拌し、次いで、減圧下で粉砕したガラスフィルターで濾過した。過剰の硝酸銀を、塩化ナトリウムの添加により塩化銀を沈殿させることによって取り除いた。この溶液を、エタノールに注ぎ、４℃で約１８時間冷却した。この沈殿を濾過し、水で可溶化し、この溶液を凍結乾燥させた。
この産物を１３Ｃ ＮＭＲ分光法で分析した。
この産物は以下の特徴を有する。
ＵＶ：［Ｃ］＝０．１ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝１．０９２；λ＝１９５ｎｍ。
元素分析：Ｃ：２０．２５％；Ｎ：２．１０％；
糖当たりのＮ：０．６２
糖当たりのＯＮＯ２：０．１２
電気伝導度滴定：ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．２。
【００４３】
実施例１４
Ｎ−脱硫酸化した超硫酸化ヘパリン（ＨＥＰ６）のＮ−ヨードアセチル化およびニトロ化を介したニトロヘパリンの調製
２７６ｍｇのジヨード酢酸無水物を２００ｍｇのＨＥＰ６の水溶液３ｍｌに添加し、４℃で冷却し、炭酸水素ナトリウムで約４８時間飽和させた。この溶液を１０００Ｄの膜中において蒸留水に対して透析し、この水溶液を凍結乾燥した。
得られた固体を６ｍｌの水に懸濁した。１６３ｍｇの硝酸カルシウムと３９１ｍｇの硝酸銀を、この溶液に４℃で添加した。この混合物をこの条件で２４時間攪拌し、次いで、減圧下で粉砕したガラスフィルターで濾過した。過剰の硝酸銀を、塩化ナトリウムの添加により塩化銀を沈殿させることによって取り除いた。この溶液を、エタノールに注ぎ、４℃で約１８時間冷却した。この沈殿を濾過し、水で可溶化し、この溶液を凍結乾燥させた。
この産物は以下の特徴を有する。
ＵＶ：［Ｃ］＝０．１ｍｇ／ｍｌ；ａｂｓ＝０．９１３；λ＝１９５ｎｍ。
元素分析：Ｃ：１７．１０％；Ｎ：１．５３％；
糖当たりのＮ：０．５５
糖当たりのＯＮＯ２：０．０５
電気伝導度滴定：ＳＯ３−／ＣＯＯ−＝１．１。
【００４４】
薬理学的研究
ニトロヘパリンを、標準的なヘパリン（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ−Ｒｏｃｈｅ）と比較した。
凝固アッセイ
５０μｌの試験ヘパリン溶液を、健康なドナー血漿の４５０μｌのプール（少なくとも１０）に添加した。活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）およびトロンビン凝固時間（ＴｃＴ）を、Ｍｏｍｉ Ｓら，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ２００１；８６：２９７−３０２に記載されているようにして自動凝固計（ｃｏａｇｕｌｏｍｅｔｅｒ）（ＡＣＬ３００Ｒ、Ｉｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍｉｌａｎ）を用いた標準アッセイにより測定した。
最大収集時間をａＰＴＴについて２４９ｓ、ＴｃＴについて１６７ｓに設定した。
【００４５】
全血凝集アッセイ
Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ全血血小板凝集計（ｍｏｄ．５４０，Ｃｈｒｏｎｏ−Ｌｏｇ Ｃｏｒｐ．，Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ，Ｐａ，ＵＳＡ）を用いて、Ｇｒｅｓｅｌｅ Ｐら Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ １９８６；５５：１２−１８に記載されているインピーダンス法を用いて、血小板凝集を全血において調べた。
クエン酸塩添加全血のサンプル（１ｍｌ）を用いて、連続的攪拌の下で、および血小板アゴニストで刺激した後に、血液に浸された二つの鋭敏な電極間の電気的インピーダンスの変化を測定した。始めは、血小板の単層が電極を被覆する。凝集剤の存在が、さらなる血小板を凝集させ、単層に付着させ、電極間のインピーダンスを増加させる。インピーダンスの変化を記録し、凝集と相関させる。
【００４６】
１０μｌの試験ヘパリン溶液またはビヒクル（水）を、クエン酸塩添加生理溶液で１：２に希釈した１ｍｌのクエン酸塩添加血液に加え、３７℃で２分間インキュベートした。凝集剤ＡＤＰ（半最大（ｓｕｂ ｍａｘｉｍａｌ）効果を得るために２から１０μＭ）を添加し、凝集曲線を１０分間にわたって記録した。得られた最大振幅を測定し、ヘパリンとのプレインキュベーション後の凝集の最大振幅の増加を試験化合物の前凝集（ｐｒｏａｇｇｒｅｇａｔｏｒｙ）活性の指標とした。
【００４７】
血小板に富む血漿（ＰＲＰ）の凝集研究
血液を、健康なドナーから１／１０ｖ：ｖクエン酸三ナトリウム（３．８％）に回収した。血液を、室温で１８０ｘｇで１５分間遠心した。血小板に富む血漿を分離し、ＰＲＰでの血小板カウントを、自己由来の血小板に乏しい血漿（ＰＰＰ）で２．５ｘ１０８／ｍｌに調節した。
ＰＲＰを３７℃で２分または１０分間にわたりニトロヘパリンでインキュベートし、その後ＡＤＰ（半閾値または閾値）または閾値凝集濃度の安定なトロンボキサンアナログＵ４６６１９で刺激した。アゴニストの閾値量は、３分以内に最大凝集の６０％を与えるインデューサーの最少量として定義した（投与量−応答曲線から同定）。試験化合物の前凝集（ｐｒｏ−ａｇｇｒｅｇａｔｏｒｙ）効果を示すために半閾値量を用い、一方、試験化合物の阻害効果を識別することを目的とする実験で閾値量を用いた（Ｖｅｚｚａ Ｒら， Ｂｌｏｏｄ １９９３；８２：２７０４−２７１３）。
【００４８】
ゲル濾過血小板の凝集研究
ゲル濾過した血小板を用いた実験では、５ｍｌのＰＲＰをカラム（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ２Ｂ）に通し；血小板を約７つのフラクションに溶出した。これらは、その濁度により識別できる。血小板カウントを１０８／ｍｌ３に調節した。
【００４９】
酸化窒素（ＮＯ）の役割についての実験
血小板の阻害作用におけるＮＯの役割を識別することを目的とする実験のために、ゲル濾過ヒト血小板を、試験化合物と２分間プレインキュベートし、Ｕ４６６１９で刺激した。
【００５０】
ビヒクル、標準ヘパリン（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標））、およびＮＯ−ヘパリン処理したヒトの血漿における活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＰＴＴ）およびトロンビン凝固時間（ＴｃＴ）
【表１】
2004507587.tif 000006
値は平均±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）として表示されている。
【００５１】
ＰＲＰ（血小板に富む血漿）におけるＡＤＰおよびＵ４６６１９誘導ヒト血小板凝集に対するビヒクル、標準ヘパリン（Ｌｉｑｕｅｍｉｎ（登録商標））、およびＮＯ−ヘパリンの効果
【表２】
2004507587.tif 000007
ＰＲＰ凝集は、半閾値量の凝集剤ＡＤＰ、または閾値量のトロンボキサン安定アナログＵ４６６１９の添加により得られた。値は、コントロール（ビヒクル）の凝集のパーセントとして平均として表されている。
ｎ．ａ．：評価せず
【国際公開パンフレット】
2004507587.tif 000008
2004507587.tif 000009
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2004507587.tif 000031
2004507587.tif 000032
【国際調査報告】
2004507587.tif 000033
2004507587.tif 000034