(57)【要約】個人の腫瘍組織を治療する方法が提供される。この方法は、エンドサイトーシス媒介の細胞死を誘発することができるように選択された強度、反復周波数、およびパルス幅を有する電界パルスを腫瘍組織の細胞に加えることにより実施され、これによって腫瘍組織を治療する。
2004534784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
新生物病を有する個人の治療方法であって、２〜１５０Ｖ／ｃｍの強度、１Ｈｚ〜１００ｋＨｚの反復周波数、および１μｓ〜１００ｍｓのパルス幅を有する電界パルスを、１秒〜６０分間腫瘍細胞に加え、これによって新生物障害に罹っている個人を治療することを含む方法。
【請求項２】
前記電界パルスは単極であり、１０〜７０Ｖ／ｃｍの強度、１００Ｈｚ〜１０ｋＨｚの反復周波数、および１〜２００μｓのパルス幅を有する請求項１の方法。
【請求項３】
さらに、前記電界パルスの使用に付随して、またはそれに先立って、細胞傷害剤に前記腫瘍細胞を暴露することを含む請求項１の方法。
【請求項４】
前記細胞傷害剤への前記腫瘍細胞の前記暴露は、前記電界パルスの前記使用の０．１〜２０分前に実施される請求項３の方法。
【請求項５】
前記電界パルスは単極であり、１０〜４０Ｖ／ｃｍの強度、３００〜２，０００Ｈｚの反復周波数、および１〜２００μｓのパルス幅を有する請求項３の方法。
【請求項６】
前記細胞傷害剤への前記腫瘍細胞の前記暴露は、個人に前記細胞傷害剤を投与することによって実施される請求項３の方法。
【請求項７】
前記投与は、前記細胞傷害剤を腫瘍中またはその周りに直接注入することによって実施される請求項６の方法。
【請求項８】
前記細胞傷害剤は、ブレオマイシン、５−フルオロウラシル、シスプラチン、タクソール、ドキソルビシン、シクロホスファミド、メトトラキセート、およびカルムスチンからなる群から選択される請求項３の方法。
【請求項９】
前記細胞傷害剤は、ヒマシ油とエタノールとを含むキャリヤー混合物として供給される請求項３の方法。
【請求項１０】
さらに、腫瘍の体積を測定することを含み、前記体積は、前記腫瘍細胞に加えられる前記電界パルスの前記強度、反復周波数、および前記パルスを決定するためのものである請求項１の方法。
【請求項１１】
腫瘍細胞への前記電界パルスの前記使用は、細胞傷害剤の不存在下に実施される請求項１の方法。
【請求項１２】
新生物病は、肉腫またはガン腫であり、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸ガン、すい臓ガン、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、扁平上皮細胞ガン、基底細胞ガン、腺ガン、汗腺ガン、脂腺ガン、乳頭状ガン、乳頭腺ガン、のう胞腺ガン、髄様ガン、気管支原性ガン、腎細胞ガン、肝臓ガン、胆管ガン、絨毛ガン、精上皮腫、胎児性ガン、ウイルムス腫瘍、子宮頚ガン、睾丸ガン、肺ガン、小細胞肺ガン、膀胱ガン、上皮ガン、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、および神経芽細胞腫からなる群から選択される請求項１の方法。
【請求項１３】
新生物病に罹っている個人の治療用装置であって、
（ａ）カソード電極と、個人の組織と接触して配置されるような構成の少なくとも１つのアノード電極とを含む電極系；
（ｂ）前記電極系と回路連絡にあり、かつ前記電極系を横断して電位を発生させるための電源；および
（ｃ）前記組織内に配置された前記電極系が、２〜１５０Ｖ／ｃｍの強度、１Ｈｚ〜１００ｋＨｚの反復周波数、および１μｓ〜１００ｍｓのパルス幅を有する電界パルスに、１秒〜６０分間前記組織の細胞を暴露することができるように、前記電位の持続時間、周波数、および強度を設定するためのコントローラー
を含む装置。
【請求項１４】
前記コントローラーによって、１ｍＶのインクリメントにおいて前記電位の前記強度の設定が可能になる請求項１３の装置。
【請求項１５】
前記電極系は３つの前記アノード電極を含んでいる請求項１３の装置。
【請求項１６】
前記カソード電極および前記少なくとも１つのアノード電極は、針電極である請求項１３の装置。
【請求項１７】
前記電極系は、前記アノード電極と前記カソード電極とを保持するため、および前記アノード電極および前記カソード電極と組織部位とを同時に接触させるための支持体を含む請求項１５の装置。
【請求項１８】
前記アノード電極と前記カソード電極とは、前記支持体によって、前記カソード電極を前記組織の中心に、前記アノード電極を前記組織の周辺部に配置することを可能にする構成に保持される請求項１７の装置。
【請求項１９】
さらに、前記コントローラーに連結されている処理装置であって、前記組織部位の体積の入力にしたがって前記電位の前記持続時間、前記周波数、および前記強度を決定するための処理装置を含む請求項１３の装置。
【請求項２０】
さらに、細胞傷害剤を前記組織中に注入するためのインジェクターメカニズムを含む請求項１３の装置。
【請求項２１】
前記インジェクターメカニズムは、前記電極系の一部を形成する請求項２０の装置。
【請求項２２】
前記インジェクターメカニズムは、少なくとも一部、前記カソード内に統合されている請求項２１の装置。
【請求項２３】
新生腫瘍を有する個人の治療方法であって、細胞傷害剤の不存在下にエンドサイトーシス媒介の細胞死を誘発するのに十分な強度、反復周波数、およびパルス幅の電界パルスを腫瘍細胞に加え、これによって個人を治療することを含む方法。
【請求項２４】
前記電界パルスは、前記腫瘍細胞に対する個人の免疫応答が前記電界パルスの使用後、誘発されるかまたは向上されるように選択される請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記電界パルスは、２〜１５０Ｖ／ｃｍの強度を有する請求項２３の方法。
【請求項２６】
前記電界パルスは、１Ｈｚ〜１００ｋＨｚの反復周波数を有する請求項２３の方法。
【請求項２７】
前記電界パルスは、１μｓ〜１００ｍｓのパルス幅を有する請求項２３の方法。
【請求項２８】
前記電界パルスは、１秒〜６０分間から選択される時間の間、前記腫瘍細胞に加えられる請求項２３の方法。
【請求項２９】
新生腫瘍は、肉腫またはガン腫であり、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸ガン、すい臓ガン、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、扁平上皮細胞ガン、基底細胞ガン、腺ガン、汗腺ガン、脂腺ガン、乳頭状ガン、乳頭腺ガン、のう胞腺ガン、髄様ガン、気管支原性ガン、腎細胞ガン、肝臓ガン、胆管ガン、絨毛ガン、精上皮腫、胎児性ガン、ウイルムス腫瘍、子宮頚ガン、睾丸ガン、肺ガン、小細胞肺ガン、膀胱ガン、上皮ガン、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、および神経芽細胞腫からなる群から選択される請求項２３の方法。
【請求項３０】
前記電界パルスは、腫瘍から形成される転移を根絶することができるよう選択される請求項２３の方法。
【請求項３１】
前記電界パルスは、カソード電極と、個人の組織と接触して配置されるような構成の少なくとも１つのアノード電極とを含む電極系を用いて前記細胞に加えられる請求項２３の方法。
【請求項３２】
前記電界パルスは単極である請求項２３の方法。
【請求項３３】
新生物および潜在的に転移性の腫瘍を有する個人の治療方法であって、エンドサイトーシス媒介細胞死を誘発するのに十分な強度、反復周波数、およびパルス幅の電界パルスを腫瘍細胞に加え、これによって個人の前記細胞への免疫応答を開始または増強させ、これによって個人を治療する方法。
【請求項３４】
前記電界パルスは単極であり、１０〜７０Ｖ／ｃｍの強度、１００Ｈｚ〜１０ｋＨｚの反復周波数、および１〜２００μｓのパルス幅を有する請求項３３の方法。
【請求項３５】
さらに、前記電界パルスの使用に付随して、またはそれに先立って、細胞傷害剤に前記腫瘍組織の細胞を暴露することを含む請求項３３の方法。
【請求項３６】
前記細胞傷害剤への前記腫瘍細胞の前記暴露は、前記電界パルスの前記使用の０．１〜２０分前に実施される請求項３５の方法。
【請求項３７】
前記電界パルスは単極であり、１０〜４０Ｖ／ｃｍの強度、３００〜２，０００Ｈｚの反復周波数、および１〜２００μｓのパルス幅を有する請求項３５の方法。
【請求項３８】
前記細胞傷害剤への前記腫瘍細胞の前記暴露は、個人に前記細胞傷害剤を投与することによって実施される請求項３５の方法。
【請求項３９】
前記投与は、前記細胞傷害剤を腫瘍中またはその周りに直接注入することによって実施される請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記細胞傷害剤は、ブレオマイシン、５−フルオロウラシル、シスプラチン、タクソール、ドキソルビシン、シクロホスファミド、メトトラキセート、およびカルムスチンからなる群から選択される請求項３５の方法。
【請求項４１】
前記細胞傷害剤は、ヒマシ油とエタノールとを含むキャリヤー混合物として供給される請求項３５の方法。
【請求項４２】
さらに、腫瘍の体積を測定することを含み、前記体積は、前記腫瘍細胞に加えられる前記電界パルスの前記強度、反復周波数、および前記パルスを決定するためのものである請求項３３の方法。
【請求項４３】
腫瘍細胞への前記電界パルスの前記使用は、細胞傷害剤の不存在下に実施される請求項３３の方法。
【請求項４４】
新生腫瘍は、肉腫またはガン腫であり、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸ガン、すい臓ガン、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、扁平上皮細胞ガン、基底細胞ガン、腺ガン、汗腺ガン、脂腺ガン、乳頭状ガン、乳頭腺ガン、のう胞腺ガン、髄様ガン、気管支原性ガン、腎細胞ガン、肝臓ガン、胆管ガン、絨毛ガン、精上皮腫、胎児性ガン、ウイルムス腫瘍、子宮頚ガン、睾丸ガン、肺ガン、小細胞肺ガン、膀胱ガン、上皮ガン、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、および神経芽細胞腫からなる群から選択される請求項３３の方法。
【請求項４５】
前記電界パルスは、カソード電極と、個人の組織と接触して配置されるような構成の少なくとも１つのアノード電極とを含む電極系を用いて前記細胞に加えられる請求項３３の方法。
【請求項４６】
腫瘍細胞への個人の免疫応答を刺激する方法であって、腫瘍細胞への個人の免疫応答を刺激するのに十分な強度、反復周波数、およびパルス幅の電界パルスを腫瘍組織の細胞に加えることを含む方法。
【請求項４７】
前記電界パルスは単極であり、１０〜７０Ｖ／ｃｍの強度、１００Ｈｚ〜１０ｋＨｚの反復周波数、および１〜２００μｓのパルス幅を有する請求項４６の方法。
【請求項４８】
さらに、転移性腫瘍の体積を測定することを含み、前記体積は、前記腫瘍組織の細胞に加えられる前記電界パルスの前記強度、反復周波数、および前記パルスを決定するためのものである請求項４６の方法。
【請求項４９】
前記腫瘍組織の細胞への前記電界パルスの前記使用は、細胞傷害剤の不存在下に実施される請求項４６の方法。
【請求項５０】
前記腫瘍組織の細胞への前記電界パルスの前記使用は、投与された免疫刺激剤の存在下に実施される請求項４６の方法。
【請求項５１】
前記免疫刺激剤は、ヒマシ油とエタノールとの混合物から構成されている請求項５０の方法。
【請求項５２】
新生物障害は、肉腫またはガン腫であり、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸ガン、すい臓ガン、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、扁平上皮細胞ガン、基底細胞ガン、腺ガン、汗腺ガン、脂腺ガン、乳頭状ガン、乳頭腺ガン、のう胞腺ガン、髄様ガン、気管支原性ガン、腎細胞ガン、肝臓ガン、胆管ガン、絨毛ガン、精上皮腫、胎児性ガン、ウイルムス腫瘍、子宮頚ガン、睾丸ガン、肺ガン、小細胞肺ガン、膀胱ガン、上皮ガン、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、および神経芽細胞腫からなる群から選択される請求項４６の方法。
【請求項５３】
新生腫瘍を有する個人の治療方法であって、エンドサイトーシス媒介の細胞死を誘発するのに十分な強度、反復周波数、およびパルス幅の電界パルスを腫瘍細胞に加え、これによって個人を治療することを含む方法。
【請求項５４】
前記電界パルスは、前記腫瘍細胞に対する個人の免疫応答が前記電界パルスの使用後、誘発されるかまたは向上されるように選択される請求項５３の方法。
【請求項５５】
前記電界パルスは、２〜１５０Ｖ／ｃｍの強度を有する請求項５３の方法。
【請求項５６】
前記電界パルスは、１Ｈｚ〜１００ｋＨｚの反復周波数を有する請求項５３の方法。
【請求項５７】
前記電界パルスは、１μｓ〜１００ｍｓのパルス幅を有する請求項５３の方法。
【請求項５８】
前記電界パルスは、１秒〜６０分間から選択される時間の間、前記腫瘍細胞に加えられる請求項５３の方法。
【請求項５９】
新生腫瘍は、肉腫またはガン腫であり、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸ガン、すい臓ガン、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、扁平上皮細胞ガン、基底細胞ガン、腺ガン、汗腺ガン、脂腺ガン、乳頭状ガン、乳頭腺ガン、のう胞腺ガン、髄様ガン、気管支原性ガン、腎細胞ガン、肝臓ガン、胆管ガン、絨毛ガン、精上皮腫、胎児性ガン、ウイルムス腫瘍、子宮頚ガン、睾丸ガン、肺ガン、小細胞肺ガン、膀胱ガン、上皮ガン、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、および神経芽細胞腫からなる群から選択される請求項５３の方法。
【請求項６０】
前記電界パルスは、腫瘍から形成される転移を根絶することができるよう選択される請求項５３の方法。
【請求項６１】
前記電界パルスは、アノード電極と、個人の組織と接触して配置されるような構成の少なくとも１つのカソード電極とを含む電極系を用いて前記細胞に加えられる請求項５３の方法。
【請求項６２】
前記電界パルスは単極である請求項５１の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野および背景
本発明は、腫瘍を治療するための低強度電界を用いる方法に関する。より詳しくは本発明は、様々な腫瘍およびガン組織を処理または治療するために、付加化学療法を伴なって、または伴なわずに、２０〜７０Ｖ／ｃｍ程度の低強度パルス電界を利用する方法および装置に関する。
【０００２】
ガンは、死因としては心臓病に次いで２位であり、すべての死亡の２２％を占める（Ｆｒａｕｍｅｎｉ  ＪＦ、Ｄｅｖｅｓａ  ＳＳ、Ｈｏｏｖｅｒ  ＲＮ、Ｋｉｎｌｉｅｎ  ＬＪ．、「Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ」。「Ｃａｎｃｅｒ−ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ」、ＤｅＶｉｔａ  ＶＴ、Ｈｅｌｌｍａｎ  Ｓ、Ｒｏｚｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ（版）ｐｐ１５０、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｊ．Ｒ．Ｃｏ．、フィラデルフィア、１９９３年におけるもの）。結腸ガン、黒色腫、および乳ガンは、ガンの特に問題のある３つの型である。
【０００３】
黒色腫は侵襲性であり、メラニン細胞あるいはメラニン細胞関連母斑細胞に由来する、多くは転移性の腫瘍である（「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（１９９１年）（版）Ａｂｂａｓ  Ａ．Ｋ．，Ｌｅｃｈｔｍａｎ，Ａ．Ｈ．、Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．；Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、フィラデルフィア、３４０〜３４１ページ）。これはすべての皮膚ガンの約３％を構成する。黒色腫の現在の世界的規模の増加が特に心配されており、これを上回るほかの新生物はない。ただし例外は女性の肺ガンである（「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（１９９１年）（版）Ａｂｂａｓ  Ａ．Ｋ．，Ｌｅｃｈｔｍａｎ，Ａ．Ｈ．、Ｐｏｂｅｒ，Ｊ．Ｓ．；Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、フィラデルフィア、３４０〜３４２ページ；ＫｉｒｋｗｏｏｄおよびＡｇａｒｗａｌａ（１９９３年）「ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ」７：１〜１６）。黒色腫の侵襲性は、黒色腫が皮膚に局部化されているように見える場合でさえ、患者の３０％までが全身転移を進行させ、大部分が死亡するほどのものである。
【０００４】
乳ガンは、米国においておよび世界全体で女性にとって重大な健康上の問題である。この病気の検出および治療上の進歩がなされているが、乳ガンは依然として女性におけるガン関連死亡の二番目に多い原因であり、米国では毎年１８０，０００人を超える女性が冒されている。北米の女性の場合、一生涯に乳ガンに罹る確率は、現在では８人に一人である。
【０００５】
結腸ガンは、米国において二番目に多く悪性腫瘍と診断される病気、ならびにガン死の二番目に一般的な原因である。結腸ガンの約１００，０００の新規症例が毎年診断され、約５０，０００人が死亡する。初期局部段階で検出された結腸直腸ガン患者についての５年生存率は９２％であり、残念ながら結腸直腸ガンのわずか３７％しか、この段階で診断が下されない。ガンが隣接器官またはリンパ節まで広がっているならば、生存率は６４％まで低下し、遠隔転移を有する患者の場合は７％まで低下する。外科手術（治療の最も普通の形態）後の再発が主要な問題であり、多くの場合最終的な死因である。この病気の治療の少なからぬ研究にもかかわらず、結腸ガンは依然として診断および治療が難しい。
【０００６】
一般にガン死の主な原因は、転移の成長によるが、その理由は、大部分の症例では、悪性腫瘍と診断される時点までに、転移がほかの部位に既に広がっているからである（再検討のためには、ＦｉｄｌｅｒおよびＢａｌｃｈ、１９８７、Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｂ．Ｓｕｒｇ．２４：１３７参照のこと）。転移性の原発性腫瘍は、多くの場合外科的に除去することができ、満足すべき結果に大いに寄与しうるが、例えば播種性微小ガン組織転移などの転移は、位置決定および／または到達が難しいかまたは不可能であることがあり、したがってこのような転移の外科的除去は通常、選択の対象ではない。したがって転移は、ガン治療に対して最も重大な課題を提起し、この病気の治療の失敗の主な原因である。したがって転移の予防は、ガン患者の予後を改善するために必要である。
【０００７】
効果的にガンを治療するために、原発性腫瘍塊の効率的除去および二次腫瘍成長の予防、および転移細胞の放射が達成されなければならない。さらには、ガン成長の再発の有意義な予防は、抗ガン免疫応答の発生によって達成されうる。
【０００８】
腫瘍の外科的切除は、ガン治療のための最も広く用いられている治療モダリティであり、これの主な目的は、局部的および局所的腫瘍の完全な根絶である。このことは、腫瘍を取囲んでいる正常組織の適切な縁の除去、および局部的再発を防ぐための徹底的な幅広い切除を伴なう。しかしながら患者の外科手術前後の対処における大きい進歩にも関わらず、悪性新生物の外科的治療は、依然として非常に限定されている（Ｅｉｌｂｅｒ  ＦＲ．「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｒｇｅｒｙ」。「Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、Ｈａｓｋｅｌｌ  ＣＭ（版）第五版、４７ページ、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、フィラデルフィア、２００１年におけるもの）。外科技術は、原発性腫瘍または局部的リンパ腺の区域においてのみ効果的であり、手術野の外に位置する新生物に影響を及ぼさない。さらには解剖学的位置によって、多くの腫瘍は、外科的切除によって治療することができない。その理由は、正常組織の適切な縁の除去を行なうことができないからである。同様に外科的治療は、主要血管または極めて重要な器官に密接に関わる腫瘍の場合は選択の対象でないことが多い。同様に多くの患者は、問題の多い病歴を有する。例えば大脳血管または心臓血管の偶発症候、または制御されていない糖尿病によって、これらの患者は高い術後死亡率のため、外科手術の候補としてはあまりよくない。同様に多くの場合、腫瘍切除は、許容しえないレベルの生理学的機能の侵害または美容的損傷を伴なわずに実施することはできない。
【０００９】
単独のまたは外科手術と組合わせた化学療法は、通常最も効率的な抗ガン療法である（Ｈａｓｋｅｌｌ  ＣＭ．「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ」。「Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、Ｈａｓｋｅｌｌ  ＣＭ（版）、第五版、６２〜８６ページ、Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、フィラデルフィア、２００１年におけるもの）。しかしながら、化学療法剤は、例えば骨髄およびリンパ器官損傷などの重大で許容しえない副作用を引起こすことが多く、その結果、免疫抑制を生じ、これによって患者は、致命的な日和見感染、ならびに様々なほかの種類の器官毒性を非常に受けやすくなる。したがって細胞傷害薬の使用は、耐量のみに限定される。化学療法剤の最小治療用量を減少させる１つの方法は、ガン細胞中への化学療法薬の取り込み効率を増強することであろう。
【００１０】
過去二十年間、巨大分子の細胞中への組込みを容易にするための生物学的、化学的、および物理学的プロセスに基づく様々な技術が開発されてきた。生物現象に基づく外因性物質の細胞内送出し方法では、様々な細胞型における特異的膜チャンネルの活性を制御する分子（ＨｅｐｐｅｌおよびＷｅｉｓｍａｎ、１９８５年、Ｊ  Ｍｅｍｂｒ  Ｂｉｏｌ．８６：１８９）、細孔形成毒素（Ａｈｎｅｒｔ−Ｈｉｇｌｅｒら、１９８９年、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」３１：６３）、および化合物のリポソーム−エンドサイトーシス媒介の送出し（Ｆｒｉｅｎｄら、１９９６年、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １２７８：４１）を用いてきた。様々な物質によって、最も普通には浸透化剤としての洗浄剤の使用による細胞膜の化学的変性に基づく浸透性化方法もあり、ＤＮＡと様々な分子との中性複合体の形成による細胞表面へのＤＮＡ結合の刺激またはプロテアーゼ消化を含む、化学的誘発浸透性化に基づく方法もある。細胞中への分子の物理的導入方法には、次のものが含まれる。すなわち、低張応力の使用（Ｐｏｕｌｉｎら、１９９３年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６８：４６９０）、コーティングされた分子による細胞照射（Ｓａｌｆｏｒｄら、１９９３ａ）、マイクロインジェクション（ＳｏｒｅｇおよびＳｅｉｄｍａｎ，１９９２年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、２０７：２２５）、電気穿孔法（Ｐｏｔｔｅｒ、１９９３年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、２１７：４６１）、およびパルス低電界（ＬＥＦ）への暴露（ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＫｏｒｅｎｓｔｅｉｎ、１９９７年、「Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ」、４２：２７５）である。
【００１１】
電気穿孔法は、５００〜５，０００Ｖ／ｃｍの範囲内の高強度電界の５０〜２００μｓパルスに暴露された細胞または細菌中の可逆性高浸透性プラズマ膜状態の形成に関わる。この細胞膜全体における約１Ｖの閾値において、膜浸透性の突然の増加が観察され、これは、過渡的膜欠陥の安定化および大きい準安定親水性細孔へのこれらの膨張によって媒介されると考えられる。過渡的細孔および安定細孔のどちらも、細胞中への外因性物質の導入部位でありうる（Ｈａｐａｌａ，１９９７年、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１０５；ＲｏｌｓおよびＴｅｉｓｓｉｅ，１９９０年、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．５８：１０８９；ＲｏｌｓおよびＴｅｉｓｓｉｅ，１９９８年、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．７５：１４１５）。電気穿孔法はまた、不安定化膜構造の区域における生物学的エンドサイトーシスの刺激に関わるように思われる（Ｒｏｌｓら、１９９５年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １１１１：４５）。電気穿孔法は、電気浸透性化または電気注入とも呼ばれ、一般に細胞に核酸を入れる方法として用いられてきたが、この方法はまた、多様なその他の分子を細胞に装入するためにも用いられてきた。これらの分子には、タンパク質（Ｌａｍｂｅｒｔら、１９９０年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．６８：７２９）、例えばファロイジン（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏら、１９８９年、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９：１４３）または抗体（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉら、１９８９年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６４：１５４９４）が含まれる。
【００１２】
電気穿孔法とは対照的に、ＬＥＦへの暴露による巨大分子の細胞中への組込みは、本発明者らによって開発された方法であるが、これは低電圧電界を利用する。ＬＥＦへの細胞および小胞の暴露は、エンドサイトーシス様のプロセスに関わる、基礎をなすメカニズムを介した、例えば多糖類などの炭水化物、および例えばβ−ガラクトシダーゼなどのタンパク質を含む様々な分子の効率的な細胞内組込みを生じる（ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＫｏｒｅｎｓｔｅｉｎ、１９９７年、「Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ」４２：２７５）。このようなＬＥＦへの膜小胞および細胞の暴露は、細胞膜の平面内の装入タンパク質および脂質の電気泳動側面可動性（Ｐｏｏ、１９８１年、Ｂｉｏｅｎｇ．１０：２４５；Ｂｒｕｍｆｉｅｌｄら、１９８９年  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．５６：６０７）、および経膜電位差の発生（Ｆａｒｋａｓら、１９８４年、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．４５：３６３）を生じる。約１〜１００Ｖ／ｃｍの範囲内の一連のパルス単極電界（ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＫｏｒｅｎｓｔｅｉｎ、１９９７年、「Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ」４２：２７５）への、または約１〜６０Ｖ／ｃｍのピーク間振幅を有するＡＣ電界への懸濁液または単層における細胞の暴露が、例外的に広い範囲である約１〜２，０００ｋＤａの分子量を有する巨大分子の効率的取り込みを生じることが、本発明者らによって証明された。次の電気穿孔法とは異なって、試験管内でのＬＥＦに暴露された細胞は、それの完全性の物理的破壊による膜浸透性の変化を誘発するには低すぎる使用電界の規模によって、高い生存可能性を維持する（ＲｏｓｅｎｂｅｒｇおよびＫｏｒｅｎｓｔｅｉｎ、１９９０年、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．５８：８２３）。ＬＥＦは、エンドサイト−シスを誘発することが証明された。これは、外因性物質の取り込みを結果として生じる、複雑な一連の膜結合プロセスを含むプロセスである。これは、このような物質の細胞表面への結合、エンドサイトーシス小胞の形成、およびエンドサイトーシス小胞のリソソームへの成熟に関わる（Ｍｅｌｌｍａｎ、１９９６年、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．１２：５７５）。
【００１３】
電界を用いるいくつかの先行技術の方法が、腫瘍の治療に用いられてきた。
【００１４】
１つの方法では、培養ＤＣ−３Ｆ細胞に対するこれらの薬品の細胞毒性の増加を試みて、ネトロプシン、ブレオマイシン、またはメルファランと組合わせた電気穿孔法を用いてきた（Ｏｒｌｏｗｓｋｉ  Ｓ．ら、１９８８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３７：４７２７）。
【００１５】
さらにもう１つの方法は、培養細胞に対するこれらの細胞毒性効果を増強しようとして、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エトポシド、パクリタキセル、カルボプラチン、またはシスプラチンとともに電気穿孔法を利用してきた（Ｇｅｈｌ  Ｊ．ら、１９９８年、「抗ガン薬（Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ）」９：３１９）。
【００１６】
さらにもう１つの方法は、マウスにおけるＳＡ−１、ＥＡＴ、またはＢ１６黒色腫腫瘍の治療を試みるために、シスジアミンジクロロ白金（ＩＩ）の投与とともに、非常に高い強度の電界電気穿孔法（１，３００Ｖ／ｃｍ）を用いてきた（Ｓｅｒｓａ  Ｇ．ら、１９９５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５：３４５０）。
【００１７】
もう１つの方法は、ヌードマウスにおける女性器扁平上皮細胞ガン細胞系統ＣａＳｋｉの腫瘍を治療しようと試みるために、ブレオマイシンの投与とともに電気穿孔法を用いてきた（Ｙａｂｕｓｈｉｔａ  Ｈ．ら、１９９７年、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ．６５：２９７）。
【００１８】
別の方法は、頭および首扁平上皮細胞ガンを治療しようとして、ブレオマイシンの投与とともに、非常に高い強度の電界の電気穿孔法（１，３００Ｖ／ｃｍ）を用いてきた（Ｂｅｌｅｈｒａｄｅｋ  ＪＪ．ら、１９９３年、「Ｃａｎｃｅｒ」７２：３６９４）。
【００１９】
さらに別の方法は、頭および首扁平上皮細胞ガン、および唾液腺ガンおよび乳腺ガンを治療しようとして、ブレオマイシンの投与とともに、非常に高い強度の電界の電気穿孔法（１，０００〜１，３００Ｖ／ｃｍ）を用いてきた（Ｄｏｍｅｎｇｅ  Ｃ．ら、１９９６年、「Ｃａｎｃｅｒ」７７：９５６）。
【００２０】
しかしながら上記先行技術の方法のすべては、重大な欠点を有する。
【００２１】
例えばこれらの先行技術の方法のすべては、電気穿孔法、したがって高強度電界を用いており、これらは上記のように有意に細胞毒性があり、その極端な性質によって本質的に有害である。電気穿孔法は、薬品取り込みの増強において非効率的であること、および増強しうる取り込みを有する分子の分子量の範囲に関して制限されているという欠点がある。先行技術の方法は、制限された数の化学療法薬（ブレオマイシン、シスプラチン、アドリアマイシン、および５−フルオロウラシル）の生体内抗腫瘍効果の増強を証明している。さらにはこれらの先行技術の方法のどれも、転移性段階においてガンを治療する上で効果的であることが証明されていない。決定的なことに、これらの先行技術の方法のどれも、化学療法剤の不存在下に腫瘍細胞に対して効果的であることが証明されていない。同様に、これらの先行技術の方法のどれも、抗原投与（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）への抵抗性によって証明されているように抗腫瘍免疫応答を上方に制御（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）する能力を証明していない。
【００２２】
したがってすべての先行技術の方法は、電界を用いて腫瘍を治療するための適切な解決法を提供することに失敗している。
【００２３】
したがって上記の制限のない方法および装置への広く認められているニーズが存在し、これらを有することは非常に有利であろう。
【００２４】
発明の概要
本発明の１つの側面によれば、新生腫瘍を有する個人の治療方法であって、エンドサイトーシス媒介の細胞死を誘発するのに十分な強度、反復周波数、およびパルス幅の電界パルスを腫瘍細胞に加え、これによって個人を治療することを含む方法が提供される。
【００２５】
本発明のもう１つの側面によれば、新生物病を有する個人の治療方法であって、２〜１５０Ｖ／ｃｍの強度、１Ｈｚ〜１００ｋＨｚの反復周波数、および１μｓ〜１００ｍｓのパルス幅を有する電界パルスを、１秒〜６０分間腫瘍細胞に加え、これによって新生物障害に罹っている個人を治療することを含む方法が提供される。
【００２６】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、新生物および潜在的に転移性の腫瘍を有する個人の治療方法であって、エンドサイトーシス媒介細胞死を誘発するのに十分な強度、反復周波数、およびパルス幅の電界パルスを腫瘍細胞に加え、これによって個人の細胞への免疫応答を開始または増強させ、これによって個人を治療する方法が提供される。
【００２７】
下記の本発明の好ましい実施態様におけるほかの特徴によれば、電界パルスは単極であり、１０〜７０Ｖ／ｃｍの強度、１００Ｈｚ〜１０ｋＨｚの反復周波数、および１〜２００μｓのパルス幅を有する。
【００２８】
記載されている好ましい実施態様におけるさらにほかの特徴によれば、この方法はさらに、電界パルスの使用に付随して、またはそれに先立って、細胞傷害剤に腫瘍細胞を暴露することを含む。
【００２９】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、細胞傷害剤への腫瘍細胞の暴露は、電界パルスの使用の０．１〜２０分前に実施される。
【００３０】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、電界パルスは単極であり、１０〜４０Ｖ／ｃｍの強度、３００〜２，０００Ｈｚの反復周波数、および１〜２００μｓのパルス幅を有する。
【００３１】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、細胞傷害剤への腫瘍細胞の暴露は、個人に細胞傷害剤を投与することによって実施される。
【００３２】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、投与は、細胞傷害剤を腫瘍中またはその周りに直接注入することによって実施される。
【００３３】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、細胞傷害剤は、ブレオマイシン、５−フルオロウラシル、シスプラチン、タクソール、ドキソルビシン、シクロホスファミド、メトトラキセート、およびカルムスチンからなる群から選択される。
【００３４】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、細胞傷害剤は、ヒマシ油とエタノールとを含むキャリヤー混合物として供給される。
【００３５】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、この方法はさらに、腫瘍の体積を測定することを含む。この体積は、腫瘍細胞に加えられる電界パルスの強度、反復周波数、およびパルスを決定するためのものである。
【００３６】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、腫瘍細胞への電界パルスの使用は、細胞傷害剤の不存在下に実施される。
【００３７】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、新生物病は、肉腫またはガン腫であり、次のものからなる群から選択される。すなわち、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸ガン、すい臓ガン、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、扁平上皮細胞ガン、基底細胞ガン、腺ガン、汗腺ガン、脂腺ガン、乳頭状ガン、乳頭腺ガン、のう胞腺ガン、髄様ガン、気管支原性ガン、腎細胞ガン、肝臓ガン、胆管ガン、絨毛ガン、精上皮腫、胎児性ガン、ウイルムス腫瘍、子宮頚ガン、睾丸ガン、肺ガン、小細胞肺ガン、膀胱ガン、上皮ガン、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、および神経芽細胞腫である。
【００３８】
本発明のさらに別の側面によれば、新生物病に罹っている個人の治療用装置であって、（ａ）アノード電極と、個人の組織と接触して配置されるような構成の少なくとも１つのカソード電極とを含む電極系；（ｂ）電極系と回路連絡にあり、かつこの電極系を横断して電位を発生させるための電源；および（ｃ）組織内に配置された電極系が、２〜１５０Ｖ／ｃｍの強度、１Ｈｚ〜１００ｋＨｚの反復周波数、および１μｓ〜１００ｍｓのパルス幅を有する電界パルスに、１秒〜６０分間この組織の細胞を暴露することができるように、電位の持続時間、周波数、および強度を設定するためのコントローラーを含む装置が提供される。
【００３９】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、このコントローラーによって、１ｍＶのインクリメントにおいて電位の強度の設定が可能になる。
【００４０】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、この電極系は３つのカソード電極を含んでいる。
【００４１】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、アノード電極および少なくとも１つのカソード電極は、針電極である。
【００４２】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、この電極系は、アノード電極とカソード電極とを保持するため、およびアノード電極およびカソード電極と組織部位とを同時に接触させるための支持体を含む。
【００４３】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、アノード電極とカソード電極とは、この支持体によって、アノード電極を組織の中心に、カソード電極を組織の周辺部に配置することを可能にする構成に保持される。
【００４４】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、この装置はさらに、コントローラーに連結されている処理装置であって、組織部位の体積の入力にしたがって電位の持続時間、周波数、および強度を決定するための処理装置も含む。
【００４５】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、この装置はさらに、細胞傷害剤を組織中に注入するためのインジェクターメカニズムも含む。
【００４６】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、このインジェクターメカニズムは、電極系の一部を形成する。
【００４７】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、このインジェクターメカニズムは、少なくとも一部、アノードカソード内に統合されている。
【００４８】
本発明のさらにもう１つの側面によれば、腫瘍細胞への個人の免疫応答を刺激する方法であって、細胞への個人の免疫応答を刺激するのに十分な強度、反復周波数、およびパルス幅の電界パルスを腫瘍組織の細胞に加えることを含む方法が提供される。
【００４９】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、腫瘍組織の細胞への電界パルスの使用は、細胞傷害剤の不存在下に実施される。
【００５０】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、腫瘍組織の細胞への電界パルスの使用は、投与された免疫刺激剤の存在下に実施される。
【００５１】
記載されている好ましい実施態様のさらにほかの特徴によれば、この免疫刺激剤は、ヒマシ油とエタノールとの混合物から構成されている。
【００５２】
本発明は、例えばガンなどの新生物障害を有する個人の治療において高度に効果的な装置および方法を提供することによって、現在知られている構成の欠点に取組み、成功している。
【００５３】
図面の簡単な説明
本発明は、例としてのみ添付図面を参照して本明細書に記載される。ここで図面を詳細に具体的に参照すると、示されている特定例は、本発明の好ましい実施態様の例としてのみ、および例証的考察のみを目的とするものであり、本発明の原理および概念的側面の最も有用かつ容易に理解される記載であると考えられるものを提供するために示されているということが強調される。この点に関して、本発明の基本的理解に必要であるものよりも詳細に、本発明の構造的詳細を示そうという努力がなされているわけでなく、図面とともに行なわれている説明は、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化されうるかを当業者に明らかにしている。
図１ａ〜ｂは、ＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの生存割合に対する単独のＬＥＦ処理の効果を示している。図１ａは、ＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの累積生存割合を示すデータプロットである。未処理の腫瘍を有するマウス（ＴＢ）。図１ｂは、得られた結果の統計分析を示す表である。
図２は、ＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの腫瘍サイズに対する単独のＬＥＦ処理の効果を示す棒グラフである。未処理の腫瘍を有するマウス（ＴＢ）。
図３は、ＬＥＦを使用した時に電極間で測定されたエネルギー（ジュール）を示す棒グラフである。
図４ａ〜ｃは、ＣＴ−２６腫瘍の進行に対するＬＥＦ／ブレオマイシン処理の様々な組合わせの効果を示している。図４ａおよび４ｂはそれぞれ、ＬＥＦとブレオマイシン（化学療法）処理との示されている組合わせによって処理された、腫瘍を有するマウスの生存率パーセントを示すデータプロットである。図４ｃは、図４ａおよび４ｂで得られた結果の統計分析を示す表である。
図５ａ〜ｂは、ＬＥＦ、ＢＣＮＵ、またはその両方で処理されたＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの、それぞれ生存割合を示すデータプロットおよび腫瘍サイズを示す棒グラフである。ＴＢ−未処理の腫瘍を有するマウス。ＢＣＮＵは、３５ｍｇ／ｋｇ体重の用量で腫瘍内に注入された。累積生存データは、２つの別々の実験から集計され、統計分析はマンテル−コックス（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）テストによって評価された。
図６ａ〜ｂは、ＬＥＦ、ブレオマイシン、またはその両方で処理されたＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの、それぞれ生存割合を示すデータプロットおよび腫瘍サイズを示す棒グラフである。ＴＢ−未処理の腫瘍を有するマウス。累積生存データは、２つの別々の実験から集計された。各グループのマウスの数：９〜１３匹。統計分析はマンテル−コックステストによって評価された。
図７は、ＬＥＦ、５−ＦＵ、またはその両方で処理された、ＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの生存割合を示すデータプロットである。ＴＢ−未処理の腫瘍を有するマウス。マウスは、静脈内（ｉ．ｖ）または腫瘍内（ｉ．ｔ）のどちらかによって、１００ｍｇ／ｋｇ  ５−ＦＵで処理された。統計分析は、マンテル−コックステストによって評価された。データは、１グループあたり６匹のマウスから得られた。
図８は、ＬＥＦ処理とともに外科手術またはＢＣＮＵを用いて処理された、ＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの生存割合を示すデータプロットである。ＴＢ−未処理の腫瘍を有するマウス。統計分析は、マンテル−コックステストによって評価された。データは、１グループあたり５匹のマウスから得られた。
図９ａ〜ｂは、ＢＣＮＵと組合わせた低電界増強ガン化学療法（ＬＥＦＣＴ−ＥＣ）によってＣＴ−２６腫瘍が治癒し、その後ＣＴ−２６細胞の同じ当初致死用量が再抗原投与されたマウスにおける、それぞれ生存割合を示すデータプロットおよび腫瘍サイズを示す棒グラフである。ＴＢマウス−初めて１０５ＣＴ−２６細胞が接種されたマウス。抗原投与（Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）−ＬＥＦＣＴ−ＣＴによって治癒し、１０５ＣＴ−２６細胞が抗原投与されたマウス。
図１０ａ〜ｂは、ＬＥＦＣＴ−ＥＣによってＣＴ−２６腫瘍が治癒したマウスの脾細胞と混合されたＣＴ−２６細胞が接種されたマウスにおける、それぞれ生存割合を示すデータプロットおよび腫瘍サイズを示す棒グラフである。マウスには、１０５ＣＴ−２６細胞のみが接種されているか（対照；ＴＢマウス）、あるいは正常マウス（Ｎ；ｎｏｒｍ（正常））あるいは治癒（Ｉｍ；ｉｍｍｕｎｅ（免疫））マウスの脾細胞と混合された１０５ＣＴ−２６細胞が、ＣＴ−２６細胞対脾細胞１：５０または１：１００の比において接種された。
図１１ａ〜ｃは、ＢＣＮＵ、単独のＬＥＦ、またはＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦによる、１０ｍｍ直径のＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの処理の結果を示す。図１１ａ〜ｂはそれぞれ、生存割合を示すデータプロットおよび腫瘍サイズを示す棒グラフであり、図１１ｃは、図１１ａにおいて得られた結果の統計分析を示す表である。ＴＢマウス−未処理の腫瘍を有するマウス、ＢＣＮＵ３５ｍｇ／ｋｇ−ＢＣＮＵ（３５ｍｇ／ｋｇ）のみで処理された腫瘍を有するマウス、ＬＥＦ４０Ｖ／ｃｍ−ＬＥＦ（４０Ｖ／ｃｍ、１２分）のみで処理された腫瘍を有するマウス、ＬＥＦ−化学療法−ＢＣＮＵ（３５ｍｇ／ｋｇ）とともにＬＥＦ（４０Ｖ／ｃｍ、１２分）で処理された腫瘍を有するマウス。
図１２ａ〜ｃは、ＢＣＮＵ、単独のＬＥＦ、またはＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦ、または外科手術による、１５ｍｍ直径のＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの処理の結果を示す。図１２ａ〜ｂはそれぞれ、生存率を示すデータプロットおよび腫瘍サイズを示す棒グラフであり、図１２ｃは、図１２ａにおいて得られた結果の統計分析を示す表である。ＴＢマウス−未処理の腫瘍を有するマウス、ＢＣＮＵ３５ｍｇ／ｋｇ−ＢＣＮＵ（３５ｍｇ／ｋｇ）のみで処理された腫瘍を有するマウス、ＬＥＦ４０Ｖ／ｃｍ−ＬＥＦ（４０Ｖ／ｃｍ、１２分）のみで処理された腫瘍を有するマウス、ＬＥＦ−化学療法−ＢＣＮＵ（３５ｍｇ／ｋｇ）とともにＬＥＦ（４０Ｖ／ｃｍ、１２分）で処理された腫瘍を有するマウス、外科手術−外科手術のみで処理された腫瘍を有するマウス。
図１３は、腫瘍内シスプラチン投与を伴なうＬＥＦＣＴ−ＥＣ後の、黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの累積生存率を示すデータプロットである。６０〜７０ｍｍ３皮下腫瘍を有するマウスが、単独の、または腫瘍内に注入されたシスプラチン（４ｍｇ／ｋｇ）と組合わせたＬＥＦ処理に付された。
図１４は、タクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣ後の、黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの累積生存率を示すデータプロットである。黒色腫を有するマウスは、単独のタクソール（２０ｍｇ／ｋｇ）、ＬＥＦと組合わせたタクソールを用いて、あるいはＬＥＦと組合わせたヒマシ油／エタノール（１：１ｖ／ｖ）混合物の腫瘍内注入のいずれかによって処理された。
図１５は、腫瘍内ブレオマイシン投与を伴なうＬＥＦＣＴ−ＥＣ後の、黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの累積生存率を示すデータプロットである。黒色腫を有するマウスは、腫瘍内のブレオマイシン（８Ｕ／ｋｇ）で、および／またはＬＥＦで処理された。
図１６は、黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの累積生存率に対する、ブレオマイシンの腫瘍内あるいは腹腔内投与を伴なうＬＥＦの効果を示すデータプロットである。
図１７は、予めＢ１６−Ｆ１０．９黒色腫を有し、Ｂ１６−Ｆ１０．９黒色腫細胞での抗原投与後の、シスプラチンまたはタクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって治癒したマウスの累積生存率を示すデータプロットである。当初の腫瘍接種後１２０〜１８０日間生存した、ＬＥＦ−化学療法によって治癒したマウスに、２×１０５Ｂ１６−Ｆ１０．９細胞が皮下的に抗原投与された。
図１８ａ〜ｄは、ＬＥＦ−化学療法の２日後の腫瘍組織（図１８ｂおよび１８ｄ）中へのリンパ球（図１８ａ〜ｂ）およびマクロファージ（図１８ｃ〜ｄ）の浸潤を示す顕微鏡写真である。
図１９は、タクソールと組合わせた外科手術後、またはタクソールと組合わせたＬＥＦ後の、皮下Ｂ１６−Ｆ１０．９黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの累積生存率を示すデータプロットである。１つの処理グループにおいて、皮下黒色腫は、腫瘍を有するマウスから外科的に除去され、マウスの一部に、切除部位の近くに２０ｍｇ／ｋｇタクソールが皮下投与された。別の処理グループにおいて、腫瘍を有するマウスは、タクソールと組合わされたＬＥＦによって処理された。
図２０は、単独のＬＥＦでの処理またはタクソールと組合わせたＬＥＦによる処理後の、ＤＡ３乳腺ガンを有するＢＡＬＢ／ｃマウスの累積生存率を示すデータプロットである。
図２１は、単独の、またはブレオマイシンと組合わせたＬＥＦ−化学療法による処理後の、ＤＡ３乳腺ガンを有するＢＡＬＢ／ｃマウスの累積生存率を示すデータプロットである。
図２２は、タクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣ処理によって予めＤＡ３乳腺ガンが治癒し、その後発ガン用量のＤＡ３細胞が抗原投与された、ＢＡＬＢ／ｃマウスの累積生存割合を示すデータプロットである。挿入されている表は、このデータプロットに示されている結果の統計分析である。
図２３は、タクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによってＤＡ３腫瘍が治癒したマウスの肺転移における、免疫細胞浸潤を示す顕微鏡写真である。
図２４ａ〜ｄは、正常なマウス、単独のＬＥＦで処理されたマウス（ＥＳ）、腫瘍内タクソール注入で処理されたマウス（タクソールｉ．ｔ）、タクソールと組合わされたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって処理されたマウス（ＥＳＣｗ．タクソール）、腫瘍内ブレオマイシン注入で処理されたマウス（ブレオマイシンｉ．ｔ）、およびブレオマイシンと組合わされたＬＥＦＣＴ−ＥＣよって処理されたマウス（ＥＳＣｗ．ブレオマイシン）における、ＣＤ３−、ＣＤ４−、ＣＤ８−、およびＣＤ１９−陽性脾細胞（それぞれ図２４ａ〜ｄ）の割合の比較を示す棒グラフである。
図２５は、本発明の教示による腫瘍組織の処理に適した器具を例証している。
【００５４】
好ましい実施態様の説明
本発明は、腫瘍を治療するために用いることができる方法および装置に関する。具体的には本発明は、細胞傷害薬の存在下または不存在下に、異なる（ｄｉｓｔｉｎｃｔ）パラメーターの低電界に腫瘍細胞を暴露することによって腫瘍を治療するために用いることができる。
【００５５】
本発明の原理および操作は、図面および添付の説明を参照してよりよく理解することができる。
【００５６】
本発明の少なくとも１つの実施態様を詳細に説明する前に、本発明は、次の説明において示されているか、または図面に例証されている要素の構成の詳細および配列へのその適用において限定されているわけではないと理解すべきである。本発明は、ほかの実施態様が可能であるか、あるいは様々な方法で実行または実施されうる。同様に、本明細書において用いられている表現法および用語法は、説明を目的とするものであり、限定的なものとみなされるべきではないと理解すべきである。
【００５７】
様々な外科的処置および／または様々な細胞傷害薬を利用する処理を含む、数多くのガン治療モダリティが、当業界において知られている。
【００５８】
腫瘍細胞に対する細胞傷害薬の効率を高めようとして、研究者らは細胞傷害薬の取り込みの増加、したがって細胞傷害薬へのこれらの細胞の暴露の増加のための方法を発明してきた。
【００５９】
したがって、腫瘍細胞に対する細胞傷害効果を増強しようとするために、様々な細胞傷害薬とともに、例えば電気穿孔法などの方法が用いられてきた。
【００６０】
低電界（ＬＥＦ）への暴露による細胞中への分子の組込みは、本発明者らによって開発された方法であるが（米国特許第５，９６４，７２６号）、これはまた、細胞毒素を腫瘍細胞中へ導入するためにも用いられてきた。
【００６１】
低強度電界療法の使用は、次のものを含むが、これらに限定されるわけではない多数の利点を与える。すなわち、処理された細胞中への巨大分子を含む分子の組込みの非常に高い効率であり、その結果として、細胞外濃度よりも少なくとも数倍高い細胞毒素の細胞内濃度、ＬＥＦそれ自体に固有の強力かつ特異的な付加抗腫瘍活性、および治癒した腫瘍の再成長からのその後の免疫保護の発生を生じる。
【００６２】
本発明の研究において、本発明者らは、ＬＥＦ方法の治療効率を改良しようとして、様々な電気パルスパラメーターを用いて実験を行なった。
【００６３】
次の実施例のセクションに例証されているように、本発明の研究は、異なるサイン範囲（強度、持続時間、および周波数のパラメーターによって特徴付けられる）の電気パルスが、先行技術の電気穿孔法をベースとする方法と比較して、腫瘍の治療において細胞傷害剤の効率を実質的に改善することを明らかにした。意外にも、本発明の発明者らはまた、別の異なるサイン範囲の電気パルスを、細胞傷害剤を用いる必要もなく、腫瘍を治療するために用いることができることも明らかにした。
【００６４】
したがって本発明の１つの側面によれば、新生物障害、例えばガンに罹っている個人の治療方法が提供される。
【００６５】
本明細書において用いられている「新生物病」という語句は、異常成長（例えば過増殖）または表現型を示す細胞を含む組織の形成を特徴とするあらゆる障害のことを言う。このような組織はまた、本明細書において「腫瘍」とも呼ばれる。ガン、例えば肉腫またはガン腫またはその他のあらゆる過増殖性障害は、本明細書において新生物病と考えられる。
【００６６】
本明細書において用いられている「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、腫瘍に関連して用いられる時、腫瘍組織の成長の停止、そのサイズの減少、またはこのような腫瘍組織の根絶のことを言う。
【００６７】
本発明のこの側面による方法は、２〜１５０Ｖ／ｃｍの強度、１Ｈｚ〜１００ｋＨｚの反復周波数、および１μｓ〜１００ｍｓのパルス幅を有する電界パルスを、１秒から６０分の間腫瘍細胞に加えることによって実施される。好ましくはこれらのパラメーターは、平均電力が１．４ｍＷ〜２．２５Ｗの範囲内で、処理時間にわたって腫瘍細胞に加えられるように選択される。
【００６８】
適切なパルスパラメーターの選択は好ましくは、腫瘍サイズ、化学療法の型（用いられる場合）、細胞の型に関して行なわれる。パルスパラメーターの選択に関連するその他の説明は、次の実施例セクションにおいて示される。
【００６９】
腫瘍の位置およびサイズに応じて、このような電気パルスの使用は、外科的に配置された電極を用いるか、または好ましくは個人の体内に直接挿入し、腫瘍の中またはその周りに配置することができる電極を用いて実施することができる。本発明の教示による、腫瘍組織への電界パルスの使用に適した方法および電極構成に関するそれ以上の説明は、本明細書において以下に、および次の実施例セクションに示される。
【００７０】
好ましくは組織に加えられる電気パルスは単極であるが、ただし二極パルスも、本発明のいくつかの実施態様とともに用いることができる。好ましくは電気パルスは、２〜１００Ｖ／ｃｍの強度、１００Ｈｚ〜１ｋＨｚの反復周波数、および１〜２００μｓのパルス幅を有し、より好ましくは電気パルスは、５〜８０Ｖ／ｃｍの強度、２００〜８００Ｈｚの反復周波数、および５０〜２００μｓのパルス幅を有し、最も好ましくは電気パルスは、１０〜７０Ｖ／ｃｍの強度、３００〜５００Ｈｚの反復周波数、および１００〜２００μｓのパルス幅を有する。
【００７１】
下記の実施例セクションに示されているように、約７０Ｖ／ｃｍの電界強度、約５００Ｈｚの反復周波数、および１８０μｓのパルス幅を有するＬＥＦは、腫瘍の治療に効果的である。
【００７２】
好ましくは電気パルスは、６〜２４分の持続時間、より好ましくは８〜１６分の持続時間、最も好ましくは１０〜１４分の持続時間の間使用される。
【００７３】
下記の実施例セクションにおいて実証されているように、１２分間のＬＥＦの使用は、様々な型の腫瘍を治療するのに特に適している。
【００７４】
本明細書に記載されているように、本発明の方法は、細胞傷害剤の投与を伴なって、または伴なわずに用いることができる。
【００７５】
電気パルスの使用に先立ち（好ましくは０．１〜２０分、より好ましくは２〜４分）、またはそれに付随して投与することができる細胞傷害剤とともに用いられる時（低電界増強ガン化学療法−ＬＥＦＣＴ−ＥＣ）、本発明の方法は好ましくは、単極であり、かつ１０〜４０Ｖ／ｃｍの強度、３００〜５００Ｈｚの反復周波数、および１０〜２００μｓのパルス幅を有する電界パルスを利用する。
【００７６】
細胞傷害剤の投与は、全身的に（例えば静脈内または筋肉内注射によって）、または好ましくは腫瘍の中またはその周りへの細胞傷害剤の直接注入によって、または例えばＬｅｊｅｕｎｅ  ＦＪ．ら、２００１、Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍ．１０：８２１において教示されているように腫瘍の選択的灌流によって実施することができる。
【００７７】
本発明のこの実施態様とともに用いることが細胞傷害剤の例には、次のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。すなわち、アルトレタミン、アミフォスチン、アミノグルテイミド、アスパルギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、フロクスリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、ロイプロリド、ロイコボリム、レバミソール、ロムスチン、メクロレタミン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、オクトレオチド、パクリタキセル、ペントスタチン、プリカマイシン、プレドニゾン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビンである。このような細胞毒素は、次のものを含むが、これらに限定されるわけではない新生物障害に関連した原発性および／または転移性腫瘍を治療するために、本発明のＬＥＦ方法と組合わせて用いることができる。すなわち、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸ガン、すい臓ガン、乳ガン、卵巣ガン、前立腺ガン、扁平上皮細胞ガン、基底細胞ガン、腺ガン、汗腺ガン、脂腺ガン、乳頭状ガン、乳頭腺ガン、のう胞腺ガン、髄様ガン、気管支原性ガン、腎細胞ガン、肝臓ガン、胆管ガン、絨毛ガン、精上皮腫、胎児ガン、ウイルムス腫瘍、子宮頚ガン、睾丸ガン、肺ガン、小細胞肺ガン、膀胱ガン、上皮ガン、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、および神経芽細胞腫である。
【００７８】
次の実施例セクションに示されているように、本発明の方法は、細胞毒性治療の効率を高める上で非常に効果的であった。
【００７９】
さらには次の実施例セクションに示されているように、本発明の教示によるＬＥＦ処理と組合わせた単独のヒマシ油とエタノールとの混合物の投与を、例えば乳ガンなどの腫瘍の治療に用いることができる。
【００８０】
次の実施例セクションはまた、次のことも実証している。すなわち、本発明の方法は、様々な細胞傷害剤、例えばブレオマイシン、ＢＣＮＵ、５−ＦＵ、シスプラチン、およびタクソールの様々な腫瘍型に対する効果を劇的に増強するための一般的な方法として用いることができるということである。腫瘍型には、最も広まっている致命的な既知のガン型のいくつか、例えば結腸ガン、黒色腫、および乳ガンなどが含まれる。
【００８１】
上に記載されているように、および次の実施例セクションに説明されているように、本発明はまた、本発明の方法を細胞傷害薬投与の不存在下に腫瘍組織を処理するためにも用いることができることを証明する決定的な証拠も提供した。
【００８２】
本発明の方法のこの実施態様は、細胞傷害剤の投与の不存在下に前記細胞のエンドサイトーシス媒介死を誘発するのに十分な強度、反復周波数、およびパルス幅の電界パルスを新生物／腫瘍組織の細胞に加えることによって実施される。
【００８３】
したがって先行技術の教示とは対照的に、腫瘍療法は、投与された細胞毒素の完全な不存在下における本発明の方法のこの実施態様によって達成される。横断的（ｔｒａｖｅｒｓｉｎｇ）細胞毒素投与は、本発明の方法のこの実施態様によって用いられる電気パルスパラメーターによって可能にされるが、その理由は、このようなパラメーターが、腫瘍細胞中のエンドサイトーシスを誘発し、したがって細胞外イオンおよび分子の腫瘍細胞中へのエンドサイトーシス媒介輸送を生じるからである。この輸送は、輸送平衡によって影響されない。これらのイオンおよび／または分子の、その結果として生じた高い細胞内濃度は、細胞死を生じるメカニズムの引き金となる。
【００８４】
本発明のこの実施態様による腫瘍組織の処理は、多くの利点を与える。このような処理は、細胞傷害薬の使用を行なう必要がないので、これは、細胞傷害薬の毒性によって引起こされる副作用を排除し、細胞傷害薬療法に対して感受性の高い個人の治療を可能にし、腫瘍療法に伴なう費用を実質的に削減する。
【００８５】
さらにはこのような処理はまた、新生物組織、特にこのような組織から形成された転移に対して向けられた免疫応答を維持または向上させる。
【００８６】
本発明のこの実施態様による処理は好ましくは、単極であり、かつ１０〜７０Ｖ／ｃｍの強度、３００〜５００Ｈｚの反復周波数、および１０〜２００μｓのパルス幅を有する電界パルスを利用する。この処理方法に関するその他の詳細は、次の実施例セクションにおいて示される。
【００８７】
したがって本発明は、細胞傷害剤の付加投与を伴なって、または伴なわずに、安全かつ効果的に腫瘍を治療するために用いることができる方法を提供する。
【００８８】
次の実施例セクションにおいて例証されているように、本発明の１つの明確かつ重要な利点は、腫瘍細胞に対する個人の免疫応答を誘発するかまたは向上させ、したがって腫瘍の転移性細胞と闘う体の能力を誘発または向上させるその能力にある。したがって実際、本発明は腫瘍細胞の成長に対する個人の免疫保護を回復させるか、またはこのような細胞に対する強力な応答を誘発する。
【００８９】
本発明のこの特徴は、ガンの効果的治療に対して極めて重要であるが、その理由は、上記背景セクションにおいてさらに詳細に記載されているように、腫瘍組織の先行技術の根絶方法（例えば外科的処置）は、体から腫瘍関連抗原を直接除去するか、またはその除去につながり、したがって腫瘍細胞に対するその後の免疫応答を生じないからである。
【００９０】
次の実施例セクションに例証されているように、本発明の研究は、次のことを明確に実証している。すなわち、本発明の方法が、腫瘍細胞に対する個人の免疫応答の開始または向上において非常に効果的であるということである。本発明の方法のこの効果は、腫瘍細胞がヒマシ油−エタノール混合物に暴露された時に増幅される。この混合物は実際、免疫刺激剤として機能する。
【００９１】
腫瘍組織処理を容易にするために、本発明はまた、上記において個人に対して提案された腫瘍組織処理の使用のために特別に設計され、かつ構成された装置を提供する。
【００９２】
生体内で上記電気パラメーターを生成するように「構成されている」装置は、（ｉ）体の組織または体液と接触する装置の部分が、好ましくは生体適合性材料（例えば白金またはステンレス鋼）からできていること、（ｉｉ）この装置の電極が、処理される組織、間質液、処理部位における注入材料、標的組織に使用される材料、および上記のものの組合わせを包含しうる、生体内の生きた細胞の周りに、および電解質中に、上記電気パルスを発生させるために必要とされる電流を送ることができること、および（ｉｉｉ）このような電極を構成する材料が、電気処理の結果として壊れないようにするのに十分な電気化学的および機械的性質を有すべきであることを包含することを、当業者は理解することができる。
【００９３】
さらには標的組織の選択された部分に対して、またはその中に位置するように構成された電極とは、このような電極を形成する形状、柔軟性、および材料が、このような目的に適するように選択されることを意味する。さらには、装置が細胞傷害薬の存在下または不存在下における処理を実施するように構成されている場合、このような装置を、どちらかまたは両方の機能を果たすために用いることができることは、当業者には明らかであろう。
【００９４】
ここで図面を参照すると、図２５は、新生物障害に罹っている個人の治療用装置であって、本明細書で装置１０と呼ばれている装置を例証している。
【００９５】
装置１０は、カソード電極１４と少なくとも１つのアノード電極１６（図１５では３つ示されている）とを含む電極系１２を含む。これらのどちらも、個人の組織と接触して配置されるように設計され、かつ構成されている。電極系１２は好ましくはさらに、電極１４および１６を軸方向に間隔があけられている構成に維持するための支持体１８も含んでいる。支持体１８は、１つのプレートとしての形状であってもよく、例えばプラスチックから構成されていてもよい。支持体１８は好ましくは、処理される細胞間に特定の電界を得るため、あるいは特定の空間または組織構成に合わせた電極配列を構成するために、その上の電極１４および１６の位置を使用者が設定することができるように設計され、かつ構成されている。支持体１８は、あらゆる構成におけるあらゆる数の電極１４および／または１６を保持しうる。図２５は、このような１つの構成を例証しており、この場合、カソード電極１４が、３つのアノード電極１６によって取囲まれている支持体１８の中心に配置されている。
【００９６】
電極１４および１６は好ましくは針形状であり、あらゆる適切な導電性材料、例えばステンレス鋼、白金、およびその他の金属または金属合金から構成されている。電極１４および１６はまた、電極の導電性を減少させるため、または発生される電界の方向を変えるために、例えばプラスチックなどの材料で覆われていてもよい。さらには電極１４および１６は、支持体１８から容易に除去し、廃棄することができ、新しい電極をその上に配置することができ、これによって電極系１２は、滅菌および患者との接触を必要とする使用に適したものになる。
【００９７】
電極系１２は、電源２０と回路連絡にあり、電源はハウジング２２内に配置され、これは電力を生成するのに用いられる。電源は好ましくは１１０〜２４０Ｖ  ＡＣ入力−ＡＣまたは好ましくはＤＣ出力である。本明細書において用いられている「回路連絡にある」という語句は、（ｉ）互いに直接または間接的に電気連結されている器具；（ｉｉ）これら相互間にほかの器具または器具の組合わせ（例えばブレーカー、継電器、緩衝器、駆動装置、トランスミッター、レシーバー、およびデコーダー）を有する器具；（ｉｉｉ）互いに光学連絡にある（例えばオプトアイソレーターまたは光ファイバーリンクによる）器具；（ｉｖ）互いに電磁連絡にある（例えば無線周波数トランスミッターおよびレシーバーペアによる）器具；（ｖ）ほかの構造により、およびこれらの構造を通じて連結され、これらが互いに連絡することを可能にする器具；および（ｖｉ）上記のいずれかのあらゆる組合わせを記載するために用いられる。
【００９８】
電源２０は、電極系１２に電位を発生させるのに用いられる。電源２０は、本明細書に記載されているような予め決定されている形状、電圧、持続時間、および分離のＬＥＦパルスを送出すように変更されたパルス発生器、例えばＰＡ−２０００またはＰＡ−４０００（どちらもＣｙｔｏ  Ｐｕｌｓｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｍｄ．）製）またはＴ８２０（ＢＴＸ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を含んでいてもよい。
【００９９】
装置１０は好ましくはさらに、コントローラー２４も含んでいる。これは、処理される組織中に配置された電極系１２が、５〜１００Ｖ／ｃｍの強度、１００〜７００Ｈｚの反復周波数、および１〜２００μｓのパルス幅を有する電界パルスに、０．１秒〜６０分間組織の細胞を暴露することができるように、電位の持続時間、周波数、および強度を設定するのに用いられる。コントローラー２４は、例えばＰＡ−２０１プログラマブルパルススイッチ、または使用者が所望のパルスパラメーターを設定することができるようにするのに適したその他のあらゆる要素などの要素を含んでいてもよい。好ましくはコントローラー２４は、パルスパラメーターをプログラムするためのハードウエア／ソフトウエアを含み、精密であり、１ｍＶインクリメント以内の電界パラメーター、ナノ秒のパルスの持続時間、および０．１Ｈｚインクリメントのパルス周波数を設定しうる。
【０１００】
コントローラー２４の設定は、所望のパルスパラメーターを入力することによって、使用者の入力インターフェース２６を介して手動で実施することができる。使用者はまた、治療に関連する追加のパラメーター、例えば処理される組織の体積、組織型等も入力することができる。さらには入力インターフェース２６はまた、患者特有のデータ、例えば患者のＩＤ、年齢、体重、治療歴等を入力するために用いることもできる。入力されたデータは好ましくは、装置１０の磁気、光学、または光学−磁気保存デバイス２８に保存される。
【０１０１】
装置１０は好ましくはさらに、処理される組織の体積、組織型等に関連する情報についての使用者からの入力にしたがって、電位の持続時間、周波数、および強度を決定するために用いられる処理装置３０も含む。
【０１０２】
装置１０はまた、オペレーターが処理の進行を監視することができるようにする出力インターフェース３１（例えばディスプレー）も含む。処理の進行は、電極系１２（例えば電極１４および１６と一体化されているもの）の一部をなすフィードバック電極を用いて監視することができる。フィードバック電極は、処理される組織の電気的状態を監視し、このような監視された情報を、処理およびディスプレーのための装置１０に中継するように設計されている。
【０１０３】
装置１０はまた、処理される組織中に細胞傷害剤を注入するのに用いられるインジェクターメカニズム３２を含んでいてもよい。インジェクターメカニズム３２は、細胞毒素を組織に送出すのに用いられるインジェクター口３６と液体が流れる関係にある細胞毒素を貯蔵するためのリザーバ３４を含んでいてもよい。好ましくはインジェクター口３６は、電極１４および／または１６（例えば中空電極）の一部をなす。
【０１０４】
装置１０はさらに、処理区域を照らすのに役立つ照明源を含んでいてもよい。これは、装置１０のオペレーターが電極系１２を正確に配置することを可能にする。
【０１０５】
装置１０は、体の外から標的組織中へ電極１４および１６を方向づけるのに用いることができる、例えばＸ線および超音波などの画像化系とともに用いられてもよい。
【０１０６】
したがって本発明は、容易に、安全に、かつ効果的に腫瘍組織を処理するために用いることができる方法および装置を提供する。下記に示されている結果によって明確に例証されているように、本発明の方法は、次の点ですべての既知の先行技術の方法よりも明らかに優れている。すなわち、これは原発性腫瘍を直接破壊するために用いることができ、抗腫瘍免疫／炎症応答を引き出すことによって、残留転移疾病の破壊を容易にするという点である。
【０１０７】
本発明のその他の目的、利点、および新規特徴は、次の実施例を調べた時に、当業者には明らかになるであろう。これらの実施例は、限定的なものとされているわけではない。さらには上に記載され、特許請求の範囲のセクションにおいて特許請求された本発明の様々な実施態様および側面の各々は、次の実施例において実験的立証が得られる。
【０１０８】
実施例
ここで次の実施例を参照する。これらの実施例は、上記説明とともに本発明を非限定的に例証する。
【０１０９】
一般に本明細書において用いられている命名法および本発明において利用されている実験室手順は、当業者によく知られている。その他の一般的な参考文献は、この書類全体に示されている。本明細書における手順は、当業界でよく知られていると考えられ、読む人の利便性のために示されている。本明細書に含まれているすべての情報は、参照して本明細書に組込まれる。
【０１１０】
実施例１
低強度電界増強ガン化学療法による、ＣＴ−２６結腸ガンを有するマウスの平均余命の延長および治癒
結腸直腸ガンは、西側世界における二番目に多い悪性腫瘍である。毎年世界中で結腸直腸ガンによる約４００，０００人の死亡があると推定される。外科手術は、患者の約５０％を治癒させることができ、結腸直腸ガン患者の全体の５年生存率は、５０〜５５％程度である。しかしながらかなり多数の患者は、この病気の初期段階でさえ、重度の合併症のために外科手術を受けることができない。したがって外科手術を受けることができない、あるいは再発性疾患を有する患者にとって効果的な治療モダリティが、非常に望ましい。低電界増強ガン化学療法（ＬＥＦＣＴ−ＥＣ）は、このような患者における潜在的に貴重な治療の選択肢である。したがってＬＥＦＣＴ−ＥＣが結腸ガンの治療を向上させる可能性を測定するために、転移性結腸ガン細胞系統の腫瘍を有するマウスを、様々な化学療法薬とともにＬＥＦで処理し、原発性腫瘍成長、生存時間、および治癒率に対するこの処理の効果を、次のように分析した。
【０１１１】
材料および方法
マウス：ＢＡＬＢ／Ｃオスマウスを、イスラエル国のテルアビブ大学の繁殖コロニーから入手した。マウスは、生後８〜１２週のものを用いた。動物の世話および実験は、テルアビブ大学のガイドラインにしたがって実施した。
【０１１２】
腫瘍：ＣＴ−２６を有するマウスに、結腸ガン腫瘍を成長させ、転移性結腸ガン細胞系統を、化学的発ガンによってＢＡＬＢ／Ｃマウスに誘発させた。細胞は、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン；１ｍＭピルビン酸ナトリウム；１％非必須アミノ酸溶液；１０％熱不活性化ウシ胎児血清が補足されたダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。培養物は、加湿インキュベーターにおいて５％ＣＯ２雰囲気で３７℃に維持した。
【０１１３】
腫瘍細胞接種：１００μＬＰＢＳ中に懸濁された１０５ＣＴ−２６細胞を、マウスの背中の下部側面中に皮内接種した。局部腫瘍成長は、キャリパーを用いて、３つの互いに直交する腫瘍直径を測定して決定した。腫瘍の体積は、式：体積＝Ｄ１×Ｄ２×Ｄ３×π／６（式中、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３は、３つの互いに直交する腫瘍直径である）を用いて計算した。
【０１１４】
電界監視：電界は、電気パルス発生器ＣＲＡＳＳ  Ｓ４８スティミュレーター（ＣＲＡＳＳ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｑｕｉｎｃｙ，ＭＡ．，ＵＳＡ）およびＣＯＳ５０２０−ＳＴデジタルオシロスコープ（２０ＭＨｚ）を用いて監視した。
【０１１５】
低強度電界刺激：腫瘍をＬＥＦに付すために、ステンレス鋼針を電極として用いた。直
径５ｍｍ（約６５ｍｍ３）の腫瘍に電極針を突き刺した。腫瘍の中心の１つのカソード、および３または４個の周辺アノードがある。これらの電極を、電気パルス発生器およびオシロスコープに連結した。５００Ｈｚの反復周波数および１８０μｓのパルス幅を有するパルスＬＥＦを、１２分または２０分の持続時間、２０、４０、６０、および７０Ｖ／ｃｍで使用した。化学療法薬投与の２〜４分後、電気パルスを投与した。処置の１０分前にマウスに麻酔を行なった。
【０１１６】
化学療法剤：ブレオマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．，Ｉｓｒａｅｌ；Ｍｅｇａｐｈａｒｍ  Ｌｔｄ．，Ｉｓｒａｅｌ）を２〜８℃の温度に維持し、使用前、５０Ｕ／ｋｇ体重の投薬量を可能にする濃度に至るまで、発熱物質を含まないＰＢＳ中に溶解した。ＢＣＮＵを、３５ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で投与し、５−ＦＵ（Ａｂｉｃ，Ｉｓｒａｅｌ）を、１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で用いた。
【０１１７】
麻酔：ＬＥＦ処理の１０分前、マウス１匹あたり０．２５ｍｌの容積で腹腔内に注入された、ＰＢＳ中に溶解された６．２５ｍｇ／ｋｇ体重の塩酸キシラジンと１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量のイマルゲンとを含む麻酔カクテルを用いて、マウスに麻酔を行なった。
【０１１８】
統計分析：生存時間（カプラン−マイヤーテスト）、グループ間の生存率の比較（マンテル−コックステスト）、およびグループ間の腫瘍体積の差を、スタットソフト（ＳｔａｔＳｏｆｔ）「スタティスティカ（Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ）」統計ソフトウエアを用いてプロットした。
【０１１９】
実験結果：
単独のＬＥＦ処理による、転移性結腸ガン腫瘍を有するマウスの治癒：ＣＴ−２６腫瘍の進行に対する単独のＬＥＦの影響を調べるために、マウスに、１０５ＣＴ−２６腫瘍細胞を皮下または皮内接種した。腫瘍が５ｍｍの平均直径に達した時、ＬＥＦ処理を使用し、生存率および腫瘍体積を監視した。異なる電気パルス下の２つの電極間のエネルギーも計算した。
【０１２０】
図１ａ〜ｂに示されているように、単独のＬＥＦでの処理は意外にも生存率を向上させるうることが分かった。未処理マウスの１／２が、約４２日後にも依然として生存しているが、２０Ｖ／ｃｍのＬＥＦで処理されたマウスの１／２が、６２日後にも依然として生存し、４０Ｖ／ｃｍのＬＥＦで処理されたマウスの１／２が、６８日後にも依然として生存し、６０または７０Ｖ／ｃｍのＬＥＦで処理されたマウスの７０％が、実験の最終時点である９０日後に依然として生存していた。したがって６０および７０Ｖ／ｃｍのＬＥＦを用いた、腫瘍を有するマウスの処理の結果、７０％の治癒率を生じた。これらの結果の統計分析を図１ｂに示す。
【０１２１】
図２に示されているように、単独のＬＥＦでの処理は同様に意外にも、使用された電界の強度に比例して、腫瘍サイズを大幅に減少させうることが分かった。未処理マウスの腫瘍体積が、２７日後に５，５００ｍｍ３超に達したが、７０Ｖ／ｃｍのＬＥＦで処理されたマウスは、検出可能な腫瘍を示さなかった。
【０１２２】
図３は、ＬＥＦを用いた時の電極間で測定されたエネルギーを示す。
【０１２３】
結腸ガンの治療のためのブレオマイシンの増強作用に対するＬＥＦ持続時間および強度の効果：結腸ガンの治療に最適なＬＥＦＣＴ−ＥＣ／ブレオマイシン療法を決定するために、ＣＴ−２６腫瘍を有するマウスを、４０Ｖ／ｃｍのＬＥＦで１２分間、２０Ｖ／ｃｍで１２分または２０分間、ブレオマイシンの投与を伴なって、または伴なわずに処理し、生存率を分析した。図４ａ〜ｃに示されているように、最適なＬＥＦＣＴ−ＥＣ／ブレオマイシン処理は、４０Ｖ／ｃｍのＬＥＦでの１２分間の処理と組合わせたブレオマイシンの投与であることが分かった。テストされたすべての組合わせにおいて、単独のＬＥＦ処理よりも、ＬＥＦ処理とともにブレオマイシンを投与する時、生存率が大幅に向上した（それぞれ図４ａおよび４ｂ）。図４ａおよび４ｂにおいて得られた結果の統計分析を、図４ｃに示す。
【０１２４】
ＬＥＦ処理は、ＢＣＮＵ、ブレオマイシン、または５−ＦＣの抗結腸ガン活性を向上させる：結腸ガンの治療のために、化学療法薬ＢＣＮＵ、ブレオマイシン、または５−ＦＣとともにＬＥＦＣＴ−ＥＣを用いる有効性を測定するために、ＣＴ−２６腫瘍細胞を有するマウスを、ＬＥＦ（４０Ｖ／ｃｍ、１２分間）の使用とともにこれらの薬品で処理し、生存率および／または腫瘍サイズを監視した。
【０１２５】
図５ａに例証されているように、単独のＢＣＮＵの腫瘍内注入で処理されたマウスの半分は、約４８日後に死んだが、ＬＥＦ処理とともにこの薬品を使用すると、５２日後の８３％の生存率によって実証されているように、生存率における非常に高い増加を生じた。これは、実験の最終時点である１１０日目まで不変のままであった。図５ｂは同様に、ＬＥＦ処理によるＢＣＮＵ誘発腫瘍サイズ減少の非常に強い増強作用を実証している。その理由は、２１日後、この薬品のみで処理されたマウスの腫瘍が、ＢＣＮＵおよびＬＥＦの両方で処理されたマウスの腫瘍サイズの約３倍であったからである。したがってＢＣＮＵと組合わせた、腫瘍を有するマウスのＬＥＦＣＴ−ＥＣ処理の結果、８３％治癒率を生じた。
【０１２６】
図６ａに示されているように、単独のブレオマイシンの腫瘍内注入で処理されたマウスの半分は、約５１日後に死んだが、ＬＥＦ処理とともにこの薬品を使用すると、６０日後の３３％の生存率によって実証されているように、生存率における有意な向上を生じた。これは、実験の最終時点である１２０日目まで不変のままであった。同様に図６ｂは、ＬＥＦ処理によるブレオマイシン誘発腫瘍サイズ減少の非常に強い増強作用を示している。その理由は、２１日後、この薬品とＬＥＦとの組合わせで処理されたマウスの腫瘍が、この薬品のみで処理されたマウスの腫瘍サイズの半分以下であったからである。したがってブレオマイシンと組合わせた、腫瘍を有するマウスのＬＥＦＣＴ−ＥＣ処理の結果、３３％の治癒率を生じた。未処理マウスとＬＥＦ−化学療法グループとの生存動力学の統計学的比較は、Ｐ＝０．００００１を生じた。
【０１２７】
図７に例証されているように、単独の５−ＦＵの腫瘍内または静脈内注入で処理されたマウスの半分は、４０〜４５日の間に死んだが、一方、ＬＥＦとともにこの薬品で処理されたマウスは、生存率における大幅な増加を示した。その理由は、ＬＥＦ処理とともに５−ＦＵの腫瘍内または静脈内注入で処理されたマウスの半分が、８０日後に依然として生存していたからである。未処理グループとＬＥＦ−化学療法ｉ．ｖ．処理グループとの生存動力学の統計学的比較は、Ｐ＝０．０００５１を生じ、ＬＥＦ−化学療法ｉ．ｔ．グループと未処理マウスとの生存率の比較は、Ｐ＝０．００４９を生じた。
【０１２８】
ＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣは、マウスの転移性結腸ガンの治療のための外科手術と同程度に効率的である：ＬＥＦＣＴ−ＥＣの潜在的有効性と結腸ガンの治療のための外科手術の潜在的有効性とを比較するために、直径５ｍｍのＣＴ−２６腫瘍を有するマウスは腫瘍が外科的に除去されるか、または４０Ｖ／ｃｍのＬＥＦとＢＣＮＵとの組合わせで処理された。図８から分かるように、未処理マウスはすべて５４日後に死んだが、外科手術またはＢＣＮＵとともにＬＥＦで処理されたマウスは、実験の最終時点である約１２０日後まで、約６０日後同様に向上した４０％生存率を示した。未処理マウスと外科的処理グループとの生存動力学の統計学的比較は、Ｐ＝０．０１８を生じた。
【０１２９】
ＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって処理されたＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの治癒における免疫および／または炎症メカニズムの関与：
ＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって転移性結腸ガンが治癒したマウスは、その後の腫瘍への抵抗性を現わす：ＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによってＣＴ−２６腫瘍が治癒したマウスが、このような腫瘍の成長に対して抵抗性を有するようになるかどうかを調べるために、治癒したマウスに、最初の接種の８０〜１２０日後、最初の接種と同じ用量の１０５ＣＴ−２６細胞を抗原投与し、腫瘍の成長および生存についてこれらの動物を監視した。
【０１３０】
図９ａに例証されているように、初めてＣＴ−２６細胞が接種されたマウスの半分のみが、約３７日目に依然として生存していたが、治癒して抗原投与されたマウスの半分が、約６３日目まで依然として生存していた。同様に、図９ｂに示されている結果は、１８日後、再接種されたマウスの腫瘍の体積が、初めて接種されたマウスの腫瘍よりも約１位数の規模だけ小さかったことを示している。したがってＬＥＦＣＴ−ＥＣによるＣＴ−２６腫瘍の治癒は明らかに、この腫瘍でのその後の抗原投与に対して保護効果を誘発する能力を有する。腫瘍を有するマウスグループと抗原投与グループとの生存動力学の統計学的比較は、Ｐ＝０．００００２を生じた。
【０１３１】
ＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって治癒した腫瘍を有するマウスからの脾細胞の抗腫瘍効果：ＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによってこのような腫瘍が治癒したマウスにおける、ＣＴ−２６腫瘍での抗原投与に対する抵抗性の進行が、免疫学的に媒介されているかどうかを調べるために、正常なマウスに、治癒した動物からの脾細胞と混合されたある用量のＣＴ−２６腫瘍細胞を接種した。図１０ａ〜ｂに示されている結果は明らかに次のことを示している。すなわち、治癒したマウスからの脾細胞が、生存率を大幅に向上させる能力を有し（図１０ａ）、腫瘍細胞対脾細胞１：１００の比でＣＴ−２６細胞および脾細胞が接種された治癒マウスからのＣＴ−２６細胞脾細胞が接種されたマウスにおいて、腫瘍の成長を完全に防ぐ能力（図１０ｂ）を有するということである。したがってＣＴ−２６腫瘍を有するマウスのＬＥＦＣＴ−ＥＣ＋ＢＣＮＵ治療的処置は、このようなマウスにおけるこのような腫瘍のその後の成長への免疫抵抗を誘発させる。
【０１３２】
大きい腫瘍を有するマウスにおけるＣＴ−２６の進行に対するＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣの効果：大きい腫瘍を抱えたマウスにおける腫瘍の進行に対するＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣの有効性を調べるために、直径１０ｍｍ（約５２３ｍｍ３）または１５ｍｍ（約１，７６０ｍｍ３）の腫瘍を有するマウスを、７ｍｍ離して配置された４つの電極で処理した。
【０１３３】
図１１ａ〜ｃに示されているように、ＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによるマウスの処理は、非常に高い割合の動物を治癒させることができた。ＢＣＮＵのみでの処理は、９０日後すべてのマウスの死を生じたが、単独のＬＥＦＣＴ−ＥＣでの処理は、１２０日後３０％の生存率を生じ、ＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによる処理は、マウスの８０％以上の治癒率を生じた（図１１ａ）。同様に、図１１ｂに示されているように、ＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって処理されたマウスの腫瘍のサイズはおよそ、単独のＢＣＮＵによって処理されたマウスのものよりも約１位数小さい程度の規模であった。図１１ａにおいて得られた結果の統計分析を、図１１ｃに示す。
【０１３４】
図１２ａ〜ｃに示されているように、ＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによる腫瘍を有するマウスの処理は、１００％治癒率および腫瘍成長の完全な予防を生じた。ＢＣＮＵのみでの処理または外科手術のみは、それぞれ８７日および８４日後にすべてのマウスの死を生じたが、ＬＥＦのみまたはＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦでのマウスの処理は、それぞれ１００日後約２０％、最も劇的には１００％の生存率を生じた（図１２ａ）。同様に図１２ｂに示されているように、ＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって処理されたマウスにおいて、ＢＣＮＵ、ＬＥＦ、または外科手術のみで処理されたマウスとは異なって、４２日後に腫瘍はまったく検出されなかった。図１２ａにおいて得られた結果の統計分析を、図１２ｃに示す。
【０１３５】
したがってこれらの結果は、次のような驚くべき発見を示している。すなわち、単独のＬＥＦ処理は、転移性結腸ガン腫瘍を有する動物の高い治癒率を生じる能力を有すること、およびＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによる処理は、ＣＴ−２６結腸ガン腫瘍を有するマウスにおいて１００％治癒になりうること、およびＬＥＦ処理はまた、ブレオマイシンおよび５−ＦＵの抗結腸ガン活性を向上させることである。さらにはこれらの結果はまた、ＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣが、腫瘍を有する動物における小さい転移性結腸ガンの治療のための外科手術と同様に効率的であること、ＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによる転移性結腸ガンが治癒した動物は、その後の腫瘍成長への抵抗性を現わすこと、およびＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣは、大きい結腸ガン腫瘍に対する外科手術よりも強力な治療モダリティを示すことを証明している。したがって本発明の方法は、すべての先行技術の方法よりも明らかに優れた、結腸ガンの強力かつ新規な治療手段である。
【０１３６】
実施例２
低強度電界増強ガン化学療法によるＢ１６黒色腫を有するマウスの腫瘍成長の遅延および治癒
黒色腫は、発病率が上昇傾向にあり、非常に高い死亡率を有する非常に侵襲的な種類の皮膚ガンである。この危険な病気についての満足すべき治療モダリティは存在しない。ＬＥＦでの細胞の処理が、巨大分子の効率的な細胞取り込みを生じる能力を有することが既に証明されているので、ＬＥＦ処理が黒色腫細胞による化学療法剤の取り込みを向上させ、これによってその抗黒色腫活性を増強する能力は、次のように証明された。
【０１３７】
材料および方法
動物：Ｃ５７ＢＬ／６オスマウスを、イスラエル国のテルアビブ大学の繁殖コロニーから入手した。マウスは、生後８〜１２週のものを用いた。動物の世話および実験は、テルアビブ大学のガイドラインにしたがって実施した。
【０１３８】
黒色腫腫瘍細胞系統：マウスに黒色腫腫瘍を発生させるために、Ｂ１６黒色腫細胞系統の高度に転移性で免疫原性の低いＢ１６−Ｆ１０．９（Ｆ１０．９）サブクローンを用いた（Ｅｉｓｅｎｂａｃｈ  Ｌ．ら、１９８４、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ３４：５６７）。細胞を、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、４ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、および１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）が補足されたＤＭＥＭ中に維持し、加湿インキュベーターにおいて７％二酸化炭素および９３％空気の雰囲気中で３７℃で培養した。
【０１３９】
腫瘍発生プロトコル：Ｆ１０．９腫瘍を、２×１０５Ｆ１０．９細胞の皮下注射によってＣ５７ＢＬ／６マウス中に誘発した。腫瘍が直径５ｍｍ（約６０〜７０ｍｍ３）に達したら、マウスを実験処理に付した。
化学療法薬：用いられた化学療法薬は、次のものであった。すなわち、注入のためにＰＢＳ中に溶解されたシス−白金（ＩＩ）ジアミンジクロライド（シスプラチン；＃Ｐ−４３９４、シグマ社、イスラエル国）；６ｍｇ／ｍｇパクリタキセル、５２７ｍｇ／ｍｌの精製Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（ポリオキシエチル化ヒマシ油）、および５−ＦＵ（Ａｂｉｃ、イスラエル国）を含む滅菌非発熱性溶液として得られたタクソール（Ｍｅａｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ａ  Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ、米国）である。
【０１４０】
試薬：用いられる試薬には、ヒマシ油（Ｆｌｏｒｉｓ、イスラエル国）、メタノールを有するエオシンアルコール（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、英国）、ハリスのヘマトキシリン（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、英国）、および緩衝ホルムアルデヒド（Ｆｒｕｔａｒｏｍ、イスラエル国）が含まれる。
【０１４１】
抗体：免疫組織化学のために用いられた抗体は、ラット抗マウスＣＤ３（＃ＭＣＡ１４７７、Ｓｅｒｏｔｅｃ、米国）、ラット抗マウスＦ４／８０抗原（＃ＭＣＡ４９７、Ｓｅｒｏｔｅｃ、米国）、およびモノクローナル抗体Ｆ７−２６（＃８０４−１９２−Ｌ００１、Ａｌｅｘｉｓ、米国）であった。
【０１４２】
低強度電界増強ガン療法プロトコル：腫瘍が直径５ｍｍに達したら（腫瘍細胞接種の１１〜１７日後）、マウスをＬＥＦＣＴ−ＥＣの単一処理に付した。１００μｌまでの容積の化学療法剤を腫瘍部に注入し、電界への暴露は、化学療法剤の腫瘍内注入の３〜４分後に実施した。腫瘍を電界に暴露するために、薄い絶縁銅ワイヤを用いて真鍮の末端部にはんだ付けされた、ステンレス鋼電極針（Ｋａｒｌｓｂａｄｅｒ昆虫ピン、Ｎｏ．０、ＢｉｏＱｕｉｐ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、米国）を用いた。電極を、腫瘍の中およびそのすぐ近くに経皮的に約７ｍｍの深さまで挿入した。１つのカソード針が腫瘍の中心に、３つの周辺アノードがカソードから約５ｍｍの距離にある。針を、電気パルス発生器（Ｇｒａｓｓ  Ｓ４８スティミュレーター、米国）に連結した。使用された電界強度は約４０Ｖ／ｃｍ、反復周波数が５００Ｈｚ、パルス幅が１８０μｓであった。マウスのすべてにＬＥＦ処理の前に麻酔を行なった。
【０１４３】
麻酔：実施例セクションの実施例１で上に記載されているように実施した。
【０１４４】
統計分析：生存時間（カプラン−マイヤーテスト）、グループ間の生存率の比較（マンテル−コックステスト）、およびグループ間の腫瘍体積の差（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖテスト）を、スタットソフトスタティスティカ統計ソフトウエアを用いてプロットした。ＬＥＦまたはＬＥＦ−化学療法の５日後の１０〜１５％の死亡率は、処理によって引起こされたとみなされ、したがってこのような死亡例は除外した。
【０１４５】
腫瘍体積測定：実施例セクションの実施例１で上に記載されているように実施した。
【０１４６】
実験結果：
化学療法剤シスプラチン、タクソール、ブレオマイシン、および５−ＦＵを用いた、Ｂ１６−Ｆ１０．９を有するマウスの生存率に対するＬＥＦＣＴ−ＥＣの効果：
この研究の第一段階において、ＬＥＦ処理は、化学療法剤シスプラチン、タクソール、ブレオマイシン、および５−ＦＵと組合わせて用いられた。最適な結果に必要とされるＬＥＦＣＴ−ＥＣの電気刺激の持続時間を調査した。シスプラチン（４ｍｇ／ｋｇ体重）を腫瘍内に注入し、ついで１２、１５、または２０分間電気刺激を行なった。異なる暴露期間に付されたグループ間に有意差はなかったが、処理後数日以内の死亡率は、１２分間のみ暴露されたグループと比較して、１５または２０分間電界に暴露されたグループの方が高かった。したがってその後の実験のために、１２分の暴露時間が選択された。
【０１４７】
シスプラチンと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣの抗腫瘍効果：腫瘍内シスプラチン投与と組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによる、Ｆ１０．９腫瘍を有するマウスの処理効果を分析した。図１３に例証されているように、ＬＥＦ−化学療法処理されたマウスの平均生存時間（ＭＳＴ）（腫瘍接種の１２０日後）は、５１．１日であったが、一方、非処理の腫瘍を有する動物は、３０．３日の平均生存を有していた。単独の化学療法および単独の電気刺激は、それぞれ２９．５日および３２．８日の平均生存時間を生じた。さらにはＬＥＦ−化学療法グループにおいて、これらの動物の１３．５％が、腫瘍接種の１２０日後、腫瘍が無かった。マンテル−コックス統計分析は、その他のすべてのグループと比較して、ＬＥＦ−化学療法処理マウスの生存率において有意な改善（Ｐ＜０．０００００４）を示した。シスプラチンまたは単独のＬＥＦは、有意な効果を有していなかった。したがってＬＥＦＣＴ−ＥＣは、シスプラチンの抗黒色腫効果を有意に増強する能力を有する。
【０１４８】
タクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣの抗腫瘍効果：化学療法剤としてパクリタキセルを用いて（腫瘍内に２０ｍｇ／ｋｇ）、同様な実験を実施した。パクリタキセルをヒマシ油およびエタノール中に溶解してから、低強度電界刺激対照グループのマウスに、電気刺激に先立って、ヒマシ油＋エタノール（１：１ｖ／ｖ）からなる混合物１００μｌを腫瘍内に注入した。この混合物は、１：１の比におけるクレモフォールＥＬ（ポリオキシエチル化ヒマシ油）と脱水エタノールとからなる、パクリタキセルの商業用溶剤を模倣するように選択された。図１４に示されているこれらの結果は、単独の化学療法では、生存率に対して効果がなかったことを示している。タクソールと組合わせたＬＥＦ−化学療法のグループの治癒率は、腫瘍接種の１８０日後２６％に達した（Ｐ＝０．０００２１、ＬＥＦ−化学療法対タクソール）。ＬＥＦ−化学療法処理マウスの平均生存（腫瘍接種の１８０日後）は、８３．５日、単独の化学療法は３６．７日、およびヒマシ油＋エタノールとＬＥＦとの混合（腫瘍接種の１５０日後）は５９．１日であった。さらにはヒマシ油／エタノールとＬＥＦとの混合によって処理されたマウスにおいて、腫瘍接種の１５０日後に１３．５％の治癒率が得られた（ＬＥＦ−化学療法対ＬＥＦ、Ｐ＝０．１５８４１）。
【０１４９】
ブレオマイシンと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣの抗腫瘍効果：これらの実験のために、８Ｕ／ｋｇ体重の用量のブレオマイシンを用いた。様々なプロトコルを用いて処理されたマウスの生存率を、図１５に示す。未処理マウスは、３０．２日の平均生存時間を有し、単独のＬＥＦで処理されたマウスは、３０．９日のＭＳＴを有していた。単独のブレオマイシンで処理されたマウスは、３４．３日のＭＳＴを有していたが、一方、ＬＥＦ−化学療法処理の結果、ＭＳＴの４８日への顕著な延長を生じた（腫瘍接種の１８０日後）。さらにはＬＥＦ−化学療法グループにおいて、これらの動物の８．２％は生存しており、腫瘍接種の１８０日後、目に見える腫瘍はなかった。マンテル−コックス分析は、対照（Ｐ＝０．００００１）およびＬＥＦ（Ｐ＝０．００２）グループと比較した場合、ＬＥＦ−化学療法グループにおけるマウスの生存率間に統計的有意差を示したが、単独の化学療法で処理されたグループと比較した場合はそうではなかった（Ｐ＝０．０７４）。
【０１５０】
ブレオマイシンと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣの有効性に対する薬品注入法の有意性もテストした。５ｍｍ直径の腫瘍を有するマウスを、腫瘍内あるいは腹腔内に投与されたブレオマイシン（８Ｕ／ｋｇ）と組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって処理した。図１６に示されているこれらの結果は、腹腔内に注入されたＬＥＦ−化学療法グループ（３４．６日）と比較した場合、腫瘍内に化学療法を受けたＬＥＦ−化学療法グループのより長いＭＳＴ（４６．６日）を示している。生存率の統計分析は、これら２つのグループ間の顕著な差を示した（Ｐ＝０．０４８）。さらには腫瘍内処理されたＬＥＦ−化学療法グループの動物の５％が、腫瘍接種の１８０日後生存していた。
【０１５１】
シスプラチン、タクソール、あるいはブレオマイシンとともにＬＥＦＣＴ−ＥＣ処理されたマウスの約１０％が、処理の２ヶ月後またはその後に死んだ。これらの動物は完全に原発性腫瘍を含まず、完全な皮膚の回復があったが、死後解剖は、目に見える肺転移性病巣を暴露した。
【０１５２】
５−ＦＵと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣの抗腫瘍効果：５−ＦＵ（１５０ｍｇ／ｋｇ）と組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによる、腫瘍を有するマウスの処理は、原発性腫瘍成長の阻害に有利であることが分かった（表１）。
【表１】
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【０１５３】
原発性腫瘍サイズに対するＬＥＦＣＴ−ＥＣの効果：シスプラチン、タクソール、ブレオマイシン、および５−ＦＵ処理の７日後の腫瘍体積を、表１に示す。腫瘍体積の値は、少なくとも２０個の腫瘍の平均として得られた。すべてのＬＥＦＣＴ−ＥＣ処理において、腫瘍は、対照グループよりもはるかに小さかった（ＬＥＦＣＴ−ＥＣ対ＬＥＦ、シスプラチン、５−ＦＵ、およびブレオマイシングループの場合ｐ＜０．０１であり、タクソールグループの場合ｐ＜０．０５である）。原発性腫瘍に対する最も顕著な効果は、タクソールとともにＬＥＦＣＴ−ＥＣを用いて達成された。
【０１５４】
抗Ｂ１６−Ｆ１０．９腫瘍抵抗の発生に対するＬＥＦＣＴ−ＥＣ治療的処理の効果：ＬＥＦ−化学療法によってＢ１６−Ｆ１０．９黒色腫が治癒したマウスの抵抗性を、このような治癒マウスに、Ｂ１６−Ｆ１０．９黒色腫細胞の発ガン用量を抗原投与することによって分析した。
【０１５５】
図１７に示されている結果は、Ｂ１６−Ｆ１０．９細胞の発ガン用量を抗原投与された治癒マウスが、初めて接種を受けたマウスと比較して有意に長い生存率を見せたことを示している。同様に、タクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって治癒したマウスは、シスプラチンと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって治癒した動物と比較した場合、抗原投与に対して有意により抵抗性のあるものにされたことも観察しうる（ｐ＝０．０３４８１）。初めて接種されたマウス、およびシスプラチンと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって、およびタクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって既に治癒した、抗原投与されたマウスのＭＳＴは、それぞれ３１．３日、４８．７日、および７３．２日であった。さらには既にタクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって処理された、抗原投与されたマウスの約２３．５％（１７匹のうち４匹）は、腫瘍をまったく成長させなかった。
【０１５６】
腫瘍の組織学的検査：単独のＬＥＦまたはタクソールでの処理後の原発性腫瘍破壊における免疫浸潤の役割を確認するために、処理後の様々な時点で腫瘍を切除し（ｅｃｔｏｍｉｚｅ）、ヘマトキシリンおよびエオシンによって染色し、また抗−ＣＤ３、抗−Ｆ４／８０、およびＦ７−２６抗体と反応させた。凝縮核を有する膨張細胞が、ＬＥＦおよびＬＥＦ−化学療法の３〜４時間後に顕微鏡下観察された。浸潤物を有する最も顕著な壊死病変が、ＬＥＦＣＴ−ＥＣの４８〜７２時間後に見られた。未処理腫瘍と比較した場合、処理の４８〜７２時間後にＴ−リンパ球およびマクロファージの大規模浸潤が観察された（図１８）。ＬＥＦおよびＬＥＦ−化学療法の３〜４時間後、Ｆ７−２６抗体での免疫染色によって、珍しいアポトーシス部位が検出された。ＬＥＦＣＴ−ＥＣまたは単独のＬＥＦの２〜３日後、アポトーシス細胞は、これらのセクションのいくつかにおいてまれになるか、またはなくなった。未処理腫瘍において、アポトーシス細胞は見られなかった（結果は図示されていない）。
【０１５７】
外科手術とＬＥＦＣＴ−ＥＣとの比較：ＬＥＦＣＴ−ＥＣの有効性と通常の外科手術および化学療法処理の有効性とを比較するために、Ｃ５７ＢＬ／６オスマウス（生後８〜１２週）に、１０５Ｂ１６−Ｆ１０．９細胞を皮下注入した。腫瘍が直径５ｍｍに達すると（接種の１１〜１７日後）、これらを外科的に除去した。１つの実験グループは、腫瘍摘出の１日後、手術部位のすぐ近くに、単一用量のタクソール（２０ｍｇ／ｋｇ）が皮下投与された。
【０１５８】
実験結果を図１９に示す。マウスの５％未満が単独の外科手術で治癒したが、外科手術に加えたタクソールの使用は、治癒率を１３％まで増加させた。外科手術、および外科手術＋タクソール処理後のＭＳＴは、それぞれ３７日および５５日であった。しかしながらＬＥＦ−化学療法処理の結果、チェックされたパラメーターのすべてにおいてより良好な効果を生じた。すなわち２６％の治癒率、および８４日の生存の延長である（ＬＥＦ−化学療法対外科手術＋タクソール、Ｐ＝０．００１３１）。
【０１５９】
結論：したがってこれらの結果は、ＬＥＦＣＴ−ＥＣが、シスプラチン、タクソール、ブレオマイシン、および５−ＦＵの抗黒色腫活性を有意に増強すること、およびＬＥＦＣＴ−ＥＣを用いて黒色腫が治癒した動物は、腫瘍の再成長に対して効果的な強力な免疫防御が与えられていることを示している。さらにはタクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣは、黒色腫腫瘍を有する動物の処理のための通常の外科手術よりも優れていることが証明された。同様に、これらの結果は驚くべきことに、ＬＥＦと組合わせた、タクソール溶媒それ自体として用いられているヒマシ油とエタノールとの混合物が、非常に強力な抗黒色腫効果を有することを示している。したがって本発明の方法は、すべての先行技術の黒色腫の処理方法よりも明らかに優れている。
【０１６０】
実施例３
低強度電界増強ガン化学療法後の乳ガンを有するマウスにおける、腫瘍成長の遅延、治癒、および抗腫瘍免疫の誘発
乳ガンは、多くの場合致命的で身体を非常に衰弱させる病気であるが、西側世界で最も普通のガンであり、女性９人中約１名が罹患する。しかしながら今日、この蔓延した病気に対して、満足すべき治療は入手できない。ＬＥＦでの細胞の処理が、巨大分子の効率的な細胞取り込みを生じる能力を有することが既に証明されているので、ＬＥＦ処理が乳ガン細胞による化学療法剤の取り込みを向上させ、これによってこのような細胞に対する細胞毒性活性を増強する能力は、次のように証明された。
【０１６１】
材料および方法：
動物：イスラエル国のテルアビブ大学の繁殖コロニーから入手した、生後８〜１２週のＢＡＬＢ／Ｃメスマウスを、生体内腫瘍療法実験に用いた。動物の世話および実験は、テルアビブ大学のガイドラインにしたがって実施した。
【０１６２】
腫瘍細胞系統：マウスに乳ガン腫瘍を発生させるために、高度に転移性で免疫原性が低い乳腺ガン細胞系統ＤＡ３（Ｌｏｐｅｚ  ＤＭ．ら、１９８１、Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．６６：１９１）を用いた。細胞は、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、４ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸、および１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）が補足されたＤＭＥＭ中で成長させ、加湿インキュベーターにおいて７％二酸化炭素および９３％空気の雰囲気中で３７℃で培養した。直径１ｃｍに成長したこの細胞系統の腫瘍は、主として肺に転移性細胞を産生する。
【０１６３】
試薬：６ｍｇ／ｍｌパクリタキセル、５２７ｍｇ／ｍｌの精製クレモフォールＥＬ（ポリオキシエチル化ヒマシ油）、および４９．７％（ｖ／ｖ）脱水エタノールを含む滅菌非発熱性溶液として得られたタクソール（ミードジョンソンオンコロジープロダクツ社、Ａブリトル−マイヤーズ・スクイブ、米国）；およびブレオマイシン（メガファーム社、イスラエル国）が、用いられた抗ガン薬であった。
【０１６４】
用いられたその他の試薬は、メタノールを有するエオシンアルコール（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、英国）、ハリスのヘマトキシリン（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、英国）、および緩衝ホルムアルデヒド（フルタロム社、イスラエル国）であった。
【０１６５】
抗体：ＦＡＣＳ分析には、次のＦＩＴＣ接合抗体が用いられた：抗−ＣＤ３（＃６００Ｆ、ＩＱＰ）、抗−ＣＤ４（＃６０１Ｆ、ＩＱＰ）、抗−ＣＤ８ａ（＃６０２Ｆ、ＩＱＰ）、および抗−ＣＤ１９（＃６０４Ｆ、ＩＱＰ）。
【０１６６】
低強度電界増強ガン化学療法プロトコル：原発性腫瘍が直径５ｍｍ（約６０〜７０ｍｍ３）に達したら（皮下腫瘍細胞接種の１１〜１７日後）、マウスをＬＥＦ−化学療法の単一処理に付した。１００μｌまで化学療法剤を、腫瘍部中に注入した。電界への暴露は、実施例セクションの実施例２において上記されているように実施した。
【０１６７】
麻酔：実施例セクションの実施例２において上記されているように実施した。
【０１６８】
統計分析：実施例セクションの実施例２において上記されているように実施した。
【０１６９】
実験結果：
ＤＡ３乳腺ガンを有するマウスの生存率に対する、ブレオマイシンまたはタクソールを用いたＬＥＦＣＴ−ＥＣの効果：ＤＡ３乳腺ガンを有するＢＡＬＢ／ｃマウスを、腫瘍内タクソール（２０ｍｇ／ｋｇ）（図１９）またはブレオマイシン（３０Ｕ／ｋｇ）（図２０）投与と組合わせたＬＥＦ−化学療法によって処理し、これらの生存率を、ＬＥＦまたは化学療法のみで処理されたマウスの生存率と比較した。タクソールと組合わせたＬＥＦ−化学療法、ブレオマイシンと組合わせたＬＥＦ−化学療法、および単独のＬＥＦによる腫瘍接種の１８０日後の腫瘍を有するマウスの治癒率は、それぞれ１７％（図２０）、３０％（図２０）、および３０％（図２０〜２１）であった。マンテル−コックステスト（グループの比較）は、次のことを示した：腫瘍内タクソール対タクソールと組合わせたＬＥＦ−化学療法、Ｐ＝０．００５９３；腫瘍内タクソール対腫瘍を有する対照、Ｐ＝０．０１６２３；腫瘍内ブレオマイシン対腫瘍を有する対照、Ｐ＝０．１１１１３；腫瘍内ブレオマイシン対腫瘍内タクソール、Ｐ＝０．８１７５１；腫瘍内ブレオマイシン対ブレオマイシンと組合わせたＬＥＦ−化学療法、Ｐ＜０．０００００４（表２）。
【表２】
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【０１７０】
抗ＤＡ３腫瘍抵抗性の発生に対する、タクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣ治療的処理の効果：最初の腫瘍接種の１２０〜１８０日後に１０５ＤＡ３細胞の接種による抗原投与後の腫瘍成長への、タクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣ処理によるＤＡ３乳ガンが既に治癒したマウスの抵抗性を分析した。図２２に例証されているように、ＤＡ３細胞で抗原投与された既に治癒したマウスは、初めて接種されたマウスと比較して、有意に延長された生存率を示した（Ｐ＝０．０１２１６）。初めて接種された正常なマウスおよび抗原投与されたマウスのＭＳＴは、それぞれ３８．１日および４６．７日であった。したがって、タクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣ処理によるＤＡ３腫瘍の治療的処理は、それの発ガン用量で抗原投与された治癒マウスにおけるこのような腫瘍の成長に対して、有意な保護を誘発する能力を有する。
【０１７１】
治癒マウスの免疫エフェクターが抗ＤＡ３活性を有するかどうかを決定するために、マウスに、ＤＡ３細胞の発ガン用量、ならびにある用量の既に治癒したマウスの脾細胞（１０５ＤＡ３細胞＋１０７脾臓細胞）（ウインアッセイ）の両方を接種し、これらのマウスの生存および腫瘍成長を監視した。表３に見られるように、ＬＥＦ−化学療法処理されたマウスからの脾細胞の同時投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）は、単独または正常なマウスからの脾細胞とともにＤＡ３細胞を受入れたマウスの３１日と比較した場合、接種された動物のＭＳＴを３９日に増加させた。
【表３】
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【０１７２】
したがってこれらの発見事項は、タクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによるマウスの乳ガンの治療的処理が、このような腫瘍の再成長に対する抵抗性を与えうる免疫応答を生じることを示している。同様な効果はまた、化学療法を伴なわないＬＥＦによって治癒したマウスにも観察された。
【０１７３】
タクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによる処理による転移ＤＡ３腫瘍の予防：タクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによってＤＡ３腫瘍が治癒したマウスが、抗転移性応答を発展させたかどうか調べるために、腫瘍接種の２〜３カ月後に死んだ治癒動物の肺を切除し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。未処理マウスの肺転移は、びまん性の外見を有することが分かったが、一方、ＬＥＦ−化学療法処理されたマウスの転移病巣は、免疫細胞浸潤物を含む明白なカプセルを有していた（図２３）。したがってタクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによるＤＡ３腫瘍の処理は、抗転移性免疫応答を生じる。
【０１７４】
ＬＥＦおよびＬＥＦ−化学療法処理されたマウスにおける脾臓リンパ球集団の分析：タクソールまたはブレオマイシンを伴なう、または伴なわないＬＥＦによる処理後、ＤＡ３腫瘍を有するマウスの免疫状態を特徴決定するために、処理されたマウス（グループ中３匹）の脾細胞を、処理の１０〜１２日後（腫瘍接種の約２５日後）滅菌条件下に切除し、脾細胞を調製し、計数し、百万細胞に、それぞれ抗−ＣＤ３、抗−ＣＤ４、抗−ＣＤ８ａ、および抗−ＣＤ１９  ＦＩＴＣ接合抗体で標識し、これらのマーカーの表面発現についてＦＡＣＳによって分析した。ＦＡＣＳ分析は、ＣＤ３＋（Ｔリンパ球）、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ１９＋（Ｂリンパ球）細胞の割合が、腫瘍を有するマウスおよび化学療法処理動物において減少したことを示した。しかしながらブレオマイシンまたはタクソールを伴なう、または伴なわないＬＥＦによって処理されたマウスは、すべての場合、未処理の腫瘍を有するマウスよりも、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、およびＣＤ１９細胞の正常な、またはより正常に見える脾細胞リンパ球プロフィールを明らかに示すことが分かった（それぞれ図２４ａ〜ｄ）。
【０１７５】
結論：したがってこれらの結果は、ＬＥＦＣＴ−ＥＣが、タクソールの抗乳ガン活性を有意に増強すること、およびタクソールを伴なって、または伴なわなずにＬＥＦを用いて乳ガンが治癒した動物は、腫瘍の再成長に対して効果的である強力な免疫防御が与えられていることを示している。さらにはタクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣは、ガンに冒された患者の最大の死因である乳ガンの転移に対して特に活性であることが証明された。同様に示されている結果は、ＬＥＦＣＴ−ＥＣが原発性腫瘍を直接破壊することができ、抗腫瘍免疫／炎症応答を引き出すことによって、残留転移性疾患の破壊を容易にするということを強力に示している。したがって本発明の方法は、乳ガンの先行技術のすべての治療方法よりも明らかに優れている。
【０１７６】
本発明は、その特定の実施態様に関連して記載されてはいるが、多くの代替例、修正例、および変形例が当業者には明らかであることは明白である。したがって、添付クレームの精神および広い範囲内にあるすべてのこのような代替例、修正例、および変形例を包含するものとする。この明細書に挙げられているすべての出版物、特許、および特許出願は、個々の各出版物、特許、および特許出願が具体的かつ個別に参照して本明細書に組込まれると指摘されているのと同程度に、その全体が参照して本明細書に組込まれる。さらにはこの出願におけるあらゆる参考文献の引用および検証は、このような参考文献が、本明細書への先行技術として有効であるとの承認と考えられるわけではないものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１７７】
【図１】ＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの生存割合に対する単独のＬＥＦ処理の効果を示している。図１ａは、ＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの累積生存割合を示すデータプロットである。未処理の腫瘍を有するマウス（ＴＢ）。図１ｂは、得られた結果の統計分析を示す表である。
【図２】ＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの腫瘍サイズに対する単独のＬＥＦ処理の効果を示す棒グラフである。未処理の腫瘍を有するマウス（ＴＢ）。
【図３】ＬＥＦを使用した時に電極間で測定されたエネルギー（ジュール）を示す棒グラフである。
【図４Ａ】ＣＴ−２６腫瘍の進行に対するＬＥＦ／ブレオマイシン処理の様々な組合わせの効果を示している。図４ａおよび４ｂはそれぞれ、ＬＥＦとブレオマイシン（化学療法）処理との示されている組合わせによって処理された、腫瘍を有するマウスの生存率パーセントを示すデータプロットである。
【図４Ｂ】図４ｃは、図４ａおよび４ｂで得られた結果の統計分析を示す表である。
【図５】ＬＥＦ、ＢＣＮＵ、またはその両方で処理されたＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの、それぞれ生存割合を示すデータプロットおよび腫瘍サイズを示す棒グラフである。
【図６】ＬＥＦ、ブレオマイシン、またはその両方で処理されたＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの、それぞれ生存割合を示すデータプロットおよび腫瘍サイズを示す棒グラフである。
【図７】ＬＥＦ、５−ＦＵ、またはその両方で処理された、ＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの生存割合を示すデータプロットである。
【図８】ＬＥＦ処理とともに外科手術またはＢＣＮＵを用いて処理された、ＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの生存割合を示すデータプロットである。
【図９】ＢＣＮＵと組合わせた低電界増強ガン化学療法（ＬＥＦＣＴ−ＥＣ）によってＣＴ−２６腫瘍が治癒し、その後ＣＴ−２６細胞の同じ当初致死用量が再抗原投与されたマウスにおける、それぞれ生存割合を示すデータプロットおよび腫瘍サイズを示す棒グラフである。
【図１０】ＬＥＦＣＴ−ＥＣによってＣＴ−２６腫瘍が治癒したマウスの脾細胞と混合されたＣＴ−２６細胞が接種されたマウスにおける、それぞれ生存割合を示すデータプロットおよび腫瘍サイズを示す棒グラフである。
【図１１】ＢＣＮＵ、単独のＬＥＦ、またはＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦによる、１０ｍｍ直径のＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの処理の結果を示す。図１１ａ〜ｂはそれぞれ、生存割合を示すデータプロットおよび腫瘍サイズを示す棒グラフであり、図１１ｃは、図１１ａにおいて得られた結果の統計分析を示す表である。
【図１２】ＢＣＮＵ、単独のＬＥＦ、またはＢＣＮＵと組合わせたＬＥＦ、または外科手術による、１５ｍｍ直径のＣＴ−２６腫瘍を有するマウスの処理の結果を示す。図１２ａ〜ｂはそれぞれ、生存率を示すデータプロットおよび腫瘍サイズを示す棒グラフであり、図１２ｃは、図１２ａにおいて得られた結果の統計分析を示す表である。
【図１３】腫瘍内シスプラチン投与を伴なうＬＥＦＣＴ−ＥＣ後の、黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの累積生存率を示すデータプロットである。
【図１４】タクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣ後の、黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの累積生存率を示すデータプロットである。
【図１５】腫瘍内ブレオマイシン投与を伴なうＬＥＦＣＴ−ＥＣ後の、黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの累積生存率を示すデータプロットである。
【図１６】黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの累積生存率に対する、ブレオマイシンの腫瘍内あるいは腹腔内投与を伴なうＬＥＦの効果を示すデータプロットである。
【図１７】予めＢ１６−Ｆ１０．９黒色腫を有し、Ｂ１６−Ｆ１０．９黒色腫細胞での抗原投与後の、シスプラチンまたはタクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって治癒したマウスの累積生存率を示すデータプロットである。
【図１８】ＬＥＦ−化学療法の２日後の腫瘍組織（図１８ｂおよび１８ｄ）中へのリンパ球（図１８ａ〜ｂ）およびマクロファージ（図１８ｃ〜ｄ）の浸潤を示す顕微鏡写真である。
【図１９】タクソールと組合わせた外科手術後、またはタクソールと組合わせたＬＥＦ後の、皮下Ｂ１６−Ｆ１０．９黒色腫を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの累積生存率を示すデータプロットである。
【図２０】単独のＬＥＦでの処理またはタクソールと組合わせたＬＥＦによる処理後の、ＤＡ３乳腺ガンを有するＢＡＬＢ／ｃマウスの累積生存率を示すデータプロットである。
【図２１】単独の、またはブレオマイシンと組合わせたＬＥＦ−化学療法による処理後の、ＤＡ３乳腺ガンを有するＢＡＬＢ／ｃマウスの累積生存率を示すデータプロットである。
【図２２】タクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣ処理によって予めＤＡ３乳腺ガンが治癒し、その後発ガン用量のＤＡ３細胞が抗原投与された、ＢＡＬＢ／ｃマウスの累積生存割合を示すデータプロットである。挿入されている表は、このデータプロットに示されている結果の統計分析である。
【図２３】タクソールと組合わせたＬＥＦＣＴ−ＥＣによってＤＡ３腫瘍が治癒したマウスの肺転移における、免疫細胞浸潤を示す顕微鏡写真である。
【図２４Ａ】正常なマウス、単独のＬＥＦで処理されたマウス（ＥＳ）、腫瘍内タクソール注入で処理されたマウス（タクソールｉ．ｔ）、タクソールと組合わされたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって処理されたマウス（ＥＳＣｗ．タクソール）、腫瘍内ブレオマイシン注入で処理されたマウス（ブレオマイシンｉ．ｔ）、およびブレオマイシンと組合わされたＬＥＦＣＴ−ＥＣよって処理されたマウス（ＥＳＣｗ．ブレオマイシン）における、ＣＤ３−及びＣＤ４−陽性脾細胞（それぞれ図２４ａ及びｂ）の割合の比較を示す棒グラフである。
【図２４Ｂ】正常なマウス、単独のＬＥＦで処理されたマウス（ＥＳ）、腫瘍内タクソール注入で処理されたマウス（タクソールｉ．ｔ）、タクソールと組合わされたＬＥＦＣＴ−ＥＣによって処理されたマウス（ＥＳＣｗ．タクソール）、腫瘍内ブレオマイシン注入で処理されたマウス（ブレオマイシンｉ．ｔ）、およびブレオマイシンと組合わされたＬＥＦＣＴ−ＥＣよって処理されたマウス（ＥＳＣｗ．ブレオマイシン）における、ＣＤ８−およびＣＤ１９−陽性脾細胞（それぞれ図２４ｃ及びｄ）の割合の比較を示す棒グラフである。
【図２５】本発明の教示による腫瘍組織の処理に適した器具を例証している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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