(57)【要約】先ず昆虫卵の卵膜の硬化を防止または遅延する条件下で昆虫卵を処理し、次に卵中に転位因子を注入して胚のゲノム中への前記因子の組込みを可能にすることを含む昆虫胚の遺伝学的改変方法。本方法は、宿主寄生体の伝染を防止し得る修飾が蚊に対して成されるようにする。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫胚の遺伝学的改変方法であって、以下の：
ｉ．昆虫卵の卵膜の硬化を防止または遅延する条件下で前記昆虫卵を処理する過程と、
ｉｉ．前記卵中に転位因子を注入して前記胚のゲノム中への前記因子の組込みを可能にする過程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記昆虫は、アノフェレス属蚊である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記蚊は、Ａ． ｇａｍｂｉａｅ、Ａ． ａｒａｂｉｅｎｓｉｓまたはＡ． ｓｔｅｐｈｅｎｓｉである請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記転位因子は、ｍｉｎｏｓである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
インビボでの発現を可能にするトランスポザーゼ遺伝子を含むベクターの前記卵中への注入をさらに含む請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記転位因子は、前記胚への組込み後に発現され得る異種遺伝子を含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記異種遺伝子は、宿主寄生体の伝染を防止する産物をコードする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記産物は、抗菌剤である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記宿主寄生体は、熱帯熱マラリア原虫である請求項７または請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子は、自殺遺伝子である請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子産物は、雄性不稔を引き起こす請求項６記載の方法。
【請求項１２】
卵膜硬化は、卵膜硬化に関与する酵素を阻害することにより防止または遅延される請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素は、フェノールオキシダーゼである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記阻害剤は、ｐ−ニトロフェニル−ｐ’−グアニジノベンゾエートである請求項１２または請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
以下の：
ｉ．アノフェレス属蚊の卵膜の硬化を防止または遅延する条件下で前記アノフェレス属蚊の胚の卵を処理し、
ｉｉ．前記蚊の胚のゲノム中に組込み可能な転位因子を前記卵中に注入すること
により得ることができる遺伝学的改変アノフェレス属蚊。
【請求項１６】
前記転位因子は、Ｍｉｎｏｓである請求項１５記載の蚊。
【請求項１７】
前記転位因子は、請求項６〜１１のいずれかに記載の異種遺伝子を含む請求項１５または請求項１６記載の蚊。
【請求項１８】
卵膜の硬化を防止または遅延するための、前記卵膜硬化の過程に関与する酵素の阻害剤の使用。
【請求項１９】
前記酵素は、フェノールオキシダーゼである請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
前記阻害剤は、ｐ−ニトロフェニル−ｐ’−グアニジノベンゾエートである請求項１８または請求項１９記載の使用。
【請求項２１】
アノフェレス属蚊の胚のゲノム中に異種遺伝子を移すための前記転位因子Ｍｉｎｏｓの使用。
【請求項２２】
前記異種遺伝子は、請求項６〜１１のいずれかに記載の請求項２１記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、昆虫の遺伝子操作に関する。特に本発明は、蚊の遺伝子操作に関する。
【０００２】
［発明の背景］
マラリアは今日世界中で最も重大な寄生虫病であり、アフリカにおいて健康を脅かす主要なものの１つであり、世界の人口の１０％を占めるアフリカでの感染は、世界のマラリア感染の９０％より多くを占めている。
【０００３】
マラリアは、マラリア原虫属の原生動物寄生体により引き起こされる。４つの認識されているヒト寄生体（熱帯熱マラリア原虫（Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ． ｖｉｖａｘ）、卵形マラリア原虫（Ｐ． ｏｖａｌｅ）および四日熱マラリア原虫（Ｐ． ｍａｌａｒｉａｅ））のうち、熱帯熱マラリア原虫が最も危険であり、死亡の主因である。
【０００４】
ヒトマラリア寄生体はアノフェレス属の蚊により伝染する。ほぼ５００の既知のアノフェレス属蚊の種類のうちの少なくとも２０が、マラリア伝染に関係があることが示されている。アフリカのサハラ砂漠以南では、伝染は主に３つのアノフェレス種、即ちＡ． ｇａｍｉｂｉａｅ、Ａ． ａｒａｂｉｅｎｓｉｓ、およびＡ． ｆｕｎｅｓｔｕｓにより引き起こされる。これら３種は、熱帯熱マラリア原虫に対する世界中で最も効率的なベクター系を代表する。それらの分布は、乾燥環境、塩水、低温により、そしてＡ． ｇａｍｂｉａｅ、およびＡ． ａｒａｂｉｅｎｓｉｓの場合には、天然の森林および湿潤サバンナ地域の密集した植生により限定される。これら３種のアフリカの蚊は、宿主としてのヒトに対するそれらの顕著な選択のために、ならびにヒトによって誘発された環境変化に適応するそれらの能力のために、マラリア媒介動物として最も効率的である。アジアでは、最も効率的なマラリア媒介動物はＡ． ｓｔｅｐｈｅｎｓｉである。
【０００５】
殺虫剤の使用を基礎にした制御手段は、非常に高い熱帯熱マラリア原虫（Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）接種率を制御し得ずにきた。さらに、それらの使用と関連した生態学的損害とあわせて殺虫剤耐性の共通の出現は、寄生体を制御する代替的方法の必要性を生じさせた。抗マラリア薬の大量散布により成された試みは、一つには熱帯熱マラリア原虫（Ｐ． ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の多くの薬剤耐性株の急速な蔓延のために、成功していない。
【０００６】
生物学的制御手段は、マラリア蔓延を制御するための殺虫剤の使用に代わるものとして提案されてきた。寄生体の発育に対して耐性（抵抗性）であり、したがって感染を伝染できない宿主昆虫の産生は、マラリア制御の考え得る方法の１つである。寄生体の発育および伝染を支持する昆虫宿主の能力は、ベクター受容能と呼ばれる。アカイエカ属およびヤブカ属の蚊は、一様にヒトから養分を得るが、マラリアを伝染できない種を含有する。これに関与するメカニズムは、様々であり、通常は種特異的である。生理学的および遺伝学的根拠は、完全に判っているわけではない。マラリアを伝染させる能力がないことは、正常の発育のために寄生体に必要とされる、蚊におけるいくつかの重要な因子の非存在のためであるか、あるいはそれは寄生体発育を抑制する何らかのその他の因子の作用の結果であり得る。
【０００７】
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇらの Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １９８５； ７：１−１０では、スポロゾイトが蚊の唾液腺を認識し、侵入することができないために、アノフェレス属のＡ． ｆｒｅｅｂｏｒｎｉがサル寄生体であるマラリア原虫属のＰ． ｋｎｏｗｌｅｓｉに抵抗性があることが示された。
【０００８】
特定の寄生体に対する蚊の抵抗性に関与する遺伝子の同定およびマッピングは、分子生物学者にとって主要な目標である。蚊のゲノム中にＤＮＡを導入するための技術が利用されるようになれば、所定の種の感受性または抵抗性を決定する遺伝子の操作はマラリア伝染を防止するための途方もない重要性を有する可能性があり、そして野生型集団に抵抗性遺伝子を誘発するための手段が開発され得る（Ｃｕｒｔｉｓ ａｎｄ Ｇｒａｖｅｓ， Ｊ． Ｔｒｏｐ． Ｍｅｄ． Ｈｙｇ．， １９８８； ９１：４３−４８）。さらに昆虫は、細菌および真菌感染に対して自らを防御するための、身体中の多種多様なペプチドの産生を含めた種々の防御メカニズムを有している。抗菌性ペプチドには昆虫デフェンシンおよびセクロピン（ｃｅｃｒｏｐｉｎ）があり、一方ドロソマイシン（ｄｒｏｓｏｍｙｃｉｎ）は最もよく研究された抗真菌ペプチドである。このようなペプチドは、マラリア寄生体の発育を妨害する能力を有することが示されている。
【０００９】
蚊のＤＮＡを形質転換するための確立された技法の欠如は、遺伝子操作によりベクター媒介疾患を制御するための試みを大きく妨げた。遺伝子制御の一手段としての不妊雄の放出は、北および中央アメリカならびにリビアからの螺旋虫ハエの撲滅に成功したことが示されている（Ｋｒａｆｓｕｒら， Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ， １９８７； ３：１３１−１３７）。しかしながら、蚊の集団を制御するためにこの方法を用いる試みは主として、高繁殖能、短い世代時間、ならびに既存集団の絶滅後にある地域に迅速に再び棲みつく能力を含めた蚊の生殖戦略のために、今までのところ失敗している。寄生体を伝染させられない蚊の集団による、蚊の集団の置換は、蚊種の抑制のための妥当な代替手段を示し得る。
【００１０】
代わりに、寄生体の生活環を妨害し得る抗寄生体作用物質を発現する外来遺伝子を昆虫に導入するのが望ましい場合もある。
【００１１】
例えば、アノフェレス属の蚊に外来遺伝子を導入するための修飾ウォルバキア（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）共生体の使用が示唆されている（Ｃｕｒｔｉｓ ａｎｄ Ｓｉｎｋｉｎｓ， Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ， １９９８； １１６ Ｓｕｐｐｌ：１１１−１１５）。ウォルバキアは、それが母系遺伝され、非感染雌との感染雄の交配において不妊を引き起こすために、潜在的に有用な遺伝子を代表する。しかしながら、蚊のゲノムに外因性ＤＮＡを導入することの難しさのために、蚊の形質転換に関するデータは今までのところ報告されていない。
【００１２】
キイロショウジョウバエ属の各種のハエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）の遺伝子操作は、Ｐ転位因子を用いて首尾よく行われてきた。転位因子は、昆虫の表現型を変えるためにキイロショウジョウバエ属の各種のハエ中に異種遺伝子を導入するために用いられ得る。その他の転位因子、例えばＤ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒからのＨｏｂｏ、Ｄ． ｍａｕｒｉｆｉａｎａからのｍａｒｉｎｅｒおよびＤ． ｈｙｄｅｉからのＭｉｎｏｓも、ショウジョウバエゲノム中に首尾よく導入されてきた（Ｂｌａｃｋｍａｎら， ＥＭＢＯ Ｊ， １９８９； ８：２１１−２１７； Ｇａｒｚａら， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， １９９１； １２８：３０３−３１０； Ｌｏｕｋｅｒｉｓら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９５； ９２：９４８５−９４８９）。
【００１３】
蚊における生殖細胞系形質転換を達成するためにＤＮＡ送達ベクターとして転位因子を用いる可能性は、キイロショウジョウバエ属の各種のハエにおいてＨｅｒｔｎｅｓ、ｍａｒｉｎｅｒおよびＭｉｎｏｓを用いて得られた有望な結果により支持されてきた。しかしながら、アノフェレス属蚊における転位が可能であることが示された転位因子はない。
【００１４】
アノフェレス胚への外因性ＤＮＡの導入は、形質転換手順におけるもうひとつの重要な限定段階を表す。昆虫胚は、産卵後に急速に硬化して、アノフェレス胚へのＤＮＡの注入を非常に困難かつ時間の掛かる過程にする硬質構造である卵膜に取り囲まれている。産卵から２〜３分後、卵はすでに全く硬くなっており、胚を殺すことなく一般的に用いられる針を貫通させることは難しい。注入された胚の生存率は通常は低く、その結果、有意数の生存体を得るためには大量の胚が注入される必要がある。さらにキイロショウジョウバエ属の各種のハエの卵の卵膜は漂白により除去可能である一方で、アノフェレス胚は、構造的支持および防御を提供し、そして水分損失を最小限にしながらガス交換を可能にするそれらの卵の殻の排除に非常に敏感である。
【００１５】
したがって、アノフェレス属のゲノムにおける外来遺伝子の導入のための信頼の置ける技術の確立は、２つの大きな問題に直面している。即ち１）アノフェレス属蚊において首尾よく転位し得るＤＮＡ送達ベクターの開発、ならびに２）蚊の胚へのＤＮＡの注入の技術的困難を克服するための新規の技術の確立である。
【００１６】
［発明の概要］
本発明は、少なくとも部分的に、昆虫胚への異種ＤＮＡの注入が、先ず卵膜を操作して硬化過程を防止または遅延することにより促進され得るという認識に基づいている。次に昆虫ゲノムへの適切な転位因子の注入が実行され得る。
【００１７】
本発明の一態様によれば、昆虫胚の遺伝学的改変のための方法は、以下の：
（ｉ）昆虫卵の卵膜の硬化を防止または遅延する条件下で昆虫卵を処理する過程と、
（ｉｉ）上記卵中に転位因子を注入して胚のゲノム中への上記因子の組込みを可能にする過程と
を含む。
【００１８】
上記昆虫は好ましくは蚊であり、さらに好ましくはアノフェレス属蚊である。
【００１９】
本発明のさらに別の態様によれば、卵膜硬化は、硬化過程に関与する酵素を阻害することにより防止または遅延される。化合物ｐ−ニトロフェニル−ｐ’−グアニジノベンゾエートは、卵膜の硬化を遅延するために本発明の方法に用いられ得る。
【００２０】
本発明のさらに別の態様によれば、遺伝学的改変アノフェレス属蚊は、以下の：
ｉ．アノフェレス属蚊の卵膜の硬化を防止または遅延する条件下で上記の蚊の胚の卵を処理すること、
ｉｉ．卵中に上記蚊の胚のゲノム中に組み込み可能な転位因子を注入すること、
により得ることができる。
【００２１】
本発明のさらに別の態様によれば、ｐ−ニトロフェニル−ｐ’−グアニジノベンゾエートは、昆虫卵の卵膜の硬化を遅延するために用いられる。
【００２２】
さらなる態様によれば、転位因子Ｍｉｎｏｓは、アノフェレス属蚊胚のゲノム中に異種ＤＮＡを移すために用いられる。
【００２３】
本発明は、昆虫、特にアノフェレス属蚊のゲノムを形質転換するための効率的遺伝子転移技術を提供する。
【００２４】
このことは、疾患を引き起こす寄生体の蔓延を防止するために特有な特性を発揮するよう、またはその昆虫を改変するよう、昆虫、特にアノフェレス属蚊の遺伝学的改変を可能にする。この技術の広範な適用可能性は当業者には明らかであり、彼等は、例えばキイロショウジョウバエ属の各種のハエに関して実行されたように、その他の昆虫、例えばアノフェレス属蚊に用いるために既存の遺伝子操作を適合し得る。
【００２５】
［発明の説明］
前記のように本発明の重要な態様の一つは、昆虫卵の卵膜の硬化を防止または遅延する条件下での昆虫卵の処理である。卵膜の硬化は、一連の酵素反応により媒介され、第一の酵素はフェノールオキシダーゼである。その他の酵素としては、ドーパデカルボキシラーゼ、ドーパミンＮ−アセチルトランスフェラーゼおよびＮ−アセチルドーパミンデサチュラーゼが挙げられる。阻害剤によるこれらの酵素のターゲッティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）は、卵膜硬化過程を遅延または防止する有用な一方法である。阻害剤は、競合的または非競合的阻害剤であり得る。本発明に有用なフェノールオキシダーゼの阻害剤の例としては、グルタチオン、ジエチルジチオカルバミン酸、１−フェニル−３−（２−チアゾリル）−２−チオウレアおよびｐ−ニトロフェニル−ｐ’−グアニジノ−ベンゾエートが挙げられる。これらのうち、ｐ−ニトロフェニル−ｐ’−グアニジノベンゾエートが好ましい。その他の阻害剤は当業者には明らかであるか、標準酵素阻害アッセイを用いて同定され得る。
【００２６】
典型的には上記阻害剤は、胚の膨潤を防止するために等張溶液中に溶解される。
【００２７】
本発明に用いるのに適した阻害剤の量は、容易に決定され得る。ｐ−ニトロフェニル−ｐ’−グアニジノベンゾエートに関しては、０．１ｍＭの濃度が許容可能であることが判明している。
【００２８】
硬化過程を防止するというよりむしろ、遅延させる（減速させる）のが好ましい場合がある。したがって、余分量の酵素基質の添加により置換され得る競合的阻害剤を用いるのが好ましい場合がある。あるいは阻害剤は遅延された時間も利用され、それにより酵素をその本来の（ｎａｔｕｒａｌ）基質とともに機能させ得る。硬化遅延は、卵への核酸物質の導入のために十分な時間であるべきである。これは２〜３時間の遅延しか必要としない場合がある。
【００２９】
卵への核酸の挿入は、マイクロインジェクションにより実行され得る。慣用的装置を用いた場合、これを実行するための方法は当業者には明らかである。
【００３０】
核酸分子は、昆虫胚中で発現される異種遺伝子を含有するベクターまたはプラスミドの形態であり得る。レギュレーター配列、例えば転写プロモーター、エンハンサーおよび開始シグナルも存在し得る。核酸分子を導入する目的は、特定の遺伝的特徴を有するトランスジェニック昆虫を産生するためであり得る。トランスジェニック動物および昆虫の作製のための技法は既知であり、本発明に用いるために適合され得る。
【００３１】
核酸は、転位因子を用いて昆虫ゲノム中に組み込まれる。組込み（転位）はしばしば酵素トランスポザーゼにより促され、そして転位因子はしばしば、除去を開始するために、正しい位置にトランスポザーゼを向けるように機能する逆方向反復を含む。異種遺伝子と（遺伝子融合で）結合した転位因子を含む遺伝子構築物は、慣用的技法を用いて調製され、昆虫卵中に挿入されてトランスジェニック昆虫を産生し得る。
【００３２】
異種遺伝子のほかに、転位因子は、首尾よく発現が起こるのを保証する調節因子を含み得る。
【００３３】
本発明に有用な転位因子は、他の生物体に関して、例えばキイロショウジョウバエ属の各種のハエでなされる実験に基づいて同定され得る。例えばイエバエ（Ｍｕｓｃａ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）からのＨｅｒｍｅｓ（Ａｔｋｉｎｓｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９３； ９０：９６９３−９６９７）は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌｏｎｇａｓｔｅｒの胚中に転位することができる。Ｄ． ｍａｕｒｉｔａｎｉａからのＭａｒｉｎｅｒ（Ｈａｙｍｅｒ ａｎｄ Ｍａｒｓｈ， Ｄｅｖ． Ｇｅｎｅｔ．， １９８６； ６：２８１−２９１）は、Ｂａｃｔｒｏｃｅｒａ ｔｒｙｏｎｉ中に転位することが示された。
【００３４】
好ましい転位因子は、ショウジョウバエ属のＤ． ｈｙｄｅｉに見出されるＭｉｎｏｓである（Ｆｒａｎｚ ａｎｄ Ｓａｖａｋｉｓ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １９９１； １９：６６４６）。ｍｉｎｏｓトランスポザーゼはアノフェレス属の蚊のゲノム中への的確な挿入を媒介し、そしてプラスミド間転位を起こさせ得ることがここに見出された。したがって好ましい実施形態の一つでは、本発明は、好ましくはｍｉｎｏｓトランスポザーゼの存在下で、昆虫胚のゲノム中に異種核酸分子を組み込むために転位因子Ｍｉｎｏｓを用いて実行され得る。転位因子は、外来遺伝子と一緒になったプラスミドベクターの形態であってよく、調節配列、例えばプロモーターをさらに含む。好ましい実施形態では、プロモーターはＤ．ｍｅｌｏｎｇａｓｔｅｒからのアクチン５ｃプロモーターである。さらに好ましい実施形態では、ｍｉｎｏｓトランスポザーゼ遺伝子は、胚中への別個の導入のために別個のヘルパープラスミド上に位置する。
【００３５】
転位因子は、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で発現され得る異種遺伝子を昆虫胚中に組み込むために用いられ得る。あるいは転位因子の組込みは、特定の遺伝子の発現を妨害するために用いられ得る異種ポリヌクレオチドを組み込むために必要とされ得る。例えばＲＮＡ分子は、遺伝子サイレンシング（ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）のために用いられ得る。
【００３６】
異種遺伝子は、寄生体、例えばマラリア原虫属の伝染を制御するために用いられ得る。例えば当該遺伝子は、感染から昆虫を保護する産物をコードし得るし、あるいはこれは、寄生体の生活環を妨害し得る抗寄生体作用物質をコードする。役立ち得るいくつかの抗菌性ペプチド、例えばデフェンシンが既知である。あるいは当該遺伝子は、遺伝子制御の一手段として放出され得る不妊雄を産生するために用いられ得る。性特異的プロモーターの使用は、キイロショウジョウバエ属の各種のハエで用いるために提案されており（Ｔｈｏｍａｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２０００； ２８７（５４６２）：２４７４−２４７６）、そして本発明に用いられ得る。ウォルバキア（Ｗｏｌｂａｃｈｉａ）遺伝子も用いられ得る。ある種の化学物質に曝露されることにより活性化され得る自殺遺伝子も、導入され得る。その他の適切な遺伝子は、当業者には明らかであろう。
【００３７】
転位因子は、殺虫活性を有する化合物または産物を同定するために、あるいは特定の寄生体に対する、例えば蚊の抵抗性に関与する遺伝子をマッピングするためのアッセイに役立ち得る。ゲノム中への外来または異種遺伝子の挿入は、ゲノム中に位置するエンハンサー因子を同定するために用いられ得る。有意レベルの遺伝子産物は、転位因子が、エンハンサー因子を含有する領域の隣に挿入されない限り、検出可能にならない。転位因子は、Ｂａｎｇａ ａｎｄ Ｂｏｙｄ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９２； ８９：１７３５−１７３９に記載されているようなインビボの部位特異的突然変異誘発を実施するためにも用いられ得る。
【００３８】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【００３９】
［実施例］
以下の実験では、ＭｉｎＨｙｇと呼ばれるプラスミドベクター（図１に示されている）を用いて、アノフェレス属蚊のゲノム中への異種遺伝子の組込みを達成した。図１に示したように、グリーン蛍光タンパク質遺伝子ＧＦＰＳ６５Ｔ（ＧＦＰ）（Ｈｅｉｍら， Ｎａｔｕｒｅ， １９９５； ３７３：６６３−６６４）を、レポーター遺伝子として選択して、ＤＮＡの組込みがうまく達成されていたことを示した。
【００４０】
Ｄ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ５Ｃ遺伝子からのアクチンプロモーターを選択して、ＧＦＰＳ６５Ｔマーカーの発現させた（Ｆｙｒｂｅｒｇら， Ｃｅｌｌ， １９８３； ３３：１１５−１２３）。
【００４１】
誘導性熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）プロモーターの制御下でのヒグロマイシン遺伝子も、ＧＦＰによる選択が達成されない事象における選択可能マーカーとして作用するようベクター中に組入れた。
【００４２】
実験は、以下のように実施した。血液を与えたアノフェレス属のＡ． Ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ 蚊に、血液を与えた後４８〜７２時間目に卵を産ませた。等張緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．２）中の０．１ｍＭのｐ−ニトロフェニル−ｐ’−グアニジノベンゾエート（ＮＰＧＢ）溶液（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｎ８０１０）中に浸漬した３ｍｍ紙を含入するペトリ皿中に卵を産卵させた。ＮＰＧＢは水に可溶性でないため、それを先ずＤＭＳＯ中に溶解し、次に等張緩衝液を添加して、０．１ｍＭ最終溶液を作製した。等張緩衝液の使用は、それが胚を膨潤しないようにするので、不可欠である。最初の産卵が起きて３０分後に、ペトリ皿を蚊のケージから取り出した。次に、産卵後９０〜１２０分の間に実行される注入まで、卵をＮＰＧＢ中に放置した。等張緩衝液で湿潤させた紙で覆ったガラススライド上に、合計で約３０個の胚を載せた。それらの後極を整列させて、ガラススライドの内側部分に向けて配向させた。胚が乾燥し始めたらすぐに、低圧を掛けてそれらを、両面テープのストリップ（ｓｔｒｉｐ）を一端に張り付けた別のスライド上に移した。次に水飽和含ハロゲン炭素化合物油で胚を被覆して、さらなる乾燥を防止した。
【００４３】
マイクロローダーチップ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて、ガラス針（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｆｅｍｔｏｔｉｐｓ）に２μｌのＤＮＡ溶液を充填した。１００μｇ／ｍｌのヘルパーイントロンレスプラスミド（ｈｅｌｐｅｒ ｉｎｔｒｏｎｌｅｓｓ ｐｌａｓｍｉｄ）ｐＨＳＳ６ｈｓＩＬＭｉ２０（Ｋｌｉｎａｋｉｓら， Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２０００； ９（３）：２６９−２７５）およびプラスミドＭｉｎＨｙｇ（４００μｇ／ｍｌ）の混合物を用いて、胚をマイクロインジェクトした。ヘルパープラスミドはＭｉｎｏｓ転位に必要なトランスポザーゼ活性を提供し、一方プラスミドＭｉｎＨｙｇはＭｉｎｏｓの逆方向末端反復内でクローニングされるＧＦＰを含有する。倍率１０倍でエッペンドルフトランスジェクター５２４６ミクロマニピュレーターを用いて、マイクロインジェクションを実施した。１５°の角度で胚の後極に針を導入した。注入容量は、注入圧および時間を調節することにより制御した。注入後、ブラシを使って含ハロゲン炭素化合物油から胚を静かに取り出して、卵が浮遊するのを防止するために等張緩衝液を浸漬させた濾紙の堆積層を含入する新しいペトリ皿に移した。次にそれらを孵化させた。次に孵化幼虫をＵＶ光下で分析して、ＧＦＰ発現を検出した。
【００４４】
平均で注入胚の２９％が生存し、孵化幼虫の約５０％が、蛍光でモニタリングした場合に、強い一過性ＧＦＰ発現を示した。成虫段階（Ｇ０）まで生存したのは平均で１０％であり、それらは形質転換成功の良好な予測体であった。１６％成虫生存率を得た２つの実験では、６９匹のＧ０蚊の子孫は、分析した１０，５３９匹のＧ０幼虫の間で９２匹の蛍光個体を生じた。９２匹の蛍光Ｇ１個体は最低５匹の個々のＧ０始祖に由来し、７％（５／６９生存成虫）の形質転換頻度を示すことが、その後確定された。この頻度は、白色遺伝子マーカーで印をつけたＭｉｎｏｓを用いたＤ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒおよびＣ． ｃａｐｉｔａｔａ形質転換実験で報告されたもの（Ｌｏｕｋｅｒｉｓら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９５； ２７０：２００２−２００５およびＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９５； ９２：９４８５−９４８９）より高かった。
【００４５】
これらの成功した実験は、初めて、アノフェレス属蚊の生殖細胞系形質転換が実行可能であり、そしてＭｉｎｏｓはその達成のための優れた候補を代表するという無視できない証拠を提供する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、蚊の胚への転位のために用いられるベクター（ＭｉｎＨｙｇ）を説明する図である。図中において、アクチンＰはＤ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒからのアクチン５Ｃプロモーターを表し、ｈｓｐＰはＤ． ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒからの熱ショックプロモーターｈｓｐ７０を表し、ｈｓｐＴは熱ショックターミネーター配列を表し、ＡｍｐＲはアンピシリン耐性遺伝子を表し、ＨｙｇＲはヒグロマイシン耐性遺伝子を表し、ＭＬおよびＭＲは転位因子Ｍｉｎｏｓの左腕および右腕を表し、逆方向反復が黒三角で表されており、そしてＨ、ＥおよびＮはそれぞれ制限酵素ＨｉｎｄＩＩ、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを表す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年1月25日(2002.1.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
昆虫胚の遺伝学的改変方法であって、以下の：
ｉ．昆虫卵の卵膜の硬化を防止または遅延する条件下で前記昆虫卵を処理する過程と、
ｉｉ．前記卵中に転位因子を注入して前記胚のゲノム中への前記因子の組込みを可能にする過程と、
を含む方法。
【請求項２】
前記昆虫は、アノフェレス属蚊である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記蚊は、Ａ． ｇａｍｂｉａｅ、Ａ． ａｒａｂｉｅｎｓｉｓまたはＡ． ｓｔｅｐｈｅｎｓｉである請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記転位因子は、ｍｉｎｏｓである請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
インビボでの発現を可能にするトランスポザーゼ遺伝子を含むベクターの前記卵中への注入をさらに含む請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記転位因子は、前記胚への組込み後に発現され得る異種遺伝子を含む請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記異種遺伝子は、宿主寄生体の伝染を防止する産物をコードする請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記産物は、抗菌剤である請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記宿主寄生体は、熱帯熱マラリア原虫である請求項７または請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記遺伝子は、自殺遺伝子である請求項６記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子産物は、雄性不稔を引き起こす請求項６記載の方法。
【請求項１２】
卵膜硬化は、卵膜硬化に関与する酵素を阻害することにより防止または遅延される請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記酵素は、フェノールオキシダーゼである請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記阻害剤は、ｐ−ニトロフェニル−ｐ’−グアニジノベンゾエートである請求項１２または請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
以下の：
ｉ．アノフェレス属蚊の卵膜の硬化を防止または遅延する条件下で前記アノフェレス属蚊の胚の卵を処理し、
ｉｉ．前記蚊の胚のゲノム中に組込み可能な前記転位因子Ｍｉｎｏｓを前記卵中に注入すること、
により得ることができる遺伝学的改変アノフェレス属蚊。
【請求項１６】
以下の：
ｉ．アノフェレス属蚊の卵膜の硬化を防止または遅延する条件下で前記アノフェレス属蚊の胚の卵を処理し、
ｉｉ．転位因子を前記卵中に注入することであって、前記転位因子は前記蚊の胚のゲノム中に組込み可能であり、
前記転位因子は請求項７〜１１のいずれかに記載の異種遺伝子を含むこと、
により得ることができる遺伝学的改変アノフェレス属蚊。
【請求項１７】
卵膜の硬化を防止または遅延するための、前記卵膜硬化の過程に関与する酵素の阻害剤の使用。
【請求項１８】
前記酵素は、フェノールオキシダーゼである請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
前記阻害剤は、ｐ−ニトロフェニル−ｐ’−グアニジノベンゾエートである請求項１７または請求項１８記載の使用。
【請求項２０】
アノフェレス属蚊の胚のゲノム中に異種遺伝子を移すための前記転位因子Ｍｉｎｏｓの使用。
【請求項２１】
前記異種遺伝子は請求項６〜１１のいずれかに記載されている、請求項２０記載の使用。
【国際調査報告】
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