(57)【要約】本発明はヒストン脱アセチル化酵素の発現および酵素活性の阻害に関する。本発明は、特異的なヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）アイソフォームを阻害する方法および試薬であって、核酸レベルで発現を阻害する、またはタンパク質レベルで酵素活性を阻害することによる、方法および試薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
すべてのヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームよりは少ないが、一つまたは複数の特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害する物質。
【請求項２】
すべてのヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームよりは少ないが、一つまたは複数の特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害する物質がオリゴヌクレオチドである、請求項１記載の物質。
【請求項３】
一つまたは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの一部をコードする、ＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの領域に相補的である、請求項２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
キメラオリゴヌクレオチドである、請求項３記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
ハイブリッドオリゴヌクレオチドである、請求項３記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
（ａ）ＨＤＡＣ−１の一部をコードする核酸分子（配列番号：２）、
（ｂ）ＨＤＡＣ−２の一部をコードする核酸分子（配列番号：４）、
（ｃ）ＨＤＡＣ−３の一部をコードする核酸分子（配列番号：６）、
（ｄ）ＨＤＡＣ−４の一部をコードする核酸分子（配列番号：８）、
（ｅ）ＨＤＡＣ−５の一部をコードする核酸分子（配列番号：１０）、
（ｆ）ＨＤＡＣ−６の一部をコードする核酸分子（配列番号：１２）、
（ｇ）ＨＤＡＣ−７の一部をコードする核酸分子（配列番号：１４）、および
（ｈ）ＨＤＡＣ−８の一部をコードする核酸分子（配列番号：１８）からなる群より選択される、ＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの領域に相補的である、請求項３記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
約１３から約３５ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
約１５から約２６ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
一つまたは複数のホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有し、長さは２０〜２６ヌクレオチドであり、かつオリゴヌクレオチドの５’末端における末端の４ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドの３’末端における末端の４ヌクレオチドが、それぞれその糖残基に付着した２’−Ｏ−メチル基を有するように改変されている、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
ＨＤＡＣ−１の一部をコードするＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの領域（配列番号：２）に相補的である、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号：１７または配列番号：１８である、請求項１０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
ＨＤＡＣ−２の一部をコードするＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの領域（配列番号：４）に相補的である、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号：２０である、請求項１２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
ＨＤＡＣ−３の一部をコードするＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの領域（配列番号：６）に相補的である、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号：２２である、請求項１４記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
ＨＤＡＣ−４の一部をコードするＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの領域（配列番号：８）に相補的である、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
配列番号：２４または２６である、請求項１６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
ＨＤＡＣ−５の一部をコードするＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの領域（配列番号：１０）に相補的である、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
配列番号：２８である、請求項１８記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
ＨＤＡＣ−６の一部をコードするＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの領域（配列番号：１２）に相補的である、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
配列番号：２９である、請求項２０記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
ＨＤＡＣ−７の一部をコードするＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの領域（配列番号：１４）に相補的である、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
配列番号：３１である、請求項２２記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
ＨＤＡＣ−８の一部をコードするＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの領域（配列番号：１６）に相補的である、請求項６記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
配列番号：３２または配列番号：３３である、請求項２４記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
細胞内の一つまたは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害する方法であって、細胞を請求項１記載の物質と接触させる段階を含む方法。
【請求項２７】
細胞内の一つまたは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害する方法であって、細胞を請求項３記載のオリゴヌクレオチドと接触させる段階を含む方法。
【請求項２８】
接触細胞において細胞増殖が阻害される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
接触細胞において細胞増殖を阻害するオリゴヌクレオチドが接触細胞の成長遅延を引き起こす、請求項２７記載の方法。
【請求項３０】
接触細胞において細胞増殖を阻害するオリゴヌクレオチドが接触細胞の成長停止を誘導する、請求項２７記載の方法。
【請求項３１】
接触細胞において細胞増殖を阻害するオリゴヌクレオチドが接触細胞のプログラムされた細胞死を誘導する、請求項２７記載の方法。
【請求項３２】
接触細胞において細胞増殖を阻害するオリゴヌクレオチドが接触細胞の壊死性細胞死を誘導する、請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤と接触させる段階をさらに含む、請求項２７記載の方法。
【請求項３４】
動物における新生物細胞の増殖を阻害する方法であって、その体内に存在する新生物細胞を少なくとも一つ有する動物に、治療上有効量の請求項１記載の物質を投与する段階を含む方法。
【請求項３５】
動物における新生物細胞の増殖を阻害する方法であって、その体内に存在する新生物細胞を少なくとも一つ有する動物に、治療上有効量の請求項３記載のオリゴヌクレオチドを投与する段階を含む方法。
【請求項３６】
動物がヒトである、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
治療上有効量のヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤を、薬学的に許容される担体と共に治療上有効な期間、動物に投与する段階をさらに含む、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
細胞増殖の誘導に必要とされるヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを同定する方法であって、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害性物質と接触させる段階を含み、ここで細胞増殖の誘導低下によって、該ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームが細胞増殖の誘導に必要であることが示される方法。
【請求項３９】
阻害性物質が請求項３記載のオリゴヌクレオチドである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
細胞増殖に必要とされるヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを同定する方法であって、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害性物質と接触させる段階を含み、ここで細胞増殖の低下によって、該ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームが細胞増殖に必要であることが示される方法。
【請求項４１】
阻害性物質が請求項３記載のオリゴヌクレオチドである、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
細胞分化の誘導に必要とされるヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを同定する方法であって、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害性物質と接触させる段階を含み、ここで細胞分化の誘導によって、該ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームが細胞増殖の誘導に必要であることが示される方法。
【請求項４３】
阻害性物質が請求項３記載のオリゴヌクレオチドである、請求項３８記載の方法。
【請求項４４】
細胞内で細胞増殖を阻害する方法であって、特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害するヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤、ＤＮＡメチル基転移酵素を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＤＮＡメチル基転移酵素小分子阻害剤からなる群より選択される、少なくとも二つの試薬と、細胞を接触させる段階を含む方法。
【請求項４５】
細胞増殖または細胞の分化を調節する方法であって、細胞を請求項１記載の物質と接触させることにより、細胞増殖または分化に関与する特異的なＨＤＡＣアイソフォームを阻害する段階を含む方法。
【請求項４６】
細胞増殖が新形成である、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームが、ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７およびＨＤＡＣ−８からなる群より選択される、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームがＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４である、請求項４７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、ヒストン脱アセチル化酵素の発現および酵素活性の阻害の分野に関する。
【０００２】
関連技術の概要
真核細胞において、核ＤＮＡはヒストンと結合して、クロマチンと呼ばれる小型の複合体を形成する。ヒストンは、一般に真核生物の種間で高度に保存されている塩基性タンパク質の系統を構成する。Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４と呼ばれているコアヒストンは、結合してタンパク質コアを形成する。ヒストンの塩基性アミノ酸がＤＮＡの負に荷電しているリン酸基と相互作用して、ＤＮＡはこのタンパク質コアに巻き付く。およそ１４６塩基対のＤＮＡがヒストンコアに巻き付いて、クロマチンの反復構造モチーフであるヌクレオソーム粒子となる。
【０００３】
チョルダシュ（Ｃｓｏｒｄａｓ）、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．、２８６：２３〜３８（１９９０）は、ヒストンが、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ１）によって触媒される反応である、Ｎ末端リジン残基のε−アミノ基の翻訳後アセチル化を受けることを開示している。アセチル化によりリジン側鎖の正電荷が中和され、クロマチン構造に影響をおよぼすと考えられる。事実、タウントン（Ｔａｕｎｔｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２：４０８〜４１１（１９９６）は、転写因子のクロマチン鋳型への接近がヒストンのアセチル化過多によって促進されることを教示している。タウントンらは、ゲノムの転写不活性領域において、アセチル化過小ヒストンＨ４が多く認められていることをさらに開示している。
【０００４】
最近、遺伝子発現におけるヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）の役割に興味が持たれている。サンチェス・デル・ピノ（Ｓａｎｃｈｅｓ Ｄｅｌ Ｐｉｎｏ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３０３：７２３〜７２９（１９９４）は、部分精製した酵母ＨＤＡＣ活性を開示している。タウントンら（上記）は、酵母転写調節因子に関係しているヒトＨＤＡＣを開示し、このタンパク質は真核生物の転写の鍵となる調節因子でありうることを示唆している。
【０００５】
哺乳類ＨＤＡＣの公知の阻害剤は、遺伝子調節におけるＨＤＡＣの役割を探るために用いられている。ヨシダ（Ｙｏｓｈｉｄａ）ら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２６５：１７１７４〜１７１７９（１９９０）は、（Ｒ）−トリコスタチンＡ（ＴＳＡ）が哺乳類ＨＤＡＣの強力な阻害剤であることを開示している。ヨシダら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４７：３６８８〜３６９１（１９８７）は、ＴＳＡがマウス赤白血病細胞における分化の強力な誘導物質であることを開示している。
【０００６】
より最近になって、ＨＤＡＣ活性が実は一連の別個のＨＤＡＣ酵素アイソフォームによって提供されることが明らかにされている。グロジンガー（Ｇｒｏｚｉｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９６：４８６８〜４８７３（１９９９）は、ＨＤＡＣが２クラスに分けられることを教示しており、第一のクラスは酵母Ｒｐｄ３様タンパク質であり、第二のクラスは酵母Ｈｄａ１様タンパク質である。グロジンガーらはまた、ヒトＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、およびＨＤＡＣ３タンパク質がＨＤＡＣの第一のクラスのメンバーであることも教示しており、またＨＤＡＣの第二のクラスのメンバーである、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、およびＨＤＡＣ６と命名された新しいタンパク質を開示している。カオ（Ｋａｏ）ら、Ｇｅｎｅ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４：５５〜６６（２０００）は、ＨＤＡＣ−７と呼ばれる、この第二のクラスの新しいメンバーを開示している。より最近、ヒュー Ｅ．（Ｈｕ， Ｅ．）らＪ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ． ２７５：１５２５４〜１３２６４（２０００）は、ヒストン脱アセチル化酵素の第一のクラスの最新のメンバー、ＨＤＡＣ−８を開示した。これらの個々のＨＤＡＣ酵素がどのような役割を果たしているかは不明である。
【０００７】
ヒストン脱アセチル化酵素の公知の阻害剤はすべて小分子であり、これらはヒストン脱アセチル化酵素活性をタンパク質レベルで阻害する。さらに、公知のヒストン脱アセチル化酵素阻害剤はすべて、特定のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームに対して非特異的であり、多かれ少なかれ、両方のヒストン脱アセチル化酵素ファミリーのすべてのメンバーを同等に阻害する。
【０００８】
したがって、特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害するための試薬を開発する必要が残されている。また、腫瘍形成に関与する特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを同定し、かつ阻害するための、これらの試薬の使用法を開発する必要もある。
【０００９】
発明の概要
本発明は、特異的なヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）アイソフォームを阻害する方法および試薬であって、核酸レベルで発現を阻害するか、またはタンパク質レベルで酵素活性を阻害することによる、方法および試薬を提供する。本発明は、腫瘍形成に関与する特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの同定および特異的阻害を可能にし、したがって、癌の治療を提供する。本発明はさらに、細胞増殖および／または分化に関与する特異的なＨＤＡＣアイソフォームの同定および特異的阻害を可能にし、したがって、細胞増殖および／または分化障害の治療を提供する。
【００１０】
本発明者らは、特異的なＨＤＡＣアイソフォームを阻害する新規の物質を発見した。したがって、第一の局面において、本発明は一つまたは複数の特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームであるが、すべてのヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームよりは少ないアイソフォームを阻害する物質を提供する。そのような特異的なＨＤＡＣアイソフォームには、ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７およびＨＤＡＣ−８が含まれるが、これらに限定されない。新規の物質の非限定例には、すべてのＨＤＡＣアイソフォームよりは少ないが、一つまたは複数のＨＤＡＣアイソフォームに特異的な、アンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴ）および小分子阻害剤が含まれる。
【００１１】
本発明者らは驚くことに、ＨＤＡＣ−１の特異的阻害が、形質転換細胞の腫瘍形成状態を逆行させることを見いだした。発明者らはまた驚くことに、ＨＤＡＣ−４アイソフォームの阻害が、癌性細胞の成長およびアポトーシスの停止を劇的に誘導することも見いだした。したがって、本発明の本局面の一定の態様において、阻害されるヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４である。
【００１２】
一定の好ましい態様において、特異的なＨＤＡＣアイソフォームを阻害する物質は、そのヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームをコードする核酸分子の発現を阻害するオリゴヌクレオチドである。核酸分子はゲノムＤＮＡ（例えば、遺伝子）、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡでありうる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドはＨＤＡＣアイソフォームをコードするｍＲＮＡの転写を阻害する。他の態様において、オリゴヌクレオチドはヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの翻訳を阻害する。一定の態様において、オリゴヌクレオチドは核酸分子の分解を引き起こす。特に好ましい態様は、ＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４を対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。
【００１３】
第一の局面のさらに他の態様において、特異的なＨＤＡＣアイソフォームを阻害する物質は、すべてのヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームよりは少ないが、一つまたは複数の特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの活性を阻害する、小分子阻害剤である。
【００１４】
第二の局面において、本発明は細胞中のすべてよりは少ないが、一つまたは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害する方法であって、細胞を本発明の第一の局面の物質と接触させる段階を含む方法を提供する。他の好ましい態様において、物質はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。一定の好ましい態様において、物質は小分子阻害剤である。本発明の第二の局面の他の一定の好ましい態様において、接触細胞において細胞増殖が阻害される。好ましい態様において、細胞は新生物細胞であり、ヒトを含む動物の細胞であってもよく、新生物成長における細胞であってもよい。一定の好ましい態様において、本発明の第二の局面の方法は、一つまたは複数の特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームと相互作用して、その酵素活性を低下させるヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤と、細胞を接触させる段階をさらに含む。本発明の第二の局面のさらに他の好ましい態様において、本方法は、本発明の第一の局面の一つもしくは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または一つもしくは複数の小分子阻害剤の組み合わせである、本発明の第一の局面の物質を含む。一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、またはＨＤＡＣ−８である。他の一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４である。いくつかの態様において、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと実施可能なように結合されている。
【００１５】
第三の局面において、本発明は、動物の新生物細胞の増殖を阻害する方法であって、少なくとも一つの新生物細胞をその体内に有している動物に、治療上有効量の本発明の第一の局面の物質を投与する段階を含む方法を提供する。一定の好ましい態様において、物質は、薬学的に許容される担体と組み合わされ、治療上有効な期間投与される、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。一定の好ましい態様において、物質は薬学的に許容される担体と組み合わされ、治療上有効な期間投与される、小分子阻害剤である。本発明の本局面の一定の好ましい態様において、接触細胞において細胞増殖が阻害される。好ましい態様において、細胞は新生物細胞であり、ヒトを含む動物の細胞であってもよく、新生物成長における細胞であってもよい。他の一定の態様において、物質は薬学的に許容される担体と組み合わされ、治療上有効な期間投与される、本発明の第一の局面の小分子阻害剤である。本発明の第三の局面のさらに他の好ましい態様において、本方法は、本発明の第一の局面の一つもしくは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または一つもしくは複数の小分子阻害剤の組み合わせである、本発明の第一の局面の物質を含む。一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、またはＨＤＡＣ−８である。他の一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４である。
【００１６】
第四の局面において、本発明は、細胞増殖の誘導に必要とされる特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを同定する方法であって、細胞を本発明の第一の局面の物質と接触させる段階を含む方法を提供する。一定の好ましい態様において、物質はヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは特定のＨＤＡＣアイソフォームに特異的であり、したがって接触細胞における細胞増殖の阻害によって、そのヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームが細胞増殖の誘導に必要とされるヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームであると同定される。他の一定の態様において、物質は、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの活性を阻害する小分子阻害剤であり、該小分子阻害剤は特定のＨＤＡＣアイソフォームに特異的であり、したがって接触細胞における細胞増殖の阻害によって、そのヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームが細胞増殖の誘導に必要とされるヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームであると同定される。一定の好ましい態様において、細胞は新生物細胞であり、細胞増殖の誘導は腫瘍形成である。本発明の第四の局面のさらに他の好ましい態様において、方法は、本発明の第一の局面の一つもしくは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または一つもしくは複数の小分子阻害剤の組み合わせである、本発明の第一の局面の物質を含む。一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、またはＨＤＡＣ−８である。他の一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４である。
【００１７】
第五の局面において、本発明は細胞分化の誘導に関与するヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを同定する方法であって、細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの発現を阻害する物質と接触させる段階を含む方法を提供し、ただし接触細胞における分化の誘導によって、そのヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームが、細胞分化の誘導に関与するヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームであると同定される。一定の好ましい態様において、物質は本発明の第一の局面のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の一定の好ましい態様において、物質は本発明の第一の局面の小分子阻害剤である。さらに他の一定の態様において、細胞は新生物細胞である。本発明の第五の局面のさらに他の好ましい態様において、方法は、本発明の第一の局面の一つもしくは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または一つもしくは複数の小分子阻害剤の組み合わせである、本発明の第一の局面の物質を含む。一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、またはＨＤＡＣ−８である。他の一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４である。
【００１８】
第六の局面において、本発明は、動物の新生物細胞成長を阻害する方法であって、少なくとも一つの新生物細胞をその体内に有している動物に、治療上有効量の、本発明の第一の局面の物質を投与する段階を含む方法を提供する。その一定の態様において、物質は、薬学的に許容される担体と組み合わされ、治療上有効な期間投与される、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００１９】
第七の局面において、本発明は、細胞分化の誘導に関与するヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを同定する方法であって、細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる段階を含む方法を提供し、ただし接触細胞における分化の誘導によって、そのヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームが細胞分化の誘導に関与するヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームであると同定される。好ましくは、細胞は新生物細胞である。一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、またはＨＤＡＣ−８である。他の一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４である。
【００２０】
第八の局面において、本発明は、細胞において細胞増殖を阻害する方法であって、特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの発現を阻害する、本発明の第一の局面からのアンチセンスオリゴヌクレオチド、特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害する、本発明の第一の局面からの小分子阻害剤、ＤＮＡメチル基転移酵素を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＤＮＡメチル基転移酵素を阻害する小分子阻害剤からなる群より選択される、少なくとも二つの試薬と、細胞を接触させる段階を含む方法。一つの態様において、接触細胞の細胞成長の阻害は、試薬の一つだけと接触した細胞の細胞成長の阻害よりも大きい。一定の態様において、前記の群より選択される各試薬は、実質的に純粋である。好ましい態様において、細胞は新生物細胞である。さらに別の好ましい態様において、前記の群より選択される試薬は実施可能なように結合されている。一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、またはＨＤＡＣ−８である。他の一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４である。
【００２１】
第九の局面において、本発明は、細胞増殖または分化を調節する方法であって、細胞を本発明の第一の局面の物質と接触させる段階を含む方法を提供し、ただしすべてよりは少ないが一つまたは複数のＨＤＡＣアイソフォームが阻害され、それによって増殖または分化の調節が行われる。一定の態様において、物質は本発明の第一の局面のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の一定の好ましい態様において、物質は本発明の第一の局面の小分子阻害剤である。好ましい態様において、細胞増殖は新形成である。本発明の本局面のさらに他の好ましい態様において、方法は本発明の第一の局面の一つもしくは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチド、および／または一つもしくは複数の小分子阻害剤の組み合わせである、本発明の第一の局面の物質を含む。一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、またはＨＤＡＣ−８である。他の一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４である。
【００２２】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォーム（ＨＤＡＣ）を阻害する方法および試薬であって、核酸レベルで発現を阻害するか、または酵素レベルでタンパク質活性を阻害することによる、方法および試薬を提供する。本発明は、腫瘍形成に関与する特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの同定および特異的阻害を可能にし、したがって、癌の治療を提供する。本発明はさらに、細胞増殖および／または分化に関与する、特異的なＨＤＡＣアイソフォームの同定および特異的阻害を可能にし、したがって、細胞増殖および／または分化障害の治療を提供する。
【００２３】
本明細書において参照される特許および科学文献は、当業者に利用可能な知識を確立するものである。本明細書において引用される、ＧｅｎＢａｎｋデータベースを含む、発行済みの特許、出願、および参照文献は、それぞれが具体的かつ個別に参照として組み入れられることが示される場合と同様に、参照として本明細書に組み入れられる。
【００２４】
第一の局面において、本発明は、特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームすべてよりは少ないが、一つまたは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害する物質を提供する。本明細書において交換可能に用いられる場合、「ヒストン脱アセチル化酵素」、「ＨＤＡＣ」、「ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォーム」、「ＨＤＡＣアイソフォーム」という用語、および類似の用語は、ヒストンのＮ末端リジン残基のε−アミノ基からアセチル基を除去する酵素ファミリーのいずれか一つを指すことが意図される。文脈により特に記載がないかぎり、「ヒストン」という用語は任意の種由来のＨ１、Ｈ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４を含む任意のヒストンタンパク質も指すことが意図される。好ましいヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームには、クラスＩおよびクラスＩＩ酵素が含まれる。特異的なＨＤＡＣには、ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７およびＨＤＡＣ−８が含まれるが、これらに限定されない。非限定例として、特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームすべてよりは少ないが、一つまたは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害する有用な物質には、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび小分子阻害剤が含まれる。
【００２５】
本発明者らは驚くべきことに、ＨＤＡＣ−１の特異的阻害が、形質転換細胞の腫瘍形成状態を逆行させることを見いだした。発明者らはまた驚くべきことに、ＨＤＡＣ−４アイソフォームの阻害が、癌性細胞の成長およびアポトーシスの停止を劇的に誘導することも見いだした。したがって、本発明の本局面の一定の態様において、阻害されるヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームは、ＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４である。
【００２６】
ＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４を阻害する好ましい物質は、ｐ５３の状態とは無関係に、ヒト癌細胞の成長を劇的に阻害する。これらの物質は癌細胞のアポトーシスを著しく誘導し、劇的な成長停止を引き起こす。これらはまた、ｐ２１ＷＡＦ１、ｐ５７ＫＩＰ２、ＧＡＤＤ１５３およびＧＡＤＤ４５などの腫瘍サプレッサー遺伝子の転写を誘導することもできる。最後に、これらはインビトロおよびインビボの両方で抗腫瘍活性を示す。一つまたは複数のこれらの結果を達成する阻害物質は、本発明の本局面の範囲内にあると考えられる。非限定例として、ＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または小分子阻害剤が本発明のために有用である。
【００２７】
一定の好ましい態様において、特異的なＨＤＡＣアイソフォームを阻害する物質は、特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームをコードする核酸分子の発現を阻害する、オリゴヌクレオチドである。核酸分子はゲノムＤＮＡ（例えば、遺伝子）、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡでありうる。他の態様において、オリゴヌクレオチドはヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの翻訳を最終的に阻害する。一定の態様において、オリゴヌクレオチドは核酸分子の分解を引き起こす。好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ナノモル濃度で強力かつ特異的なアンチセンス活性を有する。
【００２８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一つまたは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの一部をコードする、ＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの領域に相補的である（異なるアイソフォーム間に相同性があるため、一つのアンチセンスオリゴヌクレオチドが複数のアイソフォームの部分に相補的となりうることを考慮に入れる）。
【００２９】
本発明の目的のために、「相補的」という用語は、生理的条件下でゲノム領域、遺伝子、またはそのＲＮＡ転写物にハイブリダイズする能力を有することを意味する。そのようなハイブリダイゼーションは通常、好ましくはワトソン−クリックまたはフーグスティン塩基対を形成するための、相補鎖間の塩基特異的水素結合の結果であるが、水素結合の他の様式、および塩基の積み重ねがハイブリダイゼーションをもたらすこともある。実際の問題として、そのようなハイブリダイゼーションは特異的な遺伝子発現阻害の観察から推測することができ、この阻害は転写もしくは翻訳（または両方）のレベルであると考えられる。
【００３０】
本発明の目的のために、「オリゴヌクレオチド」という用語は、複数のデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、もしくは２’−Ｏ−置換リボヌクレオシド残基、またはそれらの任意の組み合わせの重合体を含む。好ましくは、そのようなオリゴヌクレオチドは約８から約５０ヌクレオシド残基、最も好ましくは約１２から約３０ヌクレオシド残基を有する。ヌクレオシド残基は、多くの既知のヌクレオシド間連結のいずれかによって互いに結合されていてもよい。そのようなヌクレオシド間連結には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキルホスホネート、アルキルホスホノチオエート、ホスホトリエステル、ホスホロアミデート、シロキサン、カルボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエート、およびスルホンヌクレオシド間連結が含まれるが、これらに限定されない。一定の好ましい態様において、これらのヌクレオシド間連結はホスホジエステル、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、もしくはホスホロアミデート連結、またはそれらの組み合わせでありうる。オリゴヌクレオチドという用語は、化学的に修飾された塩基もしくは糖を有し、かつ／または疎水性基、挿入剤、ジアミンおよびアダマンタンを含むが、これらに限定されない追加の置換基を有するような、重合体も含む。オリゴヌクレオチドという用語は、ＰＮＡおよびＬＮＡなどの重合体も含む。本発明の目的のために、「２’−Ｏ−置換」という用語は、ペントース部分の２’位の、１個〜６個の飽和もしくは不飽和炭素原子を含む−Ｏ−低級アルキル基、または２個〜６個の炭素原子を有する−Ｏ−アリールもしくはアリル基による置換を意味し、ただしそのようなアルキル、アリール、またはアリル基は無置換であっても、または例えばハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルバルコキシル、もしくはアミノ基で置換されていてもよく；またはそのような２’置換はヒドロキシ基（リボヌクレオシドを生成するため）、アミノ基もしくはハロ基によるものであってもよいが、２’−Ｈ基によるものではない。
【００３１】
本発明の本局面において用いられる、特に好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドには、キメラオリゴヌクレオチドおよびハイブリッドオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００３２】
本発明の目的のために、「キメラオリゴヌクレオチド」とは、複数の種類のヌクレオシド間連結を有するオリゴヌクレオチドを意味する。そのようなキメラオリゴヌクレオチドの一つの好ましい態様は、好ましくは約２から約１２ヌクレオチドを含むホスホロチオエート、ホスホジエステルまたはホスホロジチオエート領域、およびアルキルホスホネートまたはアルキルホスホノチオエート領域を含むキメラオリゴヌクレオチドである（例えば、ペデルソン（Ｐｅｄｅｒｓｏｎ）ら、米国特許第５，６３５，３７７号および第５，３６６，８７８号参照）。好ましくは、そのようなキメラオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート連結、またはその組み合わせから選択される、少なくとも三つの連続するヌクレオシド間連結を含む。
【００３３】
本発明の目的のために、「ハイブリッドオリゴヌクレオチド」とは、複数の種類のヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを意味する。そのようなハイブリッドオリゴヌクレオチドの一つの好ましい態様は、好ましくは約２から約１２の２’−Ｏ−置換ヌクレオチドを含む、リボヌクレオチドまたは２’−Ｏ−置換リボヌクレオチド領域、およびデオキシリボヌクレオチド領域を含む。好ましくは、そのようなハイブリッドオリゴヌクレオチドは、少なくとも三つの連続するデオキシリボヌクレオチドを含み、またリボヌクレオシド、２’−Ｏ−置換リボヌクレオシド、またはその組み合わせも含むと考えられる（例えば、メテレーブ（Ｍｅｔｅｌｅｖ）およびアグラワル（Ａｇｒａｗａｌ）、米国特許第５，６５２，３５５号および第５，６５２，３５６号参照）。
【００３４】
本発明において用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドの正確なヌクレオチド配列および化学構造は、オリゴヌクレオチドが特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの発現を阻害する能力、または特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームすべてよりは少ないが、一つもしくは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害する能力を保持している限り、変動してもよい。これは、特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームをコードするｍＲＮＡを定量する段階、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームタンパク質を定量する段階、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの酵素活性を定量する段階、またはインビトロもしくはインビボの細胞成長アッセイ法において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの細胞成長を阻害する能力を定量する段階により、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドが活性であるかどうかを試験することによって容易に決定され、これらの試験はすべて本明細書に詳細に記載されている。「発現を阻害する」という用語、および本明細書において用いられる類似の用語は、これらのパラメーターのいずれか一つまたは複数を含むことが意図される。
【００３５】
本発明において用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｈ−ホスホネート化学、ホスホロアミダイト化学、またはＨ−ホスホネート化学およびホスホロアミダイト化学の組み合わせ（すなわち、いくつかのサイクルにはＨ−ホスホネート化学、および他のサイクルにはホスホロアミダイト化学）を含む、公知の化学的アプローチを用いて、適当な固体支持体上で簡便に合成することができる。適当な固体支持体には、多孔性ガラスビーズ（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅ ｇｌａｓｓ：ＣＰＧ）などの、固相オリゴヌクレオチド合成に用いられる、任意の標準的固体支持体も含まれる（例えば、ポンＲ．Ｔ．（Ｐｏｎ， Ｒ．Ｔ．）、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２０：４６５〜４９６、１９９３参照）。
【００３６】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、様々な目的のために有用である。例えば、これらは実験的細胞培養または動物系において特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの活性を阻害し、そのような特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの活性を阻害する効果を評価するために用いることによって、特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの生理機能の「プローブ」として用いることができる。これは、一つまたは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォーム発現を阻害する、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞または動物に投与し、任意の表現型効果を観察することによって達成される。この使用において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、使用が容易であり、発生または分化の選択された段階で特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォーム活性を阻害するために用いることができるため、従来の「遺伝子ノックアウト」アプローチよりも好ましい。
【００３７】
本発明の好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームをコードする核酸分子の転写、および／もしくはヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームをコードする核酸分子の翻訳のいずれかを阻害し、かつ／またはそのような核酸の分解を引き起こす。ヒストン脱アセチル化酵素をコードする核酸は、ＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ領域であってもよく、かつイントロン配列、翻訳されていない５’および３’領域、イントロン−エキソンの境界、ならびにヒストン脱アセチル化酵素ファミリーのメンバー遺伝子由来のコーディング配列を含むが、これらに限定されない。ヒトの配列については、例えば、ヤン（Ｙａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ９３（２３）：１２８４５〜１２８５０、１９９６；フルカワ（Ｆｕｒｕｋａｗａ）ら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ． Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． ７３（１〜２）：１３０〜１３３、１９９６；ヤンら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２（４４）：２８００１〜２８００７、１９９７；ベッツ（Ｂｅｔｚ）ら、Ｇｅｎｐｍｉｃｓ ５２（２）：２４５〜２４６、１９９８；Ｔａｕｎｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２（５２６０）：４０８〜４１１、１９９６；およびダンゴンド（Ｄａｎｇｏｎｄ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２４２（３）：６４８〜６５２、１９９８を参照されたい。
【００３８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの特に好ましい非限定例は、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームをコードする、ＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの領域に相補的である（例えば、ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、またはＨＤＡＣ−８）。（例えば、ヒトＨＤＡＣ−１についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ５００７９（図１Ｂ）；ヒトＨＤＡＣ−２についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３１８１４（図２Ｂ）；ヒトＨＤＡＣ−３についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ７５６９７（図３Ｂ）；ヒトＨＤＡＣ−４についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ００６６２６（図４Ｂ）；ヒトＨＤＡＣ−５についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０１１１７２（図５Ｂ）；ヒトＨＤＡＣ−６についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ０１１９７２（図６Ｂ）；ヒトＨＤＡＣ−７についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３９２４３（図７Ｂ）；およびヒトＨＤＡＣ−８についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３００９７（図８Ｂ）を参照されたい）。
【００３９】
多くの非ヒト動物種由来のヒストン脱アセチル化酵素をコードする配列も公知である（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ９８２０７（マウスＨＤＡＣ−１）；ＮＭ＿００８２２９（マウスＨＤＡＣ−２）；ＮＭ＿０１０４１１（マウスＨＤＡＣ−３）；ＮＭ＿００６０３７（マウスＨＤＡＣ−４）；ＮＭ＿０１０４１２（マウスＨＤＡＣ−５）；ＮＭ＿０１０４１３（マウスＨＤＡＣ−６）；およびＡＦ２０７７４９（マウスＨＤＡＣ−７）を参照されたい）。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非ヒト動物由来のヒストン脱アセチル化酵素をコードする、ＲＮＡおよび二本鎖ＤＮＡの領域にも相補的である。これらの態様に従うアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの役割を試験するための、動物モデルにおける手段として有用である。
【００４０】
特に好ましいオリゴヌクレオチドは、表１に示すヌクレオチド配列を含む、約１３から約３５ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。さらに追加の特に好ましいオリゴヌクレオチドは、以下に示すヌクレオチド配列の約１５から約２６ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。最も好ましくは、以下に示すオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート主鎖を有し、長さが２０〜２６ヌクレオチドであり、かつオリゴヌクレオチドの５’末端における末端の４ヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドの３’末端における末端の４ヌクレオチドが、それぞれその糖残基に結合された２’−Ｏ−メチル基を有するように改変されている。
【００４１】
本試験に用いられるアンチセンスオリゴヌクレオチドを表１に示す。
【００４２】
【表１】ヒトアイソタイプ特異的アンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドおよびそれらのミス対合（ＭＭ）オリゴヌクレオチドの配列
2004533850.tif 000002
【００４３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意の公知の薬学的に許容される担体または希釈剤と選択的に調合することもできる（例えば、「レミントンの薬学科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１８版、Ａ．ゲナロ（Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ）編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン、１９９０年の薬学的に許容される調合物の調製を参照されたい）が、ただしそのような担体または希釈剤はそれらのＨＤＡＣ活性を調節する能力に影響をおよぼさないことを条件とする。
【００４４】
非限定例として、本発明の第一の局面の物質は小分子阻害剤でもありうる。ヒストン脱アセチル化酵素の阻害に関して用いられる場合、「小分子」という用語は、ヒストン脱アセチル化酵素と相互作用し、ＨＤＡＣアイソフォームをコードする核酸分子の発現またはＨＤＡＣタンパク質の活性を阻害することができる、好ましくは１０００Ｄａ未満、より好ましくは８００Ｄａ未満、および最も好ましくは６００Ｄａ未満の分子量を有する化合物を特定するために用いられる。ヒストン脱アセチル化酵素の酵素活性を阻害するとは、ヒストン脱アセチル化酵素のヒストンからアセチル基を除去する能力を低下させることを意味する。いくつかの好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素活性のそのような低下は、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％である。他の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素活性は、少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％低下する。一つの一定の態様において、小分子阻害剤は、一つまたは複数であるがすべてよりは少ないＨＤＡＣアイソフォームの阻害剤である。「すべてのＨＤＡＣアイソフォーム」とは、ヒストンのＮ末端リジンからεアセチル基を特異的に除去するすべてのタンパク質を意味し、ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、またはＨＤＡＣ−８が含まれるが、これらに限定されることはなく、これらはすべて本明細書において用いられる場合、「関連タンパク質」と考えられる。
【００４５】
最も好ましくは、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤は、一つまたは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォーム（例えば、ＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４）と相互作用して、その活性を低下させるが、他のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームのすべて（例えば、ＨＤＡＣ−２およびＨＤＡＣ−６）と相互作用して、その活性を低下させることはない。以下に論じるとおり、好ましいヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤は、腫瘍形成に関与するヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームと相互作用して、その酵素活性を低下させるものである。
【００４６】
本発明のために有用な小分子阻害剤の非限定例を表２に示す。
【００４７】
【表２】
2004533850.tif 000003
注：インビボ抗腫瘍試験について、括弧外の数字はインビボでの腫瘍成長の阻害％を示す；括弧内の数字は用いた阻害剤の１日用量を示す（ｍｇ／ｋｇ体重／日）；経口（ＰＯ）または腹腔内（ＩＰ）投与のいずれであるかを、括弧内に示す。
【００４８】
本発明の試薬は、分析手段として、および遺伝子療法の手段を含む治療手段として有用である。本発明はまた、治療する一つまたは複数の状態に適合するよう操作し、微調整することができる一方で、発生する副作用が少ない方法および組成物も提供する。
【００４９】
第二の局面において、本発明は、細胞中の一つまたは複数であるが、すべてよりは少ない、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害する方法であって、細胞を本発明の第一の局面の物質と接触させる段階を含む方法を提供する。非限定例として、物質は細胞中の一つまたは複数であるが、すべてよりは少ない、特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの発現を阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは小分子阻害剤でありうる。
【００５０】
一つの一定の態様において、本発明は、細胞を細胞中の一つまたは複数であるが、すべてよりは少ない、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる段階を含む方法を提供する。好ましくは、接触細胞において細胞増殖が阻害される。したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触した細胞における細胞増殖を阻害することによって、良性および悪性新生物を含むヒト疾患の治療アプローチにおいて有用である。「細胞増殖を阻害する」という句は、ヒストン脱アセチル化酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは小分子ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（またはその組み合わせ）の、オリゴヌクレオチドまたは小分子阻害剤と接触した細胞の成長を、接触していない細胞と比べて遅延させる能力を指すために用いられる。そのような細胞増殖の評価は、コールター細胞計数器（Ｃｏｕｌｔｅｒ、フロリダ州マイアミ）または血球計数器を用いて、接触細胞および非接触細胞を計数することによって行うことができる。細胞が密に増殖している場合（例えば、固形腫瘍または臓器）、そのような細胞増殖の評価はカリパスで成長を測定し、接触細胞の成長サイズを非接触細胞のサイズと比べることによって行うことができる。好ましくは、この用語は、非接触細胞の少なくとも５０％の細胞増殖遅延を含む。より好ましくは、この用語は非接触細胞の１００％の細胞増殖遅延を含む（すなわち、接触細胞の数またはサイズが増加しない）。最も好ましくは、この用語は、非接触細胞と比較した場合の、接触細胞の数またはサイズの減少を含む。したがって、接触細胞の細胞増殖を阻害する、ヒストン脱アセチル化酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤は、接触細胞の成長遅延、成長停止、プログラムされた細胞死（すなわち、アポトーシス）、または壊死性細胞死を誘導することができる。
【００５１】
逆に、「細胞増殖を誘導する」という句および類似の用語は、正常（すなわち、非新生物）細胞において細胞増殖のために、特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの存在または酵素活性が要求されることを示すために用いられる。したがって、細胞増殖を誘導する特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの過剰発現は、細胞増殖の増大を引き起こすこともあれば、引き起こさないこともある。しかし、細胞増殖を誘導する特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの阻害は、細胞増殖の阻害をもたらすと考えられる。
【００５２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが細胞増殖を阻害する能力は、非同調増殖している細胞集団の同調を可能にする。例えば、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、インビトロで培養された非新生物細胞集団を細胞周期のＧ１またはＧ２期で停止させるために用いることができる。そのような同調は、例えば、細胞周期のＧ１またはＧ２期に発現される遺伝子および／または遺伝子産物の同定を可能にする。培養細胞のそのような同調は、トランスフェクション効率が変動し、トランスフェクトされる細胞の特異的な細胞周期に依存する場合、新しいトランスフェクションプロトコールの有効性を試験するためにも有用でありうる。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用することにより、細胞集団の同調が可能になり、それによりトランスフェクション効率の増強の検出が助成される。
【００５３】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの抗新生物としての有用性は、本明細書において別に詳細に記載される。
【００５４】
さらに他の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させた細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤とも接触させる。
【００５５】
いくつかの好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドと実施可能なように結合されている。前述のとおり、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、公知の薬学的に許容される担体または希釈剤と選択的に調合することができる。この調合物は一つもしくは複数の追加のヒストン脱アセチル化酵素アンチセンスオリゴヌクレオチド、および／または一つもしくは複数のヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤をさらに含むこともでき、または任意の他の薬理学的活性物質を含むこともできる。
【００５６】
本発明の特に好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドはヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤と実施可能なように結合されている。「操作可能な結合」という用語は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、一つまたは複数の特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームをコードする核酸の発現を阻害することを可能にし、かつヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤が、特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの酵素活性を阻害することを可能にする、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤との間の任意の結合を含む。本発明の一つまたは複数のオリゴヌクレオチドは、一つまたは複数のヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤と実施可能なように結合されていてもよい。いくつかの好ましい態様において、一つの特定のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォーム（例えば、ＨＤＡＣ−１）を標的とする、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、同じヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを標的とするヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤と、実施可能なように結合されている。好ましい操作可能な結合は、加水分解可能である。好ましくは、加水分解可能な結合は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤との間の共有結合である。好ましくは、そのような共有結合は、エステラーゼおよび／またはアミダーゼによって加水分解可能である。そのような加水分解可能な結合の例は、当技術分野において公知である。リン酸エステルが特に好ましい。
【００５７】
一定の好ましい態様において、共有結合はアンチセンスオリゴヌクレオチドとヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤との間に直接存在してもよく、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤は主鎖に組み入れられる。または、共有結合は追加の構造を介するものでもよく、かつアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤の両方を炭水化物、ペプチドまたは脂質もしくは糖脂質などの担体に結合することで、アンチセンスオリゴヌクレオチドをヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤に共有結合することにより、生成してもよい。他の好ましい操作可能な結合には、疎水性分子に共有結合され、したがってリポソームに結合された、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤を含むリポソームの生成などの、疎水性結合も含まれる。そのような疎水性分子には、ホスホチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、および、シアリルラックＮＡｃ−ＨＤＰＥ（ｓｙａｌｙｌｌａｃＮＡｃ−ＨＤＰＥ）などのネオ糖脂質が含まれるが、これらに限定されない。一定の好ましい態様において、操作可能な結合は、物理的結合ではなく、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドが一つのリポソームに結合されており、小分子阻害剤が別のリポソームに結合されている場合は、単に同時に体内に存在するものでよい。
【００５８】
第三の局面において、本発明は、動物の新生物細胞増殖を阻害する方法であって、少なくとも一つの新生物細胞をその体内に有している動物に、治療上有効量の、本発明の第一の局面の物質を投与する段階を含む方法を提供する。一つの一定の態様において、物質は、本発明の第一の局面のアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、方法は薬学的に許容される担体をさらに含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体は、治療上有効な期間投与される。好ましくは、動物は哺乳類、特に家畜化された哺乳類である。最も好ましくは、動物はヒトである。
【００５９】
「新生物細胞」という用語は、異常な細胞成長を示す細胞を意味するために用いられる。好ましくは、新生物細胞の異常な細胞成長は、細胞成長の増大である。新生物細胞は、過形成細胞、インビトロで成長の接触阻害の欠損を示す細胞、インビボで転移不可能な良性腫瘍細胞、またはインビボで転移可能で、除去試行後に再発しうる癌細胞であると考えられる。「腫瘍形成」という用語は、新生物成長の発生につながる細胞増殖の誘導を意味するために用いられる。
【００６０】
「治療上有効量」および「治療上有効な期間」という用語は、新生物細胞の成長を低下させるのに有効な用量および期間での、公知の治療を指すために用いられる。好ましくは、そのような投与は、非経口、経口、舌下、経皮、局所、鼻腔内、または気管内であるべきである。全身投与の場合、治療組成物は好ましくは、約０．１μＭから約１０μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドの血中レベルを達成するのに十分な用量で投与される。局所投与の場合、これよりもはるかに低い濃度でも有効であり、かつはるかに高い濃度が耐容されると考えられる。当業者であれば、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤の有効濃度を低くする、そのような治療効果は、本発明に従って治療される組織、臓器、または特定の動物もしくは患者に応じて大きく変動しうることを理解すると考えられる。
【００６１】
好ましい態様において、本発明の治療組成物は、約０．０１μＭから約２０μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドの血中レベルを達成するのに十分な用量で全身投与される。特に好ましい態様において、治療組成物は、約０．０５μＭから約１５μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドの血中レベルを達成するのに十分な用量で投与される。より好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの血中レベルは約０．１μＭから約１０μＭである。
【００６２】
局所投与のためには、これよりもはるかに低い濃度が治療上有効であると考えられる。好ましくは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全用量は、１日に体重１ｋｇあたりオリゴヌクレオチド約０．１ｍｇから約２００ｍｇの範囲となる。より好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全用量は、１日に体重１ｋｇあたりオリゴヌクレオチド約１ｍｇから約２０ｍｇの範囲となる。最も好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全用量は、１日に体重１ｋｇあたりオリゴヌクレオチド約１ｍｇから約１０ｍｇの範囲となる。特に好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドの治療上有効な量は、１日に体重１ｋｇあたりオリゴヌクレオチド約５ｍｇである。
【００６３】
本発明の第三の局面の一定の好ましい態様において、本方法は治療上有効量のヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤を、薬学的に許容される担体と共に、治療上有効な期間、動物に投与する段階をさらに含む。いくつかの好ましい態様において、前述のとおり、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤はアンチセンスオリゴヌクレオチドと実施可能なように結合されている。
【００６４】
ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤を含有する本発明の治療組成物は、約０．０１μＭから約１０μＭのヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤の血中レベルを達成するのに十分な用量で、全身投与される。特に好ましい態様において、治療組成物は、約０．０５μＭから約１０μＭのヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤の血中レベルを達成するのに十分な用量で投与される。より好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤の血中レベルは約０．１μＭから約５μＭである。局所投与のためには、これよりもはるかに低い濃度が有効であると考えられる。好ましくは、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤の全用量は、１日に体重１ｋｇあたりタンパク質エフェクター約０．０１ｍｇから約１００ｍｇの範囲と考えられる。より好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤の全用量は、１日に体重１ｋｇあたりタンパク質エフェクター約０．１ｍｇから約５０ｍｇの範囲と考えられる。最も好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤の全用量は、１日に体重１ｋｇあたりタンパク質エフェクター約０．１ｍｇから約１０ｍｇの範囲と考えられる。特に好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤の治療上有効な相乗量（アンチセンスオリゴヌクレオチドと共に投与した場合）は、１日に体重１ｋｇあたり約５ｍｇである。
【００６５】
本発明の本局面の一定の好ましい態様により、阻害効果の改善が得られ、それによって、所与の阻害効果を得るために必要とされる核酸レベルの阻害剤（すなわち、アンチセンスオリゴヌクレオチド）およびタンパク質レベルの阻害剤（すなわち、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤）のいずれか、または両方の治療上有効な濃度は、いずれかを個々に用いる場合に必要な濃度に比べて低下する。
【００６６】
さらに、当業者は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはヒストン脱アセチル化酵素阻害剤のいずれかの治療上有効な相乗量は、もう一方の成分の量を微調整し、変更することによって、減少または増加しうることを認識すると考えられる。したがって、本発明は、所与の動物種または特定の患者に特異的な特定の危急性に対し、投与／治療を調整するための方法を提供する。治療上有効な範囲は、例えば、比較的低い量から開始して、阻害を同時に評価しながら段階的に増量することにより、経験的に容易に決定することができる。
【００６７】
第四の局面において、本発明は、細胞増殖の誘導に必要とされる特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを同定する方法であって、細胞を本発明の第一の局面の物質と接触させる段階を含む方法を提供する。一定の好ましい態様において、物質は、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは特定のＨＤＡＣアイソフォームに特異的であり、したがって接触細胞における細胞増殖の阻害によって、そのヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームが細胞増殖の誘導に必要とされるヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームであると同定される。他の一定の態様において、物質は、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの活性を阻害する小分子阻害剤であり、該小分子阻害剤は特定のＨＤＡＣアイソフォームに特異的であり、したがって接触細胞における細胞増殖の阻害によって、そのヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームが細胞増殖の誘導に必要とされるヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームであると同定される。一定の好ましい態様において、細胞は新生物細胞であり、細胞増殖の誘導は腫瘍形成である。本発明の第四の局面のさらに他の好ましい態様において、本方法は、本発明の第一の局面の一つもしくは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または一つもしくは複数の小分子阻害剤の組み合わせである、本発明の第一の局面の物質を含む。一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、またはＨＤＡＣ−８である。他の一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４である。
【００６８】
第五の局面において、本発明は、細胞分化の誘導に関与するヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを同定する方法であって、細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの発現を阻害する物質と接触させる段階を含む方法を提供し、ただし接触細胞における分化の誘導によって、そのヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームが細胞分化の誘導に関与するヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームであると同定される。一定の好ましい態様において、物質は本発明の第一の局面のアンチセンスオリゴヌクレオチドである。他の一定の好ましい態様において、物質は本発明の第一の局面の小分子阻害剤である。さらに他の一定の態様において、細胞は新生物細胞である。本発明の第五の局面のさらに他の好ましい態様において、方法は、本発明の第一の局面の一つもしくは複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび／または一つもしくは複数の小分子阻害剤の組み合わせである、本発明の第一の局面の物質を含む。一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、またはＨＤＡＣ−８である。他の一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４である。
【００６９】
第六の局面において、本発明は、動物の新生物細胞成長を阻害する方法であって、少なくとも一つの新生物細胞をその体内に有している動物に、治療上有効量の、本発明の第一の局面の物質を投与する段階を含む方法を提供する。その一定の態様において、物質は、薬学的に許容される担体と組み合わされ、治療上有効な期間投与される、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００７０】
本発明の第一の局面の物質が、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤である一定の態様において、一つまたは複数の該小分子阻害剤を含む、本発明の治療組成物は、約０．０１μＭから約１０μＭのヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤の血中レベルを達成するのに十分な用量で全身投与される。特に好ましい態様において、治療組成物は、約０．０５μＭから約１０μＭのヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤の血中レベルを達成するのに十分な用量で投与される。より好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤の血中レベルは約０．１μＭから約５μＭである。局所投与のためには、これよりもはるかに低い濃度が有効であると考えられる。好ましくは、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤の全用量は、１日に体重１ｋｇあたりタンパク質エフェクター約０．０１ｍｇから約１００ｍｇの範囲と考えられる。より好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤の全用量は、１日に体重１ｋｇあたりタンパク質エフェクター約０．１ｍｇから約５０ｍｇの範囲と考えられる。最も好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤の全用量は、１日に体重１ｋｇあたりタンパク質エフェクター約０．１ｍｇから約１０ｍｇの範囲と考えられる。
【００７１】
第六の局面において、本発明は、新生物細胞の増殖を含む細胞増殖における、特定のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの役割を調べる方法を提供する。この方法において、本発明の第一の局面について記載されているとおり、関心対象の細胞型を、一つまたは複数の特異的なヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの発現を阻害する量のアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させ、細胞における一つまたは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの発現阻害を引き起こす。一つまたは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの発現が阻害されている接触細胞が、細胞増殖の阻害も示す場合、その一つまたは複数のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームは細胞増殖の誘導に必要とされる。このシナリオにおいて、接触細胞が新生物細胞であり、かつ接触新生物細胞が細胞増殖の阻害を示す場合、発現が阻害されたヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームは、腫瘍形成に必要とされるヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームである。一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、またはＨＤＡＣ−８である。一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４である。
【００７２】
したがって、細胞増殖の誘導に必要とされる特定のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを同定することにより、細胞増殖を阻害する、または分化を誘導するために、その特定のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームだけをアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的とすればよい。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドはより低い治療上有効な用量で、細胞増殖を有効に阻害することができると考えられる。さらに、細胞増殖の誘導に必要とされる一つ（または複数）のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを特異的に阻害することにより、すべてのヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害することによる、望ましくない副作用を避けることができる。
【００７３】
前述のとおり、第一の局面の物質には、すべてよりは少ないが一つまたは複数のＨＤＡＣアイソフォームの活性を阻害する、オリゴヌクレオチドおよび小分子阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの酵素活性の測定は、公知の方法を用いて達成することができる。例えば、ヨシダら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１７１７４〜１７１７９、１９９０）は、トリコスタチンＡ処理細胞におけるアセチル化ヒストンの検出による、ヒストン脱アセチル化酵素の酵素活性の評価を記載している。タウントンら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：４０８〜４１１、１９９６）は同様に、内因性および組換えＨＤＡＣを用いて、ヒストン脱アセチル化酵素の酵素活性を測定する方法を記載している。ヨシダら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１７１７４〜１７１７９、１９９０）およびタウントンら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：４０８〜４１１、１９９６）はいずれも、参照として本明細書に組み入れられる。
【００７４】
好ましくは、細胞増殖の誘導に必要とされるヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害する、本発明の一つまたは複数の小分子阻害剤は、すべてよりは少ないヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームと相互作用して、その酵素活性を低下させるヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤である。
【００７５】
第七の局面において、本発明は、細胞分化の誘導に関与するヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを同定する方法であって、細胞を、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームの発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させる段階を含む方法を提供し、ただし接触細胞における分化の誘導によって、そのヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームが、細胞分化の誘導に関与するヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームであると同定される。好ましくは、細胞は新生物細胞である。一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、またはＨＤＡＣ−８である。
【００７６】
「細胞分化を誘導する」という句および類似の用語は、ヒストン脱アセチル化酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤（またはその組み合わせ）の、接触していない細胞に比べて接触細胞における分化を誘導する能力を示すために用いられる。したがって、新生物細胞は、本発明のヒストン脱アセチル化酵素アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤（または両方）と接触すると、分化するように誘導され、接触細胞よりも系統発生的に進化した娘細胞を産生することになる。
【００７７】
第八の局面において、本発明は、細胞において細胞増殖を阻害する方法であって、細胞を、特定のヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームを阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ヒストン脱アセチル化酵素小分子阻害剤、ＤＮＡメチル基転移酵素を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、およびＤＮＡメチル基転移酵素小分子阻害剤からなる群より選択される、少なくとも二つの試薬と接触させる段階を含む方法を提供する。一つの態様において、接触した細胞の細胞成長の阻害は、試薬のうちの一つのみと接触した細胞の細胞成長の阻害よりも大きい。一定の好ましい態様において、前記の群より選択される各試薬は、実質的に純粋である。好ましい態様において、細胞は新生物細胞である。さらに別の好ましい態様において、前記の群より選択される試薬は実施可能なように結合されている。
【００７８】
ＤＮＡメチル基転移酵素を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、シフ（Ｓｚｙｆ）およびフォンホッフェ（ｖｏｎ Ｈｏｆｅ）、米国特許第５，５７８，７１６号に記載されており、その全内容は参照として本明細書に組み入れられる。ＤＮＡメチル基転移酵素小分子阻害剤には、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ｄＣ）、５−フルオロ−２’−デオキシシチジン、５−アザ−シチジン（５−アザ−Ｃ）、または５，６−ジヒドロ−５−アザ−シチジンが含まれるが、これらに限定されない。
【００７９】
第九の局面において、本発明は、細胞増殖または分化を調節する方法であって、細胞を、本発明の第一の局面の物質と接触させる段階を含む方法を提供し、ただし一つまたは複数であるが、すべてよりは少ないＨＤＡＣアイソフォームが阻害され、それによって増殖または分化の調節が行われる。好ましい態様において、細胞増殖は新形成である。
【００８０】
本局面の目的のために、特異的なＨＤＡＣアイソフォームがどのように阻害されるかは重要ではない。本発明は、特異的な個々のＨＤＡＣが細胞増殖または分化に関与する一方で、関与しないものもあることを発見した。本明細書に示すとおり、このことは、特定の一つまたは複数のＨＤＡＣアイソフォームがどのように阻害されるかとは無関係に、事実である。
【００８１】
増殖または分化を「調節する」という用語は、本発明の第一の局面の物質と接触していない対照細胞と比べた場合に、増殖または分化の相対量を増加または減少させることによって変更する段階を意味する。好ましくは、約１０％から１００％の増加または減少がある。より好ましくは、約２５％から１００％の増加または減少がある。最も好ましくは、約５０％から１００％の増加または減少がある。「約」という用語は、本明細書において、示された数値より２０％ほど上まわる、または下まわる変動を示すために用いられる。
【００８２】
一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６、ＨＤＡＣ−７、およびＨＤＡＣ−８から選択される。一定の好ましい態様において、ヒストン脱アセチル化酵素アイソフォームはＨＤＡＣ−１である。
【００８３】
以下の実施例は、本発明の一定の好ましい態様をさらに例示することを意図しており、本質的に限定的なものではない。当業者であれば、通常の実験を用いるだけで、本明細書に記載の特異的な物質および方法の、多くの等価物を理解するか、または確認することができると考えられる。そのような等価物は、本発明の範囲内であると考えられ、添付の特許請求の範囲に含まれる。
【００８４】
実施例
実施例１
アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成および同定
標的遺伝子の５’−または３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）に対するよう、アンチセンス（ＡＳ）およびミス対合（ＭＭ）オリゴデオキシヌクレオチド（オリゴ）を設計した。オリゴは、自動合成機でホスホロチオエート主鎖に４×４のヌクレオチド２’−Ｏ−メチル修飾を行って合成し、調製用逆相ＨＰＬＣにより精製した。用いたオリゴはすべて２０塩基対の長さであった。
【００８５】
ヒト癌細胞においてＨＤＡＣ−１発現を阻害することができるアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）を同定するために、ヒトＨＤＡＣ−１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ５００７９）の５’または３’ＵＴＲに相補的な配列を含有する、１１のホスホロチオエートＯＤＮを、１００ｎＭでＴ２４細胞において最初にスクリーニングした。２４時間処理後、細胞を回収し、ＨＤＡＣ−１ ＲＮＡ発現をノーザンブロット分析により分析した。このスクリーニングにより、ヒトＨＤＡＣ−１に対するアンチセンス活性を有するＯＤＮとして、ＨＤＡＣ−１ ＡＳ１およびＡＳ２を同定した。ＨＤＡＣ−１ ＭＭオリゴを対照として作製した。これは、アンチセンスオリゴに比べて、６塩基のミス対合を有している。
【００８６】
ヒトＨＤＡＣ−２遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３１８１４）の５’または３’ＵＴＲに相補的な配列を含有する、２４のホスホロチオエートＯＤＮを、前述のとおりにスクリーニングした。ヒトＨＤＡＣ−２に対するアンチセンス活性を有するＯＤＮとして、ＨＤＡＣ−２ ＡＳを同定した。ＨＤＡＣ−２ ＭＭを対照として作製した。これは、アンチセンスオリゴに比べて、７塩基のミス対合を有している。
【００８７】
ヒトＨＤＡＣ−３遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３９７０３）の５’または３’ＵＴＲに相補的な配列を含有する、２１のホスホロチオエートＯＤＮを、前述のとおりにスクリーニングした。ヒトＨＤＡＣ−３に対するアンチセンス活性を有するＯＤＮとして、ＨＤＡＣ−３ ＡＳを同定した。ＨＤＡＣ−３ ＭＭオリゴヌクレオチドを対照として作製した。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに比べて、６塩基のミス対合を有している。
【００８８】
ヒトＨＤＡＣ−４遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ００６６２６）の５’または３’ＵＴＲに相補的な配列を含有する、１７のホスホロチオエートＯＤＮを、前述のとおりにスクリーニングした。ヒトＨＤＡＣ−４に対するアンチセンス活性を有するＯＤＮとして、ＨＤＡＣ−４ ＡＳ１およびＡＳ２を同定した。ＨＤＡＣ−４ ＭＭ１およびＭＭ２オリゴヌクレオチドを対照として作製した。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドに比べて、それぞれ６塩基のミス対合を有している。
【００８９】
ヒトＨＤＡＣ−５遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３９６９１）の５’または３’非翻訳領域に相補的な配列を含有する、１３のホスホロチオエートＯＤＮを、前述のとおりにスクリーニングした。ヒトＨＤＡＣ−５に対するアンチセンス活性を有するＯＤＮとして、ＨＤＡＣ−５ ＡＳを同定した。
【００９０】
ヒトＨＤＡＣ−６遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ０１１９７２）の５’または３’非翻訳領域に相補的な配列を含有する、１３のホスホロチオエートＯＤＮを、前述のとおりにスクリーニングした。ヒトＨＤＡＣ−６に対するアンチセンス活性を有するＯＤＮとして、ＨＤＡＣ−６ ＡＳを同定した。ＨＤＡＣ−６ ＭＭオリゴを対照として作製した。これは、アンチセンスオリゴに比べて、７塩基のミス対合を有している。
【００９１】
ヒトＨＤＡＣ−７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３９２４３）の５’または３’非翻訳領域に相補的な配列を含有する、１８のホスホロチオエートＯＤＮを、前述のとおりにスクリーニングした。ヒトＨＤＡＣ−７に対するアンチセンス活性を有するＯＤＮとして、ＨＤＡＣ−７ ＡＳを同定した。
【００９２】
ヒトＨＤＡＣ−８遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３００９７）の５’または３’非翻訳領域に相補的な配列を含有する、１４のホスホロチオエートＯＤＮを、前述のとおりにスクリーニングした。ヒトＨＤＡＣ−８に対するアンチセンス活性を有するＯＤＮとして、ＨＤＡＣ−８ ＡＳを同定した。
【００９３】
実施例２
ＨＤＡＣ ＡＳ ＯＤＮはｍＲＮＡレベルで発現を特異的に阻害する
ＡＳ ＯＤＮ処理によってＨＤＡＣ発現がｍＲＮＡレベルで低下するかどうかを調べるために、ヒトＡ５４９細胞を５０ｎＭのヒトＨＤＡＣ−３に対するアンチセンス（ＡＳ）オリゴヌクレオチドまたはその対応するミス対合（ＭＭ）オリゴで４８時間処理し、次いでＡ５４９細胞を５０ｎＭもしくは１００ｎＭのヒトＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−４、ＨＤＡＣ−５、ＨＤＡＣ−６もしくはＨＤＡＣ−７、または適当なＭＭオリゴヌクレオチド（１００ｎＭ）で２４時間処理した。
【００９４】
簡単に言うと、ヒトＡ５４９および／またはＴ２４ヒト膀胱癌細胞を１０ｃｍの組織培養プレートに、オリゴヌクレオチド処理の１日前に播種した。細胞系統はアメリカン・タイプカルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ：Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（バージニア州マナッサス）から入手し、推奨される培養条件下で培養した。オリゴヌクレオチド添加前に、細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で洗浄した。次に、トランスフェクション試薬であるリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、カリフォルニア州オンタリオ）を、６．２５μｇ／ｍｌの濃度で無血清ＯＰＴＩＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、メリーランド州ロックビル）に加え、次いでこれを細胞に加えた。次いで、スクリーニングするオリゴヌクレオチドを直接細胞に加えた（すなわち、細胞プレート一つあたり一つのオリゴヌクレオチド）。ミス対合オリゴヌクレオチドを対照として用いた。試験する各オリゴヌクレオチドについて、細胞プレートごとに同じ濃度のオリゴヌクレオチド（例えば、５０ｎＭ）を用いた。
【００９５】
細胞を回収し、全ＲＮＡをノーザンブロット分析で分析した。簡単に言うと、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙミニプレップカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出した。ホルムアルデヒド含有１％アガロースゲル上、緩衝液系として０．５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）を用いて、１０から２０μｇの全ＲＮＡを泳動させた。次いで、ＲＮＡをニトロセルロース膜に転写し、示された放射性同位体標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。通常の方法を用いて、オートラジオグラフィを実施した。
【００９６】
図９Ａ〜９Ｉに、ＨＤＡＣ−１（図９Ａ）、ＨＤＡＣ−２（図９Ｂ）、ＨＤＡＣ−６（図９Ｃ）、ＨＤＡＣ−３（図９Ｄ）、ＨＤＡＣ−４（図９Ｅおよび９Ｆ）、ＨＤＡＣ−５（図９Ｇ）、ＨＤＡＣ−７（図９Ｈ）、およびＨＤＡＣ−８（図９Ｉ）ＡＳ ＯＤＮを用いて行った実験の結果を示す。
【００９７】
ヒトＡ５４９細胞において、細胞をそれぞれのＨＤＡＣ ＡＳ ＯＤＮで処理することにより、標的ＨＤＡＣ ｍＲＮＡの発現が著しく阻害される。
【００９８】
実施例３
ＨＤＡＣ ＯＳＤＮはＨＤＡＣタンパク質発現を阻害する
ＨＤＡＣ ＯＳＤＮによる処理がＨＤＡＣタンパク質発現を阻害するかどうかを調べるために、ヒトＡ５４９癌細胞を、５０ｎＭのヒトＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、またはＨＤＡＣ−６に対する５０ｎＭの対のアンチセンスまたはそのミス対合オリゴで４８時間処理した。ＯＳＤＮ処理条件は以前に記載されているとおりであった。
【００９９】
１％トリトンＸ−１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、およびプロテアーゼ阻害剤を含有する緩衝液中で細胞を溶解した。全タンパク質をＢｉｏ−Ｒａｄ（カリフォルニア州ハーキュレス）から入手したタンパク質アッセイ試薬により定量した。全タンパク質１００μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。次に、全タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、様々なＨＤＡＣ特異的一次抗体をプローブに用いて調べた。ウサギ抗ＨＤＡＣ−１（Ｈ−５１）、抗ＨＤＡＣ−２（Ｈ−５４）抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カリフォルニア州サンタクルス）は１：５００希釈で用いた。ウサギ抗ＨＤＡＣ−３抗体（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）は１：１０００の希釈で用いた。抗ＨＤＡＣ−４抗体は以前に記載されている（ワン、Ｓ．Ｈ．（Ｗａｎｇ， Ｓ．Ｈ．）ら、（１９９９）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９：７８１６〜２７）とおりに調製し、１：１０００の希釈で用いた。抗ＨＤＡＣ−６抗体は、ＨＤＡＣ−６タンパク質の断片（アミノ酸＃９９０から＃１２１６、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ２９０４８）を含むＧＳＴ融合タンパク質でウサギを免疫化することにより産生した。ウサギ抗血清を試験し、ヒトＨＤＡＣ−６アイソフォームにのみ特異的に反応することを明らかにした。ＨＤＡＣ−６抗血清をウェスタンブロットにおいて１：５００の希釈で用い、全細胞溶解物におけるＨＤＡＣ−６を検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を１：５０００の希釈で用いて、一次抗体結合を検出した。二次抗体結合は、化学発光増幅（ＥＣＬ）検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いることによって可視化した。
【０１００】
図１０Ａに示すとおり、細胞をＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、またはＨＤＡＣ−６ ＯＤＮで４８時間処理すると、それぞれのＨＤＡＣアイソタイプタンパク質の発現が特異的に阻害される。図１０Ｂは、二つのＨＤＡＣ−１ ＡＳ ＯＤＮで処理した細胞における、ＨＤＡＣ−１タンパク質の発現阻害についての用量依存的反応を示している。予想通り、ミス対合（ＭＭ）対照オリゴヌクレオチドのそれぞれで細胞を処理しても、処理細胞におけるＨＤＡＣ−１タンパク質発現の著しい低下を引き起こすことはない。
【０１０１】
ＨＤＡＣタンパク質発現のレベルは癌細胞表現型における重要な要因であることを示すために、正常細胞および癌細胞におけるＨＤＡＣアイソタイプ発現のレベルを測定する実験を行った。ウェスタンブロット分析を前述のとおりに実施した。
【０１０２】
結果を表３に示しており、ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、およびＨＤＡＣ−６アイソタイプタンパク質が癌細胞系統では過剰発現されることが明らかに示された。
【０１０３】
【表３】ヒト正常細胞および癌細胞におけるＨＤＡＣアイソタイプの発現レベル
2004533850.tif 000004
（−）：検出不可；（＋）：検出可能；（＋＋）：（＋）の２倍より高レベル；（＋＋＋）：（＋）の５倍より高レベル；（＋＋＋＋）：（＋）の１０倍より高レベル。
【０１０４】
実施例４
細胞成長およびアポトーシスに対するＨＤＡＣアイソタイプ特異的ＯＳＤＮの効果
細胞成長およびアポトーシスによる細胞死に対するＨＤＡＣ ＯＳＤＮの効果を調べるために、Ａ５４９またはＴ２４細胞、ＭＤＡｍｂ２３１細胞、およびＨＭＥＣ細胞（ＡＴＣＣ、ヴァージニア州マナッサス）をＨＤＡＣ ＯＳＤＮで以前に記載されているとおりに処理した。
【０１０５】
アポトーシス試験については、細胞死検出ＥＬＩＳＡＰｌｕｓキット（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ＧｍＢＨ、ドイツ、マンハイム）を製造者の指示に従って用いて、細胞を分析した。典型的には、１０，０００細胞を９６穴組織培養皿に播種し、２時間後に回収して溶解した。各試料を二回ずつ分析した。ＥＬＩＳＡの読み取りは、ＭＲ７００プレート読み取り器（ＤＹＮＥＸ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、英国、ミドルセックス、アッシュフォード）を４１０ｎｍで用いて行った。基準は４９０ｎｍに設定した。
【０１０６】
細胞成長分析について、ヒト癌または正常細胞を、５０ｎＭのヒトＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４、またはＨＤＡＣ−６に対する対のＡＳまたはＭＭオリゴで７２時間処理した。細胞を回収し、細胞数を血球計を用いてトリパンブルー排除により計数した。阻害の割合（％）を（１００−ＡＳ細胞数／対照細胞数）％で計算した。
【０１０７】
試験の結果を図１１〜１３、ならびに表４および表５に示す。ヒト癌細胞をＨＤＡＣ−４ ＡＳにより、また程度は低いがＨＤＡＣ−１ ＡＳにより処理することで、様々なヒト癌の成長停止およびアポトーシスが誘導される。対応するミス対合は効果がない。成長阻害およびアポトーシスに対するＨＤＡＣ−４ ＡＳまたはＨＤＡＣ−１ ＡＳの効果は、ヒト正常細胞では著しく低下する。ＨＤＡＣ−４またはＨＤＡＣ−１ ＡＳオリゴの効果とは対照的に、ヒトＨＤＡＣ−３およびＨＤＡＣ−６ ＯＳＤＮによる処理は、癌細胞の成長またはアポトーシスに対して効果がなく、ヒトＨＤＡＣ−２ ＯＳＤＮによる処理は、癌細胞成長阻害に対してわずかな効果しかない。Ｔ２４細胞はｐ５３を持たず、Ａ５４９細胞は機能性ｐ５３タンパク質を有するため、このアポトーシス誘導はｐ５３活性には無関係である。
【０１０８】
【表４】ヒト正常および癌細胞成長阻害に対するＨＤＡＣアイソタイプ特異的ＯＳＤＮの効果（ＡＳ対ＭＭ）
2004533850.tif 000005
「−」：阻害なし、「＋」：＜５０％阻害、「＋＋」：５０〜７５％阻害、「＋＋＋」：＞７５％阻害
【０１０９】
【表５】４８時間処理後のヒト正常および癌細胞アポトーシスに対するＨＤＡＣアイソタイプ特異的ＯＳＤＮの効果
2004533850.tif 000006
「−」：非特異的バックグラウンドの２倍以下；「＋」：２〜３倍；「＋＋」：３〜５倍；「＋＋＋」：５〜８倍；「＋＋＋＋」：８倍
【０１１０】
実施例５
ＨＤＡＣアイソタイプの阻害は成長調節遺伝子の発現を誘導する
ＨＤＡＣ−１またはＨＤＡＣ−４ ＡＳ処理により誘導される癌細胞の成長停止およびアポトーシスのメカニズムを理解するために、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法を用いて、細胞成長調節因子（ｐ２１およびＧＡＤＤ４５）およびプロアポトーシス遺伝子ＢａｘのｍＲＮＡ発現を分析した。
【０１１１】
簡単に言うと、ヒト癌Ａ５４９またはＴ２４細胞をＨＤＡＣアイソタイプ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチド（各５０ｎＭ）で４８時間処理した。全ＲＮＡを抽出し、ＲＮアーゼプロテクションアッセイ法を実施して、ｐ２１およびＧＡＤＤ４５のｍＲＮＡ発現レベルを分析した。対照として、Ａ５４９細胞を、ＴＳＡ（２５０ｎｇ／ｍｌ）処理と共に、またはこの処理を伴わずに、リポフェクチンで１６時間処理した。これらのＲＮアーゼプロテクションアッセイ法は、以下の方法に従って行った。細胞からの全ＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮの「ＲＮｅａｓｙミニプレップキット」を製造者のマニュアルに従って用いることで調製した。プロテクションアッセイ法で用いる標識プローブは、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（米国カリフォルニア州サンディエゴ）の「ｈＳｔｒｅｓｓ−１マルチプル−プローブテンプレートセット（ｈＳｔｒｅｓｓ−１ ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｐｒｏｂｅ ｔｅｍｐｌａｔｅ ｓｅｔ）」を製造者の指示に従って用いて合成した。プロテクション法は、Ａｍｂｉｏｎ（テキサス州オースチン）の「ＲＰＡ ＩＩ（商標）リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ法キット」を製造者の指示に従って用いて行った。オートラジオグラムからのバンドの定量を、Ｃｙｃｌｏｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏ． Ｉｎｃ．、コネチカット州メリデン）を用いることにより行った。結果を図１４、１５および表６に示す。
【０１１２】
【表６】ヒトＨＤＡＣアイソタイプ特異的アンチセンスによる細胞処理後のｐ２１、ＧＡＤＤ４５、およびＢａｘのアップレギュレーション
2004533850.tif 000007
値は、それぞれのＨＤＡＣアイソタイプ特異的なＡＳオリゴ対ＭＭオリゴについて、ＲＮアーゼプロテクション分析により測定した転写誘導の倍率を示す。
【０１１３】
実験結果を表６に示す。Ａ５４９およびＴ２４両方の癌細胞において、ＨＤＡＣ−４の阻害はｐ２１およびＧＡＤＤ４５両方の発現を劇的にアップレギュレートする。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるＨＤＡＣ−１の阻害は、ｐ２１の発現を誘導するが、ＧＡＤＤ４５の発現をより大きく誘導する。ＨＤＡＣ−４の阻害は、Ａ５４９およびＴ２４両方の細胞でＢａｘ発現をアップレギュレートする。Ａ５４９細胞におけるｐ２１誘導に対するＨＤＡＣ−４ ＡＳ処理（５０ｎＭ、４８時間）の効果は、ＴＳＡ（０．３〜０．８μＭ、１６時間）の効果に匹敵する。
【０１１４】
ＨＤＡＣタンパク質発現に対するＨＤＡＣアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を調べるための実験も実施した。Ａ５４９細胞では、ＨＤＡＣ−４アンチセンスオリゴヌクレオチド処理によって、ｐ２１タンパク質のレベルが劇的に上昇する（図１５）。
【０１１５】
実施例６
サイクリン遺伝子発現はＨＤＡＣ−１ ＡＳ処理によって抑制される
ヒト癌Ａ５４９細胞を、ヒトＨＤＡＣ１に対するＡＳ１、ＡＳ２またはＭＭオリゴで４８時間処理した。全細胞溶解物を回収し、ヒトＨＤＡＣ１、サイクリンＢ１、サイクリンＡおよびアクチンに対する抗体（すべて、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクルスから入手）を用いるウェスタンブロットにより分析した。ＡＳ１またはＡＳ２はいずれも、サイクリンＢ１およびＡの発現を抑制する。ＡＳ１およびＡＳ２によるサイクリンＡおよびＢ１発現のダウンレギュレーションは、癌細胞の成長を阻害するそれらの能力に高い相関性を示す（図１６）。
【０１１６】
実施例７
軟寒天における成長阻害
１．３ｇの顆粒化寒天（ＤＩＤＦＣＯ）を１００ｍｌの脱イオン水に加え、電子レンジで沸騰させて滅菌した。沸騰させた寒天を次の使用まで５５℃で維持した。イスコフ改変ダルベッコ培地（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１００×ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）およびウシ胎仔血清（ｍｅｄｉｃｏｒｐ）を３７℃であらかじめ加温した。５０ｍｌ滅菌チューブに、９ｍｌのイスコフ培地、２ｍｌのウシ胎児血清、および０．２ｍｌの１００×Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｇｌｎを加えた。次いで、各チューブに９ｍｌの５５℃、１．３％寒天を加えた。チューブの内容物をただちに、気泡ができないように混合し、この混合物２．５ｍｌをそれぞれ滅菌６ｃｍペトリ皿に注いで、重合下層を形成した。次いで、重合下層を含むペトリ皿を次の使用まで３７℃のＣＯ２インキュベーター内に置いた。５０ｍｌ滅菌チューブ中、各４つの細胞系統／試料、２０ｍｌのイスコフ培地、０．４ｍｌの１００×Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｇｌｎおよび８ｍｌのウシ胎仔血清を３７℃であらかじめ加温した。細胞をトリプシン処理して、トリパンブルー染色により計数し、２０，０００細胞を滅菌１５ｍｌチューブに分注した。次いで、チューブに低グルコースＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）＋１０％ウシ胎仔血清＋Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ−Ｇｌｎを加えて、最終容量１ｍｌとした。５０ｍｌチューブ中であらかじめ３７℃に加温した混合物に、８ｍｌの５５℃、１．３％寒天を速やかに加え、これをよく混合した。この混合物９ｍｌを１５ｍｌチューブ中の各１ｍｌの細胞に分注し、これを混合して、５ｍｌを６ｃｍ培養プレートの重合下層上に分注し、室温で重合させた。重合後、２．５ｍｌの下層混合物を細胞層の上に静かに加えた。プレートをホイルペーパーで覆い、ＣＯ２インキュベーター内、３７℃で３週間インキュベートし、その時点で寒天内のコロニーを計数する。結果を図１７に示す。
【０１１７】
これらの結果より、ＨＤＡＣ−１に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、軟寒天においてＡ５４９細胞の成長を阻害するが、ＨＤＡＣ−２もしくはＨＤＡＣ−６に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはミス対合対照は阻害しないことが判明した。
【０１１８】
実施例８
小分子によるＨＤＡＣアイソタイプの阻害
ＨＤＡＣ小分子阻害剤の同定を証明するために、ＨＤＡＣ小分子阻害剤を様々なヒトヒストン脱アセチル化酵素アイソタイプ酵素（すなわち、ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４およびＨＤＡＣ−６）を用いるヒストン脱アセチル化酵素アッセイ法においてスクリーニングした。Ｃ末端にＦｌａｇエピトープ（グロジンガー、Ｃ．Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６：４８６８〜４８７３（１９９９））で標識された、クローニングされた組換えヒトＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−３およびＨＤＡＣ−６酵素を、昆虫細胞中、バキュロウイルス発現系を用いて産生した。
【０１１９】
Ｆｌａｇ標識ヒトＨＤＡＣ−４酵素は、リン酸カルシウム沈殿法による形質転換後に、ヒト胎児腎臓２９３細胞において産生した。簡単に言うと、２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。Ｆｌａｇ標識ヒトＨＤＡＣ−４をコードするプラスミドＤＮＡをエタノールで沈殿させ、滅菌水中に再懸濁させた。ＤＮＡ、塩化カルシウムおよび２×ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水を混合することによって生じるＤＮＡ−カルシウム沈殿を、２９３細胞上に１２〜１６時間放置した。細胞を血清含有ＤＭＥＭ培地に戻し、トランスフェクション後４８時間の時点で回収して、Ｆｌａｇ標識ＨＤＡＣ−４酵素を精製した。
【０１２０】
ＨＤＡＣ−１およびＨＤＡＣ−６は、Ｑ−セファロースカラムと、続いて抗Ｆｌａｇエピトープアフィニティカラムで精製した。他のＨＤＡＣアイソタイプ、ＨＤＡＣ−３およびＨＤＡＣ−４は、抗Ｆｌａｇアフィニティカラムで直接精製した。
【０１２１】
脱アセチル化酵素アッセイ法のために、２０，０００ｃｐｍの［３Ｈ］で代謝的に標識されたアセチル化ヒストンを基質として用いた。ヒストンをクローニングされた組換えヒトＨＤＡＣ酵素と３７℃でインキュベートした。ＨＤＡＣ−１アッセイ法では、インキュベーション時間は１０分間で、ＨＤＡＣ−３、ＨＤＡＣ−４およびＨＤＡＣ−６アッセイ法では、インキュベーション時間は２時間であった。すべてのアッセイ条件は、各反応が確実に線形となるように、あらかじめ決定されていた。酢酸（最終濃度０．０４Ｍ）およびＨＣｌ（最終濃度２５０ｍＭ）を加えることにより、反応を停止させた。混合物を酢酸エチルで抽出し、遊離した［３Ｈ］−酢酸を液体シンチレーション計数によって定量した。阻害試験のためには、酵素アッセイ開始前に、あらかじめＨＤＡＣ酵素を試験化合物と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＨＤＡＣ酵素阻害剤のＩＣ５０値を、個々の化合物について用量反応曲線を作成し、最大阻害の５０％を示す阻害剤の濃度を求めることにより、決定した。
【０１２２】
実施例９
小分子による全細胞中でのＨＤＡＣ活性の阻害
培養において成長中のＴ２４ヒト膀胱癌細胞（ＡＴＣＣ、ヴァージニア州マナッサス）を、試験化合物と１６時間インキュベートした。培養期間の後に、標準的方法（例えば、ヨシダら、上記参照）によって、細胞からヒストンを抽出した。全コアヒストンタンパク質２０μｇをＳＤＳ／ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロース膜に転写し、次いでこの膜を、アセチル化ヒストンＨ−４に特異的なポリクローナル抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．、ニューヨーク州レークプラシッド）と反応させた。西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した二次抗体を１：５０００の希釈で用いて、一次抗体結合を検出した。二次抗体結合を化学発光増幅（ＥＣＬ）検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｔｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を用いることによって可視化した。フィルムへの曝露後、アセチル化Ｈ−４のシグナルを濃度測定により定量した。
【０１２３】
結果を上記表２に示しており、これによりＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４に選択的な小分子阻害剤は全細胞中のヒストン脱アセチル化を阻害可能であることが明らかである。
【０１２４】
実施例１０
ＨＤＡＣ小分子阻害剤による癌細胞成長の阻害
２，０００のヒト結腸癌ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ヴァージニア州マナッサス）をＭＴＴ（臭化３−［４，５−ジメチルチアゾル−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）アッセイ法に用いて、細胞増殖および細胞毒性を定量的に調べた。典型的には、ＨＣＴ１１６細胞を９６穴組織培養プレートの各ウェルに播種し、一晩放置してプレートに吸着させた。化合物を様々な濃度で培地（最終ＤＭＳＯ濃度１％）に加え、７２時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液（Ｓｉｇｍａから粉末で入手）を加え、細胞と共に５％ＣＯ２のインキュベーター内、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション中、生存細胞はＭＴＴを水に不溶性のホルマザン色素に変換する。可溶化緩衝液（５０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、２０％ＳＤＳ、ｐＨ４．７）を細胞に加え、５％ＣＯ２のインキュベーター内、３７℃で一晩インキュベートした。可溶化色素を、６３０ｎＭの標準を用い、５７０ｎＭの比色測定によって定量した。各細胞系統について、標準成長曲線との比較により、光学密度の値を細胞数の値に変換した。全細胞数を対照処理、すなわち、１％ＤＭＳＯの細胞数の５０％に低下させる試験化合物の濃度を、ＥＣ５０値とする。
【０１２５】
結果を上記表２に示しており、これによりＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４に選択的な小分子阻害剤は細胞増殖に影響をおよぼすことが明らかである。
【０１２６】
実施例１１
マウスモデルにおける腫瘍成長の小分子による阻害
雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスをＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ニューヨーク州チャールズリバー）から入手し、８〜１０週齡で用いた。ヒト前立腺腫瘍細胞（ＤＵ１４５、２×１０６）またはヒト結腸癌細胞（ＨＣＴ１１６；２×１０６）または小肺コアＡ５４９、２×１０６を、マウスの側腹部に皮下注射し、固形腫瘍を形成させた。腫瘍断片を最低でも３回連続継代培養し、次いで、全身麻酔下で小さい外科的切開部から約３０ｍｇの腫瘍断片を皮下に移植した。腫瘍が１００ｍｍ３の容積に達すれば、腹腔内または経口投与による小分子阻害剤の投与を開始した。腹腔内投与のために、ＨＤＡＣの小分子阻害剤（４０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日）を１００％ＤＭＳＯに溶解し、毎日腹腔内に注射投与した。経口投与のために、ＨＤＡＣの小分子阻害剤（４０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日）を６５％ポリエチレングリコール４００（ＰＥＧ４００（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｄｇｅ、ＣＡ、オンタリオ州ミシソーガ、カタログ番号Ｐ−３２６５）、５％エタノール、および３０％水を含む溶液に溶解した。腫瘍容積を週に２回、２０日までモニターした。各実験群は少なくとも６〜８匹のマウスを含んでいた。阻害割合（％）を、対照としての溶媒処理マウスからの腫瘍容積を用いて計算した。
【０１２７】
結果を上記表２に示しており、これによりＨＤＡＣ−１および／またはＨＤＡＣ−４に選択的な小分子阻害剤はインビボで腫瘍細胞の成長を阻害しうることが明らかである。
【０１２８】
実施例１２
小分子阻害剤による処理後のｐ２１発現のアップレギュレーションおよびサイクリン遺伝子発現のダウンレギュレーション
スルホンアミドアニリン（表２の化合物３）はＨＤＡＣ１特異的小分子阻害剤である。ヒトＨＣＴ１１６細胞を化合物３の漸増用量で１６時間処理した。全細胞溶解物を回収し、ｐ２１ＷＡＦ１、サイクリンＢ１、サイクリンＡおよびアクチンの発現をウェスタンブロットで分析した。Ａｒｉｔｉ−ｐ２１ＷＡＦ１抗体をＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ Ｃａｎａｄａ、オンタリオ州ミシソーガ）から購入した。化合物３は明らかにｐ２１ＷＡＦ１の発現をアップレギュレートし、サイクリンＡおよびＢ１の発現を抑制する。ＭＴＴアッセイ法において、これらの細胞周期調節因子の発現特性は、化合物３のＨＣＴ１１６増殖を阻害する能力と高い相関性を示す（表２参照）。
【０１２９】
実施例１３
ＨＤＡＣ小分子阻害剤により誘導された細胞周期停止
ヒト癌ＨＣＴ１１６細胞を、１０ｃｍペトリ皿に２×１０５で播種し、インキュベーター内で一晩放置して、ペトリ皿に吸着させた。細胞を小分子阻害剤の様々な濃度（典型的にはＤＭＳＯに溶解した１μＭおよび１０μＭ）で１６時間処理した。細胞をトリプシン処理により回収し、１×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で１回洗浄した。細胞を約２００μｌの１×ＰＢＳに再度懸濁させ、１ｍｌの７０％エタノールを−２０℃でゆっくり加えることにより固定し、−２０℃で少なくとも一晩放置した。固定細胞を低速（１，０００ｒｐｍ）で５分間遠心沈降し、細胞ペレットを１×ＰＢＳで再度洗浄した。固定細胞からの核酸を染色溶液（５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムを含む１×ＰＢＳ中０．１％（ｗ／ｖ）グルコース）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｄｇｅ、ＣＡ、オンタリオ州ミシソーガ）およびＲＮアーゼＡ（最終１００ユニット／ｍｌ、（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｄｇｅ、ＣＡ、オンタリオ州ミシソーガ）中、暗所、２５℃で、少なくとも３０分間インキュベートした。ＤＮＡ含有量を、蛍光活性化細胞分類装置（ＦＡＣＳ）を用いて測定した。表２のすべてのＨＤＡＣ小分子阻害剤による細胞の処理により、細胞周期のＧ２／Ｍ期における癌細胞の著しい蓄積が引き起こされ、同時に細胞周期のＳ期における癌細胞の蓄積が減少する。Ｇ２／Ｍ期における細胞対Ｓ期における細胞の比率を求めた。表２に示すとおり、（Ｇ２＋Ｍ）／Ｓの比率２．５を誘導する小分子阻害剤の有効濃度（ＥＣ）を計算する。
【０１３０】
実施例：１４
小分子化合物Ｎｏ．２の合成
以下に、表２からの小分子化合物Ｎｏ．２の合成スキームを提供する。
【化１】
2004533850.tif 000008
【０１３１】
段階１：ヨウ化３−（ベンゼンスルホニルアミノ）−フェニル（２）
３−ヨードアニリン（５ｇ、２２．８ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）溶液に、室温でＥｔ３Ｎ（６．９７ｍＬ）と、続いて塩化ベンゼンスルホニル（５．８４ｍＬ）を加えた。混合物を４時間撹拌すると、白色沈殿が生じた。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液を加え、相を分離した。水層をＣＨ２Ｃｌ２で数回抽出し、合わせた抽出物を乾燥（ＭｇＳＯ４）して、蒸発させた。粗混合物をＭｅＯＨ（１００ｍＬ）に溶解し、ＮａＯＭｅ（６ｇ）を加え、混合物を６０℃で１時間加熱した。溶液は時間経過に伴って澄明となり、ＨＣｌ（１Ｎ）を加えた。溶媒を減圧下で蒸発させ、次いで水相をＣＨ２Ｃｌ２で数回抽出した。合わせた抽出物を乾燥（ＭｇＳＯ４）して、蒸発させた。粗材料をフラッシュクロマトグラフィで、溶媒として（１００％ＣＨ２Ｃｌ２）を用いて精製し、表題化合物２１を黄色固体で得た（７．６８ｇ、９４％）。
2004533850.tif 000009
【０１３２】
段階２：３−（ベンゼンスルホニルアミノ）−フェニル−プロパルギルアルコール（３）
２（５００ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）のピロリジン（５ｍＬ）溶液に、室温でＰｄ（ＰＰｈ３）４（８０ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）と、続いてＣｕＩ（２６ｍｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を完全に溶解するまで撹拌した。プロパルギルアルコール（１６２・Ｌ、２．７８ｍｍｏｌ）を加え、室温で６時間撹拌した。次いで、溶液を飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で処理し、ＡｃＯＥｔで数回抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥（ＭｇＳＯ４）して、蒸発させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィで、溶媒混合物としてヘキサン／ＡｃＯＥｔ（１：１）を用いて精製し、３を黄色固体で得た（３９５ｍｇ、９９％）。
2004533850.tif 000010
【０１３３】
段階３：５−［３−（ベンゼンスルホニルアミノ）−フェニル］−４−イン−２−ペンテノエート（４）
３（２．７５ｇ、９．５８ｍｍｏｌ）のＣＨ３ＣＮ（１５０ｍＬ）溶液に、室温で４−メチルモルホリンＮ−オキシド（ＮＭＯ、１．６８ｇ、１４．３７ｍｍｏｌ）と、続いてテトラプロピルアンモニウムパールテネート（ＴＰＡＰ、３３６ｍｇ、０．９５８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で３時間撹拌し、次いで溶融ガラス漏斗を用いてセライトパッドを通してろ過した。ろ液に、カルボエトキシメチレントリフェニル−ホスホラン（６．６６ｇ、１９．１６ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を室温で３時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、飽和ＮＨ４Ｃｌ水溶液で洗浄した。水層をＣＨ２Ｃｌ２で数回抽出し、次いで合わせた有機抽出物を乾燥（ＭｇＳＯ４）して、蒸発させた。粗材料をフラッシュクロマトグラフィで、溶媒混合物としてヘキサン／ＡｃＯＥｔ（１：１）を用いて精製し、４を黄色オイルで得た（１．２１ｇ、３６％）。
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【０１３４】
段階４：５−［３−（ベンゼンスルホニルアミノ）−フェニル］−４−イン−２−ペンテン酸（５）
ＴＨＦ（１０ｍＬ）および水（１０ｍＬ）の溶媒混合物中、４（８８８ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）の溶液に、室温でＬｉＯＨ（１．０４ｇ、２５．０１ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を６０℃で２時間加熱し、ＨＣｌ（１Ｎ）でｐＨ２になるまで処理した。相を分離し、水層をＡｃＯＥｔで数回抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥（ＭｇＳＯ４）して、蒸発させた。粗残渣をフラッシュクロマトグラフィで、溶媒混合物としてＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９：１）を用いて精製し、５を白色固体で得た（７１２ｍｇ、８８％）。
2004533850.tif 000012
【０１３５】
段階５：化合物２
５をベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）存在下でｏ−フェニレンジアミンとカップリングさせて、アニリド化合物２を得た。
2004533850.tif 000013
【０１３６】
実施例：１５
小分子化合物Ｎｏ．３の合成
以下に、表２からの化合物Ｎｏ．３の合成スキームを提供する。
【化２】
2004533850.tif 000014
【０１３７】
段階１：３−［４−（トルエンスルホニルアミノ）−フェニル］−２−プロペン酸（８）
７（１．３９ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液に、室温でトリス（ジベンジリデンアセトン）ジパラジウム（０）（Ｐｄ２（ｄｂａ）３；１．６７ｍｍｏｌ）、トリ−ｏ−トリルホスフィン（Ｐ（ｏ−ｔｏｌ）３；０．８３ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（３．４８ｍｍｏｌ）および最後にアクリル酸（１．６７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を脱気し、Ｎ２で数回パージし、次いで１００℃で一晩加熱した。溶液を溶融ガラス漏斗を用いてセライトパッドを通してろ過し、次いでろ液を蒸発させた。残渣をフラッシュクロマトグラフィで、溶媒混合物としてＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ（９５：５）を用いて精製し、表題化合物８を得た。
【０１３８】
段階２：Ｎ−ヒドロキシ−３−［４−（ベンゼンスルホニルアミノ）−フェニル］−２−プロペンアミド（化合物３）
酸８をベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）存在下でｏ−フェニレンジアミンとカップリングさせて、アニリド化合物３を得た。
2004533850.tif 000015
【０１３９】
実施例：１６
小分子化合物Ｎｏ．１の合成
以下に、表２からの小分子化合物Ｎｏ．１の合成スキームを提供する。
【化３】
2004533850.tif 000016
【０１４０】
段階１：（１１）
ｐ−アニスアルデヒドジメチルアセタール（９）（１０ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍｌ）溶液を室温で撹拌しながら、これに２−メチル−１−トリメチルシリルオキシペンタ−１，３−ジエン（１０）（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ， ３９：８８１（１９８３））（１０ｍｍｏｌ）と、続いて触媒量の無水ＺｎＢｒ２（２５ｍｇ）を加えた。室温で５時間撹拌後、反応を水（２０ｍＬ）で停止させた。二相を分離し、水層をＣＨ２Ｃｌ２（２×２５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層を食塩水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過して、減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ（２５％酢酸エチル／ヘキサン）で精製して、所望のアルデヒド１１を二つの異性体の比率約２．５：１の混合物として収率６８％で得た：主異性体：
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【０１４１】
段階２：（１２）
トルエン（２５ｍＬ）中のアルデヒド１１（５．１４ｍｍｏｌ）および（トリフェニルホスホラニリデン）酢酸エチル（２．１５ｇ、６．１６ｍｍｏｌ）の混合物をＮ２雰囲気下で一晩加熱還流した。溶媒を減圧下で除去後、得られた粗生成物をフラッシュシリカゲルクロマトグラフィ（１０％酢酸エチル／ヘキサン）により精製して、表題化合物１２を二つの異性体の比率約２．５：１の混合物として収率９６％で得た：主異性体：
2004533850.tif 000018
【０１４２】
段階３：（１３）
ジエンエステル１２（１．２４ｍｍｏｌ）のメタノール（１０ｍＬ）溶液を室温で撹拌しながら、これにＬｉＯＨの０．５Ｎ水溶液（１．７ｍｍｏｌ）を加えた。４０℃で１６時間撹拌後、メタノールを減圧下で除去し、得られた水溶液を３Ｎ ＨＣｌで酸性化し（ｐＨ＝約４）、酢酸エチル（２５×３ｍＬ）で抽出し、乾燥（ＭｇＳＯ４）し、減圧下で濃縮して、所望のカルボン酸１３を収率９８％で得た：主異性体：
2004533850.tif 000019
【０１４３】
段階４：（１４）
カルボン酸１３（０．７５３ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、１，１’−カルボニルジイミダゾール（０．７９０ｍｍｏｌ）を室温で加え、混合物を一晩撹拌した。得られた溶液に、１，２−フェニレンジアミン（５．２７ｍｍｏｌ）と、続いてトリフルオロ酢酸（５２μｌ）を加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（３０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５ｍＬ）と、次いで水（１０ｍＬ）で洗浄し、乾燥（ＭｇＳＯ４）して、濃縮した。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィ（５０％酢酸エチル／トルエン）により精製して、表題化合物１４を二つの異性体の比率約３：１の混合物として収率６１％で得た：主異性体：
2004533850.tif 000020
【０１４４】
段階５：（化合物１）
化合物１４（０．２１６ｍｍｏｌ）の湿ベンゼン（２ｍＬ、ベンゼン：Ｈ２Ｏ＝９：１）溶液を室温で撹拌しながら、これに２，３−ジクロロ−５，６−ジシアノ−１，４−ベンゾキノン（ＤＤＱ、０．４３２ｍｍｏｌ）を加えた。１５分間激しく撹拌した後、混合物を酢酸エチル（３０ｍＬ）で希釈し、水（２×５ｍＬ）で洗浄し、乾燥（無水ＭｇＳＯ４）し、濃縮した。フラッシュシリカゲルクロマトグラフィ（５０％酢酸エチル／ヘキサンと、次いで酢酸エチルのみ）により精製して、表題化合物３５を得た（６ｍｇ、収率７％）：
2004533850.tif 000021
【０１４５】
等価物
当業者であれば、通常の実験のみを用いて、本明細書に記載されている本発明の特定の態様に対する多くの等価物を理解するか、または確認することができると思われる。そのような等価物は添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ５０４７５に提供されている、ＨＤＡＣ−１のアミノ酸配列を示す概略図である（配列番号：１）。
【図１Ｂ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ５００７９に提供されている、ＨＤＡＣ−１の核酸配列を示す概略図である（配列番号：２）。
【図２Ａ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＣ５０８１４に提供されている、ＨＤＡＣ−２のアミノ酸配列を示す概略図である（配列番号：３）。
【図２Ｂ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３１８１４に提供されている、ＨＤＡＣ−２の核酸配列を示す概略図である（配列番号：４）。
【図３Ａ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ８８２４１に提供されている、ＨＤＡＣ−３のアミノ酸配列を示す概略図である（配列番号：５）。
【図３Ｂ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ７５６９７に提供されている、ＨＤＡＣ−３の核酸配列を示す概略図である（配列番号：６）。
【図４Ａ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ２２９５７に提供されている、ＨＤＡＣ−４のアミノ酸配列を示す概略図である（配列番号：７）。
【図４Ｂ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ００６６２６に提供されている、ＨＤＡＣ−４の核酸配列を示す概略図である（配列番号：８）。
【図５Ａ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＡ２５５２６に提供されている、ＨＤＡＣ−５のアミノ酸配列を示す概略図である（配列番号：９）。
【図５Ｂ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０１１１７２に提供されている、ＨＤＡＣ−５の核酸配列を示す概略図である（配列番号：１０）。
【図６Ａ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ２９０４８に提供されている、ヒトＨＤＡＣ−６のアミノ酸配列を示す概略図である（配列番号：１１）。
【図６Ｂ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＪ０１１９７２に提供されている、ヒトＨＤＡＣ−６の核酸配列を示す概略図である（配列番号：１２）。
【図７Ａ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ６３４９１．１に提供されている、ヒトＨＤＡＣ−７のアミノ酸配列を示す概略図である（配列番号：１３）。
【図７Ｂ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３９２４３に提供されている、ヒトＨＤＡＣ−７の核酸配列を示す概略図である（配列番号：１４）。
【図８Ａ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＦ７３０７６．１に提供されている、ヒトＨＤＡＣ−８のアミノ酸配列を示す概略図である（配列番号：１５）。
【図８Ｂ】ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２３００９７に提供されている、ヒトＨＤＡＣ−８の核酸配列を示す概略図である（配列番号：１６）。
【図９Ａ】ヒトＡ５４９細胞におけるＨＤＡＣ−１ ｍＲＮＡ発現に対する、ＨＤＡＣ−１ ＡＳ１アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す、ノーザンブロットの図である。
【図９Ｂ】ヒトＡ５４９細胞におけるＨＤＡＣ−２ ｍＲＮＡ発現に対する、ＨＤＡＣ−２ ＡＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す、ノーザンブロットの図である。
【図９Ｃ】ヒトＡ５４９細胞におけるＨＤＡＣ−６ ｍＲＮＡ発現に対する、ＨＤＡＣ−６ ＡＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す、ノーザンブロットの図である。
【図９Ｄ】ヒトＡ５４９細胞におけるＨＤＡＣ−３ ｍＲＮＡ発現に対する、ＨＤＡＣ−３ ＡＳアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す、ノーザンブロットの図である。
【図９Ｅ】ヒトＡ５４９細胞におけるＨＤＡＣ−４ ｍＲＮＡ発現に対する、ＨＤＡＣ−４アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ１）の効果を示す、ノーザンブロットの図である。
【図９Ｆ】ヒトＡ５４９細胞におけるＨＤＡＣ−４ ｍＲＮＡ発現に対する、ＨＤＡＣ−４アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ２）の用量依存的効果を示す、ノーザンブロットの図である。
【図９Ｇ】ヒトＡ５４９細胞におけるＨＤＡＣ−５ ｍＲＮＡ発現に対する、ＨＤＡＣ−５アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）の効果を示す、ノーザンブロットの図である。
【図９Ｈ】ヒトＡ５４９細胞におけるＨＤＡＣ−７ ｍＲＮＡ発現に対する、ＨＤＡＣ−７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ）の効果を示す、ノーザンブロットの図である。
【図９Ｉ】ヒトＡ５４９細胞におけるＨＤＡＣ−８ ｍＲＮＡ発現に対する、ＨＤＡＣ−８アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ１およびＡＳ２）の用量依存的効果を示す、ノーザンブロットの図である。
【図１０Ａ】ヒトＡ５４９細胞におけるＨＤＡＣアイソタイプタンパク質発現に対する、ＨＤＡＣアイソタイプ特異的アンチセンスオリゴの効果を示す、ウェスタンブロットの図である。
【図１０Ｂ】ヒトＡ５４９細胞におけるＨＤＡＣアイソタイプタンパク質発現に対する、ＨＤＡＣ−１アイソタイプ特異的アンチセンスオリゴ（ＡＳ１およびＡＳ２）の用量依存的効果を示す、ウェスタンブロットの図である。
【図１１】ヒトＡ５４９癌細胞に対する、ＨＤＡＣアイソタイプ特異的アンチセンスオリゴのアポトーシス効果を示すグラフである。
【図１２Ａ】ヒトＡ５４９癌細胞の増殖に対する、ＨＤＡＣ−１ ＡＳ１およびＡＳ２アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示すグラフである。
【図１２Ｂ】ヒトＡ５４９癌細胞の増殖に対する、ＨＤＡＣ−８特異的なＡＳ１およびＡＳ２アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示すグラフである。
【図１３】ヒトＡ５４９癌細胞に対する、ＨＤＡＣ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞周期阻止効果を示すグラフである。
【図１４】ヒトＡ５４９細胞におけるＨＤＡＣアイソタイプｍＲＮＡ発現に対する、ＨＤＡＣアイソタイプ特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を示す、ＲＮアーゼプロテクションアッセイの図である。
【図１５】ヒトＡ５４９細胞のＨＤＡＣ−４ ＡＳ１アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理がｐ２１タンパク質の発現を誘導することを示す、ウェスタンブロットの図である。
【図１６】ヒトＡ５４９細胞のＨＤＡＣ−１アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳ１およびＡＳ２）による処理が、サイクリンＢ１およびサイクリンＡ遺伝子の発現を抑制することを示す、ウェスタンブロットの図である。
【図１７】ＨＤＡＣ−１に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの、Ａ５４９細胞の軟寒天における成長を阻害する能力が、ＨＤＡＣ−２、ＨＤＡＣ−６またはミス対合した対照に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力に比べてはるかに高いことを示す、平板培養データを示す図である。
【図１８】ヒトＡ５４９細胞の小分子阻害剤化合物３（表２）による処理がｐ２１タンパク質の発現を誘導し、サイクリンＢ１およびサイクリンＡ遺伝子の発現を抑制することを示す、ウェスタンブロットの図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
2004533850.tif 000028
【図４Ｂ−１】
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【図４Ｂ−２】
2004533850.tif 000030
【図４Ｂ−３】
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【図４Ｂ−４】
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【図４Ｂ−５】
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【図５Ａ】
2004533850.tif 000034
【図５Ｂ−１】
2004533850.tif 000035
【図５Ｂ−２】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図６Ｂ−３】
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【図７Ａ】
2004533850.tif 000041
【図７Ｂ−１】
2004533850.tif 000042
【図７Ｂ−２】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図９Ｉ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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