(57)【要約】本発明は、血管形成活性を増強して、新血管新生を促進するための方法に関し、この方法は、被験体に、相乗効果的に有効量のＴＷＥＡＫアゴニストおよび血管形成因子を含む処方物を添加する工程を包含する。本発明は、哺乳動物において血管形成活性を増強して、新血管新生を促進するための方法に関し、この方法は、動物に、新血管新生を促進するのに十分な、相乗効果的に有効量のＴＷＥＡＫアゴニストおよび血管形成因子を含む処方物を投与する工程を包含する。
2004500844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ培養物において内皮細胞増殖を増強するための方法であって、該方法は、細胞培養物に、相乗効果的に有効量のＴＷＥＡＫアゴニストおよび血管形成因子から本質的になる処方物を添加する工程を包含する、方法。
【請求項２】
哺乳動物において血管形成活性を増強して、新血管新生を促進するための方法であって、該方法は、該動物に、新血管新生を促進するのに十分な、相乗効果的に有効量のＴＷＥＡＫアゴニストおよび血管形成因子を含む処方物を投与する工程を包含する、方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法であって、前記血管形成因子が、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アンギオポエチン１、アンギオポエチン２、および単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）からなる群から選択される、方法。
【請求項４】
前記血管形成因子がｂＦＧＦである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が、心筋虚血状態の処置に使用される、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が、創傷治癒を促進するために使用される、請求項２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、新血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を促進するために血管形成活性（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を促進するための方法に関する。
【０００２】
（発明の背景）
微小血管の成長、すなわち血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、新血管への内皮細胞（ＥＣ）の増殖、遊走、分化、および構造編制を含む。
【０００３】
血管形成調節因子は、種々のレベルでの内皮細胞（ＥＣ）の変化を誘導し（その増殖、遊走、分泌、および接着特性が挙げられる）、そしてこの血管形成調節因子の作用を介してＥＣまたは他の細胞型に対してそのように変化を誘導し得る（Ｋｕｍａｒら，１９９８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　１２：７４９−７５７；Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏら，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２２：２５１−２５６）。これまででは、いくつかのＴＮＦファミリーのリガンドが、血管形成のプロセスに関与している（すなわちＴＮＦα、ＦａｓＬおよびＴＷＥＡＫ）。
【０００４】
（発明の要旨）
ＴＷＥＡＫ（ＴＮＦリガンドファミリーの新規メンバー）は、いくつかの上皮腫瘍細胞株によるＩＬ−８産生を誘導するその能力、減少した増殖因子条件下での種々のヒトＥＣおよび大動脈平滑筋細胞における増殖、ならびにラット角膜に移植された場合の血管形成応答の刺激に基づいて、血管形成を促進し得る。本明細書中、本発明者らは、ＴＷＥＡＫの血管形成の潜在能をさらに特徴付け、ＴＷＥＡＫが線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）と相乗作用を起こして、ＥＣの増殖および遊走を誘導することを実証する。ＴＷＥＡＫはＥＣ生存を弱く促進するが、ＥＣ増殖に対するＴＷＥＡＫおよびＦＧＦの相乗作用効果は、細胞死を減少するよりも、細胞分裂の増強に起因するようである。ＴＷＥＡＫはまた、ＦＧＦまたはＶＥＧＦについてのレセプターの発現（すなわち、インテグリンα１、α５、αｖ、β１、またはβ３の発現）を検出可能に変更しなかった。ＥＣを誘導して、他の細胞型の非存在下で毛細血管を形成するＴＷＥＡＫの能力は、３Ｄフィブリンゲルマトリックス中で実証され、ここで、ＴＷＥＡＫは著しく、侵襲の際に管腔の形態形成を誘導した（ｂＦＧＦ依存性ＥＣ索）。本発明者らの発見によってさらに、ＴＷＥＡＫを他のＴＮＦファミリーリガンドと区別し、複数の別々の段階において血管形成を促進するＴＷＥＡＫの能力を実証する。
【０００５】
本発明の１つの局面は、インビトロ培養物において内皮細胞増殖を促進するための方法であって、この方法は、細胞培養物に相乗効果的に有効量のＴＷＥＡＫアゴニストおよび血管形成因子から本質的になる処方物を添加する工程を包含する。
【０００６】
本発明の第２の局面は、哺乳動物において血管形成活性を増強して、新血管新生を促進するための方法であって、この方法は、新血管新生を促進するのに十分な、相乗効果的に有効量のＴＷＥＡＫアゴニストおよび血管形成因子を含む処方物をこの動物に投与する工程を包含する。好ましい実施形態はｂＦＧＦの使用である。
【０００７】
（詳細な説明）
本明細書中に使用される場合、用語「血管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）」、「血管再生（ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）」、「増加した側枝循環」、および「血管の再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｌｏｏｄ　ｖｅｓｓｅｌｓ）」は、同意語とみなされる。
【０００８】
「血管形成」は、既存の脈管床（ｖａｓｃｕｌａｒ　ｂｅｄ）の任意の変更または組織灌流に役立つ新規脈管構造の形成として規定される。これには、既存の血管からの内皮細胞の出芽による新規脈管の形成、またはサイズ、成熟度、方向または流れの特性を変更して組織の血液灌流を改善する既存の脈管のリモデリングを含む。
【０００９】
治療剤は、「血管形成」を調節する際に「治療効果」を有すると言われ、そして治療剤の量は、その治療剤の量の投与が、血管形成の調節を必要とする被験体（例えば、動物モデルまたはヒト患者）に投与されたとき血管形成活性に有意な調節（すなわち、増加または減少）を引起すのに十分である場合、「血管形成調節量」といわれる。
【００１０】
用語、血管形成因子は、血管形成プロセス（以下のプロセスの段階が挙げられるが、これらに限定されない：すなわち、細胞外マトリックスの分解、細胞増殖、細胞遊走、および構造編制）を促進する因子をいう（Ｋｕｍａｒら，１９９８，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　１２：７４９−７５７；Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏら，１９９７，Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，２２：２５１−２５６）。血管形成因子としては、線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、酸性ＦＧＦ（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ−５、血管内皮細胞増殖因子アイソフォーム（ＶＥＧＦ）、アンギオポエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）−１（Ａｎｇ−１）およびアンギオポエチン２（Ａｎｇ−２）、血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、胎盤増殖因子、プロリフェリン（ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ）、Ｂ６１、可溶性脈管細胞接着分子−１、可溶性Ｅ−セレクチン（Ｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）、１２−ヒドラジエイコサテトラエノン酸（１２−ｈｙｄｒｏｚｙｅｉｃｏｓａｔｅｔｒａｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質、アンギオゲニン、ＴＮＦα、ＦａｓＬ、トランスフォーミング増殖因子−βが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
本明細書中に使用される場合、別の血管形成因子と相乗作用的に作用するＴＷＥＡＫの能力は、ＴＷＥＡＫおよび血管形成因子の組合せが、血管形成プロセスの段階を測定する１つ以上のインビトロアッセイにおいて測定されるように、いずれかの因子単独に対する応答の和よりも大きい応答を誘導することを意味する。この血管形成プロセスの段階としては、本明細書中に記載されるように、内皮細胞の生存、増殖、遊走、または毛細管形成が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１２】
用語「薬学的に受容可能な」は、天然物質または合成物質に対して言及される場合、その物質がはるかに大きい有利な効果を考慮して受容可能な毒性効果を有することを意味する。一方、関連する用語「生理学的に受容可能な」は、その物質が比較的低い毒性を有することを意味する。
【００１３】
本明細書中に使用される場合、用語「抗体ホモログ」は、ジスルフィド結合を介して連結した免疫グロブリン軽鎖および免疫グロブリン重鎖からなるインタクトな抗体を含む。用語「抗体ホモログ」はまた、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、および１つ以上の抗原（すなわち、ＴＷＥＡＫまたは一部（ｐａｔｃｈｅｄ））に結合し得るそれらの抗原結合フラグメントから選択される１つ以上のポリペプチドを含むＴＷＥＡＫ治療剤を含むことが意図される。１つより多くのポリペプチドから構成される抗体ホモログの成分ポリペプチドは、必要に応じて、ジスルフィド結合するか、さもなくば共有結合的に架橋し得る。従って、「抗体ホモログ」は、ＩｇＡ型、ＩｇＧ型、ＩｇＥ型、ＩｇＤ型、ＩｇＭ型（ならびにこれらにサブタイプ）のインタクトな免疫グロブリンを含み、ここで、免疫グロブリンの軽鎖は、κ型もしくはλ型であっても、抗原結合特異性を保持するインタクトな抗体の一部（例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆ（ｖ）フラグメント、重鎖単量体もしくは二量体、軽鎖単量体もしくは二量体、１つの重鎖および１つの軽鎖からなる二量体など）であってもよい。
【００１４】
本明細書中に使用される場合、「ヒト化抗体ホモログ」は、組み換えＤＮＡ技術によって産生された抗体ホモログであり、ここで、抗原結合に必要とされないヒト免疫グロブリンの軽鎖または重鎖のアミノ酸のいくらかまたは全てが、非ヒト哺乳動物免疫グロブリンの軽鎖または重鎖由来の対応するアミノ酸の代わりに置換されている。「ヒト抗体ホモログ」は、免疫グロブリンの軽鎖または重鎖のアミノ酸の全てが（抗原結合に必要とされるか否かにかかわらず）、ヒト供給源由来である抗体ホモログである。
【００１５】
「アミノ酸」は、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の単量体単位である。天然に存在するペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質には２０個のアミノ酸が見出されていて、これらの全ては、Ｌ異性体である。この用語はまた、アミノ酸のアナログならびにタンパク質アミノ酸およびそのアナログのＤ異性体も含む。
【００１６】
用語「バイオアベイラビリティー」は、投与後に体によって吸収される化合物の能力をいう。例えば、第１および第２の化合物の両方が等量投与されたときに、第１化合物が第２化合物よりも大きい程度で血液に吸収される場合、この第１化合物は第２化合物よりも大きいバイオアベイラビリティーを有する。
【００１７】
「発現ベクター」は、ポリヌクレオチドであり、例えば、この発現ベクターが宿主細胞に導入された場合に少なくとも１つの遺伝子の発現を可能にするＤＮＡプラスミドまたはファージ（とりわけ一般的な例）である。ベクターは、宿主細胞中で複製されることができても、できなくてもよい。
【００１８】
句「細胞外シグナル伝達タンパク質」は、細胞から分泌されるかまたは細胞膜に結合しているいずれかの任意のタンパク質を意味し、そして、標的細胞上のこのタンパク質に対するレセプターへの結合の際に、標的細胞に応答を誘発する。
【００１９】
アミノ酸残基の「機能的等価体」は、（ｉ）その機能的等価体によって置換されたアミノ酸残基と類似の反応特性を有するアミノ酸、（ｉｉ）本発明のポリペプチドのリガンドのアミノ酸（このアミノ酸は、その機能的等価体によって置換されたアミノ酸残基と類似の特性を有する）、（ｉｉｉ）その機能的等価体によって置換されたアミノ酸残基と類似の特性を有する非アミノ酸分子である。
【００２０】
「異種プロモーター」は、本明細書中に使用される場合、遺伝子または精製核酸と天然に結合していないプロモーターである。
【００２１】
「相同性」および「同一性」は、各々、２つのポリペプチド配列間の配列類似性をいい、「相同性」および「同一性」の両方は、その開示において交換可能に使用される。「相同性」は、比較目的のために整列され得る各配列中の位置を比較することによって決定され得る。比較された配列中の位置が同じアミノ酸残基によって占められる場合、これらのポリペプチドは、その位置において同一であるといわれ得；等価な部位が同じアミノ酸（例えば、同一）または類似のアミノ酸（例えば、立体的な性質および／または電子的な性質が類似）によって占められる場合、この分子は、その位置において相同であるといわれ得る。配列間の相同性のパーセンテージは、これらの配列によって共有される一致した位置または相同な位置の数の関数である。「関連していない」配列または「非相同」配列は、本発明の配列と４０％未満の同一性（もっとも、好ましくは２５％未満の同一性）を共有する。
【００２２】
例えば、２つの配列において１０個の位置のうちの６個の位置が、一致しているかまたは相同である場合、２つの配列は６０％相同である。例として、ＤＮＡ配列ＣＴＧＡＣＴおよびＣＡＧＧＴＴは、５０％の相同性（全部で６個の位置のうち３個の位置が一致している）を共有する。一般に、比較は、２つの配列が最大の相同性を与えるように整列される場合に、行われる。このような整列は、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）の方法（以下により詳細に記載されるコンピュータープログラムによって簡便に実行される）を使用して提供され得る。相同配列は、同一アミノ酸残基または類似アミノ酸残基を共有し、ここで、類似の残基は、整列された参照配列における対応するアミノ酸残基の保存的置換（すなわち「許容点変異（ａｌｌｏｗｅｄ　ｐｏｉｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）」）である。この点に関して、参照配列における残基の「保存的置換」は、対応する参照残基（例えば、類似のサイズ、形、電荷、化学的特性（共有結合または水素結合を形成する能力を含む）などを有する）に物理的または機能的に類似である残基の置換である。特に好ましい保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆら、５：Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５：補遺．３，第２２章：３５４−３５２、Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８）における「許容点変異」について定義される基準を満たす保存的置換である。
【００２３】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の「パーセント相同性／同一性」は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　９０：５８７３（１９９３））において改変されるように、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ　８７：２２６４（１９９０））の整列アルゴリズムを使用して決定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）のＮＢＬＡＳＴまたはＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれる。ＢＬＡＳＴ検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施され、本発明の核酸に相同なヌクレオチド配列を得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施され、参照ポリペプチド配列に相同なアミノ酸配列を得る。比較のためのギャップ付き（ｇａｐｐｅｄ）整列を得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２５：３３８９（１９９７）において記載されるように使用される。ＢＬＡＳＴおよびギャップ付きＢＬＡＳＴを使用する場合、それぞれのプログラム（ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが使用される。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照のこと。
【００２４】
用語「疎水性」は、非極性原子を有する化学部分が、水または他の極性原子とではなくお互いに相互作用する傾向をいう。「疎水性」である物質は、多くは水中で不溶性である。疎水性性質を有する天然産物としては、脂質、脂肪酸、リン脂質、スフィンゴ脂質、アシルグリセロール、ワックス、ステロール、ステロイド、テルペン、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、イソプレノイド、レテノイド（ｒｅｔｅｎｏｉｄ）、ビオチン、ならびにトリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、プロリン、およびチロシンのような疎水性アミノ酸が挙げられる。化学的部分はまた、その物理的性質が非極性原子の存在によって決定される場合、疎水性であるかまたは疎水性性質を有する。
【００２５】
成句「内部アミノ酸（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ）」は、Ｎ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸のいずれでもないペプチド配列中の任意のアミノ酸を意味する。
【００２６】
「単離された」（「実質的に純粋な」と交換可能に使用される）は、核酸（すなわち、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列）に適用される場合、その起源または操作によって、（ｉ）天然において結合するポリヌクレオチドの全てとは結合しない（例えば、発現ベクターまたはその一部として宿主細胞中に存在する）か；または（ｉｉ）天然において結合するもの以外の核酸または他の化学部位に結合するか；または（ｉｉｉ）天然に存在しない、ＲＮＡまたはＤＮＡポリヌクレオチド、ゲノムポリヌクレオチドの一部分、ｃＤＮＡまたは合成ポリヌクレオチドを意味する。「単離された」はさらに、（ｉ）例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロで増幅されるか；（ｉｉ）化学的に合成されるか；（ｉｉｉ）クローニングによって組換え的に産生されるか；または（ｉｖ）切断およびゲル分離によって精製される、ポリヌクレオチド配列を意味する。
【００２７】
「単離された」（「実質的に純粋な」と交換可能に使用される）は、ポリペプチドに適用される場合、その起源または操作によって、（ｉ）発現ベクターの一部の発現産物として宿主細胞中に存在するか；または（ｉｉ）天然において結合するもの以外のタンパク質または他の化学部位に結合するか；または（ｉｉｉ）天然に存在しない、ポリペプチドまたはその部分（例えば、天然において見出されない形態でタンパク質が存在するように、少なくとも１つの疎水性部分をタンパク質に付加する（ａｐｐｅｎｄｉｎｇ）かまたは付加する（ａｄｄｉｎｇ）ことによって化学的に操作されたタンパク質）を意味する。「単離された」はさらに、（ｉ）化学的に合成されるか；または（ｉｉ）宿主細胞において発現され、そして結合タンパク質および混入タンパク質から離れて精製される、タンパク質を意味する。この用語は一般に、天然に存在する他のタンパク質および核酸から分離されたポリペプチドを意味する。好ましくは、このポリペプチドはまた、これらを精製するために使用される抗体またはゲルマトリクス（ポリアクリルアミド）のような物質から分離される。
【００２８】
「タンパク質」は、２０個のアミノ酸のいずれかから基本的になる任意のポリマーである。「ポリペプチド」は、しばしば、比較的大きいポリペプチドに関して使用され、そして「ペプチド」は、しばしば、小さいポリペプチドに関して使用される。これらの用語の使用は、当該分野で重複し、そして変化する。本明細書中で使用される場合、用語「タンパク質」は、他に示されない限り、ペプチド、タンパク質およびポリペプチドをいう。
【００２９】
用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能に使用される。用語「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」はまた、本明細書中で交換可能に使用される。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「組換え体」は、タンパク質が組換え哺乳動物発現系に由来することを意味する。
【００３１】
従って、「実質的に純粋な核酸」は、この核酸が由来する生物体の天然に存在するゲノム中に通常連続するコード配列の１つまたは両方と直接連続していない核酸である。実質的に純粋なＤＮＡはまた、さらなるＴＷＲＡＫ配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。
【００３２】
新血管新生を促進する血管形成活性を増強する際に有効であることが必要されるＴＷＥＡＫアゴニストおよび血管形成因子の量は、もちろん、処置される患者と共に変化し、そして最終的に医者の裁量である。考慮されるべき因子としては、処置される患者の状態、使用される特定のＴＷＥＡＫアゴニストの効力、処方物の性質、および患者の体重が挙げられる。ＴＷＥＡＫアゴニストを同時に投与することは可能であるが、血管形成因子は、ＴＷＥＡＫアゴニストの注入の開始の前に、ボーラスとして与えられ得ることがまた意図される。血管形成因子は、ＴＷＥＡＫアゴニストの注入後に投与され得ることがまた意図される。
【００３３】
ＴＷＥＡＫアゴニストは、ＷＯ９８／０５７８３、ＷＯ９８／３５０６１およびＷＯ９９／１９４９０（これら全ては、本明細書中に参考として援用される）において教示されるようなアゴニストを含む。このようなＴＷＥＡＫアゴニストは、可溶性組換えＴＷＥＡＫタンパク質を含む。
【００３４】
「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の両方について０．５×ＳＳＣ〜約５×ＳＳＣかつ６５℃に実質的に等価な塩および温度条件をいう。従って、本明細書中で使用される場合、用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、操作上の定義であり、そしてハイブリダイゼーション条件の範囲を含む。それにも関わらず、本発明の開示の目的のために「高ストリンジェンシー」条件は、プラークスクリーニング緩衝液（０．２％ポリビニルピロリドン、０．２％Ｆｉｃｏｌｌ　４００；０．２％ウシ血清アルブミン、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）；１Ｍ　ＮａＣｌ；０．１％ピロリン酸ナトリウム；１％ＳＤＳ）；１０％硫酸デキストラン、および１００μｇ／ｍｌ変性超音波処理サケ精子ＤＮＡを用いて、６５℃で１２〜２０時間ハイブリダイズすること、および７５ｍＭ　ＮａＣｌ／７．５ｍＭクエン酸ナトリウム（０．５×ＳＳＣ）／１％ＳＤＳを用いて、６５℃で洗浄することを含む。「低ストリンジェンシー」条件は、プラークスクリーニング緩衝液、１０％硫酸デキストラン、および１１０μｇ／ｍｌ変性超音波処理サケ精子ＤＮＡを用いて、５５℃で１２〜２０時間ハイブリダイズすること、および３００ｍＭ　ＮａＣｌ／３０ｍＭクエン酸ナトリウム（２．０×ＳＳＣ）／１％ＳＤＳを用いて、５５℃で洗浄することを含む。Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｓｅｃｔｉｏｎｓ　６．３．１−６．３．６，（１９８９）もまた参照のこと。
【００３５】
本明細書中で使用される場合、「治療的組成物」は、本発明の治療的成分および他の生物学的に適合性の成分を含むとして定義される。この治療的組成物は、水のような賦形剤、鉱物およびタンパク質のようなキャリアを含み得る。
【００３６】
「野生型」は、それがインビボにおいて正常に存在するような、それぞれ、タンパク質もしくはその部分のエキソンの天然に存在するポリヌクレオチド配列、または天然に存在するタンパク質配列もしくはその部分を意味する。
【００３７】
本発明の実施は、他に示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、タンパク質化学、および免疫学（これらは、当該分野内である）の従来の技術を使用する。このような技術は、文献に記載されている。他に明記されない限り、詳細な説明において引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として援用される。
【００３８】
（Ａ．フラグメントおよびアナログの生成）
単離されたタンパク質のフラグメント（例えば、ＴＷＥＡＫのフラグメント）はまた、組換え方法、タンパク質分解的消化、または当業者に公知の方法を使用する化学的合成によって、効率的に生成され得る。組換え方法において、ポリペプチドの内部フラグメントまたは末端フラグメントは、単離されたＴＷＥＡＫポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の１つの末端（末端フラグメントについて）または両方の末端（内部フラグメントについて）から１つ以上のヌクレオチドを除去することによって生成され得る。変異誘発されたＤＮＡの発現は、ポリペプチドフラグメントを生成する。「末端切除（ｎｉｂｂｌｉｎｇ）」エンドヌクレアーゼはまた、一連のフラグメントをコードするＤＮＡを生成し得る。タンパク質のフラグメントをコードするＤＮＡはまた、無作為な剪断、制限消化、もしくは組み合わせ、または両方によって生成され得る。タンパク質フラグメントは、インタクトなタンパク質から直接生成され得る。ペプチドは、タンパク質分解酵素（プラスミン、トロンビン、トリプシン、キモトリプシン、またはペプシンを含むがこれらに限定されない）によって特異的に切断され得る。これらの酵素の各々は、それが攻撃するペプチド結合の型に特異的である。トリプシンは、カルボニル基が塩基性アミノ酸（通常、アルギニンまたはリジン）に由来するペプチド結合の加水分解を触媒する。ペプシンおよびキモトリプシンは、芳香族アミノ酸（例えば、トリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニン）由来のペプチド結合の加水分解を触媒する。切断されたタンパク質フラグメントの代替のセットは、タンパク質分解酵素に感受性である部位における切断を防止することによって生成される。例えば、穏やかに塩基性の溶液における、リジンのε−アミノ酸基のエチルトリフルオロチオアセテートとの反応は、隣接するペプチド結合がもはやトリプシンによる加水分解に感受性ではない、ブロックされたアミノ酸残基を生じる。タンパク質は、タンパク質分解酵素に感受性であるペプチド結合を作製するように改変され得る。例えば、β−ハロエチルアミンを用いるシステイン残基のアルキル化は、トリプシンによって加水分解されるペプチド結合を生じる（Ｌｉｎｄｌｅｙ，（１９５６）Ｎａｔｕｒｅ　１７８，６４７）。さらに、特定の残基においてペプチド鎖を切断する化学試薬が使用され得る。例えば、臭化シアンは、メチオニン残基においてペプチドを切断する（Ｇｒｏｓｓ　ａｎｄ　Ｗｉｔｋｉｐ，（１９６１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８３，１５１０）。従って、修飾因子、タンパク質分解酵素および／または化学試薬の種々の組み合わせを用いてタンパク質を処理することによって、タンパク質は、重複のないフラグメントを有する所望の長さのフラグメントに分けられ得るか、または所望の長さの重複するフラグメントに分けられ得る。
【００３９】
フラグメントはまた、メリフィールド固相Ｆ　ｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学のような当業者に公知の技術を使用して、化学的に合成され得る。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　２３：４５１（１９６７）。
【００４０】
（Ｂ．変更されたＤＮＡおよびペプチド配列の生成：無作為な方法）
タンパク質のアミノ酸配列改変体は、タンパク質またはその特定の部分をコードするＤＮＡの無作為変異誘発によって調製され得る。有用な方法としては、ＰＣＲ変異誘発および飽和変異誘発が挙げられる。無作為アミノ酸配列改変体のライブラリーはまた、変性オリゴヌクレオチド配列のセットの合成によって生成され得る。変更されたＤＮＡおよびペプチドを使用して所定のタンパク質のアミノ酸配列改変体を生成する方法は、当業者に周知である。以下のこのような方法の例は、本発明の範囲を制限することを意図するのではなく、単に例示的な技術を示すために役立つ。当業者は、他の方法もまたこの点について有用であることを認識する。
ＰＣＲ変異誘発：例えば、Ｌｅｕｎｇら、（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　１，１１−１５を参照のこと。
飽和変異誘発：１つの方法が、Ｍａｙｅｒｓら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９，２４２において一般に記載される。
変性オリゴヌクレオチド変異誘発：例えば、Ｈａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　３９，３；Ｉｔａｋｕｒａら、（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３，３２３およびＩｔａｋｕｒａら、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ，Ｐｒｏｃ．第３版　Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２７３−２８９頁（Ａ．Ｇ．Ｗａｌｔｏｎ編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８１を参照のこと。
【００４１】
（Ｃ．変更されたＤＮＡおよびペプチド配列の生成；指向された方法）
非無作為（すなわち指向された）変異誘発は、単離されたポリペプチドの公知のアミノ酸配列の残基の欠失、挿入、または置換を含む改変体を提供するために、特定の配列または単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の特定の部分における変異を提供する。変異部位は、例えば、（１）最初に保存されたアミノ酸と置換し、次いで、達成される結果に依存して、より極端な選択アミノ酸と置換するか；（２）標的残基を欠失させるか；または（３）位置決めされた部位に隣接する同じまたは異なるクラスの残基を挿入するか、あるいは選択肢１〜３の組み合わせによって、個々にかまたは連続的に改変され得る。
【００４２】
明らかに、このような部位指向方法は、Ｎ末端システイン（または機能的等価物）が疎水性部分の接着部位を提供するために、所定のポリペプチド配列に導入され得る１つの方法である。
アラニンスキャニング変異誘発：ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４，１０８１−１０８５を参照のこと。
オリゴヌクレオチド媒介性変異誘発：例えば、Ａｄｅｌｍａｎら、（１９８３）ＤＮＡ　２，１８３を参照のこと。
カセット変異誘発：Ｗｅｌｌｓら、（１９８５）Ｇｅｎｅ　３４，３１５を参照のこと。
コンビナトリアル変異誘発：例えば、Ｌａｄｎｅｒら、ＷＯ８８／０６６３０を参照のこと。
【００４３】
（処置方法）
本発明の方法は、新血管新生を促進するために、増大した血管形成活性が所望される疾患における処置として有用である。このような疾患および状態は、としては、以下が挙げられる：心筋虚血状態（例えば、心筋梗塞、心筋虚血に罹患した冠状動脈疾患を有する患者における増大した血流、または末梢脈管疾患におけるような心臓以外の領域への不十分な血流（ここでは、減少した血流が問題である）、例えば亀裂骨折または血管形成後での心筋層の壊死組織の脈管再生、アンギナ、心臓移植、脈管移植片、ならびに血管新生、灌流、膠原化、およびこれらの病変の器質化を改善するための血管再開（ｒｅｏｐｅｎｉｎｇ　ｖｅｓｓｅｌ））、創傷治癒、ならびに組織および器官の移植（例えば、自己または異種の微小血管移植の増強）。創傷治癒の促進としては、切開、骨修復、熱傷治癒、心筋損傷における梗塞形成後修復、一般的には形成を促進するための胃潰瘍および胃腸管の他の潰瘍の治癒、組織の維持および修復が挙げられる。移植された（ｇｒａｆｔｅｄ）かまたは移植された（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ）組織の新血管新生もまた、特に脈管不全に罹患している被験体（例えば、糖尿病患者）において意図される。
【００４４】
一般的事項として、本発明の方法は、新血管形成の調節が必要な任意の哺乳動物被験体のために利用され得る。本発明の方法に従って処置され得る哺乳動物被験体としては、ヒト被験体または患者が挙げられるがこれらに限定されない。しかし、本発明はさらに、飼い慣らされた哺乳動物（ヒトコンパニオンとして養われる哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）、有意な商業的価値を有する哺乳動物（例えば、乳牛、肉牛、スポーツ用動物）、有意な科学的価値を有する哺乳動物（例えば、絶滅の危機にある種の捕獲検体または自由検体）、あるいは他の価値を有する哺乳動物）の処置において利用され得る。さらに、一般的事項として、本発明の方法で処置するための被験体は、新血管形成の調節の必要性と関連する徴候以外の、本発明の因子で処置するための徴候を示す必要はない。すなわち、処置のための被験体は、本発明のＴＷＥＡＫ治療剤での処置についての徴候がないことが予想される。
【００４５】
医学または獣医学分野の当業者は、新血管形成の調節が必要であり得る被験体を認識するように訓練される。特に、現在開示されている処置方法および他の処置方法に関連する臨床試験および非臨床試験、ならびに蓄積された経験は、当業者が決定する際に、所定の被験体が調節の必要があるか否か、および任意の特定の処置が、本発明に従う処置を含めてこの被験体の必要性に最適であるか否かを知らせることが予測される。
【００４６】
従って、本発明の方法は、新血管形成を促進するため（例えば、心筋梗塞の結果としての心筋組織の損傷を修復するため）に、ＴＷＥＡＫアゴニストまたはその生物学的に活性な部分、および血管形成因子を利用し得る。このような方法はまた、虚血後の心臓血管系の修復（側副血管系の増殖を含む）を含み得る。ＴＷＥＡＫアゴニストおよび血管形成因子を利用する方法は、冠状バイパス手術が行われる場合の移植された組織および側副血管系の増殖を刺激するために利用され得る。方法はまた、冠状動脈疾患ならびに末梢神経系および中枢神経系の脈管疾患または虚血の結果として損傷した管脈組織を処置し得る。
【００４７】
本発明の方法はまた、特に損傷組織に血管を移植するために、または虚血の間に側枝の血流を刺激するために、および新しい毛細管の新血管形成が所望される場合に、創傷治癒を促進し得る。本発明の他の方法は、真皮性潰瘍のような全層創傷（とこずれ、静脈性潰瘍、および糖尿病性潰瘍を含む）を処置するために利用され得る。さらに、ＴＷＥＡＫ治療剤を利用する方法は、全層熱傷および損傷（ここで、このような熱傷および損傷を処置するために、皮膚移植片または皮弁が使用される）を処置するために利用され得る。このようなＴＷＥＡＫアゴニストおよび血管形成因子はまた、形成手術（例えば、裂傷、熱傷、または他の外傷の修復）における使用のために利用され得る。泌尿器科学において、本発明の方法は、勃起機能の回復を補助し得る。
【００４８】
新血管形成は、創傷を清潔かつ感染されないように保つことにおいて重要であるので、方法は、手術および引き続く切断の修復に関連して利用され得る。これらはまた、感染の危険性が高い腹創傷の処置のために利用され得る。本明細書中に記載のＴＷＥＡＫ治療剤を使用する方法は、脈管移植手術における内皮化（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｉｚａｔｉｏｎ）の促進のために利用され得る。移植された材料または合成材料のいずれかを使用する脈管移植の場合において、ＴＷＥＡＫアゴニストおよび血管形成因子は、内皮細胞と関連して脈管平滑筋および外膜細胞の増殖を促進するために、移植片の表面または接合部に適用され得る。
【００４９】
本発明の方法はまた、移植される材料の拒絶を最小にするため、そして移植された材料の血管新生（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を刺激するために、身体に移植される人工プロテーゼまたは天然の器官をコートするために利用され得、そしてこの方法はまた、脈管組織の修復（例えば、動脈硬化の間に起こる修復、および脈管組織が損傷した部分でバルーン血管形成の後に必要とされる修復）のために利用され得る。具体的には、本発明の方法は、動脈壁の損傷からの回復を促進するため、従って再狭窄を防止するために利用され得る。
【００５０】
ＴＷＥＡＫアゴニストをコードする核酸配列はまた、科学的研究、ＤＮＡの合成およびＤＮＡベクターの製造に関連するインビトロの目的で、そしてヒト疾患を処置するための診断剤および治療剤の生成のために利用され得る。例えば、本発明の方法は、脈管平滑筋細胞、線維芽細胞、造血細胞、筋肉、筋腱（ｍｙｏｔｅｎｄｏｎｏｕｓ）接合部、骨または軟骨誘導細胞、および他の間葉細胞のインビトロ培養を含み得、ここでＴＷＥＡＫ治療剤は、馴化培地に１０ｎｇ／ｍｌ〜２０μｇ／ｍｌの濃度で添加される。
【００５１】
これらの治療剤は、利用される特定の薬剤と適合性の任意の経路によって投与され得る。本発明の治療剤は、任意の適切な手段（好ましくは直接的（例えば、組織部位への注射または局所投与によるように局所的に）あるいは全身的（例えば、非経口的または経口的））によって個体へと供給され得る。この薬剤が非経口的に（例えば、静脈内、動脈内、皮下、または筋肉内投与によって）提供される場合、この薬剤は、好ましくは、水溶液の部分を構成する。この溶液は、被験体への所望の薬剤の送達に加えて、この溶液が被験体の電解質および／または容量の平衡に他の悪影響を与えないように、生理学的に受容可能である。この治療剤のための水性媒体は、通常の生理食塩水（例えば、９．８５％　ＮａＣｌ、０．１５Ｍ、ｐＨ７〜７．４）を含み得る。
【００５２】
この治療剤は、好ましくは薬学的に受容可能なキャリアを含む滅菌の薬学的組成物として投与され、このキャリアは、多数の周知のキャリア（例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、またはこれらの組み合わせ）のいずれかであり得る。本発明の化合物は、無機または有機の酸および塩基から誘導される薬学的に受容可能な塩の形態で使用され得る。このような酸塩には、以下が含まれる：酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫化水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、二グルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩（ｈｅｍｉｓｕｌｆａｔｅ）、へプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピルビン酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシレート、およびウンデカン酸塩。塩基塩としては、以下が挙げられる：アンモニウム塩、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩およびカリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩およびマグネシウム塩）、有機塩基を有する塩（例えば、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミンおよびアミノ酸（例えば、アルギニン、リジンなど）を有する塩）。また、塩基性窒素含有基は、アルキルハライド（例えば、メチル、エチル、プロピル、およびブチルクロリド、ブロミドおよびヨージド）；硫酸ジアルキル（例えば、硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチル、および硫酸ジアミル）、長鎖ハライド（たとえば、デシル、ラウリル、ミリスチル、およびステアリルクロリド、ブロミド、およびヨージド）、アラルキルハライド（例えば、ベンジルブロミドおよびフェネチルブロミド）などのような薬剤で四級化され得る。水または油に溶解性または分散性の生成物は、これによって得られる。
【００５３】
ＴＷＥＡＫアゴニストおよび血管形成因子の薬学的組成物は、任意の薬学的に受容可能なキャリアと共に、本発明の化合物、またはそれらの薬学的に受容可能な誘導体のいずれかを含む。用語「キャリア」は、本明細書中で使用される場合、受容可能なアジュバントおよびビヒクルを含む。本発明の薬学的組成物において使用され得る薬学的に受容可能なキャリアとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝性物質（例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、硫酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂）。
【００５４】
（注射送達）
本発明に従って、この薬学的組成物は、滅菌注射可能調製物（例えば、滅菌注射可能な水性または油性の懸濁液）の形態であり得る。この懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して、当該分野で公知の技術に従って処方され得る。この滅菌注射可能調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の滅菌注射可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液のような）であり得る。利用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンガー溶液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として慣習的に利用されている。この目的のために、任意の穏やかな不揮発性油（合成のモノ−またはジグリセリドを含む）が利用され得る。脂肪酸（例えば、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体）は、天然の薬学的に受容可能な油（例えば、オリーブ油またはヒマシ油）と同様に、注射可能物質（特に、そのポリオキシエチル化バージョンにおいて）の調製において有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤または分散剤を含み得る。
【００５５】
特定の治療剤の制御放出投与は有用であり得る。例えば、治療剤は、静脈内注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の投与形態を使用して、投与され得る。１つの実施形態において、ポンプが使用され得る［Ｌａｎｇｅｒら編，Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ　Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．，１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら，Ｓｕｒｇｅｒｙ，８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３２１：５７４（１９８９）］。別の実施形態において、ポリマー材料が使用され得る［Ｌａｎｇｅｒ，１９７４，前出；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，前出；Ｓｍｏｌｅｎら編，Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２３：６１（１９８３）を参照のこと；Ｌｅｖｙら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇら，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．，７１：１０５（１９８９）もまた参照のこと］。なお別の実施形態において、制御放出系は、治療標的（例えば、腫瘍）の近位に配置され得、従って、全身容量の画分のみを必要とする［例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）を参照のこと］。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４９：１５２７−１５３３（１９９０）による総説において議論される。別の実施形態において、この治療化合物は、小胞（特に、リポソーム）中で送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，前出；Ｔｒｅａｔら，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｐｐ．３１７−３２７を参照のこと；一般的には同書を参照のこと）。
【００５６】
（経口送達）
経口固体用量形態が本明細書中で使用のために意図され、これは、Ｍａｒｔｉｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ　８９，１９９０，前出（これは、本明細書中で参考として援用される）において一般に記載される。固体用量形態としては、錠剤、カプセル、丸剤、トローチまたはロゼンジ、カシェあるいはペレットが挙げられる。また、リポソームまたはプロテイノイドカプセル化は、本発明の組成物を処方するために使用され得る（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号に報告されるプロテイノイドミクロスフェアのように）。リポソームカプセル化が使用され得、そしてこのリポソームは、種々のポリマーから誘導体化され得る（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。治療剤について可能な固体用量形態の記載は、Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｍｏｄｅｒｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ　１０，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編（１９７９）（本明細書中に参考として援用される）によって与えられる。一般に、この処方物は、治療剤（または化学的に修飾された形態）、ならびに胃の環境に対する保護および生物学的活性材料の腸での放出を可能にする不活性成分を含む。
【００５７】
タンパク質（または誘導体）について、放出の位置は、胃、小腸（十二指腸、空腸（ｊｅｊｕｎｅｍ）、または回腸）、あるいは大腸であり得る。当業者は、胃では溶解せず、この材料を十二指腸また腸の他の部位に放出する、利用可能な処方物を有する。好ましくは、この放出は、タンパク質（または誘導体）の保護によって、または胃の環境を越えての生物学的活性材料の放出（例えば、腸において）によってのいずれかで、胃の環境の有害な影響を回避する。胃への完全な耐性を保証するために、少なくともｐＨ５．０まで不浸透性であるコーティングが必須である。腸陽性コーティングとして使用されるより一般的な不活性成分の例は、トリメリト酸酢酸セルロース（ＣＡＴ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ　５０、ＨＰＭＣＰ　５５、フタル酸酢酸ポリビニル（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ　Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、フタル酸酢酸セルロース（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ　Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ　Ｓ、およびＳｈｅｌｌａｃ。これらのコーティングは、混合フィルムとして使用され得る。コーティングまたはコーティング混合物はまた、錠剤において使用され得、これは胃に対する保護について意図されない。これは、糖コーティング、またはより飲み込みやすい錠剤を作製するコーティングを含み得る。カプセルは、乾燥治療剤（すなわち、粉末）の送達のための硬質殻（例えばゼラチン）からなり得；液体形態については、軟質ゼラチン殻が使用され得る。カプセルの殻材料は、厚いデンプンまたは他の食用紙であり得る。丸剤、ロゼンジ、成形錠剤または錠剤粉砕物について、湿式集結技術が使用され得る。
【００５８】
治療剤は、粒子径約１ｍｍの顆粒またはペレットの形態における微細多成分のような処方物を含み得る。カプセル投与のための処方材料はまた、粉末、軽く圧縮されたプラグ、または錠剤でさえあり得る。治療剤は、圧縮によって調製され得る。着色剤および香味剤は、全て含まれ得る。例えば、タンパク質（または誘導体）が処方され得（例えば、リポソームまたはミクロスフェア被包によって）、次いでさらに、食用品（例えば、着色剤および香味剤を含む冷蔵された飲料）に含まれ得る。不活性材料を用いて希釈し、治療剤の用量を増し得る。これらの希釈剤は、以下を含み得る：炭水化物、特にマンニトール、α−乳糖、無水乳糖、セルロース、ショ糖、修飾デキストラン、およびデンプン。特定の無機塩はまた、カルシウム三リン酸、炭酸マグネシウム、および塩化ナトリウムを含む賦形剤として使用され得る。いくつかの市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ　１５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ、およびＡｖｉｃｅｌｌである。崩壊剤は、固形投与形態中における治療剤の処方物中に含まれ得る。崩壊剤として使用される材料は、デンプンを基にした市販の崩壊材であるＥｘｐｌｏｔａｂを含むデンプンを含むが、これに限定されない。デンプングリコレートナトリウム、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ウルトラミロペクチン（ｕｌｔｒａｍｙｌｏｐｅｃｔｉｎ）、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、みかんの皮、カルボキシルメチルセルロース酸、天然のスポンジ、およびベントナイトは、全て用いられ得る。この崩壊剤の別の形態は、不可溶性のカチオン交換樹脂である。粉末化されたゴムは、賦形剤および結合剤として用いられ得て、これらは、粉末化されたゴム（例えば、寒天、Ｋａｒａｙａ，またはトラガカントを含み得る。アルギン酸およびこのナトリウム塩はまた、崩壊剤として有用である。結合剤を用いて、治療剤を合わせて、固い錠剤を形成し得る。結合剤は、天然物（例えば、アカシア、トラガカント、デンプン、およびゼラチン）由来の材料を含む。他は、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）を含む。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は両方、アルコール溶液中で用いられて、治療剤を顆粒化し得る。抗摩擦剤は、治療剤の処方物中に含まれて、処方のプロセスの間の固着を予防し得る。潤滑剤は、治療剤とダイウォール（ｄｉｅ　ｗａｌｌ）の間の層として、用いられ得、これは、以下を含むが、これらに限定されない：ステアリン酸（このマグネシウム塩およびカルシウム塩を含む）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、野菜油、およびワックス。可溶性の潤滑剤はまた、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、種々の分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ　４０００および６０００が用いられる。処方の間の薬物の流動特性を改善し得、圧縮の間の再構成を助けるグリダント（ｇｌｉｄａｎｔ）を添加し得る。グリダントは、デンプン、タルク、発熱性シリカ、およびケイアルミン酸水和物を含み得る。
【００５９】
水性の環境への治療剤の溶解を助けるために、表面活性剤を湿潤剤として添加し得る。表面活性剤は、アニオン性界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、およびスルホン酸ジオクチルナトリウム）を含み得る。カチオン性界面活性剤が使用され得、これは、塩化ベンザルコニウム、または塩化ベンゼトニウムを含み得る。界面活性剤のような処方物中に含まれ得る潜在的非イオン性界面活性剤の列挙は、ラウロマクロゴール４００、ポリオキシ４０ステアリン酸、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０ならびに６０、モノステアリン酸グリセリン、ポリソルベート４０、６０、６５、ならびに８０、糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、およびカルボキシメチルセルロースである。これらの表面活性剤は、タンパク質または誘導体の処方物中に、単独または異なる割合での混合物のいずれかで存在し得る。タンパク質（または誘導体）の取りこみを潜在的に増大する添加物は、例えば、脂肪酸、オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸である。
【００６０】
（肺送達）
本発明のタンパク質（またはこれの誘導体）の肺送達も本明細書中において考慮される。タンパク質（または誘導体）は、吸入され、肺上皮内層を通って、血流へ横断し、哺乳動物の肺へ送達される。このことの他の報告は、Ａｄｊｅｉら，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７（６）：５６５−５６９（１９９０）；Ａｄｊｅｉら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，６３：１３５−１４４（１９９０）（酢酸ロイプロリド）；Ｂｒａｑｕｅｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，１３（ｓｕｐｐｌ．５）：１４３−１４６（１９８９）（エンドセリン−１）；Ｈｕｂｂａｒｄら，Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｉｎｔｅｒｎａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３（３）：２０６−２１２（１９８９）（α１−抗トリプシン）；Ｓｍｉｔｈら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８４：１１４５−１１４６（１９８９）（α１−プロテイナーゼ）　；Ｏｓｗｅｉｎら，「Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｌＩ，Ｋｅｙｓｔｏｎｅ，Ｃｏｌｏ．，（１９９０年３月）（組換えヒト成長ホルモン）；Ｄｅｂｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：３４８２−３４８８（１９８８）（インターフェロン−γおよび腫瘍壊死因子α）、およびＰｌａｔｚら，米国特許第５，２８４，６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）。本発明の実施における使用のための治療製品の肺送達のために設計される広範な機械的装置（噴霧器、定量吸入器、および粉末吸入器（これら全ては、当業者によく知られている）を含むが、これらに限定されない）が考慮される。
【００６１】
本発明の実施に適切な市販の装置のいくつかの特定の例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．製）；Ａｃｏｒｎ　ＩＩ噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ，Ｃｏｌｏ．製）、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量吸入器（Ｇｌａｘｏ　Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｔｒｉａｎｇｌｅ　Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｃ．製）；Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ　Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．製）である。全てのこのような装置は、タンパク質（または誘導体）の調剤のための適切な処方物の使用を必要とする。代表的に、各処方物は、用いられる装置の型に特異的であり、治療に有用な希釈材、アジュバント、および／またはキャリアの使用に加えて、適切な噴霧剤材料の使用を含み得る。また、リポソーム、マイクロカプセル、もしくはミクロスフェア、包含複合体、または他の型のキャリアの使用が考慮される。化学修飾されたタンパク質はまた、化学修飾の型または使用される装置の型に依存して異なる処方物に調製され得る。
【００６２】
噴霧器（ネブライザー）（ジェットまたは超音波のいずれか）の使用に適切な処方物は、代表的に水中に溶液１ｍＬあたり約０．１〜２５ｍｇの生物学的に活性なタンパク質の溶液濃度で溶解したタンパク質（または誘導体）を含む。処方物はまた、緩衝液および単糖（例えば、タンパク質安定化および浸透圧の制御のため）を含む。噴霧剤処方物はまた、界面活性剤を含み、エアロゾルを形成における溶液の微粒化によって起きる、表面タンパク質の定量誘導凝集を減少または予防し得る。
【００６３】
定量吸入器装置を用いて使用する処方物は一般に、界面活性剤に助けを借りて噴霧剤中に懸濁されたタンパク質（または誘導体）を含む、微細に分けられた粉末を含む。噴霧剤は、この目的のために用いられる任意の従来の材料であり、例えば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素（トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、およびジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２−テトラクロルエタン）、またはこれらの組み合せを含む。適切な界面活性剤は、ソルビタントリオレートおよび豆レシチンを含む。オレイン酸はまた、界面活性剤として有用であり得る。
【００６４】
粉末吸入装置から調剤するための処方物は、タンパク質（または誘導体）を含む、微細に分けられた乾燥粉末を含み、またバルキング剤（例えば、乳糖、ソルビトール、ショ糖、またはマンニトールを、装置からの粉末の撒布を容易にする量（例えば、処方物の５０〜９０重量％）において含み得る。タンパク質（または誘導体）は、肺の末端に最も効率よく送達するために、平均粒子径が１０ｍｕ　ｍ（すなわちμｍ）未満（最も好ましくは、０．５〜５ｍｕ　ｍ）である特定の形態において最も有利に調製されるべきである。
【００６５】
（投薬）
全ての上記分子について、さらなる研究が考慮されるにつれて、種々の患者における種々の状況の処置のための適切な投与レベルについての情報が明らかにされ、通常の当業者は、レシピエントの治療的背景、年齢、および全身の健康を考慮して、適した投薬を確立し得る。一般に、注射または輸液について、投薬は、０．０１ｍｕ　ｇの生物学的に活性なタンパク質／ｋｇ体重（タンパク質質量のみを計算し、化学修飾を考慮しない）と１０ｍｇ／ｋｇ（同様に基づく）の間である。使用されるタンパク質もしくは誘導体の循環中半減期、ポリペプチドがボーラス用量によって送達されれるのかまたは連続した注入によって送達されれるのか、および使用される処方物に依存して、投与スケジュールは、変化し得る。
【００６６】
（他の化合物を用いた投与）
新血管形成を改変することに関する治療について、本発明のＴＷＥＡＫアゴニスト（または誘導体）および血管新生因子を、新血管形成を改変する必要のある他の臨床的合併症の処置のために使用される、１つ以上の薬学的組成物（例えば、癌の処置に使用される組成物（例えば、化学療法剤）、悪疫質、高血圧、高コレステロール、および他の悪条件の処置に使用される組成物）と組み合せて投与し得る。投与は、同時にされ得るか、順次行われ得る。
【００６７】
（核酸に基づく治療的処置）
ＴＷＥＡＫアゴニストをコードする核酸配列は、ヒト腫瘍または血管壁細胞中に誘導され、遺伝子治療を展開する。
【００６８】
１つの実施形態において、ＴＷＥＡＫアゴニストをコードする核酸配列は、ウイルスベクターにおいて、インビボ誘導される。このようなベクターは、弱毒化されたＤＮＡウイルスまたは欠損ＤＮＡウイルス（例えば、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）、乳頭腫ウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に限定されない）を含む。ウイルス遺伝子の全体またはほぼ全体が欠損している欠損ＤＮＡウイルスが好ましい。欠損ＤＮＡウイルスベクターは、細胞導入後に、感染性でない。欠損ＤＮＡウイルスの使用は、特定の、局在領域における細胞への投与を可能にし、ベクターが他の細胞に感染し得ることを考慮する必要はない。従って、脂肪組織は、特異的に標的化され得る。特定のベクターの例は、欠損ヘルペスウイルス１（ＨＳＶ１）ベクター（Ｋａｐｌｉｔｔら，　Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２：３２０−３３０（１９９１））、弱毒化されたアデノウイルスベクター（例えば、Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９０：６２６−６３０（１９９２）に記載されるベクター）、および欠損アデノ随伴ウイルスベクター（Ｓａｍｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６１：３０９６−３１０１（１９８７）；Ｓａｍｕｌｓｋｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２−３８２８（１９８９））を含むが、これらに限定されない。別の実施形態において、核酸は、レトロウイルスベクター（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎら，米国特許第５，３９９，３４６号；Ｍａｎｎら，Ｃｅｌｌ，３３：１５３（１９８３）；Ｔｅｍｉｎら，米国特許第４，６５０，７６４号；Ｔｅｍｉｎら，米国特許第４，９８０，２８９号；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１１２０（１９８８）；Ｔｅｍｉｎら，米国特許第５，１２４，２６３号；Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙらによる国際公開特許出願ＷＯ９５／０７３５８（１９９５年３月１６日公開）；およびＫｕｏら，Ｂｌｏｏｄ，８２：８４５（１９９３）に記載される）に導入され得る。あるいは、ベクターは、リポフェクションによってインビボ導入され得る。過去１０年間、インビトロでの核酸の被包およびトランスフェクションのためのリポソームの使用が増えてきている。リポソーム媒介トランスフェクションに含まれる困難性および危険性を制限するよう設計された合成カチオン性脂質を用いて、マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションのためのリポソームを調製し得る（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７（１９８７）；Ｍａｃｋｅｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８０２７−８０３１（１９８８）を参照）。カチオン性脂質の使用は、陰性に荷電した核酸の被包を促進し得、また陰性に荷電した細胞膜との融合を促進する（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７：３８７−３８８（１９８９））。外因性遺伝子を特定の器官にインビボで導入するためのリポフェクションの使用は、特定の実用上の利点を有する。リポソームの特定の細胞への分子標的化は、１つの領域の利点を示す。特定の細胞型へのトランスフェクションを指向することは、細胞不均一性を有する組織（例えば、膵臓、肝臓、腎臓、および脳）において、特に有利であることが明らかである。脂質は、標的化の目的のために、化学的に他の分子に結合され得る（Ｍａｃｋｅｙら，１９８８，前述）。標的化ペプチド（例えば、ホルモンまたは神経伝達物質）、およびタンパク質（例えば、抗体）、または非ペプチド分子は、化学的にリポソームに結合され得る。
【００６９】
ベクターを裸のＤＮＡプラスミドとして、インビボで導入することもまた可能である。遺伝子治療のための裸のＤＮＡベクターは、当該分野において公知の方法（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用）によって、所望の細胞中に導入され得る（例えば、Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：９６３−９６７（１９９２）；Ｗｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１４６２１−１４６２４（１９８８）；Ｈａｒｔｍｕｔら，カナダ特許出願第２，０１２，３１１号（１９９０年３月１５日に出願）を参照のこと）。
【００７０】
カテーテルまたは他の装置と組み合せて、ベクターをインビボで導入することも可能である。Ｖａｌｅら，１９９９年；Ｋｏｒｎｏｗｓｋｉら，２０００年を参照のこと。
【００７１】
（実施例）
以下の実施例は、本発明の局面を例示するが、限定として解釈されるべきでない。本実施例において使用される記号および約束事は、現代の医学的および化学的文献において使用されるものと一致する。
【００７２】
（実験手順）
（細胞）ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＣｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ＣＳ−Ｃ）（Ｋｉｒｋｌａｎｄ，ＷＡ）またはＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手し、そしてヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）、ヒト肺微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）、ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＨＭＶＥＣ−Ｄ）をＣｌｏｎｅｔｉｃｓから入手した。ＨＵＶＥＣを慣用的にＣＳ−Ｃ培地中において継代し、７回継代するまで実験に用いた。他の初代細胞を、慣用的にＭｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ−２（ＥＧＭ２−ＭＶ）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）において継代した。２％胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＥＣ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＢＭ）（「基礎培地」として規定される）、ならびに２％ＦＢＳおよび増殖補助因子を含むＥＢＭ（完全培地として規定される）を増殖、遊走、および免疫蛍光染色実験に用いた。ＥＣ　Ｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　２（ＥＢＭ−２）および増殖補助因子を特定化のための毛細血管形成アッセイにおいて用いた。
【００７３】
（試薬および抗体）組換えヒトｂＦＧＦを増殖補助因子（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）として入手し、ｂＦＧＦはまた、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）およびＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手した。アネキシンＶ−ＦＩＴＣをＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）をＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手し、ウサギ抗ヒトＦｌｋ−１抗体およびウサギ抗Ｆｌｔ−１抗体を、Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｉｎｃ．（Ｆｌａｎｄｅｒｓ，ＮＪ）から入手し、マウス抗Ｆｌｇモノクローナル抗体（ｍＡｂ）をＣｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から入手し、マウス抗ヒトβ３、マウス抗ヒトβ１（クローンＬＩＡ　１／２）、およびラット抗ヒトαＶｍＡｂをＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈ（Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）から入手し、マウス抗ヒトα５をＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手し、マウス抗ヒトα１（クローンＡＪＨ１０）をＢｉｏｇｅｎから入手した（Ｇｏｔｗａｌｓ　Ｐ．Ｊ，ら，１９９９年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８：８２８０−８２８８）。
【００７４】
フィコエリトリン（ＰＥ）−結合体化ロバ抗ウサギＩｇＧ、ヤギ抗マウスＩｇＧ、およびロバ抗ラットＩｇＧをＪａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ　Ｉｎｃ．（Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｏｖｅ，ＰＡ）から入手し、ビオチン結合体化抗フラッグをＥａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）から入手し、そしてＲＰＥ−ストレプトアビジンをＳｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から入手した。可溶性ＣＤ４０ＬをＢｉｏｇｅｎにおいて以前に記載したように調製された（Ｋａｒｐｕｓａｓ，Ｍ．ら，１９９５．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　３：１４２６−ｘｘｘ）。
【００７５】
ＴＷＥＡＫ特異的ｍＡｂであるＢＥ．Ｂ３およびＡＢ．Ｄ３を、可溶性ヒトＴＷＥＡＫタンパク質で免疫することにより、そして標準的ハイブリドーマ生成手順によりアルメニアハムスターにおいて生成した。ＡＢ．Ｄ３がヒトおよびマウスＴＷＥＡＫに結合する能力、ならびにＢＥ．Ｂ３がヒトＴＷＥＡＫに結合する能力を、９６ウェルマイクロタイタープレートに固定化した組換え可溶性ＴＷＥＡＫタンパク質を用いてＥＬＩＳＡアッセイにおいて決定した。ＡＢ．Ｄ３のブロッキング能力を、ＦＡＣＳ分析において、このｍＡｂ（ＢＥ．Ｂ３ではない）が、ＨＴ２９細胞への可溶性ＦＬＡＧタグ化ヒトＴＷＥＡＫ結合を阻害する能力により決定した。ＢＥ．Ｂ３を製造業者のプロトコル（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）に従ってＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ　Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎキットを用いてビオチン化し、そして調製した。ハムスターコントロールＩｇ（クローンＨａ４／８−３．１）をアメリカンタイプカルチャーコレクションから得て、ｍＡｂを、プロテインＡ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により培養上清から精製した。
組換え可溶性ヒトＴＷＥＡＫタンパク質−ｍｙｃタグ化ヒトＴＷＥＡＫについての可溶性発現構築物を、以前に記載したように構築した（Ｃｈｉｃｈｅｐｏｒｔｉｃｈｅ，Ｙ．ら１９９７．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３２４０１−３２４１０）。Ｆｌａｇタグ化および非タグ化形態もまた作製した。これらの可溶性形態のＴＷＥＡＫを、酵母Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ株ＧＳ　１１５において、標準的方法を用いて発現させた。
【００７６】
増殖アッセイ−ＨＵＶＥＣを、９６ウェルマイクロタイタープレートにおいてコンフルエント未満に（４０００細胞／ウェル）プレートし、そして製造業者の増殖補充物を添加することなくＣＳ−Ｃ培地中で一晩増殖させた。培地を、上記で規定されるように完全培地または基礎培地と交換した。細胞を、ＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ増殖補充物（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）の１／５００−１／１０００希釈物を用いたｂＦＧＦ、もしくは１ｎｇ／ｍｌ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ），ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）またはこれらの因子の組み合わせありまたはなしの基礎培地中で培養した。示された場合、１０μｇ／ｍｌの抗ＴＷＥＡＫ　ｍＡｂであるＡＢ．Ｄ３、ＢＥ．Ｂ３またはハムスターコントロールＩｇ　Ｈａ４／８もまた添加した。細胞を、５％ＣＯ２とともに３７℃で３日間インキュベートし、そして増殖を、３Ｈ−チミジンで培養の最後の１０時間にわたりパルスすることにより測定した。細胞に結合した放射活性を、ＢｅｔａｐｌａｔｅＴＭ（ＥＧ＆Ｇ　Ｗａｌｌａｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて測定した。
【００７７】
アポトーシスの分析−ＨＵＶＥＣを、１．２×１０５細胞／ウェルの密度で６ウェルプレートに播種し、製造業者の増殖補充物なしでＣＳ−Ｃ培地中で一晩インキュベートした。培地を、完全培地、あるいはＴＷＥＡＫ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）もしくはこれらの因子の組み合わせありまたはなしの基礎培地と交換し、細胞を２４時間培養した。細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ディスパーゼ（ＣＳ−Ｃ）と３７℃で１５分間インキュベートし、続いて５ｍＭ　ＥＤＴＡおよび０．１％　ＢＳＡを含むＰＢＳを３７℃で１５分間再配置することにより剥離した。ＰＢＳでさらに洗浄した後、細胞を、製造業者（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に従って、ＦＩＴＣ−アネキシン−Ｖおよび５μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムで染色した。蛍光を、ＦＡＣＳｔａｒＰＬＵＳ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて時間内に分析した。
【００７８】
内皮細胞創傷修復アッセイ−標準的な創傷修復アッセイを、以前に記載のように（Ｂｕｓｓｏｌｉｎｏ　Ｆ．，ｅｔ　ａｌ，１９９１．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８７：９８６−９９１）用いた。簡潔には、コンフルエントな単層のＨＵＶＥＣを、２ｍｍグリッド付きの３５×１０ｍｍ細胞培養ディッシュ（Ｎａｌｇｅ　Ｎｕｎｃ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ，ＩＬ）のＣＳ−Ｓ培地中で増殖させた。この単層を、このディッシュの直径にわたり、１ｍｍチップで２回直角に引っ掻く（ｓｔｒｏｋｅ）ことにより傷をつけた（Ｍｏｒａｌｅｓ　Ｄ．Ｅ．ら，１９９５．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９１：７５５−７６３）。押しのけた細胞を吸引し、プレートをＰＢＳでリンスした。細胞を完全培地、あるいはＴＷＥＡＫ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１／１０００もしくは１ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）もしくはこれらの組み合わせありまたはなしの新鮮な基礎培地中で培養し、５％ＣＯ２とともに３７℃で１８時間インキュベートした。この時点で、プレートを１％パラホルムアルデヒドで固定し、Ｈａｒｒｉｓ　Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色した。創傷修復を、間隙が移動細胞により覆い隠されたグリッドの数を肉眼で計数することによって定量した。この数を創傷を配置したグリッドの総数で割り、結果を平均％創傷修復＋／−ＳＥＭとしてあらわした。
【００７９】
免疫蛍光染色−ＨＵＶＥＣを、ＴＷＥＡＫ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）または両因子ありまたはなしの基礎培地中で２４時間培養した。細胞を上記のように剥離し、０．１％ウシ血清アルブミンおよび０．０２％　ＮａＮ３を含有する２００μｌのＰＢＳ中の１次抗体１０μｇ／ｍｌを用いて４℃で２０分間染色した。同じ緩衝液で洗浄した後、ＰＥ結合体化検出抗体を、製造業者により特定された濃度で、さらに１５分間４℃で添加した。細胞をｆｌａｇまたはｍｙｃのいずれかでタグ化したＴＷＥＡＫとともにインキュベートすることによりＴＷＥＡＫ結合について分析した。ビオチン化したマウス抗ｆｌａｇ抗体またはビオチン化ＢＥ．Ｂ３のいずれか、およびストレプトアビジン−ＰＥを用いて結合を検出した。コールド競合を非タグ化ＴＷＥＡＫで行い、ブロッキングをＡＢ．Ｄ３　ｍＡｂで行った。
【００８０】
毛細管形成アッセイ−ＥＣによる毛細管形成を、以前に記載された方法（Ｍａｃｈ，Ｆ．ら，１９９９．Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５４：２２９−２３９）に基づいて、３次元フィブリンマトリクスゲルアッセイを用いて分析した。簡潔には、４ｍｇ／ｍｌのプラスミノゲン非含有ヒトフィブリノゲン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、ヘパリンおよびポリミキシンＢ（ともに１μｇ／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）ならびに製造業者の補充物の全て（ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを除く）を含有する無血清ＥＢＭ−２培地中に溶解した。フィブリン溶液を濾過滅菌し、フィブリンマトリクスを、２４ウェルプレートにおいてトロンビン（２０〜５０ミリユニット／ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ）を添加し、３００μｌ／ウェルで分配することにより調製した。次いで、ゲル表面に適切な濃度のＥＣ（ＨＵＶＥＣおよびＨＰＡＥＣについては４×１０４細胞／ｃｍ２、ならびにＨＭＶＥＣ−ＬおよびＨＭＶＥＣ−Ｄについては８×１０４／ｃｍ２）を播種し、上記のようにＥＢＭ−２倍地を重層し、特定されたように、ＴＷＥＡＫ、ｂＦＧＦ、ｓＣＤ４０Ｌまたはこれらの因子の組み合わせの存在下および非存在下で５％ＦＢＳを重層した。培養して７２時間後、ゲル表面の位相差顕微鏡写真を撮影した。ゲルを最初のウェルから新しいウェルに移し、１０％エタノールで１０分間、次いで４％パラホルムアルデヒドで固定した。ゲルを分析のために断片で切片にし、写真を撮った。
【００８１】
（実施例１：ＴＷＥＡＫは、ｂＦＧＦ依存性増殖を増強する）
ＴＷＥＡＫのＥＣ機能に対する効果を、ＴＷＥＡＫ単独および別の血管形成性増殖因子と組み合わせて処理した培養物においてＥＣ増殖を試験することにより調査した。ヒト臍静脈ＥＣ（ＨＵＶＥＣ）を、ｂＦＧＦの存在下および非存在下で基礎培地中で培養した（図１）。ＴＷＥＡＫの添加により、有意なＥＣの増殖は誘導されなかった。対照的に、ＴＷＥＡＫおよび最適濃度のｂＦＧＦとともに培養した細胞は、ｂＦＧＦ単独の存在下で培養した細胞と比較して、有意に増強した増殖応答が示された。達成された増殖の程度は、完全培地で培養したＥＣの程度に匹敵するか、またはこれより大きかった。１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを用いて、同様の結果が認められた。ＴＷＥＡＫとｂＦＧＦの相乗的活性は、抗ＴＷＥＡＫ　ｍＡｂであるＡＢ．Ｄ３により完全に阻害され、このことは、ＴＷＥＡＫの効果が特異的であるのに対して、抗ＴＷＥＡＫ　ｍＡｂであるＢＥ．Ｂ３または無関係のコントロールＩｇによる阻害がなかったことを示唆する。さらに、組換え可溶性ＡＰＲＩＬ（別のＴＮＦリガンド）では、増強は認められなかった（データは示さず）。図１に示した結果についての実験条件を、ここで詳細に記載する。ＨＵＶＥＣを、完全培地または基礎培地中で培養した。ＴＷＥＡＫ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１／５００希釈）またはこれらの因子の組み合わせを示されるように基礎培地に３日間添加し、３Ｈ−チミジン取り込みにより増殖を測定した。図１において、データは、３連のウェルの平均値＋／−ＳＤを示す。これらの結果は、４つの独立した実験の代表値である。ここで、ｂＦＧＦ＋ＴＷＥＡＫ処理培養物での増殖は、ｂＦＧＦ単独、ＴＷＥＡＫ単独および基礎培地で培養したものとは、有意に異なり（Ｐ値＜０．０５）、ＴＷＥＡＫありまたはなしの基礎培地での培養物の間に有意差はなかった。増殖因子に加えて、ブロッキング抗ＴＷＥＡＫ　ｍＡｂであるＡＢ．Ｄ３、非ブロッキング抗ＴＷＥＡＫ　ｍＡｂであるＢＥ．Ｂ３、および無関係のハムスターコントロールＩｇ　Ｈａ４／８（１０μｇ／ｍｌ）を、示された場合に添加した。結果は、２つの独立した実験のうちの１つの代表値である。
【００８２】
（実施例２：ｂＦＧＦとＴＷＥＡＫによるＥＣ増殖の増強は、細胞死の減少に起因しない）
ＴＷＥＡＫ／ｂＦＧＦ組み合わせによるＨＵＶＥＣ増殖の見掛けの増強は、細胞分裂の増加および細胞死の減少に起因し得る。この機構を扱うために、ＴＷＥＡＫ、ｂＦＧＦもしくは両方ありまたはなしの基礎培地中で培養したＨＵＶＥＣを分析して、アポトーシス細胞の頻度を決定した。アネキシンＶ染色を用いて、アポトーシスを受ける細胞を検出し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）色素排除を用いて生細胞を検出した。ＴＷＥＡＫおよびｂＦＧＦの組み合わせで処理した培養物は、ｂＦＧＦ単独で処理した培養物のものと匹敵する生細胞、アポトーシス細胞および死細胞の割合を示した。これらの割合を、図２において、それぞれ四半分３、４および２に示す。２つのさらなる実験において同様の結果を得、ここ２倍体未満のＤＮＡ含有量を有する細胞を定量した（ｂＦＧＦ中で１１％およびｂＦＧＦ／ＴＷＥＡＫ処理した培養物において１１％）。従って、ＴＷＥＡＫによるｂＦＧＦ依存性増殖の増強は、細胞死の減少に起因しない。にもかかわらず、ＴＷＥＡＫ単独により細胞死の頻度が２２％から１４％にまで減少したことは注目すべきである。このパターンはまた、２つの独立した実験において認められ、ここで２倍体未満のＤＮＡを有する細胞の割合は、ＴＷＥＡＫの存在下および非存在下で、それぞれ平均１８＋／−１％および９＋／−０％であった。
【００８３】
図２における結果についての実験条件を、ここで詳細に記載する。ＴＷＥＡＫ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）または両サイトカインありまたはなしの基礎培地中で２４時間培養したＨＵＶＥＣを、アポトーシス細胞についてはＦＩＴＣ−アネキシン−Ｖ（ｘ軸）および生存性についてはＰＩ色素排除（ｙ軸）で染色した。図２は、それぞれ四半分３、４および２において、生細胞、アポトーシス細胞または死細胞の割合を示す。
【００８４】
（実施例３：ＴＷＥＡＫはｂＦＧＦ依存性ＨＵＶＥＣ移動を増強する）
ＴＷＥＡＫがＥＣ移動をもたらす能力を、他の血管形成因子の存在下および非存在下で評価した。コンフルエントなＨＵＶＥＣ単層に傷を付け、ＥＣ移動を、創傷修復の程度を決定することにより、最初の１８時間内にモニターした。しかし、基礎培地へのＴＷＥＡＫまたはｂＦＧＦの添加により、低レベルの創傷修復が示されたが、これは、基礎培地単独で認められたものより有意に大きくはなかった。対照的に、ＴＷＥＡＫおよびｂＦＧＦの両方で処理した培養物は、基礎培地およびいずれかの因子単独を含有する培地での培養物より、有意に大きな程度まで修復され、完全培地におけるものと同様であった。ＨＵＶＥＣを培養物から回収し、細胞数の何らかの増加が実験過程で生じるか否かを決定するために、計数した。全ての処理群において、細胞回復は比較可能であり（データは示さず）、このことは、ＴＷＥＡＫおよびｂＦＧＦの組み合わせ効果が細胞移動のレベルにあることを支持する。
【００８５】
図３に示した結果についての実験条件を、ここで詳細に記載する。ＴＷＥＡＫ（２００ｎｇ／ｍｌ）、ｂＦＧＦ（１ｎｇ／ｍｌもしくは１／１０００希釈）、およびこれらの因子の組み合わせで処理したコンフルエントなＨＵＶＥＣ単層に傷を付け、培養して１８時間後に修復を測定した。図３は、４つの実験の平均＋／−ＳＥＭを示し、ｂＦＧＦ＋ＴＷＥＡＫにより誘導された修復は、いずれか単独または基礎培地により誘導されたものとは有意に異なっている（Ｐ値＜０．０５）。
【００８６】
（実施例４：ＴＷＥＡＫの効果は、増殖因子レセプターまたはインテグリンの調節によって媒介されない）
インテグリン（特に、αｖβ３、α１β１およびα２β１）は、細胞外マトリクスを通過する細胞移動を容易にし、そしてまた細胞生存および血管形成因子に対する応答に必要な細胞内シグナル伝達を調節する（Ｅｌｉｃｅｉｒｉ，Ｂ．　ａｎｄ　Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ．Ａ．，１９９９．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：１２２７−１２３０；Ｓｅｎｇｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら，１９９７．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：１３６１２−１３６１７）。従って、本発明者らは、ＴＷＥＡＫがＥＣ上で発現される増殖因子レセプターまたはインテグリンを調節するか否かを決定することを目的とした。ＶＥＧＦレセプターＦｌｋ−１およびＦｌｔ−１ならびにｂＦＧＦレセプターＦｌｇは、基礎培地で培養したＨＵＶＥＣ上で非常に低レベルで発現した。ポジティブコントロールとして、これらのレセプター特異的ｍＡｂは、ヒト皮膚毛細管ＥＶ（ＨＭＶＥＣ−Ｄ）上で強い染色を示した。Ｌｙｎｃｈら（１１）による研究と一致して、本発明者らは、ＴＷＥＡＫ処理培養物におけるＶＥＧＦレセプターＦｌｋ−１およびＦｌｔ−１の発現の変化も見出さず、ｂＦＧＦもしくはＴＷＥＡＫ／ｂＦＧＦ組み合わせで処理した培養物においてもＶＥＧＦレセプター発現における変化は見られなかった。さらに、本発明者らは、ＴＷＥＡＫ処理が、ｂＦＧＦレセプターＦｌｇまたはインテグリン（αｖ、α１、α５、β１およびβ３）のレベルを変化させないことを見出した。
【００８７】
（実施例５：ＴＷＥＡＫは、ＥＣ形態形成を誘導する）
血管形成プロセスにおける重要な事象は、毛細管にＥＣを侵襲するという構成である。ＴＷＥＡＫのこの形態形成工程に対する効果を、ｂＦＧＦの存在下および非存在下で、３次元フィブリンゲルの表面に播種したＥＣで測定した。本発明者らは、ＴＷＥＡＫがＥＣ単層に対して効果がないが、最適濃度のｂＦＧＦが細胞侵襲およびＥＣの索（ｃｏｒｄ）への組織化を促進することを見出した。ＴＷＥＡＫのｂＦＧＦへの添加は、ＥＣ単層において明らかな形態形成変化を誘導した。同様の結果がいくつかの異なるＥＣ型で認められ、これらの型としては、ＨＵＶＥＣ、ヒト肺動脈ＥＣ（ＨＰＡＥＣ）、ヒト肺毛細管ＥＣ（ＨＭＶＥＣ−Ｌ）およびＨＭＶＥＣ−Ｄが挙げられる。さらにこれらのゲルの断面分析により、ＴＷＥＡＫのｂＦＧＦへの添加が、ＥＣの管腔を有する管への侵襲の構造組織化を誘導することが明らかになった。別のＴＮＦメンバーであるＣＤ４０Ｌは、単独でも、ｂＦＧＦとの組み合わせにおいても効果を有さなかった。従って、ＴＷＥＡＫは、ｂＦＧＦと相乗効果を発揮して、毛細管管腔の形態形成を誘導する。この結果を、図４に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ｂＦＧＦ依存性ＨＵＶＥＣ増殖に対するＴＷＥＡＫの効果を示す。
【図２】
図２は、ＨＵＶＥＣ死に対するＴＷＥＡＫの効果を示す。
【図３】
図３は、ｂＦＧＦ依存性ＨＵＶＥＣ遊走に対するＴＷＥＡＫの効果を示す。
【図４】
図４は、毛細管形成に対するＴＷＥＡＫおよびｂＦＧＦの相乗作用効果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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