(57)【要約】血管新生を調節するために有用な端部切除されたトリプトファンｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドを含む組成物、ならびにそのようなｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドをコードする核酸を述べる。そのような組成物を作製し、使用する方法も開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロスマンフォールドヌクレオチド結合ドメインを備え、端部切除されたトリプトファンｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドを含む、血管内皮細胞機能を調節することができる単離ポリペプチド。
【請求項２】
端部切除されたポリペプチドが少なくとも４６キロダルトンの大きさを有する、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
端部切除されたポリペプチドがアミノ末端の端部切除を有する、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
ポリペプチドが血管新生性である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
ポリペプチドが血管新生抑制性である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
ポリペプチドが、
配列番号９のアミノ酸残基４８−４７１を必須成分とするポリペプチド；
配列番号９のアミノ酸残基７１−４７１を必須成分とするポリペプチド；
多形核白血球エラスターゼによる配列番号９のポリペプチドの開裂によって生じる約４７ｋＤ分子量のポリペプチド；及び
アミノ酸配列−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−を含むそれらの断片
から成る群の成員である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
端部切除されたｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドが哺乳類のものである、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８】
端部切除されたｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドがヒトのものである、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
（ａ）配列番号９のポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号９のポリヌクレオチドにハイブリド形成しうるポリヌクレオチド；
（ｃ）請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリド形成しうるポリヌクレオチド；
（ｅ）請求項６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（ｆ）請求項６のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリド形成しうるポリヌクレオチド；
（ｇ）配列番号９のポリペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチド；及び
（ｈ）配列番号９のポリペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチドにハイブリド形成しうるポリヌクレオチド
から成る群より選択される配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む単離核酸分子。
【請求項１０】
ヌクレオチド配列が５’末端又は３’末端のいずれかからの連続的なヌクレオチド欠失を含む、請求項９に記載の単離核酸分子。
【請求項１１】
請求項９の単離核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項１２】
請求項９の単離核酸分子を宿主細胞に導入することを含む、組換え宿主細胞を作製する方法。
【請求項１３】
請求項１２の方法によって作製される組換え宿主細胞。
【請求項１４】
請求項９の核酸分子を含むベクター配列を備える、請求項１３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１の単離ポリペプチドに特異的に結合する単離抗体。
【請求項１６】
請求項１の単離ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞。
【請求項１７】
単離ポリペプチドを作製する方法であって、
（ａ）該ポリペプチドが発現される請求項１６の組換え宿主細胞を培養すること、および
（ｂ）発現されたポリペプチドを細胞培養から単離すること
を含む方法。
【請求項１８】
トリプトファンｔＲＮＡシンテターゼをプロテアーゼで処理することを含む、請求項１のポリペプチドを生成する方法。
【請求項１９】
プロテアーゼが多形核白血球エラスターゼである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ケモカイン活性を有する、端部切除された哺乳類トリプトファンｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドである単離ポリペプチド。
【請求項２１】
端部切除されたポリペプチドがアミノ末端の端部切除を有する、請求項２０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２２】
ポリペプチドが血管新生作用を有する、請求項２０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２３】
血管新生作用が対照レベルの少なくとも２倍である、請求項２２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２４】
ポリペプチドが血管新生抑制作用を持つ、請求項２０に記載の単離ポリペプチド。
【請求項２５】
ポリペプチドが血管新生作用の少なくとも１０％を抑制する、請求項２４に記載の血管新生抑制作用を持つ単離ポリペプチド。
【請求項２６】
ポリペプチドが血管新生作用の少なくとも９０％を抑制する、請求項２４に記載の血管新生抑制作用を持つ単離ポリペプチド。
【請求項２７】
請求項２０のポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項２８】
請求項２７の単離核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項２９】
請求項２７の単離核酸分子を含む組換え宿主細胞。
【請求項３０】
請求項２０の単離ポリペプチドに特異的に結合する単離抗体。
【請求項３１】
請求項２０の単離ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞。
【請求項３２】
単離ポリペプチドを作製する方法であって、
（ａ）該ポリペプチドが発現される請求項３１の組換え宿主細胞を培養すること、および
（ｂ）発現されたポリペプチドを細胞培養から単離すること
を含む方法。
【請求項３３】
トリプトファンｔＲＮＡシンテターゼをプロテアーゼで処理することを含む、請求項２０のポリペプチドを生成するための方法。
【請求項３４】
経皮投与用、経粘膜投与用、経腸投与用又は非経口的投与用の医薬組成物の調製のための、請求項１に記載の単離ポリペプチドの使用。
【請求項３５】
請求項１の単離ポリペプチドと製薬上適切な賦形剤を組み合わせる段階を含む、経皮投与、経粘膜投与、経腸投与又は非経口的投与に適した医薬組成物を調製する方法。
【請求項３６】
請求項１の単離ポリペプチドと製薬上適切な賦形剤を含む組成物。
【請求項３７】
請求項６の単離ポリペプチドと製薬上適切な賦形剤を含む組成物。
【請求項３８】
請求項２０の単離ポリペプチドと製薬上適切な賦形剤を含む組成物。
【請求項３９】
血管新生の抑制に有効な量の請求項３７の組成物を哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類において血管新生を抑制する方法。
【請求項４０】
哺乳類がヒトである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
血管新生の抑制に有効な量の請求項３７の組成物を哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類において血管新生の低下から恩恵を受ける状態を治療する方法。
【請求項４２】
哺乳類がヒトである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
血管新生の抑制に有効な量の請求項３７の組成物を哺乳類に投与する段階を含む、哺乳類において固体腫瘍を治療する方法。
【請求項４４】
哺乳類がヒトである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
血管新生の抑制に有効な量の請求項３７の組成物を投与する段階を含む、哺乳類において腫瘍転移を抑制する方法。
【請求項４６】
哺乳類がヒトである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
（ａ）請求項９のポリヌクレオチドにおける突然変異の存在又は不在を判定すること、および
（ｂ）判定した該突然変異の存在又は不在に基づいて病的状態又は病的状態への感受性を診断すること
を含む、対象者において病的状態又は病的状態への感受性を診断する方法。
【請求項４８】
（ａ）生物学的試料において請求項１のポリペプチドの発現の存在又は発現量を測定すること
（ｂ）測定したポリペプチドの発現の存在又は発現量に基づいて病的状態又は病的状態への感受性を診断すること
を含む、対象者において病的状態又は病的状態への感受性を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（政府の権利）
本発明は、合衆国政府、国立衛生研究所、助成ＧＭ２３５６２からの政府援助を得て行われたものであり、合衆国政府は本発明の一部の権利を所有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、端部切除されたｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドを含む組成物、ならびにそのような端部切除されたｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドをコードする核酸に関する。そのような組成物を作製し、使用する方法も開示する。
【０００３】
（発明の背景）
ｔＲＮＡ分子のアミノアシル化を触媒するアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼは、翻訳の過程において遺伝情報を解読するために必須である、起源の古い蛋白質である。高等真核生物では、９個のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが少なくとも３個の他のポリペプチドと結びついて超分子多酵素複合体を形成する（Ｍｉｒａｎｄｅら、１９８５、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４７：２８１−８９）。真核生物ｔＲＮＡシンテターゼは、原核生物のｔＲＮＡシンテターゼ相対物と緊密に関連するコア酵素、及びコア酵素のアミノ末端又はカルボキシル末端に付属する付加ドメインから成る（Ｍｉｒａｎｄｅ，１９９１，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０：９５−１４２）。ヒトチロシンｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｙｒＲＳ）は、例えば、原核生物及び下等真核生物ＴｙｒＲＳ分子の一部ではないカルボキシル末端ドメインを持つ（図１）（Ｒｈｏら、１９９８、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１１２６７−７３）。また、ウシ及びウサギのＴｙｒＲＳ分子がエクストラドメインを持つことも示唆されてきた（Ｋｌｅｅｍａｎら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４４２０−２５）。
【０００４】
ほとんどの場合、付属ドメインは多酵素複合体の構築に寄与すると思われる（Ｍｉｒａｎｄｅ、前出）。しかし、エクストラドメインの存在は、シンテターゼが多酵素複合体へと集合することと厳密には相関していない。高等真核生物ＴｙｒＲＳは、例えば、多酵素複合体の成分ではない（Ｍｉｒａｎｄｅら、前出）。
【０００５】
ヒトＴｙｒＲＳのカルボキシル末端ドメインは、成熟形態のヒト内皮単球活性化ポリペプチドＩＩ（ＥＭＡＰ　ＩＩ）と５１％の配列同一性を共有する（Ｒｈｏら、前出）。ＴｙｒＲＳは、ＥＭＡＰ　ＩＩ様ドメインを含むことが知られている唯一の高等真核生物アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼである。ＴｙｒＲＳのＥＭＡＰ様ドメインはインビトロ及び酵母においてアミノアシル化になくともよいことが示された（Ｗａｋａｓｕｇｉら、１９９８、ＥＭＢＯ　Ｊ．１７：２９７−３０５）。
【０００６】
ＥＭＡＰ　ＩＩは、最初、マウスメチルコラントレンＡ誘導の線維肉腫細胞の産物として同定されたプロ炎症性サイトカインである。プロ−ＥＭＡＰ　ＩＩは、開裂され、アポトーシス細胞から分泌されて、生物活性の２２ｋＤ成熟サイトカインを生じる（Ｋａｏら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５１０６−１９）。成熟ＥＭＡＰ　ＩＩは単核食細胞（ＭＰ）及び多形核白血球（ＰＭＮ）の移動を誘導することができる。また、ＭＰによる腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）及び組織因子の産生ならびにＰＭＮからのミエロペルオキシダーゼの放出を刺激する。
【０００７】
トリプトファンｔＲＮＡシンテターゼ（ＴｒｐＲＳ）の触媒コアドメインはＴｙｒＲＳの触媒ドメインの密接な相同体である（Ｂｒｏｗｎら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．４５：９−１２）。図１５に示すように、哺乳類ＴｒｐＲＳ分子はアミノ末端付属ドメインを持つ。正常ヒト細胞では、２つの形態のＴｒｐＲＳが検出できる：完全長分子から成るメジャー形態とマイナー端部切除形態（「ミニＴｒｐＲＳ」）である。マイナー形態は、プレ−ｍＲＮＡの選択的スプライシングを通してのアミノ末端ドメインの欠失によって生じる（Ｔｏｌｓｔｒｕｐら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３９７−４０３）。ミニＴｒｐＲＳのアミノ末端は完全長ＴｒｐＲＳ分子の４８位のｍｅｔ残基であることが決定された（同上）。あるいは、端部切除されたＴｒｐＲＳは蛋白質分解によっても生成されうる（Ｌｅｍａｉｒｅら、１９７５、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１：２３７−５２）。例えば、ウシＴｒｐＲＳは膵臓において高度に発現され、膵液中に分泌されて（Ｋｉｓｓｅｌｅｖ，１９９３，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ　７５：１０２７−３９）、その結果端部切除ＴｒｐＲＳ分子の産生をもたらす。これらの結果は、端部切除ＴｒｐＲＳがｔＲＮＡのアミノアシル化以外の機能を持つことを示唆する（Ｋｉｓｓｅｌｅｖ，前出）。
【０００８】
血管新生、あるいは既存血管からの新しい毛細管の増殖は、胚の発生、その後の成長、及び組織修復に必要な基本過程である。血管新生は、血管樹の発生と分化、ならびに胚形成、体成長、組織及び器官の修復と再生、黄体と子宮内膜の周期的成長、そして神経系の発生と分化を含めた様々な基本的生理過程にとっての必要条件である。雌性生殖系においては、発生期の卵胞、排卵後の黄体、及び妊娠を確立し、維持するための胎盤において血管新生が起こる。血管新生はさらに、身体修復過程の一部として、例えば創傷や骨折の治癒の際に起こる。腫瘍は成長するために絶えず新しい毛細血管の増殖を刺激しなければならないので、血管新生はまた腫瘍成長における因子でもある。血管新生はヒト固体癌の成長の必須部分であり、異常血管新生は慢性関節リウマチ、乾癬、及び糖尿病性網膜症のような他の疾患に結びつく（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．とＫｌａｇｓｂｒｕｎ，Ｍ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：４４１−４４７、１９８７））。
【０００９】
血管新生にはいくつかの因子が関与している。内皮細胞及び他の細胞型にとってのマイトジェンである酸性及び塩基性線維芽細胞成長因子分子。アンギオトロピン及びアンギオゲニンは血管新生を誘導しうるが、それらの機能は不明である（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．，１９９３、「癌の医学（Ｃａｎｃｅｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、ｐ．１５３−１７０、Ｌｅａ　ａｎｄ　Ｆｅｂｉｇｅｒ　Ｐｒｅｓｓ）。血管内皮細胞に対して高度に選択的なマイトジェンは血管内皮細胞成長因子又はＶＥＧＦである（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．ら、Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１３：１９−３２、（１９９２））。
【００１０】
（発明の概要）
本発明は、研究、診断、予後及び治療適用のために有用なケモカイン活性を持つ新規の端部切除されたｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドを提供する。１つの実施形態では、ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドは血管内皮細胞機能を調節するために、特に血管新生を調節するために有用である。
【００１１】
１つの実施形態では、新規端部切除ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドはロスマンフォールド（Ｒｏｓｓｍａｎｎ　ｆｏｌｄ）ヌクレオチド結合ドメインを含み、かかる単離されたポリペプチドは血管内皮細胞機能を調節することができる。１つの実施形態では、端部切除ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドは、カルボキシル末端の端部切除を有するチロシンｔＲＮＡシンテターゼである。もう１つの実施形態では、端部切除されたｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドは、アミノ末端の端部切除を有する、好ましくは少なくとも約４６キロダルトンの大きさのトリプトファンｔＲＮＡシンテターゼである。
【００１２】
血管新生性及び血管新生抑制性の両方の端部切除されたｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドが本発明によって提供される。
【００１３】
１つの実施形態では、好ましい端部切除ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基１−３６４を必須成分とするポリペプチド、配列番号１のアミノ酸残基１−３４３を必須成分とするポリペプチド、多形核白血球エラスターゼによる配列番号１のポリペプチドの開裂によって生成される分子量約４０ｋＤのポリペプチド、及びアミノ酸配列−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−、を含むそれらの断片を含む。
【００１４】
もう１つの実施形態では、好ましい端部切除ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸残基４８−４７１を必須成分とするポリペプチド、配列番号９のアミノ酸残基７１−４７１を必須成分とするポリペプチド、多形核白血球エラスターゼによる配列番号９のポリペプチドの開裂によって生成される分子量約４７ｋＤのポリペプチド、及びアミノ酸配列−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−、を含むそれらの断片を含む。
【００１５】
１つの好ましい実施形態では、端部切除ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドは哺乳類、より好ましくはヒトのものである。
【００１６】
もう１つの実施形態では、本発明は、配列番号１又は配列番号９のポリヌクレオチド、配列番号１又は配列番号９のポリヌクレオチドにハイブリド形成しうるポリヌクレオチド、配列番号１又は配列番号９のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、配列番号１又は配列番号９のポリペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチド、及び配列番号１又は配列番号９のポリペプチドエピトープをコードするポリヌクレオチドにハイブリド形成しうるポリヌクレオチドから成る群より選択される配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を持つポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を包含する。
【００１７】
好ましい実施形態では、本発明は、ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドをコードする単離核酸分子を含む組換え発現ベクターを包含する。もう１つの実施形態は、ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドをコードする配列番号１又は配列番号９の単離核酸分子を含む組換え発現ベクターを含む宿主細胞である。
【００１８】
１つの実施形態では、本発明は、チロシンｔＲＮＡシンテターゼをプロテアーゼで処理することによってｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドを作製するための方法である。１つの実施形態では、本発明は、トリプトファンｔＲＮＡシンテターゼをプロテアーゼで処理することによってｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドを作製するための方法である。１つの好ましいプロテアーゼは多形核白血球エラスターゼである。
【００１９】
本発明は、ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドと製薬上適切な賦形剤を含む組成物を提供する。そのような組成物は経皮投与、経粘膜投与、経腸投与又は非経口的投与に適する。もう１つの実施形態では、ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドは、経皮投与用、経粘膜投与用、経腸投与用又は非経口的投与用の医薬組成物の調製のために使用できる。
【００２０】
もう１つの実施形態では、ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドは、対照レベルよりも少なくとも２倍高い血管新生作用を持ちうる。ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドが血管新生抑制作用を持つ実施形態では、ポリペプチドは血管新生作用の少なくとも１０％、より好ましくは血管新生作用の少なくとも９０％を抑制する。
【００２１】
本発明はさらに、血管新生に有効な量の、血管新生性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドと製薬上適切な賦形剤を含む組成物を投与する段階を含む、哺乳類において血管新生を促進する方法を提供する。
【００２２】
本発明はさらに、血管新生の抑制に有効な量の、血管新生抑制性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドと製薬上適切な賦形剤を含む組成物を投与する段階を含む、哺乳類において血管新生を抑制する方法を提供する。
【００２３】
１つの実施形態では、本発明は、血管新生に有効な量の、血管新生性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドと製薬上適切な賦形剤を含む組成物を投与する段階を含む、哺乳類において移植片への血管新生を促進する方法を提供する。
【００２４】
もう１つの実施形態では、本発明は、血管新生に有効な量の、血管新生性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドと製薬上適切な賦形剤を含む組成物を投与する段階を含む、哺乳類において心筋梗塞を治療する方法を提供する。
【００２５】
もう１つの実施形態では、本発明は、血管新生に有効な量の、血管新生性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドと製薬上適切な賦形剤を含む組成物を投与する段階を含む、哺乳類において血管新生の増大から恩恵を受ける状態を治療する方法を提供する。
【００２６】
もう１つの実施形態では、本発明は、血管新生の抑制に有効な量の、血管新生抑制性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドと製薬上適切な賦形剤を含む組成物を投与する段階を含む、哺乳類において血管新生の低下から恩恵を受ける状態を治療する方法を提供する。
【００２７】
もう１つの実施形態では、本発明は、血管新生の抑制に有効な量の、血管新生抑制性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドと製薬上適切な賦形剤を含む組成物を投与する段階を含む、哺乳類において固体腫瘍を治療する方法を提供する。
【００２８】
もう１つの実施形態では、本発明は、血管新生の抑制に有効な量の、血管新生抑制性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドと製薬上適切な賦形剤を含む組成物を投与する段階を含む、哺乳類において腫瘍転移を抑制する方法を提供する。
【００２９】
（図面の簡単な説明）
図１は、大腸菌ＴｙｒＲＳ、ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン、及びヒト成熟ＥＭＡＰ　ＩＩの図式的整列を示す。
【００３０】
図２は、ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン、ヒト成熟ＥＭＡＰ　ＩＩ、及び大腸菌ＴｙｒＲＳの、ＭＰ化学走性（白い棒）及びＭＰのＴＮＦα産生（灰色の棒）への作用を示す。
【００３１】
図３は、ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン、ヒト成熟ＥＭＡＰ　ＩＩ、及び大腸菌ＴｙｒＲＳの、ＭＰ組織因子産生（白い棒）及びＰＭＮのミエロペルオキシダーゼ放出（灰色の棒）への作用を示す。
【００３２】
図４は、ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン、ヒト成熟ＥＭＡＰ　ＩＩ、大腸菌ＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳ突然変異体、及びＩＬ−８のＰＭＮ化学走性への作用を示す。
【００３３】
図５は、ヒトミニＴｙｒＲＳ（配列番号１７）、大腸菌ＴｙｒＲＳ（配列番号１８）、ＩＬ−８（配列番号１９）、Ｇｒｏα（配列番号２０）、及びＮＡＰ−２（配列番号２１）の図式的部分整列を示す；ＴｙｒＲＳ内のロスマンヌクレオチド結合フォールドを分割する結合ポリペプチド１（ＣＰ１）を示している。
【００３４】
図６は、ＰＭＮに関して、非標識ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳ突然変異体、ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン、ヒト成熟ＥＭＡＰ　ＩＩ、大腸菌ＴｙｒＲＳ、ＩＬ−８、Ｇｒｏα、又はＮＡＰ−２をモル過剰で１２５Ｉ−ヒトミニＴｙｒＲＳと共に使用した競合アッセイの結果を示す。
【００３５】
図７Ａから７Ｂは、（Ａ）通常培地（レーン１）及び無血清培地（レーン２）でのＵ−９３７細胞の増殖後の上清、及び（Ｂ）無血清培地でのＵ−９３７細胞の４、１２、又は２４時間の増殖後の上清（レーン１から３）、又は無血清培地で２４時間増殖したＵ−９３７細胞から分離した細胞抽出物からの上清の免疫ブロット分析の結果を示す。
【００３６】
図８Ａから８Ｂは、（Ａ）ヒト完全長ＴｙｒＲＳ（レーン１）、ヒトミニＴｙｒＲＳ（レーン２）、ＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン（レーン３）、ヒトＴｙｒＲＳの伸長カルボキシル末端ドメイン（レーン４）、及びＰＭＮエラスターゼによる開裂後のヒト完全長ＴｙｒＲＳ（レーン５）の免疫ブロット分析の結果、ならびに（Ｂ）ヒトプロ−ＥＭＡＰ　ＩＩ（配列番号２２）及びヒト完全長ＴｙｒＲＳ（配列番号２３）についての開裂部位の図式的表示を示す。
【００３７】
図９は、ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳ、及び大腸菌ＴｙｒＲＳの図式的整列を示す。
【００３８】
図１０は、非標識ヒトミニＴｙｒＲＳ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳ、又は大腸菌ＴｙｒＲＳをモル過剰で１２５Ｉ−ヒトミニＴｙｒＲＳと共に使用した、ＰＭＮに関する競合アッセイの結果を示す。
【００３９】
図１１は、ヒトミニＴｙｒＲＳ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳ、又は大腸菌ＴｙｒＲＳのＰＭＮ化学走性への作用を示す。
【００４０】
図１２は、ヒト完全長ＴｙｒＲＳ（配列番号２４）、ヒトＥＭＡＰ　ＩＩ（配列番号２５−２６）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＭｅｔＲＳ（配列番号２７）、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡｒｃ１ｐ（配列番号２８）についてのヒトＥＭＡＰ　ＩＩ様ドメイン及び対応する合成ペプチドの図式的整列を示す。
【００４１】
図１３は、ヒトＴｙｒＲＳ、ヒトＥＭＡＰ　ＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＭｅｔＲＳ、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡｒｃ１ｐから誘導した合成ペプチドのＰＭＮ化学走性への作用を示す。
【００４２】
図１４は、ヒトミニＴｙｒＲＳ及びα−ケモカインの間の図式的比較を示す（各々のカルボキシル末端部分は省略されている）；β−シート（実線の矢印）及びＥＬＲモチーフ（円）の位置を示している。
【００４３】
図１５は、ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒト完全長ＴｒｐＲＳ、及びヒトミニＴｒｐＲＳの図式的整列を示す；カルボキシル末端及びアミノ末端付属ドメイン（斜線部分）を示している。
【００４４】
図１６は、ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ突然変異体、又はヒトＶＥＧＦのＨＵＶＥＣ化学走性への血管新生作用を示す。
【００４５】
図１７は、ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ突然変異体、ヒトミニＴｙｒＲＳ＋ＩＰ−１０、ヒトＶＥＧＦ、又はヒトＶＥＧＦ＋ＩＰ−１０の、１０日齢のヒナ胚のＣＡＭへの血管新生作用を示す。
【００４６】
図１８は、ヒト完全長ＴｙｒＲＳ又はヒトミニＴｙｒＲＳの内皮細胞増殖への血管新生作用を示す。
【００４７】
図１９は、ヒト完全長ＴｒｐＲＳ又はヒトミニＴｒｐＲＳの、ヒトＶＥＧＦ誘導又はヒトミニＴｙｒＲＳ誘導の内皮細胞移動への作用を示す。
【００４８】
図２０は、ヒトＶＥＧＦ又はヒトミニＴｙｒＲＳのヒナＣＡＭへの血管新生作用に対するヒト完全長ＴｒｐＲＳ又はヒトミニＴｒｐＲＳの作用を示す。
【００４９】
図２１は、ヒトＵ−９３７細胞からのヒトＴｒｐＲＳの分泌を示す免疫ブロット分析の結果を示す。
【００５０】
図２２は、ＰＭＮエラスターゼによるヒト完全長ＴｒｐＲＳの開裂を示す；ＴｒｐＲＳをＰＭＮエラスターゼに０分間（レーン１）、１５分間（レーン２）、３０分間（レーン３）、又は６０分間（レーン４）暴露した。
【００５１】
図２３は、ヒトＶＥＧＦ又はヒトミニＴｙｒＲＳのヒナＣＡＭへの血管新生作用に対するヒトスーパーミニＴｒｐＲＳの作用を示す。
【００５２】
図２４は、ヒトＴｒｐＲＳ（配列番号４５及び配列番号５１）、ウシＴｒｐＲＳ（配列番号４６及び配列番号５２）、マウスＴｒｐＲＳ（配列番号４７及び配列番号５３）、ウサギＴｒｐＲＳ（配列番号４８及び配列番号５４）、ヒトセマホリン−Ｅ（配列番号４９）、マウスセマホリン−Ｅ（配列番号５０）、及びマウスニューロピリン−２（配列番号５５）のアミノ酸配列類似性を示す；ミニ、スーパーミニ、及び不活性形態のＴｒｐＲＳのアミノ末端残基（矢印）、同一残基（星印）、半保存残基（点線）、及びニューロピリン−２のｃドメイン内の挿入（縦線）を示している。
【００５３】
図２５は、哺乳類ＴｒｐＲＳと配列類似性を共有するセマホリン−Ｅ及びニューロピリン−２の領域を示す（矢印で示している）；セマホリン−Ｅ及びニューロピリン−２のドメインは次のように示されている：セマホリンドメイン（ｓｅｍａ）、免疫グロブリンドメイン（Ｉｇ）、カルボキシル末端基本ドメイン（Ｃ）、補体結合ドメイン（ａ１、ａ２）、凝固因子ドメイン（ｂ１、ｂ２）、ｃドメイン（ｃ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、及び細胞質ドメイン（Ｃｙ）。ｃドメイン内に５、１７、又は２２個のアミノ酸の挿入を有するニューロピリンのアイソフォームが存在する。
【００５４】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
下記の実施例の理解を助けるために、一部の頻繁に生じる方法及び／又は用語を説明する。
【００５５】
「ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチド」の語は、対応する完全長ｔＲＮＡシンテターゼよりも短いポリペプチドを意味する。
【００５６】
ここで使用するとき「細胞培養」の語は、培地と培養された細胞の両方を包含する。ここで使用するとき「細胞培養からポリペプチドを単離する」との語句は、可溶性又は分泌されたポリペプチドを培地から単離することならびに培養した細胞から内在性膜蛋白質を単離することを包含する。
【００５７】
「プラスミド」は、大文字及び／又は数字の前及び／又は後の小文字のｐによって表される。ここでは出発プラスミドは、限定されないベースで公的に入手可能な市販のものであるか、若しくは公表されている手順に従って入手可能なプラスミドから構築することができる。さらに、記述されているものと等価のプラスミドが当該技術において既知であり、当業者には明白であろう。
【００５８】
ＤＮＡの「消化」は、ＤＮＡ内の一定配列においてのみ働く制限酵素によるＤＮＡの触媒的開裂を指す。ここで使用する種々の制限酵素は市販のものが入手可能であり、それらの反応条件、補因子及び他の必要条件は、当業者に既知であるように使用した。分析のためには、典型的には１μｇのプラスミド又はＤＮＡ断片を約２０μｌの緩衝液中で約２単位の酵素と共に使用する。プラスミド構築のためにＤＮＡ断片を単離する目的では、典型的には５から５０μｇのＤＮＡをより高い容量中２０から２５０単位の酵素で消化する。個々の制限酵素についての適切な緩衝液及び基質の量は製造者によって規定される。通常は３７℃で約１時間のインキュベーション時間を用いるが、供給者の指示に従って変化しうる。消化後、反応物をポリアクリルアミドゲル上で直接電気泳動して所望する断片を単離する。「オリゴヌクレオチド」は、化学合成されうる一本鎖ポリデオキシヌクレオチド又は２本の相補的ポリデオキシヌクレオチド鎖を指す。そのような合成オリゴヌクレオチドは５’リン酸を持たず、従ってキナーゼの存在下にＡＴＰでリン酸を付加しない限りもう１つのオリゴヌクレオチドには連結しない。合成オリゴヌクレオチドは脱リン酸されていない断片に連結する。
【００５９】
ここで使用するとき「血管新生性ｔｙｒＲＳペプチド」は、アミノ酸配列ＥＬＲを含むミニｔｙｒＲＳ、その断片、類似体及び誘導体を含むがこれらに限定されない、血管新生作用を持つｔｙｒＲＳの断片を指す。
【００６０】
ここで使用するとき、「ｔｙｒＲＳ血管新生治療」は、血管新生に有効な量のミニｔｙｒＲＳ又はその断片の送達、ならびに血管新生に有効な量のミニｔｙｒＲＳ又はその断片をコードするポリヌクレオチドの送達を指す。
【００６１】
本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態であるか又はＤＮＡの形態であってもよく、かかるＤＮＡはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは二本鎖であるか又は一本鎖であってもよく、一本鎖である場合には、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖のいずれでもよい。成熟ポリペプチドをコードするコード配列は、配列番号１又は配列番号９に示すコード配列と同一であるか、又はコード配列が、遺伝暗号の重複又は縮退の結果として、配列番号１又は配列番号９に示す同じ成熟ポリペプチド配列をコードする異なるコード配列でありうる。
【００６２】
それ故、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」の語は、ポリペプチドについてのコード配列だけを含むポリヌクレオチドならびに付加的なコード及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００６３】
本発明はさらに、配列番号１又は配列番号９のアミノ酸配列を持つポリペプチドあるいは配列番号１又は配列番号９のｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドの断片、類似体及び誘導体をコードする、上述したポリヌクレオチドの変異体に関する。ポリヌクレオチドの変異体は、ポリヌクレオチドの天然に生じる対立遺伝子変異体又はポリヌクレオチドの非天然に生じる変異体でありうる。それ故、本発明は、配列番号１又は配列番号９に示すのと同じ成熟ポリペプチドあるいは配列番号１又は配列番号９のｃＤＮＡによってコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに配列番号１又は配列番号９のポリペプチドあるいは配列番号１又は配列番号９によってコードされるポリペプチドの断片、誘導体及び類似体をコードする、そのようなポリヌクレオチドの変異体を包含する。そのようなヌクレオチド変異体は、欠失変異体、置換変異体及び付加又は挿入変異体を包含する。
【００６４】
上記で指摘したように、ポリヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号９に示すコード配列の天然に生じる対立遺伝子変異体であるコード配列を含みうる。当該技術において既知であるように、対立遺伝子変異体は、コードされるポリペプチドの機能を実質的に変化させない、１個又はそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失又は付加を有する代替形態のポリヌクレオチド配列である。
【００６５】
本発明はまた、成熟ポリペプチドのコード配列が、同じ読み枠内で、宿主細胞からのポリペプチドの発現と分泌を助けるポリヌクレオチド、例えば宿主細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列に融合しうるポリヌクレオチドを包含する。リーダー配列を持つポリペプチドはプレ蛋白質であり、リーダー配列が宿主細胞によって開裂されて成熟形態のポリペプチドを形成することができる。ポリヌクレオチドはまた、成熟蛋白質プラス付加的な５’アミノ酸残基であるプレ蛋白質をコードしうる。プロ配列を備える成熟蛋白質はプロ蛋白質であり、不活性形態の蛋白質である。ひとたびプロ配列が開裂されれば、活性な成熟蛋白質が残る。
【００６６】
従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドは成熟蛋白質、又はプロ配列を備える蛋白質又はプロ配列とプレ配列（リーダー配列）の両方を備える蛋白質をコードしうる。
【００６７】
本発明のポリヌクレオチドはまた、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にフレーム内で融合したコード配列を持ちうる。マーカー配列は、細菌宿主の場合にはマーカーに融合した成熟ポリペプチドの精製を提供する、ｐＱＥ−９ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグであるか、又は例えば、哺乳類宿主、例えばＣＯＳ−７細胞を使用するときにはマーカー配列は赤血球凝集素（ＨＡ）タグでありうる。ＨＡタグはインフルエンザ赤血球凝集素蛋白質から誘導されるエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｉ．ら、Ｃｅｌｌ，３７：７６７（１９８４））。
【００６８】
本発明はさらに、配列間に少なくとも５０％、好ましくは７０％の同一性が存在すれば上述した配列にハイブリド形成するポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、ストリンジェント条件下で上述したポリヌクレオチドにハイブリド形成するポリヌクレオチドに関する。ここで使用するとき、「ストリンジェント条件」の語は、配列間に少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の同一性が存在する場合にのみハイブリド形成が起こることを意味する。好ましい実施形態では、上述したポリヌクレオチドにハイブリド形成するポリヌクレオチドは、配列番号１又は配列番号９のｃＤＮＡによってコードされる成熟ポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドをコードする。
【００６９】
該ポリペプチド又は寄託されたｃＤＮＡによってコードされるポリペプチドを指すとき「断片」、「誘導体」及び「類似体」の語は、そのようなポリペプチドと基本的に同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドを意味する。従って、類似体は、プロ蛋白質部分の開裂によって活性化されて活性な成熟ポリペプチドを生成することができるプロ蛋白質を含む。
【００７０】
本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド又は合成ポリペプチドでありうるが、好ましくは組換えポリペプチドである。
【００７１】
配列番号１又は配列番号９のポリペプチドあるいは配列番号１又は配列番号９のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの断片、誘導体又は類似体は、（ｉ）１個又はそれ以上のアミノ酸残基が保存又は非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換されており、そのような置換アミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされるか又はコードされないもの、あるいは（ｉｉ）１個又はそれ以上のアミノ酸残基が置換基を含むもの、あるいは（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を高める化合物（例えばポリエチレングリコール）のようなもう１つ別の化合物と融合しているもの、あるいは（ｉｖ）付加的なアミノ酸が、リーダー又は分泌配列あるいは成熟ポリペプチド又はプロ蛋白質配列の精製に使用される配列のような成熟ポリペプチドに融合しているものでありうる。そのような断片、誘導体及び類似体は、ここでの教示から当業者の範囲内であるとみなされる。
【００７２】
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、好ましくは単離された形態で提供され、好ましくは均一に精製される。
【００７３】
「単離」の語は、物質がその元々の環境（例えば天然に生じるものであれば天然環境）から移されることを意味する。例えば、生存動物中に存在する天然に生じるポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、自然系において共存する物質の一部又は全部から切り離された同じポリヌクレオチド又はＤＮＡ又はポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部でありうる及び／又はそのようなポリヌクレオチド又はポリペプチドは組成物の一部であり得、そのようなベクター又は組成物がその天然環境の一部ではなくなるという意味でさらに単離されうる。
【００７４】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターで遺伝的に構築される宿主細胞、及び組換え手法による本発明のポリペプチドの産生に関する。
【００７５】
宿主細胞は、例えばクローニングベクター又は発現ベクターでありうる本発明のベクターで遺伝的に構築される（形質導入又は形質転換又はトランスフェクションされる）。ベクターは、例えばプラスミド、ウイルス粒子、ファージ、等の形態でありうる。構築した宿主細胞は、プロモーターを活性化する、形質転換体を選択する又はｔＲＮＡシンテターゼポリペプチド遺伝子を増幅するために適宜に修正した従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨ等のような培養条件は、発現のために選択した宿主細胞に関してこれまで使用されてきたものであり、当業者には明白であろう。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチドは組換え手法によってポリペプチドを生成するために使用しうる。それ故、例えば、ポリヌクレオチド配列は様々な発現ビークルのいずれか、特にポリペプチドを発現するためのベクター又はプラスミドに含まれうる。そのようなベクターは染色体、非染色体及び合成ＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；酵母プラスミド；プラスミドとファージＤＮＡの組合せから誘導されるベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、及び仮性狂犬病ウイルスのようなウイルスＤＮＡを含む。好ましいベクターはｐＥＴ２０ｂである。しかし、他のいかなるプラスミド又はベクターも、宿主において複製可能であり、生存可能である限り使用しうる。
【００７７】
上述したように、適切なＤＮＡ配列を様々な手順によってベクターに挿入することができる。一般に、ＤＮＡ配列は、当該技術において既知の手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。そのような手順その他は当業者の範囲内であるとみなされる。
【００７８】
発現ベクター内のＤＮＡ配列は、ｍＲＮＡ合成を指令するために適切な発現制御配列（プロモーター）に作動可能に連結される。そのようなプロモーターの代表的な例として、次のものが挙げられるであろう：ＬＴＲ又はＳＶ４０プロモーター、大腸菌ｌａｃ又はｔｒｐ、λファージＰＬプロモーター及び原核又は真核細胞又はそれらのウイルスにおいて遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーター。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位と転写終結因子を含む。ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含みうる。
【００７９】
さらに、発現ベクターは好ましくは、真核細胞培養についてはジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性のような、あるいは大腸菌におけるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性のような、形質転換宿主細胞の選択のための表現型形質を与える遺伝子を含む。
【００８０】
ここで上述したような適切なＤＮＡ配列、ならびに適切なプロモーター又は制御配列を含むベクターを使用して、宿主が蛋白質を発現するように適切な宿主を形質転換することができる。適切な宿主の代表的な例として、次のものが挙げられるであろう：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のような細菌細胞；酵母のような真菌細胞；ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）及びＳｆ９のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ又はＢｏｗｅｓ黒色腫のような動物細胞；植物細胞、等。適切な宿主の選択は、ここでの教示から当業者の範囲内であるとみなされる。
【００８１】
より特定すると、本発明はまた、上記で広く述べたような１又はそれ以上の配列を含む組換え構築物を包含する。構築物は、正方向又は逆方向に本発明の配列が挿入されたプラスミド又はウイルスベクターのようなベクターを含む。この実施形態の好ましい局面では、構築物はさらに、配列に作動可能に連結された、例えばプロモーターを含めた調節配列を含む。多くの適切なベクター及びプロモーターが当業者に既知であり、市販されている。例として次のようなベクターが挙げられる。細菌：ｐＱＥ７０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｓ、ファージスクリプト、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ、ｐＢｓＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ＰＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。真核生物：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ＰＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）及びｐＥＴ２０Ｂ。１つの好ましい実施形態では、ベクターはｐＥＴ２０Ｂである。しかし、他のいかなるプラスミド又はベクターも、宿主において複製可能であり、生存可能である限り使用しうる。
【００８２】
ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター又は他のベクターを選択マーカーと共に使用して所望する遺伝子からプロモーター領域を選択することができる。２つの適切なベクターはｐＫＫ２３２−８とｐＣＭ７である。特に著名な細菌プロモーターは、ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、λＰＲ、ＰＬ及びｔｒｐを含む。真核生物プロモーターは、前初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルスからのＬＴＲ、及びマウスメタロチオネイン−Ｉを含む。適切なベクターとプロモーターの選択は、十分に当該技術における通常技術のレベル内である。
【００８３】
さらなる実施形態では、本発明は上述した構築物を含む宿主細胞に関する。宿主細胞は哺乳類細胞のような高等真核細胞、又は酵母細胞のような下等真核細胞であるか、若しくは宿主細胞は細菌細胞のような原核細胞でありうる。宿主細胞への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランを介したトランスフェクション、又はエレクトロポレーションによって実施しうる（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．，Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．，「分子生物学における基本的方法（Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９８６）。
【００８４】
宿主細胞内の構築物を従来のように使用して、組換え配列によってコードされる遺伝子産物を生成することができる。あるいは、本発明のポリペプチドは従来のペプチドシンセイサイザーによって合成的に生成することができる。
【００８５】
成熟蛋白質は適切なプロモーターの制御下に哺乳類細胞、酵母、細菌、又は他の細胞において発現されうる。無細胞翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを用いてそのような蛋白質を生成するために使用できる。原核及び真核生物宿主に関して使用するための適切なクローニング及び発現ベクターは、その開示が参照してここに組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」、第２版（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）によって記述されている。
【００８６】
ベクター内にエンハンサー配列を挿入することにより、高等真核生物による本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写が上昇する。エンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を高める、通常約１０から３００ｂｐのＤＮＡのシス作用性エレメントである。その例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００−２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーを含む。
【００８７】
一般に、組換え発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製の起点と選択マーカー、例えば大腸菌のアンピシリン耐性遺伝子及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＴＲＰ１遺伝子、及び下流の構造遺伝子の転写を指令する高度発現遺伝子から誘導されるプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、中でも特に、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、α因子、酸性ホスファターゼ、又は熱ショック蛋白質のような解糖系酵素をコードするオペロンから誘導することができる。異種構造遺伝子を、翻訳開始及び終結配列、及び好ましくは、翻訳された蛋白質のペリプラズム空又は細胞外媒質中への分泌を指令することができるリーダー配列と共に適切な時期に構築する。場合によっては、異種配列は、所望する特性、例えば発現される組換え産物の安定化又は精製の単純化をもたらすＮ末端同定ペプチドを含む融合蛋白質をコードすることができる。
【００８８】
適切な宿主菌株を形質転換し、宿主菌株が適切な細胞密度に増殖した後、選択したプロモーターを適切な手段（例えば温度変化又は化学誘導）によって抑制し、さらなる期間細胞を培養する。
【００８９】
細胞を典型的には遠心分離によって収集し、物理的又は化学的手段によって破壊して、生じた粗抽出物をさらなる精製のために保持する。
【００９０】
蛋白質の発現に用いる微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波破砕、機械的破壊、又は細胞溶解剤の使用を含めた従来の方法によって破壊することができる。
【００９１】
様々な哺乳類細胞培養系も組換え蛋白質を発現するために使用できる。哺乳類発現系の例は、Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｃｅｌｌ，２３：１７５（１９８１）によって記述されたサル腎線維芽細胞のＣＯＳ−７系統、及び適合性をベクターを発現することができる他の細胞系統、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ及びＢＨＫ細胞系統を含む。哺乳類発現ベクターは、複製の起点、適切なプロモーターとエンハンサー、そしてまた、必要とされるリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与及び受容部位、転写終結配列、及び５’フランキング非転写配列を含むであろう。ＳＶ４０ウイルスゲノムから誘導されるＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライス、及びポリアデニル化部位は、必要な非転写遺伝子エレメントを提供するために使用しうる。
【００９２】
硫酸アンモニウム又はエタノール沈降法、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めて、これまで使用されてきた方法によって組換え細胞培養からポリペプチドを回収し、精製する。精製中は低濃度（約０．１から５ｍＭ）のカルシウムイオンを存在させることが好ましい（Ｐｒｉｃｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４４：９１７（１９６９））。成熟蛋白質の立体配置を完成させる際には、必要に応じて、蛋白質のリフォールディング段階が使用できる。最後に、最終精製段階には高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が使用できる。
【００９３】
本発明のポリペプチドは、天然精製産物であるか、又は化学合成手順の産物、又は原核又は真核宿主から組換え手法によって（例えば培養中の細菌、酵母、高等植物、昆虫及び哺乳類細胞によって）生成された産物でありうる。組換え産生手順で用いる宿主細胞に依存して、本発明のポリペプチドは哺乳類又は他の真核生物糖質でグリコシル化されるか、又はグリコシル化されない。
【００９４】
本発明のポリペプチドは、当該技術において既知の手段によって安定性を改善し、効力を高めるように改変することができる。例えば、Ｌ−アミノ酸をＤ−アミノ酸で置換する、アミノ末端をアセチル化する、又はカルボキシル末端を修飾する、例えばエチルアミンキャップ構造を形成することができる（Ｄａｗｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，５５：３３２−３３８（１９９９））。
【００９５】
血管新生性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドは創傷治癒薬として、特に損傷した組織を再血管形成させる必要がある場合、又は新しい毛細血管新生が重要である場合に有用である。それ故、褥瘡、静脈性潰瘍、及び糖尿病性潰瘍を含めて、皮膚潰瘍のような全層性創傷の治療のために使用しうる。さらに、皮膚移植や皮弁のために損傷部位の熱傷を準備するべく血管新生が所望される場合に全層性熱傷及び損傷の治療において使用できる。この場合は部位に直接適用しなければならない。同様に血管新生性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドは、熱傷や他の外傷後に再構成が必要なとき、またさらには美容目的のために形成外科において使用できる。
【００９６】
血管新生は創傷を清潔に保ち、感染が起きないようにする上で重要であるので、血管新生性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドは手術に関連して、及び切除の修復後に使用しうる。感染の危険度が高い腹部創傷の治療において特に有用であると考えられる。
【００９７】
血管新生性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドは、血管移植片手術において内皮形成を促進するために使用できる。移植材料又は合成材料のいずれかを使用した血管移植片の場合には、血管新生ｔｙｒＲＳペプチドを、好ましくは製薬上適切な賦形剤中で、移植片の表面に適用することができる。１つの実施形態では、製薬上適切な賦形剤はさらに、血管新生性ｔｙｒＲＳペプチドの持続放出を提供する。
【００９８】
血管新生性ｔＲＮＡシンテターゼ療法は、心筋梗塞の損傷を修復するために使用できる。１つの好ましい実施形態では、血管新生ｔｙｒＲＳ治療は、移植した組織の成長を刺激することにより、冠状動脈バイパス手術と組み合わせて使用することができる。１つの好ましい実施形態では、血管新生性ｔＲＮＡシンテターゼ治療は、血管新生性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチド又は血管新生性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを直接心筋に注入することによって投与できる。Ｌｏｓｏｄｏ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９８：２８００−２８０４（１９９８）参照。
【００９９】
もう１つの実施形態では、血管新生性ｔＲＮＡシンテターゼ療法は、血管新生性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチド又は血管新生性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを直接血管の内腔及び血管壁に投与するために血管造影法と組み合わせて使用することができる。
【０１００】
同様に、ｔＲＮＡシンテターゼ治療は、血管新生性又は血管新生抑制性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドあるいは血管新生性又は血管新生抑制性ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを直接子宮のような他の中空器官の内腔及び壁に投与するために使用できる。
【０１０１】
本発明のポリペプチドはまた、しばしば「遺伝子治療」と称される、インビボでのそのようなポリペプチドの発現により、本発明に従って使用しうる。
【０１０２】
それ故、例えば骨髄細胞のような細胞を、エクスビボでポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡ）によって構築し、次に構築した細胞をポリペプチドで治療する患者に供給する。そのような方法は当該技術において周知である。例えば、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を使用して、当該技術において既知の手順によって細胞を構築することができる。同様に、例えば当該技術で既知の手順によって、インビボでポリペプチドを発現するためにインビボで細胞を構築することができる。当該技術において既知であるように、インビボで細胞を構築し、インビボでポリペプチドを発現するために、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を作製するためのプロデューサー細胞を患者に投与することができる。そのような方法によって本発明のポリペプチドを投与するためのこれらやその他の方法は、本発明の教示から当業者には明白であろう。例えば、細胞を構築するための発現ビークルはレトロウイルス粒子以外、例えばアデノウイルスであってもよく、それらは適切な送達ビークルと組み合わせたあとインビボで細胞を構築するために使用しうる。
【０１０３】
ここで教示するような遺伝子治療のために使用できる様々なウイルスベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、又は好ましくは、レトロウイルスのようなＲＮＡウイルスを含む。好ましくは、レトロウイルスベクターはマウス又は鳥類レトロウイルスの誘導体であるか、又はレンチウイルスベクターである。好ましいレトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。単一外来遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例は、次のものを含むがこれらに限定されない：モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳腺癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＨＩＶ及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）。多くのさらなるレトロウイルスベクターが多数の遺伝子を組み込むことができる。これらのベクターはすべて、形質導入した細胞を同定し、生成することができるように選択マーカーのための遺伝子を導入する又は組み込むことができる。対象とするジンクフィンガー由来のＤＮＡ結合ポリペプチド配列を、特異的標的細胞上のレセプタについてのリガンドをコードするもう１つの遺伝子と共にウイルスベクターに挿入することにより、ベクターは標的特異的になる。例えば蛋白質をコードするポリヌクレオチド挿入することによってレトロウイルスベクターを標的特異的にすることができる。レトロウイルスベクターを標的する抗体を使用することにより、好ましいターゲティングが達成される。当業者は、ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合蛋白質ポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的送達を可能にする、レトロウイルスゲノムに挿入できる特異的ポリヌクレオチド配列を認識する、又は過度の実験を必要とせずに容易に確認することができる。
【０１０４】
組換えレトロウイルスは欠損性であるので、感染性ベクター粒子を作製するためには補助を必要とする。この補助は、例えばＬＴＲ内の調節配列の制御下でレトロウイルスのすべての構造遺伝子をコードするプラスミドを含むヘルパー細胞系を使用することによって提供されうる。これらのプラスミドは、包入機構がカプシド形成のためにＲＮＡ転写産物を認識することができるようにするヌクレオチドを欠く。包入シグナルの欠失を有するヘルパー細胞系は、例えばΨ２、ＰＡ３１７及びＰＡ１２を含むが、これらに限定されない。これらの細胞系は、ゲノムが包入されないので、空のビリオンを生じる。包入シグナルは無傷であるが、構造遺伝子が他の対象遺伝子によって置換されているそのような細胞にレトロウイルスベクターを導入した場合、ベクターは包入され、ベクタービリオンが生成されうる。その後、この方法によって生成されたベクタービリオンを使用して、ＮＩＨ　３Ｔ３細胞のような組織細胞系に感染し、多量のキメラレトロウイルスビリオンを生産することができる。
【０１０５】
ジンクフィンガー由来のＤＮＡ結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのためのもう１つの標的送達システムはコロイド分散系である。コロイド分散系は、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含めた脂質ベースの系を含む。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。リポソームは、インビトロ及びインビボでの送達ビークルとして有用な人工膜小胞である。０．２から４．０μｍのサイズの大きな単層膜小胞（ＬＵＶ）は、大きな高分子を含む水性緩衝液の実質的な割合を被包しうることが示された。ＲＮＡ、ＤＮＡ及び無傷ビリオンを水性の内部に被包し、生物学的に活性な形態で細胞に送達することができる（Ｆｒａｌｅｙら、Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，６：７７，１９８１）。哺乳類細胞に加えて、リポソームは植物、酵母及び細菌細胞におけるポリヌクレオチドの送達に使用されてきた。リポソームが効率的な遺伝子導入ビークルであるためには、次の特性が存在しなければならない：（１）生物活性を損なうことなく、高い効率での対象遺伝子の被包；（２）非標的細胞に比べて選択的で実質的な標的細胞への結合；（３）標的細胞質への小胞の水性内容物の高い効率での送達；及び（４）遺伝情報の正確で有効な発現（Ｍａｎｎｉｔｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６：６８２，１９８８）。
【０１０６】
リポソームの組成物は通常、ステロイド、特にコレステロールとリン脂質、特に相転移温度の高いリン脂質との組合せである。他のリン脂質又は他の脂質も使用しうる。リポソームの物理特性はｐＨ、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。
【０１０７】
リポソームの作製に有用な脂質の例は、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシドのようなホスファチジル化合物を含む。特に有用なのは、脂質部分が１４から１８個の炭素原子、特に１６から１８個の炭素原子を含み、飽和している、ジアシルホスファチジルグリセロールである。例示的なリン脂質は、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン及びジステアロイルホスファチジルコリンを含む。
【０１０８】
リポソームの標的化は解剖学的及び力学的要因に基づいて分類されてきた。解剖学的分類は選択性のレベル、例えば器官特異性、細胞特異性、及び細胞小器官特異性に基づく。力学的標的化は、それが受動性であるか能動性であるかに基づいて区別することができる。受動的標的化は、リポソームが洞様毛細血管を含む器官において細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布する自然傾向を利用する。能動的標的化は、他方で、リポソームがモノクローナル抗体、糖、糖脂質、又は蛋白質のような特異的リガンドに結合することによる、あるいは天然に生じる局在部位以外の器官及び細胞型への標的化を達成するためにリポソームの組成物又は大きさを変化させることによる、リポソームの変性を含む。
【０１０９】
標的送達システムの表面を様々な方法で修飾することができる。リポソーム標的送達システムの場合には、標的リガンドをリポソームの二重層と安定な結合状態に維持するために、脂質基をリポソームの脂質二重層に組み込むことができる。脂質鎖を標的リガンドに連結するためには様々な連結基が使用できる。
【０１１０】
一般に、標的送達システムの表面に結合する化合物は、標的送達システムが所望する細胞上で認識され、「取り込まれる（ｈｏｍｅ　ｉｎ）」ことを可能にするリガンド及びレセプタである。リガンドは、レセプタのようなもう１つの化合物に結合する、いかなる対象化合物でもよい。
【０１１１】
一般に、特異的エフェクター分子に結合する表面膜蛋白質はレセプタと称される。本発明においては、抗体は好ましいレセプタである。抗体を使用して、リポソームを特異的細胞表面リガンドに向けることができる。例えば、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と称される、腫瘍細胞上で特異的に発現されるある種の抗原は、抗体−ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合蛋白質を含有するリポソームを直接悪性腫瘍に向けるために利用しうる。ジンクフィンガー−ヌクレオチド結合蛋白質遺伝子産物はその作用において細胞型を識別できないと考えられるので、標的送達システムは、ランダムに注入する非特異的リポソームに比べて有意の改善を提供する。ポリクローナル又はモノクローナル抗体をリポソーム二重層に共有結合するために多くの手順が使用できる。抗体標的化リポソームは、標的細胞上の抗原エピトープに効率的に結合する限り、モノクローナル又はポリクローナル抗体、あるいはＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２のようなその断片を含みうる。リポソームはまた、ホルモン又は他の血清因子についてのレセプタを発現する細胞に向けることができる。
【０１１２】
核酸分子を標的細胞に導入するのに適した、当業者に使用可能な多くのウイルス及び非ウイルス法がある。初代腫瘍細胞の遺伝子操作がこれまでに記述されている（Ｐａｔｅｌら、１９９４）。遺伝子治療の分野において周知の１又はそれ以上の手法を用いて細胞の遺伝的修飾が実施できる（「ヒト遺伝子治療（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ）」，１９９４年４月、第５巻、ｐ．５４３−５６３；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．１９９３）。ウイルス形質導入法は、標的細胞に感染するためのシアリルトランスフェラーゼ活性を持つ蛋白質の発現を駆動する又は抑制する核酸配列を含む組換えＤＮＡ又はＲＮＡウイルスの使用を含みうる。本発明において使用するための適切なＤＮＡウイルスは、アデノウイルス（Ａｄ）、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス又はポリオウイルスを含むが、これらに限定されない。本発明において使用するための適切なＲＮＡウイルスは、レトロウイルス又はシンドビスウイルスを含むが、これらに限定されない。本発明での使用に適すると考えられる、いくつかのそのようなＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが存在することは当業者には明白であろう。
【０１１３】
アデノウイルスベクターが真核生物への遺伝子導入に特に有用であることが明らかにされた（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−ＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔとＰｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ．１９９１）。アデノウイルスベクターは真核生物での遺伝子発現（Ｌｅｖｒｅｒｏ，Ｍ．ら、１９９１）、ワクチン開発（ＧｒａｈａｍとＰｒｅｖｅｃ，１９９２）を検討するため、及び動物モデルにおいて（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔら、１９９２；Ｒｉｃｈら、１９９３）使用されて成功を収めた。ヒトにおけるＡｄを介した遺伝子治療の最初の治験は、肺への嚢胞性線維症膜内外コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の導入であった（Ｃｒｙｓｔａｌら、１９９４）。インビボで種々の組織に組換えＡｄを投与するための実験経路は、器官内滴注（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２）、筋肉内注入（Ｑｕａｎｔｉｎ，Ｂ．ら、１９９２）、末梢静脈内注入（ＨｅｒｚとＧｅｒａｒｄ，１９９３）及び脳への定位接種（Ｌｅ　Ｇａｌ　Ｌａ　Ｓａｌｌｅら、１９９３）を含んだ。その後、アデノウイルスベクターは当業者に広く使用可能であり、本発明における使用に適する。
【０１１４】
アデノ関連ウイルス（ＡＶＶ）は、遺伝子治療における潜在的適用を持つ遺伝子導入系として最近紹介された。野生型ＡＡＶは、高いレベルの感染性、広い宿主範囲及び宿主細胞ゲノムへの組込みの際の特異性を示す（ＨｅｒｍｏｎａｔとＭｕｚｙｃｚｋａ，１９８４）。単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）は、特にその神経親和特性の故に神経系における使用のためのベクター系として魅力的である（ＧｅｌｌｅｒとＦｅｄｅｒｏｆｆ，１９９１；Ｇｌｏｒｉｏｓｏら、１９９５）。ポックスウイルスファミリーのワクシニアウイルスも発現ベクターとして開発されてきた（ＳｍｉｔｈとＭｏｓｓ，１９８３；Ｍｏｓｓ，１９９２）。上述したベクターの各々が当業者に広く使用可能であり、本発明における使用に適する。
【０１１５】
レトロウイルスベクターは標的細胞の大きなパーセンテージに感染し、細胞ゲノムに組み込むことができる（ＭｉｌｌｅｒとＲｏｓｍａｎ，１９８９）。レトロウイルスは他のウイルスよりも比較的早期に遺伝子導入ベクターとして開発され、遺伝子マーキング及びアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）のｃＤＮＡをヒトリンパ球に形質導入するために最初に使用されて成功を収めた。好ましいレトロウイウルスはレンチウイルスを含む。好ましい実施形態では、レトロウイルスはＨＩＶ、ＢＩＶ及びＳＩＶから成る群より選択される。
【０１１６】
遺伝子治療のために使用又は提案されてきた「非ウイルス」送達手法は、ＤＮＡ−リガンド複合体、アデノウイルス−リガンド−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡの直接注入、ＣａＰＯ４沈降法、遺伝子ガン手法、エレクトロポレーション、リポソーム及びリポフェクションを含む（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３）。これらの方法のいずれもが当業者に広く使用可能であり、本発明における使用に適するであろう。他の適切な方法も当業者には使用可能であり、本発明が使用可能なトランスフェクション法のいずれかを使用して達成されうることは明白である。そのような方法のいくつかが当業者によって利用され、種々の度合の成功を収めている（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．、１９９３）。リポフェクションは、単離ＤＮＡ分子をリポソーム粒子内に被包し、リポソーム粒子を標的細胞の細胞膜に接触させることによって実施されうる。リポソームは、ホスファチジルセリン又はホスファチジルコリンのような両親媒性分子から成る脂質二重層が、親水性の内部を包み込むように周囲の媒質の部分を被包している、自己構築性のコロイド粒子である。内部が所望する化学物質、薬剤、又は本発明におけるように単離ＤＮＡ分子を含むように、単層膜又は多重膜リポソームを構築することができる。
【０１１７】
細胞はインビボ、エクスビボ、又はインビトロでトランスフェクションしうる。細胞は、患者から単離した初代細胞又は初代細胞から誘導した細胞系統としてトランスフェクションすることができ、必ずしも細胞が最終的に投与される患者にとって自己由来ではない。エクスビボ又はインビトロでのトランスフェクション後、細胞を宿主に移植することができる。初代腫瘍細胞の遺伝子操作がこれまでに記述されている（Ｐａｔｅｌら、１９９４）。細胞の遺伝的修飾は、遺伝子治療の分野において周知の１又はそれ以上の手法を用いて達成しうる（「ヒト遺伝子治療（Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ）」，１９９４年４月、第５巻、ｐ．５４３−５６３；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．１９９３）。
【０１１８】
標的細胞内で本発明の核酸の転写を得るために、標的細胞において遺伝子発現を駆動することができる転写調節領域を使用する。転写調節領域はプロモーター、エンハンサー、サイレンサー又はリプレッサーを含み、本発明の核酸と機能的に結合する。好ましくは、転写調節領域は標的細胞において高いレベルの遺伝子発現を駆動する。本発明における使用に適する転写調節領域は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー／プロモーター、ＳＶ４０初期エンハンサー／プロモーター、ＪＣポリオーマウイルスプロモーター、アルブミンプロモーター、ＣＭＶエンハンサーに連結されたＰＧＫ及びα−アクチンプロモーターを含むが、これらに限定されない（Ｄｏｌｌら、１９９６）。
【０１１９】
本発明のベクターは、当業者に広く使用可能な標準組換え手法を用いて構築しうる。そのような手法は、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）」、（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、「遺伝子発現テクノロジー（Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５巻、Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編集、１９９１、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、及び「ＰＣＲプロトコール：方法と適用の手引き（ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、（Ｉｎｎｉｓら、１９９０、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のような一般的分子生物学参考文献に認められる。
【０１２０】
インビボでの標的細胞への本発明の核酸の投与は、当業者に周知の様々な手法のいずれかを用いて実施しうる。
【０１２１】
本発明のベクターは、従来の製薬上許容される担体、アジュバント、及び賦形剤を含む投与単位製剤として、経口により、非経口により、吸入スプレーにより、直腸に又は局所に投与しうる。ここで使用するとき非経口的の語は、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨内、持続注入手法又は腹腔内を含む。薬剤の直腸投与のための坐薬は、常温で固体であるが直腸温度では液体であり、それ故直腸で溶けて薬剤を放出する、ココアバター及びポリエチレングリコールのような適切な非刺激性賦形剤と薬剤を混合することによって調製できる。
【０１２２】
本発明のベクター及び／又は本発明の組成物で障害又は疾患を治療するための治療レジメンは、疾患の種類、患者の年齢、体重、性別、医学的状態、状態の重症度、投与経路、及び使用する個々の化合物を含めた様々な因子に基づく。従って、投与レジメンは広く異なりうるが、標準的な方法を用いて常套的に決定することができる。
【０１２３】
本発明の製薬上活性な化合物（すなわちベクター）は、ヒト及び他の哺乳類を含めた患者への投与用の医薬品を製造するための薬学の従来の方法に従って加工することができる。経口投与用には、医薬組成物は、例えばカプセル、錠剤、懸濁液、又は液体の形態をとりうる。医薬組成物は、好ましくは所与の量のＤＮＡ又はウイルスベクター粒子（集合的に「ベクター」と称する）を含有する投与単位の形態で作製される。例えば、それらは約１０３−１０１５ウイルス粒子、好ましくは約１０６−１０１２ウイルス粒子の量のベクターを含みうる。ヒト又は他の哺乳類のための適切な１日用量は、患者の状態や他の因子に依存して広く異なりうるが、やはり常套的な方法を用いて決定することができる。ベクターはまた、食塩水、デキストロース、又は水を含めた適切な担体との組成物として注射によって投与することができる。
【０１２４】
本発明の核酸及び／又はベクターは単一活性薬剤として投与できるが、それらはまた本発明の１又はそれ以上のベクターあるいは他の作用物質と組み合わせて使用することもできる。組合せとして投与するときには、治療薬を同時に又は異なる時点で投与する別々の組成物として製剤するか、あるいは治療薬を単一組成物として投与することができる。
【０１２５】
本発明のポリペプチドは適切な製薬担体と組み合わせて使用しうる。そのような組成物は、治療上有効な量の蛋白質、及び製薬上許容される担体又は賦形剤を含む。そのような担体は、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、及びそれらの組合せを含むが、これらに限定されない。製剤は投与様式に適していなければならない。
【０１２６】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１又はそれ以上の成分を満たした１又はそれ以上の容器を含む薬剤パック又はキットを提供する。そのような容器には、医薬品又は生物学的製剤の製造、使用又は販売を規制する政府当局によって規定された書式の添付文書を添えることができ、かかる添付文書はヒトでの投与のための製造、使用又は販売についての当局による認可を反映する。さらに、本発明のポリペプチドは他の治療化合物と共に使用することができる。
【０１２７】
医薬組成物は、経皮、経粘膜、経腸及び非経口静脈内経路のような従来の方法で投与しうる。対象者に投与するｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドの量及び投与レジメンは、投与様式、治療する状態の性質、治療する対象者の体重及び処方する医師の判断などの多くの因子に依存するであろう。一般的に言えば、例えば少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重の治療上有効な用量で投与され、またほとんどの場合、１日当り約８ｍｇ／ｋｇ体重を超えない量で投与され、好ましくは、投与経路、症状、等を考慮に入れて、用量は１日当たり約１０μｇ／ｋｇ体重から約１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１２８】
本発明はさらに、アンチセンステクノロジーの使用によってインビボでｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドを抑制することを対象とする。アンチセンステクノロジーは、三重らせんの形成あるいはアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するために使用でき、どちらの方法もＤＮＡ又はＲＮＡへのポリヌクレオチドの結合に基づく。例えば、本発明のポリペプチドをコードする、成熟ポリヌクレオチド配列の５’コード部分を使用して、１０から４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドを設計する。転写に関わる遺伝子の領域に相補的であるようにＤＮＡオリゴヌクレオチドを設計し（三重らせん−Ｌｅｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，６：３０７３（１９７９）；Ｃｏｏｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：４５６（１９８８）；及びＤｅｒｖａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３６０（１９９１）参照）、それによってＶＥＧＦ２の転写と産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリド形成し、ｍＲＮＡ分子のｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドへの翻訳を遮断する（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．，５６：５６０（１９９１）；「遺伝子発現のアンチセンス阻害因子としてのオリゴデオキシヌクレオチド（Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９８８））。
【０１２９】
あるいは、上述したオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡがインビボで発現されて上述したようにｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドの産生を阻害するように、当該技術における手順によって細胞に送達することができる。血管新生と新生血管形成は固体腫瘍の成長における基本段階であるので、ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドに対するアンチセンス構築物は、それ故、ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドの活性を阻害し、固体腫瘍のさらなる成長を妨げる、またさらには後退させうる。これらのアンチセンス構築物はまた、いずれも異常血管新生を特徴とする慢性関節リウマチ、乾癬及び糖尿病性網膜症を治療するためにも使用できる。
【０１３０】
あるいは、血管新生と新生血管形成は固体腫瘍の成長における基本段階であるので、血管新生抑制性ｔｒｐＲＳ療法を使用して、ｔｙｒＲＳポリペプチドを含めた内因性及び外因性血管新生因子の血管新生作用に対抗し、固体腫瘍のさらなる成長を妨げる、またさらには後退させることができる。そのようなセラピースキャン（ｔｈｅｒａｐｉｅｓｃａｎ）はまた、いずれも異常血管新生を特徴とする慢性関節リウマチ、乾癬及び糖尿病性網膜症を治療するためにも使用できる。
【０１３１】
ポリペプチド、それらの断片又は他の誘導体、あるいはそれらの類似体、あるいはそれらを発現する細胞は、それらに対する抗体を作製するための免疫原として使用できる。これらの抗体は、例えば、ポリクローナル又はモノクローナル抗体でありうる。本発明はまた、キメラ、一本鎖、及び人体化抗体、ならびにＦａｂ断片、あるいはＦａｂ発現ライブラリーの産物を含む。当該技術において既知の様々な手法がそのような抗体及び断片の作製のために使用しうる。
【０１３２】
本発明の配列に対応するポリペプチドに対して産生される抗体は、ポリペプチドを動物に直接注入することによって、又はポリペプチドを動物、好ましくはヒト以外の動物に投与することによって入手できる。そのようにして得られた抗体は該ポリペプチド自体に結合する。このようにして、ポリペプチドの断片だけをコードする配列であっても、天然ポリペプチド全体に結合する抗体を生成するために使用できる。その後、そのような抗体を使用して、そのポリペプチドを発現する組織からポリペプチドを単離することができる。
【０１３３】
モノクローナル抗体の調製のためには、連続細胞系統培養によって生成される抗体を提供するいかなる手法も使用できる。その例は、ハイブリドーマ手法（ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７）、トリオーマ手法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ手法（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　４：７２）、及びヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ手法（Ｃｏｌｅら、１９８５、「モノクローナル抗体と癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ）」より、Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐ．７７−９６）を含む。
【０１３４】
一本鎖抗体の作製について記述されている手法（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の免疫原性ポリペプチド産物に対する一本鎖抗体を生成するように適合させることができる。
【０１３５】
中和抗体を特定し、ｔＲＮＡシンテターゼポリペプチドの活性をマスクするために適用することができる。そのようなアプローチの有用性はＶＥＧＦに対するマウスモデル系で示されている。ＶＥＧＦ２は、その遺伝子自体の中のある種のドミナントネガティブ突然変異体によっても不活性化されうる。ＰＤＧＦα及びβの両方がヘテロダイマー又はホモダイマーのいずれかを形成し、ＶＥＧＦはホモダイマーを形成することが知られている。それ故これらの抗体を使用して、内因性血管新生作用を遮断し、固体腫瘍の成長を遅延させることができる。これらの抗体はまた、血管透過性上昇によって引き起こされる炎症を治療するためにも使用しうる。
【０１３６】
これらの抗体はさらに、ある種の個体における腫瘍の存在を検出するための免疫測定法において使用しうる。個体の血液標本から酵素免疫測定法を実施することができる。
【０１３７】
本発明はまた、本発明のポリペプチドの拮抗物質／阻害因子を対象とする。拮抗物質／阻害因子は、ポリペプチドの機能を抑制する又は排除するものである。従って、例えば拮抗物質は本発明のポリペプチドに結合して、その機能を抑制する又は排除する。拮抗物質は、例えば、ポリペプチドに結合する、又は一部の場合にはオリゴヌクレオチドに結合する、ポリペプチドに対する抗体でありうる。阻害因子の一例は、ポリペプチドの触媒部位に結合して占有し、それによって触媒部位を基質に対してアクセス不能にして正常な生物活性を妨げる、低分子量分子である。低分子量分子の例は、低分子量ペプチド又はペプチド様分子を含むが、これらに限定されない。
【０１３８】
あるいは、本発明のポリペプチドが通常結合するレセプタに結合する、本発明のポリペプチドに対する拮抗物質が使用できる。拮抗物質は、天然蛋白質のレセプタ部位を認識し、結合するような密接に関連する蛋白質であると考えられるが、それらは天然蛋白質の不活性形態であり、それによって通常のポリペプチドリガンドの作用が妨げられる。拮抗物質／阻害因子は、腫瘍のレセプタ部位を占有することにより抗腫瘍薬として治療に使用しうる。拮抗物質／阻害因子はまた、炎症を予防するためにも使用しうる。拮抗物質／阻害因子はまた、固体腫瘍の成長、糖尿病性網膜症、乾癬及び慢性関節リウマチを治療するためにも使用しうる。拮抗物質／阻害因子は、例えば上述したような製薬上許容される担体との組成物として使用しうる。
【０１３９】
本発明のこれらやその他の局面は、ここでの教示から当業者には明白であろう。
【０１４０】
また、対象者において遺伝子の異常構造又は異常発現に関連する病的状態を診断するための方法も好ましく、かかる方法は、該対象者から得た生物学的試料において、存在する場合には、配列番号１及び配列番号９のヌクレオチド配列から成る群より選択される配列中の少なくとも５０個の隣接ヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出する段階を含む。
【０１４１】
病的状態を診断するための方法は、少なくとも２個のヌクレオチド配列のパネル中の１個のヌクレオチド配列を含む核酸分子を検出する段階を含み、該パネルの少なくとも１個の配列は、上記の群より選択される配列中の少なくとも５０個の隣接ヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一である。
【０１４２】
単離核酸分子を含む物質の組成物であって、該核酸分子のヌクレオチド配列が少なくとも２個のヌクレオチド配列のパネルを含み、該パネルの少なくとも１個の配列は、配列番号１及び配列番号９のヌクレオチド配列から成る群より選択される配列中の少なくとも５０個の隣接ヌクレオチドの配列に少なくとも９５％同一であるような組成物も好ましい。
【０１４３】
さらに好ましいのは、生物学的試料において、配列番号１及び配列番号９のアミノ酸配列から成る群より選択される配列中の少なくとも１０個の隣接アミノ酸の配列に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出するための方法であり、かかる方法は、該試料中の少なくとも１個のポリペプチド分子のアミノ酸配列を上記の群より選択される配列と比較して、該試料中の該ポリペプチド分子の配列が少なくとも１０個の隣接アミノ酸の該配列に少なくとも９０％同一であるかどうかを判定する段階を含む。
【０１４４】
また、生物学的試料の種、組織又は細胞型を同定するための上記の方法も好ましく、かかる方法は、少なくとも２個のアミノ酸配列のパネル中の１個のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を検出する段階を含み、該パネルの少なくとも１個の配列は、上記の群より選択される配列中の少なくとも１０個の隣接アミノ酸の配列に少なくとも９０％同一である。
【０１４５】
また、対象者において遺伝子の異常構造又は異常発現に関連する病的状態を診断するための方法も好ましく、かかる方法は、該対象者から得た生物学的試料において少なくとも２個のアミノ酸配列のパネル中の１個のアミノ酸配列を含むポリペプチド分子を検出する段階を含み、該パネル中の少なくとも１個の配列は、配列番号１及び配列番号９のアミノ酸配列から成る群より選択される配列中の少なくとも１０個の隣接アミノ酸の配列に少なくとも９０％同一である。
【０１４６】
本発明はまた、ここで述べる診断方法に従って試料中の本発明のポリペプチドの存在、そして好ましくはポリペプチドの量を検出することを所望する場合に、脳組織、細胞懸濁液又は組織切片のような身体試料；あるいはＣＳＦ、血液、血漿又は血清のような体液試料において本発明のポリペプチドの存在を検定するための、好ましくはキットの形態の、診断システムを含む。
【０１４７】
関連実施形態では、核酸分子は、本発明のポリヌクレオチド、本発明のポリヌクレオチドに対応する遺伝子、又は細胞における本発明のポリペプチドの存在又は発現についての診断である細胞中のｍＲＮＡを検出するためのプローブ（すなわちオリゴヌクレオチド）として使用することができる。核酸分子プローブは少なくとも約１０ヌクレオチドから様々な長さ、適切には約１０から約５０００ヌクレオチドの長さでありうるが、典型的には約２０から５００ヌクレオチドの長さである。ハイブリド形成法は当該技術において極めて広く知られており、ここではさらに説明しないものとする。
【０１４８】
関連実施形態では、本発明のポリヌクレオチドに対応する遺伝子の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のようなプライマー伸長反応によって実施できる。そのために、ＰＣＲプライマーは、周知のように、検出する遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて対で使用される。好ましくは、ヌクレオチド配列は、本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の一部である。特に好ましいＰＣＲプライマーは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のいずれの部分からも誘導することができるが、選択的には他の細胞蛋白質では保存されない領域から誘導される。
【０１４９】
本発明のポリヌクレオチドに対応する遺伝子及びこれらの遺伝子の発現を検出するために有用な好ましいＰＣＲプライマー対は、対応する表を含めて実施例の中に述べられている。ここで述べる本発明のポリペプチドの対応領域からのヌクレオチドプライマーは容易に調製され、様々な組織において対応する遺伝子の存在又は発現を検出するためのＰＣＲプライマーとして使用される。
【０１５０】
本発明はまた、抗血管新生化合物についてのスクリーニングアッセイを提供する。ここで開示するように、ｔｒｐＲＳポリペプチドなどの抗血管新生化合物は、ニワトリ尿膜（ＣＡＭ）及び角膜脈管形成モデルのようなモデル系へのｔｙｒＲＳポリペプチドの血管新生作用に対抗する能力によって検出することができる。
【０１５１】
診断システムは、少なくとも１回のアッセイを実施するのに十分な量で、本発明の対象ポリペプチド、対象抗体又はモノクローナル抗体、及び／又は本発明の対象核酸分子プローブを別々に包装された試薬として含む。
【０１５２】
もう１つの実施形態では、好ましくはキットの形態の診断システムは、体液試料における本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドと免疫反応性の抗体の存在について検定することが想定されている。そのような診断キットは、治療的に投与された本発明のポリペプチド又は本発明のポリペプチドと免疫反応性の抗体の運命をモニターするために有用であろう。システムは、少なくとも１回のアッセイのために十分な量で、本発明のポリペプチド及び／又は対象抗体を別々に包装された免疫化学的試薬として含む。
【０１５３】
典型的には包装されている試薬の使用についての指示も含まれる。
【０１５４】
ここで使用するとき、「包装」の語は、本発明のポリペプチド、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体を一定の区域内に保持することができるガラス、プラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロピレン又はポリカーボネート）、紙、箔等のような固体基質又は材料を指す。従って、例えば、包装は、ミリグラム量の想定されるポリペプチド又は抗体を収容するために使用されるガラスバイアルであるか、又はマイクログラム量の想定ポリペプチド又は抗体が、それぞれ抗体又は抗原によって免疫学的に結合されうるように作動可能に付着された（すなわち連結された）マイクロタイタープレートでありうる。
【０１５５】
「使用についての指示」は、典型的には、試薬濃度あるいは混合すべき試薬と試料の相対的量、試薬／試料混合物についての維持時間、温度、緩衝剤条件等のような少なくとも１つのアッセイ法のパラメータを説明する明白な表示を含む。
【０１５６】
本発明の診断システムは、好ましくはまた、本発明のポリペプチド又は抗体分子を含む免疫複合体の形成をシグナル伝達することができる標識又は指示手段を含む。
【０１５７】
ここで使用するとき「複合体」の語は、抗体−抗原又はレセプタ−リガンド反応のような特異的結合反応の産物を指す。例示的な複合体は免疫反応産物である。
【０１５８】
ここで使用するとき、種々の文法的形態での「標識」及び「指示手段」の語は、複合体の存在を指示する検出可能なシグナルの生成に直接又は間接的に関与する単一原子及び分子を指す。いかなる標識又は指示手段も、発現される蛋白質、ポリペプチド、あるいは本発明の抗体又はモノクローナル抗体組成物の一部である抗体分子に連結する又は組み込むか、あるいは別々に使用することができ、それらの原子又は分子は単独で又は付加試薬と共に使用することができる。そのような標識は、それら自体臨床診断化学において周知であり、新規蛋白質法及び／又はシステムと共に使用される限りにおいてのみ本発明の一部を構成する。
【０１５９】
標識手段は、抗体又は抗原を変性させることなくそれらに化学結合して、有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（染料）を形成する蛍光標識物質でありうる。適切な蛍光標識物質は、フルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクロリド（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ローダミン８２００スルホニルクロリド（ＲＢ　２００　ＳＣ）等のような蛍光色素である。免疫蛍光分析手法の説明は、参照してここに組み込まれる、ＤｅＬｕｃａ，「免疫蛍光分析（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、「ツールとしての抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｓ　ａ　Ｔｏｏｌ）」より、Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓら編集、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｌｔｄ．，ｐ．１８９−２３１（１９８２）に認められる。他の適切な標識物質は当業者に既知である。
【０１６０】
好ましい実施形態では、指示基は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、グルコースオキシダーゼ、等のような酵素である。主要指示基がＨＲＰ又はグルコースオキシダーゼのような酵素である場合には、レセプタ−リガンド複合体（免疫反応物）が形成された事実を視覚化するために付加試薬が必要である。ＨＲＰについてのそのような付加試薬は、過酸化水素及びジアミノベンジジンのような酸化染料前駆物質を含む。グルコースオキシダーゼに関して有用な付加試薬は２，２’−アミノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−Ｇ−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）である。
【０１６１】
放射性元素も有用な標識物質であり、ここで例示的に使用する。例示的な放射性標識物質は、γ線の放出を生じる放射性元素である。１２４Ｉ、１２５Ｉ、１２８Ｉ、１３２Ｉ及び５１Ｃｒのようなそれ自体がγ線を放出する元素は、γ線放出を生じる放射性元素指示群の１つのクラスである。特に好ましいのは１２５Ｉである。有用な標識手段のもう１つの群は、それ自体が陽電子を放出する１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏ及び１３Ｎのような元素である。そのように放出された陽電子は、動物の体内に存在する電子と遭遇してγ線を生じる。１１１インジウム又は３Ｈのようなβ線放射体も有用である。
【０１６２】
ポリペプチド及び蛋白質の標識の結合又は標識化は当該技術において周知である。例えば、ハイブリドーマによって作製した抗体分子を、培地中の成分として供給される放射性同位元素含有アミノ酸の代謝的組込みによって標識することができる（例えばＧａｌｆｒｅら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：３−４６（１９８１）参照）。特に活性化官能基を通しての蛋白質の複合又は結合手法が適用できる（例えばＡｕｒａｍｅａｓら、Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，第８巻補遺、７：７−２３（１９７８）；Ｒｏｄｗｅｌｌら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．，３：８８９−８９４（１９８４）；及び米国特許第４，４９３，７９５号参照）。
【０１６３】
診断システムはまた、好ましくは別個の包装として、特異的結合物質を含みうる。「特異的結合物質」は、本発明の試薬種又はそのような種を含む複合体に選択的に結合することができる分子単位であるが、それ自体は本発明のポリペプチド又は抗体分子組成物ではない。例示的な特異的結合物質は、第二抗体分子、補体蛋白質又はその断片、Ｓ．オーレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）プロテインＡ、等である。好ましくは特異的結合物質は、試薬種が複合体の一部として存在するときにその種に結合する。
【０１６４】
好ましい実施形態では、特異的結合物質は標識される。しかし、診断システムが標識されていない特異的結合物質を含むときには、その物質は典型的には増幅手段又は試薬として使用される。これらの実施形態では、増幅手段が試薬種を含む複合体に結合したときに、標識した特異的結合物質が増幅手段に特異的に結合することができる。
【０１６５】
本発明の診断キットは、試料中の本発明のポリペプチドの量を検出するために「ＥＬＩＳＡ」形式の中で使用することができる。「ＥＬＩＳＡ」は、試料中に存在する抗原を検出し、その量を測定するために、固相に結合した抗体又は抗原と酵素−抗原又は酵素−抗体複合体を用いる酵素結合イムノソルベント検定法を指す。ＥＬＩＳＡ手法の説明は、すべて参照してここに組み込まれる、Ｓｉｔｅｓら、「基礎及び臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」第４版２２章、Ｌａｎｇｅ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ　Ａｌｔｏｓ，ＣＡ（１９８２）及び米国特許第３，６５４，０９０号；米国特許第３，８５０，７５２号；米国特許第４，０１６，０４３号に認められる。
【０１６６】
従って、一部の実施形態では、本発明のポリペプチド、本発明の抗体又はモノクローナル抗体を固体基質に付着させて対象診断システム中の包装を含む保持体を形成することができる。
【０１６７】
試薬は典型的には水性媒質からの吸着によって固体基質に付着するが、当業者に周知である、蛋白質及びポリペプチドに適用できる他の固定方法も使用しうる。例示的な吸着方法をここで述べる。
【０１６８】
有用な固体基質も当該技術において周知である。そのような物質は水不溶性であり、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）からＳＥＰＨＡＤＥＸの商標名で市販されている架橋デキストラン、アガロース；いくつかの供給者（例えばＡｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）から市販されている直径約１ミクロン（μｍ）から約５ミリメートル（ｍｍ）のポリスチレンビーズ、ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリルアミド、ニトロセルソース又はナイロンベースのウエブ（シート、ストリップ又はパドル）又はチューブ、ポリスチレン又はポリ塩化ビニルから作られるもののようなマイクロタイタープレートのプレート又はウエルを含む。
【０１６９】
ここで述べる診断システムの試薬種、標識特異的結合物質、又は増幅試薬は、溶液中で液体分散として又は実質的乾燥粉末として、例えば凍結乾燥形態で提供されうる。指示手段が酵素である場合には、酵素の基質もシステムの別の包装中で提供することができる。前述したマイクロタイタープレートのような保持体及び１又はそれ以上の緩衝剤も、この診断アッセイシステム中の別個の包装要素として含めることができる。
【０１７０】
診断システムに関連してここで述べる包装材料は、診断システムにおいて慣例的に使用されるものである。
【０１７１】
図面１から２５及び実施例１から１８を参照することにより、本発明の好ましい実施形態がよりよく理解される。下記の実施例は本発明の特定実施形態及びその様々な用途の例示である。それらは例示のみを目的として示すものであり、本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【０１７２】
実施例１
内毒素不含組換えＴｙｒＲＳ及びＴｒｐＲＳの調製
内毒素不含組換えヒトＴｙｒＲＳ及びヒトＴｒｐＲＳを次のように調製した。各々６個のヒスチジン残基のＣ末端タグを同時にコードする、完全長ＴｙｒＲＳ（５２８アミノ酸残基；図１及び１５）、端部切除されたＴｙｒＲＳ（ミニＴｙｒＲＳ、完全長ＴｙｒＲＳの残基１−３６４；ＴｙｒＲＳのカルボキシルドメイン、完全長ＴｙｒＲＳの残基３５９−５２８）、完全長ＴｒｐＲＳ（４７１アミノ酸残基）、又は端部切除されたＴｒｐＲＳ（ミニＴｒｐＲＳ、完全長ＴｒｐＲＳの残基４８−４７１；スーパーミニＴｒｐＲＳ、完全長ＴｒｐＲＳの残基７１−４７１）をコードするプラスミドを大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）に導入した。一部の実施例で使用するために、やはり６個のヒスチジン残基のＣ末端タグを同時にコードするヒト成熟ＥＭＡＰ　ＩＩも同様にして調製した。細胞をイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドで４時間処理して組換えＴｙｒＲＳ又はＴｒｐＲＳの過剰発現を誘導した。次に細胞を溶解し、上清から採集した蛋白質を製造者の指示するプロトコールに従ってＨｉｓ・Ｂｉｎｄ（登録商標）ニッケルアフィニティーカラム（Ｎｏｖａｇｅｎ）で精製した。精製後、ＴｒｐＲＳ蛋白質を、１μｍ　ＺｎＳＯ４を含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）と共にインキュベートし、その後遊離Ｚｎ２＋を除去した（Ｋｉｓｓｅｌｅｖら、１９８１、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２０：５１１−１７）。
【０１７３】
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１１４を用いた相分離によって蛋白質試料から内毒素を除去した（Ｌｉｕら、１９９７、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：４５５−６３）。Ｅ−Ｔｏｘａｔｅ（登録商標）ゲル−クロットアッセイ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して、蛋白質試料が１ｍＬ当り０．０１単位未満の内毒素を含むことを調べた。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準品として用いたＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって蛋白質濃度を測定した。
【０１７４】
実施例２
ヒトＴｙｒＲＳのサイトカイン活性
ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン、ヒトＥＭＡＰ　ＩＩ、及び大腸菌ＴｙｒＲＳを、ＭＰ又はＰＭＮの化学走性、ＭＰのＴＮＦα又は組織因子産生、又はＰＭＮのミエロペルオキシダーゼ放出を調べるアッセイにおいてサイトカイン活性に関して分析した。
【０１７５】
上記の種々のサイトカインアッセイのための細胞を健常志願者の酸性クエン酸デキストロース処理血液から調製した。ヒトＰＭＮをＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ　１０７７及び１１１９（Ｓｉｇｍａ）での遠心分離（７００×ｇ）によって血液から単離した。ＰＭＮを含む分画を０．２％ＮａＣｌに３０秒間暴露して赤血球を溶解し、直ちに１．６％ＮａＣｌを加えて等張性を回復し、その後１０分間遠心分離した。この手順を２回繰り返した。ヒトＭＰをＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ　１０７７（Ｓｉｇｍａ）での遠心分離によって単離した。単核分画を入手し、ハンクス平衡食塩水で２回洗って、１０％熱不活化胎児ウシ血清（Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、組織培養フラスコに入れて、６％ＣＯ２培養器中３７℃で１から２時間インキュベートした（Ｋｕｍａｇａｉら、１９７９、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２９：１７−２５）。フラスコをハンクス平衡食塩水で３回洗って非接着細胞を除去し、２ｍＭ　ＥＤＴＡを含むカルシウム−マグネシウム不含リン酸緩衝食塩水と共に４℃で１５分間インキュベーションして接着細胞を採集し、その後十分に洗った。
【０１７６】
ＭＰ化学走性アッセイは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）とポリカーボネートフィルター（５μｍ孔）を入れたＣｈｅｍｏＴＸ微量化学走性チェンバー（Ｎｅｕｒｏ　Ｐｒｏｂｅ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）において実施した。１％熱不活化胎児ウシ血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培地にＭＰを懸濁し、１０４細胞をチェンバー上部に加えた。試料蛋白質（１ｎＭ）を化学走性チェンバーの下部区画に加え、チェンバーを３時間インキュベートした。インキュベーション後、非移動細胞を除去し、膜をメタノールに固定して、移動細胞をＨｅｍａｃｏｌｏｒ（登録商標）染色キット（ＥＭ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）で視覚化した。移動細胞をハイパワーフィールド（ＨＰＦ）で計数した。図２に示す各々の測定値は９回のＨＰＦ測定の平均値である。
【０１７７】
１０５ＭＰを１ｎＭの試料蛋白質と共に１４時間インキュベーションした後、ＭＰのＴＮＦα産生を調べた。次に培養上清のアリコートを、ＴＮＦα酵素結合イムノソルベントアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を用いてＴＮＦα産生に関して検定した。図２に示す各々の測定値は少なくとも３つの独立した実験からの４回の測定の平均値である。
【０１７８】
１０４ＭＰを１ｎＭの試料蛋白質と共に４時間インキュベーションした後、ＭＰの組織因子産生を調べた。次に第ＶＩＩａ因子依存性の第Ｘａ因子形成の測定から組織因子活性を推定した（Ｗｏｌｆｓｏｎら、１９９０、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．５０３：２７７−８１）。図２に示す各々の測定値は少なくとも３つの独立した実験からの４回の測定の平均値である。
【０１７９】
３×１０６ＰＭＮ／ｍＬを１ｎＭの試料蛋白質と共に６０分間インキュベーションした後、ＰＭＮのミエロペルオキシダーゼ放出を調べた。次に３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンの還元によってペルオキシダーゼの生成を測定した（Ｂａｒｋｅｒら、１９８２、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．１５０：４１９−２３）。１００％ペルオキシダーゼ活性を、１０μＭホルボールエステルに６０分間暴露した後の３×１０６ＰＭＮに関して認められる活性と定義した場合の総ペルオキシダーゼ活性のパーセントとして、ペルオキシダーゼ活性を図３に示す。図３に示す各々の測定値は少なくとも３つの独立した実験からの４回の測定の平均値である。
【０１８０】
ＰＭＮ化学走性アッセイは、ＣｈｅｍｏＴＸ微量化学走性チェンバー（上述）において実施した。試料蛋白質（１ｎＭ）を化学走性チェンバーの下部区画に加え、１０４ＰＭＮを上部区画に加えた。チェンバーを４５分間インキュベートし、移動細胞をＨＰＦで計数した。図２に示す各々の測定値は９回のＨＰＦ測定の平均値である。
【０１８１】
図２に示すように（白い棒）、ＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメインはＥＭＡＰ　ＩＩについて認められるのと同程度にＭＰの移動を誘導した。これに対し、完全長ＴｙｒＲＳに関しては化学走性を認めなかった。ＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメインはまた、ＭＰにおけるＴＮＦα（図２、灰色の棒）及び組織因子（図３、白い棒）の産生を刺激し、ＰＭＮにおけるミエロペルオキシダーゼの放出を誘導し（図３、灰色の棒）、そしてＰＭＮの移動を誘導した（図４）。ＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン及びＥＭＡＰ　ＩＩによるＰＭＮ移動の誘導は、化学走性サイトカインの特徴である明瞭な形の濃度依存性を示した（Ｗａｋａｓｕｇｉら、前出）。完全長ＴｙｒＲＳはカルボキシル末端ドメインについて認められる特性を全く有していなかった（図２から４）。
【０１８２】
ＴｙｒＲＳのアミノ末端触媒ドメイン（ミニＴｙｒＲＳ）のサイトカイン活性をＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメインの活性と平行して検討した。ミニＴｙｒＲＳはＭＰ移動を誘導せず（図２、白い棒）、ＭＰにおけるＴＮＦα（図２、灰色の棒）及び組織因子（図３、白い棒）の産生を刺激しなかった。驚くべき事に、ミニＴｙｒＲＳはＰＭＮの移動を誘導し（図４）、この作用は明瞭な形の濃度依存性を示した。これらの結果は、ミニＴｙｒＲＳが白血球化学誘引物質であることを示唆する。化学走性チェンバーの下部区画に加えたミニＴｙｒＲＳに対するＰＭＮの応答は、上部ウエルにミニＴｙｒＲＳを加えることによって減衰し、高いＰＭＮ移動が単なるケモキネシス（刺激されたランダムな動き）ではなく、化学走性によるものであることを示唆した。ヒトミニＴｙｒＲＳと同様の大きさの大腸菌ＴｙｒＲＳは、すべてのアッセイにおいて不活性であった（図２から４）。
【０１８３】
実施例３
ヒトＴｙｒＲＳ　ＥＬＲモチーフの突然変異
ＩＬ−８のようなＰＭＮ化学誘引物質として機能とするすべてのα−ケモカイン（ＣＸＣ−ケモカイン）は、アミノ末端の最初のシステインに先行する保存Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＥＬＲ）モチーフを備える（Ｂｅｃｋｅｒ，１９７７，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１０１：５０９−１３）。ＥＬＲモチーフはレセプタ結合と好中球の活性化のために不可欠である（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら、１９９７、Ａｎｎｕ，Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６７５−７０５）。ヒトミニＴｙｒＲＳも触媒ドメイン内にＥＬＲモチーフを有しており（図５）、このドメインはさらにロスマンヌクレオチド結合フォールドを含む。ロスマンヌクレオチド結合フォールドはすべてのクラスＩアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの特徴である。このモチーフは哺乳類のＴｙｒＲＳ分子間で保存される。
【０１８４】
ＥＬＲモチーフがＥＬＱ（Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ）に変異したミニＴｙｒＲＳ突然変異体を調製することによってＴｙｒＲＳ　ＥＬＲモチーフの重要性を検討した。Ａｒｇ残基はレセプタ結合にとって特に重要であると思われる（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら、前出）。ミニＴｙｒＲＳ突然変異体を実施例２で述べたようにサイトカイン活性について試験した。ミニＴｙｒＲＳ突然変異体はＰＭＮの移動を誘導せず（図４）、他のα−ケモカインと同様に、ミニＴｙｒＲＳ内のＥＬＲモチーフがＰＭＮレセプタ結合において重要な役割を果たすことを示唆した。
【０１８５】
実施例４
ヒトＴｙｒＲＳ結合アッセイ
ヒトミニＴｙｒＲＳとＰＭＮの相互作用を、放射性ヨウ素化ＴｙｒＲＳ分子を用いた結合試験において検討した（Ｍｏｓｅｒら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：７１２５−２８）。ミニＴｙｒＲＳの慣例的な放射性ヨウ素化をＲｅｓｅａｒｃｈ　＆　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）によって実施した。結合アッセイにおいて、２×１０６ＰＭＮを最初に２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）と１０ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミンを含むＲＰＭＩ−１６４０培地１２０μｌに懸濁した。次にＰＭＮ細胞懸濁液を２００倍モル過剰の非標識リガンドと共に又は非標識リガンドなしで、１０ｎＭ　１２５Ｉ−ヒトミニＴｙｒＲＳ（比活性〜６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と共に氷上で２時間インキュベートした。インキュベーション後、１０％スクロース／リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）クッション５００μＬを通して、約８０００×ｇで２分間の遠心分離によって細胞を非結合放射能から分離した。上清を吸引し、ＥｃｏＬｉｔｅ（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）を用いて細胞沈査を再懸濁し、シンチレーションカウンターで分析した。最大比応答は２０００計数／分である。図６に示すデータは３回の独立した測定の平均値である。
【０１８６】
ＰＭＮと１２５Ｉ−ミニＴｙｒＲＳのインキュベーションは４℃で用量依存的特異結合を導き、線形のスキャッチャードプロットを生じた（見かけ解離定数Ｋｄ＝２１ｎＭ；２３，０００レセプタ／ＰＭＮ）。図６に示すように、非標識ミニＴｙｒＲＳの存在は１２５Ｉ−ミニＴｙｒＲＳのＰＭＮへの結合を阻害した。これに対し、ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ突然変異体、及び大腸菌ＴｙｒＲＳは１２５Ｉ−ミニＴｙｒＲＳの結合を阻害しなかった。従って、完全長ＴｙｒＲＳ、ミニＴｙｒＲＳ突然変異体、及び大腸菌ＴｙｒＲＳについてのＰＭＮ化学走性作用の欠如はそれらのＰＭＮ結合の欠如と一致する。さらに、ＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン及びＥＭＡＰ　ＩＩのいずれもが、１２５Ｉ−ミニＴｙｒＲＳのＰＭＮへの結合を阻害しなかった。それ故、ミニＴｙｒＲＳについてのＰＭＮレセプタは、ＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン又は成熟ＥＭＡＰ　ＩＩについてのレセプタとは異なる。
【０１８７】
インターロイキン−８（ＩＬ−８）、黒色腫成長刺激活性（Ｇｒｏ）、又は好中球活性化蛋白質−２（ＮＡＰ−２）（ＥＬＲモチーフを有するα−ケモカイン）が、ミニＴｙｒＲＳが結合するのと同じＰＭＮレセプタに結合する能力を調べるために競合結合アッセイも実施した。ＩＬ−８はＡ型及びＢ型ＩＬ−８レセプタ（それぞれＣＸＣＲ１及びＣＸＣＲ２として知られる）に結合するが、Ｇｒｏ及びＮＡＰ−２はＢ型ＩＬ−８レセプタに結合する（Ｂｅｃｋｅｒ，前出）。結合アッセイでは、２０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）と１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地１２０μＬ中の２×１０６ＰＭＮ又は好塩基球性白血病細胞を、２００倍モル過剰のヒト組換えＩＬ−８（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ヒト組換えＧｒｏ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）、又はヒト組換えＮＡＰ−２（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のいずれかの不在下又は存在下で、１０ｎＭ　１２５Ｉ−ミニＴｙｒＲＳ（〜６０Ｃｉ／ｍｍｏｌの比活性を持つ）と共に氷上で２時間インキュベートした。インキュベーション後、ここで述べたように細胞を非結合放射能から分離した。
【０１８８】
図６に示すように、ＩＬ−８は１２５Ｉ−ミニＴｙｒＲＳの結合をほとんど完全に阻害したが、Ｇｒｏ及びＮＡＰ−２は結合を有意に阻害しなかった。これらの結果は、ミニＴｙｒＲＳがＡ型ＩＬ−８レセプタと特異的に結合することを示唆する。ミニＴｙｒＲＳのレセプタについてさらなる洞察を得るために、ＩＬ−８レセプタＡ型又はＢ型についての遺伝子でトランスフェクションしたＲＢＬ２Ｈ３ラット好塩基球性白血病細胞を検討した（Ｌｅｅら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６２８３−８７）。トランスフェクションしていないＲＢＬ２Ｈ３細胞はＡ型及びＢ型レセプタのいずれも発現しない。ミニＴｙｒＲＳは、ＩＬ−８と同様に（Ｋｄ＝１ｎＭ）Ａ型ＩＬ−８レセプタを発現する細胞に高い親和性で結合した（Ｋｄ＝８ｎＭ）が、Ｂ型レセプタを発現する細胞には結合しなかった（Ｋｄ＞２００ｎＭ）。スキャッチャード分析は、Ａ型発現トランスフェクタントがヒトミニＴｙｒＲＳに関してＩＬ−８と同様の数の結合部位を持つことを明らかにした。
【０１８９】
実施例５
Ｕ−９３７細胞からのヒトＴｙｒＲＳの分泌
ヒトＥＭＡＰ　ＩＩと同様に、ヒトＴｙｒＲＳがアポトーシス腫瘍細胞から分泌されるかどうかを調べるために、ヒト細網肉腫Ｕ−９３７細胞を最初に無血清培地で増殖させ、アポトーシスを誘導した。無血清培地での増殖の前に、Ｕ−９３７細胞を、３７℃で空気中６％ＣＯ２の大気下に１０％熱処理ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地に維持した。Ｕ−９３７細胞を２から３日ごとに常套的な継代によって対数増殖期に維持した。無血清増殖のために、ＦＢＳを含まないＲＰＭＩ−１６４０培地で４×１０６Ｕ−９３７細胞を２４時間培養した。Ｕ−９３７細胞のアポトーシスをＤＮＡフラグメントアッセイによって確認し、かかるアッセイにおいてアポトーシス細胞の特徴的なＤＮＡはしごをアガロースゲル上に認めた。
【０１９０】
無血清培地でＵ−９３７細胞を４、１２、又は２４時間増殖させた後、細胞上清を採集した。その後これらの上清を、ウサギポリクローナル抗ＴｙｒＲＳ抗体を用いたウエスタンブロット分析によって検査した。細胞上清中の蛋白質を調べるために、廃培地２０ｍＬを最初に２ｍＭ　ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、２０μｇ／ｍＬロイペプチン、及び１０μｇ／ｍＬペプスタチンで処理した。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０カラム（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を用いて処理した培地を濃縮し、その後１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離した。Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（登録商標）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に移した後、ＰＢＳと３％ＢＳＡでブロットを遮断し、ウサギポリクローナル抗ＴｙｒＲＳ抗体と共にインキュベートした。洗浄後、ＴｙｒＲＳの検出のために、ブロットを１：４０００希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）と共にインキュベートした。
【０１９１】
採集したＵ−９３７細胞を最初に氷冷ＰＢＳで２回洗い、次に２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｍＭジチオトレイトール、０．１％ＣＨＡＰＳ、２ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、２０μｇ／ｍＬロイペプチン、及び１０μｇ／ｍＬペプスタチンＡを含む溶解緩衝液に細胞を懸濁することによって細胞溶解産物を調製した。その後細胞を液体窒素中で３回凍結融解し、４℃で３０分間遠心分離した。
【０１９２】
ヒトＴｙｒＲＳに対するポリクローナル抗体による細胞上清分画の蛋白質免疫ブロット分析は、アポトーシス腫瘍細胞からは完全長ＴｙｒＲＳが分泌されるが、正常条件下の細胞からは分泌されないことを明らかにした（図７Ａ）。アポトーシス条件下で、分泌されるヒト完全長ＴｙｒＲＳの量はインキュベーション時間と共に上昇した（図７Ｂ）。無血清培地での２４時間の増殖後、総天然ＴｙｒＲＳの５０％以上が細胞から放出された。同様の割合の成熟ＥＭＡＰ　ＩＩが同じ条件下でＵ−３９７細胞から分泌される（Ｋａｏら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５１０６−１９）。
【０１９３】
ＴｙｒＲＳの見かけ分泌が細胞溶解によるものである可能性を排除するため、上清中の細胞質ゾル乳酸デヒトロゲナーゼ（ＬＤＨ）の活性を測定した。ＬＤＨ活性は、ＣｙｔｏＴｏｘ９６　Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ　Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて分光測光法で測定した。上清中のＬＤＨ活性は細胞抽出物中の活性の１０％未満であり、７２時間のインキュベーション後も上昇しなかった。これらの結果は、上清中のＴｙｒＲＳの上昇が蛋白質分泌によるものであるという仮説と一致する。
【０１９４】
無傷細胞についての試験としてトリパンブルー除去法を用いて「分泌」アポトーシス細胞の透過性も検討した。アポトーシス細胞は染料を吸収せず、細胞溶解がアポトーシス細胞上清におけるＴｙｒＲＳ発現の原因ではなかったことを示唆した。さらなる対照として、ヒトＴｙｒＲＳのサイトカイン様モチーフを持たないヒトアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＡｌａＲＳ）を分泌の可能性に関して検討した。蛋白質免疫ブロット分析は、同じアポトーシス条件下で、ＡｌａＲＳが分泌されなかったことを示した。アポトーシスＵ−９３７細胞の上清又は細胞抽出物中の他の４つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの活性も検討した。ウシｔＲＮＡによるアッセイにおいて細胞抽出物を使用したとき、アラニン、イソロイシン、リシン、バリン、及びチロシンについてのみアミノアシル化が認められた。これに対し、上清を使用したときには、チロシンだけがアミノアシル化された。
【０１９５】
実施例６
ＰＭＮエラスターゼによるヒトＴｙｒＲＳの開裂
完全長ＴｙｒＲＳが、ＰＭＮから放出されるプロテアーゼ、ＰＭＮエラスターゼ（Ｗｒｉｇｈｔら、１９９２、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．４８：３４４−５５）によって開裂できるかどうかを調べるため、完全長ＴｙｒＲＳを、１：３０００のプロテアーゼ：蛋白質比でＰＢＳ（ｐＨ７．４）中のＰＭＮエラスターゼにより３７℃で３０分間処理した。開裂後、試料を未処理ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン、及びヒト伸長ＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメインと共に１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離した。実施例５で述べたように免疫ブロット分析を実施した。
【０１９６】
図８Ａに示すように、完全長ＴｙｒＲＳにＰＭＮエラスターゼを添加すると〜４０ｋＤ断片と〜２４ｋＤ断片の対を生じた。〜４０ｋＤ断片はミニＴｙｒＲＳと同様の分子量を持つ。〜４０ｋＤ断片の配列分析は、ヒト完全長ＴｙｒＲＳと同様に、各々がＭ−Ｇ−Ｄ−Ａ−Ｐ（配列番号５６）のアミノ末端配列を持つことを明らかにした。図８Ｂは、ヒトプロ−ＥＭＡＰ　ＩＩとヒト完全長ＴｙｒＲＳの、それらの開裂部位に近い領域における局所配列比較を示す。
【０１９７】
免疫ブロット分析はさらに、〜２４ｋＤ断片がカルボキシル末端ドメインであることを明らかにした。ＰＭＮエラスターゼによって認識される推定開裂部位をより厳密に再現するために組換え伸長ＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン（ヒト完全長ＴｙｒＲＳの残基３４４−５２８）を調製した。伸長ＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメインとＰＭＮエラスターゼの〜２４ｋＤ開裂産物の両方が、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で同様の位置に移動した（図８Ａ）。その後の実験は、伸長カルボキシル末端ドメインがＭＰとＰＭＮの両方の化学走性を誘導できることを明らかにした。組換え端部切除ミニＴｙｒＲＳ（ＴｙｒＲＳ残基１−３６４を含むミニＴｙｒＲＳと比較してヒト完全長ＴｙｒＲＳの残基１−３４４を含む）が化学誘引物質として働く能力を調べる実験において、端部切除されたミニＴｙｒＲＳはＰＭＮにとっての化学誘引物質として機能することができたが、ＭＰについては化学誘引物質として機能しなかった。
【０１９８】
ＰＭＮエラスターゼを放出するＩＬ−８刺激ＰＭＮにおいてインビボ開裂分析を実施した（Ｂｊφｒｎｌａｎｄら、１９９８、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１２：５３５−４０）。組換えヒト完全長ＴｙｒＲＳは、そのような細胞に加えたとき、〜４０ｋＤと〜２４ｋＤの断片に開裂された。完全長ＴｙｒＲＳを刺激していないＰＭＮに加えたときには、ＴｙｒＲＳの開裂を認めなかった。アミノ末端及びカルボキシル末端ドメインに特異的な抗体を用いた免疫ブロット分析は、〜４０ｋＤと〜２４ｋＤの断片がそれぞれミニＴｙｒＲＳとＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメインを含むことを示した。アポトーシスＵ−９３７細胞から分離した天然ＴｙｒＲＳをＩＬ−８刺激ＰＭＮに加えたときには、同じ〜４０ｋＤと〜２４ｋＤの断片が生成された。
【０１９９】
ヒト完全長ＴｙｒＲＳが２つの異なるサイトカインに分割されるとの所見は、蛋白質合成とシグナル伝達の間に結びつきが存在することを示唆する。原則として、アポトーシスにおける初期事象としての翻訳装置の必須成分の分泌は翻訳を停止させ、それによってアポトーシスを加速させると予想される。分泌されたＴｙｒＲＳサイトカインは細胞内シグナルトランスデューサーとして機能することができ、ＰＭＮを誘引し、その結果ＰＭＮエラスターゼの局所濃度を増幅する。この循環サイクルは分泌されたヒトＴｙｒＲＳの開裂を高め、それによってアポトーシス部位へのマクロファージの集積を増強して、細胞死体の除去を促進すると考えられる。
【０２００】
実施例７
ヒト以外のＴｙｒＲＳのサイトカイン活性
実施例３に示すように、ヒトミニＴｙｒＲＳのＥＬＲモチーフは、α−ケモカインにおけると同様に、ＰＭＮレセプタ結合において重要な役割を果たす。α−ケモカインの重要なＥＬＲモチーフは哺乳類ＴｙｒＲＳ分子間で保存されるが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの対応する配列エレメントはＮＹＲであり、大腸菌ＴｙｒＲＳの対応する配列エレメントはＥＴＶである（図９）。大腸菌ＴｙｒＲＳはＰＭＮ上のＩＬ−８レセプタを活性化せず、結合もしない（実施例２参照）。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳのＰＭＮレセプタ結合及びＰＭＮ移動への作用は上述したように検討した（実施例２及び４参照）。
【０２０１】
実施例４に示すように、ヒトミニＴｙｒＲＳとＰＭＮの結合はＩＬ−８と厳密に競合する。この結合は、ＩＬ−８のＡ型レセプタに対して８ｎＭの解離定数Ｋｄで起こる。ＰＭＮとの１２５Ｉ−ミニＴｙｒＲＳのインキュベーションは４℃で用量依存的な特異結合を導いた。図１０に示すように、１２５Ｉ−ミニＴｙｒＲＳの結合は過剰量の非標識ミニＴｙｒＲＳの存在によって阻害されるが、過剰量の大腸菌ＴｙｒＲＳによっては阻害されない。大腸菌ＴｙｒＲＳと異なって、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳはＰＭＮへの１２５Ｉ−ミニＴｙｒＲＳの結合を阻害した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳについての解離定数はヒトミニＴｙｒＲＳについての解離定数よりも２００倍以上は高くないと思われる。これらの結果は、下等真核生物ＴｙｒＲＳはヒトミニＴｙｒＲＳについてのＰＭＮレセプタに結合しうるが、細菌ＴｙｒＲＳは結合できないことを明らかにしている。
【０２０２】
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳのＰＭＮへの結合がサイトカイン活性に関連するかどうかを調べるため、ヒトミニＴｙｒＲＳ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳ、及び大腸菌ＴｙｒＲＳの化学走性作用を検討した。図１１に示すように、ヒトミニＴｙｒＲＳとのＰＭＮのインキュベーションはＰＭＮ移動の誘導を導いた。これに対し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳ又は大腸菌ＴｙｒＲＳのいずれに関しても化学走性を認めなかった。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳの潜在的サイトカイン活性を０．１、１、１０、１００、及び１０００ｎＭの濃度で検討した。しかしながら、いずれの濃度でも有意の化学走性を認めなかった（図１１は１ｎＭの濃度での結果を示す）。それ故、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳのＰＭＮへの結合は偶発発見的な（ｓｅｒｅｎｄｉｐｉｔｏｕｓ）サイトカイン機能を伴っていない。
【０２０３】
原核生物の対応物では認められない多くの残基やモチーフが真核生物ＴｙｒＲＳ分子間で保存されているので、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳのＰＭＮへの結合はヒトミニＴｙｒＲＳとの構造的類似性を反映していると考えられる。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳがＩＬ−８様のサイトカイン活性を持たない１つの理由は、重要なＥＬＲモチーフの配列の変異（ＮＹＲ）に帰せられると考えられる。実施例３に示すように、ミニＴｙｒＲＳのＥＬＲモチーフにおける簡単な変化がそのＩＬ−８様活性を不活性化した。これに関して、原核及び真核生物細胞質ＴｙｒＲＳ分子が、それらのそれぞれのｔＲＮＡ配列の種特異的な相違を識別するために必要なペプチドモチーフの配列変異の故に、それぞれのチロシンｔＲＮＡを交差アミノアシル化できないことは注目すべきである（Ｗａｋａｓｕｇｉら、前出）。従って、ヒトＴｙｒＲＳのサイトカイン及びＲＮＡ関連活性のいずれもが、ほとんどの微妙な配列変異に対して感受性である。
【０２０４】
実施例８
ヒトミニＴｙｒＲＳについての二量体構造
原核及び下等真核生物ＴｙｒＲＳ分子は安定な二量体を形成する（Ｑｕｉｎｎら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３４：１２４８９−９５）。ヒトミニＴｙｒＲＳのサイトカイン活性がそのオリゴマー状態によるものであり、この状態が原核及び下等真核生物相同体のものとは異なる可能性を検討した。ミニＴｙｒＲＳのオリゴマー状態を調べるため、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ　６　ＨＲ　１０／３０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）でのゲルろ過クロマトグラフィーによってミニＴｙｒＲＳの分子量を検定した。サイログロブリン、ウシγグロブリン、ニワトリオボアルブミン、ウマミオグロビン、及びビタミンＢ−１２を含むゲルろ過標準品（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した。大腸菌ＴｙｒＲＳ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳのゲルろ過を対照として検査した。ヒトミニＴｙｒＲＳは、大腸菌及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳと同じ位置で溶出し、推定分子量９０ｋＤａであった。この数値は二量体形態について予想されるもの（８４ｋＤａ）と緊密に対応する。
【０２０５】
ＮＭＲ又はｘ線解析の実験条件下で、天然ＩＬ−８は二量体である（ＣｌｏｒｅとＧｒｏｎｅｎｂｏｒｎ、前出）。しかし、生理的により適切な濃度では、ＩＬ−８の単量体と二量体形態は平衡しており、単量体が優勢な形態である（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３３：１２７４１−４５）。二量体化欠損ＩＬ−８類似体を化学修飾によって又は二量体インターフェイスの残基の突然変異によって構築した（Ｌｏｗｍａｎら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ．６：５９８−６０８）。それらの構造分析は、ＩＬ−８単量体が二量体と同じ三次構造フォールディングを持つことを明らかにした（同上）。さらに、それらの機能分析は、単量体がインビトロ及びインビボで完全なサイトカイン活性を持つことを示した（同上）。他方で、ＩＬ−８の二量体形態を模倣するため、架橋一本鎖二量体を設計した（Ｌｅｏｎｇら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ．６：６０９−１７）。化学走性及びレセプタ結合アッセイの結果は、生物活性にとって二量体の解離は必要ないことを示した（同上）。それ故、ＩＬ−８の二量体化はその三次構造フォールディング又は活性にとっての構造的制約をもたらさない。同様に、ＩＬ−８様活性のために必要なＥＬＲモチーフは、ヒトミニＴｙｒＲＳについてここで認められた二量体構造においてアクセス可能である。
【０２０６】
実施例９
ＥＭＡＰ　ＩＩ様ドメインから誘導したペプチドのサイトカイン活性
ヒト成熟ＥＭＡＰ　ＩＩのアミノ末端近くの７個の残基を含む合成ペプチド（Ｒ−Ｉ−Ｇ−Ｒ−Ｉ−Ｉ−Ｔ；配列番号２６）はＰＭＮ又はＭＰの移動を誘導することができる（Ｋａｏら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９７７４−８２）。ＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメインの対応する領域から誘導した合成ペプチド（Ｒ−Ｖ−Ｇ−Ｋ−Ｉ−Ｉ−Ｔ；配列番号２４；図１２）のサイトカイン活性をＰＭＮ及びＭＰ移動アッセイにおいて検討した。化学走性アッセイを実施例２で述べたように実施した。そのようなアッセイで使用するペプチドを合成し、高速液体クロマトグラフィーによって精製して、Ｇｅｎｏｓｙｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）による質量分析によって分析した。ＥＭＡＰ　ＩＩ由来のペプチドを調製する際に、合成ペプチドの安定性と溶解度を高めるためにシステイン残基をアルギニン残基で置換した（図１２）。この置換は、Ｋａｏら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９７７４−８２が明らかにしたように、ＥＭＡＰ　ＩＩペプチドの生物学的特性を変化させなかった。
【０２０７】
図１３に示すように、ＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメインペプチドはＰＭＮの移動（白い棒）とＭＰの移動（灰色の棒）を誘導した。ＰＭＮ及びＭＰの移動へのＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメインペプチドの作用は、成熟ＥＭＡＰ　ＩＩペプチドの作用と同様の用量依存性を示した。従って、ＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメインと成熟ＥＭＡＰ　ＩＩは、それぞれの配列内の同じ位置に化学走性についての同様のペプチドモチーフを共有する。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａｒｃ１ｐとＣ．ｅｌｅｇａｎｓ　ＭｅｔＲＳの部分はＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメインと高い配列相同性を持つ（Ｋｌｅｅｍａｎら、前出；Ｓｉｍｏｓら、１９９８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　１：２３５−４２）。ＥＭＡＰ　ＩＩのＲ−Ｉ−Ｇ−Ｒ−Ｉ−Ｉ−Ｔペプチドに対応する合成ペプチドとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａｒｃ１ｐ（Ｒ−Ｖ−Ｇ−Ｆ−Ｉ−Ｑ−Ｋ；配列番号２８）及びＣ．ｅｌｅｇａｎｓ　ＭｅｔＲＳ（Ｒ−Ｖ−Ｇ−Ｒ−Ｉ−Ｉ−Ｋ；は２７）から誘導した合成ペプチドのサイトカイン活性も、ＰＭＮ及びＭＰ移動アッセイにおいて検討した。図１３に示すように、いずれのペプチドもＰＭＮ又はＭＰの移動を誘導しなかった。それ故、ヒト成熟ＥＭＡＰ　ＩＩとＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメインのサイトカイン活性は高度に特異的なペプチド配列によって規定される。
【０２０８】
ＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメインからのＲ−Ｖ−Ｇ−Ｋ−Ｉ−Ｉ−Ｔモチーフに対応するペプチド内の一部のアミノ酸残基は、原核生物及び真核生物の他の蛋白質間で高度に保存されている（表Ｉ）。しかし、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａｒｃ１ｐ又はＣ．ｅｌｅｇａｎｓ　ＭｅｔＲＳから誘導されるヘプタペプチドはＥＭＡＰ　ＩＩ様のサイトカイン活性を有していなかった。従って、これらの蛋白質におけるＥＭＡＰ　ＩＩ様モチーフは元来別の生物学的機能に関連していたと考えられる。ヒトＥＭＡＰ　ＩＩ及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　Ａｒｃ１ｐはｔＲＮＡに結合することが知られているので（Ｓｉｍｏｓら、前出）、ＥＭＡＰ　ＩＩ様モチーフはもともとＲＮＡ結合のために発生したと考えられる。Ａｑｕｉｆｅｘ　ａｅｏｌｉｃｕｓからのＥＭＡＰ　ＩＩ様Ｔｒｂｐ１１１の構造特異的ｔＲＮＡ結合活性はこの可能性に合致する（Ｍｏｒａｌｅｓら、１９９９、ＥＭＢＯ　Ｊ．１８：３４７５−８３）。
【０２０９】
これらの結果は、真核生物ＴｙｒＲＳ分子が、それらの長い進化の間を通じて、余分なドメインの付加によって又は突然変異の集積によって「サイトカイン」機能を獲得した可能性があることを示唆する。Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ及びＰｏｄｏｓｐｏｒａ　ａｎｓｅｒｉｎａのミトコンドリアＴｙｒＲＳ分子も他の機能（すなわちＲＮＡスプライシングの触媒）を有することは注目に値する（Ｋａｍｐｅｒら、１９９２、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：４９９−５１１）。これらの蛋白質は、他のミトコンドリアＴｙｒＲＳ分子と比較すると、それらのアミノ末端とカルボキシ末端に付属ドメインを含み、これらの付属ドメインはスプライシングにとって重要である（Ｋｉｔｔｌｅら、１９９１、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．５：１００９−２１）。それ故、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの分子進化の間に、これらの古くからの酵素が新しい機能を獲得したように、新しいドメインの付加と除去が頻繁に起こってきたと考えられる。
【０２１０】
実施例１０
ヒトミニＴｙｒＲＳの一次構造
ヒトミニＴｙｒＲＳは、より典型的なα−ケモカインとは一次構造が異なる。例えば、ミニＴｙｒＲＳはレセプタ結合にとって極めて重要なＥＬＲモチーフを含むが、このモチーフはチロシンアデニレートの合成のための部位を形成するロスマンフォールドの真ん中にある。これに対し、α−ケモカインのＥＬＲモチーフはアミノ末端近くに位置する。また、α−ケモカインは保存されたシステイン及びＣｙｓ−Ｘａａ−Ｃｙｓモチーフ（Ｘａａは何らかの残基である）を持つが、ミニＴｙｒＲＳは保存残基を共有しない。これらの一次構造の違いにもかかわらず、ヒトミニＴｙｒＲＳは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓＴｙｒＲＳの結晶構造に基づき（Ｂｒｉｃｋら、１９８９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０８：８３−９８）、α−ケモカインと同じ６本鎖のβ−シートを形成すると推定される（図１４）。さらに、ヒトミニＴｙｒＲＳのＥＬＲモチーフの推定位置はα−ケモカインのものに近い（ＣｌｏｒｅとＧｒｏｎｅｎｂｏｒｎ，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１７：６１１−２０）。
【０２１１】
長いアミノ末端セグメントがミニＴｙｒＲＳのＥＬＲ領域の前に存在する。ここで検討した酵母や細菌蛋白質でも同じ伸長が起こるので、この伸長の存在又は不在はヒトミニＴｙｒＲＳの独自のサイトカイン活性を説明することができない。ＥＬＲを含むケモカインの多くが、ケモカインを活性化するように開裂されるアミノ末端伸長を持つ（Ｂｒａｎｄｔら、１９９１、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　３：３１１−２１）。これらのアミノ末端伸長はＥＬＲモチーフへのアクセスを遮断すると考えられ、それが伸長を取り除いたときに活性化が起こる理由である。しかし、ミニＴｙｒＲＳの構造モデルのアミノ末端領域は物理的にＥＬＲモチーフを遮断せず、それ故この領域はサイトカインの活性化のためにアクセス可能なはずである。この結論と一致して、ＩＬ−８のアミノ末端とＦａｂ断片を含む融合蛋白質を用いた実験では、ＩＬ−８レセプタへの特異的結合はＩＬ−８を介した化学走性作用を誘導し、ミエロペルオキシダーゼの放出を刺激した（Ｈｏｌｚｅｒら、１９９６、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ　８：２１４−２１）。
【０２１２】
実施例１１
ヒトＴｙｒＲＳによる内皮細胞移動の誘導
ＩＬ−８のような、ＥＬＲモチーフを含むすべてのα−ケモカインが血管新生因子として働く（Ｓｔｒｉｅｔｅｒら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２７３４８−５７）。これに対し、ＥＬＲモチーフを欠くα−ケモカインは血管新生抑制因子として作用する（同上）。ＥＬＲモチーフを含むＴｙｒＲＳの血管新生作用を評価するため、完全長ＴｙｒＲＳとヒトミニＴｙｒＲＳを、最初に内皮細胞移動を誘導する能力に関して検討した。そのような血管新生アッセイは、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を用いて実施した。供給者の指示に従って３７℃で６％ＣＯ２の大気下に、細胞をＥＧＭ−２（登録商標）ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）に保持した。
【０２１３】
細胞移動アッセイは、ポリカーボネート膜（８．０μｍの孔サイズ）（Ｃｏｓｔａｒ　Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）と修正ボイデンチェンバー（６．５ｍｍ　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｓ）を用いて実施した（Ｍａｓｏｏｄら、１９９９、Ｂｌｏｏｄ　９３：１０３８−４４）。ウエルをＰＢＳ中２５μｇ／ｍＬのヒトフィブロネクチン（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ）で一晩被覆し、その後空気乾燥させた。ＨＵＶＥＣを、０．１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を含むダルベッコ修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、Ｇａｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に懸濁し、２×１０５細胞／ウエルをチェンバー上部に加えた。化学走性刺激（５０ｎＭの所与のＴｙｒＲＳ分子又は０．５ｎＭのヒト血管内皮細胞成長因子−１６５（ＶＥＧＦ１６５）（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，ＣＡ））をチェンバー下部に入れ、６％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で６時間、細胞を移動させた。インキュベーション後、非移動細胞を綿棒でＴｒａｎｓｗｅｌｌ膜の上面から除去し、下面に付着した移動細胞をメタノールに固定して、Ｈｅｍａｃｏｌｏｒ（登録商標）染色キット（ＥＭ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）で視覚化した。移動細胞をハイパワーフィールド（ＨＰＦ）で計数した。ＨＵＶＥＣをチェンバーに入れる前に、阻害因子と共に培地に３０分間懸濁した。図１６に示す各々の測定値は９回のＨＰＦ測定の平均値である。
【０２１４】
図１６に示すように、ヒトミニＴｙｒＲＳは、陽性対照ＶＥＧＦ１６５と同様にＨＵＶＥＣ化学走性の誘導を刺激した。これに対し、ヒト完全長ＴｙｒＲＳ又はヒトミニＴｙｒＲＳ突然変異体（保存ＥＬＲモチーフの変わりにＥＬＱを含む）に関しては化学走性を認めなかった。ミニＴｙｒＲＳが内皮細胞の指令された移動を誘導する能力は、ミニＴｙｒＲＳがインビボでも血管新生を誘導しうるという概念を裏付けた。
【０２１５】
実施例１２
ヒトＴｙｒＲＳによるインビボでの血管新生の誘導
ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）においてインビボでの血管新生アッセイを実施した（Ｎｉｃｏｌａｏｕら、１９９８、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．６：１１８５−２０８）。１０日齢のヒナの胚をＭｃｉｎｔｙｒｅ　Ｐｏｕｌｔｒｙ（Ｌａｋｅｓｉｄｅ，ＣＡ）より購入し、３７℃、７０％湿度でインキュベートした。小さなクラフトドリル（Ｄｒｅｍｅｌ，Ｅｍｅｒｓｏｎ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ，Ｒａｃｉｎｅ，ＷＩ）で卵の先端の気嚢に直接小さな穴をあけた。胚の血管に直接第二の穴をあける位置を決めるため、胚を明かりに透かして調べた。最初の穴に負の圧を適用して、絨毛尿膜（ＣＡＭ）を外皮膜から引き離し、偽気嚢を創造した。落下したＣＡＭ上の卵殻に窓を作り、ＣＡＭを実験操作のために直接アクセスできるようにした。酢酸コルチゾンで処理した５ｍｍフィルターディスクを個々の蛋白質試料（２５ｎｇのＶＥＧＦ１６５又は２５０ｎｇの所与のＴｙｒＲＳ分子）で浸漬し、比較的既存の血管がないＣＡＭにフィルターディスクを直接加えた。滅菌テープで窓を密封し、３７℃でインキュベートした。インキュベーションの０、２４、及び４８時間後、３μｇのインターフェロン−α誘導性蛋白質（ＩＰ−１０）（Ｒ　＆　Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）をフィルターディスクに局所適用した。７２時間後、フィルターディスクに結合したＣＡＭ組織を採集し、立体顕微鏡を用いて定量した。血管新生を、フィルターディスクの規定区域内の目に見える血管分岐点の数として評価した。図１７に示す各々の測定値は５から８個の胚からの平均値である。
【０２１６】
図１７に示すように、ヒトミニＴｙｒＲＳは、陽性対照であるヒトＶＥＧＦ１６５と同様に血管新生を誘導した。さらに、ミニＴｙｒＲＳとＶＥＧＦ１６５によって刺激された血管新生は、血管新生抑制性α−ケモカイン、ＩＰ−１０によって阻害された。ヒトミニＴｙｒＲＳ突然変異体はインビボで血管新生を誘導することができず、ミニＴｙｒＲＳのＥＬＲモチーフは、このモチーフがα−ケモカインの血管新生活性のために重要であるのと同程度に、血管新生にとって重要であることを示唆した。
【０２１７】
実施例１３
細胞増殖へのヒトＴｒｐＲＳの血管新生抑制作用
ヒト細胞におけるミニＴｒｐＲＳの発現はインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の添加によって高度に刺激される（Ｓｈａｗら、１９９９、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　２０：９８４−９３）。α−ケモカインＩＰ−１０（インターフェロン−γ誘導性蛋白質）及びＭＩＧ（インターフェロン−γによって誘導されるモノカイン）の発現もＩＦＮ−γによって増強されることが示された（Ｋａｐｌａｎら、１９８７、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１０９８−１０８；Ｆａｒｂｅｒ，１９９３、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９２：２２３−３０）。これらのα−ケモカインはＥＬＲモチーフを欠き、インビトロ及びインビボで血管新生抑制因子として機能する（Ｓｔｒｉｅｔｅｒら、前出）。哺乳類ＴｒｐＲＳ分子中に、ＥＬＲモチーフの代わりにロスマンヌクレオチド結合フォールドとＤＬＴ配列が存在することは、哺乳類ＴｒｐＲＳ分子が血管新生抑制因子として機能しうることを示唆する。
【０２１８】
ＴｒｐＲＳの血管新生抑制作用を、最初にヒト完全長ＴｒｐＲＳとヒトミニＴｒｐＲＳがヒトＶＥＧＦ１６５誘導の細胞増殖を抑制する能力を調べる実験において評価した。組織培養処理した９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｃｏｓｔａｒ　Ｃｏｒｐ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を０．１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）で一晩被覆した。次に熱不活化胎児ウシ血清（ＦＢＳ）（１０％、Ｓｉｇｍａ）とペニシリン／ストレプトマイシン（１００単位／ｍＬ−１００μｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中５×１０３細胞／ウエルの密度でゼラチン被覆プレートに細胞を接種した。翌日、２ｎＭ　ＶＥＧＦ１６５の存在下に２μＭの所与のＴｒｐＲＳで細胞を処理した。７２時間のインキュベーション後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）水性１溶液細胞増殖アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてアッセイを行った。阻害アッセイの結果をＶＥＧＦ１６５の正味増殖のパーセンテージとして図１８に示す。示されている各々の測定値は５回の実験の平均値である。
【０２１９】
図１８に示すように、ヒト完全長ＴｒｐＲＳは血管新生抑制作用を示さず、ヒトミニＴｒｐＲＳはヒトＶＥＧＦ１６５誘導の細胞増殖を阻害することができた。
【０２２０】
実施例１４
内皮細胞移動へのヒトＴｒｐＲＳの血管新生抑制作用
次に、ヒト完全長ＴｒｐＲＳとヒトミニＴｒｐＲＳがヒトＶＥＧＦ１６５誘導又はヒトミニＴｙｒＲＳ誘導の細胞移動を阻害する能力を調べる実験においてＴｒｐＲＳの血管新生抑制作用を評価した。細胞移動アッセイは、ＶＥＧＦ１６５誘導又はミニＴｙｒＲＳ誘導のＨＵＶＥＣ試料に加えた完全長ＴｒｐＲＳ又はミニＴｒｐＲＳに関して、実施例１１で述べたように実施した。ＨＵＶＥＣ試料を０．５ｎＭ　ＶＥＧＦ１６５、５０ｎＭミニＴｙｒＲＳ、及び５００ｎＭの所与のＴｒｐＲＳで処理した。各々の蛋白質について４回の化学走性の測定を行った。図１９に示す各々の測定値は９回のＨＰＦ測定の平均値である。
【０２２１】
図１９に示すように、ヒトミニＴｒｐＲＳはヒトＶＥＧＦ１６５誘導及びヒトミニＴｙｒＲＳ誘導のＨＵＶＥＣ化学走性を阻害した。これに対し、ヒト完全長ＴｒｐＲＳはＶＥＧＦ１６５誘導又はミニＴｙｒＲＳ誘導のＨＵＶＥＣ化学走性に作用を及ぼさなかった。
【０２２２】
実施例１５
インビボでの血管新生へのヒトＴｒｐＲＳの血管新生抑制作用
ヒト完全長ＴｒｐＲＳ及びヒトミニＴｒｐＲＳの血管新生抑制作用を、ヒナＣＡＭで実施したインビボ血管新生アッセイにおいても分析した。インビボ血管新生アッセイは、ＶＥＧＦ１６５誘導又はミニＴｙｒＲＳ誘導のＣＡＭ組織に加えた３μｇの完全長ＴｒｐＲＳ又はミニＴｒｐＲＳに関して、実施例１２で述べたように実施した。
【０２２３】
図２０に示すように、ヒトＶＥＧＦ１６５及びヒトミニＴｙｒＲＳの血管新生作用はヒトミニＴｒｐＲＳによって阻害された。ヒト完全長ＴｒｐＲＳは認められる血管新生抑制作用を有していなかった。
【０２２４】
実施例１６
Ｕ−９３７細胞からのヒトＴｒｐＲＳの分泌
実施例５に示すように、ＴｙｒＲＳは、アポトーシス腫瘍細胞がＰＭＮエラスターゼによって開裂されてミニＴｙｒＲＳとＥＭＡＰ　ＩＩ様カルボキシルドメインを放出しうる場合に、アポトーシス腫瘍細胞から分泌される。これに対し、ＡｌａＲＳ、ＬｙｓＲＳ、ＩｌｅＲＳ、及びＶａｌＲＳを含めたいくつかの他のｔＲＮＡシンテターゼは同じ条件下で分泌されないことが認められた。
【０２２５】
ＴｒｐＲＳがこれらの条件下で分泌されうるかどうかを調べるため、Ｕ−９３７細胞を用いた分泌アッセイを実施例５で述べたように実施した。ポリクローナル抗ＴｒｐＲＳ抗体を使用したウエスタンブロット分析によって細胞上清を検査した。
【０２２６】
図２１に示すように、ヒト完全長ＴｒｐＲＳはアポトーシスＵ−９３７細胞から分泌されたが、正常（すなわち血清）条件下に維持したＵ−９３７細胞からは分泌されなかった。完全長ＴｒｐＲＳから生成されるミニＴｒｐＲＳの量が比較的少ないため、ヒトミニＴｒｐＲＳもアポトーシス腫瘍細胞から分泌されるかどうかを調べることはできなかった。
【０２２７】
実施例１７
ＰＭＮエラスターゼによるヒトＴｒｐＲＳの開裂
ＰＭＮエラスターゼによるヒト完全長ＴｒｐＲＳの開裂を、実施例６で述べたのと同様の手順を用いて検討した。ＴｒｐＲＳを１：３０００のプロテアーゼ：蛋白質比で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中ＰＭＮエラスターゼによって０、１５、３０、又は６０分間処理した。開裂後、試料を１２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析した。図２２に示すように、５４ｋＤａの完全長ＴｒｐＲＳのＰＭＮエラスターゼによる開裂は、４７ｋＤａのメジャー断片と４４ｋＤａのマイナー断片を生じた。いずれの断片も４９ｋＤａのミニＴｒｐＲＳ断片と同様の大きさであった。
【０２２８】
組換えＴｒｐＲＳ蛋白質のカルボキシル末端Ｈｉｓ６−タグに対する抗体によるウエスタンブロット分析は、両断片がそれらのカルボキシル末端にＨｉｓ６−タグを持つことを明らかにした。従って、２つのＴｒｐＲＳ断片のアミノ末端だけが端部切除されていた。ＴｒｐＲＳ断片のアミノ末端配列を、ＡＢＩ　４９４型シーケンサーを用いてエドマン分解法によって決定した。これらの断片の配列決定は、アミノ末端配列がＳ−Ｎ−Ｈ−Ｇ−Ｐ（配列番号５７）及びＳ−Ａ−Ｋ−Ｇ−Ｉ（配列番号５８）であることを示し、メジャー及びマイナーＴｒｐＲＳ断片のアミノ末端残基がそれぞれ完全長ＴｒｐＲＳの７１位と９４位に位置することを示唆した。
【０２２９】
メジャー及びマイナーＴｒｐＲＳ断片の血管新生抑制作用をＨＵＶＥＣ増殖、ＨＵＶＥＣ移動、及びニワトリＣＡＭのインビボ血管新生アッセイにおいて分析した（実施例１３から１５で述べたように）。これらのアッセイで使用するためにメジャー及びマイナーＴｒｐＲＳ断片の組換え形態を調製した。図２３に示すように、メジャーＴｒｐＲＳ断片（スーパーミニＴｒｐＲＳと称する）はＶＥＧＦ１６５刺激又はヒトミニＴｙｒＲＳ刺激の血管新生を抑制することができた。スーパーミニＴｒｐＲＳもＨＵＶＥＣの増殖と移動を阻害することができた。それ故、完全長ＴｒｐＲＳのＰＭＮエラスターゼ消化の主要産物は血管新生抑制作用を持つ。これに対し、マイナーＴｒｐＲＳ断片（不活性ＴｒｐＲＳと称する）は血管新生抑制作用を示さなかった。
【０２３０】
実施例１８
ヒトミニＴｒｐＲＳの一次構造
血管新生性ミニＴｙｒＲＳ及び血管新生抑制性ミニＴｒｐＲＳ及びスーパーミニＴｒｐＲＳは、密接に類似したロスマン結合フォールドドメイン内に包埋されたそれぞれのＥＬＲ及びＤＬＴモチーフを持つ。これまでの実験で、ＥＬＲモチーフを有するα−ケモカインは血管新生因子として働き、ＥＬＲモチーフを欠くα−ケモカインは血管新生抑制因子として働くことが示された（Ｓｔｒｉｅｔｅｒら、前出）。血管新生性（ＥＬＲ）と血管新生抑制性（非ＥＬＲ）α−ケモカインの生物学的バランスが血管新生を調節すると思われる（同上）。例えば、抗腫瘍形成性ＩＦＮ−γはＩＰ−１０及びＭＩＧ（血管新生抑制性α−ケモカイン）の産生を誘導し、同時にＩＬ−８（血管新生性α−ケモカイン）の発現を減衰させる（Ｇｕｓｅｌｌａら、１９９３、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２７２５−３２）。同様に、一部の細胞系統ではＩＦＮ−γの存在下でＴｒｐＲＳが高度に発現される。
【０２３１】
哺乳類ＴｒｐＲＳはセマホリン−Ｅ（ｓｅｍａｐｈｏｒｉｎ−Ｅ）及びニューロピリン−２（ｎｅｕｒｏｐｉｌｉｎ−２）とある程度の配列類似性を共有する（図２４及び２５）。ニューロピリンは、全く異なる作用を有する２つの無関係なリガンド：血管新生因子、ＶＥＧＦ１６５と神経誘導のメディエイターであるセマホリンについてのレセプタである（Ｃｈｅｎら、１９９８、Ｎｅｕｒｏｎ　２１：１２７３−８２；Ｎｅｕｆｅｌｄら、１９９９、ＦＡＳＥＢ　Ｊ．１３：９−２２）。セマホリン−Ｅはまたニューロピリン−２のリガンドでもあり、セマホリンはＶＥＧＦ１６５のニューロピリンへの結合を遮断できることが示された（Ｃｈｅｎら、前出）。セマホリン−Ｅの一部とＴｒｐＲＳの配列類似性は、ヒトミニＴｒｐＲＳとヒトスーパーミニＴｒｐＲＳがニューロピリン−２に結合し、それによってニューロピリン−２へのＶＥＧＦ１６５の結合を阻害することを示唆する。ニューロピリン−２とＴｒｐＲＳ間で共有される配列類似性は、ニューロピリン−２の二量体化に必要なニューロピリン−２のｃドメイン内に位置するので（Ｃｈｅｎら、前出）（図２５）、ヒトミニＴｒｐＲＳ及びヒトスーパーミニＴｒｐＲＳはニューロピリン−２の二量体化を阻害すると考えられる。
【０２３２】
成熟ＥＭＡＰ　ＩＩは抗血管新生特性を備えるサイトカインであることが報告されている（Ｓｃｈｗａｒｚら、１９９９、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０：３４１−５４）。ヒトＴｙｒＲＳのカルボキシルドメインもＥＭＡＰ　ＩＩ様サイトカイン活性を有することが示された（実施例２参照）。血管新生抑制性ミニＴｒｐＲＳは、プレ−ｍＲＮＡの代替的スプライシングによって作製しうるか、若しくは実施例１７に示すように、ＰＭＮエラスターゼ開裂によって血管新生抑制性スーパーミニＴｒｐＲＳを生成することができる。ＰＭＮエラスターゼはヒト結腸直腸癌において存在し、腫瘍−宿主インターフェイスで特に豊富であることが示された（Ｂｊφｒｎｌａｎｄら、前出）。また、乳癌及び非小細胞肺癌細胞はインビトロでＰＭＮエラスターゼを分泌することが知られている（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、１９９６、Ｃｈｅｓｔ　１０９：１３２８−３４）。それ故、アポトーシス細胞から分泌されるヒトＴｙｒＲＳ及びＴｒｐＲＳは、腫瘍−宿主インターフェイスでＰＭＮエラスターゼによって開裂されると考えられる。開裂された酵素はその後、腫瘍の侵襲を調節する血管新生及び血管新生抑制因子として働くことができる。
【０２３３】
上記の開示は本発明の一部の特定実施形態を強調するものであり、それらと等価のすべての変更及び代替が添付の特許請求の範囲に示すような本発明の精神及び範囲内であることは明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】大腸菌ＴｙｒＲＳ、ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン、及びヒト成熟ＥＭＡＰ　ＩＩの図式的整列を示す。
【図２】ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン、ヒト成熟ＥＭＡＰ　ＩＩ、及び大腸菌ＴｙｒＲＳの、ＭＰ化学走性（白い棒）及びＭＰのＴＮＦα産生（灰色の棒）への作用を示す。
【図３】ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン、ヒト成熟ＥＭＡＰ　ＩＩ、及び大腸菌ＴｙｒＲＳの、ＭＰ組織因子産生（白い棒）及びＰＭＮのミエロペルオキシダーゼ放出（灰色の棒）への作用を示す。
【図４】ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン、ヒト成熟ＥＭＡＰ　ＩＩ、大腸菌ＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳ突然変異体、及びＩＬ−８のＰＭＮ化学走性への作用を示す。
【図５】ヒトミニＴｙｒＲＳ（配列番号１７）、大腸菌ＴｙｒＲＳ（配列番号１８）、ＩＬ−８（配列番号１９）、Ｇｒｏα（配列番号２０）、及びＮＡＰ−２（配列番号２１）の図式的部分整列を示す；ＴｙｒＲＳ内のロスマンヌクレオチド結合フォールドを分割する結合ポリペプチド１（ＣＰ１）を示している。
【図６】ＰＭＮに関して、非標識ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳ突然変異体、ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン、ヒト成熟ＥＭＡＰ　ＩＩ、大腸菌ＴｙｒＲＳ、ＩＬ−８、Ｇｒｏα、又はＮＡＰ−２をモル過剰で１２５Ｉ−ヒトミニＴｙｒＲＳと共に使用した競合アッセイの結果を示す。
【図７Ａ】正常条件下（通常培地（レーン１））及びアポトーシス条件下（無血清培地（レーン２））でのＵ−９３７細胞の増殖後の上清中の完全長ＴｙｒＲＳの免疫ブロット分析の結果を示す。
【図７Ｂ】アポトーシス条件下（無血清培地）でのＵ−９３７細胞の４、１２、又は２４時間の増殖後の上清（レーン１−３）、又は無血清培地で２４時間増殖したＵ−９３７細胞から分離した細胞抽出物からの上清中の完全長ＴｙｒＲＳの免疫ブロット分析の結果を示す。
【図８Ａ】ヒト完全長ＴｙｒＲＳ（レーン１）、ヒトミニＴｙｒＲＳ（レーン２）、ＴｙｒＲＳカルボキシル末端ドメイン（レーン３）、ヒトＴｙｒＲＳの伸長カルボキシル末端ドメイン（レーン４）、及びＰＭＮエラスターゼによる開裂後のヒト完全長ＴｙｒＲＳ（レーン５）の免疫ブロット分析の結果を示す。
【図８Ｂ】ヒトプロ−ＥＭＡＰ　ＩＩ（配列番号２２）及びヒト完全長ＴｙｒＲＳ（配列番号２３）についての開裂部位の図式的表示を示す。
【図９】ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳ、及び大腸菌ＴｙｒＲＳの図式的整列を示す。
【図１０】非標識ヒトミニＴｙｒＲＳ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳ、又は大腸菌ＴｙｒＲＳをモル過剰で１２５Ｉ−ヒトミニＴｙｒＲＳと共に使用した、ＰＭＮに関する競合アッセイの結果を示す。
【図１１】ヒトミニＴｙｒＲＳ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＴｙｒＲＳ、又は大腸菌ＴｙｒＲＳのＰＭＮ化学走性への作用を示す。
【図１２】ヒト完全長ＴｙｒＲＳ（配列番号２４）、ヒトＥＭＡＰ　ＩＩ（配列番号２５−２６）、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＭｅｔＲＳ（配列番号２７）、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡｒｃ１ｐ（配列番号２８）についてのヒトＥＭＡＰ　ＩＩ様ドメイン及び対応する合成ペプチドの図式的整列を示す。
【図１３】ヒトＴｙｒＲＳ、ヒトＥＭＡＰ　ＩＩ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓＭｅｔＲＳ、及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡｒｃ１ｐから誘導した合成ペプチドのＰＭＮ化学走性への作用を示す。
【図１４】ヒトミニＴｙｒＲＳ及びα−ケモカインの間の図式的比較を示す（各々のカルボキシル末端部分は省略されている）；β−シート（実線の矢印）及びＥＬＲモチーフ（円）の位置を示している。
【図１５】ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒト完全長ＴｒｐＲＳ、及びヒトミニＴｒｐＲＳの図式的整列を示す；カルボキシル末端及びアミノ末端付属ドメイン（斜線部分）を示している。
【図１６】ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ突然変異体、又はヒトＶＥＧＦのＨＵＶＥＣ化学走性への血管新生作用を示す。
【図１７】ヒト完全長ＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ、ヒトミニＴｙｒＲＳ突然変異体、ヒトミニＴｙｒＲＳ＋ＩＰ−１０、ヒトＶＥＧＦ、又はヒトＶＥＧＦ＋ＩＰ−１０の、１０日齢のヒナ胚のＣＡＭへの血管新生作用を示す。
【図１８】ヒト完全長ＴｙｒＲＳ又はヒトミニＴｙｒＲＳの内皮細胞増殖への血管新生作用を示す。
【図１９】ヒト完全長ＴｒｐＲＳ又はヒトミニＴｒｐＲＳの、ヒトＶＥＧＦ誘導又はヒトミニＴｙｒＲＳ誘導の内皮細胞移動への作用を示す。
【図２０】ヒトＶＥＧＦ又はヒトミニＴｙｒＲＳのヒナＣＡＭへの血管新生作用に対するヒト完全長ＴｒｐＲＳ又はヒトミニＴｒｐＲＳの作用を示す。
【図２１】ヒトＵ−９３７細胞からのヒトＴｒｐＲＳの分泌を示す免疫ブロット分析の結果を示す。
【図２２】ＰＭＮエラスターゼによるヒト完全長ＴｒｐＲＳの開裂を示す；ＴｒｐＲＳをＰＭＮエラスターゼに０分間（レーン１）、１５分間（レーン２）、３０分間（レーン３）、又は６０分間（レーン４）暴露した。
【図２３】ヒトＶＥＧＦ又はヒトミニＴｙｒＲＳのヒナＣＡＭへの血管新生作用に対するヒトスーパーミニＴｒｐＲＳの作用を示す。
【図２４】ヒトＴｒｐＲＳ（配列番号４５及び配列番号５１）、ウシＴｒｐＲＳ（配列番号４６及び配列番号５２）、マウスＴｒｐＲＳ（配列番号４７及び配列番号５３）、ウサギＴｒｐＲＳ（配列番号４８及び配列番号５４）、ヒトセマホリン−Ｅ（配列番号４９）、マウスセマホリン−Ｅ（配列番号５０）、及びマウスニューロピリン−２（配列番号５５）のアミノ酸配列類似性を示す。
【図２５】哺乳類ＴｒｐＲＳと配列類似性を共有するセマホリン−Ｅ及びニューロピリン−２の領域を示す（矢印で示している）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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