(57)【要約】本発明は、ORF2、3及び5によりコードされたウイルスタンパク質の特異的部位に対する核酸突然変異により弱毒化された生きた弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスに関する。本発明は更に、該ウイルスをコードしているヌクレオチド配列、このようなウイルスの作出法、及び該PRRSウイルスを含有する医薬組成物、並びにPRRSV感染症の予防及び治療のためのワクチンの製造における該PRRSウイルスの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6及びORF7を含む核酸によりコードされた弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスであり：
a)ORF2は、位置11915−11935に、下記表1に示したヌクレオチドの少なくとも1種：
2004534522.tif 000009
及び、位置12037−12057に、下記表2に示したヌクレオチドの少なくとも1種：
2004534522.tif 000010
及び、位置12058−12078に、下記表3に示したヌクレオチドの少なくとも1種：
2004534522.tif 000011
及び／もしくは、該位置(複数)に欠失を含み、並びに／又は
b)ORF3は、位置12660−12680に、下記表4に示したヌクレオチドの少なくとも1種：
2004534522.tif 000012
及び／もしくは、該位置(複数)に欠失を含み、並びに／又は
c)ORF5は、位置13684−13704に、下記表5に示したヌクレオチドの少なくとも1種：
2004534522.tif 000013
及び／もしくは、該位置(複数)に欠失を含むことを特徴とする、前記ウイルス。
【請求項２】
a)ORF2が、位置11925にC、AもしくはGを、及び／又は位置12047にC、TもしくはAを、及び／又は位置12068にA、CもしくはGを、又は該位置(複数)に欠失を含み、並びに／又は
b)ORF3が、位置12670にA、CもしくはGを、又は該位置に欠失を含み、並びに／又は
c)ORF5が、位置13694にG、AもしくはTを、又は該位置に欠失を含むことを特徴とする、請求項1記載の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス。
【請求項３】
前記核酸が更に：
a)該ORF2が、位置11925にCを、及び／又は位置12047にTを、及び／又は位置12068にCを、又は該位置(複数)に欠失を含み、並びに／又は
b)該ORF3が、位置12670にCを、又は該位置に欠失を含み、並びに／又は
c)該ORF5が、位置13694にTを、該位置に欠失を含むことを特徴とする、請求項1又は2記載の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス。
【請求項４】
前記核酸が更に：
a)該ORF2が、配列番号:1に定義された核酸を含み、及び／又は
b)該ORF3が、配列番号:2に定義された核酸を含み、及び／又は
c)該ORF4が、配列番号:3に定義された核酸を含み、及び／又は
d)該ORF5が、配列番号:4に定義された核酸を含み、
又はそれらの、断片、対立遺伝子変異体、機能変異体、縮重核酸コードを基にした変異体、融合分子又は化学誘導体であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項記載の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス。
【請求項５】
前記核酸が：
a)該ORF2が、配列番号:1に定義された核酸からなり、及び／又は
b)該ORF3が、配列番号:2に定義された核酸からなり、及び／又は
c)該ORF4が、配列番号:3に定義された核酸からなり、及び／又は
d)該ORF5が、配列番号:4に定義された核酸からなることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項記載の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス。
【請求項６】
前記核酸が、配列番号:5に定義された核酸、又はそれらの断片、対立遺伝子変異体、機能変異体、縮重核酸コードを基にした変異体、融合分子又は化学誘導体を含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項記載の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス。
【請求項７】
前記核酸が、配列番号:5に定義された核酸からなることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項記載の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス。
【請求項８】
前記核酸が更に：
a)該ORF2が、配列番号:6に定義された核酸を含み、及び／又は
b)該ORF3が、配列番号:7に定義された核酸を含み、及び／又は
c)該ORF4が、配列番号:8に定義された核酸を含み、及び／又は
d)該ORF5が、配列番号:9に定義された核酸を含み、
又は、それらの断片、対立遺伝子変異体、機能変異体、縮重核酸コードを基にした変異体、融合分子又は化学誘導体であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項記載の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス。
【請求項９】
前記核酸が：
a)該ORF2が、配列番号:6に定義された核酸からなり、及び／又は
b)該ORF3が、配列番号:7に定義された核酸からなり、及び／又は
c)該ORF4が、配列番号:8に定義された核酸からなり、及び／又は
d)該ORF5が、配列番号:9に定義された核酸からなることを特徴とする、請求項1〜3又は8のいずれか1項記載の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス。
【請求項１０】
弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスが：
a)ORF1aが、配列番号:10に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
b)ORF1bが、配列番号:11に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
c)ORF2が、配列番号:12に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
d)ORF3が、配列番号:13に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
e)ORF4が、配列番号:14に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
f)ORF5が、配列番号:15に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
g)ORF6が、配列番号:16に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
h)ORF7が、配列番号:17に定義されたアミノ酸を含み、
又は、それらの断片、対立遺伝子変異体、機能変異体、グリコシル化変異体、融合分子又は化学誘導体であることを特徴とする、前記PRRSウイルス。
【請求項１１】
前記PRRSウイルスが：
a)ORF1aが、配列番号:10に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
b)ORF1bが、配列番号:11に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
c)ORF2が、配列番号:12に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
d)ORF3が、配列番号:13に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
e)ORF4が、配列番号:14に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
f)ORF5が、配列番号:15に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
g)ORF6が、配列番号:16に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
h)ORF7が、配列番号:17に定義されたアミノ酸からなることを特徴とする、請求項10記載の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス。
【請求項１２】
弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスが：
a)ORF2が、配列番号:18に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
b)ORF3が、配列番号:19に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
c)ORF4が、配列番号:20に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
d)ORF5が、配列番号:21に定義されたアミノ酸を含み、
又は、それらの断片、対立遺伝子変異体、機能変異体、グリコシル化変異体、融合分子又は化学誘導体であることを特徴とする、前記PRRSウイルス。
【請求項１３】
前記PRRSウイルスが：
a)該ORF2が、配列番号:18に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
b)該ORF3が、配列番号:19に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
c)該ORF4が、配列番号:20に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
d)該ORF5が、配列番号:21に定義されたアミノ酸からなることを特徴とする、請求項14記載の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれか1項記載のウイルスをコードしているヌクレオチド配列。
【請求項１５】
ヌクレオチド配列が、ビルレンスマーカー及び／又は血清マーカーをコードするように修飾されている、請求項14記載のヌクレオチド配列。
【請求項１６】
前記マーカーをコードしている核酸が、構造ウイルスタンパク質をコードしているいずれかのオープンリーディングフレーム内に配置されている、請求項14又は15記載のヌクレオチド配列。
【請求項１７】
感染性の生きた弱毒化されたPRRSウイルスの作成方法が、少なくとも1個の完全長DNAコピー又はin vitroで転写されたRNAコピー、又はいずれかの誘導体を含む、組換え核酸を作出し、これにより該ヌクレオチド配列が、請求項14〜16のいずれか1項記載のヌクレオチド配列であることを含む、前記方法。
【請求項１８】
感染性の生きた弱毒化されたPRRSウイルスの作成方法が：
a)請求項1〜13のいずれか１項記載のPRRSウイルスを用い、適当な細胞株に感染する工程；
b)該PRRSウイルスを、細胞培養継代により弱毒化する工程を特徴とする、前記方法。
【請求項１９】
前記細胞株が、Marc細胞又はその誘導体である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
前記PRRSウイルスが、請求項1〜13のいずれか1項記載のウイルスである、請求項18又は19のいずれか1項記載の方法。
【請求項２１】
前記PRRSウイルスが、請求項5、9、11又は13記載のウイルスである、請求項18〜20のいずれか1項記載の方法。
【請求項２２】
請求項1〜13のいずれか1項記載のPRRSウイルスを含む細胞株。
【請求項２３】
前記細胞株が、Marc細胞又はその誘導体である、請求項22記載の細胞株。
【請求項２４】
請求項1〜13のいずれか1項記載のPRRSウイルス及び医薬として許容できる担体を含有する、医薬組成物。
【請求項２５】
PRRS感染症の予防及び治療のためのワクチン製造における、請求項1〜13のいずれか1項記載のPRRSウイルスの使用。
【請求項２６】
ヨーロッパ型PRRSウイルスの弱毒化法であり：
a)該ウイルスのヌクレオチド配列が、配列番号:22の位置130〜150及び／又は位置252〜272及び／又は位置273〜293に相当するORF2の少なくとも1個の位置で、位置指定突然変異誘発により修飾されること；
b)得られたPRRSウイルスが弱毒化されたかどうかが試験されることを特徴とする、前記方法。
【請求項２７】
ヨーロッパ型PRRSウイルスの弱毒化法であり：
a)該ウイルスのヌクレオチド配列が、配列番号:23の位置267〜287に相当するORF3の少なくとも1個の位置で、位置指定突然変異誘発により修飾されること；
b)得られたPRRSウイルスが弱毒化されたかどうかが試験されることを特徴とする、前記方法。
【請求項２８】
ヨーロッパ型PRRSウイルスの弱毒化法であり：
a)該ウイルスのヌクレオチド配列が、配列番号:24のORF5の位置201〜221に相当する少なくとも1個の位置で、位置指定突然変異誘発により修飾されること；
b)得られたPRRSウイルスが弱毒化されたかどうかが試験されることを特徴とする、方法。
【請求項２９】
修飾が、コードされたタンパク質のアミノ酸配列の変化を生じる、請求項26〜28のいずれか1項記載の方法。
【請求項３０】
修飾が、欠失又は置換である、請求項26〜29のいずれか1項記載の方法。
【請求項３１】
ORF2、ORF3、及びORF5の各々の配列が修飾されている、請求項26〜30のいずれか1項記載の方法。
【請求項３２】
ORF2の配列が、少なくとも2個の、好ましくは少なくとも3個の位置で修飾される、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
修飾が、置換又は欠失された配列番号:22でコードされたアミノ酸配列の位置47、88及び／又は95に相当する1個又は複数のアミノ酸配列の位置に、アミノ酸を有するタンパク質をコードしているORF2；置換又は欠失された配列番号:23でコードされたアミノ酸配列の位置93に相当するアミノ酸を有するタンパク質をコードしているORF3；及び／又は、置換又は欠失された配列番号:24でコードされたアミノ酸配列の位置71に相当するアミノ酸を有するタンパク質をコードしているORF5の特徴を、ひとつ又は複数生じる、請求項26〜32のいずれか1項記載の方法。
【請求項３４】
修飾が、配列番号:22でコードされたアミノ酸配列の位置47に相当する位置にセリンを有するタンパク質をコードしているORF2；配列番号:22でコードされたアミノ酸配列の位置88に相当する位置にフェニルアラニンを有するタンパク質をコードしているORF2；配列番号:22でコードされたアミノ酸配列の位置95に相当する位置にロイシンを有するORF2；配列番号:23でコードされたアミノ酸配列の位置93に相当する位置にプロリンを有するORF3；及び／又は、配列番号:24でコードされたアミノ酸配列の位置71に相当する位置にフェニルアラニンを有するORF5の特徴を、ひとつ又は複数、好ましくは全て生じる、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
修飾が、配列番号:22ならば位置140に相当する位置にCを有するORF2；配列番号:22の位置262に相当する位置にTを有するORF2；配列番号:22の位置283に相当する位置にCを有するORF2；配列番号:23の位置277に相当する位置にCを有するORF3；及び／又は、配列番号:24の位置211に相当する位置にTを有するORF5の特徴を、ひとつ又は複数、好ましくは全て生じる、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
請求項26〜35のいずれか1項記載の方法により入手可能な、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス。
【請求項３７】
配列番号:22と、位置130〜150の1個又は複数が、及び／又は位置252〜272の1個又は複数が、及び／又は位置273〜293の1個又は複数が異なるORF2を有する、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス。
【請求項３８】
配列番号:23と、位置267〜287の1個又は複数が異なるORF3を有する、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス。
【請求項３９】
配列番号:24と、位置201〜221の1個又は複数が異なるORF5を有する、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス。
【請求項４０】
請求項36〜39のいずれか1項記載の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスを、医薬として許容できる担体と組合せて含有するワクチン。
【請求項４１】
請求項40記載のワクチンを有効量ブタに投与することを特徴とする、PRRSに対しブタにワクチン接種する方法。
【請求項４２】
PRRS対するワクチンの製造に関する請求項のいずれか1項記載の、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、特異的部位での核酸突然変異により弱毒化された、生きた弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスに関する。本発明は、該ウイルスをコードしているヌクレオチド配列、このようなウイルスを作成する方法、及び該PRRSウイルスを含有する医薬組成物、並びにPRRS感染症の予防及び治療のためのワクチンの製造における該PRRSウイルスの使用にも関する。
【０００２】
（発明の背景）
ブタ繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)は、アルテリウイルス科のエンベロープを有するプラス鎖RNAウイルスにより引き起される(Snijder E.J.、Meulenberg J.J.M.、「アルテリウイルスの分子生物学」、Journal of General Virology、79(5):961-971 (1998))。およそ10から15年前、2種の異なるPRRSウイルス株が個別に、米国とヨーロッパにおいて明確に認められた。本疾患は現在、北米、ヨーロッパ及びアジアの多くの養豚国において蔓延している。これは、ブタの繁殖低下及び呼吸器疾患の主因であり続けている。米国において、本感染症の有病率は、最大70％であると推定される。
【０００３】
このウイルスは、吸入、摂餌、交尾、咬傷又は針により伝播される。これは、粘膜、肺又は限局性のマクロファージにおいて複製する。この疾患は、亜臨床的に、消散又は持続感染を生じる。持続感染した動物は、ウイルスを、口腔/咽頭の液体、血液、糞便、尿及び精液中にまき散らす。雌ブタの臨床症状は、流産又は虚弱質の生きて生まれたブタの早産、死産ブタ及び自家融解した胎仔に関連している。感染した新生仔ブタは、致死率が高いか、又は肺炎に罹患している。その後のブタの飼育及び成長は、肺炎、併発したウイルス感染症及び増大した死亡率により複雑となる。雄ブタは、発熱及び精液の形態学的変化の傾向がある。
【０００４】
全てのアルテリウイルス同様、PRRSウイルスゲノムは、約15キロベースの1本のプラス鎖RNA分子である。ORF(オープンリーディングフレーム)の1a及び1bは、レプリカーゼをコードし、ORFの2から5は想定される糖タンパク質(gp1から4)を、ORF6は膜タンパク質(M)を、並びにORF7はヌクレオキャプシドタンパク質(N)をコードしている。
【０００５】
米国(国際公開公報第93/03760号、単離株ATCC VR-2332、1991年7月18日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)(ロックビル、MD、米国)に寄託。NCBI GeneBank寄託番号U 87392 U00153)及びヨーロッパ(国際公開公報第92/21375号、単離株Lelystad Agent (CDI-NL-2.91)、寄託番号CNCM I-1102、1991年6月5日に、Institute Pasteur(パリ)に寄託；NCBI GeneBank寄託番号M 96262 [gi:11125727]、NC 002533 [gi:11138120])におけるPRRS感染症の最初の説明は、ゲノム的差異及び血清学的差異を有するウイルスを同定した。両者を比較することで、これらが、臨床疾患が1980年代後半に説明される以前に分岐した共通の祖先を有することが明らかになった。完全長ゲノム配列が、多くのPRRSウイルス及びそれらの完全な構造タンパク質-コード領域について報告されている(Snijderら、1998、前掲；Meulenberg, J.J.M.、Hulst, M.M.ら、「Lelystadウイルス、ブタの流行性流産及び呼吸器症候群の原因物質...」、Virology、192:62-72 (1993)；Conzelmann K.K.、Visser N.、Van Woensel P.、Thiel H.J.、「アルテリウイルス群の一員であるブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス分子の特徴」、Virology、103:329-339 (1993)；Murtaugh M.P.、Elam M.R.、Kakach L.T.、「PRRSウイルスのVR-2332及びLelystadウイルス株の構造タンパク質コード配列の比較」、Archives of Virology、140:1451-1460 (1995)；Kapur V.、Elam M.R.、Pawtovich T.M.、Murtaugh M.P.、「米国中西部のブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス単離株の遺伝的変種」、Journal of General Virology、77:1271-1276 (1996))。
【０００６】
PRRSウイルスは、ブタ肺マクロファージ、単球、グリア細胞並びにCL-2621及びMARC-145としても知られているふたつのMA-104細胞亜集団(サル胎仔腎細胞)において、in vitroで複製することができる(K.D. Rossow、「ブタ繁殖・呼吸障害症候群」、Vet Pathol、35:1-20 (1998))。感染性PRRSクローン作出のための組換え手段も、利用可能である(欧州特許第0839912号)。
【０００７】
ブタを保護するために、弱毒化されたPRRS生ワクチンが市販されている(RespPRRS/Ingelvac(登録商標)PRRS MLV、Boehringer Ingelheim社)。死菌ワクチン(失活された全ウイルス)又はサブユニットワクチン(通常に精製されるか又は異種発現された精製されたウイルスタンパク質)は、アジュバントの存在下であっても、それらの完全防御型免疫応答を生じる効能の点で、生ワクチンに劣ることが多い。PRRSに関して、弱毒化されたワクチンは、現在入手可能な死菌ワクチンと比べ、より長く持続しかつより効果的であるような本疾患に対する免疫を誘導することが明らかにされている(Snijderら、前記参照)。本PRRS生ワクチンは、通常のようにウイルスを、適当な宿主細胞において、病原性が喪失されるまで、連続的に継代することにより、弱毒化されている(北米株：欧州特許第0529584号；ヨーロッパ株：欧州特許第0676467号；欧州特許第0835930号)。
【０００８】
本PRRS生ワクチンは、依然改善の余地がある。ひとつは、これらは再感染を防止しないことである。第二に、これらは、ワクチン投与された動物と野外ウイルスに感染した動物の間で、血清学的識別ができないことである。更に生ワクチンには原則的に、弱毒化されない表現型に対する理論上の復帰リスクがある。特にPRRSウイルスのようなRNAウイルスは、RNA複製酵素による校正を欠いている結果としての、RNAゲノムの不正確な複製のために、高い突然変異率を有すると考えられる。通常の多回継代により得られた通常のように由来した弱毒化されたウイルスについて、その分子の起源に加え遺伝的安定性は依然不明であり、かつ復帰変異体の特徴は予測不可能である。
【０００９】
従って、本発明の基礎となる問題点は、これらの先行技術の欠点を克服するようなワクチンの製造に使用することができる改善されたPRRSウイルス株を提供することであった。
【００１０】
（発明の開示）
本発明の態様の前に、本願明細書及び添付された「特許請求の範囲」において使用される単数形("a"、"an"及び"the")は、特に明確に文中に指定しない限りは、複数の意味を含むことに注意しなければならない。従って例えば、「ある(a)PRRSウイルス」の言及は複数のこのようなPRRSウイルスを含み、この(the)「細胞」の言及は、1個又は複数の細胞及び当業者に公知のその同等物の言及であるなどである。特に定義しない限りは、本願明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の属する技術分野の通常の業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本願明細書において説明されたものと類似した又は同等の方法及び材料を、本発明の実践又は試験において使用することができるが、好ましい方法、装置、及び材料が、ここで説明されている。本願明細書において言及された全ての刊行物は、本発明に関連して使用される刊行物において報告されている細胞株、ベクター、及び方法論を説明及び開示する目的で、本願明細書に参照として組入れられている。本願明細書においては、本発明が、先行する発明によるそのような開示に先立つ日付を設定する権利を与えることを容認するために構成されるものはない。
【００１１】
本発明は、下記の特徴を有する、ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6及びORF7、並びにORF1a及びORF1b又はORF2a及びORF2bのようなそれらの亜型を含む核酸によりコードされた、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスを提供する：
a)ORF2は、位置11915-11935に、下記表1に示したヌクレオチドの少なくとも1種：
【００１２】
2004534522.tif 000002
【００１３】
及び、位置12037-12057に、下記表2に示したヌクレオチドの少なくとも1種：
【００１４】
2004534522.tif 000003
【００１５】
及び、位置12058-12078に、下記表3に示したヌクレオチドの少なくとも1種：
【００１６】
2004534522.tif 000004
【００１７】
及び／もしくは、該位置(複数)に欠失を含み、並びに／又は
b)ORF3は、位置12660-12680に、下記表4に示したヌクレオチドの少なくとも1種：
【００１８】
2004534522.tif 000005
【００１９】
及び／もしくは、該位置(複数)に欠失を含み、並びに／又は
c)ORF5は、位置13684-13704に、下記表5に示したヌクレオチドの少なくとも1種：
【００２０】
2004534522.tif 000006
【００２１】
及び／もしくは、該位置(複数)に欠失を含む。
【００２２】
驚くべきことに、PRRSウイルスは、突然変異された場合に、当初のビルレントな野外株と比べ弱毒化された表現型につながるような特異部位を個々のウイルスタンパク質上に含むことがわかった。以後「ビルレンス特異部位」又は簡単に「本発明の部位」又は単に「部位」と称するこれらのものに対する進化の圧力は、計り知れない。これらの部位はヨーロッパ型PRRSV様ワクチン株の弱毒化につながるプロセスに対し全般的関与を有すると推定される。表1から5に明らかにしたこれらの部位は、ヨーロッパ型株(野生型Lelystad Agent CNCM I-1102は参照株とみなされる)に特異的であり、PRRSウイルスの北米株との共通点はない。
【００２３】
更なる局面において、本発明は、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスに関連しており、ここで、配列番号:25、26、27、28、又は29に相当する少なくとも1種の配列区分は、1、2、3個又はそれ以上の位置で突然変異され、最大10個まで突然変異される。これらの配列番号:25、26、及び27の部位はORF2(各々、図1において、位置130-150、252-272、及び273-293である)に位置し、配列番号:28の部位はORF3(図3の位置267-287)に位置し、及び配列番号:29の部位はORF5(図4の位置201-221)に位置する。該配列区分は、本発明のビルレンス特異部位を表わしている。PRRSウイルスは、プラス鎖RNAウイルスであるので、これは、配列表に示されたDNA配列の代わりに各RNA配列を含む、すなわちこれは配列表にチミン(T)であると示された位置にウラシル(U)を、並びにデオキシリボースの代わりにリボースを含むであろう。
【００２４】
本発明の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスは、配列番号:25、26、27、28又は29を持つDNA配列に相当する配列区分を含むゲノムRNAを含み、ここで少なくとも1種の該配列区分は、参照配列と少なくとも1個の突然変異が異なることは、理解されるはずである。この状況において、「相当する」とは、本発明のウイルスは、BLASTのような標準のアラインメントアルゴリズムにより、参照配列と並置することができる配列区分を含むことを意味する(Altschul, S.F.、Gish, W.、Miller, W.、Myers, E.W.及びLipman, D.J.、「ベーシックローカルアラインメント検索ツール(Basic local alignment search tool)」、J. Mol. Biol.、215:403-410 (1990)；Gish, W.及びStates, D.J.、「データベース類似性検索によるタンパク質コード領域の同定(Identification of protein coding regions by database similarity search)」、Nature Genet.、3:266-272 (1993)；Madden, T.L.、Tatusov, R.L.及びZhang, J.、「ネットワークBLASTサーバーの適用(Applications of network BLAST server)」、Meth. Enzymol.、266:131-141 (1996)；Zhang, J.及びMadden, T.L.、「PowerBLAST：双方向又は自動配列解析及び注釈のための新規ネットワークBLASTアプリケーション(PowerBLAST: A new network BLAST application for interactive or automated sequence analysis and annotation)」、Genome Res.、7:649-656 (1997)；Altschul、Stephen F.、Thomas L. Madden、Alejandro A. Schaffer、Jinghui Zhang、Zheng Zhang、Webb Miller、及びDavid J. Lipman、「ギャップ付きBLAST及びPSI-BLAST：タンパク質データベース検索プログラムの新規作成(Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs)」、Nucleic Acids Res.、25:3389-3402 (1997))。このようなアルゴリズムにより対をなして並置されている配列位置は、互いに「相当」している。
【００２５】
従って、このようなアラインメント時に、このウイルスの各々の突然変異された配列区分は、1、2、3個又はそれ以上の位置で、最大10個の位置まで、対応する参照配列(「部位」、すなわち、配列番号:25、26、27、28又は29のいずれか)とは異なるであろう。好ましくは、本発明のウイルスは、引用された配列区分(部位)の5個全てで突然変異される。好ましくは、この突然変異(複数)は、置換(複数)及び／又は欠失(複数)である。好ましい態様において、突然変異は、各ORF(複数)によりコードされたタンパク質(複数)のアミノ酸配列(複数)の変化を生じる。
【００２６】
更なる局面において、本発明は、配列番号:25に相当する配列区分を含むORF2を有する弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスに関し、ここで配列番号:25の位置10〜12に対応するトリプレットは、突然変異されている。好ましくは、該トリプレットは、フェニルアラニンをコードしていない。好ましくは、該トリプレットは、異なるアミノ酸をコードしている。好ましい態様において、該トリプレットは、セリンをコードしている。より好ましくは、配列番号:25の位置11に対応するヌクレオチドは、Cである。従って好ましい態様において、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスは、位置47(又はBLASTアラインメントの対応する位置に)にフェニルアラニンを有さないタンパク質をコードしているORF2を有する。好ましくは、該タンパク質は、代わりにこの位置にセリンを有する。
【００２７】
更なる局面において、本発明は、配列番号:26に相当する配列区分を含むORF2を有する弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスに関し、ここで、配列番号:26の位置10から12に相当するトリプレットは突然変異されている。好ましくは、該トリプレットは、バリンをコードしていない。好ましくは、該トリプレットは、異なるアミノ酸をコードしている。好ましい態様において、該トリプレットは、フェニルアラニンをコードしている。より好ましくは、配列番号:26の位置10に相当するヌクレオチドは、T(又は、各々、RNAにおいてはU)である。従って好ましい態様において、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスは、位置88(又はBLASTアラインメントにおいて対応する位置)にバリンを有さないタンパク質をコードしているORF2を有する。好ましくは、該タンパク質は、代わりにこの位置にフェニルアラニンを有する。
【００２８】
更なる局面において、本発明は、配列番号:27に相当する配列区分を含むORF2を有する弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスに関し、ここで配列番号:27の位置11から13に相当しているトリプレットは突然変異されている。好ましくは、該トリプレットはフェニルアラニンをコードしていない。好ましくは、該トリプレットは、異なるアミノ酸をコードしている。好ましい態様において、該トリプレットはロイシンをコードしている。より好ましくは、配列番号:27の位置11に相当するヌクレオチドはCである。従って好ましい態様において、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスは、位置95(又はBLASTアラインメントにおいて対応する位置)にフェニルアラニンを有さないタンパク質をコードしているORF2を有する。好ましくは、該タンパク質は、代わりにこの位置にロイシンを有する。
【００２９】
更なる局面において、本発明は、配列番号:28に相当する配列区分を含むORF3を有する弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスに関し、ここで配列番号:28の位置11から13に相当しているトリプレットは突然変異されている。好ましくは、該トリプレットはセリンをコードしていない。好ましくは、該トリプレットは、異なるアミノ酸をコードしている。好ましい態様において、該トリプレットはプロリンをコードしている。より好ましくは、配列番号:28の位置11に相当するヌクレオチドはCである。従って好ましい態様において、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスは、位置93(又はBLASTアラインメントにおいて対応する位置)にセリンを有さないタンパク質をコードしているORF2を有する。好ましくは、該タンパク質は、代わりにこの位置にプロリンを有する。
【００３０】
更なる局面において、本発明は、配列番号:29に相当する配列区分を含むORF5を有する弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスに関し、ここで配列番号:29の位置11から13に相当しているトリプレットは突然変異されている。好ましくは、該トリプレットはロイシンをコードしていない。好ましくは、該トリプレットは、異なるアミノ酸をコードしている。好ましい態様において、該トリプレットはフェニルアラニンをコードしている。より好ましくは、配列番号:29の位置11に相当するヌクレオチドはTである(又は、各々、RNAにおいてはU)。従って好ましい態様において、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスは、位置71(又はBLASTアラインメントにおいて対応する位置)にロイシンを有さないタンパク質をコードしているORF2を有する。好ましくは、該タンパク質は、代わりにこの位置にフェニルアラニンを有する。
【００３１】
定義された突然変異及び／又は欠失により弱毒化されたヨーロッパ株を基にしたPRRS生ワクチンは、弱毒化されたワクチン製造の現在の欠点を避けることができる。弱毒化された菌株が定義されかつわかっている突然変異を保持する場合、これは品質管理及び遺伝的安定性について従来のように分析することができる。定義された欠失及び／又は置換を導入する可能性は、特に二重又は多重突然変異として、弱毒化されない又はビルレントな表現型に復帰する可能性を低下させる。この弱毒化している突然変異の更なる利点は、弱毒化されたPRRSウイルスの識別可能な標識として使用することができ、及び野外のPRRSウイルスからそれらを識別するための、それらの公知の分子の独自性にある。本発明において定義された部位で、安全で及び位置特異的に弱毒化されたウイルスが作成され得る。このようなウイルスは、PRRS感染症の予防及び／又は治療に使用するための安全な生ワクチンの調製に有用である。
【００３２】
本発明は、弱毒化されたヨーロッパ型PRRS株及びそれらの調製法に関連している。この状況において、「弱毒化された」とは、ビルレントな菌株が、修飾前よりもビルレンス又は病原性が低いような方法で、修飾されるか又は修飾されていることを意味する。特に「弱毒化された」とは、このウイルスが、臨床疾患の惹起を顕著に低下する能力を有するが、依然これは宿主において複製可能であることを意味する。好ましくはビルレンス又は病原性は、ワクチンとして投与することが許容できるウイルスを作成する量にまで低下される。好ましい態様において、このウイルスは、臨床疾患を引き起さないが、依然宿主において複製することができる程度に弱毒化されている。このような弱毒化された菌株は、宿主における複製は迅速かつ優れた免疫応答の刺激を保証するので、ワクチン接種にとって理想的な物質である。ある好ましい態様において、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスは、Lelystad Agentよりもビルレンスが低い。別の態様において、弱毒化されたウイルスは、それらが由来した親株よりもビルレンスが低い。用語「PRRSウイルスLelystad Agentよりも低いビルレンス」(又は、同じく、それらが由来した親株)は、関心のあるウイルスのLelystad Agent (CDI-NL-2.91/CNCM I-1102)、又は親株との臨床症状の比較に関して理解されるものとする。PRRSウイルスがLelystad Agentよりもビルレンスが低いかどうかを決定する、もしくは同様に、本発明に従い修飾されたウイルスが修飾前のその親株よりもビルレンスが低いかどうかを決定する好ましい方法は、実施例1に開示されている。各々及び全ての可能性のあるビルレンス特異部位での核酸突然変異が、ビルレンスの低下を暗示している訳ではない。実施例1の手法は、本発明の内容に従う生きたPRRSウイルスが、その親株又はLelystad Agentのようなビルレントな野外単離株よりもビルレンスが低いかどうかを決定するための、正確で直裁的で急進的な実験設定を提供している。
【００３３】
本発明は、下記のように北米株から区別することができるヨーロッパ型PRRSV株に関する。このウイルスが発見されてまもなく、Wensvoortら(J. Vet. Diagn. Invest、4:134-138 (1992))は、北米型及びヨーロッパ型単離株の間に抗原性の特徴の差異を認めた。これらは、数匹のブタにおいて北米型及びヨーロッパ型の両方に対する血清を生じ、かつ3種の北米型ウイルス単離株及び4種のヨーロッパ型単離株との抗-ヨーロッパ型(LV)及び抗-北米株(VR-2332)血清の交差反応性を比較した。ヨーロッパ型血清型のPRRSウイルスに対する血清は、北米単離株との反応性がヨーロッパ型単離株よりも有意に低かった。更に、北米血清型のウイルスに対して生じた血清は、ヨーロッパ型ウイルス単離株との反応性が低いか、もしくは全く反応性が無いことさえある。Wensvoortらは、同じく2種の参照ウイルスCNCM I-1102(ヨーロッパ型)及びATCC VR-2332(北米型)と、ヨーロッパ型及び北米型の単離株に対して生じた血清の反応性を示した。この実験において、ヨーロッパ型株に対して生じた血清は、北米株と全く反応性がなかった。従って、北米型血清型及びヨーロッパ型血清型の、2種のウイルスの完全に異なる血清型が存在し、これらは、それらの血清学的特性を基に識別することができる。
【００３４】
これは、分子レベルで示すこともできる。Nelsonらは、様々な単離株のポリメラーゼをコードしている遺伝子の配列を比較した(74th Annual Meeting of the Conference of Research Workers in Animal Diseases、1993年11月8-9日)。彼らは、ポリメラーゼ遺伝子が、北米株群内で87〜95％の相同性を示すことを明らかにした。しかし、核酸を基にした64〜67％と低い相同性が、ヨーロッパ型血清型と北米型血清型の間で認められた。Mardassiは、前述の会議において同様の結果を発表し、Quebec PRRS参照株及びヨーロッパ型単離株の3'-末端の530個の核酸が、わずかに59％と低い相同性を示すことを示した。前掲の論文の結果は、北米型及びヨーロッパ型の血清型は昔に分岐した可能性が高いことを示し、これは次に遺伝的差異及びそれらの血清学的同系性を容易に説明するであろう。
【００３５】
従って北米型及びヨーロッパ型の血清型は、容易に識別することができる。ヨーロッパ型血清型のウイルスは、北米型PRRSウイルス(ATCC VR-2332)に対する抗血清のパネルとの反応を比較すると、ヨーロッパ型PRRSウイルスLV(CNCM I-1102)に対する抗血清のパネルのイムノペルオキシダーゼ単層アッセイにおいて、より高い力価で反応することを特徴としている。感染の約40日後に異なる動物から得た血清のパネルが使用される場合、あらゆるウイルスは、北米型又はヨーロッパ型血清型のいずれかに属するものとして容易に分類することができる。典型的には、他のヨーロッパ型株に対する抗血清のパネルとのヨーロッパ型株の反応性は、北米株に対する抗血清のパネルとのものよりも、約400倍高かった。ヨーロッパ株が、寄託されたヨーロッパ株 I-1102及び寄託された北米株VR-2332に対する抗血清と反応される場合、約55倍の反応性の典型的差異が認められる(Wensvoortら、前記参照)。
【００３６】
「突然変異」は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の所定の位置でのヌクレオチド又はアミノ酸の、置換、欠失、又は挿入を意味する。「置換」は、ヌクレオチド又はアミノ酸の別のものとの交換である(例えば、CからT)。「欠失」は、ヌクレオチド又はアミノ酸の除去を意味する。「挿入」は、ヌクレオチド又はアミノ酸が所定の位置で挿入されることを意味する。
【００３７】
更なる局面において、本発明は、ヨーロッパ型PRRSウイルスを弱毒化する方法又はプロセスを含み、これは
a)該ウイルスのヌクレオチド配列が、配列番号:22の位置130〜150及び／又は位置252〜272及び／又は位置273〜293に相当するORF2の位置の少なくともひとつで、位置指定突然変異誘発により修飾されること；
b)得られたPRRSウイルスが弱毒化されているかどうかが試験されることを特徴としている。
【００３８】
更なる局面において、本発明は、ヨーロッパ型PRRSウイルスを弱毒化する方法を含み、これは、
a)該ウイルスのヌクレオチド配列が、配列番号:23の位置267〜287に相当するORF3の位置の少なくともひとつで、位置指定突然変異誘発により修飾されること；
b)得られたPRRSウイルスが弱毒化されているかどうかが試験されることを特徴としている。
【００３９】
更なる局面において、本発明は、ヨーロッパ型PRRSウイルスを弱毒化する方法を含み、これは、
a)該ウイルスのヌクレオチド配列が、配列番号:24のORF5の位置201〜221に相当する位置の少なくともひとつで、位置指定突然変異誘発により修飾されること；
b)得られたPRRSウイルスが弱毒化されているかどうかが試験されることを特徴としている。
【００４０】
この状況において、用語「相当する」は、先に概略した意味、すなわち、互いに相当するふたつの位置は、BLASTのような配列アラインメントにおいて対として並置されるであろうという意味を有する。好ましくは、本発明の修飾は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列の変化を生じる。好ましい態様において、修飾は、欠失及び／又は置換であり、好ましくは二重又は多重突然変異である。好ましい態様において、前述の修飾のふたつ又はそれ以上が組合せられる。更に好ましい態様において、ORF2、ORF3、及びORF5の各配列が修飾される。好ましくは、ORF2の配列は、少なくとも2個、好ましくは少なくとも3個の位置で修飾される。
【００４１】
好ましくは、前述の方法は、下記の特徴をひとつ又は複数生じる修飾(複数)を含む：置換又は欠失された配列番号:22の位置47、88及び／又は95に相当するアミノ酸配列位置の1個又は複数にアミノ酸(複数)を有するタンパク質をコードしているORF2；置換又は欠失された配列番号:23の位置93に相当するアミノ酸配列位置にアミノ酸を有するタンパク質をコードしているORF3；及び／又は、置換又は欠失された配列番号:24の位置71に相当するアミノ酸配列位置にアミノ酸を有するタンパク質をコードしているORF5。前述の位置は全て突然変異されていることが好ましい。
【００４２】
好ましくは、本発明の方法は、下記の特徴をひとつ又は複数、好ましくは全て生じる修飾(複数)を含む：配列番号:22の位置47に相当するアミノ酸配列位置にフェニルアラニンを有さないタンパク質をコードしているORF2；配列番号:22の位置88に相当するアミノ酸配列位置にバリンを有さないタンパク質をコードしているORF2；配列番号:22の位置95に相当するアミノ酸配列位置にフェニルアラニンを有さないORF2；配列番号:23の位置93に相当するアミノ酸配列位置にセリンを有さないORF3；及び／又は、配列番号:24の位置71に相当するアミノ酸配列位置にロイシンを有さないORF5。
【００４３】
好ましくは、本発明の方法は、下記の特徴をひとつ又は複数、好ましくは全て生じる修飾(複数)を含む：配列番号:22の位置47に相当するアミノ酸配列位置にセリンを有するタンパク質をコードしているORF2；配列番号:22の位置88に相当するアミノ酸配列位置にフェニルアラニンを有するタンパク質をコードしているORF2；配列番号:22の位置95に相当するアミノ酸配列位置にロイシンを有するORF2；配列番号:23の位置93に相当するアミノ酸配列位置にプロリンを有するORF3；及び／又は、配列番号:24の位置71に相当するアミノ酸配列位置にフェニルアラニンを有するORF5。
【００４４】
好ましくは、本発明の方法は、下記の特徴をひとつ又は複数、好ましくは全て生じる修飾(複数)を含む：配列番号:22であるならば、位置140に相当する位置にCを有するORF2、配列番号:22の位置262に相当する位置にTを有するORF2、配列番号:22の位置283に相当する位置にCを有するORF2、配列番号:23の位置277に相当する位置にCを有するORF3、及び／又は、配列番号:24の位置211に相当する位置にTを有するORF5。
更に、本発明は、前述の方法のいずれかひとつにより入手可能な弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスに関する。
【００４５】
更なる局面において、本発明は、前述の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスのコード情報を含む核酸を含む。先に概略したように、これは、リボ核酸(RNA)であることができる。このような核酸は更に、このようなリボ核酸と相補的であるデオキシリボ核酸、すなわち、cDNA、又はいずれか他のDNA型であってもよい。好ましい態様において、このようなcDNAは感染性である。これは、このようなcDNAが、適当な宿主細胞に導入されたならば、該細胞は、ウイルス粒子の作成を開始するであろうということを意味する。更に本発明は、前述の突然変異のいずれかひとつ又は多数を含む、RNA、cDNA、又は他のDNAに関する。
【００４６】
更なる局面において、本発明は、医薬として許容できる担体と組合せて、説明された弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスを含有するワクチンを含む。
更なる局面において、本発明は、PRRSに対するブタのワクチン接種法であり、前述のワクチンを有効量、該ブタに投与することを特徴とする方法を含む。
更なる局面において、本発明は、PRRSに対するワクチンの製造に関する、説明された弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスの使用に関する。
【００４７】
本発明に従い、ヌクレオチド又はアミノ酸の番号付けは、前述の公に入手可能であるLelystad Agentに従っている。しかし図1〜4に説明されたように、これらのORF(「オープンリーディングフレーム＝ORF」)は、その中の一部は重複しているので、別に番号付けられる。
【００４８】
この弱毒化されたヨーロッパ型ウイルスがビルレントな野生型と異なる特異部位のヌクレオチドは、ORF2の、ヌクレオチド11915−11935(表1；図1の番号130〜150に相当)、12037−12057(表2；図1の番号252〜272)、12058−12078(表3；図1の番号273〜293)；ORF3の、12660−12680(表4；図3の番号267〜287)、及び／又はORF5の、13684−13704(表5；図4の番号201-221)である。これらの表に示されたヌクレオチドのいずれかひとつへの前述の位置のひとつ又はいくつかでのLelystad Agentの突然変異及び該ヌクレオチドの該位置での欠失により、PRRSウイルスの生きた弱毒化されたヨーロッパ型ワクチン株を当業者は得るであろう。該位置での置換又は欠失のような突然変異は、ウイルスが依然複製できなければならない、すなわちこれは依然生きたウイルスでなければならないという条件によってのみ制限される。これは、過度の実験を行わずに決定することができる。当業者は、公に入手可能なLelystad Agent及び本発明の内容を基に、例えば1個の突然変異を、提供した表を基に明らかにされた各部位へ導入することができ、例えば位置11915に、これはA、C又はGを導入することができ、もしくはこれはその位置のヌクレオチド(これはT)を欠失することができる。限定的でない例を、図1〜3(Lelystad B及び弱毒化ウイルスAのORF2、ORF3及びORF5)及び実施例1に示している。
【００４９】
本発明は、唯1個のヌクレオチドではなく、いくつかのヌクレオチドが、又は全てのヌクレオチドさえも、例えば該位置の1種又は数種のアミノ酸をコードしているひとつ又はいくつかのトリプレットが突然変異されているようなウイルスを含む。しかしこの配列は、ウイルスが最早複製できない程度には突然変異されず、すなわち、本発明においては、生きたウイルスがコードされる。
前述の領域の外側の追加の核酸も、突然変異され得るが、これは、本発明にとって必須ではない(図1参照、例えば、Tの代わりにCであるLelystad-BのORF2の位置426)。
【００５０】
前記突然変異は、当該技術分野において公知である標準の遺伝子操作法、特に位置指定突然変異誘発により行うことができる。本発明の状況において、「位置指定突然変異誘発」は、核酸の予め選択された部位に指定された突然変異をもたらすような遺伝子操作技術を意味する。一般にこのような技術は、そのような核酸配列の少なくとも部分的知識が必要である。連続継代による古典的弱毒化法は、予め選択された部位に突然変異をもたらすことはできない。このような遺伝子操作法は、当該技術分野において周知である(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク(1989)；第15章；Wu(編集)、Methods in Enzymology、217:173-285(1993))。
【００５１】
突然変異導入の出発物質として、例えばLelystad Agent (CNCM I-1102)のような、ビルレントなPRSSV株のcDNAクローンが、当該技術分野において公知の手法に従い作成され得る(Boyerら、「Haenni. Infectious transcripts and cDNA clones of RNA viruses」、Virology、198:415-426 (1994))。例えば、感染性PRRSVコピーは、説明されたように調製され得(国際公開公報第00/53787号；Meulenbergら、Adv. Exp. Biol、440:199-206 (1998)；Meulenbergら、J. Virol.、72(1):380-387(1998))、これは次に本発明に従い突然変異され得る。引用された参考文献は、PRRSVの感染性cDNAクローンをいかにして得るか、及びそれらの突然変異体をいかにして作成するかの詳細な手法を提供している。突然変異されたクローン又はin vitroで作成されたそれらの感染性転写産物は、次に適当な宿主細胞へトランスフェクションすることができ、その後これは弱毒化されたウイルスを作成する。
【００５２】
特に驚くべきことに、ORF2の部位11925、12047、及び12068(図1参照)；ORF3の12670(図2参照)及び／又はORF5の13694(図4参照)は、ビルレントな野外株Lelystad Agentと比べ、一貫して変更されることがわかった。従って、別の本発明の好ましい態様は、下記を特徴とする、本発明に従い弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスである：
a)ORF2は、位置11925にC、AもしくはGを、及び／又は位置12047にC、TもしくはAを、及び／又は位置12068にA、CもしくはGを、又は該位置(複数)に欠失を含み、並びに／又は
b)ORF3は、位置12670にA、CもしくはGを、又は該位置に欠失を含み、並びに／又は
c)ORF5は、位置13694にG、AもしくはTを、又は該位置に欠失を含む。
【００５３】
更により特定すると、ビルレントな野外株Lelystad Agentと比べ、ORF2の位置11925は一貫してCに変更され、ORF2の位置12047は一貫してTに変更され、及びORF2の位置12068は一貫してCに変更され(図1参照)；ORF3の位置12670は一貫してCに変更され(図2参照)、及び／又はORF5の13694は一貫してTに変更される(図4参照)。従って、別の本発明のより好ましい態様は、本発明の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスであり、ここで該核酸は、更に下記を特徴とする、：
a)該ORF2は、位置11925にC及び／もしくは位置12047にT及び／もしくは位置12068にC又は該位置(複数)に欠失を含み、並びに／又は
b)該ORF3は、位置12670にCもしくは該位置に欠失を含み、並びに／又は
c)該ORF5は、位置13694にTもしくは該位置に欠失を含む。
【００５４】
別のより好ましい本発明の態様は、図において弱毒化ウイルスAと称される、本発明に従い弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスであり、ここで該核酸は更に、下記を特徴としている：
a)該ORF2は、配列番号:1に定義された核酸を含み、及び／又は
b)該ORF3は、配列番号:2に定義された核酸を含み、及び／又は
c)該ORF4は、配列番号:3に定義された核酸を含み、及び／又は
d)該ORF5は、配列番号:4に定義された核酸を含み、
もしくは、それらの断片、対立遺伝子変異体、機能変異体、縮重核酸コードを基にした変異体、融合分子又は化学誘導体である。
【００５５】
本発明の「断片」は、先に説明されたものより短い核酸分子によりコードされているが、依然その活性を保持することを特徴とする、本発明のPRRSウイルス又はORFのいずれかの免疫原性サブユニット、すなわちいずれかのポリペプチドサブユニットである。
【００５６】
本発明のPRRSウイルス又はORFの「機能変異体」は、本発明のPRRSウイルス又はORFに実質的に類似している生物学的活性(機能的又は構造的のいずれか)を有するPRRSウイルス又はORFである。用語「機能変異体」は同じく、「断片」、「対立遺伝子変異体」、「機能変異体」、「縮重核酸コードを基にした変異体」又は「化学誘導体」も含む。このような「機能変異体」は、例えば1種又は数種の点変異、1種又は数種の核酸の交換、欠失もしくは挿入、又は1種又は数種のアミノ酸の交換、欠失もしくは挿入を保持することができる。該機能変異体は、依然その生物学的活性、例えば、ワクチン株としての機能を、少なくとも一部保持し、又は該生物学的活性の改善と共に保持していることさえある。
【００５７】
「遺伝暗号の縮重を基にした変異体」は、あるアミノ酸がいくつかの異なるヌクレオチドトリプレットによりコードされ得るという事実に起因した変異体である。該変異体は、依然その生物学的活性を、少なくとも一部は保持し、又は該生物学的活性の改善と共に保持していることさえある。
【００５８】
「融合分子」は、例えば放射標識のようなレポーター、蛍光標識のような化学分子又は当該技術分野において公知のいずれか他の分子に融合された、本発明のPRRSウイルス又はORFである。
本願明細書において使用される本発明の「化学誘導体」は、化学的修飾された又は通常はその分子の一部ではないような追加の化学部分を含む、本発明のPRRSウイルス又はORFである。このような部分は、その分子の溶解度、吸収、生物学的半減期などを改善することができる。
【００５９】
分子は、両方の分子が実質的に類似した構造又は生物学的活性を有するならば、他方の分子に「実質的に類似」している。従って、ふたつの分子が同様の活性を有するならば、これらは変異体と見なされ、この用語は本願明細書において、ひとつの分子の構造が他方において認められない場合、又は、アミノ酸残基の配列が同一でない場合に使用される。
【００６０】
別の最も好ましい本発明の態様は、本発明に従い弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス(図面では弱毒化ウイルスAと称される)であり、ここで該核酸は、下記を特徴とする：
a)該ORF2は、配列番号:1に定義された核酸からなり、及び／又は
b)該ORF3は、配列番号:2に定義された核酸からなり、及び／又は
c)該ORF4は、配列番号:3に定義された核酸からなり、及び／又は
d)該ORF5は、配列番号:4に定義された核酸からなる。
【００６１】
別の好ましい本発明の態様は、本発明の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス(図において弱毒化ウイルスAと称される)であり、ここで該核酸は、配列番号:5に定義された核酸、又はそれらの断片、対立遺伝子変異体、機能変異体、縮重核酸コードを基にした変異体、融合分子又は化学誘導体を含むことを特徴とする。
【００６２】
別の最も好ましい本発明の態様は、本発明の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス(図において弱毒化ウイルスAと称される)であり、ここで該核酸は、配列番号:5に定義された核酸からなることを特徴としている。
【００６３】
別の好ましい本発明の態様は、本発明の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス(図においてLELYSTAD-B)であり、ここで該核酸は更に、下記を特徴とする：
a)該ORF2は、配列番号:6に定義された核酸を含み、及び／又は
b)該ORF3は、配列番号:7に定義された核酸を含み、及び／又は
c)該ORF4は、配列番号:8に定義された核酸を含み、及び／又は
d)該ORF5は、配列番号:9に定義された核酸を含み、及び／又は
又はそれらの断片、対立遺伝子変異体、機能変異体、縮重核酸コードを基にした変異体、融合分子又は化学誘導体を含む。
【００６４】
別の最も好ましい本発明の態様は、本発明の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス(図においてLELYSTAD-B)であり、ここで該核酸は更に下記を特徴とする：
a)該ORF2は、配列番号:6に定義された核酸からなり、及び／又は
b)該ORF3は、配列番号:7に定義された核酸からなり、及び／又は
c)該ORF4は、配列番号:8に定義された核酸からなり、及び／又は
d)該ORF5は、配列番号:9に定義された核酸からなる。
【００６５】
別の重要な本発明の態様は、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス(図において弱毒化ウイルスA)であり、ここで該PRRSウイルスは下記を特徴とする：
a)ORF1aは、配列番号:10に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
b)ORF1bは、配列番号:11に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
c)ORF2は、配列番号:12に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
d)ORF3は、配列番号:13に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
e)ORF4は、配列番号:14に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
f)ORF5は、配列番号:15に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
g)ORF6は、配列番号:16に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
h)ORF7は、配列番号:17に定義されたアミノ酸を含み、
又は、それらの断片、対立遺伝子変異体、機能変異体、グリコシル化変異体、融合分子又は化学誘導体である。
【００６６】
別のより好ましい本発明の態様は、本発明の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス(図において弱毒化ウイルスA)であり、ここで該PRRSウイルスは下記を特徴とする：
a)ORF1aは、配列番号:10に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
b)ORF1bは、配列番号:11に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
c)ORF2は、配列番号:12に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
d)ORF3は、配列番号:13に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
e)ORF4は、配列番号:14に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
f)ORF5は、配列番号:15に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
g)ORF6は、配列番号:16に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
h)ORF7は、配列番号:17に定義されたアミノ酸からなる。
【００６７】
別の非常に重要な本発明の態様は、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス(図におけるLELYSTAD-B)であり、ここで該PRRSウイルスは下記を特徴とする：
a)ORF2は、配列番号:18に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
b)ORF3は、配列番号:19に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
c)ORF4は、配列番号:20に定義されたアミノ酸を含み、及び／又は
d)ORF5は、配列番号:21に定義されたアミノ酸を含み、
又は、それらの断片、対立遺伝子変異体、機能変異体、グリコシル化変異体、融合分子又は化学誘導体である。
【００６８】
別のより好ましい本発明の態様は、本発明の弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルス(図におけるLELYSTAD-B)であり、ここで該PRRSウイルスは、下記を特徴とする：
a)ORF2は、配列番号:18に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
b)ORF3は、配列番号:19に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
c)ORF4は、配列番号:20に定義されたアミノ酸からなり、及び／又は
d)ORF5は、配列番号:21に定義されたアミノ酸からなる。
【００６９】
更に別の本発明の重要な態様は、前述のような本発明のウイルスをコードしているヌクレオチド配列である。このようなヌクレオチド配列は、配列表において明らかにされた配列を含む(例えば、同定番号1〜9(<400>以下で提供される＝配列番号:)。本発明は更に、配列番号:10〜21に開示されたタンパク質に関する。
【００７０】
更に別の好ましい本発明の態様は、本発明のヌクレオチド配列であり、ここでこのヌクレオチド配列は、ビルレンスマーカー及び／又は血清マーカーをコードするように修飾されている。導入(introductory)ページにおいて言及されたように、医薬組成物のビルレンスが低い生ワクチン株とビルレントな野生型ウイルスの感染症の間の識別を可能にするために、ブタの健康管理は重要である。これは、特に野外感染症の臨床症状が特異的でないか、もしくは他の感染症により重複されたか、又は観察及び評価の期間が短い場合に、困難であることが多い。関心のあるウイルスの組換え作成は、血清マーカー及び／又はビルレンスマーカーを確立する遺伝暗号への修飾の導入を可能にする。血清マーカーは、感染細胞、又は咽頭もしくは鼻の液体、又は尿などであるが、これらに限定されるものではない体液から単離することができる、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質などの、抗原性の検出可能な分子を意味する。ビルレンスマーカーは、PCR及び通常の配列決定などであるが、これらに限定されるものではない組換え分析法により同定することができる遺伝暗号のマーカーとして理解される。従って好ましい態様において、本発明は、本発明のヌクレオチド配列に関し、ここでヌクレオチド配列は、ビルレンスマーカー及び／又は血清マーカーをコードするように修飾される。特に、ウイルスを弱毒化する目的で導入された突然変異又は欠失は、ビルレンスマーカー及び血清マーカーとして有用である。明らかにされたこれらのビルレンス特異部位における突然変異を追跡することにより、初期段階での可能性のあるビルレント復帰変異体の出現を推定することが可能である。
【００７１】
更に別の好ましい本発明の態様は、本発明のヌクレオチド配列であり、ここで該マーカーをコードしている核酸は、構造ウイルスタンパク質をコードしているいずれかのオープンリーディングフレーム内に配置されている。
【００７２】
別の局面において、本発明は、感染性の生きた弱毒化されたPRRSウイルスの作成法に関し、ここで該方法は、少なくとも1種の完全長DNAコピー又はin vitroで転写されたRNAコピー又は該DNAもしくはRNAのいずれかの誘導体を含む、組換え核酸を作出し、これにより該ヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列である工程を含む。従って本発明において、これらの方法は前述のPRRSウイルスにつながっている。当業者は、位置指定突然変異誘発(Sambrookら、(1989)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press社、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク；第15章；Wu(編集)、Methods in Enzymology、217:173-285 (1993))、又は前述のPRRSウイルスを得るために突然変異(複数)を特異的に挿入するためのいずれか他の方法を利用することができる。
【００７３】
以下の好ましい局面において明らかにした方法は、(ゲノムレベルで)前述のような本発明のPRRSウイルスにつながるであろう。従って別の好ましい局面において、本発明は、感染性の生きた弱毒化されたPRRSウイルスの作出について説明された方法に関連し、該方法は、下記の工程を特徴としている：
a)本発明のPRRSウイルスを使用し、適当な細胞株を感染する工程；
b)該PRRSウイルスが、更に細胞培養継代により弱毒化される工程。
【００７４】
別の好ましい局面において、本発明は、説明した方法に関連し、ここで該細胞株は、サル胎仔腎細胞、又は好ましくはMarc細胞もしくはそれらの誘導体である(下記参照)。
別の好ましい局面において、本発明は、説明された方法に関連し、ここで該PRRSウイルスは、先に明らかにされた本発明のウイルス(複数)である。
【００７５】
更なる局面において、本発明は、本発明のPRRSウイルスを含む細胞株に関する。このような細胞株の例は、当業者に公知の永久細胞株を含み、好ましくは、ブタ、サル又はヒトの細胞株、例として、ヒト胎児腎(HEK)293、BHK、GH3、H4、U373、NT2、PC12、COS、CHO、Ltk-、線維芽細胞、ミエローマ、神経芽細胞腫、ハイブリドーマ、卵母細胞、胚性幹細胞)、昆虫細胞株(例えば、pPbac又はpMbac (Stratagene社、ラホヤ、USA)のようなバキュロウイルスベクターの使用)、酵母(例えば、Pichia pastoris又は、pYESHIS(Invitrogen社、サンディエゴ、USA)のような酵母発現ベクターの使用)、及び真菌などを含む。
更に好ましい局面において、本発明は、本発明の細胞株に関連し、ここで該細胞株は、サル胎仔腎細胞、又は好ましくはMarc細胞もしくはそれらの誘導体である。
【００７６】
更なる局面において、本発明は、下記を特徴とする、ヨーロッパ型PRRSウイルスを弱毒化する方法又はプロセスを含む：
a)該ウイルスのヌクレオチド配列が、配列番号:22の位置130〜150及び／又は位置252〜272及び／又は位置273〜293に相当するORF2の位置の少なくともひとつでの位置指定突然変異誘発により修飾されること；
b)得られたPRRSウイルスが弱毒化されているかどうかを試験すること。
【００７７】
この状況において、別の配列の位置に「相当している」核酸又はアミノ酸配列内の位置は、これらふたつの配列が、BLAST(Altschul, S.F.、Gish, W.、Miller, W.、Myers, E.W.及びLipman, D.J.、「ベーシックローカルアラインメント検索ツール」、J. Mol. Biol.、215:403-410 (1990)；Gish, W.及びStates, D.J.、「データベース類似性検索によるタンパク質コード領域の同定」、Nature Genet.、3:266-272 (1993)；Madden, T.L.、Tatusov, R.L.及びZhang, J.、「ネットワークBLASTサーバーのアプリケーション」、Meth. Enzymol.、266:131-141 (1996)；Zhang, J.及びMadden, T.L.、「PowerBLAST：双方向又は自動式配列解析及び注釈のための新規ネットワークBLASTアプリケーション」、Genome Res.、7:649-656 (1997)；Altschul, Stephen F.、Thomas L. Madden、Alejandro A. Schaffer、Jinghui Zhang、Zheng Zhang、Webb Miller、及びDavid J. Lipman、「ギャップ付きBLAST及びPSI-BLAST：新世代のタンパク質データーベース検索プログラム」、Nucleic Acids Res.、25:3389-3402 (1997))のような標準のアラインメントアルゴリズムにより並置されるように十分な構造類似性を有し、かつそのような並置が行われる場合、これらふたつの位置は対として並置されることを意味することとする。
【００７８】
更なる態様において、本発明は、下記を特徴とする、ヨーロッパ型PRRSウイルスを弱毒化する方法に関連している：
a)該ウイルスのヌクレオチド配列が、配列番号:23の位置267〜287に相当するORF3の位置の少なくともひとつでの位置指定突然変異誘発により修飾されること；
b)得られたPRRSウイルスが弱毒化されているかどうかを試験すること。
【００７９】
更なる態様において、本発明は、下記を特徴とする、ヨーロッパ型PRRSウイルスを弱毒化する方法に関連している：
a)該ウイルスのヌクレオチド配列が、配列番号:24のORF5の位置201〜221に相当する位置の少なくともひとつでの位置指定突然変異誘発により修飾されること；
b)得られたPRRSウイルスが弱毒化されているかどうかを試験すること。
【００８０】
好ましくは、前述の修飾は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列の変化を生じる。好ましくは、この修飾は、欠失又は置換である。好ましい態様において、ORF2、ORF3、及びORF5の各々の配列は修飾されている。別の好ましい態様において、ORF2の配列は、少なくとも2個、好ましくは少なくとも3個の位置で修飾される。好ましくは、この修飾は、下記の特徴のひとつ又は複数を生じる：置換又は欠失された配列番号:22によりコードされたアミノ酸配列の位置47、88及び／又は95に相当する1個又は複数のアミノ酸配列の位置にアミノ酸を有するタンパク質をコードしているORF2；置換又は欠失された配列番号:23によりコードされたアミノ酸配列の位置93に相当するアミノ酸を有するタンパク質をコードしているORF3；及び／又は、置換又は欠失された配列番号:24によりコードされたアミノ酸配列の位置71に相当するアミノ酸を有するタンパク質をコードしているORF5。
【００８１】
より好ましくは、このような方法で作成された修飾は、下記の特徴のひとつ又は複数、好ましくは全てを生じる：配列番号:22によりコードされたアミノ酸配列の位置47に相当する位置にセリンを有するタンパク質をコードしているORF2；配列番号:22によりコードされたアミノ酸配列の位置88に相当する位置にフェニルアラニンを有するタンパク質をコードしているORF2；配列番号:22によりコードされたアミノ酸配列の位置95に相当する位置にロイシンを有するORF2；配列番号:23によりコードされたアミノ酸配列の位置93に相当する位置にプロリンを有するORF3；及び／又は、配列番号:24によりコードされたアミノ酸配列の位置71に相当する位置にフェニルアラニンを有するORF5。
【００８２】
好ましい態様において、この修飾は、下記の特徴のひとつ又は複数、好ましくは全てを生じる：配列番号:22であるならば、位置140に相当する位置にCを有するORF2；配列番号:22の位置262に相当する位置にTを有するORF2；配列番号:22の位置283に相当する位置にCを有するORF2；配列番号:23の位置277に相当する位置にCを有するORF3；及び／又は、配列番号:24の位置211に相当する位置にTを有するORF5。
【００８３】
更なる態様において、本発明は、前述の方法により得ることができる弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスに関する。
更なる態様において、本発明は、配列番号:22と、位置130〜150の1個又は複数、及び／又は位置252〜272の1個又は複数、及び／又は位置273〜293の1個又は複数が異なるORF2を有する、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスに関する。
更なる態様において、本発明は、配列番号:23と、位置267〜287の1個又は複数が異なるORF3を有する、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスに関する。
更なる態様において、本発明は、配列番号:24と、位置201〜221の1個又は複数が異なるORF5を有する、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスに関する。
【００８４】
更なる態様において、本発明は、前述のような弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスを、医薬として許容できる担体と組合せて含有するワクチンに関する。更なる態様において、本発明は、PRRSに対するブタのワクチン接種の方法に関し、これは、このようなワクチンを有効量、該ブタに投与することを特徴としている。あるいは、本発明は、PRRSに対するワクチンの製造について説明された、弱毒化されたヨーロッパ型PRRSウイルスの使用に関する。
【００８５】
好ましくは、この生きた弱毒化されたPRRSウイルスは、野生型PRRSウイルスにより引き起された疾患の治療、予防又は診断に使用することができる。このような疾患及び使用は、実施例1において例証されている。更なる本発明の局面は、本発明のウイルスの使用に関する。それらの定義された弱毒化の分子的基礎は、それらを当該技術分野において公知のウイルスに勝るものにしている。特にビルレンス特異部位に欠失を含む本発明のウイルスの使用は、欠失は復帰する傾向が少ないので、好ましい。
【００８６】
別の好ましい本発明の態様は、1種又は数種の本発明のPRRSウイルス(複数)及び医薬として許容できる担体を含有する医薬組成物である。好ましい局面は、単に本発明の該ヨーロッパ型PRRSウイルスのみではなく、更に弱毒化された北米型PRRSウイルス、例えば商標RespPRRS/Ingelvac(登録商標)PRRS MLV(Boehringer Ingelheim社)で医薬組成物として販売されているウイルスなども含有する、医薬組成物である。医薬として許容できる担体は、例えば本発明のPRRSウイルスの徐放型処方の一部の吸収又は形状を安定化又は増大するように作用する、生理的に許容できる化合物を含むことができる。このような生理的に許容できる化合物は、例えば、ブドウ糖、ショ糖又はデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸又はグルタチオンのような酸化防止剤、キレート剤、低分子量タンパク質又は他の安定化剤もしくは賦形剤を含む(同じく、「レミントンの薬科学」(1990)、第18版、Mack Publ.社、イーストンを参照のこと)。当業者は、生理的に許容できる化合物を含む、医薬として許容できる担体の選択は、例えば組成物の投与経路によって決まることを知っているであろう。最も好ましくは、この組成物は、感染した細胞培養物のウイルス-含有上清(組織培養液)を得、必要に応じて安定剤の添加後に、該上清を凍結乾燥することにより処方される。凍結乾燥した組成物は、投与前に、水により再構成することができる。別の例において、適当な担体は、生理的塩溶液である。この医薬組成物は、筋肉内又は皮内に注射されることが好ましい。本発明のワクチンは、雌ブタのワクチンの投与歴に応じてブタに、週齢1、3、6又は10週目に、交配前の雌ブタに、及び／又は分娩前最高6週間前までに(ブースター免疫処置)、又は半年毎に雄豚に(ブースター)、投与することができる。
【００８７】
本発明の別の好ましい態様は、PRRS感染症の予防及び治療のためのワクチン製造における、本発明のPRRSウイルスの使用である。
下記実施例は、更に本発明を例証するために利用される；しかし、これは、本願明細書に明らかにされた本発明の範囲を限定するように構成されるものではない。
【実施例】
【００８８】
実施例1  弱毒化の確立
本実施例は、PRRSウイルスの2種の異なる菌株のビルレント特性の比較に関する、明確な指針を提供する。典型的にビルレントなヨーロッパ型菌株に関する参照菌株として、Lelystad Agent (CDI-NL-2.91)を少ない回数継代した細胞培養物(5回を超えない)を使用することができる。
【００８９】
1群につき少なくとも10頭の未経産雌ブタ(gilt)を各試験は含み、これらはPRRS非存在の農場に由来している。動物は、PRRSウイルス特異的血清及び抗体を含まないことを、並びにPRRSVについて陰性であることを試験した。試験に含まれた全ての動物は、同じ給源及び繁殖であり、かつ過去にRRSV感染症が発生していない農場から得た。群への動物の割付は無作為に行った。チャレンジは、妊娠85〜90日目に、1鼻孔当り105個のTDCID50を伴うPRRSV 1ml(3回目の継代)の鼻腔内塗布により行った。各試験設定につき少なくとも3群を用いた。
1群は、Lelystad Agent (CDI-NL-2.91)チャレンジ；1試験群は、可能性のある弱毒化されたウイルスによるチャレンジ；及び、1群は厳密な対照群。
【００９０】
本試験の正当性は、厳密な対照が試験の時間経過に沿ってPRRS陰性であり続け、かつLelystad Agentでチャレンジした群において、厳密な対照と比べ少なくとも25％少ない生きた健康な子ブタが生まれた場合に、もたらされた。
【００９１】
弱毒化、別の表現をするとより少ないビルレンスは、繁殖機能について決定する1個又は複数のパラメータの統計学的有意性のある変化として定義される：
試験群に関する、下記のパラメータの少なくともひとつの有意な低下が好ましく：
・死産頻度
・妊娠112日目又はそれ以前の流産
・ミイラ化胎仔ブタの数
・生存し虚弱な子ブタの数
・離乳前の死亡率
もしくは、更には、試験群に関する、下記のパラメータのひとつの有意な増加が、好ましい：
・1頭の雌ブタ当りの離乳した子ブタの数
・1頭の雌ブタから生まれた生存し健康な子ブタの数
・Lelystad Agent感染群との比較。
【００９２】
例証的方法において、下記の結果を、Lelystad Agentの147代継代した細胞培養物により、示された説明に従う臨床試験において得ることができる：
【００９３】
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【００９４】
先に説明したように、Lelystad Agentの5代継代した細胞培養物(第1群)及びLelystad Agentの147代継代した細胞培養物(第2群)を接種した雌ブタから、個々の雌ブタの繁殖機能データを得た。加えて、第3群の動物は、厳密な対照として利用し、かつ細胞培養物上清を含まないPRRSVによってのみ接種した。
【００９５】
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【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】図1：GenBankで公開された野生型Lelystad Virus、弱毒化ウイルスA(略号Vir.A)及び弱毒化されたLelystad Virus Bの配列比較ゲノム域：ORF2ヌクレオチド数：750太字及び箱は、本発明の突然変異(非同義ヌクレオチド交換)を示している。(請求項2及び3も参照のこと)。
【図２】図2：GenBankで公開された野生型Lelystad Virus、弱毒化ウイルスA(略号Vir.A)及び弱毒化されたLelystad Virus Bの配列比較ゲノム域：ORF3ヌクレオチド数：798太字及び箱は、本発明の突然変異(非同義ヌクレオチド交換)を示している。(請求項2及び3も参照のこと)。
【図３】図3：GenBankで公開された野生型Lelystad Virus、弱毒化ウイルスA(略号Vir.A)及び弱毒化されたLelystad Virus Bの配列比較ゲノム域：ORF4ヌクレオチド数：552
【図４】図4：GenBankで公開された野生型Lelystad Virus、弱毒化ウイルスA(略号Vir.A)及び弱毒化されたLelystad Virus Bの配列比較ゲノム域：ORF5ヌクレオチド数：606太字及び箱は、本発明の突然変異(非同義ヌクレオチド交換)を示している。(請求項2及び3も参照のこと)。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004534522.tif 000089
【国際調査報告】
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