(57)【要約】配列番号：１の塩基配列を有するヒト子宮頸部癌２癌原遺伝子またはその断片は種々の癌組織に過発現され、種々の癌の診断に使用でき、それに相補的なアンチセンス遺伝子は癌を治療するのに利用できる。
2004514446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１の塩基配列を有するヒト子宮頸部癌２癌原遺伝子またはその断片。
【請求項２】
配列番号：１の塩基番号６３〜９７７に該当する塩基配列を有する請求項１記載のヒト子宮頸部癌２癌原遺伝子またはその断片。
【請求項３】
配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片。
【請求項４】
請求項１の癌原遺伝子またはその断片を含むベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターで形質転換された微生物。
【請求項６】
大腸菌ＪＭ１０９／ＨＣＣＲ−２（寄託番号：ＫＣＴＣ　０６６８ＢＰ）である請求項５記載の微生物。
【請求項７】
請求項５または６の微生物を培養することを含む請求項３記載のタンパク質またはその断片の製造方法。
【請求項８】
請求項１または２の癌原遺伝子またはその断片を含む癌診断用キット。
【請求項９】
請求項３のタンパク質またはその断片を含む癌診断用キット。
【請求項１０】
請求項１または２の癌原遺伝子またはその断片から転写されるｍＲＮＡ配列の全部または一部と相補的な塩基配列を有し、前記ｍＲＮＡに結合して前記癌原遺伝子または断片の発現を抑制する塩基配列を有するアンチ−センス遺伝子。
【請求項１１】
請求項１０のアンチセンス遺伝子の治療学的有効量と薬剤学的に許容可能な担体を含む癌の予防または治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は、新規な癌原遺伝子およびそれによってコードされるタンパク質に関し、さらに詳細には、種々の癌の診断に用いられるヒト子宮頸部癌２癌原遺伝子およびそれから誘導されたタンパク質に関する。
【０００２】
【発明の背景】
ヒトを含む高等動物は、約１００，０００個の遺伝子を有しているが、これらのうち約１５％のみが発現され、発生、分化、恒常性（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ）、刺激に対する反応、細胞分裂周期の調節、老化およびアポトーシス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ； ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ）などのような個人の生物学的過程の特性はどの遺伝子が発現するかによって決定される（Ｌｉａｎｇ， Ｐ． ａｎｄ Ａ． Ｂ． Ｐａｒｄｅｅ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５７： ９６７−９７１（１９９２）参照）。
【０００３】
腫瘍形成のような病理学的現象は、遺伝子突然変異によって誘発され、遺伝子発現の変化をもたらす。したがって、種々の細胞における遺伝子発現の比較研究は多様な生物学的現象を理解する上で基本的で効果的な接近方法であるといえる。
【０００４】
たとえば、リアンとパーディー（Ｌｉａｎｇ， Ｐ． ａｎｄ Ａ． Ｂ． Ｐａｒｄｅｅの前記文献参照）によって提案されたｍＲＮＡディファレンシャル・ディスプレイ法（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）は、現在腫瘍抑制遺伝子や細胞分裂周期に係る遺伝子およびアポトーシスを調節する転写調節遺伝子（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｇｅｎｅ）などを探索する上で有効である。さらに、ディファレンシャル・ディスプレイ法は、また一つの細胞中の種々の遺伝子の相互関連性の調査にも広範囲に活用されている。
【０００５】
腫瘍形成は、特定染色体部位の消失、癌原遺伝子の活性化およびｐ５３遺伝子を含む他の腫瘍抑制遺伝子の失活などのような種々の遺伝的変化によって誘発されると報告されている（Ｂｉｓｈｏｐ， Ｊ． Ｍ．， Ｃｅｌｌ， ６４： ２３５−２４８（１９９１）；およびＨｕｎｔｅｒ， Ｔ．， Ｃｅｌｌ， ６４： ２４９−２７０（１９９１）参照））。さらに、ヒト癌の１０〜３０％は癌原遺伝子の増幅を通じて発癌遺伝子が活性化されることによって発病すると報告されている。
【０００６】
したがって、癌原遺伝子の活性化は多くの癌の病因学研究に重要な役割を果し、これを明らかにすることが要求されている。
【０００７】
そこで、本発明者は、子宮頸部癌の腫瘍形成に介入する機構を調査するために鋭意研究した結果、ヒト子宮頸部癌２（ＨＣＣＲ−２）と命名された新規な癌原遺伝子が癌細胞中に特異に過発現されるという意外な事実を発見した。前記癌原遺伝子は、白血病、リンパ腫、結腸癌、乳房癌、腎臓癌、胃癌、肺癌、卵巣癌および子宮頸部癌のような種々の癌の診断、予防および治療に効果的に使用し得る。
【０００８】
【発明の概要】
したがって、本発明の目的は、新規な癌原遺伝子およびその断片を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記癌原遺伝子またはその断片を含む組換えベクターおよびそれによって形質転換された微生物；
前記癌原遺伝子によってコードされるタンパク質およびその断片；
前記癌原遺伝子またはその断片を含む癌診断用キット；
前記タンパク質またはその断片を含む癌診断用キット；
前記癌原遺伝子またはその断片から誘導されるｍＲＮＡに相補的な塩基配列を有するアンチセンス遺伝子；および
前記アンチセンス遺伝子を用いて癌を治療または予防する方法を提供することである。
【００１０】
本発明の一実施態様によって、配列番号：１のヌクレオチド配列を有する新規な癌原遺伝子またはその断片が提供される。
【００１１】
本発明の他の実施態様によって、前記癌原遺伝子またはその断片を含む組換えベクターおよび該ベクターによって形質転換された微生物が提供される。
【００１２】
本発明のまた他の実施態様によって、前記癌原遺伝子またはその断片から誘導された配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片が提供される。
【００１３】
【発明の詳細な記述】
本発明の前記および他の目的および特徴は、添付の図面と共に、以下の本発明の詳細な説明によって明白になるであろう。
【００１４】
本発明の新規癌原遺伝子であるヒト子宮頸部癌２（ｈｕｍａｎ ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ １、以下「ＨＣＣＲ−２癌原遺伝子」と称する）は、２００３塩基対（ｂｐ）からなり、配列番号：１のＤＮＡ配列を有する。
【００１５】
配列番号：１の塩基配列において、塩基番号６３〜９７７部位に該当するオープン・リーディング・フレーム（Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ；ＯＲＦ）は、タンパク質コーディング領域であり、それから誘導されるアミノ酸（「ＨＣＣＲ−２タンパク質」）は配列番号：２に示される３０４個のアミノ酸からなる。また、配列番号：１のヌクレオチド番号３２１〜３８０部位は単一膜貫通ドメイン（ｓｉｎｇｌｅ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）をコードし、それから配列番号：２のアミノ酸番号８７〜１０６に相当するアミノ酸からなるアミノ酸配列が予測される。これは、本発明の癌原遺伝子が膜結合遺伝子であることを示す。
【００１６】
単一Ｎ−グリコシル化部位（配列番号：１の塩基番号８３１〜８３９および配列番号：２のアミノ酸番号２５７〜２５９に該当する）は、ＨＣＣＲ−２タンパク質のＣ−末端付近に存在し、このようなＨＣＣＲ−２タンパク質はＩＩ型膜タンパク質であると推定される。ポリアデニル化シグナルは配列番号：１のヌクレオチド番号１８９４〜１８９８に該当する。
【００１７】
コドンの縮退性および本発明の癌原遺伝子を発現させようとする特定生物において選好されるコドンを考慮するとき、配列番号：１のＤＮＡ配列の多様な変化および変形は、発現されるタンパク質のアミノ酸配列を変えない範囲内のコーディング領域または癌原遺伝子の発現に影響を及ぼさない範囲内の非−コーディング領域で行われることができる。したがって、本発明の癌原遺伝子と実質的に同様な塩基配列を有するポリヌクレオチドおよびその断片もまた本発明の範疇に含まれる。本願に用いられる「実質的に同様なポリヌクレオチド」とは、本発明の癌原遺伝子と塩基配列が８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを意味する。
【００１８】
本発明の癌原遺伝子から発現されるタンパク質は、３０４個のアミノ酸からなり、配列番号：２のアミノ酸配列を有し、このタンパク質の分子量は約４５ｋＤａである。しかし、タンパク質のアミノ酸残基の置換、付加および／または欠失をタンパク質の機能に影響を及ぼさない範囲内で行うことができる。また、目的に応じてタンパク質の一部のみが使用され得る。このような変形されたアミノ酸およびその断片もまた本発明の範囲に含まれる。したがって、本発明の範疇には、本発明の発癌遺伝子から誘導されたタンパク質と実質的に同様なアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびその断片が含まれる。本願に用いられる「実質的に同様なポリペプチド」とは、配列番号：２のアミノ酸配列とアミノ酸配列が８０％以上、好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するポリペプチドを意味する。
【００１９】
本発明の癌原遺伝子またはタンパク質は、ヒト癌組織から得られるか、通常のＤＮＡまたはペプチド合成方法に従って合成することができる。また、このように製造された遺伝子を通常のベクターに挿入して発現ベクターを製造した後、これを適切な宿主、たとえば、大腸菌または酵母のような微生物、或はマウスのような動物細胞、またはヒト細胞に導入し得る。
【００２０】
形質転換された宿主を用いて本発明のＤＮＡまたはタンパク質を大量生産することができる。たとえば、本発明のＨＣＣＲ−２遺伝子を含むベクターｐＣＥＶ−ＬＡＣ（Ｍｉｋｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ８３， １３７−１４６（１９８９））（ＨＣＣＲ−２／ｐＣＥＶ−ＬＡＣと命名する）で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換させ、ＪＭ１０９／ＨＣＣＲ２と命名された大腸菌形質転換体を得、これを特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定により、１９９９年１０月１１日付で韓国生命工学研究所遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＫＣＴＣ）；住所：大韓民国大田廣域市儒城區魚隠洞５２番地韓国生命工学研究所（Ｋｏｒｅａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＫＲＩＢＢ））に寄託番号第ＫＣＴＣ　０６６８ＢＰ号として寄託した。
【００２１】
ベクター製作の際には、プロモーター、ターミネーターのような発現調節配列、自家複製配列および分泌シグナルを宿主細胞の種類によって適宜選択することができる。
【００２２】
本発明の癌原遺伝子の過発現は、正常の子宮頸部組織においては起こらないが、子宮頸部癌組織、子宮頸部癌細胞株においては過発現が起こる。これから、本発明の癌原遺伝子は子宮頸部癌を誘発させることが分かる。また、正常の繊維芽細胞、たとえば、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞株が本発明の癌原遺伝子でトランスフェクトされると非正常細胞が生成する。光学顕微鏡と電子顕微鏡で観察した形態学的特性は非正常細胞が腫瘍細胞の形態を有することを示す。
【００２３】
また、本発明の癌原遺伝子でトランスフェクトされた正常の繊維芽細胞をヌードマウスの臀部に注射すると、注射してから約２１日後に腫瘍形成が観察され、約４０日目には１ｃｍ×１ｃｍサイズの腫瘍が観察される。ヘマトキシリン−エオシン染色法を用いて腫瘍細胞が癌であることを確認できる。
【００２４】
子宮頸部癌のような上皮性組織に加えて、本発明の癌原遺伝子も白血病、リンパ腫、乳房癌、腎臓癌、卵巣癌、肺癌および胃癌のような種々の他の癌腫瘍において過発現が観察される。したがって、本発明の癌原遺伝子は種々の癌の発生に共通した因子であると判断され、種々の癌の診断および形質転換された動物の製造およびアンチセンス遺伝子の治療に効果的に利用できる。
【００２５】
本発明の癌原遺伝子を用いた診断方法は、たとえば、本発明の癌原遺伝子またはその断片を含有するプローブを用いて対象者の体液から分離した核酸をハイブリッド化する段階および当分野で公知の検出方法を用いてその物質が癌原遺伝子を有しているかを判断する段階を含む。前記プローブを放射線同位元素または酵素で標識することによって、癌原遺伝子の存在を容易に確認することができる。したがって、本発明の癌原遺伝子またはその断片を含む癌診断用キットもまた本発明の範疇に含まれる。
【００２６】
形質転換動物は、本発明の癌原遺伝子を哺乳動物、たとえば、ラットに感染させることによって製造でき、これもまた本発明の範疇に含まれる。形質転換動物の製造に当たっては、本発明の癌原遺伝子を８細胞期以前の動物受精卵段階で導入することが好ましい。このように形質転換された動物は、発癌性物質、または抗酸化剤のような抗癌性物質の探索などに有用に利用できる。
【００２７】
また、本発明は、遺伝子治療に効果的なアンチ−センス遺伝子を提供する。本願において、「アンチセンス遺伝子（ａｎｔｉ−ｓｅｎｓｅ ｇｅｎｅ）」とは、配列番号：１の塩基配列を有する癌原遺伝子またはその断片から転写されるｍＲＮＡ配列の全部または一部と相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドを意味し、前記ヌクレオチドはｍＲＮＡのタンパク質結合部位に結合することによって癌原遺伝子のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の発現を防止することができる。
【００２８】
本発明はまた、その範囲内に本発明のアンチセンス遺伝子の治療学的有効量を患者に投与することによって癌を治療または予防する方法を含む。
【００２９】
本発明のアンチセンス遺伝子の治療に当たっては、本発明のアンチセンス遺伝子は癌原遺伝子の発現を予防するために通常の方法で患者に投与される。たとえば、アンチセンスＯＤＮを文献［Ｊ．Ｓ． Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ５３， １７５−１８２（１９９８）］に開示された方法に従って、ポリ−Ｌ−リジン誘導体と静電気的引力によって混合し、この混合したアンチセンスＯＤＮを患者に静脈投与する。
【００３０】
本発明の範囲にはまた、薬剤学的に許容可能な担体、賦形剤または必要に応じて他の添加剤とともに本発明のアンチセンス遺伝子を活性成分として含む抗癌組成物が含まれる。本発明の薬剤学的組成物は注射剤に製剤化することが好ましい。
【００３１】
実際に投与されるアンチセンス遺伝子の量は、治療する症状、選択された投与経路、患者の年齢および体重、症状の重症度を含む種々の関連因子を考慮して決定しなければならない。
【００３２】
本発明の癌原遺伝子から発現されるタンパク質は、診断道具として抗体を生産するのに有用である。本発明の抗体は、配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片を用いて当分野で公知の通常の方法に従ってモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の形態に製造できる。このような抗体を用いて当分野で公知の任意の方法、たとえば、酵素免疫測定法（ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ））、放射線免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（ＲＩＡ））、サンドイッチ分析法（ｓａｎｄｗｉｃｈ ａｓｓａｙ）、免疫組織化学的染色法、ポリアクリルゲル上ウエスタンブロットまたは免疫ブロット方法によって対象者の体液に当該タンパク質が発現されたかを確認することによって癌を診断することができる。したがって、本発明の範疇には、配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質またはその断片を含む発癌診断キットが含まれる。
【００３３】
本発明の癌原遺伝子を用いて持続的に増殖し得る癌細胞株を確立することができ、このような細胞株は、たとえば、本発明の癌原遺伝子で形質転換された繊維芽細胞をヌードマウスに注射することによって背部に形成された腫瘍組織から得られる。このように製造された細胞株は、抗癌剤の探索に効果的に利用することができる。
【００３４】
【実施例】
下記の実施例および試験例は、本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【００３５】
実施例１：ｍＲＮＡのディファレンシャルディスプレイ
（段階１）総ＲＮＡの分離
子宮筋腫患者から子宮摘出術（ｈｙｓｔｅｒｅｃｔｏｍｙ）中に正常の子宮頸部（ｅｘｏｃｅｒｖｉｃａｌ）組織試料を得、広汎子宮全摘術（ｒａｄｉｃａｌ ｈｙｓｔｅｒｅｃｔｏｍｙ）中に未処置の原発性子宮頸部癌組織試料および転移性腸骨リンパ節組織試料を得た。ヒト子宮頸部癌細胞株ＣＵＭＣ−６（Ｋｉｍ， Ｊ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｙｎｅｃｏｌ． Ｏｎｃｏｌ．， ６２， ２３０−２４０ （１９９６））はウェーマウス（Ｗａｙｍｏｕｔｈ）ＭＢ７５１／１培地で培養した。
【００３６】
市販のシステム（ＲＮｅａｓｙ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて前記組織試料および細胞から総ＲＮＡを抽出した後、メッセージクリーンキット（Ｍｅｓｓａｇｅ ｃｌｅａｎ ｋｉｔ， ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ Ｃｏｒｐ．， Ｂｒｏｏｋｌｉｎｅ， ＭＡ）を用いてこれからＤＮＡ汚染物を除去した。
【００３７】
（段階２）ディファレンシャルディスプレイ
ディファレンシャルディスプレイは、リアングらの方法（Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５７， ９６７−９７１ （１９９２）；およびＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５２， ６９６６−６９６８ （１９９２））を若干変形して次の通り行った。
【００３８】
段階１で得られた総ＲＮＡ各０．２μｇを配列番号：３の固定オリゴ−ｄＴプライマー（ＲＮＡｉｍａｇａｅ ｋｉｔ， ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ）を用いて逆転写させた後、同じ固定オリゴ−ｄＴプライマーおよび任意のプライマー５’　１３ｍｅｒ（ＲＮＡｉｍａｇｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ １， Ｈ−ＡＰ １−３２）を用いて０．５ｍＭ［α−３５Ｓ］−標識されたｄＡＴＰ（１，２００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）の存在下で重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。９５℃で４０秒、４０℃で２分、７２℃で４０秒からなるＰＣＲ熱サイクルを４０回繰り返した後、最終的に７２℃で５分間反応させた。このようにして得られたＰＣＲ産物を６％ポリアクリルアミドシークエンスゲルで電気泳動させた後オートラジオグラフィーした。
【００３９】
図１は、配列番号：３の任意の５’　１３ｍｅｒプライマーと、配列番号：５のＨ−Ｔ１１Ｃ固定オリゴ−ｄＴプライマーを用いた、正常の子宮頸部組織、子宮頸部癌組織、転移性組織および子宮頸部癌細胞株ＣＵＭＣ−６のディファレンシャルディスプレイ結果を示し、ここで矢印は、子宮頸部癌組織および転移性腸骨リンパ節組織およびヒト子宮頸部癌細胞株ＣＵＭＣ−６で特異的に発現され、ＣＣ２１４と命名された２０６ｂｐ断片を指す。
【００４０】
乾燥したシークエンスゲルから断片ＣＣ２１４のバンドを切取り、１５分間水で湧かして断片ＣＣ２１４を溶出させた。［α−３５Ｓ］−標識されたｄＡＴＰおよび２０μＭ　ｄＮＴＰを使用しない状態で前記と同一な条件を用いて断片ＣＣ２１４のＰＣＲを行った。増幅された断片ＣＣ２１４をＴＡクローニングシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ）を用いて断片ＣＣ２１４のｐＧＥＭ−Ｔ　Ｅａｓｙベクターにクローニングし、シーケナーゼ・バージョン２．０　ＤＮＡ配列決定システム（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， ＵＳＡ）を用いてその塩基配列を決定した。断片ＣＣ２１４のヌクレオチド配列をＢＬＡＳＴおよびＦＡＳＴＡプログラムを用いてジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースと比較分析した結果、この断片はジーンバンクデータベースに登録された塩基配列とは配列の類似性がほとんどなかった。
【００４１】
実施例２：ｃＤＮＡライブラリスクリーニング
バクテリオファージλｇｔ１１ヒト肺胚繊維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）ｃＤＮＡライブラリ（韓国ソウルの漢陽大学のＩＹジョン教授から供与された）を３２Ｐ−標識された無作為プライムＣＣ２１４ ｃＤＮＡプローブを用いてプラークハイブリダイゼーション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｎｕａｌ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ （１９８９））でスクリーニングすることにより全長ｃＤＮＡクローンを得た（ＨＣＣＲ−２と命名する）。全長ＨＣＣＲ−２ ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列を決定した。
【００４２】
全長ＨＣＣＲ−２ ｃＤＮＡクローンは配列番号：１のヌクレオチド配列を有する２００３ｂｐ挿入体を含み、この塩基配列は６３〜９７７番目の塩基部位に該当するタンパク質コーディング領域である全体オープン・リーディング・フレームを含み、これから誘導されたアミノ酸配列は配列番号：２の３０４個のアミノ酸からなる。さらに、配列番号：１の３２１〜３８０番目の塩基部位は単一膜貫通ドメイン（ｓｉｎｇｌｅ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）をコーディングし、それからは配列番号：２における８７〜１０６番目のアミノ酸残基が予測される。これから、本発明の癌原遺伝子は膜結合遺伝子であると判断される。
【００４３】
単一Ｎ−グリコシル化部位（配列番号：１の塩基番号８３１〜８３９に該当し、配列番号：２のアミノ酸番号２５７〜２５９に該当する）はＨＣＣＲ−２タンパク質のＣ−末端付近に存在するため、ＨＣＣＲ−２はＩＩ型膜タンパク質であるとみられる。ポリアデニル化シグナルは、配列番号：１のヌクレオチド番号１８９４〜１８９８に該当する。
【００４４】
全長ＨＣＣＲ−２ ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋに登録番号第ＡＦ３１５５９８号として登録した。
【００４５】
全長ＨＣＣＲ−２ ｃＤＮＡをベクターｐＣＥＶ−ＬＡＣ（Ｍｉｋｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ８３， １３７−１４６ （１９８９））に挿入して組換えベクターＨＣＣＲ−２／ｐＣＥＶ−ＬＡＣを得、大腸菌ＪＭ１０９を組換えベクターＨＣＣＲ−２／ｐＣＥＶ−ＬＡＣで形質転換させてＪＭ１０９／ＨＣＣＲ２と命名された形質転換大腸菌を得、これを韓国遺伝子銀行（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、住所：３０５−３３３大韓民国大田廣域市儒城區魚隠洞５２番地）に１９９９年１０月１１日付で寄託番号第ＫＣＴＣ　０６６８ＢＰ号として寄託した。
【００４６】
実施例３：ノーザンブロット分析
様々な正常の組織、癌組織および癌細胞株においてＨＣＣＲ−２遺伝子の発現水準を測定するために、次のようにノーザンブロット分析を行った。
【００４７】
実施例１の段階１の方法を繰り返して正常の子宮頸部組織、原発性子宮頸部癌およびヒト子宮頸部癌細胞株ＣａＳｋｉ（ＡＴＣＣ　ＣＲＬ１５５０）およびＣＵＭＣ−６から総ＲＮＡを製造した。各々２０μｇの総ＲＮＡを変性させた後、１％ホルムアルデヒドアガロースゲルで電気泳動させた後、ナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。得られたブロットを、レディプライム（ｒｅｄｉｐｒｉｍｅ）ＩＩ無作為プライムラベリングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて３２Ｐ−標識された無作為−プライムＨＣＣＲ−２ ｃＤＮＡプローブと４２℃で一晩ハイブリッド化した。ノーザンブロット分析結果を同様に２回繰り返して、デンシトメトリーで定量し、同じブロットをβ−アクチンプローブとハイブリッド化してｍＲＮＡ総量を確認した。
【００４８】
正常のヒト１２多重組織（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とヒト癌細胞株（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて供給者の処方に従ってノーザンブロット分析を行った。
【００４９】
図２は、正常の子宮頸部組織、原発性子宮頸部癌組織および子宮頸部癌細胞株ＣＵＭＣ−６およびＣａＳｋｉのＨＣＣＳ−１ ｃＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット分析結果であり；同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化した結果である。図２から分かるように、ＨＣＣＲ−２遺伝子の発現水準は子宮頸部癌組織および子宮頸部癌細胞株においては高かったが、正常の子宮頸部組織においては発現程度が低いか、観察されなかった。
【００５０】
図３Ａは、種々の正常のヒト組織、すなわち、脳、心臓、骨格筋、結腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝、小腸、胎盤、肺および末梢血液白血球組織のＨＣＣＲ−２　ｃＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット分析結果であり；図３Ｂは同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化した結果である。図３Ａから分かるように、ＨＣＣＲ−２　ｍＲＮＡ（〜２．０ｋｂ）は多くの正常の組織においては弱く発現されたか、またはほとんど発現されなかったが、正常の腎臓組織においては発現水準が高かった。
【００５１】
図４Ａは、ヒト白血病およびリンパ腫細胞株、すなわち、前骨髄球性白血病ＨＬ−６０細胞、ＨｅＬａ子宮頸部癌細胞、慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２細胞、リンパ性白血病ＭＯＬＴ−４、バーキットリンパ腫Ｒａｊｉ細胞、ＳＷ４８０結腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞およびＧ３６１黒色腫細胞のＨＣＣＲ−２ ｃＤＮＡプローブを用いたノーザンブロット分析結果であり；図４Ｂは、同じブロットをβ−アクチンプローブでハイブリッド化した結果である。図４Ａおよび４Ｂから分かるように、ＨＣＣＲ−２は慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ−５６２細胞、バーキットリンパ腫Ｒａｊｉ細胞、リンパ性白血病ＭＯＬＴ−４および前骨髄球性白血病ＨＬ−６０細胞およびＨｅＬａ細胞のようなヒト白血病およびリンパ腫細胞株において高水準で発現されることが分かる。
【００５２】
特に、Ｋ−５６２細胞、ＭＯＬＴ−４およびＨＬ−６０は正常の白血球に比べて約１９０、９０および７０倍程度さらに高い転写水準を示す。ＳＷ４８０結腸癌細胞、Ａ５４９肺癌細胞およびＧ３６１黒色腫細胞におけるＨＣＣＲ−２遺伝子の発現は白血病およびリンパ腫細胞においてより低かった。
【００５３】
また、ヒト腎臓癌、乳房癌、肺癌、卵巣癌および胃癌組織およびこれらの各々の正常組織に対するノーザンブロット分析を行った。図５Ａに示すように、ＨＣＣＲ−２はヒト癌組織において高水準で転写される反面、正常の組織においてはＨＣＣＲ−２遺伝子の発現はほとんど観察されなかった。図５Ｂは、同一なサンプルをβ−アクチンプローブでハイブリッド化してｍＲＮＡの存在を確認したものである。
【００５４】
実施例４：発現ベクターの製造および動物細胞の形質転換
（段階１）ＨＣＣＲ−２を含有するベクターの製造
ＨＣＣＲ−２のコーディング部位を含有する発現ベクターを次の通り製造した。
【００５５】
まず、実施例２で得られた全体ＨＣＣＲ−２　ｃＤＮＡを原核発現ベクターであるｐＣＥＶ−ＬＡＣのＳａｌＩの制限部位に挿入した（文献［Ｍｉｋｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ８３： １３７−１４６ （１９８９）参照］。次いで、前記ｐＣＥＶ−ＬＡＣ／ＨＣＣＲ−２ベクターからＳａｌＩ断片を分離した。
【００５６】
次いで、ｐｃＤＮＡ３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＸｈｏＩで処理してＳａｌＩに合う末端を製造した。全長ＨＣＣＲ−２コーディング配列を有するＳａｌＩ断片をＸｈｏＩで処理されたｐｃＤＮＡ３に挿入した。生成したｐｃＤＮＡ３／ＨＣＣＲ−２発現ベクターをリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いてＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＣＴＣ ＣＲＬ， １６５８， ＵＳＡ）中に導入し、Ｇ４１８ （Ｇｉｂｃｏ）で捕捉された培地で選択した。ＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞を「ＨＣＣＲ−２Ｍ細胞」と命名した。ｐｃＤＮＡ３のみを含むＮＩＨ／３Ｔ３細胞を他の対照群として製造した後、これを「ｐｃＤＮＡ３細胞」と命名した。
【００５７】
（段階２）ＨＣＣＲ−２癌原遺伝子でトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３繊維芽細胞
図６に示すように、分化された繊維芽細胞株である野生型正常ＮＩＨ／３Ｔ３細胞は長くて細い核と貧弱な細胞質を有する紡錘形細胞である。段階１で得られたＨＣＣＲ−２を発現するＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＨＣＣＲ−２Ｍ細胞）でＨＣＣＲ−２が発現される場合、細胞の形態は図７に示すような卵形の核および多量の細胞質を有する多角形模様に変化する。
【００５８】
ＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３を単層培養し、ヘマトキシリン−エオシンで染色して観察した結果、図８に示すように、核の多形成、明らかな核小体、および顆粒状染色質所見および腫瘍巨大細胞、並びに非定型類似分裂が観察された。
【００５９】
実施例５：動物におけるＨＣＣＲ−２Ｍ細胞の腫瘍形成能
腫瘍形成能を分析するために、５週齢のヌードマウス（ａｔｈｙｍｉｃ ｎｕ／ｎｕ ｏｎ ＢＡＬＢ／ｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）１０匹を対象に、癌原遺伝子ＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＨＣＣＲ−２Ｍ細胞）５×１０６個を臀部に皮下注射した。皮下腫瘍の大きさが１．５〜２．５ｃｍになったときヌードマウスを犠牲した。
【００６０】
図９に示すように、ＨＣＣＲ−２Ｍ細胞を注入した１０匹のマウスはすべて２１日後顕著な腫瘍を示した。
【００６１】
ＨＣＣＲ−２Ｍ細胞が移植されたヌードマウスは、上皮性癌腫の特性を示す。図１０は、ヌードマウスから取った皮下腫塊をヘマトキシリン−エオシンで染色して観察したものである。腫塊部分は繊維性間質によって分離された典型的な上皮性細胞巣であることが明らかになった。
【００６２】
実施例６：ＨＣＣＲ−２Ｍ細胞によって誘導された腫瘍組織から新規な癌細胞株の確立
前記実施例５の腫瘍組織から得た細胞を２０％のウシ胎児血清を用いて通常の方法で培養し、培養された細胞を「ＨＣＣＲ−２ＭＮ」細胞と命名した。図１１に示すように、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で各々の細胞は母細胞であるＨＣＣＲ−２Ｍ細胞と類似した細胞学的特性を示した。
【００６３】
実施例７：ＨＣＣＲ−２癌原遺伝子を大腸菌にトランスフェクトした後発現されるタンパク質サイズの決定
配列番号：１の全長ＨＣＣＲ−２癌原遺伝子をｐＥＴ−３２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）の多重クローニング部位に挿入した後、ｐＥＴ−３２ｂ（＋）／ＨＣＣＲ−２ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＡＴＣＣ ４７０９２）にトランスフェクトした。トランスフェクトされた大腸菌をＬＢブロース培地で振盪培養した後、培養液を１／１００に稀釈し、さらに３時間培養した。これに、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ ｂｅｔａ−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏ−ｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ， ＩＰＴＧ， Ｓｉｇｍａ）を加えてタンパク質生産を誘導した。
【００６４】
ＩＰＴＧ誘導前と誘導後に培養液中の大腸菌細胞を超音波粉砕した後、１２％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動させた（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。図１２は、ｐＥＴ−３２Ｂ（＋）／ＨＣＣＲ−２ベクターでトランスフェクトされた大腸菌ＢＬ２１菌株のタンパク質の発現様相をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果である。ＩＰＴＧ誘導後、約４５ｋＤａのタンパク質バンドが明らかに観察された。この４５ｋＤａ融合タンパク質はｐＥＴ−３２ｂ（＋）ベクターの遺伝子から発現された約２０ｋＤａサイズのＴｒｉｘ・Ｔａｇチオレドキシンタンパク質を含有していた。
【００６５】
実施例８：抗体生産
実施例７のｐＥＴ−３２ｂ（＋）／ＨＣＣＲ−２ベクターでトランスフェクトされた大腸菌ＢＬ２１菌株から分離した４５ｋＤａの融合タンパク質をＨｉｓ−Ｂｉｎｄ　Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）で精製した。精製したペプチドを免疫ブロッティングした結果、４５ｋＤａのタンパク質を多量含有していることを確認した。
【００６６】
次いで、２匹の６週齢スプラグダウリーラット（体重約１５０ｇ）に前記で得られたペプチド１ｍｇを１週間に３回皮下免疫させた。このように免疫化されたラットから血液試料を採取し、遠心分離してポリクローナル血清を得た。前記ポリクローナル血清の抗ＨＣＣＲ−２活性は酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ， １：１０，０００）で確認した。
【００６７】
実施例９：抗体特異性確認のための免疫ブロッティング
ウエスタンブロット分析のために、ラムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）の文献［Ｎａｔｕｒｅ ２２７： ６８０−６８５ （１９７０）］に記述された方法に従って図７で確認された細胞を収穫し、溶解した。細胞タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、ニトロセルロース膜に電気的に移動させた。前記膜を実施例８で製造したラットポリクローナル抗ＨＣＣＲ−２血清とともに１６時間反応させた。前記膜を洗浄した後、ペルオキシダーゼで結合されたヤギ−抗ラット免疫グロブリン（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１：１，０００比率の希釈液を２次抗体として含むブロッキング溶液と反応させた。ＥＣＬ−ウエスタンブロット検出キット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ （Ａｍｅｒｓｈａｍ））を用いてタンパク質を確認した。
【００６８】
図１３に示すように、ＨＣＣＲ−２タンパク質はＨＣＣＲ−２細胞に過発現され、野生型およびベクター（ｐｃＤＮＡ３）のみでトランスフェクトされた細胞（ｐｃＤＮＡ）においてはかすかなバンドのみが観察された。これは、ポリクローナル血清中の抗−ＨＣＣＲ−２抗体の特異性を示すものである。
【００６９】
また、ポリクローナル血清中のＨＣＣＲ−２抗体は種々の組織からのヒトタンパク質抽出物中で約４５ｋＤａタンパク質であることが認識された。図１４に示すように、腎臓、乳房、肺、卵巣および胃癌を含むヒト癌組織はこれらの各々の正常組織と比べたとき、高いＨＣＣＲ−２タンパク質の発現を示した。
【００７０】
実施例１０：免疫組織化学的染色法（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｔａｉｎｉｎｇ）
様々な正常組織および癌組織においてＨＣＣＲ−２タンパク質の発現程度を観察するために、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合方法（Ｈｓｕ， Ｓ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ， ２９： ５７７−５８０（１９８１））に従って次のように免疫組織化学的染色法を行った。
【００７１】
キシレンを用いてパラフィンで包埋された組織からワックスを除去し、パラフィン除去後に精製された（ｇｒａｄｅｄ）エタノールで処理し、再水和させた後水で洗浄した。次いで、組織を過酸化水素で作られたペルオキシド消光溶液（ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に３０分間入れて内因性のペルオキシダーゼの活性を除去し、血清遮断溶液（ｓｅｒｕｍ ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ， Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， ＣＡ， ＵＳＡ）で３０分間処理して非特異的結合を遮断した後、１次抗体で処理し、４℃で一晩放置した後リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄し、ビオチン−結合２次抗体（Ｚｙｍｅｄ）で３０分間処理した後ＰＢＳで洗浄した。次いで、組織を酵素接合で３０分間処理した後、ＰＢＳで洗浄し、クロモゲン（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ）であるアミノエチルカルバゾール（Ｚｙｍｅｄ）で１８分間処理した。次いで、組織切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【００７２】
図１５は、正常の白血球（Ａ）およびヒト白血病細胞（Ｂ）の免疫組織化学的（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）染色結果を示す。正常の白血球は発現を示さないが、白血病細胞は強い発現を示す。
【００７３】
図１６は、正常のリンパ球（Ａ）およびリンパ腫組織（Ｂ）の免疫組織化学的染色結果を示す。正常のリンパ球は発現を示さないが、白血病細胞は細胞質において強い発現を示す。
【００７４】
図１７は、正常の乳房組織（Ａ）および乳房癌組織（Ｂ）の免疫組織化学的染色結果を示す。正常の乳房組織は発現を示さないが、乳房癌組織は細胞質において強い発現を示す。
【００７５】
図１８は、正常の結腸組織（Ａ）および結腸癌組織（Ｂ）の免疫組織化学的染色結果を示す。正常の結腸組織は発現を示さないが、結腸癌組織は細胞質において強い発現を示す。
【００７６】
図１９は、正常の腎臓組織（Ａ）および腎臓癌組織（Ｂ）の免疫組織化学的染色結果を示す。正常の腎臓組織は発現を示さないが、腎臓癌組織は細胞質において強い発現を示す。
【００７７】
図２０は、正常の子宮頸部組織（Ａ）および子宮頸部癌組織（Ｂ）の免疫組織化学的染色結果を示す。正常の子宮頸部組織は発現を示さないが、子宮頸部癌組織は強い発現を示す。
【００７８】
実施例１１：発現ベクターの製造およびヒト細胞の形質転換
（段階１）ＨＣＣＲ−２を含有するベクターの製造
ＨＣＣＲ−２のコーディング部位を含有する発現ベクターを次の通り製造した。
【００７９】
まず、ＨＣＣＲ−２　ｃＤＮＡを原核発現ベクターであるｐＣＥＶ−ＬＡＣのＳａｌＩの制限部位に挿入した（文献［Ｍｉｋｉ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， ８３： １３７−１４６ （１９８９）参照］。次いで、前記ｐＣＥＶ−ＬＡＣ／ＨＣＣＲ−２ベクターからＳａｌＩ断片を分離した。
【００８０】
次いで、ｐｃＤＮＡ３発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＸｈｏＩで処理してＳａｌＩに合う末端を製造した。全体ＨＣＣＲ−２コーディング配列を有するＳａｌＩ断片をＸｈｏＩで処理されたｐｃＤＮＡ３に挿入した。生成したｐｃＤＮＡ３／ＨＣＣＲ−２発現ベクターをリポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いてヒト胎生期腎臓（ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ）２９３上皮細胞（ＡＣＴＣ ＣＲＬ， １５７３， ＵＳＡ）中に導入し、Ｇ４１８ （Ｇｉｂｃｏ）で捕捉された培地で選択した。ＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされた２９３上皮細胞を「ＨＣＣＲ−２Ｈ細胞」と命名した。
【００８１】
（段階２）ＨＣＣＲ−２癌原遺伝子でトランスフェクトされた２９３上皮細胞　図２１に示すように、分化された繊維芽細胞株である野生型ヒト胎生期腎臓２９３上皮細胞は、長くて細い核と貧弱な細胞質を有する紡錘形細胞である。段階１で得られたＨＣＣＲ−２を発現する２９３上皮細胞（ＨＣＣＲ−２Ｈ細胞）でＨＣＣＲ−２が発現される場合、細胞の形態は図２２に示すような卵形の核および多量の細胞質を有する多角形模様に変化する。
【００８２】
ＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされた２９３上皮細胞を単層培養し、ヘマトキシリン−エオシンで染色して観察した結果、図２３に示すように、核の多形成、明らかな核小体、および顆粒状染色質所見および腫瘍巨大細胞、並びに非定型類似分裂が観察された。
【００８３】
実施例１２：動物におけるＨＣＣＲ−２Ｈ癌原遺伝子の腫瘍形成能
腫瘍形成能を分析するために、５週齢のヌードマウス（ａｔｈｙｍｉｃ ｎｕ／ｎｕ ｏｎ ＢＡＬＢ／ｃ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）１０匹を対象に、癌原遺伝子ＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされたヒト胎生期腎臓２９３上皮細胞（ＨＣＣＲ−２Ｈ細胞）５×１０６個を臀部に皮下注射した。皮下腫瘍の大きさが１．５〜２．５ｃｍになったときヌードマウスを犠牲した。
【００８４】
図２４に示すように、ＨＣＣＲ−２Ｈ細胞を注入した１０匹のマウスはすべて２０日後顕著な腫瘍を示した。
【００８５】
ＨＣＣＲ−２Ｈ細胞が移植されたヌードマウスは、上皮性癌腫の特性を示す。図２５は、ヌードマウスから取った皮下腫塊をヘマトキシリン−エオシンで染色して観察したものである。腫塊部分は繊維性間質によって分離された典型的な上皮性細胞巣であることが明らかになった。
【００８６】
実施例１３：ＨＣＣＲ−２Ｈ細胞によって誘導された腫瘍組織から新規な癌細胞株の確立
前記実施例１２の腫瘍組織から得た細胞を２０％のウシ胎児血清を用いて通常の方法で培養し、培養された細胞を「ＨＣＣＲ−２ＨＮ」細胞と命名した。図２６に示すように、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で各々の細胞は母細胞であるＨＣＣＲ−２Ｈ細胞と類似した細胞学的特性を示した。
【００８７】
また、野生型２９３上皮細胞およびＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされた２９３上皮細胞（クローンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）を対象にノーザンブロットを行った。図２７から分かるように、ＨＣＣＲ−２が５つのクローンのすべてにおいて野生型２９３に比べて高いＨＣＣＲ−２遺伝子の発現を示した。
【００８８】
本発明を具体的な実施態様と関連させて記述したが、添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内で、当該分野の熟練者が本発明を多様に変形および変化させ得ると理解されなければならない。
【００８９】
［配列表］
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【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、正常の子宮頸部組織、初期子宮頸部癌組織、転移リンパ節組織および子宮頸部癌細胞株（ＣＵＭＣ−６）において変性遺伝子が発現されたかをディファレンシャル・ディスプレイ法で確認した結果を示す。
【図２】
図２は、正常の子宮頸部組織、子宮頸部癌組織および子宮頸部癌細胞株（ＣａＳｋｉおよびＣＵＭＣ−６）においてＨＣＣＲ−２遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。
【図３Ａ】
図３Ａは、正常のヒト１２‐列多重組織においてＨＣＣＲ−２遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、図３Ａと同じサンプルをβ−アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図４Ａ】
図４Ａは、ヒト癌細胞株においてＨＣＣＲ−２遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、図４Ａと同じサンプルをβ−アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図５Ａ】
図５Ａは、ヒト癌組織およびこれらの正常細胞においてＨＣＣＲ−２遺伝子が発現されたかを確認したノーザンブロット分析結果である。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、図５Ａと同じサンプルをβ−アクチンでハイブリッド化して得られた結果である。
【図６】
図６は、単層培養された野生型ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の成長様相である。
【図７】
図７は、単層培養されたＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＨＣＣＲ−２Ｍ細胞）の成長様相である。
【図８】
図８は、単層培養されたＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞をヘマトキシリン−エオシンで染色した結果である。
【図９】
図９は、ヌードマウスにおいてＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞の腫瘍形成能である。
【図１０】
図１０は、ヌードマウスにおいてＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞から誘導された皮下腫塊をヘマトキシリン−エオシンで染色した結果である。
【図１１】
図１１は、ヌードマウスから誘導されたＨＣＣＲ−２Ｎ細胞を単層培養した後成長様相を位相差顕微鏡で観察したものである。
【図１２】
図１２は、ＩＰＴＧ誘導前および誘導後に発現されるタンパク質発現パターンを示すドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥ結果である。
【図１３】
図１３は、トランスフェクトされていないＮＩＨ／３Ｔ３細胞（野生型）、ｐｃＤＮＡ３ベクターのみでトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ｐｃＤＮＡ３）およびＨＣＣＲ−２細胞でトランスフェクトされたＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＨＣＣＲ−２Ｍ細胞）のウエスタンブロット分析結果である。
【図１４】
図１４は、腎臓、乳房、肺、卵巣および胃腸のヒト癌組織およびこれらの正常組織のウエスタンブロット分析結果である。
【図１５Ａ】
図１５Ａは、正常の白血球で発現されたＨＣＣＲ−２タンパク質に対する免疫組織化学的（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）染色結果を示す（Ｘ２００）。
【図１５Ｂ】
図１５Ｂは、ヒト白血病細胞で発現されたＨＣＣＲ−２タンパク質に対する免疫組織化学的（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ）染色結果を示す（Ｘ２００）。
【図１６Ａ】
図１６Ａは、正常のリンパ球で発現されたＨＣＣＲ−２タンパク質に対する免疫組織化学的染色結果を示す（Ｘ２００）。
【図１６Ｂ】
図１６Ｂは、ヒトリンパ腫組織で発現されたＨＣＣＲ−２タンパク質に対する免疫組織化学的染色結果を示す（Ｘ２００）。
【図１７Ａ】
図１７Ａは、正常の乳房組織で発現されたＨＣＣＲ−２タンパク質に対する免疫組織化学的染色結果を示す（Ｘ２００）。
【図１７Ｂ】
図１７Ｂは、ヒト乳房癌で発現されたＨＣＣＲ−２タンパク質に対する免疫組織化学的染色結果を示す（Ｘ２００）。
【図１８Ａ】
図１８Ａは、正常の結腸組織で発現されたＨＣＣＲ−２タンパク質に対する免疫組織化学的染色結果を示す（Ｘ２００）。
【図１８Ｂ】
図１８Ｂは、ヒト結腸癌で発現されたＨＣＣＲ−２タンパク質に対する免疫組織化学的染色結果を示す（Ｘ２００）。
【図１９Ａ】
図１９Ａは、正常の腎臓組織で発現されたＨＣＣＲ−２タンパク質に対する免疫組織化学的染色結果を示す（Ｘ２００）。
【図１９Ｂ】
図１９Ｂは、ヒト腎臓癌で発現されたＨＣＣＲ−２タンパク質に対する免疫組織化学的染色結果を示す（Ｘ２００）。
【図２０Ａ】
図２０Ａは、正常の子宮頸部組織で発現されたＨＣＣＲ−２タンパク質に対する免疫組織化学的染色結果を示す（Ｘ２００）。
【図２０Ｂ】
図２０Ｂは、ヒト子宮頸部癌で発現されたＨＣＣＲ−２タンパク質に対する免疫組織化学的染色結果を示す（Ｘ２００）。
【図２１】
図２１は、単層培養された野生型ヒト胎生期腎臓２９３上皮細胞を位相差顕微鏡で観察した結果である。
【図２２】
図２２は、ＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされた２９３上皮細胞（ＨＣＣＲ−２Ｈ細胞）を単層培養した後、その成長様相を位相差顕微鏡で観察した結果である。
【図２３】
図２３は、ＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされた２９３上皮細胞を単層培養した後、ヘマトキシリン−エオシンで染色した結果である。
【図２４】
図２４は、ヌードマウスにおいてＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされた２９３上皮細胞の腫瘍形成能を確認したものである。
【図２５】
図２５は、ヌードマウスにおいてＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされた２９３上皮細胞から誘導された皮下腫塊をヘマトキシリン−エオシンで染色した結果である。
【図２６】
図２６は、ヌードマウスから誘導されたＨＣＣＲ−２ＨＮ細胞を単層培養した後成長様相を位相差顕微鏡で観察したものである。
【図２７】
図２７は、野生型２９３上皮細胞およびＨＣＣＲ−２でトランスフェクトされた２９３上皮細胞（クローンＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ）のノーザンブロット分析結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年2月19日(2003.2.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：１の塩基配列を有するヒト子宮頸部癌２癌原遺伝子。
【請求項２】
配列番号：１の塩基番号６３〜９７７に該当する塩基配列を有し、配列番号：２のアミノ酸配列をコードするヒト子宮頸部癌２癌原遺伝子。
【請求項３】
配列番号：２のアミノ酸配列を有するタンパク質。
【請求項４】
請求項１または２の癌原遺伝子を含むベクター。
【請求項５】
請求項４のベクターで形質転換された微生物。
【請求項６】
大腸菌ＪＭ１０９／ＨＣＣＲ−２（寄託番号：ＫＣＴＣ　０６６８ＢＰ）である請求項５記載の微生物。
【請求項７】
請求項５または６の微生物を培養することを含む請求項３記載のタンパク質の製造方法。
【請求項８】
請求項１または２の癌原遺伝子を含む癌診断用キット。
【請求項９】
請求項３のタンパク質を含む癌診断用キット。
【請求項１０】
請求項１の癌原遺伝子から転写されるｍＲＮＡの配列と相補的な塩基配列を有し、前記ｍＲＮＡに結合して前記癌原遺伝子の発現を抑制する塩基配列を有するアンチ−センス遺伝子。
【請求項１１】
請求項９のアンチセンス遺伝子の治療学的有効量と薬剤学的に許容可能な担体を含む癌の予防または治療用組成物。
【国際調査報告】
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