(57)【要約】本発明は、質量分析を使用して、DNAシーケンシング断片内でヌクレオチドの同一性を検出することにより、DNAをシーケンシングするための方法を提供する。本発明は、ラベルをジデオキシヌクレオチドに結合するための切断可能なリンカーを提供し、また、ラベルされたジデオキシヌクレオチドを提供する。また、本発明は、異なる質量を有するリンカーを使用して質量分析解像度を増大させるための方法を提供する。本発明は、溶液中の1つまたは複数の試料のうちのラベルされた部分をラベルされていない成分から分離するための系をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析を使用して、DNAシーケンシング断片の3'末端に組み入れられたジデオキシヌクレオチドの同一性を検出することにより、DNAをシーケンシングするための方法であって：
（a）リンカーを介してジデオキシヌクレオチドに化学部分を結合して、ラベルされたジデオキシヌクレオチドを生成させることと；
（b）ラベルされたジデオキシヌクレオチドでDNAシーケンシング反応を終了させて、ラベルされたDNAシーケンシング断片を作製することと、ここで、前記DNAシーケンシング断片は、3'末端を有し、前記化学部分は、前記DNAシーケンシング断片の前記3'末端にリンカーを介して結合されており；
（c）前記リンカーを介して前記DNAシーケンシング断片に結合された前記化学部分と特異的に相互作用する化合物でコートされた表面上に、前記ラベルされたDNAシーケンシング断片を捕獲し、これにより前記DNAシーケンシング断片を捕獲することと；
（d）前記表面を洗浄して、あらゆる非結合成分を除去することと；
（e）前記DNAシーケンシング断片を前記表面から遊離することと；および、
（f）前記DNAをシーケンスするように、質量分析を使用して前記DNAシーケンシング断片を分析すること、を含む方法。
【請求項２】
質量分析を使用して、異なったDNAシーケンシング断片の3'末端に組み入れられた複数のジデオキシヌクレオチドの同一性を検出することにより、DNAをシーケンシングするための方法であって：
（a）リンカーを介して複数の異なったジデオキシヌクレオチドに化学部分を結合して、ラベルされたジデオキシヌクレオチドを生成させることと；
（b）ラベルされたジデオキシヌクレオチドでDNAシーケンシング反応を終了させて、ラベルされたDNAシーケンシング断片を作製することと、ここで、前記DNAシーケンシング断片は、3'末端を有し、前記化学部分は、前記DNAシーケンシング断片の前記3'末端にリンカーを介して結合されており；
（c）前記リンカーを介して前記DNAシーケンシング断片に結合された前記化学部分と特異的に相互作用する化合物でコートされた表面上に、前記ラベルされたDNAシーケンシング断片を捕獲し、これにより前記DNAシーケンシング断片を捕獲することと；
（d）前記表面を洗浄して、あらゆる非結合成分を除去することと；
（e）前記DNAシーケンシング断片を表面から遊離すること；および、
（f）前記DNAをシーケンスするように、質量分析を使用して前記DNAシーケンシング断片を分析すること、を含む方法。
【請求項３】
前記化学部分が異なるリンカーを介して異なるジデオキシヌクレオチドに結合される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
請求項1または2に記載の方法であって、前記リンカーを介して前記DNAシーケンシング断片に結合された前記化学部分と前記表面の前記化合物との相互作用は、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用、フェニルホウ酸-サリチルヒドロキサム酸相互作用、または抗原-抗体相互作用を含む方法。
【請求項５】
請求項1または2に記載の方法であって、前記表面から前記DNAシーケンシング断片を遊離する前記工程は、前記リンカーを介して前記DNAシーケンシング断片に結合された前記化学部分と前記表面の前記化合物との相互作用分裂させることを含む方法。
【請求項６】
請求項5に記載の方法であって、前記相互作用は、物理的手段、化学的手段、物理的化学的手段、熱、および光の1つまたは複数からなる群より選択される手段によって分裂される方法。
【請求項７】
請求項1または2に記載の方法であって、前記ジデオキシヌクレオチドは、5位を有するシトシンもしくはチミン、または7位を有するアデニンもしくはグアニン、およびシトシンもしくはチミンの5位に、またはアデニンもしくはグアニンの7位に結合されたリンカーを含む方法。
【請求項８】
前記表面から前記DNAシーケンシング断片を遊離する前記工程が前記リンカーを切断することを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項９】
請求項8に記載の方法であって、前記リンカーは、物理的手段、化学的手段、物理的化学的手段、熱、および光の1つまたは複数からなる群より選択される手段によって切断される方法。
【請求項１０】
前記リンカーが紫外線によって切断される、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記リンカーが4-アミノメチル安息香酸の誘導体を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１２】
前記リンカーが1つまたは複数のフッ素原子を含む、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記リンカーが：
【化１】
2004533608.tif 000016
からなる群より選択される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
複数の異なるラベルされたジデオキシヌクレオチドが、複数の異なるラベルされたDNAシーケンシング断片を作製するために使用される、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
請求項3または14に記載の方法であって、複数の異なるリンカーは、異なるラベルされたDNAシーケンシング断片間の質量分離を増大させるために使用され、これにより質量分析解像度を増大させる、。
【請求項１６】
請求項1または2に記載の方法であって、前記化学部分はビオチンを含み、前記ラベルされたジデオキシヌクレオチドはビオチン化されたジデオキシヌクレオチドであり、前記ラベルされたDNAシーケンシング断片はビオチン化されたDNAシーケンシング断片であり、および前記表面はストレプトアビジンでコートされた固体表面である方法。
【請求項１７】
請求項16に記載の方法であって、前記ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドは：ddATP-11-ビオチン、ddCTP-11-ビオチン、ddGTP-11-ビオチン、およびddTTP-16-ビオチンからなる群より選択される方法。
【請求項１８】
請求項16に記載の方法であって、前記ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドは：
【化２】
2004533608.tif 000017
式中、ddNTP1、ddNTP2、ddNTP、3およびddNTP4が4つの異なるジデオキシヌクレオチドを表す、
からなる群より選択される方法。
【請求項１９】
請求項18に記載の方法であって、前記ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドは：
【化３】
2004533608.tif 000018
からなる群より選択される方法。
【請求項２０】
請求項16に記載の方法であって、前記ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドは：
【化４】
2004533608.tif 000019
式中、ddNTP1、ddNTP2、ddNTP3およびddNTP4が4つの異なるジデオキシヌクレオチドを表す、
からなる群より選択される方法。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法であって、前記ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドは：
【化５】
2004533608.tif 000020
からなる群より選択される方法。
【請求項２２】
請求項16に記載の方法であって、前記ストレプトアビジンでコートされた固体表面は、ストレプトアビジンでコートされた磁性ビーズまたはストレプトアビジンでコートされたシリカグラスである方法。
【請求項２３】
請求項1または2に記載の方法であって、前記工程（b）〜（e）は、単一の容器において、または複数の連結された容器において行われる方法。
【請求項２４】
単一ヌクレオチド多型の検出、遺伝的変異解析、遺伝子発現の連続的解析、遺伝子発現解析、法医学における同定、遺伝病関連研究、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための、請求項1または2に記載の方法の使用。
【請求項２５】
化学部分をジデオキシヌクレオチドに結合するためのリンカーであって、前記リンカーは、4-アミノメチル安息香酸の誘導体を含むリンカー。
【請求項２６】
前記リンカーが1つまたは複数のフッ素原子を含む、請求項25に記載のリンカー。
【請求項２７】
前記リンカーが：
【化６】
2004533608.tif 000021
からなる群より選択される、請求項26に記載のリンカー。
【請求項２８】
請求項25に記載のリンカーであって、前記リンカーは、物理的手段、化学的手段、物理的化学的手段、熱、および光の1つまたは複数からなる群より選択される手段によって切断可能であるリンカー。
【請求項２９】
前記リンカーが紫外線によって切断可能である、請求項28に記載のリンカー。
【請求項３０】
前記化学部分がビオチン、ストレプトアビジン、フェニルホウ酸、サリチルヒドロキサム酸、抗体、または抗原を含む、請求項25に記載のリンカー。
【請求項３１】
請求項25に記載のリンカーであって、前記ジデオキシヌクレオチドは、5位を有するシトシンもしくはチミン、または7位を有するアデニンもしくはグアニン、およびシトシンもしくはチミンの5位に、またはアデニンもしくはグアニンの7位に結合されたリンカーを含むリンカー。
【請求項３２】
質量分析を使用するDNAシーケンシングにおける請求項25に記載のリンカーの使用であって、前記リンカーは異なるジデオキシヌクレオチド間の質量分離を増大させて、質量分析解像度を増大する使用。
【請求項３３】
リンカーを介してシトシンもしくはチミンの5位に、またはアデニンもしくはグアニンの7位に結合された化学部分を含む、ラベルされたジデオキシヌクレオチド。
【請求項３４】
前記リンカーが物理的手段、化学的手段、物理的化学的手段、熱、および光の1つまたは複数からなる群より選択される手段によって切断可能である、請求項33に記載のラベルされたジデオキシヌクレオチド。
【請求項３５】
前記リンカーが紫外線によって切断可能である、請求項34に記載のラベルされたジデオキシヌクレオチド。
【請求項３６】
前記化学部分がビオチン、ストレプトアビジン、フェニルホウ酸、サリチルヒドロキサム酸、抗体、または抗原を含む、請求項33に記載のラベルされたジデオキシヌクレオチド。
【請求項３７】
請求項33に記載のラベルされたジデオキシヌクレオチドであって、前記ラベルされたジデオキシヌクレオチドが：
【化７】
2004533608.tif 000022
式中、ddNTP1、ddNTP2、ddNTP3、およびddNTP4が4つの異なるジデオキシヌクレオチドを表す、からなる群より選択されるジデオキシヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項37のラベルされたジデオキシヌクレオチドであって、前記ラベルされたジデオキシヌクレオチドが：
【化８】
2004533608.tif 000023
からなる群より選択されるジデオキシヌクレオチド。
【請求項３９】
請求項33に記載のラベルされたジデオキシヌクレオチドであって、前記ラベルされたジデオキシヌクレオチドが：
【化９】
2004533608.tif 000024
式中、ddNTP1、ddNTP2、ddNTP3、およびddNTP4が4つの異なるジデオキシヌクレオチドを表す、
からなる群より選択されるジデオキシヌクレオチド。
【請求項４０】
請求項39に記載のラベルされたジデオキシヌクレオチドであって、前記ラベルされたジデオキシヌクレオチドが：
【化１０】
2004533608.tif 000025
からなる群より選択されるジデオキシヌクレオチド。
【請求項４１】
質量分析を使用するDNAシーケンシングにおける請求項33のラベルされたジデオキシヌクレオチドの使用であって、前記リンカーは異なるジデオキシヌクレオチド間の質量分離を増大させて、質量分析解像度を増大する使用。
【請求項４２】
試料溶液中のその他の成分から化学部分を分離するための系であって、
（a）前記化学部分と特異的に相互作用する化合物でチャンネルコートされたチャンネルであって、該チャンネルは複数の末端を含むチャンネル；
（b）それぞれ前記試料を保持するために適した複数のウェル；
（c）それぞれのチャンネルの末端とウェルの間の連結部；および、
（d）ウェル間でチャンネルを通して試料を移動するための手段、を含む系。
【請求項４３】
請求項42に記載の系であって、前記化学部分と前記表面をコートする化合物間の相互作用は、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用、フェニルホウ酸-サリチルヒドロキサム酸相互作用、または抗原-抗体相互作用である系。
【請求項４４】
請求項42に記載の系であって、前記化学部分は、ビオチン化された部分であり、および前記チャンネルは、ストレプトアビジンでコートされたシリカグラスチャンネルである系。
【請求項４５】
前記ビオチン化された部分がビオチン化されたDNAシーケンシング断片である、請求項44に記載の系。
【請求項４６】
請求項42に記載の系であって、前記化学部分は、化学部分と前記表面をコートする化合物との間の相互作用を分裂させることにより、前記表面から遊離させることができる系。
【請求項４７】
請求項46に記載の系であって、前記相互作用は、物理的手段、化学的手段、物理的化学的手段、熱、および光の1つまたは複数からなる群より選択される手段によって分裂することができる系。
【請求項４８】
前記化学部分がリンカーを介してもう1つの化学化合物に結合される、請求項42に記載の系。
【請求項４９】
前記その他の化学化合物がDNAシーケンシング断片である、請求項48に記載の系。
【請求項５０】
請求項48に記載の系であって、前記リンカーは、物理的手段、化学的手段、物理的化学的手段、熱、および光の1つまたは複数からなる群より選択される手段によって切断可能である系。
【請求項５１】
請求項50に記載の系であって、前記チャンネルは紫外線光に対して透過性であり、および前記リンカーは紫外線によって切断可能である系。
【請求項５２】
請求項42に記載の複数の系を含む多重チャネル系。
【請求項５３】
前記チャンネルがチップ内にある、請求項52に記載の多重チャネル系。
【請求項５４】
前記チップ内に96チャンネルを含む、請求項53の多重チャネル系。
【請求項５５】
1つまたは複数のDNAシーケンシング断片を分離するための請求項42または52の系の使用であって、それぞれの断片は、リンカーを介して化学部分に結合されたジデオキシヌクレオチドで終結する使用。
【請求項５６】
異なるDNAシーケンシング断片間の質量分析解像度を増大させる方法であって、使用した異なるジデオキシヌクレオチドに異なるリンカーを結合させてDNAシーケンシング反応を終結させて、異なるDNAシーケンシング断片を作製することを含み、該異なるリンカーは該異なるDNAシーケンシング断片間の質量分離を増大させ、これにより質量分析解像度を増大させる方法。
【請求項５７】
前記1つまたは複数の異なるリンカーが1つまたは複数のフッ素原子を含む、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
前記1つまたは複数の異なるリンカーが：
【化１１】
2004533608.tif 000026
からなる群より選択される、請求項57に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
本出願を通じて、種々の刊行物が括弧内の著者および年によって参照される。これらの参照についての完全な引用文献は、以下の明細書の終わりに見出されるであろう。本発明が属する技術の水準をより完全に記載するために、これらの刊行物のその全体の開示は、参照により本明細書に援用したものとする。
【０００２】
正確かつ迅速にデオキシリボ核酸（DNA）をシーケンスする能力は、生物学および医薬に革命を起こしている。広範なヒトゲノム解析計画の集密により、ハイスループット遺伝分析技術の開発の指数的増加を推進している。化学、エンジニアリング、生物学、およびコンピュータ科学に関するこの迅速な技術開発により、一回ずつ単一遺伝子を研究することから、全てのゲノムを解析して比較することへの移行が可能になる。
【０００３】
最初のヒトゲノム配列マップの完了により、エキソンおよびイントロンの双方において非常に多形性であるゲノム内の多くの領域が明らかとなるであろう。薬理ゲノミクスの挑戦は、薬物反応における多様性に関連した遺伝子および機能的多型を包括的に同定することである（Rose, 2000）。疾患発生に関連したゲノム内の多形領域の再シーケンシングは、疾患の理解および治療の開発に非常に貢献するであろう。したがって、完全なヒトゲノム配列マップの完全な可能性を調査するためには、ゲノムにおける非常に変化しやすいイントロン/エキソン領域を再シーケンシングするためのハイスループットで正確な方法が必要である。ヒトゲノム解析計画（Pennisi2000）に使用したものなどのハイスループットDNAシーケンシングのための最新の技術水準は、レーザー誘起蛍光検出を使用するキャピラリーアレーDNAシーケンサである（Smith et al. 1986; Ju et al. 1995, 1996; Kheterpal et al. 1996; Salas-Solano et al. 1998）。また、一様な終結効率を引き起こすポリメラーゼの改良および耐熱性ポリメラーゼの導入により、シーケンスデータの質が非常に改善された（Tabor and Richardson, 1987, 1995）。
【０００４】
この技術は、大規模なDNAシーケンシングプロジェクトにおける処理能力および読取り長さの要求にある程度まで応えるが、疾患遺伝子の発見から法医学での同定の範囲にわたる多種多様な適用のためには、変異研究のために必要とされる正確度が改善される必要がある。たとえば、電気泳動に基づくDNAシーケンシング方法は、ヘテロ接合体の検出に明らかに障害を有しており、グアニン（G）またはシトシン（C）含むヌクレオチドに富んだ領域で圧縮されるために、所与の塩基に対して100%正確ではない（Bowling et al. 1991; Yamakawa et al. 1997）。さらに、プライミング部位の後の最初の数塩基は、過剰な色素でラベルされたプライマまたは色素でラベルされたターミネータからの高蛍光シグナルにより、しばしばマスクされ、したがって同定するのが困難である。
【０００５】
質量分析では、キャピラリシーケンシング技術を使用するときに典型的に遭遇する障害（GC圧縮およびヘテロ接合体検出）を克服することができる。しかし、大規模シーケンシングプロジェクトにおける、読取り長さおよび処理能力の要求を満たすことはできない。さらに、不十分な解像度では、大きなDNA断片の配列決定が妨げられる。現今では、読取り長さは、新規DNAシーケンシングのためには不十分であり、DNAシーケンシングのための質量分析に使用するための厳密にきれいな試料の要求は、現存の手順によって完全に満たされるというわけではない。この理由のため、報告された質量分析の適用の大部分は、単一ヌクレオチド多型（SNP）の検出に集中していた。この目的のためにいくつかの方法が探検された。最も一般的な方法は、単一ヌクレオチドによりプライマーを延長して、付加されたものを検出した。Tang et al（1999）によって開発されたもう1つの技術は、チップにDNAテンプレートを固定して、さらに1塩基伸長して特定のSNPを決定することに関する。多数のSNPs（Chiu et al.2000）を決定するための、制限断片の解析を同じグループが探索した。これらの各技術は、質量分析解像度の現在の限界により、同時に数個の断片のみの解析ができるだけである。これらの方法は、特定の塩基におけるSNPを決定するためには充分であるが、これらは、プライマーの設計および合成のために直前の配列について事前に知識を必要とする。特定の遺伝子の非常に変化しやすい領域においては、これらの方法は、あまり十分ではないであろう。一度にほんの数塩基のみのサンプリングでは、非常に能率が悪いことが証明され得る。
【０００６】
質量分析によるDNAシーケンシングの有意な限界は、質量分析計に導入されるDNAシーケンシング断片に厳密な純粋性が必要であることである。DNAシーケンシングの結果は、様々な試料精製手順を使用して、いくつかのグループによって報告されている。MonforteおよびBecker（1997）は、切断可能なプライマーを使用して、100塩基対（bp）までの読取り長さを示した。Fu et al.（1998）は、マトリックスレーザ脱離/電離飛行時間（MALDI-TOF）質量分析を使用して、35bpの平均の読取り長さで、p53腫瘍サプレッサー遺伝子のエキソン5および3の完全なシーケンシングを報告した。これらの努力により、100bpまでのハイスループットDNAシーケンシングのためにMALDI-TOF質量分析を使用する実現性が確立された。これらの公開された手順において、MonforteおよびBecker（1997）は、切断可能なビオチン化されたプライマーを使用してDNAシーケンシング試料を精製し、その結果、プライマーからの伸張断片は、伸張断片の5'末端でストレプトアビジンコートされた磁気ビーズによって捕らえられ、一方、シーケンシング反応におけるその他の成分は、洗い流される。Fu et al.（1998）は、1サイクル伸長のために固相に固定化されたDNAテンプレートの使用を介して、シーケンシング試料を処理した。延長したDNA断片は、固定されたテンプレートにハイブリダイズするが、シーケンシング反応におけるその他の成分は除去される。しかし、両方の方法において、偽停止したDNAシーケンシング断片は除去されず、質量分析計に導入される。偽停止は、ジデオキシヌクレオチドよりむしろデオキシヌクレオチドがシーケンシング断片を終結するときのシーケンシングに発生する。二量体化した偽停止およびプライマーが、質量分析において実際の結果をマスクし得るピークを生じ、正確な塩基の同定を防げ得ることが示されている（Roskey et al. 1996）。
【０００７】
ビオチンおよびストレプトアビジンの「ロックと鍵」の機能は、生物学的試料調整において、望まれていない不純物を除去する方法としてしばしば利用される（Langer et al. 1981）。現在まで、これらの方法は、ストレプトアビジンコートされた磁気ビーズによって捕獲するために、プライマーまたはシーケンシングDNAテンプレートの5'末端にビオチン部分を結合することを含んでいた（TongおよびSmith 1992、1993）。試料を精製するときに、生じるシーケンシングデータと干渉し得る偽停止およびプライマーは除去されない。
【０００８】
加えて、以前の質量分析シーケンシング方法のさらなる欠点は、色素ラベルしたプライマーシーケンシングに使用されるアプローチと類似して、それぞれのジデオキシヌクレオチドターミネータについて1つの、4つの別々の反応が必要であることであった。
【０００９】
理想的には、MALDI-TOF質量分析によるシーケンシングについては、1つのチューブで簡単に試料調製を行い、サイクルシーケンシングを使用してDNAシーケンシング断片の収量を増大させ、偽停止のない純粋なDNAシーケンシング断片のみを単離する、シーケンシング反応が可能な手段の確立が望まれる。この方法の確立により、100bpまでのDNAをルーチン的にシーケンシングするための強力な手順を形成される。高い忠実度のDNAシーケンシング方法は、色素ラベルされたプライマーおよび固相で捕獲可能なジデオキシヌクレオチド（ddNTP）ターミネータ（ビオチン化されたddNTPs）を使用して、すでに開発されている。ストレプトアビジンでコートされた固相での捕獲して遊離させた後、純粋なDNAシーケンシング断片のみをシーケンシングゲルにロードして検出した（Ju et al. 1999、2000）。この方法は、ヘテロ接合体の明確な変異の検出において、偽停止したDNA断片を除去するために有効な技術である。しかし、ゲル電気泳動を使用するため、GCリッチでの圧縮問題がなお存在する。
【００１０】
質量分析DNAシーケンシングにおける読取り長さ問題を克服するために、DNA断片の5'末端に結合された光または熱で切断可能なリンカーを含むエレクトロホア質量タグが探検された（Xu et al. 1997、Olejnik et al. 1999）。DNAの化学修飾は、これらが質量分析計解析プロセスを通過するので、DNA断片を安定させる目的で探究された。ヌクレオチドの糖部分に対する2'フルオロ基の付加により、断片の安定性の改善が示された（Ono et al. 1997）。その他の研究者は、断片の安定性における7デアザプリンおよびバックボーンアルキル化補助の使用を示した（Schneider et al. 1995、Gut et al. 1995）。
【００１１】
本出願は、質量分析による高い忠実度のDNAシーケンシング系のための、ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドの使用を開示する。
【００１２】
ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドおよびストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズは、MALDI-TOF質量分析計において、サンガーサイクルシーケンシングDNA断片の高品位シーケンシング質量スペクトルを作製するために使用することができる。本明細書に開示される方法は、1回の簡単な精製工程で偽停止DNA断片および過剰プライマーおよび塩を除去する効率的な方法を提供するが、高収量にシーケンシング断片産生するためにサイクルシーケンシングを使用することもなお可能である。さらに、これにより、上述したゲル電気泳動における落し穴が回避される。
【００１３】
本出願は、ビオチンまたは光切断可能なビオチンと連結された質量タグ-ジデオキシヌクレオチドにより、質量スペクトルにおけるDNAシーケンシング断片の質量分離を増大することができ、以前に達成される物よりも優れた解像度を与えるものを開示する。
【００１４】
また、本出願は、ビオチン-ストレプトアビジン複合体の光による直接の切断に使用することができるストレプトアビジンでコートされた多孔性のチャンネルを作製するための方法を開示する。市販のストレプトアビジンコートされた磁気ビーズは、これらが紫外線に対して透過性でないという点で光切断の目的に適さないので、これは重要である。
【００１５】
本明細書に開示される系は、多型および薬理遺伝学に適用するための、ハイスループットおよび高い忠実度のDNAシーケンシング系を提供する。ゲル電気泳動シーケンシングと比較して、この系は、非常に高い解像力のシーケンス断片を生じ、マイクロ秒のタイムスケールで非常に迅速に分離する。高解像度により、正確な変異およびヘテロ接合性の検出が可能となる。また、ゲルに基づいた系に関連した問題である圧縮が回避される。本明細書に開示される方法は、以前に可能であったものよりもさらに長い読取り長さおよびより高いスループットおよびより良い質量分解能の質量分析に基づいたシーケンシングを可能にする。また、本方法は、質量分析において必要とされる厳密な試料のクリーニング、並びに偽停止およにその他の不必要な成分の除去を達成する。この迅速かつ正確なDNA再シーケンシング系は、単一ヌクレオチド多型（SNPs）の検出（Chee et al. 1996）、遺伝子発現（Velculescu et al. 1995）の連続的解析、法医学における同定、および遺伝病関連研究などの分野に必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、質量分析を使用して、DNAシーケンシング断片の3'末端に組み入れられたジデオキシヌクレオチドの同一性を検出することにより、DNAをシーケンシングするための方法であって：
（a）リンカーを介してジデオキシヌクレオチドに化学部分を結合して、ラベルされたジデオキシヌクレオチドを生成させることと；
（b）前記ラベルされたジデオキシヌクレオチドでDNAシーケンシング反応を終了させて、ラベルされたDNAシーケンシング断片を作製することと、ここで、前記DNAシーケンシング断片は、3'末端を有し、前記化学部分は、前記DNAシーケンシング断片の前記3'末端にリンカーを介して結合されており；
（c）前記リンカーを介して前記DNAシーケンシング断片に結合された前記化学部分と特異的に相互作用する化合物でコートされた表面上に、前記ラベルされたDNAシーケンシング断片を捕獲し、これにより前記DNAシーケンシング断片を捕獲することと；
（d）前記表面を洗浄して、あらゆる非結合成分を除去することと；
（e）前記DNAシーケンシング断片を表面から遊離することと；および、
（f）前記DNAをシーケンスするように、質量分析を使用して前記DNAシーケンシング断片を分析することと、を含む方法に向けられる。
【００１７】
本発明は、質量分析を使用して、異なるDNAシーケンシング断片の3'末端に組み入れられた複数のジデオキシヌクレオチドの同一性を検出することにより、DNAをシーケンシングするための方法であって：
（a）リンカーを介して複数の異なったジデオキシヌクレオチドに化学部分を結合して、ラベルされたジデオキシヌクレオチドを生成させることと；
（b）前記ラベルされたジデオキシヌクレオチドでDNAシーケンシング反応を終了させて、ラベルされたDNAシーケンシング断片を作製することと、ここで、前記DNAシーケンシング断片は、3'末端を有し、前記化学部分は、前記DNAシーケンシング断片の前記3'末端にリンカーを介して結合されており；
（c）前記リンカーを介して前記DNAシーケンシング断片に結合された前記化学部分と特異的に相互作用する化合物でコートされた表面上に、前記ラベルされたDNAシーケンシング断片を捕獲し、これにより前記DNAシーケンシング断片を捕獲することと；
（d）前記表面を洗浄して、あらゆる非結合成分を除去することと；
（e）前記DNAシーケンシング断片を表面から遊離することと；および、
（f）前記DNAをシーケンスするために、質量分析を使用して前記DNAシーケンシング断片を分析することと、を含む方法を提供する。
【００１８】
本発明は、化学部分をジデオキシヌクレオチドに結合するためのリンカーであって、該リンカーは、4-アミノメチル安息香酸の誘導体を含むリンカーを提供する。
【００１９】
本発明は、リンカーを介して5位を有するシトシンもしくはチミン、または7位を有するアデニンもしくはグアニンに結合された化学部分を含むリンカーを提供する。
【００２０】
本発明は、試料溶液中のその他の成分から化学部分を分離するための系であって、
（a）前記化学部分と特異的に相互作用する化合物でコートされたチャンネルであって、該チャンネルは複数の末端を含むチャンネル；
（b）それぞれ前記試料を保持するために適した複数のウェル；
（c）それぞれのチャンネルの末端とウェル間の連結部；および、
（d）ウェル間でチャンネルを介して試料を移動するための手段、を含む系を提供する。
【００２１】
本発明は、異なるDNAシーケンシング断片間の質量分析解像度を増大させる方法であって、使用した異なるジデオキシヌクレオチドに異なるリンカーを結合させてDNAシーケンシング反応を終わらせ、異なるDNAシーケンシング断片を作製することを含み、該異なるリンカーは、該異なるDNAシーケンシング断片間の質量分離を増大させ、これにより質量分析解像度を増大させる方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
以下の定義は、本発明の理解の補助として示される。
【００２３】
ヌクレオチド塩基のための標準的な省略記号は、次のように使用される：アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、チミン（T）、およびウラシル（U）。
【００２４】
本発明は、質量分析を使用して、DNAシーケンシング断片の3'末端に組み入れられたジデオキシヌクレオチドの同一性を検出することにより、DNAをシーケンシングするための方法であって：
（a）リンカーを介してジデオキシヌクレオチドに化学部分を結合して、ラベルされたジデオキシヌクレオチドを生成させることと；
（b）前記ラベルされたジデオキシヌクレオチドでDNAシーケンシング反応を終了させて、ラベルされたDNAシーケンシング断片を作製することと、ここで、前記DNAシーケンシング断片は、3'末端を有し、前記化学部分は、前記DNAシーケンシング断片の3'末端にリンカーを介して結合されており；
（c）前記リンカーを介して前記DNAシーケンシング断片に結合された前記化学部分と特異的に相互作用する化合物でコートされた表面上に、前記ラベルされたDNAシーケンシング断片を捕獲し、これにより前記DNAシーケンシング断片を捕獲することと；
（d）前記表面を洗浄して、あらゆる非結合成分を除去することと；
（e）前記DNAシーケンシング断片を表面から遊離することと；および、
（f）前記DNAをシーケンスするために、質量分析を使用して前記DNAシーケンシング断片を分析することと、を含む方法に向けられる。
【００２５】
本発明は、質量分析を使用して、異なるDNAシーケンシング断片の3'末端に組み入れられた複数のジデオキシヌクレオチドの同一性を検出することにより、DNAをシーケンシングするための方法であって：
（a）リンカーを介して複数の異なったジデオキシヌクレオチドに化学部分を結合して、ラベルされたジデオキシヌクレオチドを生成させることと；
（b）前記ラベルされたジデオキシヌクレオチドでDNAシーケンシング反応を終了させて、ラベルされたDNAシーケンシング断片を作製することと、ここで、前記DNAシーケンシング断片は、3'末端を有し、前記化学部分は、前記DNAシーケンシング断片の3'末端にリンカーを介して結合されており；
（c）前記リンカーを介して前記DNAシーケンシング断片に結合された前記化学部分と特異的に相互作用する化合物でコートされた表面上に、前記ラベルされたDNAシーケンシング断片を捕獲し、これにより前記DNAシーケンシング断片を捕獲することと；
（d）前記表面を洗浄して、あらゆる非結合成分を除去することと；
（e）前記DNAシーケンシング断片を表面から遊離することと；および、
（f前記DNAをシーケンスするために、質量分析を使用して前記DNAシーケンシング断片を分析することと、を含む方法を提供する。
【００２６】
1つの態様において、化学部分は、異なるリンカーを介して異なるジデオキシヌクレオチドに結合される。1つの態様において、異なるリンカーは、異なるラベルされたDNAシーケンシング断片間の質量分離を増大させ、これにより質量分析解像度を増大させる。
【００２７】
1つの態様において、ジデオキシヌクレオチドは、2',3'-ジデオキシアデノシン5'-三リン酸（ddATP）、2',3'-ジデオキシグアノシン5'-三リン酸（ddGTP）、2',3'-ジデオキシシチジン5'-三リン酸（ddCTP）、および2',3'-ジデオキシチミジン5'-三リン酸（ddTTP）からなる群より選択される。
【００２８】
本明細書に記載された本方法の異なった態様において、リンカーを介してDNAシーケンシング断片に結合された化学部分と表面の化合物との間の相互作用は、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用、フェニルホウ酸-サリチルヒドロキサム酸相互作用、または抗原-抗体相互作用を含む。
【００２９】
1つの態様において、表面からDNAシーケンシング断片を遊離する工程は、リンカーを介してDNAシーケンシング断片に結合された化学部分と表面の化合物との間の相互作用を分裂させることを含む。別の態様において、相互作用は、物理的手段、化学的手段、物理的化学的手段、熱、および光の1つまたは複数からなる群より選択される手段によって分裂することができる。1つの態様において、相互作用は、紫外線によって分裂される。別の態様において、相互作用は、水酸化アンモニウム、ホルムアミド、またはpH（-ログH濃度）の変化によって分裂される。別の態様において、リンカーは、鎖構造、1つもしくは複数のリングを含む構造、または鎖構造と1つもしくは複数のリングとを含む構造を含み得る。別の態様において、ジデオキシヌクレオチドは、5位を有するシトシンもしくはチミン、または7位を有するアデニンもしくはグアニンを含み、リンカーは、シトシンもしくはチミンの5位に、またはアデニンもしくはグアニンの7位に結合される。
【００３０】
1つの態様において、DNAシーケンシング断片を表面から遊離する工程は、リンカーを切断することを含む。別の態様において、リンカーは、物理的手段、化学的手段、物理的化学的手段、熱、および光の1つまたは複数からなる群より選択される手段によって切断される。1つの態様において、リンカーは、紫外線によって切断される。別の態様において、リンカーは、水酸化アンモニウム、ホルムアミド、またはpHの変化（-ログH濃度）によって切断される。
【００３１】
1つの態様において、リンカーは、4-アミノメチル安息香酸の誘導体を含む。1つの態様において、リンカーは、1つまたは複数のフッ素原子を含む。
【００３２】
1つの態様において、リンカーは、リンカーが：
【化１２】
2004533608.tif 000002
からなる群より選択される。
【００３３】
1つの態様において、複数の異なるラベルされたジデオキシヌクレオチドは、複数の異なるラベルされたDNAシーケンシング断片を作製するために使用される。1つの態様において、複数の異なるリンカーは、異なるラベルされたDNAシーケンシング断片間の質量分離を増大させるために使用され、これにより質量分析解像度を増大させる。
【００３４】
1つの態様において、化学部分はビオチンを含み、ラベルされたジデオキシヌクレオチドはビオチン化されたジデオキシヌクレオチドであり、ラベルされたDNAシーケンシング断片はビオチン化されたDNAシーケンシング断片であり、および表面はストレプトアビジンでコートされた固体表面である。1つの態様において、ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドは：ddATP-11-ビオチン、ddCTP-11-ビオチン、ddGTP-11-ビオチン、およびddTTP-16-ビオチンからなる群より選択される。
【００３５】
1つの態様において、ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドは：
【化１３】
2004533608.tif 000003
【００３６】
式中、ddNTP1、ddNTP2、ddNTP3、およびddNTP4が4つの異なるジデオキシヌクレオチドを表す、
からなる群より選択される。
【００３７】
1つの態様において、ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドは：
【化１４】
2004533608.tif 000004
【００３８】
からなる群より選択される。
【００３９】
1つの態様において、ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドは：
【化１５】
2004533608.tif 000005
【００４０】
式中、ddNTP1、ddNTP2、ddNTP3、およびddNTP4が4つの異なるジデオキシヌクレオチドを表す、からなる群より選択される
1つの態様において、ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドは：
【化１６】
2004533608.tif 000006
【００４１】
からなる群より選択される。
【００４２】
1つの態様において、ストレプトアビジンでコートされた固体表面は、ストレプトアビジンでコートされた磁性ビーズまたはストレプトアビジンでコートされたシリカグラスである。
【００４３】
1つの態様において、工程（b）〜（e）は、単一の容器において、または複数の連結された容器において行われる。
【００４４】
1つの態様において、質量分析は、マトリックス補助レーザ脱離/電離飛行時間型の質量分析である。
【００４５】
本発明は、単一ヌクレオチド多型の検出、遺伝的変異解析、遺伝子発現の連続的解析、遺伝子発現解析、法医学における同定、遺伝病関連研究、ゲノムシーケンシング、翻訳解析、または転写解析のための本明細書に記載された方法のいずれかの使用を提供する。
【００４６】
本発明は、化学部分をジデオキシヌクレオチドに結合するためのリンカーであって、該リンカーは、4-アミノメチル安息香酸の誘導体を含むリンカーを提供する。
【００４７】
1つの態様において、ジデオキシヌクレオチドは、2',3'-ジデオキシアデノシン5'-三リン酸（ddATP）、2',3'-ジデオキシグアノシン5'-三リン酸（ddGTP）、2',3'-ジデオキシシチジン5'-三リン酸（ddCTP）、および2',3'-ジデオキシチミジン5'-三リン酸（ddTTP）からなる群より選択される。
【００４８】
1つの態様において、リンカーは、1つまたは複数のフッ素原子を含む。
【００４９】
1つの態様において、リンカーは：
【化１７】
2004533608.tif 000007
【００５０】
からなる群より選択される。
【００５１】
別の態様において、リンカーは、鎖構造、1つもしくは複数のリングを含む構造、または鎖構造と1つもしくは複数のリングとを含む構造を含み得る。
【００５２】
別の態様において、リンカーは、物理的手段、化学的手段、物理的化学的手段、熱、および光の1つまたは複数からなる群より選択される手段によって切断可能である。1つの態様において、リンカーは、紫外線によって切断可能である。別の態様において、リンカーは、水酸化アンモニウム、ホルムアミド、またはpHの変化（-ログH濃度）によって切断可能である。
【００５３】
リンカーの別の態様において、化学部分は、ビオチン、ストレプトアビジン、フェニルホウ酸、サリチルヒドロキサム酸、抗体、または抗原を含む。
【００５４】
別の態様において、ジデオキシヌクレオチドは、5位を有するシトシンもしくはチミン、または7位を有するアデニンもしくはグアニンを含み、リンカーは、シトシンもしくはチミンの5位に、またはアデニンもしくはグアニンの7位に結合される。
【００５５】
本発明は、質量分析を使用するDNAシーケンシングにおける本明細書に記載されたリンカーのいずれかの使用であって、リンカーは異なるジデオキシヌクレオチド間の質量分離を増大させて、質量分析解像度を増大する使用を提供する使用する。
【００５６】
本発明は、リンカーを介してシトシンもしくはチミンの5位に、またはアデニンもしくはグアニンの7位に結合された化学部分を含む、ラベルされたジデオキシヌクレオチドを提供する。
【００５７】
1つの態様において、ジデオキシヌクレオチドは、2',3'-ジデオキシアデノシン5'-三リン酸（ddATP）、2',3'-ジデオキシグアノシン5'-三リン酸（ddGTP）、2',3'-ジデオキシシチジン5'-三リン酸（ddCTP）、および2',3'-ジデオキシチミジン5'-三リン酸（ddTTP）からなる群より選択される。
【００５８】
別の態様において、リンカーは、鎖構造、1つもしくは複数のリングを含む構造、または鎖構造と1つもしくは複数のリングとを含む構造を含み得る。別の態様において、リンカーは、物理的手段、化学的手段、物理的化学的手段、熱、および光の1つまたは複数からなる群より選択される手段によって切断可能である。1つの態様において、リンカーは、紫外線によって切断可能である。別の態様において、リンカーは、水酸化アンモニウム、ホルムアミド、またはpHの変化（-ログH濃度）によって切断可能である。
【００５９】
ラベルされたジデオキシヌクレオチドの別の態様において、化学部分は、ビオチン、ストレプトアビジン、フェニルホウ酸、サリチルヒドロキサム酸、抗体、または抗原を含む。
【００６０】
1つの態様において、ラベルされたジデオキシヌクレオチドは：
【化１８】
2004533608.tif 000008
【００６１】
式中、ddNTP1、ddNTP2、ddNTP3、およびddNTP4は、4つの異なるジデオキシヌクレオチドを表す、
からなる群より選択される。
【００６２】
1つの態様において、ラベルされたジデオキシヌクレオチドが：
【化１９】
2004533608.tif 000009
【００６３】
からなる群より選択される。
【００６４】
1つの態様において、ラベルされたジデオキシヌクレオチドは：
【化２０】
2004533608.tif 000010
【００６５】
式中、ddNTP1、ddNTP2、ddNTP3、およびddNTP4は、4つの異なるジデオキシヌクレオチドを表す、からなる群より選択される。
【００６６】
1つの態様において、ラベルされたジデオキシヌクレオチドが：
【化２１】
2004533608.tif 000011
【００６７】
からなる群より選択される。
【００６８】
本発明は、質量分析を使用するDNAシーケンシングにおける本明細書に記載されたラベルされたジデオキシヌクレオチドのいずれかの使用であって、リンカーは異なるジデオキシヌクレオチド間の質量分離を増大させて、質量分析解像度を増大する使用を提供する。
【００６９】
1つの態様において、ラベルされたジデオキシヌクレオチドは、844、977、1,017、および1,051からなる群より選択される分子量を有する。1つの態様において、ラベルされたジデオキシヌクレオチドは、1,049、1,182、1,222、および1,257からなる群より選択される分子量を有する。
【００７０】
1つの態様において、質量分析は、マトリックス補助レーザ脱離/電離飛行時間型の質量分析である。
【００７１】
本発明は、試料溶液中のその他の成分から化学部分を分離するための系であって、
（a）前記化学部分と特異的に相互作用する化合物でコートされたチャンネルであって、該チャンネルは複数の末端を含むチャンネル；
（b）それぞれ前記試料を保持するために適した複数のウェル；
（c）それぞれのチャンネルの末端とウェルとの間の連結部；および、
（d）ウェル間でチャンネルを介して試料を移動するための手段、
を含む系提供する。
【００７２】
系の1つの態様において、化学部分と表面をコートする化合物間の相互作用は、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用、フェニルホウ酸-サリチルヒドロキサム酸相互作用、または抗原-抗体相互作用である。
【００７３】
1つの態様において、化学部分は、ビオチン化された部分であり、およびチャンネルは、ストレプトアビジンでコートされたシリカグラスチャンネルである。1つの態様において、ビオチン化された部分は、ビオチン化されたDNAシーケンシング断片である。
【００７４】
1つの態様において、化学部分は、化学部分と表面をコートする化合物との間の相互作用を分裂させることにより、表面から遊離させることができる。別の態様において、相互作用は、物理的手段、化学的手段、物理的化学的手段、熱、および光の1つまたは複数からなる群より選択される手段によって分裂することができる。別の態様において、相互作用は、水酸化アンモニウム、ホルムアミド、またはpHの変化（-ログH濃度）によって分裂することができる。
【００７５】
1つの態様において、化学部分は、リンカーを介してもう1つの化学化合物に結合される。1つの態様において、その他の化学化合物は、DNAシーケンシング断片である。1つの態様において、リンカーは、物理的手段、化学的手段、物理的化学的手段、熱、および光の1つまたは複数からなる群より選択される手段によって切断可能である。1つの態様において、チャンネルは紫外線光に対して透過性であり、およびリンカーは紫外線によって切断可能である。リンカーを切断することにより、DNAシーケンシング断片またはその他の化学化合物が、表面に捕らえられたままである化学部分から遊離される。
【００７６】
本発明は、本明細書に開示された複数の任意の単一チャネル系を含む多重チャネル系を提供する。1つの態様において、チャンネルはチップ内にある。1つの態様において、多重チャネル系は、チップ内に96チャンネルを含む。
【００７７】
本発明は、1つまたは複数のDNAシーケンシング断片を分離するための本明細書に記載された系のいずれかの使用であって、それぞれの断片は、リンカーを介して化学部分に結合されたジデオキシヌクレオチドで終結する使用提供する。
【００７８】
本発明は、異なるDNAシーケンシング断片間の質量分析解像度を増大させる方法であって、使用した異なるジデオキシヌクレオチドに異なるリンカーを結合させてDNAシーケンシング反応を終結させて、異なるDNAシーケンシング断片を作製することを含み、該異なるリンカーは、該異なるDNAシーケンシング断片間の質量分離を増大させ、これにより質量分析解像度を増大させる方法を提供する。
【００７９】
1つの態様において、1つまたは複数の異なるリンカーが1つまたは複数のフッ素原子を含む。
【００８０】
1つの態様において、1つまたは複数の異なるリンカーは：
【化２２】
2004533608.tif 000012
【００８１】
からなる群より選択される。
【００８２】
本発明は、あとに続く実験の詳細いより、より理解されるであろう。しかし、議論した特定の方法および結果は、単に、請求の範囲に記載した本発明をより完全に例証するだけであることを、当業者であれば容易に認識するあろう。
【実施例】
【００８３】
実験の詳細
I.質量分析計におけるビオチン化されたジデオキシヌクレオチドによるDNAシーケンシング
マトリックス補助レーザ脱離/電離飛行時間型の質量分析（MALDI-TOFMS）は、最近、DNAシーケンシングのために広く探索されている。サンガージデオキシ法（Sanger et al. 1977）は、DNAシーケンシング断片を作製するために使用され、ラベルは必要とされない。質量分解能は、理論的には1ダルトン程度で良好であり得る。したがって、ゲル電気泳動シーケンシング系と比較して、質量分析は、シーケンシング断片の非常に高い解像力で、かつおよびマイクロ秒のタイムスケールで極めて迅速な分離を生じる。高解像度により、変異およびヘテロ接合性の正確な検出が可能になる。質量分析によるシーケンシングのもう1つの効果は、ゲルに基づいた系に関連した圧縮が完全に除去されるということである。しかし、正確なある程度のシーケンシングDNA断片の質量を得るためには、試料をアルカリ塩およびアルカリ土類塩フリーにしなければならない。MS解析の前に試料を脱塩して混入物フリーにしなければならない。
【００８４】
ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドおよびストレプトアビジンコートされた固相を使用して、DNAシーケンシング断片を調製するための、全てのこれらの必要を満たした一般的なスキームを図1に示す。本明細書に記載した方法の別の態様において、ビオチン-ストレプトアビジン以外のアフィニティ系を使用することもできる。このようなアフィニティ系は、フェニルホウ酸-サリチルヒドロキサム酸（Bergseid et al. 2000）および抗原-抗体系を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
図1に模式的に例示したように、DNAテンプレート、デオキシヌクレオチド（dNTPs）（A、C、G、T）およびビオチン化されたジデオキシヌクレオチド（ddNTP-ビオチン）（A-b、C-b、G-b、Tb）、プライマー、並びにDNAポリメラーゼを、1つのチューブに合わせる。ポリメラーゼ伸張および停止反応の後、種々の長さを有する一連のDNAシーケンシング断片を生じさせる。次いで、シーケンシング反応液を、2、3分間ストレプトアビジンコートされた固相とインキューベートする。3'末端においてビオチン化したジデオキシヌクレオチドで終結したDNAシーケンシング断片のみを固相に捕らる。過剰なプライマー、偽終結DNA断片（ddNTPsの代わりにdNTPsで終結した断片）、酵素、およびシーケンシング反応由来のその他の全ての成分を洗い流す。次いで、ビオチン化されたDNAシーケンシング断片を、ビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用を分裂させることによって固相から切断して、DNAシーケンシング断片の純粋なセットを得る。ビオチンとストレプトアビジンとの間の相互作用は、たとえば水酸化アンモニウム、ホルムアミド、またはpHの変化を使用して分裂することができる。次いで、DNAシーケンシング断片をマトリックス（3-ヒドロキシピコリン酸）と混合して、質量分析計へロードし、DNAシーケンシング断片の正確な質量スペクトルを生じさせる。それぞれのタイプのヌクレオチドは、独特の分子質量を有するので、質量スペクトルの隣接するピーク間の質量差によりヌクレオチド配列の同一性が得られる。
【００８６】
質量分析によるDNAシーケンシングでは、試料の純度が、得られるスペクトルの質に直接影響を及ぼす。過剰なプライマー、塩、およびシーケンシング反応において早まって終結した断片（偽停止）は、余分なノイズおよび外来性のピークを生じるであろう（Fu et al. 1998）。また、過剰なプライマーは、二量体化して高分子量種を形成し、質量分析において擬似信号を与える（Wu et al. 1993）。偽停止は、シーケンシングにおいて、ジデオキシヌクレオチドよりむしろデオキシヌクレオチドでシーケンシング断片が終結するときに発生する。偽停止で終結したデオキシヌクレオチドは、そのジデオキシ対応物と16ダルトンの質量差を有する。この質量差は、アデニンとグアニンの間の差と同じである。したがって、偽停止は、不当に解釈され、または既存のピークと干渉し、正確度を減少し得る。塩は、見分けのつかないほど観察されるピークを広げることにより、スペクトルを害し得る。本明細書に開示される方法は、これらの全ての問題を除去する。
【００８７】
以前に、Juら（1999、2000）は、蛍光色素ラベルされたプライマーおよびビオチン化されたジデオキシヌクレオチドを使用して、DNAを正確にシーケンシングするための手順を確立した。ストレプトアビジン-コートされた磁性ビーズへの捕獲および遊離により、全ての偽停止した断片が、完全に除去される。本出願は、図2に示したとおり、MALDI-TOF質量分析でビオチン化されたジデオキシヌクレオチドを使用してシーケンシングデータを得るための方法（図1に示したストラテジー）を開示する。図2のシーケンシングデータは、以下の合成55bpテンプレート（配列番号：1）および13bpプライマー（配列番号：2）を使用して作製した。
【化２３】
2004533608.tif 000013
【００８８】
サイクルシーケンシング手順を使用して、全てが1つになったチューブに作製されたシーケンシングラダーを作製するために、4つの市販のビオチン化されたジデオキシヌクレオチドddATP-11-ビオチン、ddGTP-11-ビオチン、ddCTP-11-ビオチン、およびddTTP-11-ビオチン（New England Nuclear, Boston）を使用した。1つのビオチン化されたジデオキシヌクレオチドによって延長されたプライマーである第1のピークとともに、質量スペクトルにおいて非常にきれいなシーケンスピークが得られることが、図2から見ることができる。さらに、シーケンシング反応における過剰プライマーは、完全に除去され、偽停止ピークは検出されない。図2において、AとGの塩基の同一性は、明白に同定することができる。市販のddCTP-11-ビオチンとddTTP-11-ビオチンとの間の質量差は1ダルトンであり、DNA断片において質量検出器における解像度は、約3ダルトン以内のみであるので、図2においてCとTは、区別することができない。3'ジデオキシターミネータに位置するビオチンでDNAシーケンシング断片を捕獲/放出することにより、その他のどのような混入物からもフリーであるきれいなシーケンシングラダーを得ることができることを、データは示す。本手順のさらなる改良には、ddCTP-11-ビオチンと比較して、大きな質量差を有するビオチン化されたddTTPsの使用が必要である。これを達成するために、ddTTP-16-ビオチンを使用する。これは、市販されており（Enxo. Boston）、ddCTP-11-ビオチンと比較して、大きな質量差を有するからである（表1を参照されたい）。これは、ddCTP-llビオチン、ddATP-11-ビオチン、およびddGTP-11-ビオチンとペアーであり、シーケンシングラダーの質量スペクトルを明確に帰属することができる（図3を参照されたい）。
【表１】
2004533608.tif 000014
参照としての、ddCTPを使用するジデオキシヌクレオチドの相対的な質量差。断片と1つのさらなる塩基との間の相対的な差は、約300ダルトンである。全ての相対的な質量は、ダルトンとする。
【００８９】
試料調製は、ビオチン化されたddNTPs、通常のdNTPs、DNAポリメラーゼ、および反応緩衝液とシーケンシング反応を1つのチューブ内で実行することによって行う。次いで、試料をサーモサイクラー内に30サイクル置き、伸張断片を作製する。次いで、ストレプトアビジンビーズを試料に添加して、インキューベートしてビオチン-ストレプトアビジン複合体を形成させる。磁石に反応チューブを置くことによってビーズを回収して、これらを酢酸アンモニウム溶液で徹底的に洗浄し、偽停止、プライマー、および塩などの全ての不純物を除去する。次いで、稀釈水酸化アンモニウム溶液を使用して、60℃でビオチンストレプトアビジン複合体を分離する（Jurinke et.al., 1997）。一旦この複合体を分離し、溶液を磁石の後ろに置いて溶液からビーズを分離する。上澄を回収して3-ヒドロキシピコリン酸（Aldrich）のマトリックス溶液に添加し、Perkin Elmer Voyager DE MALDI-TOF質量分析計による解析のために結晶化させる。生じるスペクトルを種々のピーク部位に従って帰属する。
【００９０】
II  質量タグを有するビオチン化されたジデオキシヌクレオチドの設計および合成
質量分析を使用してDNA中の種々の塩基を識別する能力は、スペクトルにおける塩基の質量差に依存する。上記の研究については、任意の2つのヌクレオチド間で最も小さい質量差は、16ダルトンである（表1を参照されたい）。Feiら（1988）は、この問題を実現させて、通常のdNTPと組み合わせて色素ラベルされたddNTPを使用して質量差の間隔をあけ、単一ヌクレオチド伸張アッセイにおける検出解像度の増大を達成することができることを示した。シーケンシングスペクトルにおいてピークを識別する能力を強化するために、現在の出願では、4-アミノメチル安息香酸誘導体を使用して構築された質量リンカーを組み入れることにより、ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドを系統的に修飾し、個々の塩基の質量分離を増大させることを開示する。質量リンカーを1つまたは2つのフッ素原子を組み入れて修飾し、さらにヌクレオチド間の質量差の間隔をあけることもできる。4つのビオチン化されたddNTPsの構造を図4に示す。ddCTP-11-ビオチンは、市販されている（New England Nuclear, Boston）。ddTTP-リンカーI-11-ビオチン、ddATP-リンカーII-11-ビオチン、およびddGTP-リンカーIII-11-ビオチンは、たとえば図6においてddATP-リンカーII-11-ビオチンについて示したように合成される。これらの質量タグリンカーで修飾されたビオチン化されたddNTPsをデザインする際に、リンカーは、次のビオチンとの結合のために、ピリミジン塩基（CおよびT）の5'位に、およびプリン（AおよびG）の7'位に結合する。ヌクレオチドの塩基におけるこれらの部位の修飾は、大きなエネルギー転移蛍光色素を有するときでさえ、なおもDNAポリメラーゼによるDNA鎖中への修飾されたヌクレオチドの効率的な取込みを可能にする（Rosenblum et al. 1997、Zhu et al. 1994）。したがって、ddNTPs-リンカー-11-ビオチンは、DNAシーケンシング反応においてポリメラーゼによって増幅される鎖に組み込まれる得る。
【００９１】
シグナル強度が小さく解像度が低い場合に、より長い読取り長さには、より大きな質量分離が非常に助けとなるであろう。2つの個々の塩基の間で最も小さな質量差は、質量タグが付けられたビオチン化されたddNTPsでは、通常のddNTPsと比較して3倍程度大きく、表1で示したとおり、標準的なビオチン化されたddNTPsによって達成されるものの二倍以上である。3つの4-アミノメチル安息香酸誘導体の、リンカーI、リンカーII、およびリンカーIIIを、対応するジデオキシヌクレオチドにビオチンを架橋するための質量タグ並びにリンカーとしてデザインする。合成手順を例示するために、リンカーII（図5）の合成をここで記載する。公開された手順によって容易に調製することができる3-フルオロ-4-アミノメチル安息香酸（Maudling et al. 1983；Rolla 1982）をまず無水トリフルオロ酢酸で保護し、次いで、ジイソプロピルエチルアミンの存在下でN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）エステルによりジスクシンイミジルカーボネートに変換させる。その後、生じるNHSエステルを市販のプロパルギルアミンと結合させて、所望の化合物（リンカーII）を形成する。同様の手順を使用して、リンカーIおよびリンカーIIIを容易に作製することができる。
【００９２】
図6には、よく確立された手順を使用してビオチン化されたddATP-リンカーII-11-ビオチンを調製するために必要とされるスキームを記載する（Prober et al. 1987； et al. 1992；Hobbs et al. 1991）。7-I-ddAを、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（0）の存在下でリンカーIIと結合させて、7-リンカーII-ddAを生成させ、これをPOCl3のブチルアンモニウムピロリン酸溶液でリン酸化させる（Burgess and Cook, 2000）。水酸化アンモニウムでトリフルオロアセチル基を除去した後に、7-リンカーII-ddATPを生成させ、次いでスルホ-NHS-LC-ビオチン（Pierce, Rockford III）と結合して所望のddATP-リンカーII-11-ビオチンを得る。同様に、ddTTP-リンカーI-11-ビオチンおよびddGTP-リンカーIII-11-ビオチンを合成することができる。
【００９３】
III  質量分析を使用する高い忠実度およびハイスループットのDNAシーケンシング系のための、光切断可能なビオチンを含む質量タグの付いたddNTPsの設計および合成
本シーケンシング系をさらに最適化するために、本出願は、光切断可能なビオチン（PC-ビオチン）を含むddNTPsの使用を開示する。ストレプトアビジンコートされた多孔質表面での光切断可能なリンカーの捕獲および切断の概略図を図7に示す。DNAシーケンシング反応の終わりにでは、反応混合液は、過剰プライマー、酵素、塩、偽停止、および所望のシーケンシング断片からなる。この反応混合液をストレプトアビジン-コートされた表面上を通過させて、インキューベートする。ビオチン化されたシーケンシング断片は、ストレプトアビジン表面によって捕らえられが、混合液中のその他の全ては、洗い流される。次いで、光切断可能なリンカーを紫外（UV）光で切断することにより、断片を溶液中に放出されるが、ビオチンは表面に共有結合しストレプトアビジンに結合したままである。次いで、純粋なDNA断片をマトリックス溶液中で結晶化させて、質量分析によって解析するることができる。ビオチン部分は、比較的多量のいくつかの同位元素を有するイオウを含むので、これを切断することは有利である。DNA断片およびリンカーの残りの部分は、炭素、窒素、水素、酸素、フッ素、および亜リン酸のみを含み、その優位な同位元素は、99%〜100%の相対的な豊度で見出される。これによって、高解像度質量スペクトルを得ることができる。光切断メカニズムを図8に示す（Olejnik et al. 1995、1999）。300-350nmの紫外線の照射により、DNA断片1の光感受性o-芳香族ニトロ化合物カルボンアミドが機能的に切断され、DNA断片2、PC-ビオチン、および二酸化炭素を生じる。DNA断片2に残っている部分的な化学物質リンカーは、質量分析による検出の際に安定している。
【００９４】
本明細書に4つの新規なビオチン化されたddNTPsを開示したが、ddCTP-PCビオチン、ddTTP-リンカーI-PCビオチン、ddATP-リンカーII-PCビオチン、およびddGTP-リンカーIII-PCビオチンを図9に示す。これらの化合物は、図6のddATP-リンカーII-11-ビオチンの合成で示したものと同様の化学によって合成される。図10に示したとおり、唯一の違いは、最終的なカップリング工程において、NHS-PC-LC-ビオチン（Pierce, Rockford III）が使用されるということである。本明細書に開示した光切断可能なリンカーによって、固相捕獲可能なターミネータの使用が可能となり、質量分析をハイスループットなシーケンシング技術に変えられる。
【００９５】
IV  ddNTPで終結したDNA断片の表面上での捕獲、並びにddNTPおよびDNA断片の遊離の概要
DNA断片は、ジデオキシヌクレオチド（ddNTP）で終結させる。ddNTPを、リンカーを介して化学部分（図11における「X」）に結合する。ジデオキシヌクレオチドおよびDNA断片を、化学部分「X」と表面上または表面に結合した化合物（図11における「Y」）との間の相互作用を介して表面に捕獲する。本出願は、捕獲したジデオキシヌクレオチドおよびDNA断片をフリーにするための2つの方法を開示する。図11の下部に例示した状況において、ジデオキシヌクレオチドおよびDNA断片は、化学部分「X」と化合物「Y」との間の相互作用を分裂させるか、または壊すことによって表面から遊離させる。図11の上部において、ジデオキシヌクレオチドは、切断可能なリンカーを介して化学部分「X」に結合され、これを切断してジデオキシヌクレオチドおよびDNA断片をフリーにすることができる。
【００９６】
種々の部分および化合物を「X」-「Y」アフィニティ系のために使用することができ、ビオチン-ストレプトアビジン、フェニルホウ酸-サリチルヒドロキサム酸（Bergseid et al. 2000）、および抗原-抗体系を含むが、これらに限定されない。
【００９７】
別の態様において、切断可能なリンカーは、切断することができ、「X」-「Y」相互作用は、物理的手段、化学的手段、物理的化学的手段、熱、および光の1つまたは複数からなる群より選択される手段によって分裂させることができる。1つの態様において、切断可能なリンカーを切断するために紫外線を使用することができる。化学的手段は、水酸化アンモニウム（Jurinkeet.al. 1997）、ホルムアミド、または溶液のpH（-ログH濃度）の変化を含むが、これらに限定されない。
【００９８】
V  高密度ストレプトアビジンでコートされた多孔質シリカチャンネル系。
【００９９】
ストレプトアビジンでコートされた磁気ビーズは、これらが紫外線透過性でないので、光切断可能なビオチン捕獲およびDNAシーケンシング断片の遊離プロセスでの使用には理想的でない。したがって、光切断可能な反応は、効率的でない。ビオチン化されたシーケンシング断片を効率的に捕獲するためには、ストレプトアビジンでコートされた高密度表面が必須である。市販のストレプトアビジンコートされた96ウェルプレートは、ビオチン化されたDNA断片の効率的な捕獲に充分な表面積を提供することができないことが知られている。この限界を克服するためにデザインした新規の多孔質シリカチャンネル系を本出願に開示する。
【０１００】
固相捕獲に利用できる表面積を増大させるために、多孔質チャンネルを高密度のストレプトアビジンでコートする。96（96）の多孔性のシリカグラスチャンネルを、シリカチップ（図12）にエッチングすることができる。チャンネルの表面は、図13に示したとおり、ストレプトアビジンを含むように修飾する。チャンネルを、まず0.5MのNaOHで処理して水で洗浄し、次いで稀釈フッ化水素で簡潔に予めエッチングする。水で洗浄し、キャピラリチャンネルを高密度3-アミノプロピルトリメトキシシランの水性エタノール溶液（Woolley et al. 1994）でコートする。次いで、過剰のジスクシンイミジルグルタラートのN,N-ジメチルホルムアミド（DMSO）溶液をキャピラリに導入し、表面末端基のスクシンイミジルエステルへの非常に効率的な転換を保証する。次いで、ストレプトアビジンをスクシンイミジルエステルと結合させて、過剰なストレプトアビジン溶液を使用して高密度の表面を形成する。生じる96-チャンネルチップは、精製カセットとして使用される。
【０１０１】
本出願は、図12に示したとおり、ビオチン化されたターミネータと共にシーケンシング断片を生成するために使用することができる96ウェルプレートを開示する。示した例においては、チャンネルのそれぞれの末端が単一のウェルに接続される。しかし、その他の適用においては、チャンネルの末端は、複数のウェルに結合され得る。圧力をかけて、ガラス管を介してチップ上のチャンネルに試料を追いやる。チャンネル内部では、共有結合で結合されたストレプトアビジンによってビオチンが捕獲される。チャンネルを通過させた後に、試料は、チップの他端の清潔なプレートに入る。逆に圧力をかけると、チャンネルを介して複数回試料を動かし、非常に効率的な固相捕獲が保証される。水を同様に添加して、反応混合液を追い出し、捕獲された断片を徹底的に洗浄する。洗浄後に、チップを紫外線で照射して光感受性リンカーを切断し、DNA断片を遊離させる。
【０１０２】
次いで、断片溶液をチャンネルから回収プレートに追い出す。マトリックス溶液を添加した後、試料をチップ上にスポットして、MALDI-TOF質量分析によって検出するために結晶化させる。精製カセットを、ビオチン-ストレプトアビジンリンケージを化学的に切断することによってきれいにし、次いで洗浄して再利用する。
【０１０３】
VI  合成DNAテンプレートおよびゲノムDNAから作製したPCRテンプレートを使用する質量分析DNAシーケンシング系の実証
本明細書に開示した技術を実証するために、ヒト免疫不全ウイルス1型プロテアーゼ遺伝子の一部を模倣した合成DNAテンプレートを合成することができる。テンプレートの配列（配列番号：3）、およびそのシーケンシングプライマー（配列番号：4）を示す（Schmit et al. 1996）：
【化２４】
2004533608.tif 000015
【０１０４】
また、腫瘍抑制遺伝子p53をモデル系として使用することもできる。p53遺伝子は、ヒト癌において最も頻繁に変異する遺伝子のうちの1つである（O'Connor et al. 1997）。大部分のp53変異ホットスポットは、エキソン5〜8の範囲内にクラスター形成しており、p53遺伝子のこの領域をシーケンシング標的として選択する。p53遺伝子のエキソン7およびエキソン8に由来する一部の配列を含む合成シーケンシングテンプレート、並びに適切なプライマーを調製することもできる：
テンプレート：
5'CATGTGAACAGTTCCTGCATGGGCGGCATGAACCCGAGGCCCATCCTCACCATCATCACACTGGAAGACTCCAGTGGTAATCTACTGGGACGGAACAGCTTTGAGGTGCATGTTTGTGCCTGTCCTGG-3（配列番号：5）、
シーケンシングプライマー：5'-CCAGGACAGGCACAA-3'（配列番号：6）。
【０１０５】
クラスター形成したホットスポットの一塩基変異の検出に対する本明細書に開示した質量分析シーケンシング手順の使用を探索するために、このテンプレート（配列番号：5）を選択した。潜在的に変異した塩基には、上に示した合成テンプレートに下線を引いた（A、G、C、およびT）。
【０１０６】
合成テンプレートに加えて、ポリメラーゼ連鎖反応法（PCR）によって作製したテンプレートも、さらに高い忠実度のMALDI-TOF質量分析シーケンシング技術を実証するために使用することができる。シーケンシングテンプレートは、Fuら（1998）によって記載されたとおりに、ゲノムDNAのプール（Boehringer, Indianapolis, IN）由来のそれぞれのp53エキソンの境界に位置するイントロン領域に隣接するプライマーを使用して、PCRによって作製することができる。
【０１０７】
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【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】質量分析解析のためのDNAシーケンシング試料を調製するための、ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドおよびストレプトアビジンコートされた固相の使用の概略図。d（A、C、G、T）塩基アデニン（A）、シトシン（C）、グアニン（G）、またはチミン（T）を有するデオキシヌクレオチド；dd（A-b、C-b、G-b、T-b）ビオチン化されたジデオキシヌクレオチド。
【図２】固相の捕獲可能なビオチン化されたジデオキシヌクレオチドに由来するDNAシーケンシングデータ。適切な塩基を、それぞれのピークの上に示す。第一のピークは、適切な位置にあり、13bpプライマーにプラスして最初の塩基アデニンを同定するために使用される。ピークと前のピークとの間の質量差を塩基の上に示す。6500と12000（m/z）間の領域は、透過性が強められる。データは、ビオチン化されたジデオキシヌクレオチドddATP-11-ビオチン、ddGTP-11-ビオチン、ddCTP-11-ビオチン、およびddTTP-11-ビオチンを使用して得た。
【図３】シーケンシングデータは、ビオチン化されたターミネータを使用して回収してシーケンシング断片を生成し、次いで質量分析計において解析した。4つの全ての塩基類は、ビオチン化されたターミネータddATP-11-ビオチン、ddGTP-11-ビオチン、ddCTP-11-ビオチン、およびddTTP-16-ビオチンを使用して、明瞭に区別することができる。
【図４】4つの質量タグを付けたビオチン化されたddNTPsの構造。4つのddNTPs（ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP）のいずれも、図示したどのリンカーと共に使用することもできる。
【図５】質量タグリンカーのための合成スキーム。図示する目的で、リンカーには、図4、6、8、9、および10において結合させたことを示した特定のddNTPに一致するラベルをつける。しかし、3つのリンカーのいずれをも、ddNTPと共に使用することができる。
【図６】ddATP-リンカー-II-11-ビオチンの合成。
【図７】DNAシーケンシング産物をストレプトアビジンコートされた多孔質シリカ表面によって精製する。ビオチン化された断片のみが捕らえられる。次いで、これらの断片を紫外線照射（hv）によって切断して、捕らえられた断片を遊離させ、なおもストレプトアビジンに結合したビオチン部分は残しておく。
【図８】光切断可能なリンカーの切断メカニズム。
【図９】ddNTPsの構造を光切断可能な（PC）ビオチンに結合させた。4つのddNTPs（ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP）のいずれも、図示したどのリンカーと共に使用することもできる。
【図１０】ddATP-リンカー-II-PC-ビオチンの合成。PC=光切断可能。
【図１１】ddNTPで終結するDNA断片を表面に捕獲し、次いでddNTPおよびDNA断片を遊離させるための概略図。DNA断片（図示せず）の一端にあるジデオキシヌクレオチド（ddNTP）を、ddNTPおよびDNA断片を捕獲するための表面上で化合物「Y」と相互作用する化学部分「X」に、リンカーを介して結合させる。ddNTPおよびDNA断片は、化学部分Xと化合物質物Yとの間の相互作用を分裂させることにより（下のパネル）、または切断可能なリンカーを切断することにより（上のパネル）、表面から遊離させることができる。
【図１２】ハイスループットチャンネルに基づいたストレプトアビジン精製系の概略図。試料溶液は、ガラスキャピラリを介した2つのプレートとチップ内のストレプトアビジンコートされたチャンネルとの間を前後に押すことができる。固定化後に、チップ全体を照射して試料を切断することができる。
【図１３】ストレプトアビジンでコートした多孔質表面の合成。
【図１】
2004533608.tif 000027
【図２】
2004533608.tif 000028
【図３】
2004533608.tif 000029
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2004533608.tif 000033
【図８】
2004533608.tif 000034
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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