(57)【要約】本発明は、ＳＤＦ−１βを分泌するように遺伝子操作された腫瘍細胞を含む、自己腫瘍ワクチンに関する。このような腫瘍ワクチンを作製する方法、ならびに本発明のワクチンで癌を有する被験体をワクチン接種および処置するための方法もまた、特徴とする。１つの局面では、本発明は、被験体から単離された腫瘍細胞を含むワクチンを提供し、ここで、該腫瘍細胞は、改変されていない腫瘍細胞と比較して増加したレベルのＳＤＦ−１βを分泌するように改変されており、該ワクチンは、該被験体への投与の際に腫瘍免疫を付与する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体から単離された腫瘍細胞を含むワクチンであって、該腫瘍細胞は、改変されていない腫瘍細胞と比較して増加したレベルのＳＤＦ−１βを分泌するように改変されており、該ワクチンは、該被験体への投与の際に腫瘍免疫を付与する、ワクチン。
【請求項２】
前記腫瘍細胞の改変が、ＳＤＦ−１βをコードする核酸分子で該細胞を形質導入することを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
ＳＤＦ−１βをコードする前記核酸分子が、ベクターの形態である、請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
前記ベクターが、組換え発現ベクターである、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
前記組換え発現ベクターが、ウイルス発現ベクターから選択される、請求項３に記載のワクチン。
【請求項６】
前記組換え発現ベクターが、複製欠損レトロウイルスベクターである、請求項４に記載のワクチン。
【請求項７】
前記改変された腫瘍細胞が、ＳＤＦ−１βを発現する前記核酸分子の導入前に培養物中で拡大されている、請求項２に記載のワクチン。
【請求項８】
薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
自己腫瘍ワクチンを産生するための方法であって、以下：
（ａ）癌を有する被験体から腫瘍細胞を単離する工程；および
（ｂ）該腫瘍細胞が、改変されていない腫瘍細胞と比較して増加したレベルのＳＤＦ−１βを分泌するように、該腫瘍細胞を改変する工程
を包含し、その結果、自己腫瘍ワクチンが産生される、方法。
【請求項１０】
改変される前記細胞が、前記被験体から外科的に除去された腫瘍から単離される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
改変される前記細胞が、前記被験体における腫瘍の生検から単離される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
改変される前記細胞が、該細胞の改変前に培養物中で拡大される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
癌を有する被験体を処置するための方法であって、腫瘍増殖を阻害するのに十分な量の請求項１に記載の自己腫瘍ワクチンを該被験体に投与する工程を包含し、その結果、該被験体が処置される、方法。
【請求項１４】
前記自己腫瘍ワクチンが、前記被験体の腫瘍負荷が低い場合に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記自己腫瘍ワクチンが、前記被験体が化学療法を受けた後に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記自己腫瘍ワクチンが、前記被験体が放射線療法を受けた後に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記被験体における抗腫瘍免疫応答をモニターする工程をさらに包含する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍ワクチンの細胞が、前記被験体への投与前に照射される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍ワクチンの細胞が、投与前にアジュバントと混合される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍ワクチンが、前記被験体における腫瘍の少なくとも１つの部位にかまたはその付近に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍ワクチンが、該被験体から腫瘍が外科的に除去された少なくとも１つの部位にかまたはその付近に投与される、請求項１３に記載の方法。
【請求項２２】
癌を有する被験体における抗腫瘍応答を促進させるための方法であって、請求項１に記載の自己腫瘍ワクチンを該被験体に投与する工程を包含し、その結果、該被験体が、該ワクチンに対する抗腫瘍応答を発生する、方法。
【請求項２３】
前記自己腫瘍ワクチンが、前記被験体の腫瘍負荷が低い場合に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記自己腫瘍ワクチンが、前記被験体が化学療法を受けた後に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記自己腫瘍ワクチンが、前記被験体が放射線療法を受けた後に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記被験体における抗腫瘍免疫応答をモニターする工程をさらに包含する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍ワクチンの細胞が、前記被験体への投与前に照射される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記腫瘍ワクチンの細胞が、投与前にアジュバントと混合される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記腫瘍ワクチンが、前記被験体における腫瘍の少なくとも１つの部位にかまたはその付近に投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記腫瘍ワクチンが、該被験体から腫瘍が外科的に除去された少なくとも１つの部位にかまたはその付近に投与される、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本願は、米国仮出願６０／２４７，５９２、発明の名称「ＳＤＦ−１β  Ｔｕｍｏｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」（２０００年１１月９日出願）および同６０／２５０，７２８、発明の名称「ＳＤＦ−１β  Ｔｕｍｏｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」（２０００年１２月１日出願）（これらの全内容が、本明細書中に参考として援用される）に対する優先権を主張する。
【０００２】
（発明の背景）
間質細胞由来因子−１（ＳＤＦ−１）は、周産期生存性、Ｂリンパ球産生、および骨髄の骨髄造血に必須であるケモカインのＣＸＣファミリーのメンバーであり、そしてまた、Ｔ細胞、リンパ球、単球および造血前駆細胞に対する高度に効果的な化学誘引物質および高度に強力な化学誘引物質の両方として作用する。ＳＤＦ−１はまた、強力な前駆Ｂ細胞（ｐｒｅ−Ｂ  ｃｅｌｌ）増殖刺激因子であることが公知であり、そして前駆Ｂ細胞に対するコマイトジェンとしてインターロイキン−７と一緒に作用することが報告されている。Ｄ’Ａｐｕｚｚｏら（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：１７８８−１７９３。さらに、近年の報告によって、ＳＤＦ−１がヒト末梢Ｔ細胞に対して増殖促進活性を有することが実証され、そしてその活性ならびにＴ細胞の移動、強化および維持が、ＭＡＰキナーゼ（ＥＲＫ２）の活性化を含む機構を介して進行され得ることが示唆されている。Ｙｏｎｅｚａｗａら（２０００）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：１３５−１４１。
【０００３】
ＳＤＦ−１に対するレセプターであるＣＸＣＲ４は、免疫系および中枢神経系の両方の細胞において広範に発現され、そして近年、Ｔ向性ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の標的ＣＤ４＋  Ｔ細胞への侵入に関与することが示されている。ＳＤＦ−１は、細胞表面ＣＸＣＲ４をダウンレギュレートすることによって、そのレセプターを発現する細胞のＨＩＶ感染を阻害し得る。Ｓｉｇｎｏｒｅｔら（１９９７）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３９：６５１−６４。ＣＸＣＲ４もまた、内皮細胞上で発現され、そしてインビトロおよびインビボの両方において、新脈管形成の促進に機能することが提案されている。
【０００４】
ＳＤＦ−１およびＳＤＦ−１レセプター（ＣＸＣＲ４）の重要な役割を考慮すると、造血からＨＩＶ感染までの範囲の広範な生理学的活性を調節する際に、このケモカインおよびそのレセプターが、神経変性疾患における治療介入のための潜在的な標的として、ならびにＨＩＶ感染および他の免疫系疾患に対する新規治療剤の開発における潜在的な標的として提案されている。
【０００５】
（発明の要旨）
本発明は、ＳＤＦ−１βの新規抗腫瘍活性の発見に少なくとも一部基づく、今まで記載されていないＳＤＦ−１に関する治療用途を特徴とする。詳細には、本発明者らは、遺伝子改変された腫瘍細胞によって動物の腫瘍部位において分泌されるヒトＳＤＦ−１β（ｈＳＤＦ−１β）が、腫瘍拒絶および抗腫瘍記憶応答の発生を導く局所的な免疫応答を開始することを、実証した。種々の動物腫瘍モデルにおいて、ｈＳＤＦ−１βを発現する腫瘍細胞を注射された動物の４０％〜１００％が、その腫瘍を拒絶した。さらに、長期の記憶Ｔ細胞を発生する動物は、腫瘍再チャレンジに対して免疫性であり、そして腫瘍特異的ＣＴＬ活性を示した。
【０００６】
ＳＤＦ−１βのこの以前には認識されていない抗腫瘍活性に基づいて、本発明は、未改変腫瘍細胞に対して増大したレベルのＳＤＦ−１βを分泌するように改変された、被験体から単離された腫瘍細胞を含むワクチンを特徴とし、ここで、このワクチンは、被験体に投与された場合、腫瘍免疫を与える。
【０００７】
１つの実施形態において、腫瘍細胞を改変することは、ＳＤＦ−１βをコードする核酸分子を用いてその細胞を形質導入することを包含する。
【０００８】
別の実施形態において、ＳＤＦ−１βをコードする核酸分子は、ベクターの形態である。
【０００９】
別の実施形態において、ベクターは、組換え発現ベクターである。
【００１０】
なお別の実施形態において、組換え発現ベクターは、ウイルス発現ベクターから選択される。
【００１１】
別の実施形態において、組換え発現ベクターは、複製欠損レトロウイルスベクターである。
【００１２】
別の実施形態において、改変された腫瘍細胞は、ＳＤＦ−１βを発現する核酸分子の導入前に、培養中で拡大される。
【００１３】
１つの実施形態において、ワクチンは、薬学的に受容可能なキャリアをさらに含む。
【００１４】
別の局面において、本発明は、自己腫瘍ワクチンを生成するための方法に関し、この方法は、以下：
（ａ）癌を有する被験体から腫瘍細胞を単離する工程；および
（ｂ）上記腫瘍細胞が未改変細胞に対して増大したレベルのＳＤＦ−１βを分泌するように、上記腫瘍細胞を改変する工程；
を包含し、その結果、自己腫瘍ワクチンが生成される。
【００１５】
１つの実施形態において、改変される細胞は、被験体から外科的に取り出された腫瘍から単離される。
【００１６】
別の実施形態において、改変される細胞は、被験体中の腫瘍の生検から単離される。
【００１７】
別の実施形態において、改変される細胞は、細胞の改変前に、培養中で拡大される。
【００１８】
なお別の局面において、本発明は、癌を有する被験体を処置するための方法に関し、この方法は、その被験体に腫瘍増殖を阻害するのに十分な量の請求項１に記載の自己腫瘍ワクチンを投与する工程を包含し、その結果、その被験体が処置される。
【００１９】
１つの実施形態において、自己腫瘍ワクチンは、被験体の全身腫瘍組織量が低い場合に投与される。
【００２０】
別の実施形態において、自己腫瘍ワクチンは、被験体が化学療法を受けた後に投与される。
【００２１】
なお別の実施形態において、自己腫瘍ワクチンは、被験体が放射線療法を受けた後に投与される。
【００２２】
別の実施形態において、上記の方法は、被験体における抗腫瘍免疫応答をモニタリングする工程をさらに包含する。
【００２３】
１つの実施形態において、上記の腫瘍ワクチンの細胞は、被験体に投与される前に照射される。
【００２４】
別の実施形態において、上記の腫瘍ワクチンの細胞は、投与前にアジュバントと混合される。
【００２５】
なお別の実施形態において、腫瘍ワクチンは、被験体中の腫瘍の少なくとも１つの部位またはその少なくとも１つの部位の付近に投与される。
【００２６】
なお別の実施形態において、腫瘍ワクチンは、腫瘍が被験体から外科的に取り出される少なくとも１つの部位またはそのその少なくとも１つの部位の付近に、投与される。
【００２７】
なお別の局面において、本発明は、癌を有する被験体における抗腫瘍応答を促進するための方法に関し、この方法は、その被験体に請求項１に記載の自己腫瘍ワクチンを投与する工程を包含し、その結果、その被験体は、そのワクチンに対する抗腫瘍応答を発生する。
【００２８】
別の実施形態において、自己腫瘍ワクチンは、被験体の全身腫瘍組織量が低い場合に投与される。
【００２９】
なお別の実施形態において、自己腫瘍ワクチンは、被験体が化学療法を受けた後に投与される。
【００３０】
１つの実施形態において、自己腫瘍ワクチンは、被験体が放射線療法を受けた後に投与される。
【００３１】
別の実施形態において、上記の方法は、被験体における抗腫瘍免疫応答をモニタリングする工程をさらに包含する。
【００３２】
別の実施形態において、上記の腫瘍ワクチンの細胞は、被験体に投与される前に照射される。
【００３３】
なお別の実施形態において、上記の腫瘍ワクチンの細胞は、投与前にアジュバントと混合される。
【００３４】
なお別の実施形態において、腫瘍ワクチンは、被験体中の腫瘍の少なくとも１つの部位またはその少なくとも１つの部位の付近に投与される。
【００３５】
なお別の実施形態において、腫瘍ワクチンは、腫瘍が被験体から外科的に取り出される少なくとも１つの部位またはそのその少なくとも１つの部位の付近に、投与される。
【００３６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、少なくとも一部、ＳＤＦ−１β（本明細書中で、ＳＤＦ、ＳＤＦ−１β、およびｈＳＤＦ−１βとも呼ばれる）の新規の抗腫瘍活性の発見に基づく。特に、本発明は、遺伝子改変された腫瘍細胞により動物の腫瘍部位で分泌されたヒトＳＤＦ−１β（ｈＳＤＦ−１β）が、腫瘍の拒絶および抗腫瘍記憶応答の発生を導く局所的な免疫応答を開始することを示した。この新規の活性は、放射線により誘導される急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、Ｃ１４９８白血病、Ｂ１６Ｆ１黒色腫、およびＭＢ４９膀胱癌腫を含む、種々の動物腫瘍モデルにおいて実証された。改変された腫瘍細胞によるＳＤＦ−１βの発現は、形質導入された腫瘍細胞の形態変化および表現型変化を誘導するが、改変された細胞のインビトロでの増殖特性には影響を有さない。試験した全ての腫瘍モデルにおいて、ｈＳＤＦ−１β発現腫瘍細胞を注入した動物の４０％〜１００％は、それらの腫瘍を拒絶した。長期持続性の記憶Ｔ細胞を生じる、生存ＳＤＦ−１β発現腫瘍細胞を事前に拒絶した動物は、生存野生型腫瘍細胞を用いた再チャレンジに対して免疫性であり、そして腫瘍特異的ＣＴＬ活性を示した。照射したＳＤＦ−１βを形質導入した腫瘍細胞を用いて１つの部位で事前に免疫された動物は、第２の部位での生存野生型腫瘍細胞を用いた接種に対して保護された。最後に、増加したレベルのＳＤＦ−１βを分泌するよう操作された腫瘍細胞は、免疫不全動物により拒絶されず、そして組織学的分析は、ＳＤＦ−１βを分泌する腫瘍塊の周囲の免疫細胞による重度の細胞浸潤を示した。これらのデータは、集合的に、癌の処置における新規でありかつ見込みのある治療アプローチの開発を導く、ＳＤＦ−１βの以前に認識されていなかった抗腫瘍活性を実証する。
【００３７】
従って、本発明の第１の局面は、自己腫瘍ワクチンを特徴とする。１つの実施形態において、被験体（例えば、癌を有する被験体または患者）由来の腫瘍細胞を含む自己腫瘍ワクチンを特徴とし、この腫瘍細胞は、未改変腫瘍細胞により分泌されるＳＤＦ−１βの量と比較して、増加したレベルのＳＤＦ−１βを分泌するよう改変されている。別の実施形態において、未改変腫瘍細胞により分泌されるＳＤＦ−１βの量と比較して、増加したレベルのＳＤＦ−１βを分泌するよう改変された被験体由来の腫瘍細胞を含む自己腫瘍ワクチンを特徴とし、このワクチンは、被験体への投与後に腫瘍免疫性を与える。別の実施形態において、未改変腫瘍細胞により分泌されるＳＤＦ−１βの量と比較して、増加したレベルのＳＤＦ−１βを分泌するよう改変された被験体由来の腫瘍細胞を含む自己腫瘍ワクチンを特徴とし、このワクチンは、低い全身腫瘍組織量の期間に被験体に投与した後、腫瘍免疫性を与える。
【００３８】
１つの実施形態において、この腫瘍細胞は、ＳＤＦ−１βをコードする核酸分子を細胞に導入することにより、増加したレベルのＳＤＦ−１βを分泌するよう改変されている。核酸分子の例は、配列番号１に示される核酸分子である（特に、ヒト自己腫瘍ワクチンにおいて使用するために）。配列番号１の核酸分子は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するヒトＳＤＦ−１βタンパク質をコードする。核酸分子のさらなる例として、配列番号２に示されるヒトＳＤＦ−１βタンパク質の改変体（例えば、機能的改変体）をコードする核酸分子（例えば、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子に少なくとも９０％の同一性を有する核酸分子、および／または配列番号２に示されるポリペプチドに少なくとも９０％の同一性を有するＳＤＦ−１βタンパク質をコードする核酸分子）が挙げられる。核酸分子のさらなる例として、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子にハイブリダイズする核酸分子を含む、配列番号２に示されるタンパク質の改変体（例えば、機能的改変体）をコードする核酸分子が挙げられる。
【００３９】
ＳＤＦ−１βをコードする核酸分子は、例えば、ベクターの形態（例えば、分泌されるレトロウイルスベクター）中に導入され得る。好ましい組換え発現ベクターは、複製不全レトロウイルスベクターである。本発明の別の実施形態において、ワクチンの改変された腫瘍細胞は、ＳＤＦ−１βを発現する核酸分子の導入前に培養物中で展開される。本発明の他の実施形態は、ワクチンに対する被験体の免疫応答をさらに増強する薬学的に受容可能なキャリアおよび／またはアジュバントに加えて改変された腫瘍細胞を含む腫瘍ワクチンを包含する。
【００４０】
本発明の別の局面は、自己腫瘍ワクチンを生成するための方法を特徴とする。特に、被験体または患者（特に、癌を有する被験体または患者）から腫瘍細胞を単離する工程、および未改変腫瘍細胞と比較して増加したレベルのＳＤＦ−１βを分泌するように、単離された腫瘍細胞を改変する工程を包含し、それによって自己腫瘍ワクチンを生成する方法を特徴とする。１つの実施形態において、この方法は、被験体または患者から外科手術により取り出された腫瘍から単離された細胞を改変する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、被験体または患者由来の腫瘍の生検から単離された細胞を改変する工程を包含する。さらに別の実施形態において、この方法は、単離された細胞を改変する前に、培養物中でこの細胞を展開する工程を包含する。
【００４１】
本発明の別の局面は、被験体または患者（例えば、癌を有する被験体または患者）を処置する方法を特徴とする。特に、本明細書に規定される自己腫瘍ワクチンを被験体または患者に投与する工程、および被験体における腫瘍の成長および／または腫瘍の退化をモニターする工程（例えば、ワクチンを投与する工程の後に）を包含し、それによって被験体または患者を処置する方法を特徴とする。１つの実施形態において、この方法はまた、被験体または患者が、上記細胞に対する免疫応答を生じることを決定する工程を包含する。別の実施形態において、この方法は、被験体または患者の全身腫瘍組織量が低い場合（例えば、腫瘍が初期段階で検出されるか、または被験体が別の方法（例えば、化学療法または放射線療法）を用いて処置された後に検出される場合）に、ワクチンを投与する工程を包含する。
【００４２】
本発明のさらに別の局面は、癌を有する被験体または患者における抗腫瘍応答を刺激する方法を特徴とする。特に、本発明は、被験体または患者に、本明細書に規定される自己腫瘍ワクチンを投与する工程を包含する方法を特徴とし、それによって、被験体または患者は、このワクチンに対する抗腫瘍応答を生じる。特定の実施形態において、癌を有する被験体または患者における抗腫瘍応答を処置または刺激する方法は、被験体または患者が化学療法を受けた後に、この自己腫瘍ワクチンを投与する工程を包含する。他の実施形態において、この方法は、被験体が放射線療法を受けた後に、自己腫瘍ワクチンを投与する工程を包含する。さらに他の実施形態において、この方法は、被験体または患者への投与前に自己腫瘍ワクチンの細胞を照射する工程、および／または投与前に細胞をアジュバントと混合する工程を包含する。さらに他の実施形態において、この方法は、被験体または患者における腫瘍部位またはその付近、あるいは腫瘍が被験体または患者から外科手術により取り出された部位またはその付近に腫瘍ワクチンを投与する工程を包含する。なお別の実施形態において、抗腫瘍応答を刺激するこの方法はまた、その被験体における抗腫瘍応答をモニタリングする工程を包含する。
【００４３】
本発明をより容易に理解し得るために、特定の用語を本明細書中で最初に定義する。
【００４４】
本明細書中で使用する場合、用語「免疫細胞」は、造血系由来であり、免疫応答において役割を果たす細胞を含む。免疫細胞としては、リンパ球（例えば、Ｂ細胞およびＴ細胞）；ナチュラルキラー細胞；骨髄性細胞（例えば、単核細胞、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球および顆粒球）が挙げられる。
【００４５】
本明細書中で使用する場合、用語「Ｔ細胞」は、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。用語Ｔ細胞はまた、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞およびＴへルパー２型Ｔ細胞の両方を含む。用語「抗原提示細胞」は、専門的な抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単核細胞、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）、および他の抗原提示細胞（例えば、ケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、稀突起膠細胞）を含む。
【００４６】
本明細書中で使用する場合、用語「免疫応答」は、Ｔ細胞媒介性免疫応答および／またはＢ細胞媒介性免疫応答を含む。代表的な免疫応答としては、Ｔ細胞応答（例えば、サイトカイン産生）および細胞障害性が挙げられる。さらに、用語、免疫応答は、Ｔ細胞の活性化（例えば、抗体産生（体液性応答））およびサイトカイン応答性細胞（例えば、マクロファージ）の活性化により間接的に達成される免疫応答を含む。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、用語「ワクチン」は、抗原または細胞、好ましくは弱毒化された細胞または生物体の組成物（例えば、懸濁液）であって、被験体に投与された場合に、免疫応答を生じるかまたは引き起こす（例えば、活性な免疫性を生じるか引き起こす）組成物を含む。
【００４８】
本明細書中で使用する場合、用語「腫瘍」は、両性または悪性のいずれかの新生物増殖を含む。用語「腫瘍ワクチン」は、免疫応答を生じるかまたは引き起こし得る腫瘍細胞または腫瘍細胞抗原を含むワクチンを含む。用語「腫瘍細胞」は、腫瘍源由来であるかまたは腫瘍源を形成するかのいずれかである細胞を含み、このような細胞は、過剰であるか、異常であるか、調節されていないかまたは制御されていない増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎまたはｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｏｎ）により特徴付けられる。好ましい腫瘍細胞は、上皮由来の細胞または造血系由来の細胞である。
【００４９】
用語「自己」とは、当該被験体の身体により産生されるか、または当該被験体の身体由来である（例えば、ワクチンを投与されているかまたは処置されている被験体の身体により産生されるか、またはこのような被験体の身体由来である）ことを意味する（例えば、自己タンパク質、自己細胞または自己組織（例えば、自己組織サンプルまたは自己移植片））。成句「自己腫瘍ワクチン」は、本明細書中で定義されるような腫瘍ワクチンを含み、ここで腫瘍細胞またはこのワクチンの腫瘍細胞抗原は、このワクチンを投与されたかもしくは本明細書中に記載される治療方法の少なくとも１つに従って処置された被験体の身体により産生されるか、またはこのような被験体の身体由来である。
【００５０】
用語「抗腫瘍応答」は、腫瘍、腫瘍細胞、またはこの腫瘍細胞の任意の部分に対する免疫応答（例えば、腫瘍細胞の表面上に存在する腫瘍抗原に対する応答）を含む。
【００５１】
用語「癌」は、悪性新生物増殖、特に、上皮由来または造血系由来の新生物増殖を含み、これは異常な細胞増殖および接触阻害が存在しないことにより特徴付けられる。この用語は、腫瘍に局在する癌、ならびに腫瘍に局在しない癌（例えば、浸潤によって局所的に腫瘍から広がる癌細胞）を包含する。従って、任意の型の癌は、本発明に従う処置のために標的化され得る。例えば、本明細書中に記載される方法論は、好ましくは、いくつかの臨床的シナリオ（切除された癌についての局所的アジュバント治療、および腫瘍増殖（例えば、膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、直腸癌および胃癌）の局所的制御が挙げられるが、これらに限定されない）において適用され得る。この方法はまた、好ましくは、腫瘍が、肉腫（例えば、線維肉腫または横紋筋肉腫）、リンパ系もしくは骨髄系の造血腫瘍、または別の腫瘍（黒色腫、奇形癌、神経芽細胞腫または神経膠腫を含むが、これらに限定されない）である場合、処置のために使用され得る。
【００５２】
用語「被験体」は、種々の生きた哺乳動物被験体を含み、これには、げっ歯類、霊長類、家庭用哺乳動物（例えば、ネコおよびイヌ）、家畜（例えば、反芻動物またはブタ）、特に、ヒト被験体が挙げられるが、これらに限定されない。従って、成句「癌を有する被験体」は、上記の被験体を含むがこれらに限定されない、癌の症状を示すか、癌と診断されたか、または制御されていない細胞増殖、ポリープ、腫瘍、もしくは本明細書中で定義されるような癌の任意の他の表現型の症状であると今のところ診断されている、任意の被験体を含む。好ましい実施形態において、癌を有する被験体は、ヒト被験体である。別の好ましい実施形態において、癌を有する被験体は、ヒト患者（すなわち、癌を有すると診断されたヒト被験体、および／または癌の処置専門の健康管理下にあるヒト被験体）である。
【００５３】
本発明に従う「癌の処置」は、癌を有する被験体に、治療的応答を引き起こすために、化合物、薬剤、医薬または処置薬、好ましくは、本発明の自己腫瘍ワクチンを投与する工程を包含する。好ましくは、この応答は、腫瘍増殖の減少および／または腫瘍退行をモニタリングすることにより評価され得る。「腫瘍増殖」は、腫瘍サイズおよび／または腫瘍細胞の数、あるいは腫瘍の数における増加を含む。「腫瘍退行」は、腫瘍質量の減少を含む。
【００５４】
本発明の種々の局面を、以下の小節にさらに詳細に記載する。
【００５５】
（Ｉ．ＳＤＦ−１βを発現する腫瘍細胞のエキソビボ改変）
本発明は、改変前または比較可能な改変されていない腫瘍細胞もしくは腫瘍細胞集団において発現されるレベルよりも高いレベルで、サイトカインＳＤＦ−１βを発現するように改変または操作された細胞を含む自己腫瘍ワクチンを特徴とする。本発明のワクチンの調製に使用するために適切な腫瘍細胞は、癌を有する被験体に存在する固形腫瘍から単離され得るか、または本質的に造血系である癌を有する患者の生物学的流体から単離され得る。この腫瘍細胞は、例えば、器官の固形腫瘍（膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、直腸癌および胃癌が挙げられるが、これらに限定されない）から得られ得るか、あるいはリンパ系もしくは骨髄系の造血腫瘍（例えば、リンパ腫、骨髄腫または白血病）；間葉由来の腫瘍（例えば、線維肉腫または横紋筋肉腫）；または別の腫瘍（黒色腫、奇形癌、神経芽細胞腫または神経膠腫を含む）から得られ得る。好ましくは、腫瘍細胞は、上皮起源または造血起源の腫瘍由来である。
【００５６】
このような腫瘍細胞は、任意の適切な手段によって単離され得るが、好ましくは、以下の工程を包含する一般的な方法で単離される：（ａ）被験体（例えば、ヒト被験体）から腫瘍サンプルを得る工程、（ｂ）この得られた腫瘍から腫瘍細胞を収集する工程、（ｃ）腫瘍細胞の懸濁液（例えば、単細胞懸濁液）を形成する工程、および（ｄ）この腫瘍細胞を培養する工程。
【００５７】
例えば、腫瘍細胞は、例えば、腫瘍細胞の外科的除去（例えば、腫瘍の生検）により被験体から得られ得るか、または血液−骨悪性疾患の場合には、被験体由来の血液サンプルから得られ得る。実験的に誘発した腫瘍の場合、腫瘍を誘発するために使用した細胞（例えば、腫瘍細胞株の細胞）が使用され得る。固形腫瘍のサンプルは、トランスフェクションの最大効率のために、腫瘍細胞の単細胞懸濁液を生成するための改変の前に、処理され得る。可能な処置としては、細胞の手動での分散、または例えば、コラゲナーゼによる結合組織繊維の酵素消化が挙げられる。
【００５８】
腫瘍細胞は、被験体から得られた直後にトランスフェクトされ得るか、または腫瘍細胞のさらなる特徴付け（例えば、細胞表面分子の発現の決定）を可能にするために、トランスフェクションの前にインビトロで培養され得る。
【００５９】
被験体に投与する前に、この改変された腫瘍細胞は、被験体においてさらに増殖し得ないように処理され、これによりこの改変された腫瘍細胞のいずれの可能性のある増殖も防止される。可能な処理としては、照射またはマイトマイシンＣ処理が挙げられ、この処理は、Ｔ細胞を刺激し、従って免疫応答を刺激する腫瘍細胞の能力を維持しつつ、腫瘍細胞の増殖能力を排除する。
【００６０】
より詳細には、腫瘍サンプルは、代表的に、手術の際に得られ得る。この腫瘍サンプルは、次いで、滅菌技術を使用し、組織の損傷を最小限にするような様式で、扱われそして操作され得る。この組織サンプルは、氷上の滅菌容器内に入れられ、そして実験室の層流フードに移される。腫瘍細胞の単離のために用いられる腫瘍の一部は、小片に刻まれ；残りの腫瘍は、−７０℃で保存され得る。次いで、この腫瘍の小片は、コラゲナーゼ、トリプシンまたは他の適切な消化酵素を使用して単細胞懸濁液に消化され得る。この消化は、室温または高温で実施され得る。好ましくは、消化は、例えば、振盪インキュベーター中で、混合物を振盪しつつ、３７℃で実施される。
【００６１】
次いで、単細胞懸濁液をペレット化し、そしてペレットを少量の組織培地に再懸濁し得る。再懸濁された細胞を、約１〜５×１０５腫瘍細胞／ｍｌの密度で、培養物中の細胞の増殖に適切な組織培地に播種し得る。好ましくは、培地は、多くの型の細胞培養物の増殖を支持するための幅広い適用性を有する培地（例えば、重炭酸緩衝系ならびに種々のアミノ酸およびビタミンを利用する培地）である。最適には、培地は、ＲＰＭＩ−１６４０培地である。この培地は、必要に応じて（例えば、腫瘍細胞の増殖に必要とされる場合または未分化状態で腫瘍細胞を維持するのに必要とされる場合）、種々のさらなる因子を含み得る。
【００６２】
培養物は、約５〜７％のＣＯ２の存在下で、約３５〜４０℃で維持され得る。腫瘍細胞培養物は、必要に応じて供給され得、そして再培養され得る。単離プロセスの一部として、腫瘍細胞は、腫瘍細胞を培養するために最適化された増殖培地にプレートされ得る。好ましくは、この培地は、さらに、血清（例えば、胎仔血清）および／または成長因子（例えば、インシュリンおよび／またはインシュリン様成長因子）を含む。この培地および培地成分は、容易に入手可能であり、例えば、商業的供給業者から獲得され得る。このような商業的供給業者としては、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、ＭＤ）、Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、Ｓｉｇｍａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）および類似の製品を製造する他の供給業者が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６３】
未改変腫瘍細胞は、検出可能なレベルのＳＤＦ−１βを産生しない。従って、ＳＤＦ−１βが産生されるために、上記のように単離された腫瘍細胞を改変することが必要である。本明細書中で使用される場合、用語「改変された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」または「改変（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」は、ＳＤＦ−１β核酸分子の発現、ＳＤＦ−１βポリペプチドの発現もしくは産生、および／またはＳＤＦ−１βの分泌が、細胞の操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）または操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）の前、あるいは操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）または操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ）されなかった匹敵する細胞において発現されるか、産生されるかまたは分泌されるレベルよりも高いレベルに増加されるように、細胞を操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）または操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）することを包含した。遺伝的操作としては、ＳＤＦ−１βをコードする核酸配列を用いる、腫瘍細胞または腫瘍細胞集団のトランスフェクションが挙げられ得るが、これに限定されない。用語「トランスフェクション」または「〜を用いてトランスフェクションされる」とは、外因性核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に導入することをいい、核酸を哺乳動物細胞に導入するのに有用な種々の技術（エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン処理、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルスベクターを用いた感染を含む）を包含する。哺乳動物細胞をトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９８９））および他の実験教科書に見出され得る。導入される核酸は、例えば、ＳＤＦ−１βをコードする遺伝子を含むＤＮＡ、ＳＤＦ−１βをコードするセンス鎖ＲＮＡ、またはＳＤＦ−１βをコードするｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターであり得る。必要であれば、改変に続いて、腫瘍細胞は、目的の核酸とともに腫瘍細胞に導入される選択マーカー（例えば、薬物耐性）を使用することによって、核酸の導入についてスクリーニングされ得る。
【００６４】
ＳＤＦ−１βコード核酸配列を腫瘍細胞に導入するための好ましいアプローチは、核酸配列（例えば、ＳＤＦ−１βをコードする、ｃＤＮＡ）を含むウイルスベクターの使用による。使用され得るウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター（Ｅｇｌｉｔｉｓ，Ｍ．Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，１３９５−１３９８（１９８５）；Ｄａｎｏｓ，Ｏ．およびＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，６４６０−６４６４（１９８８）；Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ，Ｄ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２，１１２０−１１２４（１９８８））、アデノウイルスベクター（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，Ｍ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  ６８，１４３−１５５（１９９２））およびアデノ随伴ウイルスベクター（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，Ｊ．Ｄ．ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５，３２５１−３２６０（１９８５））が挙げられる。ウイルスベクターを用いた腫瘍細胞の感染は、細胞の大部分が核酸を受容し、それによって、核酸を受容した細胞の選択の必要性を除き、そしてウイルスベクター内にコードされる分子（例えば、ウイルスベクター内に含まれるｃＤＮＡによる）は、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞において効率的に発現されるという利点を有する。
【００６５】
本発明に従って、腫瘍細胞によって分泌されるＳＤＦ−１βのレベルまたは量を増加することは、少なくとも１つの実施形態において、細胞にＳＤＦ−１βをコードする核酸分子を導入することによって、達成され得る。用語「核酸分子」は、本明細書中で使用される場合、ＤＮＡ分子（例えば、直鎖状ＤＮＡ分子、環状ＤＮＡ分子または染色体ＤＮＡ分子）およびＲＮＡ分子（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）およびヌクレオチドアナログを使用して作製されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログが挙げられる。核酸分子は、単鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。用語「単離された」核酸分子は、核酸分子に天然に隣接する配列を含まない（例えば、核酸分子が誘導される生物において天然に存在する核酸配列に天然に隣接する、約１０ｋｂ未満、約５ｋｂ未満、約２ｋｂ未満、約１ｋｂ未満、約０．５ｋｂ未満、約０．２ｋｂ未満、約０．１ｋｂ未満、約５０ｂｐ未満、約２５ｂｐ未満または約１０ｂｐ未満のヌクレオチド配列を含む）核酸分子を含む。好ましくは、「単離された」核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子）は、組換え技術によって産生された場合、他の細胞性物質を実質的に含まないか、または化学的に合成された場合、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。
【００６６】
例示的な核酸分子は、配列番号１（特に、ヒト自己腫瘍ワクチンにおける使用のため）に示される核酸分子であり、これは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するヒトＳＤＦ−１βタンパク質をコードする。さらなる例示的な核酸分子としては、配列番号２に示されるヒトＳＤＦ−１βタンパク質の機能的改変体をコードする核酸分子が挙げられる。本明細書中で使用される場合、配列番号２に示されるヒトＳＤＦ−１βタンパク質の機能的改変体は、配列番号２に示されるヒトＳＤＦ−１β配列に対して、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を有するタンパク質を含み、そして配列番号２に示されるヒトＳＤＦ−１β配列と実質的に同じ生物学的活性を共有し、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子に対して、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれより高い同一性を有する核酸分子が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、アミノ酸配列内の種々の位置での保存的置換を有する（または例えば、非必須残基部分に、非保存的置換、または最小の欠失の挿入を有する）改変体が、ヒトＳＤＦ−１β配列の生物学的活性を保持し得る。
【００６７】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の相同性パーセントを決定するために、これらの配列は、最適な比較の目的のために整列される（例えば、ギャップおよび／または挿入が、第２アミノ酸配列または第２核酸配列との最適なアライメントのために、第１アミノ酸配列または第１核酸配列に導入され得る）。第１配列における位置が、第２配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められる場合、分子は、その位置において同一であると言われる。２つの配列間の同一性パーセントは、それらの配列によって共有される同一位置の数の関数であり（すなわち、％同一性＝（同一位置の数／位置の総数）×１００）、好ましくは、最適なアライメントを生成するために必要なギャップの数およびこのギャップのサイズを考慮する。
【００６８】
２つの配列間の配列の比較および相同性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好ましい非制限的な例は、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−６８のアルゴリズム（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７によって改変される）である。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（２．０版）に組み込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワードレングス（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝１２を用いて実行され得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワードレングス＝３を用いて実行され得る。比較の目的ためのギャップアライメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されるように利用し得る。ＢＬＡＳＴプログラムおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーター（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）が使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照のこと。配列比較のために利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非制限的な例は、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｓｃｉ．４：１１−１７のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、例えば、ＧＥＮＥＳＴＲＥＡＭネットワークサーバー、ＩＧＨ  Ｍｏｎｔｐｅｌｌｉｅｒ、ＦＲＡＮＣＥまたはＩＳＲＥＣサーバーにおいて利用可能なＡＬＩＧＮプログラムに組み込まれる。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重みつき残基テーブル（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、１２のギャップレングスペナルティーおよび４のギャップペナルティーが使用され得る。
【００６９】
別の好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列の間の相同性パーセントは、Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリクスまたはＰＡＭ２５０マトリクスのいずれか、ならびに１２、１０、８、６、または４のギャップウェイトおよび２、３、または４のレングスウェイトを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙウェブサーバー）のＧＡＰプログラムを使用して達成され得る。なお別の好ましい実施形態において、２つの核酸配列の間の相同性パーセントは、５０のギャップウェイトおよび３のレングスウェイトを使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して達成され得る。
【００７０】
さらなる例示的核酸分子としては、配列番号２として示されるタンパク質の改変体をコードする核酸分子が挙げられ、この核酸分子は、配列番号１のヌクレオチド配列を有する核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子を含む。１つの実施形態において、ＳＤＦ−１βをコードする単離された核酸分子は、ストリンジェントな条件下で、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子のすべてもしくは一部とハイブリダイズするか、または配列番号２として示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子のすべてもしくは一部とハイブリダイズする。そのようなストリンジェントな条件は、当業者に公知であり、そしてＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９５）、第２節、第４節、および第６節に見出され得る。さらなるストリンジェントな条件が、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）、第７章、第９章および第１１章に見出され得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的例としては、約６５〜７０℃にて４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃にて４×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、その後、約６５〜７０℃にて１×ＳＳＣ中で１回以上の洗浄が、挙げられる。高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的例としては、約６５〜７０℃にて１×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（または約４２〜５０℃にて１×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、その後、約６５〜７０℃にて０．３×ＳＳＣ中で１回以上の洗浄が、挙げられる。ストリンジェンシーが低下したハイブリダイゼーション条件の好ましい非限定的例としては、約５０〜６０℃にて４×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（または約４０〜４５℃にて６×ＳＳＣ＋５０％ホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、その後、約５０〜６０℃にて２×ＳＳＣ中で１回以上の洗浄が、挙げられる。上記の値の中間の範囲（例えば、６５〜７０℃または４２℃〜５０℃）もまた、本発明により包含されることが意図される。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）である）は、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液中で、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）の代わりになり得る；洗浄は、各ハイブリダイゼーションが完了した後に、１５分間行われる。５０塩基対より短いことが予測されるハイブリッドについてのハイブリダイゼーション温度は、そのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低くあるべきであり、ここで、Ｔｍは、以下の等式に従って決定される。長さ１８塩基対未満のハイブリッドについ���、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ塩基の数＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ塩基の数＋Ｃ塩基の数）。長さ１８塩基対〜４９塩基対のハイブリッドについて、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの％）−（６００／Ｎ）、ここで、Ｎは、そのハイブリッド中の塩基数であり、そして［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣについて［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。膜（例えば、ニトロセルロース膜またはナイロン膜）への核酸分子の非特異的ハイブリダイゼーションを減少するために、ハイブリダイゼーション緩衝液および／または洗浄緩衝液にさらなる試薬（ブロッキング試薬（例えば、ＢＳＡまたはサケ精子キャリアＤＮＡもしくはニシン精子キャリアＤＮＡ）、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、Ｆｉｃｏｌｌ、ＰＶＰなどが挙げられるが、これらに限定されない）を添加し得ることもまた、当業者により認識される。ナイロン膜を使用する場合、特に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる好ましい非限定的例は、約６５℃にて０．２５〜０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、７％  ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、その後の、６５℃にて０．０２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、１％  ＳＤＳ（例えば、ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１９９１〜１９９５を参照のこと）（または０．２×ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ）での１回以上の洗浄である。別の好ましい実施形態において、単離された核酸分子は、本明細書中に示されるＳＤＦ−１βをコードするヌクレオチド配列と相補的な（例えば、配列番号１として示されるヌクレオチド配列の完全な相補体である）、ヌクレオチド配列を含む。
【００７１】
（例えば、さらなるＳＤＦ−１β改変体をコードする）ＳＤＦ−１βをコードするさらなる核酸分子が、標準的分子生物学の技術と本明細書中に提供される配列情報とを使用して、単離され得る。例えば、核酸分子は、標準的ハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ、Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９に記載される）を使用して単離され得るか、または本明細書中に示されるＳＤＦ−１βをコードするヌクレオチド配列またはその隣接配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって、単離され得る。本発明の核酸は、標準的ＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートとしてのｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または染色体ＤＮＡと適切なオリゴヌクレオチドプライマーとを使用して、増幅され得る。
【００７２】
好ましくは、このＳＤＦ−１βをコードする核酸配列は、「発現に適した形態」であり、この形態においては、その核酸が、この遺伝子のコード配列、ならびにこの遺伝子の転写および翻訳に必要な調節配列すべてを含み、この調節配列としては、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナル、および腫瘍細胞からのこの分子の分泌に必要な配列（Ｎ末端シグナル配列を含む）が、挙げられ得る。この核酸が組換え発現ベクター中のｃＤＮＡである場合、このｃＤＮＡの転写および／または翻訳を担う調節機能は、しばしば、ウイルス配列によって提供される。一般に使用されるウイルスプロモーターの例としては、ポリオーマウイルス由来のプロモーター、アデノウイルス２由来のプロモーター、サイトメガロウイルス由来のプロモーター、およびシミアンウイルス４０由来のプロモーター、およびレトロウイルスＬＴＲ由来のプロモーターが、挙げられる。このｃＤＮＡに連結された調節配列は、構成的転写を提供するようにか、または、例えば、誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーターまたはグルココルチコイド応答性プロモーター）の使用によって、誘導性転写を提供するように、選択され得る。腫瘍細胞からのＳＤＦ−１βの分泌は、例えば、この核酸配列中にこの分子のネイティブシグナル配列を含めることによってか、またはこのタンパク質の分泌の増加をもたらすシグナル（例えば、異種シグナル配列）を含めることによって、達成され得る。
【００７３】
好ましい実施形態において、ＳＤＦ−１βは、約０．１ｎｇ／１０６細胞／２４時間を超えるレベル、好ましくは、１ｎｇ／１０６細胞／２４時間を超えるレベル、より好ましくは、１０ｎｇ／１０６細胞／２４時間を超えるレベル、より好ましくは、２０ｎｇ／１０６細胞／２４時間を超えるレベル、なおより好ましくは、２５ｎｇ／１０６細胞／２４時間を超えるレベル、なおより好ましくは、３０ｎｇ／１０６細胞／２４時間を超えるレベル、およびなおより好ましくは、３５ｎｇ／１０６細胞／２４時間を超えるレベルで、改変された腫瘍細胞から分泌される。
【００７４】
腫瘍細胞のトランスフェクションが、その腫瘍細胞の大集団の改変と、その腫瘍細胞からの有意なレベルのＳＤＦ−１β分泌とをもたらす場合、例えば、ウイルス発現ベクターを使用する場合に、腫瘍細胞は、さらなる単離もサブクローニングも伴わずに使用され得る。あるいは、トランスフェクトされた腫瘍細胞の均質集団が、限界希釈クローニングにより単一のトランスフェクトされた腫瘍を単離すること、その後、その単一の腫瘍細胞を、標準的技術によりクローン細胞集団への増殖させることによって、調製され得る。
【００７５】
本明細書中に記載されるように改変される腫瘍細胞としては、本発明により包含されるアプローチのうちの１つ以上によって、増加したレベルのＳＤＦ−１βを発現、産生、および／または分泌するように感染、トランスフェクト、または処理された、腫瘍細胞が挙げられる。必要な場合、その腫瘍細胞は、投与の前に、細胞複製および可能な腫瘍形成をインビボで妨げるようにさらに処理され得る。可能な処理としては、マイトマイシンＣ処理または照射が挙げられ、これらの処理は、その腫瘍細胞の増殖能力を排除しつつ、その腫瘍細胞が免疫応答を刺激する能力を維持する。腫瘍細胞の照射のために、その腫瘍細胞は、組織培養プレートにプレーティングされ、そして１３７Ｃｓ供給源を用いて、室温で照射される。好ましくは、その細胞は、線量率約５０〜約２００ラド／分、なおより好ましくは約１２０〜約１４０ラド／分で照射される。好ましくは、その細胞は、その細胞の大多数（すなわち、好ましくは、その細胞の約１００％）がインビトロで増殖することを阻害するに十分な総線量で照射される。従って、好ましくは、その細胞は、総線量約１０，０００〜２０，０００ラドで、最適には、約１５，０００ラドで、照射される。
【００７６】
さらに、その改変された腫瘍細胞（例えば、ＳＤＦ−１β発現腫瘍細胞）は、投与前に、必要に応じて、その細胞の免疫原性を増強するように処理される。好ましくは、この処理は、非特定のアジュバント（フロイント完全アジュバントまたはフロイント不完全アジュバント、細菌細胞壁成分とミコバクテリア細胞壁成分とから構成されるエマルジョンなどが、挙げられるがこれらに限定されない）との混合を包含する。あるいは、さらなる遺伝子操作（例えば、サイトカインまたは免疫副刺激機能の導入）が、本発明の範囲内にあることが、意図される。
【００７７】
（ＩＩ．腫瘍ワクチンの投与）
本発明の腫瘍細胞ワクチンを被験体に「投与する工程（投与すること）」とは、その改変された（すなわち、ＳＤＦ−１β産生）腫瘍細胞をその被験体に実際に物理的に導入することをいう。その被験体中にその改変された腫瘍細胞を導入する任意の、そしてすべての方法が、本発明により企図される；この方法は、いかなる特定の導入手段にも依存せず、そしてそのように解釈されるべきではない。導入手段は、当業者に周知であり、そしてまた、本明細書中に例証される。
【００７８】
１つの実施形態において、改変された腫瘍細胞は、被験体にこの腫瘍細胞を注射することにより、この被験体に投与される。注射経路は、被験体による腫瘍細胞に対する最適な免疫応答を可能にする任意の経路を介するものであり得、含まれる腫瘍の型に依存して変化し得る。例えば、投与は、静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下であり得る。もとの腫瘍（例えば、切除した腫瘍）の部位に改変された腫瘍細胞を投与すると、局所的な免疫応答（例えば、Ｔ細胞媒介性またはＢ細胞媒介性の免疫応答）を誘発するに有益であり得る。散在様式で（例えば、静脈内注射により）、改変された腫瘍細胞を投与すると、全身性の抗腫瘍免疫が提供され得、さらに、もとの部位からの腫瘍細胞の転移性の拡がりを防御し得る。好ましくは、腫瘍細胞ワクチン（例えば、ＳＤＦ−１β発現腫瘍細胞ワクチン）は、被験体の腫瘍負荷が低い場合に投与される。これは、例えば、照射、化学療法、外科手術的介入（例えば、外科手術的切除）などの後にワクチンを投与することにより達成され得る。癌を処置するために用いられる他の形態の治療（例えば、サイトカインによるワクチン接種、規定された抗原（例えば、腫瘍抗原）によるワクチン接種、イディオタイプ抗体ワクチン接種など）の前またはこの治療とともに（すなわち、この治療と同時に、またはこの治療の直後に）、被験体に改変された腫瘍細胞を投与することもまた、本発明の範囲内である。
【００７９】
本発明の別の局面は、インビボでの被験体への薬学的投与に適切な、生物学的に適合性の形態にある改変された腫瘍細胞の組成物である。この組成物は、一定量の改変された腫瘍細胞および生理学的に受容可能なキャリアを含む。改変された腫瘍細胞の量は、治療的に有効であるように選択される。用語「インビボでの・・・薬学的投与に適切な、生物学的に適合性の形態」は、腫瘍細胞の治療的効果が腫瘍細胞ワクチンの毒性効果に勝るワクチンの任意の形態の投与を含む。「生理学的に受容可能なキャリア」は、被験体と生物学的に適合性のキャリアである。受容可能なキャリアの例としては、生理食塩水および水性緩衝溶液が挙げられる。全ての場合において、組成物は、無菌状態でなければならず、好ましくは、容易な注入性が存在する程度に流体である。
【００８０】
本発明の治療的組成物の投与は、公知の手順を用いて、所望の結果を達成するに有効な投薬量で有効な時間にわたって行われ得る。例えば、改変された腫瘍細胞の治療的に有効な用量は、個体の年齢、性別および体重、腫瘍細胞の型および腫瘍負荷の程度、ならびに被験体の免疫学的応答能力のような要因に従って変化し得る。投薬レジメンは、最適な治療的応答を提供するように調節され得る。例えば、改変された腫瘍細胞の単一用量が投与され得るか、または１を超える用量が経時的に投与され得る。
【００８１】
好ましくは、十分な数の改変された腫瘍細胞が、薬学的組成物または治療組成物中に存在し、これらが被験体に導入され、その結果、本明細書中でさらに議論されるように、再発する腫瘍に対して、このような処置の非存在下で認められる他の免疫応答より大きな免疫応答が存在する。改変された腫瘍細胞の投与される投薬量は、投与経路が考慮に入れられ、所望の治療結果（例えば、腫瘍免疫）を達成するために十分な数の腫瘍細胞が導入されるような投薬量であるべきである。さらに、本明細書中に記載の組成物中に含まれる活性薬剤の各々の量（例えば、接触される各細胞あたりの量または特定の体重あたりの量）は、異なる適用において変化し得る。例示的な実施形態において、改変された腫瘍細胞の濃度は、ワクチン１ｍｌあたり０．５×１０５超個の細胞、好ましくは、ワクチン１ｍｌあたり１×１０５超個の細胞、および必要に応じて、ワクチン１ｍｌあたり２×１０５超個の細胞またはワクチン１ｍｌあたり１×１０７超個の細胞を含み得る。
【００８２】
これらの値は、本発明を実施するために、本発明の方法を最適化する際に実施者が利用する各成分の範囲についての一般的ガイドラインを提供する。このような範囲を本明細書中で記載することは、成分のより高い量またはより低い量の使用が、特定の適用において認められ得るように、これらの量の使用を排除するのでは決してない。例えば、実際の用量およびスケジュールは、組成物が他の薬学的組成物と組み合わせて投与されるか否かに依存して、または薬物動態学、薬物処理、および代謝における個体間の際に依存して、変化し得る。当業者は、特定の状況の緊急性に従って任意の必要な調節を容易に行い得る。さらに、組成物の有効量は、癌細胞の増殖を阻害することが公知の他の化合物に対する類似性によりさらに概算され得る。
【００８３】
（ＩＩＩ．ＳＤＦ−１β生成腫瘍細胞を特徴とする治療方法）
本発明の治療方法は、自己腫瘍ワクチンを投与することに加えて、被験体における腫瘍細胞に対する免疫応答をさらに増強させる１以上のさらなる薬剤の投与を含み得る。このような薬剤は、例えば、このワクチンと同時投与され得るか、または本発明のワクチンの腫瘍細胞は、このようなさらなる薬剤を同時発現するようにされ得る。例えば、本発明の腫瘍細胞は、ＳＤＦ−１および別の分子（例えば、副刺激分子（例えば、Ｂ７−１分子またはＢ７−２分子）もしくは他のこのような免疫刺激性分子（例えば、サイトカイン）またはワクチンの腫瘍細胞を患者の特定の部位にホーミングさせる分子（例えば、ワクチンの改変された腫瘍細胞を原発性腫瘍の部位にホーミングさせる分子）（例えば、ホーミングレセプターもしくは特定の細胞型に特異的な抗体））を同時発現するように操作され得る。
【００８４】
好ましくは、被験体に本発明のワクチンを投与することにより、以下のうちの１以上が生じ得る：被験体における腫瘍細胞に対する免疫応答の増大、被験体における（特に腫瘍部位における）脈管形成の減少、腫瘍部位に対する被験体の免疫細胞の走化性増大、被験体の細胞上でのＳＤＦレセプター発現の増大、被験体における腫瘍再増殖の再発の減少、被験体における腫瘍後退の促進。
【００８５】
種々の手段が、本発明の組成物を投与する際に治療応答をモニターするために用いられ得る。例えば、腫瘍細胞に対する免疫応答の測定において、当業者は、例えば、腫瘍細胞に対する特異的抗体応答、Ｂ細胞活性化レベル、腫瘍細胞に対するＴ細胞免疫応答（例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞応答（例えば、サイトカインの生成もしくは増殖）またはＣＤ８＋  Ｔ細胞応答（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞応答））、ならびに／または腫瘍領域への免疫細胞の走化性を測定し得る。
【００８６】
１つの実施形態において、被験体の免疫応答に対する本発明の腫瘍細胞ワクチンの効果は、被験体の免疫応答（例えば、特定の腫瘍細胞抗原に対する免疫応答または腫瘍細胞に対する免疫応答）をアッセイすることにより測定され得る。これは、標準的な技術を用いて、例えば、被験体における腫瘍細胞を認識する抗体のレベルを測定することにより、または被験体から得られたＴ細胞が腫瘍細胞に対して応答する能力を測定することにより（例えば、腫瘍細胞の溶解を引き起こすことにより、もしくはインビトロで腫瘍細胞の存在下で被験体由来のＴ細胞の増殖を測定することにより）達成され得る。
【００８７】
１つの実施形態において、腫瘍細胞に対する１次応答は、例えば、初代培養物における腫瘍細胞に対する免疫応答を測定することにより測定され得る。別の実施形態において、腫瘍細胞に対する２次免疫応答は、例えば、初代培養を行う（ここで、被験体の免疫細胞は腫瘍細胞に曝され、休止され、次いで腫瘍細胞に再び曝される）ことにより測定され得る。
【００８８】
好ましくは、本発明の改変された腫瘍細胞ワクチンを用いて処置された被験体において腫瘍細胞に対する免疫応答を測定する場合、改変していない腫瘍細胞が、本明細書中に記載のアッセイを行う際に用いられる。
【００８９】
１つの実施形態において、本発明のワクチンを用いて処置された被験体における記憶Ｔ細胞のレベルは、例えば、記憶Ｔ細胞により優先的に発現される細胞表面マーカーについてアッセイすることにより測定され得る。なお別の実施形態において、腫瘍細胞特異的記憶Ｔ細胞のレベルがアッセイされ得、好ましくは、これらのレベルは、本発明のワクチンを受けた被験体において増大する。
【００９０】
さらに、または代替的に、増大した腫瘍後退または腫瘍細胞増殖の休止もしくは縮小の増大はまた、腫瘍細胞に対する免疫応答の増強の指標として測定され得る。
【００９１】
別の実施形態において、脈管形成は、被験体において測定されて、未処置被験体と比較して（または処置前の被験体と比較して）、脈管形成の減少が生じたか否かが決定され得る。脈管形成が、当該分野で公知の技術を用いて、例えば、内皮細胞の存在の指標であるマーカーの存在について測定することにより測定され得る。
【００９２】
別の実施形態において、原発性腫瘍部位でのＴ細胞の存在の増加は、被験体における免疫応答の増強の指標として使用され得る。ＳＤＦ−１は、Ｔ細胞を化学誘引することが公知であり、そして本発明の改変された腫瘍細胞は、ＳＤＦ−１を産生する。さらに、野生型腫瘍細胞（例えば、未改変腫瘍細胞）は、ＳＤＦ−１レセプター発現を（ＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルで）下方調節し得、この下方調節は、ＳＤＦ−１産生細胞のワクチンを受けている被験体において生じない。従って、１つの実施形態において、本発明のワクチンを受けている被験体は、このワクチンでの被験体の処置前に見られたレベルを上回る、細胞上のケモカインレセプター（例えば、ＳＤＦ−１および／またはＲａｎｔｅｓ）のレベルの増加を提示する。従って、インビボでの腫瘍部位におけるＴ細胞の存在の増強は、腫瘍細胞応答の増強の指標として使用され得る。Ｔ細胞の存在は、種々の技術のいずれかを使用して測定され得、例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８）について試験することによって、生検サンプルにおいて（例えば、組織学またはＦＡＣＳによって）検出され得る。別の実施形態において、ケモカインレセプター（例えば、ＳＤＦ−１およびＲａｎｔｅｓ）のレベルは、本発明のワクチンを受けている被験体の細胞上で増強される。このようなレセプターのレベルは、標準的な技術（例えば、ＰＣＲ、ノーザンブロット、ウエスタンブロットまたはＦＡＣＳ分析）を使用して試験され得る。
【００９３】
さらに、腫瘍細胞に対するＴ細胞の走化性の増強は、インビトロで測定され得る。これは、標準的な技術（例えば、スライド上またはＢｏｙｄｅｎチャンバを使用して、例えば、被験体から得られたＴ細胞の腫瘍細胞への走化性の増強を示すことによって）行われ得る。
【００９４】
なお別の実施形態において、本発明のワクチンの投与の際に得られる治療応答は、腫瘍増殖の減弱および／または腫瘍退行をモニターすることによって評価され得る。改変腫瘍細胞ワクチンでの処置に応答する腫瘍増殖の減弱または腫瘍退行は、当業者に公知のいくつかの終点（例えば、腫瘍の数、腫瘍の重量またはサイズ、あるいは転移の減少／予防を含む）を使用してモニターされ得る。
【００９５】
さらに、またはあるいは、被験体が再発を生じないことが、本発明のワクチンが腫瘍細胞に対する免疫応答を増強したことを示すために使用され得る。例えば、特定の型の癌を有する個体は、特定の統計学的割合で再発に苦しみ得る。例えば、再発率または再発する時間量の減少もまた、被験体が腫瘍細胞に対する免疫細胞の増強を有することの指標として使用され得る。
【００９６】
本発明の改変腫瘍細胞はまた、例えば、被験体における記憶応答を誘導することによって、腫瘍の転移性の伝播の予防または処置、あるいは腫瘍の再発の予防または処置において有用である。従って、１つの実施形態において、本発明の腫瘍細胞ワクチンによって誘導される免疫応答の増強は、改変されていない腫瘍細胞でのその後のチャレンジに耐える被験体の能力によって証明される（例えば、ワクチン接種されていない被験体より、腫瘍チャレンジに対するより大きい耐性によって示される）。さらに、またはあるいは、本発明の腫瘍ワクチンで処置された被験体が腫瘍細胞に対する強力なインビトロ免疫応答（例えば、抗腫瘍細胞傷害性応答）を上昇させる能力を使用して、抗腫瘍応答の増強を実証し得る。
【００９７】
これらの記載された方法は、決して全てを包括するものではなく、特定の適用に適合させるためのさらなる方法が、当業者に明らかである。
【００９８】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示され、これらの実施例は、限定するものとして解釈されるべきでない。本出願を通して引用される全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【００９９】
（実施例）
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、本発明の範囲を限定するものとしていかようにも解釈されるべきでない。
【０１００】
（実施例Ｉ）
マウス  −  雌性ＳＪＬ／Ｊマウス、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＢａｌｂ／ｃマウス、雌性Ｃ５７ＢＬ／６  ｓｃｉｄマウス、および雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｂ細胞欠損（ｌｇｈ−６ｔｍｌＣｇｍに対してホモ接合性）マウス（６〜８週齢）を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入し、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのガイドラインに従って、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物施設で維持した。
【０１０１】
腫瘍モデル  −  以下の腫瘍モデルをこれらの研究において使用した：放射線誘導性ＳＪＬ／Ｊ急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）モデル、Ｃ１５９８急性骨髄性白血病モデル、Ｂ１６Ｆ１黒色腫モデル、およびＭＢ４９膀胱癌。ＡＭＬモデルにおいて、瀕死状態の白血病マウス（＞９５％白血病細胞）から単離された凍結脾臓単核細胞を使用した。Ｂ１６Ｆ１細胞株およびＣ１４９８細胞株を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。全ての腫瘍細胞株を、１０％  ウシ胎仔血清、２％  グルタミンおよび１％  ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するダルベッコ改変イーグル培地中３７℃で、インビトロにて維持した。腫瘍の確立のために、１０５個のＡＭＬ細胞または２×１０５個のＣ１４９８細胞を、それぞれ、ＳＪＬマウスまたはＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に静脈内（ＩＶ）注射し、そして１０５個のＢ１６Ｆ１細胞またはＭＢ４９細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に皮内（ＩＤ）注射した。腫瘍保有動物は、腫瘍接種後２０〜３５日以内に死亡したか（ＡＭＬ／Ｃ１４９８）、または腫瘍が約４００〜６００ｍｍ２のサイズに達した場合に屠殺した（Ｂ１６Ｆ１／ＭＢ４９）。
【０１０２】
腫瘍細胞によるｈＳＤＦ−１βの発現  −  標準的な滅菌組織培養技術を使用し、そして種々の商業供給源からの培地および試薬を使用して、操作を行った。腫瘍細胞によるｈＳＤＦ−１βの発現について、ｈＳＤＦ−１βをコードする複製欠損レトロウイルスを分泌するＰＴＹ６７パッケージング細胞株を使用した。元のＰＥ５０１−ＳＤＦ−１βパッケージング細胞株を、ｈＳＤＦ−１β  ｃＤＮＡをレトロウイルスベクターに挿入し、そしてこのベクターをエコトロピックパッケージング細胞株ＰＥ５０１に移入することによって、開発した。次いで、ＰＥ５０１−ＳＤＦ−１βパッケージング細胞は、ヒトＳＤＦ−１βをコードするマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）を分泌した。ＰＥ５０１−ＳＤＦ−１βパッケージング細胞は、培養物中で良好に増殖しなかった。従って、両栄養性ＰＴ６７細胞（ＣｌｏｎｅｔｅｃｈＴＭ）に、ＰＥ５０１−ＳＤＦ−１β細胞株由来の上清を感染させ、そしてＰＴ６７−ＳＤＦ−１βパッケージング細胞を開発した。これらのＰＴ６７−ＳＤＦ−１βプロデューサークローンは、ＰＥ５０１−ＳＤＦ−１βクローンよりも容易に増殖した。このレトロウイルスベクター骨格は、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）のＬＴＲを利用し、そして脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の制御下に選択可能なｎｅｏ遺伝子を含んだ。偽ウイルスを分泌するプロデューサー細胞を、コントロール細胞の感染について使用した。いくつかのインビボ腫瘍原生実験において、コントロール細胞の代わりに野生型（ｗｔ）を使用した。パッケージング細胞を、１０％  ウシ胎仔血清、２％  グルタミン、１％  ペニシリン−ストレプトマイシンおよび１ｍｇ／ｍＬ  ネオマイシン（Ｇ４１８）を含有するダルベッコ改変イーグル培地中３７℃で維持した。ＳＤＦ−１βの発現について、腫瘍細胞（５〜７×１０５／ｍＬ）を、８μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で４〜６時間、ウイルス（ＰＴ６７−ＳＤＦ−１β）上清に、２回曝露した。腫瘍細胞の感染を、以下のように行った：野生型腫瘍細胞（５〜７×１０５／ｍＬ）を、８μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で４〜６時間、ウイルス上清に、２〜３回曝露した。示された数の、形質導入された、Ｇ４１８選択された腫瘍細胞（ＡＭＬ  ＳＪＬモデル（感染ＡＭＬ細胞が選択されなかった）を除く）を、インビボ注射に使用した。
【０１０３】
ヒトＳＤＦ−１β酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）  −  Ｐ６７ＳＤＦパッケージング細胞および腫瘍細胞（１０６細胞／ｍＬ）を、２４時間培養し、そして培養物上清中のｈＳＤＦ−１βのレベルを、サンドイッチＥＬＩＳＡによって決定した。アッセイの感度は、５ｐｇ／ｍＬである。
【０１０４】
５１Ｃ放出ＣＴＬアッセイ  −  ＳＤＦ−Ｂ１６Ｆ１腫瘍接種／拒絶後１１週のマウスから、脾臓を収集し、単細胞懸濁物を調製した。脾細胞（５×１０６）を、２４ウェル組織培養プレートの１ウェルあたり２ｍＬの完全ＲＰＭＩ中で、照射（７３３５ｃＧｙ）Ｂ１６Ｆ１（１×１０５）と共に共培養した。６日後、脾細胞を収集し、そして細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）アッセイにおいてエフェクター細胞として使用した。Ｂ１６Ｆ１（Ｈ−２ｄ）またはコントロール同種異系ＴＳＡ（Ｈ−２ｂ）腫瘍細胞（２×１０６）を、２００μＣｉの５１Ｃｒで９０分間標識し、２回洗浄し、そしてＣＴＬアッセイにおける標的（５０００／ウェル）として使用した。標準的な４−ｈ  ＣＴＬアッセイを、種々のエフェクター対標的（Ｅ／Ｔ）比で設定した。
【０１０５】
インビボでのＴ細胞サブセット枯渇  −  モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＧＫ１．５（ラット抗マウスＣＤ４）および５３−６．７（ラット抗マウスＣＤ８）を、インビボでのＴ細胞サブセット枯渇に使用した。これらのｍＡｂを、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．にて標準的技術を使用して作製しそして精製した。インビボ枯渇実験のために、ｍＡｂ（０．５ｍｇ／注射）を、マウスに３日連続して腹腔内（ＩＰ）注射した。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞の枯渇を、脾細胞のフローサイトメトリー分析によって、最後の注射の３日後に検証した。この分析は、適切なサブセットの＞９５％の枯渇が他のサブセットの正常レベルに達したことを示した（データは示さず）。最後の注射の３日後に、これらのマウスに、ＳＤＦ−Ｃ１４９８生細胞を静脈内（ＩＶ）注射し、そして抗体注射を、５日毎に３週間にわたって継続した。
【０１０６】
免疫組織化学  −  Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１０６個の野生型ＳＤＦ−Ｂ１６Ｆ１生細胞をＩＤ注射した。次いで、組織を、腫瘍接種後３日目、７日目および１４日目（１０匹のマウス／時点／細胞型）に回収し、そして腫瘍細胞および免疫浸潤（ｉｍｍｕｎｅ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ）（ＩＣＩ）を評価した。組織を二分し、そして一方を、液体窒素冷却イソペンタン法によってＯ．Ｃ．Ｔ．にて凍結保存し、そして他方を、１０％中性緩衝化ホルマリンにて固定した。免疫学的評価のために、パラフィン包埋組織からの５μｍ切片を、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＋Ｅ）を用いて染色した。ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）、ＣＤ８ａ（５３−６．７）およびＧｒ−１（ＲＢ６−８Ｃ５０）免疫組織化学のために、凍結保存したサンプルを、キャピラリーギャップマイクロスライド上で凍結切片化し、そして−２０℃での貯蔵の前にアセトンにて固定した。染色の直前に、貯蔵した凍結切片を、冷アセトンにて５分間固定し、風乾し、アビジン／ビオチンブロック（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いてブロックし、そして最後にＰＢＳにて洗浄した。パラフィン包埋組織について、プロテイナーゼＫまたはマイクロ波抗原検索のいずれかを使用した。ＣＤ４５Ｒ／Ｂ２２０（ＲＡ３−６Ｂ２，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）について、プロテイナーゼＫ（Ｓｉｇｍａ）を、抗原検索溶液として使用した。スライドを、３７℃のインキュベーター内で２５μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを用いて１５分間処理した。ＣＤ３（ＣＤ３−１２；Ｓｅｒｏｔｅｃ）免疫標識のために、１０μｇ／ｍＬのＣＤ３一次抗体のインキュベーション前に、マイクロ波抗原検索技術を使用した。パラフィン切片を、脱パラフィン化し、水を用いて再水和し、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）にプレートした。個の切片を、９９℃まで５分間加熱し、そして５分間冷却した後、９９℃まで５分間再加熱し、続いて蒸留水中でリンスする前にさらに２分間冷却した。これらの切片を、アセンブリする前にリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中で２分間洗浄し、自動化免疫染色機（ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｅｒ）（Ｔｅｃｈ  Ｍａｔｅ  ５００，Ｂｅｎｔａｎａ）にて免疫標識した。一連の切片を、ネガティブコントロールとしてラット免疫グロブリンを用いて染色した。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ間接法を、色素原としてＤＡＢ（３，３’ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド）を用いて使用した。
【０１０７】
増殖アッセイ  −  脾臓を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスより回収し、単一細胞懸濁液を調製した。Ｔ細胞富化のために、マウスＴ細胞富化カラム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造業者の指示書に従って使用した。カラム溶出後のＣＤ３＋Ｔ細胞の純度は、８５〜８７％であった。脾細胞またはＴ細胞（２×１０５細胞／ウェル）を、準最適（ｓｕｂ−ｏｐｔｉｍａｌ）用量（５００ｎｇ／ｍＬ）の抗ＣＤ３ｍＡｂ  １４５−２Ｃ１１（２００ｎｇ／ｍＬのｒｈＳＤＦ−１β［ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ］を伴ってかまたは伴わずに）および漸増数の照射された（４０００ｃＧｙ）ＳＤＦ−１β腫瘍またはコントロール腫瘍細胞とともに、平底９６ウェルプレートにて培養した。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍＬ）抗体を用いる同時刺激に対する応答を、ポジティブコントロールとして使用した。応答（ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ）細胞の増殖を、インキュベーションの最後の６〜９時間にわたる３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル）の取り込みによって、７２時間後に測定した。
【０１０８】
統計的分析  −  個々の実験は、１つの処置群当り１０匹のマウスからなる。統計的生存分析を、標準的Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘログランク（ｌｏｇｒａｎｋ）試験を使用して実施した。増殖の結果は、平均±ＳＤであった。種々の群間での統計的有意性を、スチューデントｔ検定を使用して分析した。
【０１０９】
（実施例ＩＩ）
本実施例は、増加量のｈＳＤＦ−１βを分泌および発現する腫瘍細胞の改変を例示する。
【０１１０】
腫瘍細胞を、ＰＴ６７−ｈＳＤＦ−１βまたはＰＴ６７−モックのレトロウイルス上清を用いて、実施例Ｉに記載したように形質導入した。細胞株を、２４時間培養し、上清を回収して、ｈＳＤＦ−１β  ＥＬＩＳＡによって決定したようにｈＳＤＦ−１βレベルについてアッセイした（図１ａ）。ＳＤＦ−１β腫瘍細胞のインビトロでの増殖速度特性は、コントロール（モック形質導入）細胞の増殖速度と同様であった（データは示さず）。免疫染色およびフローサイトメトリー分析は、コントロール細胞と比較して増強された、ＳＤＦ−１β腫瘍細胞によるＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）の発現を示したが、ＳＤＦ−１β腫瘍細胞およびコントロール細胞を比較した場合、ＣＤ８０、ＣＤ８６またはＭＨＣクラスＩの発現において差異はなかった（データは示さず）。ＭＢ４９細胞およびＢ１６Ｆ１細胞によるＳＤＦ−１の発現は、長期細胞質投影の形態での明らかな形態的な変化、およびプラスチックに対するよりよい接着を生じさせた（図１ｂ）。
【０１１１】
（実施例ＩＩＩ）
本実施例は、インビボ全身性血液学的悪性腫瘍の４つのモデルにおける、ＳＤＦ−１βの抗腫瘍活性を例示する。インビボ腫瘍形成研究のために、（野生型もしくはモック感染させた）コントロール生細胞、またはｈＳＤＦ−１β形質導入細胞を、マウスに静脈内注射し、これらの臨床的結果を、引き続き評価した。
【０１１２】
Ｃ１４９８急性骨髄性白血病細胞を、実施例Ｉに記載されるＰＴ６７−ＳＤＦ−１β産生細胞株からの上清を用いて形質導入して、ＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８細胞を生成した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、２×１０５個のコントロール細胞（Ｃ１４９８細胞）、２×１０５個のＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８細胞または５×１０５個のＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８細胞を静脈内注射し、そして生存パーセントを図２に示した時点で測定した（腫瘍接種後の週）。２×１０５個のＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８細胞を注射した動物の約７０〜９０％は、１３週間後に生存し、５×１０５個のＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８細胞を注射した動物のほとんど全てが、１３週間後に生存した。
【０１１３】
ＳＤＦ−Ｃ１４９８生細胞を拒絶したＣ５７ＢＬ／６マウスを、野生型Ｃ１４９８生細胞を用いて３または４ヵ月後にチャレンジした。野生型Ｃ１４９８生細胞を注射した未処理のＣ５７ＢＬ／６マウスを、コントロールとして使用した。野生型Ｃ１４９８生細胞を用いて３ヵ月後にチャレンジしたマウスの少なくとも４０％が、チャレンジ後少なくとも５０日目に生存していた。野生型Ｃ１４９８生細胞を用いて４ヵ月後にチャレンジしたマウスの少なくとも６０％が、チャレンジ後少なくとも５０日目に生存していた（データは示さず）。
【０１１４】
本実験を反復し、そしていくつかの他の腫瘍モデルを含めるように拡張した。これらの研究において、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群当たり１０匹のマウス）に、示した数のＳＤＦ−Ｃ１４９８生細胞またはコントロールＣ１４９８細胞を静脈内（ＩＶ）注射した。いくつかの実験において、２×１０５個のＳＤＦ−Ｃ１４９８生細胞を用いるＣ５７ＢＬ／６マウスの注射は、９０％〜１００％の腫瘍拒絶を生じた。しかし、１×１０６個のＳＤＦ−Ｃ１４９８を注射したマウス（黒丸）は、腫瘍増殖が遅延された（Ｐ＜０．０１対コントロール（黒四角）マウス）が、ついには致死的白血病を発症した；１０×１０５個のＳＤＦ−Ｃ１４９８細胞を注射したマウス（黒三角）の９０％は、これらの白血病を拒絶した（Ｐ＜０．０００１対コントロールマウス）（図３ａ）。ついには、これらのマウスの全てが、致死的白血病を発症した（図３ａ）。このグラフは、４回の独立した実験の代表例である。ＳＪＬ−ＡＭＬモデルにおいて（図３ｂ）、ＳＪＬ／Ｊマウス（１群当たり１０匹のマウス）に、１０５個の野生型ＡＭＬ（黒四角）細胞またはＳＤＦ−ＡＭＬ（黒三角）細胞を静脈内（ＩＶ）注射した。これらのマウスの全てのマウス（１００％）は、白血病増殖において顕著に遅延し、これらのマウスの６０％は、白血病細胞を拒絶したが、コントロール細胞の全てが、致死的白血病を発症した（Ｐ＜０．００５）（図３ｂ）。このグラフは、２回の独立した実験の代表例である。Ｂ１６Ｆ１モデルにおいて（図３ｃ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群当たり１０匹のマウス）に、コントロールＢ１６Ｆ１（黒四角）細胞またはＳＤＦ−Ｂ１６Ｆ１（黒三角）細胞を脇腹に皮内（ＩＤ）注射した。コントロールマウスの全てが、致死的腫瘍を発症したが、ＳＤＦ−Ｂ１６Ｆ１細胞を注射したマウスの５０％〜６０％は、遅延した腫瘍増殖を再現可能に示したが、最終的には致死的腫瘍を発症した。このモデルにおいて、いくつかのマウス（１０％〜２０％）は、最終的に小さな触知可能な腫瘍を有したが、これらの腫瘍は進行せず、そして最終的には退行した。よって、図３ｃに示されるように、ＳＤＦ−Ｂ１６Ｆ１細胞を注射したマウスの５０％は、長期間、腫瘍なしで生存した（Ｐ＜０．００５）。このグラフは、３回の独立した実験の代表例である。ＭＢ４９モデルにおいて（図３ｄ）、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群当たり１０匹のマウス）に、コントロールＭＢ４９（黒四角）細胞またはＳＤＦ−１β−ＭＢ４９（黒三角）細胞を脇腹にＩＤ注射した。形質導入されたＭＢ４９細胞によって分泌されるＳＤＦ−１βレベルは、ＥＬＩＳＡの感度未満であったが、ＳＤＦ−１β−ＭＢ４９細胞の腫瘍形成は、コントロール細胞よりも再現可能に低かった（Ｐ＜０．００５）（図３ｄ）。このグラフは、２回の独立した実験の代表例である。全ての実験において、これらの腫瘍を拒絶したマウスは、毒性の臨床的徴候を何ら発症せず、そして腫瘍接種後、数週間または数ヶ月にわたって上記および腫瘍なしであり続けた。
【０１１５】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞を、実施例１に記載されるＰＴ６７−ＳＤＦ−１β産生細胞株からの上清を用いて形質導入して、ＳＤＦ−１β−ＡＭＬ細胞を生成した。ＳＪＬマウスに、１×１０５個のＡＭＬ細胞または１×１０５個のＳＤＦ−１β−ＡＭＬ細胞をＩＶ注射し、そして生存パーセントを、図４に示される時点で測定した（腫瘍接種後の週）。２×１０５個のＳＤＦ−１β−ＡＭＬ細胞を注射した動物の全てが７週間後に生存し、そして２×１０５個のＳＤＦ−１β−ＡＭＬ細胞を注射した動物の約６０％が、１３週間後に生存していた。
【０１１６】
ＴＳＡ細胞（哺乳動物腺癌細胞）を、実施例Ｉに記載されるＰＴ６７−ＳＤＦ−１β産生細胞株の上清を用いて形質導入して、ＳＤＦ−１β−ＴＳＡ細胞を生成した。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、２×１０５個のＴＳＡ細胞または２×１０５個のＳＤＦ−１β−ＴＳＡ細胞を皮下注射し、そして生存パーセントを、図４に示される時点で測定した（腫瘍接種後の週）。２×１０５個のＳＤＦ−１β−ＴＳＡ細胞を注射した動物の全てが１１日後に生存し、そして２×１０５個のＳＤＦ−１β−ＴＳＡ細胞を注射した動物の約４０％が、５１日後に生存していた。
【０１１７】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１×１０５個の野生型ＭＢ４９細胞（膀胱癌細胞）または１×１０５個のＳＤＦ−１β−ＭＢ４９細胞を皮下注射した。ＳＤＦ−１β−ＭＢ４９によって分泌されたＳＤＦ−１βのレベルは、利用したＳＤＦ−１βのＥＬＩＳＡの感度よりも低かった。小さな腫瘍の塊が、ＳＤＦ−１β−ＭＢ４９を注射したマウスにおいて発達したが、ＳＤＦ−１β−ＭＢ４９細胞を注射したマウスの少なくとも３０％には、注射の少なくとも８０日後は腫瘍が無かった。対照的に、野生型ＭＢ４９細胞が注射された全てのマウスは、注射の３０日後まで腫瘍を有した（図５Ａ〜Ｂ）。
【０１１８】
（実施例ＩＶ）
この実施例は、照射されたＳＤＦ−１β腫瘍細胞が、全身免疫および治療免疫の誘導を支持することを示す。
【０１１９】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０匹のマウス／グループ）を、照射した１０５個のＳＤＦ−Ｂ１６Ｆ１細胞（白丸）またはコントロールのＢ１６Ｆ１細胞（黒丸）を用いて一方の側腹部の皮内にワクチン接種し、そして１週間後に生きた１０５個の野生型Ｂ１６Ｆ１細胞を用いて他方の測腹部にチャレンジした。ＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１細胞を用いたワクチン接種は、このマウスの７０％の防御、および野生型腫瘍のチャレンジに対して耐性を生じ（コントロール野生型ワクチン対してＰ＝０．０１８）；野生型Ｂ１６Ｆ１のみを用いたワクチン接種は、このマウスの１０％のみを防御した（図６ａ）。このグラフは、２回の独立した実験の代表例である。
【０１２０】
別の実験において、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０匹のマウス／グループ）に、生きた２×１０５個の野生型Ｃ１４９８細胞を静脈内注射した。３日目に、これらのマウスを、照射した１０５個のコントロール（黒四角）またはＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８細胞（黒丸）で静脈内免疫した。マウスの３番目のグループを、１０５個のＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８細胞（白丸）で２回免疫した（生きた野生型腫瘍の接種後３日目および８日目）。３日目の免疫で、この白血病のマウスの４０％が治癒し（コントロールに対してＰ＝０．０９）、そして３日目および８日目の免疫で、白血病のマウスの３０％が治癒した（コントロールに対してＰ＝０．４９）（図６ｂ）。これらの結果は、２回の実験で再現された。
【０１２１】
（実施例Ｖ）
この実施例は、ＳＤＦ−１βが形質導入された腫瘍細胞が、抗腫瘍免疫応答および腫瘍拒絶を起こすメカニズムを解明する。
【０１２２】
本実験において、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０匹のマウス／グループ）を、生きたＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８細胞の拒絶反応の３ヶ月後（黒丸）または４ヶ月後（黒三角）に、１０５個の野生型Ｃ１４９８細胞を用いて静脈内チャレンジした。未刺激のＣ５７ＢＬ／６マウスを、コントロール（黒四角）として使用した。両方のグループは、コントロール動物と比較した場合、腫瘍の増殖が遅れ、そしてＳＤＦ−１βを分泌する腫瘍に拒絶反応を示したマウスの４０％（３ヶ月）および５０％（４ヶ月）は、この腫瘍チャレンジに抵抗する十分な記憶応答を生じた（コントロールマウスに対してＰ＜０．０００１）（図７ａ）。
【０１２３】
さらなる実験において、生きたＳＤＦ−Ｂ１６Ｆ１細胞に拒絶反応を示したＣ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞を、野生型Ｂ１６Ｆ１細胞またはコントロールＴＳＡ細胞に対するインビトロでのＣＴＬ活性について、実施例１において記載したような５１ＣｒリリースＣＴＬアッセイを利用して、３ヶ月後にアッセイした。具体的に、脾臓をＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１腫瘍の接種／拒絶反応の１１週間後に、マウスから収集し、そして脾細胞を、照射したＢ１６Ｆ１（Ｈ−２ｄ）腫瘍細胞または標準的な４時間のＣＴＬアッセイにおいて標的として使用されるコントロールの同種異系ＴＳＡ（Ｈ−２ｂ）腫瘍細胞とともに培養した。ＣＴＬ活性を、コントロールの未刺激のマウス由来の脾細胞ではなく、ＳＤＦ−Ｂ１６Ｆ１細胞に拒絶反応を示すＣ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞において検出した（図７ｂ）。しかし、生きたＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１細胞に拒絶反応を示すＣ５７ＢＬ／６マウス由来の脾細胞は、コントロールのＴＳＡ細胞に対してアッセイした場合、細胞傷害性（ｃｙｔｏｘｉｃ）活性を有さなかった。これらの結果は、２回の独立した実験の代表例である。
【０１２４】
別の実験において、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、ＳＤＦ−１β媒介腫瘍拒絶反応に対して独立していることが示された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、実施例１に記載されるように、ＣＤ４＋（黒丸）Ｔ細胞またはＣＤ８＋（黒三角）Ｔ細胞を枯渇させた。コントロールマウスを、ＰＢＳ（黒四角）で処置した。この結果を、ＰＢＳで処置したマウスの１００％および抗ＣＤ８＋ｍＡｂで処置したマウスの８０％が、ＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８細胞に拒絶反応を示し、そして白血病の任意の徴候を発症しなかった（図７ｃ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞の枯渇は、ＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８の拒絶反応に導く免疫機構を完全に抑止し、このマウスの１００％が、致命的な白血病を発症した（コントロールＰＢＳに対してＰ＜０．０００１）。
【０１２５】
ＳＤＦ−１βから誘導される腫瘍免疫の機構を調査するために、ｓｃｉｄマウスに、ＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１細胞を注射した。コントロールとして、正常なマウスに、野生型Ｂ１６Ｆ１細胞またはＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１細胞のいずれかを注射した。この生存率を、腫瘍の接種後の表示される日に測定した。ＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１細胞が注射された正常なマウスの少なくとも４０％が、接種後、少なくとも７３日間生存したが、野生型Ｂ１６Ｆ１細胞が接種された正常なマウスは、２１日後に全滅し、ＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１細胞が注射されたｓｃｉｄマウスは、２５日後に全滅した（図８ａ）。これらのデータは、ＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１細胞の拒絶反応が、Ｔ細胞に依存することを示す。
【０１２６】
別の実験において、免疫欠損マウスのインビボにおけるＳＤＦ−１β腫瘍の増殖パターンを評価した。具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６ｓｃｉｄマウス（１０匹のマウス／グループ）に、１０５個のコントロールＣ１４９８（黒四角）細胞またはＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８（Ｘ）細胞を静脈内注射した。未刺激のマウスに、１０５個のコントロールＣ１４９８（黒丸）細胞またはＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８（黒三角）細胞を注射し、そしてコントロールとして使用した。両方の腫瘍モデルにおいて、ＳＤＦ−１βを形質導入した細胞およびコントロール細胞を、全てのｓｃｉｄ動物において増殖させた（図８ｂ）。これらの結果は、２つの別々の実験の代表例である。さらに、ＳＤＦ−１βは元々、Ｂ細胞の増殖因子として記載されたことから、Ｂ細胞欠乏マウスにおけるＳＤＦ−１β腫瘍細胞の増殖もまた、試験した。結果は、コントロールまたはＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１細胞のいずれかを注射したＢ細胞欠失マウスの７０％〜８０％が、これらの腫瘍に拒絶反応を示すことを実証した（データは示さず）。
【０１２７】
腫瘍の拒絶反応に関与する免疫細胞をさらに特徴づけするために、実施例１に記載されるように、野生型Ｂ１６Ｆ１およびＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１のインビボ増殖の間の組織学的研究／免疫組織化学的研究を、実施した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、野生型Ｂ１６Ｆ１細胞またはＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１細胞および試験のために収集された組織を皮下注射した。図９に示されるように、顕著な免疫細胞（ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８のＴ細胞）の浸潤が、ＳＤＦ−１β腫瘍中で観察されたが、野生型腫瘍では観察されなかった（最初の拡大率１０×）。他の細胞型（Ｂ細胞、好中球、マクロファージ）における目立った差異は、同定することができなかった（データは示さず）。１４日目に、全てのコントロール動物と、ＳＤＦ−１β腫瘍を有する２、３匹の動物は、明確な腫瘍を有した。組織学的に、野生型動物は、ＩＣＩを有さない多数の腫瘍細胞からなる非常に大きな腫瘍を有したが、ほとんどのＳＤＦ−１β動物は、散乱された腫瘍細胞のみ、または小細胞培養物および有意なＩＣＩを有した（データは示さず）。興味深いことには、炎症性細胞（マクロファージおよび好中球）を、コントロールマウスにおいて見出された少数の細胞とともに、両方のグループにおいて検出した。
【０１２８】
次に、免疫細胞のＳＤＦ−１βレセプターにおけるＳＤＦ−１βの発現の影響を決定するための実験を行った。脾臓を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスから収集し、そして単一細胞の懸濁液を調製した。脾細胞（２×１０６細胞／ｍＬ）を、培地のみ、または野生型Ｂ１６Ｆ１腫瘍細胞もしくはＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１腫瘍細胞とともに培養した（脾細胞：腫瘍細胞の比は３：１）。２４時間、４８時間、および７２時間の時点で、脾細胞を収集し、冷ＰＢＳを用いて洗浄し、そしてＣＤ３およびＣＸＣＲ４（ＳＤＦ−１βレセプター）の発現について染色した。以下の抗体を、フローサイトメトリーの研究のために使用した：ＦＩＴＣ結合体化モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）ＣＤ３ｅ（１４５−２Ｃ１１）（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）およびヒトＳＤＦ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）。このＳＤＦ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃタンパク質は、ヒトＩｇＧ４である。染色後、この細胞を、１％パラホルムアルデヒドに固定し、そしてＦＡＣＳｃａｎＴＭフローサイトメトリーで分析した（図１０）。これらのデータは、ＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１細胞が、マウスの脾細胞上でのＣＸＣＲ４の発現を回復させ得ることを実証する。
【０１２９】
最後に、Ｃ１４９８モデルおよびＢ１６Ｆ１モデルにおける、ＳＤＦ細胞およびコントロール細胞のインビトロでのＴ細胞同時刺激活性を比較した。Ｃ５７ＢＬ／６脾細胞または富化Ｔ細胞を、実施例１に記載されるように示されたスティミュレーター／リスポンダーの比で、照射したＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８細胞またはコントロールＣ１４９８細胞とともに同時に培養した。抗ＣＤ３（Ｓ＋αＣＤ３）および抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（Ｓ＋ＣＤ３／αＣＤ２８）に対する脾細胞の増殖応答を、コントロールとして使用した。リスポンダー細胞の増殖を、インキュベーションの最後の６〜９時間で３Ｈチミジン（１μＣｉ／ウェル）を取り込むことによって、７２時間後に測定した。図１１に示されるように、顕著な増幅応答は、Ｔ細胞または脾細胞が照射したＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８細胞とともに同時培養される場合に観察された。対照的に、増殖応答は、コントロール細胞を含む培地において、ほぼ完全に存在しなかった。しかし、コントロール培養物中の細胞を、組換えＳＤＦ−１βが補充された培地中でインキュベートした場合、Ｔ細胞の増殖が、回復した（データは示さず）。
【０１３０】
（結論）
上記の結果は、以下のことを実証する：（ｉ）ＳＤＦ−１βが形質導入された腫瘍細胞による、低用量のＳＤＦ−１βの穏やかで連続的な放出は、有効な抗腫瘍応答および腫瘍拒絶反応を生じる；（ｉｉ）長期の記憶細胞を発現する生きたＳＤＦ−１β−腫瘍細胞に以前に拒絶反応を示したマウスは、生きた野生型腫瘍細胞での再チャレンジに対して免疫性であり、そして腫瘍特異的ＣＴＬ活性を有する；（ｉｉｉ）照射したＳＤＦ−１βが形質導入された腫瘍細胞を一方の側腹部に以前に免疫したマウスは、生きた野生型腫瘍細胞の他方の側腹部での接種に対して防御される；（ｉｖ）ＳＤＦ−１β−腫瘍細胞によるＳＤＦ−１βの分泌が、野生型腫瘍細胞によって媒介される不可逆的なＣＸＣＲ４下方制御を回復させ、これにより腫瘍細胞の腫瘍部位への化学誘引を増強し得ることを、インビトロでの培養物が示唆する；（ｖ）ＳＤＦ−１β−腫瘍細胞は、ｓｃｉｄマウスによって拒絶反応が示されなかった。さらに、組織学は、重い細胞が、ＳＤＦ−１βを分泌する腫瘍の塊の周りにある免疫細胞に浸潤することを示した。
【０１３１】
（均等物）
当業者は、本明細書中に記載される本発明の特定に実施形態に対する多くの均等物を認識するか、または慣用実験のみを使用して確認し得る。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【０１３２】
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１ａは、腫瘍細胞によるＳＤＦ−１βの発現を示すＥＬＩＳＡの結果を示す。図１ｂは、培養された野生型（左パネル）膀胱癌腫細胞およびＳＤＦ−１β−ＭＢ４９（右パネル）膀胱癌腫細胞の形態上の比較を示す。
【図２】
図２は、ＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８腫瘍細胞の腫瘍形成性を示す生存曲線を示す。
【図３】
図３ａは、ＳＤＦ−１β−Ｃ１４９８腫瘍細胞の腫瘍形成性を示す生存曲線を示す。図３ｂは、ＳＤＦ−１β−ＡＭＬ腫瘍細胞の腫瘍形成性を示す生存曲線を示す。図３ｃは、ＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１腫瘍細胞の腫瘍形成性を示す生存曲線を示す。図３ｄは、ＳＤＦ−１β−ＭＢ４９腫瘍細胞の腫瘍形成性を示す生存曲線を示す。
【図４】
図４は、ＳＤＦ−１β−ＡＭＬ腫瘍細胞およびＳＤＦ−１β−ＴＳＡ腫瘍細胞の腫瘍形成性を示す生存曲線を示す。
【図５】
図５は、ＳＤＦ−１β−ＭＢ４９腫瘍細胞の腫瘍形成性を示す生存曲線およびＳＤＦ−１β−ＭＢ４９により誘導される腫瘍塊の肉眼による分析を表わす。
【図６】
図６ａおよび６ｂは、照射したＳＤＦ−１β−腫瘍細胞が全身の予防免疫および治療的免疫の誘導を支持することを実証する生存曲線を示す。
【図７】
図７ａは、ＳＤＦ−１β−腫瘍拒絶反応が、抗腫瘍メモリーＴ細胞の発達を支持することを実証する生存曲線を示す。図７ｂは、ナイーブなマウスおよびＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１腫瘍保有マウスから単離された脾細胞の５１Ｃｒ放出ＣＴＬアッセイを示すグラフを示す。図７ｃは、ＣＤ４＋Ｔ細胞がＳＤＦ−１β−媒介腫瘍拒絶反応に不可欠であることを示す生存曲線を示す。
【図８】
図８ａおよび８ｂは、ｓｃｉｄマウスがＳＤＦ腫瘍を拒絶しないことを実証する生存曲線を示す。
【図９】
図９は、Ｔ細胞がＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１に浸潤するが、野生型Ｂ１６Ｆ１腫瘍には浸潤しないことを実証する免疫組織化学データを示す。
【図１０】
図１０は、ＳＤＦ−１β−Ｂ１６Ｆ１細胞が、マウス脾細胞におけるＣＸＣＲ４発現を回復することを実証するフローサイトメトリーのデータを示す。
【図１１】
図１１は、ＳＤＦ−１β−腫瘍細胞が、相乗作用性Ｔ細胞のインビトロでの増殖を有意に増大することを実証する３Ｈ−チミジン取り込みデータを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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