(57)【要約】本発明は、受容体色素、および供与体色素を有する粒子を含有する、ＦＲＥＴ原理に従って分析を実施するための試薬に関する。供与体色素および受容体色素は異なる化学相中に存在する。受容体色素は粒子に結合され、そして該粒子は該供与体色素の発光特性に影響する試験媒体に関してもしくは試験媒体の成分に本質的に不浸透性である。本発明はまた、それにより発明の試薬が測定媒体に添加される、最低１種の被検体もしくは液体の測定媒体の成分の定性的および／もしくは定量的測定方法にも関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
受容体色素、ならびに供与体色素を表す粒子を含有し、それにより供与体色素および受容体色素が異なる化学相中に配置され、受容体色素は粒子に結合したままで提供され、かつ、該粒子は該供与体色素の発光の特徴に影響を及ぼすサンプル媒体もしくはサンプル媒体の成分に本質的に不浸透性である、ＦＲＥＴ原理に従ってアッセイを実施するための試薬。
【請求項２】
無可塑ポリマーが粒子の素材として使用されることを特徴とする、請求項１記載の試薬。
【請求項３】
ポリアクリルニトリルおよびその誘導体、ＰＶＣならびに／もしくはポリ塩化ビニリデンがポリマーとして使用されることを特徴とする、請求項２記載の試薬。
【請求項４】
測定媒体への請求項１ないし３のいずれか記載の試薬の添加を含んで成る、最低１種の被検体および／もしくは液体の測定媒体の成分の定性的および／もしくは定量的測定方法。
【請求項５】
それがサンプルのｐＨ値の測定またはサンプル中のイオンの濃度および／もしくは活量の測定のために実施されることを特徴とする、請求項４記載の方法。
【請求項６】
それが、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋もしくはＣｌ−の濃度および／もしくは活量の測定のために実施されることを特徴とする、請求項５記載の方法。
【請求項７】
測定媒体が体液、とりわけ血液、血漿もしくは血清であることを特徴とする、請求項４ないし６のいずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、その吸収スペクトルを変えることにより測定されるべき成分に直接もしくは間接的に応答する発色団（もしくは発光団）、および測定されるべき成分に応答しない発光団を含有する、最低１種の被検体および／もしくは液体の測定媒体の成分の定性的および定量的測定の発光光学的（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ−ｏｐｔｉｃａｌ）方法に関し、ここで発光団の発光スペクトルと発色団の吸収スペクトルとの間に少なくとも部分的な重なり合いが存在し、かつ、ここで、発光団と発色団との間の非放射エネルギー伝達が該発光団に特徴的な最低１種の発光の測定可能な変化を生じさせる。その原理はいわゆるＦＲＥＴ原理として知られる。
【０００２】
本発明は、さらに、その吸収スペクトルを変えることにより測定されるべき成分に直接もしくは間接的に応答する発色団（もしくは発光団）、および測定されるべき成分に応答しない発光団を含有する、最低１種の被検体ならびに／または気体もしくは液体の測定媒体の成分の定量的測定のための試薬に関し、ここで発光団の発光スペクトルと発色団の吸収スペクトルとの間に少なくとも部分的な重なり合いが存在し、かつ、ここで、発光団と発色団との間の非放射エネルギー伝達が該発光団に特徴的な最低１種の発光の測定可能な変化を生じさせる。
【０００３】
以下において、発光団は、適する励起に際してリン光もしくは蛍光放射を発射する色素と理解される。発色団の吸収スペクトルは、測定されるべき成分により直接、もしくは測定されるべき成分の化学反応生成物により間接的にのいずれかで影響される。「化学成分の定量的測定」という用語は、濃度および活量ならびに気体分圧の測定を指し、該発光団に特徴的な最低１種の発光の値は測定される量を暗示するのに使用される。
【０００４】
ｐＨおよび陽イオン感受性の発色団（受容体（ａｃｃｅｐｔｏｒ））が発光団（供与体（ｄｏｎｏｒ））に好ましくは共有結合される方法およびセンサーは、米国特許第５，２３２，８５８号明細書から既知である。測定媒体中で測定されるべきｐＨ値および／もしくは陽イオンの濃度は、発光団の発光減衰時間から生じられる。
【０００５】
従来技術が関する限り、米国特許第５，６４８，２６９号明細書もまた挙げられるべきである。この文書は、測定される量を測定するための発光団の見かけの発光減衰時間の応用を提案する。１減衰時間成分をもつ発光団で、見かけの発光減衰時間は有効減衰時間と同一である。いくつかの減衰時間成分をもつ発光団では、見かけの減衰時間を評価することはより容易であるが、しかしながら、とりわけ、強固でない系では、増大する誤りという欠点が存在する。
【０００６】
発光減衰時間は、それぞれ位相変調もしくは時間分解発光測定技術によって得てよい。
【０００７】
類似の方法が欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−０  ２１４  ７６８号明細書から既知である。その中で、測定媒体中の測定されるべきパラメータの濃度は、測定される発光強度から暗示される。
【０００８】
供与体から受容体分子への非放射エネルギー伝達の速度は、２物質の分子の空間的近接に依存する。伝達速度ｋＴ（ｒ）は、供与体と受容体との間の空間的距離ｒに極めて応答性であり、かつ、距離の６乗で減衰し
【０００９】
【数１】
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【００１０】
これにより、ＴＤは受容体の非存在下での供与体の発光減衰時間を示し、またＲｏは特徴的なフェルスター距離を示す。後者は、エネルギー伝達の５０％効率が提供される供与体−受容体距離である。それぞれの供与体−受容体対に依存して、Ｒｏは２と９ｎｍとの間である。
【００１１】
供与体から受容体分子への非放射エネルギー伝達により、発光団の発光光学的パラメータ（発光量子効率、発光強度、発光減衰時間）の巨視的に測定可能な値は、２物質のかなりの数の分子が相互と緊密な空間的接触にもたらされる場合は、とりわけ効率的な変化を受けることができる。
【００１２】
緊密な空間的接触を得るために、米国特許第５，２３２，８５８号明細書は供与体および受容体分子の共有結合を提案している。欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−０  ２１４  ７６８号明細書においては、個々の供与体および受容体分子が、ガラスのような結合支持体の表面に共有結合される。
【００１３】
米国特許第５，２３２，８５８号明細書に記述されるところの供与体および受容体分子の共有結合は、供与体／受容体の平均の空間的距離が可能な限り一定に保たれるかもしれないという利点を有する。しかしながら、とりわけ大きな合成の努力が、所望の発光団間の共有結合、および適するｐＨもしくはイオン感受性の発色団を調製するために必要とされることが一欠点である。
【００１４】
供与体および受容体分子を結合支持体の表面に共有結合するためにもまたかなりの努力が必要とされ（欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−０  ２１４  ７６８号明細書）、これはとりわけ、境界表面現象が測定される結果の質を損なうという欠点をもたらす。
【００１５】
従って、米国特許第５，９４２，１８９号および同第６，０４６，０５５号明細書において、発光団および発色団は、測定されるべき化学成分に浸透性であるマトリックス素材中にイオン対として存在する異なる電荷のイオン物質であることが示唆される。
【００１６】
例えば金属−リガンド錯体、ある種のポルフィリンおよびランタニドにより表されるような永続する発光団（＞１００ｎｓ、好ましくは＞１μｓの発光減衰時間を有する）の使用は、一般的商業的応用に最高に重要である。それから生じられるべき発光減衰時間および／もしくは値の測定のための、提供される永続する発光、光電子配列ならびに成分（例えば平均発光減衰時間、位相角）は、位相もしくは時間分解法によってとりわけ安価な様式で決定されるかもしれない。
【００１７】
しかしながら、本出願の発明者は、上に挙げられた以前に知られた方法が、とりわけ、永続する発光団の発光が測定媒体の多数の成分により影響されるという共通の欠点をもたらすことを認識した。こうした発光団の既知の一特徴は、サンプルのＯ２含量への発光の特徴のとりわけ大きな依存性である。結果として、こうした発光団は、従ってＯ２含量を測定するためにしばしば使用される（欧州特許出願第ＥＰ−Ａ−０  ９０７  ０７４号明細書）。それらの発光団を、ＦＲＥＴ原理に基づくセンサーとともに供与体色素として使用する場合、従って、測定媒体のＯ２含量を正確に知りもしくは測定しかつ適切な補正を実施することが必要である。発光量子効率に対する影響を有するさらなる物質の例はアミンおよび水である。連続測定（モニタリング）の経過中に、発光色素は出現する一重項Ｏ２により完全にもしくは部分的に破壊されるかもしれない。従って、その過程を制限するための添加物が提案された。しかしながら、既知の有利な発光色素の一般的な一欠点は、サンプルのいずれかの成分、とりわけ水により引き起こされる化学物理的微小環境の小さな変化に対する発光の特徴の感受性である。未知のかつ／または変動する化学的もしくは生化学的組成のサンプル媒体の場合、それは測定の正確さの重大な制限につながる。例えば、医学的診断において、±５ミリｐＨの再現可能性が、血液ｐＨ測定の分野で期待される。
【００１８】
測定されるべきサンプルの成分により引き起こされる失敗に対するサセプタンスに関して、測定されるべき物質（被検体）もしくはその反応生成物を可逆的に結合する発光団（供与体）および発色団（受容体、指示薬（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ））に基づく、ＦＲＥＴ原理に基づく発光光学的測定方法を改良することが、本発明の目的である。さらに、かなりの数の受容体分子および遮蔽された供与体分子の空間的近接を得るために必要とされるとりわけ多くの化学合成段階が回避されるはずである。
【００１９】
本発明により、本目的は、発光団（供与体）および発色団（受容体）が異なる化学相中に配置されるために達成される。供与体相のマトリックス素材は、該供与体の発光の特徴に影響を及ぼすサンプル媒体の成分に本質的に不浸透性であるべきである。受容体相のマトリックス素材は、それぞれ被検体もしくはその反応生成物に対し浸透性であるべきである。
【００２０】
従って、本発明は、受容体色素、ならびに供与体色素を表す粒子を含有し、それにより供与体色素および受容体色素が異なる化学相（ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｈａｓｅ）中に配置され、受容体色素は粒子に結合したままで提供され、かつ、該粒子は、該供与体色素の発光の特徴に影響を及ぼすサンプル媒体もしくはサンプル媒体の成分に本質的に不浸透性である、ＦＲＥＴ原理に従ってアッセイを実施するための試薬に関する。
【００２１】
従って、供与体相のマトリックス素材は、分析されるべき物質中の小粒子の形態で分散されるように提供され、受容体分子は該粒子の表面に結合される。
【００２２】
それにより、発色団は、表面で官能基に吸着もしくは静電、または最も好ましくは共有結合されてよい。
【００２３】
好ましい一態様において、ポリアクリルニトリルおよびその誘導体、ＰＶＣならびに／もしくはポリ塩化ビニリデンのような無可塑ポリマーが、供与体色素を含有する粒子のための素材として使用される。
【００２４】
最低１種の被検体および／もしくは液体の測定媒体の成分の定性的および／もしくは定量的測定のための本発明の方法は、測定媒体への本発明の試薬の添加を含んで成る。
【００２５】
従って、粒子に結合されている受容体色素とともに供与体色素を含有する粒子のみが、例えば測定キュベット中の測定媒体に添加されなければならず、それに際してそれぞれの分析がそれ自体既知の様式で実施される。従って、測定媒体は同時にまた受容体相でもある。
【００２６】
好ましくは、本発明の方法は、サンプルのｐＨ値の測定、またはサンプル中のイオン、とりわけＬｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋もしくはＣｌ−の濃度および／もしくは活量の測定に使用される。
【００２７】
本発明の方法の応用のさらなる領域はいわゆる変換器に関する。その中で、発色団は被検体と直接反応しないがしかし間接的に反応する。それの例はいわゆる酵素的センサー（例えば尿素およびクレアチニンを測定するための）である。それにより、１種もしくはそれ以上の酵素が被検体と反応して、発色団と直接反応する生成物の形成に至る。
【００２８】
好ましくは、測定媒体は体液、とりわけ血液、血漿もしくは血清である。
【００２９】
本発明により使用される最も有利な発光団（供与体）は、高い発光量子効率および長い発光減衰時間（＞１００ｎｓ）を特徴とするものである。好ましい発光団は、パラジウム、ロジウム、白金、ルテニウム、オスミウム、希土類（とりわけユーロピウムおよびランタン）の陽イオン性の有機金属錯体である。これらの有機金属錯体の有機部分は、例えば、ポルフィリン、ビピリジル、フェナントロリンもしくは他の複素環化合物の群からのリガンドよりなってよい。
【００３０】
好ましいｐＨおよび陽イオン感受性の発色団（受容体）は、その光吸収が測定されるべきサンプル媒体の成分との直接もしくは間接的な化学的／物理的相互作用に際して変化することができ、かつ、その吸収スペクトルが発光団の発光スペクトルと少なくとも部分的に重なり合う、陰イオン物質である。
Ｉ）サンプルのｐＨ値の測定
従来技術によるｐＨ測定のための光センサー（Ｏ．Ｓ．Ｗｏｌｆｂｅｉｓ  “Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ”，ＣＲＣ  プレス（ＣＲＣ−Ｐｒｅｓｓ）、ボカレイトン、１９９１、Ｖｏｌ．Ｉ、第８章中、Ｍ．Ｊ．Ｐ．ＬｅｉｎｅｒとＯ．Ｓ．Ｗｏｌｆｂｅｉｓ  “Ｆｉｂｅｒ  Ｏｐｔｉｃ  ｐＨ  Ｓｅｎｓｏｒｓ”を参照されたい）は、通常、イオン透過性の、好ましくは親水性のポリマーマトリックス中に取り込まれた吸収色素（発色団）もしくは蛍光色素を含有する。サンプル媒体のｐＨ値（ｐＨ＝−ｌｏｇ（ａＨ＋））に依存して、熱力学的平衡が、それぞれ発色団もしくは蛍光団のプロトン化された形態と脱プロトン化された形態との間で確立される。光学的方法により測定可能な２つの形態の濃度比から、サンプル媒体のｐＨ値を得てよい。
反応：
【００３１】
【数２】
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【００３２】
ＡＨはプロトン化された、およびＡ−は脱プロトン化された形態のｐＨ感受性の発色団である。Ｈ＋はプロトンを示す。Ｋｄは平衡定数である。ｃは濃度を示す。
【００３３】
最初に挙げられた米国特許第５，２３２，８５８号明細書に、ｐＨ非感受性の発光団（供与体）に好ましくは共有結合されるｐＨ感受性の発色団が記述されている。発光団（Ｌ）の発光減衰時間から試験溶液のｐＨ値が得られる。
【００３４】
本発明の発光光学的ｐＨ測定のために、例えば、それぞれ受容体相に提供されるかもしくは受容体相と少なくとも直接接触する受容体色素としてｐＨ感受性の発色団が使用され、それにより、受容体相は分析されるべき媒体（測定媒体）である。
【００３５】
サンプル媒体の低いｐＨ値（ｐＨ＜＜発色団のｐＫ）の例において、発色団は完全にプロトン化された形態で存在する。脱プロトン化された発色団の吸収帯域および発光団の発光帯域の最小のスペクトルの重なり合いにより、発光団から発色団への非放射エネルギー伝達速度が最小に達する。相応して、該発光団の平均の発光減衰時間および相対発光強度の値が最大に達する。
【００３６】
サンプル媒体の高いｐＨ値（ｐＨ＞＞発色団のｐＫａ）の例において、発色団は完全に脱プロトン化された形態で存在する。脱プロトン化された発色団の吸収帯域および発光団の発光帯域の最大のスペクトルの重なり合いにより、発光団（供与体、供与体色素）から発色団（受容体、受容体色素）への非放射エネルギー伝達速度が最大に達する。相応して、該発光団の平均の発光減衰時間および相対発光強度の値が最小に達する。
【００３７】
発色団のｐＫｄ値（ｐＫｄ＝−ｌｏｇＫｄ）の±１．５ｐＨ単位の範囲のサンプル媒体のｐＨ値について、サンプル媒体のｐＨ値は、該発光団の平均の発光減衰時間もしくは相対発光強度から、十分な正確さを伴い暗示されるかもしれない。
ＩＩ）サンプル中の陽イオンおよび陰イオンの濃度および／もしくは活量の測定（Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋、Ｃｌ−）
サンプル媒体中の陽イオンの濃度および／もしくは活量を測定するための、それぞれ以前に知られている光センサーおよび光測定方法は、多様な方法に基づく。最初に挙げられたところの米国特許第５，２３２，８５８号明細書は、陽イオン非感受性の発光団に好ましくは共有結合される陽イオン感受性の発色団（発色イオノフォア（ｃｈｒｏｍｏｉｏｎｏｐｈｏｒｅ））を記述する。
【００３８】
非常に高い陽イオン濃度（ｃＹ＋ｐ＞＞発色団のＫｄ）のサンプル媒体の例において、発色団は完全に錯体形成された形態で存在する。（Ｙは測定されるべき陽イオンであり、＋ｐはその原子番号である。）非常に低い陽イオン濃度（ｃＹ＋ｐ＜＜発色団のＫｄ）のサンプル媒体の例において、発色団は遊離の錯体形成されない形態で存在する。
【００３９】
サンプル媒体の測定されるべき陽イオンの対数濃度ｌｏｇ（ｃＹ＋ｐ）が−ｌｏｇ（Ｋｄ）±１．５の範囲にある場合、サンプル媒体中の測定されるべき陽イオンの濃度は、該発光団の平均の発光減衰時間および／もしくは相対発光強度から、十分な正確さを伴い暗示されるかもしれない。
【００４０】
本発明により使用されるｐＨ感受性の発色団を下に表１に例示する：
【００４１】
【表１】
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【００４２】
加えて、一般的形態
【００４３】
【化１】
2004517316.tif 000006
【００４４】
のｐＨ感受性のトリフェニルメタン色素を使用する。相互に独立に、Ｒ１−６は、Ｈ、ハロゲン原子、ニトロ基およびアルキル基であってよい。Ｘ−は発色団を共有固定するための任意の基を示す。適する基は、例えば−（ＣＨ２）ｎ−ＳＯ３−もしくは−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯ−、−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（ｎ＝０〜１８）である。
【００４５】
一般的形態
【００４６】
【化２】
2004517316.tif 000007
【００４７】
式中、相互に独立に、Ｒ１−Ｒ４はそれぞれハロゲン原子、ニトロ基もしくはアルキル基のような置換基、および共有固定に適する基を示し、それにより、しかしながら、最低１個の−ＯＨ基が存在しなければならない
のｐＨ感受性のアゾ色素。
本発明による使用に適する陽イオン感受性の発色団：
リチウム、カリウム、ナトリウム、マグネシウムおよびカルシウムイオンの測定のために本発明により使用可能な陽イオン感受性の発色イオノフォアの例は、陰イオン性アゾ色素、スチルベン色素およびメロシアニンを包含し、それらは最低１個のイオン選択基（イオノフォア基）を含有し、かつ、最長波長を伴うその吸収帯域は少なくとも部分的に発光団の発光帯域と重なり合い、測定されるべき陽イオンとの相互作用は最長波長を伴う吸収帯域のスペクトルのシフトに至る。
【００４８】
【表２】
2004517316.tif 000008
【００４９】
使用される他の中心原子はＩｒ、Ｒｈ、Ｐｄ、ＰｔもしくはＲｅである。
較正値の決定：
較正曲線（図１）およびＯ２依存性の決定を、正弦様式で変調された励起光に関して発光の位相シフトを測定することにより実施した。永続する発光団の使用により、４５ｋＨｚの変調周波数を表す単純な測定の手配が十分である。測定の目的上、センサー円板をセンサーフォイルからパンチで切り取り、それらを二腕の光導体束の端片に結合し、そしてそれぞれの測定媒体と接触させたか、もしくは、光導体束の端片を、サンプルを含有する測定媒体中に直接浸した。正弦様式で４５ｋＨｚまで変調された５Ｖの増幅電圧で供給される青色ＬＥＤ（４７０ｎｍ）を励起光源として使用した。青色フォイルフィルターを励起光のフィルターとして使用した。励起光は光導体によってそれぞれセンサーフォイルもしくは試験液体に導いた。発射された発光を、光導体束によってフィルター（ＯＧ  ５７０ガラスフィルター（ショット（Ｓｃｈｏｔｔ））および赤色フォイルフィルターの組合せ）に導き、そしてさらに検出器（光電子増倍管、型  ハママツ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ）Ｈ５７０２）上に導いた。ＬＥＤの正弦様式で変調された分布電圧および検出器のシグナルを、ロックイン増幅器によって評価した。位相シフトφを測定シグナルとして得た。減衰時間τを、以下の式、すなわちτ＝ｔａｎ（φ）／（２πｆ）に従って、測定された位相シフトφおよび変調周波数ｆ＝４５ｋＨｚから計算した。
【００５０】
それぞれＮａＯＨもしくはＨＣｌの助けを借りて所望のｐＨ値に調節されたリン酸緩衝液を、ｐＨ試薬（図１）の測定および／もしくは較正媒体として使用した。緩衝液は、空気を用いる圧力測定学（ｔｏｎｏｍｅｔｒｉｃｓ）を使用することにより大気酸素値に調節したか、もしくはＮａ２ＳＯ３を添加することにより酸素を含まないようにした。
【００５１】
図１は、ＦＲＥＴ原理（実施例部分の節２．３に従って生じられる）に基づきかつｐＨ感受性の受容体色素を含有する光試薬の較正曲線を示し、供与体色素は本発明の供与体相（粒子）中に「保護された様式で」存在する。２本の曲線は、異なるｐＨ値（横軸）を表す較正液体中に分散されたｐＨ試薬の発光の位相角（縦軸）を示す。「Ｏ」により示される曲線は、空気（２１．９５％Ｏ２）により飽和されている場合に取った。「Ｎ」により示される曲線はＮ２により飽和されている場合に取った。
実施例
Ｒｕ（ジフフェン）３ＴＭＳ２
［Ｒｕ（ＩＩ）−トリス−（４，７−ジフェニル−１，１０−フェナントロリン）（３−トリメチルシリル）−１−プロパンスルホン酸］
（Ｉ．ＫｌｉｍａｎｔとＯ．Ｓ．Ｗｏｌｆｂｅｉｓ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７（１９９５）３１６０）。
実施例１
本実施例は、本発明により供与体相中に埋込まれる供与体色素が、受容体相中に埋込まれている同一の色素より小さいＯ２感受性を表すことを示す。
埋込まれた供与体色素を伴うナノ粒子の調製の一般的記述。
１．１  受容体相中への供与体色素の埋込
１ｍｇの供与体色素Ｒｕ（ジフフェン）３ＴＭＳ２および１００ｍｇの親水性ポリマーＤ４（親水性配列をもつポリウレタン；タインデイル  プレインズ  ハンター  ＬＴＤ（Ｔｙｎｄａｌｅ  Ｐｌａｉｎｓ  Ｈｕｎｔｅｒ  ＬＴＤ）、ニュージャージー州リンゴウズ、０８５５１、米国）をエタノール：水（９０：１０  ｗ／ｗ）に溶解した。溶液はナイフの適用によりポリエステルフォイル（マイラー（Ｍｙｌａｒ）、デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ））を引き上げられた。溶媒の蒸発後に、およそ２０μｍの層厚を伴う薄膜が出現した。
測定の手配（４５ｋＨｚ、青色ＬＥＤ、ＯＧ  ５７０）
2004517316.tif 000009
測定結果は、受容体相中に「保護されない様式で」存在している供与体色素Ｒｕ（ジフフェン）３ＴＭＳ２が、Ｏ２を含まない（Ｎ２飽和）もしくは２１．９５％Ｏ２（空気）で飽和された気体および水性媒体と接触されている場合に、それぞれ２．９°（乾燥受容体相）もしくは４．９°（浸潤受容体相）のＯ２感受性を表すことを示す。
１．２  供与体色素を含むナノ粒子の調製
４００ｍｇのポリアクリルニトリル（ポリサイエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ））および８ｍｇのＲｕ（ジフフェン）３ＴＭＳ２を８０ｍｌのＤＭＦ（メルク（Ｍｅｒｃｋ））に溶解した。５００ｍｌの水中にゆっくりと滴らせた後に、出現された懸濁物をＮａＣｌと混合しかつ遠心分離した。遠心分離の廃液を、水で数回、およびその後エタノールで洗浄した。
１．３  層状にされた受容体相中への供与体色素を運搬するナノ粒子の埋込
エタノール懸濁物（１．２の）を、５ｍｌのエタノール：水（９０：１０  ｗ／ｗ）中の４００ｍｇの親水性ポリマーＤ４（タインデイル  プレインズ  ハンター  ＬＴＤ（Ｔｙｎｄａｌｅ  Ｐｌａｉｎｓ  Ｈｕｎｔｅｒ  ＬＴＤ）、ニュージャージー州リンゴウズ、０８５５１、米国）の溶液と混合した。懸濁物はナイフの適用によりポリエステルフォイル（マイラー（Ｍｙｌａｒ）、デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ））を引き上げられた。溶媒の蒸発後におよそ２０μｍの層厚をもつ薄膜が出現した。
測定の手配（４５ｋＨｚ、青色ＬＥＤ、ＯＧ  ５７０）
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測定結果は、本発明のナノ粒子中に埋込まれそして従って供与体相中に「保護された様式で」存在している供与体色素Ｒｕ（ジフフェン）３ＴＭＳ２が、Ｏ２を含まないもしくは２１．９５％Ｏ２飽和された気体もしくは水性媒体と接触されている場合に、それぞれ０．８°（乾燥受容体相）もしくは１．６°（湿潤受容体相）のＯ２感受性を表すことを示す。
【００５２】
これらの値を１．１の値と比較することにより、本発明により供与体相中に存在する全く同一の供与体色素が、従来技術により受容体相中に直接存在する供与体色素より小さいＯ２感受性を表すことをが、従って明らかとなる。
実施例２（本発明の試薬）
ｐＨ官能性ナノ粒子およびｐＨ感受性層の調製の一般的記述
第一段階において、アクリロニトリルおよびＯＨ官能性メタクリレートより構成されるＯＨ官能性コポリマーを調製する。第二段階において、埋込まれた供与体色素を含有するナノ粒子をそのポリマーから調製する。第三段階において、ｐＨ感受性の受容体色素を、該コポリマーの官能基に共有結合する。そうすることにおいて、受容体色素は、該粒子の「軟」親水性領域（受容体相）中に主として配置され、従ってイオンにとって到達可能である。供与体色素は主として「硬」領域（供与体相）中に溶解され、従って物質が到達を獲得することを妨害することを困難にする。
２．１  コポリマーの調製
２３０ｇの脱イオン化Ｈ２Ｏを、窒素での２時間のすすぎにより酸素を含まないようにした。攪拌および窒素環境下で、４ｇのＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウムｐ．Ａ．、メルク（Ｍｅｒｃｋ））を溶解した。２０ｍｌのアクリロニトリル（フルカ（Ｆｌｕｋａ））および１ｍｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（ポリサイエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）、ｎ＝２００、注文番号１６７１２）をその溶液に添加した。その混合物を５０°にし、そして４ｍｌの１Ｎ  ＨＣｌ（メルク（Ｍｅｒｃｋ））と混合した。重合を、４００ｍｇのペルオキソ二硫酸アンモニウム（メルク（Ｍｅｒｃｋ））を添加することにより開始し、そして５０°で１２時間実施した。ポリマーを吸引分離し、そして水およびエタノールで数回洗浄した。以下において、このポリマーをＰＡＮ−ＰＥＧと呼ぶ。
２．２  供与体色素を含むナノ粒子の調製
４００ｍｇのＰＡＮ−ＰＥＧおよび２０ｍｇの供与体色素Ｒｕ（ジフフェン）３ＴＭＳ２を８０ｍｌのＤＭＦ（メルク（Ｍｅｒｃｋ））に溶解した。５００ｍｌの水にゆっくりと滴らせた後に、懸濁物をＮａＣｌと混合しかつ遠心分離した。遠心分離の廃液を水で数回洗浄した。
２．３  発色団のｐＨ感受性の受容体色素のナノ粒子への結合
２５ｍｇのｐＨ感受性の受容体色素Ｎ９（メルク（Ｍｅｒｃｋ））を８  Ｔｒ．濃Ｈ２ＳＯ４（メルク（Ｍｅｒｃｋ））とともに粉砕し、そしてウォータージェット真空中で３０分間活性化した。色素を１００ｍｌの脱イオン水に吸収させ、そしてＮａＯＨの助けを借りてｐＨ７にした。上述された遠心分離の廃液をこの混合物に添加し、５分後に４．２ｇのＮａＣＯ３、および５分後に２ｍｌの５Ｍ  ＮａＯＨを添加した。さらなる２０分後に、濃ＨＣＬによるｐＨ３への酸性化を実施した。粒子を遠心分離により分離し、そして塩基性緩衝液、水およびエタノールで洗浄した。
【００５３】
かように調製された粒子を水性の測定媒体に懸濁し、そして測定を多様なｐＨ値でかつ空気およびＮ２飽和下で実施した。結果を図１に描き、そして、ｐＨ測定の目的上、ｐＨ感受性の粒子は試薬（＝英語で「プローブ」）として測定媒体に添加してよいことを示す。
【００５４】
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【図面の簡単な説明】
以下において、本発明は図１を参照してより詳細に説明することができ、ここで
【図１】
発明にかかる、ｐＨ測定のための本発明の試薬の較正曲線を表す。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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