(57)【要約】本発明は、タンパク質の安定化、特にカチオン界面活性剤を用いた水溶液中のポリメラーゼの安定化のための方法および組成物を提供する。本発明はさらに、溶解状態で存在する熱安定性および熱不安定性の酵素を安定化するカチオン界面活性剤（例えば、ポリエトキシル化アミン）を提供する。これらの界面活性剤は熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素を含む様々な酵素の活性を安定化する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ポリメラーゼと、ｂ）カチオン界面活性剤とを含有する組成物。
【請求項２】
カチオン界面活性剤のＨＬＢ指数が約１１〜１６である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
カチオン界面活性剤がポリエトキシル化アミンである、請求項１記載の組成物。
【請求項４】
ポリエトキシル化アミンが下記の分子構造：
2004500005.tif 000017
を有し、ここでｚは約１５〜２０の整数であり、ｘ＋ｙの平均値は約５〜１５である、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
ポリエトキシル化アミンが０．０００５〜１．０体積％の濃度である、請求項３記載の組成物。
【請求項６】
ｚが１８で、ｘ＋ｙの平均値が５である、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
ｚが１８で、ｘ＋ｙの平均値が１５である、請求項５記載の組成物。
【請求項８】
約１０〜７０ｍＭの濃度でバッファーをさらに含有する、請求項１記載の組成物。
【請求項９】
ＮａＣｌおよびＫＣｌからなる群より選択される塩をさらに含有する、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２からなる群より選択される２価の塩をさらに含有する、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
キレート化剤をさらに含有する、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
還元剤をさらに含有する、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
ａ）触媒活性のあるタンパク質、ｂ）ポリエトキシル化アミンおよびｃ）バッファーを含有する組成物。
【請求項１４】
ポリエトキシル化アミンが０．０００５〜１．０体積％の濃度である、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
カチオン界面活性剤のＨＬＢ指数が約１１〜１６である、請求項１記載の組成物。
【請求項１６】
ポリエトキシル化アミンが下記の分子構造：
2004500005.tif 000018
を有し、ここでｚは約１５〜２０の整数であり、ｘ＋ｙの平均値は約５〜１５である、請求項１３記載の組成物。
【請求項１７】
ｚが１８で、ｘ＋ｙの平均値が５である、請求項１６記載の組成物。
【請求項１８】
ｚが１８で、ｘ＋ｙの平均値が１５である、請求項１６記載の組成物。
【請求項１９】
ａ）活性のあるポリメラーゼおよびカチオン界面活性剤を用意し、ｂ）該ポリメラーゼの活性が安定化される条件下で、該ポリメラーゼと該界面活性剤とを組み合わせて混合物をつくる、
ことを含んでなる方法。
【請求項２０】
カチオン界面活性剤のＨＬＢ指数が約１０〜１７である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
カチオン界面活性剤がポリエトキシル化アミンである、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
ポリエトキシル化アミンが下記の分子構造：
2004500005.tif 000019
を有し、ここでｚは約１５〜２０の整数であり、ｘ＋ｙの平均値は約５〜１５である、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ｚが１８で、ｘ＋ｙの平均値が５である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ｚが１８で、ｘ＋ｙの平均値が１５である、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の利用分野
本発明は、タンパク質の安定化、特にカチオン界面活性剤による水溶液中のポリメラーゼの安定化に関するものである。
【０００２】
発明の背景
酵素の安定化は長期保存と、多くの生化学的方法やバイオテクノロジーの手法での利用にとって必要である。熱変性に対して安定な酵素は好熱生物から単離されてきた。しかし、こうした高度に熱安定性の酵素でさえ、化学薬品、プロテアーゼ類または環境変化によって不活化されることがある。熱安定性酵素や他の酵素の利用には、高温、最適以下の濃度の補因子や基質を含む水性環境、酵素の最大安定性に対して最適以下のｐＨをはじめとする変性条件の同時使用がしばしば必要となる。
【０００３】
数多くの安定化方法が公知である。これらの方法として、固相支持体上への酵素の固定化、酵素の化学的修飾、酵素の遺伝子工学的操作、安定化剤の添加などがある。界面活性剤は酵素を安定化することが分かっている添加剤の１グループである。界面活性剤は、活性型の酵素とそれらを取り巻く液体環境との界面を安定化させる表面活性化合物である。
【０００４】
例えば、非イオン性界面活性剤は酵素活性のある各種タンパク質（例えば、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、酸化窒素シンターゼ、トリプトファンヒドロキシラーゼ、サツマイモのβ−アミラーゼ）の溶液安定性を高めることがいろいろ分かってきている。さらに、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００やＴｗｅｅｎ ２０のような非イオン性界面活性剤は、ＤＮＡポリメラーゼの活性を安定化することが明らかにされた（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １４： ７８９−９５ ［１９７５］ 参照）。欧州特許出願第７７６，９７０ Ａ１号（参照によりここに組み入れる）には、ポリオキシエチル化ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ ２０）およびエトキシル化アルキルフェノール（ＮＰ−４０）を使用してＴａｑ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性を安定化させることが開示されている。
【０００５】
アニオン界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を低濃度で用いると、酵素活性を安定化できることが知られている。しかし、溶液中でＳＤＳが最適濃度を上回る場合は協同的結合が起こり得るため、タンパク質安定化におけるＳＤＳの使用は制限される。しかしながら、多くのカチオン界面活性剤は、ＳＤＳなどの強いアニオン界面活性剤ほど強力にタンパク質と結合しないことが知られている（例えば、Ｎｏｚａｋｉら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２４９：４４５２−５９ ［１９７４］参照）。その上、大部分のタンパク質はアニオン結合部位よりカチオン結合部位の方が少ない。
【０００６】
ＤＮＡポリメラーゼのような酵素の有用性は、しばしば、溶液中での該ポリメラーゼの安定性により制限される。したがって、溶液中の酵素の安定性を高める添加剤、特に安定性を向上させるだけでなく、現在使用されている界面活性剤の欠点を回避する添加剤の必要性が存在している。
【０００７】
発明の概要
本発明は、タンパク質の安定化、特にカチオン界面活性剤による水溶液中のポリメラーゼの安定化に関するものである。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本発明は、酵素活性のあるタンパク質とカチオン界面活性剤との混合物を含む組成物を提供する。本発明は何らかの特定の酵素に限定されるものではない。実際、様々な酵素の安定化が考えられる。ある好ましい実施形態において、タンパク質はポリメラーゼ（例：大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｎｅポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素など）である。他の実施形態において、酵素は好ましくはキナーゼ、ホスホリラーゼ、またはホスファターゼ（例：ウシ腸ホスファターゼ）である。
【０００９】
同様に、本発明は特定のカチオン界面活性剤に限定されるものではない。実際、様々なカチオン界面活性剤が考えられる。いくつかの実施形態において、カチオン界面活性剤は約１０〜１７の親水性親油性バランス（ＨＬＢ）指数を有する。ある好ましい実施形態において、カチオン界面活性剤のＨＬＢ指数は約１１〜１６である。他の実施形態では、カチオン界面活性剤はポリエトキシル化アミンである。特に好ましい実施形態では、ポリエトキシル化アミンは下記の構造：
2004500005.tif 000002
を有する。いくつかの実施形態において、ｚは約１５〜２０の整数、最も好ましくは１８である。他の実施形態において、ｘ＋ｙの平均値は約５〜１５であり、その結果としてＨＬＢ指数は約１１〜１６となる。いくつかの好ましい実施形態では、ｘ＋ｙの平均値は５または１５である。ある実施形態において、窒素はリン、硫黄またはヒ素ラジカルで置換されてもよい。さらに他の実施形態において、カチオン界面活性剤は約０．０００５〜１．０体積％の濃度で溶液または混合物中に存在する。
【００１０】
いくつかの実施形態においては、該混合物または溶液が緩衝試薬を含む。本発明は特定の緩衝試薬に限定されない。実際、各種の緩衝試薬が考えられる。ある実施形態では、緩衝試薬をＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳまたはＴｒｉｓバッファーとすることが好ましい。他の実施形態では、溶液中のバッファーの濃度を約１０〜７０ｍＭとする。いくつかの実施形態では、ｐＨを約７．０〜９．２とする。
【００１１】
他の実施形態においては、該溶液または混合物が１価の塩および／または２価の塩を含む。本発明はどのような特定の塩にも限定されない。実際、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２を含むがこれらに限らない各種の塩が考えられる。いくつかの実施形態では、２価カチオンが約０．１〜１０ｍＭの濃度で存在する。他の実施形態では、１価カチオンが約１〜１００ｍＭ の濃度で存在する。
【００１２】
さらなる実施形態において、該溶液または混合物はキレート化剤および／または還元剤を含む。本発明は特定のキレート化剤と還元剤に限定されない。実際、各種のキレート化剤および還元剤が考えられる。好ましいキレート化剤としてはＥＤＴＡとＥＧＴＡがあるが、これらに限らない。好ましい還元剤にはジチオトレイトールとβ−メルカプトエタノールが含まれるが、これらに限らない。いくつかの実施形態では、キレート化剤が約０．０１〜１０ｍＭの濃度で存在する。他の実施形態では、還元剤が約０．１〜２０ｍＭの濃度で存在する。
【００１３】
いくつかの実施形態においては、本発明は酵素活性のあるタンパク質を安定化する方法を提供する。ある実施形態では、酵素活性のあるタンパク質（例：ポリメラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、またはホスホリラーゼ）とカチオン界面活性剤が用意される。好ましい実施形態において、カチオン界面活性剤は約１０〜１７のＨＬＢ指数を有する。特に好ましい実施形態において、カチオン界面活性剤は上記のようなポリエトキシル化アミンである。他の実施形態においては、酵素活性のあるタンパク質とカチオン界面活性剤とを組み合わせることにより、該酵素の活性がカチオン界面活性剤の不在下での酵素活性と比べて安定化されるようにする。
【００１４】
定義
本発明を理解しやすくするために、いくつかの用語を以下に定義する。
【００１５】
本明細書中で用いる「酵素」とは、化学的および生物学的反応を触媒することに関与する分子または分子集合体をさす。かかる分子は典型的にはタンパク質であるが、短いペプチド、ＲＮＡ、リボザイム、抗体および他の分子を含んでいてもよい。化学的および生物学的反応を触媒する分子を「酵素活性のある」または「触媒活性のある」分子と呼ぶ。
【００１６】
本明細書中で用いる「安定化」、「安定化する」および「安定化した」とは、酵素活性に関して用いる場合、酵素活性（経時的に測定されることが多い）を維持する、増強する、さもなくば酵素活性の減少または低下をくい止める物質の能力をいう（すなわち、安定化剤の存在下では、酵素が、安定化剤の存在しない酵素よりも長期間にわたってその活性を保持する）。また、「酵素活性の安定化」とは、最適以下の温度またはｐＨ条件下で酵素活性を維持する物質の能力をさす。他の例として、「酵素活性を安定化する」とは、「安定化」化合物または物質の存在しない酵素活性と比べて、最適以下の条件下で酵素活性を増大させる物質の能力をいう。
【００１７】
「ポリメラーゼ」とは、リボヌクレオシド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸から核酸鎖（例：ＲＮＡまたはＤＮＡ）を合成する酵素をさす。
【００１８】
「ポリメラーゼ活性」とは、酵素がリボヌクレオシド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸から核酸鎖（例：ＲＮＡまたはＤＮＡ）を合成するその能力をさす。ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡを合成し、一方ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡを合成する。
【００１９】
「界面活性剤」とは、水による溶媒和の方を強く好む極性ヘッド基と、水によって容易に溶媒和されない疎水性テイルの両方をもつあらゆる分子をさす。「カチオン界面活性剤」とは、カチオン性ヘッド基をもつ界面活性剤のことである。「アニオン界面活性剤」とは、アニオン性ヘッド基をもつ界面活性剤のことである。
【００２０】
「親水性親油性バランス指数」および「ＨＬＢ指数」とは、界面活性剤分子の化学構造をその表面活性と関連させるための指数をいう。ＨＬＢ指数は、Ｍｅｙｅｒｓ（Ｍｅｙｅｒｓ， Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２３１−２４５ ［１９９２］；参照によりここに組み入れる）に記載されるような、いろいろな実験式により計算することができる。本明細書で用いる界面活性剤のＨＬＢ指数は、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｖｏｌｕｍｅ １： Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９６（参照によりここに組み入れる）中でその界面活性剤に対して指定されたＨＬＢ指数である。市販の界面活性剤のＨＬＢ指数は０〜約７０の範囲である。水への溶解度が高く可溶化特性を有する親水性界面活性剤はこの指数の高い方にあり、一方水への溶解度が低く油中水の良好な可溶化剤である界面活性剤はこの数値の低い方にある。
【００２１】
「ポリエトキシル化アミン」とは、疎水性アルキル側鎖と１個以上の長鎖ポリオキシエチレン基を含むあらゆる界面活性剤をさす。
【００２２】
「バッファー」または「緩衝剤」とは、溶液に添加したとき、溶液がｐＨの変化に抵抗するようになる物質をさす。
【００２３】
「還元剤」および「電子供与体」とは、第２の物質に電子を供与することにより１個以上の第２の物質の原子の酸化状態を還元する物質をさす。
【００２４】
「１価の塩」とは、金属（例：Ｎａ、Ｋ、Ｌｉ）が溶解状態で１＋の実効電荷をもつ（すなわち、電子よりもプロトンが１個多い）あらゆる塩をさす。
【００２５】
「２価の塩」とは、金属（例：Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ）が溶解状態で２＋の実効電荷をもつあらゆる塩をさす。
【００２６】
「キレーター」または「キレート化剤」とは、金属イオンへの結合に利用できる孤立電子対をもつ原子が２個以上ある物質をさす。
【００２７】
「溶液」とは、水性または非水性混合物をさす。
【００２８】
「緩衝溶液」とは、緩衝試薬を含む溶液のことである。
【００２９】
「反応バッファー」とは、酵素反応を行なうための緩衝溶液をさす。
【００３０】
「保存バッファー」とは、酵素を保存するための緩衝溶液をさす。
【００３１】
「増幅」は、鋳型特異性を伴う核酸複製の特殊な事例である。これは非特異的な鋳型複製（すなわち、鋳型依存性であるが特定の鋳型に依存しない複製）と対照をなす。鋳型特異性はここでは複製の忠実度（つまり、適正なポリヌクレオチド配列の合成）およびヌクレオチド（リボ−またはデオキシリボ−）特異性と区別される。鋳型特異性はしばしば「標的」特異性という語で記載される。標的配列は、それが他の核酸から選別するために探し求められるという意味で「標的」である。増幅技術は主としてこの選別のために設計されたものである。
【００３２】
鋳型特異性はほとんどの増幅法では酵素の選択によって達成される。増幅酵素は、それが使用される条件下で、不均質な核酸混合物中の特定の核酸配列のみを処理する酵素である。例えば、Ｑβレプリカーゼの場合には、ＭＤＶ−１ ＲＮＡがこのレプリカーゼの特異的鋳型となる（Ｋａｃｉａｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９：３０３８ ［１９７２］）。その他の核酸はこの増幅酵素によって複製されない。同様に、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自身のプロモーターに対して厳格な特異性をもっている（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎら， Ｎａｔｕｒｅ ２２８：２２７ ［１９７０］）。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの場合、この酵素は連結点でオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質と鋳型の間にミスマッチがあると、これら２つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを連結させない（Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０ ［１９８９］）。最後に、ＴａｑおよびＰｆｕポリメラーゼは、高温で作用しうるという理由で、プライマーによって挟まれ規定された配列に高い特異性を示すことが見いだされた。高温は非標的配列とのハイブリダイゼーションではなく標的配列とのプライマーハイブリダイゼーションに好都合となる熱力学的条件をもたらす（Ｅｒｌｉｃｈ （ｅｄ．）， ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ ［１９８９］）。
【００３３】
本明細書中で用いる「増幅可能な核酸」とは、あらゆる増幅法で増幅しうる核酸に関して用いられる。「増幅可能な核酸」は通常「サンプル核酸」からなると考えられる。
【００３４】
本明細書中で用いる「サンプル鋳型」とは、「標的」（下記で定義）の存在について分析されるサンプルに由来する核酸のことである。これに対して、「バックグラウンド鋳型」は、サンプル中に存在するまたは存在しないサンプル鋳型以外の核酸に関して用いられる。バックグラウンド鋳型はほとんど不注意から生じることが多く、キャリーオーバー（持ち越し）の結果であるか、サンプルから除去されるべき核酸汚染物質の存在によるものである。例えば、試験サンプル中には検出すべき核酸以外の生物由来の核酸がバックグラウンドとして存在しうる。
【００３５】
本明細書中で用いる「プライマー」とは、精製した制限消化物のように天然に存在しようと、合成的に製造されたものであろうと、核酸鎖に相補的なプライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に（すなわち、ヌクレオチドとＤＮＡポリメラーゼのような誘導剤の存在下で適切な温度およびｐＨに）置いたとき、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは増幅効率を最大とするために一本鎖であることが好ましいが、二本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、最初にプライマーを処理してその二本鎖を分離してから伸長産物の生産に使用する。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは誘導剤の存在下で伸長産物の合成を開始させるに足る長さのものでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマー源、その方法の用途を含めた多くの要因に左右されるだろう。
【００３６】
本明細書中で用いる「プローブ」とは、精製した制限消化物のように天然に存在しようと、合成法、組換え法またはＰＣＲ増幅法で製造されたものであろうと、対象とする別のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を意味する。プローブは一本鎖でも二本鎖でもよい。プローブは特定の遺伝子配列の検出、同定および単離に有用である。好ましい実施形態においては、本発明で用いるプローブを任意の「レポーター分子」で標識して、いずれかの検出系、例えば酵素系（例：ＥＬＩＳＡ、酵素に基づく組織化学的アッセイ）、蛍光系、放射能系、発光系を含むがこれらに限らない検出系で検出できるようにすることが考えられる。本発明はどのような特定の検出系または標識にも制限されない。
【００３７】
本明細書中で用いる「標的」とは、ポリメラーゼ連鎖反応に関して用いる場合は、ポリメラーゼ連鎖反応用のプライマーによって挟まれた核酸の領域をさす。こうして、「標的」は他の核酸配列から選別されるべきものである。「セグメント」は標的配列内の核酸の領域として定義される。
【００３８】
本明細書中で用いる「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）とは、クローニングや精製を行なわずにゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増加させる方法を開示しているＫ．Ｂ． Ｍｕｌｌｉｓの米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，９６５，１８８号（それぞれの開示内容を参照によりここに組み入れる）に記載の方法をさす。標的配列を増幅するこの方法は、目的の標的配列を含むＤＮＡ混合物に大過剰量の２つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入し、続いてＤＮＡポリメラーゼの存在下で一連の熱サイクルを行なうことから成る。２つのプライマーは二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅反応を行なうには、混合物を変性し、次いでプライマーを標的分子内のその相補的配列にアニーリングする。アニーリング後、ポリメラーゼによってプライマーを伸長させ、新しい対の相補鎖を形成させる。変性、プライマーアニーリングおよびポリメラーゼ伸長の各ステップを多数回繰り返す（つまり、変性とアニーリングと伸長が１「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」を行なう）と、目的とする標的配列の増幅セグメントが高濃度で得られる。標的配列の増幅セグメントの長さはプライマーの互いに対する相対位置によって決まり、したがって、この長さは制御可能なパラメーターである。このプロセスの繰り返すという特性ゆえに、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以後「ＰＣＲ」）と言われる。目的とする標的配列の増幅セグメントは混合物中で（濃度に関して）優勢な配列となるので、それらは「ＰＣＲ増幅された」と言われる。
【００３９】
ＰＣＲを用いると、いくつかの異なる方法論（例えば、標識プローブとのハイブリダイゼーション、ビオチン化プライマーの組み込みとその後のアビジン−酵素コンジュゲートによる検出、３２Ｐ−標識デオキシヌクレオチド三リン酸（例：ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ）の増幅セグメントへの組み込み）により検出できるレベルにまで、ゲノムＤＮＡ中の１コピーの特定の標的配列を増幅することが可能である。ゲノムＤＮＡに加えて、どのようなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列も適切なセットのプライマー分子を用いて増幅することができる。特に、ＰＣＲ法により作られた増幅セグメントはそれ自体が後続のＰＣＲ増幅反応にとって有効な鋳型となる。
【００４０】
本明細書中で用いる「ＰＣＲ産物」、「ＰＣＲ断片」および「増幅産物」とは、変性、アニーリング、伸長のＰＣＲステップを２サイクル以上行なった後に得られる化合物の混合物をさす。これらの用語は１以上の標的配列の１以上のセグメントの増幅が存在した場合を包含する。
【００４１】
本明細書中で用いる「増幅試薬」とは、プライマー、核酸鋳型および増幅酵素を除いて、増幅に必要とされる試薬（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、バッファーなど）をさす。典型的には、増幅試薬を他の反応成分と共に反応容器（試験管、マイクロウェルなど）に入れ、その中に収容する。
【００４２】
発明の一般的説明
本発明は、タンパク質の安定化、特にカチオン界面活性剤による水溶液中のポリメラーゼの安定化のための方法および組成物を提供する。保存バッファーまたは反応バッファー中に溶解状態で存在するポリメラーゼの活性は、非イオン性界面活性剤の添加により安定化することができる。本発明は特定の作用機構に制限されるものではない。実際、タンパク質の安定化に係わる作用機構を理解することは本発明の完成および使用にとって必要ではない。しかし、界面活性剤によるタンパク質安定化の作用機構に関する１つの理論は、タンパク質に界面活性剤が結合することで、タンパク質のほぐれ（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）や変性を防止する架橋作用が働くというものである。非イオン性界面活性剤の場合には、この結合がタンパク質表面の疎水性部位で起こる。
【００４３】
タンパク質への界面活性剤結合のメカニズムおよびいくつかのイオン性界面活性剤による変性はすでに検討されている（例えば、Ｊｏｎｅｓ， ｉｎ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｓ． Ｍａｇｄａｓｓｉ （ｅｄ．）， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２３７−２８４ ［１９９６］参照）。イオン性界面活性剤とタンパク質との初期の相互作用は、タンパク質表面の高エネルギー部位へのイオン性ヘッド基の結合により仲介される。タンパク質表面の荷電部位とヘッド基との相互作用は静電的である。アニオン界面活性剤はカチオン部位（例：リシル、ヒスチジル、アルギニル残基）と結合し、カチオン界面活性剤はアニオン部位（例：グルタミル、アスパルチル残基）と結合する。その後、界面活性剤の疎水性テイルがタンパク質表面の疎水性領域と相互作用する。
【００４４】
さらに、多くのイオン性界面活性剤はタンパク質と協同的に結合することが知られている。協同的結合（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）はタンパク質の三次構造のほぐれにより特徴づけられ、これはより多くの界面活性剤分子の結合を可能にする。この初期のほぐれはタンパク質の疎水性内部への界面活性剤の疎水性テイルの挿入に起因すると考えられる。協同的結合は一般にタンパク質を完全に変性させ、活性の低下をもたらす。
【００４５】
タンパク質に対する界面活性剤の結合親和性は、その界面活性剤のヘッド基の性質、疎水性テイルの鎖長および臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）により影響される。アニオン界面活性剤については、一定の疎水性テイルの鎖長をもつ界面活性剤の場合、極性ヘッド基がＳＯ４−−＞ＳＯ３−−＞ＣＯ２−＞ＯＨの順で変化するにつれて結合親和性が低下する。鎖長も一要因となる。例えば、アルキル硫酸塩は、アルキル鎖長がＣ１２（つまり、１２個の炭素原子）であるとき広範なほぐれを伴う結合を示し、アルキル鎖長がＣ１２より短いときは広範なほぐれのない結合が生じる。これに対して、アルキルスルフィン酸塩の場合には、Ｃ１２鎖長は協同的結合にとって不十分であることが示された。
【００４６】
協同的結合は次第に増加する界面活性剤濃度で起こる。協同的結合が起こるか否かはその界面活性剤のＣＭＣに依存する。界面活性剤のＣＭＣとは、溶解状態で存在する遊離の界面活性剤分子が集合してミセルを形成する濃度のことである。界面活性剤とタンパク質との協同的結合の場合、界面活性剤のＣＭＣよりかなり低い界面活性剤濃度で初期の静電結合が起こる。多くの強力な変性界面活性剤のＣＭＣは比較的高い。ＣＭＣの低い界面活性剤の場合は、界面活性剤が比較的低濃度でミセルを優先的に形成するだろう。したがって、タンパク質の変性を引き起こすのに十分な界面活性剤濃度に溶液中で到達し得ない。非イオン性界面活性剤はそのＣＭＣおよびそれが達成しうる遊離濃度の点で制限を受け、その結果、かなり過剰に添加された界面活性剤の場合にも協同的結合と変性が起こらない。
【００４７】
界面活性剤とタンパク質との結合は、結合等温線を作製することにより調べられる。等温線は、遊離界面活性剤濃度の対数の関数としてプロットした、タンパク質分子あたりの界面活性剤分子の平均数を適用することにより作成されたＳ字状曲線である。結合等温線は多数の領域を有する。第１の領域は、天然タンパク質の表面上の荷電部位または疎水性部位への界面活性剤の特異的結合に対応する比較的急な増加スロープからなる。これらの部位が飽和されると、プラトー様の領域が現れる。タンパク質と協同的に結合する界面活性剤では、第３の険しいスロープの領域が出現する。この領域は一般に、遊離の界面活性剤が臨界ミセル濃度に近づくときに現れる。
【００４８】
結合誘発ほぐれ（ｂｉｎｄｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）の数学的モデルからは、少量の高親和性イオンの結合が他の作用物質によるほぐれからタンパク質を保護することが推測される（例えば、Ｓｔｅｉｎｈａｒｄｔ ａｎｄ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ （ｅｄｓ．）， Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２３４−３５０ ［１９６９］ 参照）。ほぐれからの保護は、界面活性剤の荷電ヘッド基とタンパク質表面の荷電残基との静電相互作用に基づいている（Ｍａｒｋｕｓら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２３９： ３６８７ ［１９６４］）。次いで、タンパク質の疎水性部位への疎水性テイルのその後の結合が非共有結合の架橋作用を提供する。
【００４９】
本発明は、酵素活性を安定化する界面活性剤を提供する。いくつかの実施形態において、エトキシル化アルキルアミン系カチオン界面活性剤であるＴｏｍａｈ Ｅ−１８−５およびＴｏｍａｈ Ｅ−１８−１５ （Ｔｏｍａｈ Ｐｒｏｄ Ｉｎｃ， Ｍｉｌｔｏｎ， ＷＩ）は、Ｔｗｅｅｎ ２０、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００、ＮＰ−４０などの常用される非イオン性界面活性剤と比べて、溶解状態で存在するポリメラーゼの同等のまたは優れた安定化をもたらした。一つのアッセイにおいて、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓから単離された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（それぞれＴａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ）の界面活性剤安定化がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を触媒する能力により測定された。得られた反応産物の量を、反応に使用した酵素の安定性の尺度として用いた。低レベルのＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼをカチオン界面活性剤と共に使用したときに優れた結果が観察された。標的ＤＮＡ配列の増幅は、非イオン性界面活性剤を含む対照反応混合物中で標的を増幅するのに要した量より５０％も少ないポリメラーゼ活性を含む反応混合物において、容易にかつ再現可能に見られた。別のアッセイでは、カチオン界面活性剤を含有するバッファー中のＴｔｈおよびＴａｑポリメラーゼの半減期は、非イオン性界面活性剤を含むバッファーで観測されたそれらの半減期と同等であるかまたはそれより優れていると測定された。
【００５０】
本発明の他の実施形態においては、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）逆転写酵素、ＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）逆転写酵素を含むがこれらに限らない他の酵素を安定化するためにもカチオン界面活性剤が使用される。これらの酵素の安定化を実証する実験では、ＤＮＡまたはＲＮＡ鋳型を含む重合反応混合物が標準的な安定剤ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）またはカチオン界面活性剤のいずれかを用いて調製された。Ｔ４ポリメラーゼとＭＭＬＶおよびＡＭＶ逆転写酵素の活性は、核酸への放射性ｄＮＴＰの取込みで測定したとき、ＢＳＡを含む反応バッファーと比較してカチオン界面活性剤を含む反応バッファーにおいて増大していた。
【００５１】
したがって、本発明のカチオン界面活性剤は、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素を含むがこれらに限らない熱安定性と熱不安定性の両ポリメラーゼを安定化するのに有用である。これらのカチオン界面活性剤は反応バッファーまたは保存バッファーのいずれにおいても安定剤として使用できる。
【００５２】
発明の詳しい説明
Ａ．　酵素活性を安定化する界面活性剤の同定
いくつかのアッセイ（実施例１〜１２参照）を用いて、約３０種類のアニオン、カチオンおよび両性界面活性剤の安定化または不安定化作用を調べた（表１にまとめてある）。これらの実験から、カチオン界面活性剤は酵素活性を安定化するために利用できることが示された。カチオン界面活性剤は、殺真菌剤、殺虫剤、化粧品の防腐剤としての使用を含めて、多様な用途が見いだされている。カチオン界面活性剤は２つのグループに大別される。すなわち、１）窒素含有界面活性剤と、２）ホスホニウム、スルホニウム、スルホキソニウムおよびアルソニウム界面活性剤を含む非窒素系の「オニウム」界面活性剤である。窒素含有界面活性剤は製造が簡単で安価であり、数の上では非窒素系の界面活性剤を圧倒している。窒素含有界面活性剤は窒素含有基の性質において相違する２つのカテゴリーに分割される。第１のカテゴリーは、疎水性を賦与する長鎖アルキル基と１個以上のアミン水素を含む単純なアンモニウム塩のようなアルキル窒素化合物を含む。アルキル窒素化合物は第二級、第三級または第四級アンモニウム化合物（すべてのアミン水素が有機基で置換されている）であり得る。第二級、第三級および第四級アミンにおいて、置換された基は長鎖もしくは短鎖アルキル、アルキルアリール、アリールまたはエトキシルであってよい。窒素含有界面活性剤の第２のカテゴリーは、ピリジニウム、モルホリニウム、イミダゾリニウム誘導体などの複素環式物質を含む。
【００５３】
【表１】
2004500005.tif 000003
2004500005.tif 000004
【００５４】
従って、いくつかの実施形態においては、本発明は酵素活性を安定化させるカチオン界面活性剤を提供する。好ましい実施形態においては、カチオン界面活性剤は、好ましくは約１０〜１７、最も好ましくは約１１〜１６の親水性−親油性バランス（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ−Ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ Ｂａｌａｎｃｅ： ＨＬＢ）指数を有する。ＨＬＢ指数とは、界面活性剤分子の化学構造をその界面活性と相関させる指数である。ＨＬＢ指数は、様々な実験式によって計算され得る（例えばＭｅｙｅｒｓ， Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．２３１−２４５［１９９２］を参照されたい。参照により本明細書に組み入れる）。ＨＬＢ指数は、市販の界面活性剤については０から約７０以上の範囲にわたっている。親水性界面活性剤は、尺度の高い末端にあるが、その理由はそれらの水に対する高い溶解度と可溶化特性によるものであり、他方、水に対する溶解度が低く、水の油中への良好な可溶化剤である界面活性剤は尺度のより低い末端にある。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態においては、カチオン界面活性剤は好ましくはエトキシル化アミンである。エトキシル化アミンは疎水性アルキル側鎖および１以上の長鎖ポリオキシエチレン官能基（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）を含有する。エトキシル化アミンの水への溶解度は、大部分はアルコキシル化の度合いに依存しており、常に塩形成によるというものではない。単純なポリオキシエチル化アミン（ＰＯＥアミン）は、エトキシル化によって長鎖アルキルアミンから調製される。大部分のエトキシル化アミンは水溶性であり、比較的弱い塩基である。エトキシル化アミンは主に乳化剤およびヘアコンディショニング剤として使用される。
【００５６】
カチオン界面活性剤は好ましくは、エトキシル化アルキルアミンであって、水溶液中で以下の一般構造を有する群から選択される：
2004500005.tif 000005
式中、ｚは約１５〜２０の整数であり、ｘおよびｙはそれぞれ少なくとも１、かつｘ＋ｙは約５〜１５の平均値を有し、ＨＬＢ指数を約１０〜１７、好ましくは約１１〜１６としている。窒素原子を、硫黄原子で置換してエトキシル化アルキル硫化物を形成してもよく、リン原子で置換してエトキシル化アルキルホスフィンを形成してもよく、またはヒ素で置換してエトキシル化アルキルアルセニン（ａｒｓｅｎｉｎｅ）を形成していてもよい。
【００５７】
最も好ましくは、カチオン界面活性剤は水溶液中において下記の構造を有する群から選択される：
2004500005.tif 000006
（式中、ｘ＋ｙは平均値５を有する）、および
2004500005.tif 000007
（式中、ｘ＋ｙは平均値１５を有する）である。
【００５８】
Ｂ． 保存バッファー中および反応バッファー中のカチオン界面活性剤の使用
上記のカチオン界面活性剤は、保存バッファーと反応バッファーの両方において酵素を安定化するために使用できる。これらの界面活性剤は多様な酵素（Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｔｆｌポリメラーゼ、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを含むがこれらに限定されない）の安定化に有用である。いくつかの実施形態においては、当技術分野で知られている通り、酵素は組換えで生産してもよく、また天然の生物から精製してもよい。他の実施形態においては、酵素は界面活性剤の不在下でカラムクロマトグラフィーによって精製してもよく、または、本発明のカチオン界面活性剤以外の界面活性剤の存在下で精製した場合には、これらの界面活性剤は、クロマトグラフィーによって除去し得る（例えば、Ｍ． Ｐ． Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（編）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ−Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ， Ｌｏｎｄｏｎ［１９９０］を参照されたい）。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態においては、熱安定性酵素および他の酵素のための保存バッファーは、緩衝剤を約１０〜７０ｍＭ（好ましくは約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０）の濃度で、塩を約５０〜１５０ｍＭ（好ましくは約１００ｍＭのＫＣｌまたはＮａＣｌ）の濃度で、キレート化剤を塩に対するモル比約１：５００〜１：１，５００（好ましくは約０．１ｍＭ ＥＤＴＡ）で、還元剤を約１〜１０ｍＭ（好ましくは約１ｍＭのＤＴＴ（ジチオトレイトール））の濃度で、グリセロールを約５０体積％の濃度で、および本発明のカチオン界面活性剤を約０．００１％〜１．０％（好ましくは約０．１％）の濃度で含むものである。
【００６０】
本発明の別の実施形態においては、熱安定性ポリメラーゼおよび他の酵素のための反応バッファーは、緩衝剤を約５〜１５ｍＭ（好ましくは約１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２５℃でｐＨは約８．０〜９．０）の濃度で、１価の塩を約２０〜１００ｍＭ（好ましくは約５０ｍＭのＫＣｌまたはＮａＣｌ）の濃度で、２価カチオンを約１．０〜１０．０ｍＭ（好ましくはＭｇＣｌ２）の濃度で、ｄＮＴＰをそれぞれ約０．０５〜１．０ｍＭ（好ましくはそれぞれ約０．２ｍＭ）の濃度で、および本発明のカチオン界面活性剤を約０．００１％〜１．０体積％（好ましくは約０．１％）の濃度で含むものである。
【００６１】
本発明のさらに別の実施形態においては、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼなどの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのための反応バッファーは、緩衝剤を約５〜１５ｍＭ（好ましくは約１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）の濃度で、１価の塩を約３０〜７０ｍＭ（好ましくは約５０ｍＭのＮａＣｌ）の濃度で、２価カチオンを約５〜１５ｍＭ（好ましくは約１０ｍＭのＭｇＣｌ２）の濃度で、還元剤を約０．５〜５ｍＭ（好ましくは約１ｍＭのＤＴＴ）の濃度で、およびカチオン界面活性剤を約０．００１％〜１．０体積％（好ましくは約０．０１％）の濃度で含むものである。
【００６２】
本発明のさらに別の実施形態においては、ＭＭＬＶ逆転写酵素などの逆転写酵素のための反応バッファーは、緩衝剤を約３０〜７０ｍＭ（好ましくは約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨは約８．３）の濃度で、２価カチオンを約５〜１５ｍＭ（好ましくは約７ｍＭのＭｇＣｌ２）の濃度で、１価の塩を約２０〜６０ｍＭ（好ましくは約４０ｍＭのＫＣｌ）の濃度で、還元剤を約１〜２０ｍＭ（好ましくは約１０ｍＭのＤＴＴ）の濃度で、およびカチオン界面活性剤を約０．０１％〜１．０体積％（好ましくは約０．０１体積％）の濃度で含むものである。
【００６３】
上記の反応バッファーおよび保存バッファーの成分には、多くの等価物が存在し、容易に交換できる。従って、これらの好ましいバッファーは、中で酵素およびポリメラーゼが保存されるバッファー、および、中で重合および他の酵素反応が行われるバッファー調製のためのガイドとしてのみの役割を担うものであり、本発明を限定するものとは意図されていない。実際に、本発明はタンパク質一般の安定化において好適であるので、本発明をポリメラーゼの安定化に限定することは意図されていない。
【００６４】
実験
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および態様を示し、さらに説明するために提供されており、本発明の範囲を限定するものと解されてはならない。
【００６５】
以下の実験の開示においては、以下の略語が適用される。℃（度、摂氏）、ｂｐ（塩基対）、ｋｂ（キロ塩基対）、ｋＤ（キロダルトン）、ｇｍ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｎｇ（ナノグラム）、μｌ（マイクロリットル）、μＣｉ（マイクロキュリー）、Ｍ（モル濃度）、ｍＭ（ミリモル濃度）、μＭ（マイクロモル濃度）、ｎＭ（ナノモル濃度）、Ｕ（ユニット）、ＭＷ（分子量）、ｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（分）、ｈｒ（時間）、ａｂ（抗体）、ＨＣｌ（塩酸）、ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）、ＫＣｌ（塩化カリウム）、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水［１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ ７．２］）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｔｒｉｓ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（Ｂ−アミノ−エチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，−四酢酸）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、ｗ／ｖ（重量対体積）、ｖ／ｖ（体積対体積）、Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、ＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）、ＡＭＶ（トリ骨髄芽球腫ウイルス）、ＲＴ（逆転写酵素）、Ｔａｑ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、Ｔｆｌ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、Ｔｔｈ（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）。
【００６６】
実施例１
界面活性剤の存在下または不在下で、ＴａｑポリメラーゼがＤＮＡセグメントを増幅する能力
本実施例においては、界面活性剤によるポリメラーゼの安定化に関するＰＣＲに基づくアッセイの開発を記述する。界面活性剤の不在下ではポリメラーゼが検出可能な増幅産物を産生できないが、Ｔｗｅｅｎ ２０などの安定化界面活性剤の存在下では検出可能な増幅産物を産生できる条件を規定した。
【００６７】
以下の反応混合物を調製した。
【００６８】
２ｍＭ ｄＮＴＰ混合物　　　　 １００μｌ
２ｎｇ／μｌ ｐＧＥＭ ｌｕｃ　　　 １０μｌ
プライマー Ａ（１μｇ／μｌ）　１０μｌ
プライマー Ｂ（１μｇ／μｌ）　１０μｌ
１０× Ｔａｑ バッファー　　１００μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２　　　　　　 １００μｌ
ナノピュア（ｎａｎｏｐｕｒｅ）水　６７０μｌ
総量　　　　　　　　 １０００μｌ
ｐＧＥＭ ｌｕｃ（Ｐａｒｔ ＃ Ｅ１５４１）および２５ｍＭ ＭｇＣｌ２（Ｐａｒｔ ＃ Ｍ１９０２）をＰｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ， Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩから入手した。１０× Ｔａｑバッファー調製物は、５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ ９．０）であった。１０×Ｔａｑバッファーは、ＫＣｌとＴｒｉｚｍａをナノピュア水に溶解させ、ｐＨを濃塩酸で調整して作製した。ナノピュア水は、ＮＡＮＯＰＵＲＥ ｗａｔｅｒ システムで処理された脱イオン水をオートクレーブして作製した。２ｍＭ ｄＮＴＰ混合物は、１００ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰのストック溶液（それぞれＰｒｏｍｅｇａ Ｕ１２０， Ｕ１２２， Ｕ１２１，およびＵ１２３）をナノピュア水と混合し、各ヌクレオチドを２ｍＭの濃度で含む溶液を作製した。使用したプライマーのＤＮＡ配列は、
ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴ（配列番号１）および
ＧＡＡＴＣＧＴＣＧＴＡＴＧＣＡＴＧＴＡＡＡＡＣＴＣ（配列番号２）
である。
【００６９】
１００μｌの反応混合物を０．２ｍｌのチューブに入れ、５０μｌを別の５つのチューブに入れた。別の反応混合物を、１０μｌの１０％（ｖ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ， Ｐ−１３７９）を６７０μｌの水のうちの１０μｌと交換した以外は上記の配合を使用して調製した。この反応混合物は、最終界面活性剤濃度が０．１％ ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ ２０であった。続いてこの第２の反応混合物を、１つのチューブが１００μｌの反応混合物を含み、別の５つのチューブが混合物５０μｌを含むように分配した。
【００７０】
いずれの工程においてもいかなる界面活性剤も添加することなく精製されたＴａｑポリメラーゼ（１０Ｕ／μｌ）を１μｌずつ、界面活性剤を含む反応混合物および界面活性剤を含まない反応混合物に添加し、チューブの内容物を混合した。以下の通り、界面活性剤を含む反応物および界面活性剤を含まない反応物の連続希釈を行った。５０μｌの第一の混合物を取り出し、反応混合物の残りの５つのチューブの１つの中にある、５０μｌの同じ反応混合物に添加した。このチューブを混合し、その結果得られる混合物の５０μｌを、５０μｌの反応混合物を有する次のチューブに移した。この混合と移動を、反応混合物を含む５つのチューブ全てが、酵素を含む反応混合物と混合されるまで続けた。このチューブをサーモサイクラー中に置き、以下のプログラムを行った。
【００７１】
前サイクル条件：温度を調整し（９４℃、１分間）、続いてサイクル条件へ進めた。
サイクル条件：各サイクルごとに、温度を調節し（９４℃、１５秒間）、温度を下げる（６５℃、２分間）。温度サイクルを２５サイクル繰り返す。後サイクル条件へ進める。
後サイクル条件：温度を調節し（６８℃、４分間）、続いて温度を下げる（４℃まで）。
【００７２】
上記のプログラム条件でチューブをサイクルに付した後、５μｌの停止溶液を各チューブへ添加した。停止溶液は、０．４％ ＳＤＳ， １６０ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．１６％ Ｏｒａｎｇｅ Ｇおよび２４％グリセロールを含むものであった。
【００７３】
アガロースゲル電気泳動によって反応産物を分析した。アガロース（３ｇ）を３００ｍｌの１×ＴＢＥバッファーを含むフラスコへ添加した。溶液をマイクロ波で加熱して沸騰させ、フラスコの内容物を混合した。続いて１０ｍｇ／ｍｌのエチジウムブロミド溶液３０μｌを添加し、溶解しているアガロースを、ＢＲＬ Ｍｏｄｅｌ Ｈ４ 水平ゲル電気泳動システム用の、コームを有するゲルカセット中に注ぎ、硬化させた。硬化後、コームを取り除き、ゲルカセットを、予め１×ＴＢＥバッファーで満たしておいた電気泳動システムのベッドの中に置いた。各増幅反応物の、２５μｌのサンプルをｐＧＥＭマーカーのサンプルとともに、ゲル中の個々のウェルにロードした。電気泳動を１００Ｖで２時間、Ｈｏｆｆｅｒ ＰＳ５００Ｘ ＤＣ電源を用いて行った後、Ａｍｂｉｓ ｓｙｓｔｅｍを使用してゲルをＵ．Ｖ．光の下で可視化した。
【００７４】
１．５ｋｂ ＤＮＡの強いバンドが、最も多量のＴａｑポリメラーゼと０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を有していた増幅反応物に由来するサンプルを含むレーンにおいて見られた。より弱い１．５ｋｂバンドが、２番目に高レベルのＴａｑポリメラーゼと０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０を有していた増幅反応物を含むレーンにおいて見られ、添加された界面活性剤を有しないで最も高レベルのＴａｑポリメラーゼを有していた増幅反応物を含むレーンにおいては１．５ｋｂバンドは見られなかった。
【００７５】
このように、これらの条件は、増幅反応の間にＴａｑポリメラーゼを安定化させる界面活性剤の能力を試験するために有用である。該酵素を安定化する物質は、界面活性剤なしでは反応中に生成されない、上記の反応で生成される１．５ｋｂ ＤＮＡバンドの強度を増加させる。非常に優れた安定化物質は、０．１％ Ｔｗｅｅｎを用いて観察された濃度よりも低い酵素濃度で、１．５ｋｂ ＤＮＡバンドの産生をもたらすものとして同定される。
【００７６】
実施例２
界面活性剤のスクリーニング
この実施例においては、界面活性剤を、酵素を安定化するそれらの能力に関してスクリーニングした。以下の化合物を、終濃度１０％で（それぞれ、物質が固体である場合はｗ／ｖ、液体である場合はｖ／ｖで）ナノピュア水中に溶解させた。テトラデシル−トリメチル−アンモニウムブロミド（Ｓｉｇｍａ Ｔ４７６２）、ジオクチルスルホスクシネート（Ｓｉｇｍａ Ｄ−４４２２）、コール酸（Ｓｉｇｍａ Ｃ−１２５４， ｌｏｔ ５６Ｈ０３３９）、タウロコール酸（Ｓｉｇｍａ Ｔ−４００９， ｌｏｔ １５Ｈ５００１）、Ｃｈａｐｓ（Ｓｉｇｍａ Ｃ−３０２３， ｌｏｔ ８６Ｈ５０３２）、Ｃｈａｐｓｏ（Ｓｉｇｍａ Ｃ−３６４９， ｌｏｔ ３５Ｈ５０６５）、セチルピリジニウムクロリド（Ｓｉｇｍａ Ｃ−９００２， ｌｏｔ ７７Ｈ１０４７）、Ｔｗｅｅｎ ２０（Ｓｉｇｍａ Ｐ−１３７９）およびＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００。
【００７７】
これらの各界面活性剤溶液について１０×バッファーを作製した。各１０×バッファーは、５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ９．０（２５℃）、１％界面活性剤を含んでいた（調製の間に、上記の界面活性剤溶液をバッファー中に１：１０で希釈して作製した）。実施例１に記載したように、これらの実験において使用したＴａｑポリメラーゼは、いずれの界面活性剤にも曝すことなく精製した。これらの各バッファー溶液は、以下の通りＴａｑ−界面活性剤溶液を調製するために使用した。
【００７８】
ナノピュア水　　　　　　 ２５５μｌ
１０×界面活性剤バッファー　 ３２μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２　　　　　　　 ３２μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ（１０Ｕ／μｌ）　 １μｌ
総量　　　　　　　　　　３２０μｌ
【００７９】
対照溶液を、界面活性剤を有しない３２μｌの１０×バッファーを用いたこと以外は、上記の通りに作製した。溶液を９５℃でインキュベートし、サンプル（１０μｌ）を０、５、１０、３０、６０、９０および１２０分に取り出して、新品のチューブ内に入れ、氷上で保存した。続いて、Ｔａｑポリメラーゼ活性に関してサンプルをアッセイした。
【００８０】
Ｔａｑポリメラーゼ活性を、サンプルの酵素が取り込むことができたトリチウム化デオキシヌクレオチド塩基の量を測定することにより決定した。アッセイを下記の通りに行った。ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの溶液（それぞれＰｒｏｍｅｇａ Ｕ１２０， Ｕ１２２， Ｕ１２１，およびＵ１２３）を、ナノピュア水を用いて、２ｍＭの終濃度まで希釈した（オリジナルは１００ｍＭ）。トリチウム化ヌクレオチド３Ｈ−ＴＴＰを、Ａｍｅｒｓｈａｍより入手した（ＴＲＫ４２４， ２５０μＣｉ／２５０μｌ）。取込みのためのテンプレートは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．３， ５ｍＭ ＭｇＣｌ２中に２．５ｍｇ／ｍｌの終濃度で溶解させたウシ胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ， Ｄ−１５０１）であった。使用に先立ってＤＮＡを、ＲＱ１ ＤＮＡｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ６１０）の１：１０希釈液（希釈は１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ５ｍＭ ＭｇＣｌ２で行った）１μｌで処理し、１０分間、３７℃でインキュベートし、続いて６８℃で３０分間インキュベートした。これは取込み用ＤＮＡを「活性化」するために実行した。１０×Ｔａｑアッセイバッファーは、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ ９．０）、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２を含んでいた。
【００８１】
以下の反応混合物を調製した。
【００８２】
１０× Ｔａｑ アッセイバッファー ５００μｌ
ナノピュア水　　　　　　　１７００μｌ
ｄＡＴＰ（２ｍＭ）　　　　　　　　 ５００μｌ
ｄＣＴＰ（２ｍＭ）　　　　　　　　 ５００μｌ
ｄＧＴＰ（２ｍＭ）　　　　　　　　 ５００μｌ
ｄＴＴＰ（２ｍＭ）　　　　　　　　 ５００μｌ
活性化ウシ胸腺ＤＮＡ　　　　　６００μｌ
３Ｈ−ＴＴＰ（１μＣｉ／μｌ）　　　　　１００μｌ
【００８３】
時点サンプル（１０μｌ）を４０μｌの反応混合物に添加し、続いて７４℃で１０分間インキュベートした。インキュベーションの後、溶液を５００μｌの氷冷１０％ ＴＣＡで希釈した。ＴＣＡ溶液をＧＦ／Ａフィルターを通して濾過した。チューブを１ｍｌの５％ ＴＣＡで３回洗浄し、続いて洗浄液を同じフィルター上で濾過した。続いてフィルターを３回、５％ ＴＣＡで濯ぎ、続いてアセトンで濯いだ。濾紙を加熱ランプで１０分間乾燥させ、続いて放射能強度をカウントした。いずれの時点においても、存在する活性％は、その時点のサンプルにおける正味のカウント数を、その酵素溶液の０分サンプルにおける正味のカウント数で割り、１００をかけることによって決定した。溶液の活性％を時間に対してプロットした。続いて点を滑らかな曲線でつなぎ、選択された条件における、見積もられた酵素の半減期は、線が５０％活性と交差している点に基づいて見積もったものである。
【００８４】
続いて、異なる時間において残存している活性％を測定してプロットし、界面活性剤の存在下における酵素の半減期を見積もった。この結果は、ＣｈａｐｓおよびＣｈａｐｓｏを含むイオン性界面活性剤溶液の、見積もられた半減期は約５分であることを示す。Ｔｗｅｅｎ ２０およびＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００を含む非イオン性界面活性剤溶液の半減期は約４０分であった。界面活性剤を有しない対照溶液の半減期は５分未満であった。他のイオン性界面活性剤溶液はすべて、５分未満の半減期であった。
【００８５】
このように、このアッセイは、ＣｈａｐｓおよびＣｈａｐｓｏに関して観察されたような、Ｔａｑポリメラーゼの安定化をいくらかの度合いで提供するイオン性界面活性剤を同定するために有用である。さらに、このアッセイを使用してＴａｑポリメラーゼを高度に安定化させるイオン性界面活性剤を同定できる。そのような界面活性剤は、これらの条件下でＴａｑポリメラーゼの半減期を、Ｔｗｅｅｎ ２０に関してみられるものと同程度かまたはより大きく増加させる。
【００８６】
実施例３
追加の界面活性剤のスクリーニング
この実施例では、タンパク質を安定化する能力に関して、さらに界面活性剤をスクリーニングした。下記の物質の溶液（１０％ ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）を、ナノピュア水中に作製した。Ｎ−ドデシル−ｎ，ｎ’−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（Ｓｉｇｍａ Ｄ−４５１６， ｌｏｔ ９５Ｈ５０４５）、Ｍｅｇａ １０（Ｓｉｇｍａ Ｄ−６２７７， ｌｏｔ ３７Ｈ５０４１）、Ｎ−オクタデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパン−スルホネート（Ｓｉｇｍａ Ｏ−８００４， ｌｏｔ ４４Ｈ５００６）、ＳＢ ３−１０、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（Ｓｉｇｍａ Ｔ−７７６３， ｌｏｔ ９６Ｈ５００１）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−２００（Ｓｉｇｍａ Ｘ２００ ｌｏｔ ７５Ｈ０９８９）、ＴＲＩＴＯＮ Ｗ−３０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ Ｃｏ．， Ｗ−３０， ｌｏｔ １８Ｆ０７６６）、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−３０１（Ｓｉｇｍａ Ｘ３０１， ｌｏｔ １３Ｈ７７０６）、ＴＲＩＴＯＮ ７７０（Ｓｉｇｍａ ７７０， ｌｏｔ １８Ｆ０７６８）。
【００８７】
実施例１に記載のマスター反応混合物の９９μｌのアリコートを別々の０．２ｍｌチューブ中に置き、続いて１μｌの１０％界面活性剤溶液、および界面活性剤の不在下で精製した２μｌのＴａｑポリメラーゼ（１０Ｕ／μｌ）を各チューブに添加した。対照反応物は、１μｌの１０％ Ｔｗｅｅｎ ２０（陽性対照）を含むチューブと、界面活性剤を含まないチューブ（陰性対照）からなる。上記の実施例１に記載の通りに、チューブを増幅条件およびゲル分析手順に付した。
【００８８】
Ｔｗｅｅｎ ２０を添加した反応物においては、強力な１．５ｋｂ ＤＮＡバンドが生成され、界面活性剤を添加しなかった反応物においても、より弱いが視覚可能なバンドが生成された。Ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニウム−１−プロパンスルホネートを添加した反応物を除き、他の反応物は全て、視覚可能な１．５ｋｂ ＤＮＡ断片を生成しなかった。この反応物は、界面活性剤のない反応物（陰性対照）とＴｗｅｅｎ ２０を添加した反応物との中間の強度を有するバンドを生成した。
【００８９】
反応物の第二のセットを調製した。９５μｌのマスター反応混合物を、５μｌの界面活性剤溶液および２μｌのＴａｑポリメラーゼ（１０Ｕ／μｌ）を含むチューブに入れた。Ｔｗｅｅｎ ２０の対照および界面活性剤を含まない対照も調製した。上記の通り、反応は増幅条件に従って行い、ゲル電気泳動により分析を行った。
【００９０】
Ｔｗｅｅｎ ２０を添加した反応物においては、強力な１．５ｋｂ ＤＮＡバンドが観察され、界面活性剤を添加しなかった反応物においては、バンドは観察されなかった。他の反応物は全て、Ｎ−デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニウム−１−プロパンスルホネートを添加した反応物でさえも、視覚可能な１．５ｋｂ ＤＮＡ断片を生成しなかった。この結果から、これらの界面活性剤には、Ｔａｑポリメラーゼに関する安定化剤としては、Ｔｗｅｅｎ ２０に匹敵するものはないことが示された。
【００９１】
実施例 ４
追加の界面活性剤のスクリーニング
この実施例では、追加の界面活性剤を、タンパク質を安定化する能力についてスクリーニングした。以下に示す物質の溶液（１０％ ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）をナノピュア水中に作製した。Ｍｉｒａｃａｒｅ ＺＭＨＴ、Ｍｉｒａｃａｒｅ ＺＭＣＡ、Ｍｉｒａｔａｉｎｅ ＢＢ、Ｍｉｒａｔａｉｎｅ ＡＣＳ、Ｍｉｒａｔａｉｎｅ ＣＢＲおよびＭｉｒａｔａｉｎｅ ＣＢ （Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ， Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｒａｎｂｕｒｙ， ＮＪ）である。該界面活性剤溶液を０．１％レベルで、実施例３に記載のようにＴｗｅｅｎ ２０と、また 界面活性剤を含まない対照と比較することにより試験した。ただし酵素濃度は、１００μｌの反応混合物あたりＴａｑ １０Ｕとなるまで減じた。
【００９２】
強い１．５ｋｂのＤＮＡバンドがＴｗｅｅｎ ２０を加えた反応物において観察され、添加の界面活性剤を含まない反応物においてはバンドは全く観察されなかった。その他すべての反応物で、目に見える１．５ ｋｂのＤＮＡ断片は生成しなかった。この結果は、これらの界面活性剤はいずれも、Ｔａｑポリメラーゼのための安定剤としてＴｗｅｅｎ ２０には匹敵しないことを示している。
【００９３】
実施例 ５
Ｔｏｍａｈからの界面活性剤の初期評価
この実施例では、エトキシル化アミンのタンパク質を安定化する能力について試験した。以下に示す物質の溶液（１０％ ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）をナノピュア水中に作製した。Ｔｏｍａｈ Ｅ−１４−２、Ｔｏｍａｈ Ｅ−１４−５、Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−１５およびＴｏｍａｈ Ｅ−１８−５ （Ｔｏｍａｈ Ｐｒｏｄ． Ｉｎｃ．， Ｍｉｌｔｏｎ， ＷＩ）である。該界面活性剤溶液を０．１％レベルで試験し、上記の実施例３のように、Ｔｗｅｅｎ ２０と、また 界面活性剤を含まない対照反応物と比較することにより評価した。ただし酵素濃度は、１００μｌの反応混合物あたりＴａｑ １０Ｕとなるまで減じた。
【００９４】
強い１．５ｋｂのＤＮＡバンドがＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−１５ およびＴｏｍａｈ Ｅ−１８−５を加えた反応物において生じた。Ｔｏｍａｈ Ｅ−１４−２ および Ｔｏｍａｈ Ｅ−１４−５を加えた反応物では、認識しうる１．５ ｋｂのＤＮＡ断片は生成されなかった。この結果は、Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−１５およびＴｏｍａｈ Ｅ−１８−５はＴａｑポリメラーゼを安定化するが、Ｔｏｍａｈ Ｅ−１４−２およびＴｏｍａｈ Ｅ−１４−５はＴａｑポリメラーゼを安定化しないことを示している。さらに、Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−５およびＴｏｍａｈ Ｅ−１８−１５は、Ｔｗｅｅｎ ２０とほぼ同等に効果的に該酵素を安定化すると考えられる。従って、更なる試験はこれらの界面活性剤を用いて実施した。
【００９５】
Ｔｏｍａｈ界面活性剤はすべてエトキシル化アミンとして化学的に説明される、カチオン界面活性剤である。しかしそれらは、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｖｏｌｕｍｅ １： Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ ａｎｄ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｅｄｉｔｉｏｎ， １９９６に報告されるように、ＨＬＢ指数において異なる。これらの物質、およびＴａｑポリメラーゼを安定化するいくつかの非イオン性界面活性剤のＨＬＢ値を表２に示す。この結果は、ＨＬＢ指数が１１〜１６の範囲にあるカチオン界面活性剤は、Ｔａｑポリメラーゼの安定化に有効であることを示唆している。
【００９６】
【表２】
2004500005.tif 000008
【００９７】
実施例 ６
エトキシル化アミンの更なる試験
Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８ 界面活性剤を用いたときに観察された最初の結果は、この物質が非イオン性界面活性剤と少なくとも同程度に、Ｔａｑポリメラーゼを安定化しうることを示唆した。これらの物質がどのように機能するかについてのより明確な知見を得るために、より低レベルの酵素および界面活性剤を用いて実験を行った。
【００９８】
反応混合物は、０．１％、０．０１％および０．００１％のＴｗｅｅｎ ２０、Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−１５およびＴｏｍａｈ Ｅ−１８−５を含有するよう上記の実施例３に記載したように合わせた。界面活性剤を含まないＴａｑポリメラーゼをこれらの混合物に添加して、反応物あたり１０、５、２．５および１．２５ＵのＴａｑポリメラーゼを含有する反応物を調製した。該反応物を熱サイクラー中でインキュベートし、反応生成物を上記実施例１に記載のように分析した。
【００９９】
ほぼすべてのレーンが、予期された１．５ｋｂのＤＮＡ断片を含んでいた。ほとんどの場合、ある界面活性剤を含む任意のレーンが、別の界面活性剤を含むレーンより強いバンドを有するか否かを判断するのは困難であった。しかし、低レベルで酵素および／または界面活性剤が存在する場合、イオン性界面活性剤を含有する反応物は、非イオン性界面活性剤を含有する反応物よりも、生成物を多量に生成するように見えた。
【０１００】
実施例 ７
イオン性界面活性剤の存在下における高温のインキュベーション条件下での改善されたＴａｑポリメラーゼの半減期
この実施例では、エトキシル化アミンの、高温下で熱安定性タンパク質を安定化する能力を試験した。界面活性剤を含まないＴａｑポリメラーゼ溶液（２．５Ｕ／１００μ１の溶液）にて０．００５％のＴｏｍａｈ Ｅ−１８−１５、Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−５、Ｔｗｅｅｎ ２０、ＮＰ−４０およびＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００を含有する溶液を実施例２のように作製した。これらの溶液を９５℃でインキュベートし、サンプルを０、１０、３０、６０および１２０分の時点で採取し、実施例２のように分析した。これらの界面活性剤存在下における酵素の半減期をグラフで見積もった。Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−５、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００およびＮＰ−４０を含有する溶液はすべて、Ｔａｑポリメラーゼの半減期が約８分であった。Ｔｗｅｅｎ ２０を含有する溶液では半減期が５０分であり、Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−１５を含有する溶液では半減期が７０分と見積もられた。これらの結果は、この２種類のカチオン界面活性剤が高温条件下で、通常該酵素の安定化に使用される非イオン性界面活性剤と同程度またはそれ以上にＴａｑポリメラーゼを安定化することを示している。
【０１０１】
実施例 ８
Ｔｔｈポリメラーゼの性能を向上させるためのイオン性界面活性剤の使用
Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−５およびＴｏｍａｈ Ｅ−１８−１５がＴａｑポリメラーゼの性能を向上させることが判明した後、この効果がその他の酵素でも示されうるのかを確認するために、更なる実験を行った。この実験では、カチオン界面活性剤および非イオン性界面活性剤存在下における熱安定性Ｔｔｈポリメラーゼの安定化を試験した。
【０１０２】
以下の溶液を合わせた１０ｍｌのサンプルを３つ調製した：
２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．５　　　　　　　　　　　　５０μｌ
３Ｍ ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｌｍｌ
１Ｍ ＤＴＴ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０μｌ
０．５Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ ８．０　　　　　　　　　　　　 ２ｍｌ
ウシ血清アルブミン （ｌＯｍｇ／ｍｌ）　　　　　　　５００μｌ
グリセロール　　　　　　　　　　　　　　　５ｍｌ
界面活性剤ストック　　　　　　　　　　　　 ２ｍｌ
ナノピュア水　　　　　　　　　　　　　　 １Ｏｍｌになるまで
【０１０３】
溶液Ａは、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００の１０％のストックを２ｍｌ含有した。溶液Ｂは、Ｔｗｅｅｎ ２０の１０％ストックを１ｍｌおよびＮＰ４０の１０％ストックをｌｍｌ含有した。溶液Ｃは、Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−１５の１０％ストックを２ｍｌ含有した。Ｔｔｈポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ２１０，ｌｏｔ ８５０２２０１）のサンプルをこれらの溶液のそれぞれと等量で混合し、２．５Ｕ／μｌのＴｔｈポリメラーゼを含有する３種の酵素界面活性剤溶液を作製した。反応混合物を、実施例１の物質を用いて記載のように合わせた。ただし、新たな１０Ｘバッファーを使用した。このバッファーは、１．６７ｍｌの３Ｍ ＫＣＬ、０．５ｍｌの２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．３ （２５ ℃）および７．８３ｍｌのナノピュア水を混合することによって作製した。続いて酵素界面活性剤溶液４μｌをそれぞれ２００μｌの反応混合物に添加して混合した。次にこの溶液１００μｌを採取して別の１００μｌの反応混合物と混合し、そして第２の１００μｌ混合物を採取した。この混合物を第２の１００μｌ反応混合物に添加して混合した。この工程を、反応混合物および５、２．５、１．２５、０．６２５および０．３１２５ならびに０．１５６ユニットのＴｔｈポリメラーゼを含有する６個のチューブが作製されるまで続けた。実施例１に記載のように熱サイクルにかけた。その後、該反応の生成物を実施例１に記載のように分析した。
【０１０４】
５、２．５および１．２５ユニットの酵素を含むＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００で酵素を安定化したものから分取したレーンに明確な１．５ｋｂのバンドが存在した。Ｔｗｅｅｎ ２０およびＮＰ４０で安定化した酵素を分析するために使用した５、２．５、１．２５ および ０．６２５ ユニットの酵素を含むレーンにも明確な１．５ｋｂのバンドが存在した。Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−１５で安定化した酵素反応物を分析するために使用したレーンでは、０．１５６ユニットの酵素反応物を除いたすべてのレーンに明確な１．５ ｋｂのバンドが存在した。
【０１０５】
この結果は、イオン性界面活性剤Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−１５がＴｔｈポリメラーゼの性能を向上させ、その向上のレベルはこの研究で使用された非イオン性界面活性剤で見られたものより大きなものであることを示している。この事実は、この酵素が逆転写酵素でもあり、ＤＮＡポリメラーゼでもあることから、本発明の界面活性剤はこれらの種類の酵素の双方を安定化するのに有用であることを示しているという点において、特に興味深い。
【０１０６】
実施例 ９
イオン性界面活性剤の使用による Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼの性能の向上
Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−１５は、２種の異なる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ（うち１種は逆転写酵素活性を有するものであった）の性能を向上させたので、熱不安定性ＤＮＡポリメラーゼ（すなわち、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ）の活性に与える影響を試験した。
【０１０７】
以下の溶液を調製した：
ナノピュア水　　　　　　　　　　　　 ９６０μｌ
１０ Ｘ バッファー＊　　　　　　　　　　　２００ｕ１
２ｍＭ ｄＮＴＰ混合物　　　　　　　　　　　 ２００μ１
活性化ＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　２００μｌ
３Ｈ−ＴＴＰ （１μＣｉ／μｌ）　　　　　　　　　　４０μｌ
＊この実施例における１０Ｘバッファーは、１ ｍｌの５Ｍ ＮａＣＩ、０．５ｍｌの２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０ （２５℃）、ｌｍｌの１Ｍ ＭｇＣｌ２、１００μｌの１Ｍ ＤＴＴを含有し、ナノピュア水を添加して最終体積が１０ｍｌに調製されている。２ｍＭのｄＮＴＰ混合物を実施例１のように作製した。
【０１０８】
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ４２１）を１ Ｘバッファー中に１：１００で希釈した。該反応物は氷上で、表３に示したように合わせた。
【０１０９】
【表３】
2004500005.tif 000009
【０１１０】
チューブを３７℃にて１５分間インキュベートし、ＴＣＡ沈殿のカウント量を測定して、このような界面活性剤レベルでの該酵素の活性を評価した。データを表４に示す。この結果は、この酵素は０．００１％および０．０１％の界面活性剤が存在する場合にそれぞれ約７９％および６８％活性が増加することを示す。
【０１１１】
【表４】
2004500005.tif 000010
【０１１２】
この発見を確かめるため、かつＢＳＡ存在下で該界面活性剤がこの酵素の活性を増加させることがきるのかを判断するために、以下の実験を実施した。２種類の反応混合物を上記のように合わせた。ただし、一方の混合物（すなわち、＋ＢＳＡ混合物）のための１０Ｘ反応バッファーは、１．７ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを用いて、成分溶液の体積を１０ｍｌに調節するために使用するナノピュア水の量を対応して減少させることにより作製した。２セットの反応物を氷上で、表５に示したとおり合わせた。
【０１１３】
【表５】
2004500005.tif 000011
＊Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを再び上記のように１Ｘバッファーで１：１００に希釈した。 ＊＊チューブの各セットのについて１種類の反応混合物を用い、一方のセットはＢＳＡを含有し、もう一方のセットはＢＳＡを含有しないようにした。
【０１１４】
チューブを１５分間、３７℃でインキュベートし、ＴＣＡ沈殿のカウント量を測定してこれらの溶液中における該酵素の活性を判定した。データを表６に示す。この結果は、１）イオン性界面活性剤はこの熱安定性ポリメラーゼの活性を向上させること、２） 活性の増大は、ＢＳＡ（該酵素の希釈した際の活性の維持を補助することが知られている物質）の添加にともなって見られたものと同様であること、３） 界面活性剤を添加したときにみられた活性の増加は、ＢＳＡを別個に添加したときに見られた活性の増加よりもわずかに大きいものであること、および ４） これらの物質双方の存在下における該酵素の活性は、ＢＳＡを単独で添加したときに見られたものよりわずかに高いものであること、を示している。
【０１１５】
【表６】
2004500005.tif 000012
【０１１６】
実施例 １０
イオン性界面活性剤を添加したときのＭＭＬＶ逆転写酵素の性能の向上
イオン性界面活性剤Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−１５は、逆転写酵素活性を有する熱安定性性酵素（Ｔｔｈポリメラーゼ）の性能を向上させたので、この界面活性剤が別の逆転写酵素、ＭＭＬＶ−ＲＴに与える影響を試験した。
【０１１７】
１０Ｘ ＭＭＬＶ−ＲＴ反応バッファーを以下のように調製した：
２Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．３ （２５℃）　　　　　　 ２．５ｍｌ
１Ｍ ＭｇＣｌ２　　　　　　　　　　　　　　　０．７ｍｌ
３Ｍ ＫＣｌ　　　　　　　　　　　　　　　　１．３３ｍｌ
１Ｍ ＤＴＴ　　　　　　　　　　　　　　　　 ｌｍｌ
ナノピュア水　　　　　　　　総体積が１０ｍｌになるまで
アッセイ混合物を以下のように作製した：
成分　　　　　　　　　　　　　　　量
１０Ｘ ＭＭＬＶ反応バッファー　　　　　５００μｌ
ナノピュア水　　　　　　　　　　３２００μ１
１００ｍＭ ｄＴＴＰ　　　　　　　　　　　 ２５μ１
ポリｒＡ／オリゴ ｄＴ＊　　　　　　　 １２５０μ１
３Ｈ−ｄＴＴＰ　　　　　　　　　　　　　２５μｌ
【０１１８】
ポリＡ／オリゴｄＴ （Ｓｕｐｅｒｔｅｃｈ、ｃａｔ ＃ １１１０２０Ａ）は、１ｍＭのポリＡ、０．１ ｍＭのオリゴｄＴである。ＭＭＬＶ−ＲＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｍ１７０、ｌｏｔ＃ ８１５７７０２）のサンプルは、アッセイバッファーで１：１００に希釈した。反応物は氷上で、表７に示すように合わせた。
【０１１９】
【表７】
2004500005.tif 000013
【０１２０】
これらの反応物を１０分間、３７℃にてインキュベートし、ｌｍｇ／ｍｌ 仔牛胸腺ＤＮＡを１０μｌおよび１０％ ＴＣＡを０．５ｍｌ添加した。そしてチューブを氷上に１０分間放置した。続いて反応物をＧＦ／Ｃフィルターを用いて濾過し、該フィルターを洗浄してカウントした。データを表８に示す。これらのデータは、上記の条件下においてイオン性界面活性剤で安定化したときに、逆転写酵素の性能が向上することを示している。
【０１２１】
【表８】
2004500005.tif 000014
【０１２２】
実施例 １１
イオン性界面活性剤の添加によるＡＭＶ逆転写酵素の性能の向上
イオン性界面活性剤Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−１５はＭＭＬＶ逆転写酵素の性能を向上させた（実施例 １０）ので、この界面活性剤が別の逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）に与える影響を実施例１０に詳述した手順に従って試験した。これらのデータ（表９を参照）は、ＡＭＶ逆転写酵素の性能が、実施例１０に詳述した条件下においてイオン性界面活性剤を用いてアッセイした場合に向上することを示している。
【０１２３】
【表９】
2004500005.tif 000015
【０１２４】
実施例 １２
イオン性界面活性剤の添加によるＴｆｌ ＤＮＡポリメラーゼの性能の向上
界面活性剤を含まないＴｆｌポリメラーゼ溶液を、Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−１５ 界面活性剤存在下でのＰＣＲ反応にて試験した。第１反応物には０．１％の界面活性剤および５ユニットのＴｆｌポリメラーゼを含有させた。一連のＰＣＲ反応物は、第１反応物を１：２で連続的に希釈して、最終的に０．００３％の界面活性剤および０．１５ユニットのＴｆｌポリメラーゼを含有する反応物まで作製した。界面活性剤を含まない対照実験も実施した。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル上に泳動させ、エチジウムブロミドで染色し、ＵＶ光を使用して可視化した。
【０１２５】
データを表１０に示す。いずれの界面活性剤も添加されていない場合、Ｔｆｌポリメラーゼは、２５サイクル後に視覚的に認識しうるＰＣＲ産物を全く産生していなかった。Ｔｏｍａｈ Ｅ−１８−１５の存在下では、０．１％〜０．０００５％の界面活性剤存在下において５ユニットから０．０３９ユニットまでのＴｆｌを使用した場合、ＰＣＲ産物が目で検出可能であった。
【０１２６】
【表１０】
2004500005.tif 000016
【０１２７】
上記の明細書中で挙げた出版物および特許は、参照により本明細書に組み入れられる。本発明の精神および範囲を逸脱することなく、本発明の記載の方法および組成物の種々の改変および変更が当業者には明らかであろう。本発明は特定の好ましい実施形態と関連させて記載したが、特許請求の範囲内に記載の本発明が、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきでないことが理解されなければならない。実際、分子生物学、生化学、タンパク質化学、または関連分野における当業者に明らかな、記載した様式についての本発明を実施するための種々の改変が、添付の特許請求の範囲内に包含されることを意図する。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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