(57)【要約】１以上の野生型転写因子結合部位の代わりに、Ｅ１Ａオープンリーディングフレームの発現を調節するプロモーター領域に、機能可能であるように配置した、１以上の腫瘍特異的転写因子結合部位を有する、ウイルスＤＮＡ構築物およびそれにコードされるウイルスを提供する。好ましい構築物は、腫瘍特異的転写因子結合部位を、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ末端タンパク質および／またはＤＮＡ結合タンパク質に対して、機能可能な関係で配置する。組成物およびそれに含有される構築物、特に療法に使用するものを提供する。新生物に関して患者を治療する方法もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト腫瘍細胞または動物腫瘍細胞において複製可能なアデノウイルスをコードするウイルスＤＮＡ構築物であって、選択した転写因子の存在下で、Ｅ１Ａタンパク質の発現を促進するように、Ｅ１Ａオープンリーディングフレームと共に、機能可能であるように配置した、前記の１以上の選択した転写因子の結合部位を含み、該転写因子のレベルまたは活性が、同一種の正常ヒト細胞または正常動物細胞のものに比較して、ヒト腫瘍細胞または動物腫瘍細胞において増加していることで特徴付けられる、前記ウイルスＤＮＡ構築物。
【請求項２】
野生型ウイルス配列のものに対応する核酸配列を有する、請求項１記載のウイルスＤＮＡ構築物であって、野生型Ｅ１Ａ転写因子結合部位のすべてまたは一部が、１以上の選択した転写因子結合部位で置換されていることで特徴付けられる、前記ウイルスＤＮＡ構築物。
【請求項３】
野生型Ｅ１Ａエンハンサーが欠失されていることで特徴付けられる、請求項１または２記載のウイルスＤＮＡ構築物。
【請求項４】
野生型パッケージングシグナルが、左側の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接した野生型部位から欠失され、そして順方向または逆方向いずれかで、構築物中の別の箇所に挿入されていることで特徴付けられる、請求項１〜３のいずれか１項記載のウイルスＤＮＡ構築物。
【請求項５】
パッケージングシグナルが、右側の末端反復配列に隣接して、好ましくは該末端反復配列から６００ｂｐ以内に挿入されていることで特徴付けられる、請求項１〜４のいずれか１項記載のウイルスＤＮＡ構築物。
【請求項６】
複製中、左側のＩＴＲと塩基対形成するのを可能にするのに十分な対称性を提供するように、１以上の選択した転写因子結合部位が右側の末端反復配列に挿入されていることで特徴付けられる、ウイルスＤＮＡ構築物。
【請求項７】
選択した転写因子結合部位が、原因となる発癌性突然変異によって、活性またはレベルが特異的に増加する転写因子に対するものであることで特徴付けられる、先行する請求項いずれか１項記載のウイルスＤＮＡ構築物。
【請求項８】
構築物の核酸配列が、各遺伝子の発現を調節するために機能可能であるように配置した、選択した転写因子結合部位を含むアデノウイルスゲノムのものに対応することで特徴付けられる、請求項７記載の構築物。
【請求項９】
選択した部位以外の構築物の核酸配列が、アデノウイルスＡｄ５、Ａｄ４０またはＡｄ４１のゲノムのものに対応するか、あるいは、Ａｄ５、Ａｄ４０またはＡｄ４１由来の線維タンパク質をコードするＤＮＡを、所望によりその末端に１５〜２５のリジンを付加して取り込むことで特徴付けられる、先行する請求項いずれか１項記載の構築物。
【請求項１０】
機能するウイルスＲＮＡ搬出能（ｅｘｐｏｒｔ  ｃａｐａｃｉｔｙ）をコードすることで特徴付けられる、先行する請求項いずれか１項記載の構築物。
【請求項１１】
Ｅ１Ｂ  ５５Ｋ遺伝子が機能性であり、そして／または損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）、Ｅ１領域を有する、先行する請求項いずれか１項記載の構築物。
【請求項１２】
野生型部位の代わりに用いる腫瘍特異的転写因子結合部位が、Ｔｃｆ−４、ＲＢＰＪκ、Ｇｌｉ−１、ＨＩＦ１アルファおよびテロメラーゼプロモーター結合部位から選択されることで特徴付けられる、先行する請求項いずれか１項記載の構築物。
【請求項１３】
置換する転写因子結合部位が、発癌性ＡＰＣおよびβ−カテニン突然変異を含有する腫瘍細胞において、選択的に活性化されることで特徴付けられる、先行する請求項いずれか１項記載の構築物。
【請求項１４】
置換部位が、単一または複数のＴｃｆ−４結合部位配列であることで特徴付けられる、先行する請求項いずれか１項記載の構築物。
【請求項１５】
置換した各プロモーター部位に２〜２０のＴｃｆ−４結合部位配列を含むことで特徴付けられる、請求項１４記載の構築物。
【請求項１６】
選択した転写因子の存在下で、Ｅ１Ｂ、Ｅ２およびＥ３タンパク質の１以上の発現を促進するように、Ｅ１Ｂ、Ｅ２およびＥ３オープンリーディングフレームの１以上と共に、機能可能であるように配置した、前記の１以上のさらに選択した転写因子結合部位も有することで特徴付けられる、先行する請求項いずれか１項記載の構築物。
【請求項１７】
構築物の配列が、Ｅ３プロモーターのＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１およびＡＴＦ領域の１以上の残基に突然変異を有するアデノウイルスゲノムのものに対応することで特徴付けられる、先行する請求項いずれか１項記載の構築物。
【請求項１８】
構築物の配列が、Ｅ２後期プロモーターがサイレント突然変異で不活性化されているアデノウイルスゲノムのものに対応することで特徴付けられる、先行する請求項いずれか１項記載の構築物。
【請求項１９】
Ｅ４プロモーターが、ＴｃｆおよびＥ４Ｆ部位に隣接するパッケージングシグナルのＥ１Ａエンハンサーの一部を含有することで特徴付けられる、先行する請求項いずれか１項記載の構築物。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか１項記載のＤＮＡ構築物を含むか、または前記構築物によってコードされるウイルス。
【請求項２１】
療法に使用するための、請求項１〜１９のいずれか１項記載のウイルスＤＮＡ構築物またはウイルス。
【請求項２２】
療法が新生物を有する患者に対するものであることで特徴付けられる、請求項２０または請求項２１記載のウイルスＤＮＡ構築物またはウイルス。
【請求項２３】
腫瘍細胞死を引き起こすことが可能であることで特徴付けられる、請求項１〜２２のいずれか１項記載のウイルス構築物またはウイルス。
【請求項２４】
新生物治療用の医薬品製造における、請求項１〜２３のいずれか１項記載のウイルス構築物またはウイルスの使用。
【請求項２５】
生理学的に許容しうるキャリアーと共に、請求項１〜２３のいずれか１項記載のウイルス構築物またはウイルスを含む、組成物。
【請求項２６】
ウイルス構築物またはそれにコードされるウイルスの存在を除いて、無菌であり、そして発熱物質不含であることで特徴付けられる、請求項２５記載の組成物。
【請求項２７】
キャリアーが生理学的に許容しうる生理食塩水であることで特徴付けられる、請求項２５または２６記載の組成物。
【請求項２８】
請求項１〜２３のいずれか１項記載のようなウイルスＤＮＡ構築物またはそれにコードされるウイルスを製造する方法であって、Ｅ１Ａ、および所望によりＥ４オープンリーディングフレームの転写を調節する１以上の野生型転写因子結合部位を有するウイルスゲノムを、腫瘍特異的転写因子結合部位でこれらの１以上を置換するように形質転換することを含むことで特徴付けられる、前記方法。
【請求項２９】
ウイルスゲノムが、酵母において環状ＹＡＣ／ＢＡＣ中のギャップ修復によってクローニングされることで特徴付けられる、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ゲノムが２工程遺伝子置換によって修飾されることで特徴付けられる、請求項２８または２９記載の方法。
【請求項３１】
ウイルス構築物ＤＮＡを産生するため、修飾ゲノムを原核生物に移すことで特徴付けられる、請求項２８、２９または３０記載の方法。
【請求項３２】
ウイルスを産生するため、請求項２８〜３１のいずれか１項記載の方法によって産生されるウイルス構築物ＤＮＡを哺乳動物細胞に移すことで特徴付けられる、ウイルス製造法。
【請求項３３】
新生物の治療が必要な患者を治療する方法であって、請求項１〜２３のいずれか１項記載のウイルスＤＮＡ構築物またはウイルスに、新生物組織を含むかまたは新生物組織に限定される患者組織を感染させ、そしてこうした新生物細胞が殺されるように、ウイルス複製を可能にする、前記方法。
【請求項３４】
患者が結腸細胞由来腫瘍の治療が必要な患者であることで特徴付けられる、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
結腸細胞由来腫瘍が、患者の肝臓に位置する転移であることで特徴付けられる、請求項３４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、腫瘍、特に結腸細胞由来の腫瘍、より詳細には結腸細胞原発腫瘍の転移である肝臓腫瘍などの新生物の治療に適用を有するウイルス剤を提供する。さらにより詳細には、複製適格であり、そして特に複製の効率がよく、腫瘍細胞に存在する転写活性化因子に反応して選択的に複製するアデノウイルス構築物であって、これらの転写活性化因子が、他の細胞に比較して、腫瘍細胞において、排他的にまたは上昇したレベルいずれかで存在し、そしてしたがって腫瘍細胞死および細胞溶解を導く、前記構築物を提供する。
【０００２】
本発明のウイルス剤を、肝臓に局所的に注入することによって、結腸癌患者における死亡率の主要な原因である肝臓転移を治療することが可能である。これを越える適用、例えば結腸直腸癌および黒色腫などの他の部位および他の腫瘍への適用もまた、提供する。
【０００３】
腫瘍細胞において選択的に複製するウイルスは、腫瘍細胞がすべて破壊されるまで腫瘍全体に進行性に広がることが可能であるため、癌の遺伝子療法に多大な潜在能力を有する。ウイルスは、原則として、残る腫瘍細胞がなくなるまで産生され続け、新たなウイルスの放出に際して腫瘍細胞を溶解するため、慣用的な置換遺伝子療法（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）で主要な限界となる、ウイルス注入時点ですべての腫瘍細胞を感染させなくてはならないという必要性の問題を克服する。したがって、癌遺伝子療法における重要な基本的相違は、非複製ウイルスを用いた単一ヒットアプローチ、および複製ウイルスを用いた多数ヒットアプローチ間の相違である。
【０００４】
実際、免疫系が感染を停止するまで、ウイルスでの再感染は数周期しか起こり得ない。感染１周期であっても、腫瘍内でウイルス濃度が局所的に大量に増加し、非複製ウイルスを注入するより、はるかに少ない量の複製ウイルスを注入しても、腫瘍細胞の同レベルの感染を達成することが可能になる。アデノウイルスの毒性は、注入したウイルスの量に非常に関連するため、複製ウイルスを用いた場合、直ちに生命を脅かす反応が起こるリスクは、潜在的にはるかに低い。
【０００５】
プロトタイプの腫瘍選択性ウイルスは、Ｅ１Ｂ  ５５Ｋ遺伝子を欠く欠陥アデノウイルス（ｄ１  １５２０／ＯＮＹＸ  ０１５、Ｂｉｓｃｈｏｆｆら、１９９６）である。正常アデノウイルスにおいて５５Ｋはｐ５３を不活性化するため、ｐ５３が突然変異体である細胞では、５５Ｋは必要でないはずである。実際は、野生型ｐ５３を含有する多くの細胞が、該ウイルスに殺される（Ｈｅｉｓｅら、１９９７）。本発明者らは、テトラサイクリン制御プロモーター下で野生型ｐ５３を含有するＨ１２２９  ｐ５３ヌル肺癌細胞において、これを試験し、そしてｄ１  １５２０が野生型ｐ５３の非存在下と同程度にｐ５３の存在下でも複製することを見出した。ｐ５３ターゲティングに加え、Ｅ１Ｂ  ５５Ｋは、選択的ウイルスＲＮＡ搬出（ｅｘｐｏｒｔ）に必要とされ（Ｓｈｅｎｋ、１９９６）、そしてｐ５３の欠失が、この機能をどのように置換可能であるかは直ちには明らかでない。現在、ｄ１  １５２０がｐ５３欠損体をターゲティングするという説得力のある証拠はない（Ｇｏｏｄｒｕｍ  １９９７、Ｇｏｏｄｒｕｍ  １９９８、Ｈａｌｌ  １９９８、Ｒｏｔｈｍａｎ  １９９８、Ｔｕｒｎｅｌｌ  １９９９）。
【０００６】
ｐ５３発現ウイルスでのように、化学療法およびｄ１  １５２０を用いた併用療法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび異種移植でより優れた結果を生じる（Ｈｅｉｓｅら、１９９７）。原則として、ウイルスは残る腫瘍細胞がなくなるまで、複製を多数周期繰り返すはずであり、そして各感染細胞が１０3〜１０4の新たなウイルス粒子を生じるため、投入ウイルス量は限定されないはずである。実際は、注入するｄ１  １５２０ウイルスの必要量は、ｐ５３補充ウイルスであるＡｄ−ＣＭＶ−ｐ５３を用いた療法に匹敵する。これは、該ウイルスが、やはりおそらく非常に複雑な理由で、複製ウイルスに関して期待されるようには機能していないことを意味する。
【０００７】
Ｅ２Ｆに制御されるような、初期遺伝子発現欠陥をターゲティングすることも可能であるが、これは、アデノウイルスがその生活環の一部として、すでにＥ２Ｆをターゲティングするタンパク質（Ｅ１ＡおよびＥ４  ｏｒｆ  ６／７）を産生しているという事実によって複雑になる。Ｅ１Ａおよびｏｒｆ  ６／７は、多機能タンパク質であるため、Ｅ１Ａおよびｏｒｆ  ６／７の突然変異の影響は複雑で、そして予測不能である。
【０００８】
Ｅ２Ｆおよびｐ５３に加え、腫瘍において活性が増加することが知られる、４つの転写因子がある。これらは、ｗｎｔ、ノッチ（ｎｏｔｃｈ）およびヘッジホッグ（ｈｅｄｇｅｈｏｇ）シグナル伝達経路の終点に相当する、Ｔｃｆ４、ＲＢＰＪκおよびＧｌｉ−１（Ｄａｈｍａｎｅら、１９９７；Ｊａｒｒｉａｕｌｔら、１９９５；ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇら、１９９７）、並びにフォンヒッペル・リンダウ腫瘍抑制遺伝子の突然変異によって安定化されるＨＩＦ１アルファ（Ｍａｘｗｅｌｌら、１９９９）である。ＡＰＣまたはβ−カテニンにおける突然変異は、結腸癌において普遍的な欠陥である（Ｋｏｒｉｎｅｋら、１９９７；Ｍｏｒｉｎら、１９９７）；が、これらはまた、黒色腫などの他の腫瘍でも、より低い頻度で生じる（Ｒｕｂｉｎｆｅｌｄら、１９９７）。こうした突然変異は、罹患細胞において、Ｔｃｆ活性増加を導く。ヘッジホッグ経路は、基底細胞癌における、ｐａｔｃｈｅｄおよびｓｍｏｏｔｈｅｎｅｄタンパク質の突然変異によって活性化される（Ｓｔｏｎｅら、１９９６；Ｘｉｅら、１９９８）。ノッチ突然変異はいくつかの白血病で生じる（Ｅｌｌｉｓｅｎら、１９９１）。テロメラーゼ活性化は、癌の１つの著しい特徴（ｈａｌｌｍａｒｋ）であり（Ｈａｎａｈａｎ  Ｄ．およびＷｅｉｎｂｅｒｇ  ＲＡ．  Ｔｈｅ  ｈａｌｌｍａｒｋｓ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｅｌｌ．  １００，  ５７−７０，  ２０００）、そして該活性化は、テロメラーゼプロモーター活性の増加から生じるが、その機構は未知である。Ｃｏｎｇ  ＹＳら（１９９９，  ＨＭＧ  ８，  １３７−４２）によれば、プロモーター活性に関与する要素が、遺伝子のＡＴＧの３３０ｂｐ上流から第二のエクソンに渡る領域内に含有され、そしてしたがって、この配列は、本発明のウイルス構築物およびウイルスにおいて使用するのに適した、さらなるプロモーター配列である。
【０００９】
本明細書に援用される同時係属ＷＯ  ００／５６９０９は、腫瘍特異的転写因子の活性化、特にｗｎｔシグナル伝達経路の活性化に反応して複製するアデノウイルスを記載する。Ｗｎｔシグナル伝達は、実質的にすべての結腸腫瘍で病的に活性化され、そしてこれがＴｃｆ結合部位を含有するプロモーターからの転写を導く。ｗｎｔ経路の恒常的な活性化は、ＡＰＣ、アキシンおよびβ−カテニン遺伝子の突然変異によって引き起こされ、こうしてβ−カテニンのＧＳＫ−３βのリン酸化、およびそれに続くプロテアソームによる分解を阻害する（３４）。細胞質β−カテニンは核に進入し、ここでＴｃｆ／Ｌｅｆ転写因子ファミリーのメンバーと会合し、そしてｃ−ｍｙｃ、サイクリンＤ１、Ｔｃｆ１およびマトリリシンなどのｗｎｔターゲット遺伝子の転写を活性することが可能である。
【００１０】
ＷＯ／００／５６９０９は、Ｔｃｆ結合部位が、ウイルス複製遺伝子の発現を制御するアデノウイルスＥ２プロモーター中に配置されている、ウイルス構築物を記載する。ウイルスまたは細胞の別の箇所の突然変異で、ウイルス複製におけるＥ２遺伝子産物の絶対的必要性を回避することは不能である。Ｅ２転写の緊密な制御を達成するため、隣接するＥ３エンハンサーもまた突然変異させた。Ｔｃｆ部位はまた、Ｅ１Ｂプロモーター中にも配置されたが、達成される制御のレベルは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのウイルス複製に影響を与えなかった。これらの「Ｔｃｆ」ウイルスは、非許容性細胞株において、５０〜１００倍の複製減少を示し、一方、その活性は、多くの結腸癌細胞株における野生型Ａｄ５に匹敵した。
【００１１】
本発明者らは、ここに、いくつかの結腸細胞株が、ＷＯ  ００／５６９０９の腫瘍特異的ウイルスに半許容性でしかなく、このため、これらの構築物のウイルスゲノムを改変し、ウイルスの有効活性の広さを増加させて、これらの細胞を含むことが望ましいことを見出した。こうした拡張はまた、例えば肝細胞癌腫およびいくつかの乳癌、Ｂ細胞癌、Ｔ細胞癌、膵臓癌、子宮内膜癌および卵巣癌などの、Ｔｃｆ経路が関与する他の腫瘍に対する有効性を増加させるとも予測可能であろう。
【００１２】
本発明は、結腸細胞株のより広い範囲で活性であるウイルスを生成する２つの異なるアプローチを試験した：（ｉ）Ｅ１Ａプロモーター領域における腫瘍特異的部位（例えば上述のようなＴｃｆ部位）の挿入、および（ｉｉ）Ｅ１Ａにおけるｐ３００結合部位の突然変異。野生型Ｅ１Ａエンハンサーは、パッケージングシグナルと重複する、ＩおよびＩＩと称される２種類の制御要素を含有する（図１を参照されたい）。要素ＩおよびＩＩに加え、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）中で、そしてＥ１Ａ  ＴＡＴＡボックス近くに、転写因子結合部位がある。
【００１３】
Ｅ１Ａのアミノ末端は、一般的な転写因子として機能するヒストンアセチラーゼであるｐ３００に結合するＥ１Ａの領域を含有する。Ｅ１ＡはＡＴＦ部位を含有するプロモーターを活性化する。ＷＯ  ００／５６９０９ウイルスｖＭＢ１３は、Ｅ３プロモーターのＡＴＦ部位を保持し、この点で利点を提供する。問題は、プロモーターがＡＴＦ部位を持たなければ、ｐ３００が結合することによって、Ｅ１Ａが該プロモーターを抑制するであろう点である。例えば：Ｅ１Ａは、Ｅ１Ａ中のｐ３００結合部位を必要とする方式で、ｐ５３に依存する転写を遮断する。いくつかの細胞株では、Ｅ１ＡによりＴｃｆが抑制される可能性があり、したがって、Ｔｃｆを細胞ターゲティングに使用する治療には、Ｅ１Ａのｐ３００結合部位の突然変異が好ましい可能性がある。
【００１４】
本発明者らは、先に開示された、ＨＣＴ１１６細胞におけるｖＭＢ１３およびｖＭＢ１４の間に相違があることを見出しているが、２つのウイルスの唯一の相違は、Ｅ３プロモーターにおけるＡＴＦ部位中にある。したがって、ｖＭＢ１４において、Ｅ１Ａのｐ３００結合部位を突然変異させると、好適である可能性がある。あるいは、Ｘｕ  Ｌら（２０００，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４，  ５８５−５９５）が、機構が未知であるものの、ＡＴＦ／ＣＲＥＢ部位がｗｎｔシグナルによって活性化可能であることを報告しているため、相違は、ＡＴＦ部位の直接の活性化のためである可能性がある。
【００１５】
したがって、本発明の第一の側面において、ヒト腫瘍細胞または動物腫瘍細胞において複製可能であり、そして好ましくはこうした腫瘍細胞の死を引き起こすアデノウイルスをコードするウイルスＤＮＡ構築物であって、選択した転写因子の存在下で、Ｅ１Ａタンパク質の発現を促進するように、Ｅ１Ａオープンリーディングフレームと共に、機能可能であるように配置した、前記の１以上の選択した転写因子結合部位を含み、該転写因子のレベルまたは活性が、同一種の正常ヒト細胞または正常動物細胞、すなわち前記転写結合部位を欠く細胞のものに比較して、ヒト腫瘍細胞または動物腫瘍細胞において増加していることで特徴付けられる、前記ウイルスＤＮＡ構築物を提供する。好ましくは、該ウイルス構築物は、腫瘍細胞死を直接引き起こすであろうウイルスをコードするが、他の態様では、該構築物はウイルスと共に、アジュバントとして好適に作用する、ワクチンなどのタンパク質をコードすることが可能である。
【００１６】
好ましくは、ウイルスＤＮＡ構築物は、野生型ウイルス配列のものに対応する核酸配列を有し、該核酸配列は、野生型Ｅ１Ａ転写因子結合部位のすべてまたは一部が、１以上の選択した転写因子結合部位で置換されていることで特徴付けられる。より好ましくは、野生型Ｅ１Ａエンハンサーはその通常の位置から欠失されているか、または例えば突然変異によって、不活性化されている。
【００１７】
構築物のパッケージング能を維持するため、好ましくは、野生型パッケージングシグナルを、野生型部位（Ａｄ５中の左側の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）近傍）から欠失させ、そしていずれかの向きで、構築物中の別の箇所に挿入する。好ましくは、パッケージングシグナルは、右側の末端反復配列に隣接して、好ましくは前記ＩＴＲから６００ｂｐ以内に挿入される。
【００１８】
好ましくは、Ｅ４プロモーターは、ＴｃｆおよびＥ４Ｆ部位に隣接するパッケージングシグナルのＥ１Ａエンハンサーの一部を含有する。
さらにより好ましくは、複製中、左側のＩＴＲと塩基対形成するのを可能にするのに十分な対称性を提供するように、１以上の選択した転写因子結合部位が右側の末端反復配列に挿入される。
【００１９】
ＷＯ／００／５６９０９から、選択した転写因子結合部位は、好適に、原因となる発癌性突然変異によって、活性またはレベルが特異的に増加する転写因子に対するものであることが理解されるであろう。
【００２０】
好ましくは、核酸配列は、各Ｅ１Ａ遺伝子の発現を調節するために機能可能であるように配置した、選択した転写因子結合部位を含むアデノウイルスゲノムのものに対応する。ＷＯ  ００／５６９０９のウイルスでのように、該構築物は、好適に、選択した部位以外はアデノウイルスＡｄ５、Ａｄ４０またはＡｄ４１のゲノムのものに対応する核酸配列を有するか、あるいは、Ａｄ５、Ａｄ４０またはＡｄ４１由来の線維タンパク質をコードするＤＮＡを、所望によりその末端に１〜３０、より好ましくは５〜２５、例えば１５〜２５のリジンを付加して取り込むことが可能である。
【００２１】
好ましい構築物は、機能するウイルスＲＮＡ搬出能（ｅｘｐｏｒｔ  ｃａｐａｃｉｔｙ）をコードし、例えばこれらは、Ｅ１Ｂ  ５５Ｋ遺伝子が機能性であるか、そして／または損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）、Ｅ１領域を有する。
【００２２】
野生型部位の代わりに用いる、好ましい腫瘍特異的転写因子結合部位は、Ｔｃｆ−４、ＲＢＰＪκ、Ｇｌｉ−１、ＨＩＦ１アルファおよびテロメラーゼプロモーター結合部位から選択される。好ましい転写因子結合部位は、発癌性ＡＰＣおよびβ−カテニン突然変異を含有する腫瘍細胞において、選択的に活性化され、例えば置換部位は、単一または複数のＴｃｆ−４結合部位配列であり、例えば、置換した各プロモーター部位に２〜２０のＴｃｆ−４結合部位配列を含む。
【００２３】
Ｅ１Ａ  ｏｒｆの調節の本質的な置換に加えて、１以上の、さらに選択した転写因子結合部位もまた、前記の選択した転写因子の存在下で、Ｅ１Ｂ、Ｅ２およびＥ３タンパク質の発現を促進するように、Ｅ１Ｂ、Ｅ２およびＥ３オープンリーディングフレームの１以上と共に、機能可能であるように配置することが可能である。やはり好ましいのは、Ｅ３プロモーターのＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１およびＡＴＦ領域の１以上の残基における突然変異である。好ましくは、Ｅ２後期プロモーターもまた、サイレント突然変異で不活性化されている。
【００２４】
上述のＤＮＡ構築物に含まれるかまたはコードされるウイルスもまた提供する。
さらなる側面において、療法に、特に新生物を有する患者の療法に使用するための、本発明のウイルスＤＮＡ構築物またはウイルスを提供する。
【００２５】
さらなる側面において、新生物治療用の医薬品製造において、本発明のウイルスＤＮＡ構築物またはウイルスを提供する。
本発明のさらなる側面において、生理学的に許容しうるキャリアーと共に、本発明のウイルス構築物またはウイルスを含む療法組成物を提供する。特に、組成物は、ウイルス構築物またはそれにコードされるウイルスの存在を除いて、無菌であり、そして発熱物質不含であることで特徴付けられる。例えばキャリアーは生理学的に許容しうる生理食塩水であることが可能である。
【００２６】
さらなる側面において、本発明によって提供されるようなウイルスＤＮＡ構築物またはそれにコードされるウイルスを製造する方法であって、Ｅ１Ａ、および所望によりＥ４オープンリーディングフレームの転写を調節する１以上の野生型転写因子結合部位を有するアデノウイルスゲノムを、腫瘍特異的転写因子結合部位でこれらの１以上を置換するように形質転換することを含むことで特徴付けられる、前記方法を提供する。好ましい方法は、酵母において環状ＹＡＣ／ＢＡＣ中のギャップ修復によって、ウイルスゲノムをクローニングする。好ましくは、ゲノムは、ＩＴＲ近傍の配列を修飾するため、突然変異体ベクターへのギャップ修復によって、または内部配列を修飾するため、２工程遺伝子置換によって修飾される。例えば、ウイルス構築物ＤＮＡを産生するため、修飾ゲノムを原核生物に移すことが可能である。好ましくは、ウイルスを産生するため、ゲノムを哺乳動物細胞に移す。
【００２７】
本発明のさらなる側面において、新生物を患う患者を治療する方法であって、本発明のウイルスＤＮＡ構築物またはウイルスに、新生物組織を含むかまたは新生物組織に限定される患者組織を感染させ、そしてこうした新生物細胞が殺されるように、ウイルス複製を可能にする、前記方法を提供する。
【００２８】
ウイルスに駆動される、緊密に制御される腫瘍特異的転写因子を産生するため、Ｔｃｆ−Ｅ１Ａプロモーターなどの突然変異体Ｅ１Ａプロモーターを導入する必要がある。これを達成するため、本発明者らは、ウイルスの左側の逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）の一部を腫瘍特異的プロモーター、例えばＴｃｆ結合部位で置換した。より好ましくは、Ｅ１Ａエンハンサーを野生型の位置から、部分的に、または全長（ｉｎ  ｆｕｌｌ）で、より好ましくは完全に欠失させる。最も好ましくは、パッケージングシグナルを左側ＩＴＲ近傍のその野生型部位から、ウイルスのパッケージングを可能にするのになお有効なウイルスゲノムの別の部分に移動させる。これは、好ましくは、右側ＩＴＲに隣接して、より好ましくは右側ＩＴＲから６００ｂｐ以内に、該シグナルを移動させる。パッケージングシグナルは、どちらの向きで移動させることも可能である。
【００２９】
プロモーターに特異的な腫瘍転写因子は、都合よくは、１以上のＴｃｆ結合部位、より好ましくは２〜１０、さらにより好ましくは３〜５のＴｃｆ部位をタンデムに含む。最も好ましくは、４つのＴｃｆ結合部位が、左側部位のＩＴＲの一部、Ｅ１Ａエンハンサーおよびパッケージングシグナルを置換する一方、右側ＩＴＲに隣接してパッケージングシグナル配列が導入され、ウイルスＤＮＡの適切なキャプシド形成を可能にする。
【００３０】
末端反復配列の対称性を維持するため、右側置換が特に望ましく、したがって、左ＩＴＲに提供されるのと同様のまたは同一の数の腫瘍特異的転写因子結合部位を右ＩＴＲに挿入して、これらの部位が複製中に共に塩基対形成するのを可能にする。これらの挿入は、好ましくは、左側変化と同様に、置換であることが理解されるであろう。
【００３１】
腫瘍特異的プロモーターに依存する転写、例えばＴｃｆ部位を用いた転写は、Ｅ１Ａに阻害されるため、本発明者らはまた、転写アッセイにおいて、この抑制を廃するであろうＥ１Ａタンパク質の突然変異も調べた。Ｅ１Ａにおけるｐ３００結合部位の突然変異は、部分的にこの抑制を軽減するが、ウイルスの背景において、この突然変異は、Ｔｃｆ−Ｅ２プロモーターからの転写増加を導かず、そして実際、ウイルスの活性を減少させた。Ｅ１Ａアミノ末端の突然変異による同様の弱毒化が、Ｏｎｙｘのグループによって報告されている。対照的に、現在、驚くべきことに、Ｅ１ＡおよびＥ４プロモーターにおいてのみ転写因子結合部位変化を含有するウイルス（例えば本明細書の実施例中のｖＣＦ１１を参照されたい）は、活性ｗｎｔシグナル伝達を持つ細胞に選択的であり、そして調べた結腸癌細胞の大部分で活性であることが決定されている。
【００３２】
好ましくは、本発明のウイルスにはまた、Ｅ２オープンリーディングフレームのプロモーター中に、そしてより好ましくは、本明細書に援用される同時係属特許ＷＯ  ００／５６９０９に記載されるようなＥ３オープンリーディングフレームのプロモーター中にもまた、腫瘍特異的転写因子結合部位が含まれる。
【００３３】
本発明の好ましいウイルスにおけるＴｃｆ部位は、Ｔｃｆ−Ｅ１Ａプロモーターにおいて、ＴＡＴＡボックスに隣接するが、Ｅ４  ＴＡＴＡボックスの数百塩基対上流にある。無関係なシグナルが干渉する可能性が最小限であるＥ１Ａプロモーターを生成するため、本発明の好ましい構築物およびウイルスの１つ、ｖＣＦ１１において、正常なＥ１Ａ制御要素すべてを野生型の位置から欠失させた。
【００３４】
この戦略は、完全なＥ１Ａエンハンサーを保持するが、該エンハンサーおよびＥ１Ａ開始部位の間に外因性プロモーターを配置した、前立腺、肝細胞癌および乳癌ターゲティングウイルスを産生するのに用いられた、先行技術のアプローチとは対照的である。ｖＣＦ１１中のＥ１Ａエンハンサーを取り除くため、ウイルスパッケージングシグナルを右ＩＴＲに移すことが必要であった。さらに、右側ＩＴＲのおよそ半分をＴｃｆ部位で置換した。この構築物は、Ｅ４開始部位に比較したＴｃｆ部位の位置を決定した。
【００３５】
Ｔｃｆ−Ｅ４プロモーターを最適化するため、さらなるＴｃｆ部位をＥ４開始部位により近くに挿入するか、または内因性Ｅ４調節要素を欠失させることが可能であろう。後者は、正常細胞におけるＥ４転写の抑制を与えるため、ｖＣＦ１１中で保持された。したがって、突然変異体Ｅ４プロモーターは、ＴｃｆおよびＥ４Ｆ部位に隣接したプロモーターを活性化可能であり、正常細胞では該プロモーターを抑制するはずの、パッケージングシグナルに含有されるＥ１Ａエンハンサーの一部を含有する。これらの変化全体の結果として、細胞種にかかわりなく、ルシフェラーゼアッセイによって測定されるＥ４転写が減少する。
【００３６】
ＷＯ  ００／５６９０９の先の世代のウイルスの複製は、主に、Ｅ２プロモーター中のＴｃｆ部位によって、ｗｎｔシグナル伝達が活性化された細胞で指示される。複数の初期プロモーターにＴｃｆ部位を有する、本発明のウイルス、ｖＣＦ２２、６２および８１は、非常に選択的であるが、比較的弱毒化されている。初期プロモーターすべてに突然変異を所持するウイルスでは、細胞変性効果アッセイにおいて活性の減少が見られるが、これは、シスの初期単位すべての転写を活性化すると先に報告された、Ｅ１Ａエンハンサー中の要素ＩＩの欠失のためである可能性がある。
【００３７】
異なるウイルスの比較によって、Ｔｃｆ−Ｅ１ＡプロモーターおよびＴｃｆ−Ｅ２プロモーターが、一団の結腸細胞株において、同一の活性階層を示すが、対応する野生型プロモーターに比較すると、Ｔｃｆ−Ｅ１Ａプロモーターは、Ｔｃｆ−Ｅ２プロモーターより活性であることが示される。これはおそらく、Ｃｏ１１５細胞において、なぜ、ｖＣＦ１１が、ｖＭＢ１９（ＷＯ  ００／５６９０９を参照されたい）より優れて複製可能であるかを説明する。
【００３８】
実質的に全スペクトルの活性を有するウイルスを産生するため、半許容性結腸細胞において、はるかにより高い活性を持つＴｃｆ−Ｅ２プロモーターを構築するのに、Ｔｃｆを用いて複数の初期プロモーターを制御することが望ましい。いくつかの細胞株において、Ｔｃｆ活性が減少することを説明する可能性がある、ありうる相違には、グルーチョ（ｇｒｏｕｃｈｏ）およびＣｔＢＰのような補抑制体の発現増加、ｐ３００およびＣＢＰ、ピゴパス（ｐｙｇｏｐｕｓ）、Ｂｃｌ  ９のような活性化補助因子の発現減少、β−カテニン結合またはＤＮＡ結合を防止する、Ｔｃｆ４のアセチル化またはリン酸化、および△Ｎ−Ｔｃｆ１陰性フィードバックループの活性増加が含まれる。
【００３９】
ルシフェラーゼレポーターアッセイは、Ｅ１ＡによってＴｃｆに依存する転写が体系的に阻害されることを示す。Ｅ１Ａ中の突然変異誘発によって、この効果が、部分的に、Ｅ１Ａによるｐ３００の阻害のためであることが示され、これはｐ３００がβ−カテニンの活性化補助因子であるという報告と一致する。Ｅ１Ａと共にｐ３００を同時発現すると、Ｔｃｆに依存する転写に対して、Ｅ１Ａ中のｐ３００結合部位を欠失させたのと同一の効果があり、これは、残りの抑制が、ｐ３００の阻害によるようではないことを示した。Ｅ１Ａの残りの抑制効果は、既知のドメインいずれにもマッピング不能であり、そしてさらに研究する価値がある。ＣＲ１  ｐ３００結合サブドメインの欠失のみで、Ｔｃｆに依存する転写が部分的に回復したため、△ＣＲ１突然変異体で得たネガティブな結果は、驚くべきことである。これは、あるいは、△ＣＲ１  Ｅ１Ａにより、ウミシイタケ（ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ調節の転写が人工的に上昇することによって説明可能であるが、よりありうる説明は、ＣＲ１ドメイン全体の欠失によって、Ｅ１Ａの別の機能が損なわれるというものである。
【００４０】
第一世代ウイルス中のＥ１Ａによる、ＴｃＦに依存する転写の阻害は、Ｃｏ１１５のような半許容性細胞株において、最大であり、これらの細胞では、Ｔｃｆ活性の出発レベルもまた、より低いため、非常に低いルシフェラーゼ活性を生じた。したがって、我々は、該ウイルスの背景において、△２−１１  Ｅ１Ａ突然変異の実質的な効果が見られると期待した。実際には、突然変異は、結腸細胞株において、Ｔｃｆプロモーターからの発現を増加させず、そして細胞変性効果アッセイにおいて、ウイルスの活性を減少させた。該突然変異は、バーストアッセイにおいて、複雑で、そして一貫しない影響を有した：この突然変異は、Ｅ２プロモーターがＥ１Ａ（すなわち野生型）に駆動された場合、許容性細胞において、バーストサイズを減少させるが、Ｅ２プロモーターがＴｃｆに駆動された場合、いくつかの非許容性細胞において、バーストサイズを増加させるようであった。一般的な説明は、このＥ１Ａ突然変異によるＴｃｆ活性のいかなる獲得も、他のＥ１Ａ活性の喪失によって相殺されたというものである。我々は１２Ｓ  Ｅ１Ａしか試験していないため、これらの機能が、ウイルス感染中に発現される、他のＥ１Ａアイソフォームにマッピングされる可能性がある。さらに、△２−１１突然変異によって抑止される可能性がある、Ｅ１Ａに制御されるいくつかの基本プロモーター活性がある。
【００４１】
調べた大部分の突然変異体ウイルス、ｖＣＦ６２は、Ｅ１Ａが通常、それを通じてウイルスを調節する転写反応要素（Ｅ１Ａ、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４プロモーター中のＡＴＦ部位；Ｅ２プロモーター中のＥ２Ｆ部位）の多くを欠き、そしてバーストアッセイおよび細胞変性効果アッセイ両方で、半許容性細胞の活性の多大な減少を示した。
【００４２】
好ましくは、ウイルスＤＮＡ構築物は、機能するウイルスＲＮＡ搬出能をコードすることで特徴付けられる。アデノウイルスに関しては、これはＥ１およびＥ４領域、特にＥ１Ｂ  ５５ＫおよびＥ４  ｏｒｆ６遺伝子にコードされる。したがって、好ましくは、コードされるウイルスは、腫瘍細胞におけるこれらの遺伝子の発現に関して、野生型であるものである。最も好ましくは、Ｅ１Ｂ  ５５ＫおよびＥ４  ｏｒｆ６オープンリーディングフレームは、対応する野生型ウイルスに存在する場合、機能性であり、そして／または損なわれていない。
【００４３】
好ましい結腸腫瘍特異的アデノウイルスは、Ａｄ５、または上述のように修飾された１以上の腸内アデノウイルスＡｄ４０およびＡｄ４１のＤＮＡ配列に対応するウイルスＤＮＡ構築物にコードされる。ＡＴＣＣから入手可能なＡｄ４０およびＡｄ４１は、結腸細胞に対して選択的であり、そしてＡｄ５に対する１つの重要な相違は、さらなる線維タンパク質があることである。該線維タンパク質は、Ａｄ５に対するコクサッキー−アデノ受容体またはＣＡＲと呼ばれる、細胞ターゲット宿主表面受容体に結合する。結腸細胞は、Ａｄ５が感染するように適応させた肺細胞より少ないＣＡＲを有する。Ａｄ４０およびＡｄ４１は２つの線維タンパク質を有し、これらは２つの異なる受容体を使用可能である可能性がある。ウイルス療法に対する耐性の予期される形式は、受容体の喪失であり、これは明らかに感染を防止する。腫瘍における遺伝子不安定度は、これがある適度な頻度；１億細胞中の約１、１０8中の１の突然変異率で生じるであろうことを意味する。２つの受容体を欠失させる場合は、確率を乗じる；すなわち両方の欠失は１０16細胞中の１で生じるであろう。腫瘍は、１０9〜１０12細胞を含有する。したがって、ウイルスが１以上の受容体を使用する場合、耐性が発展する可能性はより低い。Ａｄ４０および４１の一方の線維タンパク質はＣＡＲを使用し、一方、他方の線維タンパク質に用いられる受容体は未知である。
【００４４】
好適には、肝臓転移などの新生物を治療するための、本発明の構築物、特にそれにコードされるウイルスの形の構築物の使用は、ウイルスが効果的な複製に補助されて、肝臓内によく広がるならば、化学療法に比較して、相対的に非毒性である。
【００４５】
野生型部位の代わりに用いる、好ましい腫瘍特異的転写因子結合部位は、上にＴｃｆ−４、ＨＩＦ１アルファ、ＲＢＰＪκおよびＧｌｉ−１部位と記載されるもの、並びに腫瘍特異的転写を与えるテロメラーゼプロモーターの断片である。
【００４６】
最も好ましい転写因子結合部位は、ＵＳ  ５，８５１，７７５においてＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎらに記載されるようなＴｃｆ−４に結合し、そしてヘテロ二量体β−カテニン／Ｔｃｆ−４転写因子に反応性であるものである。こうしたものとして、転写因子結合部位は、ＡＰＣまたはβ−カテニン突然変異に引き起こされるβ−カテニンレベルの増加に反応して、遺伝子の転写を増加させる。テロメラーゼプロモーターは、Ｗｕ  ＫＪ．ら（１９９９，  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２１，  ２２０−４）およびＣｏｎｇ  ＹＳ．ら（１９９９  ＨｕｍＭｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ８，  １３７−４２）に記載される。さらなる好ましい結合部位は、Ｍａｘｗｅｌｌ  ＰＨ．ら（１９９９  Ｎａｔｕｒｅ  ３９９，  ２７１−５）に記載されるようなＨＩＦ１アルファのものである。腫瘍の低酸素領域をターゲティングするのに、ＨＩＦ１アルファが制御するウイルスを使用することが可能であり、これは低酸素に対する正常な生理学的反応であるため、経路の突然変異を伴わず、あるいは、同じウイルスを用いて、家族性ＶＨＬ癌症候群、またはやはりＶＨＬ突然変異を有する散在性腎細胞癌いずれかにおいて、ＶＨＬ突然変異を持つ細胞をターゲティングすることが可能である。ＨＩＦプロモーターを用いて、虚血における低酸素状態をターゲティングするレトロウイルスがすでにＢｏａｓｔ  Ｋ．ら（１９９９  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０，  ２１９７−２０８）に記載されている。
【００４７】
特に、本発明者らは、ここで、Ｅ１Ａ、および所望によりＥ４の上述のオープンリーディングフレームと機能可能な関係にある、上述のＴｃｆ転写因子結合部位を、特にそのプロモーター中の野生型転写因子結合部位の代わりに含有する、ウイルスＤＮＡ構築物およびそれにコードされるウイルスを提供し、そしてこれらが発癌性ＡＰＣおよびβ−カテニン突然変異を含有する腫瘍細胞に選択的であることを示した。Ｔｃｆ−４およびそのヘテロ二量体は、本明細書においてＴｃｆと称する部位に結合する。こうした好ましい置換部位は、単一または複数のＴｃｆ結合配列であり、例えば２〜２０、より好ましくは２〜６、最も都合よくは２、３または４のＴｃｆ部位を含有する。
【００４８】
特定のＴｃｆ部位は、コンセンサス配列（Ａ／Ｔ）（Ａ／Ｔ）ＣＡＡ（Ａ／Ｔ）ＧＧのものであり、これに関してはＲｏｏｓｅ，  Ｊ．およびＣｌｅｖｅｒｓ，  Ｈ．（１９９９  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４２４，  Ｍ２３−３７）を参照されたいが、より好ましくは、本明細書の実施例に示すとおりである。
【００４９】
本発明のウイルス構築物およびウイルスの好ましい群は、Ｅ２  ｏｒｆと、そしてより好ましくは、Ｅ３  ｏｒｆとも機能する関係にある、さらに選択した転写因子結合部位を有するものである。好ましくは、Ｅ３プロモーターを含有するＶＩＩＩ領域は、Ｅ３プロモーターのＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１および／またはＡＴＦ領域中の１以上の残基に突然変異を有し、より好ましくは、Ｅ３プロモーター活性に引き起こされるＥ２遺伝子転写を減少する突然変異を有することで特徴付けられる。本発明者らは、特に、いかなるウイルスタンパク質の予測されるタンパク質配列も改変しないが、重要なウイルスプロモーターの活性を改変するような、サイレント突然変異を提供した。
【００５０】
ＮＦκＢは、再生肝臓細胞、すなわち肝細胞で強く誘導される（Ｂｒｅｎｎｅｒら  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０１  ｐ８０２−８１１を参照されたい）。転移の治療が成功した後には、腫瘍がなくなった後の空間を満たす肝臓再生が起こる可能性がある。さらに、分裂する正常肝細胞の背景で生じる肝癌を治療しようと望むならば、ＮＦκＢ部位を破壊するのが好適である可能性がある。
【００５１】
Ｅ１Ａは、通常、ＡＴＦ部位を通じてＥ２プロモーターを活性化する。こうしたターゲティングの非存在下では、Ｅ１Ａは、例えばｐ３００／ＣＢＰをキレートすることによって、プロモーターを抑制する。ＡＴＦ部位が突然変異体Ｅ２プロモーターにおいて欠失している場合、ウイルスに産生されるＥ１Ａは、すべての細胞種における突然変異体Ｅ２プロモーターの一般的な漏れやすさを減少させるはずである。Ｅ３プロモーターはＥ２プロモーターと連続しており、そしてこれらの間の差異が定義されているが、機能的には恣意的である（ａｒｂｉｔｒａｒｙ）。したがって、Ｅ３プロモーター中の転写因子結合部位を修飾するかまたは欠失させることによって、突然変異体Ｅ２プロモーターの活性がさらに減少する可能性がある。Ｅ３プロモーターはコード配列中にあるため、これを単に除去することは不可能である。その代わり、本発明者らは、既知のＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１およびＡＴＦ部位の必須残基を変化させる１６までのサイレント置換を提供した（ＨｕｒｓｔおよびＪｏｎｅｓ，  １９８７，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １，  １１３２−４６、本明細書に援用される）。
【００５２】
本発明のさらなるウイルス構築物は、アデノウイルスのＥ２後期プロモーターを修飾することによって提供することが可能である。Ｅ２初期プロモーターは、ＤＮＡポリメラーゼ（ｐｏｌ）、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）および前終端（ｐｒｅｔｅｒｍｉｎａｌ）タンパク質（ｐＴＰ）の転写を調節する。Ｅ２後期プロモーターを突然変異させることによって、Ｅ１Ｂ欠失と同様の効果、すなわち少なくとも部分的に同様の効果を有することが可能であり、これはＥ１Ｂ欠失が、Ｅ２後期プロモーターから発現されるＤＢＰ  ＲＮＡの搬出を減少させるためである。ＤＢＰは化学量論的にＤＮＡ複製に必要であり、したがって正常細胞においてＤＢＰ産生を減少させることが望ましい。Ｅ２後期プロモーターは、１００ｋタンパク質コード配列内にあるため、単に欠失させることは不可能である。その代わり、本発明者らは、既知の転写因子結合部位の必須残基を変化させるサイレント突然変異を用いて、該プロモーターを不活性化可能であることを決定した。
【００５３】
Ｅ２後期プロモーター中の特定の転写因子結合部位がＤＮアーゼＩフットプリンティングによって同定された（本明細書の図４でＩ−ＩＶとマークする；Ｇｏｄｉｎｇら，  １９８７，  ＮＡＲ  １５，  ７７６１−７７８０）。最も重要なのは、フットプリントＩＩに位置するＣＣＡＡＴボックスである。このＣＣＡＡＴボックスの突然変異は、ＣＡＴアッセイにおいて、Ｅ２後期プロモーター活性を１００倍減少させる（Ｂｈａｔら，  １９８７，  ＥＭＢＯ  Ｊ，  ６，  ２０４５−２０５２）。こうした突然変異の１つは、マークしたＣＣＡＡＴボックス配列ＧＡＣ  ＣＡＡ  ＴＣＣをＧＡＴ  ＣＡＧ  ＴＣＣに変化させる（以下の図４を参照されたい）。これは１００ｋタンパク質配列を変化させることなく、ＣＣＡＡＴボックス結合因子の結合を廃するよう設計されている。他のフットプリント中のさらなるサイレント突然変異を用いて、さらに活性を減少させることが可能である。
【００５４】
さらに好ましいまたはさらなるありうる突然変異は、Ｅ１Ｂプロモーターを突然変異させることによって、Ｅ１Ｂ転写の発現を制御するものである。これは、前立腺特異的プロモーターを用いてＥ１Ｂ転写を制御するウイルスを用いて、ウイルス複製を減少させることが示された（Ｙｕ，  Ｄ．Ｃ．ら  １９９９  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５９，  １４９８−５０４）。腫瘍特異的方式で、Ｅ１Ｂ  ５５Ｋ発現を制御する、さらなる利点は、正常組織に対する炎症損傷のリスクが減少することであろう（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，  Ｈ．Ｓ．ら  １９９  ＰＮＡＳ  ９６，  １０４０９−１１）。本発明者らは、この主張を試験するため、Ｅ１ＢプロモーターＳｐ１部位を置換するＴｃｆ部位を持つウイルスを産生した。
【００５５】
例えばＣａｌｙｄｏｎウイルスと対照的に、本発明者のウイルスの設計は、アデノウイルス遺伝子の完全相補体を保持するにもかかわらず、予備のパッケージング能が利用可能であることを意味し、これはプロドラッグ活性化酵素ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）、ニトロレダクターゼ（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のもの、配列表を参照されたい）、シトシンデアミナーゼ（例えば酵母−ｍ由来のもの、配列表を参照されたい）などの条件的毒素を発現するのに使用可能である。これは、例えば、Ｅ３プロモーターから発現させることが可能であり、Ｅ３の活性は、いくつかのウイルスで制御され、さらなるレベルの腫瘍ターゲティングを提供する。あるいは、恒常性プロモーターから発現させて、安全機構として作用することが可能であり、これはその後、ガンシクロビルがウイルスを殺すことが可能であるためである。Ｅ１Ｂ欠損ウイルスにおける恒常的ｔｋ発現もまた、複製を犠牲にして、腫瘍殺傷効果を増加させる（Ｗｉｌｄｎｅｒ，  Ｏ．ら  １９９９  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６，  ５７−６２）。発現すべき代替プロドラッグ活性化酵素は、５ＦＣを５ＦＵに変換するシトシンデアミナーゼであろう（Ｃｒｙｓｔａｌ，  Ｒ．Ｇ．ら  １９９７  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ８，  ９８５−１００１）。５ＦＵは、意図される療法ターゲットである肝臓転移に活性を有するいくつかの薬剤の１つであるため、これは好都合であるが、ある患者では胆管硬化を生じる。
【００５６】
好ましいウイルスにおいて、「自殺遺伝子」、例えば毒素をコードする配列が、線維およびＥ４領域の間の位置から発現される。この遺伝子は、好ましくは、ＩＲＥＳを用いて、または示差スプライシングによって、遅く発現され、すなわち複製に依存する方式で発現される。こうした側面は新規であり、そしてそれ自体で創意があり、そして独立の発明を形成する。
【００５７】
正常細胞において複製を防止するかまたは終結させるために、１以上の制御レベルを持つウイルスを産生したら、受容体結合レベルで、感染の有効性を改善することがさらに好ましく、そして好都合である。アデノウイルスの正常細胞受容体、ＣＡＲは、いくつかの結腸腫瘍細胞上ではあまり発現されない。いくつかのリジン残基、例えば１〜２５、より好ましくは約５〜２０の残基を、アデノ線維タンパク質（天然ＣＡＲリガンド）の末端に付加することによって、該ウイルスがヘパリン硫酸糖タンパク質を受容体として用いることが可能になり、その結果、はるかにより広い範囲の細胞に、より有効に感染する。これは、Ｅ１Ｂ欠損ウイルスの細胞変性効果および異種移植治癒率を増加させることが示されている（本明細書に援用されるＳｈｉｎｏｕｒａ，  Ｈ．ら  １９９９  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９，  ３４１１−３４１６）。ＮＧＲ、ＰＲＰまたはＲＧＤターゲティングを改変する線維突然変異はまた、既定の細胞種に対する感染性を増加させるかまたは減少させる必要性に応じて、こうした効果を増加させるかまたは減少させるのに有効に用いることが可能である。
【００５８】
別の戦略は、Ａｄ４０および／またはＡｄ４１線維、あるいはＡｄ３およびＡｄ３５などの他の有効な線維種をコードするｃＤＮＡを、上述のような本発明の構築物に取り込むことである。ＥＭＢＬおよびＧｅｎｂａｎｋデータベースは、こうした配列を列挙し、そしてこれらは、すべて本明細書に援用される、Ｋｉｄｄら  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７２（１），  １３４−１４４；Ｐｉｅｎｉａｚｅｋら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８９）Ｎｏｖ  ２５；１７−２０，９４７４；Ｄａｖｉｓｏｎら  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ（１９９３）２３４（４）１３０８−１６；Ｋｉｄｄら  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９（１）ｐｌ３９−１５０にさらに記載される。
【００５９】
本発明の第二の側面において、療法に使用するための、特に新生物、例えば悪性腫瘍、特に結腸直腸腫瘍、そして最も特には結腸直腸転移を有する患者の療法に使用するための、本発明のウイルスＤＮＡ構築物、特にそれにコードされるウイルスの形の構築物を提供する。最も好ましくは、療法は、結腸直腸腫瘍の転移である肝臓腫瘍のためのものである。
【００６０】
第三の側面において、新生物、例えば悪性腫瘍、特に結腸直腸腫瘍、そして最も特には結腸直腸転移の治療用の医薬品製造における、本発明のウイルスＤＮＡ構築物、特にそれにコードされるウイルスの形の構築物の使用を提供する。最も好ましくは、治療は、結腸直腸腫瘍の転移である肝臓腫瘍に対するものである。
【００６１】
本発明の第四の側面において、生理学的に許容しうるキャリアーと共に、本発明のウイルスＤＮＡ構築物、特にそれにコードされるウイルスの形の構築物を含む組成物を提供する。こうしたキャリアーは、典型的には、無菌であり、そして発熱物質不含であり、そしてしたがって、組成物は、ウイルス構築物構成要素またはそれにコードされるウイルスの存在を除いて、無菌であり、そして発熱物質不含である。典型的には、キャリアーは、生理学的に許容しうる生理食塩水であろう。
【００６２】
本発明の第五の側面において、本発明のウイルスＤＮＡ構築物、特にそれにコードされるウイルスの形の構築物を製造する方法であって、野生型Ｅ１Ａ転写因子結合部位を有するウイルスゲノムＤＮＡ、特にアデノウイルスのゲノムＤＮＡ、特に第一の側面に定義されるようなものを、腫瘍特異的転写因子結合部位でこれらの部位を機能可能であるように置換するように、特にＴｃｆ転写因子結合部位でこれらを置換するように形質転換することを含む、前記方法を提供する。機能可能であるような置換は（ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、野生型部位の部分的または完全欠失を伴う可能性がある。好ましくは、形質転換は、２以上の、より好ましくは３または４の、Ｔｃｆ−４転写因子結合部位を挿入する。より好ましくは、形質転換は、ウイルスゲノムのＥ３プロモーター領域中のＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１および／またはＡＴＦ結合部位中の１以上の残基にさらなる突然変異を導入する。こうした突然変異は、好ましくは、Ｅ３によるＥ２活性との干渉を取り除き、そして正常細胞および非結腸細胞において、Ｅ２プロモーターが駆動する遺伝子の発現を減少させるはずである。相互に、これは好ましくは、Ｅ３の正常な制御を、近傍のＥ２プロモーターに結合したＴｃｆによる制御で置換する。
【００６３】
アデノウイルスを修飾するための伝統的な方法は、相同組換えによるウイルスゲノムのｉｎ  ｖｉｖｏ再構築後、多数の周期のプラーク精製を必要とする。これは、伝統的なクローニング技術を用いると、３６ｋｂのアデノウイルスゲノムを操作するのが困難なためである。特にＥ１置換ベクターに関するこの問題を回避するため、より新しいアプローチが開発されてきている。ＴｒａｎｓｇｅｎｅおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎのグループは、ウイルスを修飾するため、細菌におけるギャップ修復を用いる（Ｃｈａｒｔｉｅｒら、１９９６；Ｈｅら、１９９８）。これは、修飾しようとする各領域に特異的な巨大ベクターの構築を必要とする。これらのベクターは、Ｅ１置換に関して利用可能であるため、これらのアプローチは、単純なアデノウイルス発現ベクターを構築するのには非常に魅力的である。Ｋｅｔｎｅｒは、ＹＡＣ中にアデノウイルスゲノムをクローニングし、そして２工程遺伝子置換によって修飾する、酵母に基づく系を開発した（Ｋｅｔｎｅｒら、１９９４）。ＹＡＣアプローチの利点は、慣用的な組換えＤＮＡ技術を用いて操作するのに、非常に小さいピースのウイルスＤＮＡしか必要でないことである。都合よくは、修飾しようとする領域のどちらかの側に数百塩基対を提供し、そして一方の側にユニークな制限部位があるべきであるが、プラスミドが非常に小さいため、これは問題ではない。Ｋｅｔｎｅｒのアプローチの不都合な点は、ＹＡＣ  ＤＮＡの収率が低いことである。
【００６４】
本発明者らは、突然変異ウイルス配列を含有することが可能な細菌および酵母アプローチを組み合わせた。具体的には、酵母において、環状ＹＡＣ／ＢＡＣ中でのギャップ修復によってウイルスゲノムをクローニングし、２工程遺伝子置換によってこれを修復し、その後、ウイルスゲノムＤＮＡを多量に産生するため、細菌に移す。後者の工程は、ウイルスに変換する前に、修飾ゲノムの直接の配列決定を可能にするため、有用であり、そして多量のゲノムＤＮＡが入手可能であるため、ウイルス産生効率が高い。発明者らは、ＢＡＣ起点を用いて、細菌におけるウイルスゲノムの再編成を回避する。このアプローチはさらなる工程を有するが、純粋な細菌技術または酵母技術の利点をすべて併せ持ち、そしてこうした技術の不都合な点はまったく持たない。
【００６５】
これを用いてＥ１置換ウイルスを作成することが可能であるが、そして本発明者らは、この課題を単純化するため、酵母切除工程において、望ましい組換え体のシクロヘキシミド選択を可能にするＹＡＣ／ＢＡＣを構築したが、このアプローチの主な長所は、このアプローチによって、ウイルスゲノム全体に、自由自在に突然変異を導入可能になることである。ＹＡＣ／ＢＡＣのさらなる詳細は、本明細書に援用されるＧａｇｎｅｂｉｎら（１９９９）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６，  １７４２−１７５０に寄稿した本発明者によって提供される。多数の異なる部位での連続修飾はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで巨大なＤＮＡ中間体を操作する必要を伴わなくとも可能である。
【００６６】
本発明の方法を用いて突然変異すべきアデノウイルス株は、好ましくは野生型アデノウイルスである。都合よくは、ＶＲ５としてＡＴＣＣから入手可能であるような、アデノウイルス５（Ａｄ５）を用いる。ウイルスゲノムは、好ましくは、該方法によって修飾された領域外では完全に野生型であるが、腫瘍特異的毒性異種遺伝子、例えばｐ５３またはガンシクロビルでの細胞破壊を可能にするチミジンキナーゼなどのプロドラッグ活性化酵素をコードする遺伝子を搬送するのに使用可能である。しかし、該方法はまた、改善された組織向性を持つアデノウイルス種（例えばＡｄ４０およびＡｄ４１）由来のウイルスゲノムＤＮＡを用いても、好適に適用される。
【００６７】
本発明の第六の側面において、新生物を患う患者を治療する方法であって、本発明のウイルスＤＮＡ構築物、特にそれにコードされるウイルスの形の構築物を、新生物組織を含むか、または新生物組織に限定される、患者組織に感染させ、そして新生物細胞が殺されるように、ウイルス複製を可能にする、前記方法を提供する。
【００６８】
本発明は、結腸ターゲティング複製アデノウイルスを先に投与することによる、現在の動脈内肝臓化学療法を改善することをさらに試みる。ＤＮＡ損傷および代謝拮抗性化学療法は、動物モデルにおいて、別の複製アデノウイルスに腫瘍細胞を感作することが知られる（Ｈｅｉｓｅら、１９９７）。例えば、最初の周期中、毒性および安全性を決定するため、本組換えアデノウイルスを単独で投与することが可能である。第二の周期および続く周期に関しては、併用化学療法と共に、組換えアデノウイルスを投与可能である。好ましくは、安全性および有効性を評価して、そしてその後、患者自身の調節で作用している、第一の周期の反応と比較する。
【００６９】
投与経路は、患者の必要性にしたがって多様である可能性があり、そして本明細書に援用されるＵＳ  ５，６９８，４４３、第６欄に記載されるものなどの同様のウイルスに関して記載される経路のいずれによることも可能である。本発明の複製ウイルスに適した用量は、理論的には、非常に低いものであることが可能である。例えば、これらは、１０2〜１０13の桁、より好ましくは１０4〜１０11の桁であることが可能であり、感染効率は一般的に０．００１〜１００の範囲である。
【００７０】
治療のため、好ましくは、肝動脈カテーテル、例えばｐｏｒｔ−ａ−ｃａｔｈを移植する。この方法はよく確立されており、そして肝カテーテルは、眼の黒色腫および結腸癌患者の局所肝化学療法のため、定期的に配置されている。手術中に、ベースラインの生検を採取することが可能である。
【００７１】
典型的な療法措置は、以下を含むことが可能である：
周期１：第１日、第２日および第３日に、肝動脈カテーテルを通じて、１００ｍｌ生理食塩水に希釈したアデノウイルス構築物を投与。
【００７２】
周期２（第２９日）：第１日、第２日および第３日に、アデノウイルス構築物を投与、これと共に、４週間ごとに、標準的ポータブル注入ポンプ（例えばＰｈａｒｍａｃｉａまたはＭｅｌｏｄｙ）を介して、１４日間連続注入として、ＦＵＤＲ  ０．３ｍｇ／ｋｇ／日を併用投与。
【００７３】
ウイルス剤の毒性、およびしたがって適切な用量は、３患者のコホートにおいて、ウイルス接種原の用量を漸増させる標準的第１相試験によって決定可能である。第ＩＩＩ／ＩＶ等級の毒性が１人の患者で生じたならば、総数６人の患者に関して、現在の用量レベルで登録を続ける。第ＩＩＩ／Ｖ等級の毒性が、患者の５０％以上で生じると、用量制限毒性（ＤＬＴ）が確定され、そしてこれより低い用量レベルが、最大許容用量（ＭＴＤ）とみなされ、そして第２相試験で、さらに調べることが可能である。
【００７４】
規制認可が必要な場合は、ＧＭＰ等級ウイルスを用いることが理解されるであろう。
当業者には、療法アデノウイルスの投与に、炎症、および／または例えばサイトカイン放出と関連する可能性がある、他の不都合な免疫学的事象が付随する可能性があることが理解されるであろう。本発明にしたがったいくつかのウイルスもまた、これを誘発可能であり、特にＥ１Ｂ活性が弱毒化されていない場合、誘発可能である。こうしたウイルスがこの不都合な影響を欠くものの少なくともいくつかに渡って、好適な抗腫瘍活性を有する可能性があることがさらに理解されるであろう。この場合、免疫抑制、抗炎症、または別の抗サイトカイン医薬品を、例えばウイルス投与前、投与後、または投与中に、ウイルスと併用して投与することが可能である。こうした医薬品の典型は、ステロイド、例えばプレドニゾロンまたはデキサメタゾン、あるいは抗ＴＮＦ抗体または可溶性ＴＮＦ受容体などの抗ＴＮＦ剤であり、自己免疫療法に使用されるのと同様の適切な投薬措置を用いる。例えば、慢性関節リウマチ（ＷＯ９３／０７８９９を参照されたい）または多発性硬化症（ＷＯ９３／１０８１７）を治療するために投与されるステロイドの用量を参照されたく、これらの文献はどちらも、米国の対応出願を有する限り、本明細書に援用される。
【００７５】
結論として、我々は、アデノウイルス複製が、Ｅ１ＡまたはＥ２プロモーターへのＴｃｆ部位の挿入によって制御可能であることを示した。Ｅ１Ａ中のｐ３００結合部位の突然変異は、ウイルスの関係において、Ｔｃｆプロモーターからの転写を増加させなかった。△２−１１突然変異は、細胞変性効果アッセイにおいて、一貫してウイルス活性を減少させたため、療法ウイルスにおいてｐ３００  ２−１１ドメインを保持することがベターであろう。
【００７６】
弱いＴｃｆ活性しか持たない細胞株において、ウイルスＥ２転写の強い活性化を達成するため、相乗的に作用する転写因子の部位の挿入、または基本プロモーターの修飾が必要であろう。
【００７７】
本発明はここで、以下の限定されない実施例、方法、配列および図に言及することによって、例としてのみ記載されるであろう。これらに鑑みて、当業者には、請求項の範囲内に属するさらなる態様が思い浮かぶであろう。
【００７８】
【表１】
2004533852.tif 000002
【００７９】
a図３に用いる略語。
b４つのＴｃｆ結合部位による内因性プロモーターの置換。
c内因性プロモーター上流の３つのＴｃｆ結合部位およびパッケージングシグナルの挿入。
【００８０】
dＥ１Ａにおけるアミノ酸２−１１の欠失。
eＥ３プロモーター中のＮＦ１、ＮＦκＢ、およびＡＰ１部位の突然変異。
fＥ３プロモーター中のＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１、およびＡＴＦ部位の突然変異。
【００８１】
g線維のＨＳＰＧおよびＣＡＲ結合ドメインの突然変異＋ＣａＫ１線維中の線維Ｈ１ループにおけるＲＧＤ４ｃペプチドの挿入＋後期主要（ａｊｏｒ）転写物からの酵母シトシンデアミナーゼの翻訳を駆動するＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ。
【００８２】
配列表
配列番号１：アデノウイルス５型のＤＮＡ配列。
配列番号２〜２３：本発明の構築物を調製する際に使用するためのプライマー。
【００８３】
配列番号２４および２５：本発明の構築物に含めるための毒素産生遺伝子のｃＤＮＡ。
配列番号２６：ターゲティング目的のためのＥＭＣＶ内部リボソーム進入部位配列。
プライマー
【００８４】
【化１】
2004533852.tif 000003
【００８５】
先に開示された（ＷＯ  ００／５６９０９）プライマー
【００８６】
【化２】
2004533852.tif 000004
【００８７】
突然変異体左ＩＴＲおよびＥ１Ａプロモーター
【００８８】
【化３】
2004533852.tif 000005
【００８９】
方法
アデノウイルス突然変異誘発
ＡＴＣＣ  ＶＲ５アデノウイルス５ゲノムＤＮＡから、プライマーＣＧＧＡＡＴＴＣＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣ（Ｇ７６）およびＧＧＧＴＧＧＡＡＡＧＣＣＡＧＣＣＴＣＧＴＧ（ｏＣＦｌ）を用いたＰＣＲによって、Ａｄ５  Ｅ１Ａ断片（ヌクレオチドｎｔ１〜９５２）を増幅し、ＰａｃＩで切断し、そしてｐＭＢ１中のＢａｍＨＩ／ＰａｃＩ部位にクローニングして（本明細書に援用されるＷＯ  ００／５６９０９を参照されたい）、ｐＣＦ４を得た。ｐＭＢ１は、ｐＦＬ３９のＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ部位にクローニングされた、Ａｄ５の左端を含有する（どちらも本明細書に援用される、Ｂｏｎｎｅａｕｄ，  Ｎ．，Ｋ．  Ｏ．  Ｏｚｉｅｒ，  Ｇ．  Ｙ．  Ｌｉ，  Ｍ．  Ｌａｂｏｕｅｓｓｅ，  Ｓ．  Ｌ．  Ｍｉｎｖｉｅｌｌｅ，  およびＦ．  Ｌａｃｒｏｕｔｅ．  １９９１．  Ｙｅａｓｔ．  ７：６０９−１５、並びにＢｒｕｎｏｒｉ，  Ｍ．，  Ｍ．  Ｍａｌｅｒｂａ，  Ｈ．  Ｋａｓｈｉｗａｚａｋｉ，  およびＲ．  Ｉｇｇｏ．  ２００１．．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７５：２８５７−６５）。
【００９０】
プライマーｔｃｃＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＧａｔｔａＡＧＡＴＣＡＡＡＧＧＧｃｃａｃｃａｃｃｔｃａｔｔａｔ（ｏＣＦ３）およびｔＣＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴｃｃａａＣＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴａｇｔｃｃｔａｔｔｔａｔａｃｃｃｇｇｔｇａ（ｏＣＦ４）を用いた逆ＰＣＲによって、ＩＴＲ中央部からＥ１Ａ  ＴＡＴＡボックスまでの内因性アデノウイルス配列を、４つのＴｃｆ結合部位で置換して、ｐＣＦ２５を得た（プライマー中のＴｃｆ部位を大文字で示す）。突然変異体ＩＴＲおよびＥ１Ａプロモーターの最終配列は、ｃａｔｃａｔｃａａｔａａｔａｔａｃｃｔｔａｔｔｔｔｇｇａｔｔｇａａｇｃｃａａｔａｔｇａｔａａｔｇａｇｇＴｇｇｔｇｇＣＣＣＴＴＴ  ＧＡＴＣＴＴＡＡＴＣＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＣＣＡＡＣＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＡＧＴＣＣｔａｔｔｔａｔａであり、ｗｔ  Ａｄ５配列を小文字で示し、そしてＥ１Ａ  ＴＡＴＡボックスを下線で示す。第一のＴｃｆ結合部位をＳｐ１結合部位に突然変異させる直前に、ＧからＴへの突然変異を導入した（本明細書に援用される、Ｌｅｚａ，  Ｍ．  Ａ．，  およびＰ．  Ｈｅａｒｉｎｇ．  １９８８Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ６２：３００３−１３）。
【００９１】
ＶＲ５  ＤＮＡから、プライマーＧ７６およびＡＣＣＣＧＣＡＧＧＣＧＴＡＧＡＧＡＣＡＡＣ（ｏＣＦ２）を用いたＰＣＲによって、Ａｄ５  Ｅ４断片（ｎｔ  ３５３６９〜３５９３８）を増幅し、Ｐａｃ１で切断し、そしてｐＭＢ１のＢａｍＨＩ／ＰａｃＩ部位にクローニングして、ｐＣＦ６を得た。左ＩＴＲに導入された突然変異を補償するため、３つのＴｃｆ結合部位を導入し、そしてプライマーｏＣＦ３およびｔＣＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴｃｃａｃｔａｇｔｇｔｇａａｔｔｇｔａｇｔｔｔｔｃｔｔａａａａｔｇ（ｏＣＦ５）を用いた逆ＰＣＲによって、内因性配列（ｎｔ  ３５８０５〜３５８８７）を同時に欠失させて、ｐＣＦ１６を得た（Ｔｃｆ部位を大文字で示し、そしてＳｐｅＩ部位を下線で示す）。ｐＣＦ６から、プライマーＧＡＡＣＴＡＧＴＡＧＴＡＡＡＴＴＴＧＧＧ  ＣＧＴＡＡＣＣ（ｏＣＦ６）およびＡＣＧＣＴＡＧＣＡＡＡＡＣＡＣＣＴＧＧＧＣＧＡＧＴ（ｏＣＦ７）を用いたＰＣＲによって、パッケージングシグナルを増幅し、ＳｐｅＩ／ＮｈｅＩで切断し、そしてｐＣＦ６のＳｐｅＩ部位にクローニングして、ｐＣＦ３４を得た。該パッケージングシグナルは、アデノウイルスゲノムの左端と同じ末端−中央方向を有する。
【００９２】
△２−１１突然変異を２工程で導入した。第一に、プラスミドｐＣＦ４（野生型Ｅ１Ａプロモーター）およびｐＣＦ２５（Ｔｃｆ−Ｅ１Ａ突然変異体）をＳｎａＢＩ／ＳｐｈＩで切断し、その後、自己連結させて、それぞれ、ｐＲＤＩ−２８３およびｐＲＤＩ−２８４を得た。第二に、プライマーＣＡＴＴＴＴＣＡＧＴＣＣＣ  ＧＧＴＧＴＣＧ（ｏＣＦ８）およびＡＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣＣＧＣＣＡＧ（ｏＣＦ９）を用いた逆ＰＣＲによって、ｐＲＤＩ−２８３およびｐＲＤＩ−２８４中の２−１１領域を欠失させて、それぞれ、ｐＣＦ６１およびｐＣＦ５６を得た。
【００９３】
ＹＡＣ／ＢＡＣベクターｐＭＢ１９（本明細書に援用されるＧａｇｎｅｂｉｎ，  Ｊ．，  Ｍ．  Ｂｒｕｎｏｒｉ，  Ｍ．  Ｏｔｔｅｒ，  Ｌ．  Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ−Ｊｅａｎｅｒｅｔ，  Ｐ．  Ｍｏｎｎｉｅｒ，  およびＲ．  Ｉｇｇｏ．  １９９９  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ６：１７４２−１７５０）をＰａｃＩで切断し、その後、自己連結させて、ユニークなＰａｃＩ部位を宿するＹＡＣ／ＢＡＣベクターであるｐＣＦ１を得た。
【００９４】
ギャップ修復ベクターを産生するため、左および右アデノウイルス端の組み合わせを最初に組み立てて、そしてその後、ＹＡＣ／ＢＡＣベクター自体に移した。第一の工程中、ｐＣＦ３４をＥｃｏＲＩ／Ｓａ１で切断し、そしてｐＣＦ２５のＰｓｔ／ＳａｌＩ部位にクローニングして、ｐＲＤＩ−２８５を得た。同様に、ｐＣＦ５６をＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩで切断し、そしてｐＣＦ３４のＰｓｔＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングして、ｐＣＦ４６を得た。最後に、ｐＣＦ６１をＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩで切断し、そしてｐＣＦ１６のＰｓｔＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングして、ｐＣＦ５２を得た。ｐＲＤＩ−２８５、ｐＣＦ４６およびｐＣＦ５２はすべて、ゲノムの左端および右端を含むカセットを含有し、該カセットはユニークなＳａｌＩ部位に分離される。これらのカセットをＰａｃＩ消化によって単離し、そしてｐＣＦ１のＰａｃＩ部位にクローニングして、それぞれ、ｐＣＦ７８、ｐＣＦ７９およびｐＣＦ８１を生じた。ｐＣＦ７８は、突然変異体Ｅ１ＡおよびＥ４プロモーターを有し、ｐＣＦ７９は突然変異体Ｅ１ＡおよびＥ４プロモーターに加えて△２−１１突然変異を有し、そしてｐＣＦ８１は野生型Ｅ１ＡおよびＥ４プロモーターに加えて△２−１１突然変異を有する。
【００９５】
それぞれ、ＶＲ５（ＡＴＣＣ）およびｖＭＢ３１  ＤＮＡを用いた、ｐＣＦ７８のギャップ修復によって、ｖＣＦ１１およびｖＣＦ２２を構築した（本明細書に援用される、Ｇａｇｎｅｂｉｎ，  Ｊ．，  Ｍ．  Ｂｒｕｎｏｒｉ，  Ｍ．  Ｏｔｔｅｒ，  Ｌ．  Ｊｕｉｌｌｅｒａｔ−Ｊｅａｎｅｒｅｔ，  Ｐ．  Ｍｏｎｎｉｅｒ，  およびＲ．  Ｉｇｇｏ．  １９９９．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ６：１７４２−１７５０）。それぞれ、ＶＲ５およびｖＭＢ１９  ＤＮＡを用いた、ｐＣＦ７９のギャップ修復によって、ｖＣＦ４２およびｖＣＦ６２を構築した。ｖＭＢ３１  ＤＮＡを用いたｐＣＦ８１のギャップ修復によって、ｖＣＦ８１を構築した。ギャップ修復前に、ウイルスＤＮＡをＣｌａＩで切断して、ゲノム左端の突然変異より内部の部位に組換え事象をターゲティングした。
【００９６】
ｃＲ１細胞に、ＰａｃＩ消化したＹＡＣ／ＢＡＣ  ＤＮＡをトランスフェクションすることによって、ウイルスゲノムＤＮＡをウイルスに変換した。その後、ウイルスをＳＷ４８０細胞上でプラーク精製して、ＳＷ４８０上で増殖させ、ＣｓＣｌバンド形成によって精製し、ＮＡＰ２５カラムを用いて、１Ｍ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１０％グリセロールに緩衝液交換して、そして−７０℃で凍結保存した。制限消化によって、そしてプライマーＩＲ２１３（Ｅ１Ａアンチセンス：ＣＡＧＧＴＣＣＴＣＡＴＡＴＡＧＣＡＡＡＧＣ）、ＩＲ１９０（Ｅ１Ｂセンス：ＴＧＴＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＧ）、ＩＲ１１０（Ｅ２／Ｅ３センス：ＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡＧＣＣＣＡＴＡＣ）、ＩＦ１７１（Ｅ２／Ｅ３アンチセンス：ＡＧＴＴＧＣＴＣＴＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣ）およびＩＲ２１５（Ｅ４センス：ＣＧＴＧＡＴＴＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣ）を用いた、Ｅ１Ａ（ｎｔ  １〜１０５０）、Ｅ１Ｂ（ｎｔ  １３００〜２３００）、Ｅ２／Ｅ３（ｎｔ  ２６７００〜２７９５０）およびＥ４（ｎｔ  ３５２５０〜３５９３８）領域におけるＬｉｃｏｒ  ４２００Ｌ配列決定装置上の自動化蛍光配列決定によって、各バッチの同一性をチェックした。望ましい突然変異以外には、ＶＲ５ウイルスおよびＴｃｆウイルスの配列間に相違は見られなかった。粒子計数は、０．１％  ＳＤＳ中のウイルスのＯＤ260に基づき、公式１ＯＤ260＝１０12粒子／ｍｌを用いた。
【００９７】
Ｅ１Ａ、ｐ３００、Ｐ／ＣＡＦ、Ｔｉｐ４９およびβ−カテニンプラスミド
野生型１２Ｓ  Ｅ１Ａ（ｐＣＦ９）およびＥ１Ａ突然変異体△ｐＲｂ（１２４Ａ、１３５Ａ）、△ｐ３００Ｎ（△２−１１）、△ｐ３００Ｃ（△６４−６８）、△ｐ４００（△２６−３５）、△Ｐ／ＣＡＦ（Ｅ５５）、△ＣｔＢＰ（ＬＤＬＡ４）、および△Ｃ５２は、すべて本明細書に援用される、Ａｌｅｖｉｚｏｐｏｕｌｏｓら（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７：５９８７−９７およびＡｌｅｖｉｚｏｐｏｕｌｏｓら（２０００）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  １９：２０６７−７４およびＲｅｉｄら（１９９８）ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７：４４６９−７７に記載されている。ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで単離され、そしてｐｃＤＮＡ３のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングされた△ｐ３００Ｎおよび△ｐ３００Ｃ突然変異体以外のすべての突然変異体は、ｐｃＤＮＡ３主鎖（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カールスバッド）中に提供された。プライマーＴＣＴＧＴＡＡＴＧＴＴＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＧＡＡＧ（ｏＣＦ１０）およびＡＴＧＧＣＴＡＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＡＴ（ｏＣＦ１２）を用いた、ｐＣＦ９の逆ＰＣＲによって、△ＣＲ１突然変異体（△３８−６８）を作成して、ｐＣＦ４５を得た。単一突然変異体由来のＢｓｔＸＩ断片の三方連結によって、△△ｐ３００−Ｐ／ＣＡＦ二重突然変異体を構築した。△Ｎ−β−カテニンプラスミドは、Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇら  １９９７．  Ｃｅｌｌ．  ８８：７８９−９９（本明細書に援用される）によって記載されている。
【００９８】
ｐ３００ベクターは、ＣＭＶプロモーターから発現される、ＨＡタグ付きｐ３００を含有する。Ｐ／ＣＡＦ発現ベクターは、Ｂｌａｎｃｏら（１９９８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １２：１６３８−５１によって記載されている。Ｔｉｐ４９およびＴｉｐ４９ＤＮベクターは、Ｗｏｏｄら（２０００）．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．  ５：３２１−３０に記載され、これらの参考文献はすべて本明細書に援用される。
【００９９】
細胞株
ＩＳＲＥＣ−０１（１０）、ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２２８）およびＣｏｌ１５（Ｃｏｔｔｕら（１９９６）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．  １３：２７２７−３０）は、Ｂ  Ｓｏｒｄａｔ博士に供給された。ＨＣＴ１１６（ＣＣＬ−２４７）、ＨＴ２９（ＨＴＢ−３８）、２９３Ｔは、ＡＴＣＣに供給された。ＨｅＬａ（ＣＣＬ−２）は、ＩＣＲＦに供給された。Ｈ１２９９は、Ｃ  Ｐｒｉｖｅｓ博士（Ｃｈｅｎら（１９９６）．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １０：２４３８−５１．）に供給された。ｃＭＭ１細胞は、ｍｙｃタグ付き△Ｎ−β−カテニン（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｅｔｅｒｉｎｇ、同書）を発現する、テトラサイクリン反応性最小ＣＭＶプロモーター（ｔｅｔ−ｏｆｆ）株で安定にトランスフェクションしたＨ１２９９である。ｐＭＢ９２（β−カテニンベクター）ＳａｃＩＩ／ＡｃｃＩ断片をｐＵＨＤ１０−３  ＳａｃＩｌ／ＥｃｏＲＩにクローニングする。ｐＵＨＤ１０−３は、Ｇｏｓｓｅｎ，  Ｍ．  ＆  Ｂｕｊａｒｄ，  Ｈ．（１９９２）．  Ｔｉｇｈｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ８９，５５４７−５１に記載されている。Ｃ７細胞は、Ｊ  Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ博士に供給された（Ａｍａｌｆｉｔａｎｏ，  Ａ．，  およびＪ．Ｓ．  Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ．（１９９７）．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ４：２５８−６３．）。
【０１００】
ｃＲ１パッケージング細胞を生成するため、Ｃ７細胞をｍｙｃタグ付き△Ｎ−β−カテニンを発現するレンチウイルスに感染させた。Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）およびＳＡＧＭ培地は、Ｃａｍｂｒｅｘ（米国イーストラザーフォード）に供給された。その他の細胞株はすべて、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カールスバッド）を補ったダルベッコの修飾イーグル培地上で増殖させた。
【０１０１】
ルシフェラーゼアッセイ
Ｅ２レポーターを以下に記載する。Ｅ１Ａレポーターを構築するため、それぞれｐＣＦ４およびｐＣＦ２５から、プライマーＧ７６およびＧＴＧＴＣＧＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＧＡＧＧ（ｏＣＦ１３）を用いたＰＣＲによって、野生型および突然変異体Ｅ１Ａプロモーターを増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国マディソン）のＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングした。トランスフェクション２４時間前に、３５ｍｍウェルあたり、２．５ｘ１０5細胞で細胞を植え付けた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｔｒｏｇｅｎ、米国カールスバッド）４．５μｌを、レポータープラスミド１００ｎｇ、対照ウミシイタケ・ルシフェラーゼプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国マディソン）１ｎｇおよびＥ１Ａ、Ｐ／ＣＡＦ、ｐ３００またはＴＩＰ４９を発現するベクター５００ｎｇと３０分間混合した。ＤＮＡの総量を等しくするため、ｐｃＤＮＡ空ベクターを添加した。図５ｂでは、０．５、１および２μｇのｐ３００ベクターを用いた。トランスフェクション４８時間後に細胞を採取し、そしてＬＵＭＡＣ  Ｂｉｏｃｏｕｎｔｅｒ（ＭＢＶ）を用いて、製造者の指示（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国マディソン）にしたがって、二重ルシフェラーゼレポーターアッセイを行った。各値は、三つ組で行う１〜９の独立の実験の平均値であり、そしてトランスフェクション効率をウミシイタケ対照の活性に規準化した。
【０１０２】
ウェスタンブロット
細胞を細胞あたり１０００ウイルス粒子に感染させた。感染２時間後、培地を交換した。２４時間後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液に細胞を採取した。Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ５５Ｋ、ＤＢＰおよびＥ４ｏｒｆ６を、それぞれ、Ｍ７３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米国サンタクルーズ）、２Ａ６（Ｓａｒｎｏｗら（１９８２）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  １２０：５１０−７．）、Ｂ６（Ｒｅｉｃｈら（１９８３）．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  １２８：４８０−４．）およびＲＳＡ３（Ｍａｒｔｏｎら（１９９０）Ｖｉｒｏｌ．  ６４：２３４５−５９）モノクローナル抗体で検出した。Ｍｙｃ−タグ付きβ−カテニンを、９Ｅ１０モノクローナル抗体（Ｅｖａｎら（１９８５）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ５：３６１０−６）で検出した。すべての引用は、本明細書に援用される。
【０１０３】
細胞変性効果アッセイ
６ウェルプレート中の細胞を、１０倍対数希釈のウイルスに感染させた。感染２時間後、培地を交換した。６〜８日後（図６）、パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、そしてクリスタルバイオレットで染色した。
【０１０４】
ウイルス複製アッセイ
６ウェルプレート中の細胞を、細胞あたり３００ウイルス粒子に感染させた。感染２時間後、培地を交換した。４８時間後、細胞を採取し、そして３周期の凍結融解によって溶解した。１０日後、ＤＭＥＭ  １０％  ＦＣＳ中の１％バクトアガー下で、ＳＷ４８０細胞上に形成されたプラークを計数することによって、ウイルス産生に関して上清を試験した。図中の各バーは三つ組プラークアッセイの平均±ＳＤを示す。
【０１０５】
（実施例１）
Ｅ１Ａプロモーター突然変異
ｗｎｔシグナルにのみ反応する、緊密に制御されたＥ１Ａプロモーターを産生するため、ウイルスパッケージングシグナルをＥ４領域に移し、そしてＩＴＲの半分をＴｃｆ部位で置換した。生じたＥ１Ａプロモーターは、４つのＴｃｆ部位および１つのＴＡＴＡボックスを含有する（図１）。ＩＴＲ中の変化は、最小複製起点に影響を及ぼさない（１１）。右ＩＴＲに同一の変化を作成して、ウイルスＤＮＡ複製中、２つのＩＴＲがアニーリングする能力を保持した。突然変異体右ＩＴＲは、３つのＴｃｆ部位、その後、パッケージングシグナルおよび正常Ｅ４エンハンサーを含有する。酵母においてアデノウイルスゲノムＤＮＡに突然変異誘発し、そして安定なβ−カテニン突然変異体を発現するＣ７細胞（３）において該ＤＮＡをウイルスに変換した。初代ウイルスストックをプラーク精製し、そしてＳＷ４８０細胞上で増殖させた。Ｅ１Ａ／Ｅ４突然変異体ウイルスは、ＳＷ４８０細胞上で容易に増殖したが、このことは、ＩＴＲ突然変異誘発およびパッケージングシグナルの交換が生存可能なウイルスの産生と適合することを示す。この研究で用いたウイルスの構造を表１に要約する。
【０１０６】
（実施例２）
Ｔｃｆ−Ｅ１Ａプロモーターウイルス
Ｔｃｆ−Ｅ１Ａプロモーターが、ｗｎｔ経路の活性化に反応するかどうかを決定するため、ｃＭＭ１細胞を、Ｅ１Ａ／Ｅ４プロモーター変化のみを持つウイルス、ｖＣＦ１１に感染させた。ｃＭＭ１細胞は、テトラサイクリンが制御するプロモーターから△Ｎ−β−カテニンを発現するＨ１２９９肺癌細胞のクローンである。Ｗｎｔシグナル伝達は、培地からテトラサイクリンを除去することによって活性化された（図２、レーン５〜８、△Ｎ−β−カテニン）。これは野生型Ａｄ５によるＥ１Ａ発現には影響を持たなかったが、ｖＣＦ１１によるＥ１Ａの発現を誘導した（図２、レーン３および７、Ｅ１Ａを比較されたい）。ＤＢＰは、ｖＣＦ１１では正常Ｅ２プロモーターから発現されるため、ＤＢＰレベルは、ｗｎｔシグナル伝達の活性化後に上昇するはずである。これは、正常Ｅ２プロモーターがＥ１Ａによって活性化されるためである。Ｈ１２９９細胞において、プロモーターは、Ｅ１Ａの非存在下、弱く活性であり、そして△Ｎ−β−カテニン発現の誘導後、活性は中程度の増加を示した（図２、レーン３および７、ＤＢＰ）。突然変異体Ｅ１Ａプロモーターがｗｎｔ経路の活性化に反応し、そしてこれはウイルス複製タンパク質の発現への影響を通じて起こると結論付けられる。
【０１０７】
その後、活性ｗｎｔシグナル伝達を持つ一団の結腸細胞株に対して、Ｔｃｆ−Ｅ１Ａ／Ｅ４プロモーター置換の影響を試験した：ＳＷ４８０、ＩＳＲＥＣ−０１およびＨＴ２９は突然変異体ＡＰＣを有し；Ｈｃｔ１１６は突然変異体β−カテニンを有し；そしてＣｏ１１５はマイクロサテライト不安定性を有するが、ｗｎｔシグナル伝達の欠損は明示されていない（Ｃｏｔｔｕら、同書）。不活性ｗｎｔシグナル伝達を持つ３つの対照細胞株：Ｈ１２９９、ＨｅＬａおよび低継代ヒト末梢気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）を試験した。Ｅ１Ａは、ｖＣＦ１１感染２４時間後、結腸細胞株すべてでウェスタンブロットによって検出されたが、Ｈ１２９９、ＨｅＬａまたはＳＡＥＣでは検出されなかった（図３、レーン３、Ｅ１Ａ）。野生型Ａｄ５に比較して、Ｅ１Ａ発現レベルは、ＳＷ４８０およびＩＳＲＥＣ−０１でより高く、Ｃｏ１１５では同じであり、そしてＨＴ２９およびＨｃｔ１１６ではより低かった（図３、レーン２および３、Ｅ１Ａを比較されたい）。したがって、異なる細胞株におけるＴｃｆ−Ｅ１Ａプロモーターの反応性の階層は、ＷＯ  ００／５６９０９のＴｃｆ−Ｅ２ウイルスと同一であるが、正常プロモーターに比較した発現レベルは、Ｅ２よりＥ１Ａに関して高かった。Ｅ１ＢおよびＥ２エンハンサーはｖＣＦ１１では野生型であるため、これらの転写単位は、Ｅ１Ａによって誘導可能であるはずである。ｖＣＦ１１におけるＥ４プロモーターは、潜在的に、Ｅ１ＡおよびＴｃｆ両方に反応可能である。これを試験するため、ブロットをＥ１Ｂ  ５５ｋ、ＤＢＰおよびＥ４  ｏｒｆ６に関して探査した（ｐｒｏｂｅｄ）。Ｅ１Ａの結果と一致して、３つのタンパク質はすべて、ＳＷ４８０、ＩＳＲＥＣ−０１およびＣｏ１１５で正常に発現され、そしてＨｅＬａおよびＳＡＥＣでは検出不能であった（図３、レーン２および３を比較されたい）。Ｅ１Ａ発現の非存在にもかかわらず、３つのタンパク質はすべてＨ１２９９細胞で弱く発現され、これらの細胞が、Ｅ１Ａに代用可能な内因性活性を含有することが示唆された。野生型感染に比較して、Ｅ１Ｂ  ５５ｋ、ＤＢＰおよびＥ４  ｏｒｆ６のレベルは、ＨＴ２９でわずかに減少し、そしてｖＣＦ１１に感染したＨｃｔ１１６細胞でより実質的に減少した（図３、レーン２および３を比較されたい）。
【０１０８】
（実施例３）
多数の初期プロモーターにおいてＴｃｆ部位を持つウイルス
先の世代のＴｃｆウイルスの背景において、Ｅ１Ａ発現を制御する影響を試験するため、ｖＭＢ３１（Ｔｃｆ−Ｅ１Ｂ／Ｅ２）およびｖＣＦ２２（Ｔｃｆ−Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ／Ｅ２／Ｅ４；図３、レーン５および６を比較されたい）に細胞を感染させた。Ｅ１ＡおよびＥ４  ｏｒｆ６発現は、ｖＣＦ２２に感染したＳＷ４８０、ＩＳＲＥＣ−０１およびＣｏ１１５でよく保存されたが、ＤＢＰ発現はＳＷ４８０およびＩＳＲＥＣ−０１でのみ維持され、そして該細胞でも、野生型Ａｄ５よりｖＣＦ２２に感染した場合、わずかに低かった（図３、レーン２および６、ＤＢＰを比較されたい）。残る細胞株において、ｖＣＦ２２感染ではＤＢＰ発現は検出不能であった。ｖＣＦ２２中のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２およびＥ４プロモーターにおけるＴｃｆ部位の挿入は、ｖＣＦ１１に感染したＨ１２９９で見られる、Ｅ１Ｂ  ５５Ｋ、ＤＢＰおよびＥ４  ｏｒｆ６のＥ１Ａ独立発現を廃した（図３、レーン３および６、Ｈ１２９９を比較されたい）。多数の初期プロモーターへのＴｃｆ部位の挿入が、非常に選択的であるが、いくつかの結腸細胞株においてさえ、減少した活性を持つものを生じると結論付けられる。
【０１０９】
（実施例４）
Ｔｃｆに依存する転写のＥ１Ａによる阻害
半許容性細胞株におけるＴｃｆウイルスからの初期遺伝子発現の欠陥は、単一のプロモーターに限定されない。その代わり、ウイルスＴｃｆプロモーターの活性化に全般的な欠陥があるようである。これは、Ｔｃｆ活性が全般的により弱いことによって、部分的に説明可能である。この理由は明らかでないが、半許容性細胞株はすべて、ＡＰＣまたはβ−カテニンいずれかに突然変異を含有し、そしてルシフェラーゼアッセイによって測定されるＴｃｆ−Ｅ２転写活性が、外因性△Ｎ−β−カテニンのトランスフェクションによっては増加しないため、ｗｎｔ経路活性化自体の欠損を反映しない（図４ａ）。
【０１１０】
いくつかの細胞株の半許容性に関する別の説明は、例えばＴｃｆに依存する転写の活性化補助因子であるｐ３００を阻害することによって、Ｅ１ＡがウイルスＴｃｆプロモーターを阻害可能であるというものである（ＬｅｚａおよびＨｅａｒｉｎｇ．（１９８８）．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ６２：３００３−１３、Ｔａｋｅｍａｒｕ（２０００）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １４９：２４９−５４）。
【０１１１】
Ｅ１ＡがウイルスＴｃｆプロモーターを阻害するかどうかを決定するため、ルシフェラーゼ遺伝子とカップリングしたＴｃｆ−Ｅ１ＡおよびＴｃｆ−Ｅ２プロモーターを用いて、転写アッセイを行った。ＳＷ４８０において、Ｔｃｆ−Ｅ２プロモーターは、Ｅ１Ａの非存在下で、野生型Ｅ２プロモーターよりも活性であり（図４ｂ、レーン１および６）、そしてＥ１Ａの存在下で、ほぼ正確に野生型活性を生じた（図４ｂ、レーン２および７）。この合致は、Ｅ１Ａの存在下で、野生型Ｅ２プロモーター活性が増加し、そしてＴｃｆ−Ｅ２プロモーター活性が減少するためであった。Ｅ３プロモーターはＥ２プロモーターに隣接しているため（９）、緊密に制御されたＴｃｆ−Ｅ２プロモーターを産生するには、Ｅ３プロモーターの突然変異が必要である。Ｅ３突然変異は、Ｅ１ＡでトランスフェクションしたＳＷ４８０細胞において、Ｅ２プロモーター活性をわずかに減少させたが、活性はなお、野生型プロモーターでみられるものに近かった（図４ｂ、レーン２および１２）。ＳＷ４８０において、Ｔｃｆ−Ｅ２プロモーター活性が高いことは、おそらく、この細胞株がＴｃｆウイルスすべてに関して許容性であるのはなぜかを説明する。対照的に、Ｅ１Ａ存在下のＴｃｆ−Ｅ２活性レベルは、Ｃｏ１１５およびＨｃｔ１１６細胞において、野生型レベルより実質的に低かった（図４ｃおよびｄ、レーン２、７および１２）。
【０１１２】
阻害の機構を決定するため、異なるＥ１Ａ突然変異体を試験した。Ｅ１Ａ中のＲｂ結合部位の突然変異によって、ＳＷ４８０およびＣｏ１１５における野生型Ｅ２プロモーターのトランス活性化が損なわれたが（図４ｂおよびｃ、レーン３）、Ｈｃｔ１１６細胞では損なわれず（図４ｄ、レーン３）、一方、ｐ３００またはｐ４００結合部位の突然変異は、３つの細胞株すべてにおいて、Ｅ１Ａによる野生型プロモーターのトランス活性化にほとんど影響を及ぼさなかった（図４ｂ、ｃおよびｄ、レーン４および５）。Ｅ２プロモーター中にＥ２Ｆ部位が存在すれば、Ｒｂに結合不能なＥ１Ａ突然変異体によるトランス活性化が減少すると予期される。Ｔｃｆ−Ｅ２プロモーターにおいて、Ｔｃｆ部位が正常なエンハンサーを置換する。３つの細胞株すべてにおいて、Ｒｂおよびｐ４００結合部位突然変異は、Ｅ１ＡによるＴｃｆプロモーターの阻害を軽減しなかった（図４ｂ、ｃおよびｄ、レーン８、１０、１３および１５）。影響を有する唯一の突然変異は、ｐ３００結合部位突然変異（Ｅ１Ａ△２−１１、△ｐ３００Ｎと示す）であり、そしてＳＷ４８０およびＣｏ１１５において、最大回復は、失われた活性の５０％を決して超えなかった（図４ｂ、ｃおよびｄ、レーン９および１４）。やはりｐ３００結合を遮断する、Ｅ１Ａアミノ酸２のグリシンへの突然変異（Ｒ２Ｇ）は、同一の影響を有した（データ未提示）。
【０１１３】
（実施例５）
さらなるＥ１Ａ突然変異体の解析
Ｅ１Ａにおけるｐ３００結合部位の突然変異後に、活性回復が不完全なことに関して、ありうる説明を探るため、Ｈ１２９９細胞において、さらなるルシフェラーゼアッセイを行った（図５）。Ｔｃｆ−Ｅ２プロモーターは、△Ｎ−β−カテニンによって、１０倍活性化され（図５ａ、レーン１および２を比較されたい）、そしてこれは、Ｅ１Ａによって阻害された（図５ａ、レーン３）。ｐ３００は、Ｅ１Ａ中の２つの部位に結合し、そしてどちらの部位の突然変異も、Ｔｃｆに依存する転写の阻害を部分的に軽減させた（Ｅ１Ａ△ｐ３００Ｎおよび△ｐ３００Ｃ、図５ａ、レーン４および５）。Ｃ末端ｐ３００結合部位は、保存ドメイン１（ＣＲ１）の内部に位置するが、全ドメインの欠失は、活性を回復しなかった（図５ａ、レーン６）。これは、ＣＲ１のどこかに結合する、陽性作用因子がある可能性を示唆する。Ｅ１Ａ  △ｐ３００Ｎ突然変異が、ｐ３００結合を完全には遮断しないために、部分的にしか活性を回復しないのかどうかを決定するため、増加する量のｐ３００とＥ１Ａを同時トランスフェクションした（図５ｂ）。外因性ｐ３００は、ｐ３００結合部位の突然変異と同じ程度に、プロモーター活性の阻害を逆転させ（図５ｂ、レーン４および７）、そして△ｐ３００Ｎ突然変異およびｐ３００トランスフェクションの影響は、相加的ではなかった（図５ｂ、レーン８）。多量の外因性ｐ３００は、プロモーター活性を減少させ（図５ｂ、レーン５、６、９および１０）、このことは、補因子が滴定されている（ｔｉｔｒａｔｅｄ）ことを示唆する。Ｐ／ＣＡＦは、ｐ３００に結合するヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）であり、そしてｐ３００によるＴｃｆの同時活性化は、生得的なｐ３００  ＨＡＴ活性を必要としないため、この補因子の候補である。Ｅ１ＡはＰ／ＣＡＦを阻害するため、Ｅ１Ａ中のＰ／ＣＡＦ結合ドメインの突然変異が、Ｅ１ＡによるＴｃｆ活性の阻害を軽減させるかどうかを試験したが、いかなる影響も見られなかった（図５ａ、レーン７）。Ｐ／ＣＡＦ、および野生型Ｅ１Ａまたは△Ｐ／ＣＡＦ突然変異体Ｅ１Ａの同時トランスフェクションもまた、活性を回復するのに失敗したため、Ｐ／ＣＡＦが律速因子ではない（図５Ｃ、レーン４および９）。ｐ３００およびＰ／ＣＡＦが共に作用するかどうかを試験するため、両ＨＡＴの結合部位に突然変異を持つＥ１Ａ遺伝子を構築した（図５において△△と示す）が、この突然変異体もまた、Ｅ１Ａの抑制効果を軽減するのに失敗し（図５ａ、レーン８）、Ｐ／ＣＡＦおよびｐ３００結合部位におけるＥ１Ａ突然変異体の同時トランスフェクション（図５ｃ、レーン６）またはｐ３００およびＰ／ＣＡＦ結合部位におけるＥ１Ａ突然変異体の同時トランスフェクション（図５ｃ、レーン８）も同様であった。
【０１１４】
結腸細胞におけるように（図４）、Ｅ１Ａ中のＲｂ結合部位の突然変異は、Ｔｃｆに依存する転写の抑制にいかなる影響も持たなかった（図５ａ、レーン９）。ＣｔＢＰおよびＴＩＰ４９は、Ｔｃｆによる転写活性化に関連付けられてきている（Ｂａｕｅｒら（２０００）．ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ．  １９：６１２１−６１３０；Ｂｒａｎｎｏｎら（１９９９）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  １２６：３１５９−７０）が、ＣｔＢｐ結合を廃するＥ１Ａの突然変異（△ＣｔＢＰ、△Ｃ５２；図５ａ、レーン１０および１１）も、あるいは野生型または優性ネガティブＴＩＰ４９のトランスフェクション（図５ｃ、レーン１０および１１）も、Ｅ１Ａの抑制効果を克服不能であった。結論として、Ｅ１Ａマッピング研究によって、ｐ３００結合ドメインの突然変異が、Ｅ１Ａ発現に際して失われたＴｃｆ活性の約半分を回復可能であるが、残りの抑制効果は、Ｅ１Ａの既知のドメインにはマッピング不能であることが示された。
【０１１５】
（実施例６）
Ｅ１Ａ△ｐ３００Ｎ突然変異体Ｔｃｆウイルス
Ｅ１Ａのｐ３００結合部位の欠失が、ウイルスの背景において、Ｔｃｆプロモーターの活性を増加させるかどうかを試験するため、△ｐ３００Ｎ突然変異をＴｃｆ−Ｅ１Ａ、Ｔｃｆ−Ｅ１Ｂ、Ｔｃｆ−Ｅ２およびＴｃｆ−Ｅ４ウイルスに導入した（表１）。Ｔｃｆ−Ｅ１Ａプロモーターに関して、Ｅ１Ａによるｐ３００の阻害は、Ｅ１Ａ自体の発現を阻害するはずである。テトラサイクリンの存在下および非存在下で、ｃＭＭ１細胞株をｖＣＦ１１、およびｖｃｆ１１の△ｐ３００Ｎ誘導体であるｖＣＦ４２に感染させることによってこれを試験した。それ自体の発現に対してＥ１Ａから負のフィードバックがあるのと一致して、ｗｎｔシグナル伝達の活性化後のＥ１Ａレベルは、ｖＣＦ１１よりもｖＣＦ４２でより高かった（図２、レーン７および８、Ｅ１Ａを比較されたい）。Ｅ１Ａ発現増加にもかかわらず、ＤＢＰ発現には相違はなく、これはおそらく、△ｐ３００Ｎ突然変異体が、野生型Ｅ２プロモーターの活性化に必要な何らかの他の機能に不全を有するためであろう（図２、レーン８および９、ＤＢＰを比較されたい）。その後、一団の細胞株に対して、多重突然変異ウイルスを試験した（図３）。△ｐ３００Ｎ突然変異の影響は、ウイルスのマッチした対を比較することによって、最適に認識可能である：ｖＣＦ１１対ｖＣＦ４２（図３、レーン３および４）；ｖＭＢ１９対ｖＣＦ８１（図３、レーン９および８）；およびｖＣＦ２２対ｖＣＦ６２（図３、レーン６および７）。各場合で、後者は、Ｅ１Ａ中のｐ３００結合部位の欠失によって、前者から得られる（唯一の例外は、ｖＣＦ２２には存在するが、ｖＣＦ６２には存在しない、Ｅ３プロモーターＡＴＦ部位である）。ほぼすべての場合で、△ｐ３００Ｎ突然変異は、Ｅ１Ｂ  ５５Ｋ、ＤＢＰおよびＥ４  ｏｒｆ６の発現レベルを実際に減少させた。その活性が適度によく維持されている唯一のプロモーターは、Ｔｃｆ−Ｅ１Ａプロモーターであった（図３、レーン４および７、Ｅ１Ａ）。野生型Ｅ１Ａプロモーターもまた、Ｅ１Ａ△ｐ３００Ｎ突然変異によってほとんど影響を受けなかった（図３、レーン８、Ｅ１Ａ）。最も徹底的に突然変異されているウイルス（ｖＣＦ６２、図３、レーン７）は、対照細胞株（Ｈ１２９９、ＨｅＬａおよびＳＡＥＣ）では完全に不活性であったが、半許容性結腸細胞株（Ｃｏ１１５、ＨＴ２９およびＨｃｔ１１６）でもまた、非常に弱毒化されていた。Ｅ１Ａ△ｐ３００Ｎ突然変異は、Ｔｃｆ−Ｅ１ＢおよびＴｃｆ−Ｅ２プロモーターを持つウイルスいずれでも、Ｅ１Ｂ  ５５ＫまたはＤＢＰ発現を増加させなかった（図３、レーン６対７、および９対８を比較されたい）。ウイルスの背景において、Ｅ１Ａ△ｐ３００Ｎ突然変異が、半許容性細胞株におけるＴｃｆプロモーター活性の欠陥を救出しないと結論付けられる。
【０１１６】
この結果は予期せぬものであったため、細胞変性効果アッセイおよびバーストアッセイにおいても、新規ウイルスを試験した。バーストアッセイにおいて、最も許容性の結腸細胞株、ＳＷ４８０では、ｖＣＦ１１およびｖＭＢ１９はどちらも、野生型Ａｄ５よりも少なくとも１０倍より活性であった（図６ａ、レーン１をレーン２および６と比較されたい）。より操作されていないウイルスに関しては、ｐ３００突然変異体は、野生型Ｅ１Ａを発現する、対応するウイルスより約１０倍活性が低かった（図６ａ、レーン２対３、および６対７を比較されたい）。
【０１１７】
Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２およびＥ４プロモーター中にＴｃｆ部位を持つウイルスに関してのみ、ｐ３００突然変異体ウイルスは親ウイルスと同程度に活性であった（図６ａ、レーン４対５を比較されたい）が、これらのウイルスは、Ｔｃｆ−Ｅ１Ａ／Ｅ４変化のみを持つウイルスよりも、１００倍活性が低かった（ｖＣＦ１１、図６ａ、レーン２）。ｖＣＦ１１は、Ｃｏ１１５に対して野生型活性を示した（図６ｂ、レーン１対２を比較されたい）。これは、先に最適であったウイルス、ｖＭＢ１９より１０倍より優れていた（図６ｂ、レーン７）。Ｈｃｔ１１６では、状況は逆転した：ｖＭＢ１９は、ｖＣＦ１１よりわずかに優れていたが、野生型はどちらのＴｃｆウイルスよりも優れていた（図６ｃ、レーン１、２および７）。Ｃｏ１１５では、すべてのｐ３００突然変異体ウイルスは、野生型Ｅ１Ａを持つ、対応するウイルスよりも１０倍活性が低かった（図６ｂ、レーン２対３、４対５、および６対７を比較されたい）。すべてのＴｃｆウイルスは、Ｔｃｆ活性を欠くＨｅＬａ細胞上で、野生型Ａｄ５より、実質的に活性が低かった（図６ｄ）。最も操作したウイルスは、１００ｐｆｕ／細胞の感染後でさえも、ＨｅＬａ上に増殖巣を形成するのに失敗した（図６ｄ、レーン４および５）。Ｅ１Ａ中のｐ３００結合部位の突然変異の影響は、許容性細胞に対するものよりも、より明らかでなかった。総合すると、最適ウイルスは、ＨｅＬａ細胞上で、ｖＭＢ１９より１０倍活性が低く、そして野生型Ａｄ５よりも１０００倍活性が低い、ｖＣＦ１１であった（図６ｄ、レーン１、２および６）。ｖＣＦ１１は、ＳＷ４８０に対する野生型Ａｄ５より１０倍より活性であるため、最も許容性である結腸細胞に対する全体の選択性は、野生型Ａｄ５に比較して、１０，０００倍である。
【０１１８】
バーストアッセイにおいて、ｐ３００結合部位突然変異の影響は、ウイルスおよび細胞株に特異的であった。ＳＷ４８０では、突然変異は、Ｔｃｆ−Ｅ１Ａ／Ｅ４主鎖ではバーストサイズを５０倍減少させた（図７、レーン２および３を比較されたい）が、Ｔｃｆ−Ｅ１Ｂ／Ｅ２主鎖には影響を持たなかった（図７、レーン４および５を比較されたい）。この相違は、野生型Ｅ２エンハンサーがＡＴＦおよびＥ２によって活性化されるｖＣＦ４２において、Ｅ２プロモーターがＥ１Ａ機能を必要とするが、Ｅ２エンハンサーがＴｃｆ部位によって置換されているｖＣＦ８１では、必要としなかったという事実による可能性がある。初期プロモーターすべてにＴｃｆ部位を、そしてＥ１Ａに△ｐ３００突然変異を持つウイルス（ｖＣＦ６２）は、ＳＷ４８０において、野生型よりも１００倍、より活性でなく、これは、ｖＣＦ４２よりわずかに悪いだけであった（図７、レーン３および６を比較されたい）。非許容性細胞では、ｖＣＦ６２バーストサイズに著しい減少があった（ＨｅＬａ細胞では１０7倍、ＳＡＥＣでは１０5倍；図７、レーン１２および１８）。残るＴｃｆウイルスは、ＨｅＬａおよびＳＡＥＣにおいて、１００〜５０００倍に減少したバーストサイズを示した。△ｐ３００突然変異は再び、Ｅ１Ａに駆動されるＥ２を持つウイルスにおいて、バーストサイズを減少させた（図７、レーン８および９を比較されたい）が、Ｅ２プロモーターがＴｃｆに駆動される場合、ＳＡＥＣにおいて、実際に、（非常に低いレベルからではあるが）バーストサイズを増加させた（図７、レーン１６および１７を比較されたい）。
【０１１９】
ＷＯ  ００／５６９０９の匹敵するウイルス
本発明者らは、本明細書に援用されるＷＯ  ００／５６９０９に称されるような、以下のものを以前、構築した。ＧＦＰに融合させたＥ１Ｂ  ５５Ｋアミノ末端を持つウイルス（匹敵するウイルスＬＧＭ）、３つのＴｃｆ部位によるＥ２プロモーターの置換を持つウイルス（ウイルスＡｄ−Ｔｃｆ３）、および２つの組み合わさったもの（ウイルスＬＧＣ）。本発明者らはまた、４つのＴｃｆ部位のみでのＥ２プロモーターの置換を持つウイルス（ウイルスｖＭＢ１２）、Ｅ３プロモーター中の、特にＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１、およびＡＴＦ部位へのサイレント突然変異と組み合わせた４つのＴｃｆ部位によるＥ２プロモーターの置換を持つウイルス（ウイルスｖＭＢ１４）、並びにＥ３プロモーター中の、特にＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１部位であるが、ＡＴＦ部位でない部位へのサイレント突然変異と組み合わせた４つのＴｃｆ部位によるＥ２プロモーターの置換を持つウイルス（ウイルスｖＭＢ１３）。本発明者らはまた、野生型アデノウイルス主鎖（ウイルスｖＭＢ２３）、ｖＭＢ１２主鎖（ウイルスｖＭＢ２７）、ｖＭＢ１３主鎖（ウイルスｖＭＢ３１）およびｖＭＢ１４主鎖（ウイルスｖＭＢ１９）において、４つのＴｃｆ部位でのＥ１Ｂプロモーター中のＳｐ１部位の置換を持つウイルスも構築した。
【０１２０】
方法に関して以下の参考文献を本明細書に援用する：
【０１２１】
【化４】
2004533852.tif 000006
【０１２２】
Ａｄ−Ｔｃｆウイルスを調製するためのプロモーター置換配列挿入物
【０１２３】
【化５】
2004533852.tif 000007
【０１２４】
参考文献
【０１２５】
【化６ａ】
2004533852.tif 000008
【０１２６】
【化６ｂ】
2004533852.tif 000009
【０１２７】
【化６ｃ】
2004533852.tif 000010
【０１２８】
【化６ｄ】
2004533852.tif 000011
【０１２９】
【化６ｅ】
2004533852.tif 000012
【０１３０】
【化６ｆ】
2004533852.tif 000013
【０１３１】
【化６ｇ】
2004533852.tif 000014
【０１３２】
【化６ｈ】
2004533852.tif 000015
【０１３３】
【化６ｉ】
2004533852.tif 000016
【０１３４】
【化６ｊ】
2004533852.tif 000017
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１Ａ】（Ａ）Ｅ１Ａプロモーター（上部）およびＥ４プロモーター（下部）の突然変異誘発を示す模式図。どちらの領域もＩＴＲから第一のオープンリーディングフレームの開始までを示す。黒三角は、パッケージングシグナル中のＡモチーフに相当する。
【図１Ｂ】（Ｂ）この研究に用いたウイルスの突然変異領域を示す模式図（詳細に関しては表１を参照されたい）。図の解釈を容易にするため、ウイルスにクローン名（ｖＣＦおよびｖＭＢ）およびその構造を要約するコード名を与える：Ａ、Ｂ、２、４＝それぞれ、Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂ、Ｅ２、およびＥ４プロモーター中のＴｃｆ部位。３＝Ｅ３プロモーター中のＮＦ１、ＮＦκＢ、ＡＰ１、およびＡＴＦ部位のサイレント突然変異。３’＝３と同様だがＡＴＦ部位突然変異を含まない。△＝ｐ３００結合を廃する、Ｅ１Ａ中のアミノ酸２−１１の欠失。Ｆ＝ＨＳＰＧおよびＣＡＲ結合を廃する、線維中の突然変異と共に、Ｈ１ループにおけるＲＧＤ４Ｃペプチドの挿入。Ｉ＝ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ。Ｃ＝酵母シトシンデアミナーゼ。
【図２】野生型Ａｄ５およびＴｃｆウイルスでの感染２４時間後、Ｅ１ＡおよびＤＢＰに関して探査したｃＭＭ１細胞のウェスタンブロット。テトラサイクリン使用中止によって、△Ｎ−β−カテニンの発現が導かれる（レーン６〜８）。Ｔｃｆ−Ｅ１Ａプロモーターは、ｗｎｔシグナル伝達の活性化に反応する（レーン７）。
【図３】野生型Ａｄ５およびＴｃｆウイルスへの異なる細胞株の感染２４時間後のＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ５５ｋ、ＤＢＰおよびＥ４ｏｒｆ６に関するウェスタンブロット。ＳＷ４８０およびＩｓｒｅｃ０１は、許容性結腸癌細胞株である。Ｃｏ１１５、Ｈｃｔ１１６およびＨＴ２９は、半許容性結腸癌細胞株である。Ｈ１２９９、ＨｅＬａおよびＳＡＥＣは、非許容性細胞株であり、これらの細胞ではｗｎｔ経路が不活性である（ＳＡＥＣブロットは、２つの別個の実験由来であり、同様の野生型Ａｄ５活性を生じる。ｖＭＢ３１はＳＡＥＣに対しては試験しなかった）。
【図４】Ｔｃｆ−Ｅ２レポーターを用いた、ＳＷ４８０およびＣｏ１１５におけるルシフェラーゼアッセイの結果の棒グラフ；β−カテニンがＳＷ４８０およびＣｏ１１５結腸癌細胞株において律速因子でないことを示す。
【図５Ａ】Ｅ１ＡはＴｃｆに依存する転写を阻害する。（Ａ）Ｅ１Ａ１２Ｓ突然変異体の模式図。（Ｂ〜Ｄ）野生型Ｅ２レポーターおよびＴｃｆ−Ｅ２レポーターを用いたルシフェラーゼアッセイ。「Ｔｃｆ−Ｅ２  ｍｕｔ  Ｅ３」レポーターは、Ｅ３エンハンサー中に不活性化突然変異を含有する（９）。細胞をルシフェラーゼレポーターおよびＥ１Ａ突然変異体（Ａに示す）を発現するプラスミドでトランスフェクションした。（Ｂ）ＳＷ４８０、（Ｃ）Ｃｏ１１５、（Ｄ）Ｈｃｔ１１６。
【図５Ｂ】Ｅ１ＡはＴｃｆに依存する転写を阻害する。（Ａ）Ｅ１Ａ１２Ｓ突然変異体の模式図。（Ｂ〜Ｄ）野生型Ｅ２レポーターおよびＴｃｆ−Ｅ２レポーターを用いたルシフェラーゼアッセイ。「Ｔｃｆ−Ｅ２  ｍｕｔ  Ｅ３」レポーターは、Ｅ３エンハンサー中に不活性化突然変異を含有する（９）。細胞をルシフェラーゼレポーターおよびＥ１Ａ突然変異体（Ａに示す）を発現するプラスミドでトランスフェクションした。（Ｂ）ＳＷ４８０、（Ｃ）Ｃｏ１１５、（Ｄ）Ｈｃｔ１１６。
【図５Ｃ】Ｅ１ＡはＴｃｆに依存する転写を阻害する。（Ａ）Ｅ１Ａ１２Ｓ突然変異体の模式図。（Ｂ〜Ｄ）野生型Ｅ２レポーターおよびＴｃｆ−Ｅ２レポーターを用いたルシフェラーゼアッセイ。「Ｔｃｆ−Ｅ２  ｍｕｔ  Ｅ３」レポーターは、Ｅ３エンハンサー中に不活性化突然変異を含有する（９）。細胞をルシフェラーゼレポーターおよびＥ１Ａ突然変異体（Ａに示す）を発現するプラスミドでトランスフェクションした。（Ｂ）ＳＷ４８０、（Ｃ）Ｃｏ１１５、（Ｄ）Ｈｃｔ１１６。
【図５Ｄ】Ｅ１ＡはＴｃｆに依存する転写を阻害する。（Ａ）Ｅ１Ａ１２Ｓ突然変異体の模式図。（Ｂ〜Ｄ）野生型Ｅ２レポーターおよびＴｃｆ−Ｅ２レポーターを用いたルシフェラーゼアッセイ。「Ｔｃｆ−Ｅ２  ｍｕｔ  Ｅ３」レポーターは、Ｅ３エンハンサー中に不活性化突然変異を含有する（９）。細胞をルシフェラーゼレポーターおよびＥ１Ａ突然変異体（Ａに示す）を発現するプラスミドでトランスフェクションした。（Ｂ）ＳＷ４８０、（Ｃ）Ｃｏ１１５、（Ｄ）Ｈｃｔ１１６。
【図６】Ｅ１Ａの突然変異体型によるＴｃｆに依存する転写の阻害を示す、肺癌細胞株Ｈ１２９９におけるルシフェラーゼアッセイ。（Ａ）Ｔｃｆ−Ｅ１Ａレポーターと多様なＥ１Ａ突然変異体および△Ｎ−β−カテニンの同時トランスフェクション。（Ｂ）増加する量のｐ３００プラスミド（０．５、１、または２μｇ）の同時トランスフェクションによって、Ｔｃｆに依存する転写の減少が導かれる。（Ｃ）Ｅ１Ａの野生型および突然変異型の存在下でのＴｃｆに依存する転写に対するｐ３００、Ｐ／ＣＡＦおよびＴｉｐ４９の影響。値は、Ｅ１Ａおよび△Ｎ−β−カテニンの非存在下でのＥ１Ａ野生型レポーターに対する倍活性化に相当する。
【図７】野生型Ａｄ５およびＴｃｆウイルスの１０倍希釈に感染させた、異なる細胞株における細胞変性効果アッセイ。（Ａ）ＳＷ４８０細胞を、１０ｐｆｕ／細胞の出発感染効率で感染させ、そして感染６日後に染色した。（Ｂ）Ｃｏ１１５および（Ｃ）Ｈｃｔ１１６を、１００ｐｆｕ／細胞の出発感染効率で感染させ、そして感染７日後に染色した。（Ｄ）ＨｅＬａを、１００ｐｆｕ／細胞の出発感染効率で感染させ、そして感染８日後に染色した。
【図８】許容性および非許容性細胞株に対するウイルスバーストアッセイ。ＳＷ４８０、ＨｅｌａおよびＳＡＥＣ細胞を３００ウイルス粒子／細胞で感染させ、そして感染４８時間後に溶解した。ＳＷ４８０上のプラークアッセイによって、溶解物に存在するウイルス粒子の力価を測定した。各細胞株に関して、値を野生型Ａｄ５力価に規準化した。*ｖＣＦ４２はＳＡＥＣに対しては試験しなかった
【図９Ａ】野生型Ａｄ５  Ｅ１Ａプロモーターおよび本発明のＴｃｆ突然変異Ｅ１Ａプロモーターの配列比較。
【図９Ｂ】野生型Ａｄ５  Ｅ１Ａプロモーターおよび本発明のＴｃｆ突然変異Ｅ１Ａプロモーターの配列比較。
【図１０Ａ】野生型ＡＤ５  Ｅ４プロモーターおよび本発明のＴｃｆ突然変異Ｅ４プロモーターの配列比較。
【図１０Ｂ】野生型ＡＤ５  Ｅ４プロモーターおよび本発明のＴｃｆ突然変異Ｅ４プロモーターの配列比較。
【図１１】Ａｄ５  ｗｔおよび本発明の３つのウイルスに感染させたいくつかの細胞に関するヒストグラムとして示した、バーストアッセイの結果。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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