(57)【要約】植物病原体に対する植物の病害抵抗性に関連する発現された核酸配列、単離された核酸分子およびその変異体および（または）相同体、作成物、植物および前記ヌクレオチド配列によってエンコードされたポリペプチドの識別および単離の方法および病原体に対する植物内の抵抗性の発生におけるこれら配列の使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
病原体に対する植物内の病害抵抗性に関連する発現された核酸配列の識別、および任意の単離の方法において、
（ａ）  第一の植物材料を提供する工程と、
（ｂ）  過敏感反応に関係する特性において該第一の植物材料とは異なる第二の植物材料を提供する工程と、
（ｃ）  過敏感反応に関係する特性において該第一の植物材料とは異なる追加の植物材料を任意に提供する工程と、
（ｄ）  該第一の植物材料に対して生成された転写物プロファイルを、該第二の植物材料に対して生成された転写物プロファイルと、そして任意に、該追加の植物材料に対して生成された転写物プロファイルと、比較する工程と、
（ｅ）  該第一の植物材料と該第二の植物材料との間で、そして任意に、該第一の植物材料と該追加の植物材料のうちのいずれか一つとの間で、差異的に発現された転写物に対応する核酸配列を、前記転写プロファイルにおいて検出する／識別する工程と、
（ｆ）  工程（ｅ）で該識別された発現された核酸配列を、任意に、単離し、精製し、かつ（あるいは）配列決定する工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
該第一の植物材料は、過敏感反応を生じない植物から得られ、かつ、該第二および任意の追加の植物材料は、過敏感反応が誘発された一つまたはそれ以上の植物から得られることとする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
過敏感反応の誘発は、抑制可能であることとする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
抑制は、温度により制御されることとする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
該第二および追加の植物材料は、過敏感反応の誘発後、異なる時間間隔で得られたこととする請求項１〜４のうちのいずれか一つに記載の方法。
【請求項６】
該第一の植物材料は、植物病原体誘導の非病原性遺伝子を含まない植物から得られることとする請求項１〜５のうちのいずれか一つに記載の方法。
【請求項７】
該第二および任意の追加の植物材料は、
（ａ）植物病原体誘導の非病原性遺伝子と、
（ｂ）植物抵抗性遺伝子と、
の適合するペアを含む遺伝子導入植物から得られ、
該適合するペアは、過敏感反応を誘発することができることとする請求項１〜６のうちのいずれか一つに記載の方法。
【請求項８】
該植物病原体は、菌類であることとする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該菌類は、Cladosporium fulvum であることとする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該植物病原体誘導の非病原性遺伝子と、該植物抵抗性遺伝子の該適合するペアは、Avr2およびCf-2；Avr4およびCf-4； Hcr9-4EおよびCf-4E； Avr5およびCf-5； および、Avr9およびCf-9 のペアから成るグループから選択されることとする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該植物材料の該転写物プロファイルは、cDNA AFLPを用いて得られることとする請求項１〜１０のうちのいずれか一つに記載の方法。
【請求項１２】
SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420 のうちの一つで定義されたヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項１３】
SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420 のうちの一つで定義されたヌクレオチド配列の少なくとも一部を用いて、厳密な条件下でハイブリダイズすることができる核酸分子。
【請求項１４】
該核酸分子は、ヌクレオチド10〜50個の長さを有することとする請求項１２または１３に記載の核酸分子。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のうちのいずれか一つで定義された少なくとも２種類の核酸分子を含む核酸分子のコレクション。
【請求項１６】
該核酸分子は、固形の支持体に固定され、それによりそれぞれの異なる核酸分子は、該固形の支持体の特定の、かつ、別個の部分に取り付けられることとする請求項１５に記載のコレクション。
【請求項１７】
植物のゲノムを分析する際の、請求項１２〜１４のうちのいずれか一つに記載の核酸分子、または、請求項１５または１６に記載のコレクションの使用。
【請求項１８】
植物が、病害抵抗性に関係する所望の特性を発現できるかどうかを判定する際の、請求項１２〜１４のうちのいずれか一つに記載の核酸分子、または、請求項１５または１６に記載のコレクションの使用。
【請求項１９】
植物遺伝子または植物cDNA の完全長コピーをクローン化する際の、請求項１２〜１４のうちのいずれか一つに記載の核酸分子、または、請求項１５または１６に記載のコレクションの使用。
【請求項２０】
少なくとも一つの植物病原体に対して抵抗性を有する植物を提供するための請求項１２または１３に記載の核酸分子の使用。
【請求項２１】
該植物は、経済的に、かつ（あるいは）、作物栽培学的に重要な農産物または植物であることとする請求項１７〜２０のうちのいずれか一つに記載の使用。
【請求項２２】
植物ポリペプチドに対する機能的なコーディング配列を含む核酸分子において、
（ａ）  該コーディング配列は、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420 のうちの一つで定義されたヌクレオチド配列を含む植物転写物であるか、あるいは、
（ｂ）  該コーディング配列は、（ａ）における該コーディング配列によってエンコードされた該ポリペプチドとの、少なくとも４０％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをエンコードする、
ことを特徴とする核酸分子。
【請求項２３】
請求項２２で定義されたコーディング配列を含み、さらに、該コーディング配列に動作可能にリンクされた発現レギュレーティング配列を含む核酸作成物において、該発現レギュレーティング配列は、適当なホスト細胞における該コーディング配列の発現を管理することができることを特徴とする核酸作成物。
【請求項２４】
請求項２３で定義した核酸作成物を含むホスト細胞。
【請求項２５】
ホスト細胞は、植物細胞であることとする請求項２４に記載のコレクション。
【請求項２６】
ホスト細胞は、Agrobacteriumの細胞であることとする請求項２４に記載のコレクション。
【請求項２７】
請求項２４または２５で定義されたホスト細胞を含む植物。
【請求項２８】
請求項２７の植物用の培養材料において、該培養材料は、請求項２４または２５で定義されたホスト細胞を含むことを特徴とする培養材料。
【請求項２９】
請求項２７で定義された植物から得られる植物材料。
【請求項３０】
請求項２２で定義されたコーディング配列によってエンコードされたポリペプチド。
【請求項３１】
請求項３０で定義されたポリペプチドを生ずる方法において、請求項２４〜２６で定義されたホスト細胞、または、請求項２７で定義された植物は、該ポリペプチドの発現に貢献する条件下で育成されることを特徴とする方法。
【請求項３２】
遺伝子導入植物内に過敏感反応を誘発する方法において、該方法は、
（ａ）  過敏感反応の誘発を抑制する温度で、植物病原体誘導の非病原性遺伝子と植物抵抗性遺伝子の適合するペアを発現する植物を育成する工程と、
（ｂ）  該植物の温度を過敏感反応の誘発に対して許容的な温度まで下げる工程と、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項３３】
植物病原体誘導の非病原性遺伝子と植物抵抗性遺伝子の適合するペアを含む遺伝子導入植物。
【請求項３４】
該植物は、胚軸の出現を超える段階まで育成されることとする請求項３３に記載の遺伝子導入植物。
【請求項３５】
該植物は、完全に育成されることとする請求項３４に記載の遺伝子導入植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物または植物細胞に、所望の特性を付与するのに使用できるヌクレオチド配列の単離およびキャラクタリゼーションに関する。より詳しくは、本発明は、病原体に対する植物の抵抗性に関与するヌクレオチド配列に関する。
【発明の背景】
【０００２】
植物は、細菌、ウイルス、菌類、線虫、アブラムシ、昆虫および他の病害虫等、多種多様な、分類学的に非常に異なる病原体の攻撃に、絶えず曝されている。病原体と植物との間のこうした遭遇のほとんどは、蝋層、細胞壁および化学的バリアー等の受動的防御ラインで、停止する。しかしながら、この一次バリアーが突破された場合、植物と病原体との間の相互作用の結果、病原体が侵入する場合がある。この侵入の結果、多くの場合、植物の損傷に、あるいは、感染した植物の死にさえ至る可能性がある病害症状が、生じる場合がある。病原体の侵入は、植物のごく限られた領域の、あるいは、ごく少数の細胞の感染にしか至らない場合もある。病原体の感染を制限するために、植物は、第二の防御ラインを発達させた。この第二の防御ラインには、非常に複雑で、かつ、いまだ解明されていない、多種多様な機構が存在している。基本原理は、特定の抵抗性遺伝子（R遺伝子）の転写から誘導された蛋白質が、防御ラインを構築することにある。Takken他は、European Journal of Plant Pathology 106:699-713 (2000) において、４種類の根本的な機構を認識している。すなわち、i）R遺伝子によってエンコードされた生成物が、病原体によって生成され、かつ、その毒素が、通常は壊死を誘発するか、あるいは、他の能動的防御反応の誘発を阻害する毒素を、不活性化する；ii）R遺伝子生成物が、そのターゲットの不在下では植物抵抗性が生じるような病原性ターゲットを、エンコードする；iii）R遺伝子生成物が、植物防御反応を特発する；およびiv）R遺伝子生成物が、適合する非病原性（Avr）遺伝子（すなわち、遺伝子対遺伝子抵抗性）を発現する特定の病原体の特異的な認識を仲介する。ホストによる、病原体誘導のAvr遺伝子生成物（いわゆるエリシター）の特異的な認識が、蛋白質の燐酸エステル化、イオンの流動、反応性酸素種および他のシグナルの生成を含むシグナル伝達カスケードを活性化する。これらシグナルが、その後、グルタチオンS-トランスフェラーゼ、ペルオキシダーゼ、細胞壁蛋白質、プロテイナーゼインヒビター、加水分解酵素、病原関連（PR）蛋白質および二次代謝に関与する酵素等の蛋白質をエンコードする植物防御遺伝子の転写を引き起こす。それに加えて、侵入病原体と直接接触している植物細胞が、死ぬ。この現象は、過敏感反応（HR ）と呼ばれている。HR は、遺伝子対遺伝子抵抗性原理の特質と見なされている。HR は、蛋白質合成を必要とし、かつ、多くの場合、植物の非接種部分における抵抗性の誘発と相関している、能動的な過程である。この全身獲得抵抗性（SAR）の結果、多くの病原体により引き起こされる病害症状が、有意に低減する。
【０００３】
病原体が植物に、および、農産物生産の経済学に与える影響は、非常に深刻な場合がある。特に、トマト、ジャガイモ、イネおよび穀類等、作物栽培学的に重要な農産物の場合は、この影響は、破滅的ではないにしても、甚大な場合がある。したがって、病原体に対する脆弱性がより低い植物、および（または）、侵入病原体に対する自己防御能力がより高い植物が、求められている。
【０００４】
そのような植物を創出するには、遺伝子導入植物か否かに拘らず、病原体抵抗性の基礎となる生化学および遺伝子学に関するさらなる理解が必要であり、かつ、植物の防御システムの構成要素のさらなる識別が必要である。この目的のために、植物内の防御反応に至る経路が、モデルシステムを用いて研究されてきた。これら研究の過程において、病原体に対する防御反応の誘発に関与する多数の構成要素が、識別されている。
【０００５】
本発明の目的の一つは、農産物および（または）植物における、持続的、かつ（あるいは）広範な抵抗性を提供することである。本発明の別の目的は、シグナル伝達経路に関係する、あるいは、それを制御し、誘発し、それに寄与し、または別様にマイナスまたはプラスの影響または刺激を与えることができる、ヌクレオチド配列および（または）ポリペプチドを識別することである。本発明の別の目的は、植物の防御機構の、より詳しくは、病原体に対する植物の防御機構の、さらにより詳しくは、HRの、活性化または（アップまたはダウン）レギュレーションに使用および（または）応用が可能な、方法、化合物または組成を提供することである。本発明の別の目的は、抵抗性の、望ましくは、品種特異的抵抗性の調節に関係し、あるいは、関与する下流のシグナリング構成要素を識別し、かつ（あるいは）提供することである。本発明の別の目的は、病原体誘発性発現を駆動するプロモーターを識別し、かつ（あるいは）提供することである。本発明の他の目的は、発明およびその実施形態の説明から明らかになるであろう。
【発明の要約】
【０００６】
本発明は、植物病原体に対する植物の防御機構に関与するヌクレオチド配列の単離およびキャラクタリゼーションに関する。さらにより詳しくは、本発明は、植物病原体に対する植物の防御機構に関係する、一つまたはそれ以上の所望の、かつ（あるいは）良好な特性を植物に付与するのに使用できるヌクレオチド配列の単離およびキャラクタリゼーションに関する。
【０００７】
Ａ．差異的に発現された核酸断片の識別および単離の方法
第一の主要な様態では、本発明は、病原体抵抗性に関連する発現された核酸断片の識別および単離の方法に関する。この目的のためには、少なくとも二つの植物の発現プロファイルが、病害抵抗性に関係する少なくとも一つの特性において異なっている。異なる該植物は、望ましくは、同じ属のものである。より望ましくは、異なる該植物は、（遺伝子型的に）同一であるが異なる条件に置かれるか、あるいは、該植物は、病害抵抗性に関与し、あるいはそれに関連する遺伝的決定基を除いて、同質遺伝子的である。より詳しくは、該方法は、病原体に対する植物内の病害抵抗性に関連する遺伝子の転写物の一部である発現された核酸断片を識別するのに使用してよい。対応する遺伝子は、その後、単離し、かつ、病害抵抗性に関係する有利な特性を植物に付与するのに使用してよい。発現された断片は、例えば、核酸配列または断片から成るライブラリーの形態で提供してよく、より詳しくは、例えば、以下により詳細に説明されているように、cDNA AFLP（登録商標）を通して得られる一つまたはそれ以上の（増幅された）制限断片の形態であってよい。
【０００８】
望ましくは、病原体に対する植物内の病害抵抗性に関連する発現された核酸断片の識別および単離の方法は、少なくとも、
（ａ）  第一の植物材料を提供する工程と、
（ｂ）  病害抵抗性に関係する特性において第一の植物材料とは異なる少なくとも第二の植物材料を提供する工程と、
（ｃ）  同じく、病害抵抗性に関係する特性において第一の植物材料とは異なる追加の植物材料を任意に提供する工程と、
（ｄ）  第一の植物材料の転写物プロファイルを、第二の植物材料の転写物プロファイルと、そして任意に、追加の植物材料の転写物プロファイルと、比較する工程と、
（ｅ）  第一の植物材料と第二の植物材料との間で、そして任意に、第一の植物材料と追加の植物材料との間で、差異的に発現された転写物に対応する核酸断片を、転写物プロファイルにおいて識別する工程と、
を含んでいる。
【０００９】
本発明の方法では、病害抵抗性に関係する特性は、望ましくは、例えば、HR の有無またはHRの誘発後の時間等、植物におけるHR に関連する特性である。
【００１０】
本発明の方法で使用すべき植物材料、すなわち、第一、第二および追加の植物材料は、望ましくは、同じ属、同じ種、同じ変種、同じ栽培品種から得られるか、あるいは、同じ植物から得られる。それでも、第一の植物材料は、病害抵抗性に関係する少なくとも一つの特性において、第二および追加の植物材料とは異なっている。そのような差は、遺伝子型の差の結果であってよい。例えば、第二および追加の植物材料は、そこから第一の材料が得られる植物の、突然変異体である植物から得てよい。そのような場合には、該植物は、望ましくは、遺伝子型の差を除いて同質遺伝子的である。別法としては、該植物材料は、差が、異なる組織、異なる発生段階、あるいは植物が受けた異なる条件の結果である、同質遺伝子的植物から得られる。
【００１１】
望ましくは、第一の植物材料および第二の植物材料は、（本発明は、その最も広い意味において、それに限定されないが、）第一の植物材料に比べて、第二の植物材料では、病害抵抗性の所望の特性または特性（複数）が改善される（例えば、増強される）ように選択される。例えば、第一の植物材料は、正常レベルまたは野生型レベルの、病害抵抗性に関係する特性を有する植物（材料）であってよく（すなわち、基準として使用してよい）、その場合には、第二の植物材料は、異常レベルの該特性（すなわち、改善され、増強され、あるいは低減された）を有する植物であってよい。任意に、第一の植物材料の（そして任意に、同じく第二の植物材料の）転写プロファイルは、一つまたはそれ以上の追加の植物材料（例えば、第三、第四および他の植物材料）の転写プロファイル（複数も可）とさらに比較してよい。望ましくは、任意のそのような追加の植物材料は、それらが病害抵抗性に関係する特性において第一の植物材料とは異なるように、選択される。それらは、望ましくは、それらが病害抵抗性に関係する特性（例えば、上と同じ）において第二の植物材料とも異なるように、かつ（あるいは）前記特性において互いに異なるように、さらに選択される。例えば、植物材料の一シリーズまたは一コレクションを、病害抵抗性に関係する特性のレベルまたは度合いに従ってランク付けし、その上で、病害抵抗性に関係する特性のレベルまたは度合いが最も低い植物材料を第一の植物材料として使用し、かつ、残りの植物材料を第二の植物材料および（例えば、特性または特性（複数）の増強に従ってランク付けされた）追加の植物材料として使用してよい。別法としては、植物材料の一コレクションから、病害抵抗性に関係する特性のレベルまたは度合いが最も高い植物材料を、特性または特性（複数）のレベルまたは度合いが最も低い植物材料と比較してよく、その場合、特性または特性（複数）のレベルが最も高い植物材料は、一般に、第二の植物材料として使用され、かつ、特性または特性（複数）のレベルが最も低い植物材料は、一般に、第一の植物材料として使用される。その後、第一の植物材料および（または）第二の植物材料は、任意に、該コレクションからの追加の植物材料のうちの一つまたはそれ以上とさらに比較してよい。上記に関して、第一の植物材料の代わりに、既知の基準植物または植物材料、かつ（あるいは）そのような既知の基準植物または植物材料に対するデータも使用してよいことは、熟練した人には明らかであろう。
【００１２】
望ましくは、本発明の方法では、第一の植物材料は、HRを生じない植物から得られ、かつ第二および任意の追加の植物材料は、HRが誘発された一つまたはそれ以上の植物から得られる。望ましくは、第二および任意の追加の植物を、その後にHR の誘発を可能にするために抑制条件が除去される所望の段階まで、HRを抑制する条件下で育成できるように、 HRの誘発は、抑制可能である。 HRの抑制は、望ましくは、温度によって簡便に制御される。本発明の好適な実施形態では、第二および追加の植物材料は、HR  の誘発後、異なる時間間隔で得られたものである。例えば、第二および追加の植物材料は、HR の開始から、0、30、60および90分後に得られたものであってよい。特定の一実施形態では、第一の植物材料は、より後の時点で得られた材料から得られた転写物プロファイルと比較すべき、HRの開始時（すなわち、t = 0）に得られた植物材料であってよい。
【００１３】
本発明の方法では、第一の植物材料は、望ましくは、植物病原体誘導の非病原性（導入）遺伝子を含んでいない植物から得られる。非病原性遺伝子は、それを通して特定の抵抗性（R）遺伝子を保有する植物が、適合する非病原性遺伝子を保因する病原体を認識する、遺伝子対遺伝子抵抗性機構の一部である。
【００１４】
本発明の方法では、第二および任意の追加の植物材料は、望ましくは、（ａ）植物病原体誘導の非病原性遺伝子と（ｂ）植物抵抗性遺伝子との適合するペアを含み、抵抗性遺伝子と非病原性遺伝子との該適合するペアがHRを誘発することができる、遺伝子導入植物から得られる。Takken他（上記）（引用により本文書に組み込まれている）によってレビューされ、かつ、その表1にリストされているように、この技術分野において、多様な植物種およびそれらの病原体について、抵抗性遺伝子と非病原性遺伝子とのある範囲の適合するペアが知られている。望ましくは、非病原性遺伝子を提供する植物病原体は、菌類であり、より望ましくは、該菌類はCladosporium fulvumである。最も好適な実施形態では、植物病原体誘導の非病原性遺伝子とそれに適合する植物抵抗性遺伝子との適合するペアは、Avr2とCf-2、Avr4とCf-4、Hcr9-4EとCf-4E、Avr5とCf-5、および、Avr9とCf-9のペアから成るグループから選択される。
【００１５】
一般に、転写プロファイル（複数も可）を生成するために使用される植物材料は、選択された該植物または植物材料が病害抵抗性に関係する特性において少なくとも異なっている限り、一つまたはそれ以上の植物全体から選択してよく、かつ（あるいは）、根、茎、葉柄、葉、花弁、果実、種子、塊茎、分裂組織、萼片、および花を含むがそれに限定されない、一つまたはそれ以上の植物からの一つまたはそれ以上の部分、組織および（または）器官から選択してよい。また、選択された植物材料は、やはり選択された植物材料が病害抵抗性に関係する特性において少なくとも異なっている限り、植物の発生の異なる段階を、植物に影響を及ぼす可能性のある病害の異なる段階を、（例えば、水、光、栄養素の欠乏、損傷等による）異なるレベルのストレスに曝露された植物を、代表するものであってよい。一般に、二つまたはそれ以上のそのような異なる植物の発現プロファイルを比較する場合、そのような異なる植物の本質的に同じ部分（複数も可）、組織（複数も可）または器官（複数も可）の発現プロファイルが比較されることになる。
【００１６】
二つまたはそれ以上のそのような異なる植物の発現プロファイルを比較する場合、これら植物は、一般に、少なくとも同じ属に、かつ望ましくは、同じ種に属することになる。例えば、抵抗性に関係する異なる特性を有する変種または突然変異体、あるいは、ヘテロ接合体、ホモ接合体またはハイブリッドにおけるこれら突然変異のうちのいずれか等、病害抵抗性に関係する特性において差を示す異なる変種またはラインからの植物を、比較してよい。
【００１７】
また、該植物材料は、その部分、組織または器官が病害抵抗性に関係する特性において異なっている、植物の二つまたはそれ以上の異なる部分、組織および（または）器官であってよい。望ましくは、二つまたはそれ以上のそのような異なる部分、組織または器官の発現プロファイルを比較する場合、これら部分、組織または器官は、同じ種に属する植物から、より望ましくは、同じラインまたは変種に属する植物から、および最も望ましくは、同じ植物または同質遺伝子的植物から、誘導されることになる。
【００１８】
本発明の方法では、望ましくは「比較可能な」発現プロファイルが各植物材料のそれぞれから生成されることになるが、それは一般に、これら発現プロファイルが、上に概要を示したような一つまたはそれ以上の差異的に発現された断片の検出および識別を可能にするようなものであるべきであることを意味する。一般に、これは、該発現プロファイルが、同じ技法を用いて、かつ、一般に、同じ条件を用いて、得られることになることを意味する。例えば、cDNA AFLP（登録商標）が、そのような「比較可能な」発現プロファイルを生成するのに使用される場合、そのようなcDNA AFLP（登録商標）は、一般に、使用される本質的に全ての植物材料に対して、同じ制限酵素、アダプター、プライマー、検出技法（複数も可）、および他の条件を用いて、実行されることになる。しかしながら、熟練した人であれば、発現された断片のいくつかのセットを提供するために、例えば、異なる制限酵素、異なるプライマーの組合せ（例えば、異なる選択的ヌクレオチドによる）等を用いて、各植物材料のそれぞれから、いくつかの異なる比較可能な発現プロファイルを生成し得ることを理解するであろう。
【００１９】
工程（ｄ）において比較される転写物プロファイルを得るには、転写物プロファイリングのためのそれ自体既知の任意の技法を使用してよく、より詳しくは、それぞれの植物材料間の発現における一つまたはそれ以上の差の検出を可能にする、それ自体既知の任意の技法を使用してよい。さらにより詳しくは、それぞれの植物材料に存在するような、転写物における、あるいは、転写物レベルにおける差（すなわち、mRNA、mRNAレベル、あるいは、そのようなmRNAに対応するcDNAにおける差）の検出を可能にする技法が、使用されることになる。したがって、転写物プロファイルを生成するために用いられる技法は、一般に、それぞれの植物材料において差異的に発現された一つまたはそれ以上の転写物を代表すると見なすことができる、一つまたはそれ以上の発現された断片が、検出され、かつ、その後、識別されるようなものであり、望ましくは、該技法において検出された発現された断片のレベルは、それぞれの植物材料における対応する転写物のレベルを代表するようなものである。一般に、これら発現された断片は、それぞれの植物材料から生成された発現プロファイル間の、個々の発現された断片（例えば、バンド）の検出シグナルにおける差として検出されるか、あるいは、その差により識別されることになる。特に関心のあるのは、以下でさらに述べるように、例えば、第一の植物材料から第二の植物材料へ、かつ（あるいは）、第一の植物材料から追加の植物材料へ、関心のある病害抵抗性の特性または特性（複数）（例えば、上記のもの）が変化する（例えば、増強する）と、そのシグナルが変化するマーカーであろう。したがって、例えば、第二の植物材料に対して（かつ（あるいは）追加の植物材料のうちのいずれかに対して）生成された転写物プロファイル（複数も可）に存在するような、発現された断片の検出可能なシグナル（例えば、ゲルまたはオートラジオグラフ上のバンド、あるいは、クロマトグラム内のピーク）は、第一の植物材料に対して生成された転写物プロファイル（複数も可）には、存在しないか、あるいは、低減されたレベルで存在してもよい。発現された断片のシグナルは、第一の植物材料に対して生成された発現プロファイル（複数も可）に比べて、第二の植物材料に対して（かつ（あるいは）追加の植物材料のうちのいずれかに対して）生成された発現プロファイル（複数も可）において、増強されてもよい（例えば、より強くてもよい）。しかしながら、一般的に言って、本発明は、一般に、第一の植物材料と第二の植物材料（および（または）追加の植物材料のうちのいずれか）との間の、発現における任意の差（複数も可）を代表する任意の発現された断片の選択を含んでいる。したがって、例えば、本発明はまた、例えば、第一の植物材料から第二の植物材料へ、かつ（あるいは）、第一の植物材料から追加の植物材料へ、関心のある病害抵抗性の特性または特性（複数）（例えば、上記のもの）が変化する（例えば、増強する）と、そのシグナルが変化する（例えば、増強する）断片（の選択）を含んでいる。本発明はまた、例えば、ある種の（例えば、特定の、かつ（あるいは）限定された）期間中（例えば、植物の発生中、病原体による植物への侵入後の病原体の発��中（例えば、植物の防御反応システムの発生または活性化中、あるいは、植物が収集された後）の病害抵抗性のみに関連するマーカーを含んでいる。
【００２０】
転写プロファイルを得るために用いられる技法は、望ましくは、差異的に発現された転写物を代表する発現された断片が、対応する核酸配列を提供するよう配列分析に掛けることができる、増幅された制限断片等の核酸断片の形態で提供されるようなものである。そのような転写物誘導のヌクレオチド配列を、本文書では、「発現された核酸断片」と呼ぶことにする。
【００２１】
該一つまたはそれ以上の断片をそのような発現された断片の形態で生成する場合、本発明の方法は、工程（ｅ）において識別された発現された断片を、単離し、精製し、かつ（あるいは）配列決定する、任意のさらなる工程（ｆ）も含んでいてよい。
【００２２】
より詳しくは、そのような発現された断片は、差異的に発現された転写物の一部であるヌクレオチド配列（例えば、そのような転写物から誘導された制限および（または）PCR断片を含む）であってよい（として提供されてよい）。
【００２３】
望ましくは、以下でさらに述べるように、該発現された断片は、cDNA AFLP（登録商標）により得られる。そのような場合には、該発現された断片は、cDNA AFLP（登録商標）を用いてそれぞれの植物材料から生成されたDNAフィンガープリントにおいて異なる強度を有するバンドとして識別される、増幅された制限断片（例えば、cDNA AFLP（登録商標）断片）として提供されることになる。さらに望ましくは、転写物プロファイルは、例えば、以下に説明するような制限酵素、アダプター、プライマーおよび他の条件を用いて、本質的に以下に説明したように実行されるcDNA AFLP（登録商標）により生成してよい。望ましくは、それぞれの植物材料からの転写物プロファイルの生成のために使用すべきcDNA AFLP（登録商標）技法は、Vos他（1995, Nucl. Acids Res.,23: 4407-4414）によって説かれたAFLP（登録商標）法（開始DNAが、関心のある植物材料から単離されたmRNAプールを、逆転写酵素を用いて、cDNAの混合物に変換することによって従来の方法で得られたcDNAの混合物である）に基づいている。植物材料から抽出されたトータルRNAは、逆転写酵素反応のための鋳型として使用してよいが、望ましくは、該RNA鋳型は、例えば、オリゴ-dTクロマトグラフィーによって得られたpoly-A+富化RNAから成る。
【００２４】
AFLP（登録商標）法の原理工程は、下記の通りである。開始DNA（cDNA AFLP（登録商標）の場合は、cDNAの混合物）を制限酵素で消化する。望ましくは、（１）低頻度切断酵素（例えば、EcoRI等の「6カッター」）と（２）高頻度切断酵素（例えば、MseI等の「4カッター」）との組合せを使用する。別法としては、二つの（異なる）4カッターの組合せが使用できる。このようにして得られた制限断片の末端に、オリゴヌクレオチドアダプターを結紮する。次いで、一端に低頻度カッター部位（EcoRI）を、かつ、他端に高頻度カッター部位（EcoRI）を有する断片のみが増幅されるように、前置増幅PCRを行う。二つの4カッターの場合には、二つの異なる末端を有する断片が優先的に増幅される。前置増幅の生成物を、次いで、厳密な条件下で、第二の、かつ選択的な増幅における鋳型として使用する。選択的増幅において使用されるプライマーは、オリゴヌクレオチドアダプターに対して相補的であり、加えて、それらの3'末端に、前置増幅において増幅された断片のサブセットのみの増幅を可能にする任意に選択された選択的ヌクレオチドを含んでいる。該選択的プライマーは、一般に、それらの3'末端に、１〜５個の選択的ヌクレオチドを含むことになる。これら条件下では、その末端が選択的プライマーに対して完璧に相補的である断片のみが増幅されることになる。例えば、それらの3'末端にそれぞれ１個の選択的ヌクレオチドを有する二つの選択的プライマーは、１６個の断片のうちの１個を増幅することになり、一方、それらの３'末端にそれぞれ２個の選択的ヌクレオチドを有する二つの選択的プライマーは、２５６個の断片のうちの１個を増幅することになる。該増幅された断片は、その後、例えば（望ましくは、ポリアクリルアミドゲル上での、かつそれ自体既知の方法により可視化された）ゲル電気泳動により、分離される。各断片は、その大きさ（すなわち、長さ）によって、かつ、それ自体の増幅を可能にした選択的プライマーの組合せによって、定義してよい。すでに述べたように、cDNA AFLP（登録商標）の場合は、開始DNAは、分析すべきmRNA集団の逆転写によって得られたcDNAである。前置増幅および選択的増幅の後、得られた断片は、発現された転写物から誘導され、したがって、本文書では、「発現された断片」と呼ぶ。ゲル上の「発現された断片」の強度は、RNA集団における対応する転写物の発現レベルの評価を可能にする。したがって、cDNA AFLP（登録商標）技法は、それぞれの植物材料に存在する転写物から誘導された（あるいは、より一般には、それら転写物の少なくとも一部に対応する）増幅された制限断片を提供するのに使用できる。有利には、cDNA AFLP（登録商標）技法において、得られた特定の増幅された制限断片の強度は、一般に、植物材料における対応する転写物のレベルの尺度である。したがって、例えば、二つまたはそれ以上の植物材料の転写物プロファイルを比較すべき場合は、本発明において有用な発現された断片は、各植物材料のそれぞれに対して生成されたそれぞれのcDNA AFLP（登録商標）フィンガープリントにおける、対応するバンド（複数も可）間の強度における任意の差に基づいて、簡便に選択してよい。また、発現された断片に対応する実際のDNA断片は、例えば、ゲルからバンドを切��し、その後、切除された断片を、単離し、かつ精製することによって、簡便に得てよい。その上で、該断片を、任意に、クローン化し、再増幅し、かつ（あるいは）配列決定してよい。
【００２５】
上記の方法は、それぞれの植物材料間の発現における差に関連する／差を代表する、一断片（および、一般に、少なくとも二つの断片のコレクション）を提供するのに使用してよい。好適な一実施形態では、本発明の方法は、それぞれの植物材料間の病害抵抗性に関係する特性における差に関連する、発現された断片（または、一般に、むしろ、そのような発現された断片のコレクション）を提供するのに使用してよい。一般に、発現された断片のそのようなコレクションは、少なくとも５個のそのような断片（例えば、６〜１０００個のそのような断片、望ましくは、５０〜３５０個のそのような断片）を含むことになる。より詳しくは、本発明の方法は、例えば、それぞれの植物材料のために本発明の方法を用いて生成された転写物プロファイルにおける本質的に全ての差をカバーする、そのような発現された断片の「バンク」または「ライブラリー」（例えば、使用された植物材料から（あるいは、少なくとも第一の植物材料および第二の植物材料から）得られた本質的に全てのそのような断片を含む二つまたはそれ以上のそのような断片のコレクション）を提供するのに使用してよい。一般に、発現された断片のそのようなライブラリーまたはバンクは、少なくとも５個のそのような断片（例えば、６〜１０００個のそのような断片、望ましくは、５０〜３５０個のそのような断片）を含むことになる。本発明の方法を用いて得られた発現された断片、並びに、そのような断片の任意のコレクション、バンクまたはライブラリーは、本発明の別の様態を形成する。
【００２６】
発現された断片は、望ましくは、ヌクレオチド配列または核酸断片の形態であり、望ましくは、増幅された制限断片の形態であり、より望ましくは、cDNA AFLP（登録商標）断片の形態である。これら配列および（または）断片、並びに、(上で定義された）そのコレクション、バンクまたはライブラリーは、本発明の別の様態を形成する。任意に、該ヌクレオチド配列／断片は、一つまたはそれ以上の（単離された）核酸として提供してよく、かつ、これら単離された核酸、並びに、(上で定義された）そのコレクション、バンクまたはライブラリーは、本発明の別の様態を形成する。
【００２７】
これら発現された断片、それらの取得方法、およびcDNA AFLP（登録商標）を用いた転写プロファイルの生成方法は、以下の実施例にさらに説明されている。このようにして得られた転写物プロファイルを比較し、それにより、発現された断片のコレクションが提供された。本質的に、このコレクションは、例えば、上に概要を示したように実行されたcDNA AFLP（登録商標）を用いて検出された、これら植物材料間の、病害抵抗性に関係する特性における差に関連する、上記のような各種の植物材料間の発現における差を代表する全ての発現された断片のバンクまたはライブラリーを構成する。より詳しくは、コレクション内の発現された断片は、その発現がR遺伝子によって直接的または間接的に調節される遺伝子に対応している。発現された断片のこのコレクション、並びに、その個々の発現された断片は、本発明の別の様態を形成する。
【００２８】
Ｂ．差異的に発現された断片の使用法
別の様態では、本発明は、本発明の差異的に発現された断片の各種の使用法に関する。
【００２９】
本発明の発現された断片の特に好適な一使用法は、差異的に発現された断片に対応する植物のヌクレオチド配列の単離におけるそれらの使用に関する。本発明の発現された断片により単離すべき有用な植物のヌクレオチド配列は、例えば、発現された断片に対応する完全長または部分的な遺伝子、それら遺伝子に対応する完全長cDNA、それら遺伝子に関連する調節的配列、それら遺伝子または隣接遺伝子から上流または下流のフランキング配列を含んでいる。しかしながら、最も好適なヌクレオチド配列は、発現された断片に対応する完全長コーディング配列を含むゲノムまたはcDNA配列である。本発明の発現された断片により単離すべきヌクレオチド配列は、以下に説明するように、植物における病害抵抗性を改変するのに、あるいは、病害抵抗性に関係する一つまたはそれ以上の良好な特性を植物に付与するのに使用される。
【００３０】
本発明の発現された断片に対応するヌクレオチド配列の単離については、熟練した人にとって利用可能であり、かつそれ自体既知の多数の手段がある。該発現された断片自体は、例えば、対応するクローンを単離するためにゲノムまたはcDNAライブラリーをスクリーニングする際に、ハイブリダイゼーションプローブとして使用してよい。そのような使用法は、発現された断片の配列に関する知識さえ必要としない。別法としては、発現された断片の配列を決定し、その後、次いで、それらの完全長対応物に組み立て得るゲノムまたはcDNA断片を特異的に増幅することを目的とした、様々な可能な増幅反応におけるプライマーとして使用すべきオリゴヌクレオチドを設計するのに使用してよい。
【００３１】
別の好適な様態では、本発明は、それに対してアンチセンスな発現された断片が相補的である、対応するmRNAの翻訳に干渉することができる、アンチセンスRNA分子として発現された断片の配列（の一部）の発現により、対応する遺伝子の発現をダウンレギュレートするための発現された断片の使用に関する。この目的のために、発現された断片の配列（の一部）は、発現ベクターにおいてアンチセンス配向にクローン化される。該アンチセンス発現ベクターは、以下に説明するように、作成され、その後、所望の植物ホスト細胞または生物に導入され、かつ、発現される。
【００３２】
別の実施形態では、本発明の発現された断片は、植物または植物材料が病害抵抗性に関係する所望の特性（を発現する能力）を有するかどうかを判定する際に使用される。例えば、該発現された断片は、病害抵抗性に関係するそのような所望の特性に対応する遺伝子の存在について植物のゲノムを分析する際に、かつ（あるいは）、そのような所望の特性に関連する転写物の発現について植物または植物材料を分析するために、使用してよい。本発明の発現された断片は、病害抵抗性に関係する所望の特性に関与する座位（例えば、QTLを含む）の識別において、かつ（あるいは）、そのような所望の特性に関与する対立遺伝子を識別するために、使用してもよい。ゲノムまたは発現分析において本発明の発現された断片を使用する場合、本発明の好適な様態は、本発明の一つまたはそれ以上の固定化された発現された断片を含む固形の支持体に関する。
【００３３】
一つまたはそれ以上の固定化された核酸断片を含むそのような固形の支持体または担体は、核酸配列またはその混合物を分析するための（マイクロ）アレイまたはDNAチップとして知られている（例えば、WO 97/27317、WO 97/22720、WO 97/43450、EP 0 799 897、EP 0 785 280、WO 97/31256、WO 97/27317およびWO 98/08083参照）。そのようなアレイは、一般に、本発明の少なくとも１０、２０、５０、１００、２００、４２０または１０００個の異なる発現された断片を含むことになる。一つの「高密度アレイ」または「マイクロアレイ」について、異なる発現された断片の総数は、表面積一平方センチメートル当たり１０００〜１００,０００個の範囲にある場合がある。該断片は、望ましくは、斑点またはバンド等、担体上の独立して検出可能な領域を形成するよう、各断片が担体の特定の、かつ別個の部分に取り付けられるような形で、担体に結合されている。これにより、各断片が取り付けられた領域を走査する（すなわち、視覚的に、あるいは別様に）ことによって、アレイを「読み取る」ことが可能になる。望ましくは、個々の断片を含む独立して検出可能な領域は、望ましくは、「アドレス指定可能な」形態で、あらかじめ決められた、かつ望ましくは、規則的に分布したパターンで（すなわち、一つまたはそれ以上の線、列、行、正方形、長方形等の形で）、担体上で組織化され、これは、担体として、ビーズも含んでいる。これは、アレイの分析をさらに容易にする。異なる断片の密度は、一般に、異なる断片が１〜１００,０００個/ｃｍ２の範囲にあり、通常は、断片が５〜５０,０００個/ｃｍ２であり、一般に、断片が１０〜１０,０００個/ｃｍ２となる。アレイに対する固形の支持体（すなわち、担体）は、例えば、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカまたはシリカ系材料、機能化ガラス、修正されたケイ素、炭素、金属、無機ガラス、膜、ナイロン、絹、羊毛および綿等の天然繊維、並びに、ポリスチレン、ポリエチレングリコールテレフタレート、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリメチルメタクリレート、ポリテトラフルオロエチレン、ブチルゴム、スチレンブタジエンゴム、天然ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）フッ化ビニリデン、ポリカーボネートおよびポリメチルペンテン等のポリマー材料等、核酸配列を取り付けることができる任意の固形の材料であってよい。別の適当な支持材料は、例えば、US-A-5,427,779、WO 97/22720、WO 97/43450、WO 97/31256、WO 97/27317およびEP 0 799 897に述べられている。望ましくは、該担体は、その一表面に断片が結合された、本質的に平坦な長方形をしている。アレイの大きさ、並びに、異なる断片のそれぞれに対応する個々の領域の大きさは、断片の総量、並びに、アレイを分析するための意図された方法により、異なる場合がある。該断片は、それ自体既知の任意の方法で担体に結合してよく、使用される特定の技法は、主として、使用される担体に左右されることになる。結合は、適宜、5'末端、あるいは、断片上の他の任意の場所で行われることになるが、望ましくは、プライマー伸長反応を可能にするよう、3'末端以外の場所で行われる。望ましくは、該断片は、アレイに共有的に（すなわち、適当な化学的技法により）結合されている。担体に断片を取り付けるための適当な方法は、熟練した人には明らかであろう。一般に、US-A-5,427,779；US-A-4,973,493；US-A-4,979,959；US-A-5,002,582；US-A-5,217,492；US-A-5,525,041；US-A-5,263,992；WO 97/46313およびWO 97/22720、並びに、そこに引用された参照文献で説かれている方法を含む、固形の支持体に核酸を取り付けるための任意の方法が使用できる。
【００３４】
本発明による発現された断片の他の用途は、例えば、既知の／比較可能な発現された断片の既知の使用法に基づいて、熟練した人には明らかであろう。
【００３５】
Ｃ．核酸配列、ポリペプチド、DNA作成物および遺伝子導入植物.
本発明の一様態は、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のうちのいずれかで定義されたヌクレオチド配列を含む、望ましくは単離された形態の、核酸分子に関する。別の様態においては、本発明は、本質的にSEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のうちのいずれかで定義されたヌクレオチド配列から成る、望ましくは単離された形態の、核酸分子に関する。本発明は、さらに、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のうちのいずれかで定義されたヌクレオチド配列の突然変異体、変異体、相同体、類似体、対立遺伝子、部分および（または）断片に関し、かつ、そのような突然変異体、変異体、相同体、類似体、対立遺伝子、部分および（または）断片を含む、望ましくは単離された形態の、核酸分子に関する。そのような突然変異体、変異体、相同体、類似体、対立遺伝子、部分および（または）断片は、一つまたはそれ以上の位置での一つまたはそれ以上の塩基／ヌクレオチドの添加、置換、挿入および（または）除去（以下、総称して「ヌクレオチド改変」と呼ぶ）によって、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のヌクレオチド配列のうちの一つとは異なっていてよく、あるいは、それから誘導してもよい。核酸分子の突然変異体、変異体、相同体、類似体、対立遺伝子、部分および（または）断片を総称して、変異体、変異体ヌクレオチド配列または変異体核酸分子と呼ぶ。望ましくは、そのような変異体は、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のヌクレオチド配列のうちの一つとの、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、あるいは９５％、９７％、９８％または９９％以上の度合いの配列同一性を有することになる。
【００３６】
この目的のために、一定のヌクレオチド配列とSEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のヌクレオチド配列のうちの一つとの間の「配列同一性」のパーセンテージを、適当な、かつ（あるいは）標準の設定で使用してよい、BLAST、PC-geneまたはPedant-Pro等、配列アラインメントに対する既知のコンピュータアルゴリズムを用いて計算する。例えば、相同性の度合いは、表1に示す設定（のうちの一つまたはそれ以上）で、Pedant-Proプログラムを用いて計算できる。
2004530438.tif 000002
【００３７】
さらに詳しくは、実施例において、表２に示した設定を使用した。
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【００３８】
2004530438.tif 000004
【００３９】
SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のヌクレオチド配列の任意の部分または断片は、望ましくは、該当するSEQ IDの完全なヌクレオチド配列のヌクレオチドの総数の、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％以上を含むことになる。SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のヌクレオチド配列の二つまたはそれ以上のそのような部分あるいは断片は、本発明において有用なヌクレオチド配列を提供するために接合し、あるいは別様に組み合わせてよく、その場合には、断片の組み合わされた部分に存在する塩基／ヌクレオチドの総数は、やはり、望ましくは、上に示したパーセンテージ以内であるべきである。また、任意のそのような部分あるいは断片は、上で定義されたさらなるヌクレオチド改変を含んでいてよい。
【００４０】
SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の変異体ヌクレオチド配列は、適度のハイブリダイゼーション条件下、あるいは望ましくは、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のうちのいずれかのヌクレオチド配列とハイブリダイズするその能力によって定義してもよい。厳密なハイブリダイゼーション条件は、本文書では、少なくとも約２５個の、望ましくは、約５０個のヌクレオチドの、７５個または１００個および最も望ましくは約２００個またはそれ以上のヌクレオチドの核酸配列が、約1Mの塩、望ましくは、6 x SSCを含む溶液中で、あるいは、比較可能なイオン強度を有する任意の他の溶液中で、約６５℃の温度でハイブリダイズするのを可能にし、かつ、約0.1Mの塩、またはそれ以下、望ましくは、0.2 x SSCを含む溶液中で、あるいは、比較可能なイオン強度を有する任意の他の溶液中で、６５℃で洗浄することを可能にする条件と定義される。望ましくは、ハイブリダイゼーションは、一晩、すなわち、少なくとも10時間にわたって行われ、かつ望ましくは、洗浄は、洗浄溶液を少なくとも二回変えて、少なくとも1時間にわたって行われる。これら条件は、一般に、約９０％またはそれ以上の配列同一性を有する配列の特定のハイブリダイゼーションを可能にする。適度の条件は、本文書では、少なくとも５０個のヌクレオチドの、望ましくは、約２００個またはそれ以上のヌクレオチドの核酸配列が、約1Mの塩、望ましくは、6 x SSCを含む溶液中で、あるいは、比較可能なイオン強度を有する任意の他の溶液中で、約４５℃の温度でハイブリダイズするのを可能にし、かつ、約1Mの塩、望ましくは、6 x SSCを含む溶液中で、あるいは、比較可能なイオン強度を有する任意の他の溶液中で、室温で洗浄することを可能にする条件と定義される。望ましくは、ハイブリダイゼーションは、一晩、すなわち、少なくとも10時間にわたって行われ、かつ望ましくは、洗浄は、洗浄溶液を少なくとも二回変えて、少なくとも1時間にわたって行われる。これら条件は、一般に、最大５０％の配列同一性を有する配列の特定のハイブリダイゼーションを可能にする。この技術に熟練した人であれば、５０％〜９０％の範囲で同一性の異なる配列を特異的に識別するために、これらハイブリダイゼーション条件を修正することができるであろう。
【００４１】
本発明による特に好適な核酸分子は、コーディング配列、およびSEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のヌクレオチド配列またはその変異体を含んでいる。SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420は、差異的に発現された断片を含んでおり、したがって、ポリペプチドをコードする配列を含む、活発に発現された転写物から誘導される。コーディング配列およびSEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のヌクレオチド配列を含む核酸分子は、望ましくは、機能的なコーディング配列、より望ましくは、完全長コーディング配列を含んでいる。SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のヌクレオチド配列は、一般に、コーディング配列内に存在することになるが、場合によっては、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のヌクレオチド配列の一部または全部が、そこからSEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のヌクレオチド配列が誘導される転写物内の非翻訳配列に対応し得ることを、熟練した人は理解されよう。そのような場合には、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のヌクレオチド配列は、核酸分子内のコーディング配列に隣接するか、あるいは、それと部分的に重なっていてよい。したがって、本発明は、コーディング配列が、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のうちの一つで定義されたヌクレオチド配列を含む植物転写物の一部である、植物ポリペプチドに対する機能的なコーディング配列を含む核酸分子に関する。本発明の核酸分子内のコーディング配列およびその変異体は、以下にさらに定義されたポリペプチドをエンコードする。
【００４２】
SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列およびその変異体は、望ましくは、適当な細胞または生物、すなわち、ホスト細胞またはホスト生物におけるその発現が、ホスト細胞またはホスト生物における「有意な生物学的変化」に至るようなものである。「有意な生物学的変化」は、一つまたはそれ以上の生物学的特性または活動に対する一つまたはそれ以上の生物学的試験法等、それ自体既知の一つまたはそれ以上の適当な検出方法を用いて判定し得るような、ホスト細胞またはホスト生物の生物学的特性または活動における、検出可能な、あるいは、測定可能な変化を意味すると理解される。より詳しくは、有意な生物学的変化は、ホスト細胞またはホスト生物が、ヌクレオチド配列またはその変異体の発現に貢献する条件下で維持されると、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列に天然に関連する生物学的特性および（または）活動のうちの少なくとも一つ、より詳しくは、病害抵抗性に関係する所望の特性のうちの一つまたはそれ以上を示すことを意味してよい。
【００４３】
より詳しくは、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列の変異体は、該ヌクレオチド配列および（または）それによってエンコードされたアミノ酸配列の発現が行われると、生物学的特性または活動に対する適当な試験法によって測定された場合、（本質的に）同じホスト生物において、かつ（本質的に）同じ条件下で、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列により提供される量の、少なくとも３０％、望ましくは、少なくとも４０％、より望ましくは、少なくとも５０％、さらにより望ましくは、少なくとも７５％および最大１００％またはそれ以上の量について、生物学的特性または活動がホスト細胞またはホスト生物に提供されるようなものである（ここで、「生物学的特性を提供する」とは、一つまたはそれ以上の望ましくない特性の低減を意味する場合もあり、その場合には、上記のパーセンテージは、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列のうちの一つによりもたらされた低減に比した場合の、該望ましくない特性が低減された量を指すことを理解すべきである）。
【００４４】
SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列またはその変異体は、望ましくは、蛋白質または酵素等のポリペプチドのアミノ酸配列をエンコードする。それは、ホスト内の、あるいは、ホストの病害抵抗性に関係する一つまたはそれ以上の所望の特性に影響を与えることができるRNA配列をエンコードしてもよい。熟練した人には明らかなように、遺伝暗号の縮退のために、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列の変異体は、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列によってエンコードされたものと同じアミノ酸配列をエンコードする場合がある。そのような同義変異体ヌクレオチド配列は、本発明に含まれている。
【００４５】
しかしながら、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列の変異体は、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列のうちの一つによってエンコードされたアミノ酸配列の突然変異体、変異体、相同体、類似体、対立遺伝子、部分および（または）断片をエンコードする場合もある。また、アミノ酸配列またはポリペプチドのそのような突然変異体、変異体、相同体、類似体、対立遺伝子、部分および（または）断片を、総称して、変異体、変異体アミノ酸配列または変異体ポリペプチド、蛋白質または酵素と呼ぶ。そのような変異体アミノ酸配列は、以下、総称して「アミノ酸改変」と呼ぶ、一つまたはそれ以上の位置における一つまたはそれ以上のアミノ酸残基の添加、置換、挿入および（または）除去によって、天然のアミノ酸配列とは異なっていてよい。望ましくは、本発明のヌクレオチド配列によってエンコードされた変異体アミノ酸配列は、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列によってエンコードされたアミノ酸配列のうちの一つとの、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、あるいは９５％、９７％、９８％または９９％以上の度合いのアミノ酸配列同一性を有することになる。
【００４６】
アミノ酸同一性の度合いは、BLAST、PC-geneまたはPedant-Pro等、配列アラインメントに対する既知のコンピュータアルゴリズムを用いて計算してよい。例えば、アミノ酸相同性の度合いは、表3に示した設定で、Pedant-Proプログラムを用いて計算してよい。
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【００４７】
より詳しくは、実施例において、表4に示した設定を使用した。
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【００４８】
2004530438.tif 000007
【００４９】
任意に、熟練した人には明らかなように、アミノ酸同一性または相同性の度合いを判定する際、熟練した人は、いわゆる「安全をみた」アミノ酸置換も考慮し得る。安全をみたアミノ酸置換は、同様の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族の側鎖を有するアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループは、セリンおよびスレオニンであり、アミド含有の側鎖を有するアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族の側鎖を有するアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性の側鎖を有するアミノ酸のグループは、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有の側鎖を有するアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンである。好適な安全をみたアミノ酸置換グループは、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、およびアスパラギン-グルタミンである。本文書で開示されたアミノ酸配列の置換変異体は、開示された配列内の少なくとも一つの残基が除去され、かつ、その場所に異なる残基が挿入されたものである。望ましくは、該アミノ酸変化は、安全をみたアミノ酸変化である。天然に生じるアミノ酸のそれぞれについて好適な安全をみた置換は、下記の通りである。アラニンをセリンに；アルギニンをリジンに；アスパラギンをグルタミンまたはヒスチジンに；アスパラギン酸をグルタミン酸に；システインをセリンまたはアラニンに；グルタミンをアスパラギンに；グルタミン酸をアスパラギン酸に；グリシンをプロリンに；ヒスチジンをアスパラギンまたはグルタミンに；イソロイシンをロイシンまたはバリンに；ロイシンをイソロイシンまたはバリンに；リジンをアルギニンに；グルタミンまたはグルタミン酸に；メチオニンをロイシンまたはイソロイシンに；フェニルアラニンをメチオニン、ロイシンまたはチロシンに；セリンをスレオニンに；スレオニンをセリンに；トリプトファンをチロシンに；チロシンをトリプトファンまたはフェニルアラニンに；および、バリンをイソロイシンまたはロイシンに、というものである。
【００５０】
本発明では、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列は、望ましくは、MoneyMakerあるいは他のLycopersicon esculentumライン等のLycopersicon esculentum変種を含む、トマト（すなわち、Lycopersicon esculentum）の変種またはラインから誘導される。しかしながら、本文書における開示に基づいて、熟練した人であれば、他の生物学的ソースから、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列に対して相同的な、かつ望ましくは、それに対応するヌクレオチド配列を得ることができるであろうと考えられる。望ましくは、そのような相同的配列は、植物から、より望ましくは、双子葉植物から得られる。そのような相同的なヌクレオチドまたはアミノ酸配列を、本文書では、「天然の相同体」と呼ぶことにし、かつ、そのような天然の相同体の変異体として、本発明の範囲内に含まれている。望ましくは、任意のそのような天然の相同体は、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列、またはそれによってエンコードされたアミノ酸配列との、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、あるいは９５％、９７％、９８％または９９％以上の度合いの配列同一性を有することになる。配列同一性のパーセンテージは、上に述べたように計算される。SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列またはその変異体の天然の相同体は、上で定義された、適度のハイブリダイゼーション条件下、あるいは望ましくは、厳密なハイブリダイゼーション条件下で、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420のヌクレオチド配列とハイブリダイズするそれらの能力によって定義してもよい。SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列のうちの一つまたはその変異体の天然の相同体は、望ましくは、そこから該天然の相同体が得られた生物学的ソースにおいて、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含むヌクレオチド配列により提供される天然の生物学的特性または活動と本質的に同じか、あるいは、少なくとも比較可能な、生物学的特性を有し、あるいは、生物学的活動を行うことができるようなものであることが理解されよう。また、本発明による天然の相同体は、望ましくは、ホスト細胞またはホスト生物におけるその発現が、ホスト細胞またはホスト生物における、上で定義された有意な生物学的変化、より詳しくは、上に概要を示したような、病害抵抗性に関係する一つまたはそれ以上の所望の特性に関する有意な生物学的変化に至るようなものである。
【００５１】
以下、上記のヌクレオチド配列および核酸分子の全て、すなわち、SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420の配列を含む任意のそして全てのヌクレオチド配列、その任意の天然の相同体、並びに、その任意の変異体を総称して、「本発明のヌクレオチド配列」と呼ぶ。術語「本発明のヌクレオチド配列」は、以下に定義された核酸作成物の形態の、そのようなヌクレオチド配列を含む任意のそして全ての核酸分子も含んでいる。本発明のこれらヌクレオチド配列は、二本鎖核酸の形態であっても、あるいは、一本鎖核酸の形態であってもよく、ここで、後者は、本発明のヌクレオチド配列に対して相補的な任意の核酸も含んでいる。そのようなものとして、本発明のヌクレオチド配列／核酸は、やはり望ましくは、単離された形態の、かつ（あるいは）、以下に定義された核酸作成物の形態の、DNA配列および（または）RNA配列であってよい。それらは、例えば、一つまたはそれ以上のORFおよび（または）エクソン配列に加えて、一つまたはそれ以上のイントロン配列、5'-UTRまたは3'-UTRを含み得るゲノムDNA配列であってよい。それらは、cDNA配列および（または）mRNA配列を含むがそれに限定されないRNA配列であってもよい。
【００５２】
本発明のヌクレオチド配列には、SEQ ID NO 1〜420のヌクレオチド配列のうちのいずれかに対して機能的に相同的な任意のヌクレオチド配列も含まれている。術語「機能的に相同的」には、以下のことが包含される。配列（例えば、遺伝子）は、前記配列（遺伝子）の機能が実質的に維持された状態で、少なくとも一つのヌクレオチドが、除去され、挿入され、逆位（複数のヌクレオチドの場合）または転換（プリン-ピリミジンまたはピリミジン-プリン置換）または移行（プリン-プリンまたはピリミジン-ピリミジン置換）等、置き換えられた時に、その配列（遺伝子）が別の配列に対して相同的である場合、機能的に相同的と見なされる。これは、化学的に修正された配列にも適用される。配列が機能的に相同的である場合、相同性のパーセンテージが低い可能性も十分あるが、その配列の機能性は本質的に維持されている。
【００５３】
また、以下、本発明のヌクレオチド配列によってエンコードされた任意のそして全てのアミノ酸配列、より詳しくは、上に述べたようなアミノ酸配列の定義を満たすものを、以下、「本発明のポリペプチド」と呼ぶことにする。これらポリペプチドは、したがって、オリゴペプチド、酵素および非触媒性の蛋白質を含んでいる。上に定義された術語「機能的に相同的」は、本発明のアミノ酸配列にも適用される。本発明によれば、ホスト細胞またはホスト生物において発現が行われると、本発明の任意のポリペプチドは、例えば、ホスト細胞またはホスト生物内で起こり得るような、一つまたはそれ以上の翻訳後の修正を受ける場合があり、そのような翻訳後の修正（複数も可）の結果として得られた任意のそして全ての派生体も、ここで使用されている術語「本発明のポリペプチド（複数も可）」に含まれている。これら翻訳後の修正のうちの一つまたはそれ以上は、ポリペプチドの意図された、あるいは、所望の生物学的特性または活動のうちの一つまたはそれ以上を増強する場合があり、あるいは、それらにとって必要でさえある場合もあることは、熟練した人には明らかであろう。ポリペプチドの代わりに、本発明のヌクレオチド配列は、ホスト細胞内の一つまたはそれ以上の生物学的過程または経路に関して、より詳しくは、病害抵抗性に関係する特性のうちの一つまたはそれ以上に関して、（アップまたはダウン）レギュラトリー活動を有するRNA配列等のRNA配列をエンコードしてもよい。そのような場合には、術語「本発明のポリペプチド」は、「本発明の発現生成物」と読まれるべきである。
【００５４】
さらに別の様態においては、本発明はまた、本発明のヌクレオチド配列のうちの一つまたはそれ以上を含む遺伝子（例えば、望ましくは、適切な発現シグナルを含む完全長遺伝子）を提供する。さらにより詳しくは、この様態によれば、本発明は、核酸分子が次の配列エレメントを含んでいる、望ましくは単離された形態の、核酸分子を提供する。
-  発現生成物（望ましくは、ポリペプチド）をエンコードする第一のヌクレオチド配列；
-  SEQ ID NO 1〜SEQ ID NO 420またはその変異体から成るグループから選択された第二のヌクレオチド配列（望ましくは、第二のヌクレオチド配列の少なくとも一部が第一のヌクレオチド配列内に存在する）；
-  望ましくは、第一のヌクレオチド配列の5'末端にある翻訳開始コドン；
-  望ましくは、第一のヌクレオチド配列の3'末端にある翻訳停止コドン；
-  望ましくは、第一のヌクレオチド配列（の5'末端）に動作可能にリンクされた、一つまたはそれ以上のエレメント（該エレメントは、プロモーター、エンハンサー、または上流の活性化配列等、少なくとも第一のヌクレオチド配列の転写を開始し、かつ（あるいは）制御することができる）；および
-  望ましくは、第一のヌクレオチド配列（の3'末端）に動作可能にリンクされたエレメント（該エレメントは、少なくとも第一のヌクレオチド配列の下流の転写を停止させることができる）
【００５５】
核酸分子は、任意の適当な形態であってよく、例えば、一本鎖または二本鎖DNAまたはRNA（二本鎖DNAが望ましい）の形態であってよく、かつ（あるいは）、例えば、以下にさらに説明するような、核酸作成物の一部であっても、あるいは、核酸作成物の形態であってもよい。そのような核酸は、任意の適当な大きさ（例えば、５０〜１００００個のヌクレオチド、より詳しくは、１００〜５０００個のヌクレオチド）を有していてよい。該核酸は、任意に、（例えば、Agrobacteriumの）細菌細胞あるいは植物または動物細胞を含むがそれに限定されない、（例えば、以下に定義するような）ホストまたはホスト細胞に存在してもよく、かつ、そのようなものとして、ホスト細胞のゲノムに統合されてよく、あるいは、ホスト細胞内でエピソーム状に維持されてよい。完全長遺伝子を含み、かつ、（任意に、上記のような核酸分子の形態の）本発明のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列と同じ方法および同じ目的で使用してよいこと、および、多くの用途について、そのような核酸分子の使用が望ましい場合さえあることは、熟練した人には明らかであろう。したがって、本発明では、その最も広い意味において、完全長遺伝子を本質的に含み、かつ、本発明のヌクレオチド配列を含む、そのような核酸分子も、術語「本発明のヌクレオチド配列」に含まれている。また、本発明は、その最も広い意味において、本発明の完全長遺伝子によってエンコードされた、上で定義されたポリペプチドを含んでいる。さらに、本発明は、その最も広い意味において、そのような完全長遺伝子の変異体および天然の、かつ機能的な相同体、並びに、そのようなポリペプチドの変異体および天然の、かつ機能的な相同体を含んでいる。
【００５６】
本発明の観点からいう病原体は、以下に述べたような植物または農産物に関連する全ての病原体を包含している。そのような病原体は、土壌または葉の病原体である場合もあり、偏性の活物寄生または死物寄生の病原体である場合もある。さらにより詳しくは、該病原体は、細菌、ウイルス、線虫、アブラムシ、菌類および（または）病害虫のグループから選択される。望ましくは、該病原体は、Cladosporium fulvum、TMV、PVX、Pseudomonas syringae、CMV、CGMMV、TRV、Alternaria alternata、Odium lycopersici、Phytophtorea infestans、Botrytis cinerea、Fusarium oxysporum、およびFusarium品種２および３から選択される。
【００５７】
本発明のヌクレオチド配列は、（以下に定義されたような）ホスト細胞またはホスト生物に、より詳しくは、植物または植物細胞に、価値のある特性を与えるのに使用される。より詳しくは、本発明のヌクレオチド配列は、ホスト細胞またはホスト生物を提供するのに、より詳しくは、植物病原体に対する植物の病害抵抗性の発生に関係する一つまたはそれ以上の所望の特性を植物に付与するのに、有利に使用できる。さらにより詳しくは、本発明のヌクレオチド配列は、病原体に対して感受性を有する植物に、病原体に対する増強された抵抗性を提供するのに使用してよい。これを達成するために、本発明のヌクレオチド配列は、この技術分野において既知の任意の方法によって、植物の遺伝材料に形質転換できる。本発明のヌクレオチド配列の発現が行われると、植物の防御機構が誘発でき、かつ、該植物は、病原体に対する抵抗性に至る全身性HRを発現できる。
【００５８】
本発明のヌクレオチド配列のこの提唱された有用性は、実施例でさらに説明されている観察に基づいている。これら観察は、モデルシステムに基づいている。このモデルシステムは、活物寄生菌類Cladosporium fulvumのAvr4エリシターの特異的な認識による全身性HRの開始から10〜90分後にCf4トマトについて、かつ、非反応性の対照植物について行われた、大規模な差異的cDNA AFLP（登録商標）分析に基づいている。モデルシステムの一部を形成したトマト（Lycopersicon esculentum）は、C. fulvumのAvr4エリシターおよびそれに適合するCf4抵抗性遺伝子の両方を発現する遺伝子導入トマトである。Cf4を保因するトマトとAvr4を発現する植物との間の交雑種から誘導された種子は、正常に発芽する。しかしながら、一般に、数日以内に、実生は壊死状態になって死ぬ。
【００５９】
しかしながら、特定の温度処理によって、植物のHR誘発およびその後の死は抑制でき、結果として、植物は正常に発生する。抑制温度を（許容温度まで）解放すると、植物は壊死性の斑点を生じ、多くの防御関連の遺伝子の発現が誘発される。その後、これらトマト植物は、非常に短期間の内に全身性HRを生じる。このシステムの多くの利点のうちの一つは、植物の傷害が生じないことである。傷害は、防御遺伝子を含む多くの遺伝子の発現を誘発することが知られている。さらに、直接的に関与する病原体がないので、混入性の遺伝子を単離する危険性も少ない。このモデルシステムは、有利には、遺伝子の発現が同期された、事実上無限量の植物材料の単離を可能にする。cDNA AFLP（登録商標）は、差異的に発現された遺伝子を識別するのに有利に使用できる技法である。HRにおいて抑圧されているか、あるいは抑圧されていない、遺伝子導入Cf::Avr植物間の遺伝子の発現パターンを比較することによって、植物防御の誘発に関与する遺伝子が識別される。HRの抑圧解除後の異なる時点で単離された（RNA）配列の分析の結果、シグナル伝達経路に関係する遺伝子の特定のクラスが識別される。誘発される第一の遺伝子は、シグナル伝達カスケードおよび（または）転写制御因子の構成要素をエンコードするものである。これら遺伝子の生成物は、その後、防御システムに関与する遺伝子の発現を活性化することになる。特定の時間枠を選択すると、例えば、HRのごく初期には、その特定の時間枠において役割を果たす特定の遺伝子（例えば、植物防御反応の開始においてそれらの機能を発揮する遺伝子）を探すことが可能である。
【００６０】
差異的に発現された遺伝子は、配列決定され、かつ、該配列は、データベースに存在する配列と比較される。このために、BLASTサーチ、Bestfit、FASTA、TFASTA、SmithおよびWaterman Adv. Appl. Math. 2:482（1981）、NeedlemanおよびWunsch J. Mol. Biol. 48:443（1970）、PearsonおよびLipman Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988) によって開示されたようなアルゴリズム、およびPedant Pro（Biomax）等、多様なアルゴリズムおよびコンピュータープログラムを、熟練した人は利用可能である。
【００６１】
発現パターンは、マイクロアレイ上のAFLP（登録商標）断片をスポッティングすることによって、同時に、ノーザンブロットによって、あるいは、代替物において、個々に検証される。これら断片は、その後、HR抑圧の解放後の異なる時点で単離されたcDNAと、ハイブリダイズさせることができる。サイレンシング（例えば、ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（VIGS））等の技法は、関連する遺伝子の識別を行うものである。例えば、ジャガイモウイルスX（PVX）における、相同的植物遺伝子配列の発現は、結果として、転写後の遺伝子サイレンシングを生じる。サイレンシングされた植物は、適当な（品種特異的）エリシターで刺激された時にHRを誘発するそれらの能力について、試験される。候補遺伝子は、（過剰）発現および（または）誘発性発現を研究するために、遺伝子導入植物（例えば、トマトまたはArabidopsis）の生成に使用される。
【００６２】
本発明のヌクレオチド配列の、可能な他の用途または使用法は、例えば、
-   相同的配列を検出するためのプローブとしての利用；
-  種および亜種および個体の分類における利用；
-  例えば、微生物におけるポリペプチドの非相同的生成における使用；
-  本来のソースにおける過剰発現における、あるいはそのための使用；
-  非相同的ソースまたはホストにおける過剰発現における、あるいはそのための使用；
-  本来のソースにおけるサイレンシングにおける、あるいはそのための使用；
-  非相同的ソースまたはホストにおけるサイレンシングにおける、あるいはそのための使用；
-  間接的選択のためのマーカー（複数も可）としての使用；
-  DNAアレイまたはチップ上での使用
を含んでいる。
【００６３】
本発明のヌクレオチド配列は、共通の技術的特徴として、上記の特性および（または）活動の一つまたはそれ以上を、ホスト細胞またはホスト生物に与えるのに使用できることを、共有している。
【００６４】
本発明のヌクレオチド配列は、天然のソース（複数も可）（すなわち、上に示したような）から、あるいは、任意の他の適当なソースから、単離してよい。別法としては、本発明のヌクレオチド配列は、自動化DNA合成、部位特異的突然変異誘発、（例えば、一つまたはそれ以上の制限酵素および（または）リガーゼを用いた）本発明のヌクレオチド配列のうちの一つまたはそれ以上の二つまたはそれ以上の部分の組合せ、短縮されたポリペプチドの発現に至る突然変異の導入、改変された発現レベルおよび（または）プロファイルに至る突然変異の導入、および熟練した人にとってそれ自体既知の他の修正を含むがそれに限定されない、それ自体既知の組換え技法により提供してよい。例えば、特定の技法は、一つまたはそれ以上の「不適合の」プライマーを用いた、かつ、鋳型として本発明のヌクレオチド配列のうちの一つまたはそれ以上を用いた、PCR反応による突然変異の導入を含んでいる。このようにして得られた増幅された生成物／断片は、次いで、本発明のヌクレオチド配列の新しい変異体を形成するために、結紮してよい。これらおよび他の適当な技法は、例えば、Sambrook他、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) of F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)およびSaiki他、Science 239 (1988), 487-491 or PCR Protocols, 1990, Academic Press, San Diego, California, USAで説かれている。
【００６５】
別の様態では、本発明は、少なくとも本発明のヌクレオチド配列を含み、そして任意に、それ自体既知の核酸作成物の他のエレメントを含む、核酸作成物に関する。
【００６６】
そのような核酸作成物は、DNA配列の形態であっても、RNA配列の形態であってもよく、望ましくは、二本鎖DNA配列の形態である。それは、プラスミドの形態であっても、ベクターの形態であってもよい。核酸作成物は、望ましくは、意図されたホスト細胞またはホスト生物を形質転換するのに適した形態である。より詳しくは、核酸作成物は、植物または植物細胞を形質転換するのに適した形態であってよい。核酸作成物は、形質転換が行われると、それがホスト細胞またはホスト生物において、安定的に維持され、複製され、かつ（あるいは）受け継がれるようなものであってもよい。別法としては、核酸作成物は、形質転換が行われると、それが、（少なくとも）本発明のヌクレオチド配列が、ホスト細胞またはホスト生物のDNAに（かつ望ましくは、ゲノムDNAに）統合されるのを可能にするようなものであってよい。核酸作成物は、それが、ホスト細胞またはホスト生物における、本発明のヌクレオチド配列の発現を可能にするようなものであってもよい。核酸作成物は、望ましくは、それが、本発明のヌクレオチド配列が、ホスト生物のある世代から次の世代へと受け継がれるのを可能にするようなものでもある。これら目的の一方または両方のために、核酸作成物は、形質転換が行われると、上記のように、まず、ホスト細胞またはホスト生物のDNAに統合してよい。
【００６７】
本発明の核酸作成物に存在し得る「任意の他のエレメント」は、プロモーター、リーダー配列、ターミネーター、エンハンサー、統合因子、選択マーカーおよび（または）レポーター遺伝子、イントロン配列および（または）マトリックス結合（MAR）配列等、一つまたはそれ以上の発現調節配列を含むが、それらに限定されない。望ましくは、そのような任意の他のエレメントは、本発明のヌクレオチド配列に、かつ（あるいは）互いに、「動作可能にリンク」されており、それは、一般に、互いに機能的な関係にあることを意味する。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがコーディング配列の転写および（または）発現を開始することができるか、あるいは別様に制御／調節することができる場合、コーディング配列に、動作可能にリンクされており、その場合には、コーディング配列は、プロモーター「の制御下」にあると理解すべきである。一般に、二つのヌクレオチド配列が動作可能にリンクされている場合、それらは、同じ配向にあり、かつ、一般に、同じリーディングフレームにあることになる。それらは、また、一般に、本質的に近接することになるが、これは必ずしも必要ではない。
【００６８】
望ましくは、核酸作成物の任意の他のエレメントは、ホスト細胞またはホスト生物において、それらの意図された生物学的機能を提供することができるようなものである。例えば、プロモーター、エンハンサーおよび（または）ターミネーターは、ホスト生物において「動作可能」であるべきであり、これは、該当するホスト細胞またはホスト生物において、プロモーターが、それが上で定義されたように動作可能にリンクされているヌクレオチド配列（例えば、コーディング配列）の転写および（または）発現を開始することができるか、あるいは別様に制御／調節することができることを意味する。
【００６９】
本発明の核酸作成物において使用するためのプロモーターは、以下にさらに述べるように、構成的プロモーターであっても、誘発性プロモーターであってもよく、例えば、植物、動物、並びに細菌、酵母（細胞）、藻類／菌類および（または）ウイルスにおいて使用するためのそのようなプロモーターの適当な非限定例は、例えば、WO 95/07463、WO 96/23810、WO 95/07463、WO 95/21191、WO 97/11094、WO 97/42320、WO 98/06737およびWO 98/21355で説かれている。
【００７０】
本発明の核酸作成物において使用するための選択マーカーは、核酸作成物を含むホスト生物またはホスト細胞を判別することが可能である（例えば、その検出および（または）選択を可能にする）べきである。例えば、そのような選択マーカーは、マーカーを含む核酸作成物を（例えば、成功した形質転換の結果として）含んでいる植物、植物材料および植物細胞を、適当な選択媒体の使用等の適当な条件下で、選択するのに使用できる任意の遺伝子であってよい。特に好適な選択マーカーは、カナマイシンを用いて選択できるnpt遺伝子である。
【００７１】
本発明の核酸作成物において使用するためのリーダー配列は、該当するホスト細胞またはホスト生物において、それが、ホスト細胞またはホスト生物における所望の翻訳後の修正を可能にでき、転写されたmRNAをホスト細胞の所望の部分あるいは小器官に向けることができ、かつ（あるいは）、それが、ホスト細胞からのポリペプチドの分泌を可能にできるようなものであるべきである。そのようなものとして、それは、ホスト細胞またはホスト生物において動作可能なプロ配列、プレ配列、またはプレ／プロ配列であってよい。
【００７２】
本発明の核酸作成物において使用するためのレポーター遺伝子は、該当するホスト細胞またはホスト生物において、それが、検出すべき核酸作成物上に存在するヌクレオチド配列の発現を可能にするようなものであるべきである。
【００７３】
例えば、植物、動物、並びに細菌、酵母（細胞）、藻類／菌類および（または）ウイルスにおいて使用するためのターミネーター、転写および（または）翻訳エンハンサーおよび（または）統合因子等、そのような他のエレメントのいくつかの非限定例は、例えば、WO 95/07463、WO 96/23810、WO 95/07463、WO 95/21191、WO 97/11094、WO 97/42320、WO 98/06737およびWO 98/21355で説かれている。
【００７４】
また、本発明では、本発明のヌクレオチド配列は、発現が行われると、本発明のポリペプチドと別のアミノ酸配列との融合を提供するよう、蛋白質またはポリペプチド等の別のアミノ酸配列をエンコードする別の配列に、動作可能にリンクされていてよい。
【００７５】
本発明の作成物は、一般に、核酸／核酸配列の制限および結合等の技法を含む、それ自体既知の方法（それについて、Sambrook他、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) of F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987) 等の標準のハンドブックが引用されている）で、提供できる。
【００７６】
核酸作成物を、植物または植物細胞の形質転換に、かつ（あるいは）、植物または植物細胞における本発明のヌクレオチド配列の発現に使用する場合は、核酸作成物は、例えば、本発明のヌクレオチド配列に加えて、次の遺伝要素のうちの一つまたはそれ以上を含んでいてよい。
【００７７】
（ａ）  nos-プロモーター、CaMV 35Sプロモーター、アクチンプロモーター、およびmas（マンノピンシンターゼ）プロモーター等の構成的プロモーター；WIN（「傷害誘発性」）プロモーターおよびHMGR（ヒドロキシメチルグルタリルCoAレダクターゼ）プロモーター等の誘発性プロモーター；WO 97/41228で説かれているようなもの、エタノール誘発性プロモーター（WO 99/29881）およびステロイド誘発性プロモーター（PNAS 88 23, 10421-25; 1991）、銅イオン誘発性プロモーター（Transgenic Res. 5, 2, 105-113; 1996）、Tetリプレッサー調節型プロモーター（Mol Gen Genet. 227-2, 229-237; 1991）等の誘発性プロモーター；パタチンプロモーター、GBSSプロモーターおよびプラストシアニンプロモーター、およびWO 97/41228で述べられているようなもの、果実特異的プロモーター2A11（WO 8809334）、E4およびE8（WO 9201790）およびWO 9727308、WO 9717452、WO 9831812で説かれているプロモーター等の組織または器官特異的プロモーター；かつ（あるいは）、（Arabidopsis「老化関連遺伝子」から誘導される）SAG12プロモーター等、植物の生活環および（または）発生における特定の段階について特異的なプロモーターを含むがそれに限定されない、植物または植物細胞において動作可能なプロモーター
（ｂ）  nos-3'ターミネーター、CaMV 3'ターミネーターまたはtmlターミネーター等、植物または植物細胞において動作可能なターミネーター；
（ｃ）  CaMV 35Sエンハンサー配列等、植物または植物細胞において動作可能なエンハンサー；
（ｄ）  gfp-遺伝子、gus遺伝子またはluc遺伝子等、植物または植物細胞での使用に適したレポーター遺伝子；
（ｅ）  npt遺伝子、hpt遺伝子またはbar遺伝子等の選択マーカー
植物の形質転換のための核酸作成物は、例えば、Agrobacteriumを用いた植物または植物細胞の形質転換での使用に適した、プラスミド、コスミド、あるいは、バイナリーベクターまたは共統合ベクターを含むがそれに限定されないベクターの形態であってよく、以下に説明するような核酸作成物を含むAgrobacterium株は、本発明の別の様態を形成する。Agrobacteriumと共に使用するための適当なベクターシステムの例は、例えば、pBI121およびその派生体等のバイナリーベクター、pGV1500およびpBR322の派生体等の共統合ベクターである。
【００７８】
別の様態では、本発明は、本発明のヌクレオチド配列のうちの一つまたはそれ以上を含み、かつ（あるいは）、それを用いて形質転換された、ホスト生物またはホスト細胞に関する。ホスト生物またはホスト細胞は、単細胞生物（の細胞）であっても、多細胞生物（の細胞）であってもよい。本発明においてホスト生物／ホスト細胞として使用できる単細胞生物の例は、ウイルス、細菌、藻類、菌類、酵母および（または）原虫等の微生物を含むが、それらに限定されない。本発明においてホスト生物として使用でき、かつ（あるいは）、その細胞がホスト細胞として使用できる多細胞生物の例は、植物、およびヒト以外の哺乳動物を含むがそれに限定されない動物等、高等生物を含むが、それらに限定されない。
【００７９】
望ましくは、ホスト生物／ホスト細胞は、植物／植物細胞である。より詳しくは、ホスト生物／ホスト細胞は、単子葉または双子葉植物（の細胞）であってよく、望ましくは、例えば、スイカ、アボカド、ラズベリー、パイナップル、ブドウ、リンゴ、セイヨウナシ、オレンジ、小麦、大麦、ライ麦、トウモロコシ、トマト、胡椒、レタス、キュウリ、イネ、豆類、クローバー、柑橘類、バナナ、ブドウ、カッサバ、エンドウマメ、イチゴ、綿、チリ、ナス、オクラのさや、サトウダイコン、大豆、アブラナ、ヒマワリ、カリフラワー、マメ、エンドウマメ（そのうちトマト、胡椒およびaubergine（ナス）が特に好適である）等、作物栽培学的に重要な植物または農産物（の細胞）である。植物／農産物の、他の作物栽培学的に重要な種、変種および（または）ラインは、熟練した人には明らかであり、例えば、Avena、Agrostis、Antirrhinum、Arabidopsis、Asparagus、Atropa、Brassica、Beta、Bromus、Browaalia、Capsicum、Ciahorum、Citrullus、Citrus、Composita、Cucumis、Cucurbita、Datura、Daucus、Digitalis、Festuca、Fragaria、Geranium、Glycine、Gramina、Helianthus、Heterocallis、Hordeum、Hyoscyamus、Juglans、Lactuca、Linum、Lolium、Lotus、Lycopersicon、Majorana、Manihot、Medicago、Nemesis、Nicotiana、Onobrychis、Oryza、Panieum、Pelargonium、Pennisetum、Petunia、Phaseolus、Pisum、Ranunculus、Raphanus、Rosa、Salpiglossis、Secale、Senecio、Sinapis、Solanum、Sorghum、Trifolium、Trigonella、Triticum、Vigna、VitaおよびZea属からの種から選択してよい。
【００８０】
植物または植物細胞は、望ましくは、トマト、ナス、胡椒、タバコ、ジャガイモ等に例示されるようなsolanaceaであり、より望ましくは、トマトである。
【００８１】
ホスト細胞は、ホスト生物の生体内に存在してよい。例えば、ホスト細胞が多細胞（ホスト）生物の細胞である場合、ホスト細胞は、該多細胞ホスト生物に、かつ（あるいは）、該多細胞ホスト生物の任意の部分、組織あるいは器官に、存在してよく、そのような形質転換されたホスト細胞を含む任意の多細胞生物は、ここで使用されている術語「多細胞ホスト生物」に含まれていると見なすべきである。同様に、本文書で「多細胞ホスト生物」と呼ぶ場合、これは、そのような多細胞ホスト生物の任意の部分、組織、器官あるいは細胞、および（または）、そのような多細胞ホスト生物から誘導され、かつ（あるいは）それらのために誘導された、任意の材料も含んでいる。
【００８２】
例えば、該多細胞ホストが植物である場合、術語「植物」は、根、茎、葉柄、葉、花弁、果実、種子、塊茎、分裂組織、萼片、および花を含むがそれに限定されない、そのような植物の任意の部分、組織、器官あるいは細胞も含んでいる。それは、（やはり）、収集することを意図された植物の果実あるいは他の材料；原形質体および（または）カルス組織を含むがそれに限定されない、（成熟した）植物への再生が可能な材料；あるいは、種子、実生および（または）(他の）繁殖材料、および（または）、例えば、以下に述べるような培養材料等、成熟した植物への培養が可能な材料等、そのような植物の、あるいは、そのような植物のための材料も含んでいる。
【００８３】
ホスト細胞は、試験管内に（例えば、そのようなホスト細胞の培養物内に）存在してもよい。これは、上記の微生物のうちの一つの培養物等、単細胞ホスト細胞（複数も可）の培養物であってよい。それは、天然の植物細胞または動物細胞から誘導された、細胞の、または細胞ラインの、培養物を含むがそれに限定されない、植物または動物細胞の生体外培養物等、多細胞生物から誘導されたホスト細胞の培養物であってもよい。
【００８４】
一実施形態によれば、本発明のヌクレオチド配列を含み、かつ（あるいは）、それを用いて形質転換された、ホスト細胞またはホスト生物は、該ヌクレオチド配列を発現することができる。より詳しくは、本実施形態によれば、本発明のヌクレオチド配列は、ホスト細胞において、ホスト生物において、あるいは、その部分、組織、器官あるいは細胞において、発現される。より望ましくは、該発現は、それが、ホスト細胞またはホスト生物における（上で定義されたような）有意な生物学的変化に至るようなものである。
【００８５】
ホスト細胞は、別の（第二の）ホスト細胞を形質転換するのに適した細胞であってもよい。そのような場合には、本発明のヌクレオチド配列は、望ましくは、他方の（第二の）ホスト細胞を形質転換するのに適した核酸作成物の形態であり、そこでは、該核酸作成物は、望ましくは、また、それが、（第一の）ホスト細胞において、（独立して）維持でき、かつ（あるいは）、複製できるようなものである。例えば、第一のホスト細胞は、植物または植物細胞を形質転換するのに適したAgrobacterium株等、高等生物（の細胞）を形質転換するのに適したウイルスまたは微生物であってよい。
【００８６】
本発明のヌクレオチド配列、並びに、核酸作成物の一つまたはそれ以上の他の任意のエレメントは、ホスト細胞またはホスト生物に対して、相同的であっても、非相同的であってもよい。本発明のヌクレオチド配列を得るための適当なソースおよび（または）方法は、上に説明されている。該作成物の他のエレメントをエンコードするヌクレオチド配列は、（例えば、cDNAとして）天然に生じるソースから、かつ（あるいは）、既知の利用可能なソース（利用可能なプラスミド等）から、単離され、かつ（あるいは）誘導されたものであってよく、かつ（あるいは）、既知のDNA合成技法を用いて合成的に提供されたものであってよい。
【００８７】
該核酸作成物は、それ自体既知の任意の適当な形質転換技法によって、ホスト細胞またはホスト生物に形質転換できる。植物、動物、並びに細菌、酵母（細胞）、藻類／菌類および（または）ウイルスの形質転換のための適当な形質転換システムおよび技法は、例えば、WO 95/07463、WO 96/23810、WO 95/07463、WO 95/21191、WO 97/11094、WO 97/42320、WO 98/06737およびWO 98/21355、並びに、Sambrook他、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) of F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)で説かれている。植物または植物細胞の形質転換のための技法およびベクターシステムのいくつかの例は、Agrobacteriumを用いた形質転換；（例えば、粒子衝撃を用いた）「裸出」DNAを用いた形質転換、または、エレクトロポレーションまたはPEGによる処理を用いた原形質体の形質転換；並びに、WO 97/41228に述べられている形質転換技法を含んでいる。裸出DNAを用いた形質転換のための適当なベクターシステムは、pUCベクターおよびpBluescript II（SK+）ベクター等、高いコピー数を有する大腸菌ベクターを含むが、それらに限定されない。Agrobacteriumと共に使用するための適当なベクターシステムは、上に述べられている。
【００８８】
上記のように、そのような形質転換が行われると、核酸作成物は、ホスト（細胞）のゲノムDNAに組み込まれてよく、あるいは、それは、ホスト細胞におけるエピソームの遺伝要素として、ホストゲノムとは独立して、維持され、かつ受け継がれてよい。
【００８９】
形質転換が行われると、ホスト生物またはホスト細胞は、本発明のヌクレオチド配列の発現が、例えば、その細胞、組織、部分あるいは器官において得られるような条件下に、維持され、あるいは、曝露されてよい。そのような条件は、使用されるホスト細胞またはホスト生物に、かつ（あるいは）、本発明のヌクレオチド配列の発現を調節するのに使用されるプロモーターに、左右される場合がある。そのような条件は、例えば、適当な誘発条件、因子および（または）化合物の存在を含んでいてよい。植物の場合は、発現のための適当な条件は、例えば、形質転換された植物を、例えば、それが成熟し、かつ（あるいは）、果実または種子を生じるまで、育成し、かつ（あるいは）培養することも含んでいてよい。適当な条件は、本発明のヌクレオチド配列の発現が、ストレス（例えば、水、光または栄養素の欠乏）等の因子によって誘発される可能性があり、かつ（あるいは）、植物が、病害および（または）ウイルス、菌類、細菌、昆虫、線虫あるいは他の病害虫等の病原体による攻撃または損傷に、かつ（あるいは）、草食動物による損傷に、曝される可能性がある条件下で、植物を育成し、あるいは維持することも含んでいてよい。
別の様態では、本発明は、温度制御によって、植物におけるHR反応を誘発するための、あるいは望ましくは、その誘発を調節するための方法に関する。該方法は、望ましくは、（ａ）過敏感反応の誘発を抑制する温度で、植物病原体誘導の非病原性遺伝子と植物抵抗性遺伝子との適合するペアを発現する植物を育成する工程と、（ｂ）該植物の温度を過敏感反応の誘発にとって許容的な温度まで下げる工程と、を含んでいる。
【００９０】
本発明の方法において適用してよい遺伝子導入植物は、本発明の別の様態を形成する。該植物は、望ましくは、植物病原体誘導の非病原性遺伝子と植物抵抗性遺伝子との適合するペアを含んでいる。植物抵抗性遺伝子は、内因的な遺伝子であってよいが、外因的に提供された導入遺伝子であってもよい。病原体誘導の非病原性遺伝子は、一般に、導入遺伝子である。植物抵抗性遺伝子および非病原性遺伝子は、望ましくは、植物の各（体）細胞に存在し、かつ（あるいは）、そこで発現され、望ましくは、該植物の細胞のゲノムに統合される。植物抵抗性遺伝子および非病原性遺伝子は、望ましくは、植物プロモーター、あるいは少なくとも、植物細胞において活性を有するプロモーター（例えば、植物ウイルスから誘導されたプロモーター）により駆動される。該プロモーターは、望ましくは、植物の育成期（のほとんど）の間、かつ望ましくは、植物の全ての組織において、活性を有する。別法としては、植物抵抗性遺伝子および非病原性遺伝子のうちの少なくとも一つの発現を駆動するプロモーターは、過敏感反応の誘発が、調節され、かつ（あるいは）、一つまたはそれ以上の特定の組織に限局され得るような、調節された、かつ（あるいは）、組織特異的なプロモーターである。遺伝子導入植物は、望ましくは、生存し、かつ生存可能な状態で、かつ望ましくは、壊死、壊死性の斑点および（または）過敏感反応がない状態で、胚軸の出現後、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０または１１日目まで育成される。より望ましくは、該植物は、生存し、かつ生存可能な状態で、かつ望ましくは、壊死、壊死性の斑点および（または）過敏感反応がない状態で、完全に育成される。
【００９１】
本発明の方法では、遺伝子導入植物は、HRの誘発を抑制する温度で育成される。抑制温度は、一般に、室温（すなわち、２０℃）よりも高いか、あるいは、少なくとも、植物が従来の方法で育成される温度よりも高いことになる。望ましくは、抑制温度は、室温よりも、あるいは、より望ましくは、植物が従来の方法で育成される温度よりも、少なくとも５、１０、１５または２０℃高い。一方、植物が育成される温度は、HRの誘発が抑制される高さであればよく、望ましくは、植物の生長が相当に影響される高さの温度は選択されない。適当な抑制温度は、植物種、変種またはラインに、かつ、非病原性遺伝子と抵抗性遺伝子との一定の適合するペアに、左右されることになり、他の条件にさえ左右される可能性がある。しかしながら、適当な抑制温度は、熟練した人であれば、例えば、種子が発芽し、かつ、壊死性の斑点を生じることなく完全に生長する最低温度を判定するために、遺伝子導入植物の種子をある範囲の温度で発芽させることによって、容易に判定できる。一般に、許容温度は、室温（すなわち、２０℃）に等しいか、あるいは近いか、または、植物が従来の方法で育成される温度に等しいか、あるいは近いことになる。そのような高い温度を含む養生法の下で遺伝子導入植物を育成することによって、非病原性遺伝子（の生成物）と抵抗性遺伝子（の生成物）との間の相互作用による植物防御反応の開始が、抑制される。温度を、その後、許容温度まで下げると、防御反応が始動される。許容温度は、室温よりも低いか、あるいは、植物が従来の方法で育成される温度よりも低い可能性もある。また、適当な許容温度は、熟練した人であれば、この技術分野において既知の方法によって、特に、本出願で説かれている方法によって、単に温度を（例えば、段階的に、あるいは徐々に）下げ、かつ、一定の間隔で、防御反応の開始を判定することによって、余計な実験作業を行うことなく、容易に確立できる。例えば、Cf-4抵抗性遺伝子について、かつ、C. fulvum Avr4非病原性遺伝子について、遺伝子導入されている、MoneyMaker変種の遺伝子導入トマト植物に関しては、３３℃が適当な抑制温度であり、かつ、２０℃が適当な許容温度である。
【００９２】
本発明による方法を遺伝子導入植物のグループに適用すれば、植物のグループにおいて防御反応を同時に始動することが可能である。一実施形態では、本発明は、したがって、植物が温度制御された工程に掛けられる工程を含む、非病原性遺伝子および前記非病原性遺伝子に対応する抵抗性遺伝子を含んでいる、少なくとも二つの遺伝子導入植物のグループにおいて、HRを同時に誘発するための方法に関する。本発明は、また、HRの、望ましくは、同時で、かつ（あるいは）全身性の誘発の調節における、この方法の使用に関する。
【好適な実施形態】
【００９３】
実施例1 :  過敏感反応に関与する配列の識別
病原体に対する植物内の病害抵抗性は、多くの場合、植物内の特定の抵抗性（R）遺伝子、および病原体内の非病原性（Avr）遺伝子の存在に基づいている。R遺伝子とAvr遺伝子が適合すると、植物は、数多くの防御反応を誘発する。これらのうちの一つは、感染部位周辺の細胞がプログラム細胞死するHRである。HRは、他の防御反応と組み合わされて、病原体のさらなる進入を防止する。
【００９４】
Cladosporium fulvum非病原性遺伝子（Avr4）とそれに適合する植物抵抗性遺伝子（Cf-4）の両方を発現する遺伝子導入植物を生じるために、植物抵抗性遺伝子Cf-4を含む作成物およびCladosporium fulvum非病原性遺伝子Avr4を発現する植物から、遺伝子導入トマトラインが、作成されている。これらCf-4/Avr4遺伝子導入トマトラインの作成（並びに、Cf-9/Avr9遺伝子導入トマトラインの作成）は、Cai他、(2001) Mol. Plant Pathol. 2: 77-86によって説かれている。抑圧条件（高温：約３３℃）の下で育成されると、これら植物は、正常に生長するが、許容条件（室温：約２０℃）の下では、植物防御反応が活性化される。その結果、HRの全身性の、かつ、同期された誘発が生じ、約48時間以内に、植物全体が死ぬ。温度移行後の異なる時点で単離されたRNAと共に、cDNA AFLP（登録商標）を用いて、これら防御反応の誘発および調節に関与する（鍵）遺伝子を識別する。
【００９５】
RNAを、Cf4-Avr4植物およびCf0対照植物から、温度移行後の10の異なる時点で単離した。この材料をcDNA AFLP（登録商標）分析に使用した結果、一貫した、かつ、再現性の高いバンドパターンを有するフィンガープリントが得られた。単離された材料を用いて発現分析を実行するために最も情報価値のある時点を判定するため、かつ、スクリーンを、+2/+2プライマーを用いて実行すべきか、あるいは、+2/+3プライマーを用いて実行すべきかを判定するため、テスト用のゲルを実行し、かつ、分析した。これら結果に基づいて、Taq/Mse酵素の組合せ、および１０２４個の+2/+3プライマーの組合せ全てを用いた完全な分析のために、温度移行後の0、30、60および90分の時点を使用することが決まった。
【００９６】
アダプター:
2004530438.tif 000008
プライマー:   Taq rare 5’- GTAGACTGCGTACCGA -3’
Mse: 5’- GATGAGTCCTGAGTAA -3’
各プライマーの3'末端に、+2/+3選択的ヌクレオチドが位置する。
【００９７】
１０２４個のプライマーの組合せ全てを用いてゲルをランさせ、かつ、分析した結果、「Cf4::Avr4」相同体と比較された約５０ ０００個の「Cf0バンド」の発現パターンが得られた。差異的に発現されたバンドを選択し、かつ、ソフトウェアQuantar-Pro（Keygene NV , Wageningen, the Netherlandsから入手可能）を用いて、発現の正確なレベルを判定した。その後、Cf4::Avr4とCf0対照植物との間の、時点ごとの発現レベルの差を、判定した。これらデータに基づいて、二つまたはそれ以上の時点で発現の差の係数が3以上であったか、あるいは、三つまたは四つの時点で発現の差の係数が2.5〜3であった、４４２個の断片を選択した。これら４４２個の差異物のうち、３２８個は、Cf4::Avr4植物内でアップレギュレートされ、１１４個は、ダウンレギュレートされる。これら断片の約７５％について、Cf4::Avr4植物内での発現は、t = 0の時点ですでにアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた。これら差異物のうちのいくつかは、遺伝的背景（例えば、GusA、NptII、Avr4、Cf4）の差から生じるが、それは、より高い温度での植物防御シグナリングの抑圧が絶対的なものではなく、いくつかの防御関連のシグナリングがすでに生じることを示している可能性もある。
【００９８】
４４２個の差異物全てを、ゲルから単離し、再増幅し、かつ、TAクローン化戦略を用いて、pCR2.1ベクター内でサブクローン化した。再増幅プライマーは、以下の通りであった。
【００９９】
M00L : 5’- GACGATGAGTCCTGAGTAA -3’
TR00L: 5’- CTCGTAGACTGCGTACCGA -3’
形質転換の後、四つの独立したクローンを選び、かつ、インサートの大きさを配列ゲル上で確認した。形質転換後に四つ未満のコロニーしか得られなかった場合、または、四つのクローン全てが正しくない大きさのインサートを含んでいた場合は、ゲルから、断片を再度単離した。最終的に、正しい大きさのインサートを含んでいる４２０個のクローンを得た。１６個の断片は、クローン化できなかったので、以後の分析からは省略される。
【０１００】
４２０個のクローン全てについて配列決定を行い、得られた配列をAPESによってトリムした。本出願者によって開発されたこのソフトウェアツールは、AFLP（登録商標）アダプター配列を認識して除去し、かつ、配列の質を判定する。差異物の潜在的な機能を判定するために、配列のほとんどについて、PEDANTを用いてキャラクタリゼーションを行った。このプログラムは、全ての既知の公的データベースに対してBLASTサーチを実行し、かつ、蛋白質およびDNAレベルで、配列の相同性を判定する。さらに、このプログラムは、予測される蛋白質の三次元構造および認識可能な蛋白質ドメインに関して、相同性を判定する。これら分析に基づいて、４２０個の配列断片は、三つのグループに分けることができる。
【０１０１】
第一のグループ（表5）は、「内部対照」に適合できる断片を含んでいる。これら「内部対照」は、Cf-4遺伝子移入断片およびT-DNA（選択可能マーカーとして、GusAおよびNptII（カナマイシン）と共にAvr4を含んでいる）等、Cf0とCf4::Avr4との間の、遺伝的背景における既知の差から生じる。これら遺伝子の発現レベルの差は、4.5〜150の範囲で異なる。この差は、少なくとも部分的に、Cf4遺伝子がそれ自体のプロモーターの制御下にある一方で、T-DNA上の遺伝子が構成的CaMV 35Sプロモーターの制御下にあることに、起因している。予期される「内部対照」は全て、回収された。これら遺伝子の一つは、その発現が非常に低い、Cf4A（Hcr9-4E）抵抗性遺伝子である。この遺伝子は、非常に相同的な多重遺伝子族のメンバーでもあり、したがって、伝統的なノーザンブロット上で識別することはほとんど不可能である。この遺伝子断片が回収されるということは、cDNA AFLP（登録商標）が、その発現が非常に低い、差異的に発現された遺伝子を識別するための、非常に強力な技法であることを示している。
【０１０２】
第二のグループ（表6）は、公的に利用可能なデータベース内の既知の配列と相同性または類似性を共有する、全ての配列断片を含んでいる。第二のグループに属する遺伝子の機能を判定するため、BLASTサーチが行われた。蛋白質レベルでの相同性サーチは、これら配列の約４０％が、既知の植物配列に対して有意な相同性を示すことを示している。これまでに識別された遺伝子のサブセットが、（「説明」と表示した欄に強調表示されている）生物的エリシターで処理された植物から、あるいは、発生中の組織（熟しつつある果実、花蕾、根およびカルス）から作られたトマトcDNAライブラリーに、存在する。この観察結果は、植物の発生システムと植物防御システムが、少なくとも部分的に、同じシグナリング経路を使用することを示唆している。得られた結果に基づいて、遺伝子は、21の上科に細分される（表7）。これら上科は、最も高い相同性を有する遺伝子（複数も可）の一つまたは二つの基準と共に、示されている。見出されるほとんどの遺伝子は、植物防御に関与する植物遺伝子に対して、高い相同性を有する。防御シグナリングに関与することが知られている多くの(受容体様）キナーゼに加えて、膜を超える脂質系のシグナル伝達に関与するホスホリパーゼも見出される。エリシターに対する最初の反応の一つは、オキシダティブバーストであり、これら活性酸素種の生成に関与するペルオキシダーゼおよびチトクロームをエンコードする、多くの遺伝子が見出される。このバーストは、多くの後期防御遺伝子の発現を引き起こし、したがって、転写制御因子をコードするかなりの数の遺伝子が、見出される。プログラム細胞死の一形態であるHRの開始のためには、多くの蛋白質が特異的に分解されることが知られている。多くのプロテアーゼの発現が、実際、アップレギュレートされる。さらに、HR誘発後の最初の90分間に、防御の後期段階において役割を果たす蛋白質をエンコードするいくつかの遺伝子が、すでにアップレギュレートされる。これら蛋白質は、例えば、（カテコールオキシダーゼのように）フィトアレキシン生成に関与し、あるいは、PR蛋白質（キチナーゼA）と呼ばれている。
【０１０３】
実施例2 :   ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング
機能的にキャラクタリゼーションするため、得られたヌクレオチド配列を、植物に感染するとウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（VIGS）を生じるウイルス内で、クローン化する。ウイルス遺伝子ばかりでなく、本発明のヌクレオチドに対して相同的な遺伝子も、サイレンシングされることになる。遺伝子の機能性を、その後、エリシター処理によって防御反応を始動する能力について、サイレンシングされた植物を分析することによって、判定する。ジャガイモウイルスX（PVX）を、Cf4またはCf9を発現するNicotiana Benthamaniaにおいて、発現ベクターとして、かつ、遺伝子サイレンシングを誘発するベクターとして、使用する。見出された差異物を、PVXベクターにサブクローン化する。これらクローンは、タバコ（N. Benthamania）上のサイレンシングのために使用する。対照として、Cf-4抵抗性遺伝子（HRの喪失）の一部、および白葉を生じた、サイレンシングされた組織内の、（光退色を誘発する）フィトエンデサチュラーゼ（PDS）遺伝子を含むウイルスが、含まれている。十分なレベルのサイレンシングに達した後、サイレンシングされた植物にAVR4エリシターを投与し、HRの誘発についてスコアを記録した。HRに必須と思われる遺伝子を、選択する。また、タバコおよびトマトの両方におけるサイレンシングの誘発のために、タバコ茎えそウイルス（TRV）系の遺伝子サイレンシングシステムを使用する。Cf-4/t Cf-9タバコ植物上のHRに必須な遺伝子を、TRVシステム内でタバコにおいてサイレンシングされなかった他の遺伝子と共に、TRVシステム内で分析する。
【０１０４】
実施例3 :  cDNA AFLP（登録商標）を用いた他のシステムにおける遺伝子発現分析
少なくとも四つの異なる病原体を接種したトマト植物と共に、対照植物から、RNAを単離した。cDNA AFLP（登録商標）を用いて、これら遺伝子の発現を研究する。スクリーンで見出される断片の多くは、同じ遺伝子から誘導されるか、あるいは、Cladosporium-トマト相互作用に関与する遺伝子から誘導される。これらcDNA AFLP（登録商標）断片は、省略される。発現分析は、他のcDNA AFLP（登録商標）断片のみについて実行される。発現データは、各種のシステムにおいて、早期に発現され、かつ誘発される、新規な遺伝子を選択するための判断基準を提供する。これら遺伝子は、広範で、かつ持続的な抵抗性の生成のために、かつ（あるいは）、病原体誘発性プロモーターの単離のために、使用される。
2004530438.tif 000009
【０１０５】
実施例4 :  候補病害抵抗性遺伝子の機能分析および完全長転写物のキャラクタリゼーション
他のベクターおよび細菌株の取扱いおよび作成を容易にする適当なベクターに、cDNA AFLP（登録商標）断片をクローン化することによって、cDNA AFLP（登録商標）断片のクローン化を実行する。その後、完全長転写物の配列情報を得るために、完全長転写物のキャラクタリゼーションを行う。データベース内に配列の相同性に関する情報がない場合は、RACEによってcDNA配列を得る。サザンハイブリダイゼーション実験によって、クローンの単一コピー性を確認する。
【０１０６】
完全長cDNAをクローン化した後、それらを、適当なプロモーターの制御下で、形質転換ベクターに挿入する。Agrobacteriumへのベクターの移送後、その株を使用して、遺伝子導入トマト植物を生成する。各作成物から、多数の独立した二倍体形質転換体が生成され、かつ、倍数性分析、コピー数のカウントおよび無傷の統合の確認の後に、植物防御における遺伝子生成物の正確な機能を明らかにするために、完全に生長した植物に種子を生じさせ、かつ、次の世代を分析する。該植物は、例えば、既知のPR遺伝子とのノーザンブロットハイブリダイゼーション、各種の病原体の不在下または存在下でのcDNA AFLP（登録商標）のマイクロアレイ遺伝子発現分析を用いて、形態学的差、および防御反応の誘発のタイミングについて、さらに分析する。
2004530438.tif 000010
【０１０７】
2004530438.tif 000011
【０１０８】
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【０１０９】
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【０１１０】
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【０１１１】
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【０１１２】
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【０１１３】
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【０１１４】
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【０１１５】
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【０１１６】
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【０１１７】
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【０１１８】
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【０１２０】
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【０１２１】
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【０１２２】
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【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
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【０１３４】
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【０１３５】
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【０１３６】
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【０１３７】
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【０１３８】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004530438.tif 000241
【国際調査報告】
2004530438.tif 000242
2004530438.tif 000243
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