(57)【要約】パクリタクセルとセフアロマンニンを含む出発物質を入手し；該出発物質を蟻酸ブチルや酢酸ブチルなどの特に規定した溶媒のどれかに溶解させて混合物となし；この混合物をカラムクロマトグラフにかけてパクリタクセルの溶離部分とセフアロマンニンの溶離部分と残留物を得；該パクリタクセル及びセフアロマンニン部分を別々に乾燥させてそれぞれ別個の結晶形のパクリタクセルとセフアロマンニンを得ることを特徴とする、パクリタクセル、セフアロマンニン及び他の関連化合物を分離する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
パクリタクセル及びセフアロマンニンを含む出発物質を入手し；該出発物質を次式：
【化１】
2004514715.tif 000005
［式中、Ｒ１は水素又はメチルであり、Ｒ２は４−７の炭素原子を含むアルキル又はアリールアルキル基である。］
を有する溶媒中に溶解させて混合物となし；該混合物をカラムクロマトグラフにかけてパクリタクセル溶離部分、セフアロマンニンの溶離部分及び残留物を得；次いでパクリタクセル及びセフアロマンニン部分を別々に乾燥して各個別の結晶形のパクリタクセルとセフアロマンニンを得ることを特徴とする、パクリタクセルとセフアロマンニンの分離方法。
【請求項２】
前記出発物質が、セフアロマンニンとパクリタクセルを任意比率で含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記出発物質が、新鮮な又は乾燥したイチイの樹
の根、葉、枝、種又はそれらの混合物の抽出物である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記出発物質が、イチイの樹の物質の細胞培養物から得られる抽出物である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記出発物質が、固体状、シロップ状、又は半固体のゴム質物質の形状である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記溶媒の構造が、水素又はメチルとしてのＲ１、及びｎ−ブチル、イソブチル、第２級ブチル又は第３級ブチルとしてのＲ２を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
パクリタクセル及びセフアロマンニンを含む出発物質を入手し；該出発物質を次式：
【化２】
2004514715.tif 000006
［式中、Ｒ１は水素又はメチルであり、Ｒ２は４−７の炭素原子を含むアルキル又はアリールアルキル基である。］
を有する溶媒中に溶解させて混合物となし；該混合物を、溶離剤として上掲の式の単一溶媒を使用して直接相シリカゲルカラムを利用するカラムクロマトグラフにかけてパクリタクセルの溶離部分、セフアロマンニンの溶離部分と残留物を得；次いでパクリタクセル部分とセフアロマンニン部分を別々に乾燥させてそれぞれ別々の結晶形のパクリタクセルとセフアロマンニンを得ることを特徴とする、パクリタクセルとセフアロマンニンの分離方法。
【請求項８】
前記溶媒の式が、水素又はメチルとしてのＲ１；ｎ−ブチル、イソブチル、第２級ブチル又は第３級ブチルとしてのＲ２を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
シリカゲルが、出発物質の約５０−１００重量部の量で使用される、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
前記出発原料がセフアロマンニンとパクリタクセルを任意の比で含む、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
前記出発物質が、新鮮な又は乾燥したイチイの樹の根、葉、枝、種又はそれらの混合物の抽出物である、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記出発物質が、イチイの樹の物質の細胞培養物から得られる抽出物である、請求項７記載の方法。
【請求項１３】
前記出発物質が、固体、シロップ、又は半固体のゴム質物質の形状である、請求項７記載の方法。
【請求項１４】
前記溶媒の式が、水素又はメチルとしてのＲ１及びｎ−ブチル、イソブチル、第２級ブチル又は第３級ブチルとしてのＲ２を含む、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
この発明は、イチイ属の植物又はそれらの細胞培養物の抽出物から出発して、パクリタクセルをその類似物のセフアロマンニンから分離するのに向けられている。特に、パクリタクセルは直接相シリカゲルカラム上でのクロマトグラフイによりセフアロマンニンと分離される。
【０００２】
（背景技術）
以前には「タクソール」と呼ばれていたパクリタクセルは、非常に有望な抗がん剤である。このものは１９７１年Ｗａｎｉらによってイチイ属のＴａｘｕｓ　ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａの樹皮から単離され（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９３，２３２５，１９７１）、その構造は化学的な方法及びＸ−線結晶分析を用いて明らかにされた。
【０００３】
【化３】
2004514715.tif 000002
【０００４】
パクリタクセルは、ＦＤＡ（米国食品医薬品局）によって乳がん及び卵巣がんの治療用に認可されており、現在は肺及び結腸のがん治療用に臨床試験中である（例えば、Ｗ．Ｐ．ＭｃＧｕｉｒｅ及びＥ．Ｋ．Ｒｏｗｉｎｓｋｙ，Ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９９５，１−３３７ページを参照）。
【０００５】
パクリタクセルの第１の天然資源は太平洋イチイの樹（Ｔａｘｕｓ　ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａ）の樹皮である。パクリタクセルはまた、ヨーロッパイチイ種（Ｔａｘｕｓ　ｂａｃｃａｔａ）、アジアイチイ種（Ｔａｘｕｓ　ｗａｌｌｉｃｈｉａｎａ及びＴａｘｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、及び観賞目的（例えば、Ｔａｘｕｓ　ｍｅｄｉａ）で栽培するイチイ種を含む他のイチイ種の地上に出た部分や根の中に存在することがわかった。
【０００６】
天然資源からパクリタクセルの単離方法は、ひとつには植物物質中の濃度が比較的低いためであるが、またふたつめには同属の１つのセフアロマンニンが存在するため、複雑かつ不経済なものになる。植物物質中のパクリタクセルとセフアロマンニンの含有量及び比率は、植物の種類や問題にしている植物の部分によって異なる。一般に、パクリタクセルとセフアロマンニンの含有量はそれぞれ０．００１−０．０８％及び０．００１−０．２２％の範囲であることがわかった（Ｋ．Ｗ．Ｗｉｔｅｒｕｐ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，５３，１２４９，１９９０；Ｒ．Ｇ．Ｋｅｌｓｅｙ　ｅｔ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，５５，９１２，１９９２；Ｎ．Ｃ．Ｗｈｅｅｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，５５，４３２，１９９２）。
特に、再生可能な植物物質であるＴａｘｕｓ　ｍｅｄｉａ種は、パクリタクセルの製造に最も普通に用いられる原料であり、他の種と比較して平均で最も高い濃度のセフアロマンニンを含む。
【０００７】
高価な植物材料の慣用法による抽出を不必要にするため最近非常にもてはやされているイチイの細胞培養物をベースとするパクリタクセル生産方法でさえ、パクリタクセルの他にある関連量のセフアロマンニンを産する。
【０００８】
パクリタクセルとセフアロマンニンの構造の違いは、化合物の側鎖部にあるのみであり、これが類似化学性質の原因である。それ故この２つの化合物はよく似たクロマトグラフ的性質を有し、これら同族化合物の完全分離は困難である。主として逆相クロマトグラフ又は高価な結合相カラムの使用に基づく多数のクロマトグラフ的方法が提案されているが（Ｊ．Ｈ．Ｃａｒｄｅｌｌｉｎａ，Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１４，６５９，１９９１；Ｓ．Ｌ．Ｒｉｃｈｈｅｉｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６４，２３２３，１９９２；Ｅ．Ｒ．Ｍ．Ｗｉｃｋｒｅｍｅｓｉｎｈｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１６，３２６３，１９９３；Ｋ．Ｍ．Ｗｉｔｈｅｒｕｐ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｌｉｑ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１２，２１１７，１９８９）、これらは大規模商業運転に容易には適応できない。この理由のため、パクリタクセルとセフアロマンニンを分離できる方法の可能性が、実際に大きな重要なトピックとして残っている。
【０００９】
過去には、この２つの化合物の酸化剤に対する反応性が異なることに基づいてパクリタクセルとセフアロマンニンを分離する方法が提案された。セフアロマンニンのチグリン酸残さ中に存在するオレフイン二重結合が、四酸化オスミウムとの反応（Ｄ．Ｇ．Ｉ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，５５，２５９，１９９２）又はオゾンとの反応（Ｊ．Ｔ．Ｂｅｃｋｖｅｒｍｉｔ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６１，９３０８，１９９６）によって酸化されるが、一方、パクリタクセルは酸化反応中何らの化学変化も受けないことがわかった。別のアプローチではパクリタクセルとセフアロマンニンの混合物の臭素による処理が検討された（Ｊ．Ｍ．Ｒｉｍｏｌｄｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，５９，１６７，１９９６）。すなわち温度及び時間反応条件のコントロール下に行った臭素による処理はジブロモセフアロマンニンを生成させるが、パクリタクセルはこの化学薬品によって影響されない。
しかしながら、これらの方法には四酸化オスミウムなどの有毒薬品を使用すると云う欠点があり、いずれにせよ、セフアロマンニンが消滅又は変形してその誘導体を生成し、セフアロマンニンはその誘導体から難しい合成方法によってしか再生することはできない。それ故、安価、簡単、安全で効果的なパクリタクセルとセフアロマンニンの分離に依然としてニーズがある。したがって、本発明の第１の目的は、パクリタクセルとセフアロマンニンの混合物又はイチイ抽出物からそれらを分離する簡便な方法を提供することである。
【００１０】
（発明の開示）
本発明はセフアロマンニンや他の関連化合物からパクリタクセルを分離する方法を提供する。特に、この方法はパクリタクセルとセフアロマンニンを含む出発物質を入手すること；該出発物質を特に規定した多数の溶媒のうちのどれか１つに溶解させて混合物を生成させること；該混合物をカラムクロマトグラフにかけてパクリタクセルの溶離部分、セフアロマンニンの溶離部分及び残留物を得ること；さらにパクリタクセル部分及びセフアロマンニン部分を別々に乾燥させてそれぞれ別々の結晶形のパクリタクセル及びセフアロマンニンを得ることを含む。溶媒は蟻酸ブチルあるいは酢酸ブチル又は酢酸ベンジルが好ましい。
【００１１】
（発明を実施するための最良の形態）
驚いたことに、溶離剤として１つの溶媒を用いる１つの直接相シリカゲルカラム上でのクロマトグラフ分離によって極めて高純度のパクリタクセルとセフアロマンニンが高収率で得られることがわかった。好ましくはこの溶媒は次の一般式を有する。
【００１２】
【化４】
2004514715.tif 000003
【００１３】
式中、Ｒ１は水素又はメチルであり、Ｒ２は好ましくは４つの炭素原子を含み、すなわちＲ２はｎ−ブチル、イソブチル、第２級−ブチル又は第３級−ブチルとすることができる。これら溶媒はカラム上でのルーチンのクロマトグラフ精製に頻繁には使用されないが、パクリタクセル−セフアロマンニン分離の特別なケースには驚くべき程良好な実用的結果を与える。
【００１４】
この発明の出発物質は、任意比率でのセフアロマンニンとパクリタクセル単独物の混合物、あるいは新鮮な又は乾燥したイチイの根、葉、枝、種又はそれらの混合物の抽出物であってもよい。本発明方法はまた細胞培養物から得られた抽出物も含む。これらの出発物質は当業者には一般に公知であるので、ここでさらに説明の要はない。
【００１５】
問題にしている抽出物は粗抽出物又は精製抽出物であってもよく、後者は慣用の溶媒で処理され、予備的なクロマトグラフ精製を受けている。再び、これらの技術は当業者には公知であるので、ここでさらに述べる必要はない。この出発物質は、その製造に使用する実験条件によって固体状、シロップ又は半固体のゴム質物質の形状であってもよい。この物質を、本明細書に説明した溶媒のうちの１つに溶解後カラムクロマトグラフにかけさえすればよい。
【００１６】
本発明のクロマトグラフ精製は、その組成にもよるが、出発物質の約５０−１００重量部の量の簡単な直接相シリカゲルを利用する。
【００１７】
本発明の溶媒によるカラムクロマトグラフは速くて、高い圧力を要せず、通常の重力条件下で実施される。
【００１８】
表１は、シリカゲルプレートを使用する薄層クロマトグラフ分析でのセフアロマンニンとパクリタクセルの挙動と、２つの化合物の満足な分離を可能にする本発明の一聯の溶媒を示している。
【００１９】
【表１】
2004514715.tif 000004
【００２０】
直接相シリカゲルカラム上でのクロマトグラフイによるパクリタクセルとセフアロマンニンの単離に本発明記載の溶媒の使用は多くの利益を提供する。
【００２１】
第１に、カラムクロマトグラフイは事実上セフアロマンニン−フリーの（セフアロマンニンを含まない）パクリタクセル、逆に殆どパクリタクセル−フリーのセフアロマンニンを産する。第２に、直接相シリカゲルの使用は、前掲文献に記載された逆相シリカゲルの使用よりもかなりの経済的利益を提供し、そして第３に、カラムの溶離に１つの溶媒を使用することにより工業的、連続法製造に関連する運転において分留によらずに速やかなリサイクルが可能となる。パクリタクセル及びセフアロマンニンと一緒に出発物質中に存在する他の構成成分のいずれもクロマトグラフ精製によって取り除かれる。
【００２２】
溶離部分を乾涸するまで真空蒸発させ、残留物を適当な溶媒で結晶化させることにより望ましい結晶形のパクリタクセルとセフアロマンニンが得られる。
【００２３】
本発明で説明した方法は、それゆえ、収得量の収率を増加させるとともにこの抗腫瘍剤のより安価な生産方法を進展させることによりセフアロマンニン−フリーのパクリタクセルを多量製造するための簡単な解決法を提供する。
【００２４】
（実施例）
以下の実施例は本発明を説明するが限定するものではない。
実施例１　セフアロマンニンを含むＴａｘｕｓ　ｍｅｄｉａ抽出物からパクリタクセルの単離
Ｖ．Ｓｅｎｉｌｈら（Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．４７，１３１，１９８４）によって説明された方法にしたがって６２０ｋｇのＴａｘｕｓ　ｍｅｄｉａ（植物全部）から製造した２９０ｇの抽出物が、ＨＰＬＣ分析によって１８３ｇのパクリタクセルと８１ｇのセフアロマンニンを含むことがわかった。この抽出物を３．５Ｌのｔ−酢酸ブチル中に溶解し、６０ｋｇのシリカゲルを含むカラム上に装填した。合計１２００Ｌのｔ−ブチルが溶離する。パクリタクセルと３％未満のセフアロマンニンを含む４００Ｌ部分及びセフアロマンニンと３％未満のパクリタクセルを含む別の２００Ｌ部分が、３５０Ｌの溶媒溶離（ｅｌｕｔｉｏｎ）後に得られる。
この２つの部分を別々に真空濃縮して乾涸させ、残留物をヘキサン−アセトンで結晶化させる。このようにして得られた１５４ｇのパクリタクセルと７０ｇのセフアロマンニンは９９％を超えるＨＰＬＣ純度を有し、その物理化学的及び分光分析値は、文献（Ｇ．Ｎ．Ｃｈｍｕｒｎｙ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．５５，４１４，１９９２；Ｃ．Ｊ．Ｆａｌｚｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，３３，１１６９，１９９２；Ｖ．Ｓｅｎｉｌｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．４７，１３１，１９８４）によって提供された情報と一致する。
実施例２　パクリタクセル及びセフアロマンニン両者を含む混合物からパクリタクセルとセフアロマンニンの単離。
【００２５】
７０ｇのパクリタクセルと３０ｇのセフアロマンニンを含む混合物を１．５Ｌのｔ−蟻酸ブチルに溶解し、同じ溶媒中に懸濁した１０ｋｇのシリカゲルを含むカラムにかけた。カラムをｔ−蟻酸ブチルで溶離し、各溶離部分をＨＰＬＣ／ＴＬＣ分析後に一緒にした。パクリタクセルとセフアロマンニンを含む部分を別々に濃縮乾涸させ、残留物を好適な比のアセトンとヘプタンで結晶化させて９９％を超えるＨＰＬＣ純度を有するパクリタクセルとセフアロマンニンを得た。
【国際公開パンフレット】
2004514715.tif 000007
2004514715.tif 000008
2004514715.tif 000009
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2004514715.tif 000014
2004514715.tif 000015
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2004514715.tif 000017
【国際調査報告】
2004514715.tif 000018
2004514715.tif 000019
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