(57)【要約】【課題】アポ脂蛋白質Ｂ−１００（ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ−１００）のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に対する模造ペプチド、これらの連鎖物及び変形体を含む肥満症治療用ワクチン組成物を提供すること。【解決手段】本発明のアポ脂蛋白質Ｂ−１００のエピトープに対する模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体を提供して、それらの製造方法の提供して及びそれらを含む肥満症治療用ワクチン組成物を提供して達成される。【選択図】図１０
2004508029.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１で示されるアポ脂蛋白質Ｂ−１００（ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ−１００）のエピトープの模造ペプチド及びこれらの連鎖物。
【請求項２】
前記模造ペプチドの連鎖物が前記模造ペプチドが１個ないし１５個つながった連鎖物であることを特徴とする請求項１記載の模造ペプチド。
【請求項３】
前記模造ペプチドの連鎖物が前記模造ペプチドが４個続いてつながった連鎖物であることを特徴とする請求項１記載の模造ペプチドの連鎖物。
【請求項４】
前記模造ペプチドのアミノ酸配列が欠損、追加または化学的置換に変形されることを特徴とする請求項１記載の模造ペプチド及びこれらの連鎖物。
【請求項５】
配列番号２で示されるアポ脂蛋白質Ｂ−１００のエピトープの模造ペプチド。
【請求項６】
前記模造ペプチドの連鎖物が前記模造ペプチドが１個ないし１５個つながった連鎖物であることを特徴とする請求項５記載の模造ペプチド。
【請求項７】
前記模造ペプチドの連鎖物が前記模造ペプチドが４個続いてつながった連鎖物であることを特徴とする請求項５記載の模造ペプチドの連鎖物。
【請求項８】
前記模造ペプチドのアミノ酸配列が欠損、追加または化学的置換に変形されることを特徴とする請求項５記載の模造ペプチド。
【請求項９】
配列番号３で示されるアポ脂蛋白質Ｂ−１００のエピトープの模造ペプチド。
【請求項１０】
前記模造ペプチドの連鎖物が前記模造ペプチドが１個ないし１５個つながった連鎖物であることを特徴とする請求項９記載の模造ペプチドの連鎖物。
【請求項１１】
前記模造ペプチドの連鎖物が前記模造ペプチドが４個続いてつながった連鎖物であることを特徴とする請求項９記載の模造ペプチドの連鎖物。
【請求項１２】
前記模造ペプチドのアミノ酸配列が欠損、追加または化学的置換に変形されることを特徴とする請求項９記載の模造ペプチド。
【請求項１３】
アポ脂蛋白質Ｂ−１００のエピトープの配列番号１で示される模造ペプチドとそれの連鎖物または変形体、配列番号２で示される模造ペプチドとそれの連鎖物または変形体、配列番号３で示される模造ペプチドとそれの連鎖物または変形体及びこれらの混合物に成った群から選択されるのを含むことを特徴とする肥満症治療用ワクチン組成物。
【請求項１４】
前記ワクチン組成物が皮内注入（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）剤型であることを特徴とする請求項１３記載の肥満症治療用ワクチン組成物 。
【請求項１５】
前記ワクチン組成物が錠剤、丸剤、顆粒剤、粉末、カシェ剤、エリクスル、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ、エーロゾル、軟質または更質ゼラチンカプセル剤、滅菌注射液、滅菌粉末に成った群から選択されるどの一つの剤型であることを特徴とする請求項１３記載の肥満症治療用ワクチン組成物 。
【請求項１６】
１）配列番号１個ないし３で示されるアポ脂蛋白質Ｂ−１００の模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体を暗号化するＤＮＡをベクターにいれる段階；
２）段階１）のベクターを使って宿主細胞を形質転換させた後養う段階；及び
３）段階２）で培養された宿主細胞から前記模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体を分ける段階；を含める模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体の製造方法。
【請求項１７】
配列番号１で示されるアポ脂蛋白質Ｂ−１００の模造ペプチドが４個連続でつながったポリペプチドを暗号化するＤＮＡ。
【請求項１８】
配列番号１で示されるアポ脂蛋白質Ｂ−１００の模造ペプチドが４個連続でつながったポリペプチドを暗号化するＤＮＡを含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は肥満症治療用ワクチン組成物に関することとして、より詳しくは、アポ脂蛋白質Ｂ−１００（ＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢ−１００）のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に対する模造ペプチド、これらの連鎖物及び変形体を含む肥満症治療用ワクチン組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
血清脂質はコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）、トリグリセリド（ＴＧ）、遊離脂肪酸（ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）、燐脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）等の多様な成分で構成されて、アポ脂蛋白質と共に脂蛋白質を形づくって血液を通じてはこばれる。このような血清脂質を運ぶ脂蛋白質の中でＬＤＬ（ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）は主にトリグリセリドとコレステロールの運搬を担っているが、産業化による食習慣変化或いはほかの原因によって血中のＬＤＬ−コレステロール数値が増えて生ずる動脈硬化、冠状動脈疾患、心筋梗塞等の患者が急増している。従って、これを解決するための方法の一つで、ＬＤＬ−コレステロールの数値を低めるための研究と前記疾病の発生過程を明らかにするための研究が活発に進んでいる。
【０００３】
脂質代謝に係られる成人病の主要因子であるＬＤＬ−コレステロールは大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の貪食を通じてＨＤＬ（ｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）の形態で放出されて、肝でこれをリサイクルしたり或いは胆汁酸の形態で処理して排泄させる経路が明かになっている（Ｂｒｏｗｎ、Ｍ。Ｓ。ａｎｄ Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ、Ｊ。Ｌ。、１９８３、Ａｎｎｕ。Ｒｅｖ。Ｂｉｏｃｈｅｍ。、５２：２２３−２６１）。
【０００４】
アポ脂蛋白質Ｂ−１００はこのようなＬＤＬの主な蛋白質成分であり、ＶＬＤＬ（ｖｅｒｙ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）、キロミクロン（ｃｈｙｌｏｍｉｃｒｏｎ）にも存在してあり、アポ脂蛋白質Ｂ−１００を通じてＬＤＬが細胞膜のＬＤＬ−受容体に結合するために、血中にある抗体がアポ脂蛋白質Ｂ−１００を認識するように導けば大食細胞によるＬＤＬ−コレステロールの除去が起られる（ＤａｌｕｍＩ。、ｅｔ　ａｌ。、１９９７、Ｍｏｌ。Ｉｍｍｕｎｏｌ。、３４（１６−１７）：１１１３−２０）。また、ＬＤＬの表面に存在するアポ脂蛋白質Ｂ−１００に抗体と同じ巨大分子が付着される場合、血中脂肪質分解酵素である脂蛋白質リパーゼ（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ）がトリグリセリド等の加水分解が円滑に遂行されないから肥満の主要成分である遊離脂肪酸形成が阻害されることができる。
【０００５】
最近にはワクチンを利用してＬＤＬ−コレステロールの数値を低めて動脈硬化を減少させる研究がマウスとうさぎ等の多様な動物を対象と試みされている。例えば、アルビンぐ等（Ａｌｖｉｎｇ、Ｃ。Ｒ。、ｅｔ　ａｌ。、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍ。Ｓｏｃ。Ｔｒａｎｓ。、１７（４）：６３７−９；Ａｌｖｉｎｇ、Ｃ。Ｒ。、ｅｔ　ａｌ。、１９９６、Ｊ。Ｌａｂ。Ｃｌｉｎ。Ｍｅｄ。、１２７：４０−４９；Ａｌｖｉｎｇ、Ｃ。Ｒ。、ｅｔ　ａｌ。、１９９６、Ｃｕｒｒ。Ｔｏｐ。Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。Ｉｍｍｕｎｏｌ。、２１０：１８１−６）はコレステロールが酸化及び代謝産物によって変形されつつあり、場合によって高い免疫原性を表すと報告された。
【０００６】
また、正常人の血清中に自然発生的にコレステロールに対する抗体が存在しているのが報告されたこともある（Ｗｕ、Ｊ。Ｔ。、ａｎｄ Ｗｕ、Ｌ。Ｌ。、１９９７、Ｃｌｉｎ。Ｌａｂ。Ｍｅｄ。、１７（３）：５９５−６０４、Ｒｅｖｉｅｗ）。また、うさぎを用いた動物実験ではコレステロールを含む食べ物を摂取させることによって高コレステロール血症と動脈硬化を導いたが、コレステロールを含むリポソームを接種して免疫化させた動物の場合には正常対照群に比べて高コレステロール血症と動脈硬化傾向が抑制されたり或いは減ると報告された。
【０００７】
これと同じコレステロールワクチン療法によって誘導された抗体はＩｇＭ（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎＭ）タイプで、ＶＬＤＬ、ＩＤＬ（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）及びＬＤＬと結合する考えられる。高脂肪食事によって人にあらわれる高コレステロール血症及び動脈硬化に対する予防及び治療用ワクチンの可能性がこのような実験的事実を基づいで提示されている（Ｂａｉｌｅｙ、Ｊ。Ｍ。、１９９４、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４：１０６７−１０６８；Ｐａｌｉｎｓｋｉ、Ｗ。ｅｔ　ａｌ。、１９９５、Ｐｒｏｃ。Ｎａｔｌ。Ａｃａｄ。Ｓｃｉ。Ｕ。Ｓ。Ａ。、９２（３）：８２１−５；Ｗｕ、Ｒ。ｅｔ　ａｌ。、１９９９、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、３３（１）：５３−９）。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者はアポ脂蛋白質Ｂ−１００に対する模造ペプチドが肥満を効果的に予防することを見つけ、これを利用して肥満治療用ワクチン組成物を開発した。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
従って、本発明の目的はアポ脂蛋白質Ｂ−１００のエピトープに対する模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体を提供することである。
【００１０】
本発明のもう一つの目的は前記模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体の製造方法を提供することだ。
【００１１】
本発明のもう一つの目的は前記模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体を含む肥満症治療用ワクチン組成物を提供することである。
【００１２】
前記本発明の目的はアポ脂蛋白質Ｂ−１００のエピトープに対する模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体を提供して達成される。
【００１３】
本発明者は人のアポ脂蛋白質Ｂ−１００を認識するモノクローナル抗体（ＭａｂＢ２３）のエピトープを検索するためにファジ（ｐｈａｇｅ）を利用するペプチドライブラリーシステムを使った。この時検索になったペプチドは抗体が認識する抗原決定基（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）と構造的に似ている模造ペプチドとして、これらのアミノ酸配列を利用して模造ペプチド（ｍｉｍｏｔｏｐｅ ｐｅｐｔｉｄｅ）を合成した。
【００１４】
ペプチドライブラリーシステムは抗原決定基の形態を決める方法の一種として、ファジマイナーコート蛋白質（ｍｉｎｏｒ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコーディングしているＤＮＡに無作為配列のペプチドをコーディングする塩基配列を入れて、これをアルエフ（ＲＦ）ＤＮＡに入れた後、宿主大腸菌に感染させて無作為配列のペプチドを発現させる方法である。宿主大腸菌の表面で発現される無作為配列ペプチドは抗原と反応させて抗原決定基は似ている構造を持つペプチドを検索した。
【００１５】
このような模造ペプチドを抗原で使いマウスで免疫反応を導いて抗血清を得た結果、このような抗血清が元のアポ脂蛋白質Ｂ−１００と模造ペプチド及びＬＤＬを認識することを確かめた（キムチフン、１９９７、ファジに発現させたＲａｎｄｏｍ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｂｒａｒｙを利用したアポ脂蛋白質Ａ−Ｉとアポ脂蛋白質Ｂ−１００のハツカネズミのモノクローン抗体に対する抗原決定基の確認、漢陽大学校大学院修士学位論文）。本発明のアポ脂蛋白質Ｂ−１００のエピトープに対する模造ペプチドは配列番号１、配列番号２または配列番号３で示されるペプチド及びこれらの混合物に成るグループから選択される一つである。
【００１６】
本発明の模造ペプチドは免疫決定基を増やすために連鎖物（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒ）として使用されて、前記模造ペプチドが２個以上、あるいは３個ないし１５個つながったことが望ましく、もっと望ましいことは、配列番号１で示されるペプチドを４個結んだことである。
【００１７】
本明細書から前記模造ペプチドの”連鎖物”というのは前記の模造ペプチドの末端が互いに連結した重合体を意味する。本発明で前記模造ペプチドの”変形体”というのはアポ脂蛋白質Ｂ−１００に対するモノクローン性及び多クローン性抗体が認識できるペプチドのアミノ酸配列の各種変異を言って、例えば、アミノ酸配列に対する一つ或いはそれの以上のアミノ酸の置換、欠損、追加及び化学的置換等を意味する。
【００１８】
本発明のもう一つの目的は前記模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体を暗号化するＤＮＡをベクターに入れる段階；挿入されるベクターを使って宿主細胞を形質転換させた後養う段階；前記段階で培養された細胞から模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体を分ける段階を含める模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体の製造方法を提供して達成される。
本発明のもう一つの目的は前記アポ脂蛋白質Ｂ−１００のエピトープに対する模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体を含む肥満症治療用ワクチン組成物を提供して達成される。
【００１９】
本発明の模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体を使い通常的な方法によってワクチン剤型ができる。製造の過程にて、活性成分を免疫アジュバント、免疫補強剤、キャリヤー、賦形剤及び希釈剤て一緒に混合したりこれらに希釈して製造される組成物を容器形態の担体等に封入させることが望ましい。このような剤型は、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、粉末、カシェ剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ、エーロゾル、軟質または更質ゼラチンカプセル剤、滅菌注射液、滅菌粉末等の形態である。
【００２０】
本発明の組成物と一緒に用いられている免疫補粗剤（ａｄｊｕｖａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ）ではＴ細胞（Ｔ−ｃｅｌｌ）エピトープを持つ蛋白質類、例えればＢ型肝炎ウイルス表面抗原蛋白質等と同じ蛋白質類；アルミニウム塩、ベントナイト（ｂｅｎｔｏｎｉｔｅ）、ラテックス（ｌａｔｅｘ）、アクリルリック粒子（ａｃｒｙｌｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）と同じ不活性運搬体；脂質と同じ疎水性抗原；油中水及び水中油（ｗａｔｅｒ−ｏｉｌ、ｏｉｌ−ｗａｔｅｒ）乳化液、多糖類と同じ蓄積形成物（ｄｅｐｏｔ ｆｏｒｍｅｒ）；ピピヂ（ＰＰＤ）、ポリアデニン、ポリウラシル等と同じＴ細胞活性剤；エルピエス（ＬＰＳ）と同じＢ細胞ミトゲン（ｍｉｔｏｇｅｎ）類のＢ細胞活性剤；サポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）、リゾレシチン（ｌｙｓｏｌｅｃｉｔｈｉｎ）、レチナール（ｒｅｔｉｎａｌ）、クイルＡ（ｑｕｉｌＡ）、リポソーム等の界面活性剤；大食細胞強化剤；またはイヌリン（ｉｎｕｌｉｎ）、ザイモサン（ｚｙｍｏｓａｎ）、エンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）、レバミゾール（ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）、Ｃ。ｐａｒｖｕｍ等の免疫賦活化剤（ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｐａｔｈｗａｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ）が使用される。
【００２１】
本発明のワクチン組成物で”キャリヤー蛋白質”というのは本発明の模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体を血液を通じて運べる蛋白質とかアルミニウム塩と一緒に製薬学的に許容できる物質を意味する。
【００２２】
本発明の組成物に使用される適したキャリヤー、賦形剤及び希釈剤の例では、アルミニウム塩（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｓａｌｔｓ）、フェノキシエチルエタノール、お水、生理食塩水、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、無定形セルロース、ポリビニルピロリドン、メチルハイドロキシベンゾエート、プロピルハイドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレイト及び鉱物油などがある。
【００２３】
また、本発明の組成物の剤型は充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤等を追加に含める。
【００２４】
本発明の組成物は哺乳動物に投与された後、１回または数回の投与によって免疫ができあがるように当業界によく知られている方法を使って剤型化される。
【００２５】
本発明の肥満治療用ワクチン組成物は経口、経皮、皮下、静脈または筋肉を含めいろいろな経路を通じて投与されて、望ましくは皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）投与の方法が利用される。
【００２６】
本発明のワクチン組成物は人の場合、通常的１回投与量は活性成分のペプチドとして０．１個ないし１０μｇ／ｋｇ体重、望ましくは０．５ないし１．０μｇ／ｋｇ体重の範囲である。しかし、活性成分の実際投与量は免疫化条件、投与経路、患者の状態、年齢、性別及び体重等のいろいろな関連因子を考えて決えなければならない。前記投与量はいかなる方法でも本発明の範囲を限ることはない。
【００２７】
本発明のワクチン組成物の基本的薬理効果は、本発明の模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体を抗原で認識してつくられた人間の抗体がＬＤＬ表面のＢ−１００エピトープに結合してリパーゼの作用部位を立体的に遮蔽（ｓｔｅｒｉｃ ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）して肥満の主要因子である遊離脂肪酸生成を阻害して肥満症の予防及び治療効果を表す。
【００２８】
また、本発明のワクチン組成物はアポ脂蛋白質Ｂ−１００エピトープの模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体を抗原に認識して生成される人間の抗体がＬＤＬ表面のＢ−１００エピトープに結合してオプソニン化（ｏｐｓｏｎｉｚａｔｉｏｎ）作用を引き起こしてＬＤＬが大食細胞によって容易に探知されとりのぞかれるようにする仕組みを通じて高脂血症抑制の効果を表す。
【００２９】
本発明のワクチン組成物の別の薬理効果は、ＬＤＬ表面のアポ脂蛋白質Ｂ−１００のエピトープに本発明のアポ脂蛋白質Ｂ−１００エピトープの模造ペプチド、これらの連鎖物または変形体を抗原で認識して生成される人間の抗体が結合して、ＬＤＬが細胞表面のＬＤＬ受容体と特異的で結合することを妨げてコレステロール及び遊離脂肪酸等の脂肪質が細胞内に蓄積されるのを防いで肥満症予防及び治療効果を表す。
【００３０】
【発明の実施の形態】
以下で本発明を実施例に基づいてより具体的に説明する。しかし、下記の実施例は本発明を説明するためのものであるばかり、本発明の権利範囲を本実施例に限定しよとするのではない。
【００３１】
第１実施例：オリゴヌクレオチドの合成及びアニーリング
【００３２】
望む配列を持つオリゴヌクレオチドをシンテシース社（Ｇｅｎｅｍｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｉｎｃ。；Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）に依頼して合成した。オリゴヌクレオチドの５’末端に燐酸基を付着させるために、１００ｐｍｏｌ／μｌオリゴヌクレオチド５０μｌに１０ｍＭＡＴＰ１０μｌ、１０Ｕ／μｌＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｔａｋａｒａ、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）３μｌ及び１０×キナーゼ緩衝液７μｌを混ぜて反応体積全部で７０μｌにして３７℃で２時間の間反応させた。
【００３３】
また、オリゴヌクレオチドを互いに相補的関係にあるオリゴヌクレオチドとアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）させるために、リン酸化処理された各々のオリゴヌクレオチドを１０μｌずつ混ぜて８０℃で５分間加熱させた後室温になる時まで徐々に冷却させた。
【００３４】
第２実施例：連結反応
ベクターＤＮＡ１μｌ、挿入体ＤＮＡ５μｌ、Ｔ４ＤＮＡ連結酵素（ＮＥＢ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、ＵＳＡ）１μｌ、１０×酵素反応緩衝液（ＮＥＢ、Ｂｅｖｅｒｙｌｙ、ＭＡ）１μｌ及び蒸溜水２μｌを混ぜて連結反応液を作って、１６℃で一晩反応させた。
【００３５】
第３実施例：アポ脂蛋白質Ｂ−１００に対する模造ペプチド（ＰＢ１）発現用ベクター（ｐＢＸ）の製造
【００３６】
段階１：ベクターの設計
【００３７】
模造ペプチド発現用ベクターは基本的にリーダーカセットとＰＢ１ペプチド遺伝子を含めるようになって、一つのＰＢ１遺伝子を含めるベクター（プラスミドｐＢＸ１）は図１ａと同じリーダーカセットをｐＱＥ３０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のマルチクローニングサイトにクローニングとこのように制作されたプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩ位置に図１ｂに示したＰＢ１ペプチド遺伝子（ＬＢカセット）をサブクローニングして制作した。
【００３８】
一方、多数のＰＢ１ペプチド遺伝子がつながった遺伝子を含むベクターは前記プラスミドｐＢＸ１のＳａｌＩ位置に、図１ｃと互いにつながられるように考案されたＰＢ１ペプチド遺伝子（ＢＬカセット）をＳａｌＩとＸｈｏＩで切断した後一個以上入れてつくった。
【００３９】
段階２：ＰＢ１モノマー（ｍｏｎｏｍｅｒ）ペプチド発現ベクター（ｐＢＸ１）の製造
【００４０】
実施例１及び２の方法によって配列番号１０及び１１を持つオリゴヌクレオチドを合成した後アニーリングさせて図１ａと同じリーダーカセットを制作した後、ＳａｌＩ及びＢａｍＨＩで切断したｐＱＥ３０ベクター（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と結んでプラスミドｐＱＥ−Ｌｅａｄｅｒをつくった。ｐＱＥ３０システムを利用して蛋白質を発現させれば精製を容易にしようとする目的に目的蛋白質のＮ−末端に６個のヒスチジン残基が追加に付く。このような追加アミノ酸を最少限で減らすために前記リーダーカセットの配列はエンテロキナーゼ認識部位（ＤＤＤＤＫＩ；配列番号：１２）を持つように考案された。
【００４１】
一方、図１ｂのＬＢカセット（配列番号１３及び１４）を製造するために、実施例１と同じ方法で配列番号４ないし７の四種類オリゴペプチドを合成した後、リン酸化させて、各々相補的なオリゴヌクレオチドとアニーリングした。
【００４２】
続いて、アニーリングになったオリゴペプチド４０μｌに１Ｕ／μｌ Ｔ４ＤＮＡ 連結酵素３μｌ、１０×酵素反応緩衝液５μｌ及び蒸留水２μｌをこき混ぜて 連結反応液を作って、１６℃で一晩反応させて オリゴヌクレオチドを 結んだ。
【００４３】
反応が終った後、反応液を２０％ポリアクリルアミドゲルから電気泳動してＥｔＢｒ染めで５２ｂｐのオリゴヌクレオチド（ＬＢカセット）を確かめた（図３）。
【００４４】
図３で、Ｍ列は２０ｂｐＤＮＡ大きさの標識であり、第１列は連結反応液である。ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用してゲルからＬＢカセットを回収した後ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで切断した。
【００４５】
前記で製造されたプラスミドｐＱＥ−ＬｅａｄｅｒをＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで切断した後実施例２の方法で前記から製造されたＬＢカセットと結んでＰＢ１模造ペプチド発現ベクターを製造した。製造されたベクターをｐＢＸ１だと名づけてこのようなベクターで発現されるペプチドはＰＢ１１ペプチドと名づけた（図２参照）。
【００４６】
段階３：ＰＢ１１ペプチド連鎖物発現ベクターの製造
【００４７】
図１ｃのＢＬカセット（配列番号１５及び１６）を製造するために、実施例１と同じ方法で配列番号４、５、８及び９の四種類オリゴヌクレオチドを合成した後リン酸化させて、各々相補的なオリゴヌクレオチドとアニーリングした。続いて、段階２と同じオリゴヌクレオチドを結んだ後 ２０％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動して５５ｂｐ大きさのオリゴヌクレオチド （ＢＬカセット）を確かめた。ＱＩＡＥＸＩＩ抽出キットを利用してゲルからＢＬカセットを回収してＳａｌＩ及びＸｈｏＩで切断した。
【００４８】
一方、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏｌｌａ、ＣＡ、Ｕ。Ｓ。Ａ。）をＳａｌＩ及びＸｈｏＩで切断した後０．８％アガローズゲルで電気泳動後 ＱＩＡＥＸＩＩゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を利用して切断されたベクターを回収した。
【００４９】
５μｌのＢＬカセットＤＮＡ及び前記で準備された切断されたベクターＤＮＡ１μｌを使って実施例２と同じ連結反応をあこなってプラスミドｐＢｌｕｅ−ＢＬを得た。
【００５０】
プラスミドｐＢｌｕｅ−ＢＬをＳａｌＩ及びＸｈｏＩで 切断してＢＬカセットを分けた後、これを段階２で 製造されたベクターｐＢＸ１のＳａｌＩ位置に入れてプラスミドｐＢＸ２を製造した。また、ベクターｐＢＸ１のＳａｌＩ位置に挿入されるＢＬカセットの数を２個、３個に変化させてプラスミドｐＢＸ３及びｐＢＸ４を製造した（図２参照）。
【００５１】
プラスミドｐＢＸ２、ｐＢＸ３及びｐＢＸ４から発現されるペプチドはＰＢ１ペプチドが２個、３個、４個ずつ各々つながったものであり、これらはＰＢ１２、ＰＢ１３及びＰＢ１４ペプチドと各々名づけた。
【００５２】
段階４：挿入体の確認
【００５３】
プラスミドｐＢｌｕｅ−ＢＬで大腸菌（Ｅ。ｃｏｌｉＭ１５［ｐＲＥＰ４］；Ｑｉａｇｅｎ社、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を形質転換させた後の平板アガ培地（１％アガローズゲルを付け加えてゲル化させたＬＢ培地）に接種して３７℃で１６時間の間養ってコロニーを形成させた。平板アガ培地で得たコロニーを１０ｍｌのＬＢ培地に接種して３７℃一定培養機で１６時間養った後、ＤＮＡ精製システム（Ｗｉｚａｒｄ ＰＬＵＳ ＤＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ； Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、Ｕ。Ｓ。Ａ。）を利用してプラスミドＤＮＡを分けた。分けたプラスミドを制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩを利用して３７℃で１時間切断させた後２０％ＰＡＧＥを通じて分析した（図４）。図４で、Ｍ列は２０ｂｐラダー（ｌａｄｄｅｒ）ＤＮＡ大きさの標識であり、第１列は段階３から得たオリゴヌクレオチド産物であり、第２列は段階３から２０％ＰＡＧＥで 分けたＢＬカセットＤＮＡであり、第３列は制限酵素で処理された組換え体プラスミドｐＢｌｕｅ−ＢＬである。図４からプラスミドｐＢｌｕｅ−ＢＬがＢＬカセットＤＮＡを含んでいることがわかる。
【００５４】
一方、発現ベクター内の挿入体のコピー数及び方向を確かめために、プラスミドｐＢＸ１及びｐＢＸ３で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉＭ１５［ｐＲＥＰ４］）を各々形質転換させた後前記と同じプラスミドＤＮＡを分けた。分けたプラスミドを制限酵素ＳａｌＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断した後２０％ＰＡＧＥを通じて分析した（図５）。図５で、第Ｍ列は２０ｂｐラダーＤＮＡ大きさ標識であり、第１列及び第３列はｐＢＸ１内のＬＢカセットばかり確認されてＢＬカセットが挿入されなかったプラスミドであり、第２列はｐＢＸ３内の３コピー挿入体で１ＬＢカセット＋２ＢＬカセットの正しい挿入が確認されてあり、第４列は １ＬＢカセット＋２ＢＬカセットが逆方向で挿入されている様子である。従って、図５の結果からｐＢＸベクターにＢカセット（ＢＬまたはＬＢカセット）どんな方向に何個挿入されているかどうか確かめられる。
【００５５】
また、ＷｉｚａｒｄプラスＤＮＡミニプレプキット（Ｗｉｚａｒｄ ＰＬＵＳ ＤＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐｋｉｔ）を利用して精製したプラスミドＤＮＡに挿入されたＢカセットの配列をシークエナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ｖｅｒ２．１））ＤＮＡ配列分析キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＵＫ）を利用して分析した結果目的する配列と一致することを確かめた。
【００５６】
第４実施例：大腸菌を利用したＰＢ１４ペプチドの発現及び精製
【００５７】
段階１：ＰＢ１４ペプチドの発現確認
【００５８】
組換え体ＰＢ１４ペプチドの発現を確かめるために、ｐＢＸ４ベクターで形質転換した 大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］と対照群として形質転換していない大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］及びｐＱＥ３０ベクターで形質転換した大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］を各々アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）を含んでいるＬＢアガ（ａｇａｒ）プレートに塗抹してコロニーを得た後アンピシリン（１００μｌ／ｍｌ）とカナマイシン（２５μｌ／ｍｌ）を含んでいるＬＢ培養液に接種して一晩養った。
培養液を６００ｎｍで吸光度が０．５−０．７程度になるように３７℃で１時間ぐらい一定養った後、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｔｈｉｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を最終的に１ｍＭ濃度になるように加えて組換え体蛋白質の発現を促進させて、３７℃で５時間養った。
【００５９】
培養液１ｍｌを取って１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離してペレットを得た後２×ＳＤＳ試料緩衝液［１００ｍＭトリス・ＣｌｐＨ６．８、２０％グリセロール（ｗ／ｖ）、４％ＳＤＳ（ｗ／ｖ）、２％２−メルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルー］５０μｌに溶かしてＳＤＳ−ＰＡＧＥの時試料で使った。電気泳動直前に用意した試料を９５℃で５分間加熱した後ゲルに１０μｌをローディングして、２０ｍＡで５時間電気泳動を遂行した（ＭｉｇｈｔｙＳｍａｌｌＩＩ、Ｈｏｅｆｅｒ、ＵＳＡ）。使ったスタッキング（ｓｔａｃｋｉｎｇ）ゲルと分離ゲルのアクリルアミド濃度は各々５％、１５％であり、標準蛋白質では前もって染めされた標準ＳｅｅＢｌｕｅ（２５０ｋＤａ〜４ｋＤａ；ＮＯＶＥＸ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ、Ｕ。Ｓ。Ａ。）と広範囲標準Ｍａｒｋ１２（２００ｋＤａ〜２．５ｋＤａ）を使った。電気泳動が終った後クーマシーブリリアントブルー（ＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｒｉｌｌｉａｎｔｂｌｕｅＲ−２５０）を 使って１時間染めて、また脱色溶液（５％ＭｅＯＨ、７％酢酸）で１０時間脱色させた。
【００６０】
また、発現されるペプチドがＰＢ１４ペプチドであるかどうかを確かめるために、前記ゲルで分けられたバンドをニトロセルロース膜に移した後抗−ＰＢｌ血清（アメリカＢｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｉｎｃ。（Ｌｅｗｉｓｖｉｌｌｅ、ＴＸ、ＵＳＡ）に依頼して合成した ＰＢ１ペプチドをうさぎに免疫させて生産した）と反応させてウェスタンブロッティングを実施した（図６）。図６で、Ｍ列は前もって染めされた標準ＳｅｅＢｌｕｅ標識であり、第１列は形質転換していない大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］の培養液であり、第２列はｐＱＥ３０ベクターで形質転換した大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］の培養液であり、第３列はｐＢＸ４ベクターで形質転換した大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］の培養液である。
【００６１】
図６によると組換え体ＰＢ１４ペプチドは抗−ＰＢ１マウス血清と特異的で免疫学的反応を表した。
【００６２】
段階２：発現されたペプチドの溶解度確認
【００６３】
ｐＢＸ４ベクターで形質転換させた大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］を段階１と同じ養った後、ＩＰＴＧで導いてから３時間後培養液１０ｍｌを取って遠心分離し細胞を収穫した。天然系蛋白質を得るための細胞溶解緩衝液（３００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）５ｍｌを細胞ペレットに入れて、冷却させた後、細胞を破砕するために３０秒ずつ１０サイクル、サイクルごとに１分３０秒間中止して超音波処理を遂行した。４℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して上層液を分けて可溶性蛋白質が入っている粗抽出物Ａで使ったし、残っているペレットは不溶性蛋白質が入っている粗抽出物Ｂで使った。
【００６４】
各々の試料に２×ＳＤＳ試料緩衝液を混ぜて９５℃で５分間煮た後段階１と同じ方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを遂行した。その結果ＰＢ１４ペプチドは不溶性分画である粗抽出物Ｂに含まれていて、可溶性分画である粗抽出物Ａと分離精製ができることを確かめられた。
【００６５】
段階３：ＰＢ１４ペプチドの精製
【００６６】
＜段階３−１＞親和性クロマトグラフィー
【００６７】
段階１で発現が確認されたペプチドを精製するためにｈｉｓｔａｇ蛋白質用Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使った。この樹脂を用いた親和性クロマトグラフィーは樹脂に充電されているＮｉ＋と蛋白質に発現されるｈｉｓ残基の親和力を利用して望む蛋白質を容易に精製できる方法である。
【００６８】
先に１ｌのＬＢ培地にｐＢＸ４で形質転換した大腸菌Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］を一晩養った培養液を５０：１で接種して、６００ｎｍで吸光度が０．６になるまで３７℃で養った。ＩＰＴＧを最終１ｍＭ濃度に加えて５時間養った後６，０００ｘｇで３０分間遠心分離して細胞ペレットを得て−７０℃で一晩保管した。氷で溶かしたペレットに湿重量１ｇ当たり溶解緩衝液（３００ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）５ｍｌを入れてよく溶かした。段階２と同じ方法で超音波処理し細胞を破砕して、常温、１０，０００ｘｇで３０分間遠心分離してペレット（段階２の粗抽出物Ｂ）を得た。ここに細胞を溶解させて細胞内部にある蛋白質を変性させるための緩衝液（８Ｍウレア、０．１ＭＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を残っていた上層液体積と同じわりあいに混ぜてペレットを溶かした。この時十分にペレットを溶かすために超音波処理を少し行い浮遊物が見えないようにした。
【００６９】
８Ｍウレア緩衝液にもとけない抽出物に存在している細胞かすを除くために８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離を実施した。
ここで得られた上層液に細胞溶解物４ｍｌ当たりＮｉ−ＮＴＡ樹脂１ｍｌを混ぜて、４℃、２００ｒｐｍで２時間回転一定機で一定しながら結合させた。
【００７０】
充電するカラム（ｓｉｚｅ：内径２ｃｍ×高さ２．７ｃｍ）を用意して下方をキャップで防いで、慎重に結合させた混合物を入れて樹脂が沈むと、キャップを開け流出物を受けた。緩衝液（８Ｍウレア、０．１ＭＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）２０ｍｌ及びＮｉ−ＮＴＡ樹脂に非特異的に結合されている蛋白質を除くための緩衝液（８Ｍウレア、０．１ＭＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．３）２０ｍｌで順次にカラムを洗浄した後、ｈｉｓｔａｇ結合蛋白質を溶出するための緩衝液（８Ｍウレア、０．１ＭＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ５．９）を５ｍｌずつ２回、それからもっと強いｐＨ条件をあたえＮｉ−ＮＴＡ樹脂で溶出させだと思う蛋白質を得るための緩衝液（８Ｍウレア、０．１ＭＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ４．５）を５ｍｌずつ４回流して蛋白質を溶出したし、溶出を確かめるめに１５％アクリルアミドゲルを使ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを遂行した（図７）。図７で、Ｍ列は前もって染められたＳｅｅｂｌｕｅの大きさ標識であり、第１列は精製されたＰＢｌ４ペプチドである。
【００７１】
このように精製したペプチドが本来の構造（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を持つようにＰＢＳ（ＮａＣｌ８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ０．２ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４１．４４ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４０．２４ｇ／Ｌ）を使って透析を遂行した。使った透析チューブの分子量制限大きさ（ｃｕｔ−ｏｆｆｓｉｚｅ）は ３，５００であり、チューブは Ｎａ２ＨＣＯ３、ＥＤＴＡを含める緩衝液で１０分煮て蒸留水で洗浄した後ＥＤＴＡでまた１０分煮て活性化させた。先に２Ｍウレアを含めたＰＢＳ３ｌで５時間の間透析した後ＰＢＳ５ｌずつに２回、一晩透析した。
【００７２】
＜段階３−２＞疎水性クロマトグラフィー
【００７３】
段階３−１で得られたＰＢ１４ペプチドの純度を高めるために疎水性クロマトグラフィーを実施した。
【００７４】
段階３−１でＮｉ−ＮＴＡ樹脂で溶出されて出たＰＢ１４ペプチド溶液に１０％硫酸アンモニウムを少しずつ加えて溶かしｐＨを７．０で合わせた。１０％硫酸アンモニウムが十分溶けた後に３時間以上放置してフェニルセファロースカラム［充填物：ＰｈｅｎｙｌｓｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗｒｅｓｉｎ（Ｐｈａｍａｃｉａ社、Ｓｗｅｄｅｎ）；カラムｓｉｚｅ：１ｃｍ（ｉｄ）×３ｃｍ（ｈ）］にローディングした。溶出液（８Ｍウレア、０．１ＭＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．３）を０．５ｍｌ／分の流速で流しながら硫酸アンモニウム濃度勾配を１０％から０％まで逆にかけて溶出した各々の分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて確かめて、ＰＢ１４ペプチドが集まっている分画を集めてＰＢＳ緩衝液に透析して脱塩さセた同時に変性剤のウレアも除いた。
【００７５】
＜段階３−３＞Ｈｉｓｔａｇの除去
【００７６】
透析緩衝液として、精製されたｈｉｓｔａｇ蛋白質で変性剤及びイミダゾール等を除いてエンテロキナーゼが活性を表される組成を持つ緩衝液（５０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、２ｍＭＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）に２Ｍウレアを加えて緩衝液を作った。段階３−２で得た透析したＰＢ１４ペプチドをウレアガ入っている前記緩衝液で透析して脱塩しながらウレアの濃度を徐徐に低めた。このように緩衝液が交換されているＰＢ１４ペプチドが入っている溶液にエンテロキナーゼを３単位／ｍｌに加えて２３℃で養って１時間隔に試料を取ってＳＤＳ−ＰＡＧＥでバンドを確かめて ｈｉｓｔａｇが取り去られたＰＢ１４ペプチド（ＰＢ１４＋ｈｉｓペプチド）の生成量を測定した。
【００７７】
＜段階３−４＞イオン交換クロマトグラフィー
【００７８】
エンテロキナーゼ処理によって生成された不必要な蛋白質及びペプチドを除くためにイオン交換クロマトグラフィーを実施した。
【００７９】
段階３−３のＰＢ１４−ｈｉｓペプチド試料を緩衝液（２Ｍウレア、０．１ＭＮａＨ２ＰＯ４、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０）で透析して緩衝液を十分交したし、ＤＥＡＥセファロース樹脂（Ｐｈａｍａｃｉａ、ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）カラムに透析した試料をローディングの後緩衝液（５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、２Ｍウレア、ｐＨ７．０）で カラムを平衡化して緩衝液（５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液、２Ｍウレア、１ＭＮａＣｌ）を利用して０から１ＭまでＮａＣｌ濃度勾配をかけてペプチドを溶出した（流速：０．５ｍｌ／分）。また、各々の分画を何個の区域に分けて合わせた後各々を濃縮してＳＤＳ−ＰＡＧＥでＰＢ１４−ｈｉｓペプチドの存在を確かめた。
【００８０】
段階４：ＰＢ１４ペプチドの定量
【００８１】
段階３と同じ方法を通じて精製されたＰＢ１４ペプチドの量はマイクロＢＣＡ試薬（ｍｉｃｒｏＢＣＡｒｅａｇｅｎｔ；Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｊｆｏｒｄ、ＵＳＡ）を使う比色法で測定した。
【００８２】
段階５：組換え体ＰＢ１４ペプチドの特性確認
【００８３】
段階３で精製されたＰＢ１４ペプチドの純度及びＰＢ１４ペプチドを抗原として用いて得られた抗血清との反応性を確かめるためにウェスタンブロッティングを遂行したし、この時発色はＥＣＬ（Ａｍｅｒｓｈａｍ社、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＵＫ）を使った。
【００８４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（実施例２、段階１）が 終った後ゲルをニトロセルーロースペーパー （ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅｐａｐｅｒ）と一緒に伝達緩衝液（組成：０．３％トリス、１．５％ｇｌｙｃｉｎｅ、２０％ｍｅｔｈａｎｏｌ）で一定電圧６０Ｖで３時間反応させてゲル上のバンドをニトロセルロースペーパーに移動させた後、５ｍｌのブロッキング溶液（ＴＢＳｐＨ７．５、５％脱脂粉乳（ｗ／ｖ）、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０）で１時間３０分間処理してペプチドバンド以外の部分をブロッキングした。ＴＴＢＳ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝食塩水）を利用して１５分、５分、５分間３回洗浄した後、１次抗体としてＰＢ１ペプチドで誘導された抗−ＰＢ１ペプチド血清（実施例２、段階１参照）を ブロッキング溶液に１：５０００で希釈した溶液を加えて１時間３０分間反応させた。
【００８５】
また、精製されたＰＢ１４ペプチドの純度を確かめるためには１次抗体としてＰＢ１４ペプチドで誘導された抗−ＰＢ１４ペプチド血清（実施例３）を１：５０００で希釈して使った。ＴＴＢＳで１５分、５分、５分間３回洗浄した後アルカリ性ホスファターゼ−Ｆ（ａｂ’）２−山羊抗−マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｚｙｍｅｄ、ＳａｎＦｒａｎｓｉｓｃｏ、ＣＡ）をブロッキング緩衝液に１：１０００で希釈させた溶液と１時間３０分間常温で反応をさせたし、またＴＴＢＳで３回洗浄後発色気質であるＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールリールフォースフェイト ／ニトロブルーテトラゾールリーム）（Ｓｉｇｍａ）で発色させた。発色反応の終結はＴＴＢＳ溶液を使ってＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を除いて遂行された。ウェスタンブロッティング結果、発現されたＰＢ１４ペプチドが抗−ＰＢ１４血清によって認識されることを確かめた。
【００８６】
ＥＣＬの場合にはニトロセルロース紙の代わりにＰＶＤＦ膜（ＧｅｌｍａｎＳｃｉｅｎｃｅのＢｉｏＴｒａｃｅ）を使った。また、１次抗体を１：１００００で希釈して使ったし、２次抗体としてＨＲＰ−結合されたうさぎ抗−マウスＩｇＧ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ、Ｕ。Ｓ。Ａ。）を１：１００００で希釈して使った。発色反応はＥＣＬ＋Ｐｌｕｓウェスタンブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にある溶液Ａ１ｍｌ当り溶液Ｂを２５ｍｌを混ぜて使った。十分発色になった時膜をフィルムカセットに入れて５秒、１０秒、２０秒、３０秒間フィルムに露出してバンドを検出した（図８）。図８で、Ｍ列はＥＣＬ検出標識（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）であり、第１列はＰＢｌ４ペプチドである。図８の結果から発現されたＰＢ１４ペプチドが抗−ＰＢ１４血清によって認識されることがわかる。
【００８７】
また、プロティーンＧカラム（ｐｒｏｔｅｉｎＧ ｃｏｌｕｍｎ、入手先：Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を 利用して血清からＰＢｌ４ペプチドに対する抗体を精製してウェスタンブロッティングを実施した場合血清を直接利用した結果と同一の結果が確かめられた。
【００８８】
第５実施例：抗−ＰＢ１４ペプチドマウス抗体の製造
【００８９】
本実施例で使用されたＰＢｌ４ペプチドは実施例２の段階３−３でｈｉｓｔａｇが取り去られたＰＢｌ４ペプチド（ＰＢ１４−ｈｉｓ）である。
【００９０】
段階１：ＰＢ１４ペプチドとＯＶＡの結合
【００９１】
実施例２の段階３で精製されたＰＢ１４ペプチド溶液にキャリヤー（ｃａｒｒｉｅｒ）蛋白質である。オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）をモル比が約１：１０になるように加えて１時間４℃で放置した。ＰＢ１４ペプチド及びオボアルブミンの混合溶液に同一体積の２％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド水溶液を混ぜて４℃で続けて撹伴しながら１時間反応させた。反応停止のためにグリシンを最終濃度が０．２Ｍになるように付け加えた。４℃で続けて撹伴しながら１時間反応させた後、ＭＷＣＯ１２０００−１４０００の透析膜（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、ＲａｎｃｈｏＤｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、Ｕ。Ｓ。Ａ。）を通してＰＢＳ緩衝液で残余グルタルアルデヒドを除いた。
【００９２】
段階２：マウスの免疫化
【００９３】
段階１で得た結合ペプチドを濃縮してマウスの免疫化に使った。この時使用された抗原量は結合前のＰＢ１４ペプチド量が５μｇが注射されるように用意したし同量の補粗剤と十分柔和して腹腔に０．２ｍｌずつ注射した。
【００９４】
１次注射は補粗剤としてプロイント完全補粗剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ； ＣＦＡ）を使ったし２週間隔にプロイント不完全補粗剤（Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ Ａｄｊｕｖａｎｔ； ＩＦＡ）を使ってそれ以外の２回ブスティングを実施した。対照群マウスにはＢＳＡを同一の方法で注射した。
【００９５】
最後にブスティングしてから５日後心臓で１ｍｌの血液を採取して３７℃で３０分間おいておいて凝血（ｃｌｏｔｔｉｎｇ）を実施した。以後４℃２，５００ｘｇで３０分間遠心分離して、パスツールピペットを利用して血餅（ｃｌｏｔ）を分けた。
【００９６】
これだから、上層液である血清を４℃で一晩培養し、ほかにの残っている凝血物質を完全に凝縮させて１０，０００ｘｇで２０分間遠心分離して残った上層液を別に集めて分画して実験に使う分量の血清は４℃に保存し、残りは−２０℃で冷凍保存した。
【００９７】
段階３：間接ＥＬＩＳＡ（Ｉｎｄｉｒｅｃｔ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ）を利用した抗−ＰＢ１４Ａｂの力価測定
【００９８】
段階２で得られた血清試料を利用して抗体力価を測定した。９６ ウェル分析プレート（Ｆａｌｃｏｎ：ｐｒｏ−ｂｉｎｄｉｎｇ）にＰＢ１４ペプチド溶液 （１０μｇ／ｍｌ ｉｎ ＰＢＳ）を １００μｌずつ入れた後、４℃で６時間以上放置して、ＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有トリス緩衝食塩水）で ３回洗浄した。各ウェル当りブロッキング溶液（１％ＢＳＡｉｎＴＴＢＳ）を２００μｌずつ入れた後、３７℃で１時間反応させてＴＴＢＳで３回洗浄した。分けた血清をブロッキング溶液に１０２−１０５倍で希釈して １００μｌずつ入れた後３７℃で１時間反応させてＴＴＢＳ２００μｌで３回洗浄した。
【００９９】
ＨＲＰ−結合山羊抗−うさぎＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）をブロッキング溶液に１０３倍で希釈して１００ｍｌずつ入れて、３７℃で１時間反応させた後、ＴＴＢＳ２００μｌで ３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼ基質キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の溶液Ａと溶液Ｂを９：１で混ぜて１００μｌずつ入れた後常温で３０分間発色反応をさせた後ＥＬＩＳＡリーダー（ＥＬ３１２ｅ、Ｂｉｏ−ＴｅｋＩｎｓ。）で４０５ｎｍで吸光度を測定した（図９）。図９からＰＢ１４ペプチドに対するマウス抗血清が１０００倍（図のＸ軸の３．０）の希釈度までウェスタン及びＥＬＩＳＡ実験に適用されることを確かめた。
【０１００】
第６実施例：マウスモデルを利用したＰＢ１４ワクチンの抗肥満効果
【０１０１】
段階１：マウスでの肥満誘導
【０１０２】
本実験では５週令雄性ＩＣＲ系マウス（（株）大韓動物実験センター、ソウル、大韓民国）を利用したマウスは１７−２５℃で維持される動物飼育室で混合飼料 ［（株）三養飼料（Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）製品、成分：水分１１．８％以上、蛋白質２０．０％以上、粗脂肪３．０％以上、粗繊維１０．０％以下、粗灰分１０．０％以下、カルシウム０．６％以上、燐０．４％以上］で飼育した。
【０１０３】
マウスで肥満を導くためにゴールドチオグルコース（ｇｏｌｄｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｅ：ＧＴＧ）を投与して視床下部摂食調節中枢核（ｖｅｎｔｅｒｏｍｅｄｉａｌｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃｎｕｃｌｅｉ；ＶＭＨ）の病変を導くと満腹感を感じなくなって継続的に餌を取って肥満が誘導される。実験で使ったＧＴＧは非常に不安定な化合物でありお水または水分が存在すればお互いに（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）分けられ吸湿性が生ずる。従って、適当量のＧＴＧを注射するためにＢｒｅｃｈｅｒ等（ＢｒｅｃｈｅｒＧ。Ａｎｄ Ｗａｘｌｅｒ、Ｓ。Ｈ。、Ｐｒｏｃ。Ｓｏｃ。Ｅｘｐ。Ｂｉｏｌ。Ｍｅｄ。、７０：４９８−５０１（１９４９））の方法と 同一に １００ｍｇの ＧＴＧ（Ｓｉｇｍａ社）を１ｍｌの胡麻油（Ｓｉｇｍａ社）に懸濁して使った。
【０１０４】
実験群（２０匹）と対照群（４匹）に分けて、実験群にはＧＴＧを各々２５ｍｇずつ注射し対照群は正常状態に置いた。
【０１０５】
実験実施の前にマウスの体重を測定し、体重誤差が大きくないマウスを選んで飼育して実験対象にした。ＧＴＧ注射後、一部マウスが約一週間以内に死亡すると報告されていたので、実験に使われたマウスの体重は個別的に測定せずＧＴＧ注射から一週間後に測定した。この時マウスの体重は約２６．５ないし２９．５ｇ範囲だった。
【０１０６】
実験群ではＧＴＧを注射して１週間後、７匹のマウスに肥満が誘導され、残り１３匹のマウスは肥満が誘導されなかったので前記と同じ方法でＧＴＧを再び注射し、全部肥満が誘導された。これら２０匹のマウスを３つのグループに分けて、実験群１（７匹）にはＧＴＧ注射後１週間目に実施例３の段階２と同じようにＰＢ１４ペプチドを用いたワクチンを注射した。実験群２（７匹）にはＰＢ１４ペプチドワクチン注射の代わりにキャリヤー蛋白質であるオボアルブミンを注射して模擬実験（ｍｏｃｋ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）を行った。実験群３（６匹）には肥満が誘導されるようにワクチン注射をしなかった。
【０１０７】
一方、対照群マウス（正常群）にはＰＢＳ０．２ｍｌを注射して比較した。
【０１０８】
また、コレステロール摂取を導いてマウス血清内のコレステロール数値を高めるためにＧＴＧを注射する時からマウス飼料に黄身を混ぜて５０℃で乾燥させた後提供したし、コレステロールによる疾病を導いたり肥満を導いたりするために多量の餌を供給した。各マウスの体重は毎日測定した。
【０１０９】
その結果、図１０によると、ワクチンを注射した実験群１（−▲−▲−）のマウスは ＧＴＧ注射１２週後、体重は２７．７±０．４ｇから５２．２±１．７ｇに増えて増加程度においては正常対照群（−○−○−）の 体重増加に比べて大きい差はなかった。しかし肥満を誘導後、オボアルブミンを注射した実験群２（−●−●−）と肥満を導いた後ワクチン注射を全然しなかった実験群３（−■−■−）の場合には持続的に体重が増加して ２８．３±０．５ｇから６８．９±２．８ｇに顕著な体重増加を見せている。従ってＰＢ１４ペプチドをワクチン注射することで肥満が抑制されるのをはっきりと区別できる。
【０１１０】
図１０で、Ｇ１及びＧ２はＧＴＧ注射を表しており、Ｖ１、Ｖ２及びＶ３はＰＢ１４によるワクチン注射を表す。
【０１１１】
一方、図１１は肥満誘導後ワクチン注射の効果をマウスの樣子を見せた絵でＧＴＧ注射後、ワクチンを注射した 実験群１の２０週令のマウス （図１１ａ：正常体型） とワクチンを 接種しなかった実験群３の２０週令のマウス（図１１ｂ：肥満体型）を比べて実質的肥満抑制効果を表した。
【０１１２】
段階３：血中コレステロール濃度測定
【０１１３】
一回目ＧＴＧ注射後１２週目に対照群マウスとＧＴＧ注射されたマウス（実験群１及び２）を対象に血中コレステロール数値を比べた。血中総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬ−コレステロール及びＬＤＬ−コレステロール濃度は各々Ｃｈｏｌｅｓｔｅｚｙｍｅ−Ｖ、Ｔｒｉｇｌｙｚｙｍｅ−Ｖ、ＨＤＬ−Ｃ５５５（新洋化学、ソウル、大韓民国）及びＬＤＬ−ＥＸキット（Ｄｅｎｋａ 生研（株）、東京、日本） を利用して酵素学的で測定した。この時実験的誤差を減らすために、実験ごとに標準試料Ｃａｌｉｂｒａｔｅｒ−Ｄ（Ｄｅｎｋａ 生研（株）、東京、日本）を利用して各Ｏ。Ｄ。値に対する検量線式グラフを作成しており、測定しようとする試料のＯ。Ｄ。値を代入して脂質濃度と含量を分析した。その結果は下記の表１及び図１２に示している。
【０１１４】
【表１】
2004508029.tif 000003
【０１１５】
表１及び図１２によると、ＧＴＧ注射を通じた肥満の誘導結果、全般的に総コレステロール、トリグリセリド、ＨＤＬ−Ｃ、ＬＤＬ−Ｃ濃度が全部少しずつ上昇されているが、対照群と実験群で総コレステロール含量においては大きい差は見られなかった（図１２）。【０１１６】
【発明の効果】
アポ脂蛋白質Ｂ−１００のエピトープに対する模造ペプチド、それの連鎖物または変形体を含む本発明の肥満治療用ワクチン組成物は生体内で自己免疫疾患を起こさないながらも肥満の発生を効果的に抑制できる。
【０１１７】
従って、本発明のワクチンを使うと今までＬＤＬ関連循環器疾患を防ぐために使うコレステロールまたはコレステロール代謝関連酵素を阻害する一時的しかも高費用的方式に比べて効果的で簡便に肥満を予防する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の模造ペプチド発現ベクターの構成要素及び構造を示する図表であり、図１ａはリーダーカセットの構造、図１ｂはＬＢカセットの構造、図１ｃはＢＬカセットの構造、それから図１ｄは発現ベクターｐＢＸ４の構造を示するものである。
【図２】模造ペプチド発現ベクターｐＢＸ１及びｐＢＸ４の制作過程を示するものである。
【図３】ＬＢカセットの選別のためのポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）結果を示するものである。
【図４】プラスミドｐＢｌｕｅ−ＢＬに含まれたＢＬカセットＤＮＡを確かめためのＰＡＧＥ結果を示するものである。
【図５】プラスミドｐＢＸ１及びｐＢＸ３で挿入体ＤＮＡのコピー数及び方向を確かめたＰＡＧＥ結果を示するものである。
【図６】発現されたＰＢｌ４ペプチドの確認のためのウェスタンブロッティング結果を示するものである。
【図７】精製されたＰＢｌ４ペプチドを確かめための硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）−ＰＡＧＥ結果を示するものである。
【図８】精製されたＰＢｌ４ペプチドの抗−ＰＢｌ４血清との反応性を確かめたウェスタンブロッティング結果を示するものである。
【図９】マウスでＰＢｌ４ペプチドに対してつくられる抗体の力価を測定した間接酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示するものである。
【図１０】マウスでＰＢｌ４ワクチンの体重増加抑制効果を示するグラフである。
【図１１】図１１ａ及び１１ｂは視床下部摂食中枢傷害薬剤の注射後、ＰＢｌ４ワクチン注射施行可否によるマウスの体重変化を２０週で比べたものである。
【図１２】ＰＢｌ４ワクチン注射がマウスの血清脂質濃度に及ぼず影響を確かめた結果である。
【図１】
2004508029.tif 000004
【図２】
2004508029.tif 000005
【図３】
2004508029.tif 000006
【図４】
2004508029.tif 000007
【図５】
2004508029.tif 000008
【図６】
2004508029.tif 000009
【図７】
2004508029.tif 000010
【図８】
2004508029.tif 000011
【図９】
2004508029.tif 000012
【図１０】
2004508029.tif 000013
【図１１】
2004508029.tif 000014
【図１２】
2004508029.tif 000015
【国際公開パンフレット】
2004508029.tif 000016
2004508029.tif 000017
2004508029.tif 000018
2004508029.tif 000019
2004508029.tif 000020
2004508029.tif 000021
2004508029.tif 000022
2004508029.tif 000023
2004508029.tif 000024
2004508029.tif 000025
2004508029.tif 000026
2004508029.tif 000027
2004508029.tif 000028
2004508029.tif 000029
2004508029.tif 000030
2004508029.tif 000031
2004508029.tif 000032
2004508029.tif 000033
2004508029.tif 000034
2004508029.tif 000035
2004508029.tif 000036
2004508029.tif 000037
2004508029.tif 000038
2004508029.tif 000039
2004508029.tif 000040
2004508029.tif 000041
2004508029.tif 000042
2004508029.tif 000043
2004508029.tif 000044
2004508029.tif 000045
2004508029.tif 000046
2004508029.tif 000047
2004508029.tif 000048
2004508029.tif 000049
2004508029.tif 000050
2004508029.tif 000051
2004508029.tif 000052
2004508029.tif 000053
2004508029.tif 000054
2004508029.tif 000055
2004508029.tif 000056
2004508029.tif 000057
2004508029.tif 000058
2004508029.tif 000059
2004508029.tif 000060
2004508029.tif 000061
2004508029.tif 000062
2004508029.tif 000063
2004508029.tif 000064
2004508029.tif 000065
2004508029.tif 000066
2004508029.tif 000067
2004508029.tif 000068
2004508029.tif 000069
2004508029.tif 000070
2004508029.tif 000071
2004508029.tif 000072
【国際調査報告】
2004508029.tif 000073
2004508029.tif 000074