(57)【要約】本発明は、電気泳動システムを用いて分離された分子種の物理的性質を特定するためのマーカー分子に関する。さらに、本発明は、マーカー分子を調製および使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
セグメントＡ−Ｌ−セグメントＢ
のマーカー分子であり、式中、
セグメントＡは標識された分子であり、
Ｌはリンカーまたは結合であり；および
セグメントＢはタンパク質または核酸である、マーカー分子。
【請求項２】
セグメントＡが少なくとも２つ以上の標識されたアミノ酸を含む、請求項１記載のマーカー分子。
【請求項３】
標識が発色団、発蛍光団、およびＵＶ吸収基からなる群より選択される、請求項１記載のマーカー分子。
【請求項４】
Ｌがペプチド結合である、請求項１記載のマーカー分子。
【請求項５】
標識されたアミノ酸がリジンである、請求項２記載のマーカー分子。
【請求項６】
セグメントＡが約１〜約１００の共有結合したアミノ酸を含む、請求項１記載のマーカー分子。
【請求項７】
セグメントＡが約５〜約５０の共有結合したアミノ酸を含む、請求項１記載のマーカー分子。
【請求項８】
セグメントＡが約１０〜約３０の共有結合したアミノ酸を含む、請求項１記載のマーカー分子。
【請求項９】
セグメントＡが１５の共有結合したアミノ酸を含む、請求項１記載のマーカー分子。
【請求項１０】
セグメントＢが約３，０００ダルトン〜約２５０，０００ダルトンの分子量および約２〜約１２のｐＩを有する、請求項１記載のマーカー分子。
【請求項１１】
２つ以上の請求項１記載のマーカー分子を含む、マーカー分子組成物。
【請求項１２】
２つ以上のマーカー分子が異なる分子量および／または等電点（ｐＩ）を有する、請求項１１記載のマーカー分子組成物。
【請求項１３】
マトリックス内で、試料中に存在する１つまたは複数の分子を分離する方法であり、以下の段階を含む方法：
請求項１１記載のマーカー分子組成物を、１つまたは複数の分子を含む試料に添加する段階、
試料をマトリックスに適用する段階、および
マトリックスを電場にかける段階。
【請求項１４】
試料中に存在する１つまたは複数の分子を分離する方法であり、以下の段階を含む方法：
請求項１１記載のマーカー分子組成物を、１つまたは複数の分子を含む試料に添加する段階、
試料をマトリックスに適用する段階、および
１つまたは複数の分子を分離する段階。
【請求項１５】
以下の段階をさらに含む、請求項１３記載の方法：
マトリックスを電場にかけた後に、分子マーカーを検出する段階、および
標識された分子マーカーの位置と１つまたは複数の分子の位置を比較する段階。
【請求項１６】
マーカー分子を調製する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）分子を標識する段階；および
（ｂ）分子と、既知分子量のタンパク質および／または核酸を連結する段階であり、分子またはタンパク質および／もしくは核酸はα−チオエステルを含み、他方はチオール含有部分を含む段階。
【請求項１７】
以下の段階をさらに含む、請求項１６記載の方法：
（ｃ）異なる分子量およびｐＩの多数の標識されたマーカー分子を得るために、１回または複数回（ａ）〜（ｂ）を繰り返す段階；および
（ｄ）異なる分子量およびｐＩを有する標識されたマーカー分子を組み合わせる段階。
【請求項１８】
チオール含有部分が１−フェニル−２−メルカプトエチル基である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
マーカー分子を調製する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）アミノ末端システイン残基を含む分子を標識する段階；および
（ｂ）分子と、Ｃα−チオエステルを含む既知分子量のタンパク質および／または核酸を連結する段階。
【請求項２０】
以下の段階をさらに含む、請求項１９記載の方法：
（ｃ）異なる分子量およびｐＩの多数の標識されたマーカー分子を得るために、１回またはそれ以上の回数で（ａ）〜（ｂ）を繰り返す段階；および
（ｄ）異なる分子量およびｐＩを有する標識されたマーカー分子を組み合わせる段階。
【請求項２１】
マーカー分子を標識する方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）第１のアミノ酸を固相に取り付ける段階；
（ｂ）該第１のアミノ酸と、ブロック基によって保護された第２のアミノ酸をカップリングさせて、アミノ酸鎖を得る段階であり、該ブロック基はアミノ酸を付加する前に除去される段階；
（ｃ）さらなるアミノ酸を用いた固相合成によって鎖の長さを伸長して、標識されたオリゴペプチドを得る段階であり、該鎖は少なくとも１つの標識されたアミノ酸を含む段階；
（ｄ）標識されたオリゴペプチドを固相から放出する段階；および
（ｅ）標識されたオリゴペプチドと、既知分子量のタンパク質を連結する段階。
【請求項２２】
標識されたオリゴペプチドが、標識で修飾された１、２、またはそれ以上のアミノ酸を含む、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
ブロック基が、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、およびその誘導体からなる群より選択される、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】
１つまたは複数のタンパク質を特徴付ける方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）少なくとも１つの請求項１記載のマーカー分子と共に、マトリックス内で１つまたは複数のタンパク質を電気泳動する段階；
（ｂ）１つまたは複数のタンパク質の移動と少なくとも１つのマーカー分子の移動を比較する段階；および
（ｃ）任意選択的に、１つまたは複数のタンパク質の等電点（ｐＩ）および／または分子量を決定する段階。
【請求項２５】
１つまたは複数の分子を特徴付ける方法であり、以下の段階を含む方法：
（ａ）少なくとも１つの請求項１記載のマーカー分子と共に、マトリックス内で１つまたは複数の分子を分離する段階；
（ｂ）１つまたは複数の分子の移動と少なくとも１つのマーカー分子の移動を比較する段階；および
（ｃ）任意選択的に、１つまたは複数の分子の等電点（ｐＩ）および／または分子量を決定する段階。
【請求項２６】
ゲルが２次元電気泳動ゲルである、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
式：
Ｃｙｓ−Ｙｎ−Ｚ
を有するペプチドであり、式中、
Ｙは、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、および／または非天然アミノ酸からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸であり；
Ｚは、Ｃ末端アミノ酸および／または非天然アミノ酸であり；および
ｎは、１〜１００である、ペプチド。
【請求項２８】
Ｙが１つまたは複数の発色団、発蛍光団、またはＵＶ吸収基で標識されている、請求項２７記載のペプチド。
【請求項２９】
以下の配列：
2004506221.tif 000015
を有する、請求項２７記載のペプチド。
【請求項３０】
以下の配列：
2004506221.tif 000016
を有する、請求項２７記載のペプチド。
【請求項３１】
以下の配列：
2004506221.tif 000017
を有する、請求項２７記載のペプチド。
【請求項３２】
以下の配列：
2004506221.tif 000018
を有する、請求項２７記載のペプチド。
【請求項３３】
以下の配列：
2004506221.tif 000019
を有する、請求項２７記載のペプチド。
【請求項３４】
タグ分子をさらに含む、請求項２７記載のペプチド。
【請求項３５】
タグ分子が、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、ポリヒスチジン、およびその誘導体からなる群より選択される、請求項３４記載のペプチド。
【請求項３６】
少なくとも１つの容器が密に閉じ込められている運搬装置を含むタンパク質マーカーキットであり、第１の容器が少なくとも１つの請求項１記載のマーカー分子を含む、タンパク質マーカーキット。
【請求項３７】
キット成分を使用するための説明書をさらに含む、請求項３６記載のタンパク質マーカーキット。
【請求項３８】
予め成形された電気泳動ゲルをさらに含む、請求項３６記載のタンパク質マーカーキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
発明の分野
本発明は、分子生物学およびタンパク質生化学の分野にある。本発明は、電気泳動システムを用いて分離された分子種の物理的性質を特定するためのマーカー分子に関する。さらに、本発明は、マーカー分子を調製および使用する方法に関する。
【０００２】
背景技術
ゲル電気泳動は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ポリペプチド、およびタンパク質などの生物学的分子を分離するための一般的な手順である。一般的なタンパク質電気泳動法は、電気泳動前に、試料を、負に荷電した界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））で平衡化することを必要とする。これにより、全てのタンパク質が正味の負電荷を帯び、従って、陽極に移動するようになる。核酸は、そのままの状態で電荷を帯びている。ゲル電気泳動において、かけられた電場によって分子が媒体を移動する速度に従って、分子はバンドに分離する。
【０００３】
この技法の一般的に用いられる変形は、ガラス管に封入された水性ゲルまたはガラスプレートもしくはプラスチックプレートの間に板状物として挟まれた水性ゲルからなる。ゲルには穴のあいた分子網状構造があり、この構造は、導電性緩衝塩液をたっぷり含む孔を規定する。ゲルを貫くこれらの孔は、移動高分子の通過をさせるのに十分に大きい。
【０００４】
ゲルは、ゲルと電源の陰極または陽極とを電気的に接触させる緩衝溶液と接触した状態でチャンバー内に入れられる。高分子を含む試料および追跡用色素がゲル上部に入れられる。電位がゲルに加えられ、これにより、試料高分子および追跡用色素は、高分子の電荷に応じて電極の一方に向かって移動する。追跡用色素がゲル末端に達する直前に、電気泳動を止める。次いで、分離された高分子のバンドの位置を決定する。移動度が既知の追跡用色素および高分子と比較して特定のバンドが移動した距離を比較することによって、他の高分子の移動度を決定することができる。次いで、高分子のサイズを計算することができる。または、異なるサイズの高分子をゲル内で分離することができる。
【０００５】
等電点電気泳動（ＩＥＦ）は、ｐＨ勾配において分子種がその等電点（ｐＩ）に移動することに基づいた電気泳動法である。ｐＨ勾配は、通常、ゲルなどの架橋マトリックス内で、ｐＩが異なる多数の種を含む両性電解質溶液を電場にかけることによって確立される。電位差がゲルの端から端まで加えられると、両性電解質を含む媒体に添加された分析物はｐＨ勾配に沿って等電点に移動する。
【０００６】
多くの成分からなる試料の場合、１種類だけの電気泳動次元を使用する時に同時移動する種をさらによく分離するために多次元電気泳動法が用いられてきた。一般的なものとして１つには２次元電気泳動すなわち２Ｄ−Ｅが挙げられる。タンパク質の２Ｄ−Ｅ分析の場合、例えば、試料は、通常、まず最初に、チューブゲルまたはストリップゲル内でｐＨへの各タンパク質の正味の電荷の独特の依存性を利用するＩＥＦによって分画される。次に、ｐＩによって分離されたタンパク質を含むゲルを、チューブゲルの場合、チューブから押し出し、ＳＤＳで平衡化し、スラブゲル（一般的に、ＳＤＳを含む架橋ポリアクリルアミドゲル）の一端に沿って水平に置く。他のＩＥＦ分画法を用いると、非導電性の裏板で支えられたゲル片またはゲル細片をゲル平板の上に直接置くことができる。次いで、電気泳動を第１の次元とは垂直の第２の次元で行い、タンパク質は分子量に基づいて分離する。このプロセスはＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動すなわちＳＤＳ−ＰＡＧＥと呼ばれる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを通る高分子の移動速度は４つの主な要因：ゲルの多孔度；高分子のサイズおよび形状；磁界強度；ならびに高分子の電荷密度によって決まる。これらの４つの要因が正確に制御され、ゲルごとに、試料ごとに再現できることは有効な電気泳動システムにとって重要である。しかしながら、これらの要因はどれもシステムにおけるゲルおよび他の試薬の化学的性質ならびに高分子の特性の多くの変数に影響されやすいので、ゲル間の均一性を維持することは難しい。従って、第１の次元（ＩＥＦ）で十分に分離されない、ほぼ同じ正味の電荷を有するタンパク質は、第２の次元（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）における他の主な要因の変数に従って分離する。これらの２つの分離方法は独立した性質に依存しているので、総分離能は、おおよそ各次元における分離能の積である。
【０００７】
２Ｄ−ＥおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを含む、これらの電気泳動法の多くの実施に必須のものは、分子マーカー標準（すなわち、既知の分子量およびｐＩを有する標準タンパク質分子）である。分子マーカーは、電気泳動システムにおいて、関心対象の未知試料と物理的性質を比較するための基準として用いられる。分子マーカーには非常に多くの用途があるが、ある特定の例として、広いｐＨ範囲の固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）細片を使用した従来の２次元ゲル電気泳動、狭いｐＨ範囲のＩＰＧ細片を使用した重複２次元ゲル電気泳動、独立型ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、担体両性電解質を含むＩＥＦゲル、キャピラリー電気泳動、動電クロマトグラフィーが挙げられる。他の多くのゲル電気泳動形態が当業者に周知である。
【０００８】
従って、未知試料と比較するために、性質が十分に明確な信頼性の高い標準マーカーを有することが望ましい。これは、２Ｄ−Ｅなどの高分離能システムにおいて特に当てはまる。残念なことに、市販の２Ｄ−Ｅ標準（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ），Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，カタログ番号１６１−０３２０；シグマ（Ｓｉｇｍａ），Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，カタログ番号Ｇ０６５３；ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ，カタログ番号１７−０４７１−０１および１７−０５８２−０１）は、主として、限定された範囲のｐＩおよび分子量でしか利用できない、染色されていない天然タンパク質からなる。これらの市販マーカーは２次元ゲルにおいてランダムに分布し、分析物と区別することができない。さらに、様々な薬剤を用いてタンパク質のｐＩおよび分子量を操作すると、電気泳動条件下で鮮明な区画に移動しない、生成物の不均一な混合物が生じる。これは、発色団基を取り付けることによって視覚的に検出可能なタンパク質を作成する従来の技法を用いた時に特に問題である。最新技術では、タンパク質は、タンパク質を反応性薬剤（これは発色団基または他の標識でもよい）で処理することによって標識される。タンパク質は複数の潜在的に反応性の部位（例えば、−ＮＨ２または−ＳＨ基）を有し、全ての部位の完全な反応は決して得られないので、標識反応は生成物の混合物をもたらす。１つのマーカー集団には、利用可能な活性部位の数に応じて様々な数の標識があり得る。この不均一な分子混合物はｐＩおよび分子量が様々にあり、電気泳動条件下でスメアなまたは拡散したバンドまたはスポットを生じる。分子マーカーが厳密でないことは全ての分離法（特に、等電点電気泳動を伴う分離法）に悪影響を及ぼす。結果を視覚化する間のマーカーのスメアまたは不鮮明な外観は、実験データの不明瞭なまたは信頼できない表示につながる。結果として、市販の分離法（特に、電荷および／または分子量に基づいてタンパク質を分離する技法）と適合する高度に均一な目に見える分子マーカーの必要がまだ満たされていない。
【０００９】
発明の概要
本発明は、既知のｐＩおよび分子量を有する、均一な目に見える（好ましくは、色のついた）マーカー分子を調製する方法に関する。さらに、本発明は、有機分子またはペプチドを用いて、一定した再現可能な様式でタンパク質または核酸のｐＩおよび分子量を変える方法に関する。本発明のマーカー分子は、一般的に、電気泳動条件下で細い鮮明なバンドまたはスポットを生じるように分離する。本発明はまた、本発明のマーカー分子を調製する方法およびこれらの分子を使用する方法に関する。
【００１０】
１つの態様において、本発明は、同じｐＩおよび同じ分子量のマーカー分子を含むマーカー分子組成物に関する。別の態様において、本発明は、同じｐＩおよび異なる分子量のマーカー分子を含むマーカー分子組成物に関する。さらに別の態様において、本発明は、異なるｐＩおよび異なる分子量のマーカー分子を含むマーカー分子組成物に関する。さらなる態様において、異なるｐＩおよび同じ分子量を含むマーカー分子組成物に関する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、約２００ダルトン〜約２，０００ダルトン、約３００ダルトン〜約２，５００ダルトン、約３，０００ダルトン〜約２５０，０００ダルトンの分子量、約２〜約１２の等電点（ｐＩ）、および少なくとも１つまたは複数の標識分子を含むマーカー分子に関する。このような標識分子は、発色団、発蛍光団、または紫外線（ＵＶ）吸収基を含んでもよい。標識はまた、ＵＶ吸収部分を含む天然アミノ酸（例えば、トリプトファンおよびチロシンの芳香族基）を導入することによって達成することができる（シムラ（Ｓｈｉｍｕｒａ），Ｋ．ら，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ２１：６０３−６１０（２０００））。別の態様において、本発明は、式：
セグメントＡ−Ｌ−セグメントＢ
のマーカー分子に関する。式中、
セグメントＡは、標識された分子（例えば、天然または合成の分子（有機分子、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、高分子（例えば、炭水化物）、低分子、オリゴペプチド、天然もしくは非天然アミノ酸を含むが、これらに限定されない））、好ましくは、１つまたは複数の発色団、発蛍光団、またはＵＶ吸収基で標識された分子であり；
Ｌは、リンカーまたは結合であり；
セグメントＢは、タンパク質（例えば、未変性タンパク質（ｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）、組換えタンパク質、もしくは合成タンパク質）または核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）である。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、２つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０など）本発明のマーカー分子の集まりを含むマーカー分子組成物に関し、マーカー分子は分子量および／または等電点（ｐＩ）が異なる。
【００１３】
別の態様において、本発明は、標識分子が発色団、発蛍光団、およびＵＶ吸収基からなる群より選択されるマーカー分子に関する。
【００１４】
さらなる態様において、本発明は、ゲル電気泳動システム（例えば、２次元ゲル電気泳動システム）における本発明のマーカー分子の使用に関する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、ゲル電気泳動によって、試料中に存在する１つまたは複数のタンパク質を分離する方法であり、本発明のマーカー分子組成物を、１つまたは複数のタンパク質を含む試料に添加する段階、試料を電気泳動ゲルに適用する段階、および電気泳動ゲルを電場にかける段階を含む方法に関する。さらなる態様において、本発明は、ゲルを電場にかけた後に、１つまたは複数のマーカー分子を検出する段階、および１つまたは複数のマーカー分子の位置と１つまたは複数のタンパク質の位置を比較する段階をさらに含む方法に関する。さらに別の態様において、本発明は、２次元ゲル電気泳動を用いて、試料中に存在する１つまたは複数のタンパク質を分離する方法に関する。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、試料中に存在する１つまたは複数の分子を分離する方法であり、本発明のマーカー分子組成物を、１つまたは複数の分子を含む試料に添加する段階、試料をマトリックスに適用する段階、および１つまたは複数の分子を分離する段階を含む方法に関する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、マーカー分子を調製する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）分子（例えば、既知分子量のポリペプチド）を標識する段階；および
（ｂ）分子とタンパク質または核酸（例えば、既知分子量のタンパク質または核酸）を連結する段階であり、分子またはタンパク質（もしくは核酸）はα−チオエステルを含み、他方はチオール含有部分を含む段階。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、マーカー分子組成物を調製する方法であり、以下の段階をさらに含む方法に関する：
（ｃ）異なる分子量およびｐＩの多数の標識されたマーカー分子を得るために、１回またはそれ以上の回数で（ａ）〜（ｂ）を繰り返す段階；および
（ｄ）異なる分子量およびｐＩを有する標識されたマーカー分子を組み合わせる段階。
【００１９】
１つの態様において、マーカー分子に取り付けられた標識の数は既知である。さらなる態様において、標識の数は少なくとも１であり、一般的に、１またはそれ以上（例えば、１、２、３、４、５など）である。荷電発色団基などの標識は、最終的なマーカー分子のｐＩを変えることができる。スルホン酸基（ｐＫａ １．５）を有する発色団はマーカー分子のｐＩを酸性ｐＨに変え、またはアミノ基を有する発色団はｐＩを塩基性ｐＨに変える。従って、ｐＩは操作することが可能であり、結果として、既知ｐＩのマーカー分子を調製することができる。さらに別の態様において、マーカー分子の集まりは少なくとも１より多く、好ましくは少なくとも２つ以上（例えば、２、３、４、５など）である。
【００２０】
さらなる態様において、本発明は、マーカー分子を調製する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）アミノ末端システイン残基を含む分子（好ましくは、既知分子量の分子）を標識する段階；および
（ｂ）分子と、Ｃα−チオエステルを含む既知分子量のタンパク質または核酸を連結する段階。
【００２１】
さらに別の態様において、本発明は、マーカー分子組成物を調製する方法であり、以下の段階をさらに含む方法に関する：
（ｃ）異なる量およびｐＩの多数の標識されたマーカー分子を得るために、１回またはそれ以上の回数で（ａ）〜（ｂ）を繰り返す段階；および
（ｄ）異なる量およびｐＩの標識されたマーカー分子を組み合わせる段階。
【００２２】
さらなる態様において、本発明は、マーカー分子を標識する方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）第１のアミノ酸を固相に取り付ける段階；
（ｂ）該第１のアミノ酸と、ブロック基によって保護された第２のアミノ酸をカップリングさせて、アミノ酸鎖を得る段階であり、該ブロック基はアミノ酸を付加する前に除去される段階；
（ｃ）さらなるアミノ酸を用いた固相合成によって鎖の長さを伸長して、標識されたオリゴペプチドを得る段階であり、該鎖は少なくとも１つの標識されたアミノ酸を含む段階；
（ｄ）標識されたオリゴペプチドを固相から放出する段階；および
（ｅ）標識されたオリゴペプチドと、既知分子量のタンパク質を連結する段階。
【００２３】
１つの態様において、１、２、またはそれ以上の（例えば、２、３、４、５など）さらなるアミノ酸が標識で修飾される。好ましくは、ブロック基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、およびその誘導体からなる群より選択される。
【００２４】
さらに別の態様において、本発明は、１つまたは複数のタンパク質を特徴付ける方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５、６、８、１０など）本発明のマーカー分子と共に、ゲル内で１つまたは複数のタンパク質（例えば、１、２、３、４、５、６、８、１０など）を電気泳動する段階；
（ｂ）１つまたは複数のタンパク質の移動と少なくとも１つの本発明のマーカー分子の移動を比較する段階；および
（ｃ）任意選択的に、１つまたは複数のタンパク質の等電点（ｐＩ）および／または分子量を決定する段階。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、１つまたは複数の分子を特徴付ける方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５、６、８、１０など）本発明のマーカー分子と共に、マトリックス内で１つまたは複数の分子（例えば、１、２、３、４、５、６、８、１０など）を分離する段階；
（ｂ）１つまたは複数の分子の移動と少なくとも１つの本発明のマーカー分子の移動を比較する段階；および
（ｃ）任意選択的に、１つまたは複数の分子の等電点（ｐＩ）および／または分子量を決定する段階。
【００２６】
さらに別の態様において、本発明は、１つまたは複数の分子を特徴付ける方法であり、以下の段階を含む方法に関する：
（ａ）少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５、６、８、１０など）本発明のマーカー分子と共に、マトリックス内で１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、８、１０など）分子を電気泳動する段階；
（ｂ）１つまたは複数の分子の移動と少なくとも１つの本発明のマーカー分子の移動を比較する段階；および
（ｃ）任意選択的に、１つまたは複数の分子の等電点（ｐＩ）および／または分子量を決定する段階。
【００２７】
１つの態様において、１つまたは複数のタンパク質を分析して、その分子量および／またはｐＩを決定するために、２次元ゲル電気泳動を使用してもよい。別の態様において、マーカー分子は、少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５など）標識されたタンパク質、好ましくは少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５など）本発明の標識されたタンパク質を含んでもよい。
【００２８】
別の態様において、本発明は、式：
Ｃｙｓ−Ｙｎ−Ｚ
を有するペプチドに関し、式中、
Ｙは、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン、または適切な官能基を有する任意の非天然アミノ酸（ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、３−ヒドロキシプロリン、ｃｉｓ−４−フルオロ−Ｌ−プロリン、ジメチルアルギニン、およびホモシステインを含むが、これらに限定されない）からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸であり；少なくとも１つのアミノ酸が発色団、発蛍光団、またはＵＶ吸収基で標識されており、多くの場合、少なくとも２つの（例えば、２、３、４、５など）アミノ酸が標識されており；
Ｚは、Ｃ末端アミノ酸（Ｃαカルボキシル基はアミド官能基を有するように改変されてもよい）または非天然アミノ酸であり；および
ｎは、１〜１００の共有結合したアミノ酸である。１つの態様において、Ｙは、タンパク質に一般的に見出される２０のアミノ酸の１つでない非天然アミノ酸でもよい。さらに、当業者が理解するように、Ｙは、異なるアミノ酸（例えば、前記で列挙したアミノ酸）からなってもよい。別の態様において、Ｚは、前記で列挙した非天然アミノ酸を含む前記で列挙した任意のアミノ酸でもよい。
【００２９】
別の態様において、本発明は、核酸をオリゴペプチドに連結する方法に関する。例えば、チオール含有基（例えば、１−アミノ−２−メルカプトエチル）を核酸の一端に組み込み（例えば、核酸−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−ＳＨ）、その後に、Ｃα−チオエステルを含むオリゴペプチドと連結すると、核酸−オリゴペプチド結合体が形成される。この方法は、例えば、核酸マーカーを構築するのに使用することができる。核酸−ＣＨ（ＮＨ２）−ＣＨ２−ＳＨと、Ｃα−チオエステルを含む標識された高分子または標識された有機低分子との連結は、標識された核酸を形成するのに使用することができる。
【００３０】
キットは、一緒に詰められた複数の成分および試薬を供給することによって、例えば、本発明の方法の作業を迅速化するのに役立つ。さらに、これらのキットの試薬は、方法の精度および信頼性を高めるように、予め測定された単位で供給することができる。本発明のキットは、一般的に、１つのカートン（例えば、ボックス）；１つまたは複数の容器（例えば、ボックス、チューブ、アンプル、広口瓶、またはバッグ）；１つまたは複数の（例えば、１、２、３など）予め成形されたゲルなど；１つまたは複数の（例えば、１、２、３など）緩衝液；およびキット成分を使用するための説明書を含む。
【００３１】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５など）容器が密に閉じ込められている運搬装置を含むマーカー分子キットに関する。ここで、第１の容器は、少なくとも１つの（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０など）本発明のマーカー分子を含む。さらに別の態様において、本発明のマーカー分子キットは、キット成分を使用するための説明書をさらに含む。さらなる態様において、本発明のマーカー分子キットは、１つまたは複数（例えば、１、２、３など）予め成形された電気泳動ゲルをさらに含む。
【００３２】
本発明の他の態様は、当技術分野において周知なもの、以下の図面および発明の説明、ならびに特許請求の範囲を考慮すれば当業者に明らかであろう。
【００３３】
発明の詳細な説明
概して、ゲル電気泳動システム用のマーカー分子を生成するために特定の標識を付加することによってタンパク質を修飾する時、一般的に、タンパク質は、生成物の混合物を生じるように標識に連結される。これらの生成物混合物は、一般的に、様々なｐＩおよび分子量を有する分子を含み、多くの場合、電気泳動条件下でスメアになる。さらに、これらの分子には、特に、このようなマーカーを等電点によって分離しようとする時に分子マーカーに必要とされる精度または均一性がない。従って、マーカー分子を調製する方法は、ランダムではなく１つの部位（例えば、１つのアミノ酸）または少数の位置（例えば、１、２、３、４、もしくは５つの位置）に標識を向けるように、発色団または他の検出可能な基（例えば、目で見える色のついた分子）をマーカー分子に組み込むべきである。
【００３４】
本発明は、
セグメントＡ−Ｌ−セグメントＢ
を含むマーカー分子に関する。式中、
セグメントＡは、標識された分子（例えば、天然または合成の分子（有機分子、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、高分子（例えば、炭水化物）、低分子、オリゴペプチド、天然もしくは非天然アミノ酸を含むが、これらに限定されない））、好ましくは、１つもしくはそれ以上の発色団、発蛍光団、またはＵＶ吸収基で標識された分子であり；
Ｌは、リンカーまたは結合であり；
セグメントＢは、タンパク質（例えば、未変性タンパク質、組換えタンパク質、もしくは合成タンパク質）または核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ポリヌクレオチド）である。例えば、セグメントＢは、既知の分子量のタンパク質（例えば、約２００ダルトン〜約２，０００ダルトン、約３００ダルトン〜約２，５００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約２５０，０００ダルトン、約２，０００ダルトン〜約２５０，０００ダルトン、約３，０００ダルトン〜約２５０，０００ダルトン、１，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトン、約２，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトン、約３，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトン、約４，０００ダルトン〜約１５０，０００ダルトン、約６，０００ダルトン〜約１００，０００ダルトン、約２，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトン、約３，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトン、約８，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの分子量を有するタンパク質）でもよい。マーカー分子は、約０〜約１４、約２〜約１２、約３〜約１１、約４〜約１０、約５〜約９、約６〜約８の既知のｐＩを有する。セグメントＡは、セグメントＢにどちらの向きでも連結されてもよい。
【００３５】
１つの態様において、セグメントＡは、１〜１００の共有結合したアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、１０、３０、５０、７５、１００などの共有結合したアミノ酸または１０〜３０、５〜５０、１５〜４０、２０〜５０、３０〜６０、４０〜７０、５０〜８０、６０〜９０、７０〜１００などの共有結合したアミノ酸）、最も好ましくは１５の共有結合したアミノ酸を含んでもよい。さらなる態様において、セグメントＡのアミノ酸の１、２、またはそれ以上（２、３、４、５など）が標識される。別の態様において、セグメントＡの１つまたは複数のアミノ酸はチロシンまたはトリプトファンである。さらに別の態様において、標識されたアミノ酸はリジンである。さらに別の態様において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）で標識される。
【００３６】
別の態様において、セグメントＢは、約１００ヌクレオチド（ｎｔ）〜約１，０００ｎｔ、約２００ｎｔ〜約２，０００ｎｔ、約３００ｎｔ〜約３，０００ｎｔ、約１，０００ｎｔ〜約５，０００ｎｔ、約３，０００ｎｔ〜約１０，０００ｎｔ、約５，０００ｎｔ〜約２０，０００ｎｔ、約６，０００ｎｔ〜約３０，０００ｎｔ、約１０，０００ｎｔ〜約５０，０００ｎｔ、約２０，０００ｎｔ〜約１００，０００ｎｔ、約５０，０００ｎｔ〜約２００，０００ｎｔ、約７０，０００ｎｔ〜約２５０，０００ｎｔを含んでもよい。
【００３７】
本発明は、さらに、約３００ダルトン〜約３，０００ダルトン、約５００ダルトン〜約４，０００ダルトン、約１，０００ダルトン〜約５，０００ダルトン、約３，０００ダルトン〜約８，０００ダルトン、約５，０００ダルトン〜約１２，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン〜約１５，０００ダルトン、約１２，０００ダルトン〜約１８，０００ダルトン、約１５，０００ダルトン〜約２５，０００ダルトン、約２０，０００ダルトン〜約３０，０００ダルトン、約２５，０００ダルトン〜約４０，０００ダルトン、約３０，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン〜約６０，０００ダルトン、約５０，０００ダルトン〜約８０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン〜約９０，０００ダルトン、約７５，０００ダルトン〜約１１０，０００ダルトン、約９０，０００ダルトン〜約１４０，０００ダルトン、約１１０，０００ダルトン〜約１６０，０００ダルトン、約１３０，０００ダルトン〜約１８０，０００ダルトン、約１４０，０００ダルトン〜約２００，０００ダルトン、約１８０，０００ダルトン〜約２２０，０００ダルトン、または約２００，０００ダルトン〜約２５０，０００ダルトンの分子量を有するマーカー分子を提供する。
【００３８】
本発明は、さらに、約０．５〜約２、約１〜約３、約２〜約４、約３〜約５、約４〜約６、約５〜約７、約６〜約８、約７〜約９、約８〜約１０、約９〜約１１、約１０〜約１２、約１１〜約１３、約１２〜約１３．５、約２〜約６、約３〜約７、約５〜約９、約６〜約１０、約８〜約１２、または約９〜約１３のｐＩを有するマーカー分子を提供する。
【００３９】
別の態様において、本発明は、セグメントＡが、標識された有機分子を含み、Ｌがリンカー結合であり、セグメントＢがペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチドであり、セグメントＡが、セグメントＢの１つの位置だけで結合Ｌを形成することができる、マーカー分子に関する。
【００４０】
さらなる態様において、本発明は、セグメントＡがチオエステルを含み、セグメントＢが１つの１−アミノ−２−メルカプトエチル基を含むマーカー分子に関する。さらに別の態様において、本発明は、標識されたポリペプチドチオエステルまたは標識された有機チオエステルを含むセグメントＡに関する。さらなる態様において、本発明は、１−アミノ−２−メルカプトエチル基を含むタンパク質、ペプチド、またはポリヌクレオチドを含むセグメントＢに関する。さらに別の態様において、本発明は、Ｎ末端アミノ酸システインを含むタンパク質またはペプチドにおける１−アミノ−２−メルカプトエチル基に関する。別の態様において、本発明は、１つの修飾塩基を含むポリヌクレオチドにおける１−アミノ−２−メルカプトエチル基に関する。さらに別の態様において、本発明は、Ｎ末端システインを有するように構築された組換えタンパク質を含むペプチドまたはタンパク質に関する。さらなる態様において、本発明は、酵素反応によって１つの修飾塩基を含む調製されたポリヌクレオチドに関する。別の態様において、本発明は、セグメントＡが１つの１−アミノ−２−メルカプトエチル基を含み、セグメントＢがチオエステルを含むマーカー分子に関する。別の態様において、本発明は、Ｎ末端アミノ基としてアミノ酸システインを有する標識されたポリペプチドを含むセグメントＡに関する。別の態様において、本発明は、１−アミノ−２−メルカプトエチル基を含む有機分子を含むセグメントＡに関する。別の態様において、本発明は、システイニルカルボキシエステルまたはアミドを含むセグメントＡに関する。別の態様において、本発明は、自動ペプチド合成によって構築されたセグメントＡに関する。別の態様において、本発明は、セグメントＡがアルデヒド反応基を含み、セグメントＢが、ポリペプチドまたはタンパク質のＮ末端セリンまたはスレオニンの酸化によって形成されたアルデヒドを含むマーカー分子に関する。別の態様において、本発明は、セグメントＡが、標識されたヒドラゾンを含むマーカー分子に関する。別の態様において、本発明は、Ｌがヒドラジド結合であるマーカー分子に関する。
【００４１】
別の態様において、本発明は、マーカー組成物を調製する方法であり、有機分子を標識する段階、および標識された有機分子を、ペプチド、タンパク質、またはポリヌクレオチドの１つの位置に連結する段階を含む方法に関する。別の態様において、本発明は、マーカー分子を標識する方法であり、第１の標識分子を、タンパク質、ペプチド、またはポリヌクレオチドからなる第２の分子の１つの位置に連結する段階を含む方法に関する。別の態様において、本発明は、マーカー分子の等電点を改変する方法であり、酸性または塩基性のイオン化基を含む第１の標識分子を、タンパク質、ペプチド、またはポリヌクレオチドからなる第２の分子に連結する段階を含む方法に関する。
【００４２】
本明細書で使用する用語「既知のｐＩ」は、マーカー分子およびその組成物に適用される場合、ｐＩが、参照として本明細書に組み入れられるシレロ（Ｓｉｌｌｅｒｏ），Ａ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７９：３１９−３２５（１９８９）およびリベイロ（Ｒｉｂｅｉｒｏ），Ｊ．ら，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０：２３５−２４２（１９９０）に記載の多項式を用いて理論的に計算されるか、実験的に求められることを意味する。
【００４３】
さらなる態様において、リンカーは、ペプチド結合または以下の二官能リンカーの１つを含むが、これらに限定されない。
2004506221.tif 000002
【００４４】
１つの態様において、セグメントＡは、好ましくはかつ詳細には、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、２’７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、ローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、テトラメチルローダミン、またはカルボキシテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）などの発色団、発蛍光団、またはＵＶ吸収基で標識されてもよい。さらなる態様において、セグメントＡは、ビオチン、フルオロセイン、ジゴキシゲニン、ポリヒスチジン、またはその誘導体などの捕捉タグまたは結合タグを含んでもよい。別の態様において、セグメントＡは、１つもしくはそれ以上の酸性アミノ酸（例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸）または１つもしくはそれ以上の塩基性アミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジン）が存在することによってセグメントＢのｐＩを改変するのに使用することができる。別の態様において、スルホン酸を含む荷電した発色団基または発色団の付加もまたｐＩに影響を及ぼす。さらなる態様において、セグメントＡは、タンパク質の共有結合のための反応部位を導入するのに使用することができる。
【００４５】
別の態様において、本発明は、標識されたセグメントＡを、１−アミノ−２−メルカプトエチル基を有するタンパク質、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドに取り付けるための、標識されたチオエステルの使用に関し、ここで、標識されたチオエステルは、１つのアミノ酸チオエステル（例えば、Ｎ−テトラメチルローダミンアミドグリシルチオエステル）でもよい。
【００４６】
さらなる態様において、本発明は、標識を、Ｃ末端チオエステル基を有するタンパク質またはポリペプチドに取り付けるための、標識された１−アミノ−２−メルカプトエチル基の使用に関する。
【００４７】
なおさらなる態様において、本発明は、標識を、酸化した（または酸化可能な）Ｎ末端セリン基またはスレオニン基を有するタンパク質またはポリペプチドに取り付けるための、セグメントＡとしての標識されたヒドラジドおよび他のアルデヒド反応基の使用に関する。
【００４８】
タンパク質は、選択された試薬の標的となり得る官能基を排除または導入するように改変することができる。例えば、タンパク質の一次配列に天然に生じるシステインがなく、そのタンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）クローンが入手可能であれば、１つまたは複数のシステインを導入するように変異誘発を行うことができる。このような改変の手順は当技術分野において周知である（アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら，「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ ８（１９９５））。簡単に述べると、一例では、改変しようとするタンパク質をコードする野生型核酸を、ランダムなウラシル塩基を含む一本鎖バクテリオファージベクターに組み込む。一本鎖核酸を、その位置にあることが所望される新しいアミノ酸をコードする改変部位のコドンを組み込んだ相補的合成オリゴヌクレオチド配列とハイブリダイズさせる。新たな二本鎖配列をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで伸長させ、結果として生じるファージを使用して大腸菌細菌を形質転換する。次いで、当業者に周知の標準的な技法によって、発現タンパク質を単離することができる。
【００４９】
このような手順は、関心対象のアミノ酸を組み込むだけでなく、アミノ酸を置換するのに、および反応部位を排除するのにも使用することができる。例えば、改変に使用できる部位が小数しかないように野生型タンパク質のシステイン基の数を減らすことができる。システイン基は、そのスルフヒドリル側鎖と選択的に反応することができる試薬が多数あるので特に有用である。例として、発色団化合物または市販されている他の標識のマレイミジル誘導体またはヨードアセトアミジル誘導体（例えば、エオシン−５−マレイミド，商品Ｅ−１１８（モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ），Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡから市販されている）；オレゴングリーンヨードアセトアミド，商品Ｏ−６０１０（これもモレキュラープローブスから市販されている）が挙げられる。
【００５０】
他の基も選択的に改変することができる。例えば、標識試薬にあるオキサリル基はアルギニンのアミジノ基と選択的に反応する。すでにシステインについて述べたように、アルギニンを付加または欠失させるためにタンパク質をクローニングすることができる。次いで、このような改変されたタンパク質を選択的に標識することができる。別の例として、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルはタンパク質のリジン基と反応する。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルも広く市販されており、例えば、カルボキシフルオレセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（商品１０４８Ｃとしてリサーチオルガニクス（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ），Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨから入手可能）を含む。標準的なクローニング技法を用いて、所望のようにリジンを選択的に付加または排除することができる。改変のための部位としてのリジンまたはアルギニンの使用はシステインより魅力的なものではない。なぜなら、一般的に、これらの塩基性アミノ酸以外に塩基性アミノ酸があり、その排除は、多くの場合、組換えタンパク質の溶解度の特性およびｐＩを変えるからである。
【００５１】
核酸もまた、本明細書に記載の技法を用いて改変することができる。例えば、修飾塩基（例えば、特に、ビオチン−１６−ｄＵＴＰ、ビオチン−１１−ｄＵＴＰ、およびビオチン−１４−ｄＡＴＰ）を、ＤＮＡのインビトロ合成に用いられる一般的なヌクレオチド三リン酸混合物に添加した時に、このような構成要素を、ポリメラーゼの作用によって標識として組む込むことができることは周知である（アウスベル，Ｆ．Ｍ．ら，「分子生物学の最新プロトコール」，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，３．１８．３（１９９５））。１−アミノ−２−メルカプトエチル基を含むように修飾された塩基を調製し、酵素の作用によってＤＮＡに組み込ませて、セグメントＢを形成することができる。このような標識は、ＤＮＡの複数の部位への修飾塩基の非特異的な組み込みをもたらす。しかしながら、この基は、チオエステルを有するセグメントＡとしての分子または高分子（例えば、図１、３Ａおよび３Ｂに示す）と反応する。そのため、この反応基は、酵素的合成後に標識を核酸に取り付けるのに使用することができる。チオエステルを有する分子としてポリペプチドならびにより小さな分子を挙げることができる。
【００５２】
一例として、Ｎ６−（６−アミノヘキシル）ＡＴＰが市販されている（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））。この化合物は、カルボジイミドで活性化された、ブロックされたシステインに容易に連結して、６−アミノヘキシルシステイニルアミドを形成することができる。脱ブロックされると、この化合物は、前記のようにオリゴヌクレオチドの酵素的合成において使用することができる。結果として生じる１−アミノ−２−メルカプトエチル基はチオエステルと反応し、標識の容易な組み込みを可能にし、チオエステル基を有するオリゴペプチドおよびタンパク質の結合さえも可能にする。このように、プリン塩基およびピリミジン塩基の他の多くの構造類似体を修飾することができる（一例として、ＣＴＰのＮ４位またはグアニンのＮ２位への結合）。１−アミノ−２−メルカプトエチル基を組み込んだヌクレオチド三リン酸の調製に適した修飾塩基（Ｏ４−チアゾリル−ｄＴ−ＣＥ（ＣＥはβ−シアノエチルである）、Ｏ６−フェニル−ｄＩ−ＣＥ、およびＯ４−チアゾリル−ｄＵ−ＣＥなどがあるが、これらに限定されない）は、グレンリサーチ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡおよびトリリンクバイオテクノロジーズ（ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡからも入手することができる。
【００５３】
修飾塩基を核酸に組み込んでセグメントＢを形成する別の方法は、修飾塩基を核酸鎖の末端に付ける方法である。ターミナルヌクレオチドトランスフェラーゼ（インビトロジェン）は、オリゴヌクレオチドをＤＮＡの３’末端に付けるのに使用することができる周知の酵素である（フリキンガー（Ｆｌｉｃｋｉｎｇｅｒ），Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２０：９（１９９２））。この酵素はビオチン化オリゴヌクレオチドを組み込むのに用いられ、あまりかさ高くない側鎖（例えば、チオエステルとアミド結合を形成することができる１−アミノ−２−メルカプトエチル基）で修飾された塩基を容易に組み込む。
【００５４】
標識をＲＮＡに組み込むさらに別の方法は、５’末端に二リン酸基または三リン酸基を有するＲＮＡ転写物の５’末端にＧＭＰを付けるグアニリルトランスフェラーゼ（インビトロジェン）を使用する。修飾されたグアニリル三リン酸を使用すると、チオエステルと連結可能な官能基のＲＮＡへの組み込みを可能にする、１−アミノ−２−メルカプトエチル基を有する塩基が得られる（メルトン（Ｍｅｌｔｏｎ），Ｄ．Ａ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：１８（１９８４））。グアニリルトランスフェラーゼはＧＴＰを交換する性質を有し、そのため、キャップされたｍＲＮＡを、この酵素および１−アミノ−２−メルカプトエチル修飾ＧＴＰとインキュベートすることによって、キャップされたｍＲＮＡをチオエステル反応性塩基で標識することができる。
【００５５】
特定の態様において、本発明は、ゲル電気泳動システム用の均一な分子マーカー組成物を調製するための、以下でさらに説明される、異なる化学連結ストラテジーを提供する。
【００５６】
本明細書で使用する用語「単離された」は、マーカー分子に適用される場合、分子が周囲の汚染物質の実質的に全てから分離されていることを意味する。「周囲の汚染物質」は、マーカー分子の生成に関連している分子（例えば、アミノ酸、カップリングされていないセグメントＡ、カップリングされていないセグメントＢ、副産物など）を含むが、単離プロセスに関連した分子もしくは薬剤、または特定の性質をマーカー分子もしくはマーカー分子を含む組成物に付与する分子もしくは薬剤を含まない。一般的に、周囲の汚染物質であるとみなされない分子の例として、水、塩、緩衝液、およびＨＰＬＣなどのプロセスにおいて用いられる試薬（例えば、アセトニトリル）が挙げられる。従って、例えば、逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってマーカー分子生成に関連した未反応分子から分離されているマーカー分子は、有機溶媒および緩衝液（例えば、アセトニトリルおよび１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）などの１０％精製試薬を含む溶液中に存在しても単離されているとみなされる。マーカー分子が例えば、７５μｇ／ｍｌの濃度で溶液中に存在する時でさえも、このことは当てはまる。さらに、用語「単離された」は、単離されたマーカー分子が汚染物質量と比較して少なくとも９０％純粋であることを意味する。言い換えれば、単離されたマーカー分子は、周囲の汚染物質の少なくとも９０％から分離されている。
【００５７】
本発明は、さらに、単離されたマーカー分子ならびに１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、２０、５０など）単離されたマーカー分子を含む組成物、単離されたマーカー分子を調製する方法、単離されたマーカー分子を含む組成物を調製する方法、単離されたマーカー分子を使用する方法、ならびに１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、２０、５０など）単離されたマーカー分子を含む組成物を使用する方法を含む。本発明はまた、１つまたは複数の単離されたマーカー分子を含む組成物を含む。
【００５８】
本発明のマーカー分子は、任意の数の方法によって単離および／または精製することができる。このような方法の例として、ＨＰＬＣ（例えば、逆相ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、酢酸セルロース電気泳動（ＣＡＥ）、等電点分画、カラムクロマトグラフィー（例えば、アフィニティクロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）、キャピラリーゾーン電気泳動、透析、等電点電気泳動、およびフィールドフローフラクショネーションが挙げられる。
【００５９】
本発明のマーカー分子を単離および／または精製するのに使用することができる装置の一例は、アマシャムファルマシアバイオテク（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．）（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ ０８８５５）のＨｏｅｆｅｒ Ｉｓｏｐｒｉｍｅ等電点精製ユニット（カタログ番号８０−６０８１−９０）である。
【００６０】
化学連結は、脱保護された合成オリゴペプチド、ポリヌクレオチド、有機化合物、高分子、または低分子（セグメントＡと呼ばれる）と、既知の質量および電荷の別の脱保護されたタンパク質（例えば、合成タンパク質、組換えタンパク質、もしくは未変性タンパク質）または修飾核酸（セグメントＢと呼ばれる）との化学選択的な反応を伴う。連結反応は部位特異的であり、他の潜在的に反応する基の存在下で、あるセグメントの１つの部位と別のセグメントの１つの部位との１つの特異的なカップリング反応だけを可能にする。化学連結は、例えば、両方ともポリペプチドである２つのセグメントをつなぐのに有用である。ペプチドは、段階的固相ペプチド合成によって作成することができ、連結ストラテジーに応じてＮ末端システイン（またはＮα−（１−フェニル−２−メルカプトエチル））を有してもよく、Ｃ末端チオエステルを有してもよい。ペプチド鎖への発色団基、酸性基、および塩基性基の組み込みは、ペプチド合成中に、このような基で標識されたアミノ酸を使用することによって達成することができる。
【００６１】
タンパク質の化学連結には本発明において以下の利点がある。
−部位特異的であり、他の反応基の存在下で、あるセグメント（例えば、セグメントＡまたはセグメントＢ）のＣαと別のセグメント（例えば、セグメントＡまたはセグメントＢ）のＮαとの１つの特異的なカップリング反応だけを可能にする。
−１種類の生成物しか生成しない。
−結果として生じる生成物は既知のｐＩおよび既知の分子量を有する。これらのパラメータは理論的および実験的に求めることができる。
−一定した再現可能な様式で、発色団および発蛍光団を用いたタンパク質標識を可能にする。
−一定した再現可能な様式で、発色団および発蛍光団を用いた核酸標識を可能にする。
−タンパク質のｐＩを変えるのに使用することができる。セグメントＡへの荷電アミノ酸残基または荷電発色団基の組み込みは最終タンパク質生成物のｐＩを変える。例えば、アルギニンのグアニジノ基（ｐＫａ＞１２）は生成物のｐＩを塩基性ｐＨに移すが、スルホン酸基（ｐＫａ＝１．５）を有する発色団は生成物のｐＩを酸性ｐＨに移す。他の荷電発色団または荷電アミノ酸は同様の効果を有する。
−タンパク質の分子量の操作を可能にする。例えば、３０残基のオリゴペプチド（セグメントＡ）は、連結するとアミノ酸配列に応じてタンパク質（セグメントＢ）の分子量を約３．０ダルトン（ｋＤ）増加させる。
−タンパク質へのタグの組み込みを可能にする。合成ペプチドにビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、ポリヒスチジンなどのタグを付加し、その後に、このペプチドをタンパク質に連結することによって、タグ化タンパク質が生成される。このタグ化ストラテジーは精製を容易にするために使用することができる。
−一定した再現可能な様式で、標識されたオリゴペプチドへのポリヌクレオチドの連結を可能にする。
【００６２】
本発明において、タンパク質（セグメントＢ）のＮ末端アミノ酸またはＣ末端カルボキシレートに応じて、セグメントＡをセグメントＢに取り付けるために、自然の化学連結（ｎａｔｉｖｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｌｉｇａｔｉｏｎ）、インビトロ化学連結、または部位特異的修飾などの連結ストラテジーを使用することができる。
【００６３】
特定の局面において、本発明は、１）セグメントＡおよびＢの合成、２）分子マーカーを形成するためのセグメントＡとセグメントＢとの連結、および／または３）分子量および等電点マーカーとしての分子量マーカーの使用を提供する。
【００６４】
自然の化学連結
自然の化学連結は、チオエステルを含む高分子または低分子（セグメントＡ）と、Ｎ末端システインまたはＮα−（１−フェニル−２−メルカプトエチル）基を有するタンパク質（例えば、未変性タンパク質、組換えタンパク質、または合成タンパク質） （セグメントＢ）との連結を伴う。一般的に、望ましい末端を有する組換えタンパク質は、好ましくは翻訳後修飾がほとんどないか、または全くないように原核生物発現系において産生される。未変性タンパク質は適切な末端を有する限り適している。１−フェニル−２−メルカプトエチルなどの補助基とＮ末端アミノ基とのカップリングは、転写後、全ての活性のある側鎖がブロックされている時に行われる。
【００６５】
セグメントＡとして適しているペプチドは、高度に最適化された段階的固相ペプチド合成などの固相合成法によって調製することができる（ケント（Ｋｅｎｔ），Ｓ．Ｂ．Ｈ．ら，米国特許第６，１８４，３４４号Ｂ１；ダウソン（Ｄａｗｓｏｎ），Ｐ．Ｅ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：７７６−７７９（１９９４）；ルー（Ｌｕ），Ｗ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８５１８−８５２３（１９９６）；トルバート（Ｔｏｌｂｅｒｔ），Ｔ．Ｊ．ら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ １２２（２３）：５４２１−５４２８（２０００）；およびスイネン（Ｓｗｉｎｅｎ），Ｄ．ら，Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ．２：２４３９−２４４２（２０００））。
【００６６】
固相化学合成は、個々のアミノ酸からポリペプチドを系統立てて構築するための技法である。ブロックされた以下のようなアミノ酸（例えば、α−アミノ基を有するアミノ酸）を固相化学合成において使用することができる：アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン。未変性タンパク質において一般的に見られる２０のアミノ酸以外のアミノ酸も固相合成によってタンパク質に組み込むことができ、本発明のマーカー分子を調製するのに使用することができる。このような非天然アミノ酸の例として、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、３−ヒドロキシプロリン、ｃｉｓ−４−フルオロ−Ｌ−プロリン、ジメチルアルギニン、ホモシステイン、２−メチルバリンの鏡像異性体形態およびラセミ形態、２−メチルアラニン、（２−ｉ−プロピル）−β−アラニン、フェニルグリシン、４−メチルフェニルグリシン、４−イソプロピルフェニルグリシン、３−ブロモフェニルグリシン、４−ブロモフェニルグリシン、４−クロロフェニルグリシン、４−メトキシフェニルグリシン、４−エトキシフェニルグリシン、４−ヒドロキシフェニルグリシン、３−ヒドロキシフェニルグリシン、３，４−ジヒドロキシフェニルグリシン、３，５−ジヒドロキシフェニルグリシン、２，５−ジヒドロフェニルグリシン、２−フルオロフェニルグリシン、３−フルオロフェニルグリシン、４−フルオロフェニルグリシン、２，３ジフルオロフェニルグリシン、２，４−ジフルオロフェニルグリシン、２，５−ジフルオロフェニルグリシン、２，６−ジフルオロフェニルグリシン、３，４−ジフルオロフェニルグリシン、３，５−ジフルオロフェニルグリシン、２−（トリフルオロメチル）フェニルグリシン、３−（トリフルオロメチル）フェニルグリシン、４−（トリフルオロメチル）フェニルグリシン、２−（２−チエニル）グリシン、２−（３−チエニル）グリシン、２−（２−フリル）グリシン、３−ピリジルグリシン、４−フルオロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、２−ブロモフェニルアラニン、３−ブロモフェニルアラニン、４−ブロモフェニルアラニン、２−ナフチルアラニン、３−（２−キノイル）アラニン、３−（９−アントラセニル）アラニン、２−アミノ−３−フェニルブタン酸、３−クロロフェニルアラニン、３−（２−チエニル）アラニン、３−（３−チエニル）アラニン、３−フェニルセリン、３−（２−ピリジル）セリン、３−（３−ピリジル）セリン、３−（４−ピリジル）セリン、３−（２−チエニル）セリン、３−（２−フリル）セリン、３−（２−チアゾリル）アラニン、３−（４−チアゾリル）アラニン、３−（１，２，４−トリアゾール−１−イル）−アラニン、３−（１，２，４−トリアゾール−３−イル）−アラニン、ヘキサフルオロバリン、４，４，４−トリフルオロバリン、３−フルオロバリン、５，５，５−トリフルオロロイシン、２−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸、３−クロロアラニン、３−フルオロアラニン、２−アミノ−３−フ��オロ酪酸、３−フルオロノルロイシン、４，４，４−トリフルオロスレオニン、Ｌ−アリルグリシン、ｔｅｒｔ−ロイシン、プロパルギルグリシン、ビニルグリシン、Ｓ−メチルシステイン、シクロペンチルグリシン、シクロヘキシルグリシン、３−ヒドロキシノルバリン、４−アザロイシン、３−ヒドロキシロイシン、２−アミノ−３−ヒドロキシ−３−メチルブタン酸、４−チアイソロイシン、アシビシン、イボテン酸、キスカル酸、２−インダニルグリシン、２−アミノイソ酪酸、２−シクロブチル−２−フェニルグリシン、２−イソプロピル−２−フェニルグリシン、２−メチルバリン、２，２−ジフェニルグリシン、１−アミノ−１−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−１−シクロペンタンカルボン酸、１−アミノ−１−シクロヘキサンカルボン酸、３−アミノ−４，４，４−トリフルオロ酪酸、３−フェニルイソセリン、３−アミノ−２−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸、３−アミノ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸、３−アミノ−３−（４−ブロモフェニル）プロピオン酸、３−アミノ−３−（４−クロロフェニル）プロピオン酸、３−アミノ−３−（４−メトキシフェニル）プロピオン酸、３−アミノ−３−（４−フルオロフェニル）プロピオン酸、３−アミノ−３−（２−フルオロフェニル）プロピオン酸、３−アミノ−３−（４−ニトロフェニル）プロピオン酸、および３−アミノ−３−（１−ナフチル）プロピオン酸が挙げられる。従って、本発明は、タンパク質において一般的に見られる２０のアミノ酸以外の１つまたは複数のアミノ酸を含むマーカー分子を含む。
【００６７】
ペプチドの固相化学合成において、アミノ酸は、ポリペプチド鎖にＣ末端からＮ末端の方向へ１つずつ共有結合される。Ｃ末端アミノ酸は、一般的に、架橋ポリスチレン樹脂または他の適切な不溶性支持体などの固体支持体にカップリングされる。典型的な例として、アミノ酸は、まず最初に樹脂リンカー、次に先に付加されたアミノ酸に系統立てて付加される。成長している鎖に付加される各アミノ酸は、１サイクルで多くのアミノ酸が鎖に付加しないようにα−アミノ基で化学的にブロックされていなければならない。一般的なブロッキング剤として、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、アセトアミドメチル、アセチル、アダマンチルオキシ、ベンゾイル、ベンジル、ベンジルオキシ、ベンジルオキシカルボニル、ベンジルオキシメチル、２−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシ、ｔ−ブトキシメチル、ｔ−ブチル、ｔ−ブチルチオ、２−クロロベンジルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシ、２，６−ジクロロベンジル、４，４’−ジメトキシベンズヒドリル、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル、２，４−ジニトロフェニル、ホルミル、メシチレン−２−スルホニル、４−メトキシベンジル、４−メトキシ−２，３，６−トリメチル−ベンゼンスルホニル、４−メトキシトリチル、４−メチルトリチル、３−ニトロ−２−ピリジンスルフェニル、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル、タシル、トリフルオロアセチル、トリメチルアセトアミドメチル、トリチル、キサンチル、および当業者に周知の他のものが挙げられる。このようなブロックされたアミノ酸は、シグマ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手することができる。従って、アミノ酸付加の各サイクルは、一般的に、脱ブロック段階、その後のアミノ酸カップリング段階を必要とする。選択されたアミノ酸を系統立ててカップリングしてポリペプチド鎖を形成した後に、α−トルエンチオールまたは他の適切な溶媒などの薬剤を添加することによって、樹脂リンカーからペプチドを放出することができる。さらに、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、アフィニティクロマトグラフィー、または等電点分画などの精製技法によって、ペプチドを回収することができる。
【００６８】
適切なセグメントＡの調製の一例において、最初のアミノ酸は、チオエステル化によってポリエステルビーズに取り付けられ、ＦＭＯＣ基によって保護されたグリシンである。構成要素アミノ酸はＮα−Ｆｍｏｃ− Ｎε−ＴＭＲ−リジン（これもＦＭＯＣによってブロックされている）であり、モレキュラーブローブス（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，カタログ番号Ｆ−１１８３０）を含む多くの供給業者から入手することができる。ペプチド合成間の不要な反応を妨げるために、ブロック基が存在する。まず最初に、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）などの薬剤を用いてブロック基を除去し、次いで、新たに遊離したアミノ基が次の構成要素アミノ酸とペプチド結合を形成できるようにすることによって、ペプチドの伸長が起こる。樹脂リンカーの伸長後に、Ｎ末端グリシンを付加し、グレッグ・Ｔ・ヘルマンソン（Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）（「バイオコンジュゲートテクニック（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１５９頁（１９９６））によって述べられたように、ペプチドを０．１Ｍリン酸ナトリウム中で２−イミノビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（カルバイオケム−ノババイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ），Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，カタログ番号４０１７７８から入手可能）で処理することによってペプチド回収のためにイミノビオチンで標識することができる。α−トルエンチオールで切断した後に、ＲＰ−ＨＰＬＣなどのプロセスによって粗チオエステルペプチドを精製することができる（図１）。前記の連続的なかつ厳しく制御されたアプローチによるセグメントＡの合成は、特異的に標識されたペプチドの均一な集団をもたらす。前記のような本発明の方法は、予め決められた数の荷電した基および／または発色団の基をアミノ酸配列に連続的に導入して、Ｃ末端チオエステルを有するセグメントＡを形成するのに使用することができ、当業者によって容易に実施することができる。
【００６９】
別の態様において、セグメントＡは、以下の式：
Ｃｙｓ−Ｙｎ−Ｚ
を有してもよく、式中、
Ｙは、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリン、または非天然アミノ酸（例えば、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、３−ヒドロキシプロリン、ｃｉｓ−４−フルオロ−Ｌ−プロリン、ジメチルアルギニン、およびホモシステイン）からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸であり、少なくとも１つのアミノ酸が、発色団、発蛍光団、またはＵＶ吸収基で標識されており、好ましくは、少なくとも２つのアミノ酸が標識されており；
Ｚは、Ｃ末端アミノ酸であり（Ｃα−カルボキシル基がアミド官能基を有するように改変されてもよい）；および
ｎは、１〜１００の共有結合したアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、１０、３０、５０、７５、１００などの共有結合したアミノ酸、もしくは１０〜３０、５〜５０、１５〜４０、２０〜５０、３０〜６０、４０〜７０、５０〜８０、６０〜９０、７０〜１００の共有結合したアミノ酸）、および／または１４の共有結合したアミノ酸である。別の態様において、Ｚは、非天然アミノ酸（例えば、本明細書で示された非天然アミノ酸）を含む前記で列挙した任意のアミノ酸でよい。別の態様において、ペプチドは、化学合成、好ましくは固相化学合成を介して調製される。さらなる態様において、アミノ酸は、特に、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）で標識される。なおさらなる態様において、標識されたアミノ酸はリジンである。別の態様において、Ｎ末端がシステインの標識されたペプチドと、α−チオエステルを有する分子量が既知のタンパク質を連結することができる。連結は、自然の化学連結またはインビトロ化学連結を介して行われる。さらなる態様において、結果として生じる連結反応生成物は、既知の分子量およびｐＩのタンパク質マーカーである。
【００７０】
さらなる態様において、本発明は、タグ分子をさらに含む本発明のポリペプチド、タンパク質、およびマーカー分子に関する。別の態様において、タグ分子は、ビオチン、フルオレセイン、ジゴキシゲニン、ポリヒスチジン、およびその誘導体からなる群より選択される。タグに結合することができるリガンド（例えば、アビジン（ビオチンに結合する）、抗体（フルオレセインまたはジゴキシゲニンに結合する）、レクチン（糖に結合する）、またはキレート化金属イオン（ポリヒスチジンに結合する））を用いてタンパク質精製を容易にするために、タグ分子を使用することができる。別の態様において、ポリヒスチジンは、２〜１０の連続したヒスチジン残基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の連続したヒスチジン残基）を含む。タグはまた、以下の式：
Ｒ１−（Ｈｉｓ−Ｘ）ｎ−Ｒ２
を有するアミノ酸配列を含むペプチドタグでもよい。式中、（Ｈｉｓ−Ｘ）ｎは、金属キレート化ペプチドであり、ｎは、２〜１０の数字（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）であり、Ｘは、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるアミノ酸である。さらに、Ｒ２は、金属キレート化ペプチドに共有結合されたポリペプチドであり、Ｒ１は、水素または１つもしくはそれ以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、５０、６０など）アミノ酸残基である。この種のタグは、全ての開示が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第５，５９４，１１５号に記載されている。
【００７１】
セグメントＢは、任意のＮ末端システイン含有タンパク質（例えば、合成タンパク質、組換えタンパク質、または未変性タンパク質）でもよく、好ましくは、既知の分子量およびｐＩのＮ末端システイン含有タンパク質である。Ｎ末端システインを有する組換えタンパク質は、多くの大腸菌発現ベクターのいずれか１つを用いて調製することができる。大腸菌発現ベクターは、ｐＢＡＤ／Ｔｈｉｏ−ＴＯＰＯ（登録商標）（インビトロジェン）、ｐＥＴ（インビトロジェン）、ｐＴＷＩＮ（ニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ））、ｐＴＹＢ（ニューイングランドバイオラボ）、および当技術分野において周知の他のものなどがあるが、これらに限定されない。
【００７２】
セグメントＡとセグメントＢとの連結：連結反応は、全ての開示が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第６，１８４，３４４号Ｂ１のケント（Ｋｅｎｔ）の最適化されたプロトコールに従って行うことができる（図２）。
【００７３】
第１の反応は、例えば、１％トルエンチオールおよび５％チオフェノールの存在下で６Ｍグアニジン塩酸塩（ＨＣｌ）（ｐＨ７．５）中での、セグメントＢのＮ末端システインとセグメントＡ（１．５当量）のＣ末端チオエステルとの化学選択的反応である。セグメントＡのα−カルボニルチオエステルは、セグメントＢのＮ末端にあるシステイン残基による求核攻撃を受け、それによりチオエステル中間体が生じる。結果として生じるチオエステルで連結された中間体は近傍アミンへの自発的分子内アシル転移を受け、ペプチド結合を形成する（図２）。完了するまで（例えば、２４時間）反応を続け、結果として生じた生成物を、例えば、アフィニティクロマトグラフィーによって精製する。
【００７４】
別の態様において、セグメントＡは、ＴＭＲで標識された有機チオエステルでもよい（図３Ａを参照のこと）。トリエチレンテトラミン（ＴＲＥＮ，アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ），Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，カタログ番号９０４６２）から入手可能）を、３．５当量のカルボキシテトラメチルローダミン（ＴＭＲ）活性化エステル（モレキュラーブローブス，ＯＲ（カタログ番号ｅ−６１２３）から入手可能）でアシル化すると、（ＴＭＲ）３−ＴＲＥＮ ５が形成される。Ｎα−Ｆｍｏｃ−リジンを２−イミノビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ビオチン−ＮＳエステル）でアシル化すると、Ｎε−Ｆｍｏｃ−Ｎα−ビオチン−リジン６が生成される。図３Ａおよび３Ｂを参照のこと。６のα−アミノ基を脱ブロックし、その後に、ブロモアセチルクロリドでアシル化すると、Ｎε−ブロモアセトアミド− Ｎα−ビオチニル−リジン８が形成される。８とα−トルエンチオールとのカルボジイミドカップリングによって９が得られる。ヨウ化ナトリウムの存在下で５をチオエステル９でアルキル化すると、第４級アンモニウム塩１０（セグメントＡ）が生成され、前記と同じ条件下で１０とセグメントＢをカップリングすることによって１１（発色団対タンパク質比＝３）が得られる。
【００７５】
さらなる態様において、セグメントＡは、大きな消衰係数を有する発色団（例えば、図３Ｂに示されるようなテトラメチルローダミン（ＴＭＲ））で標識された合成有機分子でもよい。１−［（３−ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド、ヨウ化メチル、およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ，アルドリッチ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，カタログ番号３３，２４５−３から入手可能）の存在下で、Ｎ−Ｂｏｃ−８−ヘプタン酸１２とα−トルエンチオールが反応すると、対応するチオベンジルエステルが生成される（図３Ｂ）。ＴＦＡの存在下で１３のアミノ基を脱保護し、その後に、１４とＴＭＲのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルをカップリングすることによって、Ｎ−ＴＭＲ−８−ヘプタン酸のベンジルチオエステル誘導体１５が生成される。チオエステル１５（セグメントＡ）と、Ｎ末端システインを有する組換えタンパク質（セグメントＢ）との反応によって、透析によって精製することができるＴＭＲ−タンパク質１６（発色団対タンパク質比＝１）が形成される。
【００７６】
別の態様において、セグメントＢは、以下の式：
システイン−オリゴヌクレオチド
を有してもよい。水溶性カルボジイミド（例えば、ＥＤＣ）の存在下で、Ｎα−（６−アミノヘキシル）ＡＴＰとＮ−α−ｔ−Ｂｏｃ−Ｓ−トリチル−Ｌ−システインをカップリングすることによって、Ｎ−α−ｔ−Ｂｏｃ−Ｓ−トリチル−６−アミノヘキシルシステイニルアミドが形成される。トリフルオロ酢酸およびトリイソプロピルシランの存在下でＮ−α−ｔ−Ｂｏｃ−Ｓ−トリチル−６−アミノヘキシルシステイニルアミドを脱ブロックすることによって、システイン−オリゴヌクレオチド（セグメントＢ）を生成するようにオリゴヌクレオチド鎖に酵素的に付加できるシステイン−ＡＴＰが形成される。チオフェノールおよびトルエンチオールの存在下で、発色団、発蛍光団、およびＵＶ吸収基で標識された、Ｃα−チオエステルを有するオリゴペプチドを、システイン−オリゴヌクレオチドセグメントに連結すると、標識されたオリゴペプチド−オリゴヌクレオチドが形成される。
【００７７】
インビトロ化学連結
この方法は、セグメントＡ（これは、Ｎα−システインもしくはＮα−（１−フェニル−２−メルカプトエチル）を有する標識された分子、または標識されており、システイン残基（そのカルボキシル基を介して標識される）に１−アミノ−２−メルカプトエチル部分を含む有機低分子である）と、Ｃ末端チオエステルを有する組換えタンパク質との連結を伴ってもよい（エバンス（Ｅｖａｎｓ），Ｊｒ．，Ｔ．Ｃ．，ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８３５９−８３６３（１９９９））。しかしながら、本発明は、Ｎ末端システインを有する分子に限定されない（ロー（Ｌｏｗ），Ｄ．Ｗ．，ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９８：６５５４−６６５５（２００１））。従って、Ｎαに連結された除去可能な部分を形成するように、Ｎ末端システインを含まない分子を改変することができる（キャン（Ｃａｎｎｅ），Ｌ．ら，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：５８９１−５８９６（１９９６））。特定の態様において、チオールを含む除去可能な補助部分（例えば、１−フェニル−２−メルカプトエチル）がＮ末端に付けられた任意の合成ペプチドをセグメントＡとして使用してもよい。ペプチド結合が形成した後、適切な脱ブロック試薬の存在下で補助基を除去することができる。図９を参照のこと。別の態様において、１−アミノ−２−メルカプトエチル基を含む任意の標識された有機分子をセグメントＡとして使用してもよい。特定の態様において、標識されたシステインをセグメントＡとして使用することができる。
【００７８】
セグメントＢは、Ｃ末端チオエステルを有するタンパク質（例えば、未変性タンパク質、組換えタンパク質、もしくは合成タンパク質）または核酸でもよい。さらなる態様において、関心対象のタンパク質のＣ末端に遺伝的に融合されたＭｘｅ ＧｙｒＡインテインを発現させるために、２つの改変されたミニインテインＳｓｐ ＤｎａＢおよびＭｘｅ ＧｙｒＡを有する市販のｐＴＷＩＮ１発現プラスミド（例えば、ＩＭＰＡＣＴ（ニューイングランドバイオラボ））を使用してもよい。（例えば、Ｍｘｅ ＧｙｒＡの下流に配置されたキチン結合ドメイン（ＣＢＤ）を介した）融合タンパク質の親和性精製後に、標的タンパク質は自発的に放出されて、外部チオール（例えば、エタンチオール、ｎ−ブタンチオール、または２−メルカプトエタンスルホン酸（ＭＥＳＮＡ））による処理によってチオエステルを形成することができる。インテインおよびその使用は、全ての開示が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第５，８３４，２４７号に記載されている。ＩＭＰＡＣＴベクターは、Ｃ末端チオエステルと共にマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ＭｃｒＢ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント、Ｂａｍ ＨＩ、Ｂｇ ｌＩＩ、ＣＤＫ２、ＣａｍＫ ＩＩ、および大腸菌ＲＮＡポリメラーゼ、ならびにこれらのタンパク質の変形を発現させるのに使用されている。
【００７９】
セグメントＡとセグメントＢとの連結：まず最初に、目で見える色のついたタンパク質マーカーを作成するインビトロ化学連結の実現可能性を一連のモデル反応において調べた。４０４アミノ酸長の大腸菌マルトース結合（ＭＢＰ）のアミノ酸１−９２に対応する組換え断片を、インテイン−ＣＢＤと遺伝的に融合させた。この遺伝子は、Ｃ末端に配列Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｍｅｔを付けるようにＤＮＡレベルで改変された。この付加は、インテインからの標的タンパク質（ＭＢＰ−９５ａａ）のインビトロ切断を改善するために、ならびに連結反応を促進するために行った。固定化されたインテイン−融合構築物のＭＥＳＮＡへの暴露は切断を誘導することが示されており、これは本発明の系において確かめられた。標的タンパク質はＭＢＰ−９５ａａ−ＣＯ−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＳＯ３Ｎａとして溶出され、質量分析（ＭＳ）およびＳＤＳゲルによって特徴付けられた。次いで、固定化された構築物は、Ｎ末端システインを含む、発色団で標識された短い合成ペプチド（Ｃｙｓ−Ｌｙｓ（フルオレセイン）−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ（フルオレセイン）−Ｌｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ）（配列番号：１）に化学的に連結できるかどうかが評価された。キチンビーズを１．０ｍＭペプチドおよび３０ｍＭ ＭＥＳＮＡに４℃で一晩暴露することによってＭＢＰ−１０７ａａ−（フルオレセイン）２が生成され、これは質量分析によって特徴付けられた。ＭＢＰ−９５ａａ（１０．６ｋＤ、ｐＩ ５．１２）は、トリブチルホスフィン、トルエンチオール、およびチオフェノールの存在下で、室温、３７℃、および５０℃で、
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で処理された（図８）。生成物はＲＰ−ＨＰＬＣによって精製され、ＭＡＬＤＩ／ＭＳによって特徴付けられた（１３．０ｋＤ、ｐＩ ４．７５）。組換えタンパク質を用いたインビトロ化学連結は報告されている（ムイル（Ｍｕｉｒ），Ｔ．Ｗ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：６７０４−６７１０（１９９８））。
【００８０】
部位特異的修飾
部位特異的修飾は、ペプチドまたは有機分子と、Ｎ末端セリンまたはスレオニンを有するタンパク質との結合を伴ってもよい。この方法は、ゲオゲガン（Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ），Ｋ．Ｆ．およびストロー（Ｓｔｒｏｈ）Ｊ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）に記載されている。
【００８１】
図６に示すさらなる態様は、ペプチドまたは有機分子と、Ｎ末端セリンまたはスレオニンを有するタンパク質との結合を規定する。これらのＮ末端アミノ酸のヒドロキシ基は過ヨウ素酸塩（アルドリッチ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩから入手可能）の存在下で酸化されて、アルデヒド１７（セグメントＢ）を形成する。セグメントＡは、オリゴペプチドまたは合成有機分子（例えば、カルボキシル官能基を有する８−アミノカプリル酸、７−アミノヘプタン酸、および６−アミノヘキサン酸（１８））から調製される。ペプチドのＣαまたは有機分子のカルボキシル基をエステル化し、その後に、ヒドラジンに暴露すると、ヒドラジド１９が形成される。例えば、ゲオゲガンのプロトコール（ゲオゲガンＫ．Ｆ．およびストローＪ．Ｇ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２））を用いて、セグメントＡとセグメントＢをカップリングすると、対応するヒドラゾン２０が形成され、２０はシアノボロ水素化ナトリウムの存在下で還元されて、より安定な生成物２１を生成することができる。発色団標識は、合成間にセグメントＡに導入することができる。従って、結果として生じた生成物は目で見える色がついている。この手順は、Ｎ末端に反応基を作成するために、セグメントＢのタンパク質を傷つける可能性のあるオキシダントの使用を必要とするので、ネイティブなペプチド連結手順またはインビトロ化学連結手順を使用することより好ましくない。
【００８２】
本発明のマーカー分子およびマーカー分子組成物は、（例えば、サイズ、ｐＩ、または他の物理的性質もしくは化学的性質によって）高分子を分離するために一般的に用いられるどのシステムにおいても標準として使用することができる。マーカー分子およびマーカー分子組成物をマトリックスに添加し、マトリックスを通って分子マーカーを移動させる電磁場に暴露することができる。このようなマトリックスの例として、アガロース、架橋ポリアクリルアミドゲル、架橋デキストラン、ＤＥＡＥ−セルロース、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌなどが挙げられるが、これらに限定されない。マトリックスは、どんな形態または形状、サイズまたは多孔度であってもよい。形状として、スラブ、ブロック、チューブ、カラム、膜などが挙げられる。マトリックスは多数の添加物を含んでもよい。添加物として、変性剤および緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。別の態様において、マーカー分子およびマーカー分子組成物は、キャピラリー電気泳動のマーカーとして使用することができる。別の態様において、マーカー分子およびマーカー分子組成物は、他の任意の方法によって高分子を分離する時に標準として用いられる。このような方法として、カラムクロマトグラフィー、密度勾配遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーなどが挙げられる。
【００８３】
特に、本発明のマーカー分子は、以下に記載のようなゲル電気泳動システムにおいて使用することができる。かなりの数のゲル電気泳動分離システムが当技術分野において周知である。さらに、これらのシステムは、分離される分子に関連した様々な性質によって分子を分離するように働く。さらに、（１）単一のゲル電気泳動システムまたは（２）異なるゲル電気泳動システムにおいて分子を分離するように複数の分離原理を組み合わせることができる。言い換えると、分子は、１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６など）性質に基づいて分子を分離する一次元ゲルシステムにおいて互いと分離してもよく、分離プロセスの各段階が１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６など）性質に基づいて分子を分離する２次元ゲルを用いて互いと分離してもよい。一般的に、２次元ゲルシステムを使用する場合、分子は、少なくとも１つの異なる性質（例えば、第１の次元では電荷、第２の次元では分子量）に基づいて２つの次元のそれぞれで分離される。本発明のマーカー分子は、１次元ゲル電気泳動システムおよび２次元ゲル電気泳動システムにおいて使用することができる。
【００８４】
前記のように、ゲル電気泳動システムは様々な性質に基づいて分子を分離することができる。これらの性質の例として、分子量、等電点、および分子が界面活性剤（例えば、非イオン界面活性剤）に結合する能力、ならびにこれらの性質の組み合わせが挙げられる。さらに、本発明のマーカー分子を使用することができるゲル電気泳動システムの例として、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、酸−尿素ゲル電気泳動、１つまたは複数の界面活性剤（例えば、ＴＲＩＴＯＮ Ｘ−１００（商標）、デオキシコール酸ナトリウム、ＮＯＮＩＤＥＴ Ｐ−４０（商標）などの１つまたは複数の非イオン界面活性剤）の存在下で行われる酸−尿素ゲル電気泳動、および等電点電気泳動が挙げられる。本発明のマーカー分子は、例えば、１次元ゲル電気泳動システム、２次元ゲル電気泳動システム、キャピラリー電気泳動システム、および動電クロマトグラフィーシステム、ならびに他のゲル電気泳動システムなどの電気泳動システムと共に使用することができる。
【００８５】
１つの局面において、本発明は、均一な分子量のマーカー分子、ならびに分子量が異なる１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、２０、５０など）マーカー分子を含む組成物を含む。これらのマーカー分子は、分子量に基づいて分子を分離するゲル電気泳動システムとの使用に特に適している。主として分子量に基づいて分子を分離するゲル電気泳動システムとして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥシステム（ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ），Ｕ．Ｋ．，Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５（１９７０））が挙げられる。
【００８６】
別の局面において、本発明は、均一な等電点のマーカー分子、ならびに等電点が異なる１つまたは複数の（例えば、１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、２０、５０など）マーカー分子を含む組成物を含む。これらのマーカー分子は、等電点に基づいて分子を分離するゲル電気泳動システム（例えば、等電点電気泳動システム）との使用に特に適している。
【００８７】
本明細書で説明された方法および用途に対する他の適切な変更および適応は、当業者に周知の知識を考慮すれば、本明細書に含まれる発明の説明から容易に明らかであり、本発明の範囲または本発明の任意の態様から逸脱することなくなされ得ることが、関連する技術分野の当業者に理解されるだろう。今や、本発明は詳細に説明されたが、以下の実施例を参照することによってさらにはっきりと理解されるだろう。以下の実施例は例示のためだけに本明細書に含まれ、本発明を限定することが意図されない。
【００８８】
実施例
実施例１
自然の化学連結を用いた、Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−ＯＨ（配列番号：２）と、ＴＭＲ−チオエステル１５との反応
最適化された段階的固相ペプチド合成によって、モデルペプチドＣｙｓ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−ＯＨ（配列番号：２）を調製した。図３Ｂに概説するように、チオエステル１５を調製した。ペプチド５．０ｍｇ（２．６５×１０−３６ｍｍｏｌ）を含む（０．１Ｍリン酸ナトリウムを用いてｐＨ７．３に緩衝化した）６．０Ｍグアニジン塩酸塩溶液１ｍＬに、アセトニトリル２０μＬに溶解したＴＭＲ−チオエステル１５ ３．０ｍｇ（１．５×１０−３ｍｍｏｌ）を添加した。これに、１０μＬ（１％ｖ／ｖ）トルエンチオールおよび３０μＬ（３％ｖ／ｖ）チオフェノールを添加し、アルゴンの下で室温で一晩攪拌した。質量分析データおよびＳＤＳゲル電気泳動によって、ＴＭＲで標識されたペプチド生成物が形成されたことが分かった。
【００８９】
実施例２
ｐＴＷＩＮ１ベクターへのマルトース結合タンパク質−９５ａａ（ＭＢＰ−９５ａａ）遺伝子のクローニング
ＭＢＰ−９５ａａ遺伝子のＴＯＰＯクローニング：２つの制限部位Ｓｐｅ１およびＮｄｅ１を、ＭＢＰ−９５ａａ遺伝子の両側に導入した。ＰＣＲで増幅された遺伝子を精製し、ｐＣＲ−ＴＯＰＯベクターにＴＯＰＯクローニングした。ｐＣＲ−ＴＯＰＯＭＢＰ−９５ａａ遺伝子を形質転換によってＴＯＰ１０コンピテント細胞に導入し、ＬＢ／ＡＭＰプレート上で一晩増殖させた。１０個のコロニーを採取し、１０個の２ｍＬ ＬＢ／ＡＭＰ培養物に接種するのに使用し（１コロニー／チューブ）、３７℃で一晩増殖させた。各培養物からのＤＮＡを、Ｓ．Ｎ．Ａ．Ｐ．（商標）（Ｓｉｍｐｌｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｅｐ）Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて単離し、ＤＮＡ配列決定によって分析した。
【００９０】
制限消化および連結：ｐＣＲ−ＴＯＰＯＭＢＰ−９５ａａを、同時にＳｐｅＩおよびＮｄｅＩを用いて３７℃で一晩消化した。同じ酵素を用いてｐＴＷＩＮ１ベクターを消化した。両反応混合物を１．２％アガロースゲルで精製した。ｐＴＷＩＮ１プラスミドへのＭＢＰ−９５ａａ遺伝子の挿入を１４℃で３時間〜３０分間行った。
【００９１】
形質転換：ＴＯＰ１０細胞を前記の連結混合物で形質転換し、対照実験と共にＬＢ／ＡＭＰ／Ｘｇａｌの上にプレートした。いくつかの２ｍＬ ＬＢ／ＡＭＰ培養液に異なるコロニーを接種し（１コロニー／チューブ）、３７℃で一晩増殖させた。ｐＴＷＩＮ１ＭＢＰ−９５ａａをＳ．Ｎ．Ａ．Ｐ．Ｍｉｎｉｐｒｅｐによって単離した。
【００９２】
インサートのスクリーニング：挿入を確かめるために、ｐＴＷＩＮ１ＭＢＰ−９５ａａをＳｐｅＩおよびＮｄｅＩ酵素で消化した。この反応によって２つの断片：インサート，２５０−３００ｂｐおよびバックボーン，約７０００ｂｐが得られた。
【００９３】
細胞培養および融合タンパク質発現
ＢＬ２１／ＢＡＤ細胞をｐＴＷＩＮ１ＭＢＰ−９５ａａで形質転換し、ＬＢ／ＡＭＰの上にプレートし、３７℃で一晩増殖させた。ＬＢ／ＣＡＲ（２００μｇカルベニシリン／ｍＬ ＬＢ）培養物２ｍＬに１個のコロニーを接種し、３７℃で一晩増殖させた。０．０１％グルコースを含むＬＢ／ＣＡＲ培地１リットルに前記培養物を接種し、３０℃で増殖させた。対数期中期の細胞を、０．１ｍＭイソプロピル−１−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および０．１％アラビノースを用いて３０℃で２時間〜３０分間誘導した。
【００９４】
細胞採取
誘導培養物からの細胞を４℃で１５分間、５０００×ｇで沈殿させ、上清を捨てた。この段階で、細胞ペレットを−８０℃で保存した。
【００９５】
親和性精製およびオンカラム切断
粗細胞抽出物の調製
ペレット２．０ｇを氷冷溶解緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０），８００ｍＭ ＫＣｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，１．０ｍＭ ＰＭＳＦ）１００ｍＬに再懸濁し、２つに分けた。各懸濁液を１分×４で超音波処理した。混合した溶解産物を４℃で３０分間、１２０００×ｇでの遠心分離によって清澄した。
【００９６】
キチンカラムの調製
キチンビーズ１５ｍＬ（カラム体積）が詰められたカラムを調製し、カラム緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５），５００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）１００ｍＬで平衡化した。
【００９７】
清澄された細胞溶解産物の添加
清澄された細胞溶解産物を、流速０．５ｍＬ／分でキチンカラムに添加（ｌｏａｄ）した。フロースルーを収集し、流速１．０〜２．０ｍＬ／分で同じカラムに添加した。
【００９８】
キチンカラムの洗浄
カラムを、カラム緩衝液５００ｍＬを用いて流速２．０ｍＬ／分で洗浄した。
【００９９】
粗抽出物を跡形もなくカラム側から洗い落とした。
【０１００】
オンカラム切断の誘導
カラムにＭＥＳＮＡ緩衝液（カラム緩衝液に溶解した２００ｍＭメルカプトエタンスルホン酸）５０ｍＬをロードし、緩衝液がキチンビーズの少し上にくるまで素早く流した。流れを止め、カラムを室温で一晩ゆっくりと揺り動かした。
【０１０１】
標的タンパク質の溶出
インテインのオンカラム切断の後、ＭＢＰ−９５ａａのＭＥＳＮＡ誘導体をα−チオエステルとして放出し、カラム緩衝液を用いて溶出した。全ての画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。混合した画分を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ−１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ｄｅｖｉｃｅ Ｂｉｏｍａｘ−５Ｋを用いて濃縮して、所望のタンパク質５．６ｍｇを得た。
【０１０２】
実施例３
ペプチドの合成
「セグメントＡ」として適しており、以下のアミノ酸配列：
2004506221.tif 000004
を有するペプチドを、高度に最適化された段階的固相ペプチド合成によって調製した。Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ），０．２２ｍｅｑ．）のガラスフリット９０９ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）がはめ込まれた３０ｍＬ反応容器を、０．０５Ｍ ＨＯＢｔを含む２０％ピペリジン／ＤＭＦ溶液１０ｍｌに５分間浸けた。液体を捨て、同じ手順をもう２回繰り返した。樹脂をＤＭＦ １０ｍｌで６回洗浄した。別の反応容器において、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ（２４９．０ｍｇ，０．８ｍｍｏｌ）のカルボキシル基を、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）３０．０ｍｇ（０．２ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ １０ｍｌに溶解したＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）２８０．０μＬ（１．６ｍｍｏｌ）の存在下で、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ） ３０３．０ｍｇ（０．８ｍｍｏｌ）を用いて活性化した。混合物を室温で３分間撹拌し、樹脂に添加し、室温で１．５時間撹拌した。混合物をＤＭＦで数回洗浄した。第２のアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔ−Ｂｕ）の活性化およびカップリングを、Ｆｍｏｃ−Ａｌａについて述べたのと同じ条件下で行った。第３のアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＴＭＲ）は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（モレキュラーブローブス）として購入した。これは、さらなる活性化を必要とせず、反応混合物（２５０ｍｇ ０．３２ｍｍｏｌ）に添加し、光から保護し、室温で一晩放置した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ＴＭＲ）カップリングの後、混合物を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｐｉｏｎｅｅｒ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ容器に移した。次いで、アミノ酸配列：
2004506221.tif 000005
を有するペプチドを、Ｌｙｓ（ＴＭＲ）−Ａｓｐ−Ａｌａ−樹脂に集めた。この合成装置のための合成プロトコールは、０．０５Ｍ ＨＯＢｔを含むピペリジン／ＤＭＦ（１：４，ｖ／ｖ）を用いた５分間の脱保護段階、Ｆｍｏｃ−アミノ酸／ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ／ＤＩＥＡ（４：４：１：８）を用いた１時間のカップリング時間であった。合成装置によって合成を行った後、
2004506221.tif 000006
を含む反応混合物を手作業用反応容器に移し、残りの配列Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ＴＭＲ）を前記のように段階的に手作業でカップリングした（図８）。
【０１０３】
脱ブロック：
2004506221.tif 000007
１．３６４ｇを含む反応混合物を、スカベンジャー混合物（チオアニソール１０ｍｌ／トリイソプロピルシリン４ｍｌ／フェノール６００ｍｇ）３００μＬ、メルカプトプロピオン酸（ＭＰＡ）２００μｌ、および９５％ＴＦＡ／５％Ｈ２Ｏ １０ｍｌと共に添加し、時々攪拌しながら室温で３時間放置した。ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル（ＭＴＢＥ）／ヘキサン（１：１）１００ｍｌを反応混合物に添加し、遠心分離した。上清を捨て、残渣をＭＴＢＥ／ヘキサン（１：１）５０ｍｌで洗浄し、再度遠心分離した。固体をデカンテーションによって分離し、Ｈ２Ｏに溶解した５０％アセトニトリル５０ｍｌで抽出し、凍結乾燥した。粗混合物を調製用Ｃ−１８ ＲＰ−ＨＰＬＣで精製して、純粋なペプチド１９８ｍｇを得た。このペプチドをＭＳによって分析した（実験値２３９７．６７、計算値２３９８．７１）。
【０１０４】
以下のペプチドを調製した：
2004506221.tif 000008
【０１０５】
Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ＴＭＲ）−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ＴＭＲ）−Ａｓｐ−Ａｌａ−アミド（セグメントＡ）（配列番号：３）とＭＢＰ−９５ａａ（セグメントＢ）との連結：ＭＢＰ−９５ａａ（０．４×１０−６ｍｍｏｌ，４．０ｍｇ）およびＣｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ＴＭＲ）−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（ＴＭＲ）−Ａｓｐ−Ａｌａ−アミド（０．４×１０−５ｍｍｏｌ，８．９ｍｇ）（配列番号：３）の混合物を、５ｍＭトリブチルホスフィン（１−メチル−２−ピロリジノンに溶解した２００ｍＭ溶液２５μＬ）および２０ｍＭメルカプトエタノールの存在下で、０．１Ｍリン酸ナトリウムを用いてｐＨ７．３で緩衝化された６．０Ｍグアニジン塩酸塩溶液中で攪拌した。これに、触媒として３％（ｖ／ｖ）チオフェノールを添加し、室温で９６時間攪拌した。２４時間ごとに、反応混合物に２００ｍＭトリブチルホスフィン溶液２５μＬを添加した。反応混合物をＳＤＳゲル電気泳動でモニターした。反応は６０％完了していた。所望の生成物ＭＢＰ−１１０ａａ−（ＴＭＲ）２を調製用ＲＰ ＨＰＬＣで精製し、ＳＤＳ−ゲルおよびＭＡＬＤＩ−ＭＳによって特徴付けた（実験値１３０６１．１、計算値１３０３７．０１；ｐＩ値４．７５）。タンパク質マーカーとしてＭｕｌｔｉＭａｒｋ（インビトロジェン）を用いて、ＭＢＰ−１１０ａａ−（ＴＭＲ）２，ｐＩ ４．７５をＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ，４−１２％（インビトロジェン）および１６％トリシンゲル（インビトロジェン）において試験した。ゲルを図１０に示す。
【０１０６】
Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＴＭＲ）−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＴＭＲ）−Ａｓｐ−アミド（配列番号：６）とＭＢＰ−９５ａａとの連結によって、マーカー分子ＭＢＰ（１１０ａ）−（ＴＭＲ）２が得られた。計算ｐＩ ４．３。
2004506221.tif 000009
とＭＢＰ−９５ａａの連結によって、マーカー分子ＭＢＰ（１１０ａ）−（ＴＭＲ）２が得られた。計算ｐＩ ４．５。
2004506221.tif 000010
とＭＢＰ−９５ａａの連結によって、マーカー分子ＭＢＰ（１１０ａ）−（ＴＭＲ）２が得られた。計算ｐＩ ６．５。
2004506221.tif 000011
とＭＢＰ−９５ａａの連結によって、マーカー分子ＭＢＰ（１１０ａ）−（ＴＭＲ）２が得られた。計算ｐＩ ７．４。
2004506221.tif 000012
とＭＢＰ−９５ａａの連結によってＭＢＰ（１１０ａ）−（ＴＭＲ）２が得られた。計算ｐＩ ９．５。
【０１０７】
今や、本発明は、はっきりと理解できるようにするための例示および実例としていくらか詳細に十分に説明されたが、本発明の範囲にも本発明のどの特定の態様にも影響を及ぼすことなく条件、配合、および他のパラメータの広くかつ等価な範囲内で本発明を変更または修正することによって同じことを実施することができ、このような変更または修正は添付の特許請求の範囲内に含まれると意図されることが当業者に明らかであろう。
【０１０８】
本明細書で述べられた全ての刊行物および特許は、本発明が属する当業者の技術レベルを示し、それぞれ個々の刊行物または特許が参照として組み入れられるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に参照として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のマーカー分子のセグメントＡとして用いられるペプチドの固相合成を示すスキームを示す。この例において、チオエステルで連結されたグリシンを含む樹脂リンカーが存在する。さらに、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）で標識されているＮα−Ｆｍｏｃ− Ｎε−ＴＭＲ−リジンが構成要素アミノ酸として用いられる。Ｎ末端アミノ酸はイミノビオチンで標識されたグリシンである。標識されたペプチドはベンジルチオール（Ｐｈ−ＣＨ２−ＳＨ）処理によって固相から放出され、ペプチド生成物は逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって精製される。
【図２】セグメントＡ（ＴＭＲおよびビオチンで標識されたペプチド）と、Ｎ末端システイン含有タンパク質（セグメントＢ）との連結を示すスキームを示す。システインチオールでチオエステルをトランスチオエステル化するとＳ→Ｎアシルシフトが起こって、アミド結合によって接続された２つのセグメントを有する連結生成物が生成される。これにより、既知分子量およびｐＩの標識されたタンパク質である最終生成物が生成される。
【図３】蛍光染料（例えば、テトラメチルローダミン）で標識された有機チオエステルと、Ｎ末端システインを有するタンパク質（セグメントＢ）とのカップリングによるＴＭＲで標識されたタンパク質の調製を示すスキームを示す。図３Ａは、トリエチレンテトラミン（ＴＲＥＮ，アルドリッチ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，カタログ番号９０４６２から入手可能）を３．５当量のカルボキシテトラローダミン（ＴＭＲ）活性化エステル（モレキュラープローブス，ＯＲ（カタログ番号ｅ−６１２３）から入手可能）でアシル化して（ＴＭＲ）３−ＴＲＥＮ ５を形成することによって、標識されたタンパク質を形成するスキームを示す。Ｎα−Ｆｍｏｃ−リジンを２−イミノビオチン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ビオチン−ＮＳエステル）でアシル化すると、Ｎε−Ｆｍｏｃ− Ｎα−ビオチン−リジン６が生成される。６のα−アミノ基を脱ブロックし、その後に、ブロモアセチルクロリドでアシル化すると、Ｎε−ブロモアセトアミド− Ｎα−ビオチニル−リジン８が形成される。８とα−トルエンチオールとのカルボジイミドカップリングによって９が得られる。ヨウ化ナトリウムの存在下で５をチオエステル９でアルキル化すると、第４級アンモニウム塩１０（セグメントＡ）が生成され、前記と同じ条件下で１０とセグメントＢをカップリングすると、１１（発色団対タンパク質比＝３）が得られる。図３Ｂは、まず最初に、チオールベンジルエステル（１３）を調製することによって、ＴＭＲで標識されたタンパク質を形成するためのスキームを示す。トリフルオロ酢酸の存在下で１３のアミノ基を脱保護することによって、１４が生成され、その後に、１４とＴＭＲのＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルとカップリングすることによって、Ｎ−ＴＭＲ−８−ヘプタン酸のベンジルチオエステル誘導体１５が生成される。チオエステル１５（セグメントＡ）と、Ｎ末端システインを有する組換えタンパク質（セグメントＢ）との反応によって、透析によって精製することができるＴＭＲ−タンパク質１６（発色団対タンパク質比＝１）が形成される。
【図４】ＴＭＲで標識されたペプチド（セグメントＡ）の固相合成を示す。樹脂リンカーは、チオエステルで連結されたヒスチジンであり、Ｎα−Ｆｍｏｃ−ε−ＴＭＲ−リジンは、ＴＭＲで標識された構成要素アミノ酸である。このスキームにおいて、Ｎ末端アミノ酸はシステインである。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で処理した後、結果として生じた生成物は、発色団ＴＭＲで標識され、金属親和性結合（ヒスチジン）６配列でタグ化されたオリゴペプチドである。
【図５】インビトロ化学連結を介したタンパク質の標識を示すスキームを示す。この方法において、Ｃ末端チオエステルを有する組換えタンパク質（セグメントＢ）が、トルエンチオール、ベンジルチオール、およびチオフェノールの存在下で、Ｎ末端システインを有する、ＴＭＲで標識されたポリヒスチジンタグ化ペプチド（セグメントＡ）に連結する。反応によって、既知の分子量およびｐＩの生成物が得られる。
【図６】Ｎ末端スレオニンまたはシステインを含むタンパク質の部位特異的修飾を示すスキームを示す。Ｎ末端アルデヒドを有するタンパク質（１７，セグメントＢ）を形成するために、Ｎ末端アミノ酸の隣接する炭素にあるアミノ基およびヒドロキシル基を容易に酸化することができる。セグメントＢと１９（セグメントＡ）のカップリングによって、既知の分子量およびｐＩを有する目で見える色のついたタンパク質（２１）が得られる。
【図７】Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂またはスクノルザー（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ），Ｍ．ら，Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０：１８０（１９９０）により述べられた任意のアミド樹脂を用いた、Ｎ末端システインを有するペプチド（セグメントＡ）の固相合成を示すスキームを示す。
【図８】インビトロ化学連結を介したタンパク質の標識を示すスキームを示す。この方法において、Ｃ末端チオエステルを有する組換えタンパク質ＭＢＰ−９５ａａ（マルトース結合タンパク質の９５アミノ酸セグメント）（セグメントＢ）が、Ｎ末端システインを有する、ＴＭＲで標識されたペプチドに連結する。
【図９】Ｎ末端システインのないペプチドを用いたインビトロ化学連結を示すスキームを示す。Ｎα−（１−フェニル−２−メルカプトエチル）補助基が、固相ペプチド合成を用いてオリゴペプチドＮ末端にカップリングされる。連結すると、補助基は穏やかな条件下で除去される。
【図１０】ＭＢＰ−１１０ａａ−（ＴＭＲ）２を特徴付けるＮＵ−ＰＡＧＥ（登録商標）４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルの写真である。レーン１は、Ｍｕｌｔｉｍａｒｋ（インビトロジェン，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）タンパク質マーカーである。レーン２は、ＭＢＰ−１１０ａａ−（ＴＭＲ）２（最大分子量）、ＭＢＰ−９５ａａ、未反応
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を含む反応混合物である。レーン３はブランクである。レーン４は、ＭＢＰ−１１０ａａ−（ＴＭＲ）２（最大分子量）、ＭＢＰ−９５ａａ、未反応
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を含む反応混合物である。レーン５はＭＢＰ−９５ａａである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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