(57)【要約】本発明は、新規な治療用のポリペプチド抗原およびエピトープを同定する方法に関する方法を提供する。これらの方法は、抗体を主体とする免疫療法のための特に有効な標的となるポリペプチドを選択することを目的として設計されている。本発明はさらに、対象における免疫応答を誘導するのに有用な、治療用のポリペプチド抗原およびエピトープポリペプチドも提供する。さらに本発明は、これらのポリペプチド抗原およびエピトープを標的とする抗体、ならびに対象における疾患の進行を抑制するためにこれらの抗体を用いるための方法も提供する。
2004513332.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清抗体を特異的に認識してそれと結合する、関心対象の表現型と相関するポリペプチドを同定するための方法であって、該当する１つまたは複数の細胞または組織で差異を伴って発現される特徴づけられた遺伝子のリストおよび特徴づけられたポリペプチドのリストに共通するポリペプチドを同定する段階を含み、それによって該関心対象の表現型と相関する該ポリペプチドを同定する方法。
【請求項２】
ポリペプチドが膜会合型である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
遺伝子が細胞または組織の種類によって特徴づけられる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
リストの遺伝子が遺伝子産物の性質によって特徴づけられ、該性質が、血清抗体との特異的反応性、該当する細胞株または組織における高発現、該当する細胞株または組織における検出可能な発現がほとんどまたは全くないこと、および該当する細胞株または組織における固有の発現からなる群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項５】
２つまたはそれ以上の性質が遺伝子産物の性質を特徴づける、請求項４記載の方法。
【請求項６】
分子量の性質をさらに含む、請求項４または５記載の方法。
【請求項７】
リストのタンパク質の特徴のリストが、質量、血清抗体との反応性、ペプチダーゼ消化パターン、酵素消化パターンおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ選択基準からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
２つまたはそれ以上の性質が遺伝子産物の性質を特徴づける、請求項７記載の方法。
【請求項９】
分子量の性質をさらに含む、請求項７または８記載の方法。
【請求項１０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ選択基準が、データベースの選択、種、消化物の種類、ＣＮＢｒ、誤切断（ｍｉｓｃｌｅａｖａｇｅ）の数、分子量の範囲、不純物混入の指標、および質量の精度からなる群より選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
該当する細胞または組織を、抗ウイルス療法、抗生物質療法、化学療法および免疫療法からなる群より選択される治療法によって治療された患者から単離する、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
免疫療法が、癌ワクチン、抗体療法および養子免疫療法による治療から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
抗原を特異的に認識してそれと結合する抗体を単離することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
請求項１記載の方法によって同定されたポリペプチド。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法によって単離された抗体。
【請求項１６】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項１５記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１６記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
【請求項１８】
請求項１４記載の単離されたポリペプチドと担体とを含む組成物。
【請求項１９】
請求項１４記載のポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１９記載のポリヌクレオチドの相補物。
【請求項２１】
請求項１９記載の単離されたポリヌクレオチドと担体とを含む組成物。
【請求項２２】
担体が薬学的に許容される担体である、請求項１８または２１記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１９記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子送達媒体。
【請求項２４】
請求項１９記載のポリヌクレオチドを含む、単離された宿主細胞。
【請求項２５】
請求項１４記載のポリペプチドを含む、単離された宿主細胞。
【請求項２６】
細胞が抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、ポリペプチドが細胞表面のクラスＩ ＭＨＣ分子によって提示される、請求項２５記載の宿主細胞。
【請求項２７】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）が樹状細胞である、請求項２６記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国成文法第３５編１１９条（ｅ）項（３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ））に基づき、それぞれ２０００年９月１８日、２００１年１月１９日および２００１年６月６日に提出された米国特許仮出願第６０／２３３，５８６号、第６０／２６２，８３５号および第６０／３０３，７５１号に対する優先権を主張するものである。これらの出願の内容は参照として本開示に組み入れられる。
【０００２】
技術の分野
本発明は、免疫学および抗体技術の分野に関する。
【０００３】
発明の背景
癌またはウイルス感染細胞で発現される正常型または変異型の細胞抗原を標的とする抗体分子および体液性免疫応答の操作は、治療薬および診断薬を開発するための有用なアプローチとなる。免疫応答の修飾はさらに、自己免疫疾患および他の病原性表現型に対処するための有用な戦略にもなると思われる。適した性質を備えた治療用の抗体標的を同定することができれば、別の疾患の診断および治療も容易になると考えられる。
【０００４】
抗体を基盤とする技術は、さまざまに異なる方法で適用することができる。腫瘍特異抗原を標的とする抗体の産生を誘導するためのワクチン戦略は、抗体依存性細胞傷害反応、補体依存性細胞傷害反応およびアポトーシスを生じさせる免疫療法に用いることができる（ＳｉｎｋｏｖｉｃｓおよびＨｏｒｖａｔｈ（２０００）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． １６（１）：８１〜９６）。細胞表面腫瘍抗原を標的とするモノクローナル抗体は、さまざまな種類の癌の治療に直接的な効果を発揮することが示されている（Ｗｅｉｎｅｒ（１９９９）Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２６：４３〜５１）。また、腫瘍抗原特異的なモノクローナル抗体に由来する抗体免疫複合体は、細胞傷害物質および放射性核種の送達用物質として、または診断用の造影物質としても有用である（Ｒｏｓｅｌｌｉら（１９９６）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １６（４Ｂ）：２１８７〜２１９２；ＴｒａｉｌおよびＢｉａｎｃｈｉ（１９９９）１１（５）：５８４〜５８８）。加えて、抗腫瘍抗体は腫瘍抗原の特徴を模した抗イディオタイプ抗体を誘導することが示されている。これらの抗イディオタイプ抗体は、腫瘍に対する抗腫瘍免疫応答をさらに誘導することができる（Ｆａｇｅｒｂｅｒｇら（１９９５）９２（１１）：４７７３〜４７７７）。
【０００５】
癌に対する実験的ワクチン接種によっても、腫瘍抗原に対する体液性免疫応答の誘導だけでは、腫瘍に対する治療効果を得るには十分でないことが示されている（ＳｉｎｋｏｖｉｃｓおよびＨｏｒｖａｔｈ（２０００）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｏｎｃｏｌ． １６（１）：８１〜９６）。腫瘍由来のワクチンの投与を受けた個体は治療に反応することも反応しないこともあるが、反応例および非反応例はいずれも腫瘍抗原と反応するポリクローナル抗体を産生することはできる。投与を受けた反応例において有益な治療効果を誘導した抗原タンパク質を同定することは、有効な免疫療法を開発する上で特に有用と考えられる。
【０００６】
ウイルス感染症は免疫療法の対象となる理想的な候補である。ウイルス病原体に対する免疫応答は、ＡＩＤＳの原因となるＨＩＶなどのレンチウイルスの場合のように、有効でないことが時にある。これらのウイルスは自然変異の頻度が高いため、免疫系から逃れやすい。しかし、感染細胞の表面に提示されるＣＴＬエピトープの豊富なプロフィールから、変異に対する耐性がほとんどない必須遺伝子における種々の異なる血清型に共通の抗原が同定され、それによってさらに有効なワクチンの設計も可能になると考えられる。
【０００７】
非感染性抗原に対する免疫応答は、病的状態、例えば自己免疫、移植片拒絶反応およびアレルギーなどを引き起こすことがある。このような疾患に共通するのは、免疫応答の正常な機構が用いられて症状が生じており、このため治療に大きな困難が伴うことである。例えば、自己抗原に対する免疫応答を阻止しうる、または非病原性経路に対する免疫応答を回避させうる、抗体および／または抗原性ペプチドは、全体的な免疫能に悪影響を及ぼさずにこのような疾患の治療をもたらすと考えられている。
【０００８】
歴史的には、病的細胞に存在する抗原性ポリペプチドは、病的細胞において特異的に発現される個々の抗原を検出する目的で、病的細胞および正常細胞の試料に由来するタンパク質試料の発現レベルを比較することによって同定された。しかし、発現レベルは細胞の局在、接近性または機能的関連の指標ではないため、抗体を主体とする免疫療法の候補を同定する上でこのアプローチの有用性は限られている。さらに最近では、発現クローニング法および免疫検出法の組み合わせが、腫瘍由来のＢ細胞抗原の同定に応用されている。ＳＥＲＥＸ法（組換え発現クローニングによる抗原の血清学的同定）を用いて、この種の抗原がさまざまな種類の腫瘍から得られている（国際公開公報第００／２０４６０号；Ｔｕｒｅｃｉら（１９９９）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １８（１）：２３〜２８）。この方法は対象における体液性免疫応答を誘発する抗原の発見には有用であるが、同定された抗原の疾患との関連性または免疫療法の標的としてのその有用性に関する有用な情報がないため、この方法では「適した性質を備えた（ｗｅｌｌ−ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）」抗原標的は得られない。実際に、ヒト腫瘍抗原を標的とする抗体の多くは治療効果をもたらさない。
【０００９】
適切な抗原性ポリペプチドの解明は技術的に難しかった。抗体技術に有効なポリペプチド標的を選択するには、抗体反応を適切な組織に集中させるために十分に限定的な組織発現パターンを備えた接近可能な（ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）抗原を同定することが必要である。抗体ターゲティング法の場合は抗原性ポリペプチドの存在量および接近可能性が重要であるが、治療用モノクローナル抗体技術のためには抗原の機能的活性が極めて重要である。したがって、多数の抗原性ポリペプチドおよびこれらの標的を標的とする抗体を同定するために、さまざまな標的となる病的細胞または組織の試料をスクリーニングする手段があれば有用と考えられる。
【００１０】
本発明はこれらの需要を満たすとともに、それに関連した利益も提供する。
【００１１】
発明の開示
本発明は、血清抗体を特異的に認識してそれと結合する、関心対象の表現型と相関するポリペプチドを同定するための方法であって、該当する１つまたは複数の細胞または組織で差異を伴って発現される特徴づけられた遺伝子の第１のリストおよび特徴づけられたポリペプチドの第２のリストに共通するポリペプチドを同定し、それによって前記関心対象の表現型と相関する前記ポリペプチドを同定することを含む方法を提供する。ポリペプチドは血清から単離することもでき、または膜会合型ポリペプチドであってもよい。
【００１２】
１つの局面において、遺伝子は細胞または組織の種類によって特徴づけられる。例えば、遺伝子がすべて、関心対象の抗原を発現することが疑われる細胞もしくは組織、癌細胞、正常細胞、ウイルス感染細胞、または自己免疫疾患と関係のある細胞から単離されたものでもよい。
【００１３】
さらにもう１つの局面において、第１のリストの遺伝子は遺伝子産物の性質によって特徴づけられ、この際に前記性質は、血清抗体との特異的反応性、該当する細胞株または組織における高発現、該当する細胞株または組織における検出可能な発現がほとんどまたは全くないこと、および該当する細胞株または組織における固有の発現からなる群より選択される。さらにもう１つの局面において、リストは、これらの性質の２つまたはそれ以上を有する細胞または組織に対して作られる、またはそれらに共通したものである。さらにまたもう１つの態様において、すべての細胞および組織は、分子量がある特定の範囲内、すなわち血清抗体と結合する抗原またはポリペプチドの分子量と類似した範囲またはそれを包含する範囲内にある発現産物を理由に選択される。
【００１４】
もう１つの態様において、第２のリストはタンパク質の共通の特徴によって定義され、この際にこのような特徴または性質は、質量、血清抗体との反応性、ペプチダーゼ消化パターン、酵素消化パターンおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（マトリックス支援イオン化飛行時間型質量分析法）選択基準からなる群より選択される。さらにもう１つの局面において、リストは、これらの性質の２つまたはそれ以上を有する細胞または組織に対して作られる、またはそれらに共通したものである。さらにまたもう１つの態様において、すべての細胞および組織は、すべての細胞および組織は、分子量がある特定の範囲内、すなわち血清抗体と結合する抗原またはポリペプチドの分子量と類似した範囲またはそれを包含する範囲内にある発現産物を理由として選択される。
【００１５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、質量分析データに基づいてタンパク質を同定するための方法である。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ選択基準の例には、データベースの選択、種、消化物の種類、ＣＮＢｒ、誤切断（ｍｉｓｃｌｅａｖａｇｅ）の数、分子量の範囲、不純物混入の指標、および質量の精度が非制限的に含まれる。
【００１６】
本発明は、例えば癌、自己免疫疾患、ウイルス病原体、および多発性嚢胞腎などの変性疾患を含む、関心対象の表現型と相関する血清タンパク質、ポリペプチドまたはエピトープを同定するための方法も提供する。
【００１７】
１つの態様では、血清タンパク質を、１つまたは複数の「反応性対象（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｓｕｂｊｅｃｔ）」、すなわち、臨床的または準臨床的（ｓｕｂｃｌｉｎｉｃａｌ）反応の存在といった望ましい表現型を有する１つまたは複数の対象から単離する。対象は、癌の場合には腫瘍負荷の軽減、全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患の場合には自己免疫抗原または抗体の数の減少、多発性嚢胞腎の場合には骨脱灰の減少といった介入行為に対して良好な反応を示すことがある。しかし、本発明は、治療的介入に対する反応例には限定されない。反応性対象には、病原体に曝露された対象、または疾患に対する遺伝的素因のある対象も含まれる。いずれの場合にも、「反応性」対象には、相関する表現型に付随する臨床的または準臨床的な症状、例えば、対象におけるＨＩＶへの曝露および／またはその存在の後のＡＩＤＳ、または病原体への曝露後の感染症を示さない例が含まれる。血清を、１つまたは複数の「非反応性」対象、すなわち癌、感染症またはＡＩＤＳなどのＨＩＶ関連疾患といった病的表現型を呈している例から単離する。反応例の血清と非反応例の血清との間で存在の程度または有無に差がある血清抗体は、一群のポリペプチドに対する血清をアッセイすることにより同定する。
【００１８】
さらに別の態様では、複数の非反応性対象から血清を単離する。一群のポリペプチドに対する血清をアッセイすることにより、対象の少なくとも２例またはそれ以上に共通する血清抗体が同定されると思われる。抗体を回収し、関心対象の表現型に関する遺伝子またはペプチドの発現データとの比較により、存在の程度または有無に差がある抗体をスクリーニングする。
【００１９】
さらにもう１つの態様では、抗体を回収した時点で、存在の程度または有無に差があるものをスクリーニングして単離し、関心対象の表現型に関する発現遺伝子データとの比較によってさらに分析する。１つの好ましい態様では、発現遺伝子データを、被験対象といくつかの性質を共有するように選択する。最も好ましい態様において、発現遺伝子データは、できるだけ多くの性質を共有するように一致させた組織または細胞からのものである。特に好ましい態様は、反応例からの遺伝子プロファイルと非反応例との比較である。
【００２０】
または、抗体を回収し、ポリペプチドおよびそのポリヌクレオチド配列を同定するためにクロマトグラフィーおよび遺伝子アッセイ法によってスクリーニングする。
【００２１】
本発明はさらに、本方法によって単離されたポリペプチド、ならびに診断的および治療的な有用性を確認するための方法を提供する。さらに、ポリペプチドを特異的に認識してそれと結合する抗体（モノクローナルおよびポリクローナル）も提供する。またさらに、ポリペプチドおよび抗体をコードするポリヌクレオチドも提供する。
【００２２】
さらにまた、本発明のポリペプチドまたは抗体と特異的に結合する単離された細胞および細胞表面リガンドも提供する。さらにまた、ポリペプチド、抗体、細胞および細胞表面リガンドのそれぞれの派生物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）、例えば、診断キット中にまたは薬物分子担体として用いるための標識ポリペプチド、免疫療法用のヒト化抗体、または薬物分子担体として用いるための抗体断片、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む抗原提示細胞、および抗体または抗原のそのそれぞれの標的との結合を阻止するために用いる可溶性リガンドも提供する。これらの方法を行うための試薬およびキット、さらには治療的および／または診断的な有用性を有する抗体および抗原も提供する。
【００２３】
本発明のもう１つの局面は、その有無が対象における表現型と相関づけられている、抗体と結合するリガンドを同定するための方法である。リガンドを含むことが疑われる細胞の試料を対象から単離し、検出可能な標識がなされた抗体またはその誘導体の有効量と接触させる。リガンドは抗体または誘導体との結合によって同定される。リガンドを含む細胞からリガンドを同定するための方法は当技術分野で知られている。リガンドの細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインを除去することにより、可溶性リガンドを単離することもできる。さらに、リガンドおよびその可溶型をコードするポリヌクレオチド、さらには、単離されたリガンドの１つまたは複数を含む組成物、リガンドをコードするポリヌクレオチド、リガンドおよび／またはリガンドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞も本明細書に提供する。
【００２４】
ポリペプチドとそのパートナーまたは抗体とそのパートナーとの結合を減少させる被験化合物、さらにはその同定のための方法も本明細書に提供する。これらの分子を同定するためのスクリーニングは、ポリペプチドまたは抗体の試料をその結合パートナーと被験化合物の存在下および非存在下で接触させることによって行われる。抗体とポリペプチドまたは抗体とリガンドとの結合を、被験化合物を含まない試料（対照試料）と比較して阻害する分子は、抗体のポリペプチドまたはリガンドとの結合を減少させる分子として同定される。
【００２５】
本発明のさらにもう１つの態様は、本明細書に特定する腫瘍または他の病態を治療するための薬剤候補を同定するための方法である。本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドを発現する細胞を被験化合物と接触させる。１つまたは複数のポリヌクレオチドの発現を、細胞のｍＲＮＡと前記ｍＲＮＡに対して相補的な核酸プローブとのハイブリダイゼーションによって判定する。被験化合物は、それが本発明の１つまたは複数のポリペプチドの発現を低下させるならば、腫瘍を治療するための薬剤候補として同定される。代替的または追加的に、細胞は１つまたは複数のポリペプチドをコードする発現構築物をトランスフェクトした組換え宿主細胞である。
【００２６】
本発明の実施様式
本開示の全体を通じて、さまざまな刊行物、特許および公開特許明細書を識別用の出典によって参照している。これらの刊行物、特許および公開特許明細書の開示内容は、本発明が属する技術の現状をより詳細に記載する目的で本開示に参照として組み入れられる。
【００２７】
本発明の実施には、別に指示する場合を除いて、当技術分野の技能の範囲に含まれる、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技法を用いる。このような技法は文献中に詳細に説明されている。これらの方法は以下の刊行物に記載されている。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「分子クローニング：実験マニュアル（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）」、第２版（１９８９）；「分子生物学における最新プロトコール（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）」（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７））；「酵素学の方法（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）」シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；「ＰＣＲ：実践的アプローチ（ＰＣＲ：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ）」（Ｍ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１））；「ＰＣＲ ２：実践的アプローチ（ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ）」（Ｍ．Ｊ． ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｂ．Ｄ． ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ． Ｔａｙｌｏｒ編（１９９５））；「抗体、実験マニュアル（ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）」（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９８８））、「抗体の使用、実験マニュアル（ＵＳＩＮＧ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ、ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ）」（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編（１９９９））；および「動物細胞培養（ＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ）」（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編（１９８７））を参照されたい。
【００２８】
定義
本明細書で用いる場合、いくつかの用語は以下に定義する意味を有するものと考えられる。
【００２９】
明細書および特許請求の範囲に用いる場合、単数形の「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈で明らかに別の指示がない限り、複数形に対する言及も含む。例えば、「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」という用語は、複数の細胞を含み、これにはそれらの混合物も含まれる。
【００３０】
本明細書で用いる「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、組成物および方法に列挙される要素を含むが、他のものも除外されないことを意味する。「本質的に…からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組成物および方法の定義に用いる場合、その組み合わせに対して何らかの本質的な意味をもつ他の要素は除外されることを意味する。このため、本質的に本明細書に定義する要素からなる組成物には、単離および精製の方法による微量不純物、ならびにリン酸緩衝食塩水、保存料などの薬学的に許容される担体は除外されないと考えられる。「…からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、他の成分の微量元素および本発明の組成物を投与するための実質的な方法の段階の範囲を超えるものが除外されることを意味する。これらの連結語のそれぞれによって定義される態様は本発明の範囲に含まれる。
【００３１】
「天然型（ｎａｔｉｖｅ）」または「天然の（ｎａｔｕｒａｌ）」抗原とは、天然の生物源から単離され、対象において抗原受容体、例えば、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）、Ｂ細胞抗原受容体（ＢＣＲ）または表面免疫グロブリンと特異的に結合することができる、ポリペプチド、タンパク質またはエピトープを含むそれらの断片のことである。
【００３２】
「抗原」という用語は、当技術分野で周知であり、これには対象における反応を誘導する物質が含まれる。反応は、対象におけるウイルス量の減少などのように準臨床的なものでもよく、癌の場合における腫瘍負荷の減少などのように臨床的なものでもよい。
【００３３】
「改変抗原」とは、対応する野生型抗原のものとは異なる一次配列を有するもののことである。改変抗原は合成法または組換え法によって作製することができ、これには翻訳時または翻訳後にリン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質の加水分解切断、抗体分子、膜分子または他のリガンドとの連結などによって差異を伴って修飾される抗原性ペプチドが非制限的に含まれる（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら（１９８８）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５７：２８５〜３２０）。本発明の合成抗原または改変抗原は、天然のエピトープと同じＴＣＲと結合および／または架橋することを意図している。
【００３４】
「自己抗原」とは、本明細書で天然型または野生型の抗原とも呼ばれるが、抗原に対する自己寛容のために対象において免疫応答をほとんどまたは全く誘発しない抗原性ペプチドのことである。自己抗原の一例は、黒色腫特異抗原ｇｐ１００である。
【００３５】
「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」という用語は、腫瘍に付随する、またはそれに特異的な抗原抗原を指す。既知のＴＡＡの例には、ｇｐ１００、ＭＡＲＴおよびＭＡＧＥが含まれる。
【００３６】
「反応性対象血清（抗血清）」とは、治療後に望ましい反応を示す対象から入手したポリクローナル血清試料のことを、同様の対象、例えば同じ治療を受けたが望ましい反応を示さない対象から単離または入手した反応性ポリクローナル血清試料、すなわち「非反応性対象血清」と対比して指すものである。１つの局面において、反応性対象からの血清は、臨床的または準臨床的な反応を示す対象から得られると考えられる。
【００３７】
「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」という用語は、１つまたは複数の抗原を、免疫系の特定のエフェクター細胞によって認識されうる抗原−ＭＨＣ複合体の形態として提示し、それによって提示された１つまたは複数の抗原に対する有効な細胞性免疫反応を誘導することができる一群の細胞を指す。多くの種類の細胞が細胞表面に抗原を提示してＴ細胞により認識されうるが、有効な量の抗原を提示し、さらにＴ細胞を活性化して細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）反応を生じさせる能力があるのは専門的なＡＰＣのみである。ＡＰＣとしては、マクロファージ、Ｂ細胞および樹状細胞（ＤＣ）などの無傷の全細胞；またはβ２−ミクログロブリンと複合体を形成した精製ＭＨＣクラスＩ分子などの天然型もしくは合成型の他の分子が可能である。
【００３８】
「樹状細胞（ＤＣ）」という用語は、種々のリンパ系および非リンパ系組織に認められる形態学的に類似した複数の種類の細胞から構成される多様な集団を指す（Ｓｔｅｉｎｍａｎ（１９９１）Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ９：２７１〜２９６）。樹状細胞は、生物体において最も強力かつ優先的なＡＰＣである。樹状細胞の仮にすべてではないにしてもそのサブセットは骨髄前駆細胞に由来し、末梢血中に少数が循環しており、未熟なランゲルハンス細胞または終末分化した成熟細胞として認められる。樹状細胞が単球から分化することもあるが、それらは異なる表現型を有する。例えば、分化マーカーの一種であるＣＤ１４抗原は、樹状細胞には認められないが単球には存在する。また、成熟樹状細胞は一般に貪食性ではないが、単球は貪食性の強い細胞である。ＤＣはＴ細胞の活性化および増殖に必要なすべてのシグナルを提供することが示されている。
【００３９】
「免疫エフェクター細胞」という用語は、抗原と結合しうる、免疫応答を媒介する細胞を指す。これらの細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、ならびに細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、例えばＣＴＬ細胞株、ＣＴＬクローン、および腫瘍、炎症性または他の浸潤からのＣＴＬが非制限的に含まれる。ある種の罹患組織は特異的抗原を発現し、これらの抗原に特異的なＣＴＬが同定されている。例えば、黒色腫の約８０％はｇｐ１００として知られる抗原を発現する。
【００４０】
本明細書で用いる「免疫エフェクター分子」という用語は、抗原特異的結合を行うことのできる分子を指し、これには抗体、Ｔ細胞抗原受容体、ならびにＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子が含まれる。
【００４１】
「ナイーブな」免疫エフェクター細胞とは、抗原に一度も曝露されていない免疫エフェクター細胞のことである。
【００４２】
本明細書で用いる「教育された（ｅｄｕｃａｔｅｄ）抗原特異的免疫エフェクター細胞」とは、抗原に遭遇したことのある、その抗原に対して特異的な、上に定義した免疫エフェクター細胞のことである。教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞は、抗原との結合によって活性化されうる。「活性化された」とは、細胞がすでにＧ０期になく、細胞種に特徴的なサイトカインの産生を始めたことを意味する。例えば、活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞はＩＬ−２を分泌するほか、静止期のＣＤ４＋Ｔ細胞に比べて細胞表面の高親和性ＩＬ２受容体の数が多い。
【００４３】
本発明のペプチドまたはポリペプチドは、抗体または／ならびにＢ細胞およびＴ細胞などの抗原特異的免疫エフェクター細胞によって選好的に（ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）認識されうる。Ｔ細胞の文脈における「認識される」という用語は、ペプチドまたはポリペプチドがプロセシングを受け、抗原特異的Ｔ細胞の表面にあるＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）がエピトープと結合し、このような結合によってＴ細胞の活性化が生じるような様式で、ＭＨＣ分子とともに（すなわち、結合して）ＡＰＣの表面に提示されることを意図している。Ｂ細胞の場合には、抗原がＢ細胞受容体（ＢＣＲ）と結合すると抗原は内部に取り込まれ、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合したペプチドとして細胞表面に再び現れる。このペプチド：ＭＨＣ複合体は抗原特異的Ｔ細胞によって「認識され」、続いてそれがＢ細胞を活性化して抗体を分泌させる。「選好的に認識される」という用語は、本発明のポリペプチドが、上に定義した通り、関係のない抗原に対して特異的なＴ細胞および／または抗原によっては実質的に認識されないことを意図する。エピトープが抗体または抗原特異的Ｔ細胞によって認識されるか否かを決定するためのアッセイ法は当技術分野で知られており、本明細書にも記載している。抗体：抗原結合の文脈における「特異的に認識されて結合する」とは、その対の構成要素が他の結合パートナーによっては実質的に認識されないことを意味する。
【００４４】
本明細書で用いる「固相支持体」または「固体支持体」という用語は、互換的に用いられ、支持体の具体的な種類によっては限定されない。さらに言えば、数多くのさまざまな支持体を用いることができ、それらは当業者に知られている。固相支持体には、シリカゲル、樹脂、誘導体化されたプラスチック薄膜、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲルが含まれる。本明細書で用いる「固体支持体」には、抗原提示用合成基質、細胞およびリポソームも含まれる。適した固相支持体は、望ましい最終用途および種々のプロトコールに対する適合性に基づいて選択しうる。例えば、ペプチド合成を目的とする場合、固相支持体は、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ Ｉｎｃ．（Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ、ＰＡ）、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ、ＣＡ）などから販売されているＰＡＭ樹脂）、ＰＯＬＹＨＩＰＥ（登録商標）樹脂（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ、Ｃａｎａｄａから販売）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．から販売）、ポリエチレングリコールによるグラフト化を施したポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）、Ｒａｐｐ Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）またはポリジメチルアクリルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｎｏｖａｔｏ、ＣＡから販売）などの樹脂を指すと思われる。
【００４５】
「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、任意の長さのヌクレオチド重合体を指して互換的に用いられる。ポリヌクレオチドには、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび／またはそれらの類似体が含まれうる。ヌクレオチドは任意の三次元構造をとってよく、既知または未知の任意の機能を果たすものでよい。「ポリヌクレオチド」という用語には、例えば、一本鎖、二本鎖および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。核酸分子には修飾核酸分子も含まれうる。
【００４６】
「ペプチド」という用語は、２つまたはそれ以上のサブユニットのアミノ酸を有する化合物、アミノ酸類似体またはペプチド模倣物を指して広義に用いられる。サブユニットはペプチド結合によって連結されたものでよい。もう１つの態様において、サブユニットは他の結合、例えばエステル結合、エーテル結合などによって連結されたものでもよい。本明細書で用いる「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤ型またはＬ型光学異性体の両方、ならびにアミノ酸類似体およびペプチド模倣物を含む、天然型および／または非天然型もしくは合成型のアミノ酸を指す。３個またはそれ以上のアミノ酸を有するペプチドは、ペプチド鎖が短ければ一般にオリゴペプチドと呼ばれる。ペプチド鎖が長い場合には、ペプチドは一般にポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００４７】
「遺伝的に改変された」という用語は、細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型を変化させる外来性の遺伝子または核酸配列を含有および／または発現することを意味する。言い換えれば、これは細胞の内因性ヌクレオチドに対する何らかの付加、除去または破壊を指す。
【００４８】
本明細書で用いる「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されてペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質へと翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、適切な真核生物宿主が選択されれば、発現にはｍＲＮＡのスプライシングが含まれうる。発現に必要な調節因子には、ＲＮＡポリメラーゼと結合するためのプロモーター配列およびリボソーム結合のための転写開始配列が含まれる。例えば細菌発現ベクターは、ｌａｃプロモーターなどのプロモーター、ならびに転写開始のためのシャイン−ダルガルノ配列および開始コドンＡＵＧを含む（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前記）。同様に、真核生物発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための異種または同種プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソーム解離のための終止コドンを含む。このようなベクターは市販のものを購入することもでき、または当技術分野で周知の方法、例えばベクターの一般的な構築のための下記の方法に記載された配列によって構成することもできる。
【００４９】
「遺伝子またはポリヌクレオチドのライブラリー」とは、関心対象の抗原（ポリペプチド）をコードする遺伝子を含むことが疑われる細胞または組織から単離されたヌクレオチド配列のライブラリーのことである。
【００５０】
「ペプチドライブラリー」とは、ランダムなアミノ酸（ペプチド）配列のコンビナトリアルライブラリーのことである。
【００５１】
「配列モチーフ」という用語は、一群の分子（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）に存在するパターンを指す。例えば、１つの態様において、本発明は、抗原に存在するペプチド中の配列モチーフの同定を提供する。この態様において、典型的なパターンは、疎水性、親水性、塩基性、酸性などの特徴的なアミノ酸残基によって特定されうる。
【００５２】
「転写制御下にある」は、当技術分野でよく知られた用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常はＤＮＡ配列の転写が、転写の開始またはその促進に寄与する因子とそれが機能的に（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）結合することに依存することを意味する。「機能的に結合した（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」とは、複数の因子が機能しうるような配置で並列していることを指す。
【００５３】
「ハイブリダイゼーション」とは、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成する反応のことを指す。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対合、フーグスティーン結合または任意の他の配列特異的な様式で生じるものでよい。複合体には、二重鎖構造を形成する２本のストランド、多重鎖複合体を形成する３本またはそれ以上のストランド、またはこれらの任意の組み合わせが含まれうる。ハイブリダイゼーション反応が、ＰＣＲ反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断などのように、より大規模な工程の一段階である場合もある。
【００５４】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には以下のものが含まれる：インキュベーション温度が約２５℃〜約３７℃；ハイブリダイゼーション用緩衝液の濃度が約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度が約０％〜約２５％；洗浄液が約６×ＳＳＣ。中等度のハイブリダイゼーション条件には以下のものが含まれる：インキュベーション温度が約４０℃〜約５０℃；緩衝液濃度が約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度が約３０％〜約５０％；洗浄液が約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣ。高ストリンジェンシー条件の例には以下のものが含まれる：インキュベーション温度が約５５℃〜約６８℃；緩衝液濃度が約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣ；ホルムアミド濃度が約５５％〜約７５％；洗浄液が約１×ＳＳＣ、０．１×ＳＳＣまたは脱イオン水。一般に、ハイブリダイゼーション用のインキュベーション時間は５分間〜２４時間であり、これに１回、２回またはそれ以上の洗浄の段階が伴い、洗浄用のインキュベーション時間は約１、２または１５分間である。ＳＳＣとは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液のことである。他の緩衝系を用いるＳＳＣの同等物も用いうることは認識されている。
【００５５】
「主要組織適合遺伝子複合体」または「ＭＨＣ」という用語は、Ｔ細胞に対する抗原提示および急性移植片拒絶反応のために必要な細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体を指す。ヒトでは、ＭＨＣ複合体はＨＬＡ複合体としても知られている。ＭＨＣ複合体によってコードされるタンパク質は「ＭＨＣ分子」として知られており、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子に分類される。クラスＩ ＭＨＣは、β２−ミクログロブリンと非共有的に結合した、ＭＨＣにコードされたα鎖から構成されるヘテロ二量体膜タンパク質を含む。クラスＩ ＭＨＣ分子はほとんどすべての有核細胞によって発現され、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する抗原提示に働くことが示されている。ヒトにおけるクラスＩ分子にはＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃが含まれる。クラスＩＩ ＭＨＣ分子も、非共有的に会合したα鎖およびβ鎖からなるヘテロ二量体膜タンパク質を含む。クラスＩＩ ＭＨＣ分子はＣＤ４＋Ｔ細胞で働くことが知られており、ヒトではＨＬＡ−ＤＰ、ＨＬＡ−ＤＱおよびＨＬＡ−ＤＲが含まれる。
【００５６】
「自己の」または「自家の」という用語は、本明細書で用いる場合、細胞の由来を指す。この用語は、細胞試料が同じ対象、または対象と遺伝的に同一なドナーに由来することを示す。自己細胞は自己細胞の子孫であってもよい。この用語は、異なる細胞種の細胞が同じ対象または対象と遺伝的に同一なドナーに由来することも示す。
【００５７】
同様に、「同種の」という用語も細胞の由来を指す。この用語は、細胞試料が対象と遺伝的に同一でないドナーに由来することを示す；特にこの用語は、発現されたＭＨＣ分子の非同一性に関する。同種細胞は同種細胞の子孫であってもよい。この用語は、異なる細胞種の細胞が対象と遺伝的に同一でないドナーに由来することも示す。
【００５８】
「遺伝子送達媒体（ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｈｉｃｌｅ）」は、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞内に運ぶことができる任意の分子と定義される。遺伝子送達媒体の例には、リポソーム、天然重合体および合成重合体を含む生体適合性ポリマー；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；ならびに細菌、バキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルスなどのウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター、ならびに種々の真核生物および原核生物宿主における発現を目的として記載されており、遺伝子治療ならびに単なるタンパク質の発現にも用いうる、当技術分野で一般に用いられる他の組換え媒体がある。
【００５９】
本明細書で用いる「遺伝子送達」「遺伝子導入（ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ）」などは、外因性ポリヌクレオチド（時に「導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）」と呼ばれる）の宿主細胞への導入を指す用語であり、これは導入のために用いる方法を問わない。このような方法には、ベクターを介した遺伝子導入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または種々の他のタンパク質もしくは脂質を主体とする遺伝子送達複合体による）などの種々のよく知られた技法、さらには「裸の（ｎａｋｅｄ）」ポリヌクレオチドの送達を促す技法（電気穿孔、「遺伝子銃」による送達、およびポリヌクレオチドの導入に用いられる種々の他の技法など）が含まれる。導入されたポリヌクレオチドは宿主細胞内に安定的または一時的に維持される。安定的な維持には一般に、導入されたポリヌクレオチドが宿主細胞に適合した複製起点を含むこと、または導入されたポリヌクレオチドが染色体外レプリコンなどの宿主細胞のレプリコン（例えば、プラスミド）もしくは核もしくはミトコンドリアの染色体に組み込まれることが必要である。当技術分野で知られており、本明細書でも説明するように、多数のベクターが遺伝子の哺乳動物細胞への導入を媒介しうることが知られている。
【００６０】
「ウイルスベクター」は、インビボ、エクスビボまたはインビトロで宿主細胞内に送達しようとするポリヌクレオチドを含む、組換えによって作製したウイルスまたはウイルス粒子と定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターなどが含まれる。遺伝子導入がレトロウイルスベクターによって媒介される状況において、ベクター構築物とは、レトロウイルスゲノムまたはその一部および治療用遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。本明細書で用いる「レトロウイルスを介した遺伝子導入」または「レトロウイルス形質導入」は同じ意味であり、細胞内に侵入してそのゲノムを宿主細胞ゲノムに組み込むウイルスによって遺伝子または核酸配列が宿主細胞内に安定的に導入される過程を指す。ウイルスはその通常の感染機構によって宿主細胞内に侵入させてもよく、または異なる宿主細胞表面受容体またはリガンドと結合して細胞内に侵入するようにウイルスを改変させることもできる。本明細書で用いるレトロウイルスベクターとは、ウイルス性またはウイルス様の侵入機構によって外因性核酸を細胞内に導入することができるウイルス粒子を指す。
【００６１】
レトロウイルスはその遺伝情報をＲＮＡの形態で有している；しかし、ひとたびウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡは逆転写されてＤＮＡ形態となり、それが感染細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれる。組み込まれたＤＮＡ形態はプロウイルスと呼ばれる。
【００６２】
遺伝子導入がアデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのＤＮＡウイルスベクターによって媒介される状況において、ベクター構築物とは、ウイルスゲノムまたはその一部および導入遺伝子を含むポリヌクレオチドを指す。アデノウイルス（Ａｄ）は特徴が比較的明らかになっている同種のウイルス群であり、これには５０種を上回る血清型が含まれる。例えば、国際公開公報第９５／２７０７１号を参照。Ａｄは増殖が容易であり、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。組換えＡｄ由来のベクター、特に組換え能力および野生型ウイルスの発生能力を低下させたものも構築されている。国際公開公報第９５／００６５５号および国際公開公報第９５／１１９８４号を参照。野生型ＡＡＶは、感染性および宿主細胞のゲノムに組み込まれる特異性が高い。ヘルモナート（Ｈｅｒｍｏｎａｔ）およびムジチェカ（Ｍｕｚｙｃｚｋａ）（１９８４）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６４６６〜６４７０ならびにレブコウスキ（Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ）ら（１９８８）、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８：３９８８〜３９９６を参照。
【００６３】
プロモーター、および内部にポリヌクレオチドを機能的に結合させることが可能なクローニング部位の両方を含むベクターが当技術分野では知られている。このようなベクターにはＲＮＡをインビトロまたはインビボで転写する能力があり、これらはストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）社（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）およびプロメガバイオテク（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）社（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）などの供給元から市販されている。発現および／またはインビトロ転写を最適化するために、不適切な選択的翻訳開始コドンとなる可能性のある余分なもの、または転写もしくは翻訳のレベルで発現の障害もしくは低下を招く可能性のある他の配列を除去する目的で、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加または変更することが必要なこともある。または、発現を増強するために開始コドンのすぐ５’側にコンセンサス型リボソーム結合部位を挿入することもできる。
【００６４】
遺伝子送達媒体には、ＤＮＡ／リポソーム複合体および標的指向性ウイルスタンパク質−ＤＮＡ複合体を含む、いくつかの非ウイルス性ベクターも含まれる。標的指向性抗体またはその断片をも含むリポソームを本発明の方法に用いることができる。細胞への送達を強化するために、本発明の核酸またはタンパク質を細胞表面抗原、例えば、ＴＣＲ、ＣＤ３またはＣＤ４と結合する抗体またはその結合性断片と結合させることが可能である。
【００６５】
ポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチドの領域）が別の配列に対してある一定の比率（例えば、８０％、８５％、９０％または９５％）の「配列同一性または相同性」を有するとは、整列化して２つの配列を比較した場合にその比率の塩基（またはアミノ酸）が同一であることを意味する。この整列化および相同性または配列同一性の比率は、当技術分野で知られたソフトウエアプログラム、例えば「分子生物学における最新プロトコール（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）」（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）、補遺３０、セクション７．７．１８、表７．７．１に記載されたものを用いて決定することができる。整列化にはデフォルトのパラメーターを用いることが好ましい。好ましい整列化プログラムの１つは、ＢＬＡＳＴをデフォルトのパラメーターで用いるものである。特に好ましい整列化プログラムは、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰを以下のデフォルトのパラメータで用いるものである：遺伝子コード＝標準；フィルター＝なし；ストランド＝両方；カットオフ値＝６０；期待値＝１０；マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート順＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複性、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ジェンバンクＣＤＳ翻訳物（ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ ｔｒａｎｌａｔｉｏｎｓ）＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は以下のインターネットアドレスで見ることができる：ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００６６】
本明細書で用いる「インビボ」遺伝子送達、遺伝子導入、遺伝子治療などは、外因性ポリヌクレオチドを含むベクターをヒトまたは非ヒト哺乳動物などの生物体の体内に直接導入し、それによって外因性ポリヌクレオチドがこのような生物体の細胞にインビボで導入されることを指す用語である。
【００６７】
「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片が自然下で通常付随している細胞性およびその他の成分から分離されたことを意味する。例えば、ポリヌクレオチドの場合、単離されたポリヌクレオチドとは、染色体内でそれに通常付随する５’および３’配列から分離されたものである。当業者には明らかと思われるが、天然のものでないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片を、それをその天然の相当物と区別するために「単離」する必要はない。加えて、「濃縮された」「分離された」または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片は、濃度または容積当たりの分子数が、その天然の相当物が「濃縮された」ものよりも高い、または「分離された」ものよりも低いという点で、その天然の相当物と区別可能である。その一次配列または例えばそのグリコシル化パターンが天然の相当物と異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはそれらの断片は、その一次配列またはグリコシル化パターンなどの別の特徴によってその天然の相当物と区別できるため、単離された形態で存在する必要はない。本明細書に開示する発明のそれぞれに対して明示的には述べないが、以下に開示する組成物および適切な条件下でのそれぞれに関する、上記の態様のすべてが本発明によって提供されることは理解される必要がある。したがって、天然のものでないポリヌクレオチドは、単離された天然のポリヌクレオチドとは別の態様として提供される。細菌細胞で産生されるタンパク質は、自然下でそれが産生される真核細胞から単離された天然のタンパク質とは異なる態様として提供される。
【００６８】
「対象」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、マウス、サル、ヒト、家畜、競技動物およびペットが非制限的に含まれる。
【００６９】
「対照」とは、比較を目的として実験に用いられる別の対象または試料のことである。対照は「陽性」でも「陰性」でもよい。例えば、実験の目的が遺伝子の発現レベルの変化と特定の種類の癌との相関を明らかにすることである場合には、陽性対照（このような変化を有し、その疾患に特徴的な症候群を呈している対象、または対象からの試料）および陰性対照（発現の変化およびその疾患の臨床的症候群がみられない対象、または対象からの試料）を用いることが一般に好ましい。
【００７０】
「癌」「新生物」および「腫瘍」という用語は、互換的に単数形または複数形として用いられ、宿主生物に対して病的なものとなる悪性形質転換が起こった細胞を指す。原発性癌細胞（すなわち、悪性形質転換が起こった部位の付近から得られる細胞）は、十分に確立された技法、特に組織学的検査により、非悪性細胞と容易に区別することができる。本明細書で用いる癌細胞の定義には、原発性癌細胞だけでなく、癌細胞の祖先に由来するあらゆる細胞が含まれる。これには、転移した癌細胞、ならびに癌細胞に由来するインビトロ培養物および細胞株が含まれる。固形腫瘍として通常発現する種類の癌を言及する場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍とは、ＣＡＴスキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波または触診などの手法により、腫瘍塊に基づいて検出可能なもののことである。生化学的または免疫学的所見のみではこの定義を満たすには不十分である。
【００７１】
「免疫処置」または「ワクチン接種」とは、抗原に対する免疫応答を増強または活性化することを意味する。これは異常の除去または根絶を必要とはしておらず、抗原に対する免疫応答が臨床的に好ましい様式で増強されることを考えている。
【００７２】
対象における腫瘍の増殖を「抑制すること」または「腫瘍負荷を軽減すること」とは、対照に比べて増殖状態が抑制されていることを意味する。腫瘍細胞の増殖は、腫瘍の大きさの測定、腫瘍細胞が増殖しているか否かの３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ法を用いた判定、または腫瘍細胞数の算定を非制限的に含む、当技術分野で知られた任意の手段によって評価しうる。腫瘍細胞の増殖を「抑制する」とは、以下の状態のいずれかまたはすべてを意味する：腫瘍増殖の緩徐化、遅延および「抑制」とは、腫瘍の増殖が停止した場合に抑制される増殖状態、ならびに腫瘍の縮小を示す。
【００７３】
「培養すること」という用語は、さまざまな種類の培地上または培地中における、細胞または生物体のインビトロ増殖を指す。培養下で増殖した細胞の子孫が親細胞と（形態的、遺伝的または表現型的に）完全に同一でない場合があることは知られている。「増殖した（ｅｘｐａｎｄｅｄ）」とは、細胞の何らかの増殖または分裂を意味する。
【００７４】
「組成物」とは、活性物質と、不活性な（例えば、検出可能な物質または標識）もしくはアジュバントなどの活性のある別の化合物または組成物とを組み合わせたものを意味する。
【００７５】
「薬学的組成物」には、活性物質と、インビトロ、インビボまたはエクスビボでの診断的使用または治療的使用に組成物を適合させる不活性または活性のある担体とを組み合わせたものが含まれる。
【００７６】
本明細書で用いる「薬学的に許容される担体」という用語には、リン酸緩衝食塩液、水、および水中油型または油中水型乳剤などの乳剤、ならびにさまざまな種類の湿潤剤が含まれる。組成物は安定剤および保存料も含みうる。担体、安定剤およびアジュバントの例については、マーチン（Ｍａｒｔｉｎ）、「レミントンの薬学（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭ． ＳＣＩ．）」第１５版（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ． Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ（１９７５））を参照されたい。
【００７７】
「有効量」とは、有益な、または望ましい結果をもたらすのに十分な量のことである。有効量は１回または複数回の投与、適用または用量として投与することができる。
【００７８】
「血清」試料とは、流血中抗体および他の可溶性タンパク質を含む、血液の液相または血漿（対象から採取したもの）を指す。１つの好ましい局面において、血清試料は関心対象の表現型と相関する抗体またはタンパク質を含む。１つの局面において、「関心対象の表現型」とは、特定の疾患状態のことである。もう１つの局面において、「関心対象の表現型」は、特定の治療に対する免疫応答と相関する抗体またはタンパク質の存在を特徴とする。
【００７９】
「反応性」対象血清（抗血清）」とは、治療後に望ましい反応を示す対象から入手したポリクローナル血清試料を、同様の対象、例えば同じ治療を受けたが望ましい反応を示さない対象から単離または入手した反応性ポリクローナル血清試料、すなわち「非反応性対象血清」と対比させて指すものである。１つの局面において、反応性対象からの血清は、臨床的または準臨床的な反応を示す対象から得られる。
【００８０】
抗原性ポリペプチド、およびポリペプチドを特異的に認識してそれと結合する抗体は、治療薬として有用な可能性がある。しかし、免疫療法または薬物療法の有効な標的となるのは、抗原を含むまたは抗原を含む可能性のある細胞によって発現される抗原性ポリペプチドのサブセットに過ぎない。抗原性ペプチドおよび関連した抗体を同定するための現在の方法は、その有用性の可能性に基づいて抗原を選択するものではない。本発明は、血清抗体を特異的に認識してそれと結合する、関心対象の表現型と相関するポリペプチドを同定するための方法であって、該当する１つまたは複数の細胞または組織において差異を伴って発現される特徴づけられた遺伝子のリストおよび特徴づけられたポリペプチドのリストに共通するポリペプチドを同定し、それによって前記関心対象の表現型と相関する前記ポリペプチドを同定することを含む方法を提供することにより、その有無が望ましい反応または表現型と関連する抗原性ポリペプチドを選択するための手段を提供する。血清抗体は２つまたはそれ以上の関心対象の表現型から選択される。１つの局面において、これは所定の表現型に従って比較する対象からの血清を選択することによって行われ、すなわち、それらは例えば癌ワクチンによる治療に対する異なる反応というように、互いに共通する表現型における差異を発現する。続いて、特徴づけられた遺伝子発現データを入手し、抗原またはポリペプチドおよびリストに共通する特徴の同定および適用によってリストを入手する。例えば、治療を受けた癌患者から血清抗体を選択する場合には、関心対象の抗原を発現することが疑われる種類の細胞または組織から選択され、遺伝子発現データが入手可能であって特徴づけられている抗原を、まず抗体との結合能によって特徴づける（例えば、ウエスタンブロットにより）。これによって抗原の分子量も得られると思われる。関心対象の抗原に共通する他の共通した特徴により、発現される遺伝子配列のデータベースをさらに選択または限定することが可能であり、このような特徴を決定するための方法は本明細書中に提供している。
【００８１】
第２のリストは、異なってはいるものの、関連性のあるタンパク質データ、例えば分子量、酵素消化パターンおよび光などから作成する。これらの性質は抗原性ペプチドに共通しており、その性質は、適切な試料から別の抗原を単離することおよび本明細書に提供の方法を用いることによって決定することができる。
【００８２】
これらのリストを比較し、関連するまたは共通する表現型情報と関連づけた別のリストに基づいて、各リストに共通する少なくとも１つのポリペプチドを同定する。選択基準に基づき、このポリペプチドは、あらかじめ選択した表現型を有する対象から単離した血清抗体と結合する。
【００８３】
インビボまたはインビトロで作製したポリクローナル試料の選択
１つの局面において、望ましい反応は治療後に観察される。もう１つの局面において、望ましい反応は治療を行っていない対象で観察される。
【００８４】
本明細書で用いる「治療」または「治療法」とは、宿主または対象における反応を増強する、または活性化する介入行為を意図している。いくつかの局面において、治療反応は臨床的反応であるが、準臨床的反応も同じく本発明の範囲に含まれる。反応につながる可能性のある治療には、抗生物質療法、抗ウイルス療法、ワクチン接種、免疫処置、薬物療法（例えば、低分子）化学療法、放射線療法、一次手術の奏功による疾患の解消、抗体療法、受動的免疫療法、能動的免疫療法、養子免疫療法などが非制限的に含まれる。
【００８５】
治療反応は、治療する対象および治療の目的によって異なると考えられる。その例には、体液性および細胞性免疫応答、抗抗原抗体の産生、抗原を提示する細胞を溶解すると考えられる抗原に対して特異的な細胞傷害性Ｔ細胞の生成、非特異的な先天性免疫応答、例えば、ＮＫ細胞、食細胞またはマクロファージの活性化が含まれる。免疫応答が誘導されたか否かを判定するための方法は当技術分野で周知である。例えば、抗原特異的抗体は、固定化された抗原（またはエピトープ）に対する抗体の結合を、検出可能な標識がなされた二次抗体（例えば、酵素標識したマウス抗ヒトＩｇ抗体）で検出するＥＬＩＳＡを非制限的に含む、当技術分野で知られたさまざまな免疫アッセイ法を用いて検出することができる。抗原に対して特異的な免疫エフェクター細胞は、ＦＡＣＳ、５１Ｃｒ放出アッセイ法または３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ法を非制限的に含む、当業者に知られたいかなるさまざまなアッセイ法で検出することができる。
【００８６】
本発明の１つの局面においては、ポリクローナル抗体をを含む血清試料を２例またはそれ以上の反応性対象から単離する。１つの局面においては、後に治療しようとする２例またはそれ以上の対象から、抗体を含む試料を単離する。治療後の血清試料を２例またはそれ以上の対象から単離する。例えば、所定の治療に対して「反応性」であった対象および所定の治療に対して「非反応性」であった対象の両方から、対象のそれぞれの免疫応答を表現型的に区別しうる。この例では、反応性対象によって生じる望ましい反応が治療的免疫応答である。
【００８７】
本発明のさらに別の局面では、治療用の抗原および抗体の分析および同定のための表現型的に異なる血清試料を、対象試料のインビボまたはインビトロでのスクリーニングによって得ることができる。その例は本明細書で提供する。
【００８８】
本方法は、結合抗体のポリクローナル集団をインビトロで得るために腫瘍細胞、腫瘍細胞膜または腫瘍細胞からの遊離抗原（ｓｈｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）に対してパニングを行ったコンビナトリアル抗体ライブラリー（抗体ファージ）を用いて、インビトロで入手した試料により行うこともできる。広在性抗原を認識する汎反応性抗体を除去するために上記の方法を正常細胞に用いてポリクローナル抗体を吸収し、その後インビトロまたはインビボで、濃縮した（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）抗体の集団により標的細胞の挙動が修飾されることを調べる。
【００８９】
標的ペプチドの選択および調製
血清抗体およびそのポリペプチド標的抗原を同定するために、抗原またはポリペプチドを含むことが疑われる標的試料／細胞からのタンパク質（ポリペプチド）調製物を全細胞または組織可溶化物から単離する。または、多くの関連性のある抗体標的は細胞表面に天然に存在することから、細胞表面タンパク質が豊富に存在する膜である原形質膜（例えば、膜タンパク質）を用いることもできる。さらにまた、頂側および側底部の細胞膜タンパク質のみの選択的調製物を用いることもできる。
【００９０】
全細胞可溶化物、膜調製物または標的試料の濃縮調製物の内部のタンパク質を、例えば電気泳動による分子量に従って、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルなどのタンパク質ゲル上に配置または分離する。アッセイしようとする血清試料のそれぞれに対して１つずつ、標的試料の同一なアレイを作製する。タンパク質を分離した後に、ニトロセルロース、ビーズなどの固体支持体または液体担体といった適したアッセイ用媒体に移す。タンパク質を操作するための技法は当業者に周知である。このような技法の具体的な詳細は、「分子生物学における最新プロトコール（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）」（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編（１９８７））および「酵素学の方法（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ）」シリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）に記載されている。
【００９１】
血清ポリペプチドの単離
本発明の１つの局面では、抗体−抗原結合の検出および／または測定のための標準的な免疫学的アッセイ法を用いて、各々の血清試料を次に、後述の通りに調製した標的試料の別個のアレイに対して個別かつ独立にアッセイする。ウエスタンブロット分析はこのような方法のよく知られた一例である。
【００９２】
続いて、抗体の機能を損なわないようにニトロセルロースから血清抗体を回収または溶出させるため、マー（Ｍａａ， Ｊ．Ｓ．）ら（１９９０）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１５６９〜１５７７の方法の変法を用いる。しかし、機能を失うことなく抗体を採取する任意の方法が使用できる。
【００９３】
血清ペプチドの濃縮
抗原の同定のために別の抗原性ペプチドの単離が必要なこともある。別の抗原は免疫化学的技法を用いて単離することができる。本発明の１つの局面では、抗体を用いて、発現している標的試料／細胞株から抗原を免疫沈降させる。当業者は関心対象のタンパク質を同定するために用いうるさまざまな技法に精通している。例えば、免疫沈降のための方法は、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）編（１９８８）および（１９９９）（前記）に記載されている、または本明細書で後述する直接的および／もしくは間接的方法による。
【００９４】
同定スクリーニング
抗原は以下のものからなる群より選択されるさまざまな技法を用いて同定しうる：１）直接シークエンシング、２）直接シークエンシングおよび遺伝子またはポリヌクレオチドのデータベースとの比較、３）アミノ酸配列のコンビナトリアルペプチドライブラリー（オンビーズおよびオフビーズ）との比較；４）ペプチドライブラリー（オンビーズおよびオフビーズ）による免疫沈降、シークエンシングおよび遺伝子またはポリヌクレオチドのデータベースとの比較、５）ペプチダーゼ消化、質量分析、ならびに既知および以前に特徴づけられたタンパク質のデータベースとの比較、ならびに６）質量分析ならびに既知および以前に特徴づけられたタンパク質のデータベースとの比較。
【００９５】
ポリペプチドライブラリーのスクリーニング
いくつかの態様では同定の前に、単離した血清抗体を、関心対象の抗原を含むことが疑われる試料から選択したペプチドの第２のパネルまたはライブラリーに対して標準的な免疫化学的技法を用いてスクリーニングする。これらの方法は当技術分野で知られており（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前記、ならびにハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８）および（１９９９）前記）、または以下に述べる。これらのアッセイ法は本明細書に記載の阻止抗体を用いて直接行うことができる。
【００９６】
または、ランダムペプチドのコンビナトリアルライブラリーを用いることもできる。さらにもう１つの態様では、関心対象の抗原が存在する確率を高めるためにライブラリーをあらかじめ選択しておく。
【００９７】
「遺伝子」に基づく同定
単離したペプチドのポリヌクレオチド配列は、従来のシークエンシング法または市販の材料を用いて得ることができる。ペプチドはペプチドライブラリーに対する第２のスクリーニングの後に得ることができる。ほとんどの場合、ペプチドの配列はエピトープを含むタンパク質を同定するには不十分である。本発明は、配列を特徴づけられた発現ポリヌクレオチド配列のデータベースと比較することによる、タンパク質を同定するための手段を提供する。
【００９８】
タンパク質を同定するために用いられる最も適したデータベースは、同じまたは類似の表現型を呈する標的試料、標的細胞株または細胞または組織から得られたものである。「標的試料」または「標的細胞株」という用語は、それと関連する遺伝子発現プロファイルデータを有する生物試料を意図している。例えば、標的試料は、関連する遺伝子発現プロファイルを有する正常組織試料、異常試料、腫瘍試料または細胞株でありうる。ＤＮＡおよびタンパク質のデータベースには有料のもの（Ｉｎｃｙｔｅ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ＵＳＡ）、公開されているもの（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ／；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ；／ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ；ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／）があり、新規に作ることもできる。
【００９９】
または、差異を伴って発現されるポリヌクレオチドを同定するために当技術分野で知られた任意の方法を用いることもでき、それぞれを本発明の方法に用いることができる。本明細書で用いる「ポリヌクレオチド断片」という用語には、ＳＡＧＥタグ（米国特許第５，６９５，９３７号に記載）のほか、定量的／相対的な遺伝子発現データが得られる任意の方法によって入手した任意の他の核酸が含まれる。このような方法には、ｃＤＮＡサブトラクション法、ディファレンシャルディスプレイ法および発現配列タグ法が非制限的に含まれる。ｃＤＮＡサブトラクション法またはディファレンシャルディスプレイ法に基づく技法は、２種類の細胞間の遺伝子発現の差異を比較するのに特に有用なことがある（Ｈｅｄｒｉｃｋら（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３０８：１４９；ならびにＬｉａｎおよびＰａｒｄｅｅ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７）。ノーザンブロット法、ＲＮアーゼ保護および逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析（Ａｌｗｉｎｅら（１９７７）ＰＮＡＳ ７４：Ｐ５３５０；Ｚｉｎｎら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３４：８６５；およびＶｅｒｅｓら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：４１５）のような発現配列タグ（ＥＳＴ）のアプローチは遺伝子発見に有意義なもう１つのツールである（Ａｄａｍｓら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６５１）。さらにもう１つの方法は、ディファレンシャルディスプレイ法をリアルタイムＰＣＲおよびリプレゼンテーショナルデファレンス分析（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎａｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）と組み合わせたものである（ＬｉｓｉｔｉｓｙｎおよびＷｉｇｌｅｒ（１９９５）Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２５４：２９１）。
【０１００】
常に明示的に述べるとは限らないが、遺伝子またはポリヌクレオチドのデータベースの元となり、配列比較に用いるための標的試料／細胞の選択は、治療しようとする各々の適応症、例えば癌、自己免疫疾患、ウイルス症または寄生虫症によって異なると理解される必要がある。例えば、適応症がウイルス性である場合には、選択した標的試料／細胞を、非感染状態および関心対象ウイルスで感染させた状態の両方でアッセイする。感染した標的試料／細胞の別の試料をアッセイに含めてもよい。例えば、ウイルス感染のさまざまな段階（ｓｔａｇｅ）を代表する時間経過を伴って感染させた標的試料は、最初期、遺伝子発現の定常的および後期といった、感染の時間的成分を観測および検出するのに有用である。
【０１０１】
データベースと比較するアミノ酸配列の長さが短い場合には、検索手順を容易にするために、クエリー配列の実体を検索するためのあらかじめ選択した配列決定済みのアミノ酸配列があれば便利である。あらかじめ選択するタンパク質のセットは、標的試料によって発現される遺伝子の具体的なセットに関する情報、および血清試料中にのみ存在する抗体と一意的に反応するタンパク質の特徴を用いて作ることができる。
【０１０２】
対応する天然のエピトープの配列と同一であるのは選択した抗体反応性ペプチドの配列の一部に過ぎない可能性があるため、天然のエピトープに関するスクリーニングの際にはあらかじめ選択したポリペプチド配列の群を用いるのが有益である。これにより、同定される抗原性ペプチドと部分的な相同性がある無関係な配列が除去されるため、スクリーニング工程の効率が高まる。
【０１０３】
ペプチドデータベースによる血清ペプチドの同定
本発明の１つの態様では、血清ペプチドのアミノ酸配列を、既知および以前に特徴づけられたペプチドとの比較によって決定する。
【０１０４】
例えば、エピトープのペプチド配列は、「ファージ法」（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）ＰＮＡＳ ８７：６３７８；およびＤｅｖｌｉｎら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４）、ジャイセン（Ｇｅｙｓｅｎ）の方法（Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３：７０９：およびＧｅｙｓｅｎら（１９８７）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １０２：２５９）、フォドー（Ｆｏｄｏｒ）ら（（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７）の方法、フルカ（Ｆｕｒｋａ）ら（（１９８８）１４ｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ． ５ Ａｂｓｔｒａｃｔ ＦＲ：０１３）；フルカ（（１９９１）Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ． ３７：４８７）；ホートン（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ）（米国特許第４，６３１，２１１号）；およびラター（Ｒｕｔｔｅｒ）ら（米国特許第５，１０１，１７５号）に記載されたアゴニストまたはアンタゴニストであるペプチドを検査するための方法、合成ライブラリーを利用する方法（Ｎｅｅｄｅｌｓら（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：１０７００；およびＬａｍら、米国特許第５，５１０，２４０号）、インデックス付きのコンビナトリアルペプチドディスプレイを利用する方法（Ｏｈｌｍｅｙｅｒら（１９９３）ＰＮＡＳ ９０：１０９２２）およびペプスキャン（ｐｅｐｓｃａｎ）法（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｚｅｅ（１９８９）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９：４３）を非制限的に含む方法によって決定することができる。
【０１０５】
ペプチドライブラリーのスクリーニングを利用する態様では、本発明のペプチドを適切な固相合成手順によって合成することが最も好ましい；スチュワード（Ｓｔｅｗａｒｄ）およびヤング（Ｙｏｕｎｇ）、「固相ペプチド合成（ＳＯＬＩＤ ＰＨＡＳＥ ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）」、Ｆｒｅｅｍａｎｔｌｅ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．（１９６８）。１つの好ましい方法はメリフィールド工程である。メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）（１９６７）Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓ． ２３：４５１を参照。続いて、抗原性エピトープのアミノ酸配列を決定し、標的組織で発現されるあらかじめ選択した配列セット中の複数の遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と比較する。抗体結合ペプチドのアミノ酸配列と配列相同性のある、あらかじめ選択した群の中の遺伝子によりコードされるポリペプチド配列は、血清由来の抗体によって認識されてその抗体と結合する天然のエピトープを規定するものと考えられる。
【０１０６】
対象の血清中の抗体と一意的に反応するポリペプチド中に存在する抗原性エピトープが本明細書に記載の方法を用いて同定される場合には、選択した抗体とそれぞれが反応する複数の抗原性ペプチドをさらに同定することが有益である。抗体のポリペプチド基質との結合は基質の三次元構造に依存し、エピトープ中のすべての残基が抗体分子と直接接触するとは限らないことがしばしばであるため、複数の特異的ペプチド配列が選択した抗体と反応することが判明することもある。同定した複数の抗体結合ペプチドの整列化によってエピトープのコンセンサス配列（または配列モチーフ）の同定が可能となり、それによってタンパク質データベース中の天然のエピトープの同定が容易になる（図３参照）。
【０１０７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ
この態様では、反応性を有することが示された抗体によって認識されるペプチド標的を同定するために、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（「ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ」）を用いる（図５参照）。この局面では、抗体を単離した後、または抗体が中に存在する血清を同定した後に（図５参照）、別のタンパク質ゲルを泳動してペプチドを単離する。バンドを切り出してペプチドを単離し、１つまたは複数の既知および以前に特徴づけられたペプチダーゼで消化することにより、質量分析による分析用に調製する。本明細書で用いる「既知および以前に特徴づけられたペプチダーゼ」という用語は、既知のペプチダーゼ消化による断片が同定され、特徴づけられてカタログ化されている、タンパク質またはペプチドを意図している。
【０１０８】
例えば、シェフチェンコ（Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ， Ａ）ら（２０００）Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ７２：２１３２〜２１４１に記載されたよく知られた手順を用いて、例えば、試料または未知のペプチドをマトリックスと混合し、試料プレート上で乾燥させる。この試料を質量分析計の高真空内に導入する。試料スポットをレーザーで照射し、イオンを気相中に脱離させるとともに、飛行時間を測定する計時装置を開始させる。イオンは電場によって同じ運動エネルギーで加速され、電場内の自由飛行管を浮遊（または飛行）するうちに空中で分離する。イオンはイオンの質量電荷比に依存した異なる時間に検出器に到達する。データシステムが装置のすべてのパラメーターを制御して時間毎のシグナルを獲得することにより、データ処理が可能となる。スペクトル計によって試料のプロファイルが生成され、続いてこれを以前に特徴づけられたタンパク質およびペプチドと比較する。ペプチド質量分析データベースはウェブ上でｈｔｔｐ：／／ｎｔｗａｄｅ／ｈｔｍｌｕｃｓｆ／ｍｓｆｉｔ．ｈｔｍなどから入手可能であり、または内部で作成することもできる。その一致により、反応性を有することが示された抗体によって認識される標的が同定される。
【０１０９】
生物活性の確認
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体、および関心対象のエピトープを含むペプチドを、本発明の方法を用いて調製および単離することができる。
【０１１０】
単離した抗原またはペプチドの機能的活性または妥当性は、よく知られたインビトロまたはインビボの方法を用いて確認することができる。治療的および診断的な有用性は、治療を必要とする対象にペプチドまたは抗原を投与することによって確認される。例えば、ヒト対象からの標的試料／細胞株（遺伝子発現プロファイルが知られているもの）をマウスの免疫処置に用いて、標的試料／細胞によって発現されるポリペプチド抗原に対して特異的な体液性免疫応答を誘発させる。哺乳動物により強い体液性応答を生じさせるための手段は当技術分野で知られている。例えば、免疫処置を受けさせることを選択したマウスが生得的にＴ細胞欠損であること、またはＴ細胞反応を抑制する抗ＣＤ８抗体の投与によってＴ細胞欠損性にすることができる。
【０１１１】
免疫処置によって誘発される体液性免疫応答が防御免疫も付与することを示すための方法は当技術分野で知られており、例えば、ナイーブマウスの一群に対し、免疫処置した（防御された）マウスから入手した抗体を養子移入する。続いて、これらの抗体の投与を受けたナイーブマウスを、標的試料／細胞株および／または他の抗原的に関連のある細胞によって刺激し、それに対する免疫応答をモニタリングする。免疫処置マウスから標準的な技法を用いてモノクローナルおよびポリクローナル抗体を入手してもよい。
【０１１２】
これらの抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を、ヒト腫瘍細胞の増殖を抑制する能力を判定するためにインビトロでアッセイすることもできる。ヒト腫瘍細胞の増殖をインビトロで抑制することが示された抗体の特異性は、本明細書の上に述べた一群の標的試料／細胞株の細胞可溶化物または膜調製物を用いるウエスタンブロット分析によって評価しうる。
【０１１３】
本発明によって同定されたポリヌクレオチド
ポリヌクレオチドを、検出可能なマーカー、例えば、細胞内の核酸および／または遺伝子の発現の検出のための酵素標識または放射性同位体と結合させることができる。当技術分野では、検出可能なシグナルを生じうる蛍光性、放射性、酵素的またはアビジン／ビオチンなどの他のリガンドを含む、多岐にわたる適した検出マーカーが知られている。好ましい態様においては、放射性試薬または他の環境的に望ましくない試薬ではなく、蛍光性標識またはウレアーゼ、アルカリホスファターゼもしくはペルオキシダーゼなどの酵素タグを用いることが望ましいと考えられる。酵素タグの場合には、相補的核酸を含む試料との特異的ハイブリダイゼーションを同定することを目的としてヒトの肉眼または分光法によって観察できる手段を得るのに使用できるとして、比色分析用指標基質が知られている。
【０１１４】
本発明はさらに、一本鎖ポリヌクレオチドまたはその相補物を検出するための方法であって、相補的な一本鎖ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション（好ましくは中等度またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）を許容する条件下またはより好ましくは高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的の一本鎖ポリヌクレオチドを標識した一本鎖ポリヌクレオチド（プローブ）と接触させることによる方法を提供する。ハイブリダイズしたポリヌクレオチド対をハイブリダイズしていない一本鎖ポリヌクレオチドから分離する。ハイブリダイズしたポリヌクレオチド対は、当業者に周知であって、例えばサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）前記に記載された方法を用いて検出される。
【０１１５】
本発明のポリヌクレオチドを、ＰＣＲを用いて増幅することが可能である。ＰＣＲ技術は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、第４，７５４，０６５号および第４，６８３，２０２号の主題であり、「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ＴＨＥ ＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ ＣＨＡＩＮ ＲＥＡＣＴＩＯＮ）」（Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ（１９９４））およびそこに引用された参考文献に記載されている。
【０１１６】
または、当業者が本明細書に提供する配列および市販のＤＮＡ合成装置を用いてＤＮＡを複製することもできる。したがって、本発明は、ポリヌクレオチドの直鎖配列、適切なプライマー分子、酵素などの化学物質、ならびにその複製のため、およびヌクレオチドの化学的な複製または正しい配向での連結によりポリヌクレオチドを入手するための指示を提供することによって、本発明のポリヌクレオチドを入手するための工程も提供する。もう１つの別の態様では、これらのポリヌクレオチドをさらに単離する。またさらに、当業者がポリヌクレオチドを適した複製ベクターに挿入し、このベクターを複製および増幅のために適した宿主細胞（原核または真核）に挿入することもできる。そのようにして増幅したＤＮＡは当業者に周知の方法によって細胞から単離しうる。この方法によってポリヌクレオチドを入手するための工程、ならびにそのようにして入手したポリヌクレオチドも本明細書で提供する。
【０１１７】
ＲＮＡは、まずＤＮＡポリヌクレオチドを適した宿主細胞に挿入することによって入手しうる。ＤＮＡは任意の適切な方法により、例えば、適切な遺伝子送達媒体（例えば、リポソーム、プラスミドまたはベクター）の使用または電気穿孔法によって挿入しうる。細胞が複製してＤＮＡがＲＮＡへと転写される場合には、そのＲＮＡを当業者に周知の方法、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）前記に記載された方法によって単離することができる。例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）前記に記載された手順に従ってｍＲＮＡをさまざまな溶解酵素もしくは化学溶液を用いて単離するか、または製造者によって提供された添付の指示書に従って核酸結合樹脂により抽出することができる。
【０１１８】
特異的ハイブリダイゼーションのために「完全に一致する」プローブが必要なわけではないことが当技術分野では知られている。少数の塩基の置換、欠失または挿入によって生じるプローブ配列のわずかな変化は、ハイブリダイゼーションの特異性に影響を及ぼさない。一般に、２０％程度の塩基対ミスマッチ（最適に整列化した場合）は許容されうる。好ましくは、前記のｍＲＮＡを検出するのに有用なプローブは、同等のサイズの相同領域と少なくとも約８０％同一である。より好ましくは、相同領域の整列化の後に、プローブは対応する遺伝子配列と８５％同一であり；さらにより好ましくは、９０％の同一性を示す。
【０１１９】
これらのプローブは、これらの細胞を含むさまざまな細胞または組織の検出およびモニタリングのためのラジオアッセイ法（例えば、サザンおよびノーザンブロット分析）に用いることができる。本プローブを、１つまたは複数の本発明のポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現の検出を目的とするハイスループットスクリーニングアッセイ法に用いるためのチップなどの固体支持体またはアレイに結合させることもできる。
【０１２０】
本発明はさらに、ＲＮＡ転写のプロモーター、ならびにＤＮＡまたはＲＮＡの複製および／または一時的もしくは安定的な発現のための他の調節配列と機能的に結合した、単離されたポリヌクレオチドも提供する。本明細書で用いる「機能的に結合した」という用語は、プロモーターがＤＮＡ分子からのＲＮＡの転写を指令すると考えられるような様式で配置していることを意味する。このようなプロモーターの例には、ＳＰ６、Ｔ４およびＴ７がある。いくつかの態様では、挿入したポリヌクレオチドの組織特異的発現のために細胞特異的プロモーターを用いる。プロモーターまたはプロモーター／エンハンサー、終止コドンおよび選択マーカー配列、さらには挿入されたＤＮＡ断片がその内部で機能的に結合することが可能なクローニング部位を含むベクターは当技術分野で周知であり、市販されている。一般的な方法およびクローニング戦略については、「遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（Ｇｏｅｄｄｅｌ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．（１９９１））およびそこに引用された参考文献、ならびに種々の適したベクターに関するマップ、機能的性質、販売元およびＧｅｎＥＭＢＬアクセッション番号に対する言及が含まれた「ベクター：エッセンシャルデータシリーズ（Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｄａｔａ Ｓｅｒｉｅｓ）」（ＧａｃｅｓａおよびＲａｍｊｉ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９９４））を参照されたい。これらのベクターはＲＮＡをインビトロまたはインビボで転写できることが好ましい。
【０１２１】
本発明のポリヌクレオチドを含む送達媒体
本発明は、本発明のポリヌクレオチドの細胞内への送達のために適した送達媒体も提供する（インビボ、エクスビボ、またはインビトロで）。本発明のポリヌクレオチドをクローニングベクターまたは発現ベクターの内部に含めることができる。これらのベクター（特に発現ベクター）を、続いて、想定される任意のさまざまな形態、例えば、細胞への送達および／または細胞内への進入を促進すると思われるものへと操作することができる。
【０１２２】
これらの核酸を含む発現ベクターは、タンパク質およびポリペプチドを産生するための宿主ベクター系を得るために有用である。これらの発現ベクターは、エピソームまたは染色体ＤＮＡに組み込まれた部分として宿主生物内で複製可能でなければならないと考えられる。適した発現ベクターには、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター、コスミドなどが含まれる。アデノウイルスベクターは、インビトロおよびインビボともに発現レベルが高く、細胞の形質転換が効率的に行われるため、インビボで遺伝子を組織中に導入するのに特に有用である。核酸を原核または真核細胞などの適した宿主細胞に挿入し、宿主細胞が複製する場合には、タンパク質の組換え産生が可能である。適した宿主細胞はベクターに依存すると考えられるが、これにはよく知られた方法を用いて構築された哺乳動物細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞および細菌細胞が含まれる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）前記を参照。外因性核酸の細胞への挿入のためには、ウイルスベクターの使用に加えて、細菌細胞に対する形質転換；哺乳動物細胞に対するリン酸カルシウム沈降を用いたトランスフェクション；またはＤＥＡＥデキストラン法；電気穿孔法；マイクロインジェクションなどの当技術分野で周知の方法によって宿主細胞に核酸を挿入することもできる。この方法については、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）前記を参照のこと。したがって、本発明は、タンパク質またはポリペプチドまたは抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞、例えば哺乳動物細胞、動物細胞（ラットまたはマウス）、ヒト細胞または細菌細胞などの原核細胞も提供する。
【０１２３】
ベクターをインビボまたはエクスビボでの遺伝子治療のために用いる場合には、複製能の欠損したレトロウイルスまたはアデノウイルスベクターなどの薬学的に許容されるベクターが好ましい。本発明の核酸を含む薬学的に許容されるベクターを、挿入したポリヌクレオチドの一時的または安定的発現のためにさらに改変することができる。
【０１２４】
本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、ポリヌクレオチドの組換え複製のため、および本発明のペプチドの組換え産生のために有用である。または、本発明のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を、本明細書に記載の方法において、対象における免疫応答を誘導するために用いてもよい。
【０１２５】
本発明のポリヌクレオチドの組換え複製のため、および本発明のペプチドの組換え産生のために適した宿主細胞は、原核細胞でも真核細胞でもよい。宿主系は当技術分野で知られており、本明細書で詳細に説明する必要はない。原核宿主には細菌細胞、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）およびマイコバクテリアが含まれる。真核宿主は酵母、昆虫、両生類、植物、Ｃ．エレガンス（またはセンチュウ）および哺乳動物の細胞である。これらの細胞を、プロモーターの誘導のため、形質転換体の選択のため、または望ましい配列をコードする遺伝子を増幅するために適するように改変した従来の栄養培地中で培養する。
【０１２６】
宿主細胞が抗原提示細胞である場合には、それらを用いて腫瘍浸潤性リンパ球などの免疫エフェクター細胞の集団を増殖させることができ、続いてこれを養子免疫療法に用いることができる。抗原提示細胞については以下により詳細に説明する。
【０１２７】
本発明の抗原を提示する宿主細胞
本発明はさらに、本発明の方法によって同定された抗原を提示する、単離された宿主細胞を提供する。いくつかの態様において、これらの宿主細胞は、２つまたはそれ以上の本発明のペプチドを、ペプチドが免疫エフェクター細胞によって認識されるようにＭＨＣ分子と関連して細胞表面に提示する。本発明のポリペプチドをＭＨＣ分子と関連して提示する単離された宿主細胞はその上、教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞の集団の増殖および単離のためにも有用である。免疫エフェクター細胞、例えば細胞傷害性Ｔリンパ球は、ナイーブ免疫エフェクター細胞を、ＡＰＣの表面にＭＨＣ分子と関連してポリペプチドを提示する抗原提示細胞とともに培養することによって生じる。この集団は、ＦＡＣＳ分析またはＦＩＣＯＬＬ（商標）勾配などの当技術分野で知られた方法を用いて精製することができる。免疫エフェクター細胞の作製および培養のための方法、ならびにそれによって生じる集団も本発明者らによる寄与であり、発明である。細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物は養子免疫療法に有用である。インビボでの投与の前に、免疫エフェクター細胞を細胞のターゲティング能力に関してインビトロでスクリーニングする。
【０１２８】
これらの態様のいくつかにおいて、単離された宿主細胞はＡＰＣである。ＡＰＣには、樹状細胞（ＤＣ）、単球／マクロファージ、Ｂリンパ球、または必要なＭＨＣ／補助刺激分子を発現する他の細胞種が非制限的に含まれる。
【０１２９】
いくつかの態様では、免疫エフェクター細胞および／またはＡＰＣを遺伝的に改変する。免疫エフェクター細胞を増殖させる前、最中またはその後に、標準的な遺伝子導入を用いて、補助刺激分子および／または刺激性サイトカインをコードする遺伝子を挿入することができる。
【０１３０】
ＡＰＣは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、全血、または混合集団を含むその画分、脾細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤性リンパ球、白血球分離によって得た細胞、リンパ節、例えば腫瘍の所属リンパ節を非制限的に含む、さまざまな源から入手可能である。適したドナーには、免疫処置ドナー、非免疫処置（ナイーブ）ドナー、処置を受けたまたは受けていないドナーが含まれる。「処置を受けた（ｔｒｅａｔｅｄ）」ドナーとは、１つまたは複数の生物学的修飾物質に曝露されたドナーのことである。「処置を受けていない」ドナーとは、１つまたは複数の生物学的修飾物質に曝露されていないドナーのことである。ＡＰＣにインビトロで１つまたは複数の生物学的修飾物質による処置を行うこともできる。
【０１３１】
ＡＰＣは一般に生細胞であるが、照射したＡＰＣ、マイトマイシンＣで処理したＡＰＣ、弱毒化したＡＰＣ、または化学固定したＡＰＣでもよい。さらに、ＡＰＣが全細胞である必要もない。実際に、ＡＰＣの小胞調製物を用いることができる。
【０１３２】
ＡＰＣは遺伝的に改変することができる、すなわち、通常は発現されないか、または通常はより低いレベルで発現されると考えられるポリペプチドまたはＲＮＡ分子を発現するように、組換えポリヌクレオチド構築物をトランスフェクトすることができる。ポリヌクレオチドの例には、ＭＨＣ分子をコードするもの；Ｂ７などの補助刺激分子；および本発明のペプチドまたはポリペプチドが非制限的に含まれる。
【０１３３】
哺乳動物の体内でインビボで通常はＡＰＣのようには働かない細胞を、それらがＡＰＣとして働くように改変することができる。非常にさまざまな細胞が、適切に改変されればＡＰＣとして働くことができる。このような細胞の例には、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）またはハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）；およびヒト細胞株Ｔ２などの養育細胞が含まれる。例えば、ＭＨＣ分子などの１つまたは複数の抗原提示性ポリペプチドの合成を、選択的にはＢ７などの補助分子との合成とともに指令する発現ベクターをこれらの細胞に導入して、これらの細胞の表面に抗原提示分子、および選択的には補助分子またはその機能的部分を発現させることができる。または、自ら細胞膜に挿入しうる抗原提示ポリペプチドおよび補助分子を用いることもできる。例えば、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）修飾したポリペプチドは自らを細胞膜に挿入可能である。ヒロセ（Ｈｉｒｏｓｅ）ら（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２５０：５８２〜６１４；およびファン（Ｈｕａｎｇ）ら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：６０７〜６１３。補助分子には、ＣＤ２８、ＣＤ８０またはＣＤ８６に対して特異的な抗体などの補助刺激抗体；Ｂ７．ｌおよびＢ７．２を非制限的に含む補助刺激分子；ＩＣＡＭ−１およびＬＦＡ−３などの接着分子；ならびにＦａｓリガンドおよびＣＤ７０などの生存に関係する分子が非制限的に含まれる。例えば、ＰＣＴ出願の国際公開公報第９７／４６２５６号を参照のこと。
【０１３４】
養育（ｆｏｓｔｅｒ）抗原提示細胞はＡＰＣとして特に有用である。養育ＡＰＣは、内因性ペプチドの細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子との会合を制限する抗原プロセシング経路に１つの変異を含む、Ｔ２と呼ばれるヒト細胞株１７４ｘＣＥＭ．Ｔ２から派生する。ツヴェリンク（Ｚｗｅｅｒｉｎｋ）ら（１９９３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：１７６３〜１７７１。これは、ＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＤ８＋ＣＴＬに対する抗原提示のために必要な遺伝子ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ１およびＬＭＰ２を含むＭＨＣクラスＩＩ領域に大きなホモ接合性欠失があるためである。事実上、これらの細胞の表面には「空の（ｅｍｐｔｙ）」ＭＨＣクラスＩ分子のみが提示される。培地に添加した外因性ペプチドは、ペプチドがアレル特異的な結合モチーフを含むならば、これらのＭＨＣ分子と結合する。これらのＴ２細胞を本明細書では「養育（ｆｏｓｔｅｒ）」ＡＰＣと称する。それらは、抗原を提示させるために本発明と組み合わせて用いることができる。
【０１３５】
特定の組換えＭＨＣアレルを用いたＴ２細胞の形質導入により、ＭＨＣ拘束プロファイルのリダイレクション（ｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）が可能となる。係留残基が内因性アレルとの効率的な結合を妨げると思われるため、それらによって、組換えアレルに適合したライブラリーが優先的に提示されると考えられる。
【０１３６】
ＭＨＣ分子の高レベル発現により、ＣＴＬがＡＰＣをさらに認識しやすくなる。強力な転写プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）を用いてＴ２細胞で関心対象のＭＨＣアレルを発現させることにより、より反応性の高いＡＰＣが生じる（これは細胞表面の反応性ＭＨＣ−ペプチド複合体の濃度が高くなるためである可能性が高い）。
【０１３７】
ＡＰＣの単離のための２つの基本的なアプローチを以下に簡単に説明する。これらのアプローチには（１）骨髄前駆物質細胞（ＣＤ３４＋）を血液から単離し、それらを刺激してＡＰＣに分化させること；または（２）あらかじめ分化能が決定された（ｐｒｅｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）ＡＰＣを末梢血から収集すること、が含まれる。第１のアプローチでは、末梢血中の循環ＣＤ３４＋幹細胞の数を増やすためにＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインを患者に投与する必要がある。
【０１３８】
ＡＰＣを単離するための第２のアプローチは、すでに血中を循環している、比較的多数のあらかじめ分化能が決定されたＡＰＣを収集するためのものである。分化能が決定されたＡＰＣをヒト末梢血から単離するための以前の方法は、メトリザミド勾配および付着性／非付着性の段階（Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌら（１９９０）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：７６９８〜７７０２）；パーコール勾配による分離（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら（１９９４）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：９９６〜１００３）；および蛍光励起細胞選別法（Ｔｈｏｍａｓら（１９９３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：６８４０〜５２）などの物理的手順の組み合わせを含んでいた。
【０１３９】
多数の細胞を互いに分離するための技法の１つは対向流遠心エルトリエーション（ＣＣＥ）として知られる。この技法では、細胞を遠心にかけると同時に緩衝液の洗い出し流を加え、その流速を一定割合で速める。緩衝液の対向流が一定割合で増加することにより、主として細胞サイズに基づいて細胞の分取分離がもたらされる。
【０１４０】
本発明の１つの局面において、ＡＰＣはあらかじめ分化能が決定された、または成熟した樹状細胞であり、これはマウス、サルまたはヒトなどの哺乳動物の白血球画分から単離することができる（例えば、国際公開公報第９６／２３０６０号を参照）。白血球画分は哺乳動物の末梢血からのものでありうる。この方法は以下の段階を含む：（ａ）白血球分離などの当技術分野で知られた方法によって哺乳動物源から入手した白血球画分を提供する段階、（ｂ）対向流遠心エルトリエーションにより、段階（ａ）の白血球画分を４つまたはそれ以上の亜画分に分離する段階、（ｃ）段階（ｂ）による１つまたは複数の画分中の単球の樹状細胞への分化を、細胞をカルシウムイオノフォア、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１３またはＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４に接触させることによって刺激する段階、（ｄ）段階（ｃ）からの濃縮した樹状細胞画分を同定する段階、ならびに（ｅ）段階（ｄ）の濃縮画分を好ましくは約４℃で収集する段階。樹状細胞が濃縮した画分を同定するための１つの方法は、蛍光励起細胞分取によるものである。白血球画分を、組換え（ｒｈ）ｒｈＩＬ−１２、ｒｈＧＭ−ＣＳＦまたはｒｈＩＬ−４などの他のサイトカインの存在下でカルシウムイオノフォアにより処理することができる。分離の段階の前に、白血球画分の細胞を緩衝液で洗浄し、Ｃａ＋＋／Ｍｇ＋＋非含有培地中に再懸濁することができる。白血球画分は白血球分離によって入手しうる。樹状細胞は以下のマーカー：ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱまたはＢ７．２の少なくとも１つが存在し、同時に以下のマーカー：ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、５６、５７およびＣＤ１９、２０が存在しないことによって同定可能である。これらの細胞表面マーカーに対して特異的なモノクローナル抗体は市販されている。
【０１４１】
より詳細には、本方法は、白血球分離による白血球および血小板の濃縮収集物を収集し、続いてこれを対向流遠心エルトリエーション（ＣＣＥ）によって分画することが必要である。アブラハムセン（Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ）ら（１９９１）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ６：４８〜５３。細胞試料を特殊なエルトリエーション用ローターの中に入れる。続いてローターを定速、例えば３０００ｒｐｍで遠心する。ローターが望ましい速度に達した時点で、加圧空気を用いて細胞の流速を調節する。エルトリエーター（ｅｌｕｔｒｉａｔｏｒ）内の細胞を遠心にかけると同時に緩衝液の洗い出し流を加え、その流速を一定割合で速める。これにより、細胞サイズに限らないが、主に細胞サイズの違いに基づいた細胞画分分取が行われる。
【０１４２】
ＡＰＣの品質管理、より詳細にはＤＣの収集およびそれが培養下で首尾よく活性化されることの確認は、単球および樹状細胞の亜集団ならびに混入の可能性があるＴリンパ球の両方を観測する同時多色ＦＡＣＳ分析法に依存する。これはＤＣが以下のマーカーを発現しないという事実に基づく：ＣＤ３（Ｔ細胞）；ＣＤ１４（単球）；ＣＤ１６、５６、５７（ＮＫ／ＬＡＫ細胞）；ＣＤ１９、２０（Ｂ細胞）。同時にＤＣは血中を循環している時点で大量のＨＬＡ−ＤＲ、かなりのＨＬＡ−ＤＱおよびＢ７．２を発現する（しかし、Ｂ７．１はわずかであるかまたは皆無である）（加えて、それらは単球および好中球によっても発現される骨髄性マーカーであるＬｅｕ Ｍ７およびＭ９を発現する）。
【０１４３】
ひとたび収集すれば、ＤＣリッチ／単球ＡＰＣ画分（通常１５０〜１９０）をプールして、将来用いるために凍結保存すること、または直ちに短期培養物に加えることが可能である。
【０１４４】
または、樹状細胞を上方制御（活性化）し、単球を活性化された樹状細胞表現型に変換するための方法を報告している者もある。この方法は、カルシウムイオノフォアを培地に添加し、単球を活性化された樹状細胞に変換することを含む。カルシウムイオノフォアＡ２３１８７を例えば培養期間の最初の２４〜４８時間にわたり添加することにより、プールした「単球＋ＤＣ」画分の均一な活性化および樹状細胞表現型への変換が起こる：特徴的なことに、活性化された集団は一様にＣＤ１４（Ｌｅｕ Ｍ３）陰性であり、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７．１およびＢ７．２は上方制御されている。
【０１４５】
サイトカインの特定の組み合わせを用いることにより、カルシウムイオノフォアによって得られる活性化／変換を増幅する（または部分的に代替する）ことが成功している：これらのサイトカインには、精製または組換えヒト（「ｒｈ」）ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、ｒｈＩＬ−２およびｒｈＩＬ−４が非制限的に含まれる。それぞれのサイトカインを単独で与えても最適な上方制御には不十分である。
【０１４６】
抗原提示マトリックスによるポリペプチドの提示
本発明の免疫調節法および診断法に用いるための抗原提示マトリックスは、ＭＨＣ分子と結合した本発明の収束的な抗原性ペプチドリガンドを提示する。任意の既知の方法を、抗原提示マトリックスによる提示を実現するために用いることができる。以下のものは、用いることができる非制限的な例である。
【０１４７】
ポリペプチドは、ポリペプチドもしくはペプチド、またはタンパク質／ペプチドををコードするｃＤＮＡの形態として抗原提示細胞に送達することができる。
【０１４８】
本発明の合成抗原性ペプチドエピトープをＡＰＣに送達するためのもう１つの方法は、パルス刺激（ｐｕｌｓｉｎｇ）によるものである。パルス刺激は、ＡＰＣをインビトロ／エクスビボで本発明の抗原性ポリペプチドまたはペプチドに対して曝露させることによって行うことができる。ポリペプチドまたはペプチドを１〜１０μｍの濃度で約３時間、ＡＰＣに対して添加する。パルス刺激を受けたＡＰＣはその後、静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内または腹腔内の送達経路を介して宿主に投与することができる。
【０１４９】
ポリペプチドを、例えばポリペプチドの一部としてまたは別の高分子との複合体として、アジュバントの存在下または非存在下で、静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内または腹腔内の送達経路を介してインビボにて送達することもできる。
【０１５０】
以下のものを含むさまざまな他の技法を用いることもできる。パグリア（Ｐａｇｌｉａ）ら（１９９６）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８３：３１７〜３２２は、インビトロで総タンパク質とともにインキュベートしたＡＰＣがＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＴＬによって認識されること、およびこれらのＡＰＣによる免疫処置を動物に行うと抗原特異的ＣＴＬのインビボでの発生を招くことを示している。加えて、ＤＣなどのＡＰＣのサイトゾル中での抗原の発現をもたらすいくつかの異なる技法も記載されている。これらには（１）腫瘍細胞から単離したＲＮＡのＡＰＣへの導入、（２）抗原の内因性発現を誘導するための組換えベクターによるＡＰＣの感染、および（３）リポソームを用いたＤＣサイトゾルへの腫瘍抗原の導入（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉら（１９９６）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８４：４６５〜４７２；Ｒｏｕｓｅら（１９９４）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８：５６８５〜５６８９；およびＮａｉｒら（１９９２）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７５：６０９〜６１２）を参照。
【０１５１】
用いうるもう１つの方法は「ペインティング（ｐａｉｎｔｉｎｇ）」と呼ばれている。グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）修飾したタンパク質には精製後に自らを細胞膜に再び組み入れる能力があることが示されている。ヒロセ（Ｈｉｒｏｓｅ）ら（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２５０：５８２〜６１４；メドフ（Ｍｅｄｏｆ）ら、（１９８４）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６０：１５５８〜１５７８；メドフ（Ｍｅｄｏｆ）（１９９６）ＦＡＳＥＢ Ｊ． １０：５７４〜５８６；およびファン（Ｈｕａｎｇ）ら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：６０７〜６１３は、ＣＴＬに対する抗原提示のための特殊な組成のＡＰＣを作り出すためにこの性質を利用した。彼らはβ２−ミクログロブリンおよびＨＬＡ−Ａ２．１アレルに関する発現ベクターを考案した。これらのタンパク質はシュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）Ｓ２キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）細胞で発現され、ＧＰＩ修飾を補助することが知られている。精製の後にこれらのタンパク質を精製した抗原性ペプチドとともにインキュベートしたところ、自らを自己細胞の膜に効率的に挿入することができる三分子複合体が生じた。本質的には、これらのタンパク質混合物を用いてＡＰＣ表面を「ペイント」したところ、抗原性ペプチドに対して特異的なＣＴＬクローンを刺激する能力が付与された。細胞のコーティングは迅速に起こり、タンパク質濃度依存性であることが示された。このＡＰＣ作製法はＡＰＣへの遺伝子導入の必要性を免れており、細胞表面での抗原性ペプチド密度の調節が可能である。
【０１５２】
免疫エフェクター細胞
本発明は、抗原特異的免疫エフェクター細胞が濃縮された集団の生成を刺激するために、ＡＰＣを含む上記の組成物を利用する。したがって、本発明は、本発明の抗原性ペプチドに対して特異的な、教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞が濃縮された細胞の集団を提供する。これらの細胞は、天然（内因性）抗原上の抗原決定基（エピトープ）と交差反応（特異的に結合）することができる。いくつかの態様において、天然抗原は腫瘍細胞の表面にあり、本発明の教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞は腫瘍細胞の増殖を抑制する。ＡＰＣを用いる場合には、培養下で死滅するＡＰＣを犠牲にして、抗原特異的免疫エフェクター細胞を増殖させる。ナイーブな免疫エフェクター細胞が他の細胞によって教育される過程は、本質的にはクーリー（Ｃｏｕｌｉｅ）（１９９７）Ｍｏｌｅｃ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ ３：２６１〜２６８に記載されている。
【０１５３】
上記の通りに調製したＡＰＣをナイーブな免疫エフェクター細胞と混合する。細胞をＩＬ−２などのサイトカインの存在下で培養することが好ましい。樹状細胞はＩＬ−１２などの強力な免疫刺激性サイトカインを分泌するため、１回目および以後の増殖時に補充用のサイトカインを添加する必要はない。いずれにしても、培養条件は、抗原特異的免疫エフェクター細胞がＡＰＣよりもはるかに早い速度で増える（すなわち、増殖する）ような条件である。抗原特異的細胞の集団をさらに増やすためにＡＰＣおよび選択的にはサイトカインの多回注入を行うことができる。
【０１５４】
１つの態様において、免疫エフェクター細胞はＴ細胞である。また別の態様では、免疫エフェクター細胞を、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１１またはＩＬ−１３をコードする導入遺伝子による形質導入によって遺伝的に改変することができる。導入遺伝子をインビトロ、エクスビボおよびインビボで導入するための方法は当技術分野で周知である。サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）前記を参照のこと。
【０１５５】
本発明の方法における使用に適したエフェクター細胞集団は自家でも同種でもよいが、好ましくは自家のものである。エフェクター細胞が同種性である場合には、用いる前に細胞から同種反応性細胞を除去しておくことが好ましい。これは、例えば、同種エフェクター細胞およびレシピエント細胞集団を混合し、それらを適した期間にわたってインキュベートした後に、ＣＤ６９＋細胞もしくは同種反応性細胞を除去すること、または同種反応性細胞集団におけるアネルギーを誘導することによるものを含む、既知の任意の手段によって行うことができる。
【０１５６】
ハイブリッド免疫エフェクター細胞を用いることもできる。免疫エフェクター細胞のハイブリッドは当技術分野で知られており、さまざまな刊行物に記載されている。例えば、国際特許出願の国際公開公報第９８／４６７８５号および国際公開公報第９５／１６７７５号を参照のこと。
【０１５７】
エフェクター細胞集団は分離されていない細胞、すなわち混合集団、例えばＰＢＭＣ集団、全血などを含みうる。エフェクター細胞集団の操作は、細胞表面マーカーの発現に基づく陽性選択、細胞表面マーカーの発現に基づく陰性選択、１つもしくは複数の抗原によるインビトロもしくはインビボでの刺激、１つもしくは複数の生物学的修飾物質によるインビトロもしくはインビボでの処置、１つもしくは複数の抗原もしくは生物学的修飾物質によるサブトラクティブ刺激、またはこれらのいずれかもしくはすべての組み合わせによって行いうる。
【０１５８】
エフェクター細胞は、ＰＢＭＣ、全血または混合集団を含むその画分、脾細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤性リンパ球、白血球分離によって得た細胞、生検組織、リンパ節、例えば腫瘍の所属リンパ節を非制限的に含む、さまざまな源から入手可能である。適したドナーには、免疫処置ドナー、非免疫処置（ナイーブ）ドナー、処置を受けたまたは受けていないドナーが含まれる。「処置を受けた（ｔｒｅａｔｅｄ）」ドナーとは、１つまたは複数の生物学的修飾物質に曝露されたドナーのことである。「処置を受けていない」ドナーとは、１つまたは複数の生物学的修飾物質に曝露されていないドナーのことである。
【０１５９】
エフェクター細胞の抽出および培養の方法はよく知られている。例えば、エフェクター細胞は、白血球分離、連続流細胞分離装置を用いる機械的アフェレーシスによって入手可能である。例えば、リンパ球および単球は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（商標）勾配による分離、パーコール勾配による分離、またはエルトリエーションを非制限的に含む、既知の任意の方法によってバフィーコートから単離することができる。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（商標）の濃度は、望ましい集団、例えば、Ｔ細胞を豊富に含む集団が得られるように調整する。親和性に基づく他の方法も知られており、用いることができる。これらには例えば、蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）、細胞接着、磁気ビーズ分離などが含まれる。親和性に基づく方法には、細胞表面マーカーに対して特異的であってアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＭＤ）を含む多くの販売元から入手可能な抗体またはその部分を用いてよい。または、親和性に基づく方法に、細胞表面受容体のリガンドまたはリガンド類似体を利用することもできる。
【０１６０】
エフェクター細胞集団に対して、細胞表面マーカーの発現に基づいて１つまたは複数の分離プロトコールを行うことができる。例えば、細胞を、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ４０Ｌなどの「分化クラスター」細胞表面マーカー；リンパ球活性化と関連する他のマーカー、例えばリンパ球活性化遺伝子３の産物（ＬＡＧ３）、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）、Ｔ１／ＳＴ２など；ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ５などのケモカイン受容体；ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４４、ＣＬＡ、ＣＤ１４６、ａ４ｂ７、ａＥｂ７などのホーミング受容体；ＣＤ２５、ＣＤ６９およびＯＸ４０などの活性化マーカー；ならびにＣＤ１によって提示されるリポグリカンを非制限的に含む、１つまたは複数の細胞表面ポリペプチドの発現に基づく陽性選択にかけることができる。エフェクター細胞集団を、非Ｔ細胞および／または特定のＴ細胞サブセットの欠乏に関する陰性選択にかけることもできる。陰性選択は、ＣＤ １９およびＣＤ２０などのＢ細胞マーカー；単球マーカーＣＤ１４；ＮＫ細胞マーカーＣＤ５６を非制限的に含む、種々の分子の細胞表面発現に基づいて行いうる。
【０１６１】
エフェクター細胞集団は、インビボまたはインビトロでの１つまたは複数の生物学的修飾物質に対する曝露によって操作することができる。適した生物学的修飾物質には、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γなどのサイトカイン；フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）などのホルボールエステル、コンカナバリン−Ａおよびイオノマイシンなどの非特異的修飾物質；細胞表面マーカーに対して特異的な抗体、例えば抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、抗ＩＬ２受容体、抗ＣＤ２８など；リンホタクチンなどを含むケモカインが非制限的に含まれる。生物学的修飾物質は、天然の源から得られた天然因子、組換えＤＮＡ技術によって産生された因子、化学合成されたポリペプチドもしくは他の分子、または天然因子の機能的活性を有する任意の誘導体でありうる。複数の生物学的修飾物質を用いる場合には、曝露は同時でも逐次的でもよい。
【０１６２】
本発明は免疫エフェクター細胞を含む組成物を提供するが、これは抗原特異的細胞が濃縮されたＴ細胞でもよい。「濃縮された」とは、細胞集団が、元のナイーブな細胞集団から少なくとも約５０倍、より好ましくは少なくとも約５００倍、さらにより好ましくは少なくとも約５０００倍、またはそれ以上に濃縮されていることを意味する。抗原特異的細胞を含む濃縮された細胞集団は、１０％から最大１００％が抗原特異的細胞であるというようにかなりさまざまでありうる。細胞集団が本発明のペプチドに対して特異的な抗原特異的免疫エフェクター細胞を少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％含む場合には、集団は「実質的に純粋である」という。抗原特異的である比率は、例えば、エフェクター細胞集団（例えば、Ｔ細胞集団）に対して本発明の抗原提示マトリックス提示および抗原性ペプチドによる刺激を行う３Ｈチミジン取り込みアッセイにより、容易に決定することができる。
【０１６３】
単離された抗体および誘導型抗体
血清抗体、モノクローナル抗体および抗体誘導体は本発明の範囲に含まれる。これらの抗体組成物は本発明の方法を実施することによって同定されたポリペプチドを認識する。このような抗体にはポリクローナルおよびモノクローナル抗体が含まれる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製のため、ならびに対応する核酸配列を導き出すための実験方法は当技術分野で知られている。ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８）および（１９９９）前記、ならびにサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）前記を参照。本発明のモノクローナル抗体は、タンパク質またはその断片を動物、例えばマウスまたはウサギに導入することによって生物的に産生することができる。動物体内の抗体産生細胞を単離し、ミエローマ細胞またはヘテロミエローマ細胞と誘導させてハイブリッド細胞またはハイブリドーマを作製する。したがって、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞も提供する。
【０１６４】
すなわち、タンパク質またはその断片およびよく知られた方法を用いて、当業者はハイブリドーマ細胞および本発明の抗体を作製し、タンパク質またはポリペプチドとの結合能のある抗体に関してスクリーニングすることができる。
【０１６５】
試験するモノクローナル抗体がタンパク質またはポリペプチドと結合するならば、検査した抗体および本発明のハイブリドーマによって得られる抗体は等価である。また、本発明のモノクローナル抗体が通常反応するタンパク質またはポリペプチドと結合するのを被験抗体が阻害するか否かを判定することにより、必要以上の実験を行わずに、ある抗体が本発明のモノクローナル抗体と同じ特異性を有するか否かを判定することもできる。本発明のモノクローナル抗体による結合の低下によって示されるように、被験抗体が本発明のモノクローナル抗体と競合するならば、この２つの抗体は同じまたはよく似たエピトープと結合する可能性が高い。または、本発明のモノクローナル抗体をそれが通常反応するタンパク質とプレインキュベートし、被験モノクローナル抗体の抗原との結合能が阻害されるか否かを判定することもできる。被験モノクローナル抗体が阻害されるならば、おそらくそれは本発明のモノクローナル抗体と同じまたはよく似たエピトープ特異性を有すると思われる。
【０１６６】
「抗体」という用語は、抗体のすべてのアイソタイプを含む。モノクローナル抗体の特定のアイソタイプは、初期融合物から選択することにより直接的に調製することもでき、またはステプレフスキー（Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉ）ら（１９８５）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：８６５３もしくはスピラ（Ｓｐｉｒａ）ら（１９８４）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． ７４：３０７に記載された手順を用いて、クラススイッチバリアントを単離するための同胞選択法を用いることにより、異なるモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマから二次的に調製することもできる。
【０１６７】
本発明は、上記のポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生物活性断片も提供する。これらの「抗体断片」は、その抗原または免疫原と選択的に結合する能力をある程度保持している。このような抗体断片には以下のものが非制限的に含まれうる：１）Ｆａｂ、２）Ｆａｂ’、３）Ｆ（ａｂ’）２、４）Ｆｖ、および５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）。
【０１６８】
「生物活性のある抗体断片」の具体例は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）である。これらの断片の作製方法は当技術分野で知られており、例えば、ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８）および（１９９９）前記を参照されたい。
【０１６９】
本発明の抗体を、キメラ抗体およびヒト化抗体を作り出すために改変することもできる（Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（３）：２１４）。キメラ抗体とは、抗体の重鎖および軽鎖の種々のドメインが複数の種からのＤＮＡによってコードされているもののことである。
【０１７０】
当業者は、本発明のモノクローナル抗体の特異性を備えたモノクローナル抗体を分泌する他のハイブリドーマを、抗イディオタイプ抗体を作製することによって単離することができる（Ｈｅｒｌｙｎら（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３２：１００）。抗イディオタイプ抗体とは、関心対象のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体に存在する固有の決定基を認識する抗体のことである。
【０１７１】
２つのハイブリドーマのモノクローナル抗体間のイディオタイプの同一性により、２つのモノクローナル抗体が同じエピトープ決定基を認識するという点で同一であることが示される。このため、モノクローナル抗体のエピトープ決定基に対する抗体を用いることにより、同じエピトープ特異性を有するモノクローナル抗体を発現する他のハイブリドーマを同定することが可能である。
【０１７２】
また、抗イディオタイプ技術を用いて、エピトープを模したモノクローナル抗体を作製することも可能である。例えば、第１のモノクローナル抗体に対して作製した抗イディオタイプモノクローナル抗体は、結合ドメイン内に、第１のモノクローナル抗体が結合するエピトープの鏡像である超可変領域を有すると考えられる。このため、この場合には、抗イディオタイプモノクローナル抗体を、これらの抗体の産生のための免疫処置に用いうると考えられる。
【０１７３】
本発明において用いる場合、「エピトープ」という用語は、本発明のモノクローナル抗体に対する結合親和性を有する任意の決定基を含む。エピトープ決定基は通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的活性表面基からなり、通常は特異な三次元構造特性ならびに特異な電荷特性を有している。
【０１７４】
本発明の抗体および／または抗原（ポリペプチド）は、検出可能な物質または標識と結合させることができる。標識および標識法は当業者に知られており、これには多くの異なるものがある。
【０１７５】
抗体と低分子量ハプテンとの結合により、アッセイ法の感度を高めることができる。続いてハプテンを第２の反応によって特異的に検出することができる。例えば、特異的な抗ハプテン抗体と反応する、ビオチン（アビジンと反応する）、またはジニトロフェノール、ピリドキサールおよびフルオレセインなどのハプテンを用いることが一般的である。ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）およびレーン（Ｌａｎｅ）（１９８８）および（１９９９）前記を参照。
【０１７６】
本発明の抗体をさまざまな担体と結合させることもできる。このため、本発明は、抗体および他の活性または不活性な物質を含む組成物も提供する。よく知られた担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロースおよび修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよび磁鉄鉱が含まれる。本発明の目的には、担体の性質は可溶性であっても不溶性であってもよい。当業者は、結合抗体または抗原に適した多くの他の担体を知っているか、またはルーチンの実験を用いることによってそれを確認しうると考えられる。
【０１７７】
抗体、その断片、または抗体を産生する細胞株を含む組成物は本発明に含まれる。これらの組成物を薬学的に用いる場合には、それらを薬学的に許容される担体と組み合わせる。
【０１７８】
本発明の抗体または抗原を含む組成物は、特異的抗原性ポリペプチド、抗体反応性ペプチドエピトープおよび治療用抗体分子を検出および単離するために有用である。これらの組成物には、病的細胞の診断および阻害に関してさまざまな用途がある。例えば、当技術分野で周知の方法を用いて、動物に抗原性ポリペプチドによる免疫処置を行うことにより、抗原反応性抗体を作製することができる。また、対象への投与用のモノクローナル抗体を調製することも望ましい。ヒト対象に対する使用の場合、抗体分子の種特異的部分がヒト抗体に特徴的な配列へと変換された「ヒト化抗体」を作製するための方法が今では確立している。このような分子は、ヒト対象に投与するとより有効な働きをする。
【０１７９】
診断用抗体は病的細胞を検出するために有用であり、これらの抗体の標識および検出のためのさまざまな代替的な方法が確立されている。例えば、抗体を、抗体の投与後に対象内に局在しうる放射性同位体と結合させることができる。抗原性ペプチド、および診断薬として用いるためのこれらのペプチドを認識する抗体を入手するための改善された手段を提供することは本発明の明確な目的である。
【０１８０】
治療用抗体を、疾患の進行を抑制するために対象に投与することもできる。ヒト対象では、この目的にヒト化モノクローナル抗体を投与することが望ましい。抗体に受動免疫を付与することができ、これは標的の病的組織中の抗原と結合し、補体媒介性細胞傷害、抗体性細胞傷害または受容体−リガンド相互作用の妨害を誘導することによって疾患を抑制する。または、対象への抗体の投与は、抗イディオタイプ免疫応答を誘導することによって疾患に対する予防接種ともなりうる。ヒト対象に用いる場合、この目的にはマウスモノクローナル抗体などのモノクローナル抗体が有効である。
【０１８１】
本発明の方法を実施することによって同定された抗原性ポリペプチドは、対象に投与した際には治療薬としても有用であり、またはナイーブな免疫エフェクター細胞を根絶するためにも有用である。このようなポリペプチドはアジュバントとともに製剤化し、病的標的組織に対する免疫応答を誘導するためのワクチンとして投与しうる。このような抗原性ポリペプチドをエクスビボで、例えば、対象から単離した樹状細胞に投与することもできる。続いて、抗原パルス刺激を行った樹状細胞を培養下で増殖させ、養子免疫療法を行うために対象に戻すことができる。
【０１８２】
同様の方法を、本発明の方法によって同定された抗原性エピトープを含む合成ペプチドおよび天然ペプチドを用いて行うことができる。このようなペプチドはインビボでもエクスビボでも投与することができる。また、抗原およびエピトープの適切なアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子送達媒体を用いてそれらを送達することもできる。対象に組換えワクチンによる予防接種を行うためのさまざまな方式および処方が当業者に周知である。
【０１８３】
本発明の組成物
本発明は、上記のペプチド、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗原提示マトリックス、ベクター、細胞、抗体およびその断片、ならびに許容される固体または液体担体の任意のものを含む組成物も提供する。組成物を薬学的に用いる場合には、それらを診断的および治療的使用のための「薬学的に許容される担体」と組み合わせる。これらの組成物を、本発明の診断法および免疫調節法のための医薬品の調製のために用いることもできる。
【０１８４】
診断法
本発明は、本発明のポリペプチドおよび抗体を用いる診断法を提供する。本方法は、本発明のポリペプチドと結合する抗原特異的ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を検出するために用いることができる。
【０１８５】
本発明の診断法は以下を含む：（１）本発明のポリペプチドの有効性を予測するためのアッセイ法；（２）ポリペプチドおよび／またはその天然の相当物に対して特異的な免疫エフェクター細胞の前駆細胞の頻度（すなわち存在および数）を決定するためのアッセイ法；ならびに（３）本発明の免疫調節法におけるポリペプチドまたは抗体の有効性を決定するためのアッセイ法。抗体を、その抗体が産生された対象である細胞表面リガンドを同定するために用いることもできる。
【０１８６】
本発明の診断法は一般に、ポリペプチドと、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞の表面上のＴＣＲまたは抗体などの免疫エフェクター分子との間で特異的な結合が起こるのを可能にする適した条件下で十分な時間にわたって行う。「適切な条件」および「十分な時間」とは一般に、特異的な結合に適した条件および時間である。適切な条件は、約４℃から約４０℃の間、好ましくは約４℃から約３７℃の間、緩衝溶液中であり、ｐＨの範囲は５から９の間である。さまざまな緩衝液が当技術分野で知られており、本発明の診断法に用いることができ、これにはリン酸緩衝食塩水が非制限的に含まれる。結合および反応のための十分な時間は一般に、収束性抗原性ペプチドリガンドに対する試料の曝露後、約１秒間から約２４時間であると考えられる。
【０１８７】
いくつかの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドの有効性を予測するための診断アッセイ法を提供する。これらの態様のいくつかにおいては、インビボワクチン試験の予測される有効性をあらかじめ決定するために、規定されたＴ細胞エピトープを用いて、腫瘍およびウイルス病原体の臨床的な特徴を決定する。これは、規定されたＴ細胞エピトープを刺激因子として用いる患者末梢血単核細胞の単純な増殖アッセイ法によって行うことができる。反応を誘発するペプチドは、その患者に対して有効なワクチンの候補である。
【０１８８】
他の態様においては、本発明のポリペプチドに対して特異的であり、そのため活性化される可能性のある休止（ナイーブ）免疫エフェクター細胞の前駆細胞の頻度（すなわち、存在および数）を決定するためのアッセイ法を提供する。これらの態様では、表面に本発明のポリペプチドを有する抗原提示細胞を用いて、生物試料における免疫エフェクター細胞の存在を検出する。抗原特異的免疫エフェクター細胞の決定（および定量化）には機能アッセイ法を用いる。その一例としては、腫瘍のある対象からＰＢＭＣを単離する。これらのＰＢＭＣの試料を、同じ対象からの標的細胞とともに適した時間にわたって培養する。機能的アッセイ法には、免疫エフェクター細胞の増殖、サイトカイン産生、ＡＰＣの特異的溶解が非制限的に含まれる。
【０１８９】
他の態様において、本発明の免疫調節法を含む免疫調節法が、本発明のポリペプチドに対する免疫応答を調節する有効性を、本発明の診断アッセイ法を用いて試験することができる。また、これらの診断アッセイ法は、ポリペプチドの生物活性を確認するため、または免疫療法薬の有効性をモニタリングするためにも有用である。これらの態様のいくつかにおいては、本方法によって免疫エフェクター細胞の検出があり、これは抗原性ペプチドエピトープに対する曝露の結果として活性化またはアネルギー化された活性化ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。本発明の所定のポリペプチドに対する結合の結果として活性化またはアネルギー化されたＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の存在に関して、対象由来の細胞を含む試料を試験することができる。
【０１９０】
免疫調節法
本発明は、本発明のポリペプチドによって個体における免疫応答を調節する方法を提供する。本発明の免疫調節法は、対象における免疫応答の誘導または増加を生じる方法とともに、抑制または減少を生じる方法も含み、本発明のペプチド（または任意の免疫調節薬）の有効量を、ペプチドに対する免疫応答（またはその欠失）に対して望ましい影響をもたらす処方中および／または条件下で、対象に送達することを含む。本発明の免疫調節法には、ワクチン法、養子免疫療法、およびＴ細胞アネルギーを誘導する方法が含まれる。
【０１９１】
本発明の方法に用いるための「免疫調節剤」は、免疫応答を調節する分子、高分子複合体または細胞であり、以下のものが含まれる：単独か、または本明細書に記載する種々の処方のいずれかの中に存在する本発明のポリペプチド；本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；ＭＨＣクラスＩと結合し、続いて（補助刺激分子の存在下または非存在下での）ＡＰＣを含む抗原提示マトリックスと結合するポリペプチド；別の分子または高分子構造と共有的または非共有的に複合体化したペプチドまたは抗体またはそれらの誘導体；および本発明のポリペプチドに対して特異的な、教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞。
【０１９２】
Ｔ細胞活性化を評価するさまざまな方法が知られている。ＣＴＬ活性化は、トリチウム化チミジン取り込み（ＤＮＡ合成の指標）、および例えばコロニーの同定による、成長または増殖に関する集団の検査を非制限的に含む、任意の既知の方法によって検出することができる。または、テトラゾリウム塩ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチル−チアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を添加してもよい。モスマン（Ｍｏｓｓｍａｎ）（１９８３）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ６５：５５〜６３；ニックス（Ｎｉｋｓ）およびオットー（Ｏｔｔｏ）（１９９０）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １３０：１４０〜１５１。生細胞のミトコンドリア中に認められるコハク酸デヒドロゲナーゼは、ＭＴＴをホルマザン・ブルーに変換する。このため、濃い青色は代謝活性のある細胞を示すと考えられる。さらに別の態様において、放射標識、例えばトリチウム化チミジンの取り込みをアッセイし、細胞の増殖を示してもよい。同様に、タンパク質合成を３５Ｓ−メチオニンの取り込みによって示すことも可能である。さらに別の態様において、細胞傷害性および細胞死滅アッセイ法、例えば典型的なクロム放出アッセイ法を用いて、エピトープ特異的ＣＴＬ活性化を評価してもよい。ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を検出するためには、サイトカイン産生；および例えばトリチウム化チミジン取り込みによる増殖の測定を非制限的に含む、さまざまな方法の任意のものを用いてよい。
【０１９３】
標識標的細胞からの５１Ｃｒの放出は、生物試料におけるペプチド特異的ＣＴＬの数を評価するのに用いることが可能な標準的なアッセイ法である。腫瘍細胞または本発明のＡＰＣを標的として約２００μＣｉのＮａ２５１ＣｒＯ４により３７℃で６０分間放射標識し、その後に洗浄する。続いて、Ｔ細胞および標的細胞（〜１×１０４／ウェル）を、９６穴Ｕ底プレート中で、さまざまなエフェクター対標的比で混合する。プレートを１００×ｇで５分間遠心して細胞接触を開始し、５％ＣＯ２とともに３７℃で４〜１６時間インキュベートする。上清中の５１Ｃｒの放出を測定し、Ｔ細胞の非存在下で（陰性対照）、または０．１％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００とともに（陽性対照）インキュベートした標的と比較する。例えば、ミッシェル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）およびシーギ（Ｓｈｉｉｇｉ）編、「細胞免疫学における主な方法（ＳＥＬＥＣＴＥＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＣＥＬＬＵＬＡＲ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ）」（１９８０）Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．を参照されたい。
【０１９４】
本発明のポリペプチドの処方は、望ましい結果に応じて異なると考えられる。一般に、適切な補助刺激分子とともに、クラスＩ ＭＨＣ分子によって抗原提示マトリックス上に提示されるペプチドは、そのポリペプチドに対する免疫応答の誘導をもたらすと考えられる。Ｔリンパ球におけるアネルギー（または無応答性）状態は、表面上に適切なＭＨＣ分子を含むが、適切な補助刺激分子を欠く抗原提示マトリックス（ＡＰＣであってもよい）による抗原の提示によって誘導することが可能である。本明細書に記載するさまざまな処方のいずれを用いてもよい。
【０１９５】
本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子送達媒体中にて投与することもでき、またはコードされるポリペプチドを組換え的に転写し、翻訳してプロセシングする宿主細胞に挿入することによって投与することもできる。薬学的に許容される担体中にある本発明のポリヌクレオチドを含む単離された宿主細胞は、有効なワクチン接種を行うために、適切かつ有効な量のアジュバント、サイトカインまたは補助刺激分子と組み合わせることができる。いくつかの態様において、宿主細胞は樹状細胞などのＡＰＣである。サイトカイン、補助刺激分子のいずれかまたは両方の有効量をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより、宿主細胞をさらに改変することもできる。
【０１９６】
本発明の方法を、対象にサイトカインまたは補助刺激分子の有効量を共投与することにより、さらに改変することができる。
【０１９７】
意図した目的に有効であるとして本明細書に提供する作用物質（ａｇｅｎｔ）を、本発明の免疫調節法で治療しようとする疾患を有する対象、またはこのような疾患に対する感受性もしくは発症のリスクがある個体に投与することができる。作用物質をマウス、ラットまたはヒト患者などの対象に投与する場合には、作用物質を薬学的に許容される担体に添加し、対象に全身的または局所的に投与することができる。治療量は経験的に決定可能であり、治療しようとする病変または異常、治療しようとする対象、ならびに治療法の有効性および毒性によって異なると考えられる。
【０１９８】
本発明のポリペプチド、抗体、抗体誘導体、宿主細胞または免疫エフェクター細胞の量は、一部にはその意図する効果によって異なると考えられ、最終的には医師または獣医師の判断による。考慮すべき要因には、治療しようとする状態、投与経路、および処方の性質、哺乳動物の体重、表面積、年齢および全身状態、ならびに投与しようとする特定のペプチドが含まれる。本発明の免疫エフェクター細胞の適切な有効量は一般に、１回の投与当たり約１０２〜約１０９個の範囲にある。細胞を１回投与し、その後に疾患症状または腫瘍塊の減少などの臨床反応をモニタリングすることができる。投与は、例えば月単位で反復してもよく、または適宜反復してもよい。当業者は、適切な投与レジメンが医師または獣医師の判断によるであろうことを理解すると考えられる。
【０１９９】
インビボ投与は単回でもよく、治療経過にわたる連続的または間欠的な投与であってもよい。最も有効な手段および投与量を決定する方法は当業者に周知であり、治療法に用いられる組成物、治療法の目的、治療しようとする標的細胞、および治療しようとする対象によって異なると考えられる。治療する医師により選択される用量レベルおよびパターンで単回または多回の投与を行ってもよい。適切な投薬処方および作用物質の投与方法は以下に見出すことができる。
【０２００】
本発明の作用物質および組成物は、医薬品の製造に用いることができ、従来の手順に従った投与、例えば薬学的組成物中の有効成分により、ヒトおよび他の動物の治療のために用いることもできる。
【０２０１】
より詳細には、本明細書において有効成分とも称する本発明の作用物質は、鼻腔、局所（経皮、エアロゾル、頬側および舌下を含む）、非経口（皮下、筋内、静脈内および皮内を含む）および肺を含む、任意の適切な経路により、治療法のために投与してよい。好ましい経路は、レシピエントの状態および年齢、ならびに治療しようとする疾患または異常によって異なるであろうことも理解されると考えられる。
【０２０２】
癌の治療および予防のためのワクチン
１つの態様において、本発明の免疫調節法は癌治療のためのワクチンを含む。癌細胞は免疫系によって認識される可能性のある数多くの新たな抗原を含んでいる。エピトープを同定しうる速度が与えられれば、固形腫瘍の患者からＴＩＬを単離し、そのＭＨＣ拘束性を決定し、反応性エピトープに関してこれらのＣＴＬを適切なライブラリーに対してアッセイすることにより、罹患個体に対して個別用の抗癌ワクチンを作製することができる。これらのワクチンは、罹患個体に対する治療法となるほか、再発（または疾患に対する家族性遺伝的素因をもつ患者における疾患の確立）に対する予防的治療にもなると考えられる。癌を経験したことが全くない個体の接種は、腫瘍抗原特異的ＣＴＬ応答がまだ誘発されていなくても予防的治療として非常によく奏功すると予想されるが、これはほとんどの場合に親和性ペプチドが免疫原性であるように思われ、このことから機能性Ｔ細胞レパートリーの欠陥は仮にあっても比較的稀である可能性が示唆されるためである。セッテ（Ｓｅｔｔｅ）ら（１９９４）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３：５５８６〜５５９２。マウスでは、適切なエピトープを用いたワクチン接種は、成立した腫瘍を除くだけでなく、それを行っていなければ致死的である用量の腫瘍細胞を接種した後の腫瘍再成立も防御する。ビストリン（Ｂｙｓｔｒｙｎ）ら（１９９３）前記。
【０２０３】
ワクチンアジュバントにおける最近の進歩により、ペプチドが免疫系に最大の影響を与えるようにペプチドを投与する有効な手段がもたらされた。デル−ジュディス（Ｄｅｌ−Ｇｉｕｄｉｃｅ）（１９９４）Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ ５０：１０６１〜１０６６。これらのペプチドワクチンは、従来の治療法に一般に反応しない転移性腫瘍を治療するのに非常に有意義と考えられる。劣性癌遺伝子のホモ接合型欠失に起因する腫瘍は、体液性（抗体）応答による除去に対する感受性が低いため、細胞性ＣＴＬ応答を誘発することによってより効果的に治療されると考えられる。
【０２０４】
病原生物によって引き起こされる疾患に対するワクチン
本発明のポリペプチドは、病原生物に対する免疫応答を誘導（または増加もしくは増強）させるための方法にも有用である。これらには病原性ウイルス、細菌および原生生物が含まれる。
【０２０５】
ウイルス感染症は免疫療法の対象となる理想的な候補である。ウイルス病原体に対する免疫応答は、ＡＩＤＳの原因となるＨＩＶなどのレンチウイルスの場合のように有効でないことが時にある。これらのウイルスは自然変異の頻度が高いため、免疫系から逃れやすい。しかし、感染細胞の表面に提示されるＣＴＬエピトープの豊富なプロフィールから、変異に対する耐性がほとんどない必須遺伝子における種々の異なる血清型に共通の抗原が同定され、それによってさらに有効なワクチンの設計も可能になると考えられる。
【０２０６】
養子免疫療法
本発明の抗原特異的免疫エフェクター細胞およびＡＰＣの増殖集団は、養子免疫療法措置において、およびワクチンとして有用である。
【０２０７】
養子免疫療法は、１つの局面において、上記のようにナイーブな免疫エフェクター細胞をＡＰＣとともに培養することによって生じた、教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞の実質的に純粋な集団を対象に投与することを含む。いくつかの態様において、ＡＰＣは樹状細胞である。
【０２０８】
１つの態様において、本明細書に記載される養子免疫療法は自己性である。この場合には、ＡＰＣは単一の対象から単離された親細胞を用いて作製される。増殖集団にもその対象から単離したＴ細胞を用いる。その上で、抗原特異的細胞の増殖集団を同じ患者に投与する。
【０２０９】
さらにもう１つの態様では、ＡＰＣまたは免疫エフェクター細胞を、有効量の刺激性サイトカイン、例えばＩＬ−２または補助刺激分子とともに投与する。
【０２１０】
Ｔ細胞アネルギーの誘導法
本発明の方法によって単離された抗原性ポリペプチドは、Ｔ細胞アネルギーを誘導するための方法に有用である。これらの方法を用いて治療しうる疾患には、自己免疫疾患、アレルギーおよび同種移植片拒絶反応が含まれる。
【０２１１】
自己免疫疾患は、身体の免疫系が自己組織に対して反応する疾患である。これには関節炎、潰瘍性大腸炎および多発性硬化症の大半の病型が含まれる。異物として認識される内因性因子に対応する収束性抗原性ペプチドリガンドは、遺伝子治療または他のアプローチを用いる治療の開発に用いうる。例えば、自己免疫を媒介するＣＴＬに対する「自殺基質」として作用しうる合成ＣＴＬエピトープを、上記のように設計することができる。すなわち、ＭＨＣアレルに対して高親和性であるがＴＣＲを活性化することはできないペプチドは、当該の抗原を提示している細胞に対する細胞性免疫応答を効果的に遮蔽しうると考えられる。このアプローチを裏づけるものとして、ＨＩＶウイルスの潜伏期の長さは抗ウイルス性免疫応答に起因し、ウイルスが最終的に免疫系を回避する機序は、ＭＨＣ分子を占有するもののＴＣＲ溶解反応は刺激しないエピトープを作り出して特異なＴ細胞アネルギーを誘導するためと考えられている。クレナーマン（Ｋｌｅｎｅｒｍａｎ）ら（１９９５）Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２５：１９２７〜１９３１。
【０２１２】
Ｔ細胞抗原受容体とＣＤ３単独との複合体による、他のシグナルの非存在下でのＴ細胞のインビトロ刺激により、Ｔ細胞アネルギーまたは無反応性が誘導される。インビトロでのインターロイキン−２産生および増殖によって評価されるＴ細胞活性化には、抗原特異的Ｔ細胞および抗原提示細胞の間の細胞間相互作用によって生じる抗原シグナルおよび補助刺激シグナルが必要である。Ｔ細胞表面上のこれらのＣＤ２タンパク質とＣＤ５８（ＬＦＡ−３）タンパク質および抗原提示細胞との相互作用、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）タンパク質とＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）タンパク質との相互作用、ならびにＣＤ５タンパク質とＣＤ７２タンパク質との相互作用はこのような補助刺激シグナルをインビトロで伝える。抗原提示細胞に由来するサイトカイン（例えば、インターロイキン−１およびインターロイキン−６）も、インビトロでのＴ細胞活性化をもたらす補助刺激シグナルを提供する。抗原シグナルおよび補助刺激シグナルの両方の送達は、インターロイキン−２遺伝子および他の主要なＴ細胞活性化遺伝子の安定的な転写につながる。前記の補助刺激シグナルはプロテインキナーゼＣおよびカルシウムに依存する。強力な抗原提示細胞はＣＤ８０（Ｂ７およびＢＢ１）および他の関連した表面タンパク質を発現し、多くのＴ細胞はＢ７結合タンパク質、すなわちＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４タンパク質を発現する。ＣＤ８０にＣＤ２８およびＣＤＬＡ−４が結合することにより、プロテインキナーゼＣおよびカルシウムに非依存的にＴ細胞補助刺激経路が刺激され、激しいＴ細胞増殖を招く。Ｂ細胞の刺激も、特異的抗原と細胞表面免疫グロブリンとの相互作用に依存する。Ｔ細胞由来のサイトカイン（例えば、インターロイキン１および４）、受容体および補助受容体の特定の対によるＴ細胞とＢ細胞との物理的接触、またはその両方により、Ｂ細胞刺激に必須な１つまたは複数のシグナルが提供される。
【０２１３】
従来の投与経路を用いる。本発明による免疫治療用抗原−スーパー抗原ポリマーのＴ細胞刺激量およびアネルギー発生量（または上記の治療的有効量）を標的細胞と接触させる。「Ｔ細胞アネルギー有効量」とは、ＴＣＲを介した細胞活性の統計学的に有意な阻害をもたらすのに有効な量を意図している。これはＴ細胞活性化試験を用いてインビトロで評価しうる。Ｔ細胞アネルギーまたは活性化は、特異的抗原に反応したトリチウムチミジン取り込みによってアッセイされることが典型的である。
【０２１４】
Ｔ細胞アネルギーを誘導しうる１つの手法は、ＭＨＣクラスＩ分子中に本発明のポリペプチドを提示するが、Ｔ細胞を活性化するのに必要な補助刺激分子は存在しない抗原提示マトリックスをＴ細胞に対して提示することである。例えば、選択したＴ細胞クローンが拘束されているＭＨＣ抗原を正常な抗原提示細胞（ＡＰＣ）以外の細胞にトランスフェクトしたものを用いることができる。休止Ｔ細胞は、ＡＰＣ以外の細胞宿主にトランスフェクトされたＭＨＣに関連づけられる、休止Ｔ細胞によって認識される適切なペプチドとともに提供される。ＭＨＣクラスＩ分子をインバリアント鎖とともに構成性に発現している抗原提示細胞以外の哺乳動物細胞への遺伝子の導入の結果として、ＭＨＣが発現される。重要なことにこれらの細胞は、抗原提示細胞と関連し、ＭＨＣおよびペプチドとともに補助刺激シグナルを生じる他のタンパク質を、細胞表面タンパク質としても分泌タンパク質としても提供しない。
【０２１５】
アネルギーが誘導されたか否かを決定するためには、被験Ｔ細胞を、本発明の抗原をＭＨＣクラスＩ分子中に、Ｔ細胞を活性化するのに必要な補助刺激分子とともに提示するものとともに培養する。培養物を約４８時間インキュベートした後にトリチウムチミジン取り込みのパルス添加を行い、約１８時間後に取り込みを測定する。Ｔ細胞が拘束されていないＭＨＣを用いることまたはＴ細胞が感受性を持たないペプチドを用いることにより、Ｔ細胞を刺激しない抗原提示細胞をＴ細胞に提示した場合の対照レベルを上回る取り込みがなければ、活性化が存在しないことの指標となる。活性化の程度を評価するために、ＩＬ−２、ＩＬ−３もしくはＩＬ−４、活性化と関連のある細胞表面タンパク質、例えばＣＤ７１に関するアッセイ法、または他の従来の技法などの、他の従来のアッセイ法を用いてもよい。もう１つの方法は、静止Ｔ細胞上では発現されるがアネルギー性Ｔ細胞上では発現されないタンパク質の発現を評価することである。米国特許第５，７４７，２９９号。
【０２１６】
以下の例は、本発明を例示することを意図しており、それを制限するものではない。
【０２１７】
実験方法
頂側および側底細胞膜タンパク質を単離するための方法
図４は、頂側および側底細胞膜の単離に関する概略図を示している。チャニー（Ｃｈａｎｅｙ）およびヤコブセン（Ｊａｃｏｂｓｅｎ）（１９８３）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５８：１００６２〜１００７２に開示された方法のこの変法により、全細胞可溶化物の調製物の収量に比べて、頂側および側底膜タンパク質が濃縮される。第１に、標的細胞の単層に、原形質膜と結合する「活性化された」陽イオン性コロイドシリカ粒子のスラリーをコーティングする。「活性化された」とは、シリカ粒子をアルミニウムクロロヒドロキシドでコーティングすることにより、スラリーが正電荷を獲得した（すなわち、陽イオン性となった）ことを意図している。次に、ポリアクリル酸ナトリウムなどの陰イオン性ポリマーを添加して陽イオン性シリカ粒子と架橋させ、構造的に安定な薄膜を原形質膜の外側に形成させる。続いて細胞をイミダゾールを主体とする低浸透圧緩衝液と接触させ、細胞を徐々に膨張させて破裂させる。この結果得られる可溶化物は、核、内膜およびシリカでコーティングされた頂側膜を含む；一方、側底膜は細胞培養プレートに付着したままである。水性可溶化物を９００ｇで１０分間遠心し、コーティングされた膜および核を沈殿させる。この結果得られる内膜を含む上清は廃棄する。ペレット化した核および膜を再懸濁し、２８，０００ｇで３０分間遠心して７０％ナイコデンツ（Ｎｙｃｏｄｅｎｚ）（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）中をさらに沈殿させ、この結果得られる核を含む上清を廃棄する。残るペレットはシリカでコーティングされた頂側膜を含む。単離した頂側膜調製物を単独で用いてもよく、側底膜調製物（これは標準的な細胞培養法を用いて培養プレートから容易に採取しうる）と組み合わせてもよい。
【０２１８】
イムノブロットからの抗体溶出
固体支持体上の関心対象の抗原と結合する血清抗体に関してさらに分析を行うためには、抗体をその機能が保たれるような様式で取り出す必要がある。機能性抗体を単離するためには、抗体が結合した固体支持体（例えば、ニトロセルロース）の部分を切り出し、マー（Ｍａａ， Ｊ．Ｓ．）、ロドリゲス（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ）ら（１９９０）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１５６９〜１５７７を改変した方法を用いて、抗体を固体支持体から溶出させる。
【０２１９】
関心対象のバンドを記載のウエスタンブロット法によって同定した後に、できるだけ多くの標的抗原を含む調製用規模（ｐｒｅｐ−ｓｃａｌｅ）のゲルを調製し、ニトロセルロースに移す。標準的なウエスタンブロット法のプロトコールに従って、ブロットを適切な血清または抗体とともにインキュベートして洗浄する。ブロット上に存在する抗体反応（すなわち、バンド）を標準的な技法（すなわち、放射性標識、ＥＣＬなど）によってフィルム上に可視化する。
【０２２０】
フィルムをニトロセルロース膜と並置させた後に、関心対象のバンドを含むニトロセルロースを鋏で切り出して、１００ｍＭグリシンｐＨ ２．５緩衝液を含むチューブに入れ、室温で５分間インキュベートする。続いてニトロセルロースの断片をチューブから取り出し、緩衝液（溶出した抗体を含む）を１／１０倍容量の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０で中和する。中和後にＢＳＡを緩衝液（溶出液）に添加し、最終濃度を１％とする。
【０２２１】
図１は、上記のプロトコールによって溶出した抗体が特異的な抗原結合特性を保っていることを示している。右側のブロットは、左側のブロットから溶出した抗Ｈｅｒ２抗体（Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ、カタログ番号：ＭＳ−３２７−Ｐ：クローンＬ８７およびｅ２−４００１（Ａｂ−１０））（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を用いて作製した。
【０２２２】
この後には、単離した機能性抗体を用いてペプチドのライブラリーをスクリーニングし、抗体エピトープの候補を同定することができる。
【０２２３】
単離した抗体をライブラリーと接触させ、陽性ビーズのシークエンシングを行ってエピトープを同定する。陽性ビーズは、標準的な標識法、すなわちビオチン、酵素、蛍光色素および類似の試薬を用いることによって可視化しうる。エピトープ配列が決定されれば、ペプチドライブラリースのクリーニングで同定されたエピトープ配列を含む遺伝子発現産物の配列を同定する目的で、このペプチドの配列を、適切なサイズの発現産物を有する候補遺伝子の特定のリストと比較することができる。
【０２２４】
ポリペプチド抗原の免疫沈降のための方法
直接法
関心対象の抗体が豊富にある場合は、標準的な免疫沈降法を用いることができる。例えば、関心対象の抗体を上記のよく知られたウエスタンブロット法に用いて、ポリペプチド抗原の高レベル発現を示す標的試料／細胞株をまず同定する。続いて、標準的な技法または本明細書に記載の方法を用いて、標的試料／細胞株を例えば３５Ｓ−メチオニンで代謝的に標識する。標的細胞を丁寧に破壊して溶液中に露出する。続いて、血清抗体を放射性細胞可溶化液に添加してインキュベートし（一般的には、回転させながら４℃で１〜２時間）、例えばプロテインＡセファロースビーズにて収集する。抗体および抗原を固体支持体に結合させ、試料の洗浄および濃縮ができるようにする。洗浄用緩衝液（例えば、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０）を除去した後に、ビーズをＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料用緩衝液とともにインキュベートし、９５℃に３分間加熱して標準的タンパク質用ゲルにローディングする。ゲル泳動が終わった時点で、ガラスプレートの一方を分離してゲルを露出する（もう一方のプレートには付着したまま）。ゲルが乾燥するのを防ぐためにゲルをラップのシートで覆ってもよい。続いて、標識抗原の位置を検出するために、ゲルを適した時間にわたってＸ線フィルム上に置く。抗原の位置が検出されたらラップをゲルから外し、ゲルを露光したＸ線フィルムと正確に並置させて、標識抗原の位置に対応するゲルの部分を鋏を用いて切り出してゲルから回収する。回収した抗原を標準的な方法、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳによって分析する。
【０２２５】
トレーサー法または間接法
本方法は、用いうる抗体の量が限られている場合に利用しうる。この方法は直接法とほぼ同じであるが、関心対象の抗体をイムノブロットから溶出させた後に、３５Ｓ−メチオニン標識した細胞可溶化物からそれに対応する抗原を免疫沈降させる点が異なる。回収した免疫沈降抗原の量がシークエンシングを行うには不十分な場合には、標識した免疫沈降抗原が、追加的な量の抗原を同定して回収するための「トレーサー」として役立つと考えられる。したがって、標識した「トレーサー」抗原を、以前の免疫沈降に用いたものと同じ標的試料／細胞株のより多量のコールド（非標識）細胞可溶化物と混合した上で、上記の通りにタンパク質をゲルで分離する。標識した「トレーサー」抗原の検出により、それ自体のゲル上の位置が同定されるだけでなく、それとともにゲル上を移動したはるかに大量の対応する非標識タンパク質抗原の位置も同定される。上記の通り、続いて、標識した「トレーサー」抗原および対応する共移動性非標識タンパク質抗原の位置を検出するために、ゲルを適切な時間にわたってフィルムに対して露出する。本明細書に記載の方法を用いてゲルから一度切り出す。抗原は標準的な方法によるシークエンシング、または抗原もしくは抗体のさらなる単離に用いることができる。
【０２２６】
ペプチドライブラリーのスクリーニング
１９種の一般的なアミノ酸（システインを除く）を用いて、それぞれのカルボキシ末端の位置のアミノ酸が固定され、そこでリンカーを介して固相支持体と結合しているランダムなペプチドから構成されるコンビナトリアルライブラリーを作製する。ペプチドのカルボキシ末端位置を固定することにより、固体支持体からペプチドが等しく放出される。このライブラリーの複雑度は１９６である、または約４７００万種のペプチドを有する。１つの態様において、ライブラリーはランダムな６量体から構成される。代替的な態様において、ライブラリーは、１つまたは複数の固定したまたは不変の位置を有する部分的に重複したペプチド、すなわち７量体〜１０量体から構成されてもよい。
【０２２７】
１つの典型的な抗体捕捉アッセイでは、標識していない抗原／エピトープを固体支持体上に固定化し、固定化した抗原／エピトープに抗体を結合させるが、抗体は直接標識することもでき、または抗体を特異的に認識すると思われる標識した二次試薬を用いることによって検出することもできる。
【０２２８】
ほとんどの免疫化学的技法にはある種のバックグラウンドがあるため、特定の抗原の存在量が他のタンパク質と比べて減少するのに伴って、抗体がバックグラウンドから正しい抗原を識別する能力は低下するおそれがある。これはポリクローナル抗体の場合に特にそうである。抗原がバックグラウンドノイズの中から特異的に同定されうる任意の技法を、二次的な技法として用いることができる。
【０２２９】
「オフビーズ（ｏｆｆ−ｂｅａｄ）」スクリーニング技術を利用する場合には、阻止抗体の使用による抗体の濃縮が好ましい。本発明の方法の１つの態様においては（図２参照）、利用する抗体を以下の通りに命名する：（ａ）一次抗体はウエスタンブロットから溶出した抗体のことである；（ｂ）ヒトＩｇＧ定常領域に対して特異的な「第１の」二次抗体は「阻止抗体」であり、間接的検出アッセイ法に用いるための酵素標識も行う；（ｃ）「第２の」二次抗体は「真または実際の二次抗体」であり、標識の点を除いて「第１の」二次抗体または阻止抗体とすべての点で同一である。例えば、１匹の動物に単一の免疫原（すなわち、ヒトＩｇＧ ＣＲ）による免疫処置を行い、その血清を採取して２つのアリコートに分けた上で、一方のアリコートを西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識を有する「第１の」二次（阻止）抗体へと誘導体化し、第２のアリコートをアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識を有する「第２の」二次（真または実際の）抗体へと誘導体化した。
【０２３０】
本発明の１つの態様においては、ペプチドライブラリーを以下の通りにスクリーニングする。ライブラリーをまず「第１の」二次（阻止）抗体で飽和させる。阻止抗体を除去するために数回洗浄した後に一次抗体をペプチドライブラリーと接触させる。数回の洗浄段階によって一次抗体をライブラリーから除去する。次に「第２の」二次（真または実際の）抗体をビーズライブラリーと接触させる。「第２の」二次（真または実際の）抗体を洗い流した後に、ＡＰ標識した「第２の」二次（真または実際の）抗体の基質である３’，３’−ジアミノベンチジン四塩酸（ＤＡＢ）をライブラリーに添加する。これにより、ペプチドが特異的に結合したビーズは紫色に染色される（図２には黒で示した）。ＤＡＢを除去するために数回洗浄した後に、ライブラリーを、ＨＲＰ標識した「第１の」二次（阻止）抗体の基質である５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−リン酸／４−ニトロブルー塩化テトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）と接触させた。これにより、ペプチドが特異的に結合したビーズは褐色に染色される（図２には灰色で示した）。「第２の」二次抗体は一次抗体上のヒト定常領域のみと結合するはずであるため、一次抗体が結合したペプチドを有するビーズは紫色に染色されると考えられる。「紫色」のビーズは、褐色および透明なビーズの混合物であるライブラリーの残りのビーズから容易に検出して区別することができる。次に、陽性ビーズを単離してペプチドのシークエンシングを行う。
【０２３１】
本発明のもう１つの態様においては、ライブラリーのスクリーニングを、ペプチドを含むビーズを９６穴テフロンフィルター底プレート内に例えば１０，０００ビーズ／ウェルで配置することにより、「オフビーズ（ｏｆｆ ｂｅａｄ）」的に行う。各ウェル内の全ビーズからペプチドの一部が化学的に放出され（ペプチドプールとして）、それをレプリカプレート（標準的な９６穴プレート）に集める。続いて、ニトロセルロースなどの膜に対して、放出されたペプチドプールのアリコートをスポッティングするか、または９６穴真空マニホールドを用いて固定量の放出ペプチドを付着させる。続いて、溶出した関心対象の抗体を用いて、放出ペプチドを含む膜上でウエスタンブロットを行うことができる。陽性抗体：ペプチド複合体がウエスタンブロット上に同定されたところで、「陽性」ペプチドプールが放出されたウェルに含まれるビーズを、新たな９６穴フィルタープレート（ビーズ約１００個／ウェル）に再び配置することができる。前と同じく、各ウェル内の全ビーズからペプチドの一部がペプチドプールとして放出されるため、そのプールを固体膜支持体に移して抗体との反応性を調べる。この時点で、〜１００個のビーズのプールから放出されたペプチドに対応する単一の陽性ウェルがあるはずである。これらの〜１００個のビーズを新たな９６穴プレートに再び配置し（今度はビーズ〜１個／ウェル）、固相ペプチドの一部を放出させて膜支持体に移す。膜をもう一度関心対象の抗体をプローブとして検索することにより、反応性ペプチドを含む単一のビーズを含むウェルが同定されると思われる。エドマン分解または当技術分野で知られた他の適した方法により、陽性ビーズ上の残存ペプチドの直接シークエンシングを行うことができる。
【０２３２】
ＳＡＧＥを用いた遺伝子発現データベースの作成
ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析）は、米国特許第５，６９５，９３７号に記載されている。ＳＡＧＥとは、何千もの遺伝子転写物を迅速に同定および分析するための技法である。ＳＡＧＥを用いると、発現された遺伝子に対応する配列タグの同定および分析を行うことができる。「タグ」または「ＳＡＧＥタグ」とは、メッセンジャーＲＮＡの特定の位置に生じる一般に約２０ヌクレオチドまたはそれ未満の短いポリヌクレオチド配列のことである。タグは対応する転写物を同定し、それが転写された遺伝子を同定するために用いられる。ＳＡＧＥデータベースのアプリケーションは関心対象のポリペプチドを同定するために用いられれる。第１に、抗体が結合するタンパク質を発現する標的試料／細胞株（すなわち「陽性」標的試料／細胞）に関する発現データを検討し、前記標的試料／細胞株で過剰発現されるすべての遺伝子を同定する。そのようにして同定された遺伝子は「候補遺伝子の予備的リスト」（すなわち、陽性標的試料／細胞において過剰発現される）を構成する。第２に、対象の血清中に存在する抗体が一意的に結合するタンパク質（抗原）を含まない標的試料／細胞株（すなわち「陰性」標的試料／細胞）における「予備的リスト」中の各遺伝子の発現データを検討する。陰性標的試料／細胞における遺伝子発現レベルを決定した後に、選別基準（上記）を満たさない遺伝子を除去し、精緻化された「候補遺伝子のサブセット」、例えば「陽性」標的試料／細胞で過剰発現される遺伝子、および「陰性」標的試料／細胞で発現低下しているものなどを定める。第３に、精緻化された「サブセット」中の候補遺伝子をさらに選別し、対象の血清のウエスタンブロット分析にて抗体が結合したタンパク質（抗原）の観測分子量とほぼ等しい分子量を有するタンパク質を発現する遺伝子を同定および選択する。当業者は、例えばウエスタンブロット分析によって決定されたタンパク質の見かけの分子量はしばしば実際の分子量よりも幾分大きく示されることを理解している。このため、あらかじめ選択した分子量を有するタンパク質を発現を発現しない精緻化された「サブセット」中の遺伝子を除去し、例えば、陽性標的試料／細胞で過剰発現される、陰性標的試料／細胞で発現低下している、あらかじめ選択した特定の分子量のタンパク質産物を有するといった「選抜候補リスト（ｓｈｏｒｔ ｌｉｓｔ）」に関する基準を満たす遺伝子の数を絞る。
【０２３３】
ＳＡＧＥは、単一の候補遺伝子のみが「選抜候補リスト」のすべての基準を満たすと場合などには、上記の発現データおよびタンパク質サイズ分析から抗原をコードする遺伝子を同定することができる。しかし、「選抜候補リスト」が基準を満たす複数の候補遺伝子からなる場合もある。このような場合には、本発明はさらに、標的タンパク質を正確に同定するための方法を提供する。このような追加的な分析を行うために、抗体（ウエスタン分析でポリペプチド−抗原と複合体化したもの）をさらに利用する。用いうる抗体の量が限られている状況、例えば、抗体をヒト患者の血清試料から入手する場合などには、本発明の方法にて、抗体の機能的活性が保たれるような様式で固体支持体から血清抗体を取り出す。本発明の１つの態様においては、単離した抗体をポリペプチド抗原の免疫沈降に用いる。もう１つの態様においては、単離した抗体を抗体エピトープ候補を同定するためのペプチドライブラリーのスクリーニングに用いる。陽性エピトープ候補は標準的な標識法を用いることによって可視化しうる（すなわち、放射性同位体、酵素、ビオチン、蛍光色素など）。次にエピトープ候補（ペプチド）のアミノ酸配列を決定し、あらかじめ選択した「選抜候補リスト」中の遺伝子によってコードされる遺伝子発現産物のアミノ酸配列と比較する。エピトープ候補（ペプチド）のアミノ酸配列を含む、あらかじめ選択した「選抜候補リスト」中の遺伝子によってコードされるポリペプチド配列は、抗体が認識および結合する天然のエピトープを規定すると考えられる。
【０２３４】
ＳＡＧＥデータの選別により、抗腫瘍反応性を有することが示された抗体によって認識される細胞表面標的をコードする、差異を伴って発現される遺伝子を同定することができる。抗原が同定されれば、標的タンパク質抗原が天然の状態で免疫原性であるか否かを判定する目的で、標的タンパク質抗原をヒト癌対象から入手した血清試料に対してさらにアッセイすることができる。
【０２３５】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる抗原同定
関心対象の抗原のヌクレオチドまたは遺伝子候補リストおよび見かけの分子量がわかっても、正しい抗原をまだ明確には同定できない場合も考えられる。固相ライブラリースクリーニングで有用な情報が得られない場合には、第２の技法であるＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（図５に示す）を、ライブラリースクリーニングの代わりにヌクレオチド配列相同性分析と組み合わせてもよい。この方法により、遺伝子分析とは独立した方法によって抗原候補のリストを作成することが可能となる。
【０２３６】
ヌクレオチド配列またはデータベースのリストには「正しい」抗原が１つしかない可能性があり、同じ抗原がＭＡＬＤＩ−ＴＯＦリストにも存在しなければならないため、この２つの比較によって関心対象の抗原を迅速に同定することができる。さらに、標準的な一次元タンパク質ゲルから入手した抗原を用いて分析を首尾よく行うことができる。両方のリストの「偽陽性物」の間に重複がほとんどまたは全くないという理由は、偽陽性物の各セットが得られる元となった基準が極めて異なることによる。すなわち、正しい抗原に類似した発現パターンを有する擬陽性物（ＳＡＧＥ）と、正しい抗原とたまたま共移動した、またはデータベース検索によって誤って同定された偽陽性物（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）との間には何ら一貫した因果関係はないと思われる。
【０２３７】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるエピトープマッピング
必要な試薬は、精製または半精製した抗原調製物および関心対象の抗体である。第１に、予測可能な分子量のペプチドを生じさせるために、完全な抗原を酵素（例えば、トリプシン、キモトリプシン）または化学物質（例えば、ＣＮＢｒ）による方法で消化する。次に、抗体をペプチド混合物に添加し、その線状認識配列を含むペプチドを「捕捉」する。抗体−ペプチド複合体は、例えば、非結合ペプチドを容易に洗い流せるようにプロテインＡをコーティングした磁気ビーズで収集することができる。洗浄後に、溶液のｐＨを調整することによって抗体複合体を変性させ、関心対象のエピトープを含む結合ペプチドを遊離させる。溶出ペプチドに対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行うことにより、ペプチド断片の分子量を決定できる。この「実際の」分子量を理論的に「計算した」分子量のリストと比較し、エピトープを含むペプチド断片の配列を同定することができる。
【０２３８】
以下の状況では、あいまいな結果（上記の方法を用いる）が得られる可能性がある：（１）「混入」ペプチドが正しいエピトープを含むペプチドとともに精製された場合、このような場合には複数の分子質量がＭＳ分析で検出されると思われる；および（２）抗原の消化中に最小必須エピトープが破壊された場合（すなわち、それが切断されるコンセンサス配列を有する場合）、このような場合にはＭＳ分析によって質量が同定されないか、混入した質量のみが同定される。
【０２３９】
いずれの（上記の）状況であっても、以下のようにしてあいまいさをしばしば解消することが可能である。同一な試料を異なる抗原消化法（好ましくは、コンセンサス配列が互いに排他的な方法）を用いて処理してもよい。これにより、両方の消化物でともに最小エピトープが破壊される確率を大きく下げられる。両方の消化物から得た質量を比較し、正しいエピトープを含むペプチドを同定する。消化物を比較したところ、エピトープが各消化物から同定したペプチドの間の重複領域に存在することが示されることもあり、最小必須エピトープの位置がさらに精緻化される。消化法の一方がエピトープを破壊しない場合には、他の消化物中の正しいエピトープを含むペプチドは第１の消化物に特異的な切断コンセンサス配列を必ず含むものと推定される。
【０２４０】
実施例１：αＨｅｒ−２抗体反応性ペプチドに関するコンビナトリアルペプチドライブラリーのスクリーニング
ＨＥＲ−２抗原
2004513332.tif 000003
と互いに関連する２つの新規なエピトープ
2004513332.tif 000004
および
2004513332.tif 000005
、ならびにそれらをコードするポリヌクレオチドを、図２および３に示した方法を用いて同定した。ペプチドライブラリーのスクリーニングを「オフビーズ（ｏｆｆ−ｂｅａｄ）」的に行ったため、前記の間接法またはトレーサー法を用いて抗原またはポリペプチドの濃縮試料を得ることが必要であった。
【０２４１】
用いた抗体は、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ：Ｎｅｏｍａｒｋｅｒｓ カタログ番号ＭＳ−５９９−Ｐ１：クローン３Ｂ５（Ａｂ−１５）（Ｌａｂ Ｖｉｓｉｏｎ Ｃｏｒｐ．、Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、ＣＡ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＨＲＰ：Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ９９１７（ヤギ２匹からの貯留ポリクローナル血清）およびヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＡＰ：Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ１２９３（１ヤギ匹からのポリクローナル血清：この同じヤギからの血清は直前に記載した貯留ポリクローナル血清の一部でもある）。
【０２４２】
１０７個のビーズ（オレンジ色キャップの５０ｍｌチューブに入れた乾燥重量＝２０．４３ｇ ｛ビーズ＝７．２ｇ｝）を５％ＢＬＯＴＴＯで３０分間以上ブロックした。ビーズをヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＨＲＰ（１：２５００）とともに室温（「ＲＴ」）で回転させながら１．５時間インキュベートした。ビーズをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で数回洗い、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体Ａｂ−１５（以前にイムノブロットから溶出したもの）とともに２０ｍｌ中にて２時間、ＲＴでインキュベートした。ビーズをＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で数回洗った。このビーズをヤギ抗マウスＩｇＧ＋ＡＰ（１：２５００）とともに ＲＴで回転させながら１．５時間インキュベートした。
【０２４３】
ビーズを回転させながらＯ／Ｎ、４℃で洗浄した。ＡＰ（アルカリホスファターゼ）の基質であるＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸／４−ニトロブルー塩化テトラゾリウム）（Ｚｙｍｅｄカタログ番号００−２２１０；Ｓｏ． ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を添加し、ビーズとともにＲＴで３０分間インキュベートした。このビーズをＰＢＳで数回洗った。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）の基質であるＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンチジン四塩酸）（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｓカタログ番号ＳＫ−４１００；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を添加し、１０分間インキュベートした。このビーズをＰＢＳで数回洗った。ビーズを解剖顕微鏡で観察した。紫色に染色されたビーズを選択し、フィルター底９６穴マイクロタイタープレート中に配置した。配置したビーズの２つからペプチドをトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）による化学的切断によって放出させ、続いてシークエンシングを行った。
【０２４４】
図３は、Ｈｅｒ−２抗体が溶出したウエスタンブロット（左上）およびシークエンシングを行った「陽性」ビーズの１つ（左下）を示している。図の右下には、Ｈｅｒ−２タンパク質のある領域を有する２つのライブラリー配列のアライメントを示している。これらの配列を候補遺伝子データベースのリストと比較した。この領域はαＨｅｒ２抗体の作製に最初に用いた１５アミノ酸のペプチドの内部に位置する。
【０２４５】
実施例２：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを用いた抗原同定
この実施例では、アデノウイルスベクターにて送達されるＭＡＲＴ−１ワクチンによる治療を受けた黒色腫患者および完全な臨床反応がみられた例からの分画していない縦断的な血清試料を分析した。
【０２４６】
転移の多部位縮退と相関したＩｇＭ抗体活性が同定された。血清のブロットを行った可溶化物の調製に用いた細胞株はすべて、ＳＡＧＥデータが入手可能な腫瘍細胞株であった。図６参照。
【０２４７】
関心対象のバンドを同定した上で、上に示した分析に用いるための同一なタンパク質ゲルを第３の縦断的な血清試料を用いて調製した。このバンドをゲルから切り出してトリプシンで消化した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳをトリプシン処理ペプチドに対して行ったところ、９９種の分子質量が明らかになった。これらの質量を、ＵＣＳＦのピーター・ベーカー（Ｐｅｔｅｒ Ｂａｋｅｒ）およびカール・クローザー（Ｋａｒｌ Ｃｌａｕｓｅｒ）により開発されたＭＳ−ＦＩＴプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｐｅｃｔｏｒ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｕｃｓｆｈｔｍ１３．４／ｍｓｆｉｔ．ｈｔｍを参照）を用いて、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベース中の全タンパク質のトリプシン消化物の計算値と比較した。
【０２４８】
検索パラメーターは以下のようにまとめられる：
2004513332.tif 000006
【０２４９】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ抗原候補リストを上に示したスコアの高かったタンパク質を用いて作成した上で、データベースライブラリー、この場合には黒色腫細胞株から作成したＳＡＧＥライブラリーを用いて、このリストの上位１００件を細胞株における発現パターンに関して調べた。おおよそ正しい分子量のタンパク質のみ、ウエスタンブロットの結果と概ね一致した。
【０２５０】
抗体を確認するために、市販のモノクローナル抗体を用いて、このタンパク質を発現することが知られた腫瘍細胞株の全細胞可溶化物からのタンパク質の免疫沈降を行った。全細胞可溶化物、免疫沈降したタンパク質、および免疫沈降した試料の上清を、第３の縦断的な患者血清試料を用いるウエスタンブロット法によって分析した。このブロットを図７に示す。
【０２５１】
実施例３　動物モデルを用いた抗原の同定または確認
フラデット（Ｆｒａｄｅｔ）ら（１９８４）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ． ＵＳＡ ８１：２２４の方法を用いて、免疫能のあるマウスに対して、全腫瘍細胞、腫瘍細胞膜または培養腫瘍細胞からの無血清馴化培地による免疫処置を行う。屠殺したマウスから全血清を採取し、ライリー（Ｒｅｉｌｌｙ）ら（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６１：８８０の方法を用いて全抗体を収集する。広在性抗原を認識する汎反応性マウス抗体を除去するために、マウス抗体を正常細胞（線維芽細胞、リンパ球）に吸着させる。インビトロまたはインビボでのアッセイ法を行って濃縮した抗体調製物の機能的性質を評価する。例えば、抗体が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介しうるか否かを判定するために、スコット（Ｓｃｏｔｔ）ら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：３２５４の方法を用いて、インビトロで補体および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の存在下でヒト腫瘍細胞に濃縮抗体を加える。または、ライリー（Ｒｅｉｌｌｙ）ら（２００１）前記の方法により、抗体の産生に用いた免疫能マウスと同様の遺伝的背景を持つ免疫不全マウスに濃縮抗体の養子移入を行い、ヒト腫瘍細胞の注入刺激に対する防御性が付与されるか否かを判定する。抗体調製物がヒト腫瘍細胞をインビトロで死滅させること、またはヒト腫瘍細胞のインビボでの増殖を遅らせることが知られている場合には、生物活性のある抗ヒト癌細胞抗体が存在するはずである。生物活性抗体を用いたウエスタンブロット分析を行い、治療用抗体に対する同族（ｃｏｇｎａｔｅ）抗原が直ちに同定するために、抗体による影響を受けるヒト癌細胞に対する反応性を、影響を受けない他のヒト細胞（癌および正常）と対比して検討する。自己または同種のヒト癌細胞またはマウス癌細胞またはそれぞれの膜画分または脱離抗原は、免疫能マウスに生物活性のあるポリクローナル抗体を産生させるのに有用である。しかし、生物活性のある抗体が生じる確率は、免疫能マウスにおける抗体産生に用いるヒト腫瘍細胞が、免疫不全マウスに対する刺激に用いるものと同じである方が高いと考えられる。
【０２５２】
実施例４　自己免疫疾患である全身性エリテマトーデスと関連づけられる抗原を同定するための方法の使用
さまざまな異なるサイトカインが、全身性エリテマトーデス（「ＳＬＥ」）の発症と関連づけられている。例えば、インターロイキン１０はＳＬＥ患者で高値であるように思われ、このことから、それがこの自己免疫疾患の発症または進行に役割を果たす可能性が示唆されている。ロレンテ（Ｌｌｏｒｅｎｔｅ）ら（１９５５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １８１：８３９）は、ＳＬＥ患者由来の末梢血単核をあらかじめ注射した免疫不全マウスに抗ＩＬ−１０抗体を投与し、この処置によって処置マウスの血清中のヒト自己抗体の濃度が低下したことを観察している。しかし、他の分泌因子（インターロイキン１）および細胞表面マーカー（ＣＤ４０Ｌ）もＳＬＥ患者で高値であることが報告されており、これらの分子のＳＬＥの発生に対する相対的寄与は不明であるため、そのうち１つの標的（ＩＬ−１０）を中和用に恣意的に選択すると臨床的に失敗する可能性がある。
【０２５３】
単一の定められた標的に対する抗体を産生させることに代わる選択肢として、免疫能低下マウスに対して、ＳＬＥ患者の末梢血単核細胞（「ＰＢＭＣ」）またはＳＬＥ患者から単離した細胞（例えば、樹状細胞、Ｔ細胞またはＢ細胞）、またはこのような細胞に由来する細胞膜もしくは無血清馴化培地による免疫処置を行う。屠殺したマウスから全血清を採取し、全抗体を収集する。広在性抗原を認識する汎反応性マウス抗体を除去するために、マウス抗体を正常細胞（線維芽細胞、リンパ球）に吸着させる。インビトロまたはインビボでのアッセイ法を行って濃縮した抗体調製物の機能的性質を評価する。例えば、濃縮抗体をＳＬＥ患者の細胞に添加する。抗体がＡＤＣＣを媒介しうるか否かを判定するために、インビトロで補体およびＰＢＭＣの存在下でＳＬＥ患者の細胞に濃縮抗体を加える。または、免疫不全マウス（抗体の産生に用いた免疫能マウスと同様の遺伝的背景を持つもの）に濃縮抗体の養子移入を行い、免疫不全マウスに注入したＳＬＥ患者のＰＢＭＣの挙動が修飾されるか否かを判定する。抗体調製物がＳＬＥ患者のＰＢＭＣをインビトロまたはインビボで修飾することが示されれば、ＳＬＥ標的を認識する生物活性のある抗体が存在するはずである。続いて、生物活性抗体を用いたウエスタンブロット分析を行い、治療用抗体に対する同族抗原を直ちに同定するために、抗体による影響を受ける患者ＳＬＥ細胞に対する反応性を、影響を受けない他のヒト細胞（健康ドナー由来の正常相当物）と対比して検討する。
【０２５４】
実施例５　タンパク質の不適切な発現が疾病状態と関連する疾患である多発性嚢胞腎における抗原の同定
免疫能のあるマウスに対して、多発性嚢胞腎細胞、またはこの種の細胞に由来する細胞膜もしくは無血清馴化培地による免疫処置を行う。屠殺したマウスから全血清を採取し、全抗体を収集する。広在性抗原を認識する汎反応性マウス抗体を除去するために、マウス抗体を正常細胞（線維芽細胞、リンパ球）に吸着させる。インビトロまたはインビボでのアッセイ法を行って濃縮した抗体調製物の機能的性質を評価する。例えば、濃縮抗体をＳＬＥ患者の細胞に添加する。抗体がＡＤＣＣを媒介しうるか否かを判定するために、インビトロで補体およびＰＢＭＣの存在下で多発性嚢胞腎細胞に濃縮抗体を加える。または、多発性嚢胞腎を自然発生するマウス（抗体の産生に用いた免疫能マウスと同様の遺伝的背景を持つもの）に濃縮抗体の養子移入を行い、それがインビボでの嚢胞発生を抑制するか否かを判定する。抗体調製物が嚢胞に対して細胞分裂阻止作用または細胞傷害作用をもつことが示されれば、治療的有用性があると推定される抗体が存在するはずである。続いて、生物活性抗体を用いたウエスタンブロット分析を行い、治療用抗体に対する同族抗原を直ちに同定するために、抗体による影響を受ける嚢胞細胞に対する反応性を、影響を受けない他の細胞と対比して検討する。ポリクローナル抗体の産生、ならびにウエスタンブロット分析およびその後の抗原同定のための可溶化物の調製にはヒトまたは非ヒトのいずれかの多発性嚢胞腎細胞を用いる。
【０２５５】
本発明を上述の態様とともに説明してきたが、前記の説明および実施例は本発明を例示することを意図したものであり、本発明の範囲を制限するものではないことが理解される必要がある。本発明の範囲に含まれる他の局面、利点および修正は、本発明が属する当業者には明らかであると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本明細書に提供するプロトコールによって溶出した抗体がその特異的抗原結合性を保っていることを示している。右側のブロットは、左側のブロットから溶出した抗Ｈｅｒ２抗体を用いて作製した。
【図２】ヒト抗Ｈｅｒ２抗体を用いるトレーサー法または間接法の概略図である。
【図３】Ｈｅｒ−２抗体が溶出したウエスタンブロット（上）、および本明細書に記載の方法を用いてシークエンシングを行った「陽性」ビーズの１つ（中）を示している。図の下には、Ｈｅｒ−２タンパク質のある領域を有する２つのライブラリー配列のアライメントを示している。
【図４】頂側細胞膜および側底細胞膜の単離に関する概略図である。
【図５】関心対象の抗原の同定にＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析を用いる、本発明の代替的な態様の概略図である。
【図６】ＭＡＲＴ−１ワクチンによる免疫処置を受けた反応性黒色腫患者から単離した抗体のバンドを示している。ワクチン接種の前および後の血清を示している。
【図７】本発明の方法によって単離した免疫沈降ポリペプチド（タンパク質）のウエスタンブロット法による確認分析である。従来のＥＬＩＳＡを用いることにより、ポリペプチドが、反応性患者の血清から単離したＩｇＭ抗体を特異的に認識してそれと結合することが示されている。中央のレーン（ＩＰ上清）ではバンドが著しく減弱している。
【図８】図７で同定した単離ペプチド（タンパク質）と結合した市販のモノクローナル抗体のウエスタンブロットである。
【図１】
2004513332.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004513332.tif 000101
2004513332.tif 000102
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004513332.tif 000103
2004513332.tif 000104
【国際調査報告】
2004513332.tif 000105
2004513332.tif 000106
2004513332.tif 000107
2004513332.tif 000108
2004513332.tif 000109
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