(57)【要約】本発明は、ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの活性を調節する治療薬に関する。本発明によれば、ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰのモジュレータは、ａ）ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメイン、およびｂ）ポリマー（たとえばＰＥＧ、またはデキストラン）、またはＦｃドメインなどのビヒクルを含み、Ｆｃドメインが好ましく、ビヒクルは、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインのＣ末端に共有結合している。ビヒクルおよびＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインは、本明細書に記載のとおりＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインのＮ末端またはＣ末端を介して結合することができる。好ましいビヒクルはＦｃドメインであり、好ましいＦｃドメインはＩｇＧＦｃドメインである。好ましいＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインは、本明細書に記載のＰＴＨおよびＰＴＨｒＰ由来のアミノ酸配列を含む。他のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインは、ファージディスプレイ、ＲＮＡペプチドスクリーニング、および本明細書に述べた他の技法によって生成することができる。そのようなペプチドは典型的にＰＴＨ活性およびＰＴＨｒＰ活性両方のモジュレータとなるが、そのような技法は選択的モジュレータとして働く（たとえば、ＰＴＨ活性のアゴニストであるが、ＰＴＨｒＰ活性のアゴニストではない）ペプチド配列を生成するために用いることができる。【選択図】図２
2004500838.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式の物質およびその多量体の組成物であって、
Ｐ１−（Ｌ１）ａ−Ｆ１
式中、
Ｆ１は、ビヒクルであり、Ｐ１−（Ｌ１）ａのＣ末端に結合しており、
Ｐ１は、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインであり、
Ｌ１は、リンカーであり、
ａは、０、または１である組成物。
【請求項２】
式Ｐ１−Ｆ１の請求項１に記載の物質の組成物。
【請求項３】
Ｆ１が、Ｆｃドメインである請求項１に記載の物質の組成物。
【請求項４】
Ｆ１が、ＩｇＧＦｃドメインである請求項１に記載の物質の組成物。
【請求項５】
Ｆ１が、ＩｇＧ１Ｆｃドメインである請求項１に記載の物質の組成物。
【請求項６】
Ｆ１が、配列番号２の配列を含む請求項１に記載の物質の組成物。
【請求項７】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインが次式であり、
ＸＮＨＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＫＸ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＲＸ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８ＸＣ
（配列番号３）
式中、
ＸＮは、存在しないか、あるいはＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７、Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７、またはＹＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７であり、
Ｘ１からＸ７、Ｘ１０、Ｘ１１、Ｘ１２、Ｘ１４からＸ２８は、それぞれ独立してアミノ酸残基であり、
ＸＣは、存在しないか、あるいはＸ２９、Ｘ２９Ｘ３０、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５、またはＸ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６であり、
Ｘ２９からＸ３６は、それぞれ独立してアミノ酸残基である請求項１に記載の物質の組成物。
【請求項８】
ＸＮは、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７であり、
Ｘ１は、親水性、または非官能性残基であり、
Ｘ２は、Ｖであり、
Ｘ３は、Ｓであり、
Ｘ４は、Ｅであり、
Ｘ５は、非官能性、または塩基性残基であり、
Ｘ６は、Ｑであり、
Ｘ７は、Ｌであり、
Ｘ１０は、酸性、または親水性残基であり、
Ｘ１１は、非官能性、または塩基性残基であり、
Ｘ１２は、非官能性残基であり、
Ｘ１４は、塩基性、または親水性残基であり、
Ｘ１５は、非官能性残基であり、
Ｘ１６は、非官能性、または親水性残基であり、
Ｘ１７は、酸性、親水性、または非官能性残基であり、
Ｘ１８は、非官能性残基であり、
Ｘ１９は、酸性、または塩基性残基であり、
Ｘ２１は、非官能性、または塩基性残基であり、
Ｘ２２は、親水性、酸性、または芳香族残基であり、
Ｘ２３は、芳香族、または親油性残基であり、
Ｘ２４は、親油性残基（好ましくはＬ）であり、
Ｘ２５は、親水性、または塩基性残基であり、
Ｘ２６は、親水性、または塩基性残基であり、
Ｘ２７は、親油性、塩基性、または非官能性残基であり、
Ｘ２８は、親油性、または非官能性残基である請求項７に記載の物質の組成物。
【請求項９】
ＸＣは、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４であり、
Ｘ２９は、親水性、または非官能性残基であり、
Ｘ３０は、親水性、または酸性残基であり、
Ｘ３１は、親油性、または非官能性残基であり、
Ｘ３２は、Ｈであり、
Ｘ３３は、親水性残基であり、
Ｘ３４は、非官能性、または芳香族残基である請求項８に記載の物質の組成物。
【請求項１０】
ＸＣは、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１であり、
Ｘ２９は、親水性、または非官能性残基であり、
Ｘ３０は、親水性、または酸性残基であり、
Ｘ３１は、親油性、または非官能性残基である請求項８に記載の物質の組成物。
【請求項１１】
ＸＣは、Ｘ２９Ｘ３０であり、
Ｘ２９は、親水性、または非官能性残基であり、
Ｘ３０は、親水性、または酸性残基である請求項８に記載の物質の組成物。
【請求項１２】
ＸＣは、Ｘ２９であり、
Ｘ２９は、親水性、または非官能性残基である請求項８に記載の物質の組成物。
【請求項１３】
ＸＣは存在しない請求項８に記載の物質の組成物。
【請求項１４】
Ｘ１は、Ａ、Ｓ、またはＹであり、
Ｘ５は、Ｈ、またはＩであり、
Ｘ１０は、Ｎ、またはＤであり、
Ｘ１１は、Ｌ、Ｒ、またはＫであり、
Ｘ１２は、Ｇ、Ｆ、またはＷであり、
Ｘ１４は、Ｈ、またはＳであり、
Ｘ１５は、Ｌ、またはＩであり、
Ｘ１６は、Ｑ、Ｎ、Ｓ、またはＡであり、
Ｘ１７は、Ｓ、Ｄ、またはＬであり、
Ｘ１８は、Ｍ、Ｌ、Ｖ、またはＮｌｅであり、
Ｘ１９は、Ｅ、またはＲであり、
Ｘ２１は、Ｖ、Ｍ、Ｒ、またはＮｌｅであり、
Ｘ２２は、Ｅ、またはＦであり、
Ｘ２３は、Ｗ、またはＦであり、
Ｘ２５は、Ｒ、またはＨであり、
Ｘ２６は、Ｋ、またはＨであり、
Ｘ２７は、Ｋ、またはＬであり、
Ｘ２８は、Ｌ、またはＩである請求項８に記載の物質の組成物。
【請求項１５】
ＸＣは、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４であり、
Ｘ２９は、Ｑ、またはＡであり、
Ｘ３０は、Ｄ、またはＥであり、
Ｘ３１は、Ｖ、またはＩであり、
Ｘ３３は、Ｎ、またはＴであり、
Ｘ３４は、Ａ、Ｆ、またはＹである請求項１４に記載の物質の組成物。
【請求項１６】
ＸＣは、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１であり、
Ｘ２９は、Ｑ、またはＡであり、
Ｘ３０は、Ｄ、またはＥであり、
Ｘ３１は、Ｖ、またはＩである請求項１４に記載の物質の組成物。
【請求項１７】
ＸＣは、Ｘ２９Ｘ３０であり、
Ｘ２９は、Ｑ、またはＡであり、
Ｘ３０は、Ｄ、またはＥである請求項１４に記載の物質の組成物。
【請求項１８】
ＸＣは、Ｘ２９であり、
Ｘ２９は、Ｑ、またはＡである請求項１４に記載の物質の組成物。
【請求項１９】
ＸＣは存在しない請求項１４に記載の物質の組成物。
【請求項２０】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインが次式であり、
ＪＮＪ７Ｊ８ＨＮＪ１１Ｊ１２ＫＨＬＪ１６ＳＪ１８Ｊ１９ＲＪ２１ＥＷＬＲＫＫＬＪＣ
（配列番号４）
式中、
ＪＮは、存在しないか、あるいはＪ１Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６、Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６、Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６から選択され、
Ｊ１は、アミノ酸残基であり、
Ｊ２は、アミノ酸残基であり、
Ｊ３は、アミノ酸残基であり、
Ｊ４は、アミノ酸残基であり、
Ｊ５は、アミノ酸残基であり、
Ｊ６は、アミノ酸残基であり、
Ｊ７は、アミノ酸残基であり、
Ｊ８は、アミノ酸残基であり、
Ｊ１１は、非官能性、または塩基性残基であり、
Ｊ１２は、アミノ酸残基であり、
Ｊ１６は、アミノ酸残基であり、
Ｊ１８は、アミノ酸残基であり、
Ｊ１９は、酸性、または塩基性残基であり、
Ｊ２１は、アミノ酸残基であり、
ＪＣは、存在しないか、あるいはＪ２９、Ｊ２９Ｊ３０、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２Ｊ３３、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２Ｊ３３Ｊ３４であり、
Ｊ２９は、アミノ酸残基であり、
Ｊ３０は、アミノ酸残基であり、
Ｊ３１は、アミノ酸残基であり、
Ｊ３２は、アミノ酸残基であり、
Ｊ３３は、アミノ酸残基であり、
Ｊ３４は、アミノ酸残基である請求項１に記載の物質の組成物。
【請求項２１】
ＪＮは、Ｊ１Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６であり、
Ｊ１は、非官能性、または芳香族残基であり、
Ｊ２は、非官能性残基であり、
Ｊ３は、親水性残基であり、
Ｊ４は、酸性残基であり、
Ｊ５は、非官能性残基であり、
Ｊ６は、塩基性残基であり、
Ｊ７は、非官能性、または芳香族残基であり、
Ｊ８は、非官能性残基であり、
Ｊ１１は、塩基性、または非官能性残基であり、
Ｊ１２は、非官能性、または芳香族残基であり、
Ｊ１６は、非官能性、または親水性残基であり、
Ｊ１８は、非官能性残基であり、
Ｊ１９は、酸性、または塩基性残基であり、
Ｊ２１は、非官能性残基であり、
ＪＣは、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２Ｊ３３Ｊ３４であり、
Ｊ２９は、親水性、または非官能性残基であり、
Ｊ３０は、親水性、または酸性残基であり、
Ｊ３１は、親油性、または非官能性残基であり、
Ｊ３２は、塩基性残基であり、
Ｊ３３は、酸性残基であり、
Ｊ３４は、芳香族残基である請求項２０に記載の物質の組成物。
【請求項２２】
Ｊ１は、Ａ、Ｓ、またはＹであり、
Ｊ２は、Ｖであり、
Ｊ３は、Ｓであり、
Ｊ４は、Ｅであり、
Ｊ５は、Ｉであり、
Ｊ６は、Ｑであり、
Ｊ７は、Ｌ、またはＦであり、
Ｊ８は、Ｍ、またはＮｌｅであり、
Ｊ１１は、Ｌ、Ｒ、またはＫであり、
Ｊ１２は、Ｇ、またはＷであり、
Ｊ１６は、Ｎ、Ｓ、またはＡであり、
Ｊ１８は、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｌ、またはＶであり、
Ｊ１９は、Ｅ、またはＲであり、
Ｊ２１は、Ｖ、Ｍ、またはＮｌｅであり、
Ｊ２９は、Ｑ、またはＡであり、
Ｊ３０は、Ｄ、またはＥであり、
Ｊ３１は、Ｖ、またはＩであり、
Ｊ３２は、Ｈであり、
Ｊ３３は、Ｎであり、
Ｊ３４は、Ｆ、またはＹである請求項２１に記載の物質の組成物。
【請求項２３】
ＪＮは、Ｊ１Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６であり、
Ｊ１は、非官能性、または芳香族残基であり、
Ｊ２は、非官能性残基であり、
Ｊ３は、親水性残基であり、
Ｊ４は、酸性残基であり、
Ｊ５は、非官能性残基であり、
Ｊ６は、塩基性残基であり、
Ｊ７は、非官能性、または芳香族残基であり、
Ｊ８は、非官能性残基であり、
Ｊ１１は、塩基性、または非官能性残基であり、
Ｊ１２は、非官能性、または芳香族残基であり、
Ｊ１６は、非官能性、または親水性残基であり、
Ｊ１８は、非官能性残基であり、
Ｊ１９は、酸性、または塩基性残基であり、
Ｊ２１は、非官能性残基であり、
ＪＣは、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１であり、
Ｊ２９は、親水性、または非官能性残基であり、
Ｊ３０は、親水性、または酸性残基であり、
Ｊ３１は、親油性、または非官能性残基である請求項２０に記載の物質の組成物。
【請求項２４】
Ｊ１は、Ａ、Ｓ、またはＹであり、
Ｊ２は、Ｖであり、
Ｊ３は、Ｓであり、
Ｊ４は、Ｅであり、
Ｊ５は、Ｉであり、
Ｊ６は、Ｑであり、
Ｊ７は、Ｌ、またはＦであり、
Ｊ８は、Ｍ、またはＮｌｅであり、
Ｊ１１は、Ｌ、Ｒ、またはＫであり、
Ｊ１２は、Ｇ、またはＷであり、
Ｊ１６は、Ｎ、Ｓ、またはＡであり、
Ｊ１８は、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｌ、またはＶであり、
Ｊ１９は、Ｅ、またはＲであり、
Ｊ２１は、Ｖ、Ｍ、またはＮｌｅであり、
Ｊ２９は、Ｑ、またはＡであり、
Ｊ３０は、Ｄ、またはＥであり、
Ｊ３１は、Ｖ、またはＩである請求項２３に記載の物質の組成物。
【請求項２５】
ＪＮは、Ｊ１Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６であり、
Ｊ１は、非官能性、または芳香族残基であり、
Ｊ２は、非官能性残基であり、
Ｊ３は、親水性残基であり、
Ｊ４は、酸性残基であり、
Ｊ５は、非官能性残基であり、
Ｊ６は、塩基性残基であり、
Ｊ７は、非官能性、または芳香族残基であり、
Ｊ８は、非官能性残基であり、
Ｊ１１は、塩基性、または非官能性残基であり、
Ｊ１２は、非官能性、または芳香族残基であり、
Ｊ１６は、非官能性、または親水性残基であり、
Ｊ１８は、非官能性残基であり、
Ｊ１９は、酸性、または塩基性残基であり、
Ｊ２１は、非官能性残基であり、
ＪＣは、Ｊ２９Ｊ３０であり、
Ｊ２９は、親水性、または非官能性残基であり、
Ｊ３０は、親水性、または酸性残基である請求項２０に記載の物質の組成物。
【請求項２６】
Ｊ１は、Ａ、Ｓ、またはＹであり、
Ｊ２は、Ｖであり、
Ｊ３は、Ｓであり、
Ｊ４は、Ｅであり、
Ｊ５は、Ｉであり、
Ｊ６は、Ｑであり、
Ｊ７は、Ｌ、またはＦであり、
Ｊ８は、Ｍ、またはＮｌｅであり、
Ｊ１１は、Ｌ、Ｒ、またはＫであり、
Ｊ１２は、Ｇ、またはＷであり、
Ｊ１６は、Ｎ、Ｓ、またはＡであり、
Ｊ１８は、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｌ、またはＶであり、
Ｊ１９は、Ｅ、またはＲであり、
Ｊ２１は、Ｖ、Ｍ、またはＮｌｅであり、
Ｊ２９は、Ｑ、またはＡであり、
Ｊ３０は、Ｄ、またはＥである請求項２５に記載の物質の組成物。
【請求項２７】
ＪＮは、Ｊ１Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６であり、
Ｊ１は、非官能性、または芳香族残基であり、
Ｊ２は、非官能性残基であり、
Ｊ３は、親水性残基であり、
Ｊ４は、酸性残基であり、
Ｊ５は、非官能性残基であり、
Ｊ６は、塩基性残基であり、
Ｊ７は、非官能性、または芳香族残基であり、
Ｊ８は、非官能性残基であり、
Ｊ１１は、塩基性、または非官能性残基であり、
Ｊ１２は、非官能性、または芳香族残基であり、
Ｊ１６は、非官能性、または親水性残基であり、
Ｊ１８は、非官能性残基であり、
Ｊ１９は、酸性、または塩基性残基であり、
Ｊ２１は、非官能性残基であり、
ＪＣは、Ｊ２９であり、
Ｊ２９は、親水性、または非官能性残基である請求項２０に記載の物質の組成物。
【請求項２８】
Ｊ１は、Ａ、Ｓ、またはＹであり、
Ｊ２は、Ｖであり、
Ｊ３は、Ｓであり、
Ｊ４は、Ｅであり、
Ｊ５は、Ｉであり、
Ｊ６は、Ｑであり、
Ｊ７は、Ｌ、またはＦであり、
Ｊ８は、Ｍ、またはＮｌｅであり、
Ｊ１１は、Ｌ、Ｒ、またはＫであり、
Ｊ１２は、Ｇ、またはＷであり、
Ｊ１６は、Ｎ、Ｓ、またはＡであり、
Ｊ１８は、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｌ、またはＶであり、
Ｊ１９は、Ｅ、またはＲであり、
Ｊ２１は、Ｖ、Ｍ、またはＮｌｅであり、
Ｊ２９は、Ｑ、またはＡである請求項２７に記載の物質の組成物。
【請求項２９】
ＪＮは、Ｊ１Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６であり、
Ｊ１は、非官能性、または芳香族残基であり、
Ｊ２は、非官能性残基であり、
Ｊ３は、親水性残基であり、
Ｊ４は、酸性残基であり、
Ｊ５は、非官能性残基であり、
Ｊ６は、塩基性残基であり、
Ｊ７は、非官能性、または芳香族残基であり、
Ｊ８は、非官能性残基であり、
Ｊ１１は、塩基性、または非官能性残基であり、
Ｊ１２は、非官能性、または芳香族残基であり、
Ｊ１６は、非官能性、または親水性残基であり、
Ｊ１８は、非官能性残基であり、
Ｊ１９は、酸性、または塩基性残基であり、
Ｊ２１は、非官能性残基であり、
ＪＣは、不在である請求項２０に記載の物質の組成物。
【請求項３０】
Ｊ１は、Ａ、Ｓ、またはＹであり、
Ｊ２は、Ｖであり、
Ｊ３は、Ｓであり、
Ｊ４は、Ｅであり、
Ｊ５は、Ｉであり、
Ｊ６は、Ｑであり、
Ｊ７は、Ｌ、またはＦであり、
Ｊ８は、Ｍ、またはＮｌｅであり、
Ｊ１１は、Ｌ、Ｒ、またはＫであり、
Ｊ１２は、Ｇ、またはＷであり、
Ｊ１６は、Ｎ、Ｓ、またはＡであり、
Ｊ１８は、Ｍ、Ｎｌｅ、Ｌ、またはＶであり、
Ｊ１９は、Ｅ、またはＲであり、
Ｊ２１は、Ｖ、Ｍ、またはＮｌｅである請求項２９に記載の物質の組成物。
【請求項３１】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインが、表１から選択される請求項２０に記載の物質の組成物。
【請求項３２】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインが次式であり、
ＯＮＬＨＯ１０Ｏ１１Ｏ１２ＫＳＩＯ１６Ｏ１７ＬＲＲＲＦＯ２３ＬＨＨＬＩＯＣ
（配列番号５）
であって、
式中、
ＯＮは、存在しないか、あるいはＹＯ１Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ１Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ６Ｏ７、またはＯ７であり、
Ｏ１は、アミノ酸残基であり、
Ｏ２は、アミノ酸残基であり、
Ｏ３は、アミノ酸残基であり、
Ｏ４は、アミノ酸残基であり、
Ｏ５は、アミノ酸残基であり、
Ｏ６は、アミノ酸残基であり、
Ｏ７は、アミノ酸残基であり、
Ｏ１０は、アミノ酸残基であり、
Ｏ１１は、アミノ酸残基であり、
Ｏ１２は、アミノ酸残基であり、
Ｏ１６は、アミノ酸残基であり、
Ｏ１７は、アミノ酸残基であり、
Ｏ２３は、アミノ酸残基であり、
ＯＣは、存在しないか、あるいはＯ２９、Ｏ２９Ｏ３０、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３Ｏ３４、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３Ｏ３４Ｏ３５、またはＯ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３Ｏ３４Ｏ３５Ｏ３６であり、
Ｏ２９からＯ３６は、それぞれ独立してアミノ酸残基である請求項１に記載の物質の組成物。
【請求項３３】
ＯＮは、Ｏ７であり、
Ｏ７は、非官能性残基であり、
Ｏ１０は、酸性、または親水性残基であり、
Ｏ１１は、塩基性、または非官能性残基であり、
Ｏ１２は、芳香族、または非官能性残基であり、
Ｏ１５は、親水性、または非官能性残基であり、
Ｏ１６は、親水性残基であり、
Ｏ１７は、酸性、または非官能性残基であり、
Ｏ２３は、芳香族残基であり、
ＯＣは、存在しない、請求項２７に記載の物質の組成物。
【請求項３４】
ＯＮは、Ｏ１Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７であり、
Ｏ１は、非官能性アミノ酸残基であり、
Ｏ２は、非官能性アミノ酸残基であり、
Ｏ３は、親水性アミノ酸残基であり、
Ｏ４は、酸性アミノ酸残基であり、
Ｏ５は、塩基性、または非官能性アミノ酸残基であり、
Ｏ６は、親水性アミノ酸残基であり、
Ｏ７は、非官能性残基であり、
Ｏ１０は、酸性、または親水性残基であり、
Ｏ１１は、塩基性、または非官能性残基であり、
Ｏ１２は、芳香族、または非官能性残基であり、
Ｏ１５は、親水性、または非官能性残基であり、
Ｏ１６は、親水性残基であり、
Ｏ１７は、酸性、または非官能性残基であり、
Ｏ２３は、芳香族残基である請求項２３に記載の物質の組成物。
【請求項３５】
Ｏ１は、Ａであり、
Ｏ２は、Ｖであり、
Ｏ３は、Ｓであり、
Ｏ４は、Ｅであり、
Ｏ５は、Ｈ、またはＩであり、
Ｏ６は、Ｑであり、
Ｏ７は、Ｌであり、
Ｏ１０は、Ｎ、またはＤであり、
Ｏ１１は、Ｋ、またはＬであり、
Ｏ１２は、Ｇ、Ｆ、またはＷであり、
Ｏ１５は、Ｉ、またはＳであり、
Ｏ１６は、Ｑ、またはＮであり、
Ｏ１７は、Ｄ、またはＬであり、
Ｏ２３は、Ｆ、またはＷである請求項３４に記載の物質の組成物。
【請求項３６】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインが、表２から選択される請求項２７に記載の物質の組成物。
【請求項３７】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインが、ＴＩＰ３９のアミノ酸配列を有する請求項１に記載の物質の組成物。
【請求項３８】
表４から選択された配列を含む請求項１に記載の物質の組成物。
【請求項３９】
配列番号１７、１８、１９、および６９から選択されたペプチドを含む組成物。
【請求項４０】
請求項１に記載の物質の組成物をコードする核酸。
【請求項４１】
請求項７に記載の物質の組成物をコードする核酸。
【請求項４２】
請求項２０に記載の物質の組成物をコードする核酸。
【請求項４３】
請求項３２に記載の物質の組成物をコードする核酸。
【請求項４４】
請求項３９に記載の物質の組成物をコードする核酸。
【請求項４５】
請求項４０に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項４６】
請求項４１に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項４７】
請求項４２に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項４８】
請求項４３に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項４９】
請求項４４に記載のＤＮＡを含む発現ベクター。
【請求項５０】
請求項４５に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５１】
請求項４６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５２】
請求項４７に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５３】
請求項４８に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５４】
請求項４９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項５５】
細胞が大腸菌細胞である請求項５０に記載の細胞。
【請求項５６】
細胞が大腸菌細胞である請求項５１に記載の細胞。
【請求項５７】
細胞が大腸菌細胞である請求項５２に記載の細胞。
【請求項５８】
細胞が大腸菌細胞である請求項５３に記載の細胞。
【請求項５９】
ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターのアンタゴニストを調製する方法であって、
ａ）レセプターに結合する少なくとも１つのペプチドを選択する段階、および
ｂ）選択した１つまたは複数のペプチドの少なくとも１つのアミノ酸配列に共有結合した少なくとも１つのＦｃドメインを含む薬剤を調製する段階を含む方法。
【請求項６０】
ペプチドが、配列番号３、４、または５から選択される請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ペプチドが、ファージディスプレイライブラリー、大腸菌ディスプレイライブラリー、リボソームライブラリー、ＲＮＡペプチドライブラリー、または化学ペプチドライブラリーのスクリーニングを含む方法において選択される請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
薬剤の調製が、
ａ）選択されたペプチドをコードする核酸配列、およびＦｃドメインをコードする核酸配列を含む遺伝子構築体を調製し、
ｂ）その遺伝子構築体を発現することによって行われる請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
遺伝子構築体が、大腸菌細胞に発現する請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
ペプチドの選択が、
ａ）選択された第１のペプチドをコードする核酸配列、およびＦｃドメインをコードする核酸配列を含む遺伝子構築体を調製する段階、
ｂ）遺伝子構築体および突然変異誘発プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行う段階であって、
ｉ）第１の突然変異誘発プライマーが、遺伝子構築体のコーディング鎖の５’末端またはその近傍の配列に相補的な核酸配列を含み、
ｉｉ）第２の突然変異誘発プライマーが、遺伝子構築体の非コーディング鎖の３’末端に相補的な核酸配列を含む段階
を含む方法によって行われる請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
オステオペニアを治療する方法であって、ＰＴＨアゴニストおよび骨吸収阻害剤を投与することを含み、ＰＴＨアゴニストが請求項１に記載の物質の組成物を含む方法。
【請求項６６】
オステオペニアを治療する方法であって、ＰＴＨアゴニストおよび骨吸収阻害剤を投与することを含み、ＰＴＨアゴニストが請求項７に記載の物質の組成物を含む方法。
【請求項６７】
オステオペニアを治療する方法であって、ＰＴＨアゴニストおよび骨吸収阻害剤を投与することを含み、ＰＴＨアゴニストが請求項２０に記載の物質の組成物を含む方法。
【請求項６８】
オステオペニアを治療する方法であって、ＰＴＨアゴニストおよび骨吸収阻害剤を投与することを含み、ＰＴＨアゴニストが請求項３２に記載の物質の組成物を含む方法。
【請求項６９】
オステオペニアを治療する方法であって、ＰＴＨアゴニストおよび骨吸収阻害剤を投与することを含み、ＰＴＨアゴニストが請求項３９に記載の物質の組成物を含む方法。
【請求項７０】
骨吸収阻害剤が、ＯＰＧ、ＯＰＧ−Ｌ抗体、カルシトニン、ビスホスホネート、エストロゲン、エストロゲンレセプターモジュレータ、およびチボロンから選択される請求項６５に記載の方法。
【請求項７１】
骨吸収阻害剤が、ＯＰＧ、ＯＰＧ−Ｌ抗体、カルシトニン、ビスホスホネート、エストロゲン、エストロゲンレセプターモジュレータ、およびチボロンから選択される請求項６６に記載の方法。
【請求項７２】
骨吸収阻害剤が、ＯＰＧ、ＯＰＧ−Ｌ抗体、カルシトニン、ビスホスホネート、エストロゲン、エストロゲンレセプターモジュレータ、およびチボロンから選択される請求項６７に記載の方法。
【請求項７３】
骨吸収阻害剤が、ＯＰＧ、ＯＰＧ−Ｌ抗体、カルシトニン、ビスホスホネート、エストロゲン、エストロゲンレセプターモジュレータ、およびチボロンから選択される請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
骨吸収阻害剤が、ＯＰＧ、ＯＰＧ−Ｌ抗体、カルシトニン、ビスホスホネート、エストロゲン、エストロゲンレセプターモジュレータ、およびチボロンから選択される請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
オステオペニアを治療する方法であって、請求項１に記載の物質の組成物を投与することを含む方法。
【請求項７６】
オステオペニアを治療する方法であって、請求項７に記載の物質の組成物を投与することを含む方法。
【請求項７７】
オステオペニアを治療する方法であって、請求項２０に記載の物質の組成物を投与することを含む方法。
【請求項７８】
オステオペニアを治療する方法であって、請求項３２に記載の物質の組成物を投与することを含む方法。
【請求項７９】
オステオペニアを治療する方法であって、請求項３９に記載の物質の組成物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、参照により本明細書の一部とする２００１年２月６日出願の米国特許仮出願第６０／２６６６７３号、２０００年６月２８日出願の米国特許仮出願第６０／２１４８６０号、および２０００年４月２７日出願の米国特許仮出願第６０／２０００５３号の特典を主張するものである。
【０００２】
発明の背景
副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）および副甲状腺ホルモン関連タンパク質（ＰＴＨｒＰ）はそれぞれ、カルシウムホメオスタシス、および発達において重要な生理的役割を果たしている。血液中のカルシウム濃度は、細胞代謝におけるカルシウムの不可欠な役割のために、厳格に調節されている。ＰＴＨは、血清カルシウムレベルの低下に応答して副甲状腺から分泌される内分泌性ホルモンである。ＰＴＨは、骨吸収の増加および腎臓のカルシウム再吸収の促進に直接作用し、したがって循環カルシウムストアを増大または維持する。ＰＴＨはまた、ビタミンＤの腎性水酸化を刺激することによって、腸におけるカルシウム吸収を間接的に増加する。
【０００３】
原発性副甲状腺機能亢進、および続発性副甲状腺機能亢進は共に、循環副甲状腺ホルモンの過剰なレベルを伴う症状である。前述の経路を経て、過剰なＰＴＨレベルは、高カルシウム血症およびオステオペニアを引き起こすことがある。ビスホスホネート、ＯＰＧなどの骨吸収阻害剤は、有効に骨を保護することができ、高カルシウム血症に対する骨格の寄与を阻害することができる。しかしながら現在利用できる療法は、腎臓および腸における副甲状腺機能亢進のカルシウム上昇作用を対象としていない。
【０００４】
ＰＴＨｒＰは、多くの細胞型によって産生され、骨格発達の調節に重要な役割を果たしている。出生後、ＰＴＨｒＰの役割はそれほど明確に定義されていない。ＰＴＨｒＰの循環レベルは、正常な健康成人では本質的に検出できない。しかしながら、多様な発生学的起源の多くの腫瘍は、高カルシウム血症を引き起こすのに充分な量のＰＴＨｒＰを産生し、分泌する。実際、悪性の液性高カルシウム血症（ＨＨＭ）は、もっとも一般的な腫瘍随伴性症候群であり、この症候群は著しい患者罹患率および死亡率の原因となる。
【０００５】
現在のところ、ＨＨＭは、食塩水補給、それに続くビスホスホネートなどの骨吸収阻害剤によって治療されている。この治療法は血清カルシウムの著しい低下を達成するのに、典型的に３〜４日を要し、その効果は比較的に短期である（１ヵ月未満）。ＰＴＨｒＰの循環レベルが高い患者の場合、現在の治療選択肢による効果は、さらに低い。従来の療法を繰り返し実施すると、通常、効果は次第に低下する。現在の療法におけるこれらの限界は、ＨＨＭに対する迅速、有効で、かつ長期間効果のある治療の、新しい医療の必要性を強く示している。
【０００６】
現在のＨＨＭ療法の利益が限られている主要な理由は、ＨＨＭにおいて病態生理学的因子として確立されているＰＴＨｒＰを直接阻害できないことである。ビスホスホネートなどの骨吸収阻害剤は骨吸収のみを阻害するが、ＰＴＨｒＰはさらに、腎臓および腸に対する著しいカルシウム上昇作用を有する。ＰＴＨｒＰの全中和は、ＨＨＭの治療に対する理想的な補助療法アプローチであろう。
【０００７】
ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰは共にＰＴＨ−１レセプターと相互に作用し、知られている効果のほとんどはそれによるものである。Ｍａｎｎｓｔａｄｔ等（１９９９）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７７、５Ｐｔ２、Ｆ６６５〜７５（１９９９）。ＰＴＨのみが、新しく発見されたＰＴＨ−２レセプターと相互に作用する。同文献。しかしながらＰＴＨｒＰは、２つの残基をＰＴＨのそれらの位置の残基に変えることによって、ＰＴＨ−２レセプターゴニストに変化することができる。Ｇａｒｄｅｌｌａ等（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３３）：１９８８８〜９３。
【０００８】
ＰＴＨのＮ末端フラグメントは、治療薬として用いられてきた。間歇投与された天然ＰＴＨ−（１−８４）は骨形成特性を示し、これらの特性は、Ｃ末端切断フラグメントＰＴＨ−（１−３４）によって完全に得られることが数十年の間、認められてきた。両方のペプチドは、類似の親和性でＰＴＨ−１レセプターに結合し、それを活性化して、アデニレートシクラーゼ（ＡＣ）ならびにホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）の活性化をもたらす。ＰＴＨ−１レセプターを介したＡＣの活性化はｃＡＭＰを生じ、一方、ＰＴＨ−１レセプターを介したＰＬＣの活性化はＰＫＣおよび細胞内カルシウムトランジェントを生じる。ＰＴＨ−（１−３４）は、ＡＣおよびＰＬＣ経路の両方を、最大限に活性化することができる。ＰＴＨ−（１−３４）のアナボリック作用は、間隔の短い間歇的な（毎日の）曝露を要することが実証されている。Ｄｏｂｎｉｇ（１９９８）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：４６０７〜１２。閉経後の女性によるヒトの試験において、低用量のＰＴＨ（１−３４）を毎日皮下注射することによって、脊椎骨折の発生数の著しい減少と共に、脊柱および大腿骨頸部に著しい骨形成がもたらされることが示された。これらの臨床データは、ＰＴＨが骨粗鬆症に関して試験されたもっとも有効な薬剤の１つであることを明らかにしている。
【０００９】
切断ＰＴＨフラグメントでは、ＡＣ／ｃＡＭＰの活性化が低減し、同様にアナボリック活性も低減した。Ｒｉｘｏｎ等（１９９４）、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．９：１１７９〜８９、Ｈｉｌｌｉｋｅｒ等（１９９６）、Ｂｏｎｅ１９：４６９〜４７７、Ｌａｎｅ等（１９９６）Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１１：６１４〜２５。そのような切断ＰＴＨフラグメントは、ＰＫＣに対する完全なアゴニズムを維持している場合であっても、この低減した活性を有する（Ｒｉｘｏｎ等（１９９４）、Ｈｉｌｌｉｋｅｒ等（１９９６）、Ｌａｎｅ等（１９９６））。Ｒｉｘｏｎ等（１９９４）。これらの観察は、ＡＣ／ｃＡＭＰ経路はＰＴＨの骨のアナボリック特性に重要であり、ＰＬＣ／ＰＫＣ経路はこの点において必ずしも必要でないという提案に至った。Ｒｉｘｏｎ等（１９９４）、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ等（１９９６）、Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ５３：８１〜７。
【００１０】
互いに相容れないものではないが、対立する理論は（ＡＣに加えて）ＰＬＣ活性化もアナボリックＰＴＨフラグメントの重要な特性である可能性を示唆している。Ｔａｋａｓｕ（１９９８）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３９：４２９３〜９。いくつかのアナボリックＣ末端切断ＰＴＨペプチドによってＰＬＣが活性化されないことは、より低いレセプター結合と組み合わせた不感受性アッセイ法のアーチファクトである可能性がある。Ｔａｋａｓｕ（１９９８）。ＰＴＨ−（１−３４）のＣ末端からの漸進的切断（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ　ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）は、ＰＴＨ１Ｐに対する結合親和性の段階的な低減をもたらす、Ｔａｋａｓｕ（１９９８）。ＰＴＨ−１レセプターによるＰＫＣ活性化は、結合親和性、およびレセプター濃度に鋭い感受性を有しているように思われるが（Ｇｕｏ等（１９９５）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ１３６：３８８４〜９１）、それに反してｃＡＭＰ活性化は、これらの変数に対する感受性がはるかに低い。ｈＰＴＨ−（１−３１）は、ｈＰＴＨ−（１−３４）に比べてＰＴＨ−１レセプターに対してわずかに低減された（１〜６倍）親和性を有し、ｈＰＴＨ−（１−３０）は、著しく低減された（１０〜１００倍）親和性を有する、Ｔａｋａｓｕ（１９９８）。おそらくこのようにＰＴＨ−１レセプター親和性が低減されているために、ＰＴＨ−（１−３０）は、ラットＰＴＨ−１レセプターによるＰＬＣ活性化に対して弱く不完全なアゴニストである。
【００１１】
ＰＴＨ−（１−３４）と比較して、ＰＴＨ−（１−３１）は、類似またはわずかに低減されたアナボリック能（Ｒｉｘｏｎ等（１９９４）、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ等（１９９６）、Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ５３：８１〜７、Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ等（１９９６）、Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ６５：１４３〜７）、ＰＴＨ１Ｒに対する結合親和性、およびｃＡＭＰ誘導性（Ｔａｋａｓｕ（１９９８））を有する。ＰＴＨ−（１−３１）はまた、わずかに低いＰＬＣ活性化を有する。Ｔａｋａｓｕ（１９９８）。健康なヒトにおいて、ＰＴＨ−（１−３１）およびＰＴＨ−（１−３４）の注入は、血漿中および尿中ｃＡＭＰ濃度に対し類似の刺激作用を有したが、ＰＴＨ−（１−３４）と異なり、ＰＴＨ−（１−３１）は、血清カルシウム、血漿中１，２５（ＯＨ）２Ｄ３、および尿中Ｎ−ＴＸレベルを上昇させなかった。Ｆｒａｈｅｒ等（１９９９）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ．Ｍｅｔ．８４：２７３９〜４３。これらのデータは、ＰＴＨ−（１−３１）が骨吸収を誘発し、ビタミンＤ合成を刺激する能力が低いことを示唆し、これは骨のアナボリック剤にとって有利なプロファイルである。
【００１２】
ＰＴＨ−（１−３０）は当初、アナボリック特性を欠くことが示された。Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ等（１９９６）、Ｃａｌｃｉｆｉｅｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ５３：８１〜７。しかしながら、より最近になって、非常に高用量で投与されたとき（ＰＴＨ−（１−３４）の８０μｇ／ｋｇに対して４００〜２０００μｇ／ｋｇ）、ＰＴＨ−（１−３０）がアナボリックであることが実証された。ＰＴＨ−１レセプターに対する低い結合親和性、低減されたｃＡＭＰ活性化、および／または大いに低減されたＰＫＣ活性化によって、ＰＴＨ−（１−３０）の効力が低いことは予測された。Ｔａｋａｓｕ（１９９８）。ＰＴＨ−（１−３０）が骨吸収活性において、類似の、あるいはさらに望ましい低減を有するかどうかはまだ判断されていない。
【００１３】
ＰＴＨ−（１−２８）はｃＡＭＰを完全に活性化する、報告されている最小のフラグメントである。Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ等（１９９５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３４：８８３５〜４２。しかしながら、ｈＰＴＨ−（１−２８）は当初、ＯＶＸラットにおいて骨形成作用は持たないと報告されていた。Ｍｉｌｌｅｒ等（１９９７）、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１２：Ｓ３２０（抄録）。近年、非常に高用量のＰＴＨ−（１−２８）（１０００μｇ／ｋｇ／日）がＯＶＸラットにおいてアナボリックであることが示されたが、２００μｇ／ｋｇ／日は無効であった。Ｗｈｉｔｆｉｅｌｄ等（２０００）、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．１５：９６４〜７０。いくつかの切断ＰＴＨフラグメントにおけるアナボリック作用の低減または不在は、ｉｎ　ｖｉｖｏでの急速なクリアランスによるものとされた。Ｒｉｘｏｎ等（１９９４）。
【００１４】
組換えおよび修飾タンパク質は、新しい種類の治療薬剤である。有用な治療薬剤タンパク質の修飾には、抗体の「Ｆｃ」ドメインとの組み合わせ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデキストランなどのポリマーとの結合が含まれる。そのような修飾は、その全体を参照により本明細書の一部とする「Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ　ａｓ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ　Ａｇｅｎｔｓ」という名称の特許出願、米国特許出願第０９／４２８０８２号、ＰＣＴ出願ＷＯ第９９／２５０４４号に詳しく論じられている。
【００１５】
治療薬剤を開発するための大きく異なるアプローチは、ペプチドライブラリースクリーニングである。タンパク質リガンドと、そのレセプターとの相互作作用は多くの場合、比較的大きな接触面（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）で起こる。しかしながら、ヒト成長ホルモンおよびそのレセプターに関して実証されたように、接触面にある少数の主要残基のみが、結合エネルギーの大部分に寄与している。Ｃｌａｃｋｓｏｎ等（１９９５）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：３８３〜６。タンパク質リガンドの大半は単に、正しいトポロジーに結合エピトープを提示するか、あるいは結合に関係のない機能を果たすだけである。したがって、「ペプチド」長のみの分子（２から４０個のアミノ酸）が、所与の大きなタンパク質リガンドのレセプタータンパク質に結合することができる。そのようなペプチドは、大きなタンパク質リガンドの生物活性を模倣する（「ペプチドアゴニスト」、あるいは競合結合によって、大きなタンパク質リガンドの生物活性を阻害する（「ペプチドアンタゴニスト」）可能性がある。
【００１６】
ファージディスプレイペプチドライブラリーは、そのようなペプチドアゴニストおよびアンタゴニストの同定における強力な方法として出現した。たとえば、Ｓｃｏｔｔ等（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６、Ｄｅｖｌｉｎ等（１９９０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４、１９９３年６月２９日発行の米国特許第５２２３４０９号、１９９８年３月３１日発行の米国特許第５７３３７３１号、１９９６年３月１２日発行の米国特許第５４９８５３０号、１９９５年７月１１日発行の米国特許第５４３２０１８号、１９９４年８月１６日発行の米国特許第５３３８６６５号、１９９９年７月１３日発行の米国特許第５９２２５４５号、１９９６年１２月１９日公開のＷＯ９６／４０９８７、および１９９８年４月１６日公開のＷＯ９８／１５８３３（それぞれの全体を参照により本明細書の一部とする）を参照されたい。そのようなライブラリーにおいて、ランダムペプチド配列は、線状ファージのコートタンパク質との融合によって提示される。典型的に、ディスプレイペプチドは、レセプターの抗体固定化細胞外ドメインに対して親和性溶出される。残留ファージは、親和性精製および再増殖の連続実行によって富化することができる。最良の結合ペプチドは、ペプチドの１種または複数の構造的に関連したファミリー内の主要残基を同定するために配列決定することができる。２つの異なるファミリーを同定した、Ｃｗｉｒｌａ等（１９９７）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７６：１６９６〜９を参照されたい。このペプチド配列はさらに、アラニンスキャニング、またはＤＮＡレベルでの変異誘発によって、どの残基を安全に置き換えられるかを示唆できる可能性がある。変異誘発ライブラリーを作り、スクリーニングして、最良のバインダの配列をさらに最適化することができる。Ｌｏｗｍａｎ（１９９７）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：４０１〜２４。
【００１７】
タンパク質−タンパク質相互作用の構造分析は、大きなタンパク質リガンドの結合活性を模倣するペプチドを示唆するために用いることもできる。そのような分析において、結晶構造は大きなタンパク質リガンドの重要な残基の同一性および相対配向を示唆する可能性があり、そこからペプチドが設計される可能性がある。たとえば、Ｔａｋａｓａｋｉ等（１９９７）、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ１５：１２６６〜７０を参照されたい。これらの分析方法は、レセプタータンパク質と、ファージディスプレイによって選択されたペプチドとの相互作用を調べるために用いることもでき、結合親和性を高めるペプチドのさらなる修飾を示唆する可能性がある。
【００１８】
他の方法は、ペプチド研究においてファージディスプレイに競合する。ペプチドライブラリーは、ｌａｃリプレッサーのカルボキシル末端と融合し、大腸菌に発現することができる。他の大腸菌をベースとする方法は、ペプチドグリカン関連リポタンパク（ＰＡＬ）との融合による細胞外膜上への提示を可能にする。以下において、これらの方法、および関連した方法を、一括して「大腸菌ディスプレイ」と呼ぶ。他の方法において、ランダムＲＮＡの翻訳がリボソーム放出前に停止され、それらの関連ＲＮＡを結合したままのポリペプチドライブラリーがもたらされる。以下において、この方法、および関連した方法を、一括して「リボソームディスプレイ」と呼ぶ。他の方法は、ＲＮＡに結合したペプチドを用い、たとえばＰＲＯｆｕｓｉｏｎ技術、Ｐｈｙｌｏｓ，Ｉｎｃ．である。たとえば、ＲｏｂｅｒｔｓおよびＳｚｏｓｔａｋ（１９９７）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１２２９７〜３０３を参照されたい。以下において、この方法、および関連した方法を、一括して「ＲＮＡペプチドスクリーニング」と呼ぶ。化学的に誘導されたペプチドライブラリーが開発され、ここでペプチドは、安定な非生物材料、たとえばポリエチレンロッド、または溶媒浸透性樹脂に固定される。他の化学的誘導ペプチドライブラリーは、スライドガラス上に固定されたペプチドをスキャンするために写真印刷を用いる。以下において、これらの方法、および関連した方法を、一括して「化学ペプチドスクリーニング」と呼ぶ。化学ペプチドスクリーニングは、Ｄアミノ酸、および他の非天然類似体、ならびに非ペプチド因子の使用を可能にする点で好都合である可能性がある。生物的方法、および化学的方法は共に、ＷｅｌｌｓおよびＬｏｗｍａｎ（１９９２）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３５５〜６２に概説されている。概念上、ファージディスプレイ、ＲＮＡペプチドスクリーニング、および他の上述の方法を用いて、任意のタンパク質のペプチド擬似体を見出すことが可能である。
【００１９】
発明の概要
本発明は、ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰの活性を調節する治療薬に関する。本発明によれば、ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰのモジュレータは、
ａ）ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメイン、好ましくはＰＴＨおよび／またはＰＴＨｒＰのＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインのアミノ酸配列、あるいはファージディスプレイ、ＲＮＡペプチドスクリーニング、または他の上述の技法によってそこから誘導された配列、および
ｂ）ポリマー（たとえばＰＥＧ、またはデキストラン）またはＦｃドメインなどのビヒクル、好ましくはＦｃドメインを含み、
ビヒクルは、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインのカルボキシル末端に共有結合している。好ましいビヒクルはＦｃドメインであり、好ましいＦｃドメインはＩｇＧＦｃドメインである。好ましいＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインは、以下に記載したＰＴＨおよびＰＴＨｒＰ由来のアミノ酸配列を含む。他のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインは、ファージディスプレイ、ＲＮＡペプチドスクリーニング、および本明細書に述べた他の技法によって生成することができる。そのようなペプチドは、典型的にＰＴＨおよびＰＴＨｒＰ両方のアンタゴニストとなるが、そのような技法を用いて選択的阻害剤として働く（たとえば、ＰＴＨの阻害剤であるが、ＰＴＨｒＰの阻害剤でない）ペプチド配列を生成することができる。
【００２０】
さらに本発明によれば、ＰＴＨおよびＰＴＨｒＰのモジュレータを製造する方法であって、
ａ）ＰＴＨ−１またはＰＴＨ−２レセプターに結合する少なくとも１つのペプチドを選択する段階、および
ｂ）前記ペプチドをビヒクルに共有結合する段階を含む。
好ましいビヒクルは、Ｆｃドメインである。段階（ａ）は、好ましくは以下の表１および２のペプチド配列から、あるいはファージディスプレイ、ＲＮＡペプチドスクリーニング、または本明細書に述べた他の技法からの選択によって行われる。
【００２１】
本発明の化合物は、標準的な合成方法、組換えＤＮＡ技法、あるいはペプチドまたは融合タンパク質を調製する他の任意の方法によって調製することができる。非ペプチドタンパク質を包含する本発明の化合物は、適用できるときには標準的なペプチド化学反応に加えて、標準的な有機化学反応によって合成することができる。
【００２２】
本発明の化合物に企図された主たる使用は、治療薬、または予防薬としての使用である。このビヒクル結合ペプチドは、ペプチドによって模倣された天然リガンドに匹敵する活性、あるいはさらに高い活性を有する可能性がある。
【００２３】
本発明の化合物は、適切な薬剤担体材料と共に製剤し、それを必要とする患者、たとえばヒト（または他の哺乳動物）に有効量を投与することによって、治療または予防目的に用いることができる。他の関連した態様も、本発明に含まれる。
【００２４】
本発明において特に対象となるのは、ＰＴＨ−（１−２８）または（１−３４）など、短縮ＰＴＨＣ末端配列を有するＰＴＨ／ＰＴＨＲＰ調節ドメインを含む分子である。従来技術は、そのようなＣ末端切断ＰＴＨフラグメントの持続送達を用いるアナボリック研究を示していない。従来技術はそれを示唆していないが、ＰＴＨ−（１−３０）−Ｆｃなど、より小さなフラグメントを含む分子は、単独でアナボリックであることができる。ＰＬＣに対する弱いアゴニズムにもかかわらず（発明の背景を参照）、ｈＰＴＨ−（１−３０）は、ｃＡＭＰ刺激において、ｈＰＴＨ−（１−３４）とほぼ同様に有効である。理論に縛られることを望むものではないが、本発明者等は、ＰＴＨフラグメントのアナボリック特性は、ＰＬＣ活性化ではなく、ｃＡＭＰ活性化に選択的に関連する可能性があり、そのため低減されたレセプター親和性を備えたＰＴＨフラグメントが好都合なアナボリックプロファイルを有するであろうことを特に言及する。切断ＰＴＨフラグメントへの連続曝露は、Ｆｒａｈｅｒ等（１９９９）によってヒトにおいて実証されたＰＴＨ−（１−３４）またはＰＴＨ−（１−８４）への連続曝露と比較して、骨に対して異なる、より好都合な影響を及ぼす可能性がある。
【００２５】
本発明の数多くのさらなる態様および利点は、図面および本発明の詳細な説明を考察することにより明らかとなるであろう。
【００２６】
図面の簡単な説明
図１は、ＩｇＧ１抗体から誘導される可能性のある、代表的なＦｃ二量体を示す図である。この図において「Ｆｃ」は、本明細書における「Ｆｃドメイン」の意味に含まれる任意のＦｃ変異型を表す。「Ｘ１」および「Ｘ２」は、以下に定義するペプチド、またはリンカーペプチドの組み合わせを表す。特定の二量体は以下のとおりである。
【００２７】
Ａ．ジスルフィド単結合二量体。ＩｇＧ１抗体は典型的に、不変ドメインと可変ドメインの間の蝶番部域に２つのジスルフィド結合を有する。図１ＡのＦｃドメインは、２つのジスルフィド結合部位間の切断によって、またはシステイニル残基の非反応残基（たとえば、アラニル）との置換によって形成することができる。図１Ａにおいて、ＦｃドメインはペプチドのＣ末端で結合している。
【００２８】
Ｂ．２つのジスルフィド結合により結合した二量体。このＦｃドメインは、親抗体を切断してＦｃドメイン鎖に両方のシステイニル残基を保持することによって、またはそのようなＦｃドメインをコードする配列を含む構築体から発現させることによって形成できる。図１Ｂにおいて、ＦｃドメインはペプチドのＣ末端で結合している。
【００２９】
Ｃ．非共有結合二量体。このＦｃドメインは、切断または置換のいずれかによってシステイニル残基を除去することによって形成することができる。そのシステイニル残基と、宿主細胞に存在する他のタンパク質のシステイニル残基との反応によって形成される不純物を回避するために、システイニル残基の除去を所望する可能性がある。Ｆｃドメインの非共有結合は、二量体を合わせて保持するのに充分である。異なる型の抗体（たとえば、ＩｇＧ２、ＩｇＭ）から誘導されたＦｃドメインを用いることによって、他の二量体を形成することができる。
【００３０】
図２は、本発明のさらなる化合物の構造を示す図である。図２Ａは単鎖分子を示し、さらにこの分子のＤＮＡ構築体を表す可能性がある。図２Ｂは、二量体の１つの鎖だけにリンカーペプチド部分が存在する二量体を示す図である。図２Ｃは、両方の鎖にペプチド部分を有する二量体を示す図である。図２Ｃの二量体は、図３に示した単鎖をコードするＤＮＡ構築体の発現によって、ある種の宿主細胞に自然発生的に形成する。二量体の形成に好ましい条件下で他の宿主細胞にこの細胞を置くことができ、あるいはｉｎ　ｖｉｔｒｏで二量体を形成することができる。
【００３１】
図３は、本発明に用いることのできる、ヒトＩｇＧ１の代表的な核酸配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１および２）を示す図である。
【００３２】
図４は、ＰＴＨ−（１−３４）、およびＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃに対する正常なマウスのカルシウム上昇応答を示す図である。マウスに、ビヒクル（ＰＢＳ、−Ｘ−）、あるいはＰＴＨ−（１−３４）（白抜き記号）、またはＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ（黒塗り記号）を投与した。投与量は、１５６ｎｍｏｌ／ｋｇ（丸）、４６９ｎｍｏｌ／ｋｇ（三角）、または１５６０ｎｍｏｌ／ｋｇ（四角）であった。データは、マウスｎ＝６／グループのグループ平均を表す。
【００３３】
図５は、［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃが、正常なマウスのＰＴＨｒＰに対するカルシウム上昇応答を阻害することを示す図である。正常な雄のマウスに、ビヒクル（ＰＢＳ、丸）、またはヒトＰＴＨｒＰ−（１−３４）０．５ｍｇ／ｋｇ（四角）を皮下注射した。その後すぐに、ＰＴＨｒＰ投与マウスに、［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃを１０ｍｇ／ｋｇ（三角）、または３０ｍｇ／ｋｇ（菱形）で皮下注射した。データは、マウスｎ＝６／グループのグループ平均を表す。
【００３４】
図６は、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃによって誘発された慢性高カルシウム血症に対する［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃの影響を示す図である。正常な雄のマウスに、皮下注射によってＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ（３０ｍｇ／ｋｇ）（白抜き丸）、またはビヒクル（ＰＢＳ、白抜き四角）を１度投与した。ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ投与マウスの一部を、投与時に［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃ１０ｍｇ／ｋｇ（黒塗り三角）、３０ｍｇ／ｋｇ（黒塗り丸）、または１００ｍｇ／ｋｇ（黒塗り四角）で処置した。［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃのすべての投与量が、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ媒介高カルシウム血症の著しい抑制をもたらした。データは、マウスｎ＝５／グループ、平均±標準誤差を表す。
【００３５】
図７は、ＲＯＳ１７／２．８ラット骨芽細胞様細胞におけるｃＡＭＰの蓄積を示す図である。培養物をホスホジエステラーゼ阻害剤ＩＢＭＸで処理し、次いで、種々のＰＴＨフラグメントを１５分間与えた。ｃＡＭＰは、ＥＬＩＳＡによって測定した。
【００３６】
図８は、臨床検査値に対する単回処置の影響を示す図である。記載した化合物を単回皮下注射した後、３日間、毎日末梢血液を得た。図８Ａは全血清カルシウム、図８Ｂはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、骨芽細胞活性のマーカー、図８Ｃは酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）、破骨細胞活性のマーカー、図８ＤはＡＰ：ＴＲＡＰ比、骨芽細胞：破骨細胞相対活性の指数を示す図である。
【００３７】
図９は、骨塩密度に対するＰＴＨ構築体の影響を示す図である。０日、５日、および１０日にＰＴＨ構築体を注射した後、第１５日のマウスの脛骨近位骨幹端で末梢骨定量的ＣＴ（ｐＱＣＴ）を行った。
【００３８】
図１０は、脛骨、海綿質骨、皮質骨の骨塩密度（ＢＭＤ）に対する、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ週２回投与、ＰＴＨ−（１−３４）毎日投与の影響を示す図である。毎日のＰＴＨ［ＰＴＨ−（１−３４）］は、８０μｇ／ｋｇ／日（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）で投与した。
【００３９】
図１１は、卵巣摘出（ＯＶＸ）老齢ラットにおける、ＢＭＤおよび血清カルシウムに対する週２回処置の影響を示す図である。ＯＶＸの１１ヵ月後、ラットを週に２回、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ビヒクル）、またはＡＰＤ（０．５ｍｇ／ｋｇ）、またはＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ（５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）で処置した。ＤＥＸＡを週に１回行った。ＰＴＨ−Ｆｃのカルシウム上昇作用が典型的に最大となる、週２回目の注射２４時間後に血液を採った。
【００４０】
図１２は、ＯＶＸカニクイザルへのＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃの単回皮下注射の影響を示す図である。サルに、投与量１〜３０μｇ／ｋｇ（ｎ＝１／グループ）、または１００〜１０００μｇ／ｋｇ（ｎ＝２／グループ）でＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃを注射した。全カルシウム量に関して血清を分析した。点線は、２つ以上の連続した時点での正規平均より高い３標準偏差を超えるカルシウムの上昇に基づく高カルシウム血症に対する閾値を示している。
【００４１】
発明の詳細な説明
用語の定義
特定の事例において限定されない限り、本明細書を通して用いられる用語は以下のように定義される。
【００４２】
「含む」という用語は、ある化合物が、所与の配列のＮ末端、またはＣ末端のいずれか、または両方に追加のアミノ酸を含むことができることを意味する。当然ながら、これらの追加のアミノ酸は、その化合物の活性を著しく妨げるべきではない。
【００４３】
「酸性残基」という用語は、酸性基を含む側鎖を有するＤまたはＬ型のアミノ酸残基を指す。代表的な酸性残基には、Ｄ、およびＥが含まれる。
【００４４】
「芳香族残基」という用語は、芳香族基を含む側鎖を有するＤまたはＬ型のアミノ酸残基を指す。代表的な芳香族残基には、Ｆ、Ｙ、およびＷが含まれる。
【００４５】
「塩基性残基」という用語は、塩基性基を含む側鎖を有するＤまたはＬ型のアミノ酸残基を指す。代表的な塩基性残基には、Ｈ、Ｋ、およびＲが含まれる。
【００４６】
「親水性残基」および「Ｈａａ」という用語は、少なくとも１つの親水性官能基または極性基を含む側鎖を有するＤまたはＬ型のアミノ酸残基を指す。代表的な親水性残基には、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、およびＴが含まれる。
【００４７】
「親油性残基」および「Ｌａａ」という用語は、非電荷の脂肪族または芳香族基を含む側鎖を有するＤまたはＬ型のアミノ酸残基を指す。代表的な親油性側鎖には、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、Ｗ、およびＹが含まれる。アラニン（Ａ）は両親媒性であり、親水性または親油性残基として作用することが可能である。したがってアラニンは、「親油性残基」および「親水性残基」両方の定義に含まれる。
【００４８】
「非官能性残基」という用語は、酸性基、塩基性基、または芳香族を含まない側鎖を有するＤまたはＬ型のアミノ酸残基を指す。代表的な非官能アミノ酸残基には、Ｍ、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、およびノルロイシン（Ｎｌｅ）が含まれる。
【００４９】
「ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）」という用語は、治療タンパク質の分解を防ぐ、かつ／または半減期を伸ばす、毒性を低減する、免疫抗原性を低減する、または生物学的活性を高める分子を指す。代表的なビヒクルには、Ｆｃドメイン（これが好ましい）、ならびに線状ポリマー（たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリシン、デキストランなど）、分枝鎖ポリマー（たとえば、１９８１年９月１５日、Ｄｅｎｋｅｎｗａｌｔｅｒ他に発行の米国特許第４２８９８７２号、１９９３年７月２０日、Ｔａｍに発行の第５２２９４９０号、１９９３年１０月２８日公開のＦｒｅｃｈｅｔ他のＷＯ９３／２１２５９を参照）、脂質、コレステロール基（ステロイドなど）、炭水化物またはオリゴ糖（たとえば、デキストラン）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および関連分子、トランスセラチン（ｔｒａｎｓｔｈｅｒａｔｉｎ）（ＴＴＲ）および関連分子、あるいはサルベージレセプターに結合する任意の天然または合成タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドが含まれる。ビヒクルは以下にさらに詳しく記載する。
【００５０】
「天然Ｆｃ」という用語は、単量体または多量体形態の、全抗体の消化から生じる非抗原結合フラグメントの配列を含む分子または配列を指す。天然Ｆｃの免疫グロブリン源は、好ましくはヒト由来であり、任意の免疫グロブリンであることができるが、ＩｇＧ１、およびＩｇＧ２が好ましい。天然Ｆｃは、共有（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合によって二量体または多量体形態に結合できる単量体ポリペプチドからなる。天然Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子内ジスルフィド結合の数は、クラス（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）またはサブクラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて１から４の範囲である。天然Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎ等（１９８２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１０：４０７１〜９を参照）。本明細書において「天然Ｆｃ」という用語は、単量体、二量体、および多量体形態の総称である。
【００５１】
「Ｆｃ変異型」という用語は、天然Ｆｃから修飾されているが、依然としてサルベージレセプターＦｃＲｎ結合部位を含む分子または配列を指す。国際出願ＷＯ９７／３４６３１（１９９７年９月２５日公開）、およびＷＯ９６／３２４７８は、代表的なＦｃ変異型、ならびにサルベージレセプターとの相互作用を記載しており、その全体を参照により本明細書の一部とする。したがって、「Ｆｃ変異型」という用語は、非ヒト天然Ｆｃからヒト化された分子または配列を含む。さらに天然Ｆｃは、本発明の融合分子に必要とされない構造的特徴または生物活性を提供するために除去される可能性のある部位を含む。したがって、「Ｆｃ変異型」という用語は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性、（３）選択された宿主細胞における発現でのＮ末端異質性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージレセプターではなくＦｃレセプターへの結合、または（７）抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼす、または関わる１つまたは複数の天然Ｆｃ部位または残基を欠く分子または配列を含む。Ｆｃ変異型は、以下にさらに詳しく記載する。
【００５２】
「Ｆｃドメイン」という用語は、上に定義した天然ＦｃおよびＦｃ変異型分子および配列を包含する。Ｆｃ変異型、および天然Ｆｃという用語と同じように、「Ｆｃドメイン」という用語は、全抗体から消化された、あるいは他の手段によって生成された、単量体または多量体形態の分子を含む。
【００５３】
Ｆｃドメイン、またはＦｃドメインを含む分子に適用される「多量体」という用語は、共有、非共有、または共有および非共有相互作用の両方によって結合した２つ以上のポリペプチド鎖を有する分子を指す。ＩｇＧ分子は典型的に二量体を形成し、ＩｇＭは５量体、ＩｇＤは二量体、ＩｇＡは単量体、二量体、三量体、または四量体を形成する。多量体は、Ｆｃの天然Ｉｇ源の配列および生じる活性を用いて、あるいはそのような天然Ｆｃを誘導体化する（以下に定義）ことによって形成することができる。
【００５４】
Ｆｃドメイン、またはＦｃドメインを含む分子に適用される「二量体」という用語は、共有、非共有的に結合した２つのポリペプチド鎖を有する分子を指す。本発明の範囲に含まれる代表的な二量体は、図１および２に示したとおりである。
【００５５】
「誘導体化」、および「誘導体」または「誘導体化された」という用語はそれぞれ、（１）化合物が、環状部分、たとえば化合物内のシステイニル間の架橋を有する、（２）化合物が、架橋されている、または架橋部位を有する、たとえば、化合物がシステイニル残基を有し、それによって培養またはｉｎ　ｖｉｖｏで架橋二量体を形成する、（３）１つまたは複数のペプチジル結合が、非ペプチジル結合によって置換されている、（４）Ｎ末端が、−ＮＲＲ１、ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ、スクシンイミド基、あるいは置換または非置換ベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−によって置換されており、Ｒ、Ｒ１、および環式置換基は以下に定義するとおりである、（５）Ｃ末端が、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、または−ＮＲ３Ｒ４で置換されており、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は以下に定義するとおりである、（６）各アミノ酸部分が、選択された側鎖または末端残基と反応することのできる薬剤による処理によって修飾されている化合物であるような方法および生じる化合物を含む。誘導体は、以下にさらに詳しく記載する。
【００５６】
「ペプチド」という用語は、アミノ酸１から８５個の分子を指し、アミノ酸５から３４個の分子が好ましい。代表的なペプチドには、天然分子のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメイン、またはランダム化配列が含まれる。
【００５７】
ペプチド配列を指すために用いられる「ランダム化」という用語は、完全ランダム配列（たとえば、ファージディスプレイ法、またはＲＮＡペプチドスクリーニングによって選択）、および天然分子の１つまたは複数の残基が、天然分子ではその位置に出現しないアミノ酸で置き換えられている配列を指す。ペプチド配列を同定するための代表的な方法には、ファージディスプレイ、大腸菌ディスプレイ、リボソームディスプレイ、ＲＮＡペプチドスクリーニング、化学スクリーニングなどが含まれる。
【００５８】
「ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメイン」という用語は、ＰＴＨ−１レセプターおよび／またはＰＴＨ−２レセプターに結合し、天然配列またはランダム化配列を含む任意のアミノ酸配列を指す。代表的なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインは、その全体を本明細書の一部とする、表１および２に関して挙げた参照文献に記載のとおり同定または誘導することができる。
【００５９】
「ＰＴＨアゴニスト」という用語は、ＰＴＨ−１またはＰＴＨ−２レセプターに結合し、完全長天然ヒト副甲状腺ホルモンと同様に、１つまたは複数のＰＴＨ活性アッセイパラメータを上昇または低下させる分子を指す。代表的なＰＴＨ活性アッセイの１つを実施例１に記載する。
【００６０】
「ＰＴＨアンタゴニスト」という用語は、ＰＴＨ−１またはＰＴＨ−２レセプターに結合し、完全長天然ヒト副甲状腺ホルモンによるそれらのパラメータへの正常な影響を遮断する、または妨げる分子を指す。代表的なＰＴＨ活性アッセイの１つを実施例２に記載する。
【００６１】
「骨吸収阻害剤」という用語は、その全体を参照により本明細書の一部とするＷＯ９７／２３６１４の実施例４および１１のアッセイにより判別されるような分子を指す。代表的な骨吸収阻害剤には、その全体を参照により本明細書の一部とするＷＯ９７／２３６１４、およびＷＯ９８／４６７５１にそれぞれ記載されているＯＰＧおよびＯＰＧ−Ｌ抗体が含まれる。
【００６２】
さらに、本発明の化合物の生理的に許容される塩も本発明に包含される。「生理的に許容される塩」とは、現在知られている、または後に薬剤として許容されることが認められる任意の塩を意味する。いくつかの特定の例は、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、ハロゲン化水素酸塩、たとえば塩酸塩、臭化水素酸塩など、硫酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、グリコール酸塩、およびシュウ酸塩である。
【００６３】
化合物の構造
概要。ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプターに結合するアミノ酸配列を、表１および２に記載する。ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰに関する他の情報は、Ｍａｎｎｓｔａｄｔ等（１９９９）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７７．５Ｐｔ２：Ｆ６６５〜７５、およびＧａｒｄｅｌｌａ（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３３）：１９８８８〜９３に記載されている。各参考文献の全体を参照により本明細書の一部とする。
【００６４】
前述の配列から、本発明者等はＰＴＨ／ＰＴＨｒＰから誘導された特に好ましい配列を同定した。これらの配列は、前述の技法によってランダム化することができ、それによってペプチドの結合親和性を維持、または向上させながら、１つまたは複数のアミノ酸を変えることができる。
【００６５】
本発明によって調製された物質の組成物において、ペプチドは、ペプチドのＣ末端によってビヒクルに結合することができる。したがって本発明のビヒクル−ペプチド分子は、以下の式Ｉによって表すことができる。
Ｉ
Ｐ１−（Ｌ１）ａ−Ｆ１
およびその多量体であって、式中、
Ｆ１は、ビヒクル（好ましくはＦｃドメイン）であり、Ｐ１−（Ｌ１）ａのＣ末端で結合しており、
Ｐ１は、ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインの配列であり、
Ｌ１は、リンカーであり、
ａは、０、または１である。
【００６６】
ペプチド。本発明と共に任意の数のペプチドを用いることができる。ペプチドは、天然タンパク質の配列の一部を含むことができ、あるいは天然タンパク質の配列から誘導されたランダム化配列であることができ、あるいは完全にランダム化配列であることができる。本発明で用いるペプチドの生成において、特にファージディスプレイおよびＲＮＡペプチドスクリーニングが有用である。
【００６７】
特に対象となるＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメイン配列は、以下の式のものであって、
ＩＩ
ＸＮＸ８ＨＸ１０Ｘ１１Ｘ１２ＫＸ１４Ｘ１５Ｘ１６Ｘ１７Ｘ１８Ｘ１９ＲＸ２１Ｘ２２Ｘ２３Ｘ２４Ｘ２５Ｘ２６Ｘ２７Ｘ２８ＸＣ
（配列番号３）
式中、
ＸＮは、存在しないか、あるいはＸ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７、Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７、Ｘ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７、またはＹＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７であり、
Ｘ１は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性、親水性、または芳香族残基、好ましくはＡ、Ｓ、またはＹ）であり、
Ｘ２は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性残基、もっとも好ましくはＶ）であり、
Ｘ３は、アミノ酸残基（好ましくは親水性残基、もっとも好ましくはＳ）であり、
Ｘ４は、アミノ酸残基（好ましくは酸性残基、もっとも好ましくはＥ）であり、
Ｘ５は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性、または塩基性残基、もっとも好ましくはＨ、またはＩ）であり、
Ｘ６は、アミノ酸残基（好ましくは酸性、または親水性残基、もっとも好ましくはＱ、またはＥ）であり、
Ｘ７は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性、または芳香族残基、もっとも好ましくはＬ、またＦ）であり、
Ｘ８は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性残基、もっとも好ましくはＭ、またはＮｌｅ）であり、
Ｘ１０は、アミノ酸残基（好ましくは酸性、または親水性残基、もっとも好ましくはＮ、またはＤ）であり、
Ｘ１１は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性、または塩基性残基、もっとも好ましくはＬ、Ｒ、またはＫ）であり、
Ｘ１２は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性、または芳香族残基、もっとも好ましくはＧ、Ｆ、またはＷ）であり、
Ｘ１４は、アミノ酸残基（好ましくは塩基性、または親水性残基、もっとも好ましくはＨ、またはＳ）であり、
Ｘ１５は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性残基、もっとも好ましくはＬ、またはＩ）であり、
Ｘ１６は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性、または親水性残基、もっとも好ましくはＱ、Ｎ、Ｓ、またはＡ）であり、
Ｘ１７は、アミノ酸残基（好ましくは酸性、親水性、または非官能性残基、もっとも好ましくはＳ、Ｄ、またはＬ）であり、
Ｘ１８は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性残基、もっとも好ましくはＭ、Ｌ、Ｖ、またはＮｌｅ）であり、
Ｘ１９は、アミノ酸残基（好ましくは酸性、または塩基性残基、もっとも好ましくはＥ、またはＲ）であり、
Ｘ２１は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性残基、または塩基性残基、もっとも好ましくはＶ、Ｍ、Ｒ、またはＮｌｅ）であり、
Ｘ２２は、アミノ酸残基（好ましくは親水性、酸性、または芳香族残基、もっとも好ましくはＥ、またはＦ）であり、
Ｘ２３は、芳香族、または親油性残基（好ましくはＷ、またはＦ）であり、
Ｘ２４は、親油性残基（好ましくはＬ）であり、
Ｘ２５は、アミノ酸残基（好ましくは親水性、または塩基性残基、もっとも好ましくはＲ、またはＨ）であり、
Ｘ２６は、アミノ酸残基（好ましくは親水性、または塩基性残基、もっとも好ましくはＫ、またはＨ）であり、
Ｘ２７は、アミノ酸残基（好ましくは親油性、塩基性、または非官能性残基、もっとも好ましくはＫ、またはＬ）であり、
Ｘ２８は、アミノ酸残基（好ましくは親油性、または非官能性残基、もっとも好ましくはＬ、またはＩ）であり、
ＸＣは、存在しないか、あるいはＸ２９、Ｘ２９Ｘ３０、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５、Ｘ２９Ｘ３０Ｘ３１Ｘ３２Ｘ３３Ｘ３４Ｘ３５Ｘ３６であり、
Ｘ２９は、アミノ酸残基（好ましくは親水性、または非官能性残基、もっとも好ましくはＱ、またはＡ）であり、
Ｘ３０は、アミノ酸残基（好ましくは親水性、または酸性残基、もっとも好ましくはＤ、またはＥ）であり、
Ｘ３１は、アミノ酸残基（好ましくは親油性、または非官能性残基、もっとも好ましくＶ、またはＩ）であり、
Ｘ３２は、アミノ酸残基（好ましくは塩基性残基、もっとも好ましくはＨ）であり、
Ｘ３３は、アミノ酸残基（好ましくは親水性残基、もっとも好ましくはＮ、またはＴ）であり、
Ｘ３４は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性、または芳香族残基、もっとも好ましくはＡ、Ｆ、またはＹ）であり、
Ｘ３５は、アミノ酸残基（好ましくは酸性残基、もっとも好ましくはＥ）であり、
Ｘ３６は、アミノ酸残基（好ましくは芳香族残基、もっとも好ましくはＹ）である。
【００６８】
好ましいＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメイン配列の式は、
ＩＩＩ
ＪＮＪ７Ｊ８ＨＮＬＪ１２ＫＨＬＪ１６ＳＪ１８Ｊ１９ＲＪ２１ＥＷＬＲＫＫＬＪＣ
（配列番号４）
であって、
式中、
ＪＮは、存在しないか、あるいはＪ１Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６、Ｊ２Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６、Ｊ３Ｊ４Ｊ５Ｊ６から選択され、
Ｊ１は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性、親水性、または芳香族残基、もっとも好ましくはＡ、Ｓ、またはＹ）であり、
Ｊ２は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性残基、もっとも好ましくはＶ）であり、
Ｊ３は、アミノ酸残基（好ましくは親水性残基、もっとも好ましくはＳ）であり、
Ｊ４は、アミノ酸残基（好ましくは酸性残基、もっとも好ましくはＥ）であり、
Ｊ５は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性残基、もっとも好ましくはＩ）であり、
Ｊ６は、アミノ酸残基（好ましくは塩基性残基、好ましくはＱ）であり、
Ｊ７は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性、または芳香族残基、もっとも好ましくはＬ、またはＦ）であり、
Ｊ８は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性残基、もっとも好ましくはＭ、またはＮｌｅ）であり、
Ｊ１２は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性、または芳香族残基、もっとも好ましくはＧ、またはＷ）であり、
Ｊ１６は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性、または親水性残基、もっとも好ましくはＮ、Ｓ、またはＡ）であり、
Ｊ１８は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性残基、もっとも好ましくはＭ、Ｎｌｅ、Ｌ、またはＶ）であり、
Ｊ１９は、酸性、または塩基性残基（好ましくはＥ、またはＲ）であり、
Ｊ２１は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性残基、もっとも好ましくはＶ、Ｍ、またはＮｌｅ）であり、
ＪＣは、存在しないか、あるいはＪ２９、Ｊ２９Ｊ３０、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２、Ｊ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２Ｊ３３、またはＪ２９Ｊ３０Ｊ３１Ｊ３２Ｊ３３Ｊ３４であり、
Ｊ２９は、アミノ酸残基（好ましくは親水性、または非官能性残基、もっとも好ましくはＱ、またはＡ）であり、
Ｊ３０は、アミノ酸残基（好ましくは親水性、または酸性残基、もっとも好ましくはＤ、またはＥ）であり、
Ｊ３１は、アミノ酸残基（好ましくは親油性、または非官能性残基、もっとも好ましくＶ、またはＩ）であり、
Ｊ３２は、アミノ酸残基（好ましくは塩基性残基、もっとも好ましくはＨ）であり、
Ｊ３３は、アミノ酸残基（好ましくは酸性残基、もっとも好ましくはＮ）であり、
Ｊ３４は、アミノ酸残基（好ましくは芳香族残基、もっとも好ましくはＦ、またはＹ）である。
【００６９】
配列番号４の式から、以下の表１に記載のペプチドがもっとも好ましい。
【００７０】
他の好ましいＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメイン配列は、
ＩＶ
ＯＮＬＨＯ１０Ｏ１１Ｏ１２ＫＳＩＯ１５Ｏ１６ＬＲＲＲＦＯ２３ＬＨＨＬＩＯＣ
（配列番号５）
であって、
式中、
ＯＮは、存在しないか、あるいはＹＯ１Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ１Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ２Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ３Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ４Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ５Ｏ６Ｏ７、Ｏ６Ｏ７、またはＯ７であり、
Ｏ１は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性残基、もっとも好ましくはＡ）であり、
Ｏ２は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性残基、もっとも好ましくはＶ）であり、
Ｏ３は、アミノ酸残基（好ましくは親水性残基、もっとも好ましくはＳ）であり、
Ｏ４は、アミノ酸残基（好ましくは酸性残基、もっとも好ましくはＥ）であり、
Ｏ５は、アミノ酸残基（好ましくは塩基性、または非官能性残基、もっとも好ましくはＨ、またはＩ）であり、
Ｏ６は、アミノ酸残基（好ましくは親水性残基、もっとも好ましくはＱ）であり、
Ｏ７は、アミノ酸残基（好ましくは非官能性残基、もっとも好ましくはＬ）であり、
Ｏ１０は、アミノ酸残基（好ましくは酸性、または親水性残基、もっとも好ましくはＮ、またはＤ）であり、
Ｏ１１は、アミノ酸残基（好ましくは塩基性、または非官能性残基、もっとも好ましくはＫ、またはＬ）であり、
Ｏ１２は、アミノ酸残基（好ましくは芳香族、または非官能性残基、もっとも好ましくはＧ、Ｆ、またはＷ）であり、
Ｏ１５は、アミノ酸残基（好ましくは親水性、または非官能性残基、もっとも好ましくはＩ、またはＳ）であり、
Ｏ１６は、アミノ酸残基（好ましく親水性残基、もっとも好ましくはＱ、またはＮ）であり、
Ｏ１７は、アミノ酸残基（好ましくは酸性、または非官能性残基、もっとも好ましくはＤ、またはＬ）であり、
Ｏ２３は、アミノ酸残基（好ましくは芳香族残基、もっとも好ましくはＦ、またはＷ）であり、
ＯＣは、存在しないか、あるいはＯ２９、Ｏ２９Ｏ３０、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３Ｏ３４、Ｏ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３Ｏ３４Ｏ３５、またはＯ２９Ｏ３０Ｏ３１Ｏ３２Ｏ３３Ｏ３４Ｏ３５Ｏ３６であり、
Ｏ２９からＯ３６は、それぞれ独立してアミノ酸残基である。
【００７１】
配列番号５の式から、以下の表２に記載のペプチドがもっとも好ましい。
【００７２】
本発明の代表的なペプチド配列を、以下の表１および２に記載する。これらのペプチドは、引用参考文献、または米国特許第４４２３０３７号、第４９６８６６９号、第５００１２２号、および第６０５１６８６号に記載されているように調製することができ、各参考文献の全体を参照により本明細書の一部とする。これらのペプチド配列を組み込む本発明の分子は、当分野で知られる方法によって調製することができる。１文字のアミノ酸の略語を用いる。これらの任意のペプチドは、リンカーを用いて、あるいは用いずに、直列に（すなわち、連続的に）結合することができる。システイニル残基を含有する任意のペプチドは、他のＣｙｓ含有ペプチドと架橋することができ、そのいずれか、または両方がビヒクルと結合することができる。複数のＣｙｓ残基を有する任意のペプチドは、さらにペプチド内ジスルフィド結合を形成することができる。これらの任意のペプチドは、以下に記載のとおり誘導することができる。
【００７３】
【表１】
2004500838.tif 000003
2004500838.tif 000004
2004500838.tif 000005
【００７４】
【表２】
2004500838.tif 000006
2004500838.tif 000007
2004500838.tif 000008
2004500838.tif 000009
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2004500838.tif 000011
【００７５】
他の有用なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメインは、ＴＩＰ３９として知られるペプチドの配列を有する。
ＳＬＡＬＡＤＤＡＡＦＲＥＲＡＲＬＬＡＡＬＥＲＲＨＷＬＮＳＹＭＨＫＬＬＶＬＤＡＰ
（配列番号１６０）
ＴＩＰ３９は、Ｕｓｄｉｎ等（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２（１１）：９４１〜３、Ｕｓｄｉｎ等（１９９６）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３７（１０）：４２８５〜９７、Ｕｓｄｉｎ等（１９９５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（２６）：１５４５５〜８、Ｕｓｄｉｎ等（１９９９）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４０（７）：３３６３〜７１に記載されている。
【００７６】
さらなる有用なＰＴＨ／ＰＴＨｒＰ調節ドメイン配列は、配列番号３、４、５、ＴＩＰ３９のアミノ酸配列、または表１、および２に挙げた配列の保存的および／または非保存的修飾から得ることができる。
【００７７】
保存的修飾によって、そのような修飾が作られる元となるＰＴＨまたはＰＴＨｒＰと類似の機能特性および化学特性を有するペプチドが生成されることになる。対照的に、ペプチドの機能特性および／または化学特性の実質的修飾は、（ａ）置換領域の分子主鎖の構造、たとえばシート構造またはらせん構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）分子の大きさを維持する作用が著しく異なるアミノ酸配列において置換基を選択することによって達成することができる。
【００７８】
たとえば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置でアミノ酸残基の極性または電荷にほとんど、あるいはまったく影響を及ぼさないように、非天然残基による天然アミノ酸残基の置換基を含むことができる。さらに、ポリペプチドの任意の天然残基は、「アラニンスキャニング変異誘発」に関して前に記載されているように、アラニンで置換されてもよい（たとえば、アラニンスキャニング変異誘発を論じているＭａｃＬｅｎｎａｎ等、１９９８、Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｕｐｐｌ．６４３：５５〜６７、Ｓａｓａｋｉ等、１９９８、Ａｄｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３５：１〜２４を参照のこと）。
【００７９】
所望のアミノ酸置換（保存的または非保存的）は、そのような置換が所望である時に当分野の技術者によって決定することができる。たとえば、ペプチド配列の重要な残基を同定するために、あるいは本明細書に記載したペプチド、またはビヒクル−ペプチド分子（前述の式を参照）の親和性を高める、または低下するために、アミノ酸置換を用いることができる。代表的なアミノ酸置換を表３に記載する。
【００８０】
【表３】
2004500838.tif 000012
【００８１】
いくつかの実施形態において、保存的アミノ酸置換はさらに、典型的に生物系での合成ではなく、化学的ペプチド合成によって組み込まれる非天然アミノ酸残基を包含する。
【００８２】
前述の「用語の定義」の項で言及したように、天然残基は、配列の修飾に有用である可能性のある共通の側鎖の特性に基づくクラスに分類することができる。たとえば、非保存的置換は、これらの１つのクラスの一員を他のクラスの一員と交換することを含む。そのような置換残基は、非ヒトオルソログと相同性のペプチド領域、または分子の非相同性領域に導入することができる。さらに、鎖の配向に影響を及ぼす目的で、ＰまたはＧを用いて修飾を行うこともできる。
【００８３】
そのような修飾において、アミノ酸のハイドロパシーインデックスが考慮される可能性がある。各アミノ酸は、疎水性および電荷特性に基づいてハイドロパシーインデックスが与えられており、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、トレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）、およびアルギニン（−４．５）である。
【００８４】
タンパク質にインタラクティブな生物学的機能を与えるときのハイドロパシーアミノ酸インデックスの重要性は、当分野において理解されている。Ｋｙｔｅ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７：１０５〜１３１（１９８２）。ある種のアミノ酸は、類似のハイドロパシーインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸と置換することができ、依然として類似の生物活性を保持することが知られている。ハイドロパシーインデックスに基づいて変更を行うとき、ハイドロパシーインデックスが±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに好ましい。
【００８５】
アミノ酸のような置換は、親水性に基づいて有効になされることも当分野で理解されている。隣接アミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性は、免疫原性、および抗原性、すなわちタンパク質の生物特性に関連する。
【００８６】
以下の親水性値がアミノ酸残基に与えられている。アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、トレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、トリプトファン（−３．４）である。類似した親水性値に基づいて変更を行うとき、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに好ましい。親水性に基づいて１次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
【００８７】
当分野の技術者は、よく知られている技法を用いて前述の配列に示したポリペプチドの適切な変異型を求めることができるであろう。活性を損なうことなく変更できる分子の適切な領域を同定するために、当分野の技術者は、活性に重要でないと考えられている領域を標的とすることができる。たとえば、同一種または他種由来の類似の活性を有する類似のポリペプチドが知られているとき、当分野の技術者は、ペプチドのアミノ酸配列と類似のペプチドを比較することができる。そのような比較によって、類似のポリペプチドのなかで保存されている残基および分子の部分を同定することができる。そのような類似のペプチドに比べて保存されていないペプチドの領域のおける変更は、ペプチドの生物活性および／または活性に不利な影響を及ぼす可能性が低いことが理解されるであろう。当分野の技術者はさらに、比較的に保存された領域においても、活性を保持しながら（保存的アミノ酸残基置換）、化学的に類似したアミノ酸を天然残基と置換できることを理解するであろう。したがって、生物活性または構造にとって重要である可能性のある領域であっても、生物活性を損なうことなく、あるいはペプチド構造に不利な影響を及ぼすことなく、保存的アミノ酸置換に供することができる。
【００８８】
さらに、当分野の技術者は、活性または構造にとって重要な類似のペプチドの残基を同定する構造−機能研究を再検討することができる。そのような比較を考慮して、類似のペプチドにおいて活性または構造に重要であるアミノ酸残基に対応する、ペプチドのアミノ酸残基の重要性を予測することができる。当分野の技術者は、そのように予測されたペプチドの重要なアミノ酸残基に対して、化学的に類似したアミノ酸置換基を選択することができる。
【００８９】
当分野の技術者はさらに、類似のポリペプチドにおいてその構造に関して３次元構造およびアミノ酸配列を分析することができる。その情報を考慮して、当分野の技術者は、その３次元構造に関してペプチドのアミノ酸残基のアラインメントを予測することができる。当分野の技術者は、タンパク質の表面にあると予測されたアミノ酸残基は他の分子との重要な相互作用に関わる可能性があるので、そのような残基に極端な変化がないように選択することができる。さらに、当分野の技術者は、所望の各アミノ酸残基に単一のアミノ酸置換基を含有する試験変異型を生成することができる。その後、この変異型は、当分野の技術者に知られている活性アッセイを用いてスクリーニングできる。そのようなデータは、適切な変異型についての情報を集めるために用いることができる。たとえば、特定のアミノ酸残基への変更が、活性の損失、望ましくない低減、または不適切な活性をもたらすことを見出した場合、そのような変更を伴う変異型を回避することになる。換言すれば、そのようなルーチンの実験から集められた情報に基づいて、当分野の技術者は、単独で、あるいは他の突然変異との組み合わせで、さらなる置換を避けるべきであるアミノ酸を容易に判別することができる。
【００９０】
いくつかの科学文献が、２次構造の予測を対象としている。Ｍｏｕｉｔ　Ｊ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．７（４）：４２２〜４２７（１９９６）、Ｃｈｏｕ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１３（２）：２２２〜２４５（１９７４）、Ｃｈｏｕ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１１３（２）：２１１〜２２２（１９７４）、Ｃｈｏｕ等、Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４７：４５〜１４８（１９７８）、Ｃｈｏｕ等、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７：２５１〜２７６、およびＣｈｏｕ等、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．２６：３６７〜３８４（１９７９）を参照されたい。さらに現在では、２次構造の予測を助けるためにコンピュータプログラムを利用することができる。２次構造を予測する一方法は、ホモロジーモデリングに基づくものである。たとえば、３０％を超える配列同一性、または４０％を超える相似性を有する２つのポリペプチドまたはタンパク質は、多くの場合、類似した構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベース（ＰＤＢ）の最近の発達によって、ポリペプチドまたはタンパク質構造内の潜在的フォールド数を含めて、２次構造の予測精度が高まった。Ｈｏｌｍ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２７（１）：２４４〜２４７（１９９９）を参照されたい。所与のポリペプチドまたはタンパク質には限定された数のフォールドがあり、ひとたび限界構造数が解明されると、構造予測は劇的に正確となることが示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ等、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７（３）：３６９〜３７６（１９９７）。
【００９１】
２次構造を予測する追加的な方法には、「スレディング」（Ｊｏｎｅｓ、Ｄ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７（３）：３７７〜８７（１９９７）、Ｓｉｐｐｌ等、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、４（１）：１５〜９（１９９６）、「プロファイル分析」（Ｂｏｗｉｅ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：１６４〜１７０（１９９１）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ等、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１８３：１４６〜１５９（１９９０）、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４（１３）：４３５５〜８（１９８７）、および「エボリューショナリーリンケージ」（Ｈｏｍｅ前述、およびＢｒｅｎｎｅｒ前述を参照）が含まれる。
【００９２】
ビヒクル。本発明は、１つのアミノ酸残基のＣ末端または側鎖を経てペプチドに結合した、少なくとも１つのビヒクルの存在を必要とする。複数のビヒクルを用いることもでき、たとえば、Ｃ末端のＦｃ、および側鎖のＰＥＧ基である。
【００９３】
Ｆｃドメインが好ましいビヒクルである。このＦｃドメインは、ペプチドのＣ末端と融合していてもよい。
【００９４】
前述のように、Ｆｃ変異型は本発明の範囲内で適切なビヒクルである。天然Ｆｃは、サルベージレセプターへの結合が維持されるという条件で、広範囲に修飾して本発明によるＦｃ変異型を形成することができ、たとえば、ＷＯ９７／３４６３１、およびＷＯ９６／３２４７８を参照されたい。そのようなＦｃ変異型において、本発明の融合分子によって必要とされない構造特性または機能活性を提供する天然Ｆｃの１つまたは複数の部位を除去することができる。たとえば、残基を置換または削除する、その部位に残基を挿入する、あるいはその部位を含有する部分を切断することによって、これらの部位を除去することができる。挿入または置換残基は、ペプチド擬似体、またはＤ型アミノ酸など、アミノ酸に変えることができる。Ｆｃ変異型はいくつかの理由により望ましく、そのいくつかを以下に記載する。代表的なＦｃ変異型には、以下のような分子および配列が含まれる。
【００９５】
１．ジスルフィド結合形成に関わる部位が除去されている。そのような除去は、本発明の分子を生成するために用いられる宿主細胞に存在する他のシステイン含有タンパク質との反応を回避する可能性がある。この目的のために、Ｎ末端のシステイン含有セグメントは切断されるか、あるいはシステイン残基は削除されるか、他のアミノ酸（たとえば、アラニル、セリル）で置換されることができる。特に、配列番号２のＮ末端２０−アミノ酸セグメントを切断するか、あるいは配列番号２の７位および１０位でシステイン残基を削除または置換することができる。システイン残基が除去されるときでも、単鎖Ｆｃドメインは依然として、非共有的に結合する二量体Ｆｃドメインを形成することができる。
【００９６】
２．選択された宿主細胞との適合性を高めるために、天然Ｆｃが修飾されている。たとえば、典型的な天然ＦｃのＮ末端に近いＰＡ配列を除去することができ、これはプロリンイミノペプチダーゼなどの大腸菌の消化酵素によって認識することができる。特に分子が大腸菌などの細菌細胞に組換えによって発現しているとき、Ｎ末端メチオニン残基を付加することもできる。配列番号２のＦｃドメインは、そのようなＦｃ変異型である。
【００９７】
３．選択された宿主細胞に発現したときのＮ末端異質性を防ぐために、天然ＦｃのＮ末端部分が除去されている。この目的のために、Ｎ末端にある任意の最初の２０アミノ酸残基、特に１、２、３、４、および５位を削除することができる。
【００９８】
４．１つまたは複数のグリコシル化部位が除去されている。典型的にグリコシル化される残基（たとえば、アスパラギン）は、細胞溶解反応を与える可能性がある。そのような残基は、削除するか、非グリコシル化残基（たとえば、アラニン）で置換することができる。
【００９９】
５．補体との相互作用に関わる部位、たとえばＣ１ｑ結合部位などが除去されている。たとえば、ヒトＩｇＧ１のＥＫＫ配列を削除または置換することができる。補体リクルートメントは本発明の分子に有利でない可能性があるので、そのようなＦｃ変異型で回避することができる。
【０１００】
６．サルベージレセプターではなく、Ｆｃレセプターとの結合に影響する部位が除去されている。天然Ｆｃは、本発明の融合分子に必要とされず、除去することのできる、ある種の白血球との相互作用に関する部位を有する。
【０１０１】
７．ＡＤＣＣ部位が除去されている。ＡＤＣＣ部位は当分野で知られており、たとえば、ＩｇＧ１のＡＤＣＣ部位に関して、Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（５）：６３３〜９（１９９２）を参照されたい。これらの部位も、本発明の融合分子に必要とされず、除去することができる。
【０１０２】
８．天然Ｆｃが非ヒト抗体から誘導されるとき、その天然Ｆｃはヒト化することができる。典型的に、天然Ｆｃをヒト化するために、非ヒト天然Ｆｃにおいて選択された残基を、通常はヒト天然Ｆｃに見出される残基で置換する。抗体ヒト化の技法は、当分野でよく知られている。
【０１０３】
好ましいＦｃ変異型には、以下が含まれる。配列番号２において（図４）、１５位のロイシンをグルタミン酸で、９９位のグルタミン酸をアラニンで、１０１および１０３位のリシンをアラニンで置換することができる。さらに、１つまたは複数のチロシン残基を、フェニルアラニン残基によって置き換えることができる。
【０１０４】
別のビヒクルは、サルベージレセプターと結合することのできる、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体フラグメント、または小分子（たとえば、ペプチド擬似体化合物）である。たとえば、Ｐｒｅｓｔａ他に１９９８年４月１４日に発行された米国特許第５７３９２７７号に記載のとおり、ポリペプチドをビヒクルとして用いることができる。ペプチドも、ＦｃＲｎサルベージレセプターとの結合のために、ファージディスプレイ、ＲＮＡペプチドスクリーニングによって選択することができる。そのようなサルベージレセプター結合化合物も、「ビヒクル」の意味に包含され、本発明の範囲内である。そのようなビヒクルは、半減期を延長する（たとえば、プロテアーゼによって認識される配列を回避することによって）、免疫抗原性を低減する（たとえば、抗体ヒト化において発見された非免疫抗原性を選ぶことによって）ために選択されるべきである。
【０１０５】
前述のように、ポリマービヒクルはＦ１およびＦ２に用いることもできる。現在、ビヒクルとして有用な化学部分を結合する種々の手段が利用でき、たとえば、その全体を参照により本明細書の一部とする「Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ」という名称の特許協力条約（「ＰＣＴ」）国際公開ＷＯ９６／１１９５３を参照されたい。このＰＣＴ公開は、なかでも、タンパク質のＮ末端への水溶性ポリマーの選択的結合を開示している。
【０１０６】
好ましいポリマービヒクルは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧ基は、任意の都合のよい分子量であることができ、線状または分枝であることができる。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２キロダルトン（「ｋＤ」）から約１００ｋＤ、より好ましくは約５ｋＤから約５０ｋＤ、もっとも好ましくは約５ｋＤから約１０ｋＤの範囲となる。ＰＥＧ基は一般に、ＰＥＧ部分の反応基（たとえば、アルデヒド、アミノ、チオール、またはエステル基）から本発明化合物の反応基（たとえば、アルデヒド、アミノ、またはエステル基）へのアシル化または還元アルキル化を経て、本発明の化合物に結合される。
【０１０７】
合成ペプチドのＰＥＧ化の有用な方策は、溶液中での共役結合の形成によって、それぞれ他方に対して相互に反応性の特別の官能基を有するペプチドおよびＰＥＧ部分を結合することからなる。このペプチドは、通常の固相合成で容易に調製することができる。このペプチドは、特定の部位で、適切な官能基によって「前活性化」されている。この前駆体は、ＰＥＧ部分との反応に先立って、精製され、完全に特性決定される。ペプチドのＰＥＧとのライゲーションは通例、水相で行われ、逆相分析ＨＰＬＣによって容易にモニターすることができる。ＰＥＧ化ペプチドは、分取ＨＰＬＣによって容易に精製することができ、分析ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、およびレーザ脱離質量分析法によって特性決定することができる。
【０１０８】
多糖ポリマーは、タンパク質修飾に用いることのできる他の種類の水溶性ポリマーである。デキストランは、主としてα１−６結合によって結合したグルコースの個々のサブユニットからなる多糖ポリマーである。デキストラン自体は、多くの分子量範囲で利用可能であり、約１ｋＤから約７０ｋＤの分子量で容易に利用可能である。デキストランは、単独で、あるいは他のビヒクル（たとえば、Ｆｃ）と組み合わせて、ビヒクルとして本発明に用いるのに適した水溶性ポリマーである。たとえば、ＷＯ９６／１１９５３、およびＷＯ９６／０５３０９を参照されたい。治療用または診断用免疫グロブリンに複合したデキストランの使用が報告されており、たとえば、その全体を参照により本明細書の一部とする欧州特許公開第０３１５４５６号を参照されたい。本発明によるビヒクルとしてデキストランを用いるとき、約１ｋＤから約２０ｋＤのデキストランが好ましい。
【０１０９】
リンカー。任意の「リンカー」基を自由選択できる。リンカーが存在するとき、主としてスペーサーとして働くので、その化学構造は重要でない。リンカーは、好ましくはペプチド結合によって結合されたアミノ酸からなる。したがって、好ましい実施形態において、リンカーはペプチド結合によって結合した１から２０個のアミノ酸からなり、アミノ酸は２０種の天然アミノ酸から選択される。これらのアミノ酸のいくつかは、当分野の技術者に充分に理解されているように、グリコシル化することができる。より好ましい実施形態において、１から２０個のアミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリシンから選択される。さらに好ましい実施形態において、リンカーは、グリシン、およびアラニンなど、立体化学的に妨げられていない多数のアミノ酸からなる。したがって、好ましいリンカーは、ポリグリシン（特に（Ｇｌｙ）４、（Ｇｌｙ）５）、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、およびポリアラニンである。リンカーの他の特定の例は、
（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号６）
（Ｇｌｙ）３ＡｓｎＧｌｙＳｅｒ（Ｇｌｙ）２（配列番号７）
（Ｇｌｙ）３Ｃｙｓ（Ｇｌｙ）４（配列番号８）、および
ＧｌｙＰｒｏＡｓｎＧｌｙＧｌｙ（配列番号９）である。
【０１１０】
上述の命名法を説明すると、たとえば、（Ｇｌｙ）３Ｌｙｓ（Ｇｌｙ）４は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを意味する。ＧｌｙおよびＡｌａの組み合わせも好ましい。ここに示したリンカーは代表的なものであり、本発明の範囲内のリンカーは、はるかに長くてもよく、他の残基を含むこともできる。
【０１１１】
非ペプチドリンカーも可能である。たとえば、−ＮＨ−（ＣＨ２）Ｓ−Ｃ（Ｏ）−、式中ｓ＝２〜２０などのアルキルリンカーを用いることができる。これらのアルキルリンカーはさらに、低級アルキル（たとえば、Ｃ１〜Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（たとえば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなど、任意の非立体障害基によって置換されていてもよい。代表的な非ペプチドリンカーはＰＥＧリンカーであり、
【０１１２】
【化１】
2004500838.tif 000013
式中、ｎは、このリンカーが１００から５０００ｋＤ、好ましくは１００から５００ｋＤの分子量を有するような値である。ペプチドリンカーは、前述と同じ方法で、誘導体を形成するように変えることができる。
【０１１３】
誘導体。本発明者等はさらに、この化合物のペプチドおよび／またはビヒクル部分を誘導体化することを企図する。そのような誘導体は、化合物の溶解性、吸収性、生物学的半減期などを向上させる可能性がある。この部分は、あるいは、化合物の所望でない副作用などを除く、または減ずる可能性がある。代表的な誘導体は以下のような化合物を含む。
【０１１４】
１．化合物またはその一部が環式である。たとえば、ペプチド部分は、２つ以上のＣｙｓ残基を含有するように（たとえば、リンカーにおいて）修飾することができ、これはジスルフィド結合の形成によって環化することができる。
【０１１５】
２．化合物が架橋しているか、分子間で架橋可能である。たとえば、ペプチド部分は、１つのＣｙｓ残基を含有するように修飾することができ、それによって同様の分子と分子間ジスルフィド結合を形成することができる。この化合物は、以下に示した分子のように、Ｃ末端によって架橋されることもできる。
【０１１６】
【化２】
2004500838.tif 000014
【０１１７】
３．１つまたは複数のペプチジル［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ−］結合が、非ペプチジル結合に置き換えられている。代表的な非ペプチジル結合は、−ＣＨ２−カルバメート［−ＣＨ２−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ−］、ホスホネート、−ＣＨ２−スルホンアミド［−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ−］、尿素［−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨ−］、−ＣＨ２−第二級アミン、およびアルキル化ペプチド［−Ｃ（Ｏ）ＮＲ６−、式中、Ｒ６は低級アルキル］である。
【０１１８】
４．Ｎ末端が誘導体化されている。典型的に、Ｎ末端はアシル化、または置換アミンに修飾することができる。代表的なＮ末端誘導体化基には、−ＮＲＲ１（−ＮＨ２以外）、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ１、−ＮＲＣ（Ｏ）ＯＲ１、−ＮＲＳ（Ｏ）２Ｒ１、−ＮＨＣ（Ｏ）ＮＨＲ１、スクシンイミド、またはベンジルオキシカルボニル−ＮＨ−（ＣＢＺ−ＮＨ−）が含まれ、式中、Ｒ、およびＲ１はそれぞれ独立して水素、または低級アルキルであり、フェニル環は、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルコキシ、クロロ、およびブロモからなるグループから選択された１から３個の置換基で置換されていてもよい。
【０１１９】
５．遊離Ｃ末端が誘導体化されている。典型的に、Ｃ末端はエステル化またはアミド化される。代表的なＣ末端誘導体化基には、たとえば、−Ｃ（Ｏ）Ｒ２、式中、Ｒ２は低級アルコキシ、または−ＮＲ３Ｒ４、式中Ｒ３、およびＲ４は独立して水素、またはＣ１〜Ｃ８アルキル（好ましくはＣ１〜Ｃ４アルキル）が含まれる。
【０１２０】
６．ジスルフィド結合が、他の架橋部分、好ましくはより安定な架橋部分で置き換えられている（たとえば、アルキレン）。たとえば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ等（１９９６）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４〜９、Ａｌｂｅｒｔｓ等（１９９３）Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ　Ａｍ．Ｐｅｐ．Ｓｙｍｐ．，３５７〜９を参照されたい。
【０１２１】
７．１つまたは複数の個々のアミノ酸残基が修飾されている。以下に詳しく述べるように、選択された側鎖、または末端残基と特異的に反応する、様々な誘導体化剤が知られている。
【０１２２】
リシニル残基およびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸無水物と反応させることができる。これはリシニル残基の電荷を逆転する。α−アミノ含有残基の誘導体化に適切な他の試薬には、イミドエステル、たとえばピコリンイミド酸メチル、リン酸ピリドキサル、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびグリコキシレートとのトランスアミナーゼ触媒性反応などが含まれる。
【０１２３】
アルギニル残基は、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンを含む、任意の１つ、またはいくつかの通常の試薬の組み合わせと反応させることによって修飾することができる。アルギニル残基の誘導体化には、グアニジン官能基のｐＫａが高いため、この反応をアルカリ性条件で行うことが必要とされる。さらに、これらの試薬は、リシン基、ならびにアルギニンイプシロン−アミノ基と反応することができる。
【０１２４】
チロシル残基の特異的修飾は、特に芳香族ジアゾニウム化合物、またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入を対象として広範に研究されてきた。もっとも一般的には、Ｏ−アセチルチロシル種、および３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成するために、Ｎ−アセチルイミダゾール、およびテトラニトロメタンが用いられる。
【０１２５】
カルボキシル側鎖基（アスパルチル、またはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド、または１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾することができる。さらに、アスパルチル、およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル、およびグルタミニル残基に変換することができる。
【０１２６】
グルタミニル、およびアスパラギニル残基は、対応するグルタミル、およびアスパルチル残基に脱アミド化することができる。あるいは、これらの残基は、緩酸条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲に含まれる。
【０１２７】
システイニル残基は、ジスルフィド結合を除去するために、あるいは逆に架橋を安定化するために、アミノ酸残基または他の部分と置き換えることができる。たとえば、Ｂｈａｔｎａｇａｒ等（１９９６）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：３８１４〜９を参照されたい。
【０１２８】
二官能剤による誘導体化は、ペプチドまたはその官能誘導体を、水不溶性保持マトリクス、または他の高分子ビヒクルに架橋するのに有用である。一般に用いられる架橋剤には、たとえば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、たとえば４−アジドサリチル酸とのエステル、ジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能イミドエステル、たとえば３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）など、および二官能マレイミド、たとえばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどが含まれる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在化で架橋を形成することのできる光活性型中間体を生じる。別法として、反応性水不溶性マトリクス、たとえば臭化シアン活性化炭水化物など、ならびに米国特許第３９６９２８７号、第３６９１０１６号、第４１９５１２８号、第４２４７６４２号、第４２２９５３７号、および第４３３０４４０号に記載されている反応性基質がタンパク質固定化に用いられる。
【０１２９】
炭水化物（オリゴ糖）基は、タンパク質のグリコシル化部位であることが知られている部位に都合よく結合することができる。一般に、それらがＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒの一部であって、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸であるとき、Ｏ結合オリゴ糖は、セリン（Ｓｅｒ）またはトレオニン（Ｔｈｒ）残基に結合し、Ｎ結合オリゴ糖は、アスパラギン（Ａｓｎ）残基に結合する。Ｘは、好ましくはプロリン以外の１９種の天然アミノ酸の１つである。それぞれの型に見出されるＮ結合およびＯ結合オリゴ糖、ならびに糖残基の構造は異なっている。両方に一般に見出される糖の１つの種類は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアリン酸と呼ばれる）である。シアリン酸は一般に、Ｎ結合およびＯ結合オリゴ糖両方の末端残基であり、その負の電荷のために、グリコシル化化合物に酸性の特性を与える可能性がある。そのような部位は、本発明の化合物のリンカーに組み込むことができ、好ましくは、ポリペプチド化合物の組換え生成の間に、細胞によって（たとえば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＣＯＳなどの哺乳類の細胞）グリコシル化される。しかしながら、そのような部位はさらに、当分野で知られる合成または半合成手順によってグリコシル化することができる。
【０１３０】
他の可能な修飾には、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、Ｃｙｓの硫黄原子の酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化が含まれる。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）７９〜８６頁（１９８３）。
【０１３１】
本発明の化合物は、ＤＮＡレベルでも変えることができる。化合物の任意のタンパク質のＤＮＡ配列を、選択した宿主細胞により適合性のコドンに変えることができる。好ましい宿主細胞である大腸菌の場合、最適化コドンは当分野で知られている。制限部位を除去するために、あるいは選択された宿主細胞においてＤＮＡのプロセシングを促進する可能性のあるサイレント制限部位を包含するために、コドンを置換することができる。ビヒクル、リンカー、およびペプチドＤＮＡ配列は、前述の任意の配列変化を包含するために修飾することができる。
【０１３２】
製造方法
本発明の化合物は主として、組換えＤＮＡ技法を用いて、形質転換宿主細胞において製造することができる。そのために、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子を調製する。そのようなＤＮＡ分子を調製する方法は、当分野でよく知られている。たとえば、ペプチドをコードする配列は、適切な制限酵素を用いて、ＤＮＡから切除することができる。別法として、ＤＮＡ分子は、ホスホアミド化などの化学合成技法を用いて合成することができる。また、これらの技法の組み合わせを用いることもできる。
【０１３３】
本発明はさらに、適切な宿主にペプチドを発現することのできるベクターを含む。このベクターは、適切な発現制御配列と有効に結合したペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子をベクターに挿入する前、または後のいずれかに、その有効な結合をもたらす方法はよく知られている。発現制御配列には、プロモータ、アクチベータ、エンハンサ、オペレータ、リボソーム結合部位、開始シグナル、停止シグナル、ｃａｐシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関わる他のシグナルが含まれる。
【０１３４】
結果として生じたＤＮＡ分子を有するベクターは、適切な宿主を形質転換するために用いられる。この形質転換は、当分野でよく知られている方法を用いて行うことができる。
【０１３５】
入手可能であり、よく知られている多数の宿主細胞のうち任意のものを本発明の実施において用いることができる。特定の宿主の選択は、当分野で認識されているいくつかの要因に応じて行われる。それらの要因には、たとえば、選択された発現ベクターとの適合性、そのＤＮＡ分子によってコードされたペプチドの毒性、形質転換の速度、ペプチドの回収の容易性、発現特性、バイオセイフティ、およびコストが含まれる。これらの要因のバランスは、すべての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に等しく有効ではない可能性があるという理解に忠実でなければならない。これらの一般的な指針の範囲内で、有用な微生物の宿主には、細菌（大腸菌など）、酵母（サッカロミセスなど）、他の真菌、昆虫、植物、哺乳動物（ヒトを含む）の培養細胞、または当分野で知られている他の宿主が含まれる。
【０１３６】
次に、形質転換された宿主を培養し、精製する。宿主細胞は、所望の化合物が発現するように、通常の発酵条件下で培養することができる。そのような発酵条件は、当分野でよく知られている。最後に、当分野でよく知られている方法によって、培養物からペプチドを精製する。
【０１３７】
この化合物は、合成によって製造することもできる。たとえば、固相合成技法を用いることができる。適切な技法は当分野でよく知られており、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３）、Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ、３３５〜６１頁（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ、Ｐａｎａｙｏｔｉｓ編）、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９、Ｄａｖｉｓ等（１９８５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．１０：３９４〜４１４、ＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（１９６９）、Ｓｏｌｉｄ　Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、米国特許第３９４１７６３号、Ｆｉｎｎ等（１９７６）、Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（第３版）２：１０５〜２５３、およびＥｒｉｃｋｓｏｎ等（１９７６）、Ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（第３版）２：２５７〜５２７に記載のものが含まれる。固相合成は、小ペプチドを製造するのにもっとも費用効果のある方法なので、個々のペプチドを製造するのに好ましい方法である。
【０１３８】
誘導ペプチドを含有する化合物、または非ペプチド基を含有する化合物は、よく知られている有機化学技法によって合成することができる。
【０１３９】
化合物の使用
本発明の化合物は、ＰＴＨ−１レセプター、またはＰＴＨ−２レセプターとの相互作用によって生ずる薬理活性を有する。Ｍａｎｎｓｔａｄｔ等（１９９９）、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７７．５Ｐｔ２．Ｆ６６５〜７５。ＰＴＨおよびそのアゴニストは、骨吸収を増加、腎臓カルシウム再吸収を増加、表皮増殖を低減、毛髪成長を低減する。Ｈｏｌｉｃｋ等（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１（１７）：８０１４〜６、Ｓｃｈｉｌｌｉ等（１９９７）、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０８（６）：９２８〜３２。したがって、ＰＴＨ−１レセプターおよび／またはＰＴＨ−２レセプターのアンタゴニストは、以下の治療に有用である。
【０１４０】
・原発性または続発性副甲状腺機能亢進症
・高カルシウム血症であって、充実性腫瘍（乳房、肺、および腎臓）および血液性悪性腫瘍（多発性骨髄腫、リンパ腫、および白血病）から生じる高カルシウム血症、特発性高カルシウム血症、ならびに甲状腺機能亢進および腎機能障害を伴う高カルシウム血症を含む
・腫瘍転移、特に骨への転移、および特に乳癌および前立腺癌に関連するもの
・悪液質および食欲不振、特に癌に伴うもの
・異常ＰＴＨレセプターシグナルに関連する、あるいはそれによって悪化したオステオペニア症であって、様々な形態の骨粗鬆症を含み、たとえば
−原発性骨粗鬆症
−閉経後および加齢性骨粗鬆症
−内分泌性骨粗鬆症（甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、および末端肥大症）
−遺伝性および先天性形態の骨粗鬆症（たとえば、骨形成不全症、ホモシスチン尿症、メンケズ症候群、およびライリーデイ症候群）
−四肢固定による骨粗鬆症
−他の疾患に続発性の骨粗鬆症、たとえばヘモクロマトーシス、過プロラクチン血症、神経性食欲不振、甲状腺中毒症、真性糖尿病、セリアック病、炎症性腸疾患、原発性胆汁性肝硬変、慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、多発性骨髄腫、リンパ増殖性疾患、および全身性肥満細胞症
−手術（たとえば、胃切除）、あるいは薬剤療法、たとえば化学療法、抗痙攣薬療法、免疫抑制剤療法、および抗凝固薬療法などに続発性の骨粗鬆症
−慢性関節リウマチ（ＲＡ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、喘息、側頭動脈炎、脈管炎、慢性閉塞性肺疾患、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、慢性間質性肺疾患などの疾病の糖質コルチコステロイド治療に続発性の骨粗鬆症
−腎臓、肝臓、肺、心臓移植などの器官移植後の器官拒絶を予防するための糖質コルチコステロイドおよび／または免疫調節治療に続発性の骨粗鬆症
−宇宙旅行中に認められるような、微小重力を受けることによる骨粗鬆症
−悪性疾患、たとえば乳癌、前立腺癌などに伴う骨粗鬆症など
・成人および若年における骨のパジェット病（変形性骨炎）
・骨喪失に至る骨髄炎、または骨の感染性病変
・ステロイド投与によって誘発され、小腸および大腸の障害、ならびに慢性肝疾患および腎疾患に伴う手術後のオステオペニア
・外傷性損傷に伴う骨壊死、または骨細胞死、あるいはゴシェ病、鎌状赤血球貧血、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、歯周病、骨溶解性転移、および他の病状に伴う非外傷性壊死
・男性ホルモン性脱毛症（男性型脱毛症）、中毒性脱毛症、老人性脱毛症、円形脱毛症、脱毛性脱毛症、抜毛癖を含む脱毛症（不充分な毛髪成長、あるいは部分的または完全な毛髪喪失）などである。
【０１４１】
患者がＰＴＨまたはＰＴＨｒＰの活性から利益を得るであろう他の病状もある。それらの適応症に関して、ＰＴＨレセプターゴニストは、治療法として有用である。特にそのような適応症には、骨折修復（偽関節骨折の治癒を含む）、様々な形態の骨粗鬆症を含むオステオペニアを含み、たとえば
−原発性骨粗鬆症
−閉経後および加齢性骨粗鬆症
−内分泌性骨粗鬆症（甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、および末端肥大症）
−遺伝性および先天性形態の骨粗鬆症（たとえば、骨形成不全症、ホモシスチン尿症、メンケズ症候群、およびライリーデイ症候群）
−四肢固定による骨粗鬆症
−他の疾患に続発性の骨粗鬆症、たとえばヘモクロマトーシス、過プロラクチン血症、神経性食欲不振、甲状腺中毒症、真性糖尿病、セリアック病、炎症性腸疾患、原発性胆汁性肝硬変、慢性関節リウマチ、強直性脊椎炎、多発性骨髄腫、リンパ増殖性疾患、および全身性肥満細胞症
−手術（たとえば、胃切除）、あるいは薬剤療法、たとえば化学療法、抗痙攣薬療法、免疫抑制剤療法、および抗凝固薬療法などに続発性の骨粗鬆症
−ＲＡ、ＳＬＥ、喘息、側頭動脈炎、脈管炎、慢性閉塞性肺疾患、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎、慢性間質性肺疾患などの疾病の糖質コルチコステロイド治療に続発性の骨粗鬆症
−腎臓、肝臓、肺、心臓移植などの器官移植後の器官拒絶を予防するための糖質コルチコステロイドおよび／または免疫調節治療に続発性の骨粗鬆症
−宇宙旅行中に認められるような、微小重力を受けることによる骨粗鬆症
−悪性疾患、たとえば乳癌、前立腺癌などに伴う骨粗鬆症などである。
半減期が延長されたＰＴＨアゴニスト（たとえば、Ｆｃドメインに結合したもの）は、骨吸収阻害剤と共に用いることができる。骨吸収阻害剤には、ＯＰＧおよびＯＰＧ誘導体、ＯＰＧ−Ｌ（ＲＡＮＫＬ）抗体、カルシトニン（たとえば、Ｍｉａｃａｌｃｉｎ（登録商標）、Ｃａｌｃｉｍａｒ（登録商標））、ビスホスホネート（たとえば、ＡＰＤ、アレンドロネート、リセドロネート、エチドロネート、パミドロネート、チルドロネート、クロドロネート、ネリドロネート、イバンドロネート、ゾレドロネート）、エストロゲン（たとえば、Ｐｒｅｍａｒｉｎ（登録商標）、Ｅｓｔｒａｄｅｒｍ（登録商標）、Ｐｒｅｍｐｒｏ（登録商標）、Ａｌｏｒａ（登録商標）、Ｃｌｉｍａｒａ（登録商標）、Ｖｉｖｅｌｌｅ（登録商標）、Ｅｓｔｒａｔａｂ（登録商標）、Ｏｇｅｎ（登録商標））、選択的エストロゲン受容体モジュレータ（たとえば、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、ラソフォキシフェン）、チボロンなどが含まれる。代表的な骨吸収阻害剤は、ＷＯ９８／４６７５１、およびＷＯ９７／２３６１４に記載されており、それらの全体を参照により本明細書の一部とする。
【０１４２】
本発明の化合物は、骨粗鬆症を治療するための単剤療法に適している可能性があり、ＰＴＨ−Ｆｃ治療への抗吸収剤の添加は、それらの有効性、および治療窓の両方を増大することが可能である。ＰＴＨおよびＰＴＨ−Ｆｃは共に、骨形成および骨吸収の両方を増加する。破骨細胞応答を遮断する抗吸収剤の能力は、ＰＴＨ−Ｆｃの高カルシウム上昇作用を制限し、さらに骨量を高めることができる。
【０１４３】
薬剤組成物
概要。本発明はまた、本発明の化合物の薬剤組成物を用いる方法を提供する。そのような薬剤組成物は、注射投与用、あるいは経口、経肺、経鼻、経皮用、または他の投与形態であることができる。一般に、本発明は、薬剤として許容される希釈剤、保存薬、可溶化剤、乳化剤、補助剤、および／または担体と共に有効量の本発明の化合物を含む薬剤組成物を包含する。そのような組成物には、様々な緩衝剤含量（たとえば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨ、およびイオン強度の希釈剤、添加剤、たとえば洗浄剤および可溶化剤（たとえば、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、抗酸化剤（たとえば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存薬（たとえば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）、および増量物質（たとえば、ラクトース、マンニトール）、ポリ硫酸、ポリグリコール酸などポリマー化合物の粒状製剤、またはリポソームへの材料の組み込みが含まれる。ヒアルロン酸も用いることができ、これは循環における持続性を促進する効果を有する可能性がある。そのような組成物は、本発明のタンパク質および誘導体の物理的状態、安定性、ｉｎ　ｖｉｖｏ放出速度、ｉｎ　ｖｉｖｏクリアランス速度に影響を及ぼす可能性がある。たとえば、その全体を参照により本明細書の一部とする、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ１８０４２）１４３５〜１７１２頁を参照されたい。この組成物は、液体形態で調製することができ、あるいは凍結乾燥形態など、乾燥粉末で調製することもできる。経皮製剤と同様に、埋込み型持続放出性製剤も企図される。
【０１４４】
齧歯動物における骨芽細胞数、骨量、および骨塩密度の増加に関して、本発明の化合物の週２回投与は、ＰＴＨ−（１−３４）の毎日の注射投与より優れている。成体のマウスにおいて、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃの週２回投与はＰＴＨ（１−３４）の毎日の投与に比べて、骨密度および骨量に、より大きな増加をもたらした（図１０参照）。加齢ＯＶＸラット骨粗鬆症モデルにおいて、週２回投与は、１年のエストロゲン除去によって誘発された骨喪失を５０％超逆行させることができた。加齢ラットモデルにおいて見られたこの効果は、ビスホスホネート（ＡＰＤ）と組み合わせたとき、さらに大きかった。ラットにおいて、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃの単回ＳＣ注射は（３４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、高カルシウム血応答を引き起こし、これは７２時間持続した（図８）。この期間は、血清からのＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃのクリアランス速度に一致し、ラットにおける週２回の最適投与と矛盾しない。
【０１４５】
霊長類の最適投与は、ラットまたはマウスに比べて頻度が少ない可能性がある。ＯＶＸカニクイザルのＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃの単回皮下注射（１０〜３４ｎｍｏｌ／ｋｇ）に対する高カルシウム血応答が約１６８時間持続した（図１１）という観察に基づいて、霊長類において週１回（またはより少ない頻度）投与が最適である可能性がある。この観察は、霊長類においてＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃの単回皮下投与は、約１週間以内に浄化されることを示唆しており、これがアナボリック作用に必要とされる最大投与頻度を表すこともあり得る。
【０１４６】
経口投与形態。本発明において使用が企図されているのは、経口固体投与形態であり、その全体を参照により本明細書の一部とするＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）、第１８版、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ　ＰＡ　１８０４２の８９章に広く記載されている。固体投与形態には、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤または口内剤、カシェ剤またはペレット剤が含まれる。さらに、本発明の組成物を製剤するために、リポソームまたはプロテイノイド被包を用いることもできる（たとえば、米国特許第４９２５６７３号に報告されたプロテイノイド微小球）。リポソーム被包を用いることができ、リポソームは様々なポリマーで誘導体化することができる（たとえば、米国特許第５０１３５５６号）。治療用として可能な固体投与形態の説明は、Ｇ．Ｓ．ＢａｎｋｅｒおよびＣ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｒｓｈａｌｌ、Ｋ．、Ｍｏｄｅｒｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ（１９７９）の１０章に記載されており、その全体を参照により本明細書の一部とする。一般に、この製剤は本発明の化合物、および胃環境に対する防護を可能にする不活性成分を含み、生物活性材料を腸に放出する。
【０１４７】
さらに、上述の本発明化合物の経口投与形態が特に企図されている。必要であれば、この化合物は経口送達が有効となるように、化学的に修飾することができる。一般に、企図される化学的修飾は、化合物分子自体に少なくとも１つの部分を結合することであり、ここで前記部分は（ａ）タンパク分解の阻害、および（ｂ）胃または腸から血流への取り込みを可能にする。さらに所望なのは、化合物の総体的な安定性の向上、体内での循環時間の増大である。本発明において共有結合ビヒクルとして有用な部分は、この目的のために用いることもできる。そのような部分の例には、ＰＥＧ、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、およびポリプロリンが含まれる。たとえば、ＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉおよびＤａｖｉｓ、Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ　Ａｄｄｕｃｔｓ，Ｅｎｚｙｍｅｓ　ａｓ　Ｄｒｕｇｓ（１９８１）、ＨｏｃｅｎｂｅｒｇおよびＲｏｂｅｒｔｓ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ、，３６７〜８３、Ｎｅｗｍａｒｋ等（１９８２）、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５〜９を参照されたい。用いることのできる他のポリマーは、ポリ−１，３−ジオキソラン、およびポリ−１，３，６−チオキソカンである。上に示したように、薬剤としての使用に好ましいのはＰＥＧ部分である。
【０１４８】
経口送達投与形態の場合、本発明の治療化合物の吸収を向上させる担体として、Ｎ−（８−［２−ヒドロキシベンゾイル］アミノ）カプリル酸ナトリウム（ＳＮＡＣ）などの、修飾脂肪族アミノ酸の塩を用いることもできる。ＳＮＡＣを用いるヘパリン製剤の臨床有効性は、Ｅｍｉｓｐｈｅｒｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって行われた第ＩＩ相試験で実証されている。米国特許第５７９２４５１号「Ｏｒａｌ　ｄｒｕｇ　ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ」を参照されたい。
【０１４９】
本発明の化合物は、粒径約１ｍｍの顆粒またはペレット形態の微細多粒子として、製剤に含めることができる。カプセル投与用材料の製剤は、粉末、軽く圧縮されたプラグ、さらには錠剤であることもできる。この治療剤は、圧縮によって調製することができる。
【０１５０】
着色剤および風味剤もすべて含めることができる。たとえば、タンパク質（または誘導体）を（リポソームまたは微小球被包などによって）製剤し、その後さらに食用製品、たとえば着色剤および風味剤を含む冷蔵飲料に含有させることができる。
【０１５１】
不活性材料を用いて、本発明の化合物を希釈、または容量を増すことができる。これらの希釈剤には、炭水化物、特にマンニトール、α−ラクトース、無水ラクトース、セルロース、ショ糖、変性デキストラン、およびデンプンが含まれる。ある種の無機塩も増量剤として用いることができ、三リン酸カルシウム、炭酸マグネシウム、および塩化ナトリウムが含まれる。いくつかの市販の希釈剤は、Ｆａｓｔ−Ｆｌｏ、Ｅｍｄｅｘ、ＳＴＡ−Ｒｘ１５００、Ｅｍｃｏｍｐｒｅｓｓ、およびＡｖｉｃｅｌｌである。
【０１５２】
この治療剤の固体投与形態の製剤には、崩壊剤を含むことができる。崩壊剤として用いる材料には、これに限定されるものではないが、デンプンが含まれ、デンプンをベースとする市販の崩壊剤Ｅｘｐｌｏｔａｂを含む。デンプングリコール酸ナトリウム、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ウルトラアミロペクチン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、オレンジピール、酸性カルボキシメチルセルロース、天然海綿、およびベントナイトもすべて用いることができる。崩壊剤の他の形態は、不溶性陽イオン交換樹脂である。粉状ゴムを崩壊剤および結合剤として用いることができ、これらには、寒天、カラヤ、トラガカントなどの粉状ゴムが含まれる。アルギン酸、およびそのナトリウム塩も、崩壊剤として有用である。
【０１５３】
治療薬剤を合わせて保持し、硬い錠剤を形成するために結合剤を用いることができ、結合剤には、アカシア、トラガカント、デンプン、およびゼラチンなどの天然物由来の材料が含まれる。他の結合剤には、メチルセルロース（ＭＣ）、エチルセルロース（ＥＣ）、およびカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）が含まれる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、およびヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）は共に、治療薬剤を粒状にするためにアルコール性溶液中で用いることができる。
【０１５４】
製剤工程中の粘着を防ぐために、治療薬剤の製剤に抗摩擦剤を含むことができる。治療薬剤と型壁との間の層として潤滑剤を用いることができ、これらの潤滑剤には、これに限定されるものではないが、マグネシウム塩およびカルシウム塩を含むステアリン酸、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、流動パラフィン、植物油および蝋が含まれる。ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム、様々な分子量のポリエチレングリコール、Ｃａｒｂｏｗａｘ４０００および６０００などの可溶性潤滑剤も用いることができる。
【０１５５】
製剤中の薬剤の流動性を高め、圧縮中の再構成を促進することのできる流動促進剤を添加することができる。流動促進剤には、デンプン、タルク、発熱性シリカ、および水和シリコアルミネートを含むことができる。
【０１５６】
本発明の化合物の、水性環境への溶解を促進するために、湿潤剤として界面活性剤を添加することができる。界面活性剤には、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、およびスルホン酸ジオクチルナトリウムなどの陰イオン洗浄剤が含まれる。陽イオン洗浄剤を用いることができ、塩化ベンザルコニウム、または塩化ベンゼトニウムを含むことができる。界面活性剤として製剤に含むことの可能な非イオン性洗浄剤の例は、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油１０、５０、および６０、モノステアリン酸グリセロール、ポリソルベート４０、６０、６５、および８０、ショ糖脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースである。これらの界面活性剤は、タンパク質または誘導体の製剤に、単独で、あるいは異なる割合の混合物として存在できる。
【０１５７】
化合物の吸収を向上するために、添加剤も製剤に含むことができる。この特性を潜在的に有する添加剤は、たとえば脂肪酸オレイン酸、リノール酸、およびリノレン酸である。
【０１５８】
放出調節製剤が所望である可能性がある。本発明の化合物は、たとえばゴムのような、拡散または浸出機構のいずれかによる放出を可能にする不活性マトリクスに組み入れることができる。ゆっくりと変質するマトリクスも製剤に組み入れることができ、たとえば、アルギン酸塩、多糖である。本発明の化合物の放出を調節する他の形態は、Ｏｒｏｓ治療系（Ａｌｚａ　Ｃｏｒｐ．）をベースにした方法によるもので、すなわち水が侵入し、浸透圧効果によって単一の小さな開口部から薬剤を押し出すような半透性膜に薬剤を封入する。いくつかの腸溶被覆物も、遅延放出効果を有する。
【０１５９】
他の被覆物もこの製剤に用いることができる。これらには、被覆槽に適用することのできる多様な糖が含まれる。この治療用薬剤は、薄膜被覆錠剤で提供することもでき、この場合に用いられる材料は２つのグループに分けられる。最初のグループは非腸溶材料であり、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、プロビドン、およびポリエチレングリコールが含まれる。２つめのグループは、一般にフタル酸のエステルである腸溶材料である。
【０１６０】
最適な薄膜被覆を提供するために、材料の混合物を用いることができる。薄膜被覆は、槽被覆機または流動層において、あるいは圧縮被覆によって行うことができる。
【０１６１】
経肺送達形態。本発明のタンパク質（またはその誘導体）の経肺送達も、本発明に企図されている。このタンパク質（または誘導体）は、吸入され、肺上皮から血流を通って、哺乳動物の肺に送達される。（これに関する他の報告書には、Ａｄｊｅｉ等、Ｐｈａｒｍａ．Ｒｅｓ．（１９９０）７：５６５〜９、Ａｄｊｅｉ等（１９９０）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ６３：１３５〜４４（酢酸ロイプロリド）、Ｂｒａｑｕｅｔ等（１９８９）、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３（補遺５）：ｓ．１４３〜１４６（エンドセリン−１）、Ｈｕｂｂａｒｄ等（１９８９）、Ａｎｎａｌｓ　Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．３：２０６〜１２（α１−抗トリプシン）、Ｓｍｉｔｈ等（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８４：１１４５〜６（α１−プロテイナーゼ）、Ｏｓｗｅｉｎ等（１９９０年３月）、「Ａｅｒｏｓｏｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｐｒｏｃ．Ｓｙｍｐ．Ｒｅｓｐ．Ｄｒｕｇ　ＤｅｌｉｖｅｒｙＩＩ、Ｋｅｙｓｔｏｎｅ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ（組換えヒト成長ホルモン）、Ｄｅｂｓ等、（１９８８）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３４８２〜８（インターフェロン−γ、および腫瘍壊死因子α）、およびＰｌａｔｚ他、米国特許第５２８４６５６号（顆粒球コロニー刺激因子）が含まれる）。
【０１６２】
本発明の実施において使用が企図されるのは、治療薬の肺送達のために設計された多岐にわたる機械的装置であり、これに限定されるものではないが、噴霧器、定量投与吸入器、および粉末吸入器が含まれ、これらはすべて当分野の技術者によく知られている。本発明の実施に適している市販の装置のいくつかの特定の例は、Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ製、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器、Ｍａｒｑｕｅｓｔ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏｒａｄｏ製、Ａｃｏｒｎ　ＩＩ噴霧器、Ｇｌａｘｏ　Ｉｎｃ．、Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｔｒｉａｎｇｌｅ　Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ　Ｃａｒｏｌｉｎａ製、Ｖｅｎｔｏｌｉｎ定量投与吸入器、およびＦｉｓｏｎｓ　Ｃｏｒｐ．、Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ製、Ｓｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器である。
【０１６３】
そのような装置はすべて、本発明の化合物の投与に適した製剤の使用を必要とする。典型的に、各製剤は用いられる装置のタイプに特異的であり、療法に有用な希釈剤、補助剤、および／または担体に加えて、適切な噴霧剤材料を含むことができる。
【０１６４】
本発明の化合物は、末梢肺にもっとも有効に送達されるように、１０μｍ（またはミクロン）未満、もっとも好ましくは０．５から５μｍの平均粒径を有する粒状形態に、もっとも有利に調製されるべきである。
【０１６５】
薬剤として許容される担体には、炭水化物、たとえばトレハロース、マンニトール、キシリトール、ショ糖、ラクトース、およびソルビトールなどが含まれる。製剤に用いる他の成分には、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＣ、およびＤＯＰＣを含むことができる。天然および合成界面活性剤を用いることができる。ＰＥＧを用いることができる（タンパク質またはアナログを誘導体化するための使用とは別に用いることができる）。シクロデキストランなどのデキストランを用いることができる。胆汁酸塩、および他の関連したエンハンサを用いることができる。セルロース、およびセルロース誘導体を用いることができる。緩衝製剤での使用など、アミノ酸を用いることができる。
【０１６６】
さらに、複合体を含むリポソーム、マイクロカプセル、または微小球、あるいは他のタイプの担体の使用も企図される。
【０１６７】
ジェット式または超音波式の噴霧器と共に用いるのに適した製剤は、典型的に、溶液１ｍｌ当たり生物活性タンパク質約０．１から２５ｍｇの濃度で水に溶解した本発明の化合物を含むことになる。この製剤はさらに、緩衝剤、および単純糖を含むこともできる（たとえば、タンパク質の安定化、および浸透圧の調節のため）。噴霧器製剤はさらに、エアロゾルの形成において溶液の噴霧化によって引き起こされるタンパク質の表面誘発凝集を低減または防止するために、界面活性剤を含有することができる。
【０１６８】
定量投与吸入装置と共に用いる製剤は、一般に、界面活性剤によって噴霧剤に懸濁された、本発明の化合物を含有する微細に分割された粉末を含む。噴霧剤は、この目的に用いられる任意の通常の材料であることができ、たとえば、クロロフルオロカーボン、ヒドロクロロフルオロカーボン、ヒドロフルオロカーボン、または炭化水素などであって、トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール、および１，１，１，２−テトラフルオロエタン、またはそれらの組み合わせを含む。適した界面活性剤には、トリオレイン酸ソルビタン、およびダイズレシチンが含まれる。オレイン酸も界面活性剤として有用である。
【０１６９】
粉末吸入装置から投薬するための製剤は、本発明の化合物を含有する微細に分割された乾燥粉末を含み、さらに、装置からの粉末の拡散を促進する量、たとえば製剤の５０から９０重量％の、たとえばラクトース、ソルビトール、ショ糖、マンニトール、トレハロース、またはキシリトールなどの増量剤を含むことができる。
【０１７０】
経鼻送達形態。本発明の化合物の経鼻送達も企図される。経鼻送達は、治療薬を鼻に投与した直後に、肺に薬剤を沈着させる必要なしに、タンパク質が血流を通過することを可能にする。経鼻送達のための製剤には、デキストラン、またはシクロデキストランを含有したものが含まれる。他の粘膜を経る輸送による送達も企図される。
【０１７１】
投薬。前述の症状を治療するための方法に関わる投与計画は、薬剤の作用を変える様々な要因、たとえば、患者の年齢、症状、体重、性別、および食事、感染の重症度、投与時間、および他の臨床要因などを考慮して、主治医によって決定されることになる。一般に、１日の投与計画は、体重１ｋｇ当たり本発明の化合物０．１〜１０００マイクログラム、好ましくは１ｋｇ当たり０．１〜１５０マイクログラムの範囲であるべきである。
【０１７２】
特定の好ましい実施形態
本発明者等は、以下の表４に挙げた好ましいペプチドの好ましい構造を決定した。記号「Λ」は、本明細書に記載した任意のリンカーであることができ、あるいは単純に通常のペプチド結合（すなわちリンカーが存在しない）を表すこともできる。反復配列およびリンカーは、明確にするためにダッシュで分けて示している。
【０１７３】
【表４】
2004500838.tif 000015
【０１７４】
「Ｆ１」は、本明細書で前に定義したＦｃドメインである。表４に挙げたものに加えて、本発明者等はＦｃ二量体の各鎖が異なるペプチド配列に結合しているヘテロ二量体を企図し、たとえば、鎖の１つを配列番号１６６で記すことができ、他方を配列番号１７０で表すことのできる分子、あるいは表１および２の任意の配列に結合したＦｃである。
【０１７５】
本発明のすべての化合物は、ＰＣＴ出願第ＷＯ９９／２５０４４に記載の方法によって調製することができる。
【０１７６】
ここで本発明を、限定的ではなく例示的な以下の実施例によってさらに詳しく説明する。
【０１７７】
実施例１
Ｆｃ複合ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター（ＰＴＨ−Ｒ１）アゴニスト［ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ］の生物活性
序文
副甲状腺ホルモン［ＰＴＨ−（１−３４）または天然ＰＴＨ−（１−８４）］は、毎日注入されたとき、骨形成の増大および骨量の増加をもたらす。このアナボリック応答は、以前にはＰＴＨへの短期曝露が必要であると考えられており、これはＰＴＨの短い半減期（１時間未満）によって助長される。臨床的には、ＰＴＨ療法のアナボリック作用は毎日の皮下注射を必要とし、これがＰＴＨの広範な使用に著しい障壁となっている。より頻度の少ないＰＴＨ注射は臨床的に望ましく、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいてＰＴＨの半減期を延ばすことによって達成できる。ＰＴＨへの短時間（間欠）曝露（＜１時間／日）は骨芽細胞骨形成を促進し、一方、長時間（連続）曝露（＞２時間／日）は破骨細胞骨吸収を促進する（Ｄｏｂｎｉｇ等、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ１３８：４６０７、１９９８）。延長された半減期を有するＰＴＨは単独で骨吸収を増大し、高カルシウム血症をもたらす可能性があることを、この技術は示唆している。しかしながら、骨吸収阻害剤によってＰＴＨ誘発破骨細胞活性を防ぐことが可能なはずである。破骨細胞形成阻害因子（ＯＰＧ）はこの目的に充分に適している可能性がある。ラット、マウス、またはヒトにおけるＯＰＧ−Ｆｃによる単回処置は、破骨細胞集団を本質的に絶滅することによって、骨吸収の持続した阻害をもたらす。ＯＰＧのような有効な骨吸収阻害剤の併用投与は、より大きな効果をもたらす可能性がある。この投与計画は、理論上、対立しないＰＴＨによる骨形成刺激を可能にし、骨量の増加をもたらす。ビスホスホネートまたはエストロゲンを含む他の骨吸収阻害剤もＰＴＨ誘発骨吸収を阻害し、したがって長時間作用型ＰＴＨ分子と組み合わせて用いることができると考えられる。この目標のために、本発明者等は、ヒトＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃをクローン化し、発現し、精製した。タンパク質のＦｃ複合は、その循環半減期を著しく延長し、それによってＯＰＧ−Ｆｃと類似の、または同一のスケジュールで、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃを注射できる可能性がある。本発明の利益には、現在の標準的な１日に１回から４半期に１回という、より少ない頻度でのＰＴＨの注入が含まれる。
【０１７８】
材料、方法、および結果
高カルシウム血アッセイ
本発明者等は、マウスの高カルシウム血モデルにおけるＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ作用の効力、および持続性を試験した。簡潔には、様々な用量のＰＴＨ−（１−３４）またはＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃをマウスに１回、皮下注射し、血液イオン化カルシウムを求めるために、眼窩後部静脈洞から末梢血を採取した。ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃに対するマウスの持続された高カルシウム血応答から明らかなように（図４）、ＰＴＨ−（１−３４）よりも、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃの半減期は長く、効力は高かった。ＰＴＨ−（１−３４）によって誘発された高カルシウム血は、６〜２４時間持続し、等モル用量のＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃはより持続した高カルシウム血（４８〜７２時間）をもたらした。この応答持続期間は、ＰＴＨ−（１−３４）に比べてＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ構築体の半減期が長いことに矛盾しない。ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃの効力も、ＰＴＨ−（１−３４）に比べて著しく高かった（図４）。最高用量のＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃは、等モル用量のＰＴＨ−（１−３４）に比べて、より高いピークイオン化カルシウムレベルであった。曲線下面積（ＡＵＣ）の分析は、用いられた最高用量において、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃが等モル用量のＰＴＨ−（１−３４）よりも２．６倍高い高カルシウム血応答をもたらすことを実証した。
【０１７９】
アナボリックアッセイ
ＰＴＨ−（１−３４）よりも優れたＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃの薬理性および半減期が実証されたので、本発明者等は、ＰＴＨ−（１−３４）−ＦｃのＯＰＧ−Ｆｃとの併用処置が骨質量を増加するかどうかを判定するために予備的試験を行った。簡潔には、６ヵ月齢の雄のＳｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを、６つのグループに分けた。すべてのラットの第３腰椎（Ｌ３）で、２エネルギーＸ線吸光光度法（ＤＥＸＡ）によって基準骨塩密度（ＢＭＤ）を求めた（第０日）。その後、以下のスケジュールに従ってラットを処置した。
【０１８０】
グループ１：ビヒクルコントロール（ＰＢＳ、皮下注射、第１日、３日、５日）
グループ２：ＯＰＧ−Ｆｃ、第１日に単回皮下注射（１ｍｇ／ｋｇ）
グループ３：ＰＴＨ−（１−３４）、第１日、３日、５日に、注射当たり２０ｎｍｏｌＰＴＨ／ｋｇ／を皮下注射。これは最適アナボリックＰＴＨ投与計画である。
グループ４：グループ３と同じであるが、第１日にＯＰＧ−Ｆｃを単回注射
グループ５：ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃを、第１日に６０ｎｍｏｌ／ｋｇで単回皮下注射。これはグループ３で投与されたＰＴＨ−（１−３４）の全用量に等しいモル用量であるが、単回注射である。
グループ６：グループ５と同じであるが、第１日にＯＰＧ−Ｆｃを単回注射（皮下、１ｍｇ／ｋｇ）
【０１８１】
ＢＭＤの変化を評価するために、再び第７日に腰椎のＤＥＸＡを行った。Ｌ３のＢＭＤは、ＰＢＳ処置のラットに比べて、ＯＰＧ−Ｆｃの単回注射、またはＰＴＨ−（１−３４）の３回注射で、わずかに増加した（図５）。ＰＴＨ−（１−３４）＋ＯＰＧは、ＯＰＧ、またはＰＴＨ−（１−３４）単独の場合よりも多くＢＭＤを増加した。単剤療法としては、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃの単回注射はＢＭＤを増加しなかった。しかしながら、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃの単回注射にＯＰＧ−Ｆｃの単回注射を加えたものは、ＢＭＤを著しく増加した（図５）。延長された循環半減期を有するＰＴＨ構築体は、ＯＰＧ−Ｆｃのような有効な抗吸収剤と組み合わせてアナボリック骨格応答を生じることができるという原理の証拠を、この結果は提供している。ＰＴＨ−（１−３４）−ＦｃとＯＰＧ−Ｆｃとの単回処置によるアナボリック効果は、ＯＰＧ−Ｆｃの併用処置を伴う、あるいは伴わないＰＴＨ−（１−３４）の複数回注射によって誘発された効果よりも高かった。結論として、ＢＭＤの最大増量は、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ＋ＯＰＧ−Ｆｃの頻度の低い注射によって達成することができ、これは毎日、または１日置きに注射しなければならないＰＴＨ−（１−３４）に比べて優れた治療計画である。
【０１８２】
図５は、第３腰椎（Ｌ３）における骨塩密度（ＢＭＤ）に対するＰＴＨ−Ｆｃ＋ＯＰＧ−Ｆｃの作用を示す図である。正常な６ヵ月齢の雄のラットを、単回皮下注射によって、ＰＴＨ−Ｆｃ、ＰＴＨ、またはビヒクルで処置した。ラットの一部はさらにＯＰＧの単回皮下注射を受けた。ＢＭＤを７日後にＤＥＸＡによって求めた。データは平均±ＳＤ、ラットｎ＝６／グループで表す。
【０１８３】
実施例２
Ｆｃ複合ＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター（ＰＴＨ−Ｒ１）アンタゴニスト（［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃ）の生物活性
序文
いくつかの疾病状態は、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰの循環レベルの上昇を伴う。原発性および続発性副甲状腺機能亢進症（それぞれＰＨＰＴおよびＳＨＰＴ）は、ＰＴＨレベルの上昇を伴い、一方、悪性の液性高カルシウム血症（ＨＨＭ）は、ＰＴＨｒＰレベルを上昇させる。両方のタンパク質は、共通のＰＴＨ／ＰＴＨｒＰレセプター（ＰＴＨ−Ｒ１）を介してシグナルを送り、骨吸収、腎臓カルシウム再吸収、および腎臓のビタミンＤ生合成を増大する。骨吸収阻害剤は、これらの疾病状態の破骨細胞骨吸収の阻害において変動的な成果を収めるが、現在のところ、カルシウム血症に及ぼす腸および腎臓のＰＴＨまたはＰＴＨｒＰ過剰の影響を緩和する療法はない。したがって、ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰシグナルに直接阻止する薬剤は、吸収阻害剤に比べて高い効力を有すると考えられる。
【０１８４】
ＰＴＨ−Ｒ１のもっとも研究されたアンタゴニストは、アミノ末端切断をベースとするものである。ＰＴＨ−（７−３４）ペプチドは、非常に緩和なアゴニスト活性を有するかなり有効なＰＴＨ−Ｒ１アンタゴニストである。ＰＴＨ−（７−３４）に比べて、ＰＴＨｒＰ−（７−３４）ペプチドは、ＰＴＨ−Ｒ１に対して高い親和性を有し、より有効なアンタゴニストである。しかしながら、ＰＴＨｒＰ−（７−３４）はまた、ＰＴＨ−（７−３４）に比べて（依然として穏やかではあるが）高いアゴニスト活性を有する（Ｍｃｋｅｅ（１９９０）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２７：７６）。最適なアンタゴニストは、ＰＴＨ−（７−３４）の弱いアゴニズムと、ＰＴＨｒＰ−（７−３４）の強いアンタゴニズムとの組み合わせである。Ｎｕｔｔ等（１９９０）、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２７：４９１は、ＰＴＨのＡｓｎ１０およびＬｅｕ１１をＰＴＨｒＰ配列に置換することによって（Ａｓｐ１０およびＬｙｓ１１と置き換える）、実質的にアゴニスト活性を持たないが、非常に有効なアンタゴニスト活性を持つペプチド（［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃ）が生じることを実証している。
【０１８５】
天然ＰＴＨと同様に、すべてのペプチドベースＰＴＨ−Ｒ１アンタゴニストは、循環半減期が非常に短いという特性を共有している（＜１時間）。さらに、レセプターゴニズムを除去するのに必要とされるアミノ末端切断は、ＰＴＨ−Ｒ１に対するペプチドの親和性を著しく低減する。これらの特性が、従来のペプチドアンタゴニストの臨床上の可能性を制限している。アミノ末端切断ＰＴＨまたはＰＴＨｒＰペプチドのＦｃ複合は、それらの循環半減期を著しく増大するはずであり、これらのＦｃアンタゴニストへの充分な曝露によってＰＴＨ−Ｒ１の連続的なアンタゴニズムが得られる可能性がある。
【０１８６】
材料、方法、および結果
本発明者等は、［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃ）をクローン化、発現、精製した。本発明者等は、この化合物がマウスにおいて急性および慢性両方の高カルシウム血応答を阻止する能力を試験した。［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃの急性効果を評価するために、カルシウム血剤としてＰＴＨｒＰ−（１−３４）を用いた。ＰＴＨｒＰはＨＨＭの主たる媒介物質であるため、この研究はまた、高カルシウム血症誘発腫瘍のモデルとなる。簡潔には、血液イオン化カルシウム（ＢＩＣ）をベースラインで測定し、その後、マウスにビヒクル（ＰＢＳ）、またはＰＴＨｒＰ−（１−３４）（０．５ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射によって投与した。次にマウスを、様々な用量の［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃ）、またはビヒクル（ＰＢＳ）を用いて、１回、皮下によって処置した。ＰＴＨｒＰ−（１−３４）を投与したビヒクル処置マウスにおいて、一過性の高カルシウム血応答が認められた。カルシウム血応答のピークは投与後３時間で起こり、投与後少なくとも６時間まで持続した。１０ｍｇ／ｋｇの［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃ）は、ビヒクル処置に比べて、より急速にＰＴＨｒＰ誘発高カルシウム血を正常化した。投与量３０ｍｇ／ｋｇでは、ＰＴＨｒＰ−（１−３４）に対するカルシウム血応答が完全に遮断された（図６）。
【０１８７】
より慢性的な高カルシウム血症を阻止する［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃの能力を試験するために、本発明者等は、長時間作用カルシウム血剤としてＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃを用いた。この研究はまた、ＰＴＨレベルの持続的な上昇によって特徴づけられる疾病、原発性および続発性副甲状腺機能亢進症のモデルとなる。ビヒクル処置マウスにおいて、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ（３０ｍｇ／ｋｇ）の単回皮下注射は、正常なマウスにおいて強い高カルシウム血応答をもたらし、投与後２４時間で２．７５ｍｇ／ｄｌのレベルに達した（通常対照値は１．３５）。１０〜１００ｍｇ／ｋｇの［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃの単回皮下注射は、２４時間において、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃに対する高カルシウム血応答のピークを著しく低減した（図６）。
【０１８８】
結論として、本発明者等は、急性および慢性両方の高カルシウム血症動物モデルにおいて、［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃ）のアンタゴニスト活性を実証した。これらのモデルは、ＰＴＨ配列およびＰＴＨｒＰ配列の両方に基づくカルシウム血剤を用いた。これらのデータは、［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃ）、ならびに他のＦｃ複合ＰＴＨ−Ｒ１アンタゴニストが、副甲状腺機能亢進症、ＨＨＭ、および異常なＰＴＨ−Ｒ１シグナルを伴う他の疾病に対する有効な治療選択肢である可能性を示唆している。
【０１８９】
実施例３
Ｆｃ複合、天然Ｃ末端切断ＰＴＨフラグメントの骨形成特性
Ａ．ｃＡＭＰアッセイ
本発明者等は、ラットの骨芽細胞様ＲＯＳ１７／２．８細胞において、ｃＡＭＰ蓄積を刺激するＰＴＨ−Ｆｃ構築体の相対能力を試験した。ｃＡＭＰの蓄積を促進するために、培養物をホスホジエステラーゼ阻害剤ＩＢＭＸで処理した。次いで、培養物に１５分間、ビヒクル（ＰＢＳ）、または様々なＰＴＨ複合体を投与した。すべてのフラグメントに関して、用量依存ｃＡＭＰ蓄積が実証された。非Ｆｃ複合ＰＴＨ−（１−３４）は、ＰＴＨ−（１−３１）−Ｆｃ、およびＰＴＨ−（１−３０）−Ｆｃに比べて、わずかに有効であった（図７）。Ｆｃ複合ＰＴＨフラグメントが、骨芽細胞においてＡＣ経路を活性化する能力を維持していることを、これらのデータは実証している。
【０１９０】
Ｂ．マウスバイオアッセイ
次いで本発明者等は、マウスにおいて、ＰＴＨ−（１−３４）、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ、ＰＴＨ−（１−３１）−Ｆｃ、およびＰＴＨ−（１−３０）−Ｆｃの効果を試験した。４週齢の雄のマウスに、ビヒクル、またはＰＴＨフラグメントを、第０日、５日、１０日に皮下注射によって注入した。臨床化学のために、２４時間、４８時間、７２時間で末梢血を得た。第１５日にマウスを屠殺し、組織学のために椎骨、脛骨、および大腿骨を採取、骨密度測定のために脛骨を１つ採取した（末梢骨定量的ＣＴ、ｐＱＣＴ）。臨床化学の評価項目には、全血清カルシウム、血清アルカリホスファターゼ（ＡＰ、骨芽細胞活性のマーカー）、および血清酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ、破骨細胞活性のマーカー）が含まれる。各動物に関して、破骨細胞活性に対する骨芽細胞活性の相対指数として、ＡＰ：ＴＲＡＰの比率を計算した。ＡＰ：ＴＲＡＰの比率が高いほど、潜在的によりアナボリックな薬剤となる。臨床化学評価項目において著しい変化を実証した前の研究に基づいて、比較的に高い用量（最適アナボリック用量より１５倍高い）を選択した。骨密度へのアナボリック作用を実証するためにはより低い用量が必要とされ、アナボリック応答を得るためには抗吸収併用処置が必要とされる可能性が予期された。
【０１９１】
臨床化学の結果を図８に示す。血清カルシウムは、ＰＴＨ−（１−３４）３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（１．２ｍｇ／ｋｇ）の注射後、２４時間、４８時間、または７２時間で、著しく異なることはなかった。この結果は、通例血清カルシウムに一過性（１２時間）の増加をもたらす、非Ｆｃ複合ペプチドの短い半減期と矛盾しない。対照的に、等モル用量のＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃは、血清カルシウムに劇的で持続的な増加をもたらし、そのピークは２４時間であった。ＰＴＨ−（１−３１）−Ｆｃは、より有効なカルシウム血剤であり、ＰＴＨ−（１−３０）−Ｆｃは、３種のＦｃペプチドのなかでもっともカルシウム上昇作用が低かった（図８Ａ）。血清ＡＰ（骨芽細胞マーカー）は、ＰＴＨ−（１−３４）の投与によって変化しなかったが、３００ｎｍｏｌ／ｋｇのＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ、およびＰＴＨ−（１−３１）−Ｆｃによって、７２時間において著しく上昇した。ＰＴＨ−（１−３０）−ＦｃはＡＰの最大の上昇を示し、１０００ｎｍｏｌ／ｋｇの投与７２時間後にピークに達した（図８Ｂ）。血清ＴＲＡＰ（破骨細胞マーカー）は、ＰＴＨ−（１−３４）、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ、またはＰＴＨ−（１−３０）−Ｆｃによって著しく変化しなかったが、ＰＴＨ−（１−３１）−Ｆｃによって劇的に増加した（図８Ｃ）。算出したＡＰ：ＴＲＡＰ比は、ＰＴＨ−（１−３４）によって変化せず、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃによって徐々に増大した。低用量のＰＴＨ−（１−３１）−Ｆｃ（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）はＡＰ：ＴＲＡＰを増大し、一方、高用量（１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）はＡＰ：ＴＲＡＰを低減した。ＡＰ：ＴＲＡＰの最大の増加は、ＰＴＨ−（１−３０）−Ｆｃ（１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ）で得られた（図８Ｄ）。
【０１９２】
様々なＰＴＨ構築体の骨塩密度（脛骨近位骨幹端）への影響を図９に示す。第０日、５日、および１０日に注射したとき、１５日の研究の最後に、ＰＴＨ−（１−３４）（３００ｎｍｏｌ／ｋｇ）がわずかな（著しくない）アナボリック作用を有することが認められた。ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ（３００ｎｍｏｌ／ｋｇ）は骨密度に影響を及ぼさず、１００ｎｍｏｌ／ｋｇのＰＴＨ−（１−３１）−Ｆｃも影響を及ぼさなかった。より高用量のＰＴＨ−（１−３１）−Ｆｃは、著しい高カルシウム血関連毒性を引き起こし、これらの動物からｐＱＣＴの骨は採取しなかった。ＰＴＨ−（１−３０）−Ｆｃは、骨密度に最大の増加をもたらした。すべての用量でＢＭＤはコントロールより高かったが、明らかな逆用量−反応があり、１００ｎｍｏｌ／ｋｇでＰＴＨ−（１−３０）−Ｆｃは最大の作用を示し、１０００ｎｍｏｌ／ｋｇで最小の作用を示した（図９）。逆用量−反応は、用いた用量（臨床化学評価項目のために選択した）が最適アナボリック用量より５〜５０倍高かったことと矛盾しない。著しく血清カルシウムを増加しない低用量のＰＴＨ（またはＰＴＨ−Ｆｃ）は、アナボリック作用に最適である。Ｈｏｃｋ、Ｊ．Ｍ．（１９９２）、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｍｉｎ．Ｒｅｓ．７：６５〜７２を参照されたい。現時点の研究において最大のアナボリック作用を有する投与計画（１００ｎｍｏｌ／ｋｇのＰＴＨ−（１−３０）−Ｆｃ）は、著しく血清カルシウムを増加しなかった唯一のＰＴＨ−Ｆｃ処置であった（図８Ａ）。
【０１９３】
これらのデータは、Ｃ末端切断ＰＴＨ−Ｆｃペプチドの潜在的なアナボリック作用を実証している。Ｆｃ複合によって与えられた長い半減期は、Ｃ末端切断によるＡＣ／ｃＡＭＰの選択的刺激と合わせて、有効な骨吸収阻害剤が存在しないときのアナボリック作用を説明することができる。段階的なＰＴＨ−（１−３０）−ＦｃのＣ末端切断によって、ＰＴＨ−（１−３０）−Ｆｃのアナボリックプロファイルを維持または超過する、より短いフラグメントが明らかになることが予期される。これらのフラグメントは、骨芽細胞の刺激により選択的である可能性があり、カルシウム上昇作用が低く、したがってアナボリック療法に対してより広い治療窓を提供する可能性がある。
【０１９４】
実施例４
単剤療法としてのＰＴＨ−Ｆｃ処置
単剤療法としてのＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃの効力を成体マウスにおいて実証した。簡潔には、雄のＢＤＦ１マウス（４ヵ月齢）を、週に２回、様々な用量のＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ、またはビヒクル（ＰＢＳ）を用いて皮下注射によって処置した。他のマウスは、齧歯動物における骨量の増加に最適な治療計画である用量８０μｇ／ｋｇ／日（２０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日）のＰＴＨ−（１−３４）の皮下注射によって、毎日処置した（Ｍ．Ｇｕｎｎｅｓｓ−ＨｅｙおよびＪ．Ｍ．Ｈｏｃｋ、Ｍｅｔａｂ．Ｂｏｎｅ　Ｄｉｓ．＆Ｒｅｌ．Ｒｅｓ．５：１７７〜１８１、１９８４）。３週後、マウスを屠殺、脛骨の骨塩密度（ＢＭＤ）をｐＱＣＴによって分析した（図１０）。
【０１９５】
全脛骨ＢＭＤおよび界面質骨ＢＭＤは共に、ビヒクル処置コントロールに比べて、毎日のＰＴＨ−（１−３４）注射によって著しく増加した（図１、２元配置ＡＮＯＶＡ、ｐ＜０．０５）。週に２回のＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃの注射は、全ＢＭＤおよび海綿質骨ＢＭＤの両方において用量依存性の増加をもたらし、その増加は２つの最高用量において（５０および１５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）、ビヒクルまたは毎日のＰＴＨ−（１−３４）の効果に比べて著しく大きかった。脛骨における皮質骨ＢＭＤは、毎日のＰＴＨ−（１−３４）処置によって著しく高くなった。週に２回のＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃは、皮質骨ＢＭＤに用量依存性の増加をもたらし、その最高用量において、ビヒクルまたは１日１回ＰＴＨ−（１−３４）で処置したマウスで認められた増加に比べて著しく大きかった（ｐ＜０．０５）。
【０１９６】
週に２回のＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃはさらに、老齢卵巣摘出（ＯＶＸ）ラットにおいて、単剤療法として有効にＢＭＤを増加した。Ｓｐｒａｇｕｅ　Ｄａｗｌｅｙラットを３ヵ月齢で卵巣摘出し、１１ヶ月間骨を喪失させた。他のラットは偽手術をし、週に２回、ビヒクル（ＰＢＳ）で処置した。ＯＶＸラットを週に２回、ビヒクルまたはビスホスホネートＡＰＤ（パミドロネート、０．５ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射、あるいはＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ（５０ｎｍｏｌ／ｋｇ）またはＡＰＤ＋ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃで処置した。２エネルギーＸ線吸光光度法（ＤＥＸＡ）で週ごとにＢＭＤを求めた。処置４週後にラットを屠殺した。処置の開始時に、ＯＶＸラットは、ビヒクル処置ＯＶＸラットに比べて、分析したすべての骨格部位においてＢＭＤが著しく低減した（図１１、ｐ＜０．０５、２元配置ＡＮＯＶＡ）。ＡＰＤ単独は、ビヒクル処置ＯＶＸラットに比べて、いずれの骨格部位でもＢＭＤを著しく増加しなかった。ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ単独は、処置４週後に、大腿骨骨幹端においてＢＭＤを著しく増加した（ｐ＜０．０５）。ＰＴＨ＋ＡＢＤで処置したＯＶＸラットは、この部位で、より早い時期にＢＭＤの著しい増加を伴った（第３週）。ＡＰＤとＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃの組み合わせも、腰椎、および大腿骨幹端に著しいＢＭＤの増加をもたらした（ｐ＜０．０５）。ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ単独は、緩和で一過性の高カルシウム血応答を引き起こし、これは処置を継続したにもかかわらず、第１０日後に自然に消散した。ＡＰＤの併用投与は、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃのカルシウム上昇作用を完全に遮断した。
【０１９７】
これらのデータは、成体マウスおよび老齢ＯＶＸラットの両方において、単剤療法として用いられたとき、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃが有効なアナボリック剤であることを示唆している。本発明者等はまた、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃへの抗吸収剤（ＡＰＤ）の添加が、老齢ＯＶＸにおいてＢＭＤの類似の増加、あるいはより急速な増加を伴うことを実証した。ＡＰＤの併用投与はさらに、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃによって誘発された一過性の高カルシウム血応答を遮断し、これはＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃの治療指数が、有効な抗吸収剤の併用投与によって著しく向上され得ることを示唆している。
【０１９８】
本発明をここに充分に説明したが、本明細書に記載の本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更および修正を加えられることが当分野の技術者には明らかであろう。
【０１９９】
略語
ＡＣ　　　　アデニレートシクラーゼ
ＡＰ　　　　アルカリホスファターゼ
ＢＭＤ　　　骨塩密度
ｃＡＭＰ　　アデノシン３’，５’−サイクリック一リン酸
ＤＥＸＡ　　２エネルギーＸ線吸光光度法
ＨＨＭ　　　悪性の液性高カルシウム血症
ＯＰＧ　　　破骨細胞形成阻害因子
ＯＶＸ　　　卵巣摘出
ＰＢＳ　　　リン酸緩衝食塩水
ｐＱＣＴ　　末梢骨定量的ＣＴ
ＰＴＨ　　　副甲状腺ホルモン
ＰＴＨｒＰ　副甲状腺ホルモン関連タンパク質
ＴＲＡＰ　　酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＩｇＧ１抗体から誘導される可能性のある、代表的なＦｃ二量体を示す図である。
【図２】
本発明のさらなる化合物の構造を示す図である。
【図３】
本発明に用いることのできる、ヒトＩｇＧ１の代表的な核酸配列およびアミノ酸配列（それぞれ、配列番号１および２）を示す図である。
【図４】
ＰＴＨ−（１−３４）、およびＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃに対する正常なマウスのカルシウム上昇応答を示す図である。
【図５】
［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃが、正常なマウスのＰＴＨｒＰに対するカルシウム上昇応答を阻害することを示す図である。
【図６】
ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃによって誘発された慢性高カルシウム血症に対する［Ａｓｎ１０，Ｌｅｕ１１］ＰＴＨｒＰ−（７−３４）−Ｆｃの影響を示す図である。
【図７】
ＲＯＳ１７／２．８ラット骨芽細胞様細胞におけるｃＡＭＰの蓄積を示す図である。
【図８Ａ】
臨床化学に対する単回処置の影響を示す図であり、記載した化合物を単回皮下注射した後、３日間、毎日末梢血液を得た。８Ａは全血清カルシウムを示す図である。
【図８Ｂ】
臨床化学に対する単回処置の影響を示す図であり、記載した化合物を単回皮下注射した後、３日間、毎日末梢血液を得た。８Ｂはアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、骨芽細胞活性のマーカーを示す図である。
【図８Ｃ】
臨床化学に対する単回処置の影響を示す図であり、記載した化合物を単回皮下注射した後、３日間、毎日末梢血液を得た。８Ｃは酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）、破骨細胞活性のマーカーを示す図である。
【図８Ｄ】
臨床化学に対する単回処置の影響を示す図であり、記載した化合物を単回皮下注射した後、３日間、毎日末梢血液を得た。８ＤはＡＰ：ＴＲＡＰ比、骨芽細胞：破骨細胞相対活性の指数を示す図である。
【図９】
骨塩密度に対するＰＴＨ構築体の影響を示す図である。
【図１０】
脛骨、海綿質骨、皮質骨の骨塩密度（ＢＭＤ）に対する、ＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃ週２回投与、ＰＴＨ−（１−３４）毎日投与の影響を示す図である。
【図１１】
卵巣摘出（ＯＶＸ）老齢ラットにおける、ＢＭＤおよび血清カルシウムに対する週２回処置の影響を示す図である。
【図１２】
ＯＶＸカニクイザルへのＰＴＨ−（１−３４）−Ｆｃの単回皮下注射の影響を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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