(57)【要約】角質層（２１０）に孔（６００）を形成する方法は、角質層の表面領域に水性材料（１２３）を塗布し、その後、前記水性材料に音波および／または超音波放射（１１２）を当てることを含み、前記音波および／または超音波放射が、１０ＫＨｚから５ＭＨｚの範囲内の周波数を有し、かつ角質層の前記表面領域にキャビテーション・バブル（５００）を発生させるのに有効な、強度、期間、および角質層の前記表面領域からの距離を隔てて当てられ、キャビテーション・バブルが潰れてそのエネルギーが角質層に伝達され、孔の形成が引き起こされる。水性材料中に溶解した大きいサイズの分子（＞５００Ｄａ）は、治療的使用に適する流量で、これらの孔内を移動し、角質層を横切って、血管に到達する。
2004520852.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
角質層に孔を形成する方法であって、
角質層の表面領域に水性材料を塗布すること、および水性材料に音波および／または超音波放射を当てることを含み、前記音波および／または超音波放射が、１０ＫＨｚから５ＭＨｚの範囲の周波数を有し、かつ角質層の前記表面領域にキャビテーション・バブルを発生させるのに有効な強度、期間、および角質層の前記表面領域からの距離を隔てて当てられ、前記キャビテーション・バブルが潰れてそのエネルギーが角質層に伝達され、孔の形成を引き起こす方法。
【請求項２】
前記超音波の周波数が２０ＫＨｚである請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記超音波の強度が５Ｗ／ｃｍ２から５５Ｗ／ｃｍ２の範囲内である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記距離が１ミリメートルから１０ミリメートルの範囲内である請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記距離が４ミリメートルである請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記期間が、音波および／または超音波放射に連続的に曝される場合は約３０秒から１分の範囲内である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記期間が、５％のデューティサイクルで音波および／または超音波放射にパルス状態で曝される場合は１０分から２０分の範囲内である請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記音波および／または超音波放射が連続的である請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記音波および／または超音波放射がパルス状態である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記孔の直径が１マイクロメートルから１００マイクロメートルの範囲内である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
角質層を横切るように分子を輸送する方法であって、
前記分子を含有する水性材料を角質層の表面領域に塗布すること、
音波および／または超音波放射を前記水性材料に当てることを含み、前記音波および／または超音波放射が、１０ＫＨｚから５ＭＨｚの範囲の周波数を有し、かつ角質層の前記表面領域にキャビテーション・バブルを発生させるのに有効な強度、期間、および角質層の前記表面領域からの距離を隔てて当てられ、キャビテーション・バブルが潰れてそのエネルギーが角質層に伝達され、孔の形成が引き起こされ、
前記音波および／または超音波放射が、超音波ジェットを発生させるのに有効な、強度および角質層からの距離を隔てて当てられ、前記超音波ジェットにより前記分子を角質層全体に形成された前記孔内に通す方法。
【請求項１２】
前記分子の分子量が１８Ｄａから１００ｋＤａの範囲内である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記音波および／または超音波放射が連続的である請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記音波および／または超音波放射がパルス状態である請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記超音波の周波数が２０ＫＨｚである請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記超音波の強度が５Ｗ／ｃｍ２から５５Ｗ／ｃｍ２の範囲内である請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記距離が１ミリメートルから１０ミリメートルの範囲内である請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記距離が４ミリメートルである請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記期間が、音波および／または超音波放射に連続的に曝される場合は３０秒から１分の範囲内である請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記期間が、５％のデューティサイクルで音波および／または超音波放射にパルス状態で曝される場合は１０分から２０分の範囲内である請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記孔の直径が１マイクロメートルから１００マイクロメートルの範囲内である請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
前記分子が、鎮痛薬、麻酔薬、抗生物質、抗凝血剤、解毒剤、抗ヒスタミン剤、種々の抗感染薬、抗炎症性のステロイド系および非ステロイド系、抗腫瘍薬、抗ウイルス薬、食欲抑制剤、生物学的製剤、心・血管作動薬、避妊薬、中枢神経興奮薬、皮膚用製剤、糖尿病治療薬、酵素および消化薬、抗真菌剤、発毛剤、ヘルペス治療薬、ホルモン、免疫抑制薬、虫刺され予防薬、片頭痛治療薬、筋弛緩薬、麻薬拮抗薬、血漿蛋白分画、向精神薬、パーキンソン治療薬、アルツハイマー治療薬、エイズ治療薬、アンチワード、制癌剤、骨粗しょう症治療薬、遺伝物質からなる群から選択される薬物である請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
前記分子が、ビタミン、薬用化粧品、および薬用栄養剤からなる群から選択される活性成分である請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
角質層に孔を形成するための装置において、
水性材料が入っている容器であって、水性材料が角質層の表面領域に接触するように角質層の表面領域に取着可能な容器と、
前記容器内に沈められ、前記水性材料に音波および／または超音波放射を当てる超音波ホーンとを含み、前記音波および／または超音波放射が、１０ＫＨｚから５ＭＨｚの範囲の周波数を有し、かつ角質層の前記表面領域にキャビテーション・バブルを発生させるのに有効な強度、期間、および角質層の前記表面領域からの距離を隔てて当てられ、前記キャビテーション・バブルが潰れてそのエネルギーが角質層に伝達され、角質層に孔が形成される装置。
【請求項２５】
前記超音波の周波数が２０ＫＨｚである請求項２４に記載の装置。
【請求項２６】
前記超音波の強度が５Ｗ／ｃｍ２から５５Ｗ／ｃｍ２の範囲内である請求項２４に記載の装置。
【請求項２７】
前記距離が１ミリメートルから１０ミリメートルの範囲内である請求項２４に記載の装置。
【請求項２８】
前記距離が４ミリメートルである請求項２４に記載の装置。
【請求項２９】
前記期間が、音波および／または超音波放射に連続的に曝される場合は約３０秒から１分の範囲内である請求項２４に記載の装置。
【請求項３０】
前記期間が、５％のデューティサイクルで音波および／または超音波放射にパルス状態で曝される場合は１０分から１０分の範囲内である請求項２４に記載の装置。
【請求項３１】
前記音波および／または超音波放射が連続的である請求項２４に記載の装置。
【請求項３２】
前記音波および／または超音波放射がパルス状態である請求項２４に記載の装置。
【請求項３３】
前記孔の直径が１マイクロメートルから１００マイクロメートルの範囲内である請求項２４に記載の装置。
【請求項３４】
角質層を横切るように分子を輸送するための装置において、
水性材料および前記分子が入っている容器であって、水性材料および前記分子が角質層の表面領域に接触するように角質層の表面領域に取着されている容器と、
前記容器内に沈められ、前記水性材料に音波および／または超音波放射を当てる超音波ホーンとを含み、前記音波および／または超音波放射が、１０ＫＨｚから５ＭＨｚの範囲の周波数を有し、角質層の前記表面領域にキャビテーション・バブルを発生させるのに有効な強度、期間、および角質層の前記表面領域からの距離を隔てて当てられ、前記キャビテーション・バブルが潰れてそのエネルギーが角質層に伝達され、角質層に孔の形成が生じ、
前記音波および／または超音波放射が、超音波ジェットを発生させるのに有効な強度および角質層からの距離を隔てて当てられ、前記超音波ジェットにより前記分子を角質層全体に形成された前記孔内に通す装置。
【請求項３５】
前記超音波の周波数が２０ＫＨｚである請求項３４に記載の装置。
【請求項３６】
前記超音波の強度が５Ｗ／ｃｍ２から５５Ｗ／ｃｍ２の範囲内である請求項３４に記載の装置。
【請求項３７】
前記距離が１ミリメートルから１０ミリメートルの範囲内である請求項３４に記載の装置。
【請求項３８】
前記距離が４ミリメートルである請求項３４に記載の装置。
【請求項３９】
前記期間が、音波および／または超音波放射に連続的に曝される場合は約３０秒から１分の範囲内である請求項３４に記載の装置。
【請求項４０】
前記期間が、５％のデューティサイクルで音波および／または超音波放射にパルス状態で曝される場合は１０分から２０分の範囲内である請求項３４に記載の装置。
【請求項４１】
前記音波および／または超音波放射が連続的である請求項３４に記載の装置。
【請求項４２】
前記音波および／または超音波放射がパルス状態である請求項３４に記載の装置。
【請求項４３】
前記孔の直径が１マイクロメートルから１００マイクロメートルの範囲内である請求項３４に記載の装置。
【請求項４４】
前記分子が、鎮痛薬、麻酔薬、抗生物質、抗凝血剤、解毒剤、抗ヒスタミン剤、種々の抗感染薬、抗炎症性のステロイド系および非ステロイド系、抗腫瘍薬、抗ウイルス薬、食欲抑制剤、生物学的製剤、心・血管作動薬、避妊薬、中枢神経興奮薬、皮膚用製剤、糖尿病治療薬、酵素、消化薬、抗真菌剤、発毛剤、ヘルペス治療薬、ホルモン、免疫抑制薬、虫刺され予防薬、片頭痛治療薬、筋弛緩薬、麻薬拮抗薬、血漿蛋白分画、向精神薬、パーキンソン治療薬、アルツハイマー治療薬、エイズ治療薬、アンチワード、制癌剤、骨粗しょう症治療薬、遺伝物質からなる群から選択される薬物である請求項３４に記載の装置。
【請求項４５】
前記分子が、ビタミン、薬用化粧品、および薬用栄養剤からなる群から選択される活性成分である請求項３４に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連する同時係属出願の相互参照）
本願は、１９９９年１１月２日に出願されたＳＯＮＯＰＯＲＥＴＩＣ  ＣＡＵＳＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＰＯＲＥＳ  ＩＮ  ＳＫＩＮ  ＦＯＲ  ＴＲＡＮＳＤＥＲＭＡＬ  ＤＲＵＧ  ＤＥＬＩＶＥＲＹ  ＯＦ  ＬＡＲＧＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＥＳという名称の、米国仮出願第６０／１６３，１４６号の利益を請求するものであり、その内容を、参照により本明細書に特に組み込む。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、経皮薬物伝達のため皮膚に微細孔を形成するための方法および装置に関し、より詳細には、音波および／または超音波放射を使用して薬物およびその他の高分子量の分子を経皮伝達することに関する。
【０００３】
（発明の背景）
薬物の経皮伝達は、経口および注射による方法を含めた従来の伝達方法に優る、いくつかの利点を提供する。経皮伝達は、所定の薬物量を、制御された安定した速度でかつ均一な分布になるように局所領域に伝達し、非侵襲性で、便利であり、痛みが無い。
【０００４】
薬物の経皮伝達は、角質層、すなわち皮膚の最外層を通して薬物分子を輸送する必要がある。角質層（ＳＣ）は、任意の化学物質が身体に入る際に強固な化学障壁となり、分子量が５００Ｄａ（ダルトン）未満の小さい分子だけが、治療効果をもたらす速度で皮膚内に抵抗無く拡散することができる。ダルトンは、水素分子と比較した分子量の単位と定義される。
【０００５】
５００Ｄａよりも大きい分子の経皮伝達を容易にするいくつかの方法が提案されており、イオン導入法、電気穿孔法、エレクトロインコーポレーション、ソノフォレシス、およびケミカル・エンハンサを含めたＳＣを通した薬物伝達の速度が速くなる。
【０００６】
イオン導入法は、Ｕ．Ｓ．５，２２４，９２７に記載されているように、薬物分子を皮膚に送り込むのに低電界を利用する。しかし、イオン導入法はイオン性薬物および分子に限られ、Ｎ．Ｇ．Ｔｕｒｎｅｒ他のＰｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ−１４、１３２２〜１３３１、１９９７に記載されているように、分子量が約７ｋＤａよりも大きい分子には効果が無い。
【０００７】
電気穿孔法およびエレクトロインコーポレーション法は、Ｕ．Ｓ．５，０１９，０３４に記載されるように、皮膚に直接印加される１５０Ｖの高電圧電気パルスを利用する。電気パルスは、皮膚に孔を開けるのを助け、したがって、７ｋＤａを超える分子が皮膚に入ることができる。しかし、高電界を使用すると、安全性に関する問題が生じ、複雑な装置が必要である。さらに、薬物は、米国特許第５，６８８，２３３号に記載されるように二次的な手段によって孔内に通す必要があり、適用をさらに複雑にする。
【０００８】
ソノフォレシス法は、米国特許第５，８１４，５９９号および第５，９４７，９２１号に記載されるように、超音波を利用し、最大４８ｋＤａの分子を伝達できることが示されている。しかし、伝達の速度は極めて遅く、したがって実用的ではなくなる。
【０００９】
不飽和脂肪酸や飽和脂肪酸、それらのエステルやテルペンなどのケミカル・エンハンサは、Ｊ．Ｒ．Ｋｕｎｔａ他のＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６、１３６９〜１３７３、１９９７および米国特許第５，９４７，９２１号に記載されているように、エストラジオールやテストステロンなど分子量が大きい薬物、および塩基性薬物の塩酸塩などの極性薬物（例えばプロプラノロールＨＣｌ）がＳＣを通る流束を増大させることができる。しかし、ケミカル・エンハンサには処方に関する深刻な問題があり、皮膚刺激を引き起こしかつ経皮パッチを付着させて使用する際にその接着剤に不要な可塑化が生じる可能性があり、その有効性は、薬物のタイプおよびその付着方法に左右される。
【００１０】
任意のサイズの薬物分子を速い伝達速度で経皮伝達するための方法を提供することが有利と考えられる。
（発明の概要）
一般に、一態様では、本発明は、角質層に孔を形成する方法であって、角質層の表面領域に水性材料を塗布すること、およびこの水性材料に音波および／または超音波放射を当てることを含む方法を提供する。音波および／または超音波放射は、１０ＫＨｚから５ＭＨｚの範囲の周波数を有し、角質層の表面領域にキャビテーション・バブルを発生させるのに有効な強度、期間、および角質層の表面領域からの距離を隔てて当てられる。キャビテーション・バブルは潰れ、そのバブルのエネルギーが角質層に伝達されて、孔の形成を引き起こす。
【００１１】
本発明の実施に際し、以下の特徴の１つまたは複数を含めることができる。音波および／または超音波放射は、２０ＫＨｚの周波数と、５Ｗ／ｃｍ２から５５Ｗ／ｃｍ２の強度を有するものでよい。超音波は、角質層の表面積からある距離を隔てて、すなわち１ミリメートル〜１０ミリメートルの範囲の距離を隔てて当てることができる。一例では、その距離は４ミリメートルでよい。音波および／または超音波放射は連続的でもパルス状態でもよく、この放射に連続的に曝される場合は約３０秒から１分の範囲内の時間、また５％のデューティサイクルでパルス状態の放射に曝される場合は１０分から２０分の範囲内の時間、当てることができる。孔の直径は、１マイクロメートルから１００マイクロメートルの範囲内である。
【００１２】
一般に、別の態様では、本発明は、角質層を横切るように分子を輸送する方法であって、分子を含有する水性材料を角質層の表面領域に塗布することを含む方法を特徴とする。音波および／または超音波放射は、１０ＫＨｚから５ＭＨｚの範囲の周波数を有し、角質層の表面領域にキャビテーション・バブルを発生させるのに有効な強度、期間、および角質層の表面領域からの距離を隔てて当てられる。キャビテーション・バブルは潰れ、そのバブルのエネルギーが角質層に伝達されて、孔の形成を引き起こす。音波および／または超音波放射は、超音波ジェットを発生させるのに有効な、強度および角質層からの距離を隔てて当てられ、次いでこの超音波ジェットにより、分子は、角質層全体に形成された孔内を通過する。
【００１３】
本発明のこの態様の実施に際し、以下の特徴の１つまたは複数を含めることができる。分子は、１８Ｄａから１００ｋＤａの範囲内の分子量を有する。分子は、鎮痛薬、麻酔薬、抗生物質、抗凝血剤、解毒剤、抗ヒスタミン剤、種々の抗感染薬、抗炎症性のステロイド系および非ステロイド系、抗腫瘍薬、抗ウイルス薬、食欲抑制剤、生物学的製剤、心・血管作動薬、避妊薬、中枢神経興奮薬、皮膚用製剤、糖尿病治療薬、酵素、消化薬、抗真菌剤、発毛剤、ヘルペス治療薬、ホルモン、免疫抑制薬、虫刺され予防薬、片頭痛治療薬、筋弛緩薬、麻薬拮抗薬、血漿蛋白分画、向精神薬、パーキンソン治療薬、アルツハイマー治療薬、エイズ治療薬、アンチワード、制癌剤、骨粗しょう症治療薬、遺伝物質からなる群から選択される薬物でよい。分子は、ビタミン、薬用化粧品、および薬用栄養剤からなる群から選択される活性成分でよい。
【００１４】
一般に、別の態様では、本発明は、角質層に孔を形成するための装置であって、水性材料が入っている容器、すなわちこの水性材料が角質層の表面領域に接触するように角質層の表面領域に取着されている容器と、この容器内に沈められ、水性材料に音波および／または超音波放射を当てる超音波ホーンとを含む装置を特徴とする。音波および／または超音波放射は、１０ＫＨｚから５ＭＨｚの範囲の周波数を有し、角質層の表面領域にキャビテーション・バブルを発生させるのに有効な強度、期間、および角質層の表面領域からの距離を隔てて当てられる。キャビテーション・バブルは潰れ、そのバブルのエネルギーが角質層に伝達されて、孔の形成を引き起こす。
【００１５】
一般に、さらに別の態様では、本発明は、角質層を横切るように分子を輸送するための装置であって、水性材料および分子が入っている容器、すなわちこの水性材料および分子が角質層の表面領域に接触するように角質層の表面領域に取着されている容器と、この容器内に沈められ、水性材料に音波および／または超音波放射を当てる超音波ホーンとを含む装置を特徴とする。音波および／または超音波放射は、１０ＫＨｚから５ＭＨｚの範囲の周波数を有し、角質層の表面領域にキャビテーション・バブルを発生させるのに有効な強度、期間、および角質層の表面領域からの距離を隔てて当てられる。キャビテーション・バブルは潰れ、そのバブルのエネルギーが角質層に伝達されて、孔の形成を引き起こす。音波および／または超音波放射は、超音波ジェットを発生させるのに有効な、強度および角質層からの距離を隔てて当てられ、次いでこの超音波ジェットにより、分子は、角質層全体に形成された孔内を通過する。
【００１６】
この発明の利点には、以下の１つまたは複数が含まれる。本発明は、細分された開口を角質層に形成し、この皮膚を通して高分子量の薬物を血流内に伝達する方法を提供する。５００Ｄａよりも大きい分子量の薬物は、高電圧または皮膚刺激や経皮パッチ接着剤の可塑化などの化学的な副作用に関連する危険性が無い状態で、適切な体積用量を治療のため伝達するのに十分高い流量で短時間で移送される。この方法は、イオン・タイプの薬物に限定されず、複雑な装置を必要としない。
【００１７】
本発明の１つまたは複数の実施形態の詳細について、添付図面および以下の記述の中で述べる。本発明のその他の特徴、目的、および利点は、以下の好ましい実施形態の記述、図面、および特許請求の範囲から明らかにされよう。
【００１８】
様々な図面で、同じ参照番号および呼称は同じ要素を指している。
（好ましい実施形態の詳細な説明）
図１を参照すると、インビトロ・ソノポレーションおよび経皮薬物伝達を行うための装置１００が、超音波機器アセンブリ１１０と、Ｆｒａｎｚセル・アセンブリ１２０とを含む。超音波機器アセンブリ１１０は、電気ケーブル１１５によって超音波トランスデューサ１１３に接続された電源１１７を含む。電源１１７はトランスデューサ１１３にエネルギーを提供し、トランスデューサが電気エネルギーを超音波１１２に変換する。超音波１１２は、トランスデューサ１１３に取り付けられているホーン１１１によって水性媒体１２３中に伝達される。ホーン１１１は、水性媒体１２３中に浸水された先端１１４を有する。一例では、超音波機器アセンブリ１１０は、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．、Ｄａｎｂｕｒｙ、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔが製造している市販のＳｏｎｉｆｉｅｒモデル４５０である。ホーン１１１は、図２に示された、１５ｃｍの長さ１１８と、１ｃｍ２の先端断面積１１６とを有するテーパ形円筒体である。トランスデューサ１１３は、周波数が１０ＫＨｚ〜５ＭＨｚの範囲内にあり、強度が５Ｗ／ｃｍ２〜５５Ｗ／ｃｍ２の範囲内にある超音波１１２を発生する非合焦シングル・バンド・トランスデューサである。
【００１９】
図３を参照すると、一例では、超音波は、周波数が２０ＫＨｚで、強度１１９ｃが２０Ｗ／ｃｍ２のパルス１１９である。パルス幅１１９ａは０．５秒であり、１つのパルスの終わりと次のパルスの始めとの時間間隔１１９ｂは９．５秒であり、超音波の周期は１０秒である。一例では、皮膚は、５％デューティサイクルで２０分間（すなわち、各パルスが超音波エネルギーを０．５秒間提供して１２０パルス）超音波に露出され、その結果、計１分の連続超音波露出となる。
【００２０】
図１および４を参照すると、Ｆｒａｎｚセル・アセンブリ１２０はカスタムメードのものであり、ドナー・コンパートメント１２２、レシーバ・コンパートメント１２４、およびドナー・コンパートメントとレシーバ・コンパートメントの間に取り付けられた試料保持アセンブリ１４０を含む。一例では、ドナー・コンパートメント１２２とレシーバ・コンパートメントはどちらも、Ｋｒａｃｋｅｌｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．、Ａｌｂａｎｙ、ＮＹ  １２２０１から購入される市販のＯリング接合ガラス管からできている。ドナー・コンパートメント・ガラス管１３０は、６ｃｍの長さ１３１と、第１の端部１３３と、第２の端部１３４とを有し、両端部が、１．６ｃｍの直径１３２をもつ開口を有する。第２の端部１３４はフランジ１３５を有し、溝１３６がＯリング１３７を収容する。レシーバ・コンパートメント１２４は、３ｃｍの長さ１４８をもつ円筒形本体１４２を有する。本体１４２は、第１の端部１４３と、第２の端部１４４と、第２の円筒形管１４６に接続された側部ポート１４５とを有する。レシーバ・コンパートメント１２４の第１の端部１４３は、フランジ１４７を有し、かつドナー・コンパートメント１２２の第２の端部１３４の開口と同じ直径１４９をもつ開口を有する。第２の端部１４４は閉じている。ドナー・コンパートメントは、開端部１３４と１４３が位置合わせされるようにレシーバ・コンパートメントの上に配置される。膜１５２上に支持される人の死体の表皮１５０の試料は、ドナー・コンパートメント１２２の第２の端部１３４のフランジ１３５と、レシーバ・コンパートメント１２４の第１の端部１４３のフランジ１４７との間に取り付けられる。クランプ１５５が、２つの・コンパートメント１２２と１２４を一体に保持する。クランプ１５５は、ばね１５６によってフランジ１３５および１４７に圧力を加える。加えられた圧力がＯリング１３７を溝１３６内に押し込み、それにより耐液性封止が得られる。支持膜は、Ｄｕ  Ｐｏｎｔ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ  １９８９８によって製造されるスパンボンド不織布オープン・メッシュ材料である。膜を使用して、真皮による表皮のインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）支持をシミュレートし、起こり得る皮膚試料の損傷を低減する。
【００２１】
図５を参照すると、人の皮膚２００の断面は、上層２１０と、中間層２２０と、下層２３０とを含む。上層２１０は角質層と呼ばれ、厚さ約１５マイクロメートルであり、図６に示される脂質二重層２１２によって取り囲まれた角化蛋白質２１１の複数の層からなる。角化蛋白質２１１またはケラチノサイトは、ケラチン繊維で充填された死んだ細胞である。各ケラチノサイトが、直径が約１５〜２０マイクロメートルで、厚さが１マイクロメートルの領域を有するプレート状構造を有する。ケラチノサイトは脂質によって取り囲まれ、隣接して配置されて層を形成し、この層は、脂質二重層２１２によって互いに離隔されている。脂質二重層２１２は、厚さが約５０ナノメートルである。角質層のこの構造は、「れんが壁」に似ており、ケラチノサイトが「れんが」を構成し、脂質が、「れんが」を一体に保持する「セメント」を構成する。この非常に秩序だった構造は、角質層を、多くの薬物に対して不浸透性にする。中間層２２０は、角質層の下に位置し、生存表皮と呼ばれる。生存表皮２２０は、生きている細胞からなり、親水性を有する。生存表皮の下に位置する下層２３０は真皮である。生存表皮２２０と真皮２３０との界面に、毛管血管系２４０の末端がある。
【００２２】
角質層の試料は、死後の人の皮膚から抽出される。一例では、死後の人の皮膚は、Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ、Ｌａｎｓｉｎｇ、ＭＩ  ４８９０９から提供された７１歳の匿名の成人の大腿部から得られる。皮膚試料は、冷凍器内で−５０℃で保管し、死後数週間のうちに使用する。角質層および表皮の一部を、熱剥離法によって真皮から分離する。熱剥離を行うために、皮膚を解凍し、食塩溶液の浴内に配置する。この食塩溶液は、塩化ナトリウム濃度が９ｇ／リットルであり、温度が５５℃である。皮膚試料を、２分間溶液中に維持し、次いで取り出して、温度が２３℃の同様の食塩溶液中に配置する。次いで、角質層の外層、および生存表皮の一部を、人の指を使って、皮膚試料から手作業で分離する。角質層試料は、４０〜５０マイクロメートルの範囲内の厚さを有する。
【００２３】
図４に戻ると、角質層１５０の試料は、試料ホルダ・アセンブリ１４０内に配置される。試料アセンブリ１４０は、Ｆｒａｎｚセル１２０のドナー・コンパートメント１２２とレシーバ・コンパートメント１２４の間に配置されている。次いで、Ｆｒａｎｚセル１２０が組み立てられ、ドナー・コンパートメント１２２に、ｐＨ＝７．４の２５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液中の２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−ＦＩＴＣ水溶液１２３が充填される。ＨＥＰＥＳは、Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］を意味し、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ  ６３１７８−９９１６から得られる。２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−ＦＩＴＣは、フルオレセインイソチオシアネートでタグ付けされたオクタ−ｌ−リジンを指し、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ  ２０８７７から得られる。レシーバ・コンパートメント１２４には、ｐＨ＝７．４で緩衝された２５ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液１２５が充填される。超音波ホーンの先端１１４は、ドナー・コンパートメントの溶液１２３中に浸水されており、角質層試料の上面１５１の上方に、事前設定された距離１８０で維持される。先端１１４と角質層上面１５１との距離１８０は、１〜１０ミリメートルの間で変化する。電源１１７がオンに切り換えられ、トランスデューサ１１３が、周波数２０ＫＨｚで交互に正および負となる圧力サイクルを有する超音波圧力波１１２を発生する。浸水された超音波先端１１４は、ドナー・コンパートメントの溶液１２３中で超音波を伝達する。超音波は、水溶液１２３中を伝播して、角質層試料の上面１５１に衝突する。超音波の強度は、５〜５５Ｗ／ｃｍ２の間で変化し、熱電対１６０を用いて熱量測定法によって測定される。熱電対１６０は、銅とコンスタンタンの２つの１００μｍ直径ワイヤの接合点１６２を有し、人の死体の皮膚１５０に固定されている。熱電対信号は、Ｋｅｉｔｈｌｅｙ  Ｍｏｄｅｌ  １９６デジタル・マルチメータを使用して測定される。
【００２４】
超音波の全エネルギーが熱に変換されると仮定すると、超音波強度は、以下の式から計算される。
超音波強度＝４．１９ｃｐ＊ｍ＊ΔＴ／（Ａ＊ｔ）
ここで、ｃｐは水の熱容量であり、１ｃａｌ／ｇ℃であり、ｍは、超音波に露出された水溶液の質量であり、一例では４ｇであり、ΔＴは、５秒間の超音波露出時間中の温度上昇であり、ｔは超音波露出時間であり、Ａは超音波放出面積であり、一例では１ｃｍ２であり、４．１９は、「カロリー」から「ジュール」への単位変換係数である。温度上昇ΔＴは、デジタル・マルチメータを用いてミリボルト（ｍＶ）単位で測定され、次いで、０．０３９で割ることによって摂氏（℃）に変換される。すなわち、ΔＴ＝ｍＶ／０．０３９である。
【００２５】
角質層試料は、所定の時間にわたって超音波に露出される。一例では、露出時間は、パルス超音波の５％デューティサイクルで２０分であり、または連続超音波で計１分である。
【００２６】
図７を参照すると、２０ＫＨｚ超音波に露出された人の皮膚の概略断面図が、角質層２１０の上面２１５でのキャビテーション５００の形成を示している。キャビテーションは、超音波圧力波の負の圧力サイクル中に水溶液中に形成される小さなガス空洞である。これらの小さなガス空洞は引き続き成長し、後の圧力サイクルを通じて高いエネルギーを蓄積して、最終的には臨界サイズおよびエネルギーに達し、その後、崩壊する。これらの空洞は、角質層の上面１５１付近で崩壊すると、その高いエネルギーを角質層に伝達し、脂質二重層２１２の破断、または角質層内での孔の形成をもたらす。キャビテーションは、空気ポケットが存在する角質層内部で発生する場合もある。
【００２７】
図８を参照すると、２０ＫＨｚ超音波に露出された角質層２１０の概略断面が、超音波によって生成される孔６００を示している。この孔は、拡大共焦光顕微鏡検査で見ることができる。
【００２８】
図９を参照すると、超音波に露出する前の角質層資料の上面１５１の光学的画像が、角化細胞２１１のよく秩序立てられた細胞構造を示している。周波数が２０ＫＨｚで、強度が２０Ｗ／ｃｍ２の超音波に露出した後の同じ試料を図１０に示す。孔６００（黒い領域）を倍率４０倍で見ることができる。超音波露出後、１〜２時間、観察が行われる。孔６００は、１〜１００マイクロメートルの範囲内の直径を有する。
【００２９】
特定の周波数、強度をもつ、所定の距離での音波および／または超音波放射線への角質層の露出中に孔が形成されることを利用して、薬物の経皮伝達を行う。図１および図４に戻ると、Ｆｒａｎｚセル１２０のドナー・コンパートメント１２２に、４ミリリットルの０．１０６４ｍＭのオクタ−ｌ−リジン−４−ＦＩＴＣが充填される。オクタ−ｌ−リジン−４−ＦＩＴＣは、分子サイズが２．５ｋＤａであり、４つのフルオレセインイソチオシアネート分子が取り付けられている。レシーバ・コンパートメント１２４には、ｐＨ７．４を有する８ミリリットルの２５ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液が充填される。磁気攪拌装置１２６が、５００ｒｐｍの速度でＨＥＰＥＳ溶液を連続的に攪拌する。溶液１２３と１２５はどちらも、１８Ｍオーム／ｃｍよりも大きい抵抗率を有する脱イオン水を用いて調製される。総面積８ｃｍ２を有する角質層試料１５０が試料ホルダ１４０内に取り付けられる。一例では、超音波に露出される角質層試料の表面積は２．５ｃｍ２である。試料の構造的完全性は、皮膚抵抗を測定することによって保証される。皮膚抵抗は、皮膚全体に１．５Ｖの電圧および１Ｈｚを加えることによって測定される。５０Ｋオームよりも大きい抵抗を有する試料のみが使用される。超音波ホーン１１１は、あらかじめ設定された角質層試料上面からの距離だけ、ドナー溶液１２３中に浸水される。一例では、超音波ホーン１１１は、角質層試料の上面から１３ミリメートルの距離１８０にあらかじめ設定されている。角質層１５１の上面からの超音波先端１１４の距離１８０は、キャリパを用いて測定される。２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−４−ＦＩＴＣ溶液の温度は、２５℃〜３０℃の間で維持される。
【００３０】
図１１を参照すると、人の角質層試料を介する２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−４−ＦＩＴＣのフラックスが、角質層試料１５０の上面１５１からの超音波先端１１４の距離１８０に応じて示されている。試料は、周波数が２０ＫＨｚであり、５％デューティサイクルでパルス強度が２０Ｗ／ｃｍ２である音波および／または超音波放射線に露出される。角質層試料にわたって移送されるオクタ−ｌ−リジン−４−ＦＩＴＣの量は、レシーバ溶液１２５の蛍光測定によって求められる。蛍光測定は、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｆ−２０００蛍光分光器を用いて行われる。励起波長は４９７ｎｍであり、フルオレセイン・タグ付き２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−４−ＦＩＴＣの放出は５２２ナノメートルである。０．８ミリリットルのレシーバ溶液１２５の試料が、マイクロピペットを用いて側部ポート管１４６を介して収集され、同量のＨＥＰＥＳ溶液がレシーバ溶液に再び加えられる。次の溶液試料の蛍光測定は、希釈係数に関する補正がなされる。
【００３１】
角質層試料を介する２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−４−ＦＩＴＣのフラックスは、まず、試料の上面１５１からの超音波先端１１４の距離が増加するにつれて増大する（領域Ｉ）。この値は、２〜４ミリメートルの距離で最大値に達し（領域ＩＩ）、その後、距離の増加と共に減少する（領域ＩＩＩ）。角質層の表面１５１からの超音波先端１１４の距離が約４ミリメートルのとき、オクタ−ｌ−リジン−４−ＦＩＴＣの分子移送が最適になる。本発明者は、超音波先端１１４が皮膚試料１５０の上面１５１に非常に近い領域Ｉでは、皮膚の表面でのキャビテーション・プロセスによる超音波ジェット１７０（図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃに示される）の高い干渉により皮膚の孔形成が小さくなると仮説を立てている。距離が増大するにつれ、この干渉が低減し、それによりキャビテーション活動が高まり、皮膚の効果的な穿孔が得られる。次いで、超音波ジェット１７０は、角質層全体にわたって、孔を介してレシーバ・コンパートメント内に２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−４−ＦＩＴＣ溶液を打ち込む（領域ＩＩ）。距離のさらなる増大は、超音波ジェットの打込み効果を低減させ、２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−４−ＦＩＴＣの量が減少する（領域ＩＩＩ）。図１１Ａ、１１Ｂ、および１１Ｃは、それぞれ約１８Ｗ／ｃｍ２、３７Ｗ／ｃｍ２、および５５Ｗ／ｃｍ２の超音波強度での超音波ジェット１７０を示す。超音波ジェット１７０は、ドナー・コンパートメント１２２内に光１６５を送ることによって視覚化される。
【００３２】
図１２を参照すると、角質層の試料を介する２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−４−ＦＩＴＣのフラックスが、超音波強度の関数として示されている。超音波強度は、５％のデューティサイクルで、２０ＫＨｚパルス励起に関して５〜５５Ｗ／ｃｍ２の間で変化する。超音波先端１１４は、角質層試料１５１の上面から２ミリメートルの距離で維持される。最適な分子移送は、超音波強度が約１８Ｗ／ｃｍ２のときに生じる。
【００３３】
図１３を参照すると、角質層の試料を介する２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−４−ＦＩＴＣの累積フラックスが、２０ＫＨｚの周波数、５％デューティサイクル、３７Ｗ／ｃｍ２をもち、試料表面から４ｍｍの距離での超音波励起に対する露出時間に応じて示される。領域Ｉでは、超音波出力がオンであり、露出時間が増大するにつれて、孔が形成され、角質層をわたって移送する２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−４−ＦＩＴＣの分子の数が増大する。その後、領域ＩＩで、超音波出力がオフに切り換えられ、角質層をわたる分子の移送が実質的に観察されなくなる。最後に、領域ＩＩＩで、超音波出力が再びオンに切り換えられ、露出時間が増大するにつれて角質層をわたる分子の移送の増大が観察される。これらの観察に基づき、本発明者は、角質層をわたる分子の移送が、角質層内の一過性微細孔の形成と、超音波ジェットの打込み力との両方によるものであると結論付ける。
【００３４】
表１を参照すると、２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−４−ＦＩＴＣの分子と、音波および／または超音波放射線に露出された２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−４−ＦＩＴＣの分子とに関する角質層の浸透率が、ソノポレーションおよび超音波ジェット形成をもたらす本発明の超音波条件に関して要約されている。浸透率は、フィックの拡散式を使用してフラックス・データから計算される。フィックの式によれば、
Ｊ＝ＰｘＣ
であり、ここで、Ｊは図１３の累積フラックス曲線の傾斜であり、Ｐは試料の浸透率であり、Ｃは、ドナー溶液１２３中の２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−ＦＩＴＣ分子の濃度である。一例では、Ｃが０．１ｍＭである。５１ｋＤａポリ−ｌ−リジンおよび２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−ＦＩＴＣに関する対応する計算値が、ソノフォレーシス薬物伝達に関する従来技術の結果と共に表１に示されている。本発明による５１ｋＤａポリ−ｌ−リジン−ＦＩＴＣの浸透率が、ソノフォレーシスによって得られる浸透率の約１０００００倍であることが観察される。
【００３５】
【表１】
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【００３６】
図１４および１５を参照すると、それぞれ音波および／または超音波放射線を用いた場合、または用いなかった場合の、０．１ｍＭの２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−ＦＩＴＣ溶液に露出された人の表皮試料の断面の共焦顕微鏡検査画像が、ＦＩＴＣ蛍光色素の４８８ナノメートルのレーザ光励起の下で得られている。画像は、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡが製造するＬａｓｅｒＳｈａｒｐ  ＭＲＣ  １０２４  Ｃｏｎｆｏｃａｌ  Ｌａｓｅｒ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅを使用して得られる。音波および／または超音波放射線に露出された試料では、角質層２１０と生存表皮２２０の両方が特性ＦＩＴＣ蛍光を放出し、一方、音波および／または超音波放射線に露出されていない試料では、角質層２１０の上面のみが特性ＦＩＴＣ蛍光を放出する。これは、２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−ＦＩＴＣの経皮移送が超音波露出下でのみ生じることを示唆している。超音波によって生成される微細孔６００は、表皮の永久外乱ではなく、超音波露出が除去されたときに閉じる一過性および弾性の開口であり、角質層の表面に孔が存在していたことを表す印をほんのわずかに残すだけで消える。
【００３７】
他の実施形態も、本発明の範囲内にある。例えば、ソノポレーションおよび分子の経皮伝達の上述した方法は、２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−ＦＩＴＣ分子に関連して記述したが、本発明は、鎮痛剤、麻酔剤、抗生物質、凝固阻止剤、解毒薬、抗ヒスタミン剤、種々の抗感染薬、抗炎症ステロイドおよび非ステロイド、抗腫瘍剤、抗ウィルス剤、食欲抑制剤、生物学的製剤、心臓血管薬、避妊薬、中枢神経系刺激薬、外皮用剤、糖尿病薬、酵素消化薬、抗真菌剤、毛髪成長刺激薬、ヘルペス治療薬、ホルモン剤、免疫抑制剤、抗昆虫刺傷薬、抗偏頭痛薬、筋弛緩剤、抗麻酔薬、血漿蛋白分画剤、向精神薬、抗パーキンソン、アルツハイマー、エイズ、アンチウォーズ（ａｎｔｉ−ｗａｒｄｓ）、抗癌、ビスフォスフォネートなどの抗骨粗鬆症薬、および遺伝物質からなる群から選択される薬物を含めた任意のサイズを有する任意の分子を移送するために使用することができることを理解されたい。ビタミン、美容食品、および栄養補給食品からなる活性成分の群から選択される分子を、本発明のソノポレーション法を使用して角質層を介して移送することもできる。
【００３８】
音波および／または超音波放射線は、連続であっても、パルスであってもよく、周波数が１ＫＨｚ〜５ＭＨｚの範囲内にある。パルス音波および／または超音波放射線は、試料の温度を上昇させないという利点を有し、連続する超音波は、短い治療時間で済むという利点を有する。音波および／または超音波放射線は、連続露出では約３０秒〜１分の範囲内の時間間隔にわたって適用することができ、５％デューティサイクルでのパルス露出では、１０分〜２０分の範囲にわたって適用することができる。
【００３９】
本発明の多くの特徴および利点は詳細な明細書から明らかであり、したがって、頭記の特許請求の範囲により、本発明の真の精神および範囲に従う上述の装置の全てのそのような特徴および利点をカバーできるものとする。さらに、当業者には多数の修正および変更が容易に想起されるので、本明細書で上述した正確な構成および動作に本発明を限定するのは望ましくない。さらに、本発明の方法および装置、ならびに医療適用例で使用される関連装置および方法は、性質上、複雑になる傾向があり、動作パラメータの適切な値を実験により求めることによって、または所与の適用例に関する最良の設計に到達するようにコンピュータ・シミュレーションを行うことによってしばしば最良に実施される。したがって、他の実施形態も頭記の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】
皮膚のインビトロ・ソノポレーション用の装置の概略図である。
【図２】
超音波ホーンの概略図である。
【図３】
パルス超音波を示すグラフである。
【図４】
図１の試料ホルダ・アセンブリの断面図である。
【図５】
人の皮膚の試料の概略断面図である。
【図６】
図５の角質層領域Ａの詳細図である。
【図７】
音波および／または超音波放射線に露出中の人の皮膚の試料の概略断面図である。
【図８】
音波および／または超音波放射線に露出した後の人の皮膚の試料の概略断面図である。
【図９】
超音波に露出する前の倍率４０倍での角質層試料の光学的画像である。
【図１０】
本発明による超音波に露出した後の倍率４０倍での角質層試料の光学的画像である。
【図１１】
図１１は、角質層（ＳＣ）試料の上面からの超音波ホーンの距離に応じた、ＳＣ試料を介する２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−ＦＩＴＣのフラックスを示すグラフである。図１１Ａは、超音波強度１８Ｗ／ｃｍ２での超音波ジェットの概略図である。図１１Ｂは、超音波強度３７Ｗ／ｃｍ２での超音波ジェットの概略図である。図１１Ａは、超音波強度５５Ｗ／ｃｍ２での超音波ジェットの概略図である。
【図１２】
超音波強度に応じた、角質層（ＳＣ）試料を介する２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−ＦＩＴＣのフラックスを示すグラフである。
【図１３】
超音波露出時間に応じた、角質層（ＳＣ）試料を介する２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−ＦＩＴＣのフラックスを示すグラフである。
【図１４】
２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−ＦＩＴＣに露出された人の表皮の断面の共焦顕微鏡検査画像である。
【図１５】
２．５ｋＤａオクタ−ｌ−リジン−ＦＩＴＣと、音波および／または超音波放射線とに露出された人の表皮の断面の共焦顕微鏡画像である。
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520852.tif 000052
2004520852.tif 000053
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520852.tif 000054
2004520852.tif 000055
【国際調査報告】
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