(57)【要約】【課題】ネイティブな宿主タンパク質（エクステイン）において、または相同なエクステインにおいてインテインのスプライシングを制御する薬剤についてスクリーニングするための、選択系および方法を提供する。【課題を解決する手段】本発明によれば、タンパク質スプライシングを阻害するかまたは活性化する薬剤をスクリーニングするためのポジティブな遺伝子選択系が提供され、これは：標的酵素または野生型標的酵素の薬物耐性の形態のいずれかをコードする染色体遺伝子、および薬物との相互作用の際に優性的に細胞障害性である標的酵素の薬物感受性の形態、または標的酵素の優性的に細胞障害性の形態のいずれかをコードするプラスミドに保有される遺伝子を含む宿主細胞を包含する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質スプライシングを阻害又は活性化する薬剤をスクリーニングするための、その天然の又は相同な改変可能なエクステイン情況（ｃｏｎｔｅｘｔ）においてネイティブなインテインを含む前駆体を用いたポジティブな遺伝子選択系であって、該選択系が：
（１）標的酵素の非選択可能な形態をコードする第１の遺伝子を含む宿主細胞、及び、
（２）予め決定された選択条件下での相互作用の際に優性的に細胞障害性である該標的酵素の選択可能な形態をコードする第２の遺伝子であって、該第２の遺伝子はインテインを含み、ここで所与の薬剤による該標的酵素の該選択可能な形態の阻害又は活性化は該宿主細胞の生存能を影響するもの、
を含有してなる選択系。
【請求項２】
所与の薬剤による標的酵素の選択可能な形態の活性化が宿主細胞の死を生じる、請求項１に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項３】
所与の薬剤による標的酵素の選択可能な形態の阻害が宿主細胞の生存能を生じる、請求項１に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項４】
宿主細胞が標的酵素の薬物耐性形態をコードする第１の遺伝子、及び該薬物との相互作用の際に優性的に細胞障害性である標的酵素の薬物感受性の形態をコードする第２の遺伝子を含む、請求項１に記載のポジティブな遺伝子系。
【請求項５】
第１の遺伝子が標的酵素の野生型の形態をコードし、第２の遺伝子が該標的酵素の優性な細胞障害性の形態をコードする、請求項１に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項６】
エクステインのサイレント変異の不在下で、インテインが、標的酵素の薬物感受性の形態に挿入されるインテイン、及び変異されたネイティブな又は相同なエクステインにおける天然のインテインからなる群から選択され、該変異が該薬物との相互作用の際にエクステインを細胞障害性にする、請求項４に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項７】
薬剤がインビボ・ペプチド・ライブラリー又はその誘導体を含む、請求項１に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項８】
インテインがＭ．ｘｅｎｏｐｉ　ＧｒｙＡインテインを含み、相同なエクステインがＥ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡを含み、及び宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉを含む、請求項４に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項９】
標的酵素の薬物耐性の形態が、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡのＳｅｒ８３変異体である、請求項８に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項１０】
ペプチド・ライブラリーがチキンα−スペクトリンのフラグメントにおけるコンビナトリアル・ペプチド・ライブラリーを含む、請求項７に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項１１】
エクステインにおけるサイレント変異の不在下で、インテインが標的酵素の細胞障害性の形態に挿入されるインテイン、及び変異されたネイティブな又は相同なエクステインにおける天然のインテインからなる群より選択され、該変異されたネイティブなエクステインが細胞障害性である、請求項５に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項１２】
薬剤がインビボ・ペプチド・ライブラリー又はその誘導体を含む、請求項１１に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項１３】
天然のインテインがＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＤｎａＢインテインであり、変異されたネイティブなエクステインがＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｒ２３１Ｃ変異体であり、宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉである、請求項１１に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項１４】
インビボ・ペプチド・ライブラリーがチキンα−スペクトリンのフラグメントにおけるコンビナトリアル・ペプチド・ライブラリーを含む、請求項１３に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項１５】
タンパク質スプライシングを阻害する薬剤についてスクリーニングする方法であって、該方法が以下の工程：
（ａ）インテインを含む優性的に細胞障害性のタンパク質をコードする遺伝子を含む宿主細胞を含んだポジティブな遺伝子選択系を作製する工程；及び、
（ｂ）試験薬剤の存在下で工程（ａ）の宿主細胞を培養する工程であって、ここで該細胞障害性のタンパク質のスプライシングの阻害が該宿主細胞の生存能を生じる工程、
を含有してなる方法。
【請求項１６】
薬剤がタンパク質又はその部分として宿主細胞内に発現され、及び該薬剤が生存する宿主からの該薬剤をコードする遺伝子によって同定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記工程（ａ）のポジティブな選択系がポジティブな遺伝子選択を含み、宿主細胞が標的酵素の薬物耐性の形態をコードする第１の遺伝子及び該薬物との相互作用の際に優性的に細胞障害性である標的酵素の薬物感受性の形態をコードする第２の遺伝子を含み、前記工程（ｂ）はさらに薬物の存在下で工程（ａ）の該宿主細胞を培養することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程（ａ）のポジティブな遺伝子選択系が標的酵素の野生型形態をコードする第１の遺伝子、及び該標的酵素の優性な細胞障害性の形態をコードする第２の遺伝子を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記工程（ａ）の宿主細胞がインビボ・ペプチド・ライブラリー又はその誘導体を発現し、前記工程（ｂ）の試験薬剤が該インビボ・ペプチド・ライブラリー又はその誘導体を含む、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
インビボ・ペプチド・ライブラリーがチキンα−スペクトリンのフラグメントにおけるコンビナトリアル・ペプチド・ライブラリーを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質スプライシングを活性化する薬剤をスクリーニングするための方法であって、該方法が：
（ａ）優性的に細胞障害性のタンパク質をコードする遺伝子を含んだ宿主細胞を含むポジティブな選択系を作製する工程であって、該遺伝子が不活性なインテインを含む工程；及び、
（ｂ）個々の試験薬剤の存在下で工程（ａ）の宿主細胞を培養する工程であって、該細胞障害性のタンパク質のスプライシングの活性化が宿主細胞の死を生じる工程、
を含有してなる方法。
【請求項２２】
薬剤がタンパク質又はその部分として制御可能に宿主細胞内に発現され、該薬剤が該薬剤の発現が活性化されなかった該宿主細胞の平行なサンプルにおける該薬剤をコードする遺伝子の同定によって同定される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記工程（ａ）のポジティブな選択系がポジティブな遺伝子選択系を含み、宿主細胞が標的酵素の薬物耐性の形態をコードする第１の遺伝子及び該薬物との相互作用の際に優性的に細胞障害性である標的酵素の薬物感受性の形態をコードする第２の遺伝子を含み、前記工程（ｂ）はさらに薬物の存在下で工程（ａ）の該ポジティブな遺伝子選択系を培養することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記工程（ａ）のポジティブな選択系がポジティブな遺伝子選択系を含み、標的酵素の薬物耐性の形態がＥ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡのＳｅｒ８３変異体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記工程（ａ）の宿主細胞がインビボ・ペプチド・ライブラリー又はその誘導体を発現し、前記工程（ｂ）の試験薬剤が該インビボ・ペプチド・ライブラリー又はその誘導体を含む、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２６】
インビボ・ペプチド・ライブラリーがチキンα−スペクトリンのフラグメントにおけるコンビナトリアル・ペプチド・ライブラリーを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
タンパク質スプライシングを阻害する薬剤をスクリーニングするためのポジティブな遺伝子選択系であって、該選択系が：
（１）細胞生存能のために必要とされる標的酵素の制御可能な形態をコードする第１の遺伝子を含む宿主細胞、及び、
（２）該標的酵素の発現される形態をコードする第２の遺伝子であって、該第２の遺伝子はインテインを含み、所与の薬剤による該標的酵素のスプライシングの阻害が該標的酵素の該制御可能な第１の遺伝子の発現を許容しない条件下で該宿主細胞の減少された生存能又は死を生じるもの、
を含有してなるポジティブな遺伝子選択系。
【請求項２８】
標的タンパク質の制御可能な形態が、薬物感受性の標的タンパク質、インデューサー感受性の標的タンパク質、温度感受性の標的タンパク質、及び制御可能なプロモーターに作動可能に連結された標的タンパク質からなる群より選択される、請求項２７に記載の選択系。
【請求項２９】
インテインが、標的酵素の相同なエクステインに挿入された外来インテイン、及びネイティブなエクステインにおける天然のインテインからなる群より選択される、請求項２７に記載の選択系。
【請求項３０】
タンパク質スプライシングを活性化する薬剤をスクリーニングするためのポジティブな遺伝子選択系であって、該選択系が：
（１）細胞生存能に必要とされる標的酵素の制御可能な形態をコードする第１の遺伝子を含む宿主細胞、及び、
（２）該標的酵素の発現された形態をコードする第２の遺伝子であって、該第２の遺伝子は不活性なインテインを含み、所与の薬剤による該標的酵素のスプライシングの活性化が該標的酵素の該制御可能な第１の遺伝子の発現を許容しない条件下で該宿主細胞の生存を生じるもの、
を含有してなる選択系。
【請求項３１】
制御可能な標的タンパク質が、薬物感受性の標的タンパク質、インデューサー感受性の標的タンパク質、温度感受性の標的タンパク質、及び制御可能なプロモーターに作動可能に連結された標的タンパク質からなる群より選択される、請求項３０に記載の選択系。
【請求項３２】
不活性なインテインが、標的酵素の相同なエクステインに挿入された外来の不活性なインテイン及びネイティブなエクステインにおける天然の不活性なインテインからなる群より選択される、請求項３０に記載の選択系。
【請求項３３】
前記工程（ａ）の宿主細胞がインビボ・ペプチド・ライブラリー又はその誘導体を発現し、前記工程（ｂ）の試験薬剤がインビボ・ペプチド・ライブラリー又はその誘導体を含む、請求項２７又は３０に記載の方法。
【請求項３４】
インビボ・ペプチド・ライブラリーがチキンα−スペクトリンのフラグメントにおけるコンビナトリアル・ペプチド・ライブラリーを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
タンパク質スプライシングを阻害する薬剤についてスクリーニングする方法であって、該方法が：
（ａ）非許容性の条件下で試験薬剤の存在下、請求項２７に記載のポジティブな選択系を培養する工程；及び、
（ｂ）工程（ａ）から生存しない宿主細胞を同定する工程であって、該薬剤はタンパク質スプライシングを阻害する工程、
を含有してなる方法。
【請求項３６】
薬剤がタンパク質又はその部分として宿主細胞内に発現され、前記工程（ｂ）の生存しない宿主細胞はタンパク質スプライシングを阻害する試験薬剤を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
タンパク質スプライシングを活性化する薬剤についてスクリーニングする方法であって、該方法が：
（ａ）非許容性の条件下で試験薬剤の存在下、請求項３０に記載のポジティブな選択系を培養する工程；及び、
（ｂ）工程（ａ）から生存する宿主細胞を同定する工程であって、該薬剤はタンパク質スプライシングを活性化する工程、
を含有してなる方法。
【請求項３８】
薬剤がタンパク質又はその部分として宿主細胞内に発現され、前記工程（ｂ）の生存する宿主細胞はタンパク質スプライシングを活性化する試験薬剤を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記工程（ａ）の宿主細胞がインビボ・ペプチド・ライブラリー又はその誘導体を発現し、前記工程（ａ）の試験薬剤がインビボ・ペプチド・ライブラリー又はその誘導体を含む、請求項３６又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
インビボ・ペプチド・ライブラリーがチキンα−スペクトリンのフラグメントにおけるコンビナトリアル・ペプチド・ライブラリーを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
タンパク質スプライシングを阻害する薬剤をスクリーニングするためのレポーター系であって、該レポーター系は非必須のタンパク質をコードするレポーター遺伝子を含んだ宿主細胞を含み、該レポーター遺伝子はインテインを含み、該インテインが、該エクステインのサイレント変異の不在下で該レポーター遺伝子の相同な又は非相同なエクステインに挿入される外来のインテイン、及びネイティブなレポーターエクステインにおける天然のインテインからなる群より選択され、所与の薬剤による該非必須のタンパク質のスプライシングの阻害が該宿主細胞の特異的に検出可能な表現型を生じる、レポーター系。
【請求項４２】
タンパク質スプライシングを活性化する薬剤をスクリーニングするためのレポーター系であって、該レポーター系は非必須のタンパク質をコードするレポーター遺伝子を含んだ宿主細胞を含み、該レポーター遺伝子は不活性なインテインを含み、該不活性なインテインが、該エクステインのサイレント変異の不在下で該レポーター遺伝子の相同な又は非相同なエクステインに挿入される外来の不活性なインテイン、及びネイティブなレポーターエクステインにおける天然の不活性なインテインからなる群より選択され、所与の薬剤による該非必須のタンパク質のスプライシングの活性化が該宿主細胞の特異的に検出可能な表現型を生じる、レポーター系。
【請求項４３】
タンパク質スプライシングを阻害する薬剤についてスクリーニングする方法であって、該方法が：
（ａ）試験薬剤の存在下で請求項４１に記載のレポーター系を培養する工程；及び、
（ｂ）工程（ａ）から特異的に検出可能な表現型を有する宿主細胞を同定する工程であって、検出可能な表現型を有する該宿主細胞はタンパク質スプライシングを阻害する試験薬剤の存在下にある工程、
を含有してなる方法。
【請求項４４】
試験薬剤がタンパク質又はその部分として宿主細胞内に発現され、前記工程（ｂ）が特異的に検出可能な表現型を有する工程（ａ）からの宿主細胞を同定することを含み、検出可能な表現型を有する該宿主細胞はタンパク質スプライシングを阻害する試験薬剤を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
タンパク質スプライシングを活性化する薬剤についてスクリーニングする方法であって、該方法が：
（ａ）試験薬剤の存在下で請求項４２に記載のレポーター系を培養する工程；及び、
（ｂ）特異的に検出可能な表現型を有する工程（ａ）からの宿主細胞を同定する工程であって、検出可能な表現型を有する該宿主細胞はタンパク質スプライシングを活性化する試験薬剤の存在下にある工程、
を含有してなる方法。
【請求項４６】
試験薬剤がタンパク質又はその部分として宿主細胞内に発現され、前記工程（ｂ）が特異的に検出可能な表現型を有する工程（ａ）からの宿主細胞を同定することを含み、検出可能な表現型を有する該宿主細胞はタンパク質スプライシングを活性化する試験試薬を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記工程（ａ）の宿主細胞がインビボ・ペプチド・ライブラリー又はその誘導体を発現し、工程（ａ）の試験薬剤が該インビボ・ペプチド・ライブラリー又はその誘導体を含む、請求項４４又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
インビボ・ペプチド・ライブラリーがチキンα−スペクトリンのフラグメントにおけるコンビナトリアル・ペプチド・ライブラリーを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
インビボで遺伝子発現を制御する方法であって、該方法が：
（ａ）インテインを含む遺伝子で宿主細胞中の相同なエクステイン遺伝子を置き換える工程；及び、
（ｂ）工程（ａ）のインテインを含有する遺伝子のスプライシングを、該スプライシングを阻害又は活性化する薬剤で調節する工程、
を含有してなる方法。
【請求項５０】
前記工程（ａ）の置き換えが相同組換えによって相同なエクステイン遺伝子にインテイン遺伝子を挿入することを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記工程（ａ）の置き換えが相同なエクステイン遺伝子を不活性化することを含み、インテインを含有する遺伝子が細胞中に第２の遺伝子として導入される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
インビボで少なくとも部分的にタンパク質分解性である薬物の送達を制御するための方法であって、該方法が：
（ａ）該薬物のタンパク質部分にインテインを挿入して不活性な薬物を作製する工程；
（ｂ）工程（ａ）の該不活性な薬物を投与する工程；及び、
（ｃ）該不活性な薬物のタンパク質スプライシングを活性化して、活性な薬物を生成する工程、
を含有してなる方法。
【請求項５３】
前記工程（ｂ）が、さらに、不活性な薬物を所望される組織に標的するために遺伝子治療を利用することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記工程（ａ）のインテインが温度感受性のインテインを含み、前記工程（ｃ）の活性化が標的組織の温度を減少するか又は増加する任意の処理に所望される標的組織を曝露し、このようにして該温度感受性のインテインのスプライシングを誘導することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記工程（ｃ）の活性化がスプライシングを活性化する薬剤で所望される標的組織を注入することを包含する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
前記工程（ａ）が、さらに、所望される組織に対してスプライシングを活性化する薬剤を標的するために遺伝子治療を利用することを含み、前記工程（ｂ）の投与が全身性の投与を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記工程（ｂ）の投与が所望される組織特異的プロモーターに作動可能に連結された前記工程（ａ）の不活性な薬物を含む非細胞特異的ベクターでの全身性の形質転換を含み、該不活性な薬剤が該組織特異的プロモーターを活性化し得る細胞においてのみ発現される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｒｙＡにおいてＭｘｅ　ＧｙｒＡの温度感受性変異体を作製するための方法であって、該方法が：
（ａ）Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡにおけるＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインβ鎖Ｂ８、及びβ鎖Ｂ８とＢ９との間のループを含有する領域の同定；
（ｂ）該領域を変異する工程；及び、
（ｃ）細胞に変異されたインテイン遺伝子を導入し、許容性及び非許容性の温度の下でスプライスする能力を試験する工程
を含有してなる方法。
【請求項５９】
インテインの温度感受性変異体を作製するための方法であって、該方法が：
（ａ）インテインにおけるＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインβ鎖Ｂ８、及びβ鎖Ｂ８とＢ９との間のループに相同な領域の同定；
（ｂ）該第２のインテインの該相同な領域を変異する工程；及び、
（ｃ）細胞に変異されたインテイン遺伝子を導入し、許容性及び非許容性の温度の下でスプライスする能力を試験する工程
を含有してなる方法。
【請求項６０】
温度感受性のインテインについてスクリーニングする方法であって、該方法が、
（ａ）優性的に細胞障害性のタンパク質をコードする遺伝子を含む宿主細胞を含むポジティブな遺伝子選択系を作製する工程であって、該遺伝子がインテインを含み、該インテインが変異誘発される工程；及び、
（ｂ）ある範囲の温度にて工程（ａ）の宿主細胞を培養する工程であって、予め決定された温度において、タンパク質はスプライシングできず、該宿主細胞の生存能を生じる工程、
を含有してなる方法。
【請求項６１】
温度感受性のインテインについてスクリーニングする方法であって、該方法が、
（ａ）優性的に細胞障害性のタンパク質をコードする遺伝子を含んだ宿主細胞を含むポジティブな選択系を作製する工程であって、該遺伝子が不活性なインテインを含み、該インテインが変異誘発される工程；及び、
（ｂ）ある範囲の温度において工程（ａ）の宿主細胞を培養する工程であって、予め決定された温度において、インテインはスプライシングし、該宿主細胞の死を生じる工程、
を含有してなる方法。
【請求項６２】
温度感受性のインテインにおけるタンパク質スプライシングを阻害する温度のスクリーニングについてのポジティブな選択系であって、該選択系が、
（１）細胞生存能に必要とされる標的酵素の制御可能な形態をコードする第１の遺伝子を含む宿主細胞、及び、
（２）該標的酵素の発現される形態をコードする第２の遺伝子であって、該第２の遺伝子はインテインを含み、該インテインは変異誘発され、所与の非許容性の温度による該標的酵素のスプライシング阻害が該標的酵素の該制御可能な第１の遺伝子の発現を許容しない条件下で該宿主細胞の減少された生存能及び死を生じるもの
を含有してなる選択系。
【請求項６３】
温度感受性のインテインにおけるタンパク質スプライシングを活性化する温度のスクリーニングについてのポジティブな選択系であって、該選択系が、
（１）細胞生存能に必要とされる標的酵素の制御可能な形態をコードする第１の遺伝子を含む宿主細胞、及び、
（２）該標的酵素の発現される形態をコードする第２の遺伝子であって、該第２の遺伝子はインテインを含み、該インテインは変異誘発され、所与の非許容性の温度による該標的酵素のスプライシングの活性化が該標的酵素の該制御可能な第１の遺伝子の発現を許容しない条件下で該宿主細胞の生存能を生じるもの、
を含有してなる選択系。
【請求項６４】
温度感受性のインテインにおけるタンパク質スプライシングを阻害する温度についてスクリーニングする方法であって、該方法が：
（ａ）非許容性の温度の存在下で請求項６２に記載のポジティブな選択系を培養する工程；及び、
（ｂ）工程（ａ）からの生存しない宿主細胞を同定する工程であって、該温度がタンパク質スプライシングを阻害する工程、
を含有してなる方法。
【請求項６５】
温度感受性のインテインにおけるタンパク質スプライシングを活性化する温度についてスクリーニングする方法であって、該方法が：
（ａ）許容性の温度の存在下で請求項６３に記載のポジティブな選択系を培養する工程；及び、
（ｂ）工程（ａ）からの生存する宿主細胞を同定する工程であって、該温度がタンパク質スプライシングを活性化する工程、
を含有してなる方法。
【請求項６６】
温度感受性のインテインにおけるタンパク質スプライシングを阻害する温度のスクリーニングのためのレポーター系であって、該レポーター系は非必須のタンパク質をコードするレポーター遺伝子を含んだ宿主細胞を含み、該レポーター遺伝子はインテインを含み、該インテインが、該エクステインのサイレント変異の不在下で該レポーター遺伝子の相同な又は非相同なエクステインに挿入される外来のインテイン、及びネイティブなレポーターエクステインにおける天然のインテインからなる群より選択され、該インテインは変異誘発され、非許容性の温度による該非必須のタンパク質のスプライシングの阻害が特異的に検出可能な表現型を生じる、レポーター系。
【請求項６７】
温度感受性のインテインにおけるタンパク質スプライシングを活性化する温度のスクリーニングのためのレポーター系であって、該レポーター系は非必須のタンパク質をコードするレポーター遺伝子を含んだ宿主細胞を含み、該レポーター遺伝子はインテインを含み、該インテインが、該エクステインのサイレント変異の不在下で該レポーター遺伝子の相同な又は非相同なエクステインに挿入される外来のインテイン、及びネイティブなレポーターエクステインにおける天然のインテインからなる群より選択され、該インテインは変異誘発され、許容性の温度による該非必須のタンパク質のスプライシングの活性化が特異的に検出可能な表現型を生じる、レポーター系。
【請求項６８】
温度感受性のインテインにおけるタンパク質スプライシングを阻害する温度についてスクリーニングするための方法であって、該方法が：
（ａ）ある範囲の温度の存在下で請求項６６に記載のレポーター系を培養する工程；及び、
（ｂ）工程（ａ）からの特異的に検出可能な表現型を有する宿主細胞を同定する工程であって、検出可能な表現型を有する該宿主細胞はタンパク質スプライシングを阻害する非許容性の温度の存在下にある工程、
を含有してなる方法。
【請求項６９】
温度感受性のインテインにおけるタンパク質スプライシングを活性化する温度についてスクリーニングするための方法であって、該方法が：
（ａ）ある範囲の温度の存在下で請求項６７に記載のレポーター系を培養する工程；及び、
（ｂ）工程（ａ）からの特異的に検出可能な表現型を有する宿主細胞を同定する工程であって、検出可能な表現型を有する該宿主細胞はタンパク質スプライシングを活性化する許容性の温度の存在下にある工程、
を含有してなる方法。
【請求項７０】
エクステインが異種エクステインであり、インテインがインテインのいずれか又は両方の末端において約１個から５個のアミノ酸残基が相同なエクステインに実質的に同一である部位でエクステインに挿入される、請求項６、１１、２９、又は３２に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項７１】
エクステインが異種エクステインであり、インテインがインテインのいずれか又は両方の末端において約１個から５個のアミノ酸残基が相同なエクステインに実質的に同一である部位でエクステインに挿入される、請求項４１に記載のレポーター系。
【請求項７２】
エクステインが異種エクステインであり、ネイティブなエクステインの１個から５個のアミノ酸残基がインテインの一方又は両方の末端において存在し、該１個から５個のアミノ酸残基がインテインとともに異種エクステインに挿入される、請求項６、１１、２９、又は３２に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項７３】
エクステインが異種エクステインであり、ネイティブなエクステインの１個から５個のアミノ酸残基がインテインの一方又は両方の末端において存在し、該１個から５個のアミノ酸残基がインテインとともに異種エクステインに挿入される、請求項４１に記載のレポーター系。
【請求項７４】
挿入部位が、エクステイン上の表面の位置、エクステインのループ領域、エクステイン内のプロテアーゼ感受性部位からなる群より本質的に選択されるか、又はエクステインを不活性化することなくエクステインの１つ以上のアミノ酸残基の挿入を許容することが知られる位置である、請求項６、１１、２９、又は３２に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項７５】
挿入部位が、エクステイン上の表面の位置、エクステインのループ領域、エクステイン内のプロテアーゼ感受性部位からなる群より本質的に選択されるか、又はエクステインを不活性化することなくエクステインの１つ以上のアミノ酸残基の挿入を許容することが知られる位置である、請求項７０に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項７６】
挿入部位が、エクステイン上の表面の位置、エクステインのループ領域、エクステイン内のプロテアーゼ感受性部位からなる群より本質的に選択されるか、又はエクステインを不活性化することなくエクステインの１つ以上のアミノ酸残基の挿入を許容することが知られる位置である、請求項７２に記載のポジティブな遺伝子選択系。
【請求項７７】
挿入部位が、エクステイン上の表面の位置、エクステインのループ領域、エクステイン内のプロテアーゼ感受性部位からなる群より本質的に選択されるか、又はエクステインを不活性化することなくエクステインの１つ以上のアミノ酸残基の挿入を許容することが知られる位置である、請求項４１又は７１に記載のレポーター系。
【請求項７８】
タンパク質スプライシングを阻害する薬剤をスクリーニングするためのポジティブな遺伝子選択系であって、該選択系が：
ｉ）予め決定された条件下で細胞の生存能に必要とされる標的酵素の不活性化された形態をコードする第１の遺伝子を含む宿主；及び、
ｉｉ）該標的酵素の発現される形態をコードする第２の遺伝子であって、該第２の遺伝子はインテインを含有し、所与の薬剤による該標的酵素のスプライシングの阻害は該予め決定された条件下で該宿主細胞の減少された生存能を生じ、該標的酵素の発現は生存能又は増殖に必要とされるもの、
を含有してなる選択系。
【請求項７９】
温度感受性のインテインにおいてタンパク質スプライシングを阻害する温度をスクリーニングするためのポジティブな選択系であって、該選択系が：
ｉ）予め決定された条件下での細胞の生存能に必要とされる標的酵素の不活性化された形態をコードする第１の遺伝子を含む宿主；及び、
ｉｉ）該標的酵素の発現される形態をコードする第２の遺伝子であって、該第２の遺伝子がインテインを含み、該インテインは変異誘発され、少なくとも１つ以上の予め決定された温度での該標的酵素のスプライシングの阻害は予め決定された条件下で減少された該宿主細胞の生存能を生じ、該標的酵素の発現は生存能又は増殖に必要とされるもの、
を含有してなる選択系。
【請求項８０】
必須の遺伝子において天然にインテインを有する微生物病原体に対する抗微生物活性のための薬剤を同定する方法であって、その天然の情況又は相同なエクステインの情況において、インテインをスプライシングをブロックする薬剤についてスクリーニングする工程を含有してなる方法。
【請求項８１】
必須の遺伝子において天然にインテインを有する微生物病原体に対する抗微生物活性のための薬剤を同定する方法であって、インテインの一方又は両方の末端を隣接する１つ以上のネイティブなエクステイン残基を含む異種エクステインの情況において、インテインのスプライシングをブロックする薬剤についてスクリーニングする工程を含有してなる方法。
【請求項８２】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓに対する抗微生物活性を有する薬剤を同定する方法であって、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＤｎａＢインテインのスプライシングを阻害する薬剤についてスクリーニングする工程を含有してなる方法。
【請求項８３】
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅに対する抗微生物活性を有する薬剤を同定する方法であって、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｘｅｎｏｐｉ又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅのＧｒｙＡインテインのスプライシングを阻害する薬剤についてスクリーニングする工程を含有してなる方法。
【請求項８４】
抗微生物活性を有するリード化合物を同定する方法であって、その生物体において天然に存在するインテインのスプライシングを阻害する薬剤を同定する工程を含有してなる方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、天然の前駆体を使用するか、又は相同なエクステイン遺伝子においてインテインを挿入することによって、インテインのタンパク質スプライシングをブロック又は活性化する変異又は薬剤について選択又はスクリーニングする方法に関する。
本出願は、１９９８年１１月１０日に発行された、米国特許第５，８３４，２４７号の一部係属出願であり、従ってその開示は本明細書中に参考として援用されている。
【０００２】
【従来の技術】
本発明は、インテイン（ＩＶＰＳ）のタンパク質スプライシングを阻害するか又は活性化するかのいずれかである薬剤についてのスクリーニング、及びその使用に関する。具体的には、本明細書中に開示されているのは、Ｇｙｒａｓｅ　Ａ及びＤｎａＢインテインについての２つの特異的なレポーター系の開発である。本発明に従ってスクリーニングされる薬剤は、インビボ又はインビトロで、必須の遺伝子においてインテインを含有する生物体の抗細菌活性を含む、任意の目的のためにタンパク質スプライシングを制御するために使用され得る。より具体的には、本発明は、スプライシング、又はスプライシングを阻害若しくは活性化する薬剤を調節する変異についてスクリーニングするための、改変された又は未改変のネイティブなタンパク質スプライシング前駆体又は相同なエクステイン系において発現されるインテインの使用に関する。本発明は、ネイティブでない前駆体に由来する薬剤は、ネイティブな前駆体に対して同一の選択された活性を有しないかもしれないので、天然の前駆体によって形成されるよりネイティブなインテイン活性部位又は相同なエクステインにおけるインテインを利用するために、改変された又は未改変のネイティブなタンパク質スプライシング前駆体又は前駆体相同体を使用することによって、スプライシングを制御し得る薬剤についてスクリーニングするために使用される現在のレポーター系を改良する。
【０００３】
ＤＮＡからＲＮＡ、タンパク質への情報の流れは、成熟なタンパク質の生成を包含する。その情報を妨げるＤＮＡ及びＲＮＡエレメントの正確な切り出しは以前に記載されてきた（Ｍ．Ｂｅｌｆｏｒｔ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２４：３６３（１９９０）：Ｔ．Ｒ．Ｃｅｃｈ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：５４３（１９９０）；Ｈｕｎｔｅｒら、Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．３：２１０１（１９８９））。より最近、介入するタンパク質配列の正確な切り出しについての証拠が、また、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ＣｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＴＦＰＩ対立遺伝子（Ｈｉｒａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：６７２６（１９９０）；Ｋａｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５０：６５１（１９９０））及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓからのｒｅｃＡ遺伝子（Ｄａｖｉｓら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７３：５６５３（１９９１）；Ｄａｖｉｓら、Ｃｅｌｌ　７１：１（１９９２））について記載された。これらの遺伝子のそれぞれは、成熟タンパク質を生成するために除去されなくてはならない内部のインフレームなペプチドセグメントを含む。Ｔｆｐ１及びＲｅｃＡの発現はそれぞれ２つのペプチドを生じ、一方は介入するタンパク質配列（ＩＶＰＳ）を示し、他方は外部のタンパク質配列（ＥＰＳ）の連結された産物を示す。１９９４年に、用語「インテイン」及び「エクステイン」は、それぞれ、「ＩＶＰＳ」及び「ＥＰＳ」の代わりに採用された（Ｐｅｒｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：１１２５−１１２７（１９９４））。この転写後のスプライシング事象は、「タンパク質スプライシング」と呼ばれた。同様に超高熱性古細菌Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓからの「Ｖｅｎｔ」（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は２つのインフレームなＩＶＰＳを含み（Ｐｅｒｌｅｒら、ＰＮＡＳ　８９：５５７７（１９９２））、及び超好熱性古細菌Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ種ＧＢ−ＤからのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は１つのインテインを含む（Ｘｕ、Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ　７５、１３７１−１３７７（１９９３））。
【０００４】
８０を超えるインテインが、細菌、古細菌、及び真正細菌において同定された（Ｐｅｒｌｅｒ、Ｆ．Ｂ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２５、１０８７−９３（１９９７）、Ｄａｌｇａａｒｄ、Ｊ．Ｚ．ら、Ｊ　Ｃｏｍｐｕｔ　Ｂｉｏｌ　４、１９３−２１４（１９９７）、Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ、Ｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ．７、６４−７１（１９９８）、及びＰｅｒｌｅｒ、Ｆ．Ｂ．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７、３４６−４７（１９９９）。４つのインテインが、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅにおいて見出された（Ｄａｖｉｓ、Ｅ．Ｏ．ら、ＥＭＢＯ　Ｊ．１３、６９９−７０３（１９９４）及びＳｍｉｔｈ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ　７、８０２−１９（１９９７））、並びに３つのインテインがＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓにおいて見出された（Ｃｏｌｅ、Ｓ．Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ　３９３、５３７−４４（１９９８））。１つのインテインはＣａｎｄｉｄａ　Ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓにおいて見出された（Ｇｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８（１０）：７３７２−７３８１（１９９３））。
【０００５】
制御可能なＩＶＰＳ（ＣＩＶＰＳ）及び標的タンパク質を改変、生成、及び精製するためにこれを使用するための方法が記載された（Ｃｏｍｂら、米国特許第５，４９６，７１４号、１９９６年３月５日発行；Ｃｏｍｂら、米国特許第５，８３４，２４７号、１９９８年１１月１０日発行）。ペプチド（又はその誘導体、アナログ、若しくは模倣体）、又は天然の若しくは実験的なレポータータンパク質のスプライシングをブロック若しくは活性化するために細胞に入り得る任意の薬剤をスクリーニングするためにインテインを使用するための方法がまた記載された（米国特許第５，８３４，２４７号、前述、実施例１７にて）。これらの方法は、標的としてｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌのインテインを使用するペプチドのスクリーニングを具体的に記載する。チキンα−スペクトリンを利用するインビボ・ペプチド・ライブラリーの調製が、また、記載される。
【０００６】
チミジル酸合成酵素（ＴＳ）レポーター系においてＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＲｅｃＡインテインを使用した抗微生物剤についてスクリーニングする一般的な方法が記載されたが（Ｂｅｌｆｏｒｔ、米国特許第５，７９５，７３１号、１９９８年８月１８日発行）、この系は、いくつかの制限を受ける。重要なことに、外来情況（（ｆｏｒｅｉｇｎ ｃｏｎｔｅｘｔｓ）例えば、Ｂｅｌｆｏｒｔ系）におけるタンパク質スプライシングのいくつかの研究は、インテイン・スプライシングが外来のエクステインにおけるよりもネイティブなエクステインにおいて効果的であることを示す（Ｘｕ、ＥＭＢＯ　Ｊ．１３：５５１７−５５２２（１９９４）、Ｘｕ、ＥＭＢＯ　Ｊ．１５：５１４６−５１５３（１９９６）、Ｔｅｌｅｎｔｉ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６３７９−６３８２（１９９７）、Ｃｈｏｎｇ　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１０５６７−１０５７７（１９９８）、Ｌｉｕ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４０８：３１１−３１４（１９９７）、Ｗｕ、Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１３８７：４２２−４３２（１９９８Ｂ）、Ｎｏｇａｍｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４７：７３−８５（１９９７）、Ｋａｗａｓａｋｉ　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１５６６８−１５６７４（１９９７）、Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９４：１１４６６−１１４７１（１９９７）、Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２７：１１０−１２１（１９９９）、図１７）。例えば、外来エクステインの使用は、Ｐｓｐ−ＧＢＤ　Ｐｏｌ、Ｍｘｅ　ＧｙｒＡ及びＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ＤｎａＢインテインの温度依存性のスプライシングを生じる（Ｘｕ、ＥＭＢＯ　Ｊ．、１３：５５１７−５５２２（１９９４）、Ｘｕ、ＥＭＢＯ　Ｊ．　１５：５１４６−５１５３（１９９６）、Ｔｅｌｅｎｔｉ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６３７９−６３８２（１９９７）、Ｃｈｏｎｇ　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１０５６７−１０５７７（１９９８）、Ｌｉｕ、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、４０８：３１１−３１４（１９９７）、Ｗｕ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．ＢｉｏＰｈｙｓ．Ａｃｔａ　１３８７：４２２−４３２（１９９８Ｂ）、Ｎｏｇａｍｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４７：７３−８５（１９９７）、Ｋａｗａｓａｋｉ　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：１５６６８−１５６７４（１９９７）、及びＳｏｕｔｈｗｏｒｔｈ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２７：１１０−１２１（１９９９）、並びに図１７）。
【０００７】
理論に束縛されることを望むのではないが、外来エクステインの情況におけるこのような非効率的なタンパク質スプライシングは、隣接するエクステインが、実際にインテインの基質であることから生じると考えられる。それゆえ、インテインは全ての他の酵素のように基質特異性を示し得るようである。インテインの基質特異性は受容可能なエクステイン配列を制限し、従ってネイティブなエクステイン配列は至適な基質であるが、外来エクステイン配列は全く受容可能な基質ではないかもしれない。例えば、Ｓｃｅ　ＶＭＡ及びＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインの研究は、チオール誘導性のＮ−末端スプライス接合部の切断及びスプライシングは、種々の程度に、インテインに先行する単一のエクステイン残基に依存することを示す（Ｃｈｏｎｇ、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７３：１０５６７−１０５７７（１９９８）、Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈ、ＢｉｏＴｈｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２７：１１０−１２１（１９９９））。他のエクステイン残基はまた、Ｓｃｅ　ＶＭＡインテインのスプライシングを影響することが示された（Ｎｏｇａｍｉ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１４７：７３−８５（１９９７）、Ｋａｗａｓａｋｉ　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：１５６６８−１５６７４（１９９７））。
【０００８】
さらに、エクステインは、インテイン活性部位でのパッキング、又はインテイン及び／若しくは前駆体の広範な折り畳みに影響があってもよく、従って外来エクステインの使用はインテイン又は前駆体の不正確な折り畳みを生じてもよく、非効率であり得るか又はスプライシングしなくてもよい。さらに、例えばＥ．ｃｏｌｉ又は酵母の、外来宿主においてインテインを天然に含むエクステイン遺伝子の発現は、効率的でないかもしれないが（Ｐｅｒｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：５５７７−５５８１（１９９２）、及びＨｏｄｇｅｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：６１５３−６１５７（１９９２））、相同な内因性エクステインの発現は、より効率的であるようである。例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅ　ＲｅｃＡインテインはＥ．ｃｏｌｉにおいてスプライスできないが、これはＭ．ｌｅｐｒａｅにおいてスプイラスする（Ｄａｖｉｓら、ＥＭＢＯ　Ｊ．１３：６９９−７０３（１９９４））。Ｍ．ｌｅｐｒａｅ　ＲｅｃＡインテインがＥ．ｃｏｌｉ　ＲｅｃＡにおいてスプライスすることは可能であるが、それは未だ試験されていない。別の例において、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　ｓｐ．株ＰＣＣ６８０３　ＤｎａＢ遺伝子はインテインを含有し、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてクローン化できなかった（Ｗｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：９２２６−９２３１（１９９８））。Ｍ．ｌｅｐｒａｅ　ＧｙｒＡ前駆体はＥ．ｃｏｌｉにおいて効率的にスプライスせず、及びほとんど不溶性であるが、相同なＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインはＥ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡにおいて効率的にスプライスされた。
【０００９】
さらに、相同なエクステインの使用は、多くの例において、所望のインテインを挿入するためにレポーター遺伝子中にサイレント変異を導入する必要性を排除する（Ｂｅｌｆｏｒｔ、前出；Ｃｏｍｂ、前出；実施例１７を参照のこと）。相同なエクステインは、相同なエクステインへのインテインのクローニングを許容していて天然に存在する保存された制限酵素部位を有してもよいか、又はこれらは組換えにより相同なエクステインへのインテインの挿入を許容するのに十分なエクステインの類似性を有してもよい。このような系はまた、ネイティブなエクステインの生来のエクステイン特性が選択のために使用されてもよいので、外因性レポーター遺伝子の必要性を排除する。あるいは、ネイティブなエクステインは、選択可能なマーカー又はレポーター遺伝子へエクステインを作製するために、デノボで変異されてもよいか、又は類似のエクステイン遺伝子における変異に基づいてもよいかのいずれかである。
【００１０】
従って、最も所望されるインテインスプライシング系は、発現のために使用される外来宿主生物体からの相同なエクステインにおいてある生物体からのインテインを発現するか、又は適切な外来宿主生物体においてネイティブな前駆体遺伝子を発現するための、それらの系である。
【００１１】
このようなインテイン系は、レポーター遺伝子内でインテインスプライシングを阻害する抗微生物剤のスクリーニングにおいて有用であるのみでなく（Ｂｅｌｆｏｒｔ、前出；Ｃｏｍｂ、前出）、エクステイン産物の直接的な発現を指向する制御可能な標的として有用である。薬剤、例えばペプチドは、インテインスプライシングを阻害し、このような系においてエクステインの発現を制限するために使用されてよい。このような発現の抑制は、例えば、ガン細胞を殺傷するにおいて活性である酵素をオンにすることを望む場合の情況、又は例えばインシュリンについて必要とされる活性を送達することによる薬物送達の情況において、非常に有用であり得る。
【００１２】
同様に、このようなインテイン系は、スプライシングを活性化する能力を有する薬剤についてスクリーニングするためにスプライシングイン無能のインテインを利用してよい。
【００１３】
【発明の解決しようとする課題】
本発明によれば、任意の宿主生物体におけるインテインのネイティブな宿主タンパク質（エクステイン）又は相同なエクステインの使用を包含しているインテインのスプライシングを制御する変異か薬剤について選択するか又はスクリーニングするための選択系及び方法が提供される（図１８）。具体的には、１つの好ましい実施態様において、タンパク質スプライシングを阻害する薬剤のスクリーニングのためのポジティブな遺伝子選択系が提供され、これは以下のものである：（１）標的酵素（これは、本明細書中で使用されるように酵素のみでなく、タンパク質、ペプチドなどをも含む）の変異体又は天然の薬物耐性の形態をコードするエクステイン遺伝子（エピソーム、染色体、又は合成のいずれか）遺伝子のコピー、及び（２）薬剤との相互作用の際に優性的に細胞障害性である標的酵素の薬物感受性の形態をコードするエクステイン遺伝子（エピソーム、染色体、又は合成のいずれか）の野生型又は変異体の形態を含み、標的酵素の薬物感受性の形態をコードする遺伝子は、インテインを含み、所与の試薬による標的酵素の薬物感受性の形態のスプライシングの阻害は薬物の存在下での宿主細胞の生存を生じる。１つの特定の実施態様において、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ　ＧｙｒＡインテインを利用するポジティブな遺伝子選択系が提供される。この系はまた、ＧｙｒＡエクステイン遺伝子における同じ又は異なる部位で挿入される任意のＧｙｒＡインテインに適用可能である。
【００１４】
別の好ましい実施態様において、タンパク質スプライシングを阻害する薬剤のスクリーニングのための類似のポジティブな遺伝子選択系が提供され、これは以下のものである：（１）標的酵素の野生型の形態をコードするエクステイン遺伝子（エピソーム、染色体、又は合成のいずれか）のコピー、及び（２）標的酵素の優性的に細胞障害性の形態をコードする遺伝子（エピソーム、染色体、又は合成のいずれか）を含む宿主細胞を含み、標的酵素の優性及び細胞障害性の形態をコードする遺伝子は、インテインを含み、所与の試薬による標的酵素の細胞障害性の形態のスプライシングの阻害は宿主細胞の生存を生じる。１つの特異的な実施態様において、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＤｎａＢヘリカーゼインテインを利用するポジティブな遺伝子選択系が提供される。このポジティブな遺伝子選択系は、また、ＤｎａＢ　エクステイン遺伝子における同じ及び／又は異なる部位にて挿入される任意のＤｎａＢインテインを用い得る。タンパク質スプライシングを活性化する薬剤についてスクリーニングする類似の系及び方法が、また、ネイティブな又は相同なエクステインを利用するレポーター系及びインテインを利用する系として提供される。
【００１５】
本発明によってまた提供されるのは、阻害剤又は活性化剤でタンパク質スプライシングを調節することによってタンパク質のインビボ発現を制御する方法である。タンパク質スプライシングを調節することによって、インビボでタンパク質分解性薬物の送達を制御する類似の方法がまた提供される。
【００１６】
本明細書中で使用されるように、「薬剤」は、ペプチド（遊離の又はチキンα−スペクトリンのような骨格において示される）、ペプチド誘導体、アナログ又は模倣体、天然の産物、又は合成分子を包含する。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
本発明は、天然の前駆体を使用するか、又は相同なエクステイン遺伝子においてインテインを挿入することによって、インテインのタンパク質スプライシングをブロック又は活性化する変異又は薬剤について選択又はスクリーニングする方法に関する。これらの変異又は薬剤は、薬理学的な、化学治療的な、又は生物工学的な目的のために、インビボ又はインビトロで酵素を活性化するか、又は酵素を不活性なままにするために使用され得る。対照的に、これらの同じ方法は、ネイティブなエクステインタンパク質について遺伝子選択系又はスクリーニングが何も作製され得ない場合、非相同なエクステインにおいてスプライシングをブロック又は活性化する薬剤を選択するために使用され得る。
【００１８】
制御可能な介入するタンパク質配列（ＣＩＶＰＳ）に対して作用する、ブロック若しくは活性化ペプチド、又は細胞に入り得る他の薬剤によって媒介されるタンパク質スプライシングのインビボ制御の記載がある（米国特許第５，８３４，２４７号、前出、実施例１７にて）。本発明において、制御可能でないＩＶＰＳ、又はインテインは、ＩＶＰＳをＣＩＶＰＳに変換する薬剤を同定するために使用されることが留意されるべきである。ペプチド又は天然の産物、及びそのアナログのような特異的な薬剤によるこのようなスプライシング活性のブロッキングは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ、又はＣａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓのような病原体をこれらの生物体において必須のタンパク質のスプライシングをブロックすることによる戦いにおいて特に有用である。
【００１９】
約９７個のインテインが同定され、及び公的なデータベースから入手可能である（Ｐｅｒｌｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：１１２５−１１２７（１９９４）、Ｐｅｒｌｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７：３４６−３４７（１９９９）、Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ、Ｓ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ．、７：６４−７１（１９９８）及びＤａｌｇａａｒｄら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．、４：１９３−２１４（１９９７）。小さな原核生物ゲノム（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅ、及びＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）の配列決定プロジェクトは、既に、多数の公開されたインテイン配列を説明している。これらのインテインの宿主遺伝子に、しばしば、ＤＮＡ複製、発現、又は種々の代謝プロセスのような必須の細胞機能が関与している（Ｐｅｒｌｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：１０８７−１０９３（１９９７）、Ｐｅｒｌｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７：３４６−３４７（１９９９）、Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ、Ｓ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ．、７：６４−７１（１９９８）、及びＤａｌｇａａｒｄら、Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．４：１９３−２１４（１９９７）において編集される）。従って、ペプチド、又は他の薬剤によるインテインスプライシングのブロッキングを介するこれらの必要不可欠な機能の破壊は、それによって抗微生物剤及び抗病原体剤についてスクリーニングするための手段を提供する。
【００２０】
一般に、ポジティブな遺伝子選択系は、増殖培地又は宿主株の遺伝的背景に依存する宿主生物に対して有害である遺伝子からなる。遺伝子産物は細胞にとって毒性であり、遺伝子産物が不活性化されない限り増殖を阻害するか又は宿主を殺傷する。タンパク質スプライシング遺伝子系の情況において、ポジティブな選択系は宿主遺伝子にインフレームで挿入されるインテインのスプライシングに対して選択を許容する系として規定される（図２を参照のこと）。スプライシングがインテインを含有する前駆体タンパク質において生じる場合、細胞障害性宿主タンパク質は活性であり、及び細胞増殖を阻害するか、又は細胞を殺傷するし、スプライシングが破壊される場合、細胞障害性の宿主タンパク質は不活性であり、細胞増殖を許容する。同様の説明が、生物体生存能についての選択ではなく宿主タンパク質の検出がスコアされる場合のレポーター系にも適用される。多くのレポーター遺伝子が知られ、大部分の共通の例は青／白スクリーニングであり、青色を生成するＸ−ｇａｌに対するβ−ガラクトシダーゼ機能を包含する
【００２１】
本発明の１つの実施態様によれば、タンパク質スプライシングをブロック又は活性化する薬剤を同定するためのポジティブな遺伝子選択系が提供され、これは以下のものである：（１）標的酵素の変異体又は天然の薬物耐性の形態をコードするエクステイン遺伝子（エピソーム、染色体、又は合成のいずれか）のコピー、及び（２）薬物に対して感受性である標的酵素をコードするエクステイン遺伝子（エピソーム、染色体、又は合成のいずれか）の野生型又は変異体の形態を含み、その中にインテインが挿入され、インテインを含有する標的酵素のスプライシングされた形態はある薬物との相互作用の際に宿主細胞に対して毒性である。この系においてそのように形質転換された宿主細胞は、インテインが正確にスプライスされる場合に薬物感受性酵素を発現し、スプライスされた産物が、宿主生物体に対して優性致死性であるか又は細胞障害性であるので、薬物耐性の相同な遺伝子がまた発現されるという事実にもかかわらず、生物体の減少された生存能を生じる。遺伝子のインテインレスコピーは、プラスミドに保有されるエクステイン遺伝子のスプライシングをブロックする細胞において生存能を維持するために必要とされる。
【００２２】
１つの好ましい実施態様において、プラスミドにコードされる、薬物感受性遺伝子は天然に存在するインテイン／エクステイン前駆体、又はインテインを含有するその相同体であり、インテインは天然に存在するか又は挿入されるかのいずれかであってよく、薬物感受性はこの前駆体遺伝子において天然に存在するか、又は遺伝子のエクステイン部分における変異によって導入されてよい。この系は、全ての細胞の死を生じ、またスプライシングが生じ、従って細胞生存能がスプライシングの妨害を必要とするのでインビボでスプライシングをブロックする変異、薬物、化学物質、ペプチドなどについて選択するための系を提供する。
【００２３】
特に好ましい実施態様において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｘｅｎｏｐｉ　ＧｙｒＡインテイン（Ｍｘｅ　ＧｙｒＡ）（配列番号１１）（Ｔｅｌｅｎｔｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：６３７８−６３８２（１９９７）がＥ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡの相同なエクステインに挿入される（図６を参照のこと）。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、ＧｙｒＡは、Ｅ．ｃｏｌｉジャイレースへテロ四量体タンパク質複合体のＡサブユニットについてコードする必須の遺伝子である。Ｅ．ｃｏｌｉジャイレースは、細菌染色体ＤＮＡの複製起点でのＤＮＡ弛緩に関与するＩＩ型トポイソメラーゼである（Ｓｗａｎｂｅｒｇ及びＷａｎｇ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７：７２９−７３６（１９８７））。野生型Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡは、オフロキサシンのようなキノリン薬物に不可逆的に結合し、複製の間のＤＮＡ弛緩を妨げて細胞死に導く（図３を参照のこと）。しかし、野生型Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡのある変異体は薬物耐性であるが、ジャイレース活性を保持する。第２のインテインを含有する薬剤感受性ｇｙｒＡ遺伝子とともに、薬剤耐性ｇｙｒＡ遺伝子の染色体コピーを含むＥ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡ二倍体宿主細胞の作製は、薬剤感受性のＥ．ｃｏｌｉ宿主を生じる。なぜなら、この場合において、薬剤感受性は優性であるからである。薬剤感受性ＧｙｒＡが、ＤＮＡ複製を妨げる薬物と不可逆的な共有結合性の毒複合体を形成するので、薬剤感受性の表現型は優性である（図３）。
【００２４】
二倍体によって、本発明者らは、形質転換、感染、結合、プラスミド、ウイルス、ファージのような当業者に公知の任意の手段によって、又はトランスジェニック株を作製することによって細胞へ導入されており、エピソームエレメント上に又は宿主染色体上のいずれかに存在してよく、１つの遺伝子（又はいくつかの遺伝子）の余分なコピーを、細胞が含むことを意味する。
【００２５】
本発明によれば、ポジティブな遺伝子選択系の類似のタイプ（タンパク質スプライシングをブロック又は活性化する薬剤を同定するための）が提供され、これは（１）エクステインタンパク質の非毒性の形態を発現し、標的酵素の野生型の形態をコードするエクステイン遺伝子（エピソーム、染色体、又は合成のいずれか）のコピー、及び（２）その中にインテインが挿入される、標的酵素の細胞障害性の形態をコードする第２のエクステイン遺伝子（エピソーム、染色体、又は合成のいずれか）、を含んだ宿主細胞を含む。この系において二倍体宿主細胞は、インテインが正確にスプライスされる場合に細胞障害性酵素を発現する。従って、細胞は、細胞障害性酵素は発現される全ての時に、細胞障害性酵素のスプライシングをブロックする化学物質、薬剤、又はペプチドで処理されなくてはならない。細胞障害性エクステインは、エクステイン遺伝子のインテインレスコピーがまた発現されるので、優性致死性である。遺伝子のインテインレスコピーは、プラスミドに保有されるエクステイン遺伝子のスプライシングがブロックされる細胞において生存能を維持するために必要とされる。
【００２６】
１つの好ましい実施態様において、細胞障害性の外来エクステイン相同体に挿入されるインテインを使用する代わりに、天然のインテイン前駆体が、インテインのスプライシング後に、細胞障害性エクステイン酵素を生成するように変異されてよい。
【００２７】
特に好ましい実施態様において、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＤｎａＢ前駆体（Ｃｏｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ、３９３：５３７−５４４（１９９８））は、エクステイン領域において、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤｎａＢにおいて、公知の細胞傷害性変異に基づいて、細胞障害性形態に変異され、ここではＡｒｇ２３１はシステインに変異された（Ｍａｒｓｚａｌｅｋ及びＫａｇｕｎｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：１９３３４−１９３４０（１９９２）並びにＳｈｉｒｍａｎｋａｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７４：７６８９−７６９６（１９９２））。ＤＮＡヘリカーゼは、複製、組換え、及び修復のために必要とされる１本鎖ＤＮＡ中間体を生じるために、ＤＮＡ二量体を巻き戻す必須のタンパク質である（ＬｅＢｏｗｉｔｚ及びＭｃＭａｃｋｅｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６１：４７３８−４７４８（１９８６）、並びにＬｏｈｍａｎ、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６：５−１４（１９９２））。ｄｎａＢ遺伝子によってコードされる六量体のＥ．ｃｏｌｉヘリカーゼは、六量体ＤｎａＣ複合体及びＡＴＰと相互作用する。いくつかのＤｎａＢ変異体は、優性致死性である（Ｂｏｕｖｉｅｒ及びＯｒｅｇｌｉａ、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｈｅｂｄ　Ｓｅａｎｃｅｓ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　Ｄ．、２８０：６４９−６５２（１９７５）、並びにＭａｕｒｅｒ及びＷｏｎｇ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７０：３６８２−３６８８（１９８８）、Ｓａｌｕｊａ及びＧｏｄｓｏｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７７：１１０４−１１１１（１９９５）、並びにＳｃｌａｆａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８２：１１２−１１８（１９８１））。Ｒ２３１Ｃ変異体タンパク質は、ＡＴＰ加水分解においてヘリカーゼ活性を、及び染色体の複製起点で複製活性を欠き、細胞死を生じる。図１２において示されるように、Ｍｔｕ　ＤｎａＢはこの同じアルギニン（Ｒ２２７）を含み、及びこれをシステインに変異することは、Ｍｔｕ　ＤｎａＢ遺伝子を細胞障害性にする。この変異は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて優性的に細胞障害性であり、そしてＥ．ｃｏｌｉ及びＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＤｎａＢタンパク質の両方は、不活性な複合体にＥ．ｃｏｌｉ　ＤｎａＣタンパク質を隔離すること、ＤｎａＣがＥ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡ複製フォーク上へＤｎａＢを「負荷する」のを防ぐことを生じる（図８及び図９を参照のこと）。
【００２８】
本発明の記載における両方のポジティブな遺伝子選択系は、タンパク質スプライシングを至適化するために、そして非相同な外来エクステインへのインテインの挿入から生じ得る非効率的なスプライシングを回避するために、ネイティブな又は相同な外来エクステインのいずれかを利用する。
【００２９】
インビボ・ペプチド・ライブラリーの発現のために操作されるプラスミドにおける、これらのポジティブな選択系における宿主細胞の同時形質転換、又は選択マーカー及びインビボ・ペプチド・ライブラリーの両方を含むプラスミドでの形質転換（図１６におけるように）は、タンパク質スプライシングをブロックする（あるいは活性化する）ペプチドを発現するクローンの直接的な選択を許容する。ペプチドのインビボでの発現は、宿主の効率的なタンパク質分解性の分解系によって妨害されるかもしれない。それゆえ、より大きなタンパク質の情況において、特により大きなタンパク質の表面ループ領域において、インビボでのこれらのペプチドの発現が、好ましい。より大きなタンパク質に融合されるペプチドのインビボでの発現は、例えばチオレドキシンの触媒ループにおいて達成され（Ｃｏｌａｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：５４８−５５０（１９９６））、及び多くの異なるタンパク質内に融合されるペプチドを発現することが可能である。非常に可溶性で、十分に発現された、熱安定性の、溶媒に曝露されるタンパク質のループにおいて、インフレームに発現されるペプチドは、インビボタンパク質分解又は分解をほとんど受けず、このような融合物は細胞においてペプチドの機能的な発現を増強する。
【００３０】
好ましい実施態様において、以前に記載されているように（米国特許第５，８３４，２４７号、前出、実施例１７を参照のこと）、チキンα−スペクトリンのフラグメントにおけるコンビナトリアル・ペプチド・ライブラリーが構築される。チキンα−スペクトリンのＥＦハンド領域が選択されたが、なぜならその構造が公知であり、そのＥＦハンドドメインが安定な構造を有する小さなタンパク質を形成し、これが柔軟な表面ループを有するからである。チキンα−スペクトリンＥＦハンドドメインの構造はＮＭＲ解析によって解明された（Ｔｒａｖｅら、ＥＭＢＯ　Ｊ．１４：４９２２−４９３１（１９９５））。用語「ＥＦハンド」は、へリックス、ターン（ループ）及び第２のへリックスからなるタンパク質３次構造モチーフのタイプと説明される。チキンα−スペクトリンのＥＦハンドドメインは、チキンα−スペクトリンのカルボキシ末端に位置される。その８４アミノ酸構造は、１４個のアミノ酸の長い柔軟性のリンカー（配列番号１２）によって分離される２つのＥＦハンドへリックス−ターン−へリックスモチーフにおいて配置される。タンパク質は１０ｍＭまでの濃度であっても、任意の検出可能な沈殿又は凝集を伴わずに、極めて可溶性である。リンカーループは主に溶液中で構造化されておらず、変異誘発データは、ループにおける少数の欠失又は挿入が２つのＥＦハンド間の安定化する疎水性相互作用を妨げないことを示す。
【００３１】
本発明者らは、チキンα−スペクトリンＥＦハンド間のリンカー領域中にランダムなペプチドを導入するために、この最後の特性を利用した。種々の大きさのペプチドライブラリーを調査することができる。スクリーニングのためのインビボ・ペプチド・ライブラリーを生成する代替の方法が利用されてよく、及び本発明の範囲内にあることは当業者に明らかである。
【００３２】
上述で考察される系は、ネイティブな又は相同なエクステインのスプライシングをブロックする薬剤について選択するが、類似のストラテジーが、活性なレポーター遺伝子の発現を阻害する薬剤を探索するために、レポーター遺伝子でのスクリーニングのために使用され得ることが、当業者によって認識され、類似のストラテジーが、エクステイン遺伝子がレポーターに変換され得る限り、そのネイティブな情況において又は相同なエクステイン遺伝子において、スプライシング欠乏性インテインのスプライシングを活性化する薬剤を探索するために使用され得ることが、当業者によって同様に認識され得る。例えば、１つの実施態様において、スプライシングを欠く前駆体を活性化する試薬は、活性なレポータータンパク質の発現を生じ、細胞増殖の阻害又は活性なレポータータンパク質の検出を生じる。
【００３３】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＧｙｒＡ及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＤｎａＢ選択系が上述で記載されるが、任意の遺伝子選択系が、また、タンパク質スプライシングを破壊又は触媒するペプチド配列又は他の薬剤を単離するために使用され得ることが、当業者によって認識される、同様に、本発明者らはＭ．ｘｅｎｏｐｉ　ＧｙｒＡインテイン（配列番号１１）及びＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＤｎａＢインテイン（配列番号１３）の特定の使用を記載するが、当業者は、本ストラテジーが、そのネイティブな又は相同な情況に存在する任意のインテイン（例えば、「Ｐｅｒｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７：３４６−３４７　１９９９」を参照のこと）に等しく適用可能であることを認識するであろう。スクリーニングのためのペプチドライブラリーを作製する代替の手段が使用されてよいことは、当業者に同様に明らかである。ネイティブなエクステインタンパク質についての選択又はスクリーニング系の不在下で、類似のストラテジーが、わずかに至適であり異種エクステイン系におけるインテインのスプライシングに適用され得ることは、当業者によって同様に認識されるであろう。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法によって同定される活性化及び／又は阻害剤は、また、標的タンパク質のインビボでの発現を制御するために使用されてもよい。一旦活性なエクステイン遺伝子のコピーのみがインテインを含まれると、生物体がスプライシングをブロックする薬剤で処理される場合、遺伝子機能は阻害され得る。他方、スプライシング障害性インテインが使用される場合、生物体がスプライシングを活性化する薬剤で処理される場合、遺伝子機能は活性化され得る。薬剤及びスプライシングは、スプライシング活性化又は阻害剤の添加又は除去によって、生物体の発生及び生涯の間の任意の時点にて調節され得る。
【００３５】
同様に、制御可能なスプライシングが、特定の時間にて又は特定の位置に活性なタンパク質を送達するために、使用されてよい。多くの例において、治療用薬物は宿主に対して細胞障害性であり得、標的部位でのみ活性である場合が最も良好である。例えば、化学的治療薬物は、しばしば、一般的に細胞障害性であり、正常な細胞における有害な反応は薬物が腫瘍中で特異的に活性化され得る場合に排除され得る。少なくとも部分的にタンパク質分解性である薬剤を有するならば、上記のように、第２の試薬によって活性化又は阻害され得るインテインは治療用薬剤のタンパク質部分に挿入され得るであろう。次いで、薬物は不活性な形態において投与され、続いて所望される標的組織において活性化される。
【００３６】
上記のように、インテインは基質特異性を示すことがあり、外来エクステインの配列よりもそれらのネイティブなエクステイン配列を好むので、外来エクステイン情況において不十分なタンパク質スプライシングが生じると考えられる。別の実施態様によれば、１つ以上の、好ましくは１〜５個の、そのネイティブなエクステインからのアミノ酸残基を有するインテインを使用することによってこの制限を克服する方法が提供される。このようなアミノ酸残基の包含は、相同なインテインのいずれかの、又は両方の末端においてであってよい。ネイティブなエクステインからのアミノ酸残基の包含は、本発明の方法を容易にする。ネイティブなエクステインからのこのようなアミノ酸残基は当業者に周知の方法によって前駆体に組み込まれてよい。
【００３７】
異種エクステインにおける標的インテインの挿入は、任意の多くの部位においてであってよく、エクステインのループ領域内、プロテアーゼ感受性部位、エクステインにおける表面位置、又はエクステインを不活性化することのないさらなるアミノ酸残基の挿入を促進することが知られる位置を含み、さらにそれらに限定されない。
【００３８】
以下に示される実施例は、本発明の特定の好ましい実施態様として単に意図されるたのであり、本明細書中の請求の範囲において提供される場合を除いて、本発明の範囲を制限することを意図するわけではない。本発明は、当業者に明らかである本明細書中に教示される方法の改変及び変化を包含する。
【００３９】
上記及び下記に引用される文献は、本明細書中に参考として援用される。
【００４０】
【実施例】
実施例１
タンパク質スプライシングの阻害のためのＭｘｅ　ＧｙｒＡインテイン媒介性のポジティブな選択系
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡにおけるＭｘｅ　ＧｙｒＡインテイン（ＩＶＰＳ）のスプライシングをブロックすることに基づくポジティブな選択系；背景
ジャイレースは、細菌におけるＤＮＡ複製に関与する、必須の多量体酵素である（Ｓｗａｎｂｅｒｇ及びＷａｎｇ、１９８７）。ジャイレースサブユニットＡ及びＢの両方は、細菌ヒト病原体（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｅｎｔｅｒｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）における薬物標的として広範囲に研究されてきた。ジャイレースのＧｙｒＡサブユニットは、オフロキサシンのようなキノリン薬物と複合体化し得、細胞死を誘導する。ジャイレースとキノリンとの複合体形成後、ＤＮＡ合成の迅速な及び不可逆性の阻害、増殖の阻害、及びＳＯＳ応答の誘導が続く（図３を参照のこと）。より高い薬物濃度にて、細菌染色体における２本鎖ＤＮＡ破損片が、捕獲されたジャイレース複合体から放出されるので細胞死が生じる。
【００４１】
多くのグラム陰性細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）において、キノリンに対する耐性は、ｇｙｒＡ９６又はｇｙｒＡ８３のようなキノリン耐性決定領域におけるＧｙｒａｓｅＡタンパク質の変異から生じる。これらの変異は、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡにおけるＳｅｒ８３を含んでいてよい。染色体上に薬物耐性ｇｙｒＡ遺伝子（例えばｇｙｒＡ８３）を含有し、プラスミド上にｇｙｒＡの野生型（ｇｙｒＡ＋）コピーを含有する二倍体細胞において、ｇｙｒＡの野生型遺伝子（薬物感受性）産物が優性である。二倍体によって、本発明者らは、形質転換、感染、結合、プラスミド、ウイルス、ファージのような当業者に公知の任意の手段によって、又はトランスジェニック株を作製することによって細胞へ導入されている、及びエピソームエレメント上に又は宿主染色体上のいずれかに存在していてよく、１つの遺伝子（又はいくつかの遺伝子）の余分なコピーを、細胞が含むことを意味する。野生型ｇｙｒＡ遺伝子は、当業者に公知の任意の手段によって細胞に導入され得、プラスミドに制限されることを考慮されるべきではない。オフロキサシンのようなキノリン薬物に耐性であるｇｙｒＡ変異体を含む多くのＥ．ｃｏｌｉ株が利用可能である。しかし、この系はまた、任意の他の宿主系に適用可能であり、ここでは（１）ｇｙｒＡ遺伝子の染色体コピーはキノリン薬物に対して耐性であり、（２）導入される感受性ｇｙｒＡ遺伝子は、異種Ｅ．ｃｏｌｌ　ｇｙｒＡ：：Ｍｘｅ　ｇｙｒＡインテイン融合物として、又はネイティブなＭｘｅ　ｇｙｒＡ又はＭ．ｌｅｐｒａｅ　ｇｙｒＡ遺伝子として存在し、及び（３）薬物感受性ｇｙｒＡ遺伝子を含有するインテインはその宿主における発現のために適切なシグナルと作動可能に連結される。同様に、Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテインは、これがＥ．ｃｏｌｉ　ｇｙｒＡ遺伝子にまさに挿入されたように、任意の実験的な宿主細胞のｇｙｒＡ遺伝子に挿入され得た。同様に、任意のｇｙｒＡインテインが、上述の選択系において使用され得、Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテインと同じ部位又は異なる部位のいずれかで存在する。
【００４２】
キノリン薬物に対する感受性は優性的に細胞障害性であるので、これらの薬物の存在下で、ｇｙｒＡ＋／ｇｙｒＡ８３宿主細胞は生存可能でない。なぜなら野生型ＧｙｒＡタンパク質はなお、薬剤分子に結合し得、ＤＮＡ複製を毒するからである（図４を参照のこと）。チキンα−スペクトリンペプチドライブラリーの同時発現（米国特許第５，８３４，２４７号、前出において、実施例１７にて記載されるように）は、Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテインのスプライシングを破壊し得るペプチドのポジティブな選択を許容する。同様にこの系は、インビボでのＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインのスプライシングを阻害する任意の薬剤についての、又はスプライシングをブロックするＭｘｅ　ＧｙｒＡインテイン変異についてのスクリーニングのために使用され得る。
【００４３】
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡ遺伝子における相同な部位へのＭｘｅ　ＧｙｒＡインテイン（ＩＶＰＳ）遺伝子の挿入
いくつかのＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａにおいて、ジャイレースＡサブユニット活性部位はしばしば、活性部位チロシン残基近くの天然に存在する対立遺伝子インテイン（ＩＶＰＳ）によって中断される（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍａｌｍｏｅｎｓｅ、及びＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｘｅｎｏｐｉ、（Ｓａｎｄｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４４：５８９−５９１（１９９８）、Ｔｅｌｅｎｔｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９：６３７８−６３８２（１９９７）、Ｐｅｒｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７：３４６−３４７（１９９９）、Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈ、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２７：１１０−１２１（１９９９））。本明細書中に記載される系を利用するＭ．ｘｅｎｏｐｉ（Ｍｘｅ）ＧｙｒＡインテイン（ＩＶＰＳ）は、内因性サインモチーフ及びホーミングエンドヌクレアーゼに類似する他の配列を欠損し、並びにプロトタイプの最小のインテイン（ＩＶＰＳ）として広範囲に研究された（Ｋｌａｂｕｎｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：３１−３６（１９９８）、及びＴｅｌｅｎｔｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７９：６３７８−６３８２（１９９７）、及びＳｏｕｔｈｗｏｒｔｈ　ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２７：１１０−１２１（１９９９））。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡにおけるＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインについての最も好ましい挿入部位は、ネイティブなＭｘｅ　ＧｙｒＡエクステインに比較される相同な挿入部位である。なぜならこれはネイティブなＭｘｅ　ＧｙｒＡエクステインと配列同一性を共有するからである（図６）。インテイン（ＩＶＰＳ）挿入部位は、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡにおいて１２２位での保存されたチロシン活性部位残基のすぐ上流に選択された：
ＤＳＡＡＡＭＲＹ１２２ｃｉｔ−−−ｓｈｎＴ１２３ＥＩＲＬＡＫＩ
（配列番号１４）　　　　　　　（配列番号４５）。
【００４４】
アミノ酸の番号は、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡにおけるアミノ酸の位置を言及する（部分的なＥ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡ配列について配列番号１を参照のこと）。下線されたアミノ酸（１文字アミノ酸コード）は、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＭｘｅの両方のＧｙｒＡ　エクステインにおいて同一であるアミノ酸である（図６を参照のこと）。小文字は、Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテイン（ＩＶＰＳ）アミノ酸を示す。破線は、列挙されないＭｘｅ　ＧｙｒＡインテイン（ＩＶＰＳ）の残基の残りを示す（完全なＭｘｅ　ＧｙｒＡインテイン配列について、配列番号２を参照のこと）。
【００４５】
第１に、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｇｙｒＡ遺伝子を、以下の実験条件下でＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２ゲノムＤＮＡを使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってクローン化した。正方向プライマ５’−ＧＡＴＡＧＧＣＴＡＧＣＧＡＴＧＡＧＣＧＡＣＣＴＴＧＣＧＡＧＡＧ−３’（配列番号１５）及び逆方向プライマー５’−ＴＧＡＡＧＣＡＡＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＣＴＴＣＴＴＣＴＧＧＣＴＣＧ−３’（配列番号１６）を、２０Ｕ／ｍｌ　Ｖｅｎｔ（登録商標）Ｅｘｏ＋ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、４００μＭの各ｄＮＴＰ、４ｎＭの各プライマー、及び１００ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２ゲノムＤＮＡを含有するＰＣＲ混合液中で使用した。増幅を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）サーマルサイクラー４８０において、９５℃で１分間行い、及び次いで４５℃、３０秒間；７２℃、２分３０秒間；９５℃、３０秒間を２０サイクルについてサイクルした。１つの５０μｌ　ＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物及び２μｇのｐＣＹＢ１（１ＭＰＡＣＴ（商標）１キット、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を別々に、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡの存在下で２５０Ｕ／ｍｌのＮｈｅＩ及び１０００Ｕ／ｍｌのＭｆｅＩで別々に消化した。消化を３７℃で１時間行った。消化されたＰＣＲ産物及びプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分離し、切り出されたバンドを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製した。ライゲーションを、１：４の比率のベクター対インサート、及び４０，０００Ｕ／ｍｌのＴ４リガーゼを使用して、２０℃で１時間行った。ライゲーション産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株　ＥＲ２２６７コンピテントセルに形質転換した。組換えプラスミドを、正確にライゲーションされた組換え体においてクローン化されたインサートの切り出しを生じる、ＮｈｅＩ／ＭｆｅＩ消化によって確認した。ｐＣＹＢ１　ｐＴａｃプロモータの転写制御下に置かれたＥ．ｃｏｌｉ　ｇｙｒＡ遺伝子を含有する得られた正確なプラスミドの１つを、ｐＥＡ５００と命名した。ｇｙｒＡインサートを、ＰＣＲによって導入された配列のエラーがないことを確実にするためにＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００４６】
第２に、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡへのＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインのクローニングを容易にするために、独特のサイレントなＮｏｔＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位を、部位特異的サイレント変異誘発により、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡ活性部位残基、ｐＥＡ５００のＹ１２２の各側から、７ｂｐ及び４４ｂｐ離れて操作した。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキットを、変異原性プライマー：ＮｏｔＩオリゴヌクレオチド：５’−ＣＧＧＣＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧＣＧＴＴＡＴＡＣＧＧ−３’（配列番号１７）及び５’−ＣＣＧＴＡＴＡＡＣＧＣＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＧＴＣＧＣＣＧ−３’（配列番号１８）、及びＸｂａＩオリゴヌクレオチド：５’−ＧＡＡＣＴＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＡＡＧＡＧＡＣＧＧ−３’（配列番号１９）及び５’−ＣＣＧＴＣＴＣＴＴＴＴＴＣＴＡＧＡＧＣＧＧＣＣＡＴＣＡＧＴＴＣ−３’（配列番号２０）とともに、製造業者の指示（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬＡ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に従って使用した。ＮｏｔＩ及びＸｂａＩ制限酵素部位を伴うＥ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡを含有する得られるプラスミドを、ｐＥＡ５０２と呼んだ。
【００４７】
第３に、隣接するＮｏｔＩ／ＸｂａＩ制限部位を伴う６８ｂｐＤＮＡカセットを、ｐＥＡ５０２の独特のＮｏｔＩ／ＸｂａＩ部位にクローン化するために、設計した。このカセットを、Ｙ１２２から１０ｂｐ離れたＢｌｐｌサイレント制限酵素部位に導入し、これは続いて、ＮｏｔＩ及びＢｌｐｌ制限酵素部位を使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡ活性部位のＹ１２２近くに任意のインテイン（ＩＶＰＳ又はＣＩＶＰＳ）のクローニングを可能にした。このカセットは、２つの相補的なオリゴヌクレオチド：５’−ＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧＣＧＴＴＡＴＡＣＧＧＡＡＡＴＣＣＧＣＴＴＡＧＣＧＡＡＡＡＴＴＧＣＣＣＡＴＧＡＡＣＴＧＡＴＧＧＣＣＧＡＴ−３’（配列番号２１）及び５’−ＣＴＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴＣＡＧＴＴＣＡＴＧＧＧＣＡＡＴＴＴＴＣＧＣＴＡＡＧＣＧＧＡＴＴＴＣＣＧＴＡＴＡＡＣＧＣＡＴＴＧＣ−３’（配列番号２２）をアニーリングすることによって作製された。５ｎＭの各オリゴヌクレオチドを、１×Ｔ４リガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中で合わせ、５分間煮沸し、室温に冷却した。１０μｇのｐＥＡ５０２を、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡの存在下、ＮｏｔＩ及びＸｂａＩで、５００Ｕ／ｍｌの各酵素を使用して消化した。消化を３７℃で２時間行った。消化されたプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分離し、切り出されたバンドを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸ　ＩＩビーズを使用してさらに精製した。オリゴヌクレオチドカセット及び消化されたプラスミドＤＮＡのライゲーションを、２０℃で１時間、１：２の比率のベクター対インサート、及び４０，０００Ｕ／ｍｌのＴ４リガーゼを使用して行った。ライゲーション産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＥＲ２２６７コンピテントセルに形質転換した。組換えプラスミドを、正確な組換えプラスミドの直鎖化を生じるＢｌｐＩ消化によって確認した。得られた正確なプラスミドの１つをｐＥＡ５２３と命名した。
【００４８】
第４に、Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテイン（ＩＶＰＳ）を以下の実験条件下でｐＭＩＰ（Ｍｘｅ）番号４プラスミドＤＮＡ（Ｔｅｌｅｎｔｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７９：６３７８−６３８２（１９９７））を使用して、プライマー由来のＮｏｔＩ及びＢｌｐｌ部位の付加を伴うＰＣＲによって増幅した：正方向プライマー５’−ＣＧＡＣＣＣＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＴＧＣＧＴＴＡＴＴＧＣＡＴＣＡＣＧＧＧＡＧ−３’（配列番号２３）及び逆方向プライマー５’−ＧＣＣＡＡＡＧＧＣＧＣＴＡＡＧＣＧＧＡＴＴＴＣＣＧＴＧＴＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣＧＡＡＣＣＣＧ−３’（配列番号２４）を、１０Ｕ／ｍｌ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、４ｎＭの各プライマー、及び１００ｎｇ　ｐＭＩＰ（Ｍｘｅ）番号４ＤＮＡを含有するＰＣＲ混合液中で使用した。増幅を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）サーマルサイクラー４８０において、１０サイクルについて９４℃、３０秒間；５０℃、３０秒間；７２℃、１５秒間にて行った。１つの５０μｌ反応のＰＣＲ産物及び２μｇのｐＥＡ５２３を別々に、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡの存在下、１０００Ｕ／ｍｌのＮｏｔＩ及び３００Ｕ／ｍｌのＢｌｐＩを使用して消化した。消化を、３７℃で２時間行った。消化されたＰＣＲ産物及びプラスミドＤＮＡを、アガロースゲル電気泳動によって分離し、切り出されたバンドを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製した。ライゲーションを、１：３の比率のベクター対インサート、及び４０，０００Ｕ／ｍｌのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、２０℃で２時間行った。ライゲーション産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株　Ｔｏｐ１０Ｆ’（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）コンピテントセルに形質転換した。組換えプラスミドを、正確な組換えプラスミドの直鎖化を生じる、ＥｃｏＮＩ制限酵素消化によって確認した。得られた正確なプラスミドの１つは、ｐＥＡ６００と命名され、及び活性部位Ｙ１２２にてＥ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡエクステインへのＭｘｅ　ＧｙｒＡインテイン（ＩＶＰＳ）のインフレームな挿入を含む（図６及び７を参照のこと）。
【００４９】
ペプチドライブラリー及びＭｘｅ　ＧｙｒＡインテイン（ＩＶＰＳ）：：Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡ選択系の同時発現のためのベクターの構築
上記されるように、Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテイン（ＩＶＰＳ）を、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡの活性部位に挿入した。この相同な情況において、Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテイン（ＩＶＰＳ）は、効率的にスプライスして、活性なＥ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡを生成する。以下に詳述されるように、上記されるＥ．ｃｏｌｉ　ｇｙｒＡ：：Ｍｘｅ　ｇｙｒＡインテイン（ＩＶＰＳ）遺伝子融合物は、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモータ−の制御下でクローン化され、Ｅ．ｃｏｌｉ、ＥＲ２７２６（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に導入された。ＥＲ２７２６はＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを発現し、及び染色体ｇｙｒＡ遺伝子を、キノリン薬物に対して耐性にするｇｙｒＡ８３変異を有する。オフロキサシンのようなキノリン薬物の存在下で、スプライスされたｇｙｒＡ産物は優性な細胞障害性の様式において（上述を参照のこと）オフロキサシンに対して感受性であるので、スプライシングを欠損するクローンのみが生存し得る（図４及び５を参照のこと）。
【００５０】
スペクトリン足場は、以下のようにＥＡ６００にクローン化された。第１に、隣接するＰｆｌＭＩ／ＡｐａＩ制限部位を有する３０ｂｐ　ＤＮＡカセットを、ｐＥＡ６００（これはまた、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｇｙｒＡ：：Ｍｘｅ　ｇｙｒＡ融合物を含む）における独特のｐｆｌＭＩ／ＡｐａＩ部位にクローン化するために設計した。このカセットを、ｌａｃｌｑ遺伝子の代わりに独特のＳｐｈＩ部位を導入し、そして２つのオリゴヌクレオチド：５’−ＡＴＧＧＧＣＡＴＧＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＧＧＣＣＴＧＧＧＣＣ−３’（配列番号２５）及び５’−ＣＡＧＧＣＣＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＣＡＴＧＣＣＣＡＴＴＣＧ−３’（配列番号２６）のアニーリングによって合成した。５ｎＭの各オリゴヌクレオチドを、１×Ｔ４リガーゼ緩衝液（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中で合わせ、５分間煮沸し、そして室温に冷却した。５μｇのｐＥＡ６００を、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡの存在下で３２０Ｕ／ｍｌのＰｆｌＭＩ及び８００Ｕ／ｍｌのＡｐａＩを使用して消化した。消化を３７℃で２時間行った。消化されたプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分離し、切り出されたバンドを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸ　ＩＩビーズを使用してさらに精製した。ライゲーションを、１６℃で１時間、１：１の比率のベクター対インサート、及び４０，０００Ｕ／ｍｌのＴ４リガーゼを使用して行った。ライゲーション産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）コンピテントセルに形質転換した。組換えプラスミドを、正確な組換えプラスミドの直鎖化を生じるＳｐｈＩ消化によって確認した。得られた正確なプラスミドの１つをｐＥＡ６６１と命名した。
【００５１】
第２に、独特のＳｇｆＩ及び部位ＣｌａＩを、製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）によって記載されているようにＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキットを使用して、部位特異的サイレント変異誘発によってスペクトリンをコードするプラスミドにおけるスペクトリンループ領域のいずれかの側において操作した（Ｔｒａｖｅら、ＥＭＢＯ　Ｊ．１４：４９２２−４９３１（１９９５））。ＳｇｆＩオリゴヌクレオチドは：５’−ＧＴＴＴＡＡＧＴＣＴＴＧＣＴＴＧＣＧＡＴＣＧＣＴＴＧＧＣＴＡＴＧＡＣＣＴＧＣＣ−３’（配列番号２７）及び５’−ＧＧＧＣＡＧＧＴＣＡＴＡＧＣＣＡＡＧＣＧＡＴＣＧＣＡＡＧＣＡＡＧＡＣＴＴＡＡＡ−３’（配列番号２８）であり、並びにＣｌａＩオリゴヌクレオチドは：５’−ＧＣＣＴＧＡＣＣＣＣＧＡＡＴＴＴＧＡＡＴＣＧＡＴＴＣＴＴＧＡＣＡＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号２９）及び５’−ＣＡＡＣＡＧＴＧＴＣＡＡＧＡＡＴＣＧＡＴＴＣＡＡＡＴＴＣＧＧＧＧＴＣＡＧＧＣ−３’（配列番号３０）であった。得られるプラスミドをｐＥＡ６７０と呼んだ。
【００５２】
第３に、ＳｇｆＩ／ＣｌａＩ変異されたスペクトリン遺伝子を、以下の実験条件の下でｐＥＡ６６１にＰＣＲによってクローン化した。正方向プライマー５’−ＡＡＴＧＧＴＧＣＡＴＧＣＡＡＧＧＡＧＡＴＧＧＣＧＣＣＣＡＡＣＡＧＴＣ−３’（配列番号３１）及び逆方向プライマー５’−ＧＣＴＴＴＧＧＣＴＡＧＣＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＡＴＧＡＡＣＧ−３’（配列番号３２）を、１×緩衝液２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）及び５０ｎｇのｐＥＡ６７０　ＤＮＡの存在下、Ｅｘｐａｎｄ　Ｈｉｇｈ　Ｆｉｄｅｌｉｔｙ　ＰＣＲ系（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）において記載されるように使用した。増幅を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）サーマルサイクラー４８０において、９４℃で３０秒間、４５℃、３０秒間；７２℃、４５秒間；１５サイクルについて行った。１つの５０μｌチューブのＰＣＲ産物及び５μｇのｐＥＡ６６１を、２５０Ｕ／ｍｌの各酵素を使用して、ＮｈｅＩ／ＳｐｈＩ消化した。消化を３７℃で２時間行った。消化されたＰＣＲ産物及びプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分離し、切り出されたバンドを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製した。ライゲーションを、１：５の比率のベクター対インサート、及び４０，０００Ｕ／ｍｌのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、１６℃で１時間行った。ライゲーション産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｎｏｖａｂｌｕｅ　ＤＥ３（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｏｎ、ＷＩ）コンピテントセルに形質転換した。組換えプラスミドを、クローン化されたインサートの切り出しを生じる、ＮｈｅＩ／ＳｐｈＩ消化によって確認した。得られた正確なプラスミドの１つを、ｐＥＡ６７１と命名した。
【００５３】
第４に、ｐＥＡ６７１における最初のＥ．ｃｏｌｉ　ｇｙｒＡ　ＰｖｕＩ部位を、製造業者（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｌｏｌｌａ、ＣＡ）によって記載されているようにＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキット、及びオリゴヌクレオチド５’−ＧＣＧＴＡＡＡＧＣＴＣＧＣＧＡＣＣＧＴＧＣＴＣＡＴＡＴＣＣ−３’（配列番号３３）及び５’−ＧＧＡＴＡＴＧＡＧＣＡＣＧＧＴＣＧＣＧＡＧＣＴＴＴＡＣＧＣ−３’（配列番号３４）を使用して、部位特異的サイレント変異誘発によって排除して、プラスミドｐＥＡ６８１を生じた。
【００５４】
第５に、ｐＥＡ６８１からの２００ｂｐ　Ａｃｃ６５１／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＥＡ６７１に移して、ＥＡ６７１のＡｃｃ６９１／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを置き換えた。プラスミドｐＥＡ６７１及びｐＥＡ６８１を、５００Ｕ／ｍｌのＡｃｃ６５１及び５００Ｕ／ｍｌのＨｉｎｄＩＩＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、１×緩衝液２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中で消化した。消化を３７℃で２時間行った。消化されたプラスミドをアガロースゲル電気泳動によって分離し、切り出されたバンドを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製した。ライゲーションを、１：３の比率のベクター対インサート、及び４０，０００Ｕ／ｍｌのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、１６℃で３時間行った。ライゲーション産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１Ｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）コンピテントセルに形質転換した。組換えプラスミドを、ＰｖｕＩ消化によって確認した。得られた正確なプラスミドの１つを、ｐＥＡ６８２と命名した。このプラスミドは、同じプラスミド上にα−スペクトリンペプチドライブラリー及びＥ．ｃｏｌｉ　ｇｙｒＡ：：Ｍｘｅ　ｇｙｒＡインテインベースの選択系の両方を含み、両方ともＴ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下にある（図１３）。
【００５５】
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡにおけるＭｘｅ　ＧｙｒＡインテイン（ＩＶＰＳ）のタンパク質スプライシングを破壊するペプチドについての理論的なスクリーニング
以下に詳述される理論的な実施態様において、７〜１２アミノ酸のランダムなペプチドは、α−スペクトリンの２つのＥＦハンドモチーフ間のループにインフレームに挿入され、上述で記載されるように、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｇｙｒＡ：：Ｍｘｅ　ｇｙｒＡインテイン融合物として同じプラスミド上に含まれる。得られるプラスミドは、株ＥＲ２７２６（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に電気形質転換される。形質転換体は、スプライシング堪能なクローンに対する選択を許容するために、アンピシリン、オフロキサシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）及びＩＰＴＧの存在下でＬＢ液体増殖培地中で選択される。アンピシリンは、プラスミドの存在を選択し、及びスプライスされたＥ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡタンパク質は薬物に感受性であり細胞死に導くので、オフロキサシンはスプライシングをブロックするペプチドを選択する。プラスミドＤＮＡは選択されたクローンから単離され、そして選択されたスペクトリンペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを単離するためにＳｇｆＩ及びＣｌａＩで消化される。次いで、スペクトリンＤＮＡループフラグメントは、元来の選択プラスミドにクローン化されて戻される。薬物選択及び「バックークローニング」の反復的なラウンドが行われる（図１４）。反復的なスクリーニングは、いくつかの他の変異又は異常のために選択を生存したクローンを排除しながら、真にスプライシングをブロックする薬剤についての富化を補助する。最終的に選択されるクローンは、液体培養において個々に増殖され、そしてプラスミドにコードされるＥ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡは、ＩＰＴＧによって特異的に誘導される。粗タンパク質細胞抽出物は、電気泳動され、そして免疫染色のためにブロットされる。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡのスプライスされた産物が検出されないクトーンはポジティブ、すなわち、潜在的に選択されたペプチドによって、スプライシングが破壊されているクローンであると考慮される。
【００５６】
ランダムなペプチドライブラリーは、実施例２において行われたように、以下プロトコルを使用してインビトロで合成される。１本鎖／２本鎖ＤＮＡハイブリッドカセットは、２つのオリゴヌクレオチド：５’−ＴＧＴＣＡＡＧＡＡＴＣＧＡＴＴＣＡＡＡＴＴＣＧＧＧＧＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣ（（Ｗ）ＮＮ）７−１２ＡＴＡＧＣＣＡＡＧＣＧＡＴ−３’（配列番号３５）及び５’Ｐ−ＣＧＣＴＴＧＧＣＴＡＴ−３’（配列番号３６）をアニーリングすることによって合成される。５μｌのオリゴヌクレオチド配列番号３５及びオリゴヌクレオチド配列番号３６の３モルの等価物を、５０μｌの最終容量において、０．１Ｍ　ＮａＣｌの存在下で共に混合した。次いで混合物を煮沸し、そして即座に同じ煮沸器中で室温に冷却した。２つのオリゴのアニーリングによって形成されるＤＮＡハイブリッドカセットの１本鎖化されたランダムなヌクレオチド部分は、１×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中で２００μｌの最終容量において、４００μＭの各ｄＮＴＰ及び６０Ｕ／ｍｌのＫｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して伸長される。伸長反応は、２０分間３７℃で放置され、そして製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製される。６０μｇのｐＥＡ６８２（５０μｇ／ｍｌ）は、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡの存在下、２５０Ｕ／ｍｌのＳｇｆＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）及び５００Ｕ／ｍｌのＢｓｐＤＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）（ＣｌａＩのイソ制限酵素）を使用して、１×緩衝液２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中で消化される。消化は、３７℃で２時間行われる。精製されたカセット（５０μｌ）は次いで、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡの存在下、５００Ｕ／ｍｌのＣｌａＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、１×緩衝液４（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中で消化される。カセットは、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製される。消化されたプラスミドＤＮＡは、０．７％アガロースゲル上で電気泳動され、そして切り出されたバンドは、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製される。ライゲーションは、１：１の比率のベクター（２ｎｇ／μｌ）対インサート、及び１，６００Ｕ／ｍｌのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、１６℃で１時間行われる。ライゲーション産物は次いで、各２００μｌアリコートのコンピテントセルについて、１〜２μｇの全ライゲーションされたプラスミドを使用して、２．５ｋＶ／ｃｍで、２ｍｍキュベット（ＢＩＯＲＡＤ　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）において、Ｅ．ｃｏｌｉ株　ＥＲ２７４４（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）コンピテントセル（１０９　ｐＵＣ１８形質転換体／μｇ）に電気形質転換される。細胞は、１時間３７℃にて、振盪器中で回復されることを許容される。回復された形質転換体は、適切な量のオフロキサシン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、及び１ｍＭ　ＩＰＴＧを含有するＬＢ液体増殖培地中に１／１００希釈の比率で接種される。形質転換体は、一晩３７℃で接種される。プラスミドＤＮＡは、ｔｉｐ１００カラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、１００ｍｌの一晩培養物から単離される。ＣｌａＩ／ＳｇｆＩは、上述のように消化され、そして４％ＧＴＧＮｕｓｉｅｖｅアガロースゲル（ＦＭＣ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）において電気泳動される。５７〜７２ｂｐのスペクトリンループＤＮＡインサート（ペプチドライブラリーが７又は１２のランダムなアミノ酸を含んだかどうかに依存する）が、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているようにＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用して精製され、そして上記のようにＳｇｆＩ／ＣｌａＩ消化され、精製された選択プラスミドにクローン化されて戻される。このプロトコルは、Ｍｘｅインテイン（ＩＶＰＳ）のタンパク質スプライシングに対して最も生物学的に活性な配列を有するペプチドクローンについての形質転換体のプールを富化するために、３回反復される。最後に選択されたクローンは、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する１０ｍｌ　ＬＢ中で、３７℃にて個々に増殖され、そして１ｍＭ　ＩＰＴＧで３時間誘導される。粗タンパク質細胞抽出物は、１０〜２０％の勾配のゲル（Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）において電気泳動される。ゲルは次いで、ＧｙｒＡ：：Ｍｘｅインテイン（ＩＶＰＳ）タンパク質スプライシング産物を検出するために抗Ｈｉｓタグ抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用する免疫染色のために、電気ブロットされる。スプライスされた産物の不在を観察することを予測する。次いで、クローンは、選択されたアミノ酸配列を決定するために配列決定される。
【００５７】
スプライシングを阻害する薬剤での仮説的なスクリーニング
この段階で、ベクター、ｐＥＡ６００は、上記されるスプライシングをブロックするペプチドについてのような類似のスクリーニングプロトコルを使用して、スプライシングをブロックする任意のタイプの薬剤でスクリーニングするために受け入れられる。しかし、この場合において、ｐＥＡ６００又は類似のプラスミドは、上記のようにチキンα−スペクトリン遺伝子内に含まれるペプチドライブラリーをクローン化しなければならないことを伴わずに、直接的にスクリーニングされ得る。プロトコルは、細胞に入り得る単一の又はプールされた薬剤で個々の培養物を処理する工程、細胞増殖について観察する工程を包含し、当業者に公知の任意の方法を使用する。スプライシングをブロックする薬剤は、オフロキサシンの存在下で細胞が増殖することを許容する。
【００５８】
まとめ
まとめると、本発明者らは、スプライシングを阻害する薬剤についての選択における使用のための、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｇｙｒＡエクステイン遺伝子へのＭｘｅ　ｇｙｒＡインテイン遺伝子のクローニングを記載する。Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテインは、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡエクステインにおいて良好にスプライスし、活性なＥ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡタンパク質の生成を生じる。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡインテインは、Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテインとともに使用された。なぜなら、Ｍｌｅ　ＧｙｒＡインテインは、そのネイティブな情況においてＥ．ｃｏｌｉにおいて効率的にスプライスされず、及び前駆体はほとんどＥ．ｃｏｌｉにおいて不溶性であったからである。ＧｙｒＡインテイン及びエクステイン配列は非常に類似するので（Ｔｅｌｅｎｔｉら、Ｊ．ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１７９：６３７８−６３８２（１９９７）、及びＰｅｒｌｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７：３４６−３４７（１９９９））、インテイン、エクステイン、及び実験宿主の混合及び適合は、類似の挿入部位、及びそれゆえネイティブな情況におけるような類似のスプライシング活性部位を有するエクステインを使用して、ＧｙｒＡインテインのスプライシングを調節する薬剤を試験するための効率的なモデル系を生じた。
【００５９】
実施例２
Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＤｎａＢインテイン媒介性のポジティブな選択系
Ｅ．ｃｏｌｉにおいてそのネイティブなＭｔｕ　ＤｎａＢエクステインにおけるＭｔｕ　ＤｎａＢインテイン（ＩＶＰＳ）を使用する、ポジティブな選択系：
背景
ｄｎａＢ遺伝子によってコードされる六量体Ｅ．ｃｏｌｉヘリカーゼは、六量体ＤｎａＣ複合体及びＡＴＰと相互作用する。いくつかのＤｎａＢ変異体は、優性致死である（Ｂｏｕｖｉｅｒ及びＯｒｅｇｌｉａ、Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｈｅｂｄ．Ｓｅａｎｃｅｓ　Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｄ．、２８０：６４９−６５２（１９７５）、Ｍａｕｒｅｒ及びＷｏｎｇ、Ｊ，Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７０：３６８２−３６８８（１９８８）、Ｓａｌｕｊａ及びＧｏｄｓｏｎ、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：１１０４−１１１１（１９９５）、並びにＳｃｌａｆａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、１８２：１１２−１１８（１９８１））。優性の又は優性的な細胞障害性によって、本発明者らは毒性が、細胞障害性でない又は薬剤に耐性である相同なタンパク質が存在する場合であっても生じる、すなわち、細胞障害性効果は、非毒性の相同体の存在にかかわらず支配することを意味する。変異体タンパク質はＡＴＰ加水分解、ヘリカーゼ活性、及び染色体の複製の起点での複製活性において欠乏性であり、細胞死を生じる（図８及び９を参照のこと）。細菌のヘリカーゼ間の中程度のタンパク質配列同一性のみにもかかわらず、アルギニン２３１はＤｎａＣと直接的に相互作用することが提唱される保存されたモチーフ中に位置される（Ｍａｒｓｚａｌｅｋ及びＫａｇｕｎｉ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：１９３３４−１９３４０（１９９２）、並びにＳｈｒｉｍａｎｋａｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１７４：７６８９−７６９６（１９９２））。Ｍ．ｔｕｂｅｒｏｃｕｌｏｓｉｓ（Ｍｔｕ）ＤｎａＢは、カルボキシ末端で天然に存在するインテイン、及びＥ．ｃｏｌｉ　ＤｎａＢのアルギニン２３１に相同な２２７位でのアルギニンを有する（図１２を参照のこと）。
【００６０】
本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＭｒｕ　ＤｎａＢ前駆体タンパク質からのＭｔｕ　ＤｎａＢインテイン（ＩＶＰＳ）の堪能なタンパク質スプライシングを実証し、さらに、Ｒ２２７Ｃ変異が優性致死を生じることを示した。それゆえ、野生型ＤｎａＢ遺伝子及びＭｔｕ　ＤｎａＢ（Ｒ２２７Ｃ）遺伝子を含む二倍体細胞は、タンパク質スプライシングが破壊されない限り生存可能ではない（図１０及び１１を参照のこと）。二倍体によって、本発明者らは、形質転換、感染、結合、プラスミド、ウイルス、ファージのような当業者に公知の任意の手段によって、又はトランスジェニック株を作製することによって細胞へ導入されている、及びエピソームエレメント上に又は宿主染色体上のいずれかに存在し得る、１つの遺伝子（又はいくつかの遺伝子）の余分なコピーを、細胞が含むことを意味する。チキンα−スペクトリンペプチドライブラリー（米国特許第５，８３４，２４７号、前出において、実施例１７にて記載されるように）の共発現は、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＤｎａＢインテインのスプライシングを破壊し得るペプチドのポジティブな選択を許容する（図１３を参照のこと）。同様に、この系は、Ｍｔｕ　ＤｎａＢインテイン若しくはインビボでの任意の他のＤｎａＢインテインのスプライシングを阻害する任意の薬剤について、又はスプライシングをブロックするＤｎａＢインテイン変異について、スクリーニングするために使用され得る。
【００６１】
そのネイティブなＭｔｕ　ＤｎａＢエクステインにおけるＭｔｕ　ＤｎａＢインテイン（ＩＶＰＳ）を使用するポジティブな遺伝子選択系の構築
以下に詳細に記載されるように、Ｍｔｕ　ｄｎａＢ遺伝子が、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ転写制御下で、ＰＣＲによってクローン化された。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて、Ｍｔｕ　ＤｎａＢインテイン（ＩＶＰＳ）は、Ｍｔｕ　ＤｎａＢヘリカーゼを生成するために、その天然の前駆体から非常に効果的にスプライスする。Ｍｔｕ　ｄｎａＢ遺伝子は、アルギニンからシステインに２２７位にて変異誘発され、そしてプラスミドは、ＢＬ２１（ＤＥ３）−Ｇｏｌｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に形質転換された。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ（ＩＰＴＧによって誘導される）の存在下で、スプライシングを欠乏するクローンのみが生存し得る（図１１を参照のこと）。
【００６２】
第１に、Ｍｔｕ　ｄｎａＢ遺伝子を、以下の実験条件の下、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｈ３７ＲａゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲによってクローン化した。正方向プライマー５’−ＡＧＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＧＧＴＣＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣ−３’（配列番号３７）及び逆方向プライマー５’−ＴＡＴＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧＴＣＡＣＣＧＡＧＣＣＡＴＧＴＴＧＧＣＧ−３’（配列番号３８）を、１×緩衝液３及び１００ｎｇのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓゲノムＤＮＡの存在下、Ｅｘｔｅｎｄ　Ｌｏｎｇ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＰＣＲ系（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）において記載されるように使用した。増幅を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）サーマルサイクラー４８０において、９４℃で２分間行い、及び次いで４５℃、３０秒間；６８℃、２分間；９５℃、１分間を２５サイクルについてサイクルした。１つの５０μｌ反応からのＰＣＲ産物及び５μｇのｐＥＴ２１ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、１×ＥｃｏＲＩ緩衝液（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中で１０００Ｕ／ｍｌのＥｃｏＲＩ及び８００Ｕ／ｍｌのＨｉｎｄＩＩＩを使用して消化した。消化を３７℃で１時間行った。消化されたＰＣＲ産物及びプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分離し、切り出されたバンドを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製した。ライゲーションを、１：５の比率のベクター対インサート、及び４０，０００Ｕ／ｍｌのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、１６℃で１時間行った。ライゲーション産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株　Ｎｏｖａｂｌｕｅ　ＤＥ３（Ｎｏｖｅｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）コンピテントセルに形質転換した。組換えプラスミドを、クローン化されたインサートの切り出しを生じる、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化によって確認した。得られた正確なプラスミドの１つを、ｐＥＡ８０７と命名した。ｄｎａＢインサートの配列を、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【００６３】
第２に、スペクトリンベースのペプチドライブラリーを含有するｐＥＡ６８２からの１２００ｂｐ　ＢｇｌＩＩ／ＳｇｒＡＩフラグメントを、ｐＥＡ８０７に移した。プラスミドｐＥＡ６８２及びｐＥＡ８０７を、５００Ｕ／ｍｌのＢｇｌＩＩ及び２４０Ｕ／ｍｌのＳｇｒＡＩを使用して、１×緩衝液２（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中で消化した。消化を３７℃で１時間行った。消化されたプラスミドをアガロースゲル電気泳動によって分離し、切り出されたバンドを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製した。ライゲーションを、１：５の比率のベクター対インサート、及び４０，０００Ｕ／ｍｌのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、１６℃で１時間行った。ライゲーション産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＥＲ２７２６（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）コンピテントセルに形質転換した。組換えプラスミドを、ＣｌａＩ／ＮｃｏＩ消化によって確認した。得られた正確なプラスミドの１つを、ｐＥＡ８０８と命名した。
【００６４】
第３に、以下の実験条件下でのＰＣＲによってＭｔｕ　ｄｎａＢ遺伝子をＲ２２７Ｃに変異誘発した。正方向プライマー５’−ＡＧＧＴＧＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＧＧＴＣＧＴＴＧＡＴＧＡＣＣ−３’（配列番号３９）及び逆方向プライマー５’−ＴＴＴＣＣＣＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣａＣＧＣＣＧＣＣＡＣＧＡＴＧＡＣＣ−３’（配列番号４０）を、１×緩衝液３（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）及び５００ｎｇのｐＥＡ８０８ＤＮＡの存在下、Ｅｘｔｅｎｄ　Ｌｏｎｇ　Ｔｅｍｐｌａｔｅ　ＰＣＲ系（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）において記載されるように使用した。増幅を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓ（Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）サーマルサイクラー４８０において、９４℃で２分間行い、及び次いで４５℃、３０秒間；７２℃、４５秒間；９５℃、１分間を２０サイクルについてサイクルした。１つの５０μｌ反応からのＰＣＲ産物及び２μｇのｐＥＡ８０８を、１×ＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中で、１００Ｕ／ｍｌのＥｃｏＲＩ及び４０Ｕ／ｍｌのＳｒｆＩを使用して３７℃にて一晩消化した。消化されたＰＣＲ産物及びプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分離し、切り出されたバンドを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製した。ライゲーションを、１：１の比率のベクター対インサート、及び４０，０００Ｕ／ｍｌのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、１６℃で１時間行った。ライゲーション産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株　ＫＬ１０−Ｋａｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）コンピテントセルに形質転換した。組換えプラスミドを、ＮｄｅＩ／ＡｓｃＩによって確認した。得られた正確なプラスミドの１つを、ｐＥＡ８０９と命名した。
【００６５】
第４に、ＮｏｔＩ　ｄｎａＢ−スペクトリンモジュールを、プラスミドｐＥＡ８０９上で反転した。２μｇのｐＥＡ８０９　ＤＮＡを５００Ｕ／ｍｌのＮｏｔＩで、３７℃で２時間消化し、そして消化産物を、２つのチューブに分割した。１μｇのＮｏｔＩ消化ｐＥＡ８０９を含有する１つのチューブを、１００Ｕ／ｍｌの子ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＰ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）で２０分間、３７℃にてさらにインキュベートした。両方のチューブからの消化されたプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分離し、切り出されたバンドを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製した。ＣＩＰ処理されたチューブからのベクターバンドと、ＣＩＰ未処置のチュ−ブからのインサートバンドのライゲーションを、１：１の比率のベクター対インサート、及び４０，０００Ｕ／ｍｌのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、１６℃で１時間行った。ライゲーション産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株　ＸＬ−１　Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）コンピテントセルに形質転換した。組換えプラスミドを、ＳａｃＩＩ消化によって確認した。得られた正確なプラスミドの１つを、ｐＥＡ８１０と命名した。
【００６６】
第５に、ｐＥＡ８１０からのＬａｃｑ遺伝子を除去し、そしてＰＢＲ３２２からのより小さなＤＮＡフラグメントによって置き換えた。ｐＥＡ８１０及びｐＢＲ３２２ＤＮＡを、５００Ｕ／ｍｌ　ＥｃｏＲＶ及び５００Ｕ／ｍｌ　ＨｉｎｄＩＩＩを使用して、緩衝液２（（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中で３７℃にて２時間消化した。消化されたプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分離し、切り出されたバンドを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製した。ｐＥＡ８１０ベクターバンドと、ＰＢＲ３２２のインサートバンドとのライゲーションを、１：１の比率のベクター対インサート、及び４０，０００Ｕ／ｍｌのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、１６℃で１時間行った。ライゲーション産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）コンピテントセルに形質転換した。得られた正確なプラスミドの１つを、ｐＥＡ８１３と命名した。
【００６７】
第６に、ｐＥＡ８１３の最初のＭｔｕ　Ｒ２２７Ｃ　ｄｎａＢ　ＡａｔＩＩ部位を、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）及びオリゴヌクレオチド５’−ＧＣＣＧＣＣＧＡＴＣＣＧＣＧＡＣＡＴＣＧＴＡＧＡＴＴＴＣＧＧＣＣ−３’（配列番号４１）及び逆方向プライマー５’−ＧＧＣＣＧＡＡＡＴＣＴＡＣＧＡＴＧＴＣＧＣＧＧＡＴＣＧＧＣＧＧＣ−３’（配列番号４２）を使用して、部位特異的サイレント変異誘発によって排除して、プラスミドｐＥＡ８３２を得た。
【００６８】
第７に、プラスミドｐＥＡ８０８のＭｔｕ　ＤｎａＢ遺伝子を含有する野生型インテインをｐＥＡ８３２にシャッフルして戻した。ｐＥＡ８０８及びｐＥＡ８１３　ＤＮＡを、１×緩衝液１（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、５００Ｕ／ｍｌ　ＥｃｏＲＩ及び５００Ｕ／ｍｌ　ＨｉｎｄＩＩＩで、３７℃にて１時間消化した。消化されたプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって分離し、切り出されたバンドを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製した。ｐＥＡ８１３ベクターバンドと、ｐＥＡ８０８のインサートバンドとのライゲーションを、１：１の比率のベクター対インサート、及び４０，０００Ｕ／ｍｌのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、１６℃で１時間行った。ライゲーション産物を、Ｅ．ｃｏｌｉ株　ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）コンピテントセルに形質転換した。得られた正確なプラスミドの１つを、ｐＥＡ８２５と命名した。
【００６９】
第８に、ｐＥＡ８２５におけるＡａｔＩＩ部位の排除をｐＥＡ８１３について記載されたのと同一に行い、プラスミドｐＥＡ８３５を得た。
【００７０】
Ｍｔｕ　ＤｎａＢインテイン（ＩＶＰＳ）タンパク質スプライシングを破壊するペプチドについてのスクリーニング
以下は、スプライシングをブロックするペプチドについて選択するためのこの系の使用を実証する、実際の実験的な例である。以下に詳述されるように、７〜１２アミノ酸のランダムなペプチドは、α−スペクトリンの２ＥＦ−ハンドモチーフのループにインフレームに挿入され、上記に記載されるように、Ｍｔｕ　ＤｎａＢインテイン（ＩＶＰＳ）選択系と同じプラスミド上に含まれた。得られるプラスミドを、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼＥ．ｃｏｌｉ株ＥＲ２７４４（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に電気形質転換した（図１３及び１４を参照のこと）。形質転換体を、スプライシング堪能なクローンに対する選択を許容するためにアンピシリン及びＩＰＴＧの存在下、ＬＢ液体増殖培地中で選択した。プラスミドＤＮＡを選択されたクローンから単離し、そして消化して選択されたスペクトリンペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを単離した。選択されたスペクトリンループ領域ＤＮＡを、元来の選択プラスミドにクローン化して戻した。選択及び「バッククローニング」を反復回行った（図１４）。選択後、選択されたスペクトリンペプチドを発現分析のためにｐＥＡ８２５（非毒性ＤｎａＢ遺伝子を含有する）にクローン化した。最終的に選択されたクローンを、液体培地中で個々に増殖し、プラスミドにコードされたＭｔｕ　ｄｎａＢ遺伝子をＩＰＴＧによって特異的に誘導した。粗タンパク質細胞抽出液を電気泳動し、免疫染色のためにブロットした。Ｍｔｕ　ＤｎａＢのスプライスされた産物が検出されないクローンはポジティブ、すなわち、潜在的に選択されたペプチドによって、スプライシングが破壊されたクローンと考慮された。
【００７１】
ランダムなペプチドライブラリーを、以下のプロトコルを使用してインビトロにおいて合成した。１本鎖／２本鎖ＤＮＡハイブリッドカセットを、２つのオリゴヌクレオチド：５’−ＴＧＴＣＡＡＧＡＡＴＣＧＡＴＴＣＡＡＡＴＴＣＧＧＧＧＴＣＡＧＧＣＴＣＴＣＣ（（Ｗ）ＮＮ）７−１２ＡＴＡＧＣＣＡＡＧＣＧＡＴＣＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＴＴＴＡＡＡＧＣＣＣＴＧＡＴＧＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴ−３’（配列番号４３）及び５’Ｐ−ＣＴＧＡＡＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣ−３’（配列番号４４）のアニーリングによって合成した。５μｇのオリゴヌクレオチド配列番号４３及びオリゴヌクレオチド４４の３モルの等価物を、５０μｌの最終容量において、０．１Ｍ　ＮａＣｌの存在下で共に混合した。混合物を煮沸し、そして即座に同じ煮沸器中で室温に冷却した。２つのオリゴのアニーリングによって形成されるＤＮＡハイブリッドカセットの１本鎖のランダムなヌクレオチドの部分を、１×ＥｃｏＰｏｌ緩衝液（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）における２００μｌの最終容量中、４００μＭの各ｄＮＴＰ及び６０Ｕ／ｍｌのＫｌｅｎｏｗ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して伸張した。伸長反応は、２０分間３７℃でインキュベートし、そして製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｙ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているようにＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製した。６０μｇのｐＥＡ８３２（５０μｇ／ｍｌ）を、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡの存在下、４００Ｕ／ｍｌのＡａｔＩＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）及び５００Ｕ／ｍｌのＣｌａＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、１×緩衝液４（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中で消化した。消化を、３７℃で２時間行った。合成されたランダムなカセット（２０μｇ／ｍｌ）を、１００μｇ／ｍｌのＢＳＡの存在下、５００Ｕ／ｍｌのＣｌａＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、１×緩衝液４（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）中で消化した。カセットをさらに、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｙ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているようにＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製した。消化されたプラスミドＤＮＡを、０．７％アガロースゲルにおいて電気泳動し、切り出されたバンドを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているように、ＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用してさらに精製した。ライゲーションを、１：１の比率のベクター（２ｎｇ／μｌ）対インサート、及び１，６００Ｕ／ｍｌのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、１６℃で１時間行った。ライゲーション産物を、コンピテントセルの各２００μｌのアリコートについて２μｇの全ライゲーション産物を使用して、２．５４ｋＶ／ｃｍにて、２ｍｍキュベット（ＢＩＯＲＡＤ　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）中でＥ．ｃｏｌｉ株　ＥＲ２７４４（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）コンピテントセル（１×１０９ｐＥＡ８３５形質転換体／μｇの能力）に電気形質転換した。細胞を、１時間３７℃にて、振盪器中で回復させた。回復された形質転換体を、１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び１ｍＭ　ＩＰＴＧを含有するＬＢ液体増殖培地中に１／１００希釈にて接種した。形質転換体を、一晩３０℃にてインキュベートした。プラスミドＤＮＡを、ｔｉｐ１００カラム（ＱＩＡＧＥＮ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して、一晩培養物から単離した。ＡａｔＩＩ／ＣｌａＩを、上述のように消化し、４％ＧＴＧ　Ｎｕｓｉｅｖｅアガロースゲル（ＦＭＣ　ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）において電気泳動した。５７〜７２ｂｐのスペクトリンループＤＮＡインサートを、製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓｔｕｄｉｏ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）によって記載されているようにＱＩＡＥＸＩＩビーズを使用して精製し、上記のようにＡａｔＩＩ／ＣｌａＩ消化され、及び精製された選択プラスミド（ｐＥＡ８３２）にクローン化した。このプロトコルは、Ｍｔｕ　ＤｎａＢインテイン（ＩＶＰＳ）のタンパク質スプライシングに対して最も生物学的に活性な配列を有するペプチドクローンについての形質転換体のプールを富化するために、３回反復された。最終的に選択されたスペクトリンモジュールを野生型Ｍｔｕ　ｄｎａＢ遺伝子（ｐＥＡ８２５）を含有するｐＥＡ８３２相同プラスミドにクローン化し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する１０ｍｌ　ＬＢ中で、３７℃にて個々に増殖し、１ｍＭ　ＩＰＴＧで３時間誘導した。粗タンパク質細胞抽出物を、１０〜２０％の勾配のゲル（Ｎｏｖｅｘ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）において電気泳動した。ゲルは、さらに、Ｍｔｕ　ＤｎａＢタンパク質スプライシング産物を検出するために抗Ｔ７タグ抗体（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用する免疫染色のために、電気ブロットされた（図１５）。レーンＥｃｏ　ＤｎａＢは、Ｔ７でタグされた、インテイン非含有のＥ．ｃｏｌｉ　ＤｎａＢの抽出物を含む。ｐＭｔｕＤｎａＢは、Ｍｔｕ　ＤｎａＢのみを発現するクローンからの抽出物を含む。レーンｐ８１４、ｐ８１５、ｐ８１６、ｐ８１７、及びｐ８１８は、それぞれスプライシングの阻害について選択されるペプチドをコードする、クローンｐＥＡ８１４、ｐＥＡ８１５、ｐＥＡ８１６、ｐＥＡ８１７、及びｐＥＡ８１８の抽出物を含む。スプライシングの阻害がチキンα−スペクトリンループに挿入されるペプチドに起因したことを実証するために、ｐＥＡ８１８の選択された配列を、スペクトリン配列、ＤＬＰＭＶＥＥ（配列番号１０）で置き換えて、クローンｐＥＡ８１８ｒｅｖを作製し、そして抽出物をレーンｐ８１８ｒｅｖに負荷した。ｐＥＡ８１８ｒｅｖのスプライシングは、野生型スペクトリンタンパク質を発現するｐＭｔｕ　ＤｎａＢクローンと同じくらい効率的に生じた。スプライシングの不在下で、多くのＤｎａＢ前駆体は、インテインＣ末端スプライシング接合部にて切断を受けることに留意のこと。
【００７２】
これらのクローンにおいて挿入されたペプチドの配列は以下のものである：
ｐＥＡ８１４　　　　　ＴＶＱＳＴＫＲ（配列番号５）
ｐＥＡ８１５　　　　　ＲＰＡＰＲＰＬ（配列番号６）
ｐＥＡ８１６　　　　　ＰＴＡＲＴＹＥ（配列番号７）
ｐＥＡ８１７　　　　　ＰＴＲＰＴＡＰＰＬＮＦＳ（配列番号８）
ｐＥＡ８１８　　　　　ＨＰＮＰＨＰＴＬＳＧＱＲ（配列番号９）
ｐＥＡ８１８ｒｅｖ　　ＤＬＰＭＶＥＥ（配列番号１０）。
【００７３】
従って、本発明者らは、この系が、Ｍｔｕ　ＤｎａＢインテインのスプライシングをブロックするペプチドについて選択するために使用され得ることを実証した。この系は、薬剤が細胞に入り得る限り、Ｍｔｕ　ＤｎａＢインテイン又は他のＤｎａＢインテインのスプライシングの任意の調節因子の選択に受け入れられる。
【００７４】
実施例３
化学療法の目的のための、又は制御可能な遺伝子ノックアウトを作製するための、タンパク質スプライシングのインビボ制御
タンパク質スプライシングを調節する薬剤の選択について記載される選択及びスクリーニング系は、また、エクステイン遺伝子産物を阻害又は活性化する薬剤について選択するために、エクステイン遺伝子のインテインレスバージョンに適用される。本発明において記載される全ての選択及びスクリーニング系は、前駆体のエクステイン部分の活性又は不活性に基づく。当業者に公知の方法によってインテインを含有する遺伝子からインテインを欠失する場合、インテインを含有する前駆体のスプライシングを阻害又は活性化するために記載される方法をまた使用して、エクステイン活性をブロック又は活性化する薬剤について選択し得る。なぜなら、これらの後者の方法は、エクステイン機能をアッセイする工程を包含するからである。例えば、当業者に公知の方法によってＭｔｕ　ＤｎａＢ遺伝子からインテインを欠失する場合、ＤｎａＢ　インテインのスプライシングを阻害するために記載される方法を使用して、細胞障害性Ｍｔｕ　ＤｎａＢタンパク質の活性をブロックする薬剤について選択し得る。Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓは、次いで、必須のＤｎａＢタンパク質の活性をブロックする２つの薬剤のカクテルを使用して攻撃され得、これらの薬剤に対する耐性を発達することを生物体にとってより困難にする。
【００７５】
本発明者らは、以前に外来遺伝子へのＣＩＶＰＳ又はＩＶＰＳの挿入を記載した。これらの場合において、タンパク質スプライシングは、温度、変異、ｐＨ、光活性化ブロック基、リン酸化、又はペプチドによって制御され得る（Ｃｏｍｂら、米国特許第５，８３４，２４７号、及びＣｏｍｂら、米国特許第５，４９６，７１４号）。本実施例において、本発明者らは、インビボ又はインビトロでタンパク質スプライシングを制御し得る、特異的なタンパク質スプライシング阻害又は活性化剤を選択するための一般的な方法を記載する。方法は、遺伝子選択系又はレポーター系に等しく適用可能である。遺伝子選択によって、本発明者らは、本実施例において、試験生物体の生存能又は増殖速度は、実験の間にモニターされること意味し、一方本実施例においてレポーター系は、細胞生存能ではなく、呈色検出、蛍光、表現型などのようなマーカーのモニタリングを言及する。遺伝子選択系又はレポーター系は、所与のインテインのタンパク質スプライシングを破壊するか又は触媒するかのいずれかであり得る薬剤を同定するために使用され、実験の情況に依存する。当業者に公知の任意の遺伝子選択系又はレポーター系は、タンパク質スプライシングを破壊又は触媒する薬剤を単離するために使用され得る。このストラテジーは、外来の情況において、又はその天然の若しくは相同な情況において存在する任意のインテインに等しく適用可能である（例えば、相同なエクステインにおける同じ位置でのインテインの挿入）。しかし、ネイティブなインテインの使用が、これはインテインの酵素標的を最も良好に示すので好ましい。ネイティブな前駆体が実験宿主生物体において十分に発現しないか又は十分にスプライスしない場合、インテインは、当業者に公知の又は以前の実施例において記載される任意の方法を使用して、ネイティブなエクステインの宿主生物体の相同体におけるか、又は試験するための所望の特性を有する別のエクステイン相同体における同じ部位に挿入され得る。スプライシングを調節する薬剤を見出す本方法は、タンパク質スプライシング前駆体がその宿主における転写及び翻訳についての適切な制御シグナルに作動可能に連結される限り、任意の宿主に適用可能である。標的生物体は、タンパク質スプライシングを調節する薬剤を同定するための容易な実験モデルではないかもしれないので。薬剤はまずモデル系において同定されてよく、次いで最終的な標的生物体おいて試験されてよい。本ストラテジーは図１８においてまとめられている。
【００７６】
スプライシングの阻害を包含する実験は、制御可能であり得るか又はそうでないかもしれない十分に活性なインテインを含む前駆体を用いて開始される。本実験の目的は、このインテインのスプライシングを制御するために使用され得る薬剤を見出すことである。スプライシングの活性化を包含する実験において、目的は以前に不活性なインテインを活性にする薬剤を見出すことであるので、ＣＩＶＰＳ（制御可能なインテイン）又は不活性なインテインが必要とされる。インテインは、温度感受性のインテイン、スプライシングを遅延するか又はブロックする触媒に関与することが知られるアミノ酸における変異を伴うインテイン（両方のスプライシング接合部での及びインテインＢｌｏｃｋ　Ｂにおける保存されたアミノ酸を含む、（Ｐｅｒｌｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：０８７−１０９３（１９９７）、Ｐｉｅｒｔｒｏｋｏｖｓｋｉ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ．、３：２３４０−２３５０（１９９４））、ランダムに変異された及びスプライシングの阻害又はブロックについて選択されたインテインのように、当業者に公知の任意の手段によって不活性化されてよい。
【００７７】
好ましいのは、ポジティブな選択系である。一般に、ポジティブな選択系は宿主生物体に有害である遺伝子からなり、増殖培地又は宿主株の遺伝子背景に依存する。遺伝子産物は、細胞にとって、静的又は致死的であり、遺伝子産物が不活性化されない限り、宿主を殺傷するか又は増殖を妨げる。遺伝子産物は、ＤｎａＢの例（実施例２）におけるように優性的な様式において宿主細胞に対して直接的に細胞障害性であり得るか、又は、これはＧｙｒＡの例（実施例１）におけるように、遺伝子の染色体コピーが耐性である薬物に応答して優性的に細胞障害性であり得る。優性の又は優性的に細胞障害性によって、本発明者らは、細胞障害性でないか又は薬物に対して耐性である相同なタンパク質が存在する場合であっても毒性が生じること、すなわち、細胞障害性効果が、非細胞障害性相同体の存在にもかかわらず、細胞障害性の効果を支配することを意味する。タンパク質スプライシング阻害系の情況において、ポジティブな選択は、ＩＶＰＳ又はインテインのスプライシングに対する選択を許容する系を包含する。スプライシングが生じる場合、細胞障害性エクステインタンパク質は活性であり、細胞を殺傷するか又は増殖を阻害し；スプライシングが破壊される場合、細胞障害性エクステインタンパク質が不活性であり、細胞は増殖する。細胞増殖は、当業者に公知の任意の手段によってモニターされ得、固形培地上でのコロニーの観察、光学密度、ルシフェラーゼ活性の緑色蛍光タンパク質のような細胞増殖の蛍光レポーターのモニタリングを包含するが、これらに制限されない。エクステイン遺伝子は、未関連のレポーター系又はインテインの天然のエクステインであり得る（天然の前駆体を使用するか、又は相同なエクステイン情況へインテインを挿入するかのいずれかである）（図１８）。この情況において、選択系は、スプライシングを阻害する薬剤のみが細胞増殖を許容し、従ってスプライシングに対する効果を何ら有しない又は細胞に対して直接的に毒性である薬剤の背景において容易に見出されるという利点を有する。試験される薬剤が、また、宿主細胞において発現される場合、プレート上で生存するコロニーを試験する。試験される薬剤が、宿主細胞において発現されないが、代わりに培地に添加される場合、宿主細胞のアリコートは、マイクロタイターディッシュのような任意の数の装置中に、個々の薬剤又は薬剤のプールでの試験のために配置されなくてはならない。このような場合において、細胞が緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼのような蛍光を導くタンパク質を発現する場合、細胞増殖はより容易に測定され得る。
【００７８】
スプライシングを活性化する薬剤について選択する場合、インテインは既に存在するか、又はそのタンパク質産物が細胞増殖のために必要とされる遺伝子に挿入される。スプライシングの不在下で、細胞は増殖できないか又は死亡する。この選択系を実際に用いるために、スプライシングの不在下で細胞を救済し得る第２の遺伝子が存在する。遺伝子のこの第２のコピーは、温度感受性又は制御可能なプロモーターのような方法によって、スプライシングを活性化する薬剤が適用されるか、又は細胞に導入されるまで細胞増殖を許容するように制御可能であるべきである。細胞はスプライシングアクチベーターで処理され、次いでインテインを含まないか、又はこの遺伝子の発現がオフにされた第２の遺伝子産物の活性について許容されない条件に移される。次いで細胞増殖は、インテインを欠損する第２の遺伝子産物がもはや活性でないので、スプライシングを必要とする。
【００７９】
タンパク質スプライシングを改変するための薬剤を同定するための別の方法は、遺伝子選択ではなくスクリーニングを包含する。スクリーニング系は、その産物が容易にアッセイされ得るレポーター遺伝子を用いるが、細胞増殖を影響する必要はない。青／白β−ガラクトシダーゼスクリーニング系のような、多くのレポーター系が公知である。β−ガラクトシダーゼがＸ−ｇａｌに対して作用し、例えば、青色を生成し；β−ガラクトシダーゼ活性の不在下で、Ｘ−ｇａｌは無呈色の又は「白色」のままである。他のレポーターは、Ｂｕｒｎｓ及びＢｅａｃｈａｍ、Ｇｅｎｅ、２７：３２３−３２５（１９８４）、並びにＭｅｃｈｕｌａｍら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６３：７８７−７９１（１９８５）において記載されるレポーターを包含する。レポーター系がそれらのエクステイン遺伝子について利用可能であるか、又はインテインがレポーター遺伝子（本実施例においてβ−ガラクトシダーゼ）にクローン化され得る場合、ネイティブな前駆体を使用し得る（例えば、Ｂｅｌｆｏｒｔ、米国特許第５，７９５，７３１号及びＣｏｍｂら、米国特許第５，８３４，２４７号を参照のこと）。インテインのスプライシングを阻害するか、又はそうでなければ活性化する薬剤は、Ｘ−ｇａｌに対するβ−ガラクトシダーゼ作用のようなレポータータンパク質の機能をブロックして、青色のコロニーの変わりに白色を生じる。インテインのスプライシングを活性化するか、又はそうでなければ不活性化する、若しくはインテインをゆっくりと作用する薬剤は、レポータータンパク質機能を保持し、例におけるようにβ−ガラクトシダーゼ系を使用して青色コロニーを生じる。試験される薬剤が宿主細胞の中で発現されれば、プレート上に生存しているコロニーを調べる。試験される薬剤がまた宿主細胞中で発現されないが、代わりに培地に添加される場合、宿主細胞のアリコートは、マイクロタイターディッシュのような任意の数のデバイスにおいて、個々の薬剤又は薬剤のプールで試験するために配置されなくてはならない。選択とは異なり、全ての細胞がレポーター系において増殖し、及び読み取り結果が、各コロニー又は微生物培養物についてポジティブ又はネガティブであるかを決定しなければならない。
【００８０】
以前の実施例は、ｐｈｅＳ非相同性選択系並びにｇｙｒＡ及びｄｎａＢインテイン／エクステイン系に基づく遺伝子選択系を記載した。本実施例は、任意の選択又はレポーター系を使用してスプライシングを調節する薬剤についてどのようにスクリーニングするかを記載する。選択又はスクリーニング系は、インテインを含有する生物体において元来同定されていなかもしれないことに留意のこと。しかし、選択又はスクリーニング系がエクステイン相同体について記載された場合、これはインテインを含有する相同体に適用され得る。ＤｎａＢの場合に置けるように、同じ変異が、インテインを含有するエクステイン遺伝子についての選択可能な表現型を作製するために、インテインを含有する相同体において作製され得る。ＧｙｒＡにおける場合のように、スクリーニング系は、宿主を薬物耐性なままにする染色体変異を包含する；インテインを含有する相同体がまた、薬物に対してまた感受性であることを示すようにしさえすればよい。
【００８１】
反復性のスクリーニング（図１４）は、リード化合物を同定し、及びバックグラウンドを減少する方法を提供し、以下に記載されるスキームのいずれかにおいて使用され得る。反復性のスクリーニングは、新鮮なエクステイン遺伝子に対して薬剤を試験する反復されるサイクルを包含する。これは、薬剤が、スクリーニングの副生成物もまたであり得る変異されたエクステインに対して作用しないことを確実にすることを補助する。
【００８２】
天然の前駆体又はエクステイン相同体におけるインテインのタンパク質スプライシングの阻害又は活性化についてのポジティブな選択系
この場合において、目的のインテインは、選択可能なマーカー若しくはレポーターとして天然に作用し得るか、又は選択可能なマーカー若しくはレポーターに変換され得る、標的遺伝子において天然に見出され得る。最初の実験は、標的生物体において、又は細菌、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、哺乳動物細胞、昆虫細胞などのような実験的により受容されるモデル宿主において行われ得る。スプライシングをブロックする薬剤について選択するために天然のスプライシング前駆体を使用するか、又はモデル生物体からの相同なエクステイン遺伝子にインテイン遺伝子をまず挿入するかどうかに関する決定は、エクステイン遺伝子間の類似性、選択又はスクリーニングについて使用されるモデル宿主において発現する天然の前駆体又は組換え前駆体の能力、及びモデル宿主においてスプライシングする各前駆体の能力に依存する（図１８）。これらのパラメーターは、実験的に決定されなければならないが、よりエクステイン配列が類似するほど、モデル生物体からの相同なエクステインタンパク質においてスプライシングはより作用するようである。配列比較は、モデル生物体からの相同なエクステイン遺伝子における適切な相同なインテイン挿入部位を示す。
【００８３】
次に、任意の遺伝子選択系又はスクリーニングが任意の生物体において標的エクステインについて利用可能であるか否か、及びエクステイン遺伝子が任意の生物体において細胞増殖について必須であるか否かを、文献サーチによって決定しなければならない。標的遺伝子が必須であるが、遺伝子選択又はスクリーニングがなにも利用可能でない場合、選択又はレポーター系を作製することを試みるために、これは直接的に又はモデル系において変異誘発され得る。標的遺伝子産物が細胞に必須である場合、規定された条件下で、宿主遺伝子はノックアウトされ、そして遺伝子の制御可能なコピーによって置き換えられるか、又は温度感受性活性を作製するために変異されるかのいずれかであり得る。インテインを含有する遺伝子は、宿主遺伝子相同体が不活性化される場合、活性な産物を生成しなければならない。温度感受性表現型は容易に、当業者によるランダムな又は合理的な変異によって作製され得る。一旦選択系が同定され、そして良好なスプライシング前駆体が決定されると（天然に存在する前駆体から選択するか、又は標的又は選択生物体からの相同なエクステインにインテインを挿入した後に）、スプライシングをブロックする薬剤について試験することは、モデル生物体又は標的生物体のいずれかにおいて開始され得、使用の容易さに依存する。スプライシングをブロック又は活性化する薬剤を同定するための可能なスキームのいくつかが、図１９において示される。
【００８４】
スキーム１は、スプライシングを阻害する薬剤について選択するための方法である。選択系は、薬物に応答する優性な細胞障害性の表現型を包含する。優性な細胞障害性によって、本発明者らが意味するところでは、スプライスされた産物は、エクステイン遺伝子の耐性コピーの発現にもかかわらず、細胞に対して毒性である。実施例１において記載されるＧｙｒＡ系は、このタイプのスキームの例である。選択宿主生物体は、薬物に対して耐性であり及び薬物の存在下での生物体の増殖を許容するエクステイン遺伝子の染色体コピーを含有する。第１に、薬物に感受性でありインテインを含有する遺伝子、及び薬物に耐性でありインテインを含有しない遺伝子を含む、二倍体が作製される、第２に、耐性なエクステイン遺伝子及びインテインを含有する感受性のエクステイン遺伝子を含む宿主が、次いで、細胞に入り得る薬剤で、又は細胞内での薬剤の発現の誘導によって処理される。最後に、選択薬物が細胞に添加される。インテインがスプライスする場合、薬剤が存在すると、薬剤感受性の標的タンパク質は細胞を殺傷するか、又は増殖を阻害する。任意の薬剤がスプライシングをブロックする場合、薬物感受性エクステインタンパク質は何ら作製されず、及び生物体は増殖する。通常、単一の薬剤ではなく、任意のタイプの化合物のライブラリーを試験し、例えば、マイクロタイターディッシュにおけるように小さな培養物を使用する。任意のタイプの薬剤が、これが細胞に入り得る限り、使用され得る。あるいは薬剤はクローン化され得、標的細胞において発現され、そしてクローンはプレート上での又は液体培地中での増殖について試験され得る。コンビナトリアルペプチドライブラリーの発現は、細胞において発現されるこのような薬剤の例である。
【００８５】
スキーム２は、スプライシングを阻害する薬剤について選択するための第２の方法である。選択系は、外因性薬剤処置の不在下での優性致死の表現型を包含し、これはインテインを含有するエクステインタンパク質において遺伝されるか、又はエクステインタンパク質に導入され得る。実施例２において記載されるＤｎａＢ系は、このタイプの系を例示する。選択宿主生物体は、細胞に対して毒性でなく、及び生物体の増殖を許容する野生型遺伝子を含む。先ず、細胞に対して毒性であるが、インテインを含有する遺伝子、及び毒性でないインテインレスエクステイン遺伝子を含む二倍体が作製される。次に、この宿主は、細胞障害性前駆体遺伝子が発現される前に細胞に入り得る薬剤で処理される。最後に、インテインを含有する細胞障害性エクステイン遺伝子の発現が誘導される。インテインがスプライスする場合、細胞障害性の標的タンパク質は細胞を殺傷するか、又は増殖を阻害する。任意の薬剤がスプライシングをブロックする場合、細胞障害性の標的タンパク質は何ら作製されず、生物体は増殖する。通常、単一の薬剤ではなく、任意のタイプの化合物のライブラリーを試験し、例えば、マイクロタイターディッシュのような、小さな培養物を使用する。任意のタイプの薬剤が、これが細胞に入り得る限り、使用され得る。あるいは薬剤はクローン化され得、標的細胞において発現され得、そしてクローンはプレート上での又は液体培地中での増殖について試験され得る。コンビナトリアルペプチドライブラリーの発現は、細胞において発現されるこのような薬剤の例である。
【００８６】
スキーム３は、必須の遺伝子のスプライシングを阻害する薬剤を選択する。この場合において、遺伝子の染色体コピー、又はその等価物は、温度感受性であるか、劣性の様式において薬物に感受性であるか、又はいくつかのタイプの発現制御下にあるかのいずれかである。あるいは、エクステイン遺伝子の染色体コピーは、不活性化されるか、又はノックアウトされる。細胞は遺伝子産物が必要とされない条件下で増殖し得る。次いで、細胞は、生存にエクステインタンパク質を必要とする条件に移される。このタイプのエクステインの例は、代謝酵素である。細胞が富化培地中で増殖される場合、それらは増殖し得る。しかし、細胞が最小培地、又はエクステインでブロックされる代謝経路の下流の産物を欠損する培地中で増殖される場合、細胞は増殖できない。インテインを含有する標的遺伝子は、温度感受性でも薬物耐性でもない。染色体エクステイン相同体について非許容性の条件下でスプライシングが生じる場合、細胞は生存する。この系は、例えば、マイクロタイターディッシュウェルのような単離された容器中での細胞増殖のアッセイを必要とする。薬剤がスプライシングをブロックする場合、細胞は、エクステインタンパク質のインテインレスコピーの活性について非許容性の条件下で増殖しない。細胞増殖は、光学密度、又は細胞において生成される蛍光団の存在を測定することを包含するがこれらに制限されない、当業者に公知の任意の手段によって決定され得る。第１に、実験宿主は、エクステイン遺伝子又はその等価物の制御可能なコピーを含むことが見出されなくてはならない。これは、活性なインテインレスエクステインタンパク質の発現について許容性の条件下で増殖される。第２にこの宿主は、野生型エクステイン遺伝子又はインテインを含有するエクステイン相同体遺伝子を含むベクターで形質転換される。第３に、エクステイン遺伝子のインテインプラス及びインテインマイナスコピー、又はその等価物を含む二倍体細胞が、スプライシングをブロックするための薬剤で処理され、さらに、インテインレスエクステインタンパク質の活性について非許容性の条件下に移される。これは、インテインマイナスタンパク質が不活性である温度への移行、異なる培地に移行するインテインマイナスの発現についてインデューサーの除去、又はインテインマイナスタンパク質を不活性化する薬物の添加を包含し得る。スプライシングが生じる場合、細胞はインテインプラス遺伝子産物を使用して増殖することを継続する。しかし、薬剤がスプライシングを阻害する場合、遺伝子の両方のコピーの産物が不活性化され、細胞は死亡する。あるいは、薬剤は、標的細胞中にクローン化され得、発現され得る。しかし、この場合において、各クローンは、ライブラリーの生存するコピー及びスプライシングの阻害について試験されるコピーを維持するために、コピーされなくてはならないか、又はレプリカプレートされなくてはならない。コンビナトリアルペプチドライブラリーの発現は、宿主細胞において発現されるこのような薬剤の例である。
【００８７】
スキーム４〜６は、スプライシングを阻害するのではなく、これを活性化する薬剤について選択する方法である。前駆体は、任意のタイプのベクター上で細胞に導入される不活性なインテインを含む。薬剤は、個々に、又はプールにおいて、単離された培養物に添加される。あるいは、薬剤が、標的細胞においてクローン化され、及び発現される。しかし、この後者の場合において、各クローンは、ライブラリーの生存するコピー及びスプライシングの活性について試験されるコピーを維持するために、コピーされなくてはならないか、又はレプリカプレートされなくてはならない。コンビナトリアルペプチドライブラリーの発現は、宿主細胞において発現されるこのような薬剤の例である。
【００８８】
スキーム４は、スキーム１に同一である。薬物の存在下で、スプライシングを活性化する薬剤は、遺伝子のインテインプラス薬物感受性コピーが活性化され、優性的に細胞障害性であるので、宿主細胞を殺傷する。例えば、マイクロタイターディッシュウェルのような単離された培養物における増殖の不在についてアッセイする。
【００８９】
スキーム５は、スキーム１に類似する。スプライシングを活性化する薬剤は、インテインマイナス遺伝子に由来する野生型エクステインタンパク質の存在にもかかわらず、優性的に細胞障害性のエクステインがインテインのスプライシング後に活性であるので、宿主を殺傷する。例えば、マイクロタイターディッシュウェルのような単離された培養物における増殖の不在についてアッセイする。
【００９０】
スキーム６は、選択系が、細胞増殖のためにスプライスされた標的遺伝子の発現を必要とし、及びスプライシングを活性化する薬剤について選択することを除いて、スキーム３に類似する。このタイプの系において、標的エクステイン遺伝子のインテインマイナスコピー、又はその等価物は、温度感受性であるか、劣性の様式において薬物に感受性であるか、又はいくつかのタイプの発現制御下にあるかのいずれかである。あるいは、エクステイン遺伝子の染色体コピーは、不活性化されるか、又はノックアウトされる。細胞は遺伝子産物が必要とされない条件下で増殖し得る。次いで、細胞は生存にエクステインタンパク質を必要とする条件に移される。このタイプのエクステインの例は、代謝酵素である。細胞が富化培地中で増殖される場合、それらは増殖し得る。しかし、細胞が最小培地、又はエクステインブロックされる代謝経路の下流の産物を欠損する培地中で増殖される場合、細胞は増殖できない。インテインを含有する標的遺伝子は、温度感受性でも薬物に対して耐性でもない。インテインを含有する標的遺伝子は、当業者に公知の任意の手段によって細胞の中に導入される。この場合において、インテインはこれがアッセイ条件下でスプライスし得ないように改変されている。遺伝子の宿主コピーは、許容性の条件（許容性の温度、薬物の不在下、許容性の発現条件下の富化培地など）の下で活性な形態において発現されて、細胞を増殖させる。標的エクステイン遺伝子のインテインプラスコピーは、不活性なインテインを含み、細胞に導入される。インテイン前駆体の発現が確立される後、薬剤は外的に添加されるか、又はペプチドライブラリーはスプライシングを誘導するために内的に発現される。薬剤にスプライシングを活性化させた後、細胞は非許容性の条件（非許容性の温度、薬物の存在下の、非許容性発現条件の下の最小培地）に移される。増殖し得る細胞のみが、スプライシング活性が薬剤によって回復された細胞である。外部薬剤が試験される場合、マイクロタイターディッシュウェルのような薬剤は単離された容器中で細胞に添加される。あるいは、薬剤はクローン化され、標的細胞において発現される。この場合において、薬剤のライブラリーはプレート上で細胞生存能について直接的に試験され得る。コンビナトリアルペプチドライブラリーの発現は、宿主細胞において発現されるこのような薬剤の例である。
【００９１】
その天然の前駆体又はエクステイン相同体におけるインテインのタンパク質スプライシングの阻害又は活性についてのレポーター系
扱いやすい表現型に変換され得る任意のエクステインが、レポーター系スクリーニングにおいて使用され得る。このタイプの系は、任意の直接的な又は間接的な手段により、活性なインテインと不活性なエクステインとの間を区別する能力を必要とする。一旦レポーター系が利用可能になると、インテインを含有する遺伝子は、当業者に公知の任意の方法によって細胞に導入され、そしてスプライシングを阻害する薬剤が添加されるか、又は上述のように導入される。あるいは、不活性なインテインは細胞に導入され、これを活性化する薬剤が添加されるか、又は上述のように導入される。次いで、個々のクローンを試験し、エクステインが活性であるか否かを決定する。
【００９２】
未関連のエクステイン情況におけるインテインタンパク質スプライシングの阻害又は活性化についての系
スプライシングを阻害又は活性化する薬剤を同定するこの方法についてのシナリオは、インテインが未関連のエクステインにおいて配置されることを除いて、上記のスキームと同じである。しかし、最初にインテインが非相同なエクステインにおいてスプライスすることを決定しなければならない（図１８）。インテインが非相同な外来情況においてスプライスするという可能性を改善するために、インテイン挿入部位は、天然のエクステイン配列に対して、少なくとも１つから５つまでの、又はそれ以上のエクステイン残基について可能なように類似するべきである。インテインが標的タンパク質の非必須の領域に挿入される場合、インテイン挿入部位で、そのインテインのネイティブなエクステイン配列と同じであるように標的タンパク質の配列を潜在的に改変し得る。インテインは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ，又はＣｙｓの前で、クローン化されなくてはならず、インテインを天然に続くアミノ酸は、最も良好な選択であり、又はＳｅｒ、Ｔｈｒ、若しくはＣｙｓコドンは、インテイン配列と共にエクステインに挿入されなくてはならない。折り畳みを改善するために、タンパク質上の表面配置は、これらがエクステインがインテインから独立して折り畳まれることをより許容するようであるので、好ましい。標的タンパク質の構造が未知である場合、標的タンパク質におけるプロテアーゼ感受性部位は、インテインを挿入するための良好な部位であるべきである。スプライシングは配列依存性であり得るので、最終的に制御することを所望する同じ標的タンパク質においてスプライシングを改変する薬剤を実験的に同定することが至適である。しかし、薬剤はまた潜在的に、任意のエクステインにおいてそのインテインのスプライシングを制御し得る。新規なエクステインは、実験的に処理されなくてはならないかもしれない。
【００９３】
制御可能なノックアウト
一旦、スプライシングを阻害又は活性化し得る薬剤が見出されると、標的生物体における相同なエクステイン遺伝子は、当業者に公知の方法によってインテインを含有する相同な遺伝子によって置き換えら得る。例えば、これは、インテインを含有する遺伝子を、相同組換えによってエクステイン遺伝子の染色体コピーに直接的に挿入することによって、１工程プロセスにおいて行われ得る。あるいは、インテインを含有する遺伝子は、生物体に導入され、インテインを含有しない相同体は、同時に又は別々のいずれかで、事象の任意の順序において、不活性化される。一旦、活性なエクステイン遺伝子のコピーのみが、インテインを含むと、遺伝子機能は、生物体がスプライシングをブロックする薬剤で処理される場合、阻害され得る。他方、スプライシング障害性のインテインが使用される場合、遺伝子機能は、生物体がスプライシングを活性化する薬剤で処理される場合、活性化され得る。薬剤及びスプライシングは、スプライシング活性化剤又は阻害剤の添加又は除去によって生物体の発生及び生涯の間の任意の時点で調節され得る。例えば、マウス肺発生についての遺伝子は、インテインを含有する遺伝子相同体で置き換えられ得、そしてその遺伝子の産物は、遺伝子産物が必要とされる時期を決定するために、及びこれが発生又は増殖の複数の段階の間必要とされるのか否かを決定するために種々の時点で活性化又は不活性化され得る。第２の例において、細胞周期の特定の段階を介する継代について必要とされると考えられる遺伝子産物は、遺伝子産物が必要とされる正確な時期の研究を、又は同期化された細胞の培養物において任意の薬剤の効果を研究するために細胞周期における同じ時点で全ての細胞を静止することによって培養を同期化することなどを、許容するインテインを含有するコピーで置き換えられ得る。
【００９４】
治療における制御可能なインテイン（ＣＩＶＰＳ）の使用
いくつかの選択が、特定の時期に又は特定の場所に活性なタンパク質を送達するための、制御可能なスプライシングの使用について想定され得る。多くの例において、治療学的薬物は宿主に対して細胞障害性であり、標的部位でのみ活性である場合最も良好である。例えば、化学療法薬物は、しばしば、遺伝的に細胞障害性であり、正常な細胞における有害な反応は、薬物が腫瘍において特異的に活性化され得る場合、排除され得る。少なくとも部分的にタンパク質分解性である薬物を有する場合、上記のように、第２の薬剤によって活性化又は阻害され得るインテインは、治療学的薬剤のタンパク質部分へ挿入され得る。次いで、薬物は、不活性な形態において全身的に投与される。次いで薬物は、（１）腫瘍に活性化剤を注入することによって、（２）腫瘍の温度を増加し、従って温度感受性のインテインのスプライシングを誘導するために、レーザー処理に腫瘍を曝露することによって、（３）不活性な細胞障害性前駆体を腫瘍細胞に標的し、次いで、スプライシングアクチベーターを全身的に添加するために遺伝子治療を使用することによって、又は（４）活性化ペプチドを腫瘍に標的化し、不活性なインテインを含有する薬物を全身的に添加する遺伝子治療を使用することによって、腫瘍又は標的器官において特異的に活性化され得る。上記の実施例において、不活性な細胞障害性前駆体又は活性化ペプチドはそれぞれ、組織又は細胞特異的でないベクターで全身的に形質転換され得、組織特異的プロモーターにこれらの遺伝子を作動可能に連結することによって、特定の標的細胞においてのみ発現され得る。
【００９５】
実施例４
温度制御可能なインテインを作製するための方法
スプライシングを阻害又は活性化する薬剤を同定する為に使用される方法はまた、ある温度で活性であり及び第２の温度で不活性であるインテイン（温度感受性のインテインと呼ばれる）を同定するために使用され得る。外部薬剤を添加するか、又は内部薬剤を発現する代わりに、インテインは、エラー傾向ポリメラーゼ連鎖反応（図２０）又はインテインにおける特定の部位でのコンビナトリアルＤＮＡ配列の使用のような、当業者に公知の任意の方法によってランダムに変異される。あるいは、Ｃ末端スプライス接合部残基、インテインＮ末端、インテインの最後から二番目の残基、インテインＢｌｏｃｋＢ（Ｐｅｒｌｅｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：１０８７−１０９３（１９９７）、Ｐｅｒｌｅｒ、Ｎｕｃｌｅａｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７：３４６−２４７（１９９９）、Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ、前出）における残基、結晶学的に決定されるようなインテイン活性部位に近接する残基（Ｄｕａｎら、Ｃｅｌｌ、８９：５５５−５６４（１９９７）；Ｋｌａｂｕｎｄｅら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、５：３１−３６（１９８８）などのような、化学反応において機能するか、又はこれを補助すると考えられる残基を特異的に変異し得る。次いで、変異されたインテイン遺伝子は、細胞に導入され、研究者によって選択されるような、及び任意の組み合わせの温度であり得る、許容性の又は非許容性の温度下でスプライシングする能力について試験される（図２１）。スプライシングは、染色体又はインテインマイナスエクステイン遺伝子が同様に温度に感受性でない限り、実施例Ｉ〜ＩＩＩにおけるようにアッセイされる。
【００９６】
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡエクステインにおいてＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞において融合物を発現して（実施例１）、本発明者らは、Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテインのスプライシングを温度感受性にする変異を作製するいくつかのポリメラーゼ連鎖反応を同定した（図２０、２１、２２、及び２３）。これらの前駆体は、１９℃でスプライスするが、３７℃でスプライスしない。さらに、これらの変異体は、インテインＢｌｏｃｋ　Ｂを含むβシート中に集中される（図２２及び２３）。
【００９７】
温度感受性Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテイン変異体についてのスクリーニング
実施例１において記載されるｇｙｒＡ選択系は、また、オフロキサシン感受性Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡエクステインにおけるＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインの温度感受性スプライシング変異体についてスクリーニングするために、使用され得る。実験は、ｐＥＡ６００に類似するベクターを用いて行われた。スプライシング堪能なクローン及びスプライシング欠損クローン（インテインＣｙｓ１のＡｌａへの、及びＡｓｎ１９８のＡｌａへの変異を含有する）を、スプライシング欠損クローンの増殖を許容するが、スプライシング堪能なクローンの増殖をブロックしながら、適当な薬剤濃度を決定するために、種々の濃度のオフロキサシンを含有する固形培地上にプレートした。次いで、Ｍｘｅ　ｇｙｒＡインテイン遺伝子を、当業者に公知の変異原性ストラテジーを使用するＰＣＲによって増幅し（図２０）、Ｅ．ｃｏｌｉ　ｇｙｒＡ遺伝子に挿入した。ライブラリーを予め決定された濃度でオフロキサシンを含む固形培地上にプレートし、レプリカプレートし、３７℃又は１６℃のいずれかで増殖した（図２１）。スプライシングを欠損するクローンのみが生存し、プレート上で増殖した。レプリカプレートを、３７℃で増殖したが、１６℃では増殖しなかったクローンを同定するために比較した。このようなクローンをつついて、温度依存性スプライシングについて再試験した。あるいは、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡにおいて変異されたＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインのライブラリーを３７℃にて増殖し、次いで第２のプレート上に画線して、１６℃のスプライシング許容性の温度での増殖の欠損について試験した。ＧｙｒＡ前駆体のスプライシングを、３７℃で３時間、オフロキサシンの不在下でインキュベートし、次いで１６℃に一晩移行することによって、１６℃で増殖できないクローンにおいて試験した。細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、これを次いでクマシーブルーで染色した。スプライスされたＧｙｒＡが、いくつかのクローンにおいて観察されたが、スプライシングは完全ではなかった（図２２）。
Ｍｘｅ　ｇｙｒＡインテイン遺伝子を、いくつかのこれらの温度感受性クローンから配列決定し、図２３においてまとめられる１つ以上の変異を有することを見出した。Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテインの３−Ｄ構造は公知であり（Ｋｌａｂｕｎｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：３１−３６（１９９８））、ＧｙｒＡは、本発明者らが、これらの変異をＭｘｅ　ＧｙｒＡインテイン構造上に配置することを可能にした（図２４）。本発明者らは多くの変異が、インテイン　Ｂｌｏｃｋ　Ｂ（図２３及び２４）を含むβ−シート中に、特にＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインβ鎖Ｂ８、及びβ鎖Ｂ８とＢ９（Ｋｌａｂｕｎｄｅ、前出；Ｐｅｒｌｅｒ　Ｃｅｌｌ　９２：１−４（１９９８））との間のループ中に特異的にあったことを見出した。インテインＢｌｏｃｋ　Ｂは、インテインＮ末端スプライス接合部での自己触媒反応を補助すると考えられる保存されたインテイン残基を含む（Ｋｌａｂｕｎｄｅ、前出；Ｎｏｒｅｎ、Ｃ．Ｊ．ら、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ　Ｃｈｅｍｉｅ（印刷中））。温度感受性Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテイン変異体についてのこの選択におい見出されるような、インテインＢｌｏｃｋ　Ｂに空間において近位の残基における変異は、Ｂｌｏｃｋ　Ｂ残基の位置をわずかに混乱させ得、温度感受性の表現型を生じる。
【００９８】
本発明者らは、他のインテイン中の類似のβ鎖及びループにおけるアミノ酸の変異が、任意のインテインの温度感受性変異体を作製し得ることを示唆する。他のインテインにおける相同な領域は、公知のインテインスプライシングドメインの構造的な類似性、及びインテインの複数の配列アラインメントに起因して、容易に同定され得る。今日までに、Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテイン（Ｋｌａｂｕｎｄｅ、前出）、Ｓｃｅ　ＶＭＡインテイン（Ｄｕａｎら、Ｃｅｌｌ　８９：５５５−５６４（１９９７））、及びショウジョウバエハリネズミタンパク質自己プロセシングドメイン（Ｈａｌｌら、Ｃｅｌｌ、９１：８５−９７（１９９７））の３−Ｄ構造が決定された。両方のインテインのスプライシングドメイン及びハリネズミ自己プロセシングドメインのＮ末端部分は、同じタンパク質折り畳みを有し；これらの３つの構造のそれぞれにおけるアミノ酸の大部分のα炭素追跡は極めて不可能である（Ｋｌａｂｕｎｄｅ、前出；Ｐｅｒｌｅｒ、前出（１９９８））。インテインアミノ酸配列の類似性の比較はまた、文献において記載されている（Ｐｅｒｌｅｒ、前出（１９９７）、Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ、前出（１９９４）、Ｐｉｅｔｒｏｋｏｖｓｋｉ、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ．７：６４−７１（１９９８）、Ｄａｌｇａａｒｄら、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｌ．４：１９３−２１４（１９９７））。
【００９９】
インテインスプライシングドメイン構造及び配列における類似性を考慮して、当業者は、Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテインβ鎖Ｂ８及びβ鎖のＢ８とＢ９との間のループに類似である任意のインテインにおいて領域を同定すること、及びこの情報を用いて、温度感受性タンパクスプライシング変異体を特異的に生成するために、この領域を変異することが容易に可能であるべきと考えられる。
【０１００】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
タンパク質スプライシング前駆体及び産物、並びに各エレメント又はその部分についての代替の名称を示した図である。
【図２】
インビボで優性致死自殺遺伝子のインテインスプライシングをブロックするペプチドの選択についての一般的なスキームを示した図である。
【図３】
薬物（オフロキサシン）とのＥ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡ相互作用によるＤＮＡ複製の不可逆的なブロッキングを示した図である。
【図４】
インテインスプライシングをブロックする薬剤の選択についての、Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテインスプライシング系を示した図である。相同なＥｃｏ　ＧｙｒＡエクステインからのＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインのスプライシングは、薬物感受性の、野生型Ｅｃｏ　ＧｙｒＡを生成し、これは、薬物耐性である染色体変異体ＧｙｒＡの存在にもかかわらず、オフロキサシンの存在下で、複製の間に細胞を殺傷する不可逆性の共有結合性の毒複合体を形成する。
【図５】
インテインスプライシングをブロックする薬剤の選択のための、Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテインスプライシング系を示した図である：相同なＥｃｏ　ＧｙｒＡエクステインからのＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインのスプライシングのブロッキングは、不活性な薬物感受性Ｅｃｏ　ＧｙｒＡ、及びオフロキサシン耐性である染色体変異体ＧｙｒＡの発現を生じる。従って、活性な薬物耐性Ｅｃｏ　ＧｙｒＡの不在下で（スプライシングの妨害物に起因する）、宿主は増殖する。
【図６】
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡ（配列番号１）及びＭ．ｘｅｎｏｐｉ　ＧｙｒＡ（配列番号２）配列の部分のアミノ酸配列比較を示しており、ＧｙｒＡエクステインが、アミノ酸配列において、特に矢印によって印されるインテイン挿入部位にて、非常に類似することを示す。
【図７】
相同なＥｃｏ　ＧｙｒＡエクステインにおけるＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインの効果的なスプライシングを示すゲルである。ＥｃｏＧｙｒＡの位置は、黒く塗りつぶされた囲みによって示され、及びＥｃｏ　ＧｙｒＡにおいてＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインを含む前駆体の位置は、黒及び白の囲まれたマーカーによって示され、白い囲みはインテインの存在を示す。
【図８】
ＤＮＡ複製機構にＤｎａＢを負荷するために必要とされる、ＤｎａＣでのＤｎａＢの交差を示した図である。
【図９】
破壊されたＤＮＡ複製及び細胞死を導く変異体Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤｎａＢヘリカーゼによるＤｎａＣの隔離を示した図である。
【図１０】
インテインスプライシングをブロックする薬剤の選択のためのＭｔｕ　ＤｎａＢヘリカーゼインテインスプライシング系を示した図であり：優性致死変異体Ｍｔｕ　ＤｎａＢヘリカーゼエクステインからのＭｔｕ　ＤｎａＢヘリカーゼインテインのスプライシングは、染色体　Ｅｃｏ　ＤｎａＢヘリカーゼの存在にもかかわらず、Ｅｃｏ　ＤｎａＣを隔離し、及び複製を毒する変異体Ｍｔｕ　ＤｎａＢヘリカーゼを生成し、結果として、宿主は死亡する。
【図１１】
インテインスプライシングをブロックする薬剤の選択のためのＭｔｕ　ＤｎａＢヘリカーゼインテインスプライシング系を示した図であり：優性致死変異体Ｍｔｕ　ＤｎａＢヘリカーゼエクステインからのＭｔｕ　ＤｎａＢヘリカーゼインテインのスプライシングのブロックは、Ｅｃｏ　ＤｎａＣの隔離を妨げ；染色体Ｅｃｏ　ＤｎａＢヘリカーゼは発現され、そして宿主は増殖する。
【図１２】
Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤｎａＢヘリカーゼ（配列番号３）及びＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＤｎａＢのヘリカーゼ（配列番号４）の配列の部分のアミノ酸配列比較を示しており、アミノ酸配列が非常に類似すること、及びこれを細胞傷害性にするために変異されたＥ．ｃｏｌｉ　ＤｎａＢにおける部位が、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＤｎａＢにおいて保存されること（最初の拡大された配列）、及びインテイン挿入部位がまた、Ｅ．ｃｏｌｉ　ＤｎａＢにおいて保存されること（矢印によって示される）を示す。
【図１３】
チキンα−スペクトリンを使用するコンビナトリアルペプチドライブラリーの生成、及びＭｘｅ　ＧｙｒＡヘリカーゼインテインスプライシングをブロックするそれらについてのこれらのペプチドのスクリーニングを示した図である。「ａａ」はランダム化され得るスペクトリンの１部分を示す。スペクトリン足場は種々の他の形状によるトラパゾイド及び異なるアミノ酸配列によって示される。スペクトリンが前駆体に結合する場合、スプライシングはブロックされる。系は３つの成分を有する：Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主細胞、スペクトリンライブラリー、及びインテイン＋ＧｙｒＡ遺伝子。後者の２つの遺伝子は、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下で単一のプラスミド上に存在する。
【図１４】
Ｍｘｅ　ＧｙｒＡをブロックするコンビナトリアルペプチドの反復性のスクリーニングを示す流れ図である。
【図１５】
ペプチドｐ８１４−８１８（配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０）が、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてＭｔｕ　ＤｎａＢのスプライシングをブロックすることを示すゲルである。これは、各ＤｎａＢタンパク質のＮ末端でＴ７タグを検出するために抗Ｔ７タグ抗体を使用するウェスタンブロックである。ｐ８１５ｒｅｖにおいて、α−スペクトリンにおける選択されたブロッキングペプチド配列は、スプライシングの阻害が選択されたペプチド配列に起因することを実証するために、野生型スペクトリン配列で置き換えられた。右側のバンド及びマーカーは、ウェスタンブロットの上部から下部へ、それぞれ、前駆体、推定のＣ―末端切断産物、及びスプライスされたＤｎａＢエクステインを示す。サイズマーカーはレーンＭにある。
【図１６】
チキンα−スペクトリンを使用するコンビナトリアルペプチドライブラリーの生成、及びＭｔｕ　ＤｎａＢにおいてＭｔｕ　ＤｎａＢインテインスプライシングをブロックするそれらについてのこれらのペプチドのスクリーニングを示した図である。Ｅ．ｃｏｌｉ　ＧｙｒＡジャイレース。「ａａ」はランダム化され得るスペクトリンの１部分を示す。スペクトリン足場は種々の他の形状によるトラパゾイド及び異なるアミノ酸配列によって示される。スペクトリンが前駆体に結合する場合、スプライシングはブロックされる。系は３つの成分を有する：Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主細胞、スペクトリンライブラリー、及びインテイン＋ＧｙｒＡ遺伝子。後者の２つの遺伝子は、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの制御下で単一のプラスミド上に存在する。
【図１７】
スプライシング及びＤＴＴによるＮ末端切断の際の、異種エクステインの情況におけるＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインを先行する単一のアミノ酸の効果を示す表である。
ａＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインは、マルトース結合タンパク質とショウジョウバエｉｍｍｉｔｉｓパラミオシンのフラグメント（Ｔｅｌｅｎｔｉら、（１９９７）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１７９、６３７８−８２；Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、（１９９９）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（印刷中））との間に挿入された。この融合タンパク質はＥ．ｃｏｌｉにおいて、スプライシングを試験するために１９℃にて、またはＤＴＴ（ジチオトレイトール）による切断についてのＮ末端タンパク質スプライス接合部の活性化を試験するために３７℃にて（その前駆体のスプライシングについて非許容性の温度）、発現された。３７℃にて発現されたサンプルは、５０ｍＭ　ＤＴＴの存在下で１９℃にてインキュベートされ、そして（１）Ｎ末端スプライス接合部でのＤＴＴ切断の速度は、野生型￣インテインを先行する１アミノ酸（Ｔｙｒ）を有する前駆体に比較される各前駆体のＤＴＴ切断速度のパーセントとして定量されるか、または（２）ＤＴＴ中での一晩のインキュベーション後の切断される産物の量であった。（ＮＤ＝測定せず）
【図１８】
インテインのスプライシングを阻害又は活性化する薬剤を試験するための選択又はレポーター系を開発するために、ネイティブな前駆体、相同なエクステイン、又は異種エクステインを選択するためのフローチャートである。
【図１９】
タンパク質スプライシングを阻害又は活性化する薬剤を選択する種々の方法のまとめである。各系はインテインプラス−及びインテインマイナス−エクステイン遺伝子を含む二倍体細胞に基づく。
【図２０】
インテインのエラー傾向のＰＣＲ、続いてＥ．ｃｏｌｉ　Ｍｘｅ　ｇｙｒＡエクステインへの変異されたインテイン遺伝子のクローニングによる、Ｍｘｅ　ｇｙｒＡインテインにおいてランダムな変異を作製するための模式図を描く。
【図２１】
薬物の存在が細胞を殺傷し、インテインがスプライスされた実施例１において記載されるＧｙｒＡ選択に基づく選択のスキームを描く。温度１にてスプライスしないクローンは増殖するが、より低い温度２にてスプライスするレプリカプレートのクローンは増殖しない。
【図２２】
ＳＤＳアクリルアミドゲルにおいて電気泳動された野生型又は変異されたインテインクローンからの細胞溶解物を示す。３７℃にて増殖された温度感受性のクローンはスプライスできないが（「Ａ」で標識される）、野生型インテインクローンはスプライスする（「ＷＴ」で標識される）。一晩１６℃に移行される場合、スプライシングの野生型レベルは変異体クローン（１〜６）において観察される。
【図２３】
温度感受性スプライシングクローンにおいて見出された変異を有する、Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテイン配列（配列番号４６）を説明し、野生型残基の下部に示される。
【図２４】
Ｍｘｅ　ＧｙｒＡインテイン３−Ｄ構造において、温度感受性スプライシングクローンにおける変異の位置を説明する。２つのパネルは、インテインを先行する単一のアラニンを有するＭｘｅ　ＧｙｒＡインテインの向かい合う側を示す。２重アミノ酸変化は、クローンが１つ以上の変異を有したことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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