(57)【要約】本発明は、４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン（ＤＨＣＰ）の抗細菌活性に対する耐性を与える遺伝子、ｄｅｐに関連する。本発明は更に、ｄｅｐによってコードされ、疎水性であり、ＤＨＣＰに対して特異的な膜貫通型の流出タンパク質である、推定上のタンパク質に関連する。本発明は更にｄｅｐ遺伝子を含有するプラスミド、及びｄｅｐを発現する細菌細胞に関連する。更に、本発明は、生物中で、抗細菌活性に対する耐性を与えることにおいて用いる為の利用を供する。ｄｅｐ遺伝子はＤＨＣＰ又はＤＨＣＰと機能的に等しい化合物に対する耐性を担う流出活性を阻害する化合物を同定するのに用いることが出来うる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン（ＤＨＣＰ）に対して特異的である、ＤＨＣＰ流出タンパク質。
【請求項２】
ＤＨＣＰの流出輸送に対して特異的な細胞質チャネルを形成する膜貫通タンパク質である、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
ＤＨＣＰに対する耐性を与える請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】
大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）由来のタンパク質である、請求項１記載のタンパク質
【請求項５】
以下のいずれの抗生物質：クロラムフェニコール、スペクチノマイシン及びテトラサイクリンに対する交叉耐性を与えない、請求項１記載のタンパク質。
【請求項６】
タンパク質が予測された１３個の膜貫通横断α−ヘリックスを有する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項７】
ｄｅｐである前記ＤＨＣＰ流出タンパク質をコードする遺伝子。
【請求項８】
前記ｄｅｐ遺伝子は大腸菌由来である、請求項７記載のｄｅｐ遺伝子。
【請求項９】
細菌細胞中で多重コピーにて存在する場合に、前記遺伝子がＤＨＣＰ又は機能的に等しい化合物に対する耐性を与える、請求項７記載の遺伝子。
【請求項１０】
ｄｅｐ遺伝子を含んで成るプラスミドであって、当該プラスミドで形質転換されている細菌細胞中でｄｅｐ遺伝子の多重コピーの発現を与える、プラスミド。
【請求項１１】
前記プラスミドがＤＨＣＰに対する耐性を与え且つ以下のいずれの抗生物質：クロラムフェニコール、スペクチノマイシン及びテトラサイクリンに対する交叉耐性を与えない、請求項１０記載のプラスミド。
【請求項１２】
請求項１０記載のプラスミドの多重コピーを含有する細菌細胞。
【請求項１３】
細菌細胞がＤＨＣＰに対して耐性である、請求項１２記載の細菌細胞。
【請求項１４】
請求項７記載の遺伝子を利用し、ＤＨＣＰ又は機能的に等しい化合物に対する耐性を担う流出活性を阻害する化合物を同定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
この特許出願は２０００年８月２９日に提出された米国仮出願第６０／２２８，７２７号の優先権を主張する。この先の仮出願はここで参照として組み込まれている。
【０００２】
様々な細菌に対して有効な多くの抗生物質（がある）にもかかわらず、多剤耐性株の出現により、より新しく且つ効果的な抗細菌化合物に関する研究が続いている。４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン（ＤＨＣＰ）（図１を参照のこと）は、様々なグラム陽性及び陰性細菌、例えばエシエリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属等に対する抗細菌活性を有する化合物である。ＤＨＣＰの製造及び特性は特許化されている（Ｋｏｙａｍａら、１９９９）。それはウロン酸又はその誘導体の熱処理によって調製されている。ここにおいてウロン酸は、ガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸又は、イズロン酸である。それは又火であぶったもしくは乾燥した野菜、果物、穀類、マッシュルーム、海藻、皮質もしくは軟骨からも生産されている。この化合物は、ガン細胞の分化及びアポトーシスを誘導することが示されている。それは、ガンに対する治療剤又は予防剤としての潜在的な利用がありそして又消毒剤、歯磨粉、化粧品及び入浴剤中での抗細菌剤としての利用もある（Ｋｏｙａｍａら、１９９９）。
【０００３】
我々は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムライブラリーからＤＨＣＰの毒性に対する多重コピー型サプレッサーを単離した。この遺伝子によってコードされる推定上のタンパク質は、多くの抗生物質、例えば、クロラムフェニコール、ビシクロマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性を与える公知の流出タンパク質に対する高い相同性を示した。遺伝子は大腸菌染色体上で３７．５分でマッピングされた。それを、ｄｅｐ；ＤＨＣＰ　ｅｆｆｌｕｘ　ｐｒｏｔｅｉｎとして命名している。しかし、Ｄｅｐタンパク質は試験した全抗生物質に対しても交叉耐性を与えない。
【０００４】
先行技術分野
Ｋｏｙａｍａらへの米国特許第６，０８７，４０１号、シクロペントンの調製の為の方法及びそれらの利用。
【０００５】
この特許では、４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン（ＤＨＣＰ）を製造する方法が開示してある。又ＤＨＣＰの抗細菌活性も記載してある。
【０００６】
一方で、本仮出願中で開示した発明は、細菌細胞中で多重コピーにおいて存在する時に、ＤＨＣＰの抗細菌活性に対する耐性を与え、故に当該細菌にＤＨＣＰによる殺菌（作用）に対する耐性を持たせる遺伝子、ｄｅｐに関連する。本出願は又ｄｅｐ遺伝子によりコードされるタンパク質も記載している。
【０００７】
Ｋｏｙａｍａらへのヨーロッパ特許 ＥＰ０ ９４１ ９８１ Ａ１．シクロペントンの調製の為の方法及びそれらの利用。
【０００８】
この特許出願は本質的に、Ｋｏｙａｍａらへの米国特許第６，０８７，４０１号に記載されたような同じ題目に関連する。
【０００９】
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ らへの米国特許第６，１１１，１４５号。シクロペンテン誘導体。
【００１０】
この特許は、機能的に等しいＤＨＣＰのエーテル誘導体に関連し、そしてこれらの誘導体の活性を開示する。
【００１１】
Ｋｏｂａｙａｓｈｉ らへのヨーロッパ特許刊行物 ＥＰ１ ０００ ９２３ Ａ１。シクロペンテノン誘導体。
【００１２】
この特許出願は本質的に、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ らへの米国特許第６，１１１，１４５号に記載されたのと同じ課題に関連する。
【００１３】
Ｋｏｙａｍａらへの米国特許第６，１３６，８５４号。シクロペンテノン誘導体。
【００１４】
この特許は、ＤＨＣＰの機能的に等しいエステル誘導体に関連し、そしてこれら誘導体の生物活性を開示する。
【００１５】
Ｋｏｙａｍａらへのヨーロッパ特許刊行物 ＥＰ０ ９７６ ７１７ Ａ１。シクロペンテノン誘導体。
【００１６】
この特許出願は本質的に、Ｋｏｙａｍａらへの米国特許第６，１３６，８５４号に記載されたのと同じ課題に関連する。
【００１７】
Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ， ｒｅｌａｐｓｅ ｒａｔｅ ａｎｄ ｏｖｅｒａｌｌ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｌｅｕｋｅｍｉａ． Ｃ． Ｗｕｃｈｔｅｒ， ら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ８５ （７） ： ７１１−２１ （２０００）。
【００１８】
急性の白血病において、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）により仲介される多剤耐性（ＭＤＲ）表現型は、化学療法が失敗する原因である。この研究では、Ｐ−ｇｐ発現のレベル又は機能的なＰ−ｇｐ活性が急性の白血病における導入補助化学療法、再発率及び全体的な生存率に対する応答のよりよい予測因子であったかどうかが調べられた。機能的ローダミン−１２３−（ｒｈ１２３）流出アッセイは、急性の白血病におけるモノクローナル抗体によるＰ−ｇｐ発現解析よりも好ましいことを示した。
【００１９】
Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｂｙ Ｐ−ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ． Ａ．Ｊ． Ｓａｄｅｑｕｅ， ら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ＆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ６８ （３） ： ２３１−７ （２０００）。
【００２０】
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ研究では、止痢薬のロペラミドは流出膜輸送体Ｐ−糖タンパク質の為の基質であることが示されている。ロペラミドは有力な麻酔薬であるが、患者へ通常の投与量で与えられた時に、中枢神経系の効果、例えば呼吸抑制を示さない。この研究では、キニジンによるＰ−糖タンパク質の阻害が、ロペラミドの中枢神経系への浸入を高め、従って呼吸抑制を生じさせるという仮説を試験した。結果では、ロペラミドは単独で用いられた時には呼吸抑制を生じさせないが、ロペラミドがキニジンと共に投与された時には呼吸抑制が見られることが示された。
【００２１】
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ−ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ． Ｓ． Ｐｏｕｌａｉｎ， ら、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ １１０ （３） ： ５９１−８ （２０００）。
【００２２】
骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）において、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）の発現は薬物耐性に関連している一方で、多剤耐性関連タンパク質（ＭＲＰ１）の臨床的な意義は不明である。ＭＤＳを有する患者由来の骨髄のこの研究において、ＭＲＰ１の発現は、ＭＤＳにおける病期との相関関係があった。Ｐ−ｇｐに関して、ＭＲＰ１の不均衡な発現／機能が、あるケースにおいて発見されており、ＭＤＳにおける無機能輸送タンパク質の存在が示唆されている。ＭＲＰ１の発現はＭＤＳにおける予後因子ではなかったようだ。
【００２３】
Ｓｏｆｔ ｔｉｓｓｕｅ ｌｅｉｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａｓ ａｎｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｏｒｓ ： ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ｂ．Ｅ． Ｐｌａａｔ， ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １８ （１８） ： ３２１１−２０ （２０００）。
【００２４】
この研究において、多剤耐性（ＭＤＲ）と関連するパラメータが軟組織平滑筋肉腫（ＬＭＳ）と悪性の消化間質腫瘍（ｍａｌｉｇｍａｎｔ ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｔｕｍｏｒｓ）（ＧＩＳＴ）との間で比較された。免疫組織化学を用いて、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）、多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ（１））、肺耐性タンパク質（ＬＲＰ）、及びＣ−キットを検出した。結果では、ＬＭＳ患者はＧＩＳＴ患者と比較して生存率が良く、転移の傾向は２つの患者の群の間では異なることが示されている。試験したＭＤＲタンパク質の発現量は、ＧＩＳＴにおいてよりもＬＭＳにおいて少ないことが予測されている。
【００２５】
Ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ， ａｎｄ Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ ： Ａ ｎｅｗ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ ｆｏｒ ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｍ．Ｇ． Ｓｕｒｅｔｔｅ， ら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９６ ： １６３９−４４ （１９９９）。
【００２６】
細菌において、クオラムセンシングといわれる、細胞密度における変化に応じて発現する遺伝子の調節は、細菌によって生産されそして細菌の細胞数が増加するにつれ外部環境中に蓄積される自己誘導物質として公知のホルモン様分子に依存している。海洋性細菌ビブリオ・ハーベイ（Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ）は、各々がセンサー−自己誘導物質の対から成る２つの並行するクオラムセンシング系を持つことが分かっている。各系に属する２つの異なる自己誘導物質を、自己誘導物質１（ＡＩ−１）及び自己誘導物質２（ＡＩ−２）という。大腸菌、Ｓ．チヒムリウム（Ｓ． ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）及びＶ．ハーベイにおいてＡＩ−２生産の為に必要な遺伝子の同定及び解析が報告されている。
【００２７】
Ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ ｉｎ Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ ： Ｐｒｏｂｉｎｇ ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ−ＬｕｘＲ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｒ ａｎａｌｏｇｓ． Ａ．Ｌ． Ｓｃｈａｅｆｅｒ， ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８ ： ２８９７−２９０１ （１９９６）。
【００２８】
ビブリオ・フィッシェリ（Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ）において、発光遺伝子は、自己誘導物質として公知の拡散性のシグナル化合物との組み合わせにおける転写因子ＬｕｘＲによって活性化される。この研究では、ＬｕｘＲと相互作用する多くの自己誘導物質の能力を解析した。
【００２９】
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｑｕｏｒｕｍ ｓｅｎｓｉｎｇ ｉｎ Ｖｉｂｒｉｏ ｈａｒｖｅｙｉ ｂｙ ＬｕｘＯ ａｎｄ Ｓｉｇｍａ−５４． Ｂ．Ｎ． Ｌｉｌｌｅｙ及びＢ．Ｌ． Ｂａｓｓｌｅｒ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３６ （４） ： ９４０−９５４ （２０００）。
【００３０】
生物発光海洋性細菌のビブリオ・ハーベイは、発光（ｌｕｘ）をクオラムセンシング回路によって制御する。この研究では、応答調節タンパク質ＬｕｘＯが、選択的σ因子、σ５４との相互作用によりアクチベータータンパク質として機能することが示されている。ＬｕｘＯはルシフェラーゼ構造オペロン（ｌｕｘＣＤＡＢＥＧＨ）の抑制を担うので、これらの結果は、ＬｕｘＯが、σ５４と一緒になり機能して、発光の負の調節因子を活性化することを示唆している。
【表１】
2004507260.tif 000002
【表２】
2004507260.tif 000003
【００３１】
発明の詳細な説明
本仮出願は、大腸菌由来の膜貫通タンパク質をコードする遺伝子のクローニングを記載している。このタンパク質は、多重コピープラスミドより発現した時に４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン（ＤＨＣＰ）を細胞外へ輸送する機能を果たす。
【００３２】
ＤＨＣＰ及び機能的に等しい化合物は、式〔Ｉ〕及び式〔ＩＩ〕によって表わされており、そしてその光学活性化合物を含む。式Ｉにおいて、Ｒ１ 及びＲ２ は同じ又は異なっており、そしてその各々は、水素、直鎖又は枝分かれしたアルキル基、直鎖又は枝分かれしたアルケニル基、芳香族基、芳香−脂肪族基であり、但しＲ１ ＝ベンジル基及びＲ２ ＝Ｈは除かれる。
【００３３】
参考文献３及び４を参照のこと。Ｒ３ −Ｒ６ は独立して水素又はアルキル基であり、好ましくは低級アルキル基、例えばＣ１ −Ｃ６ アルキルである。
【化１】
2004507260.tif 000004
【００３４】
式ＩＩにおいて、Ｒ１ 及びＲ２ は同じ又は異なっており、そしてその各々は、水素、直鎖又は枝分かれしたアルキル基、直鎖又は枝分かれしたアルケニル基、芳香族基、芳香−脂肪族基であり、但しＲ１ ＝Ｒ２ ＝ＣＨ３ は除かれる。参考文献５及び６を参照のこと。Ｒ３ −Ｒ６ は独立して水素又はアルキル基であり、好ましくは低級アルキル基、例えばＣ１ −Ｃ６ アルキルである。
【００３５】
ＤＨＣＰは抗細菌活性を有することが分かっており；細胞増殖を３５０μＭ以上の濃度で阻害する。より低い濃度では、細胞を細長くしそして増殖を乏しくする。大腸菌が天然にＤＨＣＰに対して耐性であるかを特定する為に、大腸菌ゲノムＤＮＡ断片のライブラリーをＪＭ８３株に形式転換させ、そして４００μＭのＤＨＣＰを含有するアガープレート上で増殖させた。この培地上で増殖できたコロニーを単離した。ＤＮＡをこれらのコロニーから単離し、所定の耐性を有するクローン化されたゲノムＤＮＡを同定しそして配列限定した。４つの遺伝子を耐性が与えられた断片中で発見した。これら４つの遺伝子の様々な組み合わせの不活性化で、ＯＲＦ３８９は耐性を与えることを担うという結論につながった。これはＯＲＦ３８９をそれ自身ｐＵＣ１９（多重コピープラスミド）でクローニングすること及びＪＭ８３株を形質転換することによって確められた。生じた細胞はＤＨＣＰに対して耐性であった。
【００３６】
大腸菌遺伝子データベースとのＯＲＦ３８９のヌクレオチド配列の比較で、それは、クロラムフェニコール及び他の抗生物質に対する耐性を与えることに関わる公知の流出タンパク質に類似することが分かった。ＯＲＦ３８９によりコードされるタンパク質の予測された構造の更なる解析では、それは膜タンパク質であり；多重膜貫通ドメインを有し、且つ前述のクロラムフェニコール流出ポリペプチドと構造的な類似性を共有することが示された。
【００３７】
ＯＲＦ３８９が、他の抗生物質、例えばクロラムフェニコール、スペクチノマイシン及びキトラサイクリンに対する耐性を与えるかを特定する為に、ｐＵＣ１９／ＯＲＦ３８９プラスミドを含有する形質転換したＪＭ８３細胞をこれらの抗生物質を含有する培地上に塗布した。ＤＨＣＰ以外の任意の抗生物質に対する耐性を付与できないＯＲＦ３８９の存在は、Ｄｅｐタンパク質の流出活性がＤＨＣＰに対して特異的であることを示唆する。
【００３８】
ＯＲＦ３８９がＤＨＣＰに対する耐性を与えるのは、それが細胞中で多重コピーの状態で存在する時のみであることに気づくことが重要である。前記遺伝子は天然には大腸菌細胞のゲノム中で発見されるが、単一コピーにおいて存在する。係る細胞はＤＨＣＰの抗細菌活性に感受性である。ＯＲＦ３８９がｐＵＣ１９中にクローン化されそしてＪＭ８３細胞に導入された時、それは多重コピー（最大で数百コピーの遺伝子／細胞）において存在する。その理由は、ｐＵＣ１９は数百コピー／細胞迄に保持されているからだ。遺伝子の投与量が増加した時のみ、ＤＨＣＰに対して耐性であることが分かった。耐性の機構は単純に、形質転換細胞中での流出タンパク質の発現の増加により流出活性の高まりが生じることである。
【００３９】
遺伝暗号の縮重により、ＤＨＣＰ又はＤＨＣＰと機能的に等しい化合物に対する耐性を与えることを担う流出タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書中で開示した核酸配列により変わりうることに気付くべきだ。
【００４０】
本発明の更なる説明
作用形態
ＤＨＣＰは抗細菌及び抗腫瘍活性を示す化合物である。様々なウロン酸（グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸等）を加熱することによって調製される。発明者は、ＤＨＣＰを細胞外へ輸送できるタンパク質をコードする、大腸菌由来の遺伝子をクローン化した。この輸送タンパク質は、クロラムフェニコールのような抗生物質を細胞外に輸送する機能を果たす公知の流出タンパク質と配列の類似性を示す。輸送タンパク質を過度に発現する生物はＤＨＣＰに対して耐性になることが示されている。その理由は、おそらく効率的にＤＨＣＰを輸送できるからだ。輸送タンパク質の過度の発現は、大腸菌における内因性の遺伝子の発現の増加よりむしろ多重コピーの遺伝子の存在により生じる。換言すれば、全ての大腸菌は輸送遺伝子の単一コピーを有する。しかしながら、単一コピーの遺伝子による輸送タンパク質の発現のレベルはＤＨＣＰに対する耐性を与えるのには不十分である。発明者は、遺伝子を高いコピー数のプラスミド、大腸菌細胞中で２００〜５００コピー／細胞で保持されるｐＵＣ１９中でクローン化した。従って、このプラスミド構築体を含有する形質転換した大腸菌は、２００〜５００コピーの輸送遺伝子を有するだろうし、そして多重コピー由来のタンパク質の発現は、単一コピー由来よりも多い。これら形質転換細胞は、ＤＨＣＰに対して耐性である。
【００４１】
ＤＨＣＰの一般的な作用形態はそれが標的細胞に入ることを必要とする。ＤＨＣＰに対する耐性は、ＤＨＣＰが細胞内へ入るのと同時か又はそれより早く細胞外へ輸送されるならば生じうる。そのような場合、細胞内のＤＨＣＰの濃度は、毒性量まで蓄積することは決してなく、そして当該細胞は化合物の抗細菌作用に対して耐性となる。見掛上、開示された遺伝子によってコードされる輸送タンパク質は、とても効率的にはＤＨＣＰを輸送しない、又は内因性の遺伝子により発現される輸送タンパク質の量はとても低い。どちらの場合も、（遺伝子の多くのコピーにより生ずる）更なる輸送タンパク質の存在は、細胞外へのＤＨＣＰのより効率的な輸送をもたらすだろう。
【００４２】
用途
本発明の遺伝子の重要な用途は、流出活性の阻害物質を同定する研究においてそれを用いることであろう。係る阻害性の化合物は、輸送活性を阻害するように機能するだろう。従ってＤＨＣＰに対して耐性である微生物又は腫瘍細胞は、耐性細胞が化合物を輸送し追い出すことを妨げることによって前記化合物に対して一層感受性であるように作製できうる。本発明の輸送遺伝子の阻害物質は又、他の流出タンパク質、例えば、クロラムフェニコールを輸送する流出タンパク質、又は多剤耐性タンパク質のＰ糖タンパク質ファミリーによる輸送を遮断することにおいても活性がありうると考えられる。Ｐ糖タンパク質は多くの腫瘍細胞中で発現しており、これらの腫瘍細胞を化学療法剤に対して耐性にする。Ｐ糖タンパク質の研究に関する要約は先述のとおり。
【００４３】
図面の詳細な説明
図１は、４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン（ＤＨＣＰ）の化学構造である。
【００４４】
図２は、大腸菌の増殖に対するＤＨＣＰ濃度の作用である。
Ａ．ＪＭ８３細胞をＬＢ培地中最大でＫｌｅｔｔ単位５０迄増殖させ、そしてＤＨＣＰを様々な濃度（０〜４００μＭ）で添加した。増殖がＫｌｅｔｔ単位９０〜１００に達した後、細胞を各濃度のＤＨＣＰを含む培地で希釈し、そして増殖を更に観察した。ＤＨＣＰ濃度は：０μＭ、白抜き四角；５０μＭ、黒ひし形；１００μＭ、白抜き丸；２５０μＭ、白抜きひし形；４００μＭ、黒四角。
Ｂ．一晩に渡り増殖させた腸菌細胞ＪＭ８３を適度に希釈し、そして様々な濃度のＤＨＣＰ（０〜３５０μＭ）を含有するＬＢプレート上に塗布した。ＤＨＣＰがないプレート上の多くのコロニーを１００％として考えそして他の数値を相対的な百分率として表わした。
【００４５】
図３は、ＤＨＣＰに対する耐性を与えるプラスミドｐＳＰ００１の制限地図である。ＤＨＣＰに対する耐性を与えるＤＮＡ断片（５．２ｋｂ）及びフランキングＯＲＦを含んで成る４つのＯＲＦを示している。各ＯＲＦの方向を矢印で示した。制限酵素部位も又示してある。このＯＲＦの尺度を合わせてはいない。ＤＨＣＰに対する耐性を与えるＤＮＡ断片を含有するプラスミドｐＳＰ００１を制限酵素で消化し、各４つのＯＲＦを中断し、再度ライゲーションさせそしてＪＭ８３細胞に形質転換させた。次いで形質転換体をそのＤＨＣＰ（４００μＭ）に対する感受性に関して試験した。消化に用いた酵素は：ｐｕｒＲに対して：ＭｌｕＩ、ｙｄｈＢに対して：ＮｒｕＩ−Ｅｃｏ４７ＩＩＩ ：ＯＲＦ３８９、ｐｕｒＲ、及びｙｄｈＢに対して：ＮｒｕＩ及びＳｍａＩ、ＯＲＦ３８９に対して：ＡｖａＩ、並びにｐｕｒＲ及びｙｄｈＢに対して：ＭｌｕＩ及びＮｒｕＩであった。ＯＲＦ３８９（ｄｅｐ）を有するプラスミドの構築の為に、プラスミドｐＳＰ００１をＳｍａＩ及びＭｓｃＩで消化し、断片を精製し、そしてｐＵＣ１９中でクローン化しｐＳＰ００７を生産した。
【００４６】
図４は、Ｄｅｐ、Ｃｍｒ、ＣｍｒＡ、Ｃｍｘ、ＣｍｌＶ、ＢｃＲ、Ｂｍｒ３、ＹｊｃＣ及びＴｅｔ間の配列の相同性を示している。同一及び類似の配列を黒の囲み及び灰色の囲みでそれぞれ印した。膜貫通タンパク質に関するコンセンサス配列を点線で印しそしてＩ、ＩＩ及びＩＩＩ 範囲として示している。
【００４７】
図５は、Ｄｅｐ（Ａ）、ロドコッカス・ファシエンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｃｉｅｎｓ ）由来のＣｍｒ（Ｂ）（６）及びストレプトミセス・リビタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ ）由来のＣｍｌ（Ｃ）（８）の水治療特性を示している。水平のバーは、予測された膜貫通領域を示している。
【００４８】
図６は、ｄｅｐ遺伝子の配列を含有する大腸菌ゲノムの領域のＤＮＡ配列を示すヌクレオチド配列である。大腸菌ゲノムの領域は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． ＡＥ０００２６１ Ｕ０００９６ で入手可能である。示されている配列は、４３８１−８２８０のヌクレオチドである。ｄｅｐ遺伝子はヌクレオチド４６２７−５８３８によってコードされている。ｄｅｐ配列を〔　〕内に示している。
【００４９】
図７はｄｅｐ遺伝子の単離したＤＮＡ配列を示すヌクレオチド配列である。プラスミドｐＳＰ００７は、１．７ｋｂの挿入体の一端からＤＮＡ配列のデータを得ることによって、ｄｅｐ遺伝子を含んだことが確められた。この方法で得られた配列は最初のものと一致する。
【００５０】
実験研究の詳細な説明
大腸菌の増殖に対するＤＨＣＰの作用
大腸菌野生型系統ＪＭ８３〔Ｆ−ａｒａΔ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ｒｐｓＬ（ｓｔｒｒ）〕（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５）はＬｕｒｉａ培養液（ＬＢ）中で増殖した。培地に必要な時はいつでもアンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を補給した。大腸菌の増殖に対するＤＨＣＰの作用を確かめる為に、ＬＢ培地中で一晩増殖した細胞を新鮮なＬＢ培地中で希釈した。Ｋｌｅｔｔ単位５０に増殖が到達した後、ＤＨＣＰを様々な濃度（０〜４００μＭ）で添加しそして増殖を更に観測した。Ｋｌｅｔｔ単位９０〜１００に到達後、１０倍に希釈して、各々の濃度のＤＨＣＰを含有する培地に入れた。図２Ａは大腸菌に対する様々な濃度のＤＨＣＰの作用を示している。増殖は、５０μＭのＤＨＣＰの存在における３時間のインキュベーションの後緩やかになったが、ＤＨＣＰがない場合に類似して８時間後に最大密度に到達した。細胞は、１００μＭのＤＨＣＰとのインキュベーション３時間後に一層緩やかに増殖し、最大細胞密度はＤＨＣＰがない場合よりも低かった。２５０μＭのＤＨＣＰの存在において、増殖はインキュベーションの３時間後に大幅に減衰しそして５時間後には細胞の増殖が停まった。４００μＭのＤＨＣＰの存在において、細胞の増殖はインキュベーションの４時間後に停止した。２５０μＭのＤＨＣＰで８時間に渡る細胞の増殖の顕微鏡検査では、細胞は細長い（コントロールの細胞より約１５倍長い）フィラメントを形成することが分かった。これらの細胞のＤＡＰＩ（ジアミジノフェニルインドール）染色で、これらの細胞の染色体の凝集がＤＨＣＰによって損われうることが分かった（データは示していない）。
【００５１】
様々な濃度のＤＨＣＰでの大腸菌のコロニーを形成する能力を調べる為に、ＬＢ培地中で一晩増殖させた細胞を適度に希釈しそしてＤＨＣＰ（０〜３５０μＭ）を含有するＬＢプレート上に塗布した。３７℃でのインキュベーション後、各プレート上のコロニーの数を計測した。ＤＨＣＰを有さないコントロールのプレート上のコロニーの数を１００％とし、そして他の数を相対的な百分率として表した（図２Ｂ）。３００μＭのＤＨＣＰの存在において、コロニーの数は１００倍減少したことが観察された。１×１０４ の細胞を３５０μＭのＤＨＣＰを含有するＬＢ培地上に塗布した時、コロニーは得られなかった。
【００５２】
ＤＨＣＰに対する耐性を与える遺伝子の大腸菌ゲノムライブラリーのスクリーニング
大腸菌がＤＨＣＰに対する耐性を与える遺伝子（群）を含有するかを試験する為に、大腸菌ゲノムライブラリーをスクリーニングした。大腸菌ゲノムライブラリーの構造は従前に記載された（Ｌｕ及びＩｎｏｕｙｅ，１９９８）。大腸菌ＪＭ８３由来の部分的に消化したＳａｕ３ＡＩ染色体ＤＮＡ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位中でクローン化した。ＪＭ８３細胞はゲノムライブラリーで形質転換された。形質転換体を、ＤＨＣＰ（４００μＭ）含有ＬＢプレート上３７℃での増殖する能力に関して単離した。プラスミドＤＮＡを耐性コロニーから単離し、精製してＪＭ８３細胞中に形質転換させ、ＤＨＣＰに対する耐性を与えるその能力を確めた。プラスミドをｐＳＰ００１と命名し、そして５．２ｋｂのＤＮＡ断片を含有することが分かった。この断片はＳｅｑｕｅｎａｓｅを用いて両端からシークエンシングされそしてＢＬＡＳＴサーチを大腸菌ゲノム全体とこの断片との相同性の解析の為に実行した。このＤＮＡ断片は大腸菌染色体上の３７．５分に位置し且つ４つのＯＲＦ（図３）：プリン合成のリプレッサーをコードするＯＲＦ３８９，ｐｕｒＲ、Ｃｙｎオペロン転写活性化因子の相同物をコードするｙｄｈＢ及びビシクロマイシン耐性タンパク質の相同物をコードするｙｄｈＣ（Ｂｅｒｌｙｎら、１９９６）を含んだ。
【００５３】
どの遺伝子がＤＨＣＰに対する耐性を与えることを担うのかを特定する為に、いくつかの欠失構築体を図３に示すように作製した。ｐｕｒＲ、ｙｄｈＢ並びにｐｕｒＲ及びｙａｈＢの両方の中断はＤＨＣＰに対する耐性への影響を持たなかった（構築体はそれぞれｐＳＰ００２、ｐＳＰ００３及びｐＳＰ００６である）。しかし、ｐｕｒＲ及びｙｄｈＢとＯＲＦ３８９（ｐＳＰ００４）の中断並びにＯＲＦ３８９単独（ｐＳＰ００５）の中断はＤＨＣＰ耐性の欠失につながった。従って我々は、ｐＵＣ１９においてＯＲＦ３８９を別にクローン化し、（ｐＳＰ００７）生じたプラスミドをＪＭ８３中に形質転換し、そしてＤＨＣＰに対する感受性を調べた。このプラスミドはＤＨＣＰに対する耐性を与えた。これらの結果で、ＯＲＦ３８９は、多重コピープラスミド中でクローン化され、そしてプラスミドｐＳＰ００７を用いた更なる研究を行った時にＤＨＣＰに対する耐性を担うことが明らかに証明された。ＯＲＦ３８９をｄｅｐ−ＤＨＣＰ　ｅｆｆｌｕｘ　ｐｒｏｔｅｉｎ（以下を参照のこと）と命名した。
【００５４】
薬物耐性を与える他の遺伝子を伴うＯＲＦ３８９の相同性解析
ＢＬＡＳＴ−相同性検索コンピュータプログラムを用いて、我々はｄｅｐによってコードされる推定上のタンパク質の相同性検索を行った。図４には、有意にＤｅｐと高い相同性を示す９つのタンパク質を示している。これらのタンパク質の半分は、クロラムフェニコールに対する耐性を与える。最高程度の相同性を示すタンパク質は、ロドコッカス・ファシエンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｓｃｉｅｎｓ）由来のＣｍｒ（Ｄｅｓｏｍｅｒら、１９９２）、Ｒ．エリトロポリス（Ｒ． ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）（Ｎａｇｙら、１９９７）由来のＣｍｒＡ、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）１３２６由来のＣｍｌ（Ｄｉｔｔｒｉｃｈ ら、１９９１）、コリネバクテリウム・ストリアタム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ． Ｕ７２６３９）由来のＣｍｘ、及びＳ．ベネズエラエ（Ｓ． ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）ＩＳＰ５２３０（Ｍｏｓｈｅｒ ら、１９９５）由来のＣｍｌＶが挙げられる。図４から分かるように、Ｄｅｐは、他のタンパク質と比べた場合、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃｍｒ）の産物Ｃｍｒと最高程度の相同性を有する。Ｃｍｒタンパク質は、Ｒｏｕｃｈ ら（１９９０）によって特定された膜貫通タンパク質に関する３つのコンセンサス配列を含有することが示されている。これらの配列は予測された膜貫通タンパク質との関係で類似の位置で類似にある。これらは図６に破線で印してあり且つＩ、ＩＩ、ＩＩＩ と命名されている。Ｄｅｐの場合、ＬＰを含んで成る第１の範囲（Ｉ）は、これらの作者によって特定された範囲と完全に相同性を持つ。第２の範囲（ＩＩ）はＣｍｒタンパク質のそれと５０％の類似性を示しそして第３の範囲（ＩＩＩ） は１つの残基以外これら２つのタンパク質の間で相同である。Ｒｏｕｃｈ ら（１９９０）により提案されたモデルによると、範囲Ｉ及びＩＩＩ は細胞膜の外部に位置し、そして範囲ＩＩは膜の内部に位置する。ｑａｃＡによりコードされる推定上のタンパク質に関する膜ループの位置は、抗原性指標特性（ａｎｔｉｇｅｒｉｃ ｉｎｄｅｘ ｐｒｏｆｉｌｅ）を調査し、そして予測を変えることによって確められた。係る領域は高い抗原性指標を有しそして確率を変更する（Ｒｏｕｃｈ ら、１９９０）。
【００５５】
一次配列における相同性に加えて、Ｄｅｐの水治療特性（図５Ａ）は、Ｒ．ファシエンス（Ｒ． ｆａｃｉｅｎｓ）のＣｍｒ（Ｄｅｓｏｍｅｒら、１９９２）及びＳ．リビダンス（Ｓ． ｌｉｖｉｄａｎｓ）のＣｍｌ（図．５Ｃ）のものと有意に類似している。Ｄｅｐは主に疎水性でありそしておそらく１２個の予測される膜貫通α−ヘリックスを含有する（図５Ａ）。
【００５６】
Ｄｅｐと相同的な他のタンパク質は、大腸菌由来のＢｃＲ（ビシクロマイシン耐性タンパク質）（Ｂｅｎｔｌｅｙら、１９９３）、Ｂ．サブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のピューロマイシン、トスフロキサシン、ノルフロキサシンに対する耐性を与える多剤流出ポンプに関与するＢｍｒ３（Ｏｈｋｉ及びＭｕｒａｔａ， １９９７）、スタフィロコッカス・ヒカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｙｉｃｕｓ）由来のテトラサイクリン耐性を与えるＴｅｔ（Ｓｃｈｗａｒｚら、１９９２）及びテトラセノマイシン耐性を与えるＹｊｃＣ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ Ｄ９０８２６）（図４）が挙げられる。すべてこれらは流出タンパク質であり、それは薬剤耐性の為の最も共通の機構の１つである。我々はｄｅｐがＤＨＣＰに対して特異的な細胞質チャネルを形成する、推定上の流出タンパク質をコードすると推測する。相同性はタンパク質のＮ末端近くで顕著であり、またそれは流出タンパク質の共通の特徴である（Ｄｅｓｏｍｅｒら１９９２）。
【００５７】
ｐＵＣ１９及びｐＳＰ００７を含有する細胞に対する最小阻害濃度の測定
Ｄｅｐは、多剤耐性の為の流出タンパク質に対して相同性を示すので、我々はそれが他の抗生物質に対する耐性も同じように与えるのかを調べた。ｐＵＣ１９又はｐＳＰ００７プラスミドを含む大腸菌の野生型の細胞をアンピシリンを含有するＬＢ培地中で一晩に渡り増殖させた。細胞を１０及び１０００倍に希釈し、そして５μｌの各希釈物（それぞれ３．５×１０５ 細胞及び３．５×１０３ 細胞に対応する）を、様々な希釈率のカナマイシン、クロラムフェニコール、スペクチノマイシン、テトラサイクリン及びＤＨＣＰを含有するＬＢ培地に滴下した。プレートを３７℃で２０時間に渡りインキュベートした。表１から分かるように、ｐＳＰ００７は、試験した全ての抗生物質に対しても有意な交叉耐性を与えなかった。ｐＵＣ１９及びｐＳＰ００７を含有する細胞に対するＭＩＣ値はスペクチノマイシン、クロラムフェニコール及びテトラサイクリンについて同じであった。ＭＩＣ値は、ｐＵＣ１９を含有する細胞よりもｐＳＰ００７を含有する細胞に対するカナマイシンについて２倍高かった。一方でＤＨＣＰに関するＭＩＣ値は、ｐＵＣ１９を含有する細胞よりもｐＳＰ００７を含有する細胞について８倍高かった。Ｄｅｐは、ｃｍｒに対する高い相同性にも関わらず、クロラムフェニコールに対する耐性を与えなかったことは注目に値する。
【表３】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
４，５−ジヒドロキシ−２−シクロペンテン−１−オン（ＤＨＣＰ）の化学構造である。
【図２Ａ】
大腸菌の増殖に対するＤＨＣＰ濃度の作用のグラフ表示である。
【図２Ｂ】
大腸菌の生存率に対するＤＨＣＰ濃度の作用のグラフ表示である。
【図３】
ＤＨＣＰに対する耐性を与えるＤＮＡ断片を示すプラスミドｐＳＰ００１の制限地図である。
【図４】
ｄｅｐによってコードされるポリペプチドとｃｍｒ、ｃｍｒＡ、ｃｍｘ、ｃｍｌｖ、ｂｃｒ、ｂｍｒ３、ｙｊｃＣ及びｔｅｔによってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の比較である。
【図５】
ｄｅｐ、ｃｍｒ及びｃｍｌによってコードされる推定タンパク質の水治療特性の比較である。
【図６】
ｄｅｐ遺伝子の配列を含有する大腸菌のゲノムの領域のＤＮＡ配列を示すヌクレオチド配列である。
【図７】
ｄｅｐ遺伝子の単離したＤＮＡ配列を示すヌクレオチド配列である。
【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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