(57)【要約】式（Ｉ）による新規なシアニン染料であり、Ａ1とＡ2とは各独立にＯ、ＳまたはＮおよびＲはＨまたは炭化水素で、異種原子を含有し、ｍは０〜５、ｎは０〜５である。
2004536900.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
2004536900.tif 000022
または
【化２】
2004536900.tif 000023
からなる群から選ばれ、かつＡ1、Ａ2がそれぞれ独立にＯ、ＳまたはＮであり、ＲがＨまたは異種原子を含有する炭水化物であり、ｍが０〜５であり、ｎが０〜５であることを特徴とするＤＮＡの溝に結合するシアニン染料。
【請求項２】
Ｒがメチルまたはエチルであり、ｍが１であり、ｎが０であることを特徴とする請求項１に記載のシアニン染料。
【請求項３】
Ｒがメチルまたはエチルであり、ｍが１であり、ｎが０であり、Ａ1、Ａ2がＳであることを特徴とする請求項１に記載のシアニン染料。
【請求項４】
Ｒがメチルまたはエチルであり、ｍが１であり、ｎが０であり、Ａ1、Ａ2がＯであることを特徴とする請求項１に記載のシアニン染料。
【請求項５】
Ｒがメチルまたはエチルであり、ｍが１であり、ｎが０であり、Ａ1がＳであり、Ａ2がＯであることを特徴とする請求項１に記載のシアニン染料。
【請求項３】
２−位にピリジン／キノリン環を有していることを特徴とする請求項１に記載のシアニン染料。
【請求項４】
請求項１〜２のシアニン染料を含有した核酸ハイブリダイゼーション用プローブ。
【請求項５】
ＤＮＡテンプレートのリアルタイムＰＣＲ−反応実施方法であって、二重鎖ＤＮＡ中の小溝位置において見られたときに蛍光反応を増加する蛍光染料が用いられ、該染料がそれぞれ少なくとも１個の窒素原子含有する少なくとも２個の芳香族環システムを含有しており、該芳香族環が４個までの炭素原子を有するアルキン基によって結合されて共役結合を形成しており、さらに該染料が、強固な共役システムを提供する単一結合またはアセチレン結合などの顕著な二重鎖特性を有する結合を介して、自身に結合された少なくとも１個の第３の芳香族システムを含有していることを特徴とするＰＣＲ−反応実施方法。
【請求項６】
染料が非対称シアニン染料であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項７】
シアニン残基のひとつがＳおよび／またはＯを含有していることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項８】
染料化合物が三日月形であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項９】
染料が請求項１〜２の１以上による誘導体であることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ配列用、中でも［ポリ（ｄＡ−ｄＴ）］2小溝バインダーに特に適する、新規シアニン染料に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
組み合わせ化学、人間のゲノム配列、微細化、つまりラボラトリーオンチップ、ナノ化学の導入によって、「新規化学的実体」の広範なライブラリを創ることが可能となった。数百万ものこれら「新規化学的実体」を、そのアクティブサイトと薬剤を識別するために、高処理量スクリーニングで迅速に試験しなければならない。
【０００３】
ＤＮＡ小溝内で、ＤＮＡに可逆的に結合するための薬剤が、抗がん性と抗ウイルス性とを具える、新規リード化合物生成の助けを借りて、ついに合成された。以前は、放射性プローブが薬剤−ＤＮＡ間の相互作用研究のために用いられたが、最近数年前から、別の蛍光遺伝子検定に置換えられ始めた。
【０００４】
今日では、薬剤−ＤＮＡ間相互作用は、主として次の方法で研究される。つまり、スペクトル吸収、蛍光染料遷移検定、フットプリンティング、あるいはＮＭＲで主として研究される。蛍光マーカーの数は数種に限られるので、現存品の限界を回避できる、新規蛍光染料を発見すべく挑戦が行なわれている。
【０００５】
小溝内で結合する新規蛍光遺伝子化合物は、次の両方で良く機能することができる。つまり、染料遷移検定においても機能し、置換物が小溝確認要素としていかに良く作用するかの見通しを得るためにも機能できる。
【０００６】
蛍光遺伝子化合物は、励起すると大収量の量子を発するので、多大なセンシティビティを提供することができる。ひとつの限界は、ターゲットとハイブリダイゼーションしたり、反応したときに、多量の蛍光増加を与えるフルオロフォアが、それほど数多くないことである。
【０００７】
非対称形シアニン染料は、その優れた核酸染色特性の故に、多大な関心を集めてきた。そのような染料を核酸に結合すると、通常蛍光強度が大幅に増加する1ので、ＤＮＡ用蛍光マーカーとして、様々な場面2-4で幅広く使われている。
【０００８】
二重鎖ＤＮＡと、非対称形シアニン染料との相互作用、ＴＯとＹＯ（図１）は、多くの研究においてスペクトル的に研究され、特別な形態ではなく8、層間挿入5-7により結合することが発見された。
【０００９】
これらはまた、一重鎖ＤＮＡとも強固に結合し、蛍光強度の大幅な増加を伴う9。二重鎖ＤＮＡ信号だけが欲しい研究においては、このことは、かえって本染料の有用性を損なう。
【００１０】
しかし、一重鎖ＤＮＡ、つまりＤＡＰＩ10、およびＨｏｅｃｈｓｔ（ヘキスト）−誘導体11にではなく、選択的に二重鎖ＤＮＡに結合する、層間挿入の代わりに、小溝に結合する蛍光リガンド（配位子）が存在する。
【００１１】
大部分のシアニン染料と対照的に、これらのリガンドは、むしろＡ／Ｔリッチセグメントに対して、選択的にＤＮＡ配列を有する12。その上、層間挿入染料に比較して、それらのリガンドは、結合したＤＮＡ−複数部位におよぼす動揺が少ない。
【００１２】
このことは、例えばある種の蛍光顕微鏡試験13、14のような、ＤＮＡが引き伸ばされないことが肝要な、研究には貴重である。
【００１３】
しかし、小溝バインダーは、非対称形シアニン染料がＤＮＡに結合されたとき、１０００倍以上も増加したのと同等には、劇的な蛍光増加を示すわけではない。1
【００１４】
ＢＯ（図１）については、４００倍の蛍光増加が報告された15が、一方で、ＨｏｅｃｈｓｔとＤＡＰＩはそれぞれ、〜９５倍16と〜２０倍17の蛍光増加を示した。
【００１５】
ＤＮＡ用ラベルとしての非対称形シアニン染料のもうひとつの利点は、吸収最大値波長が比較的長いことであり、これが生物的材料からのバックグラウンド吸収の問題を軽減してくれることである。
【００１６】
ＤＮＡに結合したときの、図１で示す染料の吸収最大値波長は、概略４３５ｎｍ〜５１０ｎｍの範囲であり6、9、17、ちなみにＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８（Ｈｏｅｃｈｓｔ）とＤＡＰＩは約３５０ｎｍである17。
【００１７】
小溝結合リガンドの形態と、通常の非対称形シアニン染料の、光物理的特性とを結び付ける染料は、このように、ＤＮＡの検出と研究に多大な価値を有する。
【００１８】
そのような染料を目指す最初の努力として、我々は非対称形シアニン染料ＢＥＢＯ（方式１）をデザインした。この染料は、層間挿入染料ＢＯと同じシアニン発色団を有するが、その構造は第６位置にベンゾチアゾーレ（ｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｅ）で置換し、延長されている。
【００１９】
ベンゾチアゾーレ部分の位置取りは、別の小溝バインダー、つまりＨｏｅｃｈｓｔと同様に、ＢＥＢＯに三日月型形状を与える。市中で入手可能なアニリン１置換のベンゾチアゾーレから出発するＢＥＢＯ合成短距離ルートは、ベンゾチアゾーレ・グループ（方式１）選択を動機付けた。
【００２０】
加えて、ふたつのベンゾチアゾーレ部分を含む対称形シアニン染料が、小溝内でモノマー18またはダイマー19のいずれかとして、結合することを示唆した。
【００２１】
ここで我々は、ＢＥＢＯとＢＯ類似染料の合成とＤＮＡ結合研究について述べる。
【００２２】
今日最も頻繁に使われるフルオロフォアは、フルオロセイン、ＢＯＤＩＰＹ、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ、およびＴＯ、ＹＯ、およびＴＯＴＯのような非対称形シアニン染料である。
【００２３】
フルオロセイン、およびＢＯＤＩＰＹは、タンパク質の標識用同位体として、一番良く知られた蛍光発生剤グループであり、一方、ＤＡＰＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ、およびシアニン染料は、一番良く知られた核酸検出用のフルオロフォアである。
【００２４】
【化１】
2004536900.tif 000003
ＤＡＰＩ
【００２５】
【化２】
2004536900.tif 000004
Ｈｏｅｃｈｓｔ誘導体のひとつ
【００２６】
【化３】
2004536900.tif 000005
シアニン染料のひとつ
【００２７】
ＤＡＰＩ（吸収最大波長４００ｎｍ）、およびＨｏｅｃｈｓｔ（吸収最大波長３５０ｎｍ）は、小溝内で結合し、ＤＮＡに結合すると２０倍の蛍光増加を示す、ＤＮＡ用ベース特定蛍光プローブとして使用される。
【００２８】
これと対照的に、非対称形シアニン染料は、ＤＮＡに結合すると１８０００倍もの蛍光増加を示した。
【００２９】
これらはまた、芳香族環間の二重結合数を変えることにより、吸収および発光が簡単に変化できるという利点を有する。しかしながら、非対称形シアニン染料の最大の問題点は、それらが通常ＤＮＡ配列に対して非特定形態で結合することである。（つまり、層間挿入、または、ＤＮＡに対しイオン−ペアー配位化合物を形成し、その結果、複雑な、または弱い蛍光信号になってしまうことである。）
【００３０】
従って、もっと組織的に結合するシアニン染料ならば、ハイブリダイゼーションすると、高度な蛍光増加が見られ、かくして一層高感度なフルオロフォアとなるであろう。
【００３１】
小溝は攻撃に便利な部位（サイト）である。何故なら、それらの部位は通常、タンパク質のような細胞化合物で塞がれていないからである。それらはまた、マイナスの静電気電圧と、小溝が凹型フロアであるが故に、凹型カチオン染料に対し、完全な補体である。
【００３２】
ある種の小溝バインダーは、ＤＮＡ複数部位を安定化させ、ＤＮＡ−タンパク質の制御機構として機能することができる。その結果、配列−特化小溝バインダーが作用すると、抗がん性、および／または、抗ウイルス性を具える新規化合物が生成される可能性があり、かくして、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療方針に対する、代替および補体的アプローチとして役立つ。
【００３３】
その上、小溝バインダーのＤＮＡ複数部位上での安定化効果は、小溝リガンド−核酸共役を含むプローブ内で、プローブ−ＤＮＡ複数部位の融点（Ｔｍ）を高めるために使うことができる。プローブの融点Ｔｍを上昇させると、一層フレキシブルな検定デザインが可能になる。何故なら、プローブ内のオリゴは、一層短くでき、しかもなお、最適の融点Ｔｍを有するからである。
【００３４】
配列選択的小溝バインダーはまた、ミスマッチ識別もできる。リポーター・グループとしての、小溝バインダーによる核酸プローブは、マッチしたＴｍと、シングル型ミスマッチ核酸のふたつの間で、リポーター・グループとしての、対応する層間挿入を有するプローブよりも、増大した差異を持つべきである。このようにして、ハイブリダイゼーション検定の識別力が強化される。
【００３５】
小溝バインダーの有益な形態のひとつは、一重鎖ＤＮＡに対するよりも、二重鎖ＤＮＡに対する選択性があることであり、他方で、層間挿入は通常、一重鎖でも、二重鎖ＤＮＡでも特に選択性を持たない。
【００３６】
この形態は、次のことに帰結する。つまり、小溝バインダー・プローブは、層間挿入によるプローブよりも、低いバックグランド蛍光を有し、その結果、ハイブリダイゼーション後には、一層大きな信号／雑音比を有することに帰結する。
【００３７】
その上、複数部位−ＤＮＡ用の特定染料は、ＲＮＡ、または一重鎖ＤＮＡが混濁した、混合物中のＤＮＡ定量化にも使用することができる。
【発明の要約】
【００３８】
ひとつの挑戦は、それぞれが別々の、良く分離された発光スペクトルを有する蛍光染料であって、正確に結合でき、かくして一連のターゲットの、高感度なマルチ検出を可能にするような、高感度な蛍光染料群を数多く開発することである。
【００３９】
先に述べたように、シアニン染料は、ハイブリダイゼーションすると１８０００倍もの蛍光増加を示すことができ、これは今日使われている小溝バインダーに比べ、約１０００倍の蛍光増加である。
【００４０】
また、光吸収、発光特性は、シアニン染料の共役システムを変化させることにより、容易に調整できる。かくして、小溝に結合することが主目的の、シアニン染料置換物ではあるが、しかし、保有できた公知シアニン染料群の、特別な蛍光発光特性により、これらは極めて興味有るターゲット化合物である。
【００４１】
【化４】
2004536900.tif 000006
【００４２】
【化５】
2004536900.tif 000007
【００４３】
小溝バインダーの凹型構造で発想し、ベンゾチアゾーレ、および関連構造グループが、小溝の検知を支配することができるということを新発見したので、上述した方法により、ベンゾチアゾーレ・グループを付加した非対称形シアニン染料置換物を、設計し合成した。
【００４４】
この新規染料とＤＮＡ間の相互作用について、例えばフローＬＤ、およびＣＤのような、種々の分光分析的手法で研究した。
【００４５】
これらふたつの技法は、薬剤が層間挿入によりＤＮＡに結合しているか、小溝結合しているかについての、情報を提供する。ＣＤの弱い誘起は通常、層間挿入に付随し、一方で、非対称誘起は、小溝結合によるものである。小溝結合は、フローＬＤにおいて強力な信号を与える。
【００４６】
子牛胸腺ＤＮＡの存在下で、フローＬＤスペクトルにおいて弱いポジティブな信号が観察された。このことは、層間挿入された染料と、小溝結合染料との混合物内での、異種間結合による可能性が有る。
【００４７】
他方、ポリ［（ｄＡ−ｄＴ）］2の存在下では、小溝結合を強く示唆する、明確にポジティブなＬＤが示された。
【００４８】
ポリ［（ｄＧ−ｄＣ）］2だけの存在下では、弱いネガティブな信号が観察された。このことは、異種間結合、または、層間挿入された僅かな染料の存在を示唆する。
【００４９】
以下の化合物が上記したような問題を解決することが明らかになり、この発明は以下のような新規な化合物を主たる特徴とするものである。ＤＮＡの溝に結合するシアニン染料であって
【００５０】
【化６】
2004536900.tif 000008
または
【００５１】
【化７】
2004536900.tif 000009
【００５２】
からなる群から選ばれ、ここでＡ1とＡ2とはそれぞれ独立にＯ、ＳまたはＮであり、ＲはＨまたは異種原子を含有することのできる炭水化物であり、ｍは０〜５であり、ｎは０〜５である。
【００５３】
一実施例のシアニン染料にあっては、Ｒはメチルまたはエチルで、ｍは１であり、ｎは０である。
【００５４】
一実施例のシアニン染料にあっては、Ｒはメチルまたはエチルで、ｍは１であり、ｎは０であり、Ａ1、Ａ2はＳである。
【００５５】
一実施例のシアニン染料にあっては、Ｒはメチルまたはエチルで、ｍは１であり、ｎは０であり、Ａ1、Ａ2はＯである。
【００５６】
一実施例のシアニン染料にあっては、Ｒはメチルまたはエチルで、ｍは１であり、ｎは０であり、Ａ1はＳであり、Ａ2はＯである。一実施例のシアニン染料は２−位にピリジン／キノリン環を有している。
【００５７】
この発明の核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブは上記したようなシアニン染料を有している。
【００５８】
またＤＮＡテンプレートのリアルタイムＰＣＲ反応を実施するこの発明の方法にあっては、二重鎖ＤＮＡ中のミラー溝位置において見たときに蛍光反応を増加させる蛍光染料が使われており、該染料が少なくとも１個の窒素原子を含有する少なくとも２個の芳香族環システムを有しており、該環が４個までの炭素原子を有したアルキン基により連結されて共役結合を形成しており、さらに該染料は、強い共役システムを提供する単一結合やアセチレン結合などの顕著な二重鎖特性を有した結合を介して、それに結合された少なくとも１個の第３の芳香族システムを含有している。
【００５９】
この発明の方法の実施例においては、染料が非対称シアニン染料である。他の実施例ではシアニン残基のひとつはＳおよび／またはＯを含んでいる。他の実施例では染料化合物は三日月形である。他の実施例では染料は上記したような一般的構成の誘導体である。新規な染料は明らかに異なるやりかたで豊Ａ−Ｔおよび豊Ｇ−Ｃ領域に結合する。ＣＤ測定の結果からこの新規な染料の溝結合が支持されている。
【００６０】
ポリＧＣについては信号はほとんど見られず、これは層間挿入または外部結合に一致する。一方ポリＡＴについては非常に強い非対称誘導が見られる。
【００６１】
それは豊Ａ−Ｔ領域の小さな溝に結合し、その故にＤＮＡデュープレックス中のＧ−Ｃ結合よりも多くＡ−Ｔ結合を安定化する。したがって、豊Ａ−Ｔ領域が小溝バインダーの下に配置されるようにプローブが設計されるならば、それをプローブ中に用いて食違い識別を改良することができる。
【００６２】
興味あることに、ベンゾチアゾール基が小溝認識要素としての利用性を有しているという予備報告を我々の結果も際立たせているのである。もしそうならば、小溝中に結合する新規な薬剤を設計する可能性を開くことになるので、これは重要な発見である。
【００６３】
我々の最初の結果によれば、小溝バインダーとして作用する非対称シアニン染料を設計提供することが可能である。
【００６４】
さらにこの発明の観念を広げると、置換シアニン染料についてのより合成の道があるので、最初のステップはメチン置換基からのオルト位の窒素、２−ＢＥＢＯである。
【００６５】
【化８】
2004536900.tif 000010
【００６６】
【化９】
2004536900.tif 000011
【００６７】
２種のキノリン誘導体、ＢＥＴＯおよび２−ＢＥＴＯ、の合成と共にベンゾキサゾールとベンゾイミダゾール誘導体の合成も行える。これらの新規なベンゾキサゾールとベンゾイミダゾール置換染料の合成は若干異なる合成過程による。
【００６８】
【化１０】
2004536900.tif 000012
【００６９】
同種の化合物のスチレ結合とベンゾキサゾール−とベンゾイミダゾール−スタナンの合成については文献がある。最後のステップである化合物１とピリジンまたはキノリン塩との縮合は非対称シアニン染料の合成に通常使用される。
【００７０】
合成。一般に非対称シアニン染料は、一方の塩に脱離基として作用するチオメチル基を有した２種の１／４複素環式塩の縮合により、調製される。しかしＤｅｌｉｇｅｏｒｇｉｅｖ他20により開発された代りの縮合方法は市販の４−置換アニリン１（方式１）から出発する４ステップだけでＢＥＢＯへの合成過程を提供する。チオシアン化カリウムとＤＭＦ中のブロミンによるアニリン１のチオシアン化により４０％収量の２−アミノベンゾチアゾール２を与える21、22。イオドメタンによる２のメチル化およびそれに続く全体で７７％収量のデプロトネーション（ｄｅｐｒｏｔｏｎａｔｉｏｎ）により２−イミノ−３−メチルーベンゾチアゾリン３が製造される。真空下１６０℃でピリジン塩４と一緒にベンゾチアゾリン３を単に溶解することにより、染料ＢＥＢＯは２４％で調製される20。
【００７１】
比較ＤＮＡ結合研究を可能とすべく、Ｚｈｏｕ他（方式２）23による変更処理を用いた従来の方法で、推定層間挿入染料ＢＯ（１−メチル−４−［（３−メチル−２（３Ｈ）―ベンゾチアゾリジン）メチル］―ピリジン−イオダイド）が合成された。トリエチルアミンを塩基として用いてのジクロロメタン中でのピリジン塩４とベンゾチアゾリウム塩５の縮合により４６％収量で該染料が与えられた。
【００７２】
線型二色性測定。ＢＥＢＯ中のベンゾチアゾール置換基により引き起こされるそのＤＮＡとの相互作用への効果を研究すべく、類似染料ＢＯの結合研究も比較として行われた。図２に異なるＤＮＡを有したＢＥＢＯとＢＯのフロー線型二色性（ＬＤ）スペクトルを示す。ここでＬＤは、配列の顕微鏡軸に対して平行および垂直に偏光された光の吸収の相違として、定義される。配列ＤＮＡリガンド錯体のＬＤスペクトルは角度で分析して結合構造についての情報を提供することができる。この角度はＤＮＡ螺旋軸とリガンドの電子転移モーメントがなす角度である24。
【００７３】
ＤＮＡ錯体の配列は外回転シリンダーを用いたフロークエットセルで達成された。［ポリ（ｄＡ−ｄＴ）］2（ポリ−ＡＴ）存在下ＢＥＢＯについて明らかなポジティブＬＤが示されて、小溝結合の強い顕示を提供している（図２）。等方吸収によるＬＤ分離で得られた還元ＬＤから、ＢＥＢＯの長波長転移モーメントとＤＮＡ螺旋との間の角度は４４度であると計算された。これは既知の小溝バインダー、例えばＤＡＰＩ25についての角度と同じである。ＢＥＢＯの主たる転移モーメントはピリジンと最も近いベンゾチアゾール環26とを繋ぐ線にほぼ沿って偏光されるものと期待できる。
【００７４】
子牛胸線ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）の存在下でのＢＥＢＯについて示されたより弱い信号は、対称シアニン染料13についての従来の研究で提示されるように、多分小溝中での結合によるものでその角度は５４度に近い。しかしポリ−ＡＴへの結合角度４４度にＣＤ−滴定データ（下記参照）を加えるとｃｔＤＮＡへのより複雑な結合が結論され、結合モードの混合の結果平均して低いＬＤ信号となる。ヘキストとＤＡＰＩとはＡＴ−豊領域への小溝結合を好むものであるが、非古典的な層間挿入過程27、28によってＧＣ配列に結合するものと考えられる。［ポリ（ｄＧ−ｄＣ）］2（ポリ−ＧＣ）を伴ったＢＥＢＯの還元ＬＤスペクトルはＤＮＡ基表示層間挿入（データは示さず）についてと同じ振幅のネガティブ値を示すので、このモデルはここでも応用できるようである。
【００７５】
ＢＥＢＯの結合とは対照的にＬＤ測定によれば、層間挿入によりＢＯは研究された全ての３種の異なるポリヌクレオチド、つまりｃｔＤＮＡ（図２）、ポリ−ＡＴおよびポリ−ＧＣ（図３）に結合する。ＢＯ構造のベンゾチアゾール拡大により引き起こされる結合モードの変化は特にポリ−ＡＴの場合に明白である。
【００７６】
円形二色性測定。ポリ−ＡＴ（図４ａ）の存在下で誘発されたＢＥＢＯのためのポジティブＣＤは小溝中における結合により強い支持を与えるものである29。図４ａは結合比ＲでのＢＥＢＯ中へのポリ−ＡＴの滴定であって、塩基当たりの染料分子の総数として定義され、０．０２５〜０．１と変化する。最大結合比におけるＢＥＢＯの大なるＣＤ振幅は、密に結合された発色団間の励起子結合相互作用により、合理化される。これは図４ａ中でＣスペクトル（Ｒ＝０．１）からＢスペクトル（Ｒ＝０．０５）を減算することにより示され、励起子結合（Ｄ、図４ａ）に独特なスペクトルを形成する。
【００７７】
ｃｔＤＮＡが存在すると誘発されるＣＤは小さいが、それでも染料の層間挿入または外部積重ねが大きな振幅への上昇を与えないだろう。かくして小溝中には顕著な量の染料が残っていなければならない。図４ｂに０．０１２５〜０．１０の結合比ＲでのＢＥＢＯ中へのｃｔＤＮＡの滴定を示す。ポリ−ＡＴへのＢＥＢＯの結合の場合のように、高い結合比における密に離間したリガンド間の励起子結合相互作用の兆しがある。振幅は小さくなるが、低い結合比では、信号は対応するポリ−ＡＴスペクトルのそれと類似する。
【００７８】
ポリ−ＧＣにＢＥＢＯが結合すると非常に小さな誘発ＣＤ（図５ａ）が起き、ＧＣ領域への層間挿入結合モードを支持する。これがｃｔＤＮＡへの結合に際して得られる低ＣＤの主な原因になるようである。しかし交互するＧＣ−とＡＴ−セグメントの単なる混合物よりもｃｔＤＮＡがより複雑であることは留意しなければならない。
【００７９】
ｃｔＤＮＡの存在下におけるＣＤスペクトルの振幅はポリ−ＡＴスペクトルの約１／４である。ｃｔＤＮＡへの結合がＡＴ−領域への溝結合とＧＣ−領域への層間挿入の混合であるならば、７５％は層間挿入流で結合されるだろう。その場合ＬＤは顕著によりネガティブであるので、これは持ち応えられない。かくして交互ＡＴに結合される場合よりは、実質的な染料の量は低誘発ＣＤを与える位置に非層間挿入流でｃｔＤＮＡに結合されなければならない。
【００８０】
ｃｔＤＮＡの存在下でのＢＯについてのＣＤ信号は若干ネガティブであり（データは示さず）、これがＢＯに比べてのＢＥＢＯの結合モードの違いを示している。
【００８１】
ポリヌクレオチド結合嗜好。ポリ−ＧＣおよびポリ−ＡＴ存在下でのＢＥＢＯについてのＣＤ信号振幅の顕著な相違の故に、簡単な実験で可能性のあるＡＴ嗜好を調べることが可能である。ポリ−ＧＣ（Ｒ＝０．０５）の存在下でのＢＥＢＯの試料にポリ−ＡＴが添加されると、ＣＤ信号は劇的に増加されて、ポリ−ＡＴ（図５ａ）への著しい嗜好を示す。これらのスペクトルはポリ−ＧＣ（図４ａ）なしでのポリ−ＡＴ存在下でのＢＥＢＯのＣＤスペクトルと一致するが、信号の振幅は若干低い。
【００８２】
同様な実験が行われて、ポリ−ＡＴとｃｔＤＮＡに対するＢＥＢＯの結合親和性を比較した。再びｃｔＤＮＡの存在下でのＢＥＢＯの試料にポリ−ＡＴが添加された。ポリ−ＡＴの添加によりＣＤ信号の増加があったが、試料が最初にポリ−ＧＣ（図５ｂ）を含んでいた場合ほど大きくはなかった。かくしてそれらの比ではまだかなりの量の染料がｃｔＤＮＡに結合したが、このことはＢＥＢＯを顕著に牽引するｃｔＤＮＡ中の交互ＡＴ領域とは他の結合位置がなければならないことを示している。
【００８３】
蛍光性および吸光度測定。異なる核酸を伴ったＢＥＢＯの蛍光性および吸光度を表１にまとめて示す。他の非対称シアニン染料と類似してＢＥＢＯはＤＮＡに結合すると蛍光性が大きく増加する。ＢＥＢＯのポリ−ＡＴに対する明らかな小溝結合により、蛍光強度が１８０倍向上し、ｃｔＤＮＡとポリ−ＧＣへの結合の際の増加は若干より大である。緩衝液中では、結合染料の４９２ｎｍに比べて自由染料の放射ピークは５４２ｎｍである。溶液とした緩衝液の代わりにエタノールを用いると、自由染料放射は４９２ｎｍに移行し、蛍光強度はほぼ１０倍低くなる。最近ＤＮＡの存在・非存在下でのＴＯの集合が、吸光度と蛍光性の分光器により研究されて、集合形成による同様な徴候が観察された30。かくして、緩衝液中におけるより長い放射最大量の２量体または高位の集合は染料の疎水性により形成されるのである。
【００８４】
水中における自由ＢＥＢＯの吸収スペクトルの形状からして二量体または集合（図６）の存在が示唆される。異なるメタノール−水混合物中におけるＢＥＢＯの吸収測定によれば、実質的な増加が認められ、メタノール（図６ｂ）の増量とともに吸収度における赤方偏位が認められた。染料分子は純粋メタノール中に単量体として存在するものと推定される。メタノール中の自由ＢＥＢＯの吸収スペクトルおよびＤＮＡに完全に結合したＢＥＢＯのスペクトルは非常に類似した形状を有しており、これは染料が単量体として低結合比で結合していることを示している。
【００８５】
要約すると、ＢＯの構造変化は、層間挿入から小溝結合への結合モードの移行、を誘発することが分かった。さらに我々の結果からすると、小溝認識部分としてのベンゾチアゾールの潜在能力が示唆される。染料は市販のアニリン１から４つのステップだけで合成できる。ＣＤ−およびＬＤ−スペクトルから推定されるように、ポリ−ＡＴへのＢＥＢＯの結合は小溝中であることが明らかである。ＤＡＰＩおよびヘキストのそれと同様に、ポリ−ＧＣへのＢＥＢＯの結合は主として層間挿入による。
【００８６】
他方ランダム配列ｃｔＤＮＡではＢＥＢＯは混成的に相互作用する。しかしＧＣセグメントへの層間挿入およびＡＴ領域への小溝結合はｃｔＤＮＡについて得られたＬＤ−およびＣＤ−結果の唯一の説明にはならない。ＢＥＢＯのためのｃｔＤＮＡには他に好ましい結合サイトがなければならなく、該サイトはポリ−ＡＴではなくて低ＣＤを誘発するものである。しかしＣＤ信号の比較的大きな振幅からして、ｃｔＤＮＡへのＢＥＢＯの小溝結合の顕著な貢献があると言える。他の小溝バインダーと同じく、ＢＥＢＯはポリ−ＧＣに比べてポリ−ＡＴへの明らかな嗜好を有している。ポリ−ＡＴの小溝への結合に際しての蛍光増加はヘキストとＤＡＰＩについてより大きい。ＢＥＢＯの結合性、特にそのポリ−ＡＴへの強い小溝結合は小溝結合への強い嗜好を具えた新規なクラスの非対称シアニン染料の開発と結合に際しての蛍光性の大きな増加を約束するものである。類似の染料の合成と研究とは進行中でありいずれ適切な機会に報告する。
【００８７】
実験例。反応様式による調製。市販のアニリン１から出発して４ステップで染料１を調製した。ＤＭＦ中のチオシアン化カリウムおよびブロミンと４−置換アニリン１とのチオシアン化により収量４０％で２−アミノベンゾチアゾール２を得た。化合物２のメチル化と脱プロトン化収量７０％で進み、２−イミノ−３−メチルベンゾチアゾリン３を製造した。化合物３をピリジン塩４と一緒に真空下１６０℃で溶解して、染料５が２０％中で調製された。
【００８８】
合成。ベンゾチアゾールとベンゾオキサゾールとをそれぞれｎ−ＢｕＬｉで−７８℃で処理してからｔｉｉ−ｎ−塩化ブチルチンを添加することにより、２−（Ｔｉｉ−ｎ−ブチルスタニル）−ベンゾチウオール（１）および２−（Ｔｒｉ−ｎ−ブチルスタニル）−ベンゾオキシオール（２）を調製した。
【００８９】
【化１１】
2004536900.tif 000013
方式：有機スタナンの調製。
【００９０】
６−ブロモ−２−メチル−ベンゾチアゾール（５）。２，４−ジブロモ−ウイリンをピリジン中でアクチック（ａｃｃｔｉｃ）無水物で処理して、アセトアニリド（３）を得た。還流ベンゼン中で（３）をフォスフォラス・ペンタサルファイドと反応させて、スルファー（ｓｕｌｐｈｕｒ）原子によりカルボニル酸素を置換して、チオアセトアニリド（４）を得た。（３）から（４）の分離は、水性ＮａＯＨによる抽出により、容易に達成された。スルファー（ｓｕｌｐｈｕｒ）原子は酸素より大きくより偏光可能であり水溶性チオアセトウイリデアニオン（４’）を形成することができるので、これが可能である。この（４’）を形成する能力は最後のステップでも利用され、（４）がメトボオキサイド・ナトリウム処理され、２−位のブロミンの除去により閉環に至り、生成物（５）を得た。バルブ−ツー−バルブ（ｂｕｌｂ−ｔｏ−ｂｕｌｂ）蒸留によるＮＭＰの除去により、（５）が昇華により容易に純化されることが分かった。
【００９１】
【化１２】
2004536900.tif 000014
【００９２】
方式：２，４−ジブロモ−アニリンからの（５）の調製。
【００９３】
【化１３】
2004536900.tif 000015
【００９４】
６−ロド−２−メチル−ベンゾチアゾール（９）。（５）の合成とそのイオド類似物（９）は非常に似ている。しかしこの場合、ジハロゲン化アセトアニリド（７）が４−イオド−アニリンのアシル化により達成されて続く臭素化により（６）を与える。この臭素化ステップにおいて４−位のイオジンのあるものはブロミンで置換された。（７）からの形成された２，４−ジブロモ−アセトアニリドの分離は成果がなかった。分子比３：１での（９）と（５）の混合物が結果された。これにも拘わらず混合物は以下のＳｔｉｌｌｅ結合反応に用いられた。
【００９５】
【化１４】
2004536900.tif 000016
方式：４−イオドアニリンからの（９）の調製。
【００９６】
６−ブロモ−２−メチルチオ−ベンゾチアゾール（１０）。後続の反応では使用されないが、他のハロゲン化電子物質、６−ブロモ−２−メチルチオ−ベンゾチアゾール（１０）、が調製された。（１０）の合成は、以下の方式に見られるように、全く複雑ではない。ＦｅＣｌ3を触媒として２−メチルチオ−ベンゾチアゾールが酢酸中でブロム化されるだけである。
【００９７】
【化１５】
2004536900.tif 000017
方式：２−メチルチオ−ベンゾチアゾールの６位でのブロム化。
【００９８】
Ｓｔｉｌｌｅ結合。パラジウムが触媒作用をする架橋反応を研究し最適化すべく、異なる出発物質および２種の異なる触媒上の中性リガンドを用いて多数の実験が行われた。しかし実験の部分において（１１）と（１３）の合成を示す過程は全てＳｔｉｌｌｅ結合に従った。ＣｕＩが結合への共触媒的効果の故に使用された。表１はこの作業で行われたＳｔｉｌｌｅ実験の要約である。
【００９９】
【表１】
2004536900.tif 000018
表１：行われたＳｔｉｌｌｅ反応の要約
【０１００】
出発点１において、フラッシュクロマトグラフィー（シリカ上にクロロフォルム）にも拘わらず純生成物は分離できなかった。しかしマススペクトロメトリーにより少量の生成物は確認された。ブロミンに比べて秀れた求電子剤へのイオジンの挙動については既に記載したところであり、したがって期待された。この性質は脱離基として作用するイオジンの大きな能力によるものである。出発点４〜７における実験の失敗は、ブロミンに対して４位の窒素がその自由電子対をアリル環へ与えるからであり、それにより求電子剤を不活性にするものと考えられる。いずれにせよブロム化された求電子剤を用いようと試みる理由はその容易な合成にある。出発点８〜９におけるアリルハライドは（９）と（５）との３：１（モル−）混合物であり、表１の収量は（９）の量についてのみ計算したものである。これは出発点４〜７におけるブロム化求電子剤の反応の鈍さによるものである。
【０１０１】
パラジウム−リガンドとしてのトリフェニルアルシンの使用が報告されており、トリフェニルフォスフィンに比べて、１１００倍までの反応速度増加が見られる２”’１。でも驚いたことに、実施された実験においてはトリフェニルアルシンはトリフェニルフォスフィンより効果が劣っていた。皮相的ではあるが、これはリガンドとしてのトリフェニルアルシンの優秀さによるのだろう。つまりＰｄ（Ｏ）をより酸化し易くし触媒をトリフェニルフォスフィンに関してよりもより空気に敏感にするからだろう。反応槽に少量の空気／酸素汚染があると、トリフェリルアルシン配位パラジウムの触媒効果が低減され、フォスフィン−リガンドを含んだ触媒は影響が少ない。
【０１０２】
ＢＥＴＯとＢＯＸＴＯ。方式８、９に示す反応により２種の新たな非対称シアニン染料ＢＥＴＯとＢＯＸＴＯが調製された。
【０１０３】
【化１６】
2004536900.tif 000019
方式８：ＢＥＴＯの合成における２つの最終ステップ。
【０１０４】
【化１７】
2004536900.tif 000020
方式９：ＢＯＸＴＯの合成における２つの最終ステップ。
【０１０５】
（１１）と（１３）とを過剰の熔融メチルトシレートで処理することにより、メチル化塩（１２）と（１４）が７０％、５６％の収量で形成された。これらの塩はジクロロメタン中で１−メチル−キノリニウムトシレートと反応して所望の染料を製造した。最終ステップでの収量は２７％、３０％であった。
【０１０６】
水の添加によりブロックマンＩＩＩ級まで非活性化された酸化アルミニウム（活性化、中性、ほぼ１５０メッシュ）を用いてカラム・クロマトグラフィーが行われた。融点はメトラーＦＰ８２ＨＴホットステージ顕微鏡上で決定された。Ｖａｒｉａｎ  ＵＮＩＴＹ−４００ＮＭＲスペクトロメーターを用いて1Ｈ（４００ＭＨｚ）および13Ｃ（１００．６ＭＨｚ）ＮＭＲスペクトルが記録された。化学シフトはｐｐｍで、溶融ピークに関してはＤＭＳＯ（1Ｈについてはδ２．５０、13ＣＮＭＲについてはδC３９．５１）。Ｊ値はＨｚで与えられた。ＶＧＺａｂＳｐｅｃ装置を用いて高解像度マススペクトルが記録された。
【０１０７】
Ｖａｒｉａｎ  Ｃａｒｙ４分光光度計を用いてＵＶ−ｖｉｓスペクトルが測定された。ＳＰＥＸ蛍光探査π２スペクトロフルオリメーターを用いて蛍光スペクトルが記録された。ＪＡＳＣＯ７２０分光偏光計上でＬＣ、ＣＤスペクトルが記録された。外側回転シリンダーを具えたフローＣｏｕｅｔｔｅセルを用いてＤＮＡ錯体の配列が達成された。全てのスペクトロスコープ的測定は２５℃で２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で行われた。ＢＥＢＯおよびＢＯの水性溶液は一般的にＤＭＳＯ中の２ｍＭストック溶液から得られた。緩衝液中の溶液として［ポリ（ｄＡ−ｄＴ）］2および［ポリ（ｄＧ−ｄＣ）］2が薬局から購入された。子牛胸腺ＤＮＡはＦｌｕｋａから購入された。試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入され純化なしに使用された。ピリジン塩４およびベンゾチアゾリウム塩５は前記と同様に調製された23。
【０１０８】
２−アミノ−６−（６−メチル−ベンゾチアゾール−２−ｙｌ）−ベンゾチアゾール（２）。２−（４−アミノフェニル）−６−メチル−ベンゾチアゾール１（４．０ｇ、１６．６ｍｍｏｌ）とＫＳＣＮ（２．６ｇ、２６．７ｍｍｏｌ）がＤＭＦ（２０ｍｌ）中に溶解され氷槽中で冷却された。３ｈでＤＭＦ（１５ｍｌ）中のＢｒ2（０．９ｍｌ、１７ｍｍｏｌ）が滴下添加された。混合物をさらに２０ｈ攪拌された。水を添加し沈殿物を濾過乾燥により回収した。未精製の生成物を数部分の蒸留ジクロロメタンとともに沈殿物上で粉末にして、ライトグリーン−黄色の固体（１．９７ｇ、４０％）として２を得た。Ｍｐ２５０−２５１℃；1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ２．４５（３Ｈ、ｓ、Ａｒ−ＣＨ3）、７．３４（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４、ＡｒＨ）、７．５０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４、ＡｒＨ）、７．８９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４、ＡｒＨ）、７．９１（１Ｈ、ｓ、ＡｒＨ）、７．９９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４、ＡｒＨ）、８．５１（１Ｈ、ｓ、ＡｒＨ）、８．５６（２Ｈ、ｓ、ＮＨ2）；13ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ２１．１０、１１６．７、１２０．７、１２１．８、１２２．１、１２５．６、１２６．９、１２８．１、１２９．７、１３３．３、１３４．５、１３５．０、１５１．７、１６５．９、１６９．３；ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｆｏｕｎｄ：２９８．０５２１  Ｃ15Ｈ12Ｎ3Ｓ2（Ｍ＋Ｈ+）：ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｍ、２９８．０４７３。
【０１０９】
２−アミノ−３−メチル−６−（６−メチル−ベンゾチアゾール−２−ｙｌ）−ベンゾチアゾリウムイオダイド。２−アミノベンゾチアゾール２（０．３ｇ、１．０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍｌ）中に溶解した。メチルイオダイド（０．２５ｍｌ、２．０ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１１０℃で１７時間攪拌した。混合物を冷却して水中に滴下した。形成された沈殿物を濾過回収し、水で洗浄して黄色の固体状の生成物を得た（０．３８ｇ、８６％）。Ｍｐ２６７−２６９℃；1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ２．４７（３Ｈ、ｓ、Ａｒ−ＣＨ3）、３．７４（３Ｈ、ｓ、Ｎ−ＣＨ3）、７．３８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４、ＡｒＨ）、７．７９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４、ＡｒＨ）、７．９３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４、ＡｒＨ）、７．９５（１Ｈ、ｓ、ＡｒＨ）、８．２２（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４、ＡｒＨ）、８．７５（１Ｈ、ｓ、ＡｒＨ）、１０．１９（２Ｈ、ｓ、ＮＨ2）；13ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ２１．１４、３２．３９、１１３．９、１２２．０、１２２．２、１２２．４、１２２．７、１２６．６、１２８．３、１２９．８、１３４．７、１３５．６、１４０．９、１５１．６、１６４．７、１６８．９；ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｆｏｕｎｄ：３１２．０６３８  Ｃ16Ｈ14Ｎ3Ｓ2（Ｍ+）：ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｍ、３１２．０６２９。
【０１１０】
２−イミノ−３−メチル−６−（６−メチル−ベンゾチアゾール−２−ｙｌ）−ベンゾチアゾリン（３）。２−アミノ−３−メチル−６−（６−メチル−ベンゾチアゾール−２−ｙｌ）−ベンゾチアゾリウムイオダイド（０．３ｇ、０．６８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１０ｍｌ）中に得た。水を添加し（２０ｍｌ）、水性ＮａＯＨ（２０％）で混合物をｐＨ１０に塩基化し、沈殿物を濾過回収し、水で洗浄して生成物３をライトイエロー固体状（０．１９ｇ、８９％）で製造した。Ｍｐ１４６−１４８℃；1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：２．４５（３Ｈ、ｓ、Ａｒ−ＣＨ3）、３．３８（３Ｈ、ｓ、Ｎ−ＣＨ3）、７．１６（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４、ＡｒＨ）、７．３３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４、ＡｒＨ）、７．８７（１Ｈ、ｓ、ＡｒＨ）、７．９０（１Ｈ、ｓ、ＡｒＨ）、７．９３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４、ＡｒＨ）、８．１６（１Ｈ、ｓ、ＡｒＨ）、８．５５（１Ｈ、ｓ、ＮＨ）；13ＣＮＭＲ重水素化溶媒中への４の溶解性が乏しく分析不可能であった；ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｆｏｕｎｄ：３１２．０６１９  Ｃ16Ｈ14Ｎ3Ｓ2（Ｍ＋Ｈ+）：ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｍ、３１２．０６２９。
【０１１１】
４−［（３−メチル−６−（６−メチル−ベンゾチアゾール−２−ｙｌ）−２，３，−ジヒドロ−（ベンゾ−１，３−チアゾール）−２−メチリデン）］−１−メチル−ピリジニウムイオダイド（ＢＥＢＯ）。ベンゾチアゾリン３（０．１ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）と１，４−ジメチル−ピリジン・トシレート４を１６０℃の真空下で一緒に１時間溶解した。ＤＭＳＯ（５ｍｌ）を添加して混合物を３０分間還流加熱した。混合物を水性ＫＩ（３０％）に添加して、形成された沈殿物を濾過回収した。固体をメタノール−ジクロロメタン（２：９８）で中性Ａｌ2Ｏ3上にフラッシュクロマトグラフィーで純化して、ＢＥＢＯ（０．０４ｇ、２４％）を得た。Ｍｐ２８０−２８１℃；1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ２．４７（３Ｈ、ｓ、Ａｒ−ＣＨ3）、３．７６（３Ｈ、ｓ、Ｎ−ＣＨ3）、４．０２（３Ｈ、ｓ、Ｎ−ＣＨ3）、６．３４（１Ｈ、ｓ、＝ＣＨ−）、７．３８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４、ＡｒＨ）、７．４７（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８、ＰｙＨ）、７．７０（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４、ＡｒＨ）７．９３（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４、ＡｒＨ）、７．９５（１Ｈ、Ｓ、ＡｒＨ）、８．１８（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝８．４、ＡｒＨ）、８．３９（１Ｈ、ｄ、Ｊ＝６．８、ＰｙＨ）、８．６５（１Ｈ、ｓ、ＡｒＨ）；13ＣＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：２１．１３、３２．９９、４５．１１、９０．６６、１１２．０、１１８．８、１２０．９、１２１．８、１２２．２、１２４．６、１２６．７、１２７．９、１２８．１、１３４．５、１３５．２、１４２．４、１４２．５、１５０．１、１５１．６、１５６．４、１６４．９；ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｆｏｕｎｄ：４０２．１１４５  Ｃ23Ｈ20Ｎ3Ｓ2（Ｍ+）：ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｍ、４０２．１１０５。
【０１１２】
２−（トリ−ｎ−ブチルスタニル）−ベンゾチアゾール（１）。２０ｍｌのフレッシュ蒸留ＴＨＦを３０分窒素流れで還流した後、ベンゾチアゾール（１．０ｇ、７．４ｍｍｏｌ）を添加した。さらに３０分流し、不活性窒素雰囲気下で溶液を−７８℃に冷却した。０．９当量のｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中の２Ｍ溶液、２．６６ｍＩ、６．６６ｍｍｏｌ）を３０分間滴下添加し、これにより溶液は濃赤色に変わった。溶液を−７８℃で１ｈ保持し、トリ−ｎ−塩化ブチルチン（２．０ｍｉ、７．４ｍｍｏｌ）を１ｈ滴下添加した。この添加の間、溶液は濃赤色から茶黄色に変化し、ついで緑青になり最後にライトブラウンになった。−７８℃で１時間後溶液を室温にした。ＴＨＦを回転蒸発器で除き、生成物、黄色油を真空中で蒸留した。収量：２．４７ｇ、７９％。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ０．９０（ｔ、Ｊ＝Ｓ、９Ｈ、Ｂｕ3Ｓｎ）、１．２９（ｉｎ、６Ｈ、Ｂｕ3Ｓｎ）、１．３５（ｍ、６Ｈ、Ｂｕ3Ｓｎ）、１．６３（ｔ、Ｊ＝８、６Ｈ、Ｂｕ3Ｓｎ）、７．３７（ｔ、Ｊ＝８、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．４６（ｔ、Ｊ＝８、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．９６（ｄ、Ｊ＝８、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．１７（Ｄ、Ｊ＝８、１Ｈ、ＡｒＨ）。
【０１１３】
２−（トリ−ｎ−ブチルスタニル）−ベンゾオキサゾール（２）。２０ｍｌのフレッシュ蒸留ＴＨＦを窒素流れとともに３０分流し、爾後ベンゾオキサゾール（１．０ｇ、８．３ｍｍｏｌ）を添加した。さらに３０分還流した後、溶液を−７８℃に冷却し不活性窒素雰囲気下に置いた。０．９当量のｎ−ＢｕＬｉ（ヘキサン中の２Ｍ溶液、３．０ｍｌ、７．６ｍｍｏｌ）を１ｈ滴下添加し、これにより溶液はピンクに変わった。溶液を−７８℃で３０分保持した後、塩化トリ−ｎ−ブチルチン（２．３ｍｌ、８．３ｍｍｏｌ）を１ｈ滴下添加した。この添加の間、溶液はピンクからブラウンに変化した。さらに−７８℃で１時間後、溶液を室温にしたら、濃赤色に変わった。ＴＨＦを回転蒸発器で除き、生成物、オレンジ油を真空中で蒸留分離した。収量：１．３７ｇ、４０％。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ０．９０（ｔ、Ｊ＝７、９Ｈ、Ｂｕ3Ｓｎ）、１．３０（ｍ、６Ｈ、Ｂｕ3Ｓｎ）、１．３５（ｍ、６Ｈ、Ｂｕ3Ｓｎ）、１．６２（ｔ、Ｊ＝７、６Ｈ、Ｂｕ3Ｓｎ）、７．２９（ｔ、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．５５（ｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．７７（ｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）。
【０１１４】
２，４−ジブロモ−アセトアニリド（３）。２，４−ジブロモ−アニリン（３．０ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）の溶液、１．１当量の無水酢酸（１．３５ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）およびピリジン（０．９５ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を１００℃に加熱した。数分後沈殿物が形成されピリジン（〜３ｍｌ）を添加して沈殿物を溶解した。溶液を１００℃で２時間保った後、室温に冷却して水に滴下した。形成された沈殿物を濾過回収し水で洗浄して白粉状の生成物を収量（３．９ｇ、若干湿っている）で得た。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．２４（ａ、３Ｈ、−ＣＨ3）、７．４３（ｄ、Ｊ1＝８．８、Ｊ2＝２、１Ｈ、ＡｒＨ）７．６９（ｓ、Ｊ＝２、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．２７（ｄ、Ｊ＝８．８、１Ｈ、ＡｒＨ）。
【０１１５】
２，４−ジブロモ−チオアセトアニリド（４）。２，４−ジブロモ−アセトアニリド（２．２ｇ、７．５１ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのベンゼン中で溶解し、フォスフォラス・ペンタサルファイド（３．３４ｇ、７．５１ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を８０℃で還流した。数分後ガム状の固体がフラスコの底部に形成された。固体を懸濁させて可能な攪拌をすべく、ベンゼン２０ｍｌを追加添加し混合物を激しくかき回した。５．５ｈ還流した後、クロロフォルム中のシリカ上の薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）が完全な反応を示唆し、熱が除かれた。室温に冷却した後、茶色のスラリーを濾過して、沈殿物をジエチルエーテルで洗浄した。ＮａＯＨ（１０％）でベンゼン／エーテル濾過物が２回抽出された。コーンＨＣｌで塩基性水性相をｐＨ〜１に酸化した。ライトブラウンのミルク状スラリーが得られた。沈殿物は濾過により回収できず、したがってスラリーをジエチルエーテルで２回抽出した。これにより黄色有機相が得られ、乾燥蒸発させてブラウン黄色油としてチオアセトアニリドが得られた。収量１．３３ｇ、５７％。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．７８（Ｓ、３Ｈ、−ＣＨ3）、７．５０（ｄ、Ｊ1＝８．８、Ｊ2＝１．６、１Ｈ、ＡｒＨ）７．９０（ｓ、Ｊ＝１．６、１Ｈ、ＡｒＨ）８．４０（ｄ、Ｊ＝８．８、１Ｈ、ＡｒＨ）。
【０１１６】
６−ブロモ−２−メチル−ベンゾチアゾール（５）。２，４−ジブロモ−チオアセトアニリド（１．３３ｇ、４．３ｍｍｏｌ）と１．２当量のメトキサイド・ナトリウム（０．５１３ｇ、５．２ｍｍｏｌ）を３ｍｌのＮＭＰに溶解した。１５０℃で２ｈ後室温に冷却、バルブ−ツー−バルブ蒸留によりＮＭＰを除去した。ブラウンの残留物を昇華により純化し、白結晶の生成物を得た。収量：７０７ｍｇ、７２％。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．８３（ｓ、３Ｈ、−ＣＨ3）、７．５５（ｄ、Ｊ1＝８．８、Ｊ2＝１．６、１Ｈ、ＡｒＨ）７．８０（ｄ、Ｊ＝８．８、１Ｈ、ＡｒＨ）７．９６（ｓ、Ｊ＝１．６、１Ｈ、ＡｒＨ）。
【０１１７】
４−イオド−アセトアニリド（６）。４−イオド−アニリン（５．０ｇ、２２．８ｍｍｏｌ）と１．１当量の無水酢酸（２．５６ｇ、２５．１ｍｍｏｌ）を３ｍｌのピリジンに溶解した。１００℃で２ｈ後、ＴＬＣが完全な反応を示唆し、熱が除かれた。溶液が室温に達したときに、水に滴下された。形成された沈殿物は濾過回収され水で洗浄して白粉として生成物を得た。収量：５．８６ｇ、９８％。1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ２．０３（ｓ、３Ｈ、−ＣＨ3）７．４１（ｄ、Ｊ＝８．８、２Ｈ、ＡｒＨ）７．６１（ｄ、Ｊ＝８．８、２Ｈ、ＡｒＨ）１０．０３（ｓ、１Ｈ、ＮＨ）。
【０１１８】
２−ブロモ−４−イオド−アセトアニリド（７）。２０ｍｌＨＡｃaq.（７０％）中の４−イオド−アセトアニリド（３．７４ｇ、１４．３ｍｍｏｌ）の溶液に１．１当量のブロミン（２．５３ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）を滴下添加した。７０℃で１０分の反応の後、溶液を水に滴下し、形成された沈殿物を濾過回収（３．０２ｇ）した。1ＨＮＭＲは所望の生成物の混合物および９：４モル比で２，４−ジブロモ−アセトアニリドを呈した。総収量：３．０２ｇ、６５％。所望生成物の収量：２．１８ｇ、４５％。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、）：δ２．２３（ｓ、３Ｈ、−ＣＨ3）、７．６０（ｄ、Ｊ1＝８．８、Ｊ2＝１．６、１Ｈ、ＡｒＨ）７．８５（ｓ、Ｊ＝１．６、１Ｈ、ＡｒＨ）８．１３（ｄ、Ｊ＝８．８、１Ｈ、ＡｒＨ）。副産物の収量：０．８４ｇ、２０％。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：上記したような２，４−ジブロモ−アセトアニリドのスペクトルと一致。
【０１１９】
２−ブロモ−４−イオド−チオアセトアニリド（８）。総量２．８７ｇの２−ブロモ−４−イオド−アセトウイリド（２．０８ｇ、６．１ｍｍｏｌ）と２，４−ジブロモ−アセトアニリド（０．８０ｇ、２．７ｍｍｏｌ）の混合物を〜１０ｍｌのベンゼンに溶解し、フォスフォラス・ペンタサルファイド（３．７５ｇ、８．４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を８０℃で２ｈ還流した。室温に冷却後、ブラウンスラリーを濾過して沈殿物をジエチルエーテルで洗浄した。ベンゼン／エーテル濾過物をＮａＯＨ（１０％）で２回抽出し、濃ＨＣｌで塩基性水性相をｐＨ〜１に酸化した。ライトブラウンのミルク状スラリーが得られ、ジエチルエーテルで２回抽出したら、黄色の有機相が得られた。この相を乾燥蒸発させて２−ブロモ−４−イオド−チオアセトアニリドと２，４−ジブロモ−チオアセトアニリドの混合物がブラウン油として得られた。総収量：２．１４ｇ、７１％。所望生成物収量：１．６６ｇ、７７％1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．７８（Ｓ、３Ｈ、−ＣＨ3）、７．６８（ｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）７．９６（ｓ、１Ｈ、ＡｒＨ）８．２９（ｄ、１Ｈ、ＡｒＨ）。副産物収量：４８０ｍｇ、５７％。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：上記したような２，４−ジブロモ−チオアセトアニリドのスペクトルと一致。
【０１２０】
６−イオド−２−メチル−ベンゾチアゾール（９）。総量２．０２ｇの２−ブロモ−４−イオド−チオアセトアニリド（１．５７ｇ、４．４ｍｍｏｌ）と２，４−ジブロモ−チオアセトアニリド（４５４ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）との混合物が１５ｍｌのＮＭＰ中に溶解した。メトオキサイド・ナトリウム（０．６７７ｇ、６．９ｍｍｏｌ）を添加して、混合物を１５０℃で２．５ｈ攪拌した。ブラウン溶液が室温に冷却されると、バルブ−ツー−バルブ蒸留によりＮＭＰを除去した。ブラウン残留物を昇華により純化し６−イオド−２−メチル−ベンゾチアゾールと６−ブロモ−２−メチル−ベンゾチアゾール（モル比３：１）の混合物を白結晶状で得た。総収量：１．３３ｇ、８６％。所望生成物の収量：１．０４ｇ、８６％。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．８２（ｓ、３Ｈ、−ＣＨ3）、７．６８（ｄ、Ｊ＝８．４、１Ｈ、ＡｒＨ）７．７３（ｄ、Ｊ＝８．４、１Ｈ、ＡｒＨ）８．１６（ａ、１Ｈ、ＡｒＨ）。副産物収量：２８９ｍｇ、８６％。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）上記したような６−ブロモ−２−メチル−ベンゾチアゾールのスペクトルと一致。
【０１２１】
６−ブロモ−２−メチルチオ−ベンゾチアゾール（１０）。１０ｎｉｌ酢酸中の２−メチルチオ−ベンゾチアゾール（１．１４ｇ、６．３ｍｍｏｌ）とブロミン（１．２４ｇ、７．７ｍｍｏｌ）の溶液にＦｅＣｌ3の触媒量を添加した。１２０℃で４ｈ還流した後、オレンジ反応混合物を室温に冷却し酢酸エチル中に滴下した。形成された沈殿物を濾過回収して、酢酸エチルで洗浄し、酢酸エチル中で１ｈ還流した。スラリーを濾過し回転蒸発で酢酸エチルを濾過物から除いて、黄色結晶状の生成物（１３０ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）を得た。還流スラリーから濾過回収された沈殿物をｎ−ペンタンついでジエチルエーテルでＳｏｘｈｌｅｔｔ抽出した。溶媒を蒸発すると別の少量の所望の生成物（７０ｍｇ、２７ｍｍｏｌ）を得た。総収量：２００ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ、１２％。1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ２．７９（ｓ、３Ｈ、−ＳＣＨ3）、７．６１（ｄ、Ｊ1＝８．８、Ｊ2＝２、１Ｈ、ＡｒＨ）７．７７（ｄ、Ｊ＝８．８、１Ｈ、ＡｒＨ）８．３２（ｓ、Ｊ＝２、１Ｈ、ＡｒＨ）。
【０１２２】
２−メチル−６−（ベンゾチアゾール−２−ｙｌ）−ベンゾチアゾール（１１）。６−イオド−２−メチル−ベンゾチアゾール（１６９ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）と６−ブロモ−２−メチル−ベンゾチアゾール（４７ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の２１６ｍｇ混合物を１０ｍｌＤＭＦに溶解した。窒素とＰｄ２ｄｂａ３（２１ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）で溶液を３０分流し、ついでトリ−フェニルフォスフィン（４６ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）を添加した。さらに１５分流した後で、ＣｕＩ（４５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を１５分還流し、不活性窒素雰囲気下に置いた。２−（トリ−ｎ−ブチルスタニル）−ベンゾチアゾール（５００ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を６０℃に加熱した。６０℃で６ｈ保った後、反応混合物を室温に冷却した。ＤＭＦをバルブ−ツー−バルブ蒸留で除いてダークイエロー油を得た。この油をクロロフォルムでシリカ上にフラッシュクロマトグラフィーにより純化し、ピンク結晶状の生成物を得た。収量：１６９ｍｇ、７４％（６−ハロゲン化２−メチル−ベンゾチアゾールの総量について計算した）、９８％（６−イオド−２−メチル−ベンゾチアゾールの量について計算した）。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．８９（ａ、３Ｈ、−ＣＨ3）、７．４１（ｔ、Ｊ＝７．６、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．５２（ｔ、Ｊ＝７．６、１Ｈ、ＡｒＨ、７．９３（ｄ、Ｊ＝７．６、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．０３（ｄ、Ｊ＝８．４、１Ｈ、ＡｒＨ）８．０９（ｄ、Ｊ＝８．８、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．１５（ｄ、Ｊ＝８．４、１Ｈ、ＡｒＨ）８．６４（ｓ、１Ｈ、ＡｒＨ）。ＨＲ−ＦＡＢ∧−ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｆｏｕｎｄ：２８３．０３８  Ｃ15Ｈ11Ｎ2Ｓ2（Ｍ＋Ｈ+）：ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｍ、２８３．０３６。
【０１２３】
２−メチル−３−メチル−６−（ベンゾチアゾール−２−ｙｌ）−ベンゾチアゾリウム・トシレート（１２）。２−メチル−６−（ベンゾチアゾール−２−ｙｌ）−ベンゾチアゾール（４４ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）を溶融メチルトシレート（６６０ｇ、３．５ｍｍｏｌ）中で９０℃で５ｈ攪拌した。室温まで冷却した後、アセトンを添加して沈殿させ、濾過回収した。沈殿物をアセトンで洗浄し、一晩乾燥させた。これによりグリーン結晶状の生成物を得た。収量：５１ｍｇ、７０％。1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ２．２８（ｓ、３Ｈ、−ＣＨ3）、３．２０（ｓ、３Ｈ、ＣＨ3）、４．２４（ｓ、３Ｈ、−ＣＨ3）、７．１１（ｄ、Ｊ＝７．２、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．４６（ｄ、Ｊ＝７．２、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．５５（ｔ、Ｊ＝７．６、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．６２（ｔ、Ｊ＝７．６、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．１４（ｄ、Ｊ＝８、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．２５（ｄ、Ｊ＝８、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．４５（ｄ、Ｊ＝８．８、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．５９（ｄ、Ｊ＝８．８、１Ｈ、ＡｒＨ）、９．２４（ｓ、１Ｈ、ＡｒＨ）。ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｆｏｕｎｄ：２９７．０６７  Ｃ16Ｈ13Ｎ2Ｓ2（Ｍ+）：ｒｅｑｕｉｒｅ  Ｍ、２９７．０５２  。
【０１２４】
４−［（３−メチル−６−（ベンゾチアゾール−２−ｙｌ）−２，３−ジヒドロ−（ベンゾ−１，３−チアゾール）−２−メチル−イデン）］−１メチル−キノリニウム・トシレート（ＢＥＴＯ）。２ｍｌのジクロロメタンに２−メチル−３−メチル−６−（ベンゾチアゾール−２−ｙｌ）−ベンゾチアゾリウム・トシレート（１７ｍｇ、３６μｍｏｌ）と１−メチル−キノリニウム・トシレート（１２ｍｇ、３６μｍｏｌ）を溶解した。トリエチルアミンの２当量（１０μｌ、７２μｍｏｌ）を添加して、濃赤色溶液を室温において４８ｈ反応させた。この間それはブラウンスラリーに変わった。メタノール−ジクロロメタン（２：９８）を用いて中性Ａｌ2Ｏ3上にフラッシュクロマトグラフィーでＢＥＴＯを赤色固体で分離した。収量：６ｍｇ、２７％。1ＨＮＭＲ（メタノール−Ｄ4）：δ３．６４（ｓ、３Ｈ、−ＣＨ3）、３．８３（ｓ、３Ｈ、−ＣＨ3）、６．１４（ｓ、１Ｈ、ＣＨ）、６．７１（ｄ、Ｊ＝６．８、１Ｈ、ＡｒＨ）、６．９１（ｔ、Ｊ＝７．２、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．０２（ｔ、Ｊ＝７．２、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．２９（ｍ、３Ｈ、ＡｒＨ）、７．５０（ｍ、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．６７（ｔ、Ｊ＝７．２、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．７２（ｄ、Ｊ＝８．８、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．９７（ｓ、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．０２（ｄ、Ｊ＝６．４、１Ｈ、ＡｒＨ）８．０９（ｄ、Ｊ＝８．４、１Ｈ、ＡｒＨ）。ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｆｏｕｎｄ：４３８．１１８  Ｃ26Ｈ20Ｎ3Ｓ2（Ｍ）：ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｍ、４３８．１１０。
【０１２５】
２−メチル−６−（ベンゾキサゾール−２−ｙｌ）−ベンゾチアゾール（１３）。６−イオド−２−メチル−ベンゾチアゾール（１６９ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）と６−ブロモ−２メチル−ベンゾチアゾール（４７ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）の混合物２１６ｍｇを１０ｍｌのＤＭＦに溶解した。窒素とＰｄ2ｄｂａ3（２１ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）で溶液を３０分間流し、トリ−フェニルフォスフィン（４６ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）とＣｕＩ（４５ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を１５分間流してから、不活性窒素雰囲気中に置いた。２−（トリ−ｎ−ブチルスタニル）−ベンゾキサゾール（４８１ｍｇ、１．１８ｍｍｏｌ）を添加して、混合物を６０℃に加熱した。６０℃で７ｈ保った後、反応混合物を室温に冷却した。ＤＭＦをバルブ−ツー−バルブ蒸留で除いた。残りの油をクロロフォルムによりシリカ上にフラッシュクロマトグラフィーで純化して、赤色結晶状の生成物を得た。収量：１５４ｍｇ、７１％（６−ハロゲン化２−メチル−ベンゾチアゾールの総量について計算した）、９５％（６−イオド−２−メチル−ベンゾチアゾールの量のみについて計算した）。1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）：δ２．８９（ｓ、３Ｈ、−ＣＨ3）、７．３７（ｍ、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．５９（ｍ、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．７８（ｍ、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．０６（ｄ、Ｊ＝８．８、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．４０（ｄ、Ｊ＝８．８、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．７５（ｓ、１Ｈ、ＡｒＨ）。ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｆｏｕｎｄ：２６７．０５８  Ｃ15Ｈ11Ｎ２ＯＳ（Ｍ＋Ｈ+）：ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｍ、２６７．０５９。
【０１２６】
２−メチル−３−メチル−６−（ベンゾキサゾール−２−ｙｌ）−ベンゾチアゾリウム・トシレート（１４）。２−メチル−６−（ベンゾキサゾール−２−ｙｌ）−ベンゾチアゾール（５０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をｍ過剰の溶融メチルトシレート中（９００ｍｇ、４．７８ｍｍｏｌ）中で９０℃で３ｈ攪拌した。室温まで冷却した後、アセトンを添加して沈殿させ、濾過回収した。沈殿物をアセトンで洗浄し、一晩乾燥させた。これによりライトブラウン結晶状の生成物を得た。収量：５６ｍｇ、５６％。1ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ）：δ２．２７（ｓ、３Ｈ、ＣＨ3）、３．２１（ｓ、３Ｈ、−ＣＨ3）、４．２４（ｓ、３Ｈ、−ＣＨ3）、７．０９（ｄ、Ｊ＝８、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．４７（Ｍ、４Ｈ、ＡｒＨ）、７．８８（ｔ、Ｊ＝８．８、２Ｈ、ＡｒＨ）、８．４９（ｄ、Ｊ＝８．８、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．６４（ｄ、Ｊ＝８．８、１Ｈ、ＡｒＨ）、９．３２（ａ、１Ｈ、ＡｒＨ）。ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｆｏｕｎｄ：２８１．０７８  Ｃ16Ｈ13Ｎ2ＯＳ（Ｍ+）：ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｍ、２８１．０７５。
【０１２７】
４−［（３−メチル−６−（ベンゾキサゾール−２−ｙｌ）−２，３−ジヒドロ−（ベンゾ−１，３−チアゾール）−２−メチリデン）］−１−メチル−キノリニウム・トシレート（ＢＯＸＴＯ）。２ｍｌのジクロロメタン中に２−イネチル−３−メチル−６−（ベンゾキサゾール−２−ｙｌ）−ベンゾチアゾリウム・トシレート（２０ｍｇ、４４μｍｏｌ）とイメチル−キノリニウム・トシレート（１４ｍｇ、４４μｍｏｌ）とを溶解した。トリエチルアミン（１０μｌ、７２μｍｏｌ）を添加して、清明な赤色溶液を室温で週末間反応させた。この間それはブラウン赤スラリーに変わった。メタノール：ジクロロメタン（２：９８）で中性Ａｌ2Ｏ3上にフラッシュクロマトグラフィーでＢＯＸＴＯを赤色固体として分離した。収量：８ｍｇ、３０％。1ＨＮＭＲ（メタノール−Ｄ4）：δ３．７４（ｓ、３Ｈ、−ＣＨ3）、３．９７（ｓ、３Ｈ、−ＣＨ3）、６．３３（ｓ、１Ｈ、ＣＨ）、６．８８（ｄ、Ｊ＝６．８、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．０１（ｍ、２Ｈ、ＡｒＨ）、７．１１（ｄ、Ｊ＝７．２、１Ｈ、ＡｒＨ、７．１７（ｄ、Ｊ＝７．２、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．４２（ｄ、Ｊ＝７．２、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．５５（ｔ、Ｊ＝８、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．６３（ｄ、Ｊ＝８．４、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．７０（ｔ、Ｊ＝７．６、１Ｈ、ＡｒＨ）、７．９１（ｄ、Ｊ＝８、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．１３（ａ、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．１９（ｄ、Ｊ＝６．８、１Ｈ、ＡｒＨ）、８．２３（ｄ、Ｊ＝８．４、１Ｈ、ＡｒＨ）。ＨＲ−ＦＡＢ−ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｆｏｕｎｄ：４２２．１３４  Ｃ26Ｈ20Ｎ3ＯＳ（Ｍ+）：ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｍ、４２２．１３３。
【０１２８】
緩衝液中で自由で異なるＤＮＡに結合したＢＥＢＯの蛍光性および吸収性a。
【表２】
2004536900.tif 000021
a１０ｍＭナトリウム・フォスフェイト緩衝液（７．０ｐＨ）中で２５℃で測定。
b染料：塩基比１：１００
c蛍光量収量、ψF1は０．１ＭＮａＯＨ中のフルオレセインに対して定められた、０．９３のψFを仮定。
d４６７ｎｍで励起したときの４９２ｎｍにおける蛍光強度の増加。
【０１２９】
上記したような小溝結合、非対称シアニン染料ＢＥＢＯはリアルタイムＰＣＲを用いて評価され、ＳＹＢＲグリーンＩと比較された。ＢＥＢＯは低濃度でＰＣＲを抑制せず、ｄｓＤＮＡへの結合に際しての蛍光性増加は使用した機器上でリアルタイム測定をするのに充分であった。背景蛍光は集合によって起因され最適濃度でのＳＹＢＲグリーンのそれのほぼ２倍であった。
【０１３０】
ＤＮＡ結合時での蛍光性の増加はＳＹＢＲグリーンについてより低く、曲線の遅延を結果し、ＣｔはＳＹＢＲグリーンに比べてほぼ４サイクル遅れた。
【０１３１】
同様な染料ＢＥＴＯとＢＯＸＴＯはともに少集合とＤＮＡ結合時のより大なる蛍光性増加の故に低背景であった。それらの染料がリアルタイムＰＣＲに適していればさらなるテストが証明するであろう。
【０１３２】
この研究ではリアルタイムＰＣＲにＢＥＢＯが使用され、ＳＹＢＲグリーンＩと比較された。ｄｓＤＮＡの小溝に結合する染料は層間挿入染料のようにＤＮＡデュープレックスを混乱させない、このことは例えば蛍光性顕微鏡研究に有用である。
【０１３３】
ＢＥＢＯは非対称シアニン染料であり、小溝の凹床に曲線状に相補される。ＢＥＢＯのシアニン発色団はＢＯにおけるそれと同じである。その形状はヘキストやＤＡＰＩなどの他の小溝結合染料と類似である。しかしＢＥＢＯはＤＮＡに結合したときにより高い蛍光性増加を呈し、より高いより便利な波長で吸収する。ほとんどの小溝バインダーは、恐らくＢＥＢＯもＧＣ豊領域中に層間挿入するが、ＡＴ領域では明らかに小溝に結合する。この研究はなぜまたいかにしてＰＣＲ反応がＢＥＢＯの結合により影響されるか、およびいかにして検知試薬ＳＹＢＲグリーンＩとして一般に使用されるものに匹敵するかを研究する。
【０１３４】
材料と方法。ＢＥＢＯはＤＭＳＯ中の５．８ｍＭストック溶液中に供給される。２個のリアルタイムＰＣＲ機器を用いて研究した。Ｒｏｃｈｅ製のＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒとＣｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅｒｃｈ製のＲｏｔｏｒｇｅｎｅ。従来から開発最適化されたＰＣＲシステムが用いられた。純化ＰＣＲ生成物のストックからの２４０ｂｐテンプレートを増幅した。使用された試薬の濃度は［Ｍｇ］＝３ｍＭ、［ｄＮＴＰ］＝２００μＭ、［ｐｒｉｍｅｒｓ］＝０．４μＭ、［ＢＳＡ］＝０．２ｍｇ／ｍｌ、Ｔａｑポリメラーゼ１Ｕ。１００μＭ  ＢＥＢＯおよび１００Ｘ  ＳＹＢＲグリーンストック溶液がＤＭＳＯ中に調製された。ＢＥＢＯの最大吸収は４６７ｎｍで放射は４９２ｎｍであった。Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ（チャンネル１Ｅｘｃｉｔ：４７０、Ｄｅｔｅｃｔ：５１０）でありＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｅｘｃｉｔ：４７０、Ｄｅｔｅｃｔ  Ｃｈ１：５３０）だった。両方とも適当な検知状態を齎した。効率（Ｅ）はＰn＝Ｐo（１＋Ｅ）nと定義された。テンプレート希釈シリーズから引き出され、Ｅ＝１０-1/a−１。ここでａは対応する標準曲線の勾配であり、さらなる詳細についてはプロトコルと実験室ノートを参照されたい。
【０１３５】
ＰＣＲの結果。添付したプロトコルおよびデータファイルの記載を表１に示す。ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ（図９）上でのＢＥＢＯ（０．０５−５μＭ）の希釈シリーズによれば、０．２μＭが背景蛍光と信号増加の良好な釣合いで、この濃度が続いてテンプレート希釈に使用されＳＹＢＲグリーンと比較された。ＰＣＲ抑制のレベルが示すように、テンプレート希釈シリーズが行われて（図１０）、効率は７４％と定められた。図１１〜１２にＳＹＢＲグリーン（０．１Ｘ）との比較を示す。この結果によると、ＢＥＢＯはより高い蛍光背景と低い蛍光増加とを有している。
【０１３６】
希釈から計算された効率はＢＥＢＯについては６６％で、ＳＹＢＲグリーンについては７２％であった。これはＳＹＢＲグリーンを用いたＰＣＲシステムについて通常観察されるよりも低い。ＢＥＢＯ試料はＳＹＢＲグリーン均等物よりもほぼ４サイクル遅いように確実に思える。ＤＭＳＯが高い背景蛍光を低減できるか否かをテストすべく、１５％ＤＭＳＯが６個の試料（データは示さず）中に存在した。２０％までの濃度のＤＭＳＯが一般に使われてＰＣＲにおける特異性を増加させるが、総抑制が観察された。ＢＥＢＯとＳＹＢＲグリーンとの間の第２の比較がプロトコルに若干の変更を加えて行われた（図１４）、［ＢＥＢＯ］＝０．４μＭ、［ＳＹＢＲグリーン］＝０．２Ｘ、それぞれ８０％と９９％の効率を与えた。
【０１３７】
この研究によると、ＢＥＢＯはリアルタイムＰＣＲに使用するのに適切な非特異性ｄｓＤＮＡ結合染料である。使用された機器中でのリアルタイムＰＣＲに使用するに最適な濃度範囲は０．１〜０．５μＭである。より高い濃度では好ましくない高背景蛍光となり、０．０５μＭより低い濃度では充分な蛍光増加を齎し得ない。
【０１３８】
上記したような低濃度範囲ではＢＥＢＯはポリメラーゼ鎖反応への抑制を高めることはない。反応の主たる乱れは１μＭを越える濃度で起き、そこではＰＣＲがその特異性を失い、プライマー二量体に非常によく似た短く特異性のない生成物を形成するだけである。抑制は０．４μＭで観察されるが、０．２μＭのＢＥＢＯはＰＣＲをさほど抑制しないようである。
【０１３９】
ＢＥＢＯをＳＹＢＲグリーンと比較すると、最も衝撃的な相違は増加した背景蛍光性と同じテンプレート濃度におけるＣｔの遅れである。効率はＳＹＢＲグリーンの方が高い：［ＳＹＢＲ］＝０．１Ｘで［ＢＥＢＯ］＝０．２μＭについては７２％対６６％、そして［ＳＹＢＲ］＝０．２Ｘで［ＢＥＢＯ］＝０．４μＭについては９９％対８０％である。最終的に達した蛍光性は同じであるが、ＢＥＢＯの背景はほぼＳＹＢＲグリーンのそれの２倍である。
【０１４０】
背景蛍光性はＢＥＢＯの集合に起因するもので、自発的な蛍光を結果する。この集合はＰＣＲが進むにつれ累積されるようであり、図９、１１、１３の背景信号の線型増加に示されている。高い染料濃度においては、この現象がＳＹＢＲグリーンについても見られる（データ示さず）。集合（エタノールまたはメタノール中には現実には非存在である）を低減するために、１５％ＤＭＳＯが反応に添加された。背景は顕著に低減したが、ＰＣＲの特異性は失われる結果となった。
【０１４１】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを使用すると、ＰＣＲの抑制に至るには非常に高いプローブ濃度が必要なことが観察された。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを使用して５μＭまでのＢＥＢＯは特異な生成物を与えた。ＲｏｔｏｒＧｅｎｅ上の２μＭ  ＢＥＢＯは生成物を与えなかった。これはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置に用いられたガラス毛細管のガラス面への顕著な吸収によるものと結論される。
【０１４２】
現在ＳＹＢＲグリーンＩの構造、結合モード、モル濃度などについての情報は非常に少ない。この故にＢＥＢＯとの詳細な比較は難しく、ある種の応用に当たってはＢＥＢＯに現在使える染料についての情報が必要である。
【０１４３】
曲線分析。増幅曲線をさらに分析するべく、指数成長相の回帰が計算された（図８）。この分析はＢＥＢＯとＳＹＢＲグリーンとの第２の比較に焦点が当てられた。ＢＥＢＯの平均効率は０．９１であり、ＳＹＢＲグリーンは０．９７である。効率とともにこの比較は希釈シリーズから計算され：０．８０と０．９９であった。
【０１４４】
同じテンプレート濃度でＢＥＢＯがしきい値に達するのがＳＹＢＲグリーンより約４サイクル遅い理由は多分ｄｓＤＮＡへの結合に際しての低い蛍光性増加にあるのだろう。低効率だけでは４サイクルの遅れは説明できず、これは曲線分析から引き出された効率によって確認される。ＰＣＲ間にＳＹＢＲグリーンはＤＮＡに効率的に結合し、早期の蛍光効果を呈している。しかしＳＹＢＲグリーンを用いた増倍中にＰＣＲ反応は遅延されるので、この効果は強すぎるようである。かくしてＳＹＢＲグリーンはいずれにしても好ましくない程度にＤＮＡ分子と干渉する。
【非特許文献１】
１．Ｒｙｅ、Ｈ．Ｓ．；Ｙｕｅ、Ｓ．；Ｗｅｍｍｅｒ、Ｄ．Ｅ．；Ｑｕｅｓａｄａ、Ｍ．Ａ．；Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｒ．Ｐ．；Ｍａｔｈｉｅｓ、Ｒ．Ａ．；Ｇｌａｚｅｒ、Ａ．Ｎ．「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」１９９２年、１１、２８０３−２８１２。
【非特許文献２】
２．Ｌｅｅ、Ｌ．Ｇ．；Ｃｈｅｎ、Ｃ．−Ｈ．；Ｃｈｉｕ、Ｌ．Ａ．「Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」１９８６年、７、５０８−５１７。
【非特許文献３】
３．Ｓｖａｎｖｉｋ、Ｎ．；Ｗｅｓｔｍａｎ、Ｇ．；Ｗａｎｇ、Ｄ．；Ｋｕｂｉｓｔａ、Ｍ．「Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．」２０００年、２８１、２６−３５。
【非特許文献４】
４．Ｇｕｒｒｉｅｒｉ、Ｓ．；Ｗｅｌｌｓ、Ｋ．Ｓ．；Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｉ．Ｄ．；Ｂｕｓｔａｍａｎｔｅ、Ｃ．「Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．」１９９７年、２４９、４４−５３。
【非特許文献５】
５．Ｎｅｔｚｅｌ、Ｔ．Ｌ．；Ｎａｆｉｓｉ、Ｋ．；Ｚｈａｏ、Ｍ．；Ｌｅｎｈａｒｄ、Ｊ．Ｒ．；Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｉ．「Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．」１９９５年、９９、１７９３６−１７９４７。
【非特許文献６】
６．Ｌａｒｓｓｏｎ、Ａ．；Ｃａｒｌｓｓｏｎ、Ｃ．；Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｍ．；Ａｌｂｉｎｓｓｏｎ、Ｂ．「Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．」１９９４年、１１６、８４５９〜８４６５。
【非特許文献７】
７．Ｌａｒｓｓｏｎ、Ａ．；Ｃａｒｌｓｓｏｎ、Ｃ．；Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｍ．「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」１９９５年、３６、１５３〜１６７。
【非特許文献８】
８．Ｐｅｔｔｙ、Ｊ．Ｔ．；Ｂｏｒｄｅｌｏｎ、Ｊ．Ａ．；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ、Ｍ．Ｅ．「Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂ」２０００年、１０４、７２２１〜７２２７。
【非特許文献９】
９．Ｎｙｇｒｅｎ、Ｊ．；Ｓｖａｎｖｉｋ、Ｎ．；Ｋｕｂｉｓｔａ、Ｍ．「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」１９９８年、４６、３９〜５１。
【非特許文献１０】
１０．Ｋａｐｕｓｃｉｎｓｋｉ、Ｊ．；Ｓｋｏｃｚｙｌａｓ、Ｂ．「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」１９７８年、５、３７７５〜３７９９。
【非特許文献１１】
１１．Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ、Ｋ．Ｆ．；Ｖａｒｓｈｎｅｙ、Ｕ．；ｖａｎ  ｄｅ  Ｓａｎｄｅ、Ｊ．Ｈ．「Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｄｙｎ．」１９８８年、５、１００５〜１０２３。
【非特許文献１２】
１２．Ｎｅｉｄｌｅ、Ｓ．「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」１９９７年、４４、１０５〜１２１。
【非特許文献１３】
１３．Ｙｏｓｈｉｎａｇａ、Ｎ．；Ａｋｉｔａｙａ、Ｔ．；Ｙｏｓｈｉｋａｗａ、Ｋ．「Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．」２００１年、２８６、２６４〜２６７。
【非特許文献１４】
１４．Ｍａｔｓｕｚａｗａ、Ｙ．；Ｙｏｓｈｉｋａｗａ、Ｋ．「Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄ．  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ．」１９９４年、１３、１４１５〜１４２３。
【非特許文献１５】
１５．Ｉｓａｃｓｓｏｎ、Ｊ．；Ｗｅｓｔｍａｎ、Ｇ．「Ｔｅｔｒａｈｅｄｏｎ  Ｌｅｔｔ．」２００１年、４２、３２０７〜３２１０。
【非特許文献１６】
１６．Ｓｉｎｇｅｒ、Ｖ．Ｌ．；Ｊｏｎｅｓ、Ｌ．Ｊ．；Ｙｕｅ、Ｓ．Ｔ．；Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｒ．Ｐ．「Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．」１９９７年、２４９、２２８〜２３８。
【非特許文献１７】
１７．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｒ．Ｐ．「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第６編」、１９９６年、１４４〜１５２。
【非特許文献１８】
１８．Ｍｉｋｈｅｉｋｉｎ、Ａ．Ｌ．；Ｚｈｕｚｅ、Ａ．Ｌ．；Ｚａｓｅｄａｔｅｌｅｖ、Ａ．Ｓ．「Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｄｙｎ．」２０００年、１８、５９〜７２。
【非特許文献１９】
１９．Ｓｅｉｆｅｒｔ、Ｊ．Ｌ．；Ｃｏｎｎｏｒ、Ｒ．Ｅ．；Ｋｕｓｈｏｎ、Ｓ．Ａ．；Ｗａｎｇ、Ｍ．；Ａｒｍｉｔａｇｅ、Ｂ．Ａ．「Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．」１９９９年、１２１、２９８７〜２９９５。
【非特許文献２０】
２０．Ｄｅｌｉｇｅｏｒｇｉｅｖ、Ｔ．Ｇ．；Ｇａｄｊｅｖ、Ｎ．Ｉ．；Ｄｒｅｘｈａｇｅ、Ｋ．−Ｈ．；Ｓａｂｎｉｓ、Ｒ．Ｗ．「Ｄｙｅｓ  ａｎｄ  Ｐｉｇｍｅｎｔｓ」１９９５年、２９、３１５〜３２２。
【非特許文献２１】
２１．Ｍｉｔａｌ、Ｒ．Ｌ．；Ｊａｉｎ、Ｓ．Ｋ．「Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｃ」１９６９年、２１４８〜２１５０。
【非特許文献２２】
２２．Ｎａｉｍ、Ｓ．Ｓ．；Ｓｉｎｇｈ、Ｓ．Ｋ．；Ｓｈａｒｍａ、Ｓ．「Ｉｎｄ．  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．」１９９１年、３０Ｂ、４９４〜４９８。
【非特許文献２３】
２３．Ｚｈｏｕ、Ｘ．Ｆ．；Ｐｅｎｇ、Ｚ．Ｈ．；Ｇｅｉｓｅ、Ｈ．Ｊ．；Ｐｅｎｇ、Ｂ．Ｘ．；Ｌｉ、Ｚ．Ｘ．；Ｙａｎ、Ｍ．；Ｄｏｍｍｉｓｓｅ、Ｒ．；Ｃａｒｌｅｅｒ、Ｒ．；Ｃｌａｅｙｓ、Ｍ．「Ｊ．  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．」１９９５年、３９、２４４〜２５２。
【非特許文献２４】
２４．Ｎｏｒｄｅｎ、Ｂ．；Ｋｕｂｉｓｔａ、Ｍ．；Ｋｕｒｕｃｓｅｖ、Ｔ．「Ｑｕａｒｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．」１９９２年、２５、５１〜１７０。
【非特許文献２５】
２５．Ｋｕｂｉｓｔａ、Ｍ．；Ａｋｅｒｍａｎ、Ｂ．；Ｎｏｒｄｅｎ、Ｂ．「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」１９８７年、２６、４５４５〜４５５３。
【非特許文献２６】
２６．Ｃａｒｌｓｓｏｎ、Ｃ．；Ｌａｒｓｓｏｎ、Ａ．；Ｊｏｎｓｓｏｎ、Ｍ．；Ａｌｂｉｎｓｓｏｎ、Ｂ．；Ｎｏｒｄｅｎ、Ｂ．「Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．」１９９４年、９８、１０３１３〜１０３２１。
【非特許文献２７】
２７．Ｗｉｌｓｏｎ、Ｗ．Ｄ．；Ｔａｎｉｏｕｓ、Ｆ．Ａ．；Ｂａｒｔｏｎ、Ｈ．Ｊ．；Ｓｔｒｅｋｏｗｓｋｉ、Ｌ．；Ｂｏｙｋｉｎ、Ｄ．Ｗ．；Ｊｏｎｅｓ、Ｒ．Ｌ．「Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．」１９８９年、１１１、５００８〜５０１０。
【非特許文献２８】
２８．Ｃｏｌｓｏｎ、Ｐ．；Ｂａｉｌｌｙ、Ｃ．；Ｈｏｕｓｓｉｅｒ、Ｃ．「Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．」１９９６年、５８、１２５〜１４０。
【非特許文献２９】
２９．Ｌｙｎｇ、Ｒ．；Ｒｏｄｇｅｒ、Ａ．；Ｎｏｒｄｅｎ、Ｂ．「Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ」１９９２年、３２、１２０１〜１２１４。
【非特許文献３０】
３０．Ｏｇｕｌ’ｃｈａｎｓｋｙ、Ｔ．Ｙ．；Ｌｏｓｙｔｓｋｙｙ、Ｍ．Ｙ．；Ｋｏｖａｌｓｋａ、Ｖ．Ｂ．；Ｙａｓｈｃｈｕｋ、Ｖ．Ｍ．；Ｙａｒｍｏｌｕｋ、Ｓ．Ｍ．「Ｓｐｅｃｔｒｏｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ  Ａ」２００１年、５７、１５２５〜１５３２。
【図面の簡単な説明】
【０１４５】
【図１】層間挿入非対称シアニン染料。
【図２】Ａ）［ポリ（ｄＡ−ｄＴ）］2、Ｂ）ｃｔＤＮＡおよびＣ）ｃｔＤＮＡとともにＢＯ錯体と錯体化したＢＥＢＯのフローＬＤスペクトル。ＤＮＡ塩基転移において標準化。結合比Ｒ（染料：塩基）は、全てのスペクトルにおいて０．０５［染料］＝１１μＭ。
【図３】ＡＴ）［ポリ（ｄＡ−ｄＴ）］2、ＧＣ）［ポリ（ｄＧ−ｄＣ）］2。［ＢＯ］＝１１μＭ。Ｒ＝０．０２５の存在下での標準化ＬＤおよびＢＯの吸収スペクトル。
【図４ａ】（ａ）［ポリ（ｄＡ−ｄＴ）］2、［Ｒ＝０．０２５（Ａ）、０．０５（Ｂ）、０．１０（Ｃ）、（Ｄ）＝（Ｃ）−（Ｂ）］および（ｂ）ｃｔＤＮＡ（底から頂上までのＲ値が０．１、０．０５、０．０３３、０．０２５および０．０１２５）。全てのスペクトルにおいて［染料］＝１１μＭの存在下でのＢＥＢＯのＣＤスペクトル。
【図４ｂ】（ａ）［ポリ（ｄＡ−ｄＴ）］2、［Ｒ＝０．０２５（Ａ）、０．０５（Ｂ）、０．１０（Ｃ）、（Ｄ）＝（Ｃ）−（Ｂ）］および（ｂ）ｃｔＤＮＡ（底から頂上までのＲ値が０．１、０．０５、０．０３３、０．０２５および０．０１２５）。全てのスペクトルにおいて［染料］＝１１μＭの存在下でのＢＥＢＯのＣＤスペクトル。
【図５ａ】（ａ）［ポリ（ｄＧ−ｄＣ）］2と（ｂ）ｃｔＤＮＡ（両図においてＲ＝０．０５）。［ポリ（ｄＡ−ｄＴ）］2を添加して混合比を与える、染料：ＡＴ−塩基の；（ａ）（Ｂ）０．１および（Ｃ）０．０５、（ｂ）底から上：０．１、０．０５および０．０２５。全てのスペクトルにおいて［染料］＝１１μＭの存在下での［ポリ（ｄＡ−ｄＴ）］2のＢＥＢＯ試料中への添加後のＣＤの変化。
【図５ｂ】（ａ）［ポリ（ｄＧ−ｄＣ）］2と（ｂ）ｃｔＤＮＡ（両図においてＲ＝０．０５）。［ポリ（ｄＡ−ｄＴ）］2を添加して混合比を与える、染料：ＡＴ−塩基の；（ａ）（Ｂ）０．１および（Ｃ）０．０５、（ｂ）底から上：０．１、０．０５および０．０２５。全てのスペクトルにおいて［染料］＝１１μＭの存在下での［ポリ（ｄＡ−ｄＴ）］2のＢＥＢＯ試料中への添加後のＣＤの変化。
【図６ａ】（ａ）：緩衝液（Ａ）中で自由でかつ子牛胸腺ＤＮＡ（Ｂ）に０．０２Ｒ値で結合したＢＥＢＯの吸収スペクトル。（ｂ）：水−メタノール溶液中のフリーＢＥＢＯの吸収スペクトルで、その構成は０〜１００％メタノール（太線）。
【図６ｂ】（ａ）：緩衝液（Ａ）中で自由でかつ子牛胸腺ＤＮＡ（Ｂ）に０．０２Ｒ値で結合したＢＥＢＯの吸収スペクトル。（ｂ）：水−メタノール溶液中のフリーＢＥＢＯの吸収スペクトルで、その構成は０〜１００％メタノール（太線）。
【図７ａ】錯体化したＢＥＢＯのフローＬＤスペクトル：子牛胸腺ＤＮＡ（上左）、ポリ［ｄＡ−ｄＴ］2（底左）、ポリ［ｄＧ−ｄＣ］2（底右）および子牛胸腺で錯体化したＢＯ（上右）。混合比（Ｒ＝染料／ＤＮＡ塩基）はポリ［ｄＧ−ｄＣ］2（Ｒ＝０．０２）を除いてすべて０．０５。
【図７ｂ】錯体化したＢＥＢＯのフローＬＤスペクトル：子牛胸腺ＤＮＡ（上左）、ポリ［ｄＡ−ｄＴ］2（底左）、ポリ［ｄＧ−ｄＣ］2（底右）および子牛胸腺で錯体化したＢＯ（上右）。混合比（Ｒ＝染料／ＤＮＡ塩基）はポリ［ｄＧ−ｄＣ］2（Ｒ＝０．０２）を除いてすべて０．０５。
【図７ｃ】錯体化したＢＥＢＯのフローＬＤスペクトル：子牛胸腺ＤＮＡ（上左）、ポリ［ｄＡ−ｄＴ］2（底左）、ポリ［ｄＧ−ｄＣ］2（底右）および子牛胸腺で錯体化したＢＯ（上右）。混合比（Ｒ＝染料／ＤＮＡ塩基）はポリ［ｄＧ−ｄＣ］2（Ｒ＝０．０２）を除いてすべて０．０５。
【図７ｄ】錯体化したＢＥＢＯのフローＬＤスペクトル：子牛胸腺ＤＮＡ（上左）、ポリ［ｄＡ−ｄＴ］2（底左）、ポリ［ｄＧ−ｄＣ］2（底右）および子牛胸腺で錯体化したＢＯ（上右）。混合比（Ｒ＝染料／ＤＮＡ塩基）はポリ［ｄＧ−ｄＣ］2（Ｒ＝０．０２）を除いてすべて０．０５。
【図８】錯体化したＢＥＢＯのＣＤスペクトル：（−−−）ポリ［ｄＡ−ｄＴ］2、（―――）ポリ［ｄＧ−ｄＣ］2、それぞれＲ＝０・０５およびＲ＝０．０２。
【図９】ＢＥＢＯ希釈、生データ。５個の異なるＢＥＢＯ濃度の三つ組、ポジティブおよびＮＴＣ。上から底まで（左軸）：５μＭ（茶色）、２μＭ（パープル）、０．８μＭ（グリーン）、０．２μＭ（青）および０．０５μＭ（赤）。
【図１０】テンプレート希釈、標準化データと対応する標準曲線。［ＢＥＢＯ］＝０．２μＭ。純化ＰＣＲ生成物の６種類の１０倍希釈、１０9〜１０4ｃｏｐｉｅｓ／ｒｘｎ。Ｅ＝０．７４。第５番目の試料（１０5ｃｏｐｉｅｓ）は正しくなく希釈されてしきい値を１サイクル遅くクロスした。
【図１１】ＢＥＢＯ対ＳＹＢＲグリーン、生データ。３通りの１００倍テンプレート希釈を伴った三つ組。ＢＥＢＯについての高背景蛍光レベルおよび総蛍光増加を示す。ＢＥＢＯ試料についての背景蛍光における線型増加に注目。
【図１２】ＢＥＢＯ対ＳＹＢＲグリーン、標準化データ。同じテンプレート濃度についてＳＹＢＲグリーンよりＢＥＢＯがほぼ４サイクル遅い。
【図１３】ＢＥＢＯ対ＳＹＢＲグリーン、生データ。三つ組４倍希釈。［ＢＥＢＯ］＝０．４μＭ、［ＳＹＢＲ］＝０．２Ｘ。ＢＥＢＯについて背景蛍光性の線型増加が見られるが、ＳＹＢＲグリーンについてはなし。
【図１４】ＢＥＢＯ対ＳＹＢＲグリーン。標準化データ。希釈の全範囲に亙って４．５サイクル移行が見られた。
【図１５】熔融曲線。ＢＥＢＯ試料は８７．９℃で熔融ピーク平均を有し、ＳＹＢＲグリーン試料の８８．９℃での熔融ピーク平均。
【図１６】ＳＹＢＲグリーン（上）の指数成長の一部の対数表示とＢＥＢＯ（下）およびその対応する線型回帰。
【図１７】異なるタイプのＤＮＡ結合モード。
【図１８】方式１、試薬と条件：ｉ、Ｂｒ2、ＫＳＣＮ、ＤＭＦ、３ｈ；ｉｉ、１、ＭｅＩ、ＤＭＳＯ、１７ｈ、１１０℃、２。ＮａＯＨaq、ＤＭＳＯ；ｉｉｉ、１６０℃、真空１ｈ。  方式２、試薬と条件：トリエチルアミン、ジクロロメタン、ｒｔ１４ｈ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図７ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2004536900.tif 000042
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年6月13日(2003.6.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化１】
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または
【化２】
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からなる群から選ばれ、かつこれらの構造式において、Ａ1、Ａ2が独立にそれぞれＯ，ＳまたはＮであり、ＲがＨまたは異種原子を含む炭水化物であり、ｍが０〜５であり、ｎが０〜５であることを特徴とするＤＮＡの溝中に結合したシアニン染料。
【請求項２】
Ｒがメチルまたはエチルであり、ｍが１であり、ｎが０であることを特徴とする請求項１に記載のシアニン染料。
【請求項３】
Ｒがメチルまたはエチルであり、ｍが１であり、ｎが０であり、Ａ1、Ａ2がＳであることを特徴とする請求項１に記載のシアニン染料。
【請求項４】
Ｒがメチルまたはエチルであり、ｍが１であり、ｎが０であり、Ａ1、Ａ2がＯであることを特徴とする請求項１に記載のシアニン染料。
【請求項５】
Ｒがメチルまたはエチルであり、ｍが１であり、ｎが０であり、Ａ1がＳ、Ａ2がＯであることを特徴とする請求項１に記載のシアニン染料。
【請求項６】
ピリジン／キノリン環を２−位に有することを特徴とする請求項１に記載のシアニン染料。
【請求項７】
請求項１〜６のシアニン染料を含んだ核酸ハイブリダイゼーション用プローブ。
【請求項８】
ＤＮＡテンプレートのリアルタイムＰＣＲ反応を実施する方法であって、二重鎖ＤＮＡ中の小溝位置中に見られたときに蛍光反応を増加させる請求項１〜６の蛍光染料が使用され、ともに少なくとも１個の窒素原子を含有する少なくとも２個の芳香族環システムを染料が有しており、該芳香族環が４個までの炭素原子を有するアルキン基により連結されて共役結合を形成しており、該染料がさらに単一結合またはアセチレン結合などの顕著な二重鎖特性を具えた結合を介して自身に連結されて強固な共役システムを形成する少なくとも１個の第３芳香族システムを含有していることを特徴とする方法。
【請求項９】
染料が非対称シアニン染料であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
シアニン残基のひとつがＳおよび／またはＯを含んでいることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
染料化合物が三日月形であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
染料が請求項１〜６の１以上の誘導体であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【国際調査報告】
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