(57)【要約】キメラ昆虫ホルモンの受容体及び受容体カセットが提供され、また、適切な化学的リガンドの存在において、植物における標的ポリペプチドの発現を調節するのにこの受容体及び受容体カセットを使用する方法が提供される。具体的には、それぞれの受容体カセットは、ＤＮＡ結合ドメインと、ヒンジ領域と、リガンド結合ドメインと、活性化ドメインとを含む受容体ポリペプチドをコード化する。１つの実施態様によれば、ヒンジドメインと、リガンド結合ドメインとは、２つの異なる昆虫エクジソン受容体に由来する。別の実施態様によれば、受容体カセットは、ＤＮＡ結合ドメイン又は活性化ドメインのうちの１つ又は複数が、キメラ受容体カセットに存在する他のドメインに対して異種の源から得られる点でキメラである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ受容体ポリペプチドをコードする受容体カセットであって、該キメラ受容体ポリペプチドが、
ａ）  ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと；
ｂ）  Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ， Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ及びＬｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）のヒンジ（Ｄ）ドメインと；
ｃ）  前記ヒンジ（Ｄ）ドメインに対して異種のリガンド結合（Ｅ）ドメインと；
ｄ）  活性化ドメインと
を含むことを特徴とする、受容体カセット。
【請求項２】
ａ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｂ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｃ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｄ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｅ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｆ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｇ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｈ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｉ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｊ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；又は、
ｋ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである、
請求項１に記載の受容体カセット。
【請求項３】
前記活性化ドメインが、ＶＰ１６活性化ドメインである、請求項２に記載の受容体カセット。
【請求項４】
前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである、請求項１に記載の受容体カセット。
【請求項５】
前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである、請求項４に記載の受容体カセット。
【請求項６】
前記キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１のアミノ酸１〜５０８に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の受容体カセット。
【請求項７】
前記キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１のアミノ酸１〜５０８を含む、請求項６に記載の受容体カセット。
【請求項８】
ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０のヌクレオチド１〜１５２４とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む、請求項５に記載の受容体カセット。
【請求項９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０のヌクレオチド１〜１５２４を含む、請求項８に記載の受容体カセット。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、前記活性化ドメインが、ＶＰ１６活性化ドメインである、請求項５に記載の受容体カセット。
【請求項１１】
前記キメラ受容体ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の受容体カセット。
【請求項１２】
前記キメラ受容体ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１を含む、請求項１１に記載の受容体カセット。
【請求項１３】
ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む、請求項５に記載の受容体カセット。
【請求項１４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０を含む、請求項１３に記載の受容体カセット。
【請求項１５】
キメラ受容体ポリペプチドをコード化する受容体カセットであって、該キメラ受容体ポリペプチドが、
ａ）  ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと；
ｂ）  ヒンジ（Ｄ）ドメインと；
ｃ）  Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ， Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ及びＬｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）の、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインに対して異種のリガンド結合（Ｅ）ドメインと；
ｄ）  活性化ドメインと
を含むことを特徴とする、受容体カセット。
【請求項１６】
ａ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｂ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｃ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｄ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；又は、
ｅ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである請求項１５に記載の受容体カセット。
【請求項１７】
前記活性化ドメインが、ＶＰ１６活性化ドメインである、請求項１６に記載の受容体カセット。
【請求項１８】
キメラ受容体ポリペプチドをコード化する受容体カセットであって、該キメラ受容体ポリペプチドが、
ａ）  ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン、又は、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）のＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと；
ｂ）  Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインと；
ｃ）  Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインと；
ｄ）  異種の活性化ドメインと
を含み、
前記キメラ受容体ポリペプチドが、エクジソン受容体Ａ／Ｂ  Ｎ末端ドメインを含まない
ことを特徴とする、受容体カセット。
【請求項１９】
前記キメラ受容体ポリペプチドが、
ａ）  ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン、又は、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）のＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと；
ｂ）  Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインと；
ｃ）  Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインと；
ｄ）  エクジソン受容体Ａ／Ｂ  Ｎ末端ドメインではない異種の活性化ドメインと
から本質的に成る、請求項１８に記載の受容体カセット。
【請求項２０】
ａ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｂ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｃ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｄ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｅ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；
ｆ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであるか；又は、
ｇ）  前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである
請求項１８に記載の受容体カセット。
【請求項２１】
前記活性化ドメインがＶＰ１６活性化ドメイン、Ｃ１活性化ドメイン又はＤｏｆ１活性化ドメインである、請求項２０に記載の受容体カセット。
【請求項２２】
前記ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインが、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、前記リガンド結合（Ｅ）ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、前記活性化ドメインがＶＰ１６活性化ドメインである、請求項１８に記載の受容体カセット。
【請求項２３】
前記ＶＰ１６活性化ドメインが、前記キメラ受容体ポリペプチドのＮ末端に位置している、請求項２２に記載の受容体カセット。
【請求項２４】
前記ＶＰ１６活性化ドメインが、前記キメラ受容体ポリペプチドの内部で、前記ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、前記Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインとの間に位置している、請求項２２に記載の受容体カセット。
【請求項２５】
前記ＶＰ１６活性化ドメインが、前記キメラ受容体ポリペプチドのＣ末端に位置している、請求項２２に記載の受容体カセット。
【請求項２６】
前記キメラ受容体ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の受容体カセット。
【請求項２７】
前記キメラ受容体ポリペプチドが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５を含む、請求項２６に記載の受容体カセット。
【請求項２８】
ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のヌクレオチド２００７〜３６６８とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む、請求項２５に記載の受容体カセット。
【請求項２９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のヌクレオチド２００７〜３６６８を含む、請求項２８に記載の受容体カセット。
【請求項３０】
キメラ受容体ポリペプチドをコード化する受容体カセットであって、該キメラ受容体ポリペプチドが、
ａ）  少なくとも１つのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと；
ｂ）  昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）のヒンジ（Ｄ）ドメインと；
ｃ）  前記ヒンジ（Ｄ）ドメインに対して異種の、昆虫のエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインと；
ｄ）  異種の活性化ドメインと
を含み、
前記キメラ受容体ポリペプチドが、エクジソン受容体Ａ／Ｂ  Ｎ末端ドメインを含まない
ことを特徴とする、受容体カセット。
【請求項３１】
前記キメラ受容体ポリペプチドが、
ａ）  少なくとも１つのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと；
ｂ）  昆虫のエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインと；
ｃ）  前記ヒンジ（Ｄ）ドメインに対して異種の、昆虫のエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインと；
ｄ）  エクジソン受容体Ａ／Ｂ  Ｎ末端ドメインではない異種の活性化ドメインと
から本質的に成る、請求項３０に記載の受容体カセット。
【請求項３２】
キメラ受容体ポリペプチドをコード化する受容体カセットであって、該キメラ受容体ポリペプチドが、
ａ）  ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと；
ｂ）  昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）のヒンジ（Ｄ）ドメインと；
ｃ）  Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ以外の鱗翅目昆虫のエクジソン受容体の、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインに対して異種のリガンド結合（Ｅ）ドメインと；
ｄ）  活性化ドメインと
を含むことを特徴とする、受容体カセット。
【請求項３３】
前記ヒンジ（Ｄ）ドメインが、鱗翅目昆虫のエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインである、請求項３２に記載の受容体カセット。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載の受容体カセットに作用連関された異種のプロモータ配列を含むことを特徴とする受容体発現カセット。
【請求項３５】
請求項３４に記載の受容体発現カセットを含むことを特徴とする、組換えベクター。
【請求項３６】
請求項３５に記載の受容体発現カセットを含むことを特徴とする、遺伝子導入宿主細胞。
【請求項３７】
植物細胞である、請求項３６に記載の遺伝子導入宿主細胞。
【請求項３８】
請求項３７に記載の遺伝子導入植物細胞を含むことを特徴とする遺伝子導入植物。
【請求項３９】
請求項３８に記載の遺伝子導入植物に由来することを特徴とする種子。
【請求項４０】
植物における遺伝子発現をコントロールする方法であって、
ａ）  キメラ受容体ポリペプチドをコード化する請求項１から３７までのいずれか１項に記載の受容体カセットに作用連関されて植物細胞中での発現を促進することができる５’調節領域と３’末端領域とを含む受容体発現カセットと；前記キメラ受容体ポリペプチドのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインに対して相補的な１つ又は複数の応答要素を含んで標的ヌクレオチド配列に作用連関された５’調節領域を含む標的発現カセットとで、前記植物を形質転換し；
ｂ）  前記植物中に前記キメラ受容体ポリペプチドを発現させ；さらに、
ｃ）  前記キメラ受容体ポリペプチドのリガンド結合（Ｅ）ドメインに対して相補的な化学的リガンドと、前記植物を接触させ、これにより、前記化学的リガンドの存在における前記キメラ受容体ポリペプチドが、前記標的ヌクレオチド配列の発現を活性化する
ことを特徴とする、植物における遺伝子発現をコントロールする方法。
【請求項４１】
キメラ受容体ポリペプチドであって、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の受容体カセットによってコード化されることを特徴とする、キメラ受容体ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本願は、２０００年１０月２４日付けの米国仮出願第６０／２４２，９６９号明細書の利益を主張する。上記仮出願明細書全体を本明細書中に援用する。
【０００２】
発明の分野
本発明は植物における遺伝子発現の外生的コントロールに関する。具体的には、本発明は、キメラ昆虫ホルモン受容体、及び適切な化学的リガンドの存在において植物中の標的ポリペプチドの発現を調節するために、前記キメラ昆虫ホルモン受容体を使用することに関する。
【０００３】
発明の背景
核受容体のステロイド・甲状腺ホルモン超科が、哺乳類及び昆虫において見出されており、この超科は、１００を上回る既知の蛋白質から成っている。これらの受容体は、クラスＩ及びクラスＩＩとして知られる、少なくとも２つの機能的に区別可能なカテゴリに分けられる（Ｂｅａｔｏ， Ｃｅｌｌ ５６： ３３５−３４４ （１９８９）； Ｐａｒｋｅｒ， Ｓｅｍ． Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ． Ｓｅｒ． １： ８１−８７（１９９０））。クラスＩＩの受容体蛋白質の最もよく研究されている例は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）、甲状腺ホルモン受容体（Ｔ３Ｒ）、及びレチノイン酸Ｘ受容体（ＲＸＲ）である。これらの受容体は、標的遺伝子の５’調節領域に結合し、化学的リガンドが受容体に結合すると、その受容体は、他の転写開始因子と相互作用することにより、遺伝子発現に影響を与える。
【０００４】
哺乳類において見出された上述のようなクラスＩＩ受容体蛋白質に加えて、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのような昆虫において、類似の構造と活性とを有する受容体が同定されている（Ｋｏｅｌｌｅ他、Ｃｅｌｌ ６７：５９ （１９９１）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ及びＫａｆａｔｏｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １９３： １３１８ （１９９３）； Ｈｅｎｒｉｃｈ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８： ４１４３ （１９９０））。エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、ステロイドホルモン２０−ヒドロキシエクジソン（本明細書中では「エクジソン（ｅｃｄｙｓｏｎｅ）」と呼ぶ）と結合し、超スパイラクル（ＵＳＰ）遺伝子の生成物とヘテロ二量体化されると、遺伝子発現をトランスアクティベートする。ＵＳＰはＲＸＲαに対してほとんど相同であり、ＲＸＲは、ＥｃＲとヘテロ二量体を形成することができる（Ｔｈｏｍａｓ他、Ｎａｔｕｒｅ ３６２： ４７１−４７５（１９９３））。
【０００５】
クラスＩＩの核受容体ポリペプチド、例えばＥｃＲは、５つのドメイン、すなわちＡ／Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦの存在を特徴とする（Ｅｖａｎｓ， Ｒ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：８８９−８９５（１９８８））。この場合、「Ａ／Ｂ」はトランスアクティベーション・ドメインを意味し、「Ｃ」はＤＮＡ結合ドメインを意味し、「Ｄ」はヒンジ／リンカードメイン意味し、「Ｅ」はリガンド結合ドメインを意味し、「Ｆ」はいくつかの受容体ポリペプチドに存在する可変Ｃ末端ドメインを意味する。
【０００６】
「Ａ／Ｂ」（トランスアクティベーション）ドメインは、サブドメインとして作用する１つ又は複数のアミノ酸配列を含む。これらのサブドメインは、受容体ポリペプチド中のＤＮＡ結合ドメインと組み合わされると、ＴＡＴＡボックスにおける前開始中及び組み立て中の転写因子の動作に影響を与える（総体的には、Ｐｔａｓｈｎｅ， Ｎａｔｕｒｅ ３３５： ６８３−６８９ （１９８８）参照）。トランスアクティベーション・ドメインの効果は、繰り返しの転写開始事象を可能にし、これにより、標的遺伝子からの遺伝子発現レベルをより大きくすることである。種々異なるトランスアクティベーション・ドメインが、転写開始を増大する能力において種々異なる有効度を有することで知られている。
【０００７】
「Ｃ」（ＤＮＡ結合）ドメインは、特定の機能的構成要件を有するアミノ酸配列である。これらの機能的構成要件は、特異的なヌクレオチド配列、応答要素に、受容体ポリペプチドを結合する原因となる。これらの応答要素は標的遺伝子の５’調節領域に存在する。
【０００８】
「Ｄ」（ヒンジ／リンカー）ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインとリガンド結合ドメインとの間に位置している。
【０００９】
受容体ポリペプチドの「Ｅ」（リガンド結合）ドメインは、標的遺伝子の５’調節領域が化学的リガンドの存在に応答して活性化される際の手段を提供する。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに由来するエクジソン受容体（ＥｃＲ）は、リガンド結合ドメインに結合する相補的な化学的リガンドが同定されている受容体ポリペプチドの一例である。ステロイドホルモンであるエクジソンは、組織発達の協調変化を誘導し、その結果、変態を引き起こす。エクジソンは、ＥｃＲに結合することが判っている（Ｋｏｅｌｌｅ他、Ｃｅｌｌ ６７： ５９−７７ （１９９１））。植物により生成されたエクジソン類似体、ムリステロンもまた、ＥｃＲのリガンド結合ドメインに結合する。他の化学物質、例えば非ステロイド系エクジソンアゴニストＲＨ５８４９（Ｗｉｎｇ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ４６７−４６９ （１９８８））、及び殺虫剤ＭＩＭＩＣ（登録商標）として知られるテブフェノザイド（ｔｅｂｕｆｅｎｏｚｉｄｅ）もまた、ＥｃＲのリガンド結合ドメインに対応する化学的リガンドとして作用することになる。
【００１０】
植物、植物細胞又は植物組織における表現型形質の発現の時間又は程度を制御することが望ましい、いくつかの事例がある。理想的な状況は、農作物、観賞用低木などに容易に加えることができる化学物質を誘因として、随意にこのような形質の発現を調節することである。この理想的な状況に達するために用いることができるこのような１つの遺伝子発現調節システムは、核受容体のステロイド・甲状腺ホルモン超科、例えばＥｃＲ／超スパイラクル・へテロ二量体化受容体である。
【００１１】
本明細書中に引用する米国特許第５，８８０，３３３号明細書に記載された、植物における遺伝子発現をコントロールする方法は、少なくとも２つの受容体発現カセットと、少なくとも１つの標的発現カセットとで植物を形質転換することを含む。第１の受容体発現カセットは、３’末端領域に作用連関された第１の受容体ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列に作用連関された５’調節領域に対応するヌクレオチド配列を含む。第２の受容体発現カセットは、３’末端領域に作用連関された第２の受容体ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列に作用連関された５’調節領域に対応するヌクレオチド配列を含む。これら第１及び第２の受容体ポリペプチドは、それぞれ第１及び第２のリガンド結合領域を含む。これらのリガンド結合領域は互いに区別可能である。標的発現カセットは、３’末端領域に作用連関された標的ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列に作用連関された５’調節領域に対応するヌクレオチド配列を含む。この場合、前記標的発現カセットの５’調節領域は、１つ又は複数の化学的リガンドの存在において、前記第１及び第２の受容体ポリペプチドによって活性化される。これにより、前記標的ポリペプチドの発現が達成される。この方法は、作物学的に重要な種々の形質、例えば植物稔性をコントロールするのに有用である。
【００１２】
しかし、米国特許第５，８８０，３３３号明細書に記載されたような進歩にもかかわらず、化学的リガンドに対する感応性が増大した新規のキメラ昆虫ホルモン受容体を開発する必要性を含め、植物における誘導可能な遺伝子発現のための新しい効果的なシステムを開発する必要性は絶えない。特に望ましいのは、通常のヘテロ二量体化の相手の不存在において機能するクラスＩＩのキメラ昆虫ホルモン受容体を開発することである。
【００１３】
発明の概要
本発明は、新規のキメラ昆虫ホルモン受容体と受容体カセットとを提供することにより、前述の必要性に対処する。本発明の受容体カセットは、詳細には、適切な化学的リガンドの存在において標的ポリペプチドの発現を調節するのに有用である。具体的には、各受容体カセットは、ＤＮＡ結合ドメインとヒンジ領域とリガンド結合ドメインと活性化ドメインとを含む受容体ポリペプチドをコード化する。好ましい実施態様の場合、ヒンジ・ドメイン及びリガンド結合ドメインは２つの異なる昆虫エクジソン受容体に由来する。別の好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＤＮＡ結合領域又は活性化領域のうちの１つ又は複数が、キメラ受容体カセット中に存在するほかのドメインに対して異種の源から得られる点でキメラである。
【００１４】
第１の観点によれば、本発明は、キメラ受容体ポリペプチドをコードする受容体カセットであって、キメラ受容体ポリペプチドが、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと；Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ， Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ及びＬｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）のヒンジ（Ｄ）ドメインと；前記ヒンジ（Ｄ）ドメインに対して異種のリガンド結合（Ｅ）ドメインと；活性化ドメインとを含む、受容体カセットを提供する。好ましくは、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ， Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ， Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ及びＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインである。また好ましくは、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインである。好ましくは、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様によれば、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインである。好ましくは、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメイン、トウモロコシＣ１活性化ドメイン又はトウモロコシＤｏｆ１活性化ドメインである。
【００１５】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの１つの実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４のアミノ酸１〜４２１に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４のアミノ酸１〜４２１を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３のヌクレオチド１〜１２６３とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３のヌクレオチド１〜１２６３を含む。
【００１６】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３を含む。
【００１７】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６のアミノ酸１〜４２２に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６のアミノ酸１〜４２２を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５のヌクレオチド１〜１２６６とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５のヌクレオチド１〜１２６６を含む。
【００１８】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５を含む。
【００１９】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９のアミノ酸１〜５１１に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９のアミノ酸１〜５１１を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８のヌクレオチド１〜１５３３とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８のヌクレオチド１〜１５３３を含む。
【００２０】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８を含む。
【００２１】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの好ましい実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸１〜４１９に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸１〜４１９を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７のヌクレオチド１〜１２５７とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７のヌクレオチド１〜１２５７を含む。
【００２２】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１のアミノ酸１〜５０８に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１のアミノ酸１〜５０８を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０のヌクレオチド１〜１５２４とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０のヌクレオチド１〜１５２４を含む。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。この実施態様によれば、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０を含む。
【００２３】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７を含む。
【００２４】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０のアミノ酸１〜４１９に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０のアミノ酸１〜４１９を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９のヌクレオチド１〜１２５７とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９のヌクレオチド１〜１２５７を含む。
【００２５】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９を含む。
【００２６】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３のアミノ酸１〜５０８に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３のアミノ酸１〜５０８を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２のヌクレオチド１〜１５２４とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２のヌクレオチド１〜１５２４を含む。
【００２７】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２を含む。
【００２８】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４のアミノ酸１〜４０７に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４のアミノ酸１〜４０７を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３のヌクレオチド１〜１２２１とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３のヌクレオチド１〜１２２１を含む。
【００２９】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３を含む。
【００３０】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６のアミノ酸１〜４１６に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６のアミノ酸１〜４１６を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５のヌクレオチド１〜１２４８とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５のヌクレオチド１〜１２４８を含む。
【００３１】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５を含む。
【００３２】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０のアミノ酸１〜４４１に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０のアミノ酸１〜４４１を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のヌクレオチド１〜１３２３とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９のヌクレオチド１〜１３２３を含む。
【００３３】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９を含む。
【００３４】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２のアミノ酸１〜４２０に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２のアミノ酸１〜４２０を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１のヌクレオチド１〜１２６０とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１のヌクレオチド１〜１２６０を含む。
【００３５】
本発明の第１の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１を含む。
【００３６】
第２の観点によれば、本発明は、キメラ受容体ポリペプチドをコード化する受容体カセットであって、キメラ受容体ポリペプチドが、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと；ヒンジ（Ｄ）ドメインと；Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ， Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ及びＬｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）の、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインに対して異種のリガンド結合（Ｅ）ドメインと；活性化ドメインとを含む、受容体カセットを提供する。好ましい実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ， Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ， Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ及びＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。
【００３７】
本発明の第２の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のアミノ酸１〜４２７に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のアミノ酸１〜４２７を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７のヌクレオチド１〜１２８１とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７のヌクレオチド１〜１２８１を含む。
【００３８】
本発明の第２の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７を含む。
【００３９】
本発明の第２の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０のアミノ酸１〜４３０に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０のアミノ酸１〜４３０を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９のヌクレオチド１〜１２９０とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９のヌクレオチド１〜１２９０を含む。
【００４０】
本発明の第２の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９を含む。
【００４１】
本発明の第２の観点に基づく上記受容体カセットの好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７のアミノ酸１〜５１９に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７のアミノ酸１〜５１９を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６のヌクレオチド１〜１５５７とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６のヌクレオチド１〜１５５７を含む。
【００４２】
本発明の第２の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６を含む。
【００４３】
本発明の第２の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２のアミノ酸１〜４３６に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２のアミノ酸１〜４３６を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１のヌクレオチド１〜１３０８とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１のヌクレオチド１〜１３０８を含む。
【００４４】
本発明の第２の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１を含む。
【００４５】
本発明の第２の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４のアミノ酸１〜４３３に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４のアミノ酸１〜４３３を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のヌクレオチド１〜１２９９とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３のヌクレオチド１〜１２９９を含む。
【００４６】
本発明の第２の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３を含む。
【００４７】
第３の観点によれば、本発明は、キメラ受容体ポリペプチドをコード化する受容体カセットであって、キメラ受容体ポリペプチドが、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン、又は、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）のＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインと、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインと、異種の活性化ドメインとを含み、キメラ受容体ポリペプチドが、エクジソン受容体Ａ／Ｂ  Ｎ末端ドメインを含まない、受容体カセットを提供する。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、本質的に下記のドメインから成るキメラ受容体ポリペプチド、すなわち：ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン、又は、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）のＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインと、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインと、エクジソン受容体Ａ／Ｂ  Ｎ末端ドメインではない異種の活性化ドメインとから成るキメラ受容体ポリペプチドをコード化する。１つの好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。また別の好ましい実施態様の場合、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメイン、トウモロコシＣ１活性化ドメイン又はトウモロコシＤｏｆ１活性化ドメインである。
【００４８】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの１つの実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメイン２３である。１つの構成において、ＶＰ１６活性化ドメインは、キメラ受容体ポリペプチドのＮ末端に位置している。別の構成において、ＶＰ１６活性化ドメインは、キメラ受容体ポリペプチドの内部で、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインとの間に位置している。さらに別の構成において、ＶＰ１６活性化ドメインは、キメラ受容体ポリペプチドのＣ末端に位置している。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のヌクレオチド２００７〜３６６８とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のヌクレオチド２００７〜３６６８を含む。
【００４９】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４を含む。
【００５０】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、トウモロコシＣ１活性化ドメインである。この実施態様によれば、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４を含む。
【００５１】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、トウモロコシＤｏｆ１活性化ドメインである。この実施態様によれば、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６を含む。
【００５２】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、活性化ドメインは、Ｎ末端ＶＰ１６活性化ドメインであり、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。この実施態様によれば、キメラ受容体ポリペプチドは好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２を含む。
【００５３】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、活性化ドメインは、内部に形成されたＶＰ１６活性化ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。この実施態様によれば、キメラ受容体ポリペプチドは、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７を含む。
【００５４】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のアミノ酸１〜４２４に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のアミノ酸１〜４２４を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のヌクレオチド１〜１２７２とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５のヌクレオチド１〜１２７２を含む。
【００５５】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５を含む。
【００５６】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２のアミノ酸１〜３９８に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２のアミノ酸１〜３９８を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１のヌクレオチド１〜１１９４とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１のヌクレオチド１〜１１９４を含む。
【００５７】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１を含む。
【００５８】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８のアミノ酸１〜４３６に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８のアミノ酸１〜４３６を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７のヌクレオチド１〜１３０８とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７のヌクレオチド１〜１３０８を含む。
【００５９】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７を含む。
【００６０】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４のアミノ酸１〜４２５に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４のアミノ酸１〜４２５を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のヌクレオチド１〜１２７５とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３のヌクレオチド１〜１２７５を含む。
【００６１】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３を含む。
【００６２】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６のアミノ酸１〜４３２に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６のアミノ酸１〜４３２を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５のヌクレオチド１〜１２９６とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５のヌクレオチド１〜１２９６を含む。
【００６３】
本発明の第３の観点に基づく上記受容体カセットの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６を含む。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。特に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５を含む。
【００６４】
第４の観点において、本発明は、キメラ受容体ポリペプチドをコード化する受容体カセットであって、キメラ受容体ポリペプチドが、少なくとも１つのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと、昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）のヒンジ（Ｄ）ドメインと、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインに対して異種の、昆虫のエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインと、異種の活性化ドメインとを含み、キメラ受容体ポリペプチドが、エクジソン受容体Ａ／Ｂ  Ｎ末端ドメインを含まない、受容体カセットを提供する。殊に好ましい実施態様の場合、受容体カセットは、本質的に下記のドメインから成るキメラ受容体ポリペプチド、すなわち：少なくとも１つのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと、昆虫のエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインと、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインに対して異種の、昆虫のエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインと、エクジソン受容体Ａ／Ｂ  Ｎ末端ドメインではない異種の活性化ドメインとから成るキメラ受容体ポリペプチドをコード化する。好ましくは、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。また好ましくは、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメイン、トウモロコシＣ１活性化ドメイン又はトウモロコシＤｏｆ１活性化ドメインである。
【００６５】
第５の観点によれば、本発明は、キメラ受容体ポリペプチドをコード化する受容体カセットであって、キメラ受容体ポリペプチドが、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと、昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）のヒンジ（Ｄ）ドメインと、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ以外の鱗翅目昆虫のエクジソン受容体の、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインに対して異種のリガンド結合（Ｅ）ドメインと、活性化ドメインとを含む、受容体カセットを提供する。好ましくは、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。また好ましくは、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメイン、トウモロコシＣ１活性化ドメイン又はトウモロコシＤｏｆ１活性化ドメインである。さらに、好ましくは、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、鱗翅目昆虫のエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインである。
【００６６】
第６の観点によれば、本発明は、分離された核酸分子であって、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ又はＡｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのエクジソン受容体をコード化する核酸配列を含む、分離された核酸分子を提供する。好ましくは、エクジソン受容体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、エクジソン受容体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を含む。より好ましくは、分離された核酸分子は、ストリンジェント条件下、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９とハイブリダイズする相補体を有する核酸配列を含む。さらにより好ましくは、分離された核酸分子は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９を含む。
【００６７】
本発明の付加的な観点は、本発明の上述の受容体カセットのうちの任意のカセットに作用連関された異種のプロモータ配列を含む受容体発現カセットと；本発明による受容体発現カセットを含む組換えベクターと；本発明による受容体発現カセットを含む形質導入宿主細胞とに関与する。好ましくは、形質導入宿主細胞は、植物細胞である。本発明のさらに付加的な観点は、このような形質導入植物細胞を含む形質導入植物、及びこのような形質導入植物に由来する種子に関与する。本発明による形質導入植物は、単子葉植物又は双子葉植物であってよく、その一例としては、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦、サツマイモ、豆、えんどう豆、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリ、蕪、ダイコン、ほうれん草、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ペッパー、セロリ、スカッシュ、カボチャ、麻、ズッキーニ、リンゴ、西洋ナシ、マルメロ、メロン（例えば西瓜）、プラム、チェリー、桃、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボカド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、大豆、トマト、サトウモロコシ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、菜種、クローバー、タバコ、ニンジン、綿花、アルファルファ、米、ジャガイモ、ナス、キュウリ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、及び樹木植物、例えば針葉樹及び落葉樹が挙げられる。
【００６８】
本発明の第１２の観点は、植物における遺伝子発現をコントロールする方法であって、上述の本発明の受容体カセットに作用連関されて植物細胞中での発現を促進することができる５’調節領域と３’末端領域とを含む受容体発現カセットと；前記キメラ受容体ポリペプチドのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインに対して相補的な１つ又は複数の応答要素を含んで標的ヌクレオチド配列に作用連関された５’調節領域を含む標的発現カセットとで、植物を形質転換し；植物中にキメラ受容体ポリペプチドを発現させ；さらに、キメラ受容体ポリペプチドのリガンド結合（Ｅ）ドメインに対して相補的な化学的リガンドと、植物を接触させ、これにより、化学的リガンドの存在におけるキメラ受容体ポリペプチドが、標的ヌクレオチド配列の発現を活性化することを含む、植物における遺伝子発現をコントロールする方法に関する。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのリガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。また好ましくは化学的リガンドはテブフェノザイド又はメトキシテブフェノザイドである。
【００６９】
特に好ましい実施態様の場合、本発明は、植物における遺伝子発現をコントロールする方法であって、ａ）  （ｉ）ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインとＭａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインとＭａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインと活性化ドメインとを含むキメラ受容体ポリペプチドをコード化する受容体カセットに作用連関されて植物細胞中での発現を促進することができる５’調節領域と、３’末端領域とを含む受容体発現カセットと；（ｉｉ）前記キメラ受容体ポリペプチドのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインに対して相補的な１つ又は複数の応答要素を含んで標的ヌクレオチド配列に作用連関された５’調節領域を含む標的発現カセットとで、植物を形質転換し；ｂ）  植物中にキメラ受容体ポリペプチドを発現させ；さらに、ｃ）  キメラ受容体ポリペプチドのリガンド結合（Ｅ）ドメインに対して相補的な化学的リガンドと、植物を接触させ、これにより、化学的リガンドの存在におけるキメラ受容体ポリペプチドが、標的ヌクレオチド配列の発現を活性化することを含む、植物における遺伝子発現をコントロールする方法を提供する。好ましくは、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインである。また、好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドの活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメイン、トウモロコシＣ１活性化ドメイン、又はトウモロコシＤｏｆ１活性化ドメインである。またさらに好ましくは、化学的リガンドはテブフェノザイド又はメトキシテブフェノザイドである。
【００７０】
第１３の観点によれば、本発明は、キメラ受容体ポリペプチドであって、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと；Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ， Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ及びＬｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）のヒンジ（Ｄ）ドメインと；前記ヒンジ（Ｄ）ドメインに対して異種のリガンド結合（Ｅ）ドメインと；活性化ドメインとを含む、キメラ受容体ポリペプチドを提供する。好ましい実施態様の場合、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ， Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ， Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ及びＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインである。別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインである。好ましい実施態様によれば、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインである。好ましくは、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメイン、トウモロコシＣ１活性化ドメイン又はトウモロコシＤｏｆ１活性化ドメインである。
【００７１】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの１つの実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４のアミノ酸１〜４２１に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４のアミノ酸１〜４２１を含む。
【００７２】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４を含む。
【００７３】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６のアミノ酸１〜４２２に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６のアミノ酸１〜４２２を含む。
【００７４】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６を含む。
【００７５】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９のアミノ酸１〜５１１に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９のアミノ酸１〜５１１を含む。
【００７６】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９を含む。
【００７７】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸１〜４１９に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８のアミノ酸１〜４１９を含む。
【００７８】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８を含む。
【００７９】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１のアミノ酸１〜５０８に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１のアミノ酸１〜５０８を含む。
【００８０】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。この実施態様によれば、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１を含む。
【００８１】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０のアミノ酸１〜４１９に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０のアミノ酸１〜４１９を含む。
【００８２】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０を含む。
【００８３】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３のアミノ酸１〜５０８に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３のアミノ酸１〜５０８を含む。
【００８４】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３を含む。
【００８５】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４のアミノ酸１〜４０７に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４のアミノ酸１〜４０７を含む。
【００８６】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４を含む。
【００８７】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６のアミノ酸１〜４１６に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６のアミノ酸１〜４１６に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００８８】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６を含む。
【００８９】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０のアミノ酸１〜４４１に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０のアミノ酸１〜４４１を含む。
【００９０】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０を含む。
【００９１】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２のアミノ酸１〜４２０に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２のアミノ酸１〜４２０を含む。
【００９２】
本発明の第１３の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２を含む。
【００９３】
第１４の観点によれば、本発明は、キメラ受容体ポリペプチドであって、キメラ受容体ポリペプチドが、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと；ヒンジ（Ｄ）ドメインと；Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ， Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ及びＬｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）の、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインに対して異種のリガンド結合（Ｅ）ドメインと；活性化ドメインとを含む、キメラ受容体ポリペプチドを提供する。
本発明の第１４の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ， Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ， Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ及びＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメイン、トウモロコシＣ１活性化ドメイン又はトウモロコシＤｏｆ１活性化ドメインである。
【００９４】
本発明の第１４の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のアミノ酸１〜４２７に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８のアミノ酸１〜４２７を含む。
【００９５】
本発明の第１４の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８を含む。
【００９６】
本発明の第１４の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０のアミノ酸１〜４３０に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０のアミノ酸１〜４３０を含む。
【００９７】
本発明の第１４の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０を含む。
【００９８】
本発明の第１４の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７のアミノ酸１〜５１９に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７のアミノ酸１〜５１９を含む。
【００９９】
本発明の第１４の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７を含む。
【０１００】
本発明の第１４の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２のアミノ酸１〜４３６に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２のアミノ酸１〜４３６を含む。
【０１０１】
本発明の第１４の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２を含む。
【０１０２】
本発明の第１４の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。別の好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４のアミノ酸１〜４３３に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４のアミノ酸１〜４３３を含む。
【０１０３】
本発明の第１４の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４を含む。
【０１０４】
第１５の観点によれば、本発明は、キメラ受容体ポリペプチドであって、キメラ受容体ポリペプチドがＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン、又は、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）のＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインと、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインと、異種の活性化ドメインとを含み、キメラ受容体ポリペプチドが、エクジソン受容体Ａ／Ｂ  Ｎ末端ドメインを含まない、キメラ受容体ポリペプチドを提供する。殊に好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドは、本質的に下記のドメイン、すなわち：ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン、又は、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）のＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインと、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインと、エクジソン受容体Ａ／Ｂ  Ｎ末端ドメインではない異種の活性化ドメインとから成る。１つの好ましい実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。また別の好ましい実施態様の場合、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメイン、トウモロコシＣ１活性化ドメイン又はトウモロコシＤｏｆ１活性化ドメインである。
【０１０５】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの１つの実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。１つの構成において、ＶＰ１６活性化ドメインは、キメラ受容体ポリペプチドのＮ末端に位置している。別の構成において、ＶＰ１６活性化ドメインは、キメラ受容体ポリペプチドの内部で、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインとの間に位置している。さらに別の構成において、ＶＰ１６活性化ドメインは、キメラ受容体ポリペプチドのＣ末端に位置している。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５を含む。
【０１０６】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５を含む。
【０１０７】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、トウモロコシＣ１活性化ドメインである。この実施態様によれば、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５を含む。
【０１０８】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、トウモロコシＤｏｆ１活性化ドメインである。この実施態様によれば、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７を含む。
【０１０９】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、活性化ドメインは、Ｎ末端ＶＰ１６活性化ドメインであり、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。この実施態様によれば、キメラ受容体ポリペプチドは好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３を含む。
【０１１０】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインであり、活性化ドメインは、内部に形成されたＶＰ１６活性化ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。この実施態様によれば、キメラ受容体ポリペプチドは、好ましくは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８を含む。
【０１１１】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のアミノ酸１〜４２４に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６のアミノ酸１〜４２４を含む。
【０１１２】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６を含む。
【０１１３】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２のアミノ酸１〜３９８に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２のアミノ酸１〜３９８を含む。
【０１１４】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２を含む。
【０１１５】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８のアミノ酸１〜４３６に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８のアミノ酸１〜４３６を含む。
【０１１６】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８を含む。
【０１１７】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４のアミノ酸１〜４２５に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４のアミノ酸１〜４２５を含む。
【０１１８】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４を含む。
【０１１９】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６のアミノ酸１〜４３２に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６のアミノ酸１〜４３２を含む。
【０１２０】
本発明の第１５の観点に基づく上記キメラ受容体ポリペプチドの別の実施態様の場合、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインであり、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメインであり、リガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインであり、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメインである。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６を含む。
【０１２１】
第１６の観点によれば、本発明は、キメラ受容体ポリペプチドであって、キメラ受容体ポリペプチドが、少なくとも１つのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと、昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）のヒンジ（Ｄ）ドメインと、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインに対して異種の、昆虫のエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインと、異種の活性化ドメインとを含み、キメラ受容体ポリペプチドが、エクジソン受容体Ａ／Ｂ  Ｎ末端ドメインを含まない、キメラ受容体ポリペプチドを提供する。殊に好ましい実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドは、本質的に下記のドメイン、すなわち：少なくとも１つのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと、昆虫のエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインと、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインに対して異種の、昆虫のエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインと、エクジソン受容体Ａ／Ｂ  Ｎ末端ドメインではない異種の活性化ドメインとから成る。好ましくは、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。また好ましくは、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメイン、トウモロコシＣ１活性化ドメイン又はトウモロコシＤｏｆ１活性化ドメインである。
【０１２２】
第１７の観点によれば、本発明は、キメラ受容体ポリペプチドであって、キメラ受容体ポリペプチドが、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインと、昆虫のエクジソン受容体（ＥｃＲ）のヒンジ（Ｄ）ドメインと、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ以外の鱗翅目昆虫のエクジソン受容体の、前記ヒンジ（Ｄ）ドメインに対して異種のリガンド結合（Ｅ）ドメインと、活性化ドメインとを含む、キメラ受容体ポリペプチドを提供する。好ましくは、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインである。また好ましくは、活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメイン、トウモロコシＣ１活性化ドメイン又はトウモロコシＤｏｆ１活性化ドメインである。好ましい実施態様の場合、ヒンジ（Ｄ）ドメインは、鱗翅目昆虫のエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインである。
【０１２３】
第１８の観点によれば、本発明は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ又はＡｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎの分離されたエクジソン受容体を提供する。好ましくは、このような受容体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０に対して最小９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、このような受容体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を含む。
【０１２４】
第１９の観点によれば、本発明は、形質導入植物における遺伝子発現をコントロールする方法であって、上述の本発明のキメラ受容体ポリペプチドと、キメラ受容体ポリペプチドのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインに対して相補的な１つ又は複数の応答要素を含んで標的ヌクレオチド配列に作用連関された５’調節領域を含む標的発現カセットとを、形質導入植物中で発現させ；さらに、キメラ受容体ポリペプチドのリガンド結合（Ｅ）ドメインに対して相補的な化学的リガンドと、形質導入植物を接触させ、これにより、化学的リガンドの存在におけるキメラ受容体ポリペプチドが、標的ヌクレオチド配列の発現を活性化することを含む、形質導入植物における遺伝子発現をコントロールする方法を提供する。好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドのリガンド結合（Ｅ）ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲのリガンド結合（Ｅ）ドメインである。また好ましくは化学的リガンドはテブフェノザイド又はメトキシテブフェノザイドである。
【０１２５】
特に好ましい実施態様の場合、本発明は、遺伝子導入植物における遺伝子発現をコントロールする方法であって、（ｉ）ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインとＭａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメインとＭａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインと活性化ドメインとを含むキメラ受容体ポリペプチドと；（ｉｉ）前記キメラ受容体ポリペプチドのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインに対して相補的な１つ又は複数の応答要素を含んで標的ヌクレオチド配列に作用連関された５’調節領域を含む標的発現カセットとを、植物中に発現させ；さらに、キメラ受容体ポリペプチドのリガンド結合（Ｅ）ドメインに対して相補的な化学的リガンドと、遺伝子導入植物を接触させ、これにより、化学的リガンドの存在におけるキメラ受容体ポリペプチドが、標的ヌクレオチド配列の発現を活性化することを含む、植物における遺伝子発現をコントロールする方法を提供する。好ましくは、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインである。また、好ましくは、キメラ受容体ポリペプチドの活性化ドメインは、ＶＰ１６活性化ドメイン、トウモロコシＣ１活性化ドメイン、又はトウモロコシＤｏｆ１活性化ドメインである。またさらに好ましくは、化学的リガンドはテブフェノザイド又はメトキシテブフェノザイドである。
【０１２６】
本発明のその他の観点及び利点は、本発明の下記の説明及び例を検討することから、当業者には明らかになる。なお、下記の例は本発明を限定するものではない。
【０１２７】
配列リストにおける配列の簡単な説明
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ｛タバコイモムシ（ｔｏｂａｃｃｏ ｈｏｒｎｗｏｒｍ）｝のエクジソン受容体をコード化するヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１によりコード化されたＭａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのエクジソン受容体のアミノ酸配列を示す。
【０１２８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３は、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ｛アワノメイガ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎｂｏｒｅｒ）｝のエクジソン受容体をコード化するヌクレオチド配列の５’末端を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３によりコード化されたＯｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのエクジソン受容体のＮ末端のアミノ酸配列を示す。
【０１２９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５は、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ｛アワノメイガ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎｂｏｒｅｒ）｝のエクジソン受容体をコード化するヌクレオチド配列の３’末端を示す。。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５によりコード化されたＯｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのエクジソン受容体のＣ末端のアミノ酸配列を示す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６は集合的に、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓのエクジソン受容体のＡ／Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを含む。
【０１３０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ｛フォール・アーミーワーム （Ｆａｌｌ ａｒｍｙｗｏｒｍ）（アメリカ産行列毛虫ヨトウガの一種）｝のエクジソン受容体をコード化するヌクレオチド配列の３’末端を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７によりコード化されたＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのエクジソン受容体のＣ末端（Ｄドメインの一部及びＥドメイン全体）のアミノ酸配列を示す。
【０１３１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９は、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ｛ブラック・カットワーム（Ｂｌａｃｋ ｃｕｔｗｏｒｍ）｝のエクジソン受容体をコード化するヌクレオチド配列の３’末端を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９によりコード化されたＡｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのエクジソン受容体のＣ末端（Ｄドメインの一部及びＥドメイン全体）のアミノ酸配列を示す。
【０１３２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１は、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ｛移動性イナゴ（ｍｉｇｒａｔｏｒｙ ｌｏｃｕｓｔ）｝のエクジソン受容体をコード化するヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１によりコード化されたＬｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのエクジソン受容体のアミノ酸配列を示す。
【０１３３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３は、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのエクジソン受容体をコード化するヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３によりコード化されたＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのエクジソン受容体のアミノ酸配列を示す。
【０１３４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１は、オリゴヌクレオチド・プライマである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４２は、ｐＣＧＳ１５４における挿入領域のヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０は、オリゴヌクレオチド・プライマである。
【０１３５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２は集合的に、多クローニング部位（ＭＣＳ）を形成するのに使用される二本鎖オリゴヌクレオチドを示す。ＭＣＳは、制限酵素ＳｍａＩ、ＳａｌＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｐＥＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩのための認識配列を有する。
【０１３６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３は、エクジソン受容体キメラＭＤＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＭＤＶは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＣドメイン及びＤドメインと、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１２６３は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１２６４〜１５０６は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１３７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３によりコード化されたエクジソン受容体キメラＭＤＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４２１は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
【０１３８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５は、エクジソン受容体キメラＭＢＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＭＢＶは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＣドメイン及びＤドメインと、ブラック・カットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）のＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１２６６は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１２６７〜１５０９は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５によりコード化されたエクジソン受容体キメラＭＢＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４２２は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
【０１３９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７は、エクジソン受容体キメラＭＥＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＭＥＶは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＣドメイン及びＤドメインと、アワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）のＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１２５７は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１２５８〜１５００は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１４０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７によりコード化されたエクジソン受容体キメラＭＥＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４１９は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９は、エクジソン受容体キメラＭＦＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＭＦＶは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＣドメイン及びＤドメインと、フォール・アーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１２５７は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１２５８〜１５００は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１４１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９によりコード化されたエクジソン受容体キメラＭＦＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４１９は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１は、エクジソン受容体キメラＤＭＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＤＭＶは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＣドメイン及びＤドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１３０８は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１３０９〜１５５１は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１４２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１によりコード化されたエクジソン受容体キメラＤＭＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４３６は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３は、エクジソン受容体キメラＤＢＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＤＢＶは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＣドメイン及びＤドメインと、ブラック・カットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）のＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１２９９は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１３００〜１５４２は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１４３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３によりコード化されたエクジソン受容体キメラＤＢＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４３３は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
【０１４４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５は、エクジソン受容体キメラＥＥＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＥＥＶは、アワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）のＣドメイン及びＤドメインと、アワノメイガのＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１２７２は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１２７３〜１５１５は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５によりコード化されたエクジソン受容体キメラＥＥＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４２４は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
【０１４５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７は、エクジソン受容体キメラＥＢＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＥＢＶは、アワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）のＣドメイン及びＤドメインと、ブラック・カットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）のＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１２８１は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１２８２〜１５２４は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７によりコード化されたエクジソン受容体キメラＥＢＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４２７は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
【０１４６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９は、エクジソン受容体キメラＥＭＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＥＭＶは、アワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）のＣドメイン及びＤドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１２９０は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１２９１〜１５３３は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９によりコード化されたエクジソン受容体キメラＥＭＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４３０は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
【０１４７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１は、エクジソン受容体キメラＬＬＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＬＬＶは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＣドメイン及びＤドメインと、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１１９４は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１１９５〜１４３７は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１４８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１によりコード化されたエクジソン受容体キメラＬＬＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜３９８は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３は、エクジソン受容体キメラＬＭＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＬＭＶは、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＣドメイン及びＤドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１２２１は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１２２２〜１４６４は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１４９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３によりコード化されたエクジソン受容体キメラＬＭＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４０７は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５は、エクジソン受容体キメラＭＬＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＭＬＶは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＣドメイン及びＤドメインと、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１２４８は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１２４９〜１４９１は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１５０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５によりコード化されたエクジソン受容体キメラＭＬＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４１６は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７は、エクジソン受容体キメラＣＣＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＣＣＶは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＣドメイン及びＤドメインと、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１３０８は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１３０９〜１５５１は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１５１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７によりコード化されたエクジソン受容体キメラＣＣＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４３６は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９は、エクジソン受容体キメラＣＭＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＣＭＶは、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＣドメイン及びＤドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１３２３は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１３２４〜１５６６は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１５２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９によりコード化されたエクジソン受容体キメラＣＭＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４４１は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１は、エクジソン受容体キメラＭＣＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＭＣＶは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＣドメイン及びＤドメインと、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１２６０は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１２６１〜１５０３は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１５３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１によりコード化されたエクジソン受容体キメラＭＣＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４２０は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３は、エクジソン受容体キメラＭＭＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＭＭＶは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＣドメイン及びＤドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１２７５は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１２７６〜１５１８は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１５４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３によりコード化されたエクジソン受容体キメラＭＭＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４２５は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５は、エクジソン受容体キメラＤＤＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。エクジソン受容体キメラＤＤＶは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＣドメイン及びＤドメインと、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＥドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜１２９６は、ＥｃＲのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインをコードし、ヌクレオチド１２９７〜１５３９は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５によりコード化されたエクジソン受容体キメラＤＤＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜４３２は、受容体キメラのＣドメイン、Ｄドメイン及びＥドメインを構成する。
【０１５５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２は、オリゴヌクレオチド・プライマである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３は、ｐＣＧＳ６０１中にクローニングされるリポーター・フラグメントのヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４は、エクジソン受容体キメラＧ（Ｍ）ＭＶをコード化するヌクレオチド配列（ヌクレオチド２００７〜３６６８）を示す。Ｇ（Ｍ）ＭＶは、ｐＣＧＳ２０２中に含有されるような、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、ＭａｎｄｕｃａのＤドメイン及びＥドメインと、ＶＰ１６活性化ドメインとを含む。
【０１５６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のヌクレオチド２００７〜３６６８によりコード化されたエクジソン受容体キメラＧ（Ｍ）ＭＶのアミノ酸配列を示す。アミノ酸１〜１４７は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを構成し、アミノ酸１４８〜４７３は、ＭａｎｄｕｃａのＤドメイン及びＥドメインを構成し、アミノ酸４７４〜５５３は、ＶＰ１６活性化ドメインを構成する。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６は、トウモロコシＡｄｈイントロン第１号のヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７は、トウモロコシ収縮（Ｓｈ）イントロン第１号のヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８は、トウモロコシ・ユビキチン・イントロン第１号のヌクレオチド配列を示す。
【０１５７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９は、コメ・アクチン・イントロンのヌクレオチド配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７は、オリゴヌクレオチド・プライマである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８は、エクジソン受容体キメラＧ（Ｍ）ＢＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。Ｇ（Ｍ）ＢＶは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、ＭａｎｄｕｃａのＤドメイン及びＥドメインと、ＶＰ１６活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜５６４は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードし；ヌクレオチド５６５〜８４８は、Ｍａｎｄｕｃａのヒンジ（Ｄ）ドメインをコードし；ヌクレオチド８４９〜１５３３は、ＢＣＷ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）のリガンド結合（Ｅ）ドメインをコードし；さらに、ヌクレオチド１５３４〜１７７６は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１５８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８によりコード化されたエクジソン受容体キメラＧ（Ｍ）ＢＶのアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０は、エクジソン受容体キメラＧ（Ｍ）ＥＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。Ｇ（Ｍ）ＥＶは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、ＭａｎｄｕｃａのＤドメインと、ＥＣＢ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）のリガンド結合（Ｅ）ドメインと、ＶＰ１６活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜５６４は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードし；ヌクレオチド５６５〜８４８は、Ｍａｎｄｕｃａのヒンジ（Ｄ）ドメインをコードし；ヌクレオチド８４９〜１５２４は、ＥＣＢ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）のリガンド結合（Ｅ）ドメインをコードし；さらに、ヌクレオチド１５２５〜１７６７は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１５９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０によりコード化されたエクジソン受容体キメラＧ（Ｍ）ＢＶのアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２は、エクジソン受容体キメラＧ（Ｍ）ＦＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。Ｇ（Ｍ）ＦＶは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、ＭａｎｄｕｃａのＤドメインと、ＦＡＷ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のリガンド結合（Ｅ）ドメインと、ＶＰ１６活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜５６４は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードし；ヌクレオチド５６５〜８４８は、Ｍａｎｄｕｃａのヒンジ（Ｄ）ドメインをコードし；ヌクレオチド８４９〜１５２４は、ＦＡＷ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のリガンド結合（Ｅ）ドメインをコードし；さらに、ヌクレオチド１５２５〜１７６７は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１６０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２によりコード化されたエクジソン受容体キメラＧ（Ｍ）ＦＶのアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４は、エクジソン受容体キメラＧ（Ｅ）ＥＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。Ｇ（Ｅ）ＥＶは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、ＥＣＢ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）のＤドメインと、ＥＣＢ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）のリガンド結合（Ｅ）ドメインと、ＶＰ１６活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜５６４は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードし；ヌクレオチド５６５〜８６３は、ＥＣＢ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）のヒンジ（Ｄ）ドメインをコードし；ヌクレオチド８６４〜１５３９は、ＥＣＢ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）のリガンド結合（Ｅ）ドメインをコードし；さらに、ヌクレオチド１５４０〜１７８２は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１６１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４によりコード化されたエクジソン受容体キメラＧ（Ｅ）ＥＶのアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６は、エクジソン受容体キメラＧ（Ｅ）ＭＶをコード化するヌクレオチド配列を示す。Ｇ（Ｅ）ＭＶは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、ＥＣＢ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）のＤドメインと、Ｍａｎｄｕｃａのリガンド結合（Ｅ）ドメインと、ＶＰ１６活性化ドメインとを含む。ヌクレオチド１〜５６４は、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードし；ヌクレオチド５６５〜８６３は、ＥＣＢ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）のヒンジ（Ｄ）ドメインをコードし；ヌクレオチド８６４〜１５５７は、Ｍａｎｄｕｃａのリガンド結合（Ｅ）ドメインをコードし；さらに、ヌクレオチド１５５８〜１８００は、ＶＰ１６の活性化ドメインをコードする。
【０１６２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６によりコード化されたエクジソン受容体キメラＧ（Ｅ）ＭＶのアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８は、Ｇ（Ｍ）Ｍ（ＭａｎｄｕｃａのＥｃＲのヒンジ・リガンド結合ドメインに融合された、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン）キメラ受容体ヌクレオチドをコード化する配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８によりコード化された、ＭａｎｄｕｃａのＥｃＲのヒンジ・リガンド結合ドメインに融合された、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列を示す。
【０１６３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３は、オリゴヌクレオチド・プライマである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４は、エクジソン受容体キメラＧ（Ｍ）ＭＣをコード化するヌクレオチド配列を示す。Ｇ（Ｍ）ＭＣは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、ＭａｎｄｕｃａのＤドメインと、Ｍａｎｄｕｃａのリガンド結合（Ｅ）ドメインと、トウモロコシＣ１活性化ドメインとを含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４によりコード化されたエクジソン受容体キメラＧ（Ｍ）ＭＶのアミノ酸配列を示す。
【０１６４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６は、エクジソン受容体キメラＧ（Ｍ）ＭＤをコード化するヌクレオチド配列を示す。Ｇ（Ｍ）ＭＤは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、ＭａｎｄｕｃａのＤドメインと、Ｍａｎｄｕｃａのリガンド結合（Ｅ）ドメインと、トウモロコシＤｏｆ１活性化ドメインとを含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６によりコード化されたエクジソン受容体キメラＧ（Ｍ）ＭＤのアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１は、オリゴヌクレオチド・プライマである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２は、エクジソン受容体キメラＶＧ（Ｍ）Ｍをコード化するヌクレオチド配列を示す。ＶＧ（Ｍ）Ｍは、ＶＰ１６活性化ドメインと、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、ＭａｎｄｕｃａのＤドメインと、Ｍａｎｄｕｃａのリガンド結合（Ｅ）ドメインとを含む。
【０１６５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２によりコード化されたエクジソン受容体キメラＶＧ（Ｍ）Ｍのアミノ酸配列を示す。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４〜ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６は、オリゴヌクレオチド・プライマである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７は、エクジソン受容体キメラＧＶ（Ｍ）Ｍをコード化するヌクレオチド配列を示す。ＧＶ（Ｍ）Ｍは、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、ＶＰ１６活性化ドメインと、ＭａｎｄｕｃａのＤドメインと、Ｍａｎｄｕｃａのリガンド結合（Ｅ）ドメインとを含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７によりコード化されたエクジソン受容体キメラＧＶ（Ｍ）Ｍのアミノ酸配列を示す。
【０１６６】
定義
「関連／作用的に連関」は、物理的又は機能的に関係する２つの核酸配列を意味する。例えば、プロモータＤＮＡ配列又は調節ＤＮＡ配列と、ＲＮＡ又は蛋白質をコードするＤＮＡ配列との２つの配列が作用的に連関している場合、又は、レギュレータＤＮＡ配列がコーディングＤＮＡ配列又は構造ＤＮＡ配列の発現レベルに影響を与えることになるような状況にある場合に、プロモータＤＮＡ配列又は調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ又は蛋白質をコードするＤＮＡ配列と「関連している」と言われる。
【０１６７】
「キメラ」遺伝子は、組換え核酸配列であって、プロモータ核酸配列又は調節核酸配列が、ｍＲＮＡをコードする核酸配列又は蛋白質として発現させられる核酸配列と作用的に連関又は関連していて、これにより、レギュレータ核酸配列が、関連核酸配列の転写又は発現を調節可能であるような、組換え核酸配列である。キメラ遺伝子のレギュレータ核酸配列は、自然に見出されるような関連核酸配列とは、通常は作用的に連関させられない。
【０１６８】
本発明との関連において、「キメラ」という用語は、受容体ポリペプチドが複数のドメインから成り、これらのドメインのうちの少なくとも１つが、存在する他のドメインに対して異種の起源を有することを示すのにも使用される。これらのキメラ受容体ポリペプチドは、一緒に融合又は連結されているヌクレオチド配列によってコード化され、自然発生しないコーディング配列をもたらす。
【０１６９】
本発明のキメラ受容体ポリペプチドは、ポリペプチドのＮ末端部分からＣ末端部分までの線状の命名法によって呼ばれる。このような命名法を用いて、ＥｃＲ受容体のＮ末端に融合されたＶＰ１６からのトランスアクティベーション・ドメインを有するキメラ受容体ポリペプチドは、ＶＰ１６−ＥｃＲと呼ばれることになる。逆に、ＥｃＲ受容体のＣ末端にＶＰ１６が融合される場合、キメラ受容体ポリペプチドは、ＥｃＲ−ＶＰ１６と呼ばれることがある。
【０１７０】
あるいは、本発明のキメラ受容体ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ配向された構造中にどのドメインが存在するかを示すために、線状三重項又は線状四重項命名法により言及される。三重項命名法の場合、三重項の第１の文字は、ＤＮＡ結合ドメイン及びヒンジドメインの起源に相当し；三重項の第２の文字は、リガンド結合ドメインの起源を示し；さらに三重項の最後の文字は、活性化ドメインを示す。このように、キメラ受容体は、例５に記載の表において指定される。例えば、ＭＤＶのＥｃＲキメラは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａに由来するＤＮＡ結合ドメイン及びヒンジドメインと、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒに由来するリガンド結合ドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含み；ＭＢＶのＥｃＲのキメラは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａに由来するＤＮＡ結合ドメイン及びヒンジドメインと、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ｛ブラック・カットワーム（Ｂｌａｃｋ ｃｕｔｗｏｒｍ）｝に由来するリガンド結合ドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。
【０１７１】
四重項命名法の場合、四重項の第１の文字は、ＤＮＡ結合ドメインの起源に相当し；四重項の第２の文字（括弧内）は、及びヒンジドメインの起源に相当し；四重項の第３の文字は、リガンド結合ドメインの起源を示し；さらに四重項の最後の文字は、活性化ドメインを示す。このように、キメラ受容体は、例２３に記載の表において指定される。例えば、Ｇ（Ｍ）ＥＶのＥｃＲキメラは、イーストＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａに由来するヒンジドメインと、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｃｏｒｎｂｏｒｅｒ｛アワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）｝に由来するリガンド結合ドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含み；Ｇ（Ｍ）ＭＶのＥｃＲキメラは、イーストＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａに由来するヒンジドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａに由来するリガンド結合ドメインと、ＶＰ１６の活性化ドメインとを含む。
【０１７２】
遺伝子構造は、５’調節領域及びその作用連関されたコーディング配列の観点から命名される。この場合、５’調節領域はスラッシュ（／）の前に指定され、コーディング配列はスラッシュの後に指定される。例えば、遺伝子構造ｕｂｉ／ＥｃＲ−ＶＰ１６は、キメラ受容体ＥｃＲ−ＶＰ１６に融合された（例えばＺｅａ ｍａｙｓの）ユビキチン・プロモータを指定する。キメラ受容体ＥｃＲ−ＶＰ１６において、ＶＰ１６のトランスアクティベーション・ドメインは、ＥｃＲのＣ末端に融合されている。
【０１７３】
「コーディング配列」は、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡ，ｒＲＮＡ，ｔＲＮＡ，ｓｎＲＮＡ，センスＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡに転写された核酸配列である。好ましくは、ＲＮＡは次いで、蛋白質を生成するために生物において翻訳される。
【０１７４】
相補体：「相補体」は、逆平行ヌクレオチド配列中の相補的な塩基残基相互間に水素結合が生じたときに、互いに対合可能な逆平行ヌクレオチド配列を含む２つのヌクレオチド配列を意味する。
【０１７５】
特定の核酸配列の「同類修飾変異」は、互いに同一又は本質的に同一のアミノ酸配列をコード化する核酸配列を意味するか、又は核酸配列がアミノ酸配列をコード化しない場合には、互いに本質的に同一の配列を意味する。遺伝子コードの同義性に基づき、機能的に同一の多数の核酸が所与のポリペプチドをコード化する。例えば、コドンＣＧＴ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ及びＡＧＧはすべて、アミノ酸アルギニンをコード化する。したがって、アルギニンがコドンによって特定される位置毎に、そのコドンは、コードされた蛋白質を変更することなしに、記載の対応コドンのうちのいずれかに変更することができる。このような核酸変異は「サイレント変異」であり、「同類修飾変異」の一種である。蛋白質をコード化する、本明細書中に記載した核酸配列はまた、特に断りのない限り、いずれもそれぞれ可能なサイレント変異を記述する。当業者には明らかなように、核酸におけるそれぞれのコドン（ただし、通常はメチオニンに対応する唯一のコドンであるＡＴＧを除く）は、従来技術により機能的に同一の分子をもたらすように修飾することができる。したがって、蛋白質をコード化する核酸の各「サイレント変異」は、それぞれ記載された配列に潜在している。
【０１７６】
さらに、当業者には明らかなように、コード化された配列において単独のアミノ酸又は少量のアミノ酸（典型的には５％未満、より典型的には１％未満）を変更、付加又は削除する個々の置換、削除又は付加は「同類修飾変異」である。この場合、変更を加えた結果、アミノ酸は、化学的に類似するアミノ酸と置換されることになる。機能的に類似のアミノ酸を提供する同類置換表は、当業者によく知られている。下記の５つの群、すなわち：脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ），トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）はそれぞれ、互いに同類置換形であるアミノ酸を含有する。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ （１９８４） Ｐｒｏｔｅｎｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙも参照されたい。これに加えて、コード化された配列において単独のアミノ酸又は少量のアミノ酸を変更、付加又は削除する個々の置換、削除又は付加は「同類修飾変異」である。
【０１７７】
「ＤＮＡ結合ドメイン」（「Ｃドメイン」としても知られる）は、応答要素（ＲＥ）として知られる特異的ヌクレオチド配列と非共有結合するアミノ酸の配列を含む。核受容体において、応答要素は、標的発現カセットの５’調節領域内に位置し、一対のハーフ・サイトを含む。それぞれのハーフ・サイトは、６つの塩基対コアを有し、単独ＤＮＡ結合ドメインは単独のハーフ・サイトを認識する。ハーフ・サイトは、直列反復、パリンドローム反復又は逆方向反復として、互いに相対的な線状配向で配列されていてよい。応答要素は、受容体ポリペプチドのホモ二量体又はヘテロ二量体に結合する。ハーフ・サイトのヌクレオチド配列及び線状配向は、どのＤＮＡドメインが前記応答要素と相補的な結合対を形成することになるかを決定し、また、二量体における受容体ポリペプチドの相互作用能力を決定する。
【０１７８】
「エクジソン受容体」（「ＥｃＲ」）は、リガンドとしてエクジソンと結合することで知られる或る特定の昆虫に見出される受容体、又は、他の昆虫から予め分離されたエクジソン受容体と高度の相同性を有する或る特定の昆虫に見出される受容体を意味する。エクジソン受容体は、双翅類、鞘翅類及び鱗翅類の昆虫を含め、多数の昆虫から分離されている。
【０１７９】
本明細書中に使用される「発現カセット」は、適切な宿主細胞中で特定のヌクレオチド配列の発現を導くことができる核酸配列を意味する。この核酸配列は、当該ヌクレオチド配列に作用的に連関されたプロモータを含み、当該ヌクレオチド配列は終止信号に作用的に連関される。発現カセットはまた、典型的には、ヌクレオチド配列の適正な翻訳に必要となる配列を含む。当該ヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってよい。このことは、発現カセットの成分のうちの少なくとも１つが、発現カセットの他の成分のうちの少なくとも１つに対して異種であることを意味する。発現カセットはまた、自然発生しているがしかし異種発現に有用な組換え形態で得られた発現カセットであってもよい。しかし典型的には、発現カセットは宿主に対して異種である。すなわち発現カセットの特定の核酸配列は、宿主細胞中で自然発生はせず、形質転換事象によって宿主細胞中又は宿主細胞の原型中に導入されている。発現カセット内のヌクレオチド配列の発現は、構成プロモータ又は誘導プロモータの制御下で行われてよい。この構成プロモータ又は誘導プロモータは、宿主細胞がいくつかの外的刺激に晒されたときにのみ転写を開始する。植物のような多細胞生物の場合、プロモータは特定の組織又は器官、又は発生段階に対して特異的であってもよい。
【０１８０】
遺伝子：「遺伝子」という用語は、生体機能と関連するＤＮＡの任意のセグメントに言及するのに幅広く使用される。したがって、遺伝子は遺伝子発現に必要なコーディング配列及び／又は調節配列を含む。遺伝子はまた、例えば他の蛋白質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントを含む。遺伝子は、当該源からのクローニング、又は、既知の又は予測された配列情報からの合成を含めて、種々の源から得ることができ、所望のパラメータを有するように指定された配列を含むことができる。
【０１８１】
「当該遺伝子」とは、宿主生物に移されるときに、所望の特性を宿主に付与する任意の遺伝子を意味する。植物宿主の場合、所望の特性は、抗生物質抵抗、ウィルス抵抗、昆虫抵抗、疾病抵抗、又はその他の害虫に対する抵抗、除草剤耐性、改善された栄養価、産業上のプロセスにおける改善された性能、又は変化した生殖能力を含む。「当該遺伝子」は、宿主中に商業価値のある酵素又は代謝物を生成するのに際して、宿主生物、例えば植物に移される遺伝子であってもよい。
【０１８２】
異種の／外生的な：核酸配列（例えばＤＮＡ配列）又は遺伝子に言及するために本明細書中に使用する場合、「異種の」及び「外生的な」という用語は、特定の宿主細胞にとって外来の源を起源とする配列、又は、同じ源を起源とする場合には、その元の形態から修飾された配列を意味する。このように、宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞にとって内生的ではあるがしかし、例えばコドン最適化の利用によって修飾されている遺伝子を含む。これらの用語は、自然発生配列の非自然発生的な複数のコピーをも含む。このように、これらの用語は、細胞に対して外来又は異種の核酸セグメントを意味するか、又は、細胞に対して相同ではあるものの、その相同性が、通常は要素が見出されない宿主細胞核酸内の所定の位置にあるような核酸セグメントを意味する。外生的核酸セグメントは、外生的ポリペプチドをもたらすために発現させられる。例えば、本発明との関連において「異種の」という用語は、受容体ポリペプチドがその目下の宿主に対して異なる自然起源を有することを示すのに使用される。例えば、昆虫種に由来するエクジソン受容体（ＥｃＲ）が植物細胞中に発現させられる場合、ＥｃＲは、植物細胞であるその目下の宿主に対して異種のものとして記述される。「異種の」という用語はまた、受容体ポリペプチド中に存在するドメインのうちの１つ又は複数が、存在するその他のドメインに対してこれらの自然起源において異なっていることを示すのに使用される。例えば、単純ヘルペスＶＰ１６蛋白質に由来するトランスアクティベーション・ドメインが、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａに由来するエクジソン受容体に融合されている場合、ＶＰ１６トランスアクティベーション・ドメインは、ＥｃＲ分に対して異種である。さらに、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲに由来するドメインが、機能受容体を形成するためにＡｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎのＥｃＲに由来するドメインに融合される場合、このキメラ融合は、互いに異種のドメインを有することになる。加えて、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのエクジソン受容体へのＶＰ１６蛋白質の融合を含む異種受容体ポリペプチドも、植物中に発現させられると、植物宿主に対して異種となると考えられる。
【０１８３】
「ヒンジドメイン」（Ｄドメインとしても知られる）は、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインとリガンド結合（Ｅ）ドメインとの間のアミノ酸を含む受容体ポリペプチドである。ヒンジドメインは、この受容体ポリペプチドと別の受容体ポリペプチドとの相互作用に参加し、これによりホモ二量体又はヘテロ二量体を形成することができる。
【０１８４】
「相同」の核酸（例えばＤＮＡ）配列は、その核酸配列が導入される宿主細胞と自然の状態で関連する核酸（例えばＤＮＡ）配列である。例えば、本発明との関連において、「相同」という用語は、受容体ポリペプチドが、その目下の宿主に対して同じ自然起源を有することを示すのに用いられる。例えば、エクジソン受容体は或る特定の昆虫種に見出され、エクジソン受容体の起源となる昆虫種に対して相同であると言われる。「相同」という用語は、受容体ポリペプチド中に存在するドメインのうちの１つ又は複数が、互いに同じ自然起源を有することを示すのにも用いられる。例えば、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＤＮＡ結合ドメインと、リガンド結合ドメインとは、互いに相同の起源を有すると考えられる。
【０１８５】
「相同の組換え」は、相同の核酸分子相互間の核酸フラグメントの相互交換である。
「同一」、又は２つ以上の核酸配列又は蛋白質配列の関連における「同一性」百分率という用語は、下述の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、又は視覚的な検査によって測定して、最大一致に関して比較し整列させたときに、同一であるか、又は、同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドの特定の百分率を有する２つ以上の配列又は部分配列を意味する。
【０１８６】
核酸配列は、これが基準核酸配列によってコード化されたポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード化するときに、基準核酸配列と「イソコーディング」している。
【０１８７】
「分離された」核酸分子又は分離された酵素は、人の手によって天然環境から離れて存在し、したがって自然の産物ではない核酸分子又は酵素である。分離された核酸分子又は酵素は、精製された形態で存在してよく、又は非天然環境、例えば組換え宿主細胞内に存在してもよい。
【０１８８】
「リガンド結合ドメイン（Ｅドメインとしても知られている）」は、化学的リガンドと非共有結合する構造を有するアミノ酸配列を含む受容体ポリペプチド部分である。したがって、リガンド結合ドメイン及びその化学的ドメインは、結合対を形成する。
【０１８９】
成熟蛋白質：通常、細胞小器官に対してターゲティングされる蛋白質であって、この成熟蛋白質からは、通過ペプチドは除去されている。
最小プロモータ：不活性であるか、又は上流活性化の不存在においてプロモータ活性が大きく減じられているプロモータ要素、具体的にはＴＡＴＡ要素。好適な転写因子の存在において、最小プロモータは転写を可能にするように機能する。
【０１９０】
「分」は、示された源に由来する受容体ポリペプチドの割り当て又は部分を意味する。例えば、「ＥｃＲ分」は、天然エクジソン受容体に由来する受容体ポリペプチド部分を意味する。本明細書中に使用される「分」は１つ又は複数のドメインを含むことができる。
【０１９１】
天然：形質転換されていない細胞のゲノムに存在する遺伝子を意味する。
【０１９２】
自然発生的：「自然発生的」という用語は、人によって人工的に生成されるものは除外して、自然に見出すことができる対象を記述するのに用いられる。例えば、自然源から分離することができ、実験室において人によって意図的には修飾されていない、生物（ウィルスを含む）に存在する蛋白質又はヌクレオチド配列は、自然発生的である。
【０１９３】
核酸：「核酸」という用語は、一本鎖又は二本鎖の形態の、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びこれらのポリマーを意味する。特に限定しない限り、この用語は、基準核酸と同様の結合特性を有し、かつ自然発生的ヌクレオチドと同様に代謝される自然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。特に断らない限り、特定の核酸配列はまた、その同類修飾変異形（たとえば縮重コドン置換形）と相補配列とを潜在的に包含し、また明示された配列をも包含する。具体的には、縮重コドン置換形は、１つ又は複数の選択された（又はすべての）コドンの第３の位置が混合塩基残基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を発生させることにより、達成することができる（Ｂａｔｚｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９： ５０８１ （１９９１）； Ｏｈｔｓｕｋａ他、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０： ２６０５−２６０８ （１９８５）； Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ他、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８： ９１−９８ （１９９４））。「核酸」又は「核酸配列」という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、及び遺伝子によってコード化されたｍＲＮＡと交換可能に使用することもできる。
【０１９４】
「ＯＲＦ」はオープン・リーディング・フレームを意味する。
【０１９５】
「植物」は、任意の発生段階における任意の植物、具体的には種子植物である。
【０１９６】
「植物細胞」は、プロトプラスト及び細胞壁とを含む、植物の構造単位及び生理学的単位である。植物細胞は、分離された単細胞又は培養細胞の形態を成していてよく、あるいは、高度に組織化された単位、例えば植物組織、植物器官又は全植物の一部として形成されていてよい。
【０１９７】
「植物細胞培養」は、植物単位、例えばプロトプラスト、細胞培養細胞、植物組織中の細胞、花粉、花粉管、胚珠、胚嚢、接合体及び種々の発生段階における胚の培養を意味する。
【０１９８】
「植物材料」は、葉、茎、根、花又は花部分、果実、花粉、卵細胞、接合体、種子、挿し木、細胞又は組織の培養、又は植物のその他の任意の部分又は産物を意味する。
【０１９９】
「植物器官」は、視覚的に構造化されて識別される区別可能な植物部分、例えば根、茎、葉、蕾又は胚である。
【０２００】
「プロモータ」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのための結合部位を含有してＤＮＡの転写を開始するコーディング領域の上流側の未翻訳ＤＮＡ配列である。プロモータ領域は、遺伝子発現のレギュレータとして作用する他の要素を含んでもよい。
【０２０１】
「プロトプラスト」は、細胞壁を有していないか、又は、一部の細胞壁しか有していない、分離された植物細胞である。
【０２０２】
「精製された」：「精製された」という用語は、核酸又は蛋白質に用いられる場合、核酸又は蛋白質が、これが自然の状態において関連する他の細胞成分を本質的に含有しないことを示す。精製された核酸又は蛋白質は、乾燥状態であるか又は水溶液中にあってよいが、均質な状態にあることが好ましい。純度及び均質度は典型的には、分析化学技術、例えばポリアクリルアミド・ゲル電気泳動法、又は高性能液体クロマトグラフィを用いて決定される。調製物中に存在する主要な種である蛋白質が実質的に精製される。「精製された」という用語は、核酸又は蛋白質が電気泳動ゲル中に事実上１つのバンドを生み出すことを示す。具体的にはこのことは、核酸又は蛋白質が最小約５０％純粋であり、より好ましくは最小約８５％純粋であり、最も好ましくは最小約９９％純粋であることを意味する。
【０２０３】
本明細書中に用いられる「受容体カセット」は、受容体ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を含む。
【０２０４】
本明細書中に用いられる「受容体発現カセット」は、受容体ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列に作用連関された５’調節領域に対応するヌクレオチド配列、例えば植物組織中の発現を可能にするプロモータと未翻訳３’終止領域（ストップコドン及びポリアデニル化配列）と、を含む。
【０２０５】
２つの核酸は、２つの核酸のそれぞれに由来する配列が子孫核酸中で組み合わされたときに「組換えられる」。両核酸が組換えのための基質である場合、２つの配列は「直接的に」組換えられる。２つの配列が交差オリゴヌクレオチドのような中間体を使用して組換えられる場合、これらの配列は「間接的に組換えられる」。間接的な組換えの場合、一方の配列だけが組換えのための実際の基質となり、いくつかの事例では、いずれの配列も組換えのための基質とはならない。
【０２０６】
「調節要素」は、ヌクレオチド配列の発現のコントロールに関与する配列を意味する。調節要素は、当該ヌクレオチド配列と終結信号とに作用連関されたプロモータを含む。調節要素は典型的には、ヌクレオチド配列の適正な翻訳に必要とされる配列をも包含する。
【０２０７】
実質的に同一：２つの核酸配列又は蛋白質配列との関連における「実質的に同一」という言い方は、下記の配列比較アルゴリズムのうちの１つを用いて、又は視覚的検査によって測定して、最大一致に関して比較し整列させた場合に、最小６０％、好ましくは８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％、最も好ましくは最小９９％のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有する２つ以上の配列又は部分配列を意味する。好ましくは、実質的な同一性は、最小約５０個の残基長さの配列領域、より好ましくは最小約１００個の残基の配列領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は最小約１５０個の残基にわたって実質的に同一である。特に好ましい実施態様の場合、これらの配列は、コーディング領域の全長にわたって実質的に同一である。さらに、実質的に同一の核酸配列又は蛋白質配列は、実質的に同じ機能を発揮する。
【０２０８】
配列比較に関して、典型的には１つの配列が基準配列として作用し、この基準配列に、試験配列が比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び基準配列がコンピュータに入力され、必要な場合には、部分配列座標が指定され、配列アルゴリズム・プログラム・パラメータが指定される。配列比較アルゴリズムは次いで、指定されたプログラム・パラメータを基準として、基準配列に対する試験配列の配列同一性百分率を計算する。
【０２０９】
例えば、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ， Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２：４８２ （１９８１）の局地的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍｅｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３ （１９７０）の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：２４４４ （１９８８）の類似性探索法、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ， ５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩにおけるＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）のコンピュータ化された実施、又は視覚的検査（総体的にＡｕｓｕｂｅｌ他参照、後述）によって、比較のための配列の最適配列を行うことができる。
【０２１０】
配列同一性及び配列類似性の百分率を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−４１０ （１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴアルゴリズムを実施するソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を介して公に入手可能である。このアルゴリズムは先ず、問い合わせ配列においてＷの長さの短い単語を識別することにより、高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を識別することを伴う。Ｗの長さの単語は、データベース配列内の同じ長さの単語と整列したときに、或る正の値の閾値スコアＴとマッチするか、又はＴを満たす。Ｔは近隣単語スコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他，１９９０）。これらの初期の近隣単語ヒットは、これらのヒットを含むより長いＨＳＰを見出す探索を開始するためのシードとして作用する。次いでこれらの単語ヒットは、蓄積する整列スコアを増加させることができる範囲で、各配列に沿って両方向に拡張させられる。蓄積するスコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータＭ（マッチング残基対に対する報奨スコア；常に＞０）及びパラメータＮ（ミスマッチング残基に対するペナルティスコア；常に＜０）を使用して、計算される。アミノ酸配列の場合、蓄積スコアを計算するために、スコアリング・マトリックスが使用される。各方向における単語ヒットの拡張は、蓄積した整列スコアがその最大限に達成される値から量Ｘだけ低下するか、蓄積スコアがゼロになるか、又は、１つ又は複数の負のスコアリング残基配列が蓄積することにより、ゼロを下回るか、あるいは、いずれかの配列の端部に到達するときに、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズム・パラメータＷ，Ｔ及びＸは、整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）はデフォルトとして、１１の単語長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムはデフォルトとして、３の単語長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング・マトリックスを用いる（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５ （１９８９））。
【０２１１】
配列同一性百分率を計算するのに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計的分析を行う（例えばＫａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：５８７３−５７８７ （１９９３））。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））である。この最小和確率は、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間のマッチングが偶然に発生する確率を示す。例えば、基準核酸配列と比較した試験核酸配列の最小和確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、試験核酸配列は基準配列と類似すると考えられる。
【０２１２】
２つの核酸配列が実質的に同一であることの別の示唆となるのは、２つの分子が緊縮条件下で互いにハイブリダイズすることである。「特異的にハイブリダイズする」という言い方は、特定のヌクレオチド配列が複合的な混合物（例えば全細胞の）ＤＮＡ又はＲＮＡに存在しているときに、分子が緊縮条件下で前記特定のヌクレオチド配列に対してだけ結合するか、二重らせん形成するか、又はハイブリダイズすることを意味する。「実質的に結合する」は、プローブ核酸と標的核酸との間の相補的ハイブリダイゼーションを意味し、僅かなミスマッチを包含する。これらのミスマッチは、標的核酸配列の所望の検出を達成するために、ハイブリダイゼーション培地の緊縮性を低減することにより受容することができる。
【０２１３】
サザン及びノーザン・ハイブリダイゼーションのような核酸ハイブリダイゼーション試験との関連における「ストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェント・ハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列に依存し、種々異なる環境パラメータの下で異なる。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションの広範囲に判るガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅ 第Ｉ部第２章「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ」Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見出される。一般に、高ストリンジェントのハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、規定のイオン強度及びｐＨにおいて特異的配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。典型的には「緊縮条件」下では、プローブは、その標的配列とハイブリダイズし、他の配列とはハイブリダイズすることはない。
【０２１４】
Ｔｍは、標的配列の５０％が完全にマッチングされたプローブとハイブリダイズする温度（規定のイオン強度及びｐＨのもとで）である。極めて高ストリンジェントの条件は、特定のプローブのＴｍに対して等しいように選択される。サザン又はノーザンブロットにおいてフィルタ上に１００個の相補的残基を有する相補的核酸をハイブリダイズするためのストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃で１ｍｇのヘパリンとともに５０％ホルムアミドを使用し、ハイブリダイゼーションを一晩行うことである。高ストリンジェント洗浄条件の例は、約１５分間、７２℃で０．１５ＭのＮａＣｌを使用することである。ストリンジェント洗浄条件の例は、１５分間、６５℃で０．２ｘＳＳＣ洗浄することである（ＳＳＣバッファの説明に関しては、後述のＳａｍｂｒｏｏｋを参照）。しばしば、高ストリンジェンシー洗浄を、低ストリンジェンシー洗浄に続いて行うことにより、バックグラウンド・プローブ信号を除去する。例えば１００個を上回るヌクレオチドを有する二重らせんのための中ストリンジェンシー洗浄の例は、１５分間、４５℃で１ｘＳＳＣを使用することである。例えば１００個を上回るヌクレオチドを有する二重らせんのための低ストリンジェンシー洗浄の例は、１５分間、４０℃で４〜６ｘＳＳＣを用いることである。プローブが短い（例えば１０〜５０個のヌクレオチド）の場合、ストリンジェント条件は典型的には、約１．０Ｍ未満のＮａイオンの塩濃度、典型的にはｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度（又はその他の塩）を伴い、温度は典型的には最低約３０℃である。ストリンジェント条件は、ホルムアミドのような不安定化剤を添加することにより達成することもできる。一般には、特定のハイブリダイゼーション・アッセイにおいて無関係のプローブに関して観察される比の２倍（又は２倍よりも高い）の信号・ノイズ比が、特異的ハイブリダイゼーションの検出を示す。ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズしない核酸も、これらの核酸がコード化する蛋白質が実質的に同一ならば、なおも実質的に同一である。このことは例えば、遺伝子コードによって許可された最大コドン縮重を用いて、核酸のコピーが作成されるときに生じる。
【０２１５】
下記のものは、一連のハイブリダイゼーション／洗浄条件の例である。これらの条件は、本発明の基準ヌクレオチド配列に対して実質的に同一の相同ヌクレオチド配列をクローニングするのに用いることができる：基準ヌクレオチド配列は好ましくは、５０℃における２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄とともに、５０℃で７％ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中で、基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、より望ましくは、５０℃における１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄とともに、５０℃で７％ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中で、基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、より望ましくは、５０℃における０．５Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄とともに、やはり５０℃で７％ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中で、基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、好ましくは、５０℃における０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄とともに、５０℃で７％ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中で、基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズし、より好ましくは、６５℃における０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での洗浄とともに、５０℃で７％ナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤＳ）、０．５ＭのＮａＰＯ４、１ｍＭのＥＤＴＡ中で、基準ヌクレオチド配列とハイブリダイズする。
【０２１６】
２つの核酸配列又は蛋白質が実質的に同一であることの更なる示唆は、第１の核酸によりコード化される蛋白質が、第２の核酸によってコード化される蛋白質と免疫学的に交差反応性を有するか、又はこの蛋白質と特異的に結合することである。このように、蛋白質は第２の蛋白質と典型的には実質的に同一であり、例えばこれら２つの蛋白質は同類置換形によってのみ異なる。
【０２１７】
「抗体に特異的に（又は選択的に）結合する」又は「との特異的（又は選択的）免疫反応性を有する」は、蛋白質又はペプチドに言及する場合、蛋白質及びその他の生物学的物質の異種個体群の存在において、蛋白質の存在を決定する結合反応を意味する。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下では、特定された抗体は特定の蛋白質に結合し、試料中に存在する他の蛋白質には有意な量では結合しない。このような条件下での抗体に対する特異的な結合は、特定の蛋白質に対する特異性に関して選択された抗体を必要とすることができる。例えば、本発明の核酸配列のうちの任意の配列によってコード化されたアミノ酸配列を有する蛋白質に対してもたらされる抗体は、その蛋白質との特異的免疫反応性を有し、かつ多型変異形を除く他の蛋白質との特異的免疫反応性は有さない抗体を得るように選択することができる。特定の蛋白質との特異的免疫反応性を有する抗体を選択するために、多様なイムノアッセイ・フォーマットを使用することができる。例えば、蛋白質との特異的免疫反応性を有するモノクローナル抗体を選択するのには、固相ＥＬＩＺＡイムノアッセイ、ウェスタン・ブロット、又は免疫組織化学が日常的に使用される。特異的免疫反応性を見極めるのに用いることができるイムノアッセイ・フォーマット及び条件の説明に関しては、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ 「ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ」を参照されたい。典型的には、特異的又は選択的反応は、少なくとも２倍のバックグラウンド信号又はノイズとなり、より典型的には１０〜１００倍を上回るバックグランドとなる。
【０２１８】
「配列」は、それぞれ核酸又はアミノ酸（例えば蛋白質）から成るより長い配列の一部を含む核酸又はアミノ酸の配列を意味する。
「合成的」は、自然の配列には存在しない構造特性を含むヌクレオチド配列を意味する。例えば、Ｇ＋Ｃの含量、及び、双子葉遺伝子及び／又は単子葉遺伝子の正常なコドン分布により酷似している人工的な配列は合成的であると言われる。
【０２１９】
「標的発現カセット」は、標的ヌクレオチド配列に作用連関された５’調節領域に対応するヌクレオチド配列を含む。標的ヌクレオチド配列の発現は、化学的リガンドの存在において受容体ポリペプチドによって活性化される。標的遺伝子の５’調節領域はコア・プロモータ配列と、転写配列の開始部と、受容体ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインの相補的結合に必要な１つ又は複数の要素とを含む。プロモータ配列は最小のプロモータであってよい。標的発現カセットは、３’終結領域（ストップ・コドン及びポリアデニル化配列）をも有する。標的ヌクレオチド配列は、ポリペプチドをコード化することができ、又は標的ヌクレオチド配列が発現する結果、ＲＮＡ種をもたらすことができる。このＲＮＡ種はそれ自体、アンチセンスＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ分子のように活性である。
【０２２０】
「転写活性化ドメイン」又は「トランスアクティベーション・ドメイン」又は「活性化ドメイン」（Ａ／Ｂドメインとしても知られる）は、アミノ酸の１つ又は複数の配列を含む受容体ポリペプチド部分であり、この配列は、ＴＡＴＡボックスにおける前開始中及び組み立て中に転写因子の動作に影響を与えるサブドメインとして作用する。トランスアクティベーション・ドメインの効果は反復転写開始事象を可能にすることができ、この事象は、遺伝子発現レベルをより大きくする。
【０２２１】
「形質転換」は、異種の核酸を宿主細胞又は宿主生物に導入するプロセスである。具体的には「形質転換」は、当該生物のゲノム中にＤＮＡ分子を安定的に組込むことを意味する。形質転換された細胞、組織又は昆虫は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、細胞、組織又は昆虫の形質導入子孫をも包含すると解釈される。
【０２２２】
「形質転換型／遺伝子導入型／組換え型」は、異種の拡散分子が内部に導入されているバクテリア又は植物のような宿主生物を意味する。核酸分子は、宿主のゲノム内に安定的に組込むことができるか、又は、核酸分子は、染色体外分子として存在することもできる。このような染色体外分子は、自己複製可能である。形質転換された細胞、組織又は植物は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、細胞、組織又は植物の形質導入子孫をも包含すると解釈される。「非形質転換」、「非遺伝子導入」又は「非組換え」宿主は、野生型の生物、例えばバクテリア又は植物を意味する。野生型のバクテリア又は植物は異種核酸分子を含有しない。
【０２２３】
ヌクレオチドは、下記の標準的な略語によって、これらの塩基、すなわち：アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）及びグアニン（Ｇ）、により示される。アミノ酸も同様に下記の標準的な略語、すなわち：アラニン（Ａｌａ；Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リシン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）によって示される。さらに、（Ｘａａ；Ｘ）は任意のアミノ酸を示す。
【０２２４】
発明の詳細な説明
Ｉ．  天然及びキメラの受容体ポリペプチド
本発明は、受容体ポリペプチドをコード化する受容体カセットを含む。好ましい実施態様の場合、受容体ポリペプチドは、ヒンジ領域と、リガンド結合ドメインと、ＤＮＡ結合ドメインと、トランスアクティベーション・ドメインとから成る。ＤＮＡ結合ドメインは受容体ポリペプチドを、標的発現カセットの５’調節領域に、その応答要素部位で結合する。受容体ポリペプチドのヒンジドメインはＤＮＡ結合ドメインとリガンド結合ドメインとの間に位置し、リガンド結合ドメインの活性に影響を与える。受容体ポリペプチドのリガンド結合ドメインは、存在する場合には、相補的な化学的リガンドと結合する。化学的リガンドの結合は、受容体ポリペプチドを構造変化させ、トランスアクティベーション・ドメインが、標的ヌクレオチド配列の転写に影響を与えるのを可能にし、その結果、例えばコード化されたポリペプチド、アンチセンスＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡ分子が生成される。
【０２２５】
キメラ受容体ポリペプチドは、例えば標的ポリペプチドをコード化する標的ヌクレオチド配列の発現を活性化するために、本発明において使用することができる。受容体ポリペプチドの４つのドメインのうちの１つ又は複数のドメインは、トランスアクティベーション、ＤＮＡ結合、又は化学的リガンド結合に関するこれらの有効性に基づいて、異種源から選択することができる。キメラ受容体ポリペプチドのＤＮＡ結合（Ｃ）ドメイン及びトランスアクティベーション（Ａ／Ｂ）ドメインは、同様の転写調節機能を有する任意の生物、例えば植物、昆虫及び哺乳動物から得ることができる。キメラ受容体ポリペプチドのヒンジ（Ｄ）ドメイン及びリガンド結合（Ｅ）ドメインは、好ましくは昆虫エクジソン受容体から選択される。本発明の１つの実施態様において、ヒンジ（Ｄ）ドメインとリガンド結合（Ｄ）ドメインとはそれぞれ、異なる昆虫のエクジソン受容体から選択される。本明細書中に提供されるようなキメラ受容体ポリペプチドは、最適なトランスアクティベーション活性と、選択された化学的リガンドの相補的結合と、特異的応答要素の認識とを組み合わせた利点をもたらす。このように、キメラポリペプチドは、特定の目的に合わせて構成することができる。これらのキメラ受容体ポリペプチドは、機能性をも改善する。
【０２２６】
また、トランスアクティベーション（Ａ／Ｂ）ドメイン、リガンド結合（Ｅ）ドメイン及びＤＮＡ−結合（Ｃ）ドメインとは、任意の機能配列でキメラ受容体ポリペプチド内で組み立てることができることも本発明の一部である。例えば、トランスアクティベーション・ドメインの１つのサブドメインが自然発生的受容体のＮ末端部に見出される場合、本発明のキメラ受容体ポリペプチドは、Ｎ末端のトランスアクティベーション・ドメインの代わりに、又はこのドメインに加えて、Ｃ末端にトランスアクティベーション・ドメインを含んでよい。本発明に開示されたキメラ受容体ポリペプチドは、同タイプの複数のドメイン、例えば１つの受容体ポリペプチド当たり２つ以上のトランスアクティベーション・ドメインを有していてもよい。
【０２２７】
キメラ受容体カセット及びキメラ受容体ポリペプチドは、自然昆虫個体群のエクジソン受容体から入手可能なドメインから構成することができる。多数のエクジソン受容体が入手可能であり、本発明とともに使用することができる。これらのエクジソン受容体の一例としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（遺伝子バンク信託（ｇｅｎｂａｎｋ）Ｍ７４０７８； Ｋｏｅｌｌｅ他 （１９９１） Ｃｅｌｌ ６７：５９−７７）、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ（遺伝子バンク信託 Ｕ１９８１２； Ｆｕｊｉｗａｒａ他 （１９９５） Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２５：８４５−８５６）、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（遺伝子バンク信託 Ｌ３５２６６及びＤ４３９４３； Ｓｗｅｖｅｒｓ他（１９９５） Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２５：８５７−８６６）、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ（国際公開第００／１５７９１号パンフレット）、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ（遺伝子バンク信託 Ｓ６０７３９）、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａが挙げられる（国際公開第９６／３７６０９号パンフレット）、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ（遺伝子バンク信託 ＡＦ０４９１３６；Ｓａｌｅｈ他 （１９９８） Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ １４３： ９１−９９）、Ｃｈｒｏｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ（遺伝子バンク信託 Ｕ２９５３１； Ｋｏｔｈａｐａｌｌｉ他 （１９９５） Ｄｅｖ． Ｇｅｎｅｔ． １７： ３１９−３３０）及びＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ （国際公開第９６／３７６０９号パンフレット）に由来のエクジソン受容体が挙げられる。本発明の付加的な実施態様の場合、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ及びＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの昆虫エクジソン受容体から、新規のエクジソン受容体ドメインがクローニングされる。
【０２２８】
Ａ．リガンド結合ドメイン
受容体ポリペプチドのリガンド結合（Ｅ）ドメインは、化学的リガンドの存在に応じて、標的発現カセットの５’調節領域を活性化する手段を提供する。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａに由来するエクジソン受容体（ＥｃＲ）は、リガンド結合ドメインに結合する相補的な化学的リガンドが同定されている受容体ポリペプチドの一例である。ステロイドホルモンであるエクジソンは、組織発達の協調変化を誘導し、その結果、変態を引き起こす。エクジソンは、ＥｃＲに結合することが判っている（Ｋｏｅｌｌｅ他、Ｃｅｌｌ ６７： ５９−７７ （１９９１））。植物により生成されたエクジソン類似体、ムリステロンもまた、ＥｃＲのリガンド結合ドメインに結合する。他の化学物質、例えば非ステロイド系エクジソンアゴニストＲＨ５８４９（Ｗｉｎｇ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１： ４６７−４６９ （１９８８））、ＲＨ−２４８５（ｍｅｔｈｏｘｙｆｅｎｏｚｉｄｅ， Ｄｈａｄｉａｌｌａ他（１９９８） Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｅｎｔｏｍ ４３： ５４５−５６９）、及び殺虫剤ＭＩＭＩＣ（登録商標）として知られるＲＨ５９９２（テブフェノザイド）もまた、ＥｃＲのリガンド結合ドメインに対応する化学的リガンドとして作用することになる。Ｄｈａｄｉａｌｌａ他、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｅｎｔｏｍｏｌ． ４３：５４５−５６９ （１９９８）も参照されたい。この文献の内容を本明細書中に援用する。この文献には、エジステロイド及び幼若ホルモンの活性を有する殺虫剤が記載されている。
【０２２９】
種々異なる昆虫に由来するエクジソン受容体は、一般的に、これらのアミノ酸配列の間で相同性を有する。密接に関係する昆虫に由来するＥｃＲのリガンド結合ドメインは、高い相同性を示し、これに対してさほど密接には関係しない種に由来するＥｃＲはこれらのアミノ酸配列においてより大きく分岐する。本発明の１つの実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのリガンド結合ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ， Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ， Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ及びＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体に由来する。好ましい実施態様の場合、リガンド結合ドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ又はＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓに由来する。これらのリガンド結合ドメインは、受容体ポリペプチドが標的発現カセットとともに細胞中に発現させられ、リガンドに晒されると、キメラ受容体ポリペプチドに高レベルの活性を付与する。
【０２３０】
化学的リガンドの選択は、どのリガンド結合ドメインが受容体ポリペプチドに存在するかに依存することになる。選択されたリガンド結合ドメインと相補的な結合対を形成することが示される限り、いかなる化学的化合物でも間に合う。自然発生的な化合物が、特定のリガンド結合ドメインと相補的な結合対を形成することで知られている場合、これらの既知の化合物も本発明において使用される。具体的に有用な化学物質の一例としては、リガンド結合ドメインと相補的な結合対を形成する殺虫剤が挙げられる。このような化学物質の一例としては、昆虫における天然受容体蛋白質との結合に起因する殺虫剤としての機能を有するホルモン、ホルモン・アゴニスト、及びホルモン・アンタゴニストが挙げられる。加えて、殺虫剤として知られるこれらのホルモン又はホルモンに関係する特性を有する化学物質は、農業生産に関して既に検査済みであるという付加的な恩恵を有し、このような化学物質は、農作物に対して畑で適用するのに際して、「すぐに使用」可能になる。これらの特性を有する有用な化学物質の一例としては、ＲＨ５８４９、ＲＨ−２４８５（メトキシフェノザイド）及びＲＨ５９９２（テブフェノザイド）が挙げられる。
【０２３１】
Ｂ．  ヒンジドメイン
ヒンジ（Ｄ）ドメインは、ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインとリガンド結合（Ｅ）ドメインとの間の受容体ポリペプチドのアミノ酸として定義付けされる。この領域に起因する活性は受容体ポリペプチドの、ホモ二量体においてはそれ自体と相互作用する能力、又はヘテロ二量体においては第２の異種受容体ポリペプチドと相互作用する能力である。ヒンジ領域における突然変異は、超スパイラクル受容体及びＲＸＲ受容体と相互作用する、エクジソン受容体の能力を変化させることが判っている。本発明において、ヒンジドメインは、キメラ受容体ポリペプチドの活性を調節するのに使用される。本発明の１つの実施態様の場合、キメラ受容体ポリペプチドのヒンジドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ， Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ， Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ及びＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓから成る群から選択された昆虫のエクジソン受容体に由来する。好ましい実施態様の場合、ヒンジドメインは、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ， Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ， Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ及びＬｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａのエクジソン受容体に由来する。
【０２３２】
本発明の好ましい実施態様は、ヒンジドメインとリガンド結合ドメインとが互いに異なる昆虫エクジソン受容体から選択されるようなキメラ受容体ポリペプチドを提供する。キメラ受容体ポリペプチドにおけるヒンジドメインとリガンド結合ドメインとの組み合わせは、リガンドに応じて新しい活性を有する受容体ポリペプチドをもたらす。
【０２３３】
Ｃ．ＤＮＡ結合ドメイン及びその応答要素
ＤＮＡ結合（Ｃ）ドメインは、特定の機能的構成要件を有するアミノ酸配列である。これらの機能的構成要件は、特異的なヌクレオチド配列、応答要素に、受容体ポリペプチドを結合する原因となる。これらの応答要素は標的遺伝子の５’調節領域に存在する。本発明の１つの実施態様の場合、ＤＮＡ結合ドメインは、昆虫エクジソン受容体から得られ、亜鉛イオンによって配位結合されるといわゆる「亜鉛フィンガー」モチーフを形成するように配列されたシステイン残基を含有している。昆虫エクジソン受容体のためのＤＮＡ結合ドメインの構造は、昆虫種間で極めて保守的である。したがって、相補的結合対を形成するのに使用される応答要素の変化は制限されている（Ｅｖａｎｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：８８９−８９５ （１９８８））。にもかかわらず、他の方式でこれらの保守的な応答要素を使用することにより、遺伝子発現コントロール方法に、かなりのフレキシビリティを導入することができる。本発明の好ましい実施態様の場合、適切な応答要素の複数のコピーが、５’調節領域内に位置している。５’調節領域は、受容体ポリペプチドの結合のための複数の部位を可能にし、その結果活性度が大きくなる。
【０２３４】
本発明により遺伝子発現をコントロールする上での付加的なフレキシビリティは、他の転写アクティベータに由来するＤＮＡ結合ドメイン及び応答要素を使用することにより得ることができる。これらの転写アクティベータの一例としては、ＬｅｘＡ蛋白質又はＧＡＬ４蛋白質が挙げられる。Ｅ．Ｃｏｌｉに由来するｌｅｘＡ遺伝子によってコード化されるＬｅｘＡ蛋白質から得られるＤＮＡ結合ドメイン、及びその相補的な結合部位（Ｂｒｅｎｔ ａｎｄ Ｐｔａｓｈｎｅ， Ｃｅｌｌ ４３： ７２９−７３６ （１９８５）、この文献には、ＬｅｘＡ／ＧＡＬ４転写アクティベータが記載されている）を利用することができる。別の有用な源が酵母のＧＡＬ４蛋白質から得られる（Ｓａｄｏｗｓｋｉ他、Ｎａｔｕｒｅ ３３５： ５６３−５６４ （１９８８）、この文献にはＧＡＬ４−ＶＰ１６転写アクティベータが記載されている）。本発明の１つの好ましい実施態様の場合、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａのＥｃＲに由来するヒンジドメイン及びリガンド結合ドメインの含有分に融合することによって、キメラ受容体ポリペプチドが構成される。ヒンジドメイン及びリガンド結合ドメインの含有分は標的発現カセットの発現をコントロールすることができる。
【０２３５】
合成ＤＮＡ結合ドメインと応答要素とを使用することにより、遺伝子発現をコントロールする上での付加的な度合いのフレキシビリティを得ることができる。蛋白質工学試験は、亜鉛フィンガー・ドメインの、選択したＤＮＡ標的配列に結合するというＤＮＡ結合特性を合理的に変化させることが可能であることを示した（Ｌｉｕ他、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９４：５５２５−５５３０ （１９９７）； Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓ ａｎｄ Ｂｅｒｇ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９０： ２２５６−２２６０ （１９９３））。合成亜鉛フィンガー・ドメインを使用すると、キメラ受容体ポリペプチドが、選択した標的配列を認識することが可能になる。この標的配列は、植物中に形質転換された標的カセットの一部であってよく、又は、天然植物遺伝子の発現をコントロールするための、植物のゲノム中の標的配列であってもよい。
【０２３６】
Ｄ．トランスアクティベーション・ドメイン
トランスアクティベーション（Ａ／Ｂ）ドメインは、受容体ポリペプチド内でＤＮＡドメインと組み合わされたときに、ＲＮＡポリメラーゼによる生産的転写開始を増進する。（総体的に、Ｐｔａｓｈｎｅ， Ｎａｔｕｒｅ ３３５：６８３−６８９ （１９８８）； Ｍｅｓｈｉ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ３６： １４０５−１４２０ （１９９５）参照）。種々異なるトランスアクティベーション・ドメインは、転写開始を増進するこれらの能力において、異なる度合いの有効性を有することで知られている。化学的リガンドの存在に応じて、標的発現カセットを高レベルで発現させるために、植物細胞中にトランスアクティベーションの秀でた有効性を有するトランスアクティベーション・ドメインを使用することが望ましい。本発明の方法において特に効果的であることが判っているトランスアクティベーション・ドメインの一例としては、ＶＰ１６（Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ他、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ． ２（６）： ７１８−７２９ （１９８８）−単純ヘルペスウィルスから分離）及びＣ１（Ｇｏｆｆ他、Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ． ５： ２９８−３０９ （１９９１）−トウモロコシから分離）、ＡＰ１（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから分離）、及びＤｏｆ１（トウモロコシから分離）が挙げられる。本発明の１つの好ましい実施態様の場合、ＶＰ１６に由来するトランスアクティベーション・ドメインは、植物における標的ポリペプチド発現をコントロールするためにＥｃＲ分に融合される。その他のトランスアクティベーション・ドメインも効果的である。
【０２３７】
ＩＩ．  遺伝子発現の抑制
上述のように、本発明の方法は、最小の基礎レベルを上回るように遺伝子発現を増進するために用いることができる。しかし本発明の方法の傑出した利点の１つは、遺伝子発現を低減又は阻害する、すなわち遺伝子抑制のために本発明の方法を用いることができることである。抑制によって遺伝子発現を制御する手段は、トランスアクティベーション・ドメインの代わりに抑制ドメインを使用することにより達成することができる。抑制ドメインは、受容体ポリペプチド中のＤＮＡ結合ドメインと組み合わされたときに、ＲＮＡポリメラーゼによる生産的転写を低下させるアミノ酸配列として定義付けすることができる（Ｎｇ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ２５： １２１−１２６ （２０００））。標的カセットの発現を低下させるために、本発明とともに使用することができる抑制ドメインの一例としては、ＡｔＨＤ２Ａの抑制ドメイン（Ｗｕ， Ｐｌａｎｔ Ｊ． ２２： １９−２７ （２０００））、Ｏｓｈｏｘ１及びＯｓｈｏｘ３（Ｍｅｉｊｅｒ， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２６３：１２−２１ （２０００））が挙げられる。
【０２３８】
ＩＩＩ．  遺伝子導入植物における遺伝子発現のコントロール
本発明はさらに、キメラ受容体ポリペプチドをコード化する昆虫エクジソン受容体カセットと、少なくとも１つの標的発現カセットとで植物を形質転換することを含む、植物遺伝子発現のコントロール方法を含む。昆虫のエクジソン受容体カセットは、植物細胞における発現を促進することができる５’調節領域と、３’終結領域と作用連関されている。標的発現カセットは、標的ヌクレオチド配列に作用連関された５’調節領域を含む。この場合、５’調節領域は、受容体ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインに対して相補的な１つ又は複数の要素を含む。標的発現カセットは、１つ又は複数の化学的リガンドの存在において、キメラ受容体ポリペプチドによって活性化され、標的ヌクレオチド配列の発現が達成される。
【０２３９】
本発明の好ましい実施態様によれば、Ｍａｎｄｕｃａエクジソン受容体のヒンジドメインと、リガンド結合ドメインとを含むキメラ受容体ポリペプチドが、リガンドの存在において標的発現カセットの高レベルの発現を活性化することが発見されている。したがって、本発明の好ましい実施態様は、標的発現カセット、及び、植物細胞中での発現を促進することができる５’調節領域と、ＤＮＡ結合ドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａエクジソン受容体に由来するヒンジドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａエクジソン受容体に由来するリガンド結合ドメインと、トランスアクティベーション・ドメインとを含む受容体カセットと、３’終結領域とを含む受容体発現カセットで植物を形質転換することを含む、植物における遺伝子発現をコントロールする方法である。標的発現カセットは、１つ又は複数の化学的リガンドの存在において受容体ポリペプチドによって活性化され、標的ヌクレオチド配列の発現が達成される。
【０２４０】
受容体カセットによってコード化されたキメラ受容体ポリペプチドは、これが植物の組織及び細胞において発現を可能にするプロモータに作用的に連関されていると、植物中で発現させることができる。受容体ポリペプチドの発現が構成的であり、発生に関して調節されており、組織特異的であり、細胞特異的であり、又は細胞区画特異的であり得るように、受容体発現カセットに対して適切なプロモータが選択される。プロモータはまた、受容体ポリペプチド自体の発現を植物中で化学的に誘導することができ、これにより、リガンドによるプロモータ誘導レベルを増大させるように選択される。特異的発現を付与するプロモータ要素と、化学的に誘導される発現を付与するプロモータ要素とを組み合わせることにより、受容体ポリペプチドは、化学的用途に応じて植物の特異的細胞又は組織内で発現又は活性化することができる。受容体ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、植物における発現の改善、機能性の改善、又はその両方のために修飾することができる。このような修飾の一例としては、コドン使用頻度の変更、イントロンの挿入又は突然変異の形成が挙げられる。
【０２４１】
化学的リガンドの存在において受容体ポリペプチドにより活性化されて発現する標的ポリペプチドも開示されている。任意のコーディング配列の発現を本発明によりコントロールすることができる。ただしこの場合、前記コーディング配列に作用連関されたプロモータは、使用される受容体ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインに対して相補的な１つ又は複数の応答要素を含有するように工学的に作り出されていることを条件とする。例えば、植物稔性をコントロールするのに有用な標的ポリペプチドが、化学的リガンドの存在において受容体ポリペプチドによって活性化される。
【０２４２】
Ａ．  コーディング配列及び隣接配列の修飾
異種源に由来する遺伝子の、植物における遺伝子導入発現は、植物における遺伝子の発現を達成して最適化するために、これらの遺伝子を修飾することに関与する。具体的には、別個の酵素をコード化するがしかし天然の微生物中の同じ転写物によってコード化された細菌のＯＲＦが、植物中で別個の転写物上に最良に発現させられる。これを達成するために、各細菌ＯＲＦが個別に分離され、カセット内でクローニングされる。このカセットは、ＯＲＦの５’末端で植物プロモータ配列を提供し、ＯＲＦの３’末端で植物転写ターミネータを提供する。分離されたＯＲＦは好ましくは、開始ＡＴＧコドンとストップコドンとを含んでいるが、しかし、開始ＡＴＧコドン及びストップコドンを超えて付加的な配列を含んでいてもよい。加えて、ＯＲＦは先端切除されていてよいが、しかし、所要の活性をなおも保持している。特に長いＯＲＦの場合、活性を保持する先端切除バージョンは、遺伝子導入生物における発現にとって好ましい場合がある。「植物プロモータ」及び「植物転写ターミネータ」は、植物細胞内で動作するプロモータ及び転写ターミネータを意味しようとするものである。これは、ウィルス（例えばカリフラワー・モザイクウィルス）のような非植物源に由来可能なプロモータ及び転写ターミネータを含む。
【０２４３】
ＯＲＦコーディング配列及び隣接配列に対する修飾が必要でない場合がある。当該ＯＲＦを含有するフラグメントを分離して、これを植物プロモータの下流に挿入すれば十分である。例えば、Ｇａｆｆｎｅｙ他 （Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：７５１−７５６ （１９９３））は、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモータ及びＣａＭＶ  ｔｍｌターミネータのコントロール下で、遺伝子導入植物内でＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｎａｈＧ遺伝子を発現させることに成功した。この場合、コーディング配列は修飾されておらず、ＡＴＧの上流のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ遺伝子のヌクレオチド及びストップコドンの下流のヌクレオチドはｎａｈＧ ＯＲＦにまだ付着されたままである。好ましくは小さな隣接微生物配列は、ＡＴＧの上流及びストップコドンの下流に付着されたままであることが望ましい。実際にはこのような構造は、制限部位の利用可能性に依存してよい。
【０２４４】
他の事例の場合、微生物源に由来する遺伝子の発現は、発現の問題を招くことがある。これらの問題は当業者において良く特徴付けされており、具体的には、Ｂａｃｉｌｌｕｓのような特定源に由来する遺伝子と共通である。これらの問題は本発明のヌクレオチド配列に当てはまる場合があり、これらの遺伝子の修飾は、当業者に今良く知られている技術を用いて行うことができる。下記の問題に直面することがある。
【０２４５】
１．  コドン使用頻度
植物における好ましいコドン使用頻度は、或る特定の微生物における好ましいコドン使用頻度とは異なる。クローニングされた微生物ＯＲＦ内のコドン使用頻度を植物遺伝子内（及び標的植物に由来する特定遺伝子内）の使用頻度と比較すると、変化させることが好ましいＯＲＦ内のコドンが同定可能になる。典型的には、植物の進化は、単子葉植物の第３の塩基位置においてヌクレオチドＣ及びＧを強力に優先させる傾向があり、これに対して、双子葉植物はこの位置において、しばしばヌクレオチドＡ又はＴを使用する。特定の標的遺伝子導入種に対して好ましいコドン使用頻度を組込むために、遺伝子を修飾することにより、ＧＣ／ＡＴ含量及び非正統的スプライシングに関する下記の問題の多くが克服されることになる。
【０２４６】
２．  ＧＣ／ＡＴ含量
植物遺伝子は典型的には３５％を上回るＧＣ含量を有する。Ａ及びＴのヌクレオチドに富んだＯＲＦ配列は、植物のいくつかの問題を引き起こすおそれがある。第１に、ＡＴＴＴＡのモチーフは、メッセージを不安定化させると考えられ、多くの短命なｍＲＮＡの３’末端に見出される。第２に、メッセージ内の不適切な位置にＡＡＴＡＡＡのようなポリアデニル化信号が発生すると、これが転写の早期の打ち切りを招くと考えられる。加えて、単子葉植物は、スプライス部位としてＡＴに富んだ配列を認識することがある（下記参照）。
【０２４７】
３．  開始メチオニンに隣接する配列
植物は、これらのメッセージが所定のリボソーム結合部位を所有しないという点で、微生物とは異なる。むしろ、リボソームはメッセージの５’末端に付着し、翻訳を開始すべき第１の利用可能なＡＴＧに関してスキャンすると考えられる。にもかかわらず、ＡＴＧに隣接する特定のヌクレオチドが好ましく、ＡＴＧに真核生物の共通翻訳イニシエータを含むことにより、微生物遺伝子の発現を向上させることができると考えられる。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ （１９９３／１９９４カタログ、第２１０頁、この内容を本明細書中に援用する）は、植物中にＥ． ｃｏｌｉ ｕｉｄＡ遺伝子を発現させるための共通翻訳イニシエータとして１つの配列を示唆している。さらに、Ｊｏｓｈｉ （Ｎ．Ａ．Ｒ． １５： ６６４３−６６５３ （１９８７）、この内容を本明細書中に援用する）は、ＡＴＧに隣接する多くの植物配列を比較し、別の共通配列を示唆している。植物中に微生物ＯＲＦを発現させる上で困難に直面した場合には、開始ＡＴＧにこれらの配列のうちの１つを含むことにより、翻訳を改善することができる。このような場合には、共通配列の最後の３つのヌクレオチドは、第２のＡＡ残基が修飾されているので、修飾された配列内に含むには適当ではない。開始メチオニンに隣接する好ましい配列は、種々の植物種間で異なることがある。遺伝子バンクのデータベースに置かれた１４個のトウモロコシ遺伝子の調査は下記の結果をもたらした。
【０２４８】
【表１】
2004533212.tif 000002
【０２４９】
この分析は、ヌクレオチド配列が組込まれている所望の植物種、及び、好ましいヌクレオチドを組込むために修飾されたＡＴＧに隣接する配列に関して行うことができる。
【０２５０】
４．  非正統的スプライス部位の除去
非植物源からクローニングされ、植物における発現のためには最適化されていない遺伝子がさらに含有するモチーフは、５’又は３’スプライス部位として植物中で認識することができ、またこれらのモチーフは切断することができ、したがって先端切除されるか又は削除されたメッセージを発生させる。これらの部位は、当業者によく知られた技術を用いて除去することができる。
【０２５１】
コーディング配列及び隣接配列を修飾するための技術は、当業者によく知られている。微生物ＯＲＦの初期発現度が低く、上述の配列に変更を加えるのが適切であると思われる場合、合成遺伝子は、当業者に良く知られた方法に従って構成される。これらの方法は例えば欧州特許第０３８５９６２号明細書（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）、欧州特許第０３５９４７２号明細書（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ）及び国際公開第９３／０７２７８号パンフレット（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ）に記載されている。これらの開示内容すべてを本明細書中に援用する。ほとんどの場合、形質導入植物への転移前に、（当業者に良く知られた）過渡的なアッセイプロトコルを用いて、遺伝子構造の発現を検定することが好ましい。
【０２５２】
Ｂ．  植物発現カセットの構成
遺伝子導入植物において発現させられるように意図されたコーディング配列が、先ず、植物において発現可能な好適なプロモータの後ろに、発現カセット内で組み立てられる。発現カセットは、形質導入遺伝子の発現に必要とされるか又は選択されるさらなる配列を含んでもよい。このような配列の一例としては、転写ターミネータ、発現を向上させるための外生的配列（例えばイントロン）、バイタル配列、及び遺伝子産物を特異的な細胞小器官及び細胞区画に対してターゲティングするように意図された配列が挙げられる。次いでこれらの発現カセットは、下記の植物形質転換ベクターに容易に転移させることができる。以下に、典型的な発現カセットの種々の成分について説明する。
【０２５３】
１．  プロモータ
発現カセット内で使用されるプロモータを選択することにより、遺伝子導入植物中の導入遺伝子の空間的かつ時間的な発現パターンが決められることになる。選択されたプロモータは、特異的な細胞型（例えば葉の表皮細胞、葉肉細胞、根の皮膚細胞）、又は、特異的な組織又は器官（例えば根、葉又は花）において導入遺伝子を発現させることになり、この選択は遺伝子産物の所望の蓄積場所を反映することになる。あるいは、選択されたプロモータは、種々の誘導条件下で、遺伝子の発現を推進することもできる。プロモータは、これらの強度、すなわち転写を促進する能力において、種々多様である。利用される宿主細胞系に応じて、遺伝子の天然プロモータを含めて、多数の好適なプロモータのいずれか１つを使用することができる。下記のものは、発現カセット内で使用可能なプロモータの例であるが、これらの例は本発明を限定するものではない。
【０２５４】
ａ．  構成的発現、ユビキチン・プロモータ：
ユビキチンは、多くの細胞型に蓄積することで知られる遺伝子産物であり、ユビキチンのプロモータは、形質導入植物において使用するために、いくつかの種からクローニングされている（例えばヒマワリ−Ｂｉｎｅｔ他、Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７９： ８７−９４ （１９９１）；トウモロコシ−Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ他、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １２：６１９−６３２ （１９８９）；及びＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ−Ｃａｌｌｉｓ他、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１２４８６−１２４９３ （１９９０）及びＮｏｒｒｉｓ他、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１：８９５−９０６ （１９９３））。トウモロコシのユビキチン・プロモータは、形質導入単子葉植物系において作成されており、単子葉植物の形質転換のために構成されたその配列及びベクターは欧州特許第０３４２９２６号明細書（Ｌｕｂｒｉｚｏｌ）に開示されている。この開示内容を本明細書中に援用する。Ｔａｙｌｏｒ他（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １２：４９１−４９５ （１９９３））には、トウモロコシのユビキチン・プロモータと第１のイントロンとを含むベクター（ｐＡＨＣ２５）、及び、マイクロプロジェクタイル・ボンバードによって導入されたときの、数多くの単子葉植物の細胞懸濁液におけるベクターの高活性が記載されている。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓユビキチン・プロモータは、本発明のヌクレオチド配列とともに使用するのに理想的である。ユビキチン・プロモータは、単子葉植物及び双子葉植物の両方の形質導入植物における遺伝子発現に適している。好適なベクターは、ｐＡＨＣ２５の誘導体、又は適切なユビキチン・プロモータ及び／又はイントロン配列を導入することにより修飾された、本出願に記載された形質転換ベクターのうちの任意のベクターである。
【０２５５】
ｂ．  構成的発現、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモータ
プラスミドｐＣＧＮ１７６１の構成は、欧州特許第０３９２２２５号明細書（例２３）に記載されている。その内容を本明細書中に援用する。ｐＣＧＮ１７６１は「二重」のＣａＭＶ  ３５Ｓプロモータ及びｔｍｌ転写ターミネータを、プロモータとターミネータとの間の固有のＥｃｏＲＩ部位とともに含有しており、ｐＵＣ型バックボーンを有している。修飾されたポリリンカーを有するｐＣＧＮ１７６１の誘導体が構成される。このポリリンカーは既存のＥｃｏＲＩ部位に加えてＮｏｔＩ及びＸｈｏＩ部位を含んでいる。この誘導体はｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸと呼ばれる。ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸは、形質導入植物中に３５Ｓプロモータのコントロール下でｃＤＮＡ配列又はコーディング配列（微生物ＯＲＦ配列を含む）を発現させる目的で、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸのポリリンカー内でこれらの配列をクローニングするのに有用である。このような構成を有する、３５Ｓプロモータ−コーディング配列−ｔｍｌターミネータのカセット全体は、下記のような形質転換ベクターに導入するために、プロモータのＨｉｎｄＩＩＩ， ＳｐｈＩ， ＳａｌＩ及びＸｂａＩの部位５’、及びターミネータのＸｂａＩ， ＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩの部位３’によって切除することができる。さらに、二重３５Ｓプロモータ・フラグメントは、別のプロモータと置き換えるために、ＨｉｎｄＩＩＩ， ＳｐｈＩ， ＳａｌＩ， ＸｂａＩ又はＰｓｔｌによる５’切除、及び、ポリリンカー部位（ＥｃｏＲＩ， ＮｏｔＩ又はＸｈｏＩ）のうちのいずれかによる３’切除によって、除去することができる。所望の場合には、クローニング部位の周りの修飾を、翻訳を向上し得る配列を導入することによって行うことができる。このことは、過剰発現が望まれる場合に特に有用である。例えば、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸは、米国特許第５，６３９，９４９号明細書（この内容を本明細書中に援用する）の例３７に記載されているような翻訳開始部位を最適化することにより修飾することができる。
【０２５６】
ｃ．  構成的発現、アクチン・プロモータ：
アクチンのいくつかのイソ型が、ほとんどの細胞型において発現させられることが知られており、したがってアクチン・プロモータは、構成性プロモータの良好な選択肢となる。具体的には、コメＡｃｔＩ遺伝子に由来するプロモータがクローニングされ、特徴づけされている（ＭｃＥｌｒｏｙ他、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２： １６３−１７１ （１９９０））。１．３ｋｂフラグメントのプロモータが、コメ・プロトプラスト中での発現に必要とされる調節要素全てを含有することが判っている。さらに、ＡｃｔＩプロモータに基づく多数の発現ベクターが、単子葉植物における使用のために特異的に構成されている（ＭｃＥｌｒｏｙ他、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２３１： １５０−１６０ （１９９１））。これらのベクターは、ＡｃｔＩ−イントロン１、ＡｄｈＩ５’側面配列及びＡｄｈＩ−イントロン１（トウモロコシ・アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子に由来）、及びＣａＭＶ  ３５Ｓプロモータに由来する配列を組込んでいる。最高発現レベルを示すベクターは、３５ＳとＡｃｔＩイントロン又はＡｃｔＩ５’側面配列とＡｃｔＩイントロンとの融合体であった。（ＧＵＳ受容体遺伝子の）開始ＡＴＧの周りの配列の最適化はまた、発現を向上させた。ＭｃＥｌｒｏｙ他（Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．２３１： １５０−１６０ （１９９１））によって記載されたプロモータ発現カセットは、遺伝子発現に関して容易に修飾することができ、単子葉植物に使用するのに特に適している。例えば、プロモータ含有フラグメントが、ＭｃＥｌｒｏｙ構造から取り出され、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸにおいて二重３５Ｓプロモータを置き換えるのに使用される。ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸは次いで、特異的遺伝子配列の挿入に利用可能である。こうして構成された融合遺伝子は、次いで適切な形質転換ベクターに転移させることができる。別個の報告では、第１のイントロンを備えたコメＡｃｔＩプロモータも、培養された大麦細胞中で高レベルの発現を示すことが判っている（Ｃｈｉｂｂａｒ他、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ． １２： ５０６−５０９ （１９９３））。
【０２５７】
ｄ．  誘導性発現、ＰＲ−１プロモータ：
ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ中の二重３５Ｓプロモータを、選択された他の任意のプロモータと置き換えることができる。この他のプロモータは、好適に高い発現レベルをもたらすことになる。例えば、米国特許第５，６１４，３９５号明細書に記載した化学的に調節可能なプロモータ、例えばタバコＰＲ−１ａプロモータを、二重３５Ｓプロモータの代わりに使用することができる。あるいは、Ｌｅｂｅｌ他、Ｐｌａｎｔ Ｊ． １６：２２３−２３３ （１９９８）に記載されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＰＲ−１プロモータを使用することもできる。選択したプロモータは好ましくは制限酵素によって、そのプロモータの源から切除されるが、しかし、適切な末端制限部位を担持するプライマを使用して、ＰＣＲ増幅させることもできる。ＰＣＲ増幅を行う場合には、プロモータは、標的ベクター内で増幅プロモータをクローニングした後、増幅エラーに関してチェックするために、再配列決定されるべきである。化学的／病原論的に調節可能なタバコＰＲ−１ａプロモータは、プラスミドｐＣＩＢ１００４から切断され（構成に関しては、欧州特許第０３３２１０４号明細書の例２１参照、この明細書の内容を本明細書中に援用する）、プラスミドｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ（Ｕｋｎｅｓ他、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ４： ６４５−６５６ （１９９２））に転移させられる。ｐＣＩＢ１００４はＮｃｏＩで切断され、結果として生じる、線形化フラグメントの３’オーバハングは、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理することにより平滑にされる。次いで、このフラグメントはＨｉｎｄＩＩＩで切断され、結果として生じたＰＲ−１ａプロモータ含有フラグメントはゲル精製され、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ中にクローニングされる。このｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸから、二重３５Ｓプロモータは除去されている。このことは、ＸｈｏＩによる切断と、Ｔ４ポリメラーゼによる平滑化とに続いて、ＨｉｎｄＩＩＩによる切断と、より大きなベクター−ターミネータ含有フラグメントの分離とによって行われる。このフラグメント中には、ｐＣＩＢ１００４プロモータ・フラグメントがクローニングされる。このことはＰＲ−１ａプロモータ及びｔｍｌターミネータを有するｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸ誘導体と、固有のＥｃｏＲＩ部位及びＮｏｔＩ部位を有する介在ポリリンカーとを発生させる。選択されたコーディング配列はこのベクター中に挿入することができ、次いで下記のものを含めて、融合産物（すなわちプロモータ−遺伝子−ターミネータ）を、選択された任意の形質転換ベクターに転移させることができる。本発明に基づいて形質転換された植物中に、選択されたコーディング配列の発現を誘導するように、米国特許第５，５２３，３１１号明細書及び同第５，６１４，３９５号明細書に開示されたベンゾチアジアゾール、イソニコチン酸及びサリチル酸の化合物を含めて、種々の化学的レギュレータを採用することができる。
【０２５８】
ｅ．  誘導性発現、エタノール誘導プロモータ
本発明のコーディング配列の誘導性発現を付与するために、特定のアルコール又はケトン、例えばエタノールによって誘導可能なプロモータを使用することもできる。このようなプロモータは、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ （Ｃａｄｄｉｃｋ他 （１９９８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：１７７−１８０）に由来するａｌｃＡ遺伝子プロモータである。Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓにおいて、ａｌｃＡ遺伝子はアルコールデヒドロゲナーゼＩをコード化する。アルコールデヒドロゲナーゼＩの発現は、化学的誘導物質の存在において、ＡｌｃＲ転写因子によって調節される。本発明の目的上、最小の３５Ｓプロモータに融合されたａｌｃＡ遺伝子プロモータ配列を含むプラスミドｐａｌｃＡ：ＣＡＴにおけるＣＡＴコーディング配列（Ｃａｄｄｉｃｋ他、（１９８８） Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １６：１７７−１８０）は、本発明のコーディング配列によって置き換えられ、これにより、ａｌｃＡ遺伝子プロモータのコントロール下で、コーディング配列を有する発現カセットが形成される。このことは当業者に良く知られた方法を用いて行われる。
【０２５９】
ｆ．  誘導性発現、グルココルチコイド誘導プロモータ
ステロイドホルモンに基づく系を使用して、本発明の核酸配列の発現を誘導することも考えられる。例えば、グルココルチコイドによって媒介される誘導系が用いられ（Ａｏｙａｍａ及びＣｈｕａ （１９９７） Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ １１： ６０５−６１２）、遺伝子発現は、グルココルチコイド、例えば合成グルココルチコイド、好ましくはデキサメタゾンを好ましくは０．１ｍＭ〜１ｍＭ、より好ましくは１０ｍＭ〜１００ｍＭの濃度範囲で適用することにより、誘導される。本発明の目的上、ルシフェラーゼ遺伝子配列は、本発明の核酸配列によって置き換えられ、これにより、３５Ｓ最小プロモータに融合されたＧＡＬ４上流活性化配列の６つのコピーのコントロール下で、本発明の核酸配列を有する発現カセットが形成される。このことは、当業者に良く知られた方法を用いて行われる。トランス作用因子はＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン （Ｋｅｅｇａｎ他、（１９８６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１：６９９−７０４）を含む。このＤＮＡ結合ドメインは、ヘルペスウィルス蛋白質ＶＰ１６（Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒｇ他、（１９８８） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌ． ２： ７１８−７２９）に融合されている。このヘルペスウィルス蛋白質ＶＰ１６は、ラットのグルココルチコイド受容体（Ｐｉｃａｒｄ他 （１９８８） Ｃｅｌｌ ５４： １０７３−１０８０）のホルモン結合ドメインに融合されている。融合蛋白質の発現は、当業者に知られた、又は本明細書に記載された植物中の発現に適した任意のプロモータによってコントロールされる。この発現カセットはまた、６ｘＧＡＬ４／最小プロモータに融合された本発明の核酸配列を含む植物に含まれる。したがって、融合蛋白質の組織特異性又は器官特異性が達成され、殺虫毒素の組織特異性又は器官特異性をもたらす。
【０２６０】
ｇ．  根特異的発現：
遺伝子発現の別のパターンが根の発現である。好適な根のプロモータは、Ｆｒａｍｏｎｄ （ＦＥＢＳ ２９０：１０３−１０６（１９９１））によって、また米国特許第５，４６６，７８５号明細書（これらの内容を本明細書中に援用する）に記載された、トウモロコシのメタロチオネイン状（ＭＴＬ）遺伝子のプロモータである。この「ＭＴＬ」プロモータは、選択された遺伝子を挿入し、次いでプロモータ−遺伝子−ターミネータのカセット全体を当該形質転換ベクターに転移させるために、ｐＣＧＮ１７６１ＥＮＸのような好適なベクターに転移させられる。
【０２６１】
ｈ．  傷害誘導プロモータ：
傷害誘導プロモータも遺伝子発現に適している。多数のこのようなプロモータが記載されており（例えばＸｕ他、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． ２２：５７３−５８８ （１９９３）， Ｌｏｇｅｍａｎｎ他、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ： １５１−１５８ （１９８９）， Ｒｏｈｒｍｅｉｅｒ ＆ Ｌｅｈｌｅ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ． ２２：７８３−７９２ （１９９３）， Ｆｉｒｅｋ他、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ． ２２：１２９−１４２ （１９９３）， Ｗａｒｎｅｒ他、Ｐｌａｎｔ Ｊ． ３：１９１−２０１ （１９９３））、これら全ては、本発明とともに使用するのに適している。Ｌｏｇｅｍａｎｎ他は、双子葉植物ジャガイモＷｕｎＩ遺伝子の５’上流配列について記載している。Ｘｕ他は、双子葉植物ジャガイモ（ｐｉｎ２）に由来する傷害誘導プロモータが単子葉植物コメにおいて活性であることを示す。さらに、Ｒｏｈｒｍｅｉｅｒ ＆ Ｌｅｈｌｅが記載するトウモロコシＷｉｐＩのｃＤＮＡのクローニングは、傷害誘導され、標準的な技術を用いて同系プロモータを分離するのに用いることができる。同様に、Ｆｉｒｅｋ他及びＷａｒｎｅｒ他は、単子葉植物Ａｓｐａｒａｇｕｓ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓに由来する傷害誘導遺伝子について記載している。この遺伝子は、局所的な傷害部位及び病原体侵入部位において発現させられる。当業者に良く知られたクローニング技術を用いて、これらのプロモータは好適なベクターに転移させ、本発明に関する遺伝子に融合し、植物傷害部位においてこれらの遺伝子を発現させるのに使用することができる。
【０２６２】
ｉ．  髄優先発現：
国際公開第９３／０７２７８号パンフレット（この内容を本明細書中に援用する）に記載された、トウモロコシｔｒｐＡ遺伝子の分離は、髄細胞に優先的に発現させられる。転写開始から−１７２６ｂｐまで拡張する遺伝子配列及びプロモータが提示されている。標準的な分子生物学的技術を用いて、このプロモータ又はプロモータ部分は、ｐＣＧＮ１７６１のようなベクターに転移させることができる。このベクターにおいて、このプロモータは３５Ｓプロモータの代わりとなり、髄が優先されるように、外来遺伝子の発現を推進するのに使用することができる。事実上、髄優先プロモータを含有するフラグメント又はこれらのフラグメントの部分は、いかなるベクターにも転移させることができ、また、形質導入植物における有用性に関して変更を加えることができる。
【０２６３】
ｊ．  葉特異的発現：
ホスホエノールカルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）をコード化するトウモロコシ遺伝子が、Ｈｕｄｓｐｅｔｈ ＆ Ｇｒｕｌａ （Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ Ｂｉｏｌ １２： ５７９−５８９ （１９８９））によって記載されている。標準的な分子生物学技術を用いて、この遺伝子のプロモータを使用することにより、形質導入植物中における任意の遺伝子の葉特異的な発現を推進することができる。
【０２６４】
ｋ．  花粉特異的発現：
国際公開第９３／０７２７８号パンフレットには、花粉細胞中に発現させられるトウモロコシ・カルシウム依存蛋白質キナーゼ（ＣＤＲＫ）遺伝子の分離が記載されている。この遺伝子配列及びプロモータは転写開始から１４００ｂｐまで拡張する。標準的な分子生物学的技術を用いて、このプロモータ又はプロモータ部分が、ｐＣＧＮ１７６１のようなベクターに転移させることができ、このベクターにおいて、このプロモータは３５Ｓプロモータの代わりとなり、本発明の核酸配列の花粉特異的な発現を推進するのに使用することができる。
【０２６５】
２．  転写ターミネータ
発現カセットにおいて使用するために、種々の転写ターミネータが利用可能である。これらのターミネータは、形質導入遺伝子を超えた転写の終結、及び正確なｍＲＮＡポリアデニル化を担う。適切な転写ターミネータは、植物中で機能することで知られているターミネータであり、ＣａＭＶ３５Ｓターミネータ、ｔｍｌターミネータ、ノパリンシンターゼ・ターミネータ及びえんどう豆ｒｂｃＳ  Ｅ９ターミネータを含む。これらのターミネータは、単子葉植物及び双子葉植物の両方に使用することができる。加えて、遺伝子の天然転写ターミネータが使用されてよい。
【０２６６】
３．  発現の向上又は調節のための配列
多数の配列が、転写ユニット内部からの遺伝子発現を向上させることがわかっている。これらの配列は、形質導入植物における遺伝子発現を増強するために、本発明の遺伝子との関連において使用することができる。
種々のイントロン配列が、具体的には単子葉植物細胞中での発現を増強することが判っている。例えば、トウモロコシＡｄｈＩ遺伝子のイントロンは、トウモロコシ細胞中に導入されると、その同系プロモータ作用下で野生型遺伝子の発現を有意に増強することが判っている。イントロン１は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を有する融合構造において特に効果的な、増強された発現をもたらすことが判った（Ｃａｌｌｉｓ他、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ． １：１１８３−１２００ （１９８７））。同じ実験システムにおいて、トウモロコシＢｒｏｎｚｅ１遺伝子に由来するイントロンは、発現を増強する上で同様の効果を有した。イントロン配列は、植物形質転換ベクター中に、典型的には非翻訳リーダ内で日常的に組込まれている。
【０２６７】
ウィルスに由来する多数の非翻訳リーダ配列も、発現を向上させることで知られており、これらの配列は双子葉植物細胞において特に効果的である。具体的には、タバコモザイクウィルス（ＴＭＶ、「Ｗ−配列」）、トウモロコシ・クロロティック斑ウィルス（Ｍａｉｚｅ Ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ Ｍｏｔｔｌｅ Ｖｉｒｕｓ， ＭＣＭＶ）及びアルファルファ・モザイクウィルス（ＡＭＶ）に由来するリーダ配列が、発現を向上させる上で効果的であることが判っている（例えばＧａｌｌｉｅ他、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５： ８６９３−８７１１ （１９８７）； Ｓｋｕｚｅｓｋｉ他、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １５： ６５−７９ （１９９０））。当業者に知られている他のリーダ配列の一例としては、ピコルナウィルス・リーダ、例えばＥＭＣＶリーダ（脳心筋炎５’非コーディング領域）（Ｅｌｒｏｙ−Ｓｔｅｉｎ， Ｏ．， Ｆｕｅｒｓｔ， Ｔ． Ｒ．及びＭｏｓｓ， Ｂ． ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６： ６１２６−６１３０ （１９８９））；ポティウィルス・リーダ、例えばＴＥＶリーダ（タバコエッチウィルス）（Ａｌｌｉｓｏｎ他、１９８６）；ＭＤＭＶリーダ｛トウモロコシ小型モザイクウィルス（Ｍａｉｚｅ Ｄｗａｒｆ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）｝（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １５４；９−２０）；ヒト免疫グロブリン重鎖結合蛋白質（ＢｉＰ）リーダ（Ｍａｃｅｊａｋ， Ｄ．Ｇ．及びＳａｒｎｏｗ， Ｐ．， Ｎａｔｕｒｅ ３５３：９０−９４ （１９９１）；アルファルファモザイク・ウィルスの外皮蛋白質ｍＲＮＡ（ＡＭＶ  ＲＮＡ４）に由来する未翻訳リーダ（Ｊｏｂｌｉｎｇ， Ｓ． Ａ．及びＧｅｈｒｋｅ， Ｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６２２−６２５ （１９８７）；タバコモザイクウィルス・リーダ（ＴＭＶ）（Ｇａｌｌｉｅ， Ｄ． Ｒ．他， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ＲＮＡ， 第２３７−２５６頁 （１９８９）；及びトウモロコシ・クロロティック斑ウィルス・リーダ（ＭＣＭＶ）（Ｌｏｍｍｅｌ， Ｓ．Ａ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８１：３８２−３８５ （１９９１））が挙げられる。さらに、Ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ他、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ８４：９６５−９６８ （１９８７）も参照されたい。
【０２６８】
上述の要素の１つ又は複数を、本発明の標的発現カセットの５’調節領域中に組込むことに加えて、標的発現カセットに対して固有の他の要素を組込むこともできる。このような要素の一例としては最小プロモータが挙げられる。最小プロモータによって、上流が活性化されずに基礎プロモータ要素が不活性となるか、又はほとんど不活性になるようになっている。このようなプロモータが植物中に有するバックグラウンド活性レベルは、トランスアクティベータが存在しないか、又はエンハンサー又は応答要素結合部位が存在しない場合には低い。植物中の標的遺伝子に特に有用な１つの最小プロモータは、Ｂｚ１最小プロモータである。このプロモータはトウモロコシのブロンズ（ｂｒｏｎｚｅ）１遺伝子から得られる。Ｂｚ１コアプロモータは、−５３〜−５８に位置するＮｈｅＩ部位で切断することにより、「ｍｙｃ」突然変異Ｂｚ１−ルシフェラーゼ構造ｐＢｚ１ＬｕｃＲ９８から得られる。Ｒｏｔｈ他、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：３１７ （１９９１）。導出されたＢｚ１コアプロモータ・フラグメントはこうして、−５３〜＋２２７で拡張し、５’未翻訳領域においてＢｚ１イントロンを含んでいる。また本発明にとって有用なのは、合成ＴＡＴＡ要素の使用により形成される最小プロモータである。ＴＡＴＡ要素は、ＲＮＡポリメラーゼ因子によるプロモータの認識を可能にし、活性化が存在しない状態で、遺伝子発現の基礎レベルを付与する（総体的には、Ｍｕｋｕｍｏｔｏ （１９９３） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２３： ９９５−１００３； Ｇｒｅｅｎ （２０００） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ２５：５９−６３参照）。
【０２６９】
４．細胞内における遺伝子産物のターゲティング
遺伝子産物をターゲティングするための種々のメカニズムが植物中に存在することで知られている。これらのメカニズムの機能をコントロールする配列は詳細に特徴づけされている。例えば、葉緑体に対する遺伝子産物のターゲティングは、種々の蛋白質のアミノ末端に見出される信号配列によってコントロールされる。このアミノ末端は、成熟蛋白質をもたらすために、葉緑体移入中に切断される（例えばＣｏｍａｉ他、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３： １５１０４−１５１０９ （１９８８））。これらの信号配列は異種遺伝子産物に融合し、これにより、葉緑体中に異種産物を移入することができる（ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｏｅｃｋ他、Ｎａｔｕｒｅ ３１３： ３５８−３６３ （１９８５））。適切な信号配列をコード化するＤＮＡを、ＲＵＢＩＳＣＯ蛋白質、ＣＡＢ蛋白質、ＥＰＳＰシンターゼ酵素、ＧＳ２蛋白質、及び、葉緑体に局在することで知られる多くの他の蛋白質をコード化するｃＤＮＡの５’端部から分離することができる。さらに、米国特許第５，６３９，９４９号明細書の例３７に記載の「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ」と題する項目を参照されたい。
【０２７０】
ミトコンドリアやペルオキシソームのような他の細胞小器官には、他の遺伝子産物が局在化している（例えばＵｎｇｅｒ他、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １３：４１１−４１８ （１９８９））。これらの産物をコード化するｃＤＮＡを操作することにより、これらの細胞小器官に対して異種遺伝子産物をターゲティングすることもできる。このような配列の例は、核によってコード化されたＡＴＰａｓｅ及びミトコンドリアの特異的アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ・イソ型である。標的細胞蛋白粒が、Ｒｏｇｅｒ他によって記載されている（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：６５１２−６５１６ （１９８５））。
【０２７１】
加えて、遺伝子産物を他の細胞区画に対してターゲティングさせる配列が特徴づけされている。アミノ末端配列は、ＥＲ、アポプラストに対するターゲティング、及びアリューロン細胞からの細胞外分泌を担う（Ｋｏｅｈｌｅｒ ＆ Ｈｏ， Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２： ７６９−７８３ （１９９０））。さらに、カルボキシ末端配列との関連におけるアミノ末端配列は、遺伝子産物の空胞ターゲティングを担う（Ｓｈｉｎｓｈｉ他、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃ． Ｂｉｏｌ． １４： ３５７−３６８ （１９９０））。
【０２７２】
上述の適切な標的配列を当該形質導入遺伝子配列と融合することにより、形質導入遺伝子産物を任意の細胞小器官又は細胞区画に導くことが可能である。葉緑体ターゲティングの場合、例えば、ＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子、ＣＡＢ遺伝子、ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子又はＧＳ２遺伝子に由来する葉緑体信号配列は、形質導入遺伝子のアミノ末端ＡＴＧにフレーム単位で融合される。選択された信号配列は既知の切断部位を含み、構成される融合体は、切断に必要とされる切断部位の後方のいかなるアミノ酸をも考慮に入れるべきである。いくつかの事例において、このような要件は、切断部位と形質導入遺伝子ＡＴＧとの間に少数のアミノ酸を付加するか、あるいは、形質導入遺伝子配列内のいくつかのアミノ酸を置き換えることにより満たすことができる。葉緑体移入のために構成された融合体は、葉緑体取込み有効性に関して試験することができる。この試験は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写された構造をｉｎ ｖｉｔｒｏで翻訳し、次いでｉｎ ｖｉｔｒｏで葉緑体を取込むことにより行われる。この葉緑体取込みは、Ｅｄｅｌｍａｎｎ他（編）「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ第１０８１〜１０９１頁（１９８２）においてＢａｒｔｌｅｔｔ他によって記載され、また、Ｗａｓｍａｎｎ他、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０５：４４６−４５３ （１９８６）において記載された技術を用いて行われる。これらの構成技術は当業者によく知られており、ミトコンドリア及びペルオキシソームにも同等に適用可能である。
【０２７３】
細胞ターゲティングのための上述のメカニズムは、これらの同系のプロモータとの関連において活用できるだけでなく、異種プロモータとの関連においても活用することができ、これにより、標的信号の起源となるプロモータのパターンとは異なるパターンを有するプロモータの転写調節下で、特異的な細胞標的目標がもたらされる。
【０２７４】
Ｃ．  植物形質転換ベクターの構成
植物形質転換に利用可能な多数の形質転換ベクターは、植物形質転換の当業者に知られており、本発明に関連する遺伝子は、任意のこのようなベクターとの関連において使用することができる。ベクターの選択は、好ましい形質転換技術及び形質転換の標的種に依存することになる。或る標的種の場合、種々異なる抗生物質選択マーカー又は除草剤選択マーカーが好ましい。形質転換において日常的に使用される選択マーカーは、カナマイシン及び関連抗生物質に対する耐性を付与するｎｐｔＩＩ遺伝子（Ｍｅｓｓｉｎｇ ＆ Ｖｉｅｒｒａ， Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８ （１９８２）； Ｂｅｖａｎ他、Ｎａｔｕｒｅ ３０４：１８４−１８７ （１９８３））と、除草剤ホスフィノトリシンに対する耐性を付与するｂａｒ遺伝子 （Ｗｈｉｔｅ他、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １８： １０６２ （１９９０）， Ｓｐｅｎｃｅｒ他、Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ ７９： ６２５−６３１ （１９９０））と、抗生物質ヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｐｈ遺伝子（Ｂｌｏｃｈｉｎｇｅｒ ＆ Ｄｉｇｇｅｌｍａｎｎ， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４： ２９２９−２９３１）と、メタトレキセートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Ｂｏｕｒｏｕｉｓ他、ＥＭＢＯ Ｊ． ２（７）： １０９９−１１０４ （１９８３））と、グリホセートに対する耐性を付与するＥＰＳＰＳ遺伝子（米国特許第４，９４０，９３５号明細書及び同第５，１８８，６４２号明細書）、及び、マンノースを代謝する能力を提供するマンノース−６−ホスフェートイソメラーゼ遺伝子（米国特許第５，７６７，３７８号明細書及び同第５，９９４，６２９号明細書）とを含む。
【０２７５】
１．  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの形質転換に適したベクター
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用した形質転換には、多くのベクターが利用可能である。これらのベクターは典型的には少なくとも１つのＴ−ＤＮＡ境界配列を担持し、ｐＢＩＮ１９のようなベクターを含む（Ｂｅｖａｎ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． （１９８４））。以下に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に適した２つの典型的なベクターの構成について説明する。
【０２７６】
ａ．  ｐＣＩＢ２００及びｐＣＩＢ２００１：
バイナリ・ベクターｐＣＩＢ２００及びｐＣＩＢ２００１は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍと共に使用するための組換えベクターを構成するのに用いられる。テトラサイクリン耐性遺伝子の切除を可能にするｐＴＪＦ７５のＮａｒＩ消化（Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ ＆ Ｈｅｌｉｎｓｋｉ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏ． １６４： ４４６−４５５ （１９８５））によって、次いでＮＰＴＩＩを担持するｐＵＣ４Ｋから得られるＡｃｃＩフラグメントの挿入（Ｍｅｓｓｉｎｇ ＆ Ｖｉｅｒｒａ， Ｇｅｎｅ １９：２５９−２６８ （１９８２）： Ｂｅｖａｎ他、Ｎａｔｕｒｅ ３０４： １８４−１８７ （１９８３）： ＭｃＢｒｉｄｅ他、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １４： ２６６−２７６ （１９９０））によって、ｐＴＪＳ７５ｋａｎが形成される。ＸｈｏＩリンカーは、左右のＴ−ＤＮＡ境界を含有するＰＣＩＢ７のＥｃｏＲＶフラグメントと、植物選択可能なｎｏｓ／ｎｐｔＩＩキメラ遺伝子と、ｐＵＣポリリンカーとに連結され（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ他、Ｇｅｎｅ ５３： １５３−１６１ （１９８７））、Ｘｈｏｌで消化されたフラグメントは、ＳａｌＩで消化されたｐＴＪＳ７５ｋａｎ中にクローニングされ、これにより、ｐＣＩＢ２００が生成される（さらに欧州特許第０３３２１０４号明細書の例１９参照）。ｐＣＩＢ２００は、以下の固有のポリリンカー制限部位、すなわち：ＥｃｏＲＩ， ＳｓｔＩ， ＫｐｎＩ， ＢｇｌＩＩ， ＸｂａＩ及びＳａｌＩを含有している。ｐＣＩＢ２００１は、付加的な制限部位のポリリンカー中に挿入することにより生成されたｐＣＩＢ２００の誘導体である。ｐＣＩＢ２００１のポリリンカー中の固有の制限部位は、ＥｃｏＲＩ， ＳｓｔＩ， ＫｐｎＩ， ＢｇｌＩＩ， ＸｂａＩ， ＳａｌＩ， ＭｌｕＩ， ＢｃｌＩ， ＡｖｒＩＩ， ＡｐａＩ， ＨｐａＩ及びＳｔｕＩである。ｐＣＩＢ２００１は、これらの固有の制限部位を含有することに加えて、さらに植物及び細菌性カナマイシンの選択作用と、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって媒介される形質転換のための左右のＴ−ＤＮＡ境界と、ＲＫ２によって誘導される、Ｅ． ｃｏｌｉとその他の宿主との間の可動化のためのｔｒｆＡ機能と、やはりＲＫ２から生じるＯｒｉＴ機能及びＯｒｉＶ機能とを有する。ｐＣＩＢ２００１のポリリンカーは、それ自体の調節信号を含有する植物発現カセットをクローニングするのに適している。
【０２７７】
ｂ．  ｐＣＩＢ１０及びそのヒグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ）選択誘導体：
バイナリ・ベクターｐＣＩＢ１０は、植物における選択のためにカナマイシン耐性をコード化する遺伝子と、左右のＴ−ＤＮＡ境界配列とを含有し、Ｅ． Ｃｏｌｉ及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの双方において複製を可能にする広い宿主範囲のプラスミドｐＲＫ２５２から得られる配列を内部に組込んでいる。その構造は、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ他 （Ｇｅｎｅ ５３： １５３−１６１ （１９８７））によって説明されている。Ｇｒｉｔｚ他 （Ｇｅｎｅ ２５：１７９−１８８ （１９８３））によって記載されたヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼに対応する遺伝子を内部に組み込む、ｐＣＩＢ１０の種々の誘導体が構成される。これらの誘導体はヒグロマイシンにおいてのみ（ｐＣＩＢ７４３）、又はヒグロマイシン及びカナマイシンにおいて（ｐＣＩＢ７１５、ｐＣＩＢ７１７）、形質導入植物細胞を選択することを可能にする。
【０２７８】
２．  非Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に適したベクター
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを使用しない形質転換は、選択された形質転換ベクターにおけるＴ−ＤＮＡ配列の必要性を回避し、したがって、これらの配列を欠いたベクターを、Ｔ−ＤＮＡ配列を含有する上述のようなベクターに加えて活用することができる。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに依存しない形質転換技術は、粒子ボンバード、プロトプラスト取込み（例えばＰＥＧ及びエレクトロポレーション）及びマイクロインジェクションを介した形質転換を含む。ベクターは概ね、形質転換される種の好ましい選択に応じて選ばれる。以下に、非Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に適した典型的なベクターの構造について説明する。
【０２７９】
ａ．  ｐＣＩＢ３０６４：
ｐＣＩＢ３０６４は、ｐＵＣにより誘導されたベクターであり、除草剤バスタ（又はホスフィノトリシン）による選択と組み合わせた直接的な遺伝子導入に適している。プラスミドｐＣＩＢ２４６は、Ｅ． Ｃｏｌｉ ＧＵＳ遺伝子に操作上融合されたＣａＭＶ３５Ｓプロモータ及びＣａＭＶ３５Ｓ転写ターミネータを含み、国際公開第９３／０７２７８号パンフレットに記載されている。このベクターの３５Ｓプロモータは、開始部位の２つのＡＴＧ配列５’を含有している。これらの部位は、ＡＴＧを除去して制限部位ＳｓｉＩ及びＰｖｕｌＩを発生させるように、標準ＰＣＲ技術を用いて突然変異させられる。新しい制限部位は、固有のＳａｌＩ部位から９６ｂｐ及び３７ｂｐだけ離れており、実際の開始部位から１０１ｂｐ及び４２ｂｐだけ離れている。その結果得られたｐＣＩＢ２４６の誘導体をｐＣＩＢ３０２５と呼ぶ。次いでＧＵＳ遺伝子は、ＳａｌＩ及びＳａｃＩでの消化によって、ｐＣＩＢ３０２５から切除され、その末端が平滑化されて再連結されることにより、プラスミドｐＣＩＢ３０６０が発生する。プラスミドｐＪＩＴ８２は、Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｃｅｎｔｒｅ， Ｎｏｒｗｉｃｈから得られ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓに由来するｂａｒ遺伝子を含有する４００ｂｐのＳｍａＩフラグメントが切除され、このフラグメントはｐＣＩＢ３０６０のＨｐａＩ部位中に挿入される（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ他、ＥＭＢＯ Ｊ ６： ２５１９−２５２３ （１９８７））。こうして発生させられたｐＣＩＢ３０６４は、殺虫剤選択に際してＣａＭＶ３５Ｓプロモータ及びターミネータの制御下にあるｂａｒ遺伝子と、（Ｅ． Ｃｏｌｉにおける選択のための）アンピシリン耐性のための遺伝子と、固有の部位ＳｐｈＩ， ＰｓｔＩ， ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩを有するポリリンカーとを含む。このベクターは、それ自体の調節信号を含有する植物発現カセットをクローニングするのに適している。
【０２８０】
ｂ．  ｐＳＯＧ１９及びｐＳＯＧ３５：
ｐＳＯＧ３５は、メトトレキセートに対する耐性を付与する選択可能なマーカーとして、Ｅ． Ｃｏｌｉ遺伝子のジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＦＲ）を活用する形質転換ベクターである。３５Ｓプロモータ（−８００ｂｐ）と、トウモロコシＡｄｈ１遺伝子に由来するイントロン６（−５５０ｂｐ）と、ｐＳＯＧ１０に由来する１８ｂｐのＧＵＳ未翻訳リーダ配列とを増幅するために、ＰＣＲが使用される。ＰＣＲによって、Ｅ． Ｃｏｌｉのジヒドロ葉酸レダクターゼＩＩ型遺伝子をコード化する２５０−ｂｐフラグメントも増幅され、これら２つのＰＣＲフラグメントは、ｐＢ１２２１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から得られるＳａｃＩ−ＰｓｔＩフラグメントと共に組み立てられる。このフラグメントはｐＵＣ１９ベクター・バックボーンと、ノパリンシンターゼ・ターミネータとを含む。これらのフラグメントのアセンブリは、ｐＳＯＧ１９を発生させる。このｐＳＯＧ１９は、イントロン６配列と融合された３５Ｓプロモータと、ＧＵＳリーダと、ＤＨＦＲ遺伝子と、ノパリンシンターゼ・ターミネータとを含有する。ｐＳＯＧ１９中のＧＵＳリーダの代わりに、トウモロコシ・クロロティック斑ウィルス（ＭＣＭＶ）を使用すると、ベクターｐＳＯＧ３５が発生する。ｐＳＯＧ１９及びｐＳＯＧ３５は、アンピシリン耐性のためのｐＵＣ遺伝子を担持し、外来物質のクローニングに利用可能なＨｉｎｄＩＩＩ， ＳｐｈＩ， ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩ部位を有する。
【０２８１】
３．  葉緑体形質転換に適したベクター
植物色素体において本発明のヌクレオチド配列を発現させるために、色素体形質転換ベクターｐＰＨ１４３（国際公開第９７／３２０１１号パンフレット、例３６）が使用される。ヌクレオチド配列は、ｐＰＨ１４３中に導入され、これによりＰＲＯＴＯＸコーディング配列の代わりとなる。次いでこのベクターは、色素体形質転換及びスペクチノマイシン耐性のための形質転換細胞の選択に使用される。あるいはヌクレオチド配列は、これがａａｄＨ遺伝子の代わりとなるように、ｐＰＨ１４３中に挿入される。この場合、形質転換細胞は、ＰＲＯＴＯＸ阻害剤に対ｓる耐性のために選択される。
【０２８２】
Ｄ．  形質転換
本発明の核酸配列が発現系にクローニングされると、この核酸は植物細胞中に形質転換される。受容体及び本発明の標的発現カセットは、当業者に認識された多くの方法で植物細胞中に導入することができる。植物の再生法も当業者によく知られている。例えばＴｉプラスミド・ベクターが、外来ＤＮＡのデリバリー、並びに直接的なＤＮＡ取込み、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション及びマイクロプロジェクタイルのために活用されている。加えて、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に由来する細菌を、植物細胞を形質転換するために活用することができる。以下に、双子葉植物及び単子葉植物双方の代表的な形質転換技術、並びに、代表的な色素体形質転換技術について説明する。
【０２８３】
１．  双子葉植物の形質転換
双子葉植物の形質転換技術は当業者に良く知られており、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに基づく技術と、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを必要としない技術とを含む。非Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ技術は、プロトプラスト又は細胞によって直接的に外生的遺伝子物質を取込むことに関与する。このことは、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションを媒介とする取込み、粒子ボンバードを媒介とするデリバリー、又はマイクロインジェクションによって達成することができる。これらの技術の例は、Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ他、ＥＭＢＯ Ｊ ３： ２７１７−２７２２ （１９８４）， Ｐｏｔｒｙｋｕｓ他、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． １９９： １６９−１７７ （１９８５）， Ｒｅｉｃｈ 他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４： １００１−１００４ （１９８６）及びＫｌｅｉｎ他， Ｎａｔｕｒｅ ３２７： ７０−７３ （１９８７）に記載されている。それぞれの事例において、形質転換された細胞は、当業者に知られた標準的な技術を用いて全植物に対して再生される。
【０２８４】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを媒介とする形質転換は、双子葉植物の形質転換のための好ましい技術である。なぜならば、この技術は高い形質転換効率と、種々多様な種との幅広い有用性とを有するからである。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換は典型的には、当該異種ＤＮＡ（例えばｐＣＩＢ２００又はｐＣＩＢ２００１）を担持するバイナリ・ベクターを、適切なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌種に転移させることに関与する。この菌種は、宿主Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌種によって担持されるｖｉｒ遺伝子の相補体に関しては、共生Ｔｉプラスミド又は染色体に依存してよい｛例えばｐＣＩＢ２００又はｐＣＩＢ２００１に関しては菌種ＣＩＢ５４２（Ｕｋｎｅｓ他、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ５： １５９−１６９ （１９９３））｝。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍへの組換えバイナリ・ベクターの転移は、組換えバイナリ・ベクターを担持するＥ． ｃｏｌｉ、ヘルパーＥ． Ｃｏｌｉ菌種を使用した三親交配手順によって達成される。このヘルパーＥ． Ｃｏｌｉ菌種は、ｐＲＫ２０１３のようなプラスミドを担持し、組換えバイナリ・ベクターを標的Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌種に移動することができる。あるいは、組換えバイナリベクターは、ＤＮＡ形質転換によって、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに転移させることもできる（Ｈｏｅｆｇｅｎ ＆ Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６： ９８７７ （１９８８））。
【０２８５】
組換えＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる標的植物種の形質転換は通常、植物からの外植片とＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍとを同時培養することに関与し、当業者によく知られたプロトコルに従う。形質転換される組織は、バイナリ・プラスミドＴ−ＤＮＡ境界間に存在する抗生物質又は除草剤に対する耐性を担持する選択可能な培地上に再生させられる。
【０２８６】
遺伝子で植物細胞を形質転換する別の手段は、植物組織及び細胞における不活性又は生物学的に活性の粒子を推進することに関与する。この技術は、全てＳａｎｆｏｒｄ他に与えられた、米国特許第４，９４５，０５０号明細書、同第５，０３６，００６号明細書及び同第５，１００，７９２号明細書に開示されている。一般的に、このような手順は、細胞の外面を貫通して、細胞内部での組込みを可能にするのに効果的な条件下で、不活性又は生物学的に活性の粒子を細胞において推進することに関与する。不活性粒子が活用される場合、所望の遺伝子を含有するベクターを粒子にコーティングすることにより、細胞中にベクターを導入することができる。あるいは、粒子の伴流によってベクターが細胞中に運ばれるように、標的細胞をベクターにより取り囲むこともできる。生物学的に活性の粒子（例えば乾燥酵母細胞、乾燥細菌又はバクテリオファージ、これらはそれぞれ、導入しようとするＤＮＡを含有する）を、植物細胞組織中に推進することもできる。
【０２８７】
２．  単子葉植物の形質転換
ほとんどの単子葉植物種の形質転換も、現在日常的になってきている。好ましい技術は、ＰＥＧ又はエレクトロポレーション技術、及びカルス組織内への粒子ボンバードを用いた、プロトプラスト内への直接的な遺伝子導入を含む。形質転換は、単独のＤＮＡ種又は複数のＤＮＡ種（すなわち共形質転換）で行うことができ、これらの技術は両方とも、本発明と共に用いるのに適している。共形質転換の利点は、完全なベクター構造を回避し、当該遺伝子及び選択可能なマーカーの座が同一連鎖群に属さない遺伝子導入植物を発生させることである。これにより、望ましいとみなされる場合には、後続の発生において選択可能なマーカーを除去することができる。しかし、共形質転換を利用すると、別個のＤＮＡ種が遺伝子内に組み込まれる頻度が１００％に満たないという欠点がある（Ｓｃｈｏｃｋｅｒ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４： １０９３−１０９６ （１９８６））。
【０２８８】
欧州特許出願第０２９２４３５号明細書、同第０３９２２２５号明細書及び国際公開第９３／０７２７８号パンフレットには、トウモロコシの優良近交系からカルス及びプロトプラストを調製し、ＰＥＧ又はエレクトロポレーションを用いてプロトプラストを形質転換し、形質転換されたプロトプラストからトウモロコシ植物を再生させることが記載されている。Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ他（Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２： ６０３−６１８ （１９９０））及びＦｒｏｍｍ他（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ８３３−８３９ （１９９０））は、粒子ボンバードを用いた、Ａ１８８から誘導されたトウモロコシ系列の形質転換技術を公開している。さらに、国際公開第９３／０７２７８号パンフレット及びＫｏｚｉｅｌ他（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１： １９４−２００ （１９９３））は、粒子ボンバードによるトウモロコシの優良近交系の形質転換技術を記載している。この技術は、受粉から１４〜１５日後のトウモロコシの穂から切除された１．５〜２．５ｍｍ長の未成熟のトウモロコシ胚と、ＰＤＳ−１０００Ｈｅ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓボンバード装置とを利用する。
【０２８９】
プロトプラスト又は粒子ボンバードを利用する直接的な遺伝子導入技術により、コメの形質転換を行うこともできる。プロトプラストを媒介とする形質転換が、Ｊａｐｏｎｉｃａ型及びＩｎｄｉｃａ型に関して記載されている（Ｚｈａｎｇ他、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ７： ３７９−３８４ （１９８８）； Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ他、Ｎａｔｕｒｅ ３３８： ２７４−２７７ （１９８９）； Ｄａｔｔａ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ７３６−７４０ （１９９０））。双方の型も、粒子ボンバードを用いて形質転換可能である（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９： ９５７−９６２ （１９９１））。さらに、国際公開第９３／２１３３５号パンフレットには、エレクトロポレーションによるコメの形質転換技術が記載されている。
【０２９０】
欧州特許出願第０３３２５８１号明細書には、Ｐｏｏｉｄｅａｅプロトプラストの発生、形質転換及び再生のための技術が記載されている。これらの技術は、Ｄａｃｔｙｌｉｓ及び小麦の形質転換を可能にする。さらに、長期再生可能なＣ型カルスの細胞中への粒子ボンバードを用いた小麦形質転換が、Ｖａｓｉｌ他（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０： ６６７−６７４ （１９９２））によって記載されており、また、未成熟胚及び未成熟胚から誘導されたカルスの粒子ボンバードを用いた小麦形質転換が、Ｖａｓｉｌ他（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１： １５５３−１５５８ （１９９３））によって記載されている。しかし小麦形質転換の好ましい技術は、未成熟熟胚の粒子ボンバードにより小麦を形質転換することに関与し、遺伝子送達前に高サッカロース又は高マルトースのステップを含む。ボンバードに先立って、任意の数の胚（０．７５〜１ｍｍ長）が、体細胞胚を誘導するために、３％サッカロース（Ｍｕｒａｓｈｉｇａ ＆ Ｓｋｏｏｇ， Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ Ｐｌａｎｔａｒｕｍ １５：４７３−４９７ （１９６２））、及び３ｍｇ／Ｌの２，４−Ｄを含有するＭＳ培地上に平板培養される。この体細胞胚の誘導は、暗所で放置された状態で進行する。ボンバードの選択日に、胚が誘導培地から取り出され、浸透圧処理培地（Ｏｓｍｏｔｉｃｕｍ、すなわち、所望の濃度、典型的には１５％で付加されたサッカロース又はマルトースを含有する誘導培地）上に、平板培養される。胚は放置されて２〜３時間原形質分離され、次いでボンバードされる。標的プレート１つ当たり２０個の胚が典型的であるが、このことは重要ではない。標準的な手順を用いてマイクロメータ・サイズの金粒子上に、適切な遺伝子を担持するプラスミド（例えばｐＣＩＢ３０６４又はｐＳＧ３５）が沈殿させられる。胚の各プレートは、標準的な８０メッシュ・スクリーンを使用して〜１０００ｐｓｉ破裂圧力を用いて、Ｄｕｐｏｎｔ Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ（登録商標）ヘリウム装置によって撃たれる。ボンバード後、（なおも浸透圧処理培地上で）約２４時間にわたって回収するために、胚は暗所に戻される。２４時間後、胚は浸透培地から取り出され、誘導培地上に戻され、この誘導培地において、胚は約１ヶ月間留まった後、再生させられる。ほぼ１ヵ月後、胚形成カルスが発生した胚外植体は、再生培地（ＭＳ＋１ｍｇ／リットルＮＡＡ、５ｍｇ／リットルＧＡ）に移される。この再生培地は、適切な選択剤（ｐＣＩＢ３０６４の場合、１０ｍｇ／Ｌバスタ、及びＰＳＯＧ３５の場合、２ｍｇ／Ｌメトトレキセート）を含有する。ほぼ１ヵ月後、発生した生育物は、半分の強度のＭＳと、２％サッカロースと、及び同一濃度の選択剤とを含有する「ＧＡ７」として知られるより大きな滅菌容器に移される。
【０２９１】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを使用した単子葉植物の形質転換もすでに記載されている。国際公開第９４／００９７７号パンフレット及び米国特許第５，５９１，６１６号明細書を参照されたい。これらの内容を本明細書中に援用する。さらに、Ｎｅｇｒｏｔｔ他、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９： ７９８−８０３ （２０００）も参照されたい。この内容を本明細書中に援用する。
【０２９２】
３．  色素体の形質転換
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ 栽培種「Ｘａｎｔｈｉ ｎｃ」の種子が、１プレート当たり７個ずつ、１インチの円形アレイを成してＴ寒天培地上に発芽させられ、播種から１２〜１４日後、１μｍのタングステン粒子（Ｍ１０， Ｂｉｏｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ ＣＡ）でボンバードされる。タングステン粒子には、主として既に文献に記載されているように、プラスミドｐＰＨ１４３及びｐＰＨ１４５に由来するＤＮＡがコーティングされている（Ｓｖａｂ， Ｚ．及びＭａｌｉｇａ， Ｐ． （１９９３） ＰＮＡＳ９０， ９１３−９１７）。葉が切除された後の２日間、ボンバードされた苗がＴ培地上でインキュベートされ、ＲＭＯＰ培地のプレート上に、軸から離れた側を上にして明光（３５０〜５００μｍｏｌフォトン／ｍ２／ｓ）中に置かれる（Ｓｖａｂ， Ｚ．， Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ， Ｐ及びＭａｌｉｇａ， Ｐ． （１９９０） ＰＮＡＳ ８７， ８５２６−８５３０）。この培地は、５００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンジヒドロクロリド（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を含有する。ボンバードから３〜８週間後に、漂白された葉の下側に現れた耐性生育物が、同じ選択的培地上にサブクローニングされ、放置されてカルスを形成し、二次的な生育物が分離され、サブクローニングされる。独立したサブクローン中の形質転換色素体ゲノムのコピー（同種原形質）の完全な隔離が、サザンブロッティング（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、（１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）の標準的な技術によって評価される。ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで消化された細胞ＤＮＡ全体（Ｍｅｔｔｌｅｒ， Ｉ． Ｊ． （１９８７） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ５， ３４６−３４９）が、１％トリス−ボレート（ＴＢＥ）アガロースゲル上で分離され、ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移され、ランダムプライム処理された３２Ｐ標識付きＤＮＡ配列でプローブされる。これらのＤＮＡ配列は、ｒｐｓ７／１２色素体標的配列の一部を含有するｐＣ８由来の０．７ｋｂのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡに対応する。同種原形質の生育物が、スペクチノマイシン含有ＭＳ／ＩＢＡ培地上に無菌状態で植え付けられ（ＭｃＢｒｉｄｅ， Ｋ． Ｅ．他（１９９４）ＰＮＡＳ ９１， ７３０１−７３０５）、温室に移される。
【０２９３】
ＩＶ．  育種及び種子生産
Ａ．  育種
本発明の核酸配列で形質転換することにより得られる植物は、単子葉植物及び双子葉植物の種を含め、種々様々な植物種のうちのいずれであってもよい。しかし、本発明の方法において使用される植物は、好ましくは上記の作物学上重要な標的農作物のリストから選択される。生産及び品質にとって重要なその他の特性と組み合わされた本発明の遺伝子の発現は、育種を通して植物系列に組込むことができる。育種手段及び育種技術は当業者に知られている。例えば、Ｗｅｌｓｈ Ｊ．Ｒ．， Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ （１９８１）； Ｃｒｏｐ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｗｏｏｄ Ｄ．Ｒ．（編） Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ａｇｒｏｎｏｍｙ Ｍａｄｉｓｏｎ， Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ （１９８３）； Ｍａｙｏ Ｏ．， Ｔｈｅ Ｔｈｅｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， 第２版、Ｃｌａｒｅｎｄｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ （１９８７）； Ｓｉｎｇｈ， Ｄ．Ｐ．， Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｆｏｒ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｅｓｔｓ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， ＮＹ （１９８６）；及びＷｒｉｃｋｅ及びＷｅｂｅｒ， Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ， Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ ａｎｄ Ｃｏ．， Ｂｅｒｌｉｎ （１９８６）を参照されたい。
【０２９４】
上述の遺伝子導入種子及び遺伝子導入植物の内部に工学的に作り出された遺伝子特性は、有性生殖又は栄養成長によって広められ、こうして子孫植物において維持し、伝播することができる。一般に前記維持及び伝播は、特定の目的、例えば耕作、播種又は収穫に見合うように開発された既知の農法を利用する。水耕栽培又は温室技術のような特定のプロセスを適用することもできる。成長した農作物は、昆虫又は感染により攻撃や損傷を受けやすく、さらに、雑草植物による競合に対して脆弱なので、雑草、植物病害、昆虫、線虫及びその他の不都合な条件をコントロールして、これにより収穫高を改善する手段が講じられる。これらの手段は機械的手段、例えば土壌の耕作、又は、雑草及び感染された植物の除去、並びに、農芸化学物質、例えば除草剤、防カビ剤、ガメトシド、線虫駆除剤、成長調節剤、熟成剤及び殺虫剤の適用を含む。
【０２９５】
本発明による遺伝子導入植物及び遺伝子導入種子の有利な遺伝子特性はさらに、改善された特性、例えば害虫、除草剤又はストレスの耐性、改善された栄養価、増大した収穫高、又は、倒伏や飛散による損失を少なくする改善された構造を伴う植物の開発を目標とした、植物育種において用いることもできる。種々の育種ステップは、明確な人間の介入によって特徴付けられる。このような介入は、例えば、交配されるべき系列の選択、親系列の受粉の指向、又は適切な子孫植物の選択である。所望の特性に応じて、種々異なる育種手段が採用される。該当する技術が当業者に良く知られており、例えば雑種形成、同系交配、戻し交配、多系列交配、品種混合、種間雑種形成、異数性技術などを含む。雑種形成技術は、機械的、化学的又は生化学的手段により、雄性又は雌性の不稔株をもたらすための植物の不稔化をも含む。異なる系列の花粉との雄性不稔株の他家受粉は、雄性不稔であるがしかし雌性稔性である植物が、両方の親系列の特性を均一に得ることを保証する。このように、本発明による遺伝子導入種子及び遺伝子導入植物を、改善された植物系列の育種に用いることができる。これらの植物系列は、例えば、コンベンショナルな方法、例えば除草剤処理又は殺虫剤処理の有効性を高めるか、又は、これらの植物系列の遺伝子特性が変更されているため、前記方法を省くことを可能にする。あるいは、改善されたストレス耐性を有する新しい農作物を得ることができ、これらの農作物は、遺伝的「装備」が最適化されているため、同等の不都合な発育条件を許容できなかった産物よりも良好な品質を有する収穫産物をもたらす。
【０２９６】
Ｂ．  種子生産
種子生産において、種子の発芽及び均一性が本質的な産物特性である。農作物を他の農作物及び雑草の種子とは無関係にしておき、種子によってもたらされる病害をコントロールし、良好な発芽を伴う種子を生産するのは難しいので、きわめて広範囲で明確な種子生産手法が種子生産者、すなわち純粋種子の育成、状態調節及び市場取引の分野において経験を積んだ生産者によって開発されている。したがって、農業従事者が自分の農作物から収穫された種子を使用する代わりに、特定の品質基準に見合う認定種子を購入することが一般的である。種子として使用されるべき繁殖材料は、習慣的に保護剤コーティングで処理される。この保護剤コーティングは、除草剤、殺虫剤、防カビ剤、殺菌剤、線虫駆除剤、軟体動物駆除剤、又はこれらの混合物を含む。習慣的に使用される保護剤コーティングは、キャプタン、カルボキシン、サイラム（ＴＭＴＤ（登録商標））、メタラキシル（Ａｐｒｏｎ（登録商標））、及びピリミホス−メチル（Ａｃｔｅｌｌｉｃ（登録商標））のような化合物を含む。所望の場合には、これらの化合物は、配合の当業者において習慣的に採用されるさらなるキャリヤ、界面活性剤、塗布促進アジュバントと一緒に配合され、これにより、細菌、カビ又は害虫により引き起こされる損傷に対する保護を可能にする。保護剤コーティングは、液状配合物に繁殖材料を含浸することにより、又は、複合的な湿潤又は乾燥配合物をコーティングすることにより塗布することができる。芽又は果実に向けられた処理のような、他の塗布法も可能である。
【０２９７】
例
本発明をさらに下記の詳細な例に基づいて説明する。これらの例は説明のために提供したにすぎず、特に断らない限り、本発明を限定しようとするものではない。ここで使用される標準的な組換えＤＮＡ技術及び分子クローニング技術は、当業者にはよく知られており、Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． （１９９４）； Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ （２００１）；及びＴ．Ｊ． Ｓｉｌｈａｖｅｙ， Ｍ．Ｌ． Ｂｅｒｍａｎ及びＬ．Ｗ． Ｅｎｑｕｉｓｔ， Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ（１９８４）によって記載されている。
【０２９８】
例１：昆虫エクジソン受容体のクローニング
Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａエクジソン受容体（ＥｃＲ）の発表された配列に基づいて、ＰＣＲプライマーを設計し、これにより遺伝子を二等分にクローニングする。ＬｉＣｌ／フェノール法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ 第１巻，ユニット４．３， １９８７， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ発行）を用いて、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａの前蛹期幼虫からＲＮＡを調製し、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてｃＤＮＡを調製するために、１μｇの全ＲＮＡを使用する。上述のプライマとのＰＣＲ反応にｃＤＮＡを使用することにより、遺伝子の５’半部及び３’半部に対応して２つのＰＣＲ産物を発生させる。これらの産物をｐＧＥＭ−ＴＡベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にサブクローニングし、配列決定する。これら２つのフラグメントを各フラグメント内部の固有のＮｄｅＩで接合し、ｐＢＳ−ＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に連結することにより、ｐＢＳＦＬＭａと名付けられた全長Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａＥｃＲクローンを形成する。
【０２９９】
付加的な鱗翅目エクジソン受容体ドメインをクローニングするために、昆虫エクジソン受容体相互間の相同性に基づいて、アライン・シーケンサプログラムを用いてプライマを設計する。好ましく使用されるプライマは、各遺伝子の５’半部に関しては、５’−ｇｔｇａａｇｔｇａａａｇｃｃｔａｃｇｔｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５）（ＡＴＧの上流）及び５’−ｔｇａｃｇｃｇｃｔｃｔｔｃｇａｃａｔｇａｇａｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６）（ＡＴＧ以前の出発点）、縮重プライマ５’−ｇｇｙｔｇｙｃｒｔａｂｃｃｂｔｃｃｔｇｇｔａ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）（ｙ＝ｃ／ｔ， ｒ＝ｇ／ａ及びｂ＝ｇ／ｔ／ｃ）、及び、各遺伝子の３’半部に関しては、プライマ５’−ｃｃｂｓｃｓａｔｈａｔｇｃａｒｔｇｔｇａｈｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８）及び５’−ｃｃａｃｒｔｃｃｃａｇａｔｃｔｃｃｔｃｇａ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）（ｂ＝ｇ／ｔ／ｃ， ｈ＝ａ／ｔ／ｃ， ｒ＝ａ／ｇ）である。ブラック・カットワーム（ＢＣＷ， Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アワノメイガ（ＥＣＢ，Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）及びフォール・アーミーワーム（ＦＡＷ，Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）の前蛹期幼虫から全ＲＮＡを調製し、上述の逆転写酵素及びＰＣＲ反応に使用する。産物をｐＧＥＭ−ＴＡ中にクローニングし、配列決定する。エクジソン受容体からは下記の部分クローンが得られる：ＥＣＢの５’末端（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３及び４）及び３’末端（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５及び６）（集合的にＡ／Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥドメインを含む）；ＦＡＷ３’の末端（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７及び８）（Ｄドメインの一部と全Ｅドメインとを含む）；及びＢＣＷの３’末端（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９及び１０）（Ｄドメインの一部と全Ｅドメインとを含む）。
【０３００】
発表された遺伝子バンク配列ＡＦ０４９１３６（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１及び１２）及びＳ６０７３９（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３及び１４）をそれぞれ用いて、Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ及びＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのエクジソン受容体をクローニングすることにより、ＰＣＲプライマを設計する。（Ｃ，Ｄ及びＥドメインを含む）部分ｃＤＮＡを分離し、ｐＧＥＭ−ＴＡ中でクローニングし、配列決定により確認する。
【０３０１】
例２：エクジソン受容体（ＥｃＲ）とのＶＰ１６トランスアクティベーション・ドメイン融合体の構成及び昆虫細胞発現ベクター中へのクローニング
ＰＣＲプライマ５’−ａａｇｃｔｔｇｃｃｃｃｃｃｃｇａｃｃｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）（ドメインの５’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位を置く）及び５’−ｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃｔａｃｃｃａｃｃｇｔａｃｔ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）（ドメインの３’末端にインフレーム・ストップコドンを置き、続いてＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ部位を置く）を用いて、プラスミド３５Ｓ／ＵＳＰ−ＶＰ１６（米国特許第３，８８０，３３３号明細書）から、単純ヘルペスＶＰ１６トランスアクティベーション・ドメインを含有するフラグメントがクローニングされる。
【０３０２】
オリゴヌクレオチド：５’−ｇｇａｔｃｃｔａａａｇｃｔｔｃｇｔｃｇｔｃｇａｃａｃｔｔｃｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）（Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ ＥｃＲの場合）， ５’−ｇｇａｔｃｃｔａａａｇｃｔｔｃｃｃｇｃｇｇｇａｔｔｃｃａｃｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）（ブラック・カットワームＥｃＲの場合）， ５’−ｇｇａｔｃｃｔａａａｇｃｔｔｃａｃｇｔｃｃｃａｇａｔｃｔｃｃｔｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）（フォール・アーミーワームＥｃＲの場合）， ５’−ｇｇａｔｃｃｔａａａｇｃｔｔｃａｃｇｔｃｃｃａｇａｔｃｔｃｃｔｃｃａｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）（アワノメイガＥｃＲの場合）， ５’−ｇｇａｔｃｃｔａａａｇｃｔｔｔｇｇｇａｔｃａｃａｔｃｃｃａｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）（Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ ＥｃＲの場合）， ５’−ｇｇａｔｃｃｔａａａｇｃｔｔｔｇｇｃｇｇｇａｔｇｇｃａｔｇａ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７）（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＥｃＲの場合）及び５’−ｇｇａｔｃｃｔａａａｇｃｔｔｇａｃａｔｃｇｃｃｇａｃａｔｃｃｃａｇａｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８）（Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓ ＥｃＲの場合）をＰＣＲ反応において使用して、クローニングされたそれぞれの鱗翅目受容体のＥドメイン（リガンド結合ドメイン）の３’末端に、ＨｉｎｄＩＩＩ部位と、これに続いてインフレーム・ストップコドン及びＢａｍＨＩ部位を置く。
【０３０３】
ＥｃＲ−ＶＰ１６キメラの場合、それぞれのＥｃＲクローンのＨｉｎｄＩＩＩ部位３’と、ＶＰ１６の５’末端に工学的に作り出されたＨｉｎｄＩＩＩ部位を使用して、クローニングされたエクジソン受容体全てのＥドメインの３’末端に、フレーム単位でＶＰ１６ドメインを融合する。
【０３０４】
ｐＢＳＦＬＭａ（例１）から得られるＭａｎｄｕｃａのＥｃＲクローンの場合、オリゴヌクレオチド５’−ｃｔｇｃａｇｇａｔｃｃａｇａｃｇｃｃｇｃｔｇｇｔｃａａａｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９）をＰＣＲ反応で使用して、ＥｃＲのＡＴＧに隣接するように、ＢａｍＨＩ部位を工学的に作り出す。３５Ｓ／ＥｃＲから得られたＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＥｃＲクローン（米国特許第５，８８０，３３３号明細書）は、オリゴヌクレオチド５’−ｇｇｃａｇｇａｔｃｃａｔｇａａｇｃｇｇｃｇｃｔｇｇｔｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０）を用いてＡＴＧのすぐ上流にＢａｍＨＩ部位を配置し、オリゴヌクレオチド５’−ｃｇｇａａｇａｔｃｔｃｇｔｇｃａｔｇｇｃｃａｇｃｇｔｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１）をＰＣＲ反応で使用して、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのエクジソン受容体のリガンド結合（Ｅ）ドメインの３’末端にＢｇｌＩＩ部位を配置することにより修飾される。
【０３０５】
発現構造のための開始ベクターとして、プラスミドｐＰａｃＵ（Ｃｏｕｒｅｙ ＡＪ及びＴｊｉａｎ Ｒ （１９８８） Ｃｅｌｌ ５５，８８７−８９８）を使用する。ＭａｎｄｕｃａのＥｃＲコーディング領域の側面に位置するＢａｍＨＩ部位を使用して、ＭａｎｄｕｃａのＥｃＲクローンをｐＰａｃＵ中に連結する。このような発現カセットをＭａＦＬと呼ぶ。ＢａｍＨＩ部位及びＢｇｌＩＩ部位を使用して、ｐＰａｃＵのＢａｍＨＩ部位中にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＥｃＲを連結する。このような発現カセットをＤｒｏｓＦＬと呼ぶ。
【０３０６】
ＶＰ１６に融合されるドメインＣ，Ｄ及びＥだけを含有するＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＥｃＲ−ＶＰ１６融合体を形成するために、Ｃドメインのすぐ上流のＢａｍＨＩ部位及びＥドメインのすぐ上流のＫｐｎＩ部位を使用して、プラスミド３５Ｓ／ＥｃＲ２２７−８２５−Ｃ１（米国特許第５，８８０，３３３号明細書の例５）からフラグメントを取り出し、これをＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｅドメイン−ＶＰ１６融合体の前述のＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメントと融合する。この融合体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５）を、ＢａｍＨＩ部位を使用してｐＰａｃＵ中に連結することにより、ＤＤＶと呼ばれる構造を形成する。
【０３０７】
ドメインＣ，Ｄ及びＥを含有する先端切除されたＭａｎｄｕｃａ ＥｃＲをＶＰ１６に融合する。縮重プライマ５’−ｇｇａｔｃｃａｔｇｇｇｙｃｇａｇａａｇａａｔｔｒｔｃａｃｃｒ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）及び５’−ｃｃａｃｒｔｃｃｃａｇａｔｃｔｃｃｔｃｇａ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３）を使用して、Ｃドメインの丁度５’位に、ＢａｍＨＩ部位及びインフレームＡＴＧを工学的に作り出す。次いでこのフラグメントを、Ｎｄｅ部位を使用して、Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲの３’末端に接合する。Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲは、上述の３’末端に、工学的に作り出されたＨｉｎｄＩＩＩ部位を有している。次いで、再構成されたＭａｎｄｕｃａのＣ，Ｄ，Ｅドメインを、ＨｉｎｄＩＩＩ部位を用いてＶＰ１６にフレーム単位で融合し、融合体（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３）全体をｐＰａｃＵ中にＢａｍＨＩ部位で連結し、これにより、ＭＭＶと呼ばれる構造を形成する。同様に、縮重プライマ５’−ｇｇａｔｃｃａｔｇｇｇｙｃｇａｇａａｇａａｔｔｒｔｃａｃｃｒ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）及び５’−ｇｇｙｔｇｙｔｃｒｔａｂｃｃｂｔｃｃｔｇｇｔａ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）を使用して、アワノメイガＥｃＲのＣドメインの丁度５’位に、ＢａｍＨＩ部位及びインフレームＡＴＧを工学的に作り出す。さらに、プライマ５’−ｇｇａｔｃｃａｔｇｇｇｃｃｇｇｇａｇｇａｃｃｔｃｔｃｇｃｃｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６）及び５’−ｇｇａｔｃｃｔａａａｇｃｔｔｔｇｇｇａｔｃａｃａｔｃｃｃａｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７）を使用して、Ｌｏｃｕｓｔａ ＥｃＲのＣドメインの５’末端にも、ＢａｍＨＩ部位を工学的に作り出す。
【０３０８】
例３：リポータ・プラスミドの構成
合成ＴＡＴＡボックス配列オリゴヌクレオチド対、５’−ａｇｃｔｔｇａｇｇｇｔａｔａａｔｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８）及び３’−ａｃｔｃｃｃａｔａｔｔａｃｔｃｇａ−５’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９）をベクターｐＧＫ３−ベーシック（Ｐｒｏｍｅｇａ）のＨｉｎｄＩＩＩ部位中に連結することにより、最小プロモータ・ベクターを作成し、これによりＨｉｎｄＩＩＩ部位は、挿入されたオリゴヌクレオチドの５’で再形成され、オリゴヌクレオチドと下流ルシフェラーゼ遺伝子との間で破壊される。このベクターをＴＡＴＡ５と呼ぶ。
【０３０９】
ｈｓｐ２７遺伝子（Ｋｏｅｌｌｅ他、Ｃｅｌｌ ６７ （１）： ５９−７７ （１９９１））に由来する結合部位を、オリゴヌクレオチド対、５’−ｇａｔｃｃｇａｇａｃａａｇｇｇｔｔｃａａｔｇｃａｃｔｔｇｔｃｃａａｔｇａ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０）及び３’−ｇｃｔｃｇｔｔｃｃｃａａｇｔｔａｃｇｔｇａａｃａｇｇｔｔａｃｔｃｔａｇ−５’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１）を用いて作成する。この部位をマルチマー化し、ベクターＴＡＴＡ−５のＢｉｌＩＩ部位中に連結する。１つの分離体、ｐＣＧＳ１５４は、挿入された領域内で下記の配列を含有し、逆の配向の２対の部位を有している。１つの部位は、共通配列から生じる単独塩基の削除部を有する。ｐＣＧＳ１５４における挿入領域の配列を下に示す：
【０３１０】
2004533212.tif 000003
【０３１１】
例４：Ｍａｎｄｕｃａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＥｃＲ活性の比較
リポータ・プラスミドの受容体による転写活性を測定するために、ｉｎ ｖｉｖｏ細胞に基づくアッセイを企画する。燐酸カルシウム沈殿手順（Ｄｉ Ｎｏｃｅｒａ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ （１９８３） ＰＮＡＳ ８０， ７０９５−７０９８）を用いて、Ｓ２Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１９６３）にルシフェラーゼ・リポータと受容体発現プラスミドとを一時的にトランスフェクトする。シュナイダーのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ培地１６６．６μＬ中に２ｘ１０５の密度で、Ｓ２細胞を９６ウェル・フォーマットで平板培養する。この培地には、抗生物質及び１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＧＩＢＯ−ＢＲＬ）が補足されている。次の日に、３〜６ｎｇのｐＣＧＳ１５４リポータプラスミド及び３〜６ｎｇのＥｃＲ受容体プラスミドを含有する３３．４μＬの燐酸カルシウム沈殿物を、サケ精子ＤＮＡと共に、１ウェル当たり合計４００ｎｇのＤＮＡに加える。細胞にＤＮＡを添加してから１６〜２４時間後に化学的リガンドを添加する。次いで、化学物質添加から２４時間後に、ルシフェラーゼ・アッセイのための手順に従って、細胞ペレットを１００μＬの細胞培養溶解試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で遠心分離し、再懸濁することにより、収穫して抽出する。分析的ルミネッセンス・モデル２００１ルミノメータによる化学ルミネッセンス（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性を量化する。
【０３１２】
Ｓ２細胞はＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＥｃＲとＵＳＰとを含有する。内政的なＵＳＰは、ＥｃＲに対するヘテロ二量体化の相手として使用することができ、又は、外生的ＵＳＰ発現プラスミドをアッセイに添加することができる。
【０３１３】
Ｍａｎｄｕｃａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＥｃＲの活性を比較するために、上述の手順を用いて、Ｓ２細胞には、リポータ・プラスミドｐＣＧＳ１５４と、全長Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＥｃＲ、ＤＤＶ、全長Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲ又はＭＭＶのいずれかとをトランスフェクトする。テブフェノザイドを０．２μＭ及び２μＭで、化学的リガンドとして使用する。ルシフェラーゼ・アッセイを上述のように実施する。その結果の全てを、化学物質を含有しないＰＣＧＳ１５４リポータの光単位値に対する活性の比として基準化する。
【０３１４】
【表２】
2004533212.tif 000004
【０３１５】
これらの結果は、Ｍａｎｄｕｃａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのリポータが、テブフェノザイドに対して異なる応答を有することを示している。Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＥｃＲよりも低いレベルの化合物（０．２μＭ）でリポータ構造を活性化することができる。さらに、ＶＰ１６に融合された先端切除Ｍａｎｄｕｃａ受容体（ＭＭＶ）は、全長Ｍａｎｄｕｃａ受容体及びＶＰ１６に融合された同様の先端切除ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＥｃＲ（ＤＤＶ）よりも高い活性を示す。
【０３１６】
例５：キメラＥｃＲ発現ベクターの構成
Ｅドメインの丁度５’位にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ及び鱗翅目のＥｃＲ中の保存ＫｐｎＩ部位が存在することにより、ドメインは、互いに異なる受容体間で交換することが可能になる。Ｌｏｃｕｓｔａ ｍｉｇｒａｔｏｒｉａ及びＣｈｉｒｏｎｏｍｕｓ ｔｅｎｔａｎｓのＥｃＲの場合、Ｃｈｉｒｏｎｏｍｕｓに関しては、オリゴヌクレオチド５’−ｇｇａｔｃｃａｔｇａａａｃｔｔｇａｔｇａｔｇｇｃａａｔａｔｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４３）、５’−ｔｇｇｔａｃｃａｇａｔａａｇｃｔｔａｔａａａｔａａｃｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４）、５’−ｔｇｇｔａｃｃａａｇａｃｇｇｔｔａｔｇａａｃａｇｃｃｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５）、５’−ｇｇａｔｃｃｔａａａｇｃｔｔｇａｃａｔｃｇｃｃｇａｃａｔｃｃｃａｇａｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６）を、また、Ｌｏｃｕｓｔａに関しては、５’−ｇｇａｔｃｃａｔｇｇｇｃｃｇｇｇａｇｇａｃｃｔｃｔｃｇｃｃｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７）、５’−ｇｇａｔｃｃａｃａｃａａｇｃｃｔａｔｇｔａｔａａｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）、５’−ｔｇｔｇｇｔａｃｃａｇａａｔｇａａｔａｔｇａｇｔｃｔｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９）及び５’−ｇｇａｔｃｃｔａａａｇｃｔｔｔｇｇｇａｔｃａｃａｔｃｃｃａｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０）をＰＣＲ反応で使用することにより、同等の位置にＫｐｎＩ部位を形成する。
ｐＰａｃＵ中に発現構造を形成させ、この発現構造は、１つの種のＥｃＲのＣドメイン及びＤドメインを、異なる種のＥｃＲに由来するＥドメイン−ＶＰ１６融合体に融合したものを含有する。これらの構造は、ＥｃＲクローンに由来するＢａｍＨＩ−ＫｐｎＩフラグメント（Ｃ及びＤドメイン）と、ＥｃＲ−ＶＰ１６融合体に由来するＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（Ｅドメイン−ＶＰ１６）とを使用して発生させる。
【０３１７】
【表３】
2004533212.tif 000005
【０３１８】
【表４】
2004533212.tif 000006
【０３１９】
例６：Ｍａｎｄｕｃａ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａのＣ＋Ｄ（ヒンジ＋ＤＮＡ結合）ドメインを有するＥｃＲキメラの活性の比較
例３に記載したようにＳ２細胞を一時的にトランスフェクト処理することにより、ＥｃＲ−ＶＰ１６キメラの活性を比較する。細胞に０．２μＭ濃度でテブフェノザイドを添加する。その結果をフォールド活性として、すなわち、化学物質が添加された構造の活性の、化学物質を含有しない構造の活性と比較した場合の比として表現する。全ての結果を、受容体が付加されていないＰＣＧＳ１５４リポータのルシフェラーゼ活性に対して基準化する。
【０３２０】
【表５】
2004533212.tif 000007
【０３２１】
【表６】
2004533212.tif 000008
【０３２２】
これらの結果は、Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲのＥドメインが、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ又はＬｏｃｕｓｔａのＥドメインと比較した場合、テブフェノザイドに応答して、より高い活性を付与することを示している。ＭａｎｄｕｃａのＥｃＲのＣドメイン及びＤドメインが付加された場合、ＭａｎｄｕｃａのＥドメインの活性はさらに増大する。
【０３２３】
例７：種々異なるＥ（リガンド結合）ドメインを有するＥｃＲキメラの活性の比較
例３に記載したようにＳ２細胞を一時的にトランスフェクト処理することにより、ＥｃＲ−ＶＰ１６キメラの活性を比較する。細胞に０．２μＭ濃度でテブフェノザイドを添加する。その結果を、化学物質を含有しない構造の活性と比較した場合の、化学物質を含有する構造のフォールド活性として表現する。全ての結果を、受容体が付加されていないＰＣＧＳ１５４リポータのルシフェラーゼ活性に対して基準化する。
【０３２４】
【表７】
2004533212.tif 000009
【０３２５】
これらの結果は、鱗翅目ＥｃＲのＥドメインを含有する構造が、他の昆虫のＥｃＲ、例えばＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ及びＬｏｃｕｓｔａに由来するＥドメインと比較して、テブフェノザイドに対するより高い応答を有することを示す。
【０３２６】
例８：鱗翅目Ｃ、Ｄ及びＥドメインを有するＥｃＲキメラの比較
例３に記載したようにＳ２細胞を一時的にトランスフェクト処理することにより、ＥｃＲ−ＶＰ１６キメラの活性を比較する。細胞に０．２μＭ濃度でテブフェノザイドを添加する。その結果を、化学物質を含有しない構造の活性と比較した場合の、化学物質を含有する構造のフォールド活性として表現する。全ての結果を、受容体が付加されていないＰＣＧＳ１５４リポータのルシフェラーゼ活性に対して基準化する。
【０３２７】
【表８】
2004533212.tif 000010
【０３２８】
これらの結果は、鱗翅目昆虫に由来するＣドメイン及びＤドメインを付加すると、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａに由来するＣドメイン及びＤドメインを含有するキメラと比較して、テブフェノザイドに対する受容体の応答が増大することを示す。
【０３２９】
例９：キメラＥｃＲの活性増大
例３に記載したようにＳ２細胞を一時的にトランスフェクト処理することにより、ＥｃＲ−ＶＰ１６キメラの活性を比較する。細胞に０．２μＭ濃度でテブフェノザイドを添加する。その結果を、化学物質を含有しない構造の活性と比較した場合の、化学物質を含有する構造のフォールド活性として表現する。全ての結果を、受容体が付加されていないＰＣＧＳ１５４リポータのルシフェラーゼ活性に対して基準化する。
【０３３０】
【表９】
2004533212.tif 000011
【０３３１】
この例は、ＥドメインのようなＭａｎｄｕｃａ ＥｃＲの特異的ドメインを他のＥｃＲと融合して、テブフェノザイドに対する応答の増大を伴うキメラＥｃＲを形成できることを示す。
【０３３２】
例１０：蛍ルシフェラーゼ・リポータ遺伝子を含み、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに対応する応答要素を有する、単子葉植物に発現可能な標的発現カセットの構成
ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに対応する応答要素を有し、蛍ルシフェラーゼ・リポータ遺伝子を含む、単子葉植物に発現可能なリポータ構造を下記のように構成する。ＨｉｎｄＩＩＩを使用してｐＧＬ３−ベーシック（Ｐｒｏｍｅｇａ）から、ルシフェラーゼを取り出し、次いで、ＫｌｅｎｏｗのＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑化末端を形成するように５’オーバハングを埋め、次いでこのルシフェラーゼをＸｂａＩで切断する。ルシフェラーゼ・フラグメントをＸｂａＩ部位及びＳｍａＩ部位でｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサブクローニングする。この構造をｐＢＳ−ｌｕｃと呼ぶ。ＮＯＳ３’転写終結領域をｐＢＳ−ｌｕｃ中にクローニングし、その結果生じる構造をｐＢＳ−ｌｕｃＮＯＳと呼ぶ。
【０３３３】
最小ブロンズ１（ｂｚ１）プロモータ（Ｒｏｔｈ他、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ３：３１７ （１９９１））をｐＢＳ−ｌｕｃＮＯＳ中に２つの部分でクローニングする。すなわち一方の部分はＴＡＴＡ領域であり、他方の部分はイントロンである。２組のアニールされたオリゴ、すなわち、ｂｚｔａｔａ３（５’−ｃｇａａｇｃｃｃｇｃａｃｇｃａｔｃｇｃａｔｔｃｇｃａｔｃｇｃａｔｃｇｃａｇｇｔｃｇｃａｔｃｃｇａｃｇｃｔａｇａａｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３））＋ｂｚｔａｔａ４（５’−ａａｔｃｔｔｃｔａｇｃｇｔｃｇｇａｔｇｃｇａｃｃｔｇｃｇａｔｇｃｇａｔｇｃｇａａｔｇｃｇａｔｇｃｇｔｇｃｇｇｇｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４））にアニールされたｂｚｔａｔａ１（５’−ａｇｃｔｔｃｇｃａｃｇｃｇｔｇｇｔｃｇｃｇｃｇｇａａｔａａａｇｃｇｇａｃａｃｇｔｔｇｃｇｃｃｃｃｃａｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１））＋ｂｚｔａｔａ２（５’−ｔｔｃｇｃｔｇｇｇｇｇｃｇｃａａｃｇｔｇｔｃｃｇｃｔｔｔａｔｔｃｃｇｃｇｃｇａｃｃａｃｇｃｇｔｇｃｇａ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２））を一緒に連結することにより、ｂｚ１プロモータのＴＡＴＡ領域をクローニングする。アニール・セットｂｚｔａｔａ １／２はアニール・セットｂｚｔａｔａ３／４に対して相補的なオーバハングを含有する。最終ＤＮＡフラグメントはＨｉｎｄＩＩＩ（５’）及びＥｃｏＲＩ（３’）のアダプタ・オーバハングを含有する。この領域をｐＢＳ−ｌｕｃＮＯＳに連結して、ｐｂｚ１ＴＡＴＡＬＵＣを形成する。
【０３３４】
ｂｚ１イントロン領域をＰＣＲによってクローニングし、プライマであるｂｚｉｎｔｒｏｎ１（５’−ｃｃｇａａｔｔｃｃｇｇｇａｇｇａｃｇｔｔｇｇｃｇａｃｃａｇｇｇｔ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５））及びｂｚｉｎｔｒｏｎ２（５’−ｃｃｇａａｔｔｃｇｇｔｇｇｇａｇａｔｃａｇｔａｇｃｃｃｇｔｃｃａ −３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６））を使用して、５’末端及び３’末端の両方にＥｃｏＲＩ制限部位を有するように設計する。
【０３３５】
アニールされた２つのｂｚ１  ＴＡＴＡ  ＤＮＡフラグメントを、ｂｚ１イントロンと混合する。ｂｚ１イントロンはＰＣＲにより得られ、ＥｃｏＲＩで消化される。３つのＤＮＡフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに連結する。その結果生じる、ｂｚ１  ＴＡＴＡとイントロンとの両方を含有するプラスミドをｐＢＳ−ＴＡＴＡ／イントロンと呼ぶ。ＨｉｎｄＩＩＩでの消化及び部分的なＥｃｏＲＩ消化により、ｐＢＳ−ＴＡＴＡ／イントロンからｂｚ１  ＴＡＴＡ／イントロン・フラグメントを得る。このフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位でｐＢＳ−ｌｕｓＮＯＳに連結し、これにより、ｐＢＳ−ｂｚ１ＴＡＴＡ／イントロンＬＵＣを形成する。
【０３３６】
リポータを作成する最終ステップは、ｐＢＳ−ｂｚ１ＴＡＴＡＬＵＣ及びｐＢＳ−ｂｚ１ＴＡＴＡ／イントロンＬＵＣ中に１０個のＧＡＬ４のＤＮＡ結合部位を挿入することである。１０個のＧＡＬ４要素（Ｇｕｙｅｒ他（１９９８）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４９：６３３−９）を、ｐＢＳ−ｂｚ１ＴＡＴＡＬＵＣ及びｐＢＳ−ｂｚ１ＴＡＴＡ／イントロンＬＵＣ中に、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ部位で挿入する。その結果得られるベクターをｐＣＧＳ２２８及びｐＣＧＳ２０６と呼ぶ。
【０３３７】
蛍ルシフェラーゼ・リポータ遺伝子を含有し、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに対応する応答要素を有する４つの付加的なリポータ構造を形成する。これらの構造は、プロモータのブロンズ１のＴＡＴＡ領域の下流で、ｂｚ１イントロンの代わりに挿入されたイントロンにおいて異なっている。４つの付加的なイントロン、すなわち、Ａｄｈイントロン第１番（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６）、Ｓｈイントロン第１番（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７）、トウモロコシ・ユビキチン・イントロン第１番（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）及びライス・アクチン・イントロン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）が使用される。
【０３３８】
トウモロコシｕｂｉイントロン第１番（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８）の場合、ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマＵｂｉ５ｐｓｔ（５’−ｇｇｃｃｔｇｃａｇｇｇｃｇｔｔｃｃｇｇｔｃｃａｔｇｇｔｔａｇｇｇｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０））及びｕｂｉ３ｐｓｔ（５’−ｔｃｃｃｔｇｃａｇａａｇｔａａｃａｃｃａａａｃａａｃａ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１））を使用して、ＮＯＳ（ノパリンシンターゼ）ターミネータを有するトウモロコシ・ユビキチン・プロモータを含有する発現ベクターから、イントロンを増幅する。増幅されたイントロンをＰｓｔＩで消化し、ＰｓｔＩで消化されたｐＣＧＳ２２８に連結する。
【０３３９】
両端に平滑末端を含有するＡｄｈイントロン１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６）を、ＥｃｏＲＩで消化されたｐＣＧＳ２２８に連結し、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化する。結果として生じるベクターをｐＣＧＳ２１６と呼ぶ。
【０３４０】
両端に平滑末端を含有するＳｈイントロン１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７）を、ＥｃｏＲＩで消化されたｐＣＧＳ２２８に連結し、Ｋｌｅｎｏｗ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化する。結果として生じるベクターをｐＣＧＳ２１７と呼ぶ。
ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びＰＣＲプライマａｃｔ５−ｅｃｏｒｉ（５’−ｇｇｃｇａａｔｔｃｃｃｇｇｔａａｃｃａｃｃｃｃｇｃｃｃｃｔｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２））及びａｃｔ３−ｅｃｏｒｉ （５’−ｃｇｃｇａａｔｔｃｔｃｃｃｔｇｃａｇｃｔｔｃｔａｃｃｔａｃａａａａ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３））を使用して、ＮＯＳ（ノパリンシンターゼ）ターミネータを有するトウモロコシ・アクチン・プロモータを含有する発現ベクターから、コメ・アクチン・イントロン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９）を増幅する。増幅されたイントロンをＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩで消化されたｐＣＧＳ２２８に連結する。結果として生じるプラスミドをｐＣＧＳ２１８と呼ぶ。
【０３４１】
例１１：イーストＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、Ｍａｎｄｕｃａエクジソン受容体のヒンジ（Ｄ）ドメイン及びリガンド結合（Ｅ）ドメインと、単純ヘルペスウィルスの蛋白質１６（ＶＰ１６）転写活性化ドメインとを含有する、トウモロコシ・ユビキチン・プロモータにより推進される発現ベクターＧ（Ｍ）ＭＶの構成
イーストＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、Ｍａｎｄｕｃａのヒンジ（Ｄ）ドメイン及びリガンド結合（Ｅ）ドメインと、単純ヘルペスウィルスＶＰ１６転写活性化ドメインとから成るキメラ蛋白質Ｇ（Ｍ）ＭＶを推進するトウモロコシ・ユビキチン・プロモータを含有する発現ベクターを、下記のように構成する。下記のプライマ及びプラスミドｐＢＤ−ＧＡＬ４ Ｃａｍ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を鋳型として使用して、ＰＣＲによって、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを増幅する：ＧＡＬ４ＢＤフォワード（５’−ａｇｇａｔｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇａａｇｃｔａｃｔｇｔｃｔｔｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７））及びＧＡＬ４ＢＤリバース（５’−ａａｃｇｃｇｔｃｇａｔａｃａｇｔｃａａｃｔｇｔｃｔｔｔｇａｃｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８））。結果として生じたＰＣＲフラグメントを、ＴＡクローニングによりｐＴ−Ａｄｖ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）中にクローニングし、ｐＴ−Ａｄｖ−ｇａｌ４ｂｄと呼ぶ。
【０３４２】
Ｃ末端にＶＰ１６の活性化ドメインを有するＭａｎｄｕｃａ ＥｃＲのヒンジドメイン及びリガンド結合ドメイン（Ｄドメイン及びＥドメイン）を、下記のプライマ及びＭＭＶ（例２）を鋳型として使用して、ＰＣＲによって増幅する：ＭＶフォワード（５’−ａａｃｇｃｇｔａｔｇａｇｇｃｃｃｇａｇｔｇｃｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９））及びＭＶリバース（５’−ａａａｔｃｃｇｇａａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｇａａｔ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０））。結果として生じたＰＣＲフラグメントを、ＴＡクローニングによりｐＴ−Ａｄｖ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）中にクローニングし、ｐＴ−Ａｄｖ−ＭＶと呼ぶ。
【０３４３】
ＧＡＬのＤＮＡ結合ドメインを、ＭｌｕＩ及びＢａｍＨＩで消化することにより、ｐＴ−Ａｄｖ−ｇａ１４ｂｄから分離する。ＶＰ１６活性化ドメインを有するＭａｎｄｕｃａのＤドメイン及びＥドメインを、ＳａｃＩＩで消化し、次いでＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、次いでＭｌｕＩで消化することにより、ｐＴ−Ａｄｖ−ＭＶから分離する。ＮＯＳ（ノパリンシンターゼ）ターミネータを有するトウモロコシ・ユビキチン・プロモータを含有する発現ベクターを、ｓａｃＩで消化し、次いでＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化し、次いでＢａｍＨＩで消化する。ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン、ＶＰ１６活性化ドメインを有するＭａｎｄｕｃａのＤ及びＥドメイン、及びベクターフラグメントを一緒に連結し、その結果生じる、Ｇ（Ｍ）ＭＶをコード化するプラスミドをｐＣＧＳ２０３と呼ぶ。キメラ受容体Ｇ（Ｍ）ＭＶをコード化するＤＮＡ配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４のヌクレオチド２００７〜３６６８として示し、コード化された受容体のアミノ酸配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５として示す。
【０３４４】
例１２：ＭａｎｄｕｃａのＥｃＲポリペプチドをコード化するベクターで、トウモロコシ懸濁培養細胞を形質転換することにより、化学的リガンドの存在においてリポータ・ポリペプチドの発現をコントロールする
トウモロコシＢＭＳ（ブラック・メキシカン・スウィート）培養細胞に、高速マイクロプロジェクタイル・ボンバードによって、ｐＣＧＳ２０６及びｐＣＧＳ２０８をトランスフェクトする。さらに、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の発現を推進するトウモロコシ・ユビキチン・プロモータを含有する発現プラスミドを、トランスフェクション物に付加し、試料間の変動に対して基準化を行うための内部対照としてこれを使用する。
【０３４５】
主に米国特許第５，８８０，３３３号明細書に記載されているように、トランスフェクション物を処理し、細胞溶解物を作成する。テブフェノザイド（Ｔｅｂ）を最終濃度１０μＭで細胞に添加する。ルシフェラーゼ・アッセイ及びＧＵＳアッセイの双方を、それぞれＰｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｋｉｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ ＃Ｅ１５００）及びＧＵＳ−Ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔ （Ｔｒｏｐｉｘ）を用いたアッセイ毎に、２０μＬの細胞溶解物を使用して実施する。Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ ２０／２０ルミノメータを使用して、相対光単位を測定する。（ＧＵＳリポータ対照を用いて）基準化された値を、以下の表に挙げる。
【０３４６】
【表１０】
2004533212.tif 000012
【０３４７】
「Ｇ（Ｍ）ＭＶ」Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲ（ｕｂｉ／ＧＡＬ−ＭＶ）はテブフェノザイドと共に、平均３６倍の誘導を達成することができる。
テブフェノザイドに加えて、メトキシテブフェノザイド（「ＭｅｔｈｏｘｙＴｅｂ」）も、トウモロコシのＢＭＳ細胞中で遺伝子発現を誘導することができる。ｐＣＧＳ２０６及びｐＣＧＳ２０８を上述のようにトランスフェクト処理し、メトキシテブフェノザイドをテブフェノザイドの代わりに２５μＭ及び１０μＭで添加する。
【０３４８】
【表１１】
2004533212.tif 000013
【０３４９】
このように、メトキシテブフェノザイドは、Ｍａｎｄｕｃａ「Ｇ（Ｍ）ＭＶ」ＥｃＲ（ｕｂｉ／ＧＡＬ−ＭＶ）を平均２５倍で活性化する。
【０３５０】
ｐＣＧＳ２０３におけるテブフェノザイド誘導の発現レベル全体は、培養されたトウモロコシ細胞中のリポータのプロモータ／イントロンに依存する。トウモロコシＢＭＳ細胞を上述のようにトランスフェクト処理し、検定する。
【０３５１】
【表１２】
2004533212.tif 000014
【０３５２】
【表１３】
2004533212.tif 000015
【０３５３】
種々のイントロンを添加すると、テブフェノザイド誘導の活性化レベル全体が変化する。Ａｄｈイントロン１を添加すると、発現レベルは８７．９ＲＬＵまで上昇するのに対し、Ｓｈイントロン１を添加した場合の発現レベルは中度の１８．７である。したがって、種々異なるイントロンを使用することにより、スイッチ系から産出される所望の形質の発現レベルが調節される。
【０３５４】
例１３：双子葉植物における外来遺伝子発現のためのベクターの構成
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓユビキチン・プロモータ及び５’ＵＴＲと、多クローニング部位（ＭＣＳ）と、ノパリンシンターゼ３’転写終結領域（ＮＯＳ）とを含有する双子葉植物発現ベクターを発生させ、これをｐＣＧＳ４１７と呼ぶ。Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓユビキチン・プロモータと５’未翻訳領域（ＵＴＲ）とＮＯＳターミネータとを含有するカセットを、ＸｈｏＩ及びＮｏｔＩを用いて、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中にクローニングする。ＭＣＳは、下記の二本鎖オリゴヌクレオチド中に連結することにより、ユビキチン５’ＵＴＲ及びＮＯＳターミネータとの間のＢａｍＨＩ部位で形成する。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、制限酵素ＳｍａＩ， ＳａｌＩ， ＥｃｏＲＩ， ＢｓｐＥＩ， ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩに対応する認識配列を有し、
【０３５５】
2004533212.tif 000016
【０３５６】
である。
【０３５７】
例１４：ＧＡＬ４に由来するＤＮＡ結合ドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲに由来するリガンド結合ドメインとをコード化する、双子葉植物に発現可能な受容体発現カセットの構成
ＧＡＬ４に由来するＤＮＡ結合ドメイン、Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲに由来するリガンド結合（Ｅ）ドメイン、及びＶＰ１６に由来するウィルス・トランスアクティベーション・ドメインとを含有するキメラ受容体融合物ＧＡＬ４−ＭＶを、単子葉植物発現ベクターｐＣＧＳ２０８から取り出し、ＢａｍＨＩ制限部位を使用してｐＣＧＳ４１７中にクローニングする。この構造をｐＣＧＳ４３１と呼ぶ。ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで制限することにより、キメラ蛋白質からＶＰ１６活性化ドメインを取り出す。その消化物により発生した５’オーバハングを、ＤＮＡポリメラーゼＩの大型（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメントを使用して埋め、ベクターを自己連結により再環状化させる。結果として生じるベクターは、埋め込まれたＨｉｎｄＩＩＩ配列のすぐ下流側に、インフレーム転写終結コドンを含有する。ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン−ＭａｎｄｕｃａのＥｃＲのＥドメイン−ＶＰ１６融合蛋白質をコード化するこのようなベクターをｐＣＧＳ４３２と呼ぶ。
【０３５８】
例１５：リポータ構造及び受容体構造でタバコ細胞を形質転換することにより、化学的に誘導可能な植物細胞系を生産する
ＧＡＬ−ＭＶ発現ベクターｐＣＧＳ４３２と、ＧＡＬ４ｘ１０−ルシフェラーゼ・ベクターｐＣＧＳ２０６とを、高速マイクロプロジェクタイル・ボンバードにより、ＢＹ２懸濁細胞｛Ｎｉｃｏｔａｎｉａ ｔｏｂａｃｕｍ Ｌ． 栽培種ブライト・イェロー２（Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２）｝中に同時に送達する。試料間のトランスフェクション効率に関する内部対照として、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）ベクターを含む。トランスフェクト処理した細胞を、ＢＹ２液状培地中の適切な化学的リガンド（テブフェノザイド（Ｔｅｂ），ＲＨ５８８９）の存在及び不存在において、一晩インキュベートする。インキュベーション後、細胞を収穫し、機械的破壊によって溶解させる。細胞破片を、１０分間４℃で、２０，８００ｇで遠心分離によって取り出す。細胞溶解物を、Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ ２０／２０ルミノメータを使用してＰｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｋｉｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ ＃Ｅ１５００）によって、ルシフェラーゼ発現レベルに関して検定する。ＧＵＳ−Ｌｉｇｈｔ キット（Ｔｒｏｐｉｘ）を使用して、ＧＵＳ発現レベルを測定する。それぞれの試料へのＤＮＡ送達の差異を補償するために、ＧＵＳ活性を用いてルシフェラーゼレベルを基準化する。
【０３５９】
【表１４】
2004533212.tif 000017
【０３６０】
これらの結果は、ルシフェラーゼ受容体が、ＧＡＬ４−ＭＶ構造及びリガンドテブフェノザイドの双方の存在においてのみ活性化されることを示している。テブフェノザイドは、ＥｃＲ受容体の不存在においてはリポータを活性化することはない。
【０３６１】
例１６：ＧＡＬ４に由来するＤＮＡ結合ドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲに由来するリガンド結合（Ｅ）ドメインと、Ｃ１転写活性ドメインとをコード化する、双子葉植物において発現可能な受容体発現カセットの構成
Ｎ末端配置（Ｃ１−ＧＡＬ４−ＭＥｃＲ）、内部配置（ＧＡＬ４−Ｃ１−ＭＥｃＲ）又はＣ末端配置（ＧＡＬ４−ＭＥｃＲ−Ｃ１）を成して、Ｃ１転写活性化ドメインに融合された、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と、Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲ（ＭＥｃＲ）のリガンド結合（Ｅ）ドメインとを含有するキメラ受容体融合蛋白質を構成する。双子葉植物ＧＡＬ４−ＭＥｃＲ−ＶＰ１６発現ベクター、ｐＣＧＳ４３１（例１４）を使用して、ＧＡＬ４−ＭＥｃＲ−Ｃ１受容体を設計する。ｐＣＧＳ４３１をＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより、ＶＰ１６活性化ドメインを取り出す。プライマ５’−ｇｇｃａａｇｃｔｔｃｃｃａａｇｇｃｃｇｔｇｃｇｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７）及び５’−ｇｇｃｔｃｔａｇａｃｔａｃｇｃａａｇｃｔｇｃｃｃｇｇｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８）を使用して、Ｃ１活性化ドメインをＰＣＲ増幅する。これらのプライマはＣ１の５’末端においてインフレームＨｉｎｄＩＩＩ部位を含み、Ｃ１の３’末端に翻訳ストップコドンとＸｂａｌＩ部位とを含む。ＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩの両方で消化し、消化されたｐＣＧＳ４３１中にクローニングする。融合受容体ＧＡＬ４−ＭＥｃＲ−Ｃ１をコード化するこのような双子葉植物発現ベクターをｐＣＧＳ４４３と呼ぶ。
【０３６２】
ＧＡＬ４−Ｃ１−ＭＥｃＲキメラ受容体を、ＧＡＬ４−ＭＥｃＲ発現ベクター、ｐＣＧＳ４３２を使用して設計する（例１４）。ｐＣＧＳ４３２をＭｌｕＩで消化する。プライマ５’−ｇｇｃａｃｇｃｇｔｃｃｃａａｇｇｃｃｇｔｇｃｇｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９）及び５’−ｇｃｃａｃｇｃｇｔｃｇｃａａｇｃｔｇｃｃｃｇｇｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００）を使用して、Ｃ１活性化ドメインをＰＣＲ増幅する。これらのプライマは、Ｃ１の５’及び３’の両末端にインフレームＭｌｕＩ部位を含む。ＰＣＲ産物をＭｌｕＩで消化し、ＧＡＬ４のＤＢＤとＭａｎｄｕｃａ ＥｃＲのＥドメインとの間で、ＭｌｕＩで消化されたｐＣＧＳ４３２中にクローニングする。融合受容体ＧＡＬ４−Ｃ１−ＭＥｃＲをコード化するこのような双子葉植物発現ベクターをｐＣＧＳ４４２と呼ぶ。
【０３６３】
Ｃ１−ＧＡＬ４−ＭＥｃＲキメラ受容体も、ＧＡＬ４−ＭＥｃＲ発現ベクター、ｐＣＧＳ４３２を使用して設計する。ｐＣＧＳ４３２をＢａｍＨＩで消化する。ＢａｍＨＩはＧＡＬ４のＤＢＤとＭａｎｄｕｃａＥｃＲのＥドメインとの接合部を切断する。Ｃ１活性化ドメインは、プライマ５’−ｃｃｇｇｇａｔｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｃｃｃａａｇｇｃｃｇｔｇｃｇｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１）及び５’−ｃｃｇｇｇａｔｃｃｃｇｃａａｇｃｔｇｃｃｃｇｇｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２）を使用して、Ｃ１活性化ドメインをＰＣＲ増幅する。これらのプライマは、Ｃ１の５’及び３’の両末端にインフレームＢａｍＨＩ部位を含む。ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、消化されたｐＣＧＳ４３２中にクローニングする。融合受容体Ｃ１−ＧＡＬ４−ＭＥｃＲをコード化するこのような双子葉植物発現ベクターをｐＣＧＳ４４１と呼ぶ。
【０３６４】
例１７：リポータ及びＧＡＬ４−ＭＥｃＲ−Ｃ１リポータでタバコ細胞を形質転換することにより、化学的に誘導可能な植物細胞系を生産する
ＧＡＬ４−Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲ−Ｃ１発現ベクター（ｐＣＧＳ４４１、ｐＣＧＳ４４２及びｐＣＧＳ４４３）と、ＧＡＬ４ｘ１０−ルシフェラーゼ・ベクターｐＣＧＳ２０６（例１０）とを、高速マイクロプロジェクタイル・ボンバードにより、ＢＹ２懸濁細胞｛Ｎｉｃｏｔａｎｉａ ｔｏｂａｃｕｍ Ｌ． 栽培種ブライト・イェロー２（Ｂｒｉｇｈｔ Ｙｅｌｌｏｗ ２｝中に同時に送達する。試料間のトランスフェクション効率に関する内部対照として、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）ベクターを含む。トランスフェクト処理した細胞を、ＢＹ２液状培地中の適切な化学的リガンド（テブフェノザイド（ｔｅｂ），ＲＨ５９９２）の存在及び不存在において、一晩インキュベートする。インキュベーション後、細胞を収穫し、機械的破壊によって溶解させる。細胞破片を、１０分間４℃で、２０，８００ｇで遠心分離によって取り出す。細胞溶解物を、Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ ２０／２０ルミノメータを使用してＰｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｋｉｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ ＃Ｅ１５００）によって、ルシフェラーゼ発現レベルに関して検定する。ＧＵＳ−Ｌｉｇｈｔ キット（Ｔｒｏｐｉｘ）を使用して、β−グルクロニダーゼ発現レベルを測定する。それぞれの試料へのＤＮＡデリバリーの差異を補償するために、ＧＵＳ活性を用いてルシフェラーゼレベルを基準化する。
【０３６５】
【表１５】
2004533212.tif 000018
【０３６６】
これらの結果は、３つの全てのキメラ受容体（ｐＣＧＳ４４１、ｐＣＧＳ４４２及びｐＣＧＳ４４３）が、リガンド・テブフェノザイドで処理すると、ルシフェラーゼ・リポータを特異的に活性化できることを示す。ＧＡＬ４−ＭＥｃＲ−Ｃ１（ｐＣＧＳ４４３）構造は、ＧＡＬ４−Ｃ１−ＭＥｃＲ（ｐＣＧＳ４４２）キメラ受容体又はＣ１−ＧＡＬ４−ＭＥｃＲ（ｐＣＧＳ４４１）キメラ受容体よりも、リガンド誘導に関して高いリポータ発現レベルを示すことができる。
【０３６７】
例１８：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換において使用するための単子葉植物リポータ構造の構成
ブロンズ１のＴＡＴＡの上流に１０個のＧＡＬ４  ＤＮＡ結合要素を含有する、トウモロコシのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に使用するためのベクターであって、このＴＡＴＡが、ルシフェラーゼ発現を推進するブロンズ１の第１イントロン配列のフラグメントと融合された最小プロモータを含有するようなベクターを、下記のように構成する。ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩを使用して、ｐＣＧＳ２０６（例１０）から、リポータ・フラグメントを切除する。ＢｇｌＩＩ部位を含有する、修飾されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターを、ＫｐｎＩ及びＢｇｌＩＩで消化し、リポータ・フラグメントを、修飾されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に連結する。次いで、ＫｐｎＩ及びＳｍａＩを用いて、修飾されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターからリポータ・フラグメント（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３）を取り出し、これをＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ単子葉植物形質転換ベクター中に指向的にクローニングする。このベクターは、トウモロコシ・ユビキチン・プロモータのコントロール下でＰＭＩ遺伝子を含有する。このプラスミドをｐＣＧＳ６０１と呼ぶ。
【０３６８】
例１９：イーストＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲのリガンド結合ドメインと、ＶＰ１６の転写活性化ドメインとを含有する、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に使用するための単子葉植物発現ベクターの構成
キメラ蛋白質を推進するトウモロコシ・ユビキチン・プロモータを含有する、トウモロコシのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換に使用するためのベクターであって、このキメラ蛋白質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、Ｍａｎｄｕｃａのリガンド結合（Ｅ）ドメインと、単純ヘルペスウィルス１６の転写活性化ドメインとから成っているようなベクターを下記のように構成する。ＡｓｃＩ及びＳｆｏＩを使用して、プラスミドｐＣＧＳ２０８から、ＧＡＬ４−Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲ−ＶＰ１６のキメラ受容体を切除する。除草剤に対して耐性を有するＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓプロトックス遺伝子を含有するプラスミドを、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、次いで、ＫｌｅｎｏｗのＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端化する。このプロトックス遺伝子は、トウモロコシ・ユビキチン・プロモータの下流のＡＡ４２６でＴｙｒからＭｅｔへの突然変異形を有し、ＡＡ３０５でＳｅｒからＬｅｕへの突然変異形（米国特許第６，０８４，１５５号明細書の表１Ｂにおける部分配列７及び１３）を有するプロトックス酵素をコード化している。次いで、プラスミドをＡｓｃＩで消化し、ＧＡＬ４−Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲ−ＶＰ１６のＤＮＡフラグメント（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４）をプラスミド中に連結し、これによりｐＣＧＳ２０２を形成する。ユビキチン−プロトックス・カセット及びユビキチン−ＧＡＬ４−ＥｃＲ−ＶＰ１６キメラの双方は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換のための左右の境界フラグメント間に位置する。
【０３６９】
例２０：Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって媒介される、トウモロコシの形質転換
主としてＮｅｇｒｏｔｔ他、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ １９： ７９８−８０３ （２０００）に記載されているように、未成熟のトウモロコシ胚を形質転換する。この例に関しては、全ての培地構成要素は上述のＮｅｇｒｏｔｔ他に記載されている通りである。しかしこの文献に記載された種々の培地構成要素を置き換えてもよい。
【０３７０】
Ａ．  形質転換プラスミド及び選択可能なマーカー
形質転換に使用する遺伝子を、トウモロコシ形質転換に適したベクター中にクローニングする。使用されるベクターは、ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＭＩ）遺伝子（Ｎｅｇｒｏｔｔ他、２０００）、又は、除草剤に対して耐性を有するプロトポルフィリンオキシダーゼ（プロトックス）遺伝子｛例えば、ＡＡ４２６でＴｙｒからＭｅｔへの突然変異形を有し、ＡＡ３０５でＳｅｒからＬｅｕへの突然変異形（米国特許第６，０８４，１５５号明細書の表１Ｂにおける部分配列７及び１３）を有するプロトックス酵素をコード化する｝を含有する。上記ベクターは、それぞれマンノース又は除草剤を補足された培地を用いて遺伝子導入細胞を選択することを可能にする。単独の遺伝子、例えばリポータ構造又は誘導系の場合、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの１つの菌株を試験に利用する。両遺伝子の導入の際には、これらを１つのプラスミド上の単独のＴ領域中にクローニングするか、又は、別個のプラスミド上にクローニングし、これらの別個のプラスミドを収容する２つのＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株を１：１で混合した後、接種し、次いで、両マーカー遺伝子を選択する。あるいは、遺伝子を同等の複製起源を有するプラスミド上に別個にクローニングし、形質転換に用いられる単独のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株中に形質転換するか、又は、単独の導入遺伝子に由来する形質転換植物を交配させることにより、両方の形質を有する子孫を生産する。
【０３７１】
Ｂ．  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの調製
植物形質転換プラスミドを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ菌株ＬＢＡ４４０４（ｐＳＢ１）をＹＥＰ｛酵母抽出物（５ｇ／Ｌ）、ペプトン（１０ｇ／Ｌ）、ＮａＣｌ（５ｇ／Ｌ）、１５ｇ／Ｌ寒天、ｐＨ６．８｝固形培地上で２〜４日間２８℃で成長させる。ほぼ０．８ｘ１０９のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、１００μＭのＡｓで補足されたＬＳ−ｉｎｆ中で懸濁する（Ｎｅｇｒｏｔｔｏ他、２０００）。細菌をこの培地中に３０〜６０分間、予め誘導する。
【０３７２】
Ｃ．  接種
Ａ１８８に由来する未成熟の胚又はその他の好適なトウモロコシ遺伝子型を、８〜１２日の日齢の穂から切除し、これを液状のＬＦ−ｉｎｆ＋１００μＭのＡｓ中に導入する。胚を新鮮な感染培地ですすぐ。次いでＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ溶液を添加し、胚を３０秒間ボルテックス処理し、５分間放置することにより細菌となじませる。次いで胚を、胚盤側を上にしてＬＳＡ培地に移し、２〜３日間暗所で培養する。次いでペトリ皿１つ当たり２０〜２５個の胚を、セフォタキシム（２５０ｍｇ／Ｌ）及び硝酸銀（１．６ｍｇ／Ｌ）で補足されたＬＳＤ培地に移し、１０日間２８℃で暗所で培養する。
【０３７３】
Ｄ．  形質転換細胞の選択及び形質転換植物の再生
ＰＭＩ選択：胚形成カルスを生産する未成熟胚を、ＬＳＤ１Ｍ０．５Ｓ培地に移す。この培地上で６週間、及び継代培養ステップで３週間、培養を選択する。生き残ったカルスをＬＳＤ１Ｍ０．５Ｓ培地に移して増大させるか、又は、マンノースを補足されたＲｅｇ１培地に移す。明所内での培養（１６時間・明／８時間・暗の管理形態）に続いて、緑色組織を、成長レギュレータを有さないＲｅｇ２培地に写し、１〜２週間インキュベートする。次いで小植物を、Ｒｅｇ３培地を含有するＭａｇｅｎｔａ ＧＡ−７ボックス（Ｍａｇｅｎｔａ Ｃｏｒｐ， イリノイ州シカゴ在）に移し、明所で成長させる。２〜３週間後、ＰＭＩ遺伝子及び他の当該遺伝子の存在に関して、植物をＰＣＲによって試験する。ＰＣＲアッセイから生じた陽性の植物を温室に移す。
【０３７４】
除草剤選択：主として、下記の培地改変を伴うＰＭＩ選択及び再生に関して記載したように、選択条件を実現する。開始培地及び選択培地の両方に硝酸銀を使用し、３０ｇ／Ｌでサッカロースを使用する。開始及び一次選択のために５ｎＭ、第２の選択のために５００ｎＭ、最終選択のために７５０ｎＭで、プロトックス阻害除草剤（米国特許第６，０８４，１５５号明細書）を培地に添加する。これに続く再生培地においては、除草剤選択なしで、５０ｎＭの除草剤を補足された培地上で再生１を行う。
【０３７５】
組み合わせ選択：混合感染を用いると、マンノース及び除草剤の両方を含有する培地で、選択及び再生が達成される。
【０３７６】
例２１：  ＧＡＬ４−Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲキメラ蛋白質及びルシフェラーゼ・リポータの双方を含有する遺伝子導入トウモロコシ植物の化学的誘導
それぞれ例１８及び例１９から得られるｐＣＧＳ６０１とｐＣＧＳ２０２とを含有する遺伝子導入トウモロコシ植物を、テブフェノザイド（ｔｅｂ、ＲＨ５９９２）で化学的に誘導する。２．０ｍＭテブフェノザイドの１０％エタノール溶液と、１％の界面活性剤とを含有する配合混合物を、形質導入トウモロコシ植物の葉に直接的に塗布する。この溶液を、１８〜４０時間にわたって葉上に残す。次いで葉を液体窒素中で凍結し、粉砕することにより粉末にする。次いで、細胞培養溶解試薬（ＣＣＬＲ；２５ｍＭトリス−ホスフェートｐＨ７．８、 ２ｍＭ  ＤＴＴ，２ｍＭ  １，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１０％グリコール、及び１％トリトンＸ−１００）中で葉を均質化する。細胞破片をペレット化するために７分間、１４，０００ｇで回転させたあと、２０μＬの上澄みを（前述の例において記載のような）標準的な方法によって、ルシフェラーゼ活性に関して検定する。
６つの植物を化学物質で処理する。このうち３つを対照としてエタノールで処理し、３つをテブフェノザイドで処理する。４０時間後、植物をルシフェラーゼ活性に関して検定する。
【０３７７】
【表１６】
2004533212.tif 000019
【０３７８】
ルシフェラーゼ・リポータとＧＡＬ４−Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲ−ＶＰ１６キメラ蛋白質とを含有する遺伝子導入トウモロコシ植物は、テブフェノザイドで処理すると、エタノール対照を上回る有意な誘導を示す。
【０３７９】
テブフェノザイドによるフォールド誘導を測定するために、個々の植物の葉を活性に関して比較する。同じ植物を使用して、１枚の葉をエタノールで処理し、別の葉をテブフェノザイドで処理する。これらの植物を１８時間インキュベートし、上述のようにルシフェラーゼ活性に関して検定する。
【０３８０】
【表１７】
2004533212.tif 000020
【０３８１】
これらの結果は、テブフェノザイドで処理したあとの、ほぼ１０〜４０倍の誘導を示す。
【０３８２】
例２２：ｐＣＧＳ２０２及びｐＣＧＳ６０１を含有する遺伝子導入植物の種々の組織における、テブフェノザイドによる化学的誘導
プラスミドｐＣＧ２０２及びｐＣＧＳ６０１に由来するＤＮＡを収容する遺伝子導入植物を、１％界面活性剤中に配合された２．０ｍＭ  ＲＨ５９９２を使用して、例２１に記載されているように、テブフェノザイドで化学的に誘導する。この混合物を植物の１枚の葉に直接的に塗布する一方、テブフェノザイドの代わりにエタノールを含有する対照配合混合物を別の葉に塗布する。処理剤を２４〜４８時間にわたって葉の上に残す。次いで、７．５ｍルシフェリンと１％界面活性剤とを含有する混合物を葉に噴霧し、５分間インキュベートすることにより、植物を処理する。全植物又は組織をダークボックス内に置き、デジタルカメラ及びソフトウェアを使用して、フォトン放射をモニターする。このソフトウェアは、放射された蓄積フォトンをカウントする。組織の画像及び総フォトンカウントの両方を記録する。
【０３８３】
Ｖ５期における植物を上述のように処理する。テブフェノザイドで処理された植物は、エタノールだけで処理された植物と比較して大量の光を放射する。下記の表は、ｐＣＧＳ６０１及びｐＣＧＳ２０２で形質転換されたトウモロコシ植物に由来する葉試料の実際のカウントを含む。
【０３８４】
【表１８】
2004533212.tif 000021
【０３８５】
受粉後の後期のトウモロコシ植物も上述のように処理する。上述のように葉を分析し、総フォトンカウントを下記の表に記録する。
【０３８６】
【表１９】
2004533212.tif 000022
【０３８７】
以下の組織、すなわち：根、房、葯、茎、胚及び種子で、同様の処理及び結果を得る。
【０３８８】
例２３：酵母のＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、Ｄ＋Ｅドメイン（ヒンジ＋リガンド結合ドメイン）の組み合わせと、単純ヘルペスウィルス蛋白質１６（ＶＰ１６）転写活性化ドメインとを含有する、トウモロコシ・ユビキチン・プロモータにより推進される発現ベクターの構成
受容体ドメイン（ＭｌｕＩ， ＰｖｕＩＩ又はＥｃｏＲＶ）と酵母ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＢａｍＨＩ， ＭｌｕＩ）とを、三路連結によって発現ベクター中に挿入することにより、クローニングする。発現ベクターは、ＮＯＳ（ノパリンシンターゼ）ターミネータ（ＳａｃＩ平滑、ＢａｍＨＩ）を有するトウモロコシ・ユビキチン・プロモータを含有する。例５に記載された構造（ＭＢＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５−６６）；ＭＦＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９−７０）；ＭＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７−６８）；ＥＥＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５−７６）；及びＥＭＶ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９−８０）から、Ｄ（ヒンジ）、Ｅ（リガンド結合ドメイン）及びＶＰ１６をＰＣＲ増幅することにより、受容体ドメインをクローニングする。フォワード・プライマＭａｎｄｕｃａ＿ヒンジ−ｆ（５’−ｇｃｔｃｇａｃｇｃｇｔａｔｇａｇｇｃｃｃｇａｇｔｇｃｇｔｃｇｔｃｃｃａｇａｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４））及びＥＣＢ＿ヒンジ−ｆ（５’−ｇｃｔｃｇａｃｇｃｇｔａｔｇａｇｇｃｃｃｇａｇｔｇｃｇｔｇｇｔｇｃｃａｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５））は、Ｄドメインの５’末端にＭｌｕＩ制限部位を置く。リバース・プライマＶＰ１６−ｒ（ＰｖｕＩＩ）（５’−ｔｇｃｃａｇｃｔｇｃｔａｇａｇｇａｔｃｃｔａｃｃｃａｃｃｇｔａｃｔｃｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６））及びＶＰ１６−ｒ（ＥｃｏＲＶ）（５’−ｔｇｃｇａｔａｔｃｇｇａｔｃｃｔａｃｃｃａｃｃｇｔａｃｔｃｇｔｃａａｔｔｃｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７））は、Ｅドメインの３’末端に、表示のようなＰｖｕＩＩ部位又はＥｃｏＲＶ部位を置く。ＰＣＲ反応（５０μＬ容積）は、１ｘバッファ、０．１μｇのＤＮＡ鋳型、２００μＭのｄＮＴＰ、４００ｎＭのフォワード及びリバースの両プライマ、及び２．５ＵのＤＮＡポリメラーゼを含有する。ＰＣＲ反応条件は下記の通りである：９４℃で５分間、９４℃で１分のサイクルを３０回、６５℃で１分間、７２℃で１分間、次いで７２℃で１０分間。増幅されたｃＤＮＡフラグメントは下記のものを含む：１）  Ｍａｎｄｕｃａ ＤドメインとＢＣＷ  ＥドメインとＶＰ１６とから成る（Ｍ）ＢＶ（１２１５ｂｐ）、２）  Ｍａｎｄｕｃａ ＤドメインとＥＣＢ  ＥドメインとＶＰ１６とから成る（Ｍ）ＥＶ（１２０６ｂｐ）、３）  Ｍａｎｄｕｃａ ＤドメインとＦＡＷ  ＥドメインとＶＰ１６とから成る（Ｍ）ＦＶ（１２１１ｂｐ）、４）  ＥＣＢ  ＤドメインとＥＣＢ  ＥドメインとＶＰ１６とから成る（Ｅ）ＥＶ（１２２１ｂｐ）、５）  ＥＣＢ  ＤドメインとＭａｎｄｕｃａ ＥドメインとＶＰ１６とから成る（Ｅ）ＭＶ（１２４４ｂｐ）。酵母ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインを、ＢａｍＨＩ及びＭｌｕＩで消化し、次いで４５３ｂｐの産物を分離することにより得る。ＮＯＳ（ノパリンシンターゼ）ターミネータ（ＳａｃＩ平滑、ＢａｍＨＩ）バックボーンを有するトウモロコシ・ユビキチン・プロモータを含有する発現ベクターを、ＳａｃＩでの消化、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼによる３’オーバハングの除去、次いでＢａｍＨＩでの消化によって調製し、これにより４９６８ｂｐの産物をもたらす。
【０３８９】
【表２０】
2004533212.tif 000023
【０３９０】
例２４：Ｄ＋Ｅドメイン（ヒンジ＋リガンド結合ドメイン）の組み合わせにより、リガンドを有さないバックグラウンドのレベル及びテブフェノザイド誘導に関する発現全体のレベルを変える
例１２におけるように、メイズＢＭＳ細胞をトランスフェクト処理し、検定する。
【０３９１】
【表２１】
2004533212.tif 000024
【０３９２】
Ｄ＋Ｅドメイン（ヒンジ＋リガンド結合ドメイン）の組み合わせに応じて、リガンドを有さないバックグラウンドのレベル及びテブフェノザイド誘導レベルに影響を与える。このような変更は、受容体ドメインを変えることにより、遺伝子発現出力の特異的条件を確立する機会を提供する。Ｍａｎｄｕｃａ Ｄ（ヒンジ）ドメイン及びアワノメイガＥ（リガンド結合ドメイン）とを有するＥｃＲキメラＧ（Ｍ）ＥＶから、最高フォールド誘導が得られる。
【０３９３】
例２５：酵母ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、Ｍａｎｄｕｃａヒンジ（Ｄ）ドメインと、リガンド結合（Ｅ）ドメインと、植物転写因子に由来する別の活性化ドメインとを含有する発現ベクターの構成
ＮＯＳ（ノパリンシンターゼ）ターミネータを有するトウモロコシ・ユビキチン・プロモータを含有する発現ベクターをベクター・バックボーンとして使用する。Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲのヒンジドメイン及びリガンド結合ドメインに融合されたＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン）Ｇ（Ｍ）Ｍキメラ受容体ヌクレオチドをコードする配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８−１２９）を、双子葉植物発現ベクターｐＣＧＳ４４３（例１６）をＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化することにより発生させる。これらの試薬は、以下に詳細に説明するように、Ｇ（Ｍ）Ｍキメラ受容体と共に、付加的な転写活性化ドメインをフレーム単位でクローニング導入するのに使用する。
【０３９４】
Ｃ１活性化ドメインのそれぞれ５’末端及び３’末端にＨｉｎｄＩＩＩ部位及びＳａｃＩ部位を工学的に作り出すために、トウモロコシＣ１活性化ドメインを、下記のプライマを用いてＰＣＲ増幅する：ＨｉｎｄＩＩＩ Ｃ１ ５’ （５’−ａａａａａａａｇｃｔｔｃｃｃａａｇｇｃｃｇｔｇｃｇｇｔｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０）及びＳａｃＩ Ｃ１ ３’ （５’−ａａａａａｇａｇｃｔｃｔｔａｃｇｃａａｇｃｔｇｃｃｃｇｇｃｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１））。
【０３９５】
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩで消化されたＣ１のＰＣＲ産物と、ＢａｍＨＩ及びＳａｃＩで消化された、ＮＯＳ（ノパリンシンターゼ）ターミネータを有するトウモロコシ・ユビキチン・プロモータを含有する発現ベクターと、Ｇ（Ｍ）ＭのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとの間の三路連結によって、発現ベクターｐＵｂｉ−Ｇ（Ｍ）ＭＣ（ｐＣＧＳ６７２）を得る。
下記のプライマを使用して、総トウモロコシＲＮＡからＲＴ−ＰＣＲによって、トウモロコシＤｏｆ１転写活性化ドメインをクローニングする：ＨｉｎｄＩＩＩ Ｄｏｆ１ ５’ （５’−ａａａａａａｇｃｔｔｇａｇｃｔｃｇｃｃａｃｃｇｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２）及びＢａｍＨＩ Ｄｏｆ１ ３’ （５’−ａａａａａｇｇａｔｃｃｔｃａｃｇｇｇａｇｇｔｔｇａｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３））。
【０３９６】
ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｃＩで消化されたＤｏｆ１のＰＣＲ産物と、ＢａｍＨＩで消化された、ＮＯＳ（ノパリンシンターゼ）ターミネータを有するトウモロコシ・ユビキチン・プロモータを含有する発現ベクターと、Ｇ（Ｍ）ＭのＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントとの間の三路連結によって、発現ベクターｐＵｂｉ−Ｇ（Ｍ）ＭＤ（ｐＣＧＳ６７８）を得る。
【０３９７】
【表２２】
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【０３９８】
例２６：ルシフェラーゼ・リポータ遺伝子ベクターに加えて、Ｇ（Ｍ）ＭＶ、Ｇ（Ｍ）ＭＣ及びＧ（Ｍ）ＭＤキメラ受容体をコード化するベクターによるトウモロコシ懸濁培養細胞の形質転換
例１２に記載したように、トウモロコシ懸濁細胞の形質転換、化学的処理、及びリポータ活性アッセイを実施する。トウモロコシＢＭＳ（ブラック・メキシカン・スウィート）培養細胞に、高速マイクロプロジェクタイル・ボンバードによって、ｐＣＧＳ２０６（ｐＢＳ−ｂｚ１ＴＡＴＡ／イントロンＬＵＣ）及びｐＣＧＳ２０３（Ｇ（Ｍ）ＭＶ）、ｐＣＧＳ６７２（Ｇ（Ｍ）ＭＣ）及びｐＣＧＳ６７８（Ｇ（Ｍ）ＭＤ）をトランスフェクトする。さらに、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）の発現を推進するトウモロコシ・ユビキチン・プロモータを含有する発現プラスミドを、トランスフェクション物に付加し、試料間の変動に対して基準化を行うための内部対照としてこれを使用する。
【０３９９】
主に米国特許第５，８８０，３３３号明細書に記載されているように、トランスフェクション物を処理し、細胞溶解物を作成する。テブフェノザイド（Ｔｅｂ）を最終濃度１０μＭで細胞に添加する。ルシフェラーゼ・アッセイ及びＧＵＳアッセイの双方を、それぞれＰｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｋｉｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ ＃Ｅ１５００）及びＧＵＳ−Ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔ （Ｔｒｏｐｉｘ）を用いたアッセイ毎に、２０μＬの細胞溶解物を使用して実施する。Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ ２０／２０ルミノメータを使用して、相対光単位を測定する。（ＧＵＳリポータ対照を用いて）基準化された値を、以下の表に挙げる。
【０４００】
【表２３】
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【０４０１】
例２７：ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインと、Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲに由来するヒンジドメイン及びリガンド結合ドメインと、ＶＰ１６転写活性ドメインとを種々の配置でコードする単子葉植物受容体発現カセットの構成
Ｎ末端配置（ＶＰ１６−ＧＡＬ４−ＭＥｃＲ）、内部配置（ＧＡＬ４−ＶＰ１６−ＭＥｃＲ）又はＣ末端配置（ＧＡＬ４−ＭＥｃＲ−ＶＰ１６）を成して、Ｖ１６転写活性化ドメインに融合された、ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）と、Ｍａｎｄｕｃａ ＥｃＲのヒンジ（Ｄ）ドメイン及びリガンド結合（Ｅ）ドメイン（ＭＥｃＲ）とを含有するキメラ受容体融合蛋白質を構成する。単子葉植物Ｇ（Ｍ）ＭＶ発現構造（ＧＡＬ４−ＭＥｃＲ−ＶＰ１６）はすでに記載されている（ｐＣＧＳ２０３、例１１）。
【０４０２】
構造ＶＧ（Ｍ）Ｍ（ＶＰ１６−ＧＡＬ４−ＭＥｃＲ）の場合、ＧＡＬ４−ＭＥｃＲ−Ｓｔｏｐを発生させるために、下記のプライマを使用する：Ｇａｌ４ ＤＢＤ ５’（５’−ａａａａａｃｔａｇｔａａｇｃｔａｃｔｇｔｃｔｔｃｔａｔｃｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８））及びＭＥｃＲ ３’ｗ／ｓｔｏｐ（５’−ｇｇａｔｃｃｔａａａｇｃｔｔｃｇｔｃｇｔｃｇａｃａｃｔｔｃｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９））。ＡＴＧ／Ｋｏｚａｋ  ＶＰ１６活性化ドメインカセットをｐＣＧＳ２０３から、下記のプライマを使用して増幅する：ＶＰ１６ ５’ ＡＴＧ／Ｋｏｚａｋ （５’−ａａａａａｇｇａｔｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇｃａｃｇｔｇａａｇｃｔｔｇｃｃｃｃｃｃｃｇａｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０）及びＶＰ１６ ３’ ｎｏ ｓｔｏｐ （５’−ａａａａａａｃｔａｇｔｃａｃｇｔｇｃｃｃａｃｃｇｔａｃｔｃｇｔｃａａｔｔｃｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１）。ＢａｍＨＩで消化された、ＮＯＳ（ノパリンシンターゼ）ターミネータを有するトウモロコシ・ユビキチン・プロモータを含有する発現ベクターと、ＳＰｅＩ及びＢａｍＨＩで消化されたＧａｌ４−ＭＥｃＲ−Ｓｔｏｐと、ＳＰｅＩ及びＢａｍＨＩで消化されたＡＴＧ／Ｋｏｚａｋ  ＶＰ１６との間の三路連結を実施することにより、単子葉植物発現ベクターを発生させ、その結果、ｐＵｂｉ：ＶＰ１６−Ｇａｌ４  ＤＢＤ−ＭＥｃＲ  ＬＢＤ（ＶＧ（Ｍ）Ｍ；ｐＣＧＳ６８６）をもたらす。キメラ受容体ＶＧ（Ｍ）Ｍをコード化するＤＮＡ配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２として示し、コード化された受容体のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３として示す。
【０４０３】
構造ＧＶ（Ｍ）Ｍ（ＧＡＬ４−ＶＰ１６−ＭＥｃＲ）の場合、ＡＴＧ／Ｋｏｚａｋ  Ｇａｌ４  ＤＢＤ−ＭＥｃＲ−Ｓｔｏｐを発生させるために、ＭＥｃＲ  ３’ｗ／ｓｔｏｐ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９）との関連において、下記のプライマを使用する：Ｇａｌ４ ＤＢＤ ５’ＡＴＧ・Ｋｏｚａｋ（５’−ｃａａｇｇａｔｃｃｇｃｃａｃｃａｔｇａａｇｃｔａｃｔｇｔｃｔｔｃｔａｔｃｇ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４））。このＧａｌ４  ＤＢＤ−ＭＥｃＲ産物をｐＴ−Ａｄｖ中にＴＡクローニングし、ＢａｍＨＩで消化する。次いでこれを、ＢａｍＨＩで切断されているＮＯＳ（ノパリンシンターゼ）ターミネータを有するトウモロコシ・ユビキチン・プロモータを含有する発現ベクター中にクローニングすることにより、ｐＵｂｉ−Ｇａｌ４  ＤＢＤ−ＭＥｃＲを産出する。ＶＰ１６活性化ドメインカセットをｐＣＧＳ２０３から、下記のプライマを使用してＰＣＲ増幅により発生させる：ＶＰ１６ ＰｍｌＩ ５’ （５’−ａａａａａｃａｃｇｔｇｃａａｇｃｔｔｇｃｃｃｃｃｃｃｇａｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５）及びＶＰ１６ ＰＭｌＩ ３’ （５’−ａａａａａｃａｃｇｔｇｔｔｃｃｃａｃｃｇｔａｃｔｃｇｔｃａａｔｔｃｃ−３’（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６）。その結果生じるＰＣＲ産物をＰｍｌＩで消化して、やはりｐｍｌＩで消化されているｐＵｂｉ−Ｇａｌ４  ＤＢＤ−ＭＥｃＲ中にクローニングする。その結果生じるＧＶ（Ｍ）Ｍ構造は、Ｇａｌ４  ＤＢＤ−ＶＰ１６−ＭＥｃＲキメラ受容体（ｐＣＧＳ６８７）の発現を推進するＺｍ  Ｕｂｉプロモータを有する。キメラ受容体ＧＶ（Ｍ）Ｍをコード化するＤＮＡ配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７として示し、コード化された受容体のアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８として示す。
【０４０４】
例２８：Ｇ（Ｍ）ＭＶ，ＧＶ（Ｍ）Ｍ及びＶＧ（Ｍ）Ｍ受容体でトウモロコシ懸濁培養細胞を形質転換することにより、化学的リガンドの存在においてリポータの発現をコントロールする
リポータ・ベクターｐＣＧＳ２０６及びキメラ受容体で、トウモロコシＢＭＳ細胞をボンバードし、主に例１２に記載されているようにテブフェノザイドで処理する。主に米国特許第５，８８０，３３３号明細書に記載されているように、トランスフェクション物を処理し、細胞溶解物を作成する。テブフェノザイド（Ｔｅｂ）を最終濃度１０μＭで細胞に添加する。ルシフェラーゼ・アッセイ及びＧＵＳアッセイの双方を、それぞれＰｒｏｍｅｇａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｋｉｔ （Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ ＃Ｅ１５００）及びＧＵＳ−Ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔ （Ｔｒｏｐｉｘ）を用いたアッセイ毎に、２０μＬの細胞溶解物を使用して実施する。Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ ＴＤ ２０／２０ルミノメータを使用して、相対光単位（ＲＬＵ）を測定する。（ＧＵＳリポータ対照を用いて）基準化された値を、以下の表に挙げる。
【０４０５】
【表２４】
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【０４０６】
本明細書で述べた全ての刊行物及び特許明細書は、本発明が関連する当業者の技術レベルを示すものである。個々の刊行物又は特許明細書が具体的且つ個別に表示されているものとして、全ての刊行物及び特許明細書を本明細書中に同程度に援用する。
前記発明をわかり易さの目的で、例を用いて詳細に説明してきたが、本発明の範囲内で何らかの変更及び改変を加えることが可能であることは明らかである。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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