(57)【要約】本発明は、ドナー宿主細胞内で生産されるベクターであって、レシーバー宿主細胞への移入時に、該ベクター内に位置するヌクレオチド配列の所望される発現を維持するベクターに関する。所望される発現の維持は、該ベクターがレシーバー宿主細胞内で少なくとも部分的にメチル化されていないままであることにより達成される。ドナー宿主細胞はレシーバー宿主細胞と異なるものであり、レシーバー宿主細胞はＤＮＡをメチル化し得るものである。メチル化を防止するために、移入されるヌクレオチド配列のＣｐＧモチーフ中のシトシンが、メチル化に対して耐性なシトシン類似体により置換される。本発明はまた、該ベクターの生産方法ならびに産業および医療における該ベクターの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＣｐＧモチーフ中の１個または２個のシトシンがメチル化に対して耐性なシトシン類似体により置換されたヌクレオチド配列を含んでなるベクター。
【請求項２】
シトシン類似体がＣｐＧモチーフ中に位置するシトシンのピリミジン環の５位をＮ，ＯまたはＣ−Ｘで置換する、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
シトシン類似体がシチジン誘導体である、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
シチジン誘導体が５−アザシチジンおよび／または５−アザデオキシシチジンである、請求項３に記載のベクター。
【請求項５】
Ｘが低求電子性または無求電子性の基である、請求項２に記載のベクター。
【請求項６】
低求電子性または無求電子性の基がエチルおよびメトキシからなる群より選択される、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
置換されたシトシンが該ベクターの一方の同一のＤＮＡ鎖に又は両方のＤＮＡ鎖に位置する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８】
該ベクターが線状、環状、一本鎖または二本鎖のベクターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９】
該ベクターが、バクテリオファージ、プラスミド、ファージミド、ウイルスベクター、植物形質転換ベクター、昆虫ベクターおよび酵母人工染色体からなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０】
シトシン類似体の数およびシトシン類似体の分布が、前記シトシン類似体を含有するヌクレオチド配列をメチル化に対して耐性にするとともに、シトシン類似体を含有するＣｐＧモチーフを含むヌクレオチド配列の発現を維持する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１】
少なくとも１％のＣｐＧモチーフがシトシン類似体により置換される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２】
少なくとも５％のＣｐＧモチーフがシトシン類似体により置換される、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
少なくとも１０％のＣｐＧモチーフがシトシン類似体により置換される、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
少なくとも約１％〜約１００％のＣｐＧモチーフがシトシン類似体により置換される、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
該ベクターが少なくとも１つの遺伝子または１つの遺伝子の部分を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１６】
該ベクターが１つ以上の発現制御配列を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベクターを含んでなる、ドナー宿主細胞。
【請求項１８】
該ドナー細胞が真核細胞または原核細胞である、請求項１７に記載のドナー宿主細胞。
【請求項１９】
該ドナー宿主細胞が、単離された細菌、菌類、植物、昆虫、哺乳動物または他の適当な動物の細胞または細胞系、ならびにトランスジェニック動物または植物からなる群より選択される、請求項１８に記載のドナー宿主細胞。
【請求項２０】
該ドナー宿主細胞がＧＭＰ認定の細胞系に属する宿主細胞である、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載のドナー宿主細胞。
【請求項２１】
該細胞系が哺乳動物細胞系である、請求項２０に記載のドナー宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のドナー宿主細胞から得られるヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列が請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベクターの部分である、ヌクレオチド配列。
【請求項２３】
該ヌクレオチド配列が１つ以上の遺伝子および／または１つ以上の遺伝子の部分および／または１つ以上の発現制御配列および／または転写単位である、請求項２２に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２４】
請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のドナー宿主細胞によって生産されるポリペプチドであって、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベクターの部分である、ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベクターおよび／または請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のドナー宿主細胞および／または請求項２２〜２３のいずれかに記載のヌクレオチド配列および／または請求項２４に記載のポリペプチドならびに医薬として許容される希釈剤、担体、補助剤または賦形剤を含んでなる、医薬組成物。
【請求項２６】
レシーバー宿主におけるベクターのＣｐＧモチーフのメチル化を減少させる方法であって、ＣｐＧモチーフ中の少なくとも１個のシトシンを請求項１〜１６のいずれか一項に記載のシトシン類似体により置換することを含んでなる方法。
【請求項２７】
ｉ）ベクターを供給するステップ、ii）該ベクターをドナー宿主細胞に移入するステップ、 iii）該ベクターを内部にもった該ドナー宿主細胞を適量のシトシン類似体からなる増殖培地中で増殖させるステップおよびiv）少なくとも１つのＣｐＧモチーフ中に取り込まれたシトシン類似体を含む増殖したベクターを収穫するステップを含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
シトシン類似体がシチジン誘導体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
シチジン誘導体が５−アザシチジンおよび／または５−アザデオキシシチジンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
収穫されるベクターが請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベクターである、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
ドナー宿主細胞が請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のドナー宿主細胞である、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
製薬産業のような化学産業においてヌクレオチド配列および／またはポリペプチドの小規模または大規模な生産に用いられる、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベクターおよび／または請求項１７〜２１のいずれか一項に記載のドナー宿主細胞を含んでなる、キット。
【請求項３４】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベクター、請求項２２〜２３のいずれかに記載のヌクレオチド配列、請求項２４に記載のポリペプチドまたは請求項２５に記載の医薬組成物を移入する方法であって、エレクトロポレーション、微粒子銃およびリポソームにより媒介される送達からなる一覧より選択される方法。
【請求項３５】
治療および／または診断用の、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベクター、請求項１７〜２１のいずれかに記載のドナー宿主細胞、請求項２２〜２３のいずれかに記載のヌクレオチド配列、請求項２４に記載のポリペプチドまたは請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
治療および／または診断用の医薬品の製造のための請求項１〜１６のいずれか一項に記載のベクター、請求項１７〜２１のいずれかに記載のドナー宿主細胞、請求項２２〜２３のいずれかに記載のヌクレオチド配列、請求項２４に記載のポリペプチドまたは請求項２５に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、レシーバー宿主細胞への移入時のメチル化に対して少なくとも部分的に耐性なままであるベクターに関する。レシーバー宿主細胞はドナー宿主細胞と異なるものである。本発明はまた、該ベクターの生産のための方法ならびに産業および医療における該ベクターの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現の調節は、多様な細胞プロセスとその基礎をなす生化学経路を理解するために、益々重要なアプローチとなっている。遺伝子発現の調節は複雑なプロセスであり、多くの調節機構が未だ理解されないままである。真核生物におけるＤＮＡのメチル化は１つの重要な遺伝子調節機構である。ＤＮＡのメチル化は、真核細胞のゲノム内に位置する遺伝子の発現を制御するとともに真核細胞に入る外来のヌクレオチド配列の発現を抑制するための機構である。この現象は、動物細胞および植物の両方で研究されており、メチル化はＣｐＧの伸長鎖(stretch）中に位置するシトシンのピリミジン環の５位で起こることが特定されている。
【０００３】
遺伝子または遺伝子クラスターの沈黙化(silencing）は、遺伝子または遺伝子クラスターのヌクレオチド配列中に位置するＣｐＧモチーフのメチル化ならびにプロモーターおよび転写因子の応答配列のような調節配列のメチル化の結果として起こり得る。メチル化の程度は沈黙化の程度に影響を与え、一般に、メチル化の程度が低いと生じる発現の減少が少なく、メチル化の程度が高いと遺伝子の発現の完全な沈黙化が生じる。
【０００４】
メチル化は発現ベクター中に位置するポリペプチドの発現に影響を及ぼす。外来ＤＮＡ伸長鎖が細胞の核に入るときに、外来ＤＮＡ伸長鎖はメチル化される。外来ＤＮＡ伸長鎖のメチル化の程度は当該特定ＤＮＡの発現のレベルに影響を与える。導入されたＤＮＡは組換えにより分裂する細胞の染色体ＤＮＡにも組み込まれ得る。染色体ＤＮＡへの組み込みと細胞分裂に先立って当該特定ＤＮＡがメチル化されている場合には、後続の細胞分裂時に多分メチル化されることになる。高レベルの発現が所望される場合には、発現ベクター中のＤＮＡのメチル化は問題である。
【０００５】
類似の問題は、ベクターが疾患の治療用およびワクチン接種用の医薬品に使用されるときにも見出される。例えば、ＤＮＡワクチンは、プラスミド発現ベクターの形態で細菌において生産される場合が非常に多く、次に精製され筋肉や皮膚に送達される。ＤＮＡワクチンは、多数のウイルス性、細菌性および寄生生物性の疾患に対して効力を示すことが動物モデルで実証されている。しかしながら、このようなＤＮＡのメチル化のレベルが、抗原に対する免疫応答の誘発にとって不可欠な抗原性タンパク質の発現のレベルに影響を与えることになる。同じ問題は遺伝子治療におけるＤＮＡベクターの使用にも当てはまる。
【０００６】
新たな宿主への移入時のヌクレオチド配列のメチル化問題を解決する１つの方法は、コードされるポリペプチドを変化させること無く、全てのＣｐＧモチーフを除去するために遺伝子の操作を行うことである。このように修飾された遺伝子はメチル化を受けることにならない。しかしながら、このように修飾された遺伝子を使用する戦略は、短いヌクレオチド配列をもった遺伝子の場合には良く適用されるが、ベクターのような大きなヌクレオチド配列の場合や幾つかの異なるベクターが必要な場合には適用できない。さらに、遺伝子の発現のために用いられるプロモーターはＣｐＧモチーフが豊富にある場合が多く、このＣｐＧモチーフを、プロモーター機能およびそれによる発現レベルを損なうこと無く、除去することはできない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
産業および医療の両方における使用のための、真核細胞への移入時にメチル化を受けない、安定な最適化されたベクターに対する必要性がある。このようなベクターを提供することによって、産業は、真核細胞内での関心ある遺伝子の定常的で高度な発現を得る際の問題が少なくなることになる。
【０００８】
さらに医療は、レシーバー宿主細胞への移入時にメチル化を受けず、かつ該ベクター中に位置するヌクレオチド配列の発現が維持されて、ワクチン接種および遺伝子治療の両方において有用であるとともに発現ベクターを使用する他の処置においても有用である改善されたベクターを備えることになる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、レシーバー宿主細胞へのベクターの移入時にベクターのメチル化が実質的に減少するようにして改変されたベクターに関する。それにより、レシーバー宿主内での該ベクターのヌクレオチド配列の発現が許容可能なレベルに維持される。そのレベルは、該ヌクレオチド配列および／または該ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの期待される機能を維持するレベルである。本発明はまた、前記ベクターの生産のための方法ならびに産業および医薬、例えば治療および／または診断における該ベクターの使用にも関する。
【００１０】
従って、第１の態様において、本発明は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ中の１個または２個のシトシンがメチル化に対して耐性なシトシン類似体により置換されたヌクレオチド配列を含むベクターに関する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ中の１個または２個のシトシンがメチル化に対して耐性なシトシン類似体により置換されたヌクレオチド配列を含むベクターを有するドナー宿主細胞に関する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、ドナー宿主細胞から得られるベクターの部分であるヌクレオチド配列および／またはドナー宿主細胞により生産されるポリペプチドに関する。
【００１３】
更に別の態様において、本発明は、ベクターおよび／またはドナー宿主細胞および／またはヌクレオチド配列および／またはポリペプチドならびに医薬として許容される希釈剤、担体、補助剤または賦形剤を含む、医薬組成物に関する。
【００１４】
更に別の態様において、本発明は、レシーバー宿主細胞におけるベクターのＣｐＧモチーフのメチル化を減少させる方法であって、ＣｐＧモチーフ中の少なくとも１個のシトシンをシトシン類似体により置換することを含む方法に関する。
【００１５】
更に別の態様において、本発明は、ベクターおよび／またはドナー宿主細胞を含むキットに関する。
【００１６】
更に別の態様において、本発明は、ベクター、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたは医薬組成物をレシーバー宿主細胞へ移入する方法であって、エレクトロポレーション、微粒子銃およびリポソームにより媒介される送達からなる一覧より選択される方法に関する。
【００１７】
更に別の態様において、本発明は、治療および／または診断における使用のためのベクター、ドナー宿主細胞、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたは医薬組成物に関する。
【００１８】
更なる態様において、本発明は、治療および／または診断用の医薬品の製造のためのベクター、ドナー宿主細胞、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたは医薬組成物の使用に関する。
【００１９】
本発明は、ＣｐＧモチーフ中のシトシンがシトシン類似体により置換された全く新規なベクターを提供する。シトシン類似体はメチル化に対して耐性のものである。前記シトシン類似体はＣｐＧモチーフ中のシトシンのピリミジン環の５位で置換する。このような置換により、レシーバー宿主細胞、例えば真核細胞への移入時に、該ベクターのヌクレオチド配列の活性／発現を維持する改善されたベクターが生じる。本発明は更に、該ベクターの生産方法ならびに該ベクターの、例えば産業および医療における使用方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
定義
本願および本発明との関連で以下の定義が適用される。
「ヌクレオチド配列」という用語は、２個以上のヌクレオチドの配列を意味することが意図される。ヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成もしくは合成に由来するもの又はこれらの混合物のヌクレオチドであってよい。この用語は、環状、線状、一本鎖および二本鎖の形態のＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００２１】
「ベクター」という用語は、ヌクレオチド配列であって、通常、染色体ＤＮＡとは独立して宿主内で多数のコピーに増殖する能力を有する、すなわち、複製開始点を有するＤＮＡの環状二重鎖である。ベクターは、レシーバー宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターであってもよい。さらに、ベクターは、該ベクター中の選択マーカーの使用などにより、増殖時に宿主内で安定に維持され及び／又は生産される。ベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、ファージミド、ウイルスベクター、植物形質転換ベクター、昆虫ベクターまたは酵母人工染色体であってよい。さらに、ベクターは、アンチセンスとして又はアプタマーを形成するために有用なヌクレオチド配列であってよい。
【００２２】
「複製開始点」という用語は、そこにおいてベクターの複製のためにＤＮＡ合成が開始するヌクレオチド配列を意味することが意図される。複製開始点は、プラスミドベクターにおける１点またはアデノベクターにおける数点のように、使用されるベクターに依存してベクター中の１以上の点で存在してよい。複製開始点は、プラスミドベクターにおいて複製起点（ｏｒｉ部位と略記される）と一般に称される。
【００２３】
「選択マーカー」という用語とは、例えば、薬剤、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンまたはメトトレキセートに対する耐性を付与するポリペプチドをコードする遺伝子を意味することが意図される。
【００２４】
「制御配列」または「制御配列群」という用語は、作用の応答の制御に関与するヌクレオチド配列を意味することが意図される。これには、構造遺伝子の発現、あるいはプラスミドまたはウイルスベクターの複製、選択または維持に関与するヌクレオチド配列および／またはタンパク質が含まれる。例として、アテニュエーター、サイレンサー、エンハンサー、オペレーター、ターミネーターおよびプロモーターが挙げられる。
【００２５】
「ＣｐＧモチーフ」という用語は、シトシンに続いてリン酸結合でつながったグアニンを有する二本鎖ヌクレオチド配列を意味することが意図され、すなわち、ＣｐＧモチーフは二本鎖ヌクレオチド配列の各鎖に１個づつ、２個のシトシンを有する。
【００２６】
「メチル化」または「メチル化されたＣｐＧモチーフ」という用語は、シトシンがピリミジン環上で、通常はピリミジン環の５位で、メチル化されることを意味することが意図される。ヌクレオチド配列における１つ以上のメチル化されたＣｐＧモチーフは、該ヌクレオチド配列の発現の沈黙化を生じ得る。メチル化されたＣｐＧモチーフが、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列内に位置するか、または特異的なヌクレオチド配列、例えば上で定義される制御配列の発現に関与する他のヌクレオチド配列内に位置する場合に、前記ヌクレオチド配列の発現の実質的な又は完全な減少が得られる。
【００２７】
「メチル化に対して耐性」という用語は、ＣｐＧモチーフ中に位置するピリミジン環上の５位の一方または両方のメチル化が存在しないことを意味することが意図される。メチル化に対して耐性なベクターにおいて、１つ以上のＣｐＧモチーフがメチル化されていなくてよい。メチル化に対する耐性は、存在するシトシンをシトシン類似体により置換することによって達成される。
【００２８】
「レシーバー宿主細胞」という用語は、ドナー宿主細胞と比べて異なる細胞を意味することが意図される。レシーバー宿主細胞の内部で、ベクターはＣｐＧモチーフでメチル化される。レシーバー宿主細胞は該レシーバー宿主細胞のヌクレオチド配列と比べて異なるヌクレオチド配列においてＣｐＧモチーフのメチル化を開始させるからである。このことは、レシーバー宿主細胞が、ドナー宿主細胞内で生産／増殖されたベクターを受け取るときに起こる。ベクターのメチル化は減少した又は完全なベクターの沈黙化を生じさせる。
【００２９】
「シトシン類似体により置換」という用語は、上で定義されるＣｐＧモチーフ中に存在するシトシンがシトシン類似体により置換されることを意味することが意図される。シトシン類似体はシトシンのピリミジン環の少なくとも５位で置換する。シトシン類似体はメチル化に対して耐性のものである。しかしながら、シトシン類似体はシトシンを部分的に又は完全に置換し得る。シトシンは、ベクターの複製時にシトシン類似体により置換される。
【００３０】
「シチジン誘導体」という用語は、例えば該ヌクレオチド配列の活性がシチジン誘導体によるシトシンの置換前と同じである等、その置換されたシチジン誘導体を内部にもったヌクレオチド配列の活性に影響を与えることなく、ＣｐＧモチーフ中のシトシンを置換することが可能なシチジン誘導体を意味することが意図される。例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シチジン誘導体による１個以上のシトシンの置換後に、依然として活性であり、該ポリペプチドを発現する。シチジン誘導体は、該シチジン誘導体中に存在するピリミジン環の５位でメチル化を受けることができない誘導体である。シチジン誘導体の例は、図１と図２に見られる。
【００３１】
「発現を維持する」という用語は、ポリペプチドをコードし、かつ１個以上のシトシン類似体を内部にもったヌクレオチド配列の発現を維持すること、すなわち当該発現を少なくとも許容可能なレベルまで維持することを意味することが意図される。そのレベルは、ヌクレオチド配列の非メチル化形態よりも高い。維持される発現は同じヌクレオチド配列のメチル化された形態の発現よりも高い範囲にあってよく、あるいは維持される発現は同じヌクレオチド配列の非メチル化形態の発現と同じ程度であってよい。
【００３２】
「ドナー宿主細胞」という用語は、ベクターの生産／増殖のために用いられる細胞を意味することが意図される。ドナー宿主細胞の成長時または増殖時に、ベクターのコピー数が増加し、同時に、シトシン類似体がドナー宿主細胞の成長用の増殖培地に十分な量で加えられるときに、ＣｐＧモチーフ中のシトシンがシチジン類似体により置換される。例えばドナー宿主細胞が細菌細胞またはウイルス粒子であり、そしてレシーバー宿主細胞が動物細胞または植物細胞である等、ドナー宿主細胞はレシーバー宿主細胞と比べて異なるものである。
【００３３】
本発明のベクター
本発明によるベクターは、少なくとも１つのＣｐＧモチーフ中の１個または２個のシトシンがメチル化に対して耐性なシトシン類似体により置換されたヌクレオチド配列を含むベクターである。
【００３４】
メチル化に対して耐性である前記ベクターを備えることによって、該ベクター中に位置するヌクレオチド配列の発現が、該ベクターのメチル化された形態と比べて高いレベルに維持される。それにより、該ベクターの機能が維持される。さらに、シトシンをシトシン類似体により置換することによって、ヌクレオチド配列の発現を制御し得る。メチル化のレベルを減少または増大させることは異なるレベルの発現を生じさせ、増大したメチル化レベルは発現レベルの減少を生じさせる。シトシンをシトシン類似体により置換することによって、ベクターがレシーバー宿主細胞に導入されるときに起こり得るメチル化問題を回避することが可能である。
【００３５】
第１の実施態様によれば、ＣｐＧモチーフ中に位置するシトシンのピリミジン環の５位を置換するシトシン類似体により、シトシンが置換される。シトシン類似体はＮ、ＯまたはＣ−Ｘであってよい。Ｃ−Ｘ中のＸは、低求電子性または無求電子性(low or non-electrophillic）の基、例えばエチルまたはメトキシであってよい。さらに、シトシンは、シチジン誘導体、例えば５−アザシチジンおよび／または５−アザデオキシシチジンにより置換されてよい。５−アザデオキシシチジンは、ｓ−トリアジン−２（１Ｈ）−オン、４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシル）−（８ＣＩ）、１，３，５−トリアジン−２（１Ｈ）−オン、４−アミノ−１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシル）−（９ＣＩ）、５−アザ−２’−デオキシシチジンまたはデシタビン（Decitabine）とも称される（ＵＳＡＮ）。
【００３６】
ベクターのＣｐＧモチーフ中のシトシン類似体の数および分布が、ピリミジン環の５位のメチル化を阻害する結果、ベクター中に位置するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現の維持を生じる。該ベクターのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列領域内に組み込まれたシトシン類似体の数が増大すると、当該領域のヌクレオチド配列に存在するヌクレオチド配列の発現を維持する可能性が増大することになる。該ベクターの他の領域内に組み込まれたシトシン類似体の数が増大すると、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列領域の維持に間接的に影響を与える場合がある。他のヌクレオチド配列領域に間接的に影響を与えるヌクレオチド配列領域の例としては、制御配列、例えばプロモーターが挙げられる。
【００３７】
ＣｐＧモチーフは、シトシン類似体により置換される可能性をもった２個のシトシンを含む。それら２個のシトシンのいずれか一方または両方が置換されてよい。その場合に、幾つかのシトシン類似体がベクターに組み込まれる。シトシン類似体は、一方の同一の鎖に組み込まれてもよく又は両方の鎖に組み込まれてもよい。シトシン類似体は該ベクターの複製時に該ベクターに組み込まれる。
【００３８】
シトシン類似体の数およびその分布は、前記シトシン類似体のメチル化に対して耐性を生じさせる。前記シトシン類似体が存在することは、シトシン類似体を含むヌクレオチド配列の発現を許容可能なレベルに維持する。
【００３９】
１つの実施態様では、少なくとも１％（例えば１〜５％）のＣｐＧモチーフがシトシン類似体により置換され、例えば５％（例えば５〜１０％）、１０％（例えば１０〜２０％）、２０％（例えば２０〜３０％）、３０％（例えば３０〜４０％）、４０％（例えば４０〜５０％）、５０％（例えば５０〜６０％）が置換される。好ましくは、シトシンの約１〜約１００％がシトシン類似体により置換され、例えば１〜約９５％または約５％〜約９５％が置換される。シトシン類似体は、ベクターのヌクレオチド配列の一方の鎖または両方の鎖に組み込まれる。
【００４０】
ベクターは、少なくとも１つの遺伝子または１つの遺伝子の部分を含んでよい。いずれの遺伝子を含むかはどのベクターが用いられるかに依存する。可能な遺伝子の候補としては、インフルエンザに対して免疫応答を生じさせるものであって、ヒトのワクチン接種のために有用なものが挙げられる。さらに、ベクターは１つ以上の制御配列を含んでよい。制御配列は、適当なドナー宿主内で該ベクターを維持および増殖する可能性を与える制御配列および／またはレシーバー宿主細胞内でベクターを維持および／または増殖する可能性を与える制御配列である。レシーバー宿主細胞内で遺伝子および／または遺伝子の部分を適当な発現レベルで発現させる可能性を与える、追加的な制御配列が存在してもよい。制御配列の選択は、該遺伝子または該遺伝子の部分の所望される発現レベルに依存し、当業者はこのような制御配列を特定することができるであろう。
【００４１】
ベクターは、上で定義されるヌクレオチド配列であって、アンチセンスＤＮＡとして治療上使用され得るものであってよい。このようなＤＮＡの生産に関心が示されており、可能なら作製物においてＣｐＧジヌクレオチドが削除される。アンチセンスＤＮＡは、例えば、核ＤＮＡと干渉するために用いられ、三重らせんモチーフが形成される。このような三重らせん構造は転写活性が損なわれるか、又は干渉するＤＮＡが鎖破壊活性につながることができる。アンチセンスＤＮＡはまた、ｍＲＮＡと結合させて、該ｍＲＮＡの翻訳が損なわれるようにするとともにＲＮＡアーゼＨ活性が導入されて該ｍＲＮＡが分解されるようにするために用いることもできる。
【００４２】
ベクターは、上で定義されるヌクレオチド配列であって、アプタマーを形成し得るものであってよい。アプタマーは、かなり短い線状ＤＮＡであって、異なる生物学的分子、例えば特異的なタンパク質モチーフ、炭水化物およびステロイド等と特異的な態様で結合するものである。それにより、アプタマーはある種の生物学的分子の活性を阻害することができる。
【００４３】
ベクターは、該ベクターが宿主（レシーバーおよび／またはドナー）内で増殖することができる、すなわち複製開始点を有する限り、いずれのベクターであってもよい。全てのベクターおよび制御配列が、関心あるヌクレオチド配列を発現するために等しく良好に機能するわけではないことに留意すべきである。同一の発現系を用いる場合でも宿主は等しく良好に機能しない。しかしながら、当業者は、過度の実験を行うことなく、これらのベクター、制御配列および宿主の中から選択することができるであろう。例えば、ベクターを選択する際に、該ベクターはドナーおよび／またはレシーバー宿主細胞内で複製されなければならないか又はレシーバー宿主細胞の染色体に組み込むことができなければならないので、宿主を考慮すべきである。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、および該ベクターによりコードされる他のいずれかのタンパク質、例えば、選択マーカーの発現も、考慮すべきである。制御配列を選択する際には、多様な因子を考慮すべきである。これらの因子としては、例えば、該配列の相対強度、該配列の制御可能性、および、特に可能な二次構造に関して、関心あるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列との該配列の適合性が挙げられる。宿主は、選択されるベクターとの該宿主の適合性、ヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの毒性、該宿主の分泌特性、ポリペプチドを正しく折りたたむ該宿主の能力、該宿主の発酵または培養の要件、およびヌクレオチド配列によりコードされる産物の精製の容易さを考慮して選択すべきである。
【００４４】
ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体複製とは独立しているベクター、例えばプラスミド、であってよい。あるいは、ベクターは、レシーバー宿主細胞のゲノムに組み込まれて、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってよい。レシーバー宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターは、ある種の遺伝子および／または遺伝子の部分および／または制御配列が将来起こり得るメチル化問題に対して保護される必要がある場合に、それを使用することが有利となり得る。メチル化は、該ベクターが組み込まれたゲノムの複製時に起こり得る。他の例は、ゲノム内に存在するある種の遺伝子および／または遺伝子の部分および／または制御配列を除去する必要がある場合である。該遺伝子および／または遺伝子の部分および／または制御配列の発現はメチル化により減少されることが可能であり、このようなメチル化された遺伝子および／または遺伝子の部分および／または制御配列を非メチル化形態により置換することで、既存の発現レベルを増大させることが可能である。当該置換は線状ＤＮＡを用いた相同組換え等の方法を用いて行い得る。該遺伝子および／または遺伝子の部分および／または制御配列は、そのような置換によって、発現が向上または抑制され得る。ゲノムに組み込まれる１個以上のシチジン類似体を含むベクターは、ゲノムの複製時に、１個以上のシチジン類似体を有しない前記ベクターを含むゲノムの新たなコピーを生じ得る。しかしながら、ベクターを内部にもったゲノムの新たなコピーは、該ゲノムの新たなコピー内に位置する該ベクターの新たなコピー内にシチジン類似体が存在しなくても、いずれにしてもメチル化に対して耐性であり得る。
【００４５】
ベクターは、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の転写に必要な追加の配列部分に機能し得るように連結された発現ベクターであってよい。ベクターは、通常、プラスミドまたはウイルスＤＮＡに由来するものである。本願明細書で言及される宿主細胞における発現のための適当な多数の発現ベクターが商業上利用可能であるか、又は文献で記載されている。真核宿主用の有用な発現ベクターとしては、例えばＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスからの制御配列を含むベクターが挙げられる。具体的なベクターは、例えばｐＣＤＮＡ３．１（＋）／Ｈｙｇ(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）およびｐＣＩ−ｎｅｏ(Stratagene, La Jolla, CA, USA）である。酵母細胞用の有用な発現ベクターとしては、２μプラスミドおよびその誘導体である、ＰＯＴ１ベクター（米国特許第４，９３１，３７３号）、Okkels, Ann. New York Acad. Sci. 782, 202-207, 1996 に記載されているｐＪＳＯ３７ベクターおよびｐＰＩＣＺ  Ａ，ＢまたはＣ（Invitrogen）が挙げられる。昆虫細胞用の有用なベクターとしては、ｐＶＬ９４１、ｐＢＧ３１１（Cate et al., "Isolation of the Bovine and Human Genes for Mullerian Inhibiting Substance and Expression of the Human Gene in Animal Cells", Cell, 45, pp. 685-98 (1986))、ｐＢｌｕｅｂａｃ４．５およびｐＭｅｌｂａｃ（両方ともInvitrogenより利用可能）が挙げられる。細菌宿主用の有用な発現ベクターとしては、公知の細菌プラスミド、例えばｐＢＲ３２２、ｐＥＴ３ａおよびｐＥＴ１２ａ（両方ともNovagen Inc., WI, USAより利用可能）を含む大腸菌（E. coli）からのプラスミド、広い宿主範囲のプラスミド、例えばＲＰ４、ファージＤＮＡ、例えばλファージの多数の誘導体、例えばＮＭ９８９、および他のＤＮＡファージ、例えばＭ１３および線状一本鎖ＤＮＡファージが挙げられる。適当なウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ヘルペスベクターおよびサイトメガロウイルスベクターが挙げられる。
【００４６】
本発明に使用される他のベクターとして、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をコピー数に増幅されるようにするものが含まれる。このような増幅可能なベクターは当業界でよく知られており、例えば、ＤＨＦＲ増幅（例えば、Kaufman, 米国特許第４，４７０，４６１号、Kaufman and Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19(1982) 参照）およびグルタミン合成酵素（「ＧＳ」）増幅（例えば、米国特許第５，１２２，４６４号およびＥＰ３３８，８４１号参照）。
【００４７】
組換えベクターは、該ベクターが問題の宿主細胞内で複製されることを可能にするＤＮＡ配列を更に含んでよい。このような配列の例は、ＳＶ４０の複製開始点である。宿主細胞が酵母細胞である場合には、該ベクターの複製を可能にする適当な配列は酵母プラスミド２μ複製遺伝子群ＲＥＰ１−３および複製開始点である。
【００４８】
ベクターは、選択マーカー、例えば、宿主細胞内で毒素関連欠損症を補う産物の遺伝子、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子、または分裂酵母シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）ＴＰＩ遺伝子（P.R. Russell, Gene 40, 1985, pp. 125-130に記載されている）、あるいは薬物、例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシン、ヒグロマイシンまたはメトトレキセート、に対する耐性を付与する遺伝子を含んでもよい。出芽酵母サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の場合には、選択マーカーとしてｕｒａ３およびｌｅｕ２が挙げられる。糸状菌(filamentous fungi）の場合には、選択マーカーとしてａｍｄＳ、ｐｙｒＧ、ａｒｃＢ、ｎｉａＤおよびｓＣが挙げられる。
【００４９】
「制御配列」という用語は、本願明細書において、本発明のポリペプチドの発現に必要な又は有利な全ての要素を含むものとして定義される。各制御配列は、該ポリペプチドをコードする核酸配列に対して天然のものまたは外来のものであってよい。このような制御配列としては、限定されないが、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター（誘導性または構成的）、エンハンサーまたは上流活性化配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。少なくとも、制御配列としてはプロモーターが含まれる。
【００５０】
本発明において多種多様な制御配列を使用し得る。かかる有用な制御配列としては、前述の発現ベクターの構造遺伝子と関連する制御配列、ならびに原核細胞または真核細胞あるいはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御する公知のいずれかの配列、およびそれらの種々の組合せが挙げられる。
【００５１】
哺乳動物細胞内での転写のために適当な制御配列の例としては、ＳＶ４０およびアデノウイルスの初期および後期プロモーター、例えばアデノウイルス２主要後期プロモーター、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター、ヒトまたはげっ歯類のサイトメガロウイルス先発型初期(immediate-early）遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、ヒト伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター、ショウジョウバエ（Drosophila）ミニマル熱ショックタンパク質７０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトユビキチンＣ（ＵｂＣ）プロモーター、ヒト成長ホルモンターミネーター、ＳＶ４０またはアデノウイルスＥ１ｂ領域ポリアデニル化シグナルおよびコザックコンセンサス配列（Kozak, M. J Mol Biol 1987 Aug 20; 196(4); 947-50）が挙げられる。
【００５２】
哺乳動物細胞内での発現を向上するために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の５’非翻訳領域に、合成イントロンを挿入してよい。合成イントロンの例として、プラスミドｐＣＩ−Ｎｅｏ由来またはβ−グロブリン遺伝子由来の合成イントロン（Promega Corporation, WI, USAより利用可能）が挙げられる。さらに、ＩＲＥＳ配列も挙げられる。
【００５３】
昆虫細胞内での転写のために適当な制御配列の例としては、ポリヘドリン（polyhedrin）プロモーター、Ｐ１０プロモーター、オートグラファ・カリフォルニア核多角体病ウイルス（Autographa California polyhedrosis virus）塩基性タンパク質プロモーター、バキュロウイルス先発型初期(immediate-early）遺伝子１プロモーターおよびバキュロウイルス３９Ｋ後発型初期(delayed-early）遺伝子プロモーター、およびＳＶ４０ポリアデニル化配列が挙げられる。酵母宿主細胞内での使用のために適当な制御配列の例としては、酵母α−交配系のプロモーター、酵母トリオ−スリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）プロモーター、酵母解糖系遺伝子群由来またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子群由来のプロモーター、ＡＤＨ２−４ｃプロモーター、および誘導性ＧＡＬプロモーターが挙げられる。糸状菌宿主細胞内での使用のために適当な制御配列の例としては、ＡＤＨ３プロモーターおよびターミネーター、アスペルギウス・オリザ（Aspergillus oryzae）タカアミラーゼ、トリオ−スリン酸イソメラーゼまたはアルカリ性プロテアーゼ、アスペルギウス・ニガー（A. niger）α−アミラーゼ、アスペルギウス・ニガー（A. niger）またはアスペルギウス・ニドランス(A. nidulans）グルコアミラーゼ、アスペルギウス・ニドランス(A. nidulans）アセトアミダーゼ、リゾムコア・ミーヘイ(Rhizomucor miehei）アスパラギン酸プロティナーゼまたはリパーゼをコードする遺伝子由来のプロモーター、ＴＰＩ１ターミネーターおよびＡＤＨ３ターミネーターが挙げられる。細菌宿主細胞内での使用のために適当な制御配列の例としては、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系もしくはＴＲＣ系のプロモーター、およびλファージの主要プロモーター領域が挙げられる。
【００５４】
シグナルペプチドの存在または非存在は、発現されるポリペプチドの生産のために使用される発現宿主細胞（それが細胞内ポリペプチドか又は細胞外ポリペプチドか）および分泌物を得ることが望ましいか否かに依存することになる。糸状菌内で使用するためには、シグナルペプチドは、アスペルギウス・エスピー(Aspergillus sp.）アミラーゼもしくはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコア・ミーヘイ(Rhizomucor miehei）リパーゼもしくはプロテアーゼまたはフミコーラ・ラヌギノーザ(Humicola lanuginosa）リパーゼをコードする遺伝子から便宜に導き得る。シグナルペプチドは、好ましくは、アスペルギウス・オリザ（Aspergillus oryzae）タカアミラーゼ、アスペルギウス・ニガー（A. niger）中性α−アミラーゼ、アスペルギウス・ニガー（A. niger）酸安定性アミラーゼまたはアスペルギウス・ニガー（A. niger）グルコアミラーゼをコードする遺伝子から導かれる。昆虫細胞内で使用するためには、シグナルペプチドは、昆虫遺伝子（ＷＯ９０／０５７８３号参照）、例えばレピドプテラン・マンヅーカ・セクスタ（Lepidopteran manduca sexta）脂肪動員ホルモン前駆体（米国特許第５，０２３，３２８号参照）、ミツバチメリチン(melittin)（Invitrogen）、エクジステロイドＵＤＰグルコシルトランスフェラーゼ（ｅｇｔ）（Murphy et al., Protein Expression and Purification 4, 349-357 (1993)）またはヒト膵臓リパーゼ（ｈｐｌ）（Methods in Enzymology 284, pp. 262-272, 1997）から便宜に導き得る。哺乳動物細胞内で使用するために好ましいシグナルペプチドは、ｈＧ−ＣＳＦのシグナルペプチドまたはネズミＩｇκ軽鎖シグナルペプチド（Coloma, M (1992) J. Imm. Methods 152: 89-104）である。酵母細胞内で使用するために適したシグナルペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ（S. cerevisiae）由来のα−因子シグナルペプチド（米国特許第４，８７０，００８号参照）、修飾カルボキシペプチダーゼ  シグナルペプチド(L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897参照）、酵母ＢＡＲ１シグナルペプチド（ＷＯ８７／０２６７０号参照）、酵母アスパラギン酸プロテアーゼ３（ＹＡＰ３）シグナルペプチド（M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137参照）、および合成リーダー配列ＴＡ５７（ＷＯ９８／３２８６７号）であることが分かっている。
【００５５】
本発明のベクターの維持または生産のために、真核細胞または原核細胞、例えば細菌、菌類（酵母を含む）、植物、昆虫、哺乳動物または他の適当な動物の細胞または細胞系、ならびにトランスジェニック動物または植物など、何れの適当なドナー宿主細胞も使用してよい。ドナー宿主細胞は、ＧＭＰ（優良製造規範）認定の細胞系に属するドナー宿主細胞、例えば哺乳動物細胞系であってよい。細菌ドナー宿主細胞の例としては、グラム陽性菌、例えばバシラス属（Bacillus）、例えばバシラス・ブレビス(B. brevis）またはバシラス・サチリス(B. subtilis）、シュードモナス属(Pseudomonas）またはストレプトマイセス属（Streptomyces）の各種菌株、あるいはグラム陰性菌、例えば大腸菌(E. coli）の各種菌株が挙げられる。適当な糸状菌ドナー宿主細胞の例としては、アスペルギウス属(Aspergillus）、例えばアスペルギウス・オリザ(A. oryzae）、アスペルギウス・ニガー（A. niger）またはアスペルギウス・ニドランス(A. nidulans）、フザリウム属（Fusarium）あるいはトリコデルマ属(Trichoderma）の各種菌株が挙げられる。適当な酵母ドナー宿主細胞の例としては、サッカロマイセス属(Saccharomyces）、例えばサッカロマイセス・セレビシエ(S. cerevisiae）、シゾサッカロマイセス属(Schizosaccharomyces）、クリベロマイセス属（klyveromyces）、ピチア属（Pichia）、例えばピチア・パストリス(P. pastoris）またはピチア・メタノーリカ（P. methanolica）、ハンセニューラ属(Hansenula）、例えばハンセニューラ・ポリモルファ(H. polymorpha）またはヤローウイア属（Yarrowia）の各種菌株が挙げられる。適当な昆虫ドナー宿主細胞の例としては、レピドプトラ(Lepidoptora）細胞系、例えばスポドプテラ・フルギパーダ(Spodoptera frugiperda）（Ｓｆ９またはＳｆ２１）またはトリチョプラシオア・ニ（Trichoplusioa ni）細胞（ハイ・ファイブ（High Five)）（米国特許第５，０７７，２１４号）が挙げられる。適当な哺乳動物ドナー宿主細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系（例えばＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ミドリザル細胞系（ＣＯＳ）（例えばＣＯＳ  １（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、ＣＯＳ  ７（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１））；マウス細胞（ＮＳ／Ｏ）、仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞系（例えばＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３２またはＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）、およびヒト細胞（例えばＨＥＫ  ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３））、ならびに組織培養における植物細胞が挙げられる。追加の適当なドナー細胞系が当業界で公知であり、例えばメリーランド、ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）のような公共寄託機関より利用可能である。
【００５６】
特定の実施態様において、本発明はベクターの部分であるヌクレオチド配列を内部にもったドナー宿主から得られるヌクレオチド配列に関する。該ベクターおよび該ドナー宿主は、上で定義されるベクターおよびドナー宿主である。該ヌクレオチド配列は、プロモーター、ヌクレオチド配列、例えば遺伝子または遺伝子の部分、およびポリアデニル化部位を含む、転写単位であってよい。該ヌクレオチド配列は、遺伝子および／または遺伝子の部分および／または１つ以上の上で定義される制御配列であってもよい。関心ある遺伝子または遺伝子群の１つの例は、核コアタンパク質をコードする遺伝子、例えばワクチン接種のために使用し得るインフルエンザ核コアタンパク質をコードする遺伝子である。他の例は、パーキンソン病の治療に有用となり得るチロシンヒドロキシラーゼをコードする遺伝子である。第三の例は、血液凝固複合体またはインターフェロンγに関与する因子ＸまたはVIIIをコードする遺伝子である。さらに、遺伝子治療、例えば癌の治療、に有用な全ての種類の遺伝子も、本発明により使用するのが有用な遺伝子の候補であり、例えば単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）由来のチミジンキナーゼが挙げられる。該ヌクレオチド配列は、アンチセンスとして使用してもよい。アンチセンスＤＮＡは、例えば、核ＤＮＡと干渉して三重らせんモチーフが形成されるように使用される。このような三重らせん構造は転写活性が損なわれるか、又は干渉するＤＮＡが鎖破壊活性につながることができる。アンチセンスＤＮＡはまた、ｍＲＮＡと結合させて、該ｍＲＮＡの翻訳が損なわれるようにするとともにＲＮＡアーゼＨ活性が導入されて該ｍＲＮＡが分解されるようにするために用いることもできる。さらに、該ヌクレオチド配列は、短いヌクレオチド配列の伸長鎖であって、異なる生物学的分子、例えば特異的なタンパク質モチーフ、炭水化物、ステロイド等と特異的な態様で結合する、アプタマーとして使用してもよい。メチル化することができない、例えばアザ−デオキシ−シチジンのような、シトシン塩基類似体を使用することにより、非メチル化ＤＮＡの免疫原性を低下することができ、それにより免疫刺激副作用を低減する。該ベクターおよび／または該ヌクレオチド配列、例えばＰＣＲにより増幅される転写単位は、細胞に形質移入(transfect）するために使用してよい。該ベクターは線状にされてよく、例えば、制限酵素による消化によって原核部分を省くことができる。このような生体外（in vitro）で生産されるＤＮＡは、例えば、免疫化のために、あるいは生体外（ex vivo）または生体内(in vivo）での遺伝子治療において使用することができる。
【００５７】
他の実施態様において、本発明は、上記ドナー宿主細胞により生産されるポリペプチドに関し、該ポリペプチドは上述の本発明によるベクターの部分であるヌクレオチド配列によりコードされている。
【００５８】
他の実施態様において、本発明は、上述のベクターおよび／または宿主細胞および／または該ベクターにより得られるヌクレオチド配列および／またはポリペプチドならびに医薬として許容される希釈剤、担体、補助剤または賦形剤を含む、医薬組成物に関する。
【００５９】
上述のベクター、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたは医薬組成物は、例えばエレクトロポレーション、微粒子銃、リポソームにより媒介される送達などの適当な形質転換法により、レシーバー宿主細胞に移入され得る。
【００６０】
上述のベクター、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたは医薬組成物は、治療および／または診断において使用し得る。
【００６１】
上述のベクター、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたは医薬組成物は、治療および／または診断用の医薬品の製造のために使用し得る。
【００６２】
本発明のベクターの生産方法
本発明の１つの実施態様は、レシーバー宿主におけるベクターのＣｐＧモチーフのメチル化を減少させる方法に関し、この方法はＣｐＧモチーフ中の少なくとも１個のシトシンをシトシン類似体により置換することを含み、該ベクターは上述したものである。この方法は培養方法、またはＰＣＲ等により該ベクターを増幅する方法となり得る。
【００６３】
本発明の他の実施態様によれば、上記方法は、ベクターを供給するステップ、該ベクターをドナー宿主細胞に移入するステップ、該ベクターを内部にもった該ドナー宿主細胞を適量のシトシン類似体からなる増殖培地中で増殖させるステップおよび少なくとも１つのＣｐＧモチーフ中の１個または２個のシトシンに取り込まれたシトシン類似体を含む増殖したベクターを収穫するステップを含む。該ベクターは上述したベクターであり、ドナー宿主は上述したドナー宿主である。
【００６４】
該ベクターおよび該ドナー宿主は、シトシン類似体が取り込まれた当該特異的ベクターを作製する目的に応じて選ばれ、当業者は当該選択を行い得る。該ベクターは、どのドナー宿主が選択されたかに依存する適当な方法を使用して、上記ドナー宿主に移入（導入）される。ベクターの細菌ドナー宿主細胞への導入は、例えば、プロトプラスト形質転換（例えば、Chang及びCohen , 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115を参照）、コンピテント細胞の使用（例えば、Young and Spizizin, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829 またはDubnau及びDavidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56; 209-221を参照）、またはエレクトロポレーション（例えば、Shigekawa and Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751を参照）、または接合（例えば、Koehler and Thorne, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278を参照）により、行い得る。菌類細胞は、それ自体は公知である方法による、プロトプラスト形成、該プロトプラストの形質転換および細胞壁の再生を含むプロセスによって形質転換し得る。アスペルギウス属(Aspergillus）宿主の形質転換のために適した手順は、ＥＰ ２３８ ０２３号および米国特許第５，６７９，５４３号に記載されている。フザリウム属（Fusarium）を形質転換するために適した方法は、Malardier et al, 1989, Gene 78: 147-156およびＷＯ９６／００７８７号に記載されている。酵母は、Becker and Guarente, In Abelson, J.N. and M.I., editors, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920: に記載されているような手順により、またClontech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA, USA（YeastmakerTM Yeast Transformation System Kitについての製品プロトコル）に論じられているような手順により、形質転換し得る。昆虫細胞の形質転換およびその中での異種ポリペプチドの生産は、Invitrogenにより記載されているようにして行い得る。外因性ＤＮＡを哺乳動物ドナー宿主細胞に導入する方法としては、リン酸カルシウムにより媒介されるトランスフェクション、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されるトランスフェクション、リポソームにより媒介されるトランスフェクション、ウイルスベクター、およびリポフェクタミン（Lipofectamin）２０００を使用するLife Technologies Ltd, Paisley, UKにより記載されているトランスフェクション方法が挙げられる。これらの方法は当業界でよく知られており、例えば、Ausbel et al. (eds), 1996, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, USA に記載されている。
【００６５】
本発明の上記生産方法において、当業界で公知である方法を使用してベクターの維持および／または生産に適した増殖培地中で細胞が培養される。例えば、該ベクター、ヌクレオチド配列またはポリペプチドの発現および／または単離を可能とする条件の下、適した培地中で行われる、振とうフラスコ培養、研究室または産業用の発酵槽における小規模または大規模な発酵（連続発酵、回分発酵、流加発酵または固体発酵を含む）により、細胞が培養される。該ベクター、ヌクレオチド配列またはポリペプチドは、化学産業または製薬産業で使用し得る。培養は、当業界で公知の手順を使用して、炭素源と窒素源と無機塩を含む、適した培地中で行われる。適した培地は、商業的供給業者から利用可能であるか、又は（例えばアメリカンタイプカルチャーコレクションのカタログ中で）公表された組成に従って調製し得る。哺乳動物ドナー宿主細胞の培養は、例えば（Animal Cell Biotechnology, Methods and Protocols, Edited by Nigel Jenkins, 1999, Human Press Inc., Totowa, New Jersey, USAおよび Harrison MA and Rae IF, General Techniques of Cell Culture, Cambridge University Press 1997）に開示されているような確立された方法により行われる。
【００６６】
上述したシトシン類似体は、適量の培地に加えられるが、この量はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の所望される発現を生じさせるのに十分な量のシトシン類似体が取り込まれたベクターを得るために十分な量である。シトシン類似体の量は、ベクターの大きさ、ＣｐＧモチーフの量および宿主細胞など種々の因子に依存する。例えば、真核細胞では、しばしば１０μＭの５−アザシチジンおよび／または５−アザデオキシシチジンが使用される。シトシン類似体は、培養前または培養ステップ時に加えてよい。
【００６７】
培養後、ドナー宿主が例えば遠心分離により収穫され、ベクターが当業界で公知の方法により回収される。方法の例としては、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour Press) (1989)およびQiagen Incに言及されるような方法が挙げられる。
【００６８】
適当なドナー宿主内での生産後にベクター中に存在するシトシン類似体の量と分布は、例えば標識した５−アザシチジンおよび／または５−アザデオキシシチジン、ＨＰＬＣ、ＧＣまたはＴＣを使用することにより、決定し得る。
【００６９】
さらに、上記のベクターは、増幅、例えばＰＣＲの使用により、生産し得る。１つの例は、ＰＣＲによる転写単位の増幅および直接細胞に移入するためにこのような転写単位を使用することである。他の可能性は、本発明のベクター、例えばプラスミドベクター、を形質移入（トランスフェクション）のために使用することである。該ベクターは線状にされてよく、例えば、制限酵素による消化によって原核部分を省くことができる。シトシン類似体により置換され得る全ての部位が、ＰＣＲの使用により、増幅反応時のｄＣＴＰの不存在のためにシトシン類似体により置換され得る。増幅されたベクターは、生体外または生体内での、遺伝子治療において、あるいは免疫化のために使用し得る。１つの例は、プロモーター、ｃＤＮＡおよびポリアデニル化部位を含む転写単位による哺乳動物細胞のトランスフェクションであり、これを行うことによって、発酵槽内で細胞から分泌されることになるｃＤＮＡによりコードされるタンパク質を生産し得る。
【００７０】
本発明のキット
従って、本発明は、上述のベクターおよび／または上述のドナー宿主細胞、ならびに該ベクターおよび／または該ベクターおよび該ドナー宿主細胞をどのように使用するかについての説明書を含むキットに関する。
【００７１】
上記キットは、該ベクターを増殖（増幅）する能力について該ドナー宿主細胞に適した培地を更に含んでよい。
【００７２】
上記キットは、産業において、あるいは疾患を患っているか又はワクチン接種の必要がある哺乳動物の治療方法において使用し得る。疾患の例としては、インフルエンザおよび癌が挙げられる。
【００７３】
医薬用途および製剤
本発明の１つの実施態様によれば、ワクチン接種および遺伝子治療を含む幾つかの用途のために、本発明による上記ベクター、ドナー宿主、ヌクレオチド配列または医薬組成物を使用し得る。
【００７４】
しかしながら、疾患の治療またはワクチン接種のために上記ベクターおよび／または上記ドナー宿主を使用するときは、該ベクターを構成するヌクレオチド配列が、レシーバー宿主内すなわち患者細胞内でポリペプチドを発現する等その活性を維持するヌクレオチド配列（例えば、複製開始点および制御配列）であることが重要である。例えば、該ベクターをヒトのワクチン接種のために使用する場合には、免疫応答を生じさせるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の上流でプロモーターが使用されること、すなわち該プロモーターがヒト細胞において活性であることが重要である。該プロモーターは誘導性および／または構成的であってよい。誘導性プロモーターを使用する場合には、上記ベクターおよび／または上記ドナー宿主と一緒に投与される物質またはその後に投与される物質によってプロモーターが誘導され得る。該プロモーターは、局部的または全身的に患者内で生産される物質によって更に誘導され得る。
【００７５】
例えば、インスリンをコードするプラスミドがエレクトロポレーションにより筋肉内に導入される場合には、このプラスミドがインスリンを一時的に発現した後に発現が低下する。一方、メチル化耐性プラスミドは多分、長期間、定常的な発現を有することになる。このようなプラスミドがテトラサイクリン誘導性プロモーターを有する場合には、テトラサイクリンの経口投与によりインスリン産生を制御し得る。このタイプの遺伝子治療は、インスリン欠乏型糖尿病をもった患者に対し、または発現される遺伝子が血友病患者による欠失した凝固因子である場合に適用し得る。
【００７６】
第２の実施態様において、本発明による上記ベクター／ドナー宿主、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたは医薬組成物は、例えば癌のような疾患の治療用またはワクチン接種用の医薬品の製造のために使用される。今日の癌治療では、古典的な放射線療法および化学療法以外の療法が焦点となっている。癌に対する免疫療法ならびに抗血管形成療法(anti-angiogenic therapy）が２つの有望な分野である。両療法とも、抗血管形成剤の生産のため又は免疫刺激性もしくは毒性物質の生産のために遺伝子治療を利用できる。これらのタイプの療法は、メチル化に対して耐性にされたウイルスベクターまたは純粋プラスミドの両方として、メチル化耐性ベクターを使用することによって最適にすることができる。例えば、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）の遺伝子を発現する遺伝子操作アデノウイルスが、本願に記載のシトシン類似体の存在下で生産され得る。そして、該アデノウイルスのＤＮＡはシトシン類似体を含むことになり、メチル化耐性ＤＮＡを有しないアデノウイルスに比べて、該アデノウイルスは感染時に長期間、高レベルのＨＳＶ−ＴＫを発現することになる。そして、ヘルペスウイルス薬物により、腫瘍細胞が死滅する。死滅はＨＳＶ−ＴＫの生産と相関し、すなわち、ＨＳＶ−ＴＫの濃度が高いほど、腫瘍細胞が薬物について感受性になる。
【００７７】
他の実施態様において、本発明による上記ベクター／ドナー宿主、ヌクレオチド配列、ポリペプチドまたは医薬組成物が、疾患を患っているか又はワクチン接種の必要がある哺乳動物の治療方法において使用される。ワクチン接種は、変異または死滅した病原性ウイルスを使用することによって伝統的に行われている。ＤＮＡワクチン接種は、病原体のＤＮＡによりコードされるタンパク質を使用するものである。このような遺伝子または遺伝子群は、プラスミドまたは他のベクター内でクローニングされる。病原性タンパク質をコードするプラスミドは、例えば筋肉内に、注射することができる。このプラスミドは、当該個体の免疫系により認識される病原性タンパク質を発現することになる。このタイプの免疫化は、次に、該病原体の後続の感染に対する保護となる。免疫反応の強さは、病原性タンパク質の生産に依存する。病原性タンパク質の生産が低すぎると、免疫系により認識されないことになりかねない。したがって、メチル化耐性ベクターによるヒトおよび動物の免疫化は両方ともその効率を改善することになる。
【００７８】
本発明の上記ベクター／ドナー宿主、ヌクレオチド配列、ポリペプチドの医薬製剤は、通常、１種以上の医薬として許容される担体または賦形剤を含む組成物で投与される。このような医薬組成物は、十分に貯蔵安定性であってヒトおよび動物に対する投与のために適した公知の方法で調製されてよい。医薬組成物は凍結乾燥されてよい。
【００７９】
「医薬として許容される」とは、採用される用量および濃度において、それが投与される患者に望ましくない効果を生じさせない担体または賦形剤を意味する。このような医薬として許容される担体または賦形剤は当業界でよく知られている（Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A.R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) およびhandbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000) を参照）。
【００８０】
医薬組成物は、補助剤、例えばラクトース、スクロース、澱粉、アルカン酸セルロースエステル類、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよび／またはポリビニルアルコール等と混合されてよく、また常法の投与のために錠剤化またはカプセル化されてもよい。あるいは、医薬組成物は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、オイル類（例えばトウモロコシ油、ピーナッツ油、綿実油またはゴマ油）、トラガカントゴム、および／または種々の緩衝液中で溶解されてよい。他の補助剤および投与態様が製薬業界でよく知られている。担体または希釈剤は、時間遅延材料、例えばグリセリルモノステレアートまたはグリセリルジステアレートを単独で、あるいはワックスまたは当業界で公知である他の物質と共に、含んでよい。
【００８１】
医薬組成物は、従来の製薬処理、例えば滅菌等の対象としてよく、及び／又は、従来の補助剤、例えば保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤、充填剤等、例えば本願明細書中の他の部分に記載されているものを含んでよい。
【００８２】
本発明による医薬組成物は、局部的に又は全身的に、例えば局所的に、静脈内で、経口的に、非経口的に又はインプラント剤として、投与してよく、直腸投与さえも可能である。適した固形または液状の医薬剤形としては、例えば、顆粒、粉剤、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、乳濁剤、懸濁剤、乳剤、エアゾール剤、滴剤、またはアンプル形態の注射可能液剤、さらに活性化合物の徐放を伴う製剤が挙げられ、これらの製剤において賦形剤、希釈剤、補助剤または担体が上述のように常法により使用される。
【００８３】
医薬組成物は、医薬として有効な用量で患者に投与される。「医薬として有効な用量」とは、それが投与される条件に関して所望の効果を生じるために十分な用量を意味する。正確な用量は、化合物の活性、投与の態様、疾患の性質と重さ、患者の体重および年齢に依存し、異なる用量が必要となる場合もある。上記用量の投与は、個体用量単位またはより少ない幾つかの用量単位の形態での単回投与、および特定間隔において細分された複数回投与の両方によって、実行することができる。例えば、ワクチン接種である。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、単独で又は他の治療剤とともに投与してよい。これらの物質は同一医薬組成物の部分として取り込まれてよく、又は別々に投与されてよい。
【００８５】
本発明の目的のために「患者」としては、ヒトおよび他の哺乳動物の両方が含まれる。しかがって、本方法はヒト治療および獣医用途の両方に適用できる。
【００８６】
以下の実施例は、明示的または暗示的に如何なる態様、形状または形態でも本発明を限定することなく、本発明を例示することが意図されるものである。
【実施例】
【００８７】
例１
細菌内でのメチル化耐性プラスミドの生産
１．  関心あるプラスミドを内部にもった E. Coliを用いて、１０ｍｌ試験管内の２ｍｌの慣用ＬＢ培地および５０μｇ／ｍｌのアンピシリンに接種する。
２．  その培地を、振とう装置（２００ｒｐｍ）内で、３７℃において終夜、インキュベートする。
３．  次に、その終夜培養物を用いて、２リットル培養フラスコ内の５００ｍｌのＬＢ培地に接種する。そのフラスコを、細菌の増殖が０．５〜０．８のＯＤ（６５０）に達するまで、振とう装置内で、３７℃においてインキュベートする。
４．  ５’−デオキシ−アザシチジンまたは他のデオキシ−シチジン類似体を１０μＭの濃度まで加え、またクロラムフェニコールを１８０μｇ／ｍｌの最終濃度まで加える。
５．  その培養物を、上記のような振とう装置上で、３７℃において終夜、インキュベートする。
６．  常法の遠心分離により細菌をペレット化し、標準的なQiagen Inc. Maxiprepプロトコルに従ってプラスミドＤＮＡを単離する。
【００８８】
例２
メチル化耐性ＤＮＡをもったアデノウイルスの生産
１．  ９１１または２９３細胞を、感染時に６０〜９０％の密集性になるまで、慣用のＴ−７５フラスコに入れる（約１×１０7 細胞／Ｔ−７５）。高力価ストックを作るためには、通常、１５〜２０のＴ−７５フラスコで十分である。
２．  細胞にウイルス上澄みを細胞当たり５〜１０ＰＦＵ（プラーク形成単位）の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させる。
３．  ２日目に、５’−デオキシ−アザシチジンを１０μＭの濃度まで加える。
４．  全ての細胞が集まり、その細胞の約半数が離れた時（通常は感染後３〜４日目）に、全てのフラスコを収穫して組み合わせる。ベンチトップ遠心分離機（〜５００ｇ）で５分回転させ、上澄みを除去する。
５．  ペレットを８ｍｌの無菌ＰＢＳ中に再懸濁する。４サイクルの冷凍／解凍／ボルテックス処理を行う。可溶化液（lysate）を、４℃、６０００ｒｐｍ（７０００ｇ）のSorvall HS4 ローター内で５分間、遠心分離する。
６．  ５０ｍｌ円錐管に４．４グラムのＣｓＣｌを秤取り、その管に８．０ｍｌの透明ウイルス上澄みを移し、ボルテックス処理により良く混合する。そのＣｓＣｌ溶液（約１０ｍｌ、密度１．３５ｇ／ｍｌ）をSW41ローター用の１２ｍｌポリアロマー管に移す。２ｍｌの鉱物油を上に加える。バランス管を調整する。その勾配液を、１０℃、３２，０００ｒｐｍのSW41ローター内で、１８〜２４時間、回転させる。
７．  ３ｃｃ注射器と１８ｇ針を用いて、ウイルス分画（約０．５〜１．０ｍｌ）を集める。円錐管を通じて下から針を挿入する。等体積の２Ｘ貯蔵緩衝液（２Ｘ貯蔵緩衝液＝１０ｍＭトリス；ｐＨ８．０，１００ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ ＢＳＡ，および５０％グリセロール、フィルター滅菌済み）と混合する。ウイルスストックを−２０℃で貯蔵する。
８．  プラークアッセイ（下を参照）による又は免疫組織化学染色によるＧＦＰ（好適）によって、あるいは単に２６０ｎｍにおけるＯＤを読み取ることによって、ウイルス力価をチェックする。ＯＤを読み取るために、１５μｌのブランク溶液（ブランク溶液＝等体積の２Ｘ貯蔵緩衝液と混合された１．３５ｇ／ｍｌ ＣｓＣｌ液）＋１００μｌ ＴＥ／０．１％ ＳＤＳ に１５μｌウイルス液を加え、３０秒間ボルテックス処理し、５分間遠心分離し、Ａ２６０を測定する。Ａ２６０の１単位は〜１×１０12 ウイルス粒子（粒子：感染性粒子は約２０：１である必要がある）を含む。
【００８９】
例３
ＤＮＡへの５−アザデオキシシチジン取込みの程度の測定
方法１
上記の増殖細胞の培地に５’−デオキシ−アザシチジンを１０μＭの濃度で加える。また、痕跡量 14Ｃ−標識デオキシ−アザシチジン、例えば５μＣｉも加える。該標識アザシチジンの特異的活性が５００Ｃｉ／ｍｍｏｌであれば、この量は１０ｐｍｏｌのアザシチジンと等価である。用いられる体積が１００ｍｌであれば、該放射性標識ヌクレオチドの濃度は１００ｐＭである。従って、非放射性ヌクレオチドと放射性標識ヌクレオチドの間の関係は、１００，０００：１である。該単離ＤＮＡの放射活性をシンチレーションカウンターで測定し、取込みをシンチレーションカウンターの効率に依存して概算する（１Ｃｉ＝１×１０10 ドロップ）。
【００９０】
方法２
該増殖細胞の培地に５’−デオキシ−アザシチジンを１０μＭの濃度で加える。該アザシチジン分子は、ＨＰＬＣによりシチジンから分離することができる。該単離ＤＮＡを、高濃度の遊離ヌクレオチドが生成するようにＤＮアーゼＩで処理する。該試料を適当なＨＰＬＣカラムに注入し、ヌクレオチドをシチジン、チミジン、グアニン、アデニンおよび５’アザシチジンにそれぞれ分離する。シチジンに対するアザシチジンの濃度を測定する。
【００９１】
例４
ＰＣＲを使用して生体外（in vitro）でのベクターＤＮＡの生産
反対方向の２つのインシュレータに囲まれた、ＣＭＶプロモーター、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子、およびＨＳＶ−ＴＫポリアデニル化部位を含む転写単位をプラスミドでクローニングにする。この反対方向の２つのニワトリβグロブリンインシュレータは、組換えが起こる場合に、転写単位の向きが逆転するだけで失われないようにするために使用される。目的は、転写単位をメチル化耐性にする塩基類似体とともに転写単位を増幅するため、および該転写単位をヒトグリオーマ細胞に導入するためである。塩基類似体５’−アザ−２’−デオキシシチジン三リン酸と２’−デオキシシチジン三リン酸の間の異なる比を用いて、異なるレベルのメチル化耐性５’−アザ−シチジンをもったベクターＤＮＡを作製する。
１．  シャトルベクターｐＡｄ−ｅａｓｙ内の１０ｎｇのクローニングされた遺伝子作製物を、２５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰを含有するデオキシヌクレオチド三リン酸混合物、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、１００ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ７．４と共にｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液を含む反応管内で混合した。反応混合物はまた、以下の比１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５および０：１００の５’−アザ−２’−デオキシシチジン三リン酸と２’−デオキシシチジン三リン酸の間の混合物を、これら２種類のシチジンを合わせた最終濃度が２５０μＭとなるように含有する。反応混合物はまた２種類のプライマーも含有し、順方向(forward）プライマーはＣＡＧＧＡＣＴＣＴＧＡＴＧＧＡＡＣＣＡＧＧであり、逆方向(reverse）プライマーはＣＣＣＴＡＣＣＡＴＴＡＧＡＴＧＧＡＴＣＡＧである。反応混合物は２５０ｎｇの各プライマーを含有し、反応体積は５０マイクロリットルである。
２．  上記５種類の異なる管に対し、２単位のｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene Inc., USA）を加え、５６℃のアニーリング温度で１分間、７２℃の反応温度で２分間および９５℃の変性温度で４０秒間の２０サイクルのＰＣＲを行った。
３．  ＰＣＲ後、５種類の反応物を穏やかなＵＶの下でアガロースゲル電気泳動にかけ、５種類の異なるバンドをゲルから切り取り、５種類の異なる断片をゲルから単離した。
４．  ３種類の異なる初代ヒトグリオーマ細胞培養物に対し、上記５種類の異なるベクターの各々１μｇを使用して、ＦＵＧＥＮＥを使用するBoehringer & Mannheim のプロトコルに従うトランスフェクション（形質移入）を行った。各トランスフェクションについて使用された細胞数は１０本の異なる組織培養フラスコ内で５×１０6 細胞であった。
５．  ２４時間後、細胞をトリプシン化（trypsinate）し、１０本の新たな組織培養管に移し、１×１０5 細胞を使用してＦＡＣＳ解析を行い、１０種の異なる試料からの一時的発現を監視した。
６．  トランスフェクション後１週間で、細胞を再びトリプシン化し、ＦＡＣＳ（Becton Dickinson Inc., USA）を使用して細胞を選別（sort）した。ＧＦＰ陽性細胞を２４穴プレート上に再び入れた。倒立蛍光顕微鏡(Olympus）を使用して、培養物を追跡および監視した。培養物を広げた後さらに２週間で、細胞をもう一度ＦＡＣＳ細胞選別にかけた。
７．  ＧＦＰ陽性細胞を０．５細胞／１００マイクロリットルに希釈し、１００マイクロリットルを上記１０種の異なる培養物の各々について９６同型穴に入れた。このクローニングに由来する１細胞クローンをＧＦＰの長期発現について測定した。
【００９２】
例５
トランスジェニック植物の作製
アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のコンピテント細胞に対し、緑色蛍光タンパク質の遺伝子が該プラスミドのＥｃｏ ＲＩ部位 にクローニングされてカリフラワーモザイクウイルスプロモーター（ＣａＭＶ）の制御下にあるプラスミドｐＲＴ１０１によるトランスフェクションを行った。その細菌をＹＭブロス（０．０４％酵母抽出物、１％マンニトール、１．７ｍＭ  ＮａＣｌ、０．８ｍＭ  ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、２．２ｍＭ Ｋ2ＨＰＯ4・３Ｈ2Ｏ、（ｐＨ７．０））中でＯＤ０．１に増殖させ、培地に１００μＭの５’−アザ−２’−デオキシシチジンを補充した。Qiagene Inc.から入手したキットを用いた標準的技術を使用して、プラスミドＤＮＡを単離した。
単離されたプラスミドＤＮＡを用いて、barleyから入手したカルス細胞（ホルデウム・ウルガレ(Hordeum vulgare））のエレクトロポレーションを行った。対照として、アザシチジンを含有しない同じプラスミドを用いた。
倒立蛍光顕微鏡の下で形質転換頻度を追跡し、天然プラスミド形質移入体およびアザシチジン含有プラスミドにより形質転換された形質移入体の両方からの安定クローンを分化させ、両方の範疇から植物を生育させた。２つの群の長期にわたる該クラゲ（jelly-fish）タンパク質（ＧＦＰ）の発現を検討した。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】５−アザデオキシシチジンの構造を示す図である。
【図２】シチジン誘導体の一般構造の例を示す図である。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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