(57)【要約】本発明は、単離した修飾イノシン５’−一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）ポリペプチドを提供する。これらの修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは、サブドメイン領域に取って代わる置換オリゴペプチドを含む。本発明に係る修飾ポリペプチドは、インヒビター、例えばＭＰＡに結合し、そして／または野生型ＩＭＰＤＨホロ酵素の機能的活性を示す。
2004514409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドのサブドメインに代わり置換されたオリゴペプチドドメインを含み、この置換は野生型ＩＭＰＤポリペプチドに比して長さが短い修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを与える、単離された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項２】
野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドがＩ型またはＩＩ型ＩＭＰＤＨである、請求項１に記載の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項３】
第一のＩＭＰＤＨ触媒コアドメインおよび第二のＩＭＰＤＨ触媒コアドメインをさらに含む、請求項１に記載の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項４】
オリゴペプチドドメインが第一および第二のＩＭＰＤＨ触媒コアドメインの間に位置する、請求項３に記載の単離された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項５】
第一のＩＭＰＤＨ触媒コアドメインが第二のＩＭＰＤＨ触媒コアドメインのＮ末端に位置する、請求項３に記載の単離された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項６】
オリゴペプチドドメインがトリペプチドを含む、請求項１に記載の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項７】
オリゴペプチドドメインがテトラペプチドを含む、請求項１に記載の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項８】
配列番号２０−３９のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項９】
トリペプチドが配列番号１−１０のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有する、請求項６に記載の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項１０】
テトラペプチドが配列番号１１−１９のいずれか１つに示すアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項１１】
トリペプチド配列の第１位アミノ酸がアスパラギン酸、スレオニン、セリン、またはグリシン、リジン、イソロイシンおよびアラニンより成る群から選ばれる、請求項６に記載の単離された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項１２】
トリペプチド配列の第２位アミノ酸がリジン、プロリン、アラニン、バリン、ロイシン、グリシンおよびセリンより成る群から選ばれる、請求項６に記載の単離された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項１３】
トリペプチド配列の第３位アミノ酸がチロシン、セリン、スレオニン、グリシン、フェニルアラニン、イソロイシン、ヒスチジンおよびアスパラギン酸より成る群から選ばれる、請求項６に記載の単離された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項１４】
置換テトラペプチド配列の第１位アミノ酸がグリシン、グルタミン、アスパラギン、セリン、スレオニン、チロシン、およびアラニンより成る群から選ばれる、請求項７に記載の単離された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項１５】
置換テトラペプチド配列の第２位アミノ酸がセリン、グリシン、プロリン、イソロイシン、およびアルギニンより成る群から選ばれる、請求項７に記載の単離された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項１６】
置換テトラペプチド配列の第３位アミノ酸がセリン、グルタミン、スレオニン、チロシン、イソロイシン、プロリン、およびアルギニンより成る群から選ばれる、請求項７に記載の単離された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項１７】
置換テトラペプチド配列の第４位アミノ酸がトリプトファン、プロリン、ロイシン、セリン、グルタミン、スレオニン、およびチロシンより成る群から選ばれる、請求項７に記載の単離された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項１８】
互いに結合している１個から８個の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを含むタンパク質多量体（ここでこの修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは各々、野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドのサブドメインに代わり置換されたオリゴペプチドドメインを含み、その結果野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドに比して長さが短い）。
【請求項１９】
二量体である、請求項１８に記載のタンパク質多量体。
【請求項２０】
四量体である、請求項１８に記載のタンパク質多量体。
【請求項２１】
八量体である、請求項１８に記載のタンパク質多量体。
【請求項２２】
請求項８に記載の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドのいずれか１つをコードしているポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２３】
ＲＮＡである、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２４】
ＤＮＡである、請求項２２に記載の核酸分子。
【請求項２５】
請求項２４に記載のポリヌクレオチド配列と相補的であるポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項２６】
検出可能マーカーで標識されている、請求項２２、２３、２４または２５に記載の核酸分子。
【請求項２７】
検出可能マーカーが、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、生物発光化合物、化学ルミネセンス化合物、金属キレート化剤、および酵素より成る群から選ばれる、請求項２６に記載の核酸分子。
【請求項２８】
請求項８に記載の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドのいずれか１つをコードしているポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項２９】
適当な宿主細胞に請求項２８に記載のベクターを含む宿主−ベクター系。
【請求項３０】
適当な宿主細胞が細菌、酵母、哺乳動物、昆虫、および植物より成る群から選ばれる生物由来のものである、請求項２９に記載の宿主−ベクター系。
【請求項３１】
ａ） 請求項３０に記載の宿主−ベクター系を修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを産生する適当な条件下で培養し；そして、
ｂ） 産生された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを回収する、
ことを含む、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを生産する方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法により生産される修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項３３】
請求項１または３２に記載の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドと反応するモノクローナル抗体。
【請求項３４】
検出可能マーカーで標識されている、請求項３３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３５】
検出可能マーカーが、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、生物発光化合物、化学ルミネセンス化合物、金属キレート化剤、および酵素より成る群から選ばれる、請求項３４に記載のモノクローナル抗体。
【請求項３６】
修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを含むタンパク質多量体の活性を阻害する目的物質を同定する方法であって、
ａ） このタンパク質多量体をイノシン−５’−一リン酸、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、および目的物質と接触させ；そして、
ｂ） 生成される還元型のイノシン−５’−一リン酸またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドのレベルを検出し、ここに、生成した還元型のイノシン−５’−一リン酸またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドの低レベルが、該目的物質がＩＭＰＤＨ活性を阻害することを示す方法。
【請求項３７】
実質的に同一の複数の試料をそれぞれ別個に、異なる目的物質と接触させることを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
複数の試料が約１０４以上の試料である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
複数の試料が約１０５以上の試料である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
複数の試料が約１０６以上の試料である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
実質的に同一の複数の試料をそれぞれ、異なる目的物質と、本質上同時に接触させる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＩＭＰＤＨポリペプチドまたはＩＭＰＤＨポリペプチド複合体のＸ線結晶構造の分解能を改善する方法であって、ＩＭＰＤＨポリペプチドのサブドメインを除去し、それによりＩＭＰＤＨポリペプチドまたはＩＭＰＤＨポリペプチド複合体のＸ線結晶構造の分解能を改善することを含む方法。
【請求項４３】
ＩＭＰＤＨポリペプチドが配列番号２０−３９のいずれかに記載のアミノ酸配列を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
該タンパク質またはタンパク質複合体が化合物と複合体形成している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
該化合物がインヒビターである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
インヒビターがＭＰＡである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ＩＭＰＤＨポリペプチドのサブドメインが比較的短いペプチド断片に置換されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
ＩＭＰＤＨポリペプチドの長さを縮小し、それにより該ＩＭＰＤＨポリペプチドのＸ線結晶構造の分解能を改善することを含む、ＩＭＰＤＨポリペプチドのＸ線結晶構造の分解能を改善する方法。
【請求項４９】
配列番号４８、４９、６２、６３、６４、または６５のいずれかに記載のアミノ酸１１１−２４３をトリペプチドで置換し、それによりＩＭＰＤＨポリペプチドのＸ線結晶構造の分解能を改善することを含む、ＩＭＰＤＨポリペプチドのＸ線結晶構造の分解能を改善する方法。
【請求項５０】
トリペプチドが配列番号１−１０のいずれかに示すアミノ酸配列を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
配列番号４８、４９、６２、６３、６４、または６５のいずれかに記載のアミノ酸１１１−２４３をテトラペプチドで置換し、それによりＩＭＰＤＨポリペプチドのＸ線結晶構造の分解能を改善することを含む、ＩＭＰＤＨポリペプチドのＸ線結晶構造の分解能を改善する方法。
【請求項５２】
テトラペプチドが配列番号１１−１９に示すアミノ酸配列を有する、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
配列番号２０−３９のいずれかに示すアミノ酸配列を含む修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項５４】
配列番号４０−４７のいずれかに示す核酸配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項５５】
配列番号４８、４９、６２、６３、６４、または６５のいずれかに示すアミノ酸１１１−２４３がトリペプチドによって置換されている、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【請求項５６】
配列番号４８、４９、６２、６３、６４、または６５のいずれかに示すアミノ酸１１１−２４３がテトラペプチドによって置換されている、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本明細書全編を通じて様々な刊行物を引用する。これらの刊行物の開示は引用によりその全体を本明細書の一部とする。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、サブドメイン領域の代わりに置換オリゴペプチドを含む、単離された修飾イノシン５’−一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）ポリペプチドに関する。
【０００３】
（背景技術）
酵素イノシン５’−一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ；ＥＣ １．１．１．２０５）は、グアノシンヌクレオチドのデノボ合成に関与している（Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｇ．Ｗ．， ａｎｄ Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｆ． １９７１ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３１：９８５−９９１；Ｓｎｙｄｅｒ，Ｆ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９７２ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２１：２３５１−２３５７；Ｗｅｂｅｒ，Ｇ．， １９８３ Ａｃｃｔ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ． ２４：２０９−２１５）。ＩＭＰＤＨは、イノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）からキサントシン−５’−一リン酸（ＸＭＰ）への酸化を触媒する（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｒ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９７５ Ｎａｔｕｒｅ ２５６：３３１−３３３）。ＩＭＰＤＨ酵素は、基質と補助因子結合の規則正しいＢｉ−Ｂｉ反応連鎖および産物放出に従う。まずＩＭＰがＩＭＰＤＨに結合し、続いて補助因子ＮＡＤの結合が起こり、その後ＮＡＤＨへの還元が起こる。還元されたＮＡＤＨが次いで放出され、その後、産物ＸＭＰが放出される（Ｃａｒｒ，Ｓ．Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：２７２８６−９０；Ｈｏｌｍｅｓ，Ｅ．Ｗ． ｅｔ ａｌ．， １９７４ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ． ３６４：２０９−２１７）。
【０００４】
ＩＭＰＤＨは全ての原核生物と真核生物に見出される遍在性の酵素である（Ｎａｔｓｕｍｅｄａ，Ｙ． ａｎｄ Ｃａｒｒ，Ｓ．Ｆ．， １９９３ Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． ６９６：８８−９３）。全ての種に由来するＩＭＰＤＨ酵素は、Ｉ型またはＩＩ型ＩＭＰＤＨポリペプチドの４つのサブユニットを含む、ホモ四量体として存在する。各サブユニットは、比較的大きな触媒コアドメインと小さなサブドメイン、または隣接ドメイン（これは機能が分かっていない）とを持つＩＭＰＤＨポリペプチドである。各々のサブユニットは、活性部位の周囲に四量体を組織化し得るカリウムイオン（Ｓｉｎｔｃｈａｋ，Ｍ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｃｅｌｌ ８５：９２１−９３０）によって結合している（Ｘｉａｎｇ，Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：１４３５−１４４０）。原核生物のＩＭＰＤＨポリペプチドのアミノ酸配列は、ヒトＩＭＰＤＨと３０−４０％配列が一致している（Ｎａｔｓｕｍｅｄａ，Ｙ． ａｎｄ Ｃａｒｒ，Ｓ．Ｆ． １９９３ 上記）。サブドメインのアミノ酸配列は、異なる種由来のＩＭＰＤＨ間で実質的な変異を示す。
【０００５】
Ｉ型およびＩＩ型と呼ばれるヒトＩＭＰＤＨの二つのイソ型が同定され、配列決定された（Ｃｏｌｌａｒｔ，Ｆ．Ｒ． ａｎｄ Ｈｕｂｅｒｍａｎｎ，Ｅ． １９８８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３：１５７６９−１５７７２；Ｎａｔｓｕｍｅｄａ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ． １９９０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６５：５２９２−５２９５）。Ｉ型とＩＩ型はいずれも５１４アミノ酸残基の長さであり、両者の配列の８４％が一致している。Ｉ型およびＩＩ型ＩＭＰＤＨ分子の配列の変異もまた開示されている。野生型のＩＩ型ヒトＩＭＰＤＨのヌクレオチドおよびアミノ酸配列が、Ｎａｔｓｕｍｅｄａ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ． １９９０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６５：５２９２−５２９５；Ｃｏｌｌａｒｔ，Ｆ．Ｒ． ａｎｄ Ｈｕｂｅｒｍａｎｎ，Ｅ． １９８８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３：１５７６９−１５７７２；および米国特許第５６６５５８３号（配列番号６３）に開示されている。野生型ヒトＩＭＰＤＨＩ型のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、Ｎａｔｓｕｍｅｄａ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ． １９９０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６５：５２９２−５２９５（配列番号６５）に開示されている。他の野生型ヒトＩＭＰＤＨ Ｉ型の配列もまた開示されている（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７２：４４５８−４４６６（配列番号６２）；Ｄａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９４ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：９８４（配列番号６４）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０：６８０８−６８１４（１９９５）；およびＧｌｅｓｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ５３７−５４４（１９９４））。さらに、ＩＭＰＤＨ Ｉ型とＩＩ型の両者は、５６ｋＤａのサブユニット分子量を持つ活性四量体を溶液中で形成する（Ｙａｍａｄａ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：２７３７−２７４５）。
【０００６】
ＩＭＰＤＨはＢおよびＴリンパ球の増殖にとって重要である、それはＢおよびＴリンパ球がサルベージ経路ではなくデノボ経路に依存し、マイトジェンまたは抗原に対する増殖反応の開始に必要なヌクレオチドレベルを作り出しているためである（Ａｌｌｉｓｏｎ，Ａ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， １９７５ Ｌａｎｃｅｔ ＩＩ， １１７９；Ａｌｌｉｓｏｎ，Ａ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， １９７７ Ｃｉｂａ Ｆｏｕｎｄ．Ｓｙｍｐ． ４８：２０７）。ＩＭＰＤＨはさらに平滑筋の増殖にも役割を果たしている（Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｃ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ５９：６５５−６１）。加えて、ＩＭＰＤＨは或る種のウイルスセルラインにおけるウイルス複製で役割を果たしている（Ｃａｒｒ，Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， １９９３ 上記）。したがって、ＩＭＰＤＨはＢおよびＴリンパ球の増殖に関連する疾患またはウイルス疾患にとって重要である。
【０００７】
ミコフェノール酸（ＭＰＡ）はヒトＩ型およびＩＩ型ＩＭＰＤＨの強力な非競合的可逆的インヒビターである（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，Ｔ．Ｊ．， ａｎｄ Ｃｏｏｋ，Ｊ．Ｍ．， １９６９ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． １１３：５１５−５２４）。ＭＰＡは、ＮＡＤＨが放出された後に、但しＸＭＰが産生する前に、ＩＭＰＤＨに結合する（Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，Ｌ． ａｎｄ Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｃ． １９９０ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：８４９−８５４；Ｌｉｎｋ，Ｊ．Ｏ． ａｎｄ Ｓｔｒａｕｂ，Ｋ． １９９６ Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． １１８：２０９１−２０９２）。ヒトＩ型ＩＭＰＤＨについて報告されているＫ１値は様々で１１ｎＭ（Ｈａｇｅｒ，Ｐ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４９：１３２３−１３２９）から３３−３７ｎＭ（Ｃａｒｒ，Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， １９９３ 上記）までの範囲であるが、ＩＩ型のＫ１値は６−１０ｎＭである（Ｃａｒｒ，Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， １９９３ 上記；Ｈａｇｅｒ，Ｐ．Ｗ．， ｅｔ ａｌ．， １９９５ 上記）。
【０００８】
マイトジェンまたは抗原に対するＢおよびＴ細胞の応答を遮断する免疫抑制剤としてＭＰＡが使用されてきた（Ａｌｌｉｓｏｎ，Ａ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ６９６：６３）。ＭＰＡはまた、腎臓移植拒絶および自己免疫疾患の治療にも使用されてきた（Ｍｏｒｒｉｓ，Ｒ．Ｅ． １９９６ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｌ． ４９， Ｓｕｐｐｌ． ５３：Ｓ−２６）。ところが、ＭＰＡには、胃腸毒性および劣悪なバイオアベイラビリティーといった望ましくない薬理作用がある（Ｓｈａｗ，Ｌ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ １７：６９０−６９９）。ＩＭＰＤＨ活性のその他のインヒビター、例えばチアゾフリン、リバビリンおよびミゾリビンを包含するヌクレオシド類似体が同定されている（Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．， １９９０ 上記）。しかし、これらの化合物はＩＭＰＤＨの競合的インヒビターであり、特異性を欠く。
【０００９】
過去の研究結果は、Ｉ型またはＩＩ型ヒトＩＭＰＤＨのいずれが重要な治療標的であるかを示していない。例えば、ＩＭＰＤＨ ＩＩ型のレベルがリンパおよび白血病セルラインを増殖させる際に増大することが証明されている（Ｋｏｎｎｏ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６：５０６−５０９；Ｎａｇａｉ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１：３８８６−３８９０；Ｎａｇａｉ，Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， １９９２ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：２５８−２６１；Ｃｏｌｌａｒｔ，Ｆ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， １９９２ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：５）。別の研究者等は、両方のイソ型のｍＲＮＡレベルがマイトジェン刺激後にＴ細胞で増大することを証明した（Ｄａｙｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：９８４−９９１）。
【００１０】
ＩＭＰＤＨはグアニンヌクレオチドのデノボ合成にとって必須であり、例えばＩＭＰＤＨはイノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）を触媒してキサントシン−５’−一リン酸（ＸＭＰ）とする（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｒ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９７５ 上記）。故にＩＭＰＤＨの機能的活性の阻害はＤＮＡ合成を停止させる（Ｄｕａｎ， ｅｔ ａｌ．， １９８７ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４７：４０４７−４０５１）。異常レベルのＩＭＰＤＨに関連する疾患を阻害するために、野生型および改善された薬理学的性質を持つ修飾ＩＭＰＤＨ両者に対する強力なＩＭＰＤＨインヒビター分子が依然として要求されている。
【００１１】
したがって現在、野生型ＩＭＰＤＨの活性を選択的に阻害する物質の同定に、研究努力が集中している。このような阻害物質は、免疫抑制剤、抗癌剤、抗血管過剰増殖剤および抗ウイルス剤として使用するための強力な治療用インヒビターである。さらに、ＩＭＰＤＨインヒビターは、移植拒絶、ならびに、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、若年性糖尿病、喘息、および炎症性腸疾患を包含する自己免疫疾患の治療に使用できる。加えてこれらのインヒビターは、癌や再狭窄を包含する血管疾患、およびレトロウイルス疾患やヘルペスを包含するウイルス複製疾患の治療に有用となり得る。
【００１２】
標的タンパク質を阻害する物質を発見する１つの方法は構造に基づく方法であり、これは、既知のインヒビターと複合体形成した標的タンパク質のＸ線結晶構造の分析を含む。ＭＰＡおよびＩＭＰと複合体形成した野生型チャイニーズハムスターＩＭＰＤＨ ＩＩ型の多量体のＸ線結晶構造が、２．６オングストロームレベルで解析されている（Ｓｉｎｔｃｈａｋ，Ｍ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， １９９６ 上記；米国特許第６１２８５８２号）。しかしながら、このレベルの分解能はＩＭＰＤＨとＭＰＡとの相互作用の充分な詳細を提供していない。これらの詳細を提供するような解析レベルで、インヒビターと複合体形成したＩＭＰＤＨのＸ線結晶構造を入手する要求が依然として存在する。本発明は、サブドメイン領域に代わって置換オリゴペプチドを含むよう修飾したヒトＩＭＰＤＨポリペプチドを提供する。この修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは野生型ＩＭＰＤＨよりも短く、機能的活性を示し、ＭＰＡと結合し、そしてその結晶構造はより高レベルまたは細かい分解能で解析され得る。
【００１３】
（発明の要約）
本発明は、単離された新規な修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドおよびそれらをコードしている核酸分子を提供する。本発明に係るポリペプチドは各々短い置換オリゴペプチドを含み、これは野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドのサブドメインに取って代わり、それにより修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの全体の長さを短縮し、そしてインヒビターと複合体形成した修飾ＩＭＰＤＨ多量体のＸ線結晶構造のより良い解析を可能にする。この置換オリゴペプチドは、折り畳まれた修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドがＩＭＰＤＨのインヒビターに結合し、そして／または野生型ＩＭＰＤＨの機能的活性を保持するよう選択された長さと配列を有する。
【００１４】
本発明はさらに、修飾ＩＭＰＤＨをコードしているＤＮＡを含む組換えベクターおよび宿主−ベクター系、ならびに修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの産生のための方法を提供する。本発明はまた、この修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドと反応する抗体を提供する。
【００１５】
修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは、薬物発見法、例えば構造に基づく薬品設計（ドラッグデザイン）にとって有用である。本発明に係る修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドはさらに、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの検出および／または定量のための、そして任意のＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしている対応核酸分子の検出および／または定量のための治療法、診断法および予後判定法にとって有用である。
【００１６】
（発明の開示）
（定義）
本明細書で使用する全ての科学および技術用語は、別途記載のない限り当該分野で使用する通常の意義を有する。本明細書で使用する以下の語または句は、明記した意義を有する。
【００１７】
本明細書中使用する「ホロ酵素」という語は、互いに結合してそのホロ酵素を作り上げている、ポリペプチドサブユニットおよび補助因子のような複数の構成成分を含む完全な機能的酵素を指す。これらポリペプチドサブユニットは共有結合的または非共有結合的相互作用によって互いに結合することができる。
【００１８】
本明細書に記載の「ＩＭＰＤＨホロ酵素」という語は、グアニンヌクレオチドのデノボ合成における決定付けられた工程である、イノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）依存性酸化を触媒する生物学的活性または機能を有する完全な酵素を指す。典型的には、天然に存在するＩＭＰＤＨホロ酵素は、各々がカリウムイオンに結合しているＩＭＰＤＨポリペプチドの４つの単量体サブユニットを含む四量体分子として見出される。さらに、野生型ヒトＩＭＰＤＨホロ酵素の触媒活性はミコフェノール酸（ＭＰＡ）によって阻害される。
【００１９】
本明細書に記載の「ＩＭＰＤＨ多量体」という語は、互いに結合してＩＭＰＤＨ多量体分子を形作っているＩＭＰＤＨポリペプチドの少なくとも二つの単量体サブユニットを指す。このポリペプチドサブユニットは、共有結合的または非共有結合的相互作用により互いに結合することができる。ＩＭＰＤＨ多量体はカリウムイオンを含んでいてもいなくてもよい。ＩＭＰＤＨ多量体は、天然に存在するＩＭＰＤＨホロ酵素の機能的活性を示しても示さなくてもよい。ＩＭＰＤＨ多量体は修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの単量体サブユニットを２、３、４、または８個まで含むことができる。さらにこの多量体は、同一または異なるイソ型の単量体サブユニット、例えば修飾Ｉ型またはＩＩ型ＩＭＰＤＨポリペプチドを含むことができる。
【００２０】
本明細書中使用する「野生型ＩＭＰＤＨポリペプチド」という語は、Ｎ末端触媒ドメイン、非触媒的内部ドメイン、およびＣ末端触媒ドメインを包含するポリペプチドを指す。本明細書で論ずるように、野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドはそのアミノ酸配列に相違があり得る。野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドの例は配列番号４８、４９、および６２−６５に示す。野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドは、或る構造に折り畳まれてその結果Ｎ末端とＣ末端ドメインが触媒部位を形成するようになる。非触媒ドメインは隣接ドメインまたはサブドメインとしても知られている。野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドは野生型ＩＭＰＤＨホロ酵素の、または野生型ＩＭＰＤＨ多量体の、単量体ポリペプチドサブユニットである。
【００２１】
本明細書中使用する「修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド」という語は、本明細書で「置換ペプチド」と称するオリゴペプチドで置換された野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドのＩＭＰＤＨサブドメイン（例えば非触媒的内部ドメイン）を有するＩＭＰＤＨポリペプチドを指す。
【００２２】
本明細書中使用する「オリゴペプチドドメイン」という語は、オリゴペプチドが野生型ＩＭＰＤＨサブドメインに取って代わっている、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドにおける領域または部分（例えば非触媒的内部ドメイン）を指す。
【００２３】
本明細書中使用する「置換ペプチド」または「置換オリゴペプチド」または「置換テトラペプチド」または「置換トリペプチド」という語は、野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドのサブドメイン領域に置き換わる、選択された長さと配列を持つペプチド断片を指す。このペプチド断片は該サブドメイン領域よりも小さい（例えば、これは１３３アミノ酸より少ない）。好ましい態様では、このペプチド断片はトリペプチドまたはテトラペプチドである。
【００２４】
本明細書で使用するように、第一のヌクレオチドまたはポリペプチド配列と第二のヌクレオチドまたはポリペプチド配列とを比較し、それらが全く等しい場合、第一の配列は第二の配列に対して配列が「一致」していると言う。
【００２５】
本明細書で使用するように、二つの配列の比較が、それらが低レベルの配列相違を示す時、第一のヌクレオチド配列は第二の参照配列に「類似して」いると言う。例えば、二つの配列間で相違しているヌクレオチドのパーセンテージが約６０％ないし９９．９９％の間である時、二つの配列は互いに類似していると考えられる。
【００２６】
本明細書中使用する「相補的」という語は、プリンおよびピリミジンヌクレオチドが水素結合によって結合して二本鎖核酸分子を形成する能力を指す。以下の塩基対は相補性によって関連している：グアニンとシトシン；アデニンとチミン；ならびにアデニンとウラシル。「相補的」という語は二つの一本鎖核酸分子を含む全ての塩基対に適用する。
【００２７】
本明細書で使用するように、目的とするポリペプチドをコードしている核酸分子は、該核酸分子が、目的とするポリペプチド以外のポリペプチドをコードしている混入核酸分子から実質的に分離している時、「単離されている」と言う。
【００２８】
本明細書で使用するように、目的とするポリペプチドが他の「混入」ポリペプチドから実質上分離している時、該ポリペプチドは「単離されている」と言う。さらに、「単離された」核酸分子またはポリペプチドは、いかに組み立てられまたは合成されようとも、任意のＤＮＡ、ＲＮＡ、またはポリペプチド配列を指す。
【００２９】
本明細書中使用する「天然に存在する」とは、天然に見出されるポリペプチドを指す。
【００３０】
本明細書中使用する「実質上精製された」とは、実質上全ての混入物質（即ち、その特定分子とは異なる物質）が該核酸またはタンパク質から分離された、特定の単離された核酸もしくはポリペプチドまたはそれらの断片を意味する。
【００３１】
アミノ酸残基についての一文字コードは以下のものを包含する：Ａ＝アラニン、Ｒ＝アルギニン、Ｎ＝アスパラギン、Ｄ＝アスパラギン酸、Ｃ＝システイン、Ｑ＝グルタミン、Ｅ＝グルタミン酸、Ｇ＝グリシン、Ｈ＝ヒスチジン、Ｉ＝イソロイシン、Ｌ＝ロイシン、Ｋ＝リジン、Ｍ＝メチオニン、Ｆ＝フェニルアラニン、Ｐ＝プロリン、Ｓ＝セリン、Ｔ＝スレオニン、Ｗ＝トリプトファン、Ｙ＝チロシン、Ｖ＝バリン。
【００３２】
本明細書に記載の発明をより完全に理解するため、以下の説明を開示する。
【００３３】
Ａ． 本発明に係る分子
その様々な態様において、下に詳細に記載するように、本発明は、単離された、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド、核酸分子、組換えＤＮＡ分子、形質転換された宿主細胞、作成方法、検定、免疫療法、トランスジェニック動物、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドのインヒビター（例えば抗体）、免疫学的および核酸に基づく検定、ならびに組成物を提供する。
【００３４】
１． 修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドおよび修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを含む多量体分子
ａ）　　　単離された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド
本発明に係る修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドおよびその断片は、数多くの形で、好ましくは単離された形で具体化できる。本発明に係るポリペプチドは天然合成されたポリペプチドとして、または天然、合成、半合成、または組換えの如何に拘わらず、任意の供給源から単離できる。したがって、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは、任意の種、特に牛、羊、豚、マウス、馬、および好ましくはヒトを包含する哺乳動物由来の天然合成されたタンパク質として単離できる。これとは別に、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは、原核または真核宿主細胞で発現される組換えポリペプチドとして、または合成ポリペプチドとして単離できる。
【００３５】
当業者は、標準的単離法を用いて、本発明に係る方法に従い製造した、単離された修飾ＩＭＰＤＨタンパク質を取得できる。単離の性格と程度は、単離するタンパク質の供給源および意図する用途に依存する。例えば、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９７９） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ． １８３：４８１−４９４およびＫｒｉｓｈｎａｉａｈ（１９７５） Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． １７０：５６７−５７５に記載のような天然に存在する細菌ＩＭＰＤＨタンパク質の単離に使用する方法を用いて細菌宿主細胞から単離できる。別法を用いて真核細胞、例えば植物細胞（Ａｔｋｉｎｓ， ｅｔ ａｌ．，（１９８５） Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２３６：８０７−８１４）またはチャイニーズハムスター細胞（Ｃｏｌｌａｒｔ， ｅｔ ａｌ．，（１９８７） Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． ７：３３２８−３３３１）またはヨシダ肉腫腹水細胞（Ｏｋａｄａ， ｅｔ ａｌ．，（１９８３） Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２７：２１９３−２１９６）またはラット肝癌細胞（Ｉｋｅｇａｍｉ， ｅｔ ａｌ．，（１９８７） Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ４０：２２７７−２２８２）から修飾ＩＭＰＤＨを単離できる。
修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを作製する方法を下に詳細に述べる。
【００３６】
ａ）　　精製された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド
本発明に係る修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドおよびその断片は精製された形態で単離できる。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは、ＩＭＰまたは抗ＩＭＰＤＨ抗体を用いる親和クロマトグラフィー（Ｍａｒｃｈａｋ，Ｄ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， １９９６ ｉｎ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎ．Ｙ．）を包含する当分野で周知の方法によって精製できる。単離および精製の性格と程度は意図する用途に依存する。例えば、精製された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは、この修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドに対する抗体またはリガンドの結合を損なう分子またはその他のタンパク質を実質上含まないであろう。
【００３７】
ｃ）　　　結晶化された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド
本発明に係る修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドおよびその断片は、当分野で周知の方法（Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５， ６９９０−６９９７）を用いて結晶形で単離できる。
【００３８】
ｄ）　　　修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは置換されたサブドメインを持つ
本発明は、野生型ＩＭＰＤＨのＮ末端触媒コアドメイン；野生型ＩＭＰＤＨサブドメイン領域に取って代わっている、または該サブドメイン領域内の或る領域に取って代わっている内部置換オリゴペプチドドメイン；野生型ＩＭＰＤＨのＣ末端触媒コアドメイン、をそれぞれ包含する修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを提供する。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドのＮおよびＣ末端触媒コアドメインは、種々の供給源、例えばＧｅｎＢａｎｋ， ＥＣ１．１．１．２０５、または国際公開第ＷＯ９４／２４２６４号由来のＩ型またはＩＩ型の野生型配列を含むことができる。さらにこのＮまたはＣ末端配列は、Ｃｏｌｌａｒｔ，Ｆ．Ｒ． ａｎｄ Ｈｕｂｅｒｍａｎｎ，Ｅ． １９８８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３：１５７６９−１５７７２またはＮａｔｓｕｍｅｄａ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ． １９９０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６５：５２９２−５２９５に記載の配列と同一の配列、または本明細書の配列番号４８、４９、および６２−６５に明記する配列を包含できる。野生型サブドメイン領域に取って代わるオリゴペプチド（図３）は一般に「置換オリゴペプチド」と呼ばれ、より詳細には、そのオリゴペプチドの長さに応じて「置換トリペプチド」または「置換テトラペプチド」と呼ばれる。
【００３９】
置換オリゴペプチドの目的は、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの全体の長さを短縮し、インヒビター、例えばＭＰＡと複合体形成した修飾ＩＭＰＤＨ多量体のＸ線結晶構造のより良好な解析を得ることである。さらに、置換オリゴペプチドの配列と長さは、折り畳まれたＩＭＰＤＨポリペプチドおよび多量体がＩＭＰＤＨのインヒビターに結合し、そして／または野生型ＩＭＰＤＨの機能的活性（例えば、ＮＡＤＨを産生する）を保持することを可能にするように選択する。
【００４０】
本発明はさらに、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの断片［ここでこの断片は野生型ＩまたはＩＩ型ＩＭＰＤＨのサブドメイン領域に取って代わる置換オリゴペプチドを含んでいる］を提供する。
【００４１】
かつて決定された野生型ヒトＩ型（Ｎａｔｓｕｍｅｄａ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ． １９９０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６５：５２９２−５２９５；配列番号６５；Ｇｕ ｅｔ ａｌ．， １９９７ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７２：４４５８−４４６６（配列番号６２）；およびＤａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ． １９９４ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：９８４（配列番号６４））またはＩＩ型（図２；配列番号４９）（Ｎａｔｓｕｍｅｄａ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ． １９９０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６５：５２９２−５２９５；Ｃｏｌｌａｒｔ，Ｆ．Ｒ． ａｎｄ Ｈｕｂｅｒｍａｎｎ，Ｅ． １９８８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３：１５７６９−１５７７２；および米国特許第５６６５５８３号（配列番号６３）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０：６８０８−６８１４（１９９５）；およびＧｌｅｓｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ５３７−５４４（１９９４））ＩＭＰＤＨポリペプチドのアミノ酸配列を使用して野生型サブドメイン領域を位置決定できる。または、配列番号４８、４９または６２−６５に示すアミノ酸配列を使用してサブドメイン領域を位置決定できる。別法として、野生型チャイニーズハムスターＩＭＰＤＨ（Ｃｏｌｌａｒｔ，Ｆ．Ｒ． ａｎｄ Ｈｕｂｅｒｍａｎｎ，Ｅ． １９８８ 上記）、または原核生物およびその他の真核生物由来の野生型ＩＭＰＤＨタンパク質のアミノ酸配列を使用して、野生型サブドメイン領域を位置決定できる。
【００４２】
例えば、修飾されたヒト野生型ＩＩ型ＩＭＰＤＨポリペプチドは、（１）残基１−１１０を包含するＮ末端触媒コアドメイン；（２）オリゴペプチドで置換された、残基Ｇｌｕ１１１−Ｇｌｎ２４３を包含する非触媒的内部サブドメイン；および（３）残基２４４−５１４を包含するＣ末端触媒コアドメイン、を包含するが、これらに限定されない。したがって、置換オリゴペプチドは、二つの触媒コアドメイン（１および３）を連結して、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの全体の長さを野生型ＩＩ型ＩＭＰＤＨに比して短縮している（図４、６、８、１０、１３、１５、または１７）。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの長さは該オリゴペプチドの長さに依存する。例えば、該オリゴペプチドがトリペプチドであるならば、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは３８４アミノ酸残基長である。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドが折り畳まれて機能的に触媒コアを形成するよう、置換オリゴペプチドの好ましい配列と長さを選択する。この折り畳まれた修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドはＩＭＰＤＨ活性（例えばＮＡＤＨを産生する）のインヒビターに結合する。
【００４３】
ｅ）　　　置換オリゴペプチドのサイズ
本発明は、約３ないし１０アミノ酸残基長の置換オリゴペプチドを含む修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを提供する。或る好ましい態様は、トリペプチドである置換オリゴペプチドを含む修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを提供する。また、或る好ましい態様は、テトラペプチドである置換オリゴペプチドを含む修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを提供する。
【００４４】
ｆ）　　　置換オリゴペプチドの配列
本発明はさらに、配列番号１−１０に記載する置換トリペプチド配列のいずれか１つとアミノ酸配列一致を有する置換オリゴペプチドを含む修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド（配列番号２０−３０）を提供する。例えば、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは、配列（一文字アミノ酸コード）：ＤＫＴ、ＴＰＩ、ＳＰＳ、ＳＡＨ、ＫＰＩ、ＩＶＤ、ＡＬＦ、ＳＰＴ、ＧＧＹまたはＧＳＧ、のいずれか１つを有する置換トリペプチドを含むことができる（配列番号１−１０）。好ましい態様は、異なる置換トリペプチドをそれぞれ含む修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド、例えばＩ型ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴ（図１７、配列番号３０）またはＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴ（図４、配列番号２０）、またはＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＳＰＳ（図６、配列番号２２）、ＩＭＰＤＨ−ＳＰＴ（図１０、配列番号２７）、およびＩＭＰＤＨ−ＧＳＧ（図８、配列番号２９）を提供する。
【００４５】
本発明は、配列番号１１−１９に記載する置換テトラペプチド配列のいずれか１つとアミノ酸配列一致を有する置換オリゴペプチドを含む、さらなる修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド（配列番号３１−３９）を提供する。例えば、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは、配列：ＧＳＳＷ、ＱＰＱＳ、ＮＩＩＰ、ＳＰＴＱ、ＴＲＹＴ、ＡＧＲＰ、ＮＧＱＹ、ＮＳＰＬ、またはＹＧＴＷ、のいずれか１つを有する置換テトラペプチドを含むことができる（配列番号１１−１９）。好ましい態様は、置換テトラペプチドを含む修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド、例えばＩＭＰＤＨ−ＡＧＲＰ（図１３、配列番号３６）を提供する。
【００４６】
ｇ）　　　置換オリゴペプチドの変異体配列
本発明はさらに、本明細書に記載する置換トリまたはテトラペプチド領域の配列変異を有する、置換オリゴペプチド領域を含む修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを提供する。例えば、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの変異体は、配列番号１−１０または配列番号１１−１９にそれぞれ記載の置換トリまたはテトラペプチド配列と、１またはそれ以上のアミノ酸置換によって相違しているかも知れない。このアミノ酸置換は、置換されたアミノ酸が類似の構造的または化学的性質を持つ、保存的変化、例えばロイシンからイソロイシンへの置換であるかも知れない。変異体はまた、非保存的変化、例えばグリシンからトリプトファンへの置換であるかも知れない。置換オリゴペプチド領域においてどの、そして幾つのアミノ酸残基を変化させ得るかを決定する指針は、折り畳まれた野生型哺乳動物ＩＭＰＤＨ多量体中のサブドメインが及んでいる距離で見出すことができる［ここで、この及んでいる距離は、予想（例えばアミノ酸配列に基づいて）および／または実験（例えば、Ｘ線結晶学に基づいて）によって誘導する］。好ましくはアミノ酸は、及んでいる距離が、野生型サブドメインの及んでいる距離と一致または殆ど一致するように変化させる。
【００４７】
当業者には周知であるように、ポリヌクレオチド配列は、そのポリペプチドのコンホメーションまたは機能を変化させることなくアミノ酸置換をコードすることができる。本発明に関して、アミノ酸置換は、置換オリゴペプチド、または該ポリペプチドの任意の部分（例えば、Ｎ末端触媒ドメイン、サブドメインまたはＣ末端触媒ドメイン）に起こり得る。保存的アミノ酸変化は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）のいずれかで、これら疎水性アミノ酸のうち他のいずれかを置換すること；アスパラギン酸（Ｄ）でグルタミン酸（Ｅ）を置換、またはその逆；グルタミン（Ｑ）でアスパラギン（Ｎ）を置換、またはその逆、ならびにセリン（Ｓ）でスレオニン（Ｔ）を置換、またはその逆が包含されるがこれらに限定される訳ではない。個々のアミノ酸の環境およびタンパク質の三次元構造内でのその役割に応じて、他の置換もまた保存的であると考えられる。例えば、グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）、またはグリシン（Ｇ）とセリン（Ｓ）は互換性のあることが多く、アラニン（Ａ）とバリン（Ｖ）もまた同様である。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）は、しばしばロイシンおよびイソロイシンと、そして時にはバリンと相互交換できる。リジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）はしばしば位置を相互交換することができ、ここで、アミノ酸残基の重要な特徴はその電荷であって、これら二つのアミノ酸残基の相違するｐＫは重要でない。特別な環境では、さらなるその他の変化も「保存的」であると考えることができる。
【００４８】
本発明のさらなる態様では、アミノ酸置換は「非保存的」であってよい。例には、アスパラギン酸（Ｄ）をグリシン（Ｇ）で置換；アスパラギン（Ｎ）をリジン（Ｋ）で置換；またはアラニン（Ａ）をアルギニン（Ｒ）で置換、が包含されるが、これらに限定されない。
【００４９】
さらに本発明は、置換オリゴペプチド領域（例えば、置換トリペプチドまたは置換テトラペプチド）を含み、且つＮ末端触媒ドメインおよび／またはＣ末端触媒ドメインに配列変異を有する、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを提供する。好ましくは、このような置換は野生型または修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの機能的活性を変化させない。Ｎ末端触媒ドメインの変異の例は配列番号６２に示す。特に、２９位のアスパラギン酸（Ｄ）（Ｄ２９；配列番号４８）をグリシン（Ｇ）に置換できる。加えて、１０９位のアスパラギン（Ｎ）（Ｎ１０９；配列番号４８）はリジン（Ｋ）に置換できる。当業者には理解できるであろうが、かなりの数のアミノ酸を単独、または他のアミノ酸と組み合わせて変化させることができ、尚且つそのポリペプチドは機能的活性を保持できる（例えば、本明細書に記載のように、アミノ酸置換を有するＩＭＰＤＨポリペプチドはＮＡＤＨ産生を調節する能力を保持する）。したがって、野生型または修飾ＩＭＰＤＨと同様に機能するいかなる分子も、本明細書に記載の発明の実施に使用できる。
【００５０】
Ｎａｔｓｕｍｅｄａ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６５：５２９２−５２９５（１９９０）；Ｃｏｌｌａｒｔ，Ｆ．Ｒ． ａｎｄ Ｈｕｂｅｒｍａｎｎ，Ｅ． １９８８ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３：１５７６９−１５７７２；および米国特許第５６６５５８３号；Ｇｕ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７２：４４５８−４４６６（１９９７）；Ｄａｙｔｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：９８４（１９９４）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０：６８０８−６８１４（１９９５）；およびＧｌｅｓｎｅ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， ５３７−５４４（１９９４）に、異なるヌクレオチドまたはアミノ酸配列のＩＭＰＤＨの例を見出すことができる。これらのアミノ酸配列もまた本明細書で配列番号６２−６５に示す。
【００５１】
置換トリペプチド領域（例えばＤＫＴ）に保存的アミノ酸置換を有する、本発明に係るＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドの変異体の特別な例は、（一文字コードで）ＧＫＴ、ＤＲＴ、ＤＫＧ、またはＧＲＳを包含するがこれらに限定されない。当業者は置換オリゴペプチド配列のその他の変異体を容易に予想できる。
【００５２】
ｈ）　　　変化させたアミノ酸類似体またはポリペプチド
本発明はさらに、アミノ酸類似体を含む修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを提供する。このアミノ酸類似体は化学合成でき、右旋体もしくは左旋体、または擬似ペプチドを包含する。さらに本発明は、例えば翻訳後経路または化学合成によって変化させた、Ｎ−またはＯ−グリコシル化アミノ酸残基を含む本発明に係るポリペプチドを提供する。該ポリペプチドのＮ末端は、アシル化またはアルキル化された残基を含むよう変化させることができる。該ポリペプチドのＣ末端は、エステル化またはアミド化残基を含むよう変化させることができる。非末端アミノ酸残基を変化させることができ、これは、アミノ酸アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、プロリン、グルタミン酸、リジン、セリン、スレオニン、チロシン、ヒスチジン、およびシステインの変化を包含するがこれらに限定されない。
【００５３】
ｈ）　　　置換オリゴペプチドの及んでいる距離
本発明は、折り畳まれた野生型哺乳動物ＩＭＰＤＨポリペプチド中のサブドメインの距離に及んでいる置換オリゴペプチドを含む修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド、または、互いに結合している折り畳まれた修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを複数含んでいるＩＭＰＤＨ多量体［その結果、この折り畳まれたＩＭＰＤＨポリペプチドは野生型ＩＭＰＤＨの機能的活性を示し、そして／またはＩＭＰＤＨのインヒビターに結合する］を提供する。
【００５４】
折り畳まれた野生型ＩＭＰＤＨポリペプチド中のサブドメインが及んでいる距離は、野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドのアミノ酸配列から予想でき、そして／または野生型ＩＭＰＤＨポリペプチド単量体または野生型ＩＭＰＤＨ多量体または野生型ＩＭＰＤＨホロ酵素のＸ線結晶構造から実験的に取得できる。
【００５５】
例えば、ヒトＩ型（Ｎａｔｓｕｍｅｄａ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ． １９９０ 上記）および／またはＩＩ型（Ｃｏｌｌａｒｔ，Ｆ．Ｒ．， ａｎｄ Ｈｕｂｅｒｍａｎｎ，Ｅ． １９８８ 上記；Ｎａｔｓｕｍｅｄａ，Ｙ．， ｅｔ ａｌ． １９９０ 上記）ＩＭＰＤＨポリペプチドのアミノ酸配列は、折り畳まれたヒト野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドのサブドメインが及んでいる距離を予想する根拠に使用できる。残基Ｇｌｕ１１１−Ｇｌｎ２４３を包含している野生型ヒトＩＩ型ＩＭＰＤＨポリペプチドのサブドメインは、１３３アミノ酸残基の直線長さに及んでいる（配列番号６１）。
【００５６】
ＩＭＰＤＨのＸ線結晶構造もまた、折り畳まれたＩＭＰＤＨポリペプチド中のサブドメインが及んでいる距離を予想するのに使用できる。例えば、ＩＭＰおよびＭＰＡと複合体形成している野生型チャイニーズハムスターＩＭＰＤＨホロ酵素のＸ線結晶構造が過去に決定されており、このサブドメインの寸法がほぼ２０ ｘ ２０ ｘ ４０オングストロームである事、そしてＧｌｕ１１１−ＣＡからＧｌｎ２４３−ＣＡ（例えば、ＣＡは各アミノ酸残基について炭素α原子である）までのサブドメインが及んでいる距離が約５．１オングストロームである事が示されている（Ｍ．Ｄ．Ｓｉｎｔｃｈａｋ， ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｃｅｌｌ ８５：９２１−９３０）。ヒトＩＭＰＤＨのＸ線結晶構造もまた決定されており、Ｇｌｕ１１１−ＣＡからＧｌｎ２４３−ＣＡまでの距離は約５．５オングストロームである（Ｃｏｌｂｙ，Ｔ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， １９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：３５３１）。折り畳まれたＩ型ＩＭＰＤＨのサブドメインが及んでいる距離はおよそ５オングストロームであると仮定できる。
【００５７】
本発明は、ＭＰＡに結合した本発明に係るＩＭＰＤＨ−ＤＫＴ多量体中の置換トリペプチドの長さが及んでいる距離は、Ｘ線結晶データからの決定によると約５オングストロームであるという発見を提供する。
【００５８】
本発明の或る態様は、約４．８ないし６．０オングストロームの間の距離に及んでいる置換オリゴペプチドをそれぞれ含む修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを提供し、この距離は、折り畳まれた野生型哺乳動物ＩＭＰＤＨポリペプチド単量体または折り畳まれた野生型哺乳動物ＩＭＰＤＨ多量体のサブドメイン領域の距離の範囲である。より好ましい態様は、約５．０および５．２オングストロームの間の距離に及んでいる置換オリゴペプチドをそれぞれ含む修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを提供する。
【００５９】
ｈ）　　　修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド由来の多量体型
本発明は、互いに結合している複数の修飾Ｉ型および／またはＩＩ型ヒトＩＭＰＤＨポリペプチドを含む、本明細書で修飾ＩＭＰＤＨ多量体と称する多量体ＩＭＰＤＨ分子を提供する。この修飾ＩＭＰＤＨ多量体は、他の構成成分、例えばカリウムイオンを含んでいてもいなくてもよい。したがって、修飾ホモ多量体ＩＭＰＤＨ分子は、複数のＩ型またはＩＩ型修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを含むことができる。同様に、修飾ヘテロ多量体ＩＭＰＤＨ分子は、Ｉ型およびＩＩ型修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの組み合わせを含むことができる。
【００６０】
例えば、ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴ、−ＳＰＳ、−ＳＰＴ、および−ＡＧＲＴ多量体を包含する、特定の修飾されたＩＩ型ヒトＩＭＰＤＨポリペプチドを各々に複数含む、修飾ホモマーＩＭＰＤＨ分子が単離された。
【００６１】
修飾ＩＭＰＤＨ多量体は２ないし８個の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを含むことができる（Ｃａｒｒ，Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， １９９３ 上記）。本発明の或る態様は、２個の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを有する修飾ＩＭＰＤＨ多量体（例えば二量体）を提供する。より好ましい態様は４個の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを有する修飾ＩＭＰＤＨ多量体（例えば四量体）を包含し、そして最も好ましい態様は、８個の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを有する修飾ＩＭＰＤＨ多量体（例えば八量体）を包含する。
【００６２】
修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは、適当な緩衝溶液、例えば２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２；３００ｍＭ ＫＣｌ；１０％グリセロール；１ｍＭ ＥＤＴＡ；および２ｍＭ ＤＴＴを含有する溶液中で多量体分子を形成できる（Ｂｒａｎｄｏｎ Ｃ． ＆ Ｔｏｏｚｅ Ｊ． １９９１ ｉｎ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．， Ｌｏｎｄｏｎ））。
【００６３】
溶液中での四量体および八量体の形成は、静的および動的光散乱（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ，Ｄ． １９８２ ｉｎ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）、および分析用超遠心分離（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ． １９９０ ｉｎ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を包含する種々の方法によって測定できる。これに代わる方法は、天然ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル電気泳動およびゲル透過クロマトグラフィーを包含する（ｅｄ． Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ，Ｄ． １９８２ ｉｎ： Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ； Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ； ｅｄ． Ｏｌｉｖｅｒ，Ｒ．Ｗ．Ａ． １９８９ ｉｎ： ＨＰＬＣ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ： ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）。
【００６４】
例えば、ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴ、−ＳＰＳ、−ＳＰＴ、および−ＡＧＲＰ多量体は、分析用ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定したところ、二量体と四量体という多量体型の間で動的平衡にあるように見受けられる（ｅｄ． Ｏｌｉｖｅｒ，Ｒ．Ｗ．Ａ． １９８９ ｉｎ： ＨＰＬＣ ｏｆ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ： ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ））。
【００６５】
ｈ）　　　修飾ＩＭＰＤＨ多量体は機能的活性を示す
本発明は、野生型ＩＭＰＤＨホロ酵素の機能的活性を示す修飾ＩＭＰＤＨ多量体を提供する。例えば、野生型哺乳動物ＩＭＰＤＨホロ酵素は、ＩＭＰの存在下でＮＡＤからＮＡＤＨへの変換を触媒する。したがって、本発明に係る多量体分子はＩＭＰの存在下でＮＡＤＨの産生を触媒する。当業者は、本明細書に記載の、またはＳ．Ｆ．Ｃａｒｒ， ｅｔ ａｌ（１９９３） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：２７２８６−２７２９０およびＢ．Ｘｉａｎｇ， ｅｔ ａｌ．（１９９６） Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７１：１４３５−１４４０に記載のインビトロ法を用いてＮＡＤＨの産生について修飾ＩＭＰＤＨ多量体を容易に検定することができる。
【００６６】
例えば、修飾ＩＭＰＤＨ多量体および野生型ヒトＩＩ型ＩＭＰＤＨホロ酵素が産生するＮＡＤＨの量は３７℃で３４０ｎｍ（ε＝６２２０Ｍ−１ｃｍ−１）の分光光度測定によって比較できる（Ｃａｒｒ，Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， １９９３ 上記）。
【００６７】
別法として、本発明に係る多量体分子の機能的活性は、ＨＰＬＣ分析と分光光度検定を用いてＩＭＰおよびＮＡＤからのＸＭＰおよびＮＡＤＨの産生を測定することによって分析できる（Ｍｏｎｔｅｒｏ，Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｃｌｉｎｉｃａ Ｃｈｅｍｉｃａ Ａｃｔａ ２３８：１６９−１７８）。
【００６８】
ｈ）　　　修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドに及ぼすＭＰＡおよび／またはその他の化合物の
阻害効果
本発明は、野生型哺乳動物ＩＭＰＤＨホロ酵素の活性を阻害することが分かっている化合物により阻害される、野生型ＩＭＰＤＨホロ酵素の機能的活性を有する、修飾ＩＭＰＤＨ多量体を提供する。例えば、ＭＰＡは、ＩＭＰＤＨホロ酵素活性の非競合的インヒビターである化合物であって、ＮＡＤからＮＡＤＨへの変換を阻害する（Ｔ．Ｊ．Ｆｒａｎｋｌｉｎ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｃｏｏｋ １９６９ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． １１３：５１５−５２４）。これに代わる化合物には、ラパミシン、ならびに競合的インヒビターであるヌクレオシド類似体、例えばチアゾフリン、リバビリンおよびミゾリビンが包含される（Ｈｅｄｓｔｒｏｍ，Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， １９９０ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：８４９−８５４； Ｃｏｏｎｅｙ，Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， １９８２， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ． ３１：２１３３−２１３６； Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， １９７４：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．， ２３：２７２７−２７３５； Ｋｏｙａｍａ，Ｈ． ＆ Ｔｓｕｊｉ，Ｍ．， １９８３， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．， ３２：３５２７−３５５３）。
【００６９】
典型的には、推定阻害化合物の効果を評価する方法は以下の工程を含む：適当な濃度のＩＭＰ、ＮＡＤ、緩衝液、および評価すべき化合物をそれぞれ入れた別々の反応容器に、野生型ホロ酵素および修飾ＩＭＰＤＨ多量体を入れ；反応容器の内容物を適当なインキュベート条件の下で充分な時間反応させ；そして、各反応容器内で生成したＮＡＤＨの量を当分野で既知の方法によって監視し；野生型ホロ酵素が産生したＮＡＤＨの量を、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドが産生した量と比較して、該化合物に対する修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの相対感受性を決定する。
【００７０】
例えば、修飾ＩＭＰＤＨ多量体の機能的活性（例えばＮＡＤＨ産生）に及ぼすＭＰＡの阻害効果を、連続希釈法と定常状態酵素動力学法を用いて決定できる（Ｓ．Ｆ．Ｃａｒｒ， ｅｔ ａｌ． １９９３ 上記；Ｂ．Ｘｉａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， １９９６ 上記）。
【００７１】
２． 修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしている核酸分子
本発明は、本明細書中「修飾ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列」と称する、本発明に係る修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を有する、様々な単離された、そして組換えの核酸分子を提供する。本発明はさらに、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド断片、および関連ポリヌクレオチド分子、例えば修飾ＩＭＰＤＨに相補的なポリヌクレオチド配列またはその一部、および本発明に係る核酸分子とハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を提供する。
【００７２】
本明細書中、本発明に係る核酸分子とも称する修飾ｉｍｐｄｈポリヌクレオチドは、好ましくは単離形態であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、および関連分子、ならびにそれらの断片を包含するが、これらに限定される訳ではない。特に考えられるのは、ゲノムＤＮＡ、リボザイム、およびアンチセンス分子、ならびに代替バックボーンに基づく核酸、または天然起源から誘導されているか合成されたものであるかに拘わらず代替塩基を含んでいる核酸である。
【００７３】
ａ）　　　本発明に係る単離されたポリヌクレオチド配列
本発明は、多くの形態に具体化される、好ましくは単離形態の、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたはその断片をコードしているポリヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する。本発明に係るｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列は、天然合成ポリヌクレオチドとして、または天然、合成、半合成、もしくは組換えの如何に拘わらず、任意の供給源から単離することができる。したがって、修飾ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列は、任意の種、特に、牛、羊、豚、マウス、馬、および好ましくはヒトを包含する哺乳動物から単離できる。ｉｍｐｄｈポリヌクレオチドの単離には標準法を使用でき、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｃｈ， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。
【００７４】
例えば、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列は、野生型ＩＭＰＤＨタンパク質をコードしているｃＤＮＡクローンを単離し、次いで組換えＤＮＡ技術を用いて、サブドメイン配列を置換オリゴペプチドをコードしているヌクレオチド配列で置換するよう、このｃＤＮＡクローンを操作することによって作製できる。この組換えＤＮＡ法は例えばＰＣＲ技術を包含する（米国特許第４６０３１０２号）。
【００７５】
ａ）　　　本発明に係る修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしているポリヌクレオチ
ド配列
本発明は、本発明に係る修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列を有する、単離された核酸分子を提供する。例えば本発明は、配列番号４０−４４に記載の置換トリペプチドを有する修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列のいずれかと配列一致を有する、単離された核酸分子を提供する。これとは別に本発明は、配列番号４５−４７に記載の置換テトラペプチドを有する修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列のいずれかと配列一致を有する、単離された核酸分子を提供する。
【００７６】
ｃ）　　　修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの断片をコードしている核酸配列
本発明はさらに、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの一部または断片をコードしているポリヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する。ポリヌクレオチド断片のサイズはその意図する用途によって決定する。例えば、核酸プローブまたはＰＣＲプライマーとして使用する断片の長さは、プロービングまたはプライミング中に比較的少数の偽陽性が得られるように選択する。これとは別に、修飾ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列の断片を使用して、異なる配列と融合する修飾ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列を有する組換え融合遺伝子、例えば、発現されたポリペプチドの単離および／または精製を促進するヒスチジンタグをコードしているヌクレオチド配列を組み立てることができる。
【００７７】
本発明に係るプローブ、プライマー、および断片は、例えばゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニング、または遺伝子発現の分析手段としてのｍＲＮＡ種の検出および定量を包含する様々な分子生物学的技術にとって有用である。好ましくはこのプローブおよびプライマーはＤＮＡである。理論的および実用的理由により、少なくとも１５塩基対の長さのプローブまたはプライマーが示唆される（Ｗａｌｌａｃｅ ａｎｄ Ｍｉｙａｄａ １９８７ ｉｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５２：４３２−４４２， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。本発明に係るプローブとプライマーは当業者に周知の方法により製造できる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９８９　上記、を参照されたい）。好ましい態様では、このプローブおよびプライマーは米国特許第４６８３２０２号に開示のポリメラーゼ連鎖反応によって合成する。
【００７８】
本発明の或る態様は、本発明に係る核酸分子またはその任意の特定部分の特異的増幅を可能にする、修飾ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列に相補的な核酸プライマーを提供する。
【００７９】
ｄ）　　　修飾ｉｍｐｄｈ配列に相補的な配列
本発明は、本発明に係るヌクレオチド配列、例えば配列番号４０−４７に記載の配列に相補的なポリヌクレオチド配列を包含する。
【００８０】
ｄ）　　　ｉｍｐｄｈ配列とハイブリダイズできる配列
本発明は、高度緊縮ハイブリダイゼーション条件下で修飾ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列、例えば配列番号４０−４７に記載の配列と選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を有する核酸分子を提供する。典型的には、標準的高度緊縮条件下のハイブリダイゼーションは、互いに相補的な二つの核酸分子（例えば１００％の正確な相補性）、または互いに殆ど相補的な二つの核酸分子（例えば約７０％ないし９９％一致する、例えばホモローガス配列）の間で起こる。核酸分子間の高度緊縮ハイブリダイゼーションは、例えば相同性の程度、ハイブリダイゼーションの緊縮性、およびハイブリダイズする鎖の長さに依存するということが、当業者にとっては容易に明らかである。
【００８１】
非ホモローガス塩基の対合を嫌う高度緊縮ハイブリダイゼーション条件は当分野で周知である。典型的には、高度緊縮ハイブリダイゼーション条件とは、５Ｘ ＳＳＰＥおよび５０％ホルムアミド中５０℃ないし６５℃でのハイブリダイズ、および０．５Ｘ ＳＳＰＥ中での５０℃ないし６５℃での洗浄を含む。典型的な低緊縮条件は、５Ｘ ＳＳＰＥおよび４０％ないし４５％ホルムアミド中３５℃ないし３７℃でのハイブリダイズ、および１−２Ｘ ＳＳＰＥ中での４２℃での洗浄を含む。
【００８２】
高度緊縮ハイブリダイゼーション法のための条件と手順は当分野でよく知られており、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ； Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｃｈ， ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓから容易に得られる。
【００８３】
ｄ）　　　修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしているコドン使用頻度変異体
開示されたヌクレオチド配列とは異なっているが、コードされているアミノ酸配列は変化させない、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドのコドン使用頻度変異体を作製することが有利であるかも知れない。例えば、宿主細胞が利用するコドンの頻度に従って、特定の原核または真核発現宿主における修飾ｉｍｐｄｈ転写物または修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの産生レベルを最適化するよう、コドンを選択することができる。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を変化させる別の理由は、より望ましい性質、例えば増大した半減期を有するＲＮＡ転写物の産生を包含する。遺伝コードの縮重の結果、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしている沢山の変異体ヌクレオチド配列が単離できる。したがって本発明は、開示されている修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドのアミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列の可能な全組み合わせを産生する全ての可能なトリプレットコドンの選択を企図している。本発明の或る態様は、単離されたヌクレオチド配列が配列番号４０−４７に記載の配列と異なっており、その結果、各々の変異体ヌクレオチド配列が、配列番号２０、２２、２７、２９、３０、３４、３６、または３８に記載の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドのアミノ酸配列とそれぞれ配列一致を有するポリペプチドをコードしているような、単離されたヌクレオチド配列を提供する。
【００８４】
アミノ酸コード化配列は以下の通りである：
2004514409.tif 000003
【００８５】
ｇ）　　　修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしているＲＮＡ分子
本発明は、配列番号２０−３９に記載の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたはその断片をコードしている、単離されたＲＮＡ分子を提供する。特に、本発明に係る、完全長または部分的ｍＲＮＡ分子、または修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしているＲＮＡオリゴマーが単離できる。このＲＮＡ分子は、天然に存在する分子として単離でき、または組換えＤＮＡ技術もしくは化学合成によって製造できる。本発明に係るＲＮＡ分子は、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの全体または一部をコードしているヌクレオチド配列をそれぞれ包含する。本発明に係るＲＮＡ分子は、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の検出のためのハイブリダイズする核酸プローブとして有用である。
【００８６】
ｈ）　　　修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしている、標識した核酸分子
修飾ＩＭＰＤＨポリヌクレオチド配列を有する核酸分子は検出可能なマーカーで標識することができる。この標識化ＩＭＰＤＨポリヌクレオチド配列は、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしている核酸分子の検出のためのハイブリダイズ可能な核酸プローブとして使用できる。検出可能なマーカーの例は、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、生物発光化合物、化学ルミネセンス化合物、金属キレート化剤または酵素を包含するがこれらに限定されない。標識化ＤＮＡおよびＲＮＡプローブを製造する技術は当分野でよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ， ｅｔ ａｌ．， １９８９ 上記）。
【００８７】
ｉ）　　　修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の変異体
本発明は、配列番号４０−４７に記載の配列とは異なる修飾ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列を提供する。この変異体ポリヌクレオチド配列は、天然に存在する供給源から単離、または組換えＤＮＡ技術によって製造することができる。変異体ポリヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２０、２２、２７、２９、３０、３４、３６、または３８に記載の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしている。
【００８８】
この修飾ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列は、置換トリまたはテトラペプチド領域に保存的または非保存的変化を有する修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしている。例えば、変異体ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列は、置換オリゴペプチド領域に保存的アミノ酸変化、例えばロイシンからイソロイシンへの置換を有する修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの変異体をコードすることができる。別の態様では、ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド変異体は非保存的変化、例えばグリシンからトリプトファンへの置換を有することができる。
【００８９】
ポリヌクレオチド配列は、該ポリペプチドのコンホメーションまたは機能のいずれも変化させることなく保存的アミノ酸置換をコードすることができる。このような変化は、イソロイシン（Ｉ）、バリン（Ｖ）、およびロイシン（Ｌ）のいずれかをこれら疎水性アミノ酸のうち別のアミノ酸に；グルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｅ）に、そしてその逆；アスパラギン（Ｎ）をグルタミン（Ｑ）に、そしてその逆；そしてスレオニン（Ｔ）をセリン（Ｓ）に、そしてその逆に置換することを包含する。特定のアミノ酸の環境およびタンパク質の三次元構造内でのその役割に応じて、その他の置換もまた保存的であると考えることができる。例えば、グリシン（Ｇ）とアラニン（Ａ）はしばしば相互交換可能であり、アラニン（Ａ）とバリン（Ｖもまた同様である。比較的疎水性であるメチオニン（Ｍ）はしばしばロイシンおよびイソロイシンと、そして時にバリンと交換できる。リジン（Ｋ）とアルギニン（Ｒ）はしばしば位置を交換でき、この場合、該アミノ酸残基の重要な特徴はその電荷であって、これら二つのアミノ酸残基のｐＫの相違は重要でない。特別な環境ではさらに別の変化も保存的と考えることができる。
【００９０】
ｊ）　　　修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしている誘導体核酸分子
本発明に係る核酸分子はまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡと塩基対依存的様式で特異的に結合するホスホロチオアート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダイト、およびメチルホスホナートといった誘導体分子を包含する（Ｚａｍｅｃｎｉｋ，Ｐ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， １９７８ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ７５：２８０２８４；Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，Ｐ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， １９８６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ８３：４１４３−４１４６）。
【００９１】
ＰＮＡ分子は、リジンのようなアミノ酸残基およびアミノ基が付加した核酸オリゴマーを含む。抗遺伝子物質とも呼称されるこれらの小分子は、核酸の相補的（鋳型）核酸鎖に結合することによって転写物の伸長を停止させる（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．， ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ ８：５３−６３）。例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびそれらの類似体の合成法についての総説は、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ， ｅｄｓ． Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ， １９９１， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ； Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ｅｄ． Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ， １９８４， ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， Ｅｎｇｌａｎｄに見出すことができる。加えて、アンチセンスＲＮＡ技術のための方法は米国特許５１９４４２８および５１１０８０２に記載されている。当業者は本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を用いてこれらのクラスの核酸分子を容易に取得できる。例えばＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９２） Ｅｇｈｏｌｍ， ｅｔ ａｌ． ｐｐ３２５−３２８または米国特許第５５３９０８２号を参照されたい。
【００９２】
３． 修飾ＩＭＰＤＨ配列を含む組換え核酸分子および宿主ベクター系
本発明は、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド配列またはその断片をコードしている組換え核酸分子、例えば組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）を提供する。本明細書中使用するｒＤＮＡ分子とは、インビトロでの分子操作に付されたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子の製造方法は当分野で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８９）を参照されたく、その方法は修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの産生にとって有用である。
【００９３】
本発明に係る核酸分子は、異なる配列に結合した修飾ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列をそれぞれ含む組換え分子であってよい。例えば、修飾ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列は、組換えベクターを生成するためのベクターに機能的に結合していてよい。
【００９４】
ａ）　　　修飾ｉｍｐｄｈ配列を含むベクター
ベクターという語は、プラスミド、コスミド、およびファグミド（ｐｈａｇｍｉｄ）を包含するがこれらに限定されない。自律的に複製するベクターは、典型的には、適当な宿主細胞内でのｒＤＮＡの複製を指令するレプリコンを含む核酸分子を指す。好ましいベクターはまた、発現調節要素、例えばプロモーター配列を含み、これは挿入された修飾ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列の転写を可能にし、適当な宿主細胞、例えばＥ．ｃｏｌｉ中で機能的に結合した修飾ＩＭＰＤＨ配列の発現（例えば、転写および／または翻訳）の調節に用いられる。原核生物発現調節要素は当分野で知られており、誘導的プロモーター、構成的プロモーター、分泌シグナル、エンハンサー、転写ターミネーター、およびその他の転写調節要素を包含するがこれらに限定されない。翻訳に関与するその他の発現調節要素が当分野で知られており、シャイン−ダルガルノ配列、ならびに開始および停止コドンを包含する。
【００９５】
好ましいベクターはさらに、薬物耐性、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン耐性を付与する遺伝子産物をコードしている少なくとも１個の選択可能マーカー遺伝子を含む。典型的には、ベクターは、外因性ＤＮＡ配列の都合良い挿入を可能にする複数のエンドヌクレアーゼ制限部位をも含む。
【００９６】
好ましいベクターは、原核宿主細胞と共存可能な発現ベクターである。原核細胞発現ベクターは当分野で周知であり、幾つかの商業的供給源から入手できる。典型的な係るベクターはｐＥＴ２４ａ発現ベクターであって、これはＥ．ｃｏｌｉ中で外来遺伝子を発現するのに使用し、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ系を含み、そしてカナマイシン耐性を付与する（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）。
【００９７】
ａ）　　　修飾ｉｍｐｄｈ配列を含む融合遺伝子
融合遺伝子は、異なる配列と融合した修飾ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列を含む組換え分子のもう一つの例である。例えば、修飾ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列は、発現された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの単離および／または精製を容易にする隣接ヒスチジン残基をコードしているタグ配列と融合させることができる（Ｍａｒｓｈａｋ，Ｄ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， １９９６ ｉｎ： Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｐｐ３９６）。
【００９８】
これに代わり、キメラ組換え分子は、それぞれ異なる供給源から単離したｉｍｐｄｈ配列と結合した置換オリゴペプチドを含む。例えば、Ｎ末端触媒ドメインをコードしているポリヌクレオチド配列は、Ｃ末端ドメインをコードしているポリヌクレオチド配列とは異なる供給源からのものであってよい。ＩＭＰＤＨのＮおよびＣ末端ドメインは、ヒト（Ｃｏｌｌａｒｔ ａｎｄ Ｈｕｂｅｒｍａｎｎ １９８８ 上記）、チャイニーズハムスター（Ｎａｔｓｕｔｍｅｄａ ａｎｄ Ｃａｒｒ １９９３ 上記）もしくはその他の真核生物、または原核生物由来であってよい。
【００９９】
Ｂ． 宿主−ベクター系
本明細書に開示する核酸分子を持っている宿主細胞もまた本発明によって提供する。本発明は、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたはその断片をコードしているヌクレオチド配列を含むベクター、プラスミド、ファグミド、またはコスミドを導入した適当な宿主細胞を含む宿主−ベクター系を提供する。宿主細胞は原核細胞または真核細胞とすることができる。例えば、多くの商業的に入手し得るＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ菌株は、外来タンパク質の発現にとって特に有用である。好適な真核宿主細胞の例は、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、または動物細胞、例えば哺乳動物細胞を包含する。好ましい態様は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）宿主細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）中に導入した修飾ｉｍｐｄｈポリヌクレオチド配列を含む、組換えＮｏｖａｇｅｎ ｐＥＴ２４ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）を含む宿主−ベクター系を提供し、これは例えば修飾ＩＭＰＤＨタンパク質の産生にとって有用である。
【０１００】
本発明に係る組換えＤＮＡ分子は、典型的には使用ベクターおよび使用宿主系の型に依存する周知の方法によって適当な宿主細胞中に導入できる。例えば、典型的には電気穿孔および塩処理法による原核宿主細胞の形質転換を使用し、例えば、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９７２） ６９：２１１０； およびＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， （１９８９） ｉｎ： Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹを参照されたい。ｒＤＮＡ、電気穿孔、カチオン性脂質または塩処理法を含む、ベクターによる脊椎動物細胞の形質転換を、典型的に使用する（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．， １９７３ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６； Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９７９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７６：１３７３−７６）。
【０１０１】
組換えＤＮＡ分子により導入した細胞は周知の技術により同定できる。例えば、本発明に係るｒＤＮＡの導入から導かれた細胞をクローニングして、単一コロニーを生成できる。これらのコロニー由来の細胞を収穫し、溶菌し、それらのＤＮＡ内容を、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． （１９７５）９８：５０３、またはＢｅｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈ． （１９８５） ３：２０８に記載のような方法を用いてｒＤＮＡの存在について調べるか、または該細胞の産生したタンパク質を免疫学的方法によって検定する。
【０１０２】
選択されたベクターは、細菌宿主細胞中で修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを発現および産生させるための発現ベクターとすることができる。例えば、容易に精製できる融合タンパク質の高レベル発現を指令するベクターが望ましい。このようなベクターは、多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクター、例えばＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）［ここでは修飾ＩＭＰＤＨコード化配列を、アミノ末端Ｍｅｔおよびこれに続くβ−ガラクトシダーゼの７残基のための配列を有するベクターにフレーム内でライゲーションし、その結果ハイブリッドタンパク質が生成する］；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ １９８９ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６４：５５０３−５５０９）； などを包含するがこれらに限定される訳ではない。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ， Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるのに使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着とその後の遊離グルタチオン存在下での溶離によって、溶菌した細胞から容易に精製することができる。このような系で製造するタンパク質は、ヘパリン、トロンビンまたは第ＸＡ因子プロテアーゼ開裂部位を含むよう設計し、その結果、目的とするクローンポリペプチドはＧＳＴ部分から随意に放出され得る。
【０１０３】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母宿主細胞では、構成的または誘導的プロモーター、例えばβ因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨを含む幾つかのベクターが使用できる。総説として、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９８９ ｉｎ： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．およびＧｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １５３：５１６−５４４を参照されたい。
【０１０４】
植物発現ベクターを使用する場合、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしている配列の発現は幾つかのプロモーターのうちいずれかによって駆動できる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウイルスプロモーター（Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４ Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１−５１４）を、単独またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用できる（Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．， １９８７ ＥＭＢＯ Ｊ．６：３０７−３１１）。別法として、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニット（Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．， １９８４ ＥＭＢＯ Ｊ ３：１６７１−１６８０； Ｂｒｏｇｌｉｅ ｅｔ ａｌ．， １９８４ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８−８４３）のような植物プロモーター；または熱ショックプロモーター（Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ． ａｎｄ Ｓｉｎｉｂａｌｄｉ，Ｒ．Ｍ． １９９１ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒ． １７：８５−１０５）が使用できる。これらの組み立て物は直接ＤＮＡ形質転換または病原体仲介トランスフェクションにより植物細胞に導入できる。係る技術の総説については、Ｈｏｂｂｓ，Ｓ．またはＭｕｒｒｙ Ｌ Ｅ ｉｎ： ＭｃＧｒａｗ Ｙｅａｒｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９２） ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．， ｐｐ１９１−１９６またはＷｅｉｓｓｂａｃｈ ａｎｄ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ （１９８８） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｎ．Ｙ．， ｐｐ４２１−４６３を参照されたい。
【０１０５】
修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの発現に使用できる別の発現系は昆虫系である。このような系の１つでは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用し、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫で外来遺伝子を発現させる。修飾ＩＭＰＤＨコード化配列をこのウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子中にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置くことができる。ｉｍｐｄｈヌクレオチド配列は、うまく挿入されるとこのポリヘドリン遺伝子を不活性とし、コートタンパク質を欠く組換えウイルスを産生する。次いでこの組換えウイルスを用いてＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫を感染させ、そこで修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドが発現される（Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， １９８３ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ４６：５８４； Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ． ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９１：３２２４−７）。
【０１０６】
哺乳動物宿主細胞では幾つかのウイルスに基づく発現系を利用できる。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、修飾ｉｍｐｄｈコード化配列を、アデノウイルス後期プロモーター（例えば転写のための）および三部分リーダー配列（例えば翻訳のための）を含むアデノウイルスベクターと機能的に結合できる。このウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域への挿入は、感染した宿主細胞において修飾ＩＭＰＤＨを発現できる、利用可能なウイルスを導く（Ｌｏｇａｎ ａｎｄ Ｓｈｅｎｋ １９８４ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８１：３６５５−５９）。加えて、転写エンハンサー、例えばラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーを使用して哺乳動物宿主細胞での発現を増大させることができる。
【０１０７】
修飾ｉｍｐｄｈ配列の有効な翻訳には特異的開始シグナルもまた必要であるかも知れない。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドンと隣接配列を包含する。修飾ｉｍｐｄｈ開始コドンと上流配列を適当な発現ベクター中に挿入する場合、さらなる翻訳調節シグナルは必要ない。しかしながら、コード化配列またはその一部分のみを挿入する場合、ＡＴＧ開始コドンを包含する外因性転写調節シグナルを供給する必要がある。さらに、この開始コドンは、挿入物全体の転写を確実とするために正しいリーディングフレームになければならない。外因性転写要素と開始コドンは、天然および合成両者の様々な起源であってよい。発現の効率は使用する細胞系にとって適切なエンハンサーを包含させることにより、増強できる（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ． ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ ２０：１２５−６２； Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８７ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５３：５１６−５４４）。
【０１０８】
加えて、宿主細胞菌株は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現されたタンパク質を所望のやり方でプロセシングする能力について選択できる。ポリペプチドのこのような修飾は、アセチル化、カルボキシ化、グリコシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化を包含するがこれらに限定されない。正しい挿入、折り畳みおよび／または機能のためには、「プレプロ」型のタンパク質を開裂する翻訳後プロセシングもまた重要である。ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などといった異なる宿主細胞は、特異的細胞機構およびこのような翻訳後活性のための特徴的メカニズムを持っており、導入された外来タンパク質の正しい修飾とプロセシングを確実にするよう選択することができる。
【０１０９】
組換えタンパク質の長期高収量産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、修飾ＩＭＰＤＨを安定に発現するセルラインは、ウイルス複製起点または内因性発現要素および選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換できる。このベクターの導入後、細胞を強化培地で１−２日間増殖させ、その後これを選択培地に交換する。選択マーカーの目的は選択に対する耐性を付与することであり、その存在が、導入された配列をうまく発現する細胞の増殖と回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性細菌塊を、その細胞型にとって適切な組織培養技術を用いて増殖させることができる。
【０１１０】
形質転換されたセルラインを回収するため数多くの選択系を使用できる。これらには、ｔｋ−マイナスまたはａｐｒｔ−マイナス細胞でそれぞれ使用できる、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９７７ Ｃｅｌｌ １１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ． ｅｔ ａｌ．， １９８０ Ｃｅｌｌ ２２：８１７−２３）遺伝子が包含されるがこれらに限定される訳ではない。また、抗代謝産物、抗生物質または除草剤耐性、例えばメソトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．， １９８０ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ７７：３５６７−７０）； アミノグリコシドネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｐｔ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ． ｅｔ ａｌ．， １９８１ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １５０：１−１４）およびクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性をそれぞれ付与するａｌｓまたはｐａｔも選択の基礎に使用できる。さらなる選択遺伝子、例えば細胞に、トリプトファンの代わりにインドールを利用させるｔｒｐＢ、または細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用させるｈｉｓＤ（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ． ａｎｄ Ｒ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ １９８８ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ８５：８０４７−５１）が記載されている。近年、可視マーカーの使用が人気を集めており、アントシアニン、β−グルクロニダーゼとその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼとその基質ルシフェリンのようなマーカーが、形質転換体の同定のためのみならず、特定のベクター系に帰すことのできる一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するために広く使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５５：１２１−１３１）。
【０１１１】
Ｃ．　　　修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの製造のための方法
本発明に係る修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドおよびその断片は組換え法または化学合成法によって製造できる。
【０１１２】
高収量を望むならば組換え法が好ましい。一般に、組換え修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの産生は宿主／ベクター系の使用を含み、これは典型的には以下の工程を含む。まず、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたはその断片をコードしている核酸分子、例えば配列番号４０−４７に開示のポリヌクレオチド配列または上に記載した配列変異体のいずれか１つを入手する。次にこの修飾ＩＭＰＤＨコード化核酸分子を、好ましくは上記の適当な発現調節配列と機能的に結合させて発現ベクター中に挿入し、修飾ＩＭＰＤＨコード化配列を含む組換え発現ベクターを作製する。次いでこの発現ベクターを標準的形質転換法によって適当な宿主中に導入し、得られた形質転換宿主を、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドのインビボ産生を可能にする条件の下で培養する。例えば、修飾ｉｍｐｄｈ遺伝子の発現が誘導的プロモーターの調節下にあるならば、好適な増殖条件は適当なインデューサーを包含する。組換えベクターは修飾ｉｍｐｄｈ配列を宿主ゲノム中に組み込むことができる。別法として、組換えベクターはこの修飾ｉｍｐｄｈ配列を、自律的に複製するベクターの一部として染色体外に維持することができる。このように生成された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを増殖培地からまたは細胞から直接単離するが、幾らかの不純物を寛容できる場合は、該タンパク質の回収および精製は必要ないかも知れない。当業者は、当分野で既知の適当な宿主／発現系を、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを製造するための修飾ＩＭＰＤＨコード化配列と共に使用するため、容易に適合させることができる（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９７２ Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２１１０； およびＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ）。様々なタンパク質精製法の例をＳｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ （１９９６） ｐｐ３９６， Ｍａｒｓｈａｋ，Ｄ．Ｒ．， ｅｔ ａｌ．に見出すことができる。或る態様は、アニオン交換クロマトグラフィー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．， １９９０ ｉｎ： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、色素親和クロマトグラフィー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．， １９９０ ｉｎ： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、ＩＭＰ親和クロマトグラフィー（Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， １９８７， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４０：２２７７−２２８２）、およびゲル透過クロマトグラフィー（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．， １９９０ ｉｎ： Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を包含���る３種類までの一連のクロマトグラフィー法を使用して精製した修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを提供する。
【０１１３】
本発明に係る修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは化学合成により製造することもできる。ポリペプチドの固相化学合成の原理は当分野で周知であり、この領域に関する一般教科書に見出すことができる（Ｄｕｇａｓ，Ｈ． ａｎｄ Ｐｅｎｎｅｙ，Ｃ． １９８１ ｉｎ： Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ５４−９２）。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチド合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， Ｃａｌｉｆ．）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの供給する合成サイクルを利用する固相法により合成できる。保護アミノ酸、例えばｔ−ブトキシカルボニル保護アミノ酸、およびその他の試薬は多くの化学薬品供給会社から商業的に入手できる。
【０１１４】
Ｃ．　　　修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの用途
本発明に係る修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは、抗体産生を導く能力としての用途、疾病の診断および／または予後マーカー、ならびにさらに下に記載する種々の治療様式のための標的としての用途を包含する（但しこれらに限定されない）様々な目的に役立つ。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドはさらに、修飾ＩＭＰＤＨに結合するリガンドおよびその他の物質の同定および単離にも有用である。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドおよびその断片は、標準ペプチド合成技術または組換えＤＮＡ技術を用いて製造できる。
【０１１５】
１．　　　修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを認識しこれに結合する抗体
本発明に係るペプチドは、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの性質、例えば修飾されたおよび／または野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドの種々のドメインに付随するエピトープに特異的に結合する抗体の生成を導く能力を示す。これらの抗体は修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを発現する細胞を同定および／または標的化するために使用できる。例えば、これらの抗体を使用して、ＩＭＰＤＨ活性を調節するため、または野生型もしくはその他の形のＩＭＰＤＨを発現する細胞を直接殺滅するために、野生型またはその他の形のＩＭＰＤＨを発現する細胞に対するコンジュゲートした毒素をデリバリーすることができる。このコンジュゲートした毒素には、ジフテリア毒素、コレラ毒素、リシンまたはシュードモナス外毒素が包含されるがこれらに限定されない。これに代わり、これらの抗体を用いて、野生型ＩＭＰＤＨまたは修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド／多量体と相互作用する物質を同定できる。これらの抗体はさらに、競合的結合物質を同定するスクリーニング検定に使用できる。
【０１１６】
本発明は、修飾および／または野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドに結合する抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、免疫学的に活性な断片、およびヒト化抗体）を提供する。最も好ましい抗体は特定の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドに選択的に結合し、異なる修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド、または修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドでないポリペプチドには結合しない（または弱く結合する）であろう。特に企図される抗体は、抗原結合ドメインおよび／またはこれらの抗体の１もしくはそれ以上の相補性決定領域を含む、モノクローナルおよびポリクローナル抗体ならびにそれらの断片（例えば組換えタンパク質）を包含する。これらの抗体は任意の供給源、例えばウサギ、羊、ラット、イヌ、ネコ、豚、馬、マウス、およびヒトからのものであってよい。
【０１１７】
本発明はさらに、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたはその断片を特異的に認識する抗体断片を包含する。本明細書中使用する抗体断片とは、標的に結合する免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部、即ち抗原結合領域として定義する。免疫グロブリンの定常領域の幾らかが包含されるかも知れない。
【０１１８】
当業者には理解できるであろうが、抗体が標的とする修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの領域またはエピトープは、意図する適応によって変わる。他のエピトープを認識する抗体は、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたはその断片の膜結合型または分泌型を検出するために、損傷を受けたまたは死にかかっている細胞上またはその内部で修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを同定するために役立つかも知れない。
【０１１９】
抗体製造のための種々の方法が当分野で良く知られている。例えば、単離されたまたは免疫コンジュゲートした形の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたは断片を用いて適当な哺乳動物宿主を免疫することにより、抗体を製造できる（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ． １９８９ ｉｎ： Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）。加えて、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを含む融合タンパク質、例えば修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド／ＧＳＴ融合タンパク質を使用することもできる。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを発現または過剰発現する細胞を免疫に使用することもできる。同様に、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを発現するよう操作した任意の細胞を使用できる。この戦略は、内因性修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを認識する能力の増強したモノクローナル抗体の産生を導き得る。
【０１２０】
本発明は、異なる種由来の少なくとも二つの抗体部分、例えばヒトおよび非ヒト部分を含むキメラ抗体を企図する。キメラ抗体は、非ヒト定常領域および可変領域を持つ抗体よりもヒト対象に対して抗原性がより低い傾向があるため、有用である。キメラ抗体の抗原結合領域（可変領域）はヒトから誘導し、免疫グロブリンに生物学的エフェクター機能を付与するキメラ抗体の定常領域は非ヒト供給源から誘導できる。キメラ抗体は、原核生物抗体分子の抗原結合特異性、および真核生物抗体分子により付与されたエフェクター機能を持たねばならない。
【０１２１】
一般に、キメラ抗体の製造に用いる方法は以下の工程を含み得る：
ａ） 抗体分子の抗原結合部分をコードしている正しい免疫グロブリン遺伝子セグメントを同定およびクローニングし［この遺伝子セグメント（重鎖についてはＶＤＪ、可変、変化および結合領域、または軽鎖についてはＶＪ、可変、結合領域、または単にＶもしくは可変領域として知られる）はｃＤＮＡまたはゲノム型のいずれであってもよい］；
ｂ） 定常領域またはその所望部分をコードしている遺伝子セグメントをクローニングし；
ｃ） 転写および翻訳され得るような形で完全なキメラ抗体がコードされるよう、可変領域を定常領域とライゲーションし；
ｄ） この組み立て物を、選択マーカーおよび遺伝子調節領域、例えばプロモーター、エンハンサーおよびポリ（Ａ）付加シグナルを含むベクター中にライゲーションし；
ｅ） この組み立て物を細菌中で増幅し；
ｆ） このＤＮＡを真核細胞、最も普通には哺乳動物リンパ球中に導入（トランスフェクション）し；
ｇ） 選択マーカーを発現している細胞を選択し；
ｈ） 所望のキメラ抗体を発現している細胞をスクリーニングし；そして、
ｋ） この抗体を適当な結合特異性およびエフェクター機能について試験する。
【０１２２】
抗ＴＮＰ抗体（Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９８４ Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６４３）；および抗腫瘍抗原抗体（Ｓａｈａｇａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８６ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３７：１０６６）を包含する幾つかの明瞭な抗原結合特異性を持つキメラ抗体が、当分野で周知のプロトコルによって製造されている。同様に、幾つかの異なるエフェクター機能が、抗原結合領域をコードしている配列に新たな配列を結合させることによって達成された。これらの例には、酵素（Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８４ Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４）；別の種由来の免疫グロブリン定常領域および別の免疫グロブリン鎖の定常領域（Ｓｈａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８４ Ｎａｔｕｒｅ ３０９：３６４； Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８５ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３５：３５６５−３５６７）が包含される。加えて、遺伝子修飾を目的としてホモローガス組換えを用いる、抗体分子を修飾するための、およびキメラ抗体分子を製造するための方法が記載されている（Ｆｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８５０７−８５１１）。
【０１２３】
修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドのアミノ酸配列を用いて、抗体産生用の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの特定の領域を選択できる。例えば、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの疎水性および親水性分析を用いて、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの親水性領域を同定できる。免疫原性構造を示す修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの領域ならびにその他の領域およびドメインは、当分野で既知の様々なその他の方法（Ｒｏｓｔ，Ｂ．， ａｎｄ Ｓａｎｄｅｒ，Ｃ． １９９４ Ｐｒｏｔｅｉｎ １９：５５−７２）、例えばＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−ＳｃｈｕｌｔｚまたはＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ分析を用いて容易に同定できる。これらの残基を含む断片は特定クラスの抗体を作製するのにとりわけ好適である。
【０１２４】
免疫原として使用するタンパク質を製造するための、そして、担体、例えばＢＳＡ、ＫＬＨまたはその他の担体タンパク質とタンパク質の免疫原性コンジュゲートを製造するための方法は、当分野でよく知られている。幾つかの状況では、例えばカルボジイミド試薬を使用する直接コンジュゲーションが使用でき、別の例ではＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬの供給するような結合試薬が有効となり得る。修飾ＩＭＰＤＨ免疫原の投与は、一般に当分野で理解されているように、適当な期間にわたる注射によって、且つ適当なアジュバントを使用して実施する。免疫スケジュールの間、抗体価を測定して抗体形成の妥当性を決定する。
【０１２５】
このようにして生成したポリクローナル抗血清は幾つかの適応にとっては満足できるものであるが、医薬組成物用にはモノクローナル抗体調製物が好ましい。所望のモノクローナル抗体を分泌する不死化セルラインを、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎの標準法（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）またはＭｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ； Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ＣＲＣ ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， Ｆｌａ．（１９８７） ｅｄ．， Ｚｏｌａに記載のその他の技術を用いて製造できる。所望の抗体を分泌する不死化セルラインを、抗原が修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたはその断片であるイムノアッセイによりスクリーニングする。所望の抗体を分泌する適当な不死化細胞培養を同定したならば、この細胞をインビトロで、または腹水中での産生によって培養することができる。
【０１２６】
次にこの所望のモノクローナル抗体を培養上清または腹水上清から回収する。免疫学的に重要な部分（即ち、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを認識および結合する部分）を含む本発明に係るモノクローナル抗体またはポリクローナル抗血清の断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、融合タンパク質）は、アンタゴニストおよび無傷の抗体として使用できる。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドに対するヒト化抗体もまた有用である。本明細書中使用するヒト化抗体とは、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドと結合でき、且つ、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質上有するＦＲ領域および非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質上有するＣＤＲを含む、免疫グロブリン分子、または、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドに結合するよう操作した配列である。１またはそれ以上の非ヒト抗体ＣＤＲを、対応するヒト抗体配列に置換することによる、マウスおよびその他の非ヒト抗体をヒト化する方法は、よく知られている（例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９８６ Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５； Ｒｉｅｃｈｍｎａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２７； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９： １５３４−１５３６； Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５；およびＳｉｍｓ ｅｔ ａｌ．， １９９３ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：２２９６を参照されたい）。
【０１２７】
免疫学的反応性断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２断片は一般に免疫グロブリン全体より免疫原性が低いため、これらの使用が、特に治療的場面では好ましい。さらに、２またはそれ以上のエピトープに特異的な二重特異性抗体を、当分野で一般に知られている方法を用いて作製できる。また、抗体エフェクター機能を、本発明に係る抗体の治療効果を増強するように修飾することができる。例えば、システイン残基をＦｃ領域中に導入し、鎖間ジスルフィド結合の形成と、ホモ二量体（これは、インターナライゼーション、ＡＤＣＣおよび／または補体仲介細胞殺滅の増強能力を有し得る）の作製をさせることができる（例えば、Ｃａｒｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９２ Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １７６：１１９１−１１９５； Ｓｈｏｐｅｓ， １９９２ Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：２９１８−２９２２； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， １９９８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：４０５５−４０６０を参照されたい）。ホモ二量体抗体は当分野で既知の架橋技術によって作製することもできる（例えば、Ｗｏｌｆｆ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３：２５６０−２５６５）。本発明はさらに、本発明に係るモノクローナル抗体または抗イディオタイプモノクローナル抗体を有する医薬組成物を提供する。
【０１２８】
この抗体または断片は組換え手段により現行技術を用いて製造できる。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの所望領域に特異的に結合する領域はさらに、複数の種の起源を持つキメラまたはＣＤＲ移植された抗体との関連で作製できる。本発明は、抗体、例えば修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドに対する本発明に係る任意のモノクローナル抗体の免疫特異的結合を競合阻害するモノクローナル抗体を包含する。
【０１２９】
これとは別に、ファージディスプレーおよびトランスジェニック法を包含する、完全なヒトモノクローナル抗体を作製する方法が知られており、ヒトｍＡｂの作製に使用できる（総説として、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．， １９９８ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６：５３５−５３９を参照されたい）。例えば、完全なヒトモノクローナル抗体は、大きなヒトＩｇ遺伝子組み合わせライブラリー（即ちファージディスプレー）を使用するクローニング技術を用いて作製できる（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ａｎｄ Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， ”Ｂｕｉｌｄｉｎｇ ａｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ： ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｌｉｂｒａｌｉｅｓ” ｉｎ： Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｎ， Ｃｌａｒｋ，Ｍ．（Ｅｄ．）， Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ Ａｃａｄｅｍｉｃ， ｐｐ４５−６４（１９９３）； Ｂｕｒｔｏｎ ａｎｄ Ｂａｒｂａｓ， ”Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ” 同上， ｐｐ６５−８２）。完全なヒトモノクローナル抗体はまた、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９８／２４８９３、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７年１２月３日公開）に記載の、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むよう操作されたトランスジェニックマウスを用いて作製できる（Ｊｏｋｏｂｏｖｉｔｓ， １９９８， Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ ７：６０７−６１４をも参照されたい）。この方法は、ファージディスプレー技術に必要なインビトロ操作を回避し、真正の高親和性ヒト抗体を効率的に生成する。
【０１３０】
本発明に係る抗体またはその断片は、検出可能なマーカーで標識し、または第二の分子、例えば治療物質（例えば細胞毒性物質）とコンジュゲートさせ、それにより免疫コンジュゲートを生成することができる。例えばこの治療物質は、抗腫瘍薬、毒素、放射性物質、サイトカイン、第二の抗体または酵素を包含するがこれらに限定されない。さらに本発明は、本発明に係る抗体を、プロドラッグを細胞毒性薬へと変換する酵素に結合させる態様を提供する。
【０１３１】
細胞毒性物質の例は、リシン、リシンＡ鎖、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、エチジウムブロミド、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシンＤ、ジフテリア毒素、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アルブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、ゲロニン、ミトゲリン、レツトリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、キュリシン、クロチン、カリキアミシン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、メイタンシノイド、グルココルチコイドおよびその他の化学療法物質、ならびに２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙおよび１８６Ｒｅといったラジオアイソトープを包含するが、これらに限定される訳ではない。好適な検出可能マーカーは、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、生物発光化合物、化学ルミネセンス化合物、金属キレート化剤または酵素を包含するがこれらに限定されない。抗体はさらに、プロドラッグをその活性型に変換することのできる、細胞殺滅または阻害プロドラッグ活性化酵素とコンジュゲートさせることができる。例えば米国特許第４９５２３９４および５６３２９９９号を参照されたい。
【０１３２】
加えて、本発明に係るモノクローナル抗体のいずれかの抗原結合領域を含む、本発明に係る組換えタンパク質を作製できる。係る状況では、組換えタンパク質の抗原結合領域を、治療活性を持つ第二のタンパク質の、少なくとも機能的に活性な一部分と結合させる。この第二のタンパク質は、酵素、リンホカイン、オンコスタチンまたは毒素を包含できるがこれらに限定されない。好適な毒素は上記のものを包含する。
【０１３３】
治療物質を抗体にコンジュゲートまたは結合させる技術はよく知られている（例えば、Ａｍｏｎ ｅｔ ａｌ．， ”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ｐｐ２４３−５６ （Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ． １９８５）； Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．， ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”， ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ （２ｎｄ Ｅｄ．）， Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， ｐｐ６２３−５３ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ． １９８７）； Ｔｈｏｒｐｅ， ”Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”， ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４： Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）， ｐｐ４７５−５０６（１９８５）； およびＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．， ”Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ”， Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．， ６２：１１９−５８（１９８２）を参照されたい）。
【０１３４】
２． 修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを認識しこれに結合する抗体の用途
本発明に係る修飾ＩＭＰＤＨ抗体は、診断検定、画像化法、および癌またはその他の増殖型疾患の管理における治療法にとりわけ有用となり得る。このような検定は一般に、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを認識しこれに結合することのできる１またはそれ以上の抗体を含み、様々な型の沈殿、凝集、補体固定、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）、酵素結合免疫蛍光検定（ＥＬＩＦＡ）（Ｌｉｕ，Ｈ． ｅｔ ａｌ． １９９８ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８：４０５５−４０６０）、免疫組織化学検定などを包含する（但しこれらに限定されない）当分野で周知の様々な免疫学的検定フォーマットを包含する。
【０１３５】
本発明に係る抗体はさらに、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを精製するための、そして野生型および突然変異体ＩＭＰＤＨポリペプチドのような関連分子を単離するための方法に使用できる。
【０１３６】
例えば或る態様では、タンパク質を精製するこの方法は、固体マトリックスに結合させてある修飾ＩＭＰＤＨ抗体を、ＩＭＰＤＨ抗体をＩＭＰＤＨポリペプチドに結合させる条件下で、ＩＭＰＤＨを含有する溶菌液またはその他の溶液とインキュベートし；この固体マトリックスを洗浄して不純物を取り除き；そして結合した抗体からＩＭＰＤＨポリペプチドを溶離させることを含む。さらにＩＭＰＤＨ抗体は、細胞選別および精製技術を用いてＩＭＰＤＨ陽性細胞を単離するために使用できる。罹患細胞上のＩＭＰＤＨポリペプチドの存在および量（単独または他の細胞表面マーカーと組合わさっている）を使用して、罹患細胞を他の細胞から識別、単離することができる。
【０１３７】
３． 修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを発現する細胞
組織培養中で、または動物モデル（例えば、ＳＣＩＤまたはその他の免疫不全マウス）の異種移植片として増殖させ得る大量の比較的純粋な修飾ＩＭＰＤＨ陽性細胞を生成する能力は、例えば比較的均質な疾患細胞集団の増殖またはその他の表現型性質に関する様々なトランスジーンまたは治療用候補化合物の評価を包含する、多くの利点を提供する。加えて、本発明の特徴は、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしている核酸分子の高度濃縮調製物の単離をも可能にし；その核酸分子は様々な分子操作にとって充分な量で濃縮され得る。例えば、このような大量の核酸分子調製物は、ＩＭＰＤＨ関連疾患の進行に生物学的関連性を持つ稀少遺伝子の同定を助けるであろう。
【０１３８】
本発明のこの態様のもう一つの貴重な適応は、原発性または局所で進行したまたは転移性疾患を持つ患者からクローニングした修飾ＩＭＰＤＨ陽性の生存腫瘍細胞の比較的純粋な調製物を単離し、分析し、そして実験する能力である。このようにして、例えば修飾ＩＭＰＤＨ陽性である患者の罹患細胞を、限られた生検試料から拡大し、次いで、診断および予後判定遺伝子、タンパク質、染色体異常、遺伝子発現プロファイル、またはその他の関連する遺伝子型および表現型の性質の存在について、混乱を招くかも知れない混入細胞という変数なしに試験することができる。加えて、このような細胞は、動物モデルにおいて新生物の攻撃性および転移可能性について評価できる。同様に、ワクチンおよび細胞免疫療法剤をこのような細胞調製物から作り出すことができる。
【０１３９】
免疫学的に反応性の断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２断片は、一般に免疫グロブリン全体よりも免疫原性が低いため、これらの断片は特に治療的状況においてしばしば好ましい。本発明はさらに、本発明に係るモノクローナル抗体または抗イディオタイプモノクローナル抗体を有する医薬組成物を提供する。
【０１４０】
３． 薬物発見戦略における修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの用途
ａ）　　　標的ポリペプチドとしての修飾ＩＭＰＤＨの用途
本発明に係る修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは、構造に基づく薬品設計戦略の出発点として有用である。これらの戦略には、標的ポリペプチドまたはタンパク質、例えば修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドと、この標的ポリペプチドに結合する物質との相互作用についての情報を使用することが含まれる。典型的には、係る薬品設計戦略の目標は、標的ポリペプチドに結合し、その標的ポリペプチドの活性を調節する、例えば標的ポリペプチドの活性化または阻害を行う物質または物質群を同定することである。もう一つの目標は、例えば標的ポリペプチドについての増大した結合親和性、または標的ポリペプチドについての増大した選択性、または哺乳動物対象（例えば人間の患者）への投与に対する増大した適合性といったような改善された性質を持つ治療物質を開発するために、同定された物質を変化させることである。これらの物質は、ＩＭＰＤＨタンパク質の、細胞による異常な発現に関連する苦痛、例えば免疫系疾患を治療するために役立ち得る。
【０１４１】
構造に基づく薬品設計戦略は、該物質と複合体形成した標的ポリペプチドの三次元構造についての情報の使用を含み得る。例えば、インヒビターと複合体形成した標的ポリペプチドのＸ線結晶構造の解析は、該物質と相互作用するそして／または結合する標的ポリペプチド内部の特異的アミノ酸残基についての情報を提供できる。さらに、目的とする野生型タンパク質の機能的活性を示す標的ポリペプチドの結晶構造を得ることは有利である。しばしばこの物質はかなり小さく、故に、技術的な難題は、該物質と複合体形成した機能的に活性な標的ポリペプチドの結晶構造を、該物質および標的ポリペプチドとのその相互作用を解析するに充分高い分析レベルで取得することである。
【０１４２】
本発明は、修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドは、ＭＰＡと複合体形成した機能的に活性なＩＭＰＤＨ多量体のタンパク質結晶構造を、過去に他の研究者が取得した、ＭＰＡに結合した野生型ＩＭＰＤＨの結晶構造に比してより高い分析レベルで取得するのに有用であるという発見を提供する。特に本発明は、修飾ヒトＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴの４個のサブユニットを含み１分子のＭＰＡと複合体形成した、ホモ多量体の結晶構造が、２．０オングストロームレベルで解析されたという発見を提供する。対照的に、ＭＰＡと複合体形成したチャイニーズハムスター由来の野生型ＩＭＰＤＨのホモ多量体の結晶構造は、Ｍ．Ｄ．Ｓｉｎｔｃｈａｋ， ｅｔ ａｌ （１９９６ Ｃｅｌｌ ８５：９２１−９３０）により２．６オングストロームレベルで解析されている。
【０１４３】
修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴを含むホモ多量体のより高い解析レベルは、各々の修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドが野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドよりも短いという事実によるものである。特に、修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドは、１３３アミノ酸残基長であるサブドメイン領域の一部が、より短い置換ＤＫＴトリペプチド（例えば一文字アミノ酸コード）で置換されている。したがって、修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドは、５１４アミノ酸残基長である野生型ＩＩ型ＩＭＰＤＨ（図２）に比してわずか３８４アミノ酸残基長（図４）である。さらに、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは野生型ＩＭＰＤＨの機能的活性（例えば、ＮＡＤＨ産生を触媒する）を示し、ＭＰＡに結合する。したがって、修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドは、修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴおよび野生型ＩＭＰＤＨに結合する物質を発見するための、構造に基づく薬品設計戦略における使用にとって理想的な候補標的ポリペプチドである。
【０１４４】
ｂ）　　　修飾ＩＭＰＤＨに結合する物質を検出および同定する方法
本発明はさらに、本発明に係る修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドおよび／または多量体と相互作用する物質を検出および同定する方法を提供する。本発明に係る修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたは多量体と相互作用する物質は、修飾ＩＭＰＤＨ多量体の活性に変化、例えば阻害または刺激を惹起してもしなくてもよい。したがって、本発明の一つの態様は、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたは多量体と相互作用する物質を同定する方法を提供する。さらなる態様は、修飾ＩＭＰＤＨ多量体の活性に影響を及ぼす物質、例えばアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法を提供する。
【０１４５】
修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたは多量体と相互作用し、またはこれに結合する候補物質を同定する一般法は以下の工程を含む。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたは多量体を候補物質と接触させ、接触させた修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたは多量体を、当該修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたは多量体と候補物質との相互作用を起こす条件の下でインキュベートし、そしてこの修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたは多量体と候補物質との相互作用を、任意の適当な手段によって検出する。これらの方法はインビボまたはインビトロで実施できる。加えて、これらの方法はＰＡＮＤＥＸ．ＲＴＭ（Ｂａｘｔｅｒ−Ｄａｄｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）系のような自動化法に適合させ、候補物質の効率的な大容量スクリーニングを可能にすることができる。
【０１４６】
本発明方法で使用できる修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは、単離した修飾ＩＭＰＤＨポリペプチド、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの断片、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを発現するよう改変した細胞、または修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを発現するよう改変した細胞の画分を包含するが、これらに限定される訳ではない。これらの修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドおよびその断片は互いに結合して多量体を形成する。
【０１４７】
修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたは多量体と候補物質との相互作用を同定および検出するインビトロ法は、ゲル遅延検定、免疫検出を包含し、バイオチップ技術を修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたは多量体と共に使用するために採用できる。その他の方法には、蛍光滴定（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ，Ｄ．， １９８２ ｉｎ： Ｐｈｙｓｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ： Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｔｏ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）および滴定熱量測定（Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７９：１３１−１３７）が包含される。インビトロ法はさらに、プロテアーゼに対するタンパク質の感受性を監視することによって、または折り畳まれた状態のタンパク質に対する特異抗体によるタンパク質の結合、もしくはシャペロンタンパク質への結合、もしくは任意の適当な表面への結合のし易さを監視することによって、折り畳まれていないタンパク質に対する折り畳まれたタンパク質の比率を監視することを包含する（米国特許第５５８５２７７号）。当業者は、或る特定の物質が修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたは多量体に結合するかどうかを決定するため、当分野で既知の多数の技術を容易に使用することができる。
【０１４８】
これに代わり、候補物質と修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたは多量体との相互作用を同定および検出するインビボ法を、酵母二ハイブリッド系を用いて全細胞検定で実施できる（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｓ． ａｎｄ Ｓｏｎｇ，Ｏ． １９８９ Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６）。酵母二ハイブリッド系を使用して、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドと相互作用／結合するリガンドについて、ｃＤＮＡ発現ライブラリー（Ｇ．Ｊ．Ｈａｎｎｏｎ， ｅｔ ａｌ． １９９３ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖ． ７：２３７８−２３９１）、ランダムアプトマーライブラリー（Ｊ．Ｐ．Ｍａｎｆｒｅｄｉ， ｅｔ ａｌ． １９９６ Ｍｏｌｅｃ．Ａｎｄ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １６：４７００−４７０９）、またはセミランダム（Ｍ．Ｙａｎｇ， ｅｔ ａｌ． １９９５ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３：１１５２−１１５６）アプトマーライブラリーをスクリーニングできる。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたは多量体と該物質との相互作用／結合は、リポーター遺伝子、例えばｌａｃＺの発現によって検出可能である。
【０１４９】
該物質は、例えば典型的にはポリペプチド、核酸分子、有機分子、ビタミン誘導体、または金属であるリガンドである。当業者は、このスクリーニング法に使用する物質の構造的性質に制限のないことが容易に理解できるであろう。該物質は合成のまたは天然に存在する化合物、例えば細胞成分であってよい。本発明方法において試験される細胞抽出物は、例えば細胞または組織の水性抽出物、細胞または組織の有機抽出物、または部分精製された細胞画分であってよい。
【０１５０】
このポリペプチド物質は、当分野で知られているように、標準的固相または溶液相ペプチド合成法を用いて作製できる。さらに、これらのペプチドをコードしている核酸分子が、標準的組換えＤＮＡ技術を用いて作製でき、または市販のオリゴヌクレオチド合成機器を用いて合成できる。
【０１５１】
該ポリペプチド物質のアミノ酸配列は、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドまたは多量体の構造に基づいて選択できる。小さなポリペプチドは、修飾ＩＭＰＤＨ多量体への修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの組み立ての競合的インヒビターとしても働き得る。
【０１５２】
抗体物質は、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの選ばれたドメインまたは領域と免疫反応性であり得る。一般に、該抗体が標的とするよう意図された修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの一部を抗原性領域として含むペプチドで適当な哺乳動物対象を免疫することにより、抗体が得られる。
【０１５３】
上記の方法で検定した物質を、無作為に選択、または合理的に選択または設計できる。本明細書での使用において、或る物質を修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの特定の配列を考慮せずに無作為に選択する場合、この物質を無作為に選択する、と言う。無作為に選択した物質の例は、化学ライブラリーまたはペプチド組み合わせライブラリー、または生物もしくは植物抽出物の成長ブロスの使用である。
【０１５４】
本明細書での使用において、或る物質を、標的ポリペプチドの配列および／または標的ポリペプチドのコンホメーションを考慮して非無作為的基準で選択する場合、この物質を合理的に選択または設計する、と言う。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを作り上げるアミノ酸配列を利用することにより、物質は合理的に選択または合理的に設計できる。
【０１５５】
修飾ＩＭＰＤＨ多量体と相互作用する物質を、無細胞検定系または細胞検定系を用いて、修飾ＩＭＰＤＨ多量体の機能的活性を調節する能力について試験することができる。例えば、修飾ＩＭＰＤＨ多量体と相互作用する物質は、野生型ＩＭＰＤＨ多量体またはホロ酵素と比較したＮＡＤＨの産生レベルの相対変化によって検出したところ、ＮＡＤからＮＡＤＨへの触媒的変換を阻害または増大させることができる（Ｃａｒｒ，Ｓ．Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， １９９３ 上記；Ｘｉａｎｇ，Ｂ．， ｅｔ ａｌ．， １９９６ 上記）。
【０１５６】
本明細書で使用する場合、或る物質が修飾ＩＭＰＤＨ多量体の活性を低下させる、例えば生成するＮＡＤＨのレベルを低下させる場合、その物質は修飾ＩＭＰＤＨ多量体の活性に拮抗する、と言う。好ましいアンタゴニストは、他のいかなる細胞タンパク質または多量体にも影響を及ぼさずに、修飾ＩＭＰＤＨ多量体と選択的に拮抗する。さらに、好ましいアンタゴニストは、修飾ＩＭＰＤＨ多量体の活性を５０％以上、より好ましくは９０％以上低下させ、最も好ましくは修飾ＩＭＰＤＨ多量体の全活性を除去する。
【０１５７】
本明細書で使用する場合、或る物質が修飾ＩＭＰＤＨ多量体の活性を増大させる、例えば生成したＮＡＤＨのレベルを増大させる場合、その物質は修飾ＩＭＰＤＨ多量体の活性をアゴナイズする、と言う。好ましいアゴニストは、他のいかなる細胞タンパク質または多量体にも影響を及ぼさずに、修飾ＩＭＰＤＨ多量体を選択的にアゴナイズする。さらに、好ましいアゴニストは、修飾ＩＭＰＤＨ多量体の活性を５０％以上、より好ましくは９０％以上増大させ、最も好ましくは修飾ＩＭＰＤＨ多量体の活性を倍増する。
【０１５８】
３． 修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの診断用途
修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドには多数の診断用途がある。例えば、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドは、動物または人間対象のような対象において、異常な量のＩＭＰＤＨポリペプチドまたはタンパク質の存在に関連する疾病または異常を診断する方法を提供する。或る態様では、この方法は、本発明に係る抗体のいずれか１つまたはその組み合わせを用いて、適当な生物学的被験試料中のＩＭＰＤＨタンパク質の量を定量的に決定することを含む。次いで、このように決定された被験試料中のＩＭＰＤＨタンパク質の量を、正常量のＩＭＰＤＨタンパク質を持つ対象由来の生体試料中の量と比較できる。正常試料由来の量と比較して、測定可能なほど相違する量のＩＭＰＤＨが被験試料中に存在しているということが、当該疾病の存在を示し得る。適当な生体試料とは、血液、血清、細胞、組織、または鼻、耳もしくは咽喉からの拭き取り試料を包含する。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの量は、イムノアッセイ法のような当分野で周知の方法によって決定できる。
【０１５９】
これに代わり、診断法は本発明に係る核酸分子の使用を包含する。例えば、適当な生物学的被験試料内部に存在するこのような配列の量を、本発明に係る修飾ＩＭＰＤＨ配列に相補的な核酸配列を持つ核酸分子の量を決定する分子生物学的検定によって決定することができる。正常試料由来の量と比較して、測定可能なほど相違する量の、ＩＭＰＤＨ配列を持つ核酸分子が被験試料中に存在しているということが、当該疾病の存在を示し得る。適当な生体試料とは、血液、血清、細胞、組織、または鼻、耳もしくは咽喉からの拭き取り試料を包含する。修飾ＩＭＰＤＨポリヌクレオチド配列を有する核酸分子の量は、ハイブリダイゼーション法のような当分野で周知の方法によって決定できる。
【０１６０】
一般に、このような診断法は以下の工程を包含する。生物学的被験試料から核酸分子を取得し、これらの被験核酸分子を、被験核酸分子の相補配列と本発明に係る核酸分子とのハイブリダイゼーションを起こす条件の下で、本発明に係る核酸分子と接触させ、そしてハイブリダイズした核酸分子の存在を検出する。本発明に係るポリヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列が被験試料中に存在すること、または、正常もしくは「対照」試料中のレベルと比較して、測定可能なほど相違するレベルの係る配列が存在することが、本発明に係る遺伝子配列を有する試料を示唆し得る。ここで、相補的核酸配列とは、比較的些少の配列相違を持ち、標準条件下で本明細書に開示する配列とハイブリダイズできる核酸配列である。
【０１６１】
Ｆａｌｋｏｗ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４３５８５３５号に記載の診断検定を包含する、ＩＭＰＤＨ配列を持つ核酸分子の量を検出するために使用できる様々なハイブリダイゼーション法が知られている。その他の好適なハイブリダイゼーション法の変法が、核酸の検出における使用のために利用できる。これらは、例えばｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、サザンブロッティングおよびノーザンブロッティングを包含する。
【０１６２】
ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法は一般に、１またはそれ以上の細胞または組織内部に位置する標的核酸分子を、本発明に係るＩＭＰＤＨ配列を有する検出可能な核酸プローブと接触させることを含む。この細胞または組織試料は、対象から取得した一次試料、または組織培養中で増殖した細胞であってよい。当分野で周知のように、細胞を固定によってハイブリダイゼーション用に調製し（例えば化学的固定）、そして、検出可能なプローブと、固定した細胞または組織内部に位置する核酸とのハイブリダイゼーションをさせる条件におく。
【０１６３】
別法として、ＩＭＰＤＨ配列を有する標的核酸分子の存在および／または量を、サザン（例えばＤＮＡ）またはノーザン（例えばＲＮＡ）ブロット法によって決定できる。これらの方法は、被験細胞または組織試料から核酸分子を単離し、単離した核酸分子をサイズに従って分離し、分離した核酸分子を固体マトリックス上に固定化し、そしてこの固定化した核酸分子を、本発明に係るＩＭＰＤＨ配列を有する検出可能な核酸プローブと接触させることを含む。この核酸分子は、塩化セシウム勾配遠心、クロマトグラフィー（例えばイオン、親和、磁気）、フェノール抽出などのような方法を用いて単離できる。単離した核酸分子は、電気泳動分離を包含する方法を用いて、サイズに従い分離できる。
【０１６４】
本発明に係る核酸分子はＰＣＲ技術（米国特許第４６０３１０２号；引用により本明細書の一部とする）を用いて生物学的被験試料中に検出できる。ＰＣＲ法は、生物学的被験試料から核酸分子を単離し、この被験核酸分子を、本発明に係るＩＭＰＤＨ配列に相補的な配列を有する二つの核酸プライマーと接触させ、そしてこの被験核酸分子およびプライマーを、ハイブリダイゼーションと重合が起こるような条件の下にインキュベートすることを含む。典型的には、一方は５’フランキング領域に対応し、他方は３’フランキング領域に対応する一対のプライマーを使用して、被験試料中の本発明に係る核酸分子の存在および量を検出する。
【０１６５】
本発明を例示し、当業者がこれを作製および使用するのを助けるために以下の実施例を提示する。この実施例はいかなるやり方によっても本発明の範囲を別途限定する意図はない。
【０１６６】
（実施例）
実施例１
本発明に係るヒトＩ型およびＩＩ型修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを製造し単離するために使用する方法の説明を以下に提供する。
【０１６７】
Ａ） 野生型ヒトＩＭＰＤＨをコードしているヌクレオチド配列を作製
ＰＣＲ増幅を使用して、ＰＨＡ活性化ヒト末梢血白血球から単離したＲＮＡから、完全長ヒトｉｍｐｄｈ Ｉ型およびＩＩ型ｃＤＮＡを作製した。野生型ｉｍｐｄｈ ｃＤＮＡの増幅に使用したプライマーは以下のものを包含する：
【０１６８】
2004514409.tif 000004
【０１６９】
５’プライマーは、ＮｄｅＩ制限部位を含むよう修飾した、野生型ｉｍｐｄｈのＮ末端配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでいた。３’プライマーは、野生型ｉｍｐｄｈのＣ末端配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでいた。
【０１７０】
このＰＣＲ生成物をベクターｐＥＴ２４ａ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）中にサブクローニングし、ＤＨ５アルファＦ’（ＩＱ）コンピテント細胞（Ｇｉｂｃｏ）に導入した。この配列はヌクレオチド配列決定により確認し、報告されたゲノム配列と比較した（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，Ａ．Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７０：６８０８−６８１４； Ｇｌｅｓｎｅ，Ｄ．Ａ． ａｎｄ Ｈｕｂｅｒｍａｎ，Ｅ． １９９４ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ． ２０５：５３７−５４４）。
【０１７１】
上記のように作製した完全長ヒトＩ型ｉｍｐｄｈ ｃＤＮＡを鋳型に用いて、ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴをコードしているＰＣＲ増幅ヌクレオチド配列を作製した（配列番号４４）。完全長ヒトＩＩ型ｉｍｐｄｈ ｃＤＮＡを鋳型に用いて、ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴ、−ＳＰＳ、−ＧＳＧ、−ＳＰＴ、−ＡＧＲＰ、および−ＮＳＰＬを包含する様々なトリおよびテトラペプチドＩＭＰＤＨをコードしているＰＣＲ増幅ヌクレオチド配列を作製した（例は、配列番号４０−４３、および４５−４７を包含する）。様々な修飾ｉｍｐｄｈ配列の増幅に使用したプライマーは以下のものを包含していた：
【０１７２】
2004514409.tif 000005
【０１７３】
５’プライマーは、ＮｄｅＩ制限部位を含むよう修飾した、野生型ｉｍｐｄｈのＮ末端配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでいた。
【０１７４】
３’プライマーは、置換オリゴペプチド（例えば、トリまたはテトラペプチド）をコードしているヌクレオチド配列を含み、そしてＩＩ型ＩＭＰＤＨの１０８−１１０位のＬｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒに相補的な配列をそれぞれ含んでいた。
【０１７５】
得られた増幅させた断片を、野生型ＩＩ型ｉｍｐｄｈの８２０ｂｐ Ｃ末端ドメイン（Ｌｅｕ−２４４からＰｈｅ−５１４まで）に対応するｃＤＮＡ断片にライゲーションし、修飾ＩＩ型ｉｍｐｄｈポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子を作製した。この８２０ｂｐ断片は、野生型ｉｍｐｄｈ ＤＮＡをＰｖｕ ＩＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩ制限酵素で消化することにより作製した。このＰｖｕ ＩＩ制限酵素は、平滑末端切断面を作製し、且つＩＭＰＤＨサブドメインとＣ末端ドメインの間の接合点（例えばＧｌｎ２４３およびＬｅｕ２４４）で切断し、それが該サブドメイン（Ｇｌｕ−１１１からＧｌｎ−２４３まで）を除去する独特な戦略を提供した。修飾ＩＩ型ＩＭＰＤＨポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子をｐＥＴ２４ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）中にライゲーションした。
【０１７６】
ＳＰＴＱテトラペプチドを含むプライマーは、予想に反してＳＰＴトリペプチドを有する修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを生成した。
【０１７７】
Ａ） 修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを単離
ｐＥＴ２４ａベクターは、ＩＰＴＧで誘導され得るＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ系を包含する。この組換えベクターを標準的形質転換技術を用いてコンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞、ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ）中に導入した。形質転換された細胞を、カナマイシン１００μｇ／ｍＬを含有するＭ９最少培地寒天プレートに蒔き、３７℃で一夜インキュベートした。Ｍ９プレート上に生育した個々のコロニーを選択し、１％カザアミノ酸、微量ミネラル、チアミンおよびビタミンＢ１２を添加し１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する液体Ｍ９培地に接種した。この液体培養を激しく振盪しながら（例えば２００ｒｐｍ）３７℃で一夜生育させた。
【０１７８】
上記の物質を添加した、バッフル付き２リットル振盪フラスコに入れた液体Ｍ９培地０．５リットルを、一夜培養１０ｍＬを接種物に使用して培養することにより、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを発現させた。この細胞をＯＤ６００＝０．６−０．７となるまで３７℃で激しく振盪しながら生育させ、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭとなるまで加えた。次にこの培養を氷上で３０分間冷却し、３０℃で激しく振盪しながらさらに６時間生育させ、細胞を４℃、１００００ＲＰＭで遠心分離することにより収穫した。この細胞ペレットを凍結し−８０℃で保存した。
【０１７９】
修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドの大規模生産のため、上記の方法に従った。スケールは、２リットルバッフル付き振盪フラスコあたり液体培地０．５Ｌに維持した。培養を最初３７℃で生育させ、その後氷上での３０分間の冷却、０．５ｍＭ ＩＰＴＧによる誘導、そして３０℃で６時間の誘導後生育をさせた。これらの条件で培養１リットルあたり２５−３５ｍｇの修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドが産生し、これは再現性があった。
【０１８０】
図１８は野生型ヒトＩＩ型ＩＭＰＤＨタンパク質のモデルを示す。触媒コアドメインはこの図の上部領域に、サブドメインは下部領域に位置する。触媒コアとサブドメイン領域の間に位置する２個の球体は、残基Ｅ−１１１およびＱ−２４３に対応する。残基Ｅ−１１１とＱ２４３の距離はおよそ５．１オングストロームであり；本発明に係る置換オリゴペプチドはこの距離に橋を架けるよう設計した。
【０１８１】
実施例２
以下に、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの機能的活性を特性決定するために使用する方法の説明を提供する。
Ａ） 部分精製修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを単離
修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴ、−ＳＰＳ、−ＳＰＴ、および−ＡＧＲＰのポリペプチドを単離し、青色色素親和クロマトグラフィー工程を用いて部分精製した。別途記載のない限り、全ての工程を４℃で実施した。凍結細胞ペレット（例えば実施例１に記載）を氷上で融解し、緩衝液Ａ（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２、２０ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、および１μｇ／ｍＬロイペプチン）１０ｍＬに再懸濁した。Ｂｒａｎｓｏｎモデル４５０超音波振動器（２．５出力に設定）で１／４”Ｍｉｃｒｏｔｉｐを用いて２ ｘ ２０秒間の超音波パルスにより細胞を溶菌し、過剰の泡立ちを注意深く回避した。この試料を４℃、８５００ ｘ ｇで２０分間遠心分離し、上清を１５ｍＬ管に移した。Ｃｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３ＧＡ色素樹脂（Ｓｉｇｍａ，製品＃８３２１）を含有する５０％スラリー１．０ｍＬを各試料に加え、内容物を穏やかに振盪しながら２時間混合した。次にこの試料を個々の０．８ ｘ ４．０ｃｍ（Ｂｉｏｒａｄ， Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ，カタログ番号７３１−１５５０）に移し、非結合物質を重力の下で樹脂から排出させた。各カラムを緩衝液Ａ ６ｍＬ、次いで緩衝液Ｂ（例えば３００ｍＭ ＫＣｌを加えた緩衝液Ａ）６ｍＬ、そして最後に緩衝液Ｃ（例えば１．５Ｍ ＫＣｌを含有する緩衝液Ａ）６ｍＬで洗浄し、一方で６ｍＬずつの画分を清浄な管に集めた。この試料を修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの存在について評価し、クマシーブルー染色による標準ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を用いて純度を概算した。修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの各々について、緩衝液Ｃ画分の純度はおよそ７５％の修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを含有していると測定された。総タンパク質含有量は、Ｂｉｏｒａｄタンパク質試薬（製品＃５００−０００６）とタンパク質標準としてのＢＳＡを使用し、Ｂｒａｄｆｏｒｄ検定法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ｍ．Ｍ． １９７６， Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７２：２４８）を用いて定量した。
【０１８２】
Ａ） ＮＡＤＨの産生を検出
修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの機能的活性を評価するため、ＮＡＤからＮＡＤＨへの変換を３７℃、３４０ｎｍで分光光度的に測定した。検定緩衝液は、０．４０ｍＭ ＩＭＰおよび０．４０ｍＭ ＮＡＤを添加した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２（３７℃）、１００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、および３ｍＭ ＤＴＴ（即ち緩衝液Ｄ）で構成した。合計１．００ｍＬの反応混合物をそれぞれ入れた石英キュベット（１．０ｃｍ光路長）を使用した。多セル移送手段を備えたＣａｒｙ Ｍｏｄｅｌ ３Ｅ ｕｖ−ｖｉｓ分光光度計を用いて６種類の濃度のタンパク質を同時に評価した。タンパク質濃度は２０−３００ｎＭの間で相違していた。ＮＡＤＨの産生をδＯＤ３４０（ε＝６２２０Ｍ−１ｃｍ−１）で５分間測定することにより決定した。機器のソフトウェアを用いて、反応初速度を、各データの組への線形最小二乗法の当てはめとして算出した。
【０１８３】
修飾ＩＭＰＤＨ多量体−ＤＫＴ、−ＳＰＳ、−ＳＰＴ、および−ＡＧＲＰは、野生型ホロ酵素に比して、より高レベルのＮＡＤＨ、１．２３ないし１．９４μｍｏｌｅ／分ｍｇタンパク質の範囲のレベルを産生した（図１９）。例えば、ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴの多量体は１．９４μｍｏｌｅ／分ｍｇタンパク質、ＩＭＰＤＨ−ＳＰＳの多量体は１．２３μｍｏｌｅ／分ｍｇタンパク質、ＩＭＰＤＨ−ＳＰＴの多量体は１．６２μｍｏｌｅ／分ｍｇタンパク質、そしてＩＭＰＤＨ−ＡＧＲＰの多量体は１．２２μｍｏｌｅ／分ｍｇタンパク質を産生した。これに対して野生型ＩＭＰＤＨホロ酵素はおよそ１．００μｍｏｌｅ／分ｍｇタンパク質を産生した。
【０１８４】
修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチド多量体を＞９５％純度に精製した後、さらに分析した。動力学的特性決定（例えばｋｃａｔ値に基づく）は、修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドが野生型ＩＭＰＤＨ ＩＩ型よりもほぼ２倍活性であることを示した。
【０１８５】
実施例３
以下に、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの機能的活性に及ぼすＭＰＡの阻害効果を評価するために使用した方法の説明を提供する。
【０１８６】
修飾ＩＭＰＤＨ多量体−ＤＫＴ、−ＳＰＳ、−ＳＰＴおよび−ＡＧＲＰの機能的活性（例えばＮＡＤＨ産生）に及ぼすＭＰＡの阻害効果を、連続希釈法と定常状態酵素動力学法を用いて決定した（図２０）（Ｓ．Ｆ．Ｃａｒｒ， ｅｔ ａｌ． １９９３ 上記；Ｂ．Ｘｉａｎｇ， ｅｔ ａｌ．， １９９６ 上記）。
【０１８７】
修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの濃度を１つの濃度に固定し（例えば７０ｍＭ）、緩衝液Ｄ中、高基質条件（即ち、０．４０ｍＭ ＩＭＰ、０．４０ｍＭ ＮＡＤ）の下で、インヒビターを６種類の濃度に変化させた（即ち、０、２、５、１０、２０および５０ｎＭ）。ＭＰＡ（Ｓｉｇｍａ、製品＃Ｍ５２５５）をＤＭＳＯ中２０ｍＭに調製し、１．００ｍＬ反応につき２５μＬ ＭＰＡ試料となるよう連続希釈を調製した。酵素の添加によって反応を開始させ、１５分間監視した。算出した初速度をＭＰＡ濃度の関数としてプロットしたが、これは各々の突然変異体がナノモル範囲でＭＰＡに感受性であることを立証した。ＭＰＡ濃度プロットに対する規格化した活性（即ちＭＰＡが存在しない）を目視調査することによっておよそのＩＣ５０値を見積もったが、その値は１５−３０ｎＭの範囲であった。
【０１８８】
修飾ＩＭＰＤＨ多量体および野生型ヒトＩＩ型ＩＭＰＤＨホロ酵素の活性は、１５−３０ｎＭの濃度範囲でＭＰＡにより５０％まで阻害された。全試料について、修飾ＩＭＰＤＨ多量体についてはおよそ７０ｎＭタンパク質濃度、そして野生型ＩＭＰＤＨホロ酵素についてはおよそ５０ｎＭタンパク質に対応する、３μｇのタンパク質を使用した。
【０１８９】
＞９５％純度に精製した修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドを定常状態酵素動力学法を用いてさらに評価した。ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴタンパク質の固定濃度５０ｎＭを使用し、基質ＩＭＰおよびＮＡＤを変えて初速度を３７℃で測定し、それぞれのＫｍおよびｋｃａｔ値を決定した（Ｓｅｇｅｌ，Ｉ．Ｈ．， １９７５， Ｅｎｚｙｍｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ： Ｂｅｈａｖｉｏｒ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒａｐｉｄ Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ａｎｄ Ｓｔｅａｄｙ−Ｓｔａｔｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹ）。緩衝液Ｄを使用し５０ｎＭタンパク質で以下の速度パラメータを決定した：ｋｃａｔ、ＫｍＩＭＰ、ＫｍＮＡＤ、およびＫｉＸＭＰ。ＫｉｉＭＰＡの決定には１０ｎＭタンパク質を使用した。ＫｉｎｅｔＡｓｙｓｔ動力学ソフトウェア（ＩｎｔｅｌｌｉＫｉｎｅｔｉｃｓ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）またはＴｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ（登録商標）ソフトウェア（ＭｉｃｒｏＭａｔｈ（登録商標） Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ．， Ｓａｌｔ Ｌａｋｅ Ｃｉｔｙ， ＵＴ）のいずれかによる適当なモデルを用いて、複製データの組への広域当てはめから、値を決定した。
【０１９０】
定常状態動力学的パラメータ
2004514409.tif 000006
【０１９１】
実施例４
以下に、修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴ多量体の精製試料を得るために、そしてそのＸ線結晶構造を得るために使用した方法の説明を提供する。
【０１９２】
ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドは典型的には二つのクロマトグラフィー工程で＞９５％純度まで精製した。培養４Ｌから得た凍結細胞を、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２（４℃で測定）、２０ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、それぞれ１μｇ／ｍＬのベスタチン、ロイペプチン、ペプスタチン、およびＥ−６４からなる溶菌緩衝液（緩衝液＃１）中で、氷上で融解させた。別途記載のない限り、全ての工程を４℃で実施した。３／４”プローブチップおよびＢｒａｎｓｏｎモデル４５０超音波波動器（７出力設定、および３０％効率サイクルで２ ｘ ５分サイクル）を使用する超音波処理により、細胞を氷上で溶菌した。この試料を８５００ ｘ ｇで２０分間遠心分離し、上清を清浄なポリカーボネート瓶に移した。
【０１９３】
緩衝液＃２（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２、２０ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、および１μｇ／ｍＬロイペプチン）で平衡化したＣｉｂａｃｒｏｎ Ｂｌｕｅ ３ＧＡ高速流アガロース色素親和樹脂（Ｓｉｇｍａ、カタログ＃Ｃ８３２１）の５０ｍＬカラム（２．５ ｘ １０ｃｍ）に、このタンパク質をロードした。タンパク質を蠕動ポンプにより０．７ｍＬ／分でロードし、流れを２８０ｎｍでの吸光度検出によって監視した。非結合タンパク質は吸光度が基線に戻るまで緩衝液＃２により３ｍＬ／分で溶出した。ＫＣｌ勾配を１５カラム容量にわたって使用し、緩衝液＃２および緩衝液＃３（即ち、２０００ｍＭ ＫＣｌを含有する他は緩衝液＃２と同じ）を用いてＩＭＰＤＨ−ＤＫＴを溶出した。ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび活性検定（即ち、δＯＤ３４０によるＮＡＤＨ産生）によって同定し、適当な画分を合し、３回交換した緩衝液＃４（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２、３００ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、および１μｇ／ｍＬロイペプチン）に対して透析した。
【０１９４】
記載のようにして（即ち、Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ， １９８７， Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４０：２２７７−２２８２）調製した樹脂５０ｍＬ（２．５ ｘ １０ｃｍ）を用いてＩＭＰ親和クロマトグラフィーを実施した。タンパク質を０．７ｍＬ／分でカラムにロードし、計２００ｍＬを用いて３ｍＬ／分で洗浄して非結合物質を除去した。ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴは、２００ｍＬの緩衝液＃５（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２、３００ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＩＭＰ）を用いて３ｍＬ／分で特異的に溶出した。溶出したタンパク質を、４回交換した緩衝液＃６（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．２、３００ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール（ｖ／ｖ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ）に対して透析し、非結合ＩＭＰを除去した。
【０１９５】
ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドの試料の純度を、クマシー染色した４−２０％ Ｔｒｉｓ−グリシンゲルで表す（図２１）が、これはおよそ４２ｋＤａに検出される単一のバンドを示す。この試料の高い純度は、添付したＨＰＬＣ−ＥＭＳ追跡（図２２Ａ、Ｂ、Ｃ）および分析用ゲル透過クロマトグラフィー追跡（図２３）においても立証できる。エレクトロスプレー質量分析により、観測質量４１０７７Ｄａを有する修飾されたデス−Ｍｅｔ型に矛盾しない質量を有する単一のタンパク質成分が同定された（図２２Ｃ）。
【０１９６】
さらに、この分析用ゲル透過クロマトグラフィー追跡の結果は、修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドが恐らくは四量体と八量体型の間で動的平衡状態にあるということを示した（図２３）。この方法および０．６９ｍｇ／ｍＬでの動的光散乱法のいずれによっても凝集物は観察されなかった。この精製修飾タンパク質のＵＶ−ｖｉｓスペクトルは、野生型ＩＭＰＤＨ試料について観察されたように、強固に結合したヌクレオチドＯＤ２８０／ＯＤ２６０＝１．２４と矛盾が無かった。最終精製工程はＩＭＰ−親和カラムからの溶出を含んでいたため、これは予期せぬ事ではなかった（Ｉｋｅｇａｍｉ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， １９８７ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ４０：２２７７−２２８２）。円二色性スペクトル測定の結果は、修飾タンパク質が良好に折り畳まれ、熱的にかなり安定であることを示した（ｔ１／２〜７５℃）。
【０１９７】
実施例５
以下に、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの結晶を取得するために使用した方法の説明を提供する。
【０１９８】
Ａ） 材料：
略語：ＩＭＰＤＨ：イノシン５’−一リン酸デヒドロゲナーゼ：ＩＭＰ ：イノシン５’−一リン酸：ＮＡＤ＋：β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド：ＭＰＡ：ミコフェノール酸：ＭＥＰ：１−メチル−２−ピロリジノン：ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸：ＤＴＴ：ジチオトレイトール：ＡＤＡ：Ｎ−［２−アセトアミド］−２−イミノジ酢酸。
【０１９９】
ＩＭＰ（遊離酸）、ＮＡＤ＋（ナトリウム塩）、ＭＰＡ、ＥＤＴＡ、ＡＤＡ、Ｔｒｉｚｍａ塩基、ＫＣｌ、およびグリセロールはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。ＭＥＰ、およびＤＴＴはＡｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙから購入した。Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ（登録商標）−４ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｆｉｌｔｅｒ ＆ Ｔｕｂｅ Ｂｉｏｍａｘ−１０Ｋ ＮＭＷＬ ＭｅｍｂｒａｎｅはＭｉｌｌｉｐｏｒｅから購入した。
【０２００】
Ａ） タンパク質の結晶化：
修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴの活性は前進経路によって阻害される（Ｆｌｅｍｉｎｇ，Ｍ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５：６９９０−６９９７）。ＭＰＡを秤量し、ＭＥＰに最終濃度５００ｍＭで溶解した。新しい緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３００ｍＭ ＫＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．０、２３℃）を調製し、０．２２μｍフィルターで濾過した。精製タンパク質を緩衝液Ａ中に０．６９ｍｇ／ｍｌで保存した。次にＮＡＤ＋、ＩＭＰ、およびＭＰＡを二倍モル過剰で加え、室温で１時間平衡化した。阻害された複合体を徹底的に濃縮し、１０Ｋ ＮＭＷＬ膜を用いて２ｍＭ ＭＰＡを含有する新しい緩衝液Ａに４℃で交換した。ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴ多量体の結晶を、懸滴蒸気拡散法を用いて室温で成長させた。２ｍＭ ＭＰＡを含有する緩衝液Ａ中２．９７ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液２μｌを、１１．７５％飽和硫酸アンモニウムおよび０．１Ｍ ＡＤＡ ｐＨ６．５を含有する保存溶液２．０μｌと混合した。このプレートを密封し、保存液１．０ｍｌに対して平衡化した。結晶は数日以内に現れ、２週間で０．０９ｍｍ ｘ ０．０９ｍｍ ｘ ０．０７ｍｍの最大サイズに達した。
【０２０１】
実施例６
以下に、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドに結合したＭＰＡの結晶構造を分析するために使用した方法の説明を提供する。
【０２０２】
修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴ多量体のＸ線結晶構造を以下のようにして決定した。ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴの結晶をミコフェノール酸と共に同時結晶化させ、１００ｍＭ Ｎ−（２−アセトアミド）−２−イミノジ酢酸、ｐＨ６．５、１４％飽和硫酸アンモニウム、および凍結保護物質としての２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する溶液に移した。次にこの結晶をＨａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（登録商標）クライオピンに取り付けたファイバーループで捕捉し、ループとピンを液体窒素中に沈めた（Ｒｏｄｇｅｒｓ， １９９４）。次いでファイバーループ内の結晶を、Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ ＳｏｕｒｃｅのＩＭＣＡ光線１７ＩＤで、ＭＡＲ（登録商標） ＣＣＤ １６５ｍｍにマウントし、１オングストロームの波長でデータを集めた。空間群はａ＝ｂ＝１０２．９オングストローム；ｃ＝１７８．３オングストロームのＩ４２２であった。このデータを統合し、ＨＫＬプログラム群により変形した（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，Ｚ．， ＆ Ｍｉｎｏｒ，Ｗ．， １９９７ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２７６：３０７−３２６）。データ収集の統計を下に要約する：
【０２０３】
2004514409.tif 000007
データの分解能は、検出機の開口部がかなり小さいため限られていた。後にＣｕＫα（１．５４オングストローム）放射を用いて、さらにデータを２オングストロームの分解能まで集めた。
【０２０４】
ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴ突然変異体の構造を、ＣＣＰ４プログラム群（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ， Ｎｕｍｂｅｒ ４， １９９４ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ． Ｓｅｃｔ． Ｄ ５０， ７６０−７６３）に提供されたＡｍｏＲｅプログラム（Ｎａｖａｚａ，Ｊ．， １９９４ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ． Ａ ５０：１５７−１６３）を使用して、分子置換により決定した（Ｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｍ．Ｇ．， １９９０ Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｔ．Ｓｅｃｔ． Ａ ４６：７３−８２）。このモデルはハムスターＩＭＰＤＨ ＩＩの残基１７−１１０、２４４−４２０および４２７−５１４で構成されていた（Ｓｉｎｃｈａｋ，Ｍ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｃｅｌｌ ８５， ９２１−９３０）。ハムスターとヒトの間の配列相違のため、以下の残基：２６５、２９０、２９２をＡｌａに変え、残基３２７をＣｙｓからＳｅｒに変換した。回転および翻訳機能の両者において１０−４オングストロームの分解能からのデータを使用した。回転機能溶液は１．９のシグナル対ノイズ比、翻訳機能溶液は１．８のシグナル対ノイズ比を持ち、いずれも極めて明確な構造決定を示した。最小二乗剛体当てはめの後、相関係数は７０．８、Ｒ値は３２．８であり、これもまた極めて明確な構造決定を示した。この構造をＸ−ＰＬＯＲ（Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．， １９９２ Ｘ−ＰＬＯＲバージョン３．１、Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ）で精密にし、手動の再構築をＣＨＡＩＮ（Ｓａｃｋ，Ｊ．Ｓ．， １９８８ Ｊ．Ｍｏｌ． Ｇｒａｐｈ． ６：２２４−２２５）を用いて達成した。最終的なモデルは２６８４のタンパク質原子、Ｃｙｓ ３３１に共有結合したイノシン一リン酸、ミコフェノール酸および２１９の溶媒分子で構成されていた。理想結合長から０．０１１オングストローム、理想結合角から１．５゜、そして不適切な二面角から１．５゜のｒ．ｍ．ｓ．偏差である、８−２．２オングストローム分解能からのデータについて、Ｒ値は０．２０１、自由Ｒ値は０．２６４であった。
【０２０５】
この構造は、ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴ多量体が、無傷のハムスターＩＭＰＤＨに関する初期の研究（Ｓｉｎｃｈａｋ，Ｍ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｃｅｌｌ ８５：９２１−９３０）で示されたものと全く同じ様式でＩＭＰおよびミコフェノール酸に結合することを示した。この構造は、Ｇｌｙ３０２とＡｓｎ３０３の間の活性部位の近傍に異常なｃｉｓペプチド結合を同定する能力によって立証されるように、より高い分解能の故に、より良質であった。さらに、Ｖｅｒｔｅｘが本発明者等に提示したハムスターＩＭＰＤＨ ＩＩの座標は溶媒分子を含んでいなかった。但しそれらは論文には記載されていた（Ｓｉｎｃｈａｋ，Ｍ．Ｄ．， ｅｔ ａｌ．， １９９６ Ｃｅｌｌ ８５：９２１−９３０）。本明細書に開示する結果は、活性部位における水分子の部位を提供し、それはモデル作製にとって極めて貴重であった。加えて、Ｎ末端（１１−１６番）の６残基およびＤＫＴ挿入物（各々１１０Ａ、１１０Ｂおよび１１０Ｃと番号付けた）ならびに残基４２１主鎖を、ハムスター構造のモデルには無かった電子密度に当てはめることができた。
【０２０６】
要約すると、修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴ多量体は、構造に基づく薬品設計のための優れた対象である。ミコフェノール酸を伴う該分子は容易に結晶化でき、実験室で２オングストロームの分解能まで回折される結晶を生成したが、これは、化学者および分子モデル製造者に、より強力なインヒビターおよびより望ましい性質を持つインヒビターを設計するための高品質の情報を提供する充分な範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、Ｉ型野生型ヒトＩＭＰＤＨポリペプチドのアミノ酸配列を示す（配列番号４８）。
【図２】図２は、ＩＩ型野生型ヒトＩＭＰＤＨポリペプチドのアミノ酸配列を示す（配列番号４９）。
【図３】図３は、野生型ＩＭＰＤＨポリペプチドのサブドメイン領域を置換している置換オリゴペプチドを含む修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの模式的表示である。
【図４】図４は、本発明に係るＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドのアミノ酸配列を示す（配列番号２０）。
【図５】図５は、本発明に係るＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号４０）。
【図６】図６は、本発明に係るＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＳＰＳポリペプチドのアミノ酸配列を示す（配列番号２２）。
【図７】図７は、本発明に係るＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＳＰＳ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号４１）。
【図８】図８は、本発明に係るＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＧＳＧポリペプチドのアミノ酸配列を示す（配列番号２９）。
【図９】図９は、本発明に係るＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＧＳＧ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号４２）。
【図１０】図１０は、本発明に係るＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＳＰＴポリペプチドのアミノ酸配列を示す（配列番号２７）。
【図１１】図１１は、本発明に係るＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＳＰＴ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号４３）。
【図１２】図１２は、本発明に係るＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＳＰＴＱ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号４５）。
【図１３】図１３は、本発明に係るＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＡＧＲＰポリペプチドのアミノ酸配列を示す（配列番号３６）。
【図１４】図１４は、本発明に係るＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＡＧＲＰ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号４６）。
【図１５】図１５は、本発明に係るＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＮＳＰＬポリペプチドのアミノ酸配列を示す（配列番号３８）。
【図１６】図１６は、本発明に係るＩＩ型ＩＭＰＤＨ−ＮＳＰＬ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号４７）。
【図１７】図１７は、本発明に係るＩ型ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドのアミノ酸配列を示す（配列番号３０）。
【図１８】図１８は、上記実施例１に記載する、置換トリおよびテトラペプチドの設計に使用する、折り畳まれた野生型ヒトＩＩ型ＩＭＰＤＨタンパク質のモデルを示すリボン図である。
【図１９】図１９は、上記実施例２に記載するように、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドを含むタンパク質多量体からのＮＡＤＨ産生の検出を説明する棒グラフである。
【図２０】図２０は、上記実施例３に記載するように、修飾ＩＭＰＤＨポリペプチドの酵素活性をＭＰＡが阻害することを証明するグラフである。
【図２１】図２１は、上記実施例４に記載するように、単離された修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドを示すクマシー染色したＴｒｉｓ−グリシンゲルである。
【図２２】図２２Ａ−Ｃは、上記実施例４に記載するように、単離した修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドのＨＰＬＣ−ＥＭＳ追跡である。Ａ） 合計のイオン流量対溶出時間を示すＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドのクロマトグラム；Ｂ） １１．０３分に溶出するタンパク質についての規格化した強度対質量／電荷を示す積分した質量スペクトル；Ｃ） １１．０３分に溶出するタンパク質について図１３Ｂのデータを再構成したスペクトル。
【図２３】図２３は、上記実施例４に記載する、単離した修飾ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴポリペプチドのゲル透過クロマトグラフを例示している。
【図２４】図２４は、本発明に係るＩ型ＩＭＰＤＨ−ＤＫＴ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す（配列番号４４）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004514409.tif 000193
2004514409.tif 000194
【国際調査報告】
2004514409.tif 000195
2004514409.tif 000196