(57)【要約】本発明は、転写されたヒト配列について同定された単一ヌクレオチド多型を含む核酸ならびにその核酸を使用する方法を提供する。ａ）多型配列（配列番号１〜２１７）の１つ以上を含むヌクレオチド配列；ｂ）該ヌクレオチド配列のフラグメントであって、ただし、該フラグメントは、該多型配列における多型部位を含む、フラグメント；ｃ）該多型配列（配列番号１〜２１７）の１つ以上に相補的な配列を含む相補的なヌクレオチド配列；およびｄ）該相補的なヌクレオチド配列のフラグメントであって、ただし、該フラグメントは、該多型配列における多型部位を含む、フラグメント、からなる群より選択される単離されたポリヌクレオチド。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
ａ）多型配列（配列番号１〜２１７）の１つ以上を含むヌクレオチド配列；
ｂ）該ヌクレオチド配列のフラグメントであって、ただし、該フラグメントは、該多型配列における多型部位を含む、フラグメント；
ｃ）該多型配列（配列番号１〜２１７）の１つ以上に相補的な配列を含む相補的なヌクレオチド配列；および
ｄ）該相補的なヌクレオチド配列のフラグメントであって、ただし、該フラグメントは、該多型配列における多型部位を含む、フラグメント、
からなる群より選択される単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２】
ＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
ＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
約１０ヌクレオチド長と約１００ヌクレオチド長との間である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
約１０ヌクレオチド長と約９０ヌクレオチド長との間である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
約１０ヌクレオチド長と約７５ヌクレオチド長との間である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
約１０塩基長と約５０塩基長との間である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
約１０塩基長と約４０塩基長との間である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
アンジオポエチン、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼ、ＭＨＣクラスＩ組織適合性抗原、またはホスホグリセレートキナーゼに関連するポリペプチドをコードする核酸に由来する、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記多型部位が前記多型配列について表１、第５列に列挙されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
前記多型部位の相補体が、前記多型配列の相補体について、表１第５列に列挙されるヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記多型部位が、前記多型配列について、表１第６列に列挙されるヌクレオチドを含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記多型部位の相補体が、前記多型配列について、表１第６列に列挙されるヌクレオチドの相補体を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
第一のポリヌクレオチド中に含まれる多型部位において該第一のポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離された対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドであって、該第一のポリヌクレオチドは、以下：
ａ）１つ以上の多型配列（配列番号１〜２１７）を含むヌクレオチド配列であって、ただし、該多型配列は、該多型配列について、表１第５列に示されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列；
ｂ）該多型配列のフラグメントであるヌクレオチド配列であって、ただし、該フラグメントは、該多型配列ににおける多型部位を含む、ヌクレオチド配列；
ｃ）１つ以上の多型配列（配列番号１〜２１７）に相補的な配列を含む相補的なヌクレオチド配列であって、ただし、該相補的なヌクレオチド配列は、表１第５列に示されるヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチドを含む、相補的なヌクレオチド配列；および
ｄ）該相補的な配列のフラグメントである、ヌクレオチド配列であって、ただし、該フラグメントは、該多型配列における多型部位を含む、ヌクレオチド配列、
からなる群より選択される、オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
以下：
ａ）１つ以上の多型配列（配列番号１〜２１７）を含むヌクレオチド配列であって、該多型配列は、該多型配列について表１第５列に列挙されるヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列；
ｂ）該ヌクレオチド配列のいずれかのフラグメントである、ヌクレオチド配列；
ｃ）１つ以上の多型配列（配列番号１〜２１７）に対して相補的な配列を含む相補的なヌクレオチド配列であって、該多型配列が表１第５列に列挙されるヌクレオチドの相補体を含む、ヌクレオチド配列；および
ｄ）該相補的な配列のフラグメントであるヌクレオチド配列であって、ただし、該フラグメントは、該多型配列における多型部位を含む、ヌクレオチド配列、からなる群より選択される第二のポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
約１０塩基長と約５１塩基長との間である、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
アンジオポエチン、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼ、ＭＨＣクラスＩ組織適合性抗原、またはホスホグリセレートキナーゼに関連するポリペプチドを同定する、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
前記オリゴヌクレオチドが約１５塩基長と約３０塩基長との間である、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
核酸における多型部位を検出する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）配列番号１〜２１７からなる群より選択される多型配列またはその相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに、該核酸を接触させる工程であって、ただし、該多型配列は、該多型配列について、表１第５列に示されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを含むか、または該相補体は、表１第５列に示されるヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチドを含む、工程；ならびに
ｂ）該核酸および該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするか否かを決定する工程、
を包含する、方法であって、それによって、該オリゴヌクレオチドの該核酸配列へのハイブリダイゼーションが、該核酸における該多型部位の存在を示す、方法。
【請求項２０】
前記オリゴヌクレオチドは、前記多型配列が該多型配列について表１第５列に示されるヌクレオチドを含む場合、または該多型配列の相補体が該多型配列について表１第５列に示されるヌクレオチドの相補体を含む場合、該多型配列にハイブリダイズしない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記オリゴヌクレオチドが、アンジオポエチン、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼ、ＭＨＣクラスＩ組織適合性抗原、またはホスホグリセレートキナーゼに関連するポリペプチドを同定する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記オリゴヌクレオチドが約１５塩基長と約３０塩基長との間である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
被験体における配列多型の存在を検出する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）該被験体からの核酸を提供する工程；
ｂ）配列番号１〜２１７からなる群より選択される多型配列またはその相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに、該核酸を接触させる工程であって、ただし、該多型配列は、該多型配列について、表１第５列に示されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを含むか、または該相補体が、表１第５列に示されるヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチドを含む、工程；ならびに
ｃ）該核酸および該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズするか否かを決定する工程であって、それによって、該オリゴヌクレオチドの該核酸配列へのハイブリダイゼーションが、該被験体における該多型の存在を示す、工程、
を包含する、方法。
【請求項２４】
第一の核酸および第二の核酸の関連性を決定する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）第一の核酸および第二の核酸を提供する工程；
ｂ）配列番号１〜２１７からなる群より選択される多型配列またはその相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに、該第一の核酸および該第二の核酸を接触させる工程であって、ただし、該多型配列は、該多型配列について、表１第５列に示されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを含むか、または該相補体が、表１第５列に示されるヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチドを含む、工程；
ｃ）該第一の核酸および該第二の核酸が該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするか否かを決定する工程；ならびに
ｄ）該オリゴヌクレオチドへの該第一の核酸および該第二の核酸のハイブリダイゼーションを比較する工程であって、ここで、該第一の核酸および該第二の核酸の該核酸配列へのハイブリダイゼーションが、該第一の被験体および該第二の被験体が関連していることを示す、工程、
を包含する方法。
【請求項２５】
前記オリゴヌクレオチドは、前記多型配列が該多型配列について表１第５列に示されるヌクレオチドを含む場合または該多型配列の相補体が該多型配列について表１第５列に示されるヌクレオチドの相補体を含む場合、該多型配列にハイブリダイズしない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記オリゴヌクレオチドが、約１０塩基長と約５１塩基長との間である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記オリゴヌクレオチドが、約１０塩基長と４０塩基長との間である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記オリゴヌクレオチドが、約１５塩基長と３０塩基長との間である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
１つ以上のアミノ酸残基において多型部位を含む単離されたポリペプチドであって、該タンパク質は、多型配列配列番号１〜２１７からなる群より選択されるポリヌクレオチドまたはその相補体によってコードされ、ただし、該多型配列は、該多型配列について、表１第５列に示されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを含むか、または該相補体が、表１第５列に示されるヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチドを含む、単離されたポリペプチド。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが野生型タンパク質と同一のオープンリーディングフレームにおいて翻訳され、該野生型タンパク質のアミノ酸配列は、前記多型の部位を除き該多型タンパク質のアミノ酸配列と同一である、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記多型配列またはその相補体によってコードされるポリペプチドが、該多型配列について表１第６列に列挙されるヌクレオチドを含むか、または該相補体が表１第６列に列挙されるヌクレオチドの相補体を含む、請求項２９に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
多型配列配列番号１〜２１７からなる群より選択されるポリヌクレオチドによってコードされるヌクレオチド配列またはその相補体を含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体であって、ただし、該多型配列が、該多型配列について、表１第５列に示されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを含むか、または該相補体が表１第５列に示すヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチドを含む、抗体。
【請求項３３】
前記多型配列について、表１第６列に列挙されるヌクレオチドを含む多型配列によってコードされるポリペプチドに特異的に結合する、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３４】
前記多型配列について、表１第５列に列挙されるヌクレオチドを含む多型配列によってコードされるポリペプチドに特異的に結合しない、請求項３２に記載の抗体。
【請求項３５】
被験体において、１つ以上のアミノ酸残基多型を有するポリペプチドの存在を検出する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）該被験体からのタンパク質サンプルを提供する工程；
ｂ）抗体抗原複合体の形成を可能にする条件下で、請求項３４に記載の抗体に、該サンプルを接触させる工程；ならびに
ｃ）該抗体抗原複合体を検出する工程、
を包含する方法であって、それによって、該複合体の存在が該ポリペプチドの存在を示す、方法。
【請求項３６】
被験体における配列多型の存在に起因する病理に罹患する、危険性にある、またはその疑いのある該被験体を処置する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）配列番号１〜２１７からなる群より選択される多型配列またはその相補体を含む第一の核酸の異常発現に関連する病理に罹患する被験体を提供する工程；ならびに
ｂ）該多型配列を含む第二の核酸配列の治療有効用量を該被験体に投与する工程であって、ただし、該第二の核酸が、野生型対立遺伝子において存在するヌクレオチドを含む、工程、
を包含する方法であって、それによって、該被験体を処置する、方法。
【請求項３７】
前記第二の核酸配列が、前記多型配列について、表１第５列に列挙されるヌクレオチドを含む多型配列を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
被験体における配列多型の存在に起因する病理に罹患する、危険性にある、またはその疑いのある該被験体を処置する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）多型配列配列番号１〜２１７からなる群より選択される多型配列またはその相補体の異常発現に関連する病理に罹患する被験体を提供する工程；および
ｂ）ポリペプチドの治療有効用量を該被験体に投与する工程、
を包含する、方法であって、
ここで、該ポリペプチドが配列番号１〜２１７からなる群より選択される多型配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるか、または多型配列配列番号１〜２１７のいずれか１つに相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ、ただし、該多型配列は、該多型配列について、表１第６列に列挙されるヌクレオチドを含む、方法。
【請求項３９】
被験体における配列多型の存在に起因する病理に罹患する、危険性にある、またはその疑いのある該被験体を処置する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）配列番号１〜２１７からなる群より選択される多型配列またはその相補体を含む第一の核酸の異常発現に関連する病理に罹患する、危険性にある、またはその疑いのある被験体を提供する工程；ならびに
ｂ）請求項３４に記載の抗体の有効用量を該被験体に投与する工程、
を包含する方法であって、それによって、該被験体を処置する、方法。
【請求項４０】
被験体において配列多型の存在に起因する病理に罹患する、危険性にある、またはその疑いのある被験体を処置する方法であって、該方法は以下の工程：
ａ）配列番号１〜２１７からなる群より選択される多型配列またはその相補体を含む核酸の異常発現に関連する病理に罹患する、危険性にある、またはその疑いのある被験体を提供する工程；ならびに
ｂ）配列番号１〜２１７からなる群より選択される多型配列を含むオリゴヌクレオチド、または多型配列配列番号１〜２１７のいずれか１つに相補的なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの有効用量を該被験体に投与する工程であって、ただし、該多型配列が、該多型配列について、表１第５列または表１第６列に列挙されるヌクレオチドを含む、工程、
を包含する、方法であって、それによって、該被験体を処置する、方法。
【請求項４１】
第一のポリヌクレオチド中に含まれる多型部位において該第一のポリヌクレオチドにハイブリダイズする１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドアレイであって、該第一のポリヌクレオチドは、以下：
ａ）１つ以上の多型配列（配列番号１〜２１７）を含むヌクレオチド配列；
ｂ）該ヌクレオチド配列のいずれかのフラグメントであるヌクレオチド配列であって、ただし、該フラグメントは、該多型配列において多型部位を含む、ヌクレオチド配列；
ｃ）１つ以上の多型配列（配列番号１〜２１７）に相補的な配列を含む、相補的なヌクレオチド配列；ならびに
ｄ）該相補的な配列のフラグメントであるヌクレオチド配列であって、ただし、該フラグメントは、該多型配列における多型部位を含む、ヌクレオチド配列、からなる群より選択される、オリゴヌクレオチドアレイ。
【請求項４２】
１０のオリゴヌクレオチドを含む、請求項４１に記載のアレイ。
【請求項４３】
１００のオリゴヌクレオチドを含む、請求項４１に記載のアレイ。
【請求項４４】
１００のオリゴヌクレオチドを含む、請求項４１に記載のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本願は、１９９８年１１月１７日に出願された米国特許出願第６０／１０９，２０４号に対して優先権を主張する。この出願の全体は、本明細書において参考として援用される。
【０００２】
（発明の背景）
核酸配列の配列多型ベースの分析は、個体の同一性および関連性を決定するための新たなアプローチをもたらした。このアプローチは、一般に、関連する個体の間の核酸配列における変更に基づく。この分析は、種々の遺伝的、診断的および法医学的な適用において広汎に使用されている。例えば、多型分析は、同一性およびパターン分析、ならびに遺伝子マップ研究において使用されている。
【０００３】
１つのそのような型の変種は、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）である。ＲＦＬＰは、第二の核酸に対して１つの核酸における制限エンドヌクレアーゼについての認識配列を作製または欠失させ得る。この変動の結果は、２つの核酸において制限酵素が生成したＤＮＡフラグメントの相対長の変更において存在する。
【０００４】
他の多型は、短縦列反復（ＳＴＲ）配列（これはまた、可変数縦列反復（ＶＮＴＲ）配列とも称される）の形式をとる。ＳＴＲ配列は、代表的に、１つの個体からの核酸において存在するが、対応するゲノム位置において、第二の関連する個体には存在しない２、３または４のヌクレオチド配列の縦列反復を含む。
【０００５】
他の多型は、個体間の、単一ヌクレオチド変種（単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ（スニップ））と称される）の形式を採る。ＳＮＰは、いくつかの場合において、ＳＮＰを含むヌクレオチド配列がｃＤＮＡに起源を有するという意味で、「ｃＳＮＰ」と称され得る。
【０００６】
ＳＮＰは、いくつかの方法で生じ得る。単一ヌクレオチド多型は、多型部位において１つのヌクレオチドが別のヌクレオチドに置換されるに起因して生じ得る。置換は、トランジションまたはトランスバージョンであり得る。トランジションは、１つのプリンヌクレオチドが、別のプリンヌクレオチドによって置換されること、または１つのピリミジンが別のピリミジンに置換されることである。トランスバージョンは、プリンがピリミジンに置換されること、またはその逆である。
【０００７】
単一ヌクレオチド多型はまた、参照対立遺伝子に対するヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入から生じ得る。従って、この多型部位は、１つの対立遺伝子が、別の対立遺伝子における単一のヌクレオチドに関してギャップを有する部位である。いくつかのＳＮＰは、遺伝子内または付近にて生じる。１つのそのようなクラスは、ポリペプチド産物をコードする遺伝子の領域内に入るＳＮＰを含む。これらのＳＮＰは、ポリペプチド産物のアミノ酸配列の変化を生じ得、そして欠損または他の改変体タンパク質の発現を生じ得る。そのような改変体産物は、いくつかの場合において、病理状態（例えば、遺伝子疾患）を生じ得る。コード配列内の多型が遺伝子疾患を生じる遺伝子の例は、鎌状赤血球貧血および嚢胞性線維症を含む。他のＳＮＰは、ポリペプチド産物の変更を生じない。当然、ＳＮＰはまた、遺伝子の非コード領域において生じ得る。
【０００８】
ＳＮＰは、高い頻度で生じる傾向があり、そしてゲノム中に均一に広がっている。ＳＮＰの頻度および均一性は、そのような多型が目的の遺伝子座の極近位に見出される確率が高いことを意味する。
【０００９】
（発明の要旨）
本発明は、一部は、ヒトＤＮＡの領域中の新規な単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の発見に基づく。
【００１０】
従って、１つの局面において、本発明は、本明細書中に記載される１つ以上のＳＮＰを含む単離されたポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは、例えば、表１に示される１つ以上の多型配列を含むヌクレオチド配列（配列番号１〜２１７）、および多型配列またはこの多型配列のフラグメントを含む（配列が多型部位を含みさえすれば）ヌクレオチド配列であり得る。このポリヌクレオチドは、あるいは、１つ以上のこの配列（配列番号１〜２１７）に相補的な配列、またはこの相補的ヌクレオチド配列のフラグメント（ただし、このフラグメントが多型配列中に多型部位を含む場合）を含むヌクレオチド配列を含み得る。
【００１１】
このポリヌクレオチドは、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであり得、そして約１０ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間、例えば、１０〜９０、１０〜７５、１０〜５１、１０〜４０、または１０〜３０ヌクレオチド長であり得る。
【００１２】
いくつかの実施形態において、多型配列中の多型部位は、多型配列について表１第５列に列挙したヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む。例えば、多型部位は、多型配列について表１第６列に列挙したヌクレオチドを含む。
【００１３】
他の実施形態において、多型部位の相補体は、多型配列の相補体について表１第５列に列挙したヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチド、例えば、多型配列について表１第６列に列挙したヌクレオチドの相補体を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、この多型配列は、本明細書において開示されるタンパク質ファミリーの１つに関するポリペプチドに関連する。例えば、この核酸は、ＡＴＰａｓｅ関連タンパク質、カドヘリン、または表１第１０列に同定される任意の他のタンパク質に関するポリペプチドに関連し得る。
【００１５】
別の局面において、本発明は、多型部位を含む第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離された対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを提供する。この第１のポリヌクレオチドは、例えば、１つ以上の多型配列を含むヌクレオチド配列（配列番号１〜２１７）であり得る（ただし、この多型配列が、多型配列について表１第５列に示されたヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む場合）。あるいは、この第１のポリヌクレオチドは、多型配列のフラグメントであるヌクレオチド配列であり得る（ただし、このフラグメントが、多型配列中に多型部位を含む場合）か、または１つ以上の多型配列（配列番号１〜２１７）に相補的な配列を含む相補的ヌクレオチド配列である（ただし、この相補的ヌクレオチド配列が、表１第５列に示されたヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチドを含む場合）。この第１のポリヌクレオチドは、相補的配列のフラグメントであるヌクレオチド配列をさらに含み得る（ただし、そのフラグメントがこの多型配列中に多型部位を含む場合）。
【００１６】
いくつかの実施形態において、このオリゴヌクレオチドは、第二のポリヌクレオチドに対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズしない。この第二のポリヌクレオチドは、例えば、（ａ）１つ以上の多型配列（配列番号１〜２１７）を含むヌクレオチド配列であって、この多型配列は、その多型配列について表１第５列に列挙されるヌクレオチドを含む、ヌクレオチド配列；（ｂ）その多型配列のいずれかのフラグメントであるヌクレオチド配列；（ｃ）１つ以上の多型配列（配列番号１〜２１７）に相補的な配列を含む相補的なヌクレオチド配列であって、ここで、その多型配列は、表１第５列に列挙されるヌクレオチドの相補体を含む、ヌクレオチド配列；ならびに（ｄ）その相補的な配列のフラグメントであるヌクレオチド配列であって、ただし、そのフラグメントは、その多型配列における多型部位を含む、ヌクレオチド配列。
【００１７】
このオリゴヌクレオチドは、例えば、約１０塩基長と約１００塩基長との間であり得る。いくつかの実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、約１０塩基長と約７５塩基長との間であり、約１０塩基長と約５１塩基長との間であり、約１０塩基長と約４０塩基長との間であり、または約１５塩基長と約３０塩基長との間である。
【００１８】
本発明はまた、核酸における多型部位を検出する方法を提供する。この方法は、配列番号１〜２１７からなる群より選択される多型配列またはその相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドにその核酸を接触させる工程であって、ただし、その多型配列は、その多型配列について表１第５列に示されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを含むか、またはその相補体が表１第５列に示されるヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチドを含む、工程を包含する。この方法はまた、その核酸およびそのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするか否かを決定する工程を包含する。このオリゴヌクレオチドのその核酸配列へのハイブリダイゼーションは、その核酸におけるその多型部位の存在を示す。
【００１９】
好ましい実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、その多型配列がその多型配列について表１第５列に示されるヌクレオチドを含む場合またはその多型配列の相補体がその多型配列について表１第５列に示されるヌクレオチドのその相補体を含む場合、その多型配列にハイブリダイズしない。
【００２０】
そのオリゴヌクレオチドは、例えば、約１０塩基長と約１００塩基長との間であり得る。いくつかの実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、約１０塩基長と約７５塩基長との間であり、約１０塩基長と約５１塩基長との間であり、約１０塩基長と約４０塩基長との間であり、または約１５塩基長と約３０塩基長との間である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、そのオリゴヌクレオチドによって同定される多型配列は、本明細書において開示されるタンパク質ファミリーの１つに関連するポリペプチドに関連する。例えば、この核酸は、ＡＴＰアーゼ関連タンパク質カドヘリン、または表１第１０列において同定される任意の他のタンパク質ファミリーに関連するポリペプチドに関連し得る。
【００２２】
別の局面において、本方法は、配列多型がヒトのような被験体において存在するか否かを決定する工程を包含する。この方法は、その被験体から核酸を提供する工程、および配列番号１〜２１７からなる群より選択される多型配列またはその相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドにその核酸を接触させる工程を包含する。ただし、この多型配列は、その多型配列について表１第５列において示されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを含むか、またはその相補体は、表１第５列において示されるヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチドを含む。次いで、その核酸とそのオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションが決定される。このオリゴヌクレオチドのその核酸配列への配列番号は、その被験体における多型の存在を示す。
【００２３】
さらなる局面において、本発明は、第一の核酸および第二の核酸の関連性を決定する方法を提供する。この方法は、第一の核酸および第二の核酸を提供する工程、ならびに配列番号１〜２１７からなる群より選択される多型配列またはその相補体にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドに、その第一の核酸および第二の核酸を接触させる工程であって、ただし、この多型配列は、その多型配列について、表１第５列に示されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを含むかまたはその相補体は、表１第５列に示されるヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチドを含む、工程を包含する。その方法はまた、その第一の核酸およびその第二の核酸がそのオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするか否かを決定する工程、ならびにその第一の核酸およびその第二の核酸のそのオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを比較する工程を包含する。第一の核酸および第二の核酸のその核酸へのハイブリダイゼーションは、その第一の被験体およびその第二の被験体が関連していることを示す。
【００２４】
好ましい実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、その多型配列がその多型配列について表１第５列に示されるヌクレオチドを含む場合、またはその多型配列の相補体がその多型配列について表１第５列に示されるヌクレオチドのその相補体を含む場合、その多型配列にハイブリダイズしない。
【００２５】
そのオリゴヌクレオチドは、例えば、約１０塩基長と約１００塩基長との間であり得る。いくつかの実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、約１０塩基長と約７５塩基長との間であり、約１０塩基長と約５１塩基長との間であり、約１０塩基長と約４０塩基長との間であり、または約１５塩基長と約３０塩基長との間である。
【００２６】
この方法は、種々の適用において使用され得る。例えば、この第一の核酸は、犯罪現場において集められた物理的証拠から単離され得る。そして第二の核酸は、その犯罪に関与していると疑われている個人から得られ得る。この方法を用いてこの２つの核酸を適合させることにより、その物理的証拠がその個人に起源を有するか否かを確立し得る。
【００２７】
別の例において、第１のサンプルは、子供の父親であると疑われるヒトの男性由来であり得、そして第２のサンプルは、子供由来であり得る。記載された方法を使用して一致を確立することは、この男性がこの子供の父親であるか否かを確立し得る。
【００２８】
別の局面において、本発明は、１つ以上のアミノ酸残基で多型部位を含む、単離されたポリペプチドを提供し、このタンパク質は、多型配列である配列番号１〜２１７またはその相補体のうちの１つを含むポリヌクレオチドにより、コードされ、ただし、この多型配列は、この多型配列について表１の５列に記載されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを含むか、またはこの相補体は、表１の５列に記載されるヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチドを含む。
【００２９】
このポリペプチドは、例えば、本明細書中に開示されるタンパク質ファミリーのうちの１つに関連し得る。例えば、ＡＴＰａｓｅ関連タンパク質、カドヘリン、または表１の１０列に提供される他のタンパク質のいずれかに関連し得る。
【００３０】
いくつかの実施形態において、このポリペプチドは、野生型タンパク質が翻訳されるのと同じオープンリーディングフレームで翻訳され、この野生型タンパク質のアミノ酸配列は、多型の部位以外は、この多型タンパク質のアミノ酸配列と同一である。
【００３１】
いくつかの実施形態において、この多型配列またはその相補体によりコードされるポリペプチドは、この多型配列について表１の６列に列挙されるヌクレオチドを含むか、またはこの相補体は、表１の６列に列挙されるヌクレオチドの相補体を含む。
【００３２】
本発明はまた、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供し、このポリヌクレオチドは、多型配列である配列番号１〜２１７からなる群より選択されるポリヌクレオチドまたはその相補体によりコードされる、ヌクレオチド配列を含む。この多型配列は、この多型配列について表１の５列に記載されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを含むか、またはこの相補体は、表１の５列に記載されるヌクレオチドの相補体以外のヌクレオチドを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態において、この抗体は、多型配列によりコードされるポリペプチドに特異的に結合し、この多型配列は、この多型配列について表１の６列に列挙されたヌクレオチドを含む。
【００３４】
好ましくは、この抗体は、多型配列によりコードされるポリペプチドに特異的には結合せず、この多型配列は、この多型配列について表１の５列に列挙されたヌクレオチドを含む。
【００３５】
本発明はさらに、被験体において、１つ以上のアミノ酸残基多型を有するポリペプチドの存在を検出する方法を提供する。この方法は、この被験体由来のタンパク質サンプルを提供する工程、およびこのサンプルを上記の抗体と、抗体−抗原複合体の形成を可能にする条件下で接触させる工程を包含する。次いで、この抗体−抗原複合体が、検出される。この複合体の存在は、このポリペプチドの存在を示す。
【００３６】
本発明はまた、被験体（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ラット、マウス、雌ウシ、ブタ、ヤギまたはウサギ）における配列多型の存在に帰せられる病理に罹患しているか、罹患している危険性があるか、または罹患している疑いのある、被験体を処置する方法を提供する。この方法は、配列番号１〜２１７またはその相補物からなる群より選択される多型配列を含む第１の核酸の異常な発現に関連する病理に罹患する被験体を提供する工程、および有効用量の治療剤をこの被験体に投与することによってこの被験体を処置する工程、を包含する。異常な発現は、遺伝子の発現（例えば、その野生型対応物に対して変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子の発現）における質的変化を含み得る。質的に異なるポリペプチドは、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、短いか、長いか、または変更したポリペプチドを含み得る。異常な発現はまた、遺伝子の発現における量的変化を含み得る。遺伝子発現における量的変化の例は、その野生型対応物と比較して低いレベルかまたは高いレベルの遺伝子発現、あるいは遺伝子の一時的または組織特異的な発現パターンにおける変化を含む。最後に、異常な発現はまた、遺伝子発現において質的変化および量的変化の組合せを含み得る。
【００３７】
この治療剤は、例えば、この多型配列を含む第２の核酸を含み得る。ただし、この第２の核酸は、その野生型対立遺伝子中に存在するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、この第２の核酸配列は、多型配列について表１、カラム５に列挙されるヌクレオチドを含む、多型配列を含む。
【００３８】
あるいは、この治療剤は、配列番号１〜２１７からなる群より選択される多型配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるか、または多型配列である配列番号１〜２１７のいずれか１つに相補的であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチドであり得る。ただし、この多型配列は、この多型配列について表１、カラム６に列挙されるヌクレオチドを含む。
【００３９】
この治療剤はさらに、本明細書中に記載されるような抗体、または配列番号１〜２１７からなる群より選択される多型配列を含むオリゴヌクレオチド、または多型配列である配列番号１〜２１７のいずれか１つに相補的であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含み得る。ただし、この多型配列は、この多型配列について表１、カラム５または表１、カラム６に列挙されたヌクレオチドを含む。
【００４０】
別の局面において、本発明は、オリゴヌクレオチドアレイを提供し、このオリゴヌクレオチドアレイは、第１のポリヌクレオチドに、その第１のポリヌクレオチドに包含される多型部位でハイブリダイズする、１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。この第１のポリヌクレオチドは、例えば、１つ以上の多型配列（配列番号１〜２１７）を含むヌクレオチド配列；このヌクレオチド配列のうちのいずれかのフラグメントであるヌクレオチド配列であり得る。ただし、このフラグメントは、この多型配列中の多型部位；１つ以上の多型配列（配列番号１〜２１７）に相補的な配列を含む、相補的ヌクレオチド配列；またはこの相補的配列のフラグメントであるヌクレオチド配列を含む。ただし、このフラグメントは、この多型配列中の多型部位を含む。
【００４１】
好ましい実施形態において、アレイは、１０以上；１００以上；１，０００以上；１０，０００以上；１００，０００以上のオリゴヌクレオチドを含む。
【００４２】
本発明はまた、本明細書中に記載される核酸の１つ以上を含む、キットを提供する。このキットは、例えば、本明細書中に記載される１つ以上のＳＮＰを含む、ポリヌクレオチドを含み得る。このポリヌクレオチドは、例えば、表１に示される多型配列（配列番号１〜２１７）の１つ以上を含み、そして多型配列、またはこの多型配列のフラグメント（このフラグメントが多型部位を含む限り）を含む、ヌクレオチド配列であり得る。あるいは、このポリヌクレオチドは、配列（配列番号１〜２１７）の１つ以上に相補的な配列、またはこの相補的なヌクレオチド配列のフラグメントを含む、ヌクレオチド配列を含み得る。ただし、このフラグメントは、この多型配列中の多型部位を含む。あるいは、またはさらに、このキットは、多型部位を含む第１のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、単離された対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを含み得る。この第１のポリヌクレオチドは、例えば、１つ以上の多型配列（配列番号１〜２１７）を含むヌクレオチド配列であり得る。ただし、この多型配列は、この多型配列について表１、カラム５に列挙されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを含む。あるいは、この第１のポリヌクレオチドは、この多型配列のフラグメントであるヌクレオチド配列であり得る。ただし、このフラグメントは、この多型配列中の多型部位を含むか、または１つ以上の多型配列（配列番号１〜２１７）に相補的な配列を含む、相補的ヌクレオチド配列を含む。ただし、この相補的ヌクレオチド配列は、表１、カラム５に列挙されるヌクレオチドの相補物以外のヌクレオチドを含む。この第１のポリヌクレオチドは、さらに、この相補的配列のフラグメントであるヌクレオチド配列を含み得る。ただし、このフラグメントは、この多型配列中の多型部位を含む。
【００４３】
他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野における当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献を、それらの全体において参考として援用する。抵触する場合には、定義を含む本願明細書が制御する。さらに、材料、方法、および実施例は、単に例示であり、そして制限するように意図されない。
【００４４】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかである。
【００４５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、転写される（すなわち、ｃＳＮＰである）配列におけるヒトＳＮＰを提供する。以下でより詳細に説明されるように、多くのＳＮＰが、既知の機能のポリペプチドに関連した遺伝子において同定されている。いくつかの適用については、種々のポリペプチドに関連したＳＮＰを、共に使用し得る。例えば、ＳＮＰは、それらが、特定のタンパク質ファミリーに関連したポリペプチドをコードする核酸由来であるか、または特定の機能に関与するかに従って、グループ分けされ得る。従って、ＡＴＰａｓｅ関連タンパク質に関連するＳＮＰが、いくつかの適用のために収集され得、カドヘリンと関連するＳＮＰ、もしくはエプフェリン（ｅｐｈｒｉｎ）（ＥＰＨ）と関連するＳＮＰ、または表１の第１０列に引用される他のタンパク質のうちのいずれかと関連するＳＮＰも同様であり得る。同様に、ＳＮＰは、それらの遺伝子産物によって果たされる機能に従ってグループ分けされ得る。このような機能としては、構造タンパク質、代謝経路、脂肪酸代謝、解糖、中間代謝、カルシウム代謝、プロテアーゼおよびアミノ酸代謝などと関連するタンパク質が挙げられる。
【００４６】
ＳＮＰを、表１に示す。表１は、本明細書中に開示される多型配列のまとめを提供する。この表において、「ＳＮＰ」は、多型配列に包埋される多型部位である。多型部位は、野生型配列と多型対立遺伝子配列との間のヌクレオチドのバリエーションの位置である単一ヌクレオチドによって占拠される。この部位は通常、対立遺伝子の比較的高度に保存された配列（例えば、集団中の１／１００未満または１／１０００未満のメンバーにおいて変動する配列）の前後である。従って、多型配列は、以下の配列のうちの１つ以上を含み得る：（１）多型配列中の多型部位で、表１の第５列に示されるヌクレオチドを有する配列；および（２）多型配列中の多型部位で、表１の第５列に示されるヌクレオチド以外のヌクレオチドを有する配列。後者の配列の例は、多型配列中の多型部位で、表１の第６列に示されるヌクレオチドを有する多型配列である。
【００４７】
参照される多型対についてのヌクレオチド配列は、表１に提示される。各ｃＳＮＰエントリーは、野生型ヌクレオチド配列ならびに多型部位でＳＮＰを含む対応の配列に関する情報を提供する。野生型配列はすでに公知であるので、本願に添付する配列表は、多型対立遺伝子の配列のみを提供する；その配列番号はまた、表１において相互参照される。翻訳されたアミノ酸配列を提供する配列番号に対する参照もまた、適切な場合に提供される。表は、各ｃＳＮＰについての説明的な情報を提供する１３の列を含み、各ｃＳＮＰについての説明的な情報の各々が、この表の１列を占める。列の表題、および各々についての説明は、以下に提供される。
【００４８】
「配列番号（ＳＥＱ　ＩＤ）」は、本願の配列表におけるヌクレオチド配列番号、および以下に説明されるような、同様のアミノ酸配列番号に対する相互参照を提供する。逆に、配列表中の各配列エントリーはまた、「登録番号」の表示のもとで、ＣｕｒａＧｅｎ配列ＩＤに対する相互参照を含む。表の各列の第１の列に提供される第１の配列番号は、多型について核酸配列を同定する配列番号である。多型が、列のアミノ酸部分についてのエントリーを保有する場合、「後アミノ酸（Ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ａｆｔｅｒ）」（以下を参照のこと）の列の括弧内に第２の配列番号が記載される。この第２の配列番号は、ヌクレオチド多型の翻訳物である多型アミノ酸配列を提供するアミノ酸配列をいう。多型が、列のタンパク質部分についてエントリーを保有しない場合、１つのみの配列番号が提供される。
【００４９】
「ＣｕｒａＧｅｎ配列番号」は、ＣｕｒａＧｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの登録番号を提供する。
【００５０】
「ＳＮＰの基本位置」は、ｃＳＮＰが見出される参照遺伝子または野生型遺伝子中のヌクレオチドの位置の数値を与える。この塩基の一覧は、参照遺伝子が得られた公のデータベースにおいて、本出願の出願日の時点で見出されたものである（カラムの頭にある「ＣｕｒａＧｅｎ配列のＢＬＡＳＴＸ分析後に同定されたタンパク質の名称」を参照のこと）。
【００５１】
「多型配列」は、配列における２６番目の塩基の多型部位、ならびに多型部位の５’側および３’側の参照配列由来の２５塩基を有する５１塩基配列を提供する。多型部位の割り当ては、角括弧に囲まれており、そして最初に参照ヌクレオチド；２番目に「スラッシュ（／）」；そして３番目に多型ヌクレオチドを提供する。特定の場合において、多型は、挿入または欠失である。この場合、「満たされていない」位置（すなわち、参照位置または多型位置）は、用語「ギャップ」によって示される。
【００５２】
「前の塩基」は、多型が見出される位置の参照遺伝子または野生型遺伝子中に存在するヌクレオチドを提供する。
【００５３】
「後の塩基」は、多型の位置での変化したヌクレオチドを提供する。
【００５４】
「前のアミノ酸」は、多型がコード領域に存在する場合に、参照タンパク質中のアミノ酸を提供する。
【００５５】
「後のアミノ酸」は、多型がコード領域に存在する場合に、多型タンパク質中のアミノ酸を提供する。この列はまた、多型がコード領域に存在する場合に、括弧内に配列番号を含む。
【００５６】
「変化の型」は、多型の性質についての情報を提供する。
「サイレント−非コード（ＳＩＬＥＮＴ　ＮＯＮＣＯＤＩＮＧ）」は、多型が核酸の非コード領域に存在する場合に使用される。
「サイレント−コード（ＳＩＬＥＮＴ　ＣＯＤＩＮＧ）」は、多型が核酸のコード領域中に存在し、そして翻訳された多型タンパク質中のアミノ酸の変化を生じない場合に使用される。
「保存性（ＣＯＮＳＥＲＶＡＴＩＶＥ）」は、多型が核酸のコード領域中に存在し、そして変更されたアミノ酸が参照アミノ酸と同じクラスに入る変化を提供する場合に使用される。そのクラスは以下である：
１）脂肪族：Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ；
３）硫黄含有：Ｃｙｓ，Ｍｅｔ；
４）脂肪族ＯＨ：Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
５）塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；
６）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
７）Ｐｒｏは、他のクラスのいずれにも入らない；および
８）終了（Ｅｎｄ）は、終止コドンを規定する。
「非保存性（ＮＯＮＣＯＮＳＥＲＶＡＴＩＶＥ）」は、多型が核酸のコード領域に存在し、そして変更されたアミノ酸が参照アミノ酸とは異なるクラスに入る変化を提供する場合に使用される。
「フレームシフト（ＦＲＡＭＥＳＨＩＦＴ）」は、挿入または欠失に関する。フレームシフトがコード領域中に存在する場合、表は、多型部位に対して３’のフレームシフトしたコドンの翻訳を提供する。
【００５７】
「ＣｕｒａＧｅｎ遺伝子のタンパク質分類」は、タンパク質が分類される一般的なクラスを提供する。上記に同定した４つの適用のファイリングをもたらす研究の過程の間、いくつかのタンパク質のクラスが同定された。いくつかをさらに以下に記載する。
【００５８】
「ＣｕｒａＧｅｎ遺伝子のタンパク質分類」は、タンパク質が分類される一般的なクラスを提供する。タンパク質のおよその複数のクラスが同定された。そのクラスには、以下が含まれる：
（アミラーゼ）
アミラーゼは、オリゴサッカリドおよびポリサッカリド中の１，４−α−グルコシド結合の内部加水分解の原因である。アミラーゼ遺伝子におけるバリエーションは、遅延した成熟および新生物および癌腫を産生する種々のアミラーゼを示し得る。
【００５９】
（アミロイド）
血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）タンパク質は、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と優先的に結合している脊椎動物タンパク質のファミリーを含む。このファミリーの特定のメンバーの合成は、炎症において非常に増加する。慢性の炎症におけるような、血漿ＳＡＡレベルの長期的な上昇、１５は、アミロイドーシスと呼ばれる病理学的状態を生じ、これは、肝臓、腎臓、および脾臓に罹患し、そしてこれらの組織において高度に不溶性のＳＡＡの蓄積によって特徴付けられる。アミロイドは、インスリン刺激性のグルコース利用および筋肉におけるグリコーゲンの蓄積を選択的に阻害するが、一方、脂肪細胞のグルコース代謝には影響を与えない。神経内で、神経細線維もつれとして、細胞外に、プラークとして、そして血管内での、原線維のアミロイドタンパク質の沈着は、アルツハイマー病および加齢性ダウン症候群の両方で特徴付けられる。アミロイド沈着はまた、ＩＩ型糖尿病と関連する。
【００６０】
（アンジオポエチン）
アンジオポエチン／フィブリノーゲンファミリーのメンバーは、新しい血管の生成を刺激し、新しい血管の生成を阻害し、そして血液凝固においていくつかの役割を果たすことが示されている。新しい血管の生成は、脈管形成と呼ばれ、これはまた、腫瘍が、その腫瘍が拡大するために必要とする血液供給を得るための、腫瘍増殖における必須の工程でもある。これらの遺伝子における変化は、心臓病、多くの血液凝固障害、発作、高血圧ならびに腫瘍形成および転移の素因の、任意の形態を予測し得る。特に、これらの改変体は、種々の抗高血圧薬ならびに化学療法剤および抗腫瘍剤に対する応答を予測し得る。
【００６１】
（アポトーシス関連タンパク質）
活性細胞の自殺（アポトーシス）は、増殖因子の撤退および毒素のような事象によって誘導される。これは、調節因子によって制御され、これらの調節因子は、プログラムされた細胞死に対する阻害効果を有するか（抗アポトーシス性）、またはインヒビターの保護効果をブロックする（プロアポトーシス性）かのいずれかである。多くのウイルスは、それらの標的細胞の早すぎる死を防止する、それら自身の抗アポトーシス遺伝子をコードすることによって、防御的アポトーシスに対抗する方法を見出した。アポトーシス関連遺伝子の改変体は、抗老化薬物の処方において有用である。
【００６２】
（カドヘリン、サイクリン、ポリメラーゼ、オンコジーン、ヒストン、キナーゼ）
細胞分裂／細胞周期経路のメンバー（例えば、サイクリン）、多くの転写因子およびキナーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ヒストン、ヘリカーゼならびに他のオンコジーンは、発癌（ここで、制御されない細胞の増殖が、腫瘍形成および最終的に転移を導く）における重要な役割を果たす。これらの遺伝子の変化は、癌の任意の形態（腫瘍形成の危険性の増大から転移の速度の増大まで）に対する素因を予測し得る。特に、これらの改変体は、種々の化学療法剤および抗腫瘍剤に対する応答を予測し得る。
【００６３】
（コロニー刺激因子関連タンパク質）
顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子は、血液の２つの関連する白血球の集団、顆粒球および単球マクロファージの、産生、分化および機能を制御することによって造血において作用するサイトカインである。
【００６４】
（補体関連タンパク質）
補体タンパク質は、免疫関連細胞傷害性因子であり、これは、細胞膜傷害複合体（ＭＡＣ）を形成することによって、抗体でオプソニン化（プライム）された標的細胞を根絶するための連鎖反応において作用する。殺傷の機構は、標的細胞膜に孔を開けることによる。２０の補体遺伝子またはそれらのインヒビターにおける変化は、多くの自己免疫疾患と関連する。補体産物の血清レベルの変更は、種々の組織の水腫、狼瘡（ＳＬＥ）、脈管炎、糸球体腎炎、腎不全、溶血性貧血、血小板減少症、および関節炎を引き起こす。これらは、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害性）の機構に干渉し、免疫能を激しく損傷し、そして食作用能力を減少する。補体遺伝子の改変体はまた、Ｉ型真性糖尿病、髄膜炎、神経学的障害（例えば、ネマリンミオパシー）、新生児低血圧症、筋肉障害（例えば、先天性ミオパシー）および他の疾患を示し得る。
【００６５】
（シトクロム）
呼吸鎖は、全ての好気性の細胞に必須の重要な生化学的経路である。この鎖に関与する、５つの異なるシトクロムが存在する。これらは、電子キャリアとして機能する、ヘム結合タンパク質である。これらの遺伝子における改変は、運動失調、反射消失、痴呆ならびに筋肉におけるミオパシー性およびニューロパシー性の変化を予測し得る。また、種々の型の固形腫瘍にも関連する。
【００６６】
（キネシン）
キネシンは、細胞内の細胞小器官を輸送するため、および細胞分裂の間の微小管に沿って染色体を移動するために機能する、チューブリン分子モーターである。これらの遺伝子の改変は、脳のピック病、結節硬化症のような神経学的障害を示し得る。
【００６７】
（サイトカイン、インターフェロン、インターロイキン）
サイトカインファミリーのメンバーは、低い濃度でさえ、細胞の増殖および分裂を刺激する、それらの強力な能力について公知である。エリスロポイエチンのようなサイトカインは、それらの増殖刺激において細胞特異的であり；エリスロポイエチンは、赤芽球の増殖の刺激に有用である。サイトカインにおける改変体は、癌の素因を含む、広範に種々の疾患について予測的であり得る。
【００６８】
（Ｇタンパク結合レセプター）
Ｇタンパク結合レセプター（Ｒ７Ｇとも呼ばれる）は、グアニンヌクレオチド結合（Ｇ）タンパクとの相互作用によって細胞外シグナルを伝達する、広範な群のホルモン、神経伝達物質、臭気物質および光レセプターである。Ｇ結合タンパクをコードするの遺伝子における変化は、非常に多くの生理学的状態に関与し、そしてこの状態を示し得る。これらの状態には、血圧調節、腎機能不全、男性不妊、ドパミン関連の認知、情動および内分泌機能、高カルシウム血症、軟骨形成不全症および骨粗しょう症、偽性副甲状腺機能低下症、成長遅延、ならびに小人症が挙げられる。
【００６９】
（チオエステラーゼ）
真核生物のチオールプロテアーゼは、活性部位のシステインを含むタンパク質分解酵素のファミリーである。触媒作用は、チオエステル中間体を通って進行し、そしてすぐ隣のヒスチジン側鎖によって促進され、アスパラギンは、必須の触媒三つ組を完了する。様々なチオエステル関連遺伝子が、神経疾患および精神病（例えば、セロイド脂褐素沈着症、ニューロナル１、小児疾患、サンタブオリ（Ｓａｎｔａｖｕｏｒｉ）疾患など）の前兆となり得る。
【００７０】
「ＣｕｒａＧｅｎ配列のＢＬＡＳＴＸ分析に従って同定されるタンパク質の名称」は、新規の参照多型同族対に最もよく類似していることが見出されるタンパク質についてのデータベース規準を提供する。
【００７１】
「ＢＬＡＳＴＸ分析に従う類似性（ｐ値）」は、ｐ値を与え、これは、多型配列が参照または野生型の配列と類似し、従ってこれらの対立遺伝子であるという、ＢＬＡＳＴＸ分析からの統計測定である。本願において、１×１０−５０より大きいのｐ値のカットオフ（例えば、表の１．０Ｅ−５０として得られる）が使用されて、この参照多型同族対が新規であることを証明する。１×１０−５０未満のｐ値は、既知であると考えられるタンパク質を規定する。
【００７２】
「マップ位置」は、染色体上の遺伝子の位置決定に関する、出願時に利用可能な任意の情報を提供する。
【００７３】
多型は、以下の順で表に配置される。
【００７４】
配列番号１〜１１４は、サイレントなＳＮＰである。
【００７５】
配列番号１１５〜１３３は、保存的アミノ酸変化を生じるＳＮＰである。
【００７６】
配列番号１３４〜１９４は、非保存的アミノ酸変化を生じるＳＮＰである。
【００７７】
配列番号１９５〜２１７は、ギャップを含むＳＮＰである。多型の位置における参照または野生型の配列に関して、対立遺伝子のｃＳＮＰは、さらなるヌクレオチドを導入する（挿入）か、またはヌクレオチドを欠失する（欠失）。ギャップを含むＳＮＰは、フレームシフトを生じる。
【００７８】
表１に示される多型配列によってコードされる推定アミノ酸配列はまた、本明細書と共に提出される配列表に示される。配列番号１１９３〜１２０８は、連続した対において、参照配列と多型配列との間に保存的アミノ酸変化を生じるＳＮＰによって提供されるタンパク質産物の多型アミノ酸残基に集中したアミノ酸配列である。多型部位のいずれかの側上の７または８アミノ酸が示される。これらの配列が現れる順は、同族ヌクレオチド配列の提示の順を反映し、そして表１に記載される。配列番号２１８〜２３６は、保存的アミノ酸変化を生じるＳＮＰによって提供されるタンパク質産物の多型アミノ酸残基に集中したアミノ酸配列である。多型部位のいずれかの側上の７または８アミノ酸が示される。これらの配列が現れる順は、同族ヌクレオチド配列の提示の順を反映し、そして表に記載される。
【００７９】
配列番号２３７〜２９７は、非保存的アミノ酸変化を生じるＳＮＰによって提供されるタンパク質産物の多型アミノ酸残基に集中したアミノ酸配列である。多型部位のいずれかの側上の７または８アミノ酸が示される。これらの配列が現れる順は、同族ヌクレオチド配列の提示の順を反映し、そして表に記載される。
【００８０】
配列番号２９８〜３２０は、フレームシフト誘導性アミノ酸変化を生じるＳＮＰによって提供されるタンパク質産物の多型アミノ酸残基に集中したアミノ酸配列である。多型部位のいずれかの側上の７または８アミノ酸が示される。これらの配列が現れる順は、同族ヌクレオチド配列の提示の順を反映し、そして表に記載される。
【００８１】
これらの多型を有する核酸配列を含むか、またはこれを検出し得る組成物、ならびに核酸を使用する方法が、本明細書中で提供される。
【００８２】
（ＳＮＰを保有する個体の同定）
本発明の多型対立遺伝子を保有する個体は、当該分野において周知の種々の技術を使用して、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質のレベルのいずれかで検出され得る。同定および検出のための戦略が、例えば、ＥＰ７３０，６６３、ＥＰ７１７，１１３、およびＰＣＴ　ＵＳ９７／０２１０２に記載されている。本発明の方法は、通常、予め特徴付けられた多型を用いる。すなわち、遺伝子型決定位置および部位に存在する多型形態の性質は、既に決定されている。この情報のアベイラビリティーは、プローブのセットが、既知の多型形態の特異的同定のために設計されることを可能にする。
【００８３】
以下に記載される多くの方法は、標的サンプルからのＤＮＡの増幅を必要とする。これは、例えば、多型を検出するためのＰＣＲ．（１９８９）、Ｂによって達成され得る。一般的には、ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　ＤＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，ＮＹ，１９９２）；ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９、４９６７（１９９１）；Ｅｃｋｅｒｔら、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　１、１７（１９９１）；ＰＣＲ（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）；ならびに米国特許第４，６８３，２０２号を参照のこと。
【００８４】
句「組換えタンパク質」または「組換え産生されたタンパク質」とは、タンパク質を発現し得るＤＮＡの内因性コピーを有しない非ネイティブ細胞を使用して産生されたペプチドまたはタンパク質をいう。特に、本明細書中で使用される場合、組換え産生されたタンパク質は、ヌクレオチド多型の翻訳の部位にて、変更されたアミノ酸を含む、多型対立遺伝子の遺伝子産物（すなわち、「多型タンパク質」）に関する。これらの細胞は、このタンパク質を産生する。なぜなら、これらの細胞は、適切な核酸配列の導入によって遺伝的に変更されているからである。この組換えタンパク質は、このタンパク質を産生する細胞と通常随伴　　　　　　　するタンパク質および他の細胞内成分と会合して見出されない。用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書中で交換可能に使用される。
【００８５】
句「実質的に精製された（した）」または「単離された（した）」は、核酸、ペプチドまたはタンパク質をいう場合には、化学組成が、天然に会合している他の細胞成分をほとんど含まないか、または好ましくは本質的に含まない環境にあることをいう。従って、句「単離された（した）」または「実質的に純粋な」とは、宿主細胞中で核酸と通常会合している少なくとも１つのタンパク質または核酸を欠く核酸調製物をいう。これは、均質な状態にあることが好ましいが、乾燥または水溶液のいずれかにおいてであり得る。純度および均質性は、代表的には、分析化学技術（例えば、ゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィー）を使用して決定される。一般に、実質的に精製されたかまたは単離された核酸またはタンパク質は、調製物中に存在する全ての高分子種のうちの８０％よりも多くを含む。好ましくは、この核酸またはタンパク質は、精製されて、存在する全ての高分子種のうちの９０％よりも多くを表す。より好ましくは、この核酸またはタンパク質は、精製されて、９５％よりも多く、そして最も好ましくは、この核酸またはタンパク質は、本質的に均質まで精製され、ここで他の高分子種は、従来の分析手順によって検出されない。
【００８６】
診断に使用されるゲノムＤＮＡは、身体の任意の有核細胞（例えば、末梢血、尿、唾液、頬内サンプル、手術標本、および剖検標本に存在するもの）から得られ得る。このＤＮＡは、変異分析の前に、直接的に使用され得るか、またはＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：４８７〜４９１（１９８８））、または他のインビトロでの増幅方法（例えば、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４：５６０〜５６９（１９８９））、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）（Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３９２〜３９６（１９９２））、自己持続配列複製（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（３ＳＲ）（Ｆａｈｙら、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｐ＆Ｊ＆　１：２５〜３３（１９９２））の使用を通してインビトロで酵素的に増幅され得る。
【００８７】
変異検出に適切である形態に核酸を調製するための方法は、当該分野において周知である。「核酸」は、一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーであり、他に示されない限り天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む。用語「核酸」は、本明細書中で使用する場合、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをいう。「核酸配列」または「ポリヌクレオチド配列」は、５’末端から３’末端に読まれる、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖配列をいう。発生しようとしている（ｎａｓｃｅｎｔ）ＲＮＡ転写物の５’から３’付加の方向は、転写方向といわれる；ＲＮＡと同じ配列を有し、そして５’方向においてＲＮＡ転写物の５’末端を越えるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」といわれる；ＲＮＡと同じ配列を有し、そして３’方向においてＲＮＡ転写物の３’末端を越えるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」といわれる。この用語は、自己複製プラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマー、および非機能的なＤＮＡまたはＲＮＡの両方を含む。本発明の任意の核酸配列の相補体は、その配列の定義内に含まれることが理解される。「核酸プローブ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのフラグメントであり得る。
【００８８】
特定のＤＮＡ配列における多型の検出は、対立遺伝子特異的制限エンドヌクレアーゼ切断に基づいて制限フラグメント長多型検出（ＫａｎおよびＤｏｚｙ　Ｌａｎｃｅｔ　ｉｉ：９１０−９１２（１９７８））、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブでのハイブリダイゼーション（Ｗａｌｌａｃｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．６：３５４３−３５５７（１９７８））（固定化オリゴヌクレオチド（Ｓａｉｋｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳＣＩ．ＵＳＡ、８６：６２３０−６２３４（１９６９））またはオリゴヌクレオチドアレイ（ＭａｓｋｏｓおよびＳｏｕｒｔｈｅｒｎ　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ　２１：２２６９−２２７０（１９９３）を含む）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ（Ｎｅｗｔｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ　１７：２５０３−２５１６（１９８９））、ミスマッチ修復検出（ＭＲＤ）（ＦａｈａｍおよびＣｏｘ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ　５：４７４−４８２（１９９５））、ＭｕｔＳタンパク質の結合（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ　２３：３９４４−３９４８（１９９５）、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（ＦｉｓｈｅｒおよびＬｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：１５７９−１５８３（１９８３））、一本鎖コンホメーション多型検出（Ｏｒｉｔａら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　５：８７４−８７９（１９８３））、ミスマッチ塩基対でのＲＮＡａｓｅ切断（Ｍｙｅｒｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３０：１２４２（１９８５））、ヘテロ二重鎖ＤＮＡの化学的切断（Ｃｏｔｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ｗＳｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８Ｚ４３９７−４４０１（１９８８））または酵素的切断（Ｙｏｕｉｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：８７−９１（１９９５））、対立遺伝子特異的プライマー伸長に基づく方法（Ｓｙｖａｎｅｎら、Ｇｅｎｏｉｃｓ　８：６８４−６９２（１９９０））、遺伝子ビット分析（ＧＢＡ）（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖら、＆＆Ｉ　Ａｃｉｄｓ　２２：４１６７−４１７５（１９９４））、オリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４１：１０７７（１９８８））、対立遺伝子特異的ライゲーション連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｂａｒｒａｎｙ　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１８９−１９３（１９９１））、ギャップＬＣＲ（Ａｂｒａｖａｙａら、Ｎｕｃｌ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　２３：６７５−６８２（１９９５））、当該分野で周知の標準的な手順を使用する放射能および／または蛍光ＤＮＡ配列決定、ならびにペプチド核酸（ＰＮＡ）アッセイ（Ｏｒｕｍら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，２１：５３３２−５３５６（１９９３）；Ｔｈｉｅｄｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２４：９８３−９８４（１９９６））を含むがこれらに限定されない種々の方法によって達成され得る。
【００８９】
「特異的ハイブリダイゼーション」または「選択的ハイブリダイゼーション」は、その配列が複雑な混合物（例えば、全細胞ＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合に、適切なストリンジェント条件下で、核酸分子が、その核酸に相補的である第２の特定のヌクレオチド配列のみに結合または二重鎖形成することをいう。「ストリンジェント条件」は、プローブがその標的サブ配列にハイブリダイズするが、その他の配列にはハイブリダイズしない条件である。ストリンジェントな条件は、配列依存性であり、そして異なる状況下で異なる。より長い配列は、より短い配列よりも、高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、その温度が、ハイブリダイゼーションが規定されたイオン強度およびｐＨで起こることが意図される特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５℃低いように選択される。Ｔｍは、標的配列の５０％が平衡において（規定されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）その相補プローブにハイブリダイズする温度である。代表的には、ストリンジェントな条件には、ｐＨ７．０〜８．３で、少なくとも約０．０１〜約１．０ＭのＮａイオン濃度（またはその他の塩）の塩濃度が含まれる。温度は、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドのような不安定化剤を添加することによって達成され得る。例えば、５×ＳＳＰＥ（７５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ　Ｎａリン酸、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）の条件および２５〜３０℃の温度が、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適切である。
【００９０】
「相補的」核酸配列または「標的」核酸配列とは、核酸プローブに選択的にハイブリダイズする核酸配列のことをいう。適切なアニーリング条件は、例えば、プローブの長さ、塩基組成、およびミスマッチの数、およびプローブ上でのそれらの位置に依存し、そしてしばしば経験的に決定されなければならない。核酸プローブ設計およびアニーリング条件の考察については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、またはＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　ａｎｄ　Ｗｉｌｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照のこと。
【００９１】
完全にマッチしたプローブは、特定の標的配列に完全に相補的な配列を有する。その試験プローブは、代表的には、標的配列の一部に完全に相補的である。「多型」マーカーまたは部位は、参照配列に対して配列差異が生じる位置である。多型マーカーには、制限フラグメント長多型、タンデム反復の可変数（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純配列反復、およびＡｌｕのような挿入エレメントが含まれる。参照対立遺伝子形態は、例えば、集団において最も豊富な形態、または同定される第１の対立遺伝子形態であり得、そして他の対立遺伝子形態が代替の改変体または多型対立遺伝子として指摘される。選択される集団において最も頻繁に生じる対立遺伝子形態は、ときどき、「野生型」形態といわれ、そして本明細書において、「参照」形態ともいわれる。二倍体生物は、対立遺伝子形態についてホモ接合体またはヘテロ接合体であり得る。二重対立遺伝子多型は、２つの識別可能な形態（すなわち、塩基配列）を有し、そして三重対立遺伝子多型は、３つのそのような形態を有する。
【００９２】
本明細書において使用する場合、「オリゴヌクレオチド」は、２〜約６０塩基長の範囲の一本鎖核酸である。オリゴヌクレオチドは、しばしば、合成的であるが、天然に存在するポリヌクレオチドから生成され得る。プローブは、１つ以上の型の化学結合（通常、水素結合形成を介する相補的塩基対形成を通じて）を通じて相補配列の標的核酸に結合し得るオリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドプローブはしばしば、５塩基と６０塩基の間であり、特定の実施形態において、１０〜４０、または１５〜３０塩基長の間であり得る。オリゴヌクレオチドプローブは、天然（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）あるいは修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシンなど）を含み得る。さらに、オリゴヌクレオチドプローブ中の塩基は、ホスホジエステル結合以外の結合（例えば、ホスホロアミダイト結合またはホスホロチオエート結合）によって連結され得るか、あるいはハイブリダイゼーションを妨げない限り、ホスホジエステル結合以外のペプチド結合によって構成塩基が連結されるペプチド核酸であり得る。
【００９３】
本明細書において使用する場合、用語「プライマー」とは、適切な条件下（例えば、４つの異なるヌクレオシド三リン酸およびポリメライゼーション剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素）の存在下）で、適切な緩衝液中で、そして適切な温度において、鋳型指向性のＤＮＡ合成を開始する点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図される使用に依存するが、代表的には、１５〜３０ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、一般により低い温度を必要とする。プライマーは、鋳型の正確な配列に完全に相補的である必要はないが、鋳型とハイブリダイズするのに十分相補的であるべきである。用語「プライマー部位」とは、プライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡの配列をいう。用語「プライマー対」とは、増幅されるＤＮＡ配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマーおよび増幅されるその配列の３’末端の相補物とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含む一組のプライマーをいう。
【００９４】
ＤＮＡフラグメントは、例えば、プラスミドＤＮＡを消化することによって、またはＰＣＲの使用によって、調製され得る。プライマーまたはプローブとしての使用のためのオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの化学合成の分野において公知の方法（非限定的例として、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　２２：１８５９〜１８６２（１９８１））によって記載されるホスホロアミダイト法、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３：３１８５（１９８１））によって提供されるトリエステル法（両方を本明細書において参考として援用する）を含む）によって化学的に合成される。これらの合成は、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１２：６１５９〜６１６８（１９８４）において記載されるような自動合成機を使用し得る。オリゴヌクレオチドの精製は、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．およびＲｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍ、２５５：１３７〜１４９（１９８３））に記載されるように、ネイティブのアクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによって行われ得る。次に、所望される場合、二本鎖フラグメントを、適切な相補的な一本鎖をともに適切な条件下でアニールすることによってか、または適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を合成することによって、得られ得る。核酸プローブのための特定の配列が与えられる場合、相補的鎖もまた同定され、そして含まれることが理解される。その相補的鎖は、標的が二本鎖核酸である場合、同等に良く作用する。
【００９５】
合成オリゴヌクレオチドの配列または任意の核酸フラグメントの配列は、ジデオキシチェーンターミネーション法またはマクサム−ギルバート法のいずれかを使用して得られ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、（１９８９）、本明細書において参考として援用する）。このマニュアルを、本明細書において、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら」という；「Ｚｙｓｋｉｎｄら（１９８８）」。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。診断アッセイにおいて有用なオリゴヌクレオチドは、代表的には、少なくとも８個の連続するヌクレオチド長であり、１８ヌクレオチド長から、１００以上の連続するヌクレオチドを超える範囲であり得る。
【００９６】
本発明の別の局面は、本発明のＳＮＰ含有ヌクレオチド配列を含有する核酸分子にハイブリダイズ可能であるか、または相補的である単離されたアンチセンス核酸分子、あるいはそのフラグメント、アナログまたは誘導体に関する。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的なヌクレオチド配列（例えば、二本鎖ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的か、またはｍＲＮＡ配列に相補的）を含む。特定の局面において、少なくとも約１０、約２５、約５０、もしくは約６０ヌクレオチド、またはＳＮＰコード鎖全体、あるいはその部分のみに対して相補的な配列を含むアンチセンス核酸分子が、提供される。
【００９７】
１つの実施形態において、アンチセンス核酸分子は、本発明の多型ヌクレオチド配列のコード鎖の「コード領域」に対してアンチセンスである。用語「コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されるコドンを含有するヌクレオチド配列の領域をいう。別の実施形態において、アンチセンス核酸分子は、本発明のヌクレオチド配列のコード鎖の「非コード領域」に対してアンチセンスである。用語「非コード領域」とは、アミノ酸に翻訳されない、コード領域に隣接する５’配列および３’配列（すなわち、５’非翻訳領域および３’非翻訳領域ともいう）をいう。
【００９８】
本明細書中に開示されたコード鎖配列が与えられると、本発明のアンチセンス核酸は、ワトソン・クリック型またはフーグスティーン型塩基対合の規則に従って設計され得る。例えば、アンチセンス核酸分子は、一般には、ｍＲＮＡのコード領域全体に相補的であり得るが、より好ましくは、本明細書中において具体化されるように、それは、ｍＲＮＡのコード領域または非コード領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さが、約５ヌクレオチドと約６０ヌクレオチドとの間、好ましくは、約１０ヌクレオチドと約４５ヌクレオチドとの間、より好ましくは、約１５ヌクレオチドと約４０ヌクレオチドとの間、そしてさらにより好ましくは、約１５ヌクレオチドと約３０ヌクレオチドとの間の範囲であり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手順を用いて、化学合成反応または酵素連結反応を用いて構築され得る。例えば、アンチセンス核酸（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増大させるか、もしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間で形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された種々の修飾ヌクレオチドを用いて、化学的に合成され得る。例えば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが使用され得る。
【００９９】
アンチセンス核酸を生成するために使用され得る修飾ヌクレオチドの例としては、以下が挙げられる：５−フルオロフラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキシオシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、プソイドウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン。あるいは、このアンチセンス核酸は、核酸がアンチセンス方向にサブクローニングされている発現ベクターを用いて生物学的に生成され得る（すなわち、挿入された核酸から転写されるＲＮＡは、以下の小節でさらに説明する、目的の標的核酸に対してアンチセンス方向である）。
【０１００】
本発明のアンチセンス核酸分子は、代表的には、被験体に投与されるか、インサイチュで生成され、これによりそれらは、多型性タンパク質をコードする細胞ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリダイズするかまたはこれらに結合して、それによってこのタンパク質の発現を（例えば、転写および／または翻訳を阻害することにより）阻害する。ハイブリダイゼーションは、安定な二重鎖を形成する通常のヌクレオチド相補性によるか、または例えば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合、二重ヘリックスの主溝における特異的相互作用によってであり得る。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位への直接注入を含む。あるいは、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするように改変され得、次いで全身投与され得る。例えば、全身投与のために、アンチセンス分子は、それらが、（例えば、このアンチセンス核酸分子を、細胞表面レセプターまたは抗原に結合するペプチドまたは抗体に連結することにより）選択された細胞表面上で発現されたレセプターまたは抗原に特異的に結合するように改変され得る。アンチセンス核酸分子はまた、本明細書中に記載のベクターを使用して細胞に送達され得る。十分な細胞内濃度のアンチセンス分子を達成するためには、このアンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ　ＩＩまたはｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターの制御下に配置されるベクター構築物が好ましい。
【０１０１】
なお別の実施形態では、本発明のアンチセンス核酸分子は、α−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補的ＲＮＡと特異的な二重鎖ハイブリッドを形成し、ここでは、通例の単位とは反対に、鎖は互いに対して並行に伸びている（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１５：６６２５−６６４１）。このアンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡアナログ（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ　２１５：３２７−３３０）を含み得る。
【０１０２】
２つ以上の核酸またはポリヌクレオチド間の配列関係を記載するために、以下の用語を使用する：「参照配列」、「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一パーセント」、および「実質的同一」。「参照配列」は、配列比較の基準として使用される規定された配列である。参照配列は、例えば、配列表中に示された全長のｃＤＮＡまたは遺伝子配列のセグメントとして、より大きな配列のサブセットであり得るか、または完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列を含み得る。比較ウインドウを整列するための最適な配列整列は、例えば、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ　Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによるか、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ　Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによるか、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５２４４４（１９８８）の類似性検索方法によるか、またはこれらのアルゴリズムのコンピューター化実行（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ　Ｒｅｌｅａｓｅ　７．０、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ、５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって実施され得る。
【０１０３】
ポリペプチドをコードする核酸配列を発現ベクター中にサブクローン化すること、プローブを標識すること、ＤＮＡハイブリダイゼーションなどのような、本発明のｃＳＮＰをもつ核酸配列の核酸操作のための技法は、一般にＳａｍｂｒｏｏｋらに記載されている。用語「コードする核酸配列」とは、特定のタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸配列の発現を指向する核酸をいう。この核酸配列は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列、およびタンパク質、ペプチドまたはアミノ酸配列に翻訳されるＲＮＡ配列の両方を含む。この核酸配列は、本明細書で開示される完全長核酸配列、および完全長タンパク質に由来する非完全長配列の両方を含む。この配列は、ネイティブ配列の縮重コドン、または特定の宿主細胞におけるコドン優先を提供するために導入され得る配列を含むことがさらに理解される。結果的に、プローブ選択およびアレイ設計の原理は、より複雑な多型（ＥＰ７３０，６６３を参照のこと）を分析するために容易に拡張され得る。例えば、３対立遺伝子のＳＮＰ多型を特徴付けるために、３つの群のプローブが、上記のように３つの多型形態に関してタイル張りされて設計され得る。さらなる例として、ヌクレオチドの欠失を含む２対立遺伝子多型を分析するために、参照配列として非欠失多型形態に基く第１の群のプローブ、および参照配列として欠失形態に基く第２の群のプローブをタイル張りし得る。
【０１０４】
ゲノムＤＮＡのアッセイのために、全血、精液、唾液、涙、尿、糞便材料、汗、頬（口腔），皮膚および毛を含む実質的にすべての生物学的に好都合な組織サンプルが用いられ得る。代表的には、ゲノムＤＮＡは分析前に増幅される。通常、増幅は、分析されるべき多型の遺伝子座を含む、例えば、５０〜５００ヌクレオチドの適切なフラグメントに隣接するプライマーを用いるＰＣＲにより行われる。通常、標的は、増幅の途中で標識される。この増幅産物は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、一本鎖または二本鎖であり得る。二本鎖の場合、代表的には、この増幅産物は、アレイへの適用の前に変性される。増幅なしにゲノムＤＮＡが分析される場合、それをアレイに適用する前にサンプルからＲＮＡを除去することが所望され得る。これは、ＤＮａｓｅフリーのＲＮＡａｓｅを用いる消化により達成され得る。
【０１０５】
（核酸サンプル中の多型の検出）
本明細書に開示されたＳＮＰを用いて、分析中の個体において特徴付けられた多型のどの形態が存在するかを決定し得る。
【０１０６】
多型を分析するための対立遺伝子特異的プローブの設計および使用は、Ｓａｉｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３２４、１６３〜１６６（１９８６）；Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ、ＥＰ　２３５，７２６、Ｓａｉｋｉ、ＷＯ８９／１１５４８により記載されている。２つの個体からの個々のセグメント中の異なる多型形態の存在に起因して、１つの個体からの標的ＤＮＡのセグメントにハイブリダイズするが、別の個体からの対応するセグメントにハイブリダイズしない対立遺伝子特異的プローブが設計され得る。ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子間のハイブリダイゼーション強度における有意な差異、そして好ましくは本質的にバイナリな応答が存在し、それによってプローブがこれら対立遺伝子の１つのみにハイブリダイズするという、十分にストリンジェントであるべきである。いくつかのプローブは、標的ＤＮＡのセグメントに、多型部位がプローブの中央位置（例えば、１５マー中の７位；１６マー中の７、８または９位のいずれか）とアラインするようにハイブリダイズするよう設計される。プローブのこの設計は、異なる対立遺伝子形態間のハイブリダイゼーションにおいて良好な識別を達成する。
【０１０７】
対立遺伝子特異的プローブは、しばしばペアで用いられ、ペアの１つのメンバーは標的配列の参照形態に対して完全マッチを示し、そして他のメンバーは改変形態に対して完全マッチを示す。次いで、いくつかのペアのプローブが、同じ標的配列内の複数多型の同時分析のために同じ支持体上に固定され得る。
【０１０８】
多型はまた、核酸アレイへのハイブリダイゼーションにより同定され得、そのいくつかの例は、公開されたＰＣＴ出願ＷＯ　９５／１１９９５に記載されている。ＷＯ　９５／１１９９５はまた、予備特徴付けられた多型の改変体形態の検出に最適化されているサブアレイを記載する。このようなサブアレイは、第１の参照配列の対立遺伝子改変体である、第２の参照配列に相補的であるように設計されるプローブを含む。第２の群のプローブは、プローブが第２の参照配列に対して相補性を示すことを除いて、同じ原理により設計される。第２の群（またはさらなる群）を含めることは、複数変異が、プローブの長さと釣り合った短距離内で生じると期待される（例えば、９〜２１塩基内に２以上の変異）第１の参照配列の短サブ配列を分析するために特に有用であり得る。
【０１０９】
対立遺伝子特異的プライマーは、多型に重複する標的ＤＮＡ上の部位に結合し、そしてこのプライマーが完全相補性を示す対立遺伝子形態の増幅のみをプライムする。Ｇｉｂｂｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１７　２４２７〜２４４８（１９８９）を参照のこと。このプライマーは、遠位部位でハイブリダイズする第２のプライマーと組み合わせて用いられる。増幅は、２つのプライマーから進行し、特定の対立遺伝子形態が存在することを示す検出可能な産物を生じる。通常、一方が多型部位で１塩基ミスマッチを示し、そして他方が遠位部位で完全相補性を示すプライマーの第２のペアを用いてコントロールが実施される。この１塩基ミスマッチは、増幅を防ぎそして検出可能な産物は形成されない。この方法は、このミスマッチが、多型とアラインされるオリゴヌクレオチドの最も３’位置に含められる場合に最良に作用する。なぜなら、この位置は、プライマーからの伸長に最も不安定化させるからである（例えば、ＷＯ　９３／２２４５６を参照のこと）。
【０１１０】
ポリメラーゼ連鎖反応を用いて生成される増幅産物は、変性勾配ゲル電気泳動の使用によって分析され得る。異なる対立遺伝子は、異なる配列依存性の融解特性および溶液中のＤＮＡの電気泳動的移動に基づいて同定され得る。Ｅｒｌｉｃｈ編、ＰＣＲ技術、ＤＮＡ増幅に関する原理および適用、（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９２，第７章）。
【０１１１】
標的配列の対立遺伝子は、一本鎖コンホメーション多型分析を用いて区別され得、この分析は、Ｏｒｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，２７６６−２７７０（１９８９）に記載されるように、単鎖ＰＣＲ産物の電気泳動的移動の変化によって、塩基の差異を同定する。増幅ＲＣＰ産物が生成され、そして加熱されるか、または変性され、単鎖増幅産物を形成する。単鎖核酸は、再び折り畳まれ得るか、または２次構造を形成し得、この構造は、塩基配列に部分的に依存する。単鎖増幅産物の異なる電気泳動的移動度は、標的配列の対立遺伝子間の塩基配列の差異に関連し得る。
【０１１２】
遺伝的多型によって引き起こされると疑われる病状に関する個体の遺伝子型は、関連分析によって評価され得る。関連分析に適した遺伝子型の特性は、知られてはいたがこれまでは遺伝的成分がマッピングされていなかった疾患を含む（例えば、無ガンマグロブリン血症、尿崩症、Ｌｅｓｃｈ−Ｎｙｈａｎ症候群、筋ジストロフィー、Ｗｉｓｋｏｔｔ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群、ファブリー病、家族性高コレステロール血症、多発性嚢胞腎疾患、遺伝性球状赤血球症、ヴォン・ヴィレブランド病、結節硬化症、遺伝性出血性毛細管拡張症、家族性結腸ポリープ症、Ｅｈｌｅｒｓ−Ｄａｎｌｏｓ症候群、骨形成不全、および急性間欠性ポルフィリン症）。
【０１１３】
表現型特性はまた、多因子性疾患の兆候、または多因子性疾患に対する感受性を含み、この成分は、遺伝的（例えば、自己免疫疾患、炎症、癌、系、神経の疾患、および病原微生物による感染）であるか、またはそうであり得る。自己免疫疾患のいくつかの例としては、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病（インスリン依存性および非依存性）、全身性エリテマトーデスおよびグレーブス病が挙げられる。癌のいくつかの例としては、膀胱、脳、乳房、大腸、食道、腎臓、口腔、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、白血病、肝臓、肺、および子宮の癌が挙げられる。表現型の特性にはまた、寿命、外見（例えば、禿頭症、肥満症）、強度、スピード、耐久性、受胎能、および特定の薬物または治療的処置に対する感受性あるいは受容性のような特性が挙げられる。
【０１１４】
このような相関は、いくつかの様式で開発され得る。多型形態と処置が有効な疾患との間の強い相関の場合、ヒトまたは動物患者における多型形態セットの検出により、処置の迅速な投与、あるいは少なくとも患者の定期的モニタリングの設定を正当だと理由付けられ得る（ｊｕｓｔｉｆｙ）。家族を想定したカップルにおける重篤な疾患と相関する多型形態の検出はまた、それらの生殖の判断においてカップルに対して価値があり得る。例えば、女性のパートナーは、インビトロ受精を受けるように選択し得、彼女の夫から彼女の子孫へのこのような多型形態を伝える可能性を回避する。しかし、より弱いが多型セットとヒト疾患との間でなお統計学的に有意な相関がある場合、迅速な治療の介入またはモニタリングは、正当化されないかもしれない。にもかかわらず、患者は、シンプルなライフスタイルの変化（例えば、ダイエット、運動）を始めることを動機付けられ得、これは、患者に対してほとんどコストをかけずに達成され、患者が変異体対立遺伝子による増大された感受性を有し得る条件のリスクを減らすことにおいて潜在的な利点を与え得る。１つ以上の多型部位での、個体において存在する多型形態を決定した後、この情報は、多数の方法で使用され得る。
【０１１５】
どの多型形態が個体における１セットの多型部位を占めるかの決定は、個体を識別する１セットの多型形態を同定する。一般に、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｔｈｅ　Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｎｓｉｃ　ＤＮＡ　Ｅｖｉｄｅｎｃｅ（Ｐｏｌｌａｒｄら編、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　Ｐｒｅｓｓ，ＤＣ，１９９６）を参照のこと。多型部位はヒトゲノムにおける５０，０００ｂｐの領域内にあるので、これらの多型部位間の組換えの確率は低い。この低い確率は、本願において記載されるハプロタイプ（全１０の多型部位のセット）が、少なくともいくつかの世代の間で変化することなく遺伝されることを意味する。分析される部位が多いほど、１個体における多型形態のセットが無関係の個体における多型形態のセットと同じである確率は低くなる。好ましくは、複数の部位が分析される場合、この部位は連鎖していない。従って、本発明の多型はしばしば、遠位の遺伝子の多型と組み合わせて使用される。法医学での使用のための適切な多型は、二対立遺伝子（ｄｉａｌｌｅｌｉｃ）である。なぜならば、２つの多型形態の集団頻度は、通常、多対立遺伝子（ｍｕｌｔｉ−ａｌｌｅｌｉｃ）の座における複数の多型形態のそれよりも大きな精度で決定され得るからである。
【０１１６】
個体中の独特または固有のセットの法医学的なマーカーを同定する能力は、法医学的分析のために有用である。例えば、容疑者からの血液サンプルが、犯罪現場からの血液または他の組織サンプルと適合するかどうかは、選択された多型部位を占有する多型形態のセットが、容疑者およびサンプルで同じかどうかを決定することによって、決定され得る。多型マーカーのセットが、容疑者とサンプルとの間で適合しない場合、容疑者はサンプルの供給源ではなかったと結論され得る（実験誤差がなければ）。マーカーのセットが適合する場合、容疑者由来のＤＮＡが、犯罪現場で発見されたＤＮＡと一致すると結論され得る。試験された遺伝子座での多型形態の頻度が決定されている場合（例えば、個体の適切な集団を分析することによって）、統計学的分析を実施して、容疑者と犯罪現場のサンプルとの適合が偶然に起こる確率を決定し得る。
【０１１７】
ｐ（ＩＤ）は、２つの無作為な個体が所定の多型部位で同じ多型形態または対立遺伝子形態を有する確率である。２対立遺伝子座において、４つの遺伝子型が可能である：ＡＡ、ＡＢ、ＢＡおよびＢＢ。対立遺伝子ＡおよびＢが、生物の一倍体ゲノムにおいて、頻度ｘおよびｙで起こるならば、二倍体生物における各遺伝子型の確率は、以下である（ＷＯ　９５／１２６０７を参照のこと）：
ホモ接合体：ｐ（ＡＡ）＝ｘ２
ホモ接合体：ｐ（ＢＢ）＝ｙ２＝（１−ｘ）２
単一のヘテロ接合体：ｐ（ＡＢ）＝ｐ（ＢＡ）＝ｘｙ＝ｘ（１−ｘ）
両方のヘテロ接合体：ｐ（ＡＢ＋ＢＡ）＝２ｘｙ＝２ｘ（１−ｘ）。
１つの遺伝子座での同一性の確率（すなわち、集団から無作為に選ばれた２つの個体が所定の遺伝子座で同一の多型形態を有する確率）は、以下の等式によって与えられる：
ｐ（ＩＤ）＝（ｘ２）２＋（２ｘｙ）２＋（ｙ２）２。
【０１１８】
これらの計算は、所定の遺伝子座での任意の数の多型形態に対して拡張され得る。例えば、３対立遺伝子系（ここで、対立遺伝子は、それぞれｘ、ｙ、およびｚの母集団での頻度を有する）に対する同一性ｐ（ＩＤ）の確率は、遺伝子型頻度の２乗の和に等しい：
ｐ（ＩＤ）＝ｘ４＋（２ｘｙ）２＋（２ｙｚ）２＋（２ｘｚ）２＋ｚ４＋ｙ４。
ｎ対立遺伝子の遺伝子座において、適切な二項展開が、ｐ（ＩＤ）およびｐ（ｅｘｃ）を計算するために使用される。
【０１１９】
複数の連鎖していない遺伝子座のそれぞれに対する同一性の累積確率（ｃｕｍ　ｐ（ＩＤ））は、各遺伝子座によって提供される確率をかけることによって決定される：
ｃｕｍ　ｐ（ＩＤ）＝ｐ（ＩＤ１）ｐ（ＩＤ２）ｐ（ＩＤ３）．．．ｐ（ＩＤｎ）。
ｎ遺伝子座に対する非同一性の累積確率（すなわち、２つの無作為な個体が１つ以上の遺伝子座で異なる確率）は、以下の等式によって与えられる：
ｃｕｍ　ｐ（ｎｏｎＩＤ）＝１−ｃｕｍ　ｐ（ＩＤ）。
いくつかの多型遺伝子座が試験される場合、無作為な個体に対する非同一性の累積確率は、非常に大きくなる（例えば、１０億対１）。このような確率は、他の証拠と共に、容疑者の有罪または無罪を決定する際に考慮され得る。
【０１２０】
親子鑑定の目的は、通常、雄が子供の父親であるかを決定することである。ほとんどの場合において、子供の母親は既知であり、従って、子供の遺伝子型に対する母親の寄与が追跡され得る。親子鑑定は、母親に起因しない子供の遺伝子型の部分が、推定の父親の遺伝子型と一致するかどうかを調査する。親子鑑定は、推定の父親と子供とにおける多型のセットを分析することによって実施され得る。
【０１２１】
父親に起因する、子供における多型のセットが、推定の父親と適合しない場合、実験誤差がなければ、推定の父親は本当の父親ではないと結論され得る。父親に起因する、子供における多型のセットが、推定の父親の多型のセットと適合する場合、偶然の適合の確率を決定するために、統計学的計算が実施され得る。
【０１２２】
親子排除（ｐａｒｅｎｔａｇｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）の確率（無作為な雄が、所定の多型部位で、その雄を父親として不適合にする多型形態を有する確率を表す）は、以下の等式によって与えられる（ＷＯ　９５／１２６０７を参照のこと）：
ｐ（ｅｘｃ）＝ｘｙ（１−ｘｙ）。
ここで、ｘおよびｙは、２対立遺伝子多型部位の対立遺伝子ＡおよびＢの母集団頻度である。（３対立遺伝子部位で、ｐ（ｅｘｃ）＝ｘｙ（１−ｘｙ）＋ｙｚ（１−ｙｚ）＋ｘｚ（１−ｘｚ）＋３ｘｙｚ（１−ｘｙｚ）、ここで、ｘ、ｙおよびｚは、対立遺伝子Ａ、ＢおよびＣの各母集団頻度である）。非排除の確率は、以下である：
ｐ（ｎｏｎ−ｅｘｃ）＝１−ｐ（ｅｘｃ）。
非排除の累積確率（ｎ遺伝子座が使用される場合に得られる値を表す）は、従って以下である：
ｃｕｍ　ｐ（ｎｏｎ−ｅｘｃ）＝ｐ（ｎｏｎ−ｅｘｃ１）ｐ（ｎｏｎ−ｅｘｃ２）ｐ（ｎｏｎ−ｅｘｃ３）．．．ｐ（ｎｏｎ−ｅｘｃｎ）。
ｎ座についての排除の累積確率（ランダムな雄性が排除される確率を表す）は、以下である：
ｃｕｍ　ｐ（ｅｘｃ）＝１−ｃｕｍ　ｐ（ｎｏｎ−ｅｘｃ）。
いくつかの多型遺伝子座がこの分析に含められる場合には、ランダムな雄性の排除の累積確率は非常に高い。この確率は、推定上の父親（その多型マーカーセットが、自分の父親に寄与し得る子供の多型マーカーセットに合致する）の義務を評価する際に、考慮され得る。
【０１２３】
本発明の多型は、生物の表現型に異なる様式で寄与し得る。いくつかの多型は、タンパク質コード配列において生じ、そしてタンパク質構造に影響を与えることによって、表現型に寄与する。この影響は、環境に依存して、中性、有益もしくは有害、または有益および有害の両方であり得る。例えば、ヘテロ接合型鎌状細胞変異は、マラリアに対する耐性を与えるが、ホモ接合型鎌状細胞変異は、通常は致死である。他の多型が、非コード領域において生じるが、複製、転写、および翻訳に対する影響を介して間接的に、表現型の影響を与え得る。単一の多型が、１つより多い表現型形質に影響を与え得る。同様に、単一の表現型形質は、異なる遺伝子における多型により、影響を受け得る。さらに、いくつかの多型は、特定の表現型に原因となって関連する異なる変異に、個体を罹患しやすくする。
【０１２４】
表現型形質としては、公知であるが従来マッピングされていない遺伝的成分を有する疾患が挙げられる。多型形質としてはまた、その成分が遺伝的であるかもしくは遺伝的であり得る、多因子性疾患の症状またはその疾患に対する感受性が挙げられ、この疾患としては、例えば、自己免疫疾患、炎症、癌、神経系の疾患、および病原性微生物による感染が挙げられる。自己免疫疾患のいくつかの例としては、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病（インスリン依存性およびインスリン非依存性）、全身性エリテマトーデスならびにグレーヴス病が挙げられる。癌のいくつかの例としては、膀胱、脳、胸部、結腸、食道、腎臓、白血病、肝臓、肺、口腔、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃および子宮の癌が挙げられる。表現型形質としてはまた、寿命、外観（例えば、禿頭症、肥満症）、強さ、速度、忍耐力、受胎能、および特定の薬物または治療処置に対する感受性または受容性などの特徴が挙げられる。
【０１２５】
問題の表現型形質の存在または非存在について、および多型マーカーセットについて、試験された個体の集団に関して、相関付けを行う。このような分析を実施するために、多型のセット（すなわち、多型セット）の存在または非存在を、個体のセット（この何人かは特定の形質を示し、そして何人かはその形質の欠損を示す）に対して決定する。次いで、このセットの各多型の対立遺伝子を再検討して、特定の対立遺伝子の存在または非存在が問題の形質に関連するか否かを決定する。相関付けは、標準的な統計学的方法（χ２乗検定（　−ｓｑｕａｒｅｄ　ｔｅｓｔ））によって実施され得、そして多型形態と表現型特性との間の統計学的に有意な相関が、注目される。例えば、多型Ａにおける対立遺伝子Ａ１の存在が心疾患に相関することが、見出され得る。さらなる例として、多型Ａにおける対立遺伝子Ａ１および多型Ｂにおける対立遺伝子Ｂ１の組み合わせの存在が、家畜における増加した乳生産に相関することが、見出され得る。
【０１２６】
このような相関は、いくつかの方法で利用され得る。１つ以上の多型形態のセットと処置される疾患との間の強力な相関が利用可能である場合には、ヒトまたは動物患者におけるこの多型形態セットの検出は、処置のすぐの実施、または少なくとも、その患者の定期的なモニタリングの設定を正当化し得る。家族を考慮する夫婦における、重篤な疾患に相関する多型形態の検出はまた、その夫婦の生殖決定において、その夫婦に対して価値があり得る。例えば、雌性配偶者は、インビトロ受精を受けることを選択して、自分の夫から自分の子へのこのような多型の伝達の確率を回避し得る。多型セットと人疾患との間の、より弱い、しかし依然として統計的に有意な相関の場合には、すぐの治療介入またはモニタリングは正当化されないかもしれない。それにもかかわらず、その患者は、その患者に対して低費用で達成され得るが、その患者が改変体対立遺伝子によって増大される感受性を有し得る状態の危険性を減少させることにおいて可能な利点を与える、簡単なライフスタイルの変化（例えば、食事療法、運動）を開始するよう動機付けされ得る。疾患に対するいくつかの処置レジメンのうちの１つに対する増大された受容性に相関する、患者における多型セットの同定は、この処置レジメンに従うべきであることを示す。
【０１２７】
動物および植物については、特性と表現型との間の相関は、所望の特性を作出するために有用である。例えば、Ｂｅｉｔｚら、米国特許第５，２９２，６３９号は、雌性ウシにおける乳生産を改善するための、繁殖プログラムにおけるウシミトコンドリア多型の使用を議論する。ｍｔＤＮＡ　Ｄループ配列多型の、乳生産に対する効果を評価するために、考慮した１７の位置の各々における基本型ミトコンドリアＤＮＡ配列に対して、改変体であれば１の値に、または野生型であれば０の値に、各ウシを割り当てた。
【０１２８】
前節は、表現型形質と、これらの形質に直接的にまたは間接的に寄与する多型との間の相関を同定する工程に関する。本節は、目的の形質と関連する遺伝子座と、この形質と関連しないが、この形質を担う遺伝子座とは物理的に近接し、そしてそれと同時に分離している多型マーカーとの間の物理的連鎖の同定を記載する。このような分析は、染色体位置に対する表現型形質と関連する遺伝子座をマッピングし、それによってこの形質を担う遺伝子をクローニングするために有用である。Ｌａｎｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８３，７３５３−７３５７（１９８６）；Ｌａｎｄｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８４，２３６３−２３６７（１９８７）；Ｄｏｎｉｓ−Ｋｅｌｌｅｒら，Ｃｅｌｌ　５１，３１９−３３７（１９８７）；Ｌａｎｄｅｒら，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１２１，１８５−１９９（１９８９））を参照のこと。連鎖により位置決めされた遺伝子は、方向性クローニング（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ　ｃｌｏｎｉｎｇ）として公知のプロセスによりクローニングされ得る。Ｗａｉｎｗｒｉｇｈｔ，Ｍｅｄ．Ｊ．Ａｕｓｔｒａｌｉａ　１５９，１７０−１７４（１９９３）；Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１，３−６（１９９２）（これらの各々は、全ての目的のためにその全体が参考として援用される）を参照のこと。
【０１２９】
連鎖研究は、代表的には、家族の構成員に対して行われる。この家族のうち利用可能な構成員は、表現型形質の存在または非存在について、および多型マーカーのセットについて特徴付けられる。次いで、有益な減数分裂における多型マーカーの分布が分析されて、どの多型マーカーが表現型形質と同時に分離するかが決定される。例えば、Ｋｅｒｅｍら，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４５，１０７３−１０８０（１９８９）；Ｍｏｎａｃｏら，Ｎａｔｕｒｅ　３１６，８４２（１９８５）；Ｙａｍｏｋａら，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ　４０，２２２−２２６（１９９０）；Ｒｏｓｓｉｔｅｒら，ＦＡＳＥＢ　Ｊｏｕｒｎａｌ　５，２１−２７（１９９１）を参照のこと。
【０１３０】
連鎖は、ＬＯＤ（オッズの対数）値を計算することにより分析される。ｌｏｄ値は、マーカーおよび遺伝子座が、この２つが連鎖せず、そのために独立して分離する状況に対して、組換え割合で位置決めされる場合に、この２つについての観察された分離データを得る相対的尤度である（ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＴｈｏｍｐｓｏｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（第５版，Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９１）；Ｓｔｒａｃｈａｎ，「Ｍａｐｐｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｏｍｅ」、Ｔｈｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　（ＢＩＯＳ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ　Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ），第４章）。一連の尤度比は、種々の組換え割合（　）で計算され、　　＝０．０（一致した遺伝子座）から　　＝０．５０（連鎖しない）の範囲である。従って、　　の所定の値における尤度は、以下である：遺伝子座が連鎖しない場合のデータの確率に対して、遺伝子座が　　において連鎖した場合のデータの確率。計算された尤度は、通常、この比のｌｏｇ１０（すなわち、ｌｏｄ値）として表される。例えば、３というｌｏｄ値は、明らかに観察された連鎖に対して１０００：１のオッズと一致していることを示す。対数を使用することにより、異なるファミリーから収集したデータを、単に加算により合わせることが可能になる。コンピュータープログラムは、　　の異なる値についてのｌｏｄ値を計算するために利用可能である（例えば、ＬＩＰＥＤ，ＭＬＩＮＫ（Ｌａｔｈｒｏｐ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）８１，３４４３−３４４６（１９８４））。任意の特定のｌｏｄ値に関しては、組換え割合が数学的表から決定され得る。Ｓｍｉｔｈら，Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ　ｔａｂｌｅｓ　ｆｏｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｗｏｒｋｅｒｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９６１）；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３２，１２７−１５０（１９６８）を参照のこと。ｌｏｄ値が最も高い　　の値は、組換え割合の最良推定値であるとみなされる。
【０１３１】
正のｌｏｄ値は、２つの遺伝子座が連鎖することを示唆し、それに対して負の値は、２つの遺伝子座が連鎖しないという確率よりも、連鎖する確率が低い（　　のその値において）ことを示唆する。慣習により、＋３以上の組み合わせｌｏｄ値（連鎖のために１０００：１のオッズ以上）は、２つの遺伝子座が連鎖するという最も信頼できる証拠とみなされる。同様に、慣習により、−２以下の負のｌｏｄ値は、比較される２つの遺伝子座の連鎖に対する最も信頼できる証拠として採用される。負の連鎖データは、考慮事項から染色体またはそのセグメントを除く際に有用である。この検索は、残りの除かれていない染色体位置に対して焦点を当てる。
【０１３２】
本発明はさらに、外来性の改変体遺伝子を発現し得る、および／または内因性の不活化された改変体遺伝子のうち１つまたは両方の対立遺伝子を有し得るトランスジェニック非ヒト動物を提供する。外因性改変体遺伝子の発現は、通常、遺伝子をプロモーター（および必要に応じてエンハンサー）に対して作動可能に連結すること、およびこの構築物を接合子にマイクロインジェクションすることにより達成される。Ｈｏｇａｎら，「Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ」，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ．（１９８９）を参照のこと。内因性改変体遺伝子の不活化は、クローニングされた改変体遺伝子がポジティブ選択マーカーの挿入により不活化されるトランスジーンを形成することにより達成され得る。Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４，１２８８−１２９２を参照のこと。次いで、トランスジーンを胚幹細胞に導入し、胚幹細胞で、これは、内因性改変体遺伝子で相同組換えを受ける。マウスおよび他の齧歯類は、好ましい動物である。このような動物は、有用な薬物スクリーニング系を提供する。
【０１３３】
本発明はさらに、特定の薬学的化合物に対するか、またはこのような化合物のクラスに対する単一ヌクレオチド多型を保有する被験体のゲノム薬理学的感受性（ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を評価する方法を提供する。薬物代謝酵素、薬物輸送体、薬剤に対するレセプター、および他の薬物標的における遺伝的多型は、被験体に投与された薬剤の効力および毒性における差異に基づいて、個々の差異と相関されている。薬物に対する被験体の感受性のゲノム薬理学的特徴は、被験体の特定の遺伝子構成に対する投薬レジメを調整する（ｔａｉｌｏｒ）能力を増強し、それによって、治療の治療的有効性を増強および最適化する。
【０１３４】
ｃＳＮＰが、病理学的状態の原因であるとされる多型タンパク質を導く場合において、このような状態を処置する方法は、病理を経験する被験体に多型タンパク質の野生型同族を投与する工程を包含する。一旦、有効投与レジメンで投与されると、この野生型同族は多型タンパク質に起因する欠失の相補または改善を提供する。この被験体の状態はこのタンパク質治療によって回復される。
【０１３５】
ｃＳＮＰから生じる多型タンパク質に起因し得る病理に羅患したと疑いのある被験体は、核酸中のｃＳＮＰの存在、または被験体からとられた適切な臨床サンプル中の同族多型タンパク質の存在を同定し得る任意の種々の診断方法を使用して診断されるべきである。一旦、ｃＳＮＰの存在が確認されれば、この病理は正常遺伝子または野生型遺伝子を投与することによって修正可能であり、この被験体は、正しい野生型遺伝子を有する核酸、または野生型遺伝子の正しい配列を含むフラグメントを含む薬学的組成物で処置される。このような核酸が投与され得る方法の非限定的な例として、アデノウイルスまたはアデノ関連ウイルスのようなウイルス性ベクターに野生型遺伝子を組み込む工程、投与される核酸の細胞内摂取を促進する薬学的組成物中の裸のＤＮＡの投与が挙げられる。一旦、多型の野生型対立遺伝子に対してコードする遺伝子を含む核酸が被験体の細胞内に組み込まれると、それは野生型遺伝子産物の新規な生合成を開始する。その核酸が被験体のゲノムにさらに組み込まれる場合、処置は、長期の持続時間の間、野生型タンパク質の新規な合成を提供する長期間の効果を有する。被験体の細胞中の野生型タンパク質の合成は、被験体の臨床状態の治療学的向上に寄与する。
【０１３６】
ＳＮＰに起因する病理に羅患している被験体は、遺伝性欠失を修正するために処置され得る（Ｋｒｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６：１０３４９−１０３５４（１９９９））。このような被験体は、被験体から抽出されたサンプルの多型を検出し得る任意の方法によって同定される。このような遺伝性欠失は、ＳＮＰの位置にて野生型ヌクレオチドを供給する修復配列を組み込む核酸フラグメントをこのような被験体に投与することによって永続的に修正され得る。この部位特異的修復配列は、被験体のゲノムＤＮＡの内因性修復を促進するように作動するＲＮＡ／ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む。ポリエチレンイミンとの複合体またはアニオン性リポソーム中にカプセル化されたのような適切なビヒクルにおける投与の際に、先天性病理を導く遺伝性欠失は、キメラオリゴヌクレオチドが被験体のゲノムへの野生型配列の組み込みを誘導する際に克服され得る。組み込みの際、野生型遺伝子産物が発現され、そして置換が伝播し、それによって永続的修復を引き起こす。
【０１３７】
本発明は、上記のような少なくとも１つの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを含むキットをさらに提供する。時折、このキットは、異なる形態の多型にハイブリダイズする１対以上の対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドを含む。幾つかのキットにおいて、対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチドは基板に固定されて提供される。例えば、同じ基質は、表に示された多型の少なくとも１０、１００、１０００または全てを検出するための対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを含み得る。このキットの任意の追加の成分として、例えば、制限酵素、逆転写酵素またはポリメラーゼ、基質ヌクレオシドトリホスフェート、標識するために使用される手段（例えば、標識がビオチンである場合、アビジン−酵素複合体および酵素基質および色素原）、および逆転写、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション反応のための適切な緩衝液が挙げられる。通常、このキットはまた、ハイブリダイズする方法を実施するための使用説明書を含む。
【０１３８】
本発明の幾つかの局面は、本発明のＳＮＰを含む核酸によってコードされた多型タンパク質を利用可能にする工程に依存する。これらの核酸配列を単離する種々の方法が存在する。例えば、ＤＮＡは、本明細書中に開示された配列に対して相補的な配列を有する標識されたオリゴヌクレオチドプローブを使用してゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから単離される。
【０１３９】
このようなプローブは、ハイブリダイゼーションアッセイにおいて直接使用され得る。あるいは、プローブはＰＣＲのような増幅技術における使用のために設計され得る。
【０１４０】
ｃＤＮＡライブラリーを調製するために、ｍＲＮＡが、心臓または膵臓のような組織、好ましくは遺伝子または遺伝子ファミリーの発現が起こり得る組織から単離される。ｃＤＮＡはｍＲＮＡから調製され、組換えベクター内に連結される。このベクターは、増殖、スクリーニングおよびクローニングのための組換え宿主にトランスフェクトされる。ｃＤＮＡライブラリーを作製しスクリーニングするための方法は周知である。Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．およびＨｏｆｆｍａｎ，Ｂ．Ｊ．Ｇｅｎｅ２５：２６３−２６９（１９８３）およびＳａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと。
【０１４１】
ゲノムライブラリーの場合、例えば、ＤＮＡは組織から抽出され、機械的にせん断されるか、または酵素学的に消化され約１２〜２０ｋｂのフラグメントを生じる。次いで、このフラグメントは所望ではないサイズから勾配遠心分離によって分離され、バクテリオファージλベクター内に構築される。これらのベクターおよびファージは、Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されるようにインビトロでパッケージされる。組換えファージは、ＢｅｎｔｏｎおよびＤａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９６：１８０−１８２（１９７７）に記載されるようにプラークハイブリダイゼーションによって分析される。コロニーハイブリダイゼーションは、一般にＭ．Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．７２：３９６１−３９６５（１９７５）に記載されるように実施される。目的のＤＮＡは、例えばＳｏｕｔｈｅｒｎブロット上で、核酸プローブでハイブリダイズするその能力によってｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー内で同定され、これらのＤＮＡ領域は、当業者にとって手馴れた標準方法によって単離される。Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと。
【０１４２】
ＰＣＲ技術において、増幅されるべきＤＮＡ領域の２つの３’ボーダーに相補的なオリゴヌクレオチドプライマーが合成される。次いで、ポリメラーゼ連鎖反応が２つのプライマーを使用して行われる。ＰＣＲプロトコールを参照のこと：ａ　Ｇｕｉｄ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，Ｍ，Ｇｅｌｆａｎｄ，Ｄ．，Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．およびＷｈｉｔｅ，Ｔ．編），Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ（１９９０）。プライマーは、目的の全長配列をコードする全領域を増幅するために、または所望されるより小さなＤＮＡセグメントを増幅するために選択され得る。ＰＣＲは、目的の配列をコードするｃＤＮＡセグメントを単離するために種々のプロトコールで使用され得る。これらのプロトコールでは、目的の配列をコードするＤＮＡを増幅するための適切なプライマーおよびプローブは、本明細書中に列挙されるＤＮＡ配列の分析から生成される。一旦、このような領域がＰＣＲ増幅されると、これらは、配列決定され得、オリゴヌクレオチドプローブがこの配列から調製され得る。
【０１４３】
一旦、ｃＳＮＰを含む配列をコードするＤＮＡが単離され、そしてクローン化されると、種々の組換え的に操作された細胞においてコードされる多型タンパク質が発現され得る。目的の配列をコードするＤＮＡの発現に利用可能な多くの発現系において、当業者は良く知っていると期待される。原核生物または真核生物におけるタンパク質の発現について公知である種々の方法を詳細に記載する試みは、本明細書においては行わない。
【０１４４】
短くまとめると、目的の配列をコードする天然または合成の核酸の発現は、典型的には、ＤＮＡまたはｃＤＮＡをプロモーター（これは、構成的または誘導的のいずれかである）に作動可能に連結し、続いて、発現ベクターに組み込むことによって達成される。このベクターは、原核生物または真核生物のいずれかにおける複製または組み込みに適切であり得る。典型的な発現ベクターは、目的のポリヌクレオチド配列の発現の調節に有用な、開始配列、転写および翻訳ターミネーター、およびプロモーターを含む。クローン遺伝子の高いレベルの発現を得るために、最低限、転写に指向するための強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳ターミネーターを含む発現プラスミドを構築することが望ましい。発現ベクターはまた、少なくとも１つの独立なターミネーター配列、真核生物および原核生物の両方においてプラスミドの複製を可能にする配列（すなわち、シャトルベクター）、および原核生物系と真核生物系の両方に対する選択マーカーを含む一般的な発現カセットを含み得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと。
【０１４５】
種々の原核生物発現系は、本発明の多型タンパク質を発現するために使用され得る。例としては、Ｅ　ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓなどが挙げられる。
【０１４６】
最低限、転写に指向するための強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写／翻訳ターミネーターを含む発現プラスミドを構築することが好ましい。Ｅ．ｃｏｌｉにおけるこの目的に適切な調節領域の例は、Ｙａｎｏｆｓｋｙ，Ｃ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．１５８：１０１８−１０２４（１９８４）に記載されるようなＥ．ｃｏｌｉトリプトファン生合成経路のプロモーター領域およびオペレーター領域、ならびにΛ、Ｉ．およびＨａｇｅｎ、Ｄ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１４：３９９−４４５（１９８０）によって記載されるようなファージλ（Ｐ　）の左への（ｌｅｆｔｗａｒｄ）プロモーターである。Ｅ．ｃｏｌｉ．中で形質転換されるＤＮＡベクター中の選択マーカーの封入もまた、有用である。このようなマーカーの例には、アンピシリン、テトラサイクリン、またはクロラムフェニコールに対する遺伝子特異的耐性が挙げられる。Ｅ．ｃｏｌｉにおける使用のための選択マーカーに関する詳細について、Ｓａｍｂｒｏｏｋらを参照のこと。
【０１４７】
発現された組換えタンパク質の適切な折り畳みを高めるために、Ｅ．ｃｏｌｉからの精製の間、発現タンパク質は、最初に変性され、次いで再生され得る。これは、細菌的に産生されたタンパク質をグアニジンＨＣｌのようなカオトロピズム剤中に溶解し、β−メルカプトエタノールのような還元剤を用いて全てのシステイン残基を還元することによって達成され得る。次いで、タンパク質は、ゆっくりした透析またはゲル濾過のいずれかによって再生される。米国特許第４，５１１，５０３号を参照のこと。発現抗原の検出は、放射免疫アッセイ、あるいはウェスタンブロット技術または免疫沈降のような当該分野で公知の方法によって達成される。Ｅ．ｃｏｌｉからの精製は、米国特許第４，５１１，５０３号に記載されるような手順に従って達成され得る。
【０１４８】
酵母、昆虫細胞株、鳥細胞、魚細胞、および哺乳動物細胞のような種々の真核生物発現系の任意もまた、本発明の多型タンパク質を発現するために使用され得る。手短に以下に説明するように、ｃＳＮＰを含むヌクレオチド配列は、これらの真核生物系において発現され得る。酵母中の異種タンパク質の合成は、周知である。Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｆ．ら、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８２）は、酵母におけるタンパク質を産生するために利用可能な種々の方法を記載するよく認識された仕事である。適切なベクターは、通常、プロモーターのような発現制御配列（３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖酵素を含む）、および所望な複製、ターミネーション配列の起源などを有する。例えば、適切なベクターは、文献（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｇｅｎｅ　８：１７−２４（１９７９）；Ｂｒｏａｃｈら、Ｇｅｎｅ　８：１２１−１３３（１９７９））に記載される。
【０１４９】
２つの手順が、酵母細胞を形質転換する際に使用される。１つの場合では、酵母細胞は、最初に、ザイモリアーゼ、リティカーゼ（ｌｙｔｉｃａｓｅ）またはグルスラーゼ（ｇｌｕｓｕｌａｓｅ）を使用してプロトプラストに転換され、続いて、ＤＮＡおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が添加される。次いで、ＰＥＧ処理されたプロトプラストは、選択的な条件下で、３％寒天培地中で再生される。この手順の詳細は、Ｊ．Ｄ．Ｂｅｇｇｓ、Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２７５：１０４−１０９（１９７８）；およびＨｉｎｎｅｎ，Ａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７５：１９２９−１９３３（１９７８）による論文に与えられる。第２の手順は、細胞壁の除去を含まない。代わりに、この細胞は、塩化リチウムまたは酢酸リチウムおよびＰＥＧで処理され、選択的なプレート（Ｉｔｏ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔ，１５３１６３−１６８（１９８３））に、細胞を置き、溶解物に標準的なタンパク質単離技術を適用する。
【０１５０】
精製プロセスは、ウエスタンブロット技術またはラジオイムノアッセイ、または他の標準的な技術を使用することによってモニタリングされ得る。本発明のタンパク質をコードする配列はまた、例えば、哺乳動物、昆虫、鳥または魚の起源の、細胞培養物を形質転換する際に使用するための種々のイムノアッセイ発現ベクターに結合され得る。ポリペプチドの産生のために有用である細胞培養の例は、哺乳動物の細胞である。哺乳動物の細胞懸濁液がまた使用され得るが、哺乳動物の細胞系は、しばしば、単層の細胞の形態である。インタクトなタンパク質を発現し得る多数の適切な宿主細胞株は、当該分野で開発され、これらには、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、およびＣＨＯ細胞株、ならびにＣＯＳ細胞株のような種々のヒトの細胞、ＨｅＬａ細胞、ミエローマ細胞株、Ｊｕｒｋａｔ細胞などが挙げられる。これらの細胞の発現ベクターには、複製の起点のような発現制御配列、プロモータ（例えば、ＣＭＶプロモータ、ＨＳＶ　ｔｋプロモータ、またはｐｇｋ（ホスホグリセレートキナーゼ）プロモータ）、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ、８９：４９（１９８６））、ならびに、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴ　ＡｇポリＡ添加部位）、および転写ターミネーター配列のような必要なプロセシング情報部位が挙げられ得る。
【０１５１】
他の動物細胞が、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ　ａｎｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（第７版（１９９２））から利用可能である。昆虫細胞において、本発明のタンパク質を発現するための適切なベクターは、通常、バキュロウイルス由来である。昆虫細胞株には、蚊の幼虫、蚕、アワヨトウの幼虫、蛾およびショウジョウバエの細胞株（例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ細胞株）が挙げられる（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ　Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．、２７：３５３−３６５（１９８７）を参照のこと）。上記のように、宿主細胞を形質転換するために使用されるベクター（例えば、プラスミド）は、好ましくは、転写を開始するためのＤＮＡ配列、およびタンパク質の翻訳を制御するための配列を含む。これらの配列は、発現制御配列として言及される。酵母について、高等動物の宿主細胞を使用する場合、公知の哺乳動物由来のポリアデニル化配列または転写ターミネーター配列が、ベクターに取り込まれることが必要である。ターミネーター配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子由来のポリアデニル化配列である。転写の正確なスプライスのための配列がまた、含まれ得る。スプライシング配列の例は、ＳＶ４０由来のＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅ、Ｊ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３−７８１（１９８３））。さらに、宿主細胞において複製を制御するための遺伝子配列は、Ｓａｖｅｒｉａであり得る（Ｃｏｍｐｏ，Ｍ．、１９８５、「Ｂｏｖｉｎｅ　Ｐａｐｉｌｌｏｍａ　ｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ　ａ　Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒ」ｉｎ　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏｌ．ＩＩ　ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ　２１３−２３８頁）。この宿主細胞は、種々の手段によって形質転換するために受容能があるか、またはその受容能を与えられる。ＤＮＡを動物の細胞に導入するいくつかの周知の方法が存在する。これらには、リン酸カルシウム沈降、ＤＮＡを含む細菌のプロトプラストを用いたレシピエントの細胞の融合、ＤＮＡ、ＤＥＡＥデキストランを含むリポソームを用いたレシピエントの細胞の処理、エレクトロポレーション、およびＤＮＡの細胞への直接的なマイクロインジェクションが挙げられる。
【０１５２】
形質転換された細胞は、当該分野で周知の手段によって培養される（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｋｕｃｈｌｅｒ、Ｒ．Ｊ．、Ｄｏｗｄｅｎ、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒｏｓｓ，Ｉｎｃ．（１９７７））。発現されたポリペプチドは、懸濁物としてか、または単層として増殖された細胞から単離される。後者は、周知の機械的手段、化学手段または酵素手段によって回収される。
【０１５３】
組換えタンパク質を発現する一般方法はまた公知であり、Ｒ．ＫａｕｆｍａｎのＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５，５３７−５６６（１９９０）に例示される。本明細書中に記載される「作動可能に連結される」は、プロモータがＤＮＡ配列の転写を媒介するようなＤＮＡ配列から上流のプロモータの連鎖を言う。特に、「作動可能に連結される」とは、タンパク質をコードする遺伝子が、結合したポリヌクレオチド／発現配列で形質変換（トランスフェクト）された宿主細胞によって発現する方法で、本発明の単離されたポリヌクレオチドおよび発現制御配列がベクターまたは細胞内に配置されることを意味する。用語「ベクター」とは、ウイルス発現系（自立性自己複製環状ＤＮＡ（プラスミド））を言い、そして発現プラスミドと非発現プラスミドの両方を含む。
【０１５４】
本明細書中で使用される用語「遺伝子」は、ポリペプチドをコードする核酸配列を言うことを意図する。この定義は、種々の配列多型、変異、および／または配列改変体を含み、ここで、これらの変化は、遺伝子産物の機能に影響を与えない。用語「遺伝子」は、コード遺伝子ばかりでなく、プロモータ、エンハンサー、末端領域および類似の非翻訳ヌクレオチド配列のような調節領域を含むことを意図する。さらにこの用語は、代替のスプライシング部位から得られる改変体の他に、全てのイントロンおよびｍＲＮＡ転写物からスプライシングされる他のＤＮＡ配列を含む。
【０１５５】
多数の型の細胞は、タンパク質の発現のための適切な宿主細胞として作用し得る。哺乳動物の宿主細胞には、例えば、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３　ｌ細胞、ヒトＣｏ１０２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、他の形質転換された霊長類の細胞株、通常の二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物由来の細胞株、初代体外移植組織、ＨｅＬａ細胞、マウスＬ細胞、ＢＨＫ、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。あるいは、酵母のような下等真核生物または細菌のような原核生物において産生することが可能であり得る。潜在的に適切な酵母株には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ株、カンジダ属、または異種タンパク質を発現可能な任意の酵母株が挙げられる。潜在的に適切な細菌株には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、または異種タンパク質を発現可能である任意の細菌株が挙げられる。このタンパク質が酵母または細菌で作製される場合、機能性タンパク質を得るために、この中で産生されるタンパク質を、例えば、適切な部位のリン酸化またはグルコシル化によって、改変することが必要であり得る。
【０１５６】
このタンパク質はまた、本発明の単離されたポリヌクレオチドを１種以上の昆虫発現ベクターにおける適切な制御配列へ作動可能に連結し、そして昆虫発現系を利用することによって産生され得る。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系についての物質および方法は、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．からのキット形態（ｔｈｅ　ＭａｘＢａ（Ｃ）キット）で市販されており、そしてＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　Ｓｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ．１５５５（１９８７）（これは、本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、このような方法は当該分野において周知である。本明細書中で使用される場合、本発明のポリヌクレオチドを発現し得る昆虫細胞は、「形質転換される」。本発明のタンパク質は、形質転換された宿主細胞を、組換えタンパク質を発現するに適切な培養条件下で、培養することによって調製され得る。
【０１５７】
本発明の多型タンパク質はまた、形質転換動物の産物、例えば、形質転換ウシ、ヤギ、ブタ、またはヒツジ（これらは、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む体細胞または生殖細胞によって特徴付けられる）のミルクの成分として発現され得る。このタンパク質はまた、公知の従来の化学合成によって産生され得る。合成手段によって本発明のタンパク質を構築するための方法は、当業者に公知である。
【０１５８】
組換えＤＮＡ技術によって産生される多型タンパク質は、組換えタンパク質を単離または精製するために一般的に利用される技術によって精製され得る。組換えで産生されたタンパク質は、直接発現されるか、または融合タンパク質として発現され得る。次いで、このタンパク質は、細胞溶解（例えば、音波破砕）とアフィニティークロマトグラフィーとの組み合わせによって精製される。融合産物について、適切なタンパク質分解酵素でのこの融合タンパク質の引き続く消化によって、所望のポリペプチドを放出する。本発明のポリペプチドは、硫酸アンモニウムのような物質での選択的沈殿法、カラムクロマトグラフィー法、免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などを含む、当該分野で周知の標準的な技術によって実質的な純度まで精製され得る。例えば、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８２）を参照のこと（これらは、本明細書中で参考として援用される）。例えば、ある実施形態において、抗体が、本明細書中で記載されるように、本発明のタンパク質に対して惹起され得る。細胞膜が、この組換えタンパク質を発現する細胞株から単離され、このタンパク質は、この膜から抽出され、そして免疫沈降される。次いで、このタンパク質は、上述のような標準的なタンパク質化学技術によってさらに精製され得る。
【０１５９】
次いで、得られる発現されたタンパク質を、公知の精製プロセス（例えば、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィー）を使用して、このような培養物から（すなわち、培養媒体または細胞抽出物から）精製され得る。このタンパク質の精製はまた、以下を含み得る：このタンパク質へ結合する薬剤を含むアフィニティーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ＠またはＣｉｂａｃｒｏｍ　ｂｌｕｅ　３ＧＡ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｂのようなアフィニティー樹脂に渡る１以上のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのような樹脂を使用する疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む１以上の工程；あるいは免疫親和性クロマトグラフィー。あるいは、本発明のタンパク質はまた、精製を促進する形態で発現され得る。例えば、それは、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）のような融合タンパク質として発現され得る。このような融合タンパク質の発現および精製のためのキットは、それぞれ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）およびＩｎ　Ｖｉｔｒｏｇｅｎから市販されている。このタンパク質はまた、エピトープでタグ化され得、このようなエピトープへ指向される特異的な抗体を使用して引き続いて精製される得る。１つのこのようなエピトープ（「Ｆｌａｇ」）は、Ｋｏｄａｋ（Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）から市販される。最終的に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンダントメチルまたは他の脂肪族基を有するシリカゲル）を使用する１以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程は、このタンパク質をさらに精製するために使用され得る。前述の精製工程のうちのいくつかまたは全てはまた、種々の組み合わせで、実質的に均一な単離された組換えタンパク質を提供するために利用され得る。このように精製されたタンパク質は、他の哺乳動物タンパク質を実質的に含まず、そして本発明に従って「単離されたタンパク質」として規定される。
【０１６０】
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、抗原と特異的に結合する（免疫反応する）抗原結合部位を含む分子）（例えば、多型）をいう。このような抗体としては、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、単鎖、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント、ならびにＦａｂ発現ライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、ヒト多型タンパク質に対する抗体が開示される。
【０１６１】
タンパク質またはペプチドを参照して、抗体「に特異的に結合する」、抗体「に免疫特異的に結合する」または抗体「と特異的に免疫反応性である」との成句は、異種のタンパク質の集団および他の生物学的物質の存在下においてタンパク質の存在を決定する結合反応のことをいう。従って、例えば、設計されたイムノアッセイ条件下で、特定の抗体は、特定のタンパク質へ結合し、そしてサンプル中に存在する他のタンパク質に対して有意な量で結合しない。このような条件下での抗体への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択される抗体を必要とし得る。当然ながら、本発明における関心は、多型タンパク質に免疫特異的に結合するが、その同族野生型対立遺伝子タンパク質に結合しない（その逆も真）抗体である。種々のイムノアッセイ形式が、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、慣用的に、タンパク質と特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために使用される。特異的免疫活性を決定するために使用され得るイムノアッセイ形式および条件の記載については、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋを参照のこと。
【０１６２】
免疫特異的に多型遺伝子産物に結合するが、対応するプロトタイプの遺伝子産物または「野生型」遺伝子産物とは結合しない、ポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体もまた、提供される。抗体は、改変遺伝子産物または合成ペプチドを用いてマウスまたは他の動物に注入することにより作製され得る。モノクローナル抗体を、例えば、Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８８）；Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８６）に記載されるようにスクリーニングする。モノクローナル抗体を、改変遺伝子産物との特定の免疫反応性および対応するプロトタイプの遺伝子産物に対する免疫反応性の欠損を試験する。
【０１６３】
単離された多型タンパク質またはその一部すなわちフラグメントは、ポリクローナル抗体調製およびモノクローナル抗体調製のための標準的技術を使用して、多型タンパク質に結合する抗体を生成するための免疫原として使用され得る。全長多型タンパク質が使用され得るか、あるいは、本発明は、免疫原として使用するために多型の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。本発明の多型タンパク質の抗原性ペプチドは、多型アミノ酸を含むアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を含み、かつ多型タンパク質のエピトープを含み、その結果、多型タンパク質を有する特定の免疫複合体を形成するペプチドに対して抗体が産生される。好ましくは、抗原性ペプチドは、少なくとの１０アミノ酸残基を含み、より好ましくは少なくとも１５アミノ酸残基を含み、さらにより好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基を含み、そして最も好ましくは少なくとも３０アミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより含まれる好ましいエピトープは、タンパク質の表面に位置する多型の領域である（例えば、親水性領域）。
【０１６４】
ポリクローナル抗体の産生のために、種々の適切な宿主動物（例えば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）が、この多型タンパク質を用いる注入によって免疫化され得る。適切な免疫原性調製物は、例えば、組換えて発現される多型タンパク質または化学的に合成された多型ポリペプチドを含み得る。この調製物は、さらにアジュバンドを含み得る。免疫学的応答を増加するために使用される種々のアジュバンドには、Ｆｒｅｕｎｄのアジュバンド（完全および不完全）、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油状エマルジョン、ジニトロフェノールなど）、ヒトアジュバンド（例えば、Ｂａｃｉｌｌｅ　Ｃａｌｍｅｔｔｅ−ＧｕｅｒｉｎおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒｖｕｍ）または類似の免疫刺激剤が挙げられるが、これらに限定されない。所望される場合、ＩｇＧ画分を得るために、多型タンパク質に対して方向付けられる抗体分子は、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され得、そして周知の技術（例えば、タンパク質Ａクロマトグラフィー）によってさらに精製され得る。
【０１６５】
本明細書中で使用される場合、用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」とは、別々のハイブリドーマ細胞のクローンから生じ、そして多型タンパク質の特定のエピトープと免疫反応し得る１つの型の抗原結合部位のみを含む抗体分子の集団をいう。従って、モノクローナル抗体組成物は、それが免疫反応する特定の多型タンパク質に対する単一の結合親和性を代表的に示す。特定の多型タンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに向けて方向付けられるモノクローナル抗体の調製のために、連続的な細胞株培養による抗体分子の産生のために提供する任意技術が利用され得る。そのような技術には、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５　Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５−４９７を参照のこと）；トリオーマ（ｔｒｉｏｍａ）技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｔｏｄａｙ　４：７２を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，７７−９６頁を参照のこと）。ヒトモノクローナル抗体は、本発明の実施において利用され得、そしてヒトハイブリドーマ（Ｃｏｔｅら、１９８３．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８０：２０２６−２０３０を参照のこと）を使用することによって産生され得るか、またはＥｐｓｔｅｉｎ　Ｂａｒｒ　Ｖｉｒｕｓ（Ｃｏｌｅら、１９８５：ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ　ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ　ＡＮＤ　ＣＡＮＣＥＲ　ＴＨＥＲＡＰＹ，Ａｌａｎ　Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ，７７−９６頁を参照のこと）をインビトロで用いてヒトＢ細胞を形質転換することにより産生され得る。
【０１６６】
本発明に従って、技術が、多型タンパク質に対して特異的な単鎖抗体の産生のために適用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号参照のこと）。さらに、方法論が、多型タンパク質またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの迅速かつ効率的な同定を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリー（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５−１２８１を参照のこと）の構築について適用され得る。非ヒト抗体は、当該分野において周知の技術によって、「ヒト化」され得る。例えば、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと。多型タンパク質に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、当該分野において公知の技術によって産生され得、これらには、以下に挙げられるが、限定されない：（ｉ）抗体分子のペプシン消化によって産生されるＦ（ａｂ’）２フラグメント：（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することによって産生されるＦａｂフラグメント：（ｉｉｉ）パパインおよび還元剤を用いる抗体分子の処理によって生成されるＦａｂフラグメントおよび（ｉｖ）ＦＶフラグメント。
【０１６７】
さらに、標準組換えＤＮＡ技術を用いて作製され得る組換え抗多型タンパク質抗体（例えば、ヒト部分および非ヒト部分の両方を含むキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体）は、本発明の範囲内である。このようなキメラ抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野において公知の組換えＤＮＡ技術によって産生され得、例えば、以下に記載の方法を使用する：ＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；欧州特許出願第１８４，１８７号；欧州特許出願第１７１，４９６号；欧州特許出願第１７３，４９４号；ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８６／０１５３３；米国特許第４，８１６，５６７号；欧州特許出願第１２５，０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）ＰＮＡＳ　８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）　Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）ＰＮＡＳ　８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ　４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ　３１４：４４６−４４９；Ｓｈａｗら（１９８８）Ｊ　Ｎａｔｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ　８０：１５５３−１５５９；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　４：２１４；米国特許第５，２２５，５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）　Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　１４１：４０５３−４０６０。
【０１６８】
１つの実施形態において、所望の特異性を有する抗体のスクリーニングのための方法論は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）および当該分野で公知の他の免疫学的に媒介された技術を含むが、これらに限定されない。
【０１６９】
抗多型タンパク質抗体は、多型タンパク質の検出、定量化および／または細胞性局在または組織局在に関して当該分野で公知の方法に使用され得る（例えば、適切な生理学的なサンプル内の多型タンパク質のレベルを測定する際の使用のため、診断的方法での使用のために、タンパク質を画像化する際の使用のために、など）。所定の実施形態において、抗体由来のＣＤＲを含む、多型タンパク質、またはその誘導体、フラグメント、アナログもしくはホモログに対する抗体は、被験体におけるｃＳＮＰ対立遺伝子の存在から生じる、被験体における病状の処置を企図する治療的適用において薬理学的に活性な化合物として利用される。
【０１７０】
抗多型タンパク質抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、種々の免疫化学的技術（例えば、免疫アフィニティクロマトグラフィーまたは免疫沈降）によって多型タンパク質を単離するために使用され得る。抗多型タンパク質抗体は、細胞からの天然の多型タンパク質の精製および宿主細胞内に発現した組換え的に産生された多型タンパク質の精製を容易にし得る。さらに、抗多型タンパク質抗体は、多型タンパク質の発現の発生量およびパターンを評価するための多型タンパク質を検出するために使用され得る（例えば、細胞溶解物または細胞上清において）。抗多型タンパク質抗体は、例えば、所定の処置療法の有効性を決定するための臨床的試験手順の一部として、組織中のタンパク質レベルをモニターするために診断的に使用され得る。抗体を検出可能な基質と結合する（すなわち、物理的連結）ことによって、検出は容易にされ得る。種々の酵素を含む検出可能な基質の例として、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる；適切な補欠分子団複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる；適切な蛍光物質の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる；発光物質の例として、ルミノールが挙げられる；生物発光物質の例として、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、そして適切な放射活性物質の例として、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１〜図３９に示される表１は、本発明の多型配列のヌクレオチド配列（配列番号１〜２１７）についての情報を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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