(57)【要約】本発明は、組織同等物技術を用いて構築される抗癒着性パッチ（１Ａ）に関する。この抗癒着性パッチ（１Ａ）は、膠原質材料と少なくとも一つの非生存細胞成分を含んでなる。また、この明細書で開示した抗癒着性パッチ（１Ａ）を使用することにより、手術手技時に手術を受ける器官と他の組織の間の組織癒着を防止する方法も提供される。
2004533857.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膠原質材料と少なくとも一つの非生存細胞成分を含んでなる抗癒着性パッチ。
【請求項２】
上記膠原質材料がコラーゲンタイプＩまたはコラーゲンタイプＩと共成分の組み合わせ物である請求項１の抗癒着性パッチ。
【請求項３】
上記共成分がエラスチン、間質コラーゲン、コラーゲンタイプＩＩＩ、Ｖ及びＩＸ、糖タンパク質及びプロテオグリカンからなる群から選ばれる請求項２の抗癒着性パッチ。
【請求項４】
上記膠原質材料が天然の材料源または組み換え材料源のものである請求項１の抗癒着性パッチ。
【請求項５】
上記非生存細胞成分が天然の材料源または組み換え材料源からのものである請求項１の抗癒着性パッチ。
【請求項６】
天然の材料源からの上記非生存細胞成分がヒト結合組織細胞である請求項５の抗癒着性パッチ。
【請求項７】
上記ヒト結合組織細胞が線維芽細胞または血管平滑筋細胞である請求項６の抗癒着性パッチ。
【請求項８】
上記線維芽細胞が皮膚線維芽細胞である請求項７の抗癒着性パッチ。
【請求項９】
組み換え材料源からの上記非生存細胞成分が設計された細胞である請求項５の抗癒着性パッチ。
【請求項１０】
抗癒着性パッチを構築する方法であって、
（ａ）ヒト結合組織細胞を膠原質材料と混合し、
（ｂ）生成した混合物をマトリックス組織化媒体中でインキュベーションして、該細胞を刺激して、膠原質材料に適合、組織化して、望ましい寸法と機械的性質を有する単一細胞組織同等物とし、
（ｃ）該組織同等物を処理して、該細胞を除去し、そして
（ｄ）該処理後に該組織同等物中に生細胞が存在しないことを確認し、ここで、上記組織同等物が抗癒着性パッチとして使用できる、
段階を含んでなる方法。
【請求項１１】
上記膠原質材料が酸溶液中にあり、そして最初に混合段階の前に４℃で中和される請求項１０の方法。
【請求項１２】
上記酸性溶液が塩酸溶液である請求項１１の方法。
【請求項１３】
上記ヒト結合組織細胞が線維芽細胞または血管平滑筋細胞である請求項１０の方法。
【請求項１４】
上記線維芽細胞が皮膚線維芽細胞である請求項１３の方法。
【請求項１５】
上記膠原質材料がコラーゲンタイプＩまたはコラーゲンタイプＩと共成分の組み合わせ物である請求項１０の方法。
【請求項１６】
上記共成分がエラスチン、間質コラーゲン、コラーゲンタイプＩＩＩ、Ｖ及びＩＸ、糖タンパク質及びプロテオグリカンからなる群から選ばれる請求項１５の方法。
【請求項１７】
上記膠原質材料が天然の材料源または組み換え材料源のものである請求項１０の方法。
【請求項１８】
上記マトリックス組織化媒体がウシ胎仔血清を含有する請求項１０の方法。
【請求項１９】
上記マトリックス組織化媒体が線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）及びこれらの混合物からなる群から選ばれる増殖因子の無血清のカクテルである請求項１０の方法。
【請求項２０】
上記増殖因子のカクテルが増殖プロモーターの存在下にある請求項１９の方法。
【請求項２１】
上記増殖プロモーターがトランスフェリンとインスリンを含む請求項２０の方法。
【請求項２２】
該細胞除去処理が栄養欠乏、抗生物質処理及び抗有糸分裂剤処理を含む請求項１０の方法。
【請求項２３】
上記抗生物質がピューロマイシン、アンホテラシン及びマイトマイシンを含む請求項２２の方法。
【請求項２４】
上記抗有糸分裂薬が５−フルオロウラシルである請求項２２の方法。
【請求項２５】
手術処置の間に手術を受ける器官と他の組織の間の組織癒着を防止する方法であって、手術を受ける組織の表面の一カ所に抗癒着性パッチを取り付ける段階を含んでなり、ここで、上記抗癒着性パッチが膠原質材料と少なくとも一つの非生存細胞成分を含んでなり、上記抗癒着性パッチが癒着形成に参加し、回復時に生体分解可能である方法。
【請求項２６】
手術を受ける上記組織が心臓である請求項２５の方法。
【請求項２７】
上記抗癒着性パッチが組織グルーを用いて外傷を受けた組織に取り付けられる請求項２５の方法。
【請求項２８】
上記組織グルーが線維素組織グルーまたは別なタイプの生体接着剤である請求項２７の方法。
【請求項２９】
上記別なタイプの生体接着剤がＮｉｔｉｎｏｌ  Ｃｏｕｐｌｅｒである請求項２８の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、概して、組織同等物（ｔｉｓｓｕｅ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）技術に関する。特に、本発明は、心膜の抗癒着性パッチ（ＰＡＰ）、患者への移植に先立って再組織化されるコラーゲンと少なくとも一つの非生存細胞成分を含んでなる事前形成されたあらい膠原質無細胞組織に関する。このパッチは、手術処置の間に手術を受ける器官と他の組織の間の組織癒着を防止し、癒着形成機構が最も活発である手術後の期間（初期の２−３週）の間正しい場所に維持されなければならない。その後、ＰＡＰは、創傷治癒過程を再構築フェーズに変換し、その間にこの抗癒着性パッチは溶解して、アミノ酸成分、主としてプロリンとリシンとなる。
【０００２】
（背景技術）
体腔を開き、中に入ることは外部器官の表面を種々の外傷性条件に曝す侵襲的な出来事である。外傷または損傷の重篤度は、組織の乾燥と過度の取り扱いから、不適切な止血、異物材料との長時間の接触、吻合中の組織面の誤整列、及びすべての異常組織の除去の失敗までの範囲がある。心胸郭の手術時、冠状脈管構造と心臓へのアクセスは、胸壁と取り囲んでいる内部器官（例えば、肺）から心臓を包み、分離している心膜袋（すなわち、心膜）の切開を必要とする。このような方法に引き続き、心外膜と心膜、胸骨、胸膜及び他の隣接する構造の間で癒着が日常的に生成する。胸骨後方の癒着は右心室、大動脈、右心房、寛骨静脈、及び大動脈冠動脈バイパスグラフトに損傷を生じる。一般に、心臓手術後の癒着形成は高発現頻度で起こり、普通避けられ得ない。手術が完了したならば、胸腔は閉じられるが、心膜中の切開（スリット）はゆるく閉じるか、あるいは開いたままにされる。いずれの場合にも手術後の浮腫により、この切開は普通卵形の開口になる。治癒過程の間に、心膜の弁は胸壁、肺及び心臓それ自身に癒着（「瘢痕化」）する。これらの癒着は１００％のケースで起こり、反復手術の必要がある場合には深刻なリスク因子である。反復手術は現在増加しつつあるので、この方法の成功を高めるために、心膜癒着形成を防止する方法に対する深刻な必要性が存在する。心膜癒着を防止するのにＦＤＡにより承認された器具はない。癒着は、また、眼、整形外科、中枢神経系、及び子宮内であってもよい。それゆえ、胸腔中のみならずすべての解剖学的位置中の手術後の癒着を防止することが望ましい。
【０００３】
この手術による外傷は、切開それ自身から体腔を内張りする中皮細胞の喪失までの範囲の組織損傷を含む。中皮細胞（ｍｅａｓｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）は線維素を溶解する酵素のフィブリノリシンを分泌する。不適切な止血は血液と血餅の蓄積を引き起こし、線維素の形成と堆積を生じ、これは、中皮細胞の不在下で損傷の部位に蓄積する。線維素は極めて接着性のタンパク質であり、損傷を受けた表面を一緒にくっつける。一時的であるが、手術により引き起こされる虚血によって、線維素マトリックスが残存し続け、マクロファージ、線維芽細胞、及び巨細胞により徐々に増殖する。線維素がカルシウム沈着小結節と共に線維素質バンドとなるにつれて、初期の癒着は成熟し、時には４−５日後に形成される中皮により被覆される（手術後１０日で完了）。癒着は血管新生し、神経支配することができ、そして成熟の最後の段階で癒着は膠原化する。この過程には組織修復、線維芽細胞、並びに循環免疫系細胞（マクロファージ）において含まれる主要な結合組織細胞の活性化が関与する。これらの細胞は分割し、一般の炎症性応答として損傷を受けた領域の中に移行し始める。線維芽細胞はコラーゲンを分泌（膠原化）し、最終的にコラーゲン（線維素）塊を収縮させて、密な組織とする。この収縮過程は傷跡形成を更に強め、強い「癒着」を形成し、以前は充分に分離されていた隣接する組織表面を「つなぎ」あるいは「溶接」する。時間がたつと癒着はますます繊維状になり、石灰化することさえある。カルシウム沈着は癒着形成の極めて望ましくない局面である。ある個人（特に、アフリカンアメリカンとヒスパニック民族の）は、ひどい傷跡化とそれゆえ癒着形成への遺伝的素因を持つ。これらの個人は、また、外科的介入を必要とする心臓の問題に対しても高リスクにある。この高リスクグループを癒着形成から保護することは重要である。
【０００４】
癒着の防止は長年問題であり、この形成を防止するのに最も一貫して適用されてきた戦略は、「障壁」によって癒着する可能性のある組織表面を物理的に分離することであった。この非癒着性障壁は初期にはかなり初歩的（例えば、微細な外科用スチールワイヤメッシュ）であり、大部分生体適合型であるが、非生体分解型である。近年、更に有効で生体分解型の抗癒着性障壁が強化された。しかしながら、全体的に満足な解決はなお見出されず、新しいアプローチの開発が極めて望ましい。特に望ましいのは、癒着形成の問題に対して一般的な解決をもたらし、体内のいかなる解剖学的位置でも癒着形成を防止する戦略である。広範で種々の正常なヒト細胞の収集、培養に使用される方法の進歩と３次元マトリックスの中へのこれらの細胞の組み込みは、癒着防止と新世代の抗癒着性障壁の進歩に対する新しい機会を提供する。
【０００５】
（発明の開示）
本発明は、抗癒着性パッチ（パッチ）とこの明細書で開示したパッチを構築する方法を指向する。具体的には、ＰＡＰは、機械的及び光学的性質がヒト線維芽細胞によるコラーゲンタイプＩゲルの組織化から生じるが、その最終形状が無細胞である設計された組織同等物である。詳細には、このパッチは正常なヒト結合組織細胞、好ましくは線維芽細胞、または血管平滑筋細胞、及びコラーゲンタイプＩ溶液などのコラーゲンを混合することにより構成される。この生成混合物をインキュベーションして、細胞を刺激し、コラーゲンゲルマトリックスに適合させ、組織化して、所望の寸法と機械的性質を有する単細胞組織同等物（ｍｏｎｏ−ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）（ＭＣＴＥ）とする。
【０００６】
本発明は、この明細書で開示した抗癒着性パッチを使用することにより、手術手技時に手術を受ける器官と他の組織の間の組織癒着を防止する方法を指向する。
【０００７】
本発明の他及び更なる局面、特徴、及び利点は、開示の目的で示した本発明の現時点での好ましい態様の次の説明から明白であろう。
【０００８】
（発明の実施の態様）
本発明は、抗癒着性パッチ（パッチ）とこのパッチを癒着防止用に使用する方法を指向する。
【０００９】
本発明の一つの態様においては、膠原質材料と少なくとも一つの非生存（ｎｏｎ−ｌｉｖｉｎｇ）細胞成分を含んでなる抗癒着性パッチが提供される。好ましくは、この膠原質材料はコラーゲンタイプＩまたはコラーゲンタイプＩとエラスチンなどの共成分の組み合わせ物、間質コラーゲン、コラーゲンタイプＩＩＩ、Ｖ及びＩＸ、糖タンパク質及びプロテオグリカンである。このコラーゲンは天然の材料源または組み換え材料源（すなわち、設計された細胞株により製造された）のものとすることができる。更に好ましくは、この非生存細胞成分はヒト結合組織細胞などの天然の材料源、または組み換え材料源のものとすることができる。ヒト結合組織細胞の例は線維芽細胞と血管平滑筋細胞を含む。更に好ましくは、この線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である。
【００１０】
本発明の別な態様においては、抗癒着性パッチを構築する方法であって、
（ａ）ヒト結合組織細胞を膠原質材料と混合し、
（ｂ）この生成した混合物をマトリックス組織化媒体中でインキュベーションして、細胞を刺激し、コラーゲンゲルマトリックスに適合させ、組織化して、所望の寸法と機械的性質を有する単一細胞組織同等物（ＭＣＴＥ）にコラーゲンゲルマトリックスとし、
（ｃ）この組織同等物を処理して、この細胞を除去し、そして
（ｄ）この処理後この組織同等物中の生細胞が存在しないことを確認する
段階を含んでなる方法が提供される。得られる生成組織同等物を抗癒着性パッチとして使用してもよい。好ましくは、この膠原質材料を酸溶液中に入れ、混合段階の前に最初に４℃で中和する。この酸の例は塩酸溶液である。
【００１１】
好ましい態様においては、このヒト結合組織細胞は、線維芽細胞または血管平滑筋細胞である。更に好ましくは、この線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である。
【００１２】
別な好ましい態様においては、この膠原質材料は、コラーゲンタイプＩまたはコラーゲンタイプＩとエラスチンなどの共成分の組み合わせ物、間質コラーゲン、コラーゲンタイプＩＩＩ、Ｖ及びＩＸ、糖タンパク質及びプロテオグリカンである。この膠原質材料は、天然の材料源または組み換えの材料源のものとすることができる。
【００１３】
更に別な好ましい態様においては、この酸性溶液は塩酸溶液であり、そしてこのマトリックス組織化媒体はウシ胎仔血清を含有するか、あるいは増殖プロモーター、例えば、トランスフェリン、インスリンなどの存在下の線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）及びこれらの混合物からなる群から選ばれる増殖因子の無血清のカクテルである。
【００１４】
更に別な好ましい態様においては、この細胞除去処理は、栄養欠乏、抗生物質処理及び抗有糸分裂剤による処理を含む。抗生物質の代表的な例は、ピューロマイシン、アンホテラシン及びマイトマイシンを含み、そして抗有糸分裂薬の例は５−フルオロウラシルである。
【００１５】
本発明の更に別な態様においては、非癒着性パッチを手術中の組織の表面の一つに取り付ける段階を含んでなる手術手技時に手術を受ける器官と他の組織の間の組織癒着を防止する方法が提供される。この非癒着性パッチは、膠原質材料と少なくとも一つの非生存細胞成分を含んでなり、癒着の形成に参加する。このような抗癒着性パッチは回復時には生体分解型である。手術を受ける組織の代表的な例は心臓である。好ましくは、この抗癒着性パッチは、線維素組織グルーなどの組織グルーまたは別なタイプの取り付け（例えば、Ｎｉｔｉｎｏｌ  Ｃｏｕｐｌｅｒ）を用いて外傷を受けた組織に取り付けられる。
【００１６】
詳細には、このようなパッチの一つの適用は下記のように説明される。特別な溶液を使用して、細胞を殺し、免疫拒絶を開始し、炎症性過程を更に増進し、延期させるすべての可溶な生物材料を流し出す。免疫反応と過度の炎症の開始は望ましくない。このような製品は、無菌、冷蔵、及び湿潤状態に保たれるならば、好ましい保存寿命を有すると考えられる。心膜と心臓中の切開の間に挟むことにより、このパッチは癒着形成が通常起こる臨界的な時間で癒着形成機構の標的となされる。このパッチの溶解時には、癒着が形成される組織修復過程の臨界相は通過し、心膜と心臓は相互に充分分離されている。胸腔を閉じた後に、このパッチの移植の結果として最少の炎症があることが望ましい。この適用は緊急手術のケースに最も好適である。
【００１７】
この抗癒着性パッチを適用するために、インビボ実験の成功の重要な要素は心膜へのＰＡＰの取り付け方法である。縫合それ自身が損傷であるために、この問題を解決する適切な方法は、「線維素グルー」を使用してＰＡＰを心膜にくっつけることによるものである。
【００１８】
次の実施例は本発明の種々の態様を例示する目的で示すものであり、本発明をいかなる方法であれ限定することを意図するものでない。
【００１９】
実施例１
設計された組織ＰＡＰ
このパッチ組織を乳児の皮膚線維芽細胞（または他の組織の線維芽細胞）をほぼ３５０，０００細胞／ｍｌの個体群密度で、またコラーゲンタイプＩをほぼ４ｍｇ／ｍｌの濃度で使用して結合組織同等物として構築する。次に、得られる混合物をインキュベーションする。２つの濃度、すなわち、〜３ｍｇ／ｍｌ及び〜５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンＩのみが市販されている。これらの２つの溶液の混合物が〜４ｍｇ／ｍｌの追加の濃度をもたらすことができる。このコラーゲン含量は初期の密度を、したがって、この構築物の機械的性質をコントロールする。ＰＡＰのサイズと形状は、キャスト用容器のサイズと形状によりコントロールされ、それに対してＰＡＰの厚さは使用コラーゲンの量に依存する。最初に、ＰＡＰを１００ｍｍの組織培養皿中でキャストする。このＰＡＰがこの媒体に適応し、細胞が正常な形態をとったならば、ＰＡＰをこの組織培養皿から注意深く取り外し、媒体を１０−２０％ＦＢＳ、好ましくは高速の組織化には２０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭに変える。所望の機械的性質を持つサイズまでＰＡＰを組織化してもよい。あるいは、独自の被覆方法を使用して、収縮を開始させずに、ＰＡＰをペトリ皿に付着しないようにすることができる。収縮過程は数日を要することが見積もられる。組織化が完了した後、次に、媒体を吸引し、生細胞が存在しないことが顕微鏡検査により示されるまで（これはＤＥ片のニュートラルレッド着色により確認可能である）、ＰＡＰを無菌のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベーションする。ＰＢＳを毎日交換しながらすべての生物学的に活性な分子をマトリックスから除去するまで、インキュベーションを継続する。次に、ＰＡＰを無菌の水中４℃でインキュベーションして、すべてのＰＢＳを洗い出し、その後、必要とされるまでこれを無菌のジップロック袋中４℃で湿潤で貯蔵することができる。
【００２０】
実施例２
細胞の材料源
Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ−Ｂｉｏｗｈｉｔａｋｅｒから生存培養（組織培養フラスコ中）として、あるいは液体窒素（Ｎ２）下で貯蔵した凍結ストック細胞のアンプルとして正常なヒト皮膚線維芽細胞を購入してもよい。氷ペレットがバイアル中で自由に動くようになるまで、この凍結細胞を解凍する。バイアルの内容物を７５ｃｍ２の換気キャップ組織培養フラスコの中にピペットでとる。次に、このフラスコに１０％のＦＢＳを含有する１５ｍｌのＤｕｌｂｅｃｏの変成Ｅａｇｌｅ媒体（ＤＭＥＭ）に添加し、この培養物を３７°と５％のＣＯ２を含有する空気でインキュベーションする。細胞が約８０−９０％の増殖度に増殖するまで媒体を２日ごとに取り替える。次に、線維芽細胞を更に継代して、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中同一条件下で数を増殖する。この細胞を７５ｃｍ２の組織培養フラスコ中の培養物として購入する場合には、フラスコは換気キャップを有さず、空気の空間を設けず媒体により完全に充填される。輸送媒体を除去し、新しい増殖媒体（１５％のＦＢＳを含有する１５ｍｌのＤＭＥＭ）を添加する。培養物が８０−９０％集密になった後、トリプシンを使用し、下記の実施例３に述べるようにこの細胞を継代する。
【００２１】
正常なヒト細胞についての問題は、これらがインビトロで限られた寿命を有するということである。組織の材料源が乳児の包皮である場合にはこのことはさほど明白でないが、異なるドナーからの細胞が遺伝的に依存した差異を有することを主張することができる。この問題への理想的な解決は、同一子孫の無限の供給を確保することができる標準細胞株を有することである。不運なことには、このような細胞は正常でなく、それゆえ組織工学用途においては許容されない。将来は、他のいかなる細胞機能も変更せずに細胞分裂を上方制御する細胞工学技術を利用することが可能である。今までのところ、細胞の中へのヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）の触媒的サブユニットに対するｃＤＮＡの導入がこの達成に近づいている。できれば、ｈＴＥＲＴ活性の変更を伴わない他の方法が使用可能になるであろう。
【００２２】
実施例３
異種移植ＰＡＰ用細胞の収集
環状切除術からの皮膚組織の残りが地方の新生児室または妊婦病棟（ＯＢＧＹＮ）から得られる。２０％のペニシリン／ストレプトマイシンを含有する血清を含まないＤＭＥＭ中に４℃でこの残りを浸漬することにより、最初にこれらを浄化する。次に、皮下脂肪を包皮から除去し、ＤＭＥＭ中のペニシリン／ストレプトマイシンの濃度が１０％であることを除いて同一の媒体を用いて浄化を繰り返す。次に、この皮膚試料をディスパーゼ（１０単位／ｍｌ）中４℃で４８時間インキュベーションする。その後、表皮を真皮から容易に引っ張り、剥がし、そして除去することができる。この真皮をＰＢＳ中で数回すすぎ、次に極めて小さい片（２−３ｍｍ）に切断し、これを７５ｃｍ２の換気キャップ組織培養フラスコの内表面に置く。インキュベーター（５％ＣＯ２と９８％湿度）中で３７℃で１０−２０分間インキュベーションすることにより、この片をフラスコに付着させた。その後、１０％のＦＢＳ（１０ｍｌ）を含有するＤＭＥＭをこのフラスコに添加する。皮膚組織片がこのフラスコに付着した状態に存在することが重要である。約５−１０日のインキュベーションと媒体の規則的な注意深い交換の後、この細胞は外植された組織から充分に増殖し、このフラスコで増殖し始める。この時点で、組織片を注意深く取り除き、フラスコ中の細胞個体群が９０％集密となるまで媒体を２日に一度規則的に交換しながら、培養を継続する。次に、媒体をフラスコから取り除き、そしてこの細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（５ｍｌ）を用いて剥離（「持ち上げる」）する。トリプシンインヒビター（２×使用トリプシン／ＥＤＴＡの容積）による処理の後、血球計を用いて細胞を計数し、遠心分離にかけ、上澄みを除去し、そしてペレットを新鮮なＤＭＥＭ（１０％のＦＢＳと共に）中に再懸濁し、そしていくつかの１５０ｃｍ組織培養フラスコの中に蒔く（分割比は使用細胞の元の数に依存し、普通１：４と１：８の間である）。その後、細胞を通常の基準で増殖させ、過剰凍結し、そして液体窒素中で貯蔵してもよい。必要数をＰＡＰ構築で使用する。
【００２３】
実施例４
同種移植ＰＡＰ用細胞の収集
この適用のためには、選択的手術に決める患者はこの細胞を同種移植ＰＡＰの中に組み込むことができるように、自身の細胞を収集し、培養して、細胞数を増殖するために、皮膚パンチ生検（ｐｕｎｃｈ  ｂｉｏｐｓｉｅｓ）を提供しなければならない。このパンチ生検を行なう解剖学的位置は露出されず、患者に美的に許容できる部位であるように普通選ばれる。これらは普通前腕または上腕の内側である。この皮膚を清浄にし、殺菌し、そして局所麻酔薬を投与する。次に、全厚６ｍｍのパンチ生検を行い、創傷を１針または２針で閉じる。この皮膚試料を無菌に保ち、乳児の包皮試料について実施例３で述べたものと類似の方法で処理する。皮膚線維芽細胞を同一方法で得る。充分な細胞数を得たならば、このＰＡＰを構築することができ、手術の準備を始めてもよい。
【００２４】
実施例５
異種移植／同種移植用の設計されたＰＡＰ
このＰＡＰを無細胞ＰＡＰについて実施例３で述べたのと全く同一の方法で作製した。この組織の収縮を開始する段階を省略し、実施例３で述べたようなＨａｍのＦ１２媒体を用いて培養を継続した。５−１０日間（好ましくは、１０日間）培養した後、このＰＡＰは使用準備ができた。実施例３で述べた成分細胞を殺す段階も省略した。
【００２５】
この皮膚線維芽細胞は、収縮し、コラーゲンマトリックスを再組織化するが、活性化されて、創傷治癒過程に参加するこれらの細胞の分化した表現型である。コラーゲンタイプＩが主要成分である細胞外マトリックスの組織化は、創傷を閉じるのに設計された創傷治癒の必要な相である。しかしながら、この過程を、コントロールし、血管化と生体分解には密で、困難であり過ぎる傷跡組織を形成するほど過剰としないことが必須である。この仕事を達成するためには、この線維芽細胞は、アルファ平滑筋アクチンなどの細胞骨格タンパク質の発現により特徴付けられる筋線維芽細胞にこの表現型を変える。事実、この筋線維芽細胞は、生理学的機能が定常的な収縮、弛緩を必要とする平滑筋細胞などの筋肉組織関連細胞の性質を取り入れる。コラーゲンマトリックスを収縮させることができ、事実、収縮させているもう一つの細胞タイプは、血管壁の主要細胞成分の血管平滑筋細胞である。それゆえ、これらもコラーゲンゲルを再組織化し、増殖し、これらが組み込まれている組織の機械的性質を改善するために、これらの細胞を皮膚線維芽細胞のようにＰＡＰの構築に有利に使用してもよい。しかしながら、血管平滑筋細胞機能のメディエーターは血管収縮性を持つ物質を含む。更には、ＰＡＰの無細胞あるいは異種移植の方法においてのみこの血管平滑筋細胞を使用することができる。
【００２６】
実施例６
血管平滑筋細胞の収集
ヒト病原体（肝炎Ｂ／Ｃ、ＨＳＶ、ＨＩＶ、梅毒）を持たないドナーの帝王切開出産からヒト臍帯組織を得た。この臍帯を取り扱える長さ（好ましくは１０ｃｍ）に切断し、臍動脈を無菌条件下で周囲の結合組織からの切開により分離した。この動脈の長さを一端で結び（無菌ナイロン糸）、平滑末端の針と注射器（１０ｍｌ）を用いて、２０％のペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２媒体で充填し、次に完全に封じた。２０％のペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２媒体中４℃で２０分間インキュベーションした後、この動脈片の内側と外側で１０％のペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＨａｍのＦ１２媒体を用いて、浄化過程を３０分間繰り返した。次に、この動脈の内側と外側を無菌のＰＢＳによりリンスし、トリプシン／ＥＤＴＡ（０．０５％／５３ｍＭ，Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で充填し、そして上述のプロトコルを用いて無菌条件下３７℃で１時間インキュベーションした。内皮細胞を含有する溶液を動脈片から搾り出し、この過程をリプシン／ＥＤＴＡの新鮮な溶液で３回繰り返した。このプロトコルはこの血管平滑筋細胞が内皮細胞により汚染されていないことを確実にする。トリプシン／ＥＤＴＡを用いた５回、６回、及び７回目の洗浄に対して、インキュベーション時間を２時間まで増加させる。これらの３回の洗浄をトリプシンインヒビターの処理と組み合わせ、５，０００ｒｐｍで３−５分間遠心分離することにより、臍動脈平滑筋細胞（ＵＡＳＭＣ）をペレットとして分離した。この細胞をＳｍＧＭ２規定の媒体（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ−Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で再懸濁し、計数（血球計）し、そして２５ｃｍ２ＴＣフラスコの中に蒔いた。この細胞を一夜付着させ、２４時間後の媒体交換時に非付着細胞（「浮くもの」）を除去した。これらの細胞は何回かの継代後極めて高い有糸分裂能力と老化を有するために、この培養物を８０％集密まで増殖させ、高播種密度で継代した。これらの細胞の培養のために、市販の調合よりも極めて優れた媒体を開発した。
【００２７】
実施例７
コラーゲンの材料源
いくつかの材料源からのコラーゲンが組織同等物−組織工学の最終結果を構築するために使用されてきた。研究用途、特に初期の研究では工場内で抽出したラット尾コラーゲンタイプＩに遭遇した。子牛皮膚またはウシの腱が酢酸（Ｃｏｈｅｓｉｏｎ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｖｉｔｒｏｇｅｎａ，塩酸中３％）中の無菌の粘稠な酸性溶液（ＩＣＮ  Ｃｅｌｌａｇｅｎａ  ３％または５％，ｐＨ３．０）あるいは粉末（Ｓｉｇｍａ）として供給されている。ヨーロッパの材料源（ＣｅｌｌｏｎＳ．Ａ．，Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、Ｃｅｌｌｏｎａ、塩酸中３％溶液，ｐＨ２．０）からのコラーゲンタイプＩ溶液も使用された。コラーゲンタイプＩの予め作製した溶液を使用する難点は、このパッチのコラーゲン含量に関して柔軟性が制約されているということである。利点は酸性であるので、低ｐＨが広範囲の微生物（特に、ビールス）を排除するということである。コラーゲンの可溶化が困難であり、研究所設備での生成溶液の無菌化が時間をとり、そして微生物の排除の成功が不確かであるために、酸性溶液の使用が好ましい。
【００２８】
最初に、Ｃｅｌｌａｇｅｎ  ＡＣ３、Ｃｅｌｌｏｎ、またはＶｉｔｒｏｇｅｎ（すべて３ｍｇ／ｍｌのコラーゲンタイプＩを含有）をＣｅｌｌａｇｅｎ  ＡＣ５（酢酸中ｐＨ３．０で５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンタイプＩを含有）と充分に混合することにより、このＰＡＰ構築用にコラーゲンタイプＩ溶液を作製してもよい。好ましい比は、４ｍｇ／ｍｌのコラーゲンタイプＩを含有する溶液を提供する、ＡＣ３とＡＣ５の１：１混合物である。この溶液（８部）にＨａｍのＦ１２媒体（１０×，１部）を添加し、充分な混合の後、この混合物を４℃（氷上で）で再構成緩衝液（ＮａＨＣＯ３ＮａＯＨ、１部）により中和した。必要な場合には０．１ＭＮａＯＨの注意深い添加によりこのｐＨを７．４に更に調整し、使用まで４℃に保つ必要がある。この中和された溶液を室温まで温めると、ロスなしに容易に逆転することができない一方向の過程である、ゲルを形成する。
【００２９】
コラーゲンを生医学用途に考慮する場合にしばしば取り上げられる問題は、移植コラーゲンに対するヒトの免疫学的反応である。コラーゲンは、種にわたってよく保存されたアミノ酸配列を持つ哺乳動物における最も遍在的なタンパク質である。それゆえ、純粋な形では、これは免疫応答を引き起こしてはならない。抽出と精製の方法が不適切である場合にしばしば問題が起こる。このように、この材料源組織中に通常存在する免疫学的活性体は、コラーゲンの高分子構造内に捕捉された状態になり、次に、人体の中に導入される場合に抗体として提供される。ヒト組織からヒトコラーゲンを抽出するポイントまたはチャンスが極めて少ないので、理想的には、使用されるべき材料はヒト組み換えコラーゲンである。しかしながら、コラーゲン合成に関する以前の議論から結論されるように、細胞レベルではこの過程は極めて複雑であり、いくつかの細胞内及び細胞外の段階を伴う。いまのところ、発酵過程が他の組換えタンパクとペプチドを生産できる方法で細胞工学によりコラーゲンを生成させる分子生物学的アプローチは、成功していない。Ｆｉｂｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により開示された組み換え製品は架橋されていず、この抽出材料を近似するように再製造されなければならない。この現在の価格は、実験室規模の目的のためであっても極めて高く、製造規模は非実用的である。
【００３０】
あるいは、このパッチを構築するために、エラスチン、コラーゲンタイプＩＩＩ、及びグルコサアミノグリカン（ＧＡＧ）（例えば、ケラチン硫酸塩、コンドロイチン硫酸塩など）などの他の高分子もコラーゲンタイプＩと共に共成分としてこのマトリックス中に含まれる。
【００３１】
実施例８
無細胞パッチ中でのマトリックスの組織化
細胞外の空間へのコラーゲン堆積は複雑な過程である。これは翻訳後にグリコシル化され、三重のらせん状可溶プロ−コラーゲンの鎖間架橋と形成のためにプロリル残基を作るプロリルヒドロキシラーゼにより作用を受ける可溶の単鎖の合成で始まる。このプロコラーゲンは、リーダーペプチドと共に細胞から押し出され、これから三重のらせん状の「ロッド」が割裂され、放出される。これらのロッドは長手方向の端と端をつなぐ会合により集合し、そしてまた細胞外リシリルオキシダーゼにより酸化されたリシル残基も有し、架橋による更なる横方向の集合を作る。原線維発生と呼ばれるこの過程は、生理的ｐＨと温度下で不溶である原線維を形成する。結合組織に機械的完全性を与えるのは、原線維といくつかのサイズに繊維へのコラーゲンタイプＩの細胞外組織化である。これらのコラーゲン原線維と繊維は不溶であり、細胞の周りに堆積（沈殿）する。コラーゲン合成のある既知のスチミュレーターが存在し、通常のものは酸素、アスコルビン酸（ビタミンＣ）及びグリコール酸である。培養媒体に添加すると、これらはコラーゲン合成を刺激する。このパッチの培養に使用する媒体の中にアスコルビン酸塩を組み入れる。このパッチを高血清条件中で培養することはリシリルオキシダーゼの生産と活性を刺激すると予期される。
【００３２】
あるいは、特異的（リシリルオキシダーゼ活性）あるいは非特異的（ワサビペルオキシダーゼ，ＨＲＰ）な酸化酵素またはコラーゲンの架橋を開始し、この方法で構築されたＰＡＰの機械的性質を改善する他の任意の架橋剤の添加または方法により、このパッチの機械的完全性を細胞の非存在下で生じさせてもよい。
【００３３】
実施例９
線維芽細胞によるＰＡＰのマトリックス組織化の機構
インテグリンと呼ばれる細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に細胞表面受容体を使用して、線維芽細胞はコラーゲンの特異領域（例えば、アミノ酸配列ＲＧＤ）に付着し、そしてＥＣＭを更に組織化することができる。線維芽細胞は合成と分解によりコラーゲン濃度を調整する。コラーゲン欠乏（例えば、損傷後）に直面すると、線維芽細胞はコラーゲンを合成する。コラーゲンが過剰生産される（線維症）と、線維芽細胞はコラゲナーゼを合成し、分泌することによりそれを分解する。この調整過程は組織止血の正常な部分として低レベルで作動するが、組織維持は創傷治癒／組織修復時に特に向上し、傷跡の溶解の主な機構である（組織再構築）。組織再構築がこのパッチの生体分解の基本である。
【００３４】
それゆえ、このパッチの構築の場合のように、線維芽細胞をコラーゲンタイプＩマトリックスの中に組み入れる場合には、この初期の培養期間は、この過程中にもたらされるコラーゲンへの線維芽細胞の付着（インテグリンによる）を促進する。マトリックス組織化の第２相時には、この線維芽細胞は刺激されて、ａ）新しいコラーゲンを合成し、それを細胞外の空間に分泌し、ｂ）リシリルオキシダーゼを分泌することにより、新しく合成されたコラーゲンの集合（原線維形成）と組織化を更に引き起こし、そしてｃ）この過程中にもたらされるコラーゲンを組織化するのと同一の方法で作用する。線維芽細胞は、また、マトリックスの中をランダムに動き、再配列して、この過程中のコラーゲン上に付着し、機械的に引っ張り、そしてこのパッチの完全性を生じる。このパッチを作製するのに使用されるこの培養過程は、それゆえ、多面的なメリットがある。
【００３５】
マトリックス組織化の過程は、創傷治癒／組織修復時の一時的なマトリックスの形成と再構築に類似する。適切なシグナル形質導入経路をコントロールする必要なリガンド（例えば、増殖因子とケモカイン）の主要な材料源は血清である。しかしながら、これらの成分に関する血清組成は変りやすいので、ウシ血清はある環境下で使用するのに望ましい材料でない。そこで、無血清規定の媒体が必要であることもある。これらは、普通、線維芽細胞増殖因子（ベーシックあるいは２）（ＦＧＦ２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）及びトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）などの増殖因子のカクテルをトランスフェリン、インスリンなどの増殖プロモーターの普通の補助剤（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）の存在下で代わりに使用する。これらの増殖因子は今では組み換え技術を用いてヒトｃＤＮＡ配列から生産される。この細胞を数の点で増殖するか、あるいはコラーゲンマトリックス内で培養する場合には、無血清媒体を培養物の単層で使用することができる。細胞増殖と維持のすべての方法は単層として保護される必要があり、コラーゲンマトリックスの中に導入する場合、３次元の培養物となる。
【００３６】
実施例１０
パッチの構築
このパッチの構築時にはいくつかの変数が存在する。第１に、コラーゲン濃度は市販されていることにより３、４または５ｍｇ／ｍｌとすることができる。コラーゲン濃度が高いほど、この「パッチ」の機械的性質は良好である。すなわち、一部の強度は組織の密度の増加に由来する。しかしながら、組織は密であるほど、傷跡により類似し、崩壊し、生体吸着するのに時間がかかる。
【００３７】
コントロールすることができる第２の変数は、コラーゲンマトリックスの中に接種される細胞数である。細胞はコラーゲンマトリックスを組織化するので、細胞数が高いほど、このマトリックスはより良好にかつ急速に組織化される。これまでに使用された最大細胞数は、このコラーゲン溶液の５００，０００細胞／ｍｌである。これがこのパッチ構築で使用される細胞密度である。
【００３８】
第３の変数は、非収縮性条件下でのこのパッチの培養における時間である。このパッチが培養物中に長く存在するほど、成分細胞（線維芽細胞）によるこのコラーゲンマトリックスの組織化の拡がりにより強くなる。
【００３９】
そして、第４の変数は、マトリックス組織化条件下での培養である。この過程のいくつかの特異的な開始剤（例えば、トロンビン，高カルシウム，ＴＧＦβ）を使用して、マトリックス縮合過程をコントロールしてもよい。あるいは、このパッチの性質に対する基準を落とさない前提で、コラーゲン溶液と人工の生体適合型（及び生体分解型）ポリマーの間の組み合わせをこの目的に使用してもよい。
【００４０】
このパッチを構築するために、表皮を除いた乳児包皮外植物からの細胞を増殖させることにより、正常な皮膚線維芽細胞を得た。若い継代における細胞をトリプシン化により収集し、３次元マトリックス（結合組織同等物）の構築に使用した。線維芽細胞（好ましくは、３００−３６０，０００細胞／ｍｌ）を添加し、冷たい（４℃）中和した（ｐＨ７．４）コラーゲンタイプＩ溶液（２０ｍｌ，３．０ｍｇ／ｍｌ）の中に充分に分散した。一定量の生成混合物を１００ｍｍの組織培養皿に中に注ぎ、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションすることによりゲル化させた。５−１２時間の平衡化の後、この培養物を５％のＦＢＳ、アスコルビン酸塩とα−ケトグルタル酸塩（またはグリコール酸、または他のコラーゲン合成賦活剤）及び媒体（５％またはＦＢＳの適応を支えるＣｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＦＧＭ，Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＦＧＭなどの任意の規定された媒体を含有するＨａｍのＦ１２）を含有するＨａｍのＦ−１２の２０ｍｌの媒体をその後１週間４８時間ごとに変えた。この期間の終わりに、このパッチを平らなスパチュラを用いて皿の壁と床から分離した。
【００４１】
実施例１１
パッチ中でのマトリックス再組織化
この媒体をＤＭＥＭ（２０％までのＦＢＳを含有するか、あるいはＴＧＦβ、リゾホスファチド酸（ＬＰＡ）、ＰＤＧＦ、トロンビン、高カルシウムなどを含有する他の定義されたいかなる媒体も使用）に変えることにより、心臓の上に置いた場合に血管構造を見えるようにするある程度の半透明性を保持しながら、この細胞をコラーゲンゲルを時間依存的な方法で組織様マトリックスに再組織化するように誘導した。媒体を２日ごとに変え、このパッチの直径と厚さを毎日モニターすることにより（図３Ａ及び４Ａを参照）、コントロールされた組織を組織化するこの過程を継続した。ほぼ１０日の培養後、このマトリックスの機械的性質を適切とみなしたが、このパッチは実質的な半透明性をなお保持していた。
【００４２】
取り扱いと取り付けの容易さに寄与する機械的性質を改善するのに加えて、このパッチの半透明性を維持することも望ましい。これは、外科医がこのパッチにより被覆されている血管構造を容易に識別することができなければならないためである。このパッチが吸収される前に再び開く必要性と心臓血管を手術する必要性が存在するならば、このことは重要である。外科医はパッチを切り進むだけで、その下の血管にアクセスすることができる。他のＥＣＭ高分子を第２及び第３世代のパッチに組み込むことにより、機械的な完全性（縫合を受ける能力）を更に進歩させてもよい。
【００４３】
実施例１２
パッチからの細胞成分の除去
このパッチがその厚さを保持しながら初期サイズの約６０％に達したならば、媒体を除去し、ＰＢＳ（１×，２０ｍｌ）を添加し、そして引き続いてこのパッチを４℃に維持した。１−２週間２−３日ごとにＰＢＳを変え、次に、ＰＢＳを除去し、無菌の水（２０ｍｌ）を添加した。無菌の水を何度か交換した後、使用するまでこのパッチを４℃で湿潤状態に維持した。すべての操作を無菌の試薬を用いて無菌条件下で行なった。細胞成分が存在しないことを生細胞に対するニュートラルレッド標識と光学顕微鏡により確認した。
【００４４】
他の方法を使用して、この細胞を殺すことができる。これらは、哺乳動物の細胞に対して毒である普通の抗生物質（例えば、ピューロマイシン、アンフォテラシン、マイトマイシンなど）並びに微生物、または５−フルオロウラシル（古い世代の抗がん剤である）などの抗有糸分裂薬のレベル、及び浸透圧変化（高ないし低浸透圧溶液）を含む。使用が容易であるために栄養欠乏が好ましい。方法が何であれ、最初に媒体に対して、次に細胞を殺す溶液に対して洗い流し期間が存在する。
【００４５】
選択手術の場合には、患者自身の細胞を用いてこのパッチを構築し、組織化することができる。これらの線維芽細胞を６ｍｍの皮膚パンチ生検から極めて単純に得ることができ、いくつかのパッチに対して充分な数まで増殖させることができる。一つのパッチは、現状でほぼ７百万個の細胞（一つの集密な１５０ｃｍ２ＴＣフラスコ）を使用する。公式化可能であるが、未だ行なわれていないアプローチは、将来これらを必要とする場合の個人に対して組織と細胞を培養し、保存することである。
【００４６】
また、このパッチを使用して、外科外傷の結果として中皮細胞を除去した領域にこれらを送達することもできる。一つの可能性はヒト羊膜である。しかしながら、この材料はヒト病原体による汚染のリスクを大きく増大させるために極めて望ましいものではない。
【００４７】
実施例１３
パッチの移植
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＵＰＣ）により承認された実験プロトコルを用いて、「鼓動している心臓手術」のイヌ科のモデル（２０−２５ｋｇの重量の雑種の成犬）でＰＡＰの効能を評価した。第１のシリーズの実験においては、左開胸術の後、Ｆｉｂｒｉｎ  Ｓｅａｌａｎｔ（ＨａｅｍａｃｕｒｅＣｏｒｐ．，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＩ）を用いてこのパッチを心外膜に取り付け、心膜を開いた状態とした。第２のシリーズの実験においては、乳動脈吻合を行い、２つのＰＡＰを使用した。一つを心外膜に取り付け、もう一つを閉じた心膜に取り付けた。Ｎｉｔｉｎｏｌ  Ｃｏｕｐｌｅｒ（Ｃｏａｌｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて、この取り付けを行なった。
【００４８】
実施例１４
手術の方法
イヌ科のモデルを用いた実験をＧｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ（ＮＩＨ８５−２３，１９９６改訂）とＩＡＵＰＣ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｔｅｘａｓ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｔ  Ｆｏｒｔ  Ｗｏｒｔｈによる承認に従って行なった。各実験においては、ペントバルビタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ体重）を用いて、雑種のイヌ（２０−２５ｋｇ，オスまたはメス）に麻酔をかけた。補助的なペントバルビタールナトリウムとフェンタニル（１０μｇ／ｋｇ体重）を必要に応じて投与して、麻酔の手術面を維持した。このイヌを気管切開術により挿管し、Ｈａｒｗａｒｄ人工呼吸器により部屋の空気を通気した。動脈の血液を頻繁に試料に採取し、ＰＯ２、ＰＣＯ２、及びｐＨについて分析した。通気を調節して、これらの変数をそれぞれ１００−１４０ｍｍＨｇ、３５−４５ｍｍＨｇ、及び７．３５−７．４５の限界内に維持した。重炭酸ナトリウムを投与して、ＰＣＯ２が正常な限界内である場合には正常な動脈のｐＨを維持した。体温を直腸温度計により測定し、水循環加熱パッドにより３６−３７℃に維持した。第５肋間の空間中の左開胸術により心筋層を露出させた。切開を心膜中で行い、心膜の内表面と心外膜（心臓の表面）の一部をガーゼ（ｇａｕｓｅ）により擦り、この抗癒着性パッチを心外膜にかぶせて置いて、切開を覆った。所定の場所に保つために、線維素「ｔｉｓｓｕｅ  ｇｌｕｅ」（Ｆｉｂｒｉｎ  Ｓｅａｌａｎｔ，Ｈａｅｍａｃｕｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＩ）を用いて、このパッチを縁でグルー止めした。次に、この動物を閉じ、麻酔から戻し、回復室に帰し、そして胸管を取り外した。手術時間は２．５−３．０時間であった。このイヌを拒絶（温度、血液中のリンパ球数）についてモニターして、強い炎症反応または拒絶反応がなかったことを確認した。イヌは回復時あるいはそれ以後投薬を必要としなかった。
【００４９】
特定の期間（６ケ月）後、上述のように準備したイヌを麻酔にかけ、第５肋間の空間中の左開胸術を行なった。コントロール領域中に癒着が存在するか、あるいはしないかを評価し、写真で記録した。
【００５０】
もう一つの手術法もイヌで行なって、冠状動脈バイパス移植を模倣した。麻酔と上述のような左開胸術の後、それを取り付けていない胸腔の領域中で左内胸動脈（ＬＩＭＡ）を分離した。ＬＩＭＡの１０−１５ｍｍの切片をくくり、取り出して、この実験において後で模倣の「グラフト」として使用した。
【００５１】
心膜の「穴」を近位の外側前下行冠状動脈（ＬＡＤ）にかぶる開口と共に作成し、ＬＡＤの小領域（長さ３−５ｍｍ）をこの動脈にわたって直ちに擦ることにより露出した。次に、ＬＩＭＡグラフトを擦ったＬＡＤにわたって縫合（６．０プロリン縫合糸を用いて）して、ＬＩＭＡ−ＬＡＤ吻合を模倣した。このＬＩＭＡグラフトの他端を心膜から取り出し、固定して、ＬＩＭＡグラフトの末端を自由な状態（取り付けず）とし、そして心膜の外側に配置した。１−２ｃｍの切込みをこのパッチ中に作り、そしてこの切込みがこの吻合を収容するような方法でこのパッチを心臓の上に配置した。また、このパッチの一方の部分がＬＩＭＡの下にあり、もう一方の部分がそれを覆った。このパッチを線維素組織グルーにより心外膜に取り付け、縫合し、そしてグルー止めするか、あるいはＮｉｔｉｎｏｌ  Ｃｏｕｐｌｅｒｓ（Ｃｏａｌｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いて所定の位置に保持することができた。Ｎｉｔｉｎｏｌ  Ｃｏｕｐｌｅｒｓの使用が好ましい。この心膜の「穴」の縁を３−４ｍｍの開口を残す３つの縫合により近似した。次に、第２のパッチを心膜の開口の頂部に配置し、また、Ｎｉｔｉｎｏｌ  Ｃｏｕｐｌｅｒｓを用いて心膜にも固定した。次に、このイヌを閉じ、回復後、手術後の回復から解放した。
【００５２】
実施例１５
実験の終結
心膜癒着の形成の防止におけるこのパッチの効能と溶解時間を観察するために、この実験用のイヌを同一の準備方法、麻酔及び開胸にかけた。初期の手術時に外傷を受けた領域を癒着形成について試験し、Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｓｃｏｒｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ，１９９４；６２：９８４）に従って得点付けした。最良のカテゴリーは癒着なしであり、次はこの癒着表面の間に手袋をはめた指を通すことにより分離される膜状の癒着の存在であり、そして最悪のクラスは鋭利な器具（小刀）を用いる分離を必要とするものである。これらの観察を写真で記録した（デジタルカメラ）。次に、この動物を処方したプロトコルに従って安楽死させた。
【００５３】
実施例１６
パッチ構築実験
予備実験の後、実施例１４で述べた方法を用いて１２のバッチにおいてこのパッチを構築した。図１Ａ及び１Ｂは細胞によるこのマトリックスの組織化の統計的な均一性を示す。図２Ａ及び２Ｂはこのマトリックスの組織化後に細胞を殺した前後におけるこのパッチの組織の比較を示す。これらの図の細胞をヘマトキシンとエオシンで染色した。細胞内ｐＨ指示薬であるニュートラルレッド染色も使用して、この細胞が生きているか、死んでいるかを示した。図３Ａ及び４Ａはマトリックス組織化条件の開発に使用されるミニパッチの直径（厚さでなく）の変化を示す。この概念は図３Ｂ及び４Ｂで棒グラフとして更に示される。洗い出し期間時、無菌のＰＢＳを使用して、殺された細胞の残りと媒体を除去し、その後、無菌の水を使用して、ＰＢＳを除去することはこの過程中の簡単な段階であるが、無菌の溶液と厳格な無菌の技術を使用しないと潜在的に汚染源となり得る。また、液を吸引する場合にはこのパッチの機械的完全性をこわさないように注意をすべきである。このパッチは取り扱いが容易で、冠状脈管構造が目視可能であるように充分半透明でなければならない（図５Ａ，５Ｂ，６Ａ及び６Ｂを参照）。
【００５４】
実施例１７
抗癒着性実験
心外膜は中皮細胞層により被覆されていないので、それを擦って、癒着形成を刺激するか、あるいは刺激しなくとも、すべての実験においてこのパッチは心外膜に癒着した。それゆえ、外傷を受けた場合には、胸腔中の他の表面はすべて癒着形成の主な開始源である。
【００５５】
心膜を開いた状態にした３頭のイヌを用いた第１のシリーズの実験で上記のことを示した。このシリーズは、また、このパッチの溶解時間が３ケ月以上であることも確認した。２及び３ケ月で終結した実験はパッチ配置部位に位置する心膜上の乳白色の膜をなお示した。また、２ケ月から微小脈管構造が見られたので、このパッチは血管形成（血管新生）の標的であることも明白であった。血管系がマクロファージとリンパ球を移植部位に運ぶことによりこのパッチの溶解に寄与するので、このことはメリットであると考えられた。
【００５６】
５及び６ケ月で終結された第２のシリーズの３頭のイヌにおいては、心膜の裏面を横隔神経のいずれかの側で擦った。背側がコントロールであり、そして腹側が試験領域であり、このパッチが心外膜と心膜の間に介在する。このシリーズにおいては心膜も閉じなかった。３つのケースのすべてにおいて、非保護側（背側）には強い癒着（等級３−４）があり（図７Ｄを参照）、保護側（腹側）には癒着がなかった（図７Ｂを参照）。一つのケースでこのパッチが元の配置位置から動いて、外れた場合でも、このことは成り立った。また、このパッチが５−６ケ月でより完全に生体吸収されたこともこのシリーズの実験から明白であった（図７Ａを参照）。もう一つのケースにおいては、弱い癒着形成（等級０．５−１）がこのパッチにより保護されていない領域で起こった（図７Ｃを参照）。
【００５７】
第３のシリーズの実験においては、５頭のイヌに左内胸動脈（ＬＩＭＡ）吻合を施した（図８Ａ−８Ｅ及び９Ａ−９Ｅを参照）。これは、ヒト患者に現在使用される実際のバイパス法の模倣である。この方法においては、２つのパッチを各実験で使用した。一つのパッチを心外膜に取り付け、吻合と心臓の間、及び吻合と心膜の間に介在させた。第２のパッチを取り付け、心膜中の閉鎖スリットを被覆した。いまのところ、これらのイヌの２頭を終結させたが、このパッチまたはいかなる癒着の証拠も存在しなかった。これらのイヌは後まで研究に残される。
【００５８】
全体の結果はＰＡＰが癒着を防止することを示す。２つの異なる方法を使用した８つのインビトロの実験において、１２．５％のケースは等級１の癒着（手袋を付けた指を１回パスさせることにより分離することができる）を有し、残りの８７．５％が全く癒着を示さなかった。すべてのケースにおいて、初期、実験の中間段階、及びこのパッチが吸収された時にも確かに冠状脈管構造は目視可能であった。１６の実験において、死亡、または炎症性あるいは拒否反応はなかった。いかなる心臓学的な出来事もなかった。
【００５９】
この動物の１頭を液の引き抜きと検査のために挿管した。イヌ科のリンパ球あるいはマクロファージ上の表面抗原の抗体は市販されていない。マクロファージ、リンパ球及びＴ細胞のマウス抗体を用いて、胸腔中の液（ｅｘｈｕｄａｔｅ）をフローサイトメトリーにより評価した。これによって、第１週においては、手術後のマクロファージとリンパ球が存在する唯一の炎症性細胞であり（Ｔ細胞は存在しなかった）、正常な外傷後の炎症を示すことが示された。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣ）の承認を得て、この実験の終結の３週前に別なイヌに追加のパッチを皮下に移植した。この原理的説明はこのＰＡＰの成分への免疫原応答が存在するならば、この動物がＬＩＭＡ法で使用される２つのパッチにより感作され、そして追加の移植が大きくはなくとも著しい免疫反応を顕在化させるということである。２週間免疫応答はなかった。この実験をＬＩＭＡ研究中の残りの２頭のイヌについて繰り返す。２頭の追加の動物を同一方法で処理する。
【００６０】
研究中のこの３頭のイヌも癒着を示さないと考えられる。それゆえ、原理の証拠が本発明に対して明示されたことを主張する。癒着防止のこの方法の効能と安全性は他の解剖学的位置に好適であり、更なる臨床評価を受けることになる。
【００６１】
実施例１８
要約と議論
上記の実験によって、パッチは外傷を受け、癒着形成に参加する表面の一つに取り付けた場合に、最もよく機能することが示される。ある位置においては、一方の表面への取り付けは他方におけるよりも重要かもしれない。この目的には、線維素組織グルー、他のタイプの生体接着剤または代替のＦＤＡ承認の取り付け方法が好適である。Ｎｉｔｉｎｏｌ  Ｃｏｕｐｌｅｒｓは生物学的に不活性であり、新しいＦＤＡ承認の技術に基づいている。これは使用が容易で、効果的で、そして心外膜などの敏感な表面上でも安全である。しかしながら、これはすべての解剖学的位置（例えば、脳）に好適でないかもしれない。
【００６２】
このパッチはインビボモデルの胸腔中で評価されただけであるが、その解剖学的位置に対する取り付けの方法が確立されるという前提ならば、作用と分離の機構が包括的であるので、多数の解剖学的位置において同等の効率で利用可能であろう。例えば、外傷を受けた表面の一つへの取り付けを行なうことができるという前提ならば、物理的形状によって、このパッチはオルソスコープ及び腹腔鏡法に好適なものとなる。このように、このパッチをそれ自身付着せずに巻いて管状構造とし、潤滑したオルソスコープ及び腹腔鏡から送達してもよいであろう。ここで、抗癒着性障壁（例えば、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍａ）はこのタイプの方法で使用するには接着性があり過ぎる。
【００６３】
加えて、本発明で開示されたパッチは湿潤、無菌及び冷凍貯蔵が容易である。このパッチをつまみ上げ、大多数の方法で使用される手術器具で手術することが容易である。
討論：本発明のアプローチは２つのパラダイムシフトに基づく。このうち第１のものは、不活性な迅速に分離する障壁の確立された戦略を離れて癒着形成の防止の機構に能動的に参加するゆっくりと吸収される障壁を生成する戦略に移行したことである。第２のパラダイムシフトは、心外膜への抗癒着性障壁の取り付けが異物反応を引き起こすことはないということである。
【００６４】
本発明のパッチは線維素でなく、膠原質（ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ）ベースの内部傷跡組織であるように設計されている。このパッチの密度は細胞浸潤を受けやすく、種々の細胞に対する足場となり得るようなものである。例えば、これは血管を新生させ、手術後早期（４−８週）に手術部位を検査すると微小血管がこのパッチ中に観察される。血管新生はこのパッチをマクロファージとリンパ球に接近させるために、このパッチの生体分解を助ける。マクロファージはコラゲナーゼを分泌するので、このパッチの生体分解の機構において主要な役割を果たすものとして関与する。両方の細胞タイプは、創傷治癒過程の炎症性の相とマトリックス溶解のゆっくりとした過程である組織再構築を支える。このパッチは膠原質であるので、その溶解は線維素溶解活性と分泌性中皮の存在に依存しない。このパッチの膠原質マトリックスは血液により悪影響を受けない。それゆえ、細部までいきとどいた止血を確立する必要性は存在しない。
【００６５】
心外膜は中皮により被覆されていないので、このパッチを取り付ける場合には、この内表面にのみ癒着する。心外膜にこのパッチを取り付けた結果としてインビトロ実験のいずれにも異物反応はなかった。更に、このパッチの密度によって、初期の半透明性が保持されるために、心臓の脈管構造がこのパッチにより不鮮明になることはない。
【００６６】
本発明は、その形のいくつかで示されたが、このように限定されたものでなく、この精神から逸脱せずに種々の変更と改変を受ける。
【図面の簡単な説明】
本発明の上述の特徴、利点及び目的、並びに明らかになるであろうその他を詳細に得、理解することができるからには、添付の図面に図示される本発明のしかるべき態様を参照することにより、上記に短く要約された本発明の更に特別な説明を得るかもしれない。これらの図面はこの明細書の一部を形成する。しかしながら、添付の図面は本発明の好ましい態様を図示するものであって、それゆえ本発明の範囲を限定するものと考えられるべきでないことを特記すべきである。
【図１Ａ】
図１Ａは３次元のコラーゲンタイプＩ環境への細胞（線維芽細胞）の初期適応後のプロトタイプパッチを示す。これは、この実験の開始後４８時間の時点（２４−９６時間間隔における好ましい時間であり、その間に媒体を２４時間ごと、好ましくは１２時間ごとに変える）におけるものである。マトリックスの中への媒体の拡散によるこのパッチの着色は、媒体中に存在するｐＨ指示薬により生じる。このパッチはかなり半透明であることが特記される。
【図１Ｂ】
図１Ｂは１２日続いたマトリックス再組織化過程とリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ，ｐＨ７．４）中４℃でインキュベーションした後のプロトタイプパッチを示す。インキュベーションの間、ＰＢＳを２−３日間１２時間ごとに変える。この過程は細胞を殺し、この培養媒体に関連するすべての可溶の細胞破片と要素を洗い出す。この過程の完了を近似的に指示するのは、このプロトタイプパッチがピンク色を失い、無色になるということである。このパッチがなお実質的に半透明であることが特記される。
【図２Ａ及び２Ｂ】
図２Ａ及び２Ｂは細胞死を確認するために、このパッチをニュートラルレッドで標識し、光学顕微鏡下で観察することを示す。ニュートラルレッドは、活発な代謝を行なう生きた細胞中の細胞内ｐＨに対して反応する細胞透過性の指示薬であり、頻繁に使用される簡単な細胞生存可能性染料である。図２Ａはこのプロトタイプパッチの光学顕微鏡像であり、生きた細胞が拡げられ、マトリックスと相互作用していることが観察される。図２Ｂは細胞を殺し、媒体を洗い出した後のこのプロトタイプパッチの光学顕微鏡像を示す。ニュートラルレッド陽性の細胞は存在しない。
【図３Ａ】
図３Ａはマトリックス組織化条件の開発に使用されるミニパッチの直径（厚さでなく）の変化を示す。この実験を数度繰り返したが、極めて小さいエラーバーにより示されるように結果は統計的に有意である。
【図３Ｂ】
図３Ｂは図３Ａにおいて表で示したマトリックス再組織化実験時に得た結果を図示する棒グラフである。高血清（ＤＭＥＭ中の２０％ＦＢＳ）の条件が最もよい結果を生じることが特記される。ＨａｍのＦ１２媒体中の高血清は頭打ちになる限界効果を及ぼし、それに対して陰性のコントロール条件（５％のＦＢＳを含むＨａｍのＦ１２）は安定な静止条件を維持する。後者の意義は、これらをＤＭＥＭ中の２０％のＦＢＳ中に置くことにより、パッチを製造し、一つの組織化状態で保持し、次に、所望の方向に進行するように誘導させるということである。次に、後者の条件をＰＡＰの作製に使用する。
【図４Ａ及び４Ｂ】
図４Ａは上記の図３Ａで開発し、示した条件を与えた場合のフルサイズのプロトタイプＰＡＰの直径の変化を表で示す。図４ＢはプロトタイプＰＡＰに対するマトリックス再組織化のグラフ表示である。
【図５Ａ及び５Ｂ】
図５Ａ及び５Ｂは手術前のこのパッチの準備を示す。このパッチは手術器具（図５Ａ）による取り扱いが明らかに極く容易である。また、鼓動している心臓の心外膜で精確に配置するためにパッチを切断し、操作することもできる。これをつまみ上げ、一つの位置から別な位置に動かしてもよい（図５Ｂ）。
【図６Ａ及び６Ｂ】
図６Ａ及び６Ｂは組織シール剤を用いて心膜に取り付けた後の心外膜上のＰＡＰを示す。第１のシリーズの実験法においては、心膜を開いたままにした（図６Ａ）。このパッチはさほど半透明ではないが、冠状脈管構造がなおはっきりと目視できる（図６Ｂ）ことが特記される。
【図７Ａ及び７Ｂ】
図７Ａはこの実験を終了した後（手術後４−５ケ月）、このパッチが全体的に溶解していることを示す。図７Ｂはこのパッチにより保護された位置においては肺と心膜、肺と心臓及び心膜と心臓の間に癒着がないことを示す。図７Ｃはこのパッチにより保護されていない領域においては、弱い癒着形成が起こる（等級０．５−１，手袋をはめた指により分離可能）ことを示す。図７Ｄは非保護領域における癒着の一部が相当実質的なものであることを示す（等級３、鋭利な手術器具により分離可能）。
【図８Ａ−８Ｅ】
図８Ａ−８ＥはＬＩＭＡ法に対するこのパッチの適用を示す。図８Ａは心膜に切開を行い、そして乳動脈（ｍａｍｍａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ）を切断し、くくった直後に、このパッチを心膜にかぶせ、心外膜に取り付けることを示す。このパッチをこの吻合の下及び上に配置し、Ｎｉｔｉｎｏｌ  Ｃｏｕｐｌｅｒｓにより心外膜に取り付ける。図８Ｂは取り付け前に、このパッチを持ち上げて、最良の保護をもたらすように鼓動している心臓の周りで動かすことを示す。図８Ｃは次に心膜を２−３針の縫合で閉じることを示す。図８Ｄは次に、第２のパッチを閉じた心膜切開にかぶせて置き、Ｎｉｔｉｎｏｌ  Ｃｏｕｐｌｅｒｓにより心膜に取り付けることを示す。図８Ｅは胸腔を閉じる前に所定の位置に配列されたすべての器官を示す。
【図９Ａ−９Ｅ】
図９Ａ−９ＥはＬＩＭＡ実験後４ケ月にこの動物を再び開いた時に得られた結果を示す。図９Ａはこの心膜中の閉じた切開にかぶせて置いたパッチの全体の溶解を示す。保護された心膜と肺にも癒着はない。図９Ｂは心膜が治癒し、閉じられていて、そして緩いことを示す。この閉じられた状況で、心臓への癒着がないことが明白である。このことは心膜を開くことにより確認される。図９Ｃは心膜を再び開いて、このパッチが溶解したために、閉塞されていない吻合を観察することが容易であることを示す。図９ＤはＬＩＭＡを容易に持ち上げて心外膜から自由にし、可能なバイパスのために操作することができることを示す。図９Ｅは心膜と心外膜の間に癒着がなく、外科医が心臓を完全につかんで、持ち上げ、心膜の袋から出すことができることを示す。また、すべての冠状血管は容易に見られ、癒着により不明瞭となっていない。そして、必要ならば、冠状バイパスを行なうことができる。
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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