(57)【要約】本発明は、ＣＤ１８を含有する白血球細胞表面抗原（例えばＣＤ１８およびＣＤ１１形の両方を含むＭａｃ−１のような細胞表面抗原）のＣＤ１８サブユニットに特異的に結合する分子（例えばモノクローナル抗体またはそれらの部分）が、血管の狭窄および再狭窄損傷、およびそのような損傷に関連する症状および障害を抑制し、防止し、そして軽減するために使用できるという知見に基づく。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの血管の狭窄を抑制する方法であって、ＣＤ１８を含んで成る哺乳動物タンパク質の少なくともＣＤ１８部分と特異的に結合する抗−ＣＤ１８抗体をヒトに投与することを含んで成り、それにより血管の狭窄が抑制される上記方法。
【請求項２】
抗−ＣＤ１８抗体が実質的にタンパク質の抗−ＣＤ１８部分にのみ特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗−ＣＤ１８抗体がモノクローナル抗体１Ｂ４と同じかまたは類似するエピトープ特異性を有する請求項１に記載の方法。
【請求項４】
抗−ＣＤ１８抗体がモノクローナル抗体１Ｂ４である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗−ＣＤ１８抗体が、ＣＤ１８を含んで成る霊長類タンパク質の少なくともＣＤ１８部分と特異的に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
タンパク質が白血球の細胞−表面抗原である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗原がＭａｃ−１、ＬＦＡ−１、ｐ１５０，９５およびＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８から成る群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抗原がＭａｃ−１である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗−ＣＤ１８抗体と抗原との結合が、抗原の天然のリガンドと抗原の結合を阻害する、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
リガンドがＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、Ｃ３ｂｉ、第Ｘ因子、フィブリンおよびフィブリノーゲンから成る群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
リガンドがＩＣＡＭ−１、Ｃ３ｂｉ、第Ｘ因子、フィブリンおよびフィブリノーゲンから成る群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
抗−ＣＤ１８抗体とタンパク質との結合が、タンパク質の天然のリガンドとタンパク質の結合に通常関係している少なくとも１つの機能を調節する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
機能が、白血球と血管内皮との結合、白血球の血管内皮を通る移動、白血球の内膜血管組織への浸潤、血管組織中の白血球から走化性因子の放出、血管組織中の白血球から増殖因子の放出、白血球の結合に付随する血管組織から走化性因子の放出、および白血球の結合に付随する血管組織から増殖因子の放出から成る群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
白血球が好中球である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
血管は血管内皮が外傷的に混乱した血管である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
血管が、移植した血管、中で血管形成バルーンが膨張した血管、レーザー血管形成術が行われた部位を含んで成る血管、押し潰された傷害を受けた血管、および中にステントが留置された血管から成る群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
血管は血管内皮が外傷的には悪化しなかった血管である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
血管がアテローム硬化症の血管および動脈硬化症の血管から成る群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
血管が、冠状血管および大脳血管から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
抗−ＣＤ１８抗体が全抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
抗−ＣＤ１８抗体が抗体フラグメントである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
抗体フラグメントがＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂＮ）２フラグメントから成る群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗−ＣＤ１８抗体がキメラ抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
抗−ＣＤ１８抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
抗−ＣＤ１８抗体がヒト抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
抗−ＣＤ１８抗体が、抗−ＣＤ１８抗体を血管に供給することによりヒトに投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
抗−ＣＤ１８抗体は、血管の内皮が外傷的に混乱する前に血管に提供される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗−ＣＤ１８抗体は、血管の内皮が外傷的に混乱した後に血管に提供される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
狭窄がヒトに行った血管形成術の介入後の再狭窄である、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
介入がバルーン血管形成介入である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
介入が血管内の血管ステントの留置である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
哺乳動物タンパク質がヒトのタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
抗体を血管に投与することを含んで成るヒトの血管の狭窄を軽減する方法であって、抗体がＣＤ１８を含んで成る哺乳動物タンパク質の少なくともＣＤ１８部分と特異的に結合し、それにより狭窄が軽減される上記方法。
【請求項３４】
検出可能な標識を有する抗−ＣＤ１８抗体、およびヒトの血管中の抗−ＣＤ１８抗体の検出を記載する使用説明書を含んで成る、ヒトの血管の狭窄を評価するためのキット。
【請求項３５】
検出可能な標識がガンマ放射線源である、請求項３４に記載のキット。
【請求項３６】
抗−ＣＤ１８抗体と特異的に結合する白血球をヒトの血液から除去することを含んで成り、これにより血管中の狭窄が抑制される、ヒトの血管の狭窄を抑制する方法。
【請求項３７】
抗−ＣＤ１８抗体と特異的に結合する白血球をヒトの血液から除去することを含んで成り、これにより血管中の狭窄が軽減される、ヒトの血管の狭窄を軽減する方法。
【請求項３８】
白血球を抗−ＣＤ１８抗体と接触させることを含んで成り、これにより白血球と血管内皮との相互作用が阻害される、ヒトにおいてＣＤ−１８を含有する細胞表面タンパク質を有する白血球と血管内皮との相互作用を阻害する方法。
【請求項３９】
白血球が、リンパ球、単球、顆粒球、好中球、Ｔ細胞および好塩基球から成る群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
白血球が好中球である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
白血球と血管内皮との相互作用が、白血球と血管内皮との結合である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
白血球と血管内皮との相互作用が、血管内皮を通る白血球の移動である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
ヒトから得た血液中の血管狭窄に関係する白血球の存在を評価する方法であって、
血液を抗−ＣＤ１８抗体と接触させ、そして
血液中の抗−ＣＤ１８抗体と白血球との結合を検出する、
ことを含んで成り、
ここで抗−ＣＤ１８抗体と血液中の白血球との結合は血液中の血管狭窄と関係する白血球の存在の指標である、上記方法。
【請求項４４】
抗−ＣＤ１８抗体と血液中の白血球との結合が定量される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
抗−ＣＤ１８抗体とヒトの血液中の白血球との結合が、血管狭窄症に罹患しているヒトおよび血管狭窄症に罹患していないヒトから成る群から選択されるヒトから得た対照血液中の白血球と抗−ＣＤ１８抗体との結合と比較される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
ヒトから得た血液中の血管狭窄に関連する白血球の存在を評価するためのキットであって、
ｉ）抗−ＣＤ１８抗体および
ｉｉ）少なくとも
ａ）ヒトの血液中の白血球の存在を定量すること、
ｂ）血管狭窄症に罹患しているヒトの血液中の白血球含量、および
ｃ）血管狭窄症に罹患していないヒトの血液中の白血球含量
の１つを記載する使用説明書、
を含んで成る上記キット。
【請求項４７】
ヒトの血管中の狭窄に関連する障害を抑制する方法であって、ＣＤ１８を含んで成る哺乳動物タンパク質の少なくともＣＤ１８部分と特異的に結合する抗−ＣＤ１８抗体をヒトに投与することを含んで成り、それにより血管中の狭窄が抑制され、そしてこれにより障害が抑制される上記方法。
【請求項４８】
ヒトの血管中の狭窄に関連する障害を軽減する方法であって、ＣＤ１８を含んで成る哺乳動物タンパク質の少なくともＣＤ１８部分と特異的に結合する抗−ＣＤ１８抗体をヒトに投与することを含んで成り、それにより血管中の狭窄が軽減され、そしてこれにより障害が軽減される上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
発明の背景
本発明は一般に、狭窄および再狭窄ならびに狭窄および再狭窄に関連する症状および障害を抑制し、防止し、そして軽減する組成物および方法に関する。
【０００２】
外科的およびカテーテルが媒介する血管介入に比較的共通する合併症は、血管部分の狭窄および再狭窄である。例えば動脈狭窄は、冠状動脈バイパス術後の冠状動脈内のような血管移植部位で、またはその付近で起こり得る。再狭窄は経皮経管的冠状動脈形成術および他のバルーン血管形成術の長期効力を限定する主要な合併症である。同様に、動血管内にステントを留置すると留置部位に狭窄を誘導し得る。
【０００３】
血管狭窄症は平滑筋細胞の狭窄部位への移動、その部位での平滑筋の増殖、またはその両方を伴う。しかし平滑筋細胞の移動および増殖を誘導し、または持続する原因である因子（１つまたは複数）は、未だに確実には知られていない。血小板および白血球（例えば好中球）の局所的蓄積は、血管の損傷部位で起こり、損傷の発生後すぐに始まり、そして少なくともその後数日は続くことが知られている。少なくともヒトでは白血球活性化が再狭窄に関係しているが、他の研究者により炎症を抑制する薬剤（例えばグルココルチコイド）の投与はヒトにおける再狭窄を抑制できないことが判明した（Ｐｅｐｉｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ８１：１７５３−１７６１；Ｐｅｉｔｅｒｓｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９１：１３２０−１３２５；Ｍｉｃｋｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２８：３４５−３５３；Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ａｍｅｒ Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２８：１１２７−１１３３）。炎症を抑制する薬剤が大変必要とされているにもかかわらず、狭窄および再狭窄症状を防止し、抑制し、または軽減するために比較的広く効力のある薬剤を同定することは困難で、そしてわずかな薬剤が記載されただけであった。
【０００４】
Ｍａｃ−１と呼ばれる（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８またはαＭβ２としても知られている）白血球細胞−表面抗原とそのリガンドの１つ（例えばＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−２）との間の結合を阻害することができる抗体は、血管の治癒を強化し、そして損傷後の血管の狭窄および再狭窄を減らすことが知られている（国際公開第９８／４２３６０号明細書）。しかし以前に他の研究者によれば、Ｍａｃ−１のＣＤ１８部分に特異的に結合するモノクローナル抗体は、再狭窄の防止、抑制または軽減に効果的ではなく、そしてそのような抗体は再狭窄の症状を実際に悪化させるかもしれないと教示した（Ｇｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｏｒｏｎ．Ａｒｔ．Ｄｉｓ．６：６９３−７０１）。白血球細胞−表面抗原のＣＤ１８部分に特異的に結合すると仮定されたモノクローナル抗体（６０．３およびＲ１５．７と命名）の効果について解説した他の研究者は、そのような抗体がヒトにおいて狭窄症および関連する症状および障害の発生または進行に影響するならばどのような効果を有するのかを調査しなかった（Ｋｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１２：９９７−１００７；Ｋｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７７：１１２１−１１２８；Ｇｏｌｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：７８３−７８８）。実際には、他の研究者によりこれらの実験に使用したウサギのモデルでは、ヒトでの抗−狭窄的効力は示されないことが証明された。ヒトの狭窄症の霊長類モデルを使用して得た結果は、ヒトで得た結果とより一層一致していた。例えば例として、ヘパリンはヒトおよび他の霊長類において再狭窄症を防止するためには効果的ではないが、実験用の哺乳動物を含む他の実験系においては再狭窄症を抑制または防止することが示された。
【０００５】
本発明は狭窄および再狭窄的損傷およびそれらに付随する症状を抑制し、防止し、そして軽減するために効力のある薬剤の長い間の必要性を満たすものである。
【０００６】
発明の簡単な要約
本発明は、ヒトの血管の狭窄症（すなわち再狭窄症を含む）を抑制する方法に関する。この方法は、ＣＤ１８を含んで成る哺乳動物（例えばヒト）のタンパク質の少なくともＣＤ１８部分と特異的に結合する抗−ＣＤ１８抗体をヒトに投与することを含んで成る。これにより血管内の狭窄症が抑制される。
【０００７】
この方法では、抗−ＣＤ１８抗体は例えば実質的にタンパク質のＣＤ１８部分にのみ特異的に結合する抗体、モノクローナル抗体１Ｂ４と同じかまたは類似するエピトープ特異性を有する抗体、またはモノクローナル抗体１Ｂ４であることができる。
この方法の１態様では、抗−ＣＤ１８抗体はＣＤ１８を含んで成る霊長類タンパク質の少なくともＣＤ１８部分と特異的に結合する。
【０００８】
抗−ＣＤ１８抗体と結合する哺乳動物タンパク質は、例えばＭａｃ−１、ＬＦＡ−１、ｐ１５０，９５およびＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８の１つのような白血球細胞−表面抗原であることができる。Ｍａｃ−１が好適である。１つの観点では、抗−ＣＤ１８抗体と抗原との結合がＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、Ｃ３ｂｉ、第Ｘ因子、フィブリンおよびフィブリノーゲン（すなわちＭａｃ−１に関するＩＣＡＭ−１、Ｃ３ｂｉ、第Ｘ因子、フィブリンおよびフィブリノーゲン）のような抗原の天然のリガンドとの抗原の結合を阻害する。抗−ＣＤ１８抗体とタンパク質との結合は、タンパク質の天然の（ｎａｔｕｒａｌ）リガンドとのタンパク質の結合に通常関係している１以上の機能を調節することができる。例としてこの機能は、白血球と血管内皮との結合、白血球の血管内皮を通る移動、白血球の内膜血管組織への浸潤、血管組織中の白血球から走化性因子の放出、血管組織中の白血球から増殖因子の放出、白血球の結合に付随する血管組織から走化性因子の放出、および白血球の結合に付随する血管組織から増殖因子の放出から成る群から選択される。白血球は例えば好中球であることができる。
【０００９】
１つの観点では本方法は、血管内皮が外傷的に混乱した血管の狭窄症を抑制するために使用する。例えば血管は、移植した血管、中で血管形成バルーンが膨張した血管、レーザー血管形成術が行われた部位を含んで成る血管、押し潰された損傷を経験した血管、および中にステントが留置された血管の１つであることができる。もちろん、血管はアテローム硬化症の血管および動脈硬化症の血管のように血管内皮が外傷的には悪化しなかった血管であることもできる。血管は例えば冠状血管または大脳血管であることができる。
【００１０】
本方法で使用する抗−ＣＤ１８抗体は、例えば全抗体、抗体フラグメント（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂＮ）２フラグメントの１つ）、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全にヒト抗体であることができる。
【００１１】
本方法に従い抗−ＣＤ１８抗体は、抗−ＣＤ１８抗体を血管に提供することにより（血管内皮が外傷的に混乱（ｐｅｒｔｕｒｂｉｎｇ）する前に、そのような外傷的混乱中に、または血管内皮が外傷的に混乱した後に）ヒトに投与することができる。この混乱は例えば、血管形成術の介入（例えばバルーン血管形成介入または血管内の血管ステントの留置）を含んで成ることができる。
【００１２】
実質的に同じ方法を使用して、ヒトの血管中で既往の、または発症中の狭窄を軽減することができる。
【００１３】
本発明はさらに、ヒトの血管の狭窄を評価するためのキットに関する。このキットは、検出可能な標識（例えばガンマ放射線源）を有する抗−ＣＤ１８抗体およびヒトの血管中の抗−ＣＤ１８抗体の検出を記載する使用説明書を含んで成る。
【００１４】
本発明はヒトの血管中の狭窄を抑制または軽減する別の方法を含む。この方法は、抗−ＣＤ１８抗体と特異的に結合する白血球をヒトの血液から除去することを含んで成る。これにより血管中の狭窄が抑制、または軽減される。
【００１５】
また本発明に含まれるのは、ＣＤ１８を含有する細胞表面タンパク質を有する白血球とヒトの血管内皮との相互作用を阻害する方法である。この方法は白血球を抗−ＣＤ１８抗体と接触させることを含んで成る。これにより白血球と血管内皮との相互作用が阻害される。白血球は例えばリンパ球、単球、顆粒球、好中球、Ｔ細胞および好塩基球から成る群から選択することができる。阻害される相互作用は例えば、白血球と血管内皮との結合または血管内皮を通る白血球の移動であることができる。
【００１６】
さらに本発明は、ヒトから得た血液中の血管狭窄に関係する白血球の存在を評価する方法を含む。この方法は、
ａ）血液を抗−ＣＤ１８抗体と接触させ、そして
ｂ）血液中の抗−ＣＤ１８抗体と白血球との結合を検出する、
ことを含んで成る。血液中の抗−ＣＤ１８抗体と白血球との結合は、血液中に血管狭窄と関係する白血球が存在することの指標である。血液中の抗−ＣＤ１８抗体と白血球との結合は定性的に評価するか、あるいは定量する（例えばヒトの血液中の抗−ＣＤ１８抗体と白血球との結合を、
ｉ）血管狭窄症に罹患しているか、または
ｉｉ）血管狭窄症に罹患していない、
いずれかのヒトから得た対照血液中の白血球との抗−ＣＤ１８抗体の結合と比較する）ことにより評価することができる。
【００１７】
さらに本発明は、ヒトから得た血液中に血管狭窄症に関連する白血球の存在を評価するためのキットを含む。このキットは、
ｉ）抗−ＣＤ１８抗体および
ｉｉ）少なくとも１つの
ａ）ヒトの血液中の白血球の存在を定量すること、
ｂ）血管狭窄症に罹患しているヒトの血液中の白血球含量、および
ｃ）血管狭窄症に罹患していないヒトの血液中の白血球含量
を記載する使用説明書を含んで成る。
【００１８】
別の観点では、本発明はヒトの血管の狭窄に関連する障害を抑制する方法に関する。この方法は、ＣＤ１８を含んで成る哺乳動物タンパク質の少なくともＣＤ１８部分と特異的に結合する抗−ＣＤ１８抗体をヒトに投与することを含んで成る。これにより血管の狭窄が抑制され、そしてこれにより障害が抑制される。
【００１９】
さらに別の観点では、本発明はヒトの血管中の狭窄症に関連する障害を軽減する方法に関する。この方法はＣＤ１８を含んで成る哺乳動物タンパク質の少なくともＣＤ１８部分と特異的に結合する抗−ＣＤ１８抗体をヒトに投与することを含んで成る。それにより血管の狭窄が軽減され、そしてこれにより障害が軽減される。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は従来技術での技法（例えばＧｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｃｏｒｏｎ．Ａｒｔ．Ｄｉｓ．６：６９３−７０１）とは対照的に、Ｍａｃ−１白血球細胞表面抗原のＣＤ１８サブユニットと特異的に結合する分子が、血管（例えば動脈）の狭窄または再狭窄的損傷およびそのような損傷に付随する症状（例えば虚血）および障害（例えば血管移植拒絶）を抑制し、防止し、そして軽減するために使用できるという知見に基づく。ＣＤ−１８結合抗体はＣＤ１１ｂと複合化する時（すなわちＭａｃ−１抗原中で）、ＣＤ１１ａと複合化する時（すなわちＬＦＡ−１抗原中で）、およびＣＤ１１ｄと複合化する時（すなわちｐ１５０，９５抗原中で）、ＣＤ１８と結合することができると認識されている。
【００２１】
本発明は、Ｍａｃ−１、ＬＦＡ−１、ｐ１５０，９５およびＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８と命名されたヒトの白血球細胞−表面抗原に見いだされるような哺乳動物（好ましくは霊長類、そしてより好ましくはヒト）のＣＤ１８タンパク質と特異的に結合する抗体またはそれらの機能的フラグメントに関する。本明細書で使用するように、「抗−ＣＤ１８抗体」とは、全抗体およびそのような全抗体のフラグメントを集合的および個別に指すために使用し、ここで抗体またはフラグメントはＣＤ１８タンパク質との特異的結合を現す。１つの態様では、抗−ＣＤ１８抗体はＣＤ１８タンパク質に特異的に結合するが、抗原Ｍａｃ−１、ＬＦＡ−１、ｐ１５０，９５およびＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８の他の成分と特異的に結合しない（例えば、抗−ＣＤ１８抗体はこれら抗原の任意のＣＤ１１サブユニットとは特異的に結合しない）。ＣＤ１８と特異的に結合する実質的に任意の抗体を使用することができるが、抗−ＣＤ１８抗体はＣＤ１８がＣＤ１１サブユニット（例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１１ｄの１つ）のような白血球細胞表面抗原中の他のタンパク質と複合化できるかどうかにかかわらず特異的に結合するものであることが好ましい。
【００２２】
１つの態様では抗−ＣＤ１８抗体は、単離された哺乳動物（例えばヒト）のＣＤ１８タンパク質または単離されたＣＤ１８−含有タンパク質（例えば白血球細胞表面抗原）に対して生成される。もちろん抗−ＣＤ１８抗体は、そうではなくて組換え哺乳動物ＣＤ１８またはそれらの部分（例えば、ＣＤ１８タンパク質上に通常は露出されているエピトープを含んで成るポリペプチド、特にタンパク質が白血球膜中のＣＤ１１サブユニットと複合化する時、通常は露出されるもの）に対して生成することもできる。抗−ＣＤ１８抗体はさらに哺乳動物のＣＤ１８を発現する宿主細胞（例えば好中球のようなヒト白血球またはＣＤ１８を発現するように形質転換された細菌細胞）に対して生成することができる。本明細書で使用するように、標的に対して抗体を「生成する」ことは、既知の方法を使用して行うことができる。標的に対して抗体を生成するために使用する方法の例は、標的を脊椎動物（例えばウサギ、ハムスター、マウス、カンガルー、ヤギ、ヒツジ、ブタまたはウシ）の身体（例えば血流中）に提供し、脊椎動物から免疫細胞を単離し、抗−ＣＤ１８抗体を生産する１以上の免疫細胞を選択し、そしてその細胞（１つまたは複数）から抗−ＣＤ１８抗体を得ることを含む。別の例としては、標的を、表面に露出された抗体または抗体のフラグメントを有し、そして露出された抗体またはフラグメントをコードする核酸を含むか、または核酸に関連し得る粒子（細胞、ファージ、ベクター等）のライブラリー（例えばＭ１３ファージライブラリーのような糸状ファージライブラリー）と合わせ、標的と結合する１以上の粒子を選択し、粒子内に含まれるか、または関係する核酸を得、そして得られた核酸を使用して抗−ＣＤ１８抗体を生成するかまたは設計することである。
【００２３】
好適な態様では、抗体はヒトのＣＤ１８タンパク質またはそれらの部分と特異的に結合し、そして特に好適な態様では、抗体は自然に存在するか、または内因性のヒトＣＤ１８タンパク質に特異性を有する。哺乳動物ＣＤ１８タンパク質に特徴的な１以上の機能を阻害することができる抗−ＣＤ１８抗体が本発明に包含される。これらの機能の例には、白血球と内皮細胞との結合、白血球とそれらの表面にＩＣＡＭ−１タンパク質を有する細胞との結合、白血球とそれらの表面にＩＣＡＭ−２タンパク質を有する細胞との結合を媒介すること、白血球の血管内皮を通る移動を媒介すること、白血球の病んだまたは傷害を受けたまたは炎症した組織への移動を媒介すること、および走化性または増殖調節物質（例えば増殖因子およびケモカイン）の白血球および白血球が結合する細胞からの放出を媒介することを含む。例えば１つの観点では、抗−ＣＤ１８抗体はＣＤ１８とＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−２のような天然のリガンドとの相互作用を阻害する（すなわち頻度または強度を下げるか、または防止する）。
【００２４】
抗−ＣＤ１８抗体が結合するＣＤ１８のエピトープは、重要ではない。１つの態様では、抗−ＣＤ１８抗体はモノクローナル抗体１Ｂ４が結合する同じエピトープに結合する。モノクローナル抗体１Ｂ４は、例えば欧州特許出願公開第０４３８３１２号明細書に記載されている。好ましくは抗−ＣＤ１８抗体はすでに知られている抗−ＣＤ１８抗体（例えば抗体Ｒ１５．７および６０．３）が結合するエピトープ（１つまたは複数）とは異なるＣＤ１８のエピトープと結合するか、あるいは抗−ＣＤ１８抗体が既知の抗−ＣＤ１８抗体と同じＣＤ１８のエピトープに結合する時、既知の抗体よりも高い親和性で結合する。
【００２５】
本発明の抗−ＣＤ１８抗体はヒトのＣＤ１８により媒介される機能を阻害することができ、白血球の傷害を受けたまたは炎症した組織（外科的またはバルーン血管形成術のようなカテーテルが媒介する介入にかけられた血管組織のような）への再集合を含む。抗体は対応する身体部位での流体中の抗体濃度に一般的に関連する程度まで、そのような機能を阻害することができる。さらなる抗体が実質的により高い阻害効果を持たない上の抗体濃度が存在すると認識されている。低い濃度では、抗体の阻害効果は日常的な実験を使用して当業者により予想され得る様式で抗体の濃度に伴い変動するだろう。使用することができる本明細書に記載する抗−ＣＤ１８抗体の効果的濃度には、例えばミリリットルあたり１０００、５００、２００、１００、５０、２０、１０、５、２または１マイクログラムを含む。抗−ＣＤ１８抗体の送達が局所的に投与される場合（例えば、関節の滑液のような分離した身体成分内）は、全身的に投与する場合（例えば血流を介する全身投与）よりも低濃度の抗体を使用することができる。
【００２６】
本発明のさらなる態様では、抗−ＣＤ１８抗体はＣＤ１８とそれらのリガンド（例えばＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−２）との結合を、好ましくはミリリットルあたり約５０、２０、１０、５、２、１または（好ましくは）０．５マイクログラム未満のＩＣ５０で阻害することができる。本発明のさらなる態様では、抗−ＣＤ１８抗体はＣＤ１８と少なくとも約１０−７、１０−８、または（好ましくは）１０−９モルの親和性で結合する。
【００２７】
ＣＤ１８と特異的に結合するヒト化したモノクローナル抗体は本明細書に記載するように生成され、そして１Ｂ４と命名する。好適な態様では、本発明の抗体はヒトのＣＤ１８に結合し、そして本明細書に記載する１Ｂ４と同じかまたは類似するエピトープ特異性を有する。１Ｂ４モノクローナル抗体と同じかまたは類似するエピトープ特異性を持つ抗体は、当該技術分野で知られている技法を使用して同定することができる。例えば１Ｂ４と同じかまたは類似するエピトープ特異性を持つ抗体は、それらが１Ｂ４モノクローナル抗体とヒトのＣＤ１８（例えば、１以上のＭａｃ−１、ＬＦＡ−１、ｐ１５０，９５およびＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８細胞−表面抗原を持つ白血球のようなヒトのＣＤ１８を持つ細胞）との結合を拮抗する能力により、それらが１Ｂ４のヒトＣＤ１８への結合を阻害する能力により、あるいはレセプターのキメラを使用して（例えばＲｕｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９６，Ｃｅｌｌ ８７：４３７−４４６に記載されているように）同定することができる。これらのまたは他の適当な技法を使用して、本発明の抗体と同じかまたは類似するエピトープ特異性を持つ抗体を同定することができる。本発明はまた、１Ｂ４および少なくとも１つの他の抗体と同じかまたは類似するエピトープ特異性を持つ二重特異性抗体またはそれらの機能的フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）２）に関する（例えば米国特許第５，１４１，７３６号明細書（Ｉｗａｓａ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第４，４４４，８７８号、同第５，２９２，６６８号、同第５，５２３，２１０号明細書（すべてＰａｕｌｕｓへの）、および米国特許第５，４９６，５４９号明細書（Ｙａｍａｚａｋｉ ｅｔ ａｌ．）を参照にされたい）。
【００２８】
本発明の抗−ＣＤ１８抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であることができる。さらに本明細書に記載する抗−ＣＤ１８抗体を利用する方法は、全抗−ＣＤ１８抗体、全抗−ＣＤ１８抗体のＣＤ１８抗原−結合フラグメント、モノクローナル抗体１Ｂ４、１Ｂ４と同じかまたは類似するエピトープ特異性を持つ抗体（すなわち全抗体およびＣＤ１８−結合抗原フラグメント）、およびこれらの組み合わせであると考えられる。これらの抗体およびフラグメントは、場合によりＣＤ１８と特異的に結合しない抗体または抗体フラグメントと組み合わせて使用することができる。
【００２９】
本明細書に記載する抗−ＣＤ１８抗体は、本明細書に記載するように治療、診断、防止、予後および調査的応用に使用することができる。本発明は抗−ＣＤ１８抗体（例えばモノクローナル抗体１Ｂ４、またはそれらのＣＤ１８−結合フラグメント）を、治療（予防を含む）または診断（例えば本明細書に記載する特定の疾患または症状）において使用するために、ならびにそのような抗体を本明細書に記載する疾患または症状の処置、防止または診断に使用するための薬剤の製造に使用するために包含する。
【００３０】
免疫感作抗原の調製およびポリクローナルおよびモノクローナル抗体の生産は本明細書に記載するように、あるいは他の適当な技法を使用して行うことができる。様々な方法が記載された（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）およびＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２６６：５５０−５５２（１９７７）；Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，１７２，１２４号明細書；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ． ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ア ラボラトリーマニュアル（Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、（コールドスプリングハーバーラボラトリー：コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）；分子生物学における現在の技法（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第２巻、（補追２７、’９４年夏）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．編集、（ジョン ウィリー アンド サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：ニューヨーク、ＮＹ）、第１１章、（１９９１）を参照にされたい）。一般にハイブリドーマは適当な不死化細胞系（例えばＳＰ２／０のようなミエローマ細胞系）と抗体生産細胞とを融合することにより生産することができる。好ましくは脾臓または１以上のリンパ節から得た抗体生産細胞は、目的の抗原を単独または他の抗原と組み合わせて（例えばアジュバントと組み合わせて、または表面に抗原を露出した細胞として）提供した動物から得ることができる。融合細胞（すなわちハイブリドーマ）は、選択的な培養条件を使用して単離することができ、そして限界希釈によりクローン化する。所望の結合特性を持つ抗体を生産する細胞は、適切なアッセイにより選択することができる（例えばＣＤ１８−結合抗体を検出するためにＥＬＩＳＡを使用して）。
【００３１】
ヒトまたは人工的な抗体を含めＣＤ１８に結合する抗体を生産または単離する他の適当な方法を使用することができ、それらには例えばライブラリーから組換え抗体（例えば単鎖ＦｖまたはＦａｂ）を選択する方法、またはヒトまたは人工的抗体のレパートリーを生産することができるトランスジェニック動物（例えばマウス）の免疫感作に依存する方法（例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｌｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５４５，８０６号明細書；Ｓｕｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５４５，８０７号明細書を参照にされたい）を含む。例として抗−ＣＤ１８抗体はＣＤ１８またはそれらの画分を、場合によりアジュバントと混合して、またはキメラタンパク質内に包含して、アブジェニックス社（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．、フリーモント、カリフォルニア州）から入手可能なマウスのＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）種のような、マウス抗体遺伝子発現が抑制され、そして機能的にヒトの抗体遺伝子発現と置き換えられた遺伝子操作されたマウスに提供し、そして次いで抗−ＣＤ１８抗体をマウスから単離することにより生成することができる。
【００３２】
異なる種に由来する部分を含んで成る単鎖抗体、およびキメラ、ヒト化、ヒトまたは霊長類化（ＣＤＲ−移植）抗体ならびにキメラまたはＣＤＲ−移植単鎖抗体等も本発明および用語「抗体」に包含される。これら抗体の種々の部分は、通例の技法により化学的に一緒に連結することができ、あるいは遺伝子工学的技法を使用して連続するタンパク質として調製することができる。例えばキメラ、ヒトまたはヒト化された鎖をコードする核酸を発現させて連続するタンパク質を生成することができる。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、欧州特許第０，１２５，０２３号明細書；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｂｏｓｓ ｅｔ ａｌ．、欧州特許第０，１２０，６９４号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．、国際公開第８６／０１５３３号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．、欧州特許第０，１９４，２７６号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００号明細書；およびＱｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，５８５０８９号、同第５，６９８，７６１号および同第５，６９８，７６２号明細書を参照にされたい。また霊長類化した抗体に関してはＮｅｗｍａｎ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）を、そして単鎖抗体に関してはＬａｄｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，９４６，７７８号明細書およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８））を参照にされたい。
【００３３】
さらにキメラ、ヒト化、霊長類化、ヒト（すなわち完全にヒト）または単鎖抗体のフラグメントを含む抗体の機能的フラグメントも生成することができる。前述の抗体の機能的フラグメントは、それらが由来する完全長の抗体の少なくとも１つの結合機能および／または調節機能を保持する。好適な機能的フラグメントは、対応する完全長の抗体の抗原−結合機能を保持する（例えば、哺乳動物のＣＤ１８に結合する能力を保持する）。特に好適な機能的フラグメントは、白血球と内膜との結合を調節する能力または白血球の内皮を渡る移動のような哺乳動物のＣＤ１８に特徴的な１以上の機能を阻害する能力を保持する。例えば１つの態様では、機能的フラグメントはヒトの白血球（例えば好中球）と自然にＩＣＡＭ−１またはＩＣＡＭ−２を含んで成る組織（例えば内皮）との結合を阻害することができる。別の態様では、機能的フラグメントは血管内バルーン血管形成術的介入の部位で好中球の内膜血管組織への滲出を抑制することができる。機能的フラグメントが調節することができる他の活動は幾つかの態様において、白血球のトラフィッキング（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、Ｔ細胞活性化、炎症メディエーターの放出および白血球のデグラニュレーション（ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を含む。
【００３４】
例えば哺乳動物のＣＤ１８またはそれらの部分に結合することができるＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂＮ）２抗体フラグメントを含む抗−ＣＤ１８抗体フラグメントは、本発明に包含される。そのようなフラグメントは全抗−ＣＤ１８抗体の酵素的開裂により、または例えば組換え法により生成することができる。例えばパパインまたはペプシン開裂は、それぞれＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを生成することができる。抗体も１以上の終止コドンが天然の終止部位の上流に導入された抗体遺伝子を使用して、種々の短縮化された形態で生成することができる。例えばＦ（ａｂ’）２重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ１ドメインおよびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計することができる。
【００３５】
例としてキメラ抗−ＣＤ１８抗体（全抗−ＣＤ１８抗体のフラグメントを含む）は、キメラ抗体またはフラグメントをコードする様式で連結されたヒト（例えばヒトの定常領域）および非−ヒト（例えばマウスの相補性−決定領域：ＣＤＲ）セグメントのＤＮＡセグメントを含んで成るＤＮＡを合成し、そして次いでＤＮＡを転写し、そして翻訳して連続するポリペプチド鎖を生成することにより調製することができる。
【００３６】
本明細書で使用する用語「ヒト化免疫グロブリン」および「ヒト化抗体」とは、異なる動物起源の免疫グロブリンの部分を含んで成る免疫グロブリン、または免疫グロブリンの部分を称し、ここで少なくとも１つの部分がヒト起源である。したがって本発明は、哺乳動物のＣＤ１８（例えばヒトのＣＤ１８またはカニクイザルＣＤ１８）に特異的に結合するヒト化免疫グロブリンに関する。このヒト化抗体は、非ヒト（例えば齧歯類）起源の抗原結合領域およびヒト起源（例えばヒトを枠組み領域、または１以上のヒトの定常領域またはそれらの部分）の免疫グロブリンの少なくとも１つの部分を含んで成る。例えばヒト化抗体は、通例の技法（すなわち合成抗体を生成するために）により化学的に一緒に連結されるか、または組換え（すなわち「遺伝子操作」）法を使用して連続するポリペプチドとして調製された必要な抗−ＣＤ１８特異性を現す非ヒト（例えばマウス）起源の免疫グロブリンに由来する１以上の部分、ヒト起源の１以上の免疫グロブリン部分を含んで成ることができる。本発明のヒト化免疫グロブリンの例は、非ヒト起源のＣＤＲを含んで成る１以上の免疫グロブリン鎖（例えば、非ヒト起源の抗体に由来する１以上のＣＤＲ）およびヒトの軽鎖、ヒトの重鎖またはそれらの幾つかのハイブリッドに由来する枠組み領域を含む免疫グロブリンである（すなわち、枠組みに変化が有るかまたは無いＣＤＲ−移植抗体）。
【００３７】
１つの態様では、ヒト化抗−ＣＤ１８抗体はヒトのＣＤ１８と結合するために１Ｂ４モノクローナル抗体と競合することができる。好適な態様では、ヒト化免疫グロブリン（ａ）の抗原−結合領域は１Ｂ４モノクローナル抗体に由来する（例えば１Ｂ４軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、および１Ｂ４重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含んで成るヒト化免疫グロブリンにおけるような）。
【００３８】
ヒト化抗−ＣＤ１８抗体は、所望のヒト化された鎖をコードする遺伝子（例えばｃＤＮＡ）を調製するために合成核酸、組換え核酸またはその両方を使用して生成することができる。例えばヒト化された可変領域をコードする核酸（例えばＤＮＡ）配列は、以前にヒト化された可変領域に由来するＤＮＡ鋳型のようなヒトまたはヒト化された鎖をコードするＤＮＡ配列を改変するための、ＰＣＲ突然変異誘発法を使用して構成することができる（例えばＫａｍｍａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７：５４０４（１９８９）；Ｓａｔｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：８５１−８５６（１９９３）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９（９）：２４７１−２４７６（１９９１）；およびＬｅｗｉｓ，Ａ．Ｐ．，ａｎｄ Ｊ．Ｓ．Ｃｒｏｗｅ，Ｇｅｎｅ，１０１：２９７−３０２（１９９１）を参照にされたい）。これらのまたは他の適当な方法を使用して、変異体も容易に生成することができる。１つの態様では、クローン化された可変領域を突然変異させることができ、そして所望の特異性を持つ変異体をコードする配列を選択することができる（例えばファージライブラリーから；Ｋｒｅｂｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｕ．Ｓ．５，５１４，５４８；１９９３年４月１日に公開されたＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９３／０６２１３号明細書；１９９７年３月６日に公開されたＫｎａｐｐｉｋ ｅｔ ａｌ．，国際公開第９７／０８３２０号明細書を参照にされたい）。本内容で使用する「遺伝子」とは、ＣＤ１８に特異的に結合する全抗−ＣＤ１８抗体またはそれらのフラグメントをコードする発現可能な核酸構築物を意味する。そのような遺伝子は一般に、翻訳開始部位および翻訳終止コドンを含む。遺伝子がＤＮＡである場合、遺伝子は転写開始部位も含むべきであり、そしてさらに当該技術分野では既知のポリ−アデノシン領域を含むことができる。
【００３９】
抗−イディオタイプ抗体も提供される。抗−イディオタイプ抗体は別の抗体の抗原−結合部位に付随する抗原決定基を認識する。抗−イディオタイプ抗体は、例えば米国特許第４，６９９，８８０号明細書に記載されているような第２抗体を生成するために使用された動物と同じ種の、そして好ましくは同じ血統（ｓｔｒａｉｎ）の動物を免疫感作することにより第２抗体に対して調製することができる。
【００４０】
本発明は本明細書に記載する１Ｂ４ハイブリドーマ細胞系、そのハイブリドーマ細胞系により生産された抗−ＣＤ１８モノクローナル抗体、およびそれらのＣＤ１８−結合フラグメントにも関する。この細胞系および抗−ＣＤ１８抗体を生産する他のハイブリドーマは、モノクローナル抗体の生産を越えた用途を有する。例えば細胞系は他の細胞系（ヒトのミエローマ、マウスのミエローマ、ヒト−マウスヘテロミエローマ、またはヒトのリンパ芽球細胞のような、これら任意の細胞系を作成することができ、あるいは既知の方法を使用して選択した薬剤に感受性になるように選択する）と融合して、さらなるハイブリドーマを生成することができる。これらのさらなるハイブリドーマを使用して、モノクローナル抗体をコードする遺伝子をインビトロまたはインビボのいずれかで細胞群または組織に移すことができる。
【００４１】
さらに抗−ＣＤ１８抗体生産細胞系は、１以上の抗−ＣＤ１８抗体鎖をコードする核酸の供給源として使用することができ、そしてこれら核酸を単離し、発現させ（例えば適当な技法（例えばＣａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号明細書を参照にされたい）を使用して他の細胞に移して）、または操作することができる（例えばキメラ抗−ＣＤ１８抗体をコードする核酸を得るために他の抗体をコードする核酸の部分と合わせて）。例えば再配列した抗−ＣＤ１８抗体の軽および重鎖を含んで成るクローンを単離することができ（例えばＰＣＲにより）、あるいはｃＤＮＡライブラリーを細胞系から単離したｍＲＮＡから調製することができ、そして抗−ＣＤ１８免疫グロブリン鎖をコードするｃＤＮＡクローンを単離することができる。このように抗−ＣＤ１８抗体の重鎖、軽鎖または両方をコードする核酸を得、そして特異的な免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはこれらのいずれかの変異体を生産するための組換えＤＮＡ法に従い（例えばヒト化免疫グロブリンを生産するために）、種々の宿主細胞中またはインビトロの翻訳系で使用することができる。
【００４２】
ヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１８抗体、またはそれらの重または軽鎖のような変異体をコードする核酸は、原核または真核ベクター（例えばプラスミドまたはウイルスベクターのような発現ベクター）に提供され、そして宿主細胞（例えば形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションまたは細胞の感染により）に導入され得る。既知の発現制御要素（例えばプロモーター、ターミネーター領域、転写調節領域等）をベクターに含めることができ、または宿主細胞中での抗体または鎖の発現を助長するために宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。宿主細胞中でのコードされた鎖（１つまたは複数）の生産は、当該技術分野で知られているように発現に適する条件に細胞を維持することにより達成できる（例えばインデューサーの存在下、適当な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補充物が補充された適当な培地等）。所望によりコードされたタンパク質は、宿主細胞または宿主細胞が核酸を発現する培地または組織から回収および／または単離することができる。この生産法には例えば国際公開第９２／０３９１８号明細書に記載されているように、トランスジェニック動物の宿主細胞中で抗−ＣＤ１８抗体またはそれらの鎖の発現を包含する。
【００４３】
本明細書で記載するように、本発明の抗−ＣＤ１８抗体はＣＤ１８とそれらのリガンドとの結合を遮断（阻害）することができる。このようにＣＤ１８／リガンド結合の阻害は、そのような結合に関係する１以上の機能を阻害するために使用することができる。以下に記載するように種々の方法を使用してリガンドとＣＤ１８の結合を阻害を評価することができ、そしてこれらの方法はすなわち、ＣＤ１８／リガンド結合に関係する機能の阻害を評価するために使用することができる。
結合アッセイ
本明細書で使用するように、「哺乳動物のＣＤ１８」とは自然に存在するかまたは内因性の哺乳動物のＣＤ１８タンパク質、および自然に存在するかまたは内因性の対応する哺乳動物のＣＤ１８タンパク質と同じアミノ酸配列を有するタンパク質（例えば組換えタンパク質）を称する。したがって本明細書で定義するように、この用語には成熟ＣＤ１８タンパク質、ホモ多量体ＣＤ１８タンパク質、少なくとも１つのＣＤ１８ポリペプチドを含んで成るヘテロメリック（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ）タンパク質（例えば白血球細胞表面抗原Ｍａｃ−１、ＬＦＡ−１、ｐ１５０，９５およびＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８、その各々が｛異なる｝ＣＤ１１サブユニットおよびＣＤ１８サブユニットを含んで成る）、これらタンパク質の多形または対立遺伝子変異体、およびこれらタンパク質の他のアイソフォーム（例えば、交互スプライシングまたは他の細胞プロセスにより生成される）を含む。前述のタンパク質の翻訳後に修飾された形態およびそのように修飾されていない形態の両方を含む（例えばグリコシル化および非グリコシル化ＣＤ１８タンパク質およびＣＤ１８−含有ヘテロマー）。哺乳動物のＣＤ１８タンパク質は天然の供給源から単離するか、または組換えもしくは他の合成法により生成することができる。自然に存在するまたは内因性の哺乳動物のＣＤ１８タンパク質は、成熟ＣＤ１８、多形もしくは対立遺伝子変異体、および哺乳動物内（例えばヒトおよび非ヒト霊長類）で自然に生じる他のアイソフォーム、およびＣＤ１８を含んで成るヘテロメリックタンパク質（例えばＭａｃ−１、ＬＦＡ−１、ｐ１５０，９５およびＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８のような白血球細胞表面抗原）のような野生型タンパク質を含む。そのようなタンパク質は例えば哺乳動物のＣＤ１８を自然に生産する供給源から回収または単離することができる。自然に存在するかまたは内因性の対応する哺乳動物ＣＤ１８と同じアミノ酸配列を有するこれらのタンパク質および哺乳動物のＣＤ１８タンパク質は、対応する哺乳動物の名前により呼ばれている。例えば対応する哺乳動物がヒトである場合、このタンパク質はヒトＣＤ１８タンパク質と命名されている（例えば適当な宿主細胞中で生産された組換えヒトＣＤ１８）。
【００４４】
哺乳動物ＣＤ１８タンパク質の「機能的変異体」には、機能的フラグメント、機能的突然変異体タンパク質、および機能的融合タンパク質（例えば突然変異誘発法または組換え法により生産されたもの）を含む。一般に哺乳動物ＣＤ１８タンパク質のフラグメントまたは部分は、成熟哺乳動物ＣＤ１８タンパク質に対してアミノ酸残基（すなわち１以上のアミノ酸残基）の欠失（すなわち１以上の欠失）を有するものを含む（アミノ−末端、カルボキシル−末端または内部の欠失のような）。成熟哺乳動物ＣＤ１８タンパク質に対して連続アミノ酸のみが欠失しているか、または非連続アミノ酸が欠失しているフラグメントまたは部分も想定する。
【００４５】
一般に哺乳動物ＣＤ１８タンパク質の突然変異体には、付加、欠失、置換により、またはこれらの幾つかの組み合わせの、または１以上の連続または非連続アミノ酸残基の差異による哺乳動物ＣＤ１８タンパク質の天然のまたは人工的な変異体を含む。そのような突然変異は、哺乳動物種間のＣＤ１８アミノ酸配列相同性により評価されるような保存または非保存領域であることができる。
【００４６】
一般に融合タンパク質は、天然に見いだされる哺乳動物ＣＤ１８中には存在しない第２部分にペプチド結合を介して連結された哺乳動物ＣＤ１８（例えばヒトＣＤ１８）またはそれらの変異体を第１部分として含んで成るポリペプチドを包含する。すなわち第２部分はアミノ酸、オリゴペプチドまたはポリペプチドであることができる。第１部分は融合タンパク質に対してアミノ−末端の位置、カルボキシル−末端の位置または内部位置であることができる。１つの態様では、融合タンパク質は第１部分として親和性リガンド（例えば酵素、抗原、エピトープタグ）を含んで成り、そして第２部分はリンカー配列およびヒトＣＤ１８またはそれらの部分を含んで成る。さらなる（第３または４）部分も存在することができる。
【００４７】
哺乳動物ＣＤ１８タンパク質の「機能的」フラグメント、部分、突然変異体または融合タンパク質とは、本明細書で記載するように哺乳動物ＣＤ１８タンパク質の少なくとも１つの特徴的機能を有する単離された、組換えの、またはその両方のポリペプチドを称する。好適な機能的変異体は、リガンド（例えばＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２の１つまたは両方）に結合することができ、そして本明細書ではＣＤ１８の「リガンド結合変異体」と称する。
【００４８】
１つの態様では、哺乳動物ＣＤ１８の機能的変異体は対応する哺乳動物ＣＤ１８（例えばＧｅｎＢａｎｋ 寄託番号ＮＭ ０００２１１に記載されているヒトＣＤ１８、または別の霊長類ＣＤ１８）と少なくとも約８５％の配列同一性を、好ましくは該哺乳動物ＣＤ１８と少なくとも約９０％の配列同一性を、そしてより好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を共有する。別の態様では、機能的な融合タンパク質は対応する哺乳動物ＣＤ１８と少なくとも約８５％の配列同一性を、好ましくは哺乳動物ＣＤ１８と少なくとも約９０％の配列同一性を、そしてより好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を共有する第１部分を含んで成る。配列同一性は、Ｂｌａｓｔｘ プログラム（バージョン１．４）のような適当なプログラムを使用して、ＮＣＢＩウェッブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）で説明されるデフォルトパラメーターのような適当なパラメーターを使用して決定することができる。１つの態様では、Ｂｌａｓｔｘ調査に関するパラメーターは、スコアリングマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、Ｗ＝３である。別の態様では機能的変異体は、自然に存在する核酸分子とは異なるが遺伝子暗号の縮重により哺乳動物ＣＤ１８またはそれらの部分もしくは機能的変異体をコードする配列を有する核酸を含んで成る。
【００４９】
単離された、または組換えの哺乳動物ＣＤ１８タンパク質またはそれらの機能的変異体を含んで成る組成物を、結合に適する条件下に維持することができる。そのような条件下で、タンパク質を抗体または抗体フラグメントと接触させ、そして結合を直接的または間接的に検出する。１つの態様では、ＣＤ１８を自然に発現する細胞または哺乳動物ＣＤ１８またはそれらの変異体をコードする組換え核酸配列を含んで成る細胞を使用する。細胞はレセプターの発現に適する条件下で維持する。結合に適する条件下で（例えば適当な結合バッファー中）、細胞を抗体またはフラグメントと接触させ、そして結合を標準的な技法により検出する。
【００５０】
ＣＤ１８タンパク質または変異体と抗体または抗体フラグメントとの結合の程度は、適当な対照に対して決定することができる。対照との比較は、例えば抗体またはフラグメントの不存在を含むバックグラウンド条件下でＣＤ１８結合をアッセイすることを含んで成ることができ、あるいはＣＤ１８と第２抗体（例えばモノクローナル抗体１Ｂ４のようなＣＤ１８について既知の親和性を有する第２抗体）の結合に対して、ＣＤ１８と抗体／フラグメントの結合を比較することを含んで成ることができる。ＣＤ１８タンパク質を含んで成る細胞画分（例えば膜画分）またはＣＤ１８を含んで成る合成の組成物（例えばリポソーム）を、結合アッセイで全細胞の代わりに使用することができる。
【００５１】
１つの態様では、抗体またはフラグメントをＣＤ１８との結合能力を測定する前に適当な標識（例えば蛍光標識、アイソトープ標識、抗原もしくはエピトープ標識、酵素標識）で標識し、そして結合は標識を検出することにより測定する。別の態様では、結合した抗体はＣＤ１８結合能が評価される抗体またはフラグメントと特異的に反応する標識した第２抗体を使用して検出する。結合の特異性は、例えば幾つかの既知の方法に従い、競合物として標識もしくは非標識抗体またはリガンドを使用して競合もしくは置換により評価することができる。
【００５２】
結合阻害アッセイも、抗体またはフラグメントが抗−ＣＤ１８抗体であるかどうかを評価するために使用することができる。これらのアッセイでは、抗−ＣＤ１８抗体の結合が別の化合物とＣＤ１８との結合を阻害する。別の化合物は例えば、既知の特異性の抗−ＣＤ１８抗体またはＣＤ１８の既知のリガンド（例えばＩＣＡＭ−１およびＩＣＡＭ−２、またはこれらのいずれかを持つ細胞）またはＣＤ１８の機能的変異体であることができる。例えば結合アッセイでは、ＣＤ１８の既知のリガンド（例えばモノクローナル抗体１Ｂ４）の結合をＣＤ１８の未知の、または推定されるリガンドの結合と比較するように行うことができる。既知のリガンド／ＣＤ１８結合の程度の減少は、未知のまたは推定されるリガンドがＣＤ１８に特異的に結合することを示す。単離された、もしくは組換え哺乳動物ＣＤ１８またはそれらの機能的変異体を含んで成る組成物は、リガンドおよび抗体と同時またはいずれかの順序で連続して接触させることができる。
【００５３】
抗−ＣＤ１８抗体の存在を同定する他の方法を使用することができ、そして当該技術分野で知られている多数の抗体−エピトープ結合アッセイを含む。あるいはＣＤ１８と既知のもしくは推定される抗−ＣＤ１８抗体との間の結合は、既知のもしくは推定される抗−ＣＤ１８抗体の存在および不存在下で、ＣＤ１８とそれらの天然のリガンド（例えばＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、またはこれらのいずれかをその表面に発現する細胞）との間の結合に関係する生物学的機能を評価することにより選択的に評価することができる。例として、好中球が内皮細胞表面（例えば血管形成術を施した血管の管腔表面）に結合する能力は、既知のもしくは推定される抗−ＣＤ１８抗体の存在および不存在下で評価することができ、そして好中球のその場所への結合の阻害は、既知のもしくは推定される抗−ＣＤ１８抗体がＣＤ１８に結合することを示す。
走化性または細胞性刺激に関するアッセイ
走化性アッセイは、抗−ＣＤ１８抗体がリガンドと哺乳動物ＣＤ１８またはそれらの機能的変異体との結合を遮断する能力を評価するために使用することができる。そのようなアッセイは、抗−ＣＤ１８抗体がリガンドと哺乳動物ＣＤ１８との結合に関係する機能を阻害する能力を評価するためにも使用することができる。これらのアッセイは、化合物により誘導されるインビトロまたはインビボでの細胞の機能的移動に基づく。走化性は、例えば９６−ウェルの走化性プレートを使用するアッセイで、あるいは走化性を評価するための他の当該技術分野で既知の方法を使用して評価することができる。例えばインビトロの経内皮（ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）走化性アッセイの使用は、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．により記載されている（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９９４年９月１５日に公開された国際公開第９４／２０１４２号明細書、その内容は引用により本明細書に編入する；またＢｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．１７：６２５−６７７（１９８８）も参照にされたい）。内皮を渡ってコラーゲンゲルへの移動も記載された（Ｋａｖａｎａｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｍｏｌ．，１４６：４１４９−４１５６（１９９１））。例えばマウスＬ１．２ｐｒｅ−Ｂ細胞または走化性が可能な他の適当な宿主細胞の安定なトランスフェクション体を走化性アッセイに使用することができる。
【００５４】
一般に、走化性アッセイでは適当な細胞（白血球（例えばリンパ球、好酸球、好塩基球）のような）がバリアーの第１の表面から反対側の第２の表面に向かって、高レベルの化合物に向かうバリアー（例えば内皮、フィルター）中への、またはそれを通る方向性のある運動もしくは移動を監視する。膜またはフィルターは都合の良いバリアーを提供するので、適当な細胞がフィルターの第１の表面から反対側の第２の表面に向かって、高レベルの化合物に向かうフィルター中への、またはそれを通る方向性のある運動または移動が監視される。アッセイの中には膜をＩＣＡＭ−１、フィブロネクチンまたはコラーゲンのような接着し易い物質で被覆するものもある。そのようなアッセイは白血球の「ホーミング」のインビトロの近似を提供する。
【００５５】
例えば第１チャンバーから微孔性の膜中へ、またはそれを通って試験する抗体を含有し、そして膜により第１チャンバーから別れている第２チャンバーへの細胞の適当な容器中（手段を含有する）での移動の阻害を検出または測定することができる。化合物に反応した特異的な移動を監視するために、例えばニトロセルロース、ポリカーボネートを含む適当な孔サイズを有する適当な膜が選択される。例えば約３〜８ミクロン、そして好ましくは約５〜８ミクロンの孔サイズを使用することができる。孔サイズはフィルター上で均一であるか、または適当な孔サイズの範囲内であることができる。
【００５６】
移動および移動の阻害を評価するために、フィルター中への移動距離、フィルターの第２面に付いているフィルターを渡った細胞の数、第２チャンバー中に蓄積された細胞の数またはその両方を標準技法（例えば顕微鏡）を使用して測定することができる。１つの態様では、細胞は検出可能な標識（例えば放射性同位体、蛍光標識、抗原またはエピトープ標識）を用いて標識し、そして移動は抗−ＣＤ１８抗体の存在および不存在下で、適当な方法を使用して（例えば放射性、蛍光、イムノアッセイを検出することにより）、フィルターの膜に付いている標識の存在、第２チャンバー中の存在またはその両方を測定することにより評価する。抗−ＣＤ１８抗体により誘導されるか、または遅れる移動の程度は、適当な対照に対して測定することができる（例えば抗体の不存在下で測定されるバックグラウンドの移動と比較して、第２化合物（すなわち標準）により誘導される移動の程度と比較して、抗体により誘導される非−トランスフェクト細胞の移動と比較して）。
【００５７】
Ｔ細胞、単球または哺乳動物ＣＤ１８を発現している細胞に有用である１つの態様では、経内皮移動を監視することができる。この態様では、内皮細胞層を通る通過（ｔｒａｎｓｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を評価する。この細胞層を調製するために内皮細胞は、内皮細胞を付着し易くするためにコラーゲン、フィブロネクチンまたは他の細胞外マトリックスタンパク質のような物質で場合により被覆した微孔性フィルターまたは膜上で培養することができる。好ましくは内皮細胞はコンフルエントな単層が形成されるまで培養する。単層形成のために種々の哺乳動物の内皮細胞を利用することができ、それらには例えば静脈、動脈またはヒトの臍帯静脈内皮細胞（クローンテックス（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）社、サンディエゴ、カリフォルニア州）のような微小血管内皮を含む。特定の哺乳動物レセプターに応答する走化性をアッセイするために、同じ哺乳動物の内皮細胞が好適である：しかしヘテロロガスな哺乳動物種または属に由来する内皮細胞も使用することができる。
【００５８】
一般にこのアッセイは、フィルターの第１の表面から反対側のフィルターの第２の表面に向かって、化合物のレベルが増す方に向かう細胞の膜またはフィルター中への、またはそれを通る方向性のある移動を検出することにより行われ、ここでフィルターは第１表面上に内皮細胞層を含む。方向性の移動は第１表面に隣接した領域から生じ、膜中へ、またはそれを通ってフィルターの反対側上にある化合物に向かう。第２表面に隣接する領域に存在する化合物の濃度は、第１表面に隣接する領域内より高い。
【００５９】
そのような移動で抗−ＣＤ１８抗体の効果を試験するために使用する１つの態様では、移動することができ、しかも哺乳動物ＣＤ１８を発現する細胞を含んで成る組成物を第１チャンバーに配置する。第１チャンバー中の細胞に走化性を誘導することができる１以上のリガンドまたは促進因子（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を含んで成る組成物（誘引機能を有する）を、第２チャンバーに配置する。好ましくは細胞を第１チャンバーに配置する直前に、または細胞の配置と同時に、試験する抗−ＣＤ１８抗体を含んで成る組成物を好ましくは第１チャンバー内に配置する。このアッセイで哺乳動物ＣＤ１８を含有するタンパク質に結合し、そしてリガンドまたは促進因子により哺乳動物ＣＤ１８を発現している細胞の走化性の誘導を阻害する抗−ＣＤ１８抗体は、ＣＤ１８を含有するタンパク質が誘導する機能のインヒビターである（例えば刺激機能のインヒビター）。抗−ＣＤ１８抗体の存在下でリガンドまたは促進因子により誘導される移動の程度における減少は、阻害活性の指標である。別の結合実験（上記を参照にされたい）を行って、阻害が抗体のＣＤ１８を含有するタンパク質への結合の結果であるか、または異なるメカニズムを介して起こるのかを決定することができた。
【００６０】
組織に化合物（例えばケモカインまたは抗体）を注入することに反応して、組織中への、組織を通る、または組織内の白血球浸潤を監視するインビボアッセイを以下に記載する（炎症のモデルを参照にされたい）。これらのインビボホーミングのモデルは、炎症の部位への移出（ｅｍｉｇｒａｔｉｏｎ）および走化性により細胞がリガンドまたは促進因子に応答する能力を測定し、そして抗−ＣＤ１８抗体がこの移出を阻害または遮断する能力を評価する。
【００６１】
記載した方法に加えて、抗体またはフラグメントのＣＤ１８の刺激機能に及ぼす効果は、レセプターを含有する適当な宿主細胞を使用して活性なレセプターにより誘導される細胞性の応答を監視することにより評価することができる。
哺乳動物ＣＤ１８機能のさらなるリガンド、インヒビターおよび／または促進因子の同定
本明細書に記載する抗−ＣＤ１８抗体の結合および機能を評価するために使用することができる上記のアッセイは、哺乳動物ＣＤ１８またはそれらの機能的変異体に結合するさらなるリガンドまたは他の物質、ならびに哺乳動物ＣＤ１８機能のインヒビターおよび／または促進因子を同定するために適合させることができる。例えば抗−ＣＤ１８抗体の結合特異性（例えばモノクローナル抗体１Ｂ４）と同じかまたは類似の特異性を有する作用物質は、抗体を含む競合アッセイを使用して同定することができる。このように本発明はまた、哺乳動物ＣＤ１８タンパク質に結合するリガンドまたは他の物質、ならびにＣＤ１８およびＣＤ１８を含有するタンパク質機能のインヒビター（例えばアンタゴニスト）または促進因子（例えばアゴニスト）を同定する方法も包含する。１つの態様では、哺乳動物ＣＤ１８タンパク質またはそれらの機能的変異体を有する細胞（例えば白血球、該細胞中に導入された該核酸によりコードされる哺乳動物ＣＤ１８タンパク質または機能的変異体を発現するように操作された細胞系または適当な宿主細胞）をこのアッセイに使用して、ＣＤ１８またはＣＤ１８を含有するタンパク質に結合するリガンドまたは他の物質の効力を同定し、そして評価する。そのような細胞も、発現したタンパク質またはポリペプチドの（あるいはもちろん、細胞が自然に発現するＣＤ１８の）機能を評価するために有用である。
【００６２】
本発明に従い、ＣＤ１８またはＣＤ１８を含有するタンパク質に結合するリガンドまたは他の物質、およびそのようなタンパク質の機能のインヒビターおよび促進因子を、適当なアッセイで同定し、そしてさらに治療的効果を評価することができる。レセプター機能のインヒビターを使用してＣＤ１８またはＣＤ１８を含有するタンパク質活性を阻害（低下または防止）することができ、そしてリガンドおよび／または促進因子を使用して、示される場合は正常なＣＤ１８またはＣＤ１８を含有するタンパク質機能を誘導（誘起または強化）することができる。これらのインヒビターは、自己免疫疾患および移植拒絶を含む炎症性疾患を処置する方法に使用することができ、この方法はＣＤ１８またはＣＤ１８を含有するタンパク質機能のインヒビターを個体（例えば哺乳動物）に投与することを含んで成る。本明細書に記載するように同定されたリガンドおよび／または促進因子は、タンパク質機能の新規リガンドまたは促進因子を個体に投与することによりＣＤ１８またはＣＤ１８を含有するタンパク質機能の刺激法に使用することができ、例えば感染性疾患およびガンの処置において有用である白血球機能を選択的に刺激するための新規取り組みを提供する。
【００６３】
本明細書で使用するように、哺乳動物ＣＤ１８タンパク質の「リガンド」とは天然のリガンドおよび天然のリガンドの合成の形態、組換え体またはその両方を含め、哺乳動物ＣＤ１８タンパク質と結合する特定の種類の物質を称する。哺乳動物ＣＤ１８−陽性細胞に親和性を有する感染源も哺乳動物ＣＤ１８タンパク質に結合することができる。好適な態様では、哺乳動物ＣＤ１８タンパク質のリガンド結合は高い親和性で起こる。
【００６４】
本明細書で使用するように、「インヒビター」は哺乳動物ＣＤ１８タンパク質に特徴的な少なくとも１つの機能（例えばヒトＣＤ１８：例えば走化性の刺激、エキソサイトーシスまたは白血球による炎症メディエータの放出）を阻害（低下または防止）する物質である。用語インヒビターは、ＣＤ１８またはＣＤ１８を含有するタンパク質に結合するアンタゴニストを含む物質（例えば、抗体、天然のリガンドの突然変異体、低分子量有機分子、リガンド結合の他の競合インヒビター）、およびＣＤ１８またはＣＤ１８を含有するタンパク質機能をそれらに結合せずに阻害する物質（例えば抗−イディオタイプ抗体）を称する。
【００６５】
本明細書で使用するように、「促進因子」は哺乳動物ＣＤ１８タンパク質に特徴的な少なくとも１つの機能を促進（誘導し、引き起こし、強化し、または増加する）する物質である（例えばヒトＣＤ１８：例えば走化性の刺激、エキソサイトーシスまたは白血球による炎症メディエータの放出）。用語促進因子は、ＣＤ１８またはＣＤ１８を含有するタンパク質に結合するアゴニストを含む物質（例えば、抗体、他の種に由来する天然のリガンドの相同体）、およびＣＤ１８またはＣＤ１８を含有するタンパク質機能をそれらに結合せずに促進する物質（例えば会合タンパク質の活性化による）を称する。好適な態様では、アゴニストは天然のリガンドの相同体以外である。
【００６６】
このように本発明は、例えばリガンド、インヒビター、促進因子および哺乳動物ＣＤ１８レセプターまたはそれらの機能的変異体に結合する他の物質を含む、哺乳動物ＣＤ１８タンパク質と結合する作用物質を検出または同定する方法にも関する。この方法に従い、試験する作用物質、本明細書に記載する抗−ＣＤ１８抗体（例えば１Ｂ４、１Ｂ４と同じかまたは類似するエピトープ特異性を有する抗体、およびそれらのＣＤ１８−結合フラグメント）、および哺乳動物ＣＤ１８タンパク質、ＣＤ１８を含有するタンパク質、またはそれらのリガンド結合変異体を含んで成る組成物を、抗−ＣＤ１８抗体がタンパク質に結合するために適する条件下で合わせ、そして抗体とタンパク質との結合を本明細書に記載する方法または他の適当な方法に従い直接的または間接的に評価する。適当な対照（例えば試験する作用物質の不存在下）に比べて、形成された複合体の量が低下すれば、作用物質が該レセプターまたは変異体に結合することを示す。タンパク質を含んで成る組成物は、タンパク質を持つ、または含んで成る細胞の膜画分であることができる。抗−ＣＤ１８抗体を放射性同位体、スピン標識、抗原またはエピトープ標識、酵素標識、蛍光基または化学発光基を用いて標識することができる。
【００６７】
上記のアッセイは、単独で、あるいは各々または他の適当な方法を組み合わせて使用して、哺乳動物ＣＤ１８タンパク質に結合するリガンドまたは他の物質、および哺乳動物ＣＤ１８タンパク質または変異体のインヒビターまたは促進因子を同定することができる。本発明のインビトロ法を高処理量スクリーニングに適用させ、ここで多数のサンプルを処理することができる（例えば９６−ウェル形式）。高処理量スクリーニングに適当なレベルで哺乳動物ＣＤ１８（例えばヒトＣＤ１８）を発現している細胞を使用することができ、すなわちこれらの細胞は哺乳動物ＣＤ１８タンパク質のレセプターに結合するリガンドまたは他の物質、およびインヒビターまたは促進因子を同定および／または単離するために大変価値がある。ＣＤ１８またはＣＤ１８を含有するタンパク質の発現は、種々の方法で監視することができる。例えば発現はそのようなタンパク質に結合する本発明の抗体を使用して監視することができる。また市販されている抗体を使用して、ＣＤ１８を含んで成る抗原−またはエピトープ−標識した融合タンパク質（例えばＦＬＡＧ標識レセプター）を検出することができ、そして所望のレベルで発現している細胞を選択できる。
【００６８】
哺乳動物ＣＤ１８タンパク質またはそれらの機能的変異体をコードする核酸を発現系に組み込んで、ＣＤ１８タンパク質またはＣＤ１８を含有するタンパク質を生成することができる。哺乳動物ＣＤ１８タンパク質または変異体をコードする組換え核酸を含んで成る構築物で安定に、または一時的にトランスフェクトされた細胞中で、あるいはレセプターを含有する細胞画分中（例えば、トランスフェクトされた細胞に由来する膜画分、タンパク質を取り込んだリポソーム）で発現されるタンパク質のような単離された、組換えの、またはその両方のＣＤ１８タンパク質、ＣＤ１８を含有するタンパク質、またはこれら１つの変異体は、ＣＤ１８機能に関する試験に使用することができる。所望によりタンパク質はさらに精製することができる。ＣＤ１８機能の試験は、インビトロまたはインビボで行うことができる。
【００６９】
単離された、組換えの、またはその両方のヒトＣＤ１８のような哺乳動物ＣＤ１８タンパク質、ＣＤ１８を含有するタンパク質またはこれらの１つの機能的変異体は、本発明の方法に使用することができ、ここで化合物の効果が本明細書に記載するレセプター機能を監視することにより、または他の適当な技法を使用して評価される。例えば安定なまたは一過性のトランスフェクション体（例えばバキュロウイルスが感染したＳｆ９細胞、マウスＬ１．２ｐｒｅ−Ｂ細胞の安定なトランスフェクション体）を結合アッセイに使用することができる。例えば走化性アッセイには、Ｊｕｒｋａｔ 細胞または走化性となることができる他の適当な細胞の安定なトランスフェクション体（例えばマウスＬ１．２ｐｒｅ−Ｂ細胞）を使用することができる。
【００７０】
本発明の方法に従い、化合物は個別にスクリーニングされることができ、または１以上の化合物を本明細書の方法に従い同時に試験することができる。化合物の混合物を試験する場合、記載する工程により選択される化合物を（適当に）分離し、そして適当な方法（例えばＰＣＲ、シークエンシング、クロマトグラフィー、質量分析）により同定することができる。試験サンプル中の１以上の化合物（例えばリガンド、インヒビター、促進因子）の存在も、これらの方法に従い決定することができる。
【００７１】
組み合わせ化学合成または他の方法により生成される化合物の大きな組み合わせライブラリー（例えば有機化合物、組換えまたは合成ペプチド、「ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄｓ）」、核酸）を試験することができる（例えばＺｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７：２６７８−２６８５（１９９４）およびそこに引用されている技術文献を参照にされたい；またＯｈｌｍｅｙｅｒ，Ｍ．Ｈ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：１０９２２−１０９２６（１９９３）および標識した化合物に関してＤｅＷｉｔｔ，Ｓ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９−６９１３（１９９３）；Ｒｕｔｔｅｒ，Ｗ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．米国特許第５，０１０，１７５号明細書；Ｈｕｅｂｅｎｅｒ，Ｖ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１８２，３６６号明細書；およびＧｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．、米国特許第４，８３３，０９２号明細書を参照にされたい）。本方法により組み合わせライブラリーから選択される化合物が独自の標識を持つ場合、クロマトグラフィー法による個々の化合物の同定が可能である。
【００７２】
１つの態様では、ファージ展示法を使用する。例えば哺乳動物ＣＤ１８タンパク質、ＣＤ１８を含有するタンパク質またはこれらの１つの機能的変異体、抗−ＣＤ１８抗体、およびポリペプチドを展示するファージ（例えば単一ファージ、またはライブラリーのような複数または多様（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ）なファージ）を、抗体がＣＤ１８を含有するタンパク質／変異体と結合するために適当な条件下で混合することができる（例えば適当な結合バッファー中で）。抗体と競合し、そしてタンパク質と結合することができるファージは標準的な技法または他の適当な方法を使用して検出または選択することができる。結合したファージは適当な溶出バッファーを使用してレセプターから離すことができる。例えばイオン強度またはｐＨの変化によりファージの放出を導くことができる。あるいは溶出バッファーは放出成分を含んで成ることができ、または成分は化合物（例えば結合を競合的に阻害するリガンド、インヒビターおよび／または促進因子のような展示するペプチドとＣＤ１８を含有するタンパク質／変異体との結合を破壊することができる１以上の化合物）との結合が破壊するように設計することができる。場合により選択工程を繰り返すことができ、または他の選択工程を使用してタンパク質／変異体と結合するファージをさらに濃縮することができる。展示されたポリペプチドを特性決定することができる（例えばファージＤＮＡをシークエンシングすることにより）。同定されたポリペプチドを生成し、そしてさらに結合について、そしてインヒビターまたは促進因子の機能について試験することができる。安定性が増大し、または他の所望の特性を有するそのようなペプチドの同族体を生成することができる。
【００７３】
１つの態様では、無作為の配列の核酸によりコードされるアミノ−末端ペプチドを持つコートタンパク質を含んで成る融合タンパク質を発現し、そして展示するファージを生成することができる。ＣＤ１８を含有するタンパク質／変異体を発現する適当な宿主細胞および抗−ＣＤ１８抗体をファージと合わせ、結合したファージを選択し、回収し、そして特性決定する。（Ｇタンパク質共役レセプターと使用されるファージ展示法を検討しているＤｏｏｒｂａｒ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４４：３６１（１９９４）、および１９９７年３月６日に公開された国際公開第９７／０８３２０号明細書（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）を参照にされたい）。
【００７４】
哺乳動物ＣＤ１８タンパク質に結合する有力なリガンドまたは他の物質、またはそのインヒビター、促進因子またはその両方の他の供給源には、限定するわけではないが、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、Ｃ３ｂｉ、第Ｘ因子、フィブリンおよびフィブリノーゲンの自然に存在する、合成の、または組換え変異体を含む既知のＣＤ１８リガンドの変異体、他の誘引物質またはケモカインのような物質、それらの変異体、低分子量有機分子、他のインヒビターおよび／または促進因子（例えば抗−ＣＤ１８抗体、アンタゴニスト、アゴニスト）、インヒビターおよび／または促進因子（例えばアンタゴニストまたはアゴニスト）、およびＣＤ１８機能を阻害することができる適当なレセプターペプチドまたは同族体のような哺乳動物ＣＤ１８の可溶性部分を含む。
炎症のモデル
治療薬としてインビボで抗−ＣＤ１８抗体の効果を評価するために使用することができる炎症のインビボモデルが利用可能である。例えば哺乳動物のＣＤ１８と反応性のケモカインおよび抗体またはそれらのフラグメントの、ウサギ、マウス、ラット、モルモットまたはアカゲザル（好ましくはカニクイザルのような霊長類）のような適当な動物への皮内注射で白血球の浸潤を監視することができる（例えばＶａｎ Ｄａｍｍｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：５９−６５（１９９２）；Ｚａｃｈａｒｉａｅ，Ｃ．Ｏ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７１：２１７７−２１８２（１９９０）：Ｊｏｓｅ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：８８１−８８７（１９９４）を参照にされたい）。１つの態様では、皮膚の生検を白血球の浸潤について組織学的に評価する（例えば好酸球、顆粒球）。別の態様では、走化性および管外遊出が可能な標識した細胞（例えば１１１Ｉｎで標識した哺乳動物ＣＤ１８を発現している安定にトランスフェクトされた細胞）を動物に投与する。例えば評価する抗−ＣＤ１８抗体は、リガンドまたはアゴニストを試験動物に投与する前、同時または後のいずれかに投与することができる。インヒビターの不存在下での浸潤の程度と比べて、抗体の存在下での浸潤の程度の減少は、阻害の指標である。
診断、治療および予防法
Ｍａｃ−１白血球細胞−表面抗原（およびＬＦＡ−１、ｐ１５０，９５およびＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８のような他のＣＤ１８を含有するタンパク質）のＣＤ１８サブユニットに特異的に結合する分子が、白血球と血管内皮との相互作用を阻害することが見いだされた。そのような分子により阻害される相互作用には
・白血球と血管内皮との結合
・血管内皮を通る白血球の移動
・内膜血管組織への白血球の浸潤
・血管組織中の白血球から走化性因子の放出
・血管組織中の白血球から増殖因子の放出
・血管組織から、白血球の結合に付随する走化性因子の放出、および
・血管組織から、白血球の結合に付随する増殖因子の放出
を含む。
【００７５】
このようにＣＤ１８を含有するタンパク質（特にＣＤ１８を含有する白血球細胞表面抗原を含む）の相互作用を阻害するためにＣＤ１８に特異的に結合する分子を、このような白血球−血管内皮相互作用を阻害、防止または逆転させるために使用することができる。
【００７６】
本発明はこのように、哺乳動物の血管中の狭窄（再狭窄を含む）を抑制し、さらに防止する方法を含む。この方法は哺乳動物に、ＣＤ１８を含んで成る哺乳動物の少なくともＣＤ１８タンパク質部分に特異的に結合する抗−ＣＤ１８抗体を投与することを含んで成る。これにより哺乳動物の血管の狭窄が抑制される。実質的に同じ方法を使用して、哺乳動物の血管内の既往の狭窄および関連する障害を軽減することができる。例えばこの方法を使用してヒトの冠状および脳血管の狭窄または再狭窄を抑制または防止することができ、あるいはそのような血管内の既往の狭窄を軽減することができる。そのような狭窄に関連する症状および障害も同様に抑制、防止または軽減することができる。狭窄および再狭窄に付随する症状には、例えば狭窄した部位から上流または下流に位置する組織中の短期−および長期−の虚血、ならびに付随する疼痛および組織壊死を含む。狭窄に関係する障害の例には、狭窄の存在によりもたらされ得る障害（例えば心筋梗塞）および狭窄が単なる障害の症状である障害（例えば高コレステロール血症および付随するアテローム硬化症）の両方を含む。
【００７７】
本明細書に記載する方法を使用して抑制し、防止し、または軽減することができる狭窄には、外科的、血管形成的または血管内皮を混乱される他の意図的な介入を含む。そのような介入の例には、例えば血管撮影法、血管形成術（例えば、バルーン、アテレクトミー、レーザー血管形成術またはロタブレーション（ｒｏｔａｂｌａｔｉｏｎ）およびステント留置を含む、または含まない他の適当な方法）、動脈内膜切除術、冠状動脈バイパス術、ステント留置（例えば血管内ステント、冠状ステント）、他の血管介入法（例えば血管外科医術、血管移植、末梢ステントの散開（ｄｅｐｌｏｙｍｅｎｔ））、補綴バルブまたは管の挿入（例えば自己、非−自己または合成血管移植）、臓器、組織または細胞の移植、および静脈内近接照射療法を含む。特別な観点では、この方法を使用して経皮経管的冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）のような冠状動脈介入術、あるいはステントの留置を含む血管介入術（例えばＰＴＣＡに続いて１以上の冠状動脈を含む血管内ステントの留置）後に起こる狭窄または再狭窄を抑制、防止、または軽減するために使用することができる。
【００７８】
本明細書に記載する方法を使用して抑制、防止または軽減することができる狭窄症を導き得る種類の血管内皮の混乱には、例えば血管内皮の露出、血管組織層の他の血管組織層からの切開（例えば内皮、内膜、弾性層等）、血管の内膜組織層の破壊、および血管組織層の意図的な切開（例えば切断（ｃｕｔｔｉｎｇ）血管形成バルーンを使用する）を含む。
【００７９】
種々の既知の方法を使用して患者の血管傷害を診断することができる。そのような方法の例には、血管の特定領域を通って流れる染料のＸ−線透視検査、臨床的判断に基づく疼痛のような症状の存在、または身体検査により示される兆候を含む。あるいは傷害は上で検討した外科的または他の意図的な血管介入の１つを行うと生じるか、あるいは患者の血管の混乱（例えばアテローム硬化症）に伴うことが知られている疾患または障害の診断後に生じると思われる。
【００８０】
これらの狭窄を抑制し、そして軽減する方法で使用することができる抗−ＣＤ１８抗体（１つまたは複数）は、本明細書に記載する実質的に任意の抗−ＣＤ１８抗体であることができる。例えば抗体はモノクローナル抗体１Ｂ４または１Ｂ４と同じエピトープ特異性を表す抗体（すなわち１Ｂ４が結合するＣＤ１８の同じエピトープと特異的結合する）であることができる。このように１つの態様では、使用する抗体は実質的ＣＤ１８を含有するタンパク質のＣＤ１８部分にのみ特異的に結合する（例えば実質的にＭａｃ−１白血球細胞−表面抗原のＣＤ１８サブユニットにのみ結合する）。
【００８１】
特定の操作理論に拘束されないが、抗−ＣＤ１８抗体とＣＤ１８を含有するタンパク質との結合はタンパク質の天然のリガンドとタンパク質との結合を阻害すると考えられる（例えばＭａｃ−１とＩＣＡＭ−１との結合が阻害され得る）。ＣＤ１８を含有するタンパク質とそれらの天然のリガンドとの結合の阻害は、通常、そのような結合に付随する生理学的効果（例えば白血球の血管内皮への付着）を抑制する。生理学的効果が狭窄に関係する時、狭窄は生理学的効果を阻害することにより抑制、防止または軽減される。すなわち、抗−ＣＤ１８抗体の狭窄およびそれらに付随する症状および障害に及ぼす阻害／防止／軽減効果は、白血球の細胞表面ＣＤ１８含有タンパク質と血管細胞の表面上の、血管細胞の周囲の細胞外マトリックス中、またはその両方のレセプター分子との間の結合により媒介される、白血球と内皮および内膜血管組織細胞との間の相互作用の阻害に起因し得る。
【００８２】
抗−ＣＤ１８抗体による好中球と血管細胞（特に血管内皮細胞）との間の相互作用の阻害が、そのような抗体を投与することに起因し得る有意な程度の抗−狭窄効果の原因であると考えられる。それでもなおＣＤ１８を含有するタンパク質は、リンパ球、単球、顆粒球、Ｔ細胞および好塩基球を含む他の白血球の細胞表面上に生じると認識されている。ＣＤ１８を含有するタンパク質と結合することにより、抗−ＣＤ１８抗体はこれらの細胞の狭窄症に関連する症状および障害への貢献を阻害することができ、そしてさらにこれらの細胞の狭窄症自体への貢献も阻害できる。
【００８３】
本明細書に記載する方法の操作性はその操作性を説明するために示された理論に依存しないが、以下は真実であると考えられる。インテグリンはＣＤ１８を含む種類の白血球の細胞表面タンパク質であると認識されている。各インテグリンはＣＤ１１アイソタイプ（すなわちＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１１ｄの１つ）単量体およびＣＤ１８単量体から成るヘテロ二量体である。インテグリンは他の細胞の細胞−表面タンパク質および細胞外マトリックスのタンパク質と特異的に結合する。インテグリンが特異的に結合すると知られているタンパク質には、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、Ｃ３ｂｉ、第Ｘ因子、フィブリンおよびフィブリノーゲンを含む。例えばＭａｃ−１抗原（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）は、ＩＣＡＭ−１、Ｃ３ｂｉ、第Ｘ因子、フィブリンおよびフィブリノーゲンに特異的に結合することが知られている。抗−ＣＤ１８抗体とインテグリンとの結合は、インテグリンと１以上のこれらの因子との間の結合を阻害することができ、その幾つかは血管の細胞外マトリックスおよび血管細胞の表面上（血管内皮細胞を含む）で起こる。インテグリンと１以上のこれらのリガンドの結合が白血球と血管組織との結合を促進する限り、血管組織を通るまたはその中への白血球の浸潤、白血球または血管細胞のいずれかからの走化性（誘引物質またはケモリペラント）因子または増殖因子の放出、あるいは狭窄症に関連する他の症状は、そのような結合の阻害がそのような症状を軽減し、抑制し、さらに逆転する。
【００８４】
本明細書に記載する抗−ＣＤ１８抗体は、狭窄の処置後に再狭窄が再発するかまたは再発する危機にある血管を含む、狭窄が生じる実質的に任意の哺乳動物の血管中の狭窄を処置するために使用することができる（例えば、通常のまたは切断バルーン血管形成術を使用する経皮経管的冠状動脈形成術の後の冠状動脈で）。哺乳動物の血管は好ましくはヒトの血管、特にヒトまたはヒト化抗体（例えばモノクローナル抗体１Ｂ４）が使用される時のヒトの血管である。
【００８５】
狭窄（および再狭窄）がよく起こる血管には、外科的または血管形成術的介入により、または外傷的傷害（押し潰される（ｃｒｕｓｈｉｎｇ）種類の傷を含む）によるような血管内皮が外傷的に混乱した血管を含む。外傷的に混乱した内皮を有する血管の例には、互いに移植した血管（すなわち、移植する切片の起源および宿主の同一性（１つまたは複数）にかかわらず、移植された管切片および移植される切片の両方を含む）、外科的に穿刺または切り込みを入れられた血管、中で血管形成バルーンまたは他の膨張手段が膨張した血管、血管の一部または血管中のプラークまたは他の障害物を除去するためにレーザー血管形成術を施した部分を含んで成る血管、ステントが留置された血管等を含む。
【００８６】
狭窄は内皮への外傷的傷害を経験しなかった血管でも起こることが知られているが、ここでは内皮の漸進的悪化または分解が起こり、しばしば内膜の肥厚化、細胞、脂質、ミネラルまたは他の細胞外材料または両方の蓄積が伴う。血管内皮の漸進的分解を導く疾患の例には、アテローム硬化症および動脈硬化を含む。アテローム硬化症は少なくとも一部は血管内皮の傷害部位への白血球の局在化に起因し、続いてプラーク形成、そして最終的に狭窄すると考えられ、本明細書に記載する防止および治療法は狭窄が起こる前に、あるいは疾患の大変早い段階でアテローム硬化症を抑制または防止するために使用することができる。さらにそれらの治療法は、例えばアテローム硬化症のプラークの収縮または消散を誘導することにより、および血管内皮の傷害部位への白血球の局在化を阻害することにより既往のアテローム硬化症を軽減するために使用することができる。すなわち狭窄の「抑制、防止または軽減」には、この障害のさらに比較的早期の段階（切迫した狭窄症が起こるはるか以前に）で、アテローム硬化症の抑制、防止または軽減を含む。
【００８７】
本明細書に記載する治療および防止法は、狭窄（または再狭窄）が起こる実質的に任意の血管の狭窄を抑制、防止または軽減するために使用することができ、この方法には白血球と血管組織との相互作用に無関係であると思われる大動脈根および大動脈弁狭窄症のような先天的な狭窄症に必ずしも応用できるとは限らないと理解される。例えば本明細書に記載する方法は、冠状および脳血管の狭窄症を処置し、防止し、または抑制するために使用することができる。
【００８８】
本明細書に記載する治療的および防止的方法に使用する抗−ＣＤ１８抗体は、本開示に記載する任意の種類の抗−ＣＤ１８抗体であることができる。例えば全抗体を使用することができる（例えば、ヒトＣＤ１８に特異的に結合する単離されたマウス抗体）。あるいは抗−ＣＤ１８抗体は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂＮ）２フラグメントのような全抗体のフラグメントであることができる。抗−ＣＤ１８抗体はヒトから、非ヒト哺乳動物から、非ヒト脊椎動物から、ランダムまたは合成抗体のライブラリーから単離された抗体であることができる。さらに抗−ＣＤ１８抗体は異なる起源から得たセグメントを含んで成る抗体であることができる（すなわちキメラ抗体）。例として、抗体はＣＤ１８に特異的に結合するマウス抗体と同じ領域のアミノ酸配列を有する相補性決定領域を有することができ；同じ抗体は１以上のヒト抗体またはコンセンサスなヒト抗体配列に由来するアミノ酸配列を有する非−相補性決定領域（構造的、枠組または定常領域とも言われる）を有することができる。この抗体はヒト化抗体の例でもある（すなわち、抗体の少なくとも一部は非ヒト起源に由来するが、抗体の少なくとも他の部分はそのアミノ酸配列という意味でヒト抗体により一層近い抗体となるように修飾された抗体）。本明細書に記載した方法または当該技術分野で既知の、または今後開発される方法を使用して、ヒト化される抗−ＣＤ１８抗体は本開示で記載する任意の方法に使用することができる。
【００８９】
本明細書に記載する方法に従い抗−ＣＤ１８抗体を哺乳動物に投与するために使用する経路および方法は、重要ではない。必要なすべてのことは、抗−ＣＤ１８抗体が非−変性状態で作用すべき血管の細胞（１つまたは複数）または組織（１つまたは複数）に、あるいは血管の細胞（１つまたは複数）または組織（１つまたは複数）と接触し得る白血球に提供されることである。すなわち抗−ＣＤ１８抗体を血管組織（例えば血管内膜組織または血管内皮組織）に、組織への注射により、または組織を外科的に露出した後に組織に局所的に適用することにより直接提供することができる。あるいは、そして好ましくは抗−ＣＤ１８抗体は、抗−ＣＤ１８抗体を血流に提供することにより哺乳動物に投与することができ、そこから抗体はＣＤ１８を含有するタンパク質に血流中に存在する白血球の表面で結合することができる。抗−ＣＤ１８抗体をリンパへ、脾臓へ、胸腺へ、または哺乳動物中で白血球を見いだすことができる他の部位への投与も使用することができる。
【００９０】
可能な場合は、抗−ＣＤ１８抗体の哺乳動物の血流への提供は好ましくは血管内皮の破壊前に行う（例えば哺乳動物の血管中の外科的または血管形成的介入の前）。しかし抗−ＣＤ１８抗体は、血管内皮の破壊時に、またはさらにそれらのかなり後でも、特に軽減される狭窄障害が進行中の障害であるか、処置前のかなりの期間に検出できない障害である時（例えばアテローム硬化症）でも哺乳動物に投与することができる。すなわち抗−ＣＤ１８抗体は、血管組織の傷害前、最中または後に投与することができる。
【００９１】
哺乳動物の血中の抗−ＣＤ１８抗体濃度は、ＣＤ１８を含有する白血球細胞表面抗原の実質的にすべて、または少なくとも大部分の画分（すなわち、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以上）が、少なくとも１つの抗体のコピーで占有されていることを維持するために十分なレベルで維持することが有利である。これは哺乳動物に抗−ＣＤ１８抗体の多用量を投与することにより、または抗体の徐放性組成物を投与することにより達成することができる。抗体含量および投与時期は、日常的な実験により経験的に決定することができる。抗−ＣＤ１８抗体の半減期（すなわち機能的な寿命）は、投与される哺乳動物により通常生成される抗体に抗−ＣＤ１８抗体が似ているほど、長くなるだろう。すなわち哺乳動物がヒトである時、投与する必要がある抗−ＣＤ１８抗体の量、ならびに必要な投与頻度を下げるためにヒトまたはヒト化抗体を使用することが好ましい。
【００９２】
典型的には、効果的な量は成人１日あたり約０．０１ミリグラムから１日あたり約１００ミリグラムの範囲であることができる。好ましくは投薬範囲は１日あたり約１ミリグラムから１日あたり約１００ミリグラムの範囲である。抗体およびそれらの抗原−結合フラグメント、特にヒト、ヒト化およびキメラ抗体および抗原−結合フラグメントは、他の種類の治療薬よりも低い頻度で投与できることが多い。例えば抗体の効果的量は、１キログラムの体重あたり約０．０１ミリグラムから１キログラムの体重あたり約５〜１０ミリグラムの範囲で、毎日、毎週、隔週または毎月投与することができる。
【００９３】
本明細書に記載する１以上の抗−ＣＤ１８抗体を、抗体（１つまたは複数）および狭窄を抑制、防止または軽減するための１以上の抗体の投与を記載する使用説明書（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍａｔｅｒｉａｌ）を含むキットの状態で包装することができる。この使用説明書はさらに、例えば抗−ＣＤ１８抗体（１つまたは複数）を含んで成る医薬組成物に関して関連する投薬および投与情報を含むことができる。
【００９４】
本明細書に記載する抗−ＣＤ１８抗体は、ＣＤ１８を含有するタンパク質を持つ（すなわちそれらの表面上または細胞外の溶媒が接近できる位置に現す）細胞および組織を検出するために使用することができる。抗−ＣＤ１８抗体は、細胞および組織構造が自然に存在する方向から人工的に再配置されたサンプル（例えば細胞のホモジネート）中に、ＣＤ１８を含有するタンパク質を検出するためにも使用することができる。細胞、組織または体液（例えば血液）サンプル中のＣＤ１８を含有するタンパク質の検出は、そのようなタンパク質を持つ細胞（例えば白血球）の存在を示すことができる。抗−ＣＤ１８抗体は、抗体（および抗体が結合し得るタンパク質、細胞または組織）の検出を容易にするために、例えば蛍光、着色、酵素または放射性標識（例えばガンマ線を放射する放射性核種のようなガンマ照射線源）を用いて標識することができる。
【００９５】
ＣＤ１８を含有するタンパク質を持つ細胞の存在は、特にサンプルが採取された個体に関して通常よりも高いレベルで、あるいは狭窄症または狭窄症に関連する障害に罹患していない、発症中の、または発症すると前以て診断された患者で自然に起こるレベルより高いか、その範囲のレベルで、サンプルを採取した個体がそのような障害を発症すると前以て診断し、発症しているか、または現在罹患していることを示すことができる。医療現場の人に都合が良いように、このキットの成分（すなわち１以上の抗−ＣＤ１８抗体および使用説明書）は、個体から得たサンプル中にＣＤ１８を含有するタンパク質の存在を評価するキットの状態で包装することができる。
【００９６】
本明細書に記載する抗−ＣＤ１８抗体は、調査応用を含む様々な応用に有用である。１つの態様では、抗体を適当な標識（例えば蛍光標識、化学発光標識、同位体標識、抗原またはエピトープ標識または酵素標識）で標識する。例えば標識はＣＤ１８タンパク質、ＣＤ１８を含有するタンパク質、それらの天然の変異体またはそれらの部分を単離および／または精製し、そしてＣＤ１８構造（例えば立体配置）および機能を研究するために使用することができる。
【００９７】
さらに本発明の種々の抗体を使用してＣＤ１８を検出するか、または例えばＴ細胞（例えばＣＤ２６＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞）、好中球、好酸球上、あるいはレセプター遺伝子でトランスフェクトした細胞上のタンパク質発現を測定することができる。このように、診断または調査目的で抗体はセルソーティング（例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化セルソーティング）のような応用に用途を有する。
【００９８】
典型的には診断アッセイには、抗−ＣＤ１８抗体とＣＤ１８またはＣＤ１８を含有するタンパク質との結合から生じる複合体の形成を検出する必要がある。診断目的には、抗体（１つまたは複数）は標識するか、または非標識であることができる。例えば抗体は直接標識することができる。限定するわけではないが、放射性核種、フルオロホア、酵素、酵素基質、酵素のコファクター、酵素インヒビターおよびリガンド（例えばビオチン、ハプテン）を含め種々の標識を使用することができる。当業者には多数の適切なイムノアッセイが知られている（例えば米国特許第３，８１７，８２７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９０１，６５４号および同第４，０９８，８７６号明細書を参照にされたい）。非標識である時、抗−ＣＤ１８抗体は例えば凝集アッセイのように適当な手段を使用して検出することができる。非標識抗−ＣＤ１８抗体は、抗−ＣＤ１８抗体と特異的に結合する（例えば抗−イディオタイプ抗体または非標識免疫グロブリンに特異的な他の抗体）標識抗体（例えば第２抗体）のような抗体を検出するために使用することができる１以上の適当な試薬、あるいは他の適当な試薬（例えば標識プロテインＡ）と組み合わせて使用することができる。
【００９９】
１つの態様では、本明細書に記載する抗−ＣＤ１８抗体は酵素イムノアッセイに使用することができ、ここで主題の抗体またはそれと特異的に結合する抗体を酵素に連結する。哺乳動物のＣＤ１８タンパク質を含んで成る生物サンプルが抗体（１つまたは複数）と合わせられる時、抗−ＣＤ１８抗体とＣＤ１８タンパク質との間で結合が起こる。１つの態様では、ヒト血液のような哺乳動物のＣＤ１８タンパク質を発現している細胞を含有するサンプルと抗体と合わせ、そして抗体とヒトＣＤ１８タンパク質を持つ細胞との間に結合が起こる（すなわちエピトープを含んで成る細胞が抗−ＣＤ１８抗体に認識される）。これらの結合した細胞は非結合試薬と分けることができ、そして抗体に結合した細胞の存在は、例えばサンプルを、酵素が作用した時に色または他の検出可能な変化を生じる酵素の基質と接触させることにより測定することができる。別の態様では、主題の抗体は非標識であることができ、そして手段の抗体を認識する第２の標識した抗体を加えることができる。
【０１００】
生物サンプル中に哺乳動物のＣＤ１８タンパク質の存在を検出するために有用なキットも、本開示の観点で調製することができる。そのようなキットは、抗−ＣＤ１８抗体および抗体とＣＤ１８との間の複合体の存在を検出するために適する１以上の補助的な試薬を含む。抗体は凍結乾燥状態で、単独または他のエピトープと特異的に結合するさらなる抗体と組合わせて提供することができる。標識または非標識であることができる抗体は、付属の材料（例えばＴｒｉｓ、リン酸および炭酸バッファーのようなバッファー、安定化剤、賦形剤、殺生物剤、不活性タンパク質｛例えばウシ血清アルブミン｝、またはこれら幾つかの組み合わせ）と共にキットに含むことができる。例えば抗体は付属の材料との凍結乾燥混合物として提供することができ、または付属の材料は使用者が合わせるように別に提供することができる。一般にこれらの付属材料は、活性な抗体の量に基づき約５重量％未満で存在し、そして抗体濃度に基づき、少なくとも約０．００１重量％未満で存在し得る。キットに第２抗体が含まれる時、第２抗体は抗−ＣＤ１８抗体と特異的に結合することができ、第２抗体はキット中に例えば別のバイアルまたは容器中で提供され得る。第２抗体が存在するならば、それを標識することができ、そして上記の抗体配合物に類似する様式で配合することができる。
【０１０１】
同様に、本発明は細胞による哺乳動物ＣＤ１８またはＣＤ１８の部分の発現を検出および／または定量する方法に関する。この方法に従い、細胞またはそれらの画分（例えば膜画分）を含んで成る組成物を抗−ＣＤ１８抗体（例えばモノクローナル抗体１Ｂ４）と、抗体とタンパク質との結合に適する条件下で接触させ、そして結合を監視する。抗体の検出は抗体とＣＤ１８との間の複合体の形成の指標であり、タンパク質の存在を示す。抗体と細胞との結合は、例えば「結合アッセイ」の見出しの元で上記のように測定することができる。この方法を使用して個体から得た細胞上のＣＤ１８の発現を検出することができる（例えば血液、唾液または他の体液のようなサンプル中の）。Ｔ細胞または単球の表面上のＣＤ１８の発現レベルも、例えばフローサイトメトリーにより測定することができ、そして発現のレベル（例えば染色強度）を、疾患の疑い、進行または危険性と相関させることができる。
【０１０２】
本明細書に記載する抗−ＣＤ１８抗体の別の用途は、哺乳動物の血液から抗−ＣＤ１８抗体と特異的に結合する白血球を除去することである。個体の血流からそのような細胞を除去する（または少なくとも数を減らす）ことにより、個体の血管中の狭窄および関連する症状および障害を抑制、防止または軽減することができる。例として、抗−ＣＤ１８抗体を固体支持体に固定し、そして個体から得た血液を支持体と接触させた後（ここでＣＤ１８タンパク質を持つ細胞は支持体に結合する）、個体の血流に血液を戻すことができる。
投与モデル
本明細書に記載する１以上の抗−ＣＤ１８抗体は、単独または別の薬剤もしくは試薬と（事前に、同時に、または後に）組み合わせて、適切な経路により個体に投与することができる。例えば本発明の抗体は別のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と（例えば限定するわけではないが細胞表面免疫グロブリンレセプターおよびセレクチンを含む他の白血球細胞表面抗原に結合する抗体と組み合わせて）、または予防的もしくは治療的処置に使用する市販のガンマグロブリンおよび免疫グロブリン生成物のような既存の血漿生成物と組み合わせて使用することができる。抗−ＣＤ１８抗体は、抗生物質および／または抗微生物剤と一緒に与えられる別個に投与される組成物として使用することができる。抗−ＣＤ１８抗体は抗−ウイルス剤、免疫抑制剤（例えばシクロスポリンＡのようなカルシニューリンインヒビター；プレドニゾンまたはメチルプレドニゾロンのようなグルココルチコイド；およびアザチオプリンまたはマイコフェノール酸のような核酸合成インヒビター）、インターフェロンおよびＴｈ２−生産サイトカインのようなサイトカイン、および副腎皮質刺激ホルモンのようなホルモンと組み合わせて投与することもできる。
【０１０３】
効果的な量の抗体またはフラグメント（すなわち１以上の抗体またはフラグメント）を投与する。効果的な量は、ＣＤ１８機能の阻害に十分な量となるような所望の治療（予防を含む）効果を投与の条件下で達成するために十分な量であり、そしてこれによりヒトにおける狭窄症または狭窄症に関係する症状または障害を抑制、防止または軽減する。
【０１０４】
種々の投与経路が可能であり、それには必ずしも限定する必要はないが、処置する疾患または症状に応じて経口、食事、局所、非経口（例えば静脈内、動脈内、筋肉内、皮下注射）、吸入（例えば気管内、眼内、鼻内または経口吸入、点鼻）、眼内を含む。他の適当な投与法には、再充填可能または生分解性デバイスおよび緩効性ポリマーデバイスを含むこともできる。本発明の医薬組成物は他の薬剤との併用療法の一部として投与することもできる。
【０１０５】
投与すべき抗−ＣＤ１８抗体の製剤は、選択した投与経路および製剤（例えば溶液、乳液、カプセル）に従い変動するだろう。投与すべき抗−ＣＤ１８抗体を含んで成る適切な医薬組成物は、生理学的に許容される賦形剤またはキャリアー中に調製することができる。抗体の混合物を使用することもできる。溶液または乳液に適当なキャリアーは、例えば塩水および緩衝化媒質を含む水性またはアルコール性／水溶液、乳液または懸濁液を含む。好適な賦形剤は、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化リンゲルまたは固定油を含む。様々な適切な水性キャリアーが当業者には知られており、それらには水、緩衝水、緩衝塩水、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、デキストロース溶液およびグリシンを含む。静脈内賦形剤は種々の添加剤、保存剤または流体、栄養または電解質補充物を含むことができる（一般に、レミングトンの製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第１６版、Ｍａｃｋ、編集、１９８０を参照にされたい）。組成物は生理学的条件に近づけることが必要である時、ｐＨ調整剤および緩衝化剤および毒性調整剤のような場合により医薬的に許容される補助物質、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムおよび乳酸ナトリウムを含むことができる。本発明の抗−ＣＤ１８抗体フラグメントは保存用に凍結乾燥させ、そして技術的に既知の凍結乾燥および再構成技法に従い、使用前に適当なキャリアー中で再構成することができる。選択した媒質中の有効成分（１つまたは複数）の最適濃度は、当業者に周知な手法に従い経験的に決定することができ、そして最終的には所望する医薬製剤に依存するだろう。吸入には、抗体またはフラグメントを可溶化し、そして投与に適するディスペンサー（例えば噴霧器、ネブライザーまたは加圧型エアゾールディスペンサー）に充填することができる。
【０１０６】
冠詞“ａ”および“ａｎ”は、本明細書では１以上（すなわち少なくとも１）の名詞の文法的目的語を指すために使用する。例として「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は１以上の要素を意味する。
【０１０７】
これから本発明を以下の実施例を参照にして記載する。この実施例は具体的説明の目的でのみ与え、そして本発明は実施例により限定されることはないが、ここに提供する教示の結果として明白なすべての変更態様を包含する。
【０１０８】
【実施例】
この実施例で与える実験において、カニクイザルの再狭窄モデルでヒトＣＤ１８と特異的に結合するマウスモノクローナル抗−ＣＤ１８抗体の使用を評価した。
【０１０９】
カニクイザルは体重に基づき、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（Ｓ−Ｓ．１）として無関係なマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）および抗−ヒトＣＤ１８ｍＡｂ（１Ｂ４）のいずれかの処置を受ける群に無作為に分けた。動物には１−日目にｍＡｂの負荷用量を静脈内に投与し（ＩＶ）、続いて１〜１３日まで毎日ＳＣ注射を行った。１日目にすべての動物が再狭窄症のモデルとして両肢にバルーン血管形成術が誘導する腸骨大動脈内皮露出を行い、続いて静脈内ステントを留置した。動物は試験期間の終わりに安楽死させ、潅流固定を可能とし、そして腸骨大動脈および他の組織サンプルを集めた（表Ａを参照にされたい）。
【０１１０】
処置の効力はステント留置および実験の終了時に定量的な血管形成の使用、および腸骨大動脈組織の免疫組織学的および形態計測的評価により評価した。血液サンプルは血清ｍＡｂレベル（薬物動態学）、白血球ｍＡｂ結合（薬力学）、抗−ｍＡｂアンチグロビン応答（免疫原性）、ならびに血液学および血清化学（安全性）をアッセイするために周期的に集めた。安全性は試験期間中、注入中のバイタルサインおよび体重、臨床的所見および注射部位の所見を記録することによりさらに評価した。他の組織は正当な理由が生じるまで評価しなかった（表Ｂを参照にされたい）。
【０１１１】
【表１】
2004507448.tif 000002
【０１１２】
【表２】
2004507448.tif 000003
【０１１３】
ａ＝第３サンプルまで優先順位を決定する。１００μＬアリコートとして凍結（−７０℃）。
ｂ＝第１サンプルとして優先順位を決定する。
ｃ＝集めた第２サンプルまで優先順位を決定する。ミクロテイナー（ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ）を使用する。
ｄ＝第４サンプルまで優先順位を決定する。１つのアリコートとして残りの血清を凍結（−７０℃）。
特に記載しない限り、手順（バイタルサイン、血管形成およびＮｘ）は処置の前に行った。
略号：Ａｂｓ＝抗体；ＢＬ＝ベースライン；ＢＷ＝体重；Ｈｅｍ＝血液学；ＩＭＧ＝免疫原性；ｍＡｂ＝モノクローナル抗体；Ｎｘ＝安楽死、潅流および組織回収；ＰＤ＝薬力学；ＰＫ＝薬物動態学；前／後＝注入前および後；ＳＣ＝血清化学；Ｘ＝実施した。
疾患モデル
アテローム硬化症は脂質濃度が高い繊維−炎症プラークが冠状血管壁に蓄積し、管腔を塞ぎ、そして狭め（「狭窄し」）、これにより心臓組織への酸素を含む血液供給が制限され、そして急性の心筋疼痛および／または梗塞をもたらす疾患である。障害が起きた冠状血管に取り組む現在の医学的プラクティスには、経皮径管的冠状動脈形成術（ＰＣＴＡ）を介するバルーンカテーテルを用いた血管の機械的拡張、しばしばそれに続いて管腔の直径を維持するために血管内ステントの留置が関与する（１）。かなりの数の患者では、後期（より遅い）再狭窄ではこの手法の効果が制限される（２）。新内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ）過形成、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）増殖および浸潤性白血球が再狭窄の領域を特徴付ける。このプロセスに関与する可能なメカニズムには、血小板凝集（血栓症）、内皮細胞活性化およびＶＳＭＣ増殖および移動が関与する。アテローム硬化症および／または再狭窄症の様々な動物モデルがマウス、ラット、ウサギ、ブタおよび非ヒト霊長類（カニクイザルおよびヒヒ）のような種で開発された。この実験で使用する新内膜過形成、バルーン血管形成術が誘導する内皮の露出、それに続くステントの留置のモデルは、以前にウサギで使用され、再狭窄症に関与する幾つかのメカニズムを解明した（４）。
試験材料
１Ｂ４は、ヒト、非ヒト霊長類およびウサギの好中球上のＣＤ１８を認識するマウスＩｇＧ２ａ ｍＡｂである。１Ｂ４は抗体を生産する市販されている細胞系を使用して生成した（ＡＴＣＣ寄託番号 ＴＩＢ１０１６４）。Ｓ−Ｓ．１は、ヒトジの赤血球細胞Ｓ−Ｓ．１に対するマウスＩｇＧ２ａ ｍＡｂである。Ｓ−Ｓ．１は抗体を生産する市販されている細胞系を使用して生成し（ＡＴＣＣ寄託番号 ＴＩＢ１１１）、そして無関係なアイソタイプが合った対照抗体として使用する。
用量および投薬処方
用量および投薬処方は、それらが少なくとも１４日を通して白血球上のＣＤ１８の連続飽和を維持するために必要とされる用量より過剰な、頂点と谷の血清ｍＡｂ濃度をもたらすと思われるので選択した。中和サル抗−マウスｍＡｂアンチグロブリン（ＭＡＭＡ）応答がこれらの動物で発生し、そしてこれらの応答が血清または細胞に結合したｍＡｂレベル、そしてすなわちＰＫ、ＰＤおよび／または効力終点に影響を及ぼし得ると考えられる。
バイタルサインの監視
これらのｍＡｂは多くの他の抗体のように、初期注入中のサイトカインの放出、または沈殿ＡＤＣＣ（抗体−依存的な細胞性細胞傷害性）または補体が媒介する細胞溶解に関係する「第１−用量効果」を誘導する可能を有する。これらの効果は、通常は生命を脅かさない低血圧および気管支収縮のような一過性の悪い生理学的変化をもたらし得る。バイタルサインを監視することによりそのような変化の検出が可能である。
試験系
マウス抗−ヒトＣＤ１８ ｍＡｂもカニクイザルＣＤ１８に結合する。
動物数
この実験に使用した動物の数は、結果を評価するために十分な数であった。ウサギのモデルでは以前に４匹の動物／群で効力の検出が可能であったが（４）、サルでは血管傷害およびそれに対する応答においてより大きな程度の変動の可能性から、この実験では５匹の動物／群を使用することが適当であると考えた。
【０１１４】
この実施例で与えるこの実験で使用した試験動物および製剤は、これから以下に記載する。
特性決定
ｍＡｂ溶液は使用前に生化学的に特性決定した（表Ｃを参照にされたい）。
安定性
試験物のサンプルは、投薬が完了した試験部位から回収し、そして生化学的に特性決定した。元の特性決定に対してサンプル中の有意な変化は検出されなかった。
用量の配合法
使用する日（１または複数）に、凍結したｍＡｂ溶液の適当数のバイアルを室温とし、そして必要に応じて賦形剤（塩水）で適当な容量に希釈して、すべての動物にＩＶ（６０ｃｃのシリンジ中の３０ｍＬ）またはＳＣ（３ｃｃのシリンジで３ｍＬ）投与するために均一な全容量を提供した。解凍日をバイアル（１または複数）に記録した。未使用（解凍、開いた）のバルクなｍＡｂ溶液は後日（１または複数）使用するために冷蔵（２〜８℃）した。
用量配合サンプル
用量配合サンプルは回収しなかった。
廃棄
残った希釈した用量配合物は捨てた。
【０１１５】
【表３】
2004507448.tif 000004
【０１１６】
この実施例に与える実験で使用した試験系をこれから記載する。
動物
種：マカカ ファスシクラリス（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）
一般名：カニクイザル
動物数：１５
年齢および性別：若い−成体のオス
処置開始時の体重：〜４ｋｇ
起源および選択
動物は試験施設により認可された供給源から得た。動物は試験時に利用可能なものから選択し、そして獣医師により良好な健康状態であると測定された。すべての動物が隔離期間を完了し、そして各動物を独自の番号により識別した。この実験で使用したすべての動物は実験の終了時に安楽死させた。
動物の世話
試験施設は実験動物の世話の評価および認可に関する協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＡＡＡＬＡＣ））により認可され、そして米国農務省（ＵＳＤＡ）により、動物保護法（Ａｍｉｎａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ａｃｔ）、ＵＳＤＡ規制および国立調査審議会（ＵＳＤＡ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅａｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ：ＮＲＣ）のガイドラインに従い実験動物での調査を行うことを認められた（３、４、５）。本明細書に記載する動物の活動は試験施設の研究用の動物の世話および使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＩＡＣＵＣ）により見直され、そして認められた。
【０１１７】
動物管理、食事、水および環境条件は、ＮＲＣのガイドライン（１７）および試験施設の標準操作手順（ＳＯＰｓ）に従い行った。
【０１１８】
この実施例に与える実験で使用した材料および方法をこれから記載する。
無作為化
実験に適当であると思われる動物は、体重により処置群に無作為化し、そして各群内で連続する独自の確認番号を割り当てた。動物が処置を受けるために割り当てられる順序は、手法的な片寄りを最小にするために確認番号に基づき群間を回るようにした。
身体的拘束に対する順化
動物は身体的拘束のロープおよびカラー法に順化し、そして処置の開始前に霊長類の椅子に拘束した。
鎮静化
動物は、取り扱い、血液採取または他の技術的手法を行い易くするために、必要に応じて鎮静させた（実行するためにケタミンＨＣｌ、５〜１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）。
絶食
すべての食料は鎮静化または安楽死前、一晩は与えなかった。水は自由に与えた。
用量の算出
用量は１−日目の体重に基づき算出した。用量は処置期間を通じて維持した。
投薬
すべての処置は、イン−ラインまたはシリンジ−チップの低タンパク質−結合フィルターを使用して投与した。動物を霊長類の椅子に拘束している間、末梢静脈におかれた皮下カテーテルを介して、臨床用の注入ポンプを使用してＩＶ処置を投与した。
採血
血液サンプルは鎮静化させた動物から、大腿部静脈の直接的な静脈穿刺を介して集めた。採血は可能な時には左と右の大腿部静脈間で交互に行った。局所的な血管の外傷および出血が最少となるようにかなりの注意を払った。採血が困難な場合は個々のサンプルを回収しない事を許容し、局所的な血管外傷を誘導する可能性が示唆された（例えば血腫形成、動脈穿刺）。
併用療法
許容された獣医学的プラクティスによる併用療法は、獣医師により必要と見なされた場合に利用した。
動物の観察
体重はほぼ毎週記録した（表Ｂを参照にされたい）。瀕死および死亡に関するカゴからの観察を１日２回行った。
臨床所見
処置に関連する効果を示すための臨床所見は、１−日目の処置前の始め、および処置から１時間後に行い、そしてその後毎日行った。ＳＣ処置の日には、臨床所見は処置前に行った。
注射部位の所見
ＳＣ注射部位（肩甲骨間領域）は１日目の注射前の始めに観察し、そしてその後は毎日行った。この部位は腫れおよび／または紅斑について主観的に採点した（０＝なし、１＝軽度、２＝中度、３＝顕著）。
注入中のバイタルサインの監視
ＩＶ処置中、悪い反応の兆候についてバイタルサイン（心拍、呼吸速度、直腸温度および間接的血圧）を断続的に監視した。これらのパラメーターに関する代表的値を、注入前、注入中に１０分間隔で、そして終了時に記録した。
【０１１９】
悪い反応が起こった場合、処置を一時停止するか、または中断することができた。試験施設の獣医師は、実験指示者および／または実験のスポンサーの代表者に相談して、適切な治療があるならばそれを決定した。
血管形成術およびステント留置手法
抗凝固療法
動物はアスピリン（〜４０ｍｇ、経口）を毎日受容して抗凝固機能を提供し、そして３−日に始まるステント血栓症を最少にした。
抗生物療法
動物は、血管形成術の前１日に、ベンザチン／プロカイン／ペニシリンＧ（４２，０００ＩＵ／Ｋｇ、ＩＭ）の単回の予防的注射を受けた。
麻酔
動物に前−麻酔を行い（ケタミンＨＣｌ、１０ｍｇ／Ｋｇ、ＩＭ；アトロピン ＳＯ４、０．０４ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）、次いで挿管し、そしてイソフルラン吸入剤麻酔ガスで麻酔を維持した。
準備
動物は背もたれの状態で手術台に配置した。膀胱にカテーテルを挿入して尿の蓄積を防いだ。血管に接近する部位をクリップで挟み、そして無菌手術の準備をした。カテーテルを末梢静脈に配置して、流体を投与し易くした（乳酸化リンゲル溶液、５〜１０ｍＬ／ｋｇ／時間）。
ヘパリン処理
ヘパリン（１００Ｕ／ｋｇ、ＩＶ、初期に）は血管形成術前に投与して抗凝固を提供した。活性化凝血時間（ＡＣＴ）を周期的に監視し、そして血管形成術の間にＡＣＴ値＞２５０秒を維持するために必要なヘパリンをさらに投与した。
器具使用
右頸動脈を外科的に露出し、そして６Ｆｒ皮下血管挿入シース（例えばＣＰ−０７７１１、アロウインターナショナル（ＡＲＲＯＷ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、リーディング、ペンシルベニア州 １９６０５）を配置して静脈内にカテーテルを配置し易くした。
【０１２０】
透視装置のガイダンスを使用して、６Ｆｒゲージのカテーテルを遠位腹大動脈が右および左腸骨動脈に二股に別れるレベルに進めた。放射線不透過性の０．０１４インチのガイドワイヤ（例えば２２２２５Ｍ，アドバンスト カルジオバスキュラーシステムズ（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）社、テメキューラ、カリフォルニア州 ９２５９１）を使用して、ガイドカテーテルまたは必要ならば他のカテーテルが進行し易くした。必要ならば放射線不透過性のコントラスト媒質（例えばＯｍｎｉｐａｑｕ（商標）、イソヘキソール注射、コニメド（Ｎｙｃｏｍｅｄ）、プリンセトン、ニュージャージ州 ７５０３９）を使用して透視装置を使い易くした。
血管撮影のビデオテープ録画
定量的な血管形成に関して測定し易くするために、各動物について透視装置法をビデオテープに録画した。実験番号、実験日、動物番号および手順を確認する情報もビデオテープに録画した。
血管形成術前の血管撮影
血管形成術の前に、ニトログリセリン（５０μｇ、ＩＡ）を投与して、動脈拡大を誘導した。放射線不透過性のコントラスト媒質を投与して血管撮影をし易くした。
バルーン血管形成術を介する内皮の露出
血管に対して適当なサイズのバルーンを有するｎ８０ｃｍ、３Ｆｒ Ｆｏｇａｒｔｙ バルーン血栓切除カテーテル（例えば１２０８０３Ｆ、バクスターヘルスケア（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）社、イルバイン、カリフォルニア州 ９２７１４）を、ガイドカテーテルを介して大動脈の二肢に対して〜４ｃｍ遠位のレベルまで右腸骨大動脈に進めた。次いでバルーンを０．６ｃｃの空気で膨張させ、そして内皮を露出し易くするために大動脈の〜３ｃｍ区分にわたり膨張したまま引いた。バルーン血管形成は３回行った。この手順は次いで、反対側（左）の腸骨大動脈で繰り返し、そしてバルーン血栓切除カテーテルを引き出した。場合により、左腸骨大動脈を最初に露出し、続いて右を行った。
ステント留置
バルーン−膨張性の７−ｍｍステント（例えば１５−ｍｍ長のステントの半分（例えばＣＳ１５−０３０、Ｐａｌｍａｚ−Ｓｃｈａｔｚ（商標）クラウンバルーン−膨張性ステント、コルディス（Ｃｏｒｄｉｓ）社、マイアミ、フロリダ州 ３３１０２））を具備する適当なサイズの拡大カテーテル（ＳＬＸ（商標）コーティングを含むＮｉｎｊａ（商標）ＰＴＣＡ拡大カテーテル、コルディス（Ｃｏｒｄｉｓ）社、マイアミ、フロリダ州 ３３１０２）を、右腸骨大動脈に内皮露出の中点のレベルまで進めた。１．１〜１．２のバルーン／ステント：大動脈の比率（典型的には２．５，３．０または３．５ｍｍカテーテルについては６Ａｔｍ）を提供するために十分にステントを膨張するために必要な膨張圧までバルーンを膨張させた。バルーンを収縮させ、そしてカテーテルを引き出した。この手順を反対側（左）の腸骨大動脈で繰り返した。場合により、左腸骨大動脈に最初にステントを留置し、続いて右を行った。
血管形成術後の血管撮影
第２ステントの配置からおよそ１０分後、ニトログリセリン（５０μｇ、ＩＡ）を投与して、両大動脈の定量的血管撮影のために動脈拡大を誘導した。放射線不透過性のコントラスト媒質を投与して血管撮影をし易くした。
回収
血管導入器シースを取り出し、そして頸動脈を連結した。切開を適当な縫合糸で閉じた。動物を麻酔から回復させ、そしてそれらのカゴに戻した。
痛覚脱失法
動物は手順の完了後にブプレノルフィン（０．０１ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）の単回注射を受けた。
血管形成の追跡
麻酔
安楽死および動脈組織の回収前に（ＶＩＩＩ．Ｌ節を参照にされたい）、動物に前−麻酔をかけ（ケタミンＨＣｌ、１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ：アプロチンＳＯ４ ０．０４ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）、次いで挿管し、そしてイソフルラン吸入麻酔ガスで麻酔を維持した。
準備
動物は背もたれの状態で手術台に配置した。カテーテルを末梢静脈に配置した。切開部位をクリップで挟み、そして洗浄し；厳密な無菌はこの最終手術では必要ではなかった。
カテーテルの配置
ヘパリン（１５０Ｕ／ｋｇ、ＩＶ）を投与した。必要ならば放射線不透過性のコントラスト媒質を投与して透視し易くした。左頸動脈を外科的に露出し、そして６Ｆｒ皮下血管挿入器シースを配置した。透視装置の案内を使用して、６Ｆｒゲージのカテーテルを遠位腹大動脈が右および左腸骨動脈に二股に別れるレベルに進めた。ニトログリセリン（５０μｇ、ＩＡ）を投与した。放射線不透過性のコントラスト媒質を投与して血管撮影をし易くした。透視法は各動物についてビデオテープに記録し、定量的な血管形成を測定し易くした。
【０１２１】
大動脈組織の回収は以下のように行った。
安楽死
動物は血管形成術の追跡のためにすでに麻酔をかけていた（ＶＩＩＩ．Ｋ．１節を参照にされたい）。動物は米国動物獣医学協会（ＡＶＭＡ）のガイドライン（６）に従い、深い麻酔（ペントバルビタールナトリウム、３５ｍｇ／ｋｇ、ＩＶ）により安楽死させ、続いて放血させた。
潅流
中心線開腹切開を行い、そしてカニューレを下行腹大動脈に配置し、そして分岐のレベルまで進めた。腸骨大動脈に１００ｍＬの乳酸化リンゲル溶液を流し、続いて０．４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を〜５分間、１００ｍｍＨｇ圧で潅流した。
大動脈組織の切除
右および左腸骨大動脈は別個に摘出し、近位末端を識別し（例えば結びにより）、そして０．４％ＰＦＡに浸した。
限定的な粗い検死
動物は、外部身体および腹部および胸部腔の評価として定めた限定的な検死を受けた。
限定的な器官／組織採取
特定した器官および組織からの代表的サンプル（表Ｄを参照にされたい）を採取し、そして１０％の中性−緩衝化ホルマリンで組織病理学的評価のために固定するか、または包埋し、そして免疫組織学用にＯＣＴ中で凍結した。
2004507448.tif 000005
ａ＝目はデビッドソンの固定液に固定した。
ｂ＝すべての細胞計数は絶対値のみで報告した。他の細胞型（例えば前駆体細胞）が観察されれば計数した。他の形態学的特徴（例えばＲＢＣ染色特性）が存在すれば記載した。【０１２２】
サンプル処理は以下のように行った。
血液サンプル
血液学
血液サンプルは血液分析機を使用して分析した（表Ｅを参照にされたい）。血液スメアの特異形態は手動の顕微鏡で行った。
血清化学
血清サンプルは化学分析機を使用して分析した（表Ｆを参照にされたい）。
2004507448.tif 000006
ａ＝計算値
ｂ＝細胞計数は、絶対値でのみ報告した。他の他の細胞型（例えば前駆体細胞）が観察されれば計数した。他の形態学的特徴（例えばＲＢＣ染色特性）が存在すれば記載した。
2004507448.tif 000007
ａ＝計算値
さらなる分析用のサンプル
薬力学アッセイ用の血液サンプルおよび薬物動態学および免疫原性アッセイ用の血清サンプルを得た。
薬物動態学
血清治療剤１Ｂ４モノクローナル抗体（ｍＡｂ）レベルは、マウスＩｇＧに対する酵素−結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。簡単に説明すると、９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ＃４−３９４５４）は１００μｌのヤギ−抗−マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体（ジャクソン イムノリサーチ＃１１５−００５−０６８）を用いて、４０℃で炭酸バッファーｐＨ９．３中にて一晩、２．５μｇ／ｍｌで被覆した。プレートは続いて３回、ＰＢＳ０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、そして３００μｌのＰＢＳ／１％ＢＳＡで３７℃にて６０分間ブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでさらに３回洗浄した後、血清サンプルをＰＢＳ／１％ＢＳＡで１：１００に希釈し、そして１００μｌのアリコートをプレート中の二連のウェルに加えた。抗体標準（ＭＯＰＣ−２１、シグマ（Ｓｉｇｍａ））を５０ｎｇ／ｍｌに希釈し、そして１００μｌのアリコートをプレートに加えた。続いてすべてのサンプルはプレートをわたって２倍に希釈し、そして室温で２時間インキューベーションした。プレートは続いて再度ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、そして１００μｌのペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（ジャクソン イムノリサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）＃１１５−０３５−０６８）を３７５ｎｇ／ｍｌの濃度で加え、そして室温で２時間インキューベーションした。さらにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した後、プレートをＯＰＤ（シグマ）でクエン酸バッファーｐＨ５．０中で発色させ、そして９６ウェル蛍光プレートリーダー（ダイナテック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）ＭＲ４０００）で４９２ｎｍで分析した。抗体標準の希釈を使用して標準曲線を作成し、そして血清抗体濃度を標準曲線から自動的に導き、そして希釈因子データはＢｉｏｌｉｎｘ２．２２ソフトウェアを使用して提供した。
薬力学
標的の飽和
適当な白血球サブセット（好中球および単球）上の１Ｂ４標的（ＣＤ１８）の飽和を、フローサイトメトリーアッセイにより測定した。
１Ｂ４（抗−ＣＤ１８）を持つ循環している白血球の飽和の測定
血液は１Ｂ４の投与前および後に特定した間隔で試験動物からヘパリン中に集めた。全血のサンプルは過剰飽和量の１Ｂ４で（スパイク）または無しで染色した。血液サンプルはバッファー中で洗浄し、そしてＦＩＴＣ結合ヤギ−抗−マウスＩｇＧで染色した。ＦＩＴＣ−標識ビーズを用いたフローサイトメトリーの毎日の標準化後、ＦＩＴＣに対する均等な日ごとの感度を確実とするために、血液を塩化アンモニウム溶解液で溶解し、そしてリンパ球、単球および顆粒球群の蛍光を測定した。１Ｂ４投与による好中球または単球上のいずれかのＣＤ１８の飽和の程度は、１Ｂ４を加えなかったサンプルの平均チャンネル蛍光（ｍｅａｎ ｃｈａｎｎｅｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＭＣＦ）と１Ｂ４の加えたスパイクを有するサンプルとの間の差異により決定した。実際に、インビボに送達された１Ｂ４で被覆されていない細胞表面上の遊離ＣＤ１８は、外から加えた１Ｂ４により染色され、そしてスパイクしなかったサンプルの平均チャンネル蛍光はスパイクしたサンプルの平均チャンネル蛍光よりもぼんやりしていた。染色強度における差異は、細胞表面上の遊離（非飽和）ＣＤ１８の反映であった。
循環している白血球のＳ−Ｓ．１（無関係なアイソタイプ対照抗体）を用いた飽和の測定
Ｓ−Ｓ．１は、結合に無関係なマウス抗体である。白血球抗原とこのｍＡｂとの「飽和」の可能性を測定するためのアッセイは上記のように行い、陽性（細胞染色）の結果は見られそうもなく、そして期間中の非スパイクとスパイクサンプルとの間に平均チャンネル蛍光における差異は一貫して無いと考えられた。
末梢血白血球の力学
白血球力学に及ぼすｍＡｂ投与の効果（トラフィッキング、辺縁趨向／脱辺縁趨向）は、処置前に比べて循環中の白血球数を評価することにより間接的に確認した。白血球の接着および／または走化性の阻害は、正常なトラフィッキングを防止し、そして循環する細胞数を上昇させると期待される。日常的な血液学分析を行って末梢血白血球の総数、ならびに好中球、リンパ球および単球の数を測定した。
免疫原性
１Ｂ４（ＣＤ１８）に対する抗体応答の測定
血清サンプルを特定した時期に回収し、そして実験が完了するまで凍結保存した。抗−１Ｂ４抗体は２つのアッセイを使用して検出した。
【０１２３】
第１アッセイは抗−イディオタイプおよび抗−アイソタイプ抗体の両方を検出するために計画した。このアッセイは１Ｂ４でマイクロタイタープレートを被覆し、そして未使用タンパク質の結合部位をＢＳＡで遮断することにより行った。次いで血清を適当に希釈し、そして幾つかの希釈物をプレートの２連のウェルに加えた。血清中の抗体を３７℃で２時間結合させ、そして次いでウェルを振盪し、そしてＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。サル抗−１Ｂ４抗体はＨＲＰ−結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ（マウスのタンパク質に対して吸着）を用いて検出した。２時間後、非結合検出抗体はＰＢＳ Ｔｗｅｅｎでプレートを３回洗浄することにより洗い出した。結合した複合体は、黄色を生成するためにｏ−フェニレンジアミンを添加することにより検出した。色はＥＬＩＳＡプレートリーダー上で４９０ｎｍで読んだ。力価は、市販のＨＲＰ−結合ヤギ抗−マウスＩｇＧ（ヒト血清タンパク質に対して吸着）の特別な希釈により生成された光学密度に等しい光学密度を生じる血清の希釈の逆数を計算することにより決定した。
【０１２４】
第２アッセイは、マウスＩｇＧ２ａに対する応答に比べて１Ｂ４イディオタイプと反応する応答の比率を評価するために使用した。これは競合的ＥＬＩＳＡであり、ここでピーク抗体反応の血清を希釈して０．６−１．０の間の光学密度を生成した。希釈血清は上記のように１Ｂ４で被覆したＥＬＩＳＡプレートの３連ウェルに加えた。血清は単独で、５μｇの市販されているマウスＩｇＧ２ａと混合して、または５μｇの１Ｂ４と混合して加えた。ＥＬＩＳＡは上記のように行い、そしてプレート上の１Ｂ４に結合したサルの抗体を、上記のようにＨＲＰ−抗−ヒトＩｇＧを使用して検出した。マウスＩｇＧ２ａまたは１Ｂ４でスパイクした血清により生成した光学密度と、非競合血清により生成されたシグナルの光学密度を比較することにより、１Ｂ４で処置した動物に生じた抗−１Ｂ４抗体の特異性を評価することが可能であった。
Ｓ−Ｓ．１（無関係なアイソタイプ対照抗体）に対する抗体応答の測定
抗−Ｓ−Ｓ．１抗体は、上記の２種類のアッセイを使用して検出した。
定量的な血管撮影の計算：
偏りの制御
血管形成術およびステント留置時に、血管撮影測定を行った。この測定は非−ブラインド様式（ｎｏｎ−ｂｌｉｎｄｅｄ ｆａｓｈｉｏｎ）を採用して、各大動脈の直径を測定し、そして適当なサイズのバルーン拡大カテーテルおよびのステントの拡大ための膨張圧力を選択し、すなわち望ましいバルーン／ステント：大動脈比率を提供した。この非−ブラインド測定はまた追跡にも使用する。治療効果（１つまたは複数）を評価する目的で、記録したビデオ画像はより大きなビデオスクリーンで再生し、そして無関係な観察者によりブラインド様式で評価した。
血管撮影測定
ブラインド血管撮影測定は、デジタルカリパスを用いて中央−ステント領域で透視画像をビデオスクリーンから直接測定することにより行った。両腸骨大動脈について、以下のパラメーターを測定した（ｍｍで）：
血管形成術／ステント留置
実際のガイドカテーテル ｏ．ｄ．（実際の測定）（ａ）
観察されたガイドカテーテル ｏ．ｄ．（拡大された画像としてビデオスクリーン上で観察される）（ｂ）
血管形成術前の管腔 ｉ．ｄ．（ｘ）
血管形成術後にステントが膨張したバルーン ｏ．ｄ．（ｙ）
血管形成術後／ステント管腔中のステント ｉ．ｄ．（ｘ’）
追跡
実際の追跡ガイドカテーテル ｏ．ｄ．（ｃ）
観察された追跡ガイドカテーテル ｏ．ｄ．（ｄ）
ステント管腔中の追跡 ｉ．ｄ．（ｘ”）
再狭窄の計算
以下の計算を行った：
血管形成／ステント留置
倍率補正因子１（ＭＣＦ１）＝［ｂ］÷［ａ］
バルーン／ステント：大動脈率＝［ｙ：ｘ］＝理想的には１．１〜１．２
急性管腔増大（ＡＬＧ；ｍｍで）＝［（ｘ’）（ＭＣＦ１）］−［（ｘ）（ＭＣＦ１）］
追跡
倍率補正因子２（ＭＦ２）＝［ｄ］÷［ｃ］
後期管腔減少（ＬＬＬ；ｍｍで）＝［（ｘ’）（ＭＣＦ１）］−［（ｘ”）（ＭＣＦ２）］
大動脈組織分析
偏りの制御
大動脈組織サンプルは、群または動物番号を示さない寄託または確認番号に無作為に割り当てた。処置の効果（１つまたは複数）に関する大動脈組織サンプルを評価する人（１または複数）は、サンプルの同一性に対して分からなかった。
組織処理
ステント留置をしていない（バルーン傷害）近位および遠位大動物区分は、ステントを留置した区分から離し、各々の近位末端を確認し、そして印を付けた。ステントを留置した大動脈区分はメタクリレート中に包埋し、そして多数の５ｍｍ断面をタングステンカーバイドナイフで切断した。ステント留置をしていない大動脈区分はパラフィンに包埋して抗原性を保存したが、正当な理由が生じるまでさらに処理することはなかった。
【０１２５】
ステント留置区分は、ｖｅｒＨｏｅｆｆの組織エラスチン染色、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＋Ｅ）、そしてＢｒｄＵｒｄを取り込んだ細胞、または平滑筋、内皮細胞および炎症細胞のような細胞型に関する種々の免疫細胞化学マーカーで染色した。
新内膜過形成の評価
ステント内の断面新内膜（内部弾性膜［ＩＥＬ］の管腔側上）および中心（ＩＥＬのアブルミナル（ａｂｌｕｍｉｎａｌ）側上）の領域（ｍｍ２）を、コンピューターを用いたデジタル面積測定を使用して組織形態計測的に測定した（３）。サンプル採取の誤差を最小とするために、３種のエラスチン染色したステント内断面（それぞれが右および左腸骨大動脈の近位、中央および遠位部分に由来する）を、形態計測的に分析した。右また左大動脈に関する複合値を、各大動脈について３回の測定値の平均で表した。
【０１２６】
各断片は、各ステント圧縮材（８−１２／断面）に関係する深いステントが誘導した大動脈の傷害について評価し（０−３）、そして各断面に関する傷害の深さの採点の平均を算出した（１９）。これらの値を使用して、初期の傷害が群全体に相当するかどうかを評価した。
統計分析
処置および対照群の間のＴ−試験による効力データの分析を行い、そしてこれらの値を報告する。
【０１２７】
この実施例で与える実験の結果をこれから記載する。
安全性
注入中にバイタルサインに関して処置に関連する効果は無かった。この実験中に体重および臨床所見に関して処置に関連する効果は無かった。１以上の動物で個々の注射部位は、副作用とは考えられない軽度の一時的な紅斑が示された。カテーテルの切開に付随する副作用は無かった（すなわち創傷治癒の減損は無く、そして細菌感染を示すものも無かった）。臨床的病理パラメーターに及ぼす悪影響は無かった。予想とおり、血清グロブリンレベルが処置および対照動物で上昇した。白血球計数は１Ｂ４投与により影響を受けた（以下を参照にされたい）。検死では処置に関係する著しい損傷は無かった。
薬物動態学
対照ｍＡｂに対する血清ｍＡｂレベル（平均±標準偏差）は、図１に与える。
【０１２８】
１Ｂ４の投与で血管形成術およびステント留置（１日）に血清濃度＞５０μｇ／ｍＬを、そして８日間は維持血清濃度＞１μｇ／ｍＬをもたらした。１−日から１３日までの連続投与にかかわらず、１５日までに１Ｂ４レベルはほとんど検出できなかった。
薬力学
白血球を標的とする飽和
対照ｍＡｂに関する白血球を標的とする飽和（平均±標準偏差）を、図２に与える。
【０１２９】
１Ｂ４の投与により、ＩＶ注入の直後に１−日目で好中球および単球ＣＤ１８の急速な飽和、そして８日間は標的飽和の維持がもたらされた。１５日までに、白血球上の利用可能なＣＤ１８結合部位（不飽和標的）はベースラインレベルに戻った。
抹消血白血球の力学
対照ｍＡｂに関する抹消血の白血球計数（平均±標準偏差）を、図３に与える。
【０１３０】
１Ｂ４の投与は、顕著な白血球溶解、好中球溶解および単球溶解により示されるＣＤ１８の飽和により改変した白血球力学を８日目にもたらした。測定はされていないが、これらの細胞計数はより早い時期にも上昇したと思われる。
免疫原性
対照ｍＡｂに関する抗−ｍＡｂ抗体力価（平均±標準偏差）を、図４に与える。
【０１３１】
抗−グロブリン応答は、わずか８日目に検出したすべての動物で生じた。これらの応答のほとんどが抗−アイソタイプ（定常領域に対する）というよりはむしろ抗−イディオタイプ（可変領域、特に相補性決定領域に対する）であった。８日から１５日の有力な中和化抗−イディオタイプ抗体の急速な上昇は、循環しているｍＡｂレベルの損失、白血球を標的とする飽和の損失および末梢血白血球数のベースライン（正常）レベルへの回復に対応した。これらの観察は、抗−ｍＡｂ抗体の治療用ｍＡｂ抗体への結合、そして活性の防止（中和化）と一致する。さらにこれらの観察は、治療用ｍＡｂの効果的な血清／白血球レベルが８日間を通してのみ維持されたことを示唆していた。
効力
定量的血管撮影法
対照ｍＡｂに関するブラインド定量血管撮影の結果（平均±標準偏差）を、図５に与える。
【０１３２】
１Ｂ４の投与は、腸骨大動脈の中央−ステント領域で測定した時、後期管腔損失（ＬＬＬ）（ｐ＝０．０６）を減少させ、そして指数（ＬＬＬ／ＡＬＧ）（ｐ＜０．０５）を有意に減少させる傾向にあった。
組織形態計測的分析
対照ｍＡｂに関するブラインド組織形態計測的分析結果（平均±標準偏差）を、図６に与える。
【０１３３】
重篤な採点では、群間でステントが誘導する大動脈に対する傷の程度において群間に差異が示されず、すなわち群間の差異は処置に起因し、傷の程度が異なるのではない。
【０１３４】
１Ｂ４の投与は、腸骨大動脈のバルーンのみ（内膜領域についてｐ＝０．０２、Ｉ：Ｍ比についてｐ＝０．０１）、そしてバルーン＋ステント（内膜領域およびＩ：Ｍ比の両方についてｐ＜０．０１）の区分内の新内膜過形成を抑制した。ＣＤ１８は主に好中球に存在し、そして単核細胞（単球およびリンパ球）上での程度は低いので、このデータはバルーン−のみおよびバルーン＋ステントの新内膜過形成の両方に好中球が重要な（恐らく優勢な）原因であることを示唆している。ＣＤ１８を発現する他の細胞（すなわち単核細胞）がいずれかの損傷を持つ新内膜過形成の原因となる可能性も排除しない。抗−ＣＤ１８阻害によるバルーン−のみおよびバルーン＋ステントでの新内膜過形成の効果的減少の観察は、ヒトのバルーン−のみおよびバルーン＋ステント（ステント内）での再狭窄に関係し得る。
【０１３５】
新内膜過形成に及ぼすＣＤ１８の遮断効果を図７で具体的に説明する。
【０１３６】
この実施例で引用する参考文献は以下を含み、実施例で示した番号を付す。
１．連邦規則集（ＣＦＲ）。タイトル２１；パート５８；グッド ラボラトリー プラクティス レギュレーション：ファイナル ロー（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｆｉｎａｌ Ｒｕｌｅ）。ワシントン（ＤＣ）、連邦登記所。１９７８年１２月２２日（１９９３年４月１日改定）。
２．Ｈｏｌｍｅｓ ＤＲ，Ｖｌｉｅｔｓｔｒａ ＲＥ，Ｓｍｉｔｈ ＨＣ，Ｖｅｔｒｏｖｅｃ ＧＷ，Ｋｅｎｔ ＫＭ，Ｃｏｗｌｅｙ ＭＪ，Ｆａｘｏｎ ＤＰ，Ｇｒｕｎｔｚｉｇ ＡＲ，Ｋｅｌｓｅｙ ＳＦ，Ｄｅｔｒｅ ＫＭ，ｖａｎ Ｒａｎｄｅｎ ＭＪ，Ｍｏｃｋ ＭＢ．経皮経管的冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄症：国立心臓、肺および血液研究所のＰＣＴＳ登録からの報告（Ｒｅｔｅｎｏｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｔｒａｎｓｌｕｍｉｎａｌ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ（ＰＴＣＡ）：ａ ｒｅｐｏｒｔ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ＰＣＴＳ ｒｅｇｉｓｔｒｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ，Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１９８４；５３：７７Ｃ−８１Ｃ．
３．Ｓｅｒｒｕｙｓ ＰＷ，Ｌｕｉｔｊｅｎ ＨＥ，Ｂｅａｔｔ ＫＪ，Ｇｅｕｓｋｅｎｓ Ｒ，ｄｅ Ｆｅｙｔｅｒ ＰＪ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒａｎｄ Ｍ，Ｒｅｉｂｅｒ ＪＨ，ｔｅｎ Ｋａｔｅｎ ＨＪ，ｖａｎ Ｅｓ ＧＡ，Ｈｕｇｅｎｈｏｌｔｚ ＰＧ．成功裏の冠状血管形成術後の再狭窄症の発生：３４２名の一貫した患者を対象とした１、２、３および４カ月目の定量的な血管形成実験（Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ ａｆｔｅｒ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｃｏｒｏｎａｒｙ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ：ａ ｔｉｍｅ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ：ａ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｉｃ ｓｔｕｄｙ ｉｎ ３４２ ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅ ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｔ １，２，３ ａｎｄ ４ ｍｏｎｔｈｓ．）。Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９８８；７７：３６１−３７１．
４．Ｒｏｇｅｒｓ Ｃ，Ｅｄｅｌｍａｎ ＥＲ，Ｓｉｍｏｎ ＤＩ．β２−白血球インテグリンＭａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）に対するｍＡｂは、ウサギにおける血管形成術またはステントの移植後の内膜肥厚化を減少する（Ａ ｍＡｂ ｔｏ ｔｈｅ β２−ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８） ｒｅｄｕｃｅｓ ｉｎｔｉｍａｌ ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ ａｆｔｅｒ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ ｏｒ ｓｔｅｎｔ ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｂｂｉｔｓ）。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９８：９５：１０１３４−１０１３９．
５．Ｒｏｇｅｒｓ Ｃ，Ｅｄｅｌｍａｎ ＥＲ：血管内ステントのデザインが実験的な再狭窄症および血栓症を規定する（Ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ ｓｔｅｎｔ ｄｅｓｉｇｎ ｄｉｃｔａｔｅｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．）。Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９５；９１：２２９５−３００１．
６．Ｐｏｎａｔｈ Ｐ．ケモカインレセプターアンタゴニスト：炎症およびＡＩＤＳの新規治療薬（Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ：ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ＡＩＤＳ．）。Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ １９９８；７：１−１８．
７．Ｎｅｌｋｅｎ ＮＡ，Ｃｏｕｇｈｌｉｎ ＳＲ，Ｇｏｒｄｏｎ Ｄ，Ｗｉｌｃｏｘ ＪＮ．ヒトのアテロームプラーク中の単球誘引物質タンパク質−１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｉｎ ｈｕｍａｎ ａｔｈｅｒｏｍａｔｏｕｓ ｐｌａｑｅｓ）。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９１；８８：１１２１−１１２７．
８．Ｂｏｒｉｎｇ Ｌ，Ｇｏｓｌｉｎｇ Ｊ，Ｃｌｅａｒｙ Ｍ，Ｃｈａｒｏ ＩＦ．ＣＣＲ２−／−マウスにおける損傷形成の減少は、アテローム硬化症の始まりにおけるケモカインの役割を明らかにする（Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｌｅｓｉｏｎ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ＣＣＲ２−／−ｍｉｃｅ ｒｅｖｅａｌｓ ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．）。Ｎａｔｕｒｅ １９９８；３９４：８９４−８９７。
９．Ｇｕ Ｌ，Ｏｋａｄａ Ｙ，Ｃｌｉｎｔｏｎ ＳＫ，Ｇｅｒａｒｄ Ｃ，Ｓｕｋｈｏｖａ ＧＫ，Ｌｉｂｂｙ Ｐ．Ｒｏｌｌｉｎｓ ＢＪ．単球誘引物質タンパク質−１の不存在は、低リポタンパク質レセプター−欠失マウスにおいてアテローム硬化症を減少させる（Ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１ ｒｅｄｕｃｅｓ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ｉｎ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ）。Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ １９９８；２：２７５−２８１．
１０．Ｆｕｒｕｋａｗａ Ｙ，Ｍａｔｓｕｍｏｒｉ Ａ，Ｏｈａｓｈｉ Ｎ，Ｓｈｉｏｉ Ｔ，Ｏｎｏ Ｋ，Ｈａｒａｄａ Ａ，Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ Ｋ，Ｓａｓａｙａｍａ Ｓ．抗−単球誘引物質タンパク質−１／単球ケモタクタントおよび活性化因子抗体は、損傷したラットの頸動脈において新内膜過形成を抑制する（Ａｎｔｉ−ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ−１／ｍｏｎｏｃｙｔｅ ｃｈｅｍｏｔａｃｔａｎｔ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ ｉｎ ｉｎｊｕｒｅｄ ｒａｔ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｉｅｓ．）。Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１９９９；８４：３０６−３１４．
１１．Ｋｉｌｉｎｇ Ｄ，Ｆｉｎｇｅｒｌｅ Ｊ，Ｈａｒｌａｎ ＪＭ，Ｌｏｂｂ ＲＲ，Ｌａｎｇ Ｆ．単核白血球は、ＣＤ１８−およびＶＬＡ−４−依存的メカニズムを介してウサギの大動脈内膜に侵襲し、そして平滑筋の移動を刺激する（Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ｉｎｖａｄｅ ｒａｂｂｉｔ ａｒｔｅｒｉａｌ ｉｎｔｉｍａ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｖｉａ ＣＤ１８−ａｎｄ ＶＬＡ−４−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ａｎｄ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．）。Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．１９９５；７７：１１２１−８．
１２．Ｋｌｉｎｇ Ｄ，Ｆｉｎｇｅｒｌｅ Ｊ，Ｊ，Ｈａｒｌａｎ ＪＭ． ウサギの頸動脈を対象とした実験的内膜肥厚化の形成中に、ＣＤ１８に対するモノクローナル抗体を用いた白血球の管外遊出の抑制（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ＣＤ１８ ｄｕｒｉｎｇ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｉｎｔｉｍａｌ ｔｈｉｃｋｅｎｉｎｇ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｉｅｓ．）。Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．１９９２；１２：９９７−１００７．
１３．Ｇｏｌｉｎｏ Ｐ，Ａｍｂｒｏｓｉｏ Ｇ，Ｒａｇｎｉ Ｍ，Ｃｉｒｉｌｌｏ Ｐ，Ｅｓｐｏｓｉｔｏ Ｎ，Ｗｉｌｌｅｒｓｏｎ ＪＴ，Ｒｏｔｈｌｅｉｎ Ｒ，Ｐｅｔｒｕｃｃｉ Ｌ，Ｃｏｎｄｐｒｅｌｌｉ Ｍ，Ｃｈｉａｒｉｅｌｌｏ Ｍ，Ｂｕｊａ ＬＭ．白血球および血小板の付着の阻害が、動脈傷害後の新内膜過形成を減少する（Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｒｅｄｕｃｅｓ ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ ａｆｔｅｒ ａｒｔｅｒｉａｌ ｉｎｊｕｒｙ．）。Ｔｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ １９９７；７７；７８３−８．
１４．Ｇｕｚｕｍａｎ ＬＡ，Ｆｏｒｕｄｉ Ｆ’，Ｖｉｌｌａ ＡＥ，Ｔｏｐｏｌ ＥＪ．ウサギのアテローム硬化症モデルにおけるバルーン血管形成後の新内膜形成における白血球の役割（Ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｂａｌｌｏｎ ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉｃ ｍｏｄｅｌ）。Ｃｏｒ．Ａｒｔ．Ｄｉｓ．１９９５；６：６９３−７０１．
１５．合衆国規則集。タイトルＵ．Ｓ．Ｃ．２１３１−２２１５９章（Ｐ．Ｌ．９９−１９８により補正された動物保護法）、１９８６年１２月２３日発行。
１６．連邦規則集（ＣＦＲ）。タイトル９；第１章、サブチャピターＡ（動物保護基準）（Ａｎｉｍａｌ Ｗｅｌｆａｒｅ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）：最終則１−３部。ワシントン（ＤＣ）、連邦登記所。１９９７年１月１日。
１７．国立研究議会、実験動物資源の研究所。実験動物の世話および使用に関する指針（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ．Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ．）。ワシントン（ＤＣ）：ナショナル アカデミック 出版（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）、１９９６。
１８．米国獣医師協会。安楽死に関する米国獣医師協会（ＡＶＭＡ）パネルの報告（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ．Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＶＭＡ） ｐａｎｅｌ ｏｎ ｅｕｔｈａｎａｓｉａ）。Ｊ．Ａｍ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．１９９３；２０２：２２９−２４９．
１９．Ｓｃｈｗａｒｔｚ ＲＳ，ｅｔ ａｌ．，冠状動脈の傷害に対する再狭窄症および比例的な新内膜応答：ブタのモデルにおける結果（Ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ Ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｒｔｅｒｙ Ｉｎｊｕｒｙ：Ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ Ｐｏｒｃｉｎｅ Ｍｏｄｅｌ．）。Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９２；１９：２６７−２７４．
本明細書に引用する各特許、特許出願および公報は、引用により全部、本明細書に編入する。
【０１３７】
本発明を具体的な態様を参照にして記載したが、当業者により本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明の他の態様および変更を考案され得ることは明らかである。前述の特許請求の範囲はそのような態様および均等な変更態様を包む。
【図面の簡単な説明】
【図１】試験動物から得た血清中のＥＬＩＳＡにより評価したモノクローナル抗体濃度を表すグラフである。
【図２】図２Ａおよび２Ｂから成り、抗−ＣＤ１８抗体（三角）の存在下または対照モノクローナル抗体（丸）の存在下で、白血球を標的とする飽和の程度を表す一対のグラフである。図２Ａは好中球の標的部位の飽和の程度を表し、そして図２Ｂは単球の標的部位の飽和の程度を表す。
【図３】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄから成り、モノクローナル抗体１Ｂ４（三角）または対照モノクローナル抗体（ＳＳ１；丸）が投与された動物中の白血球計数を表す４つのグラフである。総白血球細胞計数は図３Ａに示し；総好中球計数は図３Ｂに示し；総リンパ球計数は図３Ｃに示し；総単球計数は図３Ｄに示す。
【図４】モノクローナル抗体１Ｂ４（三角）または対照モノクローナル抗体（丸）が投与された動物中の平均抗−モノクローナル抗体力価を示すグラフである。
【図５】図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃから成り、本明細書の実施例に記載するような試験動物におけるブラインドの定量的な血管形成術の結果を表す。図５Ａはモノクローナル抗体１Ｂ４（三角）または対照モノクローナル抗体（丸）が投与された動物において、時間の関数としての管腔の直径を表すグラフである。図５Ｂおよび５Ｃは、モノクローナル抗体１Ｂ４または対照モノクローナル抗体が投与された動物において、後期の管腔損失とＬＬＬ／ＡＬＧ指数の間の差異を表す棒グラフである。
【図６】図６Ａおよび６Ｂから成り、モノクローナル抗体１Ｂ４または対照モノクローナル抗体のいずれかが投与され、そしてバルーン血管形成術（「バルーンのみ」）またはバルーン血管形成術および管内皮ステント留置の両方（「バルーンおよびステント」）を受けた動物から得た血管の内膜領域（ｍｍ２：図６Ａ）および内膜：中膜の比の組織形態計測分析の結果を表す一対の棒グラフである。
【図７】図７Ａおよび７Ｂから成り、モノクローナル抗体１Ｂ４または対照モノクローナル抗体のいずれかが投与された動物から得た血管間の差異を表す一対の画像である。
【図１】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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