(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの多型部位を有するＧＰＲ５０と称される受容体遺伝子をコードする単離ポリヌクレオチド類を提供する。本発明は、前記受容体遺伝子における多型部位を分析する方法をさらに提供する。多型部位（対立遺伝子変異体）を有するこれらポリヌクレオチド類の幾つかは、対照集団と比較して、臨床的双極性うつ病患者集団において、より多く見られることが判明している。双極性うつ病の遺伝子試験は、本発明のさらなる実施形態である。さらに、これらの多型部位を含むポリヌクレオチド類、多型部位に対し遠位または近位に不変に局在化したポリヌクレオチド類、ならびにＧＰＲ５０をコードするポリヌクレオチド類は本発明の一部である。本発明はまた、これらの受容体に活性な新規化合物が、治療的使用のために確認できるような、適切な濃度でこれら新規受容体を発現する組換え細胞株を提供する。
2004533847.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＰＲ５０受容体蛋白質をコードする、少なくとも１つの多型部位を有する単離ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記多型部位が、配列番号：１の１５０３位〜１５０４位、１５８２位または１８０４位に局在化している請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号：２から８のいずれか１つを含む請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号：１０から１６のいずれか１つを含むポリペプチドをコードする請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、１５８２位および／または１８０４位にＡを有し、または１５８２位および／または１８０４位のＧと組合わせて、１５０３位〜１５０４位に１個の挿入を有する請求項１に記載の単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクター。
【請求項７】
請求項１から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６に記載の組換え発現ベクターによりコードされるポリペプチド。
【請求項８】
請求項１から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６に記載の組換え発現ベクターにより形質移入された細胞。
【請求項９】
請求項７に記載のポリペプチドを発現する安定な形質移入細胞である請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
新薬の確認に関するスクリーニングアッセイにおいて、ＧＰＲ５０蛋白質またはその多型変異体をコードする請求項１から５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、または請求項６に記載の組換え発現ベクター、請求項８又は９に記載の細胞または請求項７に記載のポリペプチドの使用。
【請求項１１】
精神障害用薬剤の調製のためのＧＰＲ５０モジュレーターに対するスクリーニングにおける請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記障害がＢＰＡＤまたはＵＰである請求項１０に記載の使用。
【請求項１３】
配列番号：１の１５８２位および／または１８０４位におけるＡを有し、または１５８２位および／または１８０４位におけるＧと組合わせて１５０３位〜１５０４位における１個の挿入を有するＧＰＲ５０受容体をコードする診断用ポリヌクレオチドの存在に関して個人の生体試料を分析すること；および
前記診断用ポリヌクレオチドが、前記生体試料において検出される場合に、前記遺伝子が多型性を有していることを確認すること、
を含むヒトのＧＰＲ５０をコードする遺伝子における多型部位を分析する方法。
【請求項１４】
ａ）請求項１〜５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項６に記載の組換え発現ベクターを好適な宿主細胞に導入するステップ；
ｂ）導入されたポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養するステップ；
ｃ）発現産物を場合によっては単離するステップ；
ステップｃの発現産物またはステップｂの宿主細胞を、潜在的なリガンド類と接触させるステップ；
前記リガンドの発現蛋白質に対する結合量、またはそのシグナル伝達能を確立するステップ；および場合によっては、
前記リガンドを単離するステップを含む、精神障害、好ましくはＢＰＡＤまたはＵＰ用の薬剤を調製するために、請求項７に記載のＧＰＲ５０蛋白質またはその多型変異体のリガンド結合を測定する方法。
【請求項１５】
請求項１４に記載の方法を含む薬剤組成物を製剤化し、確認された化合物を薬剤として許容できる担体と混合する方法。
【請求項１６】
配列番号：１の１８０４位にＡを有し、および／または１５０３位〜１５０４位に挿入が欠如しているＧＰＲ５０受容体をコードするポリヌクレオチドの存在に関して個人の生体試料を分析すること；前記ポリヌクレオチドの存在が、前記生体試料に検出される場合、ＢＰＡＤまたはＵＰを伴う多型を有する前記遺伝子を確認することを含むヒトにおける臨床的双極性うつ病またはＵＰの危険性が増大したことを確認する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの多型部位を有するＧＰＲ５０と呼ばれる受容体遺伝子をコードする単離ポリヌクレオチド類を提供する。本発明は、前記受容体遺伝子における多型部位を分析する方法をさらに提供する。多型部位（対立変異体）を有するこれらポリヌクレオチド類の幾つかは、対照集団と比較して、臨床的双極性うつ病または単極性うつ病患者集団において、より多く見られることが判明している。双極性うつ病および単極性うつ病の遺伝子的試験は、本発明のさらなる実施形態である。さらに、これらの多型部位を含むポリヌクレオチド類、多型部位に対し遠位または近位に不変に局在化したポリヌクレオチド類、ならびにＧＰＲ５０をコードするポリヌクレオチド類は本発明の部分である。
【０００２】
本発明はまた、これらの受容体に活性な新規化合物が、治療的使用のために確認できるような、適切な濃度でこれら新規受容体を発現する組換え細胞株を提供する。
【背景技術】
【０００３】
Ｇ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ類）は、広範囲で多数の一連の細胞外シグナルを細胞内応答に変換する膜受容体の大きなスーパーファミリーである。同種のリガンドによる受容体刺激により、対合したヘテロトリマーＧ蛋白の活性化に導き、次にこれがエフェクター酵素およびイオンチャンネルに作用する細胞内経路を調節する（Ｗｅｓｓら、１９９７年）。ＧＰＣＲ類に結合する内因性リガンド類の幾つかの例としては、神経伝達物質、神経ペプチド類、ホルモン類、ケモカイン類および臭気物質が挙げられる。したがって、この受容体群は、神経伝達、給餌、気分、痛み、返報、視覚、嗅覚、ならびに炎症応答および免疫応答を含む複数の生理学的過程の調節に関与する（Ｓｔｒａｄｅｒら、１９９５年）。
【０００４】
今日まで薬剤標的の４０〜５０％がＧＰＣＲ類であり、ＧＰＣＲ類は優れた治療上の標的としての歴史が示されている（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９８年）。ＧＰＣＲファミリーは、３５０種を超えるクローニングされたヒトメンバーを含むが、これら受容体に対する内因性リガンドの一部だけが確認されている。分子クローニング法および生理的リガンドが知られていない生体情報により確認されるＧ蛋白質共役型受容体の数が増え続けており；これらはオーファン受容体と言われる。これらオーファンＧＰＣＲ類の多くが脳内で発現するため、ＣＮＳ疾患治療のための新規な治療標的となることができる（Ｏ’Ｄｏｗｄら、１９９７年）。
【０００５】
逆薬理学または機能的ゲノミックスが、現在、創薬過程において採用されている。これは、代用リガンド類または内因性リガンドのいずれかにより、新規遺伝子を薬理的に検証すること目指す遺伝子に基づく生物学である。
【０００６】
新規オーファンＧＰＣＲ類に加えて、以前に未確認のリガンドを結合する新規なＧＰＣＲ遺伝子サブファミリーもまた存在することを示唆する証拠がある。オーファンＧＰＣＲ類の多くが、天然リガンドに帰せられることを待機していることから、多くのこれら受容体は、このように今まで確認にほど遠かった新規リガンドと結合できると考えられる（Ｃｉｖｅｌｌｉら、１９９９年）。
【０００７】
不活性な受容体は、進化上廃棄されたはずであるという前提に立って、オーファンＧＰＣＲはリガンドと結合することが予想される。したがってオーファン受容体を、それらの天然リガンド類または代用リガンド類を単離するための釣り餌として用いることができる。新規リガンド類の同定においてこの方策の使用は、オーファニン（ｏｒｐｈａｎｉｎ）／ノシセプチン（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｎ）、オレキシン（ｏｒｅｘｉｎ）類／ヒポクレチン類（ｈｙｐｏｃｒｅｔｉｎ）およびプロラクチン放出ペプチドの同定において例証されている（Ｒｅｉｎｓｃｈｅｉｄら、２０００年、Ｓａｋｕｒａｉら、１９９８年およびＨｉｎｕｍａら、１９９８年）。
【０００８】
多くの知られたＧ蛋白質共役型受容体（ＧＰＣＲ）類はよく確立された薬物標的であり、このようなＧＰＣＲ類を標的とした現在利用できる薬物はかなり多い（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８年）。受容体へのリガンド結合によるＧＰＣＲの活性化後、シグナルは、シグナル伝達のカスケードの範囲で増幅され、その結果、ＧＰＣＲへのリガンド結合を経たシグナル伝達経路の調節により、厳密に制御された生物学的経路の調節が可能となる。
【０００９】
ＧＰＣＲ類は、広範囲の生体関連過程を媒介し、光、生体アミン類、アミノ酸類、ペプチド類、脂質類、ヌクレオシド類、および大型ポリペプチド類などの、広範囲の刺激および化学／神経伝達物質に応答する。特定受容体のクローニングが、治療化合物の開発をいかに導いたかは、セロトニンとアドレナリン受容体の場合で具体的に例証される。さらに、多くの疾患が、知られたＧＰＣＲ類における変異を伴っていることが報告されている（Ｗｉｌｓｏｎら、１９９８年）。ＧＰＣＲ類の作用を媒介するシグナル伝達経路はまた、製薬産業に対して重要な多くの生物学的過程に関係してきた。このようなシグナル伝達経路には、Ｇ蛋白質、ｃＡＭＰまたはカルシウムなどの第２のメッセンジャー類、ホスホリパーゼＣなどのエフェクター蛋白質、アデニリルシクラーゼ、ＲＧＳ蛋白質、プロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣが含まれる（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，１９９１年）。
【００１０】
例えば、ＧＰＣＲは、その受容体へのリガンド結合により活性化でき、シグナル伝達経路の次の成分にメッセージを運ぶＧ蛋白質を活性化することとなる。このような成分は、アデニリルシクラーゼであり得る。この酵素の活性化のために、あるファミリーの一員である関連Ｇ蛋白質は、Ｇ蛋白質が不活性状態にある場合に結合しているＧＤＰに、ＧＴＰを交換しなければならない。ＧＤＰのＧＴＰへの交換は、ＧＰＣＲへのリガンド結合後に生じるが、ＧＤＰのＧＴＰへのある程度の基礎交換は、調査中の受容体に依存して生じることもできる。
【００１１】
Ｇ蛋白質に結合したＧＴＰのＧＤＰへの交換は、加水分解によって生じ、Ｇ蛋白質自体によって触媒される。この加水分解後、Ｇ蛋白質は不活性状態に戻る。その結果、Ｇ蛋白質は、活性化受容体から細胞内シグナル伝達経路へのシグナル伝達を媒介するのみならず、受容体が、ＧＴＰ結合Ｇ蛋白質を介して細胞内シグナル伝達経路を活性化できる時間の長さを制御することにより、他のレベルの制御をもたらす。
【００１２】
一般に、これら受容体のトポロジーは、おおよそ２０〜３０個のアミノ酸からなる７つの膜貫通（ＴＭ）ドメインを含有するものである。その結果、これらの受容体は、７ＴＭ受容体としてしばしば知られている。これら７ＴＭドメインは、コンセンサスアミノ酸配列およびＫｙｔｅ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプログラム（Ｐｒｏｂｓｔら、１９９２年）などの構造予知演算法により決めることができる。推定の膜貫通ドメイン内で、細胞外および細胞内ループを経て連結される疎水性ヘリックスが形成される。ポリペプチドのＮ末端は膜の外面上にあり、Ｃ末端は膜の内面上にある。
【００１３】
他にも多くの特徴がＧＰＣＲ類にしばしば観察される。その中の１つにＮ末端部のグリコシル化が挙げられる。最初の２つの細胞外ループ各々の保存されたシステインは、ジスルフィド結合が形成されるように修飾され、これが、安定化された機能的三次構造を生じると考えられている。ＧＰＣＲ類に生じる他の修飾としては、脂質化（例えば、パルミトイル化およびファルネシル化）ならびにホスホリル化が挙げられる。ホスホリル化事象は、第３の細胞内ループおよびＧＰＣＲ類の細胞質Ｃ末端部に生じることが多い。Ｇ蛋白質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）類は、標的としてトレオニン残基およびセリン残基を有する複数の部位でＧＰＣＲ類をリン酸化することが知られている。これらのリン酸化事象は、受容体の細胞内取込み、脱感作、および／またはダウンレギュレーション経路を調節するために重要である（ＴｓａｏおよびＺａｓｔｒｏｗ、２０００年；Ｔｉｒｕｐｐａｔｈｉら、２０００年；Ｊａｃｋｓｏｎら、２０００年）。その結果、ＧＰＣＲの特定領域における具体的変異は、下流の細胞内シグナル伝達事象に対し機能的な意義を有することができる。
【００１４】
バクテリオロドプシンは、微生物、ハロバクテリウム−サリナリウムに見出された７ＴＭ  ＧＰＣＲである。この細菌は、唯一のエネルギー源として光を利用し、蛋白バクテリオロドプシンは、光駆動プロトンポンプとして寄与し、細胞膜を通って蛋白質を輸送する。したがって、バクテリオロドプシンは、より複雑な哺乳類のＧＰＣＲ類の構造／機能特性の幾つかを調べる簡便なモデルとして使用されることが多い。バクテリオロドプシンの結晶構造が、最近解明され（Ｋｕｈｌｂｒａｎｄｔ、２０００年；Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉら、２０００年）、したがって、これは、二次構造要素の帰属および高保存性アミノ酸の位置など、他のＧＰＣＲ類のための構造鋳型として寄与できる。ロドプシンは、ＧＰＣＲファミリーの中でサイズが中位であるので、Ｇ蛋白質活性化において機能的に重要性な大部分の本質的部分を特色付けることができる。７つの膜貫通ヘリックスおよび３つの細胞外ループの長さは、ファミリーのメンバーの大部分とほぼ同一であると予想される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
細胞内シグナル伝達経路の活性化に加えて、ＧＰＣＲ類はまた、Ｇ蛋白質を経由して、イオンチャンネル、輸送体および酵素などのさらなる遺伝子族と結合できる。ＧＰＣＲ類の多くは、極めて特異的なパターンから極めて広いパターンの分布範囲を示す哺乳動物系に存在する。この理由のため、推定の新規ＧＰＣＲの同定後、新規ＧＰＣＲに対する治療適用の帰属は、以前に報告されたＧＰＣＲ類のこの多様な機能および分布のため明白ではない。
【００１６】
矯正、予防または改善のために病状を変化させるように機能することができる新規ＧＰＣＲ類を同定し、特性を決定することは明らかに必要である。このような疾患は多様であり、限定はしないが、うつ病、分裂病、不安症、神経障害、肥満症、不眠症、嗜癖、神経退化、低血圧、高血圧、急性心不全、アテローム血栓症、アテローム、骨粗鬆症、リウマチ性関節炎、および不妊症が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、ＧＰＲ５０と称されるＧ蛋白質共役型受容体またはメラトニン受容体関連受容体（ＭＲＲ）に関する新規な対立遺伝子変異体を提供する。ＧＰＲ５０は、クローン化Ｍｅｌ１ａおよびＭｅｌ１ｂメラトニン受容体（Ｒｅｐｐｅｒｔら、１９９６年）に対し最も高い配列類似性を示すオーファンＧＰＣＲである。Ｍｅｌ１ａおよびＭｅｌ１ｂ受容体の各々は、［１２５Ｉ］ヨードメラトニンと高親和性を有して結合することが示されたが、ＧＰＲ５０は、受容体のＣＯＳ−７細胞への一過性トランスフェクション後のリガンド結合研究においてこのホルモンと結合することは見出されなかった（Ｒｅｐｐｅｒｔら、１９９６年；Ｃｏｎｗａｙら、２０００年、ＧｕｂｉｔｚおよびＲｅｐｐｅｒｔ、２０００年）。メラトニンは松果体から分泌される主要ホルモンで、概日リズムのタイミングを調整し、気分調節に関与すると考えられている（Ｒｅｐｐｅｒｔら、１９９５年）。
【００１８】
ヒトＧＰＲ５０  ｍＲＮＡは、脳下垂体および視床下部で発現し、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション実験により、それが脳下垂体内に不均一的に分布し、漏斗茎および中央基底の視床下部に局在化していることが証明されている（Ｒｅｐｐｅｒｔら、１９９６年）。Ｄｒｅｗらは最近、マウス、ラットおよびハムスターの間でＧＰＲ５０の発現が、視床下部および第３心室の内側上皮層および傍室視床核の領域において保存されているという証拠を提供した（Ｄｒｅｗら、２００１年）。これらのデータは、受容体にとって重要な生理的役割を示している。さらに、ｉｎ  ｓｉｔｕデータを用いて、我々は視床下部の数個の核およびさらに海馬においてもＧＰＲ５０の区別できる発現を見出した。このように、ＧＰＲ５０の発現は、うつ病、分裂病および不安症に関係が有ると考えられるＨＰＡ軸を伴う脳領域に限定されているようである。
【００１９】
抑うつ病の種々の形態が定義されており、精神医学のハンドブック、例えば、「Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、第４版（ＤＳＭ−ＩＶ）、アメリカ精神医学会により発行、ワシントン、ＤＣ（１９９４）に供された基準に従って個々に診断されている。
【００２０】
ヒトのＧＰＲ５０遺伝子は、Ｘ結合であり、Ｘｑ２８に局在化している（ＧｕｂｉｔｚおよびＲｅｐｐｅｒｔ、１９９９年）。２０を超える遺伝子疾患の遺伝子座は、この多遺伝子染色体領域上に集中していることが判っており、したがって、ＧＰＲ５０はこのような疾患の原因となり得る候補遺伝子である。
【００２１】
双極性情動障害（ＢＰＡＤ）は、うつ病と気分高揚との周期的な組合わせを示す精神病であり、この疾患はＸｑ２８遺伝子座に関連していることが証明されている（Ｂａｒｏｎら、１９９４年；Ｓｔｉｎｅら、１９９７年）。ＧＰＲ５０が、精神病を伴うことは、以前の遺伝子研究では示されていなかった。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明によれば、数種のポリヌクレオチド類が、ＧＰＲ５０遺伝子上に多型部位を含んでいることが確認された。これらは、ＧＰＲ５０の対立遺伝子変異体と呼ばれる。これらの対立遺伝子変異体は、精神病、好ましくはＢＰＡＤまたは単極性うつ病（ＵＰ）の遺伝機構を理解する上で役立つと思われる。したがって、ポリヌクレオチド類またはその部分は、さらにこれらの障害の遺伝学的試験に使用できると考えられる。ポリヌクレオチド類の部分は、少なくとも１０個の連続するヌクレオチド類、好ましくは１０〜１００個のヌクレオチド類であることが好ましい。それらは、ハイブリダイゼーションに基づく核酸検出法に使用できる。配列番号：１から得られた配列の一部を含む断片、ならびに対立遺伝子変異体配列を含む断片がこの目的のために、使用できることは明らかであろう。
【００２３】
本発明の目的は、ＧＰＲ５０前駆物質である蛋白質をコードする全配列を含むポリヌクレオチド、または対立遺伝子変異体を含む成熟蛋白質を提供することである。また、完全なｍＲＮＡ配列またはＧＰＲ５０のゲノム配列も、前記配列が、配列番号：１で同定された配列から逸脱する少なくとも１つの多型部位を有するという条件で、本発明の一部を形成する。最も好ましい多型部位は、１５８２位、１８０４位および１５０３位〜１５０４位に局在化する。ポリヌクレオチドは１５８２位および／または１８０４位にＡまたはＧ、および／または１５０３位〜１５０４位に挿入／欠失を有することが好ましい。ヌクレオチドの１５０３位〜１５０４位における挿入は、好ましくは１２種のヌクレオチド類、より好ましくはＡＣＣＡＣＴＧＧＣＣＡＣのヌクレオチド長からなる。ＢＰＡＤとＵＰに最も強力な対合は、１５０３位〜１５０４位における挿入の欠如、および／または１８０４位における多型部位の欠如である。この部位はヌクレオチドＡを有することが好ましい。
【００２４】
コドンの変異性に適応し、本発明はまた、本明細書中に開示された配列と同一のアミノ酸配列をコードする配列を含む。配列番号：１のヌクレオチド配列は、配列番号：９で示される配列の蛋白質をコードする。したがって、ヌクレオチド配列が本発明に従った多型部位を含むという条件で、本発明はまた、配列番号：９の蛋白質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。また、発現蛋白質の個々のドメインをコードするコード配列の部分も、本発明の一部である。時に遺伝子は、スプライシング変異体としてある一定の組織に発現し、改変された５’または３’ｍＲＮＡとなるか、またはさらなるエクソン配列が含まれることとなる。これらの配列ならびにこれらの配列によりコードされる蛋白質は全て、同一または類似の機能を実行することが予想され、やはり、本発明の一部を形成する。
【００２５】
本明細書中に提供された配列情報は、誤って同定された塩基の包含を必要とするほど狭義に解釈すべきではない。本明細書中に開示された特定の配列は、完全遺伝子を単離するために容易に使用でき、次にこれをさらなる配列分析に容易に提供することができ、それによって配列決定の誤りを確認できる。
【００２６】
このように、本発明は、ＧＰＲ対立遺伝子変異体をコードする単離ポリヌクレオチド類を提供する。
【００２７】
本発明によるＤＮＡは、ｃＤＮＡから得ることができる。この組織はヒト由来であるのが好ましい。リボ核酸は、脳下垂体、視床下部または他の組織から単離するのが好ましい。他に、コード配列は、ゲノムＤＮＡであってもよく、またはＤＮＡ合成法を用いて調製できる。ポリヌクレオチドはまた、ＲＮＡの形態であってもよい。ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、１本鎖または２本鎖の形態であってもよい。前記１本鎖は、コード鎖であっても、非コード（アンチセンス）鎖であってもよい。小断片は、よく知られた化学合成法を用いて容易に調製できる。
【００２８】
本発明はさらに、僅かな変異を有する配列番号：１のポリヌクレオチド類の対立遺伝子変異体に関する。僅かな変異を有するポリヌクレオチド類は、蛋白質の天然の成熟対立遺伝子形と同一の生物学的機能または活性を保持するポリペプチド類をコードする。他に、依然として標的に結合できるＧＰＲ５０蛋白質のドメインをコードする上記ポリヌクレオチド類の断片もまた、本発明の実施形態である。
【００２９】
このようなポリヌクレオチド類は、好ましくは高厳密条件下のハイブリダイゼーションにより同定できる。本発明によれば、用語の「厳密」とは、６５℃の温度で１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳの洗浄条件を意味し；高厳密条件は、０．３×ＳＳＣへのＳＳＣでの希釈、より好ましくは０．１×ＳＳＣへの希釈を言う。
【００３０】
このように、前記ポリヌクレオチド類の誘導体もまた、本発明の一部である。前記用語の誘導体とは、少なくとも１つの多型部位を有するＧＰＲ５０の対立遺伝子変異体をコードする任意のポリヌクレオチド類であって、配列番号：１との同一性が、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９８％、さらにより好ましくは少なくとも９９％を有するものと解されるべきである。このようなポリヌクレオチド類は、蛋白質の天然の成熟対立遺伝子形と同一の生物学的機能または活性を保持するポリペプチド類をコードする。対立遺伝子変異体は、配列番号：１の１５８２位、１８０４位および１５０３位〜１５０４位の上記同定部位に位置することが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、１５８２位および／または１８０４位にＡまたはＧ、および／または１５０３位〜１５０４位に挿入を有することが好ましい。ヌクレオチドの１５０３位〜１５０４位における挿入は、好ましくは１２個のヌクレオチド類、より好ましくはＡＣＣＡＣＴＧＧＣＣＡＣのヌクレオチド長からなる。
【００３１】
２種の配列間の同一性パーセンテージは、ＤＮＡＭＡＮ（Ｌｙｎｎｏｎ  Ｂｉｏｓｏｆｔ、バージョン３．２）などのプログラムにより決定できる。このプラグラムを用いて、２種の配列は、至適整列演算法（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ，１９８１年）を用いて整列させることができる。２種の配列の整列後、同一性パーセンテージは、整列配列の長さから全ギャップの長さを差し引いたもので２種の配列間の同一ヌクレオチド数を割ることにより算出できる。
【００３２】
本発明の他の態様は、配列番号：１の多型部位における不変の近位、または不変の遠位ヌクレオチド配列に特異的にハイブリッド形成できるヌクレオチドを有し、単一のヌクレオチド多型部位を特異的に検出するために使用されるポリヌクレオチド類に関する。このようなポリヌクレオチド類は、例えばＰＣＲなどのプライマー伸長法に基づくアッセイに特に有用である。
【００３３】
個人からのポリヌクレオチド類を分析する方法を提供し、配列番号：１の多型部位を占めるヌクレオチドを決定することが本発明のさらなる目的である。１５０３位〜１５０４位、１５８２位および１８０４位のヌクレオチド類が決定されることが好ましい。ヌクレオチドの１５０３位〜１５０４位に、好ましくは１２種のヌクレオチド類、より好ましくはＡＣＣＡＣＴＧＧＣＣＡＣのヌクレオチド長の挿入が存在する可能性があることが判明した。ヌクレオチドの１５８２位および１８０４位は、ＡまたはＧによって占められることが好ましい。これらの変異体の組合わせを含む多型変異体が、数人の個人からの核酸の配列決定により発見された。ＧＰＲ５０の７つの可能な対立遺伝子変異体を一覧表にしている（配列番号：２から８はヌクレオチド配列、配列番号：１０から１６はアミノ酸配列）。
【００３４】
かように本発明は、ＧＲ５０遺伝子をコードする核酸配列における変異に関連した精神病のための診断用アッセイの一部としてのＧＰＲ５０遺伝子の使用に関するものである。このような変異は、例えば、ＰＣＲ（Ｓａｉｋｉら、１９８６年）または特異的ハイブリダイゼーションを使用することによって検出できる。また、ＲＮＡの相対濃度は、例えば、ハイブリダイゼーションまたは定量的ＰＣＲ法またはＤＮＡマイクロアレイを用いて決定できる。
【００３５】
ＧＰＲ５０受容体自体の存在および濃度は、受容体に対して増加した特異的抗体を用いてラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット法およびＥＬＩＳＡなどの免疫学的技術によりアッセイできる。ＲＮＡおよび蛋白質濃度を測定するこのような方法は、当業技術者によく知られている。
【００３６】
個々の患者の受容体発現レベルの測定によって、治療プロトコルの細かい調整ができるようになる。
【００３７】
本発明によるポリヌクレオチド類は、全てこの受容体の細胞質尾部に含有されている。ＧＰＣＲ類のＣ末端部は受容体のダウンレギュレーション、細胞内取込みおよび／または脱感作の経路を特異的に指令することが報告されている（ＴｓａｏおよびＺａｓｔｒｏｗ、２０００年；Ｔｒａｐａｉｄｚｅら、２０００年；Ｗａｎｇら、２０００年）。本明細書中に提供されたポリヌクレオチド類は、ＧＰＲ５０のＣ末端部にスレオニン類を導入する。ＧＰＫ類はセリンおよびスレオニン残基におけるＧＰＣＲのＣ末端部をリン酸化することが知られており、このことが受容体の脱感作を改変することで、この受容体の機能性に対して著しい作用を及ぼすと考えられる。
【００３８】
本発明の他の態様においては、上記のＤＮＡ分子によってコードされたアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。
【００３９】
本発明によるポリペプチドは、５２８位および／または６０２位にアミノ酸置換を有し、および／または５０１位〜５０２位に挿入を有する、配列番号：９で示されたアミノ酸配列の少なくとも一部の変異体を含むことが好ましい。好ましい変異体は、アミノ酸の５２８位にＴｈｒまたはＡｌａおよび／または６０２位にＩｌｅまたはＶａｌ、および／または５０１位〜５０２位に挿入を含むポリペプチドである。位置は、配列番号：９におけるアミノ酸配列を指す。最も好ましい挿入はＴｈｒ−Ｔｈｒ−ＧｌｙＨｉｓである。
【００４０】
配列変異を有しているが機能的特性はなお維持している、配列番号：９またはその部分の変異体に相同なポリペプチドである機能的等価物もまた本発明に含まれる。
【００４１】
配列において生じ得る機能上等価な変異体は、配列全体における単数または複数のアミノ酸の違いまたは、前記配列における単数または複数のアミノ酸の削除、置換、挿入、反転または付加によって示すことができる。生物学的および免疫学的活性を本質的に変化させないと考えられるアミノ酸置換は記載されている。関連アミノ酸の間の交換または進化において生じることの多い交換は、とりわけ、Ｓｅｒ／Ａｌａ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌである（Ｄａｙｈｏｆ、Ｍ．Ｄ．「Ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」、Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．、ワシントンＤ．Ｃ．１９７８年、５巻、増刊３を参照）。この情報に基づきＬｉｐｍａｎとＰｅａｒｓｏｎは、迅速で感度の良い蛋白質の比較方法を開発し（ＬｉｐｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎ、１９８５年）、相同ポリペプチド間の機能的類似性を測定した。
【００４２】
本発明によるポリペプチドは、配列番号：９の対立遺伝子変異体を含むポリペプチド類を含むが、また、それらの誘導体、すなわち、配列番号：９と比較して８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９８％の類似性を有するポリペプチド類も含む。また、依然として生物学的作用を与えることのできるそのようなポリペプチド部分も含まれる。特に、依然としてリガンドに結合している部分は本発明の一部を形成している。このような部分は、可溶化形態において、それ自体で機能的であり得るか、または、知られた生物学的方法または化学合成によって他のポリペプチドと結合させて、キメラ蛋白質を得ることができると考えられる。このような蛋白質は、ＧＰＲ５０遺伝子発現の変形により、個人における遺伝子産物の代わりとなり得るという点で治療剤として有用となり得るであろう。
【００４３】
前記遺伝子配列はまた、好適な宿主細胞におけるコード化蛋白質発現のためのベクター分子の調製においても使用できる。本発明のＧＰＲ５０蛋白質またはその部分をコードする核酸配列のクローニングには、多種多様な宿主細胞とクローニングには、多種多様な宿主細胞とクローニング媒体との組合わせが有益に使用できる。例えば、有用なクローニング媒体としては、種々の知られた細菌のプラスミドおよび広域宿主プラスミド、およびプラスミドの組合わせ由来のベクターおよびファージまたはウィルスＤＮＡなどの染色体、非染色体、および合成のＤＮＡ配列を挙げることができる。
【００４４】
本発明の遺伝子、またはそのリガンド結合ドメインの発現に使用される媒体は、リガンド結合ドメインをコードする核酸配列に操作可能に結合した制御配列をさらに含む。このような制御配列は一般に、そのプロモーター配列および発現レベルを調節および／または増加させる配列を含む。もちろん、制御配列および他の配列は選択される宿主細胞に応じて変わり得る。
【００４５】
好適な発現ベクターは、例えば、細菌または酵母のプラスミド、広域宿主プラスミドやプラスミドの組合わせ由来のベクター類およびファージまたはウィルスＤＮＡである。染色体ＤＮＡ由来のベクター類も含まれる。さらに、本発明によるベクター内には、複製源および／または優性選択マーカーが存在し得る。本発明によるベクターは、宿主細胞の形質転換に好適である。
【００４６】
本発明のＤＮＡを含む組換え発現ベクター類、ならびに前記ＤＮＡまたは前記発現ベクターにより形質転換した細胞もまた本発明の部分を形成する。
【００４７】
本発明による好適な宿主細胞は、細菌の宿主細胞、酵母や他の真菌宿主、植物宿主またはチャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒト胚腎臓細胞またはサル細胞などの動物宿主である。このように、本発明によるＤＮＡまたは発現ベクターを含む宿主細胞もまた、本発明の範囲内にある。設計された宿主細胞は、従来の栄養培地で培養できるが、例えば適切な選択増幅または転写誘導のために変更できる。温度、ｐＨ、栄養物などの培養条件は当業者によく知られている。
【００４８】
本発明によるＤＮＡまたはベクターの調製、ならびに前記ＤＮＡまたはベクターによる宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションは標準的であり、当業界によく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版、ニューヨーク州コールドスプリングハーバーのＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９８９年を参照されたい。
【００４９】
本発明による蛋白質は、硫酸アンモニウム沈殿、抽出、疎水性相互作用クロマトグラフィ、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィ、または親和性クロマトグラフィ、および高性能液体クロマトグラフィなどのクロマトグラフィなど、一般的な生化学的精製法によって回収し、精製することができる。必要であれば、蛋白質の再折りたたみステップを含めることができる。
【００５０】
本発明の他の実施形態は、ヒトにおける臨床的双極性うつ病の同定法に関しており、前記方法において、前記ヒトからポリヌクレオチドを含有した生体試料を得て、診断性ポリヌクレオチドの存在に関して分析するが、前記診断性ポリヌクレオチドは配列番号：１の１５８２位および／または１８０４位にＡを有し、または１５０３位〜１５０４位に挿入を有し、それと組合わせて、１５８２位および／または１８０４位にＧを有するＧＲＰ５０受容体をコードし、前記診断性ポリヌクレオチドの存在が、前記生体試料内に検出される場合は、前記遺伝子が多型を有することが確認されているポリヌクレオチドである。
【００５１】
本発明によるＧＲＰ５０遺伝子産物は、新規リガンドまたはその類縁体のインビボまたはインビトロの同定に使用できる。この目的のために、例えば、本発明によるＤＮＡによって形質転換した細胞、本発明によるＤＮＡを含む発現ベクター、本発明によるＧＲＰ５０遺伝子産物を発現する前記細胞を用いて結合試験が実施できる。他に、ＧＲＰ５０遺伝子産物それ自体、またはそのリガンド結合ドメインもまた、ＧＲＰ５０遺伝子産物に関する機能的リガンドまたは類縁体の同定用アッセイに使用できる。本発明により、ＧＲＰ５０は、ＢＰＡＤおよびＵＰを伴うことが判明した。したがって、ＧＲＰ５０に結合している化合物を、これらの疾患状態を調整するために使用できる。
【００５２】
発現遺伝子産物への結合を測定する方法、ならびに遺伝子産物の生物学的活性を測定するためのインビトロおよびインビボアッセイはよく知られている。一般に、発現した遺伝子産物を被験化合物と接触させ、結合や、例えば、シグナル導入能力などの機能性応答の刺激または阻害を測定する。
【００５３】
以下の実施例は、本発明を例示するためのものであり。本発明の範囲を限定するものとして解釈してはならない。
【００５４】
（実施例）
【実施例１】
【００５５】
ＧＰＲ５０のＰＣＲ増幅
ＧＰＲ５０をコードする完全および部分ｃＤＮＡを、プルーフリーディング伸長ポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）および配列番号：１で示されたＧＰＲ５０の配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマー類を用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応に用いられた鋳型は、ヒトの５’−伸長下垂体ｃＤＮＡライブラリ、ヒト視床下部Ｍａｒａｔｈｏｎ−ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはヒトゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）であった。完全および部分ＧＰＲ５０のＰＣＲ産物を図１に示す。完全長ＧＰＲ５０の増幅の場合、５’プライマーは、以下の配列：
５’−ＧＡＣＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＴＡＧＣＧＧＴＴＣＣＣＡＣＣ−３’（プライマー１）
を有するＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位を含み、３’プライマー類の各々は、以下の配列：
５’−ＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＧＣＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣ−３’（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｍｙｃ  Ｈｉｓ（Ｂ）中への連結のためのストップコドン無し）（プライマー２）、
５’−ＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡＧＧＡＴＣ−３’（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇｒｏ中への連結のためのストップコドン有り）（プライマー３）
を有するＢａｍＨＩ部位を含んだ。
以下の追加のセンスプライマー類は、部分長ＧＰＲ５０断片の増幅のために使用された：
５’−ＧＣＣＴＧＴＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣ−３’（プライマー４）、
５’−ＡＴＣＣＴＧＡＣＡＡＣＣＡＡＣＴＴＧＣＴＧＡＧＧＴＴＣＧＣ−３’（プライマー５）。
使用されたサイクル条件は、以下のとおりである：
９４℃で２分間の最初の変性ステップ後、反応は、一連の温度によって３３回から３５回サイクルさせた：１）９４℃で３０秒間の変性、２）６０℃で１分間のプライマーのアニール化、３）７２℃で２分間から３分間の伸長化。７２℃で６分間の最終伸長化ステップを実施して、完全長産物の生成を確実にした。
【実施例２】
【００５６】
完全長ＧＰＲ５０のクローニング
上記のＰＣＲ反応で生成した完全長ＧＰＲ５０  ｃＤＮＡを、哺乳動物発現ベクター類のｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ−（Ｂ）またはｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に結合した。化学的変換およびミニ分取ＤＮＡ単離後、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＢａｍＨＩを用いて制限消化を実施し、陽性クローン類を同定した。
【実施例３】
【００５７】
ｃＤＮＡ源からのＧＰＲ５０の配列決定
ＤＮＡ配列決定は、ＡＢＩ  ｐｒｉｓｍ（登録商標）ＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネータサイクル配列決定即時反応キットを用いて実施した。精製ＰＣＲ産物を直接配列決定、またはｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−ＨｉｓベクターまたはｐｃＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏベクターにクローン化し、次いで個々の陽性クローン類を配列決定した。配列決定反応に使用されたプラーマー類としては、ＧＰＲ５０配列特異的プライマー類、またはＴ７プロモーター部位およびｐｃＤＮＡ３．１ベクター上に存在するｐｃＤＮＡ３．１／ＢＧＨ逆プライム化部位に設計したプライマー類が挙げられる。ＤＮＡＭＡＮプログラムソフトウェアを用いて配列を比較した。
【００５８】
脳下垂体または視床下部から単離された多くの独立したＧＰＲ５０クローン類の配列決定により、このヌクレオチド配列に関する数種の対立遺伝子変異体の存在が明らかになった。ＧＰＲ５０に関する７つの可能な対立遺伝子変異体を図２に示しているが、全ての変異体ヌクレオチド類は、翻訳された蛋白質の細胞質Ｃ末端部に生じる。対立遺伝子変異体は、配列番号：１の１５８２位、１８０４位および１５０３位〜１５０４位に位置している。１５８２位は、ＡまたはＧのいずれかであり得、１８０４位は、ＡまたはＧのいずれかであり得、１５０３位〜１５０４位にヌクレオチド伸張ＡＣＣＡＣＴＧＧＣＣＡＣからなる１２個のヌクレオチド挿入の有無のいずれかである。
【００５９】
さらに、ＧＰＲ５０の配列決定分析により、公表されたＧＰＲ５０のｃＤＮＡ配列（アクセス番号Ｕ５２２１９）が２つの配列エラーを含んでいることを明らかにした。これらは、配列番号：１に９５８位および１３４３位に位置している。９５８位は、プロリンからセリンに変化させるＣ（Ｔでなく）であり、１３４３位は、グリシンからアラニンに変化させるＣ（Ｇでなく）である。
【実施例４】
【００６０】
各個人のゲノムＤＮＡからのＧＰＲ５０の配列決定
幾つかの多型性が、ＧＰＲ５０配列に同定されたので、各個人がＧＰＲ５０に関して異なる配列を含むかどうかを調べるために、ゲノムＤＮＡを、１４人の対照患者から得た。部分ＰＣＲ産物を、遺伝子特異性（プライマー２およびプライマー５）を用いて、これら各々の試料から増幅し、精製断片（１１６６ｂｐ）を直接配列決定した。数人の個人が、１２個のヌクレオチド挿入を有するＧＰＲ５０配列を含んでいることが判り、他は、挿入なしの配列を含み、おおよそ半分が挿入有る配列と無い配列を含んでいた。１５８２位および１８０４位のヌクレオチド類は、やはり、各々ＡとＧ間の変異体であった。配列決定結果は表１にまとめてある。男性はＸ染色体の１個の複製のみを含むことから、ＧＰＲ５０に関する異型接合性配列は女性のみに見られた。８種の対立遺伝子の全てがＧＰＲ５０に可能性であったが、ある一定の配列がより多く存在することが見出された。例えば、配列が挿入を含んだ場合は、１５９４位と１８１６位に、それぞれＡとＧが最も多く（対立遺伝子７）、配列が挿入を含まない場合、１５８２位と１８０４位にそれぞれＧとＡが最も多かった（対立遺伝子２）。さらに、対立遺伝子７は、１４個のゲノムＤＮＡ試料に最もよく見られる配列であった。
【実施例５】
【００６１】
制限分析によるＧＰＲ５０対立遺伝子変異体の決定
ＢａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ部位は、１２個のヌクレオチド挿入部位内、ならびにＧＰＲ５０配列内の他の幾つかの部位に含まれることが判った。これにより、挿入を含んだ、または含まなかったＧＰＲ５０対立遺伝子変異体の決定が可能になった。部分長ＧＰＲ５０は、プライマー２およびプライマー５に相当するプライマー類を用いて各個人のゲノムＤＮＡから増幅された。ＰＣＲ産物を精製し、各３００ｎｇをＢａｌＩにより３７℃で２時間消化し、次いで臭化エチジウムを含有する２％寒天ゲル上で分解し、ＵＶ照射により肉眼で見た。ＢａｌＩ消化により、挿入の有無を示す以下のフレグメントサイズを生じた。断片３４０ｂｐと７５ｐは、１２個のヌクレオチド挿入を示し；断片４０３ｂｐは挿入を示さず、４０３ｂｐ、３４０ｂｐおよび７５ｐのバンドは、挿入有り無しの対立遺伝子、両方が存在することを示した。図３は、試料１、２および３からＧＰＲ５０ＰＣＲ産物のＢａｌＩ消化を示す。これは、試料１が挿入有りのＧＰＲ５０対立遺伝子のみを含み、試料２は、挿入有り無しの対立遺伝子を有し、試料３は、挿入無しのＧＰＲ５０対立遺伝子のみを含んでいることを示している。したがって、このことは、表１に示した配列決定結果と一致する。
【実施例６】
【００６２】
ＧＰＲ５０の組織分布解析
ＧＰＲ５０ｃＤＮＡは、プライマー４（センス）およびプライマー２（アンチセンス）を用いてＰＣＲにより増幅し、この受容体のＣ末端領域に相当する０．７８ｋｂプローブを産生した。ＰＣＲ産物を精製し、ＤＮＡ濃度を寒天ゲル電気泳動により推定した。ｃＤＮＡ（１００ｎｇ）を、Ｈｉｇｈ  ＰｒｉｍｅランダムプライマーＤＮＡ標識法（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて放射性標識し、引続きＰｒｏｂｅＱｕａｎｔ  Ｇ−５０ミクロカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて、取り込みのないヌクレオチドからプローブを分離精製した。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、製造元のガイドラインに従ってＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ溶液（ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて実施した。ＭＴＥアレイを以下の一連の洗浄ステップに供した：２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃で２０分洗浄を４回；および１×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ中、５５℃で２０分洗浄を２回。全ての洗浄ステップは、連続振とうによって実施した。前記ＭＴＥをサランラップで包み、−７０℃で一晩、増感スクリーンによりＸ線フィルムに曝露した。
【００６３】
図４に示されるように、強いハイブリッド形成シグナルが、脳下垂体中にのみ観察された。ヒトＧＰＲ５０の発現は、脳下垂体および視床下部に限定されていることが以前報告されており（Ｒｅｐｐｅｒｔら、１９９６年）、したがってここで得られた結果は、このデータと一致する。ＧＰＲ５０の発現は、図４に示された末梢組織のいずれにおいても検出されなかった。ＧＰＲ５０の発現は、ＰＣＲにより視床下部において確認された（図１ｂ）。脳下垂体および視床下部においてＧＰＲ５０発現が確認されたこと、および図４に調べられた他の組織のいずれにも、この転写体の発現を検出できなかったことは、ＨＰＡ軸機能におけるこのオーファン受容体の役割を支持している。
【実施例７】
【００６４】
ＧＰＲ５０多型性と双極性情動障害および再発性単極性うつ病との関連性
症例−対照関連性試験を、１５０３位〜１５０４位における１２個のヌクレオチドの挿入／欠失多型性および単一ヌクレオチド多型、ＳＮＰ１８０４により実施した。前記挿入／欠失は、双極性情動障害（ＢＰＡＤ）（２７４人）、再発性の単極性うつ病（ＵＰ）（２６２人）または分裂病（ＳＣＺ）（２６５人）の診断を有する被験者を含む８０１人の無関係の被験者、および５１９人の無関係の対照被験者において遺伝子型決定がなされた。ＳＮＰは、ＢＰＡＤ（２５７人）、ＵＰ（２６０人）またはＳＣＺ（２６０人）の診断を有する被験者を含む７７７人の無関係の被験者、および４５２人の無関係の対照被験者において遺伝子型決定がなされた。表２は、性別および診断による被験者数を示す。
【００６５】
試料：
双極性情動障害（２９６人）、再発性の単極性うつ病（２６９人）または分裂病（２８９人）の診断を有する個人からなる８５４人の無関係の被験者は、スコットランド南部の精神医学サービス施設の入院患者または外来患者であった。「情動障害および分裂病のためのスケジュール−生涯版」（Ｅｎｄｉｃｏｔｔ  Ｊ、Ｓｐｉｔｚｅｒ  ＲＬ、１９７８年、診断インタビュー：情動障害および分裂病のスケジュール、一般精神医学書３５：８３７〜８４４頁および症例記録報告書）を用いて、熟練精神科医（Ｄｏｕｇｌａｓ  Ｂｌａｃｋｗｏｏｄ教授、Ｗａｌｔｅｒ  Ｍｕｉｒ博士）による個人インタビュー後、ＤＳＭ−ＩＶ基準（「Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」、アメリカ精神医学会、ワシントンＤＣ、１９９４年）に従って総意診断がなされた。年令および性別が知られた６１０人の対照被験者を、同じ地域から募集し、この地域の輸血施設によって募集された幾人かの被験者も含んだ。対照被験者は、短いアンケートを用いてインタビューしたが、主たる精神病歴は無かった。
【００６６】
末梢血試料からのＤＮＡ抽出には標準的方法が用いられた。
【００６７】
遺伝子型決定：
プライマー類は、挿入／欠失多型およびＳＮＰを交差して増幅させるように設計した。追加の伸長プライマーは、ＳＮａＰｓｈｏｔ（商標）プライマー伸長反応におけるＳＮＰの遺伝子型を分類するように設計した。
挿入／欠失多型
プライマーＡ：ＴＴＣＡＴＴＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＴＴＣＣ
プライマーＢ：ＣＴＴＡＧＧＧＴＧＧＣＴＧＧＴＡＧＴＧＧ
ＰＣＲ産物設計サイズ：１８５／１９７
ＳＮＰ１８０４
プライマーＡ：ＣＡＣＴＧＣＴＧＡＣＴＡＴＣＣＣＡＡＧＣ
プライマーＢ：ＴＣＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＴＴＣＡＴＣＡＧ
伸長プライマー：ＧＡＴＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡ
ＳＮＰ：Ａ／Ｇ
挿入／欠失の遺伝子型決定
挿入／欠失多型を遺伝子型決定するためのＰＣＲ反応は、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中、合計２４ｎｇのＤＮＡ、１０ｐｍｏｌの各プライマー、１００μＭのｄＮＴＰ類（Ｓｉｇｍａ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２および１ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いてＰＴＣ２２５（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）上で実行された。使用されたＰＣＲプログラムは、次のとおりである：９４℃で３分間の最初の変性化、次いで９４℃で１５秒間、３０秒間で６５℃〜１℃／サイクルおよび７２℃で４５秒間の１０サイクル。
【００６８】
試料を希釈し、２μｌを、５容量の脱イオンホルムアミド：２容量の２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍｇ／ｍｌ青色デキストラン、１容量のＧｅｎｅＳｃａｎ（登録商標）−３５０［ＴＡＭＲＡ］（商標）の内部レーン基準（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、１容量の水を含有する２μｌのＴＡＭＲＡ充填緩衝液に加えた。試料を、最初に９４℃で５分間変性させ、電気泳動をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシーケンサ上で実施した。
【００６９】
ＳＮＡ遺伝子型決定
ＳＮＰ遺伝子型決定のためのＰＣＲ反応は、１×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中、合計２４ｎｇのＤＮＡ、２．５ｐｍｏｌの各プライマー、１００μＭのｄＮＴＰ類（Ｓｉｇｍａ）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２および１ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を用いてＰＴＣ２２５（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）上で実施された。使用されたＰＣＲプログラムは、次のとおりである：９４℃で３分間の最初の変性化、次いで９４℃で１５秒間、３０秒間で６５℃〜１℃／サイクルおよび７２℃で４５秒間の１０サイクル。ＰＣＲプライマー類およびｄＮＴＰ類を、遺伝子型決定前に除去した：４μｌのＰＣＲ産物を、１μｌのＥｘｏＳａｐｌＴ（Ａｎｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と共に３７℃で４５分間温置し、次いで酵素不活化のために８０℃で２０分温置した。
【００７０】
遺伝子型決定反応は、２μｌの精製ＰＣＲ産物、１μｌのＳｎａＰｓｈｏｔ（商標）マルチプレックスミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、２ｐｍｏｌｅの伸長プライマー（製造元の推奨に従って設計した）を含有する最終容量１０μｌ中で実施した。ＰＣＲ条件は、９４℃で１０秒間、５０℃で５秒間、および６０℃で３０秒間の２５サイクルであった。サイクル後、取り込まれなかったｄｄＮＴＰ類を、１Ｕのシュリンプアルカリホスファターゼ（Ａｎｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を添加することによって除去し、３７℃で４５分間温置し、次いで酵素不活化のために８０℃で２０分間温置した。２μｌの充填緩衝液（５容量の脱イオンホルムアミド：１容量の２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍｇ／ｍｌ青色デキストラン）を、２μｌのＳｎａＰｓｈｏｔ（商標）反応液に加え、試料を９４℃で５分間変性させた。電気泳動をＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシーケンサ上で実施した。
【００７１】
結果を、ＧｅｎｅＳｃａｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．１を用いて解析し、挿入／欠失多型に関して、Ｇｅｎｏｔｙｐｅｒバージョン１．１を用いてさらに解析した。
【００７２】
統計解析
関連性解析を、診断と性別に基づき、対立遺伝子の頻度、遺伝子型およびハプロタイプのレベルで実施した。本実施例で記載された関連性試験に関して、１５０３〜１５０４挿入／欠失多型性を記載する場合、対立遺伝子１は、挿入の欠如（すなわち欠失）に相当し、対立遺伝子２は、挿入の存在に相当する。同様に、ＳＮＡＰ１８０４に関して、対立遺伝子１はアデノシン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）に、また対立遺伝子２はグアニン（Ｇｕａｎｉｎｅ）に相当する。遺伝子型およびハプロタイプの記載は、適切な表内に記載される。
【００７３】
統計解析を実行する前に、遺伝子型決定の誤差の影響を予想し、対照集団が無作為試料の集団で構成されていることを確認することが必要である。最初に、男性において遺伝子型の度数および遺伝子型決定誤差に対して解析を実施した。ＧＰＲ５０はＸ染色体上に位置していることから、異型接合の男性は、遺伝子分類誤差から生じていると推測される。この誤差率は、挿入／欠失多型に関して１．８％、ＳＮＰ１８０４に関して２．８％（平均２．３％）と算出された。遺伝子型誤差率は、女性においても男性と同じであると推定される。男性の異型接合体の存在により測定された誤差率は、極めて低いと考えられたので、この結果に強い影響を与えないと思われる。１つ以上の遺伝子座における男性の異型接合体の解析は、以後の解析から除外された。
【００７４】
対立遺伝子の度数を、対照試料において推定し、対照におけるＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ（Ｈ−Ｗ）予想値と比較した（表３）。Ｈ−Ｗ平衡式は、式ｐ２＋２ｐｑ＋ｑ２＝１を用い、式中ｐは対立遺伝子１の度数であり、ｑは対立遺伝子２の度数であり、ｐ＋ｑ＝１である。したがって、ｐ２は、遺伝子型１／１が発生する確率であり、ｑ２は、遺伝子型２／２が発生する確率であり、２ｐｑは、遺伝子型１／２が発生する確率である。女性における対立遺伝子１の度数（ｐｆ）および男性における対立遺伝子１の度数（ｐｍ）を、別々に導き、次いでこれらを対立遺伝子１の合計度数（加重平均、ｐ）を計算するために用いた。算出された加重平均ｐ値を用いて、表３に示されたとおり、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ比に従って予想度数を計算した。次に観察度数および予想度数を、その比率が異なっているかどうかを見るためにカイ２乗検定で比較した。この結果から、対照集団における観察度数と予想度数との間の差は有意ではなく、その結果、対照集団においてバイアスがあることを示唆する証拠はＨ−Ｗ検定からないことが証明された。したがって、診断状態と関心のある多型性との関連性に関するこれらの結果を検定することは妥当である考えられた。
【００７５】
各々の診断群における対立遺伝子の度数解析（表４）は、ＢＰＡＤ女性（ｐ＝０．００００４）およびＵＰ女性（ｐ＝０．００２）において１５０３位〜１５０４位（対立遺伝子１）における欠失多型との関連性に関して強い証拠があることを示している（表４ａ）。これらの群の男性またはＳＣＺでは関連性がやはり観察されなかった（表４ｂ）。男性と女性を合わせると、生じたｐ値は、ＢＰＡＤおよびＵＰに関してそれぞれ０．００２と０．００２であり、ＳＣＺに関しては０．０７３であった（表４ｃ）。
【００７６】
ＳＮＰ１８０４は同様の関連性パターンを示し；ＢＰＡＤ女性（ｐ＝０．００３）およびＵＰ女性（０．０１９）におけるＳＮＰ１８０４＝Ａ（対立遺伝子１）との関連性に関する強い証拠がある（表４ａ）。これらの群の男性またはＳＣＺ群では対合が観察されなかった（表４ｂ）。ＳＮＰに関して男性と女性を合わせると、生じたｐ値は、ＢＰＡＤおよびＵＰに関してそれぞれ０．００３と０．０３２であり、ＳＣＺに関しては０．０２２である（表４ｃ）。
【００７７】
３つの診断群全てを合わせると（ＢＰＡＤ、ＳＣＺおよびＵＰ）、挿入／欠失多型およびＳＮＰ１８０４の双方に関して、女性および女性と男性を合わせた群により有意な関連性が見出される。
【００７８】
遺伝子型度数の解析（表５）により、遺伝子型１／１が，ＢＰＡＤ女性（ｐ＝０．０００２）およびＵＰ女性（０．００６）における挿入／欠失多型性とＳＮＰ１８０４の双方に関して有意に上昇することを示唆する。これは、欠失対立遺伝子を有するＧＰＲ５０の２つの複製またはＳＮＰ１８０４における対立遺伝子Ａの２つの複製のいずれかに相当する。男性ではマーカーと疾患状態について、遺伝子型決定との関連性に関する証拠はない。
【００７９】
男性におけるハプロタイプ（挿入／欠失多型とＳＮＰ１８０４の組合わせ）の度数の比較でもまた、有意な関連性を示されなかった（データは示さず）。両方のマーカーが異型接合であってもハプロタイプであることを決定できないので、女性のハプロタイプの比較は推定ハプロタイプ度数に依る。ＥＨプログラム（ＴｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒおよびＯｔｔ、１９９４年）は、ＥＭ演算法を用いて二重異型接合の個人に関するハロタイプを帰属させる。導かれた女性ハロタイプの度数解析（表６）により、ＢＰＡＤ、ＵＰおよび全症例（それぞれ、ｐ＝０．０００２、ｐ＝０．０２１６およびｐ＝０．００２７）における有意な関連性に関する証拠が提供されている。
【００８０】
要約すると、１５０３位〜１５０４位における１２個のヌクレオチド挿入／欠失多型および単一ヌクレオチド多型、ＳＮＰ１８０４との関連性を評価するために設計した症例対照試験において、ＧＰＲ５０は、女性ＢＰＡＤおよびＵＰ症例における疾患状態と有意に関連しているが、男性では関連してないことが判明した。このことにより、ＧＰＲ５０の変異は、女性においてこれらの情動障害を発現する確率に影響を与えること、または、その確立に影響を与える変異によりＧＰＲ５０が強い結合不均衡にあることを示唆している。
【００８１】
表１  各個人のゲノムＤＮＡからＧＰＲ５０の配列決定
ＧＰＲ５０は、１４人の対照個人のゲノムＤＮＡから増幅され、次に精製ＰＣＲ産物を直接配列決定した。
【００８２】
【表１】
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【００８３】
表２  関連性試験において各多型に関して遺伝子型決定された個人の試料数
全症例は、ＢＰＡＤ、ＳＣＺおよびＵＰ症例群の全個人を含む。
【００８４】
【表２】
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【００８５】
表３  対照における対立遺伝子度数の推定および対照における遺伝子型度数とＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂａｒｇ予想値との比較
挿入／欠失多型に関して、欠失は対立遺伝子１として、挿入は対立遺伝子２としてコードされ；ＳＮＰ１８０４に関して、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅは対立遺伝子１として、Ｇｕａｎｉｎｅは対立遺伝子２としてコードされている。加重平均ｐ値（対立遺伝子１：挿入／欠失では０．３９８、ＳＮＰでは０．３６７）は、Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂａｒｇ比に従って予想値を計算するために用いた。
【００８６】
【表３】
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【００８７】
表４  患者群および対照群における挿入／欠失多型性に関する対立遺伝子１の度数およびＳＮＰ１８０４に関する対立遺伝子１の度数
挿入／欠失に関する対立遺伝子１は欠失に相当し、ＳＮＰ１８０４に関する対立遺伝子１はＡに相当する。各症例群において観察された対立遺伝子度数を、カイ二乗分割検定を用いて対照群の度数と比較した。報告されたｐ値は、ゼロ仮説（症例群と対照群との間が等しい対立遺伝子度数）を検定するカイ二乗分割表検定（１度の自由度で）に由来する。
【００８８】
【表４】
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【００８９】
表５  女性における遺伝子型度数の解析
挿入／欠失多型に関する遺伝子型１／１は、欠失対立遺伝子の２つの複製に相当し、遺伝子型２／２は、１５０３位〜１５０４位における１２個のヌクレオチド挿入の２つの複製に相当し、遺伝子型１／２は、１つの欠失対立遺伝子および１つの挿入対立遺伝子に相当する。ＳＮＰ１８０４に関する遺伝子型１／１は、対立遺伝子Ａを有するＧＰＲ５０の２つの複製に相当し、遺伝子型２／２は、対立遺伝子Ｇの２つの複製に相当し、遺伝子型１／２は、１つの対立遺伝子Ａと１つの対立遺伝子Ｇを有するＧＰＲ５０に相当する。
【００９０】
各症例群において観察された遺伝子型度数を、カイ二乗分割検定を用いて対照群の度数と比較した。報告されたｐ値は、ゼロ仮説（症例群と対照群との間で遺伝子型度数が等しい）を検定するカイ二乗分割表検定（２度の自由度で）に由来する。
【００９１】
【表５】
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【００９２】
表６  女性における推定ハプロタイプ度数
ハプロタイプ１−１は、欠失およびＡ  ＳＮＰに相当し、ハプロタイプ１−２は、欠失およびＧ  ＳＮＰに相当し、２−１は、挿入およびＡ  ＳＮＰに相当し、２−２は、挿入およびＧ  ＳＮＰに相当する。ＥＨプログラムにおけるＥＭ演算法（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｎｇｅｒ＆Ｏｔｔ、１９９４年）を用いて、二重異型接合の各人に対しハプロタイプを帰属させた。報告されたｐ値は、ゼロ仮説（症例群と対照群との間でハプロタイプ度数が等しい）を検定するカイ二乗検定統計値に由来する。カイ二乗検定統計値（Ｘ２）は、症例、対照および合わせたデータに関する可能性対数から算出されるＸ２＝２（ｌｎ（Ｌｃａｓｅ）＋ｌｎ（Ｌｃｏｎｔｒｏｌ）−ｌｎ（Ｌｃｏｍｂｉｎｅｄ））（例えば、Ｓｈａｒｍ１９９８年）。
【００９３】
【表６】
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【００９４】
【表７】
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【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ヒト脳下垂体ｃＤＮＡおよびヒト視床下部ｃＤＮＡ由来ＧＰＲ５０のＰＣＲ増幅を示す図である。
配列番号：１に従って設計した遺伝子特異的プライマー類を用いてＰＣＲにより、ＧＰＲ５０をヒト脳下垂体ｃＤＮＡライブラリ（ａ）およびヒト視床下部ｃＤＮＡ（ｂ）から増幅した。レーン１と４は、ＤＮＡ分子サイズのマーカー（それぞれ１ｋｂ段階およびＤＮＡ低質量段階、Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を含む。
【図２】ＧＰＲ５０ヌクレオチド配列の対立遺伝子変異体を示す図である。
ＧＰＲ５０ヌクレオチド配列に関する７種の対立遺伝子変異体（対立遺伝子２〜８）を示す。ＧＰＲ５０遺伝子は、おおよそ３ｋｂのイントロンにより分離された２種のエクソンからなる。ＴＭドメインＩ〜ＶＩＩ、それに続いて大きな細胞質Ｃ末端部が示されている。変異体ヌクレオチド類は、全てＣ末端領域内に含まれる。ヌクレオチド類の番号は、１２個のヌクレオチド挿入のない対立遺伝子に相当する。対立遺伝子１は配列番号：１によって表され、対立遺伝子２（対立遺伝子変異体）は配列番号：２によって表され、対立遺伝子３（対立遺伝子変異体）は配列番号：３によって表されるというように配列番号：８まで同様である。
【図３】１２個のヌクレオチド挿入を含む対立遺伝子を決定するためのＧＰＲ５０のＢａｌ  Ｉ制限分析を示す図である。
ＧＰＲ５０は、各個人のゲノムＤＮＡから増幅され、精製ＰＣＲ産物は、Ｂａｌ  Ｉによって消化され、次に２％寒天ゲル上で分解される。断片３４０ｂｐおよび７５ｂｐは配列が、挿入を含んでいることを示し；断片４０３ｂｐは配列には、挿入を含まないことを示し；これら３本のバンド全ては、１２個のヌクレオチド挿入の有無による配列が存在することを示した。
【図４】ＧＰＲ５０の組織分布分析を示す図である。
広範囲のヒト組織由来のポリＡ＋ＲＮＡ類を含有する多重組織発現（ＭＴＥ）アレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、このｃＤＮＡの３’−末端に相当するＧＰＲ５０の０．７８ｋｂ放射標識断片により調べた。
【図５】ＧＰＲ５０対立遺伝子１〜８の配列整列を示す図である。
７種のＧＰＲ５０対立遺伝子変異体（対立遺伝子２〜８）のアミノ酸配列整列。対立遺伝子１の蛋白質配列は、配列番号：９によって表され、対立遺伝子２（対立遺伝子変異体）は配列番号：１０によって表され、対立遺伝子３（対立遺伝子変異体）は配列番号：１１によって表されるというように配列番号：１６まで同様である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004533847.tif 000103
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