(57)【要約】本発明は、ポリペプチドに共有結合した少なくとも一つのフラボノイドを含むＵＶ放射線吸収化合物に関する。この結合は、ポリペプチドの窒素原子とフラボノイド分子の芳香族炭素に付随するアルキリデン基によって構成され得る。前記ＵＶ放射線吸収化合物は、第１又は第２アミンとケルセチンのようなフラボノイド化合物とを伴って生じるマンニッヒ型の反応によって製造することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２０〜２０００のアミノ残基の鎖長のポリペプチドに共有結合した少なくとも一つのフラボノイドを含むことを特徴とするＵＶ放射線吸収化合物。
【請求項２】
前記フラボノイドが、フラボノイドとポリペプチドのアミノ基に付随したアルキリデン基を介して結合されていることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ポリペプチドが水溶性であることを特徴とする請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、３０〜１０００のアミノ酸残基を有していることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、少なくとも一つのリジン残基を有していることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
少なくとも一つのフラボノイドが、４−ケト−５−ヒドロキシ基及び／又はカテコール基を含むことを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
前記フラボノイドが、フラボン及びフラバノンを含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
前記フラボンが、ケルセチンであることを特徴とする請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記フラボノイドの少なくとも一つのヒドロキシ基が化学的に修飾され、該修飾が、アルキル化、ヒドロキシアルキル化、アシル化、グリコシル化又はこれらの組合せであることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項１０】
前記フラボノイドがルチンであることを特徴とする請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
前記ポリペプチドに連結したフラボノイドの量が、１００アミノ酸あたり０．１５〜１５フラボノイド分子であり、好ましくは１００アミノ酸あたり１〜７．５フラボノイド分子であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の化合物。
【請求項１２】
ポリペプチドが、カゼイン、セリシン、水溶性のコラーゲン及びゼラチンから選択されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかに記載の化合物。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、らせん構造を有しないコラーゲン又はゼラチンであることを特徴とする請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
ビタミンＣやビタミンＥのような抗酸化物が前記ペプチドに共有結合していることを特徴とする請求項１〜１３のいずれかに記載の化合物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の化合物を含み、美容上及び皮膚科学的に許容される基材から構成されることを特徴とするＵＶ放射線から保護するための美容用組成物。
【請求項１６】
アルデヒドの存在下でフラボノイドがポリペプチドと反応することを特徴とする請求項１〜１４のいずれかに記載のＵＶ放射線吸収化合物を製造するための方法。
【請求項１７】
前記反応が、ｐＨ１〜７、好ましくはｐＨ５〜６で行われることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
加えられるアルデヒドのモル量が、フラボノイドのモル量に対して１．５〜４倍であることを特徴とする請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＵＶ放射線の有害な影響を防ぐための請求項１〜１４のいずれかに記載の化合物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＵＶ放射線（UV-radiation）やその有害な影響から保護するための新規な光安定ポリペプチドに関する。さらに、本発明は、前記光安定ポリペプチドの合成や美容用の使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＵＶ光に曝された皮膚の有害な影響は、多種多様であって、先行技術に詳しく記載されている。２９０〜３２０ｎｍの波長をもつＵＶ−Ｂ放射線が、紅斑や日焼けを引き起こすことは、長い間認識されてきた。３２０〜４００ｎｍの波長のＵＶ−Ａが、光毒性及び光化学の反応を引き起こすことは１９８０年あたりまで発見されなかった。
【０００３】
７０％のＵＶ−Ｂ放射線は外皮や角質層によって防がれるが、ＵＶ−Ａ放射線の場合は異なり、その後、皮膚の奥深くまで突き抜ける。よく知られたＵＶ−Ａの有害な影響は、酸化的ストレスである。ＵＶ−Ａ放射線によって形成されるスーパーオキシドは、皮膚の中の線維芽細胞中に存在する鉄蓄積タンパク質であるフェリチンから鉄を解放し得る（非特許文献１参照。）。非常に有害なヒドロキシル・ラジカルや過酸化水素の生成をもたらすフェントン反応やハーバー・ウェイス反応における鉄の役割はよく知られている。また、銅イオンのような他の金属イオンは、酸素ラジカルの形成の触媒となると報告されている。損傷したＤＮＡにおけるこれらの有害な生成物の役割は、例えばSestili et al によって述べられているようによく知られている（非特許文献２）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
フェントン反応やハーバー・ウェイス反応は、キレート鉄によって効果的に阻害される。ケルセチンのようなあるフラボノイド化合物は、金属キレート剤やラジカルスカベンジャーとして知られている。フラボノイド化合物は、酸化的ストレスを減少させるために効果的に使用され、その結果、メラノーマやノンメラノーマの癌種を阻止し又は制限する（非特許文献３）。他の金属キレート剤に対するケルセチンの利点は、より優れたスカベンジャーであって、皮膚刺激副作用をもたないことである。さらに、ケルセチンは、ラジカルスカベンジャーとして機能し、スーパーオキシドラジカルによってフェリチンからの鉄の解放を防止する。
【０００５】
スーパーオキシドジスムターゼのような酵素による通常の生化学的な保護は、ＵＶ−Ａ放射線により引き起こされる反応を有効に止めるには十分でない。従って、これらの有害な影響から皮膚を保護する必要性はいまだ必須である。ケルセチンによって防がれ低減される他の酸化的ストレス現象は、急速に進展する皮膚の老化や白斑をもたらすコラーゲンの損傷や、脂質過酸化反応による細胞壁の損傷である。ケルセチンの金属キレート特性は、カテコール基の存在や４−ケト，５−ヒドロキシ部位の存在が関係していることがわかった（非特許文献４）。AherneとO ' Brienは、ケルセチンの３−ヒドロキシ基がジグリコシド基によって置換されたルチンは、ケルセチンのように効果的に金属イオンをキレートせず、ケルセチンのラジカルスカベンジング機能をもたないことを報告している（非特許文献５）。フラボンとフラボノンの不利な点は、水への溶解性が低いことである。したがって、これらは、ヒドロゲルのような水性の化粧品の使用には適していない。これらは、通常好ましくない副作用をもつ有機溶媒の使用を必要とする。一般に、ＵＶ吸収化合物のさらなる不利な点は、それ自身、ＵＶ光の下で不安定であることである。ＵＶ照射は、ＵＶ吸収化合物を破壊する光化学反応を引き起こし、その結果、ＵＶ放射線に対する防御が低減する。先行技術に記載されているフラボノイドのさらなる不利な点は、これらの化合物は、皮膚を突きぬけ血流に入る危険性があるかもしれないということである。
【０００６】
ＵＶ−Ａフィルターとしてのケルセチンやその誘導体の使用が先行技術に記載されている。特許文献１には、α−グリコシルケルセチンが記載されている。よりＵＶに安定で水に溶解性の高いものがクレームされている。しかしながら、このような化合物は、金属キレート剤としての機能を低下させラジカルスカベンジャーとして機能しないであろうことが予想される（非特許文献５）。
【０００７】
特許文献２には、テトラアルキル化ケルセチンを含むＵＶ放射線に対する防御のための美容用の化合物が開示されている。これらの化合物は癌を防ぐことができることが述べられているが、カテロール基と他のヒドロキシ基の両方がアルキル化されてしまうので、アルキル化ケルセチンが金属イオンをキレートできるとは考えられない。
【０００８】
特許文献３〜５には、好ましくは３−ヒドロキシ基がグリコシル化された構造の、高い濃度のＵＶ光によってフラボノイドが破壊するのを防止する安定剤と共にもちいるフラボノイドの使用が開示されている。特許文献６には、日よけフィルターとしてフラボンとフラバノンの組み合わせから構成される組成物が開示されている。これらの化合物の金属キレート剤やラジカルスカベンジャーとしての役割は、ここには記載されていない。
【０００９】
特許文献７には、皮膚の中に又は皮膚を通して突き抜けることができないような分子量のＵＶ吸収基をもった有機ポリシロキサンポリマーが開示されている。
【００１０】
上記のような試みにもかかわらず、残存するブロックされない放射線の有害な影響を防ぎ又は減らすと同時に、放射線をブロックすることによって日光からの十分に直接的な防御を提供するＵＶフィルターの必要性はなお存在する。
【特許文献１】
ＵＳ５５６５４３５号公報
【特許文献２】
ＵＳ５７１８９０６号公報
【特許文献３】
ＥＰ１０５５４１５Ａ２号公報
【特許文献４】
ＥＰ１０５５４１１Ａ２号公報
【特許文献５】
ＥＰ１０５５４１２Ａ２号公報
【特許文献６】
ＷＯ ９９／２５３１６号公報
【特許文献７】
ＵＳ５４０３９４４号公報
【非特許文献１】
Pourzand et al , Proc . Natl, Acad, Sci.USA, June 1999, Vol 96 ,p.6751-56
【非特許文献２】
Free Radical Bioligy & Medicine [US], July 15 1998 , 25 , [2] p.196-200
【非特許文献３】
Caltagirone et al , Int . J . of Caner , 2001 , V87 , N4 [Aug 15], p.595-600
【非特許文献４】
Chenh , Breen , Biometals (Netherlands) March 2000 , 13 [1] p.77-83
【非特許文献５】
Free radical Biology and Medicine , 2000 , V29 , N6 [Sep 15] , p.507-514
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の目的は、新規な水溶性ＵＶ吸収フラボノイド化合物を提供することにある。
【００１２】
また、本発明の目的は、前記新規な水溶性ＵＶ吸収フラボノイド化合物の合成方法を提供することにある。
【００１３】
さらに、本発明の目的は、ＵＶ光の下での破壊に対して高い安定性を有して、高い濃度において使用可能な、新規な水溶性ＵＶ吸収フラボノイド化合物を提供することにある。
【００１４】
本発明の他の目的は、前記放射線を吸収することによるＵＶからの最適の保護や、金属イオンをキレートし酸素ラジカルをスカベンジングすることによる前記放射線の悪影響からの最適の保護をを提供する新規なフラボノイド化合物を提供することにある。
【００１５】
本発明の他の目的は、血流に導入される危険性を最小限に抑えて、皮膚に安全に適応することができる新規なフラボノイド化合物を提供することにある。
【発明の効果】
【００１６】
本発明は、水溶性の生体高分子に連結した少なくとも一つのフラボノイド化合物から構成されるＵＶ放射線吸収生体高分子によって、これらのすべての目的に到達し得るという驚くべき見識に基づくものである。ＵＶ放射線吸収生体高分子は、鉄や銅のような金属イオンをキレートすることができる。生体高分子は、好ましくはゼラチンのようなポリペプチドやタンパク質である。また、生体高分子は、特に、免疫原性を持たず、アレルギー性ではない。この新規なＵＶ吸収ポリマーは、血流に導入されるという重大な危険性がなく用いられ、免疫反応の危険性や有害な影響を防ぐ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、例えば、美容分野において適用され、日光を浴びることによる有害な影響から人間の皮膚や髪を保護するためのＵＶ放射線吸収化合物を対象とする。また、本発明は、十分な保護を与えることができるほど十分に高い濃度で使用可能で、水溶性の、安定性の高いＵＶ放射線吸収化合物を対象とする。
【００１８】
さらに、本発明は、金属イオンキレート特性やラジカルスカベンジング特性を表わすことによって、酸化的ストレスのような影響から皮膚や髪を保護することができる化合物を対象とする。
【００１９】
特に、本発明は、皮膚を通って血流中に浸透することのない、安定した水溶性のＵＶ放射線吸収化合物を対象とする。前記ＵＶ吸収ポリマーが血流中に導入されることを防ぐことによって、免疫反応や他の有害な影響の危険性を低減させる。
【００２０】
ケルセチンのようなフラボノイドは数多くの有益な効果を持っていると報告されてきたが、Drewa et al によって記載されているように、投与されると、そのような化合物には発がん性の影響の危険性がある疑いがある（Neoplasma , 2001 , V48 , N1 , p12-18）。したがって、そのような化合物が皮膚を通って浸透し血流に導入されることを防ぐことに慎重になる。そのような溶媒は、さらに、皮膚過敏症のような免疫反応を誘発し、角質層の層状の細胞間脂質バリアを通して有害な物質の移動を促進することによって皮膚浸透を増大させるので、この点において、美容用途への有機溶媒の使用は避けなければならない。
【００２１】
好ましい実施形態におけるＵＶ吸収生体高分子は、ポリペプチドである。本発明において、ポリペプチドは、ペプチド結合により結合した少なくとも２０のアミノ酸をもった分子から構成されると理解される。例えば、天然タンパク質、変性タンパク質、合成、組み換えタンパク質、合成、組み換えペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、リポタンパクや、側鎖としての又は主鎖中の生体オリゴマーや生体ポリマー群等のその他の群を含む他の分子である。最長は、通常、２０００のアミノ酸である。好ましい実施形態においては、ポリペプチドは３０〜１０００のアミノ酸を含む。特にゼラチンタイプであって、５０〜５００のアミノ酸をもつポリペプチドは、特に好ましい。最小数（例えば、２０）と最大数（例えば、２０００）の間のアミノ酸をもつポリペプチドとは、平均数（重量及び数の両方における）が前記最低及び最高の間にある。そして、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％の大部分の分子が、前記最低及び最高の間のアミノ酸の数であることをいう。
【００２２】
好ましい実施形態においては、ＵＶ吸収化合物は、ポリペプチドに連結し、ケルセチンのように鉄をキレートできる、フラバノール（３−ヒドロキシ−フラボン）化合物から構成される。さらに好ましい実施形態は、鉄イオンをキレートでき、ＵＶ−ＡとＵＶ−Ｂ放射線とをそれぞれ吸収することのできるフラバノール化合物とフラバノン化合物とから構成される。フラボン／フラバノンの割合は、ＵＶ−Ｂ／ＵＶ−Ａ保護の割合を決定するために調整される。フラバノンの高い含有は、優れたＵＶ−Ａ保護を与えるが、皮膚の日焼けを止めるであろう。ＷＯ ９９／２５３１６には、１０：１〜２５：１（ｗ／ｗ）のフラバノン／フラボン割合は、皮膚の日焼けを許すけれども、ＵＶ−Ａに対する十分な保護を与えることが述べられている。
【００２３】
他の実施形態においては、前記フラバノール化合物又はフラバノン化合物の一つは、鉄イオンをキレートすることができる。フラノイド化合物に加えて、ＥＰ１０５５４１５に記載されているような、従来のＵＶ吸収化合物を結合させることもできる。従来のＵＶ吸収化合物だけや、任意に金属キレート化合物を結合させる可能性も検討されたが、本発明によって提供される溶液のシンプルさ（simplicity）の点から、却下された。
【００２４】
他の実施態様では、ヒドロキシル基の存在によって起きる黄色を減少させるために、フラノイド分子が化学的に修飾されている。このような修飾は、アルキル化、ヒドロキシアルキル化、アシル化、又はこのような修飾の組合せであってもよい。修飾は、カテコール基の金属キレート機能が損なわれない（not compromised）限り、いずれかのヒドロキシ基で行われ得る。この観点から、３−キドロキシ基が二糖類によって置換されているルチンが好ましい。このような修飾の追加的な利点は、フラボノイド化合物の溶解性が増加していることである。修飾は、前記フラボノイドをポリペプチドに結合する前又は後に行われ得る。
【００２５】
生体ポリマーに結合されるべきフラボノイドの量は、複数の要因によって決定される。含有は、１００アミノ酸あたり０．１５〜１５フラボノイド分子であってもよい。低い含有では、要求されているＵＶ保護を達成するために皮膚につけるクリーム又は（ヒドロ）ゲル等の形でのポリペプチドの量は多すぎる。ポリマー上で利用することができるアミン基やカルボキシル基のような遊離型反応性基の数が、主として上限を決定する。例えば、好ましい生体ポリマーであるゼラチンは、１００アミノ酸あたり約５フラボノイド分子の含有に対応することができる。ゼラチンは、利用できる遊離型反応性基の数を増やすために修飾され得る。高すぎる含有は、生体ポリマーの高すぎる疎水性を引き起こし水の溶解度を減少させる。好ましくは含有は、１００アミノ酸あたり１〜７．５フラボノイド分子である。水溶性の生体ポリマーとして使用することができるゼラチンは、酸若しくは石灰で処理した皮膚、又は哺乳類若しくは冷血動物の骨ゼラチンである。かかるゼラチンは、先行技術において周知であり、文献に詳しく記載されている。
【００２６】
また、化学的に修飾された数多くのゼラチンが先行技術で周知であり、例えば、トリメリト化（trimellitated）、スクシニル化、アシル化、アルキル化、又はフタル化されたゼラチンが挙げられる。修飾されたゼラチンは、皮膚に適用したときに免疫反応などの有害な反応を誘発しない限り、有利に使用される。例えば、スクシニル化されたゼラチンは血漿増量剤として使用され、医学的及び免疫学的に許容されるゼラチンである。
【００２７】
遊離型のアミン基の量が増加した修飾されたゼラチンは、ゼラチンのフラボノイド化合物の含有を増加するために使用することができる。ＥＰ０４８７６８６は、カルボキシル基をアミン基に転換する方法を記載している。スペーサーは、ゼラチンのような生体ポリマーの遊離型反応基の量を増やすために使用することができる。スペーサーは、ゼラチンのカルボキシ基又はアミン基のような生体ポリマーの反応基に共有結合することができる分子であり、かかるスペーサー分子は、アミン基又はカルボキシル基のような少なくとも２つの反応基を含み、利用できる活性基の量を増やす。スペーサー分子は、例えばリジン、グルタミン酸又はアスパラギン酸などのアミノ酸が挙げられるが、このような構造物に限定されていない。例えば、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド（ＮＨＳ）の活性エステルを使用して、カルボキシ基及び一級アミン基などの官能基間のペプチド連鎖を形成することができ、それは周知である（Anderson et al., 1964, J. Am. Chem. Soc. 86:1839-1842, US 5,366,958）。ＮＨＳは、ＮＨＳと官能基（例えば、ジヒドロキシ安息香酸又はその類似物）の間にエステル結合を形成することにより活性化され、エステル結合がゼラチンに付加される。活性化したＮＨＳエステルのゼラチンのアミノ基への結合は、化学的に修飾されたゼラチンをもたらし、Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドは遊離される。他の例として、官能基（例えば、フラボノイド）はリジンに結合することができ、修飾されたリジンのカルボキシ基は、ＮＨＳで活性化され、ゼラチンに結合される。また、リジンはゼラチンに側鎖として結合することができ、その２つのアミノ基はフラボノイド分子を結合するために使用することができる。
【００２８】
カゼイン、セリシン、溶解性のコラーゲン等の遊離型アミンをもった他の生体ポリマーを使用することができ、抗原性と免疫原性が低いのでゼラチン及びコラーゲンが好ましい。さらに免疫反応を回避したい場合、例えば、（自己）免疫疾患の患者の場合、ヘリックス形成ができないゼラチンが好ましく用いられる。これは、ヘリックス形成を障害するためにゼラチンを化学的に修飾することによって、また、好ましくはＥＰ１０６３６６５に記載されている組換え技術によって生成されたゼラチンを使用して、達成することができる。かかる組換えゼラチンは、ペプチドバックボーンにおけるプロリンの存在が欠如しているであろうと考えられ、そうでなければ、ヒドロキシ−プロリンへのヒドロキシ化を減少、防止、回避することができる。かかる組換えゼラチンは、修飾されたゼラチンと比較して、免疫反応を誘発する可能性が低いので好ましい。
【００２９】
ヒドロキシ−プロリンを全く又は少ししか有さないゼラチンのさらなる利点は、かかるゼラチンが、ゲル化温度が低いか全くゲル化しないことである。ゲル化が少ない又はゲル化しないことにより、美容用途において、広い濃縮範囲の本発明のフラボノイド−ゼラチン化合物を使用することが可能になる。この点では、冷水に生存する生物由来のゼラチンは、有利に使用することができる。なぜなら、そのゼラチンは、生来ヒドロキシ−プロリン容量が低く、したがってゲル化温度、免疫原性、抗原性も低いからである。  皮膚への浸透の深さは、ゼラチンの分子量を制御することによって、血流に入ることを防ぎながら、調節することができる。先行技術におけるフラボノイドの適用は、皮膚への浸透を制御する方法は含まれず、皮膚浸透を自由に認めている。ＵＳ５４０３９４４は、重合体のＵＶ吸収体を使用しているが、フラボノイドではない。皮膚への均等に浅い浸透が阻止されている。
【００３０】
２００ｋＤ（約２０００アミノ酸）以上の高分子量のゼラチンは、あまり好ましくない。このような高分子は、美容用途において、浸透が不足しているために、問題を生じるかもしれない。従来の天然の又は修飾したゼラチンの分子量は、例えばゼラチンの加水分解又は酵素分解によって調節することができる。要求される平均分子量を満足できるように調節することは可能であるが、分子量分布の幅は問題を生じるかもしれない。ゼラチンの分解後、小さすぎるポリペプチド（＜＝５ｋＤ）や大きすぎるタンパク質鎖は、限外濾過、透析、ヌードル洗浄（noodle washing）等の周知の技術によって、取り除くことができる。組み換え型のゼラチンには、分子量及び分布が正確に調節できるというさらなる利点がある。皮膚浸透を調節する別の方法としては、親水基又は疎水基をタンパク質又はポリペプチドに共有結合させ、タンパク質又はポリペプチドを化学的に修飾することにより、タンパク質又はポリペプチドの疎水性を調節する。
【００３１】
ＵＶ吸収性成分としてフラボノイドを使用する利点は、この種の化学物質が、ＵＶ−Ａを吸収できる化合物及びＵＶ−Ｂ放射を吸収できる化合物を含んでいることである。さらに、いくつかのフラボノイドは、金属イオンをキレートし、及び／又はラジカルをスカベンジャーすることができる。皮膚は免疫的に活性化した組織であるので、日焼け止め処方をシンプルに保ち、多くの異なる化合物に晒すのを避けることが好ましい。また、新規な化合物の水の溶解性は、この望ましいシンプル性に貢献している。なぜなら、先行技術で使用されているオイル又は他の有機溶媒が、フラボノイドを溶解するのに必要でないからである。
【００３２】
先行技術において、“フラボノイド”の用語が異なった意味で使用されている。本発明者らは、“フラボノイド”の用語を、フラバン（flavane）、フラバノン、フラボン及びその誘導体を示すのに使用している。
【００３３】
フラバン（flavane）は、以下の特徴的な基本構造を有する。
【００３４】
【化１】
2004533476.tif 000002
フラバノンは、以下の特徴的な基本構造を有する。
【００３５】
【化２】
2004533476.tif 000003
フラボンは、以下の特徴的な基本構造を有する。
【００３６】
【化３】
2004533476.tif 000004
構造は、目的とする機能に基づき選択することができる。ＵＶ−Ａ又はＵＶ−Ｂ吸収体であるフラボノイド構造体及び誘導体は、ＥＰ１０５５４１５及びＷＯ９９／２５３１６に記載のものから選択することができるが、それに限定されない。
【００３７】
金属イオンキレートとしては、カテコール（３’，４’−ジヒドロキシフェニル）基を含み、任意に、４−ケト−５−ヒドロキシ部位を選択することができる。例えば、カテコール基を含むフラボノイドは、フラボン（ルテオリン、フィセチン、ケルセチン、ロビネチン（robinetin）、ゴシペチン、ミリセチン）及びフラバノン（エリオジクチオール（２，３−ジヒドロルテオリン）（eriodictyol(2,3-dihydroluteolin)、タキシフォリン（２，３−ジヒドロケルセチン）taxifoline(2,3-dihydroquercetin)）を含む。４−ケト−５−ヒドロキシ基を有するフラボノイドは、フラボン（クリシン（chrysin）、アピゲニン、ルテオリン、カンフェロール（campherol）、ケルセチン、モリン、ゴシペチン（gossypetin）、ミリセチン）、及びフラバノン（エリオジクチオール（eriodictyol）、タキシフォリン（taxifoline））を含む。もっとも好ましいフラボノイドは、フラバノールケルセチン（the flavanol quercetin）である。なぜなら、フラバノールであり、好ましいカテロール基及び４−ケト−５−ヒドロキシ基を有し、自然界に多く存在するからである。フラバノールは、３位にヒドロキシ基を有するフラボンである。
【００３８】
少なくとも一つのフラボノイド化合物に結合している、本発明の水溶性のポリマーは、皮膚や髪をＵＶ放射から保護するために、美容用品（化粧品）に有利に適用することができる。
【００３９】
ＵＶ吸収体化合物を含む皮膚を保護するための様々な美容用品は、ローション、エマルジョン、クリーム、乳液、ゲル等として市場で手に入れられる。これらは、オイル及び／又はアルコールを含むであろう。また、エアロゾル又はスティックもよく知られている。このような全ての美容用品は、本発明のフラボノイド生体ポリマーを適用する媒質として機能することができる。前記のように、本発明のフラボノイド生体ポリマーを適用することは、オイル又はアルコールの使用をなくし、これらの物質に対する免疫反応や皮膚のバリア機能の減少などの好ましくない効果を防ぐことさえできる。
【００４０】
本発明のフラボノイド生体ポリマーは、ヒドロゲルなどのオイルレス調製物に好ましく適用することができるが、それに限定されない。
【００４１】
本発明のフラボノイド生体ポリマーを含む美容用品は、かかる生体ポリマーに加えて、第２の従来のＵＶ吸収化合物を含むことができる。これは、例えばＥＰ１０５５４１２に記載されている、ＵＶ−Ａ、ＵＶ−Ｂ又は幅広いＵＶの吸収化合物であってもよい。当該方法で適用されている他の添加剤も、本発明のフラボノイド生体ポリマーと組み合わせて使用することができる。
【００４２】
当業者にとって、ゼラチンのような水溶性の生体ポリマーに化合物を結合する利点が、ＵV吸収剤に限定されないことは明らかである。例えば、ビタミンＣ及びビタミンＥのようなビタミンは、通常美容用品に酸化防止剤として添加されている。それらは、ヒトの組織に危険を及ぼすものではないものの、かかるビタミンが皮膚を通して溶解することが許容されるときに、その機能は減少する。かかる化合物は、例えばゼラチンに有利に結合することができる。
【００４３】
驚くことに、ケルセチンはマンニッヒ反応を用いてゼラチンに結合することができる。ホルムアルデヒドや、Ｃ1−Ｃ6のアルカナル（alkanal）等のその他のアルデヒドを、ゼラチン及びケルセチンの存在下、３０℃〜８０℃の間で縮合し、したがって、ケルセチンがゼラチンの第１アミン基に結合する。有機化学の熟練者にとって、オルト位やパラ位のヒドロキシ基で付加がおこるかもしれないことは、よく知られている。その後に、ゼラチンの第２アミン基がケルセチン分子と結合し、結果として架橋すると予想されていた。しかし、予想に反して、このような架橋は起こらなかった。好ましくは、少なくともアルデヒドの１．５当量から５当量がフラボノイドの１当量あたり使用され、特には２〜４モル当量である。
【００４４】
すでに、第１及び第２アミンが、アミン及び（ポリ）フェノールをアルデヒドの存在下で熱するマンニッヒ反応を用いて、フェノール又はポリフェノールに添加できることは、既に知られている。ＧＢ１１１０３８７及びＧＢ１０６６２９７は、マンニッヒ反応によって、ホルムアルデヒド及び第１又は第２アミンを用いて入手した治療上有用なルチンの誘導体について記載している。さらに、付加が、好ましくは５’位、２’位及び８’位で起こることが記載されている。ＤＥ１９７５５０３５は、ホルムアルデヒド及びモルフォリンやピペリジンなどの第２アミンを用いて、マンニッヒ反応によって入手した治療上有用な水溶性の３−メチルケルセチン誘導体について記載している。付加は、好ましくは８位置で、しかし６位、２’位又は５’位でも起きることが記載されている。しかし、マンニッヒ反応を用いて、第１アミノ基を含む生体ポリマーへのフラボノイド化合物の結合は、先行技術で、開示も示唆もされていない。
【００４５】
ＮＭＲ調査では、本発明の工程中、マンニッヒ反応付加は８位でしか起こらないことが示されている。通常、付加は、あまり好ましくない位置でも起きるため、このことは予想されていなかった。
【００４６】
マンニッヒ反応は、好ましくは、第２アミンと共に行われる。第１アミンはマンニッヒ反応を２度経ることができ、１回目はその後さらに反応する第２アミンを形成するために反応する。予想に反して、この第２次工程はこの合成では起こらなかった。
【００４７】
マンニッヒ反応によるフラボノイドのゼラチンへの付加は、３０℃〜８０℃の温度で起きる。反応温度は、７０℃が好ましい。長すぎる反応時間又は高すぎる温度は、望ましくない赤色の副産物を結果としてもたらす。反応時間の超過は、アルコール、エーテル、又は環状エーテル、又はエチル酢酸塩等の有機混合溶剤（organic co-solvent）を、６／１〜２／１の水／混合溶剤比率で使用することによって防ぐことができる。比率が高すぎると反応速度を減少させすぎ、比率が低すぎるとゼラチンが沈殿する。好ましくは、エタノールが使用される。好ましくは、ポリペプチドは、ポリペプチドの１００アミノ酸残基あたり、少なくとも平均１リシン残基を含む。ホルムアルデヒドのようなアルデヒドの付加を含む合成ルートを使用することは、当業者にとっては明らかな選択ではない。例えば、ホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドは、ゼラチンの架橋結合体としてよく知られている。ホルムアルデヒドは、現像液でゼラチンの写真の層を“固める（harden）”ため、すなわち、ゼラチンが溶けないように架橋するために使用されている。アルデヒドによるゼラチンの架橋は、中性又は約１〜７の酸性ｐＨ、好ましくは３〜６．５の酸性ｐＨ、さらに好ましくは５〜６の酸性ｐＨで合成を行うことにより、本発明にしたがって効率的に回避された。さらなる問題としては、再現性のある反応を行うために、フラボノイド分子量の２〜４倍のアルデヒドの超過を付加しなければならない。アルデヒドの超過が多すぎると、その結果ゼラチンが即時に架橋する。開始時の溶液の構成（ゼラチン濃度：約１〜１０％、水／混合溶剤比率：約６／１−２／１、ｐH：約１−７）によって、ゼラチンを架橋することなく付加できるアルデヒドの最大量は変わってくる。例えば、エタノール／水の比率が１／３、ｐHが５．５の５％ゼラチン溶液では、最大３０ミリモーラーのホルムアルデヒドを付加することができる。
【００４８】
また、開始時のケルセチン及びアルデヒドの溶液濃度が高すぎると、結果として架橋をおこす。例えば、エタノール／水の比率が１／３、１５ｍＭのケルセチン及び１５ｍＭのホルムアルデヒド、開始時の５％ゼラチン溶液（ｐH５．５）の場合、結果としてゼラチンが即時に架橋した。
【００４９】
上記のように、即時的な架橋が防止されるが、フラボノイド−ゼラチン化合物を乾燥すると、その結果、過剰なアルデヒドで架橋する。これは、フラボノイド−ゼラチンプロダクトを陰イオン交換樹脂で精製する前に、NaHSO3を付加することによって、回避することができる。イオン交換樹脂は、NaHSO3−アルデヒド付加物を効果的に結合し、アルデヒドをフラボノイド−ゼラチンプロダクトから取り除く。カラムでゼラチンが架橋するのを防ぐためには、陰イオン交換樹脂は、ＯＨ型で使用しない方がよく、Ｃｌ型で使用することができる。原則として、未反応ケルセチン及びNaHSO3−アルデヒド付加物を充分に保持し、カラムで架橋するなどのケルセチン−ゼラチン化合物に有害作用がなければ、どの陰イオン交換カラムを使用してもよい。
【００５０】
予想に反して、このようにすべての問題を解決することによって、本発明のＵＶ吸収水溶性生体ポリマーを合成し、精製することが可能となった。
実施例１．
［ゼラチン１ｇあたり０．１ｍＭのケルセチンを含有したケルセチン−ゼラチン化合物の製造］
１０ｇの石灰骨ゼラチン（lime bone gelatin）を、６０℃で、１５０ｍｌの純水に溶解した。５０ミリリットルのエタノールを、溶液に添加した。透明な溶液（ｐH５．５）に、ケルセチンビスハイドレート３３８ｇを加え、懸濁液を調整した。次に、２４３マイクロリットルのホルムアルデヒド溶液（水に３７％）を、攪拌しながら添加した。懸濁液を、７０℃まで熱した。１５〜４５分後に、沈殿したケルセチンは消え、混合液は明るい黄色になった。９０分後、４１６ミリグラムのNaHSO3を添加し、混合物をさらに１時間攪拌した。さらに、黄色の溶液を、あらかじめ６０℃の温かい脱塩水で溶出したイオン交換樹脂Amberlite IRA-93（Ｃｌ型）の上に注いだ。反応混合物は、脱塩水と共に樹脂を通して溶出された。樹脂は、１カラム−容積の脱塩水ですすいだ。
溶出液を一晩５５℃で乾燥し、ゼラチン１グラムあたり０．１ミリモルのケルセチンを含有したケルセチン−ゼラチン混合物、すなわち、１００アミノ酸あたり１分子のケルセチンを有したケルセチン−ゼラチン混合物を１００％の収率で得た。
ＮＭＲ分析は、ケルセチンの８位でのみにおいて、ケルセチンがゼラチンのアミン基に結合していることを示した。
実施例２
［ゼラチン１ｇあたり０．１ｍＭのルチンを含有した（１００アミノ酸あたり１分子ルチン）ルチン−ゼラチン化合物の合成］
合成は、ルチンが、ケルセチンと同じ分子量で添加された以外は、実施例１と同様に行われた。ゼラチン１ｇあたり０．１ｍＭのルチン含有した（１００アミノ酸あたり１分子ルチン）ルチン−ゼラチン化合物を１００％の収率で得た。
実施例３
［ゼラチン１ｇあたり０．２ｍＭのケルセチンを含有した（１００アミノ酸あたり２分子のケルセチン）ケルセチン−ゼラチン化合物の合成］
ケルセチンを添加した後の明るい黄色の溶液が形成された時に、さらに３３８ｇのケルセチンを添加したこと以外は、実施例１と同様に行い、懸濁液を生じた。溶液が明るい黄色になるまで反応が再び行われ、その後、合成は実施例１と同様に進められた。
ゼラチン１ｇあたり０．２ｍＭのケルセチンを含有した（１００アミノ酸あたり２分子のケルセチン）ケルセチン−ゼラチン化合物を１００％の収率で得た。
実施例４
［ゼラチン１ｇあたり合計０．２ｍＭのフラボノイドを含有したケルセチン−タキシフォリン−ゼラチン化合物の合成］
ケルセチンを添加した後に明るい黄色の溶液が形成された時に、１ミリモルのタキシフォリン（２，３−ジヒドロ−ケルセチン）をさらに添加し、懸濁液を生じた。溶液が明るい黄色になるまで反応が再び行われ、その後、合成は実施例１と同様に進められた。
【００５１】
ゼラチン１ｇあたり合計０．２ｍＭのフラボノイドを含有したケルセチン−タキシフォリン−ゼラチン化合物の合成を１００％の収率で得た。
実施例５
［ゼラチン１ｇあたり０．１ｍＭケルセチンを含有したケルセチン−ゼラチン化合物によるＵＶ−Ａ保護］
正常な皮膚III（中程度の日焼け、徐々の日焼け）又はIV（最小の日焼け、よい日焼け）のボランティアの被験者にテストを行った。被験者は、光過敏性（photo-sensivity）の病歴はなく、計画的な投薬を行ってなく、実験の前６週間、直射日光に当っていなかった。
５×１０ｃｍの２つのテスト部位を６つのサブ部位に分け、被験者の背中のウエストライン及び肩甲骨の間にマークした。一つのテスト部位を処理せず、保護していない状態にした。もう一方のテスト部位には、日焼け止めの製品を皮膚に均一にのばし、UV吸収化合物が１ｍ2あたり約２ｍｇとなるように塗った。ケルセチン−ゼラチン化合物の場合も、塗布量は、２mg／ｍ2となるような量とした。塗布した日焼け止めを１５分間乾かした。
エネルギーが増加する連続的な６線量のＵＶ−Ａ放射線を、UV−A  sellas  sun  ２０００（放射照度は、３０ｃｍで約５０ミリＷａｔｔ／ｃｍ2）を使用して照射した。照射量は、３３〜８ｊｏｕｌｅ／ｍ2であり、ランダムに６つののサブ部位に照射し、それぞれの照射を直前のものの２５％減とした。
各テスト部位のＭＰＤ（最少色素量minimal pigmenting dose）は、照射３時間後に、視覚的に決定された。ＭＰＤは、最初の明白な色素反応を生成するための必要な照射エネルギー量として定義した。
ＳＰＦ（日焼け防止指数）は、保護されていない皮膚のＭＰＤと保護した皮膚のＭＰＤの指数として計算された。
結果を、下記の表にまとめた。
【００５２】
【表１】
2004533476.tif 000005
結果は、本発明のケルセチン−ゼラチン化合物が、ＵＶ−Ａ放射に対する優れた保護を提供することを示した。ゼラチン結合ケルセチンは、ＵＶ照射下での安定性が高いので、遊離ケルセチンより、よい結果を示した。
実施例６：［ケルセチン−ゼラチンの皮膚内への浸透深さ］
Ａ．呈色反応
特別な日焼け止め成分の存在を視覚化するための特別な検出方法の存在が、必須条件である。ケルセチンの場合、ベンゼン環Ｂ上のオルト−ジヒドロキシベンゼン（カテコール）立体配置の存在を利用することができる。カテコールのさまざまな比色分析方法が記載されている。本発明者らは、J. Invest.Dermatol., 70:197, 1978 (S.Pavel et al.)に記載されている反応を選択した。
Ｂ．皮膚浸透
皮膚浸透の調査を下記調製物を使用して行った。
１．セトマクロゴールＦＮＡ（cremor cetomacrogolis FNA）(CMC)中、ケルセチン（１％）
２．ＣＭＣ中、ケルセチン−ゼラチン（低分子量画分）（１０〜２０％）
３．ＣＭＣ中、ケルセチン−ゼラチン（高分子量画分）（１０〜２０％）
４．ＣＭＣ中、カテコール（１％）（浸透マーカーとして）
調製物を、３人のボランティアの皮膚（臀部）に塗布した。浸透時間は、３０分、１時間、３時間であった。各浸透時間の後、局部麻酔後にバイオプシー（４ｍｍ）を行った。バイプシー物質は、液体窒素内で凍結し、さらなる分析のために保存した。
顕微鏡観察
バイオプシー物質は、８μｍの厚さに連続して切断した。スライスは、選択した溶液でインキュベートし、カテコール構造独特の色を達成した。浸透の深さは、視覚的に測定し、下記の通り、浸透した表皮の割合を示した。
【００５３】
【表２】
2004533476.tif 000006
実施例７：[ケルセチン−ゼラチンのキレート力]
遊離Ｆｅ2+及びＦｅ3+の量は、イオンクロマトグラフィーで決定することができる。ゼラチンは、鉄イオンの決定に使用するディオネックス（Dionex）カラム物質に対して、非常に高い親和性を有する。ゼラチンはカラムから溶出しないので、カラムの特徴が変わり、分離が安定しない。これを回避して、ゼラチンマトリックスから金属イオンを分離するために、固体状態抽出（SPE）カラムを使用した。この前処理後、サンプルを１０ｍMの塩酸で保存した。サンプルは、次にイオンクロマトグラフィーに注入した。金属イオンは、ピリジン−２，６−ジカルボン酸(PDCA)と複合体を形成する。鉄錯イオンは、陰イオンの特徴も陽イオンの特徴も有する（混合モード）カラム物質に対する親和性の相違によって分離する。分離後、可視領域の光を吸収する４−（２−プリジルアゾ）レゾルシノール(PAR)を添加した。Ｆｅ2+及びＦｅ3+に知られている滞留時間で入手したシグナルは、検量線で算出した濃度と比例する。
サンプルの事前処理
Dionex OnGuard-RP P/N039595カラムは、５ｍｌのメタノール及び１０ｍｌの脱イオン水で調整した。９ｍｌのサンプルをカラム上に配置した。最初の３ｍｌの溶出液を捨て、次の６ｍｌを回収した。５ｍｌの溶出液を１０ｍｌ容量フラスコに定量的にピペットでとり、２０ｍMの塩酸を１０．００ｍｌとなるまで添加した。
イオンクロマトグラフィー（Dionex technical note nr.10）による遊離Ｆｅ2+及びＦｅ3+の量の決定
使用した装置は、GP40勾配ポンプを備えたDionex DX500システム、ＡＳ４０  オートサンプラー、LC30カラム乾燥機、AD20分光光度検知器、ED40電気化学検知器、及びPC10圧縮ポストカラム試薬ポンプである。
【００５４】
溶出液は、Dionex MetPac 溶出液濃縮P/N46008の５倍希釈によって調製された。ポストカラム試薬は、１．０ＬのMetPac ポストカラム溶出液P/N46094に０．１２ｇのＰＡＲを溶解することにより調製した。きれいな溶液は、超音波処理によって得た。イオン交換カラムは、Dionex IonPac CS5A分析カラムP/N46100を、P/N46104プレカラムと一緒に使用した。ポストカラム反応器は、３７５マイクロリットルのメリヤス反応コイル（knitted reaction coil）（Dionex社製）である。
５０マイクロリットルの事前処理を行ったサンプルを注入した。溶出液の流速は、１．２ｍｌ／分であり、ポストカラム試薬の流速は、０．７ｍｌ／分である。検出は、５３０ｎｍの波長で行った。全ての溶液をヘリウムでパージし、酸化を防ぐために窒素雰囲気下で保存した。下記の試験溶液を１：３の比率のエタノール／水で調製した。
【００５５】
溶液１             ＦｅＳＯ4 １ｍｍｏｌ／Ｌ
溶液２             １０ｇ石灰骨ゼラチン／Ｌ
溶液３             実施例のゼラチン／ケルセチン化合物１０ｇ／Ｌ
溶液４             ケルセチン１ｍｍｏｌ／Ｌ
テストサンプル１ａ 溶液１：エタノール−水溶液（１：３）＝１：１
テストサンプル２ａ 溶液１：溶液２＝１：１
テストサンプル３ａ 溶液１：溶液３＝１：１
テストサンプル４ａ 溶液１：溶液４＝１：１
同様に、テストサンプル１ｂ、２ｂ、３ｂ及び４ｂは、ＦｅＳＯ4の変わりにＦｅ2（ＳＯ4）3で調製した。テストサンプルを、１０分間、３７℃で混合した。遊離Ｆｅ2+又はＦｅ3+の量は、上記の方法で決定した。結果を下記の表にまとめた。
【００５６】
【表３】
2004533476.tif 000007
結果は、ケルセチンのキレート能は、ゼラチンに結合後も存在することを示している。遊離鉄もＮＭＲによって決定することができ、上記と同様の結果である
【国際公開パンフレット】
2004533476.tif 000008
2004533476.tif 000009
2004533476.tif 000010
2004533476.tif 000011
2004533476.tif 000012
2004533476.tif 000013
2004533476.tif 000014
2004533476.tif 000015
2004533476.tif 000016
2004533476.tif 000017
2004533476.tif 000018
2004533476.tif 000019
2004533476.tif 000020
2004533476.tif 000021
2004533476.tif 000022
2004533476.tif 000023
2004533476.tif 000024
2004533476.tif 000025
2004533476.tif 000026
【国際調査報告】
2004533476.tif 000027
2004533476.tif 000028
2004533476.tif 000029