(57)【要約】本発明は、ネグレリア属、特にネグレリアフォーレリ種の原虫を迅速に検出する方法に関する。本発明はさらに、その検出方法で使用する特異的オリゴヌクレオチドプローブと、そのようなオリゴヌクレオチドプローブを含むキットとに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’−ＡＣＣ−ＡＴＡ−ＧＣＧ−ＣＴＣ−ＧＣＴ−ＧＧＴ−３’、
５’−ＧＴＧ−ＧＣＣ−ＣＡＣ−ＧＡＣ−ＡＧＣ−ＴＴＴ−３’、
５’−ＧＧＴ−ＣＧＡ−ＴＧＣ−ＣＣＡ−ＧＣＴ−ＣＣＣ−３’、および
５’−ＧＴＣ−ＡＡＡ−ＧＣＣ−ＴＴＧ−ＴＴＴ−ＧＴＣ−３’から成る群より選択されたヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
ａ）サンプル中に存在するネグレリア属細胞を固定する工程、
ｂ）ハイブリダイゼーションを達成するために、前記固定した細胞を、
（ｉ）請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと少なくとも６０％と同一であり、かつネグレリア属細胞の核酸配列と特異的ハイブリダイゼーションをなすことが可能なオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）欠失または付加の少なくともいずれか一方の分だけ請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと異なり、かつネグレリア属細胞の核酸配列と特異的ハイブリダイゼーションをなすことが可能なオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）〜（ｉｉｉ）のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、
から成る群より選択された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドとインキュベートする工程、
ｃ）ハイブリダイズしていないオリゴヌクレオチドを除去する工程、
ｄ）ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドを用いてネグレリア属細胞を検出し、任意選択で定量化および視覚化する工程、から成るサンプル中のネグレリア属の原虫を検出する方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、
ａ）蛍光マーカー、
ｂ）化学ルミネセンスマーカー、
ｃ）放射性マーカー、
ｄ）酵素活性基、
ｅ）ハプテン、
ｆ）ハイブリダイゼーションにより検出可能な核酸、から成る群より選択された検出マーカーに共有結合でつながれている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが環境サンプルであり、水、土、または空気から採取される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
サンプルが食品サンプルである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
サンプルが医学サンプルである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項７】
検出が落射蛍光顕微鏡によって行なわれる、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
検出がフローサイトメトリーによって行なわれる、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ネグレリア属細胞がネグレリアフォーレリ種の細胞である、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ｉ）請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと少なくとも６０％と同一であり、かつネグレリア属細胞の核酸配列と特異的ハイブリダイゼーションをなすことが可能なオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）欠失または付加の少なくともいずれか一方の分だけ請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと異なり、かつネグレリア属細胞の核酸配列と特異的ハイブリダイゼーションをなすことが可能なオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）〜（ｉｉｉ）のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、から成る群より選択されたオリゴヌクレオチドの、サンプル中のネグレリア属細胞を検出するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用方法。
【請求項１１】
ｉ）請求項１に記載のオリゴヌクレオチド、
ｉｉ）請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと少なくとも６０％と同一であり、かつネグレリア属細胞の核酸配列と特異的ハイブリダイゼーションをなすことが可能なオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）欠失または付加の少なくともいずれか一方の分だけ請求項１に記載のオリゴヌクレオチドと異なり、かつネグレリア属細胞の核酸配列と特異的ハイブリダイゼーションをなすことが可能なオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）ストリンジェントな条件下で（ｉ）〜（ｉｉｉ）のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、から成る群より選択された少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、請求項２〜９のいずれか一項に記載の方法を行なうためのキット。
【請求項１２】
ハイブリダイゼーション溶液と洗浄溶液とをさらに含む、請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ネグレリア属（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ）、特にネグレリアフォーレリ（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ ）種の原虫を迅速に検出する方法に関する。本発明はさらに、その検出方法で使用する特異的オリゴヌクレオチドプローブと、そのようなオリゴヌクレオチドプローブを含むキットとに関する。
【０００２】
ネグレリア属は、水サンプルに主に見出される世界中に分布する小さな自由生活の鞭毛アメーバである。今日知られているネグレリア属のうち、ネグレリアフォーレリだけが病原性であることがわかっている。ネグレリアフォーレリは３つの形式、すなわち嚢子、アメーバおよび鞭毛の形式で存在する。温水では、この原虫は、アメーバ型から鞭毛型に急速に変形し、これはかなり速い移動様式を可能にする。これらの自由生活アメーバによる感染は、淡水（特に、穏やかで温かい池や湖、場合によってはあまりメンテナンスがされていないワールプール）での水泳中や潜水中に起こり得る。アメーバは鼻から侵入し、嗅神経を通って脳に移動し、毒素を生産し、この毒素が脳を破壊する。この生物は人体では嚢子を形成しない。この特異的疾患は原発性アメーバ性髄膜脳炎（ＰＡＭ）と呼ばれる。ＰＡＭは急速に進行し、ほとんどの場合死に至る。ＰＡＭは、ＰＡＭの発症前にはまったく健康に見える子供や若い成人で主として生じる。突然の疾病発症は、熱、悪心、嘔吐、頭痛および肩こりによって特徴付けられる。疾病は発熱性髄膜脳炎の病像で急速に進行し、患者は意識不明になり、外見上の神経学的局所症状を示さずに１週間以内に死亡することが多い。多くの場合、診断は死後の脳検死で行われる。唯一の現在知られている治療法は、リファンピシンの経口投与と組み合わせた高用量のアンホテリシンＢおよびミコナゾールの全身および髄膜内投与、ならびにメトロニダゾールと組み合わせたアンホテリシンＢの投与である。
【０００３】
感染性微生物の非常に迅速な診断は、治療を適時に開始するための必須条件である。ネグレリアオーストラリエンシス（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ ）も、ネグレリアフォーレリよりは弱いが、病原性の性質を有し得る
【０００４】
従って、ネグレリア属の種の存在を確認するためにヒトサンプル、水浴場、スイミングプール、屋内スイミングプールおよびワールプールを分析することは非常に重要であろうし、予防衛生策に従えば公衆にとって大きな関心事である。従って、ネグレリア属の種を検出し、かつ非病原性種から病原性種を区別する迅速で正確な識別方法が求められている。
【０００５】
今日、ネグレリアフォーレリを識別するにはいくつかの方法が存在する。それには、特異的モノクローナル抗体による血清学的試験（Ｖｉｓｖｅｓｖａｒａ ｅｔ ａｌ． （１９８７）， Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ， ｔｈｅ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ａｍｅｂｉｃ ｍｅｎｉｎｇｏｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２５：１６２９−１６３４）、イソ酵素の電気泳動プロフィール（Ｄｅ Ｊｏｎｃｋｈｅｅｒｅ （１９８１） Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ ｓｐ． ｎｏｖ．， ａｎｏｔｈｅｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｎｏｅｇｌｅｒｉａ ｆｒｏｍ ｗａｔｅｒ， Ｐｒｏｔｉｓｔｏｌｏｇｉｃａ ＸＶＩＩ：４２３−４２９ ）、ＤＮＡ制限断片長多形（ＲＦＬＰ）のキャラクタリゼーション（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ａｎｄ Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ ａｍｏｅｂａｅ． Ｊ． Ｃｌｉｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２６：１６５５−１６５８）、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓｐａｒａｇａｎｏ （１９９３） Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ Ｎａｅｇｌｅｒｉａｅ ｂｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ． ＦＥＭＳ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｔ Ｌｅｔｔ．， １１０：３２５−３３０ ）が挙げられる。しかしながら、これらの方法は非常に手がかかり、時間を費し、高濃度のアメーバを要する。更に、これらの方法は、しばしば特異性をかなり欠くため、確固たる非常に特異的で迅速な分析に適していない。別の可能性は、培養後の、ドットブロットハイブリダイゼーションを使用するネグレリア属の種特異的検出用のＤＮＡプローブである（Ｋｉｌｖｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｎａｅｇｌｅｒｉａ ｆｏｗｌｅｒｉ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｐｒｏｂｅｓ， Ａｐｐｌ． Ｅｎｖ． Ｍｉｃｒｏｂ．， ６１：２０７１−２０７８ ）。この方法では時間を費やす培養工程が必要であり、その後に核酸ハイブリッド形成が続くという事実とは別に、先行技術で周知のプローブは、通常数百塩基の長さに及ぶため、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションや細胞全体のハイブリダイゼーションに使用するには適していない。
【０００６】
本発明の目的は、ネグレリア属の原虫を迅速かつ特異的に検出するための、ならびに、必要な場合や所望の場合にネグレリア属の原虫を視覚化するための、プローブ配列および方法を提供することである。
【０００７】
本発明によれば、この問題は、以下の核酸プローブ分子の提供により解決される。
ａ）ネグレリア属のすべての種（すなわちＮ ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ， Ｎ． ｉｔａｌｉｃａ， Ｎ． ｊａｍｉｅｓｏｎｉ， Ｎ． ａｎｄｅｒｓｏｎｉ， Ｎ． ｌｏｖａｎｅｎｓｉｓ， Ｎ． ｆｏｗｌｅｒｉ， Ｎ． ｇｒｕｂｅｒｉ， Ｎ． ｃｌａｒｋｉ およびＮ． ｍｉｎｏｒ）を検出するオリゴヌクレオチド分子：
ＮＡＥＧ１：５’−ＡＣＣ−ＡＴＡ−ＧＣＧ−ＣＴＣ−ＧＣＴ−ＧＧＴ−３’
ＮＡＥＧ２：５’−ＧＴＧ−ＧＣＣ−ＣＡＣ−ＧＡＣ−ＡＧＣ−ＴＴＴ−３’
ｂ）ネグレリアフォーレリ種を特異的に検出するオリゴヌクレオチド分子：
ＮＦＯＷ１：５’−ＧＧＴ−ＣＧＡ−ＴＧＣ−ＣＣＡ−ＧＣＴ−ＣＣＣ−３’
ＮＦＯＷ２：５’−ＧＴＣ−ＡＡＡ−ＧＣＣ−ＴＴＧ−ＴＴＴ−ＧＴＣ−３’
【０００８】
本発明のさらなる主題は、配列および／または長さの変化に拘わらずネグレリア属の種の核酸配列と特異的ハイブリダイゼーションをなす、オリゴヌクレオチドＮＡＥＧ１、ＮＡＥＧ２、ＮＦＯＷ１およびＮＦＯＷ２の修飾物である。
【０００９】
それには以下のものが含まれる。
ａ）（ｉ）少なくとも６０％、６５％、好ましくは少なくとも７０％、７５％、より好ましくは少なくとも８０％、８４％、８７％、特に好ましくは少なくとも９０％、９４％、９７％の塩基がＮＡＥＧ１、ＮＡＥＧ２、ＮＦＯＷ１およびＮＦＯＷ２のオリゴヌクレオチド配列と同一の核酸分子（この場合、ＮＡＥＧ１、ＮＡＥＧ２、ＮＦＯＷ１およびＮＦＯＷ２の配列領域に対応する核酸分子の配列領域を考慮すべきであり、ＮＡＥＧ１、ＮＡＥＧ２、ＮＦＯＷ１およびＮＦＯＷ２と比較して１または複数の塩基だけ延びうる核酸分子の配列全体を考慮すべきではない）、（ｉｉ）少なくとも１つの欠失および／または付加だけＮＡＥＧ１、ＮＡＥＧ２、ＮＦＯＷ１およびＮＦＯＷ２と異なり、ネグレリア属の種の核酸配列と特異的ハイブリダイゼーションをなすことが可能な核酸分子。「特異的ハイブリダイゼーション」とは、ここでは、本明細書で説明したハイブリダイゼーション条件で、またはｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション法に関する当業者に知られている条件で、非標的生物（例えばプローブＮＦＯＷ１に関するＮ．ｌｏｖａｎｉｅｎｓｉｓ ）のｒＲＮＡではなく標的生物（つまり例えばオリゴヌクレオチドＮＦＯＷｌに関するＮ．ｆｏｗｌｅｒｉ ）のリボソームＲＮＡだけが、オリゴヌクレオチドに結合することを意味する。
【００１０】
ｂ）ａ）で言及した核酸分子またはプローブＮＡＥＧ１、ＮＡＥＧ２、ＮＦＯＷ１またはＮＦＯＷ２に相補的な核酸分子、もしくはａ）で言及した核酸分子またはプローブＮＡＥＧ１、ＮＡＥＧ２、ＮＥＯＷ１またはＮＦＯＷ２と特異的にハイブリダイズする核酸分子。
【００１１】
ｃ）オリゴヌクレオチド配列ＮＡＥＧ１、ＮＡＥＧ２、ＮＦＯＷ１、ＮＦＯＷ２もしくはａ）またはｂ）の核酸分子の配列を含み、上述の配列またはａ）またはｂ）によるそれらの修飾物に加えて少なくとも１つのさらなるヌクレオチドを有し、かつネグレリア属の種の核酸配列と特異的にハイブリダイズする核酸分子。
【００１２】
プローブＮＡＥＧ１、ＮＡＥＧ２、ＮＦＯＷ１およびＮＦＯＷ２に対する核酸分子の配列同一性の程度は、通常のアルゴリズムを使用して決定することができる。これについては、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ （このページ上の例えばリンク「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＬＡＳＴ［ｂｌａｓｔｎ］」で利用可能な配列同一性決定プログラムが適当である。
【００１３】
ネグレリア属の種の検出の範囲内のプローブとして使用可能な本発明の核酸分子には、合成により作製されたプローブ分子と、上記プローブ配列を用いて組換えにより作製されたプローブとが含まれる。さらに、実際のヌクレオチドは、差を生じない位置で、イノシン等のヌクレオチド類似体と置き換わってもよい。更に、プローブ分子は、ＰＮＡ（ペプチド核酸）等のヌクレオチド類似体を使用して合成してもよい。
【００１４】
従って、本発明による上述のオリゴヌクレオチド分子ならびにそれらの分子の修飾物は、
ａ）サンプルの中に存在するネグレリア属細胞を固定する工程、
ｂ）ハイブリダイゼーションを達成するために、前記固定した細胞を、本発明の少なくとも１つの核酸プローブ分子、特に
５’−ＡＣＣ−ＡＴＡ−ＧＣＧ−ＣＴＣ−ＧＣＴ−ＧＧＴ−３’、
５’−ＧＴＧ−ＧＣＣ−ＣＡＣ−ＧＡＣ−ＡＧＣ−ＴＴＴ−３’、
５’−ＧＧＴ−ＣＧＡ−ＴＧＣ−ＣＣＡ−ＧＣＴ−ＣＣＣ−３’、および
５’−ＧＴＣ−ＡＡＡ−ＧＣＣ−ＴＴＧ−ＴＴＴ−ＧＴＣ−３’から成る群より選択された核酸プローブ分子とインキュベートする工程、
ｃ）ハイブリダイズしていない核酸プローブ分子を除去する工程、
ｄ）ハイブリダイズした核酸プローブ分子を用いてネグレリア属細胞を検出し、任意選択で定量化および視覚化する工程、から成る、核酸プローブを使用したサンプル中の微生物を検出する本発明の方法に使用される。
【００１５】
本発明の範囲内では、細胞の「固定」とは、原虫の細胞外膜が核酸プローブに対して透過性となる処理のことを指す。オリゴヌクレオチドと、それにつながれたマーカーとから成る核酸プローブは、細胞中の核酸プローブに対応する標的配列に結合するために細胞外膜を透過することができる。結合は、相補的な核酸領域間の水素結合の形成と見なされる。外膜は、ウイルスを被覆する脂質外膜、細菌の細胞壁、または原生動物の細胞壁であり得る。固定に関しては、低いパーセントのパラホルムアルデヒド溶液または希釈ホルマリンが一般に使用され得る。これらの技術を使用しても核酸プローブが細胞壁を透過することができない場合、専門家には同じ結果に結びつく十分なさらなる方法が理解されよう。それには、エタノール、メタノール、それらのアルコールの混合物、酵素処理等が含まれる。
【００１６】
本発明の趣旨内の核酸プローブは、通常１２〜１０００の間、好ましくは１２〜５００の間、より好ましくは１２〜２００の間、特に好ましくは１２〜５０の間、１５〜４０の間、最も好ましくは１７〜２５ヌクレオチドを含むＤＮＡまたはＲＮＡプローブである。核酸プローブの選択は、検出される微生物中に相補的配列が存在するかどうかという基準に従って行われる。特定の配列の選択により、細菌種、細菌属、または細菌群全体が検出され得る。１５ヌクレオチドから成るプローブでは、１００％の配列が相補的でなければならない。１５よりも多いヌクレオチドから成るオリゴヌクレオチドでは、１または複数の誤対合が許容される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を遵守することにより、核酸プローブ分子が標的配列と実際にハイブリダイズすることが保証される。本発明の趣旨に従う「適度な条件」とは、例えば、実施例１に示されているようにハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドが０％であることである。本発明の趣旨に従う「ストリンジェントな条件」とは、例えば、ハイブリダイゼーション緩衝液中のホルムアミドが２０〜８０％であることである。
【００１７】
核酸プローブは、検出される微生物の染色体ＤＮＡまたはエピゾームＤＮＡに相補的であり得るが、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡに相補的であってもよい。本発明の範囲内では、核酸プローブは、検出されるネグレリア属の種の１８Ｓ　ＲＮＡに好ましくは相補的である。検出される微生物中に１より多いコピーで存在する領域に相補的な核酸プローブを選択することが有利である。検出される配列は、５００〜１００，０００コピー／細胞で存在することが好ましく、１，０００〜５０，０００コピー／細胞で存在することが特に好ましい。このため、個々の活動中の細胞では、蛋白生合成部位としてのリボゾームが何千コピーも存在するので、ｒＲＮＡが標的部位として好ましく使用される。
【００１８】
本発明によれば、核酸プローブ分子の微生物への透過と、核酸プローブ分子の微生物核酸とのハイブリダイゼーションとを許容するために、核酸プローブを、上記の意味で固定された微生物とインキュベートする。次に、通常の洗浄工程により、ハイブリダイズしていない核酸プローブ分子を除去する。その後、核酸プローブが検出できる条件で（例えばプローブ分子が共有結合によってマーカーとつながれている）、特異的にハイブリダイズした核酸プローブ分子を個々の細胞で検出することができる。検出マーカーとしては、ＣＹ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、アメリカ合衆国アーリントンハイツ所在から入手可）、ＣＹ３（やはりＡｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手可）、ＣＹ５（やはりＡｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社から入手可）、ＦＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、アメリカ合衆国ユージーン所在）、ＦＬＵＯＳ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ 社、ドイツ国マンハイム所在から入手可）、ＴＲＩＴＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、アメリカ合衆国ユージーン所在から入手可）、またはＦＬＵＯＳ−ＰＲＩＭＥのような蛍光性の基が使用され、これらはいずれも当業者に周知である。化学マーカー、放射性マーカー、または西洋ワサビペルオキシダーゼ、酸性ホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼのような酵素マーカーも同様に使用され得る。このシリーズの各酵素については、天然基質の代わりに変換可能で、有色生成物または蛍光生成物に変換可能な多くの色原体が知られている。
【００１９】
そのような色原体の例を以下の表に列挙する。
【００２０】
【表１】
2004514437.tif 000002
最後に、ハイブリダイゼーションに適した別の核酸配列が核酸プローブ分子の５’または３’末端に存在するように、核酸プローブ分子を生成することが可能である。この核酸配列も、約１５〜１，０００ヌクレオチド、好ましくは１５〜５０ヌクレオチドを含む。この第２の核酸部分も、上述の薬剤のうちの１つにより検出可能なオリゴヌクレオチドプローブによって検出することが可能である。
【００２１】
別の可能性は、検出可能な核酸プローブ分子のハプテンへの結合である。ハプテンは後でハプテン認識抗体と接触させる。そのようなハプテンの例として、ジゴキシゲニンが挙げられる。説明した例の他に他の例も専門家には周知である。
【００２２】
標準的なハイブリダイゼーション法は、スライド上、フィルタ上、マイクロタイタープレート上、または反応容器中で行われる。分析は、使用するプローブの標識付けの種類に依存して決まり、光学顕微鏡、落射蛍光顕微鏡、化学発光測定計、蛍光計、フローサイトメーターなどを使用して行われる。
【００２３】
本発明のプローブ分子は、様々なハイブリダイゼーション溶液を用いて検出方法の範囲内で使用することができる。様々な有機溶媒が０％〜８０％の濃度で使用される。例えば、ホルムアミドは、ハイブリダイゼーション緩衝液中で、好ましくは２０％〜６０％の濃度で、特に好ましくは２０％の濃度で使用される。更に、塩、好ましくは塩化ナトリウムが、０．１ｍｏｌ／Ｌ〜１．５ｍｏｌ／Ｌの濃度、好ましくは０．５ｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌの濃度、より好ましくは０．７ｍｏｌ／Ｌ〜０．９ｍｏｌ／Ｌの濃度、最も好ましくは０．９ｍｏｌ／Ｌの濃度でハイブリダイゼーション緩衝液に含まれる。ハイブリダイゼーション緩衝液の緩衝については、ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸ナトリウム、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ緩衝液のような様々な化合物を、０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．１ｍｏｌ／Ｌの範囲、好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．０８ｍｏｌ／Ｌの範囲、特に好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌで使用することができる。ｐＨは通常は６．０と９．０の間にあり、好ましくは７．０と８．０の間にある。好ましくは、ハイブリダイゼーション緩衝液は０．０２ｍｏｌ／Ｌのｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を含む。
【００２４】
さらに、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘやドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような界面活性剤が、通常０．００１％〜０．２％の濃度、好ましくは０．０５％〜０．１％の濃度で存在する。ここで、特に好ましいハイブリダイゼーション緩衝液は０．０１％のＳＤＳを含む。
【００２５】
未標識核酸（例えば破断したサケ精子ＤＮＡ、未標識オリゴヌクレオチド等）や、反応スペースの制限によりハイブリダイゼーション反応を加速させることが可能な分子（ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、硫酸デキストラン等）などの、さらなる添加物を、様々な状況の元で使用してもよい。専門家なら、ハイブリダイゼーション緩衝液に、既知の通常濃度でそのような添加物を加えることができる。
【００２６】
専門家は当然ながら、ハイブリダイゼーション反応の所望のストリンジェンシーが達成されるように、ハイブリダイゼーション緩衝液の構成成分の先に列挙した濃度を選択することができる。特に好ましい実施形態は、特にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対するストリンジェンシーを反映する。このようなストリンジェントな条件を使用して、専門家は、特定の核酸分子がネグレリア属の種の核酸配列の特異的に検出できるかどうか、従って特定の核酸分子が本発明の範囲内で高い信頼性で使用できるかどうかを知ることができる。
【００２７】
プローブの濃度はマーカーと期待される標的構造の数とに依存して、大きく変わり得る。迅速で効率的なハイブリダイゼーションを可能にするためには、プローブ数は、標的構造の数をいくつかの桁数だけ超えるべきである。しかしながら、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）では、高レベルの蛍光標識されたハイブリダイゼーションプローブによってバックグラウンド蛍光の増大が観察される必要がある。従って、プローブ量は、０．５ｎｇ／μｌ〜５００ｎｇ／μｌ、好ましくは１．０ｎｇ／μｌ〜１００ｎｇ／μｌ、特に好ましくは５０ｎｇ／μｌであるべきである。
【００２８】
ハイブリダイゼーションの後にはストリンジェントな洗浄工程が続く。これは、任意の非特異的に結合したプローブ分子を除去するためのものである。その結果、洗浄工程がより低い塩濃度またはより高い温度の緩衝液中で行われることを除いて、ハイブリダイゼーション緩衝液（緩衝した塩化ナトリウム溶液）に原則的に非常に類似した緩衝液が使用される。
【００２９】
ハイブリダイゼーション条件の理論的推定値については、以下の式を使用することができる。
Ｔｄ＝８１．５＋１６．６ｌｇ［Ｎａ＋］＋０．４ｘ（％ＧＣ）−８２０／ｎ−０．５Ｘ（％ＦＡ）
Ｔｄ＝解離温度（℃）
［Ｎａ＋］＝ナトリウムイオンのモル濃度
％ＧＣ＝塩基総数に対するグアニンヌクレオチドとシトシンヌクレオチドの割合
ｎ＝ハイブリッド長さ
％ＦＡ＝ホルムアミドの割合
【００３０】
この式を用いて、洗浄緩衝液のホルムアミド含量（毒性があるため、できるだけ低くすべきである）を、例えば対応するより低い塩化ナトリウム含量と置き換えることができる。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態では、洗浄緩衝液の塩化ナトリウム含量は、０．０１４ｍｏｌ／Ｌ〜０．９ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０．２２５ｍｏｌ／Ｌであり、ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）は０．０２ｍｏｌ／ＬおよびＳＤＳは０．０１％、ならびにＥＤＴＡは０〜０．００５ｍｏｌ／Ｌ、特に好ましくは０ｍｏｌ／Ｌである。
【００３２】
しかしながら、ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションに関しては、当業者は膨大な文献からｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションを理解することができ、示した含量をどのように変えたらよいかも理解することができる。
【００３３】
同じことが、ハイブリダイゼーション緩衝液について先に概説したようなハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーにも当てはまる。
本発明の方法の別の実施形態では、本発明の核酸プローブ分子は、ネグレリア属の種を特異的に検出するいわゆる高速ＦＩＳＨ法で使用される。高速ＦＩＳＨ法は専門家に周知であり、例えば、ドイツ特許出願ＤＥ１９９　３６　８７５．９および国際出願ＷＯ９９／１８２３４に説明されている。これにより、それらの文書に説明された検出法を行うためには、それらの文書に含まれる開示を明示的に参照する。
【００３４】
従来の検出方法と比較した、ネグレリア属の種の特異的検出のための本願で説明されている方法の重要な利点は、その速度である。ネグレリアフォーレリによる感染による死は数日以内に生じるため、適当な治療薬（例えばアンホテリシンＢ）を適時に投与できるように、迅速で、かつとりわけ特異的な検出が肝要である。これまでのところ、診断は、従来法が遅いため、主として死後の脳検死で行われている。
【００３５】
別の利点はこの方法の特異性である。使用される遺伝子プローブを用いて、すべのネグレリア属の種を特異的に検出および視覚化することができるが、さらには、病原性の種であるネグレリアフォーレリだけを高度に特異的に検出および視覚化することも可能である。ネグレリア属の視覚化により、視覚的制御を同時に行なうことが可能である。
【００３６】
この方法の別の利点は、それが培養を必要とせずに任意選択で行なわれ得るということである。
この方法を使用すると、ネグレリア属細胞の存在、特にネグレリアフォーレリの存在について、大量のサンプル数を容易に試験することができる。
【００３７】
標識付けの選択肢の多様性は、さらに２つ以上のオーバラップ集団または非オーバラップ集団の同時検出を可能にする。例えば２つの異なる蛍光マーカーを使用することによって、ネグレリア属に属する他のすべての細胞のバックグラウンド中で、ネグレリアフォーレリを特異的に検出することができる。
【００３８】
本発明の方法は、種々に使用することができる。環境サンプルをネグレリア属の存在について試験することができる。これらのサンプルは、空気、水または土から採取され得る。
【００３９】
本発明の方法を適用する別の分野は食品の分析である。これにはとりわけ水と混合された食品が含まれる。
本発明の方法は、医学サンプルの分析のためにも使用することができる。本発明の方法は、脳、肺、腫瘍または炎症性組織からの生検材料、汗、唾液、精液および鼻分泌物を始めとする分泌物、尿道分泌物または膣分泌物、ならびに尿または便サンプルの分析に適している。
本発明の方法の適用の別の例は、湖および川、例えば水浴場の分析である。
【００４０】
更に、本発明によれば、サンプル中のネグレリア細胞を迅速かつ非常に特異的に検出する方法を行なうためのキットが提供される。該キットは、その主要構成要素として、検出される微生物に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを含む。キットはさらに、ハイブリダイゼーション緩衝液と洗浄緩衝液を含む。ハイブリダイゼーション緩衝液の選択は主として使用される核酸プローブの長さに依存する。ハイブリダイゼーション条件の例は、Ｓｔａｈｌ ＆ Ａｍａｎｎ （１９９１， ｉｎ Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ ａｎｄ Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ （ｅｄｓ．）， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ； Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ．， Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ， ＵＫに記述されている。キットは、ネグレリア属の検出用の上述の特異的プローブの少なくとも１つを含む。好ましくはキットは、ネグレリア属のすべての種の検出に適した少なくとも１つのプローブ、すなわちＮＡＥＧ１またはＮＡＥＧ２と、ネグレリアフォーレリ種の特異的検出に適した少なくとも１つのプローブ、すなわちＮＦＯＷ１またはＮＦＯＷ２とを含む。
【００４１】
以下の実施例は、本発明を制限せずに、本発明について説明することを意図する。
実施例
水サンプル中のネグレリア属の検出
水サンプルを遠心し、１０分の１量の少なくとも３７％含パラホルムアルデヒド溶液（Ｍｅｒｃｋ 社、ドイツ国ダルムシュタット所在）をペレットに加え、よく混合する。懸濁液を室温で５分間インキュベートする。その後、細胞を１，３００ｇで５分間遠心し、上清を捨て、ペレットを適切な量の１×ＰＢＳ（ＮａｘＰＯ４）に溶解する。ここで、量は自由に選択することができるが、エッペンドルフ反応容器によく適合し、かつ十分に遠心できる、１００〜５００μｌのような量が好まれる。ペレットを完全に再懸濁した後、同量の無水エタノールを加える。この形式でネグレリア属は少なくとも３か月の間−２０℃で保存可能である。
【００４２】
ハイブリダイゼーションについては、固定細胞の適当なアリコート（８〜１０μｌ）をスライドに載せる。これについては、ネグレリア属細胞を個々に混合してもよいし、他のネグレリア種またはアカントアメーバ属（Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ）もしくは細菌類と混合してもよい。
【００４３】
ネグレリア属のハイブリダイゼーションを、細胞膜の透過処理のためにエタノール濃度を系列増加せずに行なう。エタノール濃度の系列増加は、当該技術分野では一般的なことである。
【００４４】
ネグレリア属（Ｎ． ｆｏｗｌｅｒｉ、 Ｎ． ｇｒｕｂｅｒｉ 、 Ｎ． ｃｌａｒｋｉ、 Ｎ． ａｕｓｔｒａｌｉｅｎｓｉｓ 、Ｎ． ｌｏｖａｎｅｎｓｉｓ 、 Ｎ． ｊａｍｉｅｓｏｎｉ 、Ｎ． ｉｔａｌｉｃａ、Ｎ． ａｎｄｅｒｓｏｎｉ、およびＮ． ｍｉｎｏｒ）のアメーバを検出するために、上述のプローブＮＡＥＧ１またはＮＡＥＧ２を用いてハイブリダイゼーションを行なうか、ヒト病原体であるＮ．ｆｏｗｌｅｒｉ を検出するために、上述のプローブＮＦＯＷ１またはＮＦＯＷ２を用いてハイブリダイゼーションを行なう。プローブは５ｎｇ／μｌの濃度で使用されるが、一般に、１〜１００ｎｇ／μｌ間の濃度が適切である。
【００４５】
数μｌの固定したネグレリア属細胞をスライドに載せ、２０分間乾燥させる。その後、数μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．９ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／Ｌ　ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１％　ＳＤＳ、２０％　ホルムアミド）をウェルに加え、高湿チャンバ内で４６℃で９０分間インキュベートする。その後、スライドをチャンバから取り出し、洗浄緩衝液（０．２２５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ、０．０２ｍｏｌ／Ｌ　ｔｒｉｓ、０．０１％　ＳＤＳ）で簡単にリンスし、４８℃で１５分間この緩衝液中でストリンジェントに洗浄する。ここで、ストリンジェントとは、先に詳細に説明したように、標的核酸は依然として含まれるが最も関連が深い非標的核酸は含まれない（つまり洗浄して取り去れられる）ように洗浄条件が選択されることを意味する。
【００４６】
その後、スライドを蒸留水でリンスし、風乾させる。
任意選択で、染料ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール−ジヒドロクロリド；Ｓｉｇｍａ 社；ドイツ国ディーゼンホーフェン所在）による核酸の非特異的染色を、さらに追加で行ってもよい。これに関して、１μｇ／ｍｌ　ＤＡＰＩを含むＰＢＳ溶液でサンプルを覆い、室温で暗所で５〜１５分間インキュベートする。蒸留水でのさらなる洗浄工程後、サンプルを蛍光顕微鏡を使用して適切な包埋剤（Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ　ＡＦ１， Ｃｉｔｉｆｌｕｏｒ 社， イギリス国ロンドン所在； Ｖｅｃｔａｓｈｉｌｄ， Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 社， アメリカ合衆国バーリンゲーム所在）で分析することができる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004514437.tif 000029
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