(57)【要約】本発明は、β２インテグリンのアンタゴニストとして有用な新規ペプチド、該ペプチドを含む医薬組成物、炎症性疾患およびヒトの白血病の処置のための および白血球細胞の接着と遊走を一般に阻害するための、医薬組成物の製造における該新規ペプチドの使用、炎症性疾患およびヒトの白血病の治療的もしくは予防的処置方法、および in vitro での生化学的単離および精製方法における、β２インテグリンアンタゴニストとして該新規ペプチドの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造：
［化１］
ＬＬＧ          (配列番号１)
を含むペプチド、またはその構造的アナログもしくは化学的アナログ。
【請求項２】
構造：
［化２］
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ          (配列番号２)
[式中、Ｘは何れかのアミノ酸残基である]を含むペプチド、またはその構造的アナログもしくは化学的アナログ。
【請求項３】
構造：
［化３］
ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ          (配列番号３)
を含むペプチド、またはその構造的アナログもしくは化学的アナログ。
【請求項４】
該ペプチドが２つのジスルフィド結合によって、構造的に拘束される、請求項２または３に記載のペプチド。
【請求項５】
該ペプチドがＣ１とＣ８システインの間に１つのジスルフィド結合を、かつＣ３とＣ９システインの間に第２のジスルフィド結合を含む、請求項４に記載のペプチド。
【請求項６】
該ペプチドがＣ１とＣ９システインの間に１つのジスルフィド結合を、かつＣ３とＣ８システインの間に第２のジスルフィド結合を含む、請求項４に記載のペプチド。
【請求項７】
医薬として使用するための、請求項１から６の何れか１つに記載のペプチド。
【請求項８】
薬学的に許容される担体と組み合わせた、請求項１から６の何れか１つに記載の医薬組成物。
【請求項９】
炎症性疾患およびヒトの白血病を処置するための医薬組成物の製造における、請求項１から６の何れか１つに記載のペプチドの使用。
【請求項１０】
in vitro において、種々のインテグリンおよび種々のタイプの白血球細胞の、生化学的単離および精製方法における、β２インテグリン・アンタゴニストとしての請求項１から６の何れか１つに記載のペプチドの使用。
【請求項１１】
治療上もしくは予防上効果的な量の、請求項１から６の何れか１つに記載のペプチドを、炎症性疾患およびヒトの白血病の処置が必要な対象に投与することを含む、炎症性疾患およびヒトの白血病の治療上もしくは予防上の処置方法。
【請求項１２】
白血球細胞の接着および遊走を阻害するための医薬組成物の製造における、トリペプチドモチーフ：ＬＬＧ、またはその構造的アナログもしくは化学的アナログの使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（本発明の分野）
本発明は、β２インテグリンのアンタゴニストとして有用な新規ペプチド、該ペプチドを含む医薬組成物、炎症性疾患およびヒトの白血病を処置する および白血球細胞の接着と遊走を一般に阻害するための医薬組成物の製造における新規ペプチドの使用、炎症性疾患およびヒトの白血病の治療方法または予防方法、および in vitro での生化学的な単離・精製方法におけるβ２インテグリンアンタゴニストとしての、新規ペプチドの使用に関する。
【０００２】
（本発明の背景）
身体および様々なリンパ組織中での白血球の遊走は、免疫系の重要な要素である。血液中もしくはリンパ管中を循環する間は、白血球は、接着休止状態および低接着状態にある。しかし、白血球が免疫系からのシグナルによって刺激された場合、例えば免疫コンプレックスもしくはケモカイン濃度勾配に曝された場合、白血球のインテグリン接着受容体が活性化される。インテグリンの活性化は、白血球の多くの機能において重要である。該機能は、例えば、抗原が存在する細胞に結合すること、リンパ節を再循環すること、および血管から出て細胞外マトリックスを通り炎症部位に遊走することである。不適切な白血球の接着が正常組織に重大な損傷を引き起こすために、インテグリン活性化は、厳密に制御される必要がある。
【０００３】
白血球は、インテグリン・ファミリーの特異的なサブセットを発現する。β２インテグリンでは、現在４つのメンバーが知られている。これらは、共通のβ２鎖(ＣＤ１８)を有するが、異なるαサブユニット(αＬまたはＣＤ１１ａ、αＭまたはＣＤ１１ｂ、αＸまたはＣＤ１１ｃ、およびαＤまたはＣＤ１１ｄ)を有する(Gahmberg et al., 1997)。αサブユニットは、保存された２００残基のＡドメインまたはＩドメインを含む。このドメインは、殆どのリガンドの結合に重要である。αＬサブユニットとαＭサブユニットからのＩドメインの結晶構造は、金属依存性接着部位と呼ばれるカチオン結合部位の存在を示している。この部位のアミノ酸置換は、リガンドの結合を失わせる(Huang and Springer, 1995; Kamata et al., 1995)。
【０００４】
これらのインテグリンの主要なリガンドであるＩＣＡＭは、免疫グロブリンのスーパーファミリーに属する。結合特異性が僅かに異なる５個のＩＣＡＭが報告されている。表皮細胞上でのＩＣＡＭ−１の発現は、炎症性サイトカインによる刺激で起こり、表皮細胞上での白血球のβ２インテグリン介在接着を増やす。ＩＣＡＭに加えて、フィブリノーゲンおよびｉＣ３ｂ補体タンパク質は、β２インテグリンの、特にαＭβ２ (Ｍａｃ−１)の既知リガンドである。
【０００５】
白血球の機能に対するβ２インテグリンの重要性のために、これらのアンタゴニストは、可能性がある抗炎症剤である。β２インテグリンまたはＩＣＡＭに対する抗体は、免疫性疾患の動物モデルへの治療効果を有する。β２インテグリンを標的とする薬剤はまた、ヒトの白血病における治療方針の立案に有用である(Lalancette et al., 2000)。しかし、これまでは、β２インテグリンの幾つかの小分子アンタゴニストが記載されているのみであった(Kallen et al., 1999; Kelly et al., 1999)。この種の化合物が足りないために、白血病の増悪における および炎症性疾患におけるβ２インテグリン・ファミリーの各メンバーの役割の詳細な試験が妨げられていた。特に、インテグリンの不活性状態と活性状態を区別する化合物を設計することが望ましい。該小分子阻害剤のモデリングは、今までに開発された大きなサイズのペプチドリガンドによって阻害されてきた。直鎖ペプチドは、溶液中の遊離状態の場合、しばしば十分に固定された構造を保持しない。見出された数少ないβ２インテグリンリガンドの中で、２２個のアミノ酸の長さのペプチドが、Ｐ１として知られており、これはＩＣＡＭ−２から誘導される(Li et al., 1993)。このペプチドは、ＩＣＡＭ−２に典型的な白血球のインテグリン活性化効果を保持している(Li et al., 1995; Kotovuori et al., 1999)。抗β２インテグリン抗体の相補的に決定される領域が、リガンドペプチドを得るための別のソースを有し、単離されたペプチドの１つは、２３個のアミノ酸の長さであって、ＩＣＡＭ−１上に存在する配列に類似性を示す(Feng et al., 1998)。
【０００６】
β２インテグリンに対するより小さいペプチドリガンドのリード化合物を開発するために、本発明者らは、繊維状ファージ上に、ディスプレイされたランダム・ペプチド・ライブラリーをスクリーニングした。ファージ・ディスプレイ法は、先に、インテグリンα５β１に(Koivunen et al., 1994)、αＶβ３／β５に(Koivunen et al., 1995)、およびαＶβ６に(Kraft et al., 1999)、選択的なペプチド・リガンドを得た。ファージ・ライブラリー・スクリーニングはまた、トリペプチド配列ＲＧＤがインテグリンのサブセットの共通の認識配列であるという、以前の発見を確認している(Pierschbacher and Ruoslahti, 1984)。さらに、明らかに変化したＲＧＤのアナログ、例えばＲＬＤ、ＫＧＤ、およびＮＧＲなどが、見出されている。白血球インテグリンα４β１およびα４β７は、別のタイプのトリペプチド配列ＬＤＶを含むペプチドに特異的であることが知られている(Komoriya et al., 1991)。
【０００７】
本発明の要約
本発明者らは、白血球に特異的なβ２インテグリンが、３つのアミノ酸を含むモチーフを認識することを見出した。αＭβ２インテグリンによって好まれるトリペプチドは、以前に知られていない接着モチーフＬＬＧであることが分かった。ＬＬＧモチーフは、主なβ２インテグリンリガンドであるＩＣＡＭ−１上に存在するが、フォン・ウィルブランド因子やコラーゲンを含む幾つかのマトリックスたんぱく質上にもまた存在する。本発明者らは、ＬＬＧ−Ｃ４と名付けられた新規のβ２インテグリン・アンタゴニスト・ペプチドを開発した。これは、ＮＭＲによって決定されたように、コンパクトなジスルフィドで拘束された構造を有する。特に、この二環式ペプチドは、白血球細胞の接着および遊走の強力な阻害剤であり、そして抗炎症剤の開発のための新規のリード化合物である。
【０００８】
従って、配列表の配列番号１に示される配列に対応する構造：
［化１］
ＬＬＧ
を含む新規ペプチド、またはその構造的アナログもしくは化学的アナログを提供することが、本発明の目的である。
【０００９】
配列表の配列番号２に示される配列に対応する構造：
［化２］
ＣＸＣＸＬＬＧＣＣ
を含む新規ペプチド、またはその構造的アナログもしくは化学的アナログを提供することが、本発明の別の目的である。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、配列表の配列番号３に示される配列に対応する構造：
［化３］
ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ
を含むペプチド、またはその構造的アナログもしくは化学的アナログを提供することである。
【００１１】
配列番号３のペプチドが好ましい。該ペプチドは、２つのジスルフィド結合によって、構造的に拘束されている。特に好ましいのは、Ｃ１とＣ８システインの間に１つのジスルフィド結合を、そしてＣ３とＣ９システインの間に第２のジスルフィド結合を有するペプチドである。
【００１２】
本発明はまた、医薬としての新規のペプチドの使用に関する。薬学的に許容される担体と組み合わせた新規ペプチドを含む医薬組成物もまた、本発明の目的である。
【００１３】
本発明はまた、炎症性疾患およびヒトの白血病の処置、および一般に白血球の細胞の接着と遊走を阻害するための医薬組成物の製造における新規ペプチドの使用を含む。本発明のさらなる目的は、治療上もしくは予防上効果的な量の本発明による新規ペプチドを、炎症性疾患およびヒトの白血病の処置が必要な対象に投与することを含む、炎症性疾患およびヒトの白血病の治療的もしくは予防的処置のための方法である。
【００１４】
本発明による新規ペプチドはまた、in vitro での種々のインテグリンの および種々のタイプの白血球細胞の生化学的な単離および精製手順において、β２インテグリン・アンタゴニストとして用いられ得る。
本発明は、本明細書中で、添付の図面で より詳細に述べられる。
【００１５】
（図面の簡単な説明）
図１は、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ ノナペプチドの、β２白血球インテグリンおよびそのＩ−ドメインへの結合が、どのように二価のカチオン依存性であるかを示している。図１(Ａ)において、血球ライセート由来のインテグリンを、マイクロタイターウェル上に、αＭサブユニット抗体 ＭＥＭ １７０またはＯＫＭ １またはαＸサブユニット抗体 ＴＳ ２／４を用いて免疫捕捉した。精製したＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴまたはＧＳＴコントロール(２μｇ／ウェル)を、ＥＤＴＡの存在下または非存在下で、６０分間結合させた。洗浄後、結合したＧＳＴタンパク質を、抗ＧＳＴ抗体を用いることによって決定した。結果は、３個のウェルの平均値±ＳＤで示した。試験は３回繰り返し、同様の結果を得た。
【００１６】
図１(Ｂ)において、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴまたはＧＳＴを、精製されたαＭサブユニット Ｉ−ドメインでコートされたマイクロタイターウェル中で、６０分間インキュベートした。ＧＳＴタンパク質の濃度は示された通りである。洗浄後、結合したＧＳＴを抗ＧＳＴ抗体を用いることによって決定した。結果は、３個のウェルの平均値±ＳＤで示した。２つの別の試験において、結果は同様であった。
【００１７】
図１(Ｃ)において、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ(１０μｇ／ｍｌ)を、Ｉ−ドメインでコートされたウェル中で、ＥＤＴＡ(２．５ｍＭ) またはＬＬＧ−Ｃ４(１)ペプチド(１００μＭ) または不活性ＬＬＧ−Ｃ４(２)ペプチド(１００μＭ)の存在下もしくは非存在下で、インキュベートした。６０分インキュベーションした後、ウェルを洗浄し、結合を抗ＧＳＴ抗体で決定した。結果は、３個のウェルの平均値±ＳＤである。
【００１８】
図２において、固定されたＬＬＧ−Ｃ４は、どのようにβ２インテグリン指向性細胞接着を助けるかを示している。図２(Ａ)において、ホルボールエステル活性化ＴＨＰ−１細胞を、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ、ＧＳＴ、またはアルブミンでコートされたマイクロタイターウェルに、６０分間結合させた。ＥＤＴＡを２．５ｍＭの濃度で含む。結合した細胞を、細胞性ホスファターゼ活性を測定するアッセイによって決定した。データは、３個のウェルの平均値±ＳＤである。同様の結果を、６個の別の試験で得た。
【００１９】
図２(Ｂ)において、ＴＨＰ−１細胞を、５０μｇ／ｍｌの濃度で、β１、β２、β３、αＬ、αＭ、またはαＸ インテグリン・サブユニットに対する抗体と、それぞれ記載した通りに混合した。細胞のアリコートを、次にＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴでコートされたウェルに移し、３７℃で６０分間インキュベートした。洗浄した後、結合した細胞をホスファターゼアッセイによって決定した。結果は、２−４の独立した実験をそれぞれ３個のウェルで行った平均値％接着±ＳＤである。
【００２０】
図２(Ｃ)において、Ｃ(１−８；３−９)ペプチド、およびＣ(１−９；３−８)ペプチドを、グルタルアルデヒドの非存在下もしくは存在下で、ＴＢＳ中４０μｇ／ｍｌの濃度で、一晩インキュベートすることによって、マイクロタイターウェル上にコートした。プラスチック上の遊離の結合部位を、次に５％ ＢＳＡでブロックした。ＴＨＰ−１細胞(ウェル当たり１０５個)を、３７℃で６０分間結合させた。ＰＢＳで洗浄した後、結合した細胞を決定し、結果を３個のウェルの平均値±ＳＤで示す。試験は２回繰り返した。
【００２１】
図２(Ｄ)において、αＸβ２インテグリンをトランスフェクトさせたＬ細胞を、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴまたはＧＳＴに結合させた。７Ｅ４抗体およびＥＤＴＡを、競合剤として用いた。％接着の平均値±ＳＤの結果は、３個のウェルで導かれる３個の試験で代表している。ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴへの結合 対 ＧＳＴへの結合の違いは、統計学的に有意である(ｐ＝０．０１６)。
【００２２】
図３は、環状ＬＬＧペプチドの活性の比較を示している。図３(Ａ)において、ＴＨＰ−１細胞を、Ｃ(１−８；３−９)またはＣ(１−９；３−８)ジスルフィドの何れかを含むペプチドの懸濁液中に混合した。ペプチドの最終濃度を示す。次に、細胞を、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴでコートしたマイクロタイターウェル中で、３７℃で６０分間インキュベートした。ウェルを洗浄後、結合した細胞をホスファターゼアッセイによって定量した。結果は、３個のウェルの平均値±ＳＤである。３個のウェルでの２つの別の試験において、同様の結果を得た。
【００２３】
図３(Ｂ)において、ＴＨＰ−１細胞のＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴへの結合を、Ｃ(１−８；３−９)、ＣＬＬＧＣ、またはＣＡＡＧＣペプチドの存在下で調べた。合成ペプチドを示された濃度で用いた。６０分インキュベートした後、ウェルを洗浄し、結合した細胞をホスファターゼ・アッセイによって決定した。データを３個のウェルの平均値±ＳＤで示す。データは、２つの別の試験において同様であった。
【００２４】
図４は、ＬＬＧ−Ｃ４ペプチドによるＩＣＡＭ−１への白血球細胞の接着の阻害を示す。図４(Ａ)において、ジャーカット細胞を、ＬＬＧ−Ｃ４ペプチドの非存在下もしくは存在下で、マイクロタイターウェル中で、固定されたＩＣＡＭ−１−Ｆｃに接着させた。４５分インキュベートした後、結合していない細胞を、マイクロタイター・プレートをＰＢＳを含むデカンター上に逆さまに浸すことによって除去し、そして接着した細胞を Crystal Violet で染色した。結果は、それぞれ３個もしくは４個のウェルでの ２回の試験の％細胞接着±ＳＤを示している。
【００２５】
図４(Ｂ)において、マイクロタイターウェル上で成長させたＴＮＦ−αで刺激された Eahy 表皮細胞単層に、Ｔ細胞を結合させた。ＬＬＧ−Ｃ４またはＲＧＤ−４Ｃを５０μＭ含んだ。４５分インキュベートした後、ＰＢＳ溶液にマイクロタイター・プレートを浸すことによって、非結合細胞を除去し、結合したＴ細胞をホスファターゼ・アッセイによって決定した。データは、３個のウェルの平均値±ＳＤである。
【００２６】
図５は、フォン・ウィルブランド因子 およびタイプ IV コラーゲンへのＴＨＰ−１ 細胞接着が、どのようにＬＬＧ−Ｃ４ペプチドによってブロックされるかを示している。図５(Ａ)において、β２(７Ｅ４)、αｖβ３(ＬＭ ６０９)、またはαIIBβ３(Ｐ２)インテグリンに対する抗体の存在下で、フォン・ウィルブランド因子に結合したＴＨＰ−１細胞を調べた。フォン・ウィルブランド因子でコートされたウェル中で６０分インキュベートした後、結合した細胞を決定した。データは、３個のウェルの平均値±ＳＤである。試験は、３回繰り返した。
【００２７】
図５(Ｂ)において、ＴＨＰ−１細胞を、フォン・ウィルブランド因子、タイプ IV コラーゲン、またはフィブロネクチンでコートされたマイクロタイターウェルに結合させた。Ｃ(１−８；３−９)ペプチドは、記載の濃度で競合剤として含まれる。結合した細胞は、ホスファターゼ・アッセイによって決定された。データは、３個のウェルの平均値±ＳＤであり、４個の別の試験において同様であった。
【００２８】
図６は、合成ペプチドＬＬＧ−Ｃ４がＴＨＰ−１細胞のフィブリノーゲン基層への接着および遊走を妨げることを示している。図６(Ａ)において、ＴＨＰ−１細胞を、Ｃ(１−８；３−９)またはＣ(１−９；３−８)と共に、またはペプチドの非存在下で、フィブリノーゲンでコートされたマイクロタイターウェルに加えられた。６０分インキュベートした後、結合した細胞をホスファターゼ・アッセイによって決定した。結果は、３個のウェルの平均値±ＳＤであり、２つの異なる試験において同様であった。
【００２９】
図６(Ｂ)において、インテグリンを活性化するために、ＴＨＰ−１細胞をホルボールエステル(５０ｎＭ)、ＲＧＤ−４Ｃ およびＣ(１−８；３−９)ペプチド(それぞれ２．５μＭ)で１時間刺激した。洗浄後、上記の濃度のＣ(１−８；３−９)またはＲＧＤ−４Ｃの存在下で、細胞をＣ(１−８；３−９)フィブリノーゲンでコートしたウェルに結合させた。３０分インキュベートした後、結合した細胞を決定した。結果は、３個のウェルの平均値±ＳＤであり、２つの別の試験において同様であった。幾つかのデータ点では、ＳＤ値が小さすぎて見えない。
【００３０】
図６(Ｃ)において、トランスウェル・フィルターは、フィブリノーゲンで上部表面および下部表面の両方をコートするか、またはコートしないままとし、次に、ＢＳＡを飽和させた。ＴＨＰ−１細胞(フィルター当たり５×１０４個)を、１０％血清を含む媒体中で、フィルターの上部表面に置いた。Ｃ(１−８；３−９)およびＣ(１−９；３−８)の濃度は、２００μＭであった。１８時間培養後、フィルターの下で遊走した細胞を決定した。細胞を固定し、染色し、次に顕微鏡で計数した。結果を少なくとも３回の試験の平均値±ＳＤで示す。
【００３１】
図６(Ｄ)において、トランスウェルフィルターの両面を、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ、ＧＳＴ、フィブリノーゲン、またはＢＳＡでコートした。１０％血清を含む媒体中、フィルター当たり５×１０４個のＴＨＰ−１細胞の全量を加えた。細胞を１８時間培養し、フィルターの下部表面に遊走した細胞の数を、顕微鏡で計数した。結果を少なくとも３回の試験の平均値±ＳＤで示す。
【００３２】
図７は、ＮＭＲによる環状ＬＬＧ−Ｃ４ペプチドのコンホーマーの構造の比較を示す。図７(Ａ)において、Ｃ(１−８；３−９)(左)およびＣ(１−９；３−８)(右)の４０個のコンホメーションのファミリーを示す。ジスルフィド閉環バックボーンの重原子は、それぞれのファミリーに重ねて示しており、そして２つのファミリーが図から除いてある。
【００３３】
図７(Ｂ)において、Ｃ(１−８；３−９)(上)およびＣ(１−９；３−８)の代表的な溶液の構造の立体図を示してある。この表示において、２つの構造を主鎖の原子Ｆ４、Ｌ５、およびＬ６で重ねてあり、次に図から除いてある。Ｃ(１−８；３−９)ペプチドにおいて、Ｃ１は環状構造より上でＣ８とペアを組み、そしてＣ３とＣ９は環状構造より下でペアを組んでいる。同様に、Ｃ(１−９；３−８)ペプチドにおいて、Ｃ１は環より上でＣ９とペアを組み、Ｃ３とＣ９は環より下でペアを組んでいる。
【００３４】
（本発明の詳細な説明）
予期しないＬＬＧトリペプチド結合モチーフを含む新規の非常に特異的なペプチド・アンタゴニストを、ファージ・ディスプレイを用いて展開した。新規ペプチドは、白血球の接着を阻害し、かつ固定された場合は、白血球の接着を助ける。最も活性なアンタゴニストであるＣＰＣＦＬＬＧＣＣ（ＬＬＧ−Ｃ４と呼ぶ)は、２つのジスルフィド結合によって構造的に拘束された二環式のノナペプチドであり、かつβ２インテグリンに好まれるＬＬＧトリペプチド結合モチーフを含む。ＬＬＧ−Ｃ４ペプチドは、特異的にβ２インテグリン介在白血球接着をブロックし、主なリガンドであるＩＣＡＭ−１への白血球の結合を阻害した。さらに、典型的なインテグリンのリガンドと同様に、該ペプチドが、プラスチック上に固定された場合に細胞接着を助け、白血球細胞株を結合したが、β２インテグリンを有しない細胞は結合しなかった。該ペプチドの有効性と白血球特異性は、白血球インテグリンにおける既知の活性部位である Ｉ−ドメインと相互作用できることによって説明される。興味深いことに、ＩＣＡＭ−１だけではなく、フォン・ウィルブランド因子やタイプ IV コラーゲンを含む幾つかの他の接着タンパク質も、ファージ・ディスプレイによって識別される 一致したＰＰ／ＸＸＬＬＧ配列を含む。我々の研究は、フォン・ウィルブランド因子およびタイプ IV コラーゲンは、白血球β２インテグリンの強力なリガンドであることを示している。
【００３５】
最も活性なアンタゴニストであるＬＬＧ−Ｃ４ ノナペプチドの活性は、２つのジスルフィド架橋の正確な形成に厳密に依存した。ジスルフィド架橋の配置のみについて異なった２つの二環式のコンホーマーの活性には、２０倍の違いがあった。より活性なペプチドは、ＮＭＲで示されるように、ジスルフィド結合の交差した配置のために、非常にコンパクトな構造を有していた。興味深いことに、ロイシン側鎖は、環状構造からアンテナのように突き出しており、これがインテグリンと直接相互作用し得ると考えられる。小さいグリシン残基は、２つのロイシン側鎖の間の正確な距離を調整しうる。
【００３６】
先の研究は、ＩＣＡＭ−１のＬＬＧ領域(Ross et al., 1992)、またはＩＣＡＭ−２の対応する領域(Li et al., 1993)にまたがる合成ペプチドが、該ペプチドがプラスチック上に固定されている場合に、白血球の接着を助けることを示している。可溶性の形態において、該ペプチドは、表皮細胞単層に発現したＩＣＡＭ−１への白血球細胞の結合をブロックする。ＬＬＧ−Ｃ４ ノナペプチドは、先に述べたβ２インテグリンに対するペプチド・リガンドよりも非常に小さく、そしてグルタメートのような負に荷電したアミノ酸残基がないけれども高い活性を示す。ペンタペプチド：ＣＬＬＧＣもまた、細胞接着を阻害した。従って、β２インテグリン標的リガンドは、非荷電ＬＬＧモチーフに基づいて組み立てられ得る。これは、ＩＣＡＭ−１の第１ Ｉｇドメインの結晶構造および構造的なモデルと一致しており、ＬＬＧ配列が、明らかにインテグリン Ｉ−ドメインと直接接触し得る、短いβ鎖の一部で見られる(Casasnovas et al., 1998; Bella et al., 1998)。ＩＣＡＭ−１の第１ Ｉｇドメイン中の個々のアミノ酸のアラニン走査突然変異試験(Alanine scanning mutagenesis studies)は、ＬＬＧ領域がＩＣＡＭ−１のインテグリンの結合に重要であることを示している。ロイシン残基の１つの変異は、ＩＣＡＭ−１の結合活性を部分的に減少させ、グリシンの変異は完全に減少させる(Fisher et al., 1997)。グリシンを変異させたＩＣＡＭ−１が不活性であることから、グリシン残基は構造的な役割を果たすのではなく、むしろインテグリンに直接作用すると示唆されている。ＩＣＡＭ−２において、対応するバリンおよびグリシン アミノ酸のアラニンへの変異はまた、タンパク質のインテグリン結合活性を損なわせる(Casasnovas et al., 1999)。
【００３７】
フォン・ウィルブランド因子は、２つのＬＬＧ配列を含むが、これらの配列がインテグリンと相互作用し得ることは報告されていない。フォン・ウィルブランド因子は、幾つかのタンパク質に結合する多機能性接着リガンドであり、曝露された内皮下層への血小板の接着に介在することによって、血管の損傷の際に出血を防ぐ。それは、２つのＲＧＤ配列を含み、その少なくとも１つが血小板インテグリンαIIbβ３を結合するのに重要である。本発明者らの知識によると、フォン・ウィルブランド病での出血性疾患を伴うＬＬＧ配列における既知の変異はない。本発明者らは、フォン・ウィルブランド因子への ホルボールエステル活性化白血球細胞の強い結合を見出した。該結合は、β２インテグリン標的ＬＬＧペプチド およびβ２インテグリン・ブロック抗体 ７Ｅ４によって阻害されるが、β３インテグリンに対する抗体によっては阻害されなかったため、ＬＬＧモチーフによって、主として媒介されることが分かった。ＬＬＧ配列を除いて、フォン・ウィルブランド因子は、β２インテグリンのαサブユニットに存在するＩドメインと類似したＩドメインを含むことは、注目に値する。したがって、ＬＬＧ配列と、タンパク質のフォールディングに影響を与える 隣接したＩドメインの間の分子内もしくは分子間相互作用があることもあり得る。もし該相互作用が起こるならば、そのことは、フォン・ウィルブランド因子の血漿の形態が不活性であることを一部説明し得る。我々の結果は、例えば血管の内皮下層もしくは他の表面に存在する、フォン・ウィルブランド因子の固定された形態に、白血球が結合し得ること、そしてこれらの相互作用が炎症の第１段階で役割を果たし得ることを示唆している。
【００３８】
興味深いことに、我々が相同性検査によって同定したコラーゲン IV のα鎖の配列：ＬＬＧＲＰＧＥＡは、α２β１インテグリンに結合する臨床的なモチーフＧＦＯＧＥＲ(Ｏ＝ヒドロキシプロリン)を有するコラーゲン様ペプチドに配列の類似性を示す(Emsley et al., 2000)。ペプチドのグルタメート残基は、複合体の結晶構造中で、コラーゲン様ペプチドとα２β１インテグリンのＩ−ドメインの間で、金属イオンに配位していることが分かっている。インテグリンに結合する際に、ＬＬＧモチーフのＣ末端に位置するグルタメートは、ＩＣＡＭ−１およびコラーゲン IV のα鎖の両方において、同様の金属イオンに結合する役割を果たしている。
【００３９】
ＬＬＧ−Ｃ４ ノナペプチドは、β２インテグリンに対してそれまでに開発された、最も短く かつ最も有効なペプチド・リガンドであり、そしてβ２インテグリン アンタゴニストや可能性のある抗炎症剤の開発におけるリード構造を提供する。β２インテグリンが血球および骨髄中の血球の前駆体で発現されるために、これらのインテグリンは、循環するリガンドによるターゲティングのためにたやすく近づくことがでなければならない。しかし、β２インテグリンは、不活性な状態で存在し、ケモカインなどによる生理学的な刺激の後、または抗原の存在する細胞への接着を介してのみ活性化されることが知られている。従って、活性化されたインテグリンを生じる細胞に、より選択的に結合する化合物を開発することが、望ましく かつ臨床的に有用である。本発明者らは、該性質を示す、すなわち固定されたペプチドが、インテグリンが完全に活性化された後にのみ細胞に強く結合する、ＬＬＧ−Ｃ４ペプチドを見出した。フォン・ウィルブランド因子およびコラーゲンにおけるＬＬＧ様配列の存在は、損傷した血管の内皮下層マトリックスへの、血小板のみならず白血球の接着も媒介するという、タンパク質の新規の機能を示唆している。その結果、本発明のペプチドによる、炎症性細胞の結合の阻害、また白血病細胞のフォン・ウィルブランド因子およびタイプ IV コラーゲンへの結合の阻害は、臨床的に有用である。ＩＣＡＭ−１が、普通感冒を引き起こす リノウイルスにおける受容体として機能するため、ＩＣＡＭ−１様ペプチドはまた、新規の抗ウイルス化合物の開発を助ける(Casasnovas et al., 1998; Bella et al., 1998)。本発明のペプチドはまた、糖尿病、リウマチ性関節炎、クローン病、乾癬、多発性硬化症、および移植拒絶反応を含む(これらに制限されない)、免疫疾患の処置に有用であり得る。
【００４０】
炎症性疾患およびヒトの白血病の治療的処置方法もしくは予防的処置方法において、該処置が必要な対象に投与されるべき 治療上もしくは予防上効果的な量の本発明のペプチドは、該処置が必要な対象の状態、体重、年齢などに依存して変化し得る。マウスにおいて、適切な有効量は、例えば静脈で もしくは腹腔内での投与で、１日当たり０．２から１mgであるか、または１週間当たり約１０mgである。白血球への直接の効果を有するために、より大きな動物またはヒトにおいて、１回投与における有効量は、例えば静脈に１０から１００mgである。
【００４１】
本発明のペプチドはまた、βインテグリンを発現する白血球の細胞のタイプを識別するために用いられ得る。そして、これは炎症性細胞を分類するのに、または白血病を診断するのに有用である。活性化された形態のαＭβ２インテグリンを発現する細胞は、例えば、血液もしくは組織から、カラムの表面に細胞群を通し、次に細胞をＥＤＴＡもしくは競合ペプチドで溶出することによって単離され得る。該方法は、特に、インテグリンのパネルを発現するリンパ球群のサブセットを単離するのに有用であり得る。
【００４２】
本発明のペプチドはまた、細胞に発現したβ２インテグリンの、ペプチド表面もしくは人工のペプチドマトリックスへの接着を促進するために用いられ得る。該人工のマトリックスは、骨髄もしくはリンパ管のように作用し得、そして移植組織を調整するのを助け得る。他方、可溶形のペプチドは、該ペプチドがマクロファージのβ２インテグリン指向性遊走、およびそれに付随した炎症性反応を阻害することから、移植した組織に対する宿主の反応を妨げる。
下記の実施例は本発明を例示するが、これを限定するものではない。
【実施例】
【００４３】
実施例１：ファージ・ディスプレイ
αＭβ２インテグリンを、Finnish Red Cross Blood Transfusion Service から得られた、前述(Li et al., 1995)のバフィーコートから、抗体アフィニティ・クロマトグラフィーによって精製した。Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水(ＴＢＳ)／１ｍＭ ＭｎＣｌ２に希釈したインテグリンを、第１バイオパニングにおいてウェル当たり１μｇを、次のパニングにおいて１００ng、１０ng、および１ngを用いて、マイクロタイターウェル上に、４℃で一晩コートした。ウェルをＴＢＳ中５％ ＢＳＡで、２２℃で、１時間ブロックし、次にＴＢＳで４回洗浄した。バイオパニングは、ＣＸ７ＣおよびＣＸ９Ｘファージ・ペプチド・ライブラリーを用いて、本質的に記載された(Koivunen et al., 1994)通りに行った。ライブラリーの構築を修飾し、その結果変性した配列をコードする１本鎖ＤＮＡを、リバース・プライマーのみで５サイクル、次にリバース・プライマーとフォワード・プライマーで１１サイクルのＰＣＲを用いて、二本鎖の形態に変えた。全量で６μｇの二本鎖オリゴヌクレオチドを、QIAGEN PCR purification kit を用いて精製し、４２μｇの Fuse5 ファージ・ベクターでライゲートした。ライブラリーにおけるリコンビナントの数は、１０９個以上であった。E. coli におけるファージ結合、溶出、および次の増殖を５回繰り返し、各パニング後にバクテリアのコロニーを取り、マイクロタイター・ウェルに、１０μｌのＴＢＳ中、−２０℃で保存した。直接コロニー配列決定のために、解凍した試料の１μｌのアリコートを、それぞれ１０pmolの フォワード・プライマー：５'−TAATACGACTCACTATAGGGCAAGCTGATAAACCGATACAAT T−３'、およびリバース・プライマー：５'−CCCTCATAGTTAGCGTAACGATCT−３'で、ＰＣＲにかけた。ＰＣＲの条件は、９２℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で６０秒であり、サイクルの数は３５であった。ＰＣＲ反応の１μｇのアリコートを、１５pmolの何れか１つのプライマーを用いて配列決定するために取り、そして ABI 310 apparatus (PE Applied Biosystems, Foster City, CA)で分析した。
【００４４】
選択の５番目のラウンドの後、ＣＸ７Ｃライブラリーは、バックグラウンドと比較して、インテグリンに結合したファージが６００倍多く、ＣＸ９Ｃライブラリーは１０００倍多かった。結合したファージの配列決定では、７つの異なる配列のみが明らかとなり、それがインテグリンに特異的なペプチドの選択を示している(表１)。これらのうちの４個がＬＬＧトリペプチド・モチーフを含んでいた。最も多い２つの配列は、ＣＰＣＦＬＬＧＣＣ（ＬＬＧ−Ｃ４）、および ＣＷＫＬＬＧＳＥＥＥＣ であり、それぞれランダムに選択されたクローンにおいて１５回観測され、そしてこれらは、インテグリンのコーティング濃度の低いものを用いることによって、高い親和性バインダーを探したあとに残った唯一のクローンであった。興味深いことに、ＬＬＧ−Ｃ４は、プロリン、ロイシン、グリシン、またはシステイン残基の保存に関して、全てのペプチドがそれに類似性を示したことから、一致した結合配列ように見える。
【００４５】
表１：αＭβ２インテグリン(Ｍａｃ−１)に結合した７個のファージ配列、および細胞接着タンパク質中に存在するＬＬＧを含む配列のアラインメント
【表１】
2004536041.tif 000002
【００４６】
【表２】
2004536041.tif 000003
【００４７】
ファージ・ペプチドと同一のアミノ酸を太字で示す。ＩＣＡＭ−１配列は、第１ Ｉｇドメイン由来である。フォン・ウィルブランド因子配列は、Ａ２ドメインとＤ３ドメイン由来であり、タイプ Ｉ コラーゲン配列とタイプ IV コラーゲン配列は、α鎖由来である。オステオポンチン配列は、No.５−１７の残基を含む。それぞれのペプチドをコードする 単離されたヌクレオチド配列の数を、かっこ内に示す。
【００４８】
スクリーニングタンパク質データベースは、ＬＬＧトリペプチド配列が、ＩＣＡＭ−１の第１ Ｉｇドメイン上に位置し、αＭβ２インテグリンへのＩＣＡＭ−１の結合に重要である Glu-34 残基がその前にあることを示している(Staunton et al., 1990; Stanley and Hogg, 1998)。ＣＷＫＬＬＧＳＥＥＥＣ ペプチドは、最も高い類似性を示し、６個の連続した残基のうち５個は、ヒトのＩＣＡＭ−１配列と同一である(表１)。ＬＬＧトリペプチド配列はまた、フォン・ウィルブランド因子のドメインＡ２とＤ３、タイプ Ｉ コラーゲンとタイプ IV コラーゲンのα鎖、およびオステオポンチンの中に含まれる。これらのＬＬＧを含む配列は、ＩＣＡＭ−１を除いて、強力な細胞接着部位を含むことを、以前に報告されていない。フォン・ウィルブランド因子(Savage et al., 1996)、およびオステオポンチン(Helluin et al., 2000)は、ＲＧＤ指向性β３インテグリンの強力なリガンドであるが、これらがさらにβ２インテグリンに結合し得るかどうかは知られていない。興味深いことに、タイプ Ｉ コラーゲンが、近年、αＸβ２インテグリンのリガンドであることが示されている(Garnotel et al., 2000)。
【００４９】
実施例２：インテグリン結合アッセイ
ＧＳＴの製造およびＦｃ融合タンパク質
ＬＬＧ−Ｃ４をコードするヌクレオチド配列は、ファージＤＮＡから、BamH I サイト(５'−AGGCTCGAGGATCCTCGGCCGACGGGGCT−３')、および EcoR I サイト(５'−AGGTCTAGAATTCGCCCCAGCGGCCCC−３')を含むプライマーで、ＰＣＲ増幅された。ＰＣＲ生成物を、アガロースゲルで精製し、２つの制限酵素で消化し、そして PGEX-2TK ベクター(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)にライゲートした。ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴを発現するリコンビナントは、ＤＮＡ配列決定によって確かめた。ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴは、E. coli strain BL 21 において生産され、グルタチオン・アフィニティー・クロマトグラフィー、次に透析によって精製された。５個のＩＣＡＭ−１ Ｉｇ ドメインを含むＩＣＡＭ−１−Ｆｃ融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞中に生産され、タンパク質Ａ アフィニティー・クロマトグラフィーによって精製された。約２０mgのＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴを生産した。それは、PhastSystem apparatus (Amersham Pharmacia)におけるＳＤＳゲル電気泳動によって分析された結果、９５％以上純粋であった。
【００５０】
モノクローナル抗体
インテグリンのβ２サブユニットに対する抗体は、前述のように、７Ｅ４、１１Ｄ３、３Ｆ９、１Ｄ１０、および２Ｅ７である(Nortamo et al., 1988)。抗αＬサブユニット抗体は、ＴＳ２／４、およびＭＥＭ−８３である(Monosan, Netherlands)。抗体ＯＫＭ１、ＯＫＭ１０、およびＭＥＭ−１７０は、抗αＭサブユニットに対する抗体であり、そして抗体３．９は、αＸサブユニットに対する抗体である(Li et al., 1993; Li et al., 1995)。αIIbβ３インテグリン抗体Ｐ２は、Immunotech (Marseille, France)から購入し、αｖβ３インテグリン抗体 ＬＭ６０９、およびβ１サブユニット抗体 ６Ｓ６は、Chemicon (Temecula, CA)から購入した。
【００５１】
インテグリン結合アッセイ
インテグリンを、αＭサブユニット抗体 ＯＫＭ１もしくはＭＥＭ１７０、αＸサブユニット抗体 ＴＳ２／４、または非特異的なＩｇＧ(Dako, Carpinteria, CA)でコートしたマイクロタイターウェル上に免疫捕捉した。抗体は、ＴＢＳ中１０μｇ／ｍｌの濃度で、４℃で一晩コートされた。ウェルを５％ ＢＳＡ、１％のオクチルグルコシド／１ｍＭ ＭｎＣｌ２／ＴＢＳ中の２００μｌのバフィーコート・ライセートのアリコートで満たした後、４℃で２時間インキュベートした。次に、ウェルをオクチルグルコシドを含む緩衝液で５回洗浄した。ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ またはコントロールＧＳＴを、２５ｍＭ オクチルグルコシド／ＴＢＳ／１ｍＭ ＭｎＣｌ２中１０μｇ／ｍｌの濃度で、１時間インキュベートした。ウェルを洗浄した後、結合したＧＳＴを、抗ＧＳＴ抗体(Amersham Pharmacia)で決定した。該抗体は、製造者(Wallac, Turku, Fin-land)の指示に従って、Ｅｕ３＋−キレートでラベルされている。Ｅｕ３＋−蛍光を、1230 Arcus fluorometer (Wallac)で測定した。Ｉ−ドメイン結合を調べるために、我々は、記載されたように、E. Coli 中でＧＳＴ融合タンパク質として発現されたリコンビナントのαＭ Ｉ−ドメインを用いた(Ueda et al., 1994)。融合タンパク質は、グルタチオン結合ビーズのアフィニティ・クロマトグラフィーによって精製され、トロンビンで切断され、分子量約２３ｋＤａのリコンビナントのＩ−ドメインを放出した。Ｉ−ドメインを、２０μｇ／ｍｌの濃度でマイクロタイターウェル上にコートし、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ およびＧＳＴの結合を調べた。
【００５２】
ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ融合タンパク質 (ＧＳＴのみではない)は、強い活性を有することが見出され、典型的なインテグリン・リガンドのような二価のカチオン感受性の挙動でαＭβ２インテグリンに結合した。カチオンキレート剤であるＥＤＴＡは、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴのインテグリンへの結合を阻害した。これは、αＭサブユニット抗体ＭＥＭ１７０またはＯＫＭ１で、マイクロタイターウェル上に免疫捕捉した(図１Ａ)。同様に、ＥＤＴＡで阻害可能なＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴの結合は、αＬβ２インテグリンに検出された。これは、ＴＳ２／４抗体で捕捉された。非特異的なＩｇＧを免疫捕捉に用いた場合は、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ結合は、ＧＳＴコントロールと違わず、ＥＤＴＡによって阻害し得ない(示さず)。
【００５３】
我々はまた、ペプチドが直接αＭβ２インテグリンのＩ−ドメインの、既知のリガンド結合部位と相互作用し得るかどうかを試験した。ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴは、０．０１−１００μｇ／ｍｌの濃度で試験し、単離したαＭサブユニットのＩ−ドメインへの濃度依存性結合を示す(図１Ｂ)。同じ濃度では、ＧＳＴは結合しなかった。Ｉ−ドメインのＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴと結合する能力は、結合培地に加えられたＭｎ２＋カチオンに依存し、ＥＤＴＡでＭｎ２＋をキレート化することで、結合はブロックされた(図１Ｃ)。融合タンパク質のみならず、Ｉ−ドメインもまたＬＬＧ−Ｃ４ ノナペプチドと結合し得ることを示すために、我々は、二環式ＬＬＧ−Ｃ４ ノナペプチドを合成した。しかし、混合されたジスルフィドが、容易に空気酸化されることが明らかなため、活性で水に可溶なペプチドを製造するのが困難であった。１つのＬＬＧ−Ｃ４（１）の生成物は、高い活性を有し、Ｉ−ドメインのＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴと結合し得る能力をブロックした。同じペプチドはまた、細胞の培養試験において活性であった。別の生成物であるＬＬＧ−Ｃ４(２)は、不利なジスルフィド結合のために明らかに不活性であり、そしてＩ−ドメインへのＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ結合を阻害しない。
【００５４】
実施例３：細胞の培養およびノナペプチド・リガンドへの細胞株の接着
ジャーカット Ｔ細胞白血病(ATCC no. TIB-152)、U-937 組織球性リンパ腫(no. CRL-1593.2)、および K562 赤白血病 (no. 45507) 細胞株を、２ｍＭ グルタミンと、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳと、１ｍＭ ピルビン酸ナトリウムと、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）と、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）と、１０％ ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を加えた RPMI 1640 培地中で維持した。ＴＨＰ−１単球白血病細胞(ATCC TIB-202)を、０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノールを加えた同じ培地中で培養した。非白血球性細胞株 Eahy926、HT1080、KS6717、および SKOV-3 を、前述のように維持した(Koivunen et al., 1999)。Ｔ細胞を、Ficoll-Hypaque 遠心分離後、ナイロン・ウール・カラムを通すことによって、血液のバフィーコートから単離した(Valmu and Gahmberg, 1995)。野生型のマウス L929 細胞株およびαＸβ２インテグリンをトランスフェクトさせたＬ−細胞株を、Dr. Y. van Kooyk (University Hospital, Nijmegen, NL)から得た。
【００５５】
細胞接着
フィブリノーゲン、フィブロネクチン、フォン・ウィルブランド因子、タイプ IV コラーゲン、ＧＳＴ融合タンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、または合成ペプチドを、別記しない限り５０μｌのＴＢＳ中２μｇの濃度で、マイクロタイターウェル上にコートした。Drs. J. J. Sixma and Ph. G. de Groot (University Medical Center Utrecht, the Netherlands) から親切にも提供された、リコンビナントのフォン・ウィルブランド因子、およびそれに捕捉した抗体も用いた。ポリマー化したペプチドを製造するために、グルタルアルデヒドを最終濃度０．２５％で加えた。ウェルを５％ ＢＳＡで満たし、次にＰＢＳで５回洗浄した。接着アッセイを行う前に、血清を含まない培地中で、５０ｎＭ ４β−ホルボール １２,１３−ジブチレート、または２００μＭ Ｐ１ ペプチド(Kotovuori et al., 1999)で、室温で３０分間細胞を処理し、インテグリンを活性化した。あるいは、細胞をホルボール エステル(５０ｎＭ)と、Ｃ(１−８；３−９)(２．５μＭ)と、ＲＧＤ−４Ｃ(２．５μＭ)で、３７℃で６０分間刺激した。その後、該ペプチドをＰＢＳ／２．５ｍＭ ＥＤＴＡで洗浄することによって除去した。細胞(ウェル当たり１００,０００個)をマイクロタイターウェル中で、競合ペプチド、抗体、またはＥＤＴＡの非存在下もしくは存在下で、３７℃で６０分間インキュベートした。結合していない細胞をＰＢＳで穏やかに洗浄することによって除去し、ペーパータオルでプレートを押した。結合した細胞を、細胞性ホスファターゼ活性を測定するアッセイによって決定した。簡便法では、１％ Triton X-100、および６ｍｇ／ｍｌ ｐ−ニトロフェニル ホスフェートを含む１００μｌの ５０ｍＭ 酢酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ ５．０)を、ウェル毎に加え、３７℃で１時間インキュベートした。反応を５０μｌの１Ｍ ＮａＯＨで停止させた。４０５nmの吸光度を、マイクロプレート・リーダーで測定した。別法では、接着した細胞を Crystal Violet で、本質的に前述のように染色した(Mould et al., 1995)。
【００５６】
表皮細胞単層に結合したＴ細胞を調べ、Eahy926 表皮細胞を、マイクロタイタープレート上に、ウェル当たり５×１０４個の密度で置き、３日間成長させた。ＩＣＡＭ−１の生成を刺激し、細胞をさらに１０ng/mlの濃度で、ＴＮＦ−αの存在下で、１６時間成長させた。Ｔ細胞(ウェル当たり１．５×１０５個)を、初めの３０分間は４℃で、次の１５分間は３７℃で、Eahy926 細胞に結合させた。結合していないＴ細胞を、マイクロタイタープレートを、逆さまにＰＢＳに漬けることによって除去した。結合していない細胞をホスファターゼ・アッセイによって決定した。
【００５７】
ホルボール・エステル活性化ＴＨＰ−１単層白血病細胞は、マイクロタイターウェル上にコートした ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴに効率的に結合したが、ＧＳＴやペプチド−ＧＳＴコントロール(ＣＬＲＳＧＲＧＣ−ＧＳＴ、ＣＰＰＷＷＳＱＣ−ＧＳＴ)は、結合しなかった(図２Ａ)。２．５ｍＭの濃度のＥＤＴＡは、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴへの結合を完全に阻害した。抗インテグリン抗体のパネルでのスクリーニングは、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴへの細胞接着が、完全にβ２鎖へのブロック抗体 ７Ｅ４によって阻害されていることを示した(図２Ｂ)。β１インテグリン抗体(６Ｓ６)およびβ３インテグリン抗体(ＬＭ６０９, Ｐ２)では、効果は見られなかった。部分阻害は、β２鎖抗体１１Ｄ３および３Ｆ９で得られた。３つのβ２抗体の能力の順序は、顆粒球細胞凝集アッセイにおいて先に得られたものと同じである。７Ｅ４は、細胞の凝集の最も活性な阻害剤であり、次に１１Ｄ３、３Ｆ９と続く(Nortamo et al., 1988)。本発明者らはまた、β２インテグリン介在細胞接着を活性化し得るβ２鎖抗体 １Ｄ１０、２Ｆ３、および２Ｅ７を調べた。従って、３つの抗体は、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴへのＴＨＰ−１細胞接着を刺激する(データは示さず)。
【００５８】
白血球インテグリンαサブユニットに対する抗体での試験は、特に強い接着への阻害が、αＸサブユニット抗体３．９で得られることを示した。αＭサブユニット抗体 ＯＫＭ１０、ＭＥＭ１７０、および６０．１は、弱く阻害し、一方αＬ指向性抗体 ＴＳ１／２２、およびＴＳ２／４は、ほとんど効果を有さない。ＴＨＰ−１細胞は、αＸおよびαＭを発現するが、αＬは少しのみであり、抗体阻害プロフィールは、Ｐ１ ペプチド刺激 ＴＨＰ−１細胞の、フィブリノーゲンへの結合の阻害で得られるプロフィールに類似している(Li et al., 1995)。さらに、本発明者らは、αＸ抗体３．９およびαＭ抗体ＯＫＭ１０は、一緒に加えた場合に、相乗効果を有し、細胞接着の競合阻害を引き起こすことを見出した。
【００５９】
実施例４：ＬＬＧ−Ｃ４の活性へのシステイン結合の配置
ＬＬＧ−Ｃ４に存在する４個のシステインは、理論的に異なる方法でペアを組み得るが、我々はシステイン結合の配置が活性に影響を与えるかどうかを試験した。この目的のために、我々は、異なるジスルフィド配置で合成ペプチドを製造した。
【００６０】
ペプチドを、Ｆｍｏｃ化学を用いて、Applied Biosystems model 433A (Foster City, CA)で合成した。ジスルフィドは、１０ｍＭ 炭酸水素アンモニウム緩衝液(ｐＨ ９)中で、一晩酸化させることによって形成された。次に、ペプチドをＨＰＬＣによって、アセトニトリル濃度勾配で精製した。ジスルフィドの生成は、マス・スペクトル分析によって確認した。規定されたジスルフィド架橋を有するＣ(１−８；３−９)およびＣ(１−９；３−８)ペプチドは、Anaspec (San Jose, CA)によって、カスタム−メイドした。ＡＣＤＣＲＧＤＣＦＣＧ（ＲＧＤ−４Ｃ)ペプチド(Koivunen et al., 1995)は、Dr. E. Ruos-lahti (Burnham Institute, San Diego, CA)から得られた。
【００６１】
最も活性なペプチド Ｃ(１−８；３−９)は、Ｃ１とＣ８システインの間の１個のジスルフィド結合、およびＣ３およびＣ９システインの間の第２のジスルフィド結合を直接形成することによって得られる。ペプチド Ｃ(１−９；３−８)は、Ｃ１とＣ９システインの間、およびＣ３とＣ８システインの間にジスルフィド架橋を有した。細胞は、Ｃ(１−８；３−９) ジスルフィド含有ペプチドに結合したが、Ｃ(１−９；３−８) ジスルフィドを有するコンホーマーには結合しなかった(図２Ｃ)。Ｃ(１−８；３−９)ペプチドの、グルタルアルデヒドでの架橋は、明らかに多重結合のペプチドの よりよいコーティングのために、さらに細胞の結合を強めた。一方、Ｃ(１−９；３−８)の同様の処理は、細胞の結合を起こさなかった。一般的に、Ｃ(１−８；３−９)ペプチドは、β２インテグリン発現細胞株、例えばβ２インテグリンをトランスフェクトさせたＬ細胞、および白血球細胞株 THP-1、U937、およびジャーカット細胞の結合を助ける。αＸβ２をトランスフェクトさせたＬ細胞の、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴへの結合は、ＥＤＴＡおよびβ２インテグリン ブロック抗体 ７Ｅ４によって阻害された(図２Ｄ)。β２インテグリンを発現しない非白血球性細胞 L929、K562、SKOV-3、KS6717、および Eahy96 は、ホルボール エステルで前処理したかどうかにかかわらず、ペプチドまたはＧＧＬ−Ｃ４−ＧＳＴへの結合を示さない(データを示さず)。
【００６２】
実施例５：ＬＬＧ−Ｃ４ ノナペプチドによる、白血球細胞株のβ２インテグリン介在接着のブロック
ＬＬＧ含有ペプチドがＬＬＧトリペプチド配列を含む または含まない接着タンパク質に結合する能力を調べた。ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴへのＴＨＰ−１細胞接着は、Ｃ(１−８；３−９)ペプチドによって、ＩＣ５０が２０μＭで阻害された。別のコンホーマーであるＣ(１−９；３−８)は、Ｃ(１−８；３−９)より２０倍活性が低い。ＬＬＧトリペプチド配列がβ２インテグリンによる認識に十分であるかどうかを試験するために、本発明者らは、ジスルフィドで拘束された構造を誘発するために末端にシステインを含む最小のＣＬＬＧＣペプチドを製造した。コントロールペプチドにおいて、ロイシンはアラニンによって置換された。ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ基層を用いたＴＨＰ−１細胞接着試験は、ＣＡＡＧＣが、細胞接着の弱い競合剤であることを示した。一方、ＣＬＬＧＣは、１ｍＭまたはそれ以上の濃度で、細胞接着をたやすく阻害し、β２インテグリンによるＬＬＧモチーフの特異的な認識を示した(図３Ｂ)。
【００６３】
ＬＬＧ含有ペプチドが、ＬＬＧ配列を含む第１ Ｉｇ ドメインを含む、ＩＣＡＭ−１−Ｆｃ リコンビナント タンパク質への、ジャーカット細胞の αＬβ２インテグリン介在結合を阻害し得るかもまた調べた。ＩＣＡＭ−１−Ｆｃを、マイクロタイターウェル上に直接コートするか、またはタンパク質Ａを介して捕捉した。両方の場合において、ジャーカット細胞接着に対して、Ｃ(１−８；３−９)ペプチドによる濃度依存性阻害が見出され、ＩＣ５０は約８０μＭであった(図４Ａ)。Ｃ(１−９；３−８)コンホーマーは、数倍活性が低く、殆ど効果が無かった。Ｃ(１−８；３−９)ペプチドは、ＴＮＦ−αで処理することによってＩＣＡＭ−１を発現するよう刺激された、培養された表皮細胞への、新しく単離されたＴ細胞の結合を、同様に阻害した(図４Ｂ)。Ｔ細胞は、刺激されていない表皮細胞に結合しなかった。コントロールとして、ＲＧＤ含有ペプチド ＲＧＤ−Ｃ４は、表皮細胞のＩＣＡＭ−１へのＴ細胞の結合に対して効果が無かった。
【００６４】
フォン・ウィルブランド因子 およびタイプ IV コラーゲンは、ＬＬＧ様ペプチドモチーフを含むことから、新規の強力なβ２インテグリン・リガンドである。本発明者らは、ホルボール エステルで活性化されたＴＨＰ−１が、両方のタンパク質に強く結合することを見出した。β２インテグリン抗体 ７Ｅ４は、ＴＨＰ−１細胞のフォン・ウィルブランド因子への結合をブロックした(図５Ａ)。そして、カチオンキレート剤 ＥＤＴＡとほぼ同程度有効な阻害剤であった(データ示さず)。β３インテグリン抗体 ＬＭ６０９ および Ｐ２ は、効果がなかった。Ｃ(１−８；３−９)ペプチドは、ＴＨＰ−１細胞のフォン・ウィルブランド因子への結合の強力な阻害剤であった。ペプチドは、ＩＣ５０が約２０μＭで阻害した(図５Ｂ)。さらに、ＣＡＡＧＣでは見られなかったが、ＣＬＬＧＣペプチドは、５００μＭの濃度で阻害した(データ示さず)。同様に、Ｃ(１−８；３−９)ペプチド介在阻害が、フォン・ウィルブランド因子へのジャーカット細胞の結合において観測された(示さず)。タイプ IV コラーゲンへのＴＨＰ−１接着は、Ｃ(１−８；３−９)ペプチドによって、部分的に阻害された。ＩＣ５０は、約２００μＭであった。さらにＬＬＧペプチドの特異性を試験するために、我々は、幾つかのβ１インテグリンおよびβ３インテグリンの既知のリガンドである、ＴＨＰ−１のフィブロネクチンの接着を試験した。Ｃ(１−８；３−９)ペプチドは、ＴＨＰ−１細胞によるフィブロネクチンへの結合の著しい阻害を示さなかった。Ｃ(１−８；３−９)ペプチドはまた、フィブロネクチンもしくはフィブリノーゲンへの、HT 1080 繊維肉腫細胞の β１インテグリンおよびβ３インテグリン介在結合に対して効果がなかった(データ示さず)。
【００６５】
Ｃ(１−８；３−９)ペプチドは、ＬＬＧ配列を含まないフィブリノーゲンへのＴＨＰ−１接着を阻害し得る(図６Ａ)。より弱いＣ(１−９；３−８)コンホーマーは、フィブリノーゲン結合に対して効果がなかった。抗体阻害試験によると、ホルボール エステルで刺激されたＴＨＰ−１細胞の、フィブリノーゲンへの接着は、以前に報告されたように、αＭβ２インテグリンおよびαＸβ２インテグリンを介して、主として媒介される(Li et al., 1995)。Ｃ(１−８；３−９)は、αＭβ２インテグリンおよびαＸβ２インテグリンを発現する、U937 単球性白血病細胞への、β２インテグリン介在フィブリノーゲン結合を同様に阻害した(データ示さず)。ＲＧＤ依存性インテグリンはまた、フィブリノーゲンへの細胞接着を媒介し得るので、Ｃ(１−８；３−９)の活性を、幾つかのβ１インテグリンおよびβ３インテグリンの強力なリガンドである、ＲＧＤ−４Ｃの活性と比較した。低濃度のＣ(１−８；３−９) およびＲＧＤ−４Ｃペプチドを伴うＴＨＰ−１細胞は、前もって刺激され、β２およびＲＧＤ依存性インテグリンの両方を完全に活性化された。ペプチドを前もって刺激した後、ＲＧＤ−４Ｃは、フィブリノーゲンへのＴＨＰ−１細胞の接着を、Ｃ(１−８；３−９)よりも有効に阻害した(図６Ｂ)。Ｃ(１−８；３−９)およびＲＧＤ−４Ｃが、異なるインテグリンを標的とするかどうかを試験すｒために、ペプチドを共に細胞に加えた。Ｃ(１−８；３−９)およびＲＧＤ−４Ｃの効果は、相加的であり、ペプチドの組み合わせは、細胞接着を有効にブロックした。
【００６６】
実施例６：細胞遊走アッセイ
ＴＨＰ−１細胞の in vitro 遊走は、１０％血清を含み、細胞の接着性に邪魔にならない生理学的な条件に近い条件で調べた。孔のサイズが８μｍの Transwell filter の上部表面と下部表面の両方を、フィブリノーゲン、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ、またはＧＳＴで、４０μｇ／ｍｌの濃度で、４℃で一晩コートした。遊離の結合部位を５％ ＢＳＡ／ＴＢＳでインキュベートすることによってブロックした。ＴＨＰ−１細胞(１００μｌ中５×１０４個)を、１０％ ＦＣＳを含む溶媒中で、上部区画に置いた。Ｃ(１−８；３−９)またはＣ(１−９；３−８)ペプチドを、２００μＭの濃度で含む。下部区画を７５０μｌの１０％ ＦＣＳを含む溶媒で満たした。３７℃で１８時間培養した後、フィルターをメタノールに１５分間、水に１０分間、そして０．１％ トルイジン・ブルーに５分間漬けた。次にフィルターを、染色された細胞が透明になるまで、水で３−５回洗浄した。細胞を綿でぬぐって、フィルターの上部表面から除去し、下部表面に遊走した細胞を顕微鏡で、計数した。Student's t-test を、統計学的な分析に用いた。
【００６７】
１０％血清の存在下で、細胞は有効に遊走した。２００μＭの濃度のＣ(１−８；３−９)ペプチドは、細胞がフィルターの裏に遊走し、その下部表面に結合することを完全に阻害した(図６Ｃ)(ｐ＝０．００５；ｎ＝６)。Ｃ(１−９；３−８)コンホーマーは、Ｃ(１−８；３−９)よりも活性が低く、一部のみ阻害した(ｐ＝０．０１、ｎ＝６)。Ｃ(１−８；３−９)とＣ(１−９；３−８)のペプチドの間の活性の違いは、有意であった(ｐ＝０．００３)。細胞は、自発的にフィルターの８μｍの大きさの孔を通って下部チャンバーに落ちなかった。細胞の大多数は、１日培養した後も上部チャンバーに留まっていた。フィルターをＬＬＧ−Ｃ４でコートした逆転法において、細胞の遊走は、かなり増加した。コントロールＧＳＴ基層へと遊走した細胞よりも、約１０倍以上の細胞が、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ基層へ遊走した(図６Ｄ)。ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴへの細胞の遊走はまた、フィブロネクチンもしくはフィブリノーゲンのコーティングへの遊走よりも効果的であった。２００μＭの濃度でのＣ(１−８；３−９)は、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴへの細胞の遊走を、完全に抑制した(ｐ＝０．００２６、ｎ＝６)(データは示さず)。
【００６８】
実施例７：ペプチドのＮＭＲ分析
Ｃ(１−８；３−９)およびＣ(１−９；３−８)ペプチドを、ＮＭＲスペクトルによって分析し、ペプチドのコンホメーションにおいて、ジスルフィド結合の位置による違いがあるかどうかを決定した。測定のために、Ｃ(１−８；３−９)ペプチドを、１−３ｍＭの濃度で、ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ(９０／１０)に溶解し、そしてＣ(１−９；３−８)をＨ２Ｏに溶解した。異なる溶媒は、２つのペプチドの溶解性の違いによる。２次元スペクトルは、６００ＭＨｚと８００ＭＨｚの１Ｈ−周波数で操作したスペクトロメーターで得られ、Ｃ(１−８；３−９)において、１１４個の 核オーバーハウザー効果増強 (nOes) が識別され、Ｃ(１−９；３−８)において、８５個が識別された。０．２Å以上で拘束違反のない４０個の構造が、刺激されたアニーリング(ＤＹＡＮＡプログラム)によって得られた２００個の構造のファミリーから選択された。
【００６９】
それぞれのノナペプチドの構造決定は、正確に規定されたバックボーンのコンホメーションを与えた。主鎖原子のＲＭＳＤは、Ｃ(１−８；３−９)において、０．４±０．２Åであり、Ｃ(１−９；３−８)において、０．３±０．２Åであり、それぞれは４０個の構造の集団から計算された。両方のペプチドにおいて、主鎖の二面角φおよびψは、Ramachandran plot の領域が好ましく、また許容される。幾つかの核オーバーハウザー効果増強(nOes) のみが、側鎖の配向を定義し、従って、側鎖の二面角 F4、L5 および L6 が、特にばらつきがある(図７Ａ)。
【００７０】
ジスルフィドの幾つかの組み合わせは、ノナペプチドの構造にかなり影響を与える。Ｃ(１−８；３−９)ペプチドの“ジスルフィドの架橋の位置”は、Ｃ(１−９；３−８)ペプチドの“ジスルフィドの平行の位置”より、全体の構造を、よりきっちりと束縛する。これは、Ｃ(１−８；３−９)ペプチドで観測された nOes の数(１１４)が、Ｃ(１−９；３−８)で観測された数よりも大きいことによって反映される。Ｃ(１−９；３−８)における拘束に比べて、Ｃ(１−８；３−９)ペプチドにおける、より短い距離の拘束に対してバイアスがない。ジスルフィドの２-種類の組み合わせ方の結果として、構造の１つにのみ、中間基（interresiue）nOes が見出される。Ｃ(１−８；３−９)ペプチドにおいては３７、Ｃ(１−９；３−８)においては２０である。
【００７１】
Ｃ(１−８；３−９)ペプチドにおけるジスルフィドの交差配置は、位相的に、Ｃ(１−９；３−８)ペプチドにおける平行架橋より入り組んでいる。短いノナペプチドにおいて、van der Waals 半径が大きい硫黄原子を有する隣接のジスルフィドは、非常に大きな立体的な拘束を生じる。Ｐ２はまた、コンホメーションの自由を拘束し、一方Ｇ７は、コンホメーションの自由に寄与する。立体的な拘束における単なる位相の影響は、代表的な構造から明らかである(図７Ｂ)。Ｃ(１−８；３−９)ペプチドは、Ｃ(１−９；３−８)ペプチドよりコンパクトである。さらに、Ｃ(１−８；３−９)ペプチドにおいて、Ｐ２、Ｆ４、およびＬ５の脂肪族基からなる連続的な疎水性表面のパッチである。全体的に見て、Ｃ(１−８；３−９)ペプチドでは、ジスルフィド架橋およびＦ４−Ｌ６鎖が縮んでいるが、Ｃ(１−９；３−８)では、それらは伸びている。このことは、おそらく、Ｃ(１−８；３−９)ペプチドが水への溶解性が低いことを説明し、そしてそのより高い活性に寄与している。
【００７２】
（配列表フリーテキスト）
配列番号２において、位置２における変数aa、Xaaは、何れかのアミノ酸であり得、位置４における変数aa、Xaaは、何れかのアミノ酸であり得る。
【００７３】
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【図面の簡単な説明】
【００７９】
【図１Ａ】ＥＤＴＡ存在下もしくは非存在下のＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴノナペプチドのβ２白血球インテグリンへの結合およびＧＳＴの結合の比較。
【図１Ｂ】精製αＭサブユニット Ｉ−ドメインに対するＬＬＧ−Ｃ４ＧＳＴまたはＧＳＴの結合におけるＧＳＴ濃度依存性。
【図１Ｃ】ＥＤＴＡまたはＬＬＧ−Ｃ４(１)ペプチドまたは不活性なＬＬＧ−Ｃ４(２)の 存在下もしくは非存在下での、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴのＩ−ドメインへの結合。
【図２Ａ】固定されたＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴによるβ２インテグリン指向性細胞接着の促進、およびそのＥＤＴＡによる阻害。
【図２Ｂ】抗体β１、β２、β３、αＬ、αＭ、またはαＸインテグリンに対する抗体と混合したＴＨＰ−１細胞の、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴへの細胞接着。
【図２Ｃ】Ｃ(１−８；３−９)ペプチドとＣ(１−９；３−８)ペプチドへの、グルタルアルデヒドの存在下もしくは非存在下での細胞接着。
【図２Ｄ】αＸβ２インテグリンをトランスフェクトさせたＬ細胞の、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴもしくはＧＳＴへの細胞接着。
【図３Ａ】Ｃ(１−８；３−９)とＣ(１−９；３−８)ペプチドの活性の比較。
【図３Ｂ】Ｃ(１−８；３−９)、ＣＬＬＧＣ、またはＣＡＡＧＣペプチドの存在下もしくは非存在下での、ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴへのＴＨＰ−１細胞接着。
【図４Ａ】ＬＬＧ−Ｃ４ペプチドによるＩＣＡＭ−１への白血球細胞接着の阻害。
【図４Ｂ】ＲＧＤ−Ｃ４またはＬＬＧ−Ｃ４存在下での、ＴＮＦ−αで刺激した Eahy 表皮細胞層への、Ｔ細胞の細胞接着。
【図５Ａ】β２、αＶβ３、またはαIIbβ３インテグリンに対する抗体(それぞれ７Ｅ４、ＬＭ ６０９、またはＰ２)存在下での、フォン・ウィルブランド因子へのＴＨＰ−１細胞接着。
【図５Ｂ】Ｃ(１−８；３−９)存在下での、ＴＨＰ−１細胞のフォン・ウィルブランド因子、タイプ IV コラーゲン、またはフィブロネクチンへの結合。
【図６Ａ】フィブロネクチン基層上のＴＨＰ−１細胞の接着および遊走における、合成ＬＬＧ−Ｃ４ペプチドによる阻害。
【図６Ｂ】フィブロネクチン基層上の、ホルボール エステルおよびＲＧＤ−４Ｃで刺激されたＴＨＰ−１細胞の 接着および遊走における、合成ＬＬＧ−Ｃ４ペプチドによる阻害。
【図６Ｃ】Ｃ(１−８；３−９)またはＣ(１−９；３−８)ペプチド存在下での、フィブリノーゲンでコートしたフィルターにおける、ＴＨＰ−１細胞の遊走。
【図６Ｄ】ＬＬＧ−Ｃ４−ＧＳＴ、ＧＳＴ、フィブリノーゲン、またはＢＳＡでコートしたフィルターにおける、ＴＨＰ−１細胞の遊走。
【図７Ａ】ＮＭＲによるＣ(１−８；３−９)ペプチドとＣ(１−９；３−８)ペプチドの構造の比較。
【図７Ｂ】Ｃ(１−８；３−９)ペプチドとＣ(１−９；３−８)ペプチドの溶液での構造の立体図の比較。
【配列表フリーテキスト】
【００８０】
配列番号２において、位置２における変数aa、Xaaは、何れかのアミノ酸であり得、位置４における変数aa、Xaaは、何れかのアミノ酸であり得る。
【図１Ａ】
2004536041.tif 000004
【図１Ｂ】
2004536041.tif 000005
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
2004536041.tif 000007
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
2004536041.tif 000009
【図２Ｄ】
2004536041.tif 000010
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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