(57)【要約】骨髄細胞（ＢＭＣ）と脱灰骨基質（ＤＢＭ）及び／又は石灰化骨基質（ＭＢＭ）とを含み、そして任意選択で骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）を含み、骨髄腔内又は骨外性部位内への骨髄移植において特に使用される組成物、並びにその移植／埋込み方法。本発明の組成物及び方法は、移植されたＢＭＣから生じる造血微小環境の形成を回復及び／又は強化させることができ、そして幹細胞及び／又はその生成物の欠乏症、異常な幹細胞及び／又は生成物をもたらす遺伝的状態、悪性起源又は非悪性起源の造血障害などの様々な造血障害の処置において有用である。本発明の組成物及び方法はまた、移植片寛容性を誘導させるために、すなわち、移植片対宿主疾患を防止するために使用することができる。本発明の組成物及び方法は、造血を維持及び調節する間質微小環境に一次的又は二次的に影響を及ぼす疾患を処置するために適用できることは非常に重要である。さらに、ＢＭＣをＤＢＭ及び／又はＭＢＭとの混合で哺乳動物に移植するためのキットが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨髄細胞（ＢＭＣ）と脱灰骨基質（ＤＢＭ）及び／又は石灰化骨基質（ＭＢＭ）とを含む組成物。
【請求項２】
哺乳動物への骨髄移植のために使用される、ＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭとを含む組成物。
【請求項３】
哺乳動物への骨髄移植のために使用される、ＢＭＣとＤＢＭとを含む組成物。
【請求項４】
移植が骨外性部位内である請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
骨外性部位が、腎臓被膜、筋肉、肝臓、腹腔壁からなる群から選択される請求項４記載の組成物。
【請求項６】
移植が骨髄腔内である請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項７】
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）をさらに含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
ＤＢＭ及び／又はＭＢＭが脊椎動物起源である請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
ＤＢＭ及び／又はＭＢＭがヒト起源である請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
ＤＢＭ及び／又はＭＢＭが粉末形態である請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＤＢＭの粒子サイズが約５０μ〜２５００μである請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
ＤＢＭの粒子サイズが約２５０μ〜５００μである請求項１１記載の組成物。
【請求項１３】
ＢＭＣとＤＢＭとの比率が０．５部のＤＢＭに対して１０部のＢＭＣ濃縮物（体積／体積）である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
ＢＭＣとＤＢＭとの比率が１部のＤＢＭに対して４部のＢＭＣ濃縮物（体積／体積）である請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記哺乳動物がヒトである請求項２〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
移植されたＢＭＣから生じる造血微小環境を発達させるために骨外性部位内に移植される請求項２〜５及び７〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
移植されたＢＭＣから生じる造血微小環境の形成を回復及び／又は強化するために骨髄腔内に移植される請求項２、３及び６〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
造血障害に罹患している患者の処置に使用される請求項１〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記造血障害が、幹細胞及び／又はその生成物の欠乏症、異常な幹細胞及び／又は生成物をもたらす遺伝的状態、悪性起源又は非悪性起源の造血障害、先天性又は遺伝性の骨障害、骨感染症、骨形成不全症、ムコ多糖症、ムコリピドーシス、並びに骨の非新生物性障害から選択される請求項１８記載の組成物。
【請求項２０】
哺乳動物に移植される骨髄移植片としての、ＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭとを含む組成物の使用。
【請求項２１】
移植が、患者の腎臓被膜、筋肉、肝臓及び腹腔壁からなる群から好ましくは選択される骨外性部位の中である請求項２０記載の使用。
【請求項２２】
移植部位が、混合キメラ現象の状態を確立することによる寛容性誘導のために作製された同種移植片又は異種移植片又はヘテロ移植片の中である請求項２１記載の使用。
【請求項２３】
移植が骨髄腔内である請求項２２記載の使用。
【請求項２４】
前記組成物がＢＭＰをさらに含む請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２５】
ＤＢＭ及び／又はＭＢＭが脊椎動物起源である請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２６】
ＤＢＭ及び／又はＭＢＭがヒト起源である請求項２５記載の使用。
【請求項２７】
ＤＢＭ及び／又はＭＢＭが粉末形態である請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
ＤＢＭの粒子サイズが約５０μ〜２５００μである請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
ＤＢＭの粒子サイズが約２５０μ〜５００μである請求項２８記載の使用。
【請求項３０】
ＢＭＣとＤＢＭとの比率が０．５部のＤＢＭに対して１０部のＢＭＣ濃縮物（体積／体積）である請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
ＢＭＣとＤＢＭとの比率が１部のＤＢＭに対して４部のＢＭＣ濃縮物（体積／体積）である請求項３０記載の使用。
【請求項３２】
前記哺乳動物がヒトである請求項２０〜３１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
前記骨外性移植が、移植されたＢＭＣから生じる造血微小環境を発達させるためのものである請求項２０〜２２及び２４〜３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３４】
前記骨髄腔内移植が、移植されたＢＭＣから生じる造血微小環境の形成を回復及び／又は強化するためのものである請求項２３〜３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
造血障害に罹患している患者を処置するための請求項２０〜３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
前記造血障害が、幹細胞及び／又はその生成物の欠乏症、異常な幹細胞及び／又は生成物をもたらす遺伝的状態、悪性起源の造血障害、先天性又は遺伝性の骨障害、骨感染症、骨形成不全症、ムコ多糖症、ムコリピドーシス、並びに骨の非新生物性障害から選択される請求項３５記載の使用。
【請求項３７】
造血障害を処置するための骨髄移植片を調製することにおける、ＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭとの混合物の使用。
【請求項３８】
前記混合物がＢＭＰをさらに含んでいてもよい請求項３７記載の使用。
【請求項３９】
前記造血障害が、幹細胞及び／又はその生成物の欠乏症、異常な幹細胞及び／又は生成物をもたらす遺伝的状態、並びに悪性起源の造血障害から選択される請求項３８記載の使用。
【請求項４０】
ＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭとの混合物を前記哺乳動物に導入することを含む、ＢＭＣをＤＢＭ及び／又はＭＢＭとの混合で哺乳動物に移植／埋込みするための方法であって、前記混合物が薬学的に許容されるキャリア及び／又は希釈剤をさらに含んでいてもよい方法。
【請求項４１】
前記混合物が、正常な組織膜内及び／又は栄養物、サイトカイン及び細胞の浸透を可能にし、並びにＤＢＭ粒子及び／又はＭＢＭ粒子がその中に保持される選択的な生体適合性膜内にカプセル化されていてもよい請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記混合物が前記哺乳動物の骨外性部位内に導入される請求項４１記載の移植方法。
【請求項４３】
前記混合物が前記哺乳動物の骨髄腔内に導入される請求項４１記載の移植方法。
【請求項４４】
前記混合物がＢＭＰをさらに含む請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の移植方法。
【請求項４５】
骨髄移植が必要とされる、造血障害、並びに／或いは骨髄の奇形及び／又は悪性腫瘍及び／又は機能不全に関連する障害を、そのような障害の処置を必要とする哺乳動物に対して処置する、ＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭとの混合物を前記哺乳動物の骨髄腔又は骨外性部位の中に投与することを含む方法であって、前記混合物が、薬学的に許容されるキャリア及び／又は希釈剤をさらに含んでいてもよい方法。
【請求項４６】
前記混合物がＢＭＰをさらに含んでいてもよい請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
幹細胞懸濁物を好ましくは静脈内注入によって前記患者に投与することをさらに含む請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＢＭＣが同種であるか、又は前記哺乳動物自身のものである請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ＢＭＣをＤＢＭ及び／又はＭＢＭとの混合で哺乳動物に移植するためのキットであって、
ａ．圧縮された形態にあるＤＢＭ及び／又はＭＢＭ；
ｂ．ＢＭ吸引ニードル；
ｃ．骨内骨穿孔用バー；
ｄ．骨髄−ＤＢＭ又は骨髄−ＭＢＭの粘性混合物を注入するための肉厚内腔ニードル；
ｅ．ＢＭＣ−ＤＢＭ又はＢＭＣ−ＭＢＭを希釈剤と同時に混合するための二方内腔コネクター；
ｆ．ＢＭＣを維持するための培地、
を含み、及び
ｇ．ＢＭＣを、又はＤＢＭと一緒にＢＭＣを取扱い、及び維持するための低温手段、
を含んでいてもよいキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨髄細胞（ＢＭＣ）と脱灰骨基質及び／又は石灰化骨基質（それぞれ、ＤＢＭ及びＭＢＭ）とを含む組成物、並びに骨髄移植におけるその新規な使用に関する。本発明の組成物は、間質微小環境を回復させること、造血を維持すること、そして造血組織を発達させることにおいて特に効果的であると考えられる。
【背景技術】
【０００２】
造血系の発達及び機能が間質起源のその微小環境によって維持され、かつ調節されていることが広く知られている（出生後、造血は骨格骨に完全に限定される）［Ｄｏｒｓｈｋｉｎｄ，Ｋ．（１９９０）、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、８：１１１；Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ｓ．Ａ．（１９８１）、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ、９：３０３；Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．Ｒ．（１９９０）、Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ、６３：３７１〜３８０］。
【０００３】
正常な骨髄機能は、正常な造血幹細胞及びその微小環境（これらはほとんどが骨の髄質部に存在する）が同時に存在することに依存する。幹細胞は、十分な微小環境がない場合には正しく機能することができない。幹細胞の不足又は異常な幹細胞によって引き起こされる悪性又は非悪性の血液学的疾患では、幹細胞移植が、治癒をもたらす最良の処置であるのに対して、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄線維症、及び異常な微小環境に関連する他の状態などの疾患では、細胞遺伝学的な異常を全くを認めることができない明らかに正常な造血細胞が存在するにもかかわらず、汎血球減少症が生じることがある。実際、そのような患者では、不応性貧血の正常化がときには自家骨髄移植後に達成され得るが、成功率は、他の血液学的悪性腫瘍における移植組織の結果と比較してかなり悪い。過剰な芽球を伴うＭＤＳ（これはまた芽球過剰性不応性貧血（ＲＡＥＢ）として知られている）、芽球の形質変換を伴うＭＤＳ（ＲＡＥＢ−Ｔ）、又は完全に顕性化した白血病（ｏｖｅｒｔ  ｌｕｋｅｍｉａ）を伴うＭＤＳでは、疾患は、通常、悪性の骨髄幹細胞と異常な骨髄微小環境との組合せによって引き起こされる。ＭＤＳ患者における生着及び無疾患生存に関する成功率は、急性白血病及び慢性白血病の患者において認められる成功率よりも低い。この理由としては、適正な生着及び正常な骨髄機能のためには、幹細胞だけを置換しても不十分であるかもしれないということが最も考えられる。理論的には、異常な幹細胞を置換し、かつ新しい微小環境を提供することによって、骨髄移植（ＢＭＴ）の結果は改善することができると考えられる。
【０００４】
同種ＢＭＴでは、健康なドナーから得られた同種骨髄幹細胞を、必要としている患者に移入することが伴う。ＢＭＴ後、患者の骨及び造血領域はドナーの細胞で再構成され、赤血球、血小板、有核細胞を含む造血系全体、循環性及び組織結合型細網内皮系並びに免疫系全体がドナー起源のものに変換される［Ｓｌａｖｉｎ  Ｓ．及びＮａｇｌｅｒ  Ａ．（１９９１）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ、３（２）：２５４〜７１］。ＢＭＴは、骨髄生成物のいずれかにおける不全症を含む非常に多くの造血障害を処置及び正常化するために、異常な幹細胞の置換を必要とする場合に、そして非常に多くの遺伝的障害に広範囲に適用することができる［Ｂｕｃｋｌｅｙ  Ｒ．Ｈ．（１９９３）他、Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、３０（４、増刊４）：９２〜１０１；Ｂｒｏｃｈｓｔｅｉｎ  Ｊ．Ａ．（１９９２）、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｈｕｎｔｉｎｇｔ）、６（３）：５１〜８；考察５８、６３〜６］。あるいは、ＢＭＴは、ガン治療のために、そして骨髄破壊性化学放射線療法を受けている患者の救剤のために広く使用されている［Ｓｌａｖｉｎ  Ｓ．及びＮａｇｌｅｒ  Ａ．（１９９１）、上掲］。ＢＭＴには多くのさらなる潜在的な適用がある。例えば、臓器移植における移植寛容性の誘導［Ｓｙｋｅｓ  Ｍ．及びＳａｃｋｓ  Ｄ．Ｈ．（１９９０）、Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２：４０１〜４１７］などがあり、そしてドナーリンパ球の注入に関連する免疫療法に対する基盤としての適用［Ｃｈａｍｐｌｉｎ  Ｒ．（１９９１）、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ、２３（４）：２１２３〜７；Ｂｒｅｎｎｅｒ  Ｍ．Ｋ．及びＨｅｓｌｏｐ  Ｈ．Ｅ．（１９９１）、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌ、４（３）：７２７〜４９；Ｓｌａｖｉｎ  Ｓ．他（１９９１）、Ｂａｉｌｌｉｅｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｈａｅｍａｔｏｌ、４（３）：７１５〜２５］がある。骨髄破壊性前処置後、宿主の免疫造血系のすべてをドナータイプの細胞で置換するためにＢＭＴを使用することができる。あるいは、非骨髄破壊性前処置の後、混合キメラ現象を誘導するために宿主の造血と併存してドナー造血の永続した生着を達成するよう、ＢＭＴの役割を向かわせることができる。
【０００５】
残念なことに、ＢＭＴの適用性は、下記のようないくつかの制約によって制限されている：
１．ＢＭＴが適応される特定の血液学的疾患はまた、骨髄の微小環境にも影響を及ぼすことがあり、したがって、幹細胞移植だけでは、完全な血液学的回復を得るためには不十分なことがある［Ｅｎｒｉｇｈｔ  Ｈ．及びＭｃＧｌａｖｅ  Ｐ．Ｂ．（１９９５）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、２（４）：２９３〜９；Ｋｏｉｊｉｍａ  Ｓ．（１９９８）、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ、６８（１）：１９〜２８；Ｇｉｄａｌｉ  Ｊ．他（１９９６）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、１４（５）：５７７〜５８３］。
【０００６】
２．同種骨髄細胞（ＢＭＣ）（特に、純化された幹細胞又はＴ細胞除去幹細胞）の効率的な安定した生着には、得ることが困難であり得るか、又は得ることさえできない、非常に多くの幹細胞（例えば、細胞数が限られている臍帯血幹細胞、小児から成人への輸血、など）の移入を必要とする［Ｒｅｉｓｎｅｒ  Ｙ．及びＭａｒｔｅｌｌｉ  Ｍ．Ｆ．（１９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ、１６：４３７；Ｒｏｗｅ  Ｊ．Ｍ．他（１９９４）、Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ、１２０（２）：１４３〜５８］。
【０００７】
３．造血障害の患者における幹細胞の生着、特に、放射線照射又は化学療法による強制的な前処置の後に処置される患者における幹細胞の生着は、造血微小環境が損傷しているために、効率がかなり低い［Ｅｎｒｉｇｈｔ  Ｈ．及びＭｃＧｌａｖｅ  Ｐ．Ｂ．（１９９５）、上掲；Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ  Ｅ．他（１９９５）、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１５：２０７］。
【０００８】
４．血液学的障害の患者において今日まで適用されているような同種ＢＭＴは、多くの場合、手法に関連した毒性、生着不良、及び移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）をもたらす抗宿主反応によって複雑化している［Ｌａｚａｒｕｓ  Ｈ．Ｍ．他（１９９７）、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１９：５７７；Ｑｕｉｎｏｎｅｓ  Ｒ．Ｒ．（１９９３）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ／Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、１５（１）：３〜１７］。
【０００９】
上記の制約を考慮して、本発明の主要な目的の１つは、造血微小環境が損傷しているレシピエントにおけるＢＭＣの改善された生着である。本発明者らが最近明らかにしたように、ドナーの造血微小環境の中におけるＢＭＣの移植はＧＶＨＤの発生率を低下させた［Ｇｕｒｅｖｉｔｃｈ  Ｏ．Ａ．他（１９９９）、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、６８：１３６２〜１３６８］。したがって、ＧＶＨＤを処置するために免疫抑制剤を使用することによる手法関連毒性が同種ＢＭＴに伴うとき、合併症を避けることができる。さらに、移植手法の改善により、移植のために必要とされるＢＭＣの数の削減がもたらされた。
【００１０】
本発明者らは、脱灰した骨基質又は歯基質を異所的に移植した後、マウスにおいて発達した誘導された骨及び造血微小環境が、骨格骨の主な性質を示すことを以前に明らかにしている［Ｇｕｒｅｖｉｔｃｈ  Ｏ．Ａ．（１９９０）、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｃｌｏｎ．８：１３０〜１３７；Ｇｕｒｅｖｉｔｃｈ  Ｏ．Ａ．及びＦａｂｉａｎ  Ｉ．（１９９３）、Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、１１：５６〜６１］。下記の観測結果が得られた：
ａ．誘導された骨における造血微小環境は、完全に発達した３系統の造血を持続させることができる。
ｂ．誘導された骨における造血微小環境は、脾臓におけるコロニー形成単位（ＣＦＵ−Ｓ）によって最も良く表すことができるように、造血幹細胞の増殖能力を維持することができる。
ｃ．ｄｅ  ｎｏｖｏで誘導された造血微小環境は、何らかの外部からの補充物をさらに加えることなく、長期間の維持及びリモデリング及び自己更新が可能である。一旦発達すると、誘導された骨は、機能的に活性な造血領域を有する異所的な位置における永続的な構造体になる。
【００１１】
これらの観察結果は、造血微小環境の誘導が、造血を強化するためだけでなく、間質障害及び造血障害を正常化するための有望な方法であり得ることを示唆している。
【００１２】
移植されたＢＭＣの生着は、造血細胞が骨移植片と一緒に移入されたとき［Ｉｓｈｉｄａ  Ｔ．他（１９９４）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５２：３１１９〜３１２７；Ｈｉｓｈａ  Ｈ．他（１９９５）、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ、２３：３４７〜３５２；Ｓａｎｄｈｕ  Ｊ．Ｓ．他（１９９６）、Ｂｌｏｏｄ、８８（６）：１９７３〜１９８２；Ｎａｋａｇａｗａ  Ｔ．他（１９９３）、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ、３６：２６３〜２６８］、又は造血細胞がドナー起源の間質細胞の注射と一緒に移入されたとき［Ｌａｚａｒｕｓ，Ｈ．Ｍ．他（１９９５）、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、１６：５５７〜５６４；Ｅｌ−Ｂａｄｒｉ，Ｎ．Ｓ．他（１９９８）、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ、２６：１１０〜１１６］に改善される。１９９９年に、本発明者らは、造血ＢＭＣがそれら自身の造血微小環境の中に移入された場合、ＧＶＨＤが抑制されることを示している［Ｇｕｒｅｖｉｔｃｈ  Ｏ．Ａ．（１９９９）、上掲］。同種骨髄は、造血幹細胞のみが生着することができる単一細胞懸濁物の通常の形態においてではなく、ドナーマウスの大腿骨骨髄腔から取り出された乱されていない骨髄栓子の形態で移植した。ドナーの骨髄栓子はレピシエントの腎臓被膜下に置いた。ほとんど臨床的には適用することができないこのケースでは、乱されていない多細胞構造体の形態にある移植組織に存在する間葉性細胞により、移植された造血細胞に対する異所性（骨外性）の微小環境が、同じ骨髄栓子の中にもたらされる。
【００１３】
しかし、骨の骨芽細胞又は骨髄栓子の移植は、多くの技術的制約のために、臨床的実施においては未だ広く受け入れられていない。
【００１４】
現行のＢＭＣ移植法のすべてに対する１つの大きな欠点は、造血細胞と、造血を維持させる間質微小環境との両方を同時に移入することができないということである。血液学的操作において現在使用されているＢＭＣ移植法では、実際、ドナーから得られた造血細胞のみがレピシエントにおいて生着しているだけである。
【００１５】
ＢＭＣは、造血細胞と、誘導された骨生成が可能である間葉性幹細胞との両方の供給源を提供し得るという考えに基づいて、本発明者らは、ドナーＢＭＣ移植組織から生じる造血組織及び間質組織を同時に発達させることを可能にする、ＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭ（間葉性前駆細胞の骨生成発達を刺激し、かつ維持する物質）とを含む組成物の移植を提案する。
【００１６】
より詳細には、（ＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭとを含む）本発明の組成物は、レピシエントの骨髄腔内又は骨外性的に直接移植され、これにより、造血を持続させる間質微小環境と、同じ移植されたＢＭＣ懸濁物に由来する造血組織とのｄｅ  ｎｏｖｏ形成がもたらされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、本発明の主要な目的の１つは、例えば、血液学的障害に罹患している患者のような、そのような処置を必要としている患者への移植のために使用される、骨髄細胞と脱灰骨基質又は石灰化骨基質との混合物である。
【００１８】
本発明のこれらの目的及び他の目的は、本説明を読んだときに明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、骨髄細胞（ＢＭＣ）と脱灰骨基質及び／又は石灰化骨基質（それぞれ、ＤＢＭ及びＭＢＭ）とを含む組成物、並びに骨髄移植におけるその新規な使用に関する。
【００２０】
したがって、第１の態様において、本発明は、ＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭとを含む組成物に関する。
【００２１】
別の態様において、ＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭとを含む前記組成物は、ヒトであってもよい哺乳動物への骨髄移植（ＢＭＴ）のために使用されるためのものである。好ましくは、本発明の組成物は、哺乳動物（好ましくはヒト）へのＢＭＴのために使用されるＢＭＣとＤＢＭとを含む。
【００２２】
本発明の組成物の移植部位は骨髄腔であり得る。あるいは、前記移植部位は、患者の腎臓被膜下空間、筋肉、腹腔壁、並びに寛容性誘導のための同種移植片の腎臓又は肝臓又は心臓被膜からなる群から選択される骨外性部位であり得る。
【００２３】
別の実施形態において、本発明の組成物は骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）をさらに含む。
【００２４】
さらに別の実施形態において、本発明の組成物に含まれるＤＢＭ及び／又はＭＢＭは脊椎動物起源であり、そしてヒト起源であってもよい。
【００２５】
さらなる実施形態において、本発明の組成物に由来するＤＢＭ及び／又はＭＢＭは粉末形態又は薄片形態である。本発明の組成物において使用されるＤＢＭは、粒子サイズが約５０μ〜２５００μであり得る。好ましくは、ＤＢＭの粒子サイズは約２５０μ〜５００μである。
【００２６】
本発明の組成物に含まれるＢＭＣとＤＢＭとの比率は、０．５部のＤＢＭに対して１０部のＢＭＣ濃縮物（体積／体積）であり、好ましくは、１部のＤＢＭに対して４部のＢＭＣ濃縮物（体積／体積）である。
【００２７】
さらにさらなる実施形態において、本発明の組成物は、移植されたＢＭＣから生じる造血微小環境の形成を回復及び／又は強化させるために骨髄腔内に移植されるためのものである。さらに、本発明の組成物は、移植されたＢＭＣから生じる造血微小環境の形成を発達させるために骨外性部位内に移植されるためのものである。新しく形成された造血微小環境が、移植されたＢＭＣ懸濁物に存在する間葉性前駆細胞の分化から生じる。
【００２８】
したがって、さらなる実施形態において、本発明の組成物は、幹細胞及び／又はその生成物の欠乏症、異常な幹細胞及び／又は生成物をもたらす遺伝的状態、悪性起源の造血障害、並びに、骨構造及び／又は骨組成のいずれか（すなわち、造血を維持及び調節する間質微小環境）に主に影響を及ぼす疾患、骨形成不全症、ムコ多糖症及びムコリピドーシスから選択される血液学的障害に罹患している患者の処置に使用されるためのものである。
【００２９】
別の態様において、本発明は、ＢＭＣをＤＢＭ及び／又はＭＢＭとの混合で哺乳動物に移植／埋込みするための方法に関する。この場合、この方法は、ＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭとの混合物を前記哺乳動物に導入することを含み、前混合物は任意選択で薬学的に許容されるキャリア及び／又は希釈剤をさらに含む。
【００３０】
１つの実施形態において、本発明の混合物は、任意選択で、正常な組織膜内及び／又は栄養物、サイトカイン及び細胞の浸透を可能にし、かつＤＢＭ粒子及び／又はＭＢＭ粒子がその中に保持される選択的な生体適合性膜内にカプセル化される。
【００３１】
別の実施形態において、前記混合物は、前記哺乳動物の骨髄腔内及び／又は前記哺乳動物の骨外性部位内に導入される。骨外性の移植部位は、腎臓被膜、筋肉、肝臓、腹腔壁及び血管からなる群から選択される。
【００３２】
さらにさらなる実施形態において、本発明の移植方法において使用される混合物はＢＭＰをさらに含む。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、骨髄移植が必要とされる、造血障害、並びに／或いは骨髄の奇形及び／又は悪性腫瘍及び／又は機能不全に関連する障害を、そのような障害の処置を必要とする哺乳動物に対して、処置する方法に関する。前記本発明の方法は、ＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭとの混合物を前記哺乳動物の骨髄腔又は骨外性部位の中に投与することを含み、前記混合物は任意選択で薬学的に許容されるキャリア及び／又は希釈剤をさらに含む。
【００３４】
１つの実施形態において、本発明の前記方法において使用される前記混合物は、任意選択でＢＭＰをさらに含む。
【００３５】
別の実施形態において、本発明の前記方法は、好ましくは静脈内注入及び骨内注入との組合せで、微小環境の発達を高めるＢＭＰ及び／又は他の因子（例えば、造血性増殖因子など）とともに、或いはそれらを用いることなく、前記患者に幹細胞懸濁物を投与することをさらに含む。
【００３６】
さらに別の実施形態において、本発明の前記方法において使用されるＢＭＣは同種であるか、又は前記哺乳動物自身のものである。
【００３７】
さらにさらなる実施形態において、本発明の前記方法において使用されるＤＢＭ又はＭＢＭは、それぞれ、脱灰骨薄片及び／又は石灰化骨薄片を含む。
【００３８】
本発明の最後の態様は、ＢＭＣをＤＢＭ及び／又はＭＢＭとの混合で哺乳動物に移植するためのキットに関する。このキットは、
（ａ）圧縮された形態にあるＤＢＭ及び／又はＭＢＭ；
（ｂ）ＢＭ吸引ニードル；
（ｃ）骨内骨穿孔用バー；
（ｄ）骨髄−ＤＢＭの粘性混合物を注入するための肉厚内腔ニードル；
（ｅ）ＢＭＣ及びＤＢＭを同時に混合するための二方内腔コネクター；
（ｆ）混合物を希釈するための希釈剤；
（ｇ）ＢＭＣを維持するための培地；そして任意選択で、
（ｈ）ＢＭＣを、又はＤＢＭと一緒にＢＭＣを取扱い、かつ維持するための低温手段、
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
下記の略号が本明細書中を通して用いられる：
・ＢＭ：骨髄
・ＢＭＣ：骨髄細胞
・ＢＭＰ：骨形態形成タンパク質
・ＢＭＴ：骨髄移植
・ＣＦＵ−Ｓ：脾臓コロニー形成単位
・ＤＢＭ：脱灰骨基質
・ＧＶＨＤ：移植片対宿主疾患
・ＨＶＧＤ：宿主対移植片疾患
・ＬＣＭ：レーザー捕捉顕微解剖
・ＭＢＭ：石灰化骨基質
・ＭＤＳ：骨髄異形成症候群
・ＲＡＥＢ：芽球過剰性不応性貧血（ＭＤＳの１つのタイプ）
・ＲＡＥＢ−Ｔ：芽球の形質変換を伴う不応性貧血
【００４０】
骨髄移植法を改善する研究において、本発明者らは、ＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭとを含む組成物を使用することにより、同じドナーから生じる造血組織及び間質組織（造血微小環境を含む）が同時に発達することを見出した。さらに、同種骨髄移植におけるＢＭＣ−ＤＢＭ混合物のさらなる利点は、同種造血幹細胞の生着と、同じドナーに由来する間質前駆体細胞から生じる間質微小環境を同時に発達させることによって維持される造血の再構成とを促進することにある。
【００４１】
本発明者らの研究成果の結果として、本発明者らは、骨髄細胞（ＢＭＣ）と脱灰骨基質及び／又は石灰化骨基質（それぞれ、ＤＢＭ及びＭＢＭ）との混合物を含む組成物、及び骨髄移植におけるその新規な使用に関する本発明に到達した。
【００４２】
したがって、第１の態様において、本発明は、骨髄細胞（ＢＭＣ）と脱灰骨基質（ＤＢＭ）及び／又は石灰化骨基質（ＭＢＭ）とを含み、任意選択で薬学的に許容されるキャリア及び／又は希釈剤をさらに含む組成物に関する。
【００４３】
本発明の組成物において、ＤＢＭ及びＭＢＭは、組み合わせて又は別々に使用することができる。ＢＭＣを、ＤＢＭではなく、ＭＢＭと組み合わせて使用する実験（図１）において、本発明者らは、２つの骨基質の間の大きな違いが、ＭＢＭを用いた場合の遅れた骨形成であることを認めた。これらの２つ（ＤＢＭ及びＭＢＭ）の混合物をＢＭＣと一緒に移植することにより、両者の利点を組み合わせることができるはずであり、すなわち、（早く作用するＤＢＭと、遅れて使用するＭＢＭとを用いて）骨生成活性の期間を著しく延ばすことができるはずである。また、ＭＢＭ粒子は、ＤＢＭ粒子と比較したとき、はるかに高密度で、硬いので、ＭＢＭの混合物は、新しい組織が形成されている期間を通してインプラントの形状保持が必要とされるときには有用であり得る。したがって、ＢＭＣ：ＭＢＭの比率及びＢＭＣ：ＤＢＭ：ＭＢＭの比率は特定の必要性に依存する。
【００４４】
さらなる実施形態において、本発明の組成物に由来するＤＢＭ及び／又はＭＢＭは粉末形態又は薄片形態である。本発明の組成物において使用されるＤＢＭは、粒子サイズが約５０μ〜２５００μであり得る。好ましくは、ＤＢＭの粒子サイズは約２５０μ〜５００μである。
【００４５】
それにもかかわらず、ＤＢＭは、ＤＢＭを間葉性前駆細胞に対する優れたキャリアにするために必要とされる特徴のすべてを合わせ持つその好都合な能力を考慮すると、本発明の組成物における好ましい成分である。
【００４６】
１．ＤＢＭは、間葉性前駆細胞の生着並びにその増殖及び分化のために不可欠な、伝導性の足場を形成する様々な性質を示す。
２．さらに、ＤＢＭは、造血環境の発達を刺激することにおいて活性である様々なＢＭＰ（骨形態形成タンパク質）の天然の供給源であり、したがって誘導性の機能をも果たす。
３．ＤＢＭは、異種移植片として使用されたときには非常に低い免疫原性を有し、同種の組合せで使用されたときには免疫原性を全く有しない。
４．ＤＢＭは、大きな外科的介入を伴うことなく、局所的に、好ましくは骨内に注射することができる非晶質粉末として得ることができる。
【００４７】
本発明の組成物に含まれるＢＭＣとＤＢＭとの比率は、０．５部のＤＢＭに対して１０部のＢＭＣ濃縮物（体積／体積）であり得るが、好ましくは、１部のＤＢＭに対して５部のＢＭＣ濃縮物（体積／体積）である。本発明者らは、最も好ましくは、前記比率が１部のＤＢＭに対して４部のＢＭＣ濃縮物（体積／体積）であることを明らかにしている。
【００４８】
別の態様において、ＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭとを含む前記組成物は、好ましくはヒトである哺乳動物への骨髄移植のために使用されるためのものである。
【００４９】
本発明の組成物の移植部位は、腎臓被膜、筋肉及び腹腔壁からなる群から選択される骨外性部位であり得る。実施例１Ａに示されるように、腎臓の被膜下空間は、埋め込まれた細胞から発達する骨−造血複合体の形成を維持する必要な局所的条件のすべてを満たしている。したがって、腎臓の被膜下空間は、埋め込まれた細胞の活性を追跡することを可能にする一種の「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ管」として役立ち得る。骨髄細胞の懸濁物には、ＤＢＭの誘導的及び伝導的な支持体とともに腎臓被膜下に移植されたとき、完全に発達した造血微小環境を組み立てることができる間葉性前駆細胞が含まれる。したがって、骨髄細胞懸濁物に存在する間葉性前駆細胞から発達する新しい造血微小環境は、ＤＢＭの誘導的及び伝導的な影響のために、正常な３系統の造血を維持するだけでなく、長期間の維持及びリモデリング及び自己更新が、この場合には実験哺乳動物の寿命に匹敵する少なくとも１年間にわたって可能である。
【００５０】
あるいは、前記移植部位は骨髄腔であってもよい。実施例１Ｂに示されるように、摘出処理後の骨髄腔内にＢＭＣと一緒にＤＢＭを移植したときに、活発な造血の広範囲の発達が認められる（図３Ｂ及び図３Ｄ）。小柱骨、造血微小環境（間質起源）及び造血組織からなる完全な骨−造血複合体を、１段階の移植法で、摘出処理後の骨髄腔内に直接移入することに成功したことは初めてである。この実験により、造血微小環境を発達させるために誘導性かつ促進性の様々な性質を有する、造血前駆細胞及び間葉性前駆細胞の両方を含有する骨髄細胞懸濁物をＤＢＭと一緒に大腿骨内に移植することが可能であることが証明された。この造血微小環境は、造血組織の発達及び機能化のために不可欠な維持的及び調節的な役割を果たしている。新しく形成されたドナー由来の骨−造血複合体は、活発な造血産生だけでなく、長期間の維持及びリモデリング及び自己更新が可能である。
【００５１】
別の実施形態において、本発明の組成物は骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）をさらに含む。
【００５２】
本発明者らが示すように、いくつかの造血領域が、ＢＭＣをＤＢＭと一緒に移植した後に認められる（例えば、図２Ｂを参照のこと）。しかし、これらの領域は、ＢＭＰが移植混合物に添加されたときにはさらにより顕著になる（例えば、図２Ｃを参照のこと）。したがって、ＢＭＰの添加は、造血を維持する間質微小環境の発達を促進することによって本発明の組成物の活性を高める。
【００５３】
ＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭとを含む本発明の組成物は、ドナーの多機能細胞集団がレピシエントの骨髄腔内又は骨外性的に直接移植されるという大きな利点を有している。これにより、ドナー起源の自己維持される骨−造血複合体の完全な発達がレピシエントの骨又は骨外性部位の内部においてもたらされる。成人では、長骨内の赤色（造血）骨髄は黄色（脂肪）骨髄によって置換されやすい。本発明の新しい方法は、脂肪質の骨髄支質、又は線維形成性の骨髄支質、又はそうでなければ機能不全の骨髄支質のヒト骨における置換をさらに容易にする。間質幹細胞及び造血幹細胞の混合移植は、１段階手法を使用した場合、骨髄移植（ＢＭＴ）の適用可能性の拡大が、臨床的実施において、特に、造血を改善又は強化することにおいて、移植寛容性を誘導することなどにおいてもたらされることがさらに予想される。
【００５４】
さらに別の実施形態において、本発明の組成物に含まれるＤＢＭ及び／又はＭＢＭは脊椎動物起源であり、ヒト起源であってもよい。
【００５５】
さらなる実施において、本発明の組成物に由来するＤＢＭ及び／又はＭＢＭは粉末形態又は薄片形態である。
【００５６】
さらにさらなる実施形態において、本発明の組成物は、移植されたＢＭＣから生じる造血微小環境の形成を回復及び／又は強化させるために骨髄腔内に移植されるためのものである。さらに、本発明の組成物は、移植されたＢＭＣから生じる造血微小環境を発達させるために骨外性部位内に移植されるためのものである。
【００５７】
本発明の組成物は、骨髄の奇形及び／又は悪性腫瘍及び／又は機能不全に関連する障害を処置するために、移植されたＢＭＣ内の移入された造血前駆体細胞の生着を改善するはずである。
【００５８】
したがって、さらにさらなる実施形態において、本発明の組成物は、造血障害及び／又は骨障害に罹患している患者の処置において使用されるためのものである。この場合、前記造血障害は、幹細胞及び／又はその生成物の欠乏症又は異常又は悪性体、異常な幹細胞及び／又はその生成物をもたらす遺伝的状態、異常な骨構造（すなわち、一体性又は組成）、並びに悪性起源の造血障害から選択される。
【００５９】
前記に述べられたように、本発明の組成物は、任意選択で、薬学的に許容されるキャリア及び／又は希釈剤をさらに含むことができる。
【００６０】
薬学的に受容可能（又は生理学的に受容可能）な添加剤及び／又はキャリア及び／又は希釈剤は、用いられた投薬量及び濃度においてレピシエントに対して非治療的かつ非毒性であり、そして活性な薬剤の薬理学的又は生理学的な活性に影響を及ぼさない任意の添加剤又はキャリア又は希釈剤を意味する。
【００６１】
医薬組成物の調製は、この分野では広く知られており、多くの論文及び教本に記載されている。例えば、レミントン製薬科学（Ｒｅｍｉｎｇｈｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（Ｇｅｎｎａｒｏ  Ａ．Ｒ．編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、１９９０）、特にその１５２１頁〜１７１２頁を参照のこと。
【００６２】
本発明の組成物は、任意選択で、さらなる活性な薬剤をさらに含むことさえできる。特に注目される活性な薬剤は、増殖因子などの、組織の分化又は侵入を促進するそのような薬剤である。一例が、本発明の組成物の活性を高めることができるＢＭＰである。この目的のための他の例示的な増殖因子には、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）及び成長ホルモンが含まれる。他の活性な薬剤には、骨髄移植の成功のためには重要であり得る抗拒絶反応剤又は寛容性誘導剤（例えば、免疫抑制薬又は免疫調節薬など）を挙げることができる。
【００６３】
本発明の組成物を使用する骨内ＢＭＣ移植法は大きな利点をいくつか有している：なかでも、
１．静脈内注射されたとき、非造血系器官に留められる造血幹細胞の非特異的な相当の喪失が回避されること。
２．新しく形成された間質微小環境と、同じドナーから生じる造血細胞との適合性及び接触が改善されること。
３．脂肪質の骨髄空間、又は線維性の骨髄空間、又はそうでなければ異常な骨髄空間が、活発な多系統の造血を維持する活性な小柱系で置換されること。
４．ドナータイプ及びレピシエントタイプの支質上に一緒に生じたドナーの免疫適格細胞とレピシエントの免疫適格細胞との適合性が良好になるために、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）及び宿主対移植片疾患（ＨＶＧＤ）をほとんど伴わない混合造血を誘導することが可能であること。
【００６４】
別の局面において、本発明は、間葉性幹細胞を含有するＢＭＣを、間葉性幹細胞の発達を維持及び刺激するＤＢＭ及び／又はＭＢＭとの混合で哺乳動物に移植／埋込みするための方法に関する。この方法は、薬学的に許容されるキャリア及び／又は希釈剤を任意選択でさらに含むＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭとの混合物を前記哺乳動物に導入することを含む。
【００６５】
本発明の移植方法は、造血を維持する間質微小環境を誘導するはずである。この場合、そのような間質微小環境は、移植されたＢＭＣから生じ、より詳細にはＢＭＣに存在する間葉性幹細胞から生じる。
【００６６】
１つの実施形態において、本発明の混合物は、任意選択で、正常な組織膜内及び／又は、栄養物、サイトカイン及び細胞の浸透を可能にし、かつＤＢＭ粒子及び／又はＭＢＭ粒子がその中に保持される選択的な生体適合性膜内にカプセル化される。そのような膜は、不全障害の処置において造血細胞又は間質微小環境によって分泌される生物学的生成物を提供又は濃縮するために、そしてドナー細胞の生着を高めるために、そして移植寛容性の誘導のために重要である混合キメラ現象を誘導するために有用である。
【００６７】
別の実施形態において、前記混合物は、前記哺乳動物の骨髄腔内及び／又は前記哺乳動物の骨外性部位内に導入される。骨外性の移植部位は、患者の腎臓被膜、筋肉、腹腔壁、並びに寛容性誘導のための同種移植片の腎臓又は肝臓又は心臓被膜からなる群から選択される。
【００６８】
さらに別の実施形態において、本発明の移植方法において使用される混合物はＢＭＰをさらに含む。
【００６９】
さらなる態様において、本発明は、骨髄移植が必要とされる、造血障害、並びに／或いは骨髄の奇形及び／又は悪性腫瘍及び／又は機能不全に関連する障害を、そのような障害の処置を必要とする哺乳動物に対して処置する方法に関する。本発明のこの方法はＢＭＣとＤＢＭ及び／又はＭＢＭとの混合物を前記哺乳動物の骨髄腔又は骨外性部位の中に投与することを含み、前記混合物は任意選択で薬学的に許容されるキャリア及び／又は希釈剤を任意選択でさらに含む。
【００７０】
１つの実施形態において、本発明の前記方法において使用される前記混合物は、任意選択でＢＭＰをさらに含む。
【００７１】
本発明の組成物を骨外性部位内又はＢＭ腔内のいずれかに適用する手法は下記のステップを含む：
１．ＢＭＣ源を選択するステップ。ドナーは同種タイプであり得るか、又はＢＭＣを、処置されている同じ被験者から得ることができる（自家移植）。ＢＭＣは、標準的な手法によってドナーから吸引される。吸引された総量から、一部が、本発明の組成物に含まれるＢＭＣになり、別の一部を、任意選択で、その処置を必要とする患者に静脈内（ｉ．ｖ．）注射することができる。吸引されたＢＭＣのこれらの２つの部分は任意の割合で分けることができる。好ましくは、２部の吸引されたＢＭＣをｉ．ｖ．注射し、その一方で、１部を遠心分離して、その体積を減らし、ＢＭＣ濃縮物とする。その後、この濃縮物を、下記に示される比率でＤＢＭと混合する。
２．ＤＢＭ及び／又はＭＢＭの供給源を選択するステップ。ＤＢＭは商業的に供給されており、そしてＤＢＭは免疫原性がないので、特定のドナーに対する制約はない。ＤＢＭ及び／又はＭＢＭは粉末又は顆粒又は薄片形態であり得る。本発明の組成物において使用されるＤＢＭは、粒子サイズが約５０μ〜２５００μであり得る。好ましくは、ＤＢＭの粒子サイズは約２５０μ〜５００μである。
３．ＢＭＣ及び／又はＤＢＭ及び／又はＭＢＭの懸濁物を含む組成物を調製するステップ。本発明の組成物に含まれるＢＭＣとＤＢＭとの比率は、０．５部のＤＢＭに対して１０部のＢＭＣ濃縮物（体積／体積）であり得るが、好ましくは、１部のＤＢＭに対して５部のＢＭＣ濃縮物（体積／体積）であり得る。本発明者らは、最も好ましくは、前記比率が１部のＤＢＭに対して４部のＢＭＣ濃縮物（体積／体積）であることを明らかにしている。任意選択で、組成物はＢＭＰを含有することができる。組成物は、外科的手法によって、又は非侵襲的な注射によって、そのいずれでも投与することができる。あるいは、組成物は、正常な組織膜の内部においてカプセル化されるように投与することができる。さらにあるいは、組成物は、細胞、栄養物、サイトカインなどがデバイスに浸透することができ、同時にＤＢＭ粒子及び／又はＭＢＭ粒子をデバイス内に保持する選択的な生体適合性膜から作製された膜デバイスに含有させることができる。そのような膜デバイスは、好ましくは、手術により導入される。
４．インプラント組成物を埋込み部位において固定し、かつ／又は再形成するために使用される、好ましくはフィブリノーゲン及びトロンビンからなる生物学的な接着剤又は足場を提供するステップ。
【００７２】
別の実施形態において、本発明の前記方法は、好ましくは静脈内注入及び骨内注入の組合せによって骨髄幹細胞の懸濁物を前記患者に投与すること、あるいは骨外性の造血領域を産生させるために、コンパートメントの１つ（すなわち、膜デバイス）の中に、又は腎臓の被膜下空間などの骨外性部位である足場の中に静脈投与することをさらに含む。
【００７３】
さらに別の実施形態において、本発明の前記方法において使用されるＢＭＣは同種であるか、又は前記哺乳動物自身のものである。
【００７４】
さらにさらなる実施形態において、本発明の前記方法において使用されるＤＢＭ又はＭＢＭは脱灰骨薄片及び／又は石灰化骨薄片をそれぞれ含む。
【００７５】
本発明のさらなる目的の１つは、ＢＭＴが、非血液学的目的のために、例えば、臓器移植のための移植寛容性の誘導などのために、そしてドナーのナイーブリンパ球又は免疫リンパ球をレピシエントに注入することによる養子的同種細胞媒介の免疫療法のための基盤として使用されるそのような場合においてもまたＢＭＴを容易にすることである。
【００７６】
本発明はまた、ＤＢＭ又はＭＢＭと組み合わせられた前記ドナー由来骨髄が、混合キメラ現象の状態を確立することによる寛容性の誘導のために作製された同種移植片又は異種移植片又は異所性オルガネラの中に投与されたとき、灌流後又は細胞性の同種移植片又は異種移植片の環境において、ドナーの同種抗原に対する宿主対移植片の移植寛容性を誘導することを目的とする。
【００７７】
本発明の最後の態様は、ＢＭＣをＤＢＭ及び／又はＭＢＭとの混合で哺乳動物に移植するためのキットに関する。この場合、前記キットは、
（ａ）圧縮された形態にあるＤＢＭ及び／又はＭＢＭ；
（ｂ）ＢＭ吸引ニードル；
（ｃ）骨内骨穿孔用バー；
（ｄ）ＢＭＣ−ＤＢＭ又はＢＭＣ−ＤＢＭの粘性混合物を注入するための肉厚内腔ニードル；
（ｅ）ＢＭＣ−ＤＢＭを、本発明の組成物を希釈するための希釈剤と同時に混合するための二方内腔コネクター；
（ｆ）ＢＭＣを維持するための培地；そして任意選択で、
（ｇ）ＢＭＣを、或いはＢＭＣをＤＢＭ又はＭＢＭと一緒に取扱い、かつ維持するための低温手段、
を含む。
【００７８】
本発明のキットは、任意選択で、静脈内注射用のニードルを含むことができる。
【００７９】
骨髄細胞と脱灰骨基質又は石灰化骨基質との混合物を骨内に投与することを含む本発明の主要な利点は、移植片とともに提供された前駆細胞に由来する新しい微小環境及び造血系を生じさせることができることにある。悪性の幹細胞又はその後代によって引き起こされる血液学的悪性腫瘍の患者の処置であって、すべての悪性細胞に対する放射線照射と同時に行われる骨髄幹細胞の置換が治癒をもたらし得る処置とは異なり、異常な幹細胞及び骨髄微小環境の両方を伴う問題を有する患者では、幹細胞移植だけでは、基礎的疾患を治すためには十分でないと考えられる。すなわち、いくつかの血液学的悪性腫瘍では、「種」の置換が十分であると考えられるのに対して、正常な成熟化及び分化のための適正なシグナルを新しく移植された幹細胞にもたらすことができない異常な環境が関連している患者では、「種及び土」の置換が必要とされ、そして不可欠であると考えられる。このことが、拒絶反応の徴候を全く伴わずに生着問題が観測されることがある場合において、そのような患者に対するＢＭＴ後の不成功の原因であるようである。したがって、正常な細胞遺伝学的分析を有し、かつ悪性幹細胞疾患の証拠を有しない患者では、自己のＢＭＣをＤＢＭとともに含む本発明の組成物は、造血を正常化するために十分であり得ると予測することができる。これに対して、前悪性の幹細胞又は明らかに悪性の幹細胞を有する患者では、本発明の組成物に含まれるＢＭＣは、ｄｅ  ｎｏｖｏでの造血再構成を最適に促進させるために同種ドナーに由来しなければならない。ＭＤＳ患者の小さい割合における自家ＢＭＴの有益な作用は、実施例２に示される結果と合わせて、そのような方法が実際に有効であり、そして実施形態可能であり得ることを示唆している。まとめると、提案された処置に対する好適な候補者は、非常に悪性の支質を有するＭＤＳ患者であってもよく、そして同様に、二次的又は原発性の骨髄線維症を伴う血液学的悪性腫瘍に罹患している患者、並びに、何らかの原発性又は二次的な骨疾患によるか、或いは化学療法又は放射線による骨髄微小環境の他の一次的又は二次的な関与を伴う患者が好適であり得る。
【００８０】
多くの刊行物が本明細書中に引用される。これらの参考文献の内容は全体が参考として本明細書中に組み込まれる。
【００８１】
本明細書中及び下記の請求項を通して、文脈が他の事項を要求しない限り、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び変化形（「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」及び「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」など）は、述べられた整数又はステップ又は整数群又はステップ群を含み、任意の他の整数又はステップ又は整数群又はステップ群を排除しないことを意味することが理解される。
【００８２】
本明細書中及び添付された請求項において使用される場合、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」の単数形態は、文脈が明らかにそれ以外のことを規定していない限り、複数の指示事項を含むことに留意しなければならない。
【００８３】
下記の実施例は、本発明の様々な態様を実施する際に本発明者らによって用いられた技術を表している。これらの技術は、本発明を実施するための好ましい実施形態を例示する一方で、当業者は、本開示を考慮に入れて、本発明の精神及び意図された範囲から逸脱することなく、数多くの改変が行われ得ることを認識することを理解しなければならない。
【００８４】
（実施例）
材料及び方法
１．動物
体重が１８０ｇ〜２００ｇである８週齢のＣ５７ＢＬ／６雄性マウス及びＬｅｗｉｓ雄性ラットを、基質調製及びＢＭＣの両方のために、骨ドナーとして使用した。同じバッチに由来するマウス及びラットをレピシエントとして使用した。
【００８５】
２．脱灰骨基質（ＤＢＭ）及び石灰化骨基質（ＭＢＭ）の調製
脱灰骨基質（ＤＢＭ）を、本発明者らによって改変されたが、記載［Ｒｅｄｄｉ及びＨｕｇｇｉｎｓ（１９７３）、上掲］のようにして調製した。ラットの骨幹皮質骨柱体を骨髄及び周囲の軟組織から除いて、砕き、磁気撹拌しながら広口瓶に入れた。骨チップを蒸留水中で２時間〜３時間洗浄し、無水アルコール中に１時間、そしてジエチルエーテル中に０．５時間入れ、その後、層流中で乾燥して、液体窒素とともに乳鉢において粉砕し、ふるい分けして、４００μ〜１，０００μの間の粒子を選択した。得られた粉末を０．６ＭＨＣｌ中で一晩脱灰し、数回洗浄して酸を除き、無水エタノール及びジエチルエーテルで脱水し、乾燥した。
【００８６】
石灰化骨基質（ＭＢＭ）を、ＨＣｌを用いた脱灰化ステップを行うことなく、同じ手順に従って調製した。
【００８７】
マウスを用いた実験を、以前の記載［Ｇｕｒｅｖｉｔｃｈ他（１９９９）、上掲］のように、成体マウスの切除門歯から調製された脱灰歯基質を使用して行った。ラット及び大型動物の場合、長骨の皮質が、ＤＢＭを調製するための適した材料である。しかし、マウスでは、象牙質から調製されたＤＢＭのみが十分に活性であり、再現性のある結果をもたらす。
【００８８】
乾燥ステップを除くすべてのステップは、内因性のタンパク質分解酵素による骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）の分解を防止するために４℃で行われた。これらの基質は−２０℃で保存された。
【００８９】
３．埋め込まれた材料の調製
移植用ドナーＢＭＣ懸濁物の調製：
ドナーマウス又はドナーラットの大腿骨から筋肉を除いた。骨髄栓子をマンドリンによって大腿骨管から機械的に押し出した。ＢＭＣの濃縮された単一細胞懸濁物を、４個〜５個の大腿骨栓子を１００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）中で破砕することによって調製した。大腿骨骨髄栓子あたりの有核細胞の数は、通常、かなり安定している（Ｃ５７ＢＬ／６の雄性８週齢マウスについては約１０７細胞／栓子）。数回の再現し得る確認により、移植のために調製されたＢＭＣの単一細胞懸濁物は約３ｘ１０８個／ｍｌの細胞を含有することが示された。
【００９０】
移植片の組成物：
下記の成分を移植片に存在させることができる（各移植片は、図及び実施例に示されるようにその自身の組合せを有した）：
１．２０μｌのＢＭＣ懸濁物（３ｘ１０８細胞／ｍｌ）；
２．４ｍｇのＤＢＭ（又はＭＢＭ）が、ラットを用いた実験で使用された；２ｍｇが、マウスを用いた実験で使用された；
３．０．５μｇのＢＭＰ−２（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、アメリカ）が一部の実験では混合物に添加された。
【００９１】
必要に応じて本発明の組成物に添加された外因性ＢＭＰは必須成分ではない。ＤＢＭは、ＢＭＣ懸濁物内の移植された間葉性前駆細胞の生着を促す様々な性質、すなわち、骨及び軟骨の形成の途中におけるそれらの増殖及び分化を促す様々な性質を示す。同時に、ＤＢＭは、骨生成及び軟骨生成を刺激することにおいて活性である様々なＢＭＰの天然の供給源であり、したがって、その誘導機能をも果たす。外因性ＢＭＰの添加により、その誘導効率を高めることができる。
【００９２】
４．腎臓被膜下部位における移植
麻酔したラット又はマウスをレピシエントとして使用した。小さい切開を腎臓被膜において行い、そして移植物を、凹型スパチュラを使用して挿入した。
【００９３】
５．骨の髄腔内のレピシエント骨髄の局所的摘出処理
ラットに麻酔し、右脚に１，０００ｃＧｙの放射線を照射した。放射線は、０．２ｍｍのＣｕフィルターを使用して、７０ｃＧｙ／分の割合でＰｈｉｌｌｉｐｓ社のＸ線装置（２５０ｋＶ、２０ｍＡ）によって送達された。線源から皮膚までの距離は４０ｃｍであった。
【００９４】
局所的な放射線照射の後、小さい切開を右脚の膝関節の上に行った。大腿骨の髄腔に骨髄吸引ニードルを入れ、骨髄を吸い出した。残った骨髄を、１９ゲージのニードルを付けたシリンジを使用して、３ｍｌのリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）で洗い出した。
【００９５】
６．骨の摘出処理された髄腔内へのＢＭＣと脱灰骨基質との混合物の埋込み
麻酔後、膝関節を内側膝蓋傍部の切開によって露出させ、膝蓋骨を一時的に側方に移動させ、ＢＭの局所的な摘出処理を記載の通りに行い、所望の材料を骨腔内に埋め込んだ。細胞及び骨基質を小さいマイクロピペットチップに入れて、それを骨内の穴に挿入し、そして移植物をマンドリンにより骨腔の内部に押し出した。切開部位をフィブリノーゲン−トロンビン組織接着剤で覆い、膝蓋骨を所定位置に戻し、切開部を生体吸収性糸で縫合した。皮膚をステンレス製クリップで閉じた。
【００９６】
７．摘出処理された骨髄腔内にＢＭＣ及び脱灰骨基質を埋め込んだ後における再構成された骨−造血複合体のレーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析
ＤＢＭと混合された雄性ドナーのＢＭＣを雌性レピシエントの大腿骨の摘出処理された骨髄腔内に移植した実験において、ＰＣＲ分析によって、新しく形成された小柱骨がドナー起源であること、並びに再構成された造血組織がドナー起源であることが、確認された［Ａｎ，Ｊ．他（１９９７）、Ｊ  Ａｎｄｒｏｌ．、１８（３）：２８９〜９３］。正確な顕微鏡コントロール下で組織断面から個々の細胞を単離することを可能にするレーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）の新しい技術を使用して、新しく形成された骨組織及び造血組織から細胞を別々に集めた。集めた細胞（試験あたり約２００細胞〜３００細胞）のＰＣＲ分析を、Ｓｒｙ遺伝子（Ｙ染色体の性決定領域）に特異的なプライマー組を使用して行った。
【００９７】
８．組織学的評価
剖検材料を４％中性緩衝化ホルムアルデヒドで固定し、脱灰して、一連のエタノール段階物及びキシレンに通し、その後、パラフィンに包埋した。５ミクロン〜７ミクロンの連続切片を作製して、１組の代表的な連続切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、他方をピクロインジゴカルミンで染色した。
【実施例１】
【００９８】
ラットにおける骨髄腔内又は腎臓の被膜下空間内への脱灰（又は石灰化）骨基質と一緒のＢＭＣの移植
下記の実施例（本発明の組成物の開発に伴って行われた実験）では、ＤＢＭと一緒に骨髄腔内又は骨外に腎臓の被膜下空間内に移植されたとき、骨髄（ＢＭ）中に持続する間葉性幹細胞が誘導されて、骨及び維持可能な造血微小環境が形成され得ることが示される。一方がラットで行われ、もう一方がマウスで行われた２組の実験では、ＤＢＭ又はＭＢＭが単独で埋め込まれ、あるいは、さらなる骨形態形成タンパク質−２（ＢＭＰ−２）が補充されたＢＭＣと一緒に、又はＢＭＰ−２が補充されることなくＢＭＣと一緒に埋め込まれた（群あたり少なくとも１２個の移植片）。
【００９９】
１段階の移植法を確立した。この移植法では、（ａ）小柱骨の形成、（ｂ）維持可能な造血微小環境、そして（ｃ）移植された骨髄に存在する間葉性前駆体細胞及び造血前駆体細胞から生じる造血を誘導するために、ＢＭＣと脱灰（又は石灰化）骨基質粉末（ＤＢＭ又はＭＢＭ）との組成物が骨髄腔内又は骨外性的（腎臓の被膜下空間内）に挿入された。
【０１００】
Ａ．腎臓の被膜下空間内への移植
腎臓被膜下空間には、少なくとも２カ月〜３カ月の期間内で、骨生成状態に、そして骨を組み立てるように誘導され得る細胞が存在しないことが以前に示されていた［Ｇｕｒｅｖｉｔｃｈ，Ｏ．Ａ．他（１９８９）、Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｌ、３４：４３〜４５（ロシア語）］ので、腎臓被膜下空間が移植部位として選択された。
【０１０１】
ラットにおいて、ＢＭＣを伴うことなくＤＢＭ（又はＭＢＭ）を移植した１カ月後、造血の徴候が全くないことが観測された。埋め込まれた基質粒子は、移植部位に依然として存在しており、分解していなかった（図１Ａ及び図１Ｃ）。これに対して、ＤＢＭがＢＭＣと一緒に移植された部位では、活発な多系統の造血が観測され、そして移植された基質粒子の顕著な分解もまた認めることができる（図１Ｂ）。造血を維持することができる新しい骨の形成もまた、ＢＭＣと一緒にＭＢＭが腎臓被膜下に埋め込まれたときに観測された（図１Ｄ）。しかし、移植されたＭＢＭ粒子の分解、並びに小柱系の発達は、ＢＭ細胞がＤＢＭと一緒に移植された場合と比較して、わずかに遅れていた。
【０１０２】
興味深いことに、外因性ＢＭＰをＢＭＣ＋ＤＢＭの移植片に添加することにより、造血を維持する間質微小環境の発達が促進された。ＢＭＣだけの移植では、造血組織の発達は生じなかった（図１Ｊ）。
【０１０３】
ＢＭＣを伴うことなくＤＢＭ（又はＭＢＭ）を移植した６カ月後、依然として造血の徴候は全く見られなかった。埋め込まれた基質粒子は、依然として移植部位に存在していた（図１Ｅ及び図１Ｇ）。これに対して、ＤＢＭをＢＭＣと一緒に移植した６カ月後では、新しく形成された造血部位が自己維持及びリモデリングを続けていた。十分に発達した造血領域について特徴的な活発な造血を有する広範囲の腔が観測された（図１Ｆ）。ＭＢＭをＢＭＣと一緒に移植した６カ月後、新しく形成された造血部位は、ＤＢＭをＢＭＣと一緒に移植したときに発達した造血部位と形態学的にほとんど区別することができない（図１Ｈ）。１年後、ＤＢＭ（又はＭＢＭ）をＢＭＣと一緒に移植した結果として発達した新しい造血部位は、変性の徴候を何ら伴うことなく、自己維持を続けていた（図１Ｉ）。
【０１０４】
マウスで行われた類似する１組の実験は類似した結果をもたらした。すなわち、ＤＢＭとＢＭＣとの混合移植は、腎臓被膜下において生涯にわたって自己維持することができる新しい機能的に活発な造血部位の発達を誘導し（図５Ｂ、図５Ｅ及び図５Ｈ）、その一方で、ＤＢＭ又はＢＭＣの単独移植は同じ結果を示さず、すなわち、新しい造血組織の形成は観測されなかった（図５Ａ、図５Ｄ及び図５Ｇ）。ＢＭＰ−２の添加により、新しい造血部位の発達が高められた（図５Ｃ、図５Ｆ及び図５Ｉ）。
【０１０５】
Ｂ．骨髄腔内への移植
ラットで行われた別の１組の実験において、ＤＢＭが、ＢＭＣと一緒に、又はＢＭＣ及びＢＭＰと一緒に、局所的に放射線照射された脚の摘出処理された大腿骨の骨髄腔内に直接埋め込まれた（各実験群において少なくとも６匹の動物）。ＢＭＣを伴わないＤＢＭの大腿骨内への埋め込みを行った２週間後、新しい造血組織がかすかに認められた（図２Ａ）。これに対して、ＤＢＭがＢＭＣと一緒に埋め込まれたとき、新しく形成された活発な造血組織が観測された（図２Ｂ）。ＤＢＭ及びＢＭＣからなる移植片へのＢＭＰの添加により、造血複合体の発達が高められた（図２Ｃ）。
【０１０６】
摘出処理された骨髄腔内にＢＭＣと一緒にＤＢＭを直接移植した１カ月後、活発な造血の広範囲の発達が認められたが、部分的に分解したＤＢＭ粒子が大腿骨腔の骨幹領域には依然として存在していた（図３Ｂ）。ＢＭＰが移植混合物に補充されたとき、骨造血複合体の発達プロセスが促進され、ＤＢＭの小さい粒子のみが大腿骨骨幹において依然として認められるだけである（図３Ｃ）。ＤＢＭ−ＢＭＣの混合物を大腿骨内に移植した２カ月後、処置された骨の大腿骨骨幹の骨造血複合体は、損傷を受けていない骨造血複合体とほとんど区別することができない（それぞれ、図３Ｄ及び３Ｆ）。移植の５カ月後、新しい骨造血複合体は、変性の徴候を何ら伴うことなく、自己維持を続けていた（図３Ｅ）。大腿骨骨幹の十分に発達した、活発に機能する骨造血複合体は、レピシエントの全寿命期間を通して、自己維持及びリモデリングを続けた。
【０１０７】
ＤＢＭと混合された雄性ドナーのＢＭＣが雌性レピシエントの大腿骨の摘出処理された骨髄腔内に移植された実験において、新しく形成された造血組織がドナー起源であることが、ＬＣＭ技術を使用して正確な顕微鏡制御のもとで組織断面から単離された個々の細胞（試験あたり約７０細胞〜１００細胞）のＰＣＲ分析によって明らかにされた（図４）。
【実施例２】
【０１０８】
末期疾患患者の処置
実施例１において理解されるように、適正な条件のもとでは、造血幹細胞は、正常な骨髄間質細胞と一緒に接種された場合にだけ、完全に機能的な造血性の骨を作り出すことができる。同様に、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨髄細胞性、幹細胞生着、及び骨髄機能が除去されたレピシエントの救済効率を高めることができる。腎臓被膜下におけるＤＢＭと骨髄幹細胞との混合物に由来する新しく生じた骨の組織学的検査により、完全に機能的な造血性の骨が２週間〜４週間で生じたことが特徴として明らかにされた。髄外造血の誘導が可能であることは、患者自身の微小環境が損傷しているか、又は存在しない状況において微小環境を誘導するために、本発明者らの新しい方法が適用可能であり得ることを示唆した。上記の観測結果に基づいて、本発明者らは、微小環境及び活発な造血を伴う新しい骨形成は、異常な幹細胞を有する、進行した段階のＭＤＳ（骨髄異形成症候群）患者については、微小環境を正常化させるために、そして同様に、異常な幹細胞を置換するために有用であるかもしれないという仮説を立てた。
【０１０９】
前臨床動物モデルにおける予備的経験：
致死量の放射線が照射され、そして幹細胞の量を増大させながら、幹細胞の単独注入又は骨髄微小環境と一緒の注入により処置されたマウスにおいて得られた結果は、幹細胞が単独で与えられた場合と比較して、微小環境と組み合わせられたとき、より少ない数の幹細胞が、すべてのレピシエントを救済するために十分であったことを示していた（データ示さず）。これらのデータは、微小環境の本質的な役割、そして最適なＢＭＴのために幹細胞と微小環境とを組み合わせることのさらなる利点を裏づけている。
【０１１０】
症例１
Ｚ．Ｓ．（５３歳の女性患者）は、白血病に転化したＭＤＳの処置のために、２００１年９月初旬、Ｈａｄａｓｓａｈ大学病院（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）の骨髄移植部門に入院した。患者は細胞遺伝学的異常及び骨髄線維症を示したが、骨髄線維症は、静脈切開（ｐｈｌｅｂｏｌｏｍｙ）、ブスルファン、ヒドロキシウレア及びインターフェロンで以前に処置された真性赤血球増加症の後に発症したものであった。細胞遺伝学的分析により、１３の有糸分裂のうちの４つにおいて、４６ＸＸ＋１、ｄｅｒ（１；７）（ｑ１０；ｐ１０）が明らかにされた。同種ＢＭＴが最良の処置であり、一致した血縁者が実際に存在していた。患者は、移植の４日前から開始して、フルダラビン（３０ｍｇ／ｍ２で６回）、ブスルファン（４ｍｇ／Ｋｇで４回）及びシクロスポリン（３ｍｇ／Ｋｇ）で前処置された。このプロトコルは、これまでに処置されたすべての患者において、即座の生着と、３系統の造血の迅速な発達とをもたらしていた。残念なことに、患者は十分な数のドナー幹細胞（３５．７ｘ１０８個／Ｋｇの有核細胞）を受けたが、生着は、移植後２２日までは観測されなかった。完全な形成不全症のために、患者の状態が悪化し始めたので、抗生物質の投与と、逆分離での血小板輸血で維持することとが必要となった。ドナーの骨髄細胞と混合されたＤＢＭを含む本発明の組成物を用いた実験的な骨内移植を行う許可を、Ｈａｄａｓｓａｈ医学機構（Ｈａｄａｓｓａｈ大学病院（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）付属）のＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ委員会及びイスラエル保健省に申請した。Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ委員会及び保健省からの承認、並びに患者によるインフォームドコンセントを得た後、ＤＢＭと組み合わせたドナーＢＭＣの骨内移植が下記のように行われた。２００１年１１月５日、患者に、硬膜外麻酔のもとで得られた、同じドナーに由来する合計で２．９３ｘ１０８個／ｋｇの骨髄由来細胞が投与された。このとき、抗ＧＶＨＤ予防は何ら行われなかった。市販のＤＢＭをＰａｃｉｆｉｃ  Ｃｏａｓｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、ＣＡ、アメリカ）から購入した（粒子サイズ：２５０μ〜５００μ）。２．１７ｘ１０８個／ｋｇの骨髄幹細胞を静脈内注入した。合計で２０ｍｌ（乾燥体積）の粉末ＤＢＭをドナーＢＭ濃縮物（Ｘ５）の懸濁物と１対４の比率（体積／体積）で混合して、４カ所に注射した（脛骨の上部部分の両側及び仙骨の２カ所）。ＤＢＭと０．７６ｘ１０８個／ｋｇの骨髄細胞との混合物を、混合物の粘度を低下させるためにＢＭＣ−ＤＢＭと希釈剤とを同時に混合するための二方内腔コネクターに接続された、日常的な臨床実施における骨髄生検のために使用されているニードルを用いて注射した。この手順は鎮静下及び局所麻酔下で行われ、したがって完全に無痛であった。手順当日を０日目と見なした。活発かつ迅速な３系統の造血が５日目に始まり、すべての血液計測値が正常なレベルに迅速に戻った。患者は、２００１年１１月９日に絶対好塩基球数が１ｘ１０９／Ｌに達し、そして２００１年１１月１１日に血小板数が２５ｘ１０９／Ｌを越え、５０ｘ１０９／Ｌを越える血小板数が１１月１５日から始まった。幹細��及びＤＢＭの注入後３８日目に、患者は、優れた全身的状態で退院した。ドナー造血細胞の１００％の生着が、Ｙ染色体特異的なアメロゲニン遺伝子のＰＣＲにより検出される男性ＤＮＡが末梢血細胞に存在することによって確認された。診療科への最後の診察まで、患者は、完全に再構成された３系統の生着を伴って元気であり、優れた臨床的状態であった。移植後に調べられた合計で２０個の有糸分裂は、正常な４６ＸＹの核型が明らかにされた。
【０１１１】
まとめると、この症例は、造血微小環境を正常化することにより、同種幹細胞が維持され得ること、そしてこれが、ＤＢＭと混合されたドナー骨髄細胞の骨内移植によって可能であることを示唆する最初の症例である。したがって、この症例は、骨髄微小環境が損なわれている患者では、幹細胞移植が、幹細胞をＤＢＭとともに混合投与することによって高められ得ることを示唆している。
【０１１２】
症例２
Ｙ．Ｖ．（２２歳の男性患者）は、芽球過剰性ＭＤＳ（ＲＡＥＢ）のための、２００１年に行われた適合した血縁者からの骨髄移植の後における汎血球減少症の処置のために、２００２年１月、Ｈａｄａｓｓａｈ大学病院（Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ、イスラエル）の骨髄移植部門に入院した。１９９７年、１６歳のときに、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）と診断されたが、１９９９年まで、標準的な寛解導入及び維持プロトコルでの処置に成功していた。２００１年７月に、患者は、衰弱の増悪、倦怠感及び進行性汎血球減少症によって特徴づけられる二次的なＭＤＳを発症した。骨髄生検でＲＡＥＢが確認された。細胞遺伝学的研究により、ＭＤＳの典型的な染色体異常である第５染色体の欠失が示された。患者は、この状態の唯一の可能な治療法である骨髄移植のために入院した。２００１年９月に、患者は、フルダラビン（３０ｍｇ／ｍ２で６日間）及びブスルファン（４ｍｇ／ｋｇで４日間）による骨髄破壊性前処置の後、完全にＨＬＡが一致した兄弟からの同種幹細胞移植を受けた。０日目に、患者は、Ｇ−ＣＳＦで動員した血液幹細胞を、合計で５４ｘ１０８個／ｋｇの有核細胞でそのドナーから受けた。シクロスポリンＡ（ＣＳＡ）（３ｍｇ／Ｋｇ）が、単独の抗ＧＶＨＤ予防として、移植法の４日前から開始して与えられた。移植後の経過は併発症を伴わなかった。患者は、１４日目に生着し、大きな併発症を伴うことなく退院した。患者は急性ＧＶＨＤの徴候を何ら示さず、外来診療科で追跡調査した。
【０１１３】
１カ月後、患者は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）抗原血症を伴う長期の進行性汎血球減少症を発症した。ガンシクロビルによる静脈内処置の後、ＣＭＶ感染の徴候は消失したが、汎血球減少は持続した。血液ＤＮＡ分析により、患者はドナー／レピシエントの混合キメラ現象の特徴を有することが示された。このことは、宿主の造血が共存していることを示唆している。骨髄吸引により、明らかな骨髄性白血病に転換しているＭＤＳが明らかにされ、患者は骨髄移植部門に再入院した。ＧＶＨＤの徴候又は症状は全く見られず、したがって、ＣＳＡを中止した。高用量のＡｒａ−Ｃ及びミトキサントロンからなる化学療法を行った。２００１年１２月２３日に、患者は、同じドナーに由来する非常に多数（２６ｘ１０８個／ｋｇの単核細胞）のＧ−ＣＳＦで動員した血液幹細胞によるその後の救済を受けた。このとき、抗ＧＶＨＤ予防は何ら行われなかった。これは、ドナーの同種反応性Ｔ細胞によって媒介される最大の移植片対白血病（ＧＶＬ）効果を誘導するために移植後の再発を処置するための好ましいプロトコルである。化学療法により誘導される形成不全（＋７日目までの０．３ｘ１０９／Ｌ未満のＷＢＣ）の後、白血球数は０．４ｘ１０９／Ｌと０．６ｘ１０９／Ｌとの間の範囲であり、末梢血塗抹標本には顆粒球がほとんど見られなかった。同じドナーからの凍結血液幹細胞（９．３ｘ１０８個／ｋｇの単核細胞）による追加注入は、好中球数の増大を何ら示さなかった。Ｇ−ＣＳＦを用いた処置（５μｇ／ｋｇ、次いで１０μｇ／ｋｇ）も、絶対的好中球数を同様に増大させなかった。患者は、４日間にわたって４０℃に進行した、軽度の持続性の発熱を移植後３週間にわたって示した。重症の汎血球減少症にもかかわらず、２００２年１月１３日に行われた、宿主によるキメラ現象に対する最後のアッセイ及びドナーＤＮＡ分析（ＶＮＴＲ−ＰＣＲ）により、１００％のドナー造血が確認され、したがって、形成不全の考えられる原因としての拒絶反応がないことが確認された。同じ日に行われた骨髄吸引により、前駆体がほとんどない重度の低細胞性が示された。このことは、骨髄生検によってもまた確認された。まとめると、これらのデータは、ドナー造血細胞の生着の確固たる証拠にもかかわらず、骨髄形成不全を示唆していた。これは、造血性増殖因子に全く応答しない損なわれた骨髄微小環境、すなわち、骨髄形成不全を生じさせる命を脅かす臨床的状態のためであることが最も考えられる。そこで、ドナー幹細胞の迅速な生着を可能にすることを目指して、ＤＭＢと混合されたドナー骨髄細胞を骨髄腔内に再注入することを決定した。
【０１１４】
２００２年１月２８日に、患者によるインフォームドコンセントとともにＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ委員会及び保健省からの承認の後、合計で２．４８ｘ１０８単核細胞／ｋｇの新鮮な骨髄細胞を硬膜外麻酔のもとで同じドナーから吸引した。市販のＤＢＭをＰａｃｉｆｉｃ  Ｃｏａｓｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｂａｎｋ（Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ、アメリカ）から購入した（粒子サイズ：２５０μ〜５００μ）。合計で２０ｍｌ（乾燥体積）の粉末ＤＢＭをドナー骨髄濃縮物（Ｘ５）の懸濁物と１対４の比率（体積／体積）で混合して、４カ所に注射した（脛骨の上部部分の両側及び仙骨の２カ所）。２／３の細胞（１．６５ｘ１０８／Ｋｇ）を静脈内投与し、そして０．８３ｘ１０８個／ｋｇの有核細胞を含有するＤＢＭと混合された１／３の細胞を骨内に接種したが、ほとんどが上後腸骨棘内に接種された。ＢＭＣ−ＤＢＭ混合物は、ニードルから骨髄腔内への流れの閉塞を防止するために希釈しなければならなかった。手順は、プロポホル麻酔を使用して患者の部屋での軽い麻酔のもとで行われた。ＤＢＭと骨髄細胞との混合物は、混合物の粘度を低下させるためにＤＢＭ及び骨髄細胞を希釈剤としての緩衝化生理的食塩水と同時に混合するための二方内腔コネクターに接続された、日常的な臨床実施における骨髄生検のために使用されているニードルを用いて注射された。この手順は鎮静下及び局所麻酔下で行われ、したがって完全に無痛であった。手順当日を０日目と見なした。移植後、造血の早い再構成が観測され、４日〜５日以内に白血球数が２倍以上になり、８日目には４．９ｘ１０９／Ｌまでのレベルに達した。血小板数は、８日目には１０ｘ１０９／Ｌから４９ｘ１０９／Ｌに増大し、１１日目には８３ｘ１０９／Ｌに倍増した。同時に、ヘモグロビンレベルが８．０ｇ％から１０．１ｇ％に自発的に増大した。さらに、患者の状態が劇的に改善され、患者の元気が改善され、そして患者はベッドから移動することができた。生着には、３３ＩＵへのビリルビンの穏やかな上昇、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の１６ＩＵから６２ＩＵへの上昇、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の２３ＩＵから９０ＩＵへの上昇、そして乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の３３８ＩＵから６１８ＩＵへの上昇を伴う移植片対宿主疾患の様々な徴候が付随していた。下痢はコルチコステロイドで処置した。最後の検査まで、白血球の示差的な計数は、８４．６％までが顆粒球であることを示し、リンパ球が１０％〜２３％の間であり、単球が１０％〜２１％の間であった。芽球の証拠はなく、すべての血液細胞は、ＶＮＴＲ−ＰＣＲによって確認されるように、ドナー起源であった。
【０１１５】
まとめると、静脈内骨髄細胞と、ＤＢＭと混合された同種骨髄細胞の骨内への移植との混合使用を伴う新しい移植法は、異常な骨髄微小環境を以前に有していた２名のＭＤＳ患者において、ドナー造血細胞の迅速かつ完全な再構成をもたらした。本発明者らのデータは、類似する手法が、異常な骨髄微小環境に関連する他の疾患、又は異常な骨髄微小環境によって引き起こされる他の疾患を処置するために有用であることが証明され得ることを示唆している。これは、上記に示された２つの症例において例示されたように、正常な幹細胞を有する患者については自家骨髄移植後の宿主幹細胞の投与との組合せであるか、又は骨髄細胞及び微小環境の混合異常を有する患者については同種骨髄移植との組合せであるかのいずれかであると考えられる。
【０１１６】
さらに、ＤＢＭと一緒のＢＭＣによる造血再構成が、ＤＢＭ中に天然に存在する骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）などの形態形成性の増殖因子でこの混合物を外部から富化することによってさらに高められ得ると推定することは妥当であるようである。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】腎臓被膜下移植後のラット腎臓切片の光学顕微鏡写真を示す（図１Ａ〜図１Ｊ）。図１Ａ：ＤＢＭだけを移植した１カ月後（ピクロインジゴカルミン（ＰＩＣ）染色）。図１Ｂ：ＢＭＣ＋ＤＢＭを移植した１カ月後（ヘマトキシリン−エオシン、Ｈ＆Ｅ）。図１Ｃ：ＭＢＭだけを移植した１カ月後（ＰＩＣ染色）。図１Ｄ：ＢＭＣ＋ＭＤＭを移植した１カ月後（Ｈ＆Ｅ）。図１Ｅ：ＤＢＭだけを移植した６カ月後（ＰＩＣ染色）。図１Ｆ：ＢＭＣ＋ＤＢＭを移植した６カ月後（ＰＩＣ染色）。図１Ｇ：ＭＢＭだけを移植した６カ月後（ＰＩＣ染色）。図１Ｈ：ＢＭＣ＋ＭＤＭを移植した１カ月後（ＰＩＣ染色）。図１Ｉ：ＢＭＣ＋ＤＢＭを移植した１年後（ＰＩＣ染色）。図１Ｊ：ＢＭＣのみをを移植した１年後（ＰＩＣ染色）。略号：Ａｌ．、単独；Ｍｏ．、月数。
【図２】埋込み後１５日目の局所放射線照射ラット大腿骨の摘出処理された骨髄腔の長さ方向の切片を示す（Ｈ＆Ｅ）（図２Ａ〜図２Ｃ）。図２Ａ：ＤＢＭのみを用いた移植。図２Ｂ：ＤＢＭ＋ＢＭＣを用いた移植。図２Ｃ：ＤＢＭ＋ＢＭＣ＋ＢＭＰを用いた移植。略号：ＢＭＣ、骨髄細胞；ＢＭＰ、骨形態形成タンパク質；ＤＢＭ、脱灰骨基質；ＨＴ、造血組織。略号：ＨＴ、造血組織；Ｈ＆Ｅ、ヘマトキシリン及びエオシン。
【図３】摘出処理された骨髄腔における損傷した骨−造血複合体が脱灰骨基質及び骨髄細胞の移植によって正常化したことを示す（ラット大腿骨の摘出処理された骨髄腔の長さ方向の切片、ピクロインジゴカルミン染色、全体写真−８倍／顕微鏡写真−１００倍）（図３Ａ〜図３Ｆ）。図３Ａ：摘出処理直後。図３Ｂ：ＤＢＭをＢＭＣと一緒に移植した３０日後。図３Ｃ：ＢＭＰが補充されたＤＢＭとＢＭＣとの混合物を移植した３０日後。図３Ｄ：ＤＢＭをＢＭＣと一緒に移植した６０日後。図３Ｅ：ＤＢＭをＢＭＣと一緒に移植した１５０日後。図３Ｆ：コントロール、非摘出処理大腿骨。略号：Ｄ．、日数；Ｐｏ．Ａｂｌ．、摘出処理後；Ｐｏ．Ｔｒａｎｓｐｌ．、移植後；Ｎ．Ａｂｌ．Ｆｅ．Ｂｏ．、非摘出処理大腿骨。
【図４】摘出処理された骨髄腔の新しく再構成された造血複合体から捕捉された細胞のレーザー捕捉顕微解剖（ＬＣＭ）及びＰＣＲ分析（ＤＢＭ＋ＢＭＣを移植した１カ月後）（図４Ａ〜図４Ｅ）。図４Ａ：左、ラットの摘出処理された大腿骨。右、大腿骨の摘出処理された骨髄腔におけるＬＣＭのための目的領域の顕微鏡写真。図４Ｂ：再構成された骨髄のレーザー照射領域。図４Ｃ：レーザー照射されたキャップ部（ＰＣＲ分析のために捕捉された細胞）。図４Ｄ：レーザー照射されたキャップ部の高倍率（１０倍）。図４Ｅ：ＬＣＭによって集められたドナー由来細胞のＰＣＲ分析。レーン：１、ＤＮＡサイズマーカー（ＨａｅＩＩＩによるφＸ７１４切断物）、左側の上の矢印及び下の矢印は１９４ｂｐ長のバンド及び１１８ｂｐ長のバンドをそれぞれ示す；２、雌性ラットの摘出処理された骨髄腔の小柱骨領域に由来する雄性ラットＤＮＡ；３、雌性ラットの摘出処理された骨髄腔の骨髄領域に由来する雄性ラットＤＮＡ；４、内部陽性コントロール、雄性血液に由来するＤＮＡ。ＰＣＲの結果により、新しく再構成された造血複合体にドナー由来の細胞が存在することが確認される。略号：Ｄ．日数；Ｐｏ．Ａｂｌ．Ｍａｒ．Ｃａｖ．、摘出処理後の骨髄腔；Ｔａｒｇ．Ａｒ．ＬＣＭ  ＡＭＣ、摘出処理された骨髄腔のレーザー捕捉顕微解剖のための目的領域；Ｍａｒ．骨髄；Ｌａｎ．、レーン；Ｄｅｔ．Ｄｏｎ．Ｄｅｒ．Ｃｅｌ．ＰＣＲ  Ａｎａｌ．、ＰＣＲ分析によるドナー由来細胞の検出。
【図５】腎臓被膜下移植後のマウス腎臓切片の光学顕微鏡写真を示す（ピクロインジゴカルミン（ＰＩＣ）染色）（図５Ａ〜図５Ｊ）。図５Ａ：ＤＢＭだけを移植した１カ月後。図５Ｂ：ＢＭＣ＋ＤＢＭを移植した１カ月後。図５Ｃ：ＢＭＣ＋ＤＢＭをＢＭＰと一緒に移植した１カ月後。図５Ｄ：ＤＢＭだけを移植した４カ月後。図５Ｅ：ＢＭＣ＋ＤＢＭを移植した４カ月後。図５Ｆ：ＢＭＣ＋ＤＢＭをＢＭＰと一緒に移植した４カ月後。図５Ｇ：ＤＢＭだけを移植した１２カ月後。図５Ｈ：ＢＭＣ＋ＤＢＭを移植した１２カ月後。図５Ｉ：ＢＭＣ＋ＤＢＭをＢＭＰと一緒に移植した１２カ月後。図５Ｊ：ＢＭＣのみをを移植した４カ月後。略号：Ａｌ．、単独；Ｍｏ．、月数。
【国際公開パンフレット】
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2004525909.tif 000003
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【国際調査報告】
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