(57)【要約】本発明により提供された癌におけるプロテインキナーゼの発現の検出は、診断法として、薬物の有効性の決定のため、および患者の予後判定に有用である。このコードされたポリペプチドはさらに、腫瘍細胞の成長または転移の阻害において有効である薬学的物質のスクリーニングの標的を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌関連プロテインキナーゼ機能を調節する生物活性物質のスクリーニング法であって、
候補生物活性物質を、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つと組み合わせる工程：
（ａ）配列番号：１、３、５、７、９、１１もしくは１３のいずれか１つでコードされたポリペプチド、または配列番号：３８もしくは配列番号：３９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；
（ｂ）配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３のいずれか１つでコードされたポリペプチドをコードする核酸を含む細胞；または
（ｃ）（ｉ）配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３のいずれか１つに相当する遺伝子のノックアウト；（ｉｉ）配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３のいずれか１つでコードされたポリペプチドを含む外因性および安定して伝達された哺乳類遺伝子配列の一方を含む、癌関連キナーゼ遺伝子機能についての非ヒトトランスジェニック動物モデル；ならびに
該物質のキナーゼ機能に対する作用を決定する工程を含む方法。
【請求項２】
癌における配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、３８または３９のいずれか１つの発現の上方制御を決定する工程を含む、癌の診断法。
【請求項３】
癌が肝癌である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
癌が結腸癌である、請求項２記載の方法。
【請求項５】
決定工程が、癌における増加したｍＲＮＡ量の存在を検出することを含む、請求項２記載の方法。
【請求項６】
決定工程が、該癌における増加したタンパク質量の存在を検出することを含む、請求項２記載の方法。
【請求項７】
癌細胞における、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３のいずれか１つによりコードされたポリペプチドまたは配列番号：３８もしくは配列番号：３９に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの活性を下方制御する工程を含む、癌細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項８】
配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３のいずれか１つに特異的なアンチセンス配列を導入する工程を含む、請求項７記載の方法。
【請求項９】
癌細胞へキナーゼ活性の阻害剤を導入する工程を含む、請求項７記載の方法。
【請求項１０】
癌細胞が肝癌細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項１１】
癌細胞が結腸癌細胞である、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
癌細胞におけるシグナル伝達に関連する、癌関連プロテインキナーゼの標的をスクリーニングする方法であって、
正常細胞における遺伝子発現パターンを、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、３８または３９のいずれか１つの上方制御を特徴とする腫瘍細胞におけるパターンと比較する工程を含む方法。
【請求項１３】
遺伝子発現パターンの比較工程が、ポリヌクレオチドプローブのアレイへのハイブリダイゼーションにより、特異的ｍＲＮＡを定量する工程を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
癌細胞におけるシグナル伝達に関連する、癌関連プロテインキナーゼの標的をスクリーニングする方法であって、
正常細胞におけるタンパク質リン酸化のパターンを、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、３８または３９のいずれか１つの上方制御を特徴とする腫瘍細胞におけるパターンと比較する工程を含む方法。
【請求項１５】
シグナル伝達が、タンパク質依存性キナーゼ１による活性化に関連する、請求項１２または１４記載の方法。
【請求項１６】
配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３のいずれか１つに記載の配列を含む、単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
緒言
遺伝的変化の蓄積は、癌の発生および進行の原因となり、それらの挙動、生化学的、遺伝的、および顕微鏡的外観が正常細胞とは異なる細胞を生じる。重要なタンパク質の発現レベルの変化、またはタンパク質の生物活性の変化を引き起すＤＮＡの変異は、癌の核心であると考えられている。例えば癌は、１つには、細胞分裂の調節において重要な役割を果たす遺伝子が、それらの過剰発現につながるような変異を受けた場合に誘因となり得る。「癌遺伝子」は、癌において生じる成長の調節不良に関連している。
【０００２】
癌遺伝子活性は、多くの細胞活性、特に細胞周期への細胞の進入を開始しかつ他の機能を制御するための細胞膜から核へのシグナル伝達の調節を補助する酵素であるプロテインキナーゼに関連し得る。
【０００３】
癌遺伝子は、典型的には腫瘍細胞において上方制御される腫瘍感受性遺伝子であるか、または腫瘍細胞において下方制御されるかもしくは存在しなくなっている腫瘍抑制遺伝子である。悪性疾患は、腫瘍サプレッサーが喪失されるかおよび／または癌遺伝子が不適切に活性化される場合に生じ得る。このような変異が体細胞において生じる場合、これらは散発性腫瘍の成長をもたらす。
【０００４】
数百種の遺伝子が癌に関係すると考えられていないが、多くの場合、これらの遺伝子とそれらの作用の間の関係は余り理解されていない。今日科学者らは、大規模な同時並行の遺伝子発現解析を用いることで、これらの遺伝子を関連経路に結びつけることができるようになり始めた。
【０００５】
リン酸化は、成長因子またはホルモンのような細胞外生体シグナルを介した受容体により媒介されたシグナル伝達において重要である。例えば、多くの癌遺伝子は、プロテインキナーゼ、すなわちタンパク質のリン酸化反応を触媒するか、またはリン酸化により特異的に調節される酵素である。加えてキナーゼは、１種または複数種の個別のプロテインキナーゼにより調節されるその活性を有することができ、特異的シグナル伝達カスケードを生じる。
【０００６】
ＥＳＴデータベースのホモロジー検索により補助されたクローニング手法は、新規遺伝子発見の速度を速めているが、ＥＳＴデータベース検索は依然処理の困難な作業である。１６０万を超えるヒトＥＳＴ配列が、公共のデータベースに寄託されており、このことが新規遺伝子を表しているＥＳＴの同定を困難にしている。スケールの問題点と折り合いをつけることは、個別のホモログ間の高い配列決定誤差率および低い配列類似性を持つ検出では困難である。
【０００７】
様々な病態に関連した細胞を調節するための方法を理解しかつ発見する必要性が長い間求められているにもかかわらず、シグナル伝達経路の複雑さは、このような調節の産物および工程を開発する上での障壁となっている。従って、当技術分野においてこのような遺伝子の活性を検出および調節するための、ならびに癌およびシグナル伝達経路に関連した疾患を治療するための改善された方法が必要である。
【０００８】
関連文献
シグナル伝達タンパク質について探索するデータにおけるゲノム配列の使用は、Ｓｃｈｕｌｔｚらの論文（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２５：２０１（２０００））において考察されている。ＭＡＰＫタンパク質ファミリーは、例えばＭｅｓｋｉｅｎｅ Ｉ．およびＨｉｒｔ， Ｈ．の論文（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ、４２（６）：７９１−８０６（２０００））により検証されている。ＭＡＰ３Ｋは、例えば、Ｉｎｇ， Ｙ．Ｌ．らの論文（Ｏｎｃｏｃｏｇｅｎｅ、９：１７４５−１７５０（１９９４））およびＣｏｕｒｓｅａｕｘ， Ａ．らの論文（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３７：３５４−３６５（１９９６））において考察されている。セリン／トレオニンプロテインキナーゼは、例えば、Ｃｒｏｓｓ Ｔ．Ｇ．らの論文（Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、Ａｐｒ、１０；２５６（１）：３４−４１（２０００））により検証されている。
【０００９】
発明の概要
配列番号：１、３、５、７、９、１１および１３として、本明細書において提供された遺伝子配列は、癌細胞において過剰発現されることが示されているプロテインキナーゼをコードする。癌細胞における発現の検出は、診断法として；治療的薬物候補の作用の有効性および機序を決定するため；ならびに患者の予後判定を決定するために有用である。これらの配列はさらに、腫瘍細胞の成長または転移の阻害に効果がある薬学的物質をスクリーニングするための標的を提供する。本発明の１つの態様において、癌関連プロテインキナーゼに相当するヒトｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列が提供される。
【００１０】
具体的態様の説明
配列番号：１、３、５、７、９、１１および１３は、癌細胞において過剰発現されることが示されているプロテインキナーゼをコードする。本発明のコードされた癌関連プロテインキナーゼは、薬物スクリーニングまたは発現レベルの変更のための標的、ならびに腫瘍細胞の形質転換および成長に関連したキナーゼシグナル伝達経路における他の分子標的を決定するための標的を提供する。癌における過剰発現の検出は、患者の予後および薬効の可能性を予測する上で有用な診断法を提供する。
【００１１】
プロテインキナーゼ
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ　ＭＡＰ３Ｋ１１をコードするヒト遺伝子配列は配列番号：１として提供され、そのコードされたポリペプチド産物は配列番号：２として提供されている。腫瘍ｍＲＮＡから調製されたプローブのドットブロット分析は、ヒト腫瘍の臨床試料中でＭＡＰ３Ｋ１１の発現が構成的に上方制御されることを示した。
【００１２】
核標的と細胞表面を連結している一連のシグナル伝達タンパク質の連続的な活性化に関連する哺乳類細胞の多くの伝達経路は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）（細胞外シグナル−調節キナーゼまたはＥＲＫとも称される）により媒介される。哺乳類細胞において、３種類の平行ＭＡＰＫ経路が説明されている。一般にＭＡＰＫは、チロシンキナーゼ型成長因子受容体（例えばＥＧＦ受容体）およびＧタンパク質結合型受容体の両方によるリガンド結合に反応し迅速に活性化される。チロシン残基のリン酸化は、アダプタータンパク質のＳＨ２（Ｓｒｃホモロジー２）ドメインおよびＰＴＢ（ホスホチロシン結合）ドメインのドッキング部位の形成につながる（Ｌｅｍｍｏｎら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ．、１９：４５９−６３（１９９４）；および、Ｐａｗｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７８：２０７５−８０（１９９７）参照）。
【００１３】
マイトジェン活性化プロテイン（ＭＡＰ）キナーゼは、細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ（ＥＲＫ）、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、およびｐ３８サブグループを含む。これらのＭＡＰキナーゼイソ型は、トレオニンおよびチロシンの二重リン酸化により活性化される（Ｄｅｒｉｊａｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６７（５１９８）：６８２−５（１９９５））。ＭＡＰ３Ｋ１１は、Ｉｎｇらの論文（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、９：１７４５−１７５０（１９９４））に説明されたイソ型である。これは、１１ｑ１３．１−ｑ１３．３へのインサイチュハイブリダイゼーションにおいて蛍光によりマッピングされた（Ｃｏｕｒｓｅａｕｘら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３７：３５４−３６５（１９９６））。ＭＡＰ３Ｋはさらに、混合系（ｍｉｘｅｄ ｌｉｎｅａｇｅ）のプロテインキナーゼとして公知であるプロテインキナーゼファミリーと、一般的でないロイシンジッパー塩基性モチーフを含む点で、相同性を共有している。
【００１４】
Ｉｎｇら（前掲）は、ＭＡＰ３ＫはＳＨ３ドメインを含み、かつ公知のＳＨ３結合部位と類似するプロリンリッチモチーフを示す長いカルボキシル末端尾部を有することを発見した。ＳＨ３ドメインは、タンパク質スイッチの役割を果たし、これは次にキナーゼ活性の変化および細胞内局在の変化に反応する多くの受容体媒介型シグナルにより刺激される。これは、アダプター分子の一部として作用し、シグナル伝達経路の下流タンパク質をリクルートする。
【００１５】
カルモジュリンキナーゼ　染色体１ｑ３２．１−３２．３にマッピングされるＣａＭＫ−Ｘ１をコードするヒト遺伝子配列は、配列番号：３として提供され、このコードされたタンパク質産物は、配列番号：４として提供される。この配列のオープンリーディングフレームは、配列表（ｓｅｑｌｉｓｔ）の配列番号：３に示されており、７０位から開始する。腫瘍ｍＲＮＡから調製されたプローブのドットブロット分析は、ＣａＭＫ−Ｘ１の発現が、ヒト腫瘍組織において構成的に上方制御されることを示した。
【００１６】
セカンドメッセンジャーとしてＣａ＋＋が関与している哺乳類細胞における多くの細胞内生理活性は、カルモジュリン（ＣＡＭ）により媒介される。この普遍的Ｃａ＋＋結合タンパク質は、様々な酵素をＣａ＋＋依存様式で活性化する能力を有する。これらの酵素の中には、Ｃａ＋＋およびカルモジュリン依存性環状−ヌクレオチドホスホジエステラーゼ（ＣａＭ−ＰＤＥ）ならびにカルモジュリン依存性キナーゼがある。多くのＣａＭ−キナーゼが、ＣａＭへの結合に加えリン酸化により活性化される。このキナーゼは、自己リン酸化酵素であり、または「キナーゼカスケード」の一部として別のキナーゼによってリン酸化される。
【００１７】
ＣａＭキナーゼカスケードの各メンバーは、重複している自己−抑制ドメイン（ＡＩＤ）およびＣａＭ結合ドメイン（ＣＢＤ）を含む調節領域に隣接している触媒ドメインを有する。ＡＩＤと触媒ドメインの間の相互作用は、タンパク質基質に加えＭｇ＋＋−ＡＴＰの結合を妨げることにより、キナーゼを不活性高次構造に維持する。Ｃａ＋＋−ＣａＭのＣＢＤへの結合は、重複しているＡＩＤの高次構造を変更し、その結果もはやこれは基質結合を妨害せず；その結果このキナーゼには活性がある。他のタンパク質キナーゼの場合のように、ＣａＭＫＩは、各々、Ｍｇ＋＋−ＡＴＰおよびタンパク質基質の結合に貢献している、上側ローブおよび下側ローブの間に触媒溝（ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｃｌｅｆｔ）を有する。それらの触媒溝の底において、ＣａＭＫＩおよびＣａＭＫＩＶを含む多くのプロテインキナーゼが、そのリン酸化が強力にキナーゼ活性を増強しているトレオニン残基を含む活性化ループを有している。
【００１８】
血清、グルココルチコイド誘導性プロテインキナーゼ（ＳＧＫ）　ＳＧＫ２−αをコードするヒト遺伝子配列は配列番号：５として提供され、そのコードされたポリペプチド産物は配列番号：６として提供されている。腫瘍ｍＲＮＡから調製されたプローブのドットブロット分析は、ヒト腫瘍組織においてＳＧＫ２−αの発現が構成的に上方制御されることを示した。
【００１９】
ＳＧＫは、細胞周期と同調して核と細胞質の間を能動的にシャトルする。ＳＧＫは、当初、グルココルチコイドおよび浸透圧ストレス−応答遺伝子として同定され；２種の関連するイソ型があり、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３と命名された。加えて、ＳＧＫ２の２種のスプライシング変種、具体的には、ＳＧＫ２αおよびＳＧＫ２βが存在する。ＳＧＫ２αは、計算上の分子量４１．１ｋＤａを有する３６７残基のタンパク質をコードする。ＳＧＫ１、２および３は、配列類似性を高度に共有しているにも関わらず、ＳＧＫ２およびＳＧＫ３のレベルおよび活性を調節するメカニズムは、ＳＧＫ１を調節するものとは著しく異なっている。ＳＧＫ２は、Ａｒｇ−Ｘａａ−Ａｒｇ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒモチーフに存在するＳｅｒおよびＴｈｒ残基を優先的にリン酸化するプロテインキナーゼＢのペプチドと特異的に類似しているペプチドを有する。
【００２０】
本明細書に示されたデータは、ＳＧＫ２αが、タンパク質依存性キナーゼ１により活性化されることを示す。ＣＤＫ１は、有糸分裂への進行を誘導しかつ真核生物において普遍的であるＭ−期促進因子と称されるプロテインキナーゼ複合体の触媒サブユニットである。Ｌｅｅらの論文（Ｎａｔｕｒｅ、３３３：６７６−６７９（１９８８））は、ヒトおよびマウスのインビトロ系におけるＣＤＫ１の調節された発現およびリン酸化を説明している。ヒトおよびマウスの繊維芽細胞の血清刺激は、ＣＤＫ１転写の顕著な増加を生じる。酵母および哺乳類の両方の細胞が、遺伝子産物のリン酸化により調節される。ＨｅＬａ細胞において、ＣＤＫ１は、最も豊富なホスホチロシン−含有タンパク質であり、そのホスホチロシン含量は、細胞周期調節の影響下にある（Ｄｒａｅｔｔａら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６：７３８−７４４（１９８８））。インビボにおけるＣＤＫ１チロシンリン酸化の１つの部位は、ＳＲＣ遺伝子産物によりインビトロにおいて選択的にリン酸化される。タキソールは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞においてＣＤＫ１キナーゼを活性化し、これはＧ２／Ｍ期での細胞周期の停止、それに続くアポトーシスへとつながる。ＣＤＫ１の化学阻害剤は、これらの細胞においてタキソールが誘導したアポトーシスをブロックする（Ｙｕら、Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ、２：５８１−５９１（１９９８））。この経路の妨害は、細胞周期停止およびアポトーシスに影響を及ぼす治療薬の開発において興味深い。
【００２１】
Ｇタンパク質結合受容体キナーゼ　ＧＲＫ５をコードするヒト遺伝子配列は配列番号：７として提供され、そのコードされたポリペプチド産物は配列番号：８としで提供されている。腫瘍ｍＲＮＡから調製されたプローブのドットブロット分析は、ヒト腫瘍の臨床試料においてＧＲＫ５の発現が構成的に上方制御されることを示した。
【００２２】
ＧＲＫは、アゴニストに占有された受容体またはアゴニストに活性化された受容体のリン酸化により受容体脱感作を誘導するセリン／トレオニンキナーゼファミリーである。ＧＲＫは、細胞外リガンドの細胞内シグナル伝達事象への結合を導入する。今日まで、ＧＲＫファミリーの７種のメンバーが同定されている。これらのキナーゼに共通の特徴は、ファミリーメンバー間で顕著な配列同一性を共有している約２４０個のアミノ酸である中央に局在化された触媒ドメイン、１６１〜１９７アミノ酸のＮ末端ドメイン、および可変長Ｃ末端ドメインを含むことである。ＧＲＫは全て、ファルネシル化、パルミトイル化のような共有的修飾、もしくはプレクストリン相同ドメイン、または多塩基ドメインのような脂質結合ドメインのいずれかを介し、リン脂質と直接相互作用することができる。
【００２３】
ＧＲＫ５は、約６７．７ｋＤａのタンパク質であり（ＫｕｎａｐａｌｉおよびＢｅｎｏｖｉｃ、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．、９０：５５８８−５５９２（１９９３））、それのＧＲＫファミリーの他のメンバーとの相同性により同定された。これは、心臓、胎盤、および肺を含む多くの異なる組織において発現されている。ＧＲＫ５の自己リン酸化は、このキナーゼを活性化するように思われる（ＰｒｏｎｉｎおよびＢｅｎｏｖｉｃ、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．、２７２：３８０６−３８１２（１９９７））。ＧＲＫ５はさらに、ＰＫＣによってリン酸化され、ここでＰＫＣリン酸化の主要部位は、Ｃ末端側の２６個のアミノ酸に局在化されている。ＰＫＣリン酸化は、ＧＲＫ５活性を顕著に阻害する。
【００２４】
筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ　ＤＭ−ＰＫをコードするヒト遺伝子配列は配列番号：９として提供され、そのコードされたポリペプチド産物は配列番号：１０として提供されている。この別のイソ型の配列は配列番号：３８および配列番号：３９として示されている。腫瘍ｍＲＮＡから調製されたプローブのドットブロット分析は、ヒト腫瘍の臨床試料においてＤＭ−ＰＫの発現が構成的に上方制御されることを示した。
【００２５】
ヒト筋緊張性ジストロフィープロテインキナーゼ（ＤＭ−ＰＫ）は、様々な生体において細胞の大きさおよび形状を調節するマルチドメインプロテインキナーゼのクラスのメンバーである（Ｂｒｏｏｋら、Ｃｅｌｌ、６８：７９９−８０８（１９９２）；および、Ｆｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５：１２５６−１２５８（１９９２）参照）。ＤＭ−ＰＫは、プロテインキナーゼＣおよびＡ、ならびにＲｈｏキナーゼなどの関連プロテインキナーゼに類似しているが、識別可能である新規触媒活性を示している。現時点で、ＤＭ−ＰＫのドメイン機能、基質特異性、および可能性のある調節メカニズムを含む全般的特徴についてはほとんどわかっていない。このキナーゼの２つの型が、筋肉において発現され、ここではより大きいもの（主要翻訳産物）は、カルボキシル末端近傍でタンパク質分解性に切断され、より小さいものを生じる。この完全長キナーゼの阻害活性は、ＤＭ−ＰＫのカルボキシル最末端で、偽基質自己抑制ドメイン（ｐｓｅｕｄｏｓｕｂｓｔｒａｔｅ ａｕｔｏｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ）にマッピングされている（Ｂｕｓｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９：８４８０−９０（２０００）参照）。
【００２６】
Ｓｈａｗら（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１８：６７３−９（１９９３））は、ＤＭ−ＰＫ遺伝子が、約１３ｋｂのゲノムＤＮＡ全体に分散した１５個のエキソンを含むことを明らかにした。これは、ｃＡＭＰ依存性セリン−トレオニンプロテインキナーゼに高度に相同性であるＮ末端ドメイン、高いα−ヘリックス含量を有し様々な繊維状タンパク質に弱い類似性のある中間ドメイン、および疎水性Ｃ末端セグメントを伴う６２４個のアミノ酸のタンパク質をコードする。ＣＴＧ反復配列は、ＤＭ−ＰＫ ｍＲＮＡの３’側非翻訳領域に局在化されている。不安定なＣＴＧモチーフは、ヒトで特有に見られるが、その隣接するヌクレオチドはマウスにも存在する。筋緊張性ジストロフィーに対するプロテインキナーゼの関与は、広範な生化学経路および細胞経路におけるこのような酵素の中枢的役割と一致する。この疾患の常染色体優性の性質は、量的欠損（ｄｏｓａｇｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）に起因している。
【００２７】
プロテインキナーゼＤ２　ＰＫＤ２をコードするヒト遺伝子配列は配列番号：１１として提供され、そのコードされたポリペプチド産物は配列番号：１２として提供されている。腫瘍ｍＲＮＡから調製されたプローブのドットブロット分析は、ヒト腫瘍の臨床試料においてＰＫＤ２の発現が構成的に上方制御されることを示した。
【００２８】
ＰＫＤ２は、ヒトセリントレオニンプロテインキナーゼ遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号、ＮＭ ０１６４５７；Ｓｔｕｒａｎｙら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２７６：３３１０−３３１８（２００１））である。このタンパク質配列は、Ｎ末端の２個のシステインリッチモチーフ、プレクストリン相同ドメイン、およびセリンプロテインキナーゼの特徴的配列モチーフを全て含む触媒ドメインを含んでいる。これは、特に二重ジンクフィンガー様システインリッチモチーフ、プレクストリン相同ドメインおよびプロテインキナーゼドメインにおいて、セリントレオニンプロテインキナーゼＰＫＤ／ＰＫＣμおよびＰＫＣとの最も強力な相同性を示している。ＰＫＤ２のｍＲＮＡは、ヒトおよびマウス組織において広く発現されている。これは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動において分子量１０５ｋＤａのタンパク質をコードしており、これはＰＫＣμを発現しないＨＬ６０細胞を含む様々なヒト細胞株において発現されている。インビボにおけるホルボールエステル結合試験は、［３Ｈ］ホルボール１２，１３−ジブチレートのＰＫＤ２への濃度依存型の結合を示した。ジオレイルホスファチジルセリン中に存在する別のホルボール１２，１３−ジブチレートは、ＰＫＤ２の自己リン酸化を相乗的に刺激した。ホルボールエステルは、無傷の細胞におけるＰＫＤ２の自己リン酸化も刺激した。ＰＫＤ２のＳｅｒ８７６のリン酸化は、このキナーゼの活性化状態に関連していた。
【００２９】
診断法
配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３のいずれか１つの存在の決定は、腫瘍の診断、型決定、および病期決定に使用される。この配列の存在の検出は、患者試料中に存在する特異的タンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡを定量するために、特異的に結合するメンバー対を使用することにより実行される。一般にこの試料は、腫瘍由来の生検標本またはその他の細胞試料である。腫瘍が転移している場合は、血液試料を分析しても良い。
【００３０】
特異的に結合するメンバー
典型的アッセイ法においては、組織試料、例えば生検標本、血液試料などが、試料と、配列番号：１、３、５、７、９、１１および１３に特異的に結合するメンバーとの混合、ならびにこれら２つのメンバー間に形成された複合体の存在の直接的または間接的検出により、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３の特異的配列に相当する癌関連キナーゼの存在についてアッセイされる。本明細書において使用される「特異的に結合するメンバー」という用語は、特異的に結合する対のメンバー、すなわち分子の一方が化学的または物理的手段を介して他方の分子に特異的に結合する２個の分子を意味する。一方の分子は、配列番号：１、３、５、７、９、１１および１３に相当する核酸またはこれらの核酸によりコードされたポリペプチドであり、これは配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、３８もしくは３９で提供されたアミノ酸配列またはその断片に実質的に類似したタンパク質；または、配列番号：１、３、５、７、９、１１および１３で提供されたヌクレオチド配列またはその断片に実質的に類似した核酸を含み得る。特異的結合対のメンバーの相補的メンバーは、リガンドおよび受容体と称される場合がある。
【００３１】
対象となる結合対は、抗原および抗体の特異的結合対、ペプチド−ＭＨＣ抗原およびＴ細胞受容体の対；相補的ヌクレオチド配列（ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイ法においてプローブおよび捕獲物質として使用される核酸配列を含む）；キナーゼタンパク質および基質の対；自家モノクローナル抗体などを含む。特異的結合対は、当初の特異的結合メンバーの類似体、誘導体および断片を含んでも良い。例えば、タンパク質抗原に対して誘導された抗体は、エピトープが存在する限りは、ペプチド断片、化学的に合成されたペプチド模倣物、標識されたタンパク質、誘導されたタンパク質なども認識することができる。
【００３２】
核酸配列　別の本発明の態様において、核酸は、特異的結合メンバーとして使用される。検出のための配列は、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に相当する提供された癌関連キナーゼの１つに相補的である。本発明の核酸は、配列番号：１、３、５、７、９、１１および１３の１つに高度の配列類似性または配列同一性を有する核酸を含む。配列同一性は、例えば５０℃以上および０．１ Ｘ ＳＳＣ（９ｍＭ食塩水／０．９ｍＭクエン酸ナトリウム）のような、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションにより決定することができる。ハイブリダイゼーションの方法および条件は、当技術分野において周知であり、例えば米国特許第５，７０７，８２９号を参照のこと。遺伝子の遺伝的に変更された変型である、例えば対立遺伝子変種のような、提供された核酸配列と実質的に同一である核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に結合する。
【００３３】
これらの核酸は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに加え、それらの断片でありうる。本明細書において使用される「ｃＤＮＡ」という用語は、天然の成熟型ｍＲＮＡ種において認められる配列要素のアライメント（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を共有する全ての核酸を含み、ここで配列要素はエキソンならびに３’および５’側非コード領域であることが意図される。通常ｍＲＮＡ種は、本発明のポリペプチドをコードする連続するオープンリーディングフレームを作出するために、存在する場合には核ＲＮＡスプライシングにより取除かれるイントロンが介在している、隣接するエキソンを有する。
【００３４】
対象となるゲノム配列は、天然型染色体に通常存在するイントロンの全てを含む、列記された配列において規定されたような、開始コドンと停止コドンの間に存在する核酸を含む。これはさらに、成熟型ｍＲＮＡにおいて認められる３’および５’側の非翻訳領域を含む。これはさらに、転写された領域の５’または３’末端のいずれかに、約１ｋｂ（それよりも大きい可能性もある）の隣接するゲノムＤＮＡを含む、プロモーター、エンハンサーなどの、特異的転写および翻訳の調節配列を含むことができる。３’もしくは５’のいずれかのコード領域、または時々イントロンにおいて認められるように内部調節配列に隣接しているゲノムＤＮＡは、適切な組織、病期特異的または病態特異的発現に必要な配列を含み、かつ腫瘍細胞における発現の上方制御の研究に有用である。
【００３５】
本発明の核酸に特異的なプローブは、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に開示された核酸配列を用いて作成することができる。これらのプローブは、好ましくは配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３の対応する連続配列の少なくとも約１８ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチドまたはそれ以上であり、通常は長さが約２ｋｂ、１ｋｂ、または０．５ｋｂ未満である。好ましくはプローブは、ＢＬＡＳＴＸなどの低い複雑性をマスクするためのマスキングプログラムの適用後にマスクされずに維持される連続配列を基に設計されている。２本鎖または１本鎖断片は、常法に従いオリゴヌクレオチドを化学的に合成すること、制限酵素消化、ＰＣＲ増幅などにより、ＤＮＡ配列から得ることができる。これらのプローブは、例えば、放射性タグ、ビオチン化タグ、または蛍光タグにより標識され得る。
【００３６】
本発明の核酸は単離され、一般には完全な（ｉｎｔａｃｔ）染色体以外としての、実質的に純粋な形で得られる。通常ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかである核酸は、他の天然の核酸配列を実質的に含まないように、一般には純度少なくとも約５０％、通常は少なくとも約９０％で得られ、かつ典型的には例えば通常天然の染色体には会合されていない１個または複数のヌクレオチドにより隣接されたような「組換体」である。
【００３７】
本発明の核酸は、直鎖状分子または環状分子内で提供することができ、自律複製分子（ベクター）内または複製配列を伴わない分子内で提供することができる。これらの核酸の発現は、それら自身によりまたは当技術分野において公知である他の調節配列により調節することができる。本発明の核酸は、トランスフェリンポリカチオン−媒介型ＤＮＡの導入、裸のまたは包膜された核酸のトランスフェクション、リポソーム−媒介型ＤＮＡ導入、ＤＮＡで被覆されたラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、電気穿孔、遺伝子銃、リン酸カルシウム−媒介型トランスフェクションなどの、当技術分野において利用可能な様々な技術を用い、適当な宿主細胞へ導入することができる。
【００３８】
ＰＣＲなどの増幅反応における使用のためには、プライマー対が使用されるであろう。プライマー配列の正確な組成は、本発明には重要ではないが、ほとんどの用途について、プライマーは、当技術分野において公知のストリンジェントな条件下で対象配列にハイブリダイズすると考えられる。少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチドの増幅産物を作成するプライマー対を選択することが好ましい。プライマー配列選択のアルゴリズムは、一般に公知であり、市販のソフトウェアパッケージで利用可能である。増幅プライマーは、ＤＮＡの相補鎖へハイブリダイズし、互いに反応開始すると考えられる。ハイブリダイゼーションプローブについて、安定性および結合親和性を改善するために、核酸類似体を使用することが望ましい。「核酸」という用語は、このような類似体を包含するものとして理解されなければならない。
【００３９】
抗体　本発明のポリペプチドは、抗体産生に使用することができ、ここで短い断片は、特定のポリペプチドに特異的な抗体を提供し、比較的大きい断片または全タンパク質は、ポリペプチドの表面全体の抗体産生を可能にする。本明細書において使用される「抗体」という用語は、抗原に対する特異的結合を維持している抗体のあらゆるイソ型、断片を含み、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄ断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、１本鎖抗体、ならびに抗体および非抗体タンパク質の抗原結合部分を含む融合タンパク質を含むが、これらに限定されるものではない。抗体は、放射性同位元素、検出可能な生成物を生成する酵素、緑色蛍光タンパク質などで、検出できるように標識することができる。抗体はさらに、特異的結合対のメンバー、例えばビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対のメンバー）などのように、他の部分に複合化することができる。抗体はさらに、ポリスチレンプレートまたはビーズなどを含むが、これらに限定されるものではない固相へ結合することもできる。
【００４０】
抗体−抗原相互作用の文脈において「抗体特異性」とは、当技術分野においてよく理解された用語であり、所与の抗体は所与の抗原に結合することを示し、結合は、抗体により認識される抗原またはそれらのエピトープにより阻害され、かつ無関係の抗原には実質的に結合しない。特異的抗体結合を決定する方法は、当業者には周知であり、ポリペプチド、特に配列番号：２、４、６、８、１０または１２に相当するヒトポリペプチドに関し、本発明の抗体の特異性を決定するために使用することができる。
【００４１】
抗体は、常法に従い調製され、ここで発現されたポリペプチドまたはタンパク質は、それ自身で、または例えばＫＬＨ、ｐｒｅ−Ｓ ＨＢｓＡｇ、他のウイルスもしくは真核生物タンパク質などの公知の免疫原性担体と複合化され、免疫原として使用される。様々なアジュバントを、連続注射と共に適宜使用することができる。モノクローナル抗体について、１回または数回のブースター注射後、脾臓が摘出され、リンパ球が細胞融合により不死化され、その後、高親和性抗体結合についてスクリーニングされる。次に所望の抗体を産生する不死化された細胞、すなわちハイブリドーマを増加させてもよい。更なる説明については、「モノクローナル抗体：実験マニュアル（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編集、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８８年を参照のこと。望ましいならば、重鎖および軽鎖をコードするｍＲＮＡを単離し、大腸菌におけるクローニングにより突然変異誘発し、この重鎖および軽鎖をさらに抗体に対する親和性を増強するために混合することができる。抗体産生法として、インビボ免疫感作の代わりに、ファージディスプレイライブラリーへの結合を含み、これは通常インビトロ親和性成熟に結びつけられている。
【００４２】
核酸定量法
配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３の配列に由来した核酸試薬は、生検標本由来の腫瘍、関節炎滑膜などの炎症試料のような患者試料；細胞において増幅されたＤＮＡ、または対応するｍＲＮＡまたはタンパク質の増大した発現のスクリーニングに使用される。ＤＮＡに基づく試薬は、特定の疾患に関連した染色体遺伝子座の評価、例えばヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）試験、またはコード配列を基にしたプライマー設計における使用のためにも設計される。
【００４３】
本発明のポリヌクレオチドは、例えばヒトにおいて異常なまたは罹患した組織を同定するための方法として、２種の細胞間の発現レベルの差異を検出するために使用することができる。異常または罹患したと推定された組織は、ヒトの様々な組織型に由来することができるが、同じ組織型に由来すること；例えば、腸ポリープまたは他の異常な増殖は、正常な腸組織と比較されることが好ましい。正常な組織は、被験試料組織と同じ組織、または患者の正常組織、特に対象となるポリヌクレオチド関連遺伝子を発現している組織（例えば、脳、胸腺、精巣、心臓、前立腺、胎盤、脾臓、小腸、骨格筋、膵臓、および結腸の粘膜内層など）であることができる。例えば分子量、アミノ酸もしくはヌクレオチド配列、または相対的豊富さにおいて比較される２種の組織間のポリヌクレオチド関連遺伝子、ｍＲＮＡ、またはタンパク質の差異は、罹患したことが疑われるヒト組織における、遺伝子、またはそれを調節する遺伝子の変化を示している。
【００４４】
本核酸および／またはポリペプチド組成物を、患者試料を病態に関連した多型の存在について分析するために使用することができる。コード領域または制御領域の配列多型が、疾患、特に癌および他の増殖異常に関連するかどうかを決定するために、生化学試験を行うことができる。対象となる疾患は、その他の過増殖性疾患も含むことができる。多型に関連した疾患は、遺伝子の欠失または切断、発現レベルを変更する変異、タンパク質の結合活性、キナーゼ活性ドメインなどに影響を及ぼす変異を含むことができる。
【００４５】
発現レベルに影響を及ぼし得るプロモーターまたはエンハンサーの配列変化は、当技術分野において公知の様々な方法により、正常な対立遺伝子の発現レベルと比較することができる。プロモーターまたはエンハンサーの強度を決定する方法は、発現された天然のタンパク質の定量；従来型定量に備えるβ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼなどのようなレポーター遺伝子を有するベクターへの、変種の制御要素の挿入などを含む。
【００４６】
例えば上方制御された発現のような、特異的配列の存在に関する核酸の分析のために、多くの方法が利用可能である。配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３を発現している細胞は、ｍＲＮＡの給源として使用することができ、これは直接アッセイされるかまたは分析のためにｃＤＮＡへ逆転写され得る。核酸は、分析に十分な量を提供するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような常法により増幅することができる。ポリメラーゼ連鎖反応の使用は、Ｓａｉｋｉらの論文（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：４８７（１９８５））に記されており、技術の検証は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨ Ｐｒｅｓｓ社、１９８９年、１４．２−１４．３３ページに見ることができる。
【００４７】
検出可能な標識を、増幅反応液に含んでもよい。適当な標識は、蛍光色素、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２，７−ジメトキシ−４，５−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシ−２，４，７，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）またはＮ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）など、放射性標識、例えば３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈなどである。この標識は、２段階システムであることができ、この場合は増幅されたＤＮＡが、例えばアビジン、特異的抗体などのような高親和性結合パートナーを有するビオチン、ハプテンなどに複合され、次にその結合パートナーが検出可能な標識に複合される。この標識は、プライマーの一方または両方に複合しても良い。あるいは、増幅において使用されるヌクレオチドのプールは標識され、その結果、この標識が増幅産物に組込まれる。
【００４８】
この試料核酸、例えば増幅されるかまたはクローニングされた断片は、当技術分野において公知の多くの方法の１つにより分析される。プローブは、ノーザンブロットもしくはドットブロットでハイブリダイズされるか、または液相ハイブリダイゼーション反応が実行される。核酸は、ジデオキシ法または他の方法により配列決定され、および塩基配列が野生型配列と比較される。１本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、およびゲルマトリックス中でのヘテロ二重鎖分析を用い、ＤＮＡ配列の変種により作出されたコンホメーション変化を、電気泳動移動度の変化として検出する。ゲルまたはキャピラリー電気泳動、特にアクリルアミドまたはアガロースゲルにより分画を行う。
【００４９】
アレイは、試料中の非常に多数のポリヌクレオチドをアッセイすることができるハイスループット技法を提供する。本発明の１つの局面において、アレイは、１種または複数の配列番号：１、３、５、７、９、１１および１３を含むように、好ましくはこれらの配列の全てを含むように作製され、このアレイはさらに、腫瘍細胞において上方制御または下方制御されることが知られている他の配列を含むことができる。この技法は、示差的発現を試験するツールとして使用することができる。
【００５０】
アレイを製造する様々な方法に加え、これらの方法の変法が、当技術分野において公知であり、本発明における使用が企図されている。例えばアレイは、結合したプローブを有する二次元マトリックスまたはアレイ中の基板（例えば、ガラス、ニトロセルロースなど）上へのポリヌクレオチドプローブのスポッティングにより作製することができる。これらのプローブは、基板に共有結合または疎水性相互作用のような非特異的相互作用のいずれかにより結合させることができる。核酸の試料を、検出可能に標識し（例えば放射性標識または蛍光標識を用い）、次にこれらのプローブへハイブリダイズすることができる。試料の非結合部分を洗浄除去した後、プローブ核酸へ結合した標識した試料ポリヌクレオチドを含む２本鎖核酸を検出することができる。あるいは、被験試料の核酸を、アレイ上に固定し、プローブを検出可能なように標識することもできる。
【００５１】
アレイ作製技術およびこれらのアレイの使用法は、例えば、Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９３（２０）：１０６１４−９（１９９６）；Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０（５２３５）：４６７−７０（１９９５）；Ｓｈａｌｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、６（７）：６３９−４５（１９９６）、米国特許第５，８０７，５２２号、欧州特許第７９９ ８９７号；国際公開公報第９７／２９２１２号；国際公開公報第９７／２７３１７号；欧州特許第７８５ ２８０号；国際公開公報第９７／０２３５７号；米国特許第５，５９３，８３９号；米国特許第５，５７８，８３２号；欧州特許第７２８ ５２０号；米国特許第５，５９９，６９５号；欧州特許第７２１ ０１６号；米国特許第５，５５６，７５２号；国際公開公報第９５／２２０５８号；および米国特許第５，６３１，７３４号に開示されている。
【００５２】
アレイは、例えば、遺伝子の示差的発現を試験するために使用することができ、遺伝子機能の決定に使用することができる。例えばアレイは、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３の示差的発現を検出に使用することができ、ここで発現は、被験細胞と対照細胞（例えば、癌細胞と正常細胞）の間で比較される。対応する正常細胞においては認められないような癌細胞における特定のメッセージの高レベルの発現は、癌特異的遺伝子産物を示している。アレイの使用例はさらに、例えば、Ｐａｐｐａｌａｒａｄｏら、Ｓｅｍ． Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌ．、８：２１７（１９９８）；および、Ｒａｍｓａｙ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：４０（１９９８）にも記されている。さらに、アレイを使用する検出法に関する多くの変更は、当業者に周知であり、本発明の範囲内である。例えばプローブを固相支持体に固定するのではなく、被験試料を、固相支持体に固定し、次にプローブと接触することもできる。
【００５３】
ポリペプチド分析
本配列の発現のスクリーニングは、タンパク質の機能特性または抗原特性を基にすることができる。タンパク質切断アッセイ法は、タンパク質の生物活性に影響を及ぼし得る欠失の検出に有用である。配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３によりコードされたタンパク質の多型を検出するために設計された様々な免疫アッセイ法をスクリーニングに使用することができる。多くの多様な遺伝的変異が特定の疾患表現型につながる場合、機能タンパク質アッセイ法は、有効なスクリーニングツールであることが証明されている。キナーゼアッセイ法などにおけるコードされたタンパク質の活性は、野生型タンパク質と比較することにより決定することができる。
【００５４】
試料は、癌患者から採取される。本明細書において使用されるような試料は、血液のような生物学的液体；器官または組織培養物由来の液体などを含む。癌腫細胞の生検標本または他の給源、例えば腫瘍生検などは、特に興味深い。この用語には、このような細胞および液体の派生物および画分も含まれる。試料中の細胞数は一般に、少なくとも約１０３個、通常少なくとも１０４個であり、さらに約１０５個またはそれ以上であることができる。これらの細胞は、固形組織の場合解離されるか、または組織切片が分析される。あるいは細胞溶解液を調製してもよい。
【００５５】
検出は、常法に従い行われる、細胞または組織学的切片の染色を利用することができる。対象となる抗体または他の特異的結合メンバーは、細胞試料に添加することができ、かつエピトープへの結合に十分な時間、通常少なくとも約１０分間はインキュベーションされる。この抗体は、直接検出のために、放射性同位元素、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または他の標識により標識することができる。あるいは、二次抗体または試薬を用い、シグナルを増強することができる。このような試薬は当技術分野において周知である。例えば、一次抗体は、ビオチンに複合し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合アビジンを二次試薬として添加することができる。最終的検出には、ペルオキシダーゼの存在を呈色変化する基質を使用する。抗体結合の存在または非存在は、解離した細胞のフローサイトメトリー、顕微鏡検査、ラジオグラフィー、シンチレーション計数などを含む、様々な方法により決定することができる。
【００５６】
診断の別法は、溶解液中の抗体と配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に相当する癌関連キナーゼの間の結合のインビトロ検出によって左右される。試料またはそれらの画分中の標的タンパク質の濃度の測定は、様々な特異的アッセイ法により実現することができる。通常のサンドイッチ型アッセイ法を使用することができる。例えば、サンドイッチアッセイ法は、最初に特異的抗体を、不溶性表面または支持体に付着することができる。この結合の具体的方法は、本発明の試薬および全般的方法に適合する限りは重要ではない。これらは、プレートへ共有結合または非共有結合的に結合することができ、非共有結合が好ましい。
【００５７】
ポリペプチドが不溶性支持体に結合し、これを容易に可溶性物質から分離することができ、さもなければ全般的方法と適合可能である組成物であることができる。このような支持体の表面は、中実（ｓｏｌｉｄ）または多孔質であり、およびいずれか通常の形状であることができる。受容体が結合された適当な不溶性支持体の例は、ビーズ、例えば磁気ビーズ、膜およびマイクロタイタープレートを含む。これらは典型的には、ガラス、プラスチック（例えば、ポリスチレン）、多糖類、ナイロン、またはニトロセルロースで製造される。マイクロタイタープレートは、非常に多数のアッセイ法を同時に行うことができ、少量の試薬および試料を使用するので、特に都合がよい。
【００５８】
その後患者の試料溶解液は、抗体を含む個別にアッセイ可能な支持体（例えば、マイクロタイタープレートのセパレートウェル）に添加される。好ましくは、既知の濃度の被験タンパク質を含有する一連の標準が、対照として使用するために、試料またはそれらのアリコートと平行してアッセイされる。各試料および標準は、各々について平均値が得られるように、複数のウェルに添加されることが好ましい。このインキュベーション時間は、結合に十分なものであり、一般には約０．１〜３時間で十分である。インキュベーション後、一般に不溶性支持体は、非結合成分が洗浄される。概して、適当なｐＨ、一般にはｐＨ７〜８の希釈された非イオン性界面活性剤媒質が、洗浄媒質として使用される。試料中に存在する非特異的に結合したタンパク質を完全に洗浄するのに十分な容量での１〜６回の洗浄を使用することができる。
【００５９】
洗浄後、二次抗体を含有する溶液が加えられる。この抗体は、存在する他の構成要素から識別することができるのに十分な特異性を有し、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３によりコードされたタンパク質の１つと結合すると思われる。二次抗体は、結合の直接的または間接的定量を促進するために標識することができる。二次受容体結合の直接測定を可能にする標識の例は、例えば３Ｈまたは１２５Ｉのような放射性標識、蛍光剤、色素、ビーズ、化学発光剤、コロイド状粒子などである。結合の間接的測定を可能にする標識の例は、基質が呈色または蛍光産物を生じる酵素を含む。好ましい態様において、これらの抗体は、適当な基質の添加後に、検出可能な生成シグナルを提供することが可能である共有結合した酵素により標識される。複合体における使用に適した酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、マレイン酸デヒドロゲナーゼなどを含む。このような抗体−酵素複合体が市販されていない場合は、当業者に公知の技術により容易に作出することができる。このインキュベーション時間は、標識されたリガンドの利用可能な分子への結合に十分なものである。一般に、約０．１〜３時間で十分であり、通常１時間で十分である。
【００６０】
二次結合工程の後、不溶性支持体を再度、非特異的に結合した物質を含まないよう洗浄し、標的タンパク質と特異的結合メンバーの間で形成された特異的複合体を残留させる。結合した複合体により生成されたシグナルは、従来の方法により検出される。酵素複合体が使用される場合、検出可能な産物が形成されるように、適当な酵素基質が提供される。
【００６１】
別の免疫アッセイ法が当技術分野において公知であり、診断薬としての使用を見出すことができる。オクタロニープレートは、抗体結合の簡単な測定を提供する。ウェスタンブロットは、タンパク質ゲルまたはフィルター上のタンパク質スポットについて、望ましい配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に相当する癌関連キナーゼに特異的な検出系を用い、サンドイッチアッセイ法について説明されたような標識法を都合良く用い行うことができる。
【００６２】
場合によっては、競合アッセイ法を行うことができる。患者試料に加え、標的化されたタンパク質の競合体が、反応混合液へ添加される。この競合体および配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に相当する癌関連キナーゼは、特異的結合パートナーへの結合に関して競合する。通常、この競合体分子は、前述のように標識されかつ検出される。競合体結合の量は、存在する標的タンパク質の量に比例する。競合体分子の濃度は、最も感度の良い直線の検出範囲をもたらすために、最高予想タンパク質濃度の約１０倍からほぼ等濃度までであると考えられる。
【００６３】
一部の態様において、これらの方法は、例えば、癌細胞がどこに存在するかを位置づけまたは部位を確定するために、インビボ用途に適合される。これらの態様において、検出可能に標識された部分、例えば配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３の１つによりコードされたタンパク質に特異的である抗体が個体に投与され（例えば注射による）、標識された細胞は、磁気共鳴画像、コンピュータ断層走査法などを含むが、これらに限定されるものではない標準の画像形成技術を用いて位置づけられる。この方法において、癌細胞は示差的に標識される。
【００６４】
この検出法は、キットの一部として提供することができる。従って本発明はさらに、生物学的試料中の、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に相当するｍＲＮＡ、および／またはそれらによりコードされたポリペプチドの存在を検出するためのキットを提供する。これらのキットを使用する手法は、臨床検査室、実験室、開業医、または私的に個人により行うことができる。ポリペプチドを検出するための本発明のキットは、ポリペプチドに特異的に結合する部分を含み、これは特異的抗体であることができる。核酸を検出するための本発明のキットは、このような核酸と特異的にハイブリダイズする部分を含む。このキットは、任意に、緩衝液、呈色剤（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｒｅｇｅｎｔ）、標識、反応性表面、検出手段、対照試料、標準、指示書、および解釈用情報を含むが、これらに限定されるものではない手法において有用である追加の構成要素を提供する。
【００６５】
分析用試料
対象となる試料は、腫瘍組織、例えば切除試料、生検標本、腫瘍が転移している場合は血液試料などを含む。特に興味深いのは、固形腫瘍、例えば癌腫であり、肝臓および結腸の腫瘍を含むが、これらに限定されるものではない。対象となる肝臓癌は、肝細胞癌腫（原発性肝癌）である。これは肝細胞癌とも称され、原発性肝癌の最も一般的な形状である。Ｂ型およびＣ型肝炎による慢性感染症は、この種の癌の発症リスクを増大する。他の原因は、癌誘発物質、アルコール中毒、および慢性肝硬変である。その他の本方法による分析に関して対象となる癌は、出産適齢期の女性に最も頻繁に生じる良性腫瘍である、肝細胞腺腫；異常な血管塊を含む一種の良性腫瘍である、血管腫；肝臓または胆管内の胆汁通路（ｂｉｌｅ ｃｈａｎｎｅｌ）の内層を起源とする、胆管癌；乳児および小児において一般的である、肝芽細胞腫；肝臓の血管を起源とする希少癌である、血管肉腫；ならびに、胆管癌および肝嚢胞である。肺、乳房、結腸、膵臓および胃ならびに血液細胞に起源を持つ癌は、通常それらが転移した後に、肝臓において発見される。
【００６６】
結腸癌も興味深い。結腸および直腸のポリープ型は、腸壁から生じ、管腔へとつきだしている組織塊であるポリープを含む。ポリープは、無茎性または有茎性であり、サイズはかなり変動する。このような病巣は、組織学的に、管状腺腫、管状絨毛腺腫（絨毛腺ポリープ）、絨毛（乳頭）腺腫（腺癌を伴うまたは伴わない）、増殖性ポリープ、過誤腫、若年性ポリープ、ポリープ状癌腫、偽ポリープ、脂肪腫、平滑筋腫、または他の希少腫瘍として分類される。
【００６７】
スクリーニング法
標的スクリーニング　配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に特異的な試薬を用い、腫瘍細胞においてコードタンパク質の標的を同定する。例えば、核酸コード配列の１つを、腫瘍細胞へ、誘導可能な発現系を用いて導入することができる。適当な陽性対照および陰性対照が含まれる。例えばアデノウイルスベクターを使用する一過性トランスフェクションアッセイ法を行うことができる。この細胞系は、キナーゼ発現を伴うまたは伴わない形質転換された細胞における遺伝子発現パターンの比較を可能にする。あるいは、発現誘導後のリン酸化パターンが試験される。推定標的遺伝子の遺伝子発現は、候補遺伝子と被験試料およびキナーゼの遺伝子発現が誘導されない陰性対照との、ノーザンブロットによるか、またはマイクロアレイのプロービングによりモニタリングすることができる。リン酸化のパターンは、細胞または溶解液を、標識したリン酸と共にインキュベーションし、その後一次元または二次元タンパク質ゲル分析を行い、当技術分野において公知のＭＡＬＤＩ、微量配列決定（ｍｉｃｒｏ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ウェスタンブロット分析などにより標的を同定する。
【００６８】
本方法により同定された配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に相当する対象となる癌関連キナーゼの可能性のある標的遺伝子の一部は、遺伝子発現またはシグナル伝達の複雑なカスケードまたはシグナル伝達において二次的または三次的である。対象となるキナーゼ活性化の一次標的を同定するために、発現またはリン酸化は、発現の誘導後間もなく（１〜２時間以内に）、またはシクロヘキシミドによるカスケード内の後の工程の阻害後に試験されると思われる。
【００６９】
この方法で同定される標的遺伝子またはタンパク質は、さらに原発性患者試料における発現についても分析することができる。配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に相当する対象となる癌関連キナーゼおよび標的遺伝子発現のデータは、統計解析を用いて分析し、相関関係を確立することができる。
【００７０】
化合物スクリーニング　シグナル伝達経路中の多くの構成要素の利用可能性は、その経路のインビトロ再構成、および／または標的に対するキナーゼ作用の評価を可能にする。２種またはそれ以上の構成要素を、インビトロで混合し、その挙動を、特異的標的配列の転写活性化；タンパク質構成要素の修飾、例えばタンパク質分解性プロセシング、リン酸化、メチル化など；異なるタンパク質構成要素の互いの結合能などに関して評価される。これらの構成要素は、特異的ドメインの機能役割を決定するために、配列の欠失、置換などにより修飾することができる。
【００７１】
化合物スクリーニングは、インビトロモデル、遺伝的に変更された細胞もしくは動物、または配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３のいずれか１つに相当する精製タンパク質を用いて行うことができる。コードされたポリペプチドへの結合、その作用を調節または模倣するリガンドまたは基質を同定することができる。対象領域には、例えば、癌、再狭窄、骨関節炎、転移などの過増殖性疾患の治療の開発を含む。
【００７２】
ポリペプチドは、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に加え、遺伝暗号の縮重を考慮し、開示された核酸と配列が同じでない核酸によりコードされたもの、およびそれらの変種を含む。変種ポリペプチドは、アミノ酸（ａａ）の置換、付加、または欠失を含むことができる。アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換、あるいは、例えばグリコシル化部位、リン酸化部位、もしくはアセチル化部位を変更するための、または機能には必要ではない１個もしくは複数個のシステイン残基の置換もしくは欠失によるミスフォールディングを最小化するための、非必須アミノ酸を除外するための置換であることができる。変種は、タンパク質の特定領域（例えば、機能ドメイン、および／または、そのポリペプチドがタンパク質ファミリーのメンバーである場合、コンセンサス配列と会合された領域）において増強された生物活性を保持または保有するように設計される。変種はさらに、本明細書において開示されたポリペプチド断片、特に生物活性のある断片および／または機能ドメインに対応する断片を含む。対象となる断片は、典型的には長さが少なくとも約１０個のアミノ酸から少なくとも約１５個のアミノ酸であり、通常少なくとも約５０個のアミノ酸長であり、かつ３００個のアミノ酸長であるかまたはそれよりも長いことができるが、通常は約５００個のアミノ酸長を超えない。ここで、断片は、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３によりコードされたポリペプチドまたはそれらのホモログと同じであるアミノ酸の連続的伸長（ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ ｓｔｒｅｔｃｈ）を有する。
【００７３】
それらに由来するトランスジェニック動物または細胞も、化合物スクリーニングにおいて使用することができる。トランスジェニック動物は、相同組換えにより作出することができ、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に相当する正常遺伝子座が変更される。あるいは、核酸構築物が、ゲノムへ無作為に組込まれる。安定した組込みのためのベクターは、プラスミド、レトロウイルス、および他の動物ウイルス、ＹＡＣなどを含む。キナーゼ活性、発癌、シグナル伝達などにおける様々なエキソンの役割を決定するために、一連の小さい欠失および／または置換をコード配列中に作成することができる。対応するキナーゼの発現が、特異的に低下されるかまたは失われている、癌のためのトランスジェニック動物モデルを作出するのには、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３の使用が興味深い。対象となる特異的構築物は、標的化された遺伝子の発現およびドミナントネガティブ変異の発現をブロックするアンチセンス配列を含む。検出可能なマーカー、例えばｌａｃ Ｚは、対象となる遺伝子座に導入することができ、そこでの発現の上方制御により、表現型の容易に検出できる変化が生じる。さらに通常はそれが発現されないかもしくは異常に多く発生しているような細胞または組織における標的遺伝子またはそれらの変種の発現を提供することもできる。通常はそれが生成されない細胞における標的タンパク質の発現を提供することにより、例えば細胞成長および腫瘍発生の制御などにおける細胞挙動の変化を誘導することができる。
【００７４】
化合物スクリーニングは、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に相当する癌関連キナーゼの機能を調節する物質を同定する。その機能を模倣する物質は、細胞分裂および増殖の過程を活性化すると予想される。逆に、機能を阻害する物質は、形質転換を阻害することがある。特に興味深いのは、ヒト細胞にとって毒性が低い物質のスクリーニングアッセイ法である。多種多様なアッセイ法を、この目的に使用することができ、これは標識されたインビトロタンパク質−タンパク質結合アッセイ法、電気泳動移動度シフトアッセイ法、タンパク質結合に関する免疫アッセイ法などがある。精製された組換えタンパク質の結晶化に由来したコードタンパク質の三次元構造に関する知識により、活性を特異的に阻害する小型の薬物の理論的設計がもたらされる可能性がある。これらの薬物は、特異的ドメイン、例えばキナーゼ触媒ドメイン、調節ドメイン、自己抑制ドメインなどに作用することができる。
【００７５】
本明細書において使用される「物質」という用語は、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に相当する癌関連キナーゼの生理的機能を変更または模倣する能力を有する、例えばタンパク質または薬学的な分子を説明している。一般に、様々な濃度に対する示差的反応を得るために、複数のアッセイ混合物が、異なる物質濃度で並行して試される。典型的には、これらの濃度の１つは、陰性対照、すなわちゼロ濃度または検出レベルを下回る濃度として使用される。
【００７６】
候補物質は、多くの化学的種類を包含しているが、典型的にはこれらは有機分子、好ましくは分子量が５０ダルトンより大きくかつ約２，５００ダルトン未満である小型の有機化合物である。候補物質は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含み、これは典型的には、少なくともアミン基、カルボニル基、ヒドロキシル基、またはカルボキシル基を含み、好ましくはこれらの官能化学基の少なくとも２種を含む。これらの候補物質は、しばしば１個または複数個の前記官能基で置換された環式炭素またはヘテロ環式構造および／または芳香族もしくはポリ芳香族（ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ）構造を含む。候補物質はさらに、ペプチド、糖、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体または組合せを含む生体分子において認められる。
【００７７】
候補物質は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む多種多様な給源から得られる。例えば、多種多様な有機化合物および生体分子の無作為かつ方向性のある合成のために、無作為化されたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、多くの手段を利用することができる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形の天然化合物のライブラリーが、利用可能であるか、または容易に作成される。加えて、天然または合成により作成されたライブラリーおよび化合物は、従来型の化学的、生理学的および生化学的手段を用い容易に修飾され、コンビナトリアルライブラリーを作成するために使用することができる。公知の薬理学的物質に、構造類似体を生成するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの、方向性のあるまたは無作為の化学修飾を施してもよい。
【００７８】
スクリーニングアッセイ法が結合アッセイ法である場合、１個または複数の分子が、直接的または間接的に検出可能なシグナルを生じうる標識と結合される。様々な標識には、放射性同位元素、蛍光剤、化学発光剤、酵素、特異的結合分子、粒子、例えば磁気粒子などが含まれる。特異的結合分子は、例えばビオチンおよびストレプトアビジン、ジゴキシンおよびアンチジゴキシンなどの対を含む。特異的結合メンバーについて、相補的メンバーは、通常公知の方法に従い検出を提供する分子により標識されると考えられる。
【００７９】
様々な他の試薬を、スクリーニングアッセイ法に含めても良い。これらは、最適なタンパク質−タンパク質結合を促進するか、および／または非特異的もしくはバックグラウンドの相互作用を減ずるために使用される、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤などの試薬を含む。プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤などのアッセイ効率を改善する試薬を使用することができる。これらの構成要素の混合物は、必要な結合を生じる順序で添加される。インキュベーションは、最適な温度、典型的には４〜４０℃で行われる。インキュベーション時間は、活性が最適であるように選択されるが、迅速なハイスループットスクリーニングを促進するように最適化される。典型的には０．１〜１時間で十分であると思われる。
【００８０】
対象となる他のアッセイ法は、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に相当する癌関連キナーゼの機能を模倣する物質を検出する。例えば、この遺伝子を含む発現構築物は、発現を可能にする条件下で細胞株に導入することができる。キナーゼ活性レベルは、機能アッセイ法、例えばタンパク質リン酸化の検出により決定される。あるいは、候補物質が、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に相当する機能的癌関連キナーゼを欠損している細胞へ添加され、機能アッセイ法において活性を再生する能力がスクリーニングされる。
【００８１】
所望の薬学的活性を有する化合物を、癌の治療などのために宿主へ生理的に許容される担体中で投与することができる。これらの化合物は、さらに創傷治癒、細胞増殖などにおける機能を増強するためにも使用することができる。これらの阻害物質は、経口的、局所的、非経口的、例えば皮下、腹腔内、ウイルス感染により、血管内などの様々な方法で投与することができる。局所的な処置は、特に興味深い。化合物は、導入法に応じ、様々な方法で製剤化することができる。製剤中の治療上有効な化合物の濃度は、約０．１〜１０重量％で変動することができる。
【００８２】
製剤　本発明の化合物は、治療的投与のために様々な製剤へ混入することができる。特に、配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に相当する癌関連キナーゼの活性を調節する物質、またはそれらのポリペプチドおよび類似体は、標的活性が望ましくないほど高いかまたは低い細胞の治療のため、例えば癌細胞における活性レベルを低下するために、患者に投与するように製剤化される。より詳細に述べると、本発明の化合物は、適当な薬学的に許容される担体または希釈剤と組合わせることにより、薬学的組成物に製剤化することができ、かつ錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸引剤、ゲル剤、ミクロスフェアおよびエアゾールのような固形、半固形、液体または気体の形状の調製物中に製剤化することができる。このようにこの化合物の投与は、経口、舌下、直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内などの投与を含む、様々な方法で実現することができる。この物質は、投与後全身性であるか、または移植部位で活性量を維持するように作用する植込剤の使用により限局化することができる。
【００８３】
薬学的剤形において、これらの化合物は、薬学的に許容される塩の形で投与されるか、またはこれらは単独でもしくは適当な会合において、さらには他の薬学的活性化合物と組合わせて使用することもできる。以下の方法および賦形剤は、単に例示的なものであり、いかなる意味においても限定するものではない。
【００８４】
経口調製物について、化合物は、錠剤、散剤、顆粒剤またはカプセル剤を製造するために、単独で、または適当な添加剤との組合わせで、例えば乳糖、マンニトール、トウモロコシデンプンまたはジャガイモデンプンなどの従来型添加剤；晶質セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、トウモロコシデンプンまたはゼラチンなどの結合剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプンまたはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤；タルク、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；および望ましい場合には、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、保存剤、香味料と共に使用することができる。
【００８５】
これらの化合物は、水性または非水性溶媒、例えば植物油もしくは他の同様の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル、またはプロピレングリコール中に、これらを溶解、懸濁、または乳化することにより；ならびに、望ましいならば、可溶化剤、等張剤、懸濁化剤、乳化剤、安定剤および保存剤などの従来型の添加剤と共に、注射用調製物に製剤化することができる。
【００８６】
化合物は、吸引により投与するためにエアゾール製剤においても使用することができる。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などのような、加圧された許容される噴射剤に製剤化することができる。
【００８７】
さらに、化合物は、乳化基剤または水溶性基剤のような様々な基剤と混合することにより坐剤を製造することができる。本発明の化合物は、坐剤により経直腸的に投与することができる。坐剤は、ココアバター、カーボンワックスおよびポリエチレングリコールのような、体温で溶融するが室温では凝固している溶剤を含有することができる。
【００８８】
シロップ剤、エリキシル剤、および懸濁剤などの経口または経直腸投与のための単位剤形は、各単位用量、例えば小さじ一杯、大さじ一杯、錠剤または坐剤が、本発明の化合物を１種または複数種含む組成物を予め決められた量含有するように提供され得る。同様に、注射または静脈内投与のための単位剤形は、滅菌水、通常の食塩水または他の薬学的に許容される担体中の溶液のように、組成物中に本発明の化合物を含むことができる。
【００８９】
徐放型製剤のための植込み剤は、当技術分野において周知である。植込み剤は、生分解性または非生分解性ポリマーと共に、ミクロスフェア、スラブなどとして製剤化される。例えば乳酸および／またはグリコール酸のポリマーは、宿主の忍容性が良好な侵食性（ｅｒｏｄｉｂｌｅ）ポリマーを形成する。この植込み剤は、病巣近傍部位に配置され、その結果、有効物質の局所濃度が、生体の他の部分に比べ増大する。
【００９０】
本明細書において使用される「単位剤形」という用語は、ヒトおよび動物対象のための単一用量として適した物理的に個別の単位を意味し、各単位は、望ましい効果を生じるのに十分な量として計算された、予め決定された量の本発明の化合物を、薬学的に許容される希釈剤、担体、または溶剤と会合して含有する。本発明の新規の単位剤形の規格は、使用される具体的化合物および達成されるべき効果、ならびに宿主における各化合物に関連した薬力学によって決定される。
【００９１】
薬学的に許容される賦形剤、例えば溶剤、アジュバント、担体、または希釈剤は、容易に公に入手できる。さらに薬学的に許容される補助物質、例えばｐＨ調節剤および緩衝剤、張度調節剤、安定化剤、湿潤剤などは、容易に公に入手できる。
【００９２】
全身投与のための典型的用量は、１回の投与につき対象の体重１ｋｇ当り０．１μｇ〜１００ｍｇの範囲である。典型的用量は、１日２〜６回摂取される錠剤１錠であるか、または１日１回摂取され、比例してより含量の多い有効成分を含む徐放型のカプセル剤または錠剤１個であることができる。徐放型作用は、様々なｐＨ値で溶解するカプセル材料によるか、浸透圧により緩徐に放出するカプセルによるか、またはその他の公知の管理された放出手段により得ることができる。
【００９３】
当業者により、用量レベルが特定の化合物、症状の重症度、および対象の副作用の易罹患性の関数として変動し得ることが容易に理解されると思われる。一部の特定の化合物は、他のものよりもより効力がある。所定の化合物の好ましい用量は、様々な手段により当業者により容易に決定される。好ましい手段は、所定の化合物の生理的効力の測定である。
【００９４】
送達溶剤としてのリポソームの使用も興味深い方法の１つである。リポソームは、標的部位の細胞に融合され、その管腔の内容物を細胞内に送達する。リポソームは、単離、結合試薬などの接触を維持するための様々な手段などを使用して、融合に十分な時間細胞との接触を維持する。本発明の１つの局面において、リポソームは、肺への投与のためにエアゾールであるように設計される。リポソームは、センダイウイルスまたはインフルエンザウイルスなどの、膜の融合を媒介する精製されたタンパク質またはペプチドにより調製することができる。これらの脂質は、ホスファチジルコリンのようなカチオン性脂質を含む公知のリポソーム形成脂質の有用な組合せであってよい。残りの脂質は、通常、中性脂質、例えばコレステロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロールなどであると考えられる。
【００９５】
酵素活性の調節
配列番号：１、３、５、７、９、１１または１３に相当する癌関連キナーゼの活性をブロックする物質は、重要なシグナル伝達経路における介在ポイントを提供する。多くの物質が、この活性を低下させることに対して有用であり、前述のような発現を直接調節する物質、例えば発現ベクター、標的化されたキナーゼに特異的なアンチセンス；および、このタンパク質に作用する物質、例えば、特異的抗体およびそれらの類似体、触媒活性をブロックする小型の有機分子などを含む。
【００９６】
遺伝子、遺伝子断片、またはコードされたタンパク質もしくはタンパク質断片が、配列または発現の欠損に関連した疾患を治療するための療法において有用である。治療の観点から、活性の阻害は、炎症、再狭窄、および癌を含む、多くの増殖性疾患に対し治療効果を有する。阻害は、多くの方法で実現される。発現を阻害するためには、アンチセンス配列を投与することができる。偽基質阻害剤、例えば、キナーゼの基質を模倣するペプチドを用いて、活性を阻害することができる。他の阻害剤は、例えばインビトロまたはインビボでのキナーゼ活性の機能アッセイ法における生物活性のスクリーニングにより同定される。
【００９７】
発現ベクターを用いて、標的遺伝子を細胞へ導入することができる。このようなベクターは一般に、核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列の近傍に位置した通常の制限酵素切断部位を有する。転写開始領域、標的遺伝子、またはそれらの断片、および転写終結領域を含む転写カセットを調製することができる。この転写カセットは、様々なベクター、例えばプラスミド；レンチウイルスのようなレトロウイルス；アデノウイルスなどに導入することができ、これらのベクターは、一過性にまたは安定して細胞において、通常短くとも約１日間、より一般的には短くとも数日間から数週間の間維持することができる。
【００９８】
遺伝子またはタンパク質は、ウイルス感染、微量注入、または小胞融合を含む、任意の多くの経路により、組織または宿主細胞へ導入することができる。Ｆｕｒｔｈらの論文（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、２０５：３６５−３６８（１９９２））に記されたような噴射型注射（ｊｅｔ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）も、筋肉内投与のために使用することができる。ＤＮＡは、金微粒子にコーティングされ、粒子衝突装置（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）または文献（例えば、Ｔａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ、３５６：１５２−１５４（１９９２））に記されたような「遺伝子銃」により皮内送達することができ、金微小発射体はタンパク質またはＤＮＡによりコーティングされ、その後、皮膚細胞へ衝突させる。
【００９９】
アンチセンス分子を用い、細胞における発現を下方制御することができる。このアンチセンス試薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、特に天然の核酸由来の化学的修飾を有する合成ＯＤＮ、またはこのようなアンチセンス分子をＲＮＡとして発現する核酸構築物であることができる。アンチセンス配列は、標的化された遺伝子のｍＲＮＡに相補的であり、標的化された遺伝子産物の発現を阻害する。アンチセンス分子は、例えば翻訳に利用可能なｍＲＮＡ量の減少によるなどの様々な機構を通じて、ＲＮＡｓｅ Ｈの活性化、または立体障害を通じて、遺伝子発現を阻害する。単一のまたは組合せたアンチセンス分子を投与することができ、組合せは複数の異なる配列を含み得る。
【０１００】
アンチセンス分子は、適当なベクター中の標的遺伝子配列の全てまたは一部の発現により作出することができ、転写開始は、アンチセンス鎖がＲＮＡ分子として作成されるように方向付けられる。あるいは、アンチセンス分子は、合成オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、一般に少なくとも約７個のヌクレオチド、通常少なくとも約１２個、より一般的には少なくとも約２０個であり、その長さは約５００個より多いことはなく、通常約５０個を超えず、より一般的には約３５個のヌクレオチドを超えず、この長さは、阻害効率、交差反応性の不在を含む特異性などにより決定される。長さが７〜８塩基の短いオリゴヌクレオチドは、遺伝子発現の強力かつ選択的阻害剤であることがわかっている（Ｗａｇｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１４：８４０−８４４（１９９６）参照）。
【０１０１】
内在性センス鎖ｍＲＮＡ配列の１つまたは複数の特異的領域は、アンチセンス配列により相補されるように選択される。オリゴヌクレオチドのための特異的配列の選択は、経験的方法を用いることができ、いくつかの候補配列が、インビトロまたは動物モデルにおける標的遺伝子の発現の阻害についてアッセイされる。配列の組合せも使用することができ、ｍＲＮＡ配列のいくつかの領域が、アンチセンス相補のために選択される。
【０１０２】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野において公知の方法により化学合成することができる（Ｗａｇｎｅｒら、（１９９３）前掲、およびＭｉｌｌｉｇａｎら、前掲参照）。好ましいオリゴヌクレオチドは、それらの細胞内安定性および結合親和性を増大するために、天然型ホスホジエステル構造から化学的に修飾される。多くのこのような修飾が文献に説明されているが、これらは骨格、糖、またはヘテロ環式塩基の化学を変更する。
【０１０３】
骨格の化学における有用な変化は、ホスホロチオエート；両方の非架橋酸素が硫黄と置換されている、ホスホロジチオエート；ホスホロアミダイト；アルキルホスホトリエステルおよびボラノホスフェート（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）である。アキラルリン酸誘導体は、３’−Ｏ’−５’−Ｓ−ホスホロチオエート、３’−Ｓ−５’−Ｏ−ホスホロチオエート、３’−ＣＨ２−５’−Ｏ−ホスホネート、および３’−ＮＨ−５’−Ｏ−ホスホロアミダイトを含む。ペプチド核酸は、全リボースのホスホジエステル骨格をペプチド連結に置き換える。糖の修飾も、安定性および親和性を増大するために使用される。デオキシリボースのα−アノマーを使用することができ、この塩基は天然型β−アノマーに関して逆位になっている。リボース糖の２’−ＯＨは、２’−Ｏ−メチルまたは２’−Ｏ−アリル糖を形成するように変更され、これは親和性を含まない分解に対する抵抗性をもたらす。ヘテロ環式塩基の修飾は、適当な塩基対形成が維持されなければならない。いくつかの有用な置換は、デオキシウリジンのデオキシチミジンへ；５−メチル−２’−デオキシシチジンおよび５−ブロモ−２’−デオキシシチジンのデオキシシチジンへの置換を含む。５−プロピオニル−２’−デオキシウリジンおよび５−プロピオニル−２’−デオキシシチジンは、各々、デオキシチミジンおよびデオキシシチジンと置換された場合に、親和性および生物活性の増大を示している。
【０１０４】
実施例
下記の実施例は、本発明を作成および使用する方法に関する完全な開示および説明を当業者に提供するために示されており、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を制限することを意図するものでも、下記実験が実施した実験の全てまたは一部であることを表すことを意図するものでもない。使用した数値（例えば量、温度など）に関して精度保証に努めたが、若干の実験誤差および偏差は考慮されなければならない。特に記さない限りは、部分は質量部であり、分子量は質量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはその近傍である。
【０１０５】
本願明細書に引用された全ての刊行物および特許明細書は、各々個別の刊行物および特許明細書が具体的かつ個々に参照として本明細書に組入れられていることが記されるように本明細書に参照として組入れられている。
【０１０６】
本発明は、本発明の実践のための好ましい様式を含むことが本発明者らにより発見されるかまたは提唱された特定の態様に関して説明されている。当業者には、本開示に照らして、本発明の意図された範囲から逸脱しない限りは例示された特定の態様において多くの修飾および変更を行うことができることが理解されると思われる。例えばコドンの縮重のために、タンパク質配列に影響を及ぼすことなく基礎となるＤＮＡ配列を変更することができる。さらに、生物機能の同等物を考慮し、生物学的作用の種類または量に影響を及ぼすことなく、タンパク質構造を変更することができる。このような修飾は全て、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【０１０７】
実施例１
ＭＡＰ３Ｋ１１
Ｇｅｎｂａｎｋデータベースを、ＥＳＴについて検索し、「基本的ローカルアライメント検索手段（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）」プログラムであるＴＢＬＡＳＴＮをデフォルト設定で用い、公知のキナーゼドメイン関連タンパク質との類似性を示した。これらの公知のキナーゼドメインとの類似性を有すると同定されたヒトＥＳＴ（ｐ＜０．０００１と定義）は、ＧｅｎＢａｎｋ非重複性（ｎｏｎ−ｒｅｄｕｎｄａｎｔ：ＮＲ）データベースのＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸスクリーニングにおいて使用した。
【０１０８】
１００個のアミノ酸にわたり＞９５％の同一性を有する最高のヒトヒットを有するＥＳＴは、破棄した。これは、通常これらの配列は、配列誤差に起因した差異を伴い、開始プローブ配列と同一であるという、本発明者らの経験に基づいていた。各ＥＳＴに関する残余のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアウトプットは、手作業で試験し、すなわち本発明者らが公知のキナーゼドメイン関連プローブ配列からの変動が乏しいデータベース配列の結果であると決定した場合は、そのＥＳＴを本解析から除外した。乏しいデータベース配列は、通常ＢＬＡＳＴＮ検索のためのデータベース配列中の多くの「Ｎ」ヌクレオチドとして、およびＢＬＡＳＴＸアウトプットに関してペプチドフレムシフトを生じるデータベース配列中の塩基欠失または挿入として同定された。最高スコア化のマッチが非キナーゼドメイン関連配列に対してであるＥＳＴも、この段階で除外した。
【０１０９】
広く知られているアルゴリズム、例えば「Ｓｍｉｔｈ／Ｗａｔｅｒｍａｎ」、「Ｆａｓｔａ」、「ＦａｓｔＰ」、「Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ／Ｗｕｎｓｃｈ」、「Ｂｌａｓｔ」、「ＰＳＩ Ｂｌａｓｔ」などを使用し、対象核酸と他の公知の核酸との相同性を決定した。本発明の対象核酸と公知の配列との相同性を決定するためには、「Ｌｏｃａｌ ＦａｓｔＰ Ｓｅａｒｃｈ」アルゴリズムを行った。その後、典型的にはｋｔｕｐ値１〜３の範囲、および典型的にはセグメント長値２０〜２００を、パラメータとして選択した。次にプローブ配列について位置のアレイを構築し、そこではアレイの細胞は、長さｋｔｕｐのそのサブストリング（ｓｕｂｓｔｒｉｎｇ）の位置リストを含む。この位置アレイの各サブ配列について、標的配列がマッチし、かつ標的位置およびプローブサブ配列位置により定義された対角線に相当するスコアアレイ細胞を増強した。次にリストを作成し、スコアおよびレポートにより検索した。完全なマッチおよびミスマッチに関する判定基準は、そのアルゴリズムおよびそのデータベースの統計学的特性に基づき、典型的値は：２００個を超えるヌクレオチドについての９８％またはそれ以上のマッチは、マッチを構成し；および、２０個のヌクレオチドにおける何らかのミスマッチは、ミスマッチを構成するものとした。
【０１１０】
ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアウトプットの解析は、例えば公知のキナーゼドメイン関連タンパク質と相同性はあるが同一ではないキナーゼドメイン関連タンパク質をコードする配列と関連する可能性のあるＩＭＡＧＥクローンＡＩ８０３７５２からのＥＳＴ配列を同定した。
【０１１１】
ＭＡＰ３Ｋ１１ ＥＳＴの同一性が発見された後、これらのクローンは、腫瘍試料中の遺伝子発現の分析のために、Ｋｉｎｅｔｅｋのクローンバンクへ追加された。遺伝子発現作業は、ユニジーン（ｕｎｉｇｅｎｅ）クラスタの構築に関連し、これは「ｐｋｓ」データベース中のエントリーにより表される。これらのクラスタのメンバーのアクセッション番号の一覧を割当てた。これらのクラスタからのクローンバンクに既に存在するクラスタの差引きは、Ｋｉｎｅｔｅｋのクローンバンクにおいて先に示されていないクラスタの一覧に最近加えられた。これらの各クラスタについて、ＥＳＴ ＩＭＡＧＥアクセッション番号の無作為選択が、クラスタを維持するために選択された。ＥＳＴ ＩＭＡＧＥクローンを有さないクラスタの各々については、クローンの順番付けまたは構築が実行されるためのレポートの作成を、一件単位で行った。クラスタ内にはないアクセッション番号の一覧が構築され、レポートが作成された。
【０１１２】
ＡＩ８０３７５２ ＩＭＡＧＥクローンは、３７７自動ＤＮＡシーケンサー上で、標準ＡＢＩ色素プライマーおよび色素ターミネーター化学物質を用い、配列決定した。配列決定は、この配列が配列番号：１に相当することを明らかにした。
【０１１３】
ｃＤＮＡ末端急速増幅法（ＲＡＣＥ）
遺伝子特異的オリゴデオキシヌクレオチドプライマー配列番号：１５および１６を設計し、次に５プライムＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端急速増幅法；Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃｅｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５：８８９８−９００２（１９８８））により、完全長ＭＡＰ３Ｋ１１ ｃＤＮＡの構築に使用した。
【０１１４】
Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ（商標）ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、パロアルト、ＣＡ）により提供された入れ子式プライマー方法を、ヒト脳ｃＤＮＡについて使用した。その後、ＰＥ ＤＮＡサーマルサイクラー４８０（Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ４８０）上でサーマルサイクリングを行った。サイクリングが完了した時点で、このＰＣＲ産物を、適当なＤＮＡサイズマーカーと共に、１．０％アガロース／ＥｔＢｒゲル上で分析した。
【０１１５】
このようにして得られた産物は、配列番号：１の配列を有するＭＡＰ３Ｋ１１ポリヌクレオチドを含んだ。
【０１１６】
ＭＡＰ３Ｋ１１の発現分析
ＭＡＰ３Ｋ１１の発現をドットブロット分析により決定し、このタンパク質は、いくつかの腫瘍試料において上方制御されることがわかった。
【０１１７】
ドットブロット調製　全ＲＮＡを、同一患者から採取した臨床癌試料および対照試料から精製した。肝癌および結腸癌の両試料由来の試料を使用した。逆転写酵素を用い、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡから合成した。放射標識したｃＤＮＡを、Ｓｔｒｉｐ−ＥＺ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ社、オースチン、ＴＸ）を使用して、製造業者の指示に従い合成した。次にこれらの標識し増幅したｃＤＮＡをプローブとして使用し、ヒトＭＡＰ３Ｋ１１を含むヒトプロテインキナーゼアレイへハイブリダイズした。各整列されたＥＳＴクローンにハイブリダイズした放射標識したプローブの量は、リン光造影（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ）を用いて検出した。ＭＡＰ３Ｋ１１の発現は、試験した腫瘍組織において実質的に上方制御された。データは、表１に、対照非腫瘍試料に対する増加の倍数として表した。
【０１１８】
【表１】
2004514425.tif 000002
【０１１９】
表２に示した結果は、患者試料の病理学的報告を簡単に要約している。
【０１２０】
【表２】
2004514425.tif 000003
【０１２１】
実施例２
ＣａＭＫ−Ｘ１
Ｇｅｎｂａｎｋデータベースを、ＥＳＴについて検索し、「基本的ローカルアライメント検索手段（ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）」プログラムであるＴＢＬＡＳＴＮをデフォルト設定で用い、公知のキナーゼドメイン関連タンパク質との類似性を示した。これらの公知のキナーゼドメインとの類似性を有すると同定されたヒトＥＳＴ（ｐ＜０．０００１と定義）は、ＧｅｎＢａｎｋ非重複性（ＮＲ）データベースのＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸスクリーニングにおいて使用し、触媒ドメインＣａＭＫ−Ｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ ｈｓ２７２Ｉ１６１）配列に対して検索した。配列スクリーニングは実施例１に示したように行った。
【０１２２】
ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアウトプットの解析は、例えば公知のキナーゼドメイン関連タンパク質と相同性があるが同一ではないキナーゼドメイン関連タンパク質をコードする配列と関連する可能性のあるＩＭＡＧＥクローンＡＡ８３８３７２からのＥＳＴ配列を同定した。さらに、ＣａＭＫ−Ｘ１は、カルモジュリン依存性プロテインキナーゼファミリーのメンバーと類似した配列を有することがわかった。報告されたＡＡ８３８３７２ ＩＭＡＧＥクローンの５’ ＥＳＴのヌクレオチド配列は、配列番号：１の約４００個のヌクレオチドに相当している。ユニジーン（ＵｎｉＧｅｎｅ）データベースを検索したところ、ＡＡ８３８３７２ ＩＭＡＧＥ クローンの５’ ＥＳＴは、新規ヒト遺伝子であることが示された。
【０１２３】
ＡＡ８３８３７２ ＩＭＡＧＥクローンは、３７７自動ＤＮＡシーケンサー上で、標準ＡＢＩ色素プライマーおよび色素ターミネーター化学物質を用い、配列決定した。配列決定は、この配列が配列番号：３のヌクレオチド１〜２４４７に相当することを明らかにした。この遺伝子断片の分析は、この遺伝子産物が新規キナーゼドメイン関連タンパク質であることを明らかにし、以後ＣａＭＫ−Ｘ１と称された。
【０１２４】
ｃＤＮＡ末端急速増幅法（ＲＡＣＥ）
遺伝子特異的オリゴデオキシヌクレオチドプライマー
2004514425.tif 000004
を設計し、次に５プライムＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端急速増幅法；Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８５：８８９８−９００２（１９８８））により、完全長ＣａＭＫ−Ｘ１ ｃＤＮＡの構築に使用した。アダプタープライマー（ＡＰ１）をセンスプライマーとして使用し、配列番号：３をアンチセンスプライマーとして使用した。Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ（商標）ＲＡＣＥキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、パロアルト、ＣＡ）により提供された入れ子式プライマー方法を、胎児脳ｃＤＮＡについて使用した。その後、ＰＥ ＤＮＡサーマルサイクラー４８０上でサーマルサイクリングを行った。サイクリングが完了した時点で、このＰＣＲ産物を、適当なＤＮＡサイズマーカーと共に、１．０％アガロース／ＥｔＢｒゲル上で分析した。
【０１２５】
このようにして得られた産物は、配列番号：３の配列を有するＣａＭＫ−Ｘ１ポリヌクレオチドを含んだ。ＢＬＡＳＴＸ分析は、開始メチオニン残基が、ヌクレオチド１０に存在すること、および上流のインフレーム停止コドンがヌクレオチド１４９８に存在すること、および最長ＯＲＦ（配列番号：３）が４７６個のアミノ酸（配列番号：４）のタンパク質として推定されることを示した。
【０１２６】
ＣａＭＫ−Ｘ１の推定アミノ酸配列の相同性分析は、アミノ酸残基１１〜３３３のＣａＭＫ Ｉとの強力な配列同一性を明らかにした。ＣａＭＫ Ｉの対応する領域は、活性化に必要なトレオニン残基およびＣａＭと結合しない限りは活性部位上で折り畳まれている調節ドメインを含む（Ｍａｔｓｕｃｈｉｔａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７３：２１４７３−２１４８１（１９９８））。ＣａＭＫ−Ｘ１は同じく、高度に保存されたセリン／トレオニンキナーゼ活性部位と高度の相同性がある（４６％同一性）残基２３〜２７７の間に領域を有する。
【０１２７】
発現分析
ＣａＭＫ−Ｘ１の発現をノーザンブロット分析、およびドットブロット分析により決定し、このタンパク質は、いくつかの腫瘍試料において上方制御されることがわかった。正常組織において、ＣａＭＫ−Ｘ１は、脳において高度に発現され、腎臓および脾臓においては低いレベルで発現された。
【０１２８】
ドットブロット調製　全ＲＮＡを、同一患者から採取した臨床癌試料および対照試料から精製した。肝癌および結腸癌の両試料由来の試料を使用した。逆転写酵素を用い、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡから合成した。放射標識したｃＤＮＡを、Ｓｔｒｉｐ−ＥＺ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ社、オースチン、ＴＸ）を製造業者の指示に従い用い合成した。次にこれらの標識し増幅したｃＤＮＡをプローブとして使用し、ヒトＣａＭＫ−Ｘ１を含むヒトプロテインキナーゼアレイへハイブリダイズさせた。各整列されたＥＳＴクローンにハイブリダイズした放射標識したプローブの量は、リン光造影を用いて検出した。
【０１２９】
ＣａＭＫ−Ｘ１の発現は、試験した腫瘍組織において実質的に上方制御された。データは、表３に、対照非腫瘍試料に対する増加の倍数として表した。
【０１３０】
【表３】
2004514425.tif 000005
【０１３１】
機能アッセイ法
欠失変異体クローンを、インビボにおけるこのキナーゼの特徴決定において補助するために作出した。加えて、ＣａＭＫ−Ｘ１は、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞においてＳｅｒ１３３におけるＣＲＥＢをリン酸化し、このリン酸化は、カルモジュリン結合部位により制御されることが示されている。
【０１３２】
ＣａＭＫ−Ｘ１キナーゼ活性を、インビトロにおいては、３種の異なる方法を用いて示した。ＣａＭＫ−Ｘ１は、ＣａＭＫ−Ｘ１を過剰発現するＨｉ５昆虫細胞およびＨＥＫ２９３細胞から、ＧＳＴおよびＮｉ２＋アフィニティクロマトグラフィーを用いて精製した。さらに、ＣａＭＫ−Ｘ１は、Ｘ−ｐｒｅｓｓ融合タンパク質に対して示されたモノクローナル抗体を用い、免疫沈降により精製した。ＣａＭＫ−Ｘ１は、Ｃａ＋＋およびカルモジュリンの非存在下では、外来基質に対しては活性を示さなかった。Ｃａ＋＋およびカルモジュリンの存在下では、ＣａＭＫ−Ｘ１は、ＳｙｎｔｉｄｅおよびＣＲＥＢｔｉｄｅペプチドをリン酸化した。これは、ＣａＭＫ−Ｘ１がカルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼとして作用することを明らかにした最初の実験であった。
【０１３３】
クローニングおよびサブクローニング　 ＣａＭＫ−Ｘ１のクローニングならびにｃＤＮＡ発現ベクターおよびＣａＭＫ−Ｘ１欠失変異体の構築：ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーを、５’ＲＡＣＥシステムで使用した。ＣａＭＫ−Ｘ１の完全長ｃＤＮＡを作出するために、プライマー対を設計し、ＰＣＲ反応において使用した。
2004514425.tif 000006
ＣａＭＫ−Ｘ１のコード領域を、前記プライマー対を用いて増幅した。次に増幅産物を、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）Ｔ／Ａベクターへクローニングし、引き続き必要ならば別のベクターへクローニングした。ＣａＭＫ−Ｘ１のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ断片を、細菌発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３および哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ Ｂへクローニングした。全ての構築物を、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定により証明した。
【０１３４】
ＣａＭＫ−Ｘ１の組織分布　ＣａＭＫ−Ｘ１を使用し、ｍＲＮＡをプロービングおよびブロッティングし、市販のポリ−Ａ＋選択されたブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、パロアルト、ＣＡ）を用い、製造業者の指示に従いハイブリダイズした。ＣａＭＫ−Ｘ１クローン（配列番号：３に相当）を、Ｓｔｒｉｐ−ＥＺ ＰＣＲキット（Ａｍｂｉｏｎ社、オースチン、ＴＸ）を製造業者の指示に従い用い放射標識した。
【０１３５】
正常組織において、ＣａＭＫ−Ｘ１は、脳においてのみ高レベルで発現され、長さ約２．８ＫｂのｍＲＮＡにハイブリダイズすることがわかった。このｍＲＮＡは、腎臓および脾臓においては低レベルで発現された。ノーザンブロットにおけるｍＲＮＡの移動した位置は、分子量２．５〜２．７ｋｂと一致した。
【０１３６】
ＣａＭＫ−Ｘ１はＣｏｓ７細胞の増殖を増大させる　ＣａＭＫ−Ｘ１でトランスフェクションした場合のＣｏｓ７細胞の増殖速度を試験した。ＣａＭＫ−Ｘ１のレベルの増加は、細胞増殖に何らかの影響を及ぼすかどうかを決定するために、Ｃｏｓ７細胞を、ＫＣｌの存在下、漸増濃度のＣａＭＫ−Ｘ１またはベクタープラスミドでトランスフェクションした。細胞増殖は、標準プロトコールにより測定した。図１に示したように、ＣａＭＫ−Ｘ１のトランスフェクションは、増殖速度を増大したのに対し、同じ濃度のベクター単独では増殖速度が低下した。ＣａＭＫ−Ｘ１で一過性にトランスフェクションしたＣｏｓ７細胞の増殖速度は、５％血清中の方が２．５％または０．５％の場合よりも高く、これはＣａＭＫ−Ｘ１が誘導した増殖が血清により調節されたことを示唆している。このデータは、ＣａＭＫ−Ｘ１は細胞増殖を促進し得ることを明らかにしている。
【０１３７】
ＣａＭＫ−Ｘ１はＣＲＥＢをインビボにおいてリン酸化する　ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）は、ＤＮＡ結合転写因子である。多くの成長因子およびホルモンが、Ｓｅｒ１３３において核因子ＣＲＥＢのリン酸化を誘導することにより、細胞の遺伝子発現を刺激することが示されている（Ｍｏｎｔｍｉｎｙ、Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６６：８０７−８２２（１９９７））。当初ＰＫＡ媒介型リン酸化の標的として特徴付けられたＣＲＥＢは、プロテインキナーゼＣ、カルモジュリンキナーゼ、微小管活性化プロテインキナーゼ活性化タンパク質、およびプロテインキナーゼＢ／ＡＫＴを含む、他のキナーゼによっても認識される。
【０１３８】
ＣａＭＫ−Ｘ１は、インビボにおけるＣＲＥＢ−Ｓｅｒ １３３リン酸化を調節することができるかどうかを調べた。ＣａＭＫ−Ｘ１をインビボにおいて分析するために、ジャーカット細胞を利用した。ＣａＭＫ−Ｘ１またはベクターを保有する異なる濃度のプラスミドでトランスフェクションしたジャーカット細胞を、ＫＣｌで刺激した。全細胞タンパク質を、これらのトランスフェクションした細胞から調製し、Ｓｅｒ１３３におけるＣＲＥＢのリン酸化状態を決定した。ＣＲＥＢリン酸化の検出は、抗リン酸ＣＲＥＢ抗体を用いて行った。ＣＲＥＢのリン酸化は、Ｃａ＋＋の存在下のみで、ＣａＭＫ−Ｘ１遺伝子トランスフェクション量の増加と共に増大した。
【０１３９】
細胞内Ｃａ＋＋のＣａＭＫ−Ｘ１に対する作用を評価するために、トランスフェクションしたジャーカット細胞を、３０ｍＭ ＫＣｌで処理した。ＫＣｌは、細胞膜を分極し、これにより細胞内Ｃａ＋＋の増加を引き起す。ＫＣｌの添加は、ＣａＭＫ−Ｘ１でトランスフェクションした細胞においてのみＣＲＥＢの顕著なリン酸化生じた。これらの結果は、ジャーカット細胞において、ＣａＭＫ−Ｘ１は、Ｃａ＋＋により活性化され、引き続きＣＲＥＢのＳｅｒ１３３をリン酸化することを示している。
【０１４０】
ＣａＭＫ−Ｘ１のカルモジュリン結合部位欠失変異体はインビボにおいてＣＲＥＢを構成的にリン酸化する　先に、ＣａＭキナーゼは、カルモジュリン結合部位の切断により、Ｃａ＋＋依存性となることが示されている。同様に、ＣａＭＫ−Ｘ１の構成的活性型は、アミノ酸Ｇｌｎ３０１の切断による推定ＣａＭ結合ドメインの除去により作成された。この欠失部位は、自己抑制ドメイン中の２個の推定Ｃａ＋＋／カルモジュリン結合部位を除去する。切断された遺伝子は、トランスフェクション実験のためにｐｃＤＮＡ哺乳類発現ベクター内に配置した。
【０１４１】
インビボにおける変異体ＣａＭＫ−Ｘ１の機能を分析するために、ジャーカット細胞を使用した。様々な濃度のＣａＭＫ−Ｘ１を保有するプラスミドまたはベクターによりトランスフェクションしたジャーカット細胞を、ＫＣｌで刺激した。全細胞タンパク質を、これらのトランスフェクションした細胞から調製し、Ｓｅｒ１３３におけるＣＲＥＢのリン酸化状態を決定した。ＣＲＥＢリン酸化の検出は、抗リン酸ＣＲＥＢ抗体を用い行った。これらのベクターによる偽（ｍｏｃｋ）処理は、ＣＲＥＢリン酸化にいかなる作用も有さなかった。野生型ＣａＭＫ−Ｘ１のトランスフェクションは、ＣＲＥＢリン酸化へ作用を有さなかったが；野生型トランスフェクションされたジャーカット細胞へのＫＣｌの添加は、顕著なＣＲＥＢリン酸化を生じた。この欠失変異体のトランスフェクションは、ＫＣｌの添加なしに、ＣＲＥＢリン酸化に顕著な作用を有した。これらの結果は、野生型ＣａＭＫ−Ｘ１のＧｌｎ３０１での切断は、この酵素をＣａ＋＋／ＣａＭ依存性状態に転換することを明らかにしている。
【０１４２】
ＨＥＫ２９３細胞におけるＣａＭＫ−Ｘ１キナーゼの発現　ＣａＭＫ−Ｘ１クローンの利用可能性は、本発明者らが、シグナル伝達経路を再構築することを可能にした。これは、本発明者らが、転写因子のような下流の構成要素、またはリン酸化、タンパク質分解性プロセシング、メチル化などのようなタンパク質構成要素の修飾を同定することを可能にし、薬物スクリーニングにおける用途が見出された。
【０１４３】
ＣａＭＫ−Ｘ１をタンパク質レベルで特徴づけるために、ＨＥＫ２９３細胞を、Ｘｐｒｅｓｓエピトープに融合されたＣａＭＫ−Ｘ１コード配列を含むｐｃＤＮＡ３−Ｘｐｒｅｓｓ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））でトランスフェクションし；標準技法を用い、安定した細胞株を作出した。ｐｃＤＮＡ−ＣａＭＫ−Ｘ１プラスミドを含む５個の安定した細胞株および対照のベクターのみを含む５個の細胞株を選択し、ＣａＭＫ−Ｘ１発現レベルを決定した。全細胞抽出物を、各細胞株から調製した。これらの細胞溶解液を、抗Ｘｐｒｅｓｓモノクローナル抗体によるウェスタンブロットにより分析した。これらの実験は、ＣａＭＫ−Ｘ１でトランスフェクションした細胞に存在するが、対照細胞には存在しない、５３ｋＤａ融合タンパク質を明らかにした。
【０１４４】
トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞は、Ｘｐｒｅｓｓ融合タンパク質としてＣａＭＫ−Ｘ１を安定して発現した。同様に本発明者らは、Ｈｉ５細胞において発現されたＧＳＴ−ＣａＭＫ−Ｘ１融合タンパク質を検出した。グルタチオンセファロースアフィニティークロマトグラフィーを用い、ＧＳＴ−ＣａＭＫ−Ｘ１融合タンパク質を精製した。グルタチオンセファロースで精製したＣａＭＫ−Ｘ１および抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体で免疫沈降したＣａＭＫ−Ｘ１に、ウェスタンブロット分析を行った。このウェスタンブロットは、ＣａＭＫ−Ｘ１が、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞溶解液およびＨｉ５細胞溶解液の両方から精製され得ることを示す。これらの方法論を使用し、更なる特徴決定のためにＣａＭＫ−Ｘ１を精製した。
【０１４５】
Ｘｐｒｅｓｓ−ＣａＭＫ−Ｘ１クローンをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞の溶解時に同定した分子量５３ｋＤａを有するタンパク質に、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体による免疫沈降を施し、その後、抗Ｘ−ｐｒｅｓｓウェスタンブロットを行い、ベクター単独でトランスフェクションされた細胞にはバンドが存在しなかった。このデータにより、抗Ｘ−ｐｒｅｓｓ抗体はこの融合タンパク質（Ｘ−ｐｒｅｓｓ−ＣａＭＫ−Ｘ１）を選択的に免疫沈降することが確認される。
【０１４６】
これらの免疫沈降された物質を、ペプチド
2004514425.tif 000007
を用い、キナーゼ活性についてアッセイした。免疫沈降した物質には、前述のようなインビトロキナーゼアッセイ法を行った。ＣａＭＫ−Ｘ１はＣＲＥＢをインビボにおいてリン酸化することが示されているので、ＣａＭＫ−Ｘ１は、ＣＲＥＢｔｉｄｅおよびＳｙｎｔｉｄｅ２をリン酸化するであろうということは推論された（Ｃｏｌｂｒａｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６４（９）：４８００−４８０４（１９８９））。予想されたように、ＣａＭＫ−Ｘ１は、ＣＲＥＢｔｉｄｅおよびＳｙｎｔｉｄｅ２をインビトロにおいてリン酸化した。対照的に、ＣａＭＫ−Ｘ１は、対照ペプチドをリン酸化することができなかった。リン酸化の程度は、図２に示したように、カルモジュリンの存在により増大した。基質が存在しない場合、放射性物質（３２Ｐ）の著しい取込みはなく、これは、ＣａＭＫ−Ｘ１がこれらのアッセイ条件下では自己リン酸化しないことを示している。これは、免疫沈降したＣａＭＫ−Ｘ１はキナーゼ活性を有すること、およびこのキナーゼ活性はペプチドのインビトロにおけるリン酸化が可能であることを明らかにしている。これらの研究は、ＣａＭＫ−Ｘ１は、効果的活性にはカルモジュリンを必要とすることも明らかにしている。
【０１４７】
ＣａＭＫ−Ｘ１の触媒活性および基質特異性の比較　ＣａＭＫ−Ｘ１がインビトロにおいて活性キナーゼであるかどうかを決定するために、このクローンに、ヒスチジンタグをつけ、Ｓｆ９細胞において発現し、Ｎｉ２＋アフィニティカラムにより精製した。基質特異性の分析のために、本発明者らは、以下の３種のペプチドを試験した；ＣＲＥＢｔｉｄｅ、Ｓｙｎｔｉｄｅ２およびＣＤＰＫペプチド（対照ペプチド）。その後インビトロキナーゼアッセイ法を行った。前述のように、ＣＲＥＢｔｉｄｅおよびＳｙｎｔｉｄｅ２は、精製したＣａＭＫ−Ｘ１によりリン酸化された。そのリン酸化速度は、Ｃａ＋＋およびカルモジュリンの存在により増大された。非基質対照と比べ、これらのペプチドの添加は、顕著な３２Ｐ取込みを生じさせた。これらの結果は、ＣａＭＫ−Ｘ１がこれらのペプチドをインビトロにおいてリン酸化することを示している。本発明者らの研究はさらに、Ｓｙｎｔｉｄｅ２およびＣＲＥＢｔｉｄｅは、対照ペプチドよりもより高い３２Ｐ取込みを有することも明らかにした。さらにこれらの知見により、インビボデータが確認される。
【０１４８】
要約　本発明者らは、ＣａＭＫ−Ｘ１は、細胞内およびインビトロにおいて、ＣＲＥＢをＳｅｒ１３３でリン酸化することを明らかにした。本発明者らは、インビトロにおけるＣａＭＫ−Ｘ１キナーゼ活性も明らかにした。本発明者らは、グルタチオンセファロースおよびＮｉ２＋アフィニティークロマトグラフィーを用い、ＣａＭＫ−Ｘ１を過剰発現するトランスフェクションしたＨｉ５昆虫細胞およびＨＥＫ２９３細胞株から、ＣａＭＫ−Ｘ１を精製した。さらに、ＣａＭＫ−Ｘ１を、Ｘｐｒｅｓｓ融合タンパク質に対し示されたモノクローナル抗体を使用する免疫沈降により精製した。ＣａＭＫ−Ｘ１は、Ｃａ＋＋およびカルモジュリンの非存在下では、外因性基質に対しては活性を示さなかった。Ｃａ＋＋およびカルモジュリンが存在する場合、ＣａＭＫ−Ｘ１はＳｙｎｔｉｄｅ２およびＣＲＥＢｔｉｄｅをリン酸化した。これらの結果は、ＣａｍｋＸ−１はヒトの病理に関連することを示している。
【０１４９】
材料：
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ培地１６４０、Ｌ−グルタミン、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、および制限酵素は、ＧｉｂｃｏＢＲＬ社から入手した。ＴＯＰＯクローニングキット（ＰＣＲ材料およびｐＣＲ２．１−Ｔｏｐｏベクターを含む）は、インビトロジェン社から入手した。リン酸−ＣＲＥＢ（Ｓｅｒ１３３）ポリクローナルウサギ抗体は、セルシグナルテクノロジー（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から入手した。９６ウェルおよび６ウェルデルタサーフェスプレート（ｄｅｌｔａ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｔｅ）は、ＮＵＮＣＬＯＮ社から入手した。ＱＩＡプレップスピンミニプレップキット（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ）はキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）から入手した。ウィザードプラスミニプレップス（Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ）ＤＮＡ精製システム（ゲル抽出用）はプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ）のものである。ＦｕＧＥＮＥ ６トランスフェクション試薬は、べーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｎｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）から入手した。ｐｃＤＮＡ３．１哺乳類発現ベクターは、インビトロジェン社のものである。ウェスタンブロットルミノール試薬は、サンタクルズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から入手した。２°ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ複合抗体は、バイオラッドラボラトリー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入手した。
【０１５０】
完全長ＣａＭＫ−Ｘ１のクローニング　ＣａＭＫ−Ｘ１の完全長ｃＤＮＡを作出するために、プライマー対を設計し、ＰＣＲ反応に使用した。
2004514425.tif 000008
これらの増幅産物を、制限酵素切断部位ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで、クローニングベクターにクローンニングした。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ断片を、細菌発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３および哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＢへクローニングした。全ての構築物を、制限酵素処理およびＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１５１】
欠失変異体ＣａＭＫ−Ｘ１ＣＡの構築　欠失変異体を、これらのオリゴヌクレオチド
2004514425.tif 000009
を用いて作製した。得られたＰＣＲ断片を、哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１へクローニングした。
【０１５２】
細胞培養　細胞を、５％ＣＯ２中３７℃（標準条件）で培養した。下記に記さない限りは全ての細胞は、ＦＢＳを含有するＤＭＥＭにおいて培養した；ＦＢＳの特定量は変動し、これを各結果に関する報告に記載した。ジャーカット細胞を、グルコース、Ｌ−グルタミン、および１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地１６４０で培養した。
【０１５３】
細胞トランスフェクション　細胞を、６ウェルプレート中に密度２ｘ１０５個になるように播種し（特定の細胞株に適した培地中）、標準条件下で２４時間インキュベーションした。ＦｕＧＥＮＥ ６トランスフェクション試薬３ｍｌを、（トランスフェクションされる細胞株に適した）無血清培地９７ｍｌに希釈し、室温で５分間放置し；その後これを望ましい量のプラスミドＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３．１中）に滴下し、室温で１０分間放置した。その後仕上げのトランスフェクション溶液を細胞へ滴下し、標準条件下で２４時間インキュベーションした。
【０１５４】
増殖アッセイ法　６ウェルプレートからの培地を取除き、トリプシンを添加し、これらの細胞をプレートへ保持している細胞外マトリックスを消化し；次に（この細胞型に適した）培地を添加し、トリプシンを失活した。これらの細胞および培地をファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）チューブに移し、遠心し、上清を廃棄した。これらの細胞を、適当な培地に再懸濁した。３０００個の細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、適当な培地を加え９０ｍｌとした。各ウェルに、０．１Ｃｉ／Ｌ ３Ｈ−チミジン１０μｌを添加した。その後これらのプレートを、標準条件下で２４時間インキュベーションした。冷トリクロロ酢酸２５μｌを、各ウェルに添加し、これらのプレートを４℃で２時間維持した。その後プレートを冷流水で洗浄し、乾燥させた。増殖を、シンチレションカウンターで計測したチミジン取込みにより決定した。
【０１５５】
細胞溶解　溶解緩衝液は、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、２ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍｇ／ｍｌペプスタチン、１ｍｇ／ｍｌロイペプチン、１ｍｇ／ｍｌアプロチニン、および２０ｍＭ β−グリセロリン酸であった。接着細胞については、この培地を６ウェルプレートから取除き、ウェルをＰＢＳで洗浄し、その後取除き、これらのプレートを氷上に置き、その後、溶解緩衝液４０ｍｌを各ウェルに添加した。粗溶解液を、細胞スクレーパーで収集し、エッペンドルフチューブ内に入れた。非接着細胞については、培地および細胞を、６ウェルプレートからチューブへ移し、遠心し、上清を除去し；その後、溶解緩衝液４０ｍｌを添加した。次に全ての粗溶解液をボルテックスし、氷上に１０分間静置した。粗溶解液を、１４，０００ｒｐｍで１０分間４℃で遠心し、上清である最終溶解液を、新しいチューブに移した。
【０１５６】
ウェスタンブロット　等質量の細胞溶解液タンパク質を、４Ｘ負荷緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）と混合し、５分間煮沸し、その後短く遠心した。これらの試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動し、その後ＰＶＤＦ膜に転写し、ＴＴＢＳで洗浄し、２％ＢＳＡでブロッキングした。これらを一次抗体で４℃で１６時間ブロットした。膜をＴＴＢＳで洗浄し、二次抗体で１時間ブロットし、ＴＴＢＳで洗浄した。ルミノール試薬を添加し、これらのブロットをフィルム上に移し、オートラジオグラフィーで現像した。
【０１５７】
ＣａＭＫ−Ｘ１タンパク質の発現および精製　ヒトＣａＭＫ−Ｘ１遺伝子（Ｋ２８３）を、強力なＡｃＮＰＶ（オウトグラフガ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｇａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス）ポリヘドリンプロモーターの制御下で、ｐＡｃＧ２Ｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）由来のバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＧ４Ｔ３にサブクローニングした。これは、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）Ｓｆ９細胞において、標準手法（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に従い、直鎖状ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ＤＮＡと同時トランスフェクションした。ＧＳＴ−ＣａＭＫ−Ｘ１組換えバキュロウイルスを、１０％ウシ胎仔血清を含むＴＮＭ−ＦＨ培地（ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で、Ｓｆ９細胞において増幅した。このＧＳＴ−ＣａＭＫ−Ｘ１タンパク質を、Ｅｘｃｅｌｌ−４００培地（ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）５００ｍｌ中で約５ｘ１０８個Ｈｉ−５細胞（インビトロジェン社）において、感染多重度（ＭＯＩ）５で７２時間攪拌フラスコ中で発現させた。細胞を、４℃、８００ｘｇ、５分間で収集した。ペレットを、溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．１％β−メルカプトエタノール、１０μｇ／ｍｌ ＤＮａｓｅＩ、０．５ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭβ−グリセロリン酸、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭベンズアミジン、２μｇ／ｍｌアプロチニン、２μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチン）４０ｍｌ中で音波処理により溶解し、１０，０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心した。上清を、グルタチオンセファロース（Ｓｉｇｍａ社）２．５ｍｌを含むカラムに負荷した。このカラムを、洗浄緩衝液Ａ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％β−メルカプトエタノール、０．１％ ＮＰ−４０、０．１ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭβ−グリセロリン酸、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭベンズアミジン）で、ＯＤ２８０が基準値に戻るまで洗浄し、次に洗浄緩衝液Ｂ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ）で洗浄した。ＧＳＴ−ＣａＭＫ−Ｘ１タンパク質を、溶離緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％β−メルカプトエタノール、１０ｍＭグルタチオン、１０％グリセロール）で溶離した。分画を、アリコートとし、−７０℃で保存した。
【０１５８】
ＣａＭＫ−Ｘ１インビトロアッセイ法　ＣａＭＫ−Ｘ１を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１．５ｍＭカルモジュリン（ＣａｌＢａｉｏｃｈｅｍ社）、５０μＭ ［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ、および０．２μｇ／μｌ Ｓｙｎｔｉｄｅ２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ社）またはＣＲＥＢｔｉｄｅ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ社）中で、最終容量２５μｌとし、室温で１５分間アッセイした。反応は、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰの添加により開始し、反応混合液１０μｌをＰ８１紙上に染みこませることにより終結し、その後１％リン酸で洗浄した。
【０１５９】
免疫沈降　 免疫沈降のために、３５ｍｍディッシュ中のＣａＭＫ−Ｘ１−Ｘｐｒｅｓｓプラスミドを安定して発現しているＨＥＫ２９３細胞を、氷冷したＰＢＳで２回洗浄し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．６、２ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭジチオスレイトール、プロテアーゼ阻害剤アプロチニン（１０μｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（１００μｇ／ｍｌ）、ペプスタチン（０．７μｇ／ｍｌ）、１ｍＭ ４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩、および１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（溶解緩衝液）を含有する溶液中で溶解した。タンパク質を、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗血清（１：１００希釈物）または対照血清で免疫沈降した。タンパク質Ｇセファロースを用い、免疫複合体を回収した。
【０１６０】
免疫沈降した物質によるインビトロキナーゼアッセイ法　ＣａＭＫ−Ｘ１を、前項で説明した免疫複合体から溶離し、溶離液２０μｌを、１００μＭ［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ（比活性、４００〜６００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、３０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、および２５０ｎＭペプチドを含有するリン酸化混合液２０μｌと混合し、３０℃で１０〜１５分間インキュベーションした。
【０１６１】
ノーザンブロット分析　ノーザンブロット分析を、標準手法（Ａｍｂｉｏｎ社）に従い、ヒトＣａＭＫ−Ｘ１の塩基１．２ｋｂに相当する［α−３２Ｐ］−ｄＣＴＰ−標識したＣａＭＫ−Ｘ１ ｃＤＮＡ断片を用い行った。いくつかの原発性ヒト組織からのＲＮＡを、市販のポリ（Ａ）＋ＲＮＡブロット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）により分析した。ブロットした膜を乾燥し、オートラジオグラフィーにかけた。
【０１６２】
ＣａＭＫ−Ｘ１活性アッセイ法　等濃度の精製ＣａＭＫ−Ｘ１調製物を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ ２０００ロボット型システムを用いてインキュベーションした。各ウェル（９６ウェルマイクロタイタープレート）は、最終容量２５μｌ中に、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１．５ｍＭカルモジュリン（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ社）、５０μＭ γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（２００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）および０．２μｇ／μｌ Ｓｙｎｔｉｄｅ２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ社）またはＣＲＥＢｔｉｄｅ（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ社）で構成された１５μｌの反応混合液を含んでいた。この反応は、［γ３２−Ｐ］−ＡＴＰの添加により開始し、９６ウェルミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）マルチスクリーニングプレートへ反応混合液１０μｌをスポッティングすることにより停止した。マルチスクリーニングプレートを、１％リン酸で洗浄し、乾燥し、Ｗａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａシンチレーションカウンターにより計測した。
【０１６３】
実施例３
ＳＧＫ２α
実施例１において説明したように、Ｇｅｎｂａｎｋ ＥＳＴデータベースを検索した。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアウトプットの分析は、例えば公知のキナーゼドメイン関連タンパク質と相同性があるが同一でないキナーゼドメイン関連タンパク質をコードする配列と関連する可能性のあるＩＭＡＧＥクローンＡＦ１６９０３４から、ＥＳＴ配列を同定した。
【０１６４】
ＡＦ１６９０３４ ＩＭＡＧＥクローンは、３７７自動ＤＮＡシーケンサー上で、標準ＡＢＩ色素プライマーおよび色素ターミネーター化学物質を用いて、配列決定した。配列決定は、この配列が配列番号：５のＳＧＫ２αに相当していることを明らかにした。ＳＧＫ２αの発現は、ドットブロット分析により分析し、このタンパク質は、いくつかの腫瘍試料において上方制御されたことがわかった。配列番号：１８および１９を増幅に用いた。
【０１６５】
ドットブロット調製　 同一患者の臨床癌試料および対照試料から、全ＲＮＡを精製した。肝臓癌および結腸癌の両試料由来の試料を使用した。逆転写酵素を用い、ｃＤＮＡをこれらのＲＮＡから合成した。放射標識したｃＤＮＡを、Ｓｔｒｉｐ−ＥＺ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ社、オースチン、ＴＸ）を用いてを製造業者の指示に従って合成した。次にこれらの標識され増幅されたｃＤＮＡをプローブとして用い、ヒトＳＧＫ２αを含むヒトプロテインキナーゼアレイへハイブリダイズした。各整列したＥＳＴクローンにハイブリダイズした放射標識したプローブの量は、リン光造影を用いて検出した。
【０１６６】
ＳＧＫ２αの発現は、試験した腫瘍組織において実質的に上方制御された。データは、表４に、対照非腫瘍試料に対する増加の倍数として表した。
【０１６７】
【表４】
2004514425.tif 000010
【０１６８】
表５に示した結果は、患者試料の病理学的報告を簡単に要約している。
【０１６９】
【表５】
2004514425.tif 000011
【０１７０】
ＨＥＫ２９３細胞におけるＳＧＫ２を過剰発現する安定した細胞株の作出　本発明者らは、４５ｋＤａ ＳＧＫ２キナーゼのＮ末端Ｘｐｒｅｓｓタグ型をコードする哺乳類発現ベクターを構築した。ＳＧＫ２のＯＲＦは、標準ＰＣＲに基づくクローニング技法を用い、ｐｃＤＮＡ３哺乳類発現ベクター内で、Ｎ末端Ｘｐｒｅｓｓおよびヒスチジンタグとインフレームで配置した。タンパク質レベルでＳＧＫ２を特徴決定するために、Ｇ４１８存在下で、ｐｃＤＮＡ３ Ｈｉｓ−Ｘｐｒｅｓｓ−ＳＧＫ２プラスミドにより、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、安定した細胞株を選択した。ＨＥＫ２９３細胞は、ＳＧＫ２を組込んでいる哺乳類ベクターにより安定してトランスフェクションされ、野生型ＳＧＫ２を過剰発現するクローンを産生した。
【０１７１】
簡単に述べると、細胞を、５％ＦＣＳ、２ｍｍ Ｌ−グルタミン、グルコース（３．６ｍｇ／ｍｌ）を含有するｄ−ＭＥＭで増殖させ、Ｇ４１８（４０μｇ／ｍｌ）を、トランスフェクションした細胞へ添加し、選択圧を維持した。細胞溶解液を、安定した細胞株から調製し、抗Ｘｐｒｅｓｓ ｍＡｂおよび抗Ｈｉｓ抗体により、ウェスタンブロットを実施した。分子量４５ｋＤａのタンパク質を、ＳＧＫ２を安定して発現しているＨＥＫ２９３細胞の溶解液中で同定した。対照ＨＥＫ２９３細胞においては類似タンパク質を検出することができなかった。この分析は、ＨＥＫ２９３細胞は、融合タンパク質としてＳＧＫ２を過剰発現することを示唆している。これらの細胞がＳＧＫ２ ｍＲＮＡをより高レベルに発現するかどうかを決定するために、本発明者らは、安定した細胞株に加え、対照ＨＥＫ２９３細胞からｍＲＮＡを単離した。等量のｍＲＮＡを、ナイロン膜に固定し、特異的ＳＧＫ２プローブとのハイブリダイゼーションを実施した。安定した細胞株は、対照ＨＥＫ２９３細胞と比べ、有意に高い濃度のＳＧＫ２ ｍＲＮＡを発現した。これらの結果は、安定した細胞株がＳＧＫ２タンパク質と同様に、ＳＧＫ２ ｍＲＮＡを過剰発現していることを示す。これらの安定した細胞株をその後の実験に使用した。
【０１７２】
インビボにおいて過剰発現されたＳＧＫ２はＧＳＫ３をリン酸化することができる　本発明者らは、ＳＧＫ２を過剰発現する細胞を用い、ＳＧＫ２の下流エフェクターの同一性を探索した。ＳＧＫは、ＰＫＢと５４％のヌクレオチド配列相同性を有し、先にＰＫＢはＧＳＫ３をインビボおよびインビトロにおいてリン酸化することが示されている。本発明者らはこれを考慮し、ＳＧＫ２が、通常βカテニンをリン酸化するキナーゼであるＧＳＫ３の活性を調節することができるかどうかの決定を試みた。ＧＳＫ３は、βカテニンをリン酸化し、これをユビキチン−プロテオソーム経路を介しての分解の標的とする。ＳＧＫ２がＧＳＫ３をリン酸化することができるかどうかを決定するために、最初に、本発明者らは、ヒト胚性腎上皮細胞（ＨＥＫ２９３）において一過性トランスフェクションアッセイ法を行った。ＳＧＫ２のトランスフェクションは、ＧＳＫ３リン酸化の増加を生じた。これは特異的抗ＧＳＫ３リン酸Ｓｅｒ９抗体によりモニタリングした。これらの結果は、ＳＧＫ２が、インビボにおけるＧＳＫ３リン酸化に影響を及ぼすことを示している。
【０１７３】
対照として、本発明者らは、このアッセイ法においてＧＳＫ３タンパク質の濃度を測定した。ＧＳＫ３濃度は、ＳＧＫ２により影響を受けないが、ＧＳＫ３のリン酸化状態は、ＳＧＫ２の発現により影響を受けた。これは、比較的低濃度の血清（０．５％）およびＳＧＫ２プラスミド濃度０．１〜０．２μｇにおいて特に顕著であった。ＧＳＫ３活性は、リン酸化により阻害され得るので、ＳＧＫ２によるＧＳＫ３の阻害が、その他の下流作用につながりうる。ＳＧＫ２とＧＳＫ３の間の関連をさらに評価するために、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞およびＳＧＫ２で安定してトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞（ＳＧＫ−３７Ａと称する）におけるＧＳＫ３のリン酸化状態を測定した。ＳＧＫ２を過剰発現するＳＧＫ−３７Ａ細胞は、正常ＨＥＫ２９３細胞よりも著しく高いリン酸ＧＳＫ３を有した。
【０１７４】
このデータは、ＳＧＫ２が、安定してトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞においてＧＳＫ３のリン酸化状態を調節することができることを明らかにしている。ＧＳＫ３リン酸化は、ＧＳＫ３失活につながることが示されている（Ｃｒｏｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３７８：７８５−７８９（１９９５））。ＳＧＫ２は、ＧＳＫ３を直接リン酸化し、これを失活し、これにより細胞質シグナル伝達分子β−カテニンのリン酸化を廃し、その安定化および核移行を引き起す。核において、β−カテニンは、ＴＣＦ４と会合し、サイクリンＤ１を含むいくつかの遺伝子の転写を誘導する。
【０１７５】
ＳＧＫ２は細胞増殖を増強する　本発明者らは、ＳＧＫ２の過剰発現がＧＳＫ３リン酸化を刺激することを既に示しているので、これが細胞増殖につながりうるかどうかを調べた。ＳＧＫ２の細胞増殖に対する作用を試験するために、本発明者らは、いくつかの細胞型を使用した。これらの細胞は、ＳＧＫ２または対照ＤＮＡプラスミドにより一過性にトランスフェクションした。このＤＮＡ合成速度は、［３Ｈ］チミジン取込みの測定により決定した。ＨＥＫ２９３細胞および３Ｔ３細胞がＳＧＫ２でトランスフェクションされた場合、これらは対照ベクターよりもより多量のＤＮＡ合成を示した。増殖速度は、トランスフェクションされたＳＧＫ２プラスミド濃度により左右された。このデータは、ＳＧＫ２は、これらの細胞型において細胞増殖を刺激することを示している。ＰＤＫ１とＳＧＫの同時発現はさらに、増殖速度を増強した。
【０１７６】
これらのデータは、ＳＧＫ２が、様々な細胞における増殖を促進することを明らかにし、ＳＧＫ２が細胞増殖を促進しかつこれらの細胞型において腫瘍の進行を指示していることを示唆している。
【０１７７】
ＳＧＫ過剰発現はＡＰ１トランス活性化を刺激する　ＧＳＫ３は、Ｃ末端部位でｃ−Ｊｕｎをリン酸化し、ＤＮＡ結合の阻害を生じることが既に示されている（Ｎｉｋｏｌａｋａｋｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、８：８３３−８４０（１９９３））。これは、無傷の細胞におけるＡＰ１活性の阻害につながり得る。このことは対照において細胞の恒常性を維持していると考えられている。本発明者らは、ＳＧＫ２がＧＳＫ３をリン酸化することが示されたことから、これが、ＳＧＫ２を過剰発現する細胞においてＡＰ１トランス活性化を調節することができるかどうかについての評価を試みた。
【０１７８】
ＡＰ１活性を、ＨＥＫ２９３細胞およびＳＧＫ２により安定してトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞において測定した。ＳＧＫ−３７Ａクローンは、ＳＧＫ２を過剰発現することが示されている。ＡＰ１活性は、対照ＨＥＫ２９３細胞よりもＳＧＫ−３７Ａにおいて数倍高い活性を示した（図３）。このデータは、ＳＧＫ２が、ＨＥＫ２９３細胞においてＡＰ１プロモーター活性を上方制御することができることを示唆している。核において、ＡＰ１トランス活性化は、増殖に関連したいくつかの遺伝子およびいくつかのＭＭＰ遺伝子の転写を誘導する。本発明者らのデータは、ＳＧＫ２は、ＭＭＰ遺伝子発現のＡＰ１依存型上方制御により浸潤性表現型が誘導可能なことを示唆している。
【０１７９】
ＳＧＫ２はβカテニンの核移行を刺激する　ＳＧＫ２は、ＨＥＫ２９３細胞においてβカテニンを安定化する。ＨＥＫ２９３細胞におけるＳＧＫ２の過剰発現がβカテニン安定性を誘導するかどうかを決定するために、本発明者らは、免疫細胞化学的分析を用いた。βカテニンのモノクローナル抗体をこの分析に用いた。βカテニンのインビボ発現は、標準プロトコールにより測定した。結果は、ＳＧＫ２発現細胞は、親細胞よりもより高い濃度のβカテニンを有することを示している。βカテニンは、ＳＧＫ２を過剰発現する細胞の核に完全に局在化されており、このことはＳＧＫ２がβカテニンの核への移行を調節していることを示唆している。
【０１８０】
要約すると、これらの結果は、ＳＧＫ２が特にＧＳＫ３β活性の調節によるＷｎｔ／ｗｉｎｇｌｅｓｓ経路の構成要素を介したシグナル伝達の重要な細胞内調節因子であることを示している。βカテニンは、ＧＳＫ３βのコンセンサス配列リン酸化部位を有し、ＧＳＫ３βはβカテニンの分解を引き起すように作用する。いくつかの試験により、ＧＳＫ３βが、βカテニンをリン酸化すること、およびβカテニンのリン酸化がその分解に必須であることが示されている。βカテニンがリン酸化されない場合は、βカテニンの安定性は細胞質において増大し、その後、βカテニンの核への移行が増加する。核において、βカテニンはＴＣＦ４と会合し、サイクリンＤ１を含むいくつかの遺伝子の転写を誘導する。
【０１８１】
ＳＧＫはＴＣＦ４転写活性を刺激する　βカテニンの核移行は、βカテニンと高移動度の転写因子のメンバーであるＬＥＦ１／ＴＣＦの間の複合体形成に関連し、これは次に標的遺伝子の転写を活性化する。ＬＥＦ１は、それ自身では多量体化された部位からの転写を刺激することができないが、βカテニンとの会合において、ＬＥＦ１／ＴＣＦタンパク質は、多量体化された結合部位からのプロモーター活性を増大することができる転写因子である。
【０１８２】
本発明者らは、ＳＧＫ２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞および対照ＨＥＫ２９３細胞において、ＴＣＦ４結合部位を含む合成ＴＣＦ４／βカテニン反応性プロモーター構築物の転写活性化を試験した。ＳＧＫ２を過剰発現する細胞においてのみ、より高いプロモーター活性が認められた。ＴＣＦ４レポーター遺伝子の漸増濃度での一過性トランスフェクションは、ＳＧＫ２過剰発現細胞における濃度依存型ＴＣＦ４トランス活性化を生じたが、ＨＥＫ２９３細胞へのＴＣＦ４レポーター遺伝子の一過性トランスフェクションは、顕著なトランス活性化を生じなかった。この結果は、ＳＧＫ２は、ＧＳＫ３βを選択的に標的とすることを示している。調節されたβカテニンは、次にＨＥＫ２９３細胞におけるＴＣＦ４トランス活性化を増大した。これらのデータは、ＳＧＫ２の過剰発現は、接着／脱着によりＴＣＦ４発現の調節を克服すること、およびこれが構成的に高レベルのＴＣＦ４トランス活性化を維持することを示している。ＴＣＦ４／βカテニンは、間充織遺伝子（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｇｅｎｅ）を調節するホメオボックスタンパク質をコードする遺伝子の転写を誘導することが示されており、この経路は上皮から間充織への転換を媒介する可能性を有する。ＴＣＦ／βカテニンの構成的活性化は、ヒト結腸癌腫において発癌性である。本明細書に記載したデータにより、ＳＧＫ２はβカテニンシグナル伝達を調節し、ＴＣＦ４レポーター遺伝子をトランス活性化することができることが示される。
【０１８３】
ＳＧＫ２はＮＦ−κＢ転写を刺激する　ＰＫＢ／ＡＫＴが、ＮＦ−κＢが媒介したトランス活性化を調節することは先に示されている。本発明者らはこれを考慮し、次に、ＳＧＫ２が、ＮＦ−κＢレポーターをインビボアッセイ法において活性化することができるかどうかを調べた。ＮＦ−κＢトランス活性化を評価するために、ルシフェラーゼプラスミドを含むＮＦ−κＢプロモーターを、ＳＧＫ２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞および対照ＨＥＫ２９３細胞へ一過性にトランスフェクションした。図３に示したように、ＮＦ−κＢレポーターの活性は、ＳＧＫ２過剰発現細胞において対照ＨＥＫ２９３細胞よりも数倍高い活性を示した。ＳＧＫ２過剰発現細胞におけるＮＦ−κＢレポータープラスミドの濃度の上昇は、ルシフェラーゼ活性を上昇したのに対し、ＮＦ−κＢが媒介したトランス活性化は、対照ＨＥＫ２９３細胞に対し顕著な作用を有さなかった。このデータは、ＳＧＫ２はＮＦ−κＢトランス活性化を調節し得ることを示している。
【０１８４】
ＮＦ−κＢトランス活性化は、ＴＮＦ−α、抗癌剤、および電離放射線を含む、主要なプロアポトーシス性（ｐｒｏａｐｏｐｔｏｔｉｃ）シグナルに反応して生じる。いくつかの報告により、一部の癌細胞型において、ＮＦ−κＢが細胞生存に重要な因子であることが示されている。従って、ＳＧＫ２は、ある細胞型において細胞生存を促進し、かつ腫瘍促進に関与し得る。
【０１８５】
ＮＦ−κＢ ＤＮＡ結合活性は、ＩκＢαの分解と同時に起こる。ＳＧＫ２過剰発現細胞におけるＩκＢαの状態を試験するために、本発明者らは、下記の実験を行った。細胞抽出物を、ＳＧＫ２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞および対照ＨＥＫ２９３細胞から調製した。これらの細胞抽出物を特異的抗リン酸ＩκＢα抗体に対して分析した。細胞抽出物の濃度の上昇は、ＩκＢαリン酸シグナルの増加を生じさせたのに対し、同じタンパク質濃度の対照ＨＥＫ２９３細胞抽出物では、ＩκＢαリン酸シグナルを生じなかった。これらの結果は、ＳＧＫ２によるＮＦ−κＢ活性化がＩκＢαのリン酸化により媒介されることを示している。
【０１８６】
ＢＡＤのＳＧＫ２リン酸化　 ＳＧＫ２は、ＰＫＢによりリン酸化されたいくつかのタンパク質をリン酸化する。ＰＫＢは、ＢＡＤをリン酸化することが先に示されている。ＳＧＫ２がＢＡＤをリン酸化するかどうかについて試験した。タンパク質を、ＳＧＫ２を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞および対照ＨＥＫ２９３細胞から単離し；ＢＡＤのリン酸化状態を測定した。これらの細胞を溶解し、ＢＡＤリン酸化の発現を、抗ＢＡＤリン酸抗体により決定した。ＳＧＫ２過剰発現細胞は、正常細胞よりもより高レベルのリン酸Ｂａｄタンパク質を含むが、ＢＡＤタンパク質の発現レベルは、ＳＧＫ２による影響を受けなかった。これらの知見は、ＳＧＫ２がＨＥＫ２９３細胞においてＢＡＤリン酸化を増加させることを示している。
【０１８７】
ＢＡＤのリン酸化は、ＢＡＤリン酸化型の１４−３−３タンパク質イソ型との選択的会合に関与したメカニズムを介した、細胞死の予防につながり得る。ＳＧＫ２基質としてのＢＡＤの同定は、インビボにおけるＳＧＫ２標的のリストを拡大している。最近の研究では、ＢＡＤは、哺乳類細胞におけるアポトーシスを阻害する生存因子により活性化されるいくつかの異なるシグナル伝達経路の収束点を表すことが明らかにされている。これらのデータは、ＢＡＤのリン酸化によりＳＧＫ２が哺乳類細胞におけるアポトーシスを阻害することを示唆している。
【０１８８】
ＨＥＫ２９３細胞におけるＦＫＨＲリン酸化　転写因子のフォークヘッド型（ｆｏｒｋｈｅａｄ）ファミリーは、横紋筋肉腫および急性白血病における腫瘍形成に関与している。ＦＫＨＲ、ＦＫＨＲＬ１、およびＡＦＸは、ＩＧＦＲ１、ＰＩ３ＫおよびＰＫＢ／ＡＫＴに関連する経路を介してシグナル伝達を媒介する。ＰＫＢ／ＡＫＴによるＦＫＨＲファミリーメンバーのリン酸化は、細胞生存を促進し、ＦＫＨＲ核移行および標的遺伝子転写を調節する。インスリン刺激は、このトレオニン部位のリン酸化を特異的に促進し、リン酸化された配列に対する１４−３−３タンパク質結合によるＦＫＨＲ細胞質残留を引き起す。
【０１８９】
本発明者らは、細胞の状況においてＦＫＨＲがＳＧＫ２によりリン酸化されるかどうかを調べるために、ＳＧＫ２を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞を作出し、その後リン酸特異的抗体によるＦＫＨＲリン酸化を調べた。これらの実験では、正常ＨＥＫ２９３細胞においてＦＫＨＲ、Ｔｈｒ２４またはＳｅｒ２５６が低レベルでリン酸化されたのに対し、ＨＥＫ２９３の安定細胞は、より高レベルのＦＫＨＲリン酸化を有することが示された。このデータは、ＳＧＫ２過剰発現細胞においてＦＫＨＲがより高度のリン酸化状態を示すことを表す。
【０１９０】
既に、ＦＫＨＲリン酸化は、ＦＫＨＲの１４−３−３タンパク質との相互作用、およびその転写標的から離れた、細胞質での隔絶（ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）につながることが示されている。リン酸化されていないＦＫＨＲは核内に蓄積し、Ｆａｓリガンド遺伝子を含む細胞死遺伝子（ｄｅａｔｈ ｇｅｎｅ）を活性化し、このことはアポトーシス過程に関与している。リン酸化時に、ＦＫＨＲは、１４−３−３と相互作用し、細胞質において保持され、これによりその転写活性化能を阻害する。従って、ＦＫＨＲのＳＧＫ２によるリン酸化は、細胞生存を促進しうる。
【０１９１】
ＣＲＥＢリン酸化はＳＧＫ２により調節される　本発明者らは、ＣＲＥＢがＳＧＫ２の調節標的であるかどうかを決定するために、下記の実験を行った。等量のタンパク質を、ＳＧＫ２を過剰発現する細胞および対照ＨＥＫ２９３細胞から単離し、リン酸ＣＲＥＢ分析を行った。これらの細胞を溶解し、ＣＲＥＢリン酸化量を、ＣＲＥＢリン酸（Ｓｅｒ１３３）抗体により決定した。ＳＧＫ２過剰発現細胞は、正常細胞よりもより高いレベルのリン酸ＣＲＥＢタンパク質を含み、これはＳＧＫ２がＣＲＥＢリン酸化を増大することを示している。
【０１９２】
研究により、ＣＲＥＢ機能は細胞生存の促進において重要であることが示されている。サイクリンＤ１の発現は、ＣＲＥＢにより調節される。乳癌細胞株および乳房腫瘍の多くは、サイクリンＤ１を過剰発現しており、このことはサイクリンＤ１の誘導は乳房腫瘍形成において重要な役割を果たし得ることを示している。これらの研究はさらに、ＳＧＫ２が細胞生存を促進するメカニズムを明確にしている。ＣＲＥＢ機能は、成長因子刺激に応答することによる細胞生存の促進において重要である。これらのデータは、ＳＧＫ２が、インビボにおけるＣＲＥＢのリン酸化状態を調節し、その結果、ＣＲＥＢ経路を介した細胞生存に関与していることを暗示している。
【０１９３】
ＳＧＫ２はＰＤＫ１により活性化され、この活性化はキナーゼ活性増強につながる　クローン化され精製されたＳＧＫ２が特異的ペプチドを直接リン酸化するかどうかを決定するために、ＳＧＫ２を昆虫細胞から精製した。活性化は、インビトロにおいて、ＳＧＫ２およびＰＤＫ１を混合することにより行った。活性化後、ＰＤＫ１を混合物から取除き、精製したＳＧＫ２を分析に使用した。この細胞抽出物は、ＧＳＴアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製し、この純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。非活性化およびＰＤＫ１活性化したＳＧＫ２の両方が、類似量のタンパク質を産生した。ＰＫＤ１により活性化されたＳＧＫ２は著しくリン酸化されたのに対し、非活性化ＳＧＫ２はそうではなかった。このデータは図４に示す。
【０１９４】
ＳＧＫ２のキナーゼ活性を、特異的ペプチドを用いて評価した。ＳＧＫ２は、２種の異なるペプチド基質
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と共にインキュベーションし、インビトロキナーゼアッセイ法を行った。等濃度の精製したＳＧＫ２を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｍｅｋ ２０００ロボット型システムを用いてインキュベーションした。各ウェルは、１０μｌ ＳＧＫ２、５μｌアッセイ希釈緩衝液、５μｌペプチド基質および５μｌγ３２Ｐ−ＡＴＰで構成される反応混合液２５μｌを含有した。キナーゼ反応を室温（２２℃）で１５分間実施した。反応期間の最後に、反応混合液１０μｌを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社の９６ウェルｐ８１ホスホセルロースマルチスクリーンプレート上にスポッティングし、洗浄し、３２Ｐ取込みをＷａｌｌａｃ Ｍｉｃｒｏｂｅｔａシンチレーションカウンターで計数した。
【０１９５】
精製したＳＧＫ２と共にインキュベートしたペプチドは、顕著な３２Ｐ取込みを示したのに対し、ペプチドの非存在下では、顕著な取込みは見られなかった。これらのペプチドを比較した場合、ＰＫＢ基質は、顕著な３２Ｐ取込みを有したのに対し、同量の対照ペプチド（ＰＤＫ１ペプチド）の添加は顕著な取込みを有さなかった。このデータが、精製ＳＧＫ２はインビトロにおいてキナーゼ活性を有することを示している。さらに、ＰＤＫ１で活性化されたＳＧＫ２は、非活性化ＳＧＫ２と比べ有意に高いキナーゼ活性を有した。これらのデータは、活性化されたＳＧＫ２がＧＳＫ３ Ｓｅｒ９（ＧＳＫ３βコンセンサス）配列をリン酸化することを明確に示しており、このことは、ＳＧＫ２を過剰発現する細胞が、対照細胞よりもより高レベルのＧＳＫ３ Ｓｅｒ９リン酸化を示すという先の知見を裏付けている。
【０１９６】
ＳＧＫ２キナーゼ活性はカリクリンＡ（ｃａｌｙｃｕｌｉｎ Ａ）およびオカダ酸により刺激される　ＧＳＴ−ＳＧＫ２を発現するＨｉ５昆虫細胞を、１００ｎＭミクロシスチン、９９．８ｎＭオカダ酸、および４９．８ｎＭカリクリンＡにより、２７℃で４時間処理した。ＧＳＴ−ＳＧＫ２ａ融合タンパク質を、ＧＳＴアガロースアフィニティーカラムで精製し、２０ｍＭグルタチオン／５ＯｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で溶離した。基質は、１ｍｇ／ｍｌのＰＫＢ基質およびＣａｐＫ 基質で、室温で１５分間実施した。結果を以下に示す：
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【０１９７】
これらのデータは、オカダ酸およびカリクリンＡがＳＧＫ２キナーゼ活性を刺激することを示し、このことはオカダ酸およびカリクリンＡがＳＧＫ２活性を刺激し得ることを示唆している。オカダ酸およびカリクリンＡのようなプロテインホスファターゼ阻害剤がいくつかの核タンパク質のリン酸化を調節することは、既に示されている。
【０１９８】
これらの知見により、ＳＧＫ２は、細胞生存および細胞増殖を促進することができることが明らかにされている。ＨＥＫ２９３細胞におけるＳＧＫ２の過剰発現は、ＧＳＫ３リン酸化を増大し、その後のＧＳＫ３活性を阻害し、引き続きＡＰ１トランス活性化につながる。ＧＳＫ３は、いくつかの細胞内シグナル伝達経路の調節に関連し、その中でＷｎｔ経路は特に興味深い。哺乳類において、Ｗｎｔシグナル伝達は、βカテニンの安定性を増大し、ＬＥＦ−１／ＴＣＦの転写活性化をもたらす。ＳＧＫ２を過剰発現する細胞において、本発明者らは、細胞におけるβカテニンプールの安定性の増加により、増大したＬＥＥ−１／ＴＣＦトランス活性化を示し、このことはＳＧＫ２はＷｎｔシグナル伝達経路を活性化し、これがβカテニンの核局在および増大したＬＥＥ−１／ＴＣＦトランス活性化につながり得ることを示唆している。
【０１９９】
少なくとも６種のＳＧＫ２基質が、哺乳類細胞において同定され、これらは２つの主要なクラスに収まっている：アポトーシスの調節因子、ならびにタンパク質合成およびグリコーゲン代謝を含む細胞増殖の調節因子。細胞／死調節に関連するＳＧＫ２基質は、フォークヘッド型転写因子（ＦＫＨＲ）、プロ−アポトーシス性Ｂｃｌ−２ファミリーメンバーＢＡＤ、およびサイクリックＡＭＰ応答配列結合タンパク質（ＣＲＥＢ）を含む。
【０２００】
本発明者らは、ＳＧＫ２がＨＥＫ２９３細胞における転写因子のＮＦ−κＢファミリーの誘導につながるシグナル伝達経路を調節することができることも明らかにしている。この誘導は、ＮＦ−κＢ阻害剤ＩκＢの分解レベルで生じ、ＮＦ−κＢに特異的である。これらのデータは、ＳＧＫ２がいくつかの異なるシグナル伝達経路に関する収束点であるように思われることを示唆している。要約すると、本発明者らの結果は、ＳＧＫ２の過剰発現が、腫瘍細胞の進行において中心的役割を果たしうることを示唆している。
【０２０１】
材料および方法
緩衝液、試薬、および方法は、特に記さない限りは、実施例２に記したものである。
【０２０２】
完全長ＳＧＫ２のクローニング　ＳＧＫ２の完全長ｃＤＮＡを作成するために、プライマー対を設計し、ＰＣＲ反応に使用した。増幅産物を、細菌発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−３および哺乳類発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１／ＨｉｓＢへ、制限酵素切断部位ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩを介してクローニングした。全ての構築物を、制限酵素消化およびＤＮＡ配列決定について検証した。
【０２０３】
ＳＧＫ２タンパク質の発現および精製　ヒトＳＧＫ２遺伝子を、強力なＡｃＮＰＶ（オウトグラフガ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｇａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ Ｖｉｒｕｓ））ポリヘドリンプロモーターの制御下で、バキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＧ２Ｔ（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）へサブクローニングした。これは、スポドプテラ・フルギペルダＳｆ９細胞において、製造業者（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社）の指示に従い、直鎖状ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）ＤＮＡと同時トランスフェクションした。高力価のＧＳＴ−ＳＧＫ２組換えバキュロウイルスを、１０％ウシ胎仔血清を含むＴＮＭ−ＦＨ培地（ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中でＳｆ９細胞において増幅した。このＧＳＴ−ＳＧＫ２タンパク質を、Ｅｘｃｅｌｌ−４００培地（ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）５００ｍｌ中で約５ｘ１０８個のＨｉ−５細胞（インビトロジェン社）において、ＭＯＩ約５で７２時間攪拌フラスコ中で発現させた。細胞を、４℃、８００ｘｇ、５分間で収集した。ペレットを、溶解緩衝液４０ｍｌ中で音波処理により溶解し、１０，０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心した。上清を、グルタチオンアガロース（Ｓｉｇｍａ社）２．５ｍｌを含むカラムに負荷した。このカラムを、洗浄緩衝液Ａで、ＯＤ２８０が基準値に戻るまで洗浄し、次に洗浄緩衝液Ｂで洗浄した。ＧＳＴ−ＳＧＫ２タンパク質を、溶離緩衝液で溶離した。分画を、アリコートとし、−７０℃で保存した。
【０２０４】
ＳＧＫ２アッセイ法　ＳＧＫ２を、５ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭβ−グリセロリン酸、５０μＭジチオスレイトール、１μＭβ−メチルアスパラギン酸、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５μＭ ＰＫＩ、５０μＭ［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ、および基質として０．２μｇ／ｕｌ ＰＫＢ基質ペプチド（ＵＢＩ）またはＰＤＫｔｉｄｅペプチド（ＵＢＩ）を含有する反応混合液２５μｌにより、室温で１５分間アッセイした。ＧＳＫ３コンセンサスペプチド
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である。反応は、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰの添加により開始し、アリコート１０μｌを、９６ウェル濾過プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）中のリン酸セルロース紙へスポッティングすることにより停止し、引き続き１％リン酸で洗浄した。乾燥したプレートにシンチラント（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｎｔ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）２５μｌを添加し、計測した。
【０２０５】
ＰＤＫ１によるＳＧＫ２リン酸化　ＳＧＫ２を、活性ＨｉｓタグＰＤＫ１と共に、Ｍｇ＋＋／ＡＴＰの存在下でインキュベーションした。ＨｉｓタグＰＤＫ１は、昆虫細胞において発現し、タロン（Ｔａｌｏｎ）アフィニティーカラムにおいて精製した。ＳＧＫ２リン酸化アッセイ法は、１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭβ−グリセロリン酸、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、０．２ｍＭジチオスレイトール、０．５μＭ ＰＫＩ、０．２μＭミクロシスチン−ＬＲ、７５ｎｇ／μｌ Ｐｔｄｌｎｓ（３，４，５）Ｐ３（ＰＩＰ３）、１５６ｎｇ／μｌジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１５６ｎｇ／μｌジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、５０μＭ［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ、〜２０ｎｇ Ｈｉｓ−ＰＤＫ１、および〜５μｇ ＧＳＴ−ＳＧＫ２を含有する反応溶液２５μｌにおいて、室温で２０分間行った。反応液をインキュベーションし、２Ｘ負荷緩衝液２５μｌを添加することにより停止した。陰性対照反応液には、ＰＤＫ１を添加しなかった。前記負荷試料２５μｌを、９％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に泳動した。乾燥したクマーシーブルー染色したゲルを、ＧＳ−５２５ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒａ Ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＯ−ＲＡＤ社）において撮像した。
【０２０６】
ＰＤＫ１によるＳＧＫ２活性化　約２．５ｍｇのＧＳＴ−ＳＧＫ２および１μｇのＨｉｓ−ＰＤＫ１を１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭβ−グリセロリン酸、１ｍＭ ＥＧＴＡ、０．２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、０．２ｍＭジチオスレイトール、０．５μＭ ＰＫＩ、０．２μＭミクロシスチン−ＬＲ、７５ｎｇ／μｌ Ｐｔｄｌｎｓ（３，４，５）Ｐ３（ＰＩＰ３）、１５６ｎｇ／μｌジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、１５６ｎｇ／μｌジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、および１０ｍＭ ＡＴＰを含有する活性化溶液２０ｍｌ中で、４℃で２時間インキュベーションした。Ｑセファロースカラム上で、この活性化溶液からグルタチオンを除去した。活性化したＧＳＴ−ＳＧＫ２を、グルタチオン−アガロースカラムで再精製した。
【０２０７】
細胞および細胞培養　２９３細胞を、ＳＧＫ２を組込んでいる哺乳類ベクターで安定的にトランスフェクションし、野生型ＳＧＫ２を過剰発現させた。細胞を、１０％ＦＣＳ、２ｍｍ Ｌ−グルタミン、グルコース（３．６ｍｇ／ｍｌ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）を含有するＭＥＭ上で増殖し、およびＧ４１８（４０μｇ／μｌ）をトランスフェクションされた細胞へ添加し、選択圧を維持した。
【０２０８】
一過性トランスフェクション：ＨＥＫ２９３細胞を、１．５Ｘ１０５個細胞／ウェルプレートで播種し、トランスフェクション前に２４時間増殖させた。様々な濃度のプラスミドＤＮＡを、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ社）を用いて製造業者のプロトコールに従ってトランスフェクションした。ＤＮＡ含量を、適当な空の発現ベクターにより標準化した。細胞は、０．５％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭにおいて一晩飢餓状態とした。
【０２０９】
ウェスタンブロット：細胞を、ＮＰ−４０溶解緩衝液（１％ＮＰ４０、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＤ、２ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ｏ−バナジン酸ナトリウム、１ｍＭ ＮａＦ、１０μｇ／ｍｌアプロチニン、１０μｇ／ｍｌロイペプチン）中で、氷上で１０分間溶解した。抽出物を遠心し、アッセイ法に使用する細胞溶解液である上清を得た。溶解液を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｂｅｄｆｏｒｄ社、ＭＤ）に転写した。ウェスタンブロットのプロービングに使用した抗体は以下であった：抗Ｘｐｒｅｓｓｓリン酸ＦＫＨＲ（Ｔｈｒ２４、カスパーゼ−９、リン酸ｌｋＢａｌｐｈａ（Ｓｅｒ３２／３６）、Ｂａｄ、リン酸ＣＲＥＢ、リン酸ＧＳＫ３α（ｓｅｒ−９）、ＧＳＫ３モノクローナル、（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ社、ミシソーガ、ＯＮ、カナダ）。バンドはＥＣＬ化学発光基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｂｉｏｔｅｃｈ社）により可視化した。
【０２１０】
レポーターアッセイ法：２９３細胞を、Ｆｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を含む６ウェルプレートにおいて、製造業者の指示に従いトランスフェクションした。様々なレポーターアッセイ法を分析するために、各レポーター構築物を、ＬＥＦ−１／ＴＣＦ結合部位、ＡＰ１結合部位、およびＮＦ−κＢ結合部位のルシフェラーゼレポーター遺伝子構築物シリーズの指定量により一過性にトランスフェクションした。抽出物を調製し、トランスフェクション後２４〜４８でアッセイし、相対的ルシフェラーゼ活性を、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系を用いて、製造業者の説明に従って測定した。
【０２１１】
免疫細胞化学：２９３細胞株を、８チャンバースライド中で２日間増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、冷無水メタノールで１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄し、β−カテニン（＃Ｃ１９２２０−ＢＤ Ｔｒｕｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）、Ｈｉｓ−Ｐｒｏｂ（＃Ｓｃ−８０３、サンタクルズ、米国）および抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体（Ｒ９１０−２５、インビトロジェン社）と共に、４℃で一晩インキュベーションし、これらを全て０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有するＰＢＳ中に１：１００希釈し、その後ＰＢＳで洗浄した。ＡＢＣ法（ＡＢＣ−Ｅｌｉｔｅキット、ベクター）を用い、免疫染色を行った。染色の量および強度に従い、スケールを２つのクラスに分けた。「＋」と称するスライドは、陽性染色強度を有し、「−」と称するスライドは、免疫反応性を有さなかった。反応性の量を定量化するために、従来型の光学顕微鏡試験に加え、Ｉｍａｇｅ ｐｒｏ（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、ＭＤ、米国）を使用したコンピュータ画像解析によっても標本を調べた。
【０２１２】
Ｈｉ５昆虫細胞からのＧＳＴ−ＳＧＫ２ａの発現および精製：ヒトＳＧＫ２ａを、ベクター中に複数のクローニング部位を有するバキュロウイルスベクターｐＡｃＧ２Ｔへクローニングした。このベクターは、グルタチオンアガロースビーズ上でのアフィニティー精製を可能にするＮ末端グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ（ＧＳＴタグ）を有する。このベクターを、Ｓｆ９昆虫細胞へ脂質小胞を介して感染させた。バキュロウイルス粒子の力価は、Ｓｆ９昆虫細胞において増幅された。その後増幅された力価のバキュロウイルスを用い、約０．８ｘ１０６個細胞／ｍｌでＨｉ５細胞を含有する４個の容量２５０ｍｌの攪拌フラスコ（Ｐｙｒｅｘ社）で感染した。融合タンパク質細胞を８０ｒｐｍで攪拌しながら、２７℃で３．５日間インキュベーションして発現させた。この発現期間の終了時間際に、４個のＨｉ５細胞の１８０ｍｌ培養物の各々を、１００％ＤＭＳＯ（陰性対照）または３種の異なるＰＰ１およびＰＰ２ａホスファターゼ阻害剤：１００ｎＭミクロシスチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、５５．０５ｎＭカリクリンＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）、および９６．９ｎＭオカダ酸（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）のいずれか１つによる２７℃での処理により、４時間刺激した。最後に、これらの細胞を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｖａｎｔ−２５ローターＩＤ １０．５００で３０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心し、収集した。簡単に１ｘＰＢＳで洗浄した後、細胞を以下のプロテアーゼ阻害剤：１００μＭバナジン酸ナトリウム、１ｍＭグリセロリン酸、および２３７μｌプロテアーゼ阻害剤カクテルセットＩＩＩ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）を添加した５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／１％ＮＰ−４０、ｐＨ７．５溶解緩衝液中に再懸濁した。これらの細胞を、音波脱膜装置（ｓｏｎｉｃ ｄｉｓｍｅｍｂｒａｔｏｒ）の小プローブを用いて溶解した：８秒オンおよび５秒オフの出力１：３反復（ｒｅｐｉｔｉｔｉｏｎ）。細胞質タンパク質が上清中に放出されたら、細胞片を、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｖａｎｔｉ−３０にて１４，０００ｒｐｍ、１５ｍｌ、４℃の遠心により除去した。溶解液上清を、グルタチオンアガロースビーズ（ＳＩＧＭＡ社）に適用し、バッチ結合させ、４℃で３０分間逆さまに回転させた。非特異的タンパク質を、ＳＴＥＬ ５００（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）により５回ビーズから洗浄し、引き続きＳＴＥＬ ５０（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）で５回洗浄した。最後に、ＧＳＴタグを付けた融合タンパク質を、溶離緩衝液（２０ｍＭグルタチオン／５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／５０ｍＭ ＮａＣｌ）でビーズから溶離した。精製したＳＧＫ２ａキナーゼ活性を、共通のＳＲＣキナーゼファミリー基質であるＰＫＢペプチド
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およびＣａｐＫペプチド
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に対してアッセイした。
【０２１３】
実施例４
ＧＲＫ５
Ｇｅｎｂａｎｋ配列を、実施例１に記載のようにスクリーニングした。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアウトプットの分析は、例えば公知のキナーゼドメイン関連タンパク質と相同性はあるが同一ではないキナーゼドメイン関連タンパク質をコードする配列と関連する可能性のあるＩＭＡＧＥクローンＡＩ３５８９７４から、ＥＳＴ配列を同定した。
【０２１４】
ＡＩ３５８９７４ ＩＭＡＧＥクローンを、３７７自動ＤＮＡシーケンサー上において、標準のＡＢＩ色素プライマーおよび色素ターミネーター化学物質を用いて配列決定した。配列決定は、この配列が配列番号：７に相当していることを明らかにした。配列番号：２０および２１を増幅に使用した。
【０２１５】
ＧＲＫ５の発現は、ドットブロット分析により決定し、このタンパク質がいくつかの腫瘍試料において上方制御されたことがわかった。
【０２１６】
ドットブロット調製　全ＲＮＡを、同じ患者の臨床癌および対照試料から精製した。試料は、肝臓癌および結腸癌の両試料由来のものを使用した。逆転写酵素を用い、これらのＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。放射標識したｃＤＮＡを、Ｓｔｒｉｐ−ＥＺ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ社、オースチン、ＴＸ）を用いて製造業者の指示に従って合成した。次にこれらの標識され増幅されたｃＤＮＡをプローブとして使用し、ヒトＧＲＫ５を含むヒトプロテインキナーゼアレイへハイブリダイズした。各整列されたＥＳＴクローンへハイブリダイズした放射標識したプローブの量は、リン光造影を用いて検出した。
【０２１７】
ＧＲＫ５の発現は、試験した腫瘍組織において実質的に上方制御された。このデータは、対照非腫瘍試料に対する増加の倍数として表し、表６に示した。
【０２１８】
【表６】
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【０２１９】
ＧＲＫ５の発現　ＧＲＫ５をタンパク質レベルについて特徴決定するために、Ｈｉ５細胞を、ｐＡｃＧ４Ｔ３−ＧＲＫ５でトランスフェクションした。このＯＲＦを、バキュロウイルス発現ベクターｐＡｃＧ２Ｔ（ＢＤ ｐｈａｒｍａｇｅｎ社）へクローンニングした。この構築物をその後、直鎖状ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ＤＮＡと共に、Ｓｆ９細胞へ同時トランスフェクションし、単離された組換えウイルスを得た。この組換えウイルスを増幅し、次にｓｆ９細胞の感染に使用した。Ｈｉ５細胞において発現されたＧＲＫ５は、グルタチオンセファロースカラムクロマトグラフィーにより精製した。細胞溶解液を、更なる分析のために、これらの細胞株から調製した。簡単に述べると、方法の項で記されたように、昆虫細胞から異所性に発現されたタグが付けられたＧＲＫ５による沈殿を行った。これにより、本発明者らがこのキナーゼの特異的阻害剤を同定するためのインビトロキナーゼアッセイ法を行うことが可能になった。
【０２２０】
ＧＲＫ５をタンパク質レベルで特徴付けるために、ＨＥＫ２９３細胞を、標準方法によりｐｃＤＮＡ３−Ｘｐｒｅｓｓ−ＧＲＫ５でトランスフェクションした。一過性にトランスフェクションされた細胞株を用い、全細胞溶解液を作成し、これを抗Ｘｐｒｅｓｓモノクローナル抗体によるウェスタンブロットにより分析した。これらの実験は、安定してトランスフェクションされた細胞株中の融合タンパク質を明らかにしたのに対し、ベクターのみでトランスフェクションした対照ＨＥＫ２９３細胞株はこのタンパク質を有さなかった。同様に本発明者らは、トランスフェクションされたＨｉ５細胞においてもＧＲＫ５を検出した。
【０２２１】
抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を用い、免疫沈降によりキナーゼを精製した。抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体で沈降した融合タンパク質に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、本発明者らがトランスフェクションされた細胞の溶解液からのＧＲＫ５の精製に成功したことが示された。
【０２２２】
次に、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体で沈降した物質およびグルタチオンセファロースクロマトグラフィーで精製した物質を、インビトロキナーゼアッセイ法に使用した。カゼイン、ＭＢＰ、およびホスビチンは、精製されたＧＲＫ５によりリン酸化されることがわかった。基質が存在しない場合、放射性物質（３２Ｐ）の顕著な取込みは存在せず、これはＧＲＫ５がこれらの条件下では自己リン酸化しないことを示す。このことは、グルタチオンセファロースおよびＸ−ｐｒｅｓｓ抗体で精製された物質が、キナーゼ活性を有すること、ならびにこのキナーゼ活性はインビトロにおける基質のリン酸化することが可能であることを示唆している。
【０２２３】
ＧＲＫ５タンパク質の発現および精製　ヒトＧＲＫ５遺伝子を、強力なＡｃＮＰＶ（オウトグラフガ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス）ポリヘドリンプロモーターの制御下で、ｐＡｃＧ２Ｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）由来のバキュロウイルストランスファーベクターｐＡｃＧ４Ｔ３へサブクローニングした。これは、スポドプテラ・フルギペルダＳｆ９細胞において、標準技法を用い直鎖状ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ ＤＮＡと同時トランスフェクションされた（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）。ＧＳＴ−ＧＲＫ５組換えバキュロウイルスを、１０％ウシ胎仔血清を含むＴＮＭ−ＦＨ培地（ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で、Ｓｆ９細胞において増幅した。このＧＳＴ−ＧＲＫ５タンパク質を、Ｅｘｃｅｌｌ−４００培地（ＪＨＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）５００ｍｌ中で約５ｘ１０８個のＨｉ−５細胞（インビトロジェン社）において、多重感染度（ＭＯＩ）５で７２時間攪拌フラスコ中で発現した。細胞を、４℃、８００ｘｇ、５分間で収集した。ペレットを、溶解緩衝液４０ｍｌ中に音波処理により溶解し、１０，０００ｘｇ、４℃で１５分間遠心した。上清を、グルタチオンセファロース（Ｓｉｇｍａ社）２．５ｍｌを含むカラムに負荷した。このカラムを、洗浄緩衝液Ａで、ＯＤ２８０が基準値に戻るまで洗浄した。次にカラムを洗浄緩衝液Ｂで洗浄した。ＧＳＴ−ＧＲＫ５タンパク質を、溶離緩衝液で溶離した。溶離したタンパク質をアリコートとし、−７０℃で保存した。
【０２２４】
実施例５
ＤＭ−ＰＫ
ＧｅｎｂａｎｋのＥＳＴデータベースを、実施例１に記したように検索した。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアウトプットの分析は、例えば公知のキナーゼドメイン関連タンパク質と相同性はあるが同一ではないキナーゼドメイン関連タンパク質をコードする配列に関連する可能性のあるＩＭＡＧＥクローンＡＩ８８６００７から、ＥＳＴ配列を同定した。ＡＩ８８６００７ ＩＭＡＧＥクローンを、３７７自動ＤＮＡシーケンサー上において、標準のＡＢＩ色素プライマーおよび色素ターミネーター化学物質を用いて配列決定した。配列決定は、この配列が配列番号：９に相当していることを明らかにした。配列番号：２２および２３を増幅に使用した。ＤＭ−ＰＫの発現は、ドットブロット分析により決定し、かつこのタンパク質がいくつかの腫瘍試料において上方制御されたことがわかった。図５に示したように、配列番号：１０、配列番号：３８および配列番号：３９を含む、ＤＭＰＫの多くのイソ型が特徴決定された。
【０２２５】
ドットブロット調製　全ＲＮＡを、同じ患者の臨床癌および対照試料から精製した。試料は、肝臓癌および結腸癌の両試料由来のものを使用した。逆転写酵素を用い、これらのＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。放射標識したｃＤＮＡを、Ｓｔｒｉｐ−ＥＺ（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ社、オースチン、ＴＸ）を用いて製造業者の指示に従って合成した。次にこれらの標識され増幅されたｃＤＮＡをプローブとして使用し、ヒトＤＭ−ＰＫを含むヒトプロテインキナーゼアレイへハイブリダイズした。各整列されたＥＳＴクローンへハイブリダイズした放射標識したプローブの量は、リン光造影を用いて検出した。
【０２２６】
ＤＭ−ＰＫの発現は、試験した腫瘍組織において実質的に上方制御された。このデータは、対照非腫瘍試料に対する増加の倍数として表し、表７に示した。
【０２２７】
【表７】
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【０２２８】
表８に示したデータは、患者試料の病理学的報告の簡単な要約を提供している。
【０２２９】
【表８】
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【０２３０】
大腸菌におけるＤＭ−ＰＫ発現　ＤＭ−ＰＫをタンパク質レベルで特徴付けるために、大腸菌細胞を、ｐＧＥＸ−ＤＭ−ＰＫで形質転換した。ＤＭ−ＰＫのＯＲＦを、大腸菌の形質転換に使用したｐＧＥＸベクター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にクローニングした。形質転換されたコロニーを選択し、ＧＳＴ−ＤＭ−ＰＫ融合タンパク質を発現するために培養した。この融合タンパク質を、グルタチオンセファロースカラムクロマトグラフィーにより精製した。精製した画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、ＤＭ−ＰＫタンパク質に相当するバンドが示された。
【０２３１】
別の発現系として、本発明者らは、ＨＥＫ２９３細胞をＤＭ−ＰＫでトランスフェクションした。トランスフェクションされた細胞の細胞溶解液を調製した。本発明者らは、抗Ｘｐｒｅｓｓ抗体を使用し、組換え体ＤＭ−ＰＫを免疫沈降した。このデータは、トランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞からのＤＭ−ＰＫの発現および精製が成功したことを示している。
【０２３２】
キナーゼ活性　大腸菌およびトランスフェクションされたＨＥＫ２９３の両方から精製したＤＭ−ＰＫを、インビトロキナーゼアッセイ法に使用した。ＭＢＰおよびヒストンＨ１は両方とも、これらのアッセイ法において精製されたＤＭ−ＰＫによりリン酸化された。添加された基質が存在しない場合、放射性物質（３２Ｐ）の顕著な取込みはなく、このことは、ＤＭ−ＰＫがこれらの条件下では自己リン酸化しないことを示している。このデータは、精製されたＤＭ−ＰＫがキナーゼ活性を有することを示している。
【０２３３】
実験手法　ＤＭ−ＰＫは、細菌発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）へ、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩ部位を用いてサブクローニングした。ＧＳＴ−ＤＭ−ＰＫタンパク質は、１５０μＭ ＩＰＴＧの２Ｘ ＹＴ培地中、大腸菌ＤＨ５ａ細胞において、３７℃で一晩生成された。この細胞を、１０，０００ｘｇ、１０分間４℃で収集した。ペレットを、溶解緩衝液（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１％ＮＰ−４０、０．１％β−メルカプトエタノール、０．１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭベンズアミド、および１０μｇ／ｍｌトリプシン阻害剤）５０ｍｌ中で懸濁し、音波処理し、１０，０００ｘｇ、１５分間４℃で遠心した。上清を、３ｍｌグルタチオンセファロースカラムに負荷した。このカラムを、洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％β−メルカプトエタノール、０．１％ＮＰ−４０、０．１ｍＭ ＰＭＳＦおよび１ｍＭベンズアミド）で洗浄し、標準溶離緩衝液で溶離した。
【０２３４】
実施例６
ＰＤＫ２配列
Ｇｅｎｂａｎｋデータベースを、ＥＳＴについて検索し、実施例１に記載の公知のキナーゼドメイン関連タンパク質との類似性を示した。ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＸアウトプットの分析は、例えば公知のキナーゼドメイン関連タンパク質と相同性はあるが同一ではないキナーゼドメイン関連タンパク質をコードする配列に関連する可能性のあるＩＭＡＧＥクローンＡｆ３０９０８２からＥＳＴ配列を同定した。Ａｆ３０９０８２ ＩＭＡＧＥクローンを、３７７自動ＤＮＡシーケンサー上において、標準のＡＢＩ色素プライマーおよび色素ターミネーター化学物質を用いて配列決定した。配列決定は、この配列が配列番号：１１に相当し、第二の配列が配列番号：１３に相当していることを明らかにした。
【０２３５】
全ＲＮＡを、臨床癌および対照試料から精製し、逆転写酵素を用い、ｃＤＮＡを合成した。同一セット由来の正常組織および腫瘍組織に相当するｃＤＮＡを、αｄＣＴＰで同時に増幅および標識した。次に、標識され増幅されたｃＤＮＡを、３５４プロテインキナーゼを含むヒトプロテインキナーゼアレイへハイブリダイズした。各整列されたＥＳＴクローンへハイブリダイズした放射標識したプローブの量は、リン光造影を用いて検出した。この方法においても、結腸および肝臓の両腫瘍においてＰＤＫ２が対応する対照組織と比較して上方制御されることが明らかになった。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＫＣｌの存在下で濃度を増加したＣａＭＫ−Ｘ１またはベクタープラスミドでトランスフェクションされたＣｏｓ７細胞の増殖を示すグラフである。
【図２】ＣａｍＫＸ１によるＣＲＥＢｔｉｄｅおよびＳｙｎｔｉｄｅ２のインビトロのリン酸化を示すグラフである。
【図３】ＳＧＫ２の存在下での転写因子活性を示すグラフである。ＡＰ１およびＮＦ−κＢ活性は、ＨＥＫ２９３細胞、およびＳＧＫ２で安定してトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞において測定された。
【図４】ＰＤＫ１によるＳＧＫ２（Ｋ２５プラスミド）の活性化を示すグラフである。
【図５】いくつかのＤＭＰＫイソ型の配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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