(57)【要約】本発明は、移植に使用可能な神経細胞を提供するための、ドナーまたは患者から得た臍帯血細胞の使用に関する。本発明に係る単離細胞は、自家移植および同種移植、ならびに神経組織、特に脳および脊髄組織の修復、および脳および脊髄の神経変性疾患の治療に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞または前駆細胞の表現型を神経の表現型に変化させるために有効な量の分化促進物質に、臍帯血から得た多能性幹細胞または前駆細胞を暴露することによって得られる神経細胞。
【請求項２】
分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体のニューロン細胞、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＣＮＴＦ、ＢＭＰ、ＬＩＦ、ＧＧＦ、ＴＮＦ、ＩＧＦ、ＣＳＦ、ＫＩＴ−ＳＣＦ、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー、ＳＨＣ、神経蛋白質、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、細胞シグナル伝達分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
分化促進物質が、レチノイン酸とＮＧＦの混合物である、請求項１または２記載の細胞。
【請求項４】
以下の段階を含む、臍帯血から神経細胞を生産する方法：
ａ． 該臍帯血から単核細胞試料を得る段階；および
ｂ． 幹細胞または前駆細胞を神経の表現型に変化させるために、十分な期間、有効量の分化促進物質を含む培養培地で、段階ａで得られた該単核細胞を増殖させる段階。
【請求項５】
分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体のニューロン細胞、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＣＮＴＦ、ＢＭＰ、ＬＩＦ、ＧＧＦ、ＴＮＦ、ＩＧＦ、ＣＳＦ、ＫＩＴ、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー、ＳＨＣ、神経蛋白質、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、細胞シグナル伝達分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
分化促進物質が、レチノイン酸とＮＧＦの混合物である、請求項４または５記載の細胞。
【請求項７】
ニューロン細胞が中脳細胞および線条体細胞からなる群より選択される、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
以下の段階を含む、臍帯血から神経細胞を生産する方法：
ａ． 該臍帯血から単核細胞試料を得る段階；
ｂ． 該試料内の多能性幹細胞試料または前駆細胞試料を選択および単離する段階；および
ｃ． 幹細胞または前駆細胞を神経の表現型に変化させるために、十分な期間、有効量の分化促進物質を含む培養培地で、段階ｂで得られた幹細胞または前駆細胞を増殖させる段階。
【請求項９】
選択および単離段階ｂが、磁気細胞分離装置を用いて実施され、ＣＤマーカーを含む細胞を分離する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体のニューロン細胞、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＣＮＴＦ、ＢＭＰ、ＬＩＦ、ＧＧＦ、ＴＮＦ、ＩＧＦ、ＣＳＦ、ＫＩＴ、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー、ＳＨＣ、神経蛋白質、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、細胞シグナル伝達分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】
以下の段階を含む、臍帯血から神経細胞を生産する方法：
ａ． 該臍帯血から単核細胞試料を得る段階；
ｂ． 該単核細胞内の多能性幹細胞または前駆細胞を神経の表現型に変化させるために、十分な期間、有効量の分化促進物質を含む培養培地で、段階ａで得られた該単核細胞を増殖させる段階；および
ｃ． 該試料内の該多能性幹細胞試料または前駆細胞試料から、ＣＤマーカーを有する単核細胞試料を本質的に除去することによって、該神経細胞を選択および単離する段階。
【請求項１２】
選択および単離段階ｃが、磁気細胞分離装置を用いて実施され、ＣＤマーカーを含む細胞を分離する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体のニューロン細胞、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＣＮＴＦ、ＢＭＰ、ＬＩＦ、ＧＧＦ、ＴＮＦ、ＩＧＦ、ＣＳＦ、ＫＩＴ、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー、ＳＨＣ、神経蛋白質、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、細胞シグナル伝達分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
神経細胞が中脳細胞および線条体細胞からなる群より選択される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
以下の段階を含む、臍帯血から得た単核細胞試料から濃縮された神経細胞試料を生産する方法：
ａ． 該単核細胞試料から増殖する全ての細胞を本質的に除去するために有効な量の抗増殖物質の影響下に単核細胞を置く段階；
ｂ． 段階ａで残った非増殖細胞を、分裂促進剤に暴露し、多能性幹細胞または前駆細胞の群を含む、分化した細胞および休止期の細胞の群を提供する段階；
ｃ． 段階ｂで得られた該分化した細胞および休止期の細胞の群を増殖させて、該休止期の細胞を選択的に増殖させ、分化した細胞を本質的に排除する段階。
【請求項１６】
段階ｃで得られた細胞群を、多能性幹細胞または前駆細胞において神経の表現型を誘導するために有効な分化促進物質とインキュベートする段階をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
抗増殖物質がＡｒａ−Ｃである、請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
分裂促進因子が、上皮成長因子およびアメリカヤマゴボウマイトジェンからなる群より選択される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体のニューロン細胞、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＣＮＴＦ、ＢＭＰ、ＬＩＦ、ＧＧＦ、ＴＮＦ、ＩＧＦ、ＣＳＦ、ＫＩＴ、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー、ＳＨＣ、神経蛋白質、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、細胞シグナル伝達分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
レチノイン酸が、９−シスレチノイン酸、全トランス型レチノイン酸（ａｌｌ ｔｒａｎｓｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
神経細胞が同種移植に使用される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
神経細胞が同種移植に使用される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の有効な数の神経細胞を脳または脊髄に移植することを含む、障害を受けた脳または脊髄を治療する方法。
【請求項２４】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の有効な数の神経細胞を、患者に投与することを含む、神経変性疾患に罹患した患者を治療する方法。
【請求項２５】
神経変性疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、テイ・サックス病、レット症候群、リソソーム蓄積症、虚血、脊髄損傷、外傷による脳傷害、失調症、アルコール症、筋萎縮性側索硬化症、精神分裂病、および自閉症からなる群より選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
虚血が患者の卒中または心臓発作によって引き起こされる、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
臍帯血またはその単核細胞画分中の有効な数の神経細胞を、患者に投与することを含む、神経変性疾患に罹患した患者を治療する方法。
【請求項２８】
神経変性疾患が、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、テイ・サックス病、レット症候群、リソソーム蓄積症、虚血、脊髄損傷、外傷による脳傷害、失調症、アルコール症、筋萎縮性側索硬化症、精神分裂病、および自閉症からなる群より選択される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
患者に有効な数の神経細胞を投与することを含む、筋萎縮性側索硬化症以外の神経変性疾患に罹患した患者を治療する方法。
【請求項３０】
神経変性疾患が、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症（ＭＳ）、テイ・サックス病（βヘキソサミニダーゼ欠損）、レット症候群、リソソーム蓄積症、虚血、脊髄損傷、外傷による脳傷害、失調症、アルコール症、精神分裂病、および自閉症からなる群より選択される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも１つの有効量の神経分化促進物質と共に、臍帯血またはその単核細胞画分を含む、組成物。
【請求項３２】
分化促進物質が添加される細胞培地をさらに含む、請求項３１記載の組成物。
【請求項３３】
分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体の中脳細胞または線条体細胞、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、グリア成長因子（ＧＦＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、グリア成長因子（ＧＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＫＩＴ受容体幹細胞因子（ＫＩＴ−ＳＣＦ）、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、グリア細胞を欠如したサイレンサー因子、ニューロン限定サイレンサー因子、ＳＲＣホモロジー−２−ドメイン含有トランスフォーミング蛋白質、神経蛋白質、プロテオグリカン、糖蛋白質、および神経接着分子からなる群より選択される、請求項３１または３２記載の組成物。
【請求項３４】
分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体の中脳細胞または線条体細胞、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、グリア成長因子（ＧＦＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
分化促進物質が、レチノイン酸、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、グリア成長因子（ＧＦＦ）、および神経成長因子（ＮＧＦ）からなる群より選択される、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
分化促進物質が、レチノイン酸と神経成長因子の混合物である、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
以下の段階を含む、神経表現型マーカーを有する細胞の濃縮された単核細胞試料を含む薬学的組成物を生産する方法：
ａ． 臍帯血から単核細胞試料を得る段階；および
ｂ． 幹細胞または前駆細胞を神経の表現型に変化させるために、十分な時間、有効量の分化促進物質を含む培養培地で、段階ａで得られた単核細胞を増殖させる段階；および
ｃ． 段階ｂで得られた該細胞を、薬学的に許容される担体、添加剤、または賦形剤と組み合せる段階。
【請求項３８】
分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体のニューロン細胞、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＣＮＴＦ、ＢＭＰ、ＬＩＦ、ＧＧＦ、ＴＮＦ、ＩＧＦ、ＣＳＦ、ＫＩＴ、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー、ＳＨＣ、神経蛋白質、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、細胞シグナル伝達分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
分化促進物質が、レチノイン酸とＮＧＦの混合物である、請求項３７または３８記載の細胞。
【請求項４０】
神経細胞が、中脳細胞および線条体細胞からなる群より選択される、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
以下の段階を含む、臍帯血から得られた神経細胞を含む、薬学的組成物を生産する方法：
ａ． 該臍帯血から単核細胞試料を得る段階；および
ｂ． 該試料内の多能性幹細胞試料または前駆細胞試料を選択および単離する段階；
ｃ． 幹細胞または前駆細胞を神経の表現型に変化させるために、十分な時間、有効量の分化促進物質を含む培養培地で、段階ｂで得られた該幹細胞または前駆細胞を増殖させる段階；および
ｄ． 段階ｂで得られた該細胞を、薬学的に許容される担体、添加剤、または賦形剤と組み合せる段階。
【請求項４２】
選択および単離段階ｂが、磁気細胞分離装置を用いて実施され、ＣＤマーカーを含む細胞を分離する、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体のニューロン細胞、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＣＮＴＦ、ＢＭＰ、ＬＩＦ、ＧＧＦ、ＴＮＦ、ＩＧＦ、ＣＳＦ、ＫＩＴ、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー、ＳＨＣ、神経蛋白質、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、細胞シグナル伝達分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項４１または４２記載の方法。
【請求項４４】
以下の段階を含む、臍帯血から得られた神経細胞を含む、薬学的組成物を生産する方法：
ａ． 該臍帯血から単核細胞試料を得る段階；および
ｂ． 該単核細胞内の幹細胞または前駆細胞を神経の表現型に変化させるために、十分な時間、有効量の分化促進物質を含む培養培地で、段階ｂで得られた該単核細胞を増殖させる段階；および
ｃ． 該試料内の該多能性幹細胞試料または前駆細胞試料から、ＣＤマーカーを有する単核細胞を本質的に除去することによって、該神経細胞を選択および単離する段階；および
ｄ． 段階ｃで単離された神経細胞を、薬学的に許容される担体、添加剤、または賦形剤と組み合せる段階。
【請求項４５】
選択および単離段階ｃが、磁気細胞分離装置を用いて実施され、ＣＤマーカーを含む細胞を分離する、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
分化促進物質が、レチノイン酸、胎児または成体のニューロン細胞、ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ、ＣＮＴＦ、ＢＭＰ、ＬＩＦ、ＧＧＦ、ＴＮＦ、ＩＧＦ、ＣＳＦ、ＫＩＴ、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー、ＳＨＣ、神経蛋白質、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、細胞シグナル伝達分子、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項４４または４５記載の方法。
【請求項４７】
分化促進物質が、レチノイン酸と神経成長因子の混合物である、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
神経細胞が、中脳細胞および線条体細胞からなる群より選択される、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
有効量のヒト臍帯血またはその単核細胞画分を患者に投与することを含む、多発性硬化症（ＭＳ）、テイ・サックス病（βヘキソサミニダーゼ欠損）、レット症候群、およびリソソーム蓄積症からなる群より選択される神経変性疾患の患者を治療する方法。
【請求項５０】
ヒト臍帯血またはその単核細胞画分が、非経口投与経路から投与される、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
患者に有効量のヒト臍帯血またはその単核細胞画分を投与することを含む、筋萎縮性側索硬化症以外の神経変性疾患の患者を治療する方法。
【請求項５２】
神経変性疾患が、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症（ＭＳ）、テイ・サックス病、レット症候群、リソソーム蓄積症、虚血、脊髄損傷、外傷による脳傷害、失調症、アルコール症、精神分裂病、および自閉症からなる群より選択される、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
骨髄の造血細胞生産を抑制するために使用される放射線段階または化学療法段階を行なわずに、患者に有効量の神経細胞を投与することを含む、神経変性疾患の患者を治療する方法。
【請求項５４】
髄腔内、脳室内、実質内、嚢内、頭蓋内、線条体内、および黒質内からなる群より選択される投与経路で神経細胞が患者に投与される、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
神経変性疾患が、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、テイ・サックス病、レット症候群、リソソーム蓄積症、脊髄損傷、外傷による脳傷害、失調症、精神分裂病、および自閉症からなる群より選択される、請求項５３または５４記載の方法。
【請求項５６】
骨髄の造血細胞生産を抑制するために使用される放射線段階または化学療法段階を行なわずに、患者に有効量のヒト臍帯血または単核細胞画分を投与することを含む、筋萎縮性側索硬化症の患者を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、移植に使用する神経細胞を提供するための、ドナーまたは患者に由来するヒト臍帯血および／または単核細胞画分の使用に関する。本発明に係る単離細胞は、神経組織、特に脳および脊髄組織の移植および修復を実施するため、ならびに神経変性疾患や脳および脊髄の損傷を治療するために使用することができる。
【０００２】
発明の背景
神経生物学者により、成人の脳および脊髄のニューロンは一度障害を受けると再建できないと考えられている。したがって、脳および脊髄傷害、またはアルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経変性疾患に罹患した患者に、科学が希望を与えることはほとんどない。パーキンソン病およびアルツハイマー病は、治療が不可能だと考えられている神経変性疾患の例である。
【０００３】
パーキンソン病（ＰＤ）は、人生の中期または後期の疾患であり、非常に緩やかに進行し、長期の経過をたどる。「ハリソン内科書（Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、第２巻、２３版、Ｉｓｓｅｌｂａｃｈｅｒ、Ｂｒａｕｎｗａｌｄ、Ｗｉｌｓｏｎ、Ｍａｒｔｉｎ、ＦａｕｃｉおよびＫａｓｐｅｒ編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ Ｉｎｃ．、ニューヨーク市、１９９４、ｐ２２７５。パーキンソン病の患者に最も普通に見られる変化は、脳幹（黒質、青斑核２０）のメラニン含有神経細胞の凝集で、反応性のグリオーシスを伴う神経細胞の種々の度合いの欠失（黒質で最も顕著）、および明確な好酸性の細胞質封入体が見られる。（同上ｐ２２７６）。完全に発症すると、ＰＤは患者において容易に認識され、猫背、動作の強張りと緩慢さ、表情の不動性、ならびに積極的な意志を持った動作および完全な弛緩で鎮静する四肢の規則的な振戦が、一般的な特徴である。一般に、完全に発症した疾患に伴う他の特徴としては、加速歩行があり、これは患者が体の重心に追いつこうとしているかのように、加速したペースで素早く足を引きずって歩くか、または進行するものである。（同上ｐ２２７６）。
【０００４】
レボドパによる薬学的治療と定位手術を組み合せたパーキンソン病の治療では、良くて部分的治癒しか生じない（同上ｐ２２７７）。治療が困難なのは、主に、これらの治療法が、神経変性という基礎疾患過程に対して効果があるものではないからである。最終的に、薬理学では脳幹神経節ドーパミンの損失を代償できなくなる時点が訪れると思われる（同上）。
【０００５】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、患者における変性過程で生じる疾患で、基底前脳系、大脳皮質、および他の脳領域の細胞の進行性損失という特徴を有する。アセチルコリン伝達ニューロンおよびその標的神経が、特に影響を受ける。老人斑および神経原線維濃縮体が見られる。ピック病はアルツハイマー病と類似した臨床像を持つが、いくらか遅い臨床経過と限局性萎縮を持ち、主に前頭葉と側頭葉に影響を受ける。アルツハイマー病および他の痴呆の１つの動物モデルは、そのような病変の形成に遺伝的な傾向を示す。モデルにおいて物質が効果を示す場合、少なくともある種のアルツハイマー病とピック病に対しても有効である可能性があると考えられる。現在、待期療法はあるが、アルツハイマー患者の機能を回復する手段はない。
【０００６】
関連する一群の神経変性疾患は、小脳、脳幹、脊髄、および末梢神経ならびに時には大脳基底核の変性による進行性失調という特徴を持つ。これらの症候群の多くは遺伝性であり、散発的に起こるものもある。脊髄小脳変性症は論理的には３つの群、主に脊髄失調症、小脳失調症、および多系統変性症に分けられる。現在のところ治療法はない。フリードライヒ病は常染色体劣性の基本型の脊髄失調症である。原因遺伝子は９番染色体に見出されている。症状は９歳から１５歳の間に不安定歩行から発症し、その後上肢の失調および構音障害が続く。患者はフレキシック（ｆｌｅｘｉｃ）で、大線維感覚（振動感覚および位置感覚）を失う。同様な症状を示す疾患が他に２つある：バッセン・コンツバイク症候群（無ベータリポ蛋白血症およびビタミンＥ欠乏症）およびレフサム症候群（フィタン酸蓄積症）。小脳皮質の変性は通常３０歳から５０歳の間に起こる。臨床的には小脳機能不全の徴候のみが検知され、病的変化は、小脳、および時にはオリーブ下部に限定されている。遺伝性および散発性の症例が報告されている。同様な変性は、慢性アルコール症に関連する可能性もある。多系統変性では、失調は若年から中年成人で発症し、痙縮および錐体外、感覚、下位運動ニューロン、および自律神経の失調症の様々な組み合せで起こる。視神経萎縮症、色素性網膜炎、眼筋麻痺、および痴呆のある家族もある。
【０００７】
小脳変性の別の形態は、燕麦細胞肺癌、乳癌、卵巣癌のような一部の癌に伴って発生する腫瘍随伴小脳変性である。失調症の発生後、何週間から何年か後に癌が発見される場合もある。プルキンエ細胞は永久に失われ、失調症が発生する。患者の癌が永久に治癒した場合でも、プルキンエ細胞の損失のためにその機能能力は著しく障害を受ける可能性がある。特定の治療法はない。
【０００８】
卒中でも神経変性および機能的シナプスの損失が生じる。現在、修復方法はなく、一時的緩和およびリハビリが行われる。
【０００９】
中枢神経系の発生の研究、およびパーキンソン病および他の神経変性疾患のような疾患における罹患組織の修復のために、神経移植が用いられてきた。いくつかの大学（南フロリダ大学を含む）において、少数の患者で胎児組織を直接患者の脳に移植することによってニューロンを補充する実験が行われた；しかし今のところ、ヒトの胎児ニューロンの実験的移植は、適当な組織の供給源が少ないこと、ロジスティックスの問題、法的倫理的制約、および宿主の脳で移植されたニューロンの生存率が悪いことなどの制約を受けている。１つの方法では、骨髄間質細胞を非造血組織のための幹細胞として使用することで、ニューロンを補充する。骨髄間質細胞は、組織培養用プラスチックに接着する傾向があるために、骨髄の他の細胞から単離することができる。この細胞は、培養で骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、および筋芽細胞にさえも分化し得るので、間質細胞とおおまかに定義できる組織のための幹細胞の特徴を多く有する。骨髄細胞（ＢＭＳＣ）のこの集団は、樹状細胞の調製にも使用されたが（Ｋ． Ｉｎａｂａら、Ｊ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄ． １７６：１６９３−１７０２ （１９９２））、樹状細胞は名前の通り、ニューロンと混同され得る形態を有する。樹状細胞は、Ｔ細胞応答の開始に関与する抗原提示細胞の系を含む。樹状細胞の生産を刺激する特定の成長因子は、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子３０ （ＧＭ−ＣＳＦ）であると報告されている。Ｋ． Ｉｎａｂａら、Ｊ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄ． １７６：１６９３−１７０２ （１９９２）。
【００１０】
骨髄から得た幹細胞を用いて、神経移植に使用可能な神経細胞を提供する研究が行われた。国際公開公報第９９／５６７５９号を参照のこと。この特許は、骨髄幹細胞を非造血系に使用するための１３０年以上にわたる研究の頂点となっている。
【００１１】
１９９０年以来、いくつかの研究者グループが、骨髄からより均一な幹細胞群を調製しようと試みてきた。例えば、１９９２年２月１１日に発行された米国特許第５，０８７，５７０号は、均一な哺乳類造血幹細胞組成物の単離方法を開示している。濃縮された造血幹細胞組成物は、分化したまたは運命の決定された造血細胞を実質的に含まない。所望の細胞は、特定のマーカーを有する他の細胞を取り除くことによって得られる。得られる組成物は、個々または一群の造血細胞系統を提供するため、宿主の幹細胞を再構成するため、および様々な造血成長因子の解析法を同定するために使用できる可能性がある。
【００１２】
１９９７年５月２７日に発行された米国特許第５，６３３，４２６号は、造血細胞の分化および生産の別の例である。免疫不全キメラマウスに、移植時から少なくとも４週間にわたってヒト骨髄が投与された。骨髄は、赤血球を除いては、骨髄の正常な細胞群となった。ヒト骨髄を持つこれらのマウスは、ヒト造血細胞の増殖および分化に対する様々な物質の効果を調べるために使用することができる。１９９７年９月９日に発行された米国特許第５，６６５，５５７号は、マーカーＣＤｗ １０９を発現する細胞の濃縮画分を分離することにより、濃縮造血幹細胞を得る方法に関する。造血巨核球前駆細胞の濃縮された組成物を得る方法も提供されている。幹細胞の濃縮された組成物およびそれから得られる細胞群も、この発明によって提供される。細胞の使用方法も含まれる。
【００１３】
１９９５年６月５日に発行された米国特許第５，４５３，５０５号は、分化の別の方法である。始原組織が免疫不全の宿主に導入され、そこで始原組織は発生および分化する。このキメラ宿主では、この異種組織の過程および発生の研究、組織の増殖と分化に対する様々な物質の効果の試験、および増殖と分化に関与する物質の同定が可能である。
【００１４】
１９９８年５月１９日に発行された米国特許第５，７５３，５０５号は、約９０％より多くが哺乳類の非腫瘍由来の神経前駆細胞である単離された細胞組成物を提供するが、この神経前駆細胞は神経特異的マーカーを発現し、神経細胞に分化可能な前駆細胞を提供できるものである。この細胞組成物を利用して、神経疾患を治療する方法も提供されている。
【００１５】
１９９６年８月６日に発行された米国特許第５，７５９，７９３号は、細胞群の混合物から、磁気的に安定化した流動層を用いて、少なくとも１つの哺乳類細胞群をポジティブ選択およびネガティブ選択する方法を提供する。この方法の１つの応用は、造血細胞の分離および精製である。標的細胞群にはヒト幹細胞が含まれる。
【００１６】
１９９８年８月４日に発行された米国特許第５，７８９，１４８号は、細胞を分離するためのキット、組成物、および方法を提供する。このキットには、遠心可能な容器、およびポリラクタムを含み、電離放射線で滅菌した、密度勾配分離に適したオルガノシラン化したシリカ粒子ベースの細胞分離懸濁液が含まれる。組成物には、少なくとも０．０５％のポリラクタムを含み、好ましくは電磁放射線で処理された、細胞の分離用のシラン化シリカ粒子ベースの懸濁液が含まれる。また、血液細胞混合物から数の少ない血液細胞を単離するための方法も開示される。
【００１７】
過去数年、細胞療法および遺伝子療法の媒体として、間葉幹細胞（ＭＳＣ）が研究されてきた。これらの細胞は、局所麻酔で得られる少量の骨髄吸引液から比較的簡単に単離することができる。また、培養して増殖させ、外因性遺伝子とトランスフェクトするのも比較的容易である。Ｐｒｏｃｋｏｐ、Ｄ．Ｊ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６：７１−７４ （１９９７）。したがって、ＭＳＣは遺伝子療法に使用するために、造血幹細胞（ＨＭＣ）に比べていくつかの利点があると思われる。適当な数のＨＳＣを単離するためには、大量の骨髄（１リットルまたはそれ以上）が必要であり、培養により増殖させるのも困難である（Ｐｒｏｃｋｏｐ、ｉｏ Ｄ．Ｊ． （同上））。
【００１８】
骨髄組織には、患者自身の骨髄、血縁者またはＭＨＣの適合する他人の骨髄、および骨髄バンクを含め、いくつかの供給源がある。この供給源を含む特許がいくつかある。１９９４年５月１７日に発行された米国特許第５，４７６，９９７号は、ヒト骨髄同等物の生産方法を開示する。免疫不全哺乳類宿主中にヒト造血系が提供され、そこで造血系は長時間機能する。この方法では、ヒト胎児肝臓組織およびヒト胎児胸腺が、若い免疫不全マウスの血液系が供給される部位に導入され、それにより胎児組織が機能的なヒト骨髄組織を形成する。
【００１９】
ヒト胎児組織は、移植可能なニューロンの供給源でもあるが、その利用には異論が多い。１９９７年１１月２５日に発行された米国特許第５，６９０，９２７号も、ヒト胎児組織を使用する。ヒト胎児神経由来細胞株が宿主組織に移植される。この方法では、様々な神経疾患および他の疾患の治療が可能である。
【００２０】
１９９８年５月１９日に発行された米国特許第５，７５３，４９１号は、遺伝的に無関係な細胞を宿主に移植することにより、宿主を治療する方法を開示する。具体的には、この発明はヒト胎児神経由来細胞株、およびこれらの不死化したヒト胎児神経由来細胞を宿主に移植することによって宿主を治療する方法を提供する。１つの供給源はマウスであり、１９９６年１２月３日に発行された米国特許第５，５８０，７７７号に含まれる。この特許は、ニューロンおよび／またはグリア細胞の特徴を持つ細胞株を含む不死化した神経前駆細胞株のインビトロ生産の方法に関し、ｍｙｃファミリーの癌遺伝子メンバーを有するレトロウイルスベクターを、神経上皮または神経堤細胞に感染させる段階を含む。
【００２１】
１９９８年５月１９日に発行された米国特許第５，７５３，５０６号は、哺乳類の胎児神経上皮（ＣＮＳ幹細胞）の多能性前駆細胞の均一な細胞群が、ニューロン、希突起膠細胞、および星状細胞に分化する多能性を保持しながら、培養で１０倍にまで増殖するインビトロ手法を開示している。幹細胞から多数のニューロンを増殖させるための化学的条件が示されている。また、各々がニューロン、星状細胞、または希突起膠細胞の比率を有意に高くする４つの因子、ＰＤＧＦ、ＣＮＴＦ、ＬＩＦ、およびＴ３が同定された。これらの手法は、哺乳類のＣＮＳ幹細胞、ニューロン、星状細胞、および希突起膠細胞の大量調製を可能にするためのものである。これらの細胞は、神経疾患の細胞および遺伝子に基づく多くの治療のための重要なツールとなると提案されている。幹細胞の別の供給源は、霊長類の胚幹細胞である。１９９８年１２月１日に発行された米国特許第５，８４３，７８０号は、これらの幹細胞を利用している。幹細胞の精製された調製物が開示される。この調製物は、以下の細胞表面マーカーで特徴づけられる：ＳＳＥＡ−Ｉ （−）； ＳＳＥＡ−３ （＋）； ＴＲＡ−１−６０ （＋）； ＴＲＡ−１−８１ （＋）；およびアルカリホスファターゼ（＋）。１つの態様では、この調製物の細胞は、正常な核型を持ち、１１ヶ月の連続培養後にも、未分化状態で増殖し続ける。この胚幹細胞株は、栄養膜を形成する能力および胚の３つ全ての胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）に由来する組織に分化する能力を保持していると記述されている。霊長類の胚幹細胞株を単離する方法も、この特許に開示されている。
【００２２】
神経移植は、動物モデルおよびヒト患者の双方において、神経変性疾患および卒中の治療、ならびに脳および脊髄の外傷の修復のために、科学的に実現可能で臨床的に有望な方法であるというかなりの証拠が得られている。それにもかかわらず、神経移植が広く使われるための制限となっている倫理的および技術的な数多くの制約を回避するために、別の細胞源および分化のための新規の方法が必要である。つまり、移植のための神経細胞の、簡単に使用でき、信頼のおける供給源を開発する必要がある。
【００２３】
臍帯血は、１９７０年代初期のＥｎｄｅの研究の頃から造血系の再生に使用されてきた。臍帯血は、幹細胞を含む造血前駆細胞が豊富なため、造血系の再生のためには良い細胞源となる。しかし、おそらく、臍帯血中に見られる神経前駆細胞の生育可能な供給源を作製できないため、現在まで、臍帯血に存在する多能性幹細胞または関連する神経前駆細胞を、神経移植に使用するための研究はほとんど行われていない。
【００２４】
ヒトの臍帯血と胎盤血は、造血幹細胞の豊富な供給源を提供する。この所見に基づき、臍帯血幹細胞を用いて、悪性疾患および非悪性疾患を持つ小児において、骨髄機能廃絶化学療法の後に、造血系が再生されてきた。ＳｉｒｃｈｉａおよびＲｅｂｕｌｌａ、１９９９、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ８４：７３８−４７。初期の結果では、１つの臍帯血試料で、短期および長期の移植を提供するために十分な造血幹細胞が提供され、ＨＬＡ不適合移植でも、移植片対宿主疾患の発生率は低いことが示されている。これらの結果と、骨髄細胞はニューロンおよびグリアに分化できる幹細胞を含んでいるという本発明者らの以前の発見を合わせて、臍帯血またはその単核細胞画分を使用して脳および脊髄の神経損傷を修復する本発明に至った。Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓら、１９９８． Ｍｏｖｅｍｅｎｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ １３ （ｓ２）： １２２およびＳａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓら、（２０００） Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．
【００２５】
発明の目的
本発明において、患者の脳および脊髄への移植および神経変性疾患の治療に使用されるニューロンおよびグリア細胞に容易に分化しうる多能性幹細胞および／または前駆細胞の新規の供給源を提供することを目的とする。
【００２６】
移植に使用する神経細胞の有効な量または濃度を含む薬学的組成物、および神経変性疾患または脳もしくは脊髄の損傷もしくは障害の治療のための方法を提供することも、本発明の別の目的とする。
【００２７】
多能性幹細胞および／または前駆細胞を単離し、移植手法または神経変性疾患の治療に使用可能なニューロンおよびグリア細胞への分化を誘導するための方法を提供することも、本発明のまた別の目的とする。
【００２８】
臍帯血に由来する神経細胞および／またはニューロン細胞および／またはグリア細胞を用いて、神経変性疾患および脊髄／脳損傷を治療する方法を提供することをさらなる目的とする。
【００２９】
患者の脳および脊髄のような神経系の損傷を受けた器官を修復するために、臍帯血由来の神経および／またはニューロンおよび／またはグリア細胞を移植する方法を提供することも、本発明のさらなる目的とする。
【００３０】
本発明のこれらの目的および／またはその他の目的は、以下に記載する本発明の詳細な説明から容易に見いだすことができる。
【００３１】
本発明の簡単な説明
本発明は、新鮮なもしくは再生された臍帯血、またはその単核細胞画分が、神経細胞および／またはニューロン組織に分化することができ、ニューロン移植（自家移植および同種移植）に使用できる細胞の新規の供給源であるため、しばしば入手が困難なプールされた胎児のニューロン組織または骨髄組織を使用する必要がないという、予想外の発見に関する。したがって、本発明は自家移植（ある個体の細胞が同一の個体に使用される）、同種移植（ある個体の細胞が別の個体に使用される）、および異種移植（１つの種から別の種へ移植される）に使用できる。本発明のこの局面では、新生児または胎児の臍帯血は、インビトロおよびインビボでニューロンになるよう誘導できる細胞を含んでいるということが、予想外に発見された。これらの細胞は、神経障害を改善し、神経／ニューロン組織、特に脳および脊髄の組織の移植および修復を行ない、および脳および脊髄の神経変性疾患を治療するための、自家移植または同種移植手法に使用することができる。
【００３２】
本発明の１つの局面では、臍帯血由来の神経細胞は、患者の脳または脊髄に移植するために適している。これらの神経細胞は、本明細書に記載される任意の１つまたは複数の方法によって、精製および／または分化促進物質とインキュベートするか、またはこれらの細胞を臍帯血の粗単核細胞画分から得て、さらなる精製または分化なしに直接使用することができる。別の局面では、臍帯血は精製せずに使用することができる。
【００３３】
本発明の別の局面では、臍帯血を得る段階、神経前駆細胞である臍帯血多能性幹細胞または前駆細胞を選択する段階、および臍帯血細胞または前駆細胞を分化促進物質とインキュベートして、移植可能な神経細胞の集団を生産するために細胞の表現型を変化させる段階を含む、臍帯血から神経細胞を得る方法が提供される。本方法の段階は、神経の表現型の細胞を分離する前に、全ての細胞（例えば、臍帯血試料またはその単核細胞画分）が分化促進物質とインキュベートされるように変更することができる。
【００３４】
本発明の方法は、磁気細胞分離装置を用いてＣＤマーカーを含む全ての細胞を分離し、その後、レチノイン酸、胎児ニューロン細胞、もしくはＢＤＮＦ、ＧＤＮＦおよびＮＧＦのような成長因子、またはそれらの混合物のような分化促進物質を含む増殖培地中でマーカーを含まない細胞を増殖させて、臍帯血から得られた単核細胞群から多能性幹細胞および前駆細胞を分離する段階を含む。好ましくは、レチノイン酸および少なくとも１つの成長因子、例えば、神経成長因子が、分化促進物質として使用される。レチノイン酸は、９−シス−レチノイン酸、全トランス型レチノイン酸（ａｌｌ ｔｒａｎｓｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ）、およびそれらの混合物であってもよい。分離およびインキュベーション（分化）段階は、互換的に行うことができる。
【００３５】
または、多能性幹細胞および／または前駆細胞の濃縮細胞群は、臍帯血から得られた単核細胞群から、全てまたは実質的に全ての増殖している細胞を除去するために有効な抗増殖物質（例えばＡｒａ−Ｃ［シチジンアラビノシド］またはメトトレキセート）を単核細胞群に加え、残った非増殖細胞を上皮成長因子または他の分裂促進因子（他の成長因子を含む）のような増殖促進剤に暴露し、分化細胞および休止期の細胞（多能性幹細胞または前駆細胞）を提供することにより得られる。この細胞群は培地中で培養され、休止期の細胞は細胞群中で濃縮され分化した細胞よりはるかに数が多くなる。得られた多能性幹細胞および／または前駆細胞は、幹細胞および／または前駆細胞の表現型を、さらなる精製なしで直接に移植手法に使用できるニューロンおよび／またはグリア細胞に変化させるために、上述のように、分化促進物質を含む細胞培地中で培養することができる。
【００３６】
多能性幹細胞および／または前駆細胞に由来する臍帯血試料は、新鮮な臍帯血、低温保存した臍帯血を再生したもの、または新鮮もしくは低温保存したその単核細胞画分であってもよい。
【００３７】
本発明に係る新規組成物は、有効量の少なくとも１つの神経細胞分化促進物質と組み合わせて、臍帯血、またはその単核細胞画分を含む。本発明で使用される神経細胞分化促進物質には、例えば、レチノイン酸、中脳細胞または線条体細胞を含む胎児または成体ニューロン細胞、または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、グリア成長因子（ＧＦＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、またはそれらの混合物のような成長因子またはサイトカインが含まれる。他の分化促進物質には、例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、グリア成長因子（ＧＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＫＩＴ受容体幹細胞因子（ＫＩＴ−ＳＣＦ）、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー（グリア細胞を欠如した、ニューロン限定サイレンサー因子を含む）、ビタミンＥ（トコフェロール）およびビタミンＥエステルのような抗酸化剤、リポ酸、ＳＨＣ （ＳＲＣホモロジー−２−ドメイン含有トランスフォーミング蛋白質）、神経蛋白質、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、およびその他の細胞シグナル伝達分子、およびそれらの混合物のような成長因子が含まれる。
【００３８】
また上述の方法のうちの１つまたは複数によって生産され、特異的な神経解剖学的領域に移動及び局在し、移植部位の領域に典型的なニューロンまたはグリア細胞に分化し、特徴的な組織パターンの組織に統合される能力を有する、多能性幹細胞および／または前駆細胞の細胞株も提供される。これらの細胞または他の神経細胞を利用した薬学的組成物も本発明の１つの局面である。
【００３９】
本発明は、脱水された培地の入ったフラスコ、および多能性幹細胞および／または前駆細胞および／または他の神経細胞を含む、ニューロン移植キットにも関する。
【００４０】
本発明は、神経変性疾患または脳もしくは脊髄の損傷または神経欠損の治療方法にも関し、これはそのような損傷、神経変性疾患または神経欠損を持つ患者に、有効量の本発明に係る神経および／またはニューロンおよび／またはグリア細胞を投与（好ましくは移植）することを含む。本発明に係る方法により治療可能な神経変性疾患には、例えば、パーキンソン病、ハンチントン病、多発性硬化症（ＭＳ）、アルツハイマー病、テイ・サックス病（βヘキソサミニダーゼ欠損）、リソソーム蓄積症、虚血による脳および／または脊髄損傷、脊髄および脳障害／損傷、失調症およびアルコール症があり、他に本明細書に記載される疾患も含まれる。
【００４１】
本発明は、患者の遺伝的欠損、身体的傷害、環境的傷害、または卒中、心臓発作もしくは心血管疾患（多くは虚血による）による障害の結果として起こる脳または脊髄の神経障害を治療する方法にも関し、本方法では、患者の臍帯血から得られた有効な数または量の神経細胞を、患者の脳または脊髄の罹患組織への直接投与を含め、投与（移植を含む）することを含む。本発明に係る細胞を患者に投与し、中枢神経系の適当な部位に細胞が移動するようにすることは、本発明のもう１つの局面である。
【００４２】
患者自身の臍帯血から自家移植用の神経および／またはニューロンおよび／またはグリア細胞を得る方法には、１） 新鮮もしくは低温保存された臍帯血または臍帯血の低温保存された単核細胞画分から、単核細胞を採取する段階；２） 臍帯血または単核細胞画分から多能性幹細胞および／または前駆細胞を分離する段階；３） 有効量の分裂促進因子を含む培地中で幹細胞および／または前駆細胞をインキュベートする段階；および４） 段階３で得られた幹細胞および／または前駆細胞を分化促進物質とインキュベートする段階が含まれる。
【００４３】
発明の詳細な説明
以下の定義は本発明を説明するために明細書全体で使用されている。
【００４４】
「患者」という用語は、本発明に係る組成物を用いて予防治療を含めた治療が実施される動物、好ましくはヒトを記述するために本明細書で使用される。ヒトの患者のような特定の動物に特異的な感染、状態、または疾患の治療では、患者という用語はその特定の動物を指す。「ドナー」という用語は、患者に使用する臍帯血を提供する個体（ヒトを含めた動物）を意味する。
【００４５】
「臍帯血（ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）」または「臍帯血（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）」という用語は、本明細書では、新生児または胎児、最も好ましくは新生児から得られる血液を意味するように使用され、好ましくは新生児の臍帯または胎盤から得られた血液を指す。臍帯血または胎盤血は比較的容易に手に入り、ドナーに外傷を与えないため、単核細胞源としてこれを使用することは有利である。対照的に、ドナーから骨髄細胞を採取すると、ドナーに外傷を与える。臍帯血は、必要な場合には、自家移植または同種移植に使用することができる。好ましくは、臍帯血は臍帯からの直接の排液法および／または分娩後の胎盤の根および拡張した静脈からの針吸引によって得られる。
【００４６】
「有効量」という用語は、幹細胞および／または前駆細胞を、神経、ニューロンおよび／もしくはグリア細胞に分化させること、または神経変性疾患、もしくは卒中、心臓発作、もしくは事故の犠牲者のような患者の中枢神経系への障害を含む他の神経状態を治療することを含む意図した結果を得るために、または治療されるべき患者にそれらの細胞を移植するために、例えば、分化促進物質、分裂促進因子、神経および／またはニューロンもしくはグリア細胞、または他の物質の、有効な成分の濃度または量を記述するために本明細書で使用される。本発明に係る組成物は、脳もしくは脊髄、または治療する疾患または状態において、好ましい変化を生じさせるために、組成物内の神経細胞の移植を実行するために使用することができる。その変化とは、改善（疾患もしくは状態の悪化の停止または逆行、神経欠損の低下、または神経応答の改善など）、または治療する疾患または状態の完全な治癒である。
【００４７】
「神経細胞」は、１つまたは複数のニューロンまたはグリアマーカーの染色のような、ニューロンまたはグリアの表現型を少なくとも１つ示すか、ニューロンまたはグリアマーカーを示す細胞に分化する細胞である。本発明に係るニューロン細胞を同定するために使用できるニューロンマーカーの例には、ニューロン特異的核蛋白質、チロシンヒドロキシラーゼ、微小管関連蛋白質、カルビンジンなどがある。神経細胞という用語には、神経前駆細胞、すなわち、最終的にはニューロンまたはグリアマーカーを示す細胞または神経細胞に分化する幹細胞および／または前駆細胞も含まれ、この用語には、最終的にニューロンおよび／またはグリアに分化する、多能性幹細胞および／または前駆細胞が含まれる。上述の細胞およびその子孫は全て、本発明では神経細胞と解釈される。神経幹細胞は、生物体の一生に渡って増殖し、自己維持、または再生し、神経の子孫クローンを作り出す能力を有する細胞である。神経幹細胞は、発生時に、ニューロン、星状細胞、および希突起膠細胞を生じ、成体の脳でいくつもの神経細胞を補充できる。本発明においては、神経幹細胞は神経細胞である。「神経細胞」および「ニューロン細胞」という用語は、本発明の多くの局面では、一般的に互換的に使用される。本発明に係る特定の局面で使用されるために好ましい神経細胞には、Ｍｕｓａｓｈｉ−１、Ｎｅｓｔｉｎ、ＮｅｕＮ、クラスＩＩＩβチューブリン、ＧＦＡＰ、ＮＦ−Ｌ、ＮＦ−Ｍ、微小管関連蛋白質（ＭＡＰ２）、Ｓ１００、ＣＮＰアーゼ、グリピカン（特にグリピカン４）、神経ペントラキシンＩＩ、神経ＰＡＳ１、神経成長関連蛋白質４３、神経突起成長蛋白質、ビメンチン、Ｈｕ、インターネキシン、Ｏ４、ミエリン塩基性蛋白質、およびプレイオトロフィンなどのような神経／ニューロン表現型マーカーを１つまたは複数示す細胞が含まれる。
【００４８】
「投与」または「投与する」という用語は、本発明に係る神経細胞を、治療目的で患者に送達する過程を記述するために本明細書で使用される。神経細胞は、非経口（この用語は静脈内および動脈内、およびその他の適当な非経口経路を指す）、髄腔内、脳室内、実質内（脊髄、脳幹、または運動皮質含む）、嚢内、頭蓋内、線条体内、黒質内などを含むいくつかの経路で投与でき、この用語では、神経細胞が必要な部位に移動することが可能である。神経細胞は臍帯血の全血またはその画分（単核細胞画分または高濃度の神経細胞を含めた神経細胞画分を含む）の形態で投与できる。本発明に係る組成物は、分化促進物質の処理なしで（「未処理」すなわち、臍帯血試料中の細胞の分化を促進するための更なる処理なしで）、または分化促進物質または臍帯血内の特定の多能性幹細胞および／または前駆細胞を、ニューロンおよび／またはグリアの表現型を示す細胞に分化させる他の物質の処理後（「処理」）に、使用できる。投与はしばしば治療する疾患または状態に依存し、例えば、静脈内のような非経口経路、脳脊髄液内への投与、または脳の罹患組織への直接の投与が好ましい場合がある。例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病およびパーキンソン病の場合には、好ましい投与経路は線条体（尾状核カタメン（ｃａｕｄａｔｅ ｃｕｔａｍｅｎ））または黒質（パーキンソン病）への直接の移植である。筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）および多発性硬化症の場合には、好ましい投与経路は、脳脊髄液である。リソソーム蓄積症の場合には、好ましい投与経路は静脈内または脳脊髄液である。卒中の場合には、好ましい投与経路は卒中の場所に依存するが、しばしば罹患組織（ＭＲＩまたは他の画像診断技術で容易に決定できる）への直接投与である。
【００４９】
しかし、これらの状態はそれぞれ他の投与経路でも治療でき、これには例えば、状態または病態を治療するために、臍帯血の全血またはその単核細胞画分を静脈内または動脈内に投与することが含まれる。しかしそのような治療、特に筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）の場合には、臍帯血の全血、もしくはその単核細胞画分の非経口投与（特に静脈内または動脈内）、または他の投与経路による患者の治療は、臍帯血またはその単核細胞画分の投与前、投与中、または投与後に、放射線また化学療法（造血細胞を減少、破壊、および補充するために、患者の骨髄細胞または他の組織を除去するためにしばしば用いられる）のような他の治療法を行なわずに実行することが好ましい。
【００５０】
「移植する（ｇｒａｆｔｉｎｇ）」、「移植する（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ）」、「移植片（ｇｒａｆｔ）」、および「移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」という用語は、本発明に係る神経および／またはニューロン細胞が、好都合な効果を示すはずの神経系内の部位に送達される過程を記述するために、本明細書内で同じ意味で使用される。好都合な効果とは、例えば、事故またはその他の活動によって引き起こされた、患者の中枢神経系への障害の修復；神経変性疾患の治療；または卒中、心血管疾患、心臓発作もしくは身体的傷害もしくは外傷もしくは遺伝的障害、または脳および／または脊髄に対する環境的傷害による神経障害の効果の治療のようなものである。本発明で使用される神経細胞は、移植を達成するために、中枢神経系の適当な領域への細胞の移動に依存して、上述のような任意の投与方法によって、体の遠い領域に送達されても良い。
【００５１】
「本質的に」という用語は、少なくとも９５＋％有効、より好ましくは少なくとも約９８％有効、およびさらに好ましくは少なくとも９９％有効な細胞群または方法を記述するために使用される。したがって、所与の細胞群を「本質的に」除去する方法は、標的細胞群の少なくとも約９５＋％、最も好ましくは細胞群の少なくとも約９９％を除去する。本発明に係る神経細胞は、特定の好ましい態様においては、造血細胞（すなわち、単核細胞画分のＣＤ３４＋細胞成分）を本質的に含まない。
【００５２】
「非腫瘍形成性」という用語は、細胞が新生物または腫瘍を発生させないという事実を指す。本発明で使用される幹細胞／前駆細胞は、一般的に新生物および癌を含まない。
【００５３】
「細胞培地（ｃｅｌｌ ｍｅｄｉｕｍ）」および「細胞培地（ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａ）」という用語は、単核細胞および／または神経細胞が増殖する細胞増殖培地を意味する。細胞培地は当技術分野で周知であり、少なくとも最少必須培地に加えて、成長因子、ブドウ糖、非必須アミノ酸、インスリン、トランスフェリン、および当技術分野で周知の他の物質のような物質を選択的に含む。特定の好ましい態様では、単核細胞画分内の特定の細胞が神経細胞に分化するのを促進するために、単核細胞画分が培養される細胞培地に少なくとも１つの分化促進物質が添加される。
【００５４】
本発明の好ましい局面では、標準細胞培地（好ましくは、少なくとも非必須アミノ酸、グルタミン、メルカプトエタノール、およびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）が添加された最少必須培地）中で培養された単核細胞は、「神経増殖培地」（すなわち、神経細胞を効率的に成長させる培地）中で培養され、その後、一般的には神経増殖培地と似ているが培地に特定の神経分化促進物質が添加され、場合によっては他の成長因子が制限または除去された「分化培地」で培養される。特に好ましい神経増殖培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１細胞培地を含み、０．６％ブドウ糖、インスリン（２５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン２０ ｎＭ、プトレッシン（６０μＭ）、塩化セレニウム３０ ｎＭ、グルタミン２ ｍＭ、炭酸水素ナトリウム３ ｍＭ、ＨＥＰＥＳ ５ ｍＭ、ヘパリン２μｇ／ｍｇ、およびＥＧＦ ２０ ｎｍ／ｍｌ、ｂＦＧＦ ２０ ｎｇ／ｍｌを添加した培地である。当業者は、臍帯血の単核細胞画分を増殖させるため、または適当な神経増殖培地および／もしくは分化培地を提供するために、任意の数の細胞培地が使用できることを容易に認識すると思われる。
【００５５】
「分離」という用語は、単核細胞試料、または所望の幹細胞および／または前駆細胞以外の細胞を含む試料、例えば、臍帯血または他の画分から、多能性幹細胞および／または前駆細胞が、単離される過程を記述するために本明細書で使用される。
【００５６】
「分裂促進因子」という用語は、分化した細胞および休止期の細胞（多能性幹細胞および／または前駆細胞）を生産するために、単核細胞試料から得た非増殖細胞に添加される物質を記述するために本明細書で使用される。分裂促進因子は、臍帯血から得た多能性幹細胞および／または前駆細胞以外の特定の細胞において、有糸分裂を誘導する形質転換剤である。本発明で使用するために好ましい分裂促進因子には、上皮成長因子（ＥＧＦ）などが含まれ、それよりは好ましい程度が低いが、アメリカヤマゴボウマイトジェンも有糸分裂を誘導するために使用することができる。分裂促進因子は、神経および間葉前駆細胞に有糸分裂を誘導することが示されている様々な成長因子の１つまたはその組み合せであってもよい。それらの成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーのリガンド（ＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子α、アンフィレギュリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ベータセルリン、ヘパリン結合ＥＧＦ、およびヘレグリン）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、およびそのスーパーファミリーの他のメンバー（ＦＧＦ１、ＦＧＦ４）、血小板由来成長因子ファミリーのメンバー（ＰＤＧＦ ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ）、インターロイキン、およびトランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのメンバーである。
【００５７】
「抗増殖物質」という用語は、本発明に係る多能性幹細胞および／または前駆細胞を濃縮する方法において、細胞の増殖を阻止する物質を記述するために本明細書で使用される。抗増殖物質の例には、Ａｒａ−Ｃ、メトトレキセート、および他の抗増殖物質が含まれる。好ましい抗増殖物質は、臍帯血試料またはその単核細胞画分にある増殖細胞の増殖を制限または予防し、そのために休止状態の幹細胞および／または前駆細胞が濃縮され得るような物質である。
【００５８】
「分化促進物質」または「神経分化促進物質」という用語は、多能性幹細胞および／または前駆細胞を含む細胞培養（この用語は本発明に係る神経細胞を増殖させるために使用可能な任意の細胞培養培地を含む）に添加し、細胞が神経またはグリアの表現型を示すよう誘導する物質を記述するために本明細書で使用される。本発明で使用する好ましい分化促進物質には、例えば、レチノイン酸を含む抗酸化剤、中脳細胞または線条体細胞を含む胎児または成体のニューロン細胞、または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、またはそれらの混合物のような成長因子またはサイトカインが含まれる。その他の分化促進物質には、例えば、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、骨形成蛋白質（ＢＭＰ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、グリア成長因子（ＧＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＫＩＴ受容体幹細胞因子（ＫＩＴ−ＳＣＦ）、インターフェロン、トリヨードチロニン、チロキシン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、サイレンサー（グリア細胞を欠如した、ニューロン限定サイレンサー因子を含む）、ＳＨＣ （ＳＲＣホモロジー−２−ドメイン含有トランスフォーミング蛋白質）、神経蛋白質、プロテオグリカン、糖蛋白質、神経接着分子、およびその他の細胞シグナル伝達分子、およびそれらの混合物のような成長因子が含まれる。本発明で使用できる分化促進物質は、参照として本明細書に組み入れられる「骨髄への関心：神経新生における展望（Ｍａｒｒｏｗ−ｍｉｎｄｅｄｎｅｓｓ： ａ ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｎ ｎｅｕｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）」Ｂｊｏｒｎ Ｓｃｈｅｆｆｌｅｒら、ＴＩＮＳ、２２、ｐｐ ３８４−３５６ （１９９９）に詳述されている。
【００５９】
「神経変性疾患」という用語は、中枢神経系への障害によって引き起こされ、患者の脳および／または脊髄の障害を受けた領域に、本発明に係る神経細胞を移植することによってその障害が軽減および／または解消できる疾患を記述するために本明細書で使用される。本発明に係る神経細胞および方法で治療できる神経変性疾患の例には、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ルーゲーリック病）、アルツハイマー病、レット症候群、サンフィリポ症候群を含むリソソーム蓄積症（例えばＦｏｌｋｅｒｔｈ、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｐａｔｈ． Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏ．、５８、１９９９年９月９日に記述される「白質病」またはグリア／脱髄疾患）、テイ・サックス病（βヘキソサミニダーゼ欠損）、他の遺伝病、多発性硬化症（ＭＳ）、虚血による脳および／または脊髄損傷、事故、環境による傷害等、脊髄損傷、失調症、ならびにアルコール症が含まれる。さらに本発明は、患者における卒中または心臓発作の中枢神経系に対する影響で、患者の脳の部位への血流の欠如または虚血によって引き起こされるか、脳および／または脊髄への身体的傷害によって起きる影響を、軽減または解消するために使用することができる。神経変性疾患という用語は、例えば、自閉症、および精神分裂病のような関連する神経疾患を含む神経発生疾患も含む。
【００６０】
本発明に係る臍帯血の多能性幹細胞および／または前駆細胞の選択は、いくつかの方法で行うことができる。例えば、磁気細胞分離装置（ＦＡＣＳ）またはＣＤマーカーを含む全ての細胞を除去する他のシステムを用いて細胞を選択し、残りの細胞を増殖培地で増殖させるか、分化促進物質を含む増殖培地で分化させることができる。または、多能性幹細胞および／または前駆細胞の濃縮された細胞群は、細胞にＡｒａ−Ｃまたは試料中の増殖する細胞（幹細胞および／または前駆細胞は増殖しないため、この物質の影響を受けない）の死を誘導するメトトレキセートのような他の抗増殖物質を添加することによって、単核細胞の試料から得ることができる。その後、残りの細胞を分裂促進因子を含む細胞培養培地で増殖させ、分化した細胞および休止期の細胞の細胞群を生産し、この細胞群をさらに増殖させて休止期の細胞を濃縮して分化した細胞を事実上排除することができる（最終細胞培地中の休止期の細胞は、培地中では増殖しない元々の分化した細胞よりもはるかに数が多くなる）。その後、休止期の細胞がいくつかの分化した神経表現型を取るように誘導し、この細胞を移植に直接使用することができる。
【００６１】
当技術分野で周知の様々な細胞成長因子および共培養技術を用いて、さらにインビトロ分化技術を適合させることができる。胎児中脳細胞または線条体細胞との共培養の他に、補助細胞、および胎児および成熟した中枢神経系の他の部分の細胞を含め、様々な他の細胞を使用することができる。
【００６２】
「遺伝子療法」という用語は、疾患の治療のために、細胞内に新しい遺伝情報を伝達し、安定的に挿入することを記述するために本明細書で使用される。外来遺伝子は、増殖して細胞群全体に新しい遺伝子を広めるような細胞に伝達される。したがって、本発明に係る幹細胞または多能性前駆細胞は、外来遺伝子を発現する可能性のある様々な子孫細胞系を生産する増殖細胞であるので、分化前、または好ましくは神経細胞表現型への分化後に、遺伝子移入の標的となる。
【００６３】
以下の記述は、本発明の様々な局面の多くを実行するための典型的な方法およびガイダンスを提供する。
【００６４】
一般的方法
当技術分野で周知の標準的な分子生物技術で、具体的に記述されていないものは、一般的にＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク（１９８９、１９９２）、およびＡｕｓｕｂｅｌら「分子生物学の最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、メリーランド州ボルチモア（１９８９）に従う。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、一般的に「ＰＣＲプロトコール、方法と適用のガイド （ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）にしたがって行われる。他の核酸技術に関する反応および操作は、特に記述のないかぎり、一般的にＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓおよび参照として本明細書に組み入れられる米国特許第４，６６６，８２８号；４，６８３，２０２号；４，８０１，５３１号；５，１９２，６５９号；および５，２７２，０５７号に記述される方法にしたがって行われる。フローサイトメトリーと組み合せたインサイチューＰＣＲは、特異的ＤＮＡおよびｍＲＮＡ配列をもつ細胞の検出に使用することができる（例えばＴｅｓｔｏｎｉら、Ｂｌｏｏｄ ８７：３８２２ （１９９６）参照）。
【００６５】
当技術分野で周知の標準的な免疫学的方法で、具体的に記述されていないものは、一般的にＳｔｉｔｅｓら編、「基礎および臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」第８版、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ、コネチカット州ノーウォーク（１９９４）；およびＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｇｉ編、「細胞免疫学の方法（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ニューヨーク（１９８０）に従う。
【００６６】
イムノアッセイ法
一般に、イムノアッセイ法は細胞表面マーカーなどのような検体を評価するために使用される。免疫細胞化学アッセイ法は、当技術分野で周知である。アッセイ法にはポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が使用できる。必要な場合には、当技術分野で周知の、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）のような他のイムノアッセイ法も使用することができる。利用できるイムノアッセイ法は、特許および学術文献に広く記述されている。例えば、米国特許第３，７９１，９３２号；３，８３９，１５３号；３，８５０，７５２号；３，８５０，５７８号；３，８５３，９８７号；３，８６７，５１７号；３，８７９，２６２号；３，９０１，６５４号；３，９３５，０７４号；３，９８４，５３３号；３，９９６，３４５号；４，０３４，０７４号；４，０９８，８７６号；２ｏ ４，８７９，２１９号；５，０１１，７７１号、および５，２８１，５２１号、ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク（１９８９）参照。これらの技術に関しては他にも多くの参考文献がある。
【００６７】
抗体の生産
抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または組換え抗体であってもよい。好都合なことに、抗体は、免疫原またはその免疫原性部分（例えば、配列に基づいた合成ペプチド）に対して調製するか、クローニング技術による組換えによって調製するか、または天然の遺伝子産物および／またはその一部を単離して免疫原として使用することができる。一般的にＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ （１９８８）およびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ 「抗体操作：実用ガイド（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ − Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ）」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ． （１９９２）に記述され、当技術分野で周知の標準的な抗体産生技術によって、免疫原を用いて抗体を生産できる。当技術分野で周知の方法によって抗体から抗体断片も調製でき、これにはＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２が含まれる。ポリクローナル抗体の調製には、ウサギまたはヤギのような宿主を、通常はアジュバントとともに、必要ならば担体と結合させた免疫原または免疫原性断片で免疫する；免疫原に対する抗体は、血清から採取する。また、ポリクローナル抗体を吸収して、単一特異的にもできる。すなわち、血清を関連する免疫原に暴露して、交差反応性の抗体を血清から除去することにより、単一特異性にできる。
【００６８】
モノクローナル抗体の生産には、通常はマウスである適当なドナーを免疫原で過剰免疫し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。これらの細胞をミエローマ細胞のような不死細胞と融合させ、不死であって必要な抗体を分泌する融合細胞ハイブリッドを調製する。その後、細胞を培養し、培地からモノクローナル抗体を回収する。
【００６９】
組換え抗体の生産には、動物またはハイブリドーマの抗体産生Ｂリンパ球のメッセンジャーＲＮＡを逆転写して、相補的ＤＮＡ （ｃＤＮＡ）を調製する。全長または部分的な長さの抗体ｃＤＮＡを増幅し、ファージまたはプラスミドにクローニングする。ｃＤＮＡは、リンカーで分離または結合された部分的な長さの重鎖および軽鎖ｃＤＮＡであってもよい。抗体または抗体断片は、適当な発現系を用いて発現させる。抗体ｃＤＮＡは、適切な発現ライブラリーをスクリーニングして得ることもできる。当技術分野で周知のように、抗体は固相支持体に結合しているか、検出可能な部分に結合しているか、またはその両方であってもよい。（蛍光または酵素部分の結合に関する一般的な議論は、ＪｏｈｎｓｔｏｎｅおよびＴｈｏｒｐｅ、「免疫化学の実際（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｉｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８２参照。）抗体の固相支持体への結合も当技術分野で周知である。（一般的な議論はＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「抗体：実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ニューヨーク（１９８８）、およびＢｏｒｒｅｂａｅｃｋ 「抗体操作：実用ガイド（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ − Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ）」、Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ． （１９９２）参照。）本発明で考慮される検出可能な部分には、蛍光、金属、酵素、および放射性マーカーが含まれるが、これらに限定されることはない。その例には、ビオチン、金、フェリチン、アルカリホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、フルオレセイン、ローダミン、トリチウム、１４Ｃ、ヨード化および緑色蛍光蛋白質が含まれる。
【００７０】
遺伝子療法
本明細書では遺伝子療法とは、遺伝性または後天性疾患または状態を治療または予防するために、対象となる遺伝物質（例、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を宿主に伝達することを指す。対象となる遺伝物質は、インビボ生産が望まれる産物（例、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、機能的ＲＮＡ、アンチセンス）をコードしている。例えば、対象となる遺伝物質は、ホルモン、受容体、酵素、治療に価値のあるポリペプチドまたはペプチドをコードしている。または、対象となる遺伝物質は、自殺遺伝子をコードする。総説は「薬理学の進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ Ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、カリフォルニア州サンディエゴ、１９９７中の「遺伝子療法（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ）」を参照のこと。
【００７１】
移植用細胞の投与
本発明の細胞は、各患者の臨床的状態、投与部位と方法、投与スケジュール、患者の年齢、性別、体重および医療従事者に既知の他の要素を考慮して、適正医療基準に準拠して投与される。本明細書の目的に対して薬学的「有効量」は、当技術分野で周知であるこれらの要素によって決定される。量は、生存率の改善もしくはより迅速な回復、または症状の改善もしくは解消、および当業者が適切な手段として選択する他の指標を含むがこれらに限定されることのない、改善を達成するため有効な量である必要がある。
【００７２】
本発明の方法では、本発明の細胞は中枢神経系への移植のために適切な種々の方法によって投与することができ、これには静脈内および動脈内投与、髄腔内投与、脳室内投与、実質内、頭蓋内、嚢内、線条体内、黒質内投与が含まれるがこれらに限定されることはない。また、これらの投与経路は、全て本発明の神経細胞の移植に使用することができる。
【００７３】
神経変性疾患、または例えば身体的傷害、もしくは卒中、心臓発作、心血管疾患による虚血によって引き起こされた脳および／または脊髄傷害の患者を治療する方法は、ニューロン移植を実現するために十分な量の神経細胞を患者に投与することを含む。当業者は、そのような方法には、新鮮な臍帯血またはその単細胞画分を含め、処理された（すなわち、少なくとも１つの分化促進物質に暴露した細胞）または未処理の神経細胞が使用可能であることを容易に認識すると思われる。
【００７４】
有効量の処理された神経細胞を含む薬学的組成物も、本発明では考慮される。これらの組成物には、任意で、薬学的に許容される担体、添加剤、または賦形剤と共に、有効な数の処理された神経および／またはニューロンおよび／またはグリア細胞が含まれる。本発明の特定の局面では、細胞は、移植の必要のある患者に無菌生理食塩水中で投与される。本発明の別の局面では、細胞は、ハンクス液（ＨＢＳＳ）またはＩｓｏｌｙｔｅ Ｓ、ｐＨ ７．４中で投与される。無血清細胞培地の利用を含む他の手法も使用することができる。したがって、そのような組成物には、無菌生理食塩水中の有効量または有効数の処理された神経細胞が含まれる。これらは、新鮮または低温保存された臍帯血から直接、または当技術分野で周知の（本明細書にはそのような手法の１つが記述されている）密度勾配分離法などを用いて、全血から単核細胞（ＭＮＣ）を分離することによって得られる。単離ＭＮＣは、投与／移植に直接使用するか、少なくとも１つの分化促進物質で処理し、さらに神経細胞を精製または単離することなく使用するか、または、少なくとも１つの分化促進物質で処理してから神経細胞を単離して使用することができる。無菌生理食塩水中の細胞の静脈内または動脈内投与が好ましい適応症もあるが、罹患組織／障害組織の部位またはその近くに直接投与するのが好ましい適応症もある。
【００７５】
本発明の薬学的組成物は、一般的には溶液中で、選択的に薬学的に許容される担体、添加剤、または賦形剤と共に、好ましくは約１．０ Ｘ １０４単核細胞から約５．０ Ｘ １０７単核細胞、より好ましくは約１ Ｘ １０５から約９ Ｘ １０６単核細胞、より好ましくは約１ Ｘ １０６から約８ Ｘ １０６細胞の範囲の有効な数を含む。単核細胞試料中または濃縮または単離された神経細胞として、神経細胞の有効な数は、数百以下から数百万またはそれ以上に渡り、好ましくはこの範囲で少なくとも約１０００細胞である。細胞が治療する脳または脊髄組織の付近に注入されるような本発明の局面では、非経口投与（静脈内および／または動脈内投与を含む）に依存する本発明の局面と比較して、細胞の数は少なくても良い。
【００７６】
本発明に係る組成物を使用する際には、新鮮もしくは低温保存された臍帯血、その単核細胞画分、または神経細胞が単離および／もしくは濃縮された（ＦＡＣＳまたは単核細胞群から神経細胞を単離するための他の分離方法を用いて）画分は、分化促進物質の処理なしで、または神経移植に使用する前に有効量の分化促進物質で処理してから、使用することができる。本発明の１つの好ましい局面では、臍帯血の単核細胞画分を、臍帯血の幹細胞が神経および／またはグリアの表現型を発現するための期間、少なくとも１つの有効量の分化促進物質（細胞培地中）に暴露して、その後、これらの細胞を用いて患者への移植を行なう。
【００７７】
臍帯血幹細胞に分化させる本発明の局面では、少なくとも１つまたは複数の分化促進物質を添加した標準的な培地を使用することが好ましい。本発明の特定の局面では、分化促進物質として、有効量のレチノイン酸および神経成長因子（ＮＧＦ）の組み合せが好ましい。本発明の特定の好ましい局面では、標準増殖培地中で増殖する臍帯血幹細胞から、神経増殖培地の後に分化培地を使用した２段階方式で、神経細胞は調製される。本発明のこの局面では、標準細胞培地（好ましくは、少なくとも非必須アミノ酸、グルタミン、メルカプトエタノール、およびウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加した最少必須培地）中で増殖した細胞は、まず「神経増殖培地」（すなわち、神経細胞を効率的に増殖させる培地）で培養し、その後「分化培地」（一般に、特定の神経分化促進物質が培地に添加され、場合によっては他の成長因子が制限または除去されていること以外は、神経増殖培地と類似している）中で培養する。好ましい神経増殖培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１細胞培地を含み、０．６％ブドウ糖、インスリン（２５μｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（１００μｇ／ｍｌ）、プロゲステロン２０ ｎＭ、プトレッシン（６０μＭ）、塩化セレニウム３０ ｎＭ、グルタミン２ ｍＭ、炭酸水素ナトリウム３ ｍＭ、ＨＥＰＥＳ ５ ｍＭ、ヘパリン２μｇ／ｍｇ、およびＥＧＦ ２０  ｎｍ／ｍｌ、ｂＦＧＦ ２０ ｎｇ／ｍｌを添加した培地である。当業者は、適当な神経増殖培地および／または分化培地を提供するために、任意の数の細胞培地が使用できることを容易に認識すると思われる。
【００７８】
以下の実施例は、本発明の実例となる本発明の特定の好ましい態様を説明または例証するために提供されるものであって、本発明を限定するためのものではない。
【００７９】
実施例
細胞試料の調製
低温保存のまたは新鮮な臍帯血を（出産後に胎盤に付着したままであるヒトまたはラットの臍帯から）回収し、フィコール遠心分離により処理する。これにより、ａ）損傷した脳（例えばラットの卒中モデル、神経変性疾患モデル、または外傷モデルにおいて）のある領域に直接移植する、ｂ）表面マーカーに基づいて亜集団へと処理する、またはｃ）後で使用するために低温保存することが可能な単核細胞がほぼ１００％回収される。臍帯血を用いる初期の実験では、ＣＤ３４＋細胞成分（造血幹細胞）を分離せずに、回収された単核細胞すべてを使用する。他の実験では、ＣＤ３４＋細胞を後述するように枯渇させた臍帯血を使用する。大脳皮質への血流を急激に遮断することにより虚血となる脳半球へ約１００，０００から９０，０００，０００（１ｘ１０５から約９ｘ１０７、好ましくは少なくとも約１ｘ１０６）個の臍帯血細胞が注入される。ラット卒中モデルにおける肢機能の回復の評価は、移植の２週間、４週間、および８週間後に行う。
【００８０】
造血幹細胞（ＣＤ３４＋）を含まない臍帯血の調製
磁気セルソーティングキット（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ， Ｉｎｃ， Ａｕｂｕｒｎ Ｔｘ）を用いて、造血幹細胞抗原を発現する細胞（ヒト試料におけるＣＤ３４）に印を付けるＣＤ３４＋マイクロビーズで臍帯血細胞を標識する。ＣＤ３４＋細胞を選別するため臍帯血細胞をＭＳ＋カラムに通す。総細胞数１０８あたり２００μｌのＣＤ３４＋マルチソートマイクロビーズを加え、混合し、６〜１２℃で１５分間インキュベートする。標識化量の５〜１０倍の緩衝液を加えることにより細胞を洗浄し、２００ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を除去する。細胞ペレットを５００μｌ緩衝液に再懸濁する。ＭＳ＋／ＲＳ＋カラムを５００μｌの緩衝液で洗浄する。細胞懸濁液を「陰性」細胞が通過するカラムに供する。陰性細胞は、ＣＤ３４＋造血細胞を除く臍帯血の全細胞を含む。続いてカラムを５００μｌの緩衝液で３回すすぐ。これらの洗浄液を「陰性」細胞画分に加え、２２０ｘｇで１０分間遠心分離し、上清を除去する。細胞ペレットを５００μｌの緩衝液に再懸濁し、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）で１：１に希釈し、１，０００ｘｇで３０分密度勾配により遠心分離する（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ， １．０７７ｇ／ｍｌ， Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。上清および界面を組み合わせ約２０ｍｌの増殖培地に希釈し、ポリエチレンイミンでコートしたプラスチック製フラスコに入れる。
【００８１】
臍帯血クローンを生成するための最適培地の決定
臍帯血を、ダルベッコ最小必須培地（ＤＭＥＭ）とＦ１２栄養素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−ＢＲＬ）との１：１混合物から構成される無血清培地に懸濁する。臍帯血原料の他の試料を１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭに懸濁する。規定の培養培地は、グルコース、グルタミン、炭酸水素ナトリウム、およびＨＥＰＥＳ緩衝液を含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）に、規定のホルモンおよび塩混合物を加えたものから構成される（ＤａａｄｉおよびＷｅｉｓｓ， １９９９参照）。細胞の生存および増殖に最適な細胞密度を同定するため、特定の分裂促進増殖因子（使用した分裂促進因子については下記参照）と共に規定の培地を含むコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）Ｔ７５培養フラスコに５０，０００から３ｘ１０６細胞／ｍｌと密度を変えて細胞を播種する。細胞の生存および増殖は、培養フラスコを調査し毎日生じるクローンに注目して計測することにより非常に厳密にモニターされる。１０日間という一定の培養期間の後、クローンの総数を無血清培養物および血清を添加した培養物の両方で計測し比較する。これにより本発明者らは、クローンを生成することのできる前駆細胞の数と増殖率とを得ることができる。続いてこれらのクローンを収集し剥離して生存している総細胞数を計測し、次の継代などその後の継代のために再び播種する。この最後の計数により、各状況下において生成するクローンの増殖率およびサイズが決定できる。
【００８２】
注意：神経幹細胞を用いた本発明者らの経験から、細胞を血清へ暴露することにより分化が誘導され、神経系細胞の増殖が阻害されることが見出された。細胞密度が比較的低いことも細胞増殖には不利である。したがって、血清の存在下および非存在下、使用した細胞密度、ならびに分裂促進因子に依って細胞増殖率に変化が観察される可能性が高い。培地の組成は、神経系細胞集団にとって細胞生存、増殖、および濃縮に最適でない場合がある。本発明者らはまた、これら２つの別個の条件下において細胞により発現された形態および抗原に変化を見出した。したがって、本発明者らは各継代の前に、クローンおよび細胞の総数、またニューロン、星状細胞、および希突起膠細胞ならびに造血細胞系の比率を確認する。これらのデータは、新しい培地組成を試みることによって本発明者らの培地フォーミュラ、および必要に応じてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ） または神経幹細胞の割合がきわめて低い馴化培地を本発明者らが定常的に改良するための指針となる。
【００８３】
特異的な分裂促進因子に応答し特異的な神経マーカーを発現する臍帯血細胞の亜集団の同定
臍帯血懸濁液を、最適な培地（上記）を含むコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）Ｔ７５培養フラスコに最適な細胞密度で播種する。この培地には、神経系細胞および間葉細胞に対して分裂促進作用を発揮することが示されている様々な成長因子が一つまたは組み合わせで１０〜２０ｎｇ／ｍｌ補填されている。こうした増殖因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーリガンド（ＥＧＦ、トランスフォーミング成長因子α、アンフィレギュリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ベータセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）、ヘパリン結合ＥＧＦおよびヒアギュリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ））、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）およびそのスーパーファミリーの他のメンバー（ＦＧＦ１、ＦＧＦ４）、血小板由来成長因子ファミリーのメンバー（ＰＤＧＦ、ＡＡ、ＡＢ、ＢＢ）、インターロイキン、ならびにトランスフォーミング成長因子βスーパーファミリーのメンバーである。インビトロにて１０〜１５日後、細胞を回収し、増殖因子を含む新鮮な培地に再度播種する。それらの未成熟性を明らかにするため、これらの細胞の一部を２４穴Ｎｕｎｃｌｏｎ培養皿にてポリ−Ｌ−オルニチンでコートしたガラス製カバースリップ上に置く。３０分から１時間後、これらの細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、ネスチン、ビメンチン、ＣＤマーカーであるＣＤ３４（造血幹細胞のマーカー）およびＣＤ３３、ならびに樹状細胞マーカーなどの、未成熟細胞のための様々なマーカーを用いて染色する。残りの細胞は次の継代のために増殖培地（分裂促進因子を含む培地）に再度播種する。使用した各増殖因子について、細胞の生存性および増殖を厳密にモニターし、日毎に生じるクローンを計数し、一定の期間後に形成されるクローンの総数を決定する。本発明者らはまた、後述するように、各分裂促進因子の下で生成する細胞種の比率を決定する。
【００８４】
使用した増殖因子およびその濃度に応じて細胞増殖率および／または細胞種の比率に違いが生じる。ニューロンの分化効力および各分裂促進因子の下で実施可能な継代数を決定する。研究により、ヒト神経幹細胞の単離および増殖にはＥＦＧとＦＧＦとの組み合わせが必要であることが示された。したがって本発明者らは、これらの増殖因子の組み合わせについて試験し、特定の成分（ｂＦＧＦを分裂促進因子として使用する場合はヘパリン）を添加することにより分裂促進作用を可能にした。
【００８５】
臍帯血幹細胞の多能性クローン由来亜集団の確立
前駆細胞亜集団を後成的なシグナルに対するそれらの応答に基づいて単離することにより、インビボで移植した場合またはインビトロで特異的な処理により投与した場合に予測可能な同様の様式をとる均一な細胞集団が生成される。これらのクローン細胞株は臨床グレードの開発のための良い候補である。最初の開始増殖因子に応答する安定なヒト臍帯血細胞集団から、既に報告されているようにしてモノクローナル細胞集団を確立する（ＤａａｄｉおよびＷｅｉｓｓ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １９， １１ ４４８４， １９９９）。細胞のクラスターを乖離して計数し、培地−ホルモン混合液中に１５μｌあたり細胞１個の濃度で懸濁し、テラサキマイクロウェルまたは９６穴培養皿にて１５μｌ／ウェルで播種する。単一の細胞を含むウェルをすぐに同定し印をつける。また単一の細胞を手動の１０μｌマイクロピペットを用いて懸濁液から無作為に採取し、１０〜１５μｌの培地を含むテラサキマイクロウェルに移す。クローンの発生を位相差倒立顕微鏡を用いて１日に１回モニターする。培養物は２日ごとに２μｌの新鮮な培地と交換することにより保持する。
【００８６】
各単一細胞は増殖し細胞のクローンを生成する。これらの単一の創始細胞の画分は、増殖速度が遅いか、増殖しないか、培養して数日後に死ぬことさえある。神経幹細胞およびクローン培養物を用いた本発明者らの経験から、単一細胞の一部は、細胞の生存および特定の場合には細胞分裂のための細胞外支持材となる周辺の細胞が無いため細胞死する場合がある。このことが問題である場合は、創始細胞を、大きな幹細胞クラスターに由来する馴化培地で培養するか、または臍帯血細胞の膜抽出物の存在下で培養する。
【００８７】
各クローンの分化効力の特徴分析および決定
精製されたモノクローナルヒト臍帯血由来幹細胞集団を増殖させることに加え、クローンの各世代が幹細胞の特性をすべて示すことを確認することが必要である：幹細胞の特性とは、すなわち自己複製能、多数の子孫を生じる能力、環境のキューに応答することが可能な能力、および異なる細胞種へと分化する能力である。これらの効力の判定基準は安定な多能性クローンの発生および生成に基づく。クローン由来細胞（上述のような）は穏やかに機械的に摩砕するかトリプシンＥＤＴＡを用いるかのいずれかにより乖離する。増殖期の後、次世代クローンの一部を分化条件下で培養する。細胞が懸濁液中でクラスターとして増殖したら、各クローンを除去し、細胞外基質（ＥＣＭ）でコートしたガラス製カバースリップ上で分裂促進因子を含まない対照の培地−ホルモン混合液中に播種する。ラミニン、ポリ−Ｌ−オルニチン、およびポリ−Ｄ−リジンを含む異なるＥＣＭを、それらの分化効力の可能性について試験する。細胞が単層に増殖したら、分裂促進因子を含む培地を穏やかに吸引することにより除去し、対照の新鮮な培地（分裂促進因子を含まない）と交換する。１０〜１５日の培養期間の後、分化した細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、様々な神経細胞マーカーおよび造血細胞マーカーで染色する。標識された亜集団の解析は、免疫細胞化学技術およびフローサイトメトリー解析によって行う。神経系細胞については本発明者らは下記を用いた：未成熟前駆細胞を標識するために抗ネスチンおよび抗ビメンチン；星状細胞を標識するために抗神経膠線維性酸性蛋白質；希突起膠細胞を同定するために抗Ｏ４、抗ミエリン塩基性蛋白質および抗ＣＮＰアーゼ；ニューロンを同定するために抗ＮｅｕＮ、抗βチューブリンクラスＩＩＩ、抗ニューロン特異的エノラーゼ、抗ヒト特異的神経フィラメント、抗ＭＡＰ２。この最後のニューロン細胞集団において本発明者らは、ＧＡＢＡ、コリンアセチルトランスフェラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、およびセロトニン様の異なる神経伝達物質形質発現について試験した。本発明者らは造血細胞についても試験した：特徴分析が成された多能性幹細胞クローンの一部を一般的方法の項で記載のように凍結保存し（後述参照）、残りを継代し培養を維持する。
【００８８】
凍結保存
クローン由来臍帯血細胞を、１０％ジメチルスルホキシド、５０％ウシ胎仔血清、および４０％の規定の培地からなる細胞凍結培地に再懸濁し、当技術分野で周知のように液体窒素下で保存する。
【００８９】
全臍帯血から単核細胞層を、凍結保存のため以下の方法を用いて調製することができるが、その工程は、凍結保存という結果を有意に変化させることなく変更を加えることができる。
【００９０】
臍帯血の処理および保存
工程１．試料の調製
抗凝固処理された臍帯血を滅菌５０ｍｌ円錐管に分注し、容積を正確に測定する。少量の試料を白血球の計数および無菌試験のため採取する。血漿の試料を、凍結保存するため遠心分離によりこの時点で採取する。臍帯血は滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１：２に希釈し、管あたり最大３５ｍｌとなるよう注意深く混合する。
【００９１】
工程２．密度勾配分離
単核細胞をフィコール−ハイパーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配遠心分離により臍帯血から得る。各管の希釈した臍帯血を、滅菌したフィコール−ハイパーク溶液の下に入れ、続いて１２００ｇで３０分室温にて遠心分離する。この処理において、神経前駆細胞（幹細胞）を含む単核細胞はフィコール／血漿の界面に層を形成し、一方、赤血球および顆粒細胞（顆粒球）は密度勾配を通過して管の底へと沈降する。単核細胞は吸引により注意深く採取する。
【００９２】
工程３．単核細胞（ＭＮＣ）の調製
単核細胞を滅菌した５０ｍｌチューブに回収し、組織培養培地（ＲＰＭＩ）で１：２に希釈し、１５００ｇで１５分遠心分離する。細胞をさらにＲＰＭＩで洗浄し、一定の容量（１４ｍｌ）となるよう再懸濁し、少量の試料を白血球計数およびＣＤ３４＋細胞判定のため採取する。
【００９３】
工程４．凍結保存のためのＭＮＣの調製
続いて細胞懸濁液を１２００ｇで１０分遠心分離し、細胞を２．５ｍｌのＲＰＭＩに再懸濁する。少量の試料を無菌試験のため採取する。この懸濁液に、凍結防止剤として１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む自家血漿２．５ｍｌをゆっくりと加え、その結果得られる懸濁液を、印（バーコード）をつけた滅菌済みの５ｍｌ凍結バイアルに移す。
【００９４】
工程５．液体窒素中での制御された速度における凍結
続いて試料を、以下のプロトコールを用いて４℃から−９０℃まで制御された速度で凍結することにより凍結保存する：
＋４℃から−３℃までは１分間に１℃
−３℃から−２０℃までは１分間に１０℃
−２０℃から−４０℃までは１分間に１℃
−４０℃から−９０℃までは１分間に１０℃
その後、凍結バイアルを−１９６℃で液体窒素の気相中で保存する。
【００９５】
分化させる培養条件
１０〜１５日目の懸濁培養物の入ったＴ７５フラスコ３つを４００ｒｐｍで５分間遠沈する。細胞を採集し、１２ｍｌ遠心管に入れ、６００ｒｐｍで５分間遠沈する。増殖培地を除去し細胞をホルモン混合物を加えた新鮮な対照培地（ＥＧＦまたは他の分裂促進因子を含まない）に再懸濁する。この工程をもう１度繰り返し、培地から分裂促進因子を完全に除去する。０．５ｍｌ／ウェルの２４穴Ｎｕｎｃｌｏｎ培養皿中、ポリ−Ｌ−オルニチンでコートした（１５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）ガラス製カバースリップ上の培地−ホルモン混合液に、乖離した細胞を１ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で播種する。７〜１４日培養した後、細胞はニューロン様またはグリア様の表現型へと形態が変化する。神経系前駆細胞、ニューロン、およびグリアのマーカーを認識する特異的抗体で染色した後、ホルモン混合液の分化効力を定量化する。陽性に染色された細胞体の密度は、４０個の対象物を用いて各培養皿またはウェルから無作為に選択した少なくとも２０の視野において決定する。生成されたＮｅｕＮ−ｉｒ、ＧＦＡＰ、およびｎｅｓｔｉｎ−ｉｒの総細胞数を定量するため、計３回の実験を行い計６つの培養皿またはウェルを各条件について分析する。成長因子（またはホルモン混合物）の神経への分化効力を、ＮｅｕＮ−免疫反応性細胞の割合（ＤＡＰＩ核染色で同定された１つの培養皿中の細胞総数に対する）として算出する。
【００９６】
間接的免疫細胞化学
特異的抗原に対するウサギポリクローナル抗血清およびマウスモノクローナル抗体を間接的免疫蛍光検査の一次抗体として用いる。４％パラホルムアルデヒドで２０分間カバースリップを固定し、続いてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回（各１０分）洗浄する。ＰＢＳですすいだ後、カバースリップを一または二重に標識化するため処理し、異なる種から生じた一次抗体と共にインキュベートする。一次抗体はＰＢＳ／１０％正常ヤギ血清＋０．３％トリトンＸ−１００とする。３７℃で２時間インキュベートした後、カバースリップをＰＢＳですすぐ。蛍光標識二次抗体（１：１００、１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を室温で３０分ＰＢＳに供する。次いでカバースリップをＰＢＳで３回（各１０分）洗浄し、水ですすいでガラス製スライドにのせ、Ｆｌｕｏｒｓａｖｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を用いてかける。蛍光はＺｅｉｓｓレーザースキャニング共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）（ＬＳＭ５１０モデル）を用いて検出し写真撮影する。用いる一次抗体は以下のものに対するものである：ネスチン（１：１０００、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、ビメンチン（１：２００、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、神経膠線維性酸性蛋白質（１：５００、Ｓｉｇｍａ）、Ｏ４（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ミエリン塩基性蛋白質（１：２００、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、ＣＮＰアーゼ（１：５００、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ）、ＮｅｕＮ（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｒｐ）、β−チューブリンクラスＩＩＩ（１：１０００、Ｓｉｇｍａ）、ニューロン特異的エノラーゼ（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ヒト特異的神経フィラメント（１：１５０、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、ＭＡＰ２（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＧＡＢＡ（１：５０００、Ｓｉｇｍａ）、コリンアセチルトランスフェラーゼ（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、チロシンヒドロキシラーゼ（１：４０００、Ｉｎｃｓｔａｒ）、セロトニン（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＩＶ型コラーゲン（１：５０、Ｄａｋｏ）、ラミニン（１：３００、Ｓｉｇｍａ）、ＣＤ１０（１：１００、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、筋アクチン（１：１０００、Ｓｉｇｍａ）、ＨＬＡ−ＤＲ（１：２００、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、ＣＤ４５（１：１００、ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）、Ｍａｃ−１（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；アルカリフォスファターゼ染色キット（Ｓｉｇｍａ ＃８５Ｌ−２）。
【００９７】
フローサイトメトリー解析
分化に及ぼす特異的処理の作用を評価するため、または上述のマーカーで標識された異なる細胞集団の培養条件において比較プロフィールを確立するため、回収された細胞をフローサイトメトリー解析に供する。細胞を蛍光発色セルソーティング（ＦＡＣＳ）緩衝液（ＥＢＳＳおよび１％ＨＩＦＢＳ）ですすぎ、１ｘ１０６細胞を適当な一次抗体を加えたＦＡＣＳ緩衝液１００μｌに加え、４℃３０分インキュベートする。洗浄後、二次抗体を加え、４℃で３０分インキュベートする。ビオチン化抗体については、ゲートを設置するためアイソトープ対照を用いるか、もしくは細胞単体でゲートを設置する。細胞生存性はヨウ化プロピジウム排除を用いてモニターした。フローサイトメトリー解析は、ＦＡＣＳｃａｎ（商標）（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて行い、すべての事象で前方および側方散乱にゲートをかけた。
【００９８】
ウェスタンブロッティング
培養物は冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、氷冷ＰＢＳ中に入れて、１ｍｌにつき以下を含む氷冷した溶解緩衝液中に溶解する：２０ｎＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、３％ ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、２ｍＭオルトバナジウム酸塩、５０ｍＭ ＮａＦ、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ならびに１０μｇの各アプロチニンおよびロイペプチン。１０分間氷上でインキュベートした後、試料を１４，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、上清を回収する。一部を総蛋白質の計算（Ｂｉｏ−Ｒａｄアッセイ法）のため採取した。各試料の総蛋白質１０μｇに相当する部分試料をＳＤＳ／ＰＡＧＥ（１０％）により還元条件下で分離し、ニトロセルロースフィルターへ電気泳動によりに転写した。抗体の非特異的結合を５％脱脂粉乳を用いて、一晩４℃でブロッキングした。イムノブロットは適当な一次抗体と、続いてそれらに対応するペルオキシダーゼ結合二次抗体を用いて行った。ブロットは増強化学発光法（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）により発色させる。
【００９９】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびノーザン解析
全ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−ＢＲＬ）を用い推奨プロトコールに従って抽出する。
【０１００】
ＲＴ−ＰＣＲ：　１μｇのＲＮＡを含む部分試料を、２００ＵのスーパースクリプトＲＮａｓｅ Ｈ−逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ−ＢＲＬ）を用い、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ、および０．５μｇオリゴ−ｄＴ（１２−１８）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の存在下で逆転写する。全ＲＮＡ ４０ｎｇに相当するｃＤＮＡの部分試料を、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｐｍｏｌの各プライマー、４００μＭ ｄＮＴＰ、および０．５Ｕ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を含む２５μｌ反応液中で増幅する。ＰＣＲサーマルプロフィールを、使用したプライマー配列の各対について決定した。
【０１０１】
サザンブロット：　増幅ＰＣＲ産物の１５μｌ部分試料を、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含む２％アガローストリスアセテートゲルに流す。バンドを毛管作用によりＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜へ転写し、適当な放射性標識プローブを用いて検出する。放射活性の膜をＢｉｏＭａｘＭＲオートラジオグラフィーフィルム（Ｋｏｄａｋ）に−８０℃で一晩曝露する。
【０１０２】
ノーザンハイブリダイゼーション：　全ＲＮＡの部分試料（２０μｇ）をアガロースホルムアルデヒドゲルにて分画する。ＲＮＡを、１０ｘＳＳＣを用いてゲル基質からＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）へ毛管作用により転写し、裏打ちにより膜上に固定する。これらの膜を適当な放射性標識プローブとハイブリダイズさせ、ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで濃度を減少させて洗浄し、ＢｉｏＭａｘＭＲオートラジオグラフィーフィルム（Ｋｏｄａｋ）に−８０℃で２４時間曝露する。
【０１０３】
ヒト臍帯血は神経系統を生じさせる多能性神経前駆細胞を含有する
一般的方法  概して上述した方法にしたがい、臍帯血は神経細胞へと分化しうる細胞を含むことが示された。
【０１０４】
細胞の起源
この試験のため単核細胞をヒト臍帯血試料から単離した。臍帯血試料は分娩後の胎盤側にある臍帯血の基部より得た。各処理につき５０から１００ｍｌの血液を採取した。細胞を遠沈し、冷凍保存可能な培地に再懸濁して必要となる時まで液体窒素中で凍結した。
【０１０５】
細胞および培養培地の取り扱い　凍結細胞を融解、遠沈し、２ｍＭグルタミン（１００倍ストック、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社製）、０．００１％βメルカプトエタノール、１ｘ 非必須アミノ酸（１００倍ストック、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社製）、および１０％ＦＢＳ（条件付き幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社製）を加えた最小必須培地（ＤＭＥＭ）の入った７５ｍｍ培養フラスコに播種した。２４から７２時間後、培地を無血清の「神経増殖培地」と交換した。神経増殖培地は、０．６％グルコース、インシュリン２５μｇ／ｍｌ、トランスフェリン１００μｇ／ｍｌ、２０ｎＭプロゲステロン、６０μＭプトレッシン、３０ｎＭ塩化セレニウム、２ｍＭグルタミン、３ｍＭ炭酸水素ナトリウム、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ヘパリン２μｇ／ｍｌ、およびＥＧＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ ２０ｎｇ／ｍｌを加えた「Ｎ２」培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）からなる。分化培地は、ＥＧＦおよびｂＦＧＦを含まないが、代わりにレチノイン酸（０．５μＭ）と１００ｎｇ／ｍｌの神経成長因子（ＮＧＦ）とを含む「神経増殖培地」を含んでいた。増殖している細胞の検出は、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）（５μＭ）と共に２４〜４８時間インキュベートし、続いてＢｒｄＵ免疫反応性細胞を可視化することにより達成された。
【０１０６】
ＲＮＡの単離　ＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０キットを用い製造業者（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ”Ｂ”， Ｉｎｃ． Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ， ＴＸ ７７５４６）の推奨するプロトコールに従ってヒト臍帯血細胞（またはその画分）から全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡ単離に続いて、その吸光度を２６０ｎｍで測定し、−８０℃で保存した。完全性は１％非変性Ｓｅａｋｅｍ ＬＥアガロースゲル（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｒｏｃｋｌａｎｄ， ＭＥ）にて試験した。
【０１０７】
ＤＮＡマイクロアレイ
全ＲＮＡは上述のように調製した。異なるバッチ由来のＲＡ＋ＮＧＦ処理した、または処理していないヒト臍帯血から得られた全ＲＮＡをこの実験のために併せてプールした（１チップあたり１５〜２０ｇの全ＲＮＡが必要であった）。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．社のヒトゲノムＵ９５Ａアレイ（ＨＧ−Ｕ９５Ａ）をこの実験で用いた。単一アレイは〜１２，５００配列である。実験は、Ｈ． Ｌｅｅ Ｍｏｆｆｉｔｔ癌センター＆研究所（Ｈ． Ｌｅｅ Ｍｏｆｆｉｔｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ ＆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）の機能的ゲノム学コア、マイクロアレイ施設（Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｃｏｒｅ， Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ）にてジーンチップフリュイディクスステーション４００（ＧｅｎｅＣｈｉｐ Ｆｌｕｉｄｉｃｓ ｓｔａｔｉｏｎ ４００）、ジーンチップハイブリダイゼーションオーブン（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｈｙｂｒｉｄａｉｚａｔｉｏｎ ｏｖｅｎ）、およびＨＰジーンアレイ（ＨＰ ＧｅｎｅＡｒｒａｙ（商標））スキャナを用いて行った。遺伝子チップマイクロアレイハイブリダイゼーションパターンの解析はＧｅｎｅＣｈｉｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｕｉｔｅ ４．０ソフトウェアを用いて行った。
【０１０８】
逆転写（ＲＴ）　ＲＴはランダムヘキサマーをプライマーとして用いて行った。終量は２０μｌで細胞の各画分からの全ＲＮＡ１μｇを含んでいた。反応混合物は、５０ｍＭ ＫＣｌおよび１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）中に１ｍＭの各デオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）、１Ｕ／μｌ ＲＮアーゼ阻害剤、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５Ｕ／μｌマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）逆転写酵素、２．５μＭランダムヘキサマーを含んでいた。インキュベーションはまず室温で１０分、続いて４２℃で１５分行った。その後混合物を９９℃で５分加熱し、氷上で５分冷却することにより転写酵素を不活化した。
【０１０９】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）　ＰＣＲは総容量１００μｌにてＲＴと同じ管内で行った。終濃度は、５０ｍＭ ＫＣｌおよび１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）中、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および２．５Ｕ／１００μｌ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼであった。様々なｃＤＮＡ断片を生成させるため、ＰＥ９７００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を以下のようにプログラムした：９５℃で１０５秒を１サイクル、９５℃で１５秒続いて６０℃で３０秒を３５サイクル、最後に７２℃で７分を１サイクル。ＲＴおよびＰＣＲは共にＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキットを用いて行った。様々なニューロンマーカーの有無を確認するため、プライマーを、公開されているヒト配列に基づいて構築した。Ｎｅｓｔｉｎ（アクセッション番号Ｘ６５９６４）についてはフォワードプライマー：ｎｔ２５２４〜２５４２およびリバースプライマー：ｎｔ２９２１〜２９０３。Ｍｕｓａｓｈｉ−１（アクセッション番号ＡＢ０１２８５１）についてはフォワードプライマー：ｎｔ３１９〜３３９およびリバースプライマー：ｎｔ６１８〜５９８。Ｎｅｃｄｉｎ（アクセッション番号ＡＢ００７８２８）についてはフォワードプライマー：ｎｔ２３７４〜２３９３およびリバースプライマー：ｎｔ２７６７〜２７４７。神経フィラメントサブユニットＮＦ−Ｌ（アクセッション番号Ｘ０５６０８）についてはフォワードプライマー：ｎｔ３１５５〜３１７３およびリバースプライマー：ｎｔ３５２１〜３５０１。プライマーはＵＳＦコンピューターネットワークで入手可能なＳＥＱＷＥＢ（バージョン１．１）ソフトウェアを用いて選択した。
【０１１０】
抗体
使用した一次抗体には以下が含まれていた：Ｍｕｓａｓｈｉ−１（Ｈ．Ｏｋａｎｏ教授より寄贈）、Ｎｅｓｔｉｎ（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；ＮｅｕＮ（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、クラスＩＩＩ β−チューブリン（１：２００、Ｓｉｇｍａ）；ＧＦＡＰ（１：５００、Ｓｉｇｍａ）、ＢｒｄＵ（１：４００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、ＭＡＰ２（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、プレイオトロフィン（１：４００、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０１１１】
ウェスタンブロット　培養物は、以下の手順を用いてウェスタンブロット解析を行うための標準的な方法により処理した。培養物を冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、氷冷ＰＢＳ中に入れて、１ｍｌにつき以下を含む氷冷した溶解緩衝液中に溶解した：２０ｎＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、３％ノニデット Ｐ−４０、２ｍＭオルトバナジウム酸塩、５０ｍＭ ＮａＦ、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ならびに１０μｇの各アプロチニンおよびロイペプチン。１０分間氷上でインキュベートした後、試料を１４，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。一部を総蛋白質の計算（Ｂｉｏ−Ｒａｄアッセイ法）のため採取した。各試料の総蛋白質１０μｇに相当する部分試料をＳＤＳ／ＰＡＧＥ（１０％）により還元条件下で分離し、ニトロセルロースフィルターへ電気泳動によりに転写した。抗体の非特異的結合を５％脱脂粉乳を用いて、一晩４℃でブロッキングした。ブロットはコダックＤＳ １Ｄデジタルサイエンス電気泳動ドキュメンテーションおよび解析システム１２０．ｖ．０．２（Ｋｏｄａｋ ＤＳ １Ｄ Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｄｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ １２０ｖ．０．２）を用いて解析した。
【０１１２】
免疫細胞化学　インビトロで７〜１４日後、培養物を０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）中４％パラホルムアルデヒドを含む溶液を用い２０分固定した。次いで培養物を、免疫細胞化学検査を始める前にリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した。
【０１１３】
細胞計数　培養物中の細胞数を推定するため、各マーカーについて４つの培養皿において無作為に選んだ２０の視野（４０ｘ対物レンズ）を観察した。位相差顕微鏡下で視認できた細胞の総数および陽性標識された（免疫反応性の）細胞の数を各視野において計数した。その後、標識された細胞の平均数を細胞総数／視野の割合として表した。
【０１１４】
結果
レチノイン酸（ＲＡ）および神経成長因子（ＮＧＦ）の存在下および非存在下で培養された臍帯血細胞は、遺伝子および蛋白質発現のプロフィールに裏付けられるように、神経前駆細胞マーカーを有する細胞を生じた。計３２２の遺伝子が少なくとも２つの因子によってアップレギュレートまたはダウンレギュレートされており、ヒトマイクロアレイ「遺伝子チップ」を用いた測定により裏付けられた。最大のアップレギュレーション（４４倍に増加）は神経突起増殖伸長蛋白質またはプレイオトロフィンのｍＲＮＡで見られた。有意な程度のダウンレギュレーションは、テネイシン（８．８分の１に減少）、成長中の神経組織およびフィブロネクチンにおいて神経突起の増殖を阻害する細胞外基質蛋白質（５．８分の１に減少）、血球系統の発生を支持する細胞外基質蛋白質の発現において見られた。有意に増加した（＞２倍）神経発生に関連する他の転写物には、グリピカン−４（４．９倍に増加）、ニューロンのペントラキシンＩＩ（２．３倍に増加）、ニューロンの成長関連蛋白質４３（２．７倍に増加）、ニューロンのＰＡＳ１（２．３倍に増加）が含まれる。Ｍｕｓａｓｈｉ−１は１．５倍にアップレギュレートされた。アップレギュレートまたはダウンレギュレートされた神経発生に関連する他の遺伝子の選択は表１に列挙する。神経発生の指標となるマーカーの発現が増加するのに付随して、造血に関連する遺伝子の発現は減少していた（表２）。ＨＬＡクラスＩ遺伝子座Ｃ重鎖、マクロファージ受容体ＭＡＲＣＯ、選択されたＴ細胞活性化蛋白質Ａｔｔｒａｃｔｉｎ（アトラクチン）、白血球イムノグロブリン様受容体−８（ＬＩＲ−８）、胸腺細胞抗原ＣＤ１ｃ、エリスロポエチン受容体およびエリスロポエチンの発現に最も大きな変化が生じた。
【０１１５】
平行実験のセットにおいて、全ＲＮＡを抽出しＲＴ−ＰＣＲを行った。ネスチンおよびネクジンのｍＲＮＡは、公開されたヒト配列に基づくプライマーを用いて対照培養物およびＲＡ＋ＮＧＦ処理培養物の両方において同定された。各々の場合において適当な長さの産物がゲル上に確認された（非処理細胞については図１Ａ、処理細胞については図１Ｂ）。ネスチンは神経発生初期のマーカーと考えられるが内皮細胞前駆体にも見られる。ネクジンはニューロン特異的核蛋白質をコードする遺伝子である。神経前駆細胞の最初期マーカーであるＭｕｓａｓｈｉ−１のｍＲＮＡはＲＡ＋ＮＧＦ処理細胞で検出され、ＤＭＥＭ処理した対照での検出は最小であった。神経突起の増殖を促進する蛋白質（プレイオトロフィン）のｍＲＮＡはＲＡ＋ＮＧＦ処理細胞で検出されたが、非処理の培養物ではシグナルははるかに弱かった（図１Ｃ）。グリピカン−４のｍＲＮＡは両方の条件下で検出された。また、星状膠細胞のマーカーであるＧＦＡＰのｍＲＮＡは、シグナルはＲＡ＋ＮＧＦ処理細胞の方が強いにもかかわらず、両方の条件下で検出された。神経フィラメントサブユニットＮＦ−ＬのｍＲＮＡは、マイクロアレイにおいてはアップレギュレートされているように見られたが、処理細胞および非処理細胞のいずれにおいても検出されなかった。陰性ＲＴ対照（逆転写していない）をすべての反応物と共に泳動してＲＮＡ調製物中にゲノムＤＮＡが混入していないかチェックし、ヒトアクチンプライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を陽性対照として用いた。本発明者らはまた、ヒト脳ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてＲＴ−ＰＣＲによりＭｕｓａｓｈｉ−１および神経フィラメントサブユニットＮＦ−Ｌのプライマーを試験した：これらの各々は適当な長さの単一バンドを生じた（データは示していない）。
【０１１６】
ＲＡ＋ＮＧＦで処理した免疫染色された培養物の顕微鏡検査により、大きくて平坦な類上皮細胞から、細かく分岐している神経突起を有する小さくて紡錘型の細胞に及ぶ細胞種の異種混合物であることが明らかとなった。ＲＡ＋ＮＧＦ処理した培養物において小さな細胞の有意な割合（５から１０％）がＭｕｓａｓｈｉ−１免疫反応性であった（図２Ａ参照）が、ＤＭＥＭで処理した対照培養物では有意でなかった。同様の割合（５％）の小型細胞がβチューブリンＩＩＩ免疫反応性を示した（図２Ｂ）。約５０％の該細胞がＢｒｄＵに免疫反応性であり、このことはこの細胞が増殖し続けていたことを示している（データは示していない）。ネスチンに対する抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎより購入、ラットネスチンに対して生産された）は、ラット骨髄由来神経前駆細胞においてラットネスチンと反応することが示されている（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｎｅｗｓ ３， ３２−４３， ２０００）が、ヒト型のネスチンを認識することができなかった。約５０％のＲＡ＋ＮＧＦ処理細胞が、星状細胞のマーカーであるＧＦＡＰに免疫反応性であった（図２Ｅ）。培養物のウェスタンブロットにより、Ｍｕｓａｓｈｉ−１蛋白質、βチューブリンＩＩＩ蛋白質、プレイオトロフィン、ＧＦＡＰ、およびＮｅｕＮが処理細胞および非処理細胞の両方に存在することが確認された。ブロットの濃度測定の結果、ＮＧＦ＋ＲＡ処理によりＭｕｓａｓｈｉ−１、βチューブリンＩＩＩ、プレイオトロフィン、およびＮｅｕＮの蛋白質発現が（βアクチンと比較して）増加することが示された（表３）。
【０１１７】
【表１】神経発生に関連する遺伝子の発現
2004500824.tif 000002
【０１１８】
【表２】血球系の発生に関連する遺伝子のダウンレギュレーション
2004500824.tif 000003
【０１１９】
【表３】ウェスタンブロットにより分離された発現蛋白質の濃度測定
2004500824.tif 000004
【０１２０】
結果の考察
これらの知見は、ヒト臍帯血が、Ｍｕｓａｓｈｉ−１、グリピカン−４、およびβチューブリンＩＩＩを含む、神経発生のマーカーの発現を誘導できる細胞を含むことを示している。最近の研究から、Ｍｕｓａｓｈｉ−１はカエル、トリ、齧歯類、およびヒトの成長中および／または成体のＣＮＳ組織において免疫反応性であることが示されている（Ｋａｎｅｋｏら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２２， １３９−５３（２０００））。抗Ｍｕｓａｓｈｉ−１モノクローナル抗体は、試験したすべての脊椎動物のＣＮＳにおいて心室サブゾーン（ｓｕｂ−ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ）の非分化の増殖性細胞と反応することが示されている。ＲＡ＋ＮＧＦで処理された培養臍帯血において５倍にアップレギュレートされたグリピカン−４は、ネスチンおよび神経前駆細胞の他の公知のマーカーであるＤ１．１抗原に免疫反応性である細胞において発現することが報告されているが、分裂後の初期または完全に分化したニューロンにおいては検出されなかった（Ｈａｇｉｈａｒａら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ２１９， ３５３−６７ （２０００））。βチューブリンＩＩＩはニューロンに特異的な最も特化したチューブリンの一つである（Ｆａｎａｒｒａｇａら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １１， ５１７−２７ （１９９９））。クラスＩＩＩβチューブリンのアップレギュレーションおよび翻訳後プロセッシングは共に、神経の分化全体にわたって必須であると考えられている（Ｌａｆｅｒｒｉｅｒｅら、Ｃｅｌｌ Ｍｏｔｉｌｉｔｙ ＆ ｔｈｅ Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ ３５， １８８−９９ （１９９６）およびＬａｆｅｒｒｉｅｒｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７５， １０３−１７ （１９９７））。
【０１２１】
ＲＡ＋ＮＧＦで処理した培養臍帯血もまた、ペントラキシンＩＩ、ＧＡＰ４３、ＦＥ６５ｓｔａｔ様蛋白質、ニューロンＰＡＳ１およびＰＡＳ２を含む、ニューロンに特異的な多くの遺伝子の発現を増加させた。ニューロンペントラキシンＩＩはシナプス前ヘビ毒の毒素タイポキシン（ｔａｉｐｏｘｉｎ）との相互作用により同定された蛋白質の新規ファミリーの１つである。ニューロンペントラキシンＩＩはシナプスの形成およびリモデリングの間に機能すると考えられる（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５， １７７８６−９２ （２０００））。ニューロン成長関連蛋白質４３（ＧＡＰ４３）は特異的ニューロンマーカーと考えられるが、発生中のミオサイトにおいて発現する場合もある（Ｍｏｏｓ， Ｔ． ＆ Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ， Ｌ．Ｒ．「ＧＡＰ４３はヒト胚において発生中の筋細胞を識別する（ＧＡＰ４３ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｓ．）」Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ ４， １２９９−３０２ （１９９３））。ＦＥ６５ ｓｔａｔ様蛋白質（エキソン９−包括的形態）はニューロンにおいて特異的に発現する（Ｈｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５８， ６３２−４０ （１９９９））。ニューロンＰＡＳ１およびＰＡＳ２は中枢神経系において選択的に発現される転写因子である（Ｚｈｏｕら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ ９４， ７１３−８ （１９９７））。以下の処理で発現された神経発生の指標となる他の遺伝子には神経フィラメントのサブユニットＮＦ−ＬおよびＮＦ−Ｍ、微小管結合蛋白質２（ＭＡＰ２）、小胞アセチルコリントランスポーター、およびニューロンＤＨＰ感受性で電圧依存的なカルシウムチャネルアルファ−１Ｄサブユニットが含まれていた。臍帯血細胞はニューロン特異的エノラーゼのｍＲＮＡを発現したが、この蛋白質は骨髄、特に巨核球において多くの細胞でも発現する。ＲＡ＋ＮＧＦで処理した培養臍帯血において観察された最も大きな変化は、周産期の脳ニューロンにおいて軸策の増殖を増強する細胞外基質結合性蛋白質のｍＲＮＡの発現における４４倍の増加であった（Ｒａｕｌｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６７， １１４０８−１６ （１９９２））。それと同時に、神経突起の成長を阻害する細胞外基質蛋白質であるテナシンのｍＲＮＡの発現に有意な減少が見られた（Ｋｕｋｅｋｏｖら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ １５６， ３３３−４４ （１９９９））。グリア細胞の発生についても実証された。グリア細胞マーカーＧＦＡＰの発現増加をマイクロチップデータにおいて測定し、免疫細胞化学により確認した。神経発生の指標となるマーカーの発現増加に付随して、血球系の発生に関連する遺伝子の発現が減少した。
【０１２２】
本発明の知見は、臍帯血が、神経系細胞へと分化しうる多能性細胞を含むことの証拠となる。臍帯血を得て保存し培養により拡大することが容易であるため、これは神経変性疾患のための移植、中枢神経系への遺伝子輸送、ならびに脳および脊髄損傷の修復の好ましい細胞供給源となりうる。
【０１２３】
実施例：卒中における移植を達成するための、単核細胞を発現するニューロン、星状細胞、または希突起膠細胞マーカーの同定および単離、ならびに単核細胞の使用
この実験系は、細胞培養技術と脳虚血動物モデルの両方を用いてヒト臍帯血を、ＣＮＳ疾患または損傷を治療するためＮＳＣの生存可能な供給源として確立することを目的とする。これらの研究により、ニューロン、星状細胞、または希突起膠細胞のマーカーを発現する臍帯血中の単核細胞の有無が決定され、神経系細胞系統を生じる単核細胞が同定される。臍帯血幹細胞は、安定で、機能性ニューロンとなるＮＳＣの容易に入手可能な供給源となることが示されており、胎児ニューロンの移植で観察されたのに匹敵するレベルで、行動的回復を引き起こすことが可能である。
【０１２４】
一般的方法
培養培地　凍結細胞を融解、遠沈し、２ｍＭグルタミン（１００倍ストック、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社製）、０．００１％βメルカプトエタノール、１ｘ 非必須アミノ酸（１００倍ストック、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社製）、および１０％ＦＢＳ（条件付き幹細胞、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ社製）を加えた最小必須培地（ＤＭＥＭ）の入った７５ｍｍ培養フラスコに再懸濁して播種する。２４から７２時間後、培地を無血清の「神経増殖培地」と交換する。神経増殖培地は、０．６％グルコース、インシュリン２５μｇ／ｍｌ、トランスフェリン１００μｇ／ｍｌ、２０ｎＭプロゲステロン、６０μＭプトレッシン、３０ｎＭ塩化セレニウム、２ｍＭグルタミン、３ｍＭ炭酸水素ナトリウム、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ヘパリン２μｇ／ｍｌ、およびＥＧＦ ２０ｎｇ／ｍｌ、ｂＦＧＦ ２０ｎｇ／ｍｌを加えたＮ２培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２ １：１、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）からなる。分化培地は、ＥＧＦおよびｂＦＧＦを含まないが、代わりにレチノイン酸（０．５μＭ）と特異的成長因子（ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、またはＧＤＮＦ）とを含む「神経増殖培地」を含む。
【０１２５】
Ｍｕｓａｓｈｉ−１プロモーターにより駆動する緑色蛍光蛋白質を用いた臍帯血細胞のトランスフェクション
Ｍｕｓａｓｈｉ−１プロモーターの制御下でｈＧＦＰを有するΔＥ１アデノウイルス（ＡｄＰ／Ｍｕｓａｓｈｉ）（Ｈ．Ｏｋａｎｏ氏（Ｊａｐａｎ）より快く寄贈された）を用いて臍帯血細胞をトランスフェクトする。このアデノウイルスＤＮＡベクターは、Ｅ１ Ａ領域を欠失しておりゲノムのＥ１Ａ領域の代わりにＭｕｓａｓｈｉ−１プロモーターの制御下にあるｈＧＦＰが挿入されているウイルスゲノムの一部を含むプラスミドＤＮＡである。トランスフェクトすべき細胞を０．５ｍｌの無血清「神経増殖培地」に播種する。トランスフェクトすべき細胞の各培養皿に０．８μｇのＤＮＡを希釈して５０μｌのＯｐｔｉ−Ｍｅｍ（登録商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）に混合する。８μｌのプラス試薬混合物（Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｍｉｘ）を加え室温で１５分インキュベートする。リポフェクチン試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．）を別の試験管にて希釈し混合する（５０μｌのＯｐｔｉ−Ｍｅｍ Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｓｅｒｕｍに０．５μｌ）。室温で３０分インキュベートした後、予め複合化したＤＮＡを、希釈したリポフェクチン試薬と混合し、室温で１５分インキュベートする。次いでＤＮＡプラス−リポフェクチン試薬複合体（１００μｌ）を各ウェルに加え、前後に静かに揺り動かしながら混合する。培養物を３７℃にて５％ＣＯ２中で４〜５時間インキュベートする。２４〜４８時間後、選択された培養物を回収しトランスフェクション効率を評価する。
【０１２６】
ＲＮＡの単離　ＲＮＡ ＳＴＡＴ−６０キットを用い製造業者（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ”Ｂ”， Ｉｎｃ． Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ， ＴＸ ７７５４６）の推奨するプロトコールに従って、ヒト臍帯血細胞（またはその画分）から全ＲＮＡを単離する。ＲＮＡ単離に続いて、その吸光度を２６０ｎｍで測定し、−８０℃で保存した。完全性は１％非変性Ｓｅａｋｅｍ ＬＥアガロースゲル（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｒｏｃｋｌａｎｄ， ＭＥ）にて試験した。
【０１２７】
逆転写（ＲＴ）　ＲＴはランダムヘキサマーをプライマーとして用いて行う。終量は２０μｌで細胞の各画分からの全ＲＮＡを１μｇ含む。反応混合物は、５０ｍＭ ＫＣｌおよび１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）中に１ｍＭの各デオキシヌクレオシド３リン酸（ｄＮＴＰ）、１Ｕ／μｌ ＲＮアーゼ阻害剤、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２．５Ｕ／μｌマウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）逆転写酵素、２．５μＭランダムヘキサマーを含む。インキュベーションはまず室温で１０分、続いて４２℃で１５分行う。その後混合物を９９℃で５分加熱し、氷上で５分冷却することにより転写酵素を不活化する。
【０１２８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）　ＰＣＲは総容量１００μｌにてＲＴと同じ管内で行う。終濃度は、５０ｍＭ ＫＣｌおよび１０ｍＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）中、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、および２．５Ｕ／１００μｌ ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼである。様々なｃＤＮＡ断片を生成させるため、ＰＥ９７００サーモサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を以下のようにプログラムする：９５℃で１０５秒を１サイクル、９５℃で１５秒続いて６０℃で３０秒を３５サイクル、最後に７２℃で７分を１サイクル。ＲＴおよびＰＣＲは共にＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社のＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキットを用いて行う。様々なニューロンマーカーの有無を確認するため、プライマーを、公開されているヒト配列に基づいて構築する。Ｎｅｓｔｉｎ（アクセッション番号Ｘ６５９６４）についてはフォワードプライマー：ｎｔ２５２４〜２５４２およびリバースプライマー：ｎｔ２９２１〜２９０３。Ｍｕｓａｓｈｉ−１（アクセッション番号ＡＢ０１２８５１）についてはフォワードプライマー：ｎｔ３１９〜３３９およびリバースプライマー：ｎｔ６１８〜５９８。Ｎｅｃｄｉｎ（アクセッション番号ＡＢ００７８２８）についてはフォワードプライマー：ｎｔ２３７４〜２３９３およびリバースプライマー：ｎｔ２７６７〜２７４７。神経フィラメントサブユニットＮＦ−Ｌ（アクセッション番号Ｘ０５６０８）についてはフォワードプライマー：ｎｔ３１５５〜３１７３およびリバースプライマー：ｎｔ３５２１〜３５０１。プライマーはＵＳＦコンピューターネットワークで入手可能なＳＥＱＷＥＢ（バージョン１．１）ソフトウェアを用いて選択した。
【０１２９】
ウェスタンブロット　培養物は冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、氷冷ＰＢＳ中に入れて、１ｍｌにつき以下を含む氷冷した溶解緩衝液中に溶解する：２０ｎＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ＝８．０）、０．２ｍＭ ＥＤＴＡ、３％ノニデットＰ−４０、２ｍＭオルトバナジウム酸塩、５０ｍＭ ＮａＦ、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ならびに１０μｇの各アプロチニンおよびロイペプチン。１０分間氷上でインキュベートした後、試料を１４，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、上清を回収する。一部を総蛋白質の計算（Ｂｉｏ−Ｒａｄアッセイ法）のため採取する。各試料の総蛋白質１０μｇに相当する部分試料をＳＤＳ／ＰＡＧＥ（１０％）により還元条件下で分離し、ニトロセルロースフィルターへ電気泳動によりに転写した。抗体の非特異的結合を５％脱脂粉乳を用いて、一晩４℃でブロッキングした。
【０１３０】
ＭＣＡＯ誘導　スプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラットをイソフルレンで麻酔し、胸乳突筋および胸骨甲状筋の尾部側末端から耳まで切開する。ブラント（ｂｌｕｎｔ）解剖術を用いて右総頸動脈を露出し、注意深く解剖し迷走神経と分離する。次いで外部頸動脈を結紮し、塞栓（４．０モノフィラメントの４０ｃｍ長）を外部頸動脈を通して内部頸動脈へと約２５ｍｍ挿入する。この時点で、塞栓で左中大脳動脈の基点をブロッキングする。塞栓はその場所で１時間そのままにする。除去した後、外部頸動脈を麻痺させ、切開部を閉じる。動物は、移植の前に２４時間回復させる。
【０１３１】
移植　　新たに単離したＭＮＣを、ＨＢＳＳ＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳに１００，０００細胞／μｌの細胞密度で再懸濁する。注入部位の座標は、トゥースバー（ｔｏｏｔｈｂａｒ）を０とするとブレグマに対して１．２ｍｍ前方および＋２．７ｍｍ後方、ならびに硬膜に対して−５．２ｍｍおよび−４．７ｍｍ腹側である。５μｌの細胞懸濁液を単一の針路（ｓｉｎｇｌｅ ｎｅｅｄｌｅ ｔｒａｃｔ）に沿って梗塞部位に隣接した線条体の２つの部位で沈着させる。２．５μｌの各注入液を１μｌ／分の速度で輸送する。針は注入後さらに５分間その場所に放置し、その後ゆっくりと引き抜いた。切開部を創傷クリップで閉じた。膨張したおよび／または分化したＭＮＣを移植するため、細胞を、穏やかに機械的摩砕した培養フラスコから取りだすか、またはトリプシン（０．２５％）と１ｍＭ ＥＤＴＡを３７℃で３〜４分用いて取り出し、ＨＢＳＳ＋１５ｍＭ ＨＥＰＥＳで３回洗浄する。細胞密度は１００，０００細胞／μｌに調整した。
【０１３２】
行動試験法　 卒中の２４時間後、動物に、５つの運動および体位の活性を測定する標準化神経学的スクリーニング試験を施し、ＭＣＡＯ損傷の程度を確認する。この一連の試験を卒中後１ヶ月目に繰り返す。更に動物は、学習および記憶の受動的回避試験において両方の時点で試験する。試験の獲得相では、動物をプレキシガラスケージの角の台に置く。台から降りるとラットは、台から離れている間中、脚に周波数変動のショック（約２ｍＡ）を受ける。学習は、ラットが連続して３分間台に留まるようになるのに必要な時間の量と、ラットが台を離れる回数とにより測定する。２４時間後、ラットを台に置き、最大３分の間に測定される台から降りるまでの反応時間と、台から降りる回数とを記録することにより記憶力を測定する。また、動物を運動神経のロートロッド（Ｒｏｔｏｒｏｄ）テストにおいても試験する。動物を回転ロッド（１６ｒｐｍ）に置き、３分間試験の間に落ちる回数と最初に落ちるまでの反応時間とを記録する。試験は、各試験の間に最低３０分の休憩を取り各試験期間につき計３回の試験を２回繰り返す。第三の行動観察には自発的活動のモニター（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）が含まれる。動物を、赤外線の格子のある四角いアクリル製の箱に一晩入れ、移動と方向とを測定する。動作の非対称性を測定するエレベイテッド・ボディ・スウィングテスト（Ｅｌｅｖａｔｅｄ Ｂｏｄｙ Ｓｗｉｎｇ Ｔｅｓｔ）も行う。動物を尾の基部で支え、ケージの底面から２”上方につり上げる。頭部と胴体の持ち上がる方向を記録する。この試験を２０回繰り返す。最後の試験は高度な前脚の使い方（Ｓｋｉｌｌｅｄ Ｆｏｒｅｐａｗ Ｕｓｅ）である。これも動作の非対称性を測定するものである。動物を、２つの下り階段のあるアクリル製チャンバーに入れる。各段差に５つのフードペレットの餌を撒く。チャンバーは、各階段が一歩で届くように設計されている。回収したペレットの数により、それぞれの脚の機能が測定される。５日間の訓練期間を設け、その間は動物から一部のフードを奪う。すべての行動学的データは平均±ｓｅｍとして記録する。
【０１３３】
培養調製物における組織調製　７〜１４ＤＩＶ後、培養物を４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）で２０分固定する。その後、免疫細胞化学を開始する前に培養物をリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄する。
【０１３４】
脳切片の組織調製　ラットを抱水クローラル（１０％）による深い麻酔下で屠殺し、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＰＢ）を５０ｍｌ、次いで４％パラホルムアルデヒドを含む０．１Ｍ ＰＢを２５０ｍｌ用いて脳の心臓経由灌流を行う。脳を採取し２４時間固定した後、２０％ショ糖中で凍結保存し、その後、前脳から３０μｍの厚さの凍結切片に切断する。
【０１３５】
免疫組織化学　単一のおよび二重の免疫蛍光組織化学検査法を行う。簡単に言うと、まず浮遊している切片を、１０％メタノール、３％過酸化水素溶液を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でインキュベートすることによりクエンチングし、続いて１０％正常血清（ウマまたはヤギ；Ｖｅｃｔｏｒ）を加えた０．３％トリトンＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳでプレインキュベートする。その切片を２％正常血清を含む０．３％トリトンＸ−１００／ＰＢＳ溶液中で一次抗体にトランスファーし、４℃で一晩インキュベートする。用いる一次抗体には以下のものが含まれる：Ｍｕｓａｓｈｉ−１（Ｈ．Ｏｋａｎｏ教授より寄贈）、Ｎｅｓｔｉｎ（１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；初期の神経前駆細胞のマーカーとしてビメンチン（１：５００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；ヒトニューロンを発生の特定の時期に同定するためのＮｅｕＮ（１：１００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）およびＨｕ（１：２０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、クラスＩＩＩ β−チューブリン（１：２００、Ｓｉｇｍａ）；星状細胞を同定するためのヒト特異的ＧＦＡＰ（１：２００、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇｅｒ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌｓ）；ならびに移植されたヒトＭＮＣに由来する希突起膠細胞を同定するためのＯ４または２’３’環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰアーゼ、１：２００、Ｓｉｇｍａ）。その後切片をＰＢＳで洗浄し、２時間フルオレセインまたはローダミンのいずれかに結合した二次抗体へと置き換える。切片をＰＢＳですすぎ、標本にしてベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ）を用いてカバースリップをかける。細胞が二重染色されたか否かはＺｅｉｓｓ製共焦点顕微鏡（ＬＳＭ５１０）により得られた像のｚ−スタッキング解析により確認される。
【０１３６】
細胞計数　培養物中の細胞数を推定するため、３連で行った各マーカーのための４つの培養皿において無作為に選んだ２０の視野（４０ｘ対物レンズ）を観察する。細胞の総数および陽性標識された細胞の数を計数する。各実験条件について、陽性細胞の数と４’，６−ジアミノ−２’−フェニルインドール・ジヒドロクロライド（ＤＡＰＩ）で染色された細胞核の総数とを決定する。次いで総数を、ＤＡＰＩ−染色された核の総数の割合として表す。脳切片における免疫蛍光性の定量化について、不偏計数法を用いる。ニューロンは、特異的ＣＮＳ核を含む切片の完全なセットについて所定の均一な間隔で少数の切片において直接的に計数する。計数する各切片において、４０ｘ対物レンズを用いて切片の最上層に視野の焦点をあてる。続いて切片を貫通するよう焦点を移し、切片の最上層に存在しない陽性プロフィールの数を計数する。
【０１３７】
解析　これらの研究で用いられる動物の数は、本実験室における先の実験で得られたデータの能力（ｐｏｗｅｒ）解析に基づいていた。解析により、ｐ＜．０５という有意なレベルで目的の変数の差を見出すには一群につき最低１０匹の動物が必要であることが示された。すべての定量可能な結果は平均値±ｓｅｍで表し、変数解析（ＡＮＯＶＡ）を用いて解析する。すべてのホック（ｈｏｃ）後試験はＳｈｅｆｆｅ試験を用いて行う。
【０１３８】
臍帯血中に存在する幹細胞／前駆細胞の同定および単離
単核臍帯血細胞の不均質集団から神経前駆細胞を同定し単離する理想的な方法は、蛍光または磁気ビーズ抗体タグが結合しており選別および分離が容易である細胞表面マーカーを使用することである。残念ながら、ＮｅｓｔｉｎおよびＭｕｓａｓｈｉ−１は両者とも細胞質中に局在する。表面ベース（ｓｕｒｆａｃｅ−ｂａｓｅｄ）の免疫選択法ではまだ神経幹細胞／前駆細胞の将来的な同定もしくは特異的抽出が可能でない。新規の方法を用いて神経前駆細胞の内部分子マーカーを同定およびモニターし、蛍光活性化細胞選別法（ＦＡＣＳ）を用いて他の細胞から神経前駆細胞を分離した（Ｎ．Ｓ．Ｒｏｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９，３２１−３１ （２０００））。この方法は、レポーター遺伝子（ｌａｃＺまたは緑色蛍光蛋白質−ＧＦＰ）と神経上皮特異的遺伝子発現に必要なプロモーターとのカップリングに基づく。具体的には、Ｍｕｓａｓｈｉ−１またはα−チューブリン−１の発現に必要なｃｉｓ−調節因子（「プロモーター」）を、リポーター遺伝子ＧＦＰの上流に配置する（Ｗａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６， １９６−２０１ （１９９８）およびＮ．Ｓ．Ｒｏｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５９， ３２１−３１ （２０００））。この方法を用いて、発生段階の異なる成体および胎児哺乳動物の前脳を含む多様な不均質試料から、神経前駆細胞および若いニューロンが同定され選択的に回収された（Ｗａｎｇら、前出およびＫｅｙｏｕｎｇら、Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ａｂｓｔｒａｃｔ， １５９ （２０００））。
【０１３９】
実験デザイン  本発明者らは、ニューロンプロモーターα−チューブリン−１（Ｔα１）またはＭｕｓａｓｈｉ−１プロモーターによって制御されるＧＦＰの遺伝子でトランスフェクトされた臍帯血細胞のＦＡＣＳにより神経前駆細胞を同定し分離する。単核細胞を、輸送後の臍帯の胎盤側基部から得てフィコール遠心分離により処理する（一般的方法を参照のこと）。この結果、単核細胞はほぼ１００％回収される。これらの細胞を使用するまで２００万細胞のアリコートとして冷凍保存する。解凍し、ＦＢＳ１０％を含む補完した最小必須培地（ＤＭＥＭ）を入れた培養フラスコに４８時間置いた後、培地を「神経前駆細胞増殖培地（Ｎｅｕｒａｌ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ）」に変え２日間培養する（培地の定義については方法を参照のこと）。その後、単核細胞を、Ｐ／Ｔα１またはＭｕｓａｓｈｉ−１の制御下にあるＧＦＰの遺伝子を含むプラスミドまたはウイルスベクターを用いて懸濁培養液中でトランスフェクトさせる（トランスフェクション技術の詳細およびベクターの記載については一般的方法を参照のこと）。６時間トランスフェクションした後、細胞を遠沈し「神経前駆細胞増殖培地」に再懸濁し、小さな培養フラスコに播種する（一般的方法を参照のこと）。ＧＦＰは典型的には２日間のトランスフェクションの間に適当な標的細胞によって発現されるべきである。フローサイトメトリーおよびＧＦＰ＋細胞の選別は２〜７日培養した後に行う。細胞を洗浄し乖離し、前方および右角度（側）光散乱によってＧＦＰ蛍光性についてはレーザービーム（４８８ｎｍ、１００ｍＷ）を通過させる５１０±２０ｎｍ帯域通過フィルタを通して解析する。選別は精製モードアルゴリズムを用いて行う。バックグラウンドよりも強い蛍光性を示すとして検出された細胞を１，００〜３，０００細胞／ｓで選別する。選別されたＧＦＰ＋細胞を「神経増殖培地」（詳細については一般的方法を参照のこと）およびＢｒｄＵを含む２４穴培養フラスコに播種する。ＦＡＣＳの２日後および７日後に選別された培養物を固定し、Ｍｕｓａｓｈｉ−１、βチューブリンＩＩＩ、Ｎｅｓｔｉｎ、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ２、神経膠線維性酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）、またはＯ４（希突起膠細胞を検出するため）のいずれかと共にＢｒｄＵについて免疫染色する。
【０１４０】
結果および幹細胞様細胞を濃縮するための代替的方法  Ｐ／Ｔα１：ＧＦＰをコードするプラスミドＤＮＡまたはＰ／Ｍｕｓａｓｈｉ：ＧＦＰをコードするウイルスベクターによりトランスフェクトされた細胞は、Ｍｕｓａｓｈｉ−１、βチューブリンＩＩＩ、およびＮｅｓｔｉｎの免疫反応性によって裏付けられるように神経前駆細胞および未成熟ニューロンを識別する。たいていの場合、Ｍｕｓａｓｈｉ−１（＋）細胞の少なくとも５０％は、細胞が増殖していることを示すＢｒｄＵ抗体で共標識される。Ｗａｎｇら（前出）の研究に基づき多くのＭｕｓａｓｈｉ−１駆動性ＧＦＰ＋細胞は最大７日〜１０日間標識すべきである。これらの神経前駆細胞およびその娘細胞を選択し、続いてＦＡＣＳにより濃縮すべきである。さらに、成体の心室域の０．３６％が、発現されたＴα１駆動性ＧＦＰを乖離することも示された。臍帯血細胞の０．０１％だけがＭｕｓａｓｈｉ−１駆動性ＧＦＰを発現し、プラスミドＤＮＡを用いたトランスフェクション効率が１２．５％であると仮定して、５ｘ１０６臍帯血細胞のすべてを処理するためには６２５〜１０００個の神経前駆細胞を得る必要があると本発明者らは推測する。しかし、アデノウイルスベクターを用いると、はるかに大きなトランスフェクション効率が得られる。そのため本発明者らは、日本のＨ．Ｏｋａｎｏ氏より快く寄贈されたＭｕｓａｓｈｉプロモーターの制御下でｈＧＦＰを産生するΔＥ１アデノウイルス（ＡｄＰ／Ｍｕｓａｓｈｉ：ｈＧＦＰ）も使用する。
【０１４１】
代替的方法において本発明者らはまず臍帯血中の単核細胞からコミットされた最小の幹細胞様細胞を同定し、神経前駆細胞の増殖の誘導およびプロモーターに基づく単離を行う前に、ＣＤ３４＋細胞およびＣＤ３４−細胞の双方からこの集団を単離する。この方法の基本的な前提は、幹細胞が休止期にあり、増殖期の間以外はごくわずかの細胞表面マーカーしか発現しないということである。原始的な幹細胞はＨｏｅｓｃｈｔ３３３４２およびＰｙｒｏｎｉｎ Ｙでは染色できず、ＦＡＣＳの使用に基づいて分離することができる。さらに、幹細胞の特性を示す細胞において発現される可能性の高い多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ）の膜貫通型蛋白質産物であるＰ−ｇｐを発現する細胞も分離することができた。これらの染色特性を用いて、臍帯血単核細胞からＦＡＣＳにより幹細胞を分離できた。ＦＡＣＳによりＰ−ｇｐ＋細胞も蛍光性色素（Ｈｏｅｓｃｈｔ３３３４２およびＰｙｒｏｎｉｎ Ｙ）で染色できない細胞であることが示される場合、磁性ビーズ細胞選別を用いて臍帯血からＰ−ｇｐ免疫反応性細胞を物理的に分離する。神経前駆細胞の収率を増加させるため、臍帯血中に見られる最小のコミットされた細胞のより小さな集団を用いて開始することが好ましい。
【０１４２】
神経前駆細胞集団の自己再生能の評価
上述の例において、本発明者らは神経前駆細胞またはコミットされていない幹細胞が濃縮された細胞の亜集団を同定する。したがって、研究のため最終的には移植するために十分な細胞を選るには細胞集団を拡大することが必須であると考えられる。この研究において本発明者らは、単離された細胞集団の増殖能および神経前駆細胞の増殖を誘導する最良の薬剤に差違があるか否かについて判定する。
【０１４３】
実験デザイン  単核細胞を得て上述のようにして亜集団を単離する。本発明者らは神経前駆細胞を含むＧＦＰ＋細胞に主として焦点を当てている。これらの細胞を、「神経前駆細胞増殖培地」を含むコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）Ｔ７５フラスコに播種する。この無血清の規定の培地には、上皮成長因子（ＥＧＦ）および塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）が含まれており、胎児または成体の脳由来の神経幹細胞の増殖を誘導するのに用いられる。培養物がコンフルエントに達したら（約１週間）、０．２５％トリプシンおよび１ｍＭ ＥＤＴＡと共に３〜４分間インキュベートすることにより細胞をリフトする。細胞のアリコートをＢｒｄＵで置き換え、活発に増殖している細胞の集団を判定する。細胞は１：３に希釈した後、神経前駆細胞増殖培地に置き換える。少なくとも５回の継代の際、各継代後にトリパンブルー色素排除アッセイ法により、生産された細胞および生存性も判定する。
【０１４４】
結果  神経幹細胞はＥＧＦまたはｂＦＧＦへの曝露により増殖し、これらの成長因子を最適に組み合わせることによりヒト神経幹細胞の継続的な急速拡大および継代が可能である。または、増殖の誘導により効果的なもしくはより効果的でない栄養因子およびサイトカインの膨大なリストが存在する。これらには、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、アンフィレギュリン、βセルリン、およびヒレギュリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）といったＥＧＦファミリーの他のメンバー；ＦＧＦ２ならびに関連のＦＧＦ１およびＦＧＦ４、血小板由来成長因子ファミリー（ＰＤＧＦ）、インターロイキン、ならびにＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーが含まれる。公知の分裂促進因子の存在下における培養にもかかわらずある程度の差違が生じる場合がある。増殖し続ける細胞の比率（各継代前にＢｒｄＵアッセイ法により判定される）は、神経前駆細胞にとって最適な分裂促進因子の選択の指標となる。
【０１４５】
インビトロにおける臍帯血由来神経前駆細胞のニューロン、星状細胞、または希突起膠細胞への分化能の評価
上記で確立された単核細胞の亜集団を増殖させる単核細胞を、ニューロン、星状細胞、および希突起膠細胞へと分化させることができる。本発明者らは、骨髄ストロマ細胞画分中の非造血性幹細胞の小さな集団がニューロンおよび星状細胞へと分化することを示した。さらに予備試験の結果、１週間に満たない間ＲＡ＋ＮＧＦで処理された臍帯血は、ニューロン発生の初期に見られるマーカーであるβチューブリンＩＩＩを発現することが示されている。この試験において本発明者らは、「分化培地」を用いた処理によって本発明の神経前駆細胞がニューロンおよびグリアの表現型へと誘導されることを立証する。
【０１４６】
実験デザイン  上記で決定された最大の増殖能を有する亜集団（ＧＦＰ＋細胞）の１回または２回継代物からの単核細胞を、「ニューロン分化培地」（定義については方法を参照のこと）および特異的な一連の神経栄養因子の存在下で３５ｍｍ培養皿に再度播種する。この培地は骨髄ストロマ細胞を神経系統に沿った細胞へと分化させるのにこれまで用いられているため、最初に試験するのは脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍｌ）である。インビトロで７〜１４日（ＤＩＶ）後、培養物をウェスタンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ、および免疫細胞化学検査で処理し、神経マーカーを発現する細胞を同定する。試験するマーカーには、星状細胞を標識するためのネスチン、ビメンチン、神経膠線維性酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）、希突起膠細胞を同定するためのＯ４、ミエリン塩基性蛋白質、およびＣＮＰアーゼ、ならびにニューロンを同定するためのＮｅｕＮ、βチューブリンクラスＩＩＩ、Ｈｕ、ニューロン特異的核抗原（ＮｅｕＮ）、ヒト特異的神経フィラメント、および微小管結合蛋白質（ＭＡＰ−２）が含まれる。定量化については一般的方法に記載している。
【０１４７】
結果  臍帯血を用いた予備試験の結果および骨髄ストロマ細胞の分化により得られた結果に基づいて、アッセイ法のため選択された亜集団において神経マーカーを観察する。さらに、これらの神経細胞を生じさせる可能性が最も高い集団はＧＦＰ発現細胞である（Ｍｕｓａｓｈｉ−１プロモーターにより駆動される）。または、臍帯血由来のコミットされた最小の細胞を選択することにより得られる幹細胞様細胞を用いることが必要な場合がある。それにもかかわらず本発明者らは分化培地での処理後に、有意な数の分化したニューロンおよびグリア細胞を得ることができる。
【０１４８】
実施例：単核細胞の拡大集団および卒中の中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）モデルへの移植後における神経マーカーの発現
インビトロにおいて神経の表現型が存在することを立証するのに加えて、単離された細胞および分化した細胞が移植後に神経表現型を発現または維持できることを示すことが重要である。培養環境は容易に調整し操作される。インビボで細胞が移植される環境ははるかに予測がしにくく、一旦インサイチューに置かれると細胞に多くの影響があり、それらのいくつかによって細胞の増殖能または表現型の系統が変化する場合がある。従って本発明者らは、これらの幹細胞様細胞が脳内でニューロン、星状細胞、または希突起膠細胞となる能力を維持していることを証明する。
【０１４９】
実験デザイン  スプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ）ラット（ｎ＝１０／群）を以下の群の一つに割り当てる：１）中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）；２）新たに単離された単核細胞の線条体移植を含むＭＣＡＯ；３）および４）ＭＣＡＯ＋上記で決定された最も高い増殖能を有する２つの亜集団に由来する拡大ＧＦＰ＋細胞；５）および６）ＭＣＡＯ＋上記で決定された拡大／最小分化ＧＦＰ＋細胞。群２の未処理の臍帯血を、後に脳内で同定するため蛍光性色素ＰＫＨ２６で標識し、続いて梗塞の境界域にある線条体へと移植する。（単離された神経前駆細胞はＧＦＰですでに標識されている。）動物を、２４時間目および１ヶ月目に一連の行動測定および神経学的試験について評価する。これには、卒中後の行動的欠損および移植後の回復を立証するのに本発明者らが用いた２つのパラディグム、すなわち認知機能の受動的回避試験および運動神経のロートロッド（ｒｏｔｏｒｏｄ）試験が含まれる。続いて動物に４％パラホルムアルデヒドを用いて灌流を施し、移植片の生存性および神経分化の組織学的および免疫組織化学的解析のため脳を採取した。切片を、ＰＫＨ２６−陽性（またはＧＦＰ＋）細胞およびヒト核マトリクス抗原（ＮｕＭＡ）を発現する細胞の存在について試験する。（これによりラット脳においてヒト臍帯血由来細胞を同定する第二の方法が可能となる。）他の切片は、ＰＫＨ２６またはＮｕＭＡと、Ｈｕ、クラスＩＩＩβチューブリン、ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰ、Ｏ４とで二重標識する。ニューロンマーカー（ＮｅｕＮ、Ｈｕ、またはクラスＩＩＩβチューブリン）、グリアマーカー（ＧＦＡＰ）、および希突起膠細胞マーカー（Ｏ４）を発現する臍帯血由来細胞（ＮｕＭＡ−ｉｒおよびＰＫＨ２６＋）の割合（％）を決定する。
【０１５０】
結果  本発明者らの予備試験の結果に基づいて、ＭＣＡＯ−損傷脳において行動的改善および幹細胞子孫の生存の両方が本発明者らにより観察された。拡大／最小分化細胞での改善の方が良好である（拡大細胞集団はすでに神経系統へコミットされているためより多くのニューロンを発現すると考えられる）が、行動的改善はすべての移植群で観察される。ＭＮＣ細胞画分全体では、拡大された亜集団よりも神経細胞を生じる亜集団細胞は少ない。
【０１５１】
実施例：卒中におけるヒト臍帯血単核細胞の移植の効果
一連の小さな試験的研究において臍帯血単核細胞を、永続的または一時的（１時間）な中大脳動脈閉塞（ＭＣＡＯ）のいずれかを受けた動物の線条体に移植した。細胞（５００，０００細胞／インプラント）を解凍した直後に移植するか、または移植する前に様々な栄養因子（ＢＤＮＦ、ＮＧＦ、ＥＧＦ＋ｂＦＧＦ）と共に１週間培養して処理した。一時的卒中モデルから得られた予備試験結果により、運動神経のロートロッド（ｒｏｔｏｒｏｄ）試験において群の間で差があることが明らかとなった。レチノイン酸＋ＮＧＦで処理した単核細胞を移植された動物は、より長い時間回転軸上に留まることができ、この試験のすべての他の動物よりも３分の試験時間の間に落ちる回数が少なかった。この試験により、臍帯血細胞が、卒中における移植のための機能を改善しうる新規な細胞供給源であることが証明された。
【０１５２】
実施例：虚血（卒中）による神経損傷の処理における臍帯血画分の非経口投与
方法および材料
１．ＨＵＣＢ供給源および調製：
ＨＵＣＢはＣｒｙｏｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， ＩＮＣ．により提供され解析された。細胞は７７．２％、９５％のＣＤ３４＋細胞をそれぞれ含む。試料は液体窒素中で保存し、細胞は３７℃で元に戻した。１０００ｒｐｍ／分で５分間４℃にて遠心分離した後、細胞を０．１Ｍ ＰＢＳで洗浄した。移植に適当な細胞数を確保するため核のあるＨＵＣＢをサイトメーターを用いて計数した。最終希釈率は、各ラットに注入するための５００μｌ生理食塩水中、約３ｘ１０６ＨＵＣＢである。
【０１５３】
２．動物ＭＣＡＯモデル
体重２７０〜３００ｇのオスの成体ウィスター（Ｗｉｓｔｅｒ）ラット（ｎ＝３８）をすべての実験に用いた。要約すると、ラットをまず３．５％ハロタンで麻酔し、顔面マスクを用いて７０％Ｎ２Ｏおよび３０％Ｏ２中、１．０〜２．０％ハロタンで維持した。フィードバック制御された温水システムを用いて外科処置の間、直腸温度は３７℃に維持した。本発明者らの実験室にて改良された管腔内血管閉塞方法を用いて一時的なＭＣＡＯを誘導した（Ｃｈｅｎら、Ｊ．Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ １９９２； １２（４）： ６２１−６２８）。右総頸動脈、外部頸動脈（ＥＣＡ）、および内部頸動脈（ＩＣＡ）を曝露した。炎の傍で加熱することにより先端を丸めた、動物の体重によって決定される長さの４−０モノフィラメントナイロン縫合糸（１８．５〜１９．５ｍｍ）をＥＣＡからＩＣＡの管腔へと、ＭＣＡの基点がブロックされるまで進めた。ＭＣＡＯの２時間後、動物をハロタンで再度麻酔し、縫合糸の先端がＥＣＡの管腔を通過するまで縫合糸を引き出すことにより再灌流を行った。
【０１５４】
３．インビトロ走化性アッセイ法
１）虚血脳組織抽出物：
ＭＣＡＯの開始後６時間、２４時間、および１週間（各時点でｎ＝３）目に動物を屠殺した
；正常対照群（ｎ＝３）は、外科処置を受けていない動物を用いた。組織抽出物を実験ラットおよび対照ラットから得た。耳内部１２ｍｍから耳内部２ｍｍまでの前脳組織を直ちに得た（Ｐａｘｉｎｏｓら、「Ｔｈｅ Ｒａｔ Ｂｒａｉｎ ｉｎ Ｓｔｒｅｏｔａｘｉｃ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ．」Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， １９８６）。各試料は、ＭＣＡＯのため氷の台の上で解剖し同側である右側および反対側の脳半球とした。組織切片はＩＭＤＭを添加する（１５０ｍｇ組織／ｍｌ ＩＭＤＭ）ことによりホモジナイズし、氷上で１０分間インキュベートした。ホモジネートを１００，０００ｇで２０分間４℃にて遠心分離し、上清を抽出した。
【０１５５】
２）ＨＵＣＢ移動における脳虚血組織抽出アッセイ法
異なる時点における虚血脳組織抽出物のＨＵＣＢへの走化性活性を、記載されているように（Ｘｕら、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ， ４：３４５−３５６， １９９９）４８穴走化性マイクロチャンバー技術を一部改変して評価した。ＨＵＣＢをＩＭＤＭ（無血清）中に１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。ＭＣＡＯ後６時間、２４時間、および１週間目に正常脳および虚血脳から調製した組織抽出物２５μｌ（１５０ｍｇ組織／ｍｌ ＩＭＤＭ）を、４８穴走化性マイクロチャンバーの下方のチャンバー内に入れた。ポリカーボネートメンブレン（孔径８μｍ）一片を下方ウェルの上に置き、５０μｌのＨＵＣＢ懸濁液（１ｘ１０６細胞／ｍｌ）を上方ウェルの各々に入れた。５時間３７℃でインキュベートすることによりＨＵＣＢの移動が可能となり、下方のウェルに移動した細胞の数を測定した。
【０１５６】
４．ＨＵＣＢによるインビボでの処理
実験群：　群１（対照）：ドナー細胞を投与せずＭＣＡＯ単体（ｎ＝１０）；群２：ＭＣＡＯの２４時間後に３ｘ１０６ヒトＵＣＢ細胞を静脈注射した（ｎ＝６）。群１、２の動物をＭＣＡＯの１４日後に屠殺した。遅延した（７日）処理の効果を試験するため、本発明者らはさらに２つの群を含めた。群３（対照）：ドナー細胞を投与せずＭＣＡＯ単体（ｎ＝５）で、ラットをＭＣＡＯの３５日後に屠殺した；群４：ＭＣＡＯの７日後に３ｘ１０６ＨＵＣＢ細胞を静脈注射し、ラットをＭＣＡＯの３５日後に屠殺した（ｎ＝５）。
【０１５７】
埋め込み移植方法：  虚血後１日目または７日目に、無作為に選択した動物にＨＵＣＢを移植した。動物は３．５％ハロタンで麻酔し、Ｋｏｐｆ定位フレームに取り付けられた顔面マスクを用いて７０％ Ｎ２Ｏおよび３０％ Ｏ２中、１．０〜２．０％ハロタンで維持した。総流量０．５ｍｌ中約３ｘ１０６ＨＵＣＢ細胞を尾部静脈に注入した。
【０１５８】
機能性試験：  すべての動物において、実験群を盲検化された調査員により一組の行動性試験を、ＭＣＡＯ前、およびＭＣＡＯ後１日、７日、１４日、２１日、２８日、３５日目に行った。一組の試験は以下の試験から構成された：
１）ロータロッド（Ｒｏｔａｒｏｄ）試験：  加速的ロータロッドを用いてラットの運動機能を測定した（Ｈａｍｍ ＲＪ、Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ １１（２）： １８７−１９６ １９９４；およびＣｈｅｎ、Ｊ Ｍｅｄ； ３１（１−２）： ２１−３０， ２０００）。ラットをロータロッドシリンダの上に置き、動物がロータロッド上に留まる時間を測定した。速度を５分の間に４ｒｐｍから４０ｒｐｍまでゆっくりと増加させた。動物が段から落ちるかまたは装置をつかんだら試験を終了し、段の上を歩かせずに２回継続して回転させた。動物はＭＣＡＯの前に３日間訓練した。外科処置の１日前に３回のロータロッド測定を行い装置上での平均持続時間（秒単位で）を記録した。運動試験データは、内的なベースライン対照（外科処置前）と比較したロータロッドにおける平均持続時間（３回試行）の割合として表す。
【０１５９】
２）接着−除去体性感覚試験（Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ３７９（１）： １０４−１１１ １９８６； Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ， Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ， １０２（３）： ３１８−３２４ １９９８； Ｚｈａｎｇ， Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ， １７４（２）： １４１−１４６， ２０００；およびＣｈｅｎ， Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ， ３９（５）： ７１１−７１６ ２０００）。体性感覚の欠損を術前および術後の両方において測定した。すべてのラットを試験環境に慣れさせた。最初の試験において、各前肢の手首上の末端−半径状（ｄｉｓｔａｌ−ｒａｄｉａｌ）領域を占める左右の触覚刺激として裏面粘着式のペーパードット（サイズの等しい、１１３．１ｍｍ２）の小片２枚を用いた。その後ラットをケージに戻した。前肢から各刺激を除去するための時間を一日に５回試行して記録した。個々の試験は少なくとも５分間隔を置いた。外科処置の前に、動物を３日間慣らした。ラットが１０秒以内にドットを除去できたらＭＣＡＯに供した。
【０１６０】
３）改変神経重度スコア（ｍＮＳＳ）：（Ｂｏｒｌｏｎｇａｎ， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ； ６７６（１）： ２３１−２３４ １９９５；Ｓｈｏｈａｍｉ， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ， ６７４（１）： ５５−６２， １９９５；Ｃｈｅｎ， Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ． １９９６； １３（１０）： ５５７−５６８ １９９６；Ｓｈａｌｌｅｒ Ａｄｖ Ｎｅｕｒｏｌ， ７３： ２２９−２３８， １９９７）。神経機能を０から１８のスケールで等級付けした（正常スコア０；最大欠損スコア１８）。ｍＮＳＳは運動、感覚、反射、および平行の試験で構成される（Ｇｅｒｍａｎｏ， Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ； １１（３）： ３４５−３５３ １９９４）。損傷の重度のスコアにおいて、試験を行うことができない、または試験した反射の欠損に対して１スコアポイントを付けた；したがってスコアが高くなるにつれて損傷の度合いが高くなる。
【０１６１】
５．組織学的および免疫組織化学的評価：
動物はＭＣＡＯの後１４日間または３５日間生存させ、その時点で動物をケタミン（４４ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１３ｍｇ／ｋｇ）で再度麻酔した。ラットの脳に生理食塩水を心臓経由で灌流させ続いて４％パラホルムアルデヒドを灌流し浸潤させることにより固定し、脳、心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、および筋肉をパラフィン包埋した。脳組織を７つの等間隔（２ｍｍ）の冠状（ｃｏｒｏｎａｌ）ブロックに切った。前頭面において各ブロックから一連の隣接した６μｍ厚さの切片を切り出し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。７つの脳切片をグローバルラボイメージ解析システム（Ｇｌｏｂａｌ Ｌａｂ Ｉｍａｇｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）（Ｄａｔａ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ， Ｍａｒｂｏｒｏ， ＭＡ）を用いてトレースした。同側の脳半球の完全な領域が反対側の脳半球の領域から差し引かれる、間接的な病変領域を算出した（Ｓｗａｎｓｏｎ， Ｊ． Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ， １０（２）： ２９０−２９３， １９９０）。病変容積を、反対側の脳半球と比較した病変の容積割合として表す。
【０１６２】
単一および二重の免疫組織化学的染色（Ｌｉ， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ， ８３８（１−２）： １−１０， １９９９）を用いてＨＵＣＢ由来の細胞を同定した。要約すると標準パラフィンブロックを、ブレグマ−１〜１ｍｍの冠状座標に相当する病変の中心から得た。一連の６μｍ厚さの切片を様々なレベル（１００μｍ間隔）でこのブロックから切り出し、光学顕微鏡および蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ， ＢＨ−２）を用いて解析した。他の器官（すなわち心臓、肝臓、肺、脾臓、腎臓、筋肉、および骨髄）において移植されたＨＵＣＢ細胞の分布を検出するため、各器官から３つの切片（６μｍ厚さ、１００μｍ間隔）を得て、ＭＡＢ１２８１反応性細胞の数を測定した。ＭＡＢ１２８１（マウス抗ヒト核モノクローナル抗体、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．）はヒトのマーカーである（Ｖｅｓｃｏｖｉら、Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ； １５６（１）： ７１−８３ １９９９）。脱パラフィン化した後、切片を電子オーブン（６５０〜７２０ｗ）内で煮沸したクエン酸緩衝液（ｐＨ ６．０）に入れた。正常血清でブロッキングした後、ＰＢＳで１：３００に希釈したＭＡＢ １２８１に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いてＨＵＣＢを同定するためのＦＩＴＣ染色により切片を処理した。ＭＡＢ１２８１陽性細胞の解析は、各実験動物につき脳の１０個の組織スライド、各器官からの３つのスライドの平均の評価に基づく。
【０１６３】
同じ細胞においてＭＡＢ１２８１および細胞種特異的マーカーが細胞内に共に局在することを視覚化するために、フルオレセインイソチオシアネート結合抗体（ＦＩＴＣ， Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， ＣＡおよび赤色シアニン−５．１８）を二重標識免疫反応性に用いた。各冠状切片をまず、ＨＵＣＢを同定するためのＦＩＴＣ染色でＭＡｂ１２８１一次モノクローナル抗体を用いて処理した。上述したように、続いて以下の細胞種特異的抗体を用いてＣＹ５染色した：ニューロン核抗原（ニューロンにＮｅｕＮ、希釈率１：２００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ， ＣＡ）、微小管結合蛋白質２（ニューロンにＭＡＰ２、希釈率１：２００、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、神経膠線維性酸性蛋白質（星状細胞にＧＦＡＰ、希釈率１：１０００、Ｄａｋｏ， ＣＡ）、およびＦＶＩＩＩ（Ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子、希釈率１：４００、Ｄａｋｏ）。免疫組織化学的染色のため各動物からの陰性対照切片に、一次抗体を除外したこと以外は同一の調製を行った。動物一個体につき計５００のＭＡｂ１２８１陽性細胞を計数して、二重染色により細胞種特異的マーカー（ＭＡＰ−２、ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰ、ＦＶＩＩＩ）を用いて共局在しているＭＡｂ１２８１細胞の割合を得た。
【０１６４】
共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＣＭ）：ニューロンマーカー（ＮｅｕＮ、ＭＡＰ−２、ＧＦＡＰ）および内皮細胞マーカー（ＦＶＩＩＩ）を用いたＭＡＢ１２８１の共局在化を、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）に搭載したＢｉｏ−Ｒａｄ ＭＲＣ １０２４（アルゴンおよびクリプトン）共焦点レーザー画像化システムを用いたＬＳＣＭによって行った（Ｚｈａｎｇ ＺＧ， １９９９）。免疫蛍光性二重標識冠状切片については、切片上の緑色（ＨＵＣＢにＦＩＴＣ）および赤色シアニン−５．１８（ＭＡＰ−２、ＮｅｕＮ、またはＧＦＡＰにＣｙ５）蛍光色素を４８８ｎｍおよび６４７ｎｍのレーザービームで発光させた；発光は、５２２ｎｍおよび６８０ｎｍ発光ファイバーを通した２つの独立した光電子増倍管を用いてそれぞれ連続して得られた。目的の領域は、４０ｘ油浸対物レンズを用いてｘ−ｙ方向が２６０．６ ｘ ２６０．６ ｍ形式、ｚ方向が０．５ ｍでスキャンした。
【０１６５】
６．統計解析：
行動スコア（ロータロッド試験、接着−除去試験、およびＮＳＳ）を通常状態について評価した。分散の反復測定解析を行って時間相互作用による処置について試験し、行動スコアにおける経時的な処置の効果を試験した。時間による処置の相互作用または全体的な処置効果が０．０５レベルと有意であった場合は、亜群解析を各時点における処理の効果について０．０５レベルで行った。そうでない場合亜群解析は予備的調査とみなされた。処理群と対照群との差の試験するため平均値（ＳＴＤ）およびｐ−値を表す。
【０１６６】
ＨＵＣＢ移動の走化性活性を評価するため、正常脳組織抽出物ならびに虚血発症後６時間、２４時間、および１週間目の虚血脳組織抽出物において完全な細胞の計数を行った。本発明者らは各測定値の結果の正常性および等分散を試験した。データが病的であった場合、データの変換または置換（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）試験を考慮した。ＨＵＣＢ移動活性は正常組織と虚血組織とでそれぞれ評価した。主な効果は０．０５レベルで有意であり、続いて亜群解析により０．０５のレベルにおける有意な効果を考慮した。平均値（ＳＴＤ）を報告する。
【０１６７】
結果
機能性試験：  卒中の２４時間後にＨＵＣＢで処理したラットは各神経行動学スコアにおいて各処理群の時間相互作用による処理を全く示さなかった（相互作用のｐ−値＞０．１３）。全体的な処理効果はＮＳＳにおいてｐ＜０．０１、接着−除去試験ｐ＝０．０４、およびロータロッド試験ｐ＝０．０１と有意であった。図３Ａ、図３Ｂ、および図３Ｃは、ＭＣＡＯの１日後におけるＨＵＣＢでの処理によって、ロータロッド試験、接着−除去試験、およびＮＳＳスコア（ｐ＜０．０５）により裏付けられるように、１４日目に機能性回復が有意に改善されたことを示している。卒中の７日後にＨＵＣＢで処理したラットは、ＮＳＳについて０．８８、接着−除去試験について０．４１、およびロータロッド試験について０．０９という相互作用のｐ−値と神経行動学的スコアにおける時間相互作用による処理を全く示さなかった。全体的な処理効果はＮＳＳについてのみｐ＜０．０５と有意であり、他の試験での処理効果は全く検出されなかった（接着−除去試験のスコアはｐ＝０．１５、およびロータロッド試験のスコアは０．５５）。図４Ａ、図４Ｂ、および図４Ｃは、ＭＣＡＯの７日後におけるＨＵＣＢでの処理によって、対照群と比較してＭＣＡＯの２８日後および３５日後におけるＮＳＳ試験（ｐ＜０．０５）の機能性が有意に改善されたことを示している。しかし、ロータロッド試験および接着−除去試験では対照動物と比較して有意な差を示すことはできなかった。
【０１６８】
組織学：  Ｈ＆Ｅで染色された６μｍ厚さの冠状切片において、ＭＣＡＯの１４日後および３５日後にドナー移植を受けたもしくは受けていないＭＣＡＯを施されたすべてのラットの虚血中心部に暗赤色のニューロンが観察された。ＭＣＡＯのみを施された対照ラットと比較して、虚血の２４時間後および７日後にドナー処置を受けたラットにおいて虚血損傷の有意な減少は検出されなかった。脳組織において、ＨＵＣＢの同定はＭＡＢ１２８１染色により特徴づけられた。ＨＵＣＢは生存しており、レシピエントラットの損傷脳の全体にわたって分布していた（図５）。同側の脳半球の皮質および線条体を含む同側脳半球の複数の領域においてＭＡＢ１２８１反応性細胞が観察された。ＭＡＢ１２８１反応性細胞の大部分が虚血境界域に存在していた（図５）。反対側の脳半球には該細胞はほとんど観察されなかった。このデータは、ＨＵＣＢ細胞が経静脈経路を経て脳に輸送されたこと、好ましくは損傷した組織への移動を示している。ＭＡＢ１２８１陽性細胞の一部は血管を取り囲んでおり、一部は損傷領域の周囲にある毛細血管内皮細胞の核内に検出された（図５）。
【０１６９】
脳切片の二重染色免疫組織化学により、ＭＡＢ１２８１陽性細胞の一部が星状細胞マーカーＧＦＡＰ、ニューロンマーカーＮｅｕＮおよびＭＡＰ−２、内皮細胞マーカーＦＶＩＩＩに反応性であることが明らかにされた。ＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、ＭＡＰ−２、およびＦＶＩＩＩ蛋白質を発現した標識されたＭＡＢ１２８１の割合はそれぞれ、（〜６）％、（〜３）％、（〜２）％、および（〜８）％であった。
【０１７０】
ＨＵＣＢ移動に関する虚血脳組織抽出物アッセイ法：
正常な脳組織および虚血組織の存在下で移動するＨＵＣＢ細胞を、ＭＣＡＯの６時間後、２４時間後、および１週間後に得た。卒中の発症後２４時間目に採取された虚血大脳組織の存在下でＨＵＣＢ移動活性に有意な増加が検出された（ｐ＜０．０１）。ＨＵＣＢ移動活性における増加の傾向は、正常な非虚血脳組織の存在下で測定されたＨＵＣＢ移動活性と比較して、ＭＣＡＯの６時間後および１週間後に採取された組織で明らかであった（ｐ＞０．０９）。
【０１７１】
結果／結論
上述の実験は、静脈注射されたＨＵＣＢが移植の１４日後および３５日後に脳内に見出され、反対側の脳半球よりも同側の脳半球において有意に多くのＭＡＢ１２８１陽性細胞が見出されたことを示している。多くの細胞が虚血脳の境界域に移動しており、一部の細胞は血管を取り囲んでいた。ＨＵＣＢは生存しており、一部は細胞種特異的マーカーＧＦＡＰ、ＮｅｕＮ、およびＭＡＰ−２を発現する。最も重要なことに、卒中の１日後にＨＵＣＢを経静脈投与された動物において運動試験、感覚試験、および改変ＮＳＳ試験における機能性の結果に有意な改善が見られた。インビトロにおいては、本発明者らのデータにより、正常な非虚血脳組織と比較してＭＣＡＯの２４時間後に採取された虚血大脳組織の存在下において有意なＨＵＣＢ移動活性が存在することが示された（ｐ＜０．０１）。虚血２４時間目におけるＨＵＣＢ処理によって、ＭＣＡＯ後の機能性回復を促進しうる、虚血脳へのＨＵＣＢ移動がより増進された。
【０１７２】
この試験において、ＨＵＣＢの経静脈注入液は脳へ浸入し生存し分化して卒中後の神経学的欠損を減少させることが示された。この試験において、ＨＵＣＢ細胞のほんの一部がニューロン様細胞の形質を示す蛋白質を発現した。機能性回復はＨＵＣＢ投与後数日以内に見られた。
【０１７３】
完全な脳半球よりも損傷した脳半球においてより多くのＨＵＣＢが見出されること、ならびに虚血脳組織抽出物がＨＵＣＢの移動を誘導することも示され、このことは虚血によってＨＵＣＢ移動を容易にする走化性因子が誘導されたことを示唆している。
【０１７４】
本明細書に記載された結果により、本研究におけるＭＣＡＯの２４時間後におけるＨＵＣＢ処理は卒中後の機能性回復（運動ロータロッド試験、体性感覚接着−除去試験、およびＮＳＳのスコア）を有意に改善させることが示される。ＭＣＡＯの７日後におけるＨＵＣＢでの処理では、ＭＣＡＯ後のＮＳＳ試験においてのみ機能性回復が示された。しかし、ロータロッド試験および体性感覚接着−除去試験では有意な回復は示されなかった。したがって、ＨＵＣＢ処理の利点は処理の時間に依存すると考えられる。処理の利点はＨＵＣＢの移動活性に相関していると考えられる。ＨＵＣＢ移動活性の有意な増加は、ＭＣＡＯの２４時間後に採取された虚血大脳組織の存在下で検出された。虚血の初期におけるＨＵＣＢでの処理は、虚血脳へのＨＵＣＢ移動を増進させ、ＭＣＡＯ後の機能性回復を促進させると考えられる。
【０１７５】
採取された臍帯血の約２５％が線維芽球様（ＭＩＣ）細胞の定着した層を急速に生じる。これらの細胞の急速な増殖は（自己再生する）休止（Ｇ）細胞の集団によって支持されていると考えられる。ＭＰＣは大きなエクスビボ拡大能を有し、分化能においても臍帯血由来ＭＰＣは細胞または遺伝子導入治療選択肢の魅力ある標的として考えることができる。
【０１７６】
結論として、提示された実験により、経静脈投与されたＨＵＣＢは生存し移動して卒中後の機能性回復を改善させることが示された。その機構は不明であるが、記載された実験により、卒中の治療を目的とする臍帯血由来神経細胞の使用が支持される。
【０１７７】
実施例：外傷性脳損傷後の神経学的欠損を減少させることにおけるヒト臍帯血の非経口投与
材料および方法
注入用ヒト臍帯血の調製  使用したヒト臍帯血はＣｒｙｏｃｅｌｌ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｉｎｃ．（Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ， Ｆｌｏｒｉｄａ）から寄贈された。試料は液体窒素中で保存し、細胞は３７℃で元に戻した。１０００ｒｐｍ／分で１０分間４℃にて遠心分離した後、上清を除去し、細胞を０．１Ｍ ＰＢＳで二回洗浄した。３０μｌの細胞懸濁液を３０μｌの０．４％トリパンブルー染色液と混合し、生存細胞の数を血球計算盤およびカウンターを用いて位相差顕微鏡下で計数した。採取された細胞の総数を算出し、最終希釈率を３００μｌ生理食塩水中２ｘ１０６細胞とした。
【０１７８】
制御された皮質損傷動物モデルおよびＨＵＣＢの注入  ウィスター（Ｗｉｓｔｅｒ）ラットを３５０ｍｇ／ｋｇ体重の抱水クロラールを腹腔内投与することにより麻酔した。直腸温度はフィードバック制御された加温パッドを用いて３７℃に調整した。制御された皮質衝撃装置（ｃｏｒｔｉｃａｌ ｉｍｐａｃｔ ｄｅｖｉｃｅ）を用いて損傷を誘導した。ラットを定位固定枠に置いた。ラムダ（ｌａｍｄａ）とブレグマとの中間である中央縫合線に隣接して直径１０μｍの開頭術を２カ所行った。第二の開頭術により皮質組織を側面に沿って移動させた。硬膜は皮質の上に完全な状態で保持した。左側皮質（同側皮質）を６ｍｍ直径のチップを含む空気ピストンを用いて４ｍ／秒の速度および２．５ｍｍの圧縮にて衝撃を与えることにより損傷を誘導した。速度は線速度変位トランスデューサー（ｌｉｎｅａｒ ｖｅｌｏｃｉｔｙ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）を用いて測定した。
【０１７９】
ＴＢＩに供した２４匹のラットを３つの群に分けた。実験群（ｎ＝８）：ＴＢＩの２４時間後、ラットに２ｘ１０６細胞を含む３００ｇｌ生理食塩水を尾部静脈経由で１０分の持続時間にわたってゆっくりと注入した。プラセボ対照群（ｎ＝８）：ＴＢＩの２４時間後、ラットに３００ｇｌの生理食塩水を尾部静脈経由で１０分の持続時間にわたってゆっくりと注入した。ＴＢＩのみの群（ｎ＝８）：ラットにＴＢＩのみを施し、他の処理は行わなかった。すべてのラットを処理後２８日目に屠殺した。
【０１８０】
組織調製  （１）パラフィン切片：  各群から４匹の動物に過剰量のケタミンとキシラジンを腹腔内投与することにより安楽死させ、ヘパリン添加生理食塩水、続いて１０％緩衝ホルマリンを心臓内に灌流させた。脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、および骨髄を採取し、１０％緩衝ホルマリン中で２４時間保存した。標準の厚さ２ｍｍの７ブロックを齧歯類の脳基質にて切り出しパラフィン包埋した。他の器官の厚さ２ｍｍのブロックも切り出しパラフィン包埋した。一連の隣接した厚さ６ｇｍの切片を切り出し、脳および他の器官の各ブロックの切片をＨ＆Ｅで染色した。光学顕微鏡下での形態解析のため標準Ｈ＆Ｅ染色を用いた。（２）ビブラトーム切片：  各群からさらに４匹のラットにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−デキストラン（５０ｍｌｇ／ｍｌ、２ｘ１０６分子量；Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を含む１ｍｌの生理食塩水を静脈内投与した。この色素を１分間循環させ、その後麻酔したラットを断頭術により屠殺した。切断された頭部から脳を直ちに採取し、４％パラホルムアルデヒド中に４℃で４８時間置いた。冠状切片（１００ｔｍ）をビブラトームにて切り出した。
【０１８１】
免疫組織化学  ＨＵＣＢ細胞を同定するためすべての器官の冠状切片においてマウス抗ヒト核一次モノクローナル抗体（ＭＡＢ１２８１）およびＣｙ５−結合Ｆ（ａｂ’）２断片ウサギ抗マウス二次ＩｇＧを用いて単一染色を行った。冠状大脳切片については二重染色も行った。脳切片をまずニューロンマーカーであるＮｅｕＮおよびＭＡＰ−２、または星状細胞マーカー、神経膠線維性酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）について、相当する一次抗体および二次ＦＩＴＣ−結合Ｆ（ａｂ’）２断片を用いて染色し、続いて一次ＭＡＢ１２８１抗体およびＣｙ５−結合Ｆ（ａｂ’）２断片の二次抗体を用いてヒト臍帯血細胞を同定するため二重染色した。要約すると、ＴＢＩ、ＴＢＩ＋生理食塩水、およびＴＢＩ＋ＨＵＣＢの群から得た厚さ６ｍの切片を脱パラフィン化し、ニューロンを同定するため切片を電子オーブンにて沸騰しているクエン酸緩衝液（ｐＨ＝６）中に１０分間入れた。室温にて冷却した後、切片を０．１％サポニン−ＰＢＳ中で４℃にて一晩、ｍＡｂ ＮｅｕＮ（希釈率１：４００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）およびＭＡＰ−２（希釈率１：４００、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）についてインキュベートした。次いで抗マウスＦＩＴＣ−結合Ｆ（ａｂ’）２断片（希釈率１：２０、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＣＡ）を添加し、１週間インキュベートした。星状細胞を同定するために、切片を０．１％ペプシンで３７℃にて１５分間処理し、ｐＡｂ ＧＦＡＰ（希釈率１：４００、Ｄａｋｏｐａｔｔｓ）を添加した。切片を抗ウサギＦＩＴＣ−結合Ｆ（ａｂ’）２断片（希釈率１：２０、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＣＡ）と共に１週間インキュベートした。ＦＩＴＣ−結合Ｆ（ａｂ’）２断片で染色された上述の切片を、ヒト細胞内核抗原を同定するためにマウス抗ヒト核一次モノクローナル抗体であるＭＡＢ１２８１（希釈率１：２００）およびＣｙ５−結合Ｆ（ａｂ’）２断片ウサギ抗マウスＩｇＧ（希釈率１：２０）を用いて処理した。蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＢＨ−２）を用いてスライドを解析した。各動物由来の陰性切片に、一次抗体または二次抗体を省略したことを除いては同一の染色調製を施した。
【０１８２】
三次元画像獲得  ドナー細胞と大脳血管との関係を観察するために、Ｚｅｉｓｓ顕微（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）鏡に搭載されたＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）ＭＲＣ１０２４（アルゴンおよびクリプトン）共焦点レーザー画像化システムを用いてビブラトーム切片を解析した。ＦＩＴＣ−灌流した各群由来の組織試料を用いて、耳内部６．３８ｍｍから耳内部１．０ｍｍまでの２ｍｍ間隔での１０個のビブラトーム切片（ＰａｘｉｏｎｓおよびＷａｔｓｏｎ、１９８６）を１０ｘ対物レンズ下で４８８ｎｍにて検査した。ＭＡＢ抗体（Ｃｙ５）で染色した切片を６４７ｎｍのレーザービームで発色させた。
【０１８３】
細胞数の推定  ＭＡＢ１２８１反応性細胞の測定について、５つの等間隔のスライド（約１００ｐ．ｍ間隔）の平均数を各脳ブロックから得て、前脳を包含する厚さ２ｍｍの７ブロックにおいてＭＡＢ１２８１反応性細胞を計数した。これらの各ブロックから得た９つのスライドをまず、ＮｅｕＮ（３つのスライド）、ＭＡＰ−２（３つのスライド）、およびＧＦＡＰ（３つのスライド）を同定するためＦＩＴＣで染色し、続いてＨＵＣＢ細胞を同定するためＣｙ５染色を行った。すべての７ブロックにおいて蛍光顕微鏡を用いてＮｅｕＮ、ＭＡＰ−２、およびＧＦＡＰを発現しているＭＡＢ１２８１反応性細胞の数をそれぞれ計数した。サンプリングパラメーターにより生じる偏りを減少させるために、ラットに由来するＭＡＢ１２８１同定のためのすべての切片を同時に染色した。個々の処理を盲検化された観察者によって細胞が計数される前にＭＡＢ１２８１陽性細胞の基準を定めた。すべてのＭＡＢ１２８１反応性細胞を皮質切片全体にわたって計数した。
【０１８４】
神経学的機能の評価  加速ロータロッド−運動試験（ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ Ｒｏｔａｒｏｄ−ｍｏｔｏｒ ｔｅｓｔ）を用いて神経学的運動測定を行った。ラットを加速するロータロッドトレッドミル（Ｌａｂ−ｌｉｎｅ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ＩＮＣ）の上に置き、ラットの課題は、徐々に速度が増加して回転する回転ロッドの上を歩くことおよび平行性を維持することであった。ラットがロッドから落ちるとプレートが外れ液晶に持続時間が秒単位で記録される。安定したベースラインを確保するためＴＢＩの前に３日間毎日５回の試行（ウォーミングアップ試行）を行うことですべてのラットを予め訓練した。ＴＢＩ、およびＨＵＣＢまたは生理食塩水の投与に続くＴＢＩの後、屠殺するまでラットを１日目、４日目、７日目、１４日目および２８日目に試験した。運動試験データは、内的ベースライン値と比較したロータロッド試験における５試行の平均の割合として示されている。
【０１８５】
ＴＢＩ後またはＨＵＣＢもしくは生理食塩水の投与後２４時間目に、すべてのラットを神経学的重度スコア（ＮＳＳ）を用いて評価した。ＮＳＳは運動（筋肉状態、異常な動作）、感覚（視覚、触覚、および固有感覚性）、および反射試験から構成される。課題を果たせなかった場合に１ポイントが与えられる。したがってスコアが高いほど、損傷がより重度であり、最大１４ポイントである。ラットは、処理後１日目、４日目、７日目、１４日目、および２８日目に再評価した。すべての測定は、個々の処理を盲検化された観察者によって行われた。
【０１８６】
統計解析  ＮＳＳおよびロータロッド試験のスコアを損傷前ならびにＴＢＩの１日、４日、７日、１４日、および２８日後に測定した。ＭＡＢ１２８１反応性細胞の数を処理の２８日後に計数した。本発明者らは主としてＮＳＳの回復におけるＨＵＣＢの効果に着目した。解析は２つの対照群におけるＮＳＳの平均値の差を試験することにより開始した。０．０５レベルで２つの対照群の間に差がない場合、力を増大させるため２つの対照群を組み合わせた。時間相互作用による処理および経時的処理の効果を試験するためＡＮＯＶＡの共分散解析（反復測定）を行った。時間と時間の相互作用が０．１０レベルで検出された場合は、各時点での処理の効果について０．０５レベルにて亜群解析を行った。そうでなければ亜群解析は予備調査と見なした。同じ解析方法を用いてロータロッド試験スコアの結果を解析した。対のあるｔ検定を用いて損傷した脳半球と対照脳半球との細胞計数の平均値における差を試験した。
【０１８７】
結果
器官の組織学的解析  脳および器官のブロックから得た切片を一般的な組織病理学的評価のためＨ＆Ｅ染色法で染色した。光学顕微鏡下で解析されたすべての器官の構造的完全性は、最初に脳の機械的損傷があったことを除けば、崩壊していなかった。出血、白血球の侵入、炎症性反応、および新生物は脳を除くどのスライドにも観察されなかった。
【０１８８】
ＭＡＢ１２８１陽性細胞の分布  ＨＵＣＢを注入されていない、ＴＢＩのみの群およびＴＢＩ＋生理食塩水の群のスライドではＭＡＢ１２８１陽性細胞は観察されなかった。ＭＡＢ１２８１陽性細胞の大多数は、ＨＵＣＢを注入されたラットの脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、およびさらには骨髄の血管に見出された。いくつかの散乱したＭＡＢ１２８１陽性細胞がこれらの器官の柔組織に見られた。脳においてはＭＡＢ１２８１標識細胞は、同側脳半球の損傷領域の境界域、皮質、線条体、および脳梁において観察された。ＭＡＢ１２８１陽性シグナルは、損傷領域を取り囲む毛細血管内皮細胞の核内に検出された。共焦点レーザー顕微鏡を用いて、植え付けられた細胞が、損傷領域の境界域において新生の（ｓｐｒｏｕｔｉｎｇ）血管に組み込まれていることを確認した。脳の同側脳半球および反対側脳半球の柔組織へと移動するＭＡＢ１２８１陽性細胞の総数を計数しＴＢＩ＋ＨＵＣＢ群で解析した。同側脳半球のＭＡＢ１２８１陽性細胞の数（４３，５９７±４２６５）は、反対側脳半球（１３，７４２±６４７１、ｐ＜０．０５）の数より有意に高かった。このデータは、ＨＵＣＢ細胞が静脈内経路を経て脳へと輸送される、好ましくは損傷した組織へと移動することを示している。
【０１８９】
ＭＡＢ１２８１反応性細胞の表現型の同定  二重蛍光染色により、ＭＡＢ１２８１陽性細胞の一部がニューロンマーカーであるＮｅｕＮおよびＭＡＰ−２ならびに星状細胞マーカーであるＧＦＡＰを発現することが示された。これらの二重標識細胞はＨＵＣＢ処理群においてラットの同側脳半球においてのみ観察された。これらの陽性細胞の大部分は損傷領域の境界域に局在していた。ＨＵＣＢ処理群における同側脳半球のＭＡＢ１２８１標識細胞の６．９±１．３％がＮｅｕＮを発現していた。５．８±２．４％がＭＡＰ−２を発現しており、９．７±２．８％がＧＦＡＰを発現していた。これらのデータは、植え付けられた細胞の一部がニューロンの表現型および星状細胞の表現型を発現することを示している。
【０１９０】
神経学的および運動機能評価  ＴＢＩの２日後、損傷前と比較して３つの群では有意に低いロータロッド試験のスコアと、有意に高いＮＳＳのスコアが得られた。ロータロッド試験スコアは、ＨＵＣＢの投与後１４日目および２８日目におけるＴＢＩ群（１１８．５±１７．０％および１２９．２±１２．２％）およびＴＢＩ＋生理食塩水の群（１１７．２±１３．６％および１３３．２±１０．７％、ｐ＜０．０５）と比較した場合、ＴＢＩ＋ＨＵＣＢ群（１３８．０±１１．３％および１５５．２±１６．２％）で有意に改善された。神経学的重度スコアもまた、注入後１４日目および２８日目におけるＴＢＩ群（７．５±１．７３および６．３±１．３）およびＴＢＩ＋生理食塩水の群（７．３±０．９および５．７５±０．９、ｐ＜０．０５）と比較した場合、ＴＢＩ＋ＨＵＣＢ群（４．２±１．３および３±０．８）で有意に改善された。この結果は、ＴＢＩの２４時間後におけるＨＵＣＢの静脈内投与によりＴＢＩによって生じる運動神経学的機能欠損が減少することを示している。
【０１９１】
結論
上述の実験の主要な知見は以下の通りであった：（１）静脈内に注入されたＨＵＣＢ細胞は、ＨＵＣＢ細胞投与の２８日後までに脳に侵入する；（２）ＨＵＣＢの静脈内注射により、投与後１４日目および２８日目までに運動および神経学的欠損が減少する；（３）脳の柔組織へと移動する細胞は、ニューロンマーカーであるＮｅｕＮおよびＭＡＰ−２ならびに星状細胞マーカーであるＧＦＡＰを発現する；（４）ＨＵＣＢ細胞は標的器官内部の血管壁に組み込まれた；（５）これらの細胞は他の器官にも存在し、明らかな弊害を伴わず主に血管に局在する。本発明者らのデータは、ＨＵＣＢの静脈内投与がＴＢＩの治療に有用であることを示唆している。
【０１９２】
これらのデータは、いくつかの注入された細胞が脳、心臓、肺、腎臓、肝臓、脾臓、筋肉、および骨髄の柔組織に移動することを示している。本発明者らの研究は、静脈内投与されたＨＵＣＢの外傷性脳損傷における効果を測定するよう設計されたため、ＴＢＩ＋ＨＵＣＢ群において大脳柔組織に存在するＨＵＣＢ細胞（ＭＡＢ１２８１陽性細胞）の数を計数し解析した。反対側の脳半球よりも有意に多くのＭＡＢ１２８１陽性細胞が同側脳半球において見出された。このことは、注入された細胞が好ましくは損傷した脳半球へ、特にＴＢＩ後の損傷領域の境界域へと移動すること、ならびにＮｅｕＮ、ＭＡＰ−２、およびＧＦＡＰを発現するほぼすべてのＭＡＢ１２８１陽性細胞が同側脳半球に局在することを示しており、これにより、損傷後の脳の微小環境はＨＵＣＢ幹細胞の神経細胞表現型への分化の誘導という利点を受けることが証明される。
【０１９３】
２つの試験（ロータロッド試験およびＮＳＳ）を用いてラットの実験的損傷に対する神経学的行動反応を測定した。ロータロッド試験はラットの肢の運動神経および運動機能の平衡性局面を試験するためのよく確立された方法である。ＮＳＳはロータロッド試験と同様で、ＴＢＩ後の運動、感覚、および反射の軽い欠損を評価するための経済的で単純かつ迅速な試験である。これらの２つの試験は一般に、動物におけるＴＢＩおよび卒中後の行動反応における薬物の効果を評価するために用いられる。ＨＵＣＢの静脈内投与後１４日目および２８日目に、神経学的行動欠損が上述の実験においてＴＢＩを施されたラットで有意に減少した。これらのデータは、ＨＵＣＢの静脈内投与がＴＢＩ後のラットにおいて神経学的結果を有効に改善しうること、ならびに脳および／または脊髄に損傷を受けた患者へのＨＵＣＢの静脈内投与が外傷性脳損傷を含むそのような損傷を治療するための実行可能な治療的方法であることを示している。
【０１９４】
本発明を本明細書の上部に記載したが、特許請求の範囲に記載の本発明と矛盾する意図されていない様式で本発明を制限するものではないことに注意されたい。
【図面の簡単な説明】
【図１】ニューロン表現型に由来するｍＲＮＡの存在を示すゲル解析の代表的な結果である。
【図２】ニューロンマーカーに対する抗体との免疫反応性を試験するための、免疫染色した培養細胞の代表的な顕微鏡観察結果である。一部の図は、細胞が、Ｍｕｓｈａｓｈｉ−１（図２Ａ）、βチューブリンＩＩＩ（図２Ｂ）、および星状細胞のマーカーであるＧＦＡＰ（図２Ｅ）と免疫反応性であることを示す。
【図３Ａ、３Ｂ、および３Ｃ】ＭＣＡｏの１日後にヒト臍帯血の単核細胞画分を投与された動物における神経機能の回復結果を、接着−除去試験、ロータロッド試験、ＮＳＳ試験によって示す。
【図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃ】ＭＣＡｏの７日後にヒト臍帯血の単核細胞画分を投与された動物における神経機能の回復結果を、接着−除去試験、ロータロッド試験、ＮＳＳ試験によって示す。
【図５】ＭＡＢ１２８１による脳切片の免疫染色結果を示し、最も高濃度の臍帯血細胞が傷害組織に移動することが示される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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