(57)【要約】本発明の目的は、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP) 阻害効果を有する非タンパク質新生構造の新規化学実体の発見および調査である。前記目的は、ジメルカプトアルキル置換キナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオンの合成により達成される。上記物質クラスの化合物は、予期されない明瞭な、したがって病理学的に興味深いMMP-阻害効果を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式IaおよびIb
【化１】
2004520349.tif 000012
式中、
R1は、水素、メチル、メトキシ、ジメトキシ、Hal (Halは、フッ素、塩素、臭素である) 、ヒドロキシ、カルボキシであり、
R2は、水素、メチルであり、
ｎは、１、２である
のジメルカプトアルキル置換キナゾリン-2,4-(1H, 3H) ジオンならびにその互変異性体および塩。
【請求項２】
式Iaの化合物の製造方法であって、
所定量の対応する出発化合物IIIaをモノメチルグリコールに添加し、TLC またはHPLS制御下でその全部の変換までチオ尿素と約100 ℃の浴温で加熱し、
沈澱したイソチウロニウム塩を分離し、
約50℃の浴温でエタノールを添加することにより、1NのNaOH中でけん化し、
冷却しながら氷酢酸と混合し、
形成された沈殿物を分離し
ならびに公知の様式で水を用いて洗浄して、エタノールから再結晶化し、
得られた物質を硫酸、氷酢酸および水からなる酸混合物に添加し、
混合物をその全部の変換まで加熱し、
冷却後形成された沈澱を、一般に公知の様式で分離および精製する
ことを特徴とする製造方法。
【請求項３】
式Ibの化合物の製造方法であって、
所定量の対応する出発化合物IIIbを沸騰水浴において溶媒としてメチルグリコール／i-プロパノール／DMF 1:1:2 中でチオ尿素と加熱し、
得られたイソチウロニウム塩を冷却後に分離し、
約50℃の浴温でエタノールを添加することにより、1NのNaOH中でけん化してIIb を形成し、
それを酸性下で加水分解し、ならびに
冷却後、Ibからなる沈澱を溶媒から分離する
ことを特徴とする製造方法。
【請求項４】
式Iaの化合物のマトリックスメタロプロテイナーゼインヒビターとしての使用。
【請求項５】
式Ibの化合物のマトリックスメタロプロテイナーゼインヒビターとしての使用。
【請求項６】
1-(1',3'- ジメルカプト- プロプ-2'-イル) キナゾリン-2,4(1H,3H) ジオンが使用されることを特徴とする、請求項４記載の式Iaの化合物のMMP インヒビターとしての使用。
【請求項７】
(R,S)-1-(2',3'- ジメルカプト- プロプ-1'-イル)-キナゾリン-2,4(1H,3H) ジオンおよび／または(R,S)-1-(3',4'- ジメルカプト- ブト-1'-イル) キナゾリン-2,4(1H,3H) ジオンが使用されることを特徴とする、請求項５記載の式IIa の化合物のMMP インヒビターとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般式Ｉ
【０００２】
【化１】
2004520349.tif 000002
【０００３】
式中、
R1は、水素、メチル、トリフルオロメチル、メトキシ、ジメトキシ、Hal (Halは、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素である) 、ヒドロキシ、カルボキシであり、
R2は、水素、メチルであり、
ｎは、１、２である
のジメルカプトアルキル置換キナゾリン-2,4(1H, 3H)ジオンおよびその互変異性体および塩、ならびにマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP) インヒビターとしての使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
キナゾリン、キナゾリノン、およびキナゾリンジオンは、徹底的な医薬研究の対象である。その活性物質としての安定性、および合成構築ブロックは、議論されていない。
【０００５】
医薬としての硫黄置換キナゾリンジオン、特に3-（メルカプトアルキル）キナゾリン-2,4(1H,3H) ジオンの治療効果は、Leistnerら(DD 298 784)により発見された。この群の物質の代表的な免疫刺激性および抗ウイルス効果があることが見出された。
【０００６】
ジメルカプトアルキル置換キナゾリン-2,4(1H,3H) ジオンの合成については現在ほとんど知られてなく、ジメルカプトアルキル置換キナゾリン-2,4(1H,3H) ジオンの効果については何も知られていない。
【０００７】
一般式Ｉに対応するキナゾリン-2,4(1H,3H) ジオン系のN1窒素にジメルカプトアルキル置換基を有する化合物は、技術文献中にまだ記載されていない。
【０００８】
有効な、低分子および非タンパク質新生MMP インヒビターの開発に関する分野において徹底的な研究が世界中でなされている。生理的な観点から、MMP の酵素活性は、活性化と阻害との間で厳格に協調される調節に供されることが知られている。この目的のために、生物は、マトリックスメタロプロテイナーゼの組織インヒビター(TIMP)と呼ばれる特別なタンパク質を有し、それは迅速におよび効率よくMMP の活性を阻害しうる(Nagase, H. ら：Engineering of selective TIMPs, 1-11; Inhibition of Matrix Metalloproteinases - Therapeutic Application (Greenwald, R.A., Zucker, S., Golub, L.M. 編)Ann NY Acad Sci 878 (1999))。特に、リウマチ性疾患の場合、これらの酵素のブロックされていない酵素活性は、病理学的に重要な軟骨物質の分解、および関節の慢性でかつ痛みのある変化を生じる。(Goldbach-Mansky, R.ら：Active synovial matrix metalloproteinase-2 is associated with radiographic erosions in patients with early synovitis. Arthritis Res 2 (2000)145-153)。
【０００９】
腫瘍の浸潤および拡散は、MMP の病理学的効果の他の例を示す。放出され、かつ活性化されたMMP は、密集したコラーゲン結合組織、また特に血管の基底膜を押し分けて進み、そのようにして、癌細胞が腫瘍凝集をはなれ、血管系に移動し、転移を他の場所に形成することを可能にする。MMP はまた、新規に形成された血管のためにコラーゲン結合組織を押し分けて、そのようにして、増殖腫瘍のこの血管新生を担うことにより、増殖腫瘍の血管供給の決定的な役割をはたす(Shapiro, S.D.: Matrix metalloproteinase degradation of extracellular matrix: biological consequences. Current Opinion in Cell Biology 10 (1998) 602-608) 。
【００１０】
紫外線誘導紅斑が、MMP の不十分な衰え効果の他の関連する医学結果として述べられている。それは、とりわけ、強い日射の結果として生じる。日光または日焼け装置の高エネルギー紫外線は、照射された皮膚中の不活性プロコラーゲナーゼをとりわけ活性化し、それは結果として結合組織および毛細血管のコラーゲンを切断し、したがって日焼けの症状の原因となる。
【００１１】
抑制されていない酵素MPP 作用のこれらの例示された病理学的影響に対して、その結果は、安定なMMP インヒビターにより妨げられうるか、または実質的に低減されうる。特定のインヒビターにより十分に計算された様式でこれらの酵素を阻害するという考えを実現し、したがって、例えば、リウマチ形態の疾患と関連して生じる進行性軟骨破壊を停止するか、または腫瘍の増殖もしくは拡散を妨げることは魅力的である。
【００１２】
MMP 阻害効果を有する化合物を得る多数の方法が、すでに公知である。これらの第一世代の活性物質は、タンパク質新生構造を通常有し、特別なタンパク質である天然のインヒビターに構造的に関連する。これらのタンパク質新生または偽タンパク質新生基質アナログは、活性MMP 中心において亜鉛イオンをキレートする亜鉛結合基を構造エレメントとして有する。
【００１３】
治療適用に関しては、かかるタンパク質新生および非タンパク質新生活性物質の全てが、不十分な被吸収性、通常短い半減期、ほんのわずかな安定性、ならびにしばしば所望でない副作用などの多数の欠点を有する(Inhibition of Matrix Metalloproteinases- Therapeutic Application(Greenwald, R.A. 、Zucker, S.、Golub, L.M. 編、Ann NY Acad Sci 878 (1999)) 。
【００１４】
この分野においてなされたさらなる開発により、例えば、ホスホンアミドインヒビター、ピペラジンインヒビター、スルホンアミドインヒビター、カルバメートインヒビター、ジアゼピンインヒビター、テトラサイクリンインヒビター、ならびに最後に述べるが決して軽んじられないヒドロキサメートインヒビターを得た(Skotnicki, J.S.ら：Design and synthetic considerations of matrix metalloproteinase inhibitors, 61-72 。Inhibition of Matrix Metalloproteinases - Therapeutic Application(Greenwald, R.A. 、Zucker, S.、Golub, L.M. 編) Ann NY Acad Sci 878 (1999)) 。ほとんどのこれらの開発されたインヒビターは、印象的なインビトロ阻害効果および特異性を有するが、それらは動物実験においておよびインビボで使用される場合ヒトにおいて、多くの重大な欠点を示した。ここでは、複数の細胞に対する細胞傷害性反応、乏しいバイオアベイラビリティーおよび所望でない副作用、特に移動装置上のネガティブな影響が、目立った。
【００１５】
したがって、これまでの入手可能な活性物質の欠点を持たない、非タンパク質新生構造を有する医薬の必要に迫られている。特に、MMP 阻害効果、十分な安定性および良好な被吸収性、より良好な薬物動態学的特性を有し、かつ上記全ての所望でない副作用および細胞傷害性反応が無い新規活性物質に対する要求がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって、本発明の目的は、MMP-阻害効果を示す非タンパク質新生構造の新規化学物質を発見することである。本発明のさらなる目的は、かかる化合物、および前記化合物を含む対応する医薬を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
この目的は、特許請求の範囲により達成される。
【発明の効果】
【００１８】
最初に製造された、ジメルカプトアルキル置換キナゾリン-2,4(1H, 3H)ジオンのクラスに属する一般式IaおよびIbの本発明の化合物は、驚くべき、著しい、かつしたがって薬理学的に興味深いMMP 阻害効果を示し、これは構造と効果との間の以前より公知の関係からは導き得ない。
【００１９】
本発明の化合物の効果は、一般式IaおよびIbに対応するこれらのインヒビターを異なるヒトMMP(MMP-2 、MMP-3 の組換え触媒ドメイン、MMP-8 、MMP-9 、MMP-14の組換え触媒ドメイン) を用いて試験することにより証明される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
一般式I の本発明のジメルカプタンは、一般式IIa 、IIb またはIIc
【００２１】
【化２】
2004520349.tif 000003
【００２２】
式中、
R1は、水素、メチル、トリフルオロメチル、メトキシ、ジメトキシ、Hal(Hal は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素である) 、カルボキシであり、
R2は、水素、メチルである
で表される、対応する、角を形成するように融合され(angular anellierten)、 部分的に水素添加されたチアゾロ[3,2-a] キナゾリノンまたは[1,3] チアジノ[3,2-a] キナゾリノンから、酸触媒または塩基触媒による加水分解により得られる。
【００２３】
一般式IIの三環式メルカプタンは、一般式III
【００２４】
【化３】
2004520349.tif 000004
【００２５】
式中、
R1は、水素、メチル、トリフルオロメチル、メトキシ、ジメトキシ、Hal(Hal は、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素である) 、カルボキシであり、
R2は、水素、メチルであり、
R3は、塩素、臭素、ヨウ素、トシルである
の対応する三環式ハロゲン前駆体を反応させ、続く不活性溶媒中での硫黄伝達剤、好ましくはチオ尿素との反応、および次の単離された中間体段階、好ましくはイソチウロニウム塩(Isothiuroniumsalze)の穏やかなけん化により得られる。
【００２６】
一般式III の前駆体は、文献において公知である(Leistner ら) 。
【実施例１】
【００２７】
1-(1',3'- ジメルカプト- プロプ-2'-イル) キナゾリン-2,4(1H,3H) ジオン
（一般式Ia、R1=R2=水素）の調製
a.)   (R,S)-1-メルカプトメチル-1,2- ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a] キナゾリン-5- オン
（一般式IIa 、R1=R2=水素）
10mmolの文献公知化合物(R,S)-1-ブロモメチル-1,2- ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-b] キナゾリン-5- オン（一般式IIIa、R1=R2=水素、R3= 臭素）を、30mlのモノメチルグリコールに添加し、反応が完了するまで約100 ℃の浴温度にてTLC および／またはHPLC制御下で12mmolのチオ尿素と共に加熱する。冷却中に結晶化が生じない場合、酢酸エステルを濁りが生じるまで添加し、次いで沈殿しているイソチウロニウム塩を分離する。後者を、10％（v/v ）エタノールの添加により、および50℃の浴温度にて窒素雰囲気下で1NのNaOH中で鹸化する。反応の過程をTLC またはHPLCクロマトグラフィーにより追跡する。反応が完了すると、氷冷を実施しながら氷酢酸で酸性化し、形成した沈殿物を吸引除去し、水で洗浄し、乾燥し、必要な場合、エタノールまたは酢酸エステル／ヘプタンから再結晶化する。
【００２８】
2004520349.tif 000005
【００２９】
b.) 1-(1',3'- ジメルカプト- プロプ-2'-イル) キナゾリン-2,4(1H,3H) ジオン
（一般式Ia、R1=R2=水素）
a.) に従って得た5mmol の1-メルカプトメチル-1,2- ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a] キナゾリン-5- オンを、0.6ml 濃硫酸、1.5ml 氷酢酸および66ml水から作製した酸混合物に添加し、沸騰させてクロマトグラフィー制御下でその完全な変換まで還流する。冷却（できる限り水で希釈する）後得た沈殿物を分離し、水で洗浄し、乾燥後再結晶化する。
【００３０】
2004520349.tif 000006
【実施例２】
【００３１】
(R,S)-1-(2',3'- ジメルカプト- プロプ-1'-イル) キナゾリン-2,4(1H,3H) ジオン
（式Ib、R1=R2=水素、n=1 ）
a.)   (R,S)-2-メルカプトメチル-1,2- ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a] キナゾリン-5- オン
（一般式IIb 、R1=R2=水素）
この化合物を、文献公知化合物(R,S)-2-ブロモメチル-1,2- ジヒドロ-5H-チアゾロ[3,2-a] キナゾリン-5- オン（一般式IIIb、R1=R2=水素、R3= 臭素）から実施例１、パートa)に類似して（イソチウロニウム塩合成のために溶媒としてメチルグリコール／i-プロパノール／DMF   １：１：２を用いる）得る。
【００３２】
2004520349.tif 000007
【００３３】
b)  (R,S)-1-(2',3'- ジメルカプト- プロプ-1'-イル) キナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン
（一般式Ib、R1=R2=水素、n=1 ）
この化合物を、(R,S)-2-メルカプトメチル-1,2- ジヒドロ-5- チアゾロ[3,2-a] キナゾリン-5- オンから酸性加水分解により実施例１、パートb)に類似して得た。
【００３４】
2004520349.tif 000008
【実施例３】
【００３５】
(R,S)-1-(3',4'- ジメルカプト- ブト-1'-イル) キナゾリン-2,4(1H,3H) ジオン
（一般式Ib、R1=R2=水素、n=2 ）
a.)   (R,S)-3-メルカプトメチル-2,3- ジヒドロ-1H,6H-[1,3]チアジノ[3,2-a] キナゾリン-6- オン
（一般式IIc 、R1=R2=水素）
この化合物を、文献公知化合物(R,S)-3-ブロモメチル-2,3- ジヒドロ-1H,6H-[1,3]- チアジノ[3,2-a] キナゾリン-6- オン（一般式IIIc、R1=R2=水素、R3= 臭素）から実施例２、パートa)に類似して（イソチウロニウム塩をi-プロパノールを用いて沈殿した）得る。
【００３６】
2004520349.tif 000009
【００３７】
b)  (R,S)-1-(3',4'- ジメルカプト- ブト-1'-イル) キナゾリン-2,4(1H,3H)-ジオン
（一般式Ib、R1=R2=水素、n=2 ）
この化合物を、(R,S)-3-メルカプトメチル-2,3- ジヒドロ-1H,6H-[1,3]チアジノ-[3,2-a]キナゾリン-6- オンから酸性加水分解により実施例１、パートb)に類似して得る。
【００３８】
2004520349.tif 000010
【００３９】
この物質のMMP 阻害効果を以下のように測定する：
【００４０】
マトリクスメタロプロテイナーゼ-2（MMP-2 ）の阻害
MMP-2 （ゼラチナーゼ）は、培養した皮膚線維芽細胞により培養培地へ多量に供給され、従って容易に入手可能である。分泌された不活性プロフォーム（Proform ）の酵素を、トリプシン活性化により、または有機水銀化合物での処理により酵素的に活性な形態へ変換し得る。
【００４１】
この目的のために、ヒト皮膚線維芽細胞を、確立された標準的方法に従って得、培養し、無細胞培養上清をトリプシンで処理する。次いで、トリプシンを特異的なインヒビター（TLCK）で不活化し、活性MMP-2 をゼラチンセファロースに対するアフィニティークロマトグラフィーおよびその後のセファロース上のゲル濾過により部分的に精製する。MMP-2 を商業的免疫アッセイの有効性により同定し、特徴付けした。
【００４２】
MT1-MMP およびMMP-3 の触媒ドメインのクローニングならびに発現
反応速度測定におけるMMP-8 の触媒ドメインの使用による充分な実験に基づいて、もう２つの組換え発現、すなわちヒト膜１型マトリクスメタロプロテイナーゼ（MT1-MMP ；MMP-14）の発現およびヒトMMP-3 （ストロメリシン（Stromelysin ）-1）の発現を同様に達成した。両酵素は、ヒトマトリクスメタロプロテイナーゼのサブグループの典型的な代表である。両タンパク質を、形質転換Escherichia coli細胞の封入体から安定に、かつ触媒活性形態で復元し得る。従って、組換えMMP-8 の場合、酵素のその後の活性化を終わらせ、反応速度測定の再現性を改善する。組換え酵素ドメインの純度は、少なくとも70％であった。
【００４３】
触媒ドメインのクローニングおよび発現は、以下の刊行物にそれ自体指向される：Lichte A. 、Kolkenbrock H.、Tschesche H.：The recombinant catalytic domain of membrane-type matrix metalloproteinase-1 (MT1-MMP) induces activation of progelatinase A and progelatinase A complexed with TIMP-2. FEBS Lett (1996)、397 、277-282 およびYe Q. 、Johnson LL、Hupe DJ 、Baragi V：Purification and characterization of the human stromelysin catalytic domain expressed in Escherichia coli 、Biochemistry (1992) 、31、11231-11235 。
【００４４】
触媒MMP-8 ドメインのクローニングおよび発現
触媒MMP-8 ドメインを、別の試験酵素として使用した。なぜならば、高い安定性を有し、また活性酵素として利用可能であり、従って活性化する必要がないためである。この活性化は、エラーの最もありがちな原因の一つとして考慮される。なぜならば、活性化に使用される水銀化合物がしばしば、試験系および／または酵素を妨げ、このように測定結果を偽り得るからである。クローニングストラテジーは、全酵素の代わりにその酵素的に活性な触媒ドメインのみがE.coliにクローニングされるという１つの事実に指向される。構築した触媒MMP-8 ドメインにより、安定で、酵素的に活性な、かつ非常に純度の高い酵素を、得た。この酵素は、合成インヒビターの阻害活性の慣用的な試験に充分適切であり、個々のシリーズの測定の測定結果は完全に類似していた。
【００４５】
組換え触媒MMP-8 ドメインのクローニングおよび発現を、SCHNIERER らにより与えられた情報（Schnierer S.,Kleine T.,Gote T.,Hillmemann A.,Knaeuper V.,Tschesche H. ：The recombinant catalytic domain of human neutrophil collagenase lacks type I collagen substrate specificity. Biochem Biophys Res Comm (1993), vol.191, No.2, 319-326 ）に従って実施した。
【００４６】
ヒトコラーゲナーゼMMP-9 の調製
天然のMMP-9 を、ヒト軟膜から再現性よく、かつ良好な収率および純度で得た。この目的のため、軟膜を、10％（v/v ）triton X-100を使用して0.4 ％の最終濃度にし、30分間氷上で振盪し、次いで１容量（vol.）二重結合緩衝液（40mM Tris-HCl 、pH7.5 、10mM CaCl2、1M NaCl 、0.2 ％（v/v ）triton X-100）を添加し、氷上での振盪をもう30分間継続する。
【００４７】
この溶液を、16,000rpm でSS-34 ローター上で4 ℃にて15分間遠心除去し、ガラスウールで濾過する。濾液を結合緩衝液と平衡なゼラチンアガロースと１回分にまとめ、１時間氷上で振盪する。
【００４８】
荷電したゼラチンアガロースをカラムに移動し、少なくとも10容量の結合緩衝液を使用して無タンパク質様式でリンスする。結合MMP-9 を２ゲル容量結合緩衝液および５％（v/v ）DMSOで溶出する。
【００４９】
緩衝液の交換および少量のMMP-2 混入の同時分離のため、溶出液を、ゲル濾過によりsephadex G-75 上で分離し得る。緩衝液Ｉ（20mM Tris-HCl 、pH7.5 、5mM CaCl2 、100mM NaCl、0.1 ％（v/v ）triton X-100）をこの目的のために使用する。
【００５０】
得られた溶出液は、３つの公知の立体配置：モノマー、ホモダイマー、ヘテロダイマーでMMP-9 を含んでいる。この酵素の純度は、約90％であり、異種タンパク質の残りは、フィブロネクチンおよび非常に少量のTIMPである。
【００５１】
潜在酵素を、1/100 容量トリプシン（10mg/ml ）を使用する37℃30〜60分間のインキュベーションにより活性化する。トリプシンを、1mM PMSFを添加することにより、または特異的インヒビター（TLCK）で阻害する。
【００５２】
マトリクスメタロプロテイナーゼについての量的蛍光アッセイ
蛍光基Mca を、それぞれのコラーゲナーゼを用いて合成基質Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2 の酵素切断により内部クエンチャーDpa から分離する。これは、測定バッチにおける蛍光の顕著な増加に付随する。増加を、蛍光計（λex 328nm、λem 393nm）を使用して定量し得、初期２、３分以内に直線的に進行する。マトリクスメタロプロテイナーゼに対する試験の特定の特異性は、一方で基質中のアミノ酸配列-Pro-Leu-Gly-Leu- 、他方で選択インキュベーション条件に従う。マトリクスメタロプロテイナーゼは、Gly-Leu 結合で基質を切断する。酵素およびインヒビターの予めインキュベートしたバッチのタンパク質分解の残りの活性を測定し、基質および酵素濃度は、一定に維持され、インヒビター濃度は変化している。異なる基質濃度を使用する３シリーズの測定を、各試験インヒビターについて行った。
【００５３】
アッセイ
1984μl 測定緩衝液（100mM Tris-HCl、pH7.5 、100mM NaCl、10mM CaCl2、0.05％brij35）
DMSOに溶解した２μl インヒビター、またはDMSO単独（非阻害アプローチ）
４μl 酵素（MMP-2 またはMMP-9 またはMMP-8 の触媒ドメイン）
−攪拌しながらの室温での酵素−インヒビター混合物の５分予備インキュベーション
−DMSOに溶解した10μl 基質での反応の開始
−２分間にわたる時間感受性蛍光増加の記録
【００５４】
2004520349.tif 000011
【国際公開パンフレット】
2004520349.tif 000013
2004520349.tif 000014
2004520349.tif 000015
2004520349.tif 000016
2004520349.tif 000017
2004520349.tif 000018
2004520349.tif 000019
2004520349.tif 000020
2004520349.tif 000021
2004520349.tif 000022
2004520349.tif 000023
2004520349.tif 000024
2004520349.tif 000025
2004520349.tif 000026
2004520349.tif 000027
2004520349.tif 000028
2004520349.tif 000029
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520349.tif 000030
【国際調査報告】
2004520349.tif 000031
2004520349.tif 000032
2004520349.tif 000033
2004520349.tif 000034