(57)【要約】植物栄養素および／またはクロロフィル含量および／または収穫物の収量を増加させる方法であって、トマトのｈｐ−１突然変異体の活性を模倣するように、生存植物を回収可能な植物細胞を、該植物の収穫物組織に特異的な組織特異的プロモーターの調節下にある、フィトクロムＡをコードする配列またはフィトクロムＡ経路と相互作用する部分をコードする配列を含んでなるＤＮＡ構築物で形質転換し、そしてその後、前記細胞から生存植物を生成することを含んでなる、前記方法。該方法を達成する多様な手段を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物栄養素（ｐｈｙｔｏｎｕｔｒｉｅｎｔ）および／またはクロロフィル含量および／または収穫物の収量を増加させる方法であって、トマト（ｔｏｍａｔｏ）のｈｐ−１突然変異体の活性を模倣するように、生存植物を回収可能な植物細胞を、該植物の収穫物組織に特異的な組織特異的プロモーターの調節下にある、フィトクロムＡをコードする配列またはフィトクロムＡ経路と相互作用する部分をコードする配列を含んでなるＤＮＡ構築物で形質転換し、そしてその後、前記細胞から生存植物を生成することを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
生存植物を回収可能な植物細胞を、該植物の収穫物組織に特異的な組織特異的プロモーターの調節下にある、（ｉ）フィトクロムＡをコードする配列、および／または（ｉｉ）フィトクロムＡシグナル伝達の陰性制御因子を下方制御可能な部分をコードする配列、または（ｉｉｉ）フィトクロムＡシグナル伝達の陽性制御因子を上方制御可能な部分をコードする配列、を含んでなるＤＮＡ構築物で形質転換し、そしてその後、前記細胞から生存植物を生成し、そして該植物から収穫物を回収することを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
生存植物を回収可能な植物細胞を、ＨＰ−１遺伝子を下方制御可能な部分をコードする配列を含んでなるＤＮＡ構築物で形質転換し、そしてその後、前記細胞から生存植物を生成し、そして該植物から収穫物を回収することを含んでなる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
収穫物のカロテノイド含量を増加させる、先行する請求項いずれか１項記載の方法。
【請求項５】
組織特異的プロモーターが果実特異的プロモーターである、先行する請求項いずれか１項記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡ構築物が、フィトクロムＡシグナル伝達の陰性制御因子を下方制御可能な部分をコードする、請求項２記載の方法。
【請求項７】
フィトクロムＡシグナル伝達の陰性制御因子がＳＰＡ１遺伝子にコードされる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡ構築物が、フィトクロムＡをコードする配列を含んでなる、請求項１または請求項２記載の方法。
【請求項９】
フィトクロムＡ遺伝子が制御解除される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
植物細胞がトマト細胞である、先行する請求項いずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
先行する請求項いずれか１項記載の方法によって得られる、トランスジェニック植物。
【請求項１２】
請求項１１記載の植物の種子または子孫。
【請求項１３】
植物の収穫物組織に特異的な収穫物組織特異的プロモーターと、前記収穫物組織特異的プロモーターの調節下にある、フィトクロムＡをコードする配列と、を含んでなる、ＤＮＡ構築物。
【請求項１４】
植物の収穫物組織に特異的な組織特異的プロモーターと、前記組織特異的プロモーターの調節下にある、フィトクロムＡシグナル伝達の陰性制御因子を下方制御する部分またはフィトクロムＡシグナル伝達の陽性制御因子を上方制御する部分いずれかと、をコードする配列を含んでなる、ＤＮＡ構築物。
【請求項１５】
植物の収穫物組織に特異的な組織特異的プロモーターと、前記組織特異的プロモーターの調節下にある、ＨＰ−１遺伝子を下方制御する部分をコードする配列と、を含んでなる、ＤＮＡ構築物。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか１項に定義されるようなＤＮＡ構築物を含む、植物形質転換ベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、野生型に比較した際、果実などの収穫物部分が高収率であり、そして該部分のカロテノイドレベルが上昇した組換え植物産生法と共に、その調製に用いるＤＮＡ構築物および細胞、並びにそれによって得られる新規植物に関する。
【０００２】
ビタミンＡなどの食餌性酸化防止剤は、健康的な食餌の構成要素において、重要な要素を形成する。ビタミンＡは、多くの食品に、そして特にトマト（ｔｏｍａｔｏ）のような果実およびニンジン（ｃａｒｒｏｔ）のような野菜など、特定の収穫物に見られるカロテノイドに由来する。野生型品種に見られるものを超えて上昇したカロテノイドレベルを有する収穫物品種を育てることが可能であれば、特に、食餌にこれらの要素が概して欠けている国々では、好適であろう。こうした品種は、いわゆる「機能性食品」または「栄養補助食品」を構成するであろう。
【０００３】
さらに、食物の色は、美的品質に、そしてしたがって製品の好ましさに影響を与える。例えば、レタス（ｌｅｔｔｕｃｅ）などの野菜は、緑であればより魅力的である。緑の呈色は、葉のクロロフィルに引き起こされ、そしてその結果、クロロフィルレベルを増加させると、こうした野菜の魅力は増進するであろう。
【０００４】
リコピンは、トマトに見られる赤いカロテノイドである。広範囲の疫学的証拠によって、食餌中のリコピンが、癌、特に前立腺癌のリスク減少に、そして心臓疾患のリスク減少に、関連することが示される。
【０００５】
トマトのいくつかの天然高色素株が知られる。これらにはｈｐ−１およびｈｐ−２突然変異体が含まれ、これらはどちらも、野生型に比較して、果実中に高レベルのカロテノイドを有する。
【０００６】
さらに、育種による、トマト品種へのｈｐ対立遺伝子の取り込みは、脆弱な茎、厚い葉、矮性（ｄｗａｒｆｉｓｍ）および低稔性などの、いくつかの望ましくない非果実表現型と関連するため、それ自体、有用な商業的提案ではない。このため、今日まで、ｈｐ対立遺伝子は育種プログラムに取り込まれてこなかった。
【０００７】
高色素−１突然変異体（ｈｐ−１）は、Ｊ．Ｌ．  Ｐｅｔｅｒｓら，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９８）１１７：７９７−８０７に記載される。該変異体は、光に制御される３つの遺伝子、クロロフィルａ／ｂ−結合タンパク質（ＣＡＢ）、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニットおよびカルコン・シンターゼ（ＣＨＳ）がこの株で上方制御されることが見出されている。ＨＰ−１タンパク質は、フィトクロムシグナル伝達において、一般的に抑制的な役割を果たす可能性があるとの仮説が立てられている。
【０００８】
さらに、トマトにおけるｈｐ１突然変異は、胚軸において、プラスチドＤＮＡ増加を生じることが知られる（Ｙｅｎら，  １９９７，  Ｔｈｅｏｒ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．）。しかし、細胞容積および細胞あたりのプラスチド総容積間の比は固定されていることが、一般的に認められる（Ｐｙｋｅ，  １９９９，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １１：５４９−５６を参照されたい）。
【０００９】
トマトＨＰ１遺伝子は、フィトクロムＡシグナル伝達に特異的な陰性制御因子をコードすることが示されてきている（Ｐｅｔｅｒｓら，  １９９２，  Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．；Ｇｉｏｖａｎｎｏｎｉら，  １９９８，  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｃｒｏｐｓを参照されたい）。しかし、ＨＰ−１遺伝子自体は、単離されてきていない。
【００１０】
ＥＰ−Ａ−０３５４６８７は、日陰耐性増加および濃い緑色などの、いくつかの望ましい形質を生じる、トランスジェニック植物におけるフィトクロムの過剰発現を記載する。
トマトにおけるフィトクロム、および特にオーツムギ（ｏａｔ）（アベナ（Ａｖｅｎａ））フィトクロムの過剰発現は、ｈｐトマト突然変異体のものと非常によく似た視覚的な植物表現型を生じると記載されている（すなわち矮性、濃い緑の葉および果実、短い胚軸、並びにアントシアニンレベル増加（Ｍ．Ｔ．  Ｂｏｙｌａｎら  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  １，  ７６５−７７３，（１９８９）））。
【００１１】
出願人らは、これらのトランスジェニックトマトのカロテノイド含量が、野生型より有意により高いことをさらに見出した。さらに、これらの植物の葉に見られる細胞サイズがより大きいことを見出した。これは、これらの植物がより高い収量を生じる可能性を生み出す。
【００１２】
本発明にしたがって、植物栄養素（ｐｈｙｔｏｎｕｔｒｉｅｎｔ）および／またはクロロフィル含量および／または収穫物の収量を増加させる方法であって、トマトのｈｐ−１突然変異体の活性を模倣する（mimic）ように、生存植物を回収可能な植物細胞を、該植物の収穫物組織に特異的な組織特異的プロモーターの調節下にある、フィトクロムＡをコードする配列またはフィトクロムＡ経路と相互作用する部分をコードする配列を含んでなるＤＮＡ構築物で形質転換し、そしてその後、前記細胞から生存植物を生成することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００１３】
用語「収穫物組織」は、本明細書において、食品または餌、または繊維（綿（ｃｏｔｔｏｎ）繊維など）として使用するのに意図される、植物の部分を指す。収穫物は、園芸または畑作物であることが可能である。したがって、トマトにおいて、収穫物組織は果実であろうし、そして使用する組織特異的プロモーターは、果実特異的プロモーターであろう。他の収穫物において、これは、葉組織（例えばレタス、キャベツ（ｃａｂｂａｇｅ）およびホウレンソウ（ｓｐｉｎａｃｈ））、または種子組織（例えばトウモロコシ（ｍａｉｚｅ）またはコムギ（ｗｈｅａｔ）などの穀物において）または根組織（ニンジンおよびジャガイモ（ｐｏｔａｔｏ）などの野菜において）であることが可能であり、そしてプロモーターはそれにしたがって選択する。
【００１４】
本発明の方法を使用した結果、増加させることが可能な植物栄養素には、カロテノイド、アントシアニン、またはビタミンが含まれ、そして特にカロテノイドが含まれる。これらの含量を増加させることによって、栄養的な価値が増進するだろうし、そしてまた、収穫物の美的品質も改善可能である。クロロフィル含量の増加もまた、後者の規準を満たすことが可能である。
【００１５】
本発明にしたがって修飾した(modified)収穫物は、硬さの増加を示すことが可能である。
出願人らは、ｈｐ１遺伝子が細胞容積および細胞あたりのプラスチド総容積間の比を改変し、そしてそれによって、野生型（ＷＴ）よりも高いカロテノイドレベルを含有する果実を産生する、唯一の遺伝子であることを発見した。プラスチド面積／細胞の増加は、プラスチド中に集積する成分の量を増加させると期待されるであろう。これらには、カロテノイド、ビタミンＥなどの栄養価が高い化合物が含まれ、そしてしたがって、植物の栄養的価値が改善されるであろう。実際、ｈｐ−１突然変異体自体、カロテノイドレベルの２倍の増加を示す。
【００１６】
適切には、ｈｐ−１表現型を模倣するため、フィトクロムＡ発現を増加させ、そして／またはフィトクロムＡ伝達経路における１以上のシグナル分子の活性に影響を与えて、フィトクロムＡまたはそのシグナル伝達経路の活性を増加させる。特に、フィトクロムＡシグナル伝達の陰性制御因子として作用するシグナル伝達分子の活性を下方制御する。
【００１７】
したがって、本発明にしたがって、植物栄養素および／またはクロロフィル含量および／または収穫物の収量を増加させる方法であって、生存植物を回収可能な植物細胞を、該植物の収穫物組織に特異的な組織特異的プロモーターの調節下にある、（ｉ）フィトクロムＡをコードする配列、および／または（ｉｉ）フィトクロムＡシグナル伝達の陰性制御因子を下方制御可能な部分をコードする配列、または（ｉｉｉ）フィトクロムＡシグナル伝達の陽性制御因子を上方制御可能な部分をコードする配列、を含んでなるＤＮＡ構築物で形質転換し、そしてその後、前記細胞から生存植物を生成し、そして該植物から収穫物を回収することを含んでなる、前記方法を提供する。
【００１８】
さらなる態様において、慣用的な方法を用いて、例えばＨＰ１遺伝子の完全または部分的欠失あるいは挿入突然変異を含む突然変異と共に、センスまたはアンチセンスＲＮＡ構築物またはオリゴヌクレオチドの発現によって、ＨＰ１遺伝子自体を下方制御する。ＨＰ１遺伝子の同定は、通常の方法を用いて実行可能である。
【００１９】
本発明の方法を用いて、形質転換植物の収穫物は、トマトのｈｐ−１突然変異体の有益な特性を模倣するであろうが、表現型の問題は回避されるであろう。特に、収穫物組織特異的プロモーターを用いることによって、ｈｐ−１表現型は、果実、葉または根などの植物の収穫物部分でのみ発現され、そして矮性、並びに他の茎および葉奇形に関連する問題は回避される。さらに、こうした植物は、正常な稔性を有すると期待されるであろう。
【００２０】
トマトの高色素−１突然変異体における葉緑体および有色体発生の解析によって、葉肉および果皮細胞両方で、プラスチド区画サイズの増加が明らかになっている。これは、ｈｐ−１突然変異体の色素レベルの増加（以下の表１）が、少なくとも部分的に、細胞あたりのプラスチド区画サイズが増加し、こうしてカロテノイドおよびクロロフィル合成および沈着のため、より広い区画を提供した結果であることを強く示唆する。
【００２１】
細胞サイズまたはプラスチド数が増加した結果として、本発明の方法を用いて形質転換された植物は、野生型品種より、高い収量を有するであろう。しかし、プラスチド区画サイズの増加は、ｈｐ−１果実におけるカロテノイドの１．８倍の増加ほど多くない（表１）。その結果、ｈｐ−１は、より大きい有色体では、比例的により多くの色素を含有する。対照的に、ｈｐ−２突然変異体では、プラスチド区画容積変化はまったく観察されていない。
【００２２】
別の寄与要因は、完熟果実プラスチドにおけるフィトエン・シンターゼ活性の増加である。先の研究によって、カロテノイド経路の最初のものであるこの酵素が、リコピン合成の開始時、ブレーカー（ｂｒｅａｋｅｒ）果実で劇的に増加することが示された（Ｆｒａｓｅｒら，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９９４）１０５：４０５−４１３）。これは、この酵素がカロテノイド生成の律速段階であるという示唆を導く。したがって、ｈｐ−１で示される増加は、すべての不飽和カロテノイドへの流れを促進する。カロテノイドのプロフィールは、ｈｐ−１および野生型で同じである（表２）ため、すべてのカロテノイドに対する一般的な効果が、この突然変異体で生じる。
【００２３】
Ｐｓｙ−１およびＰｄｓの相対発現は、野生型と比較して、ｈｐ−１の果実で改変されていないため、フィトエン・シンターゼ酵素活性の増加は、おそらく、ｈｐ−１においてｍＲＮＡの利用が改善されるためである。これは、植物における増進したフィトクロム反応に特徴的な多面的な影響の１つである（Ｈａｒｔ，  １９８８  Ｌｉｇｈｔ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｒｏｗｔｈ，  Ｕｎｗｉｎ  Ｈｙｍａｎ，  ロンドン）。
【００２４】
ｈｐ−１突然変異体の胚軸において、プラストーム：ゲノムＤＮＡの比が５倍増加するという報告から、ＨＰ−１が、光に反応して、プラスチドＤＮＡコピー数を制御するという仮説が導かれた（Ｙｅｎら、１９９７、上記）。この増加した比の要素は、本研究の出願人が観察したように、ｈｐ−１におけるプラスチド区画サイズの増加を介して、明示される可能性がある。光形態形成突然変異体で起こる胚軸細胞の核内倍加プロフィールの変化（Ｇｅｎｄｒｅａｕら，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．（１９９８）１３：２２１−２３０）は、実験的に測定するＤＮＡ比に、有意な影響を有するようである。
【００２５】
ｈｐ−１葉の葉色素沈着が増加しており、これが、柵状葉肉細胞のより大きい周縁拡張から生じる葉の厚みの増加、並びに柵状および海綿状葉肉細胞両方におけるプラスチドカバーの増加、両方によるようであることが見出されている。葉の厚みの増加は、先に報告されている、ｈｐ−１葉の特定の葉の重量増加を生じるであろう（Ｓａｎｄｅｒｓら，  Ｈｏｒｔ．  Ｓｃｉ．（１９７５）１０：２６２−２６４）。ｈｐ−１葉における柵状細胞伸長増加は、光強度に対する古典的な光形態形成反応であり、しばしば、日向または日陰で（Ｌｉｃｈｔｅｎｔｈａｌｅｒ（１９８５）ＮＲ  Ｂａｋｅｒら監修，  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｌｅａｆ  Ｇｒｏｗｔｈ中，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ２０１−２０２）、あるいは異なる光強度下で（ＰｙｋｅおよびＬｏｐｅｚ−Ｊｕｅｚ，  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）１８：５２７−５４６）成長させた葉に明示される。
【００２６】
さらに、柵状葉肉下細胞もまた、こうした状況下で周縁伸長を示すことが可能であり、そしてこの表現型は、研究したｈｐ−１葉の葉部分でもときに観察された。ｈｐ−１と同様の葉表現型が、トマト（ＢｏｙｌａｎおよびＱｕａｉｌ、１９８９、上記）およびジャガイモ（Ｔｈｉｅｌｅら，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９９）１０２：７３−８２）においてｐｈｙＡを過剰発現した際に観察される。ここで特徴付けられるｈｐ−１葉表現型は、ＨＰ−１がフィトクロム仲介シグナル伝達経路の抑制要素として作用するのと一致し、そして該経路において、ｈｐ−１は、非常に多面的な表現型で、増幅された光形態形成反応を生じる（Ｐｅｔｅｒｓら、１９９８、上記）。
【００２７】
ｈｐ−１細胞において、プラスチド数と共にプラスチドサイズの増加が観察されることは新規であり、そして細胞において、プラスチド区画サイズの度合いが増加する可能性を立証する。特に、果皮細胞は、ｈｐ−１においてさえ、プラスチドカバーの比率が比較的低いが、これを非常に増加させるかなりの可能性がある。データによって、トマト果実発生中のプラスチド分裂の大部分は、果実が緑から赤に変化するブレーカー期前の緑期に生じることが示唆される。したがって、プラスチド分裂の大部分は、葉緑体分裂として生じ、そして有色体分裂として生じない。
【００２８】
しかし、ｈｐ−１がプラスチド数およびサイズを増加させる機構は、あまり明らかでない。光形態形成シグナル伝達をプラスチド区画サイズの細胞調節と結びつける研究はほとんどない。こうしたシグナル伝達系いずれにおいても、ありうる中間体は、サイトカイニンである可能性がある。野生型シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）に外因性サイトカイニンを添加すると、暗所において、光形態形成ｄｅｔ突然変異体表現型を表現型模写することが可能であり（Ｃｈｏｒｙら  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９４）１０４：３３９−３４７）、そしてサイトカイニンは、葉緑体発生（ＨｕｆｆおよびＲｏｓｓ，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９７５）５６：４２９−４３３）および苔における葉緑体分裂（Ｋａｓｔｅｎら、１９９７）を含む、多くの光形態形成反応を促進するため、サイトカイニンは、光形態形成シグナル伝達、並びにプラスチド分裂および拡張の間をつなぐものである可能性がある。これは、光中、ｈｐ−１突然変異体が外因性サイトカイニンに高感受性であるという最近の証拠に支持された（Ｍｕｓｔｉｌｌｉら  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９９９）１１：１４５−１５７）。こうした光誘導プラスチド分裂いずれかの下流標的の中に、分裂中のプラスチドの収縮機構において機能する、ＦｔｓＺ遺伝子があるであろう（Ｏｓｔｅｒｙｏｕｎｇら  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：４７５−４７９）。しかし、ＦｔｓＺ遺伝子機能の単純な撹乱(perturbation)は、葉細胞において肥大したプラスチドをいくつか生じる可能性がある（Ｏｓｔｅｒｙｏｕｎｇら、１９９８、上記）が、総プラスチド区画サイズは維持される。ｈｐ−１細胞では、プラスチド数密度およびプラスチドサイズ両方が増加するため、これらの２つの過程を制御するシグナルは、重複する要素を有する可能性がある。ｈｐ−１細胞におけるプラスチド分裂およびプラスチド拡張調節の終点の変化によって、プラスチド分裂および拡張、並びにその協調を調節するシグナル伝達経路をよりよく理解すると、細胞におけるプラスチド区画サイズの操作が実現可能なはずであることが示唆される。
【００２９】
適切には、植物が安定に形質転換され、特質が子孫において維持されるように、形質転換を達成する。
本発明の方法を用いて得た植物、並びにそれらの子孫および種子は、本発明のさらなる側面を形成する。
【００３０】
適切な組織特異的プロモーターには、トマト果実特異的Ｅ８、ポリガラクツロナーゼ、インベルターゼ、ＡＣＣ酸化酵素、フィブリリン、イネ（ｒｉｃｅ）内胚葉、グルテリン、コムギ（ｗｈｅａｔ）内胚葉、およびＲＵＢＩＳＣＯ  ｃａｂ遺伝子のプロモーターが含まれる。
【００３１】
トマト果実プロモーターの例は、Ｅ８、トマト・ポリガラクツロナーゼ、トマト・インベルターゼ、リコペルシコン・ピンピネリフォリウム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｐｉｍｐｉｎｅｌｌｉｆｏｌｌｉｕｍ）・インベルターゼ、トマトＡＣＣ酸化酵素、およびコショウ（ｐｅｐｐｅｒ）・フィブリリンプロモーターがある。穀類穀物プロモーターの例は、イネ・グルテリンプロモーター、コムギＨＭＷグルテニンプロモーター、トウモロコシＥＳＲ（Ｂｏｎｅｌｌｏら、２０００）およびＢｅｔｌ  １プロモーター（Ｈｕｅｒｏｓら、１９９９）、オオムギ（ｂａｒｌｅｙ）由来のＥＮＤ１プロモーター（Ｄｏａｎら、１９９６）、コムギ高分子グルテニン（ＲＥＦ必要）、イネＰＣＮＡ（増殖中の細胞、すなわち内胚葉および分裂組織で発現される）およびｂｌｚ２（転写因子）がある。穀類葉プロモーターの例は、トウモロコシＭＳ８−１５、トウモロコシ・クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（Ｃａｂ）（Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９８９）、イネＲＴＢＶプロモーターおよびトウモロコシ・ホスホエノールピルビン酸プロモーターである。
【００３２】
他の収穫物組織特異的プロモーターは、慣用的な方法によって得ることが可能である。例えば、他の植物組織と比較するような、望ましい収穫物組織由来のＤＮＡライブラリーのディファレンシャルスクリーニングを用いて、収穫物組織においてのみ発現される遺伝子が同定可能である。こうした方法は、例えば国際特許公告第９７／３５９８３号に、発芽特異的プロモーターの単離に関して例示される。
【００３３】
概略として、標的収穫物組織由来のＲＮＡに対する逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、ある範囲の部分的クローンを増幅する。収穫物組織におけるクローンの発現の予備的評価は、ノーザンブロッティングによって行うことが可能である。選択したクローンに対するより詳細なノーザンブロット実験を行い、例えば発現の時間経過を評価することが可能である。その後、これらのクローンの高発現を示す組織から、ｃＤＮＡライブラリーを構築し、その後、ゲノムライブラリーをスクリーニングして、プロモーター領域をサブクローニングする。クローニングしたプロモーターの空間的および時間的制御の最終評価は、プロモーター断片をβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）レポーター遺伝子などのレポーター遺伝子と転写融合させ、そしてタバコ（ｔｏｂａｃｃｏ）などの試験植物に形質転換することによって、行うことが可能である。
【００３４】
本発明の１つの態様において、組織特異的プロモーターは、フィトクロムＡの発現を調節する。この方式で、植物に、少なくとも１つのさらなるコード配列コピーを導入することによって、フィトクロムＡが、植物の果実などの収穫物部分で過剰発現されることが確実になるであろう。
【００３５】
適切には、使用するフィトクロムＡ遺伝子は、形質転換する植物の天然フィトクロムＡ配列である。しかし、異なる種由来の同様の機能を持つタンパク質をコードする（そしてある程度の構造的相同性を有し、そしてしたがって相同である可能性がある）異種遺伝子の場合は、これは必ずしもあてはまらず、同様の活性をもつシャッフル遺伝子、キメラ遺伝子、合成遺伝子が使用可能である。異種遺伝子を用いることが好ましい可能性があり、特に、遺伝子、またはＲＮＡまたはタンパク質が、相同遺伝子のものと異なって制御される場合は特にそうである。例えば、単子葉遺伝子は、双子葉植物において、適切に使用可能であり、そしてその逆も可能である。さらに、異種遺伝子の使用は、内部制御（ｅｎｄｏ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）および／または遺伝子サイレンシングに関連する問題を減少させることが可能である。
【００３６】
本発明の方法に使用するためのフィトクロムＡ遺伝子の特定の例は、Ｂｏｙｌａｎら（１９８９）（上記）に記載されるようなオーツムギ・フィトクロムＡまたはその相同体などの単子葉植物由来のフィトクロムＡである。
【００３７】
別の態様において、植物細胞を形質転換するのに使用する構築物は、フィトクロムＡシグナル伝達の陰性制御因子を下方制御可能な部分をコードする配列を含んでなる。適切には、フィトクロムＡシグナル伝達の陰性制御因子はＳＰＡ１またはＨＰ１遺伝子である。
【００３８】
ＳＰＡ１遺伝子、およびフィトクロムＡ活性に特異的な陰性制御因子としてのその機能は、シロイヌナズナで同定されてきている（Ｈｏｅｃｋｅｒら，  １９９８，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  １０：１９−３３）。同様の機能を持つタンパク質をコードする相同遺伝子は、したがって、慣用法を用いて、他の植物種において、同定可能である。特に、既知のシロイヌナズナ配列（Ｈｏｅｃｋｅｒら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８４  ４９６−４９９）に基づく配列をプローブとして使用して、他の植物種のＤＮＡライブラリーにおいて、同様の配列を同定することが可能である。
【００３９】
この方法でひとたび同定されたら、遺伝子の下方制御を生じるであろう適切な構築物が産生可能である。
下方制御は、多様な方式で、例えばセンス、アンチセンスもしくは部分的センス技術、または組換え酵素を用いて、ＤＮＡレベルで、あるいは阻害ペプチドまたはタンパク質の発現によって、タンパク質レベルで、達成することが可能である。
【００４０】
アンチセンス技術は、「アンチセンス」ＲＮＡの生成を含んでなるであろうし、そして「部分的センス」技術は、機能する遺伝子産物を少なくとも一部コードする「センス」ＲＮＡの生成を必要とする。
【００４１】
「アンチセンスＲＮＡ」は、対応するｍＲＮＡの塩基配列に相補的なＲＮＡ配列であり：アンチセンス配列（３’から５’方向に読む）の各塩基（または塩基の大部分）が、５’から３’方向に読むｍＲＮＡ配列の対応する塩基と対形成可能である（ＧとＣ、ＡとＵ）という意味で、相補的である。こうしたアンチセンスＲＮＡは、転写物（その配列の少なくとも一部が、相当する遺伝子（またはそれと実質的な相同性を示すＤＮＡ配列）のコード鎖の少なくとも一部と相補的であるような転写物）を生成するよう配置された、適切なＤＮＡ構築物で形質転換することによって、細胞において産生可能である。
【００４２】
「センスＲＮＡ」は、対応するｍＲＮＡ配列の少なくとも一部に実質的に相同なＲＮＡ配列である。こうしたセンスＲＮＡ、または部分的センスＲＮＡは、相当する遺伝子（またはそれと実質的な相同性を示すＤＮＡ配列）のコード鎖の少なくとも一部と同一の配列を持つ転写物を生成するように、正常な方向で配置された、適切なＤＮＡ構築物で形質転換することによって、細胞において産生可能である。適切なセンス、または部分的センス構築物を用いて、遺伝子発現を阻害することが可能である（国際特許公告ＷＯ９１／０８２９９に記載されるとおり）。
【００４３】
ＤＮＡレベルで、標的遺伝子（すなわちフィトクロムＡシグナル伝達の陰性制御因子をコードする遺伝子）に対応するｍＲＮＡに相補的な、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドいずれかを生成可能である。これらのオリゴヌクレオチドが、収穫物組織特異的プロモーターの調節下で、形質転換植物の収穫物部分において産生される場合、これらは、フィトクロムＡシグナル伝達の陰性制御因子に対応するいかなるｍＲＮＡにも結合し、こうしてｍＲＮＡがタンパク質に翻訳されるのを妨げるであろう。
【００４４】
あるいは、組換え酵素を使用して、フィトクロムＡシグナル伝達の陰性制御因子をコードする遺伝子を、少なくともいくつか、そして好ましくはすべて、欠失させることが可能である。しかしこの場合、組換え酵素の認識部位が標的遺伝子に隣接するように、植物のゲノムに、こうした部位を操作して入れることもまた、必要である可能性がある。その後、組換え酵素を、本発明の方法において、収穫物組織特異的プロモーターの調節下に置く。収穫物特異的プロモーターが活性になると、組換え酵素が産生され、これが植物ゲノムに存在する認識部位と相互作用して、その間の物質を切除する。これは、フィトクロムＡシグナル伝達の陰性制御因子をコードする遺伝子を、少なくともいくつか、そして好ましくはすべて含むであろうし、それによって該因子は収穫物組織において、不活性化される。
【００４５】
適切な組換え酵素系は、当該技術分野に公知であり、そしてＣｒｅ−Ｌｏｘ系（ＵＳＰ  ４，９５９，３１７）、ＦＬＰ系（Ｌｙｚｎｉｋら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９３，  Ｖｏｌ．  ２１，  ４，  ９６９−９７５）、ＳＲ１系（Ｏｎｏｕｃｈｉら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９１，  １９，  ２３，  ６３７３−６３７８）およびＧｉｎ系（Ｍａｅｓｅｒら，  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １９９１，  ２３０：１７０−１７６）を含む。
【００４６】
さらなる態様において、下方制御は、例えばフィトクロムＡ経路ともはや相互作用不能であるようにフィトクロムＡシグナル伝達自体の陰性制御因子に結合することによって、該タンパク質を阻害する、ペプチドまたはタンパク質の発現によって達成可能である。
【００４７】
こうしたペプチドは、日常的なアッセイ法を用いて同定可能である。フィトクロムＡシグナル伝達の陰性制御因子をコードする遺伝子がひとたび同定されたら、タンパク質は産生または単離可能である。その後、前記タンパク質に結合するペプチドは、慣用的な結合アッセイを用いて同定可能であり、または該ペプチドをコードする遺伝子は、酵母２ハイブリッド系によって同定可能である。タンパク質／ペプチド複合体が、フィトクロムＡ経路でなお活性であるかどうか決定する試験が使用可能である。一般的に、これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで達成可能であろう。例えば、複合体を植物細胞にマイクロインジェクションし、そして可能であればレポーター遺伝子を用いて、効果を測定することが可能である。あるいは、ペプチドをコードする配列で細胞を形質転換して、そして形質転換細胞の活性／表現型を決定可能である。
【００４８】
あるいは、ペプチドは、フィトクロムＡシグナル伝達の陰性制御因子の小断片を含んでなることが可能である。適切な断片は、経路において、レセプター・タンパク質に結合し、それによってフィトクロムＡシグナル伝達自体の陰性制御因子の結合を妨げるものである。しかし、該断片は不活性であり、そしてこうして陰性制御因子の活性を遮断する。
【００４９】
さらなる別の態様において、植物細胞を形質転換するのに用いる構築物は、特に、制御因子がフィトクロムＡ経路の律速段階を構成する場合、フィトクロムＡシグナル伝達の陽性制御因子を上方制御可能な部分をコードする配列を含んでなる。陽性制御因子の例には、ＰＨＹ１およびＰＨＹ３が含まれる。
【００５０】
上方制御は、同様の機能を有する制御因子またはタンパク質をコードする遺伝子、例えば異種遺伝子、キメラまたは合成遺伝子で植物を形質転換するか、あるいはフィトクロムＡ自体の上方制御に関連して、上に概略するような他の戦略いずれかを用いることによって、達成可能である。
【００５１】
本発明のさらなる態様において、植物細胞を形質転換するのに用いる構築物は、ＨＰ−１遺伝子を下方制御可能な部分をコードする配列を含んでなる。この遺伝子の下方制御は、陰性制御因子の下方制御に関連して上に概略するものなどの慣用法を用いて、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルで達成可能である。
【００５２】
本明細書において、用語「相同体」または「相同遺伝子」は、対立遺伝子変異体を含む変異体、および問題の遺伝子にある程度の構造類似性を有し、そして同様の機能を持つタンパク質をコードするが、他の植物種由来である遺伝子を含む。適切には、基本遺伝子および相同体間の構造的類似性のレベルは、少なくとも５０％、例えば少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％である。
【００５３】
一般的に言って、相同体または相同遺伝子は、既知の相同性プログラム、例えば以下に例示するもののいずれかを用いた配列データ比較によって、またはハイブリダイゼーション実験を行うことによって、同定可能である。
【００５４】
ハイブリダイゼーション実験は、基本ＤＮＡにハイブリダイズする遺伝子またはＤＮＡを同定するであろう。好ましくは、こうしたハイブリダイゼーションは、低および高ストリンジェンシー条件で、またはその間で起こる。一般的な用語において、低ストリンジェンシー条件は、ほぼ周囲温度から約６５℃での３ｘＳＳＣと定義可能であり、そして高ストリンジェンシー条件は、約６５℃での０．１ｘＳＳＣと定義可能である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸三ナトリウムの緩衝液の名称である。３ｘＳＳＣは、ＳＳＣの３倍強く、そして以下同様である。
【００５５】
用語「変異体」は、由来する基本配列とは配列内の１以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている点で異なるが同様の生物学的活性を保持するアミノ酸配列、をコードするＤＮＡ配列を含む。アミノ酸置換は、アミノ酸が、概して類似の特性を持つ、異なるアミノ酸で交換されている場合、「保存的」と見なすことが可能である。非保存的置換は、アミノ酸が異なる種類のアミノ酸で交換される場合である。概して、ポリペプチドの生物学的活性を改変することなしには、非保存的置換はほとんど不可能であろう。適切には、変異体は、基本配列に、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、そしてより好ましくは少なくとも９０％の類似性レベルを有するであろう。
【００５６】
本明細書において、用語「類似性レベル」は、並列した際、同様の位または領域に類似（同一または保存的交換）アミノ酸を有する配列を指すよう用いられ、ここで、同一または保存的交換アミノ酸は、出発タンパク質に比較した際、タンパク質の活性または機能を改変しないものである。例えば、互いに少なくとも８５％の類似性を持つ、２つのアミノ酸配列は、ギャップに関して、総数１５以上のアミノ酸残基が影響を受けないことを条件に、３ギャップまでを許容して最適に並列した際、同様の位に、少なくとも８５％の類似（同一または保存的交換）アミノ酸残基を有する。類似性の度合いは、当該技術分野に公知の方法を用いて決定可能である（例えば、Ｗｉｌｂｕｒ，  Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．  “核酸およびタンパク質データバンクの迅速類似性検索。”  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８０，  ７２６−７３０（１９８３）並びにＭｙｅｒｓ  Ｅ．およびＭｉｌｌｅｒ  Ｗ．  “直鎖空間における最適並列。”  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  ４：１１−１７（１９８８）を参照されたい）。類似性の度合いを決定するのに使用可能な１つのプログラムは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ系の一部として、ＤＮＡｓｔａｒ  Ｉｎｃ，  １２２８，  Ｓｅｌｆｐａｒｋ  Ｓｔｒｅｅｔ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，  ５３７１５，  ＵＳＡから得ることが可能な、ＭｅｇＡｌｉｇｎ  Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ一対（ｏｎｅ  ｐａｉｒ）法（デフォルトパラメーターを用いる）である。
【００５７】
本発明の方法を用いて形質転換可能な特定の植物には、トマトおよびバナナなどの果実産生植物、イネ、コムギおよびトウモロコシなどの穀物、レタス、キャベツおよびホウレンソウなどの葉に基づく野菜、並びにニンジンおよびジャガイモなどの根菜が含まれる。使用する組織特異的プロモーターは、上に概略するように、形質転換する植物に好適に選択されるであろう。
【００５８】
植物細胞の形質転換は、慣用法いずれを用いても達成可能である。形質転換する特定の植物種に応じて、特に、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）形質転換、照射（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、またはウィスカーを介するなどの方法が使用可能である。
【００５９】
さらなる側面において、本発明は本発明の方法で使用するためのＤＮＡ構築物を含んでなる。したがって、１つの態様において、本発明は、植物の収穫物組織に特異的な組織特異的プロモーター、および前記組織特異的プロモーターの調節下にある、フィトクロムＡをコードする配列を含んでなる、ＤＮＡ構築物を提供する。
【００６０】
別の態様において、本発明は、植物の収穫物組織に特異的な組織特異的プロモーター、および前記組織特異的プロモーターの調節下にある、フィトクロムＡシグナル伝達の陰性制御因子を下方制御する部分、またはフィトクロムＡシグナル伝達の陽性制御因子を上方制御する部分をコードする配列を含んでなる、ＤＮＡ構築物を提供する。適切な部分は、本発明の方法に関連して上述するものである。
【００６１】
本発明のさらなる側面は、上に定義するようなＤＮＡ構築物を含む、植物形質転換ベクターを含んでなる。
本発明はここで、付随する図表に関連して、例として詳細に記載されるであろう。
【００６２】
本発明はここで、以下の実施例において、例として記載されるであろう。以下の実施例において、トマトの形質転換に使用する構築物の構成要素として用いたポリヌクレオチドは、二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、フィブリリンプロモーター、トマト・インベルターゼプロモーターおよびオーツムギのフィトクロムＡ遺伝子のコード領域である。ポリアデニル化シグナルを含む終結領域は、広く用いられる、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のノパリンシンターゼ遺伝子の３’非翻訳領域であった。これらの要素の配列は、本明細書に援用する、以下の参考文献に見出すことが可能である。
【００６３】
二重ＣａＭＶ３５Ｓ（ｄ３５Ｓ）プロモーター：米国特許第５，１６４，３１６号および第５，３２２，９３８号：ＧＥＮＳＥＱＮ寄託番号ＡＡＱ３１６０９、ＡＡＱ８１７５５およびＡＡＱ８１７５６。Ｋａｙら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８７）ｖｏｌ．２３６，  １２９９−１３０２ページもまた参照されたい。
【００６４】
フィブリリンプロモーター：国際特許出願第ＷＯ９９／１６８７９、ＧＥＮＥＳＥＱＮ寄託番号ＡＡＸ３４３６７。
トマト・インベルターゼプロモーター：Ｅｌｌｉｏｔら，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２１：５１５−５２４（１９９３）；ＥＭＢＬ寄託番号Ｚ１２０２５、Ｚ１２０２６、Ｚ１２０２７およびＺ１２０２８。
【００６５】
フィトクロムＡ遺伝子：Ｂｏｙｌａｎ  ＆  Ｑｕａｉｌ，  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，（１９８９）７６５−７７７；Ｈｅｒｓｈｅｙら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １３５，  ８５４３−８５５９（１９８５）。
【００６６】
（実施例１）
トマトのｈｐ−１突然変異体の研究
トマト（リコペルシコン・エスキュレンツムｃｖアイルサ・クレイグ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  ｃｖ  Ａｉｌｓａ  Ｃｒａｉｇ））およびｈｐ−１突然変異に関してホモ接合体である同質遺伝子系統の種子は、４：１バーミキュライト／粒状粘土（ｇｒａｎｕｌａｒ−ｃｌａｙ）に基づく配合土混合物中に蒔き、そして最初の本葉が現れたら、個々に２２ｃｍ直径の植木鉢に移した。突然変異体および野生型植物は、ランダム化ブロック設計で、温室ベンチ上に配置した。第四葉由来の組織試料を、播種２１日後の正午に採取し（未成熟組織と定義）、一方、播種５６日後に採取したものを成熟完全拡張葉組織とした。トマト果実は、開花後、異なる時期に採取し、そして未成熟緑（ＩＧ、２０ＤＰＡ）および成熟緑（ＭＧ、３５ＤＰＡ）と分類した。果実熟成は、果実が緑からオレンジに変わり始めるブレーカー状態（４０ＤＰＡ）に関連した。熟成果実は、ブレーカー４および９日後に採取し、後者の段階は、完全成熟完熟果実に相当した。
【００６７】
葉組織固定および解析
葉組織１ｍｍ2の小片を、かみそりで、未成熟第四葉および完全拡張した第四葉に沿って中ほどから切除し、そして直ちに、０．１Ｍ  ＰＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中の３（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド、４％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド中、１時間固定した。さらなる固定およびそれに続くスパー樹脂（Ｓｐｕｒｒ’ｓ  ｒｅｓｉｎ）中の包埋は、シロイヌナズナ葉組織に関して先に記載されるように（ＫｉｎｓｍａｎおよびＰｙｋｅ，  １９９８，  １２５：１８１５−１８２２）、行った。突然変異型および野生型両方に関して、少なくとも６つの異なる第四葉を試料採取した。内部葉構造の解析のため、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｈｕｘｌｅｙ  ＩＩミクロトームを用いて、０．５μｍ厚の横断面切片を切り取り、ガラススライド上に乗せ、そして１％（ｗ／ｖ）トルイジンブルーで、６０℃で５秒間染色した。葉厚さおよび内部葉形態のパラメーターは、Ｌｕｃｉａ画像解析ソフトウェアおよびＮｉｋｏｎ  Ｏｐｔｉｐｈｏｔ顕微鏡を用いて測定した（ＫｉｎｓｍａｎおよびＰｙｋｅ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１９９８、上記）。
【００６８】
損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞におけるプラスチド区画サイズの決定
プラスチド区画サイズは、シロイヌナズナ葉に関して先に記載された方法（ＰｙｋｅおよびＬｅｅｃｈ，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．（１９９１）９６：１１９３−１１９５）を用いて、損なわれていない固定した別個の細胞において、プラスチド数を計数し、そしてプラスチドサイズを測定することによって決定した。葉およびトマト果皮組織両方を採取し、そして直ちに、３．５％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド溶液中で、暗所で１時間固定した。葉組織は、続いて、先に記載されるように（ＰｙｋｅおよびＬｅｅｃｈ、１９９１、上記）、プロセシングした。トマト果実由来の果皮細胞は、葉肉細胞より容易に分離され、そして過酷な処理をより必要としない。したがって、緑トマト果実由来の果皮組織は、細胞損傷を最小限にするため、０．１Ｍ  Ｎａ2−ＥＤＴＡ中、６０℃で１０−３０分間加熱し、一方、オレンジおよび赤の果実の果皮組織は、Ｎａ2−ＥＤＴＡ溶液中、４℃で保存した。これらの両方の方法により、組織をピンセットで穏やかに叩いた後、続いて、顕微鏡スライド上で、損なわれていない果皮細胞を分離することができた。葉肉細胞および果皮細胞における葉緑体および有色体の数は、Ｎｉｋｏｎ  Ｏｐｔｉｐｈｏｔ顕微鏡上でノマルスキー微分干渉コントラスト光学を用いて、損なわれていない分離した細胞において測定した。個々の細胞およびその内部のプラスチドの平面図面積は、画像解析によって測定した（ＫｉｎｓｍａｎおよびＰｙｋｅ、１９９８、上記）。プラスチド総面積は、細胞あたりの平均プラスチド面積ｘ細胞あたりのプラスチド数の積として表した。細胞指数パラメーターは、細胞サイズに関する総プラスチド区画サイズの測定値として計算し、そして細胞あたりのプラスチド総面積／細胞平面図面積として計算した。
【００６９】
色素解析
カロテノイドおよびクロロフィルを組織から抽出し、そしてその後、先に記載されるように（Ｆｒａｓｅｒら，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ（１９９４）１０５：４０５−４１３）、分光光度的に、そしてＨＰＬＣによって解析した。
【００７０】
逆転写酵素−ＰＣＲ
Ｓｃｈｕｌｔｚら（Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ（１９９４），  １２：３１０−３１６）に記載される方法を、以下の変更を伴って用い、新鮮凍結トマト果皮組織から、総果実ＲＮＡを抽出した。ホモジナイズ緩衝液中でインキュベーションした後、水性相を、等体積のフェノール：クロロホルム中で２回抽出し、そしてその後、再びクロロホルム中で抽出した。核酸は、エタノール沈殿によって回収した。ＲＮＡは、１２Ｍ  ＬｉＣｌを最終濃度２Ｍまで添加して、そして４℃で一晩インキュベーションすることによって、沈殿させた。これを、１０，０００ｇで遠心分離することによってペレットにし、７０％エタノール中でリンスし、そしてその後、ｄＨ2Ｏに溶解した。
【００７１】
ＲＮＡは、各試料（１μｇ）および外部対照（２５ｎｇ）を、６５℃で５分間インキュベーションすることによって変性した。試料を氷上で冷却し、そして３’端オリゴ（ｄＴ）15プライマー（１００ｎｇ）；１Ｕ  Ｒｎａｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤；１ｍＭ  ｄＮＴＰ類；１ｘ反応緩衝液（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３７５ｍＭ  ＫＣｌ、１５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、５０ｍＭジチオスレイトール）および５Ｕモロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ）を含有する混合物に添加した。総ＲＮＡ試料の逆転写は、３７℃で１時間行い、そしてその後、試料を９８℃で５分間加熱して、反応を終結させた。
【００７２】
フィトエン・シンターゼ−１（Ｐｓｙ−１）の増幅に用いたオリゴヌクレオチドは：上流、７２４−７４１ｂｐの５’ＣＡＧＣＣＴＴＡＧＡＴＡＧＧＴＧＧＧ３’、および下流、１０８２−１１０４ｂｐの５’ＧＡＧＴＣＴＡＣＴＴＧＣＣＴＣＡＡＧ３’であり、３８０ｂｐ  ＰＣＲ産物を生じた。フィトエン・デサチュラーゼ（Ｐｄｓ）の増幅に用いたオリゴヌクレオチドは：上流、１４５９−１４８２ｂｐの５’ＣＴＧＡＡＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＧＴＧＴＣＡＡＧ３’、および下流、２０１３−２０２７ｂｐの５’ＣＴＡＣＡＣＧＡＡＡＣＡＧＡＡＡＴＡＣＴＴＧＧＣ３’であり、５６８ｂｐ  ＰＣＲ産物を生じた。
【００７３】
外部対照は、ラット・トランスチレチン特異的プライマーであった。この方法に用いた外部対照ＲＮＡは、ラット肝癌細胞から生じた。２．５ｎｇの総ＲＮＡを、以下のプライマーを持つ、トランスチレチンｍＲＮＡに特異的なプライマー（Ｐｅｃｋｅｒら、１９９６）：上流、１３９−１５８ｂｐ、５’ＡＧＴＣＣＴＧＧＡＴＧＣＴＧＴＣＣＧＡＧ３’、および下流、３３８−３５９ｂｐ、５’ＣＴＴＧＧＣＡＴＴＴＣＣＣＣＡＴＴＣＣＡＴＧ３’と共に用いて、１８０ｂｐ  ＰＣＲ産物を生じた。
【００７４】
ＰＣＲは、最終濃度１ｘＰＣＲ緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＫＣｌ）；２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2；１ｍＭ  ｄＮＴＰ類；１０ｎｇ各プライマー；および２．５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ））で行った。反応を９５℃に５分間加熱した。増幅は、９４℃１分間；５０℃３０秒間；および７２℃３０秒間の連続３０周期で行った。最後の周期後、試料をさらに７２℃で１０分間インキュベーションした。ＰＣＲ産物は、１ｘＴＢＥおよび０．１μｇ／ｍｌエチジウムブロミドを含有する１％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上の電気泳動によって分離した。バンド強度は、Ｇｅｌ  Ｂａｓｅ／Ｇｅｌ  Ｂｌｏｔ  Ｐｒｏソフトウェアをあらかじめ装填したＵＶＰゲル・ドキュメンテーションおよび解析系、ＧＤＳ７６００を用いて、ゲルをスキャンすることによって定量化した。ＲＴおよびＰＣＲ効率における試料間変動は、対照ＰＣＲ産物の相対量を用いることによって修正した。すべてのＰＣＲ産物を配列決定し、そしてデータベース中の対応する配列と並列することによって、標的ｍＲＮＡと同定した。
【００７５】
フィトエン・シンターゼ酵素アッセイ
フィトエン・シンターゼ活性は、Ｆｒａｓｅｒら（１９９４）上記のプロトコルを用いて、プラスチド調製においてアッセイした。
【００７６】
他の測定
倍数性レベルの測定は、Ｐｌａｎｔ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｓｃｈｉｊｉｎｄｅｌ、オランダによって行った。タンパク質レベルは、沈殿（ＷｅｓｓｅｌおよびＦｌｕｇｇｅ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ，（１９８４）１３８：１４１−１４３）後、Ｌｏｗｒｙら（１９５１）の方法によって測定した。
【００７７】
結果
葉および果実のカロテノイドおよびクロロフィル含量
葉および成熟緑果実両方のクロロフィルレベルは、ｈｐ−１において、野生型におけるより高かった（それぞれ１．２０および１．３８倍）が、クロロフィルａおよびｂの相対量は、実質的に同じであった（表１）。
【００７８】
表１
【表１】
2004520822.tif 000002
【００７９】
ｎａ＝適用不能
同様に、カロテノイドは、野生型に比較して、すべてのｈｐ−１組織で増加しており、そして特に完熟果実において増加していた（１．８１倍）。葉および完熟果実における個々のカロテノイドの比較は、２つの品種間の非常に小さい相違しか明らかにしなかった（表２）。
【００８０】
表２
【表２】
2004520822.tif 000003
【００８１】
ＮＤ＝検出されない
葉構造解析
根底にある内部葉形態が、ｈｐ−１突然変異体で観察される、より濃い緑の葉の表現型に寄与しているかどうか決定するため、未成熟および成熟完全拡張第四葉の中点から採取した横断切片を解析した。葉の厚みおよび内部葉形態は、２１日後、拡張中の葉において、ｈｐ−１および野生型で同様であったが、完全な拡張時に、ｈｐ−１葉の柵状葉肉細胞は、野生型に比較して、より長い周縁伸長を示した（表３）。
【００８２】
表３
【表３】
2004520822.tif 000004
【００８３】
標準誤差を括弧内に示す。柵状葉肉細胞の寸法は、固定単離細胞調製中で測定した。葉の厚みは、葉横断面から測定した。
これは、ｈｐ−１突然変異体葉における葉の厚みの比率増加に寄与する柵状葉肉細胞を生じる。海綿状葉肉細胞は、ｈｐ−１葉において、サイズまたは形状が有意に改変されなかった（データ未提示）。ｈｐ−１突然変異体の成熟葉は、柵状葉肉細胞の周縁拡張に有意な増加を示すのであるが、全体の葉形状は突然変異体で変わってはおらず、ただ葉面積がわずかに減少した（データ未提示）。
【００８４】
葉葉緑体発生
ｈｐ−１において、葉細胞がまた、葉肉細胞の葉緑体集団においても、野生型と相違を示すかどうか決定するため、拡張中および完全に拡張した葉において、固定した単離葉肉細胞の調製における葉緑体数およびサイズを決定した。拡張中の葉の細胞において、播種２１日後、プラスチド数、プラスチドサイズまたはプラスチド密度には、野生型およびｈｐ−１突然変異体間で、相違はまったく観察されなかった（データ未提示）。しかし、ｈｐ−１の完全に拡張した葉では、細胞平面図面積単位あたりの葉緑体として表される葉緑体密度は、柵状および海綿状葉肉細胞両方において、野生型に比較して増加していることが見出された（表４）。
【００８５】
表４
【表４】
2004520822.tif 000005
【００８６】
標準誤差を括弧内に示す。細胞指数は、プラスチド総面積／細胞平面図面積として計算する。
Ｐａｌ＝柵状、Ｓｐ＝海綿状葉肉
さらに、柵状および海綿状細胞両方におけるｈｐ−１葉緑体は、野生型より大きかった。これらの２つの特徴をあわせると、ｈｐ−１突然変異体において葉肉細胞あたりの葉緑体の有意に増加した総面積および細胞指数の増加が生じる（表４）。この葉緑体区画サイズの増加は、完全に拡張した葉に観察されるある範囲の柵状細胞サイズに渡って、そしてまたより大きい海綿状葉肉細胞においても見出された。
【００８７】
トマト果実における果皮細胞プラスチドの解析
個々の果皮細胞における葉緑体数および有色体数を計数した。果実発生中の増加した果皮細胞サイズおよびプラスチド数間の関係は、複雑であった（図１）。ＩＧおよびＭＧ果実の果皮細胞では、プラスチド数および果皮細胞サイズおよび果皮細胞間の関係には、多くの変動が見られた。プラスチド数／プラスチドサイズの組み合わせに極端な相違が観察された（図２）。ＭＧおよびブレーカー期の間では、細胞あたりのプラスチド数の大きな増加が生じたが、これは、続く赤い果実の熟成期中には、実質的に増加しなかった。緑果実中の葉緑体数は、細胞あたり２００−４００の間の範囲であったが、ブレーカー期までには、プラスチド数は劇的に増加し、平均は細胞あたり８００程度までとなったが、多くのより大きい細胞は、細胞あたり２０００までの有色体を含有した。野生型果実における成熟果皮細胞は、緑果実に示されるのと同一の、プラスチド数／サイズの組み合わせの不均一性を示さず、そして小さい赤い有色体の大集団を含む、平面図面積１００，０００μｍ2程度の、極端に大きい細胞に代表された。
【００８８】
ｈｐ−１のＭＧおよび完熟果実両方における果皮細胞は、細胞あたりのプラスチド密度および細胞指数両方が、野生型と比較して、ｈｐ−１果皮細胞において、一貫して増加するように、野生型に比較して、細胞あたりのプラスチドおよびプラスチドサイズの増加を示した（表５）。
【００８９】
表５
【表５】
2004520822.tif 000006
【００９０】
標準誤差は括弧内に示す。細胞指数は、プラスチド総面積／細胞平面図面積として計算する。
カロテノイド遺伝子発現およびフィトエン・シンターゼ活性
ＰｄｓまたはＰｓｙ−１いずれの発現も、２つの品種の成熟緑および完熟果実において、有意に異ならなかった。しかし、対照的に、フィトエン・シンターゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素活性は、アイルサ・クレイグ果実より、ｈｐ−１において、１．９倍高かった（データ未提示）。
【００９１】
倍数性
両品種は、二倍体であることが見出された。
【００９２】
（実施例２）
野生型品種と、オーツムギ・フィトクロムＡ（プロモーターＣａＭＶ３５Ｓ）を発現するトランスジェニックトマト植物の比較
ＢｏｙｌａｎおよびＱｕａｉｌ，  Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，（１９８９）７６５−７７７に記載されるようなオーツムギ・フィトクロムＡを発現するトランスジェニックトマト品種（カリフォルニア大学のＰｅｔｅｒ  Ｑｕａｉｌより得た）を用いて、そして対照としてＣＶ  ＶＦ３６品種と共に、実施例１の方法を繰り返した。
【００９３】
結果を図４および表２に示す。これらの結果は、トランスジェニック葉が、より大きい細胞サイズを有することを明らかに示す。
３５ｓＰｈｙＡカロテノイド含量の統計解析の結果を表６に示す。
【００９４】
表６
【表６】
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【００９５】
カロテノイド含量は、トランスジェニック品種で有意に増加する。
【００９６】
（実施例３）
オーツムギ・フィトクロムＡ（ｄＣａＭＶ３５Ｓプロモーター）を発現するトランスジェニックトマト植物
実施例２に記載するとおりであるが、実施例２に記載するようなＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの代わりにフィブリリンプロモーターを用いる、フィトクロムＡを特定する構築物で、トマトｃ．ｖ．マネーメーカー（Ｍｏｎｅｙｍａｋｅｒ）を形質転換した。
【００９７】
（実施例４）
オーツムギ・フィトクロムＡ（フィブリリンプロモーター）を発現するトランスジェニックトマト植物
実施例２に記載するとおりであるが、実施例２に記載するようなＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの代わりにフィブリリンプロモーターを用いる、フィトクロムＡを特定する構築物で、トマトｃ．ｖ．マネーメーカーを形質転換した。
【００９８】
（実施例５）
オーツムギ・フィトクロムＡ（インベルターゼプロモーター）を発現するトランスジェニックトマト植物
実施例２に記載するとおりであるが、実施例２に記載するようなＣａＭＶ３５Ｓの代わりにトマト・インベルターゼプロモーター（Ｋａｔｈｒｙｎ  Ｊ  Ｅｌｌｉｏｔら（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１：５１５−５２４．  ２つのトマト種からの果実液胞インベルターゼ遺伝子の単離および性質決定、並びに果実熟成中の、ｍＲＮＡレベルの時間的相違）を用いる、フィトクロムＡを特定する構築物で、トマトｃ．ｖ．マネーメーカーを形質転換した。
【００９９】
実施例３、４および５−結果の比較
実施例３、４および５に記載する各構築物から、３０程度のトランスジェニック植物を産生した。さらに、２０の種子および２０の組織成長対照を成長させた。これらの植物は、温室にランダムに置いた。
【０１００】
初代Ｔ0植物に、以下の解析を行った。
・植物、葉、成熟および完熟果実表現型に関する視覚的解析
・葉カロテノイド解析
・成熟緑果実カロテノイド解析
・葉プラスチド密度測定
・７ｄｐｂ果実カロテノイド解析
・分子解析：ウェスタン、ノーザン解析およびコピー数解析
植物視覚的解析
１０程度のｄ３５ｓ  ＰｈｙＡ植物は、有意な矮性および非常に濃い緑の葉の表現型を示した。ｈｐ突然変異体および３５ｓ  ＰｈｙＡ植物において、苗（ｓｅｅｄｌｉｎｇ）は、最初は矮小であったが、より後期には、対照植物の高さに追いついた。ｈｐ突然変異体および３５ｓ  ＰｈｙＡ植物は、濃い緑の葉の表現型を示したが、ｄ３５ｓ  ＰｈｙＡ葉材料のものほど、より濃い緑ではなかった。ここで、ｄ３５ｓ  ＰｈｙＡ植物は、矮性から脱却して成長することはなく、そして濃い緑の葉の色は、植物の一生を通じて続き、このより強い表現型は、ｓ３５ｓ  ＰｈｙＡ植物で用いたものより強いプロモーターによるものである可能性があった。矮性および濃い緑の葉の表現型を示さない、２０程度のｄ３５ｓ  ＰｈｙＡ植物があった。我々は、ｄ３５ｓ  ＰｈｙＡ植物において、ｈｐ植物表現型を模倣したことを示した。
【０１０１】
果実特異的インベルターゼまたはフィブリリンプロモーターを用いた植物では、矮性または濃い緑の葉の表現型はまったく観察されなかった。
果実視覚的解析
１０の濃い緑および矮性ｄ３５ｓ  ＰｈｙＡ植物は、対照と比較した際、緑および完熟果実（特に果皮および果軸（ｃｏｌｕｍｅｌｌａ））において、有意により濃い色を示した。インベルターゼおよびフィブリリン果実は、対照果実より有意により濃い色を示さなかった。
【０１０２】
葉カロテノイド解析
ｄ３５ｓ  ＰｈｙＡ植物の葉材料の色素含量（クロロフィルＡ＋Ｂおよびカロテノイド）を重量に基づいて測定し、そして組織培養および種子成長対照における色素含量と比較した。結果は、図５にグラフ型で示す。重量に基づくと、トランスジェニックは、対照に比較して、色素の２倍までの増加を示す。図６は、図５と本質的に同一のデータであるが、面積に基づいた色素含量として再計算した濃度で示す。
【０１０３】
面積に基づくと、トランスジェニックは、対照に比較して、色素含量の３倍までの増加を示す。
重量に基づくと、ｈｐ突然変異体において、対照に比較した際、色素含量に有意な相違はなかったが、面積に基づくと、対照に比較した際、色素含量に２倍までの増加があった。この相違は、葉の厚みによるものであり、ｈｐ突然変異体はより厚い葉を有し、そしてしたがって、面積に基づいてのみ、色素含量の相違が検出可能である。このデータは、我々が先に注目していた視覚的知見、つまり、ｄ３５ｓ  ＰｈｙＡ葉が、ｈｐおよび対照葉組織より着色していることを確認する。この結果は、トランスジェニックがｄ３５ｓ  ｐｈｙＡ構築物において、ｈｐ表現型を模倣することを示唆する。
【０１０４】
成熟緑果実カロテノイド解析
ＰｈｙＡトランスジェニック由来の成熟緑果実色素含量（クロロフィルＡ＋Ｂ、およびカロテノイド）を測定し、そして組織培養成長対照の色素含量と比較した。結果は図７にグラフで示す。
【０１０５】
このデータは、ｄ３５ｓ  ＰｈｙＡ果実が、組織培養対照より、３倍までのより多い総色素含量を含有することを示す。組織培養対照と比較した際、インベルターゼおよびフィブリリン果実において、総色素含量に有意な相違はなかった。このデータは、ｄ３５ｓ  ＰｈｙＡ成熟緑果実に見られた我々の視覚的知見を確認し、ここで我々は先に、これらが、ｈｐおよび対照成熟緑果実より着色していることに注目した。
【０１０６】
葉プラスチド密度測定
ｄ３５ｓ  ＰｈｙＡ由来の若い拡張中の葉組織において、葉プラスチド密度を測定し、そして組織培養対照と比較した。総プラスチド密度は、プラスチドを保持する、柵状または海綿状葉肉細胞に対する、プラスチド総面積である。結果は、図８および９にグラフで示す。
【０１０７】
対照に比較して、トランスジェニックで、総プラスチド密度に有意な相違はなかった。
果実カロテノイド含量
ＰｈｙＡトランスジェニック由来の７ｄｐｂ果実の総カロテノイド含量を測定し、そして組織培養および種子成長対照と比較した。結果は、図１０にグラフで示す。
【０１０８】
対照に比較した際、ＰｈｙＡトランスジェニックの果実カロテノイド含量に有意な増加がある。このデータは、我々が先に、果皮および果軸組織が、対照より、そしてインベルターゼおよびフィブリリン果実より、顕著により濃い赤色であることに注目したように、特に、ｄ３５ｓ  ＰｈｙＡ果実に関する我々の視覚的知見を確認する。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】図１は、野生型トマトｃｖアイルサ・クレイグ（  ）およびｈｐ−１突然変異体（●）に関する、細胞あたりの総葉緑体平面図面積、並びに（ａ）柵状および（ｂ）海綿状葉肉細胞平面図面積間の関係を例示する。
【図２】図２は、ｃｖアイルサ・クレイグにおけるトマト果実発生中の、細胞あたりのプラスチド数および柵状細胞平面図面積間の関係を示す。発生段階はＩＧ（  ）、ＭＧ（◇）、ブレーカー（○）、ブレーカー４日後（△）およびブレーカー９日後（完熟）（▽）である。
【図３】図３は、ｈｐ−１およびアイルサ・クレイグ果実におけるフィトエン・デサチュラーゼおよびフィトエン・シンターゼ−１の発現を示し、（ａ）はｈｐおよびアイルサ・クレイグにおけるＰｓｙ−１の相対発現を示す（ｎ＝３）。アイルサ・クレイグ（ＡＣ）に比較したｈｐ−１成熟緑果実におけるＰｓｙ−１発現（ＡＣ＝１．００）は、１．０１±０．０１である。ＡＣに比較したｈｐ完熟果実におけるＰｓｙ−１発現（ＡＣ＝１．００）は、０．８６９±０．００７である；そして（ｂ）はｈｐおよびアイルサ・クレイグにおけるＰｄｓの相対発現を示す（ｎ＝３）。ＡＣに比較したｈｐ成熟緑果実におけるＰｄｓ発現（ＡＣ＝１．００）は、０．８２３±０．１である。ＡＣに比較したｈｐ完熟果実におけるＰｄｓ発現（ＡＣ＝１．００）は、０．９９４±０．００６である。
【図４】図４は、オーツムギ・フィトクロムＡを発現するトランスジェニックトマト（  ）および対照（◇）ｃｖ  ＶＦ３６の表現型の比較を例示する−（ａ）は、柵状葉肉細胞の細胞面積に対する葉プラスチド数の比較を示し、（ｂ）は、海綿状葉肉細胞の細胞面積に対する葉プラスチド数の比較を示し、（ｃ）は、柵状葉肉細胞の細胞面積に対する葉プラスチド総面積の比較を示し、そして（ｄ）は、海綿状葉肉細胞の細胞面積に対する葉プラスチド総面積の比較を示す。
【図５】図５は、二重ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの調節下にオーツムギ・フィトクロムＡを発現するトランスジェニック植物の葉の、重量に基づく、クロロフィルＡおよびＢ、並びにカロテノイド含量の解析を示す。
【図６】図６は、図５と本質的に同一のデータであるが、面積に基づく色素含量として計算しなおした濃度のものを示す。
【図７】図７は、ＰｈｙＡを発現する成熟緑トマト果実の総色素含量を示す。
【図８】図８は、柵状葉肉細胞における細胞面積あたりのプラスチド総面積の比較を示す。
【図９】図９は、海綿状葉肉細胞における細胞面積あたりのプラスチド総面積の比較を示す。
【図１０】図１０は、ＰｈｙＡを発現するトマト果実の、平均総カロテノイド含量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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