(57)【要約】本発明は、哺乳動物における喘息またはアレルギーを、３−アミノステロイド化合物を、その必要性のある哺乳動物に投与することによって処置する方法に関する。この３−アミノステロイド化合物は、ＩＬ−９経路を下方制御し得、そしてアレルゲンに対する喘息性応答を緩和し得る。本発明の方法において使用される例示的な３−アミノ化合物は、化学式（Ｉ）を有する化合物を含み、ここで、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４基は、本明細書中で定義されるとおりである。本発明はまた、式（Ｉ）の特定の新規な化合物に関する。さらに、本発明はまた、免疫調節性３−アミノステロイド化合物を同定するための方法を提供する。
2004506599.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物におけるアトピー性アレルギーおよび喘息を処置するための薬学的組成物であって、該組成物は、有効量の３−アミノステロイド化合物を含む、組成物。
【請求項２】
前記３−アミノステロイド化合物が、ＩＬ−９を下方制御する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記化合物が、以下の化学式：
【化１】
2004506599.tif 000033
を有し、ここで、Ｘは、−ＣＨ２−ＰＯ（ＯＲ５）２、−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ５、−ＮＨ−ＣＯ−ＯＲ５、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ２、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ８、−ＣＨ２−ＣＯ２−Ｒ５、
【化２】
2004506599.tif 000034
からなる群から選択され、
Ｒ１は、Ｒ６−ＮＨ２−、
【化３】
2004506599.tif 000035
からなる群から選択され、
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々、独立して、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＡｃ、および
【化４】
2004506599.tif 000036
からなる群から選択され、
Ｒ５は、Ｃ１−１２アルキルであり、そしてＲ６、Ｒ７およびＲ８は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、およびフェニルからなる群から選択される、
請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記化合物が、以下の化学式：
【化５】
2004506599.tif 000037
を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記化合物が、以下の化学式：
【化６】
2004506599.tif 000038
を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記化合物が、以下の化学式：
【化７】
2004506599.tif 000039
を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記化合物が、以下の化学式：
【化８】
2004506599.tif 000040
を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記化合物が、以下の化学式：
【化９】
2004506599.tif 000041
を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
免疫調節性３−アミノステロイド化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）３−アミノステロイド化合物およびマイトジェンの存在下で、末梢血リンパ球を培養して、細胞凝集物を形成する工程；および
（ｂ）細胞凝集物の数を決定する工程、
を包含し、ここで、該免疫調節性３−アミノステロイド化合物の非存在下で培養した末梢血リンパ球と比較した場合、該免疫調節性３−アミノステロイド化合物が、該細胞凝集物の数を減少させる、方法。
【請求項１０】
免疫調節性３−アミノステロイド化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）３−アミノステロイド化合物およびマイトジェンの存在下で、末梢血リンパ球を培養する工程；および
（ｂ）ＩＬ−９　ｍＲＮＡのレベルを決定する工程、
を包含し、ここで、該免疫調節性３−アミノステロイド化合物の非存在下で培養した末梢血リンパ球と比較した場合、該免疫調節性３−アミノステロイド化合物が、該ＩＬ−９　ｍＲＮＡのレベルを減少させる、方法。
【請求項１１】
前記末梢血リンパ球が、１２時間マイトジェンの存在下で培養される、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
免疫調節性３−アミノステロイド化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）３−アミノステロイド化合物および抗原の存在下で、抗原刺激哺乳動物から単離された末梢血リンパ球を培養して、細胞凝集物を形成する工程；および
（ｂ）該細胞凝集物の数を決定する工程、
を包含し、ここで、該免疫調節性３−アミノステロイド化合物の非存在下で培養した末梢血リンパ球と比較した場合、該免疫調節性３−アミノステロイド化合物が、該細胞凝集物の数を減少させる、方法。
【請求項１３】
前記末梢血リンパ球が、抗原の存在下で、３日間培養される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原刺激哺乳動物が、マウスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
免疫調節性３−アミノステロイド化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ＩＬ−９および３−アミノステロイド化合物の存在下で、ＩＬ−９に応答して増殖する細胞を培養する工程；および
（ｂ）細胞増殖のレベルを測定する工程、
を包含し、ここで、該免疫調節性３−アミノステロイド化合物の非存在下で培養した細胞と比較した場合、該免疫調節性３−アミノステロイド化合物が、ＩＬ−９によって誘導された細胞増殖のレベルを減少させる、方法。
【請求項１６】
ＩＬ−９に応答して増殖する前記細胞が、Ｍ０７ｅ細胞である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
以下の式：
【化１０】
2004506599.tif 000042
を有する化合物であって、ここで、Ｘは、−ＣＨ２−ＰＯ（ＯＲ５）２、−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ５、−ＮＨ−ＣＯ−ＯＲ５、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ２、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ８、−ＣＨ２−ＣＯ２−Ｒ５、
【化１１】
2004506599.tif 000043
からなる群から選択され、
Ｒ１は、Ｒ６−ＮＨ２−、
【化１２】
2004506599.tif 000044
からなる群から選択され、
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々、独立して、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＡｃ、および
【化１３】
2004506599.tif 000045
からなる群から選択され、
Ｒ５は、Ｃ１−１２アルキルであり、そしてＲ６、Ｒ７およびＲ８は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキルおよびフェニルからなる群から選択される、
化合物。
【請求項１８】
Ｘが、−ＣＨ２−ＰＯ（ＯＲ５）２、−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ５、−ＮＨ−ＣＯ−ＯＲ５、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ２、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ８、
【化１４】
2004506599.tif 000046
からなる群から選択され、
Ｒ１は、Ｒ６−ＮＨ２−、
【化１５】
2004506599.tif 000047
からなる群から選択され、
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＡｃ、および
【化１６】
2004506599.tif 000048
からなる群から選択され、
Ｒ５は、Ｃ１−１２アルキルであり、そしてＲ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、およびフェニルからなる群から選択される、
請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
Ｘは、−ＣＨ２−ＣＯ２−Ｒ５であり、
Ｒ１は、Ｒ６−ＮＨ２−、
【化１７】
2004506599.tif 000049
からなる群から選択され、
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、独立して、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＡｃ、および
【化１８】
2004506599.tif 000050
からなる群から選択され、
Ｒ５は、Ｃ１−１２アルキルであり、そしてＲ６およびＲ７は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、およびフェニルからなる群から選択される、
請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｘは、−ＣＨ２−ＣＯ２−Ｒ５であり、
Ｒ１は、
【化１９】
2004506599.tif 000051
であり、
Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々、独立して、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＡｃ、および
【化２０】
2004506599.tif 000052
からなる群から選択され、ただし、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つは、
【化２１】
2004506599.tif 000053
であり、
Ｒ５は、Ｃ１−１２アルキルであり、そしてＲ７は、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、およびフェニルからなる群から選択される、
請求項１７に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、その全体が本明細書中で参考として援用される米国仮出願６０／１６９，９５９（１９９９年１２月９日提出）の利益を主張するものである。本出願は、米国出願０８／８７４，５０３（１９９６年８月２３日提出、現在では放棄されている）の延長である米国出願０９／３２５，５７１（１９９９年６月９日提出）に関連し、これは米国仮出願６０／００２，７６５（１９９６年８月２４日提出、これらの全てが本明細書中で参考として援用される）の利益を主張する。本出願はまた、米国出願０９／１９８，４８６（１９９８年１１月２４日提出）；米国出願０８／７６９，６８９（１９９６年１２月１８日提出）、現在の米国特許第５，８５６，５３５号；および米国出願０８／４７８，７６３（１９９５年６月７日提出）、現在の米国特許第５，７２１，２２６号（これらの全てが本明細書中で参考として援用される）に関連する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、哺乳動物における、喘息などのアトピー性アレルギーおよび関連する疾患の処置の方法に関する。より詳細には、本発明は、ＩＬ−９経路を下方制御する３−アミノステロイド化合物の投与により、哺乳動物におけるＩＬ−９活性を調節する方法に関する。本発明はまた、特定の新規３−アミノステロイド化合物に関する。さらに、本発明はまた、免疫調節性の３−アミノステロイド化合物の同定の方法を提供する。
【０００３】
（発明の背景）
炎症は、身体の防御系が外来の実在物と闘う、複合プロセスである。外来の実在物に対する闘争が身体の生存に必要であり得る一方、いくつかの外来の実在物に応答する防御系は、無害なものでさえも、危険であり、それにより、続く争いにおいて周囲の組織が損傷を受ける。
【０００４】
アトピー性アレルギーまたはアトピーは、環境遺伝的障害であり、ここで遺伝的背景は、環境刺激の応答（例えば、花粉、食物、ふけ、および昆虫の毒）に影響する。この障害は一般に、偏在する抗原に対する応答でＩｇＥ抗体を産生するための、リンパ球の増大する能力によって特徴付けられる。これらの抗原による免疫系の活性は、アレルギー性炎症を誘導し、そして摂食後、皮膚を介する浸透、または吸入の後に生じる。この免疫活性が生じ、そして肺の炎症および気管支の反応亢進が付随する場合、この障害は、広く喘息によって特徴付けられる。多くの細胞型がこの炎症反応に関係し、そしてその細胞型には、Ｔ細胞および抗原提示細胞、ＩｇＥを産生するＢ細胞、およびＩｇＥに結合する好塩基球および好酸球が挙げられる。これらの炎症細胞は、アレルギー性炎症の部位に蓄積し、そしてそれらの部位が放出する毒性産物は、これらの障害に関する組織分布に寄与する。
【０００５】
喘息が一般に、気道の炎症障害として定義されている一方、臨床的な症状が、間欠的な空気の流れの閉鎖から生じる。これは、罹患率および重症度の増大が現れる、慢性的な不能障害である（Ｇｅｒｇｅｎら、（１９９２）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４６、８２３〜８２４）。人口の３０〜４０％がアトピー性アレルギーを被り、そして、人口の子どもの１５％および大人の５％が喘息を被ると推定される（Ｇｅｒｇｅｎら、（１９９２）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４６、８２３〜８２４）。従って、非常に大きな苦しみが、我々のヘルスケア資源に配置される。
【０００６】
興味深いことに、ほとんどの個体が、同様の環境曝露を経験するのに、特定の個体のみがアトピー性アレルギーおよび喘息を発症する。このアトピーとして公知の環境アレルゲンに対する過敏症は、アトピーではない個体と比較してアトピー性の個体において、しばしば血清ＩｇＥレベルの増大またはアレルゲンに対する異常に激しい肌試験応答が示される（Ｍａｒｓｈら、（１９８２）Ｎｅｗ　Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０５、１５５１〜１５５９）。アトピー性アレルギーと喘息の間の密接な関係の強力な証拠は、ほとんどの喘息患者は臨床的または血清学的なアトピーの証拠を有するという事実に由来する（Ｃｌｉｆｆｏｒｄら、（１９８７）Ａｒｃｈ．Ｄｉｓ．Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ　６２、６６〜７３；Ｇｅｒｇｅｎ、（１９９１）Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１５１、４８７〜４９２；Ｂｕｒｒｏｗｓら（１９９２）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ　Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９０、３７６〜３８５；Ｊｏｈａｎｎｓｏｎら、（１９７２）Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１、１〜２５；Ｓｅａｒｓら、（１９９１）Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２５、１０６７〜１０７１；Ｈａｌｏｎｅｎら、（１９９２）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４６、６６６〜６７０）。特に、より若い喘息患者が、アトピーの高い発生率を有する（Ｍａｒｓｈら、（１９８２）Ｎｅｗ　Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３０５、１５５１〜１５５９）。さらに、全血清ＩｇＥレベルにおける増大に関連する免疫学的因子が、肺機能低下に密接に関連する（Ｂｕｒｒｏｗら、（１９８９）Ｎｅｗ　Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２０、２７１〜２７７）。
【０００７】
これらの障害の診断および処置の両方は、問題である（Ｇｅｒｇｅｎら、（１９９２）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４６、８２３〜８２４）。炎症を起こした肺組織の評価はしばしば難しく、そして頻繁に、炎症の原因は検出され得ない。気道の炎症の原因の知識および外因性環境因子の誘発からの保護無しに、炎症プロセスを阻害し得ない。肺の炎症の制御の失敗が、肺機能を長期間にわたって非常に多く損失することは、一般に許容される。
【０００８】
現在の処置は、処置自身の不利益のセットを被る。主な治療的薬剤である、βレセプターアゴニストは症状を減少し、それによって一過性に肺機能を改善するが、根本的な炎症に影響を与えず、そのため肺組織は危険なままである。さらに、βレセプターアゴニストの定常の使用は、その効果および安全性を減少する脱感作を生じる（Ｍｏｌｉｎｏｆｆら、（１９９５）ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ　Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ　Ｂａｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭａｃＭｉｌｌｉａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。根本的な炎症を減少する薬剤である、抗炎症ステロイドは、免疫抑制から骨の損失までの範囲の、それ自身のリスクを有する（Ｍｏｌｉｎｏｆｆら、（１９９５）ＧｏｏｄｍａおよびＧｉｌｍａｎ　Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ　Ｂａｓｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭａｃＭｉｌｌｉａｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）。
【０００９】
従来の療法と関係する問題のために、代替の処置ストラテジーが調べられている。Ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ　Ａ（Ｃｈｕら，（１９９２）Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５，２２３−２３９）、シクロスポリン（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，（１９９２）Ｌａｎｃｅｔ　３３９，３２４−３２８；Ｍｏｒｅｌｙ，（１９９２）Ｊ．Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．５補遺Ａ，２６５−２６９）およびインターロイキン２（ＩＬ−２）のノナペプチドフラグメント（Ｚａｖｙａｌｏｖら，（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３１，２８５−２８８）は全て、ホメオスタシスと関連する潜在的に重要な免疫機能を阻害する。当該分野で必要とされるのは、根底にある病因に向かう、喘息のための処置である。さらに、これらの療法は、障害の偶発的な性質およびアレルギーとの緊密な関連に向けるべきであり、そして重要な免疫機能から下流にある点に介入すべきである。
【００１０】
上記の関連する特許出願において、出願人は、インターロイキン９（ＩＬ−９）、そのレセプターおよびＩＬ−９によってもたらされた活性が、アトピー性アレルギー、喘息および関連障害における治療介入のための適切な標的である。
【００１１】
アレルゲンによる肥満細胞から放出されたメディエーターは、長らく、アレルギーにおける重要な開始事象であると考えられていた。ＩＬ−９は、ＩＬ−９は本来、肥満細胞増殖因子として同定され、そしてＩＬ−９が、肥満細胞プロテアーゼ（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−４（Ｅｋｌｕｎｄら，（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，４２６６−４２７３）およびグランザイムＢ（Ｌｏｕａｈｅｄら，（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４，５０６１−５０７０））の発現を上方制御することが示されている。従って、ＩＬ−９は、肥満細胞の増殖および分化において、役割を果たすようである。さらに、ＩＬ−９は、高親和性のＩｇＥレセプターのα鎖の発現を上方制御する（Ｄｕｇａｓら，（１９９３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３，１６８７−１６９２）。調べれらたＩｇＥレベルは、アトピー性アレルギーの特徴および喘息についての危険因子であると考えられる。さらに、インビトロおよびインビボでの研究の両方は、ＩＬ−９が、プライムされたＢ細胞からのＩｇＥの放出を増強することを示した（Ｐｅｔｉｔ−Ｆｒｅｒｅら，（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　７９，１４６−１５１）。
【００１２】
喘息におけるＩＬ−９の役割に対する実質的な支持が存在する。最初に、ヒトとマウスとの間の連結相同性は、同じ遺伝子が、両方の種における抗原に対する応答において、生物学的変異性を生成する原因であることを示唆する。第二に、マウスＩＬ−９候補遺伝子の発現における差異は、気管支応答性における生物学的変異性と関連する。特に、ＩＬ−９の減少した発現は、Ｂ６マウスにおけるより低いベースラインの気管支応答と関連する（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら，（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４，１３１７５−１３１８０）。第三に、ヒトからのデータにおける連結の不均衡は、ＩＬ−９が、両方の種においてこの遺伝子についての役割と一貫するアトピーおよび気管支過剰応答と関連する（Ｄｏｕｌｌら，（１９９６）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ　Ｍｅｄ．１５３，１２８０−１２８４）。さらに、ヒト遺伝子における遺伝的変更は、サイトカイン機能の損失およびより低いＩｇＥレベルに関連するようである。第四に、アレルギー性免疫応答におけるこのサイトカインおよびそのレセプターの多面的な機能は、喘息の複雑な病因におけるＩＬ−９経路に対する役割を強力に支持する。第五に、ＩＬ−９レセプターにおける生物学的変異性はまた、アトピー性アレルギーおよび喘息に関連するようである。最後に、ＩＬ−９レセプター機能の遺伝的損失に関わらず、これらの個体は、それ以外は健康であるようである。従って、アトピー性の個体における性質は、ＩＬ−９およびＩＬ−９レセプター遺伝子またはＩＬ−９およびそのレセプターによって活性化された遺伝子の治療的下方制御が、安全であるようであることを示した。
【００１３】
気道過剰応答性は、実質的に全ての喘息マウスおよび同系マウス（ＤＢＡ２）のいくつかの株において見出される（Ｌｅｖｉｔｔら，（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ　２５，６１−６３）。気道過剰応答性は、ヒトにおける喘息の発症に対する危険因子であり、そして喘息についての処置の効力を評価するための生理学的尺度として、喘息の動物モデルにおいて使用される。このデータは、ヒト（Ｐｏｓｔｍａら，（１９９５）Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３３，８９４−９００）マウスの遺伝子マッピングの結果（米国特許第５，９０８，８３９号）と共に、マウスの気道応答におけるマウスＩＬ−９遺伝子産物に対する重要な役割を示唆する。特に、気管支過剰応答性ＤＢＡ２マウスは、ＩＬ−９の定常状態レベルのそれらの発現において、Ｃ５７ＢＬ６応答低下マウス（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら，（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４，１３１７５−１３１８０）とは異なる（米国特許第５，９０８，８３９号）。さらに、ＩＬ−９およびそのレセプターに対する抗体をブロッキングする前処置は、必要に応じて、マウスにおける抗原誘導気道過剰応答性および炎症からの完全な保護を提供し、このことは、これらの免疫応答においてＩＬ−９についての重要な調節的役割を示す。このデータは、異なる分子変化がヒトおよびマウスにおける気道応答性における生物学的変異性を生成するが、これらの変化は、この経路を調節する同じ遺伝子（ＩＬ−９およびそのレセプター）を与える。一緒にして、これらの観察は、気道過剰応答性、喘息およびアトピー性アレルギーにおけるＩＬ−９およびそのレセプターの重要な役割を確実にする。さらに、このデータは、ＩＬ−９作用をブロックする本発明の薬剤が、上記の応答のような抗原誘導応答に対して保護することを示す。
【００１４】
アトピー性アレルギー、喘息および関連疾患におけるＩＬ−９の役割、そのレセプターおよびその機能が解明されているが、当該分野における、これらの障害の病因学においてＩＬ−９によって調節される遺伝子の役割の解明についての特定の必要性が存在する。さらに、最も重要なことには、これらの知識に基づいて、これらの活性、それらの遺伝子産物、およびこれらの障害を処置するためのそれらの引き続く生物学的活性を調節しうる薬剤についての必要性が存在する。
【００１５】
（発明の要旨）
本発明は、哺乳動物において、アトピー性アレルギーおよび喘息を処置する方法に関し、この方法は、有効量の３−アミノステロイド化合物を投与する工程を包含する。好ましい実施形態において、この３−アミノステロイド化合物は、ＩＬ−９経路およびアレルゲンに対する喘息性応答を下方調節する。
【００１６】
本発明の方法において使用される例示的な３−アミノステロイド化合物は、以下の化学式（Ｉ）：
【００１７】
【化２２】
2004506599.tif 000003
を有する化合物を有する。
【００１８】
式（Ｉ）において、Ｘ基は、−ＣＨ２−ＰＯ（ＯＲ５）２、−ＮＨ−ＳＯ２−Ｒ５、−ＮＨ−ＣＯ−ＯＲ５、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ２、−ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｒ８、−ＣＨ２−ＣＯ２−Ｒ５、
【００１９】
【化２３】
2004506599.tif 000004
からなる群から選択される。Ｒ１基は、Ｒ６−ＮＨ２−、
【００２０】
【化２４】
2004506599.tif 000005
からなる群から選択される。Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、各々独立して、Ｈ、−ＯＨ、−ＯＡｃ、および
【００２１】
【化２５】
2004506599.tif 000006
からなる群から選択される。Ｒ５基は、Ｃ１−１２アルキルであり、そしてＲ６、Ｒ７、およびＲ８は、各々独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、およびフェニルからなる群から選択される。本発明はまた、式（Ｉ）を有する特定の新規な３−アミノステロイド化合物に関する。
【００２２】
本発明は、免疫調節性３−アミノステロイド化合物を同定するための方法を含み、この方法は、３−アミノステロイド化合物およびマイトジェンの存在下で、末梢血リンパ球を培養して、細胞凝集物を形成する工程；および細胞凝集物の数を決定する工程を包含し、ここで、免疫調節性３−アミノステロイド化合物の非存在下で培養した末梢血リンパ球と比較した場合、免疫調節性３−アミノステロイド化合物が、細胞凝集物の数を減少させる。
【００２３】
別の実施形態において、本発明はまた、免疫調節性３−アミノステロイド化合物を同定するための方法を含み、この方法は、３−アミノステロイド化合物およびマイトジェンの存在下で、末梢血リンパ球を培養する工程；およびＩＬ−９　ｍＲＮＡのレベルを決定する工程を包含し、ここで、免疫調節性３−アミノステロイド化合物の非存在下で培養した末梢血リンパ球と比較した場合、免疫調節性３−アミノステロイド化合物が、ＩＬ−９　ｍＲＮＡのレベルを減少させる。好ましい実施形態において、末梢血リンパ球は、約１２時間の間、マイトジェンの存在下で培養される。
【００２４】
なお別の実施形態において、本発明は、免疫調節性３−アミノステロイド化合物を同定するための方法を含み、該方法は、３−アミノステロイド化合物および抗原の存在下で、抗原刺激哺乳動物から単離された末梢血リンパ球を培養して、細胞凝集物を形成する工程；および細胞凝集物の数を決定する工程を包含し、ここで、免疫調節性３−アミノステロイド化合物の非存在下で培養した末梢血リンパ球と比較した場合、免疫調節性３−アミノステロイド化合物が、細胞凝集物の数を減少させる。好ましい実施形態において、末梢血リンパ球は、抗原の存在下で、約３日間培養され、そして、抗原刺激哺乳動物は、マウスである。
【００２５】
さらなる実施形態において、本発明は、免疫調節性３−アミノステロイド化合物を同定するための方法を含み、この方法は、ＩＬ−９および３−アミノステロイド化合物の存在下で、ＩＬ−９に応答して増殖する細胞を培養する工程；および細胞増殖のレベルを測定する工程を包含し、ここで、免疫調節性３−アミノステロイド化合物の非存在下で培養した細胞と比較した場合、免疫調節性３−アミノステロイド化合物が、ＩＬ−９によって誘導された細胞増殖のレベルを減少させる。好ましい実施形態において、ＩＬ−９に応答して増殖する細胞は、Ｍｏ７ｅ細胞である。
【００２６】
本明細書に組込まれ、そしてその一部を構成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を例示し、そして説明と一緒になって、本発明の原理を説明するように機能する。
【００２７】
（発明の詳細な説明）
本出願人は、アトピー性アレルギー（ぜん息を含む）および関連障害の診断、予防、または処置において使用され得る、ＩＬ−９経路およびこの経路に影響を及ぼす組成物を解明することによって、当該分野における必要性を解決した。ぜん息は、可逆性の気流閉塞を伴う気道の炎症性障害を含む。アトピー性アレルギーは、アトピーおよび関連障害（ぜん息、気管支過剰応答性（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ　ｈｙｐｅｒｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）、鼻炎、じんま疹、腸のアレルギー性炎症障害、および種々の形態の湿疹を含む）をいう。アトピーは、環境のアレルゲンに対する過敏症であり、これは、コントロールと比較した場合の血清ＩｇＥの上昇またはアレルゲンに対する異常な皮膚試験応答として表される。
【００２８】
アトピー性アレルギー、気管支過剰応答性、ぜん息、および関連障害の病因におけるＩＬ−９の役割を定義付けるさらなる証拠は、ＩＬ−９が、マウスにおける多数の抗原誘導性応答に重要であるという本出願人の観察から直接導き出される。ＩＬ−９の機能が、抗体または３−アミノステロイドによってダウンレギュレートされる場合、動物は、抗原誘導性応答から完全に防御され得る。これらの応答としては、以下が挙げられる：気管支過剰応答性、好酸球増加、気管支洗浄物中の細胞数の上昇、炎症に関連した肺における組織学的変化、および血清ＩｇＥの上昇。アトピー性アレルギーの病因に対して重要であり、かつ、ぜん息に関連したアレルギー性炎症を特徴付ける、このような応答のＩＬ−９機能のダウンレギュレーションによる処置は、本発明の範囲内である。
【００２９】
本出願人は、３−アミノステロイド化合物が、ＩＬ−９刺激に起因するシグナル伝達の阻害においてもまた有用であるということを見出した。本発明において有用な３−アミノステロイド化合物は、米国特許第５，６３７，６９１号および関連の米国特許第５，７３３，８９９号および同第５，７２１，２２６号、ならびに同第５，８４０，７４０号およびその関連の米国特許第５，７９５，８８５号；同第５，７６３，４３０号；同第５，８４０，９３６号；同第５，８７４，５９７号；同第０５，７９２，６３５号；同第５，９９４，３３６号および同第５，８４７，１７２号（これらは特に、本明細書中で参考として援用される）に記載されている。本発明の好ましい実施形態では、３−アミノステロイド化合物Ａ，Ｂ，Ｄ，ＪおよびＬ、ならびに誘導された類似物が、アトピー性アレルギーおよびぜん息の処置のために有用である。アトピー性アレルギーおよびぜん息の処置のために有用である、化合物Ａ，Ｂ，Ｄ，ＪおよびＬから誘導された任意の化合物（コアステロール分子に対する改変を含む）が、本発明に包含される。
【００３０】
本出願人はまた、ＩＬ−９の発現またはＩＬ−９によって制御される機能をダウンレギュレートする化合物についてスクリーニングする方法を提供する。当該分野で標準的な技術を使用することにより、ＩＬ−９によって発現される機能がダウンレギュレートされるか否かを決定し得る（Ｍｉｙａｚａｗａら，（１９９２）Ｂｌｏｏｄ　８０，１６８５−１６９２；Ｙｉｎら，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２６６１４−２６６１７；Ｒｅｎａｕｌｄら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９，５６９０−５６９４；Ｃｈａｎｇら，（１９９４）Ｂｌｏｏｄ　８３，３１９９−３２０５）。１つの実施形態では、血清ＩｇＥが、当該分野において周知の技術（Ｍｅｙｅｒｓら，（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２３，４６４−４７０）を使用して測定され、インビボにおいてＩＬ−９の機能をダウンレギュレートするにおける化合物の効力を評価し得る。別のインビボアッセイでは、気管支過剰応答性および気管支肺胞洗浄物中の好酸球増加が、当該分野において周知の技術を使用して測定され得る（Ｍｅｙｅｒｓら，（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　２３，４６４−４７０）。
【００３１】
さらに別の実施形態では、ＩＬ−９の機能が、インビトロで評価され得る。特定のアッセイは、部分的に、Ｔリンパ球の増殖、ＩＬ−９による肥満細胞からのＩｇＥの合成および放出の調節に基づき得る（Ｒｅｎａｕｌｄら，（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４，４２３５−４２４１；Ｋｅｌｌｅｈｅｒら，（１９９１）Ｂｌｏｏｄ　７７，１４３６−１４４１；Ｈｏｕｓｓｉａｕら，（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４，２６２４−２６３０；Ｍｉｙａｚａｗａら，（１９９２）Ｂｌｏｏｄ　８０，１６８５−１６９２；Ｙｉｎら，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９．２６６１４−２６６１７；Ｒｅｎａｕｌｄら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９，５６９０−５６９４；Ｃｈａｎｇら，（１９９４）Ｂｌｏｏｄ　８３，３１９９−３２０５）。別のアッセイは、ヒトＩＬ−９が、Ｍ０７ｅ細胞において複数のタンパク質の急速かつ一過的なチロシンリン酸化を特異的に誘導する能力に関する（Ｍｉｙａｚａｗａら，（１９９２）Ｂｌｏｏｄ　８０，１６８５−１６９２）。この応答は、ＩＬ−９レセプターの発現および活性化に依存するので、これは、潜在的に有益な化合物の特徴付けのための単純な方法またはアッセイを示す。Ｓｔａｔ３転写因子のチロシンリン酸化は、ＩＬ−９の作用に特異的に関連しているようであり（Ｙｉｎら，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２６６１４−２６６１７）、そしてこの応答は、本発明の範囲内にある化合物の特徴付けのための単純な方法を示す。ＩＬ−９および類似の分子の機能を特徴付けるためのさらに別の方法は、周知のマウスＴＳ１クローンおよびＡＴＣＣから入手可能なＤ１０クローンに関し、これらのクローンは、細胞増殖アッセイでヒトＩＬ−９機能を評価するために使用される（Ｒｅｎａｕｌｄら，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９，５６９０−５６９４）。薬理学的化合物の効果をモニターするためのさらに別の方法は、マイトジェンに刺激された一次リンパ球におけるＩＬ−９発現を測定することによる。ここでは、ＩＬ−９の抑制によって、リンパ球の活性化が妨げられる。
【００３２】
本発明における使用のための例示的な３−アミノステロイド化合物は、以下に示す化学式（Ｉ）を有する：
【００３３】
【化２６】
2004506599.tif 000007
。
【００３４】
式（Ｉ）において、Ｘ基は以下からなる群から選択される：
【００３５】
【化２７】
2004506599.tif 000008
Ｒ１基は以下からなる群から選択される：Ｒ６−ＮＨ２−、
【００３６】
【化２８】
2004506599.tif 000009
Ｒ２基、Ｒ３基、およびＲ４基は、以下からなる群からそれぞれ独立して選択される：Ｈ、−ＯＨ、−ＯＡｃ、および
【００３７】
【化２９】
2004506599.tif 000010
Ｒ５基はＣ１−１２アルキルであり、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、以下からなる群からそれぞれ独立して選択される：Ｈ、Ｃ１−６アルキル、およびフェニル。
【００３８】
本発明の方法において使用される例示的な３−アミノステロイド化合物は、以下を含む：
【００３９】
【化３０】
2004506599.tif 000011
。
【００４０】
さらに本発明はまた、式（Ｉ）の特定の新規の３−アミノステロイド化合物に関する。このような化合物はまた本発明の方法の実施において有用である。これらは以下の式（ＩＩ）の化合物を含む：
【００４１】
【化３１】
2004506599.tif 000012
Ｘ基は、以下からなる群から選択される：
【００４２】
【化３２】
2004506599.tif 000013
Ｒ１は、以下からなる群から選択される：Ｒ６−ＮＨ２−、
【００４３】
【化３３】
2004506599.tif 000014
Ｒ２基、Ｒ３基、およびＲ４基は、以下からなる群からそれぞれ独立して選択される：Ｈ、−ＯＨ、−ＯＡｃ、および
【００４４】
【化３４】
2004506599.tif 000015
Ｒ５基はＣ１−１２アルキルであり、Ｒ６基、Ｒ７基、およびＲ８基は、以下からなる群からそれぞれ独立して選択される：Ｈ、Ｃ１−６アルキル、およびフェニル。
【００４５】
本発明の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物に関連し、ここで、Ｘは以下からなる群から選択される：
【００４６】
【化３５】
2004506599.tif 000016
。
【００４７】
本発明の別の実施形態は、式（ＩＩ）の化合物に関し、ここで、Ｘ基は−ＣＨ２−ＣＯ２−Ｒ５であり、そしてＲ１基は、以下からなる群から選択される：Ｒ６−ＮＨ２−、
【００４８】
【化３６】
2004506599.tif 000017
この実施形態において、Ｒ２基、Ｒ３基、およびＲ４基は、以下からなる群からそれぞれ独立して選択される：Ｈ、−ＯＨ、−ＯＡｃ、および
【００４９】
【化３７】
2004506599.tif 000018
Ｒ５基はＣ１−１２アルキルであり、Ｒ６基、およびＲ７基は、以下からなる群からそれぞれ独立して選択される：Ｈ、Ｃ１−６アルキル、およびフェニル。
【００５０】
なお別の実施形態において、本発明はまた、式（ＩＩ）の化合物に関し、ここで、Ｘ基は−ＣＨ２−ＣＯ２−Ｒ５であり、Ｒ１基は、
【００５１】
【化３８】
2004506599.tif 000019
であり、そしてＲ２基、Ｒ３基、およびＲ４基は、以下からなる群からそれぞれ独立して選択される：Ｈ、−ＯＨ、−ＯＡｃ、および
【００５２】
【化３９】
2004506599.tif 000020
（ただし、Ｒ２基、Ｒ３基、およびＲ４基の少なくとも１つは、
【００５３】
【化４０】
2004506599.tif 000021
である）。この実施形態において、Ｒ５基はＣ１−１２アルキルであり、Ｒ７基は、以下からなる群からそれぞれ独立して選択される：Ｈ、Ｃ１−６アルキル、およびフェニル。
【００５４】
上記の議論の中で、アルキル基が直鎖であり得るし、また枝分かれし得ることが理解される。アルキル基およびフェニル基は、必要に応じてハロゲン、アルコキシ、または水溶性基で置換され得る。「水溶性基」は、水溶液中の化合物の溶解度を増大させる置換基である。例示的な水溶性基としては、４級アミン基、硫酸基、スルホン酸基、カルボキシル基、リン酸基、ホスホン酸基、ポリエーテル基、ポリヒドロキシル基、ホウ素基、およびアミド基（例えば、−ＣＯＮＨ２およびＣＯＮＨＣＨ３）が挙げられるがこれらに限定されない。水溶性基としてまた、スルホ基、スルホンアミド基、カルボンアミド基、スルファモイル基、カルバモイル基、ヒドロキシル基、およびこれらの塩が挙げられる。
【００５５】
さらに、本発明は、本発明の化合物または薬学的に受容可能なキャリアと共にこれらの塩を含む薬学的組成物に関する。薬学的に受容可能なキャリアは、水および油のような滅菌液であり得、石油源、動物源、植物減または合成性の供給源（例えば、ピーナツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油など）の滅菌液が挙げられる。薬学的組成物が静脈内に投与される場合、水は好ましいキャリアである。生理食塩水溶液および水性デキストロースならびにグリセロール溶液もまた、液体キャリア（特に注射可能な溶液）として用いられ得る。適切な薬学的キャリアは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５（同書は特に、本明細書中で参考として援用される）に記載される。
【００５６】
別の実施形態において、本発明の薬学的化合物または組成物は、一組の処方物として提供される。この一組の処方物は、容器または吸入デバイスの中に本発明の薬学的組成物を含み得、そしてぜん息またはアレルギーの症状を示す被験体または患者へのこの組成物の投与のための印刷された説明書を含み得る。一組の処方物はまた、ぜん息またはアレルギーに対する公知の活性を有する別の化合物または組成物と組み合わせて、被験体または患者に個の組成物を投与するための説明書を含み得る。別の形式では、一組の処方物は、この組成物の使用を示すかまたは示唆することが一般的に記載された物質およびぜん息またはアレルギーの症状と診断されたかまたはこの症状を示す患者を処置するために含まれる他の任意の化合物または組成物とともに薬学的処方物を含み得る。
【００５７】
本発明の処置方法において用いられる化合物は、全身にまたは局所に投与され得、これは、処置されるべき状態、部位特異的な処置に対する必要性、投与される薬物の量のような考慮および類似の考慮に基く。
【００５８】
局所投与が用いられ得る。任意の共通の局所用処方物（例えば、溶液、懸濁液、ゲル、軟膏剤、または塗剤など）が用いられ得る。このような局所用処方物は薬学的処方物の分野で十分に記載されており、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅが良い例である。局所適用のために、これらの化合物はまた、粉末剤または噴霧剤（特にエアロゾル形態で）として投与され得る。活性成分は、全身投与に適合された薬学的処方物中で投与され得る。公知のように、薬物が全身投与される場合、粉末剤、丸薬、錠剤など、または経口投与用の特効薬として調製され得る。静脈内投与、腹膜内投与、または病巣内投与のために、この化合物は、注射により投与され得る溶液または懸濁液として調製される。特定の場合、坐薬の形態で、もしくは皮膚または筋肉内注射の下での堆積のための拡大された放出性の処方物としてこれらの化合物を処方することは有用であり得る。好ましい実施形態において、本発明の化合物は、吸入により投与され得る。吸入治療のために、この化合物は、計測された容量の吸入器による投与のために有用な溶液中に存在し得るかまたは、または乾燥粉末吸入器に適切な形態であり得る。
【００５９】
有効量は、ＩＬ−９活性がダウンレギュレートされる量である。所定の有効量は状態間で変化し、特定の例では処置される状態の重症度および処置に対する患者の感受性により変化し得る。したがって、所定の有効量は、慣用された実験を通じた時間および場所で最良に決定される。しかし、本発明に関連するアトピー性アレルギー、ぜん息およびぜん息関連障害の処置において、０．００１と５重量％との間、好ましくは約０．０１〜１重量％を含む処方物が通常治療有効量を構成することが予測される。全身投与される場合、０．０１と１００ｍｇ／ｋｇ体重／日の間の量（しかし、好ましくは約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ）は、たいていの例で治療効果をもたらす。
【００６０】
本発明の他の実施形態は、開示された本発明の詳細および実施により、当業者に明らかとなる。詳細および実施例は、請求の範囲により示される本発明の真の範囲の例示にすぎないとみなされることが企図される。この背景の情報を提供したので、出願人は、次に本発明の好ましい局面を記載する。
【００６１】
（実施例１：ＲＮＡの単離、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ産物のクローニングおよび配列決定）
総細胞ＲＮＡを、ＲＮＡ　ＰＣＲコアキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ　ＣＡ）を用い製造者の説明書に従って、培養されたＰＢＭＣ、マウス脾臓細胞、およびＭ０７ｅ細胞から２４時間後に抽出した。それぞれの供給源由来の１μｇのＲＮＡを、６５℃で５分間変性し、次いで５０ユニット　ＭＬＶ　逆転写酵素、１ユニット／μｌ　ＲＮＡｓｅインヒビター、２．５ｍＭ　ｏｌｉｇｏ　ｄ（Ｔ）１６プライマー、それぞれ１ｍＭずつのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含有する２０μｌの反応混合物を用いて逆転写しｃＤＮＡを生成した。この反応混合物をサーモサイクラー用チューブにピペッティングし、ＰＣＲサーマルサイクラーに設置し、そして１サイクル（４２℃で１５分間、９９℃で５分間、および４℃で５分間）に供した。ｍｏｃｋ逆転写反応物を、ネガティブコントロールとして用いた。
【００６２】
次いでこの混合物を、２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、６５．５μｌ脱イオン水、２．５ユニットのＡｍｐｌｉｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼおよび１μｌ（２０μＭ）のおのおののオリゴヌクレオチド（これらは、ヒトｃＤＮＡ　ＩＬ−９エキソン１（順方向）およびエキソン５（逆方向）に相当する）を含む（終容量１００μｌ）第２のチューブに加えた。この反応混合物を以下のＰＣＲ条件に供した：９８℃で２分間、次いで９４℃で３０秒、５５℃で４０秒、７２℃で４０秒を３０サイクル。最後に反応混合物を、伸長のために７２℃で１５分間、１回サイクルさせた。
【００６３】
ＰＣＲ産物（これはヒトＩＬ−９またはＩＬ−９Ｒ　ｃＤＮＡに相当する）を、１．５％アガロースゲルを通じたゲル電気泳動に供し、そしてエチジウムブロミド染色を用いて可視化した。全ての実験で、ｍｏｃｋ（ＲＮＡを水で置換したもの）逆転写反応産物をネガティブコントロールの増幅として用いた。
【００６４】
（実施例２：Ｍ０７ｅ細胞中のＩＬ−９の生物学的アッセイ）
Ｍ０７ｅ株はヒト巨核芽球細胞株であり、ＲＰＭＩ−１６４０、２０％胎児ウシ血清および１０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）で培養される。この細胞株は、ＩＬ−９を含むサイトカインに応答する。この細胞を培養および分割し、７２時間毎に２×１０５細胞／ｍｌにした。
【００６５】
この細胞を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、そして０．５％ウシ血清アルブミンおよびインスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）コファクター（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ））を含むＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁した。細胞を血球計数器を用いて計数し、そして１×１０５細胞／ｍｌの濃度に希釈し、そして９６ウェルマイクロタイタープレートにプレートした。それぞれのウェルは２×１０４細胞／ウェルを含んだ。この細胞を５０ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子（ＳＣＦ）のみ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦおよび５０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）、または５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦおよび５０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−９で刺激した。細胞および基本的な培地のみを含有するコントロールをインキュベートした。試験化合物の段階希釈物をそれぞれの試験条件に加えた（３連）。培養物を、５％ＣＯ２の下、３７℃で７２〜９６時間インキュベートした。
【００６６】
細胞増殖を、Ａｂａｃｕｓ（登録商標）細胞増殖キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（これは細胞内酸性ホスファターゼの存在量を細胞数の指標として決定する）を用いてアッセイした。基質であるｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）を、酸性ホスファターゼによりｐ−ニトロフェノールに変換し、これを酵素濃度の指標として測定した。ｐＮＰＰをそれぞれのウェルに加え、３７℃で１字間インキュベートした。次いで水酸化ナトリウムを加えて酵素反応を停止し、ｐ−ニトロフェノールの量を、Ｄｙｎａｔｅｃｈ（登録商標）２０００プレートリーダーを用い、４１０ｎｍの波長で定量した。任意の吸光度と細胞数を比較する標準曲線を用いて、アッセイの直線の範囲を決定した。吸光度の測定がアッセイの直線の範囲内にある場合にのみ、アッセイの結果を用いた。
【００６７】
図１は、米国特許第６，６３７，６９１号；同第５，７３３，８９９号；同第５，７２１，２２６号および同第５，８４０，７４０号に記載されるような（これらは本明細書中で参考として援用される）、インビロトでのＭ０７ｅ細胞のＩＬ−９依存性増殖に対するサメ肝臓由来の単離アミノステロール（図２）の効果を示す。それぞれの３−アミノステロイドを、培養培地中の２０μｇ／ｍｌで、Ｍ０７ｅ細胞と共にインキュベートし、ＩＬ−９により誘導される細胞増殖の阻害を、コントロールの条件（処置なし）と比較することにより決定した。この処置のいずれかに伴う細胞毒性についての証拠はなかった。３−アミノステロイド３および６（図２）は、一貫して大きな増殖阻害を提供した。
【００６８】
（実施例３：インビトロでの免疫調節性３−アミノステロイドの同定）
免疫調節性３−アミノステロイド（図３〜７および表１）を、代表的な同種性または異種性の凝集およびその後のマウスまたはヒトリンパ球を刺激する分裂促進剤または抗原の増殖を阻害する能力に基き、インビトロで同定した。ヒトまたはマウスリンパ球を、記載される（Ｓｔｏｅｃｋｅｒｔら、（１９９０）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１８、１１６４−１１７０）ようにＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅにより末梢血から単離した。分裂促進剤の刺激については、１×１０５細胞／ウェルを、３−アミノステロイドの量を変化させてプレートし、ＰＨＡ−ＰＭＡ分裂刺激剤による刺激の１２時間後に凝集および増殖についてアッセイした。ウェルを１００より多い細胞の凝集について顕微鏡で計数して凝集を評価し、そして増殖を、トリチウム含有チミジンの取り込みを用いて決定し、製造者により提案されるＰａｃｋａｒｄ　Ｔｏｐ　Ｃｏｕｎｔで分析した。抗原の刺激については、３週間Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ抗原に対して感作したリンパ球をＢＡＬＢマウスから単離し、そして１００ユニットのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ抗原を加えたものと加えないものを１×１０５細胞／ウェルでプレートした。細胞を３日間培養し、次いで漸増量の化合物Ｂまたはアナログ化合物の存在下または非存在下で、上記のように細胞の凝集および増殖を記録した。化合物Ｂおよび化合物Ａは、高度に類似する化合物Ｄ（ＩＣ５０＝１０μｇ／ｍｌ）およびＥ（ＩＣ５０＞１０μｇ／ｍｌ）よりも低用量（それぞれＩＣ５０＝２．５μｇ／ｍｌおよび０．５μｇ／ｍｌ）でリンパ球の凝集（図１１）および増殖（図１２）を抑制し得た。さらに、分裂促進剤で刺激されたリンパ球の化合物ＡまたはＢによる処置は、コントロール化合物Ｅの効果と比較して、これらの培養物中でＩＬ−９の発現をブロックすることが見出された（図１３）。類似する結果が、化合物に対する抗原媒介の応答を用いるアッセイにおいて得られた（示していない）。これらのデータは、凝集および増殖の両方のアッセイは、この３−アミノステロイドファミリーについての構造−活性の関係を決定するために有用である。表Ｉは、上記のアッセイにおける他の３−アミノステロイド化合物の活性を示す。表Ｉに示される活性化合物および図８〜１０に示されるこれらの化合物の合理的な改変はすべて、本発明の実施形態である。
【００６９】
（実施例４：ぜん息応答の抑制における免疫調節性の３−アミノステロイドの効力）
ＤＢＡ２、Ｃ５７ＢＬ６またはＢ６Ｄ２Ｆ１マウス（５〜６週齢）を、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　ＩｎｓｔｉｔｕｔｅまたはＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｒｉｅｓから得た。動物を、ウイルスフリーおよび抗原フリーの設備中で、層流フードで濾過された高い効果を有する粒子中で飼育し、実験操作前の３〜数日間固形の齧歯類用飼料および水の入手を可能にした。動物施設を２２℃に維持し、そして明：暗のサイクルを自動的に制御した（１０：１４時間のサイクル）。
【００７０】
表現型決定および前処理の効果。前処理を受けていないかまたは、の動物を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ抗原の鼻からの吸入により感作し、気管支の反応性亢進、気管支肺胞の洗浄および血清ＩｇＥに対する効果を評価した。マウスを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたは食塩水を鼻腔内で用いてチャレンジさせ（月曜日、水曜日、および金曜日に行い、これを３週間続ける）、そして最後の投与後２４時間表現型発現させた。アミノステロイドによる前処理の効果を用いて、マウスにおけるＩＬ−９経路のダウンレギュレートの効果を評価した。気管支収縮の応答を決定するために、呼吸器系圧を気管で測定し、そして薬物にさらす前およびその途中で記録した。マウスを麻酔し、以前に記載されたように準備した（Ｋｌｅｅｂｅｒｇｅｒら、（１９９０）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５８、Ｌ３１３−３２０；Ｌｅｖｉｔｔら、（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ　２５、６１−６３；Ｅｗａｒｔら、（１９９５）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．７９、５６０−５６６）。気道の応答性を、以下の１つ以上に対して測定した：５−ヒドロキシトリプタミン、アセチルコリン、アトラクリウム、または基質−Ｐアナログ。気管支反応性チャレンジ後の呼吸圧のピークにおける変化の単一性で反復可能な測定を用いた（これはＡｉｒｗａｙ　Ｐｒｅｓｓｕｒｅ　Ｔｉｍｅ　Ｉｎｄｅｘ（ＡＰＴＩ）を呼ばれる）。ＡＴＰＩを、注射時から圧力のピークが基準線に戻るかまたは停滞状態になるまでを総和した呼吸圧のピークにおける変化により評価したＡＴＰＩは、気道耐性に匹敵したが、ＡＰＴＩは気管支応答からの回復に関連するさらなる要素を含む。
【００７１】
屠殺する前に、全血を麻酔した動物の下大静脈の鍼穴を用いて血清Ｉｇ測定のために回収した。サンプルを遠心分離して細胞を分離し、そして血清を回収し、そして総ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＥレベルの測定に用いた。測定に用いないサンプルは、すぐに−２０℃で凍結させた。
【００７２】
血清Ｉｇを、ＥＬＩＳＡ抗体サンドイッチアッセイを用いて測定した。マイクロタイタープレートを、ラット抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＥ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を用い、アジ化ナトリウムを含む炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリウムのコーティング緩衝液に２．５μｇ／ｍｌの濃度、５０μｌ／ウェルでコーティングした。プレートをプラスチックラップで覆い、そして４℃で１６時間インキュベートした。このプレートを、リン酸緩衝生理食塩水に０．０５％　Ｔｗｅｅｎ−２０を含む洗浄緩衝液を用いて３回洗浄した（各洗浄のために５分間インキュベートした）。非特異的な結合部位のブロッキングを、リン酸緩衝生理食塩水（５％ウシ血清アルブミン）を２００μｌ／ウェル追加し、プラスチックラップで覆い、そしえ３７℃で２時間インキュベートすることにより達成した。洗浄緩衝液での３回の洗浄後、２連の５０μｌの試験サンプルをウェルに加えた。試験サンプルを、洗浄緩衝液（５％ウシ血清アルブミン）を用いて１：１０、１：５０、および１：１００に希釈した後にアッセイした。試験サンプルに加えて、洗浄緩衝液（５％ウシ血清アルブミン含有）中の種々の直線濃度での標準Ｉｇセット（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）を、標準曲線を作成するためにアッセイした。サンプルを含まないブランクまたは標準を用いて、プレートリーダーをゼロ（バックグラウンド）にした。サンプルおよび標準物質添加後、プレートをプラスチックカバーで覆い、そして室温で２時間インキュベートした。洗浄緩衝液による３回の洗浄後５０μの二次抗体（ラット抗マウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＥ−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体）を、洗浄緩衝液（５％ウシ血清アルブミン含有）の濃度２５０ｎｇ／ｍｌで添加した。このプレートをプラスチックラップで覆い、室温で２時間インキュベートした。洗浄緩衝液を用いて３回洗浄した後、０．１Ｍクエン酸緩衝液中の１００μｌの基質（０．５ｍｇ／ｍｌ　ｏ−フェニレンジアミン）をそれぞれのウェルに添加した。５〜１０分後、５μｌの１２．５％硫酸を用いて反応を停止し、Ｄｙｎａｔｅｃｈ（登録商標）プレートリーダーを用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。標準物質を用い、標準曲線を構築した（Ｘ軸に抗原濃度（対数スケール）、Ｙ軸に吸光度（直線スケール））。サンプル中のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＥの濃度を、標準曲線から得た。
【００７３】
気管支肺胞洗浄および細胞分析を以前に記載されたように実施した（Ｋｌｅｅｂｅｒｇｅｒら、（１９９０）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２５８、Ｌ３１３−３２０）。肺を麻酔下で除去した後、肺組織学を実施した。以前の機器は人工産物を誘導し得るので、別々の動物をこれらの研究のために使用した。したがって、小グループの動物を、種々の前処理を実行した同齢集団（気管支反応性試験とは別の他の試験に用いられていない動物を除く）と正確に同じように並行処理した。気管支反応性試験後、肺を除去し、そして液体窒素中に沈めた。凍結切片実験および組織学実験を、当業者に明らかな様式で実行した。
【００７４】
インビトロで同定された活性化合物が、上に記載のアッセイを用いて気道の過剰応答性、肺における好酸球増加症、および血清Ｉｇレベルを抑制するこれらの能力についてインビボで試験した。動物は、抗原に対して感作されていない、または感作されているかのいずれかであり、そして３−アミノステロイド化合物ｉｐが、１もしくは１０ｍｇ／ｋｇ／日で３週間、または２．５ｍｇ／ｋｇを１週間に２回で、４週間のいずれかで、投与した。喘息型の応答を抑制するこれらの化合物の能力は、図１４〜１９のデータにより明示される。図１４は、化合物Ｂおよび化合物Ｄの両方が、Ｄ２未投薬（ｎａｉｖｅ）のマウスにおいて気管支の過剰応答性（これは、増大した肺におけるＩＬ−９レベルに起因する過剰応答性である（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓら、（１９９７）　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４，　１３１７５−１３１８０））を抑制する際に、有効であることを明示し、そして化合物Ｂが、より低い投与量において化合物Ｄに比べ有効であることを明示している。図１５は、３−アミノステロイド化合物Ａが、抗原に対して感作されたマウスにおいて気道の過剰応答性をブロックし得ることを示しており、そしてこれが、一般に使用されているコルチコステロイドであるデキサメタゾン（Ｄｅｘ）に比べ、より有効である。図１６は、好酸球が、化合物Ａにより影響を受ける特別な細胞の型であったことを明示しており、そしてこの化合物が、ＴＨ２−アレルギー性応答に関係する細胞に作用すること示唆している。ＴＨ２−アレルギー性応答の阻害はまた、図１７および１８で示さており、ここでは、全ての血清、ＩｇＧ１およびＩｇＥは抑制されたが、ＴＨ１関連免疫グロビンＩｇＧ２ａは抑制されなかった。図１９は、３−アミノステロイド化合物Ａが、２．５ｍｇ／ｋｇを一週間に２度投与するほどの少ない投薬量により、気道の過剰応答性をブロックし得ることを示している。要約すると、これらのデータは、３−アミノステロイド化合物および誘導されたアナログは、大変低い薬剤濃度で喘息性の応答を阻害する可能性を有し、そして、ヒト患者での副作用の発生率が低い喘息の処置として有用であることを示唆している。
【００７５】
（実施例５）
（免疫調節性３−アミノステロイドのインビボにおける作用機構）
３−アミノステロイド化合物が、アレルゲンに対して喘息性応答を抑制するために機能する機構の決定は、比較生理学的アッセイ（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ　ａｓｓａｙｓ）が、広範に研究されたＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットモデル（Ｓｃａｃｃｉａｎｏｃｅら、（１９９５）　Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　６２、３２−３８；Ｈａｔｚｉｎｇｅｒら、（１９９６）　Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　６４，　３４９−３５６）を用いて実施された。動物に、１ｍｇ／ｋｇ／日の、コルチコステロイドであるデキサメタゾンまたは化合物Ｂのいずれかが投与し、そして十時間後に、コルチコステロンおよびＡＣＴＨについて分析した。図２０に示されるように、デキサメタゾンは、処置後８〜１０時間で血漿コルチコステロンの絶対レベルを有意に抑制した（＞４５０倍）が、その一方化合物Ｂでは、有意な効果はなかった。同様の結果は、ＡＴＣＨのレベル（＞１００倍）についても見出され、デキサメタゾンとは異なる機構により化合物Ｂが作用することを支持する。より長い研究（ここでは、薬剤が２８日間投与され）は、動物はデキサメタゾンより、３−アミノステロイド化合物に対して耐性であることを明示し、ここで体重減少および脾臓の萎縮を観察した（図２１）。同様なデータが、化合物Ａまたは化合物Ｂ（１日につき１０ｍｇ／ｋｇで、２２日間）のいずれかの有効量により処置されたマウスにおいて得られ、ここでは、デキサメタゾン処置とは対照的に、脾臓の萎縮は観察されなかった。実施例２、３、および４から得られたデータを合わせたデータは、３−アミノステロイド化合物は、新規の抗炎症性および抗喘息性の化合物であり、これはアレルゲン感作に対する生物学的応答を抑制するステロイドのデキサメタゾンクラスの機構とは違った、機構により機能するように見えることを明示している。
【００７６】
（実施例６）
（３−アミノステロイダルエステル（３−ａｍｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄａｌ　ｅｓｔｅｒ））
調製されたアナログの大部分は、適切なポリアミンおよびステロイダルエステル（ｓｔｅｒｏｉｄａｌ　ｅｓｔｅｒ）（図３）を使用する、以前に記載された方法（Ｊｏｎｅｓら、（１９９６）Ｓｔｅｒｏｉｄｓ　６１，５６５−５７１）から利用可能である。さらに、３−アミノステロイドを調製する一般的な方法はまた、以前から記述されてきた（Ｚａｓｌｏｆｆら、（１９９９）米国特許第５，８５６，５３５号）。これらは、本明細書中で全体が参考として援用される。
【００７７】
多くの３−アミノステロイドのアナログが、Ｃ２２アミン５のアセチル化またはスルホニル化を介して調製され、以下の概略のように調製した。化合物１および２の調製は、以前から記載されてきた（Ｒａｏら、（１９９７）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２、４５４１−４５４５）。
【００７８】
（２２−アミンのアシル化またはスルホニル化を介して調製されたアナログ）
【００７９】
【化４１】
2004506599.tif 000022
（化合物３の調製）
化合物２（５．５ｇ、１４．６ｍｍｏｌ）うぃＴＥＡ（５ｍｌ）を含有するＴＨＦ（１００ｍｌ）に加え、そして、メタンスルホニルクロライド（ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）（２．０ｇ、１７．５ｍｍｏｌ）を小滴状（ｄｒｏｐｗｉｓｅ）で氷浴冷却を用いて加えた。反応は、３０分後にシリカゲル上のＴＬＣ（６０／４０のヘキサン／酢酸エチルを用いて溶出）により完全であると判断された。反応混合物は、トルエン（１００ｍＬ）および飽和炭酸水素ナトリウムの添加によりワークアップした。有機層を、炭酸水素ナトリウムおよび０．１Ｍ　ＨＣｌ溶液を用いて交互に洗浄した。プールされた有機層は、次いで、硫酸ナトリウム上で乾燥し、黄白色の固体として粗化合物３（５．４ｇ、１１．９ｍｍｏｌ、８１％）を得た。粗メシレート（ｍｅｓｙｌａｔｅ）（３）がさらなる精製をすることなく、次に続けた。
【００８０】
（化合物４の調製）
粗メシレート（５．０ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）がＤＭＳＯ（１５０ｍｌ）に添加した。アジ化ナトリウム（２．５ｇ、３８．５ｍｍｏｌ）を加え、そしての反応物を、シリカゲル上のＴＬＣにより完全であると判断できるまで（約４時間）、６０℃で加熱した。この反応物を、５５０／５０のヘキサン／酢酸エチル（約２００ｍＬ）の添加によりワークアップした。有機層は、ＤＭＳＯを除去するために水を用いて繰返し洗浄した。有機層は、硫酸ナトリウム上で乾燥して、そして溶媒を減圧下で除去し、粗アジ化合物４（４．２ｇ、１０．４ｍｍｏｌ、９４％）をさらなる精製をすることなく、次に続けた。
【００８１】
（化合物５の調製）
粗アジド４（４．２ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）を、２５０ｍＬのパー（Ｐａｒｒ）フラスコ中でＴＨＦ（１００ｍＬ）に溶解した。この触媒（４００ｍｇ、５％炭素担持パラジウム）を、Ｎ２の通気下、湿った状態で加えた。フラスコは、５０ｐｓｉでＨ２を導入する前に、Ｎ２でパージした。反応物は、室温で８時間にわたり水素化した。反応物をＣｅｌｉｔｅ（登録商標）を通した濾過によりワークアップし、Ｃ２２−アミン５（３．９ｇ、１０．３ｍｍｏｌ、９９％）（これは、十分な純度である）を得た。
【００８２】
（化合物５のアシル化の一般的な手順）
アシル化は、同様の手順を介して実行した。化合物５（約５００ｍｇ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解し、そしてＴＥＡ（２ｍＬ）を加えた。フラスコは、氷水浴中で冷却し、そしてアセチル化剤（約２当量）が、小滴状で加えた。この反応を、シリカゲル上のＴＬＣ（２０／ｌのクロロホルム／メタノールを用いて溶出）で追った。使用したアシル化剤は、メタンスルホニルクロライド、メチルクロロホルメート、ピロリジンカルボニルクロライドである。この反応が完結したと判断した後に、２０％ＴＦＡ水溶液（約２０ｍＬ）をフラスコに加える。沈澱が起こった場合、アセトンをステロールが、再び溶解するまで加えた。酸溶液を約２時間攪拌し、５０／５０のトルエン／酢酸エチル中に抽出することによりワークアップした。有機層を、水および飽和炭酸水素ナトリウムを用いて洗浄して、硫酸ナトリウム上で乾燥して、減圧下でエバポレートした。これにより、粗３−オキソ−２２−スルホンアミド（化合物６、４３７ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ、７３％）、カルバミン酸塩（化合物７、４７７ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ、８１％）および尿素（化合物８、５４４ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ、８６％）の十分な純度の誘導体が得られた。
【００８３】
（実施例７）
（アシル化またスルホニル化した２２−アミンから調製される３アミノステロイド）
化合物Ｆ、Ｇ、Ｉ（図４）をアシル化した、またはスルホニル化した２２−アミンから調製した。
【００８４】
（化合物６、７および８の還元的アミノ化）
還元的アミノ化を同様の手順により達成した。ステロール（化合物７および８のための６．２ｇの化合物のための、５００ｍｇ）を、２−プロパノール（２５ｍＬ）に溶解した。エチレンジアミン（１ｍＬ）をこのフラスコに添加した。３−オキソ−ステロールおよびエチレンジアミンを、約４時間、室温において攪拌した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ　ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）（化合物６のための２５０ｍｇおよび化合物７および８のための１００ｍｇ）を２−プロパノール（２ｍＬ）および酢酸（１ｍＬ）に溶解した。シアノ水素化ホウ素ナトリウム溶液を、ガスの発生がほとんど止まった後（約５分間）に、反応フラスコに添加した。全ての場合において、最初のＴＬＣ（５分未満）の前に、反応は完結した。ワークアップは、全てのアナログに対して同じものであり、溶液は、炭酸緩衝液を加えることにより、塩基性（ｐＨ１０〜１１）とした。水層は繰返しクロロホルムを用いて抽出した。クロロホルムは減圧下で除去し、そして粗３−アミノステロイドを１０％アセトニトリル／水に溶解し、ＴＦＡを用いて酸性化した。化合物Ｉの溶解度は大変乏しい。この溶液を４５μＧｅｌｍａｎ　ｖａｃｕ−ｃａｐ　フィルターに通した。３−アミノステロイド異性体を、全体に亘って、０．１％ＴＦＡ含有のアセトニトリル水溶液の勾配を使った、Ｃ１８について逆相クロマトグラフィー（Ｄｙｎａｒｎａｘ，３００，８　μＭ．２１．６　ｍｍ　ＩＤ，２５　ｃｍ／Ｌ）により分離した。スルホンアミド（Ｇ）およびスルホンアミド（Ｆ）の異性体の分離は、比較的に容易に達成できたが、その一方、メチルカルバミン酸塩（Ｈ）のみが、明瞭に分離された。尿素アナログについて、この異性体を効率的に、Ｃ１８についてのクロマトグラフィーにより分離することはできなかった。尿素誘導体を、生物学的試験に混合異性体（Ｉ）として提示した。
【００８５】
（化合物Ｆ、Ｇ、ＨおよびＩについての分析）
化合物Ｆ：１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨＺ，ＣＤ３ＯＤ）：０．７４（ｓ，３Ｈ）、０．８９（ｓ，３Ｈ）、１．０４（ｄ，３Ｈ、Ｊ＝６．７Ｈｚ）、２．７５（ｍ，１Ｈ）、２．９４（ｓ、３Ｈ）、３．１〜３．３（ｍ，溶媒のシグナルに重なった）；ＭＳ（ＥＳ）［ＭＡ＋Ｈ］＋：４５４；分析計算値Ｃ２５Ｈ４７Ｎ３Ｏ２Ｓ−２ＴＦＡ−０．８Ｈ２Ｏ：Ｃ５０．０３％、Ｈ７．３３％、Ｎ６．０４％．実測値：Ｃ４９．９８％，Ｈ７．１０％，Ｎ６．００％
化合物Ｇ：１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨＺ，ＣＤ３ＯＤ）：０．７４（ｓ，３Ｈ），０．８８（ｓ，３Ｈ），１．０２（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），２．７５（ｄのｄ，ＩＨ，Ｊ１＝ｌ０Ｈｚ，Ｊ２＝２Ｈｚ），２．９４（ｓ，３Ｈ），３．１５（ｄのｄ，Ｊ１＝１０Ｈｚ，Ｊ２＝２Ｈｚ），３．４８（シープなｍ，１Ｈ）；ＭＳ（ＥＳ）［Ｍ＋Ｈ］＋：４５４；分析計算値Ｃ２６Ｈ４７Ｎ３Ｏ２Ｓ−２ＴＦＡ−０．８Ｈ２Ｏ：Ｃ５０．０３％，Ｈ７．３３％，Ｎ６．０４％．実測値：Ｃ５０．２３％，Ｈ７．３８％，Ｎ６．０５％
化合物Ｈ：１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨＺ，ＣＤ３ＯＤ）：０．７４（ｓ，３Ｈ），０．９０（ｓ，３Ｈ），０．９７（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），２．７５（ｄのｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１０Ｈｚ，Ｊ２＝Ｈｚ），３．２０（ｍ，２Ｈ），３．６６（ｓ，３Ｈ）；ＭＳ（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ］：４３４；分析計算値　Ｃ２６Ｈ４７Ｎ３Ｏ２−２ＴＦＡ−１．５Ｈ２Ｏ：Ｃ５２．３２％，Ｈ７．６１％，Ｎ６．１０％．実測値：Ｃ５２．１０％，Ｈ７．３１％．Ｎ５．７８％．
化合物Ｉ：１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨＺ，ＣＤ３ＯＤ）：０．６９（ｓ，３Ｈ）．　０．８４　（ａ，３Ｈ，混合異性体由来の２シグナル）、０．９３（ｄ，３Ｈ、Ｊ＝６．７Ｈｚ）、２．７５（ｍ，１Ｈ），３．１０〜３．３０（溶媒のピークに重なった）、３．４５（シャープなｍ）；ＭＳ（ＦＡＢ）［Ｍ＋Ｊ］＋：４７４；分析計算値Ｃ２９Ｈ５２Ｎ４Ｏ−２ＴＦＡ−２Ｈ２Ｏ：Ｃ５３．７９％，Ｈ７．９３％，Ｎ７．６０％．実測値：Ｃ５３．９１％、Ｈ７．３５％、Ｎ７．７４％。
【００８６】
（実施例８）
（２２アルデヒドを介した、３−アミノステロイドアナログの調製）
【００８７】
【化４２】
2004506599.tif 000023
（化合物１３の調製）
化合物１（５．０ｇ，１５．２ｍｍｏｌ）を、ジクロロメタン（１００ｍＬ）に溶解し、クロロクロム酸ピリジニウム（ｐｙｒｉｄｉｎｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｏｃｈｒｏｍａｔｅ）（６．５ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）を反応物の一部分に加えた。反応物を、室温で、磁気的に約６時間攪拌して、反応物を徐々に５％亜硫酸水素ナトリウムを加えることにより、ワークアップした。有機相を、炭酸水素ナトリウム溶液、最終的には食塩水を用いて繰返し洗浄した。有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥して、溶媒を減圧下で除去して化合物１３（４．３ｇ、１３．１ｍｍｏｌ、８６％）を黄白色の固体として生成した。
【００８８】
（化合物１６の調製）
テトラエチルホスホン酸メチレン（ｔｅｒａｅｔｈｙｌ　ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）（１．４４ｇ，５ｍｍｏｌ）を１０ｍＬの無水ＴＨＦに加えた。ナトリウムｔ−ブトキシド（Ｓｏｄｉｕｍ　ｔ−ｂｕｔｏｘｉｄｅ）（４８０ｍｇ，５ｍｍｏｌ）を、一部分、そのフラスコに加えた。
その溶液を、約３０分間攪拌して、ホスホン酸カルバニオン（ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ　ｃａｒｂａｎｉｏｎ）の完全な形成を確認した。化合物１３（１．６０ｇ、４．８ｍｍｏｌ）を最少ＴＨＦに溶解して、そしてこれを反応容器に、添加用の漏斗を介して小滴状で、５分間かけて加えた。反応物を３０分間、室温で攪拌した。反応物を、５０／５０のトルエン／酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えてワークアップした。有機相を、繰返し０，１ＭＮａＯＨ溶液と、次いで塩水で洗浄した。有機相を、硫酸ナトリウム上で乾燥して、溶媒を減圧下で除去し、化合物１６（１．４８ｇ、３．２ｍｍｏｌ、６７％）を白色の結晶状固体として生成した。
【００８９】
（化合物１７の調製）
化合物１６（１．４８ｇ，３．２ｍｍｏｌ）を酢酸エチル（５０ｍＬ）で溶解し、そしてＰａｒｒフラスコ中に加えた。フラスコは窒素でパージし、そして５％炭素担持パラジウム（２８０ｍｇ）をフラスコに加えた。フラスコを排気し、そして５０ｐｓｉのＨ２で満たした。フラスコは、室温で一晩（約１４時間）振盪した。反応物をＣｅｌｉｔｅ−７（登録商標）の床を通して濾過し、完全にフィルターケーキ（ｃａｋｅ）を酢酸エチルで洗浄することにより、ワークアップした。濾液を、減圧下でエバポレートして、化合物１７を白色結晶状固体（１．４１ｇ、３．１ｍｍｏｌ、９７％）として得た。
【００９０】
（化合物１９の調製）
ホスホン酸カルバニオンを、２−（ジエチルホスホノ）−ブチロラクトン（２５ｇ，１２０ｍｍｏｌ）（これは、２−ブロモブチロラクトン（２−ｂｒｏｍｏｂｕｔｙｒｏｌａｃｔｏｎｅ）およびトリエチルホスファイト（ｔｒｉｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｉｔｅ）のニート（ｎｅａｔ）な混合物を加熱することにより調製された）を、ＴＨＦ（１．２Ｌ）に加えることにより、調製した。ナトリウムｔ−ブトキシド（１１．５ｇ，１２０ｍｍｏｌ）を氷浴冷却を用いて、加えた。反応物を放置して、室温まで３０分間にわたり暖めて、ホスホン酸カルバニオンの完全な形成を確認した。化合物１８（２５．０ｇ、７６．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２００ｍｌ）に溶解し、そしてこの反応物混合物に加えた。この反応混合物を熱し、約１６時間還流した。反応物を、減圧下でいくらかのＴＨＦ（約７００ｍＬ）を除去することよりワークアップした。次いで、トルエン（５００ｍＬ）を加え、そしてこの溶液を、０．１Ｍ　ＮａＯＨ溶液および水を用いて繰返し洗浄した。有機相は硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして溶媒は減圧下で除去した。結果として生じた固体は、ヘキサン／酢酸エチルから再結晶され、混合Ｅ、Ｚ異性体１９を、黄白色の固体（２５．７ｇ，６４．５ｍｍｏｌ，８５％）として生成した。
【００９１】
（化合物１５の調製）
化合物１９（２３．０ｇ，５７．８ｍｍｏｌ）　をＴＨＦ／トルエン３／１（約１Ｌ）に溶解した。その溶液を、次いで、アンモニア（１．２Ｌ）に−７８℃で加えた。リチウムワイヤー（Ｌｉｔｈｉｕｍ　ｗｉｒｅ）を反応物に、深い青色が持続するまで加えた。反応物を加熱し、３０分間還流して、−７８℃まで冷却し、次いで、塩化アンモニウムを加えることにより急冷した。アンモニアを、一晩煮沸することにより除去された。残余物を、激しく攪拌すしながら１．０Ｍ　ＨＣＩ溶液（５００ｍＬ）を加えることにより、酸性化し、そして、さらにトルエン（５００ｍＬ）を追加した。有機相−水相界面に有意な量の不溶性物質を得、その物質はＣｅｌｉｔｅ−７（登録商標）により濾過した。濾液は分液漏斗に加え、そして、有機相を繰返し０．１Ｍ　ＨＣＩで洗浄し，その後炭酸水素ナトリウム溶液と塩水で洗浄した。有機相は、硫酸ナトリウム上で乾燥し、そして溶媒は、減圧下で除去し、化合物１５をＣ２３での異性体の混合物（１４．３ｇ，３６．２ｍｍｏｌ、６３％）
（化合物１５および１７の還元的アミノ化）
化合物１５および１７から調製された３−アミノステロイドアナログ、化合物Ｊ、Ｋ、ＬおよびＭが図５に示されている。これらの化合物に対する反応物および単離物は全て、以前にＦ、Ｇ、ＨおよびＩの調製について記載した化合物と実質上同一である。唯一の変化は様々な調製が行われたスケールであり、そして使用さえたポリアミンである；エチレンジアミンを、ある場合にはホモピペリジンで置換えた（化合物Ｍ）。
【００９２】
（化合物Ｊ、Ｋ、ＬおよびＭの分析）
化合物Ｊ：１ＨＮＭＲ（４００ＭＨＺ、ＣＤ３ＯＤ）：０．７４（ｓ、３Ｈ）、０．９０（ｓ、３Ｈ）、１．０４（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝６．７Ｈｚ）、２．４５（ｍ、１Ｈ）、２．６４（ｍ、１Ｈ）、３．１７（ｍ、１Ｈ）３．６８（ｍ、１Ｈ）、４．２１（ｍ、１Ｈ）、４．３０（ｍ、ＩＨ）；ＭＳ（ＦＡＢ）［Ｍ＋Ｈ］＋４４５；分析計算値Ｃ２８Ｈ４８Ｎ２Ｏ２−２ＴＦＡ−ｌ．０Ｈ２Ｏ：Ｃ５５．６４％、Ｈ７．５９％、Ｎ４．０６％．実測値：Ｃ５５．７５％、Ｈ７．４１％、Ｎ４．１７％．
化合物−Ｋ：１ＨＮＭＲ（４００ＭＨＺ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：０．７４（ｓ、３Ｈ）、０．９０（ｓ、３Ｈ）、１．０４（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝６．７Ｈｚ）、２．３５（ｍ、１Ｈ）、２．６０（ｍ、１Ｈ）、３．１７（シャープなｍ、４Ｈ）、４．１２（ｍ、１Ｈ）、４．２６（ｍ、１Ｈ）；ＭＳ（ＦＡＢ）［Ｍ＋Ｈ］＋：４４５；分析計算値Ｃ２８Ｈ４８Ｎ２Ｏ２−２ＴＦＡ−１．０Ｈ２Ｏ：Ｃ５５．６４％、Ｈ７．５９％、Ｎ４．０６％．実測値：Ｃ５５．４３％、Ｈ７．６３％、Ｎ４．１０％．
化合物−Ｌ：１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨＺ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：０．７２（ｓ、３Ｈ）、０．８０（ｓ、３Ｈ）、０．９４（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝６．７Ｈｚ）、１．２１（ｔ、６Ｈ、Ｊ＝６．７Ｈｚ）、３．１０〜３．２５（ｍ、４Ｈ）、３．９５（ｄのｄ、４Ｈ、Ｊ１＝６．７Ｈｚ、Ｊ２＝２Ｈｚ）、ＭＳ（ＦＡＢ）［Ｍ＋Ｈ］−：５１１；分析計算値Ｃ２９Ｈ５５Ｎ２Ｏ３Ｐ−２ＴＦＡ−１．０Ｈ２Ｏ：Ｃ５２．３７％、Ｈ７．８６％、Ｎ３．７０％．実測値：Ｃ５２．５８％、１１７．８２％、Ｎ３．５３％．
化合物−Ｍ：１ＨＮＭＲ（４００ＭＨＺ、ＤＭＳＯ−ｄ６）：０．７２（ｓ、３Ｈ）、０．７９（ｓ、３Ｈ、混合異性体からの２つのシグナル）、０．９４（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝６．７Ｈｚ、２シグナル）、２．３１（ｍ、１Ｈ）、２．５５（ｍ、１Ｈ）、３．１５〜３．７２（ｍ、８Ｈ）、４．１０（ｍ、ＩＨ）、４．２６（ｍ、１Ｈ）；ＭＳ（ＦＡＢ）［Ｍ＋Ｈ］＋：４８５；分析計算値Ｃ３１Ｈ５２Ｎ２Ｏ２−２ＴＦＡ−２．０Ｈ２０：Ｃ５６．１４％．Ｈ７．８１％、Ｎ３．７４％．実測値：Ｃ５６．３４％、Ｈ７．１４％．Ｎ３．７９％．
（実施例９）
（化合物１とのＭｉｔｓｕｎｏｂｕ反応を介した３−アミノステロイドの調製）
【００９３】
【化４３】
2004506599.tif 000024
（化合物２４の調製）
化合物１（５．０ｇ，１５．０ｍｍｏｌ）を、無水ＴＨＦ（７５ｍＬ）に溶解して，そして２−ヒドロキシピリジン（２−ｈｙｄｒｏｘｙｐｙｒｉｄｉｎｅ）（１．７ｇ，１８．０ｍｍｏｌ）およびトリフェニルホスフィン（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｉｎｅ）（４．７ｇ，１８．０ｍｍｏｌ）で処理した。ジエチルアゾジカルボキシレート（Ｄｉｅｔｈｙｌａｚｏｄｉｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）、ＤＥＡＤ，（３．１ｇ，１８．０ｍｍｏｌ）を、添加用漏斗を介して小滴状でフラスコに加えた。ＤＥＡＤの添加により、発熱反応が生じた。反応物を、溶液の体積が減少する前に室温で３０分間攪拌し、６ｘ１０ｃｍシリカゲルカラム（２０％酢酸エチルトルエン溶液による溶出）に直接適用した。純粋な化合物２４を含む画分をプールして、そして溶媒は減圧下で除去し、白色の結晶状固体（３．７ｇ，９．１ｍｍｏｌ，６１％）を生成した。
【００９４】
（実施例１０）
（化合物Ｎ、Ｏ、およびＰの調製）
化合物Ｎ、Ｏ、およびＰ（図６）は、上述したものと同じ還元的アミノ化手順により調製された。
【００９５】
（化合物Ｎ、Ｏ、およびＰの分析）
化合物Ｎ：１ＨＮＭＲ（４００ＭＨＺ，ＣＤ３ＯＤ）：０．６９（ｓ，３Ｈ），０．８３（ｓ，３Ｈ），１．０５（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），３．１４（ｍ，４Ｈ），３．９６（ｄのｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１０Ｈｚ，Ｊ２＝２Ｈｚ），４．２４（ｄのｄ，ＩＨ，Ｊ１＝１０Ｈｚ，Ｊ２＝３Ｈｚ），６．７０（ｍ，１Ｈ），６．８６（ｍ，１Ｈ），７．６０（ｍ，ＩＨ），８．１４（ｍ，１Ｈ）；ＭＳ（＋ＦＡＢ）：［Ｍ＋Ｈ］＋４５４；分析計算値Ｃ２９Ｈ４７Ｎ３０−２ＴＦＡ−３Ｈ２０：Ｃ５３．８７％，Ｈ７．５３％，Ｎ５．７１％．実測値：Ｃ５３．７２％，Ｈ６１％，Ｎ５．８５％．
化合物Ｏ：１ＨＮＭＲ（４００ＭＨＺ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：０．７０（ｓ，３Ｈ），０．８１（ｓ，３Ｈ），１．０７（ｄ，３Ｈ，＝６．７Ｈｚ），３．１５（ｍ，４Ｈ），３．９４（ｄのｄ，１１４，Ｊ１＝１０Ｈｚ，Ｊ２＝２Ｈｚ），４．２５（ｄのｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１０Ｈｚ、Ｊ２＝３Ｈｚ），６．７０（ｍ，ＩＨ），６．８５（ｍ，１Ｈ），７．６０（ｍ，ＩＨ），８．１４（ｍ，１Ｈ）；ＭＳ（＋ＦＡＢ）：［Ｍ＋Ｈ］＋４５４；分析計算値Ｃ２９Ｈ４７Ｎ３Ｏ−２ＴＦＡ−３Ｈ２Ｏ：Ｃ５５．２２％，Ｈ７．４４％，Ｎ５．８５％．実測値：Ｃ５５．１２％，Ｈ６．７４％，Ｎ５．９５％．
化合物Ｐ：１ＨＮＭＲ（４００ＭＨＺ，ＤＭＳ０−ｄ６）：０．７０（ｓ，３Ｈ），０．８１（ｓ，３Ｈ），１．１４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６．７Ｈｚ），２．９０（ｍ，４Ｈ），４．０４（ｄのｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１０Ｈｚ，Ｊ２＝２Ｈｚ），４．２５（ｄのｄ，１Ｈ，Ｊ１＝１０Ｈｚ，Ｊ２＝３Ｈｚ），６．７０（ｍ，１Ｈ），６．８５（ｍ，ｍ），７．６０（ｍ，ＩＨ），８．１４（ｍ，１Ｈ）；ＭＳ（＋ＦＡＢ）：［Ｍ＋Ｈ］＋４８０；分析計算値Ｃ２９Ｈ４７Ｎ３Ｏ−３ＴＦＡ−１Ｈ２０：Ｃ５２．９２％，Ｈ６．４８０％，Ｎ５．００％．実測値：Ｃ５３．１８％，Ｈ５．８８％．Ｎ４．２２％．
（実施例１１）
（２４アミドの調製）
【００９６】
【化４４】
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（化合物２９の調製）
化合物２８（１．０ｇ，２．６ｍｍｏｌ）を、メタノール（５０ｍＬ）に溶解した。この溶液を０℃まで冷却し、そしてアンモニアを反応容器の中に、３０分間バブリングした。反応物は密封し、室温で２週間攪拌した。反応物を−２０℃まで冷却し、密封したチューブを開封し、そして反応物を室温まで加熱することにより、ワークアップした。過剰なアンモニアがエバポレートされた後、メタノール性の（ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃ）アンモニアの残余は減圧下で除去され、化合物２９（０．９５ｇ，２．５ｍｍｏｌ，９６％）が生成する。．
（化合物Ｑの調製（図７））
化合物２９の３−アミノステロイドアナログを、他の３−アミノステロイドアナログの調製について上述したものと同じ方法により調製した。
【００９７】
化合物Ｑ：１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨＺ，ＣＤ３ＯＤ）：０．７４（ｓ，３Ｈ），０．９３（ｓ，３Ｈ），０．９８（ｄ，３Ｈ，Ｊ６．７Ｈｚ），他のダウンフィールドシグナル（ｄｏｗｎｆｉｅｌｄ　ｓｉｇｎａｌ）が溶媒のピークと重なった；ＭＳ（＋ＦＡＢ）：［Ｍ＋Ｈ］＋４１８；分析計算値Ｃ２９Ｈ４７Ｎ３Ｏ−２ＴＦＡ−０．７Ｈ２Ｏ：Ｃ５４．７３％，Ｈ７．７２％，Ｎ６．３８％．実測値：Ｃ５４．７０％，Ｈ７．５１％，Ｎ６．１８％．
本発明が、本明細書中で、種々の特定の物質、手順および実施例を参照することにより記載され、そして明示されたが、本発明は、物質の特定の実質的な組み合わせ、およびその目的のために選択された手順に限定されないことは理解される。このような詳細の多くのバリエーションが導かれることは、当業者により理解される。
【００９８】
本発明の別の実施形態は、上に記載され、そして本明細書の考察およびここで開示された本発明の実施から、当業者にとって明らかである。
【００９９】
本願で参照された全ての引用した特許および刊行物は、本明細書中で、全体が援用される。これは、明細書および単に例示的であると考えられる実施例が、以下の、請求項により示される、本発明の真の範囲および精神を伴うことが理解される。
【０１００】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＩＬ−９媒介Ｍ０７ｅ増殖の種々の３−アミノステロイドによる阻害を示す。
【図２】図２は、コザメ由来のアミノステロイドを示す。
【図３】図３は、コザメ由来の３−アミノステロイドのアナログを示す。
【図４】図４は、アシル化またはスルホニル化２２−アミンから調製された３−アミノステロイドを示す。
【図５】図５は、２２−アルデヒドを介して調製された３−アミノステロイドアナログを示す。
【図６】図６は、Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ反応を介して調製された３−アミノステロイドを示す。
【図７】図７は、２４−アミド３−アミノステロイドアナログを示す。
【図８】図８は、エステル−等配電子体を有する新規な３−アミノステロイドを示す。
【図９】図９は、改変ポリアミンを有する新規な３−アミノステロイドを示す。
【図１０】図１０は、新規なアシル化３−アミノステロイドエステルを示す。
【図１１】図１１は、ヒトリンパ球凝集に対する３−アミノステロイドの影響を示す。
【図１２】図１２は、ヒトリンパ球増殖に対する３−アミノステロイドの影響を示す。
【図１３】図１３は、ＩＬ−９のマイトジェン誘導性誘導に対する３−アミノステロイドの影響を示す。
【図１４】図１４は、３−アミノステロイドによる、マウスにおける気管支過剰応答性の阻害を示す。
【図１５】図１５は、デキサメタゾンおよび化合物−Ａによる、ＤＢＡＪマウスにおける気管支過剰応答性の阻害を示す。
【図１６】図１６は、デキサメタゾンおよび化合物−Ａによる、マウスにおける好酸球増加症の阻害を示す。
【図１７】図１７は、デキサメタゾンおよび化合物−Ａによる、感作ＤＢＡ２ＪマウスにおけるＩｇＧ１産生の阻害を示す。
【図１８】図１８は、デキサメタゾンおよび化合物−Ａによる、感作ＤＢＡ２ＪマウスにおけるＩｇＥ産生の阻害を示す。
【図１９】図１９は、化合物−Ａによる、ＢＡＬＢｃマウスにおける気管支過剰応答性の阻害を示す。
【図２０】図２０は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの脾臓重量に対するデキサメタゾンまたは化合物−Ｂの影響を示す。
【図２１】図２１は、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの脾臓重量に対するデキサメタゾンまたは化合物−Ｂの影響を示す。
【図２２】図２２は、マウスの脾臓重量に対する化合物Ａ、Ｂまたはデキサメタゾンの影響を示す。
【図１】
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【図２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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