(57)【要約】反応混合物中の化学反応からのプロトンの遊離に対して感度の高いｐＨ指示薬を使用する、所望の基質の活性のために、加水分解酵素を定量的にスクリーニングする方法が、本明細書中に提供されている。この方法は、プロトン化された緩衝液の相対量が、反応混合物のｐＨシフトとして、プロトン化された指示薬の量に対して比例する様に、両方がプロトンに対して同じ親和性を有する様な、緩衝液及び指示薬の条件を選択することからなる。次いで、緩衝液、指示薬、試験される加水分解酵素、及び、試験される所望の基質からなる反応混合物を調製し、加水分解酵素を基質と反応させる。反応は、反応混合物の色の変化を検出することによって、監視され、指示薬に対する反応の影響によって測定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応混合物の化学反応からのプロトンの遊離に対して感度の高いｐＨ指示薬を使用する、所望の基質の活性のための加水分解酵素の定量的スクリーニング方法であって、該方法が、プロトン化された緩衝液の相対量が、反応混合物のｐＨシフトとして、プロトン化された指示薬の量に対して比例する様に、両方がプロトンに対して同じ親和性を有する様な、緩衝液及び指示薬の条件を選択し、；反応混合物中で、該選択された緩衝液、指示薬、試験される加水分解酵素、及び、試験される所望の基質を混合し、；該加水分解酵素を該基質と反応させ、；かつ、指示薬における変化を検出することによって、反応の進行を監視することからなる、前記方法。
【請求項２】
該緩衝液及び該指示薬のｐＫａが、互いに約０．１以内である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該緩衝液が、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸）である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該指示薬が４−ニトロフェノールである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該基質濃度が、約０．１ｍＭから２．０ｍＭの範囲である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
更なる有機共存溶媒が添加される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
該共存溶媒が、アセトニトリル又はジメチルスルホキシドである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該共存溶媒が、１０体積％までで存在する、請求項７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、１９９８年６月２５日に出願された米国６０／０９０５６９号の一部継続出願である。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、ｐＨ指示薬及び色原体基質を使用する、酵素の活性のための、ｐＨ依存性アッセイに関するものである。このアッセイによって、効率的で速いアッセイフォーマットを使用する、立体選択性の酵素を同定する方法が提供される。
【０００３】
（背景技術）
化学者は、合成の問題を解決するために、加水分解酵素の高い立体選択性、化学的選択性及び位置選択性を利用することが多い。これらの反応は、化学的な方法よりも、実施するのがより選択的で、安価で、かつ、容易であることが多い。目的の化合物に適する加水分解酵素を見つけるために、研究者はまず初めに市販の酵素及び微生物の培養物をスクリーンし、次いで反応条件を最適化する。スクリーニング及び最適化の両方ともに、反応生成物の選択性を測定することが必要である。
【０００４】
加水分解酵素の幅広い使用法の１つの限界は、何百もの商業的に利用可能な加水分解酵素、及び、加水分解酵素を発現する何万もの微生物から、与えられた反応に最も適する加水分解酵素を探し出すのが困難であることである。幾つかの経験的な法則が、適当な候補を選択するのを助けるのに利用され得る（例えば、Ｋａｚｌａｕｓｋａｓ等著、Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．、１９９１年、第５６巻、２６５６から２６６５頁；Ｆｒａｎｓｓｅｎ等著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：　Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、１９９６年、第７巻、４９７から５１０頁；Ｃｈｅｎ等著、Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．、１９９７年、第６２巻、４３４９から４３５７頁参照）。加えて、研究者の大多数はまた、スクリーニングを使用する。スクリーニングには、各加水分解酵素に対して小規模の反応を実施し、その反応を「精密に検査し」、かつ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）等の分析法を使用して、立体異性体の比を測定することが含まれるのが典型的である。Ｓｉｈ等によって開発された式を使用して（Ｃｈｅｎ等著、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．、１９８２年、第１０４巻、７２９４から７２９９頁）、反応生成物の純度及び／又は反応の転化率が、選択性を測定するのに使用される。これらは、時間のかかる手順であり、時間的な拘束のために全ての加水分解物を試験することができないので、通常は不完全なスクリーンとなる。
【０００５】
研究者は、プロトンを放出又は消費する、酵素で触媒作用を及ぼされる反応の進行を監視するために、ｐＨ指示薬をこれまで利用していた（Ｗａｊｚｅｒ，　Ｍ．　Ｊ．　Ｃ．　Ｒ．　Ｈｅｂｄ著、　Ｓｅａｎｃｅｓ　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．、１９４９年、第２２９巻、１２７０から１２７２貢；Ｒ．　Ａ．　Ｊｏｈｎ著、酵素アッセイ（Ｒ．　Ｅｉｓｅｎｔｈａｌ、Ｍ．　Ｊ．　Ｄａｎｓｏｎ編）、ＩＲＬ、オックスフォード社、１９９２年、８１から８２頁）。例えば、研究者は、アミノ酸脱炭酸酵素（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等著、Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８９年、第１８１巻、５９から６５頁）、炭酸脱水酵素（Ｇｉｂｂｏｎｓ等著、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、１９６３年、第２３８巻、３５０２から３５０７頁）、コリンエステラーゼ（Ｌｏｗｒｙ等著、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、１９５４年、第２０７巻、１９から３７頁）、ヘキソキナーゼ（Ｄａｒｒｏｗ等著、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１９６２年、第Ｖ巻、２２６から２３５頁；Ｃｒａｎｅ，　Ｒ．　Ｋ．；　Ｓｏｌｓ，　Ａ．著、酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１９６０年、第Ｉ巻、２７７から２８６頁）、及び、プロテアーゼ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ等著、Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９４年、第２２０巻、２３８から２４３頁）によって、触媒作用が及ぼされる反応を監視する。これに限定されるものではないが、このスクリーンはまた位置選択性に適合し得るので、選択的な、特にはエナンチオ選択性及びジアステレオ選択性の加水分解酵素の同定のための方法が、本明細書中に提供される。
【０００６】
Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ等（Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９４年、第２２０巻、２３８から２４３頁）は、本明細書中に提供される或る特徴を共有する、ｐＨ依存性アッセイを使用して、９６の窪みのマイクロ板で、プロテアーゼのエステラーゼ活性を測定した。しかしながら、Ｗｈｉｔｔａｋｅｒのアッセイでは、同じｐＫａ値を有する指示薬−緩衝液の組み合わせが使用されておらず、また酵素で触媒作用を及ぼされる加水分解の本当の速度を常に正確には測定するものではないので、更に較正実験が必要とされる。従って、色をベースとするｐＨ依存性アッセイを使用する、加水分解酵素の同定のための、充分に速くかつ効率的な方法は、現在利用可能ではない。
【０００７】
様々な比率で鏡像異性体を有する試料の加水分解の初期速度を測定することを含むか（Ｊｏｎｇｅｊａｎ等著、Ｒｅｃｌ．　Ｔｒａｖ．　Ｃｈｉｍ．　Ｐａｙｓ−　Ｂａｓ、１９９１年、第１１０巻、２４７から２５４頁；Ｖａｎ　Ｔｏｌ　等著、Ｒｅｃｌ．　Ｔｒａｖ．　Ｃｈｉｍ．　Ｐａｙｓ−　Ｂａｓ、１９９１年、第１１０巻、２５５から２６２頁）、又は、反応の進行曲線を分析することによる（Ｌｕ等著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：　Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、１９９５年、第６巻、１０９３から１０９６頁；Ｒａｋｅｌｓ等著、Ｂｉｏｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．、１９９３年、第４３巻、４１１から４２２頁；Ｆｏｕｒｎｅｒｏｎ等著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９２年、第３３巻、２４６９から２４７２頁）、立体選択性の加水分解酵素を同定するための代わりの方法が、開発されている。しかしながら、この様な方法は、顕著には速くはなく、終点方法よりも正確ではあり得ない。加えて、純粋な鏡像異性体の加水分解速度を別に測定することによって、立体選択性は、これまでは見積もられていた（例えば、Ｚａｎｄｏｎｅｌｌａ等著、Ｃｈｉｒａｌｉｔｙ、１９９６年、第８巻、４８１から４８９頁；Ｒｅｅｔｚ等著、Ａｎｇｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　Ｉｎｔ．　Ｅｄ．　Ｅｎｇｌ．、１９９７年、第３６巻、２８３０から２８３２頁参照）。
【０００８】
本明細書中に記載されるアッセイシステムは、従来のスクリーニング方法によって提供されない、幾つかの利点を提供する。ｐＨ指示薬を使用する、加水分解酵素の同定のための、速い定量及び比色定量アッセイが、本明細書中に提供される。この方法を使用すると、立体選択性が、純粋な立体異性体の加水分解の初期速度を別に測定することによって、決定される。複数の加水分解酵素が、速い実験の単一のシリーズで、立体選択性のためにスクリーンされ得る。この方法によって、研究者は、高い立体選択特性を有する加水分解酵素を素早くかつ正確に同定することが可能になり、時間及び費用の両方が節約されることになる。
【０００９】
（発明の開示）
反応混合物中の化学反応からのプロトンの遊離に対して感度の高いｐＨ指示薬を使用して、所望の基質の活性のための、加水分解酵素の定量的スクリーニング方法が、本明細書中で提供される。この方法は、プロトン化された緩衝液の相対量が、反応混合物のｐＨシフトとして、プロトン化された指示薬の量に対して比例する様に、両方がプロトンに対して同じ親和性を有する様な、緩衝液及び指示薬の条件を選択することからなる。次いで、緩衝液、指示薬、試験される加水分解酵素、及び、試験される所望の基質からなる反応混合物を調製し、それによって、加水分解酵素が基質と反応可能になる。この反応は、反応混合物の色の変化を検出することによって、監視され、指示薬に対する反応の影響によって測定される。
【００１０】
（詳細な説明）
本発明は、ｐＨ指示薬との加水分解反応の間の、プロトンの遊離を検出することによる、酵素の活性のためのアッセイに関するものである。本明細書中で引用される全ての文献は、言及することによって組み入れられる。
【００１１】
加水分解酵素の同定における現在の限界は、特定の用途のために最適な加水分解酵素を探し出すことである。この目的のために最も利用されている現在利用可能なシステムは、Ｓｉｈ及び協力者の「終点方法」（Ｃｈｅｎ等著、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．、１９８２年、第１０４巻、７２９４から７２９９頁）である。しかしながら、Ｓｉｈの方法は、遅く、時間がかかり得る。より速いアプローチが必要なことを認識することで、研究者は、他の方法を提案したが（例えば、Ｊｏｎｇｅｊａｎ等著、Ｒｅｃｌ．　Ｔｒａｖ．　Ｃｈｉｍ．　Ｐａｙｓ−　Ｂａｓ、１９９１年、第１１０巻、２４７から２５４頁；Ｆｏｕｒｎｅｒｏｎ等著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９２年、第３３巻、２４６９から２４７２頁）、これらもまた、立体選択性加水分解酵素に対する包括的なアッセイを単に行うのに必要とされる、効率及び正確性に欠くものであり得る。
【００１２】
単一のアッセイ及び高処理量のフォーマットの両方を分析可能な、ｐＨ指示薬及び参照化合物を使用する、立体特異性の加水分解酵素を同定するための方法が、本明細書中で提供される。好ましい実施態様において、立体選択性の加水分解酵素の同定方法が、提供される。他の好ましい実施態様において、位置選択性加水分解酵素の同定方法が、提供される。
【００１３】
従来のスクリーニング方法によって提供されない、本発明によって提供される、幾つかの利点がある。例えば、本発明のアッセイシステムによって、従来のスクリーニング方法よりも、非常に早くかつ効率的に、有用なデータが与えられる。このアッセイは、裸眼で通常は検出されない、色の変化の検出に基づくものである（図１）。
【００１４】
他の利点は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）等の加水分解活性のスクリーンに使用される従来の方法とは異なり、本発明の方法は定量的であることである。また、利用可能な複数の窪みのフォーマットによって、多量の試料を同時に分析することが可能になる。完全な反応及び分析は、マイクロ板の窪みの中で生じるのが典型的であるので、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）による、更に面倒な精密検査及び分析が避けられる。
【００１５】
更に他の利点は、本発明では、顕著に少ない基質（典型的には３６０μｌ中２０μｇ）及び試験酵素（時には１μｇ未満のタンパク質）しか必要としないことである。必要とされる酵素の量は、特定のアッセイに依存して変わるであろうが、だいたい２０μｇ／窪みであり得る。この通り、本発明のアッセイは、間違えやすいポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）又はＤＮＡ組換え技術を利用する、指示された発生技術等の、組換えＤＮＡ方法を使用して得られた突然変異酵素のライブラリーのスクリーニングに有用である。
【００１６】
他の利点は、このアッセイは、それらの構造中の発色団と結合するエステルだけでなく、いかなるエステルの加水分解をも測定可能であることである。類似体ではなく、目標のエステル自身をスクリーンすることができることは、酵素の選択性が、基質構造の小さい変化に対して感度が高いので、重要な利点である。
【００１７】
立体選択性アッセイの基本的なパラメーター
中性のｐＨでの、エステルの加水分解によって、プロトンが遊離する。例示的なエステルである、酪酸ソルケタール（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−メタノールのブチリルエステル）の加水分解を、下記に示す。
【００１８】
【化１】
2004513601.tif 000002
本発明によって、下記に説明される通り、ｐＨ指示薬を使用する、プロトンの遊離速度を測定するための方法が提供される。反応条件を注意深く選択することによって、色の変化がプロトンの数に比例し、次いでそれが基質の加水分解速度に関連するのを、確実にし得る。
【００１９】
基本的なアッセイには、緩衝液、ｐＨ指示薬、基質化合物、及び、立体選択性がアッセイされる酵素が必要である。ｐＨ指示薬のプロトン化を可能にすることによって、基質化合物の加水分解によって、溶液中に色の変化が生じる。尚、その吸光係数は、プロトン化によって変化する。典型的には、このアッセイは、多数の−窪みの反応容器中で行なわれる。
【００２０】
本発明を実施する際に、多くの適する緩衝液及び指示薬が、当業者には利用可能である。緩衝液及び指示薬の両方が、プロトンに対してほぼ同じ親和性を有しているのが好ましい（ｐＫａ緩衝液＝ｐＫａ指示薬）。この用途の目的のために、ｐＫａが他のｐＫａの０．１単位内である場合には、他のｐＫａとｐＫａは、「同一」又は「同じ」であると言われる。例えば、緩衝液１のｐＫａが７．０であり、指示薬１のｐＫａが７．１である場合、ｐＫａは、同一又は同じであると理解される。緩衝液及び指示薬のそれぞれが、互いに０．１単位以内のｐＫａを有し、その結果ｐＨシフトとしてプロトン化された緩衝液及びプロトン化された指示薬の相対量が、反応の間、一定であるのが好ましい。１つの計算において、０．３単位の緩衝液及び指示薬の間のｐＫａの差異は、０．１単位ｐＨが変化した際、ほぼ８％の誤差が生じるのが典型的であった。典型的なアッセイでは、ｐＨは、例えば０．０５単位（基質の１０％の加水分解）によって変わり得る。；従ってｐＫａの差異は直線的ではない、不正確な比を導き得る。緩衝液及び指示薬の間でｐＫａが異なることを、避けることができない場合には、正確な結果は、較正実験又はより複雑な式を使用して更に得られ得る。簡単な試験として、適する釣り合っているｐＨ指示薬及び緩衝液を含有するアッセイ溶液に添加される標準的な酸の量と、測定される色の変化との間のほぼ直線的な関係によって、緩衝液及び指示薬のｐＫａが、好ましい範囲内であることが示される（例えば、下記に議論される、図２参照）。更に、理論的な傾き及び実験による傾きの一致が、約５％以内であることが、このアッセイが定量的であることを立証する。この様に決めることは、当業者には充分である。緩衝液及び指示薬が異なるｐＫａ値を有する場合（即ち、０．１単位の差異よりも大きい場合）の、緩衝液−指示薬の組み合わせは、本発明に包含されることを理解すべきである。
【００２１】
当業者は、本発明を実施する際に適するいかなる緩衝液をも使用し得る。多くのこの様な適する緩衝液は、当業者に利用可能である。或るｐＨ範囲でのスクリーニングに適する緩衝液としては、限定されるものではないが、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸、ｐＫａ　６．１；ｐＨが約６でのスクリーニングに有用である）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸、ｐＫａ　７．１５；ｐＨが約７でのスクリーニングに有用である）、ＥＰＰＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［３−プロパンスルホン酸］、ｐＫａ８．０；ｐＨが約８でのスクリーニングに有用である。）、及び、ＣＨＥＳ（２−［Ｎ−シクロヘキシルアミノ］エタン−スルホン酸、ｐＫａ　９．３；ｐＨが約９でのスクリーニングに有用である）等が挙げられ得る。当業者は、本発明を実施する際に利用され得る、多くの他のこの様な適する緩衝液に気が付くであろう、その内のあるものは、Ｂｅｙｎｏｎ等等の通常利用される技術文献に列挙され得る（緩衝溶液、Ｔｈｅ　Ｂａｓｉｃｓ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード社、１９９６年）。
【００２２】
当業者に利用可能な適するｐＨ指示薬の広い配列もある。好ましくは、ｐＨ指示薬のプロトン化された形体及び脱プロトン化された形体は、吸光係数に大きな差があり（例えば、４−ニトロフェノールでは、４０４ｎｍで、２００対１８０００Ｍ−１ｃｍ−１）、それによって優れた感度が与えられる。適するｐＨ指示薬としては、限定されるものではないが、ｐＨが約６でのスクリーニングに有用である、クロロフェノール赤（ｐＫａ　６．０）、ｐＨが約７でのスクリーニングに有用である、４−ニトロフェノール（ｐＫａ　７．２）、ｐＨが約８でのスクリーニングに有用である、フェノール赤（ｐＫａ　８．０）、及び、ｐＨが約９でのスクリーニングに有用である、チモール青（ｐＫａ　９．２）等が挙げられる。他の適する指示薬は、メルクインデックス（Ｔｈｅ　Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ、第１０版、Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、ニュージャージー州、１９８３年）、指示薬（Ｅ．　Ｂｉｓｈｏｐ編集、Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９７２年）、又は、染料及び指示薬に関する、シグマ／アルドリッチハンドブック（Ｆｌｏｙｄ　Ｊ．　Ｇｒｅｅｎ著、Ｔｈｅ　Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｓｔａｉｎｓ，　Ｄｙｅｓ　ａｎｄ　Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ’、アルドリッチ化学社発行、１９９０年、ミルウオーキー、ウィスコンシン州）に同定され得る。加えて、当業者は、本発明を実施する際に利用され得る、多くの他のこの様な適するｐＨ指示薬に気が付くであろう。
【００２３】
当業者は、本アッセイが、特定のｐＨ指示薬／緩衝液の組み合わせを利用して、多くの異なるｐＨ範囲で、酵素の活性をアッセイするのに利用され得ることを、認識するであろう。加水分解酵素の大多数は、中性のｐＨ近辺で最高の活性を有するので、ｐＨ７．２で使用するように設計されたアッセイは、そのｐＫａ（７．１５）（Ｔｈｅ　Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ、第１０版、Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、ニュージャージー州、１９８３年、９５０頁）と類似しているために、ｐＨ指示薬として例えば４−ニトロフェノールを使用し得る。指示薬のｐＫａが知られていない場合、標準化された塩基が添加される時に、ｐＨの変化の中間点を測定することによって、ｐＫａを確かめることができる。ｐＫａは、異なるアッセイ条件下でシフトし得る、例えば共存溶媒及びイオン性強度が、ｐＫａ値を変え得ること、及び、当業者はこのことを考慮すべきである、ということも理解すべきである。
【００２４】
例示的な緩衝液−指示薬の組み合わせは、下記に限定されるものではないが、ｐＨが約６での使用のための、クロロフェノール赤（ｐＫａ　６．０）、及び、ＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸、ｐＫａ　６．１）；ｐＨが約７での使用のための、４−ニトロフェノール（ｐＫａ　７．２）、及び、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸、ｐＫａ　７．１５）；ｐＨが約８での使用のための、フェノール赤（ｐＫａ　８．０）、及び、ＥＰＰＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［３−プロパンスルホン酸］、ｐＫａ　８．０）；ｐＨが約９での使用のための、チモール青（ｐＫａ　９．２）、及び、ＣＨＥＳ（２−［Ｎ−シクロヘキシルアミノ］エタン−スルホン酸、ｐＫａ　９．３）等が挙げられる。好ましい実施態様において、緩衝液−指示薬の組み合わせは、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸）及び４−ニトロフェノール（ｐＫａ　７．２）である。これは、ＢＥＳのｐＫａ（７．１５）（Ｂｅｙｎｏｎ等著、緩衝溶液、Ｔｈｅ　Ｂａｓｉｃｓ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード社、１９９６年、７２頁）が、４−ニトロフェノールのｐＫａと同じであるからである。当業者は、本発明を実施する際に利用され得る、多くの他のこの様な適する緩衝液−ｐＨ指示薬の組み合わせに気が付くであろう。
【００２５】
最適な緩衝液濃度は、感度を最高にするための低濃度と（式１（Ｅｑ．１）参照）、アッセイを通してｐＨ変化が小さいこと（我々の条件下での１０％の加水分解では、＜０．０５ｐＨ単位）との間の、妥協点を表わすべきである。ｐＨ変化が小さいことは、速度定数がｐＨが変化するに連れて変化し得るので、重要である。
【００２６】
ｐＨ指示薬の濃度は、感度を最高するために、できるだけ高い方がよい。式１参照。９６の窪みの板中の通路長さは、光が溶液を通って板の上から通るので、窪み中の溶液の体積に依存する。この様に、最高の指示薬濃度は、溶液の体積に伴って、またｐＨ指示薬の吸光係数と共に変化する。或る酸−塩基指示薬では、水溶性が低いことによって、ｐＨ指示薬の最高の濃度が制限され得る。指示薬による酵素の抑制がないことを確実にするためには、アッセイ中に対照試料を有するのが、好ましい。
【００２７】
吸光係数は、共存溶媒の添加によって、僅かに変化するので、実験的に測定されるべきである。実験結果は、反応混合物へ共存溶媒を添加すると、ｐＨの変化により検出可能な色の変化が生じることを確実にしなければならない。例えば、アッセイは、７％ｖ／ｖのアセトニトリル又は他の有機溶媒の添加等の、反応条件の小さい変化を許容するのが好ましい。例えば、１０％のエタノールを添加すると、４−ニトロフェノールのｐＫａが、７．１５から７．１７にほんの僅か変化することが、これまでに示されている。１０％以下の共存溶媒の濃度は、このアッセイの正確性を妥協しないのが好ましい。加水分解酵素溶液中に存在する少量の塩（市販の加水分解酵素調製液中の緩衝液塩、プロテアーゼ溶液中のＣａＣｌ２）は、正確性に影響を与えないのが、更に好ましい。
【００２８】
多くの適する基質濃度が、本発明を実施する際に利用され得る。好ましくは、基質濃度は、０．５から２ｍＭの範囲であり、より好ましくは約１ｍＭである。約５．０ｍＭ以下の基質濃度では、約０．５ｍＭの緩衝液及び０．５ｍＭの指示薬を使用すると、吸収の変化が余りに小さくて正確には検出され得ない。例えば、ｐＨ７．２で０．２５ｍＭの基質濃度、０．４５ｍＭの４−ニトロフェノール、５ｍＭのＢＥＳの５％の加水分解では、僅かに０．００５吸収単位しか、吸収を変化させ得ない。低めの基質濃度下では、低めの緩衝液濃度が、吸収における変化を最高にするために利用され得る。分光測光測定には、安定な溶液が必要であり、溶液が透明であるのが好ましいので、水中の溶解性が、基質の上限を決める。典型的な有機系の基質は、水への溶解性が低く、有機系共存溶媒が添加され得る（即ち７体積％のアセトニトリル）。非常に不溶性の基質では、界面活性剤を使用する透明なエマルジョンが、利用され得る（Ｊａｎｅｓ等著、Ｊ．　Ｏｒｇ．　Ｃｈｅｍ．、１９９７年、第６２巻、４５６０から４５６１頁）。
【００２９】
本発明は、如何なる適する容器中でも利用され得り、この様な容器の例は、当業者によく知られている。適する反応容器としては、限定されるものではないが、充分な数の窪みを有する、ポリスチレン又はポリプロピレン製の容器が挙げられ、その窪みの数は、当業者によって決定され得る。一つの実施態様において、反応容器は、９６の窪みを有する。他の実施態様においては、反応容器は３８４の窪みを有する。更に他の実施態様においては、反応容器は３８４より多い窪みを有する。個々のキュベットもまた利用され得る。
【００３０】
アッセイの更なるパラメーター
或る一般式は、直ちに提供されるアッセイの機構の説明にとって、重要である。指示薬の吸収変化の速度と、反応速度との間の釣り合いは、緩衝液因子Ｑと通常呼ばれる（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ等著、Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８９年、第１８１巻、５９から６５頁；Ｇｉｂｂｏｎｓ等著、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、１９６３年、第２３８巻、３５０２から３５０７頁）。指示薬と緩衝液のｐＫａが同じ場合は、Ｑは式１（Ｅｑ．１）によって与えられる。尚、Ｃは、緩衝液（Ｂ）又は指示薬（Ｉｎ）の合計のモル濃度（酸及び塩基の形体の合計）を表わし、「Δε」は、指示薬のプロトン化された形体と脱プロトン化された形体との間の吸光係数の差異を表わし、「ｌ」は、通路の長さを表わす。：
【数１】
2004513601.tif 000003
本当の反応速度は、式２（Ｅｑ．２）によって与えられる。尚、ｄＡ／ｄｔは、指示薬の吸収の変化の速度である。最も高い感度（即ち最も大きいｄＡ／ｄｔ）は、Ｑが小さい時に生じる。この様に、緩衝液濃度を下げること、又は、指示薬濃度を高めることによって、本アッセイの感度が高められる。
【００３１】
【数２】
2004513601.tif 000004
一対の両方の立体異性体（この例では、鏡像異性体）の加水分解速度は、別々に測定され得り、初期速度の比は立体選択性を見積もる。これは、下記に示される通り、エナンチオ選択性を見積もるのに、速くかつ有用な方法である。：
【数３】
2004513601.tif 000005
しかしながら、上記式は、立体選択性を、上記例ではエナンチオ選択性を見積もるだけである。この式は、見積もられたジアステレオ選択性に適合させられ得る。
【００３２】
酵素のエナンチオ選択性は、溶液全体中の２種類の鏡像異性体の加水分解の速度の比である。それはまた、鏡像異性体では、特異性定数の比（Ｋｃａｔ／ＫＭ）として表現され得る（式３（Ｅｑ．３）参照）（一般的には、Ｆｅｒｓｈｔ，　Ａ．著、酵素構造及び機構（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）、第二版、Ｆｒｅｅｍａｎ編集：ニューヨーク、１９８５年、１０３から１０６頁；Ｃｈｅｎ等著、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．、１９８２年、第１０４巻、７２９４から７２９９頁も参照）。
【００３３】
【数４】
2004513601.tif 000006
初期速度が、純粋な鏡像異性体基質濃度がそのＫＭ値以下である条件下で測定される場合、次いで初期速度は、単純なミハエリス−メンテンの式に従って、Ｋｃａｔ及びＫＭ値に等しい。基質濃度がそのＫＭ以上の場合、初期速度は、そのＫｃａｔに等しい。エナンチオ選択性は、両方の鏡像異性体に対する、Ｋｃａｔ／ＫＭの比であり、従って見積もられたＥは、エナンチオ選択性に対するＫＭの影響の幾分か又は全てを無視し得る。
【００３４】
現在、Ｅを測定するための最も有用な方法は、Ｃ．　Ｊ．　Ｓｉｈのグループによって開発された終点方法であるが（Ｃｈｅｎ等著、鏡像異性体の生化学的な速度分割の定量分析（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　Ａｎａｌｙｓｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｋｉｎｅｔｉｃ　Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ）、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．、１９８２年、第１０４巻、７２９４から７２９９頁）、この方法によって、何百もの市販の酵素及び微生物の培養物をスクリーニングすることは難しい。Ｅを測定するために、当業者は、試験分割を行い、反応を精密に検査し、かつ下記の２つを測定するのが典型的である。：出発原料の鏡像異性純度（ｅｅｓ）、生成物の鏡像異性純度（ｅｅｐ）、又は、転化率（ｃ）。次いで、それらは、Ｓｉｈ及び協力者によって開発された、式３の積分された形体を使用する。尚、それは残っている基質（ｅｅｓ）又は得られる生成物（ｅｅｐ）の鏡像異性純度に対する、反応の転化率の程度に関連するものである、式４（Ｅｑ．４）。
【００３５】
【数５】
2004513601.tif 000007
従来の方法を使用する、基質に対する加水分解酵素のエナンチオ選択性を測定するための典型的なアッセイでは、完了するためには、４時間半まで必要である。例えば、当業者は、４０％の転化率（約２時間）まで速度分割をまず初めに行い、生成物の酸から残っている基質を分離し（約３０分）、ＮａＯＨ等の水性の塩基を用いて、未反応の基質を酸に加水分解し（精密検査を含めて、約１時間）、そして最後に、キラルな固定相上でＨＰＬＣによって両方の試料の鏡像異性純度を測定する（約１時間）。これは研究者の多大な時間を費やすので、限定された数の酵素を試験することを決めることとなり、その結果決して完全な分析とはなり得ない。
【００３６】
初期速度の測定に基づいて、加水分解酵素のエナンチオ選択性を正確に測定するための、ｐＨ指示薬の拡大方法である、新規な分光測光方法（「素早いＥ」と呼ばれる）が、本明細書中で提供される。Ｅを決定するために、ラセミ溶液の加水分解の相対速度を測定するよりもむしろ（これには、それぞれの鏡像異性体の加水分解の相対速度を評価するために、鏡像異性体の純度を測定する必要があるであろう）、参照化合物に対する、それぞれの鏡像異性体の加水分解速度を別々に測定する。次いで、特異性比（Ｋｃａｔ／ＫＭ）が、参照化合物に対して、それぞれの純粋な鏡像異性体に対して得られる。それぞれの純粋な鏡像異性体に対する相対的な特異性定数の比から、エナンチオ選択性が生じる。（Ｋｃａｔ／ＫＭ）速い鏡像異性体／（Ｋｃａｔ／ＫＭ）遅い鏡像異性体、式３。
【００３７】
加水分解酵素で触媒作用を及ぼされる反応の簡単な場合には、基質（Ｓ）の加水分解の観察される初期速度（Ｖ初期）は、下記定常状態式（式５；Ｅｑ．５）によって表わされ得る。尚、［Ｅ］は、遊離の酵素の濃度であり、［Ｓ］は、エステルの初期濃度である。これらの式は、ミハエリス−メンテンの速度論を想定しており、下記に記載される或る限定下のものであることに、注目すべきである。
【００３８】
【数６】
2004513601.tif 000008
２種類の基質が溶液中に存在する場合、それらは共に、酵素の活性部位に対して競合する。式５から、両方の基質の濃度を考慮に入れた後に、加水分解速度の比は、それらのＫｃａｔ／ＫＭ値（特異性定数）の比と等しいことになる。２種類の基質が一対の鏡像異性体である場合、それらの特異性定数の比は、鏡像異性体の比Ｅと等しい、式３。
【００３９】
Ｋｃａｔ及びＫＭを測定するための伝統的な方法では、その基質の濃度の関数を測定し、そのデータが分析のために直線状の形体に変換されると、それぞれの鏡像異性体の加水分解の初期速度が測定される（一般的には、Ｆｅｒｓｈｔ，　Ａ．著、酵素構造及び機構（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ）、第二版、Ｆｒｅｅｍａｎ編集：ニューヨーク、１９８５年、１０３から１０６頁；Ｃｈｅｎ等著、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．、１９８２年、第１０４巻、７２９４から７２９９頁参照）。この方法は、それぞれの鏡像異性体の速度論、並びに、全体に渡るエナンチオ選択性に対して、有用な情報を明らかにするが、エナンチオ選択性のために多数の加水分解酵素をスクリーニングするのには適していない。それは、それぞれの純粋な鏡像異性体に対して複数の測定と、重要なデータ分析とを必要とするので、時間がかかるものである。相対的なＫｃａｔ及びＫＭ値を測定するための、本明細書中に提供される方法は、より速く、その結果それぞれの鏡像異性体に対して最低単一の測定しか必要としない。他の研究者は、基質の混合物に対して、酵素の選択性を測定するために、基質の混合物をこれまでは使用していた（Ｂｅｒｍａｎ等著、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、１９９２年、第２６７巻、１４３４から１４３７頁；Ｂｒｉｋｅｔｔ等著、Ｊ．　Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９１年、第１９６巻、１３７から１４３頁；Ｐｅｔｉｔｈｏｒｎｙ等著、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、１９９１年、第８８巻、１１５１０から１１５１４頁；Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ等著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９３年、第３２巻、４３４４から４３４８頁）。この方法は、酵素の立体選択性を測定するのに使用される。
【００４０】
一つの実施態様において、本発明は、「素早いＥ」法を提供するが、それは、従来のアッセイと比べて幾つかの顕著な利点を当業者に与える。素早いＥ法は、典型的な終点測定よりも何倍も速く、また同等の正確性又は優れた正確性を有し得る。正確性は、それぞれの生成の改良が小さい場合に、指示された進化実験に関連する、スクリーニング技術にとって特に重要であり得る（Ｍｏｏｒｅ等著、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９６年、第１４巻、４５８から４６８頁）。更には、素早いＥ法では、反応全体が分光光度計内で生じるので、加水分解酵素が非常に少量しか必要でない。
【００４１】
素早いＥは、終点方法と同じ式に基づいており、従って終点方法の不正確性も素早いＥに適用される。式４を導く際になされた推定によって、終点方法及び素早いＥの両方は、反応が不純な生体触媒を含有するか、又は、反応が生成物によって抑制される場合、エナンチオ選択性が不正確になり得る。まず初めに、不純な生体触媒を使用して計算されたＥ値は、全ての酵素重量平均である。これらの酵素は、基質に対するそれらの親和性において顕著に異なる場合、次いで異なる酵素が、異なる基質濃度で活性を左右するであろう。そして、生成物が反応を抑制する場合、明らかにエナンチオ選択性が変わり得る。定量分析において生成物の抑制を含めるために、研究者は、リパーゼで触媒作用を及ぼされる、ピンポンビビ（ｐｉｎｇ−ｐｏｎｇ　ｂｉ−ｂｉ）反応の機構を考慮する、より複雑な式を使用する（Ｒａｋｅｌｓ等著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｐｒｏｇ．、１９９４年、第１０巻、４０３から４０９頁；Ｖａｎ　Ｔｏｌ等著、Ｂｉｏｃａｔａｌ．　Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍ．、１９９５年、第１２巻、１１９から１３６頁）。偏差は、通常小さいので、従って研究者は最終の方法でのみ、それらを最適化することを考慮する。
【００４２】
この様に、酵素の立体選択性を、素早くかつ高度な正確性を持って測定し得るアッセイシステムが、提供される。このアッセイによって、立体選択性酵素の同定に価値のある手段が、当業者に提供される。以下の実施例は、説明の目的のためだけのものであり、それらは、如何なる方法にも本発明を限定するものととして意図されるものでも、解釈されるべきでもない。当業者は、本発明の精神又は概念を逸脱しない限り、変形及び修正を行い得ることを、理解するであろう。
【００４３】
実施例
実施例１
Ａ．物質及び方法
１．物質
化学物質は、シグマ化学社（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）から購入され、他に断りが無い限りは、更に精製することなく使用された。Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００は、ＥＳＡ社（Ｃｈｅｌｍｅｓｆｏｒｄ、ＭＡ）から購入された。標準化された酸は、Ａ＆Ｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（モントリオール、ＱＣ）から購入された。ＥＤＣ−ＨＣｌ（Ｎ−エチル−Ｎ’−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド塩酸塩）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（無水物）は、Ｃｈｅｍ−　Ｉｍｐｅｘ社（Ｗｏｏｄ　Ｄａｌｅ、ＩＬ）から購入した。ＴＲＩＳ緩衝液は、ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社（Ａｕｒｏｒａ、ＯＨ）から購入された。他に断りが無い限りは、エステルは、アルドリッチ、Ｆｌｕｋａ、又は、ＴＣｌ社から購入された。酪酸ソルケタールは、それまでに調製された。オクタン酸ソルケタール及び酪酸フェネチルは、同様に調製された、ＴｈｅｒｍｏＧｅｎエステラーゼは、ＴｈｅｒｍｏＧｅｎ社（シカゴ、ＩＬ）から入手した。ミカンの皮からの、アセチルエステラーゼは、シグマ社から購入された。
【００４４】
リパーゼを、Ｃｏｌｔｏｎ等の方法によって精製した。粗カンジダｒｕｇｏｓａ　（Ｃａｎｄｉｄａ　ｒｕｇｏｓａ）リパーゼ（固体２０ｇ、ＰＮＰＡアッセイによって８００単位）を、ＭＥＳ緩衝液（１００ｍｌ、５０ｍＭ、ｐＨ６．０、４℃）中に、３０分間攪拌することによって、溶解させた。イソプロパノール（１００ｍｌ、４℃）３０分かけて滴下添加し、４℃で４８時間攪拌させた。溶液は、攪拌しながら、透明から濁った色に変わった。沈殿物を、４℃で、３０分間、３０００ｒｐｍで、遠心分離することによって、除去した。上澄液を、二倍に希釈された水（３×４Ｌ）に対して透析させ、Ａｍｉｃｏｎ　ＰＭ−１０膜を使用して、Ｎ２下で限外濾過によって２０ｍＬまで濃縮した：ＰＮＰＡアッセイを用いると６９２単位、標準としてＢＳＡを使用してＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイによって、タンパク質１６．８ｍｇ、収率８７％である。透明な黄色い酵素溶液を、保存料としてＮａＮ３を０．０２％ｗｔ／ｖｏｌ％用いて、４℃で、貯蔵した。
【００４５】
２−（４−イソブチルフェニル）プロパン酸の純粋な鏡像異性体及びラセミ体を、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（モントリオール、キュベック）から入手した。酵素の供給者は、表１の脚注に記されている。
【００４６】
ポリスチレン製の９６の窪みの底が平らなマイクロ板（最大体積３６０μｌ／窪み、Ｃｏｒｎｉｎｎｇ　Ｃｏｓｔａｒ社、アクトン、マサチューセッツ州）を、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｆ）の８−チャンネルピペット（５から１００μｌ、５０から１２００μｌ）及び多チャンネルピペットのための溶液容器（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｅｐｅａｎ　、ＯＮ）を使用して、充填した。全てのマイクロ板アッセイを、ＳＯＦＴｍａｘＰＲＯ版１．２．０ソフトウェアーを有する、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ３４０マイクロ板読み取り装置上で行った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ社、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）。
【００４７】
小規模な酵素で触媒作用を及ぼされる加水分解反応の初期速度を、Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ　ＲＴＳ　８２２　ｐＨスタットを用いて、測定した。ＮＭＲを、Ｖａｒｉａｎ　Ｇｅｍｉｎｉ　２００　ＭＨｚ分光計上で記録した。融点を、熱電融点装置上でとり、修正した。
【００４８】
マススペクトルは、ＥＩ（７０ｅＶ）条件、又は、ＣＩ（イオン化ガスとしてＮＨ３）を使用して、Ｋｒａｔｏｓ　ＭＳ２５ＲＦＡ二重焦点式質量分析計上で得た。
【００４９】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、Ｓｐｅｃｔｒａ　ＦＯＣＵＳ前方光学走査検出器、ＳＰ８８００オートサンプラー、及び、Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｐｈｙｓｉｃｓソフトウェアーを装備した、Ｓｐｅｃｔｒａ　Ｐｈｙｓｉｃｓ液体クロマトグラフィー、８８００型上で行った。ＨＰＬＣキラル固定相は、ダイセル化学工業社（Ｆｏｒｔ　Ｌｅｅ、ニュージャージー州）から購入された。
【００５０】
２．（±）−酪酸ソルケタール
酪酸無水物（１．５当量）、４−ジメチルアミノピリジン（０．０５当量）、及び、無水炭酸ナトリウム（１．５当量）を、酢酸エチル中の（±）−ソルケタール（１．０当量）からなる溶液に添加し、一晩攪拌した。反応混合物を、数回、水を用いて洗浄し、次いで塩水を用いて洗浄し、有機抽出物を、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。フラッシュクロマトグラフィー（３：１　ヘキサン：酢酸エチル）によって、黄色油状の純粋な酪酸エステルが、収率９１％で与えられた。Ｒｆ＝０．５６（３：１　ヘキサン：酢酸エチル）、１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）δ＝０．９８（ｔ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．４Ｈｚ，３Ｈ，ＣＨ３）、１．３７（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）、１．４３（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）、１．６７（六重，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．４Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、２．３３（ｔ，３Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝７．３Ｈｚ，２Ｈ，ＣＨ２）、３．７（ｍ，ＣＨ２の１Ｈ）、４．０５から４．１６（ｍ，３Ｈ，ＣＨ２の１Ｈ，ＣＨ２）、４．２７から４．３２（ｍ，１Ｈ，ＣＨ）。１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）δ＝１５．３（ＣＨ３）、１９．９（ＣＨ２）、２６．９（ＣＨ３）、２８．１（ＣＨ３）、３７．３（ＣＨ２）、６５．５（ＣＨ２）、６７．３（ＣＨ２）、７４．６（ＣＨ）、１１０．３（Ｃ）、１７３．１（Ｃ＝Ｏ）。
【００５１】
３．（Ｓ）−酪酸ソルケタール及び（Ｒ）−酪酸ソルケタール
試料を、上記ラセミ体に対するのと同様に、鏡像異性体的に純粋なソルケタールから調製した。ＧＣ（下記参照）によって測定された、酪酸エステルの鏡像異性純度は、それぞれ９９．２％及び９９．８％であった。ＧＣ又は１Ｈ−ＮＭＲによっては、汚染されている酪酸又はソルケタールは検出されなかった。
【００５２】
４．基質の合成
全ての他のエステルを、他の断りがない限りは、水溶性のカップリング剤（ＥＤＣ−ＨＣｌ；Ｎ−エチル−Ｎ’−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド塩酸塩）を使用して、修正されたＤＣＣカップリングを使用して合成した。アルコール（１．１当量）、酸及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（１．１当量）を、氷浴中で攪拌している、丸底フラスコ中で、無水ジクロロメタンに添加した。混合物を１５分間攪拌し、次いでＥＤＣ−ＨＣｌ（１．１当量）を添加した。反応を室温まで温め、４８時間攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウム、水、１ＮのＨＣｌ、次いで水の順番で、洗浄した。他の断りがない場合には、エステルを、ヘキサン／酢酸エチルを用いて溶離させられた、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製し、固体の場合には、ヘキサン／酢酸エチルから再結晶させた。
【００５３】
（±）−４−ニトロフェニル−２−フェニルプロノエート　１
４−ニトロフェノールを、クロロホルムから再結晶させ、（±）−２−フェニルプロパン酸をカップリングの前に真空蒸留によって精製した。反応により、黄色固体状の表題の化合物２．３５ｇ（１０．４ｍｍｏｌ、収率７８％）が与えられた。：Ｒｆ＝０．５３（３：１　ヘキサン：酢酸エチル）；融点１５５．８から１６２．５℃；１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）１．６４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、３．９６（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．１８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）、７．３８（ｍ，５Ｈ）、８．２３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ＝１９．９、４６．９、１２２．６，１２５．４、１２７．７、１２８．０、１２９．２、１３９．５、１４５．４、１５５．５、１７１．８；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ：２７１（Ｍ＋５）；１３３（５９ｄ１．６４（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、３．９６（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．１８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．０Ｈｚ）、７．３８（ｍ，５Ｈ）、８．２３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ＝１９．９、４６．９、１２２．６，１２５．４、１２７．７、１２８．０、１２９．２、１３９．５、１４５．４、１５５．５、１７１．８；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ：２７１（Ｍ”＋５）１３３（５９）、１０５（１００）、１０３（４）、７９（４）、７７（４）、６３（１）、５１（１）；ＨＲＭＳ（ＥＩ）：Ｃ１５Ｈ１３ＮＯ４に対する計算値：２７１．０８４６０；実測値２７１．０８４４５、誤差０．６ｐｐｍ
（Ｒ）−及び（Ｓ）−４−ニトロフェニル−２−フェニルプロノエート、　（Ｒ）−及び（Ｓ）−１　
試料を上記ラセミ体に対するのと同様に、鏡像異性体的に純粋な２−フェニルプロピオン酸から調製した。ＨＰＬＣ（下記参照）によって測定された、エステルの鏡像異性純度は、それぞれ９９．７％及び９９．４％であった。反応に対する収率は、それぞれ５１％及び５６％であった。
【００５４】
（±）−４−ニトロフェニル−２−（４−イソブチルフェニル）プロノエート　２　
反応によって、溶離剤として１００％のクロロホルムを使用したシリカゲルクロマトグラフィーを行い、次いで再結晶した後に、黄色固体状の生成物０．７０ｇ（２．１４ｍｍｏｌ、収率４４％）が与えられた。：Ｒｆ＝０．５７（クロロホルム、融点＝５７．８から６０．０℃；１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ０．９１７（ｄ，６Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ）、１．６３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、１．９１（ｍ，１Ｈ）、２．４８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．０Ｈｚ）、３．９６（ｑ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．１４から７．３１（ｍ，６Ｈ）、８．２３（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ＝１９．９、２３．９、３１．６、４６．３、４６．５、１１１．４、１２２．６，１２５．４、１２７．４、１２９．９、１３６．６、１４１．３、１７２．０：ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ：３２７（Ｍ＋，６）；１８９（３）、１６１（１００）１４５（４）、１１７（１１２）、１０５（３）、９１（５）；ＨＲＭＳ（ＥＩ）：Ｃ１９Ｈ２１ＮＯ４に対する計算値：３２７．１４７２０；実測値３２７．１４７０５、誤差０．５ｐｐｍ
（Ｒ）−及び（Ｓ）−４−ニトロフェニル−２−（４−イソブチルフェニル）プロノエート、　（Ｒ）−及び（Ｓ）−２　
試料を上記ラセミ体に対するのと同様に、鏡像異性体的に純粋な２−（４−イソブチルフェニル）プロピオン酸から調製した。ＨＰＬＣ（下記参照）によって測定された、エステルの鏡像異性純度は、分析のために水性ＮａＯＨを使用して、酸を加水分解した後、それぞれ９８．２％及び９９．６％であった。反応に対する収率は、それぞれ６８％及び６５％であった。
【００５５】
Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン−４−ニトロフェノール　エステルＴＦＡ塩　３
Ｄ，Ｌ−フェニルアラニンを、Ｔａｒｂｅｌｌ等の手順に従って、ジ−ｔｅｒｔブチル−ピロカルボネートを使用して、そのＮ−ｔ−ＢＯＣに転換した。次いで、保護されたアミノ酸を、上記カップリング手順に従って、その４−ニトロフェニルエステルに転換した。ｔ−ＢＯＣ基を、次いで、１０分間５ｍＬの希釈されていないＴＦＡ中で固体状化合物を攪拌することによって、除去し、次に真空下でＴＦＡを除去した。最終生成物をクロロホルムから再結晶したところ、白色のふわふわした固体状の表題の化合物が、３工程全体の収率４５％で与えられた。：融点＝１７７．１から１７８．９℃（１６０℃で試料は薄黒くなる）；１Ｈ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤ３ＯＤ）３．４１（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、４．６８（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．２９（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ）、７．３２から７．４３（ｍＭ，５Ｈ）、８．３６（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．２Ｈｚ）；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ：２８６（Ｍ＋，２）、２４０（２）、１９５（２３）、１６７（４）、１２０（１００）、９１（２９）、６９（１９）、４６（２３）；ＨＲＭＳ（ＥＩ）：Ｃ１５Ｈ１４Ｎ２Ｏ４に対する計算値：２８６．９３；．０９５３６；実測値２８６．０９５２０、誤差０．５ｐｐｍ
Ｄ−及びＬ−フェニルアラニン−４−ニトロフェノール　エステルＴＦＡ塩　、Ｄ−及びＬ−３　
試料を、ラセミ体に対するのと同様にＮ−ｔ−ＢＯＣ基を除去することによって、鏡像異性体的に純粋な、Ｌ−及びＤ−Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−フェニルアラニン−４−ニトロフェノールエステル（シグマ−アルドリッチ社、純度９９％）から調製した。ＨＰＬＣ（下記参照）によって測定された、エステルの鏡像異性純度は、両方とも９９．５％より大きかった（下記参照）。
【００５６】
５．参照化合物の合成
酢酸レゾルフィン　９
この化合物を、クラーマー及びギルバート（Ｋｒａｍｅｒ　ａｎｄ　Ｇｕｉｌｂａｕｌｔ）による修正された手順を使用して、調製した。６０ｍｌ無水ジクロロメタン中のレゾルフィンナトリウム塩（９５％純度、１．０１５ｇ、４．３ｍｍｏｌ、１当量）からなるスラリーに、無水ピリジン（０．３４９ｍｌ、４．３ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。溶液を氷浴中で冷却し、次いで塩化アセチル（０．６１４ｍｌ、８．６ｍｍｏｌ、２当量）を１０分かけて滴下添加した。深紫の反応混合物が、即座に橙色に変わった。反応を室温まで温め、一晩攪拌した。次に、反応をジクロロメタンを使用して３００ｍｌまで希釈し、粗いグラスフリットを通して濾過し、未反応のレゾルフィンを除去し、溶媒を真空下で除去した。赤らんだ−橙色の残さを、エタノールから再結晶したところ、深紅色粉末０．４８ｇ（１．８９ｍｍｏｌ、収率４４％）が生じた。：Ｒｆ＝０．２０（２：１　ヘキサン：酢酸エチル）；融点＝２１７．４から２２０．２℃（２１５．４℃で試料は薄黒くなる）［文献＝２２３から２２５℃（訂正されていない）］；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）δ２．３７（ｓ，３Ｈ）、６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ）、６．９０から６．８４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，９．９Ｈｚ）、７．１１から７．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，７．３Ｈｚ）、７．１６（ｓ，重ねあわせられた，１Ｈ）、７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ）、７．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、Ｄ６−ＤＭＳＯ）δ２２．２、１０６．３、１１０．１，１１９．７、１３０．８、１３０．９、１３４．６、１３５．０、１４３．８、１４７．９、１４９．２、１５２．９、１６８．２、１８４．９；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ：２５５（Ｍ＋，１４）；２１３（１００）；１８５．１６（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．２Ｈｚ，７．３Ｈｚ）、７．１６（ｓ，重ねあわせられた，１Ｈ）、７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ）、７．８１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．４Ｈｚ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、Ｄ６−ＤＭＳＯ）ｄ２２．２、１０６．３、１１０．１，１１９．７、１３０．８、１３０．９、１３４．６、１３５．０、１４３．８、１４７．９、１４９．２、１５２．９、１６８．２、１８４．９；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ：２５５（Ｍ”＋，１４）；２１３（１００）；１８５（７２）；１５６（７）；１２８（４）；６３（１４）；４３（９）。ＨＲＭＳ（ＥＩ）：Ｃ１４Ｈ９Ｎ１Ｏ４に対する計算値：２５５．０５３１５；実測値２５５．０５３３０、誤差０．６ｐｐｍ
テトラデカン酸レゾルフィン　６
この手順は、酢酸誘導体と同様であったが、ミリスチン酸無水物を、氷浴中で攪拌しながら、溶液に１０分間かけて滴下添加した。深紫の反応混合物が、即座に黄色に変わった。粗生成物の再結晶を数回試みたが、上手く行かなかった。それ故に、粗反応を、クロロホルム中に溶解させて、反応にシリカゲル１×３ｃｍを添加し、そのスラリーを乾燥するまで蒸発させ、次いで混合物を調製されたシリカゲルカラム（５×１５ｃｍ）の頂上に添加し、溶離として２：１　ヘキサン：酢酸エチルを使用して、フラッシュカラムを通した。生成物を含有する点を、混合し、蒸発させ、次いで酢酸エチル／ヘキサンから再結晶させたところ、明るい橙色の固体状の表題の化合物０．５７８ｇ（１．３０ｍｍｏｌ、収率３３％）が与えられた。；Ｒｆ＝０．４６（２：１　ヘキサン：酢酸エチル）；融点＝１１３．０から１１４．８℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）ｄδ０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）、１．２６（ｂｒ，ｍ，２０Ｈ）、１．５７（ｍ，２Ｈ）、２．６１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）、６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ）、６．８４から６．９１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，９．８Ｈｚ）、７．０９から７．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，７．３Ｈｚ）、７．１５（ｓ，重ねあわせられた，１Ｈ）、７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９．８Ｈｚ）、７．８１（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝０．９６Ｈｚ，８．３Ｈｚ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、Ｄ６−ＤＭＳＯ）δ１５．７、２４．２、２６．３、３０．５、３０．６、３０．７、３０．８、３０．９、３１．０、３１．１、３１．９、３２．０、３３．４、１０６．７、１１９．７、１２１．８、１２７．５、１３１．３、１３４．０、１３５．０、１４４．５、１４８．２、１４９．４、１５３．５、１６９．２、１８５．９；ＭＳ（ＣＩ）ｍ／ｚ：４２４（ＭＨ＋，２７）；２１３（１００）；１８５（１８）；１５６（３）；ＥＩ下でのＨＲＭＳは、分子イオンを示さなかった。
【００５７】
ｔ−ブチル酢酸レゾルフィン（レゾルフィン　３，３−ジメチル酪酸エステル）　１０
この手順は、上記と同様であったが、塩化ｔ−ブチルアセチル（１．１当量）を、１０分間かけて滴下添加した。溶液は、即座に黄−褐色に変わった。２４時間後、更に塩化メチレンを添加し、次いで反応を飽和炭酸水素ナトリウム、蒸留水で２回、洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。得られた橙色固体を、エタノールを用いて粉砕し、スラリーを濾過したところ、明るい橙色の固体状の表題の化合物０．２９４ｇ（０．９４５ｍｍｏｌ、収率２５％）が与えられた。；Ｒｆ＝０．３３（２．５：１　ヘキサン：酢酸エチル）；融点＝１６３．１から１６３．７℃；１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、２００ＭＨｚ）δ１．１６（ｓ，９Ｈ）、２．４９（ｓ，２Ｈ）、６．３４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．９Ｈｚ）、６．８４から６．９０（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．８Ｈｚ，９．９Ｈｚ）、７．０９から７．１４（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，７．３Ｈｚ）、７．１５（ｓ，重ねあわせられた，１Ｈ）、７．４４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１０．０Ｈｚ）、７．８０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．３Ｈｚ）；１３Ｃ−ＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ３１．１、３２．７、４９．０，１０７．７、１１０．２、１１９．７、１３１．３、１３１．４、１３５．０、１３５．３、１４４．４、１４８．２、１４９．３、１５３．５、１６９．６、１８５．８；ＭＳ（ＥＩ）ｍ／ｚ：３１１（Ｍ＋，８．２）；２５４（４．６）；２１３（１００）；１８５（２４）；１５６（４．６）；１２８（３．４）；９９（１０）；５７（２２）；ＨＲＭＳ（ＥＩ）：Ｃ１８Ｈ１７ＮＯ４に対する計算値：３１１．１１５８；実測値３１１．１１５５、誤差０．８ｐｐｍ
６．ＧＣによる鏡像異性純度の測定
ガスクロマトグラフィー分析を、Ｃｈｉｒａｓｉｌ−ＤＥＸ　Ｃｂキラルな固定相を装備したＶａｒｉａｎ　５８９−シリーズＩＩガスクロマトグラフィー上で行った（２５ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５ｍ　Ｃｈｒｏｍｐａｃｋ社、Ｒａｒｉｔａｎ、ニュージャージー州）。分析のために、無水酢酸、４−ピロリジノピリジン及び無水炭酸カリウムを含有する酢酸エチル（５ｍｌ）中に、ソルケタール及び酪酸ソルケタールからなる混合物を溶解させることによって、ソルケタールを酢酸エステルへ転換させた。溶液を室温で１時間攪拌し、次いで濾過し、塩水、次いで水を用いて洗浄し、硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ、乾燥するまで蒸発させた。両方の出発物質である、酪酸ソルケタール及び生成物の酢酸エステルを、温度勾配（１００℃から１３０℃、２℃／分）を使用することによって、基線分解を用いて、同時に分離した。酪酸ソルケタール：ｋ’ｌ＝８．１１（Ｓ）、＝１．０４；酢酸ソルケタール：ｋ’ｌ＝４．２１（Ｓ）、α＝１．１０。表に報告されているｅｅ−値は、３回の注入の平均である。誘導の間の基質のラセミ化は、観察されなかった。
【００５８】
実施例２
加水分解酵素アッセイ
１．加水分解酵素ライブラリー
加水分解酵素を、表１に列挙されている濃度（固体０．５から４０ｍｇ／溶液ｍｌ）で、ＢＥＳ緩衝液（５．０ｍＭ、ｐＨ７．２）中に溶解させた。これらの濃度は、変わり得るが、スクリーンは如何なる濃度でも有効である。プロテアーゼの中には、それらの構造を維持するためにカルシウムイオンを必要とするものがあるので、ＣａＣｌ２（２ｍＭ）を、プロテアーゼ溶液に添加した。タンパク質含量が低い加水分解酵素では、飽和した溶液（固体４０ｍｇまで／ｍｌ）を加水分解酵素試料のために利用し、タンパク質含量が高い加水分解酵素では、低めの濃度（典型的には、固体１ｍｇ／ｍｌ）を利用した。それぞれの溶液を遠心分離し、不溶性の物質を除去し（５分、２０００ｒｐｍ）、最終のｐＨが７．２まで滴定した。タンパク質濃度は、標準として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用する、Ｂｉｏ−　Ｒａｄ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ）からの染料−結合アッセイを使用して、測定された。溶液を、アルミニウム製のシーリングテープを備えた、９６の窪みのアッセイブロックである「母板」中で（それぞれの窪みの最大体積は２ｍｌ、Ｃｏｒｎｉｎｎｇ　Ｃｏｓｔａｒ社、アクトン、マサチューセッツ州）、−２０℃で貯蔵した。この「母板」は、同じ加水分解酵素を使用して、繰り返されるスクリーンの速度を上げ、大きなライブラリーの加水分解酵素を貯蔵するのに便利な方法である。このライブラリーの加水分解活性は、数ヶ月に渡って維持される。
【００５９】
２．ｐＨ指示薬を用いた加水分解酵素のスクリーニング
アッセイ溶液を、酪酸ソルケタール（アセトニトリル中の３０．０ｍＭ溶液の内の４２０μＬ）、アセトニトリル（４７０μＬ）、４−ニトロフェノール（５．０ｍＭのＢＥＳ中の０．９１１５ｍＭ溶液の内の６０００μＬ、ｐＨ７．２）、及び、ＢＥＳ緩衝液（５．０ｍＭ溶液の内の５１１０μＬ、ｐＨ７．２）を混合することによって、調製した。加水分解酵素溶液（５μＬ／窪み）を、８−チャンネルのピペットを使用して、母板から９６の窪みのマイクロリットル板に移した。アッセイ溶液（１００μＬ／窪み）を、１２００μＬの８−チャンネルのピペットを使用して、それぞれの窪みに素早く添加した。それぞれの窪み中の最終濃度は、基質１０ｍＭ、ＢＥＳ４．６５ｍＭ、４−ニトロフェノール０．４３４ｍＭ、アセトニトリル７．１％であった。板をマイクロ板読取装置に素早く置き、完全に混合するのを確実にするために振り、４０４ｎｍでの吸収の低下を、マイクロ板ソフトウェアーによって許される限り頻繁に、典型的には１１秒毎に、２５℃で、監視した。出発時の吸収は、典型的には１．２であった。データを、１時間収集し、遅い反応及び時間の遅れのある反応を検出するのを確実にした。それぞれの加水分解は、４回行って、平均を取った。最初の１０秒のデータは、多分振っている間に生じた泡の消失のために、時々失敗した。この理由のために、最初の１０秒のデータは、初期速度の計算から、削除されるのが典型的である。活性を、通常は最初の２００秒に渡る、曲線の直線部分の傾きから、計算した。初期速度は、式２を使用して、平均のｄＡ／ｄｔから計算した。尚、Δε＝１７３００Ｍ−１ｃｍ−１（我々の条件に対して、実験によって測定された）、１＝０．３０６ｃｍ。特異活性（μｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ）を計算するために、それぞれの窪みのタンパク質の合計量を、考慮した。
【００６０】
３．界面の活性化条件下での、ｐＨ指示薬を用いた市販の加水分解酵素のスクリーニング
手順は、ＢＥＳ緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ７．２）がＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（８．４５ｍＭ）を含有していた以外は、上記と同様であった。窪み中のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００の最終濃度は、２．８ｍＭであった。
【００６１】
４．１ｍＭの（±）酪酸ソルケタールを用いた小規模な反応
これらの小規模な反応は、指示薬が存在しない以外は、ｐＨ指示薬活性スクリーニングの間の、マイクロ板の条件と同じであった。加水分解酵素溶液（５０μＬ）を、最終の反応体積５０ｍＬ（基質１．０ｍＭ、ＢＥＳ４．６５ｍＭ、アセトニトリル７％）のために、（±）酪酸ソルケタール（アセトニトリル中の１４．４ｍＭ溶液の内の３．５０ｍｌ）及びＢＥＳ緩衝液（５．０ｍＭ溶液の内の４６．４５ｍｌ、ｐＨ７．２）からなる溶液に添加した。ｐＨ指示薬スクリーニングから見積もられた時間、室温で、攪拌した後、混合物をジエチルエーテル（３×２０ｍｌ）を用いて抽出した。これらの抽出物は、それはエステル基質とアルコール生成物の両方を含有しており、それを混合し、水を用いて洗浄し、硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ、濾過し、乾燥するまで蒸発させた。
【００６２】
５．５０ｍＭの（±）酪酸ソルケタールを用いた小規模な反応
加水分解溶液（ＣＲＬ、ＲＯＬ、ＨＬＥ、ＡＯＰ、Ｅ０１３に対して２５０μＬ；Ｃｕｔｉｎａｚｅ（キュチナーゼ）に対して５０μＬ）を、最終の反応体積５．０ｍＬ（基質５０ｍＭ、ＢＥＳ４．６５ｍＭ、アセトニトリル７％）のために、（±）酪酸ソルケタール（アセトニトリル中の０．７１５Ｍ溶液の内の３５２μＬ）及びＢＥＳ緩衝液（５．０ｍＭ溶液の内の４３９８μＬ、ｐＨ７．２）からなる溶液に添加した。反応は、上記と同様に精密に検査された。
【００６３】
実施例３
エナンチオ選択性の加水分解酵素の同定
本アッセイを、９６の窪みのマイクロ板中で、エナンチオ選択活性の加水分解酵素をスクリーンするために使用した。純粋な鏡像異性体を使用して、酪酸ソルケタールのそれぞれの鏡像異性体の加水分解の初期速度を、別々に測定した。市販の加水分解酵素のライブラリー（リパーゼ、エステラーゼ及びプロテアーゼ）を、酪酸ソルケタール、即ち製薬的及び生物学的に活性な化合物の合成における重要なキラルな基礎単位に対する活性のために、スクリーンした（Ｊｕｒｃｚａｋ等著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９８６年、第４２巻、４４７から４８８頁）。多くの研究者は、この基質を分解し得る、高いエナンチオ選択性の加水分解酵素を探していたが、成功していない（Ｖａｎｔｔｉｎｅｎ等著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：　Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、１９９７年、第８巻、９２３から９３３頁及び本明細書中で引用された文献）。微生物であるコマモナステストステロニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ　ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）もまた、４９のエナンチオ選択性を有する（Ｒ）−ソルケタールのエナンチオ選択性酸化に触媒作用を及ぼす（Ｇｅｅｒｌｏｆ等著、Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９４年、第４２巻、８から１５頁）。水中での加水分解では、最も高いエナンチオ選択性は、アスペルギルスｏｒｙｚａ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａ）で９であった（Ｐａｒｔａｌｉ等著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：　Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ、１９９２年、第３巻、６５から７２頁９のに対して、有機溶媒中でのソルケタールのアシル化では、最も高いエナンチオ選択性は、シュードモナス種（リパーゼ　ＡＫ）からのリパーゼで、２０から２５であった。２種類の鏡像異性体の加水分解の初期速度に大きな違いを示した加水分解酵素は、エナンチオ選択性を測定するための伝統的な方法によって更に分析された。鏡像異性体の加水分解の別々に測定された初期速度は、本当のエナンチオ選択性ではないことに注目しなさい、従ってこのスクリーニングによっては、見積もられたエナンチオ選択性のみが与えられる。本当のエナンチオ選択性は、それぞれの鏡像異性体に対する特異性定数（Ｋｃａｔ／ＫＭ）の比である。鏡像異性体の初期速度を別々に測定することによって、２種類の鏡像異性体の間の競合する結合が、除去された。飽和している基質条件下では、相対的な初期速度は、相対的なＫｃａｔ値に等しい。；部分的に飽和している条件下では、初期速度はまた、ＫＭ値に依存する。この様に、別々に測定された初期速度の比は、エナンチオ選択性に対するＫＭの影響の幾分か又は全てを無視する。この不正確性に係わらず、相対的な初期速度によって、見積もられたエナンチオ選択性が与えられる。
【００６４】
２．本アッセイの感度の最適化
殆どの加水分解酵素は、中性のｐＨ付近で最高の活性を有するので、本明細書中で提供されている例示的なアッセイは、ｐＨ７．２で行なわれるように設計された。４−ニトロフェノールを、ｐＨ指示薬として利用した。反応混合物のｐＨと、そのｐＫａ　（７．１５）（メルクインデックス（Ｔｈｅ　Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ）、第１０版、Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、ニュージャージー州、１９８３年、９５０頁）が同等であるので、ｐＨの変化が、大きくかつ直線的な色の変化を与えるのを確実にする（メルクインデックス（Ｔｈｅ　Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄｅｘ）、第１０版、Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ．、Ｒａｈｗａｙ、ニュージャージー州、１９８３年、９５０頁）。４−ニトロフェノール（二倍に希釈された水１０ｍｌ中の１０ｍｇ）のｐＫａはまた、標準化された塩基を添加した際に、ｐＨ変化の中間点を測定することによって、同定された。実験結果は、報告されている値と一致し、アセトニトリル７％を添加しても変化しなかった。プロトン化された形体及び脱プロトン化された形体の吸光係数の大きな違いが（４０４ｎｍで、２００対１８０００Ｍ−１ｃｍ−１）、優れた感度を与えた。吸光係数は、共存溶媒を添加すると僅かに変化し、実験によって測定された。４−ニトロフェノキシド／４−ニトロフェノールの高い初期吸収は、濃度を０．４５ｍＭに限定した。溶液中の４−ニトロフェノールの濃度（０．４５ｍＭ又は０．００６％）は、その溶解性の限界である０．０８％よりも充分に低く、出発時の吸収がから１．２という結果になった。ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸）を、そのｐＫａ（７．１５［］）（Ｂｅｙｎｏｎ等著、緩衝溶液、Ｔｈｅ　Ｂａｓｉｃｓ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード社、１９９６年、７２頁）が、４−ニトロフェノールのｐＫａと同一であるので、緩衝液として利用した。
【００６５】
３．スクリーニングアッセイの結果
９種類の加水分解酵素が、４以上の見積もられたエナンチオ選択性を示した。７種類のリパーゼ及びプロテアーゼは、（Ｒ）−エステルを好んだのに対して、２種類のエステラーゼは、（Ｓ）−エステルを好んだ。最も高いエナンチオ選択性は、ウマの肝臓エステラーゼ（ＨＬＥ、見積もられたエナンチオ選択性＝１２）、リゾプスオリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）リパーゼ（ＲＯＬ、見積もられたエナンチオ選択性＝１１）、及び、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ），　ｖａｒｉａｔｉｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｕｓ　Ａ（ＢＳＰ、見積もられたエナンチオ選択性＝７）で見出された。これまでの研究者は、アスペルギルスオリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）プロテアーゼ（ＡＯＰ）を、エナンチオ選択性の加水分解酵素であると同定していた。この加水分解酵素はまた、９種類のエナンチオ選択性加水分解酵素の中のものであった（見積もられたエナンチオ選択性＝５）。酪酸ソルケタールに対するエナンチオ選択性の加水分解酵素としての、ＨＬＥ、ＲＯＬ及びＢＳＰの同定は、このスクリーニングからの新規な結果である。
【００６６】
【表１】
2004513601.tif 000009
最初の３から４分間のデータのみが計算に使用されたが、反応は、時間の遅れが監視されないことを示す、遅い加水分解酵素又は加水分解酵素を確実にするために、１時間監視された。全ての基質／加水分解酵素溶液を、調製し、これは必要はないが、４回測定して、正確性を確実にした。７２の加水分解酵素で、４回の、合計のスクリーニング時間は、１８０分と、９６の窪みの板を充填するためのそれぞれの板の間の数分であった。この様に、短めのスクリーニング時間で、分単位まで時間を容易に減少させ得る。ラセミ体及びその鏡像異性体に対するライブラリーの完全なスクリーニングが、午後の内に、容易に完了させられる。ロボット工学もまた、これらの反応を実施する速度を高めるために利用されてもよい。
【００６７】
本アッセイにおける反応条件は、酪酸ソルケタールに対する見積もられたエナンチオ選択性を高めるという試みにおいて変えられた。例えば、加水分解酵素、特にはリパーゼの活性は、界面の存在で高まることが多い。この界面の活性化はまた、エナンチオ選択性を変化させ得ると、推論された。加水分解酵素のライブラリーを、ラセミ体ミセルに添加されたＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（非イオン性界面活性剤）を用いて、スクリーンされた。反応速度は、８種類の加水分解酵素（３種類のリパーゼ及び５種類のエステラーゼ）で高まり、３２種類の加水分解酵素で低下し、１２種類の加水分解酵素で変わらなかった。残念ながら、見積もられたエナンチオ選択性は、変わらないままであるか、又は、最も優れた加水分解酵素では、僅かに低下した。：ＡＯＰ（４．９から４．２へ低下）、ＲＯＬ（１１．３から９．６へ低下）、ＨＬＥ（１２．２から７．６へ低下）、ＢＳＰ（７．３から５．４へ低下）。非選択性の加水分解酵素では、見積もられたエナンチオ選択性は、僅かな増加又は低下を示した。例えば、ズブチリシンＣａｒｌｓｂｅｒｇは、２．６から２．８へ増加し、バチルス　ステアロテルモフィルスからのエステラーゼは、１．７から２．４へ増加し、アスペルギルスオリゼリパーゼは、４．９５から１．８へ低下した。全体的に、酪酸ソルケタールに対する選択性は、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の添加によって、顕著には変化しなかった。
【００６８】
これらのスクリーニング結果を確認するために、３種類の選択性加水分解酵素及び３種類の選択性の低い加水分解酵素のエナンチオ選択性を、従来の終点方法を使用して測定した、表２。スクリーニング溶液（１ｍＭの基質、共存溶媒として７％のアセトニトリル）の条件と同様の条件下で、本当のエナンチオ選択性及び見積もられたエナンチオ選択性は、２．３の因子内で一致した。１ｍＭの酪酸ソルケタールは、実際の予備反応では余りに薄いので、５０ｍＭの酪酸ソルケタールで、これらの加水分解酵素の選択性もまた測定した。尚、反応混合物は、基質の不溶性の水滴を含有していた。これらの条件下でのエナンチオ選択性もまた、２．６の因子内に、スクリーニングからのエナンチオ選択性の見積もりと一致した。
【００６９】
【表２】
2004513601.tif 000010
［ａ］反応混合物中の基質濃度、［ｂ］反応時間、［ｃ］出発物質（ｅｅｓ）又は生成物（ｅｅｐ）の測定された鏡像異性純度、［ｄ］ｅｅｓ／（ｅｅｓ＋ｅｅｐ）によって計算された転化度、［ｅ］本当のエナンチオ選択性を、参照［３］に従って、ｅｅｓ及びｅｅｐから計算した。速く反応するエステルの絶対的な立体配置は、括弧の中にある。誤差の限界は、３種類の別々のＧＣ注入から測定されたエナンチオ選択性から見積もられた。［ｆ］表１からの値である。［ｇ］ｎｒ＝反応せず
殆どのエナンチオ選択性の加水分解酵素は、ＨＬＥであり、それぞれ１ｍＭの基質濃度では、Ｅ＝１．４８であり、５０ｍＭの基質濃度ではＥ＝９．７であった。アセトニトリルを使用しない、５０ｍＭの基質では、ＨＬＥのエナンチオ選択性は、僅かに再びＥ＝８．７に傾いた（２５時間後、ｃ＝１７．１％）。これらの価値は１２．１（トリトンＸなし）と（トリトンＸあり）とのエンチオ選択制を見積もることに同意した。とＰａｒｔａｌｉ等がＡＯＰではエナンチオ選択性は９であると報告したが、我々は見積もられたエナンチオ選択性は４．９であり、我々の条件下では本当のエナンチオ選択性は４．８であると測定した。ＲＯＬに対して見積もられたエナンチオ選択性もまた、高かったが（１１．３）、本当のエナンチオ選択性は低め、Ｅ＝４．８から４．９であった。見積もられたエナンチオ選択性が低い加水分解酵素（ＣＲＬ、エステラーゼ　Ｅ０１３、キュチナーゼ）もまた、本当のエナンチオ選択性が低いことを示した。この様に、実際にエナンチオ選択性であると同定された加水分解酵素は、エナンチオ選択性であり、非選択性であると同定された加水分解酵素は、エナンチオ選択性ではなかった。この様に、このスクリーニング手順によって、中程度のエナンチオ選択性を有する、酪酸ソルケタールの分解に対する新規な加水分解酵素であると、ＨＬＥは素早く同定された。それは、ソルケタールのエステルの加水分解に対して、今日まで文献で報告されているもっとも選択的な加水分解酵素である。
【００７０】
４．本アッセイの定量的な有効性
色の変化がプロトンの遊離を正確に測定するのを確認するために、我々は、因子Ｑを実験によって測定し、それを、式１を使用して計算された理論的なＱと比較した。まず初めに、基質の加水分解によるプロトンの遊離は、ＨＣｌの添加によって真似された（図２）。酢酸等の他の酸もまた、同じ結果を示す。４−ニトロフェノキシドがプロトン化するために、吸収は直線的に低下した。傾きの逆数は、式１を使用して計算される、緩衝液の因子Ｑと対応する。減少は、全て直線的であり、傾きは、緩衝液濃度が減少するに連れて、増加した。しかしながら、２ｍＭ以下の緩衝液では、実験によって測定された傾きは、１０％以上も理論的な傾きと一致しなかった。この様に、５ｍＭは、正確性及び感度の間の妥協点として、本アッセイでは、緩衝液（ＢＥＳ）濃度として選択された。
【００７１】
反応条件における小さい変化は、本アッセイの感度又は正確性を妥協しなかった。Ｑの測定された値は、アセトニトリル又はジメチルスルホキシドを７％添加した際に、実験的な誤差（から５％）以上には変化しなかった。Ｑの測定された値はまた、市販の加水分解酵素中の知られていない緩衝液塩のために、又は、プロテアーゼの貯蔵溶液中に添加されているＣａＣｌ２（２ｍＭ）のためには、変化しなかった。
【００７２】
試験反応として、ラセミ体の酪酸ソルケタールのウマ肝臓エステラーゼで触媒作用を及ぼされた加水分解が、観察された。指示薬の吸収の低下、図３Ａは、直線的であり、１．８５μｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇの特異性活性と対応する。ソルケタールのｐＫａが高いために、ｐＨ７．２で加水分解されたそれぞれのエステル基に対して、１つのプロトンが放出されると、推定された。他のエステル（例えば、４−ニトロフェニルエステル）は、加水分解されたエステル基当り、１つ以上のプロトンを遊離し得り、式１で、説明されるべきである。基質を持たないか、又は、エステラーゼを持たない、対照実験によって、１時間に渡って、吸収が変化しないことが示された。反応が１００倍に規模が大きくなって、ｐＨスタットを用いて監視された場合、より高い特異性活性が測定された（４．９９ｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ）。この違いは、ｐＨスタットの実験において、速く機械的に攪拌することからの活性に起因し得る。
【００７３】
反応速度は、３種類の典型的な加水分解酵素に対して添加された酵素の量と共に、直線的に増加した。尚、ライブラリーの中のそれぞれの分類の加水分解酵素からの１つが、本アッセイで測定された、酵素で触媒作用を及ぼされた反応速度は、合計の酵素濃度に比例することを示した、図３Ｂ。
【００７４】
実施例５
素早いＥアッセイ
素早いＥ法は、これまでの実施例に記載されるｐＨ指示薬アッセイの拡大であり、現在利用可能なアッセイと比べて幾つかの利点を提供する。本明細書に示される通り、素早いＥ法は速くかつ正確な結果を与え、加水分解酵素を少量しか必要とせず、現在使用されている方法よりもより簡単なアッセイである。このアッセイは、下記に示される通りに行なわれた。
【００７５】
１．酪酸ソルケタールの素早いＥ測定
エステル結合の加水分解によって、上記に示される通り、アルコールと酸の部位、並びに、プロトンをも遊離させる。適するｐＨ指示薬を用いると、遊離させられたプロトンによって、ｐＨ指示薬の吸収に変化が生じる。このアッセイの条件を注意深く選択する場合、ｐＨ指示薬の吸収の変化の割合が、酵素で触媒作用を及ぼされるエステルの加水分解の速度に正比例する、式１。尚、４０４ｎｍは、ｐＨ指示薬の完全にプロトン化された形体及び脱プロトン化された形体の吸光係数の差異である。重要なことは、反応の緩衝液及びｐＨ指示薬は、吸収の速度論と酵素の速度論との間の直線的な相関関係を確実にするためには、同一のｐＫａ値を持たなくてはならない。感度の高いｐＨ指示薬アッセイによって、別々に酪酸ソルケタールの純粋な鏡像異性体の加水分解の速度を正確に測定することが可能になる、式１。
【００７６】
酪酸ソルケタールの純粋な鏡像異性体の、別々に測定された初期速度の測定に競合を導入するために、酢酸レゾルフィン等の参照化合物を添加し、続いてそれらの加水分解の相対速度を測定し得る、図４。
【００７７】
参照化合物の加水分解速度は、スクリーニング条件のためにレゾルフィンの吸光係数を測定すると、容易に計算される、式６（Ｅｑ．６）。本明細書中に示されるスクリーニング条件下で、ｐＨ７．２、７％のアセトニトリルで、ε＝１５１００Ｍ−１ｃｍ−１が測定された。
【００７８】
【数７】
2004513601.tif 000011
物の存在下で、酪酸ソルケタールの純粋な鏡像異性体の加水分解速度を測定するために、レ　ゾルフィンアルコール（ｐＫａ＝８．１５）の酸解離定数を、まず初めに測定した。酢酸レゾルフィンの加水分解で遊離させられたレゾルフィンの僅か１０％だけが、ｐＨ７．２で脱プロトン化され、従って１．１のプロトンが、加水分解された全ての酢酸レゾルフィン分子に対して、遊離させられる（１つのプロトンは、中性のｐＨで完全に脱プロトン化される酢酸からのものである）。ｐＨ指示薬は、全てのプロトンを検出するので、検出されたプロトンの合計の速度からの、参照化合物の加水分解からのプロトンが測定され、酪酸ソルケタールの純粋な鏡像異性体の酵素で触媒作用を及ぼされた加水分解の本当の速度が得られた、式７（Ｅｑ．）。
【００７９】
【数８】
2004513601.tif 000012
式７では、正確であるために、アッセイの間充分に強い緩衝液を使用して、溶液全体のｐＨが、素早いＥ測定の間顕著には変化しないのを確実にすることが重要であることに、注目のこと。脱プロトン化されたレゾルフィン分子の比は、ｐＨが変わるに連れて、変化する。５ｍＭのＢＥＳ緩衝液が、アッセイを通してｐＨの変化を小さくするのを確実にするための高い緩衝液濃度（基質の１０％の加水分解では０．０５ｐＨ単位）と、ｐＨ指示薬の感度を最大にするための低い緩衝液濃度（素早いＥ測定における基質の１０％の加水分解では吸収単位における変化は０．０５５未満）との間の妥協点である。
【００８０】
酪酸ソルケタール対参照化合物の純粋な鏡像異性体の加水分解の初期速度の比によって、基質の初期濃度を考慮した後に、選択性が生じる、式８（Ｅｑ．８）。
【００８１】
【数９】
2004513601.tif 000013
実験は、対抗する鏡像異性体を用いて繰り返され、選択性比の比によって、本当のエナンチオ選択性が生じる、式９（Ｅｑ．９）。
【００８２】
【数１０】
2004513601.tif 000014
広げられた素早いＥ法は、酪酸ソルケタール、即ち有機合成における一般的なキラルな基礎単位に対して、幾つかの加水分解酵素の素早いＥ値を測定するために利用された。次いで、これらの値は、終点方法によって測定されたＥ値と比較されて、素早いＥが正しくエナンチオ選択性を測定したことを確かめた。素早いＥによるエナンチオ選択性は、６種類の加水分解酵素のうち５つで、終点方法によるものと一致する、表３。ウマ肝臓エステラーゼだけが、終点Ｅと素早いＥの値の間に２倍の差異が観察された。これは、添加された界面活性剤であるＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００によって、素早いＥが低めであったことに起因し得り、それは終点反応の間には存在しなかった。
【００８３】
【表３】
2004513601.tif 000015
ａ表５参照、ｂデータの収集時間、ｃアッセイの間のマイクロ板の窪み中の最終濃度：酢酸レゾルフィン　０．１０ｍＭ、（Ｒ）−又は（Ｓ）−酪酸ソルケタール　１．０ｍＭ、アセトニトリル　７％、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００　０％０．１３４ｍＭ（０．８６％）、４−ニトロフェノール　０．４３４ｍＭ、ｐＨ７．２のＢＥＳ緩衝液４．６５ｍＭ。　４０４ｎｍ及び５７４ｎｍでの吸収の変化を、同時に監視した。速度（単位：ｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ）を、式５．１０及び５．１１を使用し、標準としてＢＳＡを使用してＢｉｏ−Ｒａｄアッセイによって測定される通りの、それぞれの窪み中のタンパク質の量を考慮して、計算した。自発的な化学的加水分解は観察されなかった。
【００８４】
ｄ　式６．７を使用して計算された鏡像異性体比。報告された誤差は、３回の測定で、標準偏差である。終点値は、ｐＨ指示薬又はＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を添加しなかった以外は、スクリーニングの間のマイクロ板の窪みの中と同一の条件を使用して、測定された：Ｊａｎｅｓ等著、Ｅｕｒ．　Ｊ．、１９９８年、第４巻、２３１７から２３２４頁。ｔ−ブチル酢酸レゾルフィン１０を、アッセイの間、窪みの中が０．１ｍＭの濃度で、素早いＥ測定に参照化合物として使用した。
【００８５】
２．ｐＨ指示薬を使用する、酪酸ソルケタール８の素早いＥ測定
これらの測定は、９６の窪みのマイクロ板及びマイクロ板読取装置を使用して、行なわれた。アッセイ溶液を、ｐＨ指示薬、４−ニトロフェノール（５．９ｍＭのＢＥＳ中の０．９１１５ｍＭ溶液の内の３０００Ｌ、ｐＨ７．２）、ＢＥＳ緩衝液（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を０．３３ｍＭ（２．１１％）含有する、５．０ｍＭ溶液の内の２５６０μＬ、ｐＨ７．２）、及び、アセトニトリル（２８．６μＬ）を混合し、次いでその溶液を攪拌することによって調製した。（Ｒ）−酪酸ソルケタール　（Ｒ）−８（アセトニトリル中の１６８．６ｍＭ溶液の内の３７．４μＬ）、及び、酢酸レゾルフィン　９（アセトニトリル中の１．６８５ｍＭ溶液の内の３７４μＬ）を、ゆっくりと攪拌している溶液に、滴下添加して、ミセルと透明な溶掖の形成を確実にした。加水分解酵素溶液（５μＬ／窪み）を、窪みに添加し、アッセイ溶液（１００μＬ／窪み）を、８−チャンネルのピペットを使用して、素早く添加した。それぞれの窪み中の最終濃度は、酪酸ソルケタール１．０ｍＭ、酢酸レゾルフィン０．１ｍＭ、ＢＥＳ緩衝液　４．６５ｍＭ、４−ニトロフェノール０．４３４ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を０．１３４ｍＭ（０．８６％）、アセトニトリル７％であった。板をマイクロ板読取装置に素早く置き、完全に混合するのを確実にするために振り、４０４ｎｍでの吸収の低下及び５７４ｎｍでの吸収の増加を同時に、マイクロ板ソフトウェアーによって許される限り頻繁に、典型的には１１秒毎に、２５℃で、監視した。データを、１５分間収集した。それぞれの加水分解を、４回行って、平均を取った。この手順を、他の鏡像異性体である（Ｓ）−８で繰り返した。活性を、式５．１０及び５．１１を使用し、曲線の直線で初期の部位の傾きを使用して、計算した。尚、４０４ｎｍ＝１７３００Ｍ−１ｃｍ−１であり、５７４ｎｍ＝１５１４０ｍ−１ｃｍ−１であり（両方とも我々の条件で実験によって測定された）、及び、１＝０．３０６ｃｍであった。特異性活性（μｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ）を計算するために、Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイによって測定される通りの、それぞれの窪み中のタンパク質の量を考慮した。
【００８６】
３．発色団基質を用いた素早いＥ
素早いＥ法を、発色団が直接にエステルの加水分解によって遊離させられる場合、ｐＨ指示薬を用いずに行うことができる、例えば４−ニトロフェニルエステルが、カルボン酸である。加水分解の初期速度に基づいて正確にエナンチオ選択性を評価するために、両方の鏡像異性体の加水分解速度は、酵素の活性部位のそれらの相対的な結合を同時に反映するように、同時に測定されなければならない。しかしながら、両方の鏡像異性体の加水分解の相対速度は、鏡像異性体純度を測定せずには、同時には測定され得ないので、従って研究者は、別の加水分解実験で２種類の鏡像異性体の加水分解の初期速度を測定することによって、エナンチオ選択性を見積もることがよくある、式１０（Ｅｑ．１０）。
【００８７】
【数１１】
2004513601.tif 000016
純粋な鏡像異性体の４−ニトロフェニルエステルの加水分解の初期速度を、３種類の共通のキラルなカルボン酸に対する、幾つかのリパーゼのエナンチオ選択性を素早く見積もるために、測定した。：２−フェニルプロパン酸、ｐ−ニトロフェニルエステル（又は４−ニトロフェニル　２−フェニルプロパノエート）、１；２−（４−イソブチルフェニル）プロパン酸（イブプロフェンとして商業的に入手可能である）、２；及びフェニルアラニン　３、図５。４−ニトロフェニルエステルの加水分解速度は、４０４ｎｍで４−ニトロフェノキシド陰イオンの遊離速度を監視することによって、分光測光法によって、便利なことに測定された、図６。別々に測定された加水分解の初期速度の比によって、エナンチオ選択性が見積もられた。フェニルアラニン３の素早いＥは、水溶液にはそれは不溶性であるために、測定されなかった。
【００８８】
それが酵素に対する、２種類の鏡像異性体の競合する結合を無視したので、速度の比は、７０％程度にＥを過大評価又は過小評価した。換言すると、研究者は、鏡像異性体に対するＫＭの差異が、エナンチオ選択性に、３から４の因子を与えることを見出した（Ｗｕ等著、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．、１９９０年、第１１２巻、１９９０から１９９５頁；ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｌｕｇｔ等著、有機合成における微生物試薬（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、Ｓｅｒｖｉ，Ｓ．編集、Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ、１９９２年、２６１から２７２頁）。
【００８９】
競合を再導入するために、テトラデカン酸レゾルフィンを、参照化合物として添加した、図７。（Ｓ）−１の加水分解の初期速度を、４０４ｎｍで監視し、同じ溶液中で参照化合物を５７２ｎｍで監視した。両方の基質の初期濃度を考慮した後、これらの速度の比によって、参照化合物に対する（Ｓ）−１の加水分解酵素の選択性がもたらされた、式８。
【００９０】
（Ｒ）−１及び参照化合物を使用する第二の実験によって、参照化合物に対する（Ｒ）−１の選択性がもたらされた。これらの２種類の選択性の比によって、鏡像異性体比がもたらされる、式９。
【００９１】
素早いＥ法は、５種類の異なるリパーゼを使用する、１及び２の両方で、終点方法と一致した（表３）。低い（Ｅ＝１４）、平均的な（Ｅ＝２７）及び優れた（Ｅ＝２１０）鏡像異性体比が、この技術によって正確に測定された（表４）。それぞれの加水分解実験には、３０秒必要であり、従って、Ｅの測定時間は、僅か１分であった。
【００９２】
【表４】
2004513601.tif 000017
ａ　詳細は表３参照。
【００９３】
ｂアッセイの間のキュベット中の最終濃度：テトラデカン酸レゾルフィン　０．０７１ｍＭ、（Ｒ）−又は（Ｓ）−エステル　０．３５１ｍＭ、アセトニトリル　９％、Ｘ−１００　０．７３％、ｐＨ８のＴｒｉｓ緩衝液４３ｍＭ。遊離させられた４−ニトロフェノキシド及びレゾルフィンを、２５℃で、１５秒間、それぞれ４０４ｎｍ及び５７４ｎｍで測定した。測定可能な自発的な加水分解は検出されなかった。速度（単位：μｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ）を、ｌ＋１ｃｍ、ε５７４ｎｍ＝３１５００Ｍ−１ｃｍ−１を使用して、計算した。
【００９４】
ｃ式（（初期速度（Ｓ）−１／初期速度６）×（初期速度６／初期速度（Ｒ）−１））を使用して、計算された鏡像異性体比。誤差は、３回の測定で、標準偏差である。
【００９５】
ｄ　表５からの値である。
【００９６】
ｅ　ＣＲＬ溶液（２１４ｍｇ／ｍｌ；１．９ｍｇタンパク質／ｍｌ）
【表５】
2004513601.tif 000018
ａ　反応条件：室温、ｐＨ８．０の、１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液９ｍｌ、固体のリパーゼ粉末１００ｍｇ、又は、ＩＰＡ−ＣＲＬのタンパク質０．７ｍｇ、アセトニトリル１ｍｌ中に溶解した基質１００ｍｇ、但し、３では、ｐＨ５の１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液　８ｍｌ、固体のリパーゼ　２０８ｍｇ、アセトニトリル１ｍｌ中に溶解した基質１００ｍｇ。
【００９７】
ｂ　分光測光測定、リパーゼを、Ｔｒｉｓ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．５）中に溶解させ、不溶性の物質を除去するために遠心分離した。下記リパーゼは、６０秒間に渡って、４−ニトロフェノール−２−フェニルプロパノエートのいずれの鏡像異性体に対しても活性を示さなかった（＜１×１０−５μｍｏｌ／分／ｍｌ）：アスペルギルス　リゾプス　ＡＰ−６（Ａｍａｎｏ社、４５．０ｍｇ／ｍｌ）、カンジダ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ａｍａｎｏ社、３９．０ｍｇ／ｍｌ）、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｖｉｓｃｏｓｕｍ（シグマ−アルドリッチ社、６．５ｍｇ／ｍｌ）、ムーコル　ｊａｖａｎｉｃｕｓ（Ａｍａｎｏ社、４０．２ｍｇ／ｍｌ）、リゾプス　オリゼ（Ａｍａｎｏ社、３０．９ｍｇ／ｍｌ）、リゾプス　ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒ（Ａｍａｎｏ社、３２．０ｍｇ／ｍｌ）、小麦胚芽（シグマ−アルドリッチ社、１６．１ｍｇ／ｍｌ）。ｃ　初期速度の測定に使用された貯蔵溶液中の緩衝液１ｍｌ当りの固体の酵素の量（ｍｇ）。「ｎａ」＝入手できず
ｄ　標準としてＢＳＡを使用してＢｉｏ−Ｒａｄアッセイによって測定された貯蔵溶液のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）。
【００９８】
ｅ　Ｃｈｅｎ，　Ｃ．　Ｓ；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，　Ｙ．；　Ｇｉｒｄａｕｋａｓ，　Ｇ；　Ｓｉｈ，　Ｃ．　Ｊ．著、Ｊ．　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．、１９８２年、１０４巻、７２９４から７２９９頁に定義される通りの、ｅｅｓ及びｅｅｐから計算される鏡像異性体比。全てのリパーゼは、１つの実施例以外は、（Ｓ）−鏡像異性体を好んだ。Ｅに対する誤差の限界を見積もったところ、鏡像異性体純度では誤差１％と推定された。
【００９９】
ｆ　分光測光アッセイの間の反応条件：基質０．３７ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００　０．３８％、Ｔｒｉｓ緩衝液４５．２ｍＭ、アセトニトリル４．７６％、但しＡＮＬを用いた反応では、基質０．２５ｍＭ、アセトニトリル０．５％、ｐＨ８．０のＨＥＰＥＳ緩衝液　１０ｍＭ。加水分解速度（単位：μｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ）が報告され、ε＋１５８００Ｍ−１ｃｍ−１及びｌ＋１ｃｍを用い、ベール−ランバート（Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ）の法則を使用して計算する。
【０１００】
ｊ　誤差の限界は、３回の別々の実験の平均である。
【０１０１】
ｋ　Ａｍａｎｏ　Ｅｎｚｙｍｅ　ＵＳＡ社（Ｔｒｏｙ、ＶＡ）
ｌ　シグマ−アルドリッチ社（Ｏａｋｖｉｌｌｅ、ＯＮ）
ｍ　実験の章の概要と同様、イソプロパノールを用いて部分的に精製されたＣＲＬ
ｎ　（±）−フェニルアラニン−４−ニトロフェニルエステル　ＴＦＡ塩は、３．７８×１０−４ｓ−１の速度で、ｐＨ５で、自発的に加水分解した（Ｔ１／２＝０．５１ｈ）。基質が完全に加水分解されないと、反応を行い、鏡像異性純度を測定することは不可能であった。
【０１０２】
ｏ　加水分解の速度を、バックグラウンドの化学的な加水分解に対して修正した。
【０１０３】
しかしながら、素早いＥを使用すると、１のＩＰＡ−ＣＲＬで触媒作用を及ぼされる加水分解に対して、２１０±２０のＥを測定し、２に対しては低めの限界である＞１４０を設定することが可能である、表３。素早いＥは、遅い鏡像異性体の加水分解の速度を測定することによって、これらの高い値を測定する。２に対して高めの鏡像異性体比を測定することができないのは、２の反応性が通常は低いためであった。ＩＰＡ−ＣＲＬは、速い鏡像異性体に対する因子２３、及び、遅い鏡像異性体に対する因子＞３０００の、参照化合物を好んだ。
【０１０４】
ゆっくりめに反応する参照化合物を使用すると、高めの鏡像異性体比を測定することが可能になり得る。素早いＥを用いて高い鏡像異性体比を測定するための他の限界は、出発時の遅い鏡像異性体の鏡像異性純度である。速い鏡像異性体を含有する反応は、本当のＥより低い測定されたＥを与えるであろう。遅い鏡像異性体の鏡像異性純度が＞９９．９％である場合、素早いＥは、１０００までのエナンチオ選択性を測定し得るべきである。
【０１０５】
素早いＥを使用して高いエナンチオ選択性を測定することができることは、これが殆どのスクリーニング研究の目標であるので、重要である。終点方法を使用すると、転化の測定誤差又は鏡像異性純度の限界により、１００より大きい鏡像異性体比を測定することが難しくなる。
【０１０６】
実施例６
キラルなアルコール及びカルボン酸に対する、エナンチオ選択性のための素早いＥアッセイの使用
１．分光測光アッセイ
発光団エステルの別々に測定された初期速度。２−フェニルプロパン酸　１、及び、２−（４−イソブチルフェニル）プロパン酸　２の４−ニトロフェニルエステルを、Ｖｏｒｄｅｒｗｕｂｅｃｋｅに従って、水溶液中に乳化させた。（Ｒ）又は（Ｓ）−４−ニトロフェニル−エステルからなる溶液（アセトニトリル中の７．８ｍＭ溶液の内の５００μＬ）を、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｓｕｒｆａｃｔ　−　Ａｍｐｓ社製）を０．４５ｗ／ｖ％含有する、Ｔｒｉｓ緩衝液（９００μＬ、５０ｍＭ、ｐＨ７．５）に、滴下添加し、透明になるまで攪拌した。このエマルジョンは、少なくとも３時間は透明のままであった。加水分解の初期速度を測定するために、表３のリパーゼ溶液（１００μＬ）を、２５℃で、キュベット中で基質エマルジョン（９００μＬ）に添加し、４０４ｎｍでの吸収の直線的増加を、１５秒間監視した。キュベット中の最終濃度は、基質０．３６９ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００　０．３９％、Ｔｒｉｓ緩衝液４５ｍＭ、アセトニトリル　４．７６％であった。自発的な化学的な加水分解は検出されなかった。アセトニトリル中の、フェニルアラニン　３の４−ニトロフェニルエステルからなる溶液（アセトニトリル中の５０ｍＭ溶液の内の５μＬ）を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０００μＬ、１０ｍＭ、ｐＨ７．５）に添加した。加水分解速度を測定するために、ＡＮＬ溶液５μＬを、添加し、吸収の変化を上記の通りに監視した。報告された速度を、自発的な化学的な加水分解に対して修正する（ｔｌ／２＝０．５１ｈ）。
【０１０７】
２．発光団エステル　１から２の素早いＥ測定
基質溶液は、別々に測定された初期速度測定に対するのと同じであったが、テトラデカン酸レゾルフィン　６からなる溶液（アセトニトリル中の１．５９ｍＭ溶液の内の０．５ｍｌ）を、純粋な鏡像異性からなる渦を巻いている溶液に、ゆっくりと添加した。テトラデカン酸レゾルフィンを溶解させるために、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００の濃度が２倍高いものを使用する必要があった。エマルジョンは、少なくとも２時間は透明なままであった。加水分解の初期速度を測定するために、表４のリパーゼ溶液（１００μＬ）を、２５℃で、キュベット中で基質エマルジョン（９００μＬ）に添加し、４０４ｎｍ及び５７４ｎｍでの吸収の直線的増加を、１５秒間監視した。速度（単位：μｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ）を、それぞれのキュベット中のタンパク質の量を考慮した後に、計算する。キュベット中の最終濃度は、基質０．３５１ｍＭ、テトラデカン酸レゾルフィン　０．０７１ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００　０．７３％、Ｔｒｉｓ緩衝液４３ｍＭ、アセトニトリル　９％であった。自発的な化学的な加水分解は、４０４ｎｍでも５７４ｎｍでも検出されなかった。
【０１０８】
３．本当のＥを測定するための、エステルの小規模な酵素で触媒作用を及ぼされた加水分解酵素に対する一般的な手順
リパーゼ（固体１００ｍｇ又はＩＰＡ−ＣＲＬのタンパク質０．７ｍｇ）を、ＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液（９ｍｌ、１０ｍＭ、ｐＨ８）に添加し、３０分間攪拌して、完全に溶解するのを確実にした。基質（１００ｍｇ）を、アセトニトリル１ｍｌ中に溶解させ、攪拌している溶液に添加し、０．０９６５ＮのＮａＯＨで自動的に滴定することによってｐＨ８を維持するｐＨスタットによって、加水分解速度を監視した。ジエチルエーテル（３×２０ｍｌ）を用いて、残っている出発物質を抽出することによって、反応を終了させた。次いで、水相を、１ＮのＨＣｌを用いてｐＨ２まで酸性化し、生成物の酸を、ジエチルエーテル（３×２０ｍｌ）を用いて抽出した。エマルジョンを粉砕し、酵素を不活性化させるために、精密検査している間に、エタノールを滴下添加した。両方の抽出物を、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。分析のために、残っている出発物質を、エタノール中の水性ＮａＯＨ（１．５当量）を使用して、酸に転換させた。鏡像異性体の過剰分を、下記に記載される通りにＨＰＬＣによって、測定した。
【０１０９】
４．ＨＰＬＣによる鏡像異性体の過剰分の測定
１及び２の鏡像異性体を、Ｄａｉｃｅｌ　ＯＤ−Ｈカラムを使用して、２５℃、２５４ｎｍ、１．０ｍｌ／分で、分析した。絶対的な立体配置を、確実な試料を用いて確かめた。２−フェニルプロパン酸；９８：２：１ヘキサン：イソプロパノール：ＴＦＡ；ｋＲ’＝３．３５；ｋＳ’＝４．０５；α＝１．２：Ｒｓ＝２．１３、４−ニトロフェニル−２−（４−イソブチルフェニル）プロパノエート；１００：１：０．１ヘキサン：イソプロパノール：ＴＦＡ；ｋＲ’＝２．４１；ｋＳ’＝２．９３；α＝１．２９；Ｒｓ＝１．６６、２−（４−イソブチルフェニル）プロパン酸；１００：１：０．１ヘキサン：イソプロパノール：ＴＦＡ；ｋＲ’＝３．３１；ｋＳ’＝４．２７；α＝１．２９；Ｒｓ＝２．４３。フェニルアラニンの鏡像異性体を、Ｃｒｏｗｎｐａｋ　ＣＲ（＋）カラムを使用して、２５℃、２００ｎｍ、０．８ｍｌ／分で、移動相としてｐＨ２の水性ＨＣｌＯ４を用いて、分析した。フェニルアラニン：ｋＤ’＝３．９３；ｋＬ’＝５．２０；α＝１．３２；Ｒｓ＝３．８６。
【０１１０】
実施例７
エナンチオ選択性のエステラーゼのための素早いＥスクリーニング
好熱性微生物からのエステラーゼの可能性のある合成用途を同定するための、約５０のエステルからなるライブラリーに対する基質の選択性及びエナンチオ選択性。スクリーニングを、素早いＥ法を使用して成し遂げた。尚、それは加水分解及び発光団の競合するエステルを検出して、正確な選択性を確立するために、ｐＨ指示薬を使用する。このスクリーニングによって、ＴｈｅｒｍｏＧｅｎ社（シカゴ、ＩＬ）から入手した或るエステラーゼが、通常ヘキサノイル　アシル基を好み、アセチル基と比べて選択性が１０００より大きいこともあることが、示された。しかしながら、１種類のエステラーゼであるＥ０１８ｂは、７６の因子で、ヘキサノイルと比べてアセチルを好む。この選択性によって、アセチル又はヘキサノイル保護基を選択的に除去することが可能になる。１９種類のエステラーゼの内の１３種類が、（Ｒ）−鏡像異性体を好む酪酸１フェニルに対して、高いエナンチオ選択性（＞５０）を示した。３種類のエステラーゼ（Ｅ００８、Ｅ０１１、Ｅ０１４）は、（Ｓ）−鏡像異性体を好む２−クロロプロパノエートに対して、中程度又は優れたエナンチオ選択性（＞２０）を示し、１種類のエステラーゼ（Ｅ００４）は、（Ｓ）−鏡像異性体を好む酢酸メンチルに対して、高い選択性（＞５０）を示す。この様に、可能性のある合成用途の速い同定によって、新規な酵素のキャラクタリゼーションで、素早いＥ法の有用性が示される。
【０１１１】
１．加水分解酵素の初期スクリーニング
９６の窪みのポリスチレン製マイクロ板のそれぞれの窪みを、エステル溶液（アセトニトリル中の１４．３ｍＭ溶液の内の７μＬ）、４−ニトロフェノール溶液（ＢＥＳ緩衝液（１ｍＭ、ｐＨ７．２）中の１．９３５ｍＭの内の２３μＬ）、及び、ＢＥＳ緩衝液（６５μＬ、１ｍＭ、ｐＨ７．２）で充填した。それぞれの窪み中の最終濃度は、基質１ｍＭ、４−ニトロフェノール　０．４５ｍＭ、ＢＥＳ緩衝液　１ｍＭ、及び、アセトニトリル　７％であった。エステラーゼ溶液の等分した部分（ＢＥＳ緩衝液（５ｍＭ）中の５μＬ）、及び、４０４ｎｍでの吸収の低下を、２０分間、２５℃で監視した。ブランクは、基質を含有していなかった。必要な場合には、エステラーゼ濃度を、増加又は低下させた。
【０１１２】
２．基質の選択性及びエナンチオ選択性の測定
貯蔵溶液を、４−ニトロフェノール溶液（０．３３ｍＭのＴｒｉｔｏｎ　Ｘを含有する、ｐＨ７．２の、１ｍＭのＢＥＳ中の１．８２５ｍＭ溶液の内の１．２９３μＬ）、ＢＥＳ緩衝液（０．３３ｍＭのＴｒｉｔｏｎ　Ｘを含有する、ｐＨ７．２の、１ｍＭの溶液の内の３３３９μＬ）、及び、アセトニトリル（６５．５Ｌ）を混合することによって、調製した。基質溶液（例えば、アセトニトリル中の１４９ｍＭのビニルピバレートの内の３５．１Ｌ）及びレゾルフィンエステル溶液（例えば、アセトニトリル中の２ｍＭのｔ−ブチル酢酸レゾルフィンの内の２６３Ｌ）を、連続して攪拌しながら、滴下添加して、少なくとも数時間安定な透明なエマルジョンを形成させた。この溶液を、９６の窪みのポリスチレン製マイクロ板にピペットで移した（１００μＬ／窪み）。エステラーゼ溶液（５ｍＭのＢＥＳ中の５μＬ）を、それぞれの窪みに添加して、マイクロ板読取装置に置き、５秒間振り、４０４ｎｍでの吸収の低下及び５７４ｎｍでの吸収の増加を、マイクロ板読取装置によって許される限り頻繁に、典型的には１１秒毎に、測定した。データを、２０分間、２５℃で、３回収集し、平均を取った。活性を、曲線の直線的な初期の部分を使用して、上記式から計算した。窪み中の最終濃度は、基質１．０ｍＭ（ビニルピバレート）、ｔ−ブチル酢酸レゾルフィン０．１０ｍＭ、ｐＮＰ　０．４５ｍＭ、ＢＥＳ　１．１２ｍＭ、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ　０．２９ｍＭ、ＡｃＣＮ　７％であった。
【０１１３】
同様のタイプの計算は、選択性を記録する他の方法を使用して、これまでにも行われている。最も顕著なものとして蛍光ラベリングし、次いでエドマンのペプチド配列の減成（Ｐｅｔｉｔｈｏｒｙ等著、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ、１９９１年、第８８巻、１１５１０から１１５１４頁）、及び、質量分析と組み合わされたＨＰＬＣ（Ｂｒｉｋｅｔｔ等著、Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９１年、第１９６巻、１３７から１４３頁；Ｂｅｒｍａｎ等著、Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．、１９９２年、第２６７巻、１４３４から１４３７頁）を行う方法である。加えて、これらの状況の処理のための式の誘導は、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒによってなされた（Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ等著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９３年、第３２巻、４３４４から４３４８頁）。
【０１１４】
３．スクリーニング方法
初期スクリーニングは、異なるエステルの加水分解の初期速度を測定する。反応の速度は、ｐＨ指示薬である４−ニトロフェノールを使用して、プロトンの遊離を監視することによって、測定された。このアッセイでは、フェノキシドの黄色が、反応が進行するに連れて消失する。加水分解されたエステルの量は、当業者において知られている通り、定量的に測定され得る。
【０１１５】
２種類の基質の別々に測定された初期速度を比較することによって、加水分解酵素が好む基質の考え方が与えられるが、それによっては、加水分解酵素の選択性の定量測定は与えられない。酵素の選択性は、相対的なＫｃａｔ（反応の速度）及びＫＭ（ほぼ、基質の結合）の両方によって、決定される。例えば、同じ速度で反応する２種類の基質を想像のこと、しかし一方がよりよく結合する。競合実験において、上手く結合する方が、選択的に反応するであろう、しかし速度を別々に測定する場合には、両方が同じ速度で反応するであろう（基質の濃度はＫＭ以上であると推定される）。この理由のために、別々に測定された初期速度の比は、酵素の本当の選択性を測定するものではない。定量測定には、競合実験が必要である。；即ち、活性部位に対して両方の基質を競合させる。選択性を測定するための１つの方法は、互いに対して２種類の基質を競合させることである。実際に、研究者は、基質を混合し、加水分解の相対量をＴＬＣ又はＧＣで測定することによって、加水分解酵素の鎖長の選択性をこれまでは測定していた（Ｂｅｒｇｅｒ等著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｌｅｔｔ．、１９９１年、第１３巻、６４１から６４５頁；Ｓｕｇｉｕｒａ等著、Ｃｈｅｍ．　Ｐｈａｒｍ．　Ｂｕｌｌ．、１９７５年、第２３巻、１２２６から１２３０頁）。
【０１１６】
しかしながら、それが第三の基質、即ち我々が参照化合物と呼ぶ基質に対して競合する際に、それぞれの基質の選択性を測定する方が、より速い。２種類の競合する反応の比は、本当の選択性である。参照化合物として、加水分解によってピンク色のレゾルフィンを生じる、酢酸レゾルフィンを図８に示される通り使用した。選択性を正確に測定するには、基質及び参照化合物が、比較可能な速度で反応することを必要とする。幾つかの基質は、速く反応するのに対して、他の基質はゆっくりと反応するので、我々は、速く反応する参照化合物とゆっくり反応する参照化合物の両方を必要とする。幾つかの場合で、我々は酢酸レゾルフィンを、参照化合物として、ゆっくりめに反応するレゾルフィンピバロエート又はイソ酪酸レゾルフィンと取り替えた。
【０１１７】
４．基質の選択性の測定
ＴｈｅｒｍｏＧｅｎエステラーゼの基質の選択性を調査するための、３１種類の異なる商業的に入手可能なエステルを加水分解させる酵素の可能性、図式１（図９、表６）。
【０１１８】
【表６】
2004513601.tif 000019
ａ加水分解されたエステルｍｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ、太字の数字は、加水分解されたエステルが＞１００ｍｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇの全ての特異性活性を強調している。
【０１１９】
優れている基質は、加水分解されたエステルが＞１００ｍｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇの特異性活性を示したのに対して、非常に優れている基質は、＞１０００の特異性活性を示した。最も優れている基質は、活性化されたエステルであり、それはまた化学的に最も反応性が高い。：ビニルエステル（１から６）、トリフルオロ酢酸エチル（１７）、酢酸フェニル（２６）。異なる鎖長を有するビニルエステル及びエチルエステルの中で、殆どのＴｈｅｒｍｏＧｅｎエステラーゼが、中程度の鎖長（ブタン酸エステル及びヘキサン酸エステル）を好むと思われるのに対して、Ｅ０１８ｂは、酢酸エステルを非常に好むように思われる。立体障害のあるビニルピバロエート（１１）は、全てのエステラーゼに対して劣る基質であったのに対して、安息香酸ビニル（１０）は、複数のエステラーゼに対して優れた基質であった。極性エステル（例えば、２０、２１、３１）は、通常劣る基質であった。酪酸エチル（１３）は、より疎水性のトリブチルイン（２９）よりも、非常にゆっくりと反応した。疎水性基質のこの好みによって、これらのエステラーゼが、リパーゼに関連し得ることが示される。
【０１２０】
５．アシル鎖長の選択性
異なるアシル鎖長に対するＴｈｅｒｍｏＧｅｎエステラーゼの本当の選択性を、競合実験を使用して測定した。レゾルフィンエステルを、上記に説明される通り、競合基質として使用し、その結果をヘキサン酸エステル＝１００に標準化した、表７。本当の選択性は、見積もられた選択性と同じであった。
【０１２１】
【表７】
2004513601.tif 000020
ａ　他の断りがない限りは、参照化合物として酢酸レゾルフィンを使用して測定された、本当の選択性（見積もられた選択性との誤差限界は、±１０から３０％）。ｎｄ＝測定されず。
【０１２２】
ｂ　基質が、全ての入手可能なレゾルフィンエステルよりもかなりゆっくりめに反応した。列挙された値は、見積もられた上限である。
【０１２３】
ｃ　参照化合物としてイソ酪酸レゾルフィン。
【０１２４】
ｄ　参照化合物としてレゾルフィンピバロエート。見積もられた誤差限界は、大き目であり、±５０％である。
【０１２５】
ｆ　ミカンの皮からのアセチルエステラーゼ
ビニルエステルの中で、ヘキサン酸エステルが、酢酸エステルが最も優れた基質である、Ｅ０１８ｂを除く全てに対して、最も優れた基質であった。Ｅ０１８ｂは、ヘキサン酸ビニルと比べて７６倍も酢酸ビニルを好んだ。酢酸エステルは、多くのエステラーゼ（例えば、Ｅ００６、Ｅ００８、Ｅ００１３、Ｅ００１４）に対して、非常に劣る基質であった。例えば、Ｅ００６は、酢酸ビニルと比べて、ヘキサン酸ビニルを＞１０００倍好んだ。エチルエステルに対するより限定されたデータの中で、ヘキサン酸エステル対酢酸エステルの選択性は、同じであった。；Ｅ０１８ｂは、ヘキサン酸エチルと比べて、酢酸エチルを２１倍好んだのに対して、Ｅ００６は、酢酸エチルと比べて、ヘキサン酸エチルを＞１０００倍好んだ。アセチル基に対するＥ０１８ｂの選択性を確かめると、Ｅ０１８ｂは、酢酸エステルの加水分解に触媒作用を及ぼしたが、鏡像異性体の対のライブラリー中の酪酸エステル又は他のエステルには触媒作用を及ぼさなかった、下記参照。初期スクリーニングによって示される通り、本当の選択性の測定によって、ビニルピバロエート及び安息香酸ビニルの両方は劣る基質であることが示された。
【０１２６】
ビニルエステル対エチルエステルに対する鎖長の選択性には幾分小さい差があった。例えば、Ｅ００２は、デカン酸ビニルと比べて、ヘキサン酸ビニルを１１倍好んだが、同じ酵素は、ヘキサン酸エチルと比べて、デカン酸エチルを２から３倍しか好まなかった。
【０１２７】
比較のために、鎖長の選択性を、ミカンの皮からのアセチルエステラーゼ（ＡｃＥ）に対しても測定した。尚、ＡｃＥは、シグマ社から商業的に入手可能である。それはアセチル基を除去するために有機合成で数回使用された（Ｗａｌｄｍａｎｎ等著、Ｂｉｏｏｒｇ．　Ｍｅｄ．　Ｃｈｅｍ．、１９９４年、第２巻、４７７から４８２頁；Ｗａｌｄｍａｎｎ，　Ｈ；　Ｈｅｕｓｅｒ，　Ａ；　Ｒｅｉｄｅｌ，　Ａ．著、Ｓｙｎｌｅｔｔ，１９９４年、６５から６７頁）。ビニルエステルでは、ＡｃＥは、ヘキサノイル基と比べて、僅か７．７倍しかアセチルを好まず、Ｅ０１８ｂよりも約１０倍低い選択性である。
【０１２８】
６．見積もられたエナンチオ選択性
エナンチオ選択性反応に対する、ＴｈｅｒｍｏＧｅｎエステラーゼの可能性を評価するために、エステラーゼの加水分解の初期速度を、２１の対の鏡像異性体を使用して測定した、機構２、図１０及び表８から１２。これらの初期速度の比が、見積もられたエナンチオ選択性である。
【０１２９】
【表８】
2004513601.tif 000021
ａ　特異性活性（単位：加水分解されたエステルｍｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ）。速度　１００は、強調のために太字にされている。
【０１３０】
ｂ　見積もられたエナンチオ選択性は、２種類の鏡像異性体の加水分解の初期速度の比である（速い鏡像異性体に対する速度／遅い鏡像異性体に対する速度）
ｃ　基質が反応しなかったので、測定できなかった。
【０１３１】
【表９】
2004513601.tif 000022
ａ　特異性活性（単位：加水分解されたエステルｍｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ）。速度　１００は、強調のために太字にされている。
【０１３２】
ｂ　見積もられたエナンチオ選択性は、２種類の鏡像異性体の加水分解の初期速度の比である（速い鏡像異性体に対する速度／遅い鏡像異性体に対する速度）
ｃ　基質が反応しなかったので、測定できなかった。
【０１３３】
【表１０】
2004513601.tif 000023
ａ　特異性活性（単位：加水分解されたエステルｍｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ）。速度　１００は、強調のために太字にされている。
【０１３４】
ｂ　見積もられたエナンチオ選択性は、２種類の鏡像異性体の加水分解の初期速度の比である（速い鏡像異性体に対する速度／遅い鏡像異性体に対する速度）
ｃ　基質が反応しなかったので、測定できなかった。
【０１３５】
【表１１】
2004513601.tif 000024
ａ　特異性活性（単位：加水分解されたエステルｍｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ）。速度　１００は、強調のために太字にされている。
【０１３６】
ｂ　見積もられたエナンチオ選択性は、２種類の鏡像異性体の加水分解の初期速度の比である（速い鏡像異性体に対する速度／遅い鏡像異性体に対する速度）
ｃ　基質が反応しなかったので、測定できなかった。
【０１３７】
【表１２】
2004513601.tif 000025
ａ　特異性活性（単位：加水分解されたエステルｍｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇ）。速度　１００は、強調のために太字にされている。
【０１３８】
ｂ　見積もられたエナンチオ選択性は、２種類の鏡像異性体の加水分解の初期速度の比である（速い鏡像異性体に対する速度／遅い鏡像異性体に対する速度）
ｃ　基質が反応しなかったので、測定できなかった。
【０１３９】
アルコールの位置にキラリティーを有する基質（表８及び９）は通常、カルボン酸の位置にキラリティーを有する基質（表１０から１２）よりも、より速く反応した。最も劣る基質−３９、４７、４６、４８、４０、５１、５２−は、カルボン酸の位置に立体中心を有する極性分子であった。最も優れた基質−３２、３３、３５、３７−は、アルコールの位置に立体中心を有する非極性分子であった。この観察は、極性エステルが劣る基質であることも示した、上記スクリーニングと一致する。
【０１４０】
見積もられたエナンチオ選択性は、殆どの場合に、２以下であったが、２種類の基質（３８、４５）が、殆どのＴｈｅｒｍｏＧｅｎエステラーゼで、高めの見積もられたエナンチオ選択性を示した。加えて、６種類の他の基質（３４、３６、４３、４４、４７、５０）は、複数のエステラーゼで、２以上の見積もられたエナンチオ選択性を示した。
【０１４１】
７．本当のエナンチオ選択性
これらのエステルの内の５種類に対する本当のエナンチオ選択性を、上記に記載される通り、参照化合物としてレゾルフィンエステルを使用して測定した。基質４４、４７及び５０に対するエナンチオ選択性の測定は、参照化合物として使用されたレゾルフィンエステルと比較して、それらが余りにゆっくりと反応したために、得られなかった。他の場合において、遅い鏡像異性体が、参照化合物よりもかなり遅く反応した場合には、我々は、エナンチオ選択性に対してより低めの限界を設定することだけできた。結果を、表１３に要約するが、選択された測定に対する詳細なデータは、上記表８にある。
【０１４２】
【表１３】
2004513601.tif 000026
ａ　ｎｒ＝基質が反応しなかったために測定されなかった。ｎｄ＝見積もられたエナンチオ選択性が＜２であったために測定されなかった。他の断りがない限り、本当のエナンチオ選択性は、参照化合物として酢酸レゾルフィンを使用して測定され、見積もられた誤差は±１０から３０％である。遅い鏡像異性体の速度が、余りに遅くて正確に測定できなかった場合は、エナンチオ選択性に対してより低めの限界が与えられる。
【０１４３】
エステラーゼのいずれも、一級アルコールのエステルである、３４に対しては、５以上のエナンチオ選択性を示さなかった。エステラーゼの殆どが、二級アルコールのエステルである、酪酸フェニルエチル　３８に対して、高いエナンチオ選択性を示した。エステラーゼＥ００２、Ｅ００４、Ｅ００５、Ｅ００８、Ｅ００９、Ｅ０１０、Ｅ０１１、Ｅ０１３、Ｅ０１４、Ｅ０１５、Ｅ０１９及びＥ０２０の全てが、＞５０エナンチオ選択性を示した。加えて、Ｅ００１及びＥ００６もまた、非常にエナンチオ選択性であり得るが、エナンチオ選択性に対する我々の測定された低めの限界が、４７及び３３であった。他のリパーゼ及びエステラーゼと同様に、ＴｈｅｒｍｏＧｅｎエステラーゼは、３８の（Ｒ）−鏡像異性体を好んだ。１種類のエステラーゼ、Ｅ００４が、他の第二級アルコールである、酢酸メンチルに対して、高いエナンチオ選択性（Ｅ＞６８）を示した。加えて、２種類の他のエステラーゼ、Ｅ００１及びＥ００２もまた、非常にエナンチオ選択性であり得るが、エナンチオ選択性に対する我々の測定された低めの限界が、低かった。：それぞれ２．４及び６．４。好まれた鏡像異件体は、（Ｓ）であった。確認及び批評しなさい。
【０１４４】
殆どのエステラーゼが、２−クロロプロパン酸メチル　４５に対して、中程度又は優れたエナンチオ選択性を示した。エステラーゼＥ００８、Ｅ０１１及びＥ０１４は、２４以上のエナンチオ選択性を示した。全てのエステラーゼが、（Ｓ）−鏡像異性体を好んだ。５種類のエステラーゼは、ジオキソラン誘導体　４３に対して幾分エナンチオ選択性を示した。反応が遅かったので、エナンチオ選択性に対する測定された低めの限界は、低い。
【０１４５】
本発明の好ましい形態を、図面に示し、記載したが、好ましい形体の変形が、当業者には明らかであろうので、本発明は、示され記載された特定の形体に限定されるとして解釈されるべきではないが、代わりが、特許請求の範囲に記載される通りである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
選択性、この例ではエナンチオ選択性のための比色定量スクリーンの図である。丸は、（Ｒ）−又は（Ｓ）−鏡像異性体のいずれか一方を含有する、マイクロ板中の窪みを表わす。エステルの加水分解によって、ｐＨ指示薬を脱色する酸が遊離する。黒丸は、反応が生じないことを表わすのに対して、白丸は、加水分解が生じた窪みを表わす。この図は、色の変化を誇張している。；実際には、色の変化は、裸眼には常には見えない。加水分解酵素は、鏡像異性体が反応する場合、又は、両方の鏡像異性体が同様の速度で反応する場合に、拒絶される。１つの鏡像異性体が、他方の鏡像異性体よりも顕著に速く反応する場合には、次に加水分解酵素は、更に試験される。純粋な鏡像異性体の加水分解速度を別に測定することによって、本当のエナンチオ選択性ではなく、見積もられたエナンチオ選択性のみが与えられることに、注目のこと。
【図２】
添加された酸に対するアッセイ溶液の選択性を表わす図である。
【図３】
アッセイによって測定された加水分解の速度を表わす図である。
【図４】
（「Ｓｐｅｃ」論文の図５．４）（±）−４−ニトロフェニル−２−フェニルプロパノエート　１に対する、加水分解酵素のエナンチオ選択性の、素早いＥ測定における第１の工程を表わす図である。（Ｓ）−１及びテトラデカン酸レゾルフィン　６の、加水分解酵素で触媒作用を及ぼされた加水分解によって、それぞれ黄色及びピンクの発色団が放出される。溶液は、両方の基質が加水分解された場合には、暗橙色色に変わり、参照化合物のみが加水分解された場合には、ピンク色に変わる。素早いＥの第二工程は、それがキラルなエステルの（Ｒ）−鏡像異性体を使用する以外は、同じである、式５．６によって、それぞれの工程での選択性の比率が生じる。両方の発色団の吸光係数は、ｐＨ８でのそれらの部分的なイオン化を説明する；実際には、上記に示される通り、ｐＨ８．０では完全にはイオン化されない。
【図５】
試験のための、キラルなカルボン酸の構造を表わす図である。
【図６】
４−ニトロフェノールエステルの加水分解の初期速度は、４０４ｎｍで、時間に渡る吸収率の直線的な増加を測定することによって、分光測光法で容易に測定される。（Ｓ）−１の加水分解の初期速度は、エナンチオ選択性を見積もるための、第一の工程で決定される。第二の工程は、（Ｒ）−１を使用し、２つの速度の比が、エナンチオ選択性を見積もる。吸光係数は、ｐＨ７．５での４−ニトロフェノールの部分的なイオン化を説明する；実際には、示される通り、ｐＨ７．５では４−ニトロフェノール（ｐＫａ　７．１５）は、完全にはイオン化されないことに注目しなさい。
【図７】
ｐＨ指示薬として４−ニトロフェノールを使用して、色原体でないエステルである、酪酸ソルケタール８の素早いＥ測定の第一工程を表わす図である。
（Ｓ）−８及び酢酸レゾルフィン９の、加水分解酵素によって触媒作用を及ぼされる加水分解によって、プロトン及びピンクの発色団、即ちレゾルフィンが遊離する。酢酸レゾルフィンの加水分解速度は、５７４ｎｍでの吸収率の変化によって計算された。（Ｓ）−８の加水分解速度を計算するために、我々は４−ニトロフェノールを用いて検出されたプロトンの合計速度から、参照化合物の加水分解の間に遊離されたプロトンの速度を差し引く。相対的な速度の比、即ち（Ｓ）−８：９は、素早いＥの第一工程での選択性の比である。第二工程は、（Ｒ）−鏡像異性体及び酢酸レゾルフィンを使用した以外は同じである。両工程からの選択性の比率の比によって、素早いＥが生じる。
【図８】
加水分解酵素の選択性の測定を表わす図である。
ａ）見積もられた選択性のために、異なるエステルの加水分解の初期速度を、ｐＨ指示薬として４−ニトロフェノールを使用して、比色定量的に測定する。ｂ）選択性の定量測定には、競合する実験が必要である。酢酸レゾルフィンを、その加水分解によって容易に測定されるレゾルフィン陰イオンが生じるので、競合する基質として使用した。加水分解の合計量を、ｐＨ指示薬として４−ニトロフェノールを使用して、パートａと同様に測定する。レゾルフィンの僅か１０％が、ｐＨ７．２で陰イオンに脱プロトン化され、従ってレゾルフィン１モルの加水分解によって、１．１モルのプロトンが生じる。
【図９】
ＴｈｅｒｏｍｏＧｅｎエステラーゼを調査するために使用されたエステルを表わす図である。
【図１０】
ＴｈｅｒｏｍｏＧｅｎエステラーゼのエナンチオ選択性を調査するために使用された鏡像異性体を表わす図である。
【図１】
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【図２】
2004513601.tif 000028
【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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