(57)【要約】細菌過剰増殖を防止するためにタンパク質加水分解物が使用される。さらに、哺乳動物において、特定のタンパク質加水分解物が、その雌親によって飼育された哺乳動物のものと同様の腸内フローラパターンを促すことが示される。他の利点は、この加水分解物が、活性成分を用いた細菌過剰増殖の治療に比べて、より簡単に得られ、より単純に投与できることである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌過剰増殖、壊死性全腸炎、細菌移行に伴う敗血症及び／又は栄養素の有効性低下を防止又は治療するための栄養組成物を調製するためのタンパク質加水分解物の使用。
【請求項２】
バランスのとれた及び／又は有利な腸内フローラパターンを促進あるいは確立するための栄養組成物を調製するためのタンパク質加水分解物の使用。
【請求項３】
前記タンパク質加水分解物が乳タンパク質加水分解物である、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記タンパク質加水分解物が乳清タンパク質加水分解物である、請求項１から３までのいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記栄養組成物が、早期又は満期の新生児、乳児、重病患者あるいは老人を対象としている、請求項１から４までのいずれかに記載の使用。
【請求項６】
前記栄養組成物がペットを対象としている、請求項１から５までのいずれかに記載の使用。
【請求項７】
前記タンパク質加水分解物の加水分解度が１０％より高い、請求項１から６までのいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記タンパク質加水分解物の加水分解度が１０％〜７０％である、請求項１から７までのいずれかに記載の使用。
【請求項９】
タンパク質加水分解物を含む栄養組成物を投与することを含む、細菌過剰増殖又は細菌移行を防止又は治療する方法。
【請求項１０】
タンパク質加水分解物を含む栄養組成物を投与することを含む、壊死性全腸炎、敗血症及び／又は栄養素の有効性低下を防止又は治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌過剰増殖、細菌移行、並びにそれに関連する壊死性全腸炎、細菌移行に伴う敗血症及び／又は栄養素の有効性低下のような疾患を防止する栄養組成物の使用に関する。本発明はまた、こうした症状を防止又は治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌過剰増殖は、早期産児、重病患者、及び老人でしばしば生じ、壊死性全腸炎、細菌移行、敗血症及び栄養素の有効性低下のような生命にかかわる出来事の主要原因の１つである。
【０００３】
細菌過剰増殖の最も初期の段階では、通常大腸にしか存在しない細菌が回盲弁を通って移行し始め、回腸に定着する。より後期の段階では、空腸にさえも侵入する可能性がある。一般に、大腸に存在する場合には宿主に有益な効果をもたらし得るある種の乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）又はビフィズス菌（Ｂｉｆｏｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株のようなプロバイオティック細菌の場合でも、細菌の小腸への定着は宿主にとって有害である。
【０００４】
国際公開ＷＯ００／２２９４５号（ＳＯＣ  ＰＲＯＤ  ＮＥＳＴＬＥ  ＳＡ）では、抗炎症性、抗菌性、及び抗アレルギー性を有し、したがって、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、及び他の疾患の防止並びに治療に有用な、牛乳から分離した新しいタンパク質が報告されている。
【０００５】
特開平８−５９５００（森永乳業株式会社（ＭＯＲＩＮＡＧＡ  ＭＩＬＫ  ＩＮＤ  ＣＯ  ＬＴＤ））では、腸から他の臓器への腸内細菌の移行を阻止する特定の物理化学的及び生物学的性質を有する、ラクトフェリン加水分解物から回収した新しいペプチド混合物が教示されている。
【０００６】
特開平５−３０４９２９（森永乳業株式会社（ＭＯＲＩＮＡＧＡ  ＭＩＬＫ  ＩＮＤ  ＣＯ  ＬＴＤ））では、ヒト又は動物の腸内フローラの異常な細菌構成を改善する方法が開示されている。特開平５−３０４９２９による液状又は流動状の食品にはウシラクトフェリンが含まれている。
【０００７】
一般に、タンパク質加水分解物はよく知られており、主にそれに対応する分解していないタンパク質のアレルゲン性を低下させるために液体配合物で利用される。例えば、乳タンパク質加水分解物は、乳タンパク質の抗原に対してアレルギーがある人々のための栄養配合物の一部である。
【０００８】
これまで、細菌過剰増殖の問題は、薬物療法によって、あるいはより最近では、やはり牛乳から分離又は精製できる他の生理活性物質（例えばラクトフェリン）を用いて対処されてきた。薬物療法は通常、身体に強い影響をもたらし、また大腸の細菌フローラにも影響を与えるのであまり望ましくはない。したがって、薬物療法は細菌過剰増殖を治療するだけでなく、細菌フローラ全体を死滅させる。牛乳から分離したものも含めて特定の活性成分の欠点は、それらを生成又は分離しなければならないこと、及びそれらの摂取量を正確に投与しなければならないこと、最後に、それらが副作用を引き起こす可能性もあることである。さらに、これらの物質は、通常、進行した細菌過剰増殖の治療にしか使用されず、防止目的で又はより重篤でない症状の治療の目的では使用されない。
【０００９】
したがって、費用のかかる精製手順を伴わず、同時に栄養価があり、かつ薬物療法に関連する副作用を含まない、細菌過剰増殖を治療するための天然の、製造しやすい製品が求められている。その意味では、結腸中での細菌増殖を、それが望ましいものであれば、妨害しない穏やかな治療も必要とされている。
【００１０】
結局、その母親から授乳された哺乳動物に存在するものと類似の腸内フローラパターンを促す、哺乳動物用の栄養組成物を製造するための栄養素が必要とされている。
【００１１】
医薬品又は一般に薬理学的活性物質の代わりに、当たり障りのない有効な食品に基づくこのような栄養物を提供する必要もある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、腸内での細菌の過剰増殖又は移行、及び細菌過剰増殖に密接に関連する又はその直接の結果である他の疾患に苦しんでいる患者に栄養物を提供する問題に対処する。本発明にはまた、当たり障りのない、栄養上有用で有利な栄養素及び食品に基づく栄養物を提供する目的がある。
【００１３】
また、細菌過剰増殖に苦しんでいる患者に、薬剤的活性物質の使用を最大限減らしつつ、栄養物を提供することが本発明の目的でもある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
驚くべきことに、特定のタンパク質加水分解物は、小腸での細菌過剰増殖を防止し、母乳によって誘発されたものと類似の腸内フローラパターンを促すことが判明した。
【００１５】
その結果、第１の態様では、本発明は、細菌過剰増殖、壊死性全腸炎、細菌移行に伴う敗血症及び／又は栄養素の有効性低下を防止又は治療するための栄養組成物を調製するためのタンパク質加水分解物の使用を提供する。
【００１６】
第２の態様では、本発明は、バランスのとれた及び／又は有利な腸内フローラパターンを促進又は確立する栄養組成物を調製するためのタンパク質加水分解物の使用を提供する。
【００１７】
第３の態様では、本発明は、タンパク質加水分解物を含む栄養組成物を投与することを含む、細菌過剰増殖又は細菌移行を防止又は治療する方法を提供する。
【００１８】
第４の態様では、本発明は、タンパク質加水分解物を含む栄養組成物を投与することを含む、壊死性全腸炎、敗血症及び／又は栄養素の有効性低下を防止又は治療する方法を提供する。
【００１９】
本発明の利点は、腸内での細菌過剰増殖及びそれに関連する他の病原性症状を有効に防止又は治療する、簡単で容易に入手可能な安価な手段を提供することである。
【００２０】
本発明の別の利点は、細菌過剰増殖を予防する方法を提供し、同時に患者にとって栄養上有用であることである。
【００２１】
本発明のさらに別の利点は、液体配合物、例えば経腸配合物を調製するのに特に適していることである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という表現は、「数ある中でもとりわけ含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ，  ａｍｏｎｇ  ｏｔｈｅｒ  ｔｈｉｎｇｓ）」という意味で用いられている。「だけからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ  ｏｎｌｙ）」と解釈されるものではない。
【００２３】
本明細書において、「細菌過剰増殖」という表現はまた、細菌過剰増殖に関連するあるいはその結果である疾患、倦怠感又は不快感の症状を意味する。敗血症及び栄養素の有効性低下は、このような結果の例とすることができる。
【００２４】
本明細書において、「ＤＨ」という略語は加水分解度を意味する。この用語は当技術分野でよく知られており、タンパク質原物質における、全窒素に対するα−ＮＨ２−窒素の割合（遊離アミノ窒素の形の窒素量）を意味する。この単位（％）は、特に標準的な加水分解物を使用する場合、利便性の理由で省略されることもある（例えば、ＤＨ０は分解していないタンパク質を意味し、ＤＨ３０は高度に加水分解した加水分解物を意味する）。
【００２５】
本発明の使用による栄養組成物は、一般的な方法によって生成することができる。適当な組成物は、他の目的、例えば乳タンパク質アレルギー又は大豆アレルギーなどの食物アレルギーに苦しむ個人のための栄養配合物で知られている。一般に、栄養組成物の成分は、乾燥形態で混合し、次いで例えば攪拌及び／又は加熱しながら水中で溶解させることができる。
【００２６】
したがって、任意の適当なタンパク質源を、本発明によるタンパク質加水分解物の生成に使用することができる。このタンパク質源は、高品質のタンパク質源であることが好ましく、例えば乳タンパク質、乳清タンパク質、カゼインタンパク質、大豆タンパク質、食肉タンパク質、魚肉タンパク質、鶏肉タンパク質、又はその混合物を使用することもできる。
【００２７】
本発明の実施形態では、タンパク質加水分解物が乳タンパク質加水分解物であることがより好ましい。
【００２８】
タンパク質加水分解物は、乳清タンパク質加水分解物であることが好ましい。
【００２９】
タンパク質加水分解物は、どんな種類の加水分解によっても生成することができる。これは、酸加水分解又は酵素加水分解によって生成することが好ましい。欧州特許第３２２５８９号（ＳＯＣＩＥＴＥ  ＤＥＳ  ＰＲＯＤＵＩＴＳ  ＮＥＳＴＬＥ）では、本発明の目的におけるタンパク質加水分解物を得るのに十分な方法が開示されている。さらに、国際公開ＷＯ９９／１３７３８号（ＳＯＣＩＥＴＥ  ＤＥＳ  ＰＲＯＤＵＩＴＳ  ＮＥＳＴＬＥ）では、特に有用な加水分解物を得る方法が開示されている。この参考文献の実施例１の副題「加水分解物３（Ｈｙｄｒｏｌｙｚａｔｅ  ３）」では、方法プロトコル及び得られた加水分解物の分析について示されている。
【００３０】
本発明の実施形態では、タンパク質加水分解物の加水分解度（ＤＨ）が１０％より高いことが好ましい。加水分解度は２０％より高いことが好ましく、３０％より高いことがより好ましい。
【００３１】
一実施形態では、タンパク質加水分解物の加水分解度が１０％〜７０％であることが好ましい。より好ましくは２０％〜５０％であり、より好ましくは２５％〜３５％である。例えば、タンパク質の加水分解度は３０％である。乳清タンパク質加水分解物を使用する場合、加水分解度３０％は、タンパク質の大部分がジペプチドの形で存在していることを意味する。トリペプチド及びオリゴペプチド及びポリペプチド並びに遊離アミノ酸も存在していてよく、ただし、分子の数に限って言えば、より少ない程度である。
【００３２】
本発明によるタンパク質加水分解物は市販されてもいる。例えば、Ａｒｌａ  Ｆｏｏｄ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．社の乳清タンパク質加水分解物Ｌａｃｐｒｏｄａｎ（登録商標）ＤＩ−３０６５を使用してもよい。
【００３３】
栄養組成物のタンパク質源は、タンパク質加水分解物だけであることが好ましい。
【００３４】
タンパク質源は、栄養組成物の総カロリー値の約１〜５０％を提供することが好ましい。これは、栄養組成物の総カロリー値の１０〜３０％を提供することがより好ましい。
【００３５】
栄養組成物は、脂質源を含んでいてもよい。脂肪成分又は油成分の量は、環境要因、例えば患者の症状及び他の疾患があることに対して調節することができる。脂肪供給源は、栄養組成物の総カロリー値の０〜約５０％を提供することができる。これは、総カロリー値の２０〜３５％の量で存在することが好ましい。脂肪成分は、栄養組成物に使用するのに適していることで当技術分野で知られているどんな脂質又は脂肪であってもよい。一般的な脂肪には、乳脂肪、ベニバナ油、キャノーラ油、卵黄脂質、オリーブ油、綿実油、ココナッツ油、ヘーゼルナッツ油、ヤシ油、パーム核油、及び／又は菜種油がある。脂肪供給源は、長鎖、短鎖及び／又は中鎖のトリグリセリド（ＳＣＴ、ＬＣＴ、及び／又はＭＣＴ）を十分量含んでいてよい。脂質は、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、一価、二価、三価又は多価不飽和脂肪酸で構成されていてよい。不飽和脂肪酸は、ｎ−３又はｎ−６脂肪酸であってよい。
【００３６】
栄養組成物は、炭水化物源を含んでいてもよい。炭水化物成分は、総カロリー値の５〜９０％を提供することができる。これは、好ましくはエネルギーの２０〜５５％、より好ましくは４０〜５０％を含むことができる。この炭水化物源は、どんな適当な炭水化物又は炭水化物混合物であってもよい。例えば、炭水化物は、ラクトース、マルトデキストリン、加工デンプン、アミロースデンプン、高アミロースデンプン、トピオカデンプン、コーンスターチ、スクロース、ガラクトース、グルコース、フルクトース、又はその混合物であってよい。したがって、栄養配合物に使用するのに適していることで知られているどんな多糖類、オリゴ糖類、二糖類、及び／又は単糖類を加えてもよい。
【００３７】
さらに、栄養組成物は食物繊維を含んでいてもよい。患者の環境的な要求に応じて、どんな適当な繊維供給源を使用してもよい。したがって、可溶性及び不溶性繊維を単独で又は組合せて使用することができる。可溶性繊維は、粘性繊維又は非粘性繊維又はその組合せであってよい。適している可溶性繊維供給源は、グアールガム、キサンタンガム、アラビアゴム、ペクチン、β−グルカン、イヌリン、又はこれらの混合物である。適当な不溶性繊維供給源は、豆果及び穀粒に由来する外皮繊維、例えばエンドウ豆の外皮繊維、オート麦の外皮繊維、大麦の外皮繊維、及び大豆の外皮繊維である。しかし、どんな適当な不溶性食物繊維供給源を使用してもよい。
【００３８】
栄養組成物は、完全なビタミン、ミネラルプロファイルを含むことが好ましい。例えば、十分なビタミン及びミネラルを供給して、栄養組成物１０００カロリー当りのビタミン及びミネラルの推奨一日許容量の約７５〜約２５０％を補給することができる。
【００３９】
様々な香料、甘味料、及び他の添加剤が存在していてもよい。例えば、乳化剤を使用することもできる。
【００４０】
適切な場合には、栄養配合物に機能性成分を含めてもよい。患者の症状に応じて、適当な植物抽出物を加えてもよい。例えば、消化管内フローラ、便秘、下痢などに有益な効果があることで知られている植物抽出物を加えてもよい。例には、ウイキョウ、クマツヅラ、緑茶、ハッカ抽出物、プレバイオティック繊維、カミツレ、シナノキがある。
【００４１】
栄養組成物のモル浸透圧濃度は、好都合には約１８０ｍＯｓｍ／ｌ〜約４００ｍＯｓｍ／ｌ、例えば約２５０ｍＯｓｍ／ｌ〜約３００ｍＯｓｍ／ｌである。
【００４２】
栄養組成物のエネルギー密度は、好ましくは約５００ｋｃａｌ／ｌ〜約１５００ｋｃａｌ／ｌ、より好ましくは約７００〜約１１００ｋｃａｌ／ｌである。
【００４３】
栄養組成物は、即利用可能な製剤の形であることが好ましい。この形態では、栄養組成物を経鼻胃管、空腸管を介して、又は患者に飲ませることによって患者に供給することができる。したがって、栄養組成物は種々の形態、例えば乳児用液体調乳、果汁型飲料、ミルクセーキ型飲料などの形態であってよい。しかし、栄養組成物は、使用前に溶解させる可溶性の粉末形態であってもよい。
【００４４】
本発明による細菌過剰増殖を防止又は治療する方法、あるいはそれに関連する疾患を防止又は治療する方法に関しては、タンパク質原物質の供給源はタンパク質加水分解物だけであることが好ましい。一実施形態では、標準の栄養配合物又は食品のタンパク質原物質を、本明細書内で定義したタンパク質加水分解物によって部分的に又は完全に置き換えている。
【００４５】
栄養組成物は、標準的な方法、例えば、タンパク質源、炭水化物源、脂質源をブレンドすることによって生成することができる。使用する場合には、乳化剤をこのブレンドに含めてもよい。ビタミン及びミネラルをこの時点で加えてもよいが、熱分解を防ぐために通常は後で加える。ブレンドする前に、どんな親油性ビタミン、乳化剤なども脂質源に溶解させることができる。次いで、水、好ましくは逆浸透にかけた水を混ぜ合わせて液体混合物を形成することができる。成分の分散を促進させるために、水の温度は、好都合には約５０℃〜約８０℃であってよい。市販の液化機を用いて液体を生成することもできる。
【００４６】
次いで、液体混合物を熱処理して、細菌の混入を低減させる。例えば、この液体混合物を約５秒〜約５分間、急速に７５℃〜約１１０℃の範囲の温度に加熱することができる。これは、蒸気噴射又は熱交換器、例えばプレート式熱交換器によって実施することができる。
【００４７】
次いで、液体混合物を、例えば急速冷凍によって約６０℃〜約８５℃に冷却することができる。次いで、この液体混合物を、例えば第１段階で約７ＭＰａ、第２段階で約２ＭＰａ〜約１４ＭＰａの２段階で均質化する。次いで、均質混合物をさらに冷却して、ビタミン及びミネラルなどの任意の熱感受性成分を加えることができる。好都合には、均質混合物のｐＨ及び固形分含量をこの時点で標準化する。
【００４８】
液体形態の製品の場合、均質混合物を適当な容器に無菌的に充填することが好ましい。容器の無菌充填は、均質混合物を予熱し（例えば約７５℃〜８５℃）、次いで蒸気を均質混合物中に噴射して温度を約１２０〜１８０℃、より好ましくは約１４０〜１６０℃に上げることによって実施することができる。次いで、この均質混合物を、例えば急速冷凍によって約７５〜８５℃の温度に冷却することができる。次いで、この均質混合物をさらに均質化し、ほぼ室温に冷却し、容器に充填することができる。この種の無菌充填を実施するための適当な装置は市販されている。
【００４９】
粉末形態の製品の場合、均質混合物を、例えば噴霧乾燥によって乾燥させて粉末にする。従来の手順を使用してもよい。
【００５０】
栄養組成物は、腸内での細菌過剰増殖、細菌移行、敗血症、及び栄養素の有効性低下に苦しむ患者のための完全な又は補助的な栄養物として使用することができる。この診断は、早期又は満期の新生児、乳児、重病患者及び老人でしばしば行われている。さらに、この栄養組成物は、早期又は満期の新生児、乳児、重病患者及び老人において、腸内での細菌過剰増殖、細菌移行、敗血症、及び栄養素の有効性低下を防止又は治療する完全な又は補助的な栄養物として使用することができる。
【００５１】
理論に拘泥するものではないが、細菌過剰増殖に対するタンパク質加水分解物の有益な効果が、タンパク質加水分解物の高い消化性及び速やかな吸収と関連付けられると考えられると仮定される。大部分のタンパク様物質が小部分、例えばジペプチド、トリペプチド、又はテトラペプチドで存在することから、胃腸機能障害の患者でもこれらが完全に小腸で吸収されるという結果がもたらされる。こうした患者又は早期乳児が分解していないタンパク質を摂取した場合、このタンパク質は小腸では完全に吸収されず、回腸の下端に到達することになる。そこで、タンパク様物質が、健康な個人では通常消化管のこの部分に定着しない細菌の基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）となることがある。したがって、タンパク様物質の消化性を増大させることによって、より具体的には、罹患者に分解していないタンパク質ではなくタンパク質加水分解物を提供することによって、細菌過剰増殖を防止及び治療できることが判明した。この場合もまた、この説明モデルによって本明細書で報告した驚くべき効果が完全に説明されるかどうかは証明されていない。
【００５２】
以下の実施例は、例示として示したものにすぎず、決して本出願の主題を限定するものとして解釈すべきではない。特に指定しない限り、百分率及び部は重量によるものである。
【００５３】
実施例ではラットモデルを使用した。これは、ヒトで見られるのと同一の状況を反映せず、したがって、この結果をヒトに直接かつ明確に振り替えることはできない。しかし、このモデルは、早期乳児、新生児のものような未熟な消化器系だけでなく、消化器系の病気をもつ患者に対する栄養介入の影響を研究するのにこのラットモデルを認める科学的調査に基づいて選択した。
【実施例】
【００５４】
人工飼育した哺乳ラットの腸内フローラパターンに対するタンパク質源（分解していない乳清タンパク質対加水分解した乳清タンパク質）の効果
方法
動物及び食餌
スプラーグ−ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットをこの試験で使用した。繁殖用の雌親（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、米国マサチューセッツ州、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎから購入）を個別にプラスチック製のケージ内で飼育し、２１±１℃で１２時間の暗／明サイクルの下で維持した。動物は、７００２Ｔｅｋｌａｄ６％マウス／ラット食餌（Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ社、米国ウィスコンシン州、Ｍａｄｉｓｏｎ）及び水道水に自由に近づけた。生後４日目に、１８匹の哺乳ラットを２つの実験グループに分け、次いで胃瘻造設し、１０日間人工的に餌を与えた。１０匹の同腹仔を、母乳対照とした。
【００５５】
食餌
動物に、タンパク質源（表１）以外は同じ組成の２種の実験調乳配合物を与えた。すなわち、１００％分解していない乳清タンパク質（ＤＨ０％）及び１００％高度乳清タンパク質加水分解物（ＤＨ３０％）である。タンパク質加水分解物の分子量分布を図１に示す。
【００５６】
【表１】
2004536143.tif 000002
2004536143.tif 000003
【００５７】
実験プロトコル
このプロトコルで使用したすべての手順は、アリゾナ大学動物実験委員会（ｔｈｅ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｒｉｚｏｎａ）によって審査及び承認された。生後４日の哺乳ラットに麻酔をかけ、末端が鉤状のポリエチレンカニューレ（ＰＥ−２０、Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ／Ｂｅｎｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．社、米国ニュージャージー州、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）を用いて胃瘻造設した。２時間の絶食を含めた手術後の回復の後、ラット幼仔の体重を量り、それぞれの動物に与えるべき人工配合物の体積を計算して、２４時間当り体重の約３５〜３７％を供給した。給餌試験の期間中、ラット幼仔をプラスチック製のカップに入れ、３９℃の水浴中で浮遊させて、周囲の温度及び湿度を維持した。シラスチック（Ｓｉｌａｓｔｉｃ）チューブ（Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．社、米国ミシガン州、Ｍｉｄｌａｎｄ）を用いて、胃瘻造設チューブを冷蔵庫中のモデル４４ハーバード薬物注入ポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ社、米国マサチューセッツ州、Ｓｏｕｔｈ  Ｎａｔｉｃｋ）の注射器につないだ。１時間毎に計算体積の食餌を２０分供給し、その後４０分停止するようにポンプを設定した。供給すべき食餌の体積を毎日再計算した。毎日、体重、開眼、及び尾の長さを記録した。１日２回、肛門陰部へのやさしい刺激によって排尿及び排便を促した。
【００５８】
１４日目に、ラット幼仔を断頭によって屠殺した。胃腸管を無菌状態で素早く取り出し、十二指腸（幽門から１ｃｍ）、空腸、回腸（それぞれ残りの小腸の半近位部及び末端部）及び盲腸に切除した。空腸及び回腸をそれぞれ無菌氷冷０．９％ＮａＣｌ、１０％グリセロール溶液１ｍｌで洗浄した。内容物を直接回収し、ＮＵＮＣ（Ｎａｌｇｅｎｅ）滅菌チューブ内で重さを量った。盲腸を切り開き、内容物を滅菌スパチュラで取り出し、ＮＵＮＣチューブ内で重さを量り、次いでそれにＮａＣｌ＋グリセロール溶液１ｍｌを加えた。腸内容物をすぐに液体窒素中で冷凍した。
【００５９】
腸内容物中のフローラ分析
空腸、回腸、及び盲腸の内容物中のフローラ（ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）、乳酸菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）、及びウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ））を、選択培地又は半選択培地に播いて評価した。
【００６０】
１００倍段階希釈を、システイン０．５％を含むリンゲル液中で−２〜−８まで行った。種々の選択培地を含むペトリ皿に播種し培養した（表２を参照のこと）。
【００６１】
【表２】
2004536143.tif 000004
【００６２】
嫌気性雰囲気は、Ａｎａｅｒｏｃｕｌｔ  Ａ（ＭＥＲＣＫ社、ドイツ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）を用いて得られた。培養後、コロニーをカウントし、必要に応じてさらに同定した。乳酸菌及びビフィズス菌株は、鏡検並びに酵素活性によって同定した。カウント数を、３．３０ｃｆｕ／ｇの検出限界で新鮮な糞試料のｃｆｕ／ｇとして表し、対数で表した。
【００６３】
統計的分析
いくつかのグループでばらつきが見られなかったので、従来の分散分析（ＡＮＯＶＡ）を行うことができなかった。その代わりにグループの組についてウィルコクソン順位検定を行った。ｐ値が０．０５未満の平均差を有意とみなした。
【００６４】
結果
図２〜４は、異なる腸部分の内容物中の腸内細菌数、腸球菌数、及び乳酸菌数を示す。
【００６５】
回腸中の腸内細菌数は、ＤＨ０において他のグループよりも多かった。ＤＨ３０及びＭＦでは、検出限界において同様の値が得られた。盲腸では異なるグループはＭＦだけであり、カウント数がより少なかった。
【００６６】
腸球菌は、空腸及び回腸中では、ＤＨ３０又はＭＦよりもＤＨ０ではるかに大量に存在した。盲腸では、食餌による有意差は認められなかった。
【００６７】
乳酸菌は、回腸では、その他のグループよりもＤＨ０でより大量に存在した。空腸でも同様の傾向が見られたが、その場合、ＭＦはＤＨ０及びＤＨ３０の間にある値を示した。この場合も、盲腸では差が認められなかった。
【００６８】
ビフィズス菌は、いずれのグループ又は腸部分でも認められなかった。クロストリディウム属については、盲腸では、検出可能な値を示したのは動物４匹（ＤＨ０で２匹、ＭＦで２匹）にすぎず、回腸では動物１匹であった（ＤＨ０において）。これらの値を無視できると考え、食餌間の統計的比較を行わなかった。
【００６９】
結論
分解していない乳清タンパク質を給餌すると、ラット幼仔の小腸での細菌過剰増殖が促進された。この過剰増殖は、高度乳清タンパク質加水分解物を与えることによって大幅に防止され、雌親から授乳された後に見られるものとかなり類似したフローラパターンがもたらされた。
【００７０】
したがって、タンパク質加水分解物は、細菌過剰増殖及びそれに関連する疾患を防止又は治療する有用な手段である。それにより、母乳を与えられた個体のものと類似の腸内フローラパターンに戻すことが可能である。
【００７１】
本明細書に記載した現在好ましい実施形態に対する様々な修正及び変更は、当業者に明らかであることが理解されよう。こうした修正及び変更は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、またそれに付随する利点を減らすことなく行うことができる。したがって、こうした修正及び変更は、添付の特許請求の範囲によって包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明を実施するのに有用なタンパク質加水分解物の分子量（ＭＷ）分布を示す図である。バーは、示されたＭＷ範囲に対応する、２２０ｎｍで測定した総面積の割合を表す。線は、累積粒度分布（％面積対ＭＷ）を表す。ＭＷの中央値は、４７５Ｄａである（＝ＭＤ５０％）。  ペプチドプロファイルを、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって評価した。保持時間に対する分子量の検量線を、分子量が既知の純粋なタンパク質、ペプチド、及びアミノ酸（標準物質）を用いて作成した。２２０ｎｍの波長において、ペプチド結合及びある種のアミノ酸の芳香族環が検出された。  図１の縦軸は、「２２０ｎｍにおける％面積」という名称にしている。これには、クロマトグラムの不規則な面積を、標準物質の保持時間に基づいて、それぞれが分子量のある範囲に対応する様々な区間に分けたことが反映されている。各区間の面積を総面積（１００％）で割っている。それは分子量分布を分析するための、標準的な手順である。
【図２】その雌親から授乳されたラット（ＭＦ、透明なバー）又は人工食餌（加水分解度（ＤＨ、上記の定義を参照のこと）０％及びＤＨ３０％、それぞれ黒く塗りつぶしたバー及び縦縞のバー）を与えられたラットの空腸、回腸、及び盲腸中の腸内細菌数を示す図である。平均±標準誤差（±ＳＥＭ）値を示してある。同じ腸部分において、異なる文字は有意差を示している。
【図３】腸球菌数を示す図である。詳細については図２の説明を参照のこと。
【図４】乳酸菌数を示す図である。詳細については図２の説明を参照のこと。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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