(57)【要約】本発明は、ＭｅｔＡＰの阻害活性を有する化合物の抗増殖活性を評価する新規な方法、ならびに、腫瘍の血管新生もしくは増殖を阻害する化合物をスクリーニングする方法に関する。これに加えて、本発明は、腫瘍の血管新生もしくは増殖を制御するための処置の進行をモニターする方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗増殖適応症のための治療化合物をスクリーニングする方法であって、該化合物を哺乳動物の対象に投与しそして該哺乳動物の対象からの生物学的試料中のメチオニン１４−３−３γを試験することを含む、方法。
【請求項２】
細胞の増殖異常に対して治療作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、該化合物を細胞システムに加えそして該システム中のメチオニン１４−３−３γの誘導を試験することを含む、方法。
【請求項３】
ＭｅｔＡＰ阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、該化合物を細胞システムに加えそして該システム中の１４−３−３γの改変発現を試験することを含む、方法。
【請求項４】
哺乳動物においてＭｅｔＡＰ活性を阻害する方法であって、メチオニン１４−３−３γを誘導する能力を有する化合物を該哺乳動物に投与することを含み、該化合物は哺乳動物中に該１４−３−３γを誘導するために十分な量で投与される、方法。
【請求項５】
哺乳動物において腫瘍組織もしくは末梢血リンパ球における細胞増殖を阻害する方法であって、メチオニン１４−３−３γレベルを上昇させる能力を有する化合物を、該増殖組織もしくはリンパ球中に該メチオニン１４−３−３γレベルを上昇させるために十分な量で投与することを含む、方法。
【請求項６】
ＭｅｔＡＰ阻害活性を有する化合物の抗増殖活性を同定する方法であって、
ａ）増殖細胞培養物を作成すること、
ｂ）該細胞培養物を、細胞培養物中のメチオニン１４−３−３γのレベルを増加させるための有効量でＭｅｔＡＰ阻害活性を有する化合物と共に接種すること、および
ｃ）該細胞培養物から細胞を単離しそして細胞培養物中に生成したメチオニン１４−３−３γのレベルを測定する、
ステップを含む、方法。
【請求項７】
増殖細胞培養物が小細胞肺がん腫、非−小細胞肺がん腫、骨肉種、ヒトの乳がん腫もしくは接触性阻害マウス線維芽細胞株である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＭｅｔＡＰ阻害活性を有する化合物が、ＬＡＦ３８９およびＴＮＰ−４７０を含む、フマギリン、オバリシン、ベンガミドならびにカプロラクタムからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ヒトおよび家畜の患者における腫瘍形成を処置しもしくは予防するための組成物および方法、細胞増殖および／もしくは細胞分化を調節する薬理活性を有する薬剤のライブラリーをスクリーニングするための組成物および方法、インビトロで形質転換細胞の表現型の調整のための組成物および方法を、バイオプロセス制御においてかつ市販の臨床検査試薬としての使用を含めて、提供する。この発明はさらに、ＭｅｔＡＰの阻害活性を有する化合物の抗増殖活性を評価する新規な方法に関する。
【０００２】
全ての生物細胞において、タンパク質合成はＡＵＧコドンで開始される。この開始ＡＵＧコドンはメチオニンを規定する。真核生物および原核生物の両方において、ＮＨ２−メチオニンは、もし末端前残基が小さくかつ非荷電、例えばＡｌａ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＶａｌであれば、メチオニンアミノペプチダ−ゼ（ＭｅｔＡＰ）で除去される。ＮＨ２−メチオニンの除去は、特定のタンパク質がインビボで正常に機能するために必須である。これらのタンパク質を少なくとも二つのグループに分類することができる。第一のグループにとっては、開始メチオニンの除去は、シグナル形質導入、特定のがん細胞増殖およびタンパク質の標的化を含む、それらの正常機能に必須であるところの、Ｎ−ミリスチル化のような、続いて起こるＮ−末端の修飾に必要である。第二のグループにとっては、開始メチオニンの除去は、他のＮ−末端残基が触媒作用におけるそれらの重大な役割において正常に機能するようにするために必要である。限られたＭｅｔＡＰが利用可能であるところの細菌もしくは他の生物中で過剰発現されるときには、幾らかのタンパク質は、それらのＮ−末端に結びついた、望ましくない開始メチオニンをなお所有し、かくして非機能的になるかもしれない。したがって、ＭｅｔＡＰを調節することは、増殖性疾患、例えばがん、および他のヒトの疾患を処置する有用な方法であり得る。事実、例えばフマギリンによるＭｅｔＡＰの調節は、がんを処置するための有望な方法であると示されている。フマギリンは、二つの既知ＭｅｔＡＰの一つ、即ちＭｅｔＡＰ２を、その活性部位を不可逆的にブロックすることにより阻害するように見える。
【０００３】
１４−３−３タンパク質として知られているタンパク質のファミリーは、脳組織の非常に豊富な２７〜３０ｋＤ酸性タンパク質として、Ｍｏｏｒｅ， Ｂ． Ｆ． ｅｔ ａｌ． （１９６７）、により最初に同定された（「神経組み込みの生理的および生化学的観点」、Ｆ． Ｄ． Ｃａｒｌｓｏｎ， Ｅｄ．， Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ， Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ Ｃｌｉｆｆｓ， Ｎ．Ｊ．， １９６７）。それらの名称は元の研究者の命名を反映している。最近の研究は、細胞サイクル制御における１４−３−３タンパク質の関与を示している（Ｆｏｒｄ， Ｊ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：５３３）。（一般的な総説については、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｄ． （１９９４） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６６：５６−５７ および Ａｉｔｋｅｎ， Ａ． （１９９５） ＴＩＢＳ ２０、を参照）。種々の機能が１４−３−３タンパク質に帰されている。しかしながら、幾つかの系統の証拠により、それらがシグナル形質導入カスケードを細胞サイクルと関連していることが示唆されている。種々の１４−３−３イソタイプが、細胞を形質転換するタンパク質、例えば、ポリオーマウィルスの中央Ｔ抗原であるＢｃｒ−Ａｂ１およびＰｌ３ｋ、との、シグナル分子、例えば、ｃ−Ｒａｆ１、ｃ−ＢｃｒおよびＰ１３ｋ、との、ならびに二つの細胞サイクル調節体、例えば、Ｃｄｃ２５ＡおよびＣｄｃＢ、との複合体中に見出されている。
【０００４】
ＭｅｔＡＰ活性を調節するところの限られた数の化合物が公知であるが、ＭｅｔＡＰ活性を調節するところのさらに別の活性化合物を同定する必要性が残っている。
【０００５】
コード番号、一般名もしくは商標名によって本明細書で同定される活性薬剤の構造は、標準概説“Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ”の現行版もしくはデータベース、例えば、Ｐａｔｅｎｔ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（例えば、ＩＭＳ Ｗｏｒｌｄ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）から取得され得る。対応するその内容は、出典明示により本明細書の一部とする。
【０００６】
発明の概要
本発明は、ＭｅｔＡＰの阻害活性を有する化合物の抗増殖活性を評価する新規な方法に関する。本発明は、腫瘍の増殖を阻害する化合物をスクリーニングする方法を提供する。これに加えて、本発明は、増殖性疾患を制御するための処置の進行をモニターする方法を提供する。一旦、高いレベルの抗増殖活性を有する化合物が同定されると、これらの化合物を、獣医学における動物を含む哺乳動物において、もしくはがん、ならびに他の増殖性疾患の処置を必要とするヒトにおいて、抗がん剤として使用することができる。
【０００７】
１４−３−３γイソ型、さらに具体的には改変１４−３−３γイソ型、は、ＭｅｔＡＰ阻害剤もしくは調整剤の化合物を哺乳動物の細胞に適用するときに、誘導されて、そして誘導タンパク質を適用化合物の効力をモニターするマーカーとして使用することができることが見出されている。誘導タンパク質をＭｅｔＡＰ阻害剤である新化合物をスクリーニングしかつ同定するための、ならびに選択された活性化合物の全身性効力をモニターするためのマーカーとして使用することができる。例えば、タンパク質マーカーを用いて、抗−血管新生もしくは抗−腫瘍活性を提供する化合物をスクリーニングすることができる。或る範囲の入手可能な細胞株を活性化合物で処置し、改変１４−３−３γイソ型の発現の上昇を試験することができる。例えば、Ｕ２０Ｓ細胞をベンガミド（ｂｅｎｇａｍｉｄｅ）もしくはフマギリン（ｆｕｍａｇｉｌｌｉｎ）で処置するときには、この細胞は改変１４−３−３γイソ型を発現する。
【０００８】
これに加えて、タンパク質マーカーを使用して、活性化合物による対象の処置の進行をモニターすることができる。活性化合物を対象、例えば、ヒトの患者、に投与し、そして対象からの試料検体、例えば白血球細胞、の改変１４−３−３γイソ型のレベルをタンパク質マーカーの改変レベルもしくは誘導を定期的にチェックする。望ましい作用（例えば、抗−血管新生活性）を有する活性化合物を対象に投与する場合、改変１４−３−３γイソ型のレベルは対象のシステム中で上昇する。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、ＭｅｔＡＰの酵素活性を阻害しもしくは調整する化合物をスクリーニングする方法を提供する。ＭｅｔＡＰの酵素活性が妨げられるときに、改変１４−３−３γイソ型が誘導されて、細胞中に蓄積することが見出されている。改変１４−３−３γイソ型は、イソ型が、構成的１４−３−３γイソ型のＮ−末端におけるアセチル基の代わりにＮ−末端メチオニンを有する、不完全にプロセスされた型であることを特徴とする。即ち、改変ヒト１４−３−３γイソ型のＮ−末端は、構成的１４−３−３γイソ型のアセチル−ＶａｌＡｓｐＡｒｇＧｌｕＧｌｎＬｅｕの代わりに、ＭｅｔＶａｌＡｓｐＡｒｇＧｌｕＧｌｎＬｅｕの最後の７個のアミノ酸配列を有する。表示したアミノ酸配列の長さは一例として選択されていることに注意すべきである。
【００１０】
改変１４−３−３γイソ型（メチオニン１４−３−３γ）の発現レベルを生化学的試料、例えば、細胞溶解液、組織溶解液もしくは白血球細胞溶解液、から、イムノアッセイおよび電気泳動アッセイを含む既知方法によりアッセイすることができる。例えば、イムノアッセイを用いて、生化学的試料中におけるメチオニン１４−３−３γの誘導および蓄積を検出しもしくはモニターすることができる。メチオニン１４−３−３γ−特異的ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体を任意の標準的イムノアッセイ方式で用いて、メチオニン１４−３−３γのレベルを測定することができる。ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ）型アッセイおよびモノクローナル抗体を用いる従来のウエスタンブロッティングアッセイは、マーカータンパク質の誘導と蓄積を直接測定するために利用することができるところのアッセイ例である。メチオニン１４−３−３γに特異的な抗体を既知の免疫化法に従って生成することができる。例えば、メチオニン１４−３−３γに対するモノクローナル抗体は、免疫原としてスカシガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）のヘモシアニンに結合した、上記のヒト由来のアミノ末端ペプチド配列を用いる従来の技法により生成される。
【００１１】
メチオニン１４−３−３γレベルを測定するために使用できるもう一つの方法は二次元ゲル電気泳動である。二次元ゲル電気泳動は技術上公知であり、典型的には、一次元に沿った等電点電気泳動（ＩＥＦ）に引き続く二次元に沿ったＳＤＳ−ＰＡＧＥ（硫酸ドデシルナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）を伴う。ここで得られる電気泳動図を、例えば、抗体を用いるイムノブロット分析により分析する。適当な抗体を上で議論したようにもしくは市販の供給源から取得することができる。イムノブロッティング分析のためには、抗体はメチオニン１４−３−３γに特異的である必要はなくて、それは一般的に１４−３−３もしくは１４−３−３γに反応性である抗体でよい、即ち、それは全てのイソタイプの１４−３−３に反応性であるか、もしくは、アセチル化およびメチオニンＮ−末端をそれぞれ有する二つのイソ型の１４−３−３γに特異的である。ＩＥＦを用いて、メチオニン１４−３−３γおよび構成的アセチル化１４−３−３γを容易に分離することができる。メチオニン末端残基を有する、誘導１４−３−３γイソ型のメチオニンは中性のｐＨで正に荷電し、かくしてメチオニン１４−３−３γイソ型は構成的アセチル１４−３−３γイソ型よりさらに正に荷電して、二つのイソ型がｐｌにより分離されることを可能にする。
【００１２】
ＭｅｔＡＰの酵素活性を阻害するかもしくは調整する種々の化合物（ＭｅｔＡＰ阻害剤）としては、フマギリン、オバリシン（ｏｖａｌｉｃｉｎ）、ベンガミドならびにそれらの特定の類似体および誘導体が挙げられる。フマギリン、オバリシンならびにそれらの類似体および誘導体は、ＭｅｔＡＰ２の酵素活性を阻害すると知られているが、一方ではベンガミドならびにその類似体および誘導体は、ＭｅｔＡＰ１およびＭｅｔＡＰ２の両方を阻害すると信じられている。ＭｅｔＡＰ阻害剤は、腫瘍、例えばがん、を含む増殖性疾患を処置する細胞障害剤（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ａｇｅｎｔ）として高度に有用である。ＭｅｔＡＰ阻害剤は特に、種々のリンパ腫、肉腫、がん腫および骨髄腫の増殖を阻害するのに適している。加えて、ＭｅｔＡＰ阻害剤は、血管新生−依存性疾患、例えば、種々の眼性新生血管の疾患、を処置するのに適している。
【００１３】
本発明を利用して、ＭｅｔＡＰ阻害活性を有する他の化合物を同定することができる。種々のインビトロおよびインビボ実験を使用して、潜在的化合物をスクリーニングすることができる。例えば、細胞培養物を化合物で処置し、培養し、それから培養物をアッセイして、メチオニン１４−３−３γの発現レベルを測定する。細胞培養物中におけるメチオニン１４−３−３γの誘導は、その化合物がＭｅｔＡＰ阻害剤であることを示す。細胞中におけるメチオニン１４−３−３γの蓄積は細胞サイクル依存性の出来事ではなくて、ＭｅｔＡＰ阻害剤により誘導されることが見出されている。ここでも、生物学的試料中のメチオニン１４−３−３γの検出および定量化を、上で議論したように、種々の方法で実施することができる。
【００１４】
本発明はまた、ＭｅｔＡＰ活性を阻害もしくは調節する、活性化合物の治療効力をモニターする方法を提供する。本発明を臨床マーカーとして用いて、それぞれの患者におけるＭｅｔＡＰ阻害剤化合物の効力をモニターすることができる。ＭｅｔＡＰ阻害剤化合物を患者に治療的に投与するとき、メチオニン１４−３−３γのレベルの上昇は、その化合物が患者の増殖性異常に対して有益な作用を有するときには該患者からの生物学的試料、例えば、特に標的細胞における、血液もしくは組織、の中で観測される。同様に、臨床マーカーを用いて、対象の生物学的試料中のメチオニン１４−３−３γの誘導および蓄積をモニターすることにより、活性化合物の投与量およびレジメンを最適化することができる。したがって、本発明のスクリーニング方法を用いて、治療的に有効な化合物を見出し、そして／または選択した化合物について治療的に有効な量もしくはレジメンを見出して、それにより患者についての治療法を個別に選択しかつ最適化することができる。この文脈で考慮する要素としては、処置される特定の異常、処置される特定の哺乳動物、個別の患者の臨床的異常、活性化合物の送達部位、活性化合物の特定のタイプ、投与方法、投与スケジュールおよび医師に公知の他の要素が挙げられる。投与される活性化合物の治療的有効量は、そのような考慮により決定されるであろうし、そして疾患を予防し、改善しもしくは処置するために必要な最少量である。そのような量は、好ましくは、宿主に毒性的な量以下であるかもしくは宿主を感染に対して著しくさらに感受性にする。
【００１５】
特に、本発明は、抗増殖適応症のための治療化合物をスクリーニングする方法であって、該化合物を哺乳動物の対象に投与しそして該哺乳動物の対象からの生物学的試料中のメチオニン１４−３−３γを試験することを含む、方法を提供する。
【００１６】
同様に、本発明は、生物学的試料中のメチオニン１４−３−３γを試験することを含む、抗増殖適応症のための治療化合物をスクリーニングする方法を提供するが、該生物学的試料は該治療化合物を投与した哺乳動物の対象から得られている。
【００１７】
本発明はまた、抗増殖適応症のための治療化合物をスクリーニングするために生物学的試料中のメチオニン１４−３−３γを検出する試験の使用を提供するが、該生物学的試料は該治療化合物を投与した哺乳動物の対象から得られている。
【００１８】
さらなる実施態様において、本発明は、細胞の増殖異常に対して治療作用を有する化合物をスクリーニングする方法であって、該化合物を細胞システムに加えそして該システム中のメチオニン１４−３−３γの誘導を試験することを含む、方法を提供する。
【００１９】
本発明はまた、細胞の増殖異常に対して治療作用を有する化合物をスクリーニングするために細胞システム中のメチオニン１４−３−３γの誘導を検出する試験の使用を提供するが、該化合物はメチオニン１４−３−３γの検出の前に該細胞システムに加えられる。
【００２０】
さらに別の実施態様において、本発明は、ＭｅｔＡＰ阻害活性を有する化合物をスクリーニングする方法であって、該化合物を細胞システムに加えそして該システム中の１４−３−３γの改変発現を試験することを含む、方法を提供する。
【００２１】
本発明はまた、ＭｅｔＡＰ阻害活性を有する化合物をスクリーニングするために細胞システム中の１４−３−３γの改変発現を検出する試験の使用を提供するが、該化合物は１４−３−３γの検出の前に該細胞システムに加えられる。
【００２２】
本発明はさらに、哺乳動物においてＭｅｔＡＰ活性を阻害する方法であって、メチオニン１４−３−３γを誘導する能力を有する化合物を該哺乳動物に投与することを含み、該化合物は哺乳動物中に該１４−３−３γを誘導するために十分な量で投与される、方法を提供する。
【００２３】
同様に、本発明は、哺乳動物において腫瘍組織もしくは末梢血リンパ球における細胞増殖を阻害する方法であって、メチオニン１４−３−３γレベルを上昇させる能力を有する化合物を、該増殖組織もしくはリンパ球中に該メチオニン１４−３−３γレベルを上昇させるために十分な量で投与することを含む、方法を提供する。
【００２４】
本発明はさらに、
ａ）増殖細胞培養物を作成すること、
ｂ）該細胞培養物を、細胞培養物中のメチオニン１４−３−３γのレベルを増加させるための有効量でＭｅｔＡＰ阻害活性を有する化合物と共に接種すること、および
ｃ）該細胞培養物から細胞を単離しそして細胞培養物中に生成したメチオニン１４−３−３γのレベルを測定する、
ステップを含む、ＭｅｔＡＰ阻害活性を有する化合物の抗増殖活性を同定する方法を提供する。
【００２５】
好ましい実施態様において、本発明は、増殖細胞培養物が、小細胞肺がん腫、非−小細胞肺がん腫、骨肉種、ヒトの乳がん腫もしくは接触性阻害マウス線維芽細胞株である、先行の節の方法を提供する。
【００２６】
さらに好ましい実施態様において、本発明は、ＭｅｔＡＰ阻害活性を有する化合物が、ＬＡＦ３８９およびＴＮＰ−４７０を含む、フマギリン、オバリシン、ベンガミドならびにカプロラクタムからなる群から選択される、先行の最後から二番目の節の方法を提供する。
【００２７】
以下の実施例は本発明をさらに例示し、そして実施例は例示の目的で提供され、それらに対して本発明を限定しようとするものではない。
【００２８】
実施例１
Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）、から入手される非−小細胞肺がん腫である、Ｈ１２９９、を１０％ウシ胎児血清ならびにグルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびゲンタマイシンを補充したＰＲＭＩ１６４０中で培養する。Ｈ１２９９細胞を約７０％密集度まで増殖させてから、２５μＭベンガミドの有無をもって培養する。８、１６、２４および４８時間目に細胞の試料を取る。培養期間の終末において、試料細胞をＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手可能なリン酸緩衝溶液）で洗浄し、そしてかき取りおよび遠心分離により収集する。細胞ペレットを４倍量のＲａｂｉｌｌｏｕｄ緩衝液中に溶解する。Ｒａｂｉｌｌｏｕｄ緩衝液は４％非イオン性洗剤のＣＨＡＰＳ、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、１０ｍｇ／ｍＬジチオトレイトールおよび１％ファルマライト（ｐＨ：３〜１０）を含有したが、その緩衝液は、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， １９９７ Ｍａｒ−Ａｐｒ．， １８ （３−４）： ３０７−１６， Ｒａｂｉｌｌｏｕｄ ｅｔ ａｌ．、「固定化ｐＨ勾配による二次元電気泳動におけるタンパク質の可溶化の改良」、に開示されている。細胞濃度は、２〜２．５Ｅ７／ｍｌであった。
【００２９】
固定化ｐＨ−勾配（ＩＰＧ）ゲル（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ［登録商標］、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）をファルマライトの無いＲａｂｉｌｌｏｕｄ緩衝液中で少なくとも４時間再膨潤させる。試料（細胞抽出液１μｌ）を、コームを用いて、ゲルの表面に陽極から約２ｃｍの距離に添加する。焦点泳動を、２００Ｖで２時間および１０００もしくは３５００Ｖで２５０００Ｖｈが達成されるまで行う。温度を１５℃に維持する。焦点泳動後に、ゲルを１２％ＴＣＡ−３．５％スルホサルチル酸中で１時間固定し、水中で１時間洗浄する。この洗浄ゲルを、ゲルを平坦な表面上に置いて、そして、イソプロパノール、水およびｐＨ７．５における５０ｎＭトリス−ＨＣｌ、４Ｍ塩化グアニジン、１ｍｇ／ｍｌ　ＤＴＴを持つ塩化グアニジン溶液中に順次浸漬したＰＶＤＦ−膜のシートでカバーすることにより、ブロットする。膜を塩化グアニジン溶液で浸漬した４層のろ紙のシートでカバーする。ポリエチレンフィルムをろ紙のシートを覆って置き、そして１４ｃｍ×１４ｃｍの平坦な表面を有する３ｋｇの重しをポリエチレンフィルムを覆って置いて、層間における良好な接触を確実にする。ゲル層を分散させないで一夜の間転移をさせてから、膜を水で洗浄し、ＰＢＳ中の０．５％フォルムアルデヒド溶液で３０分間処理する。膜を、ｐＨ７におけるＰＢＳ中の２％グリシンと共に３０分間インキュベートする。
【００３０】
それから、膜をＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０−１％脱脂粉乳粉で１時間ブロックする。１４−３−３に対する市販の抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を阻止緩衝液中で４時間適用する。化学発光検出（ＥＣＬキット、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、キットに付いている第二次抗体を用いて行う。
【００３１】
ＩＥＦ−イムノブロッティングは、ベンガミドと共に培養した細胞は、１４−３−３γに特異的な抗体と反応しかつメチオニン１４−３−３γのＩＥＦ位置に相当したタンパク質を４８時間の培養期間にわたって徐々に蓄積するが、ベンガミド無しで培養した細胞は、４８時間の期間にわたってもいかなる確認可能な量のメチオニン１４−３−３γタンパク質を生成しないことを明らかに示す。ＩＥＦ−イムノブロッティングの結果は、１４−３−３γ抗体に反応性のタンパク質がベンガミドにより誘導されることを明らかに実証する。
【００３２】
実施例２
次式
【化１】
2004514122.tif 000002
を有するベンガミド類似体ＬＡＦ３８９の２００ｎＭをベンガミドの代わりに使用することを除き、実施例１を繰り返す。
【００３３】
ＩＥＦ−イムノブロッティングの結果は実施例のそれと同様である。ベンガミド類似体と共に培養した細胞は、１４−３−３γ抗体に反応性のタンパク質を誘導し蓄積するが、ベンガミド類似体無しで培養した細胞はメチオニン１４−３−３γを誘導しない。
【００３４】
実施例３
フマギリン化合物である既知のＭｅｔＡＰ阻害剤で実施例１を繰り返す。フマギリン類似体のＡＧＭ−１４７０（ＴＮＰ−４７０）をベンガミドの代わりに使用する。ＩＥＦ−イムノブロッティング分析は、ＡＧＭ−１４７０と共に培養した細胞は、メチオニン１４−３−３γを誘導する一方で、未処置の細胞は認識可能な量の誘導性タンパク質を誘導しないことを実証する。
【００３５】
実施例４
実施例２を、ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ、から入手される以下の細胞株：ＭＤＡ−ＭＢ４３５（哺乳動物がん腫）、Ａ５４９（肺がん腫）およびＵ２０Ｓ（骨肉腫）で繰り返す。ＩＥＦ−イムノブロッティング分析は、全ての試験した細胞株が、ＭｅｔＡＰ阻害剤の投与後８時間以内にメチオニン１４−３−３γを誘導することを実証する。
【００３６】
実施例５
実験室ラットの一つのグループを、３ｍｇ／ｋｇの投与量で一日間に三回、実施例２のベンガミド類似体ＬＡＦ３８９で処置してから、７日間休止させる。次の日にこの投与量で三回、ラットに再び投薬する。それらを一日間休止させ、そして血液試料を採取する。末梢血をパーコール勾配遠心分離のプロトコールにより採取する。血小板を含む白血球細胞フラクションを回収し、そしてペレットをＩＥＦ試料緩衝液内で溶菌する。生体試料をＩＥＦ−イムノブロッティング分析で分析する。対照の生体試料は、ベンガミド類似体で処置されないグループのラットから得られる。
ＩＥＦ−イムノブロッティングの結果は、ＭｅｔＡＰ阻害剤で処置したラットはメチオニン１４−３−３γを誘導しかつ蓄積する一方で、対照のラットはマーカータンパク質を誘導しないことを実証し、明らかに哺乳動物におけるＭｅｔＡＰ阻害剤のインビボ効力を実証する。
【００３７】
実施例６
非−ＭｅｔＡＰ阻害剤であると知られる種々の抗腫瘍性化合物をＨ１２９９細胞に用いて、メチオニン１４−３−３γの誘導を試験する。以下の化合物を細胞に加える：ベンガミド類似体ＬＡＦ３８９の２００ｎＭと一緒に、５−フルオロウラシル（２０μｇ／ｍｌ）、エポチロン（５００ｎＭ）、ドキソルビシン（１μｇ／ｍｌ）およびスタウロスポリン（１μＭ）である。細胞を１８時間インキュベートし、実施例１で概略した手順にしたがってメチオニン１４−３−３γを試験する。
ＩＥＦ−イムノブロッティング分析は、ＭｅｔＡＰ阻害剤のみが、メチオニン１４−３−３γを誘導したことを示す。この結果は、ＭｅｔＡＰ阻害剤でない抗腫瘍性化合物はメチオニン１４−３−３γを誘導しないことを実証する。
【００３８】
実施例７
１４−３−３γのアミノ末端に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、免疫原としてスカシガイのヘモシアニンに結合した、ヒトの１４−３−３γのアミノ末端ペプチド配列を用いる従来の技法により育成する。二つの合成ペプチド配列を用いる：メチオニン１４−３−３γのアミノ末端を表すＭｅｔＶａｌＡｓｐＡｒｇＧｌｕＧｌｎＬｅｕ、および構成的１４−３−３γを表すアセチル−ＶａｌＡｓｐＡｒｇＧｌｕＧｌｎＬｅｕである。ｍＡｂを既知の方法にしたがって単離する。ｍＡｂの特異性を免疫化に用いたペプチドに対してチェックする。ｍＡｂはＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティングを含む種々のアッセイに使用される。
【国際公開パンフレット】
2004514122.tif 000003
2004514122.tif 000004
2004514122.tif 000005
2004514122.tif 000006
2004514122.tif 000007
2004514122.tif 000008
2004514122.tif 000009
2004514122.tif 000010
2004514122.tif 000011
2004514122.tif 000012
2004514122.tif 000013
2004514122.tif 000014
2004514122.tif 000015
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004514122.tif 000016
【国際調査報告】
2004514122.tif 000017
2004514122.tif 000018
2004514122.tif 000019