(57)【要約】増強された安定性および増殖特性ならびにより大きな細胞性免疫を示す第１世代アデノウイルスベクターおよび関連した組換えアデノウイルスに基づくＨＩＶワクチンを本明細書に記載する。これらのアデノウイルスベクターは、細胞培養により、ＨＩＶ−１　ｇａｇ、ＨＩＶ−１　ｐｏｌおよび／またはＨＩＶ−１　ｎｅｆポリヌクレオチド医薬品およびそれらの生物学的に関連した修飾体を含有する種々のアデノウイルスに基づくＨＩＶ−１ワクチンを作製および製造するために使用される。これらのアデノウイルスワクチンは、生きた脊椎動物組織、好ましくは哺乳動物宿主（例えばヒト、または商業的もしくは家畜獣医学的に重要な非ヒト哺乳類）内に直接導入されると、ＨＩＶ１−Ｇａｇ、Ｐｏｌおよび／またはＮｅｆタンパク質あるいはそれらの生物学的な修飾体を発現して、ＨＩＶ−１を特異的に認識する細胞性免疫応答を誘導する。例示されている本発明のポリヌクレオチドは、ＨＩＶ−１　Ｇａｇ、コード化コドン最適化ＨＩＶ−１　Ｐｏｌ、最適化ＨＩＶ−１　Ｐｏｌの誘導体（ＨＩＶ−１　Ｐｏｌのプロテアーゼ、逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよびインテグラーゼ活性が不活性化された構築物を含む）、ＨＩＶ−１　Ｎｅｆおよび最適化ＨＩＶ−１　Ｎｅｆの誘導体（宿主ＣＤ４のダウンレギュレーションおよびミリスチル化のようなＮｅｆの野生型特性に影響を及ぼすｎｅｆ突然変異体を含む）をコードする合成ＤＮＡ分子である。本発明のアデノウイルスワクチンは、単独または組合せ様式法で投与されると、これまでに未感染の個体に対して予防的利点をもたらし、および／または感染個体内のウイルス負荷レベルを減少させてＨＩＶ−１感染の無症候期を延長することにより治療効果をもたらすであろう。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｅ１において少なくとも部分的に欠失していてＥ１活性を欠き、
ａ）野生型アデノウイルスゲノムの塩基対約１からと塩基対約４００から塩基対約４５８までとの間に対応するアデノウイルス・シス作用性パッケージング領域、および
ｂ）ＨＩＶタンパク質またはその免疫学的に関連する修飾体をコードする遺伝子、
を含んでなる、組換えアデノウイルスワクチンベクター。
【請求項２】
野生型アデノウイルスゲノムの塩基対約１から塩基対約４５０までに対応するパッケージング領域を含む、請求項１記載のベクター。
【請求項３】
野生型アデノウイルスゲノムの塩基対約３５１１から約３５２４までからと塩基対約５７９８までとの間に対応するヌクレオチドを更に含む、請求項１記載のベクター。
【請求項４】
野生型アデノウイルスゲノムの１〜４５０からと３５１１〜５７９８までとの間に対応する塩基対を含む、請求項３記載のベクター。
【請求項５】
塩基対４５１〜３５１０が欠失している、請求項４記載のベクター。
【請求項６】
Ｅ３において少なくとも部分的に欠失している、請求項１記載のベクター。
【請求項７】
該Ｅ３欠失領域が塩基対２８，１３３〜３０，８１８である、請求項６記載のベクター。
【請求項８】
該ＨＩＶタンパク質またはその修飾体をコードする遺伝子が、ヒトにおける発現に関して最適化されたコドンを含む、請求項１記載のベクター。
【請求項９】
該ベクターが、
ａ）タンパク質をコードする核酸と、
ｂ）該タンパク質をコードする核酸に作動的に結合した異種プロモーターと、
ｃ）転写終結配列と
を含む遺伝子発現カセットを含む、請求項１記載のベクター。
【請求項１０】
該遺伝子発現カセットが該Ｅ１領域内に挿入されている、請求項９記載のベクター。
【請求項１１】
該遺伝子発現カセットがＥ１に平行な配向で存在する、請求項９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１２】
該遺伝子発現カセットがＥ１に逆平行な配向で存在する、請求項９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１３】
該プロモーターが、イントロン配列を欠くサイトメガロウイルスプロモーターである、請求項９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１４】
該プロモーターが最初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーターである、請求項１３記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１５】
該プロモーターがマウスサイトメガロウイルスプロモーターである、請求項９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１６】
該転写終結配列がウシ成長ホルモンポリアデニル化および転写終結配列である、請求項９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１７】
該転写終結配列が合成ポリアデニル化シグナル（ＳＰＡ）である、請求項９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項１８】
請求項１記載のアデノウイルスベクターを含んでなる細胞。
【請求項１９】
アデノウイルスＥ１タンパク質を相補的レベルで発現する細胞系内への請求項１記載のアデノウイルスベクターのトランスフェクションの後に回収され精製された組換え複製欠損型アデノウイルス粒子。
【請求項２０】
請求項１９記載の精製されたアデノウイルス粒子を含んでなるＨＩＶワクチン組成物。
【請求項２１】
生理的に許容される担体を含む、請求項２０記載のＨＩＶワクチン組成物。
【請求項２２】
アデノウイルスＥ１タンパク質を発現する宿主細胞内に該アデノウイルスベクターを導入し、得られた組換え複製欠損型アデノウイルスを回収することを含んでなる、請求項１記載のアデノウイルスベクターのアデノウイルスゲノムを含有する組換え複製欠損型アデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項２３】
該細胞がＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である、請求項２２記載の製造方法。
【請求項２４】
請求項２１記載のワクチンを該個体に投与することを含んでなる個体においてＨＩＶに対する細胞性免疫応答を生成させる方法。
【請求項２５】
ＤＮＡプラスミドワクチンを該個体に投与することを更に含み、この場合、それと共に、所望により、該免疫応答を増強しうる生物学的に有効なアジュバント、タンパク質または他の物質を投与しうる、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
アデノウイルスワクチンの投与の前に該ＤＮＡプラスミドワクチンを該個体に投与する、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
異なる血清型のアデノウイルスワクチンが該アデノウイルスワクチンに先行する、請求項２４記載の方法。
【請求項２８】
該アデノウイルスワクチンベクターを該個体に投与および再投与することを含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２９】
該ＨＩＶタンパク質がＨＩＶ　ｇａｇまたはその免疫学的に関連した修飾体である、請求項１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３０】
該遺伝子発現カセットが、ＨＩＶ　ｇａｇタンパク質またはその免疫学的に関連した修飾体をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３１】
Ｅ１において少なくとも部分的に欠失していてＥ１活性を欠き、
ａ）野生型アデノウイルスゲノムの塩基対約４５１から塩基対約３５１０までに対応する塩基対が欠失している、野生型アデノウイルスゲノムの塩基対約１から塩基対約４５０までおよび約３５１１から約５７９８までに対応するアデノウイルス・シス作用性パッケージング領域、および
ｂ）ｉ）配列番号２９と、
ｉｉ）ｉ）に作動的に結合した異種プロモーターと、
ｉｉｉ）転写終結配列と、を含む遺伝子発現カセット、
を含んでなる組換えアデノウイルスワクチンベクター。
【請求項３２】
該遺伝子発現カセットがＥ１に平行な配向で存在する、請求項３１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３３】
該遺伝子発現カセットがＥ１に逆平行な配向で存在する、請求項３１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３４】
該プロモーターが、イントロン配列を欠くサイトメガロウイルスプロモーターである、請求項３１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３５】
該転写終結配列がウシ成長ホルモンポリアデニル化および転写終結配列である、請求項３１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３６】
Ｅ３において少なくとも部分的に欠失した、請求項３１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項３７】
請求項３０記載のアデノウイルスベクターを含んでなる細胞。
【請求項３８】
アデノウイルスＥ１タンパク質を相補的レベルで発現する細胞系内への請求項３０記載のアデノウイルスベクターのトランスフェクションの後に回収され精製された組換え複製欠損型アデノウイルス粒子。
【請求項３９】
請求項３８記載の精製されたアデノウイルス粒子を含んでなるＨＩＶワクチン組成物。
【請求項４０】
生理的に許容される担体を含む、請求項３９記載のＨＩＶワクチン組成物。
【請求項４１】
アデノウイルスＥ１タンパク質を発現する宿主細胞内に該アデノウイルスベクターを導入し、得られた組換え複製欠損型アデノウイルスを回収することを含んでなる、請求項３０記載のアデノウイルスベクターのアデノウイルスゲノムを含有する組換え複製欠損型アデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項４２】
該細胞がＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である、請求項４１記載の製造方法。
【請求項４３】
請求項２１記載のワクチンを該個体に投与することを含んでなる、個体においてＨＩＶに対する細胞性免疫応答を生成させる方法。
【請求項４４】
ＤＮＡプラスミドワクチンを該個体に投与することを更に含み、この場合、それと共に、所望により、該免疫応答を増強しうる生物学的に有効なアジュバント、タンパク質または他の物質を投与しうる、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
アデノウイルスワクチンの投与の前に該ＤＮＡプラスミドワクチンを該個体に投与する、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
異なる血清型のアデノウイルスワクチンが該アデノウイルスワクチンに先行する、請求項４３記載の方法。
【請求項４７】
該アデノウイルスワクチンベクターを該個体に投与および再投与することを含む、請求項４３記載の方法。
【請求項４８】
該ＨＩＶタンパク質がＨＩＶ　ｐｏｌまたはその免疫学的に関連した修飾体である、請求項１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項４９】
該遺伝子発現カセットが、ＨＩＶ　ｐｏｌタンパク質またはその免疫学的に関連した修飾体をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５０】
Ｅ１において少なくとも部分的に欠失していてＥ１活性を欠き、
ａ）野生型アデノウイルスゲノムの塩基対約４５１から塩基対約３５１０までに対応する塩基対が欠失している、野生型アデノウイルスゲノムの塩基対約１から塩基対約４５０までおよび約３５１１から約５７９８までに対応するアデノウイルス・シス作用性パッケージング領域、および
ｂ）ｉ）配列番号１、配列番号５および配列番号７よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列と、
ｉｉ）ｉ）に作動的に結合した異種プロモーターと、
ｉｉｉ）転写終結配列と、を含む遺伝子発現カセット、
を含んでなる組換えアデノウイルスワクチンベクター。
【請求項５１】
該遺伝子発現カセットがＥ１に平行な配向で存在する、請求項５０記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５２】
該遺伝子発現カセットがＥ１に逆平行な配向で存在する、請求項５０記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５３】
該プロモーターが、イントロン配列を欠くサイトメガロウイルスプロモーターである、請求項５０記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５４】
該転写終結配列がウシ成長ホルモンポリアデニル化および転写終結配列である、請求項５０記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５５】
Ｅ３において少なくとも部分的に欠失した、請求項５０記載のアデノウイルスベクター。
【請求項５６】
請求項４９記載のアデノウイルスベクターを含んでなる細胞。
【請求項５７】
アデノウイルスＥ１タンパク質を相補的レベルで発現する細胞系内への請求項４９記載のアデノウイルスベクターのトランスフェクションの後に回収され精製された組換え複製欠損型アデノウイルス粒子。
【請求項５８】
請求項５７記載の精製されたアデノウイルス粒子を含んでなるＨＩＶワクチン組成物。
【請求項５９】
生理的に許容される担体を含む、請求項５８記載のＨＩＶワクチン組成物。
【請求項６０】
アデノウイルスＥ１タンパク質を発現する宿主細胞内に該アデノウイルスベクターを導入し、得られた組換え複製欠損型アデノウイルスを回収することを含んでなる、請求項４９記載のアデノウイルスベクターのアデノウイルスゲノムを含有する組換え複製欠損型アデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項６１】
該細胞がＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である、請求項６０記載の製造方法。
【請求項６２】
請求項５９記載のワクチンを該個体に投与することを含んでなる、個体においてＨＩＶに対する細胞性免疫応答を生成させる方法。
【請求項６３】
ＤＮＡプラスミドワクチンを該個体に投与することを更に含み、この場合、それと共に、所望により、該免疫応答を増強しうる生物学的に有効なアジュバント、タンパク質または他の物質を投与しうる、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
アデノウイルスワクチンの投与の前に該ＤＮＡプラスミドワクチンを該個体に投与する、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
異なる血清型のアデノウイルスワクチンが該アデノウイルスワクチンに先行する、請求項６２記載の方法。
【請求項６６】
該アデノウイルスワクチンベクターを該個体に投与および再投与することを含む、請求項６２記載の方法。
【請求項６７】
該ＨＩＶタンパク質がＨＩＶ　ｎｅｆまたはその免疫学的に関連した修飾体である、請求項１記載のアデノウイルスベクター。
【請求項６８】
該遺伝子発現カセットが、ＨＩＶ　ｎｅｆタンパク質またはその免疫学的に関連した修飾体をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項６９】
Ｅ１において少なくとも部分的に欠失していてＥ１活性を欠き、
ａ）野生型アデノウイルスゲノムの塩基対約４５１から塩基対約３５１０までに対応する塩基対が欠失している、野生型アデノウイルスゲノムの塩基対約１から塩基対約４５０までおよび約３５１１から約５７９８までに対応するアデノウイルス・シス作用性パッケージング領域、および
ｂ）ｉ）配列番号９、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１５よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列と、
ｉｉ）ｉ）に作動的に結合した異種プロモーターと、
ｉｉｉ）転写終結配列と、を含む遺伝子発現カセット、
を含んでなる組換えアデノウイルスワクチンベクター。
【請求項７０】
該遺伝子発現カセットがＥ１に平行な配向で存在する、請求項６９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７１】
該遺伝子発現カセットがＥ１に逆平行な配向で存在する、請求項６９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７２】
該プロモーターが、イントロン配列を欠くサイトメガロウイルスプロモーターである、請求項６９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７３】
該転写終結配列がウシ成長ホルモンポリアデニル化および転写終結配列である、請求項６９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７４】
Ｅ３において少なくとも部分的に欠失した、請求項６９記載のアデノウイルスベクター。
【請求項７５】
請求項６８記載のアデノウイルスベクターを含んでなる細胞。
【請求項７６】
アデノウイルスＥ１タンパク質を相補的レベルで発現する細胞系内への請求項６８記載のアデノウイルスベクターのトランスフェクションの後に回収され精製された組換え複製欠損型アデノウイルス粒子。
【請求項７７】
請求項７６記載の精製されたアデノウイルス粒子を含んでなるＨＩＶワクチン組成物。
【請求項７８】
生理的に許容される担体を含む、請求項７７記載のＨＩＶワクチン組成物。
【請求項７９】
アデノウイルスＥ１タンパク質を発現する宿主細胞内に該アデノウイルスベクターを導入し、得られた組換え複製欠損型アデノウイルスを回収することを含んでなる、請求項６８記載のアデノウイルスベクターのアデノウイルスゲノムを含有する組換え複製欠損型アデノウイルス粒子の製造方法。
【請求項８０】
該細胞がＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞である、請求項７９記載の製造方法。
【請求項８１】
請求項７８記載のワクチンを該個体に投与することを含んでなる、個体においてＨＩＶに対する細胞性免疫応答を生成させる方法。
【請求項８２】
ＤＮＡプラスミドワクチンを該個体に投与することを更に含み、この場合、それと共に、所望により、該免疫応答を増強しうる生物学的に有効なアジュバント、タンパク質または他の物質を投与しうる、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
アデノウイルスワクチンの投与の前に該ＤＮＡプラスミドワクチンを該個体に投与する、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
異なる血清型のアデノウイルスワクチンが該アデノウイルスワクチンに先行する、請求項８１記載の方法。
【請求項８５】
該アデノウイルスワクチンベクターを該個体に投与および再投与することを含む、請求項８１記載の方法。
【請求項８６】
組換え複製欠損型アデノウイルス粒子を含んでなり、該アデノウイルス粒子は、アデノウイルスＥ１タンパク質を発現する細胞系から回収され精製され、該粒子は、請求項９記載のアデノウイルスベクターでの該細胞のトランスフェクションの後に回収され、該ベクターが、
ａ）３つの個々のベクターから、独立して発現されるｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ、
ｂ）１つのベクターから、独立して発現されるｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ（これらのコード核酸配列は別個のプロモーターおよび転写終結配列に作動的に結合している）、
ｃ）２つのベクター（一方はｐｏｌ−ｎｅｆ融合体を発現し、もう一方はｇａｇを発現する）を介して発現されるｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ、
ｄ）２つのベクター（一方はｇａｇ−ｐｏｌ融合体を発現し、もう一方はｎｅｆを発現する）を介して発現されるｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ、
ｅ）２つのベクター（一方はｎｅｆ−ｇａｇ融合体を発現し、もう一方はｐｏｌを発現する）を介して発現されるｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ、
ｆ）ｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ融合体を発現する１つのベクターを介して発現されるｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ、
ｇ）２つの個々のベクターから、独立して発現されるｇａｇおよびｐｏｌ、
ｈ）１つのベクターから、独立して発現されるｇａｇおよびｐｏｌ（これらのコード核酸配列は別個のプロモーターおよび転写終結配列に作動的に結合している）、
ｉ）２つの個々のベクターから、独立して発現されるｐｏｌおよびｎｅｆ、
ｊ）１つのベクターから、独立して発現されるｐｏｌおよびｎｅｆ（これらのコード核酸配列は別個のプロモーターおよび転写終結配列に作動的に結合している）、
ｋ）２つの個々のベクターから、独立して発現されるｎｅｆおよびｇａｇ、
ｌ）１つのベクターから、独立して発現されるｎｅｆおよびｇａｇ（これらのコード核酸配列は別個のプロモーターおよび転写終結配列に作動的に結合している）、
ｍ）ｇａｇ−ｐｏｌ融合体を発現する１つのベクターを介して発現されるｇａｇおよびｐｏｌ、
ｎ）ｐｏｌ−ｎｅｆ融合体を発現する１つのベクターを介して発現されるｐｏｌおよびｎｅｆ、ならびに
ｏ）ｎｅｆ−ｇａｇ融合体を発現する１つのベクターを介して発現されるｎｅｆおよびｇａｇ
よりなる群から選ばれるＨＩＶタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子発現カセットを含む、多価アデノウイルスワクチン組成物。
【請求項８７】
該ｇａｇ−ｐｏｌ融合体が配列番号３９よりなる、請求項８６記載の多価アデノウイルスワクチン組成物。
【請求項８８】
該融合配列が、別個のプロモーターおよび転写終結配列に作動的に結合したコード核酸配列を有する、請求項８６記載の多価アデノウイルスワクチン組成物。
【請求項８９】
該融合配列が、単一のプロモーターに作動的に結合したコード核酸配列、およびＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に作動的に結合したコード核酸配列を有する、請求項８６記載の多価アデノウイルスワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、他の複製欠損型ベクターと比較して増強した増殖特性およびより大きな細胞性免疫を示すことが見出された組換え複製欠損型第１世代アデノウイルスワクチンに関する。本発明はまた、追加的な５’アデノウイルス配列の取り込みにより、本明細書に記載の組換え複製欠損型アデノウイルスの大規模生産効率を増加させる本明細書に記載の関連第１世代アデノウイルスベクターに関する。本発明のもう１つの態様は、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）プロモーターのイントロンＡ部分がアデノウイルスベクター構築物における不安定性の領域を構成するという驚くべき知見にある。アデノウイルス発現構築物からこの領域を除去すると、著しく改善されたベクター安定性が得られる。したがって、イントロンＡ欠失ＣＭＶプロモーターの制御下でトランスジーンを発現する改良されたベクターは、本発明のもう１つの態様を構成する。これらのアデノウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する組換えアデノウイルスワクチンの製造に有用である。特に、本明細書に記載の第１世代アデノウイルスベクターは、ＨＩＶ−１　Ｇａｇ、ＨＩＶ−１　Ｐｏｌおよび／またはＨＩＶ−１　Ｎｅｆポリヌクレオチド医薬品ならびにそれらの生物学的に活性な修飾体を含有する、アデノウイルスに基づくＨＩＶ−１ワクチンを構築し生成するために使用される。本明細書に記載の組換え複製欠損型アデノウイルスワクチンの宿主投与は、ＨＩＶ−Ｇａｇ、ＨＩＶ−１−Ｐｏｌおよび／またはＮｅｆタンパク質またはそれらの免疫学的に関連した修飾体の発現をもたらして、ＨＩＶ−１を特異的に認識する細胞性免疫応答を誘導する。例示されている本発明のポリヌクレオチドは、コドン最適化ＨＩＶ−１　Ｇａｇ、ＨＩＶ−１　Ｐｏｌ、最適化ＨＩＶ−１　Ｐｏｌの誘導体（ＨＩＶ−１　Ｐｏｌのプロテアーゼ、逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよびインテグラーゼ活性が不活性化された構築物を含む）、ＨＩＶ−１　Ｎｅｆ、および最適化ＨＩＶ−１　Ｎｅｆの誘導体（宿主ＣＤ４のダウンレギュレーションおよびミリスチル化のようなＮｅｆの野生型特性に影響を及ぼすｎｅｆ突然変異体を含む）をコードする合成ＤＮＡ分子である。本発明のＨＩＶアデノウイルスワクチンは、単独で或いは組合せ様式および／または初回抗原刺激／追加抗原刺激法で投与されると、これまでに未感染の個体に予防上の利点をもたらし、および／または、感染個体内のウイルス負荷レベルを減少させてＨＩＶ−１感染の無症候期を延長させることにより治療効果をもたらすであろう。
【０００２】
（発明の背景）
ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）は後天性ヒト免疫不全症候群（エイズ）および関連障害の病原体である。ＨＩＶ−１はレトロウイルス科のＲＮＡウイルスであり、すべてのレトロウイルスの５’−ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−ＬＴＲ３’体制を示す。プロウイルスとして公知の組込み形態のＨＩＶ−１は約９．８Ｋｂ長である。該ウイルスゲノムの各末端は、長末端反復配列（ＬＴＲ）として公知のフランキング配列を含有する。該ＨＩＶ遺伝子は少なくとも９個のタンパク質をコードし、それらは主要構造タンパク質（Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖ）、調節タンパク質（ＴａｔおよびＲｅｖ）および補助タンパク質（Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、ＶｉｆおよびＮｅｆ）の３つのクラスに分けられる。
【０００３】
ｇａｇ遺伝子は５５キロダルトン（ｋＤａ）の前駆体タンパク質（ｐ５５）をコードしており、これは、スプライスされていないウイルスｍＲＮＡから発現され、ＨＩＶプロテアーゼ（ｐｏｌ遺伝子の産物）によるタンパク質分解によりプロセシングされる。成熟ｐ５５タンパク質産物はｐ１７（マトリックス）、ｐ２４（カプシド）、ｐ９（ヌクレオカプシド）およびｐ６である。
【０００４】
ｐｏｌ遺伝子は、ウイルスの複製に必要なタンパク質、すなわち、逆転写酵素、プロテアーゼ、インテグラーゼおよびＲＮアーゼＨをコードしている。これらのウイルスタンパク質は、リボソームフレームシフトにより産生される１６０ｋＤａの前駆体タンパク質であるＧａｇ−Ｐｏｌ融合タンパク質として発現される。該ウイルスコード化プロテアーゼは、タンパク質分解により該Ｇａｇ−Ｐｏｌ融合体からＰｏｌポリペプチドを切り離し、さらに該Ｐｏｌポリペプチドを成熟タンパク質にまで切断し、該成熟タンパク質はプロテアーゼ（Ｐｒｏ、Ｐ１０）、逆転写酵素（ＲＴ、Ｐ５０）、インテグラーゼ（ＩＮ、ｐ３１）およびＲＮアーゼＨ（ＲＮアーゼ、ｐ１５）活性をもたらす。
【０００５】
ｎｅｆ遺伝子は、ＣＤ４発現のダウンレギュレーション、Ｔ細胞活性化の阻害およびＨＩＶ感染性の促進のような幾つかの活性を有することが示されている初期補助（アクセサリー）ＨＩＶタンパク質（Ｎｅｆ）をコードする。
【０００６】
ｅｎｖ遺伝子は、ウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードしており、該糖タンパク質は、１６０キロダルトン（ｋＤａ）の前駆体（ｇｐ１６０）として翻訳され、ついで細胞プロテアーゼにより切断されて、外部１２０ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）および膜貫通４１ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ４１）を与える。Ｇｐ１２０およびｇｐ４１は会合したままであり、ウイルス粒子上およびＨＩＶ感染細胞表面上に提示される。
【０００７】
ｔａｔ遺伝子は、ＨＩＶ−１の複製に必須の転写トランスアクチベーターであるＲＮＡ結合タンパク質であるＴａｔタンパク質の長い形態および短い形態をコードしている。
【０００８】
ｒｅｖ遺伝子は、ＲＮＡ結合タンパク質である１３ｋＤａのＲｅｖタンパク質をコードしている。Ｒｅｖタンパク質は、Ｒｅｖ応答配列（ＲＲＥ）と称されるウイルスＲＮＡの領域に結合する。Ｒｅｖタンパク質は、核から細胞質への、スプライスされていないウイルスＲＮＡの輸送を促進する。Ｒｅｖタンパク質は、ＨＩＶ後期遺伝子発現に要求され、そしてＨＩＶの複製に要求される。
【０００９】
Ｇｐ１２０は、他の補助受容体（コレセプター）分子に加えて、ヘルパーＴリンパ球、マクロファージおよび他の標的細胞の表面上に存在するＣＤ４／ケモカイン受容体に結合する。Ｘ４（マクロファージ指向性）ウイルスはＣＤ４／ＣＸＣＲ４複合体に対する指向性を示し、Ｒ５（Ｔ細胞系指向性）ウイルスはＣＤ４／ＣＣＲ５受容体複合体と相互作用する。ｇｐ１２０がＣＤ４に結合した後、ｇｐ４１が、ウイルスの侵入をもたらす融合事象を媒介する。該ウイルスは該標的細胞と融合しそれに侵入し、ついでＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼにより、その一本鎖ＲＮＡゲノムから二本鎖ＤＮＡへの逆転写が生じる。プロウイルスとして公知の該ウイルスＤＮＡは細胞核に侵入し、そこで、該ウイルスＤＮＡは、該核内での新たなウイルスＲＮＡの産生、初期および後期ＨＩＶウイルスタンパク質の発現、ならびにそれに続く新たなウイルス粒子の産生および細胞放出を指令する。該一次感染は、該ウイルスの非常に高い産生および組織分布ならびにそれに続くウイルスの定常状態レベル（ただし、これはこの相における連続的なウイルス産生および代謝回転によるものである）を与え、最終的には、臨床的エイズ発症を招く更なるウイルス負荷の放出をもたらすことが、宿主内のウイルス負荷の検出能における最近の進歩から示されている。生産的感染細胞は数日間の半減期を有し、一方、慢性または潜伏感染細胞は３週間の半減期を有し、それに続く非生産的感染細胞は、長い半減期（１００日以上）を有するが、疾患経過の全体にわたり認められる日々のウイルス負荷に有意には寄与しない。
【００１０】
免疫防御に決定的に重要なＣＤ４ヘルパーＴリンパ球の破壊が、ＨＩＶ感染の特徴である進行性免疫機能不全の主要原因である。ＣＤ４　Ｔ細胞の喪失は、ほとんどの侵入体と戦う身体能力を著しく損なうが、それは、ウイルス、真菌、寄生生物および或る細菌（マイコバクテリアを含む）に対する防御に対して特に深刻な影響を及ぼす。
【００１１】
最近、ＨＩＶ−１感染個体に対する有効な治療法が利用可能となった。しかし、これらの薬物は、世界の多数の地域においては該疾患に対して有意な影響を及ぼさず、それらは、ヒト集団内の感染の広がりの阻止において最低限の影響しか及ぼさないであろう。多数の他の感染症の場合と同様、ＨＩＶ−１感染の広がりに対する有意な疫学的効果は、有効なワクチンの開発および導入の後でしか見出されないであろう。現在までにワクチン開発が成功していないのには、多数の要因が関与している。前記のとおり、慢性感染者においては、抗ＨＩＶ−１体液性および細胞性免疫応答の存在ならびにウイルス感染細胞の破壊にもかかわらず、絶え間ないウイルス産生が生じている。他の感染症の場合と同様に、疾患の結末は、該免疫応答の速度論および規模と、該病原体複製速度および該免疫応答による影響の受け易さとの平衡がどのようになるかによって決まる。急性感染における既存免疫は、確立された感染における生成免疫応答より有効かもしれない。第２の要因は、該ウイルスの際立った遺伝的可変性である。細胞培養内ではＨＩＶ−１感染性を中和しうる抗ＨＩＶ−１抗体が存在するが、これらの抗体は、一般には、それらの活性において、ウイルス分離体に特異的である。伝統的な方法を用いてＨＩＶ−１の血清学的分類を定義することは不可能であることが判明している。むしろ、該ウイルスは血清学的「連続体（ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ）」を特徴づけるようであり、そのため、個々の中和抗体応答は、せいぜい、少数のウイルス変異体に対して有効であるに過ぎない。この後者の見解を考慮すると、抗ＨＩＶ−１細胞性免疫応答を惹起しうる免疫原および関連送達技術を同定することが有用であろう。ＣＴＬ応答を得るためには、抗原が細胞内で合成されるか又は細胞内に導入され、ついでプロテアソーム複合体により、小さなペプチドにプロセシングされ、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質との最終的会合のために小胞体／ゴルジ複合体分泌経路に輸送されなければならないことが公知である。ＣＤ８＋　Ｔリンパ球は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびＣＤ８細胞表面タンパク質を介して、ＭＨＣクラスＩと会合した抗原を認識する。活性化エフェクターまたは記憶細胞へのナイーブＣＤ８＋　Ｔ細胞の活性化は、一般には、前記のとおりの抗原のＴＣＲ関与および共刺激タンパク質の関与の両方を要する。ＣＴＬ応答の最適な誘導は、通常、ＴＣＲおよびＣＤ４の関与を介してＭＨＣクラスＩＩ分子と会合した抗原を認識するＣＤ４＋　Ｔリンパ球からのサイトカインの形態での「援助」を要する。
【００１２】
欧州特許出願第０　６３８　３１６号（１９９５年２月１５日付け公開）および第０　５８６　０７６号（１９９４年３月９日付け公開）（共にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｈｏｍｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎに譲渡されている）は、ｅｎｖまたはｇａｇを含むＨＩＶ遺伝子を保持する複製型アデノウイルスベクターを記載している。チンパンジーおよびイヌでの種々の治療計画が用いられ、それらのいくつかはブースターアデノウイルスまたはタンパク質＋ミョウバンでの治療を含むものであった。
【００１３】
Ｅ１領域内に欠失を保持する複製欠損型アデノウイルスベクターが公知であり、最近のアデノウイルスベクターは、これらのベクター内に公知パッケージング反復配列を組込んでいる。例えば、とりわけ、塩基対４５９〜３３２８のＥ１配列において欠失したアデノウイルスベクターを開示しているＥＰ　０７０７０７１、および、とりわけ、塩基対４５９〜３５１０が欠失したアデノウイルスベクターを開示している米国特許第６，０３３，９０８号を参照されたい。アデノウイルスのパッケージング効率は、組込まれる個々のＡ（パッケージング）反復配列の数に左右されると教示されている。例えば、ＧｒａｂｌｅおよびＨｅａｒｉｎｇ，１９９０　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４（５）：２０４７−２０５６；ＧｒａｂｌｅおよびＨｅａｒｉｎｇ，１９９２　Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６（２）：７２３−７３１を参照されたい。
【００１４】
Ｌａｒｄｅｒら（１９８７，Ｎａｔｕｒｅ　３２７：７１６−７１７）およびＬａｒｄｅｒら（１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：４８０３−４８０７）は、ＨＩＶ−１　ＲＴの部位特異的突然変異誘発を開示しており、また、そのような変化が、ＲＴの公知インヒビターとの相互作用に関連したインビトロ活性および感染性に及ぼす影響を開示している。
【００１５】
Ｄａｖｉｅｓら（１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：，８８−９５）は、ＨＩＶ−１　ＰｏｌのＲＮアーゼＨドメインの結晶構造を開示している。
【００１６】
Ｓｃｈａｔｚら（１９８９，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２５７−３１１−３１４）は、完全なＨＩＶ−１　ＲＴ／ＲＮアーゼＨ　ＤＮＡ断片内の突然変異Ｇｌｕ４７８ＧｌｎおよびＨｉｓ５３９Ｐｈｅが、ＲＴ活性に影響を及ぼすことなく欠損ＲＮアーゼ活性を与えることを開示している。
【００１７】
Ｍｉｚｒａｈｉら（１９９０，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１８：ｐｐ．５３５９−５３５３）は、同様に欠損ＲＮアーゼ活性を与えるｐｏｌ遺伝子のＲＮアーゼ領域内の追加的突然変異Ａｓｐ４４３ＡｓｎおよびＡｓｐ４９８Ａｓｎを開示している。該著者は、Ａｓｐ４９８Ａｓｎ突然変異体の特徴づけが、この突然変異体タンパク質の不安定性のために困難であったことを記載している。
【００１８】
Ｌｅａｖｉｔｔら（１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１１３−２１１９）は、ＨＩＶ−１インテグラーゼ（ＩＮ）活性に対して異なる効果を示すＡｓｐ６４Ｖａｌ突然変異を含む幾つかの突然変異を開示している。
【００１９】
Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎら（１９９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：３７６−３８６）は、ＨＩＶ−１　ＩＮおよびウイルス複製機能に影響を及ぼすアスパラギン酸残基の突然変異を含む一重および二重突然変異体を開示している。
【００２０】
ＨＩＶ感染に対して強力な細胞性免疫応答を産生する予防および／または治療に基づくＨＩＶワクチンを得ることが、エイズとの闘いにおいて非常に重要であろう。本発明は、宿主に投与されるとＨＩＶ−１遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆのコドン最適化および修飾形態を発現するアデノウイルスワクチンのクラスを開示することにより、この要求を検討し、それを満足させるものである。これらの複製欠損型組換えアデノウイルスワクチンは、単独で、あるいは本発明の成分および／または別個のウイルスＨＩＶ　ＤＮＡワクチン、非ウイルス性ＨＩＶ　ＤＮＡワクチン、ＨＩＶサブユニットワクチン、ＨＩＶ全不活化ワクチンおよび／または生弱毒化ＨＩＶワクチンでの初回抗原刺激ワクチン接種法および／または組合せ様式の一部として、ヒトのような宿主に投与することができる。
【００２１】
（発明の概要）
本発明は、ＨＩＶ−１　Ｇａｇ、ＨＩＶ−１　ＰｏｌおよびＨＩＶ−１　Ｎｅｆの免疫学的に関連した修飾体を含む種々の形態のＨＩＶ−１　Ｇａｇ、ＨＩＶ−１　Ｐｏｌおよび／またはＨＩＶ−１　Ｎｅｆをコードする増強された複製欠損型組換えアデノウイルスワクチンベクターおよび関連組換え複製欠損型アデノウイルスワクチンに関する。本発明のアデノウイルスワクチンはＨＩＶ抗原を発現し、宿主投与に際して、改善された細胞性免疫応答をもたらす。潜在的なワクチン被接種体には、霊長類、特にヒトおよび非ヒト霊長類が含まれ、また、商業的または家畜獣医学的に重要な任意の非ヒト哺乳動物が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明の改良された組換えアデノウイルスに基づくワクチンの効果は、これまでに未感染の個体に対する、より低い伝染率（すなわち、予防的用途）、および／または、感染個体内のウイルス負荷のレベルの減少によるＨＩＶ−１感染の無症候期の延長（すなわち、治療的用途）でなければならない。特に、本発明は、種々の形態のコドン最適化ＨＩＶ−１　Ｇａｇ（ｐ５５形態のコドン最適化完全長（ＦＬ）ＧａｇおよびｔＰＡ−Ｇａｇ融合タンパク質を含むが、何らこれらに限定されるものではない）、ＨＩＶ−１　Ｐｏｌ、ＨＩＶ−１　Ｎｅｆおよび免疫学的に関連のある選択された修飾体をコードする、アデノウイルスに基づくワクチンに関する。これらのアデノウイルスワクチンの投与、細胞内運搬および発現は、宿主ＣＴＬおよびＴｈ応答を惹起する。好ましい複製欠損型組換えアデノウイルスワクチンベクターには、（１）コドン最適化形態の野生型ＨＩＶ−１　Ｇａｇをコードする、（２）コドン最適化形態のＨＩＶ−１　Ｐｏｌをコードする、（３）コドン最適化形態のＨＩＶ−１　Ｐｏｌ融合タンパク質をコードする、（４）コドン最適化形態の修飾ＨＩＶ−１　Ｐｏｌタンパク質および融合タンパク質、例えば宿主細胞内でＲＴ、ＲＮアーゼおよびＩＮ活性をもたらす触媒領域内の残基を含むｐｏｌ修飾体（これらに限定されるものではない）をコードする、（５）コドン最適化形態の野生型ＨＩＶ−１　Ｎｅｆをコードする、（６）コドン最適化形態のＨＩＶ−１　Ｎｅｆ融合タンパク質をコードする、および／または（７）コドン最適化形態のＨＩＶ−１　Ｎｅｆ誘導体、例えばアミノ末端リーダー配列の導入、アミノ末端ミリスチル化部位の除去および／またはジロイシンモチーフ突然変異の導入を含むｎｅｆ修飾体（これらに限定されるものではない）をコードする合成ＤＮＡ分子が含まれるが、これらに限定されるものではない。アデノウイルスに基づくベクターワクチンから発現される本明細書に開示するＮｅｆに基づく融合体および修飾タンパク質は、宿主ＭＨＣ　Ｉ複合体に適切に提示されて宿主ＣＴＬおよびＴｈ応答を惹起する能力を保有する一方、改変された輸送（トラフィッキング）および／または宿主細胞機能を有しうる。ＨＩＶ−１　Ｇａｇ、Ｐｏｌおよび／またはＮｅｆ融合タンパク質の具体例には、該ウイルス抗原コード領域のＮＨ２末端部分でのリーダーまたはシグナルペプチドの融合体が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのようなリーダーペプチドには、ｔＰＡリーダーペプチドが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００２２】
本発明のＨＩＶ−１　Ｇａｇ、ＨＩＶ−１　Ｐｏｌおよび／またはＨＩＶ−１　Ｎｅｆに基づくワクチンの構築において使用するアデノウイルスベクターは、該組換えウイルスの大規模な製造および精製にわたる該組換えアデノウイルスゲノムの遺伝的安定性の増強をもたらす任意の複製欠損型アデノウイルスベクターを含みうる。すなわち、本発明のＨＩＶ−１　Ｇａｇ、ＰｏｌまたはＮｅｆに基づくアデノウイルスワクチンは、細胞培養における多数の継代にわたり遺伝的に安定であり従って大規模な製造および精製操作中に維持されることが示される精製された組換え複製欠損型アデノウイルスである。そのような組換えアデノウイルスベクターおよび回収されたアデノウイルスワクチンは、有効な単価または多価ＨＩＶワクチンに要求される大規模用量の充填およびそれに続く世界的な流通に有用である。本発明は、この基本要件を満足し、野生型アデノウイルスゲノムの塩基対約１から塩基対約３４２から（より好ましくは４００から）塩基対約４５８までの間の野生型アデノウイルス・シス作用性パッケージング領域を含みＥ１において少なくとも部分的に欠失した複製欠損型アデノウイルスベクターおよびそれに由来するベクターとして記載される。本発明の好ましい実施形態は、野生型アデノウイルスの塩基対１〜４５０を含む。他の好ましい実施形態においては、該複製欠損型アデノウイルスベクターは、それに加えて、塩基対３５１１〜３５２３を含むＥ１欠失領域の３’側の領域を有する。塩基対３４２〜４５０（より詳しくは４００〜４５０）は、ウイルス抗原、特にＨＩＶ抗原を保持する既に開示されているベクターの５’領域の伸長を構成する（例えば、１９９９年７月６日および１９９９年８月１３日付け出願のそれぞれ米国仮特許出願第６０／１４２，６３１号および第６０／１４８，９８１号に基づき優先権を主張している２００１年１月１１日付け公開のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／１８３３２（ＷＯ　０１／０２０６７）を参照されたい；これらの文書を参照により本明細書に組み入れることとする）。本出願人は、該５’領域を該開示ワクチン内のＥ１遺伝子内に更に伸長させると該ウイルスのパッケージングの最適化に重要であることが見い出された要素が組込まれること、を見出した。
【００２３】
野生型アデノウイルスゲノムの塩基対約１からと塩基対約３４２（より好ましくは４００）から塩基対約４５８との間までを含まない従来のベクターと比較して、前記領域を含むベクターは、より強力なウイルス効果である約５〜１０倍大きな増幅速度を伴う増強された増殖特性を示して、より低いウイルス使用量で同等の免疫生成を可能にし、この領域（塩基対１〜４５０）を含まない複製欠損型ベクターより大きな細胞性免疫応答を可能にする。より一層重要なことは、それに由来するアデノウイルス構築物、特に、イントロンＡを欠くｈＣＭＶプロモーターの制御下で発現カセットを含むものは、大規模生産において遺伝的に非常に安定である。本出願人は、驚くべきことに、ｈＣＭＶプロモーターのイントロンＡ部分が、アデノウイルスベクター中で使用された場合に不安定性の領域を構成することを見出しており、前記の安定性はこれに基づくものである。したがって、本出願人は、遺伝子治療における使用に特に適した増強されたアデノウイルスベクター、および好ましいことに大規模増殖に有用な、ヌクレオチドに基づくワクチンベクターを特定した。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態は、（ａ）タンパク質または生物学的に活性な及び／又はその免疫学的に関連した部分をコードする核酸と、（ｂ）ａ）部の核酸に作動的に結合した異種プロモーターと、（ｃ）転写ターミネーターと、を含む遺伝子発現カセットの形態で該遺伝子が挿入されている、前記のとおりの複製欠損型アデノウイルスベクターである。
【００２５】
好ましい実施形態においては、塩基対１〜４５０内に含有されているもの以外または塩基対１〜４５０および３５１１〜３５２３内に含有されているもの以外のＥ１遺伝子が該アデノウイルスベクターから欠失しており、該欠失Ｅ１遺伝子は該遺伝子発現カセットで置換されている。他の好ましい実施形態においては、該複製欠損アデノウイルスゲノムは機能的Ｅ３遺伝子を有さず、あるいは該Ｅ３遺伝子が欠失している。最も好ましくは、該Ｅ３領域は該アデノウイルスゲノム内に存在する。さらに好ましい実施形態においては、該遺伝子発現カセットは、Ｅ１に逆平行（該ベクターバックボーンに対して３’から５’への方向で転写される）な配向、より好ましくは、Ｅ１に平行（該ベクターバックボーンに対して５’から３’への方向で転写される）な配向で存在する。
【００２６】
さらなる実施形態は、アデノウイルス部分とプラスミド部分とを含むシャトルプラスミドベクターに関する。ここで、該アデノウイルス部分は、ａ）野生型アデノウイルスゲノムの塩基対約１からと塩基対約３４２（より好ましくは４００）から塩基対約４５８までの間との野生型アデノウイルス・シス作用性パッケージング領域（好ましくは１〜４５０）および好ましくはそれに加えて野生型アデノウイルス配列の塩基対３５１１〜３５２３を含みＥ１において少なくとも部分的に欠失した複製欠損型アデノウイルスゲノム、ならびにｂ）（ａ）タンパク質またはその生物学的に活性な及び／又は免疫学的に関連した部分をコードする核酸と、（ｂ）ａ）部の核酸に作動的に結合した異種プロモーターと、（ｃ）転写終結および／またはポリアデニル化部位と、を含む遺伝子発現カセットを含む。
【００２７】
本発明の他の態様は、該アデノウイルスベクターおよび／または該シャトルプラスミドベクターを含む宿主細胞；該ベクターを含むワクチン組成物；および（ａ）アデノウイルスＥ１タンパク質を発現する宿主細胞内に該アデノウイルスベクターを導入し、（ｂ）得られたアデノウイルスベクターを回収することを含む該ベクターの製造方法を含む。
【００２８】
この目的において、本発明は特に、本明細書に記載のＨＩＶ−１抗原を含む（これらに限定されるものではない）付随トランスジーを伴う又は伴わないＭＲＫＡｄ５ベクターバックボーンのいずれかに関連した回収されたウイルスを含む（これらに限定されるものではない）、２９３細胞またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（これらに限定されるものではない）のような宿主細胞に由来する回収された組換え複製欠損型ウイルスに関する。ＨＩＶ−１ワクチンは、本明細書に開示するＨＩＶ−１抗原の任意の１以上を発現する任意の回収された組換えアデノウイルス物質により表される。ついで、この回収された物質は、宿主投与の前に精製され製剤化され保存されうる。
【００２９】
本発明のもう１つの態様は、タンパク質に対する細胞性免疫応答を個体において生成させる方法であって、
ａ）塩基対約１からと塩基対約３４２（より好ましくは４００）から塩基対約４５８まで（好ましくは１〜４５０）の間との野生型アデノウイルス・シス作用性アデノウイルスパッケージング領域および好ましくはそれに加えて野生型アデノウイルス配列の塩基対３５１１〜３５２３を含む、Ｅ１において少なくとも部分的に欠失した組換え複製欠損型アデノウイルベクター、ならびに
ｂ）（ｉ）タンパク質またはその生物学的に活性な及び／又は免疫学的に関連した部分をコードする核酸と、（ｉｉ）ａ）部の核酸に作動的に結合した異種プロモーターと、（ｉｉｉ）転写ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位とを含む遺伝子発現カセットを含むアデノウイルスワクチンベクターを該個体に投与することを含んでなる方法である。
【００３０】
本明細書に記載のアデノウイルスおよび／またはＤＮＡプラスミドワクチンの有効な性質を考慮して、本発明は、有効な免疫予防を得るための、またはＨＩＶ−１ウイルスに対する曝露後のＨＩＶ−１感染の確立を妨げるため、または急性ＨＩＶ−１感染を軽減して、有益な長期的結果を伴う、より低いウイルス負荷の確立をもたらすためのＨＩＶ感染後の治療用ワクチンとしての、これらのアデノウイルスおよび／またはＤＮＡプラスミドワクチンの１以上の投与に関するすべての方法に関する。本明細書に記載されているとおり、そのような治療計画は、単価または多価組成物、種々の組合せ形態の適用、および／または初回／追加抗原刺激法（それにより、生きた脊椎動物組織内への接種後の抗原発現および付随的な細胞性および／または体液性免疫応答が最適化される）を含みうる。したがって、本発明は、哺乳類組織内に導入されるとｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｎｅｆに基づくベクターの細胞内発現を誘発する、本明細書に開示する種々のパラメーターおよび当技術分野で公知の追加的パラメーターの範囲内の本明細書に開示するアデノウイルスおよび／またはＤＮＡプラスミドワクチンの使用方法を提供する。
【００３１】
この目的において、本発明は、１つには、ワクチン被接種体、好ましくはヒトのワクチン被接種者において細胞性免疫応答を生成させる方法に関する。この場合、該個体には、アデノウイルスワクチンベクターの２以上の投与が行われ、それは、プラスミドワクチンの投与を伴う計画において投与されうる。該プラスミドワクチン（本明細書中では「ＤＮＡプラスミドワクチン」または「ワクチンプラスミド」とも称される）は、タンパク質またはその免疫学的に関連した部分をコードする核酸、該核酸配列に作動的に結合した異種プロモーター、および転写ターミネーターまたはポリアデニル化シグナル（例えば、それぞれｂＧＨまたはＳＰＡ）を含む。それらの投与を隔てる所定の最低限度の長さの時間を設けることが可能である。該個体に、第１用量のプラスミドワクチン、ついで第２用量のプラスミドワクチンを投与することができる。あるいは、該個体に、第１用量のアデノウイルスワクチン、ついで第２用量のアデノウイルスワクチンを投与することができる。他の実施形態においては、まず、該プラスミドワクチンを投与し、ついで幾らかの時間の後、該アデノウイルスワクチンを投与する。逆に、まず、該アデノウイルスワクチンを投与し、ついで幾らかの時間の後、プラスミドワクチンを投与することができる。これらの実施形態においては、個体に、ウイルスベクターまたはプラスミド形態として複数用量の同じアデノウイルス血清型を投与することが可能であり、代替的態様では、該ウイルスは、異なる血清型のものでありうる。該代替的態様においては、まず、関心のあるウイルス抗原を、アデノウイルスに基づくワクチン以外のウイルスワクチンを介して運搬し、ついで、開示されているアデノウイルスワクチンで行うことができる。代替的ウイルスワクチンには、ポックスウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
本発明はまた、本明細書に記載のＧａｇ、ＰｏｌおよびＮｅｆ成分を含む多価アデノウイルスワクチン組成物に関する。例えば、実施例２９および表２５を参照されたい。そのような組成物は、ヒトＭＨＣの及び循環ウイルスの遺伝的多様性を仮定した場合には特に、宿主への投与の後、増強した細胞性免疫応答をもたらすであろう。具体例には、二価（すなわち、ｇａｇおよびｎｅｆ、ｇａｇおよびｐｏｌ、またはｐｏｌおよびｎｅｆ成分）または三価ワクチン（すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ成分）組成物を与えるＭＲＫＡｄ５ベクターに基づく多価ワクチン組成物が含まれるが、これらに限定されるものではない。そのような多価ワクチンは１回量用に充填されたり、各個に充填された成分の複数の接種よりなることが可能であり、また、前段落に記載のウイルス性または非ウイルス性ベクターワクチンでの初回／追加抗原刺激法の一部でありうる。この目的のためには、好ましい組成物は、複数の異なるＨＩＶ抗原クラスと組合せて使用されるＭＲＫＡｄ５アデノウイルスである。各ＨＩＶ抗原クラスは配列操作に付され、それにより多数の潜在的なワクチンの組合せを与え、そのような組合せは本発明の範囲内である。そのような組合せ様式のワクチン製剤および投与の利用は、単一様式の方法での接種より一層強力な細胞性免疫応答を惹起する可能性を増大させる。
【００３３】
本明細書に開示する「組合せ様式」の概念は、複数のオープンリーディングフレームを含む前アデノウイルスプラスミドの生成のために適当なシャトルプラスミドに複数のＨＩＶ−１ウイルス抗原が連結されうる代替的投与様式をも含む。例えば、三価ベクターは、Ｅ３（−）またはＥ３（＋）バックグラウンド、好ましくはＥ３欠失バックボーンにおけるｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ融合体、あるいは、おそらくは、「２＋１」二価ワクチン、例えば、同じＭＲＫＡｄ５バックボーン内のｇａｇ−ｐｏｌ融合体（すなわち、コドン最適化ｐ５５ｇａｇおよび不活性化最適化ｐｏｌ；実施例２９および表２５）（各オープンリーディングフレームは別個のプロモーターおよび転写終結配列に作動的に結合している）を含みうる。あるいは、それらの２つのオープンリーディングフレームは単一のプロモーターに作動的に結合しており、該オープンリーディングフレームはＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に作動的に連結していることが可能である。したがって、単一の又は恐らくは第２の回収された組換え複製欠損型アデノウイルスとして運搬される多価ワクチンは、本発明の一部と意図される。
【００３４】
したがって、本発明のアデノウイルスワクチンおよびプラスミドＤＮＡワクチンは単独で投与することが可能であり、あるいは初回および追加抗原刺激投与法の一部でありうる。混合様式の初回および追加接種法は、既存の抗ベクター免疫応答が存在する場合には特に、増強された免疫応答をもたらすであろう。本発明のこの１つの態様は、該プラスミドワクチンを少なくとも１回投与することにより該プラスミドワクチンで対象を初回抗原刺激し、所定の長さの時間を経過させ、ついで該アデノウイルスワクチンを投与することにより追加抗原刺激する方法である。通常、複数の初回抗原刺激、典型的には１〜４回の初回抗原刺激を行うが、より多数の初回抗原刺激を行うことが可能である。初回抗原刺激と追加抗原刺激との間の時間の長さは、典型的には約４ヶ月〜１年と様々となりうるが、他の時間枠を用いることも可能である。アカゲザルでの実験においては、該動物をプラスミドワクチンで４回初回抗原刺激し、ついで４ヶ月後に該アデノウイルスワクチンで追加抗原刺激した。それらの細胞性免疫応答は、アデノウイルスワクチンのみが投与された動物の場合より顕著に高かった。初回抗原刺激法の利用は、既存の抗アデノウイルス免疫応答を対象者が有する場合には特に好ましいかもしれない。
【００３５】
増強された複製欠損型組換えアデノウイルスワクチンベクターバックボーンを提供することが、本発明の目的の１つである。これらの組換えアデノウイルスバックボーンは１以上のトランスジーンを受容することが可能であり、それは、増殖、増幅および回収のために細胞培養を介して継代されうる。
【００３６】
種々のトランスジーンをコードする増強された複製欠損型組換えアデノウイルスワクチンベクターを提供することが、もう１つの目的である。
【００３７】
細胞培養における連続継代後のウイルス安定性の増加と共に増殖および増幅速度の増加を示す回収された組換え複製欠損型アデノウイルスを提供することも、本発明の目的の１つである。そのような組換えアデノウイルスは、遺伝子治療における及びヌクレオチドに基づくワクチンベクターにおける使用に特に適しており、有利なことに、大規模増殖に有用である。
【００３８】
この目的において、（１）種々の形態のＨＩＶ−１　Ｇａｇ、ＨＩＶ−１　Ｐｏｌおよび／またはＨＩＶ−１　Ｎｅｆ（ＨＩＶ−１　Ｇａｇ、ＨＩＶ−１　ＰｏｌおよびＨＩＶ−１　Ｎｅｆの免疫学的に関連した修飾体を含む）をコードする本明細書に記載の増強された複製欠損型組換えアデノウイルスワクチンベクター、ならびに（２）細胞培養による１回または複数回の継代（２９３細胞またはＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞による継代を含むが、これらに限定されるものではない）を介する（１）のアデノウイルスベクターの継代により産生された回収され精製された組換え複製欠損型アデノウイルスを提供することが、本発明の目的の１つである。
【００３９】
細胞培養による１回または複数回の継代により回収された組換えアデノウイルスを提供することも、本発明の目的の１つである。組換えアデノウイルスワクチンベクターの場合と同様に、この組換えウイルスを、後続の宿主投与のために回収し製剤化する。
【００４０】
また、本発明の目的の１つは、（ａ）タンパク質またはその生物学的に活性な及び／又は免疫学的に関連した部分をコードする核酸と、（ｂ）ａ）部の核酸に作動的に結合した異種プロモーターと、（ｃ）転写ターミネーターと、を含む遺伝子発現カセットの形態で少なくとも１つの遺伝子が挿入された複製欠損型アデノウイルスベクターを提供することである。
【００４１】
また、本発明の目的の１つは、該アデノウイルスベクターおよび／または該シャトルプラスミドベクターを含む宿主細胞；該ベクターを含むワクチン組成物；および（ａ）アデノウイルスＥ１タンパク質を発現する宿主細胞内に該アデノウイルスベクターを導入し、（ｂ）得られたアデノウイルスベクターを回収することを含む該ベクターの製造方法提供することである。本発明のもう１つの目的は、タンパク質に対する細胞性免疫応答を個体において生成させる方法であって、ａ）塩基対約１からと塩基対約３４２（より好ましくは４００）から約４５０まで（好ましくは１〜４５０）の間との野生型アデノウイルス・シス作用性アデノウイルスパッケージング領域および好ましくは野生型アデノウイルス配列の３５１１〜３５２３を含みＥ１において少なくとも部分的に欠失した複製欠損型アデノウイルベクター、ならびにｂ）（ｉ）タンパク質またはその生物学的に活性な及び／又は免疫学的に関連した部分をコードする核酸と、（ｉｉ）ａ）部の核酸に作動的に結合した異種プロモーターと、（ｉｉｉ）転写ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位と、を含む遺伝子発現カセットを含むアデノウイルスワクチンベクターを該個体に投与することを含んでなる方法を提供することである。
【００４２】
ワクチン投与法、すなわち、未感染個体に対する有効的な免疫予防またはＨＩＶ感染患者に対する治療的処置をもたらす本明細書に記載の１以上のアデノウイルスおよび／またはＤＮＡプラスミドワクチンの投与のための種々の代替手段を提供することが、本発明の目的の１つである。そのような方法は、多価ＨＩＶ−１ワクチン組成物、種々の組合せ様式の方法および種々の初回／追加抗原刺激代替手段を含むが、これらに限定されるものではない。ワクチン組成物および／または計画された投与に関するこれらの投与方法は、単一様式の方法での接種より一層強力な細胞性免疫応答を惹起する可能性を増大させるであろう。
【００４３】
本明細書および特許請求の範囲の全体にわたり、以下の定義および略語を用いる。
【００４４】
「ＨＡＡＲＴ」は、高度に活性な抗レトロウイルス療法を意味する。
【００４５】
「第１世代」ベクターは、複製欠損型であるとして特徴づけられる。それは、典型的には、欠失した又は不活性化されたＥ１遺伝子領域を有し、好ましくは、欠失した又は不活性化されたＥ３遺伝子領域をも有する。
【００４６】
「ＡＥＸ」は陰イオン交換クロマトグラフィーを意味する。
【００４７】
「ＱＰＡ」はＱｕｉｃｋ　ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ　Ｐｏｔｅｎｃｙ　Ａｓｓａｙを意味する。
【００４８】
「ｂｐ」は塩基対を意味する。
【００４９】
「ｓ」または「ｓｔｒ」は、該トランスジーンが「Ｅ１平行」または「直線的」配向で位置することを示す。
【００５０】
「ＰＢＭＣ」は末梢血単球細胞を意味する。
【００５１】
「ＦＬ」は完全長を意味する。
【００５２】
「ＦＬｇａｇ」は、図２に示すとおりの完全長最適化ｇａｇ遺伝子を意味する。
【００５３】
「Ａｄ５−Ｆｌｇａｇ」は、ＣＭＶプロモーターの制御下で完全長最適化ｇａｇ遺伝子を含む発現カセットを保持するアデノウイルス血清型５複製欠損型ウイルスを意味する。
【００５４】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼが結合するＤＮＡ鎖上の認識部位を意味する。該プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼとの開始複合体を形成して、転写活性を開始させ駆動する。該複合体は、「エンハンサー」のような配列を活性化することにより、あるいは「サイレンサー」のような配列を抑制することにより修飾されうる。
【００５５】
「リーダー」は、構造遺伝子の５’末端の、該遺伝子と共に転写されるＤＮＡ配列を意味する。これは、通常、プロ配列としばしば称されるＮ末端ペプチド伸長を有するタンパク質を与える。
【００５６】
「イントロン」は、遺伝子産物中のアミノ酸をコードしていない遺伝子の中間に見出されるＤＮＡの区分を意味する。該イントロンの前駆体ＲＮＡは切り出され、したがって、タンパク質に翻訳されないｍＲＮＡには転写されない。
【００５７】
「免疫学的に関連」または「生物学的に活性」は、（１）ウイルスタンパク質に関しては、該タンパク質が、投与されると、該ウイルスの増殖および／または広がりを遅延させるのに及び／又は個体内に存在するウイルス負荷を減少させるのに十分な個体内における測定可能な免疫応答を惹起する能力を有すること、または（２）ヌクレオチド配列に関しては、該配列が、前記の能力を有するタンパク質をコードしうることを意味する。
【００５８】
「カセット」なる語は、転写および翻訳制御配列を伴う、発現される核酸配列を意味する。該カセットを交換することにより、ベクターは異なる配列を発現しうる。
【００５９】
「ｂＧＨｐＡ」は、ウシ成長ホルモン転写ターミネーター／ポリアデニル化配列を意味する。
【００６０】
「ｔＰＡｇａｇ」は、ＤＮＡに基づくワクチンベクターの場合かアデノウイルスに基づくワクチンベクターの場合かに無関係に、図３０Ａ〜Ｂに例示されている組織プラスミノーゲンアクチベーターリーダー配列のリーダー配列と最適化ＨＩＶ　ｇａｇ遺伝子との融合体を意味する。
【００６１】
「ＩＡ」または「ｉｎａｃｔ」は、用いられている場合には、遺伝子の不活性化形態（例えば、ＩＡｐｏｌ）を意味する。
【００６２】
「ＭＣＳ」は「マルチクローニング部位」である。
【００６３】
一般に、アデノウイルス構築物、遺伝子構築物は、それらに含有される遺伝子を参照することにより命名される。
【００６４】
例えば、「Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇ」は、元のＨＩＶ−１　ｇａｇアデノウイルスベクターとも称され、ｈＣＭＶイントロンＡプロモーター、完全長形態のヒトコドン最適化ＨＩＶ−１　ｇａｇ遺伝子およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルから構成されるトランスジーンカセットを含有するベクターである。該トランスジーンは、Ｅ１およびＥ３欠失アデノベクター内にＥ１逆平行配向で挿入された。
【００６５】
「ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇ」は、「ＭＲＫＡｄ５ｇａｇ」または「Ａｄ５ｇａｇ２」とも称され、塩基対１〜４５０および３５１１〜３５２３を含みヒトコドン最適化ＨＩＶ−１遺伝子をイントロンＡ無しのＣＭＶプロモーターの制御下でＥ１平行配向で有しＥ１が欠失した本明細書に教示するアデノウイルスベクターである。該構築物はまた、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。
【００６６】
「ｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇ」は、「ＨＩＶＦＬｇａｇＰＲ９９０１」とも称され、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーターおよびイントロンＡ、完全長コドン最適化ＨＩＶ　ｇａｇ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化および転写終結配列ならびに最小ｐＵＣバックボーンを含むプラスミドである。
【００６７】
「ｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」は、完全長ＨＩＶ　ｇａｇ遺伝子を含みＣＭＶのイントロンＡ部分が欠失したｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇ由来のプラスミドである。このプラスミドは、「ｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」、「ｐＶ１Ｊｎｓ−ｈＣＭＶ−ＦＬ−ｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」および「ｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）＋ＦＬｇａｇ＋ｂＧＨｐＡ」と称される。
【００６８】
「ｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）−Ｆｌｇａｇ−ＳＰＡ」は、ｂＧＨｐＡ終結配列がＳＰＡ終結配列で置換されている以外はｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡと同じ組成のプラスミドである。このプラスミドは、「ｐＶ１Ｊｎｓ−ＨＩＶｇａｇ−ＳＰＡ」および「ｐＶ１Ｊｎｓ−ｈＣＭＶ−ＦＬｇａｇ−ＳＰＡ」とも称される。
【００６９】
「ｐｄｅｌＥ１ｓｐ１Ａ」は、発現カセットを有さない（すなわち、プロモーターもポリＡも有さない）普遍的シャトルベクターである。該ベクターは、ｂｐ１〜ｂｐ３４１およびｂｐ３５２４〜ｂｐ５７９８の野生型アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）配列を含み、３４１ｂｐで終結するＡｄ５配列と３５２４ｂｐで開始するＡｄ５配列との間にマルチクローニング部位を有する。このプラスミドは、元のＡｄ５シャトルベクターとも称される。「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１ｓｐ１Ａ」または「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ−４５０）」または「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）Ｃｌａ１」は、ｂｐ１〜ｂｐ４５０およびｂｐ３５１１〜ｂｐ５７９８の野生型アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）配列を含み発現カセットを有さない（すなわち、プロモーターもポリＡも有さない）普遍的シャトルベクターである。該ベクターは、４５０ｂｐで終結するＡｄ５配列と３５１１ｂｐで開始するＡｄ５配列との間にマルチクローニング部位を有する。このシャトルベクターを使用して、該ＣＭＶプロモーターおよび該ｂＧＨｐＡ断片を直線的（「ｓｔｒ」またはＥ１平行）配向または逆（ｏｐｐまたはＥ１逆平行）配向の両方で挿入することができる。
【００７０】
「ＭＲＫｐｄｅＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）」は、該ＣＭＶプロモーター（イントロンＡ無し）および該ｂＧＨｐＡ断片を含有する修飾されたベクターである更にもう１つのシャトルベクターである。唯一のＢｇｌＩＩ部位における選択された遺伝子の挿入が、ＭＲＫｐＡｄ５（Ｅ１−／Ｅ３＋）Ｃｌａ１前プラスミド内への挿入の場合に、該トランスジーンの転写の方向がＡｄ５　Ｅ１に平行となることを保証するよう、該ｈＣＭＶプロモーター（イントロンＡ無し）および該ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含有する発現単位が該シャトルベクター内に挿入されている。このシャトルベクターは、図２２および２３に示すとおり、それぞれのＩＡｐｏｌおよびＧ２Ａ、ＬＬＡＡ　ｎｅｆ遺伝子を直接挿入するするために使用された。
【００７１】
「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１−ＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」は、イントロンＡを伴わないヒトＣＭＶ、完全長ヒトコドン最適化ＨＩＶ　ｇａｇ遺伝子およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含有する発現カセットと共に塩基対１〜４５０および３５１１〜５７９８のＡｄ５配列を含むシャトルである。このプラスミドは、「ＭＲＫｐｄｅＥ１シャトル＋ｈＣＭＶ−ＦＬ−ｇａｇ−ＢＧＨｐＡ」とも称される。
【００７２】
「ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」は、Ｅ１領域を含むヌクレオチド以外のすべてのＡｄ５配列（４５１〜３５１０）、イントロン無しのヒトＣＭＶプロモーター、完全長ヒトコドン最適化ＨＩＶ　ｇａｇ遺伝子およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含むアデノウイルスベクターである。このベクターは、「ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ｈＣＭＶ−ＦＬ−ｇａｇ−ＢＧＨｐＡ」、「ＭＲＫｐＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇ」、「ＭＲＫｐＡｄ５ｇａｇ」、「ｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇ」または「ｐＡｄ５ｇａｇ２」とも称される。
【００７３】
「ｐＶ１Ｊｎｓ−ＨＩＶ−ｐｏｌ　ｉｎａｃｔ（ｏｐｔ）」または「ｐＶ１Ｊｎｓ−ＨＩＶ　ＩＡ　ｐｏｌ（ｏｐｔ）」は、Ｖ１ＪｎｓのＢｇｌＩＩ部位内にクローニングされた不活性化Ｐｏｌ遺伝子（配列番号３中に含有されている）である。本明細書に記載のとおり、ＨＩＶ−１　ｐｏｌの種々の誘導体を、Ｖ１ＪｎｓまたはＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡのようなプラスミド発現ベクター内にクローニングして、直接的にＤＮＡワクチン候補として又は適当なアデノウイルスベクター内へのサブクローニングのための起源として使用することができる。
【００７４】
「ＭＲＫｐｄｅｌ＋ｈＣＭＶｍｉｎ＋ＦＬ−ｐｏｌ＋ｂＧＨｐＡ（ｓ）」は、適切な配向でＩＡ　ｐｏｌ遺伝子を含有する前記の「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）」シャトルである。このシャトルベクターは、ＭＲＫｐＡｄ（Ｅ１−／Ｅ３＋）Ｃｌａ１との細菌組換えにおいて使用される。
【００７５】
本発明で「ｐＭＲＫＡｄ５ｐｏｌ」とも称される「ＭＲＫｐＡｄ＋ｈＣＭＶｍｉｎ＋ＦＬ−ｐｏｌ＋ｂＧＨｐＡ（Ｓ）Ｅ３＋」は、ＣＭＶ−ｐｏｌ　ｉｎａｃｔ（ｏｐｔ）−ｐＧＨｐＡ構築物を含む前アデノウイルスプラスミドである。この前アデノウイルスプラスミドの構築を図２２に示す。
【００７６】
「ｐＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）」または「Ｖ１Ｊｎｓ／ｏｐｔ　ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）」は、アミノ末端ミリスチル化部位における修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２）およびＡｌａ−１７４−Ａｌａ−１７５へのＬｅｕ−１７４−Ｌｅｕ−１７５ジロイシンモチーフの置換をオープンリーディングフレームがコードするコドン最適化ＨＩＶ−１　Ｎｅｆを含む（配列番号１３；これは、ヌクレオチド１２〜１４の開始メチオニン残基およびヌクレオチド６６０〜６６２の「ＴＡＡ」終結コドンを含む）。この断片をＶ１Ｊｎｓおよび／またはＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡのＢｇｌＩＩ部位内にサブクローニングする（図１６Ａ〜Ｂ）。ＨＩＶ−１　ｐｏｌに関して前記したとおり、ＨＩＶ−１　ｎｅｆ構築物は、Ｖ１ＪｎｓまたはＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡのようなプラスミド発現ベクター内にクローニングして、直接的にＤＮＡワクチン候補として又は適当なアデノウイルスベクター内へのサブクローニングのための起源として使用することができる。
【００７７】
本発明で「ｐＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ」とも称される「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１ｈＣＭＶｍｉｎＦＬ−ｎｅｆＢＧＨｐＡ（ｓ）」は、ＣＭＶ−ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）コドン最適化配列を含む前アデノウイルスプラスミドである。この前アデノウイルスプラスミドの構築を図２３に示す。
【００７８】
（図面の簡単な記載）
図１は、元のＨＩＶ−１　ｇａｇアデノベクター（Ａｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇ）を示す。このベクターは、１９９９年７月６日付け出願の米国仮特許出願第６０／１４２，６３１号および１９９９年８月１３日付けの米国特許出願第６０／１４８，９８１号に基づいて優先権を主張している２０００年７月３日付け出願のＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／１８３３２（ＷＯ０１／０２６０７）に開示されており、これらの３つの出願をすべて、参照により本明細書に組み入れることとする。
【００７９】
図２は、該最適化ヒトＨＩＶ−１　ｇａｇオープンリーディングフレームの核酸配列（配列番号２９）を示す。
【００８０】
図３は、元のｇａｇトランスジーンと比較して新規トランスジーン構築物を図示する。
【００８１】
図４は、本発明の新規ベクターの作製において元のアデノベクターバックボーンに施された修飾を示す。
【００８２】
図５は、該パッケージングシグナル領域に対して施された付加（実験＃１）およびウイルス増殖に対するＥ３遺伝子（実験２）の効果を判定するために行ったウイルス混合実験を示す。棒線は、該Ｅ１欠失に対して施された修飾の領域を示す。
【００８３】
図６は、実施例６および７に記載するウイルス混合実験後のウイルスＤＮＡ分析のオートラジオグラフを示す。
【００８４】
図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは以下のとおりである。図７Ａは、ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３およびＭＲＫｐＡｄＨＶＯアデノベクターバックボーン内に構築されたｈＣＭＶ−Ｆｌｇａｇ−ｂＧＨｐＡアデノベクターを示す。Ｅ１平行およびＥ１逆平行のトランスジーン配向が示されている。図７Ｂは、ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３およびＭＲＫｐＡｄＨＶＯアデノベクターバックボーン内に構築されたｈＣＭＶ−Ｆｌｇａｇ−ＳＰＡアデノベクターを示す。この場合もまた、Ｅ１平行およびＥ１逆平行の両方のトランスジーン配向が示されている。図７Ｃは、ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３およびＭＲＫｐＡｄＨＶＯアデノベクターバックボーン内に構築されたｍＣＭＶ−Ｆｌｇａｇ−ｂＧＨｐＡアデノベクターを示す。この場合もまた、Ｅ１平行およびＥ１逆平行の両方のトランスジーン配向が示されている。
【００８５】
図８Ａは、トランスジーン配向の効果を試験するよう意図された実験を示す。図８Ｂは、ポリアデニル化シグナルの効果を試験するよう意図された実験を示す。
【００８６】
図９は、ＢｓｔＥ１１消化後のＰ５における試験された４つのアデノウイルスベクターからのウイルスＤＮＡ（実施例１２）を示す。
【００８７】
図１０は、ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３、ＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇおよびＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇＥ３−の継代１１および１２のウイルスＤＮＡ分析を示す。
【００８８】
図１１は、ウイルス競合研究を開始するために使用した継代６のＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３およびＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇのウイルスＤＮＡ分析（ＨｉｎｄＩＩＩ消化）を示す。最後の２つのレーンは、該競合研究の二重継代の継代１１分析である（各ウイルスは２８０ウイルス粒子のＭＯＩである）。
【００８９】
図１２は、特定された時点で回収が行われた血清含有培地中のＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇに関する高継代数上のＨｉｎｄＩＩＩ消化によるウイルスＤＮＡ分析を示す。第１レーンは１ｋｂ　ＤＮＡサイズマーカーを示す。その他のレーンは、前プラスミド対照（Ｐａｃ１およびＨｉｎｄＩＩＩで消化されたもの）、Ｐ１６、Ｐ１９およびＰ２１におけるＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇを示す。
【００９０】
図１３は、種々の用量のいくつかのＡｄｇａｇ構築物でｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝１０）をｉ．ｍ．免疫した３週間後の血清抗ｐ２４レベルを示す：（Ａ）ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇ（継代５）、（Ｂ）ＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶ−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ（Ｅ３−）、（Ｃ）ＭＲＫＡｄ５　ｈＣＭＶ−ＦＬｇａｇ−ＳＰＡ（Ｅ３＋）、（Ｄ）ＭＲＫＡｄ５　ｍＣＭＶ−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ（Ｅ３＋）、（Ｅ）Ａｄ５ＨＩＶ−１　ｇａｇの研究ロット（２９３細胞由来）、および（Ｆ）Ａｄ５ＨＩＶ−１　ｇａｇの臨床ロット（Ａｄ５ｇａｇＦＮ０００１）。示されているのは、各コホートの幾何平均力価（ＧＭＴ）および標準誤差線である。
【００９１】
図１４は、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｇａｇベクターの制限地図を示す。
【００９２】
図１５Ａ〜Ｘは、ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【００９３】
図１６Ａ〜Ｂは、ＤＮＡワクチン発現ベクターＶ１Ｊｎｓ（Ａ）およびＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ（Ｂ）の概要図を示す。これらは、本明細書に記載の種々のＤＮＡ／ウイルスベクター組合せ様式法におけるＨＩＶ−１　ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ構築物に使用される。
【００９４】
図１７Ａ〜Ｃは、ＩＡ−Ｐｏｌのヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。下線付きのコドンおよびアミノ酸は、表１に列挙された突然変異を示す。
【００９５】
図１８は、ｔＰＡ−ｐｏｌ　ｉｎａｃｔ（ｏｐｔ）の融合結合部にわたるコドン最適化ヌクレオチドおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号７および８中に含有される）を示す。下線付き部分はＩＡ−ＰｏｌのＮＨ２末端領域を示す。
【００９６】
図１９Ａ〜Ｂは、野生型ｎｅｆ（ｊｒｆｌ）とコドン最適化ｎｅｆとのヌクレオチド配列比較を示す。該ｊｒｆｌ分離体からの野生型ｎｅｆ遺伝子は、２１６アミノ酸のポリペプチドをコードしうる６４８ヌクレオチドよりなる。ＷＴ，野生型配列（配列番号１９）；ｏｐｔ，コドン最適化配列（配列番号１中に含有されている）。Ｎｅｆアミノ酸配列は１文字記号で示されている（配列番号２）。
【００９７】
図２０Ａ〜Ｃは、ｎｅｆ発現ベクターＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（図２０Ａ）、Ｖ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）（図２０Ｂ）、Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（図２０Ｃ）およびＶ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）（同様に図２０Ｃ）のプラスミドバックボーンとｎｅｆコード配列との間の結合部のヌクレオチド配列を示す。コドン最適化ｎｅｆまたはコドン最適化ｎｅｆ突然変異遺伝子の５’および３’フランキング配列が太字／イタリック体で示されており、ｎｅｆおよびｎｅｆ突然変異体コード配列が無修飾文字で示されている。また（下線付きで）、それぞれのｎｅｆ発現ベクターの構築に関わる制限エンドヌクレアーゼ部位が示されている。Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆおよびＶ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）は該結合部位に同一配列を有する。
【００９８】
図２１は、ｎｅｆおよびｎｅｆ誘導体の概要図を示す。Ｎｅｆ誘導体に含まれるアミノ酸残基が示されている。グリシン２ならびにロイシン１７４および１７５は、それぞれミリスチル化およびジロイシンモチーフに関わる部位である。該ｔｐａｎｅｆ融合遺伝子の両形態に関して、推定リーダーペプチド切断部位は「＊」で示されており、該突然変異の構築中に導入された外因性セリン残基は下線で示されている。
【００９９】
図２２は、前アデノウイルスプラスミド構築物ＭＲＫＡｄ５Ｐｏｌの構築の概要図を示す。
【０１００】
図２３は、前アデノウイルスプラスミド構築物ＭＲＫＡｄ５Ｎｅｆの構築の概要図を示す。
【０１０１】
図２４は、クレードＢ　ＨＩＶ感染個体におけるクレードＢとクレードＣとの抗ｇａｇ　Ｔ細胞応答の比較を示す。
【０１０２】
図２５は、クレードＢ　ＨＩＶ感染個体におけるクレードＢとクレードＣとの抗ｎｅｆ　Ｔ細胞応答の比較を示す。
【０１０３】
図２６Ａ〜ＡＯは、不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【０１０４】
図２７Ａ〜ＡＭは、不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【０１０５】
図２８は、Ｅ３（＋）またはＥ３（−）バックボーン中に種々のプロモーター断片（ｈＣＭＶまたはｍＣＭＶ）および終結シグナル（ｂＧＨまたはＳＰＡ）を含むＭＲＫＡｄ５ベクターの安定性を示す。
【０１０６】
図２９ＡおよびＢは、２４、３６、４８および６０ｈｐｉの時点における凍結融解回収細胞結合ウイルスの陰イオン交換ＨＰＬＣウイルス粒子濃度（図２９Ａ）、ならびにＭＲＫＡｄ５ｇａｇ、ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌおよびＭＲＫＡ５ｎｅｆに関する経時的ＱＰＡ上清力価（図２９Ｂ）を示す。
【０１０７】
図３０は、本明細書に開示するＤＮＡおよび／またはアデノウイルスワクチンにおいて使用する代表的なｔＰＡ−ｇａｇ融合体のオープンリーディングフレームをオープンリーディングフレーム含むヌクレオチド配列（配列番号３６）およびアミノ酸配列（配列番号３７）を示す。
【０１０８】
図３１は、第１０週（ＤＮＡ初回抗原刺激後）および第３０週（Ａｄ追加抗原刺激後）に集めたＰＢＭＣの細胞内γＩＦＮ染色を示す。該細胞は、該ｇａｇペプチドプールの存在下または不存在下で一晩にわたり刺激した。ついで、蛍光標識抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、抗ＣＤ４および抗γＩＦＮモノクローナル抗体を使用して、それらを染色した。各プロットは、表面ＣＤ８およびγＩＦＮ産生についての陽性染色に関して分離された全ＣＤ３＋Ｔ細胞を示す。各プロットの右上および右下の四分域中の数字は、それぞれＣＤ８＋γＩＦＮ＋およびＣＤ４＋γＩＦＮ＋であったＣＤ３＋細胞の割合（％）である。
【０１０９】
図３２は、単一様式アデノウイルス免疫とＤＮＡ＋アジュバント初回／アデノウイルス追加免疫との比較を示す。
【０１１０】
図３３Ａ〜Ｂは、実施例２９のｇａｇ−ＩＡｐｏｌ融合体のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す。
【０１１１】
図３４Ａ〜Ｂは、該ｇａｇ−ＩＡｐｏｌ融合フレームのタンパク質配列（配列番号３９）を示す。
【０１１２】
（発明の詳細な記載）
遺伝子治療における又はヌクレオチドに基づくワクチンベクターにおける使用に適した新規複製欠損型または「第１世代」アデノウイルスベクターを記載する。このベクターは、Ｅ１において少なくとも部分的に欠失しており、野生型アデノウイルス配列の塩基対約１からと塩基対約３４２（より好ましくは４００）〜塩基対約４５８までの間との野生型アデノウイルス・シス作用性パッケージング領域（好ましくは１〜４５０）および好ましくは塩基対３５１１〜３５２３を含む。この記載のベクターは、約５〜１０倍大きな増幅速度を伴う増強された増殖特性を有し、より強力であり、より低いウイルス用量で同等の免疫生成を可能にすることが判明している。該ベクターは更に、この領域（塩基対３４２〜４５０）を含まない複製欠損型ベクターより大きな細胞性免疫応答を示す回収された組換えアデノウイルスを与える。さらに、これらのベクターに由来するアデノウイルス構築物、特に、イントロンＡを欠くｈＣＭＶプロモーターの制御下でトランスジーンを含むものは、遺伝的に非常に安定である。ここに記載のウイルスを連続的に継代し、分析した。実施例１２を参照されたい。分析した各ウイルスは、適切な遺伝的構造でそれを維持した。また、大規模生産での実施と同様の増殖条件下で分析を行った。この場合もまた、該ベクターは、増強した遺伝的安定性を有することが判明した。実施例１２を参照されたい。継代２１の後、該ウイルスＤＮＡは再構成の証拠を示さず、１つの製造ロットから次の製造ロットに高度に再生可能であった。すべての関連試験の結果は、図２８に関連したデータで本明細書中に示されるとおり、該アデノウイルスベクターが組換え複製欠損型アデノウイルスの大規模生産に非常に良く適合することを示している。
【０１１３】
この記載の好ましいアデノウイルスベクターは、Ｅ３において欠失しており塩基対１〜４５０を含むベクターである。このベクターは、約７，５００塩基対までの外来ＤＮＡインサート（または外因性遺伝物質）を収容しうる。もう１つの好ましいベクターは、塩基対１〜４５０を含むＥ３を保有するベクターである。この記載の好ましいベクターは、塩基対１〜４５０および３５１１〜３５２３を含むＥ３＋ベクターである。このベクターは、塩基対４５１〜３５１０に及ぶ領域が欠失している場合には、約４，８５０塩基対までの外来ＤＮＡインサート（または外因性遺伝物質）を収容しうる。前記ベクターのクローニング容量は、ゲノムサイズの上限として１０５％の野生型Ａｄ５配列を使用して測定されている。
【０１１４】
野生型アデノウイルス血清型５は、本明細書の全体にわたり記載されている特定の塩基対番号の基準として用いられる。野生型アデノウイルス血清型５配列は公知であり、当技術分野において記載されている。参照により本明細書に組み入れるＣｈｒｏｂｏｃｚｅｋら，１９９２　Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８６：２８０を参照されたい。したがって、本発明の特定の実施形態は、アデノウイルス血清型５配列に基づくベクターである。当業者は、他のアデノウイルス血清型（例えば、血清型２、４、６、１２、１６、１７、２４、３１、３３および４２）における前記領域、アデノウイルス血清型５に関して与えられた前記塩基対位置に対応する塩基対により定められる領域を容易に同定することが可能である。したがって、本発明は、野生型アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）核酸配列の１〜４５０（特に、３４２〜４５０）に対応する塩基対および好ましくは３５１１〜３５２３を含みＥ１において部分的に欠失したすべてのアデノウイルスベクターを含む。本発明の特に好ましい実施形態は、亜群Ｃに分類されるＡｄ５に類似したアデノウイルス（例えば、Ａｄ２）に由来するものである。
【０１１５】
本発明のベクターは、Ｅ１において少なくとも部分的に欠失している。好ましくは、該Ｅ１領域は、完全に欠失しているか又は不活性化されている。最も好ましくは、Ｅ１が欠失した領域は塩基対４５１〜３５１０内に存在する。開示しているベクターの伸長５’および３’領域が、使用する細胞系、すなわち、塩基対４５９〜３５１０でトランスフェクトされたＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系内に存在するＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ遺伝子のいずれの部分とも重複することなく従来の構築物のＥ１欠失のサイズを有効に減少させると考えられることは注目すべきことである。アデノウイルス配列の重複が避けられるのは、組換えの可能性によるものである。したがって、疑いなく、当業者は、異なるアデノウイルスＤＮＡセグメントでトランスフェクトされた異なる細胞系を使用する場合には本発明を修飾しうると理解することが可能である。例示目的で挙げると、塩基対４５０〜３５１０のアデノウイルス配列で細胞系をトランスフェクトする場合には、塩基対１から４４９までの５’領域が、より適切である。このことは、該Ｅ１欠失の３’側のセグメントを考える場合にも当てはまる。
【０１１６】
本発明の好ましい実施形態は、無傷Ｅ３領域（すなわち、機能的Ｅ３をコードしうるＥ３遺伝子）を有する。別の実施形態は、部分的に欠失したＥ３、不活性化されたＥ３領域、またはＥ３が完全に欠失した配列を有する。本出願人は、本発明において、該Ｅ３遺伝子を含むウイルスが、Ｅ３遺伝子を含まないウイルスより迅速に増幅しうることを見出した。図６を参照されたい。この図においては、試験したＥ３＋ウイルスに対応する特徴的ＣｓＣｌバンド（５，６６５ｂｐ）が、Ｅ３−ウイルスに対応する３，０１０ｂｐの特徴的バンドより大量に存在した。これらの結果は、Ｅ３遺伝子を含むアデノベクターおよびＥ３遺伝子を含まないアデノベクターの両方を等しいＭＯＩ比（１：１）で混合することを含むウイルス競合研究の後で得られた。ついで増殖研究で、このＥ３＋アデノベクターの増幅能の増加が確認された。表４Ａを参照されたい。この表においては、Ｅ３−構築物は１１５および４０〜５０の増殖率を示しているのに対して、Ｅ３＋ウイルスは４７０、４２０および３２０の増幅率を示している。
【０１１７】
前記のとおり、本発明のベクターは、Ｅ３＋ベクターに関しては約４，８５０塩基対までの外因性遺伝物質を、そしてＥ３−ベクターに関しては約７，５００塩基対を収容しうる。好ましくは、該インサートは、該アデノウイルスベクターを、野生型ゲノムサイズ（例えば、Ａｄ５の場合、３５，９３５塩基対）に可能な限り近づける。アデノウイルスは、それがその野生型ゲノムサイズに近い場合に最も良く増幅することが良く知られている。
【０１１８】
図７Ａ、７Ｂおよび図８Ａに例示されているとおり、該遺伝物質はＥ１平行またはＥ１逆平行配向で挿入することができる。本発明の特に好ましい実施形態は、Ｅ１平行配向で該インサートを有する。本出願人は、異なる配向でトランスジーンを含有するプラスミドとの競合実験により（図８Ａ）、該外来ＤＮＡインサートをＥ１平行配向で有するベクター構築物が、Ｅ１逆平行配向トランスジーンより良く増幅し、競合において実際にそれを凌ぐことを見出した。継代３において、そしてもちろん継代６においても、該混合物のウイルスＤＮＡ分析は、Ｅ１平行配向で該トランスジーンを保持するウイルスの、Ｅ１逆平行形態より大きな比率を示した。継代１０までは、観察される唯一のウイルス種は、試験した両方のトランスジーンに関してＥ１平行配向で該トランスジーンを有するアデノベクターであった。
【０１１９】
本発明のアデノウイルスベクターは、所望のタンパク質（その一例は、ＨＩＶタンパク質、特にＨＩＶ完全長ｇａｇタンパク質である）の発現の達成に特に良く適合する。関心のあるタンパク質をコードする外因性遺伝物質は発現カセットの形態で存在しうる。遺伝子発現カセットは、好ましくは、（ａ）関心のあるタンパク質をコードする核酸、（ｂ）該タンパク質をコードする核酸に作動的に結合した異種プロモーター、および（ｃ）転写ターミネーターを含む。
【０１２０】
該転写プロモーターは、好ましくは、真核性ＲＮＡポリメラーゼにより認識される。好ましい実施形態においては、該プロモーターは「強力」または「効率的」なプロモーターである。強力なプロモーターの一例は、好ましくはイントロン配列を伴わない、最初期ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（参照により本明細書に組み入れるＣｈａｐｍａｎら，１９９１　Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　１９：３９７９−３９８６）である。本アデノウイルスベクターにおける使用に最も好ましいのは、イントロンＡのようなイントロン配列を伴わないヒトＣＭＶプロモーターである。本出願人は、イントロンＡ（ヒトサイトメガロウイルスプロモーター（ｈＣＭＶ）の一部である）がアデノウイルスベクターの不安定性の領域を構成することを見出した。イントロンＡを伴わないＣＭＶは、ＨＩＶ　ｇａｇ発現の駆動に際して、比較しうるインビトロ発現能をもたらすことが判明しており（実施例１〜３）、さらには、試験したプラスミドＤＮＡの両方の投与量（２０μｇおよび２００μｇ）で、それらの抗体およびＴ細胞応答に関して、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいてインビボでイントロンＡ含有構築物と同等に挙動した。当業者は、多数の他の公知プロモーターのいずれか、例えば強力な免疫グロブリンまたは他の真核性遺伝子プロモーター、例えばＥＦ１αプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＳＶ４０初期／後期プロモーターおよびβアクチンプロモーターを使用することが可能であると理解するであろう。
【０１２１】
好ましい実施形態においては、該プロモーターはまた、Ｔｅｔオペレーター配列のような調節可能な配列を含みうる。これは、例えば、望まない結果を遺伝子産物がもたらしており抑制が求められる場合に非常に有用であろう。
【０１２２】
該遺伝子配列カセット内に存在する好ましい転写終結配列としては、ウシ成長ホルモンターミネーター／ポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡ）および以下のとおりに定められる５０ヌクレオチド長の短い合成ポリＡシグナル（ＳＰＡ）がが挙げられる：ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ（配列番号２６）。
【０１２３】
該ＣＭＶプロモーター（イントロンＡ領域を欠くもの）とＢＧＨターミネーターとの組合せが特に好ましいが、ＦＧアデノウイルスの場合における他のプロモーター／ターミネーターの組合せも用いることができる。
【０１２４】
他の実施形態は、リーダーまたはシグナルペプチドを該トランスジーン内に組込むものである。好ましいリーダーは、組織特異的プラスミノーゲンアクチベータータンパク質ｔＰＡ由来のものである。具体例には、本明細書の全体にわたり開示されている種々のｔＰＡ−ｇａｇ、ｔＰＡ−ｐｏｌおよびｔＰＡ−ｎｅｆアデノウイルスに基づくワクチンが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２５】
本明細書に記載の改善されたアデノウイルスベクターを考慮すると、本発明の必須部分は、予防的または治療的状況において哺乳類宿主、好ましくはヒト宿主に投与されうる、前記アデノウイルスバックボーンを含む、アデノウイルスに基づくＨＩＶワクチンである。本発明のＨＩＶワクチンは、単独で投与されるか他のウイルスまたは非ウイルスに基づくＤＮＡワクチンとの組合せ法で投与されるかにかかわらず、ＨＩＶに対して強力かつ広域な細胞性免疫応答を惹起するはずであり、これは、持続的ウイルス感染の可能性を減少させ及び／又はＨＩＶ感染を受ける臨床的に有意な低下したウイルス負荷の確立を招くか、あるいはＨＡＡＲＴ療法と組合せて、既に確立されたＨＩＶ感染の影響を軽減するであろう（抗ウイルス免疫療法（ＡＲＩ））。本明細書に記載の組換えアデノウイルスベクターにおいては任意のＨＩＶ抗原（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｎｅｆ、ｇｐ１６０、ｇｐ４１、ｇｐ１２０、ｔａｔ、ｒｅｖなど）を使用することが可能であるが、好ましい実施形態には、コドン最適化ｐ５５　ｇａｇ抗原（本発明ではＭＲＫＡｄ５ｇａｇ）、ｐｏｌおよびｎｅｆが含まれる。ＨＩＶ−１の種々のクレードに基づく配列が本発明での使用に適しており、それらのうちで最も好ましいのはクレードＢおよびクレードＣである。特に好ましい実施形態は、コンセンサス・クレードＢ配列に基づく配列（特に、コドン最適化配列）である。一連のＭＲＫＡｄ５ｐｏｌおよびＭＲＫＡｄ５ｎｅｆのアデノウイルスワクチンの好ましい形態は、本明細書に記載のｐｏｌまたはｎｅｆの修飾形態をコードする。ＨＩＶエンベロープ遺伝子およびその修飾体を保持するＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ベクターの好ましい実施形態は、それぞれ１９９７年８月２８日（ＷＯ　９７／３１１１５）および１９９７年１２月２４日付けで公開されたＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／０２２９４およびＰＣＴ／ＵＳ９７／１０５１７（それらの両方の文書を参照により本明細書に組み入れることとする）のＨＩＶコドン最適化ｅｎｖ配列を含む。
【０１２６】
本発明の最も好ましい態様は、ＨＩＶ　ｇａｇの発現を達成するための前記のアデノウイルスベクターの開示されている使用である。多数のＨＩＶ株の多数の遺伝子の配列がＧＥＮＢＡＮＫにおいて公に入手可能であり、主として、ＨＩＶの野外分離体は、これらの株を入手可能にするようＱｕａｌｉｔｙ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）に委託しているＮａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｌｌｅｒｇｙ　ａｎｄ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ（ＮＩＡＩＤ）から入手可能である。また、株は、Ｗｏｒｌｄ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ（ＷＨＯ），Ｇｅｎｅｖａ　Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄからも入手可能である。該ｇａｇ遺伝子はＨＩＶ−１株由来であることが好ましい（ＣＡＭ−１；Ｍｙｅｒｓら編　“Ｈｕｍａｎ　Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　ＡＩＤＳ：１９９５，ＩＩＡ３−ＩＩＡ１９（これを参照により本明細書に組み入れることとする））。この遺伝子は、クレードＢ（北米／欧州）配列のコンセンサスアミノ酸配列に酷似している。したがって、特異的ＨＩＶ　ｇａｇまたはその免疫学的に関連した部分をコードする適当なヌクレオチド配列を選択することは当業者の認識範囲内である。実施例２５に示すとおり、クレードＢまたはクレードＣに基づくｐ５５　ｇａｇ抗原は地球的規模で潜在的に有用であろう。本明細書に記載のとおり、本発明のＤＮＡまたはＭＲＫＡｄに基づくアデノウイルスベクター内への挿入のために選択されるトランスジーンは、ｐ５５　ｇａｇのコドン最適化形態である。そのようなＭＲＫＡｄ５ｇａｇアデノウイルスベクターは実施例１１に記載されており、少なくとも本発明においてはＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇと称される。もちろん、追加的な形態も意図され、それらには、プロモーター（例えば、ｈＣＭＶの代わりにｍＣＭＶ）および／またはｐＡ終結シグナル（ｂＧＨの代わりにＳＰＡ）の置換のような修飾、ならびにＡｄ５Ｅ３遺伝子の欠失を伴う又は伴わないＭＲＫＡｄ５バックボーンの作製が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１２７】
本発明はまた、マウスおよび非ヒト霊長類での研究における投与後に細胞性免疫応答を生成することが本発明において示された一連のＭＲＫＡｄ５ｐｏｌに基づくアデノウイルスワクチンに関する。一連のＭＲＫＡｄ５ｐｏｌのいくつかは本明細書中に例示されている。１つのそのようなアデノウイルスベクターはＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶ−ｉｎａｃｔ　ｏｐｔ　ｐｏｌ（Ｅ３＋）と称され、これは、ＭＲＫＡｄ５バックボーン、ｈＣＭＶプロモーター（イントロンＡを有さない）、不活性化ｐｏｌトランスジーンを含み、該アデノウイルスバックボーン中にＡｄ５　Ｅ３遺伝子を含有する。第２の例示されている前アデノウイルスプラスミドおよび付随ウイルスはＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶ−ｉｎａｃｔ　ｏｐｔ　ｐｏｌ（Ｅ３−）と称され、これは、該Ｅ３が欠失している以外は前記アデノウイルスベクターと同一である。どちらの構築物もＨＩＶ−１　Ｐｏｌのコドン最適化不活性化形態を含有し、ここで、少なくとも全コード領域は本発明では配列番号３として開示されており、該発現タンパク質は配列番号４として示される（不活性化ｐｏｌの標的化欠失を示す図１７Ａ〜Ｃおよび表１も参照されたい）。本明細書に記載のＨＩＶ　Ｐｏｌのこの及び他の好ましいコドン最適化形態は、実質的には、２０００年１２月２１日付け出願の米国特許出願第０９／７４５，２２１号および同様に２０００年１２月２１日付け出願のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４７２４（それらの両方の文書を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載のとおりである。前記文書に開示されているとおり、これらのコドン最適化ＨＩＶ−１　Ｐｏｌに基づくＤＮＡワクチンのオープンリーディングフレームは、コドン最適化ＨＩＶ−１　Ｐｏｌ（例えば、配列番号２）、アミノ末端局在化リーダー配列に融合したコドン最適化ＨＩＶ−１　Ｐｏｌ（例えば、配列番号６）および特に好ましくは、例えば実施例１９におけるＭＲＫＡｄ５−Ｐｏｌ構築物により具体的に示された、野生型Ｐｏｌに関連した有意なＰＲ、ＲＴ、ＲＮアーゼまたはＩＮ活性を欠く生物学的に不活性化されたｐｏｌ（「ｉｎａｃｔ　ｏｐｔ　Ｐｏｌ」；例えば配列番号４）により例示される。また、ＩＡ　Ｐｏｌタンパク質のアミノ末端領域にリーダーペプチドを含有する配列番号４に関連した構築物が意図される。機能的リーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列を伴って又は伴わないでそれぞれのＨＩＶ−１　Ｐｏｌコード領域に作動的に結合した調節領域を含有する適当なＤＮＡプラスミドベクター内に、特定の構築物を連結する。この目的において、本明細書に開示する種々のＨＩＶ−１　Ｐｏｌ構築物は、野生型Ｐｏｌ（配列番号２に記載のとおりＷＴ　ｏｐｔ　ＰｏｌをコードするＤＮＡ分子を含む）、ｔＰＡ−ｏｐｔ　ＷＴＰｏｌ（配列番号６に記載のとおりｔＰＡ　ＰｏｌをコードするＤＮＡ分子を含む）、ｉｎａｃｔ　ｏｐｔ　Ｐｏｌ（配列番号４に記載のとおりＩＡ　ＰｏｌをコードするＤＮＡ分子を含む）およびｔＰＡ−ｉｎａｃｔ　ｏｐｔ　Ｐｏｌ（配列番号８に記載のとおりｔＰＡ−ｉｎａｃｔ　ｏｐｔ　ＰｏｌをコードするＤＮＡ分子を含む）を含む（これらに限定されるものではない）本発明の増強された第１世代Ａｄベクター（例えば、一連のＭＲＫＡｄ５ｐｏｌアデノウイルスワクチンベクター）にクローニングするためのオープンリーディングフレームに関する。ｐｏｌに基づく形態の増強された第１世代アデノウイルスワクチンは、霊長類、特にヒトを含む宿主に投与されると、ＣＴＬおよびＴｈ細胞性免疫応答を惹起する。前記のとおり、本発明の細胞性免疫誘導性ワクチンの効果は、これまでに未感染の個体に対する、より低い伝達率、および／またはＨＩＶ−１感染の無症候期を延長するような感染個体内のウイルス負荷のレベルの減少にあるはずである。
【０１２８】
本発明は更に、ＨＩＶ　ｇａｇおよびｐｏｌ抗原と同様に、マウスおよび非ヒト霊長類での研究において投与された後に細胞性免疫応答を生成する一連のＭＲＫＡｄ５ｎｅｆに基づくアデノウイルスワクチンに関する。その一連のＭＲＫＡｄ５ｎｅｆは、本発明では、ＨＩＶ　ｎｅｆの修飾形態と組合せて、改善されたＭＲＫアデノウイルスバックボーンを使用することにより例示される。これらの例示されているＭＲＫＡｄ５ｎｅｆベクターは以下のとおりである：（１）改善されたＭＲＫＡｄ５バックボーン、ヒトＣＭＶプロモーター、無傷Ａｄ５　Ｅ３遺伝子および修飾されたｎｅｆ遺伝子を含むＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶ−ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）（Ｅ３＋）；（２）ヒトＣＭＶプロモーターがマウスＣＭＶプロモーターで置換されている以外は前記（１）と同じであるＭＲＫＡｄ５ｍＣＭＶ−ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）（Ｅ３＋）；および（３）該ｎｅｆトランスジーンがｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）である以外は（２）と同じであるＭＲＫＡｄ５ｍＣＭＶ−ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）（Ｅ３＋）。ＨＩＶ−１　ＮｅｆおよびＨＩＶ−１　Ｎｅｆ修飾体のコドン最適化形態は、実質的には、２０００年１２月１５日付け出願の米国特許出願第０９／７３８，７８２号および同様に２０００年１２月１５日付け出願のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１６２（両方の文書を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載のとおりである。コドン最適化ＮｅｆおよびＮｅｆ修飾体の特定の実施形態は、ＨＩＶ−１　ｊｆｒｌ分離体からのＨＩＶ−１　ＮｅｆをコードするＤＮＡ分子に関する。この場合、該コドンは、ヒトのような哺乳類系内での発現に関して最適化されている。このタンパク質をコードするＤＮＡ分子は本発明では配列番号９として開示されており、発現されるオープンリーディングフレームは本発明では配列番号１０として開示されている。本発明のアデノウイルスベクターにおける使用のためのＮｅｆに基づくコード領域のもう１つの実施形態は、該ＨＩＶ−１　ＮｅｆポリペプチドのＮＨ２末端に融合したヒトプラスミノーゲンアクチベーター（ｔｐａ）リーダーペプチドを含有するタンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ分子を含む。このタンパク質をコードするＤＮＡ分子は本発明では配列番号１１として開示されており、発現されるオープンリーディングフレームは本発明では配列番号１２として開示されている。もう１つの修飾されたＮｅｆ最適化コード領域は、最適化ＨＩＶ−１　ＮｅｆをコードするＤＮＡ分子に関する。この場合、該オープンリーディングフレームは、アミノ末端ミリスチル化部位における修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２）、およびＬｅｕ−１７４−Ｌｅｕ−１７５ジロイシンモチーフからＡｌａ−１７４−Ａｌａ−１７５への置換をコードする（本発明ではｏｐｔ　ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）として記載されている）。このタンパク質をコードするＤＮＡ分子は本発明では配列番号１３として開示されており、発現されるオープンリーディングフレームは本発明では配列番号１４として開示されている。ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆベクターである（１）ＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶ−ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）（Ｅ３＋）および（２）ＭＲＫＡｄ５ｍＣＭＶ−ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）（Ｅ３＋）はこのトランスジーンを含有する。更なる実施形態は、最適化ＨＩＶ−１　ＮｅｆをコードするＤＮＡ分子に関する。この場合、アミノ末端ミリスチル化部位およびジロイシンモチーフが欠失しており、ｔＰＡリーダーペプチドを含む。このＤＮＡ分子ｏｐｔ　ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）は、ＨＩＶ−１　Ｎｅｆ（ｊｆｒｌ）のアミノ酸残基６−２１６に融合したｔＰＡリーダー配列を含有するＮｅｆタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで、Ｌｅｕ−１７４およびＬｅｕ−１７５はＡｌａ−１７４およびＡｌａ−１７５で置換されており、これは本発明ではｏｐｔ　ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）と称され、本発明では配列番号１５として開示されており、発現されるオープンリーディングフレームは本発明では配列番号１６として開示されている。ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆベクター「ＭＲＫＡｄ５ｍＣＭＶ−ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）（Ｅ３＋）」はこのトランスジーンを含有する。
【０１２９】
本明細書に記載の改善されたＭＲＫＡ５ｇａｇアデノウイルスワクチンベクターに加えて、ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌおよびＭＲＫＡｄ５ｎｅｆアデノウイルスベクターの作製は、増強したＨＩＶワクチン能力をもたらす。すなわち、このトリオのアデノウイルスワクチンベクターの作製はすべて、宿主投与後に有効な細胞性免疫応答を生成することが示されており、これらのワクチン候補を、単独で投与する可能性だけでなく、好ましくは、二価（すなわち、ｇａｇおよびｎｅｆ、ｇａｇおよびｐｏｌ、またはｐｏｌおよびｎｅｆ成分）または三価ワクチン（すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ成分）の一部として投与する可能性をも与える。したがって、本発明の好ましい態様はワクチン製剤、ならびに投与およびそれに付随する３つの異なる一連のＭＲＫＡｄ５に基づくアデノウイルスベクターワクチンの製剤化に関連した宿主細胞性免疫応答の生成の関連方法である。もちろん、異なるＨＩＶ抗原に基づくこの一連のＭＲＫＡｄ５ワクチンは、二価または三価ワクチンの製剤化の機会、あるいは恐らくは、合理的な時間枠内の１以上の一価または二価製剤の別々の製剤の投与の機会の拡大を促進する。また、特異的抗原由来の複数であるが異なる成分を含む組合せ様式法を開始することも、本発明の範囲内である。決して限定的ではない具体例としては、１つのワクチンベクターが野生型Ｐｏｌ（配列番号２）を発現しもう１つのＭＲＫＡｄ５ｐｏｌベクターが不活性化Ｐｏｌ（配列番号６）を発現する別々のＭＲＫＡｄ５ｐｏｌベクターが挙げられるであろう。もう１つの具体例としては、１つのワクチンベクターがＮｅｆのｔＰＡ／ＬＬＡＡ形態（配列番号１６）を発現しもう１つのＭＲＫＡｄ５ｎｅｆベクターがＮｅｆのＧ２Ａ，ＬＬＡＡ修飾形態（配列番号１４）を発現する別々のＭＲＫＡｄ５ｎｅｆベクターが挙げられるであろう。したがって、本発明のＭＲＫＡｄ５アデノウイルスベクターは、複数の異なるＨＩＶ抗原クラスと組合せて使用することができる。各ＨＩＶ抗原クラスを配列操作に付して、多数の潜在的なワクチンの組合せを得る。そのような組合せは本発明の範囲内である。そのような組合せ様式ワクチン製剤および投与の利用は、単一様式法での接種と比較して、より一層強力な細胞性免疫応答を惹起する可能性を増加させる。
【０１３０】
本発明はまた、初回／追加ワクチン接種計画における一連のＭＲＫＡｄ５ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆアデノウイルスワクチンの一重、二重または三重様式の投与法の適用に関する。この初回／追加計画は、本明細書に開示されている一連のＭＲＫＡｄ５ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆアデノウイルスワクチンの任意の合理的な組合せを含みうる。さらに、初回／追加法はまた、他のウイルスおよび／または非ウイルスＤＮＡワクチンを含みうる。アデノウイルスワクチンベクター法に加えられる好ましいものは、プラスミドＤＮＡワクチン、特に、本明細書に開示されているコドン最適化ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆ構築物の少なくとも１つを含有するＤＮＡプラスミドワクチンを含むが、これに限定されるものではない。
【０１３１】
したがって、本発明の１つの態様は、ｇａｇをコードするプラスミドＤＮＡと組合された初回／追加抗原刺激法における最適化ｇａｇ遺伝子を含有するアデノウイルスベクターの投与である。このプラスミドを、アデノウイルスベクターの構築において使用するアデノウイルス含有シャトルプラスミドから区別するために、このプラスミドを「ワクチンプラスミド」または「ＤＮＡプラスミドワクチン」と称することにする。この投与法において使用する好ましいワクチンプラスミドは、１９９８年２月３日付け出願の係属中の米国特許出願第０９／０１７，９８１号および１９９８年８月１３日付け公開のＷＯ９８／３４６４０（それらの両方を参照により本明細書に組み入れることとする）に開示されている。簡単に説明すると、好ましいワクチンプラスミドはＶ１Ｊｎｓ−ＦＬｇａｇと称され、これは、本発明のアデノウイルスベクターと同じコドン最適化ｇａｇ遺伝子を発現する（完全長ｐ５５　ｇａｇの例示最適化コドン形態のヌクレオチド配列に関しては、図２を参照されたい）。Ｖ１Ｊｎｓと称されるワクチンプラスミドバックボーンは、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーターおよびイントロンＡ、遺伝子発現調節要素としてのウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化および転写終結配列、ならびに最小ｐＵＣバックボーンを含有する（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら，１９９３，ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１２：７７７−７８３を参照されたい）。該ｐＵＣ配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内での高レベルのプラスミド産生を可能にし、アンピシリン耐性遺伝子の代わりにネオマイシン耐性遺伝子を有していてカナマイシンの存在下での選択増殖をもたらす。あるいは、イントロンＡが欠失したＣＭＶプロモーターを有するワクチンプラスミドを使用することが可能である。当業者は、これらの特定の構築物が代替的ワクチンプラスミドベクターで容易に置換されうると認識するであろう。本発明においては特に、そのような代替的プラスミドＤＮＡワクチンベクターの使用が予想される。
【０１３２】
本発明のもう１つの態様は、ＨＩＶ　ｐｏｌ抗原、好ましくは、コドン最適化形態のｐｏｌをコードするワクチンプラスミドを含む、および同様に好ましくは、配列番号２、４、６および８に示すＰｏｌ抗原の群から選ばれるＰｏｌ抗原をコードするヌクレオチド配列を含んでなるワクチンプラスミドを含む初回／追加抗原刺激法である。種々の生物学的に活性な形態のＨＩＶ−１　Ｐｏｌをコードする種々の潜在的ＤＮＡプラスミドワクチンにおいては、関心のあるＨＩＶ−１　Ｐｏｌ遺伝子の投与、細胞内運搬および発現は宿主ＣＴＬおよびＴｈ応答を惹起する。本発明の好ましい合成ＤＮＡ分子は、コドン最適化野生型Ｐｏｌ（Ｐｒｏ活性を有さない）および種々のコドン最適化不活性化ＨＩＶ−１　Ｐｏｌタンパク質をコードする。本明細書に開示されているＨＩＶ−１　ｐｏｌオープンリーディングフレームは、医薬用途、特に組換えアデノウイルスワクチン、特に、本明細書に記載の増強された第１世代組換えアデノウイルスワクチンにより運搬されるヒトへの投与に、特に好ましい。本発明のこの態様のいくつかの実施形態、すなわち、完全長ｐｏｌをコードするか又は本明細書に記載の修飾体もしくは融合体をコードするかにかかわらず、哺乳類、特にヒトにおける発現に関してコドン使用頻度が最適化されたＨＩＶ−１　ｐｏｌオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ分子は、後記に詳しく説明されている。この場合もまた、関心のあるそれぞれのＨＩＶ−１　Ｐｏｌ遺伝子の発現を促進し、投与後に、宿主ＣＴＬおよびＴｈ応答を惹起するよう、これらのＤＮＡ配列は、本明細書に記載の例示されている組換えアデノウイルスベクターのような組換えアデノウイルスベクター内に適切に配置されている。この場合もまた、これらの好ましい（決して限定的ではない）ｐｏｌ遺伝子は本明細書に開示されているとおりであり、実質的には、２０００年１２月２１日付け出願の米国特許出願第０９／７４５，２２１号および同様に２０００年１２月２１日付け出願のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４７２４（両方の文書を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されているとおりである。
【０１３３】
組合せ様式および／または初回／追加抗原刺激法において有用な第３の一連のワクチンプラスミドは、ＨＩＶ　ｎｅｆ抗原またはその生物学的および／または免疫学的に関連した修飾体をコードするワクチンプラスミドである。他の箇所に記載されているとおり、好ましいワクチンプラスミドは、ｎｅｆのコドン最適化形態を含有し、また、好ましくは、配列番号１０、１２、１４および１６に示すＮｅｆ抗原の群から選ばれるＮｅｆ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む。これらの好ましいｎｅｆコード領域は本明細書に開示されており、２０００年１２月１５日付け出願の米国特許出願第０９／７３８，７８２号および同様に２０００年１２月１５日付け出願のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１６２（両方の文書を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【０１３４】
したがって、本発明のアデノウイルスワクチンおよびプラスミドＤＮＡワクチンは単独で投与することが可能であり、あるいは初回抗原刺激および追加抗原刺激投与法の一部でありうる。混合様式の初回および追加接種計画は、既存の抗ベクター免疫応答が存在する場合には特に、増強された免疫応答をもたらす。本発明のこの１つの態様は、該プラスミドワクチンを少なくとも１回投与することにより該プラスミドワクチンで対象を初回抗原刺激し、所定の長さの時間を経過させ、ついで該アデノウイルスワクチンを投与することにより追加抗原刺激する方法である。通常、複数の初回抗原刺激、典型的には１〜４回の初回抗原刺激を行うが、より多数の初回抗原刺激を行うことが可能である。初回抗原刺激と追加抗原刺激との間の時間の長さは、典型的には約４ヶ月〜１年と様々となりうるが、他の時間枠を用いることも可能である。アカゲザルでの実験においては、該動物をプラスミドワクチンで４回初回抗原刺激し、ついで４ヶ月後に該アデノウイルスワクチンで追加抗原刺激した。それらの細胞性免疫応答は、アデノウイルスワクチンのみが投与された動物の場合より顕著に高かった。初回抗原刺激法の利用は、既存の抗アデノウイルス免疫応答を対象者が有する場合には特に好ましいかもしれない。
【０１３５】
それに加えて及びその代わりに、本明細書に開示されているＭＲＫＡｄ５アデノウイルスワクチンのような複数のＨＩＶ−１ウイルス抗原を適当なシャトルプラスミドに連結させて、複数のオープンリーディングフレームを含む前アデノウイルスプラスミドを生成させることができる。例えば、三価ベクターは、Ｅ３（−）またはＥ３（＋）バックグラウンド、好ましくはＥ３欠失バックボーンにおけるｇａｇ−ｐｏｌ−ｎｅｆ融合体、あるいは、おそらくは、「２＋１」二価ワクチン、例えば、同じＭＲＫＡｄ５バックボーン内のｇａｇ−ｐｏｌ融合体（すなわち、コドン最適化ｐ５５　ｇａｇおよび不活性化最適化ｐｏｌ；実施例２９および表２５）（各オープンリーディングフレームは別個のプロモーターおよび転写終結配列に作動的に結合している）を含みうる。あるいは、それらの２つのオープンリーディングフレームが単一のプロモーターに作動的に結合しており、該オープンリーディングフレームがＩＲＥＳ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍｅ　ｅｎｔｒｙ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に作動的に連結していることが可能である（参照により本明細書に組み入れる国際公開番号ＷＯ９５／２４４８５に開示されているとおりである）。図９は、複数のプロモーターおよび終結配列の使用が、同様の増殖特性をもたらすことを示しており、図２８は、これらのＭＲＫＡｄ５ｇａｇに基づくベクターがまた、少なくとも継代２１にわたり安定であることを示している。ＩＲＥＳに基づく技術を用いない場合には、ベクター安定性が最良に維持されるよう、それぞれのオープンリーディングフレームを支持するために、異なるプロモーターを使用することが好ましい。決して限定的ではない例として挙げると、潜在的な多トランスジーンワクチンは、Ｅ３欠失バックボーン中のｈＣＭＶ−ｇａｇｐｏｌ−ｂＧＨｐＡ＋ｍＣＭＶ−ｎｅｆ−ＳＰＡまたはｈＣＭＶ−ｇａｇｐｏｌ−ｂＧＨｐＡ＋ｍＣＭＶ−ｎｅｆ−ＳＰＡ（Ｅ３＋）のような３トランスジーンベクターを含みうる。本発明の潜在的な「２＋１」二価ワクチンは、すべてのトランスジーンがＥ１平行配向であるＥ３＋バックボーン中のｈＣＭＶ−ｐｏｌ−ｂＧＨｐＡ（ベクター＃２）と組合されたＥ３＋バックボーン中のｈＣＭＶ−ｇａｇ−ｂＧＨｐＡ＋ｍＣＭＶ−ｎｅｆ−ＳＰＡ（ベクター＃１）でありうる。前記のｇａｇ−ｐｏｌ融合体以外の融合構築物も、種々の二価ワクチン法での使用に適しており、お互いに融合した任意の２つのＨＩＶ抗原（例えば、ｎｅｆ−ｐｏｌおよびｇａｇ−ｎｅｆ）から構成されうる。これらのアデノウイルス組成物は、前記のとおり、好ましくは、投与後に生成する免疫応答を多様化するために追加的なＨＩＶ抗原を含むアデノウイルス組成物と共に運搬される。したがって、単一の又は可能な第２のアデノウイルスベクターとして運搬される多価ワクチンが本発明の一部と意図されることは明らかである。この場合もまた、この投与様式は、アデノウイルスに基づく有効なＨＩＶ−１ワクチンが組合せ様式法により投与されうるもう１つの例である。しかし、開示されているアデノウイルスベクター用のインサートの決定に関しては、アデノウイルスベクターの有効パッケージング限界を十分に考慮する必要があることに注目することは重要である。アデノウイルスは、該野生型Ａｄ５配列の約１０５％のクローニング容量上限を示すことが示されている。
【０１３６】
発現用に選択した遺伝子にかかわらず、該配列をヒト細胞環境中の発現に関して「最適化」することが好ましい。４つの可能なヌクレオチド塩基の「トリプレット」コドンは、異なる６４個の形態で存在しうる。これらの形態が僅か２０個の異なるアミノ酸（ならびに転写の開始および終結）のメッセージを与えるに過ぎないことは、いくつかのアミノ酸が２以上のコドンによりコードされうることを意味する。実際に、いくつかのアミノ酸は６つもの「重複」した代替的コドンを有し、一方、他のいくつかは、単一の必要なコドンを有する。完全には理解されていない理由により、代替的コドンは種々の細胞型の内因性ＤＮＡ内に決して一様には存在せず、或る細胞型においては或るコドンに関する可変的天然階層または「優先性」が存在するようである。例えば、アミノ酸ロイシンは、ＣＴＡ、ＣＴＣ、ＣＴＧ、ＣＴＴ、ＴＴＡおよびＴＴＧ（これらはそれぞれ、ｍＲＮコドンＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、ＵＵＡおよびＵＵＧに対応する）を含む６つのＤＮＡコドンのいずれかにより特定される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の内因性ＤＮＡは、最も一般的には、ロイシン特定コドンＣＴＧを含有し、一方、酵母および粘菌のＤＮＡは、最も一般的には、ロイシン特定コドンＴＴＡを含有することが、微生物についてのゲノムコドン出現頻度の詳細な分析から示されている。この階層を考慮すると、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主によるロイシンに富むポリペプチドの高レベルの発現が得られる可能性は、コドン使用頻度に或る程度は左右されると、一般に考えられている。例えば、ＴＴＡコドンに富む遺伝子は、十中八九は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内では発現されにくく、一方、ＣＴＧに富む遺伝子は、おそらく該ポリペプチドを高度に発現するであろう。同様に、酵母細胞が、ロイシンに富むポリペプチドの発現のための意図される形質転換宿主細胞である場合には、挿入されるＤＮＡ内で使用するための好ましいコドンはＴＴＡであろう。
【０１３７】
組換えＤＮＡ技術へのコドン優先性現象の関与は明白であり、該現象は、成功裏に形質転換された宿主生物において外因性遺伝子の高い発現レベルがこれまで多くの場合に達成されていないことを説明するのに役立ちうる。すなわち、該挿入遺伝子内には、それほど「好まし」くないコドンが反復的に存在している可能性があり、発現用の宿主細胞装置が、それほど効率的には機能していない可能性があるのである。この現象は、意図される宿主細胞の好ましいコドンを含むように設計された合成遺伝子が、組換えＤＮＡ技術の実施のための好ましい形態の外来遺伝物質を与えることを示唆している。したがって、本発明の１つの態様は、アデノウイルスベクター、またはワクチンプラスミドとアデノウイルスベクターとの何らかの組合せであり、この場合、それらの両方は特に、ヒト細胞環境中での発現に関してコドンが最適化された遺伝子を含む。本明細書に記載のとおり、本発明での使用のための好ましい遺伝子はコドン最適化ＨＩＶ遺伝子であり、特に、ＨＩＶ　ｇａｇ、ｐｏｌまたはｎｅｆである。
【０１３８】
本発明のアデノウイルスベクターは、Ｈｉｔｔら，１９９７“Ｈｕｍａｎ　Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｉｎｔｏ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ”Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　４０：１３７−２０６（これを参照により本明細書に組み入れることとする）に概説されているような公知技術を用いて構築することができる。
【０１３９】
本発明のアデノウイルスベクターを構築する際には、プラスミドまたはシャトルベクター内にそれを挿入することがしばしば簡便である。これらの技術は公知であり、Ｈｉｔｔら，前掲に記載されている。本発明は特に、該アデノウイルスと、シャトルプラスミド内に挿入された場合のアデノウイルスとの両方を含む。
【０１４０】
好ましいシャトルベクターは、アデノウイルス部分およびプラスミド部分を含有する。該アデノウイルス部分は、実質的には、アデノウイルス配列（非機能的または欠失したＥ１およびＥ３領域を伴う）と簡便な制限部位に隣接した遺伝子発現カセットとを含有する前記のアデノウイルスベクターと同じである。該シャトルベクターのプラスミド部分は、しばしば、原核性プロモーターの転写制御下で抗生物質耐性マーカーを含有していて、該抗生物質の発現は真核細胞内では生じない。アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子および他の医薬上許容される抗生物質耐性マーカーを使用することができる。原核生物における発酵による該ポリヌクレオチドの高レベルの産生を補助するためには、該シャトルベクターが原核性複製起点を含有し高コピー数であることが有利である。多数の商業的に入手可能な原核性クローニングベクターがこれらの利点をもたらす。非必須ＤＮＡ配列を除去することが望ましい。また、該ベクターは真核細胞内で複製不能であることが望ましい。これは、受容者のゲノム内へのポリヌクレオチドワクチン配列の組込みの危険性を最小限に抑える。該ポリヌクレオチドの発現を特定の組織型に限定することが望ましい場合には、組織特異的プロモーターまたはエンハンサーを使用することができる。
【０１４１】
本発明の１つの実施形態においては、該前プラスミド、例えば、ｐＭＲＫＡｄ５ｐｏｌ、ｐＭＲＫＡｄ５ｎｅｆおよびｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇは、ＭＲＫＨＶＥ３（およびＥ３−形態用にはＭＲＫＨＶＯ）バックボーンおよび適当なシャトルベクターを使用する相同組換えにより作製することが可能であり、ｐＭＲＫＡｄ５ｐｏｌに関しては図２２に、そしてｐＭＲＫＡｄ５ｎｅｆに関しては図２３に示されているとおりである。線状形態のプラスミドは、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞への侵入後に複製されることが可能であり、ウイルスが産生される。感染細胞および培地は、ウイルス複製が完了した後に回収した。
【０１４２】
ウイルスベクターは、公知細胞系２９３およびＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）を含む種々のＥ１相補性細胞系内で増殖しうる。これらの細胞系は共に、アデノウイルスＥ１遺伝子産物を発現する。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）は、ＷＯ　９７／００３２６（１９９７年１月３日付け公開）、および発行されている米国特許第６，０３３，９０８号（それらの両方を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。それは、複製欠損型（ＦＧ）アデノウイルスの産生を相補するＥ１遺伝子セグメントで形質導入された初代ヒト網膜芽細胞系であるが、相同組換えによる複製許容型アデノウイルスの生成を妨げるように設計される。特に関心が持たれる細胞は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）のように、４５９ｂｐ〜３５１０ｂｐ（これを含む）のＡＤ５Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子をコードするトランスジーンで安定に形質転換されている。２９３細胞は、参照により本明細書に組み入れるＧｒａｈａｍら，１９９７　Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ　３６：５９−７２に記載されている。前記のとおり、使用する相補性細胞系内に存在するアデノウイルス配列を考慮しなければならない。組換えの可能性を最小限に抑えたい場合には、該配列は、該ベクター内に存在する配列と重複しないことが重要である。
【０１４３】
前記に従い作製したベクターは、免疫応答の誘導において、より有効であることが判明しており、したがって非常に有望なワクチン候補に相当する。より詳しくは、強力な異種プロモーターで調節されるコドン最適化ＨＩＶ　ｇａｇ遺伝子を保持する前記の第１世代アデノウイルスベクターはヒト抗ＨＩＶワクチンとして使用することが可能であり、免疫応答を誘導しうることが判明している。
【０１４４】
ＤＮＡ構築物を製造し精製するための分子生物学の標準的な技術は本発明のＤＮＡ免疫原の製造を可能にする。
【０１４５】
本発明のアデノウイルスベクターを含むワクチン組成物は、バッファー、正常食塩水またはリン酸緩衝食塩水、スクロース、他の塩およびポリソルベートのような生理的に許容される成分を含有しうる。１つの好ましい製剤は、２．５〜１０ｍＭ　ＴＲＩＳバッファー、好ましくは約５ｍＭ　ＴＲＩＳバッファー；２５〜１００ｍＭ　ＮａＣｌ、好ましくは約７５ｍＭ　ＮａＣｌ；２．５〜１０％　スクロース、好ましくは約５％　スクロース；０．０１〜２ｍＭ　ＭｇＣｌ２；および０．００１％〜０．０１％　ポリソルベート８０（植物由来）を含有する。ｐＨは、約７．０〜９．０、好ましくは約８．０であるべきである。当業者は、該製剤を製造するために他の通常のワクチン賦形剤も使用しうると理解するであろう。好ましい製剤は、５ｍＭ　ＴＲＩＳ、７５ｍＭ　ＮａＣｌ、５％　スクロース、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．００５％　ポリソルベート８０をｐＨ８．０で含有する。これは、ガラス表面へのウイルスの吸着の可能性を最小限に抑えＡｄ５の安定性にとって最適に近いｐＨおよび二価陽イオン組成を有する。それは、筋肉注射の際に組織刺激を引き起こさない。それは、好ましくは、使用まで凍結される。
【０１４６】
ワクチン受容者に導入されるワクチン組成物中のアデノウイルス粒子の量は、使用する転写および翻訳プロモーターの強度ならびに発現遺伝子産物の免疫原性に左右されるであろう。一般には、免疫学的または予防的に有効な用量である１×１０７〜１×１０１２粒子、好ましくは約１×１０１０〜１×１０１１粒子を筋肉組織内に直接投与する。皮下注射、皮内導入、皮膚を介した圧入（ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）および他の投与様式、例えば腹腔内、静脈内または吸入運搬も意図される。また、追加ワクチン接種が行われると意図される。ＨＩＶアデノウイルスベクターでのワクチン接種の後、後続のＨＩＶアデノウイルスベクターおよび／またはプラスミドでの追加抗原刺激が望ましいかもしれない。本発明のワクチン組成物の非経口的導入と同時またはその後のインターロイキン１２タンパク質の非経口投与、例えば静脈内、筋肉内、皮下または他の手段の投与も有利である。
【０１４７】
本発明のポリヌクレオチドのアデノウイルスベクターおよび／またはワクチンプラスミドは、受容者の免疫系に影響を及ぼすいずれのタンパク質、アジュバントまたは他の物質とも会合していないことが可能である。この場合、該ベクターは、生理的に許容される溶液、例えば無菌食塩水または無菌緩衝食塩水（これらに限定されるものではない）中に存在することが望ましい。あるいは、該ベクターは、免疫応答を増強する当技術分野で公知のアジュバント（すなわち、「生物学的に有効」なアジュバント）、例えばタンパク質または他の担体と会合していることが可能である。本発明のワクチンプラスミドは、例えば、アジュバントの存在下または不存在下、食塩水（例えば、ＰＢＳ）中で運搬することができる。好ましいアジュバントはＡｌｕｍまたはＣＲＬ　１００５　Ｂｌｏｃｋ　Ｃｏｐｏｌｙｍｅｒである。ＤＮＡの細胞取り込みを補助する物質、例えばカルシウムイオン（これに限定されるものではない）を有利に使用することができる。これらの物質は、本発明では一般には、トランスフェクション促進試薬および医薬上許容される担体と称される。ポリヌクレオチドでコーティングされたマイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）をコーティングするための技術は当技術分野で公知であり、本発明においても有用である。
【０１４８】
本発明はまた、第１アデノウイルスベクターを投与し次いで追加抗原刺激投与を行う初回抗原刺激および追加抗原刺激法を含む。該追加抗原刺激投与は、選択された時間間隔で反復することができる。あるいは、好ましい接種計画は、第１アデノウイルス血清型で初回抗原刺激し、ついで第２アデノウイルス血清型で追加抗原刺激することを含む。より好ましくは、該接種計画は、第１アデノウイルス血清型で初回抗原刺激し、ついで第２アデノウイルス血清型で追加抗原刺激することを含み、ここで、該第１および第２アデノウイルス血清型はアデノウイルスの別々の亜群内に分類される。前記の初回／追加抗原刺激計画は、選択したアデノウイルスベクターに対して既存免疫が確認されている場合に特に好ましい。このタイプの計画においては、個体または個体集団を、既存免疫が確認されている血清型以外の血清型のアデノウイルスで初回抗原刺激する。これは、該第１アデノウイルスが、該第２アデノウイルスに対する既存免疫を避けつつ該トランスジーンの十分な発現を達成するのを可能にし、さらに、該追加抗原刺激アデノウイルスを介した該トランスジーンの後続運搬が、より有効となるのを可能にする。アデノウイルス血清型５は、そのような計画が望ましいと考えられるウイルスの一例である。したがって、本発明では、非Ｃ群アデノウイルス（例えば、Ａ群アデノウイルスであるＡｄ１２、Ｄ群アデノウイルスであるＡｄ２４、またはＢ群アデノウイルスであるＡｄ３５）で初回抗原刺激して抗Ａｄ５免疫を回避し、ついでＣ群アデノウイルスであるＡｄ５で追加抗原刺激することを選択しうるであろう。もう１つの好ましい実施形態は、異なるアデノウイルス（非ヒトアデノウイルスを含む）ワクチンの投与およびそれに続く、開示されているアデノウイルスワクチンの投与を含む。別法においては、まず、関心のあるウイルス抗原を、アデノウイルスに基づくワクチン以外のウイルスワクチンを介して運搬し、ついで、開示されているアデノウイルスワクチンで行う。別のウイルスワクチンは、ポックスウイルスおよびベネズエラウマ脳炎ウイルスを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１４９】
膨大なヒトおよび動物データは、ＨＩＶ感染の抑制（または排除）における細胞性免疫応答、特にＣＴＬの重要性を支持している。ヒトにおいては、初感染後に非常に高いレベルのＣＴＬが生じ、それはウイルス血症の抑制と相関している。ＨＩＶに繰返し曝露されたにもかかわらず未感染のままである幾つかの小さな個体群が記載されている。これらのコホートの幾つかにおいて、ＣＴＬが注目されている。ＨＩＶ感染のＳＩＶモデルにおいては、初感染後に同様にＣＴＬが生じ、抗ＣＤ８モノクローナル抗体の添加はこの感染抑制を妨げ疾患の進行を招くことが示されている。本発明では、ＣＴＬを誘導するためにアデノウイルスワクチンを単独で又はプラスミドワクチンと組合せて使用する。
【０１５０】
本発明を更に例示するために、以下に非限定的な実施例を記載する。
【０１５１】
実施例１
ｈＣＭＶプロモーターのイントロンＡ部分の除去
ｈＣＭＶプロモーターを増幅するための出発物質として、ＧＭＰ等級のｐＶＩＪｎｓＨＩＶｇａｇを使用した。ｐＶＩＪｎｓＨＩＶｇａｇは、ＣＭＶ最初期（ＩＥ）プロモーターおよびイントロンＡ、完全長コドン最適化ＨＩＶ　ｇａｇ遺伝子、ウシ成長ホルモン由来ポリアデニル化および転写終結配列、ならびに最小ｐＵＣバックボーンを含むプラスミドである。該プラスミドバックボーンの説明としては、Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙら，前掲を参照されたい。該増幅は、ｈＣＭＶプロモーターに隣接するよう適切に配置されるプライマーで行った。５’プライマーはｈＣＭＶプロモーターのＭｓｃ１部位の上流に配置され、３’プライマー（ＢｇｌＩＩ認識配列を含有するよう設計されている）はｈＣＭＶプロモーターの３’側に配置された。全ｈＣＭＶプロモーター（−イントロンＡ）を含む得られたＰＣＲ産物（高忠実度Ｔａｑポリメラーゼを使用）を、ＴＯＰＯ　ＰＣＲ平滑ベクター内にクローニングし、ついでＭｓｃ１およびＢｇｌＩＩでの二重消化により取り出した。ついでこの断片を、Ｍｓｃ１およびＢｇｌＩＩ消化後に元のプロモーター、イントロンＡおよびｇａｇ遺伝子が除去された元のＧＭＰ等級のｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇプラスミド内に再びクローニングした。この連結反応は、元のｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇベクターバックボーン内のｈＣＭＶプロモーター（−イントロンＡ）＋ｂＧＨｐＡ発現カセットの構築をもたらした。このベクターはｐＶＩＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）と称される。
【０１５２】
ＢｇｌＩＩ消化を用いてｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇからＦＬｇａｇ遺伝子を切り出し、その１，５２６ｂｐの遺伝子をゲル精製し、ｐＶＩＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）内にＢｇｌＩＩ部位においてクローニングした。正しい配向でＦｌｇａｇ遺伝子を保持するクローンを同定するために、Ｓｍａ１制限酵素を使用してコロニーをスクリーニングした。ｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡと称されるこのプラスミドを完全に配列決定して、配列の完全性を確認した。
【０１５３】
また、２つの追加的なトランスジーンを構築した。プラスミドｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ＳＰＡは、５０ヌクレオチド長の短い合成ポリＡシグナル（ＳＰＡ）でウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルが置換されていること以外はｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡと同一である。該ＳＰＡの配列は以下に示すとおりであり、ここでは、必須成分（それぞれ、ポリ（Ａ）部位、（ＧＨ）ｎおよび（Ｔ）ｎ）が下線で示されている：ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴＴＧＴＧＴＧ（配列番号１８）。
【０１５４】
プラスミドｐＶ１Ｊｎｓ−ｍＧＭＶ−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡは、ｈＣＭＶプロモーターが除去されてマウスＣＭＶ（ｍＣＭＶ）プロモーターで置換されていること以外はｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡと同一である。
【０１５５】
図３は、元のトランスジーンと比較して新規トランスジーン構築物を図示する。
【０１５６】
実施例２
修飾ｇａｇトランスジーンに関するｇａｇ発現アッセイ
一過性組織培養トランスフェクション実験から得た培養上清についてＧａｇ　Ｅｌｉｓａを行った。この場合、共にイントロンＡを欠く２つの新規ｈＣＭＶ含有プラスミド構築物ｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡおよびｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ＳＰＡを、前記のとおりｈＣＭＶプロモーターの一部としてイントロンＡを有するｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇと比較した。以下の表２は、ＧＭＰ等級の元のプラスミドと比較して該新規ｇａｇプラスミドのインビトロｇａｇ発現データを示している。表２に示す結果は、それらの新規ｈＣＭＶ　ｇａｇプラスミド構築物の両方が、ｈＣＭＶプロモーターのイントロンＡ部分を含有する元のプラスミド構築物と比較しうる発現能を有することを示している。
【０１５７】
【表１】
2004508064.tif 000002
【０１５８】
実施例３
修飾ｇａｇトランスジーンに関するげっ歯類（Ｂａｌｂ／ｃ）研究
前記の２つの新規プラスミド構築物ｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡおよびｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ＳＰＡに関して、ＣＭＶプロモーターのイントロンＡ部分を有する前記構築物ｐＶ１ＪｎｓＨＩＶｇａｇとそれらを比較するために、げっ歯類での研究を行った。ｇａｇ抗体およびＥｌｉｓｐｏｔ応答（１９９９年７月６日付け出願の米国仮特許出願第６０／１４２，６３１号および１９９９年８月１３日付け出願の米国特許出願第６０／１４８，９８１号に基づく優先権を主張している２０００年７月３日付け出願のＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ００／１８３３２（ＷＯ　０１／０２６０７）に記載されている；これらの３つの出願を参照により本明細書に組み入れることとする）を測定した。以下の表３に示す結果は、該新規プラスミド構築物が、試験したプラスミドＤＮＡの両方の用量（２０μｇおよび２００μｇ）で、その抗体およびＴ細胞応答に関して、Ｂａｌｃ／ｃマウスにおいて元の構築物と同等に挙動したことを示している。
【０１５９】
実施例４
【０１６０】
【表２】
2004508064.tif 000003
【０１６１】
修飾シャトルベクター「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１シャトル」の構築
元のＡｄ５シャトルベクター（ｐｄｅｌＥｌｓｐ１Ａ；Ａｄ５のヌクレオチド３４１〜３５２４の複数のクローニング領域と共に塩基対１〜３４１および３５２４〜５７９８のＡｄ５配列を含むベクター）に対する修飾は、以下のとおりに連続的なクローニング工程において行う以下の３つの操作を含んでいた：
（１）左ＩＴＲ領域を、該ベクターバックボーンと該アデノウイルス左ＩＴＲ配列との間の結合部にＰａｃ１部位を含むよう伸長させた。これは、細菌相同組換え系を用いる、より容易な操作を可能にする。
（２）パッケージング領域を、３４２ｂｐ〜４５０ｂｐの野生型（ＷＴ）アデノウイルスの配列を含むよう伸長させた。
（３）ｐＩＸの下流の領域を１３ヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチド３５１１〜３５２３に）伸長させた。
これらの修飾（図４）は、形質転換ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系内に存在するＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ遺伝子のいずれの部分とも重複することなくＥ１欠失のサイズを有効に減少させた。すべての操作は、ＡｄシャトルベクターｐｄｅｌＥｌｓｐ１Ａを修飾することにより行った。
【０１６２】
該修飾を該シャトルベクターに施したら、該変化は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３化学的コンピテント細胞を使用する細菌相同組換えにより元のＡｄ５アデノベクターバックボーン（ｐＡｄＨＶＯおよびｐＡｄＨＶＥ３）内に組み込まれた。
【０１６３】
実施例５
修飾アデノベクターバックボーン（Ｅ３＋およびＥ３−）の構築
元のアデノベクターｐＡｄＨＶＯ（Ｅ１およびＥ３領域を含むヌクレオチド以外のすべてのＡｄ５配列を含む）およびｐＡＤＨＶＥ３（Ｅ１領域を含むヌクレオチド以外のすべてのＡｄ５配列を含む）をそれぞれ、それらがＥ１領域への修飾を含有するように再構築した。これは、新たに修飾されたシャトルベクター（ＭＲＫｐｄｅｌＥ１シャトル）をＰａｃ１およびＢｓｔＺ１１０１で消化し、該アデノウイルス配列に対応する２，７３４ｂｐの断片を単離することにより達成された。この断片を、Ｃｌａ１線状化ｐＡｄＨＶＯ（Ｅ３−アデノベクター）またはＣｌａ１線状化ｐＡｄＨＶＥ３（Ｅ３＋アデノベクター）からのＤＮＡと共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３コンピテント細胞内に同時形質転換した。各形質転換からの少なくとも２つのコロニーを選択し、濁り状態に達するまで６〜８時間、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ（商標）ブロス内で成長させた。ＤＮＡを各細胞ペレットから抽出し、ついで大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１コンピテント細胞内に形質転換した。各形質転換からただ１つのコロニーを選択し、プラスミドＤＮＡ精製のために成長させた。正しいクローンを確認するために、該プラスミドを制限消化により分析した。該修飾アデノベクターをＭＲＫｐＡｄＨＶＯ（Ｅ３−プラスミド）およびＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３（Ｅ３＋プラスミド）と命名した。古い形態のアデノベクターおよびこれらの新規アデノベクターからのウイルス（それぞれＭＲＫＨＶＯおよびＭＲＫＨＶＥ３）を、以下の一連のウイルス競合実験に対応させるために、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞系内で産生させた。また、元のシャトルベクターのマルチクローニング部位はＣｌａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩおよびＢｇｌＩＩ部位を含有していた。このＭＣＳを、ＮｏｔＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶおよびＡｓｃＩ部位を含有する新規ＭＣＳで置換した。この新規ＭＣＳは、該パッケージング領域およびｐＩＸ遺伝子に施された修飾と共に、ＭＲＫｐＡｄＨＶＯおよびＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３前プラスミドに導入されている。
【０１６４】
実施例６
パッケージングシグナル伸長の効果の分析
Ｅ１欠失領域に施された修飾の効果を調べるために、元のバックボーン（ｐＡｄＨＶＥ３）および新規バックボーン（ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３）から得られたウイルスを等しいＭＯＩ比（１：１および５：５）で混合し、数ラウンドにわたり継代した。図５、実験＃１を参照されたい。該実験におけるウイルスの両方は、Ｅ３遺伝子を無傷で含有しており、トランスジーンを含有していなかった。それらの２つのウイルスの間の唯一の相違はＥ１欠失の領域内に存在した。Ｐ１（継代１）における該ウイルスの同時感染の後、該混合物を更に４継代にわたり増殖させ、その時点で、該細胞を回収し、該ウイルスを抽出し、ＣｓＣｌバンディングにより精製した。該ウイルスＤＮＡを抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ついで該消化産物を放射能標識した。また、対照のために、それぞれの前プラスミド（ｐＡｄＨＶＥ３（「ＯＬＤ　Ｅ３＋」）、ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３（「ＮＥＷ　Ｅ３＋」））をＨｉｎｄＩＩＩ（および該ベクターバックボーンを取り出すためにＰａｃ１）で消化し、ついで［３３Ｐ］ｄＡＴＰで標識した。該放射能標識消化産物をゲル電気泳動に付し、該ゲルをＷｈａｔｍａｎ紙上で乾燥させた後、オートラジオグラフィーフィルムにさらした。図６は、パッケージングシグナル領域に施された付加を有する新規アデノウイルスが、元のアデノウイルスと比べて増殖上の利点を有することを、明らかに示している。行った実験（試験したいずれの比においても）においては、新たに修飾されたウイルスに関する消化バンドのみが存在した。３，２０６のサイズの特徴的バンド（該新規ウイルス由来のもの）が明らかに存在した。しかし、元のウイルスから予想される２，７３７ｂｐのサイズの特徴的バンドの証拠は認められなかった。
【０１６５】
実施例７
Ｅ３遺伝子の効果の分析
第２組の該ウイルス競合研究は、ＭＲＫｐＡｄＨＶＯおよびＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３から得られた等しいＭＯＩ比（１：１）の新規修飾ウイルスを混合することを含むものであった（図５、実験＃２）。この組においては、両方のウイルスは、Ｅ１欠失に施された新たな修飾を有していた。第１ウイルス（ＭＲＫｐＡｄＨＶＯ由来）はＥ３遺伝子を含有しない。第２ウイルス（ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３由来）はＥ３遺伝子を含有しない。該ウイルスはいずれも、トランスジーンを含有しない。該ウイルスの同時感染の後、該混合物を更に４継代にわたり増殖させ、その時点で、該細胞を回収し、該全ウイルスを抽出し、ＣｓＣｌバンディングにより精製した。該ウイルスＤＮＡを抽出し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ついで該消化産物を放射能標識した。また、対照のために、それぞれの前プラスミドＭＲＫｐＡｄＨＶＯ（「ＮＥＷ　Ｅ３−」）、ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３（「ＮＥＷ　Ｅ３＋」））をＨｉｎｄＩＩＩ（および該ベクターバックボーンを取り出すためにＰａｃ１）で消化し、ついで［３３Ｐ］ｄＡＴＰで標識した。該放射能標識消化産物をゲル電気泳動に付し、該ゲルをＷｈａｔｍａｎ紙上で乾燥させた後、オートラジオグラフィーフィルムにさらした。図６は、該Ｅ３＋ウイルスおよびＥ３−ウイルス混合実験のウイルスＤＮＡ分析の結果を示す。該Ｅ３＋ウイルスに対応する特徴的バンド（５，６６５ｂｐ）は、該Ｅ３−ウイルスに対応する３，０１０ｂｐの特徴的バンドより大量に存在した。このことは、該Ｅ３遺伝子を含有するウイルスが、Ｅ３遺伝子を含有しないウイルスより迅速に増幅しうることを示している。この増幅率の増加は増殖研究により確認されている。後記の表４を参照されたい。
【０１６６】
実施例８
修飾ｇａｇトランスジーンを含有する新規シャトルベクター「ＭＲＫｐｄｅｌＥ１−ＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ」の構築
修飾プラスミドｐＶ１ＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡをＭｓｃ１で一晩消化し、ついでＳｆｉ１で５０℃で２時間消化した。ついで該ＤＮＡをマングマメヌクレアーゼで３０℃で３０分間処理した。該ＤＮＡ混合物を、Ｑｉａｅｘ　ＩＩキットを使用して脱塩し、ついで３７℃で３０分間にわたりクレノウ処理して、該トランスジーン断片の末端を完全に平滑化した。ついでその２，５５９ｂｐのトランスジーン断片をゲル精製した。該修飾シャトルベクター（ＭＲＫｐｄｅｌＥ１シャトル）を、ＥｃｏＲＶでの消化により線状化し、仔ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、ついで、得られた６，４７９ｂｐの断片をゲル精製した。ついでその２つの精製断片を互いに連結し、数十個のクローンをスクリーニングして、該シャトルベクター内の該トランスジーンの挿入に関して確認した。特徴的制限消化を行って、該トランスジーンをＥ１平行およびＥ１逆平行配向で保持するクローンを同定した。この方法に従って、該ＭＲＫｐｄｅｌＥ１シャトルベクター内のその他のｇａｇトランスジーンにおけるクローニングを行った。
【０１６７】
実施例９
ＭＲＫ　ＦＧアデノベクターの構築
ＨＩＶ−１　ｇａｇトランスジーンをＥ１平行配向で含有するシャトルベクターであるＭＲＫｐｄｅｌＥ１−ＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡをＰａｃ１で消化した。該反応混合物をＢｓｆＺ１７１で消化した。その５，２９１ｂｐの断片をゲル抽出により精製した。ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３プラスミドをＣｌａ１で３７℃で一晩消化し、ゲル精製した。約１００ｎｇの５，２９０ｂｐシャトル＋トランスジーン断片および〜１００ｎｇの線状化ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３　ＤＮＡを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＪ５１８３化学コンピテント細胞内に同時形質転換した。いくつかのクローンを選択し、濁り状態に達するまで６〜８時間、２ｍｌのＴｅｒｒｉｆｉｃ（商標）ブロス内で増殖させた。該細胞ペレットからの全ＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎアルカリ細胞溶解およびフェノールクロロホルム法を用いて精製した。該ＤＮＡをイソプロパノールで沈殿させ、２０μｌ　ｄＨ２Ｏに再懸濁させた。このＤＮＡの２μｌ　アリコートを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−１コンピテント細胞内に形質転換した。それぞれの別々の形質転換からの単コロニーを選択し、３ｍｌのＬＢ＋１００μｇ／ｍｌ　アンピシリン中で一晩成長させた。Ｑｉａｇｅｎカラムを使用して、該ＤＮＡを単離した。該ｇａｇ遺伝子および該プラスミドバックボーン中で切断する制限酵素ＢｓｔＥＩＩでの消化により、陽性クローンを同定した。該前プラスミドクローンはＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡと称され、３７，４９８ｂｐのサイズを有する。この方法に従って、Ｅ１平行およびＥ１逆平行形態のその他のｇａｇトランスジーン構築物のそれぞれのＥ３−およびＥ３＋形態を作製した。図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃは、構築したアデノベクターの種々の組合せを示す。
【０１６８】
実施例１０
プラスミド競合研究
一連のプラスミド競合研究を行った。簡単に説明すると、２つの競合プラスミドのそれぞれの等量を混合することにより、新規構築物の種々の組合せのスクリーニングを行った。図８Ａに示す実験においては、同じトランスジーンを異なる配向で含有するプラスミドを互いに混合して、それらの２つのプラスミドの「競合」を行った。その目的は、トランスジーン配向の効果を観察することにあった。図８Ｂに示す実験においては、種々のポリアデニル化シグナルを（同じ配向で）含有するプラスミドを互いに等量で混合した。その目的は、ポリＡシグナルの効果を評価することにあった。該初期トランスフェクションの後、該ウイルスを１０ラウンドにわたり継代し、該ウイルスＤＮＡを放射性制限分析により分析した。
【０１６９】
該プラスミド混合実験（図８Ａ）からのウイルス種の分析は、Ｅ１平行配向で挿入されたトランスジーンを有するアデノベクターが、Ｅ１逆平行配向で挿入されたトランスジーンを有するアデノウイルスより良く増殖し、競合においてそれを凌ぎうることを示した。継代３において、そしてもちろん継代６においても、該混合物のウイルスＤＮＡ分析は、Ｅ１平行配向で該トランスジーンを保持するウイルスの、Ｅ１逆平行形態より大きな比率を示した。継代１０までは、観察される唯一のウイルス種は、試験した両方のトランスジーン（ｈＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡおよびｈＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ＳＰＡ）に関してＥ１平行配向で該トランスジーンを有するアデノベクターであった。
【０１７０】
継代３および６におけるプラスミド混合物実験＃２（図８Ｂ）からのウイルス種の分析は、試験したポリアデニル化シグナル（ｂＧＨｐＡおよびＳＰＡ）はウイルスの増殖に影響を及ぼさないことを示した。継代１０でさえ、該混合物中の２つのウイルス種は尚も等量で存在した。
【０１７１】
実施例１１
増強されたアデノウイルス構築物「ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１ｇａｇ」のウイルス産生
該競合研究から得た結果から、本発明者らは以下のとおりに結論づけた：（１）該パッケージングシグナル伸長は有益である；（２）Ｅ３の存在はウイルス増殖を増強する；（３）Ｅ１平行配向が推奨される；および（４）ポリＡシグナルは該アデノウイルスの増殖に影響を及ぼさない。
【０１７２】
ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇは最も望ましい結果を示した。この構築物は、新規Ｅ３＋アデノベクターバックボーンＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３内にＥ１平行配向で挿入されたｈＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡトランスジーンを含有する。本発明者らは、このアデノベクターをＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇと命名した。この構築物は以下のとおりに調製した。
【０１７３】
前プラスミドＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡをＰａｃ１で消化して該ベクターバックボーンを遊離させ、〜６０％コンフルエントのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を含有する６ｃｍディッシュ中で３．３μｇをリン酸カルシウム法（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ）によりトランスフェクトした。ＣＰＥが得られたら（７〜１０日）、該培養を３回凍結／融解し、該細胞片をペレット化した。１ｍｌのこの細胞ライセートを使用して、８０〜９０％　コンフルエントのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を含有する６ｃｍディッシュ内に感染させた。ＣＰＥが得られたら、該培養を３回凍結／融解し、該細胞片をペレット化した。ついで該細胞ライセートを使用して、８０〜９０％　コンフルエントのＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を含有する１５ｃｍディッシュに感染させた。この感染手法を継続し、６継代に拡張した。ついで該ウイルスをＣｓＣｌ法により該細胞ペレットから抽出した。２回のバンディングを行った（３勾配ＣｓＣｌおよびそれに続く連続的ＣｓＣｌ勾配）。該第２バンディングの後、該ウイルスをＡ１０５バッファー中で透析した。プロナーゼ処理およびそれに続くフェノールクロロホルム処理を用いて、ウイルスＤＮＡを抽出した。ついで該ウイルスＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで消化し、［３３Ｐ］ｄＡＴＰで放射能標識した。該消化産物を分離するためのゲル電気泳動の後、該ゲルをＷａｔｍａｎ紙上で乾燥させ、ついでオートラジオグラフィーに付した。該消化産物を、（標識前にＰａｃ１／ＨｉｎｄＩＩＩで消化された）前プラスミドからの消化産物と比較した。予想されたサイズが観察され、このことは、該ウイルスが成功裏のうちにレスキューされたことを示している。この方法を用いて、調製した種々のアデノベクタープラスミド構築物のそれぞれからウイルスをレスキューした。
【０１７４】
実施例１２
安定性分析
種々のアデノベクター構築物（例えば、ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇ）が遺伝的安定性を示すか否かを判定するために、該ウイルスをそれぞれ連続継代した。該ウイルスＤＮＡを継代３、６および１０で分析した。各ウイルスは、その正しい遺伝的構造を維持していた。また、大規模生産で行うのと同様の増殖条件下で該ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇの安定性を分析した。この分析のために、ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇおよび３つの他のアデノウイルスベクターのトランスフェクションを繰返し、該ウイルスをＰ３で精製した。その３つの他のアデノベクターは以下のとおりであった：（１）Ｅ３−アデノベクターバックボーン中にｂＧＨｐＡターミネーターと共にｈＣＭＶ（無イントロン）−Ｆｌｇａｇを含むもの、（２）Ｅ３＋アデノベクターバックボーン中にＳＰＡ終結シグナルと共にｈＣＭＶ（無イントロン）−Ｆｌｇａｇを含むもの、およびＥ３＋アデノベクターバックボーン中にｂＧＨｐＡターミネーターと共にｍＣＭＶ−Ｆｌｇａｇを含むもの。該ベクターのすべては、Ｅ１平行配向で挿入されたトランスジーンを有する。ウイルスＤＮＡを放射性制限分析により分析して、それが適当であることを確認してから、無血清培地内での連続継代のための発酵細胞培養に移した。Ｐ５において、それらの４つのウイルスのそれぞれを精製し、該ウイルスＤＮＡを制限消化および放射能標識法による分析用に抽出した。後記のとおり、このウイルスは後に、一連の研究（ＣＯＳ細胞内のインビトロｇａｇ発現、げっ歯類での研究およびアカゲザルでの研究）において使用されている。Ｐ５からのウイルスを図９に示す。
【０１７５】
ＭＲＫＨＶＥ３（ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３前プラスミドから得られた無トランスジーン）およびＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇ（ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ前プラスミド）ウイルスに関して、無血清条件下での継代を継続した。図１０は、ＭＲＫＨＶＥ３、ＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇＥ３−については継代１１での、ＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇについては継代１１および１２での、放射性制限消化によるウイルスＤＮＡ分析を示す。ＤＮＡマーカーレーンである第１レーンに加えて、次の３つのレーンは、前プラスミド対照（元のウイルスに基づく対照）、すなわち、それぞれＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３（「ｐＭＲＫＨＶＥ３」）、ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡおよびｐＭＲＫＡｄ５ｇａｇ（Ｅ３−）からのウイルスである。図１０に示すとおり、該ウイルスＤＮＡサンプルのそれぞれは、示される外来バンドを伴わない予想バンドを示している。このことは、オートラジオグラフィーにより検出されうる主要変異体アデノウイルス種が存在しないことを示している。
【０１７６】
図１１は、ＭＲＫＨＶＥ３とＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇとの間のウイルス競合研究の結果を示す。これらのウイルスを等しいＭＯＩ（それぞれウイルス粒子１４０個；合計２８０　ｖｐ）で継代６において互いに混合し、Ｐ１１まで継代し続けた。該ＤＮＡマーカーレーンである第１レーンに加えて、次の２つのレーンは、ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３およびＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３＋ＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡから得られた前プラスミド対照である。次の２つのレーンは、継代６における出発ウイルス物質からのウイルスＤＮＡである。最後の２つのレーンは、二重に行った競合研究である。図１１のデータは、培養内でのｇａｇトランスジーンの効果を示している。ＭＲＫＡｄ５ｇａｇウイルスの増殖を「無トランスジーン」ＭＲＫＨＶＥ３の増殖と比較した。これらの２つのウイルスを、継代６において、同じＭＯＩ（すなわち、それぞれ１４０ｖｐ）で感染させ、ついで継代１１まで継代し、該ウイルスプールを放射性制限分析により分析した。該データは、競合において一方のウイルスが他方のウイルスを凌ぐことがなかったことを示している。したがって、該ｇａｇトランスジーンは、該アデノウイルスに対する明白な毒性の徴候を示さなかった。
【０１７７】
ＨｉｎｄＩＩＩ消化による分析は、各ウイルス種がほぼ等量で存在することを示している。前記のとおり、いずれの外来バンドの徴候も存在しないらしい。図１２は、血清含有条件下で増殖させたＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇに関して、より高い継代数を示している。この場合もまた、該ゲノム完全性が維持されており、最高継代レベル（Ｐ２１）においてさえも再構成の証拠は認められない。
【０１７８】
図９に示す４つのベクターのそれぞれを、増幅能に関して分析した。以下の表４は、Ｐ４におけるウイルス増幅率の評価において用いたＱＰＡ分析を示す。元のＨＩＶ−１　ｇａｇ構築物に関する増幅率の測定は、Ｐ１２の臨床ロットに基づく。増幅率は、元のウイルスに関しては、継代数の増加と共に増加することが示されている。この観察の理由は、無傷アデノベクターと比較して増殖率の増加を示す変異体の出現によるものである。元のＡｄ　ｇａｇベクターの連続継代により、変異体のレベルは増加し、したがって増幅率も増加する。
【０１７９】
該ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇウイルスは、プロセス条件下（すなわち、無血清培地）で連続的に継代されている。継代１１および１２から抽出されたウイルスＤＮＡは再構成の証拠を示さない。
【０１８０】
【表３】
2004508064.tif 000004
【０１８１】
実施例１３
増強されたＡｄ５構築物の分析的評価
ウイルス増幅に対する該トランスジーンおよびＥ３遺伝子の効果を調べるために、増強されたアデノウイルスベクターＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇを、その無トランスジーン形態（ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３）およびそのＥ３形態（ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇ　Ｅ３−）と共に、無血清条件下でいくつかの継代にわたり調べた。表５Ａは、ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇに関して継代Ｐ３〜Ｐ８にわたり測定した増幅率を示している。あるＭＯＩ範囲内では、該ウイルス産生量は該ウイルス投入量に正比例することが確認された。したがって、感染時の細胞当たりのウイルス粒子の数が増えれば増えるほど、産生されるウイルス量は増える。一方、ウイルス増幅率は該ウイルス投入量に反比例する。該ウイルス投入量が少なければ少ないほど、該増幅率は大きくなる。
【０１８２】
表５Ｂは、新規Ｅ３＋ベクターバックボーンＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３の増幅率を示している。それは、該ｇａｇトランスジーン含有形態より有意に低い増幅率を有していた。これは、ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇが該トランスジーンを含有しているため、より大きなサイズを有することに帰されうる。このように該トランスジーンを含むと、該アデノウイルスのサイズは、野生型Ａｄ５ウイルスのサイズに、より近づく。アデノウイルスは、それがその野生型ゲノムサイズに近い場合に最も良く増幅することが、よく知られている。野生型Ａｄ５は３５，９３５ｂｐである。ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３は３２，９０５ｂｐ長である。増強されたアデノベクターＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇは３５，４５３ｂｐである（ベクター地図に関しては図１４を参照されたい；また、図１５Ａ〜Ｘは、該ベクターバックボーンの追加的な２，０２１ｂｐを含む完全な前アデノウイルスベクター配列を示す）。
【０１８３】
表５Ｃは、新規Ｅ３−ｇａｇ含有ウイルスＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇ　Ｅ３−の増幅率を示す。この場合もまた、このウイルスは、増強されたアデノウイルスベクターより低い増殖率を示す。これは、野生型Ａｄ５と比較した場合のこのウイルスのサイズの減少（Ｅ３遺伝子の欠失による）に帰されうる。該ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇ　Ｅ３−ウイルスは３２，８１０ｂｐ長である。これは、３５，９３５ｂｐ長の野生型Ａｄ５および３５，４５３ｂｐ長のＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇに匹敵する。
【０１８４】
【表４】
2004508064.tif 000005
2004508064.tif 000006
【０１８５】
実施例１４
該新規構築物のｇａｇ発現分析
ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇおよび元のＨＩＶ−ｇａｇベクター（研究および臨床ロット）のインビトロｇａｇ分析は、比較しうるｇａｇ発現を示している。該臨床ロットは、少しだけ減少したｇａｇ発現レベルを示している。最も注目すべき相違は、ｍＣＭＶベクターでのものである。このベクターは、試験したその他のベクター（これらはすべてｈＣＭＶプロモーターを含有する）と比較して約３倍低い発現レベルを示している。ｂＧＨｐＡを伴うｍＣＭＶ−ＦＬｇａｇのアッセイは、種々の増殖および精製ロットを使用して３回行ったが、それは一貫して、より弱いｇａｇ発現を示した。
【０１８６】
実施例１５
Ｂａｌｃ／ｃマウスにおけるＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇおよび他のｇａｇ含有アデノベクターの評価
１０匹のｂａｌｂ／ｃマウスのコホートを、漸増量のＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇならびに元のＡｄ５ＨＩＶ−ｇａｇの研究および臨床ロットで筋肉内にワクチン接種した。血清サンプルを、第１投与の３週間後に集め、抗ｐ２４サンドイッチＥＬＩＳＡにより分析した。
【０１８７】
ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇ（１０７および１０９ｖｐ（ウイルス粒子）の用量）を投与したウスにおける抗ｐ２４力価は、初期のアカゲザルのデータの多くが得られたＡｄ５ＨＩＶ−１　ｇａｇの研究ロットのものと比較しうるものであった（図１３）。また、Ｅ３が欠失している場合（ＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶｇａｇｂＧＨｐＡ（Ｅ３−））またはｂＧＨｐＡターミネーターの代わりにＳＰＡを使用した場合（ＭＲＫＡｄ５　ｈＣＭＶ−ｇａｇ−ＳＰＡ（Ｅ３＋））または該ＭＲＫＡｄ５バックボーンにおいてｈＣＭＶの代わりにマウスＣＭＶプロモーターを使用した場合（ＭＲＫＡｄ５　ｍＣＭＶ−ｇａｇ−ｂＧＨｐＡ（Ｅ３＋））には、これらの力価は比較しうるものであった。
【０１８８】
表７に示す結果は、好ましいベクターＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇに加えて、それらの３つの他のベクターも、マウスにおいて強力な抗ｇａｇ抗体応答を誘導しうることを示している。非常に興味深いことに、ｂＧＨｐＡおよびＥ３＋をＥ１平行配向で含有するｍＣＭＶ−Ｆｌｇａｇ構築物は、試験したその他のベクターと比較してＣＯＳ細胞インビトロ感染において最低のｇａｇ発現を示したが（表６）、それは、このインビボＢａｌｂ／ｃ研究において最大の抗ｇａｇ抗体応答を引き起こした。また、表７は、該研究ロットおよび該臨床ロットの両方における抗ｇａｇ抗体産生の用量反応関係を示している。予想どおり、該臨床ロットは、該研究ロットに使用したのと同じ用量と比較して、各用量レベルで抗ｇａｇ抗体誘導の減少を示している。
【０１８９】
【表５】
2004508064.tif 000007
【０１９０】
【表６】
2004508064.tif 000008
【０１９１】
実施例１６
アカゲザルにおける元のＡｄ−ｇａｇ構築物と新規ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇとに対する体液性および細胞性応答の比較
３匹のアカゲザルのコホートを、ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇまたは臨床用Ａｄ５ｇａｇバルクで２つの用量（１０１１ｖｐおよび１０９ｖｐ）で筋肉内にワクチン接種した。免疫は、第０週、４週および２５週に行った。血清およびＰＢＭＣサンプルを、選択された時点で集めた。該血清サンプルを抗ｐ２４Ａｂ力価に関して（競合に基づくアッセイを使用）、そしてｇａｇ２０マーペプチドプールでの一晩の刺激後に該ＰＢＭＣを抗原特異的ＩＦＮγ分泌に関して（ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによる）アッセイした。
【０１９２】
表８に示す結果は、抗ｇａｇ抗体の生成に関する比較しうる応答を示している。表９に要約した末梢血中のｇａｇ特異的Ｔ細胞の度数は、新規構築物ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇを１回投与した後に生じた強力な細胞性免疫応答を示している。該応答はまた、同じベクターの第２投与により増強されうる。該ベクターはまた、細胞傷害性活性を引き起こすＣＤ８＋Ｔ細胞応答（ＰＢＭＣのＣＤ４＋枯渇後の残りのスポット計数により示される）を誘導しうる。
【０１９３】
【表７】
2004508064.tif 000009
【０１９４】
【表８】
2004508064.tif 000010
【０１９５】
本明細書に記載のアデノベクター、特にＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇは、血清中およびより重要なことには無血清培地条件中でのそれらの増強された増殖特性に関して非常に有望なＨＩＶ−ｇａｇアデノベクターを代表する。現在のＨＩＶ−１　ｇａｇアデノベクター構築物と比較して、ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇは、５〜１０倍増加した増幅率を示す。本発明者らは、それが継代２１において遺伝的に安定であることを示している。この構築物は、比較的低い用量である１０∧９ｖｐにおいてさえもインビボで有意な細胞性免疫応答を産生しうる。該ＭＲＫＡｄ５ｇａｇ構築物の効力は、このアカゲザル研究において示されているとおり、元のＨＩＶ−１　ｇａｇベクターより良くはないとしてもそれと比較しうるものである。
【０１９６】
実施例１７
コドン最適化ＨＩＶ−１　ＰＯＬおよびコドン最適化ＨＩＶ−１　ＰＯＬ修飾
本明細書に開示する種々の合成ｐｏｌ遺伝子のオープンリーディングフレームは、逆転写酵素（またはポリメラーゼおよびＲＮアーゼＨ活性よりなるＲＴ）およびインテグラーゼ（ＩＮ）のコード配列を含む。該タンパク質配列は、ＩＩＩＢのクローン単離物であるＨｘｂ２ｒの配列に基づく。この配列はコンセンサス・クレードＢ配列に最も近く、８４８個の残基中で１６個の不一致残基を有するに過ぎないことが示されている（Ｋｏｒｂｅｒら，１９９８，Ｈｕｍａｎ　ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ　ａｎｄ　ＡＩＤＳ，Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ　Ａｌａｍｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｍｅｘｉｃｏ）。当業者は、本明細書を精査した後、利用可能な任意のＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２株が、本明細書に開示するＨＩＶ　ｐｏｌ　ＤＮＡワクチン構築物の潜在的鋳型を与えると理解するであろう。突然変異不活性化にもかかわらず、いずれかの残留プロテアーゼ活性からの安全性を保証するために、該プロテアーゼ遺伝子が本発明のＤＮＡワクチン構築物から除去されることが、更に注目される。インビボ哺乳類発現を最高にするために、野生型（ｗｔ−ｐｏｌ）および不活性化ｐｏｌ（ＩＡ−ｐｏｌ）の両方の遺伝子配列の設計においては、該配列内の各アミノ酸残基に関するヒトにとって好ましい（「ヒト化」）コドンの使用が含まれる（Ｌａｔｈｅ，１９８５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８３：１−１２）。配列番号１、３、５および７におけるコドン使用頻度を調べることにより理解されうるとおり、哺乳類における最適化のためには以下のコドンの使用が好ましい：Ｍｅｔ（ＡＴＧ）、Ｇｌｙ（ＧＧＣ）、Ｌｙｓ（ＡＡＧ）、Ｔｒｐ（ＴＧＧ）、Ｓｅｒ（ＴＣＣ）、Ａｒｇ（ＡＧＧ）、Ｖａｌ（ＧＴＧ）、Ｐｒｏ（ＣＣＣ）、Ｔｈｒ（ＡＣＣ）、Ｇｌｕ（ＧＡＧ）；Ｌｅｕ（ＣＴＧ）、Ｈｉｓ（ＣＡＣ）、Ｉｌｅ（ＡＴＣ）、Ａｓｎ（ＡＡＣ）、Ｃｙｓ（ＴＧＣ）、Ａｌａ（ＧＣＣ）、Ｇｌｎ（ＣＡＧ）、Ｐｈｅ（ＴＴＣ）およびＴｙｒ（ＴＡＣ）。哺乳類（ヒト）におけるコドンの最適化に関して更に考察するためには、ＷＯ　９７／３１１１５（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０２２９４）（本明細書の他の箇所にも示されているとおり、これを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。当業者は別の形態のコドン最適化を用いたり、あるいは本発明の範囲内のＨＩＶ　ｐｏｌワクチン構築物の作製の際にはこの工程を省略しうると予想される。したがって、本発明はまた、本明細書に開示するＨＩＶ　Ｐｏｌタンパク質の種々の野生型および修飾形態をコードするＤＮＡ分子および関連組換えアデノウイルスＨＩＶワクチンの非コドン最適化形態に関する。しかし、これらの構築物のコドン最適化が、本発明の好ましい実施形態である。
【０１９７】
本発明のこの態様の特に好ましい実施形態は、プロテアーゼ（ＰＲ）活性をコードするＤＮＡ配列が欠失しており、ＲＴ（逆転写酵素およびＲＮアーゼＨ活性）およびＩＮインテグラーゼ活性をコードするコドン最適化「野生型」配列が残された、ｗｔ−ｐｏｌ　ＤＮＡ構築物（本発明においては、「ｗｔ−ｐｏｌ」または「ｗｔ−ｐｏｌ（コドン最適化）」と称される）をコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む。このタンパク質をコードするＤＮＡ分子は本明細書中には配列番号１として開示されており、該オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１０−１２の開始Ｍｅｔ残基からヌクレオチド２５６０−２５６２の終結コドンにわたり含有される。配列番号１は以下のとおりである。
【０１９８】
【化１】
2004508064.tif 000011
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【０１９９】
配列番号１として開示される野生型ｐｏｌ構築物のオープンリーディングフレームは、以下のとおり本明細書中で配列番号２として開示される８５０アミノ酸を含有する。
【０２００】
【化２】
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2004508064.tif 000014
【０２０１】
本発明は特に、該プロテアーゼ活性をコードする野生型配列部分の欠失に加えて、該発現タンパク質のＨＩＶ−１　ｐｏｌ（ＲＴ−ＲＨ−ＩＮ）活性に有害な活性部位残基突然変異の組合せが導入されたコドン最適化ＨＩＶ−１　ＤＮＡ　ｐｏｌ構築物を含むアデノウイルスベクターワクチンに関する。したがって、本発明は、好ましくは、アデノウイルスＨＩＶ−１　ＤＮＡ　ｐｏｌに基づくワクチンであって、該構築物が、ＲＴ、ＲＮアーゼおよび／またはＩＮ活性を少なくとも部分的に、好ましくは実質的に無効にする突然変異を含有し、いずれかのＰＲ活性をコードするＤＮＡ配列を欠くことを特徴とする前記ワクチンに関する。アデノウイルスベクターワクチンの一部および一団であるＨＩＶ−１　ｐｏｌ突然変異体の１つの型は、ＨＩＶ−１　ＰｏｌのＲＴ、ＲＮアーゼＨおよび／またはＩＮ機能に関する少なくとも実質的に減少した酵素活性を与えるよう該発現タンパク質のＲＴ、ＲＮアーゼおよび／またはＩＮ領域内の活性部位を有効に改変する点突然変異を引き起こす少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む突然変異ＤＮＡ分子を含みうるが、これに限定されるものではない。本発明のこの態様の好ましい実施形態においては、ＨＩＶ−１　ＤＮＡ　ｐｏｌ構築物は、ＲＴ、ＲＮアーゼＨおよびＩＮ活性を有効に無効にするＰｏｌコード領域内に突然変異を含有する。特に好ましいＨＩＶ−１　ＤＮＡ　ｐｏｌ構築物は、各活性を少なくとも実質的に無効にするようＰｏｌのＲＴ、ＲＮアーゼＨおよびＩＮドメインの活性部位を改変する少なくとも１つの点突然変異を含有するＤＮＡ分子である。そのようなＨＩＶ−１　Ｐｏｌ突然変異体は、十中八九、それぞれＲＴ、ＲＮアーゼＨおよびＩＮ活性をもたらす各触媒ドメイン内またはその周囲に少なくとも１つの点突然変異を含むであろう。この目的において、特に好ましいＨＩＶ−１　ＤＮＡ　ｐｏｌ構築物が本発明において例示され、それは、ＰＲ、ＲＴ、ＲＮアーゼまたはＩＮ活性を有さない不活性化Ｐｏｌタンパク質（ＩＡ　Ｐｏｌ：配列番号４、図１７Ａ〜Ｃ）を与える９個のコドン置換突然変異を含有し、その場合、３個のそのような点突然変異は該ＲＴ、ＲＮアーゼおよびＩＮ触媒ドメインのそれぞれの中に存在する。したがって、特に好ましい例は、以下の表１に示す全９個の突然変異を含有する、ＩＡ−ｐｏｌをコードするＤＮＡ分子を適当な様態で含むアデノウイルスワクチンである。置換のための追加的な好ましいアミノ酸残基は、ＰｏｌのＲＮアーゼドメイン内に位置するＡｓｐ５５１である。本明細書に開示する突然変異の任意の組合せが適している可能性があり、したがって、本発明のＩＡ−Ｐｏｌに基づくワクチンとして利用されうる。付加および欠失突然変異が意図され本発明の範囲内にあるが、好ましい突然変異は、野生型アミノ酸から別のアミノ酸残基への置換をもたらす点突然変異である。
【０２０２】
【表９】
2004508064.tif 000015
【０２０３】
ＨＩＶ−１　Ｐｏｌの活性部位内またはその周囲のエピトープを改変する可能性が少なくなるよう、本発明のＩＡｐｏｌ突然変異体ワクチン内に点突然変異を組込むのが好ましい。
【０２０４】
この目的において、配列番号３は、表１に示す９個の突然変異に加えてコドン最適化ｐｏｌをコードするヌクレオチド配列を開示しており、これは、以下のとおり開示され、本発明において「ＩＡｐｏｌ」と称される。
【０２０５】
【化３】
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【０２０６】
本発明のＩＡ−ｐｏｌに基づくアデノウイルスワクチンを製造するために、該酵素サブユニットからの９個の活性部位残基の全てをアラニン側鎖で置換することにより、酵素機能の不活性化を行った。表１に示すとおり、該ポリメラーゼの触媒性３残基、すなわちＡｓｐ１１２、Ａｓｐ１８７およびＡｓｐ１８８を含む全ての残基を、アラニン（Ａｌａ）残基で置換した（Ｌａｒｄｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ　１９８７，３２７：７１６−７１７；Ｌａｒｄｅｒら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９８９，８６：４８０３−４８０７）。ＲＮアーゼＨ活性を無効にするために、３つの追加的な突然変異をＡｓｐ４４５、Ｇｌｕ４８０およびＡｓｐ５００に導入し（このＩＡ　Ｐｏｌ構築物においてはＡｓｐ５５１は不変のままとした）、ここで、各残基を、それぞれＡｌａ残基で置換した（Ｄａｖｉｅｓら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：，８８−９５；Ｓｃｈａｔｚら，１９８９，ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．２５７：３１１−３１４；Ｍｉｚｒａｈｉら，１９９０，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１８：ｐｐ．５３５９−５３５３）。ＨＩＶ　ｐｏｌインテグラーゼ機能は、Ａｓｐ６２６、Ａｓｐ６７８およびＧｌｕ７１４における３つの突然変異により無効となった。この場合も、これらの残基のそれぞれをＡｌａ残基で置換した（Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎら１９９５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６９：３７６−３８６；Ｌｅａｖｉｔｔら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１１３−２１１９）。配列番号４のアミノ酸残基Ｐｒｏ３は該ＲＴ遺伝子の開始部位を示す。ＩＡ−Ｐｏｌの完全なアミノ酸配列は、以下のとおりに本発明においては配列番号４および図１７Ａ〜Ｃとして開示される。
【０２０７】
【化４】
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2004508064.tif 000020
【０２０８】
前記のとおり、前記で開示した突然変異の任意の組合せが適している可能性があり、したがって、単独または組合せ様式法および／または初回−追加法で投与される場合に本発明のＩＡ−ｐｏｌに基づくワクチンとして使用されうる。例えば、それぞれの逆転写酵素、ＲＮアーゼＨおよびインテグラーゼコード領域内の３個の残基中の２個だけしか突然変異させないで、尚もこれらの酵素活性を無効にすることが可能でありうる。しかしながら、前記の及び配列番号３として開示されているＩＡ−ｐｏｌ構築物ならびに該発現タンパク質（配列番号４）が好ましい。それらの３つの触媒ドメインのそれぞれにおいて少なくとも１つの突然変異が存在することも好ましい。
【０２０９】
本発明のこの形態のもう１つの態様は、真核性輸送（トラフィッキング）シグナルペプチド、例えばｔＰＡ（組織プラスミノーゲンアクチベーター）由来のもの又はリーダーペプチド（例えば、免疫グロブリンリーダーペプチドのような高度に発現される哺乳類タンパク質内で見出されるもの）を含むコドン最適化ＨＩＶ−１　Ｐｏｌに基づくワクチン構築物である。任意の機能的リーダーペプチドを、有効性に関して試験することが可能である。しかしながら、本明細書中に示すＨＩＶ−１　Ｎｅｆ構築物の場合と同様に本発明の好ましい実施形態は、ｐｏｌコード領域またはその一部がリーダーペプチド、好ましくはヒトｔＰＡ由来のリーダーペプチドに作動的に結合した本明細書に開示するＨＩＶ−１　Ｐｏｌ突然変異体アデノウイルスワクチン構築物を提供することにある。すなわち、ＩＡ−Ｐｏｌ（配列番号４）のようなコドン最適化ＨＩＶ−１　Ｐｏｌ突然変異体は、該タンパク質のアミノ末端部分にリーダーペプチドをも含むことが可能であり、これは、該宿主細胞内の該発現タンパク質の細胞輸送および従ってその免疫原性に影響を及ぼしうる。図１６Ａ〜Ｂに示すとおり、本発明を実施するために使用しうるＤＮＡベクターを、関心のあるリーダーシグナルペプチドを含有するよう公知組換えＤＮＡ法により修飾して、関心のある修飾ＨＩＶ−１タンパク質の下流クローニングが、修飾ＨＩＶ−１　ｔＰＡ／Ｐｏｌタンパク質をコードするヌクレオチド配列を与えるようにすることが可能である。別法においては、前記のとおり、リーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入を、関心のあるＰｏｌタンパク質のオープンリーディングフレームを収容するＤＮＡベクター内に挿入することができる。該クローニング方法には無関係に、該最終産物は、関心のある修飾ＨＩＶ−１　Ｐｏｌタンパク質（リーダーペプチドを含有するＨＩＶ−１　Ｐｏｌタンパク質を含むが、これに限定されるものではない）をコードするヌクレオチド配列と共に、有効な遺伝子発現のためのベクター成分を含むポリヌクレオチドワクチンである。本発明で用いるヒトｔＰＡリーダーのアミノ酸配列は以下のとおりである：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＥＩＳＳ（配列番号１７）。したがって、本発明のもう１つの態様は、真核性輸送シグナルペプチド（例えば、ｔＰＡ由来のもの）を含む、ＨＩＶ−１　Ｐｏｌに基づくワクチン構築物を製造することにある。この目的において、本発明は、コドン最適化ｗｔ−ｐｏｌ　ＤＮＡ構築物をコードするＤＮＡ分子であって、該プロテアーゼ（ＰＲ）活性が欠失しており、ヒトｔＰＡリーダー配列が該コード領域の５’末端に融合していることを特徴とするＤＮＡ分子に関する。このタンパク質をコードするＤＮＡ分子は本明細書中には配列番号５として開示されており、該オープンリーディングフレームは本明細書中には配列番号６として開示されている。
【０２１０】
この目的において、本発明は、コドン最適化ｗｔ−ｐｏｌ　ＤＮＡ構築物をコードするＤＮＡ分子であって、該プロテアーゼ（ＰＲ）活性が欠失しており、ヒトｔＰＡリーダー配列が該コード領域の５’末端に融合していることを特徴とするＤＮＡ分子（本発明においては、「ｔＰＡ−ｗｔ−ｐｏｌ」と称される）に関する。このタンパク質をコードするＤＮＡ分子は本明細書中には配列番号５として開示されており、該オープンリーディングフレームは、ヌクレオチド８−１０の開始Ｍｅｔ残基からヌクレオチド２６３３−２６３５の終結コドンにわたり含まれる。配列番号５は以下のとおりである。
【０２１１】
【化５】
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2004508064.tif 000022
【０２１２】
配列番号５として開示される野生型ｐｏｌ構築物のオープンリーディングフレームは、以下のとおり本明細書中で配列番号６として開示される８７５アミノ酸を含有する。
【０２１３】
【化６】
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【０２１４】
本発明はまた、宿主細胞内の発現タンパク質の細胞輸送および従ってその免疫原性に影響を及ぼしうるヒトｔＰＡリーダーのようなリーダーペプチドをアミノ末端部分に含む、ＩＡ−Ｐｏｌ（配列番号４）のような組換えアデノウイルスベクター内に含有されるコドン最適化ＨＩＶ−１　Ｐｏｌ突然変異体に関する。前記段落に開示している任意のそのようなアデノウイルスに基づくＨＩＶ−１　ＤＮＡ　ｐｏｌ突然変異体は、ヒトｔＰＡリーダー配列を含む（これに限定されるものではない）リーダーペプチドのようなリーダーペプチドの下流における融合に適している。したがって、任意のそのようなリーダーペプチドに基づくＨＩＶ−１　ｐｏｌ突然変異体構築物は、ＨＩＶ−１　ＰｏｌのＲＴ、ＲＮアーゼＨおよび／またはＩＮ機能の１以上に関する少なくとも実質的に減少した酵素活性を与えるよう該発現タンパク質のＲＴ、ＲＮアーゼおよび／またはＩＮ領域の触媒活性を有効に改変する突然変異体ＤＮＡ分子を含みうるが、これに限定されるものではない。本発明のこの形態の好ましい実施形態においては、リーダーペプチド／ＨＩＶ−１　ＤＮＡ　ｐｏｌ構築物は、ＲＴ、ＲＮアーゼＨおよびＩＮ活性を有効に無効にする該Ｐｏｌコード領域内に突然変異を含有する。特に好ましいＨＩＶ−１　ＤＮＡ　ｐｏｌ構築物は、各活性を少なくとも実質的に無効にするよう（好ましくは、完全に無効にするよう）ＰｏｌのＲＴ、ＲＮアーゼＨおよびＩＮドメイン内の活性部位および触媒活性を改変する少なくとも１つの点突然変異を含有するＤＮＡ分子である。そのようなＨＩＶ−１　Ｐｏｌ突然変異体は、十中八九、それぞれＲＴ、ＲＮアーゼＨおよびＩＮ活性をもたらす各触媒ドメイン内またはその周囲に少なくとも１つの点突然変異を含むであろう。本発明のこの形態の特に好ましい実施形態は、表１に示す９個の突然変異を含むＩＡ−Ｐｏｌタンパク質に融合したヒトｔＰＡリーダーに関する。該ＤＮＡ分子は本明細書中には配列番号７として開示されており、該発現ｔＰＡ−ＩＡ　Ｐｏｌタンパク質は、図１８に示すとおりの融合結合部を含む。該発現タンパク質の完全なアミノ酸配列を配列番号８に示す。この目的において、配列番号７は、表１に示す９個の突然変異を含むＩＡ　Ｐｏｌタンパク質に融合したヒトｔＰＡリーダーをコードするヌクレオチド配列（本発明においては、「ｔＰＡ−ｏｐｔ−ＩＡｐｏｌ」と称される）を開示する。該オープンリーディングフレームは、開始Ｍｅｔ（ヌクレオチド８−１０）で始まり、ヌクレオチド２６３３−２６３５の「ＴＡＡ」コドンで終結する。ｔＰＡ−ＩＡＰｏｌをコードするヌクレオチド配列はまた、以下のとおりに開示される。
【０２１５】
【化７】
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【０２１６】
配列番号７として開示されるｔＰＡ−ＩＡ−ｐｏｌ構築物のオープンリーディングフレームは、以下のとおりにｔＰＡ−ＩＡ−Ｐｏｌおよび配列番号８として本明細書中に開示される８７５アミノ酸を含有する。
【０２１７】
【化８】
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2004508064.tif 000028
2004508064.tif 000029
【０２１８】
実施例１８
コドン最適化ＨＩＶ−１　ＮＥＦおよびコドン最適化ＨＩＶ−１　ＮＥＦ修飾体
ＨＩＶ−１　ＮｅｆおよびＨＩＶ−１　Ｎｅｆ修飾体のコドン最適化形態は、実質的には、２０００年１２月１５日付け出願の米国特許出願第０９／７３８，７８２号および同様に２０００年１２月１５日付け出願のＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１６２（両方の文書を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載のとおりである。前記文書に開示されているとおり、コドン最適化ＮｅｆおよびＮｅｆ修飾体の特定の実施形態は、ＨＩＶ−１　ｊｆｒｌ分離体からのＨＩＶ−１　ＮｅｆをコードするＤＮＡ分子に関する。この場合、該コドンは、ヒトのような哺乳類系内での発現に関して最適化されている。このタンパク質をコードするＤＮＡ分子は本発明では配列番号９として開示されており、発現されるオープンリーディングフレームは本発明では配列番号１０として開示されている。本発明のアデノウイルスベクターにおける使用のためのＮｅｆに基づくコード領域のもう１つの実施形態は、該ＨＩＶ−１　ＮｅｆポリペプチドのＮＨ２末端に融合したヒトプラスミノーゲンアクチベーター（ｔｐａ）リーダーペプチドを含有するタンパク質をコードするコドン最適化ＤＮＡ分子を含む。このタンパク質をコードするＤＮＡ分子は本発明では配列番号１１として開示されており、発現されるオープンリーディングフレームは本発明では配列番号１２として開示されている。もう１つの修飾されたＮｅｆ最適化コード領域は、最適化ＨＩＶ−１　ＮｅｆをコードするＤＮＡ分子に関する。この場合、該オープンリーディングフレームは、アミノ末端ミリスチル化部位における修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２）、およびＬｅｕ−１７４−Ｌｅｕ−１７５ジロイシンモチーフからＡｌａ−１７４−Ａｌａ−１７５への置換をコードする（本発明ではｏｐｔ　ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）として記載されている）。このタンパク質をコードするＤＮＡ分子は本発明では配列番号１３として開示されており、発現されるオープンリーディングフレームは本発明では配列番号１４として開示されている。更なる実施形態は、最適化ＨＩＶ−１　ＮｅｆをコードするＤＮＡ分子に関する。この場合、アミノ末端ミリスチル化部位およびジロイシンモチーフが欠失しており、ｔＰＡリーダーペプチドを含む。このＤＮＡ分子ｏｐｔ　ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）は、ＨＩＶ−１　Ｎｅｆ（ｊｆｒｌ）のアミノ酸残基６−２１６に融合したｔＰＡリーダー配列を含有するＮｅｆタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで、Ｌｅｕ−１７４およびＬｅｕ−１７５はＡｌａ−１７４およびＡｌａ−１７５で置換されており、これは本発明ではｏｐｔ　ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）と称され、本発明では配列番号１５として開示されており、発現されるオープンリーディングフレームは本発明では配列番号１６として開示されている。
【０２１９】
前記文書（米国特許出願第０９／７３８，７８２号およびＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ００／３４１６２）に開示されており本明細書中で繰返し記載されているとおり、それぞれのオープンリーディングフレームを含むｎｅｆに基づく以下のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下のとおりである。
【０２２０】
１．コドン最適化形態のＨＩＶ−１　ｊｒｆｌ　ｎｅｆ遺伝子のヌクレオチド配列は、以下に示すとおり本発明では配列番号９として開示されている。
【０２２１】
【化９】
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【０２２２】
好ましいコドンの使用は以下のとおりである：Ｍｅｔ（ＡＴＧ）、Ｇｌｙ（ＧＧＣ）、Ｌｙｓ（ＡＡＧ）、Ｔｒｐ（ＴＧＧ）、Ｓｅｒ（ＴＣＣ）、Ａｒｇ（ＡＧＧ）、Ｖａｌ（ＧＴＧ）、Ｐｒｏ（ＣＣＣ）、Ｔｈｒ（ＡＣＣ）、Ｇｌｕ（ＧＡＧ）；Ｌｅｕ（ＣＴＧ）、Ｈｉｓ（ＣＡＣ）、Ｉｌｅ（ＡＴＣ）、Ａｓｎ（ＡＡＣ）、Ｃｙｓ（ＴＧＣ）、Ａｌａ（ＧＣＣ）、Ｇｌｎ（ＣＡＧ）、Ｐｈｅ（ＴＴＣ）およびＴｙｒ（ＴＡＣ）。哺乳類（ヒト）におけるコドンの最適化に関して更に考察するためには、ＷＯ　９７／３１１１５（ＰＣＴ／ＵＳ９７／０２２９４）（これを参照により本明細書に組み入れることとする）を参照されたい。また、ＨＩＶ−Ｎｅｆのオープンリーディングフレームを含む野生型対コドン最適化ヌクレオチドの比較に関しては図１９〜Ｂを参照されたい。
【０２２３】
前記の配列番号９のオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド１２−１４の開始メチオニン残基およびヌクレオチド６６０−６６２の「ＴＡＡ」終結コドンを含む。配列番号９のオープンリーディングフレームは、コドン最適化ＤＮＡワクチンベクターの使用により発現される２１６アミノ酸のＨＩＶ−１　Ｎｅｆタンパク質を与える。その２１６アミノ酸のＨＩＶ−１　Ｎｅｆ（ｊｆｒｌ）タンパク質は、本発明では配列番号１０として開示されており、以下のとおりである。
【０２２４】
【化１０】
2004508064.tif 000031
【０２２５】
ＨＩＶ−１　Ｎｅｆは、Ｇｌｙ−２のミリスチル化を介して宿主細胞膜の内部表面と会合する２１６アミノ酸のサイトゾルタンパク質である（Ｆｒａｎｃｈｉｎｉら，１９８６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１５５：５９３−５９９）。すべての考えられうるＮｅｆ機能が解明されているわけではないが、細胞内膜へのＮｅｆの適切な輸送は、ＨＩＶ−１の生活環の初期相を促進するために宿主の細胞内環境を改変することにより及び後代ウイルス粒子の感染性を増加させることにより、ウイルス複製を促進することが明らかになっている。コドンが最適化されたタンパク質修飾ポリペプチドに関する本発明の１つの態様においては、本発明のアデノウイルスベクターのｎｅｆコード領域を修飾して、異種リーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有させて、発現タンパク質のアミノ末端領域が該リーダーペプチドを含有するようにする。真核細胞を典型づける機能の多様性は、その膜境界の構造的相違に依存する。これらの構造を生成し維持するためには、タンパク質が、小胞体内のその合成部位から該細胞の全体にわたる所定の目的地へ輸送される必要がある。このためには、主要輸送経路へのアクセスポイントに位置する経路選択をもたらす分子装置により認識されるソーティングシグナルを該輸送タンパク質が示すことが必要である。ほとんどのタンパク質についてのソーティング決定は、それらがそれらの生合成経路を通過するにつれて１回だけ行われる必要がある。なぜなら、それらの最終目的地、すなわち、それらがそれらの機能を果たす細胞位置は、それらの永久的な存在位置となるからである。細胞内完全性の維持は、１つには、タンパク質の選択的ソーティングおよびその正しい目的地への正確な輸送に依存する。タンパク質中には、「住所標識」として機能しうる一定の配列モチーフが存在する。多数のソーティングシグナルは、膜タンパク質の細胞質ドメインと会合していることが判明している。ＣＴＬ応答の有効な誘導は、しばしば、抗原の持続的な高レベルの内因性発現を必要とした。ミリスチル化を介した膜会合は、ほとんどのＮｅｆ機能のための必須要件であるため、本明細書に記載のとおりのグリシンからアラニンへの変化、ジロイシンモチーフの変化および／またはｔｐａリーダー配列での置換によりミリスチル化を欠く突然変異体は機能的に欠損しており、したがって、ＨＩＶ−１ワクチン成分として使用するための、野生型Ｎｅｆと比較して改善された安全性プロフィールを有するであろう。
【０２２６】
本発明のこの態様のもう１つの実施形態においては、ヒト組織特異的プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）リーダーを含むよう、該ＤＮＡベクターまたは該ＨＩＶ−１　ｎｅｆヌクレオチド配列を修飾する。図１６Ａ〜Ｂに示すとおり、ＤＮＡベクターを、関心のあるリーダーシグナルペプチドを含有するよう公知組換えＤＮＡ法により修飾して、関心のある修飾ＨＩＶ−１タンパク質の下流クローニングが、修飾ＨＩＶ−１　ｔＰＡ／Ｎｅｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列を与えるようにすることが可能である。別法においては、前記のとおり、リーダーペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入を、関心のあるＮｅｆタンパク質のオープンリーディングフレームを収容するＤＮＡベクター内に挿入することができる。該クローニング方法には無関係に、該最終産物は、リーダーペプチドを含有するＨＩＶ−１　Ｎｅｆタンパク質を含む（これに限定されるものではない）関心のある修飾ＨＩＶ−１　Ｎｅｆタンパク質をコードするヌクレオチド配列と共に、有効な遺伝子発現のためのベクター成分を含むポリヌクレオチドワクチンである。本発明で用いるヒトｔＰＡリーダーのアミノ酸配列は以下のとおりである：ＭＤＡＭＫＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＥＩＳＳ（配列番号１７）。
【０２２７】
該タンパク質のカルボキシ領域内のジロイシンモチーフと結びついたＧｌｙ−２のミリスチル化は、エンドサイトーシスを介したＣＤ４のＮｅｆ誘導性ダウンレギュレーションに必須であることが示されている（Ａｉｋｅｎら，１９９４，Ｃｅｌｌ　７６：８５３−８６４）。また、Ｎｅｆ発現は、エンドサイトーシスを介したＭＨＣＩのダウンレギュレーションを促進することが示されている（Ｓｃｈｗａｒｔｚら，１９９６，Ｎａｔｕｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　２（３）：３３８−３４２）。本発明は、１つには、輸送および／または機能特性において改変した修飾Ｎｅｆタンパク質をコードするＤＮＡワクチンに関する。本発明のアデノウイルスベクターＨＩＶワクチン内に導入される修飾は、アミノ末端リーダーペプチドを含む修飾Ｎｅｆタンパク質の発現をもたらすｎｅｆオープンリーディングフレームに対する付加、欠失または置換、アミノ末端ミリスチル化部位の修飾または欠失、およびＮｅｆタンパク質内のジロイシンモチーフの修飾または欠失のうち感染宿主細胞内の機能を改変するものを含むが、これらに限定されるものではない。したがって、本発明のＤＮＡ分子および組換えアデノウイルスＨＩＶワクチンの中心的主題は、（１）ｎｅｆに基づくコドン最適化アデノウイルスＨＩＶワクチンの宿主投与および細胞内運搬、（２）ＣＴＬ応答およびＴｈ応答の両方を惹起する点で免疫原性である修飾Ｎｅｆタンパク質の発現、ならびに（３）感染宿主内でのＨＩＶ−１の複製および負荷（ｌｏａｄ）を促進することが示されているＮｅｆの公知初期ウイルス機能の抑制または少なくとも改変にある。したがって、別のアミノ酸残基を発現するようアミノ末端Ｇｌｙ−２ミリスチル化残基が欠失または修飾された修飾Ｎｅｆタンパク質を発現するＤＮＡワクチンを与えるよう、該ｎｅｆコード領域を改変することができる。また、別のアミノ酸残基を発現するようジロイシンモチーフが欠失または修飾された修飾Ｎｅｆタンパク質を発現するＤＮＡワクチンを与えるよう、該ｎｅｆコード領域を改変することができる。さらに、本発明のアデノウイルスベクターＨＩＶワクチンはまた、野生型または修飾Ｎｅｆタンパク質（本明細書に記載のとおりのもの）、例えば、Ｇｌｙ２の欠失または置換、Ｌｅｕ１７４およびＬｅｕ１７５の欠失または置換および／またはリーダー配列の含有を含む修飾Ｎｅｆタンパク質（これに限定されるものではない）を発現する、コドン使用頻度には無関係な単離されたＤＮＡ分子に関する。
【０２２８】
したがって、特定のＮｅｆに基づく構築物は更に、非限定的な例示として以下のものを含む。例えば、本発明は、ＨＩＶ−１の修飾形態をコードするアデノウイルスベクターワクチンに関する。ＨＩＶ−１　Ｎｅｆ（ｊｆｒｌ）のアミノ酸残基６−２１６に融合したｔＰＡリーダー配列を含むＮｅｆタンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、ｏｐｔ　ｔｐａｎｅｆと称される。ｏｐｔ　ｔｐａｎｅｆのオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列は、本発明では配列番号１１として開示されており、以下のとおりである。
【０２２９】
【化１１】
2004508064.tif 000032
【０２３０】
配列番号１１のオープンリーディングフレームは、ヌクレオチド２−４の開始メチオニン残基、およびヌクレオチド７１３−７１５の「ＴＡＡ」終結コドンを含む。配列番号３のオープンリーディングフレームは、アミノ酸残基１７４および１７５のジロイシンモチーフを含む（これに限定されるものではない）ＨＩＶ−１　Ｎｅｆのアミノ酸６−２１６に融合したｔＰＡリーダー配列を含む２３７アミノ酸のＨＩＶ−１　Ｎｅｆタンパク質を与える。この２３７アミノ酸のｔＰＡ／Ｎｅｆ（ｊｆｒｌ）融合タンパク質は、本発明では配列番号１２として開示されており、以下に示されるとおりである。
【０２３１】
【化１２】
2004508064.tif 000033
【０２３２】
したがって、この例示されているＮｅｆタンパク質Ｏｐｔ　ｔＰＡ−Ｎｅｆは、ヒトのような哺乳類系内での発現に関してコドンが最適化されたＨＩＶ−１　ｊｆｒｌ分離体からのＨＩＶ−１　ＮｅｆをコードするＧｌｙ−２Ａ　ＤＮＡ分子のミリスチル化部位の欠失およびｔＰＡリーダー配列の両方を含有する。
【０２３３】
本発明のもう１つの特定の実施形態においては、組換えアデノウイルスＨＩＶワクチンのオープンリーディングフレームがアミノ末端ミリスチル化部位における修飾（Ｇｌｙ−２からＡｌａ−２）およびＬｅｕ−１７４−Ｌｅｕ−１７５ジロイシンモチーフからＡｌａ−１７４−Ａｌａ−１７５への置換をコードしている最適化ＨＩＶ−１　ＮｅｆをコードするＤＮＡ分子を開示する。このオープンリーディングフレームは本発明ではｏｐｔ　ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）として記載され、配列番号１３として開示され、それは、ヌクレオチド１２−１４の開始メチオニン残基およびヌクレオチド６６０−６６２の「ＴＡＡ」終結コドンを含む。前記の修飾を有するＨＩＶ−１　ｊｆｒｌ　ｎｅｆ遺伝子のこのコドン最適化形態のヌクレオチド配列は、本発明では以下のとおりの配列番号１３として開示されている。
【０２３４】
【化１３】
2004508064.tif 000034
【０２３５】
配列番号１３のオープンリーディングフレームは、本発明では以下のとおりの配列番号１４として開示されるＮｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）をコードしている。
【０２３６】
【化１４】
2004508064.tif 000035
【０２３７】
本発明の更なる実施形態は、アミノ末端ミリスチル化部位およびジロイシンモチーフが欠失しておりｔＰＡリーダーペプチドを含む最適化ＨＩＶ−１　Ｎｅｆをコードするもう１つのＤＮＡ分子に関する。このＤＮＡ分子ｏｐｔ　ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）は、ＨＩＶ−１　Ｎｅｆ（ｊｆｒｌ）のアミノ酸残基６−２１６に融合したｔＰＡリーダー配列を含有しＬｅｕ−１７４およびＬｅｕ−１７５がＡｌａ−１７４およびＡｌａ−１７５（このｔＰＡに基づく融合タンパク質ではＡｌａ−１９５およびＡｌａ−１９６）で置換されたＮｅｆタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。ｏｐｔ　ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）のオープンリーディングフレームを含むヌクレオチド配列は、本発明では以下のとおりの配列番号１５として開示されている。
【０２３８】
【化１５】
2004508064.tif 000036
【０２３９】
本発明では配列番号１６として開示されるｔＰＡ−Ｎｅｆ（ＬＬＡＡ）をコードする配列番号７のオープンリーディングフレームは、以下のとおりである。
【０２４０】
【化１６】
2004508064.tif 000037
【０２４１】
本発明のアデノウイルスベクターは、野生型または修飾Ｎｅｆタンパク質（本明細書に記載のとおり）、例えば、Ｇｌｙ２の欠失または置換、Ｌｅｕ１７４およびＬｅｕ１７５の欠失または置換、および／またはリーダー配列の付加を含む修飾Ｎｅｆタンパク質（これに限定されるものではない）を発現する、コドン使用頻度とは無関係のＤＮＡ配列を含みうる。したがって、部分的または完全にコドンが最適化されたＤＮＡワクチン発現ベクター構築物が好ましい。なぜなら、そのような構築物は宿主発現の増加をもたらすはずだからである。しかし、本明細書に開示する構築物の「非コドン最適化」形態、特に、宿主投与後に実質的な細胞性免疫応答を促進することが示されているＨＩＶ　Ｎｅｆの修飾形態を使用することも、本発明の範囲内である。
【０２４２】
図２０Ａ〜Ｃは、ｎｅｆ発現ベクターＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（図２０Ａ）、Ｖ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）（図２０Ｂ）、Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（図２０Ｃ）およびＶ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）（同様に図２０Ｃ）のプラスミドバックボーンとｎｅｆコード配列との間の結合部のヌクレオチド配列を示す。コドン最適化ｎｅｆまたはコドン最適化ｎｅｆ突然変異遺伝子の５’および３’フランキング配列が太字／イタリック体で示されており、ｎｅｆおよびｎｅｆ突然変異体コード配列が無修飾文字で示されている。また（下線付きで）、それぞれのｎｅｆ発現ベクターの構築に関わる制限エンドヌクレアーゼ部位が示されている。Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆおよびＶ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）は該結合部位に同一配列を有する。
【０２４３】
図２１は、ｎｅｆおよびｎｅｆ誘導体の概要図を示す。Ｎｅｆ誘導体に含まれるアミノ酸残基が示されている。グリシン２ならびにロイシン１７４および１７５は、それぞれミリスチル化およびジロイシンモチーフに関わる部位である。
【０２４４】
実施例１９
ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌの構築およびウイルスレスキュー
ベクター：シャトルプラスミドおよび前アデノウイルスプラスミドの構築
ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌと称される前アデノウイルスプラスミドを含む該ベクターの構築における鍵工程を、図２２に示す。簡単に説明すると、完全長不活性化ＨＩＶ−１　ｐｏｌ遺伝子用のアデノウイルスシャトルベクターは以下のとおりである。ベクターＭＲＫｐｄｅＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）は、ＭＥＫＡｄ５ｇａｇアデノウイルス前プラスミドの構築に使用するシャトルベクターの誘導体である。該ベクターは、ｈＣＭＶプロモーター（無イントロンＡ）とウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルとを有する発現カセットを含有する。唯一のＢｇｌＩＩ部位における選択された遺伝子の挿入が、ＭＲＫｐＡｄ５（Ｅ１−／Ｅ３＋）Ｃｌａ１（またはＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３）前プラスミド内への挿入の場合に、該トランスジーンの転写の方向がＡｄ５　Ｅ１に平行となることを保証するよう、該発現単位は該シャトルベクター内に挿入されている。該ベクターは、元のシャトルベクターと同様に、ＰａｃＩ部位、パッケージングシグナル領域への伸長、およびｐＩＸ遺伝子への伸長を含有する。合成完全長コドン最適化ＨＩＶ−１　ｐｏｌ遺伝子をプラスミドｐＶ１Ｊｎｓ−ＨＩＶ−ｐｏｌ−ｉｎａｃｔ（ｏｐｔ）から直接単離した。ＢｇｌＩＩでのこのプラスミドの消化は、無傷のｐｏｌ遺伝子（配列番号３に記載のコドン最適化ＩＡ　ｐｏｌ配列を含む）を遊離する。該ｐｏｌ断片をゲル精製し、ＭＲＫｐｄｅｌＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）シャトルベクター内にＢｇｌＩＩ部位で連結した。制限酵素ＤｒａＩＩＩ／Ｎｏｔ１を使用することにより、該遺伝子の配向が正しいか否かに関して該クローンを調べた。陽性クローンを単離し、ＭＲＫｐｄｅｌ＋ｈＣＭＶｍｉｎ＋ＦＬ−ｐｏｌ＋ｂＧＨｐＡ（ｓ）と命名した。このプラスミドの遺伝的構造を、ＰＣＲ、制限酵素およびＤＮＡ配列決定により確認した。該前アデノウイルスプラスミドは以下のとおりに構築した。シャトルプラスミドＭＲＫｐｄｅｌ＋ｈＣＭＶｍｉｎ＋ＦＬ−ｐｏｌ＋ｂＧＨｐＡ（Ｓ）を制限酵素Ｐａｃ１およびＢｓｔ１１０７Ｉ（またはそのアイソシゾマーであるＢｓｔＺ１０７Ｉ）で消化し、ついで線状化（Ｃｌａ１消化）アデノウイルスバックボーンプラスミドＭＲＫｐＡｄ（Ｅ１−／Ｅ３＋）Ｃｌａ１と共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＪ５１８３内に同時形質転換した。元々はＭＲＫｐＡｄ＋ｈＣＭＶｍｉｎ＋ＦＬ−ｐｏｌ＋ｂＧＨｐＡ（Ｓ）Ｅ３＋と称されていた得られた前プラスミドを、新たに「ｐＭＲＫＡｄ５ｐｏｌ」と改称した。得られたｐＭＲＫＡｄ５ｐｏｌの遺伝的構造を、ＰＣＲ、制限酵素およびＤＮＡ配列分析により確認した。予備的産生のために、該ベクターをコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−１　Ｂｌｕｅ内に形質転換した。回収されたプラスミドを、制限酵素消化およびＤＮＡ配列分析により、ならびに一過性トランスフェクション細胞培養内の該ｐｏｌトランスジーンの発現により確認した。このｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターの完全なヌクレオチド配列を図２６Ａ〜ＡＯに示す。
【０２４５】
研究等級組換えアデノウイルスの作製
前アデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ｐｏｌを、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）接着単層細胞培養内で感染ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするために、１２μｇのｐＭＲＫＡｄ５ｐｏｌを制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、リン酸カルシウム共沈技術（Ｃｅｌｌ　Ｐｈｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ．）を用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）の６ｃｍディッシュ当たり３．３μｇをトランスフェクトした。ＰａｃＩ消化はプラスミド配列からウイルスゲノムを遊離して、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内への侵入後にウイルス複製を生じさせる。トランスフェクションの６〜１０日後、完全なウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察された後で、感染細胞および培地を回収した。感染細胞および培地を−６０℃以下で保存した。このｐｏｌ含有組換えアデノウイルスは本発明では「ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌ」と称される。この組換えアデノウイルスは、配列番号６に示すとおりの不活性化ＨＩＶ−１　Ｐｏｌタンパク質を発現する。
【０２４６】
実施例２０
ＭＲＫＡｄ５Ｎｅｆの構築およびウイルスレスキュー
ベクター：シャトルプラスミドおよび前アデノウイルスプラスミドの構築
ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆと称される前アデノウイルスプラスミドを含む該ベクターの構築における鍵工程を、図２３に示す。簡単に説明すると、前記実施例１９に示したとおり、ベクターＭＲＫｐｄｅＥ１（Ｐａｃ／ｐＩＸ／ｐａｃｋ４５０）＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）は、ＭＥＫＡｄ５ｇａｇアデノウイルス前プラスミドの構築に使用するシャトルベクターである。それは、ＰａｃＩ部位、パッケージングシグナル領域への伸長、およびｐＩＸ遺伝子への伸長を含有するよう修飾されている。それは、ｈＣＭＶプロモーター（無イントロンＡ）とウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルとを有する発現カセットを含有する。唯一のＢｇｌＩＩ部位における選択された遺伝子の挿入が、ＭＲＫｐＡｄ５（Ｅ１−／Ｅ３＋）Ｃｌａ１前プラスミド内への挿入の場合に、該トランスジーンの転写の方向がＡｄ５　Ｅ１に平行となることを保証するよう、該発現単位は該シャトルベクター内に挿入されている。合成完全長コドン最適化ＨＩＶ−１　ｎｅｆ遺伝子をプラスミドｐＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）から直接単離した。ＢｇｌＩＩでのこのプラスミドの消化は、配列番号１３に開示するヌクレオチド配列を含む無傷のｐｏｌ遺伝子を遊離する。該ｎｅｆ断片をゲル精製し、ＭＲＫｐｄｅｌＥ１＋ＣＭＶｍｉｎ＋ＢＧＨｐＡ（ｓｔｒ．）シャトルベクター内にＢｇｌＩＩ部位で連結した。制限酵素Ｓｃａ１を使用することにより、該遺伝子の配向が正しいか否かに関して該クローンを調べた。陽性クローンを単離し、ＭＲＫｐｄｅｌＥ１ｈＣＭＶｍｉｎＦＬ−ｎｅｆＢＧＨｐＡ（ｓ）と命名した。このプラスミドの遺伝的構造を、ＰＣＲ、制限酵素およびＤＮＡ配列決定により確認した。該前アデノウイルスプラスミドは以下のとおりに構築した。シャトルプラスミドＭＲＫｐｄｅｌＥ１ｈＣＭＶｍｉｎＦＬ−ｎｅｆＢＧＨｐＡ（ｓ）を制限酵素Ｐａｃ１およびＢｓｔ１１０７Ｉ（またはそのアイソシゾマーであるＢｓｔＺ１０７Ｉ）で消化し、ついで線状化（Ｃｌａ１消化）アデノウイルスバックボーンプラスミドＭＲＫｐＡｄ（Ｅ１−／Ｅ３＋）Ｃｌａ１と共に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＢＪ５１８３内に同時形質転換した。元々はＭＲＫｐｄｅｌＥ１ｈＣＭＶｍｉｎＦＬ−ｎｅｆＢＧＨｐＡ（ｓ）と称されていた得られた前プラスミドを、新たに「ｐＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ」と改称した。得られたｐＭＲＫＡｄ５ｎｅｆの遺伝的構造を、ＰＣＲ、制限酵素およびＤＮＡ配列分析により確認した。予備的産生のために、該ベクターをコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−１　Ｂｌｕｅ内に形質転換した。回収されたプラスミドを、制限酵素消化およびＤＮＡ配列分析により、ならびに一過性トランスフェクション細胞培養内の該ｎｅｆトランスジーンの発現により確認した。このｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｎｅｆアデノウイルスベクターの完全なヌクレオチド配列を図２７Ａ〜ＡＭに示す。
【０２４７】
研究等級組換えアデノウイルスの作製
前アデノウイルスプラスミドｐＭＲＫＡｄ５ｎｅｆを、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）接着単層細胞培養内で感染ビリオンとしてレスキューした。感染性ウイルスをレスキューするために、１２μｇのｐＭＲＫＡｄ５ｎｅｆを制限酵素ＰａｃＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、リン酸カルシウム共沈技術（Ｃｅｌｌ　Ｐｈｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　Ｉｎｃ．）を用いてＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）の６ｃｍディッシュ当たり３．３μｇをトランスフェクトした。Ｐａｃ１消化はプラスミド配列からウイルスゲノムを遊離して、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞内への侵入後にウイルス複製を生じさせる。トランスフェクションの６〜１０日後、完全なウイルス細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察された後で、感染細胞および培地を回収した。感染細胞および培地を−６０℃以下で保存した。ここで、このｎｅｆ含有組換えアデノウイルスは、「ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ」と称される。
【０２４８】
実施例２１
不活性化ＰｏｌおよびＮｅｆ／Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ用のマウスＣＭＶプロモーター含有シャトルベクターの構築
プライマーセット：ｍＣＭＶ（ＮｏｔＩ）フォワード５’−ＡＴＡ　ＡＧＡ　ＡＴＧ　ＣＧＧ　ＣＣＧ　ＣＣＡ　ＴＡＴ　ＡＣＴ　ＧＡＧ　ＴＣＡ　ＴＴＡ　ＧＧ−３’（配列番号２０）；ｍＣＭＶ（Ｂｇｌ　ＩＩ）リバース：５’−ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＣＴＡ　ＣＣＧ　ＡＣＧ　ＣＴＧ　ＧＴＣ　ＧＣＧ　ＣＣＴ　Ｃ−３’（配列番号２１）を使用して、プラスミドｐＭＨ４（Ｆｒａｎｋ　Ｇｒａｈａｍ，ＭｃＭａｓｔｅｒ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから供給された）からマウスＣＭＶ（ｍＣＭＶ）を増幅した。該下線付きヌクレオチドは、各プライマーのそれぞれＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩ部位を表す。該トランスジーンをＥ１平行配向で含有するｍＣＭＶシャトルベクターの構築のために、このＰＣＲアンプリコンを使用した。ＮｏｔＩおよびＢｇｌＩＩでの消化により、元のシャトルベクター（ｈＣＭＶ−ｇａｇ−ｂＧＨｐＡトランスジーンをＥ１平行配向で含有する）からｈＣＭＶプロモーターを除去した。ｍＣＭＶプロモーター（ＮｏｔＩ／ＢｇｌＩＩ消化ＰＣＲ産物）を該シャトルベクター内に一定方向で挿入した。ついで該シャトルベクターをＢｇｌＩＩで消化し、ｇａｇレポーター遺伝子（ＢｇｌＩＩ断片）を該シャトルベクター内に再挿入した。いくつかのクローンを、該レポーター遺伝子の方向の正しさに関してスクリーニングした。Ｅ１逆平行配向のｍＣＭＶ−ｇａｇの構築のためには、プライマーセット：ｍＣＭＶ（ＡｓｃＩ）フォワード５’−ＡＴＡ　ＡＧＡ　ＡＴＧ　ＧＣＧ　ＣＧＣ　ＣＡＴ　ＡＴＡ　ＣＴＧ　ＡＧＴ　ＣＡＴ　ＴＡＧ　Ｇ（配列番号２２）；ｍＣＭＶ（ＢｇｌＩＩ）リバース：５’ＡＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＣＴＡ　ＣＣＧ　ＡＣＧ　ＣＴＧ　ＧＴＣ　ＧＣＧ　ＣＣＴ　Ｃ（配列番号２３）を使用して、プラスミドｐＭＨ４からｍＣＭＶプロモーターを増幅した。該下線付きヌクレオチドは、各プライマーのそれぞれＡｓｃＩおよびＢｇｌＩＩ部位を表す。ｈＣＭＶ−ｇａｇトランスジーンをＥ１逆平行配向で含有するシャトルベクターをＡｓｃ１およびＢｇｌ１１で消化して、該トランスジーンのｈＣＭＶ−ｇａｇ部分を除去した。ｍＣＭＶプロモーター（Ａｓｃ１／Ｂｇｌ１１消化ＰＣＲ産物）を該シャトルベクター内に一定方向で挿入した。ついで該ベクターをＢｇｌ１１で消化し、該ｇａｇレポーター遺伝子（Ｂｇｌ１１断片）を再挿入した。いくつかのクローンを、該レポーター遺伝子の配向の正しさに関してスクリーニングした。それぞれの完全長ＩＡおよび完全長ｎｅｆ／Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ遺伝子に関しては、該ｍＣＭＶ−ｂＧＨｐＡシャトルベクター内の唯一のＢｇｌＩＩ部位を使用して、クローニングを行った。該ｐｏｌおよびｎｅｆ遺伝子を、ＢｇｌＩＩ消化により、それらのそれぞれのｐＶ１Ｊｎｓプラスミドから切り出した。
【０２４９】
実施例２２
ｍＣＭＶ完全長不活性化Ｐｏｌおよび完全長ｎｅｆ／Ｇ２Ａ．ＬＬＡＡアデノベクターの構築
実施例２１のこれらのトランスジーンのそれぞれを該修飾シャトルベクター内にＥ１平行およびＥ１逆平行の両方の配向で挿入した。各シャトルベクターのＰａｃ１およびＢｓｔＺ１１０Ｉ消化を行い、フランキングＡｄ５配列を含有する各特異的トランスジーン断片を単離し、ＣｌａＩで消化されたＭＲＫｐＡｄ５（Ｅ３＋）またはＭＲＫｐＡｄ５（Ｅ３−）アデノベクタープラスミドと共に、ＢＪ５１８３大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内で細菌相同組換えにより同時形質転換した。ついで、種々のトランスジーンをＥ３−およびＥ３＋の両方の形態（ならびにＥ１平行およびＥ１逆平行配向）で含有する組換え前プラスミドアデノベクターを、ＸＬ−１　Ｂｌｕｅ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞内への形質転換の後で大規模で調製し、制限分析および配列決定により分析した。
【０２５０】
実施例２３
ｈＣＭＶ−ｔｐａ−ｎｅｆ（ＬＬＡＡ）アデノベクターの構築
プライマーセット：Ｔｐａｎｅｆ（ＢａｍＨＩ）Ｆ５’−ＡＴＴ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＧＣＡ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＡＧＡ　ＧＧＧ（配列番号２４）；Ｔｐａｎｅｆ（ＢａｍＨＩ）Ｒ５’−ＡＴＡ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＴＴＡ　ＧＣＡ　ＧＴＣ　ＣＴＴ　ＧＴＡ　ＧＴＡ　ＣＴＣ　Ｇ（配列番号２５）を使用して、ＧＭＰ等級ｐＶ１Ｊｎｓ−ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）ベクターからｔｐａ−ｎｅｆ遺伝子を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＢａｍＨＩで消化し、ゲル精製し、ＭＲＫＡｄ５ＣＭＶ−ｂＧＨｐＡシャトルベクター（ＢｇｌＩＩで消化され仔ウシ腸ホスファターゼで処理されたもの）のＢｇｌＩＩ部位内にクローニングした。ｈＣＭＶプロモーターに対して正しい配向でｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）遺伝子（完全なコード領域に関しては配列番号１５を参照されたい）を含有するクローンを、ＳｃａＩ消化後に選択した。得られたＭＲＫＡｄ５ｔｐａｎｅｆシャトルベクターをＰａｃＩおよびＢｓｔＺ１１０１で消化し、細菌相同組換え技術によりＥ３＋ＭＲＫＡｄ５アデノベクター内にクローニングした。
【０２５１】
実施例２４
ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌおよびＭＲＫＡｄ５ｎｅｆワクチンの免疫原性
材料および方法−げっ歯類への免疫
Ｎ＝１０のＢＡＬＢ／ｃマウスの群の筋肉内（ｉ．ｍ．）に以下のベクターで免疫した：（１）１０∧７ｖｐおよび１０∧９ｖｐのうちのいずれかのＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶ−ＩＡｐｏｌ（Ｅ３＋）、ならびに（２）１０∧７ｖｐおよび１０∧９ｖｐのうちのいずれかのＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶ−ＩＡｐｏｌ（Ｅ３−）。投与の７週間後、１０匹／コホートのうちの５匹のマウスを、それらが最初に投与されたのと同じベクターおよび用量で追加抗原刺激した。該第２投与の３週間後、それらのすべての動物から血清および脾臓をそれぞれＲＴ　ＥＬＩＳＡおよびＩＦＮｇ　ＥＬＩｓｐｏｔ分析のために集めた。げっ歯類への全ての免疫のために、該Ａｄ５ベクターを５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、５％　スクロース、７５ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．００５％　ポリソルベート８０（ｐＨ８．０）中で希釈した。２８−１／２Ｇ針付きの０．３ｍＬ　インスリンシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を使用して、全用量を５０μＭ　アリコート中で両方の方形筋に注射した。
【０２５２】
Ｎ＝１０のＣ５７／ＢＬ６マウスの群の筋肉内（ｉ．ｍ．）に以下のベクターで免疫した：（１）１０∧７ｖｐおよび１０∧９ｖｐのうちのいずれかのＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶ−ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）（Ｅ３＋）、（２）１０∧７ｖｐおよび１０∧９ｖｐのうちのいずれかのＭＲＫＡｄ５ｍＣＭＶ−ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）（Ｅ３＋）、ならびに（３）１０∧７ｖｐおよび１０∧９ｖｐのうちのいずれかのＭＲＫＡｄ５ｍＣＭＶ−ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）（Ｅ３＋）。投与の７週間後、１０匹／コホートのうちの５匹のマウスを、それらが最初に投与されたのと同じベクターおよび用量で追加抗原刺激した。該第２投与の３週間後、それらのすべての動物から血清および脾臓をそれぞれＲＴ　ＥＬＩＳＡおよびＩＦＮｇ　ＥＬＩｓｐｏｔ分析のために集めた。
【０２５３】
非ヒト霊長類への免疫
３匹のアカゲザル（２〜３ｋｇ）のコホートを以下のＡｄベクターでワクチン接種した：（１）１０∧９ｖｐおよび１０∧１１ｖｐ用量のうちのいずれかのＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶ−ＩＡｐｏｌ（Ｅ３＋）、ならびに（２）１０∧９ｖｐおよび１０∧１１ｖｐのうちのいずれかのＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶ−ＩＡｐｏｌ（Ｅ３−）、（３）１０∧９ｖｐおよび１０∧１１ｖｐのうちのいずれかのＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶ−ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）（Ｅ３＋）、ならびに（４）１０∧９ｖｐおよび１０∧１１ｖｐのうちのいずれかのＭＲＫＡｄ５ｍＣＭＶ−ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）（Ｅ３＋）。該ワクチンを化学的拘束サル（１０ｍｇ／ｋｇ　ケタミン）に、２つの０．５ｍＬアリコートの該Ａｄベクター（５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、５％　スクロース、７５ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、０．００５％　ポリソルベート８０（ｐＨ８．０）中）の両三角筋への針注射により投与した。該動物は、４週間隔で２回免疫した（Ｔ＝０、４週）。
【０２５４】
マウス抗ＲＴおよび抗ｎｅｆＥＬＩＳＡ
標準的な二次抗体に基づくＥＬＩＳＡにより、抗ＲＴ力価を得た。ＰＢＳ中の１００μＬの１μｇ／ｍＬ　ＨＩＶ−１　ＲＴタンパク質（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）と共に一晩インキュベートすることにより、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（ＮＵＮＣ　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）をコートした。該プレートを、Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　ＭＡＰ装置（Ｈｕｎｓｔｖｉｌｌｅ，ＡＬ）を使用してＰＢＳ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０で洗浄し、２００μＬ／ウェルのブロッキング溶液（ＰＢＳ／０．０５％　ｔｗｅｅｎ／１％　ＢＳＡ）と共に２時間インキュベートした。１００倍の初期血清希釈を行い、ついで４倍の系列希釈を行った。系列希釈サンプルの１００μＬ　アリコートをウェルごとに加え、室温で２時間インキュベートした。該プレートを洗浄し、１００μＬの１／１０００希釈ＨＲＰウサギ抗マウスＩｇＧ（ＺＹＭＥＤ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を、１時間インキュベートしながら加えた。該プレートを十分に洗浄し、１００μＬ　１，２−フェニレンジアミン二塩酸塩／過酸化水素（ＤＡＫＯ，Ｎｏｒｗａｙ）溶液に１５分間浸した。ウェル当たり１００μＬの０．５Ｍ　Ｈ２ＳＯ４を加えることにより、該反応をクエンチした。Ｓ２０スタッカと共にＴｉｔｅｒｔｅｋ　Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ　ＭＣＣ／３４０を使用して、ＯＤ４９２の読み取り値を記録した。終点力価は、０．１　ＯＤ４９２（該バックグラウンド値の２．５倍）以上の吸光度値を与える最高血清希釈度と定義した。
【０２５５】
非ヒト霊長類およびマウスＥＬＩｓｐｏｔアッセイ：
酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを用いて、アカゲザルＰＢＭＣまたはマウス脾臓からの抗原特異的ＩＮＦγ分泌細胞（Ｍｉｙａｈｉｒａら，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１９９５，１８１，４５−５４）を計数した。マウス脾臓を５匹／コホートのマウスからプールし、８ｍＬの完全ＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ１６４０，１０％　ＦＢＳ，２ｍＭ　Ｌ−グルタミン，１００Ｕ／ｍＬ　ペニシリン，１００ｕ／ｍＬ　ストレプトマイシン，１０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ，５０ｕＭ　β−ＭＥ）中、５×１０６／ｍＬで単細胞懸濁液を調製した。標準的なフィコール勾配分離（Ｃｏｌｉｇａｎら，１９９８，Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）により、アカゲザルＰＢＭＣを８〜１５ｍＬのヘパリン化血から調製した。Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ不透明プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）をＰＢＳ中の１００μＬ／ウェルの５μｇ／ｍＬ　精製ラット抗マウスＩＦＮ−γ　ＩｇＧ１、クローンＲ４−６Ａ２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）または１５μｇ／ｍＬ　マウス抗ヒトＩＮＦ−γ　ＩｇＧ２ａ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１５９８−００，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）で、それぞれマウスまたはサルでのアッセイのために４℃で一晩にわたりコートした。該プレートを、ＰＢＳ／ペニシリン／ストレプトマイシンで洗浄し、２００μＬ／ウェルの完全ＲＰＭＩ培地で３７℃で少なくとも２時間にわたりブロッキングした。
【０２５６】
各ウェルに、５０μＬの細胞サンプル（４〜５×１０５細胞／ウェル）および５０μＬの該抗原溶液を加えた。該対照ウェルには、５０μＬのＤＭＳＯ含有培地を加え、特異的応答のために、選択されたペプチドまたはペプチドプール（ペプチドの最終濃度ごとに４μｇ／ｍＬ）を加えた。該ｐｏｌ構築物で免疫したＢＡＬＢ／ｃマウスに関しては、ＣＤ４＋−エピトープ含有２０量体ペプチド（ａａ２１−４０，ａａ４１１−４３０，ａａ６４１−６６０，ａａ７３１−７５０，ａａ７７１−７９０）のプールまたはＣＤ８＋−エピトープ含有ペプチド（ａａ２０１−２２０，ａａ３１１−３３０，ａａ７８１−８００）を使用して刺激を行った。該ｎｅｆ構築物で免疫したＣ５７／ＢＬ６マウスに関しては、ｎｅｆ配列に由来するａａ５１−７０（ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ）またはａａ８１−１００（ＣＤ４＋）ペプチドを特異的刺激のために加えた。サルにおいては、全ｐｏｌ配列を含み１０アミノ酸で重複する２０−ａａペプチドの２つのプール（ＬおよびＲ）を使用して、ｐｏｌに対する応答を評価した。該ｎｅｆ構築物でワクチン接種したサルにおいては、全ＨＩＶ−１　ｎｅｆ配列を含み１０ａａで重複する２０量体ペプチドを含有する単一のプールを使用した。各サンプル／抗原混合物は、マウスサンプルについては三重ウェル中で、アカゲザルＰＢＭＣについては二重ウェル中で実施された。プレートを３７℃、５％　ＣＯ２、９０％　湿度で２０〜２４時間インキュベートした。該プレートをＰＢＳ／０．０５％　Ｔｗｅｅｎ　２０で洗浄し、１００μＬ／ウェルの１．２５μｇ／ｍＬ　ビオチン共役ラット抗マウスＩＦＮ−γｍＡｂ、クローンＸＭＧ１．２（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）または０．１μｇ／ｍＬ　ビオチン化抗ヒトＩＦＮγヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に４℃で一晩インキュベートした。該プレートを洗浄し、ＰＢＳ／０．００５％　Ｔｗｅｅｎ／５％　ＦＢＳ中、１００μＬ／ウェルの１／２５００希釈度のストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ共役体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）と共に３７℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、１００μｌ／ウェルの１工程（１−ｓｔｅｐ）ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）と共に６〜１０分間インキュベートすることにより、スポットを現像した。該プレートを水で洗浄し、風乾した。解剖顕微鏡を使用して各ウェル内のスポットの数を測定し、該データを１０６個の細胞の入力に対して正規化した。
【０２５７】
非ヒト霊長類抗ＲＴ　ＥＬＩＳＡ
該サルにおけるｐｏｌ特異的抗体を競合ＲＴ　ＥＩＡアッセイで測定し、この場合、プレートウェル上のコート抗体への結合からＲＴ抗原を遮断する能力によりサンプルの活性を測定した。簡単に説明すると、Ｍｘｉｓｏｒｐプレートを飽和量のｐｏｌ陽性ヒト血清（＃９７１１１２３４）でコートした。２５０μＬの各サンプルを１５μＬの２６６ｎｇ／ｍＬ　ＲＴ組換えタンパク質（ＲＣＭ　５６３，１％　ＢＳＡ，０．１％　トゥイーン，０．１％　ＮａＮ３中）および２０μＬの細胞溶解バッファー（Ｃｏｕｌｔｅｒ　ｐ２４抗原アッセイキット）と共に室温で１５分間インキュベートする。最大ＲＴ結合を定める陰性対照および標準の系列希釈サンプルを使用して、同様の混合物を調製する。２００μＬ／ウェルの各サンプルおよび標準を該洗浄プレートに加え、該プレートを室温で１６〜２４時間インキュベートした。結合ＲＴを、Ｃｏｕｌｔｅｒ　ｐ２４アッセイキットに記載の方法に従い定量し、選択された標準により任意に定められる１ｍＬ当たりのミリ・メルク（ｍｉｌｌｉＭｅｒｃｋ）単位で表す。
【０２５８】
結果−げっ歯類での研究
ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝マウス５匹／コホート）を種々の用量のＭＲＫＡｄ５ｄｈＣＭＶ−ＩＡｐｏｌ（Ｅ３＋）およびＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶ−ＩＡｐｏｌ（Ｅ３−）で１回または２回免疫した。該第２投与の３週間後、代替抗原としてＲＴを用いるＥＬＩＳＡアッセイにより、抗ｐｏｌ　ＩｇＧレベルを測定した。ｐｏｌエピトープ含有ペプチドのプールに対するＩＮＦγＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより、細胞性応答を定量した。これらのアッセイの結果を表１０に要約する。該結果は、該ワクチン接種マウスが、僅か１０∧７ｖｐのアデノベクター用量で、検出可能な抗ＲＴ　ＩｇＧを示している。該体液性応答は高度に用量依存的であり、第２免疫で増強可能である。１または２用量のｐｏｌベクターは、高度数の抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を惹起し、該応答は、低度に用量依存的であるが、第２免疫で増強可能である。
【０２５９】
【表１０】
2004508064.tif 000038
【０２６０】
Ｃ５７／ＢＬ６マウスを、種々の用量のＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶ−ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）（Ｅ３＋）、ＭＲＫＡｄ５ｍＣＭＶ−ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）（Ｅ３＋）で１０∧７ｖｐにて、および（３）ＭＲＫＡｄ５ｍＣＭＶ−ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）（Ｅ３＋）で１０∧７ｖｐおよび１０∧９ｖｐのうちのいずれかで免疫した。同様のプロトコールを用いて該免疫応答を分析し、結果を表１１に示す。このモデル系においては該構築物のいずれにおいても抗ｎｅｆ　ＩｇＧ応答を検出することができなかったが、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイによれば、ｎｅｆに対して生成した細胞性免疫の強力な指標が存在する。
【０２６１】
【表１１】
2004508064.tif 000039
【０２６２】
サルでの研究
３匹のアカゲザルのコホートを２用量のＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶ−ＩＡｐｏｌ（Ｅ３＋）およびＭＲＫＡｄ５ｈｃＭＶ−ＩＡｐｏｌ（Ｅ３−）で免疫した。全ｐｏｌ配列を含む２つのペプチドプール（ＬおよびＲ）のうちの一方を使用して、抗原特異的Ｔ細胞の数（百万個のＰＢＭＣ当たり）を計数した。結果を表１２に示す。いずれかの構築物を１０∧９ｖｐの低用量で使用した場合にも、ワクチン被接種体において中等度〜強力なＴ細胞応答が検出された。該動物における抗ＲＴ抗体力価の縦断的分析は、体液性応答を惹起するよう該ｐｏｌトランスジーン産物が効率的に発現されることを示唆している（表１３）。Ｅ３−構築物が投与された動物においてはＥ３＋ウイルスの場合と比較して、一般に、より高い免疫応答が観察されるようであった。
【０２６３】
【表１２】
2004508064.tif 000040
【０２６４】
【表１３】
2004508064.tif 000041
【０２６５】
アカゲザルを２用量のＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ構築物で筋肉内に免疫した場合には、１２匹中８匹のワクチン被投与体において、百万当たり１００〜１１００の範囲の強力なＴ細胞応答が観察された（表１４）。これまでに得られたデータに基づけば、ｍＣＭＶおよびｈＣＭＶにより駆動されるｎｅｆ構築物の効力は比較しうるものである。
【０２６６】
【表１４】
2004508064.tif 000042
【０２６７】
実施例２５
ＨＩＶ感染対象におけるクレードＢとクレードＣとのＴ細胞応答の比較
米国においてＨＩＶ−１に感染した２４人の患者から集めたＰＢＭＣサンプルを、１０アミノ酸により重複する２０量体ペプチドのペプチドプールを使用するＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて試験した。４個の異なるペプチドプールを交差クレード認識に関して試験した。それらは、クレードＢに基づく分離体（ｇａｇ　Ｈ−ｂ；ｎｅｆ−ｂ）またはクレードＣに基づく分離体（ｇａｇ　Ｈ−ｃ，ｎｅｆ−ｃ）から誘導された。表１５のデータは、恐らくクレードＢ　ＨＩＶ−１に感染したこれらの患者からのＴ細胞が、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてクレードＣ　ｇａｇおよびｎｅｆ抗原を認識しうることを示している。相関分析は更に、クレードＣ　ｇａｇペプチドプールに対するこれらのＴ細胞応答がクレードＢ対応物の約６０％であり、クレードＣ　ｎｅｆに対するＴ細胞応答がクレードＢ対応物の約８５％であることを示した（図２５）。これらの結果は、クレードＢ　ＨＩＶ−１に感染した患者において生成した細胞性免疫応答がクレードＣ　ＨＩＶ−１由来のｇａｇおよびｎｅｆ抗原を認識しうることを示唆している。これらのデータは、クレードＢ　ｇａｇおよび／またはｎｅｆ抗原を発現するＤＮＡまたはＭＲＫＡｄに基づくワクチンのようなＨＩＶワクチンが、地球規模での予防的および／または治療的利点をもたらす能力を潜在的に有することを示している。
【０２６８】
【表１５】
2004508064.tif 000043
【０２６９】
実施例２６
ローラーボトルにおけるのＭＲＫＡｄ５ｐｏｌおよびＭＲＫＡｄ５ｎｅｆベクターの特徴づけおよび生産
ｎｅｆおよびｐｏｌアデノベクターの増殖
ｎｅｆおよびｐｏｌ　ＣｓＣｌ精製ＭＲＫＡｄ５種（シード）を使用してローラーボトルに感染させて、更なる実験の種（シード）として使用するＰ４ウイルスを製造した。Ｐ４　ＭＲＫＡｄ５　ｐｏｌおよびｎｅｆベクターを使用してＭＯＩ　２８０ｖｐ／細胞でローラーボトルに感染させた。ただし、ｈＣＭＶ−ｔｐａ−ｎｅｆ［Ｅ３＋］は例外で、これは、Ｐ４で得た種の力価が低かったため１２５のＭＯＩで感染させた。
【０２７０】
【表１６】
2004508064.tif 000044
【０２７１】
ローラーボトル継代
ｐｏｌおよびｎｅｆ構築物の継代を継代７まで継続した。全継代において得られた細胞結合（凍結／融解細胞溶解）および全ブロス（トリトン細胞溶解）力価は非常に一貫したものであった。一般には、ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌはＭＲＫＡ５ｇａｇの約７０％生産性であり、ＭＲＫＡ５ｎｅｆはＭＲＫＡｄ５ｇａｇの約２５％生産性であった。両構築物のＰ７ウイルスのサンプルを制限消化分析によるＶ＆ＣＢにより分析し、それらはいずれの再構成をも示さなかった。
【０２７２】
【表１７】
2004508064.tif 000045
【０２７３】
【表１８】
2004508064.tif 000046
【０２７４】
ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆおよびＭＲＫＡｄ５ｐｏｌウイルス生産速度論
ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌおよびＭＲＫＡｄ５ｎｅｆベクターのウイルス生産速度論がＭＲＫＡｄ５ｇａｇのものに類似しているか否かを判定するために、ローラーボトル内で経時的実験を行った。ローラーボトル培養内のＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞に、Ｐ５　ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌ、Ｐ５　ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆおよびＰ７　ＭＲＫＡｄ５ｇａｇを２８０ｖｐ／細胞のＭＯＩで感染させた。各アデノベクターに関して、感染の２４、３６、４８および６０時間後、２つの感染ボトルからサンプルを採取した。また、Ｉ相（Ｐｈａｓｅ　Ｉ）法条件下で回収する場合には、４８ｈｐｉまで、２つのボトルをサンプル未採取のまま残した。２４、３６、４８および６０ｈｐｉの時点における凍結融解回収細胞結合ウイルスの陰イオン交換ＨＰＬＣウイルス粒子濃度を図２９Ａ〜Ｂに示す。ＱＰＡ力価は、類似した傾向を示している（データは示していない）。
【０２７５】
ｈＣＭＶおよびｍＣＭＶ−ＦＬ−ｎｅｆの比較
ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ構築物（ｈＣＭＶ−ＦＬ−ｎｅｆ）で得られた力価は、ＭＲＫＡｄ５ｇａｇまたはＭＲＫＡｄ５ｐｏｌで得られたものより低かったため、ウイルス生産性比較実験はｍＣＭＶ−ＦＬ−ｎｅｆで行った。２つのアデノベクター（ｈＣＭＶ−およびｍＣＭＶ−ＦＬ−ｎｅｆ）のそれぞれに関して、２つのローラーボトルに継代５の清澄化ライセートを２８０ｖｐ／細胞のＭＯＩで感染させた。それらの４つのローラーボトルの肉眼的および顕微鏡的観察は、回収の時点で同じであった。得られた清澄化ライセートの分析は、表１９に示すとおり、ｍＣＭＶ−ＦＬ−ｎｅｆに感染したボトル内の、より高いウイルス粒子濃度を示した。ｍＣＭＶプロモーターにより駆動されるｎｅｆベクターでの、より高い生産性は、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞における、より低いｎｅｆ発現レベルによるものと認められる。ｎｅｆ発現レベルを測定するための実験がＶ＆ＣＢで進行中である。
【０２７６】
【表１９】
2004508064.tif 000047
【０２７７】
実施例２７
バイオリアクターにおけるＭＲＫＡｄ５ｎｅｆウイルスの特徴づけおよび大規模生産
材料および方法
本実施例の実験は、以下の条件下で２回実施した：３６．５℃、ＤＯ　３０％、ｐＨ７．３０、１５０ｒｐｍ攪拌速度、散布無し、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｉｂｃｏ　Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２９３　ＳＦＭ　ＩＩ（６ｍＭ　Ｌ−グルタミン含有）、ｐＨ制御用の塩基としての０．５Ｍ　ＮａＯＨ。第１の実施（Ｂ２００１０１１５）においては、２つの１０Ｌ　攪拌容器バイオリアクターにＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞を０．２×１０６細胞／ｍｌの濃度で接種した。細胞を、約１×１０６細胞／ｍｌの細胞濃度に達するまで増殖させた。該細胞に未クローン化ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）を２８０ウイルス粒子（ｖｐ）／細胞で感染させた。第２バッチ（Ｂ２００１０２０２）には、該細胞にクローン化ＭＲＡｄ５ｎｅｆを感染させたこと以外は該第１実施と同じ方法を用いた。両方の実施中、該バイオリアクターを感染の４８時間後に回収した。サンプルを採取し、全ブロス（トリトン細胞溶解を伴う）、上清および細胞ペレット（３×凍結／融解）から、ＡＥＸおよびＱＰＡアッセイでウイルス濃度を測定した。該方法の全体にわたり、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ２５０で代謝産物を測定した。
【０２７８】
【表２０】
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【０２７９】
【表２１】
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【０２８０】
結果−表２２および表２３は、ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆのバイオリアクター増殖によるスケールアップ生産の能力を示す。
【０２８１】
【表２２】
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【０２８２】
【表２３】
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【０２８３】
本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施形態により限定されるものではない。実際のところ、前記の説明から、本明細書に記載されているものに加えて本発明の種々の修飾が当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾も、特許請求の範囲の範囲内に含まれると意図される。
【０２８４】
実施例２８
ＤＮＡ初回抗原刺激動物のＭＲＫＡｄＨＩＶ−１ｇａｇ追加抗原刺激
３〜５匹のアカゲザルの群を、第０、４および８週に、（ａ）５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−Ｆｌｇａｇ（ｐＶＩＪｎｓＣＭＶ（無イントロン）−ＦＬ−ｇａｇ−ｂＧＨｐＡ）、（ｂ）４５ｍｇの非イオン性ブロック共重合体ＣＲＬ１００５で製剤化された５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−Ｆｌｇａｇ、または（ｃ）７．５ｍｇのＣＲＬ１００５および０．６ｍＭ　塩化ベンザルコニウムで製剤化された５ｍｇのＶ１Ｊｎｓ−Ｆｌｇａｇで免疫した。すべての動物に、１回量の１０ｅ７　ウイルス粒子（ｖｐ）の該ＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇを第２６週に投与した。注：単一様式での投与の場合には（用量は、アデノウイルスへの前曝露を模擬するよう選択される）、１０ｅ７は余りにも低すぎて、有効に初回抗原刺激または追加抗原刺激することができない；図３２を参照されたい。
【０２８５】
血液サンプルを全動物から幾つかの時点で集め、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、標準的なフィコール法を用いて調製した。該ＰＢＭＣを計数し、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを用いてγインターフェロン分泌に関して分析した（表２４）。各サルに関して、全ＨＩＶ−１　ｇａｇ配列を含む５０個の２０アミノ酸長ペプチドのプールの不存在下（培地）または存在下（「ｇａｇ　Ｈ」と称される）、該ＰＢＭＣを一晩インキュベートした。
【０２８６】
結果は、これらのサルにおけるＴ細胞免疫応答の増強においてＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇが非常に有効であったことを示している。該ウイルス追加抗原刺激の２８週間後または２週間後、百万個のＰＢＭＣ当たりのｇａｇ特異的Ｔ細胞数は、該追加抗原刺激の２４週間前または２週間前に観察されたレベルと比較して２〜４８倍増加した。
【０２８７】
また、該ＭＲＫＡｄ５ｇａｇ追加抗原刺激の前（第１０週）および後（第３０週）に、ＰＢＭＣを細胞内γインターフェロン染色により分析した。選択した動物に関する結果を図３１に示す。結果は、（ａ）ＤＮＡ／アジュバント製剤での免疫が、平衡的、ＣＤ４＋偏向的またはＣＤ８＋偏向的でありうるＴ細胞応答を惹起したこと、および（ｂ）ＭＲＫＡｄ５ｇａｇ構築物での追加刺激が、すべての場合において、強くＣＤ８＋偏向した応答を引き起こしたことをを示している。これらの結果は、ＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇ構築物での追加刺激が抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のレベルを改善しうることを示唆している。
【０２８８】
【表２４】
2004508064.tif 000052
【０２８９】
実施例２９
ＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌ融合構築物の構築
コドン最適化ＨＩＶ−１　ｇａｇ遺伝子のオープンリーディングフレームを、段階的ＰＣＲにより、ＩＡ　ｐｏｌ遺伝子（ＲＴ、ＲＮアーゼおよびインテグラーゼドメインよりなる）のオープンリーディングフレームに直接的に融合させた。該遺伝子（配列番号３８）は該プロテアーゼ遺伝子およびフレームシフト配列を含まないため、それは、ｐ５５、ＲＴ、ＲＮアーゼＨおよびインテグラーゼが組合されたサイズ（１３５０アミノ酸；配列番号３９）の単一ポリペプチドをコードしている。
【０２９０】
該ｇａｇ遺伝子内のＢｓｔＥＩＩ部位から最後の非終結コドンまで伸長する断片を、該ＩＡｐｏｌの開始コドンから唯一のＢａｍＨＩ部位まで伸長する断片にＰＣＲにより連結した。この断片をＢｓｔＥＩＩおよびＢａｍＨＩで消化した。ｇａｇ−ＩＡｐｏｌ融合体の構築は、ＰｓｔＩ−ＢｓｔＥＩＩ　ｇａｇ消化断片、ＢｓｔＥＩＩ／ＢａｍＨＩ消化ＰＣＲ産物および長いＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ／Ｖ１Ｒ−ＦＬｐｏｌバックボーン断片を含む３断片連結により達成された。
【０２９１】
該ＭＲＫＡｄ５−ｇａｇｐｏｌアデノウイルスベクターは、ｇａｇ−ＩＡｐｏｌ融合遺伝子の全ＯＲＦを含有するＶ１Ｒ−ｇａｇｐｏｌのＢｇｌＩＩ断片を使用して構築した。
【０２９２】
実施例３０
非ヒト霊長類における免疫原性研究
３匹のアカゲザルのコホートを、１０ｅ８または１０ｅ１０ウイルス粒子（ｖｐ）の以下のＭＲＫＡｄ５　ＨＩＶ−１ワクチンの１つで免疫した：（１）ＭＲＫＡｄ５ｇａｇ；（２）ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌ；（３）ＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ；（４）等量のＭＲＫＡｄ５ｇａｇ、ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌおよびＭＲＫＡｄ５ｎｅｆを含有する混合物、または（５）等量のＭＲＫＡｄ５ｇａｇｐｏｌおよびＭＲＫＡｄ５ｎｅｆの混合物。
【０２９３】
該ＨＩＶ−１抗原のそれぞれに対するＴ細胞応答を、各抗原の全タンパク質配列を含む２０−ａａのペプチドを使用するＩＦＮγＥＬＩＳｐｏｔアッセイによりアッセイした。結果（表２５）は、該ペプチドプールのそれぞれに応答する百万個の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）当たりのスポット形成細胞（ｓｆｃ）の数として表されている。
【０２９４】
結果は以下の観察を示している：（１）該単一遺伝子構築物（ＭＲＫＡｄ５ｇａｇ，ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌまたはＭＲＫＡｄ５ｎｅｆ）のそれぞれは、サルにおいて、高レベルの抗原特異的Ｔ細胞を惹起しうる；（２）該単一遺伝子ＭＲＫＡｄ５構築物は、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｎｅｆに対して非常に広範なＴ細胞応答を惹起しうる多カクテル製剤として混合されうる；（３）ｇａｇとＩＡ　ｐｏｌとの融合タンパク質を発現するＭＲＫＡｄ５ベクターは、ｇａｇおよびｐｏｌの両方に対して強力なＴ細胞応答を誘導しうる。
【０２９５】
【表２５】
2004508064.tif 000053
【図面の簡単な説明】
【図１】
元のＨＩＶ−１　ｇａｇアデノベクター（Ａｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇ）を示す。
【図２】
該最適化ヒトＨＩＶ−１　ｇａｇオープンリーディングフレームの核酸配列（配列番号２９）を示す。
【図３】
元のｇａｇトランスジーンと比較して新規トランスジーン構築物を図示する。
【図４】
本発明の新規ベクターの作製において元のアデノベクターバックボーンに施された修飾を示す。
【図５】
該パッケージングシグナル領域に対して施された付加（実験＃１）およびウイルス増殖に対するＥ３遺伝子（実験２）の効果を判定するために行ったウイルス混合実験を示す。
【図６】
実施例６および７に記載するウイルス混合実験後のウイルスＤＮＡ分析のオートラジオグラフを示す。
【図７Ａ】
ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３およびＭＲＫｐＡｄＨＶＯアデノベクターバックボーン内に構築されたｈＣＭＶ−Ｆｌｇａｇ−ｂＧＨｐＡアデノベクターを示す。
【図７Ｂ】
ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３およびＭＲＫｐＡｄＨＶＯアデノベクターバックボーン内に構築されたｈＣＭＶ−Ｆｌｇａｇ−ＳＰＡアデノベクターを示す。
【図７Ｃ】
ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３およびＭＲＫｐＡｄＨＶＯアデノベクターバックボーン内に構築されたｍＣＭＶ−Ｆｌｇａｇ−ｂＧＨｐＡアデノベクターを示す。
【図８Ａ】
トランスジーン配向の効果を試験するよう意図された実験を示す。
【図８Ｂ】
ポリアデニル化シグナルの効果を試験するよう意図された実験を示す。
【図９】
ＢｓｔＥ１１消化後のＰ５における試験された４つのアデノウイルスベクターからのウイルスＤＮＡ（実施例１２）を示す。
【図１０】
ＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３、ＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇおよびＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇＥ３−の継代１１および１２のウイルスＤＮＡ分析を示す。
【図１１】
ウイルス競合研究を開始するために使用した継代６のＭＲＫｐＡｄＨＶＥ３およびＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇのウイルスＤＮＡ分析（ＨｉｎｄＩＩＩ消化）を示す。
【図１２】
特定された時点で回収が行われた血清含有培地中のＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇに関する高継代数上のＨｉｎｄＩＩＩ消化によるウイルスＤＮＡ分析を示す。
【図１３】
種々の用量のいくつかのＡｄｇａｇ構築物でｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝１０）をｉ．ｍ．免疫した３週間後の血清抗ｐ２４レベルを示す：（Ａ）ＭＲＫ　Ａｄ５　ＨＩＶ−１　ｇａｇ（継代５）、（Ｂ）ＭＲＫＡｄ５ｈＣＭＶ−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ（Ｅ３−）、（Ｃ）ＭＲＫＡｄ５　ｈＣＭＶ−ＦＬｇａｇ−ＳＰＡ（Ｅ３＋）、（Ｄ）ＭＲＫＡｄ５　ｍＣＭＶ−ＦＬｇａｇ−ｂＧＨｐＡ（Ｅ３＋）、（Ｅ）Ａｄ５ＨＩＶ−１　ｇａｇの研究ロット（２９３細胞由来）、および（Ｆ）Ａｄ５ＨＩＶ−１　ｇａｇの臨床ロット（Ａｄ５ｇａｇＦＮ０００１）。示されているのは、各コホートの幾何平均力価（ＧＭＴ）および標準誤差線である。
【図１４】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｇａｇベクターの制限地図を示す。
【図１５Ａ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｂ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｃ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｄ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｅ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｆ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｇ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｈ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｉ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｊ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｋ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｌ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｍ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｎ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｏ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｐ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｑ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｒ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｓ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｔ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｕ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｖ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｗ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１５Ｘ】
ｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｇａｇベクター（配列番号２７［コード化］および配列番号２８［非コード化］）のヌクレオチド配列を示す。
【図１６】
ＤＮＡワクチン発現ベクターＶ１Ｊｎｓ（Ａ）およびＶ１Ｊｎｓ−ｔＰＡ（Ｂ）の概要図を示す。
【図１７Ａ】
ＩＡ−Ｐｏｌのヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図１７Ｂ】
ＩＡ−Ｐｏｌのヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図１７Ｃ】
ＩＡ−Ｐｏｌのヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
【図１８】
ｔＰＡ−ｐｏｌ　ｉｎａｃｔ（ｏｐｔ）の融合結合部にわたるコドン最適化ヌクレオチドおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号７および８中に含有される）を示す。
【図１９Ａ】
野生型ｎｅｆ（ｊｒｆｌ）とコドン最適化ｎｅｆとのヌクレオチド配列比較を示す。
【図１９Ｂ】
野生型ｎｅｆ（ｊｒｆｌ）とコドン最適化ｎｅｆとのヌクレオチド配列比較を示す。
【図２０】
ｎｅｆ発現ベクターＶ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（図２０Ａ）、Ｖ１Ｊｎｓ／ｎｅｆ（Ｇ２Ａ，ＬＬＡＡ）（図２０Ｂ）、Ｖ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（図２０Ｃ）およびＶ１Ｊｎｓ／ｔｐａｎｅｆ（ＬＬＡＡ）（同様に図２０Ｃ）のプラスミドバックボーンとｎｅｆコード配列との間の結合部のヌクレオチド配列を示す。
【図２１】
ｎｅｆおよびｎｅｆ誘導体の概要図を示す。
【図２２】
前アデノウイルスプラスミド構築物ＭＲＫＡｄ５Ｐｏｌの構築の概要図を示す。
【図２３】
前アデノウイルスプラスミド構築物ＭＲＫＡｄ５Ｎｅｆの構築の概要図を示す。
【図２４】
クレードＢ　ＨＩＶ感染個体におけるクレードＢとクレードＣとの抗ｇａｇ　Ｔ細胞応答の比較を示す。
【図２５】
クレードＢ　ＨＩＶ感染個体におけるクレードＢとクレードＣとの抗ｎｅｆ　Ｔ細胞応答の比較を示す。
【図２６Ａ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｂ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｃ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｄ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｅ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｆ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｇ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｈ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｉ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｊ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｋ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｌ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｍ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｎ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｏ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｐ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｑ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｒ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｓ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｔ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｕ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｖ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｗ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｘ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｙ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６Ｚ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６ＡＡ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６ＡＢ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６ＡＣ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６ＡＤ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６ＡＥ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６ＡＦ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６ＡＧ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６ＡＨ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６ＡＩ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６ＡＪ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６ＡＫ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６ＡＬ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６ＡＭ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６ＡＮ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２６ＡＯ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１ｐｏｌアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３２［コード化］および配列番号３３［非コード化］）を示す。
【図２７Ａ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｂ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｃ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｄ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｅ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｆ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｇ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｈ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｉ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｊ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｋ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｌ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｍ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｎ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｏ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｐ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｑ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｒ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｓ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｔ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｕ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｖ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｗ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｘ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｙ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７Ｚ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７ＡＡ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７ＡＢ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７ＡＣ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７ＡＤ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７ＡＥ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７ＡＦ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７ＡＧ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７ＡＨ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７ＡＩ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７ＡＪ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７ＡＫ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７ＡＬ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２７ＡＭ】
不活性化ｐｏｌ遺伝子（配列番号１３）のコード領域を含むｐＭＲＫＡｄ５ＨＩＶ−１　ｎｅｆアデノウイルスベクターのヌクレオチド配列（配列番号３４［コード化］および配列番号３５［非コード化］）を示す。
【図２８】
Ｅ３（＋）またはＥ３（−）バックボーン中に種々のプロモーター断片（ｈＣＭＶまたはｍＣＭＶ）および終結シグナル（ｂＧＨまたはＳＰＡ）を含むＭＲＫＡｄ５ベクターの安定性を示す。
【図２９Ａ】
２４、３６、４８および６０ｈｐｉの時点における凍結融解回収細胞結合ウイルスの陰イオン交換ＨＰＬＣウイルス粒子濃度を示す。
【図２９Ｂ】
ＭＲＫＡｄ５ｇａｇ、ＭＲＫＡｄ５ｐｏｌおよびＭＲＫＡ５ｎｅｆに関する経時的ＱＰＡ上清力価を示す。
【図３０Ａ】
本明細書に開示するＤＮＡおよび／またはアデノウイルスワクチンにおいて使用する代表的なｔＰＡ−ｇａｇ融合体のオープンリーディングフレームをオープンリーディングフレーム含むヌクレオチド配列（配列番号３６）およびアミノ酸配列（配列番号３７）を示す。
【図３０Ｂ】
本明細書に開示するＤＮＡおよび／またはアデノウイルスワクチンにおいて使用する代表的なｔＰＡ−ｇａｇ融合体のオープンリーディングフレームをオープンリーディングフレーム含むヌクレオチド配列（配列番号３６）およびアミノ酸配列（配列番号３７）を示す。
【図３１】
第１０週（ＤＮＡ初回抗原刺激後）および第３０週（Ａｄ追加抗原刺激後）に集めたＰＢＭＣの細胞内γＩＦＮ染色を示す。
【図３２】
単一様式アデノウイルス免疫とＤＮＡ＋アジュバント初回／アデノウイルス追加免疫との比較を示す。
【図３３Ａ】
実施例２９のｇａｇ−ＩＡｐｏｌ融合体のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す。
【図３３Ｂ】
実施例２９のｇａｇ−ＩＡｐｏｌ融合体のオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列（配列番号３８）を示す。
【図３４Ａ】
該ｇａｇ−ＩＡｐｏｌ融合フレームのタンパク質配列（配列番号３９）を示す。
【図３４Ｂ】
該ｇａｇ−ＩＡｐｏｌ融合フレームのタンパク質配列（配列番号３９）を示す。
【図１】
2004508064.tif 000054
【図２】
2004508064.tif 000055
【図３】
2004508064.tif 000056
【図４】
2004508064.tif 000057
【図５】
2004508064.tif 000058
【図６】
2004508064.tif 000059
【図７Ａ】
2004508064.tif 000060
【図７Ｂ】
2004508064.tif 000061
【図７Ｃ】
2004508064.tif 000062
【図８Ａ】
2004508064.tif 000063
【図８Ｂ】
2004508064.tif 000064
【図９】
2004508064.tif 000065
【図１０】
2004508064.tif 000066
【図１１】
2004508064.tif 000067
【図１２】
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【図１３】
2004508064.tif 000069
【図１４】
2004508064.tif 000070
【図１５Ａ】
2004508064.tif 000071
【図１５Ｂ】
2004508064.tif 000072
【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
2004508064.tif 000075
【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
2004508064.tif 000077
【図１５Ｈ】
2004508064.tif 000078
【図１５Ｉ】
2004508064.tif 000079
【図１５Ｊ】
2004508064.tif 000080
【図１５Ｋ】
2004508064.tif 000081
【図１５Ｌ】
2004508064.tif 000082
【図１５Ｍ】
2004508064.tif 000083
【図１５Ｎ】
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【図１５Ｏ】
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【図１５Ｐ】
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【図１５Ｑ】
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【図１５Ｒ】
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【図１５Ｓ】
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【図１５Ｔ】
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【図１５Ｕ】
2004508064.tif 000091
【図１５Ｖ】
2004508064.tif 000092
【図１５Ｗ】
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【図１５Ｘ】
2004508064.tif 000094
【図１６】
2004508064.tif 000095
【図１７Ａ】
2004508064.tif 000096
【図１７Ｂ】
2004508064.tif 000097
【図１７Ｃ】
2004508064.tif 000098
【図１８】
2004508064.tif 000099
【図１９Ａ】
2004508064.tif 000100
【図１９Ｂ】
2004508064.tif 000101
【図２０】
2004508064.tif 000102
【図２１】
2004508064.tif 000103
【図２２】
2004508064.tif 000104
【図２３】
2004508064.tif 000105
【図２４】
2004508064.tif 000106
【図２５】
2004508064.tif 000107
【図２６Ａ】
2004508064.tif 000108
【図２６Ｂ】
2004508064.tif 000109
【図２６Ｃ】
2004508064.tif 000110
【図２６Ｄ】
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【図２６Ｅ】
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【図２６Ｆ】
2004508064.tif 000113
【図２６Ｇ】
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【図２６Ｈ】
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【図２６Ｉ】
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【図２６Ｊ】
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【図２６Ｋ】
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【図２６Ｌ】
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【図２６Ｍ】
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【図２６Ｎ】
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【図２６Ｏ】
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【図２６Ｐ】
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【図２６Ｑ】
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【図２６Ｒ】
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【図２６Ｓ】
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【図２６Ｔ】
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【図２６Ｕ】
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【図２６Ｖ】
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【図２６Ｗ】
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【図２６Ｘ】
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【図２６Ｙ】
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【図２６Ｚ】
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【図２６ＡＡ】
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【図２６ＡＢ】
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【図２６ＡＣ】
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【図２６ＡＤ】
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【図２６ＡＥ】
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【図２６ＡＦ】
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【図２６ＡＧ】
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【図２６ＡＨ】
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【図２６ＡＩ】
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【図２６ＡＪ】
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【図２６ＡＫ】
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【図２６ＡＬ】
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【図２６ＡＭ】
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【図２６ＡＮ】
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【図２６ＡＯ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【図２７Ｇ】
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【図２７Ｈ】
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【図２７Ｉ】
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【図２７Ｊ】
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【図２７Ｋ】
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【図２７Ｌ】
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【図２７Ｍ】
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【図２７Ｎ】
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【図２７Ｏ】
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【図２７Ｐ】
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【図２７Ｑ】
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【図２７Ｒ】
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【図２７Ｓ】
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【図２７Ｔ】
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【図２７Ｕ】
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【図２７Ｖ】
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【図２７Ｗ】
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【図２７Ｘ】
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【図２７Ｙ】
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【図２７Ｚ】
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【図２７ＡＡ】
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【図２７ＡＢ】
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【図２７ＡＣ】
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【図２７ＡＤ】
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【図２７ＡＥ】
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【図２７ＡＦ】
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【図２７ＡＧ】
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【図２７ＡＨ】
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【図２７ＡＩ】
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【図２７ＡＪ】
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【図２７ＡＫ】
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【図２７ＡＬ】
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【図２７ＡＭ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
2004508064.tif 000189
【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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