(57)【要約】Ｔ細胞の活性化に関与する受容体−リガンドペアを含む新規ポリペプチドを開示する。該ポリペプチドをコードする核酸分子ならびにそれを発現させるためのベクターおよび宿主細胞も開示する。該ポリペプチドまたはそのアゴニストおよびアンタゴニストはＴ細胞媒介性障害の治療に使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）図１Ａ（配列番号１）に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）図１Ａ（配列番号１）に記載の残基１−２００または残基２１−２００のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｃ）図１Ａ（配列番号１）に記載のポリペプチドに対して少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの天然に存在する対立遺伝子変異体または選択的スプライス変異体、
ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
ｆ）少なくとも約２５、５０、７５、１００または１００を超えるアミノ酸残基のポリペプチド断片をコードする（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のヌクレオチド配列、
ｇ）少なくとも約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００または１００を超えるヌクレオチドの断片を含む（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列、および
ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項２】
ａ）図２Ａ（配列番号１１）または図３Ａ（配列番号６）または図１２Ａ（配列番号１６）に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）図２Ａ（配列番号６）に記載の残基１−３２２もしくは残基４７−３２２または図３Ａ（配列番号１１）に記載の残基１−２８８もしくは残基１９−２８８、２０−２８８、２１−２８８、２２−２８８、２４−２８８もしくは２８−２８８または図１２Ａに記載の残基１−３０２もしくは残基１９−３０２、２０−３０２、２１−３０２、２２−３０２、２４−３０２もしくは２８−３０２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｃ）図２Ａ（配列番号６）または図３Ａ（配列番号１１）または図１２Ａ（配列番号６）に記載のポリペプチドに対して少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの天然に存在する対立遺伝子変異体または選択的スプライス変異体、
ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
ｆ）少なくとも約２５、５０、７５、１００または１００を超えるアミノ酸残基のポリペプチド断片をコードする（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のヌクレオチド配列、
ｇ）少なくとも約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００または１００を超えるヌクレオチドの断片を含む（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列、および
ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項３】
該ヌクレオチド配列が、機能しうる様態で発現制御配列に結合している、請求項１または２記載の核酸分子。
【請求項４】
請求項２記載の核酸分子を含んでなる宿主細胞。
【請求項５】
真核細胞である、請求項３記載の宿主細胞。
【請求項６】
原核細胞である、請求項３記載の宿主細胞。
【請求項７】
請求項３記載の宿主細胞の培養を適当な培地中で成長させ、該培養からポリペプチドを単離することを含んでなる、ポリペプチドの製造方法。
【請求項８】
請求項７記載の製造方法により製造されたポリペプチド。
【請求項９】
請求項１記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド。
【請求項１０】
請求項２記載の核酸分子によりコードされるポリペプチド。
【請求項１１】
ａ）図１Ａ（配列番号２）に記載のアミノ酸配列、
ｂ）成熟アミノ末端を残基２１に含む、図１Ａ（配列番号２）に記載の成熟アミノ酸配列、
ｃ）少なくとも約２５、５０、７５、１００または１００を超えるアミノ酸残基を含む図１Ａ（配列番号２）に記載のアミノ酸配列の断片、
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のオルソログ、および
ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の対立遺伝子変異体または選択的スプライス変異体
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
ａ）図２Ａ（配列番号７）または図３Ａ（配列番号１２）または図１２Ａ（配列番号１７）に記載のアミノ酸配列、
ｂ）成熟アミノ末端を残基４７に含む図２Ａ（配列番号７）に記載の、又は成熟アミノ末端を残基１９、２０、２１、２２、２４もしくは２８のいずれかに含む図３Ａ（配列番号１２）に記載の、又は成熟アミノ末端を残基１９、２０、２１、２２、２４もしくは２８のいずれかに含む図１２Ａ（配列番号１７）に記載の、成熟アミノ酸配列、
ｃ）少なくとも約２５、５０、７５、１００または１００を超えるアミノ酸残基を含む図２Ａ（配列番号７）または図３Ａ（配列番号１２）または図１２Ａ（配列番号１７）に記載のアミノ酸配列の断片、
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のオルソログ、および
ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の対立遺伝子変異体または選択的スプライス変異体
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
請求項９、１０、１１または１２記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体またはそのフラグメント。
【請求項１４】
モノクローナル抗体である、請求項１１記載の抗体。
【請求項１５】
ヒト抗体である、請求項１３記載の抗体。
【請求項１６】
ヒト化またはＣＤＲグラフティング抗体である、請求項１３記載の抗体。
【請求項１７】
Ｂ７ＲＰ１に又はＢ７ＲＰ１細胞外ドメインに結合する、請求項１３記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１８】
ＣＲＰ１へのＢ７ＲＰ１の結合を抑制する、請求項１３記載の抗体またはフラグメント。
【請求項１９】
請求項９、１０、１１または１２記載のポリペプチドと医薬上許容される担体、アジュバント、可溶化剤、安定剤または抗酸化剤とを含んでなる組成物。
【請求項２０】
請求項９、１０、１１または１２記載のポリペプチドの誘導体を含んでなるポリペプチド。
【請求項２１】
水溶性重合体で共有結合的に修飾された、請求項２０記載のポリペプチド。
【請求項２２】
異種アミノ酸配列に融合した請求項９、１０、１１または１２記載のポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチド。
【請求項２３】
該異種アミノ酸配列がＩｇＧ定常ドメインまたはそのフラグメントである、請求項２２記載の融合ポリペプチド。
【請求項２４】
請求項９、１０、１１または１２記載のポリペプチドを動物に投与することを含んでなる、Ｔ細胞媒介性障害の治療、予防または改善方法。
【請求項２５】
ａ）請求項９、１０、１１または１２記載のポリペプチドの発現の存在または量を測定すること、および
ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または量に基づき、Ｔ細胞媒介性障害またはＴ細胞媒介性障害に対する感受性を診断すること
を含んでなる、動物におけるＴ細胞媒介性障害またはＴ細胞媒介性障害に対する感受性の診断方法。
【請求項２６】
ａ）請求項９、１０、１１または１２記載のポリペプチドを試験分子と接触させること、および
ｂ）該試験分子に対する該ポリペプチドの結合の度合を測定すること
を含んでなる、ポリペプチドに結合する試験分子の同定方法。
【請求項２７】
該化合物に結合した場合の該ポリペプチドの活性を測定することを更に含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
請求項１、２または３記載の核酸分子を該動物に投与することを含んでなる動物におけるＴ細胞の活性化または増殖の調節方法。
【請求項２９】
請求項３記載の核酸分子を含んでなるトランスジェニック非ヒト哺乳動物。
【請求項３０】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１のアンタゴニストを該動物に投与することを含んでなる動物における免疫応答の抑制方法。
【請求項３１】
該アンタゴニストが、Ｂ７ＲＰ１に結合する抗体である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
Ｂ７ＲＰ１アンタゴニストまたはＣＲＰ１アンタゴニストまたはそれらの組合せを、ＩｇＥ産生を減少させるのに有効な量で投与することを含んでなる、動物におけるＩｇＥ産生を減少させる方法。
【請求項３３】
治療的に有効な量のＢ７ＲＰ１アンタゴニストまたはＣＲＰ１アンタゴニストまたはそれらの組合せを投与することを含んでなる、ＩｇＥ媒介性障害の予防または治療方法。
【請求項３４】
該Ｂ７ＲＰ１アンタゴニストが、Ｂ７ＲＰ１に結合しＩｇＥ産生を部分的または完全に抑制する抗体である、請求項３２または３３記載の方法。
【請求項３５】
該ＣＲＰ１アンタゴニストが、ＣＲＰ１に結合しＩｇＥ産生を部分的または完全に抑制する抗体である、請求項３２または３３記載の方法。
【請求項３６】
該ＩｇＥ媒介性障害が喘息またはアレルギー障害である、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
ＩｇＥアンタゴニストを投与することを更に含む、請求項３２または３３記載の方法。
【請求項３８】
該ＩｇＥアンタゴニストが抗ＩｇＥ抗体である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７ＲＰ１アゴニストまたはＣＲＰ１アゴニストを投与することを含んでなる、免疫応答の増強方法。
【請求項４０】
ＣＤ２８アゴニストを投与することを更に含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
Ｂ７．１またはＢ７．２またはそれらの両方を投与することを更に含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
Ｂ７ＲＰ１を又はＣＲＰ１のアゴニストを、所望によりＢ７．１またはＢ７．２と組合せて投与することを含んでなる、癌またはウイルス感染の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔリンパ球の活性化に関与するポリペプチドに関する。特に、本発明は、Ｔリンパ球共刺激ポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸、該ポリペプチドの製造のための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびに免疫抑制および免疫活性化に関連した疾患の治療のための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
適切なＴリンパ球（Ｔ細胞）免疫応答の生成のためには、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によりＴ細胞に２つのシグナルが与えられなければならない。まず第１に、特異性を決定する事象において、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を介してＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に抗原が提示されなければならない。第２に、Ｔ細胞上のＣＤ２８タンパク質とＡＰＣ上のＢ７ファミリーのメンバーとの関与により、抗原非依存性共刺激シグナルが送達されなければならない。生産的免疫応答は、増殖、分化、クローン増殖、および作用または機能をもたらす。該第２共刺激シグナルの不存在下では、Ｔ細胞は、アネルギーと称される長く持続する抗原特異的不応答状態となる。
【０００３】
Ｔ細胞は、サイトカインを分泌することにより、免疫応答を開始し、抗原特異的エフェクター機能を媒介し、他の白血球の活性を調節する。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞を他のリンパ球から区別するものであり、抗原がＭＨＣの環境中でＡＰＣにより提示された場合にのみ該抗原に結合しうる。特定のＴ細胞の機能的活性は、ＣＤ４およびＣＤ８のような膜抗原の発現と相関しうる。例えば、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、一般には、Ｔヘルパー細胞（ＴＨ）として機能し、ＭＨＣクラスＩＩにより拘束され、一方、ＣＤ８＋細胞は、一般には、細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ）として機能し、ＭＨＣクラスＩにより拘束される。
【０００４】
既に同定されている強力なＴ細胞共刺激ポリペプチドには、Ｂ７．１（Ｆｒｅｅｍａｎら  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３，２７１４−２７２２（１９８９），Ｆｒｅｅｍａｎら  Ｊｏｕｒ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．１７４，６２５−３１（１９９１））およびＢ７．２（Ｆｒｅｅｍａｎら  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２，９０９−９１１（１９９３）およびＦｒｅｅｍａｎら  Ｊｏｕｒ．Ｅｘｐｔ．Ｍｅｄ．１７８，２１８５−２１９２（１９９３））（またはそれぞれＣＤ８０およびＣＤ８６）と称されるポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドは、種々のＡＰＣ上で誘導的または構成的に発現され、Ｔ細胞上のＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４に対する膜結合性リガンドである。ＣＤ２８（ＡｒｕｆｆｏおよびＳｅｅｄ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４，８５７３−８５７７（１９８７）ならびにＧｒｏｓｓら  Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１４４，３２０１−３２１０（１９９０））は静止Ｔ細胞上で発現され、陽性共刺激シグナルを媒介する。ＣＴＬＡ−４（Ｂｒｕｎｅｔら  Ｎａｔｕｒｅ  ３２８，２６７−２７０（１９８７）およびＤａｒｉａｖａｃｈら  Ｅｕｒ．Ｊｏｕｒ．Ｉｍｍｕｎ．１８，１９０１−１９０５（１９８８））の発現はＴ細胞活性化に際して誘導され、それはＢ７．１およびＢ７．２への、より高い結合アフィニティーを有するため、ＣＤ２８シグナルを負に調節する。ＣＴＬＡ−４遺伝子を有さないマウスは劇的に高いレベルのＴ細胞を示す。なぜなら、ＣＴＬＡ−４の不存在下では、増殖シグナルのスイッチをオフにするメカニズムが欠損しているからである。この表現型は、ＣＴＬＡ−４共刺激タンパク質がＴ細胞増殖に与える主要な抑制効果を明らかに示している。ＣＤ２８またはＢ７．１またはＢ７．２を欠くマウスは、それほど重篤でない表現型を有し、このことは、Ｔ細胞共刺激の代替経路が存在しうることを示している。
【０００５】
Ｔ細胞の活性化および増殖を調節するための手段としてのＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４経路に、相当な関心が寄せられている。ヒトＦｃに融合したＣＴＬＡ−４の細胞外部分を含有するキメラタンパク質は、強力な免疫抑制効果を有し、種々の臨床場面において研究されている。Ｂ７．１およびＢ７．２タンパク質に対する抗体も、免疫抑制の領域における同様の適応に関して評価されている。抗ＣＴＬＡ−４抗体はＴ細胞活性化の促進における有用性を示している。また、Ｂ７．１およびＢ７．２遺伝子治療は癌免疫療法の領域において非常に有望であることを示している。
【０００６】
これまでのところ、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７．１およびＢ７．２は単一のＴ細胞共刺激経路に関与している。Ｔ細胞共刺激を調節することにより免疫応答をモジュレーションする能力を仮定すると、宿主Ｔ細胞機能および免疫応答の調節における有利な特性を有しうる同じ又は異なるＴ細胞共刺激経路の他のメンバーを同定することが望ましいであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、Ｔ細胞の活性および／または増殖の刺激のための新規ポリペプチドを提供することが、本発明の１つの目的である。Ｔ細胞媒介免疫障害の予防および治療のために該新規ポリペプチドを使用することが、本発明のもう１つの目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の概要）
驚くべきことに、Ｔ細胞共刺激経路の２つの新規ポリペプチドが同定された。該ポリペプチドは、既に記載されているタンパク質であるＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７．１およびＢ７．２よりなる経路とは異なるらしい特有の共刺激経路におけるリガンド−受容体ペアに相当する。それらのポリペプチドは、ＣＤ２８関連タンパク質１またはＣＲＰ１、およびＢ７関連タンパク質１またはＢ７ＲＰ１と称される。
【０００９】
本発明は、ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチドならびに関連ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。本発明の単離された核酸分子は、
ａ）図１Ａ（配列番号１）に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）図１Ａ（配列番号１）に記載の残基１−２００または残基２１−２００のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｃ）図１Ａ（配列番号１）に記載のポリペプチドに対して少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの天然に存在する対立遺伝子変異体または選択的スプライス変異体、
ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
ｆ）少なくとも約２５、５０、７５、１００または１００を超えるアミノ酸残基のポリペプチド断片をコードする（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のヌクレオチド配列、
ｇ）少なくとも約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００または１００を超えるヌクレオチドの断片を含む（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列、および
ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
また、
ａ）図２Ａ（配列番号６）または図３Ａ（配列番号１１）または図１２Ａ（配列番号１６）に記載のヌクレオチド配列、
ｂ）図２Ａ（配列番号６）に記載の残基１−３２２もしくは残基４７−３２２または図３Ａ（配列番号１１）に記載の残基１−２８８もしくは残基１９−２８８、２０−２８８、２１−２８８、２２−２８８、２４−２８８もしくは２８−２８８または図１２Ａに記載の残基１−３０２もしくは残基１９−３０２、２０−３０２、２１−３０２、２２−３０２、２４−３０２もしくは２８−３０２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｃ）図２Ａ（配列番号６）または図３Ａ（配列番号１１）または図１２Ａ（配列番号１６）に記載のポリペプチドに対して少なくとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかの天然に存在する対立遺伝子変異体または選択的スプライス変異体、
ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかに相補的なヌクレオチド配列、
ｆ）少なくとも約２５、５０、７５、１００または１００を超えるアミノ酸残基のポリペプチド断片をコードする（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）のヌクレオチド配列、
ｇ）少なくとも約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００または１００を超えるヌクレオチドの断片を含む（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレオチド配列、および
ｈ）（ａ）〜（ｇ）のいずれかにストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列
よりなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子が、本発明により提供される。
【００１１】
本発明の主題はまた、ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチドならびに関連ポリペプチドに関する。本発明は、
ａ）図１Ａ（配列番号２）に記載のアミノ酸配列、
ｂ）成熟アミノ末端を残基２１に含む、図１Ａ（配列番号２）に記載の成熟アミノ酸配列、
ｃ）少なくとも約２５、５０、７５、１００または１００を超えるアミノ酸残基を含む図１Ａ（配列番号２）に記載のアミノ酸配列の断片、
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のオルソログ、および
ｅ）（ａ）、（ｂ）または（ｄ）の対立遺伝子変異体または選択的スプライス変異体よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチドを提供する。
【００１２】
また、本発明には、
ａ）図２Ａ（配列番号７）または図３Ａ（配列番号１２）または図１２Ａ（配列番号１７）に記載のアミノ酸配列、
ｂ）成熟アミノ末端を残基４７に含む図２Ａ（配列番号７）に記載の又は成熟アミノ末端を残基１９、２０、２１、２２、２４もしくは２８のいずれかに含む図３Ａ（配列番号１２）に記載の又は成熟アミノ末端を残基１９、２０、２１、２２、２４もしくは２８のいずれかに含む図１２Ａ（配列番号１７）に記載の成熟アミノ酸配列、
ｃ）少なくとも約２５、５０、７５、１００または１００を超えるアミノ酸残基を含む図２Ａ（配列番号７）または図３Ａ（配列番号１２）または図１２Ａ（配列番号１７）に記載のアミノ酸配列の断片、
ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のオルソログ、および
ｅ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）の対立遺伝子変異体または選択的スプライス変異体
よりなる群から選ばれるアミノ酸配列を含んでなる単離されたポリペプチドが含まれる。
【００１３】
また、本発明には、該ポリペプチドの製造のための発現ベクターおよび宿主細胞、ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチドに及び関連ポリペプチドに結合する抗体、ならびにＣＲＰ１およびＣＲＰ１関連ポリペプチドへのＢ７ＲＰ１およびＢ７ＲＰ１関連ポリペプチドの結合を検出するためのアッセイも含まれる。ＣＲＰ１またはＣＲＰ１関連ポリペプチドおよびＢ７ＲＰ１またはＢ７ＲＰ１関連ポリペプチドを含む医薬組成物も、本発明に含まれる。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１と相互作用する化合物の同定方法、およびそのような化合物がＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１活性のアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを判定するためのアッセイも提供される。
【００１４】
ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチドはＴ細胞の共刺激および増殖に関与する。ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチド、その選択的結合剤ならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、Ｔ細胞応答の制御に関連した疾患の診断、予防および治療に有用でありうる。
【００１５】
ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチド、その選択的結合剤ならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、免疫障害の診断、予防および治療に、あるいは不十分な免疫応答を刺激したり又は過大もしくは不適当な免疫応答を軽減もしくは抑制するのに有用でありうる。該免疫障害はＴ細胞により直接的または間接的に媒介されうる。
【００１６】
本発明は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを動物に投与することを含んでなる、Ｔ細胞媒介性障害の治療、予防または改善を提供する。本発明はまた、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの発現の存在または量を測定することを含んでなる、動物におけるＴ細胞媒介性障害またはＴ細胞媒介性障害に対する感受性の診断方法、および該ポリペプチドの発現の存在または量に基づくＴ細胞媒介性障害またはＴ細胞媒介性障害に対する感受性の診断方法を提供する。典型的には、Ｔ細胞媒介性障害は、Ｔ細胞により直接的または間接的に媒介されうる免疫障害である。該動物は、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。本発明はまた、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドに結合する試験分子の同定方法であって、該ポリペプチドを試験化合物と接触させ、該試験化合物への該ポリペプチドの結合の度合を測定することを含んでなる方法を提供する。該方法は、ＣＲＰ１および／またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定するために使用することができる。
【００１７】
ＣＲＰ１および／またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのアンタゴニストは、自己免疫疾患（例えば、慢性関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、糖尿病および全身性エリテマトーデス）、毒素ショック症候群、骨髄および臓器移植、炎症性腸疾患、輸血による同種感作、および移植片対宿主病の治療を含む多数の適応症に対する免疫抑制剤として使用することができる。また、アンタゴニストは、抗体媒介性自己免疫ならびに喘息およびアレルギーを含むＴ細胞依存性Ｂ細胞媒介性適応症のための抑制性物質として使用することができる。ＣＲＰ１および／またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのアゴニストは、腫瘍サーベイランスおよび除去のためのＴ細胞活性化（これに限定されるものではない）において有用でありうる。
【００１８】
本発明のアンタゴニストは、Ｂ７ＲＰ１またはＢ７ＲＰ１の細胞外ドメインと反応性である又はそれらに結合する抗体（該抗体は、ＣＲＰ１へのＢ７ＲＰ１の結合を軽減または排除する）およびその断片を含む。１つの実施形態においては、該抗体は、ヒトＢ７ＲＰ１またはその細胞外ドメインに選択的に結合する。アンタゴニストである該抗体またはその断片は、Ｂ７ＲＰ１の免疫共刺激活性を部分的または完全に抑制する。好ましい実施形態においては、該抗体はモノクローナル抗体であり、マウス抗体、ヒト抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体でありうる。
【００１９】
本発明は更に、ＣＲＰ１の選択的結合剤またはＢ７ＲＰ１の選択的結合剤または両方を動物に投与することを含んでなる、ＣＲＰ１とのＢ７ＲＰ１の相互作用を調節する方法を提供する。１つの実施形態においては、該選択的結合剤は、Ｂ７ＲＰ１に結合しＣＲＰ１へのＢ７ＲＰ１への結合を軽減または排除する抗体である。本発明はまた、Ｂ７ＲＰ１の選択的結合剤を投与することを含んでなる、Ｂ７ＲＰ１により媒介される免疫共刺激を調節する方法を提供する。該選択的結合剤は、好ましくは、Ｂ７ＲＰ１に結合しＢ７ＲＰ１媒介性免疫共刺激を部分的または完全に抑制する抗体である。
【００２０】
本発明はまた、動物におけるＴ細胞の活性化または増殖を調節する方法であって、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする核酸分子を該動物に投与することを含んでなる方法を提供する。例えば、Ｂ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする核酸分子は、種々の腫瘍に応答したＴ細胞活性化を増強するために遺伝子治療において使用することができる。
【００２１】
また、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする核酸分子を含んでなるトランスジェニック非ヒト哺乳動物も、本発明に含まれる。該ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１核酸は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの発現および循環レベルの増加を可能にする様態で該哺乳動物内に導入する。該トランスジェニック非ヒト哺乳動物は、好ましくは、げっ歯類であり、より好ましくは、マウスまたはラットである。
【００２２】
Ｂ７ＲＰ１またはＣＲＰ１、またはＢ７ＲＰ１アゴニストまたはＣＲＰ１アゴニストを投与することを含んでなる刺激または増強するための方法も提供する。所望により、Ｂ７．１および／またはＢ７．２のような分子、またはＣＤ２８アゴニスト、ＣＴＬＡ４アンタゴニストのような１以上の他の免疫刺激分子を更に投与することにより、免疫応答を刺激または増強することが可能である。
【００２３】
また、Ｂ７ＲＰ１またはＣＲＰ１またはそれらの組合せ、Ｂ７ＲＰ１アゴニストまたはＣＲＰ１アゴニストまたはそれらの組合せ、またはＢ７ＲＰ１アンタゴニストまたはＣＲＰ１アンタゴニストまたはそれらの組合せを投与することを含んでなる、ＩｇＥ産生を調節する方法も、本発明により提供される。例えば、Ｂ７ＲＰ１の投与またはＢ７ＲＰ１およびＣＲＰ１アゴニストの組合せの投与はＩｇＥ産生を増加させ、不十分なＩｇＥ媒介性免疫応答を刺激するのに有用であろう。Ｂ７ＲＰ１アンタゴニストまたはＣＲＰ１アンタゴニストまたはそれらの組合せの投与はＩｇＥ産生を減少させ、過剰または不適当なＩｇＥ媒介性免疫応答を抑制するのに有用であろう。１つの実施形態においては、Ｂ７ＲＰ１アンタゴニストまたはＣＲＰ１アンタゴニストまたはそれらの組合せの投与により、ＩｇＥ産生が部分的または完全に抑制される。もう１つの実施形態において、本発明は、Ｂ７ＲＰ１アンタゴニストまたはＣＲＰ１アンタゴニストまたはそれらの組合せを投与することを含んでなる、ＩｇＥ媒介性障害の予防および／または治療方法を提供する。ＩｇＥ媒介性障害には、過剰なＩｇＥ産生により特徴づけられる障害、例えば、喘息、アレルギー障害、過敏症および洞炎症が含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
（発明の詳細な記載）
本発明は、Ｔ細胞活性化に関与する受容体−リガンドペアを含んでなる本発明においてＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１と称される新規ポリペプチドを提供する。該ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、マウス腸上皮内細胞から調製しＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４ポリペプチド（ＣＲＰ１の場合）またはＢ７．１およびＢ７．２ポリペプチド（Ｂ７ＲＰ１の場合）に対する相同性に基づきスクリーニングしたライブラリーから同定した。
【００２５】
ＣＤ２８関連タンパク質１（すなわち、ＣＲＰ１）は、アミノ末端におけるシグナル配列および細胞外ドメイン、膜貫通ドメインならびにカルボキシ末端細胞内ドメインを有するＩ型膜貫通タンパク質であると予想される（図１）。完全長ＣＲＰ１タンパク質は、その成熟形態において、１８０アミノ酸である。該推定リーダー配列はアミノ酸残基約１−２０（開始メチオニンに基づく）に伸長し、該成熟タンパク質の細胞外ドメインは残基約２１−１４５を含む（実施例１）。該推定膜貫通ドメインは残基約１４６−１６３に伸長し、該細胞内ドメインは残基約１６４−２００を含む。アミノ末端細胞外ドメインは、保存された推定分子内および分子間結合システインを有するＩｇループに類似している。さらに、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４へのＢ７．１およびＢ７．２の結合に重要であることが既に知られている「ＭＹＰＰＰＹ」モチーフも、部分的に保存されている。
【００２６】
マウスＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の間の２６％のアミノ酸同一性により例示されるとおり、ＣＤ２８とＣＴＬＡ−４との相同性は低い。ＣＲＰ１とマウスＣＤ２８とでは１９％のアミノ酸同一性が、ＣＲＰ１とマウスＣＴＬＡ−４とでは１４％の同一性が存在する。しかし、決定的に重要なシステイン残基は、残基４２、６３、８３、１０９および１３７（ＣＲＰ１タンパク質中の開始メチオニンに基づく：図１Ａを参照されたい）において、マウスＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４およびＣＲＰ１の間で保存されている。また、おおよその成熟タンパク質の長さ及びカルボキシ末端に対する膜貫通領域の位置は、ＣＲＰ１、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４において類似している。
【００２７】
ヒトＣＲＰ１は、図１３Ａに示すとおりのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を有する膜貫通タンパク質である。該推定リーダー配列は残基約１−１９または約１−２０に伸長する。該推定成熟アミノ末端は残基２０または２１に存在する。好ましくは、該成熟アミノ末端は２１位に存在する。該細胞外ドメインは、推定成熟アミノ末端のいずれかからアミノ酸残基約１４０まで伸長し、該膜貫通ドメインは残基約１４１−１６１に伸長し、該細胞内ドメインは残基約１６２−１９９に伸長する。ヒトＣＲＰ１タンパク質は該マウスタンパク質に対して６９％の同一性を有し、該対応ヌクレオチド配列は７７％同一である。ヒトＣＲＰ１の配列は、Ｈｕｔｌｏｆｆら  Ｎａｔｕｒｅ  ３９７，２６３−２６６（１９９９）に報告されている。
【００２８】
Ｂ７関連タンパク質１（すなわち、Ｂ７ＲＰ１）は、アミノ末端におけるシグナル配列および細胞外ドメイン、膜貫通ドメインならびにカルボキシ末端細胞内ドメインを有するＩ型膜貫通タンパク質であると予想される（図２Ａ）。完全長Ｂ７ＲＰ１タンパク質は、その成熟形態において、２７６アミノ酸である。該推定リーダー配列はアミノ酸残基約１−４６（開始メチオニンに基づく）に伸長し、該成熟タンパク質の細胞外ドメインは残基約４７−２７９を含む（実施例３）。該推定膜貫通ドメインは残基約２８０−２９８に伸長し、該細胞内ドメインは残基約２９９−３２２を含む。Ｂ７．１およびＢ７．２と同様に、Ｂ７ＲＰ１の細胞外ドメインは２つのＩｇループを含む。
【００２９】
マウスＢ７．１およびＢ７．２の間の２４％のアミノ酸同一性により例示されるとおり、Ｂ７．１とＢ７．２との相同性は低い。Ｂ７ＲＰ１とマウスＢ７．１とでは２０％のアミノ酸同一性が、Ｂ７ＲＰ１とマウスＢ７．２とでは１９％の同一性が存在する。しかし、決定的に重要なシステイン残基は、残基６２、１３８、１８５および２４２（Ｂ７ＲＰ１タンパク質中の開始メチオニンに基づく：図２Ａ）において、マウスＢ７．１、Ｂ７．２およびＢ７ＲＰ１の間で保存されている。また、おおよその成熟タンパク質の長さ及びカルボキシ末端に対する膜貫通領域の位置は、ｍＢ７ＲＰ１、Ｂ７．１およびＢ７．２において類似している。
【００３０】
また、ヒトＢ７ＲＰ１は、Ｉｇループ構造に必要な細胞外ドメイン中の保存システイン残基を有する膜貫通タンパク質である。該推定リーダー配列は、図３Ａに示すとおり、残基約１−１８、１−１９、１−２０、１−２１、１−２３または１−２７を含む。該推定成熟アミノ末端は残基１９、２０、２１、２２、２４または２８のいずれかに存在しうる。好ましくは、該アミノ末端は１９１位に存在する。該細胞外ドメインは、該成熟アミノ末端のいずれかからアミノ酸残基約２５９まで伸長する。該膜貫通ドメインは残基約２５９−２７４に伸長する。該細胞内ドメインは残基２７５−３０２に伸長する。該完全長ヒトＢ７ＲＰ１ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図１２Ａに示す。ヒトＢ７ＲＰ１はは該マウスタンパク質に対して４３％同一である。
【００３１】
ＣＲＰ１とＢ７ＲＰ１とは互いに結合するが、ＣＲＰ１は、Ｂ７ＲＰ１関連タンパク質Ｂ７．２に、検出可能な様態では結合せず、Ｂ７ＲＰ１は、ＣＲＰ１関連ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４への検出可能な結合を示さない（実施例８）。Ｂ７ＲＰ１はＴ細胞増殖を調節することが示された。これは、おそらく、Ｂ７ＲＰ１とＣＲＰ１受容体との相互作用によるものであろう（実施例１１）。したがって、ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１は、Ｔ細胞の増殖および活性化を調節するための新規経路を代表するものである。
【００３２】
免疫共刺激ならびにＴ細胞の増殖および活性化が増加または減少されうるよう、Ｂ７ＲＰ１とＣＲＰ１との相互作用は調節されうる。例えば、マウスＢ７ＲＰ１に対して産生された抗Ｂ７ＲＰ１モノクローナルおよびポリクローナル抗体は、Ｂ７ＲＰ１／ＣＲＰ１相互作用を阻止し、また、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質により誘導されるＴ細胞増殖を阻止した（実施例１７を参照されたい）。ヒトＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトＢ７ＲＰ１−Ｆｃにより誘導されるヒトＴ細胞増殖を阻止した（実施例２１）。また、ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の添加は、慢性関節リウマチのモデルマウスにおいて、関節炎症状の発症を減少させた（実施例１８を参照されたい）。また、Ｂ７ＲＰ１／ＣＲＰ１共刺激は、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質またはこの経路の他のアクチベーターの添加により増強されうる（実施例２０）。
【００３３】
核酸分子
「単離された核酸分子」なる語は、それが天然で会合している少なくとも１つの混入核酸分子を含有しない核酸分子、好ましくは、いずれの他の混入哺乳類核酸分子をも実質的に含有しない核酸分子を意味する。
【００３４】
「対立遺伝子変異体」なる語は、生物の染色体上の或る与えられた遺伝子座を占める遺伝子の、いくつかの可能な天然に存在する代替形態の１つを意味する。
【００３５】
「スプライス変異体」なる語は、ＲＮＡ転写産物中のイントロン配列の選択的プロセシングにより生じる核酸分子、通常はＲＮＡを意味する。
【００３６】
「高（い）ストリンジェンシー（の）条件」なる語は、（１）洗浄のために低いイオン強度および高い温度、例えば、５０℃で０．１×ＳＳＣ（０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、０．１％  ＮａＤｏｄＳＯ４（ＳＤＳ）を使用する、または（２）ハイブリダイゼーション中に、変性剤、例えばホルムアミド、例えば０．１  ウシ血清アルブミンの存在下の５０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ホルムアミド、４２℃の５×ＳＳＣ（７５０  ＮａＣｌ，７５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）の存在下のフィコール／０．１％  ポリビニルピロリドン／５０ｍＭ  リン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）を使用する条件を意味する。高ストリンジェンシー条件のもう１つの具体例としては、４２℃の５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％  ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳおよび１０％  硫酸デキストラン、それに伴う、０．２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ中の４２℃での洗浄が挙げられる。
【００３７】
「中（等度に）ストリンジェンシー（な）条件」なる語は、前記のものより低いストリンジェンシーの洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件（例えば、温度およびイオン強度）を含む条件を意味する。中ストリンジェンシー条件の一例としては、２０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト液、１０％  硫酸デキストランおよび２０μｌ／ｍｌ  変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中、３７℃で一晩のインキュベーション、およびそれに続く、約３７〜５０℃での１×ＳＳＣ中でのフィルターの洗浄のような条件が挙げられる。当業者は、プローブの長さなどのような要因に適合させるために必要に応じて該温度、イオン強度および他のパラメーターを如何に調節するかを認識するであろう。
【００３８】
組換えＤＮＡ技術方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））および／またはＡｕｓｕｂｅｌら編，（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ  Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４））（それらの全体を参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【００３９】
本発明は、ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する。また、断片、対立遺伝子変異体、スプライス変異体である又はＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする分子に配列において相補的である核酸分子を提供する。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１をコードする分子に対して少なくとも約７０％同一である或いはＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１をコードする分子に中または高ストリンジェンシー条件でハイブリダイズする核酸分子も含まれる。該核酸分子はｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡまたは部分的もしくは全体的に合成物である核酸分子でありうる。好ましい実施形態においては、本発明の核酸分子は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１をコードする核酸分子に対して少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％同一である。
【００４０】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする遺伝子またはｃＤＮＡまたはその断片は、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーのハイブリダイゼーションスクリーニングまたはＰＣＲ増幅により得ることができる。該ライブラリーをスクリーニングするのに有用なプローブまたはプライマーは、同じ又は関連したファミリーの遺伝子からの他の公知遺伝子または遺伝子断片（例えば、システイン残基の保存された配置のようなＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１関連ポリペプチド中で見出される保存モチーフ）の配列情報に基づいて作製することができる。また、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする遺伝子が１つの種から同定されている場合には、その遺伝子の全部または一部をプローブとして使用して、他の種からの相同遺伝子を同定することが可能である。該プローブまたはプライマーを使用して、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子を発現すると考えられる種々の組織由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。
【００４１】
ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングするためにオリゴヌクレオチドプローブを使用する場合には、以下の２つの高ストリンジェンシー溶液を使用することができる。これらのうちの第１においては、３５℃〜６２℃の温度で０．０５％  ピロリン酸ナトリウムと共に６×ＳＳＣを使用し、該温度は該オリゴヌクレオチドプローブの長さに左右される。例えば、１４塩基対のプローブは３５〜４０℃で洗浄し、１７塩基対のプローブは４５〜５０℃で洗浄し、２０塩基対のプローブは５２〜５７℃で洗浄し、２３塩基対のプローブは５７〜６３℃で洗浄する。バックグラウンドの非特異的結合が高いと考えられる場合には、該温度を２〜３℃上昇させることが可能である。第２の高ストリンジェンシー溶液においては、オリゴヌクレオチドプローブを洗浄するためにテトラメチルアンモニウム  クロリド（ＴＭＡＣ）を使用する。１つのストリンジェントな洗浄溶液として、３Ｍ  ＴＭＡＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および０．２％  ＳＤＳが挙げられる。この溶液を使用する洗浄温度はプローブの長さと相関する。例えば、１７塩基対のプローブは約４５〜５０℃で洗浄する。
【００４２】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドまたはその断片製造するためのもう１つの手段は、当業者によく知られた方法（例えば、Ｅｎｇｅｌｓら，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．ｅｄ．，２８：７１６−７３４（１９８９）に記載のもの）を用いる化学合成である。これらの方法には、とりわけ、核酸合成のためのホスホトリエステル、ホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホナート法が含まれる。そのような化学合成のための好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化学を用いる高分子担持合成である。典型的には、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードするＤＮＡは数百ヌクレオチド長であろう。これらの方法を用いると、約１００ヌクレオチドより大きな核酸は幾つかの断片として合成されうる。ついで該断片を連結させて、完全長ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを形成させることができる。通常、該ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡ断片は、メチオニン残基をコードするＡＴＧを有する。宿主細胞内で産生されたポリペプチドがその細胞から分泌されることを意図するか否かに応じて、このメチオニンはＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの成熟形態上に存在する又は存在しないことが可能である。
【００４３】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１核酸分子、断片および／または誘導体であって、生物学的に活性なポリペプチドをそれ自体ではコードしないものも、哺乳類組織または体液サンプル中のＣＲＰ１もしくはＢ７ＲＰ１  ＤＮＡまたは対応ＲＮＡの存在に関して定性的または定量的に試験するための診断アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用でありうる。
【００４４】
いくつかの場合には、天然に存在するＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの核酸および／アミノ酸変異体を製造することが望ましいかもしれない。核酸変異体は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ増幅または他の適当な方法（ここで、該プライマーは所望の点突然変異を有する）を用いて製造することができる（突然変異誘発技術の説明に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲およびＡｕｓｕｂｅｌら，前掲を参照されたい）。また、Ｅｎｇｅｌｓら，前掲に記載されている化学合成を用いて、そのような変異体を製造することが可能である。当業者に公知の他の方法も用いることが可能である。
【００４５】
好ましい核酸変異体には、与えられた宿主細胞中でのＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチドの最適発現のために改変されたコドンを含有するものが含まれる。個々のコドンの改変は、タンパク質および宿主細胞の選択に左右されるであろう。そのような「コドン最適化」は、１つの具体例においては、与えられた宿主細胞中の高発現遺伝子において優先的に使用されるコドンを選択することにより行うことができる。高発現細菌遺伝子のコドン優先性に関する「Ｅｃｏｈｉｇｈ．Ｃｏｄ」のようなコドン出現頻度表を含むコンピューターアルゴリズムを使用することが可能であり、それはＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにより提供される。他の有用なコドン出現頻度表には、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ ｌｏｗ．ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」および「Ｙｅａｓｔ ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」が含まれる。他の好ましい変異体としては、野生型と比較した場合の後記のとおりの同類的なアミノ酸変化（例えば、この場合、天然に存在するアミノ酸側鎖の電荷または極性は、異なるアミノ酸での置換によっては実質的に改変されない）をコードするもの、および／または、新規グリコシル化および／またはリン酸化部位を生成するよう設計されたもの、または既存のグリコシル化部位および／またはリン酸化部位を欠失させるよう設計されたものが挙げられる。
【００４６】
ＣＲＰ１もしくはＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする遺伝子、ｃＤＮＡまたはその断片は、標準的な連結（ライゲーション）技術を用いて適当な発現ベクターまたは増幅ベクター中に挿入することができる。該ベクターは、典型的には、使用する個々の宿主細胞中で機能的であるものを選択する（すなわち、該遺伝子の増幅および／または該遺伝子の発現が生じうるよう、該ベクターは宿主細胞装置に和合性である）。ＣＲＰ１もしくはＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする遺伝子、ｃＤＮＡまたはその断片は、原核生物、酵母、昆虫（バキュロウイルス系）および／または真核宿主細胞中で増幅／発現させることができる。該宿主細胞の選択は、１つには、ＣＲＰ１もしくはＢ７ＲＰ１ポリペプチドまたはその断片がグリコシル化および／またはリン酸化されることになるか否かに左右されるであろう。そうされる場合には、酵母、昆虫または哺乳類宿主細胞が好ましい。
【００４７】
典型的には、該宿主細胞のいずれかにおいて使用する発現ベクターは、プラスミドの維持のための並びに挿入ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含有する。そのような配列は、「フランキング配列」と総称され、プロモーターおよび他の調節要素、例えばエンハンサー、複製起点要素、転写終結要素、供与および受容スプライス部位を含有する完全なイントロン配列、シグナルペプチド配列、リボソーム結合部位要素、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、および選択マーカー要素を含む。これらの要素のそれぞれについては後記で説明する。所望により、該ベクターは、「タグ」配列［すなわち、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドコード配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子であり、該オリゴヌクレオチド分子は、ポリＨｉｓ（例えばヘキサＨｉｓ）、または商業的に入手可能な対応抗体が存在するＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素インフルエンザウイルス）またはｍｙｃのような他の「タグ」をコードしている］を含有していてもよい。このタグは、典型的には、該ポリペプチドの発現に際して該ポリペプチドに融合され、宿主細胞からのＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのアフィニティー精製のための手段として機能しうる。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティーマトリックスとして該タグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーにより達成することができる。所望により、ついで或るペプチダーゼの使用のような種々の手段により、精製されたＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドから該タグを除去することができる。
【００４８】
ヒト免疫グロブリンヒンジおよびＦｃ領域をＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端において融合させることが、当業者において可能である。得られたＦｃ−融合タンパク質は、プロテインＡアフィニティーカラムを使用して精製することができる。免疫グロブリンＦｃ領域は、長いインビボ薬物動態学的半減期を示すことが公知であり、未融合対応物より実質的に大きなインビボ半減期を示すことが判明している。また、Ｆｃ領域との融合は、いくつかの分子の生物活性に有用でありうる該分子の二量体化／多量体化を可能にする。
【００４９】
該フランキング配列は、相同（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株に由来する）、異種（すなわち、宿主細胞の種または株以外の種に由来する）、ハイブリッド（すなわち、２以上の起源に由来するフランキング配列の組合せ）または合成体でありうる。あるいは、該フランキング配列は天然ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１核酸フランキング配列でありうる。そのような場合、該フランキング配列の起源は、任意の原核または真核生物、任意の脊椎または無脊椎生物、あるいは任意の植物でありうる。ただし、該フランキング配列は該宿主細胞装置内で機能的であり、該宿主細胞装置により活性化されうるものでなければならない。
【００５０】
本発明のベクター中で有用なフランキング配列は、当技術分野でよく知られたいくつかの方法のいずれかにより得ることができる。典型的には、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１核酸フランキング配列以外の本発明で有用なフランキング配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌクレアーゼ消化により予め同定されており、したがって、適当な制限エンドヌクレアーゼを使用して適当な組織源から単離されうる。いくつかの場合には、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が既知かもしれない。この場合、核酸合成またはクローニングのための前記方法を用いて、該フランキング配列を合成することができる。
【００５１】
該フランキング配列の全部または一部のみが既知である場合には、ＰＣＲを用いて及び／又は適当な同じ若しくは別の種に由来するオリゴヌクレオチドおよび／またはフランキング配列断片でゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、それを得ることができる。
【００５２】
該フランキング配列が未知の場合には、フランキング配列を含有するＤＮＡの断片を、例えばコード配列または更には別の遺伝子を含有しうる、より大きなＤＮＡ断片から単離することができる。単離は、適当なＤＮＡ断片を単離するための１以上の注意深く選択された酵素を使用する制限エンドヌクレアーゼ消化により達成されうる。消化後、所望の断片をアガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムまたは当業者に公知の他の方法により単離することができる。この目的を達成するための適当な酵素の選択は、当業者に容易に明らかとなるであろう。
【００５３】
複製起点要素は、典型的には、商業的に購入される原核性発現ベクターの一部であり、該起点は宿主細胞中での該ベクターの増幅を助ける。あるコピー数までの該ベクターの増幅は、いくつかの場合には、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの最適な発現のために重要でありうる。選択したベクターが複製起点部位を含有しない場合には、公知配列に基づいて化学的に合成し、該ベクターに連結することができる。
【００５４】
該転写終結要素は、典型的には、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドコード配列の末端の３’側に位置し、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの転写を終結するように機能する。通常、原核細胞における転写終結要素は、Ｇ−Ｃに富む断片、およびそれに続くポリＴ配列である。該要素はライブラリーから容易にクローニングされ、あるいは更にはベクターの一部として商業的に購入されるが、前記のような核酸合成法を用いて、それを容易に合成することも可能である。
【００５５】
選択マーカー遺伝子要素は、選択培地中で増殖させる宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードしている。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、テトラサイクリンまたはカナマイシンに対する耐性を原核宿主細胞に付与するタンパク質、（ｂ）該細胞の栄養要求性欠損を補うタンパク質、または（ｃ）複合培地からは入手不可能な決定的に重要な栄養素を供給するタンパク質をコードしている。好ましい選択マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００５６】
シャイン・ダルガルノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）と称される該リボソーム結合要素は、通常、ｍＲＮＡの翻訳の開始に必要である。該要素は、典型的には、該プロモーターの３’側且つ合成されるＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのコード配列の５’側に位置する。シャイン・ダルガルノ配列は様々であるが、典型的にはポリプリンである（すなわち、高いＡ−Ｇ含量を有する）。多数のシャイン・ダルガルノ配列が同定されており、それらのそれぞれは、前記の方法を用いて容易に合成し原核ベクター中で使用することができる。
【００５７】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを宿主細胞から分泌させるのが望ましい場合には、該宿主細胞からの該ポリペプチドの輸出を導くためにシグナル配列を使用することができる。また、宿主膜への結合を妨げるために、突然変異または欠失によりＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１膜貫通ドメインを不活性化させる。典型的には、該シグナル配列は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子またはｃＤＮＡのコード領域中に位置するか、あるいはＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子コード領域の直ぐ５’末端に位置する。多数のシグナル配列が同定されており、選択した宿主細胞中で機能的であるそれらの任意のものを、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子またはｃＤＮＡと共に使用することができる。したがって、該シグナル配列は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子またはｃＤＮＡに対して同種または異種であることが可能であり、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド遺伝子またはｃＤＮＡに対して同種または異種であることが可能である。また、該シグナル配列は、前記の方法を用いて化学的に合成することができる。
【００５８】
ほとんどの場合、シグナルペプチドの存在による宿主細胞からの該ポリペプチドの分泌は、該ポリペプチドからのアミノ末端メチオニンの除去を引き起こすであろう。
【００５９】
多くの場合、該ベクター中の１以上のイントロンの存在により、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子またはｃＤＮＡの転写が増強される。これは、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドが真核宿主細胞、特に哺乳類宿主細胞中で産生される場合に特に当てはまる。使用するイントロンは、使用する遺伝子が完全長ゲノム配列またはその断片である場合には特に、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子中に天然に存在しうる。該イントロンが（ほとんどのｃＤＮＡの場合のように）該遺伝子中に天然に存在しない場合には、該イントロンは別の起源から得ることができる。該イントロンは、有効となるように転写されなければならないため、５’フランキング配列およびＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子に対する該イントロンの位置が一般に重要である。したがって、該発現ベクター中に挿入されたＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子がｃＤＮＡ分子である場合には、該イントロンの好ましい位置は転写開始部位の３’側およびポリＡ転写終結配列の５’側である。好ましくは、該イントロンは、それがこのコード配列を遮断しないよう、該ｃＤＮＡの一方の側または他方の側（すなわち、５’または３’）に位置する。本発明を実施するためには、任意のウイルス、原核生物および真核生物（植物または動物）を含む任意の起源に由来する任意のイントロンを使用することができる。ただし、それは、それが挿入される宿主細胞に和合性でなければならない。合成イントロンも本発明に含まれる。所望により、２以上のイントロンを該ベクター中で使用することができる。
【００６０】
前記の要素の１以上が、使用するベクター中に予め存在しない場合には、それらを個々に得、該ベクター中に連結することができる。該要素のそれぞれを得るために用いる方法は、当業者によく知られている。
【００６１】
本発明を実施するための好ましいベクターとしては、細菌、昆虫および哺乳類宿主細胞に和合性のものが挙げられる。そのようなベクターには、とりわけ、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ｐＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）が含まれる。
【００６２】
該ベクターを構築し、完全長またはトランケート（短小）化ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドをコードする核酸分子を該ベクターの適当な部位に挿入した後、増幅および／またはポリペプチド発現のために、完成したベクターを適当な宿主細胞に挿入することができる。
【００６３】
宿主細胞は原核宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））または真核宿主細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞または脊椎動物細胞）でありうる。該宿主細胞は、適当な条件下で培養すると、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを合成し、ついでそれを培地から（該宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合）、またはそれを産生する宿主細胞から直接的に（それが分泌されない場合）集めることができる。集めた後、分子ふるいクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのような方法を用いてＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを精製することができる。
【００６４】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの製造のための適当な宿主細胞の選択は、所望の発現レベル、活性のために必要なポリペプチド修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）または生物学的に活性な分子へのフォールディングのし易さのような種々の要因に左右されるであろう。
【００６５】
適当な宿主細胞または細胞系としては、哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞、または３Ｔ３細胞が挙げられうる。適当な哺乳類宿主細胞、ならびに形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物の製造および精製のための方法の選択は、当技術分野で公知である。他の適当な哺乳類細胞系としては、サルＣＯＳ−１およびＣＯＳ−７細胞系、ならびにＣＶ−１細胞系が挙げられる。更なる典型的な哺乳類宿主細胞には、霊長類細胞系およびげっ歯類細胞系、例えば、形質転換細胞系が含まれる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養に由来する細胞株、および初代外植片も適している。候補細胞は、遺伝子型において該選択遺伝子を欠損していることが可能であり、あるいは優性作用性選択遺伝子を含有しうる。他の適当な哺乳類細胞系には、マウス神経芽細胞腫Ｎ２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、３Ｔ３系（Ｓｗｉｓｓ、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウスに由来するもの）、ＢＨＫまたはＨａＫハムスター細胞系が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
宿主細胞として同様に有用なものとして、細菌細胞が挙げられる。例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の種々の株（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０およびＭＣ１０６１）が、バイオテクノロジーの分野において宿主細胞としてよく知られている。枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス属菌種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、他のバシラス属菌種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ストレプトマイセス属菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．）などの種々の株も、この方法において使用することができる。
【００６７】
また、当業者に公知の酵母細胞の多数の株は、本発明のポリペプチドの発現のための宿主細胞として利用可能である。
【００６８】
さらに、所望により、昆虫細胞系を本発明の方法において使用することができる。そのような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：８１０−８１７（１９９３））、Ｌｕｃｋｌｏｗ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４：５６４−５７２（１９９３））およびＬｕｃｋｌｏｗら（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−４５７９（１９９３））に記載されている。好ましい昆虫細胞は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）である。
【００６９】
選択した宿主細胞中への発現ベクターの「形質転換」または「トランスフェクション」は、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクションまたはＤＥＡＥ−デキストラン法のような方法を用いて達成することができる。選択する方法は、１つには、使用する宿主細胞のタイプに左右されるであろう。これらの方法および他の適当な方法は当業者によく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲に記載されている。
【００７０】
発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞は、当業者によく知られた標準的な培地を使用して培養することができる。該培地は、通常は、該細胞の増殖および生存に必要なすべての栄養素を含有する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を培養するための適当な培地には、例えば、ルリアブロス（Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ）（ＬＢ）および／またはテリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）（ＴＢ）が含まれる。真核細胞を培養するための適当な培地には、ＲＰＭＩ  １６４０、ＭＥＭ、ＤＭＥＭが含まれ、それらはすべて、培養されている個々の細胞系の要求性に応じて血清および／または増殖因子で補足することができる。昆虫培養のための適当な培地は、必要に応じてイーストラート（ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン水解物および／またはウシ胎仔血清で補足されたグレース（Ｇｒａｃｅ）培地である。
【００７１】
典型的には、抗生物質、または形質転換細胞のみの選択的増殖に有用な他の化合物を、補足物として培地に加える。使用する化合物は、宿主細胞を形質転換したプラスミド上に存在する選択マーカー要素によって決まる。例えば、該選択マーカー要素がカナマイシン耐性である場合には、培地に加える化合物はカナマイシンとなる。
【００７２】
宿主細胞中で産生されるＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの量は、当技術分野で公知の標準的な方法を用いて評価することができる。そのような方法には、ウエスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動、非変性ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分離、免疫沈降および／または活性アッセイ、例えばＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００７３】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドが、宿主細胞から分泌されるように設計されている場合には、ポリペプチドの大部分は細胞培養培地中に見出されうる。このようにして製造されたポリペプチドは、典型的には、アミノ末端メチオニンを有さないであろう。なぜなら、それは該細胞からの分泌中に除去されるからである。しかし、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドが該宿主細胞から分泌されない場合には、それは細胞質および／または核（真核宿主細胞の場合）、あるいはサイトゾル（グラム陰性菌宿主細胞の場合）中に存在し、アミノ末端メチオニンを有しうる。
【００７４】
溶液からのＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの精製は、種々の技術を用いて達成することができる。該ポリペプチドが、それがタグ、例えばヘキサヒスチジン（ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１／ヘキサＨｉｓ）または他の小ペプチド、例えばＦＬＡＧ（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）またはｍｙｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）をそのカルボキシルまたはアミノ末端に含有するように合成されている場合には、該タグに対して又は直接的に該ポリペプチドに対して（すなわち、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを特異的に認識するモノクローナル抗体）高いアフィニティーをカラムマトリックスが有するアフィニティーカラムに該タグ付きポリペプチドを通過させることにより、それを１工程で実質的に精製することができる。例えば、ポリヒスチジンは、大きなアフィニティーおよび特異性でニッケルに結合する。したがって、ニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）ニッケルカラム）を、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１／ポリＨｉｓの精製に使用することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１０．１１．８節，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照されたい）。
【００７５】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを、タグを結合させずに製造した場合、および抗体が入手不可能な場合には、他の良く知られた精製方法を用いることができる。そのような方法には、イオン交換クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、天然ゲル電気泳動とゲル溶出との組合せ、ならびに分取等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍｅ」マシン／技術、Ｈｏｅｆｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が含まれるが、これらに限定されるものではない。いくつかの場合には、純度を増加させるために、２以上の精製技術を組合せることができる。
【００７６】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドが主として細胞内に見出されると予想される場合には、当業者に公知の任意の標準的な技術を用いて、細胞内物質（グラム陰性菌の封入体を含む）を該宿主細胞から抽出することができる。例えば、フレンチプレス、ホモジナイゼーションおよび／または音波処理およびそれに続く遠心分離により、ペリプラズム／細胞質の内容物を遊離させるために、該宿主細胞を細胞溶解することができる。
【００７７】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドがサイトゾル中に封入体を形成している場合には、該封入体は、しばしば、内部および／または外部細胞膜に結合することが可能であり、したがって主として、遠心分離後のペレット物質中に存在するであろう。ついで該ペレット物質を、極端なｐＨで処理したり、あるいは酸性ｐＨでのトリスカルボキシエチルホスフィンまたはアルカリ性ｐＨでのジチオトレイトールのような還元剤の存在下、カオトロピック剤（例えば、界面活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素または尿素誘導体）で処理して、該封入体を遊離、解離および可溶化することができる。ついで、今や可溶性形態になった該ポリペプチドを、ゲル電気泳動、免疫沈降などを用いて分析することができる。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを単離することが望ましい場合には、後記およびＭａｒｓｔｏｎら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１８２：２６４−２７５（１９９０）に記載されているような標準的な方法を用いて、単離を達成することができる。いくつかの場合には、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドは、単離直後には生物学的に活性でないかもしれない。該ポリペプチドを「リフォールディング」する又は該ポリペプチドをその三次元構造に変換しジスルフィド結合を生成させるための種々の方法を用いて、生物活性を回復させることができる。そのような方法は、該可溶化ポリペプチドを、特定の濃度の適当なカオトロープの存在下、通常は７を超えるｐＨを有する溶液と接触させることを含む。ほとんどの場合、該リフォールディング／酸化溶液はまた、該タンパク質のシステイン架橋の形成においてジスルフィド・シャフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）が生じるのを可能にする特定のレドックス電位を生成するよう、還元剤を又は還元剤および対応酸化形態を特定の比で含有する。一般に使用されるレドックス対のいくつかには、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチオビスＧＳＨ、塩化第二銅、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）／ジチアンＤＴＴ、２−メルカプトエタノール（ｂＭｅ）／ジチオ−ｂ（Ｍｅ）が含まれる。多くの場合、該リフォールディングの効率を増加させるためには共溶媒（ｃｏｓｏｌｖｅｎｔ）が必要であり、この目的に使用する、より一般的な試薬には、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコールおよびアルギニンが含まれる。
【００７８】
また、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド、その断片および／または誘導体は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９（１９６３））、Ｈｏｕｇｈｔｅｎら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：５１３２（１９８５））ならびにＳｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ（１９８４））に記載されているような当技術分野で公知の技術を用いる化学合成法（例えば、固相ペプチド合成）によっても製造することができる。そのようなポリペプチドは、アミノ末端にメチオニンを伴って又は伴わないで合成することができる。ジスルフィド架橋を形成するために、これらの参考文献に記載の方法を用いて、化学合成されたＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドまたは断片を酸化することができる。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドまたは断片は、組換え的に製造された又は天然起源から精製されたＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドに匹敵する生物活性を有すると予想され、したがって、組換え又は天然ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドと互換的に用いられうる。
【００７９】
ポリペプチド
「ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド」なる語は、図１Ａ（配列番号２）、図２Ａ（配列番号７）または図３Ａ（配列番号１２）のアミノ酸配列を有するポリペプチドおよび本明細書に記載のすべての関連ポリペプチドを意味する。関連ポリペプチドには、対立遺伝子変異体、スプライス変異体、断片、誘導、置換、欠失および挿入変異体、融合ポリペプチドならびにオルソログが含まれる。そのような関連ポリペプチドは、成熟ポリペプチド（すなわち、シグナルペプチドを欠くポリペプチド）でありうる。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドは、本明細書中に定義されている成熟ポリペプチドであることが可能であり、それが製造される方法に応じてアミノ末端メチオニンを有することも有さないこともある。
【００８０】
「ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド断片」なる語は、図１Ａ（配列番号２）、図２Ａ（配列番号７）または図３Ａ（配列番号１２）に記載のＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの完全長アミノ酸配列より短いペプチドまたはポリペプチドを意味する。そのような断片は、アミノ末端におけるトランケート化（短小化）、カルボキシ末端におけるトランケート化、および／または該ポリペプチド配列の内部の欠失から生じうる。そのようなＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド断片は、アミノ末端メチオニンを伴って又は伴わずに製造されうる。また、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド断片は、天然に存在するスプライス変異体、他のスプライス変異体、および天然に存在するインビボプロテアーゼ活性から生じる断片でありうる。好ましいＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド断片には、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１のいずれかの細胞外ドメインの一部または全部を含み機能的膜貫通ドメインを欠くＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１の可溶性形態が含まれる。
【００８１】
「ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド変異体」なる語は、図１Ａ（配列番号２）、図２Ａ（配列番号７）または図３Ａ（配列番号１２）に記載のＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドアミノ酸配列と比較して１以上のアミノ酸配列の置換、欠失および／または付加を含有するアミノ酸を有するＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを意味する。そのようなＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド変異体は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのＤＮＡ配列から変化したＤＮＡ配列を有する対応ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチド核酸分子変異体から製造することができる。
【００８２】
本発明で用いる「ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド誘導体」なる語は、例えば、１以上の水溶性重合体、Ｎ結合型もしくはＯ結合型炭水化物、糖、ホスファートおよび／または他のそのような分子（該分子は、野生型ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドに天然では結合していない）の付加により化学的に修飾されたＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド、その変異体または断片を意味する。誘導体は更に、該ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドに天然で結合している１以上の化学基の欠失を含む。
【００８３】
本発明で用いる「生物学的に活性なＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド」、「生物学的に活性なＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド断片」、「生物学的に活性なＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド変異体」および「生物学的に活性なＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド誘導体」なる語は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１に特徴的な活性の少なくとも１つを有するＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを意味する。１つの活性は、ＣＲＰ１へのＢ７ＲＰ１の結合である。もう１つの活性は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１がＴ細胞の増殖および／または活性化を刺激する能力である。
【００８４】
「オルソログ」なる語は、ある種から同定されたポリペプチドに対応するポリペプチドを意味する。例えば、マウスＢ７ＲＰ１とヒトＢ７ＲＰ１とはオルソログであるとみなされる。
【００８５】
「成熟アミノ酸配列」なる語は、リーダー配列を欠くポリペプチドを意味する。
【００８６】
「単離されたポリペプチド」なる語は、その天然環境中で見出される少なくとも１つの混入ポリペプチドを含有しないポリペプチド、好ましくは、他のいずれの混入哺乳類ポリペプチドをも実質的に含有しないポリペプチドを意味する。
【００８７】
当技術分野において公知のとおり、「同一性」なる語は、２以上の核酸分子または２以上のポリペプチドの配列の間の、それらの配列の比較により判定される関係を意味する。当技術分野においては、「同一性」は、場合によっては、一連のヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチにより判定されるポリペプチドまたは核酸分子配列間の配列関連性の度合をも意味する。「同一性」は、特定のコンピュータープログラム（すなわち、「アルゴリズム」）により検討されるギャップアライメントを伴う２以上の配列間の同一マッチの割合（％）を示す。
【００８８】
「類似性」なる語は、関連した概念であるが、「同一性」とは対照的に、同一マッチと同類置換マッチとの両方を含む類似性の尺度を意味する。同類置換はポリペプチドには適用されるが核酸分子には適用されないため、類似性はポリペプチド配列の比較のみに関するものである。２つのポリペプチド配列が、例えば、１０／２０の同一アミノ酸を有し、残りは全て非同類置換である場合には、同一性および類似性は共に５０％となろう。同じ例において、さらに５つの位置に同類置換が存在する場合には、同一性は５０％のままであるが、類似性は７５％となろう（１５／２０）。したがって、同類置換が存在する場合には、２つのポリペプチド間の類似性の度合（％）はそれらの２つの配列間の同一性（％）より高くなる。「同類」アミノ酸置換は、表Ｉを参照して後記で説明される。表Ｉに基づけば、同類アミノ酸置換体は、例えば塩基性、酸性、非荷電極性および無極性のような同一群から選ばれる代替的アミノ酸である。例えば、アルギニンに変わる同類アミノ酸置換体はリシンおよびヒスチジンであろう。
【００８９】
同一性および類似性は、公知方法により容易に計算することができる。そのような方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ,Ｓｍｉｔｈ,Ｄ.Ｗ.編,Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｆｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，ＨおよびＬｉｐｍａｎ，Ｄ，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載の方法が含まれるが、それらに限定されるものではない。
【００９０】
同一性および／または類似性を測定するための好ましい方法は、被検配列間で最大マッチを与えるように設計される。同一性および類似性を測定するための方法は、公に利用可能なコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性および類似性を測定するための好ましいコンピュータープログラム方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ、例えばＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１２（１）：３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０（１９９０））が含まれるが、それらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の入手元（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，ＮＣＢ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２１５：４０３−４１０（１９９０））から公に入手可能である。よく知られたＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも、同一性を測定するために使用することができる。
【００９１】
例えば、コンピューターアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一性（％）を測定したい２つのポリペプチドを、それらのそれぞれのアミノ酸の最適マッチング（該アルゴリズムにより測定される「マッチスパン（ｍａｔｃｈｅｄ  ｓｐａｎ）」）が得られるようにアライン（整列）させる。ギャップ開始ペナルティ（これは３×平均ダイアゴナルとして計算される；「平均ダイアゴナル」は、使用される比較マトリックスのダイアゴナルの平均である；「ダイアゴナル」は、個々の比較マトリックスにより各完全アミノ酸マッチに割り当てられたスコアまたは数である）およびギャップ伸長ペナルティ（これは通常は該ギャップ開始ペナルティの１／１０倍である）、ならびに比較マトリックス、例えばＰＡＭ  ２５０またはＢＬＯＳＵＭ  ６２を、該アルゴリズムと共に使用する。標準比較マトリックス（ＰＡＭ  ２５０比較マトリックスに関しては、Ｄａｙｈｏｆｆら，ｉｎ：Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐ．３（１９７８）を、ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較マトリックスに関しては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆら,Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）を参照されたい）も、該アルゴリズムにより使用される。
【００９２】
ポリペプチド配列の比較のための好ましいパラメーターには、以下のものが含まれる：
アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）；
比較マトリックス：ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）からのＢＬＯＳＵＮ  ６２；
ギャップペナルティ：１２；
ギャップ長ペナルティ：４；
類似性の閾値：０。
【００９３】
ＧＡＰプログラムは前記パラメーターで有用である。前記パラメーターは、ＧＡＰアルゴリズムを使用するポリペプチド比較（末端ギャップに関するペナルティを伴わない）のためのデフォルトパラメーターである。
【００９４】
核酸分子配列の比較のための好ましいパラメーターには、以下のものが含まれる：
アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）；；
比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；
ギャップペナルティ：５０；
ギャップ長ペナルティ：３。
【００９５】
ＧＡＰプログラムは前記パラメーターでも有用である。前記パラメーターは、核酸分子の比較のためのデフォルトパラメーターである。
【００９６】
Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９（１９９７年９月）に記載されているものを含む他の典型的なアルゴリズム、ギャップ開始ペナルティ、ギャップ伸長ペナルティ、比較マトリックス、類似性の閾値などが、当業者により使用されうる。行う個々の選択は、行う具体的な比較（例えば、ＤＮＡとＤＮＡ、タンパク質とタンパク質、タンパク質とＤＮＡ）に左右され、また、該比較が、与えられた配列対の間でのものなのか（この場合には、ＧＡＰまたはＢｅｓｔＦｉｔが一般には好ましい）、あるいは１つの配列と大きな配列データベースとの間のものなのか（この場合には、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）に左右されるであろう。
【００９７】
少なくとも７０％同一であるポリペプチドは、典型的には、野生型ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドと比較して１以上のアミノ酸の置換、欠失および／または付加を有するであろう。好ましい実施形態においては、ポリペプチドは、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドに対して約７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性を有する。通常、該ポリペプチドの実効電荷、極性または疎水性にほとんど又は全く影響を及ぼさないためには、該天然残基の置換体はアラニンまたは同類アミノ酸となる。同類置換を以下の表Ｉに記載する。
【００９８】
【表１】
2004520819.tif 000002
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド誘導体が本発明により提供される。１つの実施形態においては、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドが重合体に連結された化学修飾ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド組成物が、本発明の範囲内に含まれる。選択される重合体は、それが結合しているタンパク質が水性環境（例えば、生理的環境）中で沈殿しないよう、典型的には水溶性である。選択される重合体は、本方法において規定されているとおりに重合度が制御されうるよう、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有するように修飾される。該重合体は任意の分子量のものであってもよく、分枝状であっても非分枝状であってもよい。重合体の混合物も本発明の範囲内に含まれる。好ましくは、最終産物製剤の治療用途には、該重合体は医薬上許容しうるものである。
【００９９】
該水溶性重合体またはその混合物は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースまたは他の炭水化物に基づく重合体、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコールよりなる群から選ばれうる。
【０１００】
該アシル化反応の場合には、選択される重合体は単一の反応性エステル基を有すべきである。還元的アルキル化の場合には、選択される重合体は単一の反応性アルデヒド基を有すべきである。好ましい反応性アルデヒドは、水溶性であるポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシまたはアリールオキシ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照されたい）。
【０１０１】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのペジル化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、例えば以下の参考文献：Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，３：４−１０（１９９２）、ＥＰ  ０  １５４  ３１６およびＥＰ  ０  ４０１  ３８４に記載されているとおりの当技術分野で公知のペジル化反応のいずれかにより具体的に行なうことができる。好ましくは、ペジル化は、後記の反応性ポリエチレングリコール分子（または類似した反応性水溶性重合体）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して行なう。
【０１０２】
本発明で使用するための特に好ましい水溶性重合体は、ＰＥＧと略称されるポリエチレングリコールである。本発明で用いるポリエチレングリコールは、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの任意の形態（例えば、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−またはアリールオキシ−ポリエチレングリコール）を包含する意である。
【０１０３】
一般に、化学誘導体化は、生物学的に活性な物質を活性化重合体分子と反応させるのに使用される適当な任意の条件下で行なうことができる。ペジル化ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチドの製造方法は、一般には、（ａ）該ポリペプチドを、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドが１以上のＰＥＧ基に結合するようになる条件下、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）と反応させ、（ｂ）反応産物を得る工程を含む。一般には、該アシル化反応のための最適な反応条件は、公知のパラメーターおよび所望の結果に基づいて決定される。例えば、ＰＥＧ：タンパク質の比が大きくなるほど、ポリ−ペジル化産物の割合が高くなる。
【０１０４】
一般に、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１重合体コンジュゲートの投与により軽減またはモジュレーションされうる状態には、非コンジュゲート化ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドに関して本明細書に記載されているものが含まれる。しかし、本明細書に開示されているコンジュゲートは、非誘導体化分子と比較して追加的な活性、増強または軽減された生物活性、あるいは他の特性、例えば増加または減少された半減期を有しうる。
【０１０５】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド、断片、変異体および誘導体は、単独で、一緒に、または他の医薬組成物と組合せて使用することができる。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド、断片、変異体および誘導体は、治療されている適応症に応じて、サイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗炎症剤および／または化学療法剤と組合せて使用することができる。
【０１０６】
本発明は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１の選択的結合剤を提供する。選択的結合剤は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１に対する特異性を有する分子を意味し、タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、脂質または低分子量化合物を含みうる。選択的結合剤は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１と相互作用し、そしてＢ７ＲＰ１へのＣＲＰ１の結合を調節する。１つの実施形態においては、選択的結合剤は、Ｂ７ＲＰ１へのＣＲＰ１の結合を部分的または完全に遮断し、免疫共刺激活性のようなＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１の少なくとも１つの生物活性を部分的または完全に抑制する。もう１つの実施形態においては、該選択的結合剤は抗体である。該抗体は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１のいずれかと免疫反応性であり好ましくは、Ｂ７ＲＰ１と免疫反応性である。本発明の更にもう１つの実施形態においては、Ｂ７ＲＰ１と反応性の抗体がＢ７ＲＰ１上のエピトープに結合して、ＣＲＰ１への結合が部分的または完全に遮断され、免疫共刺激活性のようなＢ７ＲＰ１の少なくとも１つの生物活性が部分的または完全に抑制される。部分的に抑制なる語は、少なくとも検出可能なレベルの抑制が生じていることを意味する。完全に抑制なる語は、抑制における更なる増加が全く生じていないことを意味する。
【０１０７】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド、断片、変異体および／または誘導体は、当技術分野で公知の方法を用いて抗体を製造するために使用することができる。したがって、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドと反応する抗体、およびそのような抗体の反応性断片も、本発明の範囲内と意図される。該抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体および／または二重特異性抗体でありうる。典型的には、該抗体またはそのフラグメント（断片）はヒト由来であるか、または「ヒト化」（すなわち、患者に投与された場合に該抗体に対する免疫反応を妨げる又は最小限に抑えるよう製造される）される。該抗体フラグメントは、本発明のＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチドと反応性である任意のフラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦａｂ’など）でありうる。公知技術により、選択した哺乳動物に対して任意のＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドまたはその断片を抗原として提示し、ついで該哺乳動物の細胞（例えば、脾臓細胞）を或る癌細胞と融合して不死化細胞系を作製することにより製造したハイブリドーマも、本発明により提供される。そのような細胞系および本発明のヒトＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの全部または一部に対して産生させた抗体も、本発明に含まれる。
【０１０８】
本発明のモノクローナル抗体は「キメラ」抗体を含み、この場合、該重および／または軽鎖の部分は、特定の種に由来する又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同であるが、該鎖の残部は、別の種に由来する又は別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応配列と同一または相同である。また、そのような抗体のフラグメント（断片）も、それが所望の生物活性を示す限り、本発明に含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８５））。
【０１０９】
好ましい実施形態においては、該キメラ抗ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１抗体は「ヒト化」抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は当技術分野でよく知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト起源からそれに導入された１以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、当技術分野において記載されている方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従い、げっ歯類相補性決定部（ＣＤＲ）をヒト抗体の対応領域で置換することにより行うことができる。
【０１１０】
本発明はまた、完全ヒト抗ＣＲＰ１または抗Ｂ７ＲＰ１抗体を含む。内因性免疫グロブリン産生の不存在下でヒト抗体のレパートリーを産生しうるトランスジェニック動物（例えば、マウス）のＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１抗原での免疫により、そのような抗体を製造することができる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｃｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）を参照されたい。また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーにおいて製造することも可能である（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１））。
【０１１１】
本発明の選択的結合剤は、Ｂ７ＲＰ１へのＣＲＰ１の結合を調節するために及び免疫共刺激のようなＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１により媒介される少なくとも１つの生物活性を調節するために使用することができる。そのような選択的結合剤の一例としては、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１と免疫反応性の抗体が挙げられる。該抗体は、例えば、該ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチドのその結合相手への結合を抑制するために、治療用に使用することができる。該抗体は更に、体液または細胞サンプル中のＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチドの存在を検出するための標識形態におけるようなインビボおよびインビトロ診断目的に使用することができる。
【０１１２】
医薬組成物および投与
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの医薬組成物が、本発明の範囲内である。そのような組成物は、医薬上許容される担体と共に、治療的に有効な量の該ポリペプチドまたは断片、変異体または誘導体を含みうる。好ましい実施形態においては、医薬組成物は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１細胞外ドメインの一部または全部を含む可溶性形態としてのＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを含む。典型的には、ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチド治療用化合物は、１以上の生理的に許容される担体、賦形剤または希釈剤と共に精製ポリペプチド、断片、変異体または誘導体を含む組成物の形態で投与される。該担体物質は、好ましくは、哺乳動物への投与用の溶液において一般的な他の物質で補足された注射用水でありうる。血清アルブミンと混合された食塩水または中性緩衝食塩水が、典型的な適当な担体である。好ましくは、該産物は、適当な賦形剤（例えば、スクロース）を使用して凍結乾燥物として製剤化される。所望により、他の標準的な担体、希釈剤および賦形剤を含有させることが可能である。他の典型的な組成物は、ｐＨ約７．０〜８．５のＴｒｉｓバッファー、またはｐＨ約４．０〜５．５の酢酸バッファーを含み、それは更に、ソルビトールまたはその適当な代替物を含みうる。
【０１１３】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１医薬組成物は非経口的に投与することができる。あるいは、該組成物は、静脈内または皮下に投与することができる。本発明で使用する治療用組成物は、全身投与される場合には、発熱物質を含まない非経口的に許容される水溶液の形態でありうる。ｐＨ、等張性、安定性などに相当な配慮をして、そのような医薬上許容されるタンパク質溶液を製造することは、当業者の技量の範囲内である。
【０１１４】
本発明を実施するために有用なＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチド組成物の治療用製剤は、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形態で、所望により使用する生理的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９０））と、所望の純度を有する選択された組成物とを混合することにより、保存用に製造することができる。許容される担体、賦形剤または安定剤は、被投与者に無毒性であり、好ましくは、用いる投与量および濃度で不活性であり、バッファー、例えばリン酸塩、クエン酸塩または他の有機酸；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸；低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシン；単糖類、二糖類および他の炭水化物、例えばグルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート化剤、例えばＥＤＴＡ；糖アルコール、例えばマンニトールまたはソルビトール；塩形成対イオン、例えばナトリウム；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０１１５】
治療用に使用するＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド組成物の有効量は、例えば、治療目的（例えば、ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチドが使用される適応症）、投与経路および患者の状態に左右されるであろう。したがって、治療実施者は投与量を力価測定し、最適な治療効果を得るために必要に応じて投与経路を改変する必要があろう。典型的な１日量は、前記の要因に応じて約０．１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで又はそれ以上の範囲となりうる。典型的には、臨床家は、所望の効果を与える投与量に達するまで該組成物を投与するであろう。したがって、該組成物は、１回の用量で、または時間を隔てて２回以上の用量（これらは、同じ量のＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを含有していても含有していなくてもよい）で、または埋め込み装置またはカテーテルによる連続的注入により投与することができる。
【０１１６】
さらなる研究が行なわれるにつれて、種々の患者における種々の状態の治療のための適当な投与量レベルに関する情報が得られるであろう。当業者は、治療状況、治療中の障害のタイプ、被投与者の年齢および全身健康状態に応じて、適切な投与を確認することができるであろう。
【０１１７】
インビボ投与に使用するＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド組成物は無菌性でなければならない。これは、滅菌濾過膜による濾過により容易に達成される。該組成物を凍結乾燥する場合には、これらの方法を用いる滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれに行なってもよい。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態または溶液として保存することになろう。
【０１１８】
治療用組成物は、一般に、無菌の出入口を有する容器、例えば静脈内用溶液バッグ、または皮下注射針が貫通しうる栓を有するバイアル内に入れる。
【０１１９】
該組成物の投与経路は、公知方法に従い、例えば、経口的に、または静脈内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内または病巣内経路による注射または注入により、または徐放系または埋め込み装置（これは、所望により、カテーテルの使用を伴うものでありうる）によるものである。必要に応じて、該組成物は、注入、ボーラス注入または埋め込み装置により連続的に投与することができる。
【０１２０】
その代わりに又はそれに加えて、ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１ポリペプチドを吸収している膜、スポンジまたは他の適当な物質を罹患領域内に埋め込むことにより、該組成物を局所的に投与することができる。
【０１２１】
埋め込み装置を使用する場合には、適当な任意の組織または器官内に該装置を埋め込むことができ、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの運搬は、ボーラスまたは連続投与による装置から直接的なもの、または連続的注入を用いるカテーテルを介したものでありうる。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドは、徐放性の処方または製剤として投与することができる。徐放製剤の適当な具体例には、成形品（例えば、フィルム）の形態の半透性重合体マトリックス、またはマイクロカプセルが含まれる。徐放性マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミンとの共重合体（Ｓｉｄｍａｎら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））、エチレンビニルアセタート（Ｌａｎｇｅｒら，前掲）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ  １３３，９８８）が含まれる。徐放性組成物にはまた、リポソームが含まれ、これは、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかにより製造することができる（例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；ＥＰ  ３６，６７６；ＥＰ  ８８，０４６；ＥＰ  １４３，９４９）。
【０１２２】
場合によっては、エクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）法により、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド組成物を使用するのが望ましいかもしれない。この場合、患者から摘出した細胞、組織または器官をＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド組成物にさらし、ついで該細胞、組織および／または器官を該患者に再移植する。
【０１２３】
他の場合においては、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド、断片、変異体または誘導体を発現し分泌するよう本明細書に記載されているような方法を用いて遺伝的に操作された或る細胞を患者に移植することにより、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを運搬することができる。そのような細胞は動物またはヒトの細胞であることが可能であり、患者自身の組織または別の起源（ヒトまたはヒト以外）に由来することが可能である。所望により、該細胞を不死化することができる。一方、免疫応答の機会を減少させるために、該細胞をカプセル化（封入）して周辺組織の浸潤を避けることが好ましい。該カプセル化物質は、典型的には、該タンパク質産物の放出を可能にするが患者の免疫系による又は周辺組織からの他の有害要因による該細胞の破壊を妨げる生体適合性半浸透性重合体封入容器または膜である。
【０１２４】
細胞の膜封入のための方法は当業者に良く知られており、カプセル化細胞の製造および患者へのその移植は、過度の実験を行うことなく達成することができる。例えば、米国特許第４，８９２，５３８号、第５，０１１，４７２号および第５，１０６，６２７号を参照されたい。種々の他の徐放または制御（コントロールド）運搬手段、例えば、リポソーム担体、生分解性粒子またはビーズを製剤化するための技術も当業者に公知であり、例えば、米国特許第５，６５３，９７５号に記載されている。該細胞は、封入されたものも封入されていないものも、患者の適当な身体組織または器官に移植することができる。
【０１２５】
前記のとおり、１以上のＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド、変異体、誘導体および／または断片で細胞調製物を処理することが望ましいかもしれない。それが細胞膜に透過性である形態の場合には、これは、例えば、骨髄細胞のようなＴ細胞を含む細胞を該ポリペプチド、変異体、誘導体または断片に直接さらすことにより達成されうる。例えば、Ｔ細胞を含む細胞を、Ｔ細胞機能を活性化するためにＢ７ＲＰ１ポリペプチドにさらすことが可能であり、そのように処理した細胞を患者に移植する。
【０１２６】
あるいは、遺伝子治療を用いることができる。遺伝子治療が適用されうる１つの様態は、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成するよう構成的または誘導性プロモーターに機能しうる様態で結合していてもよいＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子（ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド、またはその断片、変異体または誘導体をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよび／または合成ＤＮＡ）を使用することである。該プロモーターは、該構築物が挿入される細胞または組織型においてそれが活性である限り、内因性ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子と同種（相同）または異種でありうる。所望により、該遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて、部位特異的組込みのために設計されたＤＮＡ分子（例えば、相同組換えに有用な内因性フランキング配列）、組織特異的プロモーター、エンハンサーまたはサイレンサー、親細胞に対して選択上の利点をもたらしうるＤＮＡ分子、形質転換細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合剤（例えば、細胞ターゲッティング用のもの）、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによる発現を増強するための転写因子、およびベクターの製造を可能にする因子を含みうる。
【０１２７】
ついで、この遺伝子治療ＤＮＡ構築物を、（エクスビボまたはインビボで）患者の細胞内に導入することができる。該遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの手段は、ウイルス性ベクターによるものである。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の運搬のために遺伝子治療において典型的に使用される適当なウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、パピローマウイルスおよびレトロウイルスベクターが含まれる。これらのベクターのいくつか（例えば、レトロウイルスベクター）は、該遺伝子治療ＤＮＡ構築物を患者の細胞の染色体ＤＮＡに運搬し、該遺伝子治療ＤＮＡ構築物は該染色体ＤＮＡ中に組込まれうる。他のベクターはエピソームとして機能し、該遺伝子治療ＤＮＡ構築物は細胞質中に留まる。遺伝子治療ベクターの使用は、例えば、米国特許第５，６７２，３４４号、第５，３９９，３４６号に記載されている。
【０１２８】
ウイルスベクターを使用することなく遺伝子治療ＤＮＡ構築物を患者の細胞に運搬するための代替的手段には、リポソーム媒介導入、裸ＤＮＡの直接注入、受容体媒介導入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降法、および微粒子射撃（例えば、遺伝子銃）が含まれるが、これらに限定されるものではない。米国特許第４，９７０，１５４号、ＷＯ  ９６／４０９５８、第５，６７９，５５９号、第５，６７６，９５４号および第５，５９３，８７５号を参照されたい。
【０１２９】
遺伝子治療により細胞内の内因性ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの発現を増強するためのもう１つの手段は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドプロモーター中に１以上のエンハンサー要素を挿入するものであり、この場合、該エンハンサー要素はＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド遺伝子の転写活性を増強するよう機能しうる。使用するエンハンサー要素は、該遺伝子を活性化することを望む組織に基づいて選択され、その組織においてプロモーター活性化をもたらすことが知られているエンハンサー要素が選択されるであろう。例えば、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドをＴ細胞中で「有効」にするためには、ｌｃｋプロモーターエンハンサー要素を使用することができる。この場合、加える転写要素の機能的部分は、標準的なクローニング技術を用いて、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドプロモーターを含有するＤＮＡの断片中に挿入（そして、所望により、ベクターおよび／または５’および／または３’フランキング配列内などに挿入）することができる。ついで、「相同組換え構築物」として公知のこの構築物を、エクスビボまたはインビボで所望の細胞内に導入することができる。
【０１３０】
遺伝子治療は、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を修飾することによりＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド発現を減少させるために用いることができる。そのような修飾は、典型的には、相同組換え法により達成される。例えば、不活性化のために選択されたＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子のプロモーターの全部または一部を含有するＤＮＡ分子を操作して、転写を調節するプロモーターの断片を除去および／または置換することができる。この場合、該プロモーターの転写アクチベーターの結合部位および／またはＴＡＴＡボックスを、標準的な分子生物学的技術を用いて欠失させることができる。そのような欠失は、プロモーター活性を抑制し、それにより対応ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子の転写を抑制しうる。該プロモーター内の転写アクチベーター結合部位またはＴＡＴＡボックスの欠失は、該ＴＡＴＡボックスおよび／または転写アクチベーター結合部位ヌクレオチドの１以上が１以上のヌクレオチドの置換、欠失および／または挿入により突然変異したＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドプロモーター（調節されるＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子と同じ又は関連した種からのもの）の全部または関連部分を含むＤＮＡ構築物を作製することにより達成することができる。その結果、該ＴＡＴＡボックスおよび／またはアクチベーター結合部位は、減少した活性を有するか、または完全に不活性となる。この構築物は、典型的には、修飾されたプロモーターセグメントの天然（内因性）５’および３’フランキング領域に対応するＤＮＡの少なくとも約５００塩基を含有し、直接的に又は前記のウイルスベクター（エクスビボまたはインビボで）により適当な細胞内に導入されうる。典型的には、該細胞のゲノムＤＮＡ内への該構築物の組込みは、相同組換えによるものであり、この場合、該プロモーター構築物中の５’および３’フランキングＤＮＡ配列は、内因性染色体ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションにより該修飾プロモーター領域が組込まれるのを補助するように機能しうる。
【０１３１】
１以上のＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドを抑制することが望ましい場合には、他の遺伝子治療方法も用いることができる。例えば、選択されたＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチド遺伝子の少なくとも一部に相補的な配列を有するアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子を該細胞内に導入することができる。典型的には、それぞれのそのようなアンチセンス分子は、それぞれの選択されたＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１遺伝子の開始部位（５’末端）に相補的である。そして該アンチセンス分子が対応ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドｍＲＮＡにハイブリダイズする場合には、このｍＲＮＡの翻訳が妨げられる。
【０１３２】
あるいは、１以上のＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドのドミナントネガティブインヒビターを作製するために、遺伝子治療を用いることができる。この場合、それぞれの選択されたＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドの突然変異完全長またはトランケート化ポリペプチドをコードするＤＮＡを調製し、前記のウイルス的または非ウイルス的方法を用いて患者の細胞内に導入することができる。それぞれのそのような突然変異体は、典型的には、その生物学的役割において内因性ポリペプチドと競合するように設計される。
【０１３３】
アゴニストおよびアンタゴニスト
本発明はまた、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１の、一方または両方の分子の活性を調節するアゴニストおよびアンタゴニストを提供する。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１アゴニストは、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１の少なくとも１つの活性を刺激または増強する。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１アンタゴニストは、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１の少なくとも１つの活性を部分的または完全に抑制する。アゴニストおよびアンタゴニストは、ＣＲＰ１へのＢ７ＲＰ１の結合を改変する試験分子から同定されうる。
【０１３４】
「試験分子」なる語は、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドに結合してＣＲＰ１へのＢ７ＲＰ１の結合を改変する能力に関して評価中の分子を意味する。好ましくは、該試験分子は、少なくとも約１０−６Ｍのアフィニティー（親和）定数で結合する。
【０１３５】
ＣＲＰ１へのＢ７ＲＰ１の結合を測定するためには、種々のアッセイを用いることができる。これらのアッセイを用いて、試験分子を、それがＣＲＰ１へのＢ７ＲＰ１の結合の速度および／または度合を増強または減弱する能力に関してスクリーニングすることができる。１つのタイプのアッセイにおいては、ＣＲＰ１ポリペプチド、好ましくは、ＣＲＰ１の可溶性形態（例えば、細胞外ドメイン）をマイクロタイタープレートのウェルの底に結合させることにより固定化する。ついで放射能標識Ｂ７ＲＰ１および該試験分子を、１つずつ一度に（いずれの順序でもよい）または同時に該ウェルに加えることができる。インキュベーション後、該ウェルを洗浄し、放射能を計数して（シンチレーションカウンターを使用する）、Ｂ７ＲＰ１によるＣＲＰ１タンパク質への結合の度合を測定することができる。典型的には、該分子を或る範囲の濃度にわたり試験し、該結果の評価における正確さのために、該試験アッセイの要素の１以上を欠く一連の対照ウェルを使用することができる。この方法に代わる方法は、該タンパク質の「位置」を逆転させ、すなわち、Ｂ７ＲＰ１を該マイクロタイタープレートに固定化し、該試験分子および放射能標識ＣＲＰ１と共にインキュベートし、ＣＲＰ１結合の度合に関して測定することを含む（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ［１９９５］の第１８章を参照されたい）。
【０１３６】
放射能標識の代わりの手段として、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１をビオチンに連結させ、ついでビオチン化タンパク質の存在を、比色法またはストレプトアビジンの蛍光タグ化により検出されうる酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ［ＨＲＰ］またはアルカリホスファターゼ［ＡＰ］）に結合したストレプトアビジンを使用して検出することができる。また、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１に対する、ビオチンに共役した抗体を使用し、それを、ＡＰまたはＨＲＰに結合した酵素結合ストレプトアビジンと共にインキュベートした後で検出することができる。
【０１３７】
また、ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１を、アガロースビーズ、アクリルビーズまたは他のタイプのそのような不活性基体への結合により固定化することができる。該基体−タンパク質複合体を、該相補的タンパク質と該試験化合物とを含有する溶液中に配置することができる。インキュベーション後、該ビーズを遠心分離により沈殿させ、ＣＲＰ１とＢ７ＲＰ１との結合の量を、前記の方法を用いて評価することができる。あるいは、該基体−タンパク質複合体をカラム内で固定化し、該試験分子および相補的タンパク質を該カラムに通過させる。ついでＣＲＰ１とＢ７ＲＰ１との複合体の形成を、前記の技術（すなわち、放射能標識、抗体結合など）のいずれかを用いて評価することができる。
【０１３８】
ＣＲＰ１／Ｂ７ＲＰ１複合体の形成を増強または減弱する試験分子を同定するのに有用なもう１つのタイプのインビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴検出系、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅアッセイ系（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）である。Ｂｉａｃｏｒｅ系は、該製造業者のプロトコールを用いて実施することができる。このアッセイは、実質的には、検出器中に位置するデキストラン被覆センサーチップへのＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１の共有結合を伴う。ついで該試験化合物およびもう一方の相補的タンパク質を、該センサーチップを含有するチャンバー内に同時または連続的に注入することができる。結合する相補的タンパク質の量は、該センサーチップのデキストラン被覆側に物理的に会合した分子量の変化に基づき評価することができる。分子量の変化は、該検出系により測定されうる。
【０１３９】
いくつかの場合には、ＣＲＰ１／Ｂ７ＲＰ１複合体の形成の増強または減弱における使用に関して、２以上の試験化合物を一緒に評価することが望ましいかもしれない。これらの場合には、前記のアッセイは、そのような追加的な試験化合物を第１試験化合物と同時にまたはそれに続いて加えることにより、容易に修飾することができる。該アッセイの残りの工程は前記のとおりである。
【０１４０】
前記のようなインビトロアッセイは、ＣＲＰ１とＢ７ＲＰ１とによる複合体形成に対する効果に関して多数の化合物を迅速にスクリーニングするのに有利に用いることができる。該アッセイは、ファージディスプレイ、合成ペプチドおよび化学合成ライブラリーにおいて得られた化合物をスクリーニングするために自動化することができる。
【０１４１】
また、ＣＲＰ１とＢ７ＲＰ１との複合体形成を増強または減弱する化合物は、いずれかのポリペプチドを発現する細胞および細胞系を使用して細胞培養内でスクリーニングすることができる。細胞および細胞系は任意の哺乳類から得ることができるが、好ましくは、ヒトまたは他の霊長類、イヌまたはげっ歯類に由来する。ＣＲＰ１を表面に発現する細胞へのＢ７ＲＰ１の結合は、試験分子の存在下または不存在下で評価し、結合の度合は、例えば、Ｂ７ＲＰ１に対するビオチン化抗体を使用してフローサイトメトリーにより測定することができる。前記のタンパク質結合アッセイにおいて陽性と評価された化合物を更に評価するために、細胞培養アッセイを有利に用いることができる。
【０１４２】
治療用途
本発明のポリペプチドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、Ｔ細胞機能を調節するために使用することができる。アゴニストおよびアンタゴニストには、ＣＲＰ１および／またはＢ７ＲＰ１活性を調節する並びにＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１タンパク質の少なくとも１つの活性（例えば、Ｔ細胞機能に関連した１つの活性、例えば、Ｔ細胞の活性化）を増強または減弱する分子が含まれる。アゴニストまたはアンタゴニストは、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１と相互作用してそれらの活性を調節するタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質または低分子量分子のような補因子でありうる。潜在的ポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストには、該タンパク質の細胞外ドメインの一部または全部を含む可溶性または膜結合形態のＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１と反応する抗体が含まれる。ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１の発現を調節する分子は、典型的には、発現のアンチセンス調節体として作用しうるＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１タンパク質をコードする核酸を含む。
【０１４３】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１ポリペプチドならびにそのアゴニストおよびアンタゴニストは、自己免疫疾患の治療、移植片生存、腫瘍細胞増殖を抑制するための免疫細胞の活性化、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞媒介疾患および癌遺伝子免疫療法において使用することができる。１つの実施形態においては、ＣＲＰ１および／またはＢ７ＲＰ１機能のアンタゴニストまたはインヒビターは、慢性免疫細胞機能不全を伴う疾患における症状を軽減するのに有益でありうる。自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、免疫性血小板減少性紫斑病および乾癬が、ＣＲＰ１／Ｂ７ＲＰ１のアンタゴニストまたはインヒビターで治療されうる。また、慢性炎症性疾患、例えば炎症性腸疾患（クローン病および潰瘍性大腸炎）、バセドウ病、橋本甲状腺炎および糖尿病も、ＣＲＰ１／Ｂ７ＲＰ１のインヒビターで治療されうる。実施例１８に記載のとおり、げっ歯類慢性関節リウマチ疾患モデルにおける疾患の発症を、ＣＲＰ１−Ｆｃは抑制し、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃは促進する。このモデルにおけるこれらの逆の効果は、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃタンパク質に関する作動的役割およびＣＲＰ１−Ｆｃタンパク質に関する拮抗的役割を支持している。該結果はまた、この経路の操作によりＴ細胞応答が如何に調節されうるか、および慢性関節リウマチの進行におけるこの経路の重要性を示している。また、実施例１９に記載のとおり、インビボにおけるＢ７ＲＰ１−Ｆｃの発現はトランスジェニックマウスにおける炎症性腸疾患（ＩＢＤ）表現型を刺激する。この実施例は、腸内の炎症の発生におけるＢ７ＲＰ１／ＣＲＰ１の役割を支持している。したがって、ヒトＩＢＤを治療するために、該Ｂ７ＲＰ１／ＣＲＰ１経路のアンタゴニストを使用することが可能である。
【０１４４】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１のアンタゴニストは、骨髄および臓器移植のための免疫抑制剤として使用することが可能であり、移植片生存を延長させるために使用することが可能である。そのようなアンタゴニストは、既存の治療に優る有意な利点をもたらしうる。骨髄および臓器移植療法では、宿主による外来細胞または組織のＴ細胞媒介性拒絶に対処しなければならない。Ｔ細胞媒介性拒絶を抑制するための現在の治療計画は、薬物シクロスポリンまたはＦＫ５０６での処理を含む。薬物は有効であるが、患者は、肝毒性、腎毒性および神経毒性を含む重篤な副作用を受ける。シクロスポリン／ＦＫ５０６クラスの治療剤の標的は、遍在性発現を伴うホスファターゼであるカルシニューリンである。ＣＲＰ１の発現はＴ細胞に限定されるため、ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１のインヒビターは、現在の免疫療法剤の使用で認められる重篤な副作用を有さない可能性がある。
【０１４５】
ＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１のアンタゴニストは、自己免疫障害、例えば慢性関節リウマチ、乾癬、多発性硬化症、糖尿病および全身性エリテマトーデスに対する免疫抑制剤として使用することができる。
【０１４６】
また、ＣＲＰ１／Ｂ７ＲＰ１媒介性共刺激経路のアンタゴニストは、毒素ショック症候群、炎症性腸疾患、輸血による同種感作、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞媒介性疾患の軽減および移植片対宿主疾患の治療に使用することができる。
【０１４７】
Ｔ細胞活性化の遅延または増強をもたらすＣＲＰ１またはＢ７ＲＰ１の抗体、可溶性タンパク質（例えば細胞外ドメインを含むもの）および他の調節体を使用して、腫瘍に対する免疫応答を増強することができる。実施例２０は、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃがマウスにおける腫瘍細胞増殖を抑制しうることを示している。同様に、ヒトＢ７ＲＰ１−ＦｃまたはＢ７ＲＰ１／ＣＲＰ１経路の他のアクチベーターを使用して、ヒトの腫瘍に対する免疫応答を増強することが可能である。抗腫瘍活性は、一般に、強力な細胞溶解Ｔリンパ球成分を有すると考えられる。実際のところ、Ｂ７−Ｆｃ融合タンパク質の抗腫瘍作用（Ｓｔｕｒｍｈｏｅｆｅｌら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：４９６４−４９７２，１９９９）は細胞溶解性ＣＤ８＋  Ｔ細胞により媒介された。ＣＲＰ１も細胞溶解性ＣＤ８＋  Ｔ細胞上で発現されるため（実施例９）、実施例２０で示された抗腫瘍作用はＣＤ８＋  細胞上のＢ７ＲＰ１−Ｆｃの作用による可能性がある。また、該Ｂ７ＲＰ１／ＣＲＰ１経路を操作して、同種移植、移植片対宿主疾患および自己免疫疾患を含む多数の他の臨床場面におけるＣＴＬ応答を調節することが可能である。
【０１４８】
本発明のＢ７ＲＰ１遺伝子を使用する遺伝子治療は癌免疫療法において使用することができる。癌細胞中に導入されたＢ７ＲＰ１遺伝子は、それを、動物に再導入された際に免疫系のＴ細胞により認識されうる抗原提示細胞に形質転換しうる。該Ｔ細胞による該トランスフェクト化腫瘍細胞の認識は、該Ｂ７ＲＰ１遺伝子を発現する又は発現しない両方の腫瘍細胞を一掃する。この免疫療法アプローチは、種々の白血病、肉腫、黒色腫、腺癌、乳癌、前立腺腫瘍、肺癌、結腸癌および他の腫瘍に用いることができる。本発明は、種々の腫瘍に応答したＴ細胞活性化を増強するために、同様に該Ｂ７ＲＰ１遺伝子を使用することを含む。
【０１４９】
実施例１４に記載のとおり、Ｂ７ＲＰ１を発現するトランスジェニックマウスの表現型は、Ｂ７ＲＰ１が抗体産生の制御において重要であることを示している。Ｂ７ＲＰ１タンパク質の活性のアゴニストおよびアンタゴニストは、抗体産生の抑制または増強を要する治療的適応において有用でありうる。
【０１５０】
例えば、多数のワクチンは、有効かつ特異的な抗体応答を惹起することにより作用する。いくつかのワクチン、特に、腸微生物（例えば、Ａ型肝炎ウイルスおよびサルモネラ）に対するワクチンは、短寿命の抗体応答を惹起する。該ワクチンの有効性を増強するためには、この応答を増強し持続させることが望ましい。したがって、可溶性Ｂ７ＲＰ１、またはＣＲＰ１に対する活性化抗体は、ワクチンアジュバントとして働きうる。
【０１５１】
また、Ｂ７ＲＰ１／ＣＲＰ１経路のアクチベーターまたはアゴニストにより、抗ウイルス応答が増強される。実施例２０のデータは、細胞性免疫がＢ７ＲＰ１−Ｆｃにより増強されることを示している。また、Ｂ７ＲＰ１／ＣＲＰ１経路の他のアクチベーターまたはＢ７ＲＰ１−Ｆｃによる細胞性免疫機能の増強は、ウイルス感染細胞の排除において有益でありうる。相補的様態で、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃは、遊離ウイルスを体内から排除するのを助けるように機能しうる実施例１３で認められた抗体媒介性応答を増強しうる体液性免疫機能に影響を及ぼす。
【０１５２】
細胞性免疫機能の増強は、癌またはウイルス感染の治療において望ましいであろう。免疫応答は、別の免疫刺激経路の活性化と所望により組合されたＢ７ＲＰ１／ＣＲＰ１経路の活性化により増強されうる。マウス慢性過敏症モデルにおけるＢ７ＲＰ１とＢ７．２との相乗効果が実施例２４に示されている。したがって、免疫機能を刺激するために、Ｂ７ＲＰ１、またはＣＲＰ１のアゴニストをＢ７．２またはＢ７．２と共に投与することができる。もう１つの実施形態においては、免疫機能を刺激するために、ＣＤ２８アゴニストまたはＣＴＬＡ４アンタゴニストと共にＢ７ＲＰ１、またはＣＲＰ１のアゴニストを投与することができる。また、細胞性免疫機能を増強するために、Ｔ細胞刺激分子のような他の免疫刺激分子と共にＢ７ＲＰ１またはＣＲＰ１アゴニストを使用しうると予想される。１つの実施形態においては、ＣＲＰ１アゴニストは、ＣＲＰに結合しＣＲＰ１活性を刺激または増強する抗体である。
【０１５３】
逆に、抗体産生の抑制により改善されうる多数の臨床的状態が存在する。過敏症は、過剰または不適当になった正常であれば有益な免疫応答であり、免疫反応および組織損傷を招く。抗体媒介性の過敏症反応は、Ｂ７ＲＰ１活性のインヒビターによる拮抗に対して特に感受性でありうる。アレルギー、枯草熱、喘息および急性浮腫はＩ型過敏症反応を引き起こし、これらの反応は、Ｂ７ＲＰ１活性のタンパク質、抗体または低分子量インヒビターにより抑制されうる。
【０１５４】
全身性エリテマトーデス、関節炎（慢性関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎）、ネフロパシー（糸球体腎炎、膜性、メサンギウム毛細血管型、巣状分節性、巣状壊死性、三日月形、増殖性−尿細管疾患（ｔｕｂｕｌｏｐａｔｈｙ））、皮膚障害（天疱瘡および類天疱瘡、結節性紅斑）、内分泌疾患（甲状腺炎−バセドウ病、橋本甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病）、種々の肺疾患（特に肺胞炎）、種々の血管障害、小児脂肪便症（ＩｇＡの異常産生を伴うもの）、多数の貧血症および血小板減少症、ギラン・バレー症候群ならびに重症筋無力症を含む、抗体媒介性過敏症反応を引き起こす疾患が、Ｂ７ＲＰ１アンタゴニストで治療されうる。
【０１５５】
また、リンパ増殖性障害、例えば多発性骨髄腫、ワルデンストレーム・マクログロブリン血症およびクリオグロブリン血症が、Ｂ７ＲＰ１のタンパク質、抗体または小分子アンタゴニストにより抑制されうる。
【０１５６】
最後に、「人工的」免疫障害である移植片対宿主疾患が、Ｂ７ＲＰ１アンタゴニストによる抗体産生の抑制から利益がもたらされうる。
【０１５７】
該Ｂ７ＲＰ１／ＣＲＰ１経路はＩｇＥ産生の調節に関与する。ＩｇＥは、喘息、食物アレルギー、枯草熱、Ｉ型過敏症および洞炎症のようなアレルギー応答の媒介に特異的に関与する免疫グロブリンイソタイプである。アレルゲンにさらされると、Ｔ細胞とＢ細胞との協同作用が関与する過程が、該アレルゲンに特異的なＩｇＥのＢ細胞の産生を引き起こす。Ｂ細胞により循環中に放出されたアレルゲン特異的ＩｇＥは、高親和性ＩｇＥ受容体（ＦｃεＲＩ）を介してマスト細胞および好塩基球に結合にする。ＩｇＥが結合したマスト細胞および好塩基球は感作され、後の該アレルゲンに対する曝露が該表面受容体の架橋およびヒスタミンの放出を引き起こす。
【０１５８】
実施例２２は、Ｂ７ＲＰ１融合タンパク質を発現するトランスジェニックマウスが、正常マウスと比較して増加したレベルのＩｇＥを有することを示している。また、ＣＲＰ１「ノックアウト」マウスはＩｇＥへのクラススイッチの完全な抑制を示す（実施例２３を参照されたい）。これらの結果は、該Ｂ７ＲＰ１／ＣＲＰ１経路の活性化がＩｇＥ産生を招くことを示している。
【０１５９】
本発明は、ＩｇＥ産生を調節するための及びＩｇＥ媒介性障害を予防または治療するための、Ｂ７ＲＰ１またはＣＲＰ１のモジュレーターの使用を提供する。１つの実施形態においては、ＩｇＥ産生を部分的または完全に抑制するために、Ｂ７ＲＰ１またはＣＲＰ１のアンタゴニストを使用する。該アンタゴニストは、ＩｇＥレベルを減少させるための治療計画において、別々に又は組合せて使用することができる。Ｂ７ＲＰ１およびＣＲＰ１アンタゴニストの具体例には、核酸、ポリペプチド、ペプチド、抗体、炭水化物、脂質および小分子が含まれる。１つの実施形態においては、該アンタゴニストは、Ｂ７ＲＰ１に結合しＩｇＥ産生を部分的または完全に抑制する抗体である。もう１つの実施形態においては、該アンタゴニストは、ＣＲＰ１に結合しＣＲＰ１活性を部分的または完全に抑制する抗体である。もう１つの実施形態においては、Ｂ７ＲＰ１アンタゴニストおよびＣＲＰ１アンタゴニスト（例えば、Ｂ７ＲＰ１アンタゴニスト抗体およびＣＲＰ１アンタゴニスト抗体）の組合せを使用することができる。Ｂ７ＲＰ１およびＣＲＰ１アンタゴニストは、ＩｇＥ産生を減少させるのに有効な量で投与される。
【０１６０】
本発明のアンタゴニストは、過剰または不適当なＩｇＥ産生により特徴づけられる障害を予防および／または治療するために使用することができる。例えば、そのような障害には、アレルギー応答、例えば喘息、食物アレルギー、枯草熱、過敏症および洞炎症が含まれる。
【０１６１】
本発明はまた、ＩｇＥ産生を部分的または完全に抑制するための並びに過剰または不適当なＩｇＥ産生により特徴づけられる障害を予防および／または治療するための、ＩｇＥアンタゴニストと組合されたＢ７ＲＰ１アンタゴニストまたはＣＲＰ１アンタゴニストの使用を提供する。本発明で用いる「ＩｇＥアンタゴニスト」なる語は、アレルゲン刺激に対する応答が減弱または排除されるようＩｇＥと細胞上のその高親和性受容体ＦｃεＲＩとの相互作用を破壊または遮断する化合物を意味する。アンタゴニストには、抗ＩｇＥ抗体およびそのフラグメント（断片）、可溶性ＦｃεＲＩ受容体およびその断片、抗ＦｃεＲＩ抗体およびそのフラグメント（断片）、ＩｇＥ変異体およびその断片、ＩｇＥ結合性ペプチド、ＦｃεＲＩ受容体結合性ペプチド、ならびにＩｇＥに結合しうる又はＦｃεＲＩ受容体への結合に関してＩｇＥと競合しうる小分子が含まれる。また、アレルギー障害の治療のために、抗ヒスタミン薬、アレルゲン脱感作療法、アレルゲンに対する曝露の減少などと組合せてＢ７ＲＰ１アンタゴニストを使用することができる。
【０１６２】
いくつかの場合には、例えば、易感染者における免疫関連障害を予防および／または治療するために、ＩｇＥ産生を増加させることが有用かもしれない。そのような場合には、Ｂ７ＲＰ１を単独で又はＣＲＰ１アゴニストと組合せて、ＩｇＥ産生を増加させるのに十分な量で投与することができる。
【０１６３】
本発明はまた、Ｂ７ＲＰ１アンタゴニストまたはＣＲＰ１アンタゴニストを単独で又は喘息の治療のための１以上の物質と組合せて投与することを含んでなる、喘息の予防および／または治療を提供する。そのような物質（剤）の具体例には、気管支拡張薬（抗コリン作用性剤、β２アドレナリン作用性受容体アゴニスト、ロイコトリエンＤ４アンタゴニスト、ニューロキニンアンタゴニスト、カリウムチャンネル開口剤、サブスタンスＰアンタゴニスト、トロンボキサンＡ２アンタゴニストおよびキサンチン）、抗炎症剤（５−リポキシゲナーゼインヒビター、５−リポキシゲナーゼ活性化タンパク質インヒビター、ホスホジエステラーゼＩＶインヒビター、血小板活性化因子アンタゴニスト、呼吸系ＮＳＡＩＤ、ステロイドおよびチロシンキナーゼインヒビター）、サイトカインインヒビター（ＣＤ４、ＩＬ−４およびＩＬ−５インヒビター）、および前記のＩｇＥアンタゴニストが含まれる。
【０１６４】
以下の実施例は、本発明をより詳しく例示するために記載されており、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例１】
【０１６５】
ＣＲＰ１  ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列
雌Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ  ６マウスを犠牲にし、小腸を切り出し、パイエル板を取り出した。該小腸組織をスライスして開き、洗浄して粘液および他の残渣を除去した。腸上皮内細胞（ｉＩＥＬ）を含有する上皮層を、３７℃で２０分間にわたり、１ｍＭ  ジチオトレイトール（ＤＴＴ）で補足されたＲＰＭＩ−１６４０中、穏やかな攪拌により遊離させた。解離した細胞を１００μフィルターに通過させ、５０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０中で洗浄して細胞塊を更に破壊し、ついで４０μ濾過器に通過させて単細胞集団を得た。ついでこれらの細胞を５０ｍｌ容量のＲＰＭＩ−１６４０中で再び洗浄して、残留ＤＴＴの除去を確実に行った。ついで前記のとおりに該組織を攪拌し洗浄して、残りのｉＩＥＬを集めた。該ｉＩＥＬを３段階Ｐｅｒｃｏｌ勾配上で脂肪細胞およびほとんどの上皮細胞から分離した（該ｉＩＥＬは４０〜８０％界面でバンド形成された）。ついでこれらの細胞をＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄して微量のＰｅｒｃｏｌを除去し、ＣＤ１０３（インテグリンαＩＥＬ）抗体で免疫染色し、ＦＡＣｓ  Ｓｔａｒセルソーター上で分離した。ついでこれらの分取細胞を、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を使用して直接的に全ＲＮＡを調製するために使用するか、あるいはプレート結合活性化抗体（これは、γ／δ  ＴＣＲ、α／β  ＴＣＲ、またはＣＤ３を架橋する）上で一晩活性化した。該ＲＮＡを前記のとおりに調製し、ＥＳＴ  ｃＤＮＡライブラリーの構築に使用するためにプールした。
【０１６６】
ｓｍｉ１２−０００８２−ａｌと称されるｃＤＮＡクローンは、ＣＤ２８に対するヌクレオチド配列相同性を含有していた（図１Ｂ）。該配列の翻訳およびそれに続く、公的データベース中の公知タンパク質との比較は、マウスＣＤ２８に対して１９％のアミノ酸同一性を示した（図１Ｂ）。マウスＣＤ２８はマウスＣＴＬＡ−４に対して２６％のアミノ酸同一性しか共有しないため、この低い相同性は有意であった。ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーにおける分子内および分子間システイン結合に決定的に重要と考えられる推定システインのすべては保存されていることが判明した（開始メチオニンに基づきアミノ酸残基８３、１０９および１３７）。また、該推定オープンリーディングフレームの全長および該膜貫通ドメインの相対位置は、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の両方のものに類似していた。本発明者らは該遺伝子をＣＤ２８関連タンパク質１（ＣＤ２８−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１）にちなんでＣＲＰ１と命名した。
【実施例２】
【０１６７】
ヒトＣＲＰ１  ｃＤＮＡのクローニング
ヒトＣＲＰ１タンパク質をコードする核酸配列を以下の方法により同定する。ヒトｃＤＮＡライブラリーを、正常ヒト志願者からの末梢ヒト血液からの富化リンパ球から調製した。該リンパ球を精製し、赤血球をＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ，ＣＡ）により除去した。ついで該細胞を、１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ、５００ｎｇ／ｍｌ  イオノマイシンおよびＣＤ３に対するプレート結合活性化抗体を含有する培地中で一晩活性化した。全ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ法（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）により該活性化細胞から調製し、ポリＡ  ＲＮＡをＤｙｎａｌビーズ精製により単離した。ｃＤＮＡを該単離ポリＡ  ＲＮＡから作製し、最大ｃＤＮＡ断片に関してサイズを選択した。ついで該サイズ選択ｃＤＮＡをプラスミドｐＳＰＯＲＴ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）中に連結した。組換えバクテリオファージプラークまたは形質転換細菌コロニーハイブリダイゼーションプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前掲）により該活性化リンパ球ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒトＣＲＰ１タンパク質をコードするＤＮＡを得る。実施例１および図１に記載のマウスＣＲＰ１遺伝子クローンからの放射能標識プローブを使用して、該ファージまたはプラスミドｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。該プローブを使用して、該プレート化ライブラリーから引き上げたナイロンフィルターをスクリーニングする。これらのフィルターを、５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、２×デンハルト液、０．５％  ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡ中で４２℃で４時間プレハイブリダイズさせ、ついで５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、２×デンハルト液、０．５％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡおよび５ｎｇ／ｍｌ  ｍＢ７ＲＰ１プローブ中で４２℃で２４時間ハイブリダイズさせる。該ブロットを２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で室温で１０分間、１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で５０℃で１０分間、０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で５０℃で１０分間、ついで再び０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中で５０℃で１０分間洗浄する。任意のヒトＣＲＰ１クローンから得たインサートを、実施例１に記載のとおりに配列決定し分析した。
【実施例３】
【０１６８】
Ｂ７ＲＰ１  ＤＮＡおよびアミノ酸配列
ｓｍｉｌ１−００００３−ｇ５と称されるｃＤＮＡクローンは、Ｂ７．１（ＣＤ８０）およびＢ７．２（ＣＤ８６）に対するヌクレオチド配列相同性を含有していた。該配列（図２Ａ）の翻訳およびそれに続く、公的データベース中の公知タンパク質との比較は、マウスＢ７．１（図２Ｂ）に対して２０％のアミノ酸同一性を示した。マウスＢ７．１はマウスＢ７．２に対して２４％のアミノ酸同一性しか共有しないため、この低い相同性は有意であった。この低い相同性にもかかわらず、このクローンのオープンリーディングフレームとマウスＢ７．１およびＢ７．２との間で、残基６２、１３８、１８５および２４２（開始メチオニンに基づく：図２Ｂ）において、決定的に重要なシステイン残基が保存されている。おおよその成熟タンパク質の長さ、および該カルボキシ末端に対する該膜貫通領域の位置も、このクローンの推定ＯＲＦにおいて、Ｂ７．１およびＢ７．２と比較して類似している。本発明者らは該遺伝子をＢ７関連タンパク質１（Ｂ７−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−１）にちなんでＢ７ＲＰ１と命名した。
【実施例４】
【０１６９】
ヒトＢ７ＲＰ１  ｃＤＮＡのクローニング
マウスＢ７ＲＰ１配列（図２を参照されたい）を使用するＧｅｎｂａｎｋ  ｂｌａｓｔ相同性検索（ＧＣＧ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）は、１６７９ｂｐのＯＲＦを有する４３５８ｂｐの配列を含有するクローン（ＡＢ０１４５５３）を導き出した。この配列に従いＰＣＲクローニングプライマーを設計した。Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｍｐｈ  Ｎｏｄｅ  Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ（商標）  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を該製造業者の推奨方法に従い使用する５’および３’ＲＡＣＥにより、１３１３ｂｐのＤＮＡ断片を得た。以下のプライマーを完全長ヒトＢ７ＲＰ１に使用した。
【０１７０】
【化１】
2004520819.tif 000003
プライマー２０８３−７５および２０８３−７６は、ＲＡＣＥ法を用いて該遺伝子の５’末端を増幅するために使用した。プライマー２０８３−７７、２０８３−７８、２１１３−２９、２１１３−３０および２１１２−３１は、ＲＡＣＥ法を用いて該遺伝子の３’末端を増幅するために使用した。
【０１７１】
得られたヌクレオチド配列は、メチオニンから始まる２８８アミノ酸残基のＯＲＦを含有していた。ついで該推定成熟ヒトＢ７ＲＰ１アミノ酸配列を該成熟マウスＢ７ＲＰ１アミノ酸配列（図３Ｂ）と比較し、それらは４８％のアミノ酸同一性を共有することが判明した。ＣＤ８０（Ｂ７．１）遺伝子における種間相同性は低く、実際のところ、マウスおよびヒトＣＤ８０は４１％のアミノ酸同一性しか共有しないため、この相同性は有意である。重要なことに、ヒトＢ７ＲＰ１タンパク質は、Ｉｇループ構造に必要な決定的に重要なシステイン残基（該成熟タンパク質に基づいた場合のアミノ酸残基１６、９２、１３８、１９４および１９５：図３Ｂ）を保存している。また、該膜貫通ドメインの位置および全長はヒトＢ７ＲＰ１ホモログと合致している。
【実施例５】
【０１７２】
Ｂ７ＲＰ１  ＲＮＡの発現
該Ｂ７ＲＰ１遺伝子に対するＲＮＡプローブを使用するＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。成体マウス組織を４％  ホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋し、５μｍで薄片化した。ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの前に、組織を０．２Ｍ  ＨＣＬで透過性を増加させ、ついでプロテイナーゼＫで消化し、トリエタノールアミンおよび無水酢酸でアセチル化した。薄片を、該マウスＢ７ＲＰ１配列のヌクレオチド１−９６９に対応する９６９塩基の３３Ｐ−標識リボプローブで５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。過剰のプローブを、ＲＮアーゼ消化、ついで漸減塩濃度を有するバッファー中での一連の洗浄、ついで５５℃で０．１×ＳＳＣ中での高ストリンジェンシーの洗浄により除去した。スライドをＫｏｄａｋ  ＮＴＢ２乳剤に浸け、４℃で２〜３週間露光し、現像し、ヘマトキシリンおよびエオシンで対比染色した。該組織形態学および該ハイブリダイゼーションシグナルの同時評価を可能にするために、薄片を暗視野および透過光照明で検査した。
【０１７３】
ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによるＢ７ＲＰ１  ＲＮＡの分析は、該Ｂ７ＲＰ１  ＲＮＡがリンパ系成熟およびリンパ球活性化の領域において高度に発現されることを示した。Ｂ７ＲＰ１  ＲＮＡは、胸腺、腸のパイエル板、脾臓およびリンパ節のリンパ様組織において発現された。これらのリンパ様組織内での発現は、該Ｂ７ＲＰ１  ＲＮＡがＢ細胞および他のＡＰＣが関与する領域において概ね発現されることを示した。これらの領域は、胸腺の髄領域、リンパ節の一次小胞およびパイエル板の小胞およびドーム領域が含まれる。Ｂ７ＲＰ１  ＲＮＡの発現は、リンパ系組織におけるＡＰＣ関与の領域に高度に特異的である。
【０１７４】
また、いくつかの非リンパ系組織の分析はＡＰＣ関与の領域におけるＢ７ＲＰ１発現を示した。肺においては、抗原プロセシングにおける機能と合致して、Ｂ７ＲＰ１発現は粘膜下組織領域内で見出された。小腸においては、Ｂ７ＲＰ１  ＲＮＡは固有層において見出された。注目すべきことに、本発明者らは、Ｂ７ＲＰ１  ＲＮＡの発現と重複するリンパ球浸潤を示す損傷された肝臓の薄片を見出した。組織損傷に応答したリンパ球蓄積とＢ７ＲＰ１発現とのこの合致は、Ｂ７ＲＰ１がリンパ球の活性化に関与していることを強く示している。
【実施例６】
【０１７５】
ＣＲＰ１  ＲＮＡの発現
該ＣＲＰ１遺伝子に対するＲＮＡプローブを使用するＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。マウス組織を実施例５と同様に調製した。組織の透過性の増加、プローブハイブリダイゼーション、スライド処理および組織染色は、実施例５に記載のとおりであった。薄片を、該マウスＣＲＰ１配列のヌクレオチド１−６０３に対応する６０３塩基の３３Ｐ−標識リボプローブで５５℃で一晩ハイブリダイズさせた。該組織形態学および該ハイブリダイゼーションシグナルの同時評価を可能にするために、薄片を暗視野および透過光照明で検査した。
【０１７６】
正常マウスまたはオキサゾロンで処理されたマウスからのリンパ節を薄片化し、ＣＲＰ１  ＲＮＡの発現に関して分析した。該感作マウスリンパ節は、正常マウスリンパ節より著しいＣＲＰ１  ＲＮＡ発現を示した。ＣＲＰ１の発現は、Ｔ細胞活性の領域である傍皮質におけるものであった。したがって、ＣＲＰ１  ＲＮＡの発現はＴリンパ球の発現と合致し、Ｔ細胞の活性化に際してアップレギュレーションされる。
【実施例７】
【０１７７】
ＣＲＰ１−ＦｃおよびＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現および精製
該ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質のＤＮＡ発現ベクターを構築するために、該ＣＲＰ１のアミノ末端の最初の１４７アミノ酸のコード配列を、ヒトＦｃ遺伝子（イソタイプＩｇＧ１）のカルボキシ末端の２３５アミノ酸のコード配列にインフレームで融合し、ｐｃＤＮＡ３（ｐｃＤＮＡ３／ＣＲＰ１−Ｆｃ）のポリリンカー配列内で連結した。該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質のＤＮＡ発現ベクターを構築するために、該Ｂ７ＲＰ１のアミノ末端の最初の２６９アミノ酸のコード配列を、ヒトＦｃ遺伝子（イソタイプＩｇＧ１）のカルボキシ末端の２３５アミノ酸のコード配列にインフレームで融合し、ｐｃＤＮＡ３（ｐｃＤＮＡ３／Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ）のポリリンカー配列内で連結した。ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１の両方のコード配列は、各タンパク質のＮ末端から各タンパク質の推定膜貫通領域まで（それは含まない）の配列を含有していた。ＦｕＧｅｎｅ  ６  トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、２９３Ｔ細胞をｐｃＤＮＡ３／ＣＲＰ１−ＦｃまたはｐｃＤＮＡ３／Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃでトランスフェクトした。４日後、該馴らし培地を集め、該Ｆｃ融合タンパク質を、プロテインＡセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用するバッチクロマトグラフィーにより精製した。該カラムに結合したＦｃ融合タンパク質を３カラム容積のＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ  Ｇｅｎｔｌｅ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶出し、ついで１５０容積の２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）に対して透析した。該透析タンパク質を、Ｍａｃｒｏｓｅｐ遠心濃縮器３０ｋＤ  ＭＷＣＯ（Ｐａｌｌ  Ｆｉｌｔｒｏｎ）を使用して濃縮し、該タンパク質濃度を、各タンパク質のアミノ酸配列から導かれた吸光係数を使用して計算した。ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現を図４Ａに示し、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現を図４Ｂに示す。
【実施例８】
【０１７８】
受容体リガンドペアとしてのＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１の同定
該新規タンパク質が、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７．１およびＢ７．２を含有するのと同じ共刺激経路の一部であるか否かを判定するために、本発明者らは、細胞表面ディスプレイアッセイを利用した。このアッセイは、細胞内で発現された膜結合タンパク質が種々のＦｃ融合タンパク質と相互作用するか否かを分析するためにＡＣＡＳ（Ａｄｈｅｒｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ）分析を用いるものである。図５の左側に示されている膜結合タンパク質を発現する細胞を、該図の上に示されているＦｃ融合タンパク質と共にインキュベートした。
【０１７９】
１０％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中で増殖させたＣｏｓ−７細胞を、２４ウェルプレート中で５００，０００細胞／ウェルでプレーティングした。ＦｕＧｅｎｅ６試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を使用して、細胞をトランスフェクトした。各トランスフェクションについて、３μｌのＦｕＧｅｎｅ６試薬を４７μｌの無血清ＤＭＥＭ培地に加えた。室温で１０分間のインキュベーションの後、該混合物を０．２５μｇのプラスミドに滴下し、ついで１５分間インキュベートした。ついで前記混合物を、１０％  ＦＢＳを含有する０．５ｍｌのＤＭＥＭと共に該細胞に加えた。該細胞を５％  ＣＯ２雰囲気中で３７℃でインキュベートした。また、対照として、ヒトＣＤ２８のｃＤＮＡを含有する発現プラスミドで安定にトランスフェクトされたＣＨＯ  Ｄ細胞を２４ウェルプレート中で５００，０００細胞／ウェルでプレーティングした。
【０１８０】
４８時間後、トランスフェクション試薬を含有する培地を除去し、該細胞をＲＰＭＩ  ＋５％  ＦＢＳで２回洗浄した。１ｍｌの培地中の１０〜２０ｎｇの精製Ｆｃ融合タンパク質を該細胞に加え、それを氷上で３０分間インキュベートした。該細胞をＲＰＭＩ  ＋  ５％  ＦＢＳで３回洗浄し、ついで２μｌのＦＩＴＣ共役抗ヒトＦｃ抗体（１ｍｇ／ｍｌ）と共に氷上で更に３０分間インキュベートした。ＲＰＭＩでの３回の連続的な洗浄の後、ＡＣＡＳ分析のために、該細胞を、フェノールレッドを含有しない２５０μｌのＲＰＭＩで培地で覆った。
【０１８１】
それらの種々のＦｃ融合タンパク質に結合した細胞のＡＣＡＳ分析は、該Ｂ７ＲＰ１タンパク質がＣＲＰ１には結合するが、公知共刺激経路中のタンパク質であるＣＤ２８にもＣＴＬＡ−４にも結合しないことを示した。逆に、ＣＲＰ１はＢ７ＲＰ１とは相互作用したが、該公知経路中の成分であるＢ７．２とは相互作用しなかった（図５を参照されたい）。これらの結果は、ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１が、ＣＤ２８およびＢ７．２に類似した新規受容体リガンドペアに相当することを強く示している。しかし、ＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１はＢ７．２、ＣＴＬＡ−４またはＣＤ２８とは相互作用しないため、それらは該公知共刺激経路とは別の独立したものである。
【実施例９】
【０１８２】
Ｂ７ＲＰ１受容体を発現する細胞の同定
ＦＡＣＳ分析により、恐らくＣＲＰ１タンパク質を含むＢ７ＲＰ１に対する受容体を発現する細胞を検出するために（実施例６を参照されたい）、該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を使用した。脾臓を雌Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ  ６マウスから摘出し、１００ミクロンメッシュフィルター上で砕いてリンパ球を遊離させ、７０ミクロンフィルターに通過させ、ついで５０ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０中で洗浄した。それらを１５００ｒｐｍでペレット化し、新鮮なＲＰＭＩに再懸濁させ、混合して該細胞塊を破壊し、４０ミクロンフィルターに通過させた。活性化させるＴ細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０、５％  ＦＢＳ、１×ＰＳＧ、ＰＭＡ、イオノマイシン中、６ウェルプレートに播き、３７℃、５％  ＣＯ２中で一晩インキュベートした。１２時間後、視覚的確認によりＴ細胞の活性化を調べた。
【０１８３】
免疫染色用の活性化脾臓細胞をＰＢＳ、０．５％  ＢＳＡ（Ｐａｔｈ−ｏｃｙｔｅ  ４，ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）洗浄バッファー中で洗浄し、再懸濁させ、ついで１００μｌの容積中にアリコート化した。１５μｇ／ｍｌの該ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質または該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を適宜加え（１．５μｇ／サンプル）、ついで、時々混合しながら該混合物を氷上で３０分間インキュベートした。該細胞を５．０ｍｌの洗浄バッファー中で２回洗浄した。該融合タンパク質の結合を、細胞染色のために、１００μｌの容積中の２μｇのヤギ抗ヒト（ＧａＨｕＦｃ−ＦＩＴＣ）共役二次抗体で可視化した。ＰＥと共役した細胞マーカー抗体を、該ＧａＨＵＦｃ−ＦＩＴＣおよび対照イソタイプ−ＰＥ共役抗体対照（示されている場合（ラットイソタイプ））と共に加えた。前記のとおり、該サンプルを氷上でインキュベートし洗浄した。該リンパ球集団に対してゲート化するＦＡＣＳｃａｎ分析により可視化を行った。ＣＤ４＋  抗体および該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質での二重染色は、該細胞が該ＣＤ４マーカーとＢ７ＲＰ１に対する受容体（おそらく、ＣＲＰ１）との両方を発現することを示した（図６）。同様に、ＣＤ８＋  抗体および該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質での二重染色は、細胞がＣＤ８およびＢ７ＲＰ１受容体の両方を発現することを示した（図６）。本発明者らは、不活性化脾細胞調製物においては、そのような二重染色細胞を、信頼しうるよう検出することはできなかった。ＣＤ４およびＣＤ８はＴリンパ球マーカーであるため、ＣＲＰ１は活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞上で発現されると仮定されうる。これらのデータは、正常マウスと比較した場合の感作マウスからのリンパ節のＴ細胞領域におけるＣＲＰ１  ＲＮＡの発現の増強と合致する（実施例６）。
【実施例１０】
【０１８４】
ＣＲＰ１リガンドを発現する細胞の同定
ＦＡＣＳ分析により、ＣＲＰ１に対するリガンド（おそらく、Ｂ７ＲＰ１タンパク質を含む）（実施例８を参照されたい）を発現する細胞を検出するために、該ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を使用した（図７）。１２時間のＴ細胞の活性化工程を省略し該細胞を直接的に分析する以外は実施例８のとおりに脾細胞を調製した。脾細胞をＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）マーカー抗体および該ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質で二重染色した。ＣＤ４５Ｒ  Ｂ細胞マーカーとＣＲＰ１に対する推定リガンド（おそらく、Ｂ７ＲＰ１を含む）（実施例８）との両方を発現する細胞が検出された。したがって、一種の抗原提示細胞であるＢ細胞上でＢ７ＲＰ１は発現されると本発明者らは結論づけている。これらのデータは、種々のリンパ系組織のＢ細胞領域中でのＢ７ＲＰ１  ＲＮＡの発現（実施例５）と合致している。
【０１８５】
腹腔マクロファージ上のＢ７ＲＰ１の発現のＦＡＣＳ分析（図８）。腹腔細胞を、正常マウスからの局所潅流により集め、洗浄した後、該ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質または対照としての該Ｆｃタンパク質と共に或いは該Ｆ４／８０モノクローナル抗体（これは、マクロファージに特異的な抗原を検出する）または無関係なイソタイプ適合対照モノクローナル抗体と共にインキュベートした。ついで細胞を再洗浄し、ヤギ抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣ共役抗体と共にインキュベートした。更なる洗浄の後、細胞を、その光散乱および蛍光染色特性に関してＦＡＣＳ分析装置中で評価した。まず、腹腔細胞は、その光散乱特性に基づいてサブセットにおいて識別された（図８Ａ）。マクロファージは、光を前方（ＦＳＣ）および側方（ＳＳＣ）に強力に散乱するその能力により並びにマクロファージのマーカーであるＦ４／８０抗原に関するそのポジティブ染色により、領域５（Ｒ５）において同定された（図８Ｂ）。領域６（Ｒ６）におけるマクロファージを、Ｆ４／８０抗原に関するそれほど強力ではないその染色に基づき選択し、それはＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質により染色されることが判明した（図８Ｃ）。これらのデータは、ＣＲＰ１に対するリガンド（おそらく、Ｂ７ＲＰ１を含む）が、プロ抗原提示細胞であるマクロファージ上で発現されることを示している。これは、Ｔリンパ球の活性化におけるＣＲＰ１およびＢ７ＲＰ１の機能と合致する。
【実施例１１】
【０１８６】
ＣｏｎＡ刺激Ｔリンパ球上のＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質のインビトロ抑制活性
マウス脾細胞を実施例８と同様にして調製し、ネガティブ選択（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によりＴリンパ球に関して富化した。Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、９６ウェルプレート中で２００，０００個の脾細胞を使用した。細胞を、図９に示されているとおりに培地（無添加）、ＣＲＰ１−Ｆｃ、Ｂ７ＲＰ１−ＦｃまたはＢ７．２−Ｆｃまたは融合タンパク質と共に１時間インキュベートした。培地（無添加）または種々の濃度のＣｏｎＡを、図９の下に示されているとおりに加えた。ついで該細胞を３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。４２時間後、細胞を３Ｈ−チミジンで６時間にわたりパルスし、回収し、取り込まれた放射能を測定した。三重サンプルからの平均ＣＰＭおよび標準偏差が図９に示されている。
【０１８７】
該Ｆｃ融合タンパク質は、それ自体では有意なＴ細胞刺激または抑制活性を示さなかったが、１μｇ／ｍｌおよび３μｇ／ｍｌ  ＣｏｎＡの存在下では、該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃおよび該公知Ｂ７．２−Ｆｃ融合タンパク質の両方は有意な抑制活性を示した（図９）。高濃度（１０μｇ／ｍｌ）では、ＣｏｎＡ刺激は、おそらく該Ｔ細胞の過剰活性化により、細胞死を招く。Ｂ７ＲＰ１−ＦｃまたはＢ７．２−Ｆｃの添加は、高濃度のＣｏｎＡの有害な作用から該細胞を有意に保護した。抑制および防御の両方の機能において、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃタンパク質による効果は、該ＣｏｎＡ刺激細胞上でＢ７．２−Ｆｃタンパク質より顕著であった。これらのデータは、該Ｂ７ＲＰ１タンパク質がＴ細胞増殖を調節するよう機能することを示している。
【実施例１２】
【０１８８】
トランスジェニックマウスにおけるＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の全身運搬
実施例７に記載のＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質をＡｐｏＥ−肝臓特異的発現ベクター（Ｓｉｍｏｎｅｔら．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４，１３１０−１３１９（１９９４）およびＰＣＴ出願番号ＵＳ９４／１１６７５）中にサブクローニングした。制限酵素ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩを使用して該コード領域をｐＣＥＰ４／Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃから切り出し、該断片を、前記のＡｐｏＥ肝臓特異的発現ベクター中の同じ部位にサブクローニングした。得られたプラスミドＨＥ−Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃを、そのタンパク質コード領域、および該コード領域に隣接する配列において配列決定して、それが突然変異を含有しないことを確認した。
【０１８９】
該プラスミドを増幅し、２ラウンドのＣｓＣｌ密度勾配遠心分離により精製した。該精製プラスミドＤＮＡを制限酵素ＣｌａＩおよびＡｓｅＩで消化し、１．５ｋｂのトランスジーンインサートをアガロースゲル電気泳動により精製した。該精製断片を５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）および０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ中で１μｇ／ｍｌのストック注入溶液になるまで希釈した。注射針を使用前に傾斜化しシリコーン処理した以外は文献記載（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２，４３３８（１９８５））と実質的に同じ方法で、ＢＤＦ１×ＢＤＦ１交配マウスからの単細胞胚に注入した。胚をＣＯ２インキュベーター中で一晩培養し、１５〜２０個の２細胞胚を偽妊娠ＣＤ１雌マウスの卵管に導入した。
【０１９０】
正期妊娠後、そのマイクロインジェクションされた胚の移植から５６匹の後代を得た。ゲノムＤＮＡサンプル中の組込まれたトランスジーンのＰＣＲ増幅により、該後代をスクリーニングした。増幅の標的領域は、該発現ベクター中に含まれていたヒトＡｐｏ  Ｅイントロンの３６９ｂｐの領域であった。ＰＣＲ増幅に使用したオリゴは以下のとおりであった。
【０１９１】
【化２】
2004520819.tif 000004
該ＰＣＲの条件は、９４℃で２分間の１サイクル；９４℃で１分間、６３℃で２０秒間および７２℃で３０秒間の３０サイクルであった。その５６匹の元の後代のうちの７匹が、ＰＣＲ陽性トランスジェニックファウンダーマウスとして同定された。
【０１９２】
１２週齢で、９匹のトランスジェニックファウンダー（マウス＃１、２、４、６、８、３０、３２、３３、４０）および５匹の対照（マウス＃５、９、１０、２５、２８）を屍検および病理学的分析のために犠牲にした。全細胞ＲＮＡを該ファウンダー動物および陰性対照同腹子の肝臓から単離した（ＭｃＤｏｎａｌｄら．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２，２１９（１９８７））。トランスジーン発現のレベルを評価するために、これらのサンプル上でノーザンブロット分析を行った。各動物からの約１０μｇの全ＲＮＡをアガロース電気泳動変性ゲル（Ｏｇｄｅｎら．Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２，６１（１９８７））により分離し、ついでＨＹＢＯＮＤ−Ｎナイロンメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にトランスファーし、３２Ｐ  ｄＣＴＰ−標識ｍＢ７ＲＰ１−ＦｃインサートＤＮＡでプローブした。ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）および２〜４×１０６  ＣＰＭの標識プローブ／ｍｌハイブリダイゼーションバッファー中、６３℃で１時間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、室温で２回（それぞれ５分間）、ついで０．１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、５５℃で２回（それぞれ１５〜２０分間）、ブロットを洗浄した。オートラジオグラフィー後、ファウンダーおよび対照同腹子におけるトランスジーンの発現を判定した。
【０１９３】
ノーザンブロット分析は、該トランスジェニックファウンダーのうちの７匹が、検出可能なレベルの該トランスジーンＲＮＡを発現することを示した（マウス＃１、２、６、８、３２、３３および４０）。該陰性対照マウスおよび３匹のファウンダー（＃４、３０および３１）は、検出可能なレベルのＲＮＡを発現しなかった。該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質は培養内の哺乳類細胞から分泌されることが確認されたため（図４Ｂおよび実施例７）、該トランスジーンｍＲＮＡの発現は、全身運搬された遺伝子産物のレベルを示しているはずである。
【実施例１３】
【０１９４】
Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の生物活性
７匹の該トランスジェニックマウス（マウス＃１、２、６、８、３２、３３および４０）および５匹の対照同腹子（＃５、９、１０、２５および２８）を、以下の方法に従い、屍検および病理学的分析のために犠牲にした。安楽死の前に、すべての動物を、それらの識別番号について確認し、ついで秤量し、麻酔し、採血した。該血液を、完全な血清化学および血液学パネルのために血清および全血の両方として保存した。致死的なＣＯ２吸入による最終麻酔の直後および肉眼的（ｇｒｏｓｓ）解剖の前にラジオグラフィーを行った。ついで組織を摘出し、組織学的検査のために１０％  緩衝Ｚｎ−ホルマリン中で固定した。集めた組織には、肝臓、脾臓、膵臓、胃、十二指腸、回腸、パイエル板、結腸、腎臓、生殖器、皮膚、乳腺、骨、脳、心臓、肺、胸腺、気管、食道、甲状腺／傍甲状腺、空腸、盲腸、直腸、副腎、白色および褐色脂肪、坐骨神経、骨髄、膀胱および骨格筋が含まれる。固定の前に、肝臓、心臓、胃、腎臓、副腎、脾臓および胸腺の全器官重量を測定した。固定後、該組織をパラフィン塊に加工し、３μｍの薄片を得た。
【０１９５】
Ｂリンパ球マーカーＢ２２０およびＴリンパ球マーカーＣＤ３の免疫組織化学的検査を行った。Ｂ２２０またはＣＤ３の発現を検出するために、ホルマリン固定パラフィン包埋４μｍ薄片を脱パラフィン化し、脱イオン水に水和させた。該薄片を３％  過酸化水素でクエンチし、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ（Ｌｉｐｓｈａｗ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）でブロッキングし、Ｂ２２０に対するラットモノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）またはＣＤ３に対するウサギポリクローナル抗体（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）中でインキュベートした。色素原としてＤＡＢ（Ｂｉｏｔｅｋ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用してビオチン化ウサギ抗ラットまたはヤギ抗ウサギ免疫グロブリン、ペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（ＢｉｏＧｅｎｅｘ，Ｓａｎ  Ｒａｍｏｎ，ＣＡ）により該抗体を検出した。薄片をヘマトキシリンで対比染色した。
【０１９６】
この研究においては、該研究の生存期中、正常な臨床的徴候が報告された。該トランスジェニックマウスの全身ラジオグラフは該対照マウスのものと比較しうるものであった。個々のマウスにおける散発的変化は存在したものの（トランスジェニック＃８および＃４０は血清グロブリンレベルの増加（高グロブリン血症）を示し、＃３２および＃３３は、低い正常範囲内のアルブミンレベルを伴う高い正常範囲内のグロブリンレベルを示し、これは、免疫系の慢性抗原刺激で一般的に認められるパターンである）、該トランスジェニックマウスの全血液学的パラメーターは該陰性対照群のものと比較しうるものであった。その他のトランスジェニックマウスの器官重量は、該対照群のものと有意には異ならなかった。
【０１９７】
該トランスジェニックマウスにおいては以下の組織病理学的変化が存在した。トランスジェニックＢ７ＲＰ１−Ｆｃマウスの腸間膜リンパ節は、該対照マウスと比較して中等度ないしは顕著に拡大していた（図１０Ａ−１０Ｄ；図１１Ａ−１１Ｅ）。該皮質は、主にＢ２２０＋  Ｂ細胞（図１１Ｄ）および少数の散在性ＣＤ３＋  Ｔ細胞（図１１Ｆ）を含有する大きな胚中心を伴う拡大した二次小胞として認められる顕著な小胞過形成（図１０Ｂ−１１Ｂ）を有していた。傍皮質（ＣＤ３＋  Ｔ細胞）領域も中等度に拡大しており（図１１Ｂ−１１Ｆ）、髄洞は若干増加した数の肥大マクロファージ（洞組織球増殖症）を有していた。該節における最も顕著な変化は髄索に存在し、これは、該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける多数の良く分化した形質細胞により軽度ないしは顕著に拡大していた（図１０Ｄ）。トランスジェニックマウス＃４０においては、髄索中に少数の散在性ラッセル小体（すなわち、免疫グロブリンを含有する顕著な大きく丸い細胞質内小胞を伴う形質細胞）も見出された（１０Ｄ）。興味深いことに、その他の内部および末梢リンパ節（例えば、頸部、鼡径部）は、全身応答を示唆する反応性リンパ系過形成の同様の形態学的特徴を有していた。これらの知見は、Ｂ細胞増殖および形質細胞への最終分化につながる体液性免疫反応の増強を伴う慢性の進行中の免疫刺激と合致する。
【０１９８】
Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスの脾臓は、該対照マウスと比較して、顕著な胚中心および動脈周囲Ｔ細胞鞘を伴う特にＢ細胞二次小胞が関わる中等度の反応性リンパ過形成を伴う種々に拡大した白脾髄領域を有していた（図１０Ｅ−１０Ｆ）。Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおけるもう１つの顕著な知見は、白脾髄領域を囲む辺縁域における及び隣接する赤脾髄における最低ないしは軽度の形質細胞増多症であった。トランスジェニックマウス＃６は、少数の散在性ラッセル小体を有していた（図１０Ｆ、差し込み図）。該赤脾は軽度ないしは中等度の髄外造血を示し、これは、該対照マウスにおいて認められるものと比較しうるものであった（図１０Ｅ）。
【０１９９】
小腸のパイエル板は、該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおいては、該対照マウスのものと比較して軽度ないしは顕著に拡大しており（図１０Ｇ）、トランスジェニックマウス＃４０および＃３２においては特に、顕著な胚中心を伴う非常に大きな小胞を有していた（図１０Ｈ）。また、該トランスジェニックマウスの小腸において認められ、結腸において、より顕著であった、肥厚した粘膜固有層における、リンパ球および形質細胞数の最低（＃３２において）ないしは軽度（＃８および＃３３において）の増加（およびこれと一緒に、マウス＃３２の回腸においては軽度の好酸球浸潤）が認められた。また、大腸リンパ凝集物（ＧＡＬＴ）は、いくつかのＢ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウス（特にマウス＃８および＃２）においては、該対照群の場合より若干顕著であった。
【０２００】
一般に、調べたその他の組織（胸腺、骨髄、肝臓、肺、心臓、膵臓、腎臓、副腎、甲状腺、副甲状腺、気管、生殖器、膀胱、乳腺、皮膚、骨格筋、末梢神経、脳、食道、胃、小腸、大腸、骨（大腿骨／脛骨））、後膝関節、白色および褐色脂肪を含む）は正常であるらしく、該対照マウスにおいて検出されたバックグラウンド変化と比較しうるものであった。
【０２０１】
この研究からのデータは、トランスジェニックマウスにおけるＢ７関連タンパク質Ｆｃキメラ（Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ）の過剰発現が、脾臓、末梢および内部リンパ節ならびに腸関連リンパ様組織において小胞過形成、Ｔ細胞領域の拡大および顕著な形質細胞増多症（いくつかの動物においては高グロブリン血症を伴う）として検出される顕著な反応性リンパ過形成により特徴づけられる表現型を誘導することを示している。該形質細胞増多症は、より高レベルの循環ＩｇＧ（トランスジェニックマウスにおいては平均±ＳＤ＝５９７±２９８ｍｇ／ｍｌであるのに対し、対照同原子においては２０９±８０ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝７、ｐ＜０．０５，ｔ検定）、特にＩｇＧ２ａ（２１７±１００ｍｇ／ｍｌ対７５±２９ｍｇ／ｍｌ、ｎ＝７、ｐ＜０．０１、ｔ検定）を伴う。ＩｇＧ２ａの誘導は、通常、ＩＦＮ−ｇのようなＴｈ１サイトカインと関連している。したがって、Ｂ７ＲＰ１は、ＢおよびＴ細胞増殖を誘導し、Ｂ細胞を刺激して形質細胞に分化させ、免疫グロブリンを産生させる。
【０２０２】
これらの変化は、調べたリンパ様器官の全体にわたりＢ細胞の刺激、増殖および抗体産生形質細胞への分化を引き起こす免疫系の体液性能力の過剰刺激による持続的全身性免疫応答と合致する。
【０２０３】
本発明者らは、該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおいて示された顕著なリンパ過形成から、Ｂ７ＲＰ１タンパク質が、免疫系の刺激に関連した有意なインビボ生物活性を有すると結論づけている。
【実施例１４】
【０２０４】
ヒトＢ７ＲＰ１のクローニング
正常ヒト循環末梢リンパ球を、Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用して赤血球から分離した。ついで該Ｔ細胞を１０μｇ／ｍｌ  プレート結合抗ＣＤ３抗体（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ，Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，ＭＥ）、１０ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡおよび５００ｎｇ／ｍｌ  イオノマイシンで３７℃、５％  ＣＯ２で一晩活性化した。ついで、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して、該細胞から全ＲＮＡを調製した。該細胞を遠心分離によりペレット化し、該細胞ペレットを５×１０６細胞当たり１ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬に再懸濁させ、室温で５分間インキュベートした。ついで１ｍｌの元のＴＲＩｚｏｌ試薬当たり０．２ｍｌのクロロホルムを加えた。該チューブを１５秒間にわたり手で激しく振とうさせ、室温で３分間インキュベートし、１３，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離した。遠心分離後、該ＲＮＡを含有する清澄上部水相を集め、該サンプルＲＮＡをイソプロピルアルコールの添加により沈殿させた。ついで該溶液を室温で１０分間インキュベートし、該ＲＮＡをペレット化し、７５％  エタノールで洗浄し、ついで１５，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。該ペレットを風乾させ、ＲＮアーゼを含有しない水に再懸濁させ、ついでアリコート化し、後の使用まで−８０℃で保存した。
【０２０５】
該ライブラリーは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  ＳｙｎｔｈｅｓｉｓおよびＰｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して構築した。簡単に説明すると、２ｋｂの平均サイズを有するｃＤＮＡインサートをｐＳｐｏｒｔベクター中にＳａｌ１／Ｎｏｔ１クローニング部位において連結した。該連結プラスミドをＥｌｅｃｔｒｏｍａｘ形質転換コンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中にエレクトロポレーションし、力価測定し、１５，０００コロニー／ＬＢプレート（アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）でプレーティングした。３００，０００コロニーをコロニー／プラークスクリーンハイブリダイゼーショントランスファーメンブレン（ＮＥＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に取り、０．５Ｎ  ＮａＯＨ、１．５Ｈ  ＮａＣｌ中で５分間にわたり変性させ、ついで以下のバッファー中で連続的にそれぞれ５分間中和した：１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１．５Ｍ  ＮａＣｌおよび２×ＳＳＣ。ついで該フィルターを紫外線照射により架橋し、真空オーブン中、８０℃で３０分間にわたり焼いた。該フィルターを２×ＳＳＣ中、４２℃で十分に前洗浄して残渣を除去し、ついで５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト液、０．５％  ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ  サケ精子ＤＮＡ中、４２℃で２時間にわたりプレハイブリダイズさせた。
【０２０６】
該ヒトリンパ球ｃＤＮＡライブラリーを、図３Ａに示すヌクレオチド１−７１１、図３Ａ中の開始メチオニンコドンの直ぐ５’側の１６７ｂｐおよび図３Ａ中の７１１位の直ぐ３’側の１７ｂｐを有する８９５ｂｐのＤＮＡ断片でスクリーニングした。１６７塩基対のこの上流５’配列は、ＨｕＢ７ＲＰ１  ｃＤＮＡ（実施例４）の５’ＲＡＣＥにより得られ、Ｅｃｏ  ＲＩ制限酵素切断部位においてＴＯＰＯ  ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から遊離された。このインサートを０．８％  アガロースＴＡＥゲル上で２回精製した。ＤＮＡゲル精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して該ＤＮＡインサートを該アガロースから単離した。
【０２０７】
１２５ｎｇの該ＤＮＡ断片を、Ｒｅｄｉ−Ｐｒｉｍｅ  ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ランダムプライム標識系プロトコールに従い、３２Ｐ  ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識した。ついで該コロニーリフトフィルターを、以下のバッファー中、該プローブで４２℃で一晩ハイブリダイズさせた：５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、２×デンハルト液、０．５％  ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ。該プローブの比活性は、ハイブリダイゼーションバッファー１ｍｌ当たり約２ｎｇの標識プローブ中、２．３８×１０９ｃｐｍ／ｇ  ＤＮＡであった。該プローブを取り出し、次ラウンドのスクリーニングのために保存した。ついで該フィルターを２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、室温で１５分間、ついで１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、５５℃で１５分間、および１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、６０℃で１０分間洗浄した。該フィルターをプラスチックで包み、２枚の増強スクリーンと共にオートラジオグラフィーフィルムに−８０℃で一晩曝露した。３個の独立した陽性クローンが同定された。曝露体を該細菌プレートと整列させ、該陽性クローンを擦り取り、希釈し、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢプレート上で再プレーティングし、一晩増殖させ（前記のとおり）、既に記載されているとおりに該コロニーを取り上げ、調製し、プローブした。３個の独立したクローンコロニーを単離し、該ＤＮＡを単離し、各クローンについて三重にＤＮＡ配列決定した。
【０２０８】
ヒトＢ７ＲＰ１タンパク質の全長は３０２アミノ酸である。該ポリペプチドの長さ及び該膜貫通ドメインの相対位置は他のＢ７ファミリーメンバーと合致する。ヒトＢ７ＲＰ１遺伝子は該マウスクローンに対して４３％のアミノ酸同一性を有する。マウスおよびヒトＣＤ８０タンパク質は４１％同一であるに過ぎないため、この相同性の度合は有意である。注目すべきことに、アミノ酸３７、１１３、１５８、２１５および２１６位のシステイン残基が該マウスおよびヒト遺伝子間で保存されている。
【実施例１５】
【０２０９】
ヒトＣＲＰ１のクローニング
マウスＢ７ＲＰ１配列（図２を参照されたい）を使用するＧｅｎｂａｎｋ  ｂｌａｓｔ相同性検索（ＧＣＧ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）は、マウスＣＲＰ１遺伝子に対して高い相同性を示す１０４ｂｐの配列を含有するゲノムクローン（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋアクセッション番号ＡＱ０２２６７６）を導き出した。この配列と重複するようＰＣＲクローニングプライマーを設計した。
【０２１０】
【化３】
2004520819.tif 000005
前記プライマーを使用し、鋳型として図１および実施例１に記載のマウスＣＲＰ１プラスミドを使用して、マウスＣＲＰ１の１５１ｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。１２５ｎｇの該ＤＮＡを、Ｒｅｄｉ−Ｐｒｉｍｅ  ２（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ランダムプライム標識系プロトコールに従い、３２Ｐ  ｄＣＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で標識した。ついで実施例１５に記載のヒト末梢血ライブラリーからのコロニーリフトフィルターを、以下のバッファー中、該プローブで４１℃で一晩（１５時間）ハイブリダイズさせた：５０％  ホルムアミド、５×ＳＳＰＥ、２×デンハルト液、０．５％  ＳＤＳ、１００ｍｇ／ｍｌ  ｓｓＤＮＡ。該プローブの比活性は、３．５２×１０９ｃｐｍ／ｇ  ＤＮＡ、１．５ｎｇ  標識プローブ／ｍｌ  ハイブリダイゼーションバンファーであった。該プローブを取り出し、次ラウンドのスクリーニングのために保存した。ついで、該フィルターが該標識プローブを遊離している速度を連続的にモニターしながら、該フィルターを２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、室温で１５分間、ついで１×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中、３７℃で７分間、４０℃で７分間、４４℃で７分間、ついで５０℃で７分間洗浄した。該フィルターをプラスチックで包み、２枚の増強スクリーンと共にフィルムに−８０℃で一晩曝露した。この方法は、９個の可能な独立した陽性クローンを示した。曝露体を該細菌プレートと整列させ、該陽性クローンを擦り取り、２００μｌのＳＯＣ中に析出させ、１：１０の２回の系列希釈を行い、該第２希釈からの７０μｌを、アンピシリンを１００μｇ／ｍｌで含有するＬＢプレート上で再プレーティングし、一晩増殖させた（前記のとおり）。既に記載されているとおりに該コロニーを取り上げ、調製し、プローブした。８個の独立したクローンを単離し、Ｑｉａｇｅｎミニプレップ法によりＤＮＡを調製した。
【０２１１】
１９９アミノ酸のオープンリーディングフレームを含有するｃＤＮＡクローンを得た（図１３Ａ）。このｃＤＮＡクローンは、実施例１および図１に記載のマウスＣＲＰ１クローンに対するヌクレオチドおよびアミノ酸相同性を含有していた。このヒトクローンのオープンリーディングフレームに対応するヌクレオチドは該マウスＣＲＰ１遺伝子と７７％同一であった。該ヒト配列の翻訳およびそれに続く該マウスＣＲＰ１タンパク質との比較は、該マウスタンパク質に対して６９％のアミノ酸同一性を示した（図１３Ｂ）。また、アミノ酸１１４−１１９のモチーフ「ＦＤＰＰＰＦ」は、該マウスおよびヒトＣＲＰ１遺伝子間で保存されていた。このモチーフは、Ｂ７タンパク質相互作用に必須であるマウスおよびヒトＣＤ２８における「ＭＹＰＰＰＹ」モチーフに対応する。さらに、アミノ酸４２、１０９および１４１位のシステインも保存されている。これらのシステインは、Ｉｇループ形成および分子間ジスルフィド二量体化に関与するＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４中のシステインに対応する。マウスＣＲＰ１に対する酷似、およびＣＤ２８相同性ファミリーに対する構造的類似性は、これがヒトＣＲＰ１ホモログであることを示している。
【実施例１６】
【０２１２】
ＣＲＰ１は静止記憶Ｔリンパ球上で発現される
記憶Ｔ細胞上でのＣＲＰ１の発現を調べるために、脾臓Ｔ細胞を６〜７月齢マウスから集めた。ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢまたはＣＤ６９に対するＰＥ共役抗体およびＦＩＴＣ共役抗ヒトＦｃ抗体により標識されたＢ７ＲＰ１−Ｆｃを使用して、これらの細胞を二重染色した。該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質での染色は、これらのＴ細胞上のＣＲＰ１タンパク質の発現を検出する。より高齢のマウスは、より若齢のマウスより多数のＣＲＰ１＋  脾臓Ｔ細胞を示す。興味深いことに、著しい数のこれらの細胞はＣＤ４４高（図１４ａ）およびＣＤ４５ＲＢ低（図１４ｂ）であり、これは記憶Ｔ細胞に典型的なプロフィールである。これらのＣＲＰ１＋  記憶Ｔ細胞は静止状態にある。なぜなら、それらは、活性化マーカーＣＤ６９を発現しないからである（図１４ｃ）。記憶Ｔ細胞上でのＣＲＰ１の発現は、ＣＲＰ１が記憶Ｔ細胞上での共刺激機能を有することを示している。
【実施例１７】
【０２１３】
Ｂ７ＲＰ１に対する抗体により抑制されるインビトロＴ細胞共刺激
該Ｂ７ＲＰ１タンパク質が、Ｔ細胞に関連した機能を有するか否かを確認するために、本発明者らは、インビトロ増殖アッセイにおいて、ＣＤ３＋  Ｔ細胞を該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質および抗ＣＤ３抗体と共にインキュベートした。ついで、インビトロでのＢ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激増殖を特異的に抑制するために、ウサギ抗マウスＢ７ＲＰ１ポリクローナル抗体またはラット抗マウスＢ７ＲＰ１モノクローナル抗体を使用した。
Ｂ７ＲＰ１ウサギポリクローナル抗血清の調製
３匹のＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギ（初期体重５〜８  ｌｂ）にマウスＢ７ＲＰ１タンパク質をＩＭ注射した。各ウサギを第１日に、等容積のＨｕｎｔｅｒｓ  Ｔｉｔｅｒ  Ｍａｘ完全アジュバント中で乳化された１５０μｇのマウスＢ７ＲＰ１タンパク質で免疫した。さらに、追加抗原刺激（第１４日および２８日）を同じ方法で行った。抗体力価をＥＩＡによりモニターした。第２追加抗原刺激の後、該抗血清は中等度の抗体力価を示した。ついで３０ｍｌの産物血を各動物から得た。これを６週間にわたり毎週繰返した。ついでポリクローナル抗体をプロテインＡアガロースクロマトグラフィーおよびそれに続くネガティブ選択Ｆｃタンパク質アフィニティークロマトグラフィーおよびＢ７ＲＰ１−Ｆｃアフィニティークロマトグラフィーによるポジティブ選択により精製した。
ラット抗マウスＢ７ＲＰ１モノクローナル抗体の調製
ラット抗マウスＢ７ＲＰ１モノクローナル抗体を、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第２版（１９８０；Ｌ．ＨｕｄｓｏｎおよびＦ．Ｃ．Ｈａｙ；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に記載のとおりに産生させた。簡単に説明すると、Ｌｏｕラット（Ｈａｒｌａｎ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に、フロイントアジュバント中で乳化されたｍｕＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を４週間隔で腹腔内注射した。融合の３日前に、可溶性ｍｕＢ７ＲＰ１でラットの静脈内に追加抗原刺激を行った。融合の当日、該動物を二酸化炭素下で犠牲にし、脾臓を無菌的に摘出した。組織スタマッカー（ｓｔｏｍａｃｈｅｒ）を使用して、単個細胞浮遊液を調製した。脾細胞およびＹ３−Ａｇ１．２．３骨髄腫細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｎ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の両方を無血清培地中で洗浄し、ついでポリエチレングリコール（ＰＥＧ  １５００：Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｂｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）の添加により融合させた。該細胞を１回リンスし、血清含有培地中に再懸濁させ、９６ウェル組織培養プレート中にプレーティングした。１０〜１２日後、各ウェルからの培地を、直接酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＩＡ）によりＢ７ＲＰ１に対する特異的抗体に関して試験した。潜在的結合を示すウェルからの細胞を１０ｍｌの培養にまで増殖させ、液体窒素中で凍結した。各培養からの培地を、フローサイトメトリーおよび機能的Ｔ細胞増殖アッセイにおいて更に試験した。これらの方法により関心有りと判定されたものを単細胞コロニーにプレーティングし、ＥＩＡにより再選択し、最終細胞系を抗体産生のために維持した。プロテインＡアガロースクロマトグラフィーにより該細胞培地から抗体を精製した。
Ｔ細胞の調製およびＴ細胞増殖アッセイ
Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（８〜１２週齢の雌，Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の脾臓からのＴ細胞を、マウスＴ細胞富化カラム（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によるネガティブ選択により精製した。ついで該Ｔ細胞を直接的に使用するか、または以下のとおりの抗体および補体溶解により精製した。マウスＣＤ１１ｂ（クローン  Ｍ１／７０）、ＮＫ−１．１（クローン  ＰＫ１３６）、ＣＤ８ａ（クローン５３−６．７）、Ｉ−Ａｂ（クローン  Ｍ５／１１４．１５．２）、ＣＤ１１ｃ（クローン  ＨＬ３）およびＢ２２０抗原（クローン  ＲＡ３−６Ｂ２）に対する抗体（すべて１０μｇ／ｍｌでありＰｈａｒｍｉｎｇｅｎからのものである）を含有するＲＰＭＩ培地に細胞を再懸濁（２．５×１０６細胞／ｍｌ）させた。ついで該細胞を氷上で３０分間インキュベートし、１２００ｒｐｍでペレット化し、４：１  ｖｏｌ／ｖｏｌのＲＰＭＩ：ウサギ補体（Ｓｉｇｍａ，＃Ｓ−７７６４）に再懸濁させ、３７℃で更に３０分間インキュベートした。該細胞を再びペレット化し、該補体処理を繰返した。プレーティングの前に、１０％  ＦＣＳを含有するＲＰＭＩで細胞を洗浄した。Ｕ底９６ウェルプレートを０〜１．２μｇ／ｍｌの範囲の濃度の抗ＣＤ３抗体（クローン  １４５−２Ｃ１１，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ２（Ｓｉｇｍａ，１２．５μｇ／ｍｌ）で４℃で一晩コートし、ついで３７℃で６〜９時間インキュベートした。Ｔ細胞（１×１０５／ウェル）を種々のＦｃ融合タンパク質の不存在下または存在下で４８時間培養し、最後の１８時間において１μＣｉの３Ｈ−チミジンでパルスした。対照Ｆｃタンパク質は、ＯＰＧとＦｃとの融合タンパク質、および非融合Ｆｃタンパク質断片を含んでいた。ついで該細胞を回収し、取り込まれた放射能を計数した。Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃは、用量依存的に、増殖するようＴ細胞を共刺激し（図１５ａ）、抗Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ抗体はこの共刺激用量依存性を特異的に抑制する（図１５ｂ）。
【実施例１８】
【０２１４】
ＣＲＰ１／Ｂ７ＲＰ１経路のインヒビターはコラーゲン誘発性慢性関節リウマチの発症を減少させる
コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）は、ヒトにおける慢性関節リウマチとの多数の類似点を有するげっ歯類および霊長類における自己免疫多発性関節炎の動物モデルである。異種の種のＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）での免疫は、感受性マウス系統においてＣＩＡの発生を招くＣＩＩに対する自己免疫応答を誘導する。Ｈ−２ｒおよびＨ−２ｑを有するマウスのコンジェニック系統はＣＩＡに非常に感受性である。ＣＩＡは、ＣＩＩ反応性Ｔ細胞および抗体の両方の相乗作用により媒介される。ブタＣＩＩ（Ｎａｂｏｚｎｙら，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０，５１−５８（１９９５））を０．０１Ｎ  酢酸に２ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、ついでＣＦＡ（Ｄｉｆｃｏ）で１：１の比で乳化した。関節炎感受性Ｂ１０．ＲＩＩＩ（Ｈ−２ｒ）マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を１００μｌのエマルションで尾の基部の皮内に免疫した。関節炎の発生に関してマウスを週２〜３回モニターした。各脚に関して以下のとおりの評価系を用いて、関節炎の重症度を判定した：０：関節炎無し；１：１〜３本の足指における腫脹または発赤；２：重篤な脚の腫脹；３：関節の強直。各肢の得点は足し算して、各動物について０〜１２の重症度範囲を得た。
【０２１５】
マウスに１００ｕｇ（２００μＬ中）のタンパク質を週２回腹腔内注射した。該処理はブタＣＩＩでの免疫の１日後から開始し、免疫の５２後に中止した。該実験は１０匹のマウスの処理群において行い、１以上の得点を有する動物を陽性と評価した。結果を図１６および表１に示す。
【０２１６】
【表２】
2004520819.tif 000006
ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質で処理したマウスにおいては、関節炎症状の発症は、該ＰＢＳ処理マウスと比較して約１０日間遅かった。このことは、ＣＲＰ１／Ｂ７ＲＰ１経路の抑制が慢性関節リウマチのこのマウスモデルにおける病状を軽減しうることを示している。
【０２１７】
Ｂ７ＲＰ１−ＦｃまたはＢ７．２−Ｆｃで処理されたマウスは、該ＰＢＳ処理対照と比較して、関節炎重症度の増加と共に、より早期の発症を示した（表１および図１６ａ）。このことは、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質がＴ細胞免疫応答を増強することを示している。そのような活性は、インビボにおける抗腫瘍免疫の生成において有用でありうる。
【０２１８】
慢性関節リウマチのこのマウスモデルにおけるＣＲＰ１−ＦｃおよびＢ７ＲＰ１−Ｆｃによる反対の効果は、該疾患の進行を増強または抑制するよう該経路が操作されうることを示している。該ＣＲＰ１タンパク質を可溶性Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃで標的化すると、該疾患が増強され、一方、可溶性ＣＲＰ１−ＦｃとＢ７ＲＰ１との相互作用は該病状を抑制する。
【実施例１９】
【０２１９】
Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃはトランスジェニックマウスにおいて炎症性腸疾患表現型を誘導する
２２〜２５週齢のトランスジェニックマウス（実施例１２）における該Ｂ７関連タンパク質（Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ）の持続的過剰発現は、小腸および大腸の著しい肥厚および慢性炎症（全腸炎）と体重減少（いくつかの動物において）とを伴う炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の、顕著な表現型を誘導する。組織学的には、最も重度な炎症性変化が近位および遠位結腸において見出され、より軽度な変化が小腸において見出された。近位結腸は著しく肥厚し、結腸粘膜の肥大、亀裂潰瘍および経壁的炎症を伴い、一方、遠位結腸は、潰瘍を伴わない散在性粘膜肥大（または局所的びらん及び腺性萎縮）を有していた。近位小腸は、より軽度な炎症性変化を伴う軽度ないしは顕著な粘膜肥大を有し、一方、遠位小腸（回腸）は、いくつかの動物においては軽度な粘膜肥大を、他のマウスにおいては萎縮を有していた。該腸変化は、雌Ｂ７ＲＰ１トランスジェニックマウスにおいて最も重度であり一貫して見出されたが、この研究における該雄トランスジェニックマウスのいくつかにおいても観察された。
【０２２０】
多核巨細胞を伴う経壁的慢性肉芽性炎症および亀裂潰瘍を含む、近位結腸において見出された組織学的特徴が、ヒトにおける潰瘍性大腸炎よりも、クローン病において見出されるものに良く似ていることに注目することは、興味深いことである。形態学的には、この大腸炎はまた、全腸管を侵す衰弱、貧血および全腸炎を現すインターロイキン１０を欠損したマウスにおいて記載されているＩＢＤ（Ｋｕｈｎら．１９９３；Ｓａｒｔｏｒ  １９９５；Ｌｅａｃｈら．１９９９）と似ている。該ＩＬ−１０ノックアウトマウスの場合と同様に、該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける初期変化は、結腸上皮過形成を伴わない固有層における炎症細胞の軽度な局所的浸潤よりなる（実施例１３）。より高齢のマウスにおいては、腺性肥大／過形成および慢性炎症により、罹患結腸区域は肥厚する。該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃマウスの近位および遠位結腸は、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の組織学的特徴を伴う中等度ないしは重度な大腸炎を有していた。該近位結腸の罹患区域（図１７Ｂ−１７Ｄ）は、増加した数の有糸分裂像およびまばらな陰窩膿瘍を有するがムチンを伴う杯細胞を保持する（図１７Ｄ）粘液腺の伸長および拡張を伴う顕著な腺性上皮肥大および過形成により、散在的に肥厚していた（図１７Ｂ）。該粘膜は、固有層における散在性慢性炎症を有し、それは、いくつかの動物においては、粘膜下組織、粘膜筋板、漿膜および隣接腸間膜脂肪組織を含む腸壁の下層を含むよう経壁的に伸長していた（図１７Ｂ−１７Ｃ）。該炎症性浸潤物は、慢性肉芽性炎症に特徴的な、いくつかの好中球および偶発的な多核巨細胞（図１７Ｅ）と混合したリンパ球（主にＣＤ３＋、ＣＤ４４＋、Ｔ細胞）、形質細胞および上皮様マクロファージ（図１７Ｆ）よりなるものであった。また、該粘膜中には、および粘膜下組織およびより深い層（腸間膜脂肪を含む）中のより小さな血管の周辺には、リンパ凝集物（ほとんどは、少数のＣＤ３＋  細胞と混合したＢ２２０＋  細胞）が存在していた（図１７Ｃ）。該内腔は粘液膿性または粘液性滲出物を含有していた（図１７Ｄ）。該粘膜の多病巣性亀裂潰瘍および経壁炎症（図１７Ｂ−１７Ｃ）を伴う大腸炎の重大な証拠が、これらのＢ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおいて見出された。
【０２２１】
また、該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスの遠位結腸は、散在的に肥厚性および過形成性であり、結腸腺の伸長、好塩基球増加および拡張を伴い（図１８Ｂ−１８Ｇ）、それらのうちのいくつかは陰窩膿瘍（図１８Ｄ−１８Ｆ）および粘液を含有していた。固有層は、いくつかの好中球と混合した上皮様マクロファージの局所的凝集物および形質細胞、およびリンパ球（主にＣＤ３＋、ＣＤ４４＋  細胞、特に、表在性粘膜において；図１８Ｅ）の軽度の散在性炎症性浸潤を有していた。また、リンパ凝集物（主にＢ２２０＋  細胞のもの；図１８Ｄおよび１８Ｆ）が該粘膜の全体にわたり散在していた。Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスの小腸は、固有層における主にリンパ形質細胞浸潤を伴う、軽度ないしは局所的に顕著な粘膜および陰窩の肥大および過形成（図１９Ｂおよび１９Ｄ；この場合、陰窩／絨毛比は１：４〜１．５：１の範囲であり、これに対して、該対照マウスにおいては１：１０である）を含む、より多様な変化を有していた。該粘膜過形成は、十二指腸（図１９Ｂ）および特に空腸（図１９Ｄ）を含む近位小腸において最も顕著であった。最も重度に罹患したマウスにおいては、陰窩構造が局所的に乱れ形成異常であった（図１９Ｄ）。これに対して、いくつかのマウスの遠位小腸（回腸）は、絨毛の鈍化、肥厚または局所的喪失（この場合、陰窩：絨毛比は１：１であり、これに対し、正常比は１：２である）を伴う軽度の不規則な回腸粘膜絨毛萎縮を有し（図１９Ｆ）、一方、他のマウスは軽度の回腸粘膜肥大を有していた。
【０２２２】
該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質は、ヒトのクローン病と酷似した表現型の惹起をもたらす細胞を活性化するよう作用する。このことは、クローン病における炎症を引き起こしうる細胞が該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質により活性化されることを示している。したがって、Ｂ７ＲＰ１の可溶性タンパク質、抗体または小分子インヒビターは、ＩＢＤの抑制において有用でありうる。
【実施例２０】
【０２２３】
Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質はマウスにおける腫瘍増殖を抑制する
免疫原性マウスＭｅｔｈ  Ａ肉腫の増殖に対するＢ７ＲＰ１およびＣＲＰ１の効果を調べるために、本発明者らは、該可溶性Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃが、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、樹立されたＭｅｔｈ  Ａ肉腫の増殖に影響を及ぼすか否かを調べた。
【０２２４】
指数関数的に増殖しているＭｅｔｈ  Ａ肉腫細胞を、第０日に、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの腹部への５０万個の細胞の皮内注射により移植した。第７日に該腫瘍が〜１００ｍｍ３に達し、第７、１０、１４および１７日に、該マウスを頚部皮下にビヒクル（ＰＢＳ）またはＢ７ＲＰ１−Ｆｃ（８ｍｇ／ｋｇ）で処理した。該腫瘍の二次元の直径をカリパスにより測定し、腫瘍体積（ｍｍ３単位）を、式：腫瘍体積＝［｛（幅）２×長さ｝／２］を用いて見積もった。該腫瘍増殖を第２８日までモニターした。各群は８匹のマウスを有していた。
【０２２５】
該対照腫瘍のＭｅｔｈ  Ａ肉腫増殖パターンは２相性であり、遅い初期相の後に、比較的速い指数増殖期が続いた。Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ処理マウスにおいては、該腫瘍の増殖は、速い指数増殖期において、有意に、より遅かった。第２８日において、該対照およびＢ７ＲＰ１−Ｆｃ処理マウスの平均体積は、それぞれ１４１０ｍｍ３および５８０ｍｍ３であった（図２０）。したがって、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ処理は、このモデルにおいて腫瘍増殖を有意に抑制した。該データは、免疫原性腫瘍の治療における、該可溶性Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃタンパク質、および該Ｂ７ＲＰ１／ＣＲＰ１経路のアクチベーターの有益な治療的有用性を強く示唆している。
【０２２６】
免疫学的抗腫瘍活性は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の機能と密接に関連している。一貫して、該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃタンパク質は細胞傷害性ＣＤ８＋  Ｔ細胞上で発現される（実施例９、図６）。これらのデータは、Ｂ７ＲＰ１が細胞傷害性ＣＤ８＋  Ｔ細胞上で機能することを強く支持している。したがって、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ、または該Ｂ７ＲＰ１／ＣＲＰ１経路の他の刺激物質は、多数の非癌関連適応症に対する細胞性免疫機能および細胞傷害性Ｔ細胞を増強するために使用することができる。
【実施例２１】
【０２２７】
インビトロにおけるヒトＢ７ＲＰ１活性の抑制
ヒトＢ７ＲＰ１が陽性共刺激特性を有するか否かを判定するために、本発明者らは、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、ヒトＢ７ＲＰ１およびヒトＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を発現する細胞を試験した。該ヒトＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質は、アミノ酸１−２４７に対応する遺伝子配列を部分ヒトＩｇＧ１遺伝子配列に融合することにより構築した（実施例１４）。該ヒトＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質は、アミノ酸１−１４６に対応する遺伝子配列を部分ヒトＩｇＧ１遺伝子配列に融合することにより構築した（実施例２）。両方の融合タンパク質の構築、発現および精製の方法は実施例７に記載のとおりに行った。Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃは、抗ＣＤ３刺激に依存する共刺激活性を示した（図２１ａ）。また、この活性は可溶性ＣＲＰ１−Ｆｃタンパク質により特異的に抑制されうる（図２１ｂ）。該全コード配列を含有する膜結合ヒトＢ７ＲＰ１を発現するＣＨＯ細胞を使用して、同様の共刺激作用が得られた（図２１ｃ）。
【０２２８】
前記のインビトロ増殖条件下でのヒトＴ細胞によるサイトカインの産生を測定した。４８および７２時間にわたり刺激されたＴ細胞培養からの上清を、製造業者の説明書（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に従うＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−２、Ｌ−１０およびＩＦＮ−γに関して分析した。該ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０レベルは有意に減少したが、ＣＤ２８共刺激の場合とは異なり、ＩＬ−２は顕著には誘導されなかった（図２１ｄ）。実施例１３に記載のとおり、Ｔｈ１サイトカインであるＩＦＮ−γの、増加したレベルは、ＩｇＧ２ａを増加させる該Ｂ７ＲＰ１機能と相関する。
【０２２９】
インビトロＴ細胞共刺激アッセイを以下のとおりに行った。高度に精製されたヒトＴ細胞（＞９８％  ＣＴ３＋）を、ｍＡｂ標識磁気ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、新鮮な又は融解された接着欠乏性ＰＢＭＣのネガティブ選択により単離した。Ｔ細胞（１×１０５細胞／ウェル）を、９６ウェルプレート中の三重ウェルで、２００μｌ／ウェル  ＲＰＭＩ＋１０％  ＦＣＳにおいて培養した。Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激を評価するために、種々の濃度の抗ＣＤ３（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）および１０μｇ／ｍｌ  抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｓｉｇｍａ）（１００μｌの１×ＰＢＳ中）を、４℃で一晩のインキュベーションにより、Ｕ底プレート上に予めコートした。未結合抗ＣＤ３および抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを除去し、該細胞を種々の濃度のＢ７ＲＰ１−Ｆｃ、ＯＰＧ−Ｆｃ対照または抗ＣＤ２８（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下または不存在下で培養した。Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激のＣＲＰ１−Ｆｃ抑制のために、１０μｇ／ｍｌから開始する系列希釈ＣＲＰ１−ＦｃまたはＯＰＧ−Ｆｃの存在下、０．５μｇ／ｍｌ  Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃと共に０．３３μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３および１０μｇ／ｍｌ  抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃで予めコートされたウェル中でＴ細胞を培養した。Ｂ７ＲＰ１を発現するＣＨＯ細胞による共刺激を評価するために、種々の量のマイトマイシンＣ処理ＣＨＯ  Ｂ７ＲＰ１細胞またはＣＨＯベクター細胞の存在下または不存在下、種々の濃度の可溶性ＣＤ３と共に平底プレート中でＴ細胞を培養した。Ｔ細胞増殖に関して試験するために、７２時間の培養の最後の１８時間にわたり、１ｕＣｉ／ウェル  ［３Ｈ］ＴｄＲで培養をパルスした。［３Ｈ］ＴｄＲの取り込みによりＴ細胞の増殖を測定した。３人の無作為ドナーからの代表的な実験の結果が、平均取り込みＣＰＭ  ＋／−  ＳＤで表されている。サイトカイン産生の分析のために細胞を４８時間および７２時間培養し、ＥＬＩＳＡのために上清を集めた。
【０２３０】
これらの実験は、実施例１４に記載のとおりのヒトＢ７ＲＰ１の細胞外部分が、ヒトＦｃ断片に融合された場合に、Ｔ細胞をインビトロで共刺激しうることを示している。この共刺激はＣＲＰ１−ｃにより抑制され、したがって、ヒトＢ７ＲＰ１の可溶性インヒビターが如何にして機能しうるかを示している。ヒトＢ７ＲＰ１およびＣＲＰ１を使用する本明細書に記載のようなインビトロアッセイは、Ｂ７ＲＰ１／ＣＲＰ１活性の抗体、可溶性タンパク質、ペプチドまたは小分子インヒビターに関してスクリーニングするために使用されうる。
【実施例２２】
【０２３１】
Ｂ７ＲＰ１トランスジェニックマウスは、増加したＩｇＥレベルを有する
実施例１２に記載のトランスジェニックマウスを血清ＩｇＥ抗体に関して分析した。Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスおよび同腹子対照からの眼窩血清を、ＥＬＩＳＡプロトコールによりＩｇＥに関して分析した。９６ウェルのポリスチレンＥＩＡプレート（Ｃｏｓｔｅｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を、５０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３バッファー（ｐＨ９．６）中のラット抗マウスＩｇＥ抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）の５μｇ／ｍｌ  溶液５０μｌで、室温で２時間、ついで４℃で一晩コートした。後続の操作は室温で行った。アッセイ希釈剤（１％  ＢＳＡ、１％  正常ヤギ血清および０．２％  ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ中））で３０分間にわたりブロッキングした後、血清サンプルおよびマウスＩｇＥ標準物（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を該ウェル中に加え、該プレートを２時間インキュベートした。該ウェルをＫＰＬ洗浄バッファー（ＫＰＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で３回洗浄した。ビオチン共役ヤギ抗ラット抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を加え、１時間インキュベートした。ＫＰＬ洗浄バッファーで３回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を該ウェルに加え、該プレートを３０分間インキュベートした。該ウェルをＫＰＬ洗浄バッファーで５回洗浄した後、ＴＭＢ−過酸化水素基質溶液（ＫＰＬ）を加え、該プレートを１０分間インキュベートした。該反応を１Ｍ  リン酸の添加により停止し、該吸光度を４５０ｎｍで測定した。該Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスからの血清中のＩｇＥレベルは、該同腹子対照の場合より約３倍高かった（図２２）。該ＩｇＥレベルにおけるこの増加は、Ｂ７ＲＰ１がＩｇＥの発現を調節することを示している。
【実施例２３】
【０２３２】
ＣＲＰ１ノックアウトマウスのＩｇＥ媒介性応答
マウスＣＲＰ１  ｃＤＮＡ配列（配列番号を参照されたい）のヌクレオチド３１８−５９１に対応するゲノム断片を欠失させることにより、マウスにおけるＣＲＰ１遺伝子を破壊した。該マウスＣＲＰ１遺伝子は、完全長（８００ｂｐ）ｃＤＮＡプローブ（Ｙｏｓｈｉｎａｇａら．Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，８２７−８３２（１９９９））を使用して、１２９Ｊライブラリーから単離した。該標的ベクターは、ＣＲＰ１転写に対してセンス配向で２．８ｋｂのゲノム断片をネオマイシン耐性（ｎｅｏ）カセットで置換するものであり、該標的ベクターをＥ１４胚幹（ＥＳ）細胞（１２９／Ｏｌａ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａから受託番号ＣＲＬ−１８２１で入手可能である）中にエレクトロポレーションした。Ｇ４１８選択後、相同組換え体を、プライマーペアＧＡＧ  ＡＣＴ  ＣＡＴ  ＧＣＴ  ＧＴＧ  ＧＴＴ  ＴＣＡ  ＧＧ（配列番号）およびＴＴＣ  ＧＣＣ  ＡＡＴ  ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＡＣＧＣＴＧ  Ｇ（配列番号）を使用するＰＣＲにより同定し、サザンブロット法により確認した。ＣＲＰ１＋／−  ＥＳクローンから作製したキメラマウスをＣ５７ＢＬ６の雌と交配して、ＣＲＰ１＋／−マウスを得た。該ＣＲＰ１突然変異の生殖系列伝達を、尾ＤＮＡのＰＣＲおよびサザンブロット分析により評価した。ヘテロ接合後代の相互交配により作製したＣＲＰ１＋／−マウスは、予想されたメンデル頻度で産まれ、生存可能であり、妊性であり、正常サイズを有していた。該ＣＲＰ１突然変異がＣＲＰ１の発現を妨げたことを証明するために、ＣＲＰ１−／−マウスおよび対照同腹子からの活性化Ｔ細胞をフローサイトメトリーにより分析した。インビトロでのＴ細胞活性化に際して、ＣＲＰ１は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方の野生型Ｔ細胞の表面上では発現されたが、ＣＲＰ１−／−  Ｔ細胞上では検出不可能であった。
【０２３３】
Ｔ細胞媒介性Ｂ細胞抗体産生およびイソタイプクラススイッチにおけるＣＲＰ１の役割を調べるために、ミョウバンに吸着された２００μｇのニトロフェノール共役オボアルブミン（ＮＰ−ＯＶＡ；Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）でＣＲＰ１−／−マウスおよび同腹子対照を腹腔内に免疫した。免疫後に毎週、マウスの尾から血液を集め、ニトロフェノール（ＮＰ）特異的ＩｇＭおよびＩｇＧ１のレベルならびにＯＶＡ特異的ＩｇＥのレベルを該血清中で評価した。
【０２３４】
ＮＰ特異的ＩｇＧ１およびＩｇＭ抗体の力価を、サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を用いて評価した。該サンドイッチＥＬＩＳＡにおいては、ＰＢＳまたは炭酸バッファー（ｐＨ９．２）（Ｓｉｇｍａ）中の５０μｇ／ｍｌのＮＰ（２３）−ウシ血清アルブミンでＥＬＩＳＡプレートをコートした。ＳＯＦＴｍａｘＰＲＯ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）ＥＬＩＳＡ分析プログラムを使用することにより得られた任意値は、各プレート上で使用したイソタイプ標準の滴定曲線に基づくものであった。オボアルブミン特異的ＩｇＥのレベルを、既に記載されているとおりの抗原捕捉（ビオチン化オボアルブミン）ＥＬＩＳＡ法（Ｓｔａｍｐｆｌｉら．Ａｍ  Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１，３１７−３２６（１９９９））を用いて検出した。通常の腹腔内感作モデル（Ｏｈｋａｗａｒａら．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６，５１０（１９９７））に従いオボアルブミンに対して感作されたマウスから得た血清を使用して、該ＥＬＩＳＡを標準化した。
【０２３５】
ＮＰ特異的ＩｇＭのレベルは正常であったが（第７日）、免疫後の第１４および２１日におけるＮＰ特異的ＩｇＧ１レベルの有意な減少が認められ、このことは、ＣＲＰ１−／−マウスにおいてＴ細胞依存性抗体産生が著しく妨げられたことを示している。さらに、免疫後の第２１および２８日におけるＩＣＯＳ−／−マウスの血清中ではＯＶＡ特異的ＩｇＥが完全に検出不可能であり、一方、これらの動物の血清中のＩｇＥの存在により測定されるとおり、ヘテロ接合および野生型対照マウスの両方においてイソタイプスイッチが生じたことを、本発明者らは観察した（表３を参照されたい）。これらの知見は、ＩＣＯＳが、Ｔ−Ｂ細胞の協同ならびにＩｇＧ１およびＩｇＥイソタイプクラスのスイッチにおいて主要で重要な役割を果たすことを示している。
【０２３６】
【表３】
2004520819.tif 000007
【実施例２４】
【０２３７】
接触過敏症モデルにおけるＢ７ＲＰ１およびＢ７．２の効果
接触過敏症を誘発させるために、まず、剃毛された腹部皮膚にアセトンおよびオリーブ油中のオキサゾロン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の１％  溶液を塗布することにより、雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（９〜１４週齢；Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を感作した。感作の７日後、右耳に該オキサゾロン溶液を塗布することによりマウスを攻撃した（第０日）。対照として、左耳に同時に該アセトンおよびオリーブ油溶媒を塗布した。該耳の厚さをマイクロメーター（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ，Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｊａｐａｎ）で測定することを、攻撃の直前から開始した。右耳と左耳との厚さにおける相違（ΔＥＴ）を用いて結果を表した（ＭｃＨａｌｅら．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２，１６４８（１９９９））。
【０２３８】
このモデルにおけるＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の投与は、感作（一次免疫応答の誘導）時においても攻撃（二次免疫応答の誘導）時においても、接触過敏症を悪化させ、該効果は、攻撃時に投与を行った場合に、より顕著であることが、既に観察されている（Ｙｏｓｈｉｎａｇａら．Ｎａｔｕｒｅ  ４０２，８２７−８３２（１９９９））。
【０２３９】
接触過敏症に対するＢ７ＲＰ１−ＦｃおよびＢ７．２−Ｆｃの組合せ効果を研究するために、攻撃とほぼ同時に、Ｂ７ＲＰ１−ＦｃおよびＢ７．２−Ｆｃを、単独または組合せて、２つの異なる用量で投与した。高用量（Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ単独の２ｍｇ／Ｋｇ、Ｂ７．２−Ｆｃ単独の２ｍｇ／Ｋｇ、およびそれぞれが１ｍｇ／Ｋｇの組合せ）においては、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ、Ｂ７．２−ＦｃおよびＢ７ＲＰ１−Ｆｃ＋Ｂ７．２−Ｆｃは、Ｆｃ（２ｍｇ／Ｋｇ）と比較して第３日からΔＥＴを増加させた（図２３Ａ）。この用量においては、Ｂ７ＲＰ１−ＦｃおよびＢ７ＲＰ１−Ｆｃ＋Ｂ７．２−Ｆｃは、第４日から、Ｂ７．２Ｆｃより著しくΔＥＴを増加させた（図２３Ａ）。Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ＋Ｂ７．２−Ｆｃも、第４日から、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃより著しくΔＥＴを増加させた（図２３Ａ）。低用量（Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ単独の０．４ｍｇ／Ｋｇ、Ｂ７．２−Ｆｃ単独の０．４ｍｇ／Ｋｇ、およびそれぞれが０．２ｍｇ／Ｋｇの組合せ）においては、Ｂ７ＲＰ１−ＦｃおよびＢ７ＲＰ１−Ｆｃ＋Ｂ７．２−Ｆｃは、Ｆｃ（０．４ｍｇ／Ｋｇ）と比較して第４日からΔＥＴを増加させたが、Ｂ７．２−ＦｃはΔＥＴを有意に変化させなかった（図２３Ｂ）。また、この用量においては、Ｂ７ＲＰ１−ＦｃおよびＢ７ＲＰ１−Ｆｃ＋Ｂ７．２−ＦｃはＢ７．２−Ｆｃより著しくΔＥＴを増加させ、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ＋Ｂ７．２−ＦｃはＢ７ＲＰ１−Ｆｃより著しくΔＥＴを増加させた（図２３Ｂ）。したがって、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃの総量の半分とＢ７．２−Ｆｃの総量の半分との組合せは、第４〜７日において、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ単独の総量またはＢ７．２単独の総量より著しくΔＥＴを増加させ、このことは、Ｂ７ＲＰ１−ＦｃおよびＢ７．２−Ｆｃが相乗的に相互作用したことを示している。
【０２４０】
本発明は好ましい実施形態に関して記載されているが、改変および修飾が当業者において見出されると理解される。したがって、添付の特許請求の範囲は、特許請求されているとおりの本発明の範囲内に含まれるすべてのそのような等価な改変を含むと意図される。
【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１Ａ−１】Ａ）マウスＣＲＰ１（ｍＣＲＰ１）のＤＮＡおよびアミノ酸配列。ＣＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されており、実験的に決定されたプロペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図１Ａ−２】Ａ）マウスＣＲＰ１（ｍＣＲＰ１）のＤＮＡおよびアミノ酸配列。ＣＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されており、実験的に決定されたプロペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図１Ｂ】Ｂ）マウスＣＲＰ１タンパク質配列（ｍＣＲＰ１）とマウスＣＤ２８（ｍＣＤ２８）とのアミノ酸アライメント。
【図２Ａ−１】Ａ）マウスＢ７ＲＰ１（ｍＢ７ＲＰ１）のＤＮＡおよびアミノ酸配列。Ｂ７ＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されており、実験的に決定されたプロペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図２Ａ−２】Ａ）マウスＢ７ＲＰ１（ｍＢ７ＲＰ１）のＤＮＡおよびアミノ酸配列。Ｂ７ＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されており、実験的に決定されたプロペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図２Ａ−３】Ａ）マウスＢ７ＲＰ１（ｍＢ７ＲＰ１）のＤＮＡおよびアミノ酸配列。Ｂ７ＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されており、実験的に決定されたプロペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図２Ａ−４】Ａ）マウスＢ７ＲＰ１（ｍＢ７ＲＰ１）のＤＮＡおよびアミノ酸配列。Ｂ７ＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されており、実験的に決定されたプロペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図２Ｂ】Ｂ）Ｂ７ＲＰ１タンパク質配列（ｍＢ７ＲＰ１）とマウスＣＤ８０（ｍＣＤ８０）とのアミノ酸アライメント。
【図３Ａ−１】Ａ）推定ヒトＢ７ＲＰ１（ｈＢ７ＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＢ７ＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されている。推定シグナルペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図３Ａ−２】Ａ）推定ヒトＢ７ＲＰ１（ｈＢ７ＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＢ７ＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されている。推定シグナルペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図３Ａ−３】Ａ）推定ヒトＢ７ＲＰ１（ｈＢ７ＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＢ７ＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されている。推定シグナルペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図３Ｂ】Ｂ）推定成熟ｈＢ７ＲＰ１タンパク質と成熟マウスＢ７ＲＰ１（ｍＢ７ＲＰ１）タンパク質とのアミノ酸アライメント。
【図４Ａ】Ａ）ｐｃＤＮＡ３／ＣＲＰ１−Ｆｃでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの可溶性ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現。示されているとおりに、１０％  ＰＡＧＥゲル上で細胞ライセートまたは馴らし培地の標準化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）容積をローディングし分離した。細胞会合型（細胞ライセート）および分泌型（培地）Ｆｃ融合タンパク質の発現に関する細胞ライセートおよび細胞培地上清のウエスタン分析。一次抗体はヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．）であった。
【図４Ｂ】Ｂ）ｐｃＤＮＡ３／Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの可溶性Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質の発現。１０％  ＰＡＧＥゲル上で２０μｌの標準化細胞ライセートまたは培地上清をローディングし分離した。ウエスタン分析を（Ａ）のとおりに行った。
【図５】ＣＯＳ−７細胞中で発現された膜結合性タンパク質とＣＲＰ１−ＦｃおよびＢ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質との相互作用。ｐｃＤＮＡ３／ＣＲＰ１、ｐｃＤＮＡ３／Ｂ７ＲＰ１またはｐｃＤＮＡ３ベクターのみで一過性にトランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞。ＣＨＯ  Ｄ細胞はｐｓＤＲα／ｈＣＤ２８でトランスフェクトされ、ヒトＣＤ２８（ｈＣＤ２８）を安定に発現した。膜結合性ＣＲＰ１、Ｂ７ＲＰ１またはｈＣＤ２８を発現する細胞は、該パネルの左側に示されている行中に示されている。Ｆｃ融合タンパク質を、該パネルの上部に示されている列中のプレート結合性細胞と共にインキュベートした。インキュベーション後、細胞を洗浄し、抗ヒトＦｃ抗体およびＡＣＡＳ（Ａｄｈｅｒｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｏｒｔｉｎｇ；ＡＣＡＳ  Ｕｌｔｉｍａ，Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｋｅｍｏｓ，ＭＩ）分析を用いて結合Ｆｃ融合タンパク質を検出した。
【図６Ａ】活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＢ７ＲＰ１に対する受容体（恐らくＣＲＰ１）の発現のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析。マウス脾細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで１２時間にわたり活性化した。各パネルの下に示されているとおり、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質、対照Ｆｃタンパク質（模擬（Ｍｏｃｋ）−Ｆｃ）またはＰＢＳ（無染色）を該細胞と共にインキュベートし、洗浄し、ついでヤギ抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣ共役抗体（ＧａＨｕＦｃ−ＦＩＴＣ）と共にインキュベートした。各パネルの左側に記載のとおりに、細胞マーカー抗体（Ｔ細胞マーカーの場合はＣＤ４およびＣＤ８）ＰＥ共役体、またはイソタイプ対照抗体（ラットイソタイプ）ＰＥ共役体、またはＰＢＳ（無染色）を加えた。
【図６Ｂ】活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＢ７ＲＰ１に対する受容体（恐らくＣＲＰ１）の発現のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析。マウス脾細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで１２時間にわたり活性化した。各パネルの下に示されているとおり、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質、対照Ｆｃタンパク質（模擬（Ｍｏｃｋ）−Ｆｃ）またはＰＢＳ（無染色）を該細胞と共にインキュベートし、洗浄し、ついでヤギ抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣ共役抗体（ＧａＨｕＦｃ−ＦＩＴＣ）と共にインキュベートした。各パネルの左側に記載のとおりに、細胞マーカー抗体（Ｔ細胞マーカーの場合はＣＤ４およびＣＤ８）ＰＥ共役体、またはイソタイプ対照抗体（ラットイソタイプ）ＰＥ共役体、またはＰＢＳ（無染色）を加えた。
【図６Ｃ】活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＢ７ＲＰ１に対する受容体（恐らくＣＲＰ１）の発現のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析。マウス脾細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで１２時間にわたり活性化した。各パネルの下に示されているとおり、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質、対照Ｆｃタンパク質（模擬（Ｍｏｃｋ）−Ｆｃ）またはＰＢＳ（無染色）を該細胞と共にインキュベートし、洗浄し、ついでヤギ抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣ共役抗体（ＧａＨｕＦｃ−ＦＩＴＣ）と共にインキュベートした。各パネルの左側に記載のとおりに、細胞マーカー抗体（Ｔ細胞マーカーの場合はＣＤ４およびＣＤ８）ＰＥ共役体、またはイソタイプ対照抗体（ラットイソタイプ）ＰＥ共役体、またはＰＢＳ（無染色）を加えた。
【図６Ｄ】活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＢ７ＲＰ１に対する受容体（恐らくＣＲＰ１）の発現のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析。マウス脾細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで１２時間にわたり活性化した。各パネルの下に示されているとおり、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質、対照Ｆｃタンパク質（模擬（Ｍｏｃｋ）−Ｆｃ）またはＰＢＳ（無染色）を該細胞と共にインキュベートし、洗浄し、ついでヤギ抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣ共役抗体（ＧａＨｕＦｃ−ＦＩＴＣ）と共にインキュベートした。各パネルの左側に記載のとおりに、細胞マーカー抗体（Ｔ細胞マーカーの場合はＣＤ４およびＣＤ８）ＰＥ共役体、またはイソタイプ対照抗体（ラットイソタイプ）ＰＥ共役体、またはＰＢＳ（無染色）を加えた。
【図６Ｅ】活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＢ７ＲＰ１に対する受容体（恐らくＣＲＰ１）の発現のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析。マウス脾細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで１２時間にわたり活性化した。各パネルの下に示されているとおり、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質、対照Ｆｃタンパク質（模擬（Ｍｏｃｋ）−Ｆｃ）またはＰＢＳ（無染色）を該細胞と共にインキュベートし、洗浄し、ついでヤギ抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣ共役抗体（ＧａＨｕＦｃ−ＦＩＴＣ）と共にインキュベートした。各パネルの左側に記載のとおりに、細胞マーカー抗体（Ｔ細胞マーカーの場合はＣＤ４およびＣＤ８）ＰＥ共役体、またはイソタイプ対照抗体（ラットイソタイプ）ＰＥ共役体、またはＰＢＳ（無染色）を加えた。
【図６Ｆ】活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＢ７ＲＰ１に対する受容体（恐らくＣＲＰ１）の発現のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析。マウス脾細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで１２時間にわたり活性化した。各パネルの下に示されているとおり、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質、対照Ｆｃタンパク質（模擬（Ｍｏｃｋ）−Ｆｃ）またはＰＢＳ（無染色）を該細胞と共にインキュベートし、洗浄し、ついでヤギ抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣ共役抗体（ＧａＨｕＦｃ−ＦＩＴＣ）と共にインキュベートした。各パネルの左側に記載のとおりに、細胞マーカー抗体（Ｔ細胞マーカーの場合はＣＤ４およびＣＤ８）ＰＥ共役体、またはイソタイプ対照抗体（ラットイソタイプ）ＰＥ共役体、またはＰＢＳ（無染色）を加えた。
【図７Ａ】Ｂ細胞上のＢ７ＲＰ１の発現のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析。マウス脾細胞上のＣＲＰ１に対するリガンド（恐らくＢ７ＲＰ１）の発現のフルオロサイトメトリー分析。マウス脾細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで１２時間にわたり活性化した。各パネルの下に示されているとおり、ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質、対照Ｆｃタンパク質（模擬（Ｍｏｃｋ）−Ｆｃ）またはＰＢＳ（無染色）を該細胞と共にインキュベートし、洗浄し、ついでヤギ抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣ共役抗体（ＧａＨｕＦｃ−ＦＩＴＣ）と共にインキュベートした。各パネルの左側に記載のとおりに、ＣＤ４５Ｒ（ＣＤ４５ＲはＢ細胞マーカーである）に対するＰＥ共役細胞マーカー抗体またはイソタイプ対照抗体（ラットイソタイプ）またはＰＢＳ（無染色）を加えた。
【図７Ｂ】Ｂ細胞上のＢ７ＲＰ１の発現のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析。マウス脾細胞上のＣＲＰ１に対するリガンド（恐らくＢ７ＲＰ１）の発現のフルオロサイトメトリー分析。マウス脾細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで１２時間にわたり活性化した。各パネルの下に示されているとおり、ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質、対照Ｆｃタンパク質（模擬（Ｍｏｃｋ）−Ｆｃ）またはＰＢＳ（無染色）を該細胞と共にインキュベートし、洗浄し、ついでヤギ抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣ共役抗体（ＧａＨｕＦｃ−ＦＩＴＣ）と共にインキュベートした。各パネルの左側に記載のとおりに、ＣＤ４５Ｒ（ＣＤ４５ＲはＢ細胞マーカーである）に対するＰＥ共役細胞マーカー抗体またはイソタイプ対照抗体（ラットイソタイプ）またはＰＢＳ（無染色）を加えた。
【図７Ｃ】Ｂ細胞上のＢ７ＲＰ１の発現のＦＡＣＳ（蛍光標示式細胞分取）分析。マウス脾細胞上のＣＲＰ１に対するリガンド（恐らくＢ７ＲＰ１）の発現のフルオロサイトメトリー分析。マウス脾細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで１２時間にわたり活性化した。各パネルの下に示されているとおり、ＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質、対照Ｆｃタンパク質（模擬（Ｍｏｃｋ）−Ｆｃ）またはＰＢＳ（無染色）を該細胞と共にインキュベートし、洗浄し、ついでヤギ抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣ共役抗体（ＧａＨｕＦｃ−ＦＩＴＣ）と共にインキュベートした。各パネルの左側に記載のとおりに、ＣＤ４５Ｒ（ＣＤ４５ＲはＢ細胞マーカーである）に対するＰＥ共役細胞マーカー抗体またはイソタイプ対照抗体（ラットイソタイプ）またはＰＢＳ（無染色）を加えた。
【図８Ａ】腹腔マクロファージ上のｍＣＲＰ１リガンドの発現のＦＡＣＳ分析。まず、腹腔細胞を、その光散乱特性に基づきサブセットにおいて識別した（パネルＡ）。マクロファージは、それが前方（ＦＳＣ）および側方（ＳＳＣ）に光を強力に散乱する能力により及びマクロファージのマーカーであるＦ４／８０抗原に関するそのポジティブ染色により、領域５（Ｒ５）において同定された（パネルＢ）。領域６（Ｒ６）におけるマクロファージを、Ｆ４／８０抗原に関するそれほど強力ではないその染色に基づき選択し、それはＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質により染色される（恐らく、Ｂ７ＲＰ１のその発現によるものであろう）ことが判明した。
【図８Ｂ】腹腔マクロファージ上のｍＣＲＰ１リガンドの発現のＦＡＣＳ分析。まず、腹腔細胞を、その光散乱特性に基づきサブセットにおいて識別した（パネルＡ）。マクロファージは、それが前方（ＦＳＣ）および側方（ＳＳＣ）に光を強力に散乱する能力により及びマクロファージのマーカーであるＦ４／８０抗原に関するそのポジティブ染色により、領域５（Ｒ５）において同定された（パネルＢ）。領域６（Ｒ６）におけるマクロファージを、Ｆ４／８０抗原に関するそれほど強力ではないその染色に基づき選択し、それはＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質により染色される（恐らく、Ｂ７ＲＰ１のその発現によるものであろう）ことが判明した。
【図８Ｃ】腹腔マクロファージ上のｍＣＲＰ１リガンドの発現のＦＡＣＳ分析。まず、腹腔細胞を、その光散乱特性に基づきサブセットにおいて識別した（パネルＡ）。マクロファージは、それが前方（ＦＳＣ）および側方（ＳＳＣ）に光を強力に散乱する能力により及びマクロファージのマーカーであるＦ４／８０抗原に関するそのポジティブ染色により、領域５（Ｒ５）において同定された（パネルＢ）。領域６（Ｒ６）におけるマクロファージを、Ｆ４／８０抗原に関するそれほど強力ではないその染色に基づき選択し、それはＣＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質により染色される（恐らく、Ｂ７ＲＰ１のその発現によるものであろう）ことが判明した。
【図９】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を使用するＴ細胞増殖の抑制。マウス脾細胞からのＴ細胞を、該グラフの下に示されているとおりにコンコナバリンＡ（Ｃｏｎｃｏｎａｖａｌｉｎ  Ａ）（Ｃｏｎ  Ａ）の濃度を増加させることにより活性化させた。ｍＣＲＰ１−Ｆｃ、ｍＢ７ＲＰ１およびｍＢ７．２−Ｆｃ融合タンパク質を、Ｃｏｎ  Ａの不存在下（無添加）または存在下、脾細胞からの富化Ｔ細胞に加えた。該Ｔ細胞増殖アッセイにおいては、９６ウェルプレート中で２００，０００細胞を使用した。細胞を、グラフ凡例に示されているとおりに培地（無添加）またはＦｃ融合タンパク質と共にインキュベートした。４２時間後、細胞をＨ−チミジンで６時間にわたりパルスし、ついで回収し、取り込まれた放射能を測定した。三重サンプルからの平均ＣＰＭおよび標準偏差が示されている。
【図１０Ａ】Ａ）腸間膜リンパ節の皮質、傍皮質および髄質を示す対照マウス＃１０からの正常な腸間膜リンパ節。ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、倍率４０倍。
【図１０Ｂ】Ｂ）顕著な小胞過形成（ＦＨ）、傍皮質の拡大および髄索過形成（ＭＨ）を有するＷＸ１１マウス＃４０からの著しく拡大した腸間膜リンパ節。Ｈ＆Ｅ、４０倍。
【図１０Ｃ】Ｃ）対照マウス＃１０の腸間膜リンパ節からの髄索（ＭＣ）および洞（ＭＳ）の拡大図。肥大したマクロファージを伴う髄洞に隣接した主に小さなリンパ球から構成される小さな髄索に注目されたい。Ｈ＆Ｅ、４００倍。
【図１０Ｄ】Ｄ．ＷＸ１１マウス＃４０の腸間膜リンパ節からの髄索（ＭＣ）および洞（ＭＳ）の拡大図。偶発的なラッセル小体細胞（矢印）を伴う多数の形質細胞から構成される著しく肥大した髄索に注目されたい。Ｈ＆Ｅ、４００倍。
【図１０Ｅ】Ｅ）動脈周囲リンパ鞘（ＰＡＬＳ）を伴う赤脾髄および白脾髄領域を示す対照マウス＃１０からの正常な脾臓、１００倍。差し込み図：小さなリンパ球、マクロファージおよび偶発的な形質細胞を伴う白脾髄を囲む辺縁域の拡大図、４００倍。
【図１０Ｆ】Ｆ）ＰＡＬＳおよび小胞（矢印）を含む拡大した白脾髄領域を有するＷＸ１１マウス＃６からの脾臓、１００倍。差し込み図：多数の形質細胞および偶発的なラッセル小体を伴う辺縁帯の拡大図、４００倍。
【図１０Ｇ】Ｇ）２つの二次小胞に隣接した小胞間域を伴う対照マウス＃２５からのパイエル板（矢印）を伴う回腸、４０倍。
【図１０Ｈ】Ｈ）顕著な胚中心および小胞間組織を伴う著しく拡大した小胞を伴うＷＸ１１マウス＃３２からのパイエル板（矢印）を伴う回腸、４０倍。
【図１１Ａ】Ａ）腸間膜リンパ節の皮質、傍皮質および髄質を示す対照マウス＃５からの正常な腸間膜リンパ節。ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、倍率４０倍。
【図１１Ｂ】Ｂ）顕著な小胞過形成（上部：外皮質中の二次小胞の列）、傍皮質の拡大（中央）および髄索過形成（下部）を伴うＷＸ１１マウス＃３３からの著しく拡大した腸間膜リンパ節。Ｈ＆Ｅ、４０倍。
【図１１Ｃ】Ｃ）抗Ｂ２２０抗体（Ｂ細胞マーカー）での対照マウス＃１０からの腸間膜リンパ節の免疫組織化学的染色。強く（褐色に）染色された皮質領域および薄い髄索。アビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）免疫ペルオキシダーゼ法（ＤＡＢ色素原、ヘマトキシリン対比染色）を用いて行った免疫染色、４０倍。
【図１１Ｄ】Ｄ）抗Ｂ２２０抗体でのＷＸ１１マウス＃３３からの腸間膜リンパ節の免疫組織化学的染色。強く染色された皮質小胞および髄索（一方、該索中の成熟形質細胞はＢ２２０に関して陰性である）に注目されたい、４０倍。
【図１１Ｅ】Ｅ）抗ＣＤ３抗体（Ｔ細胞マーカー）での対照マウス＃１０からのリンパ節の免疫組織化学的染色。該節の傍皮質域の免疫染色、４０倍。
【図１１Ｆ】Ｆ）抗ＣＤ３抗体でのＷＸ１１マウス＃３３からのリンパ節の免疫組織化学的染色。該節の拡大した強く染色された傍皮質領域に注目されたい、４０倍。
【図１２Ａ−１】Ａ）ヒトＢ７ＲＰ１（ｈＢ７ＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＢ７ＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されている。推定シグナルペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図１２Ａ−２】Ａ）ヒトＢ７ＲＰ１（ｈＢ７ＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＢ７ＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されている。推定シグナルペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図１２Ａ−３】Ａ）ヒトＢ７ＲＰ１（ｈＢ７ＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＢ７ＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されている。推定シグナルペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図１２Ａ−４】Ａ）ヒトＢ７ＲＰ１（ｈＢ７ＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＢ７ＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されている。推定シグナルペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図１２Ｂ】Ｂ）推定成熟ｈＢ７ＲＰ１タンパク質と成熟マウスＢ７ＲＰ１（ｍＢ７ＲＰ１）タンパク質とのアミノ酸アライメント。
【図１３Ａ−１】Ａ）ヒトＣＲＰ１（ｈＣＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＣＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されている。推定シグナルペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図１３Ａ−２】Ａ）ヒトＣＲＰ１（ｈＣＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＣＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されている。推定シグナルペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図１３Ａ−３】Ａ）ヒトＣＲＰ１（ｈＣＲＰ１）のタンパク質コード領域の構造および配列。ｈＣＲＰ１の推定シグナル配列がアミノ末端において下線で示されている。推定シグナルペプチド切断部位が星印で示されている。推定膜貫通配列がカルボキシ末端において下線で示されている。
【図１３Ｂ】Ｂ）推定成熟ｈＣＲＰ１タンパク質と成熟ＣＲＰ１（ｍＢ７ＲＰ１）タンパク質とのアミノ酸アライメント。
【図１４Ａ】ＣＲＰ１は、静止中の記憶Ｔ細胞上に存在する。ＦＩＴＣ共役抗ヒトＦｃ抗体とＣＤ４４（図１４Ａ）、ＣＤ４５ＲＢ（図１４Ｂ）またはＣＤ６９（図１４Ｃ）に対するＰＥ共役抗体とにより標識されたＢ７ＲＰ１−Ｆｃを使用して、６〜７月齢のマウスからの静止脾細胞を二重染色した。
【図１４Ｂ】ＣＲＰ１は、静止中の記憶Ｔ細胞上に存在する。ＦＩＴＣ共役抗ヒトＦｃ抗体とＣＤ４４（図１４Ａ）、ＣＤ４５ＲＢ（図１４Ｂ）またはＣＤ６９（図１４Ｃ）に対するＰＥ共役抗体とにより標識されたＢ７ＲＰ１−Ｆｃを使用して、６〜７月齢のマウスからの静止脾細胞を二重染色した。
【図１４Ｃ】ＣＲＰ１は、静止中の記憶Ｔ細胞上に存在する。ＦＩＴＣ共役抗ヒトＦｃ抗体とＣＤ４４（図１４Ａ）、ＣＤ４５ＲＢ（図１４Ｂ）またはＣＤ６９（図１４Ｃ）に対するＰＥ共役抗体とにより標識されたＢ７ＲＰ１−Ｆｃを使用して、６〜７月齢のマウスからの静止脾細胞を二重染色した。
【図１５Ａ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質によるＴ細胞の共刺激。Ａ）抗ＣＤ３抗体と共に種々の量のＢ７ＲＰ１−Ｆｃ（黒正方形）、Ｂ７．２−Ｆｃ（黒丸）またはＯＰＧ−Ｆｃ融合タンパク質対照（白正方形）により誘導されたＴ細胞増殖。抗ヒトＦｃ  ＦＡｂ２（１２．５μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ３抗体（０．９μｇ／ｍｌ）で予めコートされた９６ウェルプレートをコートするために、種々の濃度で融合タンパク質を使用した。Ｂ７ＲＰ１−ＦｃおよびＢ７．２−Ｆｃは、最大効果が達成される０．３μｇ／ｍｌまで、用量依存的にＴ細胞を共刺激する。Ｂ）種々の濃度のウサギ抗Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃポリクローナル抗体の存在下、抗ＣＤ３抗体（０．８５μｇ／ｍｌ）と共にＢ７ＲＰ１−Ｆｃ（黒正方形）、Ｂ７．２−Ｆｃ（黒丸）、非融合Ｆｃ（黒正方形）、Ｂ７．２−Ｆｃ（黒丸）、非融合Ｆｃ（白正方形）または無Ｆｃ（白丸）により誘導されたＴ細胞増殖。Ｆｃ融合タンパク質を０．３μｇ／ｍｌの濃度で使用し、前記のプレートに結合させた。該抗Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ抗体を、アジュバント中の抗原の皮下注射により、精製Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃに対して産生させ、ついでアフィニティー精製した。該抗体を該Ｆｃ融合タンパク質と共に３０分間インキュベートした後、該細胞を加えた。該抗Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ抗体は、用量依存的にＢ７ＲＰ１−Ｆｃにより誘導されたＴ細胞増殖を特異的に抑制する。
【図１５Ｂ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質によるＴ細胞の共刺激。Ａ）抗ＣＤ３抗体と共に種々の量のＢ７ＲＰ１−Ｆｃ（黒正方形）、Ｂ７．２−Ｆｃ（黒丸）またはＯＰＧ−Ｆｃ融合タンパク質対照（白正方形）により誘導されたＴ細胞増殖。抗ヒトＦｃ  ＦＡｂ２（１２．５μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ３抗体（０．９μｇ／ｍｌ）で予めコートされた９６ウェルプレートをコートするために、種々の濃度で融合タンパク質を使用した。Ｂ７ＲＰ１−ＦｃおよびＢ７．２−Ｆｃは、最大効果が達成される０．３μｇ／ｍｌまで、用量依存的にＴ細胞を共刺激する。Ｂ）種々の濃度のウサギ抗Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃポリクローナル抗体の存在下、抗ＣＤ３抗体（０．８５μｇ／ｍｌ）と共にＢ７ＲＰ１−Ｆｃ（黒正方形）、Ｂ７．２−Ｆｃ（黒丸）、非融合Ｆｃ（黒正方形）、Ｂ７．２−Ｆｃ（黒丸）、非融合Ｆｃ（白正方形）または無Ｆｃ（白丸）により誘導されたＴ細胞増殖。Ｆｃ融合タンパク質を０．３μｇ／ｍｌの濃度で使用し、前記のプレートに結合させた。該抗Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ抗体を、アジュバント中の抗原の皮下注射により、精製Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃに対して産生させ、ついでアフィニティー精製した。該抗体を該Ｆｃ融合タンパク質と共に３０分間インキュベートした後、該細胞を加えた。該抗Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ抗体は、用量依存的にＢ７ＲＰ１−Ｆｃにより誘導されたＴ細胞増殖を特異的に抑制する。
【図１６Ａ】マウスにおけるコラーゲン関節炎の発生率（Ａ）および重症度（Ｂ）に対するＣＲＰ１−ＦｃおよびＢ７ＲＰ１−Ｆｃタンパク質の効果。コラーゲン関節炎感受性Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスを、ＣＦＡ中の１０μｇのブタコラーゲンＩＩ型で尾の基部において免疫した。マウスには１００μｇの融合タンパク質を週２回投与した。Ｆｃ融合タンパク質および対照ＰＢＳ処理が該図凡例中に示されている。
【図１６Ｂ】マウスにおけるコラーゲン関節炎の発生率（Ａ）および重症度（Ｂ）に対するＣＲＰ１−ＦｃおよびＢ７ＲＰ１−Ｆｃタンパク質の効果。コラーゲン関節炎感受性Ｂ１０．ＲＩＩＩマウスを、ＣＦＡ中の１０μｇのブタコラーゲンＩＩ型で尾の基部において免疫した。マウスには１００μｇの融合タンパク質を週２回投与した。Ｆｃ融合タンパク質および対照ＰＢＳ処理が該図凡例中に示されている。
【図１７Ａ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける近位結腸。Ａ）粘膜、粘膜下組織、粘膜筋板（ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ）および漿膜を伴う腸壁を有する対照マウス＃５３Ｆ（雌）からの正常な近位結腸。ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、倍率４０倍。
【図１７Ｂ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける近位結腸。（Ｂ）顕著な腺性肥大、亀裂潰瘍および経壁的炎症を有するＢ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１１Ｆからの散在性肥厚近位結腸。Ｈ＆Ｅ、４０倍。
【図１７Ｃ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける近位結腸。（Ｃ）多病巣性亀裂潰瘍および経壁炎症を有するＢ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１１Ｆからの近位結腸（パネルＢ）と同様）の低倍率図。Ｈ＆Ｅ、２０倍。
【図１７Ｄ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける近位結腸。（Ｄ）Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１１Ｆ（前記パネルＢおよびＣに示されている）からの亀裂潰瘍および肥大結腸腺の拡大図。粘液膿性滲出物を伴う内腔に注目されたい。Ｈ＆Ｅ、１００倍。
【図１７Ｅ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける近位結腸。（Ｅ）マクロファージ、リンパ球および少数の好中球に包囲された多核巨細胞を伴うＢ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１２Ｆの粘膜下組織中の肉芽性炎症の拡大図。Ｈ＆Ｅ、４００倍。
【図１７Ｆ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける近位結腸。（Ｆ）粘液腺の下のリンパ球、形質細胞および少数の好中球と混合した上皮様マクロファージを伴うＢ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１２Ｆの粘膜における肉芽性炎症の拡大図。Ｈ＆Ｅ、４００倍。
【図１８Ａ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける遠位結腸。（Ａ）粘膜、粘膜下組織、粘膜筋板（ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ）および漿膜を伴う腸壁の層を示す対照マウス＃５３Ｆ（雌）からの正常な遠位結腸。ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、倍率４０倍。
【図１８Ｂ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける遠位結腸。（Ｂ）顕著な腺性肥大および過形成および散在性陰窩膿瘍を伴うＢ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１１Ｆ（雌）からの散在性肥厚遠位結腸。Ｈ＆Ｅ、４０倍。
【図１８Ｃ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける遠位結腸。（Ｃ）顕著な腺性肥大および過形成を伴うＢ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃５５Ｍ（雄）からの散在性肥厚遠位結腸。Ｈ＆Ｅ、４０倍。
【図１８Ｄ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける遠位結腸。（Ｄ）肥大結腸腺、局所リンパ様凝集物および多数の陰窩膿瘍を伴うＢ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１２Ｆ（雌）からの散在性肥厚遠位結腸。Ｈ＆Ｅ、４０倍。
【図１８Ｅ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける遠位結腸。（Ｅ）抗ＣＤ３抗体（Ｔ細胞マーカー）でのＢ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１２Ｆからの遠位結腸の免疫組織化学的染色。表在性粘膜および結腸リンパ斑の免疫染色に注目されたい。Ｈ＆Ｅ、４０倍。
【図１８Ｆ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける遠位結腸。（Ｆ）Ｂ２２０＋  Ｂ細胞（差し込み図）から構成されるリンパ様凝集物および陰窩膿瘍（矢印）を伴うＢ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃１１２Ｆの結腸粘膜の拡大図。Ｈ＆Ｅ、１００倍。
【図１９Ａ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける小腸。（Ａ）粘膜および下部の粘膜下組織、粘膜筋板（ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ）および漿膜の内腔、絨毛および陰窩を示す対照マウス＃５３Ｆ（雌）からの正常な十二指腸。ヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、倍率４０倍。
【図１９Ｂ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける小腸。（Ｂ）顕著な陰窩肥大および過形成ならびに固有層中の軽度のリンパ形質細胞浸潤を伴うＢ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃５１Ｆ（雌）からの散在性肥厚十二指腸。Ｈ＆Ｅ、４０倍。
【図１９Ｃ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける小腸。（Ｃ）正常な長さの絨毛および陰窩（空腸粘膜におけるもの）を示す対照マウス＃５３Ｆ（雌）からの正常な空腸。Ｈ＆Ｅ、倍率４０倍。
【図１９Ｄ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける小腸。（Ｄ）局所的に拡張した陰窩肥大および過形成を伴うＢ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃５１Ｆ（雌）からの顕著に肥厚した空腸粘膜。Ｈ＆Ｅ、４０倍。
【図１９Ｅ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける小腸。（Ｅ）正常な長さの絨毛および陰窩（回腸粘膜におけるもの）を示す対照マウス＃５３Ｆ（雌）からの正常な回腸。Ｈ＆Ｅ、倍率４０倍。
【図１９Ｆ】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウスにおける小腸。（Ｆ）絨毛の局所的喪失および鈍化を伴うＢ７ＲＰ１−Ｆｃトランスジェニックマウス＃２３１Ｍ（雄）からの回腸粘膜の軽度な萎縮。Ｈ＆Ｅ、４０倍。
【図２０】Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質はマウスにおける腫瘍増殖を抑制する。Ｍｅｔｈ  Ａ肉腫細胞をＢａｌｂ／Ｃマウスの腹部の皮内に移植した。移植後の第７、１０、１４および１７日に、該マウスをビヒクル（黒菱形）またはマウスＢＲＰ１−Ｆｃ（灰色の三角形、実施例７）で処理した。実施例２０に記載のとおりに、示されている移植後日数において腫瘍体積を測定した。該腫瘍増殖を第２８日までモニターした。各群は８匹のマウスを有していた。
【図２１Ａ】ヒトＢ７ＲＰ１−ＦｃによるＴ細胞共刺激。抗ＣＤ３およびヒトＢ７ＲＰ１  Ｆｃを使用して９６ウェルプレートをコートし、１×１０５個のＴ細胞／ウェル（＞９８％  ＣＤ３＋）を培養し、回収した（実施例２１に記載のとおり）。Ａ）種々の濃度の抗ＣＤ３一次刺激における、抗ＣＤ３のみ（黒丸）、０．５μｇ／ｍｌ  Ｂ７ＲＰ１  Ｆｃ（黒三角）、０．５μｇ／ｍｌ  ＯＰＧ−Ｆｃ（白丸）および５μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ２８（白三角）により誘導された共刺激。データは、Ｂ７ＲＰ−１Ｆｃが、抗ＣＤ２８抗体を使用した共刺激と同様のレベルまで、抗ＣＤ３感作Ｔ細胞を共刺激したことを示している。示されているデータは、３人の正常ドナーから単離されたＴ細胞で得られたいくつかの実験の１つの代表的実験からの３通りのウェルにおける平均取り込み［３Ｈ］ＴｄＲ  ＋／−  ＳＤである。Ｂ）ＣＲＰ１−ＦｃによるＢ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激の用量依存的抑制。０．３μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ  Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃの両方でコートされたウェル中でＴ細胞を培養した。Ｔ細胞の添加の前に３０分間にわたり、系列希釈濃度のＣＲＰ１−Ｆｃ（黒丸）またはＯＰＧ−Ｆｃ（白丸）をＢ７ＲＰ１−Ｆｃと共にプレインキュベートした。データは、ＣＲＰ１−Ｆｃが、Ｂ７ＲＰ１誘発性共刺激を用量依存的に抑制することを示している。抑制率（％）は、ＣＲＰ１−ＦｃまたはＯＰＧ−Ｆｃタンパク質濃度に対してプロットされている。示されているデータは、３通り（三重）のウェルにおいて行った３つの実験の平均取り込み［３Ｈ］ＴｄＲ  ＋／−  ＳＤであり、２人の正常ドナーで行った実験の代表例である。Ｃ）ＣＨＯヒトＢ７ＲＰ１細胞による共刺激。Ｔ細胞を末梢血から精製し、抗ＣＤ３のみ（黒丸）、１×１０４  ＣＨＯベクター対照細胞（白丸）または１×１０４  ＣＨＯ  Ｂ７ＲＰ１細胞（黒三角）の存在下、種々の濃度の抗ＣＤ３と共に培養した（実施例２２に記載のとおり）。該データは、膜結合Ｂ７ＲＰ１が、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を使用した場合に観察されるのと同様のレベルまで、Ｔ細胞増殖を共刺激したことを示している。示されているデータは、３通りの培養の平均＋／−  ＳＤであり、２人の正常ドナーで得られた結果の代表例である。Ｄ）サイトカイン産生。Ｔ細胞を、図２１Ａに記載のとおりに培養し、４８時間（黒棒線）および７２時間（灰色棒線）の時点で上清を集めた。データは、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激細胞により産生されたＩＬ−２の量（上のグラフ）が、抗ＣＤ３および対照Ｆｃにより刺激された細胞により産生されたものと同様であるが、抗ＣＤ２８共刺激細胞により産生されたものより有意に少ないことを示している。データはまた、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激が、ＩＬ−１０（中央のグラフ）およびＩＦＮ−γ（下のグラフ）の産生を増強したことを示している。
【図２１Ｂ】ヒトＢ７ＲＰ１−ＦｃによるＴ細胞共刺激。抗ＣＤ３およびヒトＢ７ＲＰ１  Ｆｃを使用して９６ウェルプレートをコートし、１×１０５個のＴ細胞／ウェル（＞９８％  ＣＤ３＋）を培養し、回収した（実施例２１に記載のとおり）。Ａ）種々の濃度の抗ＣＤ３一次刺激における、抗ＣＤ３のみ（黒丸）、０．５μｇ／ｍｌ  Ｂ７ＲＰ１  Ｆｃ（黒三角）、０．５μｇ／ｍｌ  ＯＰＧ−Ｆｃ（白丸）および５μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ２８（白三角）により誘導された共刺激。データは、Ｂ７ＲＰ−１Ｆｃが、抗ＣＤ２８抗体を使用した共刺激と同様のレベルまで、抗ＣＤ３感作Ｔ細胞を共刺激したことを示している。示されているデータは、３人の正常ドナーから単離されたＴ細胞で得られたいくつかの実験の１つの代表的実験からの３通りのウェルにおける平均取り込み［３Ｈ］ＴｄＲ  ＋／−  ＳＤである。Ｂ）ＣＲＰ１−ＦｃによるＢ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激の用量依存的抑制。０．３μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ  Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃの両方でコートされたウェル中でＴ細胞を培養した。Ｔ細胞の添加の前に３０分間にわたり、系列希釈濃度のＣＲＰ１−Ｆｃ（黒丸）またはＯＰＧ−Ｆｃ（白丸）をＢ７ＲＰ１−Ｆｃと共にプレインキュベートした。データは、ＣＲＰ１−Ｆｃが、Ｂ７ＲＰ１誘発性共刺激を用量依存的に抑制することを示している。抑制率（％）は、ＣＲＰ１−ＦｃまたはＯＰＧ−Ｆｃタンパク質濃度に対してプロットされている。示されているデータは、３通り（三重）のウェルにおいて行った３つの実験の平均取り込み［３Ｈ］ＴｄＲ  ＋／−  ＳＤであり、２人の正常ドナーで行った実験の代表例である。Ｃ）ＣＨＯヒトＢ７ＲＰ１細胞による共刺激。Ｔ細胞を末梢血から精製し、抗ＣＤ３のみ（黒丸）、１×１０４  ＣＨＯベクター対照細胞（白丸）または１×１０４  ＣＨＯ  Ｂ７ＲＰ１細胞（黒三角）の存在下、種々の濃度の抗ＣＤ３と共に培養した（実施例２２に記載のとおり）。該データは、膜結合Ｂ７ＲＰ１が、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を使用した場合に観察されるのと同様のレベルまで、Ｔ細胞増殖を共刺激したことを示している。示されているデータは、３通りの培養の平均＋／−  ＳＤであり、２人の正常ドナーで得られた結果の代表例である。Ｄ）サイトカイン産生。Ｔ細胞を、図２１Ａに記載のとおりに培養し、４８時間（黒棒線）および７２時間（灰色棒線）の時点で上清を集めた。データは、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激細胞により産生されたＩＬ−２の量（上のグラフ）が、抗ＣＤ３および対照Ｆｃにより刺激された細胞により産生されたものと同様であるが、抗ＣＤ２８共刺激細胞により産生されたものより有意に少ないことを示している。データはまた、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激が、ＩＬ−１０（中央のグラフ）およびＩＦＮ−γ（下のグラフ）の産生を増強したことを示している。
【図２１Ｃ】ヒトＢ７ＲＰ１−ＦｃによるＴ細胞共刺激。抗ＣＤ３およびヒトＢ７ＲＰ１  Ｆｃを使用して９６ウェルプレートをコートし、１×１０５個のＴ細胞／ウェル（＞９８％  ＣＤ３＋）を培養し、回収した（実施例２１に記載のとおり）。Ａ）種々の濃度の抗ＣＤ３一次刺激における、抗ＣＤ３のみ（黒丸）、０．５μｇ／ｍｌ  Ｂ７ＲＰ１  Ｆｃ（黒三角）、０．５μｇ／ｍｌ  ＯＰＧ−Ｆｃ（白丸）および５μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ２８（白三角）により誘導された共刺激。データは、Ｂ７ＲＰ−１Ｆｃが、抗ＣＤ２８抗体を使用した共刺激と同様のレベルまで、抗ＣＤ３感作Ｔ細胞を共刺激したことを示している。示されているデータは、３人の正常ドナーから単離されたＴ細胞で得られたいくつかの実験の１つの代表的実験からの３通りのウェルにおける平均取り込み［３Ｈ］ＴｄＲ  ＋／−  ＳＤである。Ｂ）ＣＲＰ１−ＦｃによるＢ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激の用量依存的抑制。０．３μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ  Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃの両方でコートされたウェル中でＴ細胞を培養した。Ｔ細胞の添加の前に３０分間にわたり、系列希釈濃度のＣＲＰ１−Ｆｃ（黒丸）またはＯＰＧ−Ｆｃ（白丸）をＢ７ＲＰ１−Ｆｃと共にプレインキュベートした。データは、ＣＲＰ１−Ｆｃが、Ｂ７ＲＰ１誘発性共刺激を用量依存的に抑制することを示している。抑制率（％）は、ＣＲＰ１−ＦｃまたはＯＰＧ−Ｆｃタンパク質濃度に対してプロットされている。示されているデータは、３通り（三重）のウェルにおいて行った３つの実験の平均取り込み［３Ｈ］ＴｄＲ  ＋／−  ＳＤであり、２人の正常ドナーで行った実験の代表例である。Ｃ）ＣＨＯヒトＢ７ＲＰ１細胞による共刺激。Ｔ細胞を末梢血から精製し、抗ＣＤ３のみ（黒丸）、１×１０４  ＣＨＯベクター対照細胞（白丸）または１×１０４  ＣＨＯ  Ｂ７ＲＰ１細胞（黒三角）の存在下、種々の濃度の抗ＣＤ３と共に培養した（実施例２２に記載のとおり）。該データは、膜結合Ｂ７ＲＰ１が、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を使用した場合に観察されるのと同様のレベルまで、Ｔ細胞増殖を共刺激したことを示している。示されているデータは、３通りの培養の平均＋／−  ＳＤであり、２人の正常ドナーで得られた結果の代表例である。Ｄ）サイトカイン産生。Ｔ細胞を、図２１Ａに記載のとおりに培養し、４８時間（黒棒線）および７２時間（灰色棒線）の時点で上清を集めた。データは、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激細胞により産生されたＩＬ−２の量（上のグラフ）が、抗ＣＤ３および対照Ｆｃにより刺激された細胞により産生されたものと同様であるが、抗ＣＤ２８共刺激細胞により産生されたものより有意に少ないことを示している。データはまた、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激が、ＩＬ−１０（中央のグラフ）およびＩＦＮ−γ（下のグラフ）の産生を増強したことを示している。
【図２１Ｄ】ヒトＢ７ＲＰ１−ＦｃによるＴ細胞共刺激。抗ＣＤ３およびヒトＢ７ＲＰ１  Ｆｃを使用して９６ウェルプレートをコートし、１×１０５個のＴ細胞／ウェル（＞９８％  ＣＤ３＋）を培養し、回収した（実施例２１に記載のとおり）。Ａ）種々の濃度の抗ＣＤ３一次刺激における、抗ＣＤ３のみ（黒丸）、０．５μｇ／ｍｌ  Ｂ７ＲＰ１  Ｆｃ（黒三角）、０．５μｇ／ｍｌ  ＯＰＧ−Ｆｃ（白丸）および５μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ２８（白三角）により誘導された共刺激。データは、Ｂ７ＲＰ−１Ｆｃが、抗ＣＤ２８抗体を使用した共刺激と同様のレベルまで、抗ＣＤ３感作Ｔ細胞を共刺激したことを示している。示されているデータは、３人の正常ドナーから単離されたＴ細胞で得られたいくつかの実験の１つの代表的実験からの３通りのウェルにおける平均取り込み［３Ｈ］ＴｄＲ  ＋／−  ＳＤである。Ｂ）ＣＲＰ１−ＦｃによるＢ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激の用量依存的抑制。０．３μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ  Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃの両方でコートされたウェル中でＴ細胞を培養した。Ｔ細胞の添加の前に３０分間にわたり、系列希釈濃度のＣＲＰ１−Ｆｃ（黒丸）またはＯＰＧ−Ｆｃ（白丸）をＢ７ＲＰ１−Ｆｃと共にプレインキュベートした。データは、ＣＲＰ１−Ｆｃが、Ｂ７ＲＰ１誘発性共刺激を用量依存的に抑制することを示している。抑制率（％）は、ＣＲＰ１−ＦｃまたはＯＰＧ−Ｆｃタンパク質濃度に対してプロットされている。示されているデータは、３通り（三重）のウェルにおいて行った３つの実験の平均取り込み［３Ｈ］ＴｄＲ  ＋／−  ＳＤであり、２人の正常ドナーで行った実験の代表例である。Ｃ）ＣＨＯヒトＢ７ＲＰ１細胞による共刺激。Ｔ細胞を末梢血から精製し、抗ＣＤ３のみ（黒丸）、１×１０４  ＣＨＯベクター対照細胞（白丸）または１×１０４  ＣＨＯ  Ｂ７ＲＰ１細胞（黒三角）の存在下、種々の濃度の抗ＣＤ３と共に培養した（実施例２２に記載のとおり）。該データは、膜結合Ｂ７ＲＰ１が、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を使用した場合に観察されるのと同様のレベルまで、Ｔ細胞増殖を共刺激したことを示している。示されているデータは、３通りの培養の平均＋／−  ＳＤであり、２人の正常ドナーで得られた結果の代表例である。Ｄ）サイトカイン産生。Ｔ細胞を、図２１Ａに記載のとおりに培養し、４８時間（黒棒線）および７２時間（灰色棒線）の時点で上清を集めた。データは、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激細胞により産生されたＩＬ−２の量（上のグラフ）が、抗ＣＤ３および対照Ｆｃにより刺激された細胞により産生されたものと同様であるが、抗ＣＤ２８共刺激細胞により産生されたものより有意に少ないことを示している。データはまた、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激が、ＩＬ−１０（中央のグラフ）およびＩＦＮ−γ（下のグラフ）の産生を増強したことを示している。
【図２１Ｅ】ヒトＢ７ＲＰ１−ＦｃによるＴ細胞共刺激。抗ＣＤ３およびヒトＢ７ＲＰ１  Ｆｃを使用して９６ウェルプレートをコートし、１×１０５個のＴ細胞／ウェル（＞９８％  ＣＤ３＋）を培養し、回収した（実施例２１に記載のとおり）。Ａ）種々の濃度の抗ＣＤ３一次刺激における、抗ＣＤ３のみ（黒丸）、０．５μｇ／ｍｌ  Ｂ７ＲＰ１  Ｆｃ（黒三角）、０．５μｇ／ｍｌ  ＯＰＧ−Ｆｃ（白丸）および５μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ２８（白三角）により誘導された共刺激。データは、Ｂ７ＲＰ−１Ｆｃが、抗ＣＤ２８抗体を使用した共刺激と同様のレベルまで、抗ＣＤ３感作Ｔ細胞を共刺激したことを示している。示されているデータは、３人の正常ドナーから単離されたＴ細胞で得られたいくつかの実験の１つの代表的実験からの３通りのウェルにおける平均取り込み［３Ｈ］ＴｄＲ  ＋／−  ＳＤである。Ｂ）ＣＲＰ１−ＦｃによるＢ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激の用量依存的抑制。０．３μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ  Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃの両方でコートされたウェル中でＴ細胞を培養した。Ｔ細胞の添加の前に３０分間にわたり、系列希釈濃度のＣＲＰ１−Ｆｃ（黒丸）またはＯＰＧ−Ｆｃ（白丸）をＢ７ＲＰ１−Ｆｃと共にプレインキュベートした。データは、ＣＲＰ１−Ｆｃが、Ｂ７ＲＰ１誘発性共刺激を用量依存的に抑制することを示している。抑制率（％）は、ＣＲＰ１−ＦｃまたはＯＰＧ−Ｆｃタンパク質濃度に対してプロットされている。示されているデータは、３通り（三重）のウェルにおいて行った３つの実験の平均取り込み［３Ｈ］ＴｄＲ  ＋／−  ＳＤであり、２人の正常ドナーで行った実験の代表例である。Ｃ）ＣＨＯヒトＢ７ＲＰ１細胞による共刺激。Ｔ細胞を末梢血から精製し、抗ＣＤ３のみ（黒丸）、１×１０４  ＣＨＯベクター対照細胞（白丸）または１×１０４  ＣＨＯ  Ｂ７ＲＰ１細胞（黒三角）の存在下、種々の濃度の抗ＣＤ３と共に培養した（実施例２２に記載のとおり）。該データは、膜結合Ｂ７ＲＰ１が、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を使用した場合に観察されるのと同様のレベルまで、Ｔ細胞増殖を共刺激したことを示している。示されているデータは、３通りの培養の平均＋／−  ＳＤであり、２人の正常ドナーで得られた結果の代表例である。Ｄ）サイトカイン産生。Ｔ細胞を、図２１Ａに記載のとおりに培養し、４８時間（黒棒線）および７２時間（灰色棒線）の時点で上清を集めた。データは、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激細胞により産生されたＩＬ−２の量（上のグラフ）が、抗ＣＤ３および対照Ｆｃにより刺激された細胞により産生されたものと同様であるが、抗ＣＤ２８共刺激細胞により産生されたものより有意に少ないことを示している。データはまた、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激が、ＩＬ−１０（中央のグラフ）およびＩＦＮ−γ（下のグラフ）の産生を増強したことを示している。
【図２１Ｆ】ヒトＢ７ＲＰ１−ＦｃによるＴ細胞共刺激。抗ＣＤ３およびヒトＢ７ＲＰ１  Ｆｃを使用して９６ウェルプレートをコートし、１×１０５個のＴ細胞／ウェル（＞９８％  ＣＤ３＋）を培養し、回収した（実施例２１に記載のとおり）。Ａ）種々の濃度の抗ＣＤ３一次刺激における、抗ＣＤ３のみ（黒丸）、０．５μｇ／ｍｌ  Ｂ７ＲＰ１  Ｆｃ（黒三角）、０．５μｇ／ｍｌ  ＯＰＧ−Ｆｃ（白丸）および５μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ２８（白三角）により誘導された共刺激。データは、Ｂ７ＲＰ−１Ｆｃが、抗ＣＤ２８抗体を使用した共刺激と同様のレベルまで、抗ＣＤ３感作Ｔ細胞を共刺激したことを示している。示されているデータは、３人の正常ドナーから単離されたＴ細胞で得られたいくつかの実験の１つの代表的実験からの３通りのウェルにおける平均取り込み［３Ｈ］ＴｄＲ  ＋／−  ＳＤである。Ｂ）ＣＲＰ１−ＦｃによるＢ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激の用量依存的抑制。０．３μｇ／ｍｌ  抗ＣＤ３および０．５μｇ／ｍｌ  Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃの両方でコートされたウェル中でＴ細胞を培養した。Ｔ細胞の添加の前に３０分間にわたり、系列希釈濃度のＣＲＰ１−Ｆｃ（黒丸）またはＯＰＧ−Ｆｃ（白丸）をＢ７ＲＰ１−Ｆｃと共にプレインキュベートした。データは、ＣＲＰ１−Ｆｃが、Ｂ７ＲＰ１誘発性共刺激を用量依存的に抑制することを示している。抑制率（％）は、ＣＲＰ１−ＦｃまたはＯＰＧ−Ｆｃタンパク質濃度に対してプロットされている。示されているデータは、３通り（三重）のウェルにおいて行った３つの実験の平均取り込み［３Ｈ］ＴｄＲ  ＋／−  ＳＤであり、２人の正常ドナーで行った実験の代表例である。Ｃ）ＣＨＯヒトＢ７ＲＰ１細胞による共刺激。Ｔ細胞を末梢血から精製し、抗ＣＤ３のみ（黒丸）、１×１０４  ＣＨＯベクター対照細胞（白丸）または１×１０４  ＣＨＯ  Ｂ７ＲＰ１細胞（黒三角）の存在下、種々の濃度の抗ＣＤ３と共に培養した（実施例２２に記載のとおり）。該データは、膜結合Ｂ７ＲＰ１が、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ融合タンパク質を使用した場合に観察されるのと同様のレベルまで、Ｔ細胞増殖を共刺激したことを示している。示されているデータは、３通りの培養の平均＋／−  ＳＤであり、２人の正常ドナーで得られた結果の代表例である。Ｄ）サイトカイン産生。Ｔ細胞を、図２１Ａに記載のとおりに培養し、４８時間（黒棒線）および７２時間（灰色棒線）の時点で上清を集めた。データは、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激細胞により産生されたＩＬ−２の量（上のグラフ）が、抗ＣＤ３および対照Ｆｃにより刺激された細胞により産生されたものと同様であるが、抗ＣＤ２８共刺激細胞により産生されたものより有意に少ないことを示している。データはまた、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ共刺激が、ＩＬ−１０（中央のグラフ）およびＩＦＮ−γ（下のグラフ）の産生を増強したことを示している。
【図２２】図２２は、対照およびＢ７ＲＰ１トランスジェニックマウスにおけるＩｇＥレベルを示す。
【図２３】図２３は、慢性過敏症に対するＢ７ＲＰ１−ＦｃおよびＢ７．２−Ｆｃの組合せ効果を示す。実施例２４に記載のとおりに、オキサゾロンでマウスを攻撃した。攻撃とほぼ同時に、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ、Ｂ７．２−Ｆｃ、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ＋Ｂ７．２−ＦｃおよびＦｃを高（２または１＋１ｍｇ／Ｋｇ，Ａ）および低（０．４または０．２＋０．２ｍｇ／Ｋｇ，Ｂ）用量で与えた。Ａ，Ｆｃと比較して、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ  Ｂ７．２−ＦｃおよびＢ７ＲＰ１−Ｆｃ＋Ｂ７．２−Ｆｃは、第３日からΔＥＴを増加させた（ｐ＜０．００１）。Ｂ７ＲＰ１−ＦｃおよびＢ７ＲＰ１−Ｆｃ＋Ｂ７．２−Ｆｃは、第４日から、Ｂ７．２−Ｆｃより著しくΔＥＴを増加させた（ｐ＜０．００１）。Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃ＋Ｂ７．２−Ｆｃは、第４日から、Ｂ７ＲＰ１−Ｆｃより著しくΔＥＴを増加させた（ｐ＜０．００１）。Ｂ，Ｆｃと比較して、Ｂ７ＲＰ１−ＦｃおよびＢ７ＲＰ１−Ｆｃ＋Ｂ７．２−Ｆｃは、第４日からΔＥＴを増加させた（ｐ＜０．００１）。Ｂ７ＲＰ１−ＦｃおよびＢ７ＲＰ１−Ｆｃ＋Ｂ７．２−Ｆｃは、Ｂ７．２−Ｆｃより著しくΔＥＴを増加させた（ｐ＜０．００１）。
【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ａ−３】
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【図２Ａ−４】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ａ−３】
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【図１２Ａ−１】
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【図１２Ａ−２】
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【図１２Ａ−３】
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【図１３Ａ−１】
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【図１３Ａ−２】
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【図１３Ｂ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１２Ａ−４】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ−３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１６Ａ】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際公開パンフレット】
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2004520819.tif 000288
2004520819.tif 000289
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520819.tif 000290
【国際調査報告】
2004520819.tif 000291
2004520819.tif 000292
2004520819.tif 000293
2004520819.tif 000294
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