(57)【要約】本発明は、遺伝的に改変された非病原性微生物の製造、およびトランス−ジヒドロキシシクロヘキサジエンカルボン酸および／またはその誘導体を製造および単離するための改善された方法、ならびに複雑な天然産物と活性物質を製造するための前記トランス−ジヒドロキシシクロヘキサジエンカルボン酸の使用に関する。
2004525606.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランス−ジヒドロキシシクロヘキサジエン−カルボン酸および／またはその誘導体を製造するための改善された方法において、トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸の合成が、エナンチオマー的に純粋な形で、検出可能なコリスメートを有する不純物を含むことなく、再生可能な炭素源から出発して、少なくとも一つの遺伝的に改変された非病原性微生物を培養することによっておこなわれ、この場合、この微生物は、芳香族化合物の代謝を有し、かつ相当する遺伝的に未改変の微生物と比較して、
ａ）イソコリスメートシンターゼ（ＥｎｔＣ）およびイソコリスメターゼ（ＥｎｔＢ）の増加した活性、および２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼ（ＥｎｔＡ）のほぼ０の活性を示すか、あるいは
ｂ）イソコリスメターゼ（ＥｎｔＢ）の増加した活性、イソコリスメートシンターゼ（ＥｎｔＣ）の減少した活性および２，３−ジヒドロベンゾエートシンターゼ（ＥｎｔＡ）のほぼ０の活性を示すことを特徴とする、トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸および／またはその誘導体を製造するための改善された方法。
【請求項２】
微生物から水性透過液中に放出されたトランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸を、付加的な前精製処理工程なしに、好ましくはカチオンキャリアーをもちいての反応抽出によってか、あるいはアニオン交換体上での吸着／脱着によってか、あるいは液−液抽出によって単離し、その際、エナンチオマー的に純粋なトランス−ＤＣＨＣが、少なくとも９０％の生成物純度で得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
非病原性微生物、好ましくは細菌、酵母、菌類および／または植物を使用し、この場合、これらの微生物は、高くともの安全要件のリスク群１に分類される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
エンテロバクター属の細菌、好ましくはエシェリキア・コリを使用する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼ（ｅｎｔ  Ａ）をコードする遺伝子を部分的にかまたは完全に、好ましくは１〜９９％、特に好ましくは５〜９０％不活性化することによって、遺伝的に未改変の微生物に対して１０〜３０倍のエナンチオマー的に純粋なトランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸のタイターの増加が達成されることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
キラル  トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸に関するエナンチオマー純度（ｅｅ）が≧９９．９％に達する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
反応抽出の際に、カチオンキャリアーとして、アンモニウム誘導体、好ましくは立体要求性置換基を有するアンモニウム誘導体および／またはシクロデキストリン−カチオン、エンドロヘドラル−カチオンフラーレン、カチオン負荷クラウンエーテルおよび／またはクリプトンの群からのカチオンキャリアーを使用する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
反応抽出の際に、カチオンキャリアーが、培養液に対して１〜３０体積％、好ましくは３〜２０体積％、特に好ましくは５〜１５体積％の濃度で使用される、請求項１から７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
反応抽出の際の抽出効率が、使用されたキャリアー濃度にほぼ比例して増加する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
反応性抽出の際に、有機溶剤として、平均的鎖数を有する酸素含有溶剤、好ましくは２−ウンデカノンおよび／またはジフェニルエーテルおよび／またはブチルベンゾールおよび／または１−オクタノールを使用し、特に１−オクタノールが好ましい、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
反応抽出の際に、再抽出剤として、好ましくは、塩化物イオンおよび／または炭酸イオンを含有し、特に好ましくは飽和塩化ナトリウム溶液の形での飽和鉱物塩溶液を使用する、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
反応抽出の際に、再抽出効率がアニオン濃度に比例して増加し、かつ直接的にｐＨ−値に左右されることがない、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
エナンチオマー的に純粋なトランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸の塩溶液からの抽出を、酸性のｐＨ値、好ましくはｐＨ０〜５、特に好ましくはｐＨ３で、有機溶剤、好ましくは中鎖アルコール、揮発性カルボン酸エステル、ケトンおよび／または官能化芳香族化合物、特に好ましくは１−ブタノール、酢酸エステル、アセトンおよび／またはジフェニルエーテルを用いて、ほぼ定量的におこなう、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
吸着／脱着を、流動床または固定床中で、場合によっては予め固体を分離除去することによっておこなう、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
検出可能なコリスメートを有する不純物を含まない、エナンチオマー的に純粋な形で、トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸を製造する改善された方法のための遺伝子的に改変された微生物が、
ａ）リスク群１の安全要件に分類されるものであって、かつ遺伝的に未改変の相当する微生物と比較して、
ｂ）２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼ（ＥｎｔＡ）のほぼ０の活性を示し、
ｃ）イソコリスメターゼ（ＥｎｔＢ）の増加した活性を示し、かつ、
ｄ）イソコリスメートシンターゼ（ＥｎｔＣ）の増加したかまたは減少した活性を示すことを特徴とする、遺伝子的に改変された微生物。
【請求項１６】
ａ）ｅｎｔＡ−遺伝子が、完全にかまたは部分的に、好ましくは少なくとも１〜９９％および特に好ましくは５〜９０％の範囲で欠失しており、かつ
ｂ）ｅｎｔＢ−遺伝子がより強く発現しており、かつ
ｃ）ｅｎｔＣ−遺伝子の発現がより増加しているかまたは減少していることを特徴とする、請求項１５に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項１７】
ｅｎｔＣ−遺伝子の増加した発現によって、（５Ｓ，６Ｓ）−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−１，３−ジエンカルボン酸の形成が増加されている、請求項１５または１６に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項１８】
ｅｎｔＣ−遺伝子の減少した発現によって、（３Ｒ、４Ｒ）−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−１，５−ジエンカルボン酸の形成が増加されている、請求項１５から１７までのいずれか１項に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項１９】
ｅｎｔＣ−構造遺伝子と操作的に結合されている、好ましくは調節可能な、少なくとも一つのプロモーターを有する遺伝子構造物および／またはベクターを含有する、請求項１５から１８までのいずれか１項に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項２０】
ｅｎｔＣ−構造遺伝子と操作的に“アンチセンス”の向きで結合されている、好ましくは調節可能な、少なくとも一つのプロモーターを有する遺伝子構造物および／またはベクターを含有する、請求項１５から２０までのいずれか１項に記載の遺伝的に改変された微生物。
【請求項２１】
請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法によって製造されるエナンチオマー的に純粋なトランス−ジヒドロシクロヘキサジエン−カルボン酸において、酸性度定数ｐＫｓが３〜５を示し、かつ室温で、ｐＨ値４〜１３、好ましくは５〜１１で、少なくとも７日間の半減期に相当する０．１ｄ−１を下廻る崩壊定数で極めて安定であることを特徴とする、エナンチオマー的に純粋なトランス−ジヒドロシクロヘキサジエンカルボン酸。
【請求項２２】
複雑な生物学的活性代謝産物、好ましくは植物代謝産物、特に好ましくはシクロヘキサンジオール−エポキシドおよび／炭水化物類似物、さらに好ましくはカルバ糖、特に好ましくアミノカルバ糖を製造するための、請求項２１に記載のエナンチオマー的に純粋なトランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸および／またはその誘導体を製造および単離するための改善された方法、ならびに該方法に適した遺伝的に改変された非病原性微生物およびトランス−ＤＣＨＣｓの使用に関する。
【０００２】
トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸（トランス−ＤＣＨＣｓ）は、シキミ酸−生合成経路（図２）での、コリスメートの二次代謝産物である。トランス−ＤＣＨＣｓは、図１に示された通り、２個の構造異性体（立体異性体）、すなわち、２，３−トランス−ＤＣＨＣ（（５Ｓ，６Ｓ）−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−１，３−ジエンカルボン酸に相当する）および３，４−トランス−ＤＣＨＣ（（３Ｒ，４Ｒ）−ジヒドロキシ−シクロヘキサ１，５−ジエンカルボン酸に相当する）に区別される。コリスメートから出発して、中間体であるイソコリスメートを介して２，３−トランス−ＤＣＨＣが生じる。形質転換は２個の酵素：イソコリスメートシンターゼ（ｅｎｔＣ遺伝子によってコードされる）およびイソコリスミターゼ（ｅｎｔＢ遺伝子によってコードされる）によっておこなわれる。２，３−トランス−ＤＣＨＣは、エンテロバクチンの生合成経路上の中間産物であり、この場合、これはキレート剤として、細胞中で鉄が欠乏する場合に形成され、かつ分泌される。２，３−トランス−ＤＣＨＣの分解のために重要な酵素は、２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼ（ｅｎｔＡ遺伝子によってコードされる）である。その概要は図３に示されている。３，４−トランス−ＤＣＨＣは、これまで原核生物においては見出すことができなかった。従来的な知識によれば、これは、ｅｎｔＢが過剰に発現される場合にわずかな量で生じるが、しかしながら生物学的機能は有していなかった。
【０００３】
芳香族化合物生合成経路の代謝産物および特にトランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸（トランス−ＤＣＨＣ）の、酵素的発酵と同様に純化学的経路による製造がすでに開示されている。化学的合成は極めて費用のかかるものであり、かつ、多くの文献中で記載された欠点を有している。化学的合成に関する特徴点は、エナンチオマー選択性を全く示さないかまたは極めてわずかにのみ示すことであり、その結果、トランス−ＤＣＨＣの極めて高い芳香化感受性による不良な収率が生じる。さらに化学的製造は、一連の多段階合成を必要とし、これらは通常、高いエネルギー入力を包む高い反応温度を必要とする。さらに、化学的合成は、毒性、爆発性でありかつ環境的危険性のある物質の使用によって、安全性および廃棄性の尺度が要求されるために非経済的なものとなる。これらの理由から、次のような特に酵素的発酵による製造がおこなわれる。これに関して、トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸の製造方法として、インヴィトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）法およびインヴィヴォ（ｉｎ ｖｉｖｏ）法が知られている。
【０００４】
したがって、Ｒｕｓｎａｋ，Ｆ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９０， ２９： １４２５−１４３５）およびＬｉｕ，Ｊ．ら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９０， ２９：１４１７−１４２５）によって、精製されたイソコリスメートシンターゼ（ＥｎｔＣ）またはイソコリスメターゼ（ＥｎｔＢ）を用いて、イソコリスメートを２，３−トランス−ＤＣＨＣにインヴィトロ変換することに関する一般的なＮＭＲ−測定法が記載されている。Ｙｏｎｇ，Ｉ．Ｇ．らは、コリスメートから出発して、遺伝子ｅｎｔＡ、ｅｎｔＢまたはｅｎｔＣのいずれかでの変異を有するＥ．Ｃｏｌｉ菌株から取り出された細胞抽出物を用いて、トランス−ＤＣＨＣのＩｎ  ｖｉｔｒｏ製造することを示している（Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １９７１， １０６： ５１−５７）。Ｙｏｎｇ，Ｉ．Ｇ．らによれば、クレブシエラ（ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）菌株由来の細胞抽出物を用いて、最初に装入したコリスメートを２，３−トランス−ＤＣＨＣにＩｎ  ｖｉｔｒｏ変換することが記載されている（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １９６９，１７７： ３８１−３８８ ｕｎｄ Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １９６９，１７７： ４０１−４１１）。しかしながら、ここで記載された方法の欠点は、使用された、粉砕細胞液の極めて短い安定性にある。しかしながら、さらなる欠点は、出発材料としてのコリスメートであり、これは少量でのみ入手可能であり、さらに極めて高価であることである（約１４００ＤＭ／ｇ）。
【０００５】
Ｇｒｉｓｏｓｔｏｍｉ，Ｇ．らによれば、トランス−ＤＣＨＣの前駆物質として使用するコリスメートの酵素発酵的合成が記載されており、この場合、この方法は、使用されたＥ．Ｃｏｌｉ菌株が芳香族アミノ酸栄養要求性を示す、生体系（ｌｉｖｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）を使用する（Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９９７， ２５： ２９７−３０５）。しかしながら、コリスメートはわずかな量でのみ製造される（５２０ｍｇ／ｌ）。コリスメートが不安定であるために、任意の後処理は高い損失を生じる。Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｋ．らによれば、クレブシエラ  ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を用いてのトランス−ＤＣＨＣの他の前駆物質、すなわちイソコリスメートのＩｎ  ｖｉｖｏでの製造が記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ． １９９５， ４５： ２８５−２９１）。この方法においては、わずか９０ｍｇ／ｌのイソコリスメートが形成される。イソコリスメートは、コリスメートよりもさらに不安定であり、したがって、これらの方法は、トランス−ＤＣＨＣおよびこれらの誘導体を製造するための前駆物質および構成単位を極めて多量に提供するには不適切である。
【０００６】
Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｒらによれば、Ｉｎ  ｖｉｖｏ系を使用して、特にヒトに対する潜在的病原性を有するクレブシエラ  ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）菌株から、トランス−ＤＣＨＣを放出させることが記載されている（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９６， １４２： １００５−１０１２）。これらの菌株は種々の欠点を有する。したがって、種々の点突然変異によって、クレブシエラ  ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）菌株は、３個の芳香族アミノ酸、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンに対して栄養要求性を示し、この場合、これは、必須アミノ酸を培養液中に添加しなければならないこと意味する。さらに微生物は、点突然変異によって、かなり急速に自然発症的復帰突然変異を受ける傾向があり、この理由から、遺伝的に著しく不安定であり、かつ工業的規模での発酵工程にはあまり適していない。付加的に、クレブシエラ菌株は、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来のヘテロ遺伝子、特にｅｎｔＢ／ｅｎｔＣ遺伝子またはｅｎｔＢを単独で含有している（Ｇｉｂｓｏｎ， Ｍ． Ｉ． ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．， １９６４，９０：２４８−２５６）。ｅｎｔＡ−遺伝子中の改変は、これらの菌株に関しては開示されていない。前記方法において特に不利であるのは、好ましいトランス−ＤＣＨＣ生成物のみが形成されるのではなく、種々の代謝産物、特にコリスメートを含むかなりの不純物がみられることである。この方法では、ｅｎｔＢ／ｅｎｔＣの過剰発現の場合には、コリスメートの他に培養液中から、２，３−トランス−ＤＣＨＣ  約９０ｍｇ／ｌを単離することができ、かつ、ｅｎｔＢの過剰発現の場合には、３，４−トランス−ＤＣＨＣ  約７０ｍｇ／ｌを単離することができた。しかしながら、このような混合物の単離および精製は困難であり、好ましい生成物のさらなる損失を伴ってさらなる時間および費用を必要とする。これに加えて、クレブシエラ  ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、病原菌、たとえば、ヒトに対して潜在的病原性を有する細菌であり、かつリスク群２の安全要件が提示されている。ストリンジェントな製造技術による安全性の調整、および低い市場経済的許容性の理由から、特に薬剤の製造に関しては、病原菌または潜在的病原性微生物を、生物工学的生成物を製造するために工業的に使用するには特に問題である。
【０００７】
また、トランス−ＤＣＨＣの正確な合成の他に、経済的理由から、好ましい化合物を得られた生成物混合物から十分な量で、かつ適切な選択率での単離を確実におこなうことが要求される。これに関連して、生成物混合物の類似化合物、たとえばコリスメートを含む不純物は特に問題である。低い選択率を有する方法かまたは“非選択的”な方法、たとえば液−液抽出または吸着／溶離、たとえばイオン−クロマトグラフィーは、特にこれらの場合において適切ではない。さらに、トランス−ＤＣＨＣｓの高い選択率は、酸／塩基および熱の作用に対して、生成物の精製に適した分離方法を制限する。
【０００８】
これとは対照的に、アニオンキャリアーまたはカチオンキャリアーを用いての反応抽出／再抽出は、一般的な後処理方法であるが、しかしながら、この場合、この方法は、従来的には、重金属塩を除去するために主に使用されていた方法である。生物工学的方法での生成物単離に関して反応抽出、同様にトランス−ＤＣＨＣｓを濃縮するための抽出の例は、記載されている（Ｍｕｅｌｌｅｒ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９６， １４２： １００５−１０１２）。しかしながら、これら全ての方法は、分析の目的ためにそれぞれの生成物を高い純度で得るために設定されている。したがって、従来的に公知の方法は、工業的規模の生成物混合物からトランス−ＤＣＨＣを製造単離するためには適していない。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸を製造および単離するための改善された方法を可能にすることであり、この場合、この方法は、純粋なトランス−ＤＣＨＣｓを十分な量で提供し、かつ前記欠点を有しないものである。
【００１０】
本発明の目的は、有利には、本発明による方法を用いて達成される。
【００１１】
本発明は、トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸および／またはその誘導体を製造するための改善された方法に関し、その際、トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸の合成は、エナンチオマー的に純粋の形で、検出可能なコリスメートを有する不純物を含むことなく、再生可能な炭素源から、少なくとも一つの遺伝的に改変された、非病原性微生物を培養することによっておこなわれ、この場合、この微生物は、芳香族化合物代謝を有しており、かつ相当する遺伝的に未改変の微生物と比較して、
ａ）イソコリスメートシンターゼ（ＥｎｔＣ）およびイソコリスメターゼ（ＥｎｔＢ）の増加した活性および２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼ（ＥｎｔＡ）のほぼ０の活性を示すか、あるいは
ｂ）イソコリスメターゼ（ＥｎｔＢ）の増加した活性およびイソコリスメートシンターゼ（ＥｎｔＣ）の減少した活性を示し、かつ２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼ（ＥｎｔＡ）のほぼ０の活性を示す。
【００１２】
これに関しては、さらに本発明は、イソコリスメターゼおよび／またはイソコリスメートシンターゼのイソ酵素の相当する方法で改変された活性を包含する。また、特に本発明は、イソコリスメートシンターゼ（ＥｎｔＣ）のイソ酵素を包含し、この場合、この酵素は、ＭｅｎＦと示され、かつｍｅｎＦ遺伝子によってコードされている（Ｄａｈｍ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ， １９９８，１４２５： ３７７−３８６）。“イソ酵素”とは、同一かまたは匹敵する基質特異性および作用特性を有する酵素を意味するものと理解されるが、しかしながら、異なる一次構造を有している。したがって、本発明の記載のＥｎｔＣおよびＭｅｎＦは同様に、場合によってはさらにイソコリスメートシンターゼのイソ酵素にも関するが、明瞭性の理由から、ＥｎｔＣのみを明記する。
【００１３】
本発明による方法の利点は、前記に示された遺伝的に改変され、かつ非病原性の微生物を使用することによって、エナンチオマー的に純粋な形のトランス−ＤＣＨＣを製造できることである。これに加えて本発明による方法は、障害となる類似構造を有する副生成物を含有することなく、たとえば、コリスメートおよび／またはイソコリスメートを有する不純物を含むことなく、トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸が形成され、かつ微生物から水性透過液（培養液）中に放出されることを特徴とする。本発明の他の利点は、一工程による方法で、たとえば単一工程中で、予め他の精製工程、たとえばＨＰＬＣを行うことなく、水性透過液からトランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸を単離することである。本発明による適した単一工程による単離方法の例は、カチオンキャリアーを用いての反応抽出か、あるいはアニオン交換体上での吸着／脱着か、あるいは抽出である（たとえば、ｐＨ１〜３での液−液抽出）。有利には、本発明によれば有利には、エナンチオマー的に純粋な形のトランス−ＤＣＨＣが少なくとも９０％の高い生成物純度で得られる。さらに本発明は、好ましい生成物の製造および単離を漸次おこなうばかりでなく、製造および単離を一緒におこなうころが可能な方法を含み、この場合、この方法は、たとえば、発酵装置を連続的に操作する一方で、生成物の分離を同時かつ連続的におこなうことができる。
【００１４】
本発明によれば、前記に示された方法は、非病原性微生物、好ましくは細菌、酵母、菌類および／または植物を使用し、この場合、これらの微生物は、高くともリスク群１の安全要件に分類され（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ａｃｔ，１９９０ ＢＧＢ１［Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｌａｗ Ｇａｚｅｔｔｅ］Ｉ １０８０； １９９３ ＢＧＢ１ Ｉ ２０６６； １９９３ ＢＧＢＩ１ ＩＩＩ ２１２１−６０−１； １９９７ ＢＧＢ１Ｉ ２３９０で定義されている）、かつ固有の芳香族生合成経路を有しているか、あるいはその微生物中に、遺伝子工学的方法によって、相当するヘテロの芳香族化合物生合成経路が導入されている。この遺伝子工学的方法は、芳香族生合成遺伝子の挿入の意味であると理解され、この場合、この遺伝子は、たとえばプラスミドをコードしていてもよく、かつ通常の方法、たとえば形質転換、接合またはエレクトロポレーションによってトランスファーされてもよく、場合によってはホスト細胞の染色体中に組み込まれていてもよい。本発明によれば、細菌およびその中でもエンテロバクター属のものが好ましく、特にエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）が好ましい。典型的な好ましい例は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＣ４１００（ＡＴＣＣ３５６９５， ＤＳＭ ６５７４）（Ｍ．Ｊ． Ｃａｓａｄａｂａｎ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９７６， １０４， ５４１−５５５ およびＭ．Ｊ． Ｃａｓａｄａｂａｎ， Ｓ． Ｎ． Ｃｏｈｅｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ １９７９， ７６， ４５３０−４５３３ ならびにＹ． Ｋｏｍｅｄａ， Ｔ． ｌｉｎｏ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １９７９， １３９， ７２１−７２９）、Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｈ１８８２であり、この場合、これは菌株ＭＣ４１００に相当し、かつ付加的にジヒドロキシベンゾエートシンターゼ欠失（ｅｎｔＡ−欠失；Δ（ｆｅｐＡ−ｅｎｔ））によって特徴付けされるか、あるいはＥ．Ｃｏｌｉ  ＡＮ１９３（Ｇ．Ｂ． Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９７０， １０４， ２１９−２２６ およびＢ． Ａ． Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ， Ｔ．Ｊ． Ｂｒｉｃｋｍａｎ， Ｍ．Ａ． Ｍｃｌｎｔｏｓｈ， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １９８９． １７１， ７７５−７８３）であり、この場合、これは同様にｅｎｔＡ−ネガティブ突然変異体を示すものである。しかしながら、これらの選択は、本発明を制限するものではない。
【００１５】
本発明によれば、トランス−ＤＣＨＣの製造は、好ましくは炭素源として炭水化物、特に好ましくはグルコースおよび／またはＤ−グルコースおよび／またはグリセリンから出発しておこなわれる。これは、特に、トランス−ＤＣＨＣの微生物による製造に適用される。Ｄ−ガラクトースおよび／またはグリセロールはこの目的のために第１のＣ−源として使用されるばかりでなく、発酵がすでに進行している場合、すなわち増殖期中において計量供給することができる。本発明によるトランス−ＤＣＨＣの製造は、極めて高価なコリスメートを前駆物質として使用する従来の方法と比較して、再生可能なＣ−源から出発することで、特に有利には、コストにおいてかなりの減少を得て実施することができる。
【００１６】
さらに本発明の方法は、エナンチオマー的に純粋なトランス−ジヒドロキシシクロヘキサジエンカルボン酸のタイターが、２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼ（ＥｎｔＡ）の活性がごくわずかであるか、または好ましくは全く存在しないことによって、遺伝的に未改変の微生物と比較して、少なくとも１０〜３０倍（ｆａｃｔｏｒ）ですでに増加していることによって特徴付けられる。これに関して、ごくわずかであるかまたは全く０である２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼの活性は、部分的にかまたは完全に、好ましくは１〜９９％、特に好ましくは５〜９０％のｅｎｔＡ遺伝子を不活性化することで達成され、たとえば、これは、全遺伝子または遺伝子のその部分を欠失させることによる。好ましくは、ｅｎｔＡ−ネガティブ−突然変異（ｅｎｔＡ−）と呼称する。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様において、エナンチオマー的に純粋なトランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸の前記に示された収率は、Ｅ．Ｃｏｌｉ株を用いて、かつＣ−源としてグルコースから出発することで達成される。さらに、特に有利には、本発明による方法は、本発明によるＥ．Ｃｏｌｉ菌株中で、コリスメートおよび／またはイソコリスメートの形での副生成物の形成が生じることなく、すなわち、好ましい生成物中で検出されうる構造的に類似する化合物、たとえばコリスメートおよび／またはイソコリスメートを有する不純物を含まないか、または、これらの化合物を有する任意の不純物が検出可能な限度を下廻る。本明細書中での意味における検出可能な限度とは、類似構造を有する障害となる化合物の濃度が、０．５ｍｇ／ｌであると理解される。つまり、障害となる副生成物としてのコリスメートおよび／またはイソコリスメートは、発酵溶液中で０．５ｍｇ／ｌを下廻る濃度で存在する。
【００１８】
本発明の他の好ましい実施態様において、１ｌ当たり数ｇでの、特に５ｇ／ｌでの２，３−トランス−ＤＣＨＣの高い収量が、ｅｎｔＡ−遺伝子を不活性化させ（ｅｎｔＡ−）かつ、ｅｎｔＢ遺伝子およびｅｎｔＣ遺伝子が過剰に発現されている遺伝的に改変されたＥ．Ｃｏｌｉ菌株を用いて達成される。この場合において、培養液中のアンモニウム濃度は、Ｐａｎ，Ｊ．らによって記載されたようにして最適化された（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ．， １９８７， ９： ８９−９４）。相当する方法で遺伝的に改変されていない微生物と比較して、好ましい菌株は、酵素イソコリスメートシンターゼおよびイソコリスメターゼの増加した活性を示し、かつ、好ましくは２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼ活性は全くないかまたはほぼ０の活性を示す。本発明をより詳細に説明するために、いくつか酵素活性について、以下の特異的な測定値を用いて示す。これらの実施態様は単なる例であって、本発明を制限するものではない。測定値は、非病原性Ｅ．Ｃｏｌｉ−菌株  ＡＮ１９３で得られた測定値であり、この場合、この菌株はいわば“コントロール株”である。この菌株Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＡＮ１９３は、Ｇ．Ｂ．Ｃｏｘら、Ｊ．Ｂａｔｅｒｉｏｌ．１９７０，１０４，２１９−２２６およびＢ．Ａ．Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｔ．Ｊ．Ｂｒｉｃｋｍａｎ，Ｍ．Ａ．Ｍｃｌｎｔｏｓｈ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８９，１７１，７７５−７８３で記載されている。特異的活性は、イソコリスメートシンターゼに関して（ｅｎｔＣによって染色体的にコードされた）は、約０．１０Ｕ／ｍｇタンパク質を示し、かつ、イソコリスメターゼ（ｅｎｔＢによって染色体的にコードされた）は、約０．０１２Ｕ／ｍｇタンパク質を示す。これと比較して、ｅｎｔＢ−遺伝子の過剰発現によって約０．２９Ｕ／ｍｇタンパク質の増加した活性が達成されるその一方で、ｅｎｔＣ−遺伝子の過剰発現により、約１．１７Ｕ／ｍｇタンパク質の著しく増加した活性が達成される。
【００１９】
驚くべきことに、未改変のイソコリスメートシンターゼ活性を示すＥ．Ｃｏｌｉ−（ｅｎｔＡ−）−菌株中でｅｎｔＢを単独で過剰発現させた場合には、３，４−トランス−ＤＣＨＣの分泌が導かれない。これは、特に病原性のクレブシエラニューモニエ（Ｋｌｅｂｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）菌株での公知の試験（Ｍｕｅｌｌｅｒ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９９６， １４２： １００５−１０１２）からは予期されえなかった。
【００２０】
さらに驚くべきことに、本発明の他の実施態様において、３，４−トランス−ＤＣＨＣのエナンチオマー的に純粋な形での分泌が、好ましくは全く活性がないかまたはほぼ０の２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼ（ＥｎｔＡ）の活性（ｅｎｔＡ−−突然変異体）およびイソコリスメターゼ（ＥｎｔＢ）の増加した活性およびイソコリスメートシンターゼ（ＥｎｔＣ）の減少した活性を示すＥ．Ｃｏｌｉ菌株を使用することによって達成することができた。
【００２１】
本発明によれば、本発明による方法は、それぞれの場合において、≧９９．９％でのエナンチオマー純度（ｅｅ）が、キラル  トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸に関して達成される事実によって特徴付けられる。ここで、本発明によって、類似構造を有する障害となる副生成物としてのコリスメートおよび／またはイソコリスメートを有する不純物が検出不可能であることを強調すべきであり、この場合の検出限界は、０．５ｍｇ／ｌを下廻る。
【００２２】
本発明によれば、２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼ（ＥｎｔＡ）のわずかであるかまたは全く欠失した活性および／またはイソコリスメターゼ（ＥｎｔＢ）およびイソコリスメートシンターゼ（ＥｎｔＣ）の改変された活性は、転写、翻訳および／または翻訳後の段階で改変することによって生じてもよい。これらの改変は、たとえば、調節エレメント、例えば、プロモーター活性、形成されたｍＲＮＡまたはタンパク質のヌクレアーゼ分解またはプロテアーゼ分解に対する耐性、あるいはリボソーム結合による翻訳の開始における改変、または触媒的酵素活性自体の低下か、あるいは改変されている調節因子の結合挙動によるもの等であると解される。さらに、ｅｎｔ−Ａ遺伝子が不活性化された結果としてわずかであるかまたは全くない２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼの活性が考えられ、これは本発明において好ましい。たとえば、これは、挿入突然変異または欠失突然変異であるか、あるいは突然変異誘発剤を用いての細胞の化学的処理のような、種々の公知の遺伝子工学的手段を用いて達成することができる。ｅｎｔＡ−欠失突然変異が好ましい。前記に示された方法は、本発明による方法を説明するものであるがこれに制限されるものではない。
【００２３】
酵素イソコリスメターゼまたはイソコリスメートシンターゼの増加した活性は、ｅｎｔＢ遺伝子／ｅｎｔＣ遺伝子の過剰発現によって、この場合、たとえば、一つの適切なベクター中に一緒にか、または種々の適切かつ互いに適合性のベクター中で別個に、遺伝子のコピー数を増加させることによって達成される。しかしながら、たとえば、強化されたかおよび／または誘発されたプロモーターのコントロール下で遺伝子を発現させるか、あるいは、形成されたｍＲＮＡおよび／または相当するタンパク質をヌクレアーゼおよび／またはプロテアーゼに対して安定化させるような他の方法も可能である。プロモーターとしては、原則として遺伝子構造物を挿入した特定のホスト微生物中で、遺伝子を発現させることが可能な任意のプロモーターが適している。例として、ＩＰＴＧ−誘発プロモーターが挙げられてもよい。
【００２４】
本発明によれば、イソコリスメートシンターゼ活性は、転写または翻訳の段階でｅｎｔＣ−遺伝子発現を改変することによってか、あるいはすでに形成された酵素活性（翻訳後）を、たとえば、イソコリスメートシンターゼの特異的エフェクター（インヒビター）を添加することによって減少させることができる。
【００２５】
遺伝子発現、特にｅｎｔＣ−発現の減少は、染色体および／またはプラスミドをコードする段階における調整を必要とする。ここで、遺伝子発現は、遺伝子が受けるプロモーター活性によって調節することができる。本発明によれば、この場合において、その活性が漏出性“ｌｅａｋｙ”であるプロモーターが好ましく、すなわち、遺伝子発現が著しく減少される程度に調節さるが、しかしながら好ましくは、完全にスイッチオフされていない。したがって、“ｌｅａｋｙ”とは完全にスイッチオフされていないが依存としてわずかな残留活性を認めるプロモーター活性を意味するものと解され、したがっていくらかは透過性である。プロモーターの微調整のための種々の可能性は、当業者に公知である。これに加えて、本発明には、他の調節作用を有するエレメント、たとえばエンハンサーまたはサイレンサーの使用および／または遺伝的改変が含まれる。
【００２６】
また、ｅｎｔＣ−遺伝子発現を調節する目的のために、形成されたｍＲＮＡをブロックする、形成されたアンチセンスＲＮＡを用いて考えられうる遺伝子発現を抑制することも可能である。いわゆるアンチセンス−抑制によって導かれる方法は当業者に公知である。したがって、本発明は、前記に示された改変された遺伝子活性または酵素活性を達成するのに要求される遺伝子構造物およびベクターをに関する。本発明の範囲内で、遺伝子構造物は、ｅｎｔＢおよび／またはｅｎｔＣおよび／または、場合によってはｅｎｔＡからの少なくとも一つのコーディングヌクレオチド配列、およびさらにはこれらの遺伝子に操作的に結合された調節ヌクレオチド配列、たとえば、プロモーター、エンハンサー、サイレンサーおよび転写ターミネーター、標的配列（移行型シグナル配列）、および／または翻訳アンプリファー（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）を包含する。本発明の範囲内で、ベクターは、形質転換されたホスト細胞を選択するため、および／またはホスト細胞の範囲内で複製するためか、あるいは相当するホスト細胞ゲノム中に組み込むための付加的なヌクレオチド配列を包む。これらの構造物およびベクターの製造は当業者に公知であり、ここで詳細には記載しない。すでに前記に示されたように、これらには、イソコリスメートムターゼおよび／またはイソコリスメートシンターゼおよび／またはこれらのイソ酵素、たとえばｍｅｎＦをコードするヌクレオチド配列が含まれる。
【００２７】
さらに、本発明による方法は、形成されたトランス−ＤＣＨＣを、ほぼ定量的に透過液（水性培養液）から反応抽出／再抽出によって単離することを特徴とする。中性水溶液中での生成物の特性を考慮して、これらの単離は、カチオンキャリアー、すなわちアニオン選択的キャリアーを用いておこなわれる。この方法において、水性（培養）溶液中で、アニオンとして存在するトランス−ＤＣＨＣは、イオン交換反応によってカチオンキャリアーに結合する。本発明において好ましいキャリアーは、アンモニウム誘導体である。特に好ましくは、トリオクチルメチル−アンモニウムクロリド（Ａｌｉｑｕａｔ （Ｒ）  ３３６， Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．）が挙げられる。生物系に対して担体の毒性が懸念される場合には、特に一体化された製造工程および単離工程中で担体が使用される際に、培養液の水相中のキャリアー濃度が、生物系に関してクリティカルな毒性限界濃度を下廻るよう維持される程度に作用する水相および有機相中の担体濃度平衡によって処理される。これに関する他の方法は当業者に公知である。本発明においてはカチオンキャリアーの使用が好ましく、これに関しては特立体要求性置換の結果として、膜を通過することができないかまたはわずかな範囲でのみ通過することができる、アンモニウム誘導体は、この理由から、生物系においてその毒性限界を超えることはなく、したがって、これが、本発明による非病原性微生物である。“膜を通過させる能力”は、キャリアーを、細胞膜を介して生物系に通過させる意味であると解され、この場合、これは、拡散によって受動的にか、または運搬プロセスによって能動的に生じてもよい（たとえば、共輸送および／または交互輸送）。さらに本発明によれば、キャリアーとしてアニオン選択的化合物複合体、たとえばシクロデキストリン−カチオン、エンドヘドラル（ｅｎｄｒｏｈｅｄｒａｌ）−カチオンフラーレン、カチオン負荷クラウンエーテルおよび／またはクリプタンドから成る群を包む。
【００２８】
本発明によれば、反応抽出の際にカチオンキャリアーを、培養液に対して１〜３０体積％、好ましくは３〜２０体積％、特に好ましくは５〜１５体積％の濃度で使用する。本発明によれば、これが行われた場合の抽出能力は、ほぼ使用されたキャリアー濃度に比例して増加する。さらに本発明の方法は、反応抽出の際に使用される有機溶剤として、Ｃ６〜Ｃ２０、好ましくはＣ４〜Ｃ１２の平均鎖数を有する酸素含有溶剤、たとえば、２−ウンデカノンおよび／またはジフェニルエーテルおよび／またはブチルベンゼンおよび／または１−オクタノールを使用することを特徴とし、その際、１−オクタノールが特に好ましい。
【００２９】
非荷電の多量の非極性トランス−ＤＣＨＣ／担体イオン対として、２個の化合物を非極性の有機相にトランスファーする。その後に２，３−トランス−ＤＣＨＣをこれらの有機相から、高い対イオン濃度を有する第３相（精製相）を用いて再度抽出する。この精製相中の生成物を濃縮するための推進力（ｄｒｉｖｉｎｇ ｆｏｒｃｅ）は、対イオンの高い濃度勾配である。生成物の担体への不可逆的結合作用の効果は観察されず、したがって、本発明によればトランス−ＤＣＨＣはほぼ定量的に有機相から再度抽出することができる。
【００３０】
本発明によれば、好ましくは塩化物イオンおよび／または炭酸イオンを含有し、特に好ましくは飽和塩化ナトリウム溶液の形での飽和鉱物塩溶液を、反応抽出中での再抽出剤として使用する。さらに、本発明による方法は、再抽出効率がアニオン濃度に比例して増加し、かつ直接的にｐＨ値に左右されることはない事実によって特徴付けられる。
【００３１】
さらに、キャリアーを含まない有機溶剤を用いての抽出によって、再抽出されたトランス−ＤＣＨＣを水から精製相中に遊離させ、その後に蒸留濃縮することは有利である。その際、方法を室温で、かつ酸性のｐＨ値で実施し、かつシリカゲルのような触媒的活性表面を使用しない場合には、損失を生じることはない。したがって、本発明による方法は、純粋なエナンチオマーであるトランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエンカルボン酸を、塩溶液から、酸性のｐＨ、好ましくはｐＨ０〜５、特に好ましくはｐＨ３で、有機溶剤、たとえば中鎖（ｍｅｄｉｕｍ−ｃｈａｉｎ）アルコール、揮発性カルボン酸エステル、ケトンおよび／または官能化芳香族化合物を用いて抽出することによって特徴付けられる。本発明のための好ましい有機溶剤の例は、種々の酢酸エステル、アセトン、ジフェニルエーテルおよび／または１−ブタノールであり、本発明においては１−ブタノールが特に好ましい。これらの記載は、本発明を説明するのに役立つものであるが、これによって制限されない。図４は、本発明によるトランス−ＤＣＨＣの精製を図式的に示したものである。
【００３２】
本発明による方法において特に有利であるのは、特に反応抽出／再抽出において、トランス−ＤＣＨＣが、極めて緩慢な条件下で製造されることであり、これによって生成物の芳香化が生じない。
【００３３】
他の実施態様において、トランス−ＤＣＨＣは、イオン交換体、好ましくは、アニオン交換体上で、たとえば、ＤＯＷＥＸ  １Ｘ８樹脂（１００〜２００メッシュ）上で、吸着／脱着することによって水性透過液（培養液）から単離される。その際、培養液は、直接的に任意の後処理をすることなく、適した吸着粒子から成る流動床または固定床上に装入することができる。場合によっては、特に固定床上での吸着の場合には、この目的のために最初に粒状成分（固体）を分離除去しなければならない。場合により予めおこなわれる粒子状成分の分離除去とは別個に、吸着体上に装入される培養液のｐＨ値をアルカリの範囲、好ましくは７．５〜１１、特にこのましくはｐＨ８に調節する。溶剤の伝導性は、適した測定方法によって、２．５〜２０ｍＳ／ｃｍ、好ましくは８〜１５ｍＳ／ｃｍ、特に好ましくは１３．５ｍＳ／ｃｍに調整する。これらの実施態様において特に有利であるのは、前記に示された方法が、本発明によれば、高い選択性によって特徴付けられることであり、かつ発酵中に形成され、水性透過液中に放出されたトランス−ＤＣＨＣは、驚くべきことに、吸着体上に主成分として結合する。トランス−ＤＣＨＣは、たとえば、吸着体を、酸性のｐＨでの水性溶剤で洗浄することによっておこなわれる。本発明によれば、揮発性の酸が好ましく、特に好ましくは蟻酸である。トランス−ＤＣＨＣを固体の形で単離するために、たとえば、凍結乾燥がおこなわれる。驚くべきことに、トランス−ＤＣＨＣは、前記に示された脱着剤を使用した結果、主に固体の残留物として得られる。前記に示された他の方法によって、本発明によるトランス−ＤＣＨＣの生成物純度は、少なくとも９０％に達する。
【００３４】
本発明は、コリスメートおよび／またはイソコリスメートを有する不純物が検出されない、エナンチオマー的に純粋な形で、トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸を製造する改善された方法のための、遺伝的に改変された微生物に関し、この場合、この微生物は、高くともリスク群１の安全要件に分類される非病原性微生物であることによって特徴付けられ、かつ相当する遺伝的に未改変の非病原性微生物と比較して、全くかまたはほとんど０の、好ましくは０の２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼ活性（ＥｎｔＡ）を示し、かつイソコリスメターゼ（ＥｎｔＢ）の増加した活性およびイソコリスメートシンターゼ（ＥｎｔＣ）の増加したかまたは減少した活性を示す。
【００３５】
ここで、２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼのわずかのみかまたは全くない活性は、相当するｅｎｔＡ遺伝子を不活性化することによって達成されうる。これは、古典的化学的突然変異をおこない、かつ栄養要求性突然変異体等を選択することによって、たとえば遺伝子の特異的組み換えＤＮＡ不活性化（たとえば挿入または欠失）をおこない、その後に明確に示された突然変異体を選択することによって達成される。さらに、転写および／または翻訳段階上で発現は減少されるかまたはブロックされる。同様に、タンパク質レベル（翻訳後）上での減少した触媒活性または改変されたエフェクター（アクチベーターまたはインヒビター）の結合挙動もかんがえられうる。
【００３６】
本発明の特別な実施態様において、遺伝的に改変された微生物は、２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼをコードするｅｎｔＡ−遺伝子を欠失させ、かつ、イソコリスメートシンターゼおよびイソコリスメターゼをコードするｅｎｔＣ遺伝子およびｅｎｔＢ遺伝子の発現をより増強することによって特徴付けられる。本発明は、ｅｎｔＡ遺伝子が完全にかまたは部分的に、好ましくは少なくとも１〜９９％、およびより好ましくは少なくとも５〜９０％の範囲で欠失し、かつｅｎｔＢ−遺伝子の発現を増強させ、かつ好ましい生成物に依存して、ｅｎｔＣ−遺伝子の発現を増強または減少させる、遺伝的に改変された微生物を包含する。さらに、ｅｎｔＣによってコードされるイソコリスメートシンターゼの活性は、また翻訳および／または翻訳後の段階で調整される。これに関して、アンチセンス−抑制のための方法または特別なエフェクターでの抑制がかんがえられうる。
【００３７】
他の変法において、本発明は、ｅｎｔＢ遺伝子および／またはｅｎｔＣ遺伝子および／またはこれらのホロモグの少なくとも一つを含有する遺伝的に改変された微生物に関し、その際、これらの遺伝子は、同種または異種の微生物から単離することが可能である。本発明によれば、“同種のヌクレオチド配列”は、使用されたホスト微生物のヌクレオチド配列と相補的であるか、および／またはこれらのヌクレオチド配列と一緒にハイブリダイズされる配列を意味すると理解される。本発明によれば、このハイブリダイズされる配列の概念は、ＤＮＡまたはＲＮＡの群と本質的に類似のヌクレオチド配列を含む、この場合、これは、当業者に公知のストリンジェントな条件下で、特別な相互作用（結合）に前記に示されたヌクレオチド配列を入れる。本発明による微生物に導入されたｅｎｔＢ遺伝子またはｅｎｔＣ遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、天然に生じる配列または人為的に、たとえば化学的合成によって得られた配列であってもよく、かつ場合によってはホスト微生物のコドン解読（Ｋｏｄｏｎ−Ｇｅｂｒａｕｃｈ）に適応する。ホ“同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）微生物”は、類縁ファミリーに属する微生物であると解される。したがって、異種微生物は、あまり近くない類縁の典型的なものを示す。
【００３８】
本発明によれば、前記に示された型の遺伝的に改変された微生物は、ｅｎｔＡ−ネガティブ突然変異体中で、増加しているｅｎｔＣ遺伝子ならびにｅｎｔＢ遺伝子の発現の結果として、２，３−トランス−ジヒドロキシシクロヘキサジエンカルボン酸が増加した範囲で形成されることによって特徴付けられる。
【００３９】
本発明によって、遺伝的に改変された微生物の他の変法において、この微生物は、ｅｎｔＣ−遺伝子の発現の減少の結果として（その一方で同時に、ｅｎｔＡ−ネガティブ−突然変異体中でｅｎｔＢの発現を増強させる）、３，４−トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸が増加した範囲で形成されることによって特徴づけられる。その際、ｅｎｔＣ−遺伝子の発現減少は、たとえば、プロモーター活性の調整を可能にすることによって達成され、この場合、ｅｎｔＣ−遺伝子は依存している。このプロモーター活性は、わずかではあるが“ｌｅａｋｙ”であってもよく、発現を完全にブロックする必要はない。さらに、アンチセンス−抑制を受けたｅｎｔＣ−遺伝子であってもよい。原則として、ｍＲＮＡは、コーディングｅｎｔＣ−遺伝子配列に基づいて転写され、その際このｍＲＮＡは引き続いて、相当するアンチセンス−ｍＲＮＡでハイブリダイズされ、かつこれによって、翻訳することはできず、結果として、ｅｎｔＣ−遺伝子は発現されない。相当するアンチセンス−ｍＲＮＡは、たとえば、ｅｎｔＣ−遺伝子を“アンチセンス”−の向きで、好ましくは調整可能なプロモーターのコントロール下で、ｅｎｔＣ遺伝子を含有し、その際、この遺伝子構造物は、公知の組み換え法によって製造され、かつ本発明によって遺伝的に改変された非病原性微生物中にトランスファーされる。一般に、本発明は、自体公知であり、かつホスト細胞中で遺伝子の発現をコントロールすることができるすべての調節エレメントを包含する。プロモーターの他に、特にエンハンサーまたはサイレンサーを含む。
【００４０】
一般的に、減少したイソコリスメートシンターゼ活性は、翻訳後レベルでの調節の結果として、たとえば、特別なエフェクターを培養液に添加することによって、本発明による３，４−トランス−ＤＣＨＣの増強した形成を導くことが可能である。
【００４１】
さらに本発明は、ｅｎｔＣ構造遺伝子とその５’末端で操作的に結合している、少なくとも一つの調節可能なプロモーターを有する遺伝子構造物を含有する、遺伝的に改変された微生物に関する。この場合において、いわゆる“センス”−配向中でのｅｎｔＣ−構造遺伝子が存在する。さらに本発明によれば、それ自体がプロモーターを含有する遺伝子構造物を有する遺伝的に改変された微生物を包含し、この場合、このプロモーターは好ましくは調整可能であり、かつアンチセンスの配向でｅｎｔＣヌクレオチド配列と操作的に結合している。
【００４２】
“操作的な結合”とは、たとえばプロモーター、コーディング配列、ターミネーター、および場合によっては他の調節可能なエレメントの配列的な構成を意味し、これによって、それぞれの調節エレメントがコーディング配列の発現と関連してその意図する機能を果たすことができる。これらの調節ヌクレオチド配列は、天然由来のものであってもよいかまたは化学的合成によって得られるものであってもよい。原則として、プロモーターとして、相当するホスト微生物中で遺伝し発現をコントロールすることが可能な任意のプロモーターが適している。その際、本発明によればプロモーターは、化学的に誘発されたプロモーターが使用さてもよく、この場合、このプロモーターは、ホスト細胞中のその従属する遺伝子の発現を、適時に特異的な箇所でコントロールするために使用される。ここで、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトシド）によって誘発されてもよいプロモーターを例として挙げることができる。
【００４３】
遺伝子構造物の製造は、適切なプロモーターと少なくとも一つのヌクレオチド配列を、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｕｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）中で記載されている、通常の組み換え技術およびコロニー後術によって融合させることによっておこなう。アダプターまたはリンカーを、互いのフラグメントを結合させる目的のために、ＤＮＡフラグメントに付着させることができる。
【００４４】
さらに本発明は、前記に示された型の少なくとも一つのヌクレオチド配列、これらの配列に操作的に結合された調節ヌクレオチド配列、さらには形質転換したホスト細胞を選択し、ホスト細胞の範囲内で複製し、かつ相当するホスト細胞ゲノム中に組み込むための付加的なヌクレオチド配列を含有するベクターに関する。さらに、本発明によるベクターは前記に示された型の遺伝子構造物を含有していてもよい。
【００４５】
本発明による微生物の遺伝的改変は、染色体および／または染色体外に存在していてもよく、かつ好ましくはプラスミドをコード（ｐｌａｓｍｉｄ−ｅｎｃｏｄｅｄ）するものであってもよい。
【００４６】
さらに本発明は、前記に示された型の方法によって製造された、エナンチオマー的に純粋なトランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸であり、この場合、これは３〜５の範囲の酸定数ｐＫｓ（ａｃｉｄ ｃｏｎｓｔａｎｔ）を有し、かつ室温でｐＨ値４〜１３で、好ましくは５〜１１で、崩壊定数少なくとも０．１ｄ−１で極めて安定であり、この場合、これは、少なくとも７日間の半減期に相当する。
【００４７】
本発明は、複雑な生物学的活性代謝産物、たとえば植物代謝産物、特に好ましくはシクロヘキサンジオール−エポキシドおよび／または炭水化物類似物（ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｍｉｍｅｔｉｃｓ）、好ましくはカルバ糖（ｃａｒｂａｓｕｇｅｒ）、特に好ましくはアミノカルバ糖を製造するための、それぞれのエナンチオマー的に純粋なトランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸の使用に関する。
【００４８】
同様に、シス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエン−カルボン酸の使用は公知である。しかしながら、シス−ＤＣＨＣの製造は、芳香族化合物の酸化的脱酸素化に基づくものであり、この場合、これは、発酵的製造方法において媒体に装入しなければならない。本発明による発酵的製造方法は、純粋なエナンチオマーであるトランス−ＤＣＨＣを高い収率で、本質的により経済的な可能性および経路で生じ、この場合のいくつかは、天然産物および活性化合物を合成することに関して完全に新規である。
【００４９】
したがって、本発明によるトランス−ＤＣＨＣｓは、たとえば、生物学的活性代謝産物誘導体、たとえば植物代謝産物を製造するための出発化合物として使用することができる。４、５または６位でエポキシ化された２，３−ジヒドロキシシクロヘキシルメタノール骨格は、これらの代謝産物の物質群として特徴的である。よく知られている典型的な例は、特に、クロテポキシド、イソクロテポキシド、エピ−クロテポキシド、セネポキシド、β−セネポキシド、ピポキシド、シクロフェリトール、ボーセノキシド（ｂｏｅｓｅｎｏｘｉｄｅ）およびチングタノキシドであり、この場合、これらは図７に示されている。炭水化物類似物としてこれらの物質群は、抑制活性、たとえば種々のがん種上で腫瘍抑制活性を示すことが試験されており、したがって、製薬学的使用に潜在的に適している。これらは、従来的には、公知の欠点、たとえば、高いコスト、高い時間消費および低いエナンチオマー選択性を有する複雑な化学合成によって製造されており、高いコストおよび要する期間、および低いエナンチオマー選択率であり、これらを挙げることは最も重要である。これらの合成では、中間生成物として、トランス−ＤＣＨＣの誘導体が生じる。図８には、シクロヘキサンジオール−エポキシド−植物代謝産物の重要な合成の概要が提供されており、それぞれの場合において、２，３−トランス−ＤＣＨＣ−誘導体は、鍵となる化合物である。したがって、本発明によるトランス−ＤＣＨＣｓの製造は、これらの化合物の広範囲での使用を可能にするものであり、かつ複雑な天然産物および活性化合物の複雑な合成の著しい簡略化に寄与し、それというのも合成は、直接的に発酵的に製造された本発明によるトランス−ＤＣＨＣｓから開始されるために、従来の複雑な合成およびトランス−ＤＣＨＣｓを製造するための精製工程はもはや必要なく、省略されるからである。したがって、本発明は、著しい経済的効果を有する。
【００５０】
これに加えて、本発明によるトランス−ＤＣＨＣから、カルバ糖および特にアミノカルバ糖を合成することが可能であり、この場合、これは同様に、炭水化物類似物として高い製薬学的ポテンシャル有する。バニエンアミン（図９）は、これらの物質群での重要な例である。バリエンアミン誘導体は、特に炭水化物類似物、たとえばアカルボース（ａｃａｒｂｏｓｅ）またはボグリボース（ｖｏｇｌｉｂｏｓｅ）の合成のための出発材料として最も重要であり、この場合、これらの炭水化物類似体は、加齢に関連した型の（ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ）糖尿病または肥満症を治療するためのα−グリコシダーゼインヒビターとして使用される。
【００５１】
さらに本発明は、他の活性化合物、たとえば、ポリサッカリド類似物を同定および／または製造するか、および／またはいわゆる“高流量スクリーニング試験のための物質ライブラリーを構築するための、トランス−ＤＣＨＣｓの使用に関する（たとえば、ポリマー担体と結合する）。
【００５２】
生物学的活性物質、たとえばアミノ抑制剤または抗腫瘍性製薬学的化合物の群の広範囲のスペクトルが考えられ、いくつかではあるが、本発明によるトランス−ＤＣＨＣｓのさらなる使用可能性を示す。このような化合物の選択は、図１０に示されている。これに加えて、本発明によるトランス−ＤＣＨＣｓを、多くの他の錯体化合物を製造するために使用することが可能であり、その際、これらの化合物は本明細書中に示されており、一般な方法で、二次的化学（ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）として記載されている。これに関しては特に、本発明によれば、選択的方法で、たとえば選択的にカルボキシル基を還元し、かつ選択的に二重結合をエポキシ化すること、および／または他の間接的に生じる改変を実施することによって反応をおこなうことは可能である。図１１は、たとえば、本発明による２，３−トランス−ＤＣＨＣを出発材料として使用する場合に製造することができる、考えられうる見込みの二次的化学化合物の概要が示されている。
【００５３】
以下の実施例は、本発明を詳細に説明するものであるが、これに制限されることはない。
【００５４】
実施例
１．一般的遺伝子工学的技術：
ゲノミックＤＮＡおよびプラスミド−ＤＮＡの単離、および制限酵素、クレノー酵素処理およびアルカリホスファターゼ処理に関するすべての技術、ＤＮＡのクローニングおよびシーケンシングおよび増殖（ＰＣＲ）のための方法、さらには形質転換、培養およびホスト細胞の選択については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， １９９８）にしたがっておこなった。
【００５５】
２．ｅｎｔＢ遺伝子およびｅｎｔＣ遺伝子の単離、ならびに発現ベクターｐＪＦ１１９ＥＨ１中へのクローニング：
ｅｎｔＢ遺伝子およびｅｎｔＣ遺伝子を、Ｅ．Ｃｏｌｉ株  Ｗ３１１０から単離した（Ｊ． Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ， Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， ＵＳＡ）。これらの野生型菌株についての記載は、Ｃ．Ｗ．Ｈｉｌｌ，Ｂ．Ｗ．Ｈａｒｎｉｓｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８１，７８，７０６９−７０６２にある。染色体ＤＮＡの製造は、Ｒ．Ｓｕｅｓｓｍｕｄ，Ｊ．Ｅｂｅｒｓｐａｃｈｅｒ，Ｒ．Ｈａａｇ，Ｗ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｓｃｈ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｃｈｅｓ  Ｐｒａｋｔｉｋｕｍ［Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］，第２版  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９からのスタンダードプロトコールにしたがっておこなった。染色体ＤＮＡ上でｅｎｔＢをＰＣＲによって増幅をおこなった。使用されたオリゴヌクレオチドは、ＴＡＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＣＧ  ＣＧＣ  ＡＴＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＡＡおよびＧＧＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＴＴＡ  ＣＣＧ  ＣＴＧであった。ＰＣＲの条件は次の通りである：熱変性  ５分（９４℃）  ３４サイクル：熱変性  ４分（９４℃）、アニーリング  ２分（５７℃）、伸長  １．５分（７５℃）、引き続いて  ７分（７５℃）で維持し、その後に４℃で冷却した。増幅されたｅｎｔＢ−フラグメント（８５５ｂｐ）は、ゲル電気泳動によって単離され（０．８％アガロースゲル、エチジウムブロマイド検出）、かつ、アフィニティークロマトグラフィーによって精製した（Ｑｉａｇｅｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｄ， Ｑｉａｇｅｎ）。このフラグメントを、エンドヌクレアーゼ  ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩで切断し、かつイオン交換クロマトグラフィーによって精製した（ｍｉｄｉ−Ｋｉｄ， Ｑｉａｇｅｎ）。
【００５６】
ｅｎｔＣ遺伝子を、相当する方法で製造した。Ｅ．Ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０からの染色体ＤＮＡを、オリゴヌクレオチド  ＧＧＣ  ＧＡＣ  ＣＴＣ  ＡＴＴ  ＡＴＴ  ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＴＴＴおよびＴＧＣ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＣＴＴ  ＡＴＴ  ＧＣを用いてＰＣＲをおこなった。このＰＣＲ条件は次の通りであった：２分（９４℃）、１０サイクル：−熱変性  ０．５分（９４℃）、アニーリング  ０．７５分（４０℃）、伸長  １分（７２℃）−、２０サイクル：−熱変性  ０．５分（９４℃）、アニーリング  ０．７５分（５５℃）、伸長  １分＋１０秒／サイクル（７２℃）−、その後に４℃に冷却した。
【００５７】
ＤＮＡ−産物（１２２０ｂｐ）は、ｅｎｔＢと同様に電気泳動によって精製し、かつ抽出した。この産物をエンドヌクレアーゼ  ＢａｍＨＩおよびＳａｃＩを用いて切断し、かつイオン交換クロマトグラフィーによって精製した。
【００５８】
プラスミドｐＤＥ１およびｐＤＥ２の構築
ｅｎｔＢ遺伝子を、Ｔ４  ＤＮＡ−リガーゼを用いて、切断したベクターｐＪＦ１１９ＥＨ１（Ｆｕｅｒｓｔｅ， Ｊ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １９８６， ４８： １１９−１３１）中にラーゲートした（切断部位  ＢａｍＨＩ， ＰｓｔＩ）。プラスミドを、クロニーングおよび発現株Ｅ．Ｃｏｌｉ  ＤＨ５α中に形質転換し、引き続いてアガープレート（ＬＢ， １００ｍｇ／ｌ アンピシリン）上で培養し、単一コロニーを得た。プラスミドｐＤＦ１（インサート  ｅｎｔＢを含むｐＪＦ１１９ＥＨ１）を選択し、制限酵素分析によって確認した。
【００５９】
同様の方法で、切断したベクターｐＤＦ１中にｅｎｔＣ−遺伝子を挿入した（切断部位  ＰｓｔＩ，ＳａｃＩ）。ＤＮＡ生成物の確認をさらに制限酵素分析によっておこなった。挿入した遺伝子について、双方のプラスミドを用いてシークエンシングをおこなった。プラスミド構築物については、図５に示す。このプラスミドをＥ．Ｃｏｌｉ−株ＡＮ１９３およびＨ１８８２中に形質転換した。活性タンパク質の発現を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび酵素活性試験によって確認した。使用されたＥ．Ｃｏｌｉ−株は以下の性質を有していた：
菌株ＡＮ１９３は、ＡＢ１５１５の親株に相当するが、しかしながら若干の欠失を有している（Ｔｒｐ ｌｅｕ ｐｒｏＣ ｌａｃ ｆｈｕＡ ｅｐｓＬ ｅｎｔＡ４０３）。菌株ＡＮ１９３は、Ｇ．Ｂ．Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９７０，１０４，２１８−２２６およびＢ．Ａ．Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｔ．Ｊ．Ｂｒｉｃｋｍａｎ，Ｍ．Ａ．Ｍｃｌｎｔｏｓｈ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８９，１７１，７７５−７８３に記載されている。菌株Ｈ１８８２は菌株ＭＣ４１００（ＤＳＭ６５７４，ＡＴＣＣ３５６９５）に相当するが、ジヒドロベンゾエートシンターゼ−欠失を有する（Δ（ｆｅｐＡ−ｅｎｔ））。菌株ＭＣ４１００に関するより詳細な記載は、Ｍ．Ｊ．Ｃａｓａｄａｂａｎ，Ｊ．ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８７６，１０４，５４１−５５５およびＭ．Ｊ．Ｃａｓａｄａｂａｎ，Ｓ．Ｎ．Ｃｏｈｅｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ１９７９，７６，４５３０−４５３３，ならびにＹ．Ｋｏｍｅｄａ，Ｔ．ｌｉｎｏ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １９７９，１３９，７１２−７２９で見出すことができる。
【００６０】
３．トランス−ＤＣＨＣを製造するための発酵：
菌株  ＡＮ１９３／ｐＤＦ２の５０％−グリセリン培養液（フィードストック）  １００μｌを、２０ｍｌの試験管中でイーストエクストラクト培養液（イーストエクストラクト５ｇ／ｌ、カゼインペプトン  １０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ、アンピシリン  １００ｍｇ／ｌ）５ｍｌを含有するプレカルチャー１に接種した。細胞を、３７℃で、振とうしながら（１５０ｒｐｍ）、１２時間に亘って培養した。プレカルチャー１  ５００μｌを、プレカルチャー２のための培養液に接種し、この場合、このプレカルチャー２は、１ｌのバッフル付振とうフラスコ１中で３Ｘ１００ｍｌのイーストエクストラクト培養液を有している（イーストエクストラクト５ｇ／ｌ、カゼインペプトン１０ｇ／ｌ、ＮａＣｌ５ｇ／ｌ、アンピシリン１００ｍｇ／ｌ）。細胞培養は、３７℃で振とうしながら（１５０ｒｐｍ）、１２時間に亘っておこなった。プレカルチャー２を、５ｌの滅菌濾過済主培養液（ＫＨ２ＰＯ４ １３ｇ／ｌ， Ｋ２ＨＰＯ４ １０ｇ／ｌ， ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ ６ｇ／ｌ， （ＮＨ４）２ＰＯ４ ２ｇ／ｌ， ＮＨ４Ｃｌ ０．２ｇ／ｌ， ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ３ｇ／ｌ，微量溶液（ｔｒａｃｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ） １ｍｌ／ｌ， アンピシリン １００ｍｇ／ｌ， チアミン  ２０ｍｇ／ｌ  ロイシン  ２０ｍｇ／ｌ、プロリン  ２０ｍｇ／ｌ、アデニン  ２０ｍｇ／ｌ、トリプトファン  ２０ｍｇ／ｌ、２，３−ジヒドロキシベンゼン酸  ２０ｍｇ／ｌ、グルコース  ３０ｇ／ｌ）を有する、通気しｐＨ調整された７．５ｌの撹拌槽反応器に移した。、で通過させた。
【００６１】
微量溶液は、５Ｎ  ＨＣｌ−溶液中に次のものを溶解した：ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ４０ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２Ｈ２Ｏ  ４０ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４ｎＨ２Ｏ  １０ｇ／ｌ、ＡｌＣｌ３６Ｈ２Ｏ  １０ｇ／ｌ、ＣｏＣｌ２  ４ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２ｇ／ｌ、Ｎａ２ＭｏＯ４Ｈ２Ｏ  ２ｇ／ｌ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  １ｇ／ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．５ｇ／ｌ。
【００６２】
発酵を、ガス流  ４．０３ｌ／分で通気した。このｐＨは、２５％アンモニア水溶液で７．０に調整した。温度を３７℃に調整した。撹拌速度は５００ｒｐｍであった。溶解された酸素濃度を、２０％の空気飽和率を上廻るように、空気装入量および撹拌速度を調整することによって調整した。消泡剤  ＡＦ２９８（Ｓｉｇｍａ）を、必要に応じて添加した。乾燥バイオマスが６ｇ／ｌに到達した後に、滅菌濾過されたＩＰＴＧ（水５ｍｌ中１３２ｍｇ）を、誘発のために添加した。最初のグルコースが消費された後に、滅菌されたグルコース濃縮物（７００ｇ／ｌ）を計量供給した。流速を０．１７ｍｌ／分にした。５０時間の工程時間の後に、２，３−トランス−ＤＣＨＣの濃度は９３０ｍｇ／ｌ（６ｍＭ）であった。
【００６３】
さらに、培養液の組成を最適化するために、たとえば、アンモニウム濃度を増加させ、かつ発酵条件、特にｐＨ−値および温度を最適化することによって、乾燥バイオマスの増加（２０ｇＤＢＭ／ｌを上廻る）を獲得することができる。高い乾燥バイオマスによって、高い生成物タイター（菌株  ＡＮ１９３／ｐＤＦ２で、２，３−トランス−ＤＣＨＣに対して５ｇ／ｌ）に付随する高い生成物形成速度（６０ｍｇｌ−１ｈ−１（ＤＢＭ）−１を上廻る）を達成することができる。乾燥バイオマスの増加は、特に、成長期後または成長期中において、トランス−ＤＣＨＣの製造のための他の炭素源、特にＤ−ガラクトースまたはグリセリンを使用することによって達成することができる。他の最適化条件下での例証的な発酵のプロセスデータについては、図６に示す。
【００６４】
４．２，３−トランス−ＤＣＨＣの反応抽出および塩溶液の分離
カチオン担体  Ａｌｉｑｕａｔ（Ｒ）を、有機溶剤  １−オクタノール中で、ｐＨ７で、５体積％の濃度に溶解し、かつ形成された２，３−トランス−ＤＣＨＣを培養液（発酵透過液）から抽出するために使用した。
【００６５】
２，３−トランス−ＤＣＨＣの再抽出（逆抽出ｂａｃｋ−ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）を、飽和塩化ナトリウム溶液を用いてｐＨ７でおこなった。
【００６６】
反応抽出による精製相は、トランス−ＤＣＨＣの他に水溶液中に多量の塩を含有していた。有機溶剤での抽出によって、生成物を塩溶液から定量的に分離した。これについては、１−ブタノールを用いてｐＨ３でおこない、その際、抽出効率は少なくとも３０％に達した。硫酸マグネシウムを用いて一晩に亘って生成物を乾燥後に、濾過し真空下で乾燥させ、生成物を塩および水不含の形でえた。１Ｈ−ＮＭＲおよび１３Ｃ−ＮＭＲ−スペクトルにおいて、このようにして得られた白みがかった黄色の固体が、不純物、特にコリスメートおよび／またはイソコリスメートを有する不純物を含まないことを確認した。
【００６７】
５．吸着および脱着による２，３−トランス−ＤＣＨＣの単離：
発酵の後に、２．２ｌの培養液を遠心分離によって、微小の粒子状成分から取り除き、かつｐＨ−値８および伝導率  １３．５ｍＳ／ｃｍに調整した。吸着体として、ＤＯＷＥＸ  １ｘ８  ５３０ｍｌ（ＣＬ−型、１００〜２００メッシュ）をカラム中に分取し、２７ｃｍの長さの堆積床（ｓｅｄｉｍｅｎｔｅｄ ｂｅｄ）にし、装填し、かつ５０ｍＭ  リン酸水素二カリウムバッファー（ｐＨ８）で平衡化した。この吸着体を、２．２ｌの培養液を用いて、２．４ｘ１０−４ｍ／ｓで装填した。完全な装填をおこなった後に、カラムの５倍容量の５０ｍＭ  リン酸水素二カリウムバッファー（ｐＨ８）で、同様の流速で洗浄した。引き続いて、脱着を、同様の流速で、カラムの８倍容量の５０ｍＭ  蟻酸を用いておこなった。得られた脱着画分を凍結乾燥させた。１Ｈ−ＮＭＲおよびＨＰＬＣ−クロマトグラフィーによる分析において、得られた固体について不純物は確認されなかった。
【００６８】
図面の簡単な説明
図１：トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエンカルボン酸立体異性体の構造式。図は、（５Ｓ，６Ｓ）−ジヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエンカルボン酸および（３Ｒ，４Ｒ）−ジヒドロキシシクロヘキシ−１，５−ジエンカルボン酸を示している。
【００６９】
図２：シキメート生合成経路を示す概略図。コリスメートは、芳香族アミノ酸、キレート剤  エンテロバクチン、葉酸塩、メナキノンおよびユビキノンの生合成における鍵となる化合物である。
【００７０】
図３：コリスメートから２，３−トランスＤＣＨＣ（イソコリスメートによる）および３，４−トランス−ＤＣＨＣへの生合成経路；ｅｎｔＣはイソコリスメートシンターゼをコードし、ｅｎｔＢはイソコリスメターゼをコードし、かつｅｎｔＡは２，３−ジヒドロキシベンゾエートシンターゼをコードする。
【００７１】
図４：反応抽出によるトランス−ＤＣＨＣの精製。有機相は、いわゆる“選択的回転戸（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｖｏｌｖｉｎｇ ｄｏｏｒ）”として生成物の抽出に役立つ。トランス−ＤＣＨＣｓは、イオン対として、水相から、有機相を介して、かつ水性生成物相中に運搬される。生成物相中のトランス−ＤＣＨＣｓ濃縮のための推進力は、対イオンの濃度勾配である。２相中の電荷は、塩化物の逆運搬によって平衡化される。
【００７２】
図５：プラスミドｐＤＦ１およびｐＤＦ２の構造を示す概略図。
【００７３】
図６：２，３−トランス−ＤＣＨＣを製造するためのプラスミドｐＤＦ２を含有するＥ．Ｃｏｌｉ菌株  ＡＮ１９３の発酵例。図は、乾燥バイオマス、グルコース濃度および生成物タイターに関する時間の経過を示す。
【００７４】
図７：生物学的に活性の植物代謝物の構造式。すべての物質は、一連のビシナルジオール単位を有する２，３−ジヒドロキシ−シクロヘキシルメタノール骨格の基本構造を有する。
【００７５】
図８：シクロヘキサンジオールエポキシド植物代謝物の主要な合成に関する概略図。それぞれの場合において、２，３−トランス−ＤＣＨＣ誘導体は鍵となる物質である。
【００７６】
図９：アミノ炭化糖の物質群の構造式の概略図。
【００７７】
図１０：他の標的群の構造式の概略図。
【００７８】
図１１：標的化合物の一般的な構造式を示す概略図（二次的化学）。これらの化合物は、選択的に、本発明によるトランス−ＤＣＨＣｓから、特に、選択的還元、エポキシ化および改変によって製造される。たとえば、２，３−トランス−ジヒドロキシシクロヘキサジエンカルボン酸は、出発物質として示されている。
【図面の簡単な説明】
【図１】
トランス−ジヒドロキシ−シクロヘキサジエンカルボン酸立体異性体の構造式を示す図。
【図２】
シキメート生合成経路を示す概略図。
【図３】
コリスメートから２，３−トランスＤＣＨＣ（イソコリスメートによる）および３，４−トランス−ＤＣＨＣへの生合成経路を示す概略図。
【図４】
反応抽出によるトランス−ＤＣＨＣの精製を示す概略図。
【図５】
プラスミドｐＤＦ１およびｐＤＦ２の構造を示す図。
【図６】
２，３−トランス−ＤＣＨＣを製造するためのプラスミドｐＤＦ２を含有するＥ．Ｃｏｌｉ菌株  ＡＮ１９３の発酵を示すグラフ図。
【図７】
生物学的に活性の植物代謝産物の構造式を示す図。
【図８】
シクロヘキサンジオールエポキシド植物代謝産物の主要な合成を示す概略図。
【図９】
アミノカルバ糖の物質群の構造式を示す図。
【図１０】
他の標的群の構造式を示す図。
【図１１】
標的化合物の一般的な構造式を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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2004525606.tif 000062
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004525606.tif 000063
【国際調査報告】
2004525606.tif 000064
2004525606.tif 000065
2004525606.tif 000066
2004525606.tif 000067