(57)【要約】本発明は、真核生物の染色体ＤＮＡから核酸配列を除去するための組換え系及び方法に関する。また本発明は、これらの系を含む、又はこれらの方法を用いて作製されたトランスジェニック生物（好ましくは植物）に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞又は生物において、
Ｉ）５’／３’方向に、
ａ１）第１の相同性配列Ａと、
ｂ１）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための少なくとも１つの認識配列と、
ａ２）第２の相同性配列Ｂ（ここで、相同性配列Ａ及びＢは、相同組換えを起こすのに十分な長さ及び十分な相同性を有する）と
からなる配列を含む、真核生物の染色体ＤＮＡに挿入されたトランスジェニック組換え構築物、並びに、
ＩＩ）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列（ｂ）でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素、又は、該認識配列（ｂ）でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素をコードする核酸配列、
を含む組換え系。
【請求項２】
上記組換え構築物が、
ａ１）第１の相同性配列Ａと、
ｂ１）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列と、
ｃ）さらに別の核酸配列と、
ａ２）第２の相同性配列Ｂ（ここで、相同性配列Ａ及びＢは、相同組換えを起こすのに十分な長さ及び十分な相同性を有する）、
として構築される、請求項１に記載の組換え系。
【請求項３】
上記組換え構築物が、
ａ１）第１の相同性配列Ａと、
ｂ１）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための第１の認識配列と、
ｃ）さらに別の核酸配列と、
ｂ２）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための第２の認識配列と、
ａ２）第２の相同性配列Ｂ（ここで、相同性配列Ａ及びＢは、相同組換えを起こすのに十分な長さ及び十分な相同性を有する）、
として構築される、請求項１又は２に記載の組換え系。
【請求項４】
上記組換え構築物又は上記別の核酸配列が、
ｉ）ポジティブセレクションマーカー、
ｉｉ）ネガティブセレクションマーカー、
ｉｉｉ）リポーター遺伝子、
ｉｖ）複製起点
ｖ）マルチクローニング領域、
ｖｉ）アグロバクテリウムトランスフェクション用の境界配列、
ｖｉｉ）宿主生物のゲノムへの相同組換え又は挿入を可能にする配列、
ｖｉｉｉ）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素のための発現カセット、
からなる群より選択される少なくとも１つのエレメントを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組換え系。
【請求項５】
ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素が、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、グループＩＩイントロンエンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ及びキメラヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え系。
【請求項６】
ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素が、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓｐＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｐｂＩＰ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳＰＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１Ｐ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳＰＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、及びＰＩ−ＴｌｉＩＩからなるホーミングエンドヌクレアーゼの群より選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換え系。
【請求項７】
ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素が、配列番号２、４、６、８及び１０に示す酵素からなるホーミングエンドヌクレアーゼの群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換え系。
【請求項８】
ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素が、該酵素をコードする核酸配列を含む発現カセットを用いて達成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換え系。
【請求項９】
ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素が、配列番号１、３、５、７又は９に示す該酵素をコードする核酸配列を含む発現カセットを用いて達成される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え系。
【請求項１０】
真核細胞又は生物の染色体ＤＮＡからＤＮＡ配列を除去する方法であって、真核細胞又は生物において、
Ｉ）５’／３’方向に、
ａ１）第１の相同性配列Ａと、
ｂ１）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための少なくとも１つの認識配列と、
ａ２）第２の相同性配列Ｂ（ここで、相同性配列Ａ及びＢは、相同組換えを起こすのに十分な長さ及び十分な相同性を有する）と
からなる配列を含む、真核生物の染色体ＤＮＡに挿入されたトランスジェニック組換え構築物と、
ＩＩ）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列（ｂ）でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素、
とを結合させ、
ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でのＤＮＡ二本鎖切断を誘導し、そして相同組換えが相同性配列ＡとＢとの間で起こることを含む、上記方法。
【請求項１１】
上記組換え構築物が、
ａ１）第１の相同性配列Ａと、
ｂ１）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための第１の認識配列と、
ｃ）さらに別の核酸配列と、
ａ２）第２の相同性配列Ｂ（ここで、相同性配列Ａ及びＢは、相同組換えを起こすのに十分な長さ及び十分な相同性を有する）、
として構築される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
上記組換え構築物が、
ａ１）第１の相同性配列Ａと、
ｂ１）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための第１の認識配列と、
ｃ）さらに別の核酸配列と、
ｂ２）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための第２の認識配列と、
ａ２）第２の相同性配列Ｂ（ここで、相同性配列Ａ及びＢは、相同組換えを起こすのに十分な長さ及び十分な相同性を有する）と
から構成される、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記組換え構築物又は上記別の核酸配列が、
ｉ）ポジティブセレクションマーカー、
ｉｉ）ネガティブセレクションマーカー、
ｉｉｉ）リポーター遺伝子、
ｉｖ）複製起点
ｖ）マルチクローニング領域、
ｖｉ）アグロバクテリウムトランスフェクション用の境界配列、
ｖｉｉ）宿主生物のゲノムへの相同組換え又は挿入を可能にする配列、
ｖｉｉｉ）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素のための発現カセット、
からなる群より選択される少なくとも１つのエレメントを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素が、制限エンドヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ及びキメラヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素が、Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓｐＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｐｂＩＰ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳＰＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１Ｐ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳＰＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、及びＰＩ−ＴｌｉＩＩからなるホーミングエンドヌクレアーゼの群より選択される、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素が、配列番号２、４、６、８及び１０に示す酵素からなるホーミングエンドヌクレアーゼの群より選択される、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素が、該酵素をコードする核酸配列を含む発現カセットを用いて達成される、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素が、配列番号１、３、５、７又は９に示す該酵素をコードする核酸配列を含む発現カセットを用いて達成される、請求項１０〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え系を含む生物。
【請求項２０】
酵母、藻類、真菌及び動物又は植物からなる群より選択される、請求項１９に記載の生物。
【請求項２１】
植物からなる群より選択される、請求項１９又は２０に記載の生物。
【請求項２２】
上記植物が、シロイヌナズナ、タバコ、コムギ、ライムギ、オオムギ、オートムギ、ナタネ、トウモロコシ、ジャガイモ、サトウキビ、ダイズ、ヒマワリ、パンプキン／カボチャ又はラッカセイからなる群より選択される、請求項１９又は２２に記載の生物。
【請求項２３】
請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の生物に由来する細胞培養物、器官、組織、部分又はトランスジェニック生殖材料。
【請求項２４】
請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の生物、又は、それらに由来する請求項２３に記載の細胞培養物、器官、組織、部分若しくはトランスジェニック生殖材料の、食料、飼料若しくは種子としての使用、あるいは、医薬品若しくはファインケミカルの製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核生物のゲノムから核酸配列を除去するための組換え系及び方法、並びに、これらの系を含むトランスジェニック生物（好ましくは、植物）に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物内における生物工学研究の目的は、中でも、特定の遺伝子及び遺伝子産物の機能に関する商業的に利用可能な情報を取得すること、並びに、生合成経路又は疾患機序（メカニズム）を解明することにある。このようにして取得した情報は、多様な方法に使用することができる。これらは、例えば、新規の医薬の調製、代替物の開発、生物工学的生産方法、又は改変植物の作出に役立つ。植物に関する生物工学研究の目的は、例えば、農業の生産性を高める、食品の品質を向上する、又は特定の化学薬品若しくは医薬品を調製するために、有利で新しい特徴を有する植物を作製することである（Dunwell JM, J Exp Bot. 2000；51 明細書487-96）。
【０００３】
トランスジェニック生物の作出では、用いられる方法（例えば、安定的形質転換又は、特に、相同組換え）の効力が低いために、所望の手法で改変された生物の選択が必要である。トランスジェニック植物は、一連の技法（参照：Potrykus I. 及びSpangenberg G.編（1995）Gene transfer to plants. Springer、ベルリン）により作出することができる。これに関しては、特に、アグロバクテリウム・ツメファシエンスが媒介する遺伝子導入、並びに、粒子ガンを用いた植物細胞のボンバードメントが重要な役割を果たしている。大きな問題は、トランスジェニックＤＮＡがいったん生物内に安定に導入されると、これを除去するのが困難になることである。選択のために形質転換方法の際に用いられる抗生物質又は除草剤に対する耐性遺伝子はトランスジェニック植物内に残るため、これが、「遺伝子食物」製品が消費者に受け入れられない実質的な原因となっている。
【０００４】
従って、外来ＤＮＡを植物ゲノム内の特定部位に組み込む、又はそこから除去するといった技法を開発する試みが、しばらくの間なされてきた（Ow DW及びMedberry SL（1995）Crit Rev in Plant Sci 14:239-261）。
【０００５】
当業者は、組換えにより導入した核酸配列の部位特異的除去のための様々な系を熟知している。これらは、配列特異的リコンビナーゼと、除去しようとする配列の両側に位置する（フランキングする）上記リコンビナーゼの２つの認識配列とを使用することに基づいている。この構築物に対するリコンビナーゼの作用によって、認識配列の内側の配列（フランキングされている配列）が除去され、認識配列の１つが該生物のゲノム内に残る。様々な配列特異的組換え系が記載されており、例えば、下記のものが挙げられる：バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系（Dale EC及びOw DW（1991）Proc Natl Acad Sci USA 88:10558-10562；Russell SHら（1992）Mol Gene Genet 234: 49-59；Osborne BIら（1995）Plant J. 7, 687-701）、酵母ＦＬＰ／ＦＲＴ系（Kilby NJら（1995）Plant J 8:637-652；Lyznik LAら（1996）Nucleic Acids Res 24: 3784-3789）、ＭｕファージＧｉｎリコンビナーゼ、大腸菌Ｐｉｎリコンビナーゼ、又はプラスミドｐＳＲ１のＲ／ＲＳ系（Onouchi Hら（1995）Mol. Gen. Genet. 247: 653-660.；Sugita Ketら（2000）Plant J. 22: 461-469）。ここで、リコンビナーゼ（例えば、Ｃｒｅ又はＦＬＰ）は、その対応する組換え配列（それぞれ、３４ｂｐのｌｏｘ配列と４７ｂｐのＦＲＴ配列）と特異的に相互作用することにより、その間に挟まれた配列を除去又は逆転させる。これらの系を植物に適用して成功した例についての報告は限られている。従って、David Owらのグループは、２つのｌｏｘ配列が両側に隣接した、植物の形質転換に用いられる選択マーカーは、Ｃｒｅの発現により植物ゲノムから再度除去することができることを示している（Dale EC及びOw DW（1991）Proc Natl Acad Sci USA 88:10558-10562）。配列特異的組換え系の欠点は、反応の可逆性である。すなわち、対象とするマーカー遺伝子の除去と組込みとの間に平衡が存在する。このことは、往々にして、突然変異の選択を引き起こす。すなわち、突然変異が、酵素とｌｏｘ認識配列のそれ以上の相互作用を阻止すると、直ちに（不要な）産物が上記平衡から排除されて、固定される。これは、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系にだけではなく、その他の配列特異的リコンビナーゼにもあてはまる（前記参照）。別の欠点は、リコンビナーゼの認識配列の１つが、そのように改変されてゲノム内に残るという事実である。これは、例えば、認識配列が、リーディングフレーム又はプロモーター若しくはエンハンサーのような遺伝子制御エレメントを改変又は破壊すると、該生物の形質に影響を与えうる。さらに、後に導入された認識配列との交互作用を除外することはできないため、ゲノム内に残る認識配列は、組換え系をそれ以上使用すること（例えば、第２の遺伝子改変）はできない。その結果、実質的な染色体の再配置又は欠失が起こる可能性がある。
【０００６】
Zubkoらは、タバコゲノムから核酸配列を欠失させるための系について記載しており、そこでは、除去しようとする配列は、バクテリオファージλ由来の２つの３５２ｂｐのａｔｔＰ認識配列に挟まれている（フランキングされている）。この挟まれた領域の除去は、ａｔｔＰ認識領域間の自発的な染色体内組換えにより、１１のトランスジェニックタバコ系統のうち２系統において、ヘルパータンパク質の発現とは独立に起こる。この方法の問題点は、組換え、又は欠失を、特定の時点で特異的に誘導することができず、自然に起こることである。この方法が少数の系統でしかうまくいかないという事実は、このような場合での組込み遺伝子座が不安定となる傾向を示唆している（Puchta H（2000）Trends in Plant Sci 5: 273-274）。
【０００７】
ＷＯ９６／１４４０８は、図３２と対応する第１２ページで、遺伝子座を排除する方法について記載しており、そこでは、それぞれホーミング制限エンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの１つの認識配列を、除去しようとする配列の対応する各末端に挿入する。エンドヌクレアーゼを用いた処理により、除去しようとする配列の両末端で、二本鎖の切断が起こる。次に、自由な末端同士が、「組換え」により結合する。ここで使用する「組換え」は、図からもわかるように、非正統的組換え（例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）事象）でしかない。というのは、ゲノムＤＮＡ内の残った２つの末端には相同性配列は一切存在しないからである。しかし、非正統的組換えは、予測できない組換え事象を引き起こす。従って、例えば、リーディングフレーム又はプロモーター若しくはエンハンサーのような遺伝子制御エレメントがこれによって改変又は破壊されると、該生物の形質に影響を及ぼしうる。この系は、除去しようとする断片の両側に位置する２つの認識配列を必要とする。
【０００８】
酵母（Haber JE （1995）Bioassays 17: 609-620）、哺乳動物細胞（Jasin M（1996）Trends Genet. 12: 224-228）又は植物（Puchta H（1999a）Methods Mol Biol 113: 447-451）などの真核生物のゲノムにおいて、制限酵素により配列特異的二本鎖切断を起こすことが記載されている。
【０００９】
エンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩ（Segal DJ及びCaroll D（1995）Proc Natl Acad Sci USA 92: 806-810）を用いた、又は合成のキメラヌクレアーゼ（Bibikova Mら（2001）Mol Cell Biol 21(1): 289-297）による配列特異的切断により、アフリカツメガエル卵母細胞において、プラスミドＤＮＡ上での分子内組換えが誘導されることが記載されている。この目的は、２つの相同性配列間での部位特異的組換えであり、これら２つの配列の間に、適切なヌクレアーゼ切断部位が位置する。いずれの場合も、染色体外組換え事象であり、この事象では、いずれも、染色体外プラスミドＤＮＡの一部だけが相同組換えを受ける。
【００１０】
Posfaiらは、原核生物である大腸菌における遺伝子の交換方法について記載している（Posfai Gら（1999）Nucleic Acids Res 27（22）: 4409-4415）。ここで、大腸菌ゲノム内で、内在性遺伝子と、突然変異した遺伝子との間に組換えが起こるが、これは、制限酵素Ｉ−ＳｃｅＩによる切断によって誘導される。この狙いと目的は、内在性遺伝子を突然変異したトランスジーンと交換することであった。大腸菌における組換えは、より高等な真核生物（例えば、Kuzminov A（1999）Microbiol Mol Biol Rev. 63(4): 751-813に記載）と比較して、極めて単純な方法で、しかも高効率で実施できる。
【００１１】
Durrenbergerらは、Ｉ−ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼ（Durrenberger Fら（1996）Nucleic Acid Res 24 (17): 3323-3331）を用いた、単細胞の緑藻クラミドモナス・レインハルドティ（Chlamidomonas reinhardtii）の葉緑体における組換えの誘導を記載している。組換えは、内在性２３Ｓ遺伝子と、Ｉ−ＳｃｅＩ切断部位を含む挿入された２３ＳｃＤＮＡとの間に起こる。二本鎖の切断は、対象のトランスジェニック生物と、Ｉ−ＳｃｅＩを発現する生物とを交配することにより誘導する。葉緑体における組換えは、より高等な真核生物の染色体ＤＮＡと比較して、極めて単純な方法で、しかも高効率で行われる。従って、実際に、相同組換えは、色素体（葉緑体）において、好ましい通常のＤＮＡ組込み方法であると思われる（Heifetz PB及びTuttle AM（2001）Curr Opinion Plant Biol 4: 157-161に記載）。色素体は、核とは反対に、該色素体に相同組換えを起こさせることができる特定の系を有し、そのために、外来ＤＮＡの部位特異的導入が容易になると考えられる（Heifetz PB（2000）Biochimie 82: 655-666）。
【００１２】
宿主生物の染色体ＤＮＡへの部位特異的組込みを相同組換えにより達成しようとする遺伝子ターゲッティング技法は、原核生物及び酵母の場合しか十分に機能しない。対応するトランスジェニック生物の作出は、わずかな種（例えば、マウスなど）でしか可能ではなく、非常に複雑でもある（Kanaar R Hoejimakers JH（1997）Genes Funct 1 (3): 165-174）。既存の不十分な相同組換えの効力（約１：１×１０６）は、この場合、対象の種に限定される複雑かつ高性能な選択手法（例えば、「ＥＳ」細胞手法）を用いて補わなければならない。その他の種（しかし、上述したより高等な植物のすべて）では、このような手法はまだ確立されていない（Mengiste T及びPaszkowski J（1999）Biol Chem. 380: 749-758；Vergunst AC及びHooykaas PJJ（1999）Crit Rev Plant Sci 18: 1-31；Puchta H（1999）Methods Mol Biol 113: 447-451；Hohn B及びPuchta H（1999）Proc Natl Acad Sci USA 96: 8321-8323）。植物における相同組換えを達成しようとする試みでは、ほとんどの場合、ランダムで非相同的な「非正統的」挿入事象が起こった。ここで、導入されたＤＮＡは、植物ゲノムにおける１以上の予測不可能な部位で組み込まれる。組込みは、非正統的組換えによって起こり（Roth DB及びWilson JH（1988）Illegitimate recombination in mammalian cells.“Genetic recombination”, R. Kucherlapati及びG.R. Smith編、American Society of Microbiology、ワシントン、USA；pp.621-635）、導入されたＤＮＡに対して相同的な配列領域では起こらない（Puchta H及びHohn B（1996）Trends Plant Sci. 1: 340-348）。相同組換えの効力が不十分であるという問題（主として、植物において深刻である）は、当業者には一般に知られている。最新の研究（参照論文：Mengiste T及びPaszkowski J（1999）Biological Chemistry 380(7-8): 749-58）で、これらの原因解明への取り組みがなされている。相同組換えの効力向上は、長い間植物生物工学での要望であったが、現在まで解決されていない。
【００１３】
生物工学研究に長く存在し、しかも、確立されている系のいずれによっても取り組まれていないもう一つの要望は、真核生物の染色体ＤＮＡから核酸配列の部位特異的に除去し、かつ、同じ宿主への反復適用を可能にする系及び方法の提供である。例えば、既存の高収率変種を組換え方法によりさらに改良することが、植物生物工学の狙いである。この場合、形質転換が起こった後、選択マーカーなどの不必要なトランスジーン配列を除去することが特に重要である。さらに、例えば、生物の染色体ＤＮＡからの、配列の推定可能な除去の方法は、遺伝子工学の分野でさらに広範な用途を提供し、それは、科学的及び経済的に大きな利益をもたらすであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、真核生物の染色体ＤＮＡからの所定の核酸配列の推定可能な除去を可能にし、かつ同じ生物への反復した連続的適用を可能にする系及び方法を開発することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、この目的が、本発明に係る組換え系を提供することにより、意外にも達成されることをみいだした。
【００１６】
本発明の第１の態様は、真核細胞又は生物の染色体ＤＮＡから、ＤＮＡ配列を除去するための組換え系であって、真核細胞又は生物において、
Ｉ）５’／３’方向に、
ａ１）第１の相同性配列Ａと、
ｂ１）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための少なくとも１つの認識配列と、
ａ２）第２の相同性配列Ｂ（ここで、相同性配列Ａ及びＢは、相同組換えを起こすのに十分な長さ及び十分な相同性を有する）と
からなる配列を含む、真核生物の染色体ＤＮＡに挿入されたトランスジェニック組換え構築物、並びに、
ＩＩ）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列（ｂ１）でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素、又は、該認識配列（ｂ１）でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素をコードする核酸配列、
を含む組換え系に関する。
【００１７】
本発明のもう一つの態様は、真核細胞又は生物の染色体ＤＮＡから、ＤＮＡ配列を除去するための方法であって、真核細胞又は生物において、
Ｉ）５’／３’方向に、
ａ１）第１の相同性配列Ａと、
ｂ１）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための少なくとも１つの認識配列と、
ａ２）第２の相同性配列Ｂ（ここで、相同性配列Ａ及びＢは、相同組換えを起こすのに十分な長さ及び十分な相同性を有する）と
からなる配列を含む、真核生物の染色体ＤＮＡに挿入されたトランスジェニック組換え構築物を、
ＩＩ）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列（ｂ１）でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素と
結合させ、
ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でのＤＮＡ二本鎖切断を誘導し、相同組換えが相同性配列ＡとＢとの間で起こることを含む組換え方法に関する。
【００１８】
本発明は、正確に推定可能に、生物の染色体ＤＮＡから配列（例えば、抗生物質又は殺虫剤に対する耐性遺伝子のような選択マーカー）を除去することができる。このようにして、除去しようとする配列は、ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列（例えば、希有な（rare-）切断制限酵素の認識配列）に挟まれるように配置し、切断部位の領域で相同性配列と結合させる。二本鎖切断は、ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列で、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素（例えば、配列特異的ヌクレアーゼ）によって誘導され、その結果、切断部位に位置する相同性配列の相同組換え、従って、両配列の間に位置するあらゆる核酸配列の除去が起こる。ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列も同様に除去されることから、この方法は、別の制御された遺伝子改変に繰り返し用いることができる。
【００１９】
驚くことに、この誘導された相同組換えは、高い効力及び精度で行なわれ、これは、植物などでの相同組換えの分野における以前の経験とは対照的である。その頻度は、相応する非相同的事象（例えば、非相同末端結合事象）と比較が可能である（実施例５参照）。これは、相同組換えの頻度（中でも植物の場合）は、「非正統的」事象と比較して二次的であり、ほぼ無視することができるという、以前の観察とは対照的な注目すべき知見である。
【００２０】
除去される配列は、相同性配列ＡとＢの間に位置する配列である。例えば、ｃｒｅ／ｌｏｘ又はＦＲＴ／ＦＬＰ系のような系とは対照的に、組換えを実施する際、特定の配列に拘束されない。当業者は、十分な長さと相同性が存在すれば、どんな配列でも、別の配列との相同組換えを受けうることを知っている。二本鎖切断の配列特異的誘導によって、相同性配列ＡとＢの間の相同組換え効力がかなり高くなり、実際に、初めて可能であった実験例もある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
組換え構築物に関して、「トランスジーン」とは、組換え方法の結果得られるすべての構築物であって、
ａ）相同性配列Ａ若しくはＢの少なくとも１つ、又は
ｂ）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための少なくとも１つの認識配列、又は
ｃ）（ａ）及び（ｂ）
のいずれかが、その天然の遺伝子環境（例えば、その天然の染色体遺伝子座）に位置しないか、あるいは、組換え方法により改変されている構築物を意味する。ここで、改変は、１以上のヌクレオチド残基の、例えば、置換、付加、欠失、逆転又は挿入を包含しうる。
【００２２】
「真核細胞又は生物」とは、一般に、あらゆる真核細胞又は生物、並びに、それらに由来する細胞、組織、部分又は生殖材料（例えば、種子や果実など）を意味し、ここで、組換え構築物と、ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素が、１つの反応空間（例えば、細胞又は細胞小器官）内に同時に存在するとき、二本鎖切断の誘導が、ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列で起こると共に、相同性配列ＡとＢの間の相同組換えが起こると考えられる。特に好ましい実施形態は、例えば、核のような真核細胞の小器官を包含する。
【００２３】
特に好ましく包含される細胞又は生物は、多細胞の真核生物を構成するもの、又は、該生物に由来するもの、並びに、その細胞、組織、部分若しくは生殖材料（種子や果実など）である。非常に好ましい細胞又は生物として、動物若しくは植物を構成するもの、又は、該生物に由来するもの、並びに、その細胞、組織、部分若しくは生殖材料が包含される。最も好ましい細胞又は生物としては、植物を構成するもの、又は、該生物に由来するもの、並びに、その細胞、組織、部分若しくは生殖材料が挙げられる。好ましい属及び種については、以下にさらに詳しく述べる。
【００２４】
相同性配列Ａ及びＢに関して、「十分な長さ」とは、少なくとも２０塩基対の長さ、好ましくは少なくとも５０塩基対の長さ、特に好ましくは少なくとも１００塩基対の長さ、非常に好ましくは少なくとも２５０塩基対の長さ、最も好ましくは少なくとも５００塩基対の長さを有する配列を意味する。
【００２５】
相同性配列Ａ及びＢに関して、「十分な相同性」とは、少なくとも２０塩基対、好ましくは少なくとも５０塩基対、特に好ましくは少なくとも１００塩基対、非常に好ましくは少なくとも２５０塩基対、最も好ましくは少なくとも５００塩基対の長さにわたる相同性配列内で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、非常に好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは１００％の相同性を有する配列を意味する。
【００２６】
２つの核酸配列間の相同性は、いずれの場合も、配列全長にわたる、核酸配列の同一性を意味するものとして理解され、これは、アルゴリズムＧＡＰプログラム（Wisconsin Package Version 10.0、ウイスコンシン大学、遺伝学コンピューターグループ（GCG）、マディソン郡、USA）を用いたアラインメントにより計算され、ここで、下記パラメーターを設定する：
ギャップ重み：１２            長さ重み：４
平均マッチ：２，９１２        平均ミスマッチ：−２，００３
好ましい実施形態では、ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための唯一つの認識配列が、相同性配列ＡとＢの間に位置し、これにより、本発明の組換え系又は方法で用いられる組換え構築物は、５’／３’方向に、以下：
ａ１）第１の相同性配列Ａと、
ｂ１）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列と、
ａ２）第２の相同性配列Ｂ（ここで、相同性配列Ａ及びＢは、相同組換えを起こすのに十分な長さ及び十分な相同性を有する）、
として構築される。
【００２７】
好ましい実施形態では、さらに別の核酸配列が、相同性配列Ａ及びＢの間に位置し、本発明の組換え系又は方法で用いられる組換え構築物は、５’／３’方向に、以下：
ａ１）第１の相同性配列Ａと、
ｂ１）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列と、
ｃ）さらに別の核酸配列と、
ａ２）第２の相同性配列Ｂ（ここで、相同性配列Ａ及びＢは、相同組換えを起こすのに十分な長さ及び十分な相同性を有する）、
として構築される。
【００２８】
ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列はまた、上記さらに別の核酸配列の後又は該配列内に位置していてもよい。
【００２９】
さらに別の好ましい実施形態では、二本鎖切断の部位特異的誘導のための第２の認識配列は、上記別の核酸配列の後に存在する。この実施形態は、相同性配列Ａ及びＢが、さらに離れている場合、あるいは、別の核酸配列がより長い場合に、組換え効力を高めるため、特に有利である。この実施形態では、本発明の組換え系又は方法で用いられる組換え構築物は、５’／３’方向に、以下：
ａ１）第１の相同性配列Ａと、
ｂ１）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための第１の認識配列と、
ｃ）さらに別の核酸配列と、
ｂ２）ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための第２の認識配列と、
ａ２）第２の相同性配列Ｂ（ここで、相同性配列Ａ及びＢは、相同組換えを起こすのに十分な長さ及び十分な相同性を有する）、
として構築される。
【００３０】
さらに、ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための第２の認識配列に加えて、相同性配列ＡとＢの間に、上記以外の認識配列が存在してもよい。ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための個々の認識配列（例えば、ｂ１又はｂ２）は、同じでも異なるものでもよい。すなわち、これらは、ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための個別の酵素、又は様々な酵素に対し認識配列として機能すればよい。本発明では、この場合、ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列が、ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための個別の酵素に対し認識配列として機能する実施形態が好ましい。
【００３１】
当業者は、本発明の組換え構築物の１つを取得する様々な方法についてよく知っている。これらの構築物は、通常の組換え及びクローニング技法により作製することができ、このような技法は、例えば、T. Maniatis, E.F. Fritsch及びJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY（1989）；T. J. Silhavy, M.L. Berman及びL.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY（1984）；Ausubel, F.M.ら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience（1987）に記載されている。
【００３２】
本発明の組換え構築物は、当業者には公知の組換え及びクローニング技法を用いて、組換え構築物の前記必須構成要素を一緒に、前記配列において結合させて作製し、こうして得られたものを宿主生物の染色体ＤＮＡに導入することが好ましい。
【００３３】
しかし、当業者であれば、別の方法で本発明の組換え構築物を取得できることを理解できる。従って、宿主生物はすでに、組換え構築物の１以上の必須構成要素をすでに含んでいてもよい。その場合、本発明の組換え構築物は、組換え構築物の１以上の別の必須構成要素を、上記生物において、既存の構成要素に対して正しい位置に導入することにより、作製することができる。従って、例えば、出発生物は、相同性配列Ａ又はＢの１つをすでに含んでいてもよい。上記生物が、相同性配列Ａをすでに含んでいる場合には、相同性配列Ａの後に、ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列と、第２の相同性配列Ｂからなる構築物を導入することにより、本発明の組換え構築物の１つが得られる。
【００３４】
さらに、当業者は、本発明の組換え構築物を真核細胞又は生物の染色体ＤＮＡに導入することができる様々な方法についてよく知っている。この場合、挿入は、特異的（すなわち、既定の挿入部位で起こる）、又は非特異的（すなわち、ランダムに起こる）のいずれでもよい。好適な技法は、当業者には公知であり、以下に例として説明する。
【００３５】
「ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列でＤＮＡ二本鎖切断を誘導するのに適した酵素」（以下「ＤＳＢＩ酵素（double strand-break inducing enzyme）」と呼ぶ）とは、一般に、配列特異的に、二本鎖のＤＮＡに二本鎖切断を起こすことができるあらゆる酵素を意味する。例として、限定するものではないが、下記のものを挙げることができる：
１．制限エンドヌクレアーゼ（ＩＩ型）、好ましくは、以下に詳細に説明するホーミングエンドヌクレアーゼ；
２．リコンビナーゼ（例えば、前述のようなＣｒｅ／ｌｏｘ；Ｒ−ＲＳ；ＦＬＰ／ＦＴＲ）；
３．トランスポザーゼ、例えば、Ｐ因子トランスポザーゼ（Kaufman PD及びRio DC（1992）Cell 69 (1): 27-39）又はＡｃＤｓ（Xiao YL及びPeterson T（2000）Mol Gen Genet 263 (1): 22-29）。原則として、トランスポザーゼ又はインテグラーゼは、配列特異性を有している限り、すべて好適である（Haren Lら（1999）Annu Rev Microbiol. 1999；53: 245-281；Beall EL, Rio DC（1997）Genes Dev. 11(16): 2137-2151）；
４．以下に詳細に説明するように、キメラヌクレアーゼ；
５．ＲＡＧ１／ＲＡＧ２系（Agrawal Aら、（1998）Nature 394（6695）：744-451）など、免疫系において二本鎖切断を誘導する酵素；
６．グループＩＩイントロンエンドヌクレアーゼ。イントロン配列の改変により、グループＩＩイントロンを二本鎖ＤＮＡ内のほぼすべての配列にを特異的に挿入することができ、そこで、後に、逆スプライス機構により、グループＩＩイントロンを挿入することができる（Mohrら（2000）Genes & Development 14: 559-573；Guoら（2000）Science 289: 452-457）。この逆スプライス機構の過程で、二本鎖切断を標的ＤＮＡに導入し、グループＩＩイントロンエンドヌクレアーゼのタンパク質部分がアンチセンス鎖を加水分解すると共に、除去されたイントロンＲＮＡがセンス鎖を切断する（Guoら（1997）EMBO J 16: 6835-6848）。完全な逆スプライシングを達成するのではなく、本発明の場合のように、二本鎖切断を誘導したいだけであれば、例えば、逆転写酵素活性を欠失したグループＩＩイントロンエンドヌクレアーゼを利用することができる。これによって二本鎖切断の誘発を阻止しない限り、逆スプライス機構は完了まで進行することはできない。
【００３６】
好適な酵素は、天然の酵素だけではなく、合成酵素も含まれる。
【００３７】
好ましい酵素は、公知の認識配列を有し、かつ、そのタンパク質の形態で得られる（例えば、精製により）か、又はその核酸配列を用いて発現させることができる、あらゆるＤＳＢＩ酵素である。
【００３８】
特に、特定の真核生物の染色体ＤＮＡ配列において、トランスジェニック組換え構築物に存在する認識配列を除き、認識配列を一切又はごくわずかしか持っていない制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）が好ましい。これによって、ゲノム内の不要な遺伝子座でのそれ以上の二本鎖切断が回避される。
【００３９】
このために、ホーミングエンドヌクレアーゼが、極めて好ましいのである（参照：Belfort M及びRoberts RJ（1997）Nucleic Acids Res 25: 3379-3388；Jasin M（1996）Trends Genet. 12: 224-228；Internet: http://rebase.neb.com/rebase/rebase.homing.html）。ホーミングエンドヌクレアーゼは、その認識配列が長いために、ほとんどの場合、真核生物の染色体ＤＮＡには、それ以外の認識配列を一切又はごくわずかしか有していない。
【００４０】
このようなホーミングエンドヌクレアーゼをコードする配列は、例えば、クラミドモナスの葉緑体ゲノムから単離することができる（Turmel Mら（1993） J Mol Biol 232: 446-467）。これらは小さく（１８〜２６ｋＤ）、そのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、真核生物での核発現にまさに適した「コドン使用法（coding usage）」を有する（Monnat RJ Jrら（1999）Biochem Biophys Res Com 255: 88-93）。特に好ましく単離されたホーミングエンドヌクレアーゼとして、下記のものが挙げられる：ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩ（ＷＯ９６／１４４０８）、Ｉ−ＳｃｅＩＩ（Sarguiel Bら（1990）Nucleic Acids Res 18: 5659-5665）、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ（Sarguiel Bら（1991）Mol Gen Genet. 255: 340-341）、Ｉ−ＣｅｕＩ（Marshall（1991）Gene 104: 241-245）、Ｉ−ＣｒｅＩ（Wang Jら、（1997）Nucleic Acids Res 25: 3767-3776）、Ｉ−ＣｈｕＩ（Cote Vら（1993）Gene 129: 69-76）、Ｉ−ＴｅｖＩ（Chuら（1990）Proc Natl Acad Sci USA 87: 3574-3578；Bell-Pedersenら（1990）Nucleic Acids Res 18: 3763-3770）、Ｉ−ＴｅｖＩＩ（Bell-Pedersenら（1990）Nucleic Acids Res 18: 3763-3770）、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ（Eddyら（1991）Genes Dev. 5: 1032-1041）、Ｅｎｄｏ ＳｃｅＩ（Kawasakiら、（1991）J Biol Chem 266:5342-5347）、Ｉ−ＣｐａＩ（Turmel Mら（1995a）Nucleic Acids Res 23: 2519-2525）及びＩ−ＣｐａＩＩ（Turmel Mら（1995b）Mol. Biol. Evol. 12, 533-545）。
【００４１】
上記以外のホーミングエンドヌクレアーゼについては、前記インターネットウェブサイトに詳しく記載してある。そのホーミングエンドヌクレアーゼの例として、下記のものを挙げることができる：Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｆ−ＳｃｅＩＩ、Ｆ−ＳｕｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｍａＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＣｍｏｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ−ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＤｄｉＩＩ、Ｉ−ＤｉｒＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＨｓｐＮＩＰ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮａａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＮｃｌＩＰ、Ｉ−ＮｇｒＩＰ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｂｏＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＩＰ、Ｉ−ＰｃｕＡＩ、Ｉ−ＰｃｕＶＩ、Ｉ−ＰｇｒＩＰ、Ｉ−ＰｏｂＩＰ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ−ＰｐｂＩＰ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳＰＢｅｔａＩＰ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＳｃｅＶ、Ｉ−ＳｃｅＶＩ、Ｉ−ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ−ＳｅｘＩＰ、Ｉ−ＳｎｅＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ−ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ−ＳｑｕＩＰ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ−ＳｔｈＰｈｉＳ３ｂＰ、Ｉ−ＴｄｅＩＰ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ−ＵａｒＡＰ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１Ｐ、Ｉ−ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ−ＶｉｎＩＰ、Ｉ−ＺｂｉＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＩ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ−ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ−ＰｆｕＩ、ＰＩ−ＰｆｕＩＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ−ＳＰＢｅｔａＩＰ、ＰＩ−ＳｃｅＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩＩ、ＰＩ−ＴｈｙＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩＩ。
【００４２】
本発明において好ましいのは、遺伝子配列がすでに知られているホーミングエンドヌクレアーゼであり、例えば、以下のものがある：Ｆ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＣｈｕＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｆ−ＴｅｖＩ、Ｆ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩ、Ｉ−ＡｎｉＩ、Ｉ−ＣｖｕＩ、Ｉ−ＤｄｉＩ、Ｉ−ＨｍｕＩ、Ｉ−ＨｍｕＩＩ、Ｉ−ＬｌａＩ、Ｉ−ＮａｎＩ、Ｉ−ＭｓｏＩ、Ｉ−ＮｉｔＩ、Ｉ−ＮｊａＩ、Ｉ−ＰａｋＩ、Ｉ−ＰｏｒＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃａＩ、Ｉ−Ｓｓｐ６８０３Ｉ、ＰＩ−ＰｋｏＩ、ＰＩ−ＰｋｏＩＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−ＴｆｕＩ、ＰＩ−ＴｌｉＩ。
【００４３】
中でも特に、Ｉ−ＣｅｕＩ、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＤｍｏＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ又はＰＩ−ＳｃｅＩなどの市販のホーミングエンドヌクレアーゼが好ましい。
【００４４】
酵素は、当業者に周知の方法で供給源の生物から単離し、及び／又はそれらのコード核酸配列をクローニングすることができる。各種酵素の配列は、ＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。
【００４５】
特に、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ及びＩ−ＣｈｕＩなどのホーミングエンドヌクレアーゼが非常に好ましい。最も好ましいのは、配列番号２、４、６、８又は１０に示したようなホーミングエンドヌクレアーゼである。
【００４６】
例として挙げることができる合成ＤＳＢＩは、非特異的ヌクレアーゼドメインと、ジンクフィンガーからなる配列特異的ＤＮＡ結合ドメインとから構成されるキメラヌクレアーゼである（Bibikova Mら（2001）Mol Cell Biol. 21: 289-297）。上記ＤＮＡ結合ジンクフィンガードメインを改変することにより、あらゆるＤＮＡ配列に適合させることができる。好適なジンクフィンガードメインを作製するのに適した方法は記載されており、当業者には公知である（Beerli PRら、Proc Natl Acad Sci USA. 2000；97 (4): 1495-1500；Beerli PRら、J. Biol Chem 2000；275 (42): 32617-32627；Segal DJ及びBarbas CF 3rd., Curr Opin Chem Biol 2000；4 (1): 34-39；Kang JS及びKim JS, J Biol Chem 2000；275 (12): 8742-8748；Beerli RRら、Proc Natl Acad Sci USA. 1998；95 (25): 14628-14633；Kim JSら、Proc Natl Acad Sci USA. 1997；94 (8): 3616-3620；Klug A, J Mol Biol 1999；293(2): 215-218；Tsai SYら、Adv Drug Deliv Rev 1998；30(1-3): 23-31；Mapp AKら、Proc Natl Acad Sci USA. 2000；97 (8): 3930-3935；Sharrocks ADら、Int J Biochem Cell Biol 1997；29(12): 1371-1387；Zhang Lら、J Biol Chem 2000；275(43): 33850-33860）。
【００４７】
ＤＳＢＩ酵素は、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む融合タンパク質として発現されるのが好ましい。このＮＬＳ配列は、核への輸送を促進し、組換え系の効力を高めることができる。様々なＮＬＳ配列が当業者には知られており、中でも、Jicks GR及びRaikhel NV（1995）Annu. Rev. Cell Biol. 11: 155-188により記載されている。植物に好ましいものとして、例えば、ＳＶ４０巨大抗原のＮＬＳ配列がある。非常に好ましいのは、以下のＮＬＳ配列である：
ＮＬＳ１：N-Pro-Lys-Thr-Lys-Arg-Lys-Val-C（配列番号２９）
ＮＬＳ２：N-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-C（配列番号３０）
【００４８】
実施例で用いられる配列番号４、６、８又は１０に示すホーミングエンドヌクレアーゼは、ネイティブヌクレアーゼと、ＮＬＳ２核局在化配列との融合タンパク質である。
【００４９】
多くのＤＳＢＩ酵素（例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼなど）のサイズが小さいため、ＮＬＳ配列は、必ずしも必要ではない。これらの酵素は、何の補助がなくても、核膜孔を通過することができる。これは、配列番号２に示すホーミングエンドヌクレアーゼ（これまで用いられ、核局在化配列を一切含まない）の効力により確認される。
【００５０】
さらに好ましい実施形態では、ＤＳＢＩ酵素の活性を誘導することができる。好適な方法が、配列特異的リコンビナーゼについて記載されている（Angrand POら（1998）Nucl. Acids Res. 26 (13): 3263-3269；Logie C及びStewart AF（1995）Proc Natl Acad Sci USA 92 (13): 5940-5944；Imai Tら（2001）Proc Natl Acad Sci USA 98 (1): 224-228）。これらの方法では、ＤＳＢＩ酵素と、ステロイドホルモン受容体（例えば、上記文献に記載されているように、ヒトアンドロゲン受容体、又はヒトエストロゲン受容体の突然変異した変異体）のリガンド結合ドメインとの融合タンパク質を用いる。誘導は、例えば、エストラジオール、デキサメタゾン、４−ヒドロキシタモキシフェン又はラロキシフェンなどのリガンドを用いて、実施することができる。
【００５１】
いくつかのＤＢＳＩ酵素は、二量体（ホモ又はヘテロ二量体；Ｉ−ＣｒｅＩはホモ二量体を形成し、Ｉ−ＳｅｃＩＶはヘテロ二量体を形成する）として活性を有する（Wernette CM（1998）Biochemical & Biophysical Research Communications 248 (1): 127-333））。二量体形成は、例えば、天然の二量体化ドメインを低分子量リガンドの結合ドメインと交換することにより、誘導可能なものとして設計することができる。次に、二量体リガンドを付加することにより、融合タンパク質の二量体形成を達成する。対応する誘導可能な二量体形成方法、並びに、二量体リガンドの作製については、記載されている（Amara JFら（1997）Proc Natl Acad Sci USA 94 (20): 10618-1623；Muthuswamy SKら（1999）Mol Cell Biol 19 (10): 6845-685；Schultz LW及びClardy J（1998）Bioorg Med Chem Lett. 8(1): 1-6；Keenan Tら（1998）Bioog Med Chem. 6 (8):1309-1335）。
【００５２】
「ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための認識配列」は、一般に、各場合で用いた真核細胞又は生物における条件下で、ＤＳＢＩ酵素による認識及び切断を可能にする配列を意味する。それぞれのＤＳＢＩ酵素に対する認識配列の詳細を、限定するものではないが、例として以下の表１に示す。
【表１】
2004533267.tif 000002
【００５３】
2004533267.tif 000003
【００５４】
2004533267.tif 000004
【００５５】
また、対象のＤＳＢＩ酵素による認識及び切断が依然として可能な認識配列のわずかな変化（縮重）も包含される。このような変化（また、例えば、カルシウム又はマグネシウム濃度のような様々なフレームワーク条件に関しても）については、記載されている（Argast GMら（1998）J Mol Biol 280: 345-353）。これらの認識配列のコア配列も含まれる。認識配列の内側部分は、誘導される二本鎖切断に十分であること、また、外側部分は、必ずしも関連しないが、切断効力を共に決定しうることがわかっている。従って、例えば、Ｉ−ＳｃｅＩには１８ｂｐのコア配列を規定することができる。
【００５６】
当業者に周知の多様な方法で、組換え構築物とＤＳＢＩ酵素を結合することにより、本発明の組換え系又は方法の１つを取得することができる。従って、例えば、以下のようにして、生物、細胞、細胞小器官又は組織において、組換え構築物とＤＳＢＩ酵素を結合することができる：
１．）染色体ＤＮＡに挿入した組換えカセットを有する生物を通常の方法で作製する。例えば、このような植物は、アグロバクテリウム媒介形質転換によって作製するのが好ましい。組換えカセットを有する一次形質転換体は、ＤＢＳＩ酵素の発現を指令する発現カセットによる形質転換に用いるか、又は好適な様式で同型接合まで生育させると、これらは、ＤＢＳＩ酵素の発現を指令する発現カセットによる形質転換のための宿主生物（例えば、宿主植物）として働く。これらの宿主植物から出発して、形質転換のために、例えば、カルス培養物又は胚発生培養物のようなｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物を開始、確立及び使用することができる。ＤＳＢＩ酵素用の発現カセットによる形質転換は、場合に応じて、安定若しくは一過性のいずれでもよい。
【００５７】
２．）マスター生物として知られる生物は、ＤＳＢＩ酵素の対応する遺伝子（又はＤＳＢＩ酵素の発現を指令する発現カセット）を担持及び発現するが、このような生物は、通常の手法で作製する。例えば、このようなマスター植物は、好ましくは、アグロバクテリウム媒介形質転換により作製することができる。ＤＢＳＩ酵素を発現する一次形質転換体を、組換え構築物による形質転換に用いるか、又は、好適な様式で同型接合まで生育させると、これら形質転換体は、組換え構築物が導入されたマスター生物又は宿主生物（例えば、マスター植物）として働く。これらのマスター植物から出発して、例えば、形質転換のために、例えば、カルス培養物又は胚発生培養物のようなｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物を開始、確立及び使用することができる。
【００５８】
３．）ＤＳＢＩ酵素をコードする遺伝子（又はＤＳＢＩ酵素の発現を指令する発現カセット）を、組換えカセットをすでに担持するベクターに組み込み、これにより、標的遺伝子と同時に、植物細胞に導入することができる。相同性配列の間に、ＤＳＢＩ酵素をコードする遺伝子を挿入することにより、該遺伝子がその機能を果たした後、染色体ＤＮＡからこれを除去するのが好ましい。特に好ましくは、このような場合、ＤＳＢＩ酵素の発現は、発生依存的プロモーターを用いて、発生依存的に誘導可能である（例えば、以下に記載する誘導性プロモーターの１つの制御下にて行う）か、あるいは、活性を誘導可能なＤＳＢＩ酵素を用いることにより、形質転換直後であってゲノムへのその挿入前の組換え構築物の切断を防止するようにする。
【００５９】
４．）共形質転換技法を用いて、ＤＳＢＩ酵素の発現を指令する発現カセットを、組換え構築物と同時に、しかし、個別のベクター上で、細胞に形質転換することができる。共形質転換は、場合に応じて、安定又は一過性のいずれでもよい。このような場合、ＤＳＢＩ酵素の発現は、好ましくは、発生依存的プロモーターを用いて、発生依存的に誘導可能である（例えば、以下に記載する誘導性プロモーターの１つの制御下にて行う）か、あるいは、活性を誘導可能なＤＳＢＩ酵素を用いることにより、形質転換直後であってゲノムへのその挿入前の組換え構築物の切断を防止するようにする。
【００６０】
５．）ＤＳＢＩ酵素を発現する生物、例えば、植物又は動物は、親個体として機能することもできる。ＤＳＢＩ酵素を発現する生物と、組換え構築物を担持する生物との交配によって得られる子孫では、相同性配列の間に、所望の二本鎖切断及び組換えが観察され、相同性配列の間に位置する配列を除去することができる。
【００６１】
６．）ＤＳＢＩ酵素の発現はまた、上記２）〜４）を利用することができる一過性形質転換手法でも考えられる。
【００６２】
７．）また、ＤＳＢＩ酵素は、例えば、マイクロインジェクション、パーティクルボンバードメント（パーティクルガン法）、ポリエチレングリコールトランスフェクション若しくはリポソーム媒介トランスフェクションにより、トランスジェニック組換え構築物を含む又は担持する細胞に直接導入することもできる。この実施形態は、ゲノム内にＤＳＢＩ酵素をコードする配列が残る可能性がないため、有利である。このような方法については、例えば、Segal DJら（1995）Proc Natl Acad Sci USA 92: 806-810により記載されている。
【００６３】
８．）ＤＳＢＩ酵素は、ＤＳＢＩ酵素をコードするｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成したｍＲＮＡを細胞に導入する（例えば、マイクロインジェクション、パーティクルボンバードメント（パーティクルガン法）若しくはリポソーム媒介トランスフェクションを用いて）ことにより作製してもよい。この実施形態は、ゲノム内にＤＳＢＩ−酵素コード化配列が残る可能性がないため、有利である。
【００６４】
９．）ＤＳＢＩ酵素は、アグロバクテリウムのＶｉｒＥ２又はＶｉｒＦタンパク質との融合タンパク質として植物細胞に導入することができる。このような方法は、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼについて記載されている（Vergunst ACら（2000）Science. 290: 979-982）。融合タンパク質の発現カセットが、境界配列の外側に位置する場合には、これは植物ゲノムには挿入されない。この実施形態は、ゲノム内にＤＳＢＩ酵素をコードする配列が残る可能性がないため有利である。
【００６５】
本発明の組換え系又は方法は、生物全体又は、それに由来する部分、細胞若しくは生殖材料、特に好ましくは、植物全体、あるいは、あらゆる植物組織、又はカルスを含む植物ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物において達成することができる。例えば、コムギ胚芽抽出物や網状赤血球抽出物を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでの用途も考慮することができる。
【００６６】
以上記載したように、ＤＳＢＩ酵素は、ＤＳＢＩ酵素をコードするＤＮＡを含む発現カセットを用いて作製することができ、これを真核細胞又は生物に導入する。この場合、ＤＳＢＩ酵素の発現カセットは、配列番号２、４、６、８若しくは１０に示すＤＳＢＩ酵素をコードする核酸配列、又は、本質的に同じ認識配列を用いて、二本鎖ＤＮＡにＤＮＡ二本鎖切断を起こすことができる上記配列の機能的同等物を含むのが好ましい。本質的に同じ認識配列とは、対象の酵素に最適なものとして同定された認識配列とは異なるが、それでも該酵素による切断を可能にする認識配列を意味する。特に、ＤＳＢＩ酵素の発現カセットは、配列番号１、３、５、７若しくは９に示す核酸配列を含むのが非常に好ましい。
【００６７】
発現カセット（例えば、ＤＳＢＩ酵素の発現カセットに関する場合）は、発現させようとするＤＮＡを少なくとも１つの遺伝子制御エレメントと機能的に結合させた構築物を意味し、このエレメントは、その発現（すなわち、転写及び［脱落］又は翻訳）を可能にするか、又は調節する。ここで、発現は、例えば、安定又は一過性、構成性又は誘導性のいずれでもよい。当業者は、それを導入するための各種の直接的方法（例えば、トランスフェクション、パーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション）又は間接的方法（例えば、アグロバクテリウムを用いた感染、ウイルスを用いた感染）を用いることができる。これらの方法のすべてを以下に詳しく説明する。
【００６８】
機能的結合は一般に、遺伝子制御配列が、例えばＤＳＢＩ酵素をコードするような核酸配列に関連してその機能を発揮させることができる配置を意味すると理解される。これに関連して、機能とは、例えば、核酸配列の発現、すなわち、転写及び／又は翻訳の制御を意味する場合もある。これに関連し、制御とは、例えば、発現、すなわち、転写、場合によっては翻訳を開始、増強、統制若しくは抑制することを包含する。制御はまた、例えば、組織及び［脱落］又は時期特異的のいずれでもよい。また、例えば、特定の化学薬品、ストレス、病原体などにより、誘導性であってもよい。
【００６９】
機能的結合は、例えば、プロモーター、発現しようとする核酸配列（例えば、ＤＳＢＩ酵素をコードするもの）、並びに、場合によっては、例えば、ターミネーターのような別の調節エレメントの連続的配置を意味するものと理解され、この配置は、上記核酸配列（例えば、ＤＳＢＩ酵素をコードするもの）を発現させると、調節エレメントの各々が、その機能を果たすことができるような配置である。
【００７０】
これは、必ずしも化学的意味での直接結合を要するわけではない。例えば、エンハンサー配列のような遺伝子制御配列もまた、離れた位置から標的配列に、又は全く別のＤＮＡ分子にその機能を発揮することができる。好ましい配置は、発現させようとする核酸配列（例えば、ＤＳＢＩ酵素をコードするもの）が、プロモーターとして働く配列の後に位置し、これにより、両配列が、相互に共有結合するような配置である。プロモーター配列と、核酸配列（例えば、ＤＳＢＩ酵素をコードするもの）との距離は、好ましくは２００塩基対以下、特に好ましくは１００塩基対以下、さらに好ましくは５０塩基対以下である。
【００７１】
当業者は、このような発現カセットを取得するための様々な方法についてよく知っている。例えば、このカセットは、プロモーターとして働く核酸配列を、発現させようとするヌクレオチド配列（例えば、ＤＳＢＩ酵素をコードするもの）と直接融合させることにより、作製するのが好ましい。機能的結合は、通常の組換え及びクローニング手法を用いて達成することができ、これらの方法については、例えば、T. Maniatis、E. F.Fritsch及びJ. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY（1989）；T. J. Silhavy, M.L. Berman及びL. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY（1984）；並びに、Ausubel, F. M. ら、Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. 及びWiley Interscience（1987）。
【００７２】
しかし、発現カセットは、発現させようとする核酸配列（例えば、ＤＳＢＩ酵素をコードするもの）を、例えば、相同組換え又はランダム挿入により、内在性遺伝子制御エレメント、例えば、プロモーターの制御下におくように、構築してもよい。このような構築物も同様に、本発明の目的のための発現カセットとして理解される。
【００７３】
これも当業者には公知であるが、ジンクフィンガータンパク質タイプの人工転写因子を用いて、核酸分子を発現させることもできる（Beerli RRら（2000）Proc Natl Acad Sci USA 97 (4)：1495-500）。これらの因子は、あらゆる配列領域に適合させ、特定のプロモーター配列とは無関係に発現を可能とすることができる。
【００７４】
用語「遺伝子制御配列」とは、広義に理解すべきであり、本発明の発現カセットの生成、又は機能に影響を与えるすべての配列を意味する。例えば、遺伝子制御配列は、原核又は真核生物において、転写、及び場合によっては、翻訳を指令する。好ましくは、本発明の発現カセットは、発現させようとするそれぞれの核酸配列の５’上流ではプロモーター、３’下流では、別の遺伝子制御配列としてのターミネーター配列、並びに、場合によっては、さらに別の通常制御エレメントを含み、いずれも、発現させようとする核酸と機能的に連結されている。
【００７５】
遺伝子制御配列については、例えば、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press、サンディエゴ、CA（1990）又はGruber及びGrosby: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, CRC Press, Boca Raton、フロリダ、Glick及びThompson編、第７章、89-108、並びに、それらに引用された参照文献に記載されている。
【００７６】
このような制御配列の例は、誘導因子又はリプレッサーが結合し、従って、核酸の発現を調節する配列である。実際の構造遺伝子の前にある配列の自然の調節は、これらの新しい制御配列に加えて、あるいは、これら配列に代わって依然として存在しており、場合によっては、自然の調節がオフにスイッチされ、遺伝子発現が増強するように、遺伝子を改変しておくこともできる。しかし、発現カセットは、構成がもっと単純であってもよい。すなわち、前記遺伝子の前に追加の調節シグナルを挿入せず、天然のプロモーターは、その調節と共に、除去しないでおく。これに代わり、調節がそれ以上起こらず、遺伝子発現が増強されるように、天然の制御配列を突然変異させる。これらの改変されたプロモーターをそれだけで天然の遺伝子の前に配置し、活性を高めることも可能である。
【００７７】
宿主生物又は出発生物に応じて、様々な制御配列が適しており、これらについては、以下にさらに詳しく説明する。これらの生物は、発現カセット若しくはベクターの導入により、遺伝子改変生物、又はトランスジェニック生物となる。
【００７８】
本発明の発現カセット若しくはベクターの有利な制御配列は、例えば、ｃｏｓ、ｔａｃ、ｔｒｐ、ｔｅｔ、ｐｈｏＡ、ｔａｔ、ｌｐｐ、ｌａｃ、ｌａｃＩｑ、Ｔ７、Ｔ５、Ｔ３、ｇａｌ、ｔｒｃ、ａｒａ、ＳＰ６、λ−ＰＲなどのプロモーター、又はλ−ＰＬプロモーターに存在し、これらのプロモーターは、グラム陰性菌で有利に用いられる。
【００７９】
さらに有利な制御配列は、例えば、グラム陽性菌プロモーターａｍｙ及びＳＰＯ２、酵母若しくは真菌プロモーターＡＤＣ１、ＭＦａ、ＡＣ、Ｐ−６０、ＣＹＣ１、ＧＡＰＤＨ、ＴＥＦ、ｒｐ２８、ＡＤＨ、又は植物プロモーターＣａＭＶ／３５Ｓ（Franckら（1980）Cell 21: 285-294）、ＰＲＰ１（Martini Nら（1993）Mol Gen Genet. 236 (2-3): 179-186）、ＳＳＵ、ＯＣＳ、ＬＥＢ４、ＵＳＰ、ＳＴＬＳ１、Ｂ３３、ＮＯＳ；ＦＢＰａｓｅＰ（ＷＯ９８／１８９４０）あるいは、ユビキチン若しくはファセオリンプロモーターに存在する。
【００８０】
脊椎動物、好ましくは、哺乳動物における発現に好適なベクターは、ＴＫプロモーター、ＲＳＶ  ３’ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター又はＳＶ４０初期若しくは後期プロモーターなどのベクターである。当業者は、その他のプロモーターについてもよく知っている。脊椎動物、好ましくは、哺乳動物での使用に好適な誘導性プロモーターは、例えば、テトラサイクリン若しくは誘導体によって誘導可能又は抑制可能なＴｅｔプロモーター／リプレッサー、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶ−ＬＴＲプロモーター、エクジソン若しくは類似体ポナステロンＡ（例えば、ｐＶｇＲＸＲ発現系（Invitrogen, Inc.）内に存在）により誘導可能なショウジョウバエ最小熱ショックプロモーターが挙げられる。
【００８１】
好ましいプロモーターは、原則として、植物において、遺伝子、特に外来遺伝子の発現を制御することができれば、どんなプロモーターでもよい。好ましいプロモーターは、植物において構成的発現を可能にするものである（Benfeyら（1989）EMBO J. 8: 2195-2202）。好ましく用いられるプロモーターは、特に、植物プロモーター、又は植物ウイルス由来のプロモーターである。特に好ましいのは、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ転写物（Franckら（1980）Cell 21: 285-294；Odellら（1985）Nature 313:810-812；Shewmakerら（1985）Virology 140: 281-288；Gardnerら、1986、Plant Mol. Biol. 6, 221-228）若しくは１９Ｓ  ＣａＭＶプロモーター（米国特許第５，３５２，６０５号及びＷＯ８４／０２９１３）である。このプロモーターは、転写エフェクターのための多様な認識配列を含み、これらの配列が全体として、導入された遺伝子の永久及び構成性的発現をもたらす（Benfeyら（1989）EMBO J 8: 2195-2202）。
【００８２】
さらに好適な構成性プロモーターは、Ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニット（ＳＳＵ）プロモーター（米国特許第４，９６２，０２８号）である。好適なプロモーターの別の例として、レグミンＢプロモーターがある（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｘ０３６７７）。さらに好ましい構成性プロモーターとして、例えば、アグロバクテリウムノパリンシンターゼプロモーター、ＴＲデュアルプロモーター、アグロバクテリウムＯＣＳ（オクトピンシンターゼ）プロモーター、ユビキチンプロモーター（Holtorfら（1995）Plant Mol Biol 29: 637-649）、液胞ＡＴＰａｓｅサブユニットのプロモーター、又はコムギプロリン高含有タンパク質のプロモーター（ＷＯ９１／１３９９１）が挙げられる。
【００８３】
発現カセットは、誘導性の、好ましくは化学的に誘導性のプロモーター（Aoyama T及びChua NH（1997）Plant J 11: 605-612；Caddick MXら（1998）Nat. Biotechnol 16: 177-180；参照：Gatz, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 1997, 48: 89-108）を含み、該プロモーターによって、植物における外因性遺伝子の発現を特定の時点で制御することができる。このようなプロモーター、例えば、ＰＲＰ１プロモーター（Wardら、Plant. Mol. Biol. 22（1993）、361-366）、サリチル酸誘導性プロモーター（ＷＯ９５／１９４４３）、ベンゼンスルホンアミド誘導性プロモーター（ＥＰ−Ａ−０３８８１８６）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Gatzら、（1992）Plant J. 2, 397-404）、アブシジン酸誘導性プロモーター（ＥＰ−Ａ３３５５２８）、サリチル酸誘導性プロモーター（ＷＯ９５／１９４４３）、又はエタノール誘導性（Salter MGら（1998）Plant J. 16: 127-132）若しくはシクロヘキサノン誘導性（ＷＯ９３／２１３３４）プロモーターなどを同様に用いることができる。
【００８４】
特に好ましい実施形態では、具体的に、ＤＳＢＩ酵素をコードする核酸を誘導性プロモーターの制御下で発現させる。これにより、例えば、植物において、制御され、統制可能な発現及び欠失が達成され、ＤＳＢＩ酵素の構成性的発現に起因するすべての問題が解消される。
【００８５】
その他の好ましいプロモーターとしては、例えば、ＰＲＰ１遺伝子の病原体誘導性プロモーター（Wardら、Plant. Mol. Biol. 22: 1993、361-366）、タバコ熱誘導性ｈｓｐ８０プロモーター（米国特許第５，１８７，２６７号）、ジャガイモ寒冷誘導性α−アミラーゼプロモーター（ＷＯ９６／１２８１４）又は創傷誘導性ｐｉｎＩＩプロモーター（ＥＰ３７５０９１）のような生物的若しくは非生物的ストレスにより誘導されるプロモーターがある。
【００８６】
上記以外の好ましいプロモーターは、葯、子房、花粉、分裂組織、花、葉、茎、根及び種子に対して特異性を有するプロモーターである。
【００８７】
発生調節プロモーターは、中でも、Baersonら（Baerson SR, Lamppa GK（1993）Plant Mol Biol 22 (2): 255-67）により記載されている。
【００８８】
特に好ましいプロモーターは、デンプン及び／又は油若しくはそれらの前駆体の生合成が行なわれる、あるいは、これら産物が有利に蓄積される、組織又は植物部分における発現を指令するプロモーターである。デンプンの生合成部位は、葉の葉緑体、又は種子、果実若しくは塊茎のような貯蔵器官のアミロプラストである。これらの器官内で、上記部位は、主として、合成が行なわれる胚の内乳又は子葉の細胞である。好ましいプロモーターは、従って、前述の構成性プロモーターに加えて、特に、下記のような種子特異的プロモーターが挙げられる：例えば、ファセオリンプロモーター（米国特許第５，５０４，２００号、Bustos MMら、Plant Cell. 1989; 1(9): 839-53）、２Ｓアルブミン遺伝子のプロモーター（Joseffson LGら（1987）J Biol Chem 262: 12196-12201）、レグミンプロモーター（Shirsat Aら（1989）Mol Gen Genet. 215 (2): 326-331）、ＵＳＰ（未知の種子タンパク質）プロモーター（Baumlein Hら（1991）Molecular & General Genetics 225 (3): 459-67）、ナピン遺伝子プロモーター（米国特許第５，６０８，１５２号；Stalberg Kら（1996）L. Planta 199: 515-519）、スクロース結合タンパク質プロモーター（ＷＯ００／２６３８８）又はレグミンＢ４プロモーター（ＬｅＢ４；Baumlein Hら（1991）Mol Gen Genet 225: 121-128；Baeumleinら（1992）Plant Journal 2 (2):233-239；Fiedler Uら（1995）Biotechnology（NY）13 (10): 1090-1093）、Ｉｎｓシロイヌナズナオレオシンプロモーター（ＷＯ９８４５４６１）、アブラナＢｃｅ４プロモーター（ＷＯ９１／１３９８０）。さらに好適な種子特異的プロモーターは、「高分子量グルテニン（ＨＭＷＧ）」、グリアジン、分枝酵素、ＡＤＰ−グルコースピロホスファターゼ（ＡＧＰａｓｅ）又はデンプンシンターゼをコードする遺伝子のプロモーターである。さらに好ましいプロモーターは、トウモロコシ、オオムギ、コムギ、ライムギ、コメなどの単子葉植物における種子特異的発現を可能にするものである。有利に用いることができるプロモーターは、ｌｐｔ２又はｌｐｔ１遺伝子のプロモーター（ＷＯ９５／１５３８９、ＷＯ９５／２３２３０）、又はＷＯ９９／１６８９０に記載されているプロモーター（ホルデイン遺伝子、グルテリン遺伝子、オリジン（oryzin）遺伝子、プロラミン遺伝子、グリアジン遺伝子、グルテリン遺伝子、ゼイン遺伝子、カシリン遺伝子若しくはセカリン遺伝子のプロモーター）である。
【００８９】
遺伝子制御エレメントとして好ましいプロモーターとして、さらに、例えば、ナタネナ（B. campestris）ｂｇｐ１遺伝子のプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｘ６８２１０；Xu Hら（1993）Mol Gen Genet 239 (1-2): 58-65；ＷＯ９４／１３８０９）、イネｏｒｙ  ｓ  １遺伝子のプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＡＪ０１２７６０；Xu Hら（1995）Gene 164 (2): 255-259）、花粉特異的トウモロコシ遺伝子ＺＭ１３のプロモーター（Hamilton DAら（1998）Plant Mol Biol 38 (4): 663-669；US 5,086,169）、並びに、アブラナ（B. napus）遺伝子Ｂｐ１０のプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｘ６４２５７；Albani D（1992）Plant J 2 (3): 331-342；米国特許第６，０１３，８５９号）などの花粉特異的プロモーターがある。
【００９０】
その他の好ましいプロモーターは、雄配偶子における細胞特異的発現のためのＬｃｇ１プロモーター（ＷＯ９９／０５２８１；XU Hら（1999）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第96巻：2554-2558）及びＡｔＤＭＣ１遺伝子のプロモーター（Klimyuk VIら（1997）Plant J. 11 (1): 1-14）である。
【００９１】
別の好適なプロモーターとして、例えば、クラスＩパタチンプロモーター（Ｂ３３）、ジャガイモカテプシンＤインヒビタープロモーター、デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ１）プロモーター、又はスポラミンプロモーターのような塊茎、貯蔵根若しくは根に特異的なプロモーター、並びに、例えば、トマト果実特異的プロモーター（ＥＰ−Ａ４０９６２５）のような果実特異的プロモーターが挙げられる。
【００９２】
さらに好適なプロモーターとして、葉特異的発現を指令するものがある。このようなプロモーターとして、ジャガイモ細胞質ゾルＦＢＰａｓｅプロモーター（ＷＯ９８／１８９４０）、Ｒｕｂｉｓｃｏ（リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ）ＳＳＵ（小サブユニット）プロモーター又はジャガイモＳＴ−ＬＳＩプロモーター（Stockhausら（1989）EMBO J 8 (9): 2445-2451）が挙げられる。その他の好ましいプロモーターは、種子及び植物胚における発現を統制するものである。
【００９３】
さらに好適なプロモーターは、例えば、トマト果実成熟特異的プロモーター（ＷＯ９４／２１７９４）のような果実成熟特異的プロモーター、例えば、フィトエンシンターゼプロモーター（ＷＯ９２／１６６３５）のような花特異的プロモーター、又はＰ−ｒｒ遺伝子のプロモーター（ＷＯ９８／２２５９３）であり、あるいは、ＥＰ−Ａ２４９６７６号に記載されている別の節特異的プロモーターも有利に用いることができる。
【００９４】
一般に、上に挙げたもののように、天然のプロモーターは、その調節配列を含めて、すべて本発明の方法に用いることができる。加えて、合成プロモーターを有利に用いることができる。
【００９５】
遺伝子制御配列はまた、発現特異的な性質を改変することができるさらに別のプロモーター、プロモーターエレメント又は最小プロモーターも包含する。従って、例えば、組織特異的発現が、遺伝子制御配列のために、特定のストレス因子の機能としてさらに起こることもある。このようなエレメントが、例えば、水ストレス、アブシジン酸（Lam E及びChua NH（1991）J Biol Chem 266 (26): 17131-17135）及び熱ストレス（Schoffl Fら（1989）Molecular & General Genetics 217 (2-3): 246-53）について記載されている。
【００９６】
さらに、別の植物組織、又は、例えば、大腸菌のようなその他の生物における発現を可能にするその他のプロモーターを、発現させようとする核酸配列と機能的に結合させてもよい。好適な植物プロモーターは、原則として、上に記載したすべてのプロモーターである。
【００９７】
遺伝子制御配列はさらに、遺伝子の５’−非翻訳領域、イントロン又は非コード３’−領域も包含する。これらは、遺伝子発現の調節において重要な役割を果たしす可能性があることが明らかにされている。すなわち、５’−非翻訳配列は、異種遺伝子の一過性発現を増強する能力があることがわかっている。さらに、これらは、組織特異性を促進しうる（Rouster Jら、Plant J. 1998, 15: 435-440）。反対に、オペーク（opaque）−２遺伝子の５’−非翻訳領域は、発現を抑制する。対象領域の欠失により、遺伝子活性が増強する（Lohmer Sら、Plant Cell 1993, 5: 65-73）。
【００９８】
遺伝子制御配列はまた、翻訳を開始するためのリボソーム結合配列を含んでもよい。これは、特に、発現させようとする核酸配列が、好適な配列を提供しない場合、又は発現系と適合性でない場合に、好ましい。
【００９９】
発現カセットは、プロモーターと機能的に結合したエンハンサー配列として知られるものを１以上含んでいれば有利であり、これにより、核酸配列のトランスジェニック発現を増強させることができる。また、さらに別の調節エレメント又はターミネーターのような別の有利な配列を、組換えにより発現させようとする核酸配列の３’−末端に挿入してもよい。発現させようとする核酸配列の１以上のコピーが遺伝子構築物に存在してもよい。
【０１００】
遺伝子制御配列はさらに、シグナルペプチド配列からなる融合タンパク質をコードする配列を意味するものとして理解される。
【０１０１】
遺伝子制御配列として好適なポリアデニル化シグナルは、植物ポリアデニル化シグナルであり、好ましくは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のＴ−ＤＮＡポリアデニル化シグナルに本質的に相当するもの、特に、ＴｉプラスミドｐＴｉＡＣＨＳのＴ−ＤＮＡの遺伝子３（オクトピンシンターゼ）のポリアデニル化シグナル（Gielenら、EMBO J. 3（1984）、835 等）又はそれらの機能的同等物である。特に好適なターミネーター配列の例として、ＯＣＳ（オクトピンシンターゼ）ターミネーター及びＮＯＳ（ノパリンシンターゼ）ターミネーターが挙げられる。
【０１０２】
前述したように、本発明の組換え構築物は、さらに別の核酸配列を含んでいてもよい。このような核酸配列は、発現カセットを構成するのが好ましい。以下に、発現構築物において発現させようとするＤＮＡ配列の例を挙げるが、これらに限定されるわけではない：
ｉ）ポジティブセレクションマーカー：
概して、選択マーカーは、相同組換え又は形質転換を首尾よく受けた細胞を選択する上で必要である。発現構築物と一緒に導入された選択マーカーは、相同組換え又は形質転換を首尾よく受けた細胞に、生物致死剤（例えば、ホスフィノトリシン、グリホセート又はブロモキシニルのような除草剤）、２−デオキシグルコース−６−リン酸（ＷＯ９８／４５４５６）のような代謝阻害物質、又は例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、Ｇ４１８、ネオマイシン、ブレオマイシン又はヒグロマイシンのような抗生物質に対する耐性を賦与する。選択マーカーは、非形質転換細胞から形質転換細胞の選択を可能にする（McCormickら、Plant Cell Reports 5（1986）、81-84）。特に好ましい選択マーカーは、除草剤に対する耐性を賦与するものである。選択マーカーの例として、下記のものを挙げることができる：
−  ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）をコードするＤＮＡ配列。これは、グルタミンシンターゼ阻害剤であるホスフィノトリシン（ＰＰＴ）の遊離アミノ基をアセチル化し、ＰＰＴの解毒を達成する（de Blockら、1987、EMBO J. 6, 2513-2518）（また、ビアロホス（登録商標）耐性遺伝子（ｂａｒ遺伝子）も参照されたい）
−  グリホセート（登録商標）（Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン）に対する耐性を賦与する５−エノールピルビルシキメート−３−リン酸シンターゼ遺伝子（ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子）
−  グリホセート（登録商標）−分解酵素（グリホセートオキシドレダクターゼ）をコードするｇｏｘ遺伝子
−  ｄｅｈ遺伝子（ダラポン（登録商標）を不活性化するデハロゲナーゼをコードする）
−  スルホニル尿素及びイミダゾリンを不活性化するアセト乳酸シンターゼ
−  ブロモキシニル（登録商標）分解ニトリラーゼ酵素をコードするｂｘｎ遺伝子
−  カナマイシン、又はＧ４１８、耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ）。ＮＰＴＩＩ遺伝子は、リン酸化反応により、カナマイシン、ネオマイシン、Ｇ４１８及びパロモマイシンの阻害効果を低下させるネオマイシンホスホランスフェラーゼをコードする。
【０１０３】
−  ＤＯＧＲ１遺伝子。ＤＯＧＲ１遺伝子は、酵母サッカロミセス・セレビシエから単離された（ＥＰ０  ８０７  ８３６）。これは、２−ＤＯＧに対する耐性を賦与する２−デオキシグルコース−６−リン酸ホスファターゼをコードする（Randez-Gilら、1995, Yeast 11, 1233-1240）。
【０１０４】
ｉｉ）ネガティブセレクションマーカーは、例えば、マーカー遺伝子を含む配列が首尾よく欠失された生物の選択を可能にする（Koprek Tら（1999）The Plant Journal 19 (6): 719-726）。ＴＫチミジンキナーゼ（ＴＫ）とジフテリア毒素Ａ断片（ＤＴ−Ａ）、シトシンデアミナーゼをコードするｃｏｄＡ遺伝子（Gleve APら（1999）Plant Mol Biol. 40 (2): 223-35；Pereat RIら（1993）Plant Mol. Biol 23 (4): 793-799；Stougaard J；（1993）Plant J 3: 755-761）、シトクロムＰ４５０遺伝子（Koprekら（1999）Plant J. 16: 719-726）、ハロアルカンデハロゲナーゼをコードする遺伝子（Naested H（1999）Plant J. 18: 571-576）、ｉａａＨ遺伝子（Sundaresan Vら（1995）Genes & Development 9: 1797-1810）又はｔｍｓ２遺伝子（Fedoroff NV & Smith DL 1993, Plant J 3: 273-289）。
【０１０５】
ｉｉｉ）容易に定量可能なタンパク質をコードし、かつ、固有の色又は酵素活性を介して、形質転換効率、又は発現の位置若しくは時期の評価を行うことができるリポート遺伝子。本発明で特に好ましいのは、以下のようなリポータータンパク質をコードする遺伝子である（Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1): 29-44も参照）：
−  「緑色蛍光タンパク質」（ＧＦＰ）（Chui WLら、Curr Biol 1996, 6: 325-330；Leffel SMら、Biotechniques. 23 (5):912-8、1997；Sheenら（1995）Plant Journal 8 (5): 777-784；Haseloffら（1997）Proc Natl Acad Sci USA 94 (6):2122-2127；Reichelら（1996）Proc Natl Acad Sci USA 93 (12): 5888-5893；Tianら（1997）Plant Cell Rep 16: 267-271；ＷＯ９７／４１２２８）
−  クロラムフェニコールトランスフェラーゼ
−  ルシフェラーゼ（Millarら、Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414；Owら（1986）Science、234: 856-859）；生物発光の検出を可能にする
−  βガラクトシダーゼ；様々な色素原基質を利用可能な酵素をコードする
−  βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）（Jeffersonら、EMBO J. 1987, 6, 3901-3907）又はｕｉｄＡ遺伝子；様々な色素原基質に対する酵素をコードする
−  Ｒ遺伝子座遺伝子産物：植物組織におけるアントシアニン色素の生成（赤色着色）を調節し、従って、追加添加物又は色素原基質の添加なしに、プロモーター活性を直接分析することができるタンパク質（Dellaportaら：Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18 th Stadler Genetics Symposium, 11: 263-282, 1988）
−  β−ラクタマーゼ（Sutcliffe（1978）Proc Natl Acad Sci USA 75: 3737-3741）、様々な色素原基質（例えば、ＰＡＤＡＣ、色素原セファロスポリン）に対する酵素
−  ｘｙｌＥ遺伝子産物（Zukowskyら（1983）Proc Natl Acad Sci USA 80: 1101-1105）、色素原カテコールを変換することができるカテコールジオキシゲナーゼ
−  α−アミラーゼ（Ikutaら（1990）Bio/technol. 8: 241-242）、
−  チロシナーゼ（Katzら（1983）J Gene Microbiol 129: 2703-2714）、チロシンを酸化することにより、ＤＯＰＡ及びドパキノンを生成し、これらが、後に、容易に検出可能なメラニンを形成する、
−  エクロリン（Prasherら（1985）Biochem Biophys Res Commun 126 (3): 1259-1268）；カルシウム感受性生物発光検出に用いることができる。
【０１０６】
本発明の組換え構築物、並びに、それらに由来するあらゆるベクターは、さらに別の機能的エレメントを含んでいてもよい。用語「さらに別の機能的エレメント」とは、広義に理解すべきである。これは、好ましくは、本発明の組換え系、本発明の組換え構築物、又はそれらを含む細胞若しくは生物の作製、増殖、機能、使用又は価値に影響を与えるすべてのエレメントを意味する。さらに別の機能的エレメントの例として、下記のものを挙げることができるが、これらに限定されるわけではない：
ｉｖ）例えば、大腸菌において本発明の発現カセット又はベクターの複製を行う複製起点。例として、ＯＲＩ（ＤＮＡ複製起点）、ｐＢＲ３２２  ｏｒｉ又はＰ１５Ａ  ｏｒｉ（Sambrookら：Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）が挙げられる。
【０１０７】
ｖ）マルチクローニング領域（ＭＣＳ）は、１以上の核酸配列の挿入を可能にし、かつ容易にする。
【０１０８】
ｖｉ）宿主生物のゲノムへの相同組換え又は挿入を可能にする配列。
【０１０９】
ｖｉｉ）植物ゲノムへの導入及び組込みを目的として、植物細胞におけるアグロバクテリウム媒介導入を可能にするエレメント、例えば、Ｔ−ＤＮＡ又はｖｉｒ領域の右若しくは左の境界などの境界配列。
【０１１０】
以上記載した発現カセット又はさらに別の機能的エレメントはすべて、前述したように、相同性配列ＡとＢの間に位置していてよい。しかし、これらは、該配列の外側に位置していてもよい。これは、特に、境界配列の場合に有利である。
【０１１１】
ＤＳＢＩ酵素のための本発明の組換えカセット又は発現構築物は、これらの構築物又はカセットを挿入したベクターを用いて、細胞に導入するのが有利である。ベクターの例として、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、レトロウイルス又はその他のアグロバクテリウムが挙げられる。
【０１１２】
大腸菌における発現のためのベクターは、好ましくは、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ−９（QIAGEN, Inc.）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｒｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Stratagene Cloning Systems, Inc.）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Pharmacia Biotech, Inc.）である。
【０１１３】
真核生物での発現に好ましいベクターは、ｐＷＬＮＥ０、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ（Stratagene, Inc.）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬ（Pharmacia Biotech, Inc.）である。誘導性ベクターとしては、ｐＴｅｔ−Ｔｈｉａ、Ｐｏｔｔｅｒ−Ｓｐｌｉｃｅ、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／ＬａｃＺ、ｐｃＤＮＡ６／ＴＲ、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ／ＬａｃＺ、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ａ、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｂ、ｐｃＤＮＡ４／ＴＯ／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｃ、ｐＶｇＲＸＲ（Invitrogen, Inc.）又はｐＭＡＭ系（Clontech, Inc.；Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号：Ｕ０２４４３）が挙げられる。これらはすでに、例えば、ＤＳＢＩ酵素の化学的誘導性発現のための誘導性調節制御エレメントを提供する。ＤＳＢＩ酵素をコードする核酸は、これらのベクターに直接挿入することができる。
【０１１４】
酵母における発現のためのベクターとしては、例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ＰＨＩＬ−Ｄ２、ＰＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３ＳＫ、ｐＰＩＣ９Ｋ及びＰＡ０８１５（Invitrogen, Inc）が挙げられる。
【０１１５】
有利な実施形態では、発現カセットは、プラスミドベクターを用いて、導入する。好ましいベクターは、宿主ゲノムへの発現カセットの安定した組込みを可能にするベクターである。
【０１１６】
本発明の別の態様は、本発明の組換え系を含む真核トランスジェニック生物、並びに、このような生物に由来する細胞、細胞培養物、組織、部分又は生殖材料（例えば、植物の場合には、葉、根、種子、果実、花粉など）に関する。
【０１１７】
真核生物、出発生物又は宿主生物とは、高等及び下等の、単又は多細胞真核生物を意味する。例えば、酵母、藻類又は真菌のような真核微生物も含まれる。
【０１１８】
好ましい酵母は、カンジダ、サッカロミセス、ハンセヌラ又はピヒアであり、サッカロミセス・セレビシエ又はピヒア・パストリス（ＡＴＣＣ登録番号２０１１７８）が特に好ましい。
【０１１９】
好ましい真菌は、アスペルギルス（コウジカビ）、トリコデルマ、アシュビア、ノイロスポラ、フザリウム、ハクキョウサン病菌類（Beauveria）、若しくはIndian Chem Engr. Section B. 第37巻、第１、２号（1995）第15ページ、表６に記載されているその他の真菌である。糸状ヘミアスコマイセート・アシュビア・ゴシピ（Hemiascomycete Ashbya gossypii）が特に好ましい。
【０１２０】
本発明の好ましい宿主又は出発生物は、さらに、動物、並びに、それに由来する細胞又は組織である。動物には、好ましくは、脊椎動物及び無脊椎動物が含まれる。特に好ましい脊椎動物は、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、マウス、ラット、ウシ又はウマなどの哺乳動物である。好ましい動物細胞として、ＣＨＯ、ＣＯＳ及びＨＥＫ２９３細胞が挙げられる。好ましい無脊椎動物としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９若しくはＳｆ２１細胞のような昆虫細胞が挙げられる。
【０１２１】
トランスジェニック生物として好ましい宿主生物又は出発生物は、特に植物である。植物界の高等及び下等植物のあらゆる属及び種が、本発明の範囲に含まれる。さらには、成熟植物、種子、シュート及び幼植物（seedlings）、並びに、それらに由来する部分、生殖材料（例えば、種子や果実）及び培養物、例えば、細胞培養物が含まれる。成熟植物は、幼植物を超えたあらゆる発育段階にある植物を意味するものと理解すべきである。幼植物は、初期発育段階にある未成熟の幼植物体を意味するものと理解すべきである。
【０１２２】
本発明の組換え系は、以下に挙げる植物科に用いるのが好ましい：ヒユ科、アブラナ科、カロフィラ（Carophyllaceae）、アカザ科、キク科、ウリ科、シソ科、マメ科−パピリオノイド（Papilionoideae）、ユリ科、アマ科、アオイ科、バラ科、ユキノシタ科、ゴマノハグサ科、ナス科、ツルナ科。
【０１２３】
トランスジェニック植物の作製に好ましい宿主生物は、一年草、多年草、単子葉及び双子葉植物である。本発明の組換え系又は方法の使用は、さらに、観賞植物、有用又は観賞樹木、花、切花、低木又は芝生のすべてにおいて有利である。例として挙げられる植物には、限定するものではないが、被子植物；例えば、スハマソウ属（Hepaticae）（スハマソウ属の各種）及び蘚綱（コケ類）のような蘚苔類；シダ、スギナ及びヒカゲノカズラ類などのシダ植物類；針葉樹、ソテツ、イチョウ及びギネタ（Gnetaeae）のような裸子植物；緑藻綱、褐藻綱、紅藻綱、粘藻綱、黄緑色藻綱、珪藻綱（珪藻類）及びミドリムシ綱などの藻類がある。
【０１２４】
本発明を目的として用いられる植物としては、例えば、下記のものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない：バラなどのバラ科、シャクナゲ及びアザレアなどのツツジ科、ショウジョウソウ及びクロトンなどのトウダイグサ科、セキチクなどのナデシコ科、ペチュニアなどのナス科、アフリカスミレなどのゲスネリア属、ホウセンカなどのツリフネソウ科、ランなどのラン科、グラジオラス、アヤメ、フリージア及びクロッカス等のアヤメ科、マリーゴールドのようなキク科、ゼラニウムのようなフウロソウ科、ドラセナのようなユリ科、イチジクのようなクワ科、のようなサトイモ科、ならびにその他の種。
【０１２５】
顕花植物の例として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：エンドウ、アルファルファ及びダイズなどのマメ科；コメ、トウモロコシ、コムギなどのイネ科；タバコ及びその他多種のナス科；セリ科、特に、ニンジン属（中でも特にニンジン種（ニンジン））及びオランダミツバ属（中でも特にセロリ種（セロリ））並びにその他多種；ナス科、特に、トマト属、中でも特に、トマト種（トマト）、及びナス属、中でも特にジャガイモ種（ジャガイモ）及びナス（ナス）並びにその他多種；トウガラシ属、中でも特に、トウガラシ種（コショウ）及びその他多種；マメ科、特にダイズ属、中でも特に、ダイズ種（ダイズ）及びその他多種；アブラナ科、特にアブラナ属、セイヨウアブラナ種（ナタネ）、アブラナ（ビート）、B. oleracea cv Tastie（キャベツ）、B. oleracea cv Snowball Y（カリフラワー）及びB. oleracea cv Emperor（ブロッコリー）；並びに、シロイヌナズナ属、中でも特にシロイヌナズナ及びその他多種；キク科、特にアキノノゲシ属、中でも特に、チシャ（レタス）及びその他多種。
【０１２６】
本発明のトランスジェニック植物は、特に単子葉作物植物、例えばコムギ、オオムギ、モロコシ及びキビ、ライムギ、ライコムギ、トウモロコシ、コメ又はオートムギ、及びサトウキビなどの穀類作物の中から選択される。さらにまた、本発明のトランスジェニック植物は、特に、例えば、以下に挙げるものを含む双子葉作物植物から選択される：
ナタネ、コショウソウ、シロイヌナズナ、キャベツ又はキャノーラなどのアブラナ科、
ダイズ、アルファルファ、エンドウ、インゲンマメ又はラッカセイなどのマメ科、
ジャガイモ、タバコ、トマト、ナス又はコショウなどのナス科、
ヒマワリ、レタス又はキンセンカ属などのキク科、
メロン、パンプキン／カボチャ又はズッキーニなどのウリ科、
並びに、アマニ、ワタ、アサ、アカトウガラシ、ニンジン、ニンジン、サトウキビ及び各種樹木、堅果及びワイン種。
【０１２７】
特に、シロイヌナズナ、タバコ及びナタネ、並びに、前記穀物種のように食品又は飼料として用いられるすべての属及び種、あるいは、油料作物（例えば、ナタネ）、堅果種、ダイズ、ヒマワリ、パンプキン／カボチャ及びラッカセイなど、油の生産に適したすべての属及び種が好ましい。
【０１２８】
本発明の目的で用いられる植物には、さらに、例えば、藻類又は藍細菌門並びにコケ類など、光合成の能力を有するその他の生物も含まれる。
【０１２９】
好ましい藻類は、例えば、ヘマトコッカス（Hematococcus）、フェダクチラム・トリコルナタム（Phaedactylum tricornatum）、オオヒゲマワリ（Volvox）又はドゥナリィラ（Dunaliella）の藻類などの緑藻類である。
【０１３０】
形質転換した生物又は形質転換した細胞を作製するには、対象の宿主細胞に対象のＤＮＡを導入する必要がある。この手順（形質転換と呼ぶ）を達成するのに、多くの方法が利用可能である（Keownら、1990、Methods in Enzymology 185: 527-537）。例えば、マイクロインジェクション又は、ＤＮＡをコーティングした微粒子の衝撃により、ＤＮＡを直接導入することができる。また、例えば、ポリエチレングリコールを用いて、細胞を化学的に透過性にすることによって、ＤＮＡが、拡散により細胞内に入れるようにすることもできる。また、ミニ細胞、細胞、リソソーム又はリポソームなどの他のＤＮＡ含有ユニットとのプロトプラスト融合により、ＤＮＡを導入することも可能である。ＤＮＡを導入するのに適した別の方法は、エレクトロポレーションであり、その場合、電気パルスにより可逆的に細胞を透過性にする。好ましい一般的方法として、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介によるトランスフェクション、カチオン脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入及び感染などが挙げられる。このような方法は当業者には公知であり、例えば、Davisら、Basic Methods In Molecular Biology（1986）に記載されている。
【０１３１】
植物においては、当業者には公知の植物の形質転換方法、及び植物組織又は植物細胞から植物を再生するための方法を用いて、一過性又は安定的形質転換を実施する。好適な方法は、特に、ポリエチレン−グリコール誘導ＤＮＡ取込みによるプロトプラスト形質転換、遺伝子ガン法（「パーティクルボンバードメント」法）のようなパーティクルガン法、エレクトロポレーション、ＤＮＡ含有溶液における乾燥胚のインキュベーション、音波破砕及びマイクロインジェクション、並びに、マイクロ又はマクロインジェクションによる組織又は胚への細胞又は組織の形質転換、組織エレクトロポレーション、ＤＮＡ含有溶液における乾燥胚のインキュベーション、あるいは、種子の真空浸潤である。植物細胞へのＤＮＡのインジェクション又はエレクトロポレーションの場合には、用いるプラスミドが、特定の要件を満たす必要は一切ない。ｐＵＣ系のような単純なプラスミドを用いてもよい。形質転換した細胞から植物全体を再生しようとする場合には、プラスミドに別の選択マーカー遺伝子が存在すれば有用である。
【０１３２】
すべての植物組織が、標的材料の役割を果たしうる。同様に、発現は、カルス、胚形成組織又は体細胞胚で起こりうる。
【０１３３】
これらの「直接的」形質転換技法以外にも、アグロバクテリウム・ツメファシエンス又はアグロバクテリウム・リゾゲネスを用いた細菌感染により形質転換を実施することもできる。これらの株は、プラスミド（Ｔｉ又はＲｉプラスミド）を含んでいる。Ｔ−ＤＮＡ（導入したＤＮＡ）と称するこのプラスミドの部分を、アグロバクテリウム感染後の植物に導入し、植物細胞のゲノムに組み込む。
【０１３４】
ＤＳＢＩ酵素のための組換え構築物又は発現カセットは、特定のプラスミド、すなわち、シャトル、又は中間体、ベクター若しくはバイナリーベクターのいずれかに組み込むのが好ましい。例えば、Ｔｉ又はＲｉプラスミドを形質転換に用いようとする場合には、Ｔｉ又はＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右の境界（しかし、ほとんどの場合、右及び左の境界）を、フランキング領域として、導入しようとする発現カセットと結合させる。好ましくは、バイナリーベクターを用いる。バイナリーベクターは、大腸菌及びアグロバクテリウムの両方で複製する能力がある。一般に、バイナリーベクターは、選択マーカー遺伝子と、右又は左Ｔ−ＤＮＡフランキング配列と隣接するリンカー若しくはポリリンカーとを含む。これらは、アグロバクテリウムに直接形質転換することができる（Holstersら、Mol. Gen. Genet. 163（1978）、181-187）。選択マーカー遺伝子は、形質転換されたアグロバクテリウムの選択を可能にするもので、例えば、カナマイシンに対する耐性を賦与するｎｐｔＩＩ遺伝子である。アグロバクテリウム（この場合、宿主生物としての役割を果たす）は、すでに、ｖｉｒ領域を有するプラスミドを含んでいなければならない。このプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に導入するのに必要である。従って、このようにして形質転換されたアグロバクテリウムを用いて、植物細胞を形質転換することができる。
【０１３５】
組織培養外植片を用いた植物の形質転換を目的とするアグロバクテリウム・ツメファシエンスの使用は、Horschら（Horsch RB（1986）Proc Natl Acad Sci USA 83 (8): 2571-2575）、Fraleyら（Fraleyら、1983、Proc Natl Acad Sci USA 80, 4803-4807）及びBevansら（Bevansら、1983、Nature 304, 184-187）により記載されている。アグロバクテリウム・ツメファシエンスの様々な株が、遺伝物質（例えば、本発明の組換え構築物）を導入することができ、このような株として、例えば、ＥＨＡ１０１株［ｐＥＨＡ１０１］、ＥＨＡ１０５株［ｐＥＨＡ１０５］、ＬＢＡ４４０４株［ｐＡＬ４４０４］、Ｃ５８Ｃ１株［ｐＭＰ９０］及びＣ５８Ｃ１株［ｐＧＶ２２６０］が挙げられる。ＥＨＡ１０１株［ｐＥＨＡ１０１］は、Hoodら（Hood EEら（1996）J Bacteriol 168 (3): 1291-1301）により、ＥＨＡ１０５株［ｐＥＨＡ１０５］は、Hoodら（Hoodら、1993, Transgenic Research 2, 208-218）により、ＬＢＡ４４０４株［ｐＡＬ４４０４］は、Hoekemaら（Hoekemaら、1983, Nature 303, 179-181）により、Ｃ５８Ｃ１株［ｐＭＰ９０］は、Koncz及びSchell（Koncz及びSchell 1986, Mol. Gen. Genet. 204, 383-396）により、また、Ｃ５８Ｃ１株［ｐＧＶ２２６０］は、Deblaereら（Deblaereら、1985, Nucl. Acids Rec. 13, 4777-4788）により、それぞれ記載されている。
【０１３６】
形質転換に用いられるアグロバクテリウム株は、安全化Ｔｉプラスミドのほかに、導入しようとするＴ−ＤＮＡを有するバイナリープラスミドを含み、該バイナリープラスミドは、一般に、形質転換細胞の選択のための遺伝子と、導入しようとする遺伝子を含んでいる。両遺伝子とも、転写及び翻訳の開始及び終結シグナルを備えていなければならない。バイナリープラスミドは、例えば、エレクトロポレーション又はその他の形質転換方法によりアグロバクテリウム株に導入することができる（Mozo & Hooykaas 1991, Plant Mol. Biol. 16, 917-918）。アグロバクテリウム株と植物外植片の共培養は、通常、２〜３日間実施する。
【０１３７】
様々なベクターを用いることができる。原則として、これらのベクターの中から、アグロバクテリウム媒介形質転換又はアグロバクテリウム感染に用いるベクターを選別ことができる、すなわち、Ｔ−ＤＮＡ内でのＤＳＢＩ酵素の発現のための組換え構築物、又は発現カセットを含み、植物ゲノムへのＴ−ＤＮＡの安定的組換えを実際に可能にするベクターを識別する。さらに、境界配列のないベクターを用いてもよく、これらは、例えば、パーティクルボンバードメントにより植物細胞に形質転換することができ、この場合、該ベクターは、一過性及び安定発現の両方を達成することが可能である。
【０１３８】
植物細胞の形質転換にＴ−ＤＮＡを用いることは、これまで研究され、詳しく記載されている（ＥＰ  １２０５１６；Hoekema, The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, 第Ｖ章；Fraleyら、Crit. Rev. Plant. Sci., 4: 1-46及びAnら、EMBO J. 4（1985）、277-287）。様々なバイナリーベクターが知られており、そのいくつかは、例えば、ｐＢＩＮ１９（Clontech Laboratories, Inc. USA）のように市販されている。
【０１３９】
ＤＮＡを植物細胞に導入するためには、植物外植片をアグロバクテリウム・ツメファシエンス又はアグロバクテリウム・リゾゲネスと一緒に共培養する。感染させた植物材料（例えば、葉、根又は茎切片、また、植物細胞のプロトプラスト若しくは懸濁液）から出発して、形質転換した細胞を選択するために、例えば、抗生物質又は生物致死剤を含む好適な媒地を用いて、植物全体を再生させることができる。次に、取得した植物を、導入されたＤＮＡ（この場合、本発明のＤＳＭＩ酵素の組換え構築物又は発現カセット）の存在についてスクリーニングすることができる。ＤＮＡを宿主ゲノムに組み込んだ後、対象の遺伝子型は、概して安定しており、また、後の世代に、対象の挿入がみいだされる。原則として、組み込まれた発現カセットは、生物致死剤（例えば、除草剤）又は、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシン若しくはホスフィノトリシンなどの抗生物質に対する耐性を、形質転換生物に賦与する選択マーカーを含んでいる。選択マーカーにより、形質転換細胞の選択が可能になる（McCormickら、Plant Cell Reports 5（1986）、81-84）。取得した植物を培養し、通常の様式で交配することができる。ゲノムの組込みが安定し、遺伝性になるのを確実にするため、２以上の世代を生育させる必要がある。
【０１４０】
前記の方法は、例えば、B. Jenesら、Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, 第１巻、Engineering and Utilization、S. D. Kung及びR. Wu編, Academic Press（1933）128-143並びに、Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42（1991）205-225に記載されている。発現させようとする構築物は、アグロバクテリウム・ツメファシエンスの形質転換に適したベクター、例えば、ｐＢｉｎ１９（Bevanら、Nucl. Acids Res. 12（1984）8711）にクローニングするのが好ましい。
【０１４１】
アグロバクテリウム媒介形質転換は、双子葉植物細胞に最もよく適しているのに対し、直接形質転換技法はすべての細胞型に適している。
【０１４２】
形質転換細胞、すなわち、宿主細胞のＤＮＡに組み込まれたＤＮＡを含む上記細胞は、選択マーカーが導入されたＤＮＡの一部となっていれば、非形質転換細胞から選択することができる。マーカーは、例えば、抗生物質又は生物致死剤に対する耐性を賦与することができれば、どんな遺伝子でもよい。このようなマーカー遺伝子を発現する形質転換細胞は、形質転換されていない野生型を死滅させる好適な抗生物質又は生物致死剤の濃縮物の存在下で生存することができる。様々なポジティブ及びネガティブセレクションマーカーを上に記載する。例として、除草剤ホスフィノトリシン耐性を賦与するｂａｒ遺伝子（Rathore KSら、Plant Mol Biol. 1993 Mar；21 (5): 871-884）、カナマイシン耐性を賦与するｎｐｔＩＩ遺伝子、ヒグロマイシン耐性を賦与するｈｐｔ遺伝子、又は除草剤グリホセート耐性を賦与するＥＰＳＰ遺伝子が挙げられる。
【０１４３】
形質転換植物細胞を作製した後、当業者には公知の方法を用いて、植物全体を取得することができる。例えば、カルス培養物を出発材料として用いる。シュート及び根の形成は、この、まだ未分化の細胞バイオマスにおいて、公知の手法で誘導することができる。得られたシュートは移植及び栽培することができる。
【０１４４】
また、本発明により、前記トランスジェニック生物に由来する細胞、細胞培養物、部分（例えば、トランスジェニック植物の場合は、根や葉など）、並びに、トランスジェニック生殖材料（種子又は果実など）も提供される。
【０１４５】
ヒト又は動物が消費することができる、本発明の遺伝子改変植物は、食品又は飼料として、例えば、直接又はそれ自体公知の加工処理後、使用することができる。ここで、例えば、トランスジェニック植物を作製する際に往々にして導入されている抗生物質及び／又は除草剤に対する耐性の欠失は、消費者の許容性だけではなく、製品の安全のためにも意味がある。
【０１４６】
本発明のさらに別の態様は、食品若しくは飼料、医薬品又はファインケミカルの製造のための、本発明の前記トランスジェニック生物、並びに、それに由来する細胞、細胞培養物、部分（例えば、トランスジェニック植物の場合には、根や葉など）、並びに、トランスジェニック生殖材料（種子又は果実など）の使用に関する。この場合もまた、抗生物質及び／又は除草剤に対する耐性の欠失は、消費者の許容性だけではなく、製品の安全のためにも、有利である。
【０１４７】
ファインケミカルとは、広く使用可能な酵素、ビタミン、アミノ酸、糖、脂肪酸、天然及び合成香味料、香料、並びに着色剤を意味するものとして理解される。特に、トコフェロール及びトコトリエノールの製造、並びに、カロテノイドの製造が好ましい。形質転換した宿主生物の培養、及び宿主生物又は培地からの単離は、当業者には公知の方法により実施する。例えば、抗体又はワクチンのような医薬品の製造については、Hood EE, Jilka JM.（1999）Curr Opin Biotechnol. 10 (4): 382-386；Ma JK及びVine ND（1999）Curr Top Microbiol Immunol. 236: 275-92に記載されている。
【０１４８】
本発明の組換え系又は方法は、さらに、従来の技術に記載されている欠失方法では達成することができない各種の有利な用途を提供する。様々な用途例を以下に例示のため挙げるが、これらに限定されるわけではない。
【０１４９】
１．生物の染色体ＤＮＡからの核酸配列の単純な欠失：
任意の相同性配列Ａ及びＢを用いて、それらの間に位置する核酸配列を除去することができる。相同性配列ＡとＢの組換えの結果生成された配列は、ゲノム内に残っている。この方法は、例えば、トランスジェニック生物（例：トランスジェニック植物）を作製した後に、染色体ＤＮＡから選択マーカーを除去するのに適している。この方法を、図２及び図３に概略的に示すが、図２には、ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための１つの認識配列を有する変異体を示し、図３には、ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための２つの認識配列を有する変異体を示す。
【０１５０】
２．生物の染色体ＤＮＡからの、組換えにより導入された異種核酸配列の完全な欠失：
生物の特定の配列に相同的な相同性配列Ａ及びＢを用いて、相同組換えにより、発現構築物を生物に導入することができる。本発明の組換え系又は方法を用いて、相同性配列の間に位置する核酸配列を除去する。相同性配列ＡとＢの間に誘導された相同組換えにより、元の配列が復元される。構築物の全部が染色体ＤＮＡから除去される。この方法は、例えば、トランスジェニック植物を作製した後に、染色体ＤＮＡから選択マーカーを除去するのに適している。さらに、本発明の系又は方法は、特定のタンパク質を一過性に発現させ、有利な作用を発揮させた後、誘導されたＤＳＢＩ酵素発現又は活性を用いて、ゲノムから対象の遺伝子を不可逆的に除去することにより、上記タンパク質をオフにスイッチするのに適している。この方法は図４に概略を示すが、ここでは、ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための２つの認識配列を有する変異体が示されている。この系は、１つの認識配列を用いて実現することができるが、相同性配列ＡとＢの間の挿入配列がもっと大きい場合には、２つの切断部位が有利である。というのは、これによって、欠失効力と相同組換え効力をさらに増加できるからである（さらに別の認識配列を、除去しようとする配列領域内に配置してもよい）。
【０１５１】
３．核酸配列の部位特異的除去により誘導される遺伝子活性化：
相同性配列Ａ及びＢ（その相同組換えにより、例えば、タンパク質の完全なオープンリーディングフレームが復元される）、若しくは機能的プロモーターを用いて、標的タンパク質の誘導性発現を、ＤＳＢＩ酵素の存在に応じて、実現することができる。本発明の組換え系又は方法を用いて、相同性配列の間に位置する核酸配列を除去しうる。この方法は、図５及び６に概略を示すが、図６は、図５に示した一般的方法の具体的実施形態を示す。この一般的方法では、相同組換えにより、より早い時点で組換え構築物を内在性遺伝子に挿入し、これによって、この遺伝子をＤＳＢＩ酵素の存在に応じて、誘導により活性化させることができる。図７ａは、本発明の系又は方法を用いて、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を再構成し、これにより、着色反応を起こす具体的な用途例に関する、遺伝子活性化の系を示す（図７ａの説明及び実施例を参照されたい）。
【０１５２】
４．生物の染色体ＤＮＡからの核酸配列の除去に関して容易に選択可能な系：
好ましい実施形態では、組換え構築物は、ポジティブ及びネガティブセレクションマーカー（並びに、必要に応じて、除去しようとする別の核酸配列）を含むが、ここで、二本鎖切断が誘導されるとき、両マーカーが除去される。このような系を図８及び９（Ａ）に示す。さらに、ＤＳＢＩ酵素の発現カセットは、相同性配列の間に存在してもよく（図１０（Ｂ））、ここで、発現は、誘導性プロモーター（Ｐｉ）の制御下で実施するのが好ましい（例えば、Aoyama T及びChua NH（1997）Plant J 11: 605-612；Caddick MXら（1998）Nat. Biotechnol 16: 177-180）。すでに記載したように、さらに別の核酸配列が存在してもよい（図９（Ｃ））。
【０１５３】
ＤＳＢＩ酵素の発現により、いずれの場合も、２つの認識配列間に位置するＤＮＡ配列の除去と、相同性配列の組換えが起こる。細胞はネガティブセレクションマーカーを同時に喪失することから、首尾よく除去が行なわれた細胞は、選択により識別することができる（Gleave APら（1999）Plant Mol Biol. 40: 223-235）。
【０１５４】
植物細胞の場合には、例えば、得られた細胞を用いて、対応する植物全体を再生及び増殖することができ、このような植物は、もはやマーカー遺伝子を一切含んでいない。
【０１５５】
５．宿主ゲノムの遺伝子操作：
本発明の組換え系又は方法は、宿主ゲノムのｉｎ  ｓｉｔｕ改変に用いることができる。従って、例えば、相同性配列は、すでにゲノム内に内在的に存在してもよい。第２の相同性配列（これは、ＤＳＢＩ酵素認識配列と結合している）の挿入後、相同性配列ＡとＢとの間に位置する調節又はコード配列がゲノムから排除される。
【０１５６】
同時に、組換え構築物は、欠失が起こった後に、生物から排除される調節又はコード配列を含むことを想定しうる。従って、例えば、部位特異的に、一過性に内在性遺伝子を調節することができる。
【０１５７】
さらに好ましい実施形態では、組換え系の効力は、相同組換えを促進する系と組み合わせることにより向上する。このような系については記載されており、例えば、ＲｅｃＡのようなタンパク質の発現、又はＰＡＲＰ阻害物質による処理を含む。タバコ植物における染色体内相同組換えは、ＰＡＲＰ阻害物質を用いることにより増加できることがわかっている（Puchta Hら（1995）Plant J. 7: 203-210）。これらの阻害物質を用いることにより、配列特異的ＤＮＡ二本鎖切断の誘導後の組換え構築物における相同組換え率と、従って、トランスジーン配列除去の効力をさらに高めることができる。この目的で、様々なＰＡＲＰ阻害物質を用いることができる。好ましくは、下記のような阻害物質が挙げられる：３−アミノベンズアミド、８−ヒドロキシ−２−メチルキナゾリン−４−オン（ＮＵ１０２５）、１，１１ｂ−ジヒドロ−［２Ｈ］ベンゾピラノ［４，３，２−ｄｅ］イソキノリン−３−オン（ＧＰＩ６１５０）、５−アミノイソキノリノン、３，４−ジヒドロ−５−［４−（１−ピペリジニル）ブトキシ］−１（２Ｈ）−イソキノリノン、又はＷＯ００／２６１９２、ＷＯ００／２９３８４、ＷＯ００／３２５７９、ＷＯ００／６４８７８、ＷＯ００／６８２０６、ＷＯ００／６７７３４、ＷＯ０１／２３３８６及びＷＯ０１／２３３９０に記載された化合物。
【０１５８】
さらに、大腸菌ＲｅｃＡ遺伝子を発現させることにより、植物における様々な相同組換え反応の頻度を増加することが可能であった（Reiss Bら（1996）Proc Natl Acad Sci USA 93 (7): 3094-3098）。また、タンパク質の存在により、相同的及び非正統的ＤＳＢ修復間の比が、相同的修復に有利にシフトする（Reiss Bら（2000）Proc Natl Acad Sci USA 97 (7): 3358-3363）。植物における相同組換えを高めるためには、ＷＯ９７／０８３３１に記載されている方法を参照することができる。組換え系の効力のさらなる向上は、相同組換え効力を高めるＲｅｃＡ遺伝子又はその他の遺伝子の同時発現により達成することができる（Shalev Gら（1999）Proc Natl Acad Sci USA 96 (13): 7398-402）。相同組換えを促進する前記の系はまた、相同組換えにより、組換え構築物を真核生物のゲノムに部位特異的に導入しようとする場合に、有利に用いることができる。
【０１５９】
配列
１．配列番号１
Ｉ−ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼの核酸配列
２．配列番号２
Ｉ−ＳｃｅＩホーミングエンドヌクレアーゼのタンパク質配列
３．配列番号３
Ｉ−ＣｈｕＩホーミングエンドヌクレアーゼとＮ−末端核局在化配列の融合タンパク質の核酸配列
４．配列番号４
Ｉ−ＣｈｕＩホーミングエンドヌクレアーゼとＮ末端核局在化配列の融合タンパク質のタンパク質配列
５．配列番号５
Ｉ−ＣｒｅＩホーミングエンドヌクレアーゼとＮ−末端核局在化配列の融合タンパク質の核酸配列
６．配列番号６
Ｉ−ＣｒｅＩホーミングエンドヌクレアーゼとＮ−末端核局在化配列の融合タンパク質のタンパク質配列
７．配列番号７
Ｉ−ＣｐａＩホーミングエンドヌクレアーゼとＮ−末端核局在化配列の融合タンパク質の核酸配列
８．配列番号８
Ｉ−ＣｐａＩホーミングエンドヌクレアーゼとＮ−末端核局在化配列の融合タンパク質のタンパク質配列
９．配列番号９
Ｉ−ＣｐａＩＩホーミングエンドヌクレアーゼとＮ−末端核局在化配列の融合タンパク質の核酸配列
１０．配列番号１０
Ｉ−ＣｐａＩＩホーミングエンドヌクレアーゼとＮ−末端核局在化配列の融合タンパク質のタンパク質配列
2004533267.tif 000005
【０１６０】
2004533267.tif 000006
【０１６１】
図面
一般に、下記の略語を本発明の図面に用いるものとする：
Ｈ１：相同性配列Ａ
Ｈ２：相同性配列Ｂ
Ｈ１／２：Ｈ１及びＨ２の相同組換えの結果得られた配列
Ｓ１：ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための第１の認識配列
Ｓ２：ＤＮＡ二本鎖切断の部位特異的誘導のための第２の認識配列
Ｅ：ＤＳＢＩ酵素
Ｐ：プロモーター又はその他の遺伝子制御エレメント
Ｎ：さらに別の核酸配列
ＮＳ：ネガティブセレクションマーカー
ＰＳ：ポジティブセレクションマーカー
Ｔ１：例えば遺伝子又はオープンリーディングフレームの前部、
Ｔ２：例えば遺伝子又はオープンリーディングフレームの後部、
ＳＴＯＰ：例えば、停止コドン又はリーディングフレームシフトによる遺伝子又はオープンリーディングフレームの分断
【０１６２】
図１：本発明の原理を示す線図
ゲノム内の配列は、これら配列が、相同性配列Ｈ１及びＨ２に挟まれており、かつ、ＤＳＢＩ酵素の切断部位（Ｓ１）が相同性配列の間に位置しているとき、効率的に除去することができる。この組換えカセット（Ｈ１−Ｓ１−Ｈ２）に対するＤＳＢＩ酵素（Ｅ）の作用により、二本鎖切断が、切断部位Ｓ１に形成され、Ｈ１とＨ２の間に位置する配列が除去される。
【０１６３】
図２：好ましい実施形態
配列（この場合には、例えば、プロモーター（Ｐ）と、発現させようとする別の核酸配列（Ｎ）（例えば、選択マーカー）からなる発現カセット）は、これら配列が、相同性配列Ｈ１及びＨ２に挟まれており、かつ、ＤＳＢＩ酵素の切断部位（Ｓ１）が相同性配列の間に位置しているときに、染色体ＤＮＡから効率的に除去することができる。この組換えカセット（Ｈ１−Ｓ１−Ｐ−Ｎ−Ｈ２）に対するＤＳＢＩ酵素（Ｅ）の作用により、二本鎖切断が、切断部位Ｓ１に形成され、Ｈ１とＨ２の間に位置する配列が除去される。切断部位Ｓ１はまた、発現カセットの前又はその内に位置してもよい。
【０１６４】
図３：好ましい実施形態
配列（この場合には、例えば、プロモーター（Ｐ）と、発現させようとするさらに別の核酸配列（Ｎ）（例えば、選択マーカー）からなる発現カセット）は、これら配列が、相同性配列Ｈ１及びＨ２に挟まれており、かつ、それぞれＤＳＢＩ酵素の１つの切断部位（Ｓ１及びＳ２）が、除去しようとする核酸配列の前及び後に位置しているとき、染色体ＤＮＡから特に効率的に除去することができる。この組換えカセット（Ｈ１−Ｓ１−Ｐ−Ｎ−Ｓ２−Ｈ２）に対するＤＳＢＩ酵素（Ｅ）の作用により、二本鎖切断が、切断部位Ｓ１及びＳ２に形成され、Ｈ１とＨ２の間に位置する配列が除去される。
【０１６５】
図４：好ましい実施形態
配列（この場合には、例えば、プロモーター（Ｐ）と、発現させようとするさらに別の核酸配列（Ｎ）（例えば、選択マーカー）からなる発現カセット）は、これらを含む組換え構築物が、例えば、相同組換えにより、宿主ゲノムに挿入されたとき、染色体ＤＮＡからほぼ完全に除去することができる。このようにして、配列セグメントＴ１、Ｈ１／２及び２からなる遺伝子を分断する。相同組換えが起こるように、組換え構築物は、分断遺伝子の２つの部分（Ｔ１−Ｈ１又はＨ２−Ｔ２）により挟まれ、その中央部分（Ｈ１又はＨ２）は重複している。切断部位（Ｓ１及びＳ２）に対するＤＳＢＩ酵素（Ｅ）の作用が二本鎖切断を誘導すると共に、相同性配列Ｈ１とＨ２の間での相同組換えを誘導し、これによって、まずＨ１とＨ２の間に位置する配列が除去され、次に元の遺伝子が復元される。
【０１６６】
図５：好ましい実施形態
核酸配列（この場合には、プロモーターＰの制御下で配列Ｔ１−Ｈ１／２−Ｔ２を有する遺伝子）は、組換え系を適用するだけで、遺伝子全体を再構成することにより、誘導的に発現させることができる。例えば、組換え構築物内の停止コドンの挿入又はリーディングフレームの別の分断により、配列セグメントＴ１、Ｈ１／２及びＴ２からなる遺伝子を不活性化する。相同組換えが起こるように、組換え構築物は、分断遺伝子の２つの部分（Ｔ１−Ｈ１又はＨ２−Ｔ２）によって挟まれ、その中央部分（Ｈ１又はＨ２）は重複している。切断部位（Ｓ１及びＳ２）に対するＤＳＢＩ酵素（Ｅ）の作用が二本鎖切断を誘導すると共に、相同性配列Ｈ１とＨ２の間に相同組換えを誘導し、これによって、まずＨ１とＨ２の間に位置する配列が除去され、次に元の遺伝子が復元される。
【０１６７】
図６：好ましい実施形態
この図は、図５で説明したものと同じ方法を示すが、この場合には、例えば、相同組換えによって、組換え構築物を導入することにより、内在性遺伝子を部位特異的に活性化しようとする。
【０１６８】
図７ａ：実施形態例
この図は、図６で説明した方法の具体的実施形態を示す。アグロバクテリウム媒介トランスフェクションにより組換え構築物を導入する。この構築物は、右及び左の境界配列（ＲＢ及びＬＢ）により挟まれ、３５Ｓプロモーター（Ｐ）及びノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーターの制御下でＧＵＳ遺伝子（βグルクロニダーゼ）の分断されたリーディングフレームを含む。ＧＵＳ遺伝子（Ｕ）の中央領域は重複し、相同性配列Ａ及びＢを構成する。これら配列の間に、ｃｏｄＡ遺伝子が、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター及びノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーターの制御下のネガティブセレクションマーカーとして位置し、これは、ＤＳＢＩ酵素の２つの認識配列（Ｓ１及びＳ２）によって挟まれている。これ以外に、組換え構築物はさらに、ポジティブセレクションマーカーとして、３５Ｓプロモーター（Ｐ）及び３５Ｓターミネーターの制御下のＢＡＲ遺伝子を含む。
【０１６９】
図７ａは、二本鎖切断の出現と、相同性Ｕ配列間の相同組換えを示す。これらは、ＤＳＢＩ酵素の作用によって起こるが、この作用により、まず相同性Ｕ配列の間に位置する配列が除去され、次に、ＧＵＳ遺伝子が復元される。従って、Ａｃｃ６５Ｉ断片の長さは、７．３ｋｂから３．７ｋｂに減少する。
【０１７０】
図７ｂ：この図は、図７ａで説明したのと同じ系を示す。図７ａは、ＤＳＢＩ酵素の作用によって起こる二本鎖切断の出現を示している。図７ａとは対照的に、この場合、相同組換えではなく、非相同末端結合による非正統的組換えが起こる。２つの切断部位により、Ｓ１とＳ２の間の領域は除去されるが、ＧＵＳ遺伝子は復元しない。従って、Ａｃｃ６５Ｉ断片の長さは、７．３ｋｂから４．４ｋｂに減少する。
【０１７１】
図７ｃ：この図は、図７ａ及び図７ｂで説明した方法の２つの末端産物の別の例を示す
Ａ：相同組換えの結果；Ａｃｃ６５Ｉ断片は、長さが３．７ｋｂであり；プライマーＯＰＮ１３及びＯＰＮ１４（矢印で示す）を用いて増幅した断片のサイズは、０．７ｋｂである
Ｂ：非正統的組換え（非相同末端結合）の結果；Ａｃｃ６５Ｉ断片は、長さが４．４ｋｂであり；プライマーＯＰＮ１３及びＯＰＮ１４（矢印で示す）を用いて増幅した断片のサイズは、１．４ｋｂである。
【０１７２】
図８：好ましい実施形態
組換えカセットは、ポジティブ及びネガティブセレクションマーカー（それぞれ、ＰＳ及びＮＳ）を含むのが有利であり、いずれの場合もプロモーターの制御下にある。ポジティブセレクションマーカーは、ゲノムへの構築物の導入を促進及び検出するのに有用である。ネガティブセレクションマーカーは、ゲノムからの構築物の除去を検出するのに有用である。両マーカーは、これらが、相同性配列Ｈ１及びＨ２に挟まれており、かつ、それぞれＤＳＢＩ酵素の１つの切断部位（それぞれ、Ｓ１及びＳ２）が、除去しようとする核酸配列の前及び／又は後に位置しているとき、染色体ＤＮＡから効率的に除去することができる。この組換えカセットに対するＤＳＢＩ酵素（Ｅ）の作用により、二本鎖切断が、切断部位Ｓ１及び／又はＳ２に出現し、次に、Ｈ１とＨ２の間に位置する配列が除去される。
【０１７３】
上記の１つのＤＳＢＩ酵素の作用が、部位特異的二本鎖切断を引き起こすと共に、相同性Ｕ配列間に相同組換えを誘導し、これによって、まず、相同性Ｕ配列の間に位置する配列が除去され、次に、ＧＵＳ遺伝子が復元される。
【０１７４】
図９：生物の染色体ＤＮＡからの核酸配列の除去に関して容易に選択が可能な系
構築物は、ポジティブセレクションマーカー（ＰＳ）及びネガティブセレクションマーカー（ＮＳ）を含み、いずれの場合も、プロモーター（Ｐ）の制御下にある
（Ｂ）さらに、ＤＳＢＩ酵素の発現カセットを含み、発現は、誘導性プロモーター（Ｐｉ）の制御下で起こるのが好ましい
（Ｃ）さらに別の核酸配列が存在してもよい。ＤＳＢＩ酵素の発現により、いずれの場合にも、２つの認識配列の間に位置するＤＮＡ配列の除去と、相同組換えが起こる。細胞は、同時にネガティブセレクションマーカーを失うため、首尾よく除去が行なわれた細胞を選択により識別することができる（Gleave APら（1999）Plant Mol Biol. 40: 223-235）。
【０１７５】
図１０：この図は、二本鎖切断による相同組換えが、様々な制限酵素で誘導できることを証明するのに用いた２つの構築物（ＳＩ構築物（Ａ）及びＳＤ構築物（Ｂ））を示す。これらの構築物をアグロバクテリウム媒介トランスフェクションにより導入する。上記構築物は、右及び左の境界配列（それぞれ、ＲＢ及びＬＢ）により挟まれており、３５Ｓプロモーター（Ｐ）とノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーターの制御下にあるＧＵＳ遺伝子（β−グルクロニダーゼ）の分断リーディングフレームを含む。ＧＵＳ遺伝子（Ｕ）の中央領域は重複しており、相同性配列Ａ及びＢを構成する。これらの配列の間に、ＳＩ構築物（Ａ）の場合には、ＤＳＢＩ酵素Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ及びＩ−ＣｒｅＩの認識配列が、また、ＳＤ構築物（Ｂ）の場合には、Ｉ−ＣｈｕＩ酵素の認識配列が存在する。組換え構築物はさらに、ポジティブセレクションマーカーとしてプロモーター（Ｐ）の制御下のＢＡＲ遺伝子を含む。
【０１７６】
図１１：二本鎖切断の誘導後に得られたタバコカルスの代表的な組織化学的分析
青色の着色（図では、黒っぽい色で示される）は、βグルクロニダーゼ遺伝子の発現、従って、相同組換えよる選択マーカーの除去を示す。青色（黒っぽい色）は、ウェルＡ２、Ａ５、Ａ６、Ｂ２、Ｃ１、Ｃ６及びＤ２におけるカルスの場合に認められる。
【０１７７】
図１２：相同組換えを検出するためのＰＣＲ分析。プライマーＯＰＮ１３及びＯＰＮ１４を用いた、タバコカルス由来のＤＮＡについてのＰＣＲ
相同組換えを示すＰＣＲ産物（サイズ：０．７ｋｂ）がレーン１、２及び３で認められる。対応するカルスは、組織化学的染色後、青色になり、対応するＰＣＲバンドを配列決定することによって、相同組換えにより、βグルクロニダーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が実際に復元したことを証明した。
【０１７８】
レーン４及び５：染色しても、カルスのＰＣＲ産物（１．４ｋｂ）は青色に変わらず、非相同末端結合により排除されなかった。
【０１７９】
図１３：対象とするトランスジーン配列の完全な除去を示すサザンブロット
ブロットＡ〜Ｄのレーンは、それぞれ下記のものを含む：
2004533267.tif 000007
Ａ：βグルクロニダーゼ特異的サンプルとハイブリダイズさせたＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ
Ｂ：ｃｏｄＡ特異的サンプルとハイブリダイズさせたＨｉｎｄＩＩＩ消化ＤＮＡ。
【０１８０】
Ｃ：βグルクロニダーゼ特異的サンプルとハイブリダイズさせたＡｃｃ６５Ｉ消化ＤＮＡ。
【０１８１】
Ｄ：ｃｏｄＡ特異的サンプルとハイブリダイズさせたＡｃｃ６５Ｉ消化ＤＮＡ。
【０１８２】
この分析から、制限酵素の発現によるＤＮＡ二本鎖切断の誘導後に、相同組換え（レーン３、６及び９）だけではなく、非正統的組換え（レーン２，５及び８）も起こる可能性があり、制限切断部位の間に位置するトランスジーン配列（ｃｏｄＡ）が植物ゲノムから除去されたことがわかる。
【実施例】
【０１８３】
一般的方法：
オリゴヌクレオチドの化学的合成は、例えば、ホスホアミダイト法（Voet、Voet, 第２版、Wiley Press New York, 896-867ページ）を用いて、公知の手法により実施することができる。本発明のために実施するクローニングステップ、例えば、制限切断、アガロースゲル電気泳動、ＤＮＡ断片の精製、ニトロセルロース及びナイロン膜への核酸のトランスファー、ＤＮＡ断片の結合、大腸菌細胞の形質転換、細菌培養、ファージの増殖、並びに、組換えＤＮＡの配列分析は、Sambrookら（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press；ISBN 0-87969-309-6に記載されているように実施する。組換えＤＮＡ分子は、Sangerの方法（Sangerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74（1977）、5463-5467）に従い、ＡＬＦ高速レーザー蛍光ＤＮＡシークエンサー（Pharmacia, Upsala、スエーデン）を用いて、配列決定した。
【０１８４】
実施例１：ホーミングエンドヌクレアーゼのクローニング
ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−ＣｒｅＩ（Wang Jら（1997）Nucleic Acids Res 25: 3767-3776）、Ｉ−ＣｈｕＩ（Cote Vら（1993）Gene 129: 69-76）、Ｉ−ＣｐａＩ（Turmel Mら（1995a）Nuculeic Acids Res 23: 2519-1515）及びＩ−ＣｐａＩI（Turmel Mら（1995b）Mol. Biol. Evol. 12, 533-545）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、対応するクラミドモナス株からクローニングした。
【０１８５】
遺伝子の翻訳を最適化するために、エンドヌクレアーゼのＯＲＦを植物ウイルスのリーダー配列と結合した（ＣａＭＶ遺伝子（Ｉ−ＳｃｅＩの場合には、有用であることが証明されているため）；Puchta H（1993）Nucl Acids Res 21: 5034-5040）。また、目的の作用部位にタンパク質を効率的に輸送するために、核局在化配列（ＮＬＳ２；配列番号３０）をＯＲＦの前に配置した。オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより、２つのエレメント（リーダー配列と核局在化配列）を導入した。
【０１８６】
クラミドモナスからエンドヌクレアーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を単離するため、藻培養物クラミドモナス・レインハルドティ／スミス（Chlamydomonas reinhardtii／Smith）（株番号：１１−３２ｂ）、クラミドモナス・アプラナタ／ラクシュ（Chlamydomonas applanata／Lucksch）（株番号：１１−９）、クラミドモナス・セグリス／キング（Chlamydomonas segris／King）（株番号：９．８３）をゲッティンゲンの藻培養物コレクション（ゲッティンゲン大学、実験藻学及び藻類培養物コレクション、Albrecht-von-Haller Institute for Plant Sciences、Untere Karspule 2, D-37073ゲッティンゲン）から取得した。これらの培養物をＭＳ培地中の振盪培養により増殖させ、Ｄｎｅａｓｙ植物マキシキット（DNeasy Plant Maxi Kit）（Qiagen、ヒルデン）を用いて、ＤＮＡを取得した。
【０１８７】
オリゴヌクレオチドＯＰＮ１及びＯＰＮ２（配列番号１１及び１２）を用いて、Ｉ−ＣｒｅＩ  ＯＲＦ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｘ０１９７７）を藻類培養物１１−３２ｂクラミドモナス・レインハルドティ／スミス（Chlamydomonas reinhardtii／Smith）のサンプルから増幅した。
【０１８８】
2004533267.tif 000008
【０１８９】
２μｌ（約１００ｎｇのＤＮＡに相当する）のＤＮＡ調製物をＰＣＲ反応に用いた。製造者（Life Technologies）の指示に従って、以下のものを混合し、合計量５０μｌとした：
５μｌの１０×ＰＣＲバッファー［２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５００ｍＭ  ＫＣｌ］
１．５μｌの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ配合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを１０ｍＭずつ）
１μｌのプライマーＯＰＮ１（１０μＭ）
１μｌのプライマーＯＰＮ２（１０μＭ）
０．４μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）
２μｌのＤＮＡ調製物
３８．１μｌのオートクレーブ済蒸留水
【０１９０】
反応混合物を約５０μｌのシリコン油で被覆し、これを下記の温度プログラム（サーモサイクラー：MWG Biotech Primus HT；MWG Biotech、ドイツ）に供した：
９５℃で１８０秒を１サイクル、
９２℃で６０秒、５４℃で６０秒、及び７２℃で３分を３０サイクル、
７２℃で５分を１サイクル。
【０１９１】
QIAquick（登録商標）ゲル抽出キット（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いたアガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ断片を精製した後、ｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Promega、マディソン郡、USA）にクローニングした。次に、ＡＬＦ高速ＤＮＡシークエンサー（Pharmacia、Upsala、スエーデン）を用いて、配列分析を実施した。この配列を配列番号５に示す。
【０１９２】
Ｉ−ＣｒｅＩについて記載したのと同様に、藻培養物９．８３クラミドモナス・セグリス／キング由来のＩ−ＣｐａＩのＯＲＦ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ３６８３０）のクローニングを実施した。オリゴヌクレオチドＯＰＮ３及びＯＰＮ４を用いて、ＰＣＲを実施した。この配列を配列番号７に示す。
【０１９３】
2004533267.tif 000009
【０１９４】
Ｉ−ＣｒｅＩについて記載したのと同様に、Ｉ−ＣｐａＩＩのＯＲＦ（GenBank登録番号：Ｌ３６８３５）のクローニングを実施した。このために、藻培養物９．８３クラミドモナス・セグリス／キングのサンプルを用いた。オリゴヌクレオチドＯＰＮ５及びＯＰＮ６を用いて、ＰＣＲを実施した。この配列を配列番号９に示す。
【０１９５】
2004533267.tif 000010
【０１９６】
Ｉ−ＣｒｅＩについて記載したのと同様に、藻類培養物１１−９クラミドモナス・アプラナタ／ラクシュ由来のＩ−ＣｈｕＩのＯＲＦ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：Ｌ０６１０７）のクローニングを実施した。オリゴヌクレオチドＯＰＮ７及びＯＰＮ８を用いて、ＰＣＲを実施した。この配列を配列番号３に示す。
【０１９７】
2004533267.tif 000011
【０１９８】
個々のホーミングエンドヌクレアーゼのＯＲＦ（核局在化シグナルを含む）をいずれの場合も、ＳａｌＩでの制限消化によりｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターから切り出し、ゲル電気泳動により精製した後、いずれもバイナリーベクターｐＢｉｎＡＲ（Hofgen及びWillmitzer（1990）Plant Science 66: 221-230）のＳａｌＩ制限切断部位にクローニングした。個々の酵素の発現は、３５Ｓプロモーター及びオクトピンシンターゼターミネーターの制御下で行なった。
【０１９９】
バイナリーＩ−ＳｃｅＩ発現ベクターｐＣＩＳｃｅＩ（Puchta Hら（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5055-5060）は、Ｔ−ＤＮＡ境界の間に、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター（Puchta Hら（1993）Nucl Acids Res 21: 5034-5040）の制御下にある合成Ｉ−ＳｃｅＩ ＯＲＦを含む。
【０２００】
５つのプラスミドすべてを大腸菌において複製させ、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒプラスミドＭｉｄｉキット（Qiagen、ヒルデン）により精製した後、エレクトロポレーションエレクトロポレーションによりアグロバクテリウムＣ５８株に導入した。
【０２０１】
実施例２：構築物ｐＧＵ．Ｉ．ＵＳＢの作製
プラスミドｐＧＵ．ＵＳ（Tinland Bら（1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8000-8004）を用いて、組換え物質を構築した。Ｔ−ＤＮＡ領域内に、該プラスミドは、５５７ｂｐのオーバーラップを有するβグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子の２つの重なり部分を含む。ヒグロマイシン遺伝子をＧＵＳ配列間の固有のＸｂａＩ切断部位に組み込む。
【０２０２】
第１のステップで、ＢＡＲ遺伝子をプロモーター及びターミネーター配列と一緒に、単離されたＨｉｎｄＩＩＩ断片の形態で、ベクターｐＲＣ（Puchta Hら（1996）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5055-5060）から切り出し、アガロースゲル電気泳動によりベクター配列から分離し、ゲルから切り出し、QIAquick（登録商標）ゲル抽出キット（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いて単離した後、ｐＧＵ．ＵＳの固有のＨｉｎｄＩＩＩ切断部位に挿入した。このために、ベクターｐＧＵ．ＵＳは、ＨｉｎｄＩＩＩで事前に切断し、アルカリ性ホスファターゼ（仔ウシアルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＰ）、New England Biolabs、フランクフルト、ドイツ）により脱リン酸化することにより、再環状化を防止した。こうして得られたベクターをｐＧＵ．ＵＳ−ＢＡＲと称する。
【０２０３】
ベクターｐＮＥ３（Stougaard J（1993）Plant J 3: 755-761）において、まず、ＸｂａＩ切断部位を反応中クレノウ充填により除去した。得られたベクターｐＮＥ３−ＸＢＡから、オリゴヌクレオチドプライマーＯＮＰ９（配列番号１６）及びＯＮＰ１０（配列番号１７）を用いたＰＣＲにより、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター及びノパリンシターゼ（ｎｏｓ）ターミネーターの制御下にあるネガティブセレクションマーカー遺伝子シトシンデアミナーゼ（ｃｏｄＡ）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を増幅した。用いたオリゴヌクレオチドプライマーＯＮＰ９及びＯＮＰ１０のために、いずれの場合も、１つのＩ−ＳｃｅＩ切断部位（以下に記載する配列では太字で強調する）と、ＮｏｔＩ又はＸｂａＩ切断部位が増幅配列（amplificate）の両端に付加された。
【０２０４】
2004533267.tif 000012
【０２０５】
２μｌ（約１００ｎｇに相当する）のｐＮＥ３−ＸＢＡのプラスミド調製物をＰＣＲ反応に用いた。製造者（Life Technologies）の指示に従って、以下のものを混合し、合計量を５０μｌとした：
５μｌの１０×ＰＣＲバッファー［２００ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５００ｍＭ  ＫＣｌ］
１．５μｌの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ配合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを１０ｍＭずつ）
１μｌのプライマーＯＰＮ１（１０μＭ）
１μｌのプライマーＯＰＮ２（１０μＭ）
０．４μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）
２μｌのｐＮＥ３−ＸＢＡのプラスミド調製物
３８．１μｌのオートクレーブ済蒸留水
【０２０６】
反応混合物を約５０μｌのシリコン油で被覆し、これを下記の温度プログラム（サーモサイクラー：MWG Biotech Primus HT；MWG Biotech、ドイツ）に付した：
９５℃で１８０秒を１サイクル、
９２℃で６０秒、５４℃で６０秒、及び７２℃で３分を３０サイクル、
７２℃で５分を１サイクル。
【０２０７】
ＰＣＲ産物をＸｂａＩ及びＮｏｔＩで消化した。ベクターｐＧＵ．ＵＳ−ＢＡＲもＸｂａＩ及びＮｏｔＩ（ヒグロマイシンマーカー遺伝子の欠失をもたらす）で同様に消化した後、QIAquick（登録商標）ゲル抽出キット（Qiagen、ヒルデン、ドイツ）を用いたアガロースゲル電気泳動により、ベクター断片を精製した。消化したＰＣＲ断片とベクターとの結合により、バイナリーベクターｐＧＵ．Ｃ．ＵＳＢ（図７ａを参照）が得られた。このベクターは、Ｔ−ＤＮＡの２つのＩ−ＳｃｅＩ切断部位の間にマーカー遺伝子（シトシンデミナーゼ（ｃｏｄＡ））を含む。これらのＩ−ＳｃｅＩ切断部位は、βグルクロニダーゼ遺伝子（ＧＵＳ）の相同性配列領域（サイズ：５５７ｂｐ）の両外側に位置する。ＧＵＳ遺伝子は、相同的復元マーカーとして働く（Swoboda Pら（1994）EMBO J 13: 481-489）。遺伝子が相同組換えにより復元される場合には、組織化学的に発現を検出することができる。マーカー遺伝子の排除により、５−ＦＣ（フルオロシトシン）耐性タバコ細胞が得られ、該細胞を再生させることにより、カルスを取得することができる（Salomon S及びPuchta H（1998）EMBO J 17: 6086-6095）。
【０２０８】
実施例３：ｐＧＵ．Ｉ．ＵＳＢによる植物形質転換
タバコ（Nicotiana tabacum L. cv. Petite Havana系統SR1）の幼植物を、バイナリーベクターｐＧＵ．Ｃ．ＵＳＢを含むアグロバクテリウムＣ５８株で形質転換した。
【０２０９】
このために、滅菌条件下で湿らせた濾紙上に種子を配置し、２週間後、上記幼植物を収穫した。これはすべて、Puchta H（1999）Methods Mol Biol 113: 447-451の記載通りである（２５℃、１６時間光／８時間暗所の周期）。
【０２１０】
接種のため、まず、バイナリー形質転換プラスミドを含むアグロバクテリウム株をＹＥＢ培地において２８℃の振盪培養中で一晩増殖させた。次に、アグロバクテリウム懸濁液を１５，０００ｇで１０分遠心分離し、細胞を１０ｍＭ ＭｇＳＯ４中に取り上げ、懸濁液の最終光学密度が約０．５の値になるようにした。それから、反応容器において、幼植物を滅菌条件下で細菌溶液に浸してから、滅菌乾燥器内で０．１５ａｔの真空を加えた。１０分後、ＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン：５μｇ／ｍｌ）及びＮＡＡ（１−ナフタレン酢酸：０．５μｇ／ｍｌ）を添加したＭＳプレート上に幼植物を載せ、生育室（２５℃、１６時間光／８時間暗所の周期）内に３日放置した。次に、ＮＡＡ及びＢＡＰに加えて、ホスフィノトリシン（１００μｇ／ｍｌ）、バンコマイシン（１μｇ／ｍｌ）及びセフォタキシム（０．５μｇ／ｍｌ）を添加したＭＳ培地に幼植物を載せた。１０日毎に、新しく調製したプレートに幼植物を移した。最終的に、得られたカルスはシュートを形成した。シュートが特定のサイズ（１〜２ｃｍ）に達した後すぐに、これらをカルス材料から取り出し、ホスフィノトリシン、バンコマイシン及びセフォタキシン（濃度は前記と同じ）を添加したＭＳ培地を含むマゼンタボックスに植え付けた。間もなく、シュートに根が発生した。２〜４週間後、これらを土に移した。植物を温室内で開花させてから、自家受粉させ、形成された種子をさく果内で熟成させた。そして、１ｍｌ当たり３００μｇのホスフィノトリシン（ポジティブセレクションのため）又は５００μｇの５−ＦＣ（フルオロシトシン：ネガティブセレクションのため）を添加したＭＳ培地に種子を載せ、分離分析を実施した。耐性幼植物と感受性幼植物の比を決定する（ポジティブセレクションでは３：１、ネガティブセレクションでは１：３）ことにより、組換え構築物が３つの選択した系統の遺伝子座に挿入されたことを確認した。
【０２１１】
実施例５：ＤＳＢＩ酵素Ｉ−ＳｃｅＩの導入による遺伝子の誘導
この実験では、トランスジェニックＧＵ．Ｃ．ＵＳＢ１、３及び７系統のＦ１幼植物（各々、図２に示すＴ−ＤＮＡ ＧＵ．Ｃ．ＵＳＢのコピーを含む）に、アグロバクテリウム株を接種するが、この株は、Ｉ−ＳｃｅＩを一過性に発現し、前述のように、プラスミドｐＣＩＳｃｅＩ（Puchta Hら（1996）Proc Natl Acad Sci USA 93, 5055-5060）を含んでいた（Puchta、1999bも参照されたい）。３日後、インキュベートする１ｍｌ当たり、１００μｇの５−ＦＣ及び１００μｇのホスフィノトリシンの存在下で、同じ培地にＢＡＰ及びＮＡＡ（濃度は前記と同じ）を添加したＭＳ培地に幼植物を載せ、除去しようとするマーカー遺伝子（この場合、ＣｏｄＡ遺伝子）が欠失している植物細胞を検出した。６週間後、培地で増殖中のカルスを２つに分け、一方をシュート軸の再生に用い、他方をＤＮＡの単離及びβグルクロニダーゼアッセイに用いた。得られた５−ＦＣ−耐性トランスジェニックカルスを、組織化学的染色により相同組換え事象について分析した。青色の染色は、カルスの復元を示す（図１１参照）。
【０２１２】
カルスの組織化学的染色は、Swobodaら、1994により記載されているように実施した。このために、染色溶液（１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファーｐＨ７．０；０．１％トリトン；０．０５％ＮａＮ３の１ｍｌ当たり０．３ｍｇのＸ−Ｇｌｕｃ［Duchefa, Harlem、Ｎｌ］）にカルスを導入した。乾燥器に真空を１５分加えてから、カルスを溶液中で３７℃にて４８時間インキュベートした。染色溶液を流した後、８０％エタノール中で振盪を繰り返すことにより、植物材料から、残ったクロロフィルを除去した。青色の染色は、βグルクロニダーゼの活性を示す。
【０２１３】
実験例の約四分の一で、相同組換えにより、マーカー遺伝子がうまく除去されていた（図１１、表２）。
【表２】
2004533267.tif 000013
【０２１４】
分子分析により、事実を確認する。すなわちＧＵ．Ｃ．ＵＳＢ１系統は、トランスジーンの単一コピーを含んでいたため、カルスは、ＰＣＲにより組換え結果について直接分析した。
【０２１５】
次に、カルスのランダム画分をＰＣＲにより分子レベルで分析した。以下のプライマー対を用いた分子分析により、タバコゲノムから新しく形成された結合部位を単離することが可能になった（図１２；表３）。
【０２１６】
2004533267.tif 000014
【０２１７】
【表３】
2004533267.tif 000015
【０２１８】
３つの０．７ｋｂのＰＣＲ断片を選択し、配列決定した。配列決定により、３つのすべてにおいてβグルクロニダーゼ遺伝子の機能的配列が確認された。すなわち、相同組換えにより、実際に遺伝子の復元が正確に起こっていたことがわかった。
【０２１９】
５つの１．４ｋｂのＰＣＲバンドを配列決定したところ、ｃｏｄＡ遺伝子の除去後、相同組換えは起こらずに、２つのＩ−ＳｃｅＩ切断部位の復元（非相同末端結合、ＮＨＥＪ）により、これらのバンドが形成されたことがわかった。ほとんどの実験で、Ｉ−ＳｃｅＩ切断部位で小さな欠失が起こった。
【０２２０】
サザンブロットにより、予想通り、Ｉ−ＳｃｅＩ切断部位の間に位置する配列の完全な除去が、０．７ｋｂ及び１．４ｋｂバンドをそれぞれ有する組換え体で起こることが明らかにされた。再生された植物のゲノムには、ｃｏｄＡ特異的ＤＮＡはまったく検出できなかった（図１３Ｂ及びＤ、レーン２及び３）。
【０２２１】
ＤＮｅａｓｙ植物ミニキット（Quiagen、ヒルデン）を用いて、ＤＮＡを単離した。組換え産物を検出するため、オリゴヌクレオチドＯＰＮ１３及びＯＰＮ１４を用いたＰＣＲにより、ゲノムのＤＮＡを分析した。
【０２２２】
2004533267.tif 000016
【０２２３】
５μｌの１０×ＰＣＲバッファー［２００ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５００ｍＭ  ＫＣｌ］
１．５μｌの５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ配合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを１０ｍＭずつ）
１μｌのプライマーＯＰＮ１（１０μＭ）
１μｌのプライマーＯＰＮ２（１０μＭ）
０．４μｌのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ）
２μｌのＤＮＡ調製物
３８．１μｌのオートクレーブ済蒸留水
【０２２４】
反応混合物を約５０μｌのシリコン油で被覆し、これを下記の温度プログラム（サーモサイクラー：MWG Biotech Primus HT；MWG Biotech、ドイツ）に供した：
９５℃で１８０秒を１サイクル、
９２℃で６０秒、５４℃で６０秒、及び７２℃で３分を３０サイクル、
７２℃で５分を１サイクル。
【０２２５】
「ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍダイターミネーターサイクルシークエンシング反応キット」（PE Applied Biosystems, Weiterstadt）を用いて、ＰＣＲ産物を配列決定した。
【０２２６】
サザンブロッティングのために、ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ又はＡｃｃ６５Ｉで切断し、０．８％アガロースゲルにおける電気泳動に供した。次に、製造者の説明書に記載されているように、キャピラリーブロッティングを用いて、ゲル中のＤＮＡをハイブリダイゼーション膜「ＨｙｂｏｎｄＮ」（Amersham、リトルチャルフォント、UK）にトランスファーさせた。分子ハイブリダイゼーションのために、ｃｏｄＡ又はＧＵＳ特異的遺伝子断片を出発プラスミドから単離し（ＰＮＥ３としてのXbaI／XhoI断片；Stougaard, 1993、及びｐＧＵＳ２３からのKpnI／SacI断片、Puchta及びHohn, 1991、ＱＩＡｑｕｉｋゲル抽出物キット［Qiagen、ヒルデン］を用いて単離）、「ランダムプライミングラベリングキット（Megaprime DNAラベリングシステムRPN1607、Amersham、リトルチャルフォント、UK）及び［α−３２Ｐ］（Amersham、リトルチャルフォント、UK）を用いて標識した。ハイブリダイゼーション反応を６５℃にて実施した。
【０２２７】
いずれの場合も、遺伝子的に連鎖した２つのトランスジーンコピーがＧＵ．Ｃ．ＵＳＢ３系統及びＧＵ．Ｃ．ＵＳＢ７系統の場合に組み込まれたため、これら系統の場合には、カルスから典型的な数の植物が再生し、ＤＮＡを取得した後、サザンブロットにより分析した（表４）。
【０２２８】
Ａｃｃ６５Ｉの場合には、ＧＵＳ特異的３．７ｋｂバンドの存在が相同組換えを示唆するのに対し、４．４ｋｂバンドは、ＮＨＥＪ事象（「非相同末端結合」；ＮＨＥＪ）を示唆する（図７ｂ及びｃ、図１３Ｃを参照）。
【表４】
2004533267.tif 000017
【０２２９】
興味深いことに、いずれの場合にも、２つのトランスジーンコピーで同じタイプの連鎖が認められた。言い換えれば、相同組換え又はＮＨＥＪ事象のいずれか一方だけが起こった。どの場合にも、両方が平行して存在する、すなわち、例えば、一方のトランスジーンでは相同組換えが、また他方ではＮＨＥＪ事象が存在する、ようなことはなかった。
【０２３０】
両系統で、ＰＣＲ分析も実施し、それぞれ、３つの０．７ｋｂのＰＣＲ断片を選択し、配列決定した。その３つのすべてにおいて、配列決定から、βグルクロニダーゼ遺伝子の機能的配列、すなわち、相同組換えにより遺伝子の復元が実際に起こっていたことが明らかになった。
【０２３１】
両系統の合計９つの１．４ｋｂのＰＣＲバンドを配列決定したところ、これらのバンドが、ｃｏｄＡ遺伝子を切り出した後、２つのＩ−ＳｃｅＩ切断部位の修復（「非相同末端結合」；ＮＨＥＪによる）により開始していたこともわかった。ここでも、ほとんどの場合、Ｉ−ＳｃｅＩ切断部位で小さな欠失が起こった。
【０２３２】
サザンブロットにより、予想通り、組換え体においてＩ−ＳｃｅＩ切断部位間の配列が完全に除去されていることが明らかにされた。再生された植物のゲノムには、ｃｏｄＡ特異的ＤＮＡはまったく検出されなかった（図１３Ｂ及びＤ、レーン５、６及び８、９）。
【０２３３】
実施例５：
合成オリゴヌクレオチドのクローニングにより、βグルクロニダーゼ遺伝子（前記と同様の構成）の半分と半分の間に、Ｉ−ＳｃｅＩ切断部位に加えて、前記制限酵素用の切断部位も含む、様々なトランスジェニックタバコ植物系統を作製した（図１０）。このタバコ系統の幼植物に、植物細胞においてＩ−ＳｃｅＩ又は対応する酵素を発現することができるアグロバクテリウムを直接対比させて接種した。こうして得られたカルスを２週間後、組織化学的に染色した。得られた結果を表４に示す。
【０２３４】
プラスミドｐＧＵ．Ｃ．ＵＳ．ＢをＩ−ＳｃｅＩで切断して、ｃｏｄＡ遺伝子をプラスミドから切り出した。アガロースゲル電気泳動により消化されたＤＮＡを分離し、大きい方のバンドを切り出してから、ＱＩＡｑｕｉｋゲル抽出キット（Qiagen、ヒルデン）により精製した後、大腸菌に結合し、形質転換させた。次に、得られたプラスミドをＸｂａＩで切断した。
【０２３５】
相補的一本鎖オリゴヌクレオチドＯＰＮ２５及びＯＰＮ２６を９２℃まで短時間加熱してから冷却することにより、二本鎖にした後、ＸｂａＩで切断したプラスミドと結合させた。こうして得られたＳＩ構築物（ｐＳＩ）は、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｐａＩ、Ｉ−ＣｐａＩＩ及びＩ−ＣｒｅＩの切断部位を含む（図１０（Ａ）を参照）。
【０２３６】
2004533267.tif 000018
【０２３７】
相補的一本鎖オリゴヌクレオチドＯＰＮ２７及びＯＰＮ２８を９２℃まで短時間加熱してから冷却することにより、二本鎖にした後、ＸｂａＩで切断したプラスミドと結合させた。こうして得られたＳＤ構築物（ｐＳＤ）は、Ｉ−ＳｃｅＩ及びＩ−ＣｈｕＩの切断部位を含む（図１０（Ｂ）を参照）。
【０２３８】
2004533267.tif 000019
【０２３９】
アグロバクテリウム形質転換により、前述したように、２つの構築物を含むトランスジェニックタバコ植物を作製した。１つの遺伝子座にしかトランスジェニック配列を含まない系統をさらに別の実験に用いた。これらの系統は、ホスフィノトリシン耐性及び非耐性植物への分離が３：１であったことにより決定した。自家受粉させた幼植物に、制限エンドヌクレアーゼを発現させる４つの構築物のうちの１つ、又はベクター対照としてプラスミドＢｉｎＡＲ、若しくは、ポジティブコントロールとしてＢｉｎＡＲ及びＣＩＳｃｅ−Ｉの１：１混合物を含むアグロバクテリウム株を接種した。接種は、前記（Puchta H（1999）Methods Mol. Biol. 113:447-451）と同様に実施し、選択のために、１ｍｌ当たり１００μｇのカナマイシンを添加したＭＳ培地で数週間にわたり増殖させた。尚、この培地は、ＢＡＰ及びＮＡＡ、バンコマイシン及びセフォタキシン（濃度は前記と同じ）も含む。得られたカルスは、前記と同様に、組織化学的βグルクロニダーゼ染色に供した。
【０２４０】
試験した制限酵素の４つすべてが、Ｉ−ＳｃｅＩ（本発明では、選択ベクターｐＢｉｎＡＲ［ＡＲ］との同時接種で用いた）と同じ程度で相同組換えを誘導することができた（表５）。これにより、どの制限エンドヌクレアーゼを用いても、相同組換えを効率的に誘導できることが明らかにされた。
【表５】
2004533267.tif 000020
【図面の簡単な説明】
【０２４１】
【図１】本発明の原理を示す線図である。
【図２】好ましい実施形態を示す図である。
【図３】好ましい実施形態を示す図である。
【図４】好ましい実施形態を示す図である。
【図５】好ましい実施形態を示す図である。
【図６】好ましい実施形態を示す図である。
【図７ａ】二本鎖切断の出現と、相同性Ｕ配列間の相同組換えを示す図である。
【図７ｂ】図７ａで説明したのと同じ系を示す図である。
【図７ｃ】図７ａ及び図７ｂで説明した方法の２つの末端産物の別の例を示す図である。
【図８】好ましい実施形態を示す図である。
【図９】生物の染色体ＤＮＡからの核酸配列の除去に関して容易に選択が可能な系を示す図である。
【図１０】二本鎖切断による相同組換えが、様々な制限酵素で誘導できることを証明するのに用いた２つの構築物（ＳＩ構築物（Ａ）及びＳＤ構築物（Ｂ））を示す図である。
【図１１】二本鎖切断の誘導後に得られたタバコカルスの代表的な組織化学的分析を示す図である。
【図１２】相同組換えを検出するためのＰＣＲ分析を示す図である。
【図１３】対象とするトランスジーン配列の完全な除去を示すサザンブロットを示す図である。
【図１】
2004533267.tif 000021
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2004533267.tif 000025
【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
2004533267.tif 000028
【図７ｃ】
2004533267.tif 000029
【図８】
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【図９】
2004533267.tif 000031
【図１０】
2004533267.tif 000032
【図１１】
2004533267.tif 000033
【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
2004533267.tif 000036
2004533267.tif 000037
2004533267.tif 000038
2004533267.tif 000039
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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