(57)【要約】単一の提供者の血漿から安定なトロンビン成分を調製する無菌的な方法であり、トロンビン成分と凝固接着性蛋白質は同時に、同一の提供者の血漿から１時間以内に採取される。両成分を組み合わせることによって改良された生物的止血剤および組織密封剤が得られ、この際、異質遺伝子のヒトまたはウシ血液源からのウイルスまたは細菌による汚染の危険がないという利点を有する。このトロンビンは５秒以内に凝固接着性蛋白質の重合をもたらし、また十分に安定であって、このような急速凝固を６時間以上にわたって提供する。また、トロンビンを食塩水で希釈することによって凝固時間を予測可能に延長することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から自己由来トロンビンを生成する方法であって、該方法は、
患者から血液製剤を得るステップと、
該製剤から血漿を分離するステップと、
血漿フラクションのプロトロンビンを濃縮するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンから粒状物を濾別するステップと、
からなる、患者から自己由来トロンビンを生成する方法。
【請求項２】
凝固時間を変化させるステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
血漿フラクション中のプロトロンビンを濃縮するためにエタノールを添加することを含む、請求項２の方法。
【請求項４】
変換するステップがＣａＣＬ２の添加を含む、請求項３の方法。
【請求項５】
血漿を得るために血液製剤を遠心分離することを含む、請求項４の方法。
【請求項６】
食塩水、ＣａＣＬ２溶液、および無菌水からなるグループのいずれかによってトロンビンを希釈することによって凝固時間の予測可能な延長が起こる、請求項２の方法。
【請求項７】
重量、大きさ、及び蛋白質結合によって血漿を濾別することを含む、請求項６の方法。
【請求項８】
１５分間超にわたって安定な、凝固の早い自己由来トロンビンを製造する方法であって、該方法は、
血漿からプロトロンビンを分離し、プロトロンビンをトロンビンに変換するステップ、を含む、自己由来トロンビンを製造する方法。
【請求項９】
１５分間超にわたって、５秒未満の急速な凝固を提供する自己由来トロンビン。
【請求項１０】
必須的に、
血漿、
エタノール（ＥＴＯＨ）、
ＣａＣＬ２、
からなる、血漿からトロンビンを抽出するための組成物。
【請求項１１】
いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが１８．９％存在し、ＣａＣＬ２が２３．０ｍＭ存在する、請求項１０の組成物。
【請求項１２】
いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが１８．９％存在し、ＣａＣＬ２が５．７ｍＭ存在する、請求項１０の組成物。
【請求項１３】
いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが８％から２０％の範囲で存在し、ＣａＣＬ２が４．５ｍＭから２３．０ｍＭの範囲で存在する、請求項１０の組成物。
【請求項１４】
トロンビンの調製方法であって、該方法は、
血漿を得ること、
血漿にＥＴＯＨおよびＣａＣＬ２を添加して組成物を形成すること、
組成物を撹拌すること、
粒状の組成物を濾別して、トロンビンをフィルター通過させること、
からなる、トロンビンの調製方法。
【請求項１５】
組成物の撹拌に続いて１０分間またはそれ以上の時間、組成物を定温放置する、請求項１４の方法。
【請求項１６】
組成物を濾別する前に組成物を再撹拌する、請求項１５の方法。
【請求項１７】
血漿からトロンビンを調製するための装置であって、該装置は、
ＣａＣＬ２溶液とＥＴＯＨを入れた反応容器と、
前記反応容器に血漿を導入する手段と、
前記反応容器に結合されてトロンビンを受け入れるトロンビン受入注射器と、
前記反応容器と前記トロンビン受入注射器の間に置かれたフィルターと、
からなる、血漿からトロンビンを調製するための装置。
【請求項１８】
自己由来の生物的接着剤を処理するための装置であって、該装置は、
トロンビン処理手段と、
前記トロンビン処理手段に操作可能に結合された凝固接着性蛋白質処理手段と、
血漿をその後トロンビンと凝固接着性蛋白質とにそれぞれ変換するために、前記操作可能の結合部を介して血漿を受け入れる手段と、
を組み合わせてなる、自己由来の生物的接着剤を処理するための装置。
【請求項１９】
血漿からトロンビンを調製するための装置であって、該装置は、
セラミックビーズまたは硼珪酸ガラスを入れた反応容器と、
前記反応容器に試薬を導入する手段と、
前記反応容器に血漿を導入する手段と、
前記反応容器に結合されてトロンビンを受け入れるトロンビン受入注射器と、
前記反応容器と前記トロンビン受入注射器の間に置かれたフィルターと、
からなる、血漿からトロンビンを調製するための装置。
【請求項２０】
試薬はＣａＣＬ２およびＥＴＯＨの溶液を含む、請求項１９の装置。
【請求項２１】
血漿をガラスビーズと接触させるステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２２】
必須的に、
血漿、
エタノール（ＥＴＯＨ）、
ＣａＣＬ２、
ガラスビーズ、
からなる、血漿からトロンビンを抽出するための組成物。
【請求項２３】
いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが１８．９％存在し、ＣａＣＬ２が２３．０ｍＭ存在する、請求項２２の組成物。
【請求項２４】
いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが１８．９％存在し、ＣａＣＬ２が５．７ｍＭ存在する、請求項２２の組成物。
【請求項２５】
いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが８％から２０％の範囲で存在し、ＣａＣＬ２が４．５ｍＭから２３．０ｍＭの範囲で存在する、請求項２２の組成物。
【請求項２６】
血漿からトロンビンを調製するための器具であって、該器具は、
ＣａＣＬ２およびエタノールを受け入れる反応容器であって、該反応容器が血漿を前記反応容器に注入するための手段を含む、反応容器と、
前記反応容器に接続されたトロンビンを受け入れるための注射器と、
前記反応容器とトロンビンを受け入れるための注射器の間に置かれたフィルターと、
からなる、血漿からトロンビンを調製するための器具。
【請求項２７】
予め入れられたガラスビーズをさらに含む請求項２６の器具。
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
以下の発明は一般的に、所与の単位の血漿から高い比活性を有するトロンビン酵素を調製することに関する。このトロンビン酵素は十分に安定であって、室温またはそれ以下に保たれるときは、フィブリノゲンに富む凝固接着性蛋白質溶液を急速に凝固させる能力を６時間超にわたって保つ。
（背景技術）
フィブリン密封剤の処方は凝固カスケード反応の最後のステップを模倣したものである。この反応においてトロンビン酵素はフィブリノゲンを開裂し、開裂したフィブリノゲンは架橋して半固体または可撓性のフィブリン凝塊となる。このフィブリン凝塊は創傷部に接着して、液の浸出に対する障壁を形成するとともに組織間の接着をもたらし、かくして処置部に止血および治癒能力を提供する。
今日市販されている、出願者のクリオシールＴＭシステムは、提供者の血漿から約１時間で、フィブリノゲンおよび第八因子を含む、寒冷沈降され、濃縮された凝固接着性蛋白質を採取する装置である。血液銀行で常用されている、１日ないし２日を要する寒冷沈降工程に較べれば、クリオシールＴＭシステムが提供する約１時間の寒冷沈降採取が意味するところは大きい。すなわちクリオシールＴＭシステムによる凝固接着性蛋白質の採取を、手術周辺環境で患者をそばにして行うことができ、したがって何日も前から工程を開始する必要を避けることができる。
このようなクリオシールＴＭ採取された凝固接着性蛋白質は、ウシまたはヒト・トロンビンと組み合わされて、外科手術の止血および組織接着に有用な生物的接着剤を形成する。しかしながら市販のトロンビンは一般にウシまたはヒトのプールされた血漿から由来しているので、患者は依然として望ましくない免疫反応や、血液中の感染性ウイルスおよび可能性としてはクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）すなわち新変異型ＣＪＤ（ＮＶＣＪＤ）による汚染の危険にさらされている。クリオシールＴＭ寒冷沈降の発明の一つの利点は、採取された凝固接着性蛋白質が患者自身の血液に由来しているので、このような凝固接着性蛋白質を患者の外科的創傷部に局所的に適用するときに、血液感染性の病気による汚染の危険が避けられるということにある。
しかしながら、外科手術患者の最も安全な条件は、凝固接着性蛋白質を採取したのと同じ提供者からトロンビン成分を採取して、二成分生物的密封剤を調製すること−すなわち完全に自己由来の生物的密封剤ないし接着剤を形成することによってもたらされる、ということは以前から理解されていた。
患者に由来するトロンビンおよび／またはフィブリノゲンを当該の患者に行われる医学的処置に利用するという発想は新規なものではなく、１９７４年にアンドリャノヴァが最初に記述している。約２０年後、セデルホルム−ウィリアムスのＰＣＴ特許（ＷＯ９４／００５６６、１９９４年１月６日）が改良されたフィブリン接着剤を記載しており、ここではトロンビン成分は遠心分離、中間的沈殿物の分離、血液のイオン強度および血漿のＰＨの調整等を含む１３のステップを要して得られ、これも同じ提供者の血漿に由来するフィブリノゲン成分と組み合わされる。しかしながらこのような多くの調製ステップは非常に時間を要するので、処理時間が１時間以内でなければならない手術周辺環境での用途には実用的ではない。
３年後、１９７７年にヒルシュ等（米国特許第５，６４３，１９２号）が、上記セデルホルム−ウィリアムスに続いて、フィブリノゲンおよびトロンビン成分が同一提供者の血漿から由来する、他のフィブリン接着剤調製法を教示した。ヒルシュ特許は血漿中のフィブリノゲンの大部分を最初に沈殿除去して上澄みを調製し、次いでこの上澄み中の残部のフィブリノゲンを凝固させるトロンビン調製法を記載している。この方法はセデルホルム−ウィリアムスが教示する方法とは異なってより単純であるが、商業的に有用なトロンビンは得られない。なぜならば（ヒルシュ等の図１参照）このトロンビンが５秒以下の凝固速度を与えるのはわずか４分間に過ぎず、１０秒未満の凝固速度を与えるのはわずか４７分間に過ぎないからである。
このような凝固速度は外科医の要求には合致しない、なぜならば外科医はヒルシュ等のフィブリン接着剤の限界前後で外科手術全体の計画をたてることは不可能だからである。
外科医はほとんどの場合、止血および組織密封または接着のために速効性（＜５秒）の凝固時間を必要とする。凝固の遅い生物的接着剤（＞５秒）は毛細管出血および出血によって、しばしば機能を果たす前に外科的創傷部から洗い去られてしまう。ヒルシュのフィブリン接着剤を使用する外科医は、ヒルシュ接着剤処置によって行おうとする止血および組織密封が、凝固時間が５秒未満に収まる４分間の枠内に行われるように、外科手術を組むことが要求されるが、これはほとんどの外科手術にとってヒルシュ発明を全く非実用的なものにしている。なぜならば６時間に及ぶこともある外科手術の全経過にわたって、急速な止血と組織接着が要求されることがほとんどだからである。
以下に挙げる先行技術は出願者が知るところの先端技術を反映しており、関係する先行技術を開示すべき出願者の義務を果たすために包含されたものである。しかしながらこれらの参考文献のなかに、以下において詳細に開示し、具体的に請求する本発明の概念を、単独で教示したり、あるいは全ての考えられる組み合わせにおいて明白にしたりするものはない。
米国特許文献
2004500026.tif 000002
2004500026.tif 000003
外国特許文献
2004500026.tif 000004
その他の先行技術（著者、題名、関係ページ、日付、等を含む）
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Ｒｅｄｌ， Ｈ．他、”Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ｍｉｘｔｕｒｅｓ Ｏｆ Ｆｉｂｒｉｎ Ｓｅａｌ Ａｎｄ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ”、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、第 ４（１）巻、２９−３２ページ、１９８３年。
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Ｔｓｖｅｔｋｏｖ， Ｔ．Ｓ．他、”Ａ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｄｒｙ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｆｏｒ Ｔｏｐｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ”、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、第 ２１（６）巻、６６１−６６３ページ、１９８４年。
Ｙｕ， Ｘ．Ｊ．他、”Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｏｎ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｌｙｓｔｙｒｅｎｅ Ｒｅｓｉｎｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、第 ３７６巻、４２９−４３５ページ、１９８６年。
Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ａ．Ｍ．他、”Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂｙ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｏｎ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、第 ３６３（１）巻、９５−１００ページ、１９８６年。
Ｈａｒｐｅｌ， Ｐ．Ｃ．、”Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ： Ｔｈｅｉｒ Ｒｏｌｅ Ｉｎ Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｐａｔｈｗａｙｓ”、２１９−２３４ページ、１９８７年。
Ｆｅｎｔｏｎ， Ｊ．ｗ．、”Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ”、Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、第 １４（３）巻、２３４−２４０ページ、１９８８年。
Ａｗａｎｏ， Ｋ．他、”Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ｓｅｒａｔｏｎｉｎ， Ｈｉｓｔａｍｉｎ， Ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｘａｎｅ Ａ２ Ｉｎ Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎｓ Ｏｆ Ｃｏｒｏｎａｒｙ Ａｅｔｅｒｉｅｓ Ａｎｄ Ａｏｒｔａｅ Ｆｒｏｍ Ｒａｂｂｉｔｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、第 １３（５）巻、７８１−７９２ページ、１９８９年。
Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ， Ｊ．他、”Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ Ｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｇｌａｓｓ Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ： Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｐｌａｔｅｌｅｔα−Ｇｒａｎｕｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｔｈｒｏｍｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、第 ６２（３）巻、９８９−９９５ページ、１９８９年。
Ｓｕｚｕｋｉ， Ｓ．他、”Ａ Ｓｔｕｄｙ Ｏｎ Ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ”、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第 ５３（３）巻、２７１−２７７ページ、１９８９年。
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Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｍ．、”Ｆｉｂｒｉｎ Ｇｌｕｅ”、Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ、第 ５巻、２４０−２４４ページ、１９９１年。
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ＭｃＣａｒｔｈｙ， Ｐ． ”Ｆｉｂｒｉｎ Ｇｌｕｅ Ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ”、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、第 ７（３）巻、１７３−１７９ページ、１９９３年。
Ｃｅｄｅｒｈｏｌｍ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｓ．、”Ｂｅｎｅｆｉｔｓ Ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｆｉｂｒｉｎ Ｇｌｕｅ Ｉｎ Ｓｋｉｎ Ｇｒａｆｔｉｎｇ”、Ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｕｓｔｒａｌｉａ、第 １６１（９）巻、５７５ページ、１９９４年。
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上に列挙したその他の先行技術は、そのすべてについて具体的に論評しないが、出願者の知るところの先行技術を網羅したものである。これらの論評されない参考文献は、以下に具体的に特徴を述べる本発明とは、さらに明瞭に異なっている。
（発明の開示）
本発明は、長い手術時間（例えば６時間）にわたって急速な（＜５秒）凝固を提供するような安定なヒト・トロンビンを、提供者の血液から調製するための簡単で実用的で早い方法という、長い間感じられていた必要性に指向されたものであり、またこのヒト・トロンビンを、同じ単位の血液から採取され、濃縮された凝固接着性蛋白質と組み合わせることによって、患者を微生物やＣＪＤまたはＮＶＣＪＤによる汚染にさらすことのない生物的密封剤を形成することに指向されたものである。この分野におけるこれまでの研究（ヒルシュ等）によって提示されたトロンビンは最小限度の安定性しかなかった、すなわちこのトロンビンは４分ないし５分という非常に短い時間の間しか、急速な（つまり５秒未満の）フィブリノゲン凝固を達成できなかった。またそれは非常に多くのステップと経過時間を要するために、手術周辺での調製に適しなかった。これら二つの事情は広範囲の手術に対して全く非実用的であった。
本発明が提供する安定なトロンビン酵素は、６時間に達する経過時間にわたって−すなわち長時間の手術であっても、その間にわたって−凝固接着性蛋白質の急速な、または緩徐な重合を、正確に再現性良く起こさせることができる。さらに、すべて単一の提供者に由来する凝固接着性蛋白質およびトロンビンを用いることによって、市販のフィブリン接着剤を使用することによって生じる様々な病気の危険が排除される。市販のフィブリン接着剤においては、フィブリンは何千人という提供者からプールされた血漿に由来しており、トロンビンは同様なプールされたヒト血漿に由来するか、またはウシ由来のものである。本発明による安定なトロンビンの製造は早くて簡単なので、手術処置の直前またはその過程で調製することが可能になり、得られたトロンビンは最も長時間の手術においても、その間にわたって急速凝固を提供する。本発明によって製造されたトロンビンは食塩水（生理食塩水）、水、または希薄ＣａＣＬ２溶液（例えば１２５ｍＭのＣａＣＬ２）に希釈可能であり、希釈によって正確な、より遅い凝固時間を提供する。このようにして、５秒未満から２分間超にわたる任意の凝固時間が得られる。
本発明の方法は好ましくは三つのステップからなり、そのはじめの二つのステップは好ましくは同時に行われる。
１．エタノールを用いてプロトロンビンの濃度を実質的に高めることによって、プロトロンビンが濃縮されたフラクション（分画）を調製し、同時に血漿中に自然に存在するフィブリノゲンやアンチトロンビンＩＩＩなどの成分を除去または変性する。これらの成分はプロトロンビンに結合し、封鎖し、または介在して、プロトロンビンが活性化して長寿命の機能性トロンビンになるのを阻害する。
２．濃縮されたプロトロンビン溶液にカルシウムイオンを加えて軽く撹拌し、プロトロンビンを安定な長寿命トロンビンに変換する。
３．トロンビン溶液をフィルターを通して押し出して、粒状物（粒状物質）を除去する。この粒状物はトロンビンを創傷部上に狭いオリフィスからスプレーしたり、細いチューブから押し出すのを妨げる。
（産業上の利用の可能性）
本発明の産業上の利用の可能性は、以下に述べる本発明の目的の説明により明らかとなる。
すなわち、本発明の第１の目的は、提供者の血漿から速効性かつ安定な自己由来トロンビンを得るための、新式かつ新規な装置および方法を提供することである。
本発明の他の目的は、関連するほとんどの外科処置よりも可使用時間の長い、上記特徴のトロンビンを提供することである。
本発明の他の目的は、食塩水希釈によって凝固時間を任意にかつ予知可能に延長できるような、前記特徴のトロンビンを提供することである。
本発明の他の目的は、単純な調製工程を有する、前記特徴のトロンビンを提供することである。
本発明の他の目的は、短くて３０分、長くても７０分の工程時間を有する、前記特徴のトロンビンの製造方法を提供することである。
本発明の他の目的は、狭いオリフィスからスプレーしたり、細いチューブから押し出すことのできるトロンビンを提供することである。
第１の利点から見れば本発明の目的は、エタノール分別によってプロトロンビン濃度を増加させて実質的に濃縮すると同時に、不純物としての蛋白質を除去したプロトロンビンのフラクションから、安定なヒト・トロンビンを製造するための、新規かつ実用的な方法を提供することである。濃縮されたプロトロンビンに塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を添加することによって、プロトロンビンはトロンビンに変換される。同じ単一の提供者の血漿から、他の方法によって凝固接着性蛋白質が同時に得られ、自己由来の生物的接着剤に必要な第２の成分となる。
第２の利点から見れば本発明の目的は、患者から自己由来のトロンビンを生成する方法を提供することであり、該方法は患者から血液製剤を得るステップ、得られた血液製剤から血漿を分離するステップ、血漿フラクション中のプロトロンビンを濃縮するステップ、プロトロンビンをトロンビンに変換するステップ、およびトロンビンから粒状物を濾別するステップ、の各ステップを含む。
第３の利点から見れば本発明の目的は、１５分間超にわたって安定な自己由来トロンビンを製造するための方法を提供することであり、該方法は血漿からプロトロンビンを分離するステップ、およびプロトロンビンをトロンビンに変換するステップを含む。
第４の利点から見れば本発明の目的は、１５分間超にわたって５秒未満の急速な凝固を提供する自己由来トロンビンを提供することである。
第５の利点から見れば本発明の目的は、必須的に血漿、エタノール（ＥＴＯＨ）、ＣａＣＬ２からなる、血漿からトロンビンを抽出するための組成物を提供することである。
第６の利点から見れば本発明の目的は、トロンビンの調製方法を提供することであり、該方法は：血漿を採取すること、血漿にＥＴＯＨおよびＣａＣＬ２を添加して組成物を形成すること、組成物を撹拌すること、組成物を静置モードまたは振動モードで定温放置ないし保温（ｉｎｃｕｂａｔｅ）すること、組成物から粒状物を濾別し、トロンビンをフィルター通過させること、からなる。
第７の利点から見れば本発明の目的は、血漿からトロンビンを製造するための装置を提供することであり、該装置はＣａＣＬ２およびＥＴＯＨの溶液を入れた反応容器と、血漿を反応容器中に導入する手段と、反応容器に結合されてトロンビンを受け入れるためのトロンビン受入注射器と、反応容器とトロンビン受入注射器の中間に位置するフィルターと、からなる。
第８の利点から見れば本発明の目的は、自己由来の生物的接着剤を処理する装置を提供することであり、該装置はトロンビン処理手段と、トロンビン処理手段に操作可能に結合された凝固接着性蛋白質処理手段と、血漿をその後にトロンビンと凝固接着性蛋白質にそれぞれ変換するために、操作可能のカップリングから血漿を受け入れる手段と、を組み合わせてなる。
本発明は、十分に安定であって最大６時間にわたって５秒未満の凝固を提供するようなトロンビンを製造するための、方法および装置を提供する。これはすべての先行技術に示されるものよりはるかに安定である。また凝固時間は食塩水希釈によって任意に調節できる。
さらにまた本発明は効率的な調製方法を提供する。クリオシールＴＭ発明による凝固接着性蛋白質の改良された寒冷沈降の所要時間は１時間未満である。これと同じ時間枠内に、自己由来ヒト・トロンビン成分を、最小限度の原料および処理で同一の血漿源から製造することができる。生物的接着剤の両方の成分は外科手術の状況において容易に組み合わされて、提供者と同一人である患者に適用され、かくして生じた凝塊は創傷部における止血と組織接着を提供する。
これに加えて本発明は生物的接着剤の両成分の無菌的製造方法を提供する。ここに記述する改良された無菌的製造方法は、本質的に非自己由来微生物による汚染のない最終製剤を提供する。
これらの、およびその他の目的は、添付の図面を参照しつつ、以下の詳細な明細書に明らかにされるであろう。
（発明を実施するための最良の形態）
図面を参照すれば、全体的に類似の要素は類似の部品を示しているが、参照符号１０は図１Ａおよび図１Ｂに示される本発明の処理セットを表している。
基本的には、処理セット１０は液受入系統２０を含み、該系統はトロンビン処理ユニット４０と凝固接着性蛋白質処理ユニット６０の、両方に連通している。
より具体的には、図１Ａおよび図１Ｂを参照すると、液受入系統２０はチューブ４に連通する入口２を含み、該入口を通して血漿が処理ユニット４０，６０に入る。チューブ４にはストップバルブ６用の場所が２ヶ所あり、前記ストップバルブはチューブ４を閉止して液の流通を防ぐ。チューブ４はＴ字部品８を介して連通しており、血漿を二つの枝管に分けている。すなわちトロンビン処理ユニット４０に通じる第１の枝管１２および凝固接着性蛋白質処理ユニット６０に通じる第２の枝管１４である。第１の枝管１２はまたストップバルブ６を含んでいる。
図１Ｂを参照すると、第１の枝管１２を通して血漿をトロンビン処理ユニット４０に導入する前に、あらかじめ液を入れた注射器９５からの試薬が、プランジャー機構９４をＡ’の方向に押すことによって、無菌バリアフィルター９２を通して受入系統２０に注入される。試薬はワンウェイバルブ９１、カップリング１８およびバルブ９１をつけたＹ字コネクタ９０、および枝管チューブ９３を通って最終的にケーシング２２の内部に入る。図３Ｂおよび図７Ｂを参照すれば、バルブ２４は当初、試薬を反応容器２６の方へ向けている。
入口２に導入される血液製剤は血漿であることが好ましいから、全血はまず濾別、遠心分離またはその他の沈降手段で重い赤血球を血液製剤から除去して、残った血漿を図１の装置に用いる。このシステムはどのような大きさのバッチに対しても対応する大きさにできるが、濃縮トロンビンの最終体積が凝固接着性蛋白質処理ユニット６０からの寒冷沈降された凝固接着性蛋白質の通常の収率に見合うようにするために、トロンビン処理ユニットに必要とされる血漿は通常９−１０ｍｌである。
図１Ａ及び図１Ｂに示される実施例においては、シールされたバッグ１６および７８が、トロンビン投与注射器４２（および導管６４の差し込み部）および寒冷沈降物保存チューブ７６の両方を覆っており、このようにして両方の保存容器が無菌の外科現場（例えば手術室）に持ち込まれるまで、無菌性が保たれる。その前に、トロンビン処理ユニット４０は図２Ａから図１０までに図示説明されるように作動する。図１Ｂを参照すると、試薬が添加された後、血漿は第１の枝管１２に入り、カップリング１８を通過し、枝管チューブ９３を通って、ケーシング２２の内部に流入する。
ふたたび図１Ａを参照すると、トロンビン処理ユニット４０は図２Ａ 、３Ａ 、４Ａ 、５Ａ 、６Ａ 、７Ａ 、８Ａ 、９Ａ 、および図１０に図示説明されるように作動する。前述したように、液は第１の枝管１２に入り（図１Ａ）、カップリング１８を通過してケーシング２２の内部に流入する。カップリング１８は好ましくは摩擦および／または接着剤によって枝管１２に取り付けられているが、なおトロンビン処理ユニット４０は血漿を受け入れた後、図２に示されるように（例えば図２Ａ）処理セット１０から取り外すことができる（例えば枝管１２を単に抜き取り、あるいはむしり取ることによって取り外され、その後おそらくはヒートシールされる）。接着剤が用いられる場合は、手術室で用いられるのと同様な無菌グレードのものが用いられる。
図３Ａを参照すると、バルブ２４は当初は血漿を反応容器２６の方へ向けている。この反応容器は好ましくはガラス製の内部チューブ２８ａ（図６Ａ）を有しており、該チューブは例えば１５ｍｌの容積（体積）を受け入れることができる。ガラスのチューブ２８ａは好ましくは外側のバレル３２より短く、その中に包み込まれている。前記バレルは好ましくはＰＶＣ製である。ＰＶＣバレル３２の窓３１ａはガラスのチューブ２８ａの内容物を計量し、および／または確認するのに用いられる。計量はガラスのチューブ上の容積（体積）を示す目盛り２９を含んでもよい。反応容器２６のガラスのチューブ２８ａは第１の枝管１２から血漿を内部に受け入れ、これをあらかじめガラスのチューブ２８ａに入れられた後述の試薬と混合する。図７Ａに示されるように、ガラスチューブの内部は好ましくは硼珪酸ガラス、ガラス、またはセラミック製のビーズ２５で、好ましくは部分的にあらかじめ充填されており、このビーズが反応および撹拌を促進する。
図３Ｂを参照すると、バルブ２４は当初は血漿を反応容器２６の方へ向けてある。この反応容器は好ましくは透明ポリカーボネート製のチューブ２８ｂ（図６Ｂ）を有しており、例えば１５ｍｌの容積を受け入れることができる。ポリカーボネートのチューブ２８ｂ上の目盛り３１ｂは、チューブ２８ｂ中の内容物を計量するのに用いられる。反応容器２６のポリカーボネートのチューブ２８ｂは第１の枝管１２から血漿を内部に受け入れ、これをあらかじめポリカーボネート製のチューブ２８ｂに入れられた後述の試薬と混合する。図７Ｂに示されるように、ポリカーボネートのチューブ２８ｂの内部は、好ましくは硼珪酸ガラス、ガラス、またはセラミック製のビーズ２５で、好ましくは部分的にあらかじめ充填されており、このビーズが反応および撹拌を促進する。
図１Ａおよび図３Ａに示される実施例の、第１と第２の端部キャップ３４を有してなる反応容器２６の詳細が、図６Ａ、７Ａおよび図８Ａに示されている。各端部キャップは、中央の、外側に向かって円錐状に先細になったスパウト３６を有し、これは一端部においてバルブ２４に、反対側の端部においてもう一つのバルブ４４に連通している。各スパウト３６は、絞り部４８内に入れられたスクリーン２３によって、ビーズ２５から遮断されている。バルブ２４は三つの枝管を有する。バルブ４４も同様であるが、バルブ４４は、一つの枝管がキャップ４５によって封鎖されているので二股のバルブをなしている。各バルブ２４、４４の一つの枝管は、各キャップ３４から突き出したスパウト３６にそれぞれ連通している。各バルブの一つの枝管と、そのガラスのチューブ２８ａ内部につながるスパウトとの間には液体流通があり、バルブ２４，４４が貫流する流れを制御している。図８Ａに示されるように、キャップ３４は環状の絞り部４８を有しており、これがＰＶＣバレル３２内部の空腔に摩擦的に、および／または接着剤を用いて係止している。このようにして絞り部４８はガラスのチューブ２８ａの端部に係止してこれと密閉的に係合しており、かくして反応容器の内部をＰＶＣバレル３２から遮断している。
図１Ｂおよび図３Ｂに示される実施例の、主としてポリカーボネートからなる反応容器２６の詳細が、第６Ｂ、７Ｂ、および８Ｂ図に示されている。この反応容器２６を形成する第１と第２の端部キャップ３４の詳細が図８Ｂに示されている。各端部キャップは、中央の、外側に向かって円錐状に先細になったスパウト３６を有し、これは一端部においてバルブ２４に、反対側の端部においてもう一つのバルブ４４に連通している。各スパウト３６は、内部の障害物を有し、これが液の通過は許すがビーズ２５の通過を防いでいる。バルブ２４は三つの枝管を有する。バルブ４４も同様であるが、バルブ４４は一つの枝管がキャップ４５によって封鎖されているので二股のバルブをなしている。各バルブ２４、４４の一つの枝管は、各キャップ３４から突き出したスパウト３６にそれぞれ連通している。各バルブの一つの枝管と、そのポリカーボネートのチューブ２８ｂ内部につながるスパウトとの間には液体流通があり、バルブ２４，４４が貫流する流れを制御している。図８Ｂに示されるように、キャップ３４は環状の内部後退部４８を有しており、これがポリカーボネートチューブ２８ｂの内部表面に接着剤によって係止している。
好ましくは、反応容器２６または試薬注射器９５にあらかじめ入れておく試薬はエタノールおよび塩化カルシウムである。図１Ａの実施例については、当初バルブ２４，４４はいずれも試薬がこれを通過しないような方向に向いていて、反応容器を密閉している。図１Ｂを参照すると、当初バルブ２４は血漿が反応容器２６に入らないような方向に、またバルブ４４は反応容器２６と吸引プランジャー５８との間の通過を許すような方向に向いている。ふたたび図１Ａを参照すれば、血漿が処理ユニット６０へポンプ送りされた後、バルブ４４はプランジャー５８への連通を許す方向に回され、バルブ２４は通路２１と反応容器２６との連通を許す方向に向けられる。トロンビン処理ユニット４０を図１Ａの平面に関して垂直に保持した状態でスライドクリップ６が開けられ、注射器のプランジャー５８が矢印Ａの方向へ動かされて反応容器２６中の空気を脱気する。ふたたび図１Ｂを参照すれば、試薬注射器９５が無菌のバリアフィルター９２の解放端に取り付けられる。プランジャー９４が押されて、試薬を無菌のバリアフィルターおよび通路９３を通して反応容器２６に移送する。図１Ａの実施例と同様に図１Ｂにおいても、トロンビン処理ユニット４０を図１Ｂの平面に関して垂直に保持した状態で注射器のプランジャー５８が矢印Ａの方向へ動かされ、反応容器２６中の空気を脱気する。両実施例とも、注射器５６は流れの経路に置かれたフィルター６２を含んでいる。より具体的には、バルブ４４と注射器５６の間の経路４３は流れの経路に置かれたフィルター６２を含んでいる。フィルター６２は無菌的な微生物バリアを提供するので、後でトロンビンを投与注射器４２（図１）に送る際に、プランジャー５８のシール５７まわりからの汚染物が注射器４２に送られることはない。次いで血漿が導管４から反応容器２６に入り、空気を置換する。バルブ２４はフィルター６６の方向へ向けられる。試薬と血漿はビーズ２５の助けで軽く撹拌される（そして約４０ないし７０分間だけ定温放置ないし保温（ｉｎｃｕｂａｔｅ）される）。定温放置ないし保温（ｉｎｃｕｂａｔｅ）後、トロンビン処理ユニット４０は生成したゲルをゆるめて崩すために撹拌される。図１Ｂの実施例においては、トロンビン処理ユニット４０は次いで１０分間以上、水平位置にもどして静置される。その後トロンビン処理ユニット４０は生成したゲルをゆるめて崩すためにふたたび撹拌される。両実施例とも、注射器５６のプランジャーが矢印Ａと反対の方向に動かされてトロンビンを反応容器２６からフィルター６６を通して注射器４２に送る。注射器４２へのトロンビンの送液は注射器４２のプランジャー４３を後退させて、プッシュプルシステムを形成することによって促進される。フィルター６６はトロンビンからゲルを含む粒状物を除去する。
反応容器２６に入れられたトロンビンを撹拌の後１０分間以上静置することによって、後の使用を便にするために粒状物を除去するフィルター６６の効果が促進される。この変換と活性化のための時間によって粒状物がフィルターで十分に除去されるようになり、後でトロンビンをスプレーなどの狭いオリフィスから噴出したり、細いチューブから押し出して用いるのが容易になる。
図９Ａ、９Ｂ，および図１０はフィルター６６の別法を開示している。これは円筒形の外壁６５と端部キャップ３４を含み、各端部キャップは、円筒形のスパウト３７と、それを取り囲む環状の凹部３９を有している。図９Ａに示される別法の実施例は、中心に配置された好ましくはポリウレタンフォーム製の円筒形のフィルター要素６７ａを示している。これに対して図９Ｂに示される中心に配置された円筒形のフィルター要素６７ｂは、好ましくはポリエステルを巻いたものでできている。図９Ｂにはまた好ましくはグラスファイバーまたはポリエステル製の円形のフィルター６８が示されている。いずれの別法実施例においても、フィルター６７ａまたは６７ｂは重量、大きさ、および蛋白質結合によって濾別する。
ふたたび図１Ａおよび図１Ｂを参照して、こんどは凝固接着性蛋白質処理ユニット６０に注目する。トロンビン処理ユニット４０に向けられなかったすべての血漿は、凝固接着性蛋白質処理ユニット６０の内部容器７２に導入される。凝固接着性蛋白質処理ユニット６０は熱交換と回転の操作を受け、これによって血漿から抽出されたすべての凝固接着性蛋白質は容器７２の先端７４に沈殿し、続いて凝固接着性蛋白質収集チューブまたは無菌のパウチ７８に入れられた投与注射器７６によって抜き取られる。容器７２はこの工程の間、汚染を防ぐフィルター通気孔８２によって保護されている。トロンビンが投与注射器４２に充填され、凝固接着性蛋白質が凝固接着性蛋白質収集チューブまたは投与注射器７６に充填されたならば、二つの保存容器４２，７６は処理セット１０から（例えば無菌の取り外し装置で）取り外され、無菌の外科現場の近傍に移される。続いて外側を覆うバッグが開かれ、保存容器４２，７６が取り外されて外科現場に移され、ここで内容物がそれぞれの無菌の３ｃｃプラスチック注射器に分配される。これらは続いてフィブリン接着剤塗布器に充填され、線状または点状に塗布される。トロンビンを凝固接着性蛋白質と混合することによって生物的接着剤が形成される。
両投与注射器４２および７６は、室温、または好ましくはそれぞれの最適条件で保存される。すなわち寒冷沈降物７６は室温で保存され、トロンビン４２は１℃ないし５℃の氷浴中に保存される。図１３から図１６までを参照されたい。
９〜１０ｍｌの室温血漿が反応容器２６に導入されたとする。その他の血漿量も有用である。図１５および図１６を参照されたい。１．０ｍｌの７５ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣＬ２）および２．０ｍｌのエタノール（ＥＴＯＨ）を添加する（すなわちエタノールは１００％の「ストック」瓶から採られて添加され、体積／単位体積でエタノール１８．９％、あるいは重量／単位体積でエタノール１５．０２％を占める）。エタノールに関するその他の試薬量対血漿量の比も有用な相がある（すなわちエタノールは１００％の「ストック」瓶から採られ、塩化カルシウム（ＣａＣＬ２）は７５ｍＭのストック溶液から採られる）。図１３および図１４を参照されたい。トロンビンの寿命は、２．９８秒の凝固時間を保ちつつ少なくとも３００分であることが示されている。エタノールの最終濃度は８．０％から２０．０％（体積／単位体積）の範囲にわたっているが、なお有用である。図１１を参照されたい。
エタノールの最終濃度が体積／単位体積で１８．９％（上述通り）で、塩化カルシウムの最終濃度が５．７ｍＭ（塩化カルシウムの７５ｍＭストック溶液の１ｍｌを採る）である場合、トロンビンの寿命は少なくとも３６０分に延び、この間凝固時間はトロンビンの室温保存において５．９８秒に保たれる。トロンビンを氷浴中で最適の１℃ないし５℃に保存すれば通常、３６０時間において２秒ないし３秒の凝固時間が保たれる。しかしながら塩化カルシウムの、５０ｍＭから２５０ｍＭまでの範囲のストック溶液濃度が有用である。図１２を参照されたい。最終濃度は４．５ｍＭから２３ｍＭの範囲である。
食塩水、希薄ＣａＣＬ２（例えば４０ｍＭないし１２５ｍＭのＣａＣＬ２）などの溶液、あるいは無菌水をトロンビンに加えることによってトロンビンの凝固時間および寿命の両方を変化させることができる。エタノールの最終濃度１８．９％および塩化カルシウムの最終濃度５．７ｍＭが反応容器２６に用いられたとする。トロンビンを水で１．５倍に希釈すると、凝固時間は３０秒弱に伸び、寿命は１５０分までとなる。
以上において本発明を説明したが、以上のように説明され、以下において請求範囲に記載される本発明の範囲および正当な意味から逸脱することなく、多くの構造的な改変および適応がなされ得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、血漿からプロトロンビンを分離し、プロトロンビンを処理してトロンビンとし、プロトロンビン向け以外の血漿を採取してこのものから凝固接着性蛋白質を抽出するための器具の斜視図である。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、血漿からプロトロンビンを分離し、プロトロンビンを処理してトロンビンとし、プロトロンビン向け以外の血漿を採取してこのものから凝固接着性蛋白質を抽出するための器具の斜視図である。
【図２Ａ】
図２Ａは、凝固接着性蛋白質を抽出する処理セットから取り外されたトロンビン処理セットの平面図である
【図２Ｂ】
図２Ｂは、凝固接着性蛋白質を抽出する処理セットから取り外されたトロンビン処理セットの平面図である。
【図３Ａ】
図３Ａは、トロンビン処理ケースの内部の斜視図であり、図２Ａおよび図２Ｂに示されるトロンビン用注射器は取り外されている。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、トロンビン処理ケースの内部の斜視図であり、図２Ａおよび図２Ｂに示されるトロンビン用注射器は取り外されている。
【図４Ａ】
図４Ａは、トロンビン用ケースの上半部の斜視図である。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、トロンビン用ケースの上半部の斜視図である。
【図５Ａ】
図５Ａは、トロンビン用ケースの下半部の斜視図である。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、トロンビン用ケースの下半部の斜視図である。
【図６Ａ】
図６Ａは、図３Ａおよび図３Ｂに示される反応容器２６の部品分解図であり、併せて両端部のバルブ構造を示している。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、図３Ａおよび図３Ｂに示される反応容器２６の部品分解図であり、併せて両端部のバルブ構造を示している。
【図７Ａ】
図７Ａは、図６Ａおよび図６Ｂに示される反応容器およびバルブ構造の断面図である。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、図６Ａおよび図６Ｂに示される反応容器およびバルブ構造の断面図である。
【図８Ａ】
図８Ａは、図７Ａおよび図７Ｂに示される構造の詳細図である。
【図８Ｂ】
図８Ｂは、図７Ａおよび図７Ｂに示される構造の詳細図である。
【図９Ａ】
図９Ａは、図３Ａおよび図３Ｂに用いられる別法のフィルターの部品分解図である。
【図９Ｂ】
図９Ｂは、図３Ａおよび図３Ｂに用いられる別法のフィルターの部品分解図である。
【図１０】
図１０は、図９に示されるものの斜視図である。
【図１１】
図１１は、異なるＥＴＯＨ濃度で分別されたトロンビンの寿命対凝固時間のグラフである。
【図１２】
図１２は、異なるＣａＣＬ２濃度における、異なるＥＴＯＨ濃度で分別されたトロンビンの寿命対凝固時間のグラフである。
【図１３】
図１３はトロンビンの寿命対凝固時間のグラフであり、トロンビンが氷浴中で保存されたときの試薬量による感度を示している。
【図１４】
図１４は、トロンビンの寿命対凝固時間のグラフであり、トロンビンが室温で保存されたときの試薬量による感度を示している。
【図１５】
図１５は、トロンビンの寿命対凝固時間のグラフであり、トロンビンが氷浴中で保存されたときの血漿量による感度を示している。
【図１６】
図１６は、トロンビンの寿命対凝固時間のグラフであり、トロンビンが室温で保存されたときの血漿量による感度を示している。
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成12年8月24日(2000.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から自己由来トロンビンを生成する方法であって、該方法は、
患者から血液製剤を得るステップと、
該製剤から純粋な血漿を分離するステップと、
純粋な血漿フラクションのプロトロンビンを濃縮するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンから粒状物を濾別するステップと、
からなる、患者から自己由来トロンビンを生成する方法。
【請求項２】
凝固時間を変化させるステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】
血漿フラクション中のプロトロンビンを濃縮するためにエタノールを添加することを含む、請求項２の方法。
【請求項４】
変換するステップがカルシウムイオン源の添加を含む、請求項３の方法。
【請求項５】
純粋な血漿を得るために血液製剤を遠心分離することを含む、請求項４の方法。
【請求項６】
食塩水、ＣａＣｌ２溶液、および無菌水からなるグループのいずれかによってトロンビンを希釈することによって凝固時間の予測可能な延長が起こる、請求項２の方法。
【請求項７】
重量、大きさ、及び蛋白質結合によって血漿を濾別することを含む、請求項６の方法。
【請求項８】
１５分間以上にわたって安定な、凝固の早い自己由来トロンビンを製造する方法であって、該方法は、
純粋な血漿からプロトロンビンを分離し、プロトロンビンをトロンビンに変換するステップ、を含む、自己由来トロンビンを製造する方法。
【請求項９】
５秒未満の急速な凝固を提供し、かつ、１５分間超にわたって安定な、自己由来トロンビン。
【請求項１０】
必須的に、
純粋な血漿、
エタノール（ＥＴＯＨ）、
ＣａＣｌ２、
からなる、血漿からトロンビンを抽出するための組成物。
【請求項１１】
いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが１８．９％存在し、ＣａＣｌ２が２３．０ｍＭ存在する、請求項１０の組成物。
【請求項１２】
いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが１８．９％存在し、ＣａＣｌ２が５．７ｍＭ存在する、請求項１０の組成物。
【請求項１３】
いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが８％から２０％の範囲で存在し、ＣａＣｌ２が４．５ｍＭから２３．０ｍＭの範囲で存在する、請求項１０の組成物。
【請求項１４】
トロンビンの調製方法であって、該方法は、
純粋な血漿を得ること、
純粋な血漿にＥＴＯＨおよびＣａＣｌ２を添加して組成物を形成すること、
組成物を撹拌すること、
粒状の組成物を濾別して、トロンビンをフィルター通過させること、
からなる、トロンビンの調製方法。
【請求項１５】
組成物の撹拌に続いて１０分間またはそれ以上の時間、組成物を定温放置する、請求項１４の方法。
【請求項１６】
組成物を濾別する前に組成物を再撹拌する、請求項１５の方法。
【請求項１７】
血漿からトロンビンを調製するための装置であって、該装置は、
ＣａＣｌ２溶液とＥＴＯＨを入れた反応容器と、
前記反応容器に純粋な血漿を導入する手段と、
前記反応容器に結合されてトロンビンを受け入れるトロンビン受入注射器と、
前記反応容器と前記トロンビン受入注射器との間に置かれたフィルターと、
からなる、血漿からトロンビンを調製するための装置。
【請求項１８】
単一提供者の生物的接着剤を処理するための装置であって、該装置は、
トロンビン処理手段と、
前記トロンビン処理手段に操作可能に結合された凝固接着性蛋白質処理手段と、
血漿をその後前記トロンビン処理手段内のトロンビンと前記凝固接着性蛋白質処理手段内の凝固接着性蛋白質とにそれぞれ変換するために、前記操作可能の結合部を介して血漿を受け入れる手段と、
を組み合わせてなる、単一提供者の生物的接着剤を処理するための装置。
【請求項１９】
血漿からトロンビンを調製するための装置であって、該装置は、
セラミックビーズまたは硼珪酸ガラスを入れた反応容器と、
前記反応容器に試薬を導入する手段と、
前記反応容器に血漿を導入する手段と、
前記反応容器に結合されてトロンビンを受け入れるトロンビン受入注射器と、
前記反応容器と前記トロンビン受入注射器との間に置かれたフィルターと、
からなる、血漿からトロンビンを調製するための装置。
【請求項２０】
試薬はＣａＣｌ２およびＥＴＯＨの溶液を含む、請求項１９の装置。
【請求項２１】
血漿をガラスビーズと接触させるステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２２】
必須的に、
血漿、
エタノール（ＥＴＯＨ）、
ＣａＣｌ２、
ガラスビーズ、
からなる、血漿からトロンビンを抽出するための組成物。
【請求項２３】
いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが１８．９％存在し、ＣａＣｌ２が２３．０ｍＭ存在する、請求項２２の組成物。
【請求項２４】
いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが１８．９％存在し、ＣａＣｌ２が５．７ｍＭ存在する、請求項２２の組成物。
【請求項２５】
いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが８％から２０％の範囲で存在し、ＣａＣｌ２が４．５ｍＭから２３．０ｍＭの範囲で存在する、請求項２２の組成物。
【請求項２６】
血漿からトロンビンを調製するための器具であって、該器具は、
ＣａＣｌ２およびエタノールを受け入れる反応容器と、該反応容器に血漿を注入するための手段と、
トロンビンを前記反応器から受け入れるために前記反応容器に接続された注射器と、
前記反応容器とトロンビンを受け入れるための注射器との間に置かれたフィルターと、
からなる、血漿からトロンビンを調製するための器具。
【請求項２７】
前記反応容器内にガラスビーズを含む、請求項２６の器具。
【請求項２８】
トロンビンを生成して、投与する方法であって、該方法は、
単一の人物から全血を採取するステップと、
該全血からプロトロンビンを分離するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
注射器にトロンビンを充填するステップと、
止血するために、トロンビンをある部位に適用するステップと、
からなる、トロンビンを生成して、投与する方法。
【請求項２９】
別の注射器に凝固蛋白質を充填し、トロンビンと同時に該凝固蛋白質を投与することを含む、請求項２８の方法。
【請求項３０】
単一の人物からトロンビンを生成する方法であって、該方法は、
該人物から採取された血漿からプロトロンビンを分離するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換し、そこから粒状物を除去するステップと、
からなる、トロンビンを生成する方法。
【請求項３１】
トロンビンの凝固時間を変化させるために、トロンビンを希釈することをさらに含む、請求項３０の方法。
【請求項３２】
カルシウムイオン源を添加して、凝固時間を変化させることを含む、請求項３１の方法。
【請求項３３】
ＣａＣｌ２を添加して、凝固時間を変化させることを含む、請求項３２の方法。
【請求項３４】
食塩水を添加して、凝固時間を変化させることを含む、請求項３１の方法。
【請求項３５】
無菌水を添加して、凝固時間を変化させることを含む、請求項３１の方法。
【請求項３６】
凝固時間を変化させるステップは、カルシウムイオン源を添加することを含む、請求項２の方法。
【請求項３７】
凝固時間を変化させるステップは、ＣａＣｌ２を添加することを含む、請求項２の方法。
【請求項３８】
凝固時間を変化させるステップは、食塩水を添加することを含む、請求項２の方法。
【請求項３９】
凝固時間を変化させるステップは、無菌水を添加することを含む、請求項２の方法。
【請求項４０】
単一の人物からトロンビンを生成する方法であって、該方法は、
該人物から全血を採取するステップと、
全血から血漿を得るステップと、
血漿内のプロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
血漿から該トロンビンを分離するステップと、
からなる、トロンビンを生成する方法。
【請求項４１】
トロンビンの凝固時間を５秒以内に凝固するように変化させるステップを含む、請求項４０の方法。
【請求項４２】
凝固時間を変化させるステップは、カルシウムイオン源を添加することを含む、請求項４１の方法。
【請求項４３】
凝固時間を変化させるステップは、ＣａＣｌ２を添加することを含む、請求項４２の方法。
【請求項４４】
凝固時間を変化させるステップは、食塩水を添加することを含む、請求項４１の方法。
【請求項４５】
凝固時間を変化させるステップは、無菌水を添加することを含む、請求項４１の方法。
【請求項４６】
トロンビンを１５分以上にわたって安定させるようにすることを含む、請求項４０の方法。
【請求項４７】
カルシウムイオン源を添加して、凝固時間を変化させることを含む、請求項４６の方法。
【請求項４８】
ＣａＣｌ２を添加して、凝固時間を変化させることを含む、請求項４７の方法。
【請求項４９】
食塩水を添加して、凝固時間を変化させることを含む、請求項４６の方法。
【請求項５０】
無菌水を添加して、凝固時間を変化させることを含む、請求項４６の方法。
【請求項５１】
血漿に試薬ＥＴＯＨおよびＣａＣｌ２を添加して、その後攪拌を行って、トロンビンを形成するステップを含む、請求項１の方法。
【請求項５２】
単一の人物から全血を採取するステップと、
該全血からプロトロンビンを分離するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
注射器にトロンビンを充填するステップと、
止血するために、トロンビンをある部位に適用するステップと、
をさらに含む、請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記トロンビン処理手段に結合され、該トロンビン処理手段からトロンビンを受け入れるためのトロンビン注射器であって、最初はバッグ内に安置されている前記トロンビン注射と、
前記凝固接着性蛋白質処理手段に結合され、該凝固接着性蛋白質処理手段から凝固接着性蛋白質を受け入れるための凝固接着性蛋白質注射器であって、最初はバッグ内に安置されている前記凝固接着性蛋白質注射器と
を含む、請求項１８の装置。
【手続補正書】
【提出日】平成13年6月15日(2001.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【書類名】明細書
【特許請求の範囲】
【請求項１】患者から自己由来トロンビンを生成する方法であって、該方法は、
患者から血液製剤を得るステップと、
血液製剤から純粋な血漿を分離するステップと、
血漿にエタノールを添加して、プロトロンビンを含有する溶液を調製するステップと、
溶液中のプロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンを濾別して、粒状物を除去するステップと、
トロンビンを患者に適用するステップと、
からなる、患者から自己由来トロンビンを生成する方法。
【請求項２】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３】変換するステップがカルシウムイオン源の添加を含む、請求項２の方法。
【請求項４】純粋な血漿を得るために血液製剤を遠心分離することを含む、請求項３の方法。
【請求項５】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、食塩水、ＣａＣｌ２溶液、および無菌水からなるグループのいずれかによってトロンビンを希釈することを含む、請求項２の方法。
【請求項６】重量、大きさ、及び蛋白質結合によって血漿を濾別することを含む、請求項５の方法。
【請求項７】１５分間以上にわたって安定な、凝固の早い自己由来トロンビンを製造する方法であって、該方法は、
エタノールを使用して、純粋な血漿からプロトロンビンを分離し、プロトロンビンをトロンビンに変換するステップ、を含む、自己由来トロンビンを製造する方法。
【請求項８】エタノールを用いて調製された自己由来トロンビンであって、５秒未満の急速な凝固を提供し、かつ、１５分間超にわたって安定な、自己由来トロンビン。
【請求項９】必須的に、
純粋な血漿、
エタノール（ＥＴＯＨ）、
ＣａＣｌ２、
からなる、血漿からトロンビンを抽出するための組成物。
【請求項１０】いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが１８．９％存在し、ＣａＣｌ２が２３．０ｍＭ存在する、請求項９の組成物。
【請求項１１】いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが１８．９％存在し、ＣａＣｌ２が５．７ｍＭ存在する、請求項９の組成物。
【請求項１２】いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが８％から２０％の範囲で存在し、ＣａＣｌ２が４．５ｍＭから２３．０ｍＭの範囲で存在する、請求項９の組成物。
【請求項１３】必須的に、
純粋な血漿を得ること、
純粋な血漿にＥＴＯＨおよびＣａＣｌ２を添加して組成物を形成すること、
組成物を撹拌すること、
粒状の組成物を濾別して、トロンビンをフィルター通過させること、
からなる、トロンビンの調製方法。
【請求項１４】組成物の撹拌に続いて１０分間またはそれ以上の時間、組成物を定温放置する、請求項１３の方法。
【請求項１５】組成物を濾別する前に組成物を再撹拌する、請求項１４の方法。
【請求項１６】血漿からトロンビンを調製するための装置であって、該装置は、
ＣａＣｌ２溶液とＥＴＯＨを入れた反応容器と、
前記反応容器に純粋な血漿を導入する手段と、
前記反応容器に結合されてトロンビンを受け入れるトロンビン受入注射器と、
前記反応容器と前記トロンビン受入注射器との間に置かれたフィルターと、
からなる、血漿からトロンビンを調製するための装置。
【請求項１７】単一提供者の生物的接着剤を処理するための装置であって、該装置は、
トロンビン処理手段と、
前記トロンビン処理手段に操作可能に結合された凝固接着性蛋白質処理手段と、
血漿をその後前記トロンビン処理手段内のトロンビンと前記凝固接着性蛋白質処理手段内の凝固接着性蛋白質とにそれぞれ変換するために、前記操作可能の結合部を介して血漿を受け入れる手段と、
を組み合わせてなる、単一提供者の生物的接着剤を処理するための装置。
【請求項１８】血漿からトロンビンを調製するための装置であって、該装置は、
セラミックビーズまたは硼珪酸ガラスを入れた反応容器と、
前記反応容器に試薬を導入する手段と、
前記反応容器に血漿を導入する手段と、
前記反応容器に結合されてトロンビンを受け入れるトロンビン受入注射器と、
前記反応容器と前記トロンビン受入注射器との間に置かれたフィルターと、
からなる、血漿からトロンビンを調製するための装置。
【請求項１９】試薬はＣａＣｌ２およびＥＴＯＨの溶液を含む、請求項１８の装置。
【請求項２０】血漿をガラスビーズと接触させるステップをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項２１】必須的に、
血漿、
エタノール（ＥＴＯＨ）、
ＣａＣｌ２、
ガラスビーズ、
からなる、血漿からトロンビンを抽出するための組成物。
【請求項２２】いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが１８．９％存在し、ＣａＣｌ２が２３．０ｍＭ存在する、請求項２１の組成物。
【請求項２３】いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが１８．９％存在し、ＣａＣｌ２が５．７ｍＭ存在する、請求項２１の組成物。
【請求項２４】いずれも体積による最終濃度としてＥＴＯＨが８％から２０％の範囲で存在し、ＣａＣｌ２が４．５ｍＭから２３．０ｍＭの範囲で存在する、請求項２１の組成物。
【請求項２５】血漿からトロンビンを調製するための器具であって、該器具は、
ＣａＣｌ２およびエタノールを受け入れる反応容器と、該反応容器に血漿を注入するための手段と、
トロンビンを前記反応容器から受け入れるために前記反応容器に接続された注射器と、
前記反応容器とトロンビンを受け入れるための注射器との間に置かれたフィルターと、
からなる、血漿からトロンビンを調製するための器具。
【請求項２６】前記反応容器内にガラスビーズを含む、請求項２５の器具。
【請求項２７】トロンビンを生成して、投与する方法であって、該方法は、
人から全血を採取するステップと、
エタノールを用いて、該全血からプロトロンビンを分離するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
注射器にトロンビンを充填するステップと、
止血するために、注射器を用いてトロンビンを投与するステップと、
からなる、トロンビンを生成して、投与する方法。
【請求項２８】別の注射器に凝固蛋白質を充填し、トロンビンと同時に該凝固蛋白質を投与することを含む、請求項２７の方法。
【請求項２９】単一の人物からトロンビンを生成する方法であって、該方法は、
エタノールを用いて、単一の人物から採取された血漿からプロトロンビンを分離するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンから粒状物を除去するステップと、
からなる、トロンビンを生成する方法。
【請求項３０】トロンビンを希釈して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることをさらに含む、請求項２９の方法。
【請求項３１】カルシウムイオン源を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項３０の方法。
【請求項３２】ＣａＣｌ２を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項３１の方法。
【請求項３３】食塩水を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項３０の方法。
【請求項３４】無菌水を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項３０の方法。
【請求項３５】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、カルシウムイオン源を添加することを含む、請求項２の方法。
【請求項３６】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、ＣａＣｌ２を添加することを含む、請求項２の方法。
【請求項３７】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、食塩水を添加することを含む、請求項２の方法。
【請求項３８】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、無菌水を添加することを含む、請求項２の方法。
【請求項３９】単一の人物からトロンビンを生成する方法であって、該方法は、
単一の人物から全血を採取するステップと、
全血から血漿を得るステップと、
エタノールを血漿に添加して、プロトロンビンを含有する溶液を調製するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンを分離するステップと、
からなる、トロンビンを生成する方法。
【請求項４０】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を約２秒ないし約５秒の間の時間に変化させるステップを含む、請求項３９の方法。
【請求項４１】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、カルシウムイオン源を添加することを含む、請求項４０の方法。
【請求項４２】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、ＣａＣｌ２を添加することを含む、請求項４１の方法。
【請求項４３】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、食塩水を添加することを含む、請求項４０の方法。
【請求項４４】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、無菌水を添加することを含む、請求項４０の方法。
【請求項４５】トロンビンを約１５分ないし３６０分の間の時間にわたって安定させるようにすることを含む、請求項３９の方法。
【請求項４６】カルシウムイオン源を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項４５の方法。
【請求項４７】ＣａＣｌ２を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項４６の方法。
【請求項４８】食塩水を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項４５の方法。
【請求項４９】無菌水を添加して、トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させることを含む、請求項４５の方法。
【請求項５０】前記トロンビン処理手段に結合され、該トロンビン処理手段からトロンビンを受け入れるためのトロンビン注射器であって、最初はバッグ内に安置されている前記トロンビン注射と、
前記凝固接着性蛋白質処理手段に結合され、該凝固接着性蛋白質処理手段から凝固接着性蛋白質を受け入れるための凝固接着性蛋白質注射器であって、最初はバッグ内に安置されている前記凝固接着性蛋白質注射器と
を含む、請求項１７の装置。
【請求項５１】患者から自己由来トロンビンを生成する方法であって、該方法は、必須的に、
患者から血液製剤を得るステップと、
血液製剤から血漿を分離するステップと、
血漿にエタノールを添加して、プロトロンビンを含有する溶液を調製するステップと、
溶液中のプロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンを濾別して、粒状物を除去するステップと、
患者にトロンビンを適用するステップと
からなる、患者から自己由来トロンビンを生成する方法。
【請求項５２】トロンビンを生成して、投与する方法であって、該方法は、必須的に、
人から全血を採取するステップと、
エタノールを用いて、該全血からプロトロンビンを分離するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
注射器にトロンビンを充填するステップと、
止血するために、注射器を用いてトロンビンを投与するステップと、
からなる、トロンビンを生成して、投与する方法。
【請求項５３】単一の人物からトロンビンを生成する方法であって、該方法は、必須的に、
エタノールを用いて、単一の人物から採取された血漿からプロトロンビンを分離するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、、
トロンビンから粒状物を除去するステップと、
からなる、トロンビンを生成する方法。
【請求項５４】単一の人物からトロンビンを生成する方法であって、該方法は、必須的に、
単一の人物から全血を採取するステップと、
全血から血漿を得るステップと、
エタノールを血漿に添加して、プロトロンビンを含有する溶液を調製するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンを分離するステップと、
からなる、トロンビンを生成する方法。
【請求項５５】エタノールは、単位体積当たりの体積率で約８％ないし約２０％の濃度で存在する、請求項５４の方法。
【請求項５６】エタノールは、単位体積当たりの体積率で約１８．９％の濃度で存在する、請求項５５の方法。
【請求項５７】トロンビンを生成するに要する時間は、約３０分ないし約７５分の間である、請求項５４の方法。
【請求項５８】トロンビンを生成するに要する時間は、約１時間より短く、０分よりも長い、請求項５４の方法。
【請求項５９】変換するステップは、ＣａＣｌ２を添加することを含む、請求項５４の方法。
【請求項６０】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を約２秒ないし約５秒の間の時間に変化させるステップをさらにを含む、請求項５４の方法。
【請求項６１】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、カルシウムイオン源を添加することを含む、請求項６０の方法。
【請求項６２】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、ＣａＣｌ２を添加することを含む、請求項６１の方法。
【請求項６３】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、食塩水を添加することを含む、請求項６０の方法。
【請求項６４】トロンビンがフィブリノゲンをフィブリン凝塊に変換するのに必要な時間を変化させるステップは、無菌水を添加することを含む、請求項６０の方法。
【請求項６５】トロンビンを約１５分ないし３６０分の間の時間にわたって安定させるようにすることを含む、請求項５４の方法。
【請求項６６】トロンビンを生成する方法であって、該方法は、必須的に、
人物から全血を採取するステップと、
全血から血漿を得るステップと、
エタノールを血漿に添加して、プロトロンビンを含有する溶液を調製するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンを分離するステップと、
からなる、トロンビンを生成する方法。
【請求項６７】血漿を酸化させるステップを伴わない、単一の人物からトロンビンを生成する方法であって、該方法は、
単一の人物から全血を採取するステップと、
全血から血漿を得るステップと、
エタノールを血漿に添加して、プロトロンビンを含有する溶液を調製するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンを分離するステップと、
からなり、よってプロトロンビンを含有する溶液のｐＨを上げるためにアルカリ性化学物質を添加する必要がない、トロンビンを生成する方法。
【請求項６８】単一の人物からトロンビンを生成する方法であって、該方法は、
単一の人物から全血を採取するステップと、
全血から血漿を得るステップと、
血漿のｐＨを下げるために酸を添加せず、エタノールを血漿に添加して、プロトロンビンを含有する溶液を調製するステップと、
プロトロンビンを含有する溶液のｐＨを上げるためにアルカリ性化学物質を添加せず、プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンを分離するステップと、
からなる、トロンビンを生成する方法。
【請求項６９】必須的に、
エタノールを用いて、単一の人物から採取された血漿からプロトロンビンを分離するステップと、
プロトロンビンをトロンビンに変換するステップと、
トロンビンから粒状物を除去するステップと、
からなるプロセスによって調製されたトロンビン。
【発明の詳細な説明】
（技術分野）
以下に述べる発明は一般的に、所与の単位の血漿から高い比活性を有するトロンビン酵素を調製することに関する。このトロンビン酵素は十分に安定であって、室温またはそれ以下に保たれるときは、フィブリノゲンに富む凝固接着性蛋白質溶液を急速に凝固させる能力を６時間以上にわたって保つ。
（背景技術）
フィブリン密封剤の処方は凝固カスケード反応の最後のステップを模倣したものである。この反応においてトロンビン酵素はフィブリノゲンを開裂し、開裂したフィブリノゲンは架橋して半固体または可撓性のフィブリン凝塊となる。このフィブリン凝塊は創傷部に接着して、液の浸出に対する障壁を形成するとともに組織間の接着をもたらし、かくして処置部に止血および治癒能力を提供する。
今日市販されている、出願者のクリオシールＴＭシステムは、提供者の血漿から約１時間で、フィブリノゲンおよび第八因子を含む、寒冷沈降され、濃縮された凝固接着性蛋白質を採取する装置である。血液銀行で常用されている、１日ないし２日を要する寒冷沈降工程に較べれば、クリオシールＴＭシステムが提供する約１時間の寒冷沈降採取が意味するところは大きい。すなわちクリオシールＴＭシステムによる凝固接着性蛋白質の採取を、手術周辺環境で患者をそばにして行うことができ、したがって何日も前から工程を開始する必要を避けることができる。
このようなクリオシールＴＭ採取された凝固接着性蛋白質は、ウシまたはヒト・トロンビンと組み合わされて、外科手術の止血および組織接着に有用な生物的接着剤を形成する。しかしながら市販のトロンビンは一般にウシまたはヒトのプールされた血漿から由来しているので、患者は依然として望ましくない免疫反応や、血液中の感染性ウイルスおよび可能性としてはクロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）すなわり新変異型ＣＪＤ（ＮＶＣＪＤ）による汚染の危険にさらされている。クリオシールＴＭ寒冷沈降の発明の一つの利点は、採取された凝固接着性蛋白質が患者自身の血液に由来しているので、このような凝固接着性蛋白質を患者の外科的創傷部に局所的に適用するときに、血液感染性の病気による汚染の危険が避けられるということにある。
しかしながら、外科手術患者の最も安全な条件は、凝固接着性蛋白質を採取したのと同じ提供者からトロンビン成分を採取して、二成分生物的密封剤を調製すること−すなわち完全に自己由来の生物的密封剤ないし接着剤を形成することによってもたらされる、ということは以前から理解されていた。
患者に由来するトロンビンおよび／またはフィブリノゲンを当該の患者に行われる医学的処置に利用するという発想は新規なものではなく、１９７４年にアンドリャノヴァが最初に記述している。約２０年後、セデルホルム−ウィリアムスのＰＣＴ特許（ＷＯ９４／００５６６−６、１９９４年１月６日およびその関連米国特許第５，７９５，７８０号）が改良されたフィブリン接着剤を記載しており、ここではトロンビン成分は遠心分離、中間的沈殿物の分離、血液のイオン強度および血漿のＰＨの調整等を含む１３のステップを要して得られ、これも同じ提供者の血漿に由来するフィブリノゲン成分と組み合わされる。しかしながらこのような多くの調製ステップは非常に時間を要するので、処理時間が１時間以内でなければならない手術周辺環境での用途には実用的ではない。本発明は、とりわけ、ｐＨの調整によって希釈されていないことで識別できる。
３年後、１９７７年にヒルシュ等（米国特許第５，６４３，１９２号およびその関連国際出願ＷＯ９６／３１２４５）が、上記セデルホルム−ウィリアムスに続いて、フィブリノゲンおよびトロンビン成分が同一提供者の血漿から由来する、他のフィブリン接着剤調製法を教示した。ヒルシュ特許は血漿中のフィブリノゲンの大部分を最初に沈殿除去して上澄みを調製し、次いでこの上澄み中の残部のフィブリノゲンを凝固させるトロンビン調製法を記載している。この方法はセデルホルム−ウィリアムスが教示する方法とは異なってより単純であるが、商業的に有用なトロンビンは得られない。なぜならば（ヒルシュ等の図１参照）このトロンビンが５秒以下の凝固速度を与えるのはわずか４分間に過ぎず、１０秒未満の凝固速度を与えるのはわずか４７分間に過ぎないからである。本発明は、とりわけ、フィブリノゲンを析出しないことなど、血漿が処理されないことで識別できる。
このような凝固速度は外科医の要求には合致しない、なぜならば外科医はヒルシュ等のフィブリン接着剤の限界前後で外科手術全体の計画をたてることは不可能だからである。
外科医はほとんどの場合、止血および組織密封または接着のために速効性（＜５秒）の凝固時間を必要とする。凝固の遅い生物的接着剤（＞５秒）は毛細管出血および出血によって、しばしば機能を果たす前に外科的創傷部から洗い去られてしまう。ヒルシュのフィブリン接着剤を使用する外科医は、ヒルシュ接着剤処置によって行おうとする止血および組織密封が、凝固時間が５秒未満に収まる４分間の枠内に行われるように、外科手術を組むことが要求されるが、これはほとんどの外科手術にとってヒルシュ発明を全く非実用的なものにしている。なぜならば６時間に及ぶこともある外科手術の全経過にわたって、急速な止血と組織接着が要求されることがほとんどだからである。
以下に挙げる先行技術は出願者が知るところの先端技術を反映しており、関係する先行技術を開示すべき出願者の義務を果たすために包含されたものである。しかしながらこれらの参考文献のなかに、以下において詳細に開示し、具体的に請求する本発明の概念を、単独で教示したり、あるいは全ての考えられる組み合わせにおいて明白にしたりするものはない。
米国特許文献
2004500026.tif 000049
2004500026.tif 000050
外国特許文献
2004500026.tif 000051
その他の先行技術（著者、題名、関係ページ、日付、等を含む）
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Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌ， Ｊ．他、”Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ Ｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｇｌａｓｓ Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ： Ｒｏｌｅ Ｏｆ Ａｄｈｅｓｉｖｅ Ｐｌａｔｅｌｅｔα−Ｇｒａｎｕｌｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”、Ｔｈｒｏｍｏｓｉｓ ａｎｄ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ、第 ６２（３）巻、９８９−９９５ページ、１９８９年。
Ｓｕｚｕｋｉ， Ｓ．他、”Ａ Ｓｔｕｄｙ Ｏｎ Ｔｈｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ”、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第 ５３（３）巻、２７１−２７７ページ、１９８９年。
Ｒｏｎｆａｒｄ， Ｖ．他、”Ｕｓｅ Ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｏｎ Ｆｉｂｒｉｎ Ｇｌｕｅ Ｉｎ Ｔｈｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｏｆ Ｂｕｒｎ Ｗｏｕｎｄｓ”、Ｂｕｒｎｓ、第 １７（３）巻、１８１−１８４ページ、１９９１年。
Ｂｒｅｎｎａｎ， Ｍ．、”Ｆｉｂｒｉｎ Ｇｌｕｅ”、Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖｉｅｗｓ、第 ５巻、２４０−２４４ページ、１９９１年。
ＤｅＰａｌｍａ， Ｌ．他、”Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｏｆ Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ Ｆｏｒ Ｕｓｅ Ａｓ Ｆｉｂｒｉｎ Ｇｌｕｅ Ｂｙ Ｆｏｕｒ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ”、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、第３３（９）巻、７１７−７２０ページ、１９３３年。
ＭｃＣａｒｔｈｙ， Ｐ． ”Ｆｉｂｒｉｎ Ｇｌｕｅ Ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｔｉｃ Ｓｕｒｇｅｒｙ”、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、第 ７（３）巻、１７３−１７９ページ、１９９３年。
Ｃｅｄｅｒｈｏｌｍ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｓ．、”Ｂｅｎｅｆｉｔｓ Ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｆｉｂｒｉｎ Ｇｌｕｅ Ｉｎ Ｓｋｉｎ Ｇｒａｆｔｉｎｇ”、Ｔｈｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｕｓｔｒａｌｉａ、第 １６１（９）巻、５７５ページ、１９９４年。
Ｃｅｄｅｒｈｏｌｍ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ， Ｓ．、”Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｆｉｂｒｉｎ Ｓｅａｌａｎｔｓ Ａｒｅ Ｎｏｔ Ｙｅｔ Ａｖａｉｌａｂｌｅ”、Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ、第 ３４４巻、３３６ページ、１９９４年。
Ｗｉｅｇａｎｄ， Ｄ．Ａ．他、”Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｏｆ Ｃｒｙｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ−Ｔｈｒｏｍｂｉｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｄｕｒａｌ Ｒｅｐａｉｒ”、Ｈｅａｄ ＆ Ｎｅｃｋ、５６９−５７３ページ、１９９４年。
上に列挙したその他の先行技術は、そのすべてについて具体的に論評しないが、出願者の知るところの先行技術を網羅したものである。これらの論評されない参考文献は、以下に具体的に特徴を述べる本発明とは、さらに明瞭に異なっている。
（発明の開示）
本発明は、長い手術時間（例えば６時間）にわたって急速な（＜５秒）凝固を提供するような安定なヒト・トロンビンを、提供者の血液から調製するための簡単で実用的で早い方法という、長い間感じられていた必要性に指向されたものであり、またこのヒト・トロンビンを、同じ単位の血液から採取され、濃縮された凝固接着性蛋白質と組み合わせることによって、患者を微生物やＣＪＤまたはＮＶＣＪＤによる汚染にさらすことのない生物的密封剤を形成することに指向されたものである。この分野におけるこれまでの研究（ヒルシュ等）によって提示されたトロンビンは最小限度の安定性しかなかった、すなわちこのトロンビンは４分ないし５分という非常に短い時間の間しか、急速な（つまり５秒未満の）フィブリノゲン凝固を達成できなかった。またそれは非常に多くのステップと経過時間を要するために、手術周辺での調製に適しなかった。これら二つの事情は広範囲の手術に対して全く非実用的であった。
本発明が提供する安定なトロンビン酵素は、６時間に達する経過時間にわたって−すなわち長時間の手術であっても、その間にわたって−凝固接着性蛋白質の急速な、または緩徐な重合を、正確に再現性良く起こさせることができる。さらに、すべて単一の提供者に由来する凝固接着性蛋白質およびトロンビンを用いることによって、市販のフィブリン接着剤を使用することによって生じる様々な病気の危険が排除される。市販のフィブリン接着剤においては、フィブリンは何千人という提供者からプールされた血漿に由来しており、トロンビンは同様なプールされたヒト血漿に由来するか、またはウシ由来のものである。本発明による安定なトロンビンの製造は早くて簡単なので、手術処置の直前またはその過程で調製することが可能になり、得られたトロンビンは最も長時間の手術においても、その間にわたって急速凝固を提供する。本発明によって製造されたトロンビンは食塩水（生理食塩水）、水、または希薄ＣａＣｌ２溶液（例えば１２５ｍＭのＣａＣｌ２）に希釈可能であり、希釈によって正確な、より遅い凝固時間を提供する。このようにして、５秒未満から２分間以上にわたる任意の凝固時間が得られる。
本発明の方法は好ましくは三つのステップからなり、そのはじめの二つのステップは好ましくは同時に行われる。
１．アルコール、好ましくはエタノール、を用いてプロトロンビンの濃度を実質的に高めることによって、プロトロンビンが濃縮されたフラクションを調製し、同時に血漿中に自然に存在するフィブリノゲンやアンチトロンビンＩＩＩなどの成分を除去または変性する。これらの成分はプロトロンビンに結合し、封鎖し、または介在して、プロトロンビンが活性化して長寿命の機能性トロンビンになるのを阻害する。
２．濃縮されたプロトロンビン溶液にカルシウムイオンを加えて軽く撹拌し、プロトロンビンを安定な長寿命トロンビンに変換する。
３．トロンビン溶液をフィルターを通して押し出して、粒状物（粒状物質）を除去する。この粒状物はトロンビンを創傷部上に狭いオリフィスからスプレーしたり、細いチューブから押し出すのを妨げる。
（産業上の利用の可能性）
本発明の産業上の利用の可能性は、以下に述べる本発明の目的の説明により明らかとなる。
すなわち、本発明の第１の目的は、提供者の血漿から速効性かつ安定な自己由来トロンビンを得るための、新式かつ新規な装置および方法を提供することである。
本発明の他の目的は、関連するほとんどの外科処置よりも可使用時間の長い、上記特徴のトロンビンを提供することである。
本発明の他の目的は、食塩水希釈によって凝固時間を任意にかつ予知可能に延長できるような、前記特徴のトロンビンを提供することである。
本発明の他の目的は、単純な調製工程を有する、前記特徴のトロンビンを提供することである。
本発明の他の目的は、短くて３０分、長くても７０分の工程時間を有する、前記特徴のトロンビンの製造方法を提供することである。
本発明の他の目的は、狭いオリフィスからスプレーしたり、細いチューブから押し出すことのできるトロンビンを提供することである。
第１の利点から見れば本発明の目的は、エタノール分別によってプロトロンビン濃度を増加させて実質的に濃縮すると同時に、不純物としての蛋白質を除去したプロトロンビンのフラクションから、安定なヒト・トロンビンを製造するための、新規かつ実用的な方法を提供することである。濃縮されたプロトロンビンに塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）を添加することによって、プロトロンビンはトロンビンに変換される。同じ単一の提供者の血漿から、他の方法によって凝固接着性蛋白質が同時に得られ、自己由来の生物的接着剤に必要な第２の成分となる。
第２の利点から見れば本発明の目的は、患者から自己由来のトロンビンを生成する方法を提供することであり、該方法は患者から血液製剤を得るステップ、得られた血液製剤から血漿を分離するステップ、血漿フラクション中のプロトロンビンを濃縮するステップ、プロトロンビンをトロンビンに変換するステップ、およびトロンビンから粒状物を濾別するステップ、の各ステップを含む。
第３の利点から見れば本発明の目的は、１５分間超にわたって安定な自己由来トロンビンを製造するための方法を提供することであり、該方法は血漿からプロトロンビンを分離するステップ、およびプロトロンビンをトロンビンに変換するステップを含む。
第４の利点から見れば本発明の目的は、１５分間超にわたって５秒未満の急速な凝固を提供する自己由来トロンビンを提供することである。
第５の利点から見れば本発明の目的は、必須的に血漿、エタノール（ＥＴＯＨ）、ＣａＣｌ２からなる、血漿からトロンビンを抽出するための組成物を提供することである。
第６の利点から見れば本発明の目的は、トロンビンの調製方法を提供することであり、該方法は：血漿を採取すること、血漿にＥＴＯＨおよびＣａＣｌ２を添加して組成物を形成すること、組成物を撹拌すること、組成物を静置モードまたは振動モードで定温放置ないし保温（ｉｎｃｕｂａｔｅ）すること、組成物から粒状物を濾別し、トロンビンをフィルター通過させること、からなる。
第７の利点から見れば本発明の目的は、血漿からトロンビンを製造するための装置を提供することであり、該装置はＣａＣｌ２溶液およびＥＴＯＨを入れた反応容器と、血漿を反応容器中に導入する手段と、反応容器に結合されてトロンビンを受け入れるためのトロンビン受入注射器と、反応容器とトロンビン受入注射器の中間に位置するフィルターと、からなる。
第８の利点から見れば本発明の目的は、自己由来の生物的接着剤を処理する装置を提供することであり、該装置はトロンビン処理手段と、トロンビン処理手段に操作可能に結合された凝固接着性蛋白質処理手段と、血漿をその後にトロンビンと凝固接着性蛋白質にそれぞれ変換するために、操作可能のカップリングから血漿を受け入れる手段と、を組み合わせてなる。
本発明は、十分に安定であって最大６時間にわたって５秒未満の凝固を提供するようなトロンビンを製造するための、方法および装置を提供する。これはすべての先行技術に示されるものよりはるかに安定である。また凝固時間は食塩水希釈によって任意に調節できる。
さらにまた本発明は効率的な調製方法を提供する。クリオシールＴＭ発明による凝固接着性蛋白質の改良された寒冷沈降の所要時間は１時間未満である。これと同じ時間枠内に、自己由来ヒト・トロンビン成分を、最小限度の原料および処理で同一の血漿源から製造することができる。生物的接着剤の両方の成分は外科手術の状況において容易に組み合わされて、提供者と同一人である患者に適用され、かくして生じた凝塊は創傷部における止血と組織接着を提供する。
これに加えて本発明は生物的接着剤の両成分の無菌的製造方法を提供する。ここに記述する改良された無菌的製造方法は、本質的に非自己由来微生物による汚染のない最終製剤を提供する。
これらの、およびその他の目的は、添付の図面を参照しつつ、以下の詳細な明細書に明らかにされるであろう。
（発明を実施するための最良の形態）
図面を参照すれば、全体的に類似の要素は類似の部品を示しているが、参照符号１０は図１Ａおよび図１Ｂに示される本発明の処理セットを表している。
基本的には、処理セット１０は液受入系統２０を含み、該系統はトロンビン処理ユニット４０と凝固接着性蛋白質処理ユニット６０の、両方に連通している。
より具体的には、図１Ａおよび図１Ｂを参照すると、液受入系統２０はチューブ４に連通する入口２を含み、該入口を通して血漿が処理ユニット４０，６０に入る。チューブ４にはストップバルブ６用の場所が２ヶ所あり、前記ストップバルブはチューブ４を閉止して液の流通を防ぐ。チューブ４はＴ字部品８を介して連通しており、血漿を二つの枝管に分けている。すなわちトロンビン処理ユニット４０に通じる第１の枝管１２および凝固接着性蛋白質処理ユニット６０に通じる第２の枝管１４である。第１の枝管１２はまたストップバルブ６を含んでいる。
図１Ｂを参照すると、第１の枝管１２を通して血漿をトロンビン処理ユニット４０に導入する前に、あらかじめ液を入れた注射器９５からの試薬が、プランジャー機構９４をＡ’の方向に押すことによって、無菌バリアフィルター９２を通して受入系統２０に注入される。試薬はワンウェイバルブ９１、カップリング１８およびバルブ９１をつけたＹ字コネクタ９０、および枝管チューブ９３を通って最終的にケーシング２２の内部に入る。図３Ｂおよび図７Ｂを参照すれば、バルブ２４は当初、試薬を反応容器２６の方へ向けてある。
入口２に導入される血液製剤は血漿であることが好ましいから、全血はまず濾別、遠心分離またはその他の沈降手段で重い赤血球を血液製剤から除去して、残った血漿を図１の装置に用いる。このシステムはどのような大きさのバッチに対しても対応する大きさにできるが、濃縮トロンビンの最終体積が凝固接着性蛋白質処理ユニット６０からの寒冷沈降された凝固接着性蛋白質の通常の収率に見合うようにするために、トロンビン処理ユニットに必要とされる血漿は通常９−１０ｍｌである。
図１Ａ及び図１Ｂに示される実施例においては、シールされたバッグ１６および７８が、トロンビン調剤注射器４２（および導管６４の差し込み部）および寒冷沈降物保存チューブ７６の両方を覆っており、このようにして両方の保存容器が無菌の外科現場（例えば手術室）に持ち込まれるまで、無菌性が保たれる。その前に、トロンビン処理ユニット４０は図２Ａから図１０までに図示説明されるように作動する。図１Ｂを参照すると、試薬が添加された後、血漿は第１の枝管１２に入り、カップリング１８を通過し、枝管チューブ９３を通って、ケーシング２２の内部に流入する。
ふたたび図１Ａを参照すると、トロンビン処理ユニット４０は図２Ａ 、３Ａ 、４Ａ 、５Ａ 、６Ａ 、７Ａ 、８Ａ 、９Ａ 、および図１０に図示説明されるように作動する。前述したように、液は第１の枝管１２に入り（図１Ａ）、カップリング１８を通過してケーシング２２の内部に流入する。カップリング１８は好ましくは摩擦および／または接着剤によって枝管１２に取り付けられているが、なおトロンビン処理ユニット４０は血漿を受け入れた後、図２に示されるように（例えば図２Ａ）処理セット１０から取り外すことができる（例えば枝管１２を単に抜き取り、あるいはむしり取ることによって取り外され、その後おそらくはヒートシールされる）。接着剤が用いられる場合は、手術室で用いられるのと同様な無菌グレードのものが用いられる。
図３Ａを参照すると、バルブ２４は当初は血漿を反応容器２６の方へ向けている。この反応容器は好ましくはガラス製の内部チューブ２８ａ（図６Ａ）を有しており、該チューブは例えば１５ｍｌの体積（容積）を受け入れることができる。ガラスのチューブ２８ａは好ましくは外側のバレル３２より短く、そのなかに包み込まれている。前記バレルは好ましくはＰＶＣ製である。ＰＶＣバレル３２の窓３１ａはガラスのチューブ２８ａの内容物を計量し、および／または確認するのに用いられる。計量はガラスチューブ上の容積を示す目盛り２９を含んでもよい。反応容器２６のガラスのチューブ２８ａは第１の枝管１２から血漿を内部に受け入れ、これをあらかじめガラスのチューブ２８ａに入れられた後述の試薬と混合する。図７Ａに示されるように、ガラスのチューブの内部は好ましくは硼珪酸ガラス、ガラス、またはセラミック製のビーズ２５で、好ましくは部分的にあらかじめ充填されており、このビーズが反応および撹拌を促進する。
図３Ｂを参照すると、バルブ２４は当初は血漿を反応容器２６の方へ向けている。この反応容器は好ましくは透明ポリカーボネート製のチューブ２８ｂ（図６Ｂ）を有しており、例えば１５ｍｌの容積を受け入れることができる。ポリカーボネートのチューブ２８ｂ上の目盛り３１ｂは、チューブ２８ｂ中の内容物を計量するのに用いられる。反応容器２６のポリカーボネートのチューブ２８ｂは第１の枝管１２から血漿を内部に受け入れ、これをあらかじめポリカーボネート製のチューブ２８ｂに入れられた後述の試薬と混合する。図７Ｂに示されるように、ポリカーボネートのチューブ２８ｂの内部は好ましくは硼珪酸ガラス、ガラス、またはセラミック製のビーズ２５で、好ましくは部分的にあらかじめ充填されており、このビーズが反応および撹拌を促進する。
図１Ａおよび図３Ａに示される実施例の、第１と第２の端部キャップ３４を有してなる反応容器２６の詳細が、図６Ａ、７Ａおよび図８Ａに示されている。各端部キャップは、中央の、外側に向かって円錐状に先細になったスパウト３６を有し、これは一端部においてバルブ２４に、反対側の端部においてもう一つのバルブ４４に連通している。各スパウト３６は、絞り部４８内に入れられたスクリーン２３によって、ビーズ２５から遮断されている。バルブ２４は三つの枝管を有する。バルブ４４も同様であるが、バルブ４４は、一つの枝管がキャップ４５によって封鎖されているので二股のバルブをなしている。各バルブ２４、４４の一つの枝管は、各キャップ３４から突き出したスパウト３６にそれぞれ連通している。各バルブの一つの枝管と、そのガラスのチューブ２８ａ内部につながるスパウトとの間には液体流通があり、バルブ２４，４４が貫流する流れを制御している。図８Ａに示されるように、キャップ３４は環状の絞り部４８ａを有しており、これがＰＶＣバレル３２内部の空腔に摩擦的に、および／または接着剤を用いて係止している。このようにして絞り部４８はガラスのチューブ２８ａの端部に係止してこれと密閉的に係合しており、かくして反応容器の内部をＰＶＣバレル３２から遮断している。
図１Ｂおよび図３Ｂに示される実施例の、主としてポリカーボネートからなる反応容器２６の詳細が、第６Ｂ、７Ｂ、および８Ｂ図に示されている。この反応容器２６を形成する第１と第２の端部キャップ３４の詳細が図８Ｂに示されている。各端部キャップは、中央の、外側に向かって円錐状に先細になったスパウト３６を有し、これは一端部においてバルブ２４に、反対側の端部においてもう一つのバルブ４４に連通している。各スパウト３６は、内部の障害物を有し、これが液の通過は許すがビーズ２５の通過を防いでいる。バルブ２４は三つの枝管を有する。バルブ４４も同様であるが、バルブ４４は一つの枝管がキャップ４５によって封鎖されているので二股のバルブをなしている。各バルブ２４、４４の一つの枝管は、各キャップ３４から突き出したスパウト３６にそれぞれ連通している。各バルブの一つの枝管と、そのポリカーボネートのチューブ２８ｂ内部につながるスパウトとの間には液体流通があり、バルブ２４，４４が貫流する流れを制御している。図８Ｂに示されるように、キャップ３４は環状の内部後退部４８ｂを有しており、これがポリカーボネートのチューブ２８ｂの内部表面に接着剤によって係止している。
好ましくは、反応容器２６または試薬注射器９５にあらかじめ入れておく試薬はエタノールおよび塩化カルシウムである。図１Ａの実施例については、当初バルブ２４，４４はいずれも試薬がこれを通過しないような方向に向いていて、反応容器を密閉している。図１Ｂを参照すると、当初バルブ２４は血漿が反応容器２６に入らないような方向に、またバルブ４４は反応容器２６と吸引プランジャー５８との間の通過を許すような方向に向いている。ふたたび図１Ａを参照すれば、血漿が処理ユニット６０へポンプ送りされた後、バルブ４４はプランジャー５６への連通を許す方向に回され、バルブ２４は通路２１と反応容器２６との連通を許す方向に向けられる。トロンビン処理ユニット４０を図１Ａの平面に関して垂直に保持した状態でスライドクリップ６が開けられ、注射器のプランジャー５８が矢印Ａの方向へ動かされて反応容器２６中の空気を脱気する。ふたたび図１Ｂを参照すれば、試薬注射器９５が無菌のバリアフィルター９２の解放端に取り付けられる。プランジャー９４が押されて、試薬を無菌のバリアフィルターおよび通路９３を通して反応容器２６に移送する。図１Ａの実施例と同様に図１Ｂにおいても、トロンビン処理ユニット４０を図１Ｂの平面に関して垂直に保持した状態で注射器のプランジャー５８が矢印Ａの方向へ動かされ、反応容器２６中の空気を脱気する。両実施例とも、注射器５６は流れの経路に置かれたフィルター６２を含んでいる。より具体的には、バルブ４４と注射器５６の間の経路４３は流れの経路に置かれたフィルター６２を含んでいる。フィルター６２は無菌的な微生物バリアを提供するので、後でトロンビンを調剤注射器４２（図１）に送る際に、プランジャー５８のシール５７まわりからの汚染物が注射器４２に送られることはない。次いで血漿が導管４から反応容器２６に入り、空気を置換する。バルブ２４はフィルター６６の方向へ向けられる。試薬と血漿はビーズ２５の助けで軽く撹拌される（そして約４０ないし７０分間だけ定温放置ないし保温（ｉｎｃｕｂａｔｅ）される）。定温放置ないし保温（ｉｎｃｕｂａｔｅ）後、トロンビン処理ユニット４０は生成したゲルをゆるめて崩すために撹拌される。図１Ｂの実施例においては、トロンビン処理ユニット４０は次いで１０分間以上、水平位置にもどして静置される。その後トロンビン処理ユニット４０は生成したゲルをゆるめて崩すためにふたたび撹拌される。両実施例とも、注射器５６のプランジャーが矢印Ａと反対の方向に動かされてトロンビンを反応容器２６からフィルター６６を通して注射器４２に送る。注射器４２へのトロンビンの送液は注射器４２のプランジャー４３を後退させて、プッシュプルシステムを形成することによって促進される。フィルター６６はトロンビンからゲルを含む粒状物を除去する。
反応容器２６に入れられたトロンビンを撹拌の後１０分間以上静置することによって、後の使用を便にするために粒状物を除去するフィルター６６の効果が促進される。この変換と活性化のための時間によって粒状物がフィルターで十分に除去されるようになり、後でトロンビンをスプレーなどの狭いオリフィスから噴出したり、細いチューブから押し出して用いるのが容易になる。
図９Ａ、９Ｂ、および図１０はフィルター６６の別法を開示している。これは円筒形の外壁６５と端部キャップ３４を含み、各端部キャップは、円筒形のスパウト３７と、それを取り囲む環状の凹部３９を有している。図９Ａに示される別法の実施例は、中心に配置された好ましくはポリウレタンフォーム製の円筒形のフィルター要素６７ａを示している。これに対して図９Ｂに示される中心に配置された円筒形のフィルター要素６７ｂは、好ましくはポリエステルを巻いたものでできている。図９Ｂにはまた好ましくはグラスファイバーまたはポリエステル製の円形のフィルター６８が示されている。いずれの別法実施例においても、フィルター６７ａまたは６７ｂは重量、大きさ、および蛋白質結合によって濾別する。
ふたたび図１Ａおよび図１Ｂを参照して、こんどは凝固接着性蛋白質処理ユニット６０に注目する。トロンビン処理ユニット４０に向けられなかったすべての血漿は、凝固接着性蛋白質処理ユニット６０の内部容器７２に導入される。凝固接着性蛋白質処理ユニット６０は熱交換と回転の操作を受け、これによって血漿から抽出されたすべての凝固接着性蛋白質は容器７２の先端７４に沈殿し、続いて凝固接着性蛋白質収集チューブまたは無菌のパウチ７８に入れられた調剤注射器７６によって抜き取られる。容器７２はこの工程の間、汚染を防ぐフィルター通気孔８２によって保護されている。トロンビンが調剤注射器４２に充填され、凝固接着性蛋白質が凝固接着性蛋白質収集チューブまたは調剤注射器７６に充填されたならば、二つの保存容器４２，７６は処理セット１０から（例えば無菌の取り外し装置で）取り外され、無菌の外科現場の近傍に移される。続いて外側を覆うバッグが開かれ、保存容器４２，７６が取り外されて外科現場に移され、ここで内容物がそれぞれの無菌の３ｃｃプラスチック注射器に分配される。これらは続いてフィブリン接着剤塗布器に充填され、線状または点状に塗布される。トロンビンを凝固接着性蛋白質と混合することによって生物的接着剤が形成される。
両調剤注射器４２および７６は、室温、または好ましくはそれぞれの最適条件で保存される。すなわち寒冷沈降物７６は室温で保存され、トロンビン４２は１℃ないし５℃の氷浴中に保存される。図１３から図１６までを参照されたい。
９〜１０ｍｌの室温血漿が反応容器２６に導入されたとする。その他の血漿量も有用である。図１５および図１６を参照されたい。１．０ｍｌの７５ｍＭ塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）および２．０ｍｌのエタノール（ＥＴＯＨ）を添加する（すなわちエタノールは１００％の「ストック」瓶から採られて添加され、体積／単位体積でエタノール１８．９％、あるいは重量／単位体積でエタノール１５．０２％を占める）。エタノールに関するその他の試薬量対血漿量の比も有用な相がある（すなわちエタノールは１００％の「ストック」瓶から採られ、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）は７５ｍＭのストック溶液から採られる）。図１３および図１４を参照されたい。トロンビンの寿命は、２．９８秒の凝固時間を保ちつつ少なくとも３００分であることが示されている。エタノールの最終濃度は８．０％から２０．０％（体積／単位体積）の範囲にわたっているが、なお有用である。図１１を参照されたい。
エタノールの最終濃度が体積／単位体積で１８．９％（上述通り）で、塩化カルシウムの最終濃度が５．７ｍＭ（塩化カルシウムの７５ｍＭストック溶液の１ｍｌを採る）である場合、トロンビンの寿命は少なくとも３６０分に延び、この間凝固時間はトロンビンの室温保存において５．９８秒に保たれる。トロンビンを氷浴中で最適の１℃ないし５℃に保存すれば通常、３６０時間において２秒ないし３秒の凝固時間が保たれる。しかしながら塩化カルシウムの、５０ｍＭから２５０ｍＭまでの範囲のストック溶液濃度が有用である。図１２を参照されたい。最終濃度は４．５ｍＭから２３ｍＭの範囲である。
食塩水、希薄ＣａＣｌ２（例えば４０ｍＭないし１２５ｍＭのＣａＣｌ２）などの溶液、あるいは無菌水をトロンビンに加えることによってトロンビンの凝固時間および寿命の両方を変化させることができる。エタノールの最終濃度１８．９％および塩化カルシウムの最終濃度５．７ｍＭが反応容器２６に用いられたとする。トロンビンを水で１．５倍に希釈すると、凝固時間は３０秒弱に伸び、寿命は１５０分までとなる。
以上において本発明を説明したが、以上のように説明され、以下において請求範囲に記載される本発明の範囲および正当な意味から逸脱することなく、多くの構造的な改変および適応がなされ得ることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
図１Ａは、血漿からプロトロンビンを分離し、プロトロンビンを処理してトロンビンとし、プロトロンビン向け以外の血漿を採取してこのものから凝固接着性蛋白質を抽出するための器具の斜視図である。
【図１Ｂ】
図１Ｂは、血漿からプロトロンビンを分離し、プロトロンビンを処理してトロンビンとし、プロトロンビン向け以外の血漿を採取してこのものから凝固接着性蛋白質を抽出するための器具の斜視図である。
【図２Ａ】
図２Ａは、凝固接着性蛋白質を抽出する処理セットから取り外されたトロンビン処理セットの平面図である
【図２Ｂ】
図２Ｂは、凝固接着性蛋白質を抽出する処理セットから取り外されたトロンビン処理セットの平面図である。
【図３Ａ】
図３Ａは、トロンビン処理ケースの内部の斜視図であり、図２Ａおよび図２Ｂに示されるトロンビン用注射器は取り外されている。
【図３Ｂ】
図３Ｂは、トロンビン処理ケースの内部の斜視図であり、図２Ａおよび図２Ｂに示されるトロンビン用注射器は取り外されている。
【図４Ａ】
図４Ａは、トロンビン用ケースの上半部の斜視図である。
【図４Ｂ】
図４Ｂは、トロンビン用ケースの上半部の斜視図である。
【図５Ａ】
図５Ａは、トロンビン用ケースの下半部の斜視図である。
【図５Ｂ】
図５Ｂは、トロンビン用ケースの下半部の斜視図である。
【図６Ａ】
図６Ａは、図３Ａおよび図３Ｂに示される反応容器２６の部品分解図であり、併せて両端部のバルブ構造を示している。
【図６Ｂ】
図６Ｂは、図３Ａおよび図３Ｂに示される反応容器２６の部品分解図であり、併せて両端部のバルブ構造を示している。
【図７Ａ】
図７Ａは、図６Ａおよび図６Ｂに示される反応容器およびバルブ構造の断面図である。
【図７Ｂ】
図７Ｂは、図６Ａおよび図６Ｂに示される反応容器およびバルブ構造の断面図である。
【図８Ａ】
図８Ａは、図７Ａおよび図７Ｂに示される構造の詳細図である。
【図８Ｂ】
図８Ｂは、図７Ａおよび図７Ｂに示される構造の詳細図である。
【図９Ａ】
図９Ａは、図３Ａおよび図３Ｂに用いられる別法のフィルターの部品分解図である。
【図９Ｂ】
図９Ｂは、図３Ａおよび図３Ｂに用いられる別法のフィルターの部品分解図である。
【図１０】
図１０は、図９に示されるものの斜視図である。
【図１１】
図１１は、異なるＥＴＯＨ濃度で分別されたトロンビンの寿命対凝固時間のグラフである。
【図１２】
図１２は、異なるＣａＣＬ２濃度における、異なるＥＴＯＨ濃度で分別されたトロンビンの寿命対凝固時間のグラフである。
【図１３】
図１３はトロンビンの寿命対凝固時間のグラフであり、トロンビンが氷浴中で保存されたときの試薬量による感度を示している。
【図１４】
図１４は、トロンビンの寿命対凝固時間のグラフであり、トロンビンが室温で保存されたときの試薬量による感度を示している。
【図１５】
図１５は、トロンビンの寿命対凝固時間のグラフであり、トロンビンが氷浴中で保存されたときの血漿量による感度を示している。
【図１６】
図１６は、トロンビンの寿命対凝固時間のグラフであり、トロンビンが室温で保存されたときの血漿量による感度を示している。
【国際調査報告】
2004500026.tif 000052