(57)【要約】本発明は、新規ポリペプチド及びこれらペプチドをコードする核酸分子を対象としている。また，ここにおいて提供されるのは、これら核酸配列を含んでなるベクター及び宿主細胞、異種ポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチド分子、本発明のポリペプチド及び本発明のポリペプチドを製造する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、Ｆｉｇ９（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１１（配列番号：２８）、Ｆｉｇ１５（配列番号：３６）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４５）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５２）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５９）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６４）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６９）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７４）、Ｆｉｇ３３（配列番号：８５）、Ｆｉｇ３５（配列番号：９０）、Ｆｉｇ３７（配列番号：９７）、Ｆｉｇ３９（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４１（配列番号：１０９）、Ｆｉｇ４３（配列番号：１１４）、Ｆｉｇ４５（配列番号：１１９）、Ｆｉｇ４７（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４９（配列番号：１３２）、Ｆｉｇ５１（配列番号：１３７）、Ｆｉｇ５３（配列番号：１４５）、Ｆｉｇ５５（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ５９（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６１（配列番号：１６２）、Ｆｉｇ６３（配列番号：１６９）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１８３）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１９０）、Ｆｉｇ７３（配列番号：１９６）、Ｆｉｇ７５（配列番号：２０６）、Ｆｉｇ７７（配列番号：２１１）、Ｆｉｇ７９（配列番号：２１６）、Ｆｉｇ８１（配列番号：２２１）、Ｆｉｇ８３（配列番号：２２６）、Ｆｉｇ８５（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ８７（配列番号：２３６）、Ｆｉｇ８９（配列番号：２４５）、Ｆｉｇ９１（配列番号：２５４）、Ｆｉｇ９３（配列番号：２５９）、Ｆｉｇ９５（配列番号：２６４）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２７０）、Ｆｉｇ１０９（配列番号：２８４）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２９６）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：３０１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：３０３）、Ｆｉｇ１２５（配列番号：３０９）、Ｆｉｇ１２９（配列番号：３２２）、Ｆｉｇ１３２（配列番号：３３０）、Ｆｉｇ１３６（配列番号：３３７）、Ｆｉｇ１３９（配列番号：３４６）、Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）、Ｆｉｇ１４５（配列番号：３５８）、Ｆｉｇ１４７（配列番号：３６３）、Ｆｉｇ１４９（配列番号：３７０）、Ｆｉｇ１５１（配列番号：３７５）、Ｆｉｇ１５３（配列番号：３８０）、Ｆｉｇ１５５（配列番号：３８５）、Ｆｉｇ１５７（配列番号：３９０）、Ｆｉｇ１５９（配列番号：３９５）、Ｆｉｇ１６１（配列番号：４００）、Ｆｉｇ１６３（配列番号：４０５）、Ｆｉｇ１６５（配列番号：４１０）、Ｆｉｇ１６７（配列番号：４１５）、Ｆｉｇ１６９（配列番号：４２０）、Ｆｉｇ１７１（配列番号：４２５）、Ｆｉｇ１７３（配列番号：４３０）、Ｆｉｇ１７７（配列番号：４３７）、Ｆｉｇ１７９（配列番号：４４２）、Ｆｉｇ１８１（配列番号：４４７）、Ｆｉｇ１８３（配列番号：４５２）、Ｆｉｇ１８５（配列番号：４５４）、Ｆｉｇ１８７（配列番号：４５６）、Ｆｉｇ１９０（配列番号：４５９）、Ｆｉｇ１９２（配列番号：４６４）、Ｆｉｇ１９４（配列番号：４６６）、Ｆｉｇ１９６（配列番号：４６８）、Ｆｉｇ１９８（配列番号：４７０）、Ｆｉｇ２００（配列番号：４７２）、Ｆｉｇ２０２（配列番号：４７７）、Ｆｉｇ２０４（配列番号：４８３）、Ｆｉｇ２０７（配列番号：４８８）、Ｆｉｇ２０９（配列番号：４９６）、Ｆｉｇ２１１（配列番号：４９８）、Ｆｉｇ２１３（配列番号：５０６）、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）、Ｆｉｇ２１７（配列番号：５１０）、Ｆｉｇ２１９（配列番号：５１５）、Ｆｉｇ２２２（配列番号：５２３）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２３０（配列番号：６１２）、Ｆｉｇ２３２（配列番号：６１４）、Ｆｉｇ２３４（配列番号：６１６）及びＦｉｇ２３６（配列番号：６１８）に示されているアミノ酸配列からなるグループから選択されたアミノ酸配列をコードする核酸配列に対して、少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
【請求項２】
Ｆｉｇ１（配列番号：１）、Ｆｉｇ３（配列番号：６）、Ｆｉｇ８（配列番号：１８）、Ｆｉｇ１０（配列番号：２７）、Ｆｉｇ１４（配列番号：３５）、Ｆｉｇ１９（配列番号：４４）、Ｆｉｇ２１（配列番号：５１）、Ｆｉｇ２３（配列番号：５８）、Ｆｉｇ２５（配列番号：６３）、Ｆｉｇ２７（配列番号：６８）、Ｆｉｇ２９（配列番号：７３）、Ｆｉｇ３２（配列番号：８４）、Ｆｉｇ３４（配列番号：８９）、Ｆｉｇ３６（配列番号：９６）、Ｆｉｇ３８（配列番号：１０１）、Ｆｉｇ４０（配列番号：１０８）、Ｆｉｇ４２（配列番号：１１３）、Ｆｉｇ４４（配列番号：１１８）、Ｆｉｇ４６（配列番号：１２３）、Ｆｉｇ４８（配列番号：１３１）、Ｆｉｇ５０（配列番号：１３６）、Ｆｉｇ５２（配列番号：１４４）、Ｆｉｇ５４（配列番号：１４９）、Ｆｉｇ５８（配列番号：１５６）、Ｆｉｇ６０（配列番号：１６１）、Ｆｉｇ６２（配列番号：１６８）、Ｆｉｇ６５（配列番号：１７７）、Ｆｉｇ６７（配列番号：１８２）、Ｆｉｇ６９（配列番号：１８９）、Ｆｉｇ７２（配列番号：１９５）、Ｆｉｇ７４（配列番号：２０５）、Ｆｉｇ７６（配列番号：２１０）、Ｆｉｇ７８（配列番号：２１５）、Ｆｉｇ８０（配列番号：２２０）、Ｆｉｇ８２（配列番号：２２５）、Ｆｉｇ８４（配列番号：２３０）、Ｆｉｇ８６（配列番号：２３５）、Ｆｉｇ８８（配列番号：２４４）、Ｆｉｇ９０（配列番号：２５３）、Ｆｉｇ９２（配列番号：２５８）、Ｆｉｇ９４（配列番号：２６３）、Ｆｉｇ９７（配列番号：２６９）、Ｆｉｇ１０８（配列番号：２８３）、Ｆｉｇ１１７（配列番号：２９５）、Ｆｉｇ１１９（配列番号：３００）、Ｆｉｇ１２１（配列番号：３０２）、Ｆｉｇ１２４（配列番号：３０８）、Ｆｉｇ１２８（配列番号：３２１）、Ｆｉｇ１３１（配列番号：３２９）、Ｆｉｇ１３５（配列番号：３３６）、Ｆｉｇ１３８（配列番号：３４５）、Ｆｉｇ１４１（配列番号：３５１）、Ｆｉｇ１４４（配列番号：３５７）、Ｆｉｇ１４６（配列番号：３６２）、Ｆｉｇ１４８（配列番号：３６９）、Ｆｉｇ１５０（配列番号：３７４）、Ｆｉｇ１５２（配列番号：３７９）、Ｆｉｇ１５４（配列番号：３８４）、Ｆｉｇ１５６（配列番号：３８９）、Ｆｉｇ１５８（配列番号：３９４）、Ｆｉｇ１６０（配列番号：３９９）、Ｆｉｇ１６２（配列番号：４０４）、Ｆｉｇ１６４（配列番号：４０９）、Ｆｉｇ１６６（配列番号：４１４）、Ｆｉｇ１６８（配列番号：４１９）、Ｆｉｇ１７０（配列番号：４２４）、Ｆｉｇ１７２（配列番号：４２９）、Ｆｉｇ１７６（配列番号：４３６）、Ｆｉｇ１７８（配列番号：４４１）、Ｆｉｇ１８０（配列番号：４４６）、Ｆｉｇ１８２（配列番号：４５１）、Ｆｉｇ１８４（配列番号：４５３）、Ｆｉｇ１８６（配列番号：４５５）、Ｆｉｇ１８９（配列番号：４５８）、Ｆｉｇ１９１（配列番号：４６３）、Ｆｉｇ１９３（配列番号：４６５）、Ｆｉｇ１９５（配列番号：４６７）、Ｆｉｇ１９７（配列番号：４６９）、Ｆｉｇ１９９（配列番号：４７１）、Ｆｉｇ２０１（配列番号：４７６）、Ｆｉｇ２０３（配列番号：４８２）、Ｆｉｇ２０６（配列番号：４８７）、Ｆｉｇ２０８（配列番号：４９５）、Ｆｉｇ２１０（配列番号：４９７）、Ｆｉｇ２１２（配列番号：５０５）、Ｆｉｇ２１４（配列番号：５０７）、Ｆｉｇ２１６（配列番号：５０９）、Ｆｉｇ２１８（配列番号：５１４）、Ｆｉｇ２２１（配列番号：５２２）、Ｆｉｇ２２４（配列番号：５２５）、Ｆｉｇ２２９（配列番号：６１１）、Ｆｉｇ２３１（配列番号：６１２）、Ｆｉｇ２３２（配列番号：６１４）、Ｆｉｇ２３４（配列番号：６１３）、Ｆｉｇ２３３（配列番号：６１５）及びＦｉｇ２３５（配列番号：６１７）に示されている核酸配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
【請求項３】
Ｆｉｇ１（配列番号：１）、Ｆｉｇ３（配列番号：６）、Ｆｉｇ８（配列番号：１８）、Ｆｉｇ１０（配列番号：２７）、Ｆｉｇ１４（配列番号：３５）、Ｆｉｇ１９（配列番号：４４）、Ｆｉｇ２１（配列番号：５１）、Ｆｉｇ２３（配列番号：５８）、Ｆｉｇ２５（配列番号：６３）、Ｆｉｇ２７（配列番号：６８）、Ｆｉｇ２９（配列番号：７３）、Ｆｉｇ３２（配列番号：８４）、Ｆｉｇ３４（配列番号：８９）、Ｆｉｇ３６（配列番号：９６）、Ｆｉｇ３８（配列番号：１０１）、Ｆｉｇ４０（配列番号：１０８）、Ｆｉｇ４２（配列番号：１１３）、Ｆｉｇ４４（配列番号：１１８）、Ｆｉｇ４６（配列番号：１２３）、Ｆｉｇ４８（配列番号：１３１）、Ｆｉｇ５０（配列番号：１３６）、Ｆｉｇ５２（配列番号：１４４）、Ｆｉｇ５４（配列番号：１４９）、Ｆｉｇ５８（配列番号：１５６）、Ｆｉｇ６０（配列番号：１６１）、Ｆｉｇ６２（配列番号：１６８）、Ｆｉｇ６５（配列番号：１７７）、Ｆｉｇ６７（配列番号：１８２）、Ｆｉｇ６９（配列番号：１８９）、Ｆｉｇ７２（配列番号：１９５）、Ｆｉｇ７４（配列番号：２０５）、Ｆｉｇ７６（配列番号：２１０）、Ｆｉｇ７８（配列番号：２１５）、Ｆｉｇ８０（配列番号：２２０）、Ｆｉｇ８２（配列番号：２２５）、Ｆｉｇ８４（配列番号：２３０）、Ｆｉｇ８６（配列番号：２３５）、Ｆｉｇ８８（配列番号：２４４）、Ｆｉｇ９０（配列番号：２５３）、Ｆｉｇ９２（配列番号：２５８）、Ｆｉｇ９４（配列番号：２６３）、Ｆｉｇ９７（配列番号：２６９）、Ｆｉｇ１０８（配列番号：２８３）、Ｆｉｇ１１７（配列番号：２９５）、Ｆｉｇ１１９（配列番号：３００）、Ｆｉｇ１２１（配列番号：３０２）、Ｆｉｇ１２４（配列番号：３０８）、Ｆｉｇ１２８（配列番号：３２１）、Ｆｉｇ１３１（配列番号：３２９）、Ｆｉｇ１３５（配列番号：３３６）、Ｆｉｇ１３８（配列番号：３４５）、Ｆｉｇ１４１（配列番号：３５１）、Ｆｉｇ１４４（配列番号：３５７）、Ｆｉｇ１４６（配列番号：３６２）、Ｆｉｇ１４８（配列番号：３６９）、Ｆｉｇ１５０（配列番号：３７４）、Ｆｉｇ１５２（配列番号：３７９）、Ｆｉｇ１５４（配列番号：３８４）、Ｆｉｇ１５６（配列番号：３８９）、Ｆｉｇ１５８（配列番号：３９４）、Ｆｉｇ１６０（配列番号：３９９）、Ｆｉｇ１６２（配列番号：４０４）、Ｆｉｇ１６４（配列番号：４０９）、Ｆｉｇ１６６（配列番号：４１４）、Ｆｉｇ１６８（配列番号：４１９）、Ｆｉｇ１７０（配列番号：４２４）、Ｆｉｇ１７２（配列番号：４２９）、Ｆｉｇ１７６（配列番号：４３６）、Ｆｉｇ１７８（配列番号：４４１）、Ｆｉｇ１８０（配列番号：４４６）、Ｆｉｇ１８２（配列番号：４５１）、Ｆｉｇ１８４（配列番号：４５３）、Ｆｉｇ１８６（配列番号：４５５）、Ｆｉｇ１８９（配列番号：４５８）、Ｆｉｇ１９１（配列番号：４６３）、Ｆｉｇ１９３（配列番号：４６５）、Ｆｉｇ１９５（配列番号：４６７）、Ｆｉｇ１９７（配列番号：４６９）、Ｆｉｇ１９９（配列番号：４７１）、Ｆｉｇ２０１（配列番号：４７６）、Ｆｉｇ２０３（配列番号：４８２）、Ｆｉｇ２０６（配列番号：４８７）、Ｆｉｇ２０８（配列番号：４９５）、Ｆｉｇ２１０（配列番号：４９７）、Ｆｉｇ２１２（配列番号：５０５）、Ｆｉｇ２１４（配列番号：５０７）、Ｆｉｇ２１６（配列番号：５０９）、Ｆｉｇ２１８（配列番号：５１４）、Ｆｉｇ２２１（配列番号：５２２）、Ｆｉｇ２２４（配列番号：５２５）、Ｆｉｇ２２９（配列番号：６１１）、Ｆｉｇ２３１（配列番号：６１２）、Ｆｉｇ２３２（配列番号：６１４）、Ｆｉｇ２３４（配列番号：６１３、Ｆｉｇ２３３（配列番号：６１５）及びＦｉｇ２３５（配列番号：６１７）に示されている核酸配列の全長コード化配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
【請求項４】
ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ２０９７９１、ＡＴＣＣ２０９７８６、ＡＴＣＣ２０９７８８、ＡＴＣＣ２０９７８７、
ＡＴＣＣ２０９７８９、ＡＴＣＣ２０９６１７、ＡＴＣＣ２０９６２０、ＡＴＣＣ２０９６１６、ＡＴＣＣ２０９６７９、ＡＴＣＣ２０９６５４、ＡＴＣＣ２０９６５５、ＡＴＣＣ２０９６５６、ＡＴＣＣ２０９７２１、ＡＴＣＣ２０９７１７、ＡＴＣＣ２０９７１６、ＡＴＣＣ２０９７２２、ＡＴＣＣ２０９６６８、ＡＴＣＣ２０９６７０、ＡＴＣＣ２０９７１８、ＡＴＣＣ２０９７８４、ＡＴＣＣ２０９７０３、ＡＴＣＣ２０９８０８、ＡＴＣＣ２０９８１０、ＡＴＣＣ２０９６９９、ＡＴＣＣ２０９８１１、ＡＴＣＣ２０９８１３、ＡＴＣＣ２０９７０５、ＡＴＣＣ２０９８０６、ＡＴＣＣ２０９８０９、ＡＴＣＣ２０９８０５、ＡＴＣＣ２０９８１２、ＡＴＣＣ２０９８４４、ＡＴＣＣ２０９８４７、ＡＴＣＣ２０９８４５、ＡＴＣＣ２０９８４３、ＡＴＣＣ２０９８４６、ＡＴＣＣ２０９７５０、ＡＴＣＣ２０９８４８、ＡＴＣＣ２０９８５１、ＡＴＣＣ２０９７５４、ＡＴＣＣ２０９７４７、ＡＴＣＣ２０９８６１、ＡＴＣＣ２０９８６２、ＡＴＣＣ２０９８６７、ＡＴＣＣ２０９８７９、ＡＴＣＣ２０９８６８、ＡＴＣＣ２０９８６９、ＡＴＣＣ２０９７７５、ＡＴＣＣ２０９７７２、ＡＴＣＣ２０９７７４、ＡＴＣＣ２０９７７７、ＡＴＣＣ２０９９０５、ＡＴＣＣ２０９８５５、ＡＴＣＣ２０９９１０、ＡＴＣＣ２０９４２４、ＡＴＣＣ２０９７２０、ＡＴＣＣ２０９７１４、ＡＴＣＣ２０９７８５、ＡＴＣＣ２０９９１１、ＡＴＣＣ２０９６６９、ＡＴＣＣ２０９７０４、ＡＴＣＣ２０９７０２、ＡＴＣＣ２０９７０１、ＡＴＣＣ２０９７００、ＡＴＣＣ２０９８１４、ＡＴＣＣ２０９７１５、ＡＴＣＣ２０９８０７、ＡＴＣＣ２０９７５３、ＡＴＣＣ２０９７４９、ＡＴＣＣ２０９７４８、ＡＴＣＣ２０９８４２、ＡＴＣＣ２０９８４９、ＡＴＣＣ２０９８８０、ＡＴＣＣ２０９８６４、ＡＴＣＣ２０９８８２、ＡＴＣＣ２０９８８３、ＡＴＣＣ２０９８６５、ＡＴＣＣ２０９８６６、ＡＴＣＣ２０９８５７、ＡＴＣＣ２０９８７０、ＡＴＣＣ２０９８５９、ＡＴＣＣ２０９６５３、ＡＴＣＣ２０９３８９、ＡＴＣＣ２０９３８６、ＡＴＣＣ２０３２４２、ＡＴＣＣ２０３２４３、ＡＴＣＣ２０９７８３、ＡＴＣＣ２０９４８７、ＡＴＣＣ２０９６８０、２４０−ＰＴＡ、又はＡＴＣＣ２０９７７３で寄託したＤＮＡの全長コード化配列と少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
【請求項５】
請求項１から４の何れか一つの核酸を含んでなるベクター。
【請求項６】
ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識されるコントロール配列と作用可能に連結した請求項５のベクター。
【請求項７】
請求項５のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項８】
前記細胞がＣＨＯ細胞である請求項７の宿主細胞。
【請求項９】
前記細胞が大腸菌である請求項７の宿主細胞。
【請求項１０】
前記細胞が酵母細胞である請求項７の宿主細胞。
【請求項１１】
前記ＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下での請求項７の宿主細胞の培養、細胞培養から前記ＰＲＯポリペプチドを回収することを含んでなるＰＲＯポリペプチドの製造方法。
【請求項１２】
Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、Ｆｉｇ９（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１１（配列番号：２８）、Ｆｉｇ１５（配列番号：３６）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４５）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５２）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５９）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６４）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６９）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７４）、Ｆｉｇ３３（配列番号：８５）、Ｆｉｇ３５（配列番号：９０）、Ｆｉｇ３７（配列番号：９７）、Ｆｉｇ３９（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４１（配列番号：１０９）、Ｆｉｇ４３（配列番号：１１４）、Ｆｉｇ４５（配列番号：１１９）、Ｆｉｇ４７（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４９（配列番号：１３２）、Ｆｉｇ５１（配列番号：１３７）、Ｆｉｇ５３（配列番号：１４５）、Ｆｉｇ５５（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ５９（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６１（配列番号：１６２）、Ｆｉｇ６３（配列番号：１６９）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１８３）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１９０）、Ｆｉｇ７３（配列番号：１９６）、Ｆｉｇ７５（配列番号：２０６）、Ｆｉｇ７７（配列番号：２１１）、Ｆｉｇ７９（配列番号：２１６）、Ｆｉｇ８１（配列番号：２２１）、Ｆｉｇ８３（配列番号：２２６）、Ｆｉｇ８５（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ８７（配列番号：２３６）、Ｆｉｇ８９（配列番号：２４５）、Ｆｉｇ９１（配列番号：２５４）、Ｆｉｇ９３（配列番号：２５９）、Ｆｉｇ９５（配列番号：２６４）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２７０）、Ｆｉｇ１０９（配列番号：２８４）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２９６）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：３０１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：３０３）、Ｆｉｇ１２５（配列番号：３０９）、Ｆｉｇ１２９（配列番号：３２２）、Ｆｉｇ１３２（配列番号：３３０）、Ｆｉｇ１３６（配列番号：３３７）、Ｆｉｇ１３９（配列番号：３４６）、Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）、Ｆｉｇ１４５（配列番号：３５８）、Ｆｉｇ１４７（配列番号：３６３）、Ｆｉｇ１４９（配列番号：３７０）、Ｆｉｇ１５１（配列番号：３７５）、Ｆｉｇ１５３（配列番号：３８０）、Ｆｉｇ１５５（配列番号：３８５）、Ｆｉｇ１５７（配列番号：３９０）、Ｆｉｇ１５９（配列番号：３９５）、Ｆｉｇ１６１（配列番号：４００）、Ｆｉｇ１６３（配列番号：４０５）、Ｆｉｇ１６５（配列番号：４１０）、Ｆｉｇ１６７（配列番号：４１５）、Ｆｉｇ１６９（配列番号：４２０）、Ｆｉｇ１７１（配列番号：４２５）、Ｆｉｇ１７３（配列番号：４３０）、Ｆｉｇ１７７（配列番号：４３７）、Ｆｉｇ１７９（配列番号：４４２）、Ｆｉｇ１８１（配列番号：４４７）、Ｆｉｇ１８３（配列番号：４５２）、Ｆｉｇ１８５（配列番号：４５４）、Ｆｉｇ１８７（配列番号：４５６）、Ｆｉｇ１９０（配列番号：４５９）、Ｆｉｇ１９２（配列番号：４６４）、Ｆｉｇ１９４（配列番号：４６６）、Ｆｉｇ１９６（配列番号：４６８）、Ｆｉｇ１９８（配列番号：４７０）、Ｆｉｇ２００（配列番号：４７２）、Ｆｉｇ２０２（配列番号：４７７）、Ｆｉｇ２０４（配列番号：４８３）、Ｆｉｇ２０７（配列番号：４８８）、Ｆｉｇ２０９（配列番号：４９６）、Ｆｉｇ２１１（配列番号：４９８）、Ｆｉｇ２１３（配列番号：５０６）、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）、Ｆｉｇ２１７（配列番号：５１０）、Ｆｉｇ２１９（配列番号：５１５）、Ｆｉｇ２２２（配列番号：５２３）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２３０（配列番号：６１２）、Ｆｉｇ２３２（配列番号：６１４）、Ｆｉｇ２３４（配列番号：６１６）及びＦｉｇ２３６（配列番号：６１８）に示されているアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、Ｆｉｇ９（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１１（配列番号：２８）、Ｆｉｇ１５（配列番号：３６）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４５）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５２）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５９）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６４）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６９）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７４）、Ｆｉｇ３３（配列番号：８５）、Ｆｉｇ３５（配列番号：９０）、Ｆｉｇ３７（配列番号：９７）、Ｆｉｇ３９（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４１（配列番号：１０９）、Ｆｉｇ４３（配列番号：１１４）、Ｆｉｇ４５（配列番号：１１９）、Ｆｉｇ４７（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４９（配列番号：１３２）、Ｆｉｇ５１（配列番号：１３７）、Ｆｉｇ５３（配列番号：１４５）、Ｆｉｇ５５（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ５９（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６１（配列番号：１６２）、Ｆｉｇ６３（配列番号：１６９）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１８３）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１９０）、Ｆｉｇ７３（配列番号：１９６）、Ｆｉｇ７５（配列番号：２０６）、Ｆｉｇ７７（配列番号：２１１）、Ｆｉｇ７９（配列番号：２１６）、Ｆｉｇ８１（配列番号：２２１）、Ｆｉｇ８３（配列番号：２２６）、Ｆｉｇ８５（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ８７（配列番号：２３６）、Ｆｉｇ８９（配列番号：２４５）、Ｆｉｇ９１（配列番号：２５４）、Ｆｉｇ９３（配列番号：２５９）、Ｆｉｇ９５（配列番号：２６４）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２７０）、Ｆｉｇ１０９（配列番号：２８４）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２９６）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：３０１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：３０３）、Ｆｉｇ１２５（配列番号：３０９）、Ｆｉｇ１２９（配列番号：３２２）、Ｆｉｇ１３２（配列番号：３３０）、Ｆｉｇ１３６（配列番号：３３７）、Ｆｉｇ１３９（配列番号：３４６）、Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）、Ｆｉｇ１４５（配列番号：３５８）、Ｆｉｇ１４７（配列番号：３６３）、Ｆｉｇ１４９（配列番号：３７０）、Ｆｉｇ１５１（配列番号：３７５）、Ｆｉｇ１５３（配列番号：３８０）、Ｆｉｇ１５５（配列番号：３８５）、Ｆｉｇ１５７（配列番号：３９０）、Ｆｉｇ１５９（配列番号：３９５）、Ｆｉｇ１６１（配列番号：４００）、Ｆｉｇ１６３（配列番号：４０５）、Ｆｉｇ１６５（配列番号：４１０）、Ｆｉｇ１６７（配列番号：４１５）、Ｆｉｇ１６９（配列番号：４２０）、Ｆｉｇ１７１（配列番号：４２５）、Ｆｉｇ１７３（配列番号：４３０）、Ｆｉｇ１７７（配列番号：４３７）、Ｆｉｇ１７９（配列番号：４４２）、Ｆｉｇ１８１（配列番号：４４７）、Ｆｉｇ１８３（配列番号：４５２）、Ｆｉｇ１８５（配列番号：４５４）、Ｆｉｇ１８７（配列番号：４５６）、Ｆｉｇ１９０（配列番号：４５９）、Ｆｉｇ１９２（配列番号：４６４）、Ｆｉｇ１９４（配列番号：４６６）、Ｆｉｇ１９６（配列番号：４６８）、Ｆｉｇ１９８（配列番号：４７０）、Ｆｉｇ２００（配列番号：４７２）、Ｆｉｇ２０２（配列番号：４７７）、Ｆｉｇ２０４（配列番号：４８３）、Ｆｉｇ２０７（配列番号：４８８）、Ｆｉｇ２０９（配列番号：４９６）、Ｆｉｇ２１１（配列番号：４９８）、Ｆｉｇ２１３（配列番号：５０６）、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）、Ｆｉｇ２１７（配列番号：５１０）、Ｆｉｇ２１９（配列番号：５１５）、Ｆｉｇ２２２（配列番号：５２３）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２３０（配列番号：６１２）、Ｆｉｇ２３２（配列番号：６１４）、Ｆｉｇ２３４（配列番号：６１６）及びＦｉｇ２３６（配列番号：６１８）に示されているアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列と比較し、少なくとも８０％のポジティブのスコアを有する単離されたポリペプチド。
【請求項１４】
ＡＴＣＣ受託番号ＡＴＣＣ２０９７９１、ＡＴＣＣ２０９７８６、ＡＴＣＣ２０９７８８、ＡＴＣＣ２０９７８７、
ＡＴＣＣ２０９７８９、ＡＴＣＣ２０９６１７、ＡＴＣＣ２０９６２０、ＡＴＣＣ２０９６１６、ＡＴＣＣ２０９６７９、ＡＴＣＣ２０９６５４、ＡＴＣＣ２０９６５５、ＡＴＣＣ２０９６５６、ＡＴＣＣ２０９７２１、ＡＴＣＣ２０９７１７、ＡＴＣＣ２０９７１６、ＡＴＣＣ２０９７２２、ＡＴＣＣ２０９６６８、ＡＴＣＣ２０９６７０、ＡＴＣＣ２０９７１８、ＡＴＣＣ２０９７８４、ＡＴＣＣ２０９７０３、ＡＴＣＣ２０９８０８、ＡＴＣＣ２０９８１０、ＡＴＣＣ２０９６９９、ＡＴＣＣ２０９８１１、ＡＴＣＣ２０９８１３、ＡＴＣＣ２０９７０５、ＡＴＣＣ２０９８０６、ＡＴＣＣ２０９８０９、ＡＴＣＣ２０９８０５、ＡＴＣＣ２０９８１２、ＡＴＣＣ２０９８４４、ＡＴＣＣ２０９８４７、ＡＴＣＣ２０９８４５、ＡＴＣＣ２０９８４３、ＡＴＣＣ２０９８４６、ＡＴＣＣ２０９７５０、ＡＴＣＣ２０９８４８、ＡＴＣＣ２０９８５１、ＡＴＣＣ２０９７５４、ＡＴＣＣ２０９７４７、ＡＴＣＣ２０９８６１、ＡＴＣＣ２０９８６２、ＡＴＣＣ２０９８６７、ＡＴＣＣ２０９８７９、ＡＴＣＣ２０９８６８、ＡＴＣＣ２０９８６９、ＡＴＣＣ２０９７７５、ＡＴＣＣ２０９７７２、ＡＴＣＣ２０９７７４、ＡＴＣＣ２０９７７７、ＡＴＣＣ２０９９０５、ＡＴＣＣ２０９８５５、ＡＴＣＣ２０９９１０、ＡＴＣＣ２０９４２４、ＡＴＣＣ２０９７２０、ＡＴＣＣ２０９７１４、ＡＴＣＣ２０９７８５、ＡＴＣＣ２０９９１１、ＡＴＣＣ２０９６６９、ＡＴＣＣ２０９７０４、ＡＴＣＣ２０９７０２、ＡＴＣＣ２０９７０１、ＡＴＣＣ２０９７００、ＡＴＣＣ２０９８１４、ＡＴＣＣ２０９７１５、ＡＴＣＣ２０９８０７、ＡＴＣＣ２０９７５３、ＡＴＣＣ２０９７４９、ＡＴＣＣ２０９７４８、ＡＴＣＣ２０９８４２、ＡＴＣＣ２０９８４９、ＡＴＣＣ２０９８８０、ＡＴＣＣ２０９８６４、ＡＴＣＣ２０９８８２、ＡＴＣＣ２０９８８３、ＡＴＣＣ２０９８６５、ＡＴＣＣ２０９８６６、ＡＴＣＣ２０９８５７、ＡＴＣＣ２０９８７０、ＡＴＣＣ２０９８５９、ＡＴＣＣ２０９６５３、ＡＴＣＣ２０９３８９、ＡＴＣＣ２０９３８６、ＡＴＣＣ２０３２４２、ＡＴＣＣ２０３２４３、ＡＴＣＣ２０９７８３、ＡＴＣＣ２０９４８７、ＡＴＣＣ２０９６８０、２４０−ＰＴＡ、又はＡＴＣＣ２０９７７３で寄託したＤＮＡの全長コード化配列にコードされているアミノ酸配列に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
【請求項１５】
異種アミノ酸配列と融合した請求項１２から１４の何れか一項に記載のポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
【請求項１６】
前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項１５のキメラ分子。
【請求項１７】
前記異種アミノ酸配列がイムノグロブリンのＦｃ領域である請求項１５のキメラ分子。
【請求項１８】
請求項１２から１４の何れか一項に記載のポリペプチドへ特異的に結合する抗体。
【請求項１９】
前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である請求項１８の抗体。
【請求項２０】
（ａ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、Ｆｉｇ９（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１１（配列番号：２８）、Ｆｉｇ１５（配列番号：３６）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４５）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５２）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５９）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６４）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６９）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７４）、Ｆｉｇ３３（配列番号：８５）、Ｆｉｇ３５（配列番号：９０）、Ｆｉｇ３７（配列番号：９７）、Ｆｉｇ３９（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４１（配列番号：１０９）、Ｆｉｇ４３（配列番号：１１４）、Ｆｉｇ４５（配列番号：１１９）、Ｆｉｇ４７（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４９（配列番号：１３２）、Ｆｉｇ５１（配列番号：１３７）、Ｆｉｇ５３（配列番号：１４５）、Ｆｉｇ５５（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ５９（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６１（配列番号：１６２）、Ｆｉｇ６３（配列番号：１６９）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１８３）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１９０）、Ｆｉｇ７３（配列番号：１９６）、Ｆｉｇ７５（配列番号：２０６）、Ｆｉｇ７７（配列番号：２１１）、Ｆｉｇ７９（配列番号：２１６）、Ｆｉｇ８１（配列番号：２２１）、Ｆｉｇ８３（配列番号：２２６）、Ｆｉｇ８５（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ８７（配列番号：２３６）、Ｆｉｇ８９（配列番号：２４５）、Ｆｉｇ９１（配列番号：２５４）、Ｆｉｇ９３（配列番号：２５９）、Ｆｉｇ９５（配列番号：２６４）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２７０）、Ｆｉｇ１０９（配列番号：２８４）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２９６）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：３０１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：３０３）、Ｆｉｇ１２５（配列番号：３０９）、Ｆｉｇ１２９（配列番号：３２２）、Ｆｉｇ１３２（配列番号：３３０）、Ｆｉｇ１３６（配列番号：３３７）、Ｆｉｇ１３９（配列番号：３４６）、Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）、Ｆｉｇ１４５（配列番号：３５８）、Ｆｉｇ１４７（配列番号：３６３）、Ｆｉｇ１４９（配列番号：３７０）、Ｆｉｇ１５１（配列番号：３７５）、Ｆｉｇ１５３（配列番号：３８０）、Ｆｉｇ１５５（配列番号：３８５）、Ｆｉｇ１５７（配列番号：３９０）、Ｆｉｇ１５９（配列番号：３９５）、Ｆｉｇ１６１（配列番号：４００）、Ｆｉｇ１６３（配列番号：４０５）、Ｆｉｇ１６５（配列番号：４１０）、Ｆｉｇ１６７（配列番号：４１５）、Ｆｉｇ１６９（配列番号：４２０）、Ｆｉｇ１７１（配列番号：４２５）、Ｆｉｇ１７３（配列番号：４３０）、Ｆｉｇ１７７（配列番号：４３７）、Ｆｉｇ１７９（配列番号：４４２）、Ｆｉｇ１８１（配列番号：４４７）、Ｆｉｇ１８３（配列番号：４５２）、Ｆｉｇ１８５（配列番号：４５４）、Ｆｉｇ１８７（配列番号：４５６）、Ｆｉｇ１９０（配列番号：４５９）、Ｆｉｇ１９２（配列番号：４６４）、Ｆｉｇ１９４（配列番号：４６６）、Ｆｉｇ１９６（配列番号：４６８）、Ｆｉｇ１９８（配列番号：４７０）、Ｆｉｇ２００（配列番号：４７２）、Ｆｉｇ２０２（配列番号：４７７）、Ｆｉｇ２０４（配列番号：４８３）、Ｆｉｇ２０７（配列番号：４８８）、Ｆｉｇ２０９（配列番号：４９６）、Ｆｉｇ２１１（配列番号：４９８）、Ｆｉｇ２１３（配列番号：５０６）、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）、Ｆｉｇ２１７（配列番号：５１０）、Ｆｉｇ２１９（配列番号：５１５）、Ｆｉｇ２２２（配列番号：５２３）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２３０（配列番号：６１２）、Ｆｉｇ２３２（配列番号：６１４）、Ｆｉｇ２３４（配列番号：６１６）又はＦｉｇ２３６（配列番号：６１８）に示されているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で、その結合シグナルペプチドを欠くヌクレオチド配列；
（ｂ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、Ｆｉｇ９（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１１（配列番号：２８）、Ｆｉｇ１５（配列番号：３６）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４５）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５２）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５９）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６４）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６９）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７４）、Ｆｉｇ３３（配列番号：８５）、Ｆｉｇ３５（配列番号：９０）、Ｆｉｇ３７（配列番号：９７）、Ｆｉｇ３９（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４１（配列番号：１０９）、Ｆｉｇ４３（配列番号：１１４）、Ｆｉｇ４５（配列番号：１１９）、Ｆｉｇ４７（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４９（配列番号：１３２）、Ｆｉｇ５１（配列番号：１３７）、Ｆｉｇ５３（配列番号：１４５）、Ｆｉｇ５５（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ５９（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６１（配列番号：１６２）、Ｆｉｇ６３（配列番号：１６９）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１８３）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１９０）、Ｆｉｇ７３（配列番号：１９６）、Ｆｉｇ７５（配列番号：２０６）、Ｆｉｇ７７（配列番号：２１１）、Ｆｉｇ７９（配列番号：２１６）、Ｆｉｇ８１（配列番号：２２１）、Ｆｉｇ８３（配列番号：２２６）、Ｆｉｇ８５（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ８７（配列番号：２３６）、Ｆｉｇ８９（配列番号：２４５）、Ｆｉｇ９１（配列番号：２５４）、Ｆｉｇ９３（配列番号：２５９）、Ｆｉｇ９５（配列番号：２６４）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２７０）、Ｆｉｇ１０９（配列番号：２８４）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２９６）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：３０１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：３０３）、Ｆｉｇ１２５（配列番号：３０９）、Ｆｉｇ１２９（配列番号：３２２）、Ｆｉｇ１３２（配列番号：３３０）、Ｆｉｇ１３６（配列番号：３３７）、Ｆｉｇ１３９（配列番号：３４６）、Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）、Ｆｉｇ１４５（配列番号：３５８）、Ｆｉｇ１４７（配列番号：３６３）、Ｆｉｇ１４９（配列番号：３７０）、Ｆｉｇ１５１（配列番号：３７５）、Ｆｉｇ１５３（配列番号：３８０）、Ｆｉｇ１５５（配列番号：３８５）、Ｆｉｇ１５７（配列番号：３９０）、Ｆｉｇ１５９（配列番号：３９５）、Ｆｉｇ１６１（配列番号：４００）、Ｆｉｇ１６３（配列番号：４０５）、Ｆｉｇ１６５（配列番号：４１０）、Ｆｉｇ１６７（配列番号：４１５）、Ｆｉｇ１６９（配列番号：４２０）、Ｆｉｇ１７１（配列番号：４２５）、Ｆｉｇ１７３（配列番号：４３０）、Ｆｉｇ１７７（配列番号：４３７）、Ｆｉｇ１７９（配列番号：４４２）、Ｆｉｇ１８１（配列番号：４４７）、Ｆｉｇ１８３（配列番号：４５２）、Ｆｉｇ１８５（配列番号：４５４）、Ｆｉｇ１８７（配列番号：４５６）、Ｆｉｇ１９０（配列番号：４５９）、Ｆｉｇ１９２（配列番号：４６４）、Ｆｉｇ１９４（配列番号：４６６）、Ｆｉｇ１９６（配列番号：４６８）、Ｆｉｇ１９８（配列番号：４７０）、Ｆｉｇ２００（配列番号：４７２）、Ｆｉｇ２０２（配列番号：４７７）、Ｆｉｇ２０４（配列番号：４８３）、Ｆｉｇ２０７（配列番号：４８８）、Ｆｉｇ２０９（配列番号：４９６）、Ｆｉｇ２１１（配列番号：４９８）、Ｆｉｇ２１３（配列番号：５０６）、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）、Ｆｉｇ２１７（配列番号：５１０）、Ｆｉｇ２１９（配列番号：５１５）、Ｆｉｇ２２２（配列番号：５２３）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２３０（配列番号：６１２）、Ｆｉｇ２３２（配列番号：６１４）、Ｆｉｇ２３４（配列番号：６１６）又はＦｉｇ２３６（配列番号：６１８）に示されているポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で、その結合シグナルペプチドを伴うヌクレオチド配列；又は
（ｃ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、Ｆｉｇ９（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１１（配列番号：２８）、Ｆｉｇ１５（配列番号：３６）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４５）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５２）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５９）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６４）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６９）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７４）、Ｆｉｇ３３（配列番号：８５）、Ｆｉｇ３５（配列番号：９０）、Ｆｉｇ３７（配列番号：９７）、Ｆｉｇ３９（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４１（配列番号：１０９）、Ｆｉｇ４３（配列番号：１１４）、Ｆｉｇ４５（配列番号：１１９）、Ｆｉｇ４７（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４９（配列番号：１３２）、Ｆｉｇ５１（配列番号：１３７）、Ｆｉｇ５３（配列番号：１４５）、Ｆｉｇ５５（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ５９（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６１（配列番号：１６２）、Ｆｉｇ６３（配列番号：１６９）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１８３）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１９０）、Ｆｉｇ７３（配列番号：１９６）、Ｆｉｇ７５（配列番号：２０６）、Ｆｉｇ７７（配列番号：２１１）、Ｆｉｇ７９（配列番号：２１６）、Ｆｉｇ８１（配列番号：２２１）、Ｆｉｇ８３（配列番号：２２６）、Ｆｉｇ８５（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ８７（配列番号：２３６）、Ｆｉｇ８９（配列番号：２４５）、Ｆｉｇ９１（配列番号：２５４）、Ｆｉｇ９３（配列番号：２５９）、Ｆｉｇ９５（配列番号：２６４）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２７０）、Ｆｉｇ１０９（配列番号：２８４）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２９６）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：３０１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：３０３）、Ｆｉｇ１２５（配列番号：３０９）、Ｆｉｇ１２９（配列番号：３２２）、Ｆｉｇ１３２（配列番号：３３０）、Ｆｉｇ１３６（配列番号：３３７）、Ｆｉｇ１３９（配列番号：３４６）、Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）、Ｆｉｇ１４５（配列番号：３５８）、Ｆｉｇ１４７（配列番号：３６３）、Ｆｉｇ１４９（配列番号：３７０）、Ｆｉｇ１５１（配列番号：３７５）、Ｆｉｇ１５３（配列番号：３８０）、Ｆｉｇ１５５（配列番号：３８５）、Ｆｉｇ１５７（配列番号：３９０）、Ｆｉｇ１５９（配列番号：３９５）、Ｆｉｇ１６１（配列番号：４００）、Ｆｉｇ１６３（配列番号：４０５）、Ｆｉｇ１６５（配列番号：４１０）、Ｆｉｇ１６７（配列番号：４１５）、Ｆｉｇ１６９（配列番号：４２０）、Ｆｉｇ１７１（配列番号：４２５）、Ｆｉｇ１７３（配列番号：４３０）、Ｆｉｇ１７７（配列番号：４３７）、Ｆｉｇ１７９（配列番号：４４２）、Ｆｉｇ１８１（配列番号：４４７）、Ｆｉｇ１８３（配列番号：４５２）、Ｆｉｇ１８５（配列番号：４５４）、Ｆｉｇ１８７（配列番号：４５６）、Ｆｉｇ１９０（配列番号：４５９）、Ｆｉｇ１９２（配列番号：４６４）、Ｆｉｇ１９４（配列番号：４６６）、Ｆｉｇ１９６（配列番号：４６８）、Ｆｉｇ１９８（配列番号：４７０）、Ｆｉｇ２００（配列番号：４７２）、Ｆｉｇ２０２（配列番号：４７７）、Ｆｉｇ２０４（配列番号：４８３）、Ｆｉｇ２０７（配列番号：４８８）、Ｆｉｇ２０９（配列番号：４９６）、Ｆｉｇ２１１（配列番号：４９８）、Ｆｉｇ２１３（配列番号：５０６）、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）、Ｆｉｇ２１７（配列番号：５１０）、Ｆｉｇ２１９（配列番号：５１５）、Ｆｉｇ２２２（配列番号：５２３）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２３０（配列番号：６１２）、Ｆｉｇ２３２（配列番号：６１４）、Ｆｉｇ２３４（配列番号：６１６）又はＦｉｇ２３６（配列番号：６１８）に示されているポリペプチドをコードする核酸配列で、その結合シグナルペプチドを欠くヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
【請求項２１】
（ａ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、Ｆｉｇ９（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１１（配列番号：２８）、Ｆｉｇ１５（配列番号：３６）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４５）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５２）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５９）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６４）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６９）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７４）、Ｆｉｇ３３（配列番号：８５）、Ｆｉｇ３５（配列番号：９０）、Ｆｉｇ３７（配列番号：９７）、Ｆｉｇ３９（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４１（配列番号：１０９）、Ｆｉｇ４３（配列番号：１１４）、Ｆｉｇ４５（配列番号：１１９）、Ｆｉｇ４７（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４９（配列番号：１３２）、Ｆｉｇ５１（配列番号：１３７）、Ｆｉｇ５３（配列番号：１４５）、Ｆｉｇ５５（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ５９（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６１（配列番号：１６２）、Ｆｉｇ６３（配列番号：１６９）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１８３）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１９０）、Ｆｉｇ７３（配列番号：１９６）、Ｆｉｇ７５（配列番号：２０６）、Ｆｉｇ７７（配列番号：２１１）、Ｆｉｇ７９（配列番号：２１６）、Ｆｉｇ８１（配列番号：２２１）、Ｆｉｇ８３（配列番号：２２６）、Ｆｉｇ８５（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ８７（配列番号：２３６）、Ｆｉｇ８９（配列番号：２４５）、Ｆｉｇ９１（配列番号：２５４）、Ｆｉｇ９３（配列番号：２５９）、Ｆｉｇ９５（配列番号：２６４）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２７０）、Ｆｉｇ１０９（配列番号：２８４）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２９６）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：３０１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：３０３）、Ｆｉｇ１２５（配列番号：３０９）、Ｆｉｇ１２９（配列番号：３２２）、Ｆｉｇ１３２（配列番号：３３０）、Ｆｉｇ１３６（配列番号：３３７）、Ｆｉｇ１３９（配列番号：３４６）、Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）、Ｆｉｇ１４５（配列番号：３５８）、Ｆｉｇ１４７（配列番号：３６３）、Ｆｉｇ１４９（配列番号：３７０）、Ｆｉｇ１５１（配列番号：３７５）、Ｆｉｇ１５３（配列番号：３８０）、Ｆｉｇ１５５（配列番号：３８５）、Ｆｉｇ１５７（配列番号：３９０）、Ｆｉｇ１５９（配列番号：３９５）、Ｆｉｇ１６１（配列番号：４００）、Ｆｉｇ１６３（配列番号：４０５）、Ｆｉｇ１６５（配列番号：４１０）、Ｆｉｇ１６７（配列番号：４１５）、Ｆｉｇ１６９（配列番号：４２０）、Ｆｉｇ１７１（配列番号：４２５）、Ｆｉｇ１７３（配列番号：４３０）、Ｆｉｇ１７７（配列番号：４３７）、Ｆｉｇ１７９（配列番号：４４２）、Ｆｉｇ１８１（配列番号：４４７）、Ｆｉｇ１８３（配列番号：４５２）、Ｆｉｇ１８５（配列番号：４５４）、Ｆｉｇ１８７（配列番号：４５６）、Ｆｉｇ１９０（配列番号：４５９）、Ｆｉｇ１９２（配列番号：４６４）、Ｆｉｇ１９４（配列番号：４６６）、Ｆｉｇ１９６（配列番号：４６８）、Ｆｉｇ１９８（配列番号：４７０）、Ｆｉｇ２００（配列番号：４７２）、Ｆｉｇ２０２（配列番号：４７７）、Ｆｉｇ２０４（配列番号：４８３）、Ｆｉｇ２０７（配列番号：４８８）、Ｆｉｇ２０９（配列番号：４９６）、Ｆｉｇ２１１（配列番号：４９８）、Ｆｉｇ２１３（配列番号：５０６）、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）、Ｆｉｇ２１７（配列番号：５１０）、Ｆｉｇ２１９（配列番号：５１５）、Ｆｉｇ２２２（配列番号：５２３）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２３０（配列番号：６１２）、Ｆｉｇ２３２（配列番号：６１４）、Ｆｉｇ２３４（配列番号：６１６）又はＦｉｇ２３６（配列番号：６１８）に示されているポリペプチドで、その結合シグナルペプチドを欠くポリペプチド；
（ｂ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、Ｆｉｇ９（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１１（配列番号：２８）、Ｆｉｇ１５（配列番号：３６）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４５）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５２）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５９）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６４）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６９）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７４）、Ｆｉｇ３３（配列番号：８５）、Ｆｉｇ３５（配列番号：９０）、Ｆｉｇ３７（配列番号：９７）、Ｆｉｇ３９（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４１（配列番号：１０９）、Ｆｉｇ４３（配列番号：１１４）、Ｆｉｇ４５（配列番号：１１９）、Ｆｉｇ４７（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４９（配列番号：１３２）、Ｆｉｇ５１（配列番号：１３７）、Ｆｉｇ５３（配列番号：１４５）、Ｆｉｇ５５（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ５９（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６１（配列番号：１６２）、Ｆｉｇ６３（配列番号：１６９）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１８３）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１９０）、Ｆｉｇ７３（配列番号：１９６）、Ｆｉｇ７５（配列番号：２０６）、Ｆｉｇ７７（配列番号：２１１）、Ｆｉｇ７９（配列番号：２１６）、Ｆｉｇ８１（配列番号：２２１）、Ｆｉｇ８３（配列番号：２２６）、Ｆｉｇ８５（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ８７（配列番号：２３６）、Ｆｉｇ８９（配列番号：２４５）、Ｆｉｇ９１（配列番号：２５４）、Ｆｉｇ９３（配列番号：２５９）、Ｆｉｇ９５（配列番号：２６４）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２７０）、Ｆｉｇ１０９（配列番号：２８４）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２９６）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：３０１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：３０３）、Ｆｉｇ１２５（配列番号：３０９）、Ｆｉｇ１２９（配列番号：３２２）、Ｆｉｇ１３２（配列番号：３３０）、Ｆｉｇ１３６（配列番号：３３７）、Ｆｉｇ１３９（配列番号：３４６）、Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）、Ｆｉｇ１４５（配列番号：３５８）、Ｆｉｇ１４７（配列番号：３６３）、Ｆｉｇ１４９（配列番号：３７０）、Ｆｉｇ１５１（配列番号：３７５）、Ｆｉｇ１５３（配列番号：３８０）、Ｆｉｇ１５５（配列番号：３８５）、Ｆｉｇ１５７（配列番号：３９０）、Ｆｉｇ１５９（配列番号：３９５）、Ｆｉｇ１６１（配列番号：４００）、Ｆｉｇ１６３（配列番号：４０５）、Ｆｉｇ１６５（配列番号：４１０）、Ｆｉｇ１６７（配列番号：４１５）、Ｆｉｇ１６９（配列番号：４２０）、Ｆｉｇ１７１（配列番号：４２５）、Ｆｉｇ１７３（配列番号：４３０）、Ｆｉｇ１７７（配列番号：４３７）、Ｆｉｇ１７９（配列番号：４４２）、Ｆｉｇ１８１（配列番号：４４７）、Ｆｉｇ１８３（配列番号：４５２）、Ｆｉｇ１８５（配列番号：４５４）、Ｆｉｇ１８７（配列番号：４５６）、Ｆｉｇ１９０（配列番号：４５９）、Ｆｉｇ１９２（配列番号：４６４）、Ｆｉｇ１９４（配列番号：４６６）、Ｆｉｇ１９６（配列番号：４６８）、Ｆｉｇ１９８（配列番号：４７０）、Ｆｉｇ２００（配列番号：４７２）、Ｆｉｇ２０２（配列番号：４７７）、Ｆｉｇ２０４（配列番号：４８３）、Ｆｉｇ２０７（配列番号：４８８）、Ｆｉｇ２０９（配列番号：４９６）、Ｆｉｇ２１１（配列番号：４９８）、Ｆｉｇ２１３（配列番号：５０６）、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）、Ｆｉｇ２１７（配列番号：５１０）、Ｆｉｇ２１９（配列番号：５１５）、Ｆｉｇ２２２（配列番号：５２３）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２３０（配列番号：６１２）、Ｆｉｇ２３２（配列番号：６１４）、Ｆｉｇ２３４（配列番号：６１６）又はＦｉｇ２３６（配列番号：６１８）に示されているポリペプチドの細胞外ドメインで、その結合シグナルペプチドを伴うポリペプチドの細胞外ドメイン；又は
（ｃ）Ｆｉｇ２（配列番号：２）、Ｆｉｇ４（配列番号：７）、Ｆｉｇ９（配列番号：１９）、Ｆｉｇ１１（配列番号：２８）、Ｆｉｇ１５（配列番号：３６）、Ｆｉｇ２０（配列番号：４５）、Ｆｉｇ２２（配列番号：５２）、Ｆｉｇ２４（配列番号：５９）、Ｆｉｇ２６（配列番号：６４）、Ｆｉｇ２８（配列番号：６９）、Ｆｉｇ３０（配列番号：７４）、Ｆｉｇ３３（配列番号：８５）、Ｆｉｇ３５（配列番号：９０）、Ｆｉｇ３７（配列番号：９７）、Ｆｉｇ３９（配列番号：１０２）、Ｆｉｇ４１（配列番号：１０９）、Ｆｉｇ４３（配列番号：１１４）、Ｆｉｇ４５（配列番号：１１９）、Ｆｉｇ４７（配列番号：１２４）、Ｆｉｇ４９（配列番号：１３２）、Ｆｉｇ５１（配列番号：１３７）、Ｆｉｇ５３（配列番号：１４５）、Ｆｉｇ５５（配列番号：１５０）、Ｆｉｇ５９（配列番号：１５７）、Ｆｉｇ６１（配列番号：１６２）、Ｆｉｇ６３（配列番号：１６９）、Ｆｉｇ６６（配列番号：１７８）、Ｆｉｇ６８（配列番号：１８３）、Ｆｉｇ７０（配列番号：１９０）、Ｆｉｇ７３（配列番号：１９６）、Ｆｉｇ７５（配列番号：２０６）、Ｆｉｇ７７（配列番号：２１１）、Ｆｉｇ７９（配列番号：２１６）、Ｆｉｇ８１（配列番号：２２１）、Ｆｉｇ８３（配列番号：２２６）、Ｆｉｇ８５（配列番号：２３１）、Ｆｉｇ８７（配列番号：２３６）、Ｆｉｇ８９（配列番号：２４５）、Ｆｉｇ９１（配列番号：２５４）、Ｆｉｇ９３（配列番号：２５９）、Ｆｉｇ９５（配列番号：２６４）、Ｆｉｇ９８（配列番号：２７０）、Ｆｉｇ１０９（配列番号：２８４）、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２９６）、Ｆｉｇ１２０（配列番号：３０１）、Ｆｉｇ１２２（配列番号：３０３）、Ｆｉｇ１２５（配列番号：３０９）、Ｆｉｇ１２９（配列番号：３２２）、Ｆｉｇ１３２（配列番号：３３０）、Ｆｉｇ１３６（配列番号：３３７）、Ｆｉｇ１３９（配列番号：３４６）、Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）、Ｆｉｇ１４５（配列番号：３５８）、Ｆｉｇ１４７（配列番号：３６３）、Ｆｉｇ１４９（配列番号：３７０）、Ｆｉｇ１５１（配列番号：３７５）、Ｆｉｇ１５３（配列番号：３８０）、Ｆｉｇ１５５（配列番号：３８５）、Ｆｉｇ１５７（配列番号：３９０）、Ｆｉｇ１５９（配列番号：３９５）、Ｆｉｇ１６１（配列番号：４００）、Ｆｉｇ１６３（配列番号：４０５）、Ｆｉｇ１６５（配列番号：４１０）、Ｆｉｇ１６７（配列番号：４１５）、Ｆｉｇ１６９（配列番号：４２０）、Ｆｉｇ１７１（配列番号：４２５）、Ｆｉｇ１７３（配列番号：４３０）、Ｆｉｇ１７７（配列番号：４３７）、Ｆｉｇ１７９（配列番号：４４２）、Ｆｉｇ１８１（配列番号：４４７）、Ｆｉｇ１８３（配列番号：４５２）、Ｆｉｇ１８５（配列番号：４５４）、Ｆｉｇ１８７（配列番号：４５６）、Ｆｉｇ１９０（配列番号：４５９）、Ｆｉｇ１９２（配列番号：４６４）、Ｆｉｇ１９４（配列番号：４６６）、Ｆｉｇ１９６（配列番号：４６８）、Ｆｉｇ１９８（配列番号：４７０）、Ｆｉｇ２００（配列番号：４７２）、Ｆｉｇ２０２（配列番号：４７７）、Ｆｉｇ２０４（配列番号：４８３）、Ｆｉｇ２０７（配列番号：４８８）、Ｆｉｇ２０９（配列番号：４９６）、Ｆｉｇ２１１（配列番号：４９８）、Ｆｉｇ２１３（配列番号：５０６）、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）、Ｆｉｇ２１７（配列番号：５１０）、Ｆｉｇ２１９（配列番号：５１５）、Ｆｉｇ２２２（配列番号：５２３）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）、Ｆｉｇ２３０（配列番号：６１２）、Ｆｉｇ２３２（配列番号：６１４）、Ｆｉｇ２３４（配列番号：６１６）又はＦｉｇ２３６（配列番号：６１８）に示されているポリペプチドの細胞外ドメインで、その結合シグナルペプチドを欠くポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。。
【請求項２２】
ＰＲＯ４９９３ポリペプチドを含有すると推測される試料よりＰＲＯ４９９３ポリペプチドを検出する方法において、前記試料をＰＲＯ３３７ポリペプチドと接触せしめ、前記試料中のＰＲＯ４９９３／ＰＲＯ３３７ポリペプチド抱合体の形成を測定することを含んでなり、前記抱合体の形成が前記試料中のＰＲＯ４９９３ポリペプチドの存在を示す方法。
【請求項２３】
前記試料が前記ＰＲＯ４９９３ポリペプチドを発現すると推測される細胞を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰＲＯ３３７ポリペプチドが検出可能なラベルによって標識されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＲＯ３３７ポリペプチドが固体支持体へ付着している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
ＰＲＯ３３７ポリペプチドを含有すると推測される試料よりＰＲＯ３３７ポリペプチドを検出する方法において、前記試料をＰＲＯ４９９３ポリペプチドと接触せしめ、前記試料中のＰＲＯ４９９３／ＰＲＯ３３７ポリペプチド抱合体の形成を測定することを含んでなり、前記抱合体の形成が前記試料中のＰＲＯ３３７ポリペプチドの存在を示す方法。
【請求項２７】
前記試料が前記ＰＲＯ３３７ポリペプチドを発現すると推測される細胞を含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＲＯ４９９３ポリペプチドが検出可能なラベルによって標識されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＲＯ４９９３ポリペプチドが固体支持体へ付着している、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
ＰＲＯ１５５９ポリペプチドを含有すると推測される試料よりＰＲＯ１５５９ポリペプチドを検出する方法において、前記試料をＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００、又はＰＲＯ７３９ポリペプチドと接触せしめ、前記試料中のＰＲＯ１５５９／ＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００又はＰＲＯ７３９ポリペプチド抱合体の形成を測定することを含んでなり、前記抱合体の形成が前記試料中のＰＲＯ１５５９ポリペプチドの存在を示す方法。
【請求項３１】
前記試料が前記ＰＲＯ１５５９ポリペプチドを発現すると推測される細胞を含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００、ＰＲＯ７３９ポリペプチドが検出可能なラベルによって標識されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００、ＰＲＯ７３９ポリペプチドが固体支持体へ付着している、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
ＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００、又はＰＲＯ７３９ポリペプチドを含有すると推測される試料よりＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００、又はＰＲＯ７３９ポリペプチドを検出する方法において、前記試料をＰＲＯ１５５９ポリペプチドと接触せしめ、前記試料中のＰＲＯ１５５９／ＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００又はＰＲＯ７３９ポリペプチド抱合体の形成を測定することを含んでなり、前記抱合体の形成が前記試料中のＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００、又はＰＲＯ７３９ポリペプチドの存在を示す方法。
【請求項３５】
前記試料が前記ＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００、又はＰＲＯ７３９ポリペプチドを発現すると推測される細胞を含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＰＲＯ１５５９ポリペプチドが検出可能なラベルによって標識されている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＲＯ１５５９ポリペプチドが固体支持体へ付着している、求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
生物活性分子をＰＲＯ３３７ポリペプチドを発現する細胞へ関連させる方法において、前記細胞を前記生物活性分子と結合しているＰＲＯ４９９３ポリペプチドと接触せしめ、前記ＰＲＯ３３７とＰＲＯ４９９３ポリペプチドが互いに結合することを可能にすることを含んでなり、これにより前記生物活性分子を前記細胞へ関連させる方法。
【請求項３９】
前記生物活性分子が毒素、放射線同位元素又は抗体である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記生物活性分子が前記細胞の死を生じせしめる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
生物活性分子をＰＲＯ４９９３ポリペプチドを発現している細胞へ関連させる方法において、前記細胞を前記生物活性分子と結合しているＰＲＯ３３７ポリペプチドと接触せしめ、前記ＰＲＯ４９９３とＰＲＯ３３７ポリペプチドが互いに結合することを可能にすることを含んでなり、これにより前記生物活性分子を前記細胞へ関連させる方法。
【請求項４２】
前記生物活性分子が毒素、放射線同位元素又は抗体である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記生物活性分子が前記細胞の死を生じせしめる、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
生物活性分子をＰＲＯ１５５９ポリペプチドを発現している細胞へ関連させる方法において、前記細胞を前記生物活性分子と結合しているＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００，又はＰＲＯ７３９ポリペプチドと接触せしめ、前記ＰＲＯ１５５９とＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００又はＰＲＯ７３９ポリペプチドが互いに結合することを可能にすることを含んでなり、これにより前記生物活性分子を前記細胞へ関連させる方法。
【請求項４５】
前記生物活性分子が毒素、放射線同位元素又は抗体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記生物活性分子が前記細胞の死を生じせしめる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
生物活性分子をＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００又はＰＲＯ７３９ポリペプチドを発現している細胞へ関連させる方法において、前記細胞を前記生物活性分子と結合しているＰＲＯ１５５９ポリペプチドと接触せしめ、前記ＰＲＯ１５５９とＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００又はＰＲＯ７３９ポリペプチドが互いに結合することを可能にすることを含んでなり、これにより前記生物活性分子を前記細胞へ関連させる方法。
【請求項４８】
前記生物活性分子が毒素、放射線同位元素又は抗体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記生物活性分子が前記細胞の死を生じせしめる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
ＰＲＯ３３７ポリペプチドを発現している細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法において、前記細胞とＰＲＯ４９９３又は抗−ＰＲＯ３３７抗体を接触せしめることを含んでなり、これにより前記ＰＲＯ４９９３ポリペプチド又は抗−３３７抗体が前記ＰＲＯ３３７ポリペプチドと結合し、前記細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法。
【請求項５１】
前記細胞が死滅せしめられる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＰＲＯ４９９３ポリペプチドを発現している細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法において、前記細胞とＰＲＯ３３７又は抗−ＰＲＯ４９９３抗体を接触せしめることを含んでなり、これにより前記ＰＲＯ３３７ポリペプチド又は抗−４９９３抗体が前記ＰＲＯ４９９３ポリペプチドと結合し、前記細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法。
【請求項５３】
前記細胞が死滅せしめられる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＰＲＯ１５５９ポリペプチドを発現している細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法において、前記細胞とＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００又はＰＲＯ７３９ポリペプチド又は抗−ＰＲＯ１５５９抗体を接触せしめることを含んでなり、これにより前記ＰＲＯ７２５，ＰＲＯ７００又はＰＲＯ７３９ポリペプチド又は前記抗−ＰＲＯ１５５９抗体が前記ＰＲＯ１５５９ポリペプチドと結合し、前記細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法。
【請求項５５】
前記細胞が死滅せしめられる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
ＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００、又はＰＲＯ７３９ポリペプチドを発現している細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法において、前記細胞とＰＲＯ１５５９ポリペプチド、又は抗−ＰＲＯ７２５、抗−ＰＲＯ７００又は抗−ＰＲＯ７３９抗体を接触せしめることを含んでなり、これにより前記ＰＲＯ１５５９ポリペプチド，又は前記抗−ＰＲＯ７２５、抗−ＰＲＯ７００又は抗−ＰＲＯ７３９抗体が前記ＰＲＯ７２５、ＰＲＯ７００又はＰＲＯ７３９ポリペプチドと結合し、前記細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法。
【請求項５７】
前記細胞が死滅せしめられる、請求項５４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般的に、新規なＤＮＡの同定及び単離、及び該ＤＮＡによりコードされる新規なポリペプチドの組換え生産に関する。
【０００２】
（発明の背景）
細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取る情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル分子は、通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境におけるその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む、様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び種々の他のサイトカインのような、現在入手可能な大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。新規な未変性分泌タンパク質を同定する努力が産業界及び学術界の両方によってなされている。多くの努力が新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９３；７１０８−７１１３（１９９６）；米国特許第５５３６６３７号を参照されたい］。
【０００３】
膜結合タンパク質及びレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞の増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるプロテインチロシンキナーゼはまた成長因子レセプターとしても作用する。具体例には、繊維芽細胞増殖因子及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド間相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター／リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子インヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。新規な未変性レセプタータンパク質を同定するための努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために、哺乳類の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。
ここで我々は、新規の分泌及び膜貫通ポリペプチド、及びこれらポリペプチドをコードする新規な核酸の同定及び特徴づけを記述する。
【０００４】
１．ＰＲＯ２１３
ヒト成長停止−特異的遺伝子６（Ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ａｒｒｅｓｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ ６）（ｇａｓ６）は、様々な異なる組織で発現され、血清欠乏期間中に高度に発現されて成長誘導中にネガティブに調節されることが報告されているタンパク質をコードする。Ｍａｎｆｉｏｌｅｔｔｉ等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３（８）：４９７６−４９８５（１９９３）及びＳｔｉｔｔ等， Ｃｅｌｌ ８０：６６１−６７０（１９９５）を参照されたい。Ｍａｎｆｉｏｌｅｔｔｉ等（１９９３），前掲は、ｇａｓ６プロテインが、ビタミンＫ依存性タンパク質ファミリーのメンバーであることを示唆しており、ここで後者のタンパク質ファミリーメンバー（例えば、プロテインＳ、プロテインＣ及びＸ因子が含まれる）は全て血液凝固経路において調節の役割を担っている。よって、ｇａｓ６は、成長調節に関連したプロテアーゼカスケードの調節又は血液凝固カスケードにおいてある役割を担っていることが示唆される。
ｇａｓ６プロテインの生理学的な重要性が分かったため、ｇａｓ６に相同な新規で未変性のタンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によりなされている。これらの努力の多くは、新規の分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にｇａｓ６と相同性を有するもののコード配列を同定するために、哺乳類の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。このようなスクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９３；７１０８−７１１３（１９９６）；米国特許第５５３６６３７号を参照されたい］。ここで我々は、ｇｓａ６ポリペプチドに対する相同性を有する新規のポリペプチドの同定について記載する。
【０００５】
２．ＰＲＯ２７４
文献においてＧ−プロテイン共役レセプター（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｐｌｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）とも呼ばれている７−膜貫通（「７ＴＭ」）タンパク質又はレセプターは、リガンドの認識と、それらリガンド内に含まれる情報の細胞の機構への続くシグナル伝達のために設計された特殊化されたタンパク質である。細胞表面レセプターの主たる目的は、各細胞が遭遇する様々な細胞外刺激から適切なリガンドを識別し、ついで細胞内シグナルをつくり出すエフェクター系を活性化させ、それによって細胞プロセスを制御することである。［Ｄｏｈｌｍａｎ， Ｈ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６０：６５３（１９９１）］。認識ドメインにリガンドを結合させ、細胞内ドメインに情報をアロステリックに伝達する７ＴＭレセプターの能力は、７ＴＭタンパク質の特殊化された特徴である。［Ｋｅｎａｋｉｎ， Ｔ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｖ．， ４８：４１３（１９９６）］。７ＴＭレセプター又はＧ−プロテイン関連レセプターをコードする遺伝子ファミリーは、これらに限定されるものではないが、Ｃ５ａ、インターロイキン８及び関連したケモカインを含む多数のリガンドを認識するレセプターをコードする。この分野における研究では、細胞表面の異なるシグナルが細胞活性化の共通の経路に送られることが示唆されている。［Ｇｅｒａｒｄ， Ｃ．，及びＧｅｒａｒｄ， Ｎ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６：１４０（１９９４）、Ｇｅｒａｒｄ， Ｃ．及びＧｅｒａｒｄ， Ｎ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２：７７５（１９９４）］。７ＴＭ又はＧ−プロテイン共役レセプターのスーパーファミリーには、光子、イオン及びとりわけアミノ酸のような様々なメッセージを認識可能な数百のメンバーが含まれる［Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｔ．Ｗ．ら， Ｈ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ．， １７（６）：２１３（１９９６）］。［Ｄｏｈｌｍａｎ， Ｈ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６０：６５３（１９９１）］。［Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｔ．Ｗ．ら， Ｈ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ．， ２：８５（１９９４）］。ここで我々は、７膜貫通セグメントレセプタータンパク質及びＦｎ５４タンパク質に対して相同性を有する新規のポリペプチド（ここではＰＲＯ２７４と命名）の同定について記載する。
【０００６】
３．ＰＲＯ３００
Ｄｉｆｆ３３プロテインはマウスの精巣腫瘍において過剰発現される。現在、その役割は不明であるが、癌においてある役割を担っていると思われる。癌の生理の理解の医学的な重要性が分かっているので、癌に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力が現在なされている。ここで我々は、ここではＰＲＯ３００と命名したＤｉｆｆ３３に対して相同性を有する新規のポリペプチドの同定について記載する。
【０００７】
４．ＰＲＯ２８４
新規な膜貫通ポリペプチドを同定し特徴づけるための努力が現在なされている。ここで我々は、ＰＲＯ２８４と命名した新規の膜貫通ポリペプチドの同定及び特徴づけについて記載する。
【０００８】
５．ＰＲＯ２９６
癌細胞は、しばしは、対応する正常な細胞型では発現されないか、対応する正常な細胞型におけるものとは異なるレベルで発現される数多くのタンパク質を発現する。これらタンパク質の多くは、正常な細胞から癌細胞への形質転換の誘発、又は癌表現型の維持に関与している。このように、癌細胞で発現されるタンパク質を同定し特徴づけることにはかなりの関心がある。ここで我々は、ここでＰＲＯ２９６と命名した肉腫増幅タンパク質ＳＡＳに対して相同性を有する新規のポリペプチドの同定及び特徴づけについて記載する。
【０００９】
６．ＰＲＯ３２９
免疫グロブリン分子は、多くの重要な哺乳類の生理的プロセスにおいて役割を担っている。免疫グロブリン分子の構造は広範囲に研究されており、無傷の免疫グロブリンは、その一つが免疫グロブリン分子の定常領域又はＦｃ領域である異なるドメインを有していることが十分に実証されている。免疫グロブリンのＦｃドメインは、抗原の認識と結合に直接には関与してはいないが、その各抗原と複合化されていまいとも複合されていようとも、免疫グロブリン分子の、血清中を循環しているか細胞表面にあるＦｃレセプターに結合する能力を媒介する。免疫グロブリンのＦｃレセプター分子への結合能力は、例えば望まれない外来粒子に対する免疫反応をなさせることを含む様々な重要な活性を生じる。このように、新規なＦｃレセプタータンパク質とそのサブユニットの同定にはかなりの関心がある。ここで我々は、ここにＰＲＯ３２９と命名した、高親和性免疫グロブリンＦｃレセプタータンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについて記載する。
【００１０】
７．ＰＲＯ３６２
結腸直腸ガン腫は、西側諸国、特に米国において高い発症率を有する悪性新生物疾患である。この種の腫瘍はしばしばリンパ又は導管チャンネルを通して転移し、米国において年間約６２０００人を死に至らしめる。
モノクローナル抗体Ａ３３（ｍＡｂＡ３３）は、結腸直腸癌腫に羅患した患者において広範な前臨床分析及び局在化研究を受けたマウス免疫グロブリンである（Ｗｅｌｔ等， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ８：１８９４−１９０６（１９９０）及びＷｅｌｔ等， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １２：１５６１−１５７１（１９９４））。ｍＡｂＡ３３は、正常な結腸細胞及び結腸ガン細胞の内部及びその表面で見出される抗原に結合することが分かった。結腸粘膜から派生した癌腫において、Ａ３３抗原は、９５％を越えるケースで均一に発現している。しかし、Ａ３３抗原は、他の広範囲の正常な組織では検出されておらず、すなわちその発現は、むしろ器官特異的であると思われる。従って、Ａ３３抗原は結腸直腸ガンの誘発において重要な役割を担っていると思われる。
腫瘍細胞の形成及び／又は増殖におけるＡ３３抗原の明らかな重要性が分かったため、Ａ３３抗原の相同体の同定にはかなりの関心がある。この点で、我々は、ここでＰＲＯ３６２と命名した、Ａ３３抗原に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけをここに記載する。
【００１１】
８．ＰＲＯ３６３
細胞表面タンパク質ＨＣＡＲは、アデノウイルスのサブグループＣ及びコクサッキーウイルスのサクグループＢに対するレセプターとして作用する膜結合タンパク質である。よって、ＨＣＡＲは細胞へのウイルス感染を媒介する手段を提供するものであり、細胞表面上にＨＣＡＲレセプターが存在すると、ウイルス粒子に対する結合部位が提供され、それによってウイルス感染が促進される。
膜結合タンパク質、特にウイルスに対する細胞表面レセプターを提供するものの生理学的重要性に鑑みて、新規で未変性の膜結合レセプタータンパク質を同定するための努力が、産業界及び学術界の双方により現在なされている。これらの多くの努力は、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでＰＲＯ３６３と命名した、Ａ３３及びガン胎児抗原を含む様々な腫瘍抗原及び細胞表面タンパク質ＨＣＡＲに対して相同性を有する新規な膜結合ポリペプチドポリペプチドをここに記載するもので、このポリペプチドは新規な細胞表面ウイルスレセプター又は腫瘍抗原でありうる。
【００１２】
９．ＰＲＯ８６８
哺乳動物における細胞数のコントロールは、細胞増殖と細胞死の間のバランスにより部分的に決定されると考えられている。しばしば壊死性細胞死と称される細胞死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病理的形態として特徴づけられる。これに対して、通常は規則的又はコントロールされた状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される［例えば、Ｂａｒｒ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １２：４８７−４９３（１９９４）；Ｓｔｅｌｌｅｒ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６７：１４４５−１４４９（１９９５）を参照］。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる［Ｉｔｏｈ等， Ｃｅｌｌ， ６６：２３３−２４３（１９９１）］。アポトーシス性細胞死のレベルの減少は、ガン、狼瘡、疱疹ウイスル感染を含む種々の病理的条件に関連している［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６７：１４５６−１４６２（１９９５）］。アポトーシス性細胞死のレベルの増加は、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、無形成性貧血、心筋梗塞、脳卒中、再灌流傷害、及び毒素誘発性肝疾患を含む様々な他の病理状態に関連している［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， 上掲を参照されたい］。
典型的には、アポトーシス性細胞死には、細胞内における一又は複数の特徴的な形態学的及び生化学的変化、例えば細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失が伴う。様々な外因的及び内因的シグナルが、このような形態学的及び生化学的な細胞変化を惹起又は誘発すると考えられている［Ｒａｆｆ， Ｎａｔｕｒｅ， ３５６：３９７−４００（１９９２）；Ｓｔｅｌｌｅｒ， 上掲；Ｓａｃｈｓら， Ｂｌｏｏｄ， ８２：１５（１９９３）］。例えば、ホルモンの刺激、例えば未成熟胸腺細胞に対する糖質コルチコイドホルモン、並びにある種の成長因子の退薬により惹起され得る［Ｗａｔａｎａｂｅ−Ｆｕｋｕｎａｇａ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３５６：３１４−３１７（１９９２）］。また、幾つかの同定された発ガン遺伝子、例えばｍｙｃ、ｒｅｌ、及びＥ１Ａ、及び腫瘍サプレッサー、例えばｐ５３が、アポトーシスを誘発する際にある役割を有していることも報告されている。ある種の化学療法薬及びある種の放射線も同様にアポトーシス誘発活性を有していることも見出されている［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ， 上掲］。
【００１３】
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子−α（「ＴＮＦ−α」）、腫瘍壊死因子−β（「ＴＮＦ−β」又は「リンホトキシン−α」）、リンホトキシン−β（「ＬＴ−β」）、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ−４０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド（Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される）、及びＡｐｏ−２リガンド（トレイル（ＴＲＡＩＬ）とも称される）が、サイトカインの腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）ファミリーのメンバーとして同定された［例えば、Ｇｒｕｓｓ及びＤｏｗｅｒ， Ｂｌｏｏｄ， ８５：３３７８−３４０４（１９９５）；Ｐｉｔｔｉ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１：１２６８７−１２６９０（１９９６）；Ｗｉｌｅｙ等， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ３：６７３−６８２（１９９５）；Ｂｒｏｗｎｉｎｇら， Ｃｅｌｌ， ７２：８４７−８５６（１９９３）；Ａｒｍｉｔａｇｅ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３５７：８０−８２（１９９２）、１９９７年１月１６日に公開されたＷＯ９７／０１６３３；１９９７年７月１７日に公開されたＷＯ９７／２５４２８］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢリガンド、Ａｐｏ−１リガンド、及びＡｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。ＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両方とも、感受性腫瘍細胞におけるアポトーシス性死を誘発することが報告されている［Ｓｃｈｍｉｄ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８３：１８８１（１９８６）；Ｄｅａｌｔｒｙ等， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １７：６８９（１９８７）］。Ｚｈｅｎｇ等は、ＴＮＦ−αがＣＤ８ポジティブＴ細胞のポスト刺激性アポトーシスに関与していることを報告している［Ｚｈｅｎｇ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３７７：３４８−３５１（１９９５）］。他の研究者は、ＣＤ３０リガンドが胸腺における自己反応性Ｔ細胞の欠失に関与していることを報告している［Ａｍａｋａｗａ等， プログラム細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要約集、第１０巻、（１９９５）］。
マウスのＦａｓ／Ａｐｏ−１レセプター又はリガンド遺伝子（それぞれ１ｐｒ及びｇｌｄと呼ばれる）における変異は幾つかの自己免疫疾患に関連しており、Ａｐｏ−１リガンドが末梢の自己反応性リンパ球のクローン除去を調節する役割を担っていることを示している［Ｋｒａｍｍｅｒ等， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６：２７９−２８９（１９９４）；Ｎａｇａｔａ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６７：１４４９−１４５６（１９９５）］。また、Ａｐｏ−１リガンドは、ＣＤ４ポジティブＴリンパ球及びＢリンパ球においてポスト刺激性アポトーシスを誘発することが報告されており、それらの機能がもはや必要でなくなった際の活性化リンパ球の除去に関与している［Ｋｒａｍｍｅｒ等， 上掲；Ｎａｇａｔａ等， 上掲］。Ａｐｏ−１レセプターと特異的に結合するアゴニストのマウスモノクローナル抗体は、ＴＮＦ−αに匹敵するか類似する細胞死滅活性を示すことが報告されている［Ｙｏｎｅｈａｒａ等， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １６９：１７４７−１７５６（１９８９）］。
【００１４】
このようなＴＮＦファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞反応誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。約５５−ｋＤａ（ＴＮＦＲ１）と７５−ｋＤａ（ＴＮＦＲ２）の２つの異なるＴＮＦレセプターが同定されており［Ｈｏｈｍａｎ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４：１４９２７−１４９３４（１９８９）；Ｂｒｏｃｋｈａｕｓ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８７：３１２７−３１３１（１９９０）；１９９１年３月２０日に公開されたＥＰ４１７５６３］、双方のレセプター型に対応するヒト及びマウスｃＤＮＡが単離され、特徴づけされている［Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ等， Ｃｅｌｌ， ６１：３５１（１９９０）；Ｓｃｈａｌｌ等， Ｃｅｌｌ， ６１：３６１（１９９０）；Ｓｍｉｔｈ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４８：１０１９−１０２３（１９９０）；Ｌｅｗｉｓ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８８：２８３０−２８３４（１９９１）；Ｇｏｏｄｗｉｎ等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １１：３０２０−３０２６（１９９１）］。広範な多型性が、双方のＴＮＦレセプター遺伝子に関連している［例えば、Ｔａｋａｏ等， Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， ３７：１９９−２０３（１９９３）を参照］。双方のＴＮＦＲは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面のレセプターの典型的な構造を共有する。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶性ＴＮＦ結合タンパク質として天然に見出される［Ｎｏｐｈａｒ， Ｙ等， ＥＭＢＯ Ｊ．， ９：３２６９（１９９０）；及びＫｏｈｎｏ， Ｔ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．， ８７：８３３１（１９９０）］。更に最近になって、組換え体可溶性ＴＮＦレセプターのクローニングがヘイル（Ｈａｌｅ）等［Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． 増補１５Ｆ， １９９１， ｐ．１１３（Ｐ４２４）］により報告されている。
１型又は２型のＴＮＦＲ（ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲ２）の細胞外部分は、ＮＨ２末端から出発して、１〜４とされる４つのシステインに富んだドメイン（ＣＲＤ）の反復アミノ酸配列パターンを含む。各ＣＲＤは約４０のアミノ酸長のものであり、良好に保存された位置に４〜６のシステイン残基を含んでいる［Ｓｃｈａｌｌ等， 上掲；Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ等， 上掲；Ｓｍｉｔｈ等， 上掲；Ｎｏｐｈａｒ等， 上掲；Ｋｏｈｎｏ等， 上掲］。ＴＮＦＲ１において、４つのＣＲＤのおおよその境界は次の通りである：ＣＲＤ１−１４から約５３までのアミノ酸；ＣＲＤ２−約５４から約９７までのアミノ酸；ＣＲＤ３−約９８から約１３８までのアミノ酸；ＣＲＤ４−約１３９から約１６７までのアミノ酸。ＴＮＦＲ２において、ＣＲＤ１は、１７〜約５４までのアミノ酸を、ＣＲＤ２は約５５から約９７までのアミノ酸を；ＣＲＤ３は約９８から約１４０までのアミノ酸を；ＣＲＤ４は約１４１から約１７９までのアミノ酸を含む［Ｂａｎｎｅｒ等， Ｃｅｌｌ， ７３：４３１−４３５（１９９３）］。また、リガンド結合におけるＣＲＤの可能な役割は前掲のＢａｎｎｅｒ等により記載されている。
【００１５】
ＣＲＤの類似の反復パターンが、ｐ７５神経成長因子レセプター（ＮＧＦＲ）［Ｊｏｈｎｓｏｎ等， Ｃｅｌｌ， ４７：５４５（１９８６）；Ｒａｄｅｋｅ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３２５：５９３（１９８７）］、Ｂ細胞抗原ＣＤ４０［Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ等， ＥＭＢＯ Ｊ．， ８：１４０３（１９８９）］、Ｔ細胞抗原ＯＸ４０［Ｍａｌｌｅｔ等， ＥＭＢＯ Ｊ．， ９：１０６３（１９９０）］及びＦａｓ抗原［Ｙｏｎｅｈａｒａ等， 上掲、及びＩｔｏｈ等， Ｃｅｌｌ， ６６：２３３−２４３（１９９１）］を含むいくつかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、ＣＲＤはショープ（Ｓｈｏｐｅ）及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型ＴＮＦＲ（ｓＴＮＦＲ）様のＴ２タンパク質にも見出されている［Ｕｐｔｏｎ等， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １６０：２０−２９（１９８７）；Ｓｍｉｔｈ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １７６：３３５（１９９１）；Ｕｐｔｏｎ等， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， １８４：３７０（１９９１）］。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。ｐ７５ＮＧＦＲに関する最近の研究では、このドメインにおけるＣＲＤ１の欠失［Ｗｅｌｃｈｅｒ， Ａ．Ａ．等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８：１５９−１６３（１９９１）］又は５−アミノ酸の挿入［Ｙａｎ． Ｈ及びＣｈａｏ， Ｍ．Ｖ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：１２０９９−１２１０４（１９９１）］は、ＮＧＦ結合には殆ど又は全く影響を持たないことが示されている［Ｙａｎ． Ｈ及びＣｈａｏ， Ｍ．Ｖ．， 上掲］。ｐ７５ＮＧＦＲはＮＧＦ結合に関与せず、そのＣＲＤ４と膜貫通領域の間に約６０のアミノ酸のプロリンに富んだ伸展を含む［Ｐｅｅｔｒｅ， Ｃ等， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｈｅｍａｔｏｌ．、４１：４１４−４１９（１９８８）；Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ， Ｐ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６４：１１９６６−１１９７３（１９８９）；Ｙａｎ． Ｈ及びＣｈａｏ， Ｍ．Ｖ．， 上掲］。同様のプロリンに富んだ領域はＴＮＦＲ２に見出されているが、ＴＮＦＲ１にはない。
リンフォトキシン−αを除き、今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、ＩＩ型の膜貫通タンパク質であり、そのＣ−末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター（ＴＮＦＲ）ファミリーのレセプター類はＩ型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン（「ＥＣＤ」）において見出されている。ＴＮＦ−α、Ａｐｏ−１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインの幾つかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；それぞれの場合に得られるタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインのインヒビターとして機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。
【００１６】
最近、ＴＮＦＲファミリーの他のメンバーが同定されている。このようなＴＮＦＲファミリーの新規に同定されたメンバーには、ＣＡＲ１、ＨＶＥＭ及びオステオプロテグリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ：ＯＰＧ）［Ｂｒｏｊａｔｓｃｈ等， Ｃｅｌｌ， ８７：８４５−８５５（１９９６）；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ等， Ｃｅｌｌ， ８７：４２７−４３６（１９９６）；Ｍａｒｓｔｅｒｓ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２：１４０２９−１４０３２（１９９７）；Ｓｉｍｏｎｅｔ等， Ｃｅｌｌ， ８９：３０９−３１９（１９９７）］が含まれる。他の既知のＴＮＦＲ様分子と異なり、Ｓｉｍｏｎｅｔ等， 上掲，は、ＯＰＧは疎水性の膜貫通−スパンニング配列を含んでいないと報告している。
更に、「グルココルチコイド−誘発性腫瘍壊死因子レセプターファミリー−関連遺伝子」に対して「ＧＩＴＲ」と呼ばれるレセプターである、ＴＮＦ／ＮＧＦレセプターファミリーの新規なメンバーがマウスにおいて同定されている［Ｎｏｃｅｎｔｉｎｉ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：６２１６−６２２１（１９９７）］。マウスＧＩＴＲレセプターは、正常なマウスの胸腺、脾臓及びリンパ節からのＴリンパ球中に発現される２２８のアミノ酸からなるＩ型膜貫通タンパク質である。マウスＧＩＴＲレセプターの発現は、抗ＣＤ３抗体、ＣｏｎＡ又はホルボール−１２−ミリスタート−１３−アセタートで活性化されたＴリンパ球において誘発される。マウスＧＩＴＲレセプターはＴ細胞レセプター−媒介性細胞死に関連していると著者は推測している。
Ｍａｒｓｔｅｒｓ等，Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ６：７５０（１９９６）において、研究者は、細胞外のシステインに富んだ反復につおいてＴＮＦＲファミリーに対して類似性を示し、細胞質死亡ドメイン配列を含む点でＴＮＦＲ１及びＣＤ９５に似ており、Ａｐｏ−３と称される、ヒトのポリペプチドの全長天然配列を開示している［Ｍａｒｓｔｅｒｓ等，Ｃｕｒｒ． Ｂｉｏｌ．， ６：１６６９（１９９６）］。他の研究者には、Ａｐｏ−３はＤＲ３、ｗｓｌ−１及びＴＲＡＭＰとも称されている［Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７４：９９０（１９９６）；Ｋｉｔｓｏｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３８４：３７２（１９９６）；Ｂｏｄｍｅｒ等， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， ６：７９（１９９７）］。
【００１７】
Ｐａｎ等は、「ＤＲ４」と称される他のＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Ｐａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７６：１１１−１１３（１９９７）］。ＤＲ４は細胞自殺器を活動させる細胞質死亡ドメインを含むと報告されている。Ｐａｎ等は、ＤＲ４がＡｐｏ−２リガンド又はＴＲＡＩＬとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることを開示している。
Ｓｈｅｒｉｄａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７：８１８−８２１（１９９７）及びＰａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７７：８１５−８１８（１９９７）には、Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬ）に対するレセプターであると考えられている他の分子が記載されている。その分子はＤＲ５と称されている（またＡｐｏ−２とも称されている）。同様に、ＤＲ４、ＤＲ５は細胞質死亡ドメインを含み、アポトーシスをシグンル伝達しうることが報告されている。
Ｓｈｅｒｉｄａｎ等， 上掲，において、ＤｃＲ１（又はＡｐｏ−２ＤｃＲ）と呼ばれるレセプターは、Ａｐｏ−２リガンド（ＴＲＡＩＬ）に対する可能なデコイレセプター（ｄｅｃｏｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であるとして開示されている。Ｓｈｅｒｉｄａｎ等は、ＤｃＲ１がＡｐｏ−２リガンドの機能をインビトロで阻害可能であると報告している。また、ＴＲＩＤと称されるデコイレセプターの開示については、Ｐａｎ等， 上掲，が参照される。
サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプターのレビューについては、Ｇｒｕｓｓ及びＤｏｗｅｒ， 上掲を参照されたい。
現在理解されているように、細胞死プログラムは、少なくとも３つの重要な要素−活性化因子、インヒビター及びエフェクターを含む；線虫（Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ）において、これらの成分はそれぞれ３つの遺伝子、Ｃｅｄ−４、Ｃｅｄ−９及びＣｅｄ−３によりコード化されている［Ｓｔｅｌｌｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２６７：１４４５（１９９５）；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７５：１１２２−１１２６（１９９７）；Ｗａｎｇ等， Ｃｅｌｌ， ９０：１−２０（１９９７）］。ＴＮＦＲファミリーのメンバーの２つ、ＴＮＦＲ１及びＦａｓ／Ａｐｏｌ（ＣＤ９５）は、アポトーシス性細胞死を活性化しうる［Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ及びＤｉｘｉｔ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ６：５５５−５６２（１９９６）；Ｆｒａｓｅｒ及びＥｖａｎ， Ｃｅｌｌ， ８５：７８１−７８４（１９９６）］。また、ＴＮＦＲ１は、転写因子、ＮＦ−κＢの活性化を媒介することも知られている［Ｔａｒｔａｇｌｉａ等， Ｃｅｌｌ， ７４：８４５−８５３（１９９３）；Ｈｓｕ等， Ｃｅｌｌ， ８４：２９９−３０８（１９９６）］。ある程度のＥＣＤ相同性に加えて、これら２つのレセプターは、死亡ドメインとして知られているオリゴマー形成界面の細胞内ドメイン（ＩＣＤ）での相同性を共有する［Ｔａｒｔａｇｌｉａ， 上掲；Ｎａｇａｔａ， Ｃｅｌｌ， ８８：３５５（１９９７）］。また、死亡ドメインはアポトーシスを調節する幾つかの後生動物タンパク質、すなわちショウジョウバエタンパク質、リーパー（Ｒｅａｐｅｒ）、及びＦＡＤＤ／ＭＯＲＴ１、ＴＲＡＤＤ及びＲＩＰと称される哺乳動物タンパク質中においても見出されている［Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ及びＩｈｌｅ， Ｃｅｌｌ， ８１：４７９−４８２（１９９５）］。
【００１８】
リガンド結合及びレセプターのクラスター形成の際に、ＴＮＦＲ１とＣＤ９５は死亡誘発性シグナル伝達複合体にＦＡＤＤを補充するものと考えられている。言われるところによれば、ＣＤ９５はＦＡＤＤに直接結合する一方、ＴＮＦＲ１はＴＲＡＤＤを介して間接的にＦＡＤＤに結合する［Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ等， Ｃｅｌｌ， ８１：５０５−５１２（１９９５）；Ｂｏｌｄｉｎ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０：３８７−３９１（１９９５）；Ｈｓｕ等， 上掲；Ｃｈｉｎｎａｉｙａｎ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１：４９６１−４９６５（１９９６）］。ＦＡＤＤは、Ｃｅｄ−３−関連プロテアーゼ、ＭＡＣＨα／ＦＬＩＣＥ（カスパーゼ８）を、死亡シグナル伝達複合体に補充するアダプターとなることが報告されている［Ｂｏｌｄｉｎ等， Ｃｅｌｌ， ８５：８０３−８１５（１９９６）；Ｍｉｚｉｏ等， Ｃｅｌｌ， ８５：８１７−８２７（１９９６）］。ＭＡＣＨα／ＦＬＩＣＥは、細胞死プログラムの幾つかの重要な側面を実施し得る、インターロイキン−１β変換酵素（ＩＣＥ）及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａを含むアポトーシス性プロテアーゼのカスケードを引き起こすトリガーであると思われる［Ｆｒａｓｅｒ及びＥｖａｎ， 上掲］。
プログラム細胞死が、線虫の細胞死遺伝子、ｃｅｄ−３、及び哺乳動物のＩＬ−１−変換酵素、ＩＣＥに関連したシステインプロテアーゼファミリーのメンバーの活性に関与していることが最近開示された。ＩＣＥ及びＣＰＰ３２／Ｙａｍａプロテアーゼの活性は、牛痘ウイルス遺伝子、ｃｒｍＡの産物により阻害されうる［Ｒａｙ等， Ｃｅｌｌ， ６９：５９７−６０４（１９９２）；Ｔｅｗａｒｉ等， Ｃｅｌｌ， ８１：８０１−８０９（１９９５）］。最近の研究では、ＣｒｍＡがＴＮＦＲ１−及びＣＤ９５−誘発細胞死を阻害しうることが示されている［Ｅｎａｒｉ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３７５：７８−８１（１９９５）；Ｔｅｗａｒｉ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０：３２５５−３２６０（１９９５）］。
Ｔｅｗａｒｉ等により最近レビューされているように、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２及びＣＤ４０は、転写因子、ＮＦ−κＢの活性化により、炎症誘発性及び同時刺激性サイトカイン、サイトカインレセプター、及び細胞接着分子の発現を変調する［Ｔｅｗａｒｉ等， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖｅｌｏｐ．， ６：３９−４４（１９９６）］。ＮＦ−κＢは、そのサブユニットが保存Ｒｅｌ領域を含む二量体転写因子のファミリーの原型である［Ｖｅｒｍａ等， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐ．， ９：２７２３−２７３５（１９９６）；Ｂａｌｄｗｉｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４：６４９−６８１（１９９６）］。その潜伏形態において、ＮＦ−κＢはＩκＢーインヒビターファミリーのメンバーと複合化しており；所定の刺激に反応してＩκＢの不活性化の際に、放出されたＮＦ−κＢが、特異的ＤＮＡ配列と結合する核に転座して遺伝子転写を活性化する。
【００１９】
１０．ＰＲＯ３８２
プロテアーゼは哺乳類及び非哺乳類生物における多数の非常に重要な生物学的プロセスに関与している酵素タンパク質である。種々のセリン含有タンパク質に対して特異的な活性を示すセリンプロテアーゼを含む、種々の異なる哺乳類及び非哺乳類生物からの多くの異なるプロテアーゼ酵素が同定され、特徴づけられている。哺乳類のプロテアーゼ酵素は生物学的プロセス、例えばタンパク質の消化、活性化、不活性化、又はペプチドホルモン活性の変調、及びタンパク質及び酵素の物理学的特性の改変において、重要な役割を担っている。
プロテアーゼ酵素が担っている重要な生理学的役割に鑑みて、新規な未変性プロテアーゼ相同体を同定するための努力が、産業界及び学術界の両方により現在なされている。これらの努力の多くは、新規な膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するための哺乳類の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９３；７１０８−７１１３（１９９６）；米国特許第５５３６６３７号を参照］。我々は、ここでＰＲＯ３８２と命名した、セリンプロテアーゼ酵素に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【００２０】
１１．ＰＲＯ５４５
メルトリン（ｍｅｌｔｒｉｎ）がメンバーである、ＡＤＡＭ［ディスインテグリン（Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ）及びメタロプロテアーゼ］タンパク質ファミリーは、細胞の相互作用及び細胞反応の変調において重要な役割を有しうる。［例えば、Ｇｉｌｐｉｎ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３（１）：１５７−１６６（１９９８）］。ＡＤＡＭタンパク質は発ガンに関与していた。メルトリン−α（ＡＤＡＭ１２）は細胞融合に必要であると報告されている筋芽細胞遺伝子産物である。［Ｈａｒｒｉｓ等， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６７（１）：１３６−１４２（１９９７）、Ｙａｇａｍｉ−Ｈｉｒｏｍａｓａ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３７７：６５２−６５６（１９９５）］。メルトリンはディスインテグリン及びメタロプロテアーゼを含有し、インテグリン−結合ディスインテグリンドメインを通じて、発達に関与している細胞接着現象に関連しているが、亜鉛依存性メタロプロテアーゼドメインを通して抗接着機能も有している。［Ａｌｆａｎｄａｒｉ等， Ｄｅｖｅｌ． Ｂｉｏｌ．， １８２（２）：３１４−３３０（１９９７）］。発ガン及び他の疾患のメカニズムにおける細胞接着及び細胞応答の変調の医学的な重要性が分かっているので、現在、細胞接着及び細胞応答の変調に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここではＰＲＯ５４５と命名した、メルトリンに対して相同性を有する新規のポリペプチドの同定についてここに記載する。
【００２１】
１２．ＰＲＯ６１７
ＣＤ２４は、好中球、単球及びある種のリンパ球、例えばＢリンパ球を含む、哺乳類の免疫系の種々の異なる細胞の細胞表面に結合しているタンパク質である。ＣＤ２４は、血小板結合性表面糖タンパクＰ−セレクチン（また、顆粒膜プロテイン−１４０すなちＧＭＰ−１４０）に対するリガンドであることが分かっており、該糖タンパク質は血小板及び内皮細胞の両方で構成的に合成され、その細胞が活性化すると血小板表面に現れる。このように、Ｐ−セレクチンは、活性化した血小板及び内皮細胞の、Ｐ−セレクチン分子に対する一又は複数のリガンド、特にＣＤ２４を発現する免疫系の種々の細胞へのカルシウム依存的接着を媒介する。このメカニズムにより、それらが最も必要とされている位置、例えば損傷部位に、免疫系細胞を補充することができる。よって、免疫系細胞の細胞表面抗原に対する相同性を示す新規のポリペプチドを同定することにはかなりの関心がある。ここで我々は、ＣＤ２４タンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載し、この新規のポリペプチドはここではＰＲＯ６１７と命名される。
【００２２】
１３．ＰＲＯ７００
タンパクジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）は、タンパク質の折り畳み中の異性化及びジスルフィド形成を触媒する酵素である。チオレドキシンに相同な２つのドメイン内に存在する２つの触媒部位を有するもので、その一方はＮ末端近傍にあり、他方はＣ末端近傍にある。［例えば、Ｇｉｌｂｅｒｔ ＨＦ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ４７：２９３９９−２９４０２（１９９７）、Ｍａｙｆｉｅｌｄ ＫＪ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７８：１９５４−１９５７（１９９７）及びＰｕｉｇ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ５２：３２９８８−３２９９４（１９９７）を参照］。ＰＤＩは原核細胞で生産されるタンパク質における天然型のジスルフィド結合の形成に有用である。（米国特許第５７００６５９号及び同５７００６７８号も参照のこと）。
よって、ＰＤＩ及びそれに関連する分子は、特にジスルフィド結合の形成を触媒する能力のために興味がある。更に、これらの分子は、酸化還元反応及び関連プロセスの研究において、一般的に関心を持たれている。更に、ＰＤＩ及び関連分子は、Ｄａｒｂｙ等， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４， １１７２５−１１７３５（１９９５）に記載されている。我々は、ここでＰＲＯ７００ポリペプチドと命名した、タンパクジスルフィドイソメラーゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００２３】
１４．ＰＲＯ７０２
コングルチニンは、当初は脊椎動物のレクチンタンパク質として記載され、４つの特徴あるドメイン、（１）Ｎ末端システイン−リッチドメイン、（２）コラーゲン様ドメイン、（３）ネックドメイン及び（４）炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を有するＣ型レクチンのファミリーに属すウシ血清タンパク質である。最近の報告では、ウシコングルチニンはそのレクチン特性のために、インフルエンザＡ型ウイルスによる血球凝集を阻害可能であることが実証されている（Ｅｄａ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ３１６：４３−４８（１９９６））。また、コングルチニン等のレクチンは、補体媒介メカニズムであるために、免疫グロブリン非依存性防御分子（ｄｅｆｅｎｓｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）として機能しうることが示唆されている。よって、コングルチニンはインビトロにおける免疫複合体の精製、及びインビボにおける患者の血漿からの循環免疫複合体の除去に有用であることが示されている（Ｌｉｍ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２１８：２６０−２６６（１９９６））。我々は、ここでＰＲＯ７０２と命名した、コングルチニンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００２４】
１５．ＰＲＯ７０３
超長鎖アシル−ＣｏＡ合成酵素（「ＶＬＣＡＳ」）は、長鎖及び超長鎖脂肪酸の細胞輸送において活性な長鎖脂肪酸輸送タンパク質である。［例えば、Ｕｃｈｉｄａ等， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ） １１９（３）：５６５−５７１（１９９６）及びＵｃｈｉｙａｍａ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７１（４８）：３０３６０−３０３６５（１９９６）］。脂肪酸の輸送メカニズムの生物学的な重要性が分かったために、現在、脂肪酸輸送に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでＰＲＯ７０３と命名した、ＶＬＣＡＳに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【００２５】
１６．ＰＲＯ７０５
グリピカン（ｇｌｙｐｉｃａｎ）は、その細胞表面局在化とヘパリン硫酸鎖の所有により、多くのヘパリン結合成長因子、細胞接着分子及び細胞外マトリックス成分に対する細胞の応答性を調節することができるグルコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカープロテオグリカンのファミリーである。一つのグリピカンタンパク質における変異がヒト出生欠損症候群の原因であり、これはグリピカンが発育において重要な役割を担っていることを示唆している（Ｌｉｔｗａｃｋ等， Ｄｅｖ． Ｄｙｎ． ２１１：７２−８７（１９９８））。また、グリピカンは様々な細胞外マトリックスと相互作用しうるため、創傷治癒においても重要な役割を担っている（ＭｃＧｒａｔｈ等， Ｐａｔｈｏｌ． １８３：２５１−２５２（１９９７））。更に、グリピカンはニューロン及び神経膠腫細胞中で発現するため、神経系の細胞生存及び細胞分割の調節においても重要な役割を担っている（Ｌｉａｎｇ等， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３９：８５１−８６４（１９９７））。よって、グリピカンがプロテオグリカンの極めて重要なファミリーであることは明らかである。従って、グリピカンファミリーのメンバーに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでＰＲＯ７０５と命名した、Ｋ−グリピカンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００２６】
１７．ＰＲＯ７０８
アリールスルファターゼは、アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）、アリールスルファターゼＢ（ＡＳＢ）及びアリールスルファターゼＣ（ＡＳＣ）を含む、多くの異なるイソ型で存在し、種々の異なる芳香族スルファートを加水分解するように機能する酵素である。アリールスルファターゼは、種々の異なる動物組織及び微生物源から単離され、その構造及び機能は広範囲に研究されている（例えば、Ｎｉｃｈｏｌ及びＲｏｙ， Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５５：６４３−６５１（１９６４））。ＡＳＡ欠乏は、異染性ロイコジストロフィー（ＭＬＤ）に関連していることが報告されている（Ｇｉｌｅｓ等， Ｐｒｅｎａｔ． Ｄｉａｇｎ． ７（４）：２４５−２５２（１９８７）及びＨｅｒｓｋａ等， Ａｍ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｇｅｎｅｔ． ２６（３）：６２９−６３５（１９８７））。更に、他のグループはアリールスルファターゼが免疫系のナチュラルキラー細胞において高レベルで見出されていることを報告しており、ＮＫ細胞媒介性細胞溶解における、これらの酵素の可能な役割を仮定している（例えば、Ｚｕｃｋｅｒ−Ｆｒａｎｋｌｉｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８０（２２）：６９７７−６９８１（１９８３））。アリールスルファターゼ酵素の明らかな生理学的な重要性が分かっているため、新規なアリールスルファートに相同なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、アリールスルファターゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載し、この新規なポリペプチドはここではＰＲＯ７０８ポリペプチドと命名される。
【００２７】
１８．ＰＲＯ３２０
フィブリン（ｆｉｂｕｌｉｎ）−１は、基底膜及び結合組織弾性繊維及び血漿タンパク質の、システインに富む、カルシウム結合性細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分であり、選択的スプライシングにより得られるＡ〜Ｄの４つのイソ型を有する。フィブリン−１はアミノ末端アナフィラトキシン様分子に９つの表皮成長因子（ＥＧＦ）様分子が続き、選択的スプライシングに応じて４つの可能なカルボキシル末端を有するモジュラー糖タンパク質である。フィブリン−２は、フィブロネクチン又はフィブリリンを含むミクロフィブリルと密に結合して頻繁に見出される新規な細胞外マトリックスタンパク質である。それらのＲＮＡ先駆物質を選択的にスプライシングするプロセスにより、Ｃ末端領域が異なる多様な形態のフィブリン−１が存在する。［例えば、Ｔｒａｎ等， Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ １５（７）：４７９−４９３（１９９７）］。
患者から取り出された悪性細胞株及び無胸腺マウスにおいて形成された腫瘍から確立した１６細胞株のノーザン及びウエスタンブロット分析により、フィブリン−１Ｄの低発現性が、腫瘍の形成及び浸潤においてある役割を担っていることを示している［Ｑｉｎｇ等， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， １８：２１５９−２１６８（１９９７）］。卵巣ガン細胞は腹腔を自由に浸潤する能力により特徴づけられている。エストラジオールはエストロゲンレセプター（ＥＲ）−ポジティブ卵巣ガン細胞の増殖、並びにフィブリン−１の発現を刺激することが実証されている。ＭＤＡ−ＭＢ２３１乳ガン細胞株の運動性に対するフィブリン−１の効果についての研究により、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞の走触性遊走の阻害が示され、著者は、フィブリン−１がインビトロにおけるガン細胞の運動性を阻害しえ、よって腫瘍の浸潤を阻害する可能性を有していると結論付けた。［Ｈａｙａｓｈｉｄｏ等， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ ７５（４）：６５４−６５８（１９９８）］。
よって、フィブリン及びその関連分子は、特にガンを予防する用途において関心を持たれている。更にこれらの分子は、一般的に結合組織及び付着分子及び関連するメカニズムの研究において関心が持たれている。フィブリン及びその関連分子は、Ａｄａｍｓ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２７２（２）：２２６−３６（１９９７）；Ｋｉｅｌｔｙ及びＳｈｕｔｔｌｅｗｏｒｔｈ， Ｍｉｃｒｏｓｃ． Ｒｅｓ． Ｔｅｃｈ．， ３８（４）：４１３−２７（１９９７）；及びＣｈｉｌｄ． Ｊ． Ｃａｒｄ． Ｓｕｒｇ． １２（２Ｓｕｐｐ．）：１３１−５（１９９７）に更に記載されている。
我々は、ここでＰＲＯ３２０ポリペプチドと命名した、フィブリンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００２８】
１９．ＰＲＯ３２４
オキシドレダクターゼは、反応に入る水分子と共に、一方の分子が酸化され、他方の分子が還元されるように化合物の２分子が相互作用する反応を触媒する酵素である。哺乳類生物において非常に重要な生理学的役割を担っている多くの異なる種類のオキシドレダクターゼ酵素がある。最も重要なオキシドレダクターゼには、例えばリアーゼ、ラクターゼ、コレステロールオキシダーゼ等が含まれる。これらの酵素は、消化、シグナル伝達及びイオン的ホメオスタシスの維持等のような必須のプロセスにおいてある役割を担っている。このように、オキシドレダクターゼ酵素には、哺乳類生物における種々の必須の用途が見出されているため、新規なオキシドレダクターゼ酵素の相同体の同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでＰＲＯ３２４と命名した、オキシドレダクターゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００２９】
２０．ＰＲＯ３５１
プロスタシン（ｐｒｏｓｔａｓｉｎ）はヒト精液から精製されるヒトセリンプロテアーゼである。免疫組織化学的局在化により、プロスタシンは上皮細胞及び前立腺の導管に存在することが明らかにされている。プロスタシンのｃＤＮＡはクローニングされ、特徴づけられている。サザンブロット分析と、続く逆転写ポリメラーゼ連鎖反応では、プロスタシンｍＲＮＡが前立腺、肝臓、唾液腺、腎臓、肺、膵臓、結腸、気管支、腎近位尿細管細胞、及び前立腺癌腫ＬＮＣａＰ細胞で発現していることが示されている。プロスタシンｍＲＮＡの細胞局在化はインシトゥーのハイブリッド形成組織化学により、ヒトの前立腺の上皮細胞内において同定された。［例えば、Ｙｕ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９４） ２６９（２９）：１８８４３−１８８４８、及びＹｕ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９４） ２７０（２２）：１３４８３−１３４８９を参照］。
よって、プロスタシン及びその関連分子は、前立腺に関与する医学的症状の研究、診断及び治療において特に関心がもたれている。プロスタシン及び関連分子は、Ｙｕ等， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ （１９９６） ３２（３）：３３４−３４０にも更に記載されている。我々は、ここでＰＲＯ３５１ポリペプチドと命名した、プロスタシンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００３０】
２１．ＰＲＯ３５２
ブチロフィリン（ｂｕｔｙｒｏｐｈｉｌｉｎ）は、哺乳類の乳の脂肪球膜に結合した全タンパク質の４０％以上を構成している乳糖タンパク質である。ブチロフィリンｍＲＮＡの発現は、妊娠終期での乳脂肪の生成の開始と相関しており、乳汁分泌期を通して維持されていることが示されている。ブチロフィリンはウシ、マウス及びヒトにおいて同定されており（Ｔａｙｌｏｒ等， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １３０６：１−４（１９９６）、Ｉｓｈｉｉ等， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １２４５：２８５−２９２（１９９５）、Ｍａｔｈｅｒ等， Ｊ． Ｄａｉｒｙ Ｓｃｉ． ７６：３８３２−３８５０（１９９３）及びＢａｎｇｈａｒｔ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：４１７１−４１７９（１９９８）を参照）、脂肪グロブリン膜内に取り込まれるＩ型膜貫通タンパク質である。ブチロフィリンは、キサンチンデヒドロゲナーゼ／オキシダーゼ及び授乳の間の尖端表面からの乳脂肪小球の発芽と放出において機能する他のタンパク質との複合体の集合体に対する主要な足場としての役割を果たしうることが示唆されている（Ｂａｎｇｈａｒｔ等， 上掲）。
ブチロフィリンは、哺乳類の乳生成において明らかに重要な役割を担っているので、新規なブチロフィリン相同体の同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでＰＲＯ３５２と命名した、ブチロフィリンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００３１】
２２．ＰＲＯ３８１
イムノフィリンはサイクロスポリンＡ、ＦＫ５０６及びラパマイシン等の免疫抑制剤に対するレセプターとして機能するタンパク質ファミリーである。イムノフィリンには、２つの別個のクラス、すなわち（１）ＦＫ５０６及びラパマイシンに結合するＦＫ５０６−結合タンパク質（ＦＫＢＰ）と、（２）サイクロスポリンＡに結合するサイクロフィリンとして生じる。ＦＫ５０６−結合タンパク質に関しては、ＦＫ５０６／ＦＫＢＰ複合体は、セリン／スレオニンプロテインホスファターゼ２Ｂ（カルシニュリン）の活性を阻害する機能を有し、よって免疫抑制活性をもたらすと報告されている。また、ＦＫＢＰイムノフィリンは哺乳類の神経系で見出されており、免疫抑制をなすプロセスとは独立したメカニズムを通しての中枢神経系における軸索再生に関与していると報告されている（Ｇｏｌｄ， 上掲）。よって、ＦＫＢＰイムノフィリンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでＰＲＯ３８１と命名した、ＦＫＢＰイムノフィリンタンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００３２】
２３．ＰＲＯ３８６
哺乳類の細胞膜は種々の細胞及び組織の構造的完全性及び活性に関する非常に重要な機能を果たす。膜の生理において特に関心があるのは、種々の生理学的、薬理学的及び細胞プロセスを直接制御するように作用する膜貫通イオンチャンネルの研究である。カルシウム（Ｃａ）、ナトリウム（Ｎａ）及びカリウム（Ｋ）チャンネルを含む数多くのイオンチャンネルが同定されており、各々が詳細に分析されて、脊椎動物及び昆虫の細胞の生理学的プロセスにおけるその役割が決定されている。
細胞膜随伴イオンチャンネルの一タイプであるナトリウムチャンネルは、イオン的ホメオスタシスを維持し、並びに細胞内及び細胞外シグナルを伝達する細胞の能力において極めて重要な役割を担っている。脳ニューロンの電位作動型ナトリウムチャンネルは、孔形成αユニットの、より小さいβ−１及びβ−２サブユニットとの複合体であることが示されている（Ｉｓｏｍ等， Ｃｅｌｌ ８３：４３３−４４２（１９９５））。細胞ホメオスタシス及び他の重要な生理学的機能におけるナトリウムチャンネルの明らかな重要性が分かっているので、ナトリウムチャンネルサブユニットに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでＰＲＯ３８６と命名した、ラットのナトリウムチャンネルのβ−２サブユニットに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００３３】
２４．ＰＲＯ５４０
ホスファチジルコリン−ステロールアシルトランスフェラーゼとしても知られているレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ（「ＬＣＡＴ」）は、特にコレステロールの代謝プロセスにおける、高密度リポタンパク質の血管内代謝のキー酵素である。［例えば、Ｂｒｏｕｓｓｅａｕ等， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．， ３８（１２）：２５３７−２５４７（１９９７）、Ｈｉｌｌ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ．， ２９４：８７９−８８４（１９９３）、及びＤｒａｙｎａ等， Ｎａｔｕｒｅ ３２７（６１２３）：６３２−６３４（１９８７）］。脂質代謝の医学的な重要性が分かっているため、現在、脂質輸送に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでＰＲＯ５４０と命名した、ＬＣＡＴに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【００３４】
２５．ＰＲＯ６１５
シナプトギリン（ｓｙｎａｐｔｏｇｙｒｉｎ）は神経系に均一に分布しているシナプス小胞タンパク質である。シナプトギリンをコードするｃＤＮＡはクローニングされ、配列決定されており、その配列により、４つの膜スパンニングドメインを有する２５，９００Ｄの分子量のタンパク質であると考えられている。シナプトギリンは、血漿膜まで及び血漿膜からの膜輸送に関連している。Ｓｔｅｎｉｕｓ等， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３１（６−２）：１８０１−１８０９（１９９５）。加えて、セルギリン（ｃｅｌｌｕｇｙｒｉｎ）と称される新規のシナプトギリンの新規なイソ型は、シナプトギリンと配列同一性を示す。ラットの組織において、セルギリンとシナプトギリンは鏡像パターンの形で発現される。セルギリンはテストした全ての組織に遍在し、脳組織で最もレベルが低かったが、これに対しシナプトギリンタンパク質は脳でのみ検出可能である。ラットの組織において、セルギリンとシナプトギリンは鏡像パターンの形で発現される。シナプス小胞タンパク質であるシナプトギリンは、偏在性タンパク質であるセルギリンが特殊化したものでありえ、２つのタンパク質は構造的類似性を共有しているが、局在化が異なる。この知見は、シナプス小胞を、ジェネリックな輸送オルガネラの単純化及び特殊化形態としての新しい概念を支持する［Ｊａｎｚ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３（５）：２８５１−２８５７（１９９８）］。ノルウェーラット、ラッタスノルベジカス（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）から得られたセルギリンの配列は、受託番号ＡＦ０３９０８５として１９９７年１２月２３日にジェンバンクデータベースに寄託されている。また、Ｊａｎｚ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３（１９９８）、印刷中を参照されたい。
シナプス伝達の医学的な重要性が分かっているため、現在、シナプス小胞の形態の単純化又は特殊化したジェネリックな輸送オルガネラの一部でありうる、新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでＰＲＯ６１５と命名した、シナプトギリンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【００３５】
２６．ＰＲＯ６１８
エンテロペプチターゼは、トリプシノーゲンから酸性プロペプチドを特異的に開裂させて活性トリプシンを産出させる、腸内の消化カスケードにおけるキー酵素である。この開裂により、多くの膵臓チモーゲンの活性化に至るタンパク分解反応のカスケードが始まる。
例えば、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９（３１）：１９９７６−１９９８２（１９９４）、Ｋｉｔａｍｏｔｏ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９１（１６）：７５８８−７５９２（１９９４）を参照。エンテロキナーゼ（エンテロペプチターゼ）は、消化、凝固及び繊維素溶解に関連する哺乳類のセリンプロテアーゼに関連している。Ｌａ Ｖａｌｌｉｅ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８（３１）：２３３１１−２３３１７（１９９３）。
消化プロセスの医学的な重要性が分かっているため、現在、消化、凝固及び繊維素溶解に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでＰＲＯ６１８と命名された、エンテロペプチターゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【００３６】
２７．　ＰＲＯ７１９
リポタンパクリパーゼは、循環する血漿リポタンパク質中に存在するリン脂質とトリグリセリドの加水分解を媒介するキー酵素である（Ｄｕｇｉ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０：２５３９６−２５４０１（１９９５））。更に、リポタンパクリパーゼは細胞内へのリポタンパク質の取り込みを媒介することが知られており、ここでリポタンパク質の細胞への取り込みは、細胞表面のプロテオグリカン及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプター関連タンパク質にリポタンパクリパーゼが結合することから開始される（Ｋｒａｐｐ等， Ｊ． Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ． ３６：２３６２−２３７３（１９９５））。よって、リポタンパクリパーゼがリポタンパク質及びコレステロール代謝において極めて重要な役割を担っていることは明らかである。よって、リポタンパクリパーゼと、配列相同性及び／又は生物学的活性を共有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでＰＲＯ７１９と命名された、リポタンパク質リパーゼＨに対して配列相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００３７】
２８．ＰＲＯ７２４
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプターは、そのリガンド、アポリポタンパク質（ａｐｏ）Ｂ−１００及びａｐｏＥに対する高親和結合性により、リポタンパク質粒子の細胞への取り込みを媒介する、コレステロールホメオスタシスにおいて重要な役割を担っている膜結合タンパク質である。ＬＤＬレセプターのリガンド結合ドメインは、約４０のアミノ酸からなる７つのシステインリッチの反復部を含み、各反復部は、３つの反復内ジスルフィド結合を形成する６つのシステインを含んでいる。これらの独特の構造的特徴により、ＬＤＬレセプターにはａｐｏＢ−１００及びａｐｏＥと特異的に相互作用する能力が付与され、これにより細胞膜を通過してこれらのリポタンパク質を輸送すること、及びそれらの成分を代謝することが可能になる。ＬＤＬレセプターの細胞外ドメインを含む可溶性断片には、その特異的なリポタンパク質リガンドと相互作用する能力が保持されていることが示されている（Ｓｉｍｍｏｎｓ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２５５３１−２５５３６（１９９７））。よって、ＬＤＬレセプターがコレステロール代謝に係る重要な生理学的活性に密接に関与していることは明らかである。このように、新規なＬＤＬレセプターに相同なタンパク質を同定することにはかなりの関心がある。我々は、ここでＰＲＯ７２４と命名した、ヒトＬＤＬレセプタータンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００３８】
２９．ＰＲＯ７７２
ヒト遺伝子Ａ４の発現は結腸上皮で多く、インビボにおける結腸上皮細胞の分化で転写的に活性化される（Ｏｌｉｖａ等， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ３０２：１８３−１９２（１９９３）及びＯｌｉｖａ等， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７２：Ｃ９５７−Ｃ９６５（１９９７））。Ａ４ｃＤＮＡは約１７キロダルトンの大きさのポリペプチドであると予想される読み取り枠を含んでいる。Ａ４タンパク質のヒドロパシー分析により、４つの推定膜スパンニングのαヘリックスが明らかになった。Ａ４タンパク質が発現している細胞の免疫細胞化学的研究によれば、発現は小胞体に局在化していた。Ａ４タンパク質の４つの膜スパンニングドメイン及び生物物理学的特徴によれば、それは、その幾つかが多量体化してイオンチャンネルを形成する、プロテオリピドと呼ばれる完全な膜タンパク質のファミリーに属することが示唆される。事実、予備的証拠においても、Ａ４がそれ自身で多量体化し、イオンチャンネルの性質を獲得することが示唆されている（Ｏｌｉｖａ等， Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． ２７２：Ｃ９５７−Ｃ９６５（１９９７））。細胞ホメオスタシスの維持におけるイオンチャンネルの重要性が分かっているため、既知及び推定のイオンチャンネルに対して相同性を有する新規なポリペプチドを同定することにはかなりの関心がある。我々は、ここでＰＲＯ７７２と命名した、推定イオンチャンネルタンパク質、Ａ４に対する相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００３９】
３０．ＰＲＯ８５２
プロテアーゼは哺乳類又は非哺乳類生物における多くの非常に重要な生物学的プロセスに関与している酵素タンパク質である。 種々の異なる哺乳類及び非哺乳類生物からの数多くの異なるプロテアーゼ酵素が同定され、特徴づけられている。哺乳類のプロテアーゼ酵素は多くの異なる生物学的プロセス、例えばタンパク質の消化、活性化、不活性化、又はペプチドホルモン活性の変調、及びタンパク質及び酵素の物理学的特性の改変において重要な役割を担っている。
プロテアーゼ酵素が担っている重要な生理学的役割に鑑みて、現在、新規で未変性のプロテアーゼ相同体を同定するための努力が、産業界及び学術界の両方でなされている。これらの努力の多くは、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するための哺乳類の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９３；７１０８−７１１３（１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照］。我々は、ここでＰＲＯ８５２ポリペプチドと命名した、種々のプロテアーゼ酵素に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【００４０】
３１．ＰＲＯ８５３
細胞のレドックス状態は細胞の運命の重要な決定因子であることが、ある研究において報告されている。更に反応性酸素種は、組織壊死、器官機能不全、アテローム性動脈硬化、不妊症、出生欠損症、時期尚早の加齢、変異及び悪性腫瘍を含む炎症性疾患の原因となる細胞毒性であると報告されている。よって、酸化と還元の制御は、脳卒中、心臓発作、酸化ストレス、高血圧の制御及び予防を含む、悪性腫瘍の発達に関与している多くの理由から重要である。反応性酸素種の水への転化を触媒する、レダクターゼ等の酸化防止酵素のレベルはガン細胞において低いことが示されている。特に、悪性の前立腺上皮はこのような酸化防止酵素の発現を低下させた［Ｂａｋｅｒ等， Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３２（４）：２２９−２３３（１９９７）］。この点において、レダクターゼには興味がある。加えて、転写因子、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１は酸化還元状態により調節され、エイズ、ガン、アテローム性動脈硬化及び糖尿病の合併症の病因に関与すると考えられる種々の遺伝子の発現に影響を及ぼすことが知られている。さらに、この主題事項について記載した出版物には、Ｅｎｇｍａｎ等， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （Ｇｒｅｅｃｅ）， １７：４５９９−４６０５（１９９７）、Ｋｅｌｓｅｙ等， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ７６（７）：８５２−４（１９９７）；ＦｒｉｅｄｒｉｃｈとＷｅｉｓｓ． Ｊ． Ｔｈｅｏｒ． Ｂｉｏｌ．， １８７（４）：５２９−４０（１９９７）及びＰｉｅｕｌｌｅ等， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７９（１８）：５６８４−９２（１９９７）が含まれる。インビボにおけるレドックス反応の生理学的な重要性が分かっているため、レドックス反応に関与している新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでＰＲＯ８５３と命名した、レダクターゼに対して配列類似性を有する新規な前立腺特異的ポリペプチドの同定についてここに記載する。
【００４１】
３２．ＰＲＯ８６０
ニューロファシン（ｎｅｕｒｏｆａｓｃｉｎ）は神経系接着分子の細胞接着分子（「ＣＡＭ」）ファミリーのＬ１サブグループのメンバーであり、細胞凝集に関連している。細胞−細胞認識と細胞接触のパターニングは、神経系における経細胞複合体又は幅広い種類の可逆的なアセンブリを媒介する上で重要な役割を有している。ニューロファスシンに結合するアンキリンを変調することにより、細胞の相互作用が調節される。例えば、Ｔｕｖｉａ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９４（２４） １２９５７−１２９６２（１９９７）を参照。ニューロファスシンは胚発達中の神経突起の伸長に関与する免疫グロブリンスーパーファミリーのＬ１サブグループのメンバーとして記載され、種々の発育段階で数多くのイソ型が検出されている。また、Ｈａｓｓｅｌ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７２（４５） ２８７４２−２８７４９（１９９７）、Ｇｒｕｍｅｔ，　Ｃｅｌｌ． Ｔｉｓｓｕｅ． Ｒｅｓ． ２９０（２） ４２３−４２８（１９９７）、Ｇａｒｖｅｒ等，　Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １３７：７０３−７１４（１９９７）、及びＬａｍｂｅｒｔ等， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， １７：７０２５−７−３６（１９９７）を参照。
インビボにおける神経系の発達及び細胞接着分子の生理学的な重要性が分かっているため、現在、神経系の細胞相互作用の調節に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでＰＲＯ８６０と命名した、ニューロファシンに対して配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００４２】
３３．ＰＲＯ８４６
ＣＭＲＦ３５モノクローナル抗体は、リンパ球細胞株、末梢血液Ｔ及びＢリンパ球の一部、好中球、単球の表面に存在し、ＣＭＲＦ３５と命名された、細胞膜抗原を同定するために使用されていた。ＣＭＲＦ３５ｃＤＮＡは免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子スーパーファミリーの新規で完全な膜糖タンパク質のメンバーをコードする。該分子は、（ａ）ポリマーＩｇＡ及びＩｇＭに対するＦｃレセプターに顕著に似通った単一の細胞外Ｉｇ可変ドメイン、（ｂ）かなりＯ−グルコシル化されていると考えられている、プロリン、セリン及びスレオニン残基を多量に含有する膜近位ドメイン、（ｃ）グルタミン酸とプロリン残基を含有する珍しい膜貫通アンカー、及び（ｄ）短い細胞質の尾部を含む。ＣＭＲＦ３５タンパク質をコードした転写物は、免疫細胞化学の染色結果で確認されているように、初期の単球細胞株、末梢血液Ｔ細胞、あるＢリンパ芽球状細胞株で検出されている。Ｊａｃｋｓｏｎ等， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２（５）：１１５７−１１６３（１９９２）。ＣＭＲＦ−３５分子は、造血細胞で差次的に発現しており、抗原の発現は、分裂促進剤及びサイトカインによる刺激に、顕著な影響を受けることが示された。例えば、Ｃｌａｒｋ等， Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２５（８）：７５９（１９９７）、Ｄａｉｓｈ等， Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７９（１）：５５−６３（１９９３）、及びＣｌａｒｋ等， Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ４８：４６１（１９９６）を参照。
免疫系及び種々の免疫系細胞に付随する抗原の生理学的な重要性が分かっているため、現在、免疫系の種々の細胞で発現する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでＰＲＯ８４６と命名した、ＣＭＲＦ３５に対して配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【００４３】
３４．ＰＲＯ８６２
リゾチームは、乳、涙及び唾液を含む分泌液及び幾つかのヒトの組織に幅広く分布しているタンパク質である。それは、Ｎ−アセチルグルコサミン間の結合を加水分解することが証明されている。毒性酸素フリーラジカルの生成及び走化性のインヒビターであることが証明されており、また石灰化プロセスにおいてある役割を有している。このように、リゾチームに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、リゾチームに対して配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【００４４】
３５．ＰＲＯ８６４
Ｗｎｔ−４は腎臓管形成（ｋｉｄｎｅｙ ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）に必要で、またこれに関連している分泌糖タンパク質である。Ｗｎｔ−４活性が欠乏したマウスは、前管細胞（ｐｒｅｔｕｂｕｌａｒ ｃｅｌｌ）の集合体を形成できないが；間充織及び尿管発達の他の面に影響を及ぼさない。よって、Ｗｎｔ−４はネフロン発達の根底にある上皮トランジションに対する間充織の誘発物質として作用するものと思われる。Ｓｔａｒｋ等， Ｎａｔｕｒｅ；３７２（６５０７）：６７９−６８３（１９９４）。加えて、Ｗｎｔ遺伝子ファミリーのメンバーは、細胞間シグナル伝達分子として作用可能で、発達中の脳において差次的に発現する、システインリッチの分泌タンパク質をコードする。Ｗｎｔ遺伝子、例えばＷｎｔ−１は中脳細胞の運命の特定化に必須であることが知られている。Ｙｏｓｈｉｏｋａ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２０３（３）：１５８１−１５８８（１９９４）。Ｗｎｔファミリーの分泌因子の幾つかのメンバーは、乳房細胞増殖及び分化の制御因子として強く関連している。Ｓｈｉｍｉｚｕ等，　Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ． ８（１２） １３４９−１３５８。Ｗｎｔ−４は妊娠初期において通常発現している。よって、Ｗｎｔ−４は妊娠中に上皮を分岐させる局部シグナルでありうる。Ｅｄｗａｒｄｓ ＰＡ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｓｙｍｐ． ６３：２１−３４（１９９８）。また、Ｌｉｐｓｃｈｕｔｚ ＪＨ， Ａｍ． Ｊ． Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ． ３１（３）：３８３−３９７（１９９８）を参照。我々は、ここでＰＲＯ８６４と命名した、Ｗｎｔ−４に対する配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００４５】
３６．ＰＲＯ７９２
少なくとも２つの細胞誘導シグナルが、Ｂ細胞で変換する免疫グロブリンアイソタイプの誘発に必要であることが示されている。第１のシグナルは可溶性リンフォカイン、インターロイキン（ＩＬ）−４又はＩＬ−１３の何れかで、生殖細胞イプシロン転写発現を誘発するものにより付与されるが、これ単独では免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の分泌を引き起こすには不十分である。第２のシグナルはＢ細胞と活性化Ｔ細胞、好塩基球とマスト細胞との物理的相互作用により提供され、ＣＤ４０／ＣＤ４０リガンド対合がＩｇＥ合成の媒介において重要であることが示されている。更に、ＩｇＥ合成に関与する表面接着分子の多くの対の中でもＣＤ２３／ＣＤ２１対がＩｇＥ生成において重要な役割を担っていると思われる。ＣＤ２３は、ＩｇＥ生成を増加又は減少させる因子により、正又は負に調節されるタンパク質である。ＣＤ２３に対する抗体はインビトロにおいてＩＬ−４誘発性ヒトＩｇＥ生成を阻害し、アイソタイプを選択する形で、ラットモデルにおける抗原特異性ＩｇＥ応答を阻害することが示されている（Ｂｏｎｎｅｆｏｙ等， Ｅｕｒ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｊ． Ｓｕｐｐｌ． ２２：６３Ｓ−６６Ｓ（１９９６））。ＣＤ２３はＢ細胞においてＣＤ２１と相互作用し、優先的にＩｇＥ生成を推進する。ＣＤ２３タンパク質が哺乳類ＩｇＥ応答の誘発において極めて重要な役割を担っているため、ＣＤ２３に対して相同性を有する新規のポリペプチドの同定にはかなりの関心がもたれている。我々は、ここでＰＲＯ７９２と命名した、ＣＤ２３に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００４６】
３７．　ＰＲＯ８６６
ミンジン（ｍｉｎｄｉｎ）及びスポンジン（ｓｐｏｎｄｉｎ）タンパク質は、互いに構造的に関連した分泌タンパク質であり、種々の生物で同定されている。例えば、Ｈｉｇａｓｈｉｊｉｍａ等， Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ． １９２：２１１−２２７（１９９７）はゼブラフィッシュの胚軸のフロアプレート細胞（ｆｌｏｏｒ ｐｌａｔｅ ｃｅｌｌ）におけるスポンジン及びミンジンの発現の特定を報告しており、これによってミンジンとスポンジンタンパク質が、胚の発達において重要な役割を担っていることが示唆される。この同じグループはミンジンとスポンデジタンパク質が基底層に対して高親和性を有する細胞外マトリックスタンパク質として機能することを報告している（同上）。また。Ｆ−スポンジンは神経接着及び神経突起伸長を促進する分泌タンパク質であり（Ｋｌａｒ等，　Ｃｅｌｌ ６９：９５−１１０（１９９２））、またＭ−スポンディンはショウジョウバエの筋付着部位に局在化する細胞外マトリックスタンパク質である（Ｕｍｅｍｉｙａ等， Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ． １８６：１６５−１７６（１９９７）ことも報告されている。よって、ミンジンとスポンジンタンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がもたれている。我々は、ここでＰＲＯ８６６と命名した、ミンジン２及びミンジン１に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００４７】
３８．ＰＲＯ８７１
サイクロフィリンはサイクロスポリンＡに結合し、ペプチジル−プロリル−シス−トランスイソメラーゼ活性を有するタンパク質のファミリーである（Ｓｈｅｒｒｙ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５：１７５８−１７６３（１９９８））。加えて、サイクロフィリンは活性化細胞により分泌され、おそらくは細胞表面のサイクロフィリンレセプターを通過するシグナル伝達により、サイトカイン様の形で作用する。宿主細胞誘導性サイクロフィリンＡはＨＩＶ−１ビリオン中に取り込まれることが示されており、この取り込みはウイルス感染に必須であることも示されている。よって、一又は複数のサイクロフィリンがＨＩＶ−１感染に直接関連している可能性がある。サイクロフィリンタンパク質の明らかな重要性が分かったため、一又は複数のサイクロフィリンタンパク質に対して配列相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がもたれている。我々は、ここでＰＲＯ８７１と命名した、サイクロフィリン様タンパク質ＣｙＰ−６０に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００４８】
３９．ＰＲＯ８７３
酵素タンパク質は食物の消化、巨大分子の生合成、化学エネルギーの利用及び放出の制御、及び生命維持に必要な他のプロセスに関与する化学反応において重要な役割を担っている。また、酵素は種々の病気及び疾患に抗するという、重要な役割を担っていることも示されている。例えば、肝臓のカルボキシルエステラーゼは、ガンのプロドラッグに対するヒト腫瘍細胞の感作を助成することが報告されている。Ｄａｎｋｓ等は、Ｒｈ３０ヒト横紋筋肉腫細胞においてカルボキシルエステラーゼをコードするｃＤＮＡが安定して発現していると、ＣＰＴ−１１ガンプロドラッグに対する細胞の敏感度が８．１倍増加すると報告している。Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （１９９８）５８（１）：２０−２２。著者は、このプロドラッグ／酵素複合体を、ガンシクロビル／単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼと５−フルオロシトシン／シトシンデアミナーゼの組合せを用いた研究下で現在なされているアプローチに類似した形で治療用に利用可能であると提案している。ｖａｎ Ｐｅｌｔ等は、５５ｋＤのヒト肝臓カルボキシルエステラーゼが、培養中の主要なヒト肝細胞へのプラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）マラリアスポロゾイトの侵入を阻害することを示している。Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ （１９９７）２７（４）：６８８−６９８。
また、カルボキシルエステラーゼは、薬剤、農薬及び他の生体異物の解毒に重要であることが見出されている。精製されたヒト肝臓カルボキシルエステラーゼは、コカインやヘロインを含む、種々の薬剤の代謝に関与していることが示されている。Ｐｒｉｎｄｅｌらは、コカイン及びヘロインの加水分解を触媒し、ヒト組織におけるこれらの薬剤の分解において重要な役割を担っている、広い基質特異性のヒト肝臓カルボキシルエステラーゼのクローニング及び精製について記載している。Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９７）６：２７２（２３）：１４７６９−１４７７５。Ｂｒｚｅｎｚｉｎｓｋｉらはカルボキシルエステラーゼにより代謝される環境エステル又は薬剤の同定に使用される分光光度競合阻害アッセイについて記載している。Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ Ｄｉｓｐｏｓ（１９９７）２５（９）：１０８９−１０９６。
カルボキシルエステラーゼによりなされる重要な生理学的役割に鑑みて、新規な未変性カルボキシルエステラーゼ相同体を同定するための努力が、産業界及び学術界の両方でなされている。我々は、ここでＰＲＯ８７３と命名した、カルボキシルエステラーゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００４９】
４０．ＰＲＯ９４０
ＣＤ３３は、シアル酸タイプと末端近くの糖へのその結合の両方に対して異なる特異性を有するシアル酸依存性結合を媒介可能なタンパク質のシアロアドヘシン（ｓｉａｌｏａｄｈｅｓｉｎ）ファミリーのメンバーである細胞表面タンパク質である。ＣＤ３３は初期の脊髄及び幾つかの単球細胞系において特異的に発現しており、例えば急性非リンパ球性白血病（ＡＮＬＬ）を含む、種々の脊髄腫瘍と強く関連していることが示されてる。このように、ＣＤ３３はタンパク質の高レベル発現に関連したガンの治療を潜在的な目的として提案されている。よって、ＣＤ３３に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がもたれている。事実、ＣＤ３３相同体の一つ（ＣＤ３３Ｌと命名）が既に同定され、記載されている（Ｔａｋｅｉ等，　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ． Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ． ７８：２９５−３００（１９９７））。我々は、ここでＰＲＯ９４０と命名した、ＣＤ３３に対して相同性を有する他の新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。ここで記載された新規なポリペプチドは、デイホフ（Ｄａｙｈｏｆｆ）データベース（３５．４５版、Ｓｗｉｓｓ Ｐｒｏｔ３５）においてＨＳＵ７１３８２ １及びＨＳＵ７１３８３ １と称されるヒトＯＢ結合性タンパク質に対して有意な相同性を示す。
【００５０】
４１．ＰＲＯ９４１
カドヘリンは大きなファミリーの膜貫通タンパク質である。カドヘリンには、事実上、多細胞生物の全ての固体組織において細胞−細胞接着を媒介するように機能するカルシウム依存性糖タンパク質のファミリーが含まれる。少なくともカドヘリン１−１３並びにＢ、Ｅ、ＥＰ、Ｍ、Ｎ、Ｐ及びＲ型が同定され、特徴づけられている。幾つかの例外はあるが、カドヘリンの機能の中でも、カドヘリンが細胞凝集に関与しており、細胞−細胞接着部位に付随していることが知られている。最近、全てのカドヘリンが、細胞外ドメインの折り畳みに対応すると考えられているカドヘリン特異的モチーフの多重反復を分かち持つが、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーは多様な構造、及びおそらくは機能を有していることが報告されている。特に、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーはシグナル伝達に関連していることが報告されている。Ｓｕｚｕｋｉ， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１（４）：５３１−５４２（１９９６）。カドヘリンはさらに、Ｔａｎｉｈａｒａ等， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．， １０７（６）：１６９７−１７０４（１９９４）、Ａｂｅｒｌｅ等， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１（４）：５１４−５２３（１９９６）及びＴａｎｉｈａｒａ等， Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２（１）：１５−２６（１９９４）にも記載されている。我々は、ここでＰＲＯ９４１と命名した、カドヘリンタンパク質に対して相同性を有する他の新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００５１】
４２．ＰＲＯ９４４
クロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）エンテロトキシン（ＣＰＥ）はＣ，パーフリンゲンスＡ型の食中毒の徴候の原因である毒性因子であると考えられており、また他のヒト及び獣医学的病気に関連している可能性もある（ＭｃＣｌａｎｅ， Ｔｏｘｉｃｏｎ． ３４：１３３５−１３４３（１９９６））。ＣＰＥはクロストリジウム・パーフリンゲンスエンテロトキシンレセプター（ＣＰＥ−Ｒ）と称される約５０ｋＤの細胞表面レセプタータンパク質に結合し、細胞表面上に約９０，０００ｋＤの複合体を形成することにより、その有害な細胞機能を実行していく。ＣＰＥ−Ｒタンパク質をコードするｃＤＮＡはヒト及びマウスの両方において同定され、特徴づけられている（Ｋａｔａｈｉｒａ等， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １３６：１２３９−１２４７（１９９７）及びＫａｔａｈｉｒａ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：２６６５２−２６６５８（１９９７））。ＣＰＥ毒素は哺乳類宿主の種々の病気の原因であることが報告されており、これらの病気はＣＰＥ−ＲにＣＰＥ毒素が結合することにより始まるので、新規なＣＰＥ−Ｒ相同体の同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでＰＲＯ９４４と命名した、ＣＰＥ−Ｒに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【００５２】
４３．ＰＲＯ９８３
膜結合タンパク質には細胞表面膜結合タンパク質だけでなく、細胞内小胞体の表面で見出されるタンパク質も含まれる。これらの小胞体は細胞血漿膜と分泌小胞体の融合であるエキソサイトーシスに関与し、２つの主たる機能を有する。一つは、細胞内空間への小胞体内容物の放出であり、第２は血漿膜自体への、新しいタンパク質及び脂質の取り込みである。エキソサイトーシスは構成的であるか調節されうる。全ての真核細胞は、形成後に分泌小胞体が直ちに融合されることで特徴づけられる構成的エキソサイトーシスを示す。これに対し、調節エキソサイトーシスは、小胞体結合膜タンパク質による適切なシグナルを受取次第、血漿膜と融合する分泌小胞体が蓄積する。通常、このシグナルは、サイトゾル中の遊離のＣａ２＋濃度が増加することである。しかしなから、Ｃａ２＋と無関係である調節エキソサイトーシスが報告されている（例えば、Ｆｕｊｉｔａ−Ｙｏｓｈｉｇａｋｉ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９６）３１：２７１（２２）：１３１３０−１３１３４を参照）。調節エキソサイトーシスは、ニューロン（シナプス小胞体から神経伝達物質を放出）、副腎クロム親和性細胞（アドレナリン分泌）、膵腺房細胞（消化酵素分泌）、膵臓β細胞（インシュリン分泌）、マスト細胞（ヒスタミン分泌）、乳房細胞（乳タンパク質分泌）、精液（酵素分泌）、卵細胞（受精包膜の生成）及び含脂肪細胞（血漿膜へのグルコース輸送体の挿入）を含む多くの特殊化細胞にとって重要なものである。
エキソサイトーシスに関連した疾患が知られている。例えばマスト細胞から放出される炎症媒介物により、喘息を含む種々の疾患に至る。同様に、チェディアック−東症候群（ＣＨＳ）は、好中球、単球及びリンパ球が巨大な細胞質顆粒を含有する、珍しい常染色体劣性病である。従って、エキソサイトーシスに関与するタンパク質には最大の関心があり、新規な小胞体結合タンパク質を同定するための努力が、産業界及び学術界の両方においてなされている。例えば、Ｓｋｅｈｅｌ等は、神経伝達物質のエキソサイトーシスに必要な、ＶＡＰ−３３と呼称される、アメフラシの３３キロダルトンの膜タンパク質を同定した。Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５） １５：２６９（５２３０）：１５８０−１５８３、及びＮｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ （１９９５）３４（１１）：１３７９−１３８５。多くの努力は、新規な小胞体結合膜タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。本発明の目的は、ここでＰＲＯ９８３と命名した、小胞体結合タンパク質、ＶＡＰ−３３に対して相同性を有するタンパク質を提供することである。
【００５３】
４４．ＰＲＯ１０５７
プロテアーゼは哺乳類及び非哺乳類生物における多くの非常に重要な生物学的プロセスに関与している酵素タンパク質である。種々の異なる哺乳類及び非哺乳類生物からの数多くの異なるプロテアーゼ酵素が同定され、特徴づけられている。哺乳類のプロテアーゼ酵素は生物学的プロセス、例えばタンパク質の消化、活性化、不活性化、又はペプチドホルモン活性度の変調、及びタンパク質及び酵素の物理学的特性の改変において、重要な役割を担っている。
プロテアーゼ酵素が担っている重要な生理学的役割に鑑みて、現在、新規な未変性プロテアーゼ相同体を同定するための努力が、産業界及び学術界の両方でなされている。これらの努力の多くは、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ９３；７１０８−７１１３（１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照］。我々は、ここでＰＲＯ１０５７と命名した、種々のプロテアーゼ酵素に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【００５４】
４５．ＰＲＯ１０７１
トロンボスポジン−１は、トロンビン刺激に応答して血小板α顆粒から放出され、発達しかつ修復している組織における細胞外マトリックスの一過性成分でもある三量体高分子量糖タンパク質である（Ａｄａｍｓ， Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ２９：８６１−８６５ （１９９７）及びＱｉａｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ． ２１２：１９９−２０７ （１９９６））。種々の因子がトロンボスポジンの発現を調節し、タンパク質が細胞外と細胞内の双方の経路により分解する。トロンボスポジン−１は細胞接着分子として機能し、また細胞移行、細胞増殖、神経突起成長及び血管形成誘導を変調する。このように、トロンボスポジンに対して相同性を持つ新規なポリペプチドを同定することには相当の重要性がある。我々は、ここでＰＲＯ１０７１と命名した、トロンボスポジンと相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【００５５】
４６．ＰＲＯ１０７２
細胞のレドックス状態は細胞運命の重要な決定要因であるという研究が報告されている。更に、反応性酸素種が、細胞毒性であり、組織壊死、臓器不全、アテローム性動脈硬化症、不妊症、出生欠損、早老、突然変異、悪性腫瘍を含む、炎症性疾患を引き起こすことが報告されている。しかして、酸化と還元の制御は、脳卒中、心臓発作、酸化ストレス、高血圧症の制御と防止を含む多くの理由から重要であり、悪性腫瘍の発達に関与している。反応性酸素種の水への転化を触媒するレダクターゼのような抗酸化酵素のレベルは、ガン細胞では低いことが分かっている。特に、悪性前立腺上皮はそのような抗酸化酵素の発現を低下させた［Ｂａｋｅｒ等， Ｐｒｏｓｔａｔｅ ３２（４）：２２９−２３３ （１９９７）］。この点に関して、レダクターゼが興味深い。また、転写因子、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１は、レドックス状態によって調節され、エイズ、ガン、アテローム性動脈硬化症及び糖尿病合併症の原因に関与していると思われる非常に多種の遺伝子の発現に影響を及ぼすことが知られている。この主題事項を更に記述している刊行物には、Ｅｎｇｍａｎ等， Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． （Ｇｒｅｅｃｅ）， １７：４５９９−４６０５ （１９９７）， Ｋｅｌｓｅｙ等， Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ， ７６（７）：８５２−８５４ （１９９７）； Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ及びＷｅｉｓｓ， Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．， １８７（４）：５２９−４０ （１９９７）及びＰｉｅｕｌｌｅ等， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７９（１８）：５６８４−９２ （１９９７）が含まれる。インビボでのレドックス反応の生理学的重要性が分かったので、現在はレドックス反応に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでＰＲＯ１０７２と命名した、レダクターゼ酵素と配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定をここに記載する。
【００５６】
４７．ＰＲＯ１０７５
タンパクジスルフィドイソメラーゼは、正しいジスルフィド結合の形成の確立を通してタンパク質の正しいリフォールディングの促進に関与する酵素タンパク質である。タンパクジスルフィドイソメラーゼは当初は還元された変性ＲＮＡ分解酵素の再生を触媒するその能力に基づいて同定された（Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ等， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２３９：１４０６−１４１０ （１９６４）及びＥｐｓｔｅｉｎ等， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ２８：４３９−４４９ （１９６３））。タンパクジスルフィドイソメラーゼは、そのＣ末端に−ＫＤＥＬ又は−ＨＤＥＬアミノ酸配列を介して小胞体に保持されている小胞体の常在性酵素であることが示されている。
ジスルフィド結合形成酵素の重要性と多くの異なった応用、例えば組み換え的に産生されたタンパク質の正しいリフォールディングの収量を増大させる際の、その潜在的な用途が分かったので、現在は産業界と学術研究機関の双方により、タンパクジスルフィドイソメラーゼに対して相同性を有する新規で未変性のタンパク質を同定するための努力がなされている。これらの努力の多くは、新規なジスルフィドイソメラーゼ相同体に対するコード配列を同定するための哺乳動物組み換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに照準が合わされている。スクリーニング法と技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。我々は、ここでＰＲＯ１０７５と命名した、タンパクジスルフィドイソメラーゼと相同性を有する新規なポリペプチドをここに記載する。
【００５７】
４８．ＰＲＯ１８１
ショウジョウバエでは、極性卵房の背側−腹側極性が、卵母細胞の背側−腹側隅への卵母細胞核とグルケン（ｇｕｒｋｅｎ）ＲＮＡの局在化に依存する。グルケンタンパク質は卵母細胞を取り囲んでいる卵胞体細胞に発現されるショウジョウバエＥＧＦレセプター（トーピード（ｔｏｒｐｅｄｏ）／ＤＥＲ）に対するリガンドとしておそらく作用する（Ｒｏｔｈ等，Ｃｅｌｌ ８１：９６７−９７８ （１９９５））。コルニコン（ｃｏｒｎｉｃｈｏｎ）、グルケン及びトーピードはまた後卵胞細胞の運命を確立し卵房の背側−腹側極性を特定する早期のシグナル伝達事象においても機能する。これらの遺伝子の何れか又は全てにおける突然変異により、腹側と後側の決定基バイコイド（ｂｉｃｏｉｄ）とオスカー（ｏｓｋａｒ）の適切な局在化と、卵母細胞の非対象な位置決めに対して必要とされる正しく極性化された微小管細胞骨格の形成が妨げられる。従って、コルニコン遺伝子産物が早期の発達において重要な役割を担っていることは明らかである。我々は、ここでＰＲＯ１８１と命名した、コルニコンタンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【００５８】
４９．ＰＲＯ１９５
新規な膜貫通タンパク質を同定し特徴づけるための努力が現在なされている。我々は、ここでＰＲＯ１９５と命名した、新規な膜貫通ポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【００５９】
５０．ＰＲＯ８６５
新規な分泌タンパク質を同定し特徴づけるための努力が現在なされている。我々は、ここでＰＲＯ８６５と命名した、新規な分泌ポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【００６０】
５１．ＰＲＯ８２７
ＶＬＡ−２は、マウスとヒトを含む多くの哺乳類生物において同定され特徴づけられた細胞表面インテグリンタンパク質である。ＶＬＡ−２は、エコーウィルス−１（ＥＶ−１）によってＶＬＡ−２発現細胞の感染を媒介するＥＶ−１に対する細胞の表面上のレセプターであることが分かった（Ｚｈａｎｇ等， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３５（２）：２９３−３０１ （１９９７）及びＢｅｒｇｅｌｓｏｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５：１７１８−１７２０ （１９９２））。ＶＬＡ−２はまたインビトロ血管形成の間の内皮とのコラーゲンの相互作用を媒介することも分かった（Ｊａｃｋｓｏｎ等， Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ． １８（９）：８５９−８６７ （１９９４））。ＶＬＡ−２と様々な度合いのアミノ酸配列相同性を分かち持つ様々な他のインテグリンタンパク質が様々な哺乳類生物において同定され特徴づけられた。これらのインテグリンは様々な異なった生理学的機能において重要な役割を果たしていることが報告された。それ故に、一又は複数のインテグリンタンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドを同定することには顕著な興味がある。我々は、ここでＰＲＯ８２７と命名した、ＶＬＡ−２インテグリンタンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【００６１】
５２．　ＰＲＯ１１１４
多くの重要なサイトカインタンパク質が同定され特徴づけられ、特異的細胞表面レセプター複合体を介してシグナル伝達をなうことが示された。例えば、クラスＩＩサイトカインレセプターファミリー（ＣＲＦ２）はインターフェロンレセプター、インターロイキン−１０レセプター及び組織因子ＣＲＦＢ４を含む（Ｓｐｅｎｃｅｒ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １８７：５７１−５７８ （１９９８） 及びＫｏｔｅｎｋｏ等， ＥＭＢＯ Ｊ． １６：５８９４−５９０３ （１９９７））。従って、様々なサイトカインタンパク質が示す多数の生物学的活性は標的細胞の表面上のサイトカインレセプタータンパク質の存在に全面的に依存する。それ故に、一又は複数のサイトカインレセプターファミリーに対して相同性を有する新規なポリペプチドを同定し特徴づけることに顕著な興味がある。我々は、ここでＰＲＯ１１１７と命名した、サイトカインレセプターファミリー−４タンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
インターフェロン（ＩＦＮｓ）は脊椎動物において生じる多くのファミリーの分泌タンパク質を包含する。インターフェロンはその抗ウィルス活性によって本来は命名されたが、増大する証拠は細胞増殖と分化におけるＩＦＮｓの重要な役割を裏付けている（Ｊａｒａｍｉｌｌｏ等， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ １３（３）：３２７−３３８ （１９９５））。ＩＦＮｓは正常なものと形質転換した表現型の双方を持つ広範な細胞の成長を阻害する能力を有する負の成長因子のクラスに属する。ＩＦＮ療法はカポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、及びヘアリー細胞白血病のようなヒトの悪性腫瘍の治療並びにＢ型肝炎のような感染症の治療に役立つことが分かった（Ｇａｍｌｉｅｌ等， Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ２（１）：４８５−４９２ （１９８８）， Ｅｉｎｈｏｒｎ等， Ｍｅｄ．Ｏｎｃｏｌ． ＆ Ｔｕｍｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ． １０：２５−２９ （１９９３）， Ｒｉｎｇｅｎｂｅｒｇ等， Ｍｉｓｓｏｕｒｉ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ８５（１）：２１−２６ （１９８８）， Ｓａｒａｃｃｏ等， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １０：６６８−６７３ （１９９５）， Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｍａｔｅｏｓ等， Ｈｅｐａｔｏ−Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ４２：８９３−８９９ （１９９５）及びＭａｌａｇｕａｒｎｅｒａ等， Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ １７（５）：９９８−１００５ （１９９７））。
【００６２】
インターフェロンはその一次配列に基づいて二つの主要なグループに分類することができる。Ｉ型インターフェロン、ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βは、ＩＦＮ−α遺伝子ファミリーからなるイントロンのない遺伝子のスーパーファミリーと共通の祖先遺伝子から生じたと思われる単一のＩＦＮ−β遺伝子によりコードされている。Ｉ型インターフェロンは殆どの細胞型により生産されうる。ＩＩ型ＩＦＮ、又はＩＦＮ−γは、リンパ球（Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞）に限定され、非特異的Ｔ細胞アクチベータ又は特異的抗原によりインビボで刺激される。
Ｉ型及びＩＩ型ＩＦＮｓの双方が類似の抗ウィルス及び抗増殖効果をつくりだすけれども、それらは別個の細胞表面レセプターに作用し、結合は一般に種特異的である（Ｌａｎｇｅｒ等， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ ９：３９３−４００ （１９８８））。ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βの両方とも同一の高親和性型Ｉレセプターに競合的に結合する一方、ＩＦＮ−γは別のＩＩ型レセプターに結合する。ＩＦＮタンパク質の効果が細胞表面インターフェロンレセプターへの結合を介して媒介されることは明らかであるが、細胞表面上のＩＦＮレセプターの存在と数は、ＩＦＮへの細胞の感度を一般には反映しない。このように、新規なインターフェロンレセプタータンパク質の同定と特徴づけは極めて興味深い。
我々は、ここで「ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプター」と命名した、新規なインターフェロンレセプタータンパク質の同定と特徴づけをここに記載する。従って、本発明のＰＲＯ１１１４ポリペプチドは新規な細胞表面インターフェロンレセプターを表す。
【００６３】
５３．　ＰＲＯ２３７
カルボニックアンヒドラーゼは、二酸化炭素と水から（及びそれらへの）炭酸の合成（及び脱水）を触媒することにより哺乳類の血液系における二酸化炭素の輸送と放出を助ける酵素タンパク質である。従って、カルボニックアンヒドラーゼの作用は哺乳類における様々な重要な生理的反応に対して不可欠である。このように、カルボニックアンヒドラーゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけは顕著な興味がある。我々は、ここでＰＲＯ２３７と命名した、カルボニックアンヒドラーゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【００６４】
５４．　ＰＲＯ５４１
数多くのトリプシンインヒビタータンパク質が同定され特徴づけされている（例えばＹａｍａｋａｗａ等， Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３９５：２０２−２０８ （１９９８）及びＭｉｚｕｋｉ等， Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ ３：２７４−２８０ （１９９２）を参照されたい）。トリプシンインヒビタータンパク質は、様々な異なった生理学的及び生物学的経路において重要な役割を果たしており、特にタンパク質の分解、消化等々の調節のようなプロセスに関与している。このような酵素タンパク質により果たされる重要な役割が分かると、既知のトリプシンインヒビタータンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドを同定し特徴づけることには顕著な興味がある。我々は、ここでＰＲＯ５４１と命名した、トリプシンインヒビタータンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【００６５】
５５．　ＰＲＯ２７３
白血球は単球、マクロファージ、好塩基球、及び好酸球を含み、免疫応答に重要な役割を果たしている。これら細胞はＴ及び／又はＢリンパ球により開始される機構において重要であり、他の炎症性細胞を補充し活性化させ組織破壊に寄与するある範囲のサイトカインを分泌する。
従って、白血球がその適切な目的地まで移動し他の細胞と相互作用する調節プロセスの研究は重要である。現在、白血球は血管壁の内皮細胞に沿って転がることにより損傷を受けたあるいは炎症を起こした組織まで移動すると考えられている。この移動は、セレクチンとそのリガンドの間の一過性の相互作用により媒介される。この血液から漏出と管外遊出工程は、またインテグリンとそのリガンドにより媒介される、より安定した白血球−内皮細胞相互作用を促進する細胞活性化を含む。
ケモカインは構造的に関連したポリペプチドサイトカインの大きなファミリーである。これらの分子は白血球の動きを刺激し、異なった炎症状況における白血球の情報交換を説明する。ケモシネシスは内皮細胞上で特定の接着分子の発現を媒介し、それらが特定の細胞型を活性化する化学誘因物質をつくりだす。また、ケモカインは特定の細胞型の増殖を刺激し活性化を調節する。これらの活動の双方において、ケモカインは高度の標的細胞特異性を証明する。
ケモカインファミリーは、二つのアミノ末端システイン残基がが直ぐに隣接しているか（Ｃ−Ｃ）、１つのアミノ酸によって分離しているか（Ｃ−Ｘ−Ｃ）に従って二つのサブファミリーに分割される。Ｃ−Ｘ−Ｃファミリーのケモカインは一般に好中球と線維芽細胞を活性化させる一方、Ｃ−Ｃケモカインは単球／マクロファージ、好塩基球、好酸球及びＴリンパ球を含むより広範なグループ標的細胞に作用する。両方のサブファミリーの既知のケモカインは、Ｔｈｏｍｓｏｎ Ａ． （１９９４） Ｔｈｅ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ， ２ｎｄ Ｅｄ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．においてレビューされているように、多くの多様な細胞型により合成される。ケモカインはまたＳｃｈａｌｌ ＴＪ （１９９４） Ｃｅｈｍｏｔａｃｔｉｃ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ： Ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ． Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｓｏｕｔｈｂｏｒｏｕｇｈ Ｍａｓｓ． ｐｐ１８０−２７０；及びＰａｕｌ ＷＥ （１９９３） Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ３ｒｄ Ｅｄ． Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． ｐｐ８２２−８２６においてレビューされている。
【００６６】
Ｃ−Ｘ−Ｃサブファミリーの既知のケモカインには、マクロファージ炎症タンパクα及びβ（ＭＩＰ−１及びＭＩＰ−２）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、及び成長調節タンパク質（ＧＲＯ−α及びβ）が含まれる。
ＭＩＰ−２はとして最初はリポ多糖類（ＬＰＳ）での刺激時にマウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７により分泌される６ｋＤａのヘパリン結合タンパク質として同定された。ＭＩＰ−２はケモカインのＣ−Ｘ−Ｃ（又はＣＸＣ）サブファミリーのメンバーである。マウスＭＩＰ−２はヒト好中球に対して化学走化性であり、マウスの足の裏に注射した場合、局所的好中球浸潤を誘発する。ラットＭＩＰ−２はマウスＭＩＰ−２に対して８６％のアミノ酸相同性を示し、ラット好中球に対して化学走化性であるが、ラット肺胞マクロファージ又はヒト末梢血好酸球又はリンパ球の遊走を刺激しない。また、ＭＩＰ−２はラット肺胞内皮細胞の増殖を刺激するが線維芽細胞の増殖は刺激しないことが分かっている。
炎症を生じた又は羅患した組織における異常の診断に対する現在の技術は、臨床的徴候の観察又はホルモン、ポリペプチド又は様々な代謝物に対する体の組織又は流体の血清学的な検査に主に依存している。問題はこれらの診断法にある。第１に、患者は疾患の初期段階では臨床的徴候を表さないであろう。第２に、血清学的試験は浸潤性疾患と遺伝的シンドローム間を必ずしも区別しない。従って、発現されたケモカインの同定は、新規な診断法、効果的な治療法の開発、及び分病原性の理解の助けとしてに重要である。
今日まで、ケモカインは少なくとも次の症状：乾癬、炎症性腸疾患、腎疾患、関節炎、免疫媒介脱毛症、脳卒中、脳炎、ＭＳ、肝炎、及びその他に関与していた。また、非ＥＬＲ含有ケモカインは血管形成誘導の阻害に関与しており、よって、これらのケモカインが腫瘍血管新生及び腫瘍形成においてある役割を有していることを示している。
従って、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−２、及びその他の関連タンパク質と配列同一性及び類似性を有するポリペプチド及びこれをコードする核酸を同定することが本発明の目的である。
【００６７】
５６．ＰＲＯ７０１
βニューレキシン及びニューロリギンはニューロン細胞表面上に示される原形質膜タンパク質である。ニューロロゴン１は、Ｉｃｈｔｃｈｅｎｋｏ等，Ｃｅｌｌ，８１（３）：４３５−４４３ （１９９５）に記載されているように、シナプス原形質膜に濃縮されており、βニューレキシンに対するスプライス部位特異的リガンドとして作用する。ニューロリギンの細胞外配列はアセチルコリンエステラーゼに相同の触媒的に不活性なエステラーゼ領域からなる。ニューロリギン２及び３はニューロリギン１に構造と配列が類似している。全てのニューロリギンは切断シグナルペプチドに大きなエステラーゼ相同領域、高度に保存された単一の膜貫通領域、及び短い細胞質領域が続く特徴を持つＮ末端疎水性配列を含む。３種のニューロリギンは同一の位置で選択的スプライシングを受け、脳においてのみ高レベルで発現される。βニューレキシンに対する３種のニューロリギンの密着結合はスプライス部位４に挿入断片を欠くβニューレキシンに対してのみ観察される。従って、ニューロリギンは、ニューロン間の認識プロセスを媒介する点でオーバーラップする機能を有する異なったアイソフォームを持つ脳特異的タンパク質の多重遺伝子族を構成する。Ｉｃｈｔｃｈｅｎｋｏ等， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７１（５）：２６７６−２６８２ （１９９６）を参照されたい。更に、ニューレキシンとニューロリギンは、βニューレキシンの選択的スプライシングによって調節されるＣａ２＋依存性反応において接着分子として機能することが報告されている。Ｎｇｕｙｅｎ及びＳｕｄｈｏｆ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７２（４１）：２６０３２−２６０３９ （１９９７）を参照されたい。
上述のことが分かると、膜結合タンパク質は興味深い。より一般的には、膜結合タンパク質とレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持に重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例には線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
【００６８】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質は、関連するレセプター／リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
新規な未変性の膜結合レセプタータンパク質、特にニューロリギン１、２及び３と配列同一性及び／又は類似性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。このような努力の結果はここに提供される。
【００６９】
５７．　ＰＲＯ７０４
ＶＩＰ３６はゴルジ体と細胞表面に局在化し、糖タンパク質、糖脂質、又は双方の情報交換に関与しているかも知れない動物分泌経路中のマメ科植物レクチン相同体のファミリーに属している。ＶＩＰ３６は、スフィンゴ糖脂質及び／又はグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーの糖残基に結合し、細胞質蛋白分離機及び糖脂質ラフトの細胞外／管腔面間の関連性を提供するかもしれない。更にＶＩＰ３６に関して、細胞質膜とゴルジの間をサイクルするその能力を付与するすると更に内部移行コンセンサス配列に一致するシグナルがそのＣ末端にあると信じられている。Ｆｉｅｄｌｅｒ等， ＥＭＢＯ Ｊ．， １３（７）：１７２９−１７４０ （１９９４）； Ｆｉｅｄｌｅｒ及びＳｉｍｏｎｓ， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．， １０９（１）：２７１−２７６ （１９９６）； Ｉｔｉｎ等， ＭＢＯ Ｊ．， １４（１０）：２２５０−２２５６ （１９９５）を参照されたい。ＶＩＰ３６はヒトＧＰ３６ｂタンパク質と同じかこれに非常に密接に関連していると信じられている。ＶＩＰ３６及び／又はＧＰ３６ｂは興味深い。
更に一般的には、小胞、細胞質、細胞外及び膜結合タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、普通は膜結合レセプタータンパク質において、細胞外環境のその作用部位に到達する。
【００７０】
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。実際、血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンは、レセプター−リガンド相互作用を阻止する治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた関連するレセプター／リガンド相互作用の潜在的ペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに対して使用することもできる。そのような膜結合タンパク質と細胞レセプターには、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホフファターゼ、細胞−細胞相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子が含まれる。細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
新規な未変性の小胞、細胞質、分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にＶＩＰ３６と配列同一性及び／又は類似性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。
【００７１】
５８．　ＰＲＯ７０６
酸性ホスファターゼタンパク質は、酸性ｐＨ条件下で末端リン酸基を脱リン酸化する分泌タンパク質である。酸性ホスファターゼはＲＨＧＸＲＸＰアミノ酸配列を含み、これは機構的に重要であると予想されている。酸性ホスファターゼはヒトの疾患の診断と治療において重要な機能を有しうる。例えば、前立腺酸性ホスファターゼは前立腺組織およっび前立腺ガンに独特に発現される分泌タンパク質である。前立腺酸性ホスファターゼのレベルは、Ｌａｎｋｆｏｒｄ等， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｒａｄｉａｔ． Ｏｎｃｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｐｈｙｓ． ３８（２）：３２７−３３３ （１９９７）に記載されているように、放射線療法で治療された前立腺ガン患者における局所的及び生化学的制御に対する潜在的な予後因子である。研究によれば、前立腺酸性ホスファターゼに対する細胞免疫応答が破壊的自己免疫前立腺炎を媒介し、前立腺酸性ホスファターゼの異種型が前立腺ガンの免疫療法に有用であることが示唆されている。Ｆｏｎｇ等， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６９（７）：３１１３−３１１７ （１９９７）を参照されたい。精液前立腺酸性ホスファターゼレベルは、３５を越えた個人において非常に低い精子レベル（精子過小症）と有意に相関している。Ｓｉｎｇｈ等， Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ Ｍｅｄ．Ｊ． ３７（６）：５９８−５９９ （１９９６）を参照。従って、前立腺酸性ホスファターゼは様々なヒトの疾患に関与しており、これらの疾患の診断と治療において重要な機能を有している。一連のアミノベンジルリン酸化合物は、Ｂｅｅｒｓ等， Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ． ４（１０）：１６９３−１７０１ （１９９６）に記載されているように、前立腺酸性ホスファターゼの非常に有力なインヒビターである。
更に一般的には、細胞外タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。新規な未変性タンパク質、特に前立腺酸性ホスファターゼ及びリソソーム酸性ホスファターゼ前駆体と配列同一性を有するもの、及びある場合には胎性心臓に見出されるＤＮＡと同一性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。
【００７２】
５９．ＰＲＯ７０７
カドヘリンは膜貫通タンパク質の大きなファミリーである。少なくともカドヘリン１−１３並びにＢ、Ｅ、ＥＰ、Ｍ、Ｎ、Ｐ及びＲ型が特徴づけられている。カドヘリンについて知られている機能のなかで、ある例外をもって、カドヘリンは細胞凝集に関与し、細胞−細胞接着部位に付随する。カドヘリンは更にＴａｎｉｈａｒａ等， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．， １０７（６）：１６９７−１７０４ （１９９４）及びＴａｎｉｈａｒａ等， Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２（１）：１５−２６ （１９９４）に記載されている。更に、カドヘリンスーパーファミリーの幾つかのメンバーは一般に伝達を含む細胞−細胞相互作用プロセスに関与している。Ｓｕｚｕｋｉ， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１（４）：５３１−５４２ （１９９６）を参照されたい。従って、カドヘリンスーパーファミリーの新規なメンバーは興味深い。
更に一般的には、膜結合タンパク質を含む、全ての新規なタンパク質は興味深い。膜結合タンパク質とレセプターは多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター／リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
新規な未変性の分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にカドヘリンと同一性を有する膜結合タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。かかる努力の結果がここに提供される。
【００７３】
６０．ＰＲＯ３２２
プロテアーゼは、哺乳類及び非哺乳類生物における多数の非常に重要な生物学的プロセスに関与する酵素タンパク質である。様々なセリン含有タンパク質に対して特異的活性を示すセリンプロテアーゼを含む、様々な異なった哺乳類及び非哺乳類生物からの無数の異なったプロテアーゼ酵素が同定されかつ特徴づけられている。哺乳類のプロテアーゼ酵素は、例えばタンパク質消化、ペプチドホルモン活性の活性化、不活性化、又は変調、及びタンパク質と酵素の物理的性質の変更のような生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。
ニューロプシンは、ｍＲＮＡが中枢神経系に発現される新規なセリンプロテアーゼである。マウスニューロプシンはクローニングされ、海馬可塑性に慣用することが研究から分かっている。ニューロプシンはまた細胞外マトリックスの改変と細胞遊走に付随していることが示されている。一般的には、Ｃｈｅｎ等， Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， ７（２）：５０８８−５０９７ （１９９５）及びＣｈｅｎ等， Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．， ４６：３１３−３２０ （１９９８）を参照されたい。
新規な未変性の膜結合又は分泌タンパク質、特にニューロプシン、セリンプロテアーゼ、ニューロシン及びトリプシノーゲンと相同性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。
【００７４】
６１．ＰＲＯ５２６
タンパク質−タンパク質相互作用はレセプター及び抗原複合体及びシグナル伝達機構に関連するものを含む。タンパク質−タンパク質相互作用の基となる構造的及び機能的機構についてよく知られているように、タンパク質−タンパク質相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用の特定の結果を調節するように更に容易に操作することができる。従って、タンパク質−タンパク質相互作用の基となる機構は科学及び医学界にとって興味深い。
ロイシンリッチ反復を含む全てのタンパク質はタンパク質−タンパク質相互作用に関与していると考えられている。ロイシンリッチ反復は多様な機能を持つ多くのタンパク質と細胞位置に存在する短い配列モチーフである。リボ核酸インヒビタータンパク質の結晶構造から、ロイシンリッチ反復はβ−α構造単位に対応することが明らかになった。これらの単位は、一面が溶媒に暴露された平行なβシートを形成するように配置され、タンパク質は珍しい非球状の形状を獲得する。これらの二つの特徴はロイシンリッチ反復を含むタンパク質のタンパク質結合機能の原因であることが示されている。Ｋｏｂｅ及びＤｅｉｓｅｎｈｏｆｅｒ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．， １９（１０）：４１５−４２１ （Ｏｃｔ．１９９４）を参照されたい。
個体発生の間にコラーゲン原線維を配向し指令する組織オーガナイザーとなり、創傷治癒、組織修復、及び腫瘍ストローマ形成のような病理プロセスに関与するロイシンリッチプロテオグリカンについて研究が報告されている。Ｉｏｚｚｏ，Ｒ．Ｖ．， Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．， ３２（２）：１４１−１７４ （１９９７）。創傷治癒、組織修復におけるロイシンリッチタンパク質の関与を示す研究は、Ｄｅ Ｌａ Ｓａｌｌｅ， Ｃ．等， Ｖｏｕｖ．Ｒｅｖ．Ｆｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ． （Ｇｅｒｍａｎｙ），３７（４）：２１５−２２２ （１９９５）であり、出血疾患ベルナール−スーリエ症候群に伴う複合体におけるロイシンリッチモチーフの突然変異を報告しており、Ｃｈｌｅｍｅｔｓｏｎ，Ｋ．Ｊ．， Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ． （Ｇｅｒｍａｎｙ），７４（１）：１１１−１１６ （Ｊｕｌｙ １９９５）は、血小板がロイシンリッチ反復を有していることを報告しており、Ｌａ Ｊｏｌｌａ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎのＲｕｏｓｌａｈｔｉ， Ｅ．Ｉ．等の国際公開第９１１０７２７−Ａは、トランスフォーミング成長因子βに結合するデコリンがガンの治療、創傷治癒及び瘢痕化に関与していることを報告している。結合組織、皮膚及び骨のような組織の再成長に関連する創傷治癒及び付随する治療法において；ヒトと動物における体成長を促進することで；及び他の成長関連プロセスを刺激する点で有用であることにおいて、この群のタンパク質に機能が関連しているのはインスリン様成長因子（ＩＧＦ）である。ＩＧＦの酸不安定サブユニット（ＡＬＳ）はまたＩＧＦの半減期を増大させインビボのＩＧＦ複合体の一部である点で興味深い。ＡＬＳはＬｅｏｎｇ及びＢａｘｔｅｒ， Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， ６（６）：８７０−８７６ （１９９２）； Ｂａｘｔｅｒ， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２６４（２０）：１１８４３−１１８４８ （１９８９）；及びＫｈｏｓｒａｖｉ等， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．， ８２（１２）：３９４４−３９５１ （１９９７）に更に記載されている。
【００７５】
ロイシンリッチ反復を有することが報告されている他のタンパク質は、アルツハイマー病のような神経変性疾患、パーキンソン病のような神経損傷の治療において、及びガンの診断に対して有用であることが報告されているＳＬＩＴタンパク質である。エール大学のＡｒｔａｖａｎｉｓｔｓａｋｏｎａｓ，Ｓ．及びＲｏｔｈｂｅｒｇ，Ｊ．Ｍ．の国際公開第９２１０５１８−Ａ１を参照。また興味深いのはＬＩＧ−１、すなわちマウス脳のグリア細胞中に特異的に発現され、ロイシンリッチ反復及び免疫グロブリン様ドメインを有する膜糖タンパク質である。Ｓｕｚｕｋｉ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（Ｕ．Ｓ．），２７１（３７）：２２５２２ （１９９６）。ロイシンリッチ反復を有するタンパク質の生物学的機能を報告している他の研究には：Ｔａｙａｒ，Ｎ．等， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， （Ｉｒｅｌａｎｄ）， １２５（１−２）：６５−７０ （Ｄｅｃ．１９９６）（ゴナドトロピンレセプター関連）；Ｍｉｕｒａ，Ｙ．等，Ｎｉｐｐｏｎ Ｒｉｎｓｈｏ （Ｊａｐａｎ）， ５４（７）：１７８４−１７８９ （Ｊｕｌｙ １９９６）（アポトーシス関連）；Ｈａｒｒｉｓ，Ｐ．Ｃ．等， Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．， ６（４）：１１２５−１１３３ （Ｏｃｔ．１９９５）（腎疾患関連）が含まれる。
タンパク質−タンパク質相互作用をよりよく理解するためにロイシンリッチ反復を有する新規なタンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。特に興味深いものは、ＡＬＳのようなロイシンリッチ反復を有する既知のタンパク質と同一性又は類似性を有するタンパク質である。多くの努力が、ロイシンリッチ反復を有する新規な分泌及び膜結合タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。
【００７６】
６２．ＰＲＯ５３１
カドヘリンは膜貫通タンパク質の大きなファミリーである。カドヘリンは、多細胞生物の実質的に全ての固体組織において細胞−細胞接着を媒介する機能をするカルシウム依存性糖タンパク質のファミリーからなる。少なくともカドヘリン１−１３並びにＢ、Ｅ、ＥＰ、Ｍ、Ｎ、Ｐ及びＲ型が特徴づけられている。カドヘリンについて知られている機能のなかで、ある例外をもって、カドヘリンは細胞凝集に関与し、細胞−細胞接着部位に付随する。最近になって、全てのカドヘリンが細胞外ドメインの折り畳みに対応すると考えられるカドヘリン特異的モチーフ複数の反復を分かち持つ一方、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーは多岐にわたる構造及びおそらくは機能を有していることが報告されている。特に、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーはシグナル伝達に関与していることが報告されている。Ｓｕｚｕｋｉ， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１（４）：５３１−５４２ （１９９６）を参照されたい。カドヘリンは更にＴａｎｉｈａｒａ等， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．， １０７（６）：１６９７−１７０４ （１９９４）、Ａｂｅｒｌｅ等， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１（４）：５１４−５２３ （１９９６）及びＴａｎｉｈａｒａ等， Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２（１）：１５−２６ （１９９４）に記載されている。
プロトカドヘリンは脳内に高度に発現されるカドヘリンスーパーファミリーのメンバーである。ある研究では、プロトカドヘリンは細胞接着活性を示した。Ｓａｎｏ等，ＥＭＢＯ Ｊ．， １２（６）：２２４９−２２５６ （１９９３）を参照されたい。しかしながら、研究では、ある種のプロトカドヘリン、例えばプロトカドヘリン３（Ｐｃｄｈ３又はｐｃ３とも称される）が強いカルシウム依存性凝集活性を示さないことも示されている。この研究とＰｃｄｈ３の更なる特徴についてはＳａｇｏ等， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ２９（３）：６３１−６４０ （１９９５）を参照されたい。
【００７７】
従って、カドヘリンスーパーファミリーの新規なメンバーは興味深い。より一般的には、全ての膜結合タンパク質とレセプターが興味深い。このようなタンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター／リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
新規な未変性の膜結合タンパク質、特にプロトカドヘリン、特に３及び４と配列同一性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な膜結合タンパク質に対するコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。ここに提供するものはかかる努力の結果である。
【００７８】
６３．ＰＲＯ５３４
タンパクジスルフィドイソメラーゼは、正しいジスルフィド結合の形成の確立を通してタンパク質の正しいリフォールディングの促進に関与する酵素タンパク質である。タンパクジスルフィドイソメラーゼは当初は還元された変性ＲＮＡ分解酵素の再生を触媒するその能力に基づいて同定された（Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ等， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２３９：１４０６−１４１０ （１９６４）及びＥｐｓｔｅｉｎ等， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ２８：４３９−４４９ （１９６３））。タンパクジスルフィドイソメラーゼは、そのＣ末端に−ＫＤＥＬ又は−ＨＤＥＬアミノ酸配列を介して小胞体に保持されている小胞体の常在性酵素であることが示されている。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと関連するタンパク質は、更にＬａｂｏｉｓｓｉｅｒｅ等， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７０（４７：２８００６−２８００９ （１９９５）； Ｊｅｅｎｅｓ等， Ｇｅｎｅ， １９３（２）：１５１−１５６ （１９９７）； Ｋｏｉｖｕｎｅｎ等， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ４２（３）：３９７−４０４ （１９９７）；及びＤｅｓｉｌｖａ等， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １５（１）：９−１６ （１９９６）に記載されている。これらの研究はタンパク質ジスルフィド関連タンパク質の同定の重要性を示している。
より一般的には、また興味深いものは、全ての新規な膜結合タンパク質とレセプターである。このようなタンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
【００７９】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター／リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
膜結合タンパク質の重要性が分かってから、新規な膜結合タンパク質を同定する努力がなされている。更に、ジスルフィド結合形成酵素の重要性と多くの異なった応用、例えば組換え的に産生されたタンパク質の正しいリフォールディングの収量を増大させる際の、その潜在的な用途が分かったので、現在は産業界と学術研究機関の双方により、タンパクジスルフィドイソメラーゼに対して配列同一性を有する新規で未変性のタンパク質を同定するための努力がなされている。これらの努力の多くは、新規なジスルフィドイソメラーゼ相同体に対するコード配列を同定するための哺乳動物組み換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、タンパクジスルフィドイソメラーゼと配列同一性を有する新規なポリペプチド及びこれをコードする核酸をここに記載する。
【００８０】
６４．ＰＲＯ６９７
分泌フリズルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）関連タンパク質（ｓＦＲＰｓ）は膜貫通レセプターのフリズルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）ファミリーである。ｓＦＲＰｓはおよそ３０ｋＤａの大きさで、それぞれ推定シグナル配列、フリズルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）様システインリッチドメイン及び保存された親水性カルボキシ末端ドメインを含む。ｓＦＲＰｓはＷｎｔシグナル伝達を変調するように機能し、又はある種のレセプターに対するリガンドとして機能することが報告されている。Ｒａｔｔｎｅｒ等， ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９４（７）：２８５９−２８６３ （１９９７）。従って、ｓＦＲＰｓ及びｓＦＲＰｓと配列同一性及び／又は類似性を有するタンパク質は興味深い。
興味深い他の分泌タンパク質は分泌アポトーシス関連タンパク質（ＳＡＲＰｓ）のファミリーの任意のメンバーである。ＳＡＲＰｓの発現はβカテニンの細胞内レベルを変え、ＳＡＲＰｓがＷｎｔ−フィルズルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）タンパク質シグナル伝達経路に緩衝することを示唆している。Ｍｅｌｋｏｎｙａｎ等，ＰＮＡＳ ＵＳＡ， ９４（２５）：１３６３６−１３６４１ （１９９７）。従って、ＳＡＲＰｓ及びＳＡＲＰｓと配列同一性及び／又は類似性を有するタンパク質は興味深い。
ｓＦＲＰｓ及びＳＡＲＰｓに加えて、多くの細胞外タンパク質は興味深い。細胞外タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
新規な未変性の分泌タンパク質、特にｓＦＲＰ−２とＳＡＲＰ−１と配列同一性及び／又は類似性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。
【００８１】
６５．ＰＲＯ７１７
新規な膜貫通レセプタータンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。
【００８２】
６６．ＰＲＯ７３１
カドヘリンは膜貫通タンパク質の大きなファミリーである。カドヘリンは、多細胞生物の実質的に全ての固体組織において細胞−細胞接着を媒介する機能をするカルシウム依存性糖タンパク質のファミリーからなる。少なくともカドヘリン１−１３並びにＢ、Ｅ、ＥＰ、Ｍ、Ｎ、Ｐ及びＲ型が特徴づけられている。カドヘリンについて知られている機能のなかで、ある例外をもって、カドヘリンは細胞凝集に関与し、細胞−細胞接着部位に付随する。最近になって、全てのカドヘリンが細胞外ドメインの折り畳みに対応すると考えられるカドヘリン特異的モチーフ複数の反復を分かち持つ一方、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーは多岐にわたる構造及びおそらくは機能を有していることが報告されている。特に、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーはシグナル伝達に関与していることが報告されている。Ｓｕｚｕｋｉ， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１（４）：５３１−５４２ （１９９６）を参照されたい。カドヘリンは更にＴａｎｉｈａｒａ等， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．， １０７（６）：１６９７−１７０４ （１９９４）、Ａｂｅｒｌｅ等， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１（４）：５１４−５２３ （１９９６）及びＴａｎｉｈａｒａ等， Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２（１）：１５−２６ （１９９４）に記載されている。
プロトカドヘリンは脳内に高度に発現されるカドヘリンスーパーファミリーのメンバーである。ある研究では、プロトカドヘリンは細胞接着活性を示した。Ｓａｎｏ等，ＥＭＢＯ Ｊ．， １２（６）：２２４９−２２５６ （１９９３）を参照されたい。しかしながら、研究では、ある種のプロトカドヘリン、例えばプロトカドヘリン３（Ｐｃｄｈ３又はｐｃ３とも称される）が強いカルシウム依存性凝集活性を示さないことも示されている。この研究とＰｃｄｈ３の更なる特徴についてはＳａｇｏ等， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ２９（３）：６３１−６４０ （１９９５）を参照されたい。
従って、カドヘリンスーパーファミリーの新規なメンバーは興味深い。より一般的には、全ての膜結合タンパク質とレセプターが興味深い。このようなタンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
【００８３】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター／リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
新規な未変性の膜結合タンパク質、特にプロトカドヘリン、とりわけ４、６８、４３、４２、３及び５と配列同一性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な膜結合タンパク質に対するコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。ここに提供するものはかかる努力の結果である。
【００８４】
６７．ＰＲＯ２１８
新規な未変性の膜結合タンパク質、特に膜調節タンパク質と配列同一性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質に対するコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。
【００８５】
６８．ＰＲＯ７６８
インテグリンは細胞接着を促進する細胞表面糖タンパク質レセプターのスーパーファミリーからなる。各細胞はその細胞接着能力を形成する数多くのレセプターを有している。インテグリンは細胞と他の細胞又はマトリックス成分との間の広範な相互作用に関与する。インテグリンは免疫系細胞の移動と機能の調節において特に重要である。血小板ＩＩｂ／ＩＩＩＡインテグリン複合体は血小板凝集の調節において特に重要である。インテグリンファミリーのメンバーであるインテグリンβ−６は、上皮細胞上に発現され上皮炎症を変調する。他のインテグリンである白血球随伴抗原−１（ＬＦＡ−１）は免疫応答の間のリンパ球の接着において重要である。
特に重要なものは、Ｓｏｎｇ等， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １１７（３）：６４３−６５７ （１９９２）に記載されているように筋形成の間に発生的に調節されるインテグリンα鎖であるＨ３６−α７である。ラミニン結合α７β１インテグリンの発現パターンは骨格、心及び平滑筋において発生的に調節される。Ｚｉｏｂｅｒ等， Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ， ８（９）：１７２３−１７３４ （１９９７）。α７−Ｘ１／Ｘ２インテグリンの発現は、細胞特異的な形でレセプターアフィニティ状態を調節し、筋肉の発達と修復の間のインテグリン依存性事象を変調しうる新規な機構であることが報告されている。上掲。ラミニンがα７インテグリンレセプターを介して骨格筋芽細胞の歩行運動を促進することが更に報告されている。特に、α７β１レセプターは限られた数のラミニンアイソフォームに対する筋芽細胞の接性着と運動性を促進し、再生と分化の間における筋原先駆体補充において重要であることが報告されている。Ｙａｏ等， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．， １０９（１３）：３１３９−３１５０ （１９９６）。インテグリンα７のスプライシングされた変異体もまたＬｅｕｎｇ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．， ２４３（１）：３１７−３２５ （１９９８）及びＦｏｒｎａｒｏとＬａｎｇｕｉｎｏ， Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．， １６（４）：１８５−１９３ （１９９７）に記載されている。更に、インテグリンα７が無いと、ある形の筋ジストロフィーを引き起こすことが報告されている。従って、インテグリン、特にインテグリン７と関連分子に関するものは興味深い。
【００８６】
インテグリンに対する興味に加えて、より一般的には、全ての膜結合タンパク質とレセプターが、このようなタンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうるために興味深い。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター／リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
従って、産業界と学術研究機関の双方により、新規な未変性のレセプタータンパク質を同定するための努力がなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質に対するコード配列を同定するための哺乳動物組み換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。このような努力、特にインテグリンと配列同一性を有する新規なポリペプチドを同定するために注がれたものをここに記載する。
【００８７】
６９．ＰＲＯ７７１
テスチカン（ｔｅｓｔｉｃａｎ）は、限定されるものではないが神経筋組織、脳及び生殖組織を含む数多くの組織において発現される多領域精巣プロテオグリカンである。テスチカンは、細胞形、接着、遊走及び増殖のような細胞社会的挙動の修飾因子に似ている。［Ｂｏｎｎｅｔ，Ｆ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７１（８）：４３７３ （１９９６）， Ｐｅｒｉｎ，Ｊ．Ｐ．等，ＥＸＳ （Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）， ７０：１９１ （１９９４）， Ａｌｌｉｅｌ，Ｐ．Ｍ．等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２１４（１）：３４６ （１９９３）， Ｃｈａｒｂｏｎｎｉｅｒ，Ｆ．等， Ｃ．Ｒ．Ｓｅａｎｃｅｓ Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ．Ｆｉｌ． （Ｆｒａｎｃｅ）， １９１（１）：１２７ （１９９７）］。とりわけ、テスチカンはニューロンプロセスに関係し、結合組織の成長に関連しているので、テスチカンと関連分子は興味深い。
より一般的には、全ての細胞外タンパク質が興味深い。細胞外タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。かかる努力の結果、特にテスチカンと同一性及び／又は類似性を有する分子を同定するために注がれたものは興味深い。
【００８８】
７０．ＰＲＯ７３３
Ｔ１／ＳＴ２は、細胞シグナル伝達に関与していると信じられている、Ｉ型インターロイキン−１レセプターに相同なレセプター様分子である。Ｔ１／ＳＴ２レセプター及び／又は推定リガンドは更に、Ｇａｙｌｅ等， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７１（１０）：５７８４−５７８９ （１９９６）， Ｋｕｍａｒ等， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７０（４６）：２７９０５−２７９１３ （１９９５）及びＭｉｔｃｈａｍ等， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７１（１０）：５７７７−５７８３ （１９９６）に記載されている。これらのタンパク質及びそれに関連するタンパク質は興味深い。
より一般的には、全ての膜結合タンパク質とレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たすので、興味深い。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター／リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
産業界と学術研究機関の双方により、新規な未変性のレセプタータンパク質を同定するための努力がなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質に対するコード配列を同定するための哺乳動物組み換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。このような努力の結果をここに提供する。
【００８９】
７１．ＰＲＯ１６２
膵臓随伴タンパク質（ＰＡＰ）は急性膵炎の間に膵臓から過剰発現される分泌タンパク質である。血清ＰＡＰ濃度は急性膵炎の患者において異常に高いことが分かっている。Ｐｅｚｚｉｌｌｉ等， Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．， ９２（１０）：１８８７−１８９０ （１９９７）。
ＰＡＰは膵臓炎症のために膵臓により合成され、膵臓の損傷に対する良好な血清マーカーであることが示されている。また、血清ＰＡＰレベルはクレアチニンクリアランス測定値と強く相関していると思われる。膵臓−腎臓移植の患者では、ＰＡＰは膵臓移植片拒絶の有用な生物学的かつ組織学的マーカーであることが証明されている。Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｉｊｌ等， Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ， ６３（７）：９９５−１００３ （１９９７）。更に、ＰＡＰは、嚢胞性線維症について新生児をスクリーニングする際に有用であることが分かっている。実際、ＰＡＰは現在の免疫反応性トリプシス（ｔｒｙｐｓｉｓ）検査法よりも良好な特異性をもって嚢胞性線維症を判別する。Ｉｏｖａｎｎａ等， Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ａｃｉ．ＩＩＩ， ３１７（６）：５６１−５６４。
ＰＡＰのような分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。
新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。かかる努力の結果がここに提供される。
【００９０】
７２．　ＰＲＯ７８８
抗悪性腫瘍尿タンパク（ＡＮＵＰ）は、マウス又はハムスター由来の幾つかの正常な二倍体細胞株又は腫瘍細胞の増殖に影響を及ぼさないでヒトの腫瘍細胞株に対して抗増殖活性を示すヒトの尿の画分中に存在する主要なタンパク質として同定された。Ｓｌｏａｎｅ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．， ２３４（２）：３５５−３６２ （１９８６）。
ＡＮＵＰはヒトの顆粒球に見出される独特のサイトカインである。Ｎ末端アミノ酸配列は独特であることが分かっている。４位と７位にＣｙｓを持つ最初の９残基に対応する合成ペプチドは、インビトロの抗腫瘍剤であることが見出されている。ＲｉｄｇｅとＳｌｏａｎｅ， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ， ８（１）：１−５ （１９９６）。
ＡＮＵＰのような分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。
【００９１】
７３．ＰＲＯ１００８
Ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ｄｋｋ−１）は分泌タンパク質のファミリーのメンバーであり、頭部誘導において機能する。Ｄｋｋ−１は両生類胎仔におけるシュペーマン形成体の誘導物質である。Ｇｌｉｎｋａ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３９１（６６６５）：３５７−３６２ （１９９８）。Ｄｋｋ−１はＷｎｔシグナル伝達の有力なアンタゴニストであり、ｄｋｋ遺伝子が分泌Ｗｎｔインヒビターのファミリーをコードしていることを示唆している。従って、ｄｋｋ−１ファミリーメンバーと関連分子は興味深い。
より一般的には、全ての細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たすので、興味深い。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。
新規な未変性の分泌タンパク質、特にｄｋｋ−１に関連するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ．，等Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。ｄｋｋ−１に関連した分子を同定するためのかかる努力の結果をここに提供する。
【００９２】
７４．ＰＲＯ１０１２
タンパクジスルフィドイソメラーゼは、正しいジスルフィド結合の形成の確立を通してタンパク質の正しいリフォールディングの促進に関与する酵素タンパク質である。タンパクジスルフィドイソメラーゼは当初は還元された変性ＲＮＡ分解酵素の再生を触媒するその能力に基づいて同定された（Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ等， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２３９：１４０６−１４１０ （１９６４）及びＥｐｓｔｅｉｎ等， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ２８：４３９−４４９ （１９６３））。タンパクジスルフィドイソメラーゼは、そのＣ末端に−ＫＤＥＬ又は−ＨＤＥＬアミノ酸配列を介して小胞体に保持されている小胞体の常在性酵素であることが示されている。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと関連するタンパク質は、更にＬａｂｏｉｓｓｉｅｒｅ等， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７０（４７：２８００６−２８００９ （１９９５）； Ｊｅｅｎｅｓ等， Ｇｅｎｅ， １９３（２）：１５１−１５６ （１９９７）； Ｋｏｉｖｕｎｅｎ等， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ４２（３）：３９７−４０４ （１９９７）；及びＤｅｓｉｌｖａ等， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １５（１）：９−１６ （１９９６）に記載されている。これらの研究はタンパク質ジスルフィド関連タンパク質の同定の重要性を示している。
より一般的には、全ての新規な膜結合タンパク質とレセプターの同定は、これらが多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうるので、興味深い。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、通常は膜結合レセプタータンパク質における、細胞外環境のその作用部位に到達する。
【００９３】
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。実際、血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター／リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
特に興味深いものは、小胞体（ＥＲ）保持シグナルを有する細胞タンパク質である。これらのタンパク質は細胞に保持され、タンパク質生産において小胞体と密接に機能する。かかるタンパク質は過去に記載されている。すなわち、ＳｈｏｒｒｏｓｈとＤｉｘｏｎ， Ｐｌａｎｔ Ｊ．， ２（１）：５１−５８ （１９９２）を参照されたい。
新規な未変性の分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にＥＲ保持シグナルを有する細胞タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。このような努力、特にタンパクジスルフィドイソメラーゼに対して配列同一性及び類似性を有する、新規なポリペプチドとこれをコードする核酸の同定の結果がここに提供される。
【００９４】
７５．ＰＲＯ１０１４
酸素フリーラジカルと酸化防止剤は脳虚血及び再灌流後における中枢神経系に重要な役割を果たしていると思われる。更に、虚血及び再灌流に関連した心臓損傷がフリーラジカルの作用によって引き起こされることが報告されている。また、細胞のレドックス状態は細胞運命の中心的な決定要因であることが研究により報告されている。更に、反応性酸素種が、細胞毒性であり、組織壊死、臓器不全、アテローム性動脈硬化症、不妊症、出生欠損、早老、突然変異、悪性腫瘍を含む、炎症性疾患を引き起こすことが報告されている。しかして、酸化と還元の制御は、脳卒中、心臓発作、酸化ストレス、高血圧症の制御と防止を含む多くの理由から重要である。この点において、レダクターゼ、特にオキシドレダクターゼは興味深い。この主題事項を更に記述している刊行物には、Ｋｅｌｓｅｙ等， Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ， ７６（７）：８５２−８５４ （１９９７）； ＦｒｉｅｄｒｉｃｈとＷｅｉｓｓ， Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．， １８７（４）：５２９−４０ （１９９７）及びＰｉｅｕｌｌｅ等， Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １７９（１８）：５６８４−９２ （１９９７）が含まれる。
特にレダクターゼに加えて、新規なポリペプチドは一般に興味深い。細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。このような努力、特にレダクターゼに対して配列同一性を有するポリペプチド、及びこれをコードする核酸を同定するものの結果がここに提供される。
【００９５】
７６．ＰＲＯ１０１７
酵素タンパク質は食物の消化に関連する化学反応、巨大分子の生合成、化学エネルギーの徐放と利用、及び生命を維持するために必要な他のプロセスにおいて重要な役割を果たしている。スルホトランスフェラーゼは、硫酸ドナーからアクセプター基質へ硫酸塩を転移させる酵素、特に末端グルクロン酸を含むものである。ＨＮＫ−１カルボヒドラーゼエピトープは幾つかの神経接着糖タンパク及び糖脂質上に発現され、細胞相互作用に関与している。グルクロニルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼは、構造の残りが複合糖質においてしばしば生じるので、このエピトープの生合成におけるキーの酵素と考えられる。ＨＮＫ−１スルホトランスフェラーゼは更にＢａｋｋｅｒ，Ｈ．等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７２（４７）：２９９４２−２９９４６ （１９９７）に記載されている。
ＨＮＫ−１スルホトランスフェラーゼ及びそれに関連する新規なタンパク質に加えて、全ての新規なタンパク質が興味深い。細胞外及び膜結合タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、普通は膜結合レセプタータンパク質における、細胞外環境のその作用部位に到達する。
【００９６】
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。実際、血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンは、レセプター−リガンド相互作用を阻止する治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた関連するレセプター／リガンド相互作用の潜在的ペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに対して使用することもできる。そのような膜結合タンパク質と細胞レセプターには、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホフファターゼ、細胞−細胞相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子が含まれる。細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
新規な未変性の分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にＨＮＫ−１と配列同一性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。かかる努力の結果がここに提供される。
【００９７】
７７．ＰＲＯ４７４
酵素タンパク質は食物の消化に関連する化学反応、巨大分子の生合成、化学エネルギーの徐放と利用、及び生命を維持するために必要な他のプロセスにおいて重要な役割を果たしている。グルコースデヒドロゲナーゼは、グルコースのグルコン酸への酸化において機能して代謝的に有用なエネルギーを産生する。ＰＱＱ関連グルコースデヒドロゲナーゼの異なった生物における調節はＮｅｉｊｓｓｅｌ等， Ａｎｔｏｎｉｅ Ｖａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ， ５６（１）：５１−６１ （１９８９）において概説されている。グルコースデヒドロゲナーゼは、エネルギーストレスの条件下において最大に合成されるので、補助エネルギー発生機構として機能している。グルコースデヒドロゲナーゼに関連した分子に加えて、全ての新規なタンパク質が興味深い。細胞外及び膜結合タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、普通は膜結合レセプタータンパク質における、細胞外環境のその作用部位に到達する。
【００９８】
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。実際、血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンは、レセプター−リガンド相互作用を阻止する治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた関連するレセプター／リガンド相互作用の潜在的ペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに対して使用することもできる。そのような膜結合タンパク質と細胞レセプターには、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホフファターゼ、細胞−細胞相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子が含まれる。細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
新規な未変性の分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特に細胞タンパク質及びデヒドロゲナーゼ又はオキシドレダクターゼに関連するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。かかる努力の結果がここに提供される。
【００９９】
７８．ＰＲＯ１０３１
サイトカインインターロイキン１７（ＩＬ−１７）は上皮、内皮、及び線維芽細胞を刺激し、ＩＬ−６、ＩＬ−８のようなサイトカイン、及び顆粒球コロニー刺激因子、並びにプロスタグランジンＥ２を分泌することが報告されている。更に、ＩＬ−１７の存在下で培養したとき線維芽細胞が好中球へのＣＤ３４＋優先成熟の増殖を維持しうることが示されている。しかして、ＩＬ−１７はＴ細胞依存性炎症反応の初期イニシエーター及び／又は免疫系を造血へ橋渡しするサイトカインネットワークの要素を構成していることが示唆されている。Ｙａｏ等， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５５（１２）：５４８３−５４８６ （１９９５）； Ｆｏｓｓｉｅｚ等， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １８３（６）：２５９３−２６０３ （１９９６）； Ｋｅｎｎｅｄｙ等， Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓ．， １６（８）：６１１−６１７ （１９９６）を参照されたい。従って、ＩＬ−１に関連したタンパク質は興味深い。
より一般的には、全ての新規なポリペプチドが興味深い。細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。
新規な未変性の分泌タンパク質、特にＩＬ−１７に関連したものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている［例えば、Ｋｌｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ９３：７１０８−７１１３ （１９９６）；米国特許第５，５３６，６３７号を参照されたい］。かかる努力の結果がここに提供される。
【０１００】
７９．ＰＲＯ９３８
タンパクジスルフィドイソメラーゼは、正しいジスルフィド結合の形成の確立を通してタンパク質の正しいリフォールディングの促進に関与する酵素タンパク質である。タンパクジスルフィドイソメラーゼは当初は還元された変性ＲＮＡ分解酵素の再生を触媒するその能力に基づいて同定された（Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ等， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２３９：１４０６−１４１０ （１９６４）及びＥｐｓｔｅｉｎ等， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ． Ｂｉｏｌ． ２８：４３９−４４９ （１９６３））。タンパクジスルフィドイソメラーゼは、そのＣ末端に−ＫＤＥＬ又は−ＨＤＥＬアミノ酸配列を介して小胞体に保持されている小胞体の常在性酵素であることが示されている。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと関連するタンパク質は、更にＬａｂｏｉｓｓｉｅｒｅ等， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．， ２７０（４７）：２８００６−２８００９ （１９９５）； Ｊｅｅｎｅｓ等， Ｇｅｎｅ， １９３（２）：１５１−１５６ （１９９７）； Ｋｏｉｖｕｎｅｎ等， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ， ４２（３）：３９７−４０４ （１９９７）；Ｄｅｓｉｌｖａ等， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １５（１）：９−１６ （１９９６）；Ｆｒｅｅｄｍａｎ等 Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． １９：３３１−３３６ （１９９４）； Ｂｕｌｌｅｉｄ， Ｎ．Ｊ． Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｒｏｔ． Ｃｈｅｍ． ４４：１２５−５０ （１９９３）；及びＮｏｉｖａ， Ｒ．， Ｐｒｏｔ． Ｅｘｐ． ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ５：１−１３（１９９４）に記載されている。これらの研究はタンパク質ジスルフィド関連タンパク質の同定の重要性を示している。
より一般的には、全ての新規な膜結合タンパク質とレセプターの同定がまた興味深い。かかるタンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
【０１０１】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質は、関連するレセプター／リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
膜結合タンパク質の重要性が分かってからは、新規な膜結合タンパク質を同定する努力がなされている。更に、ジスルフィド結合形成酵素と多くの異なった用途、例えば組換え的に生産されたタンパク質の正しいリホールディングの収量を増大させる際におけるその潜在的な使用の重要性が分かってからは、タンパクジスルフィドイソメラーゼと配列同一性を有する新規な未変性のタンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ相同体のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。
我々はここにタンパク質ジスルフィドイソメラーゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけを記載する。
【０１０２】
８０．ＰＲＯ１０８２
低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプターは、コレステロールホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす膜結合タンパク質であり、そのリガンド、アポリポタンパク質（アポ）Ｂ−１００及びアポＥに対する高親和性結合によるリポタンパク質の細胞取り込みを媒介する。ＬＤＬレセプターのリガンド結合ドメインはおよそ４０のアミノ酸のシステインリッチの反復を７つ含み、各反復は６つのシステインを含み、これが３つの反復内ジスルフィド結合を形成する。これらの独特な構造上の特徴がＬＤＬレセプターに、アポＢ−１００及びアポＥと特異的に相互作用するその能力を付与し、これらのリポタンパク質粒子の細胞膜を越えての輸送とその成分に対する代謝が可能になる。ＬＤＬレセプターの細胞外ドメインを含む可溶性断片は、その特異的リポタンパク質リガンドと相互作用する能力を維持していることが分かっている（Ｓｉｍｍｏｎｓ等， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７２：２５５３１−２５５３６ （１９９７））。ＬＤＬレセプターはＪａｖｉｔｔ， ＦＡＳＥＢ Ｊ．， ９（１３）：１３７８−１３８１ （１９９５）及びＨｅｒｚとＷｉｌｌｎｏｗ， Ａｎｎ．Ｎｙ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．， ７３７：１４−１９ （１９９４）に更に記載されている。従って、ＬＤＬレセプターと配列同一性を有するタンパク質は興味深い。
より一般的には、全ての膜結合タンパク質とレセプターが、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。特に興味深いものはＩＩ型膜貫通ドメインを有する膜結合タンパク質である。
【０１０３】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質は、関連するレセプター／リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
従って、新規な未変性のタンパク質、特にＩＩ型膜貫通結合タンパク質を含む膜結合タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。かかる努力の結果がここに提供される。
【０１０４】
８１．ＰＲＯ１０８３
特に興味深いものは７の膜貫通（７ＴＭ）レセプタースーパーファミリーに属する膜結合タンパク質である。これらのレセプターの例にはイオンレセプターのようなＧプロテイン共役レセプターが含まれる。７ＴＭレセプタースーパーファミリーのメンバーの他の例は、Ｏｓｔｅｒｈｏｆｆ等， ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， １６（４）：３７９−３８９ （１９９７）に記載されている。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質は、関連するレセプター／リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
新規な未変性のレセプタータンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。かかる努力の結果がここに提供される。
【０１０５】
８２．ＰＲＯ２００
細胞の生存、増殖及び／又は分化に関与するポリペプチドは興味深い。細胞の生存、増殖及び／又は分化に関与していることが知られているポリペプチドには、ＶＥＧＦ及び骨形成タンパク質ファミリーのメンバーが含まれる。従って、ＶＥＧＦ又は骨形成タンパク質ファミリーの何れかに関連している新規なポリペプチドが興味深い。
ヘパリン結合内皮細胞成長因子、ＶＥＧＦは、数年以上前にウシ下垂体濾胞性又は濾胞星状細胞により馴化された培地から同定され精製された。Ｆｅｒｒａｒａ等， Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ． １６１，８５１ （１９８９）を参照されたい。ＶＥＧＦは、顆粒細胞の形態学的によく特徴づけされた集団である濾胞性又は濾胞星状細胞（ＦＣ）において生産される天然に生じる化合物である。ＦＣは分泌細胞間に細胞質突起を送る星状細胞である。
ＶＥＧＦは、選択的ＲＮＡスプライシングから生じる多重ホモ二量体型（モノマー当たり１２１、１６５、１８９及び２０６のアミノ酸）として様々な組織において発現される。ＶＥＧＦ１２１はヘパリンに結合しない可溶性分裂促進因子である；ＶＥＧＦの長い型は連続的により高い親和性をもってヘパリンに結合する。ＶＥＧＦのヘパリン結合型は、プラスミンによりカルボキシ末端で切断でき、ＶＥＧＦの拡散性型を放出する。プラスミン切断後に同定されたカルボキシ末端ペプチドのアミノ酸配列はＡｒｇ１１０−Ａｌａ１１１である。アミノ末端「コア」タンパク質である、ホモ二量体として単離されるＶＥＧＦ（１−１１０）は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ（ＦＬＴ−１）、キナーゼドメイン領域（ＫＤＲ）及び胎児肝臓キナーゼ（ＦＬＫ）レセプターの可溶型及び中和モノクローナル抗体（４．６．１及び２Ｅ３）に無傷のＶＥＧＦ１６５ホモ二量体と比較して類似した親和性で結合する。
【０１０６】
説明されるように、ＶＥＧＦは、それぞれＫＤＲとＦＬＴ−１レセプターへの結合の原因である二つのドメインを含む。これらのレセプターは内皮（血管）細胞上にのみ存在する。外傷等のために細胞に酸素が欠乏すると、ＶＥＧＦ生産がそのような細胞において増加し、ついで細胞が、最終的には生物学的効果をシグナルするために各レセプターに結合する。その後シグナルが血管透過性を増大させ、細胞が分割され拡大されて新しい血管経路を形成する−血管形成と新血管形成。
しかして、ＶＥＧＦは、過剰な組織成長のない状態で血管内皮細胞への選択性作用が重要である状態、例えば糖尿病性潰瘍及び皮下創傷のような損傷から生じる血管損傷を治療するのに対して有用である。血管（動脈及び静脈）内皮細胞成長因子であるので、ＶＥＧＦは損傷を受けた細胞を修復し（血管形成と呼ばれるプロセス）、新しい血管の形成を刺激する（新血管形成と呼ばれるプロセス）。
ＶＥＧＦにはまた心筋梗塞後の脈管構造の修復の用途、並びに演繹される他の用途が見出される。この点について、特にガン細胞における新血管形成と血管形成のようなプロセスを和らげるためにＶＥＧＦのインヒビターが時々望ましい。
【０１０７】
骨形成タンパク質ファミリーに関しては、このファミリーのメンバーが軟骨の分化及び血管新生と予備成形ヒドロキシアパタイトにおける骨誘導の促進に関与していると報告されている。Ｚｏｕ等， Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． （Ｕ．Ｓ．）， １１（１７）：２１９１ （１９９７）； Ｌｅｖｉｎｅ等， Ａｎｎ．Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．， ３９（２）：１５８ （１９９７）。多くの関連した骨形成タンパク質が同定されており、全てが骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリーのメンバーである。骨形成未変性及び変異体タンパク質、それをコードする核酸、レセプターを含む関連化合物、宿主細胞及び用途が、少なくとも米国特許第５，６７０，３３８号、同第５，４５４，４１９号、同第５，６６１，００７号、同第５，６３７，４８０号、同第５，６３１，１４２号、同第５，１６６，０５８号、同第５，６２０，８６７号、同第５，５４３，３９４号、同第４，８７７，８６４号、同第５，０１３，６４９号、同第５５，１０６，７４８号及び同第５，３９９，６７７号に更に記載されている。特に興味深いものは、基質沈着の調節において重要な役割を果たすプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼである骨形成タンパク質１と相同性を有するタンパク質である。
本発明は、ＶＥＧＦ及びＢＭＰファミリーに関連する新規なポリペプチド、特に細胞の生存、増殖及び／又は分化にある役割を果たすポリペプチドを同定することを意図した研究に基づいて断定されたものである。新規なポリペプチドはそれらが相同性を有する既知のポリペプチドと同じ生物活性を有することは期待されていないが、既知のポリペプチドの生物活性を、新規のポリペプチドの相対的生物活性を決定するために使用することができる。特に、ここに記載する新規なポリペプチドは、細胞の生存、増殖又は分化を誘導するポリペプチドの能力を決定することを意図したアッセイに使用することができる。順に、これらのアッセイの結果は従って診断及び治療目的に使用することができる。このような研究の結果が本発明の主題である。
【０１０８】
８３．ＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６
胚性背側−腹側パターンの確立において中心的な役割を果たしている母性効果遺伝子であるショウジョウバエのＴｏｌｌ遺伝子のクローニングは、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ等， Ｃｅｌｌ ５２， ２６９−２７９ （１９８８）によって報告されている。ショウジョウバエＴｏｌｌ遺伝子は、８０３アミノ酸の細胞質外ドメインと２６９アミノ酸の細胞質ドメインを持つ複合膜タンパク質をコードする。細胞質外ドメインは潜在的な膜貫通セグメントを有し、多くの膜貫通タンパク質に見出される構造モチーフであるロイシンリッチセグメントの多重コピーを含む。Ｔｏｌｌタンパク質はショウジョウバエの胚において背側−腹側パターンを調節し、そのリガンドＳｐａｔｚｌｅへの結合の際に転写因子Ｄｏｒｓａｌを活性化する（ＭｏｒｉｓａｔｏとＡｎｄｅｒｓｏｎ， Ｃｅｌｌ ７６，６７７−６８８ （１９９４））。成体ショウジョウバエにおいては、Ｔｏｌｌ／Ｄｏｒｓａｌシグナル伝達経路は抗真菌免疫応答に関与する（Ｌｅｎａｉｔｒｅ等， Ｃｅｌｌ ８６，９７３−９８３ （１９９６））。
ショウジョウバエＴｏｌｌタンパク質のヒト相同体は、Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ等， Ｎａｔｕｒｅ ３８８，３９４−３９７ （１９９７）により記載されている。このヒトＴｏｌｌは、丁度ショウジョウバエＴｏｌｌのように、非ＬＲＲ領域による分離された２１の直列型反復ロイシンリッチモチーフ（ロイシンリッチ領域−ＬＲＲ）からなる細胞外ドメインと、ヒトインターロイキン−１（ＩＬ−１）レセプターの細胞質ドメインに相同な細胞質ドメインとを持つＩ型膜貫通タンパク質である。ヒト株化細胞内に形質移入されたヒトＴｏｌｌの構成的に活性な変異体は、ＮＦ−κＢの活性化及び炎症性サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−６及びＩＬ−８に対するＮＦ−κＢ調節性遺伝子の発現、並びに未変性Ｔ細胞の活性化に必要とされる、同時刺激性分子Ｂ７．１の発現を誘導しうることが示された。Ｔｏｌｌは脊椎動物において免疫系の非クローンレセプターとして機能し、これが脊椎動物における生得的及び順応免疫応答の双方を活性化するためのシグナルを誘導することができることが示唆されている。上掲のＭｅｄｚｈｉｔｏｖ等により報告されたヒトＴｏｌｌ遺伝子は脾臓及び末梢血白血球（ＰＢＬ）に最も強く発現されており、著者は、他の組織におけるその発現はマクロファージ及び樹枝状細胞の存在により、そこでは感染に対する初期警告系として作用しうることを示唆している。公のジェンバンクデータベースは次のＴｏｌｌ配列：ランダム配列全長ｃＤＮＡ ＃ＨＵＭＲＳＣ７８６−１と同一であるＴｏｌｌ１（ＤＮＡＸ＃ ＨＳＵ８８５４０−１）；Ｔｏｌｌ２（ＤＮＡＸ＃ ＨＳＵ８８８７８−１）；Ｔｏｌｌ３（ＤＮＡＸ＃ ＨＳＵ８８８７９−１）；及びＴｏｌｌ４（上掲のＭｅｄｚｈｉｔｏｖ等により報告されたＤＮＡ配列と同一であるＤＮＡＸ＃ ＨＳＵ８８８８０−１）を含んでいる。部分Ｔｏｌｌ配列（Ｔｏｌｌ５）はＤＮＡＸ＃ ＨＳＵ８８８８１−１としてジェンバンクから入手できる。
更に、Ｔｏｌｌ様レセプター（ｈｕＴＬＲｓ１−５）と命名されたショウジョウバエＴｏｌｌタンパク質のヒト相同体が最近クローニングされ、ショウジョウバエの対応物の組織分布構造を写していることが示された（Ｒｏｃｋ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５，５８８−５９３ ［１９９８］）。あるヒトＴＬＲの構成的に活性な変異体（Ｔｏｌｌタンパク質相同体−Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ等，上掲；ＴＬＲ４−Ｒｏｃｋ等，上掲）の過剰発現はＮＦ−κＢの活性化及び炎症性サイトカイン及び同時刺激性分子の誘導に至る。Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ等，上掲。
【０１０９】
８４．ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及びＰＲＯ１４４９
癌は、増殖して腫瘍集団を形成する、正常な組織から誘導された異常な、あるいは新生物の細胞の数の増加、これらの新生物腫瘍細胞による隣接組織の浸襲、及び血液又はリンパ系を介して局所リンパ節まで及び遠い部位まで（転移）最終的に広がる悪性細胞の産生により特徴づけられる。癌の状態では細胞は正常な細胞が成長しない条件下で増殖する。癌は広範な形で現れ、異なった度合いの浸襲性及び病原力により特徴づけられる。
遺伝子発現の変化は全ての癌の共通の特徴である制御されていない細胞増殖及び脱分化に密接に関連している。ある種のよく研究されている腫瘍のゲノムは、悪性腫瘍細胞増殖を通常は防止するように機能する、癌抑制遺伝子と通常呼ばれる劣性遺伝子の発現の減少、及び／又は悪性腫瘍の増殖を促進するように作用する発癌遺伝子のようなある種の優性遺伝子の過剰発現を示すことが見出されている。これらの遺伝子変化の各々は、凝集して完全な新生物表現型を表す幾つかの形質を移入する原因であると思われる（Ｈｕｎｔｅｒ， Ｃｅｌｌ　６４，１１２９ ［１９９１］； Ｂｉｓｈｏｐ， Ｃｅｌｌ， ２３５−２４８ ［１９９１］）。
癌細胞における遺伝子（例えば発ガン遺伝子）過剰発現のよく知られた機構は遺伝子増幅である。これは、特定の遺伝子の先祖細胞多重コピーの染色体がつくられるプロセスである。該プロセスは、染色体中に戻される複製セグメントの組換えが続く、遺伝子を構成する染色体領域の予定外の複製を含む（Ａｌｉｔａｌｏ等， Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４７，２３５−２８１ ［１９８６］）。遺伝子の過剰発現は遺伝子増幅と平行する、すなわち作製されたコピーの数に比例する。
【０１１０】
成長因子及び成長因子レセプターをコードするプロトオンコジーンは、乳ガンを含む様々なヒトの悪性腫瘍の病因に重要な役割を果たしていることが確認されている。例えば、上皮成長因子レセプター（ＥＧＦＲ）に関連した１８５ｋｄの膜貫通糖タンパク質レセプター（ｐ１８５ＨＥＲ２；ＨＥＲ２）をコードするヒトＥｒｂＢ２遺伝子（ｈｅｒ２としても知られるｅｒｂＢ２、又はｃ−ｅｒｂＢ−２）が、ヒトの乳ガンの約２５％〜３０％において過剰発現することが見出されている（Ｓｌａｍｏｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：１７７−１８２ ［１９８７］； Ｓｌａｍｏｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：７０７−７１２ ［１９８９］）。
プロトオンコジーンの遺伝子増幅は典型的には癌の更に悪性の形態に関与する事象であり、臨床結果のプレディクターとして作用しうることが報告されている（Ｓｃｈｗａｂ等， Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ １， １８１−１９３ ［１９９０］； Ａｌｉｔａｌｏ等， 上掲）。従って、ｅｒｂＢ２過剰発現は、特に腋窩リンパ節を関与させる原疾患を持つ患者において、不十分な予後のプレディクターと一般に見なされており（Ｓｌａｍｏｎ等，［１９８７］及び［１９８９］，上掲；Ｒａｖｄｉｎ及びＣｈａｍｎｅｓｓ， Ｇｅｎｅ １５９：１９−２７［１９９５］；及びＨｙｎｅｓ及びＳｔｅｒｎ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １１９８：１６５−１８４ ［１９９４］）、ＣＭＦ（シクロホスファミド、メトトレキサート、及びフルオロウラシル）及びアントラサイクリンを含む化学療法及びホルモン療法に対する感応性及び／又は耐性に関連している（Ｂａｓｅｌｇａ ， Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １１ （３ Ｓｕｐｐｌ １）： ４３−４８ ［１９９７］）。しかし、ｅｒｂＢ２過剰発現が不十分な予後に関連しているにも拘わらず、タキサンでの治療に臨床的に応答するＨＥＲ２陽性患者の可能性はＨＥＲ２陰性患者のものの３倍を越えていた（上掲）。組換えヒト化抗ＥｒｂＢ２（抗ＨＥＲ２）モノクローナル抗体（ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２又はハーセプチン７δと称される、マウス抗ＥｒｂＢ２抗体４Ｄ５のヒト化バージョン）は、それまでに広範な抗ガン治療を受けたＥｒｂＢ２を過剰発現する転移性乳ガンの患者において臨床的に活性であった（Ｂａｓｅｌｇａ等， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ． １４：７３７−７４４ ［１９９６］）。
タンパク質ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）とその相同体は、様々な発達プロセスにおいて細胞運命を決定する際に重要な調節レセプターである。タンパク質ノッチ−４は、ｉｎｔ−３発癌遺伝子としても知られ、マウスの乳腺腫瘍ウィルス（ＭＭＶＳ）中において頻繁な標的として元々は同定された。ノッチ−４は幹細胞の分化能に影響し上皮細胞における新生物増殖に導く導入遺伝子であると信じられている。Ｓｈｉｒａｙｏｓｈｉ等， Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ ２（３）：２１３−２２４ （１９９７）。胚形成の間、ノッチ−４の発現は、のような背側大動脈、セグメント間血管、卵黄嚢血管、頭部血管、心臓、鰓弓の血管、及び神経叢毛細血管のような組織を形成する血管の上皮細胞に検出された。これらの組織におけるノッチ−４発現はまた、血管形成と新血管形成の主要な調節遺伝子であるｆｌｋ−１に付随していた。ノッチ−４は内皮幹細胞の分化中にインビトロでアップレギュレートされる。ノッチ−４の内皮細胞特異的発現パターン、並びにノッチに対するその構造類似性は、ノッチ−４がノッチの内皮細胞特異的相同体であり、血管形成と新血管形成においてある役割を果たしていることを示唆している。
【０１１１】
８５．ＰＲＯ２９８
新規な未変性のレセプタータンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでＰＲＯ２９８ポリペプチドと命名した、新規な膜貫通ポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【０１１２】
８６．ＰＲＯ３３７
高等脊椎動物におけるニューロンの発達は、途中の別個の細胞環境を成功裡にそのシナプス標的まで航路決定しなければならないプロセスにより特徴づけられる。結果は神経回路の機能的に正確な形成である。精度は、成長円錐経路の発見と標的認識を調節し、後者の洗練とニューロン活性を必要とする現象によるそのような突出の再構築が続く機構から得られるものと信じられている。Ｇｏｏｄｍａｎ及びＳｈａｔｚ， Ｃｅｌｌ／Ｎｅｕｒｏｎ ［Ｓｕｐｐｌ．］ ７２（１０）：７７−９８ （１９９３）。更に、異なったニューロンが生化学的に区別される神経線維を伸長し、細胞−細胞、細胞−マトリックス、及び走化性相互作用によって提供される特異的案内キューに依存して、その適切なシナプス標的に到達することが明らかである。Ｇｏｏｄｍａｎ等、上掲。
ニューロン細胞表面の多様性がつくり出される一つの特定の手段は、細胞接着分子（ＣＡＭｓ）と称される細胞表面タンパク質の差次的な発現を通してである。ニューロン的に発現されたＣＡＭｓは、放射状グリア細胞に沿ったニューロンの遊走を含む、広範な発達プロセスに関与し、神経突起伸長に対して許容できる又は反発性の基質を提供し、また突出経路における軸索の選択的束状化を促進することに関与している。Ｊｅｓｓｅｌ， Ｎｅｕｒｏｎ １：３−１３ （１９９８）； Ｅｄｅｌｍａｎ及びＣｒｏｓｓｉｎ， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６０：１５５−１９０ （１９９１）。成長円錐膜上に存在するＣＡＭｓと対向する細胞膜上又は細胞外マトリックス中の分子との間の相互作用は、適切な突出経路に沿って神経線維の成長を方向付ける特異的案内キューを提供すると考えられている。そのような相互作用の結果、神経突起成長を調節する成長円錐内において様々な第２のメッセンジャー系の活性化が生じると思われる。Ｄｏｈｅｒｔｙ及びＷａｌｓｈ， Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ． ２：５９５−６０１ （１９９２）。
高等脊椎動物において、大抵の神経ＣＡＭｓはタンパク質の３つの主要な構造ファミリー：インテグリン、カドヘリン、及び免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー（ＩｇＳＦ）のメンバーであることが見出されている。Ｊｅｓｓｅｌ，上掲；Ｔａｋｅｉｃｈｉ， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ． ５９：２３７−２５２ （１９９０）； Ｒｅｉｃｈａｒｄｔ及びＴｏｍａｓｅｌｌｉ， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １４：５３１−５７０ （１９９１）。ＩｇＳＦ（又はＩｇ−ＣＡＭｓ）の細胞接着分子は特に、発達の間の神経細胞相互作用及び神経線維成長にしばしば関与しているタンパク質の大きなファミリーを構成している。Ｓａｌｚｅｒ及びＣｏｌｍａｎ， Ｄｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １１：３７７−３９０ （１９８９）； Ｂｒｕｅｍｍｅｎｄｏｒｆ及びＲａｔｈｊｅｎ， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ． ６１：１２０７−１２１９ （１９９３）。しかし、哺乳類Ｉｇ−ＣＡＭｓの大半はあまりに広範に発現されているので航路決定又はシナプス標的を特定できないように思われ、まだ同定されていない他のＣＡＭｓがニューロンのこれらの更に選択的な相互作用において役割を果たしていることが示唆される。
【０１１３】
既知の神経Ｉｇ−ＣＡＭｓの多くはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを介して原形質膜に結合していることが見出されている。また、多くの研究によれば、ＧＰＩアンカータンパク質が特異的経路におけるニューロンの成長の間、特異的案内キューの提供に関与している。バッタの神経系の研究では、細胞の表面からＧＰＩ−アンカータンパク質を選択的に除去するホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼＣ（ＰＩＰＬＣ）での胎仔の治療の結果、開拓している成長円錐のサブセットの間での誤案内及び偽りの航路決定、並びに初期ニューロンのサブセットの阻害遊走パターンが生じる。Ｃｈａｎｇ等， Ｄｅｖｅｌ． １１４：５０７−５１９ （１９９２）。網膜線維の視蓋への突出は、部分的に３３ｋＤａのＧＰＩアンカータンパク質に依存しているように思われるが、このタンパク質の正確な性質は未知である。Ｓｔａｈｌ等， Ｎｅｕｒｏｎ ５：７３５−７４３ （１９９０）。
様々なＧＰＩアンカータンパク質の発現は、後根神経節の一次ラットニューロン、頸部神経節の交感ニューロン、上頸神経節の交感ニューロン、及び小脳顆粒ニューロンの異なった集団のなかで特徴づけられている。Ｒｏｓｅｎ等， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １１７：６１７−６２７ （１９９２）。これらの異なったタイプのニューロンによる全膜タンパク質の発現の類似パターンとは対照に、顕著な差異がこれらのニューロン間でＧＰＩアンカータンパク質の発現において観察された。最近、ニューロトリミン（ｎｅｕｒｏｔｒｉｍｉｎ）として知られている６５ｋＤａのタンパク質バンドが発見され、一次ニューロンにより差次的に発現され（Ｒｏｓｅｎ等，上掲）、神経系に制限され、ＣＮＳにおいて最も豊富で最も初期に発現されたＧＰＩアンカー種であることが分かった。Ｓｔｒｕｙｋ等， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １５（３）：２１４１−２１５６ （１９９５）。ニューロトリミンの発見は更に、現在ＩｇＬＯＮと名付けられ、それぞれが有意なアミノ酸同一性を分かち持つＩｇ様ドメインを含んでいるＩｇＳＦメンバーのファミリーの同定に至った。Ｓｔｒｕｙｋ等，上掲；Ｐｉｍｅｎｔａ等，Ｇｅｎｅ １７０（２）：１８９−９５ （１９９６）。
ＩｇＬＯＮサブファミリーの更なるメンバーは、オピエート結合細胞接着分子（ＯＢＣＡＭ）、Ｓｃｈｏｆｉｅｌｄ等， ＥＭＢＯ Ｊ． ８：４８９−４９５ （１９８９）；辺縁随伴膜タンパク質（ＬＡＭＰ）、Ｐｉｍｅｎｔａ等，上掲；ＣＥＰＵ−１；ＧＰ５５、Ｗｉｌｓｏｎ等， Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ． １０９：３１２９−３１３８ （１９９６）； Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． ９（２）：３３４−４１ （１９９７）；及びＡｖＧｐ５０、Ｈａｎｃｏｘ等，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ４４（２）：２７３−８５ （１９９７）を含む。
【０１１４】
ニューロトリミンの発現は広範であると思われる一方、幾つかの神経回路の発達に相関していると思われる。例えば、Ｅ１８とＰ１０の間で、前脳内でのニューロチミンｍＲＮＡの発現が、発達中の視床、皮質サブプレート、及び皮質のニューロン、特にラミナＶ及びＶＩ（ＩＩ、ＩＩ及びＩＶでのあまり強くない発現とラミナＩでの最小の発現を伴って）において高レベルに維持される。皮質サブプレートニューロンは、皮質内のその最終のシナプス標的までの途中の内に伸びる視床求心性神経に対する初期の一時的な足場を提供する。Ａｌｌｅｎｄｏｅｒｆｅｒ及びＳｈａｔｚ， Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １７：１８５−２１８ （１９９４）。逆に、サブプレートニューロンは、層Ｖからの皮質ニューロンがＶＩを選択して視床内に成長し、層Ｖからのニューロンが小丘、脳橋、及び脊髄においてその標的を選択するのに必要とされることが示唆されている（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ等， Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ． １４：１８９２−１９０７ （１９９４））。これらの突出の多くにおけるニューロトリミンの高レベルの発現はそれがその発達に関与していることを示唆している。
後脳において、ニューロトリミンメッセージ発現の高レベルは、脳橋核内中に、及び小脳のプルキニエ細胞及び内部顆粒細胞によって観察された。脳橋核はＶ層の皮質脳橋線維を含む様々なソースから求心性線維の入力を受け取り、顆粒細胞への苔状線維を介しての求心性線維の入力の主要ソースであり、該顆粒細胞は次にプルキニエ細胞への平行線維を介しての求心性線維の入力の主たるソースである。［Ｐａｌａｙ及びＣｈａｎ−Ｐａｌａｙ， Ｔｈｅ ｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ｃｏｒｔｅｘ： ｃｙｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｓｐｒｉｎｇｅｒ （１９７４）］。これらニューロトリミンニューロンの高レベルの発現はこれらの回路の確率における強力な関与を示唆している。
ニューロトリミンはまた初期の出生後線条体において段階的な発現パターンを示す。ニューロトリミンの発現の増加はラットの背外側線条体上に横たわって見出される一方、より低いハイブリダイゼーション強さが腹側正中線条体上に横たわって見られる。Ｓｔｒｕｙｋ等，上掲。より高いニューロトリミンハイブリダイゼーション強さのこの領域は細胞構造的に区別しうる領域に対応せず、むしろ、対側性感覚運動皮質のＶＩ層からの求心性入力の一次領域に対応する（Ｇｅｒｆｅｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３１１：４６１−４６４ （１９８４）； Ｄｏｎｏｇｈｕｅ及びＨｅｒｋｅｎｈａｍ， Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ． ３６５：３９７−４０３ （１９８６））。対照的に、腹側正中線条体は鼻周囲及び連合野からその大部分の求心性入力を受け取る。ＬＡＭＰ発現の相補的段階的パターンは線条体において、腹側正中領域において最も高い発現と背外側的に最も低い発現を伴って観察されている。Ｌｅｖｉｔｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２３：２９９−３０１ （１９８５）； Ｃｈｅｓｓｅｌｅｔ等， Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ４０：７２５−７３３ （１９９１）。
【０１１５】
８７．ＰＲＯ４０３
シングルパス膜貫通タンパク質としても知られているＩＩ型膜貫通タンパク質は細胞質に留まるＮ末端部分を有する一方、Ｃ末端部分は細胞外ドメインに暴露されている。
エンドセリンは、イソペプチド及びその遺伝子（エンドセリン−１、−２及び−３）の存在と構造、遺伝子発現の調節、細胞内プロセシング、特異的エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）、レセプターサブタイプ（ＥＴ−Ａ及びＥＴ−Ｂ）、レセプター活性化に続く細胞内シグナル伝達等々を含む、その薬理学的、生化学的及び分子生物学的特徴を更に良好に理解するために多くの活動が注がれている血管収縮薬ペプチドのファミリーである。
ペプチドのエンドセリン（ＥＴ）ファミリーは、多くのヒトの疾患状態において病態生理学的な重要性を有する有力な血管、心臓及び腎臓作用を有している。ＥＴ−１は不活性な２１２アミノ酸プレプロペプチドとして発現される。プレプロペプチドは最初はＡｒｇ５２−Ｃｙｓ５３及びＡｒｇ９２−Ａｌａ９３で切断され、ついでカルボキシ末端Ｌｙｓ９１及びＡｒｇ９２はタンパク質から切り取ってプロペプチドビッグＥＴ−１を産生する。
エンドセリンは、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）である亜鉛メタロプロテアーゼにより触媒される独特のプロセシング事象により不活性な中間体であるビッグエンドセリンから生産される。ＥＣＥは最近クローニングされ、その構造は触媒ドメインと数多くのＮ−グリコシル化部位を含む長い細胞外Ｃ末端と短い細胞内Ｎ末端を持つシングルパス膜貫通タンパク質であることが分かった。ＥＣＥｓはＴｒｐ７３とＶａｌ７４の間でエンドセリンプロペプチドを切断して活性なペプチドＥＴを生産し、これが循環ホルモンよりもむしろ局所ホルモンとして機能するように思われる（Ｒｕｂａｎｙｉ，Ｇ．Ｍ．及びＰｏｌｏｋｏｆｆ，Ｍ．Ａ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ４６：３２５−４１５ （１９９４））。従って、ＥＣＥ活性はエンドセリン生産の調節の有力な部位であり、エンドセリン系における治療的介入に対する可能な標的である。ＥＣＥ活性を遮断することにより、相対的に不活性な前駆体ビッグＥＴ−１の生理学的に活性な形態への転換を阻害して、ＥＴ−１の生産を停止することができる。
エンドセリンは、１）循環器病（血管痙攣、高血圧、心筋虚血症；再灌流損傷及び急性心筋梗塞、脳卒中（脳虚血）、鬱血性心不全、ショック、アテローム性動脈硬化症、血管肥厚）；２）腎疾患（急性及び慢性腎不全、糸球体腎炎、肝硬変）；３）肺疾患（気管支喘息、肺性高血圧）；４）胃腸障害（胃潰瘍、炎症性腸疾患）；５）生殖疾患（早発分娩、月経困難症、子癇前症）及び６）発癌を含む多くの疾患状態の病態生理学における役割を担っている。Ｒｕｂａｎｙｉ ＆ Ｐｏｌｏｋｏｆｆ，上掲。
【０１１６】
（発明の概要）
１．ＰＲＯ２１３
出願人は、本出願において「ＰＲＯ２１３」と命名した新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ２１３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２（配列番号：２）のアミノ酸残基１〜２９５を持つＰＲＯ２１３をコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ２１３ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ２１３ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２（配列番号：２）の残基１〜２９５を含んでなるアミノ酸を含む。
【０１１７】
２．ＰＲＯ２７４
出願人は、本出願において「ＰＲＯ２７４」と命名した新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ２７４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ４（配列番号：７）のアミノ酸残基１〜４９２を持つＰＲＯ２７４をコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ２７４をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７８６として１９９８年４月２１日に寄託されたＤＮＡ３９９８７−１１８４ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ２７４ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ２７４ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ４（配列番号：７）の残基１〜４９２を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様はＰＲＯ２７４ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関している。場合によっては、ＰＲＯ２７４ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７８６として１９９８年４月２１日に寄託されたＤＮＡ３９９８７−１１８４ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、配列番号：８（ここでＤＮＡ１７８７３と命名）、配列番号：９（ここでＤＮＡ３６１５７と命名）及び配列番号：１０（ここでＤＮＡ２８９２９と命名）（それぞれＦｉｇ５−７を参照されたい）のヌクレオチド配列を含んでなる３種の発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０１１８】
３．ＰＲＯ３００
出願人は、本出願において「ＰＲＯ３００」と命名した新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ３００ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ９（配列番号：１９）のアミノ酸残基１〜４５７を持つＰＲＯ３００をコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ３００をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７８８として１９９８年４月２１日に寄託されたＤＮＡ４０６２５−１１８９ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ３００ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ３００ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ９（配列番号１９）の残基１〜４５７を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様はＰＲＯ３００ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関している。場合によっては、ＰＲＯ３００ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７８８として１９９８年４月２１日に寄託されたＤＮＡ４０６２５−１１８９ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１１９】
４．ＰＲＯ２８４
出願人は、本出願において「ＰＲＯ２８４」と命名した新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ２８４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１１（配列番号：２８）のアミノ酸残基１〜２８５を持つＰＲＯ２８４をコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１１（配列番号：２８）のアミノ酸残基約２５〜２８５又はＦｉｇ１１（配列番号：２８）の１からもしくは約２５からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ１１（配列番号：２８）の７１〜８０の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ２８４をコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ２８４をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７８７として１９９８年４月２１日に寄託されたＤＮＡ２３３１８−１２１１ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ２８４ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ２８４ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１１（配列番号：２８）の残基１〜２８５を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ１１（配列番号：２８）のアミノ酸約２５〜２８５又はＦｉｇ１１（配列番号：２８）の１からもしくは約２５からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ１１（配列番号：２８）の７１〜８０の任意のアミノ酸である）を含んでなる単離されたＰＲＯ２８４ポリペプチドに関している。場合によっては、ＰＲＯ２８４ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７８７として１９９８年４月２１日に寄託されたＤＮＡ２３３１８−１２１１ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、配列番号２９のヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ１２９８２とここで命名した発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、配列番号３０のヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ１５８８６とここで命名した発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０１２０】
５．　ＰＲＯ２９６
出願人は、本出願において「ＰＲＯ２９６」と命名した、肉腫増幅タンパク質ＳＡＳと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ２９６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１５（配列番号：３６）のアミノ酸残基１〜２０４を持つＰＲＯ２９６をコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１５（配列番号：３６）のアミノ酸残基約３５〜２０４又はＦｉｇ１５（配列番号：３６）のアミノ酸１からもしくは約３５からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ１５（配列番号：３６）の４２〜５１の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ２９６をコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ２９６をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７８９として１９９８年４月２１日に寄託されたＤＮＡ３９９７９−１２１３ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ２９６ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ２９６ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１５（配列番号：３６）の残基１〜２０４を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ１５（配列番号：３６）のアミノ酸約３５〜２０４又はＦｉｇ１５（配列番号：３６）の１からもしくは約３５からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ１５（配列番号：３６）の４２〜５１の任意のアミノ酸である）を含んでなる単離されたＰＲＯ２９６ポリペプチドに関している。場合によっては、ＰＲＯ２９６ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７８９として１９９８年４月２１日に寄託されたＤＮＡ３９９７９−１２１３ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、配列番号：３７のヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ２３０２０とここで命名した発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、配列番号：３８のヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ２１９７１とここで命名した発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、配列番号：３９のヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ２９０３７とここで命名した発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０１２１】
６．　ＰＲＯ３２９
出願人は、本出願において「ＰＲＯ３２９」と命名した、高親和性免疫グロブリンＦｃレセプターと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ３２９ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２０（配列番号：４５）のアミノ酸残基１〜３５９を持つＰＲＯ３２９をコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ３２９をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９６１７として１９９８年２月５日に寄託されたＤＮＡ４０５９４−１２３３ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ３２９ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ３２９ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２０（配列番号：４５）の残基１〜３５９を含んでなるアミノ酸を含む。場合によっては、ＰＲＯ３２９ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９６１７として１９９８年２月５日に寄託されたＤＮＡ４０５９４−１２３３ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１２２】
７．ＰＲＯ３６２
出願人は、本出願において「ＰＲＯ３６２」と命名した、Ａ３３抗原及びＨＣＡＲ膜結合タンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ３６２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２２（配列番号：５２）のアミノ酸残基１〜３２１を持つＰＲＯ３６２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、図２２（配列番号５２）のアミノ酸残基１〜Ｘ（ここで、Ｘはアミノ酸２７１〜２８０の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ３６２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ３６２をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９６２０として１９９８年２月５日に寄託されたＤＮＡ４５４１６−１２５１ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ３６２ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ３６２ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２２（配列番号：５２）の残基１〜３２１を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ２２（配列番号：５２）に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜Ｘ（ここで、Ｘはアミノ酸２７１〜２８０の任意のアミノ酸である）を含んでなる単離されたＰＲＯ３６２ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関している。場合によっては、ＰＲＯ３６２ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９６２０として１９９８年２月５日に寄託されたＤＮＡ４５４１６−１２５１ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１２３】
８．ＰＲＯ３６３
出願人は、本出願において「ＰＲＯ３６３」と命名した、細胞表面レセプタータンパク質ＨＣＡＲと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ３６３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２４（配列番号：５９）のアミノ酸残基１〜３７３を持つＰＲＯ３６３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、図２４（配列番号５９）のアミノ酸残基１〜Ｘ（ここで、Ｘはアミノ酸２１６〜アミノ酸２２５の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ３６３細胞外ドメインポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ３６３をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９６１６として１９９８年２月５日に寄託されたＤＮＡ４５４１９−１２５２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ３６３ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ３６３ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２４（配列番号：５９）の残基１〜３７３を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、ＰＲＯ３６３ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関しており、該細胞外ドメインは、２４（配列番号５９）に示される配列のアミノ酸１〜Ｘ（ここで、Ｘはアミノ酸２１６〜２２５の任意のアミノ酸である）を含みうる。場合によっては、ＰＲＯ３６３ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９６１６として１９９８年２月５日に寄託されたＤＮＡ４５４１９−１２５２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１２４】
９．ＰＲＯ８６８
出願人は、本出願において「ＰＲＯ８６８」と命名した、腫瘍壊死因子レセプターと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ８６８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２６（配列番号：６４）のアミノ酸残基１〜６５５を持つＰＲＯ８６８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２６（配列番号：６４）のアミノ酸残基１〜Ｘ（ここで、ＸはＦｉｇ２６（配列番号：６４）に示された配列のアミノ酸３４３〜３５２の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ８６８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。更に他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２６（配列番号：６４）のアミノ酸残基Ｘ〜６５５（ここで、ＸはＦｉｇ２６（配列番号：６４）に示された配列のアミノ酸３７１〜３８０の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ８６８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ８６８をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９６７９として１９９８年３月１７日に寄託されたＤＮＡ５２５９４−１２７０ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ８６８ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ８６８ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２６（配列番号：６４）の残基１〜６５５を含んでなるアミノ酸を含む。他の側面では、単離されたＰＲＯ８６８ポリペプチドは、Ｆｉｇ２６（配列番号：６４）のアミノ酸残基１〜Ｘ（ここで、ＸはＦｉｇ２６（配列番号：６４）に示された配列のアミノ酸３４３〜３５２の任意のアミノ酸である）を含みうる。更に他の側面では、ＰＲＯ８６８ポリペプチドは、Ｆｉｇ２６（配列番号：６４）のアミノ酸残基Ｘ〜６５５（ここで、ＸはＦｉｇ２６（配列番号：６４）に示された配列のアミノ酸３７１〜３８０の任意のアミノ酸である）を含みうる。場合によっては、ＰＲＯ８６８ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９６７９として１９９８年３月１７日に寄託されたＤＮＡ５２５９４−１２７０ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１２５】
１０．ＰＲＯ３８２
出願人は、本出願において「ＰＲＯ３８２」と命名した、セリンプロテアーゼと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ３８２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２８（配列番号：６９）のアミノ酸残基１〜４５３を持つＰＲＯ３８２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ３８２をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９６５４として１９９８年３月５日に寄託されたＤＮＡ４５２３４−１２７７ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ３８２ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ３８２ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２８（配列番号：６９）の残基１〜４５３を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、シグナルペプチドを持つか持たない、ＰＲＯ３８２ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関している。場合によっては、ＰＲＯ３８２ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９６５４として１９９８年３月５日に寄託されたＤＮＡ４５２３４−１２７７ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１２６】
１１．ＰＲＯ５４５
出願人は、本出願において「ＰＲＯ５４５」と命名した、メルトリンと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ５４５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ３０（配列番号：７４）のアミノ酸残基１〜７３５を持つＰＲＯ５４５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ５４５をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９６５５として１９９８年３月５日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ５４５ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ５４５ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ３０（配列番号：７４）の残基１〜７３５を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、ＰＲＯ５４５ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関している。場合によっては、ＰＲＯ５４５ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９６５５として１９９８年３月５日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、配列番号：７５（Ｆｉｇ３１）のヌクレオチド配列を含んでなる、ここでＤＮＡ１３２１７と命名した発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０１２７】
１２．ＰＲＯ６１７
出願人は、本出願において「ＰＲＯ６１７」と命名した、ＣＤ２４と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ６１７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ３３（配列番号：８５）のアミノ酸残基１〜６７を持つＰＲＯ６１７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ６１７をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９６５６として１９９８年３月５日に寄託されたＤＮＡ４８３０９−１２８０ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ６１７ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ６１７ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ３３（配列番号：８５）の残基１〜６７を含んでなるアミノ酸を含む。場合によっては、ＰＲＯ６１７ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９６５６として１９９８年３月５日に寄託されたＤＮＡ４８３０９−１２８０ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１２８】
１３．ＰＲＯ７００
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７００」と命名した、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７００ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ３５（配列番号：９０）のアミノ酸残基１〜４３２を持つＰＲＯ７００ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ３５（配列番号：９０）の約３４〜４３２のアミノ酸残基を持つＰＲＯ７００ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７００をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７２１として１９９８年３月３１日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７００ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７００ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ３５（配列番号：９０）の残基１〜４３２を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明はＦｉｇ３５（配列番号：９０）の約３４〜４３２の残基を含んでなるアミノ酸を含む、シグナル配列を欠いた単離ＰＲＯ７００ポリペプチドを提供する。場合によっては、ＰＲＯ７００ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７２１として１９９８年３月３１日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１２９】
１４．ＰＲＯ７０２
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７０２」と命名した、コングルチニンと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７０２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ３７（配列番号：９７）のアミノ酸残基１〜２７７を持つＰＲＯ７０２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ３７（配列番号：９７）のアミノ酸残基２６〜２７７を持つＰＲＯ７０２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７０２をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７１７として１９９８年３月３１日に寄託されたＤＮＡ５０９８０−１２８６ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７０２ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７０２ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ３７（配列番号：９７）の残基１〜２７７を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ３７（配列番号：９７）のアミノ酸残基２６〜２７７を含んでなる単離されたＰＲＯ７０２ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ７０２ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７１７として１９９８年３月３１日に寄託されたＤＮＡ５０９８０−１２８６ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１３０】
１５．　ＰＲＯ７０３
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７０３」と命名した、ＶＬＣＡＳと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７０３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ３９（配列番号：１０２）のアミノ酸残基１〜７３０を持つＰＲＯ７０３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ３９（配列番号：１０２）の約４３〜７３０のアミノ酸残基を持つＰＲＯ７０３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７０３をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７１６として１９９８年３月３１日に寄託されたＤＮＡ５０９１３−１２８７ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７０３ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７０３ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ３９（配列番号：１０２）の残基１〜７３０を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明はＦｉｇ３９（配列番号：１０２）の約４３〜７３０の残基を含んでなるアミノ酸を含む、シグナル配列を欠いた単離されたＰＲＯ７０３ポリペプチドを提供する。場合によっては、ＰＲＯ７０３ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７１６として１９９８年３月３１日に寄託されたＤＮＡ５０９１３−１２８７ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１３１】
１６．ＰＲＯ７０５
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７０５」と命名した、Ｋ−グリピカンと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７０５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ４１（配列番号：１０９）のアミノ酸残基１〜５５５を持つＰＲＯ７０５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ４１（配列番号：１０９）の約２４〜５５５のアミノ酸残基を持つＰＲＯ７０５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７０５をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７２２として１９９８年３月３１日に寄託されたＤＮＡ５０９１４−１２８９ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７０５ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７０５ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ４１（配列番号：１０９）の残基１〜５５５を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の他の実施態様は、Ｆｉｇ４１（配列番号：１０９）の約２４〜５５５のアミノ酸残基を含んでなる単離されたＰＲＯ７０５ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ７０５ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７２２として１９９８年３月３１日に寄託されたＤＮＡ５０９１４−１２８９ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１３２】
１７．　ＰＲＯ７０８
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７０８」と命名した、アリールスルファターゼと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７０８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ４３（配列番号：１１４）のアミノ酸残基１〜５１５を持つＰＲＯ７０８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７０８をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９６６８として１９９８年３月３１日に寄託されたＤＮＡ４８２９６−１２９２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７０８ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７０８ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ４３（配列番号：１１４）の残基１〜５１５を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様は、Ｆｉｇ４３（配列番号：１１４）に示すアミノ酸配列の残基３８〜５１５を含んでなるＰＲＯ７０８ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ７０８ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９６６８として１９９８年３月１１日に寄託されたＤＮＡ４８２９６−１２９２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１３３】
１８．　ＰＲＯ３２０
出願人は、本出願において「ＰＲＯ３２０」と命名した、フィブリンと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ３２０ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ４５（配列番号：１１９）のアミノ酸残基１〜３３８を持つＰＲＯ３２０ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ３２０をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９６７０として１９９８年３月１１日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ３２０ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ３２０ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ４５（配列番号：１１９）の残基１〜３３８を含んでなるアミノ酸を含む。場合によっては、ＰＲＯ３２０ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９６７０として１９９８年３月１１日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１３４】
１９．ＰＲＯ３２４
出願人は、本出願において「ＰＲＯ３２４」と命名した、オキシドレダクターゼと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ３２４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ４７（配列番号：１２４）のアミノ酸残基１〜２８９を持つＰＲＯ３２４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ４７（配列番号：１２４）のアミノ酸残基１又は約３２からＸ（ここで、Ｘは１３１〜１４０の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ３２４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ３２４をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７１８として１９９８年３月３０日に寄託されたＤＮＡ３６３４３−１３１０ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ３２４ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ３２４ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ４７（配列番号：１２４）の残基１〜２８９を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明はまたＦｉｇ４７（配列番号：１２４）の残基１又は約３２からＸ（ここで、Ｘは約１３１〜１４０の任意のアミノ酸である）を含んでなる単離されたＰＲＯ３２４ポリペプチドを提供する。場合によっては、ＰＲＯ３２４ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７１８として１９９８年３月３０日に寄託されたＤＮＡ３６３４３−１３１０ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１３５】
２０．ＰＲＯ３５１
出願人は、本出願において「ＰＲＯ３５１」と命名した、プロスタシン（ｐｒｏｓｔａｓｉｎ）と配列類似性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ３５１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ４９（配列番号：１３２）のアミノ酸残基１〜５７１を持つＰＲＯ３５１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ４９（配列番号：１３２）の約１６〜５７１のアミノ酸残基を持つＰＲＯ３５１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ３５１をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７８４として１９９８年４月２１日に寄託されたＤＮＡ４０５７１−１３１５ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ３５１ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ３５１ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ４９（配列番号：１３２）の残基１〜５７１を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、Ｆｉｇ４９（配列番号：１３２）の約１６〜５７１の残基を含んでなるアミノ酸配列を含む、シグナル配列を欠いた単離されたＰＲＯ３５１ポリペプチドを提供する。場合によっては、ＰＲＯ３５１ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７８４として１９９８年４月２１日に寄託されたＤＮＡ４０５７１−１３１５ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１３６】
２１．ＰＲＯ３５２
出願人は、本出願において「ＰＲＯ３５２」と命名した、ブチロフィリンと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ３５２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ５１（配列番号：１３７）のアミノ酸残基１〜３１６を持つＰＲＯ３５２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ５１（配列番号：１３７）の約２９〜３１６のアミノ酸残基、又はＦｉｇ５１の１あるいは約２９からＸ（ここで、Ｘは２４６〜２５５の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ３５２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ３５２をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７０３として１９９８年３月２６日に寄託されたＤＮＡ４１３８６−１３１６ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ３５２ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ３５２ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ５１（配列番号：１３７）の残基１〜３１６を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明は、Ｆｉｇ５１（配列番号：１３７）の残基約２９〜３１６及びＦｉｇ５１（配列番号：１３７）の１又は約２９からＸ（ここで、Ｘは２４６〜２５５の任意のアミノ酸である）を含んでなる単離されたＰＲＯ３５２ポリペプチドを提供する。場合によっては、ＰＲＯ３５２ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７０３として１９９８年３月２６日に寄託されたＤＮＡ４１３８６−１３１６ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１３７】
２２．ＰＲＯ３８１
出願人は、本出願において「ＰＲＯ３８１」と命名した、イムノフィリンタンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ３８１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ５３（配列番号：１４５）のアミノ酸残基１〜２１１を持つＰＲＯ３８１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ５３（配列番号：１４５）の約２１〜２１１のアミノ酸残基を持つＰＲＯ３８１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ３８１をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８０８として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４４１９４−１３１７ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ３８１ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ３８１ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ５３（配列番号：１４５）の残基１〜２１１を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様は、Ｆｉｇ５３（配列番号：１４５）の約２１〜２１１のアミノ酸残基を含んでなるＰＲＯ３８１ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ３８１ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８０８として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４４１９４−１３１７ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１３８】
２３．ＰＲＯ３８６
出願人は、本出願において「ＰＲＯ３８６」と命名した、ナトリウムチャネルのβ−２サブユニットと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ３８６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ５５（配列番号：１５０）のアミノ酸残基１〜２１５を持つＰＲＯ３８６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ５５（配列番号：１５０）のアミノ酸残基約２１〜２１５又は１もしくは約２１からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ５５（配列番号：１５０）の１５６〜１６５の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ３８６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ３８６をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８１０として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４５４１５−１３１８ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ３８６ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ３８６ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ５５（配列番号：１５０）の残基１〜２１５を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の他の実施態様は、Ｆｉｇ５５（配列番号：１５０）のアミノ酸約２１〜２１５及びＦｉｇ５５（配列番号：１５０）の１もしくは約２１からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ５５（配列番号：１５０）の１５６〜１６５の任意のアミノ酸である）を含んでなるＰＲＯ３８６ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ３８６ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８１０として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４５４１５−１３１８ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、配列番号１５１のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供し、これはＤＮＡ２３３５０とここで命名したＥＳＴに対応する。
他の実施態様では、本発明は、配列番号１５２のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供し、これはＤＮＡ２３５３６とここで命名したＥＳＴに対応する。
【０１３９】
２４．ＰＲＯ５４０
出願人は、本出願において「ＰＲＯ５４０」と命名した、ＬＣＡＴと配列類似性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ５４０ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ５９（配列番号：１５７）のアミノ酸残基１〜４１２を持つＰＲＯ５４０ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ５９（配列番号：１５７）の約２９〜４１２のアミノ酸残基を持つＰＲＯ５４０ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ５４０をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９６９９として１９９８年３月２６日に寄託されたＤＮＡ４４１８９−１３２２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ５４０ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ５４０ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ５９（配列番号：１５７）の残基１〜４１２を含んでなるアミノ酸を含む。本発明はまた単離されたＰＲＯ５４０ポリペプチドを提供し、これは一実施態様では、Ｆｉｇ５９（配列番号：１５７）の約２９〜４１２の残基を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＲＯ５４０ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９６９９として１９９８年３月２６日に寄託されたＤＮＡ４４１８９−１３２２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１４０】
２５．ＰＲＯ６１５
出願人は、本出願において「ＰＲＯ６１５」と命名した、シナプトジリン（ｓｙｎａｐｔｏｇｙｒｉｎ）と配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ６１５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ６１（配列番号：１６２）のアミノ酸残基１〜２２４を持つＰＲＯ６１５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ６１（配列番号：１６２）のアミノ酸残基約Ｘ〜２２４（ここで、Ｘは１５７〜１６６の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ６１５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ６１５をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８１１として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４８３０４−１３２３ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ６１５ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ６１５ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ６１（配列番号：１６２）の残基１〜２２４を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ６１（配列番号：１６２）のアミノ酸残基Ｘ〜２２４（ここで、ＸはＦｉｇ６１（配列番号：１６２）の１５７〜１６６の任意のアミノ酸である）を含んでなるＰＲＯ６１５ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、ＰＲＯ６１５ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８１１として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４８３０４−１３２３ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１４１】
２６．ＰＲＯ６１８
出願人は、本出願において「ＰＲＯ６１８」と命名した、エンテロペプチダーゼと配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ６１８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ６３（配列番号：１６９）のアミノ酸残基１〜８０２を持つＰＲＯ６１８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ６３（配列番号：１６９）のアミノ酸残基Ｘ〜８０２（ここで、ＸはＦｉｇ６３（配列番号：１６９）の６３〜７２の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ６１８ポリペプチドの単離された細胞外ドメインをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ６１８をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８１３として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４９１５２−１３２４ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ６１８ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ６１８ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ６３（配列番号：１６９）の残基１〜８０２を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、アミノ酸Ｘ〜８０２（ここで、ＸはＦｉｇ６３（配列番号：１６９）の６３〜７２の任意のアミノ酸である）を含んでなるＰＲＯ６１８ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、ＰＲＯ６１８ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８１３として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４９１５２−１３２４ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ３５５９７と命名された、配列番号１７０のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する（Ｆｉｇ６４を参照されたい）。
【０１４２】
２７．ＰＲＯ７１９
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７１９」と命名した、リポタンパク質リパーゼＨと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７１９ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ６６（配列番号：１７８）のアミノ酸残基１〜３５４を持つＰＲＯ７１９ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ６６（配列番号１７８）のアミノ酸残基約１７〜３５４を持つＰＲＯ７１９ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７１９をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７０５として１９９８年３月２６日に寄託されたＤＮＡ４９６４６−１３２７ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７１９ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７１９ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ６６（配列番号：１７８）の残基１〜３５４を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明は、Ｆｉｇ６６（配列番号：１７８）の約１７〜３５４の残基を含んでなる単離されたＰＲＯ７１９ポリペプチドを提供する。場合によっては、ＰＲＯ７１９ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７０５として１９９８年３月２６日に寄託されたＤＮＡ４９６４６−１３２７ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１４３】
２８．ＰＲＯ７２４
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７２４」と命名した、ＬＤＬレセプターと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７２４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ６８（配列番号：１８３）のアミノ酸残基１〜７１３を持つＰＲＯ７２４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ６８（配列番号：１８３）のアミノ酸残基１〜Ｘ（ここで、Ｘはアミノ酸４３７〜４４６の任意のアミノ酸である）を持つ可溶性ＰＲＯ７２４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。上記の二種のポリペプチドはシグナルペプチドを含んでいても含んでいなくともよい。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７２４をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８０６として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４９６３１−１３２８ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７２４ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７２４ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ６８（配列番号：１８３）の残基１〜７１３を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明は、単離された可溶性ＰＲＯ７２４ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された可溶性ＰＲＯ７２４ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様では、Ｆｉｇ６８（配列番号：１８３）の残基１〜Ｘ（ここで、Ｘは図６８（配列番号１８３）に示される配列の４３７〜４４６の任意のアミノ酸である）を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＲＯ７２４ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８０６として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４９６３１−１３２８ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１４４】
２９．ＰＲＯ７７２
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７７２」と命名した、Ａ４プロテインと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７７２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ７０（配列番号：１９０）のアミノ酸残基１〜１５２を持つＰＲＯ７７２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ７０（配列番号：１９０）のアミノ酸残基１〜Ｘ（ここで、ＸはＦｉｇ７０（配列番号：１９０）の２１〜３０の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ７７２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７７２をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８０９として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４９６４５−１３４７ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７７２ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７７２ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様では図７０（配列番号：１９０）の残基１〜１５２を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ７０（配列番号：１９０）のアミノ酸１〜Ｘ（ここで、ＸはＦｉｇ７０（配列番号：１９０）の２１〜３０の任意のアミノ酸である）を含んでなるＰＲＯ７７２ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ７７２ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８０９として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４９６４５−１３４７ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ４３５０９と命名された、配列番号：１９１のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する（Ｆｉｇ７１）。
【０１４５】
３０．ＰＲＯ８５２
出願人は、本出願において「ＰＲＯ８５２」と命名した、様々なプロテアーゼ酵素と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ８５２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ７３（配列番号：１９６）のアミノ酸残基１〜５１８を持つＰＲＯ８５２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ７３（配列番号：１９６）のアミノ酸残基約２１〜５１８又はＦｉｇ７３（配列番号：１９６）の１あるいは約２１からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ７３（配列番号：１９６）のアミノ酸４６１〜アミノ酸４７０の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ８５２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ８５２をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８０５として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４５４９３−１３４９ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ８５２ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ８５２ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ７３（配列番号：１９６）の残基１〜５１８を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、ＰＲＯ８５２は、Ｆｉｇ７３（配列番号：１９６）のアミノ酸約２１〜アミノ酸５１８あるいはＦｉｇ７３（配列番号：１９６）のアミノ酸１又は約２１からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ７３（配列番号：１９６）のアミノ酸４６１〜アミノ酸４７０の任意のアミノ酸である）を含んでなる。場合によっては、ＰＲＯ８５２ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８０５として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４５４９３−１３４９ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１４６】
３１．ＰＲＯ８５３
出願人は、本出願において「ＰＲＯ８５３」と命名した、レダクターゼと配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ７５（配列番号：２０６）のアミノ酸残基１〜３７７を持つＰＲＯ８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ７５（配列番号：２０６）のアミノ酸残基約１７〜３７７を持つＰＲＯ８５３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ８５３をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８１２として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４８２２７−１３５０ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ８５３ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ８５３ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ７５（配列番号：２０６）の残基１〜３７７を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明は、本発明は、Ｆｉｇ７５（配列番号：２０６）の残基約１７〜３７７を含んでなるアミノ酸配列を含む、シグナルペプチドを欠いた単離されたＰＲＯ８５３ポリペプチドを提供する。場合によっては、ＰＲＯ８５３ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８１２として１９９８年４月２８日に寄託されたＤＮＡ４８２２７−１３５０ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１４７】
３２．ＰＲＯ８６０
出願人は、本出願において「ＰＲＯ８６０」と命名した、ニューロファシン（ｎｅｕｒｏｆａｓｃｉｎ）と配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ８６０ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ７７（配列番号：２１１）のアミノ酸残基１〜９８５を持つＰＲＯ８６０ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ７７（配列番号：２１１）のアミノ酸残基１〜Ｘ（ここで、ＸはＦｉｇ７７（配列番号：２１１）のアミノ酸４４３〜４５２の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ８６０ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ８６０をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８４４として１９９８年５月６日に寄託されたＤＮＡ４１４０４−１３５２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ８６０ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ８６０ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ７７（配列番号：２１１）の残基１〜９８５を含んでなるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、本発明は、Ｆｉｇ７７（配列番号：２１１）の残基１〜Ｘ（ここで、ＸはＦｉｇ７７（配列番号：２１１）の４４３〜４５２の任意のアミノ酸残基である）を含んでなるアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯ８６０ポリペプチドを提供する。場合によっては、ＰＲＯ８６０ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８４４として１９９８年５月６日に寄託されたＤＮＡ４１４０４−１３５２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１４８】
３３．ＰＲＯ８４６
出願人は、本出願において「ＰＲＯ８４６」と命名した、ＣＭＲＦ３５と配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ８４６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ７９（配列番号：２１６）のアミノ酸残基１〜３３２を持つＰＲＯ８４６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ７９（配列番号：２１６）のアミノ酸残基約１８〜３３２又は配列番号：２１６の１あるいは約１８からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ７９（配列番号：２１６）の２４３〜２５２の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ８４６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ８４６をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８４７として１９９８年５月６日に寄託されたＤＮＡ４４１９６−１３５３ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ８４６ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ８４６ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ７９（配列番号：２１６）の残基１〜３３２を含んでなるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、本発明は、Ｆｉｇ７９（配列番号：２１６）の残基約１８〜３３２を含んでなるアミノ酸配列を含む、シグナル配列を欠いた単離されたＰＲＯ８４６ポリペプチドを提供する。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ７９（配列番号：２１６）の１又は約１８からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ７９（配列番号：２１６）の２４３〜２５２の任意のアミノ酸である）を含んでなるＰＲＯ８４６に関する。場合によっては、ＰＲＯ８４６ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８４７として１９９８年５月６日に寄託されたＤＮＡ４４１９６−１３５３ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１４９】
３４．ＰＲＯ８６２
出願人は、本出願において「ＰＲＯ８６２」と命名した、リゾチームと配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ８６２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ８１（配列番号：２２１）のアミノ酸残基１〜１４６を持つＰＲＯ８６２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ８１（配列番号：２２１）のアミノ酸残基約１９〜１４６を持つＰＲＯ８６２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ８６２をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８４５として１９９８年５月６日に寄託されたＤＮＡ５２１８７−１３５４ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ８６２ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ８６２ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ８１（配列番号：２２１）の残基１〜１４６を含んでなるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、本発明は、Ｆｉｇ８１（配列番号：２２１）の残基約１９〜１４６を含んでなるアミノ酸配列を含む、シグナル配列を欠いた単離されたＰＲＯ８６２ポリペプチドを提供する。場合によっては、ＰＲＯ８６２ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８４５として１９９８年５月６日に寄託されたＤＮＡ５２１８７−１３５４ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１５０】
３５．ＰＲＯ８６４
出願人は、本出願において「ＰＲＯ８６４」と命名した、Ｗｎｔ−４と配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ８６４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ８３（配列番号：２２６）のアミノ酸残基１〜３５１を持つＰＲＯ８６４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ８３（配列番号：２２６）のアミノ酸残基約２３〜３５１を持つＰＲＯ８６４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ８６４をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８４３として１９９８年５月６日に寄託されたＤＮＡ４８３２８−１３５５ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ８６４ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ８６４ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ８３（配列番号：２２６）の残基１〜３５１を含んでなるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、本発明は、Ｆｉｇ８３（配列番号：２２６）の残基約２３〜３５１を含んでなるアミノ酸配列を含む、シグナル配列を欠いた単離されたＰＲＯ８６４ポリペプチドを提供する。場合によっては、ＰＲＯ８６４ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８４３として１９９８年５月６日に寄託されたＤＮＡ４８３２８−１３５５ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１５１】
３６．ＰＲＯ７９２
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７９２」と命名した、ＣＤ２３と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７９２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ８５（配列番号：２３１）のアミノ酸残基１〜２９３を持つＰＲＯ７９２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ８５（配列番号：２３１）のアミノ酸残基Ｘ〜２９３（ここで、ＸはＦｉｇ８５（配列番号：２３１）の５０〜５９の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ７９２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７９２をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８４６として１９９８年５月６日に寄託されたＤＮＡ５６３５２−１３５８ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７９２ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７９２ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ８５（配列番号：２３１）の残基１〜２９３を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ８５（配列番号：２３１）のアミノ酸Ｘ〜２９３（ここで、ＸはＦｉｇ８５（配列番号：２３１）の５０〜５９の任意のアミノ酸である）を含んでなるＰＲＯ７９２ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ７９２ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８４６として１９９８年５月６日に寄託されたＤＮＡ５６３５２−１３５８ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１５２】
３７．ＰＲＯ８６６
出願人は、本出願において「ＰＲＯ８６６」と命名した、ミンジン（ｍｉｎｄｉｎ）及びスポンジン（ｓｐｏｎｄｉｎ）タンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ８６６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ８７（配列番号：２３６）のアミノ酸残基１〜３３１を持つＰＲＯ８６６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ８７（配列番号：２３６）のアミノ酸残基約２７〜２２９を持つＰＲＯ８６６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ８６６をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７５０として１９９８年４月７日に寄託されたＤＮＡ５３９７１−１３５９ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ８６６ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ８６６ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ８７（配列番号：２３６）の残基１〜３３１を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の他の実施態様は、Ｆｉｇ８７（配列番号：２３６）のアミノ酸約２７〜３３１を含んでなるＰＲＯ８６６ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ８６６ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７５０として１９９８年４月７日に寄託されたＤＮＡ５３９７１−１３５９ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１５３】
３８．ＰＲＯ８７１
出願人は、本出願において「ＰＲＯ８７１」と命名した、ＣｙＰ−６０と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ８７１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ８９（配列番号：２４５）のアミノ酸残基１〜４７２を持つＰＲＯ８７１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ８９（配列番号：２４５）のアミノ酸残基約２２〜４７２を持つＰＲＯ８７１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ８７１をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８４８として１９９８年５月６日に寄託されたＤＮＡ５０９１９−１３６１ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ８７１ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ８７１ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ８９（配列番号：２４５）の残基１〜４７２を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ８９（配列番号：２４５）のアミノ酸約２２〜４７２を含んでなるＰＲＯ８７１ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ８７１ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８４８として１９９８年５月６日に寄託されたＤＮＡ５０９１９−１３６１ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１５４】
３９．ＰＲＯ８７３
出願人は、本出願において「ＰＲＯ８７３」と命名した、カルボキシエステラーゼと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ８７３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ９１（配列番号：２５４）のアミノ酸残基１〜５４５を持つＰＲＯ８７３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ９１（配列番号：２５４）のアミノ酸残基約３０〜５４５を持つＰＲＯ８７３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ８７３をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８５１として１９９８年５月６日に寄託されたＤＮＡ４４１７９−１３６２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ８７３ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ８７３ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ９１（配列番号：２５４）の残基１〜５４５を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ９１（配列番号：２５４）のアミノ酸約３０〜５４５を含んでなるＰＲＯ８７３ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ８７３ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８５１として１９９８年５月６日に寄託されたＤＮＡ４４１７９−１３６２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１５５】
４０．ＰＲＯ９４０
出願人は、本出願において「ＰＲＯ９４０」と命名した、ＣＤ３３及びＯＢ結合プロテイン−２と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ９４０ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ９３（配列番号：２５９）のアミノ酸残基１〜５４４を持つＰＲＯ９４０ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ９３（配列番号：２５９）のアミノ酸残基約１６〜５４４あるいはＦｉｇ９３（配列番号：２５９）の１又は約１６からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ９３（配列番号：２５９）の３９４〜４０３の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ９４０ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ９４０をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７５４として１９９８年４月７日に寄託されたＤＮＡ５４００２−１３６７ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ９４０ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ９４０ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ９３（配列番号：２５９）の残基１〜５４４を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の他の実施態様は、Ｆｉｇ９３（配列番号：２５９）のアミノ酸約１６〜５４４あるいはＦｉｇ９３（配列番号：２５９）の１又は約１６からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ９３（配列番号：２５９）の３９４〜４０３の任意のアミノ酸である）を含んでなるＰＲＯ９４０ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ９４０ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７５４として１９９８年４月７日に寄託されたＤＮＡ５４００２−１３６７ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１５６】
４１．ＰＲＯ９４１
出願人は、本出願において「ＰＲＯ９４１」と命名した、カドヘリンタンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ９４１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ９５（配列番号：２６４）のアミノ酸残基１〜７７２を持つＰＲＯ９４１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ９５（配列番号：２６４）のアミノ酸残基約２２〜７７２あるいはＦｉｇ９５（配列番号：２６４）の１又は約２２からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ９５（配列番号：２６４）の５９２〜６０１の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ９４１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ９４１をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７４７として１９９８年４月７日に寄託されたＤＮＡ５３９０６−１３６８ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ９４１ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ９４１ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ９５（配列番号：２６４）の残基１〜７７２を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ９５（配列番号：２６４）のアミノ酸約２１〜７７２あるいはＦｉｇ９５（配列番号：２６４）の１又は約２２からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ９５（配列番号：２６４）の５９２〜６０１の任意のアミノ酸である）を含んでなるＰＲＯ９４１ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ９４１ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７４７として１９９８年４月７日に寄託されたＤＮＡ５３９０６−１３６８ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ６４１５と命名された、Ｆｉｇ９６（配列番号：２６５）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０１５７】
４２．ＰＲＯ９４４
出願人は、本出願において「ＰＲＯ９４４」と命名した、ウェルシュ菌エンテロトキシンレセプター（ＣＰＥ−Ｒ）と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ９４４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ９８（配列番号：２７０）のアミノ酸残基１〜２１１を持つＰＲＯ９４４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ９８（配列番号：２７０）のアミノ酸残基約２２〜２２９あるいはＦｉｇ９８（配列番号：２７０）の１又は約２２からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ９８（配列番号：２７０）の７７〜８０の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ９４４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ９４４をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８６１として１９９８年５月１４日に寄託されたＤＮＡ５２１８５−１３７０ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ９４４ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ９４４ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ９８（配列番号：２７０）の残基１〜２１１を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ９８（配列番号：２７０）のアミノ酸約２２〜２１１あるいは図９８（配列番号２７０）の１又は約２２からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ９８（配列番号：２７０）の７７〜８６の任意のアミノ酸である）を含んでなるＰＲＯ９４４ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ９４４ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８６１として１９９８年５月１４日に寄託されたＤＮＡ５２１８５−１３７０ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１４００７と命名された、Ｆｉｇ９９（配列番号：２７１）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１２７３３と命名された、Ｆｉｇ１００（配列番号：２７２）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１２７４６と命名された、Ｆｉｇ１０１（配列番号：２７３）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１２８３４と命名された、Ｆｉｇ１０２（配列番号：２７４）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１２８４６と命名された、Ｆｉｇ１０３（配列番号：２７５）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１３１０４と命名された、Ｆｉｇ１０４（配列番号：２７６）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１３２５９と命名された、Ｆｉｇ１０５（配列番号：２７７）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１３９５９と命名された、Ｆｉｇ１０６（配列番号：２７８）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１３９６１と命名された、Ｆｉｇ１０７（配列番号：２７９）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０１５８】
４３．ＰＲＯ９８３
出願人は、本出願において「ＰＲＯ９８３」と命名した、小胞関連タンパク質ＶＡＰ−３３と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ９８３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１０９（配列番号：２８４）のアミノ酸残基１〜２４３を持つＰＲＯ９８３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１０９（配列番号：２８４）のアミノ酸残基１〜Ｘ（ここで、ＸはＦｉｇ１０９（配列番号：２８４）の２１９〜２２８の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ９８３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ９８３をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８６２として１９９８年５月１４日に寄託されたＤＮＡ５３９７７−１３７１ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ９８３ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ９８３ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１０９（配列番号：２８４）の残基１〜２４３を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ１０９（配列番号：２８４）のアミノ酸１〜Ｘ（ここで、ＸはＦｉｇ１０９（配列番号：２８４）の２１９〜２２８の任意のアミノ酸である）を含んでなるＰＲＯ９８３ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ９８３ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８６２として１９９８年５月１４日に寄託されたＤＮＡ５３９７７−１３７１ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１７１３０と命名された、Ｆｉｇ１１０（配列番号：２８５）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ２３４６６と命名された、Ｆｉｇ１１１（配列番号：２８６）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ２６８１８と命名された、Ｆｉｇ１１２（配列番号：２８７）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ３７６１８と命名された、Ｆｉｇ１１３（配列番号：２８８）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ４１７３２と命名された、Ｆｉｇ１１４（配列番号：２８９）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ４５９８０と命名された、Ｆｉｇ１１５（配列番号：２９０）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ４６３７２と命名された、Ｆｉｇ１１６（配列番号：２９１）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０１５９】
４４．ＰＲＯ１０５７
出願人は、本出願において「ＰＲＯ１０５７」と命名した、プロテアーゼと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１０５７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２９６）のアミノ酸残基１〜４１３を持つＰＲＯ１０５７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２９６）のアミノ酸残基約１７〜４１３を持つＰＲＯ１０５７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ１０５７をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８６７として１９９８年５月１４日に寄託されたＤＮＡ５７２５３−１３８２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ１０５７ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ１０５７ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１１８（配列番号：２９６）の残基１〜４１３を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ１１８（配列番号：２９６）のアミノ酸約１７〜４１３を含んでなるＰＲＯ１０５７ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ１０５７ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８６７として１９９８年５月１４日に寄託されたＤＮＡ５７２５３−１３８２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１６０】
４５．ＰＲＯ１０７１
出願人は、本出願において「ＰＲＯ１０７１」と命名した、トロンボスポンジンと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１０７１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１２０（配列番号：３０１）のアミノ酸残基１〜５２５を持つＰＲＯ１０７１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１２０（配列番号：３０１）のアミノ酸残基約２６〜５２５を持つＰＲＯ１０７１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ１０７１をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８７９として１９９８年５月２０日に寄託されたＤＮＡ５８８４７−１３８３ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ１０７１ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ１０７１ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１２０（配列番号：３０１）の残基１〜５２５を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ１２０（配列番号：３０１）のアミノ酸約２６〜５２５を含んでなるＰＲＯ１０７１ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ１０７１ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８７９として１９９８年５月２０日に寄託されたＤＮＡ５８８４７−１３８３ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１６１】
４６．ＰＲＯ１０７２
出願人は、本出願において「ＰＲＯ１０７２」と命名した、レダクターゼタンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１０７２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１２２（配列番号：３０３）のアミノ酸残基１〜３３６を持つＰＲＯ１０７２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１２２（配列番号：３０３）のアミノ酸残基約２２〜３３６を持つＰＲＯ１０７２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ１０７２をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８６８として１９９８年５月１４日に寄託されたＤＮＡ５８７４７−１３８４ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ１０７２ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ１０７２ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１２２（配列番号：３０３）の残基１〜３３６を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ１２２（配列番号：３０３）のアミノ酸約２２〜３３６を含んでなるＰＲＯ１０７２ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ１０７２ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８６８として１９９８年５月１４日に寄託されたＤＮＡ５８７４７−１３８４ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ４０２１０と命名された、Ｆｉｇ１２３（配列番号：３０４）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０１６２】
４７．ＰＲＯ１０７５
出願人は、本出願において「ＰＲＯ１０７５」と命名した、プロテインジスルフィドイソメラーゼと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１０７５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１２５（配列番号：３０９）のアミノ酸残基１〜４０６を持つＰＲＯ１０７５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１２５（配列番号：３０９）のアミノ酸残基約３０〜４０６を持つＰＲＯ１０７５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ１０７５をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８６９として１９９８年５月１４日に寄託されたＤＮＡ５７６８９−１３８５ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ１０７５ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ１０７５ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１２５（配列番号：３０９）の残基１〜４０６を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ１２５（配列番号：３０９）のアミノ酸約３０〜４０６を含んでなるＰＲＯ１０７５ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ１０７５ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８６９として１９９８年５月１４日に寄託されたＤＮＡ５７６８９−１３８５ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１３０５９と命名された、Ｆｉｇ１２６（配列番号：３１０）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１９４６３と命名された、Ｆｉｇ１２７（配列番号：３１１）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０１６３】
４８．ＰＲＯ１８１
出願人は、本出願において「ＰＲＯ１８１」と命名した、コルニコン（ｃｏｒｎｉｃｈｏｎ）タンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１８１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１２９（配列番号：３２２）のアミノ酸残基１〜１４４を持つＰＲＯ１８１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１２９（配列番号：３２２）のアミノ酸残基約２１〜１４４又はＦｉｇ１２９（配列番号：３２２）のアミノ酸１もしくは約２１からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ１２９（配列番号：３２２）の５２〜６１の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ１８１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ１８１をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７７５として１９９８年４月１４日に寄託されたＤＮＡ２３３３０−１３９０ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ１８１ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ１８１ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１２９（配列番号：３２２）の残基１〜１４４を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ１２９（配列番号：３２２）のアミノ酸約２１〜１４４あるいはＦｉｇ１２９（配列番号：３２２）のアミノ酸１又は約２１からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ１２９（配列番号：３２２）の５２〜６１の任意のアミノ酸である）を含んでなるＰＲＯ１８１ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ１８１ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７７５として１９９８年４月１４日に寄託されたＤＮＡ２３３３０−１３９０ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１３２４２と命名された、Ｆｉｇ１３０（配列番号：３２３）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０１６４】
４９．ＰＲＯ１９５
出願人は、本出願において「ＰＲＯ１９５」と命名した新規な膜貫通ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１９５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１３２（配列番号：３３０）のアミノ酸残基１〜３２３を持つＰＲＯ１９５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１３２（配列番号：３３０）のアミノ酸残基約３２〜３２３又はＦｉｇ１３２（配列番号：３３０）のアミノ酸１もしくは約３２からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ１３２（配列番号：３３０）の２３６〜２４５の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ１９５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ１９５をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７７２として１９９８年４月１４日に寄託されたＤＮＡ２６８４７−１３９５ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ１９５ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ１９５ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１３２（配列番号：３３０）の残基１〜３２３を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ１３２（配列番号：３３０）のアミノ酸約３２〜３２３あるいはＦｉｇ１３２（配列番号：３３０）のアミノ酸１又は約３２からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ１３２（配列番号：３３０）の２３６〜２４５の任意のアミノ酸である）を含んでなるＰＲＯ１９５ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ１９５ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７７２として１９９８年４月１４日に寄託されたＤＮＡ２６８４７−１３９５ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１５０６２と命名された、Ｆｉｇ１３３（配列番号：３３１）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１３１９９と命名された、Ｆｉｇ１３４（配列番号：３３２）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０１６５】
５０．ＰＲＯ８６５
出願人は、本出願において「ＰＲＯ８６５」と命名した新規な分泌ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ８６５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１３６（配列番号：３３７）のアミノ酸残基１〜４６８を持つＰＲＯ８６５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１３６（配列番号：３３７）のアミノ酸残基約２４〜２２９を持つＰＲＯ８６５ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ８６５をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７７４として１９９８年４月１４日に寄託されたＤＮＡ５３９７４−１４０１ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ８６５ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ８６５ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１３６（配列番号：３３７）の残基１〜４６８を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ１３６（配列番号：３３７）のアミノ酸約２４〜４６８を含んでなるＰＲＯ８６５ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ８６５ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７７４として１９９８年４月１４日に寄託されたＤＮＡ５３９７４−１４０１ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ３７６４２と命名された、Ｆｉｇ１３７（配列番号：３３８）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０１６６】
５１．ＰＲＯ８２７
出願人は、本出願において「ＰＲＯ８２７」と命名した、インテグリンタンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ８２７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１３９（配列番号：３４６）のアミノ酸残基１〜１２４を持つＰＲＯ８２７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１３９（配列番号：３４６）のアミノ酸残基約２３〜１２４を持つＰＲＯ８２７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ８２７をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９７７７として１９９８年４月１４日に寄託されたＤＮＡ５７０３９−１４０２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ８２７ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ８２７ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１３９（配列番号：３４６）の残基１〜１２４を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ１３９（配列番号：３４６）のアミノ酸約２３〜１２４を含んでなるＰＲＯ８２７ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ８２７ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９７７７として１９９８年４月１４日に寄託されたＤＮＡ５７０３９−１４０２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１６７】
５２．ＰＲＯ１１１４
出願人は、本出願において「ＰＲＯ１１１４」と命名した、サイトカインレセプターファミリー−４タンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１１１４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）のアミノ酸残基１〜３１１を持つＰＲＯ１１１４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）のアミノ酸残基約３０〜３１１又はＦｉｇ１４２（配列番号：３５２）のアミノ酸１もしくは約３０からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ１４２（配列番号：３５２）の２２５〜２３４の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ１１１４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ１１１４をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９９０５として１９９８年５月２７日に寄託されたＤＮＡ５７０３３−１４０３ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ１１１４ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ１１１４ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１４２（配列番号：３５２）の残基１〜３１１を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）のアミノ酸約３０〜３１１あるいはＦｉｇ１４２（配列番号：３５２）のアミノ酸１又は約３０からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ１４２（配列番号：３５２）の２２５〜２３４の任意のアミノ酸である）を含んでなるＰＲＯ１１１４ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ１１１４ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９９０５として１９９８年５月２７日に寄託されたＤＮＡ５７０３３−１４０３ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ４８４６６と命名された、Ｆｉｇ１４３（配列番号：３５３）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０１６８】
本出願において「ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプター」と命名した新規なインターフェロンレセプターポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ５７０３３−１４０３）が同定された。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドをコードしているＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一側面では、単離された核酸は、（ａ）Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）の約１又は約３０から約３１１までのアミノ酸残基の配列を有するＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる。
他の側面では、本発明は、Ｆｉｇ１４１（配列番号：３５１）のヌクレオチド約２５０又は約３３７と約１１８２の間で核酸の補体にハイブリダイズするＤＮＡを含んでなるＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドをコードしている単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で起こる。
更なる側面では、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９９０５（ＤＮＡ５７０３３−１４０３）のヒトタンパク質ｃＤＮＡによりコードされた同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子又は（ｂ）（ａ）の核酸分子の補体に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離核酸分子に関する。好適な実施態様では、核酸はＡＴＣＣ寄託番号２０９９０５（ＤＮＡ５７０３３−１４０３）のヒトタンパク質ｃＤＮＡによりコードされた同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる。
なお更なる側面では、本発明は、（ａ）Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）のアミノ酸残基１又は約３０から約３１１の配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの補体を含んでなる単離核酸分子に関する。
更なる側面では、本発明は、少なくとも１０のヌクレオチドを有し、被験ＤＮＡ分子をストリンジェントな条件下で、（ａ）Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）のアミノ酸残基１又は約３０から約３１１の配列を有するＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体と、ハイブリダイズさせ、ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有していれば、被験ＤＮＡ分子を単離することにより生産される単離核酸分子に関する。
ある特定の側面では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを伴うか伴わない、ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドをコードしているＤＮＡを含んでなる単離核酸分子、及びその可溶性、すなわち膜貫通ドメイン欠失又は不活性化変異体、又はそのようなコード核酸分子に相補的なものを提供する。シグナルペプチドはＦｉｇ１４２（配列番号：３５２）の配列において約１のアミノ酸位置から約２９のアミノ酸位置まで伸展していると試験的に特定された。膜貫通ドメインはＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターアミノ酸配列において約２３０のアミノ酸位置から約２５５のアミノ酸位置まで伸展していると試験的に特定された（Ｆｉｇ１４２、配列番号：３５２）。
他の側面では、本発明は、（ａ）Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）の残基１又は約３０から約３１１のアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも約８０％のポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％のポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％のポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％のポジティブのスコアを示すポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの補体を含んでなる単離核酸分子に関する。
【０１６９】
他の実施態様は、ハイブリダイゼーションプローブとしての用途が見出されるＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドコード配列の断片に関する。そのような核酸断片は約２０〜約８０ヌクレオチド長、好ましくは約２０〜約６０ヌクレオチド長、より好ましくは約２０〜約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０〜約４０ヌクレオチド長のものであり、図１４１（配列番号３５１）し示されたヌクレオチド配列から引き出される。
他の実施態様では、本発明はＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターをコードするＤＮＡを含んでなるベクター又はその変異体を提供する。ベクターは上において特定した単離核酸分子の任意のものを含みうる。
そのようなベクターを含んでなる宿主細胞もまた提供される。例を挙げると、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母である。ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドを製造する方法が更に提供され、これは、ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養からＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は上記において特定した単離核酸配列の任意のものによってコードされた単離ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドを提供する。
ある特定の側面では、本発明は、ある実施態様では、Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）の残基１又は約３０から約３１１までを含んでなるアミノ酸配列を含む、単離された未変性のＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドを提供する。
他の側面では、本発明は、（ａ）Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）のアミノ酸残基１又は約３０から約３１１の配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドに関する。
更なる側面では、本発明は、Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）の残基１又は約３０から約３１１のアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも約８０％のポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％のポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％のポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％のポジティブのスコアを示すアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドに関する。
また更なる側面では、本発明は、Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）のアミノ酸残基１又は約３０から約３１１を含んでなる、単離されたＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチド、又は抗ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプター抗体に対して結合部位を提供するのに十分なその断片に関する。好ましくは、ＰＲＯ１１１４インターフェロン断片は未変性のＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドの定性的生物活性を保持する。
【０１７０】
また更なる側面では、本発明は、（ｉ）被験ＤＮＡ分子をストリンジェントな条件下で、（ａ）Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）のアミノ酸残基１又は約３０から約３１１までの配列を有するＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体と、ハイブリダイズさせ、被験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有していれば、（ｉｉ）被験ＤＮＡ分子を含んでなる宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、（ｉｉｉ）細胞培養からポリペプチドを回収することにより生産されるポリペプチドを提供する。
他の実施態様では、本発明は、異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例としては、免疫グロブリンのＦｃ領域又はエピトープタグ配列に融合したＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドが含まれる。
他の実施態様では、本発明はＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体である。
また他の実施態様では、本発明は未変性のＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプター抗体である。
更なる実施態様では、本発明は、未変性のＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドを候補分子と接触させ、該ポリペプチドにより媒介される生物活性をモニターすることにより、未変性のＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関する。
また更なる実施態様では、本発明は、ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチド、又は上記において記載したアゴニスト又はアンタゴニストを、製薬的に許容可能な担体と組み合わせて含有する組成物に関する。
【０１７１】
５３．ＰＲＯ２３７
出願人は、本出願において「ＰＲＯ２３７」と命名した、炭酸脱水酵素と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ２３７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１４５（配列番号：３５８）のアミノ酸残基１〜３２８を持つＰＲＯ２３７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１４５（配列番号：３５８）のアミノ酸残基約２４〜３２８又はＦｉｇ１４５（配列番号：３５８）のアミノ酸１もしくは約２４からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ１４５（配列番号：３５８）の１７２〜１８１の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ２３７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ２３７をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９８５５として１９９８年５月１２日に寄託されたＤＮＡ３４３５３−１４２８ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ２３７ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ２３７ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１４５（配列番号：３５８）の残基１〜３２８を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ１４５（配列番号：３５８）のアミノ酸約２４〜３２８あるいはＦｉｇ１４５（配列番号：３５８）のアミノ酸１又は約２４からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ１４５（配列番号：３５８）の１７２〜１８１の任意のアミノ酸である）を含んでなるＰＲＯ２３７ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ２３７ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９８５５として１９９８年５月１２日に寄託されたＤＮＡ３４３５３−１４２８ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１７２】
５４．ＰＲＯ５４１
出願人は、本出願において「ＰＲＯ５４１」と命名した、トリプシンインヒビタータンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ５４１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１４７（配列番号：３６３）のアミノ酸残基１〜５００を持つＰＲＯ５４１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１４７（配列番号：３６３）のアミノ酸残基約２１〜５００を持つＰＲＯ５４１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ５４１をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ２０９９１０として１９９８年５月２７日に寄託されたＤＮＡ４５４１７−１４３２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ５４１ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ５４１ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１４７（配列番号：３６３）の残基１〜５００を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ１４７（配列番号：３６３）のアミノ酸約２１〜５００を含んでなるＰＲＯ５４１ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ５４１ポリペプチドは、ＡＴＣＣ２０９９１０として１９９８年５月２７日に寄託されたＤＮＡ４５４１７−１４３２ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１７３】
５５．ＰＲＯ２７３
出願人は、本出願において「ＰＲＯ２７３」と命名した新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ２７３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１４９（配列番号：３７０）のアミノ酸残基１〜１１１を持つＰＲＯ２７３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ２７３ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ２７３ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１４９（配列番号：３７０）の残基１〜１１１を含んでなるアミノ酸配列を含む。
【０１７４】
５６．ＰＲＯ７０１
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７０１」と命名した、ニューロリジン（ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ）１、２、及び３と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７０１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１５１（配列番号：３７５）のアミノ酸残基１〜８１６を持つＰＲＯ７０１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７０１をコードするヌクレオチド配列を含む１９９８年３月３１日にＡＴＴＣに寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７０１ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７０１ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１５１（配列番号：３７５）の残基１〜８１６を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、ＰＲＯ７０１ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、ＰＲＯ７０１ポリペプチドは、１９９８年３月３１日にＡＴＴＣに寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１７５】
５７．ＰＲＯ７０４
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７０４」と命名した、ＶＩＰ３６と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７０４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１５３（配列番号：３８０）のアミノ酸残基１〜３４８を持つＰＲＯ７０４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７０４をコードするヌクレオチド配列を含む、ＤＮＡ５０９１１−１２８８としてＡＴＣＣに１９９８年３月３１日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７０４ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７０４ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１５３（配列番号：３８０）の残基１〜３４８を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、ＰＲＯ７０４ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、ＰＲＯ７０４ポリペプチドは、ＤＮＡ５０９１１−１２８８としてＡＴＣＣに１９９８年３月３１日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１７６】
５８．ＰＲＯ７０６
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７０６」と命名した、前立腺酸性ホスファターゼ及びリソソーム酸性ホスファターゼ前駆体と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７０６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１５５（配列番号：３８５）のアミノ酸残基１〜４８０を持つＰＲＯ７０６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７０６をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ４８３２９−１２９０としてＡＴＣＣに１９９８年４月２１日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７０６ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７０６ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１５５（配列番号：３８５）の残基１〜４８０を含んでなるか、Ｆｉｇ１５５（配列番号：３８５）の残基１９〜４８０を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＲＯ７０６ポリペプチドは、ＤＮＡ４８３２９−１２９０としてＡＴＣＣに１９９８年４月２１日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１７７】
５９．ＰＲＯ７０７
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７０７」と命名した、カドヘリン、特にカドヘリンＦＩＢ３と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７０７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１５７（配列番号：３９０）のアミノ酸残基１〜９１６を持つＰＲＯ７０７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７０７をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣにＤＮＡ４８３０６−１２９１として１９９８年５月２７日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７０７ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７０７ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１５７（配列番号：３９０）の残基１〜９１６を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、ＰＲＯ７０７ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、ＰＲＯ７０７ポリペプチドは、ＡＴＣＣにＤＮＡ４８３０６−１２９１として１９９８年５月２７日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１７８】
６０．ＰＲＯ３２２
出願人は、本出願において「ＰＲＯ３２２」と命名した、ニューロプシンと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ３２２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１５９（配列番号：３９５）のアミノ酸残基１又は２４から２６０を持つＰＲＯ３２２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ３２２をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ番号２０９６６９として１９９８年３月１１日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ３２２ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ３２２ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１５９（配列番号：３９５）の残基１又は２４から２６０を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、ＰＲＯ３２２ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、ＰＲＯ３２２ポリペプチドは、ＡＴＣＣ番号２０９６６９として１９９８年３月１１日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１７９】
６１．ＰＲＯ５２６
出願人は、本出願において「ＰＲＯ５２６」と命名した、ＡＬＳと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ５２６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１６１（配列番号：４００）のアミノ酸残基１〜４７３を持つＰＲＯ５２６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ５２６をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ４４１８４−１３１９としてＡＴＣＣに１９９８年３月２６日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ５２６ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ５２６ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１６１（配列番号：４００）の残基１〜４７３を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＲＯ５２６ポリペプチドはＤＮＡ４４１８４−１３１９としてＡＴＣＣに１９９８年３月２６日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１８０】
６２．ＰＲＯ５３１
出願人は、本出願において「ＰＲＯ５３１」と命名した、プロトカドヘリンと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ５３１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１６３（配列番号：４０５）のアミノ酸残基１〜７８９を持つＰＲＯ５３１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ５３１をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ４８３１４−１３２０として１９９８年３月２６日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ５３１ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ５３１ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１６３（配列番号：４０５）の残基１〜７８９を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、ＰＲＯ５３１ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、ＰＲＯ５３１ポリペプチドは、ＤＮＡ４８３１４−１３２０として１９９８年３月２６日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１８１】
６３．ＰＲＯ５３４
出願人は、本出願において「ＰＲＯ５３４」と命名した、ジスルフィドイソメラーゼ（ここではしばしばプロテインジスルフィドイソメラーゼと呼ぶ）と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ５３４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１６５（配列番号：４１０）のアミノ酸残基１〜３６０を持つＰＲＯ５３４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ５３４をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ４８３３３−１３２１として１９９８年３月２６日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ５３４ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ５３４ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１６５（配列番号：４１０）の残基１〜３６０を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、ＰＲＯ５３４ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、ＰＲＯ５３４ポリペプチドは、ＤＮＡ４８３３３−１３２１として１９９８年３月２６日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１８２】
６４．ＰＲＯ６９７
出願人は、本出願において「ＰＲＯ６９７」と命名した、ｓＦＲＰｓと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ６９７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１６７（配列番号：４１５）のアミノ酸残基１〜２９５を持つＰＲＯ６９７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ６９７をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ５０９２０−１３２５として１９９８年３月２６日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ６９７ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ６９７ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１６７（配列番号：４１５）の残基１〜２９５を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＲＯ６９７ポリペプチドは、ＤＮＡ５０９２０−１３２５として１９９８年３月２６日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１８３】
６５．ＰＲＯ７１７
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７１７」と命名した新規な１２膜貫通ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７１７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１６９（配列番号：４２０）のアミノ酸残基１〜５６０を持つＰＲＯ７１７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７１７をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ５０９８８−１３２６としてＡＴＴＣに１９９８年４月２８日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７１７ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７１７ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１６９（配列番号：４２０）の残基１〜５６０を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、ＰＲＯ７１７ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、ＰＲＯ７１７ポリペプチドは、ＤＮＡ５０９８８−１３２６として１９９８年４月２８日にＡＴＴＣに寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１８４】
６６．ＰＲＯ７３１
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７３１」と命名した、プロトカドヘリン４と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７３１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１７１（配列番号：４２５）のアミノ酸残基１〜１１８４を持つＰＲＯ７３１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７３１をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ４８３３１−１３２９としてＡＴＴＣに１９９８年３月３１日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７３１ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７３１ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１７１（配列番号：４２５）の残基１〜１１８４を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、ＰＲＯ７３１ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、ＰＲＯ７３１ポリペプチドは、ＤＮＡ４８３３１−１３２９として１９９８年３月３１日にＡＴＴＣに寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１８５】
６７．ＰＲＯ２１８
出願人は、本出願において「ＰＲＯ２１８」と命名した、膜調節タンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ２１８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１７３（配列番号：４３０）のアミノ酸残基１〜４５５を持つＰＲＯ２１８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ２１８をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ３０８６７−１３３５としてＡＴＴＣに１９９８年４月２８日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ２１８ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ２１８ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１７３（配列番号：４３０）の残基１〜４５５を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＲＯ２１８ポリペプチドは、ＤＮＡ３０８６７−１３３５として１９９８年４月２８日にＡＴＴＣに寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１４４７２と命名された、Ｆｉｇ１７４（配列番号：４３１）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１５８４６と命名された、Ｆｉｇ１７５（配列番号：４３２）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０１８６】
６８．ＰＲＯ７６８
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７６８」と命名した、インテグリンと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７６８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１７７（配列番号：４３７）のアミノ酸残基１〜１１４１を持つＰＲＯ７６８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７６８をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ５５７３７−１３４５として１９９８年４月６日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７６８ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７６８ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１７７（配列番号：４３７）の残基１〜１１４１を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、ＰＲＯ７６８ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、ＰＲＯ７６８ポリペプチドは、ＤＮＡ５５７３７−１３４５として１９９８年４月６日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１８７】
６９．ＰＲＯ７７１
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７７１」と命名した、テスチカンと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７７１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１７９（配列番号：４４２）のアミノ酸残基１〜４３６を持つＰＲＯ７７１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７７１をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ４９８２９−１３４６としてＡＴＴＣに１９９８年４月７日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７７１ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７７１ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１７９（配列番号：４４２）の残基１〜４３６を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＲＯ７７１ポリペプチドは、ＤＮＡ４９８２９−１３４６としてＡＴＴＣに１９９８年４月７日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１８８】
７０．ＰＲＯ７３３
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７３３」と命名した、Ｔ１／ＳＴ２レセプター結合タンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７３３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１８１（配列番号：４４７）のアミノ酸残基１〜２２９を持つＰＲＯ７３３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７３３をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ５２１９６−１３４８としてＡＴＴＣに１９９８年４月７日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７３３ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７３３ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１８１（配列番号：４４７）の残基１〜２２９を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、ＰＲＯ７３３ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、ＰＲＯ７３３ポリペプチドは、ＤＮＡ５２１９６−１３４８として１９９８年４月７日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１８９】
７１．ＰＲＯ１６２
出願人は、本出願において「ＰＲＯ１６２」と命名した、膵炎随伴タンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１６２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１８３（配列番号：４５２）のアミノ酸残基１〜１７５を持つＰＲＯ１６２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ１６２をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ５６９６５−１３５６としてＡＴＴＣに１９９８年５月６日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ１６２ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ１６２ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１８３（配列番号：４５２）の残基１〜１７５を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＲＯ１６２ポリペプチドは、ＤＮＡ５６９６５−１３５６として１９９８年５月６日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１９０】
７２．ＰＲＯ７８８
出願人は、本出願において「ＰＲＯ７８８」と命名した、抗悪性腫瘍尿タンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ７８８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１８５（配列番号：４５４）のアミノ酸残基１〜１２５を持つＰＲＯ７８８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ７８８をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ５６４０５−１３５７としてＡＴＴＣに１９９８年５月６日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ７８８ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ７８８ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１８５（配列番号：４５４）の残基１〜１２５を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、ＰＲＯ７８８ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、ＰＲＯ７８８ポリペプチドは、ＤＮＡ５６４０５−１３５７として１９９８年５月６日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１９１】
７３．ＰＲＯ１００８
出願人は、本出願において「ＰＲＯ１００８」と命名した、ｄｉｃｋｋｏｐｆ−１（ｄｋｋ−１）と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１００８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１８７（配列番号：４５６）のアミノ酸残基１〜２６６を持つＰＲＯ１００８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ１００８をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ５７５３０−１３７５としてＡＴＴＣに１９９８年５月２０日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ１００８ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ１００８ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１８７（配列番号：４５６）の残基１〜２６６を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＲＯ１００８ポリペプチドは、ＤＮＡ５７５３０−１３７５として１９９８年５月２０日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ１６５０８と命名された、Ｆｉｇ１８８（配列番号：４５７）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０１９２】
７４．ＰＲＯ１０１２
出願人は、本出願において「ＰＲＯ１０１２」と命名した、ジスルフィドイソメレアーゼ及びホスホリパーゼＣと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１０１２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１９０（配列番号：４５９）のアミノ酸残基１〜７４７を持つＰＲＯ１０１２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ１０１２をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ５６４３９−１３７６としてＡＴＴＣに１９９８年５月１４日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ１０１２ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ１０１２ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１９０（配列番号：４５９）の残基１〜７４７を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＲＯ１０１２ポリペプチドは、ＤＮＡ５６４３９−１３７６として１９９８年５月１４日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１９３】
７５．ＰＲＯ１０１４
出願人は、本出願において「ＰＲＯ１０１４」と命名した、レダクターゼと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１０１４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１９２（配列番号：４６４）のアミノ酸残基１〜３００を持つＰＲＯ１０１４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ１０１４をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ５６４０９−１３７７としてＡＴＴＣに１９９８年５月２０日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ１０１４ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ１０１４ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１９２（配列番号：４６４）の残基１〜３００を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＲＯ１０１４ポリペプチドは、ＤＮＡ５６４０９−１３７７として１９９８年５月２０日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１９４】
７６．ＰＲＯ１０１７
出願人は、本出願において「ＰＲＯ１０１７」と命名した、ＨＮＫ−１スルホトランスフェラーゼと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１０１７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１９４（配列番号：４６６）のアミノ酸残基１〜４１４を持つＰＲＯ１０１７ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ１０１７をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ５６１１２−１３７９としてＡＴＴＣに１９９８年５月２０日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ１０１７ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ１０１７ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１９４（配列番号：４６６）の残基１〜４１４を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＲＯ１０１７ポリペプチドは、ＤＮＡ５６１１２−１３７９として１９９８年５月２０日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１９５】
７７．ＰＲＯ４７４
出願人は、本出願において「ＰＲＯ４７４」と命名した、デヒドロゲナーゼと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ４７４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１９６（配列番号：４６８）のアミノ酸残基１〜２７０を持つＰＲＯ４７４ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ４７４をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ５６０４５−１３８０としてＡＴＴＣに１９９８年５月１４日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ４７４ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ４７４ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１９６（配列番号：４６８）の残基１〜２７０を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＲＯ４７４ポリペプチドは、ＤＮＡ５６０４５−１３８０として１９９８年５月１４日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１９６】
７８．ＰＲＯ１０３１
出願人は、本出願において「ＰＲＯ１０３１」と命名した、ＩＬ−１７と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１０３１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ１９８（配列番号：４７０）のアミノ酸残基１〜１８０を持つＰＲＯ１０３１ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ１０３１をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ５９２９４−１３８１としてＡＴＴＣに１９９８年５月１４日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ１０３１ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ１０３１ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ１９８（配列番号：４７０）の残基１〜１８０を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＲＯ１０３１ポリペプチドは、ＤＮＡ５９２９４−１３８１として１９９８年５月１４日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１９７】
７９．ＰＲＯ９３８
出願人は、本出願において「ＰＲＯ９３８」と命名した、プロテインジスルフィドイソメラーゼと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ９３８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２００（配列番号：４７２）のアミノ酸残基１〜３４９を持つＰＲＯ９３８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２００（配列番号：４７２）のアミノ酸残基約２３〜３４９又はＦｉｇ２００（配列番号：４７２）のアミノ酸１もしくは約２３からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ２００（配列番号：４７２）の１８６〜１９５の任意のアミノ酸である）を持つＰＲＯ９３８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ９３８をコードするヌクレオチド配列を含むＡＴＣＣ受託番号２０９８５７として１９９８年５月１２日に寄託されたＤＮＡ５６４３３−１４０６ベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ９３８ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ９３８ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２００（配列番号：４７２）の残基１〜３４９を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Ｆｉｇ２００（配列番号：４７２）のアミノ酸約２３〜３４９あるいはＦｉｇ２００（配列番号：４７２）のアミノ酸１又は約２３からＸ（ここで、ＸはＦｉｇ２００（配列番号：４７２）の１８６〜１９５の任意のアミノ酸である）を含んでなるＰＲＯ９３８ポリペプチドに関する。場合によっては、ＰＲＯ９３８ポリペプチドは、ＡＴＣＣ受託番号２０９８５７として１９９８年５月１２日に寄託されたＤＮＡ５６４３３−１４０６ベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１９８】
８０．ＰＲＯ１０８２
出願人は、本出願において「ＰＲＯ１０８２」と命名した、レクチン様酸化ＬＤＬレセプターと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１０８２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２０２（配列番号：４７７）のアミノ酸残基１〜２０１を持つＰＲＯ１０８２ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ１０８２をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ５３９１２−１４５７としてＡＴＣＣに１９９８年５月１４日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ１０８２ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ１０８２ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２０２（配列番号：４７７）の残基１〜２０１を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、細胞外ドメインを除く、ＰＲＯ１０８２ポリペプチドの単離されたドメインに関する。場合によっては、ＰＲＯ１０８２ポリペプチドは、ＤＮＡ５３９１２−１４５７としてＡＴＣＣに１９９８年５月１４日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【０１９９】
８１．ＰＲＯ１０８３
出願人は、本出願において「ＰＲＯ１０８３」と命名した、７ＴＭレセプター、ラトロフィリン関連タンパク質１、及びマクロファージ制限細胞表面糖タンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ１０８３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２０４（配列番号：４８３）のアミノ酸残基１〜６９３を持つＰＲＯ１０８３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、ＰＲＯ１０８３をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡ５０９２１−１４５８としてＡＴＣＣに１９９８年５月１２日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ１０８３ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ１０８３ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２０４（配列番号：４８３）の残基１〜６９３を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様はＰＲＯ１０８３ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、ＰＲＯ１０８３ポリペプチドは、ＤＮＡ５０９２１−１４５８としてＡＴＣＣに１９９８年５月１２日に寄託されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにＤＮＡ２４２５６と命名された、Ｆｉｇ２０５（配列番号：４８４）のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０２００】
８２．ＰＲＯ２００
上記において一般的に記載した本発明の目的は、ここでＰＲＯ２００とも命名した新規なポリペプチドであるＶＥＧＦ−Ｅ（配列番号：４８８）、及びそれをコードする核、配列番号：４８７、残基２５９〜１２９３の提供による少なくとも部分的には達成される。
一実施態様では、本発明はＶＥＧＦ−ＥポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２０７（配列番号：４８８）のアミノ酸残基１〜３４５を持つＶＥＧＦ−ＥポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ｅ核酸が単一又は多重の欠失、置換、挿入、切り詰め又はその組み合わせを有する変異体が提供される。
他の実施態様では、本発明は単離されたＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２０７（配列番号：４８８）の残基１〜３４５を含んでなるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドが単一又は多重の欠失、置換、挿入、切り詰め又はその組み合わせを有する変異体が提供される。
また更なる実施態様では、本発明は、製薬的に許容可能な担体と混合してここに記載したＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドを治療的に有効量含有する、細胞の増殖、生存及び／又は分化が望まれる適応症を治療するために有用な組成物に関する。
本発明は、ＶＥＧＦ−Ｅと同じ生物活性を有する修飾ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド及び修飾変異体のようなＶＥＧＦ−Ｅの関連する実施態様、及びこれらを含有する製薬組成物を更に含む。ＶＥＧＦ−Ｅのインヒビターもまた提供される。
【０２０１】
８３．ＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６
出願人は、本出願においてＰＲＯ２８５（ＤＮＡ４００２１−１１５４によりコード）及びＰＲＯ２８６（ＤＮＡ４２６６３−１１５４によりコード）と命名した、新規なヒトＴｏｌｌポリペプチドをコードする二種の新規なｃＤＮＡクローンを同定した。
一実施態様では、本発明は、（ａ）Ｆｉｇ２０９（配列番号：４９６）のアミノ酸残基２７〜８３９を有するＰＲＯ２８５ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｂ）Ｆｉｇ２１１（配列番号：４９８）のアミノ酸残基２７〜８２５を有するＰＲＯ２８６ポリペプチドをコードしているＤＮＡ分子、又は（ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）のＤＮＡ分子の補体に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
更なる実施態様では、単離された核酸分子は、Ｆｉｇ２０９（配列番号：４９６）のアミノ酸１〜８３９の配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するか；Ｆｉｇ２１１（配列番号：４９８）のアミノ酸１〜１０４１の配列を含んでなるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドと少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなる。
特定の実施態様では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列を持つか持たず、各全長配列の膜貫通領域を持つか持たない、未変性又は変異体ＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Ｆｉｇ２０９（配列番号：４９６）のアミノ酸残基１〜１０４９及びＦｉｇ２１１（配列番号：４９８）のアミノ酸残基１〜１０４１を持つ成熟全長未変性ＰＲＯ２８５又はＰＲＯ２８６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的である。他の側面では、本発明は、Ｎ末端シグナル配列を持たない未変性ＰＲＯ２８５又はＰＲＯ２８６をコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸に相補的である単離された核酸分子に関する。更に他の実施態様では、本発明は全長未変性ＰＲＯ２８５又はＰＲＯ２８６タンパク質の膜貫通ドメイン欠失又は不活性化型をコードする核酸に関する。
他の実施態様では、単離された核酸分子は、ＡＴＣＣ番号２０９３８９として１９９７年１０月１７日に寄託されたクローン（ＤＮＡ４００２１−１１５４）；又はＡＴＣＣ番号２０９３８６として１９９７年１０月１７日に寄託されたクローン（ＤＮＡ４２６６３−１１５４）を含んでなる。
更に他の実施態様では、本発明はＰＲＯ２８５又はＰＲＯ２８６をコードするＤＮＡを含んでなるベクター、又はその変異体を提供する。しかして、ベクターは、上述した単離核酸分子の任意のものを含みうる。
【０２０２】
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２０９及び２１１（配列番号：４９６及び４９８）の残基１〜１０４９及び１〜１０４１を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明はまた上に記載した単離核酸分子の任意のものによりコードされるＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６の変異体も提供する。特定の変異体には、これらに限定されるものではないが、各Ｎ末端シグナル配列を欠くか及び／又はその各膜貫通及び／又は細胞質ドメインが欠失もしくは不活性化された全長未変性配列ＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６ポリペプチドの欠失（切り詰め）変異体が含まれる。
本発明はまた二重特異性を持つ抗体、例えば一を越えるＴｏｌｌペプチドに結合する二重特異的抗体を特に含む。
更に他の実施態様では、本発明は未変性ＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６ポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗ＰＲＯ２８５又は抗ＰＲＯ２８６抗体である。
更なる実施態様では、本発明は未変性のＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するスクリーニング検定法に関する。
また更なる実施態様では、本発明は、製薬的に許容可能な担体と組み合わせて、ＰＲＯ２８５又はＰＲＯ２８６ポリペプチド、又は上述したアゴニスト又はアンタゴニストを含有してなる組成物に関する。
本発明はまたＰＲＯ２８５又はＰＲＯ２８６ポリペプチドのアンタゴニストの有効量を患者に投与することを含んでなる感染性ショックを治療する方法に関する。特定の実施態様では、アンタゴニストは未変性ＰＲＯ２８５又はＰＲＯ２８６ポリペプチドを特異的に結合する阻止抗体である。
【０２０３】
８４．ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及びＰＲＯ１４４９
本発明は、ヒトを含む哺乳類における腫瘍性細胞成長及び増殖の診断と治療のための組成物と方法に関する。本発明は腫瘍細胞のゲノムにおいて増幅される遺伝子の同定に基づく。そのような遺伝子増幅には遺伝子産物の過剰発現が付随し腫瘍形成に寄与すると予想される。従って、増幅された遺伝子によりコードされるタンパク質は、ある種のガンの診断及び／又は治療（予防を含む）に対する有用な標的であると信じられ、腫瘍治療の予後のプレディクターとして作用しうる。
一実施態様では、本発明は、ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸分子は、Ｆｉｇ２１３（配列番号：５０６）のアミノ酸残基１〜２９５、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）の２０〜２７３及びＦｉｇ２１７（配列番号：５１０）の２０〜２７３を有するＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、１９９８年４月２１日に寄託されたＤＮＡ３０９４３−１１６３（ＡＴＴＣ２０９７９１）、１９９８年９月９日に寄託されたＤＮＡ６４９０７−１１６３−１（ＡＴＴＣ２０３２４２）及び／又は１９９８年９月９日に寄託されたＤＮＡ６４９０８−１１６３−１（ＡＴＴＣ２０３２４３）と命名されたベクターのｃＤＮＡ挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は、（ａ）Ｆｉｇ２１３（配列番号：５０６）のアミノ酸残基１〜２９５、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）の２０〜２７３及びＦｉｇ２１７（配列番号：５１０）の２０〜２７３をそれぞれ有するＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する単離された核酸分子を含んでなる。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２１３（配列番号：５０６）の残基１〜２９５、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）の２０〜２７３又はＦｉｇ２１７（配列番号：５１０）の２０〜２７３をそれぞれ含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドは、ＤＮＡ３０９４３−１１６３（ＡＴＴＣ２０９７９１）、ＤＮＡ６４９０７−１１６３−１（ＡＴＴＣ２０３２４２）又はＤＮＡ６４９０８−１１６３−１（ＡＴＴＣ２０３２４３）のｃＤＮＡ挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の側面では、本発明は、Ｆｉｇ２１３（配列番号：５０６）のアミノ酸残基１〜２９５、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）の２０〜２７３又はＦｉｇ２１７（配列番号：５１０）の２０〜２７３に少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドを提供する。
更に他の実施態様では、本発明は、Ｆｉｇ２１３（配列番号：５０６）のアミノ酸残基１〜２９５、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）の２０〜２７３又はＦｉｇ２１７（配列番号：５１０）の２０〜２７３を含んでなる、単離されたＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチド、又は抗ＰＲＯ２１３−１、抗ＰＲＯ１３３０及び／又は抗ＰＲＯ１４４９抗体を提供するのに十分なその断片を提供する。好ましくは、ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９断片は未変性のＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドの定性的生物活性を保持する。
【０２０４】
更なる側面では、本発明は、Ｆｉｇ２１３（配列番号：５０６）の残基１〜２９５、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）の２０〜２７３及びＦｉｇ２１７（配列番号：５１０）の２０〜２７３のアミノ酸配列とそれぞれ比較したとき、少なくとも約８０％のポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％のポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％のポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％のポジティブのスコアを示すアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドに関する。
また更なる側面では、本発明は、（ｉ）被験ＤＮＡ分子をストリンジェントな条件下で、（ａ）Ｆｉｇ２１３（配列番号：５０６）の１〜２９５、Ｆｉｇ２１５（配列番号：５０８）の２０〜２７３及びＦｉｇ２１７（配列番号：５１０）の２０〜２７３のアミノ酸残基を有するＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドをそれぞれコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体と、ハイブリダイズさせ、被験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有していれば、（ｉｉ）被験ＤＮＡ分子を含んでなる宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、（ｉｉｉ）細胞培養からポリペプチドを回収することにより生産されるポリペプチドを提供する。
一実施態様では、本発明はＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドに結合する単離された抗体に関する。一側面では、ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドを過剰発現する細胞の死を誘導する。他の側面では、抗体はモノクローナル抗体であり、これは好ましくは非ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）残基及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）酸基を有する。抗体は標識されても固体支持体上に固定化されてもよい。更なる側面では、抗体は抗体断片、単鎖抗体、又は抗イディオタイプ抗体である。
他の実施態様では、本発明は、製薬的に許容可能な担体と混合して、ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドに結合する抗体を含有する組成物に関する。一側面では、組成物は治療的に有効量の抗体を含有する。他の側面では、組成物は更に活性成分を含有し、この成分は例えば更なる抗体又は細胞毒性もしくは化学療法剤でありうる。好ましくは組成物は無菌である。
更なる実施態様では、本発明は抗ＰＲＯ２１３−１、抗ＰＲＯ１３３０及び／又は抗ＰＲＯ１４４９抗体をコードする核酸、及びそのような核酸を含んでなるベクター及び宿主細胞に関する。
本発明は更にＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドの機能又は活性の一又は複数を阻害するＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドのアンタゴニスト及びアゴニストに関する。
更なる実施態様では、本発明はＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドをコードする核酸分子の補体にハイブリダイズする単離された核酸分子に関する。核酸分子は好ましくはＤＮＡであり、ハイブリダイゼーションは好ましくはストリンジェントな条件下で生じる。そのような核酸分子は、ここで同定された増幅遺伝子のアンチセンス分子として作用し、これにより、各増幅遺伝子の変調における用途、あるいは増幅反応におけるアンチセンスプライマーとしての用途が見出される。更に、そのような配列はリボザイム及び／又は三重らせん体配列の一部として使用でき、これにより、増幅遺伝子の調節に使用されうる。
他の実施態様では、本発明は、ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドを含む疑いのある細胞を抗ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９抗体に暴露し、細胞への抗体の結合性を測定することを含んでなる、ポリペプチドＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドの有無を測定する方法に関する。
更に他の実施態様では、本発明は、（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞の被験試料と（ｂ）同じ細胞型の既知の正常な組織細胞の対照試料中で、ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドをコードする遺伝子の発現のレベルを検出することを含んでなる、哺乳動物における腫瘍の診断方法に関し、ここで、被験試料の高い発現レベルが、被験組織細胞が得られた哺乳動物中に腫瘍が存在することを示す。
【０２０５】
他の実施態様では、本発明は、（ａ）哺乳動物から得られた組織細胞の被験試料に抗ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９抗体を接触させ、（ｂ）被験試料中における抗ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９抗体とＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドの間の複合体の生成を検出することを含んでなる、哺乳動物における腫瘍の診断方法に関する。検出は定量的とも定性的ともしえ、同じ細胞型の既知の正常な組織細胞の対照試料における複合体の生成をモニターして比較しながらなされる。被験試料中に生成された多量の複合体が、被験組織細胞が得られた哺乳動物中に腫瘍が存在することを示す。抗体は好ましくは検出可能な標識を担持する。複合体生成は、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、あるいは他の当該分野で知られている方法によりモニターすることができる。被験試料は通常は腫瘍細成長又は増殖（例えば癌細胞）を有する疑いのある個人から得られる。
他の実施態様では、本発明は、抗ＰＲＯ２１３−１、抗ＰＲＯ１３３０及び／又は抗ＰＲＯ１４４９抗体と担体（例えばバッファー）を適当な包装中に含んでなるガン診断キットに関する。好ましくはキットはＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドを検出するために抗体を使用するための指示を含む。
更なる他の実施態様では、本発明は、ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドを過剰発現する細胞を、ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害する有効量の薬剤に暴露することを含んでなる、腫瘍細胞の増殖を阻止する方法に関する。該薬剤は好ましくは抗ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９抗体、小さい無機及び有機分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス又はリボザイム分子、あるいは三重らせん体分子である。特定の側面では、該薬剤、例えば抗ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９抗体は細胞死を誘導する。更なる側面では、腫瘍細胞は放射線治療及び／又は細胞毒性又は化学療法剤に更に暴露される。
更なる実施態様において、本発明は、
ａ）　容器；
ｂ）　容器上のラベル；及び
ｃ）　容器内に含まれる活性剤を含有する組成物を含んでなる、製造物品に関し、ここで組成物は、腫瘍細胞の増殖を阻止するのに有効であり、容器上のラベルには、組成物がＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドの過剰発現により特徴づけられる症状を治療するために使用でき、組成物中の活性剤は、ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害する薬剤であることが示される。好適な側面では、活性剤は、抗ＰＲＯ２１３−１、抗ＰＲＯ１３３０及び／又は抗ＰＲＯ１４４９抗体である。
また更なる実施態様では、本発明は、候補化合物をＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドと、これら二つの化合物が相互作用するのに十分な条件と時間の間接触させることを含んでなる、ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドの発現及び／又は活性を阻害可能な化合物を同定する方法を提供する。特定の側面では、候補化合物かＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドの何れかが固体支持体上に固定化される。他の側面では、非固定化成分が検出可能な標識を担持する。
【０２０６】
８５．ＰＲＯ２９８
出願人は新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定した。ＤＮＡは本出願において「ＰＲＯ２９８」と称される、新規な多膜貫通タンパク質をコードする「ＤＮＡ３９９７５−１２１０」と命名した。
一実施態様では、本発明は、（ａ）Ｆｉｇ２１９（配列番号：５１５）のアミノ酸１〜３６４の配列を含んでなるＰＲＯ２９８をコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、図２１９（配列番号５１５）のアミノ酸残基１〜３６４を持つＰＲＯ２９８ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。
更なる実施態様では、本発明は、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９７８３（ＤＮＡ３９９７５−１２１０）のヒトタンパク質ｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体と少なくとも８０％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子に関する。
また更なる実施態様では、本発明は、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７８３（ＤＮＡ３９９７５−１２１０）のヒトタンパク質ｃＤＮＡによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子を含んでなる核酸に関する。
他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ２９８ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ２９８ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２１９（配列番号：５１５）の残基１〜３６４を含んでなるアミノ酸配列を含む。
多の実施態様では、本発明はＦｉｇ２２０（配列番号：５１６）のヌクレオチド配列を含んでなるＤＮＡ２６８３２と命名された、発現された配列タグ（ＥＳＴ）を提供する。
【０２０７】
８６．ＰＲＯ３３７
出願人は、本出願において「ＰＲＯ３３７」と命名した新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ４３３１６−１２３７）を同定した。
一実施態様では、本発明は、（ａ）Ｆｉｇ２２２（配列番号：５２３）のアミノ酸１〜３４４の配列を含んでなるＰＲＯ３３７ポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有する単離された核酸分子を提供する。配列同一性は、好ましくは約８５％、より好ましくは約９０％、最も好ましくは約９５％である。一側面では、単離された核酸は、図２２２（配列番号５２３）のアミノ酸残基１〜３４４を持つポリペプチドと少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％（９６、９７、９８及び９９％を含む）の配列同一性を有する。好ましくは、配列同一性の最も高い度合いは、免疫グロブリン及び主要組織適合性ドメイン（図２２２、配列番号５２３のアミノ酸１１３〜１３０）内で生じる。
更なる実施態様では、単離された核酸分子は、Ｆｉｇ２２２（配列番号：５２３）のアミノ酸残基約１〜３４４を持つニューロトリミンポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、本発明は、受託番号ＡＴＣＣ２０９４８７でＡＴＴＣに寄託されたクローンＤＮＡ４３３１６−１２３７の全長タンパク質の核酸、あるいは受託番号ＡＴＣＣ２０９４８７で寄託されたクローンＤＮＡ４３３１６−１２３７のコード配列を提供する。
更に他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ３３７ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ３３７ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２２２（配列番号：５２３）の残基１〜３４４を含んでなるアミノ酸配列を含む。未変性シグナル配列を持つか持たず（Ｆｉｇ２２２（配列番号：５２３）のアミノ酸１〜約２８）、開始メチオニンを持つか持たない未変性ＰＲＯ３３７ポリペプチドが特に含まれる。あるいは、本発明は、受託番号ＡＴＣＣ２０９４８７で寄託された核酸によりコードされるＰＲＯ３３７ポリペプチドを提供する。
更に他の実施態様では、本発明はＤＮＡ４２３０１（配列番号：５２４）としてＦｉｇ２２３において同定されたヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）及び他の配列断片を提供する。
【０２０８】
８７．ＰＲＯ４０３
出願人は、本出願において「ＰＲＯ４０３」と命名した新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ５５８００−１２６３）を同定した。
一実施態様では、本発明は、（ａ）Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）のアミノ酸１〜７３６の配列を含んでなるＰＲＯ４０３ポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有する単離された核酸分子を提供する。配列同一性は、好ましくは約８５％、より好ましくは約９０％、最も好ましくは約９５％である。一側面では、単離された核酸は、図２２５（配列番号５２６）のアミノ酸残基１〜７３６を持つポリペプチドと少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する。好ましくは、配列同一性の最も高い度合いは、（１）推定上のＮグリコシル化部位（アミノ酸残基１３２、１３６、１７７、２３７、２８２、３４９、５０５、５９８及び６０６）；（２）Ｋｅｌｌ血液型タンパク質ファミリー（アミノ酸残基６５、７０、８８及び９６）及び推定上の亜鉛結合モチーフ（アミノ酸残基５７０−５７９）が保存されたＣｙｓ残基内で生じる。
更なる実施態様では、単離された核酸分子は、Ｆｉｇ２２５（配列番号：５２６）のアミノ酸残基約１〜７３６を持つＰＲＯ４０３ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、本発明は、受託番号ＡＴＣＣ２０９６８０でＡＴＴＣに寄託されたクローンＤＮＡ５５８００−１２６３の全長タンパク質の核酸、あるいは受託番号ＡＴＣＣ２０９６８０で寄託されたクローンＤＮＡ５５８００−１２６３のコード配列を提供する。
更に他の実施態様では、本発明は単離されたＰＲＯ４０３ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列ＰＲＯ４０３ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではＦｉｇ２２５（配列番号：５２６）の残基１〜７３６を含んでなるアミノ酸配列を含む。開始メチオニンを持つか持たない未変性ＰＲＯ４０３ポリペプチドが特に含まれる。あるいは、本発明は、受託番号ＡＴＣＣ２０９６８０で寄託された核酸によりコードされるＰＲＯ４０３ポリペプチドを提供する。
更に他の実施態様では、本発明はここにＤＮＡ３４４１５（Ｆｉｇ２２６Ａ−Ｂ；配列番号：５２７）；ＤＮＡ４９８３０（Ｆｉｇ２２７；配列番号：５２８）及びＤＮＡ４９８３１（Ｆｉｇ２２８；配列番号：５２９）として同定されたヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ（ＥＳＴ）及び他の配列断片を提供する。
【０２０９】
８８．更なる実施態様
本発明の他の実施態様では、本発明は上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものをコードするＤＮＡを含んでなるベクターを提供する。そのようなベクターを含んでなる宿主細胞もまた提供される。例を挙げると、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母である。上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものを製造する方法が更に提供され、これは、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養から所望のポリペプチドを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例としては、免疫グロブリンのＦｃ領域又はエピトープタグ配列に融合した上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものが含まれる。
他の実施態様では、本発明は上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体である。
また他の実施態様では、本発明はゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列を単離するのに有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、これらプローブは上述したあるいは後記するヌクレオチド配列の任意のものから取り出されうる。
【０２１０】
他の実施態様では、本発明はＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
一側面においては、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示されている全長アミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを伴う又は伴わない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン，又はここに開示されている全長アミノ酸配列の全ての特異的に定義された断片、或いは（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約８２％配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８３％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８４％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８６％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８７％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８８％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８９％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９１％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９２％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９４％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる。
他の側面においては、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示されている全長ＰＲＯポリペプチドｃＤＮＡのコード化配列を含んでなるＤＮＡ分子、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くＰＲＯポリペプチドのコード化配列、ここに開示されているシグナルペプチドを伴う又は伴わない膜貫通ＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメインのコード化配列、又はここに開示されている全長アミノ酸配列の全ての特異的に定義された断片のコード化配列、或いは（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約８２％配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８３％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８４％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８６％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８７％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８８％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８９％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９１％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９２％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９４％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる。
【０２１１】
さらなる側面においては、本発明は、（ａ）ここに開示されているＡＴＣＣへ寄託されている全てのヒトタンパク質ｃＤＮＡによってコードされているのと同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の補体に対して少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約８２％配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８３％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８４％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８６％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８７％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８８％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８９％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９１％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９２％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９４％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。
その他の側面において、本発明は、ＰＲＯポリペプチドの膜貫通タンパク質がここにおいて開示されていて、膜貫通ドメイン欠損又は膜貫通ドメイン不活性化となっているＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、或いはそのようなヌクレオチド配列に対して相補的なを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
【０２１２】
その他の実施態様では、例えば、抗−ＰＲＯ抗体の結合部位を含むポリペプチドを選択的にコードするＰＲＯポリペプチドのコード化断片のためのハイブリダイゼーションプローブ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての使用を見出すことができるＰＲＯポリペプチドコード化配列の断片、又はその補体について向けられている。そのような核酸断片は、文脈において「約」という語句が引用されているヌクレオチド配列の長さのプラス又はマイナス１０％を意味していて、通常少なくとも約２０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約３０ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも約４０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約５０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約７０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約８０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約９０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約１１０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約１３０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約１４０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約１６０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約１７０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約１９０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約２００ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約２５０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約３００ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約３５０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約４００ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約５００ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約６００ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約７００ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約８００ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約９００ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約１０００ヌクレオチド長である。ＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規の断片は、任意の良く知られた配列アライメントプログラムを使用し、ＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の既知のヌクレオチド配列を整列させ、どのＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるのかを決定することによる日常的方法によって決定が可能であることは注目される。全てのそのようなＰＲＯポリペプチドコード化配列はが、本出願において検討される。さらに、検討されるのは、これらヌクレオチド配列断片によってコードされているＰＲＯポリペプチド、好ましくは抗−ＰＲＯ抗体の結合部位を含むこれらＰＲＯポリペプチド断片である。
【０２１３】
その他の実施態様では、本発明は、上文において特定された全ての単離された核酸配列によってコードされている単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。
ある側面においては、本発明は、ここに開示されている全長アミノ酸配列を有する全長ＰＲＯポリペプチド、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを伴う又は伴わない膜貫通ＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示されている全長アミノ酸配列の全ての特異的に定義された断片に対して少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約８２％配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８３％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８４％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８６％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８７％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８８％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８９％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９１％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９２％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９４％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
さらなる側面においては、本発明は、ここに開示されたＡＴＣＣへ寄託された全てのヒトタンパク質ｃＤＮＡによってコードされているアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約８２％配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８３％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８４％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８６％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８７％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８８％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも８９％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９１％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９２％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９３％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９４％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９６％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９７％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
【０２１４】
さらなる側面においては、本発明は、ここに開示されている全長アミノ酸配列を有するＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを伴う又は伴わない膜貫通ＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示されている全長アミノ酸配列の全ての特異的に定義された断片と比較して、少なくとも約８０％の陽性（ポジティブ）、好ましくは少なくとも約８１％の陽性（ポジティブ）、さらに好ましくは少なくとも約８２％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも８３％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも８４％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも８５％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも８６％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも８７％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも８８％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも８９％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも９０％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも９１％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも９２％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも９３％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも９４％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも９５％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも９６％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも９７％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも９８％の陽性（ポジティブ）、なおさらに好ましくは少なくとも９９％の陽性（ポジティブ）のスコアのアミノ酸配列を含む単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
特別な側面においては、本発明は、Ｎ−末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを含まず、前記に記載したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされている単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。ＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下にある適切なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞の培養、及びＰＲＯポリペプチドを培養細胞から回収することを含む工程である、単離されたＰＲＯポリペプチドを生産する工程が同じくここに開示されている。
【０２１５】
その他の側面においては、本発明は、膜貫通ドメイン欠損又は膜貫通ドメイン不活性の単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。ＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下にある適切なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞の培養、及びＰＲＯポリペプチドを培養細胞から回収することを含む工程である、単離されたＰＲＯポリペプチドを生産する工程が同じくここに開示されている。
さらなるその他の実施態様においては、ここにおいて開示される天然ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様においては、アゴニスト又はアンタゴニストは、抗−ＰＲＯ抗体又は小分子である。
さらなる実施態様においては、ＰＲＯポリペプチドを候補化合物と接触せしめ、そして前記ＰＲＯポリペプチドによって仲介される生物活性を監視することを含むＰＲＯポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関する。好ましくは、ＰＲＯポリペプチドは天然ＰＲＯポリペプチドである。
さらにさらなる実施態様においては、本発明は、ＰＲＯポリペプチド、又はここに開示されるＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、抗−ＰＲＯ抗体を含んでなる製造品で容器との組合せに関する。選択的には、容器は、製薬的に許容しうるものである。
本発明のその他の実施態様は、ＰＲＯポリペプチドの使用、又はＰＲＯポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト或いは抗−ＰＲＯ抗体に対して反応性のある条件の治療に有効な薬剤の調製のための前文に記載したようなＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗−ＰＲＯ抗体を対象としている。
【０２１６】
（好適な実施態様の詳細な説明）
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＰＲＯポリペプチド」及び「ＰＲＯ」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号（例えば、ＰＲＯ／数字）は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。ここで使用される「ＰＲＯ／数字ポリペプチド」及び「ＰＲＯ／数字」は、天然配列ポリペプチド及び変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。ここの記載されるＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。
「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、天然由来の対応するＰＲＯポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＰＲＯポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＰＲＯポリペプチド」という用語には、特に、特定のＰＲＯポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態（例えば、細胞外ドメイン配列）、自然に生じる変異形態（例えば、選択的にスプライシングされた形態）及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここに開示されている天然配列ＰＲＯポリペプチドは、関連する図に示されている全長アミノ酸配列を含有する成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び終止コドンは、太い書体及び下線で図中に示さている。しかし、関連する図に開示されているＰＲＯポリペプチドがメチオニン残基で開始すると図のアミノ酸位置１において示されている一方で、図のアミノ酸位置１より上流又は下流のいずれかに位置する他のメチオニン残基が、ＰＲＯポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられることが考えられるし可能である。
【０２１７】
ＰＲＯポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＰＲＯポリペプチドの形態を意味する。通常、ＰＲＯポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＰＲＯポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、ＰＲＯポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又明細書おいてに同定された膜貫通ドメインのいずれかの末端から約５を越えないアミノ酸を含みうるし、付着のシグナルペプチドを有する又は有しないそのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明において考慮される。
ここに開示する種々のＰＲＯポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書と添付の図面に示される。しかし、注記するように、シグナルペプチドのＣ−末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ−末端境界のいずれかの側で約５アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ−末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ等， Ｐｒｏｔ． Ｅｎｇ． １０： １−６ （１９９７）及びｖｏｎ Ｈｅｉｎｊｅ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １４： ４６８３−４６９０ （１９８６））。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに定義されるシグナルペプチドのＣ−末端境界の何れかの側の約５アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
【０２１８】
「ＰＲＯポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される全長天然配列ＰＲＯポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたＰＲＯの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドの他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＰＲＯポリペプチドを意味する。このようなＰＲＯポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ−又はＣ−末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＰＲＯポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯポリペプチド変異体は、ここに開示される全長天然アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたＰＲＯの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドの他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、より多くは少なくとも約２０アミノ酸長、より多くは少なくとも約３０アミノ酸長、より多くは少なくとも約４０アミノ酸長、より多くは少なくとも約５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約６０アミノ酸長、より多くは少なくとも約７０アミノ酸長、より多くは少なくとも約８０アミノ酸長、より多くは少なくとも約９０アミノ酸長、より多くは少なくとも約１００アミノ酸長、より多くは少なくとも約１５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約２００アミノ酸長、より多くは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【０２１９】
ここに定義されるＰＲＯポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較プログラムＡＬＩＧＮ−２を使用することによって得られ。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２はジェネンテク社、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから好適に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【０２２０】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、「ＰＲＯ」が対象となる仮説的ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」が対象となる「比較」タンパク質が比較されているアミノ酸配列を表し、そして「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表２及び３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【０２２１】
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６））を用いて決定してもよい。さらに、殆どのＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ここでの目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドが比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Ａが対象とする比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列である。
【０２２２】
また、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードできる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
アミノ酸配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【０２２３】
「ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここに開示する全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示するＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。通常は、ＰＲＯ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、ここに開示する全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示するＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチドの他の任意の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。
通常は、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約９０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約３００ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６００ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【０２２４】
ここで同定されるＰＲＯコード化核酸配列に対する「パーセント（％）核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＰＲＯ配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ−２プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較プログラＡＬＩＧＮ−２を使用することによって得られ。ＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．， ２０５５９に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている。ＡＬＩＧＮ−２はジェネンテク社、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから好適に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、ＵＮＩＸオペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ−２プログラムによって設定され変動しない。
【０２２５】
核酸配列比較にＡＬＩＧＮ−２が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。
核酸配列Ｃの長さがアミノ酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％核酸配列同一性の計算の例として、「ＰＲＯ−ＤＮＡ」が対象となる仮説的ＰＲＯコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」が対象となる「ＰＲＯ−ＤＮＡ」核酸分子が比較されている核酸配列を表し、そして「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表４及び５が「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ−ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
【０２２６】
特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ−２配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性値は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６））を用いて決定してもよい。さらに、殆どのＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２が用いられた場合、％核酸配列同一性値は、（ａ）天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、対象とする比較核酸配列（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子が比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって決定した一致する同一核酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂに対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、核酸配列Ａが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
【０２２７】
また、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５： ３３８９−３４０２ （１９９７））を用いて決定してもよい。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２配列比較プログラムは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖからダウンロードできる。ＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、ｕｎｍａｓｋ＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ−値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２を含む。
核酸配列比較にＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
他の実施態様では、ＰＲＯ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、活性ＰＲＯポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、ここに開示する全長ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成する核酸分子である。ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【０２２８】
「陽性（ポジティブ）」という用語は、上記のように実施された配列比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有している残基（例えば、保存的置換の結果として、下記の表６参照）を含む。ここでの目的のために、陽性の％値は、（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列（即ち、ＰＲＯポリペプチド配列が比較されるアミノ酸配列）との間の、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＯＳＵＭ６２マトリクス内でポジティブな値を記録したアミノ酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基の総数で除した商によって決定される。
特に断らない限り、陽性の％値は、直上のパラグラフに記載したようにして計算される。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、ＡＬＩＧＮ−２及びＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２について上記したように実施されるアミノ酸配列同一性には、同一のみならず類似した特性をもつ配列におけるアミノ酸残基を含む。対象とするアミノ酸残基に対して陽性とされたアミノ酸残基は、対象とするアミノ酸残基と同一であるか、又は対象とするアミノ酸残基の好ましい置換（下記の表６に定義）であるものである。
ＡＬＩＧＮ−２又はＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２を用いたアミノ酸配列比較では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する陽性の％値（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ−２又はＮＣＢＩ−ＢＬＡＳＴ２のＡ及びＢのアラインメントによって陽性であるとされたスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％陽性は、ＢのＡに対する％陽性とは異なることが理解されるであろう。
【０２２９】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、（１）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（２）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
「単離された」ＰＲＯポリペプチドコード化核酸は、同定され、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＰＲＯポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるＰＲＯポリペプチド核酸分子を含む。
【０２３０】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【０２３１】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗−ＰＲＯポリペプチドモノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む）、多エピトープ特異性を持つ抗−ＰＲＯ抗体組成物、一本鎖抗−ＰＲＯ抗体、及び抗−ＰＲＯ抗体の断片を包含している（下記参照）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ａｕｓｕｂｅｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， （１９９５）を参照のこと。
【０２３２】
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１ｘＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【０２３３】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＰＲＯポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするＰＲＯポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基（好ましくは約１０〜約２０の残基）を有する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【０２３４】
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＰＲＯポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯの形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯによって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は天然発生ＰＲＯが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＰＲＯポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子、などを含む。ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、ＰＲＯポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させ、ＰＲＯポリペプチドに通常付随する一又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含みうる。
【０２３５】
ここで使用される「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両方を意味し、患者は標的とする病理学的状態又はしっかんを防止又は低下（減少）させられる。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【０２３６】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商品名）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）を含む。
【０２３７】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ（ｄｉｓｂｏｄｉｅｓ）；直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａ等， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． ８（１０）： １０５７−１０６２ ［１９９５］）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ（ａｂ’）２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬに量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、６つのＣＤＲｓが抗体にたいする抗原結合特異性を持つ。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりＦａｂ断片と相違する。ここで、Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ’を表す。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初はＦａｂ’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【０２３８】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、
ＩｇＧ４、ＩｇＡ及びＩｇＡ２に分類される。
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓＦＶが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ｖｏｌ． １１３， Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ及びＭｏｏｒｅ編， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２６９−３１５ （１９９４）のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照のこと。
用語「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、ＥＰ ４０４，０９７； ＷＯ ９３／１１１６１； 及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ６４４４−６４４８ （１９９３）により十分に記載されている。
【０２３９】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリ法（Ｌｏｗｒｙ ｍｅｔｈｏｄ）で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、（３）クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に抱合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第４，２７５，１４９号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ＰＲＯポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
【０２４０】
ここで用いられる場合の「血管内皮細胞成長因子−Ｅ」又は「ＶＥＧＦ−Ｅ」は、Ｆｉｇ２０７のヒトアミノ酸配列を含むここに記載する哺乳動物成長因子、ＶＥＧＦ及び骨形成タンパク質１と相同性を持つ、及びＶＥＧＦの生物学的活性に必要なことが示されたＶＥＧＦの全システイン残基の完全変換を含む配列を意味する。ＶＥＧＦ−Ｅ発現は、ヒト胎児骨、胸腺、及び胃腸管における発現を含む。天然ＶＥＧＦ−Ｅの生物学的活性は、その任意の類似物又は変異体に共有され、それは、臍静脈内皮細胞の選択的成長及び／又は生存を促進でき、多能性繊維芽細胞の分化を誘発し、ヒト内皮細胞系における初期遺伝子ｃ−ｆｏｓを誘発し、心臓細胞において筋細胞肥大を生ずる、又は対応する天然ＶＥＧＦ−Ｅの少なくとも１つのエピトープに対して生じた抗体と免疫学的交差反応性である免疫エピトープを有する。ここで、ヒトＶＥＧＦ−Ｅは、種に渡っての保存を示すラット及びマウスに対して活性である。さらに、ここのＶＥＧＦ−Ｅは、成長板領域で発現され、胎児筋細胞を包含することが示された。
ここで用いられる場合の「血管内皮細胞成長因子」又は「ＶＥＧＦ」は、米国特許第５，３３２，６７１号に定義されている哺乳動物成長因子を意味する。天然ＶＥＧＦの生物学的活性は、それらの類似物又は変異体によって共有され、それらは血管内皮細胞の選択的成長促進できるが、ウシ角膜内皮細胞、レンズ内皮細胞、副腎皮質細胞、ＢＨＫ−２１繊維芽、又はケラチノサイトはせず、又は対応する天然ＶＥＧＦの少なくとも１つのエピトープに対して生じた抗体と免疫学的交差反応性である免疫エピトープを有する。
【０２４１】
用語「ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド」及び「ＶＥＧＦ−Ｅ」は、ここで用いる場合、天然配列ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド及びＶＥＧＦ−Ｅポリペプチド変異体（ここで更に定義する）を含む。ＶＥＧＦ−Ｅポリペプチドは、ヒト組織型等の種々の供給源から、又は他の供給源から単離しても、組換え又は合成方法により調製してもよい。
ＶＥＧＦ−Ｅの阻害剤は、ＶＥＧＦ−Ｅの発現又は活性を減じる或いは阻害するものを含み、そしてアンチセンス分子を含む。
略語「ＫＤＲ」は、ＶＥＧＦ分子のキナーゼドメイン領域に相当する。ＶＥＧＦ−Ｅは、このドメインにおいてＶＥＧＦとの相同性を有しない。
略語「ＦＬＴ−１」は、対応するＦＬＴ−１受容体と結合することが知られているＦＭＳ様チロシンキナーゼ結合ドメインに相当する。
「Ｔｏｌｌレセプター２」、「ＴＬＲ２」及び「ｈｕＴＬＲ２」は交換可能に用いられ、Ｒｏｃｋ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５， ５８８−５９３ （１９９８）により「ｈｕＴＬＲ２」と命名されたヒトＴｏｌｌレセプターを意味する。
【０２４２】
「リポ多糖」又は「ＬＰＳ」は、ここで「エンドトキシン」の同義語として用いられる。リポ多糖（ＬＰＳ）は、グラム陰性菌、例えば大腸菌の外膜の特徴的成分である。それらは多糖部分と脂質Ａと呼ばれる脂肪部分とからなる。一細菌種から他に変化する多糖は、Ｏ−特異的鎖（３〜８糖の繰り返し単位から構成される）及び２部コアからなる。脂質Ａは実際に、リン酸及び種々の数の脂肪酸で修飾された２つのグルコサミン糖を常に含む。さらなる情報については、例えば、Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ及びＢｒａｄｅ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｕｇｕｓｔ １９９２， ５４−６２を参照のこと。
「敗血性ショック」は、ここでは最も広い意味で用いられ、Ｂｏｎｅ， Ａｎｎ． Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ． １１４， ３３２−３３３ （１９９１）に記載された全ての定義を含む。特に、敗血性ショックは、感染に対する全身性反応で始まる、敗血症と呼ばれる症候群である。この症候群は低血圧及び器官不全をもたらし、それは敗血性ショックと呼ばれる。敗血性ショックは、グラム陽性生物及び真菌、並びにエンドトキシン含有グラム陰性生物によって開始されうる。従って、この定義は「エンドトキシンショック」に限定されない。
「遺伝子増幅」及び「遺伝子複製」なる語句は交換可能に用いられ、遺伝子又は遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞又は細胞系で生成されるプロセスを意味する。複製された領域（増幅されたＤＮＡの伸展）は、しばしば「単位複製配列」と呼ばれる。通常は、生成されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量、即ち遺伝子発現レベルも、発現された特定遺伝子の作成されたコピー数に比例して増加する。
【０２４３】
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
ここで用いられる「細胞毒性薬」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体（例えば、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０及びＲｅ１８６）、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素等の毒素、又はそれらの断片を含むことを意図する。
【０２４４】
「化学治療薬」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学治療薬の例には、アドリアマイシン、エピルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）、及びドキセタキセル（タキソテア、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ， Ａｎｔｏｎｙ， Ｆｒａｎｃｅ）、トキソテア、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン（米国特許第４，６７５，１８７号参照）、メルファラン及び関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、タモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように機能するホルモン薬もこの定義に含まれる。
「成長阻害薬」は、ここで用いられる場合、インビトロ又はインビボで、細胞、特にここに定義される遺伝子を過剰発現している癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を意味する。即ち、成長阻害薬は、Ｓ相においてそのような遺伝子を過剰発現している細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害薬の例は、細胞周期の進行を（Ｓ相以外の位置で）阻止する薬剤、例えば、Ｇ１停止及びＭ相停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ相ブロッカーは、ビンカス（ビンクリスチン及びビンブラスチン）、タキソール、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。Ｇ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ相停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル及びＡｒａ−Ｃである。さらなる情報は、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＩｓｒａｅｌ，編集， Ｃｈａｐｔｅｒ １， Ｍｕｒａｋａｍｉによる表題「Ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ， ｏｎｃｏｇｅｎｓ， ａｎｄ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｄｒｕｇｓ」（ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ： Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９５）、特に１３頁に見出される。
「ドキソルビシン」は、アントラサイクリン抗生物質である。
【０２４５】
用語「サイトカイン」は、一の細胞集団により放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質のための一般的用語である。このようなサイトカインの例は、リンカイン、モノカイン、及び伝統的ポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；リラキシン；プロリラキシン；等である。ここで用いられるように、用語サイトカインは天然供給源から又は組換え細胞培地からのタンパク質及び天然配列サイトカインの生物学的等価物を含む。
【０２４６】
2004513602.tif 000002
【０２４７】
2004513602.tif 000003
【０２４８】
2004513602.tif 000004
【０２４９】
2004513602.tif 000005
【０２５０】
2004513602.tif 000006
【０２５１】
2004513602.tif 000007
【０２５２】
2004513602.tif 000008
【０２５３】
2004513602.tif 000009
【０２５４】
2004513602.tif 000010
【０２５５】
2004513602.tif 000011
【０２５６】
2004513602.tif 000012
【０２５７】
2004513602.tif 000013
【０２５８】
2004513602.tif 000014
【０２５９】
2004513602.tif 000015
【０２６０】
2004513602.tif 000016
【０２６１】
2004513602.tif 000017
【０２６２】
2004513602.tif 000018
【０２６３】
2004513602.tif 000019
【０２６４】
2004513602.tif 000020
【０２６５】
2004513602.tif 000021
【０２６６】
2004513602.tif 000022
【０２６７】
ＩＩ．　本発明の組成物と方法
Ａ．全長ＰＲＯポリペプチド
本発明は、本出願でＰＲＯポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるＰＲＯ番号が与えられるが、ＵＮＱ番号は全ての与えられたＤＮＡ及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のＰＲＯの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「ＰＲＯ／番号」で呼称する。
下記の実施例に開示するように、種々のｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したＰＲＯポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【０２６８】
１．全長ＰＲＯ２１３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２１３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２１３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２１３ポリペプチドの一部がヒト腫瘍停止特異的６（ｇａｓ６）タンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ２１３ポリペプチドがｇａｓ６タンパク質と同一又は類似の活性を有すると考えられている。
２．全長ＰＲＯ２７４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２７４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２７４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２７４ポリペプチドの種々の部分が７膜貫通セグメントレセプター及びＦｎ５４タンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ２７４ポリペプチドが７膜貫通セグメントレセプター及び／又はＦｎ５４タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
【０２６９】
３．全長ＰＲＯ３００ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３００と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３００ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３００ポリペプチドの種々の部分がヒトＤｉｆｆ３３タンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ３００ポリペプチドがＤｉｆｆ３３ファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
４．全長ＰＲＯ２８４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２８４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２８４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。本出願人の現在の知識では、ＵＮＱ２４７（ＤＮＡ２３３１８−１２１１）核酸配列が新規な因子をコードし；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、公知のタンパク質と配列同一性を持たないことが明らかとなった。
【０２７０】
５．全長ＰＲＯ２９６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２９６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２９６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２９６ポリペプチドが肉腫増幅ＳＡＳタンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ２９６ポリペプチドが新たに同定されたＳＡＳタンパク質相同体であると考えられている。
６．全長ＰＲＯ３２９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３２９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３２９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３２９ポリペプチドが高親和性免疫グロブリンＦｃレセプターと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ３２９ポリペプチドが新たに同定されたＦｃレセプター相同体であると考えられている。
【０２７１】
７．全長ＰＲＯ３６２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３６２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３６２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３６２ポリペプチドがＡ３３抗原タンパク質並びにＨＣＡＲタンパク質及びＮｒＣＡＭ関連細胞接着分子と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ３６２ポリペプチドが新たなＡ３３抗原及びＨＣＡＲタンパク質相同体であると考えられている。
８．全長ＰＲＯ３６３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３６３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３６３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３６３ポリペプチドが細胞表面タンパク質ＨＣＡＲと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ３６３ポリペプチドが新たなＨＣＡＲ相同体であると考えられている。
【０２７２】
９．全長ＰＲＯ８６８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８６８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８６８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ８６８ポリペプチドが腫瘍壊死因子レセプターと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ８６８ポリペプチドがタンパク質の腫瘍壊死因子レセプターファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
１０．全長ＰＲＯ３８２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３８２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３８２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、天然ＰＲＯ３８２ポリペプチドが種々のセリンプロテアーゼタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。また本出願人は、ＰＲＯ３８２ポリペプチドをコードするＤＮＡが種々のセリンプロテアーゼタンパク質をコードする核酸と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ３８２ポリペプチドが新たに同定されたセリンプロテアーゼ質相同体であると考えられている。
【０２７３】
１１．全長ＰＲＯ５４５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ５４５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ５４５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ５４５ポリペプチドが、ヒトメタロプロテイナーゼ（「Ｐ＿Ｗ０１８２５」）、マウスメルトリンアルファ（「Ｓ６０２５７」）、メタロプロテアーゼ−ディスインテグリンメルトリン−アルファ（「ＧＥＮ１３６９５」）、ＡＤＡＭ１３−アフリカツメガエル（「ＸＬＵ６６００３＿１」）、マウスメルトリンベータ（「Ｓ６０２５８」）、ウサギメタロトロテアーゼ−ディスインテグリンメルトリン−ベータ（「ＧＥＮ１３６９６」）、ヒトメルトリンＳ（「ＡＦ０２３４７７＿１」）、ヒトメルトリン前駆体（「ＡＦ０２３４７６＿１」）、ヒトＡＤＡＭ２１（「ＡＦ０２９９００＿１」）、及びヒトＡＤＡＭ２０（「ＡＦ０２９８９９＿１」）と命名され同定された配列と有意な類似性を有していることを見出し、それによりＰＲＯ５４５は新規なメルトリンタンパク質であることを示している。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ５４５ポリペプチドがメルトリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、メタロプロテアーゼ及びディスインテグリンドメインを有するメルトリンタンパク質に典型的な細胞接着を有すると考えられている。
１２．全長ＰＲＯ６１７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ６１７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ６１７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ６１７ポリペプチドがＣＤ２４タンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。また本出願人は、ＰＲＯ６１７ポリペプチドをコードするＤＮＡがＣＤ２４タンパク質をコードするＤＮＡと有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ６１７ポリペプチドが新たに同定されたＣＤ２４相同体であると考えられている。
【０２７４】
１３．全長ＰＲＯ７００ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７００と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７００ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いた全長ＰＲＯ７００ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ＰＲＯ７００ポリペプチドの種々の部分が種々のジスルフィドイソメラーゼと有意な配列類似性を有している事を示唆している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３３．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析は、ＰＲＯ７００アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列；タンパク質イソメラーゼ活性を持つポリペプチド、（「Ｐ＿Ｐ８０６６４」）と命名、ヒトＰＤＩ、（「Ｐ＿Ｒ５１６９６」）と命名、ヒトＰＤＩ、（「Ｐ＿Ｒ２５２９７」）と命名、可能なタンパク質イソメラーゼｅｒ−６０前駆体、（「ＥＲ６０＿ＳＣＨＭＡ」）と命名、タンパク質イソメラーゼ前駆体−ショウジョウバエ、（「ＰＤＩ＿ＤＲＯＭＥ」）と命名、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ−回旋糸状虫、（「ＯＶＵ１２４４０＿１」）と命名、ヒトタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ関連タンパク質５、（「ＨＳＵ７９２７８＿１」）、及びタンパク質イソメラーゼ前駆体／プロリル４−ヒドロキシ、（「ＰＤＩ＿ＨＵＭＡＮ」）と命名、との間の有意な配列類似性を実証し、それによりＰＲＯ７００が新規なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼであることを示している。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７００ポリペプチドがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーに典型的なジスルフィド結合の形成を触媒する能力を有していると考えられている。
【０２７５】
１４．全長ＰＲＯ７０２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７０２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７０２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７０２ポリペプチドがコングルチニン（ｃｏｎｇｌｕｔｉｎｉｎ）タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７０２ポリペプチドが新たに同定されたコングルチニン相同体であると考えられている。
【０２７６】
１５．全長ＰＲＯ７０３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７０３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７０３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いた全長ＰＲＯ７０３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ＰＲＯ７０３ポリペプチドの種々の部分がＶＬＣＡＳタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりＰＲＯ７０３が新規なＶＬＳＡＣタンパク質であることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３３．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析は、ＰＲＯ７０３アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列；超長鎖アシル−ＣｏＡに対するヒトｍＲＮＡ、（「Ｄ８８３０８」）、超長鎖アシル−ＣｏＡシンセターゼに対するラットｍＲＮＡ、（「Ｄ８５１００」）、マウス脂肪酸輸送タンパク質、（「ＭＭＵ１５９７６」）、ヒト超長鎖アシル−ＣｏＡシンターゼ、（「Ｄ８８３０８＿１」）、マウス超長鎖アシル−ＣｏＡシンターゼ、（「ＡＦ０３３０３１＿１」）、超長鎖アシル−ＣｏＡシンターゼ−Ｒａｔｔｕｓ、（「Ｄ８５１００＿１」）、ラット長鎖脂肪酸輸送タンパク質、（「ＦＡＴＰ＿ＲＡＴ」）、マウス長鎖脂肪酸輸送タンパク質、（「ＦＡＴＰ＿ＭＯＵＳＥ」）、可能な長鎖脂肪酸輸送タンパク質、（「ＦＡＴ１＿ＹＥＡＳＴ」）、及び脂肪酸輸送タンパク質、（「ＣＨＹ１５８３９＿２」）、との間の有意な配列類似性を実証し、それによりＰＲＯ７０３が新規なＶＬＣＡＳであることを示している。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７０３ポリペプチドがＶＬＣＡＳファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ＶＬＣＡＳファミリーに典型的な長鎖及び超長鎖脂肪酸の細胞輸送を促進する能力を有していると考えられている。
【０２７７】
１６．全長ＰＲＯ７０５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７０５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７０５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７０５ポリペプチドがＫ−グリピカン（ｇｌｙｐｉｃａｎ）タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７０５ポリペプチドがプロテオグリカンタンパク質のグリピカンファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
１７．全長ＰＲＯ７０８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７０８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７０８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７０８ポリペプチドがアリールスルファターゼタンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７０８ポリペプチドが新たに同定されたアリールスルファターゼ相同体であると考えられている。
【０２７８】
１８．全長ＰＲＯ３２０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３２０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３２０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いた全長ＰＲＯ３２０ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ＰＲＯ３２０ポリペプチドの種々の部分がフィブリンタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３３．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析は、ＰＲＯ３２０アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列；ヒトフィブリン−２前駆体、「ＦＢＬ２＿ＨＵＭＡＮ」と命名、ヒトフィブリン−１アイソフォーム前駆体、「ＦＢＬＡ＿ＨＵＭＡＮ」と命名、ＺＫ７８３．１−線虫、「ＣＥＬＺＫ７８３＿１」と命名、ヒト−ｎｏｔｃｈ２、「ＨＳＵ７７４９３＿１」と命名、ＮｅＩ部分前駆体−ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、「ＮＥＬ＿ＲＡＴ」と命名、マウス細胞表面タンパク質、「Ｄ３２２１０＿１」と命名、マウス（断片）ＮｏｔｃｈＢタンパク質、「Ａ４９１７５」と命名、Ｃ５０Ｈ２．３ａ−線虫、「ＣＥＣ５０Ｈ２＿３」と命名、ＭＥＣ−９Ｌ−線虫、「ＣＥＵ３３９３３＿１」と命名、及びマウスｎｏｔｃｈ４、「１０ＭＭＭＨＣ２９Ｎ７＿２」と命名、との間の有意な配列類似性を実証し、それによりＰＲＯ３２０が新規なフィブリン又はフィブリン様タンパク質であることを示している。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ３２０ポリペプチドがフィブリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、フィブリンファミリーに典型的な生物学的活性を有していると考えられている。
【０２７９】
１９．全長ＰＲＯ３２４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３２４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３２４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３２４ポリペプチドがオキシドレダクターゼと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ３２４ポリペプチドが新たに同定されたオキシドレダクターゼ相同体であると考えられている。
【０２８０】
２０．全長ＰＲＯ３５１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３５１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３５１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いた全長ＰＲＯ３５１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ＰＲＯ３５１ポリペプチドの種々の部分がプロシタシンタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３３．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析は、ＰＲＯ３５１アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列；「ＡＣ００３９６５＿１」、「ＣＥＬＣ０７Ｇ１＿７」、「ＧＥＮ１２９１７」、「ＨＥＰＳ＿ＨＵＭＡＮ」、「ＧＥＮ１４５８４」、「ＭＣＴ６＿ＭＯＵＳＥ」、「ＨＳＵ７５３２９＿１」、「ＰＬＭＮ＿ＥＲＩＥＵ」、「ＴＲＹＢ＿ＨＵＭＡＮ」及び「Ｐ＿Ｗ２２９８７」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ３５１ポリペプチドがプロスタシンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、プロスタシンファミリーに典型的な特性及び活性を有していると考えられている。
【０２８１】
２１．全長ＰＲＯ３５２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３５２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３５２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３５２ポリペプチドがブチロフィリンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ３５２ポリペプチドが新たに同定されたブチロフィリン相同体であると考えられている。
２２．全長ＰＲＯ３８１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３８１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３８１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３８１ポリペプチドがイムノフィリンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ３８１ポリペプチドが新たに同定されたＦＫＢＰイムノフィリン相同体であると考えられている。
【０２８２】
２３．全長ＰＲＯ３８６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３８６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３８６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３８６ポリペプチドがナトリウムチャンネルタンパク質のベータ−２サブユニットと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ３８６ポリペプチドが哺乳動物細胞で発現されたナトリウムチャンネルのベータ−２サブユニットの相同体であると考えられている。
【０２８３】
２４．全長ＰＲＯ５４０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ５４０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ５４０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いた全長ＰＲＯ５４０ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ＰＲＯ５４０ポリペプチドの種々の部分がＬＣＡＴタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりＰＲＯ５４０が新規なＬＣＡＴタンパク質であることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３３．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析は、ＰＲＯ５４０アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列；ホスファチジルコリン−ステロールアシルトランスフェラーゼ、「ＬＣＡＴ＿ＨＵＭＡＮ」と命名、マクロテトロリド耐性タンパク質−ストレプトミセス、「ＪＨ０６５５」と命名、Ｔ細胞レセプターデルタ鎖前駆体「Ｃ３０５８３」と命名、アカゲザルｋｒｉｎｇｌｅ２、「Ｐ＿Ｗ０７５５１」と命名、ＲＡＧＥ−１ＯＲＦ５、「ＨＳＵ４６１９１＿３」と命名、ヒトＩｇカッパ鎖ＶＫＩＩＩ−ＪＫ３、「ＨＳＵ０７４６６＿１」と命名、及びアルストロメリアインドラ逆転写酵素、「ＡＬＩ２２３６０６＿１」と命名、との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ５４０ポリペプチドがＬＣＡＴタンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ＬＣＡＴファミリーに典型的な脂質輸送能力を有していると考えられている。
【０２８４】
２５．全長ＰＲＯ６１５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ６１５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ６１５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いた全長ＰＲＯ６１５ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ＰＲＯ６１５ポリペプチドの種々の部分がヒトシナプトギリン（ｓｙｎａｐｔｏｇｙｒｉｎ）タンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３３．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析は、ＰＲＯ６１５アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列；「ＡＦ０３９０８５＿１」、「ＲＮＵ３９５４９＿１」、「ＣＥＬＴ０８Ａ９＿８」、「ＦＳＵ６２０２８＿１」、「Ｓ７３６４５」、「Ｙ３４８＿ＭＹＣＰＮ」、「ＡＣ０００１０３＿５」、「」、「ＲＴ１２＿ＬＥＩＴＡ」及び「ＥＢＶＬＭＰ２１８＿１」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ６１５ポリペプチドがシナプトギリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、シナプトギリンファミリーに典型的な特性及び活性を有していると考えられている。
【０２８５】
２６．全長ＰＲＯ６１８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ６１８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ６１８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いた全長ＰＲＯ６１８ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ＰＲＯ６１８ポリペプチドの種々の部分がエンテロペプチダーゼタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりＰＲＯ６１８が新規なエンテロペプチダーゼであることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３３．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析は、ＰＲＯ６１８アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列；「Ｐ＿Ｗ２２９８７」、「ＫＡＬ＿ＨＵＭＡＮ」、「ＡＣ００３９６５＿１」、「ＧＥＮ１２９１７」、「ＥＮＴＫ＿ＨＵＭＡＮ」、「ＦＡ１１＿ＨＵＭＡＮ」、「ＨＳＵ７５３２９＿１」、「Ｐ＿Ｗ２２９８６」、及び「ＰＬＭＮ＿ＨＯＲＳＥ」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ６１８ポリペプチドがエンテロペプチダーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、エンテロペプチダーゼファミリーに典型的な触媒活性を有していると考えられている。
【０２８６】
２７．全長ＰＲＯ７１９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７１９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７１９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７１９ポリペプチドがリポタンパク質リパーゼＨタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７１９ポリペプチドが新たに同定されたリポタンパク質リパーゼＨ相同体であると考えられている。
２８．全長ＰＲＯ７２４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７２４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７２４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７２４ポリペプチドが低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レセプタータンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７２４ポリペプチドが新たに同定されたＬＤＬレセプターＨ相同体であると考えられている。
【０２８７】
２９．全長ＰＲＯ７７２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７７２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７７２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７７２ポリペプチドがヒトＡ４タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７７２ポリペプチドが新たに同定されたＡ４タンパク質相同体であると考えられている。
３０．全長ＰＲＯ８５２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８５２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８５２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ８５２ポリペプチドが種々のプロテアーゼタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ８５２ポリペプチドが新たに同定されたプロテアーゼ酵素相同体であると考えられている。
【０２８８】
３１．全長ＰＲＯ８５３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８５３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８５３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いた全長ＰＲＯ８５３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ＰＲＯ８５３ポリペプチドの種々の部分がレダクターゼタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりＰＲＯ８５３が新規なレダクターゼであることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３３．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析は、ＰＲＯ８５３アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列；「Ｐ＿Ｗ０３１９８」、「ＣＥＣ１５Ｈ１１＿６」、「ＭＴＶ０３０＿１２」、「Ｐ＿Ｗ１５７５９」、「Ｓ４２６５１」、「ＡＴＡＣ００２３４３１４」、「ＭＴＶ０２２＿１３」、「ＳＣＵ４３７０４＿１」、「ＣＥＬＥ０４Ｆ６＿７」及び「ＡＬＦＡ＿１」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ８５３ポリペプチドがレダクターゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、レダクターゼファミリーに典型的な抗酸化酵素活性を有していると考えられている。
【０２８９】
３２．全長ＰＲＯ８６０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８６０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８６０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いた全長ＰＲＯ８６０ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ＰＲＯ８６０ポリペプチドの種々の部分がニューロファシンタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりＰＲＯ８６０が新規なニューロファシンであることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３３．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析は、ＰＲＯ８６０アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列；「ＡＦ０４０９９０＿１」、「ＡＦ０４１０５３＿１」、「ＣＥＬＺＫ３７７＿２」、「ＲＮＵ８１０３５＿１」、「Ｄ８６９８３＿１」、「Ｓ２６１８０」、「ＭＭＢＩＧ２Ａ＿１」、「Ｓ４６２１６」、及び「ＲＮＵ６８７２６＿１」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ８６０ポリペプチドがニューロファシンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ニューロファシンファミリーに典型的な細胞接着特性を有していると考えられている。
【０２９０】
３３．全長ＰＲＯ８４６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８４６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８４６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いた全長ＰＲＯ８４６ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ＰＲＯ８４６ポリペプチドの種々の部分がＣＭＲＦ３５タンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりＰＲＯ８４６が新規なＣＭＲＦ３５タンパク質であることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３３．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析は、ＰＲＯ８４６アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列；「ＣＭ３５＿ＨＵＭＡＮ」、「ＡＦ０３５９６３＿１」、「ＰＩＧＲ＿ＲＡＢＩＴ」、「ＡＦ０４３７２４＿１」、「ＲＮＵ８９７４４＿１」、「Ａ５２０９１＿１」、「Ｓ４８８４１」、「ＥＬＫ０６Ａ９＿３」、及び「ＡＦ０４９５８８＿１」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ８４６ポリペプチドがＣＭＲＦ３５タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ＣＭＲＦ３５タンパク質ファミリーに典型的な特性を有していると考えられている。
【０２９１】
３４．全長ＰＲＯ８６２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８６２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８６２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いた全長ＰＲＯ８６２ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ＰＲＯ８６２ポリペプチドの種々の部分がリソザイムタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりＰＲＯ８６２が新規なリソザイムタンパク質であることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３３．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析は、ＰＲＯ８６２アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列；「Ｐ＿Ｐ９０３４３」及び「ＬＹＣ＿ＨＵＭＡＮ」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ８６２ポリペプチドがリソザイムファミリーの新たに同定されたメンバーであり、リソザイムファミリーに典型的な触媒活性を有していると考えられている。
【０２９２】
３５．全長ＰＲＯ８６４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８６４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８６４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いた全長ＰＲＯ８６４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ＰＲＯ８６４ポリペプチドの種々の部分がＷｎｔ−４タンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりＰＲＯ８６４が新規なＷｎｔ−４タンパク質であることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３３．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析は、ＰＲＯ８６４アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列；「ＷＮＴ４＿ＭＯＵＳＥ」、「ＷＮＴ３＿ＭＯＵＳＥ」、「ＷＮ５Ａ＿ＨＵＭＡＮ」、「ＷＮ７Ｂ＿ＭＯＵＳＥ」、「ＷＮ３Ａ＿ＭＯＵＳＥ」、「ＸＬＵ６６２８８＿１」、「ＷＮ１３＿ＨＵＭＡＮ」、「ＷＮ５Ｂ＿ＯＲＹＬＡ」、「ＷＮＴ２＿ＭＯＵＳＥ」、及び「ＷＮ７Ａ＿ＭＯＵＳＥ」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ８６４ポリペプチドがＷｎｔ−４タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、Ｗｎｔ−４タンパク質ファミリーに典型的な特性を有していると考えられている。
【０２９３】
３６．全長ＰＲＯ７９２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７９２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７９２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７９２ポリペプチドがＣＤ２３タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７９２ポリペプチドが新たに同定されたＣＤ２３相同体であると考えられている。
３７．全長ＰＲＯ８６６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８６６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８６６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ８６６ポリペプチドが種々のミンジン及びスポンジンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ８６６ポリペプチドが新たに同定されたミンジン／スポンジン相同体であると考えられている。
【０２９４】
３８．全長ＰＲＯ８７１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８７１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８７１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ８７１ポリペプチドがＣｙｐ−６０タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ８７１ポリペプチドがＣｙｐ−６０タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、サイクロフィリンタンパク質ファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【０２９５】
３９．全長ＰＲＯ８７３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８７３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８７３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ８７３ポリペプチドがヒト肝臓カルボキシルエステラーゼと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ８７３ポリペプチドがカルボキシエステラーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、カルボキシルエステラーゼファミリーに典型的な触媒活性を有すると考えられている。
４０．全長ＰＲＯ９４０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ９４０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ９４０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ９４０ポリペプチドがＣＤ３３及びＯＢ結合タンパク質−２と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ９４０ポリペプチドが新たなＣＤ３３及び／又はＯＢ結合タンパク質−２相同体であると考えられている。
【０２９６】
４１．全長ＰＲＯ９４１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ９４１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ９４１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ９４１ポリペプチドが一又は複数のカドヘリンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ９４１ポリペプチドが新たに同定されたカドヘリン相同体であると考えられている。
４２．全長ＰＲＯ９４４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ９４４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ９４４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ９４４ポリペプチドがＣＰＥ−Ｒ細胞表面タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ９４４ポリペプチドが新たに同定されたＣＰＥ−Ｒ相同体であると考えられている。
【０２９７】
４３．全長ＰＲＯ９８３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ９８３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ９８３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ９８３ポリペプチドが小胞関連タンパク質ＶＡＰ−３３と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ９８３ポリペプチドが小胞関連膜タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、小胞関連膜タンパク質ファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
４４．全長ＰＲＯ１０５７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０５７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０５７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１０５７ポリペプチドが種々のプロテアーゼタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１０５７ポリペプチドが新たに同定されたプロテアーゼ相同体であると考えられている。
【０２９８】
４５．全長ＰＲＯ１０７１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０７１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０７１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１０７１ポリペプチドがトロンボスポンジンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１０７１ポリペプチドが新たに同定されたトロンボスポンジン相同体であると考えられている。
４６．全長ＰＲＯ１０７２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０７２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０７２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１０７２ポリペプチドが種々のレダクターゼタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１０７２ポリペプチドがレダクターゼタンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
【０２９９】
４７．全長ＰＲＯ１０７５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０７５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０７５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１０７５ポリペプチドがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１０７５ポリペプチドがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、そのファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【０３００】
４８．全長ＰＲＯ１８１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１８１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１８１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１８１ポリペプチドがコルニコン（ｃｏｒｎｉｃｈｏｎ）タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１８１ポリペプチドが新たに同定されたコルニコン相同体であると考えられている。
４９．全長ＰＲＯ１９５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１９５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１９５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＰＲＯ１９５コード化クローンがヒト胎児胎盤ライブラリから、分泌されたタンパク質をコードする核酸配列を選択する捕捉技術を用いて単離された。本出願人の知識では、ＵＮＱ１６９（ＤＮＡ２６８４７−１３９５）核酸配列は新規な因子をコードし；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、公知のタンパク質と配列同一性を持たないことが明らかとなった。
【０３０１】
５０．全長ＰＲＯ８６５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８６５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８６５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＰＲＯ８６５コード化クローンがヒト胎児腎臓ライブラリから、分泌されたタンパク質をコードする核酸配列を選択する捕捉技術を用いて単離された。ＰＲＯ８６５コード化クローンは分泌されたタンパク質をコードする。本出願人の知識では、ＵＮＱ４３４（ＤＮＡ５３９７４−１４０１）核酸配列は新規な因子をコードし；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、公知のタンパク質と配列同一性を持たないことが明らかとなった。
５１．全長ＰＲＯ８２７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８２７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８２７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ８２７ポリペプチドがＶＬＡ−２及び種々の他のインテグリンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ８２７ポリペプチドが新たなインテグリンタンパク質又はそのスプライシング変異体であると考えられている。
【０３０２】
５２．全長ＰＲＯ１１１４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１１４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１１４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１１１４ポリペプチドがタンパク質のサイトカインレセプターファミリーと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１１４ポリペプチドがタンパク質のサイトカインレセプターファミリーの新たに同定されたメンバーであり、そのファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプター（ＵＮＱ５５７）と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するように、ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。別の発現ラウンドで生成されたタンパク質が異なるＰＲＯ番号で与えられたが、ＵＮＱ番号は任意の与えられたＤＮＡ及びコードされるタンパク質に特有であり、変化しないであろう。しかしながら、単純にするために、本明細書ではＤＮＡ５７０３３−１４０３にコードされるタンパク質並びにＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターの上記の定義に含まれる全てのさらなる相同体及び変異体を、それらの起源又は調製方式に関わらず「ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプター」と呼ぶ。
ＷＵ−ＢＬＡＳＴ配列アラインメントプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチド（Ｆｉｇ１４２及び配列番号：３５２に示す）が、他の公知のインターフェロンレセプターと配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターが他のインターフェロンレセプターに典型的な活性を有すると考えられている。
【０３０３】
５３．全長ＰＲＯ２３７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２３７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２３７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２３７ポリペプチドが脱炭酸酵素と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ２３７ポリペプチドが新たに同定された脱炭酸酵素相同体であると考えられている。
５４．全長ＰＲＯ５４１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ５４１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ５４１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ５４１ポリペプチドがトリプシンインヒビタータンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ５４１ポリペプチドがトリプシンインヒビタータンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
【０３０４】
５５．全長ＰＲＯ２７３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２７３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２７３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２７３ポリペプチドが種々のケモカインと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ２７３ポリペプチドがケモカインファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ケモカインファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
５６．全長ＰＲＯ７０１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７０１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７０１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７０１ポリペプチドがニューロリジン（ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ）１、２及び３及びカルボキシエステラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含むエステラーゼと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７０１ポリペプチドがニューロリジンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ニューロリジンに典型的なようにニューロン間の認識プロセスの媒介及び／又は機能に接着因子として含まれると考えられている。
【０３０５】
５７．全長ＰＲＯ７０４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７０４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７０４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７０４ポリペプチドがＶＩＰ３６及びＧＰ３６ｂと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７０４ポリペプチドが小胞複合膜タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な糖への結合及び原形質膜とゴルジの間をサイクルする能力を有すると考えられている。
５８．全長ＰＲＯ７０６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７０６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７０６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７０６ポリペプチドがヒト前立腺酸ホスファターゼ前駆体及びヒトリソソーム酸ホスファターゼ前駆体と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７０６ポリペプチドがヒト前立腺酸ホスファターゼ前駆体ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、酸ホスファターゼファミリーに典型的なホスファターゼを有すると考えられている。
【０３０６】
５９．全長ＰＲＯ７０７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７０７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７０７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７０７２７３ポリペプチドの種々の部分がカドヘリン、特に繊維芽細胞に見られるカドヘリンＦＩＢ３と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７０７ポリペプチドがカドヘリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、カドヘリンファミリーに典型的な細胞相互作用シグナル伝達を有すると考えられている。
６０．全長ＰＲＯ３２２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３２２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３２２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ３２２ポリペプチドの種々の部分がヒトニューロプシン（ｎｅｕｒｏｐｓｉｎ）、セリンプロテアーゼ、ニューロシン（ｎｅｕｒｏｓｉｎ）及びトリプシノーゲンと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ３２２ポリペプチドがセリンプロテアーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。また、ＰＲＯ３２２は海馬可塑性に含まれ、細胞外マトリクス変性及び細胞泳動を伴うとも考えられている。
【０３０７】
６１．全長ＰＲＯ５２６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ５２６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ５２６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ５２６ポリペプチドの種々の部分がインシュリン様成長因子複合体（ＡＬＳ）の酸安定性サブユニット、並びにカルボキシペプチダーゼ、ＳＬＩＴ、及び血小板糖タンパク質Ｖと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ５２６ポリペプチドがロイシン−リピートリッチスーパーファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的なタンパク質−タンパク質相互作用能力を有すると考えられている。
６２．全長ＰＲＯ５３１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ５３１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ５３１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ５３１ポリペプチドの種々の部分がカドヘリンスーパーファミリー、特にプロトカドヘリン３と有意な配列同一性及び類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ５３１ポリペプチドがカドヘリンスーパーファミリーの新たに同定されたメンバーであり、プロトカドヘリンであると考えられている。ＰＲＯ５３１は細胞外カドヘリンモチーフを持つ膜貫通タンパク質である。ＰＲＯ５３１は細胞−細胞活性、特に細胞シグナル伝達に含まれると考えられる。
【０３０８】
６３．全長ＰＲＯ５３４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ５３４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ５３４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ５３４ポリペプチドの種々の部分が推定ジスルフィドイソメラーゼｅｒｐ３８前駆体及びチオレドキシンｃ−３と有意な同一性又は類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ５３４ポリペプチドがジスルフィドイソメラーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な中間又は不正な折りたたみパターンの認識及び解読をする能力を有すると考えられている。
６４．全長ＰＲＯ６９７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ６９７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ６９７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ６９７ポリペプチドの種々の部分がｓＦＲＰ−２、ｓＦＲＰ−１及びＳＡＲＰ−１、−２及び−３と有意な同一性又は類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ６９７ポリペプチドがｓＦＲＰファミリーの新たに同定されたメンバーであり、Ｗｎｔシグナル経路に関連する活性を有すると考えられている。
【０３０９】
６５．全長ＰＲＯ７１７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７１７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７１７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。本出願人の知識では、ＵＮＱ３８５（ＤＮＡ５０９８８−１３２６）核酸配列は新規な因子をコードする；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、公知のヒトタンパク質と有意な配列同一性を持たないことが明らかとなった。
６６．全長ＰＲＯ７３１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７３１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７３１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７３１ポリペプチドの種々の部分がプロトカドヘリン４、６８、４３、４２、３及び５と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７３１ポリペプチドがプロトカドヘリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な細胞−細胞凝集又はシグナル伝達活性又はシグナル伝達関与を有すると考えられている。
【０３１０】
６７．全長ＰＲＯ２１８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２１８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２１８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＰＲＯ２１８コード化クローンがヒト胎児腎臓ライブラリから単離された。本出願人の知識では、ＵＮＱ１９２（ＤＮＡ３０８６７−１３３５）核酸配列は新規な因子をコードする；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、公知のタンパク質と有意な配列同一性がないことが明らかとなった。膜調節タンパク質と幾分の配列同一性が見られ、ＰＲＯ２１８が膜調節器として機能しうることを示している。
６８．全長ＰＲＯ７６８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７６８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７６８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７６８ポリペプチドの種々の部分がインテグリン７及び６を含むインテグリンと有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７６８ポリペプチドがインテグリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、インテグリイン７の相同体又はスプライシング変異体のいずれかであり、筋細胞及び細胞外マトリクス間の細胞接着及び連絡に含まれると考えられている。
【０３１１】
６９．全長ＰＲＯ７７１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７７１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７７１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７７１ポリペプチドの種々の部分がテスチカン（ｔｅｓｔｉｃａｎ）と有意な配列同一性及び類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７７１ポリペプチドがテスチカンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な細胞シグナル伝達、結合、又は接着特性を有すると考えられている。
７０．全長ＰＲＯ７３３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７３３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７３３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７３３ポリペプチドの種々の部分がＴ１／ＳＴレセプター結合タンパク質と有意な配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７３３ポリペプチドがインターロイキン様ファミリー結合タンパク質の新たに同定されたメンバーであり、サイトカインであり、そして細胞シグナル伝達に含まれる。ＰＲＯ７３３はＡｐｏＡＩＶ相同体であると思われる。
【０３１２】
７１．全長ＰＲＯ１６２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１６２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１６２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１６２ポリペプチドの種々の部分がヒト膵炎関連タンパク質（ＰＡＰ）と顕著な相同性を有していることを見出した。また、本出願人は、ＰＲＯ１６２ポリペプチドをコードするＤＮＡがウシｌｉｔｈｏｓｔａｔｈｉｎｅ前駆体及びウシ膵臓繊維状タンパク質（ＰＡＰ）と有意な相同性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１６２ポリペプチドが膵炎関連タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、膵炎関連タンパク質ファミリーに典型的な活性を有すると考えられる。
７２．全長ＰＲＯ７８８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７８８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７８８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７８８ポリペプチドの種々の部分が抗悪性腫瘍尿タンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。また、本出願人は、ＰＲＯ７８８ポリペプチドをコードするＤＮＡがヒトＥ４８抗原、ヒトコンポーネントＢタンパク質、及びヒト前立腺幹細胞抗原と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７８８ポリペプチドが抗悪性腫瘍尿タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、抗悪性腫瘍尿タンパク質ファミリーに典型的な抗悪性腫瘍活性を有すると考えられる。
【０３１３】
７３．全長ＰＲＯ１００８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１００８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１００８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１００８ポリペプチドの種々の部分がマウスｄｋｋ−１（ｍｄｋｋ−１）と有意な配列同一性及び類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１００８ポリペプチドがｄｋｋ−１ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な頭部誘発活性を有すると考えられる。
７４．全長ＰＲＯ１０１２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０１２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０１２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１０１２ポリペプチドの種々の部分がジスルフィドイソメラーゼと有意な配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１０１２ポリペプチドがＥＲ保有タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ジスルフィドイソメラーゼファミリーに典型的なポリペプチドのプロセシング、生成及び／又は折りたたみに関連する活性を有すると考えられる。
【０３１４】
７５．全長ＰＲＯ１０１４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０１４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０１４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１０１４ポリペプチドの種々の部分がレダクターゼ及びデヒドロゲナーゼと配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１０１４ポリペプチドがレダクターゼスーパーファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な還元能力を有すると考えられる。
７６．全長ＰＲＯ１０１７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０１７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０１７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１０１７ポリペプチドの種々の部分がＨＮＫ−１スルホトランスフェラーゼと配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１０１７ポリペプチドがＨＮＫ−１スルホトランスフェラーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的なＨＮＫ−１炭水化物エピトープの合成に含まれると考えられる。
【０３１５】
７７．全長ＰＲＯ４７４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ４７４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ４７４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ４７４ポリペプチドの種々の部分がデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼおよびオキシドレダクターゼと配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ４７４ポリペプチドがデヒドロゲナーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、グルコースの酸化に含まれると考えられる。
７８．全長ＰＲＯ１０３１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０３１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０３１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１０３１ポリペプチドの種々の部分がＩＬ−１７及びＣＴＬＡ−８と配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１０３１ポリペプチドがサイトカインファミリーの新たに同定されたメンバーであり、よって炎症及び／又は免疫系に含まれると考えられる。
【０３１６】
７９．全長ＰＲＯ９３８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ９３８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ９３８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ９３８ポリペプチドがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ９３７ポリペプチドがチオレドキシンファミリータンパク質の新たに同定されたメンバーであり、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに典型的な活性を有すると考えられる。
８０．全長ＰＲＯ１０８２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０８２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０８２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１０８２ポリペプチドの種々の部分がデータベースに「ＡＢ０１０７１０＿１」として現れるレクチン様酸化ＬＤＬレセプターと配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１０８２ポリペプチドがＬＤＬレセプターファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられる。
【０３１７】
８１．全長ＰＲＯ１０８３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０８３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０８３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＰＲＯ１０８３コード化クローンがヒト胎児腎臓ライブラリから分泌されるタンパク質をコードする核酸配列を選択する捕捉技術を用いて単離された。本出願人の知識では、ＵＮＱ５４０（ＤＮＡ５０９２１−１４５８）核酸配列は新規な因子をコードする；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、７ＴＭレセプター、ラトロフィリン関連タンパク質１及びマクロファージ制限細胞表面糖タンパク質との幾分の配列同一性が見られた。Ｆｉｇ２０４に示すキナーゼリン酸化部位及びＧ−結合レセプタードメインは、ＰＲＯ１０８３が７ＴＭレセプタースーパーファミリーの新規なメンバーであることを示している。
８２．全長ＰＲＯ２００ポリペプチド
本発明は、本出願においてＶＥＧＦ−Ｅと称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＶＥＧＦ−ＥポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＶＥＧＦ−ＥポリペプチドがＶＥＧＦ及び骨形成タンパク質１と有意な相同性を有していることを見出した。特に、ＶＥＧＦ−ＥのｃＤＮＡ配列はＶＥＧＦと２４％のアミノ酸類似性を示し、構造的保存を有している。さらに、ＶＥＧＦ−ＥはＶＥＧＦに存在しないＮ−末端半分を含み骨形成タンパク質１と２８％の相同性を有する。
【０３１８】
８３．全長ＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定及び単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６がＧｅｎＢａｍｋデータベースのＤＮＡ配列ＨＳＵ８８５４０＿１、ＨＳＵ８８８７８＿１、ＨＳＵ８８８７９＿１、ＨＳＵ８８８８０＿１、及びＨＳＵ８８８８１＿１と高度な相同性を有していることを見出した。
従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ２８５及び２８６タンパク質がショウジョウバエタンパク質Ｔｏｌｌの新たに同定されたヒト相同体メンバーであり、獲得免疫において重要な役割を果たすであろうと考えられている。より詳細には、ＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６は、炎症、敗血性ショック、及び病原に対する反応に含まれ、免疫反応によって増悪する様々な医学的状態、例えば糖尿病、ＡＬＳ、癌、慢性関節リウマチ、及び潰瘍などにおいて役割を果たす可能性がある。ＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６の病原パターン認識レセプターとしての役割は、微生物に存在する保存された分子構造の存在の感知は、本出願に開示するデータにより更に支持され、公知のヒトＴｏｌｌ様レセプター、ＴＬＲ２がＬＰＳシグナル伝達の直接的メディエータであることを示している。
【０３１９】
８４．全長ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及びＰＲＯ１４４９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するように、ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。別の発現ラウンドで生成されたタンパク質が異なるＰＲＯ番号で与えられたが、ＵＮＱ番号は任意の与えられたＤＮＡ及びコードされるタンパク質に特有であり、変化しないであろう。しかしながら、単純にするために、本明細書ではＤＮＡ３０９４３−１１６３−１、ＤＮＡ６４９０７−１１６３−１及びＤＮＡ６４９０８−１１６３−１にコードされるタンパク質並びにＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９の上記の定義に含まれる全てのさらなる相同体及び変異体を、それらの起源又は調製方式に関わらず「ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９」と呼ぶ。
８５．全長ＰＲＯ２９８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２９８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。（ＰＲＯ２９８はＦｉｇ２１８、配列番号：５１４に示した核酸にコードされ、Ｆｉｇ２１９、配列番号：５１５に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の任意の命名であることを記しておく。さらに、同じアミノ酸配列を持ち異なる発現ラウンドで発現されるタンパク質は異なる「ＰＲＯ」番号で与えられる。）
特に、本出願人は、以下の実施例で更に詳細に記載されるＰＲＯ２９８をコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴＸ２．０ａＭＰ−ＷａｓｈＵコンピュータプログラム、スコアリングパラメータＴ＝１２、Ｓ＝６８、Ｓ２＝３６、マトリクス：ＢＬＯＳＵＭ６２を用い、本出願人は、ここに特に記載するＰＲＯ２９８タンパク質が、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに見られる以下の配列：Ｓ５９３９２（可能な膜タンパク質ＹＬＲ２４６ｗ−酵母）；Ｓ５８１５４（仮説タンパク質ＳＰＡＣ２Ｆ７．１０−酵母）；ＣＥＬＦ３３Ｄ１１＿９（Ｆ３３Ｄ１１．９ｂ−線虫）；ＹＯ４１＿ＣＡＥＥＬ（仮説６８．７ｋｄタンパク質ｚｋ５７．１）；ＣＥＡＣ３＿５（ＡＣ３．４−線虫）；Ｓ５２６９１（可能な膜タンパク質ＹＤＲ１２６ｗ−酵母）；ＡＴＴ１２Ｈ１７＿１４（タンパク質−シロイヌナズナ）；Ｓ５５９６３（可能な膜タンパク質ＹＮＬ３２６ｃ−酵母）；ＣＥＬＣ４３Ｈ６＿２（Ｃ４３Ｈ６．７−線虫）；ＴＭＯ１８Ａ１０＿１４（Ａ＿ＴＭＯ１８Ａ１０．８−シロイヌナズナ）と限られた配列同一性（２７−３８％）を示すことを見出した。
【０３２０】
８６．全長ＰＲＯ３３７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３３７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３３７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列ＰＲＯ３３７が、ラットニューロトリミンと９７％の配列同一性、チキンＣＥＰＵと８５％の配列同一性、チキンＧ５５と７３％の配列同一性、ヒトＬＡＭＰと５９％の相同性、及びヒトＯＰＣＡＭと８４％の相同性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ３３７が免疫グロブリンスーパーファミリーのＩｇＬＯＮサブファミリーの新たに同定されたメンバーであり、神経突起成長及び分化可能特性を有すると考えられる。
８７．全長ＰＲＯ４０３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ４０３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ４０３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列ＰＲＯ４０３がウシＥＣＥ−２と９４％の同一性及びヒトＥＣＥ−１と６４％の同一性を有していることを見出した。従って、現在では、ＰＲＯ４０３がＥＣＥタンパク質ファミリーの新規なメンバーであり、活性エンドセリンを生成する能力を有すると考えられている。
【０３２１】
Ｂ．ＰＲＯポリペプチド変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチドに加えて、ＰＲＯ変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ変異体は、ＰＲＯポリペプチドＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のＰＲＯポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＰＲＯポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列ＰＲＯ又はここに記載したＰＲＯポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＰＲＯと比較してＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列が変化するＰＲＯポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟天然配列によって示される活性について試験することにより決定される。
【０３２２】
ＰＲＯポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ−末端又はＣ−末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＰＲＯポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＰＲＯ断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＰＲＯ断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’ 及び３’ プライマーで用いられる。好ましくは、ＰＲＯポリペプチド断片は、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表１に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【０３２３】
2004513602.tif 000023
【０３２４】
ＰＲＯポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン， ｍｅｔ， ａｌａ， ｖａｌ， ｌｅｕ， ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ， ｓｅｒ， ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ， ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ， ｇｌｎ， ｈｉｓ， ｌｙｓ， ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ， ｐｒｏ； 及び
（６）芳香族：ｔｒｐ， ｔｙｒ， ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発［Ｃａｒｔｅｒ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３： ４３３１ （１９８６）； Ｚｏｌｌｅｒ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １０： ６４８７ （１９８７）］、カセット突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ等， Ｇｅｎｅ， ３４： ３１５ （１９８５）］、制限的選択突然変異誘発［Ｗｅｌｌｓ等， Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ， ３１７： ４１５ （１９８６）］等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＰＲＯ変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Ｃｕｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４： １０８１−１０８５ （１９８９）］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， （Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ａｍｐ；ａｍｐ； Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．）； Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５０： １ （１９７６）］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸を用いることができる。
【０３２５】
Ｃ．ＰＲＯの修飾
ＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＰＲＯポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗−ＰＲＯ抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ｐｐ．７９−８６ （１９８３）］、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０３２６】
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＰＲＯに見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＰＲＯに存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
ＰＲＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯ（Ｏ−結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
【０３２７】
ＰＲＯポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行されたＷＯ ８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ及びＷｒｉｓｔｏｎ， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｐｐ． ２５９−３０６ （１９８１）に記載されている。
ＰＲＯポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ等， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ２５９：５２ （１９８７）により、及びＥｄｇｅ等， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１８： １３１ （１９８１）により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ等， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １３８：３５０ （１９８７）に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のＰＲＯの共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に記載された方法での結合を含む。
【０３２８】
また、本発明のＰＲＯポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ｐｏｌｙ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄ等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ８：２１５９−２１６５ （１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Ｅｖａｎ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５：３６１０−３６１６ （１９８５）］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体［Ｐａｂｏｒｓｋｙ等， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ３（６）：５４７−５５３ （１９９０）］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Ｈｏｐｐ等， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：１２０４−１２１０ （１９８８）］；ＫＴ３エピトープペプチド［Ｍａｒｔｉｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５：１９２−１９４ （１９９２）］；α−チューブリンエピトープペプチド［Ｓｋｉｎｎｅｒ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：１５１６３−１５１６６ （１９９１）］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６３９３−６３９７ （１９９０）］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＰＲＯポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。
【０３２９】
Ｄ．ＰＲＯの調製
以下の説明は、主として、ＰＲＯ核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＰＲＯを調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯ配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ等， Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ （１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５：２１４９−２１５４ （１９６３）参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯを生産してもよい。
【０３３０】
１．ＰＲＯをコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯをコードするＤＮＡは、ＰＲＯｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＰＲＯ−コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（ＰＲＯに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等）によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，上掲；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ等， ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９５）］。
【０３３１】
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。
【０３３２】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯ生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９９１）及びＳａｍｂｒｏｏｋ等， 上掲に見出すことができる。
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質移入の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Ｓｈａｗ等， Ｇｅｎｅ， ２３：３１５ （１９８３）及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ ８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６−４５７ （１９７８）のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ ｓｏｌｉｎｇｅｎ等， Ｊ． Ｂａｃｔ．， １３０：９４６ （１９７７）及びＨｓｉａｏ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６：３８２９ （１９７９）の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８５：５２７−５３７ （１９９０）及び Ｍａｎｓｏｕｒ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３６：３４８−３５２ （１９８８）を参照のこと。
【０３３３】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、エンテロバクター、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ） 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバシリリチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ ２６６，７１０に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｒｔ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ ｐｔｒ３ ｐｈｏＡ Ｅ１５ （ａｌｇＦ−ｌａｃ）１６９ ｄｅｇＰ ｏｍｐＴ ｒｂｓ７ｉｌｖＧ ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。
【０３３４】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｒｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ及びＮｕｒｓｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ２９０： １４０ ［１９８１］； １９８５年５月２日発行のＥＰ １３９，３８３）；クルベロミセスホスツ（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｈｏｓｔｓ）（米国特許第４，９４３，５２９号； Ｆｌｅｅｒ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９： ９６８−９７５ （１９９１））、例えばケーラクチス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ， ＣＢＳ６８３， ＣＢＳ４５７４； Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ等， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． ７３７ ［１９８３］）、ケーフラギリス（Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ １２，４２４）、ケーブルガリクス（Ｋ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ １６，０４５）、ケーウィケラミイ（Ｋ． ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、ケーワルチイ（Ｋ． ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ ５６，５００）、ケードロソフィラルム（Ｋ． ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ ３６，９０６； Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８： １３５ （１９９０））、ケーテモトレランス（Ｋ． ｔｈｅｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びケーマルキシアナス（Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ ４０２，２２６）；ピッチャパストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ １８３，０７０； Ｓｈｅｅｋｒｉｓｈｎａ等， Ｊ． Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２８： ２６５−２７８ ［１９８８］）；カンジダ；トリコデルマレーシア（ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｃａｓｅ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６： ５２５９−５２６３ ［１９７９］）；シュワニオマイセス（ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス（ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（１９９０年１０月３１日発行のＥＰ ３９４，５３８）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（１９９１年１月１０日発行のＷＯ ９１／００３５７）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（Ｂａｌｌａｎｃｅ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １１２： ２８４−２８９ ［１９８３］； Ｔｉｌｂｕｒｎ等， Ｇｅｎｅ， ２６： ２０５−２２１ ［１９８３］； Ｙｅｌｔｏｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： １４７０−１４７４ ［１９８４］）及びクロカビ（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ， ＥＭＢＯ Ｊ．， ４： ４７５−４７９ ［１９８５］）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック（ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、及びロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、Ｃ． Ａｎｔｈｏｎｙ， Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ， ２６９ （１９８２）に記載されている。
【０３３５】
グリコシル化ＰＲＯの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ等， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．， ３６：５９ （１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ， Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６ （１９８０））；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４， Ｍａｔｈｅｒ， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ２３：２４３−２５１ （１９８０））ヒト肺細胞 （Ｗ１３８， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）； ヒト肝細胞（Ｈｅｐ Ｇ２， ＨＢ ８０６５）； 及びマウス乳房腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２， ＡＴＴＣ ＣＣＬ５１）を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【０３３６】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＰＲＯをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＰＲＯは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯ−コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（酵母菌属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダアルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日発行のＥＰ３６２１７９）、又は１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０３３７】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシリに対する遺伝子コードＤ−アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【０３３８】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＰＲＯ−コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂ 等により， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６ （１９８０）に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｍａｎ等， Ｇｅｎｅ， ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ等， Ｇｅｎｅ， １０：１５７（１９８０）］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４−１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Ｊｏｎｅｓ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ８５：１２ （１９７７）］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ−コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Ｃａｈｎｇ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２７５：６１５ （１９７８）； Ｇｏｅｄｄｅｌ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：５４４ （１９７９）］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ８：４０５７ （１９８０）； ＥＰ ３６，７７６］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［ｄｅＢｏｅｒ 等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０：２１−２５ （１９８３）］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を有する。
【０３３９】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ［Ｈｉｔｚｅｍａｎ 等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５５：２０７３ （１９８０）］又は他の糖分解酵素［Ｈｅｓｓ 等， Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．， ７：１４９ （１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １７：４９００（１９８７）］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはＥＰ ７３，６５７に更に記載されている。
【０３４０】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯ転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ ２，２１１，５０４）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【０３４１】
より高等の真核生物による所望のＰＲＯをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯコード化配列の５’ 又は３’ 位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’ 位に位置する。
また真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’ 、時には３’ の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２９３：６２０−６２５ （１９８１）； Ｍａｎｔｅｉ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：４０−４６ （１９７９）； ＥＰ １１７，０６０； 及びＥＰ １１７，０５８に記載されている。
【０３４２】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５ （１９８０）］、ドットブロット法（ＤＮＡ分析）、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０３４３】
５．ポリペプチドの精製
ＰＲＯの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液（例えばトリトン−Ｘ１００）又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＰＲＯを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Ｄｅｕｔｃｈｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８２ （１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８２）に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＰＲＯの性質に依存する。
【０３４４】
Ｅ．ＰＲＯの用途
ＰＲＯをコードする核酸配列（又はそれらの補体）は、ハイブリッド形成プローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、ＰＲＯ核酸も、ここに記載される組換え技術によるＰＲＯポリペプチドの調製に有用であろう。
全長天然配列ＰＲＯ遺伝子又はその一部は、全長ＰＲＯｃＤＮＡの単離又はここに開示したＰＲＯ配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ＰＲＯの天然発生変異体又は他の種からのＰＲＯをコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド形成プローブは、少なくとも部分的に全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列ＰＲＯのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、ＰＲＯポリペプチド遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリフォスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＰＲＯポリペプチド遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【０３４５】
本出願で開示する任意のＥＳＴはプローブと同様に、ここに記載した方法で用いることができる。
ＰＲＯ核酸の他の有用な断片は、標的ＰＲＯｍＲＮＡ（センス）又はＰＲＯＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、ＰＲＯＤＮＡのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを制御する可能性は、例えば、Ｓｔｅｉｎ及びＣｏｈｅｎ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ． ４８： ２６５９： １９８８）及び ｖａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌ等（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６： ９５８， １９８８）に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＲＯタンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、ＷＯ ９１／０６６２９に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（即ち、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【０３４６】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、ＷＯ ９０／１００４８に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ−（Ｌ−リジン）に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属作体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４−媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン−バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ−ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（ＷＯ ９０／１３６４１参照）を含む。
【０３４７】
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＷＯ ９０／１０４４８に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ分子は一般に少なくとも約５塩基長、約１０塩基長、約１５塩基長、約２０塩基長、約２５塩基長、約３０塩基長、約３５塩基長、約４０塩基長、約４５塩基長、約５０塩基長、約５５塩基長、約６０塩基長、約６５塩基長、約７０塩基長、約７５塩基長、約８０塩基長、約８５塩基長、約９０塩基長、約９５塩基長、約１００塩基長、あるいはそれ以上である。
【０３４８】
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＰＲＯコード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、ＰＲＯをコードするヌクレオチド配列は、そのＰＲＯをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
ＰＲＯのコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＰＲＯがレセプターである場合）、ＰＲＯは、そのリガンドを同定するアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＰＲＯは関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＰＲＯ又はＰＲＯのレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【０３４９】
また、ＰＲＯ又はその任意の修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのにも使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物（例えばマウス又はラット）とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＰＲＯをコードするｃＤＮＡは、確立された技術によりＰＲＯをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、ＰＲＯをコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第４，７３６，８６６号や第４，８７０，００９号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＰＲＯ導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＰＲＯコード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＰＲＯをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療的処置の可能性が示される。
【０３５０】
あるいは、ＰＲＯの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＰＲＯをコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＰＲＯをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＰＲＯをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＰＲＯ「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＰＲＯをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＰＲＯをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＰＲＯをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ（５’ と３’ 末端の両方）を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはＴｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉ， Ｃｅｌｌ， ５１：５０３（１９８７）を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に（例えばエレクトロポレーションによって）導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される［例えば、Ｌｉ等， Ｃｅｌｌ， ６９：９１５（１９９２）参照］。選択された細胞は次に動物（例えばマウス又はラット）の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｅ． Ｊ． Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， ｅｄ． （ＩＲＬ， Ｏｘｆｏｒｄ， １９８７）， ｐｐ． １１３−１５２参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＰＲＯポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【０３５１】
また、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Ｚａｍｅｃｎｉｋ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３： ４１４３−４１４６ ［１９８６］）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質−リポソーム媒介形質移入である（Ｄｚａｕ等， Ｔｒｅｎｄｓ， ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１， ２０５−２１０（１９９３））。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Ｗｕ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２， ４４２９−４４３２ （１９８７）； 及びＷａｇｎｅｒ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， ３４１０−３４１４ （１９９０）によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６， ８０８−８１３ （１９９２）を参照のこと。
【０３５２】
ここに記載したＰＲＯポリペプチドは、タンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよいし、単離された核酸配列は、これらのマーカーの組み換え発現に使用しもよい。
ここに記載したＰＲＯポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は染色体同定に有用である。この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要性が存在している。本発明の各ＰＲＯ核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また本発明のＰＲＯポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のＰＲＯポリペプチドは一方の組織で他方に比較して異なる発現をする。ＰＲＯ核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
ここに記載したＰＲＯポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のＰＲＯポリペプチドは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、それにより、このＰＲＯ生成物は製薬的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ａ． Ｏｓｏｌ， Ｅｄ．， ［１９８０］）、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（残基数１０個未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、マンニトール又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（商品名）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０３５３】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、本発明の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｙａｃｏｂｉ等， 編， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９， ｐｐ． ４２−９６のＭｏｒｄｅｎｔｉ， Ｊ． 及びＣｈａｐｐｅｌｌ， Ｗ． 「Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」に記載された原理に従って実施できる。
【０３５４】
ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することは必要であることが予想される。
ＰＲＯポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＰＲＯポリペプチドの持続放出が望まれる場合、ＰＲＯポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−（ｒｈＩＦＮ−）、インターロイキン−２、及びＭＮｒｇｐ１２０で成功裏に実施されている。Ｊｏｈｎｓｏｎ等， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ２： ７９５−７９９ （１９９６）； Ｙａｓｕｄａ， Ｂｉｏｍｅｄ． Ｔｈｅｒ．， ２７： １２２１−１２２３ （１９９３）； Ｈｏｒａ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８： ７５５−７５８ （１９９０）； Ｃｌｅｌａｎｄ， 「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌｙａｃｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ」Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ： Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｐｏｗｅｌｌ 及び Ｎｅｗｍａｎ編， （Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９５）， ｐ． ４３９−４６２； ＷＯ ９７／０３６９２， ＷＯ ９６／４００７２， ＷＯ ９６／０７３９９； 及び米国特許第５，５６４，０１０号。
【０３５５】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ−乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Ｌｅｗｉｓ， 「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ ｐｏｌｙｍｅｒ」： Ｍ． Ｃｈａｓｉｎ及び Ｒ． Ｌａｎｇｅｒ （編）， Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９０）， ｐｐ． １−４１。
本発明は、ＰＲＯポリペプチドに類似する（アゴニスト）又はＰＲＯポリペプチドの効果を阻害する（アンタゴニスト）ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるＰＲＯポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
該アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるＰＲＯポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
【０３５６】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＰＲＯポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばミクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるＰＲＯポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【０３５７】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のＰＲＯポリペプチに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Ｆｉｅｌｄｓ及び共同研究者等［Ｆｉｅｌｓ及びＳｏｎｇ， Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ） ３４０， ２４５−２４６ （１９８９）； Ｃｈｉｅｎ等， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８， ９５７８−９５８２ （１９９１）］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Ｃｈｅｖｒａｙ及びＮａｔｈａｎｓ［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９， ５７８９−５７９３ （１９９１）］に開示されている酵母菌ベースの系を用いて監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２−ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１−ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２−ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（ＭＡＴＣＨＭＡＫＥＲ（商品名））は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０３５８】
ここで同定されたＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブ対照を提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
アンタゴニストを検定するために、ＰＲＯポリペプチドを特定の活性についてスクリーニングする化合物とともに添加してよく、ＰＲＯポリペプチド存在下での対象とする活性を阻害する化合物の能力が化合物がＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチド及び膜結合ＰＲＯポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを持つ潜在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ＰＲＯポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したＰＲＯポリペプチドの数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートにより同定できる。Ｃｏｌｉｇａｎ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．， １（２）： Ｃｈａｐｔｅｒ ５ （１９９１）。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＰＲＯポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はＰＲＯポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識したＰＲＯポリペプチドに暴露する。ＰＲＯポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【０３５９】
レセプター同定の代替的方法として、標識下ＰＲＯポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料はＰＡＧＥに溶解させ、Ｘ線フィルムに暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＰＲＯポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＰＲＯポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリペプチド−及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗−イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってＰＲＯポリペプチドの作用を競合的に阻害するＰＲＯポリペプチドの変異形態であってもよい。
他の潜在的なＰＲＯポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリペプチドヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＰＲＯポリペプチドをコードするポリペプチドヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（トリプルへリックス−Ｌｅｅ等， Ｎｕｃｌ， Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， ６： ３０７３ （１９７９）； Ｃｏｏｎｅｙ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４１： ４５６ （１９８８）； Ｄｅｒｖａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１： １３６０ （１９９１）参照）、それによりＰＲＯポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリッド形成してｍＲＮＡ分子のＰＲＯポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Ｏｋａｎｏ， Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．， ５６： ５６０ （１９９１）； Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｓ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ （ＳＲＳ Ｐｒｅｓｓ： Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ， １９８８））。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＰＲＯポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０３６０】
潜在的アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＰＲＯポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Ｒｏｓｓｉ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ４： ４６９−４７１ （１９９４）及びＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１（１９９７年９月１８日公開）を参照。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号ＷＯ ９７／３３５５１， 上掲を参照。
これらの小分子は、上記で検討したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【０３６１】
ＰＲＯ２１３ポリペプチド及びその一部は、成長誘発カスケード及び／又は血液凝集カスケードを調節する能力を持ち、インビボ及びインビトロでそのような目的のために用いることができる。当業者はＰＲＯ２１３ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯポリペプチド２７４及びその一部は、７ＴＭタンパク質及びＦｎ５４に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規な７ＴＭタンパク質及びＦｎ５４様分子の同定は多数のヒト疾患に関連し、それはリガンドの認識及びそれに続くリガンドに含まれる細胞プロセスの制御のための情報のシグナル伝達を含む。即ち、新たな７ＴＭタンパク質及びＦｎ５４様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、ＰＲＯ２７４などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
ＰＲＯポリペプチド３００及びその一部は、Ｄｉｆｆ３３に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なＤｉｆｆ３３様分子の同定は癌の生理学などの多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなＤｉｆｆ３３様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、ＰＲＯ３００などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【０３６２】
本発明のＰＲＯ２９６ポリペプチドは、肉腫増幅ＳＡＳタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ２９６ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ３２９ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃレセプタータンパク質又はそのサブユニットに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ３２９ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ３６２ポリペプチドは、Ａ３３抗原タンパク質、ＨＣＡＲタンパク質又はＮｒＣＡＭ関連細胞接着分子に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。
【０３６３】
本発明のＰＲＯ３６３ポリペプチドは、細胞表面ＨＣＡＲタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ３６３ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。特に、ＰＲＯポリペプチドから誘導される細胞外ドメインは、ウイルス感染の影響を低下させるためにインビボで治療的に使用できる。
本発明のＰＲＯ８６８ポリペプチドは、腫瘍壊死因子タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ８６８ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ３８２ポリペプチドは、セリンプロテアーゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ３８２ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【０３６４】
ＰＲＯポリペプチド５４５及びその一部は、メルトリンに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。細胞接着に関連する新規な分子の同定は多数のヒト疾患に関連する。メルトリンタンパク質が多くの疾患プロセスにおいて重要な役割を果たすので、新たなメルトリンタンパク質及びメルトリン様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、ＰＲＯ５４５などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
本発明のＰＲＯ６１７ポリペプチドは、ＣＤ２４タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ６１７ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯポリペプチド７００及びその一部は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ及び関連分子の同定は多数のヒト疾患に関連する。ジスルフィド結合の形成及びタンパク質折りたたみが多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たすので、新たなタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、ＰＲＯ７００などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【０３６５】
本発明のＰＲＯ７０２ポリペプチドは、コングルチニンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７０２ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。コングルチニン活性を持つＰＲＯ７０２ポリペプチドは、インフルエンザウイルスによる赤血球凝集活性を阻害することができ及び及び／又は補体媒介機構の結果として免疫グロブリン非依存性防御分子として機能すると予測される。
本発明のＰＲＯ７０３ポリペプチドは、ＶＬＣＡＳタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７０３ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯポリペプチド７０３及びその一部は、ＶＬＣＡＳに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なＶＬＣＡＳタンパク質及び関連分子の同定は多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなＶＬＣＡＳタンパク質及びＶＬＣＡＳタンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、ＰＲＯ７０３などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【０３６６】
本発明のＰＲＯ７０５ポリペプチドは、Ｋ−グリピカンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７０５ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ７０８ポリペプチドは、アリールスルファターゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７０８ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ３２０ポリペプチドは、フィブリンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ３２０ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯポリペプチド３２０及びその一部は、フィブリンに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なフィブリンタンパク質及び関連分子の同定は、癌などの多数のヒト疾患又は結合組織、接着分子及び関連機構を含むものに関連する。即ち、新たなフィブリンタンパク質及びフィブリンタンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、ＰＲＯ３２０などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【０３６７】
本発明のＰＲＯ３２４ポリペプチドは、オキシドレダクターゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ３２４ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ３５１ポリペプチドは、プロスタシンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ３５１ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯポリペプチド３５１及びその一部は、プロスタシンに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なプロスタシンタンパク質及び関連分子の同定は、多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなプロスタシンタンパク質及びプロスタシンタンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、ＰＲＯ３５１などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【０３６８】
本発明のＰＲＯ３５２ポリペプチドは、ブチロフィリンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ３５２ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ３８１ポリペプチドは、ＦＫＰＢイムノフィリンタンパク質の一又は複数に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方、例えば、免疫抑制活性の促進及び／又は軸索再生に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ３８１ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ３８６ポリペプチドは、哺乳動物細胞で発現されるナトリウムチャンネルのベータ−２サブユニットに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ３８６ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【０３６９】
本発明のＰＲＯ５４０ポリペプチドは、ＬＣＡＴタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ５４０ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ６１５ポリペプチドは、シナプトギリンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ６１５ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯポリペプチド６１５及びその一部は、シナプトギリンに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なシナプトギリンタンパク質及び関連分子の同定は、多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなシナプトギリンタンパク質及びシナプトギリンタンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、ＰＲＯ６１５などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【０３７０】
本発明のＰＲＯ６１８ポリペプチドは、エンテロペプチダーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ６１８ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯポリペプチド６１８及びその一部は、エンテロペプチダーゼに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なエンテロペプチダーゼタンパク質及び関連分子の同定は、多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなエンテロペプチダーゼタンパク質及びエンテロペプチダーゼ様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、ＰＲＯ６１８などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
本発明のＰＲＯ７１９ポリペプチドは、リポタンパク質リパーゼＨタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７１９ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【０３７１】
本発明のＰＲＯ７２４ポリペプチドは、ヒトＬＤＬレセプタータンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７２４ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ７７２ポリペプチドは、ヒトＡ４タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７７２ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ８５２ポリペプチドは、或る種のプロテアーゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ８５２ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【０３７２】
本発明のＰＲＯ８５３ポリペプチドは、レダクターゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ８５３ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯポリペプチド８５３及びその一部は、レダクターゼタンパク質に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。酸素フリーラジカル及び酸化防止剤が多数の疾患プロセスにおいて重要な役割を果たすことがわかったので、新規なレダクターゼタンパク質及びレダクターゼ様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、ＰＲＯ８５３などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
本発明のＰＲＯ８６０ポリペプチドは、ニューロファシンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ８６０ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯポリペプチド８６０及びその一部は、ニューロファシンに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なニューロファシンタンパク質及び関連分子の同定は、細胞接着を含む多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなニューロファシンタンパク質及びニューロファシン様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、ＰＲＯ８６０などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【０３７３】
本発明のＰＲＯ８４６ポリペプチドは、ＣＭＲＦ３５タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ８４６ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯポリペプチド８４６及びその一部は、ＣＭＲＦ３５タンパク質に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なＣＭＲＦ３５タンパク質及び関連分子の同定は、細胞接着を含む多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなＣＭＲＦ３５タンパク質及びＣＭＲＦ３５タンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、ＰＲＯ８４６などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
本発明のＰＲＯ８６２ポリペプチドは、リソザイムタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ８６２ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯポリペプチド８６２及びその一部は、リソザイムタンパク質に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なリソザイムタンパク質及び関連分子の同定は、細胞接着を含む多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなリソザイムタンパク質及びリソザイム様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、ＰＲＯ８６２などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【０３７４】
本発明のＰＲＯ８６４ポリペプチドは、Ｗｎｔ−４タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ８６４ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯポリペプチド８６４及びその一部は、Ｗｎｔ−４タンパク質に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なＷｎｔ−４タンパク質及び関連分子の同定は、細胞接着を含む多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなＷｎｔ−４タンパク質及びＷｎｔ−４タンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、ＰＲＯ８６０などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
本発明のＰＲＯ７９２ポリペプチドは、ＣＤ２３タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７９２ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【０３７５】
本発明のＰＲＯ８６６ポリペプチドは、ミンジン及び／又はスポンジンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ８６６ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知ってる。
本発明のＰＲＯ８７１ポリペプチドは、サイクロフィリンタンパク質ファミリーに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ８７１ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ８７３ポリペプチドは、カルボキシルエステラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。例えば、それらはプロドラッグと組み合わされ、プロドラッグをその活性形態に変換するのに用いられる（Ｄａｎｋｓ等， 上掲参照）。それらは、パラサイト感染の阻害に用いてもよい（ｖａｎ Ｐｅｌｔ等， 上掲参照）。本発明のＰＲＯ８７３ポリペプチドをそれら又は他の用途に用いる方法は、当業者には容易に理解されるであろう。
【０３７６】
本発明のＰＲＯ９４０ポリペプチドは、ＣＤ３３タンパク質及び／又はＯＢ結合タンパク質−２に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ９４０ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ９４１ポリペプチドは、カドヘリンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ９４１ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ９４４ポリペプチドは、ＣＰＥ−Ｒタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ９４４ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。ウェルシュ菌エンテロトキシン（ＣＰＥ）に結合する機能を持つ本発明のＰＲＯ９４４ポリペプチドは、ＣＰＥエンドトキシンによる感染の有効な治療に用途が見出される。
【０３７７】
本発明のＰＲＯ９８３ポリペプチドは、小胞関連膜タンパク質、ＶＡＰ−３３に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ９８３ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ１０５７ポリペプチドは、プロテアーゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ１０５７ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ１０７１ポリペプチドは、トロンボスポンジンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ１０７１ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【０３７８】
本発明のＰＲＯ１０７２ポリペプチドは、レダクターゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ１０７２ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ１０７５ポリペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ１０７５ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知ってる。
本発明のＰＲＯ１８１ポリペプチドは、コルニコンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ１８１ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【０３７９】
本発明のＰＲＯ８２７ポリペプチドは、種々のインテグリンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ８２７ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ１１１４ポリペプチドは、タンパク質のサイトカインレセプターファミリーに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ１１１４ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
上記に加えて、ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドは、インビボ及びインビトロの両方で、インターフェロンリガンドへの結合能力が望まれる用途で用いられる。このような応用はこの分野の技術常識である。
本発明のＰＲＯ２３７ポリペプチドは、脱炭酸酵素タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ２３７ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【０３８０】
本発明のＰＲＯ５４１ポリペプチドは、トリプシンインヒビタータンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ５４１ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ２７３ポリペプチドは、他のケモカインが競合的アッセイの実施に用いられるアッセイにおいて用いることができる。結果はしかるべく用いることができる。
本発明のＰＲＯ７０１ポリペプチドは、ニューロリジンファミリーに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７０１ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ７０１は、ニューロンでのアッセイに用いることができ、それに対する活性をニューロリジン１、２及び３と比較することができる。結果はしかるべく適用できる。
【０３８１】
本発明のＰＲＯ７０４ポリペプチドは、小胞複合膜タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７０４ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ７０４は、それが同一性を有するポリペプチドでアッセイでき、相対的活性を決定できる。結果はしかるべく適用できる。ＰＲＯ７０４はエンドサイトーシス活性を測定するための活性についてタグ又は測定でき、それによりエンドサイトーシスに影響する薬剤をスクリーニングできる。
本発明のＰＲＯ７０６ポリペプチドは、内因性前立腺酸ホスファターゼ前駆体に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７０６ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ７０６は、ヒト前立腺酸ホスファターゼ又はヒトリソソーム産ホスファターゼでのアッセイに使用でき、それらに対する活性をヒト前立腺酸ホスファターゼ又はヒトリソソーム産ヒスファターゼと比較する。結果はしかるべく適用できる。
【０３８２】
本発明のＰＲＯ７０７ポリペプチドは、カドヘリンに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７０７ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ７０７は、他のカドヘリン、特にカドヘリンＦＩＢ３に対するその活性を決定するアッセイに使用できる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のＰＲＯ３２２ポリペプチドは、ニューロプシンに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ３２２ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ３２２は、ニューロピリン、トリプシノーゲン、セリンプロテアーゼ及びニューロシンに対するその活性を決定するアッセイに使用でき、結果はしかるべく適用できる。
本発明のＰＲＯ５２６ポリペプチドは、タンパク質−タンパク質結合タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ５２６ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ５２６がそれに結合するか及びその結合により半減期が向上するかを決定する複合体を形成することが知られた成長因子及び他のタンパク質でアッセイを実施できる。結果はしかるべく用いられる。
【０３８３】
本発明のＰＲＯ５３１ポリペプチドは、プロトカドヘリンに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ５３１ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ５３１は、それらの相対的活性を決定するために、プロトカドヘリン３及び他のプロトカドヘリンに対するアッセイに用いることができる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のＰＲＯ５３４ポリペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ５３４ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ５３４は、相対的活性を決定するためにタンパク質ジスルフィドイソメラーゼでのアッセイに使用できる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のＰＲＯ６９７ポリペプチドは、ｓＦＲＰファミリーに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ６９７ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ６９７は、相対的活性を決定するためにｓＦＲＰ及びＳＡＲＰでのアッセイに使用できる。結果はしかるべく適用できる。
【０３８４】
本発明のＰＲＯ７３１ポリペプチドは、任意のプロトカドヘリンに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７３１ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ７３１は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のＰＲＯ７６８ポリペプチドは、インテグリンに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７６８ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ７６８は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のＰＲＯ７７１ポリペプチドは、テスチカンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７７１ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ７７１は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
【０３８５】
本発明のＰＲＯ７３３ポリペプチドは、Ｔ１／ＳＴ２レセプターに結合するタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７３３ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ７３３は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のＰＲＯ１６２ポリペプチドは、膵臓関連タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ１６２ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ１６２は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のＰＲＯ７８８ポリペプチドは、抗悪性腫瘍尿タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ７８８ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ７８８は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
【０３８６】
本発明のＰＲＯ１００８ポリペプチドは、ｄｋｋ−１に関連する生物学的活性を有しインビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ１００８ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ１００８は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のＰＲＯ１０１２ポリペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ１０１２ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知ってる。
ＰＲＯ１０１２は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のＰＲＯ１０１４ポリペプチドは、レダクターゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ１０１４ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ１０１４は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。ＰＲＯ１０１４の阻害剤が特に好ましい。結果はしかるべく適用できる。
【０３８７】
本発明のＰＲＯ１０１７ポリペプチドは、スルホトランスフェラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ１０１７ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ１０１７は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のＰＲＯ４７４ポリペプチドは、デヒドロゲナーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ４７４ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ４７４は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のＰＲＯ１０３１ポリペプチドは、ＩＬ−１７に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ１０３１ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ１０３１は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
【０３８８】
本発明のＰＲＯ９３８ポリペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ９３８ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のＰＲＯ１０８２ポリペプチドは、ＬＤＬレセプターに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ１０８２ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
ＰＲＯ１０８２は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。またＰＲＯ１０８２は、レセプターを変調させる候補薬剤を同定するアッセイに使用できる。
本発明のＰＲＯ１０８３ポリペプチドは、７ＴＭレセプターに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のＰＲＯ１０８３ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
特にＰＲＯ１０８３は、ＰＲＯ１０８３を制御又は変調させる、即ちレセプターに影響を与える候補薬剤を決定するアッセイに使用できる。
【０３８９】
ここで、ＶＥＧＦ−Ｅ分子は、細胞の生存、増殖及び／又は分化に関連する多くの治療的用途を有する。このような用途は、ＶＥＧＦ−Ｅがヒト臍静脈内皮細胞の生存を増大させる能力が示されたという観点から、臍静脈内皮細胞の治療を含む。治療は、静脈が損傷を受けた場合、又は例えば臍静脈の生存を促進するための人工的手段が用いられた状況、例えば、人工的マトリクスに基づいて又は人工的な環境においてにおいてそれが弱体化、疾患となっている状況で必要とされる。ＶＥＧＦ−Ｅの選択的分裂促進特性に基づいて向上されうる他の生理学的状態もここに含まれる。また、用途は、ＶＥＧＦ−Ｅが繊維芽細胞の増殖及び筋細胞肥大を誘発する能力が示されたという観点から、繊維芽細胞及び筋細胞の治療も含む。特に、ＶＥＧＦ−Ｅは創傷治癒、組織成長及び筋生成及び再生に使用できる。
上記した徴候のために、ＶＥＧＦ−Ｅ分子を製剤し、治療すべき特定の疾患、個々の患者の状態、ＶＥＧＦ−Ｅの送達部位、投与方法、及び実務者に知られた他の要因を考慮して良好な医学的実務に合致する形式で投与される。即ち、ここでの目的について、ＶＥＧＦ−Ｅの「治療的有効量」は、治療される状態の悪化を防止、抑制するか、その状態を軽減又は回復させるのに有効な量、特に、治療されるインビボでの細胞の生存、増殖及び／又は分化を促進するのに十分な量である。
【０３９０】
天然ＶＥＧＦに対して生じた抗体と免疫学的交差反応性であるＶＥＧＦ−Ｅアミノ酸変異体配列及び誘導体は、標準として、又は標識された場合には競合試薬としてについてのＶＥＧＦ−Ｅについてのイムノアッセイに有用である。
ＶＥＧＦ−Ｅは、適当な純度を持つＶＥＧＦ−Ｅを任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤と混合することにより貯蔵又は投与のために調製される。このような材料は、用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性である。ＶＥＧＦ−Ｅが水溶性である場合、それはクエン酸塩又は他の有機酸塩などのバッファー中に、好ましくは約７から８のｐＨで製剤される。ＶＥＧＦ−Ｅが水に一部しか溶解しない場合、それを０．０４−０．０５％（ｗ／ｖ）の量のＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ又はＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ８０とともに製剤して溶解性を向上させ、マイクロエマルションとして調製してもよい。
場合によっては、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はアルギニン；セルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；及びマンニトール又はソルビトール等の糖といった他の成分を添加してもよい。
【０３９１】
治療投与に用いられるＶＥＧＦ−Ｅは無菌でなければならない。無菌性は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通すことにより容易に達成される。ＶＥＧＦ−Ｅは通常は凍結乾燥形態又は熱的及び酸化的変性に対して安定性が高い場合には水溶液中に貯蔵される。ＶＥＧＦ−Ｅ製剤のｐＨは典型的には約６から８であるが、より高い又は低いｐＨ値が適している場合もある。上記した或る種の賦形剤、担体又は安定化剤を用いることによりＶＥＧＦ−Ｅの塩が形成されることは理解されるであろう。
ＶＥＧＦ−Ｅが非経口で用いられる場合、ＶＥＧＦ−Ｅを含有する治療用組成物は一般的に無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備するバイアルに配される。
一般に、疾患が許すならば、ＶＥＧＦ−Ｅを部位特異的輸送のために製剤し投与すべきである。これは、創傷及び腫瘍の場合に便利である。
また、持続放出製剤を調製することもでき、マイクロカプセル粒子及びインプラント可能な物品の形成も含む。持続放出ＶＥＧＦ−Ｅ組成物を調製するために、ＶＥＧＦ−Ｅは好ましくは生分解性マトリクス又はマイクロカプセルに導入される。この目的に適した材料はポリアクチドであるが、ポリ−（ａ−ヒドロキシカルボン酸）のポリマー、例えばポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸（ＥＰ １３３，９８８Ａ）を用いることもできる。他の生分解性ポリマーは、ポリ（ラクトン）、ポリ（オルトエステル）、又はポリ（オルトカーボネート）を含む。ここで最初に考慮するのは、担体自身又はその分解生成物が標的組織に非毒性であり、状態を悪化させないことである。これは、標的とする疾患の動物モデル、もしそのようなモデルが入手不能ならば正常な動物における日常的なスクリーニングによって決定できる。多数の科学出版物がそのような動物モデルを記録している。
【０３９２】
持続性放出組成物については、米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ ５８，４８１Ａ、米国特許第３，８８７，６９９号、ＥＰ １５８，２７７Ａ、カナダ国特許番号１１７６５６５、Ｕ． Ｓｉｄｍａｎ等， Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２， ５４７ （１９８３）、及びＲ． Ｌａｎｇｅｒ等， Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ． １２， ９８［１９８２］を参照のこと。
局所適用する場合、ＶＥＧＦ−Ｅは好適には他の成分、例えば担体及び／又はアジュバントと組み合わされる。そのような他の成分の性質には、それらの意図している投与について製薬的に許容可能かつ有効であり、組成物の活性成分の活性を低下させないこと以外に制限はない。適当な媒体の例には、軟膏、クリーム、ゲル、又は懸濁液を含み、精製コラーゲンを含んでも含まなくてもよい。また、組成物は経皮パッチ、プラスター、及びバンドに、好ましくは液体又は半液体形態で含浸させてもよい。
【０３９３】
ゲル製剤を得るために、液体組成物に製剤したＶＥＧＦ−Ｅを、有効量の水溶性多糖類又はポリエチレングリコールなどの合成ポリマーと混合して、局所投与するのに適した粘度のゲルを形成してもよい。用いられる多糖類は、例えば、セルロース誘導体、例えばアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、及びヒドロキシアルキルセルロースを含むエーテル化セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロース；デンプン及び分別デンプン；寒天；アルギン酸及びアルギン酸塩；アラビアゴム；プルラン；アガロース；カラゲナン；デキストラン；デキストリン；フルクタン；インシュリン；マンナン；キシラン；アラビナン；キトサン；グリコーゲン；グルカン；及び合成バイオポリマー；並びにゴム、例えばキサンタンゴム；グアールゴム；イナゴマメゴム；アラビアゴム；トラガカントゴム；及びカラヤゴム；及びこれらの誘導体及び混合物である。ここで好ましいゲル化剤は、生物学系に不活性で、非毒性で、調製が単純で、なおかつ緩すぎず粘りすぎず、そしてそこに保持されるＶＥＧＦ−Ｅを不安定化させないものである。
好ましくは、多糖類はエーテル化セルロース誘導体、より好ましくは良好に定義され、精製され、米国特許に記載されたものであり、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのメチルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロース誘導体である。ここで最も好ましいのはメチルセルロースである。
ゲル化に有用なポリエチレングリコールは、典型的には適切な粘度を得るための低及び高分子量ポリエチレングリコールの混合物である。例えば、分子量４００−６００のポリエチレングリコールと分子量１５００のものとの混合物は、ペーストを得るのに適した比率で混合した場合にこの目的に有効となるであろう。
【０３９４】
多糖類及びポリエチレングリコールに適用される「水溶性」という用語は、コロイド溶液及び分散物も含むことを意味する。一般に、セルロース誘導体の溶解性はエーテル基の置換の程度によって決まり、ここで有用な安定化誘導体は、そのようなエーテル基をセルロース鎖の無水グルコース単位当たりに誘導体を水溶性とするのに十分な量有していなければならない。無水グルコース単位当たりに少なくとも０．３５のエーテル基というエーテル置換度が一般的には十分である。さらに、セルロース誘導体はアルカリ金属塩、例えばＬｉ、Ｎａ、Ｋ、又はＣｓ塩の形態であってもよい。
ゲルにメチルセルロースが用いられる場合、好ましくはゲルの約２−５％、より好ましくは約３％を含み、ＶＥＧＦはゲル１ｍｌ当たりに約３００−１０００ｍｇの量で存在する。
【０３９５】
用いられる投与量は上記の要因に依存する。一般的な提案として、ＶＥＧＦ−Ｅは、組織において約０．１ｎｇ／ｃｃより大きく、有効だが過度に毒性ではない最大用量までのＶＥＧＦ−Ｅレベルを確立することのできる投与量で製剤され標的部位又は組織に輸送される。この細胞内濃度は、もし可能ならば、連続的吸入、持続放出、局所適用、又は経験的に決められる頻度での注射により維持されるべきである。
ここで、ＶＥＧＦ−Ｅ治療を、細胞増殖、生存、分化及び再生の促進において、ＶＥＧＦ−Ｅを含む任意の成長因子の活性を向上させるための他の新規な又は従来からの治療薬（例えば、ＶＥＧＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、タンパク同化ステロイド、ＥＧＦ又はＴＧＦ−ａ等の成長因子）と組み合わせるのも範囲内である。これらの協働治療薬は、それ自体が本発明の組成物に含まれる必要はないが、それらの薬剤がタンパク質性であるのが便利である。そのような混合物は、ＶＥＧＦ−Ｅが単独で用いられるのと同様の方式及び同様の目的で適切に投与される。ＶＥＧＦ−Ｅのそれら二次的成長因子に対する有用なモル比は、典型的には１：０．１−１０であり、およそ等モル量が好ましい。
【０３９６】
本発明の化合物は、製薬的に有用な組成物を調製するための周知の方法に従って処方でき、それによりＰＲＯポリペプチドが製薬的に許容可能な担体媒体との混合物に混合される。好適な担体媒体及びその処方は、他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含むが、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １６ｔｈ ｅｄ．， １９８０， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｏｓｏｌ等編集に記載されており、その開示は参考としてここに取り入れる。ここで、ＶＥＧＦ−Ｅは、心臓血管疾患又は状態に罹った患者に非経口で投与してもよく、又は血流への有効形態での輸送を確実にする他の方法によってもよい。
本発明の実施に用いられるＶＥＧＦ−Ｅの臨床投与に特に良く適した組成物は、例えば、無菌の水溶液、又は凍結乾燥タンパク質のような無菌の水和可能な粉末を含む。一般的に好ましいのは、製剤中に適量の、一般的には製剤を等張にするのに十分な量の製薬的に許容可能な塩をさらに含むことである。また、アルギニン塩基、及びリン酸などのｐＨ調節剤は、典型的には適当なｐＨ、一般的には５．５から７．５に維持するのに十分な量が含まれる。さらに、水性製剤の有効期間又は安定性を向上させるために、グリセロールなどの薬剤を更に含有するのも望ましい。このようにして、種々のｔ−ＰＡ製剤が非経口投与、特に静脈内投与に適したものとされる。
【０３９７】
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬剤濃度は、特に意図される用途に応じて変化する。例えば、静脈深部の血栓症又は末梢血管疾患の治療においては、「ボーラス」投与が典型的には好ましく、それに続く投与は、およそ一定な血液レベル、好ましくは約３μｇ／ｍｌのオーダーに維持するように与えられる。
しかしながら、吸入能力は一般に利用できない救急医療ケア設備に関連する用途では、横たわる疾患（例えば塞栓症、亀裂骨折）の一般的な緊急性のために、幾分多めの初期投与量、例えば静脈内ボーラスを与えるのが一般的に望ましい。
ここの化合物について述べた種々の徴候のために、ＶＥＧＦ−Ｅ分子は、治療すべき特定の疾患、個々の患者の状態、輸送部位、投与方法、及び対応する分野の実務者に知られた他の要因を考慮して良好な医学的実務に合致する方式で製剤され投与される。即ち、ここでの目的について、ＶＥＧＦ−Ｅの「治療的有効量」は、治療される状態の悪化を防止、抑制するか、その状態を軽減又は回復させるのに有効な量、特に、治療されるインビボでの細胞の生存、増殖及び／又は分化を促進するのに十分な量である。一般的に、治療すべき治療的徴候の対象である組織において約０．１ｎｇ／ｃｍ３より大きく、有効だが過度に毒性ではない最大用量までのＶＥＧＦ−Ｅレベルを確立することのできる投与量が採用される。組織内投与は、ここの化合物の或る種の治療的徴候のための選択肢であると考えられる。
【０３９８】
本発明のヒトＴｏｌｌタンパク質も、Ｔｏｌｌ媒介シグナル伝達に含まれる他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに使用できる。例えば、ＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６は、ヒトＴｏｌｌレセプターの未だ知られていない天然リガンド、又はヒトＴｏｌｌレセプターを介する活性化及び／又はシグナル伝達に（直接又は間接的に）参加する他の因子、例えば潜在的Ｔｏｌｌレセプター関連キナーゼなどを同定するのに有用である。さらに、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤（インヒビター）も同定できる。そのような結合性相互作用に含まれるタンパク質は、結合性相互作用のペプチド又は小分子インヒビター又はアゴニストのスクリーニングにも使用できる。
スクリーニングアッセイは、天然Ｔｏｌｌポリペプチド又は天然Ｔｏｌｌポリペプチドのリガンドの生物学的活性に類似するリード化合物を見出すのに設計することができる。そのようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能であり、小分子薬剤候補の同定のために特に適したものにする。考えられる小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む種々の形式で実施され、それらはこの分野で良く特徴付けされている。
【０３９９】
インビトロアッセイは、Ｔｏｌｌレセプターポリペプチドを含む成分の混合物を用いるが、それは他のペプチド又はポリペプチド、例えば検出又は固着などのためのタグとの融合生成物の一部であってもよい。アッセイ混合物は、（結合アッセイのために）天然細胞内又は細胞外Ｔｏｌｌ結合標的（例えば、Ｔｏｌｌリガンド、又はＴｏｌｌレセプターを介して活性化及び／又はシグナル伝達することが知られた他の分子）をさらに含有してよい。天然結合標的を用いてもよいが、そのような結合標的の一部（例えばペプチド）が、主題のＴｏｌｌタンパク質に対してアッセイで便利に測定可能な結合親和性及び結合活性を与える限り、その一部を用いるのが好ましい場合が多い。また、アッセイ混合物は、候補の薬理学的薬剤も含有する。候補薬剤は多くの化学的分類を含み、典型的には有機化合物、好ましくは小型有機化合物であり、合成又は天然化合物のライブラリを含む広範な供給源から得られるものに渡る。種々の他の試薬、例えば、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物薬等も含有してよい。
インビトロ結合アッセイにおいて、得られた混合物は、候補分子の存在を別にすれば、Ｔｏｌｌタンパク質が細胞結合標的、一部又は類似物に、参照結合親和性で特異的に結合する条件下でインキュベートする。混合物成分は、必要な結合を与える任意の順序で添加でき、インキュベーションは最適の結合を促進する温度で実施する。インキュベーション時間は、同様に最適な結合のために選択するが、迅速な高スループットスクリーニングを促進するために最短とする。
【０４００】
インキュベーションの後、Ｔｏｌｌタンパク質と一又は複数の結合標的との間の薬剤を介する結合が任意の便利な技術により検出される。細胞無しの結合型アッセイのために、分離工程は結合した成分を結合していない成分から分離するのにしばしば用いられる。分離は、沈殿（例えばＴＣＡ沈殿、免疫沈降など）、固定化（例えば、固体基体上）等、次いで洗浄、例えば、膜濾過（例えばＷｈａｔｍａｎ’ｓ Ｐ−１８イオン交換紙、Ｐｏｌｙｆｉｌｔｒｏｎｉｃ’ｓ 疎水性ＧＦＣ膜など）、ゲルクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過、親和性など）によってなされる。Ｔｏｌｌ依存性転写アッセイでは、結合はＴｏｌｌ依存性リポーターの発言における変化により検出される。
検出は任意の従来法でなされる。細胞無し結合アッセイでは、成分の一つが通常は標識を含むか結合している。標識は、放射活性、蛍光、光学又は電子密度としての直接検出、又はエピトープタグ、酵素などの間接的検出を与える。標識及び他のアッセイ成分の性質に応じて、例えば光学又は電子密度、放射線放出、非放射性エネルギー移動等を通して、又は間接的に検出される抗体抱合などで、種々の標識検出方法が用いられる。
また、ここに開示したＴｏｌｌポリペプチドをコードする核酸は、遺伝子治療に用いてもよい。遺伝子治療用途においては、遺伝子が細胞に導入され、例えば欠陥遺伝子を置換するために、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成する。「遺伝子治療」とは、１回の治療で長期間の効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はＲＮＡを１回又は繰り返し投与することを含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、或る種の遺伝子のインビボ発現を阻止するための治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に導入でき、それらの細胞膜による取り込みが少ないために生ずる細胞内低濃度にもかかわらず、そこでインヒビターとして作用することが既に示されている。（Ｚａｍｎｅｃｎｉｋ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３， ４１４３−４１４６ ［１９８６］）。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電したホスホジエステルを非荷電基に置換することにより、それらの取り込みを促進するような修飾をすることができる。
【０４０１】
核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかに依る。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。現在好ましいインビボ遺伝子導入技術は、ウィルス（典型的にはレトロウィルス）ベクター及びウィスル被覆リポソーム媒介形質移入を含む（Ｄｚａｕ等， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１， ２０５−２１０ ［１９９３］）。幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞をターゲティングする試薬、例えば細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞、即ち標的細胞上のレセプターのリガンドなどとともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、ターゲティング及び／又は取り込みの促進のために用いられ、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６２：４４２９−４４３２ （１９８７）；及びＷａｇｎｅｒ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ８７： ３４１０−３４１４ （１９９０）に記載されている。現在知られている遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５６：８０８−８１３ （１９９２）を参照のこと。
ここにＴｏｌｌタンパク質に関連して列挙した種々の用途は、天然Ｔｏｌｌレセプターの少なくとも１つの生物学的活性が類似している天然Ｔｏｌｌレセプターのアゴニストにも利用可能である。
【０４０２】
ニューロトリミン並びに免疫グロブリンスーパーファミリーのＩｇＬＯＮサブファミリーの他のメンバーは、神経パターニング、分化、成熟及び成長に影響を与えることが同定された。その結果、ＰＲＯ３３７というヒトニューロトリミン相同体ポリペプチドは、神経不全を特徴とする疾患において有用性を持つ。例えば、筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリグ病）、ベル麻痺、及び棘筋萎縮又は麻痺を含む種々の状態を含む運動神経疾患である。本発明のＮＧＦ変異体製剤は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、ハンティングトン舞踏病、ダウン症、感音難聴、及びメニエール病などのヒト神経変性疾患の治療に使用できる。さらにＰＲＯ３３７ポリペプチドは、特に上記の疾患に伴うもののような痴呆又は障害において学習を促進するための認識促進剤として使用できる。
さらに、ＰＲＯ３３７ポリペプチドは神経障害、特に末梢神経障害の治療に用いられる。「末梢神経障害」は、末梢神経系に影響を与える疾患を指し、運動、感覚、運動感覚、又は自律神経の１つ又は複数の機能障害として現れることが多い。末梢神経障害によって現れる広範な形態は、各々が同様に多くの原因の一つによる。例えば、末梢神経障害は、遺伝子的に獲得され、全身性疾患によりもたらされ、又は毒性薬により誘発されることもある。例としては、これらに限られないが、糖尿病性末梢神経障害、遠位感覚運動神経障害、又は胃腸管の運動低下又は膀胱のアトニーなどの自律神経障害を含む。全身性疾患に伴う神経障害の例は、ポスト−ポリオ症候群又はＡＩＤＳ関連神経障害を含み；遺伝性神経障害は、シャルコー‐マリー‐ツース病、レフサム病、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、クラッベ病、異染性白質萎縮症、ファブリー病、及びドゥジュリーヌ‐ソッタ症候群を含み；毒性薬に誘発される神経障害の例は、ビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキセート、又は３’−アジド−３’−でオキシチミジンなどの化学治療薬での処理により生じるものを含む。同様に、ニューロトリミンアンタゴニストは、過剰なニューロン活性を特徴とする疾患において有用性を持つと予想される。
【０４０３】
エンドセリンは、不活性な中間体、ビッグエンドセリンから、亜鉛メタロプロテアーゼ、エンドセリン変換酵素（ＥＣＥ）によって触媒される独特なプロセシング事象によって生成される。ＥＣＥは細菌クローニングされ、その構造が単一経路の膜貫通タンパク質であり、短い細胞内Ｎー末端及び長い細胞外Ｃ−末端を持ち、それが触媒ドメインと多数のＮ−グリコシル化部位を含むことが示された。ＥＣＥはＴｒｐ７３及びＶａｌ７４の間のエンドセリンプロペプチドを切断し、活性なペプチドであるＥＴを生成し、それは循環ホルモンではなく局所的に作用することがわかった（Ｒｕｂａｎｙｉ， Ｇ．Ｍ． ＆ａｍｐ； Ｐｏｌｏｋｏｆｆ， Ｍ．Ａ．， Ｐｈａｒｍａｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ４６： ３２５−４１５ （１９９４））。即ち、ＥＣＥ活性はエンドセリン生成の調節の潜在的部位であり、エンドセリン系における治療的介入の可能な標的である。ＥＣＥ活性を阻止することにより、相対的に不活性な前駆体ビッグＥＴ−１の生理学的に活性な形態への変換を阻止することにより、ＥＴ−１の生成を停止することができる。
【０４０４】
ＥＣＥ−２は、アミノ酸レベルでウシＥＣＥ−２と６４％同一である。ＥＣＥ−２はＥＣＥ−１（６３％同一、８０％保存）、、エンドペプチダーゼ２４．１１及びＫｅｌｌ血液グループタンパク質と密接に関連している。ウシＥＣＥ−２は、トランス−ゴルジネットワークに局在化したＩＩ型膜結合メタロプロテイナーゼであり、そこで内因性ビッグエンドセリン−１を活性エンドセリンに変換する細胞内酵素として作用する（Ｅｍｏｔｏ， Ｎ． 及び Ｙａｎａｎｇｉｓａｗａ， Ｍ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０： １５２６２−１５２６８ （１９９５））。ウシＥＣＥ−２ｍＲＮＡの発現は、脳の一部、大脳皮質、小脳及び副腎髄質で最も高い。それは、子宮筋層（ｍｙｍｅｔｒｉｕｍ）、精巣、卵巣、及び内皮細胞で低レベルで発現される。ウシＥＣＥ−２及びＥＣＥ−１はともに、基質としてＥＴ−２又はＥＴ−３よりもＥＴ−１に対して活性である、Ｅｍｏｔｏ及びＹａｎａｎｇｉｓａｗａ， 上掲。
ヒトＥＣＥ−２は７３６アミノ酸長で、３１残基アミノ末端尾部、２３残基膜貫通へリックス、及び６８２カルボキシ末端ドメインを持つ。それはウシＥＣＥ−２に９４％同一であり、ヒトＥＣＥ−１に６４％同一である。予想される膜貫通ドメインは、ヒト及びウシＥＣＥ−２タンパク質間及びヒトＥＣＥ−１及びヒトＥＣＥ−２間で高度に保存され、これは推定Ｎ−結合グリコシル化部位と同様であり、Ｃｙｓ残基は中性エンドペプチダーゼ２４．１１及びＫｅｌｌ血液グループタンパク質及び推定亜鉛結合部位に保存されている。配列は、ＮＥＰ−ＥＣＥ−Ｋｅｌｌファミリーの他の膜と同様に、ヒトＥＣＥ−２はＩＩ型膜貫通亜鉛結合メタロプロテイナーゼをコードし、それは、ウシＥＣＥ−２について知られているものから外挿することにより、細胞内生産されたビッグＥＴ−１を持つ分泌経路内に局在化した細胞内酵素であるが、分泌小胞にとどまることを示唆している。ＥｍｏｔｏおよびＹｎａｎｇｉｓａｗａ， 上掲。
【０４０５】
ＥＣＥ−２の発現パターンは、ＥＣＥ−１で観察されたものとは異なる。ｍＲＮＡレベルのノーザンブロット分析は、成人脳（小脳、被殻、髄質および側頭葉で最も高く、大脳皮質、後頭葉、および前頭葉で低い）、脊髄、肺および膵臓での３．３ｋｂ転写物の低レベル発現、および胎児脳および腎臓における高レベル４．５ｋｂを示した。２つの転写物サイズは、おそらくウシＥＣＥ−２（Ｅｍｏｔｏ及びＹａｎａｎｇｉｓａｗａ， 上掲）及びＥＣＥ−１（Ｘｕ等， Ｃｅｌｌ ７８： ４７３−４８５ （１９９４））で観察されたような代替的ポリアデニル化部位の使用を表している。ｃＤＮＡライブラリに対するＰＣＲは、胎児脳、胎児腎臓、胎児小腸、及び成人精巣における低レベルの発現を示した。胎児肝臓、胎児肺及び成人膵臓は、全て陰性であった。
ペプチドのエンドセリン（ＥＴ）ファミリーは、潜在的な血管、心臓及び腎臓活性を有し、それは多くのヒト疾患状態において病理生理学的に重要である。ＥＴ−１は不活性２１２アミノ酸プレペプチドとして発現される。プレペプチドは、最初にＡｒｇ５２−Ｃｙｓ５３及びＡｒｇ９２−Ａｌａ９３において切断され、次いでカルボキシ末端Ｌｙｓ９１及びＡｒｇ９２がタンパク質から削除されてプロペプチドビッグＥＴ−−１を生成する。ＥＣＥは、次いでＴｒｐ７３及びＶａｌ７４の間で切断され、活性なペプチドＥＴを生じ、それは循環ホルモンではなく局所で機能することがわかった（Ｒｕｂａｎｙ及びＰｏｌｏｋｏｆｆ， Ｐｈａｒｍａ． Ｒ． ４６： ３２５−４１５ （１９９４））。
エンドセリンは、１）心臓血管疾患（血管痙攣、高血圧、心筋虚血；再灌流障害及び急性心筋梗塞、発作（大脳虚血）、うっ血性心不全、ショック、アテローム性動脈硬化症、血管狭窄）；２）腎臓疾患（急性及び慢性腎不全、糸球体腎炎、肝硬変）；３）肺疾患（気管支喘息、肺高血圧症）；４）胃腸疾患（胃潰瘍、炎症性腸疾患）；５）生殖疾患（早産、月経困難症、子癇前症）；及び６）発癌を含む多くの疾患の病理生理において役割を果たす。Ｒｕｂａｎｙ及びＰｏｌｏｋｏｆｆ， 上掲。
【０４０６】
疾患は、１）ＥＴ生産の増加；２）ＥＴの反応性向上；及び／又は３）ＥＴレセプター、アンタゴニスト、抗体又はＥＣＥインヒビターの有効性を試験することにより、それに対するＥＴの衝撃について評価することができる。従前の基準に対する応答は、ＥＴが、クモ膜下出血、高血圧（劇症／合併症）、急性腎不全及びうっ血性心臓疾患に続く大脳血管痙攣において役割を果たすと思われることを示唆している。ＥＴ生産又は活性のインヒビターは、冠状血管痙攣、急性心筋梗塞、及びアテローム性動脈硬化症のモデルで使用されていないが、それらは、上昇したＥＴレベル及びＥＴに対する向上した反応性を有している。ショック及び肺性の高血圧も、上昇したＥＴレベルを示す（Ｒｕｂａｎｙ及びＰｏｌｏｋｏｆｆ， 上掲）。これらの状態におけるＥＣＥの阻害は治療的価値があると思われる。
ＥＣＥ−２の発現パターンは、ＥＣＥ−１で観察されたものとは異なる。ノーザンブロット分析によると、ＥＣＥ−２は、成人脳、肺および膵臓では低レベルで、胎児脳および腎臓では高レベルで観察された（Ｆｉｇ８）。ＰＣＲは、さらなる組織：胎児肺、胎児小腸、及び成人精巣における低レベルの発現を示した。胎児肝臓は陰性であった。類似の発現パターンはウシＥＣＥ−２について報告されている（Ｅｍｏｔｏ及びＹａｎａｎｇｉｓａｗａ， 上掲）。それは脳組織（大脳皮質、小脳及び側頭葉）、子宮筋層及び精巣で発現され、卵巣では低レベルで、他の多くの組織では極めて低レベルである。ウシＥＣＥ−１（Ｘｕ等， 上掲）は、より広く多く発現される。それは、殆どの器官の血管内皮細胞及び幾つかの実質細胞で観察される。脳での発現では、ＥＣＥ−２ｍＲＮＡはＥＣＥ−１より低レベルで存在した。本出願人は、ＥＣＥ−２が、クモ膜下出血及び発作に続く大脳血管痙攣などの疾患の治療的介入のための特に良好な標的であると信じる。
また、ここに開示された分子の使用は、下記に開示及び記載されている陽性機能アッセイヒットに基づいてよい。
【０４０７】
Ｆ．抗−ＰＲＯポリペプチド抗体
本発明は、さらに抗−ＰＲＯポリペプチド抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
抗−ＰＲＯポリペプチド抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【０４０８】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗−ＰＲＯポリペプチド抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５ （１９７５）に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には対象とするＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Ｇｏｄｉｎｇ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， （１９８６） ｐｐ． ５９−１０３］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み（「ＨＡＴ培地」）、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０４０９】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Ｋｏｚｂｏｒ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １３３：３００１ （１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ等， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８７） ｐｐ． ５１−６３］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）や酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばＭｕｎｓｏｎ及びＰｏｌｌａｒｄ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０７：２２０ （１９８０）によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０４１０】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Ｇｏｄｉｎｇ， 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【０４１１】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して）、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ等， 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【０４１２】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗−ＰＲＯポリペプチド抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト（例えばマウス）抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片（例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列）であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２９ （１９８８）； 及びＰｒｅｓｔａ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ２：５９３−５９６ （１９９２）］。
【０４１３】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター（ｗｉｎｔｅｒ）及び共同研究者［Ｊｏｎｅｓ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３２１：５２２−５２５ （１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３−３２７ （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４−１５３６ （１９８８）］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリー［Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２７：３８１ （１９９２）；Ｍａｒｋｓ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１ （１９９１）］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Ｃｏｌｅ等及びＢｏｅｒｎｅｒ等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Ｃｏｌｅ等， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ． ｐ．７７（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４７（１）：８６−９５（１９９１） ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。負荷の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，６６１，０１６号、及び次の科学文献：Ｍａｒｋｓ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０， ７７９−７８３ （１９９２）； Ｌｏｎｂｅｒｇ等， Ｎａｔｕｒｅ ３６８ ８５６−８５９ （１９９４）； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｎａｔｕｒｅ ３６８， ８１２−１３ （１９９４）； Ｆｉｓｈｗｉｌｄ等， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８４５−５１ （１９９６）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４， ８２６ （１９９６）； Ｌｏｎｂｅｒｇ及びＨｕｓｚａｒ， Ｉｎｔｅｒｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３ ６５−９３ （１９９５）に記載されている。
【０４１４】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＰＲＯ２１１、ＰＲＯ２２８、ＰＲＯ５３８、ＰＲＯ１７２、又はＰＲＯ１８２に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ及びＣｕｅｌｌｏ， Ｎａｔｕｒｅ， ３０５：５３７−５３９ （１９８３））。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ（クアドローマ）は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が１９９３年５月１３日公開のＷＯ ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等， ＥＭＢＯ Ｊ．，１０：３６５５−３６５６ （１９９１）に開示されている。
【０４１５】
所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域（ＣＨ１）が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばＳｕｒｅｓｈ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １２１：２１０（１９８６）を参照されたい。
ＷＯ９６／２７０１１に記載された他のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又はより小さいサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの（アラニン又はトレオニン）と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０４１６】
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２２９：８１ （１９８５） は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ（ａｂ’）２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ’断片はついでチオニトロベンゾアート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ’−チオールに再転換し、他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ’断片を直接回収し、化学的に結合して二重特異性抗体を形成してもよい。Ｓｈａｌａｂｙ等， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７５： ２１７−２２５ （１９９２）は、完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ’断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学結合させて二重特異性抗体を形成する。このように形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現している細胞及び正常なヒトＴ細胞に結合でき、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性をトリガーする。
【０４１７】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Ｋｏｓｔｅｌｎｙ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４８（５）：１５４７−１５５３ （１９９２）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドが遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ’部分に結合された。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ６４４４−６４４８ （１９９３）により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方法もまた報告されている。Ｇｒｕｂｅｒ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５２：５３６８ （１９９４）を参照されたい。
【０４１８】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔら Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０（１９９１）。
例示的二重特異性抗体は、ここで与えられるＰＲＯポリペプチド上の２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗−ＰＲＯポリペプチドアームは、Ｔ細胞レセプター分子（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８又はＢ７）等の白血球上のトリガー分子、又はＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）等のＩｇＧのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）に結合するアームに結合し、細胞防御メカニズムを特定のＰＲＯポリペプチド発現細胞に集中するようにしてもよい。二重特異性抗体は、細胞毒性薬を特定のＰＲＯポリペプチドを発現する細胞に局在化させるのに使用してもよい。これらの抗体は、ＰＲＯ−結合アーム及び細胞毒性薬又はキレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡに結合するアームを有する。他の対象とする二重特異性抗体は、ＰＲＯポリペプチドに結合し、さらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
【０４１９】
５．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合体抗体もまた本発明の範囲内である。ヘテロ抱合抗体は２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第４，６７６，９８０号］及びＨＩＶ感染の治療のために［ＷＯ ９１／００３６０； ＷＯ ９２／２００３７３； ＥＰ ０３０８９］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第４，６７６７，９８０号に開示されているものが含まれる。
【０４２０】
６．エフェクター機能の設計
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えばガンの治療における抗体の効能を増強することが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入して、この領域における鎖間ジスルイド結合を形成させる。このようにして産生されたホモダイマー抗体は改善されたインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害活性（ＡＤＣＣ）を有しうる。Ｃａｒｏｎ等， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６：１１９１−１１９５ （１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ， Ｂ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：２９１８−２９２２ （１９９２）を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモダイマー抗体は、Ｗｏｌｆｆ等， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは二重Ｆｃ領域を有し、よって増強された補体溶解及びＡＤＣＣ能を有しうる抗体を設計することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら， Ａｎｔｉ−ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ３：２１９−２３０ （１９８９）を参照。
【０４２１】
７．免疫複合体
本発明はまた、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性抱合）に抱合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（ｍｏｄｅｃｃｉｎ）Ａ鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ（Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ ｆｏｒｄｉｉ）タンパク質、ジアンチン（ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃａ ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカ・チャランチア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ ｃｈａｒａｎｔｉａ）インヒビター、クルシン（ｃｕｒｃｉｎ）、クロチン（ｃｒｏｔｉｎ）、サパオナリア・オフィシナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ ｏｆｉｃｉｎａｌｉｓ）インヒビター、ゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、エノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）及びトリコテセン（ｔｒｉｃｏｔｈｅｃｅｎｅ）を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。
【０４２２】
抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン等）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６−ジイソシアネート等）、及びビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Ｖｉｔｅｔｔａ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８： １０９８ （１９８７）に記載されたように調製することができる。カーボン−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。ＷＯ ９４／１１０２６参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体−レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（例えばアビジン）を投与する。
【０４２３】
８．免疫リポソーム
また、ここに開示するタンパク質、抗体などは免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８２： ３６８８ （１９８５）； Ｈｗａｎｇ等， Ｐｒｏｃ． ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７： ４０３０ （１９８０）； 及び米国特許第４，４８５，０４５号及び第４，５４４，５４５号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５７： ２８６−２８８ （１９８２）に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Ｇａｂｉｚｏｎ等， Ｊ． Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８１（１９） １４８４ （１９８９）参照。
【０４２４】
９．抗体の製薬組成物
ここで同定されるＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、上記及び下記に記した種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
ＰＲＯポリペプチドが細胞内であり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び／又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Ｍａｒａｓｃｏ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０， ７８８９−７８９３ （１９９３）を参照。ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， 上掲に開示されている。
【０４２５】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。持続放出性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商品名）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−（Ｄ）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０４２６】
Ｇ．抗−ＰＲＯ抗体の用途
本発明の抗−ＰＲＯ抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗−ＰＲＯ抗体は、ＰＲＯの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Ｚｏｌａ， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． （１９８７） ｐｐ． １４７−１５８］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはＨｕｎｔｅｒ等 Ｎａｔｕｒｅ， １４４：９４５ （１９６２）；Ｄａｖｉｄ等， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １３： １０１４ （１９７４）；Ｐａｉｎ等， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ．， ４０：２１９ （１９８１） ；及びＮｙｇｒｅｎ， Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．， ３０：４０７ （１９８２）に記載された方法が含まれる。
また、抗−ＰＲＯ抗体は組換え細胞培養又は天然供給源からのＰＲＯのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＰＲＯに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を、精製するＰＲＯを含む試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したＰＲＯ以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＰＲＯを抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。【０４２７】
（実施例）
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランドである。
【０４２８】
実施例１：新規なポリペプチド及びそれをコードするｃＤＮＡを同定するための細胞外ドメイン相同性スクリーニング
Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ公的データベースからの約９５０の公知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（必要ならな、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳＴデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、Ｄａｙｈｏｆｆ、ＧｅｎＢａｎｋ）及び独自に開発したデータベース（例えば、ＬＩＦＥＳＥＱ（商品名）、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を含む。検索は、コンピュータプログラムＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６））を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、Ｂｌａｓｔスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、ｐｈｒａｐを用いて他の同定されたＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスＤＮＡ配列を、しばしば（全てではない）ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２及びｐｈｒａｐの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、次いでオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及びＰＲＯポリペプチドの全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして用いるために使用した。正方向（．ｆ）及び逆方向（．ｒ）ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるために設計される。プローブ（．ｐ）配列は、典型的に４０−５５ｂｐ長である。或る場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲによりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンの単離するのに使用した。
ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で適切なサイズに分類し、そして適切なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫ５Ｄ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１）参照）に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
【０４２９】
実施例２：アミラーゼスクリーニングによるｃＤＮＡクローンの単離
１．オリゴｄＴプライムｃＤＮＡライブラリの調製
ｍＲＮＡを対象とするヒト組織からＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡからの試薬及びプロトコールを用いて単離した（Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ２）。このＲＮＡを、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ （Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）からの試薬及びプロトコールを用いるベクターｐＲＫ５ＤにおけるオリゴｄＴプライムしたｃＤＮＡの生成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡは１０００ｂｐを越えるサイズ分類し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ結合ｃＤＮＡをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＲＫ５Ｄを、ｓｐ６転写開始部位、それに続くＳｆｉＩ制限酵素部位、さらにＸｈｉＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位を持つベクターにクローニングした。
２．ランダムプライムｃＤＮＡライブラリの調製
一次ｃＤＮＡクローンの５’ 末端を優先的に表現するために二次ｃＤＮＡライブラリを作成した。Ｓｐ６ＲＮＡを（上記の）一次ライブラリから生成し、このＲＮＡを、ベクターｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０におけるＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ （上で参照したＳｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）からの試薬及びプロ値コールを用いたランダムプライムしたｃＤＮＡライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡを５００−１０００ｂｐにサイズ分類し、平滑末端でＮｏｔＩアダプターに結合させ、ＳｆｉＩ部位で切断し、そしてＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０は、ｃＤＮＡクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、及びクローニング部位の後にマウスアミラーゼ配列（分泌シグナルを持たない成熟配列）に次いでアルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。即ち、アミラーゼ配列でフレーム単位で融合するこのベクターにクローニングされたｃＤＮＡは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導くであろう。
【０４３０】
３．形質転換及び検出
上記２パラグラフに記載したライブラリからのＤＮＡを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ、２０ｍｌ）を添加した。細菌及びベクターの混合物は、次いで製造者に推奨されているように電気穿孔た。次いで、ＳＯＣ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｐｌｏｇｉｅｓ、１ｍｌ）を添加し、この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。形質転換体は、次いでアンピシリンを含む２０標準１５０ｍｍＬＢプレートに蒔き、１６時間インキュベートした（３７℃）。ポジティブコロニーをプレートから廃棄し、細菌ペレットから標準的な方法、例えばＣｓＣｌ−勾配を用いてＤＮＡを単離した。精製ＤＮＡは、次いで以下の酵母プロトコールにのせた。
酵母方法は３つの範疇に分けられる：（１）酵母のプラスミド／ｃＤＮＡ結合ベクターでの形質転換；（２）アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離；及び（３）酵母コロニーから直接的な挿入物のＰＣＲ増幅及び配列決定及びさらなる分析のためのＤＮＡの精製。
用いた酵母菌株はＨＤ５６−５Ａ（ＡＴＣＣ−９０７８５）であった。この株は以下の遺伝子型：ＭＡＴアルファー、ｕｒａ３−５２、ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１１２、ｈｉｓ３−１１、ｈｉｓ３−１５、ＭＡＬ＋、ＳＵＣ＋、ＧＡＬ＋を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができる。このような変異体は、ｓｅｃ７１、ｓｅｃ７２、ｓｅｃ６２に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたｓｅｃ７１が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な操作を阻害するアンタゴニスト（アンチセンスヌクレオチド及び／又はリガンドを含む）、この翻訳後経路に含まれる他のタンパク質（例えば、ＳＥＣ６１ｐ、ＳＥＣ７２ｐ、ＳＥＣ６２ｐ、ＳＥＣ６３ｐ、ＴＤＪ１ｐ、ＳＳＡ１ｐ−４ｐ）又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いられる。
形質転換は、Ｇｉｅｔｚ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ． Ｒｅｓ．， ２０： １４２５ （１９９２）に概略が記されたプロトコールに基づいて実施された。形質転換細胞は、次いで寒天からＹＥＰＤ複合培地ブロス（１００ｍｌ）に播種し、３０℃で終夜成長させた。ＹＥＰＤブロスは、Ｋａｉｓｅｒ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， ｐ． ２０７ （１９９４）に記載されているように調製した。終夜培地は、次いで新鮮なＹＥＰＤブロス（５００ｍｌ）中におよそ２ｘ１０６細胞／ｍｌ（約ＯＤ６００＝０．１）に希釈し、１ｘ１０７細胞／ｍｌ（約ＯＤ６００＝０．４−０．５）まで再成長させた。
次いで細胞を収穫し、５，０００ｒｐｍで５分間のＳｏｒｖａｌ ＧＳ３ ローターのＧＳ３ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水に再懸濁することにより形質転換のために調製し、そして５０ｍｌのファルコン管内で、Ｂｅｃｋｍａｎ ＧＳ−６ＫＲ遠心機において３，５００ｒｐｍで再度遠心分離した。上清を捨て、細胞をＬｉＡｃ／ＴＥ（１０ｍｌ， １０ｍＭのトリス−ＨＣｌ， １ｍＭのＥＤＴＡ　ｐＨ７．５， １００ｍＭのＬｉ２ＯＯＣＣＨ３）で続けて洗浄し、ＬｉＡｃ／ＴＥ（２．５ｍｌ）中に再懸濁させた。
形質転換は、マイクロチューブ内で、調製した細胞（１００μｌ）を新鮮な変性一本鎖サケ精子ＤＮＡ（Ｌｏｆｓｔｒａｎｄ Ｌａｂｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ， ＭＤ）及び形質転換ＤＮＡ（１μｇ， ｖｏｌ．＜ １０μｌ）と混合することにより起こした。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで４０％ＰＥＧ／ＴＥ（６００μｌ， ４０％のポリエチレングリコール−４０００， １０ｍＭのトリス−ＨＣｌ， １ｍＭのＥＤＴＡ， １００ｍＭのＬｉＯＯＣＣＨ３， ｐＨ ７．５）を添加した。この混合物を緩く撹拌し、３０℃で撹拌しながら３０分間インキュベートした。次いで細胞に４２℃で１５分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で１２，０００ｒｐｍで５−１０秒間遠心分離し、デカント及びＴＥ（５００μｌ， １０ｍＭのトリス−ＨＣｌ， １ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ ７．５）への再懸濁に次いで遠心分離した。次いで、細胞をＴＥ（１ｍｌ）中に希釈し、アリコート（２００μｌ）を１５０ｍｍ成長プレート（ＶＷＲ）に予め調製した選択培地に拡げた。
あるいは、複数の少量反応ではなく、形質転換を１回の大規模反応で実施したが、しやくの量はしかるべくスケールアップした。
用いた選択培地は、Ｋａｉｓｅｒ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， ｐ． ２０８−２１０ （１９９４）に記載されているように調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天（ＳＣＤ−Ｕｒａ）であった。形質転換体は３０℃で２−３日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地における赤色デンプンの包含により実施した。Ｂｉｅｌｙ等， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １７２： １７６−１７９ （１９８８）に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料（反応性 Ｒｅｄ−１２０， Ｓｉｇｍａ）に結合させた。結合したデンプンをＳＣＤ−Ｕｒａ寒天プレートに最終濃度０．１５％（ｗ／ｖ）で導入し、リン酸カリウムでｐＨ７．０に緩衝した（最終濃度５０−１００ｍＭ）。
ポジティブコロニーを拾って新鮮な選択培地（１５０ｍｍプレート）に画線し、良好に単離され同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌についてポジティブな良好に単離されたコロニーは、緩衝ＳＣＤ−Ｕｒａ寒天への赤色団分の直接導入により検出した。ポジティブコロニーは、デンプンを分解して、ポジティブコロニーの周囲に直接目視できる暈を形成する能力により決定した。
【０４３１】
４．ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの単離
ポジティブコロニーが単離された場合、その一部を楊枝で拾い、９６ウェルプレートにおいて無菌水（３０μｌ）に希釈した。この時点で、ポジティブコロニーは凍結して次の分析のために保存するか、即座に増幅するかのいずれかである。細胞のアリコート（５μｌ）を、０．５μｌのＫｌｅｎｔａｑ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）； ４．０μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）； ２．５μｌのＫｅｎｔａｑバッファー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）； ０．２５μｌの正方向オリゴ１；０．２５μｌの逆方向オリゴ２；１２．５μｌの蒸留水を含有する２５μｌ容量におけるＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。正方向オリゴヌクレオチド１の配列は：
５’− ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴＴＡＡＡＴＡＧＡＣＣＴＧＣＡＡＴＴＡＴＴＡＡＴＣＴ −３’
（配列番号：３２４）
逆方向オリゴヌクレオチド２の配列は：
５’− ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＣＣＡＴＴ−３’
（配列番号：３２５）
次いで、ＰＣＲは以下の通り実施した：
2004513602.tif 000024
下線を施した領域は、各々ＡＤＨプロモーター領域及びアミラーゼ領域にアニーリングされ、挿入物が存在しない場合はベクターｐＳＳＴ−ＡＭＹ．０からの３０７ｂｐ領域を増幅する。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドの５’ 末端の最初の１８ヌクレオチドは、配列プライマーのアニーリング部位を含んでいた。即ち、空のベクターからのＰＣＲ反応の全生成物は３４３ｂｐであった。しかしながら、シグナル配列融合ｃＤＮＡは、かなり長いヌクレオチド配列をもたらした。
ＰＣＲに続いて、反応のアリコート（５μｌ）を、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に記載されたように１％アガロースゲル中でトリス−ボレーと−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝系を用いたアガローススゲル電気泳動により試験した。４００ｂｐより大きな単一で強いＰＣＲ産物をもたらすクローンを、９６Ｑｉａｑｕｉｃｋ ＰＣＲ 清浄化カラム（Ｑｕａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｃｈａｒｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）での精製の後にＤＮＡ配列によりさらに分析した。
【０４３２】
実施例３：ヒトＰＲＯ２１３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ２８７３５と命名される。ＤＮＡ２８７３５コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ２１３の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
一組のＰＣＲプライマー（正及び逆方向）が合成された：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣ−３’（配列番号：３）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＴＧＧ−３’（配列番号：４）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ２８７３５配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＧＴＧＡＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧＣＴＡＧＧＡＧＧＧ−３’（配列番号：５）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ２１３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肺組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ２１３の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ１８７（ＤＮＡ３０９４３−１１６３）と命名される］（配列番号：１）及びＰＲＯ２１３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ１８７（ＤＮＡ３０９４３−１１６３）の全核酸配列をＦｉｇ１（配列番号：１）に示す。クローンＵＮＱ１８７（ＤＮＡ３０９４３−１１６３）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３３６−３３８に見かけの翻訳開始部位そしてヌクレオチド位置１２２１−１２２３の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１）。予測されるポリペプチド前駆体は２９５アミノ酸長である（Ｆｉｇ２）。クローンＵＮＱ１８７（ＤＮＡ３０９４３−１１６３）はＡＴＣＣに寄託されている。
全長ＰＲＯ２１３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がヒト成長静止特異的遺伝子６タンパク質と有意な相同性を有することを示唆している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）はＰＲＯ２１３アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＨＳＭＨＣ３Ｗ５Ａ＿６及びＢ４８０８９ との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４３３】
実施例４：ヒトＰＲＯ２７４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３６４６９と命名される。ＤＮＡ３６４６９コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ２７４の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。ジェネンテクが所有するＥＳＴをコンセンサスす構築に用いた。ＥＳＴはＦｉｇ５−７に示し、ここで各々ＤＮＡ１７８７３、ＤＮＡ３６１５７及びＤＮＡ２８９２９と命名する。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１（３６４６９．ｆ１）　５’−ＣＴＧＡＴＣＣＧＧＴＴＣＴＴＧＧＴＧＣＣＣＣＴＧ−３’
（配列番号：１１）
正方向ＰＣＲプライマー２（３６４６９．ｆ２）　５’−ＧＣＴＣＴＧＴＣＡＣＴＣＡＣＧＣＴＣ−３’
（配列番号：１２）
正方向ＰＣＲプライマー３（３６４６９．ｆ３）　５’−ＴＣＡＴＣＴＣＴＴＣＣＣＴＣＴＣＣＣ−３’
（配列番号：１３）
正方向ＰＣＲプライマー４（３６４６９．ｆ４）　５’−ＣＣＴＴＣＣＧＣＣＡＣＧＧＡＧＴＴＣ−３’
（配列番号：１４）
逆方向ＰＣＲプライマー１（３６４６９．ｒ１）　５’−ＧＧＣＡＡＡＧＴＣＣＡＣＴＣＣＧＡＴＧＡＴＧＴＣ−３’
（配列番号：１５）
逆方向ＰＣＲプライマー２（３６４６９．ｒ２）　５’−ＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＣＡＣＡＧＧＴＣＴＣＣＧ−３’
（配列番号：１６）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３６４６９配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ（３６４６９．ｐ１）
５’−ＴＣＧＧＧＧＡＧＣＡＧＧＣＣＴＴＧＡＡＣＣＧＧＧＧＣＡＴＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＡＡＧＧＡＧＧ−３’（配列番号：１７）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ２７４遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肝臓組織（ＬＩＢ２２９）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ２７４の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ２４１（ＤＮＡ３９９８７−１１８４）と命名される］（配列番号：１）及びＰＲＯ２７４の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ２４１（ＤＮＡ３９９８７−１１８４）の全核酸配列をＦｉｇ３（配列番号：６）に示す。クローンＵＮＱ２４１（ＤＮＡ３９９８７−１１８４）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８３−８５に見かけの翻訳開始部位そしてヌクレオチド位置１５５９−１５６１の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ３）。予測されるポリペプチド前駆体は４９２アミノ酸長であり（Ｆｉｇ４）、約５４，２４１ダルトンの見積もられた分子量及び約８．２１の見積もられたｐＩを持つ。クローンＵＮＱ２４１（ＤＮＡ３９９８７−１１８４）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７８６が付与されている。
全長ＰＲＯ２７４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがＦｎ５４タンパク質と有意な相同性を有することを示唆している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）はＰＲＯ２７４アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＭＭＦＮ５４Ｓ２＿１， ＭＭＦＮ５４Ｓ１＿１， ＣＥＬＦ４８Ｃ１＿８， ＣＥＦ３８Ｂ７＿６， ＰＲＰ３＿ＲＡＴ， ＩＮＬ３＿ＰＩＧ， ＭＴＣＹ０７Ａ７＿１３， ＹＮＡＸ＿ＫＬＥＡＥ， Ａ４７２３４， 及びＨＭＥ２＿ＭＯＵＳＥとの間の有意な相同性を明らかにした。
【０４３４】
実施例５：ヒトＰＲＯ３００をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３５９３０と命名される。ＤＮＡ３５９３０コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３００の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１（３５９３０ｆ１）　５’−ＧＣＣＧＣＣＴＣＡＴＣＴＴＣＡＣＧＴＴＣＴＴＣＣ−３’
（配列番号：２０）
正方向ＰＣＲプライマー２（３５９３０．ｆ２）　５’−ＴＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＣ−３’
（配列番号：２１）
正方向ＰＣＲプライマー３（３５９３０．ｆ３）　５’−ＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＣＴＧＧ−３’
（配列番号：２２）
正方向ＰＣＲプライマー４（３５９３０．ｆ４）　５’−ＣＣＴＧＧＧＣＡＡＡＡＡＴＧＣＡＡＣ−３’
（配列番号：２３）
逆方向ＰＣＲプライマー１（３５９３０．ｒ１）　５’−ＣＡＧＧＡＡＴＧＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＣＣＡＣＧＧ−３’
（配列番号：２４）
逆方向ＰＣＲプライマー２（３５９３０．ｒ２）　５’−ＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＧＧ−３’
（配列番号：２５）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３５９３０配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ（３５９３０．ｐ１）
５’−ＴＧＴＣＣＡＴＣＡＴＴＡＴＧＣＴＧＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＧＧＡＧＡＧＴＣＡＧＣＴＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧ−３’
（配列番号：２６）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３００遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３００の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ２６３（ＤＮＡ４０６２５−１１８９）と命名される］（配列番号：１８）及びＰＲＯ３００の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ２６３（ＤＮＡ４０６２５−１１８９）の全核酸配列をＦｉｇ８（配列番号：１８に示す。クローンＵＮＱ２６３（ＤＮＡ４０６２５−１１８９）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４５−４７に見かけの翻訳開始部位そしてヌクレオチド位置１４１６−１４１８の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ８）。予測されるポリペプチド前駆体は４５７アミノ酸長である（Ｆｉｇ９）。クローンＵＮＱ２６３（ＤＮＡ４０６２５−１１８９）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７８８が付与されている。
全長ＰＲＯ３００ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がＤｉｆｆ３３タンパク質と有意な相同性を有することを示唆している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）はＰＲＯ３００アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＨＳＵ４９１８８＿１との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４３５】
実施例６：ヒトＰＲＯ２８４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて２つのｃＤＮＡ配列が単離され、これらを、ここにＤＮＡ１２９８２（Ｆｉｇ１２参照；ヒト胎盤由来）及びＤＮＡ１５８８６（Ｆｉｇ１３参照；ヒト唾液腺由来）と命名する。ＤＮＡ１２９８２及びＤＮＡ１５８８６配列は、次いでクラスター形成して整列させ、ここにＤＮＡ１８８３２と命名するコンセンサス核酸配列を生じさせた。
ＤＮＡ１８８３２コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを生成させ、上記実施例２のパラグラフ１に記載したように調製したヒト胎盤ライブラリ（ＬＩＢ８９）をスクリーニングに使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１））、ｃＤＮＡサイズ切断は２８００ｂｐ未満であった。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１（１８８３２．ｅｓｔ．ｆ）　５’−ＴＣＧＴＡＣＡＧＴＴＡＣＧＣＴＣＴＣＣＣ−３’
（配列番号：３１）
正方向ＰＣＲプライマー２（１８８３２．ｆ）　５’−ＣＴＴＧＡＧＧＡＧＣＧＴＣＡＧＡＡＧＣＧ−３’
（配列番号：３２）
逆方向ＰＣＲプライマー（１８８３２．ｒ）　５’−ＡＴＡＡＣＧＡＡＴＧＡＡＧＣＣＴＣＧＴＧ−３’
（配列番号：３３）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ１８８３２配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ（１８８３２．ｐ）
５’−ＧＣＴＡＡＴＡＴＣＴＧＴＡＡＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧ−３’（配列番号：３４）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ２８４遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１６７−１６９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１０２２−１０２４の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１０；配列番号：２７）。予測されるポリペプチド前駆体は２８５アミノ酸長であり、約３２，１９０の計算された分子量及び約９．０３の見積もられたｐＩを有する。Ｆｉｇ１１（配列番号：２８）に示した全長ＰＲＯ２８４の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２４のシグナルペプチド、約アミノ酸７６〜約アミノ酸９６及び約アミノ酸１７１〜約アミノ酸１９５の膜貫通ドメイン、及び約アミノ酸１５３〜約１５６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位。クローンＵＮＱ２４７（ＤＮＡ２３３１８−１２１１）は１９９８年４月２１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７８７が付与されている。
全長ＰＲＯ２８４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが任意の公知のタンパク質と有意な配列類似性を持たないことを示唆している。しかしながら、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析はＰＲＯ２８４アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＪＱ０１２４，ＣＥＬＥ０４Ａ４＿５， ＡＢ００６４５１＿１， ＡＦ０３０１６２＿１， ＩＭ２３＿ＹＥＡＳＴ， Ｓ７１１９４， ＮＩＡ＿ＣＵＣＭＡ， ＩＭ１７＿ＹＥＡＳＴ， Ｉ５０４７９及びＨＵＭＺＦＨＰ＿１との間に或る程度の相同性があることを明らかにした。
【０４３６】
実施例７：ヒトＰＲＯ２９６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたｃＤＮＡ配列は、ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントにより、肉腫関連タンパク質ＳＡＳをコードする核酸配列と配列同一性を有することがわかった。このｃＤＮＡ配列を、ここにＤＮＡ２３０２０（Ｆｉｇ１６参照）と命名する。ＤＮＡ２３０２０配列は、次いで、公的データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）及び独自に開発したデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ（商品名）、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を含む種々の発現されたタグ配列（ＥＳＴ）データベースと比較し、存在する相同性を同定した。相同性検索は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ及びＧｉｓｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６））を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、ＢＬＡＳＴスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ；　ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）でクラスター形成してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ３５８５８と命名する。構築において２つの独自に開発したジェネンテクＥＳＴを用い、これらのＥＳＴ配列を、ここでＤＮＡ２１９７１（Ｆｉｇ１７；配列番号：３８）及びＤＮＡ２９０３７（Ｆｉｇ１８；配列番号：３９）と命名する。
ＤＮＡ３５８５８コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを生成させ、上記実施例２のパラグラフ１に記載したように調製したヒト腎臓ライブラリ（ＬＩＢ２２８）をスクリーニングするのに使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８（１９９１））、ｃＤＮＡサイズ切断は２８００ｂｐ未満であった。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１（３５８５８．ｆ１）　５’−ＡＣＣＣＡＣＧＴＣＴＧＣＧＴＴＧＣＴＧＣＣ−３’
（配列番号：４０）
正方向ＰＣＲプライマー２（３５８５８．ｆ２）　５’−ＧＡＧＡＡＴＡＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＧ−３’
（配列番号：４１）
逆方向ＰＣＲプライマー（３５８５８．ｒ１）　５’−ＡＧＧＡＡＴＧＣＡＣＴＡＧＧＡＴＴＣＧＣＧＣＧＧ−３’
（配列番号：４２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３５８５８配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ（３５８５８．ｐ１）
５’−ＧＧＣＣＣＣＡＡＡＧＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＡＧＣＡＧＣＴＧＴＣＡＧＧＧＡＡＣＣＴＣＣＧＣＣＧ−３’（配列番号：４３）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ２９６遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１７４−１７６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置７８６−７８８の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１４；配列番号：３５）。予測されるポリペプチド前駆体は２０４アミノ酸長であり、約２２，１４７の計算された分子量及び約８．３７の見積もられたｐＩを有する。Ｆｉｇ１５（配列番号：３６）に示した全長ＰＲＯ２９６の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸３４のシグナルペプチド、約アミノ酸４７〜約アミノ酸６３、約アミノ酸７２〜約アミノ酸９５及び約アミノ酸１６２〜約アミノ酸１８２の膜貫通ドメイン。クローンＵＮＱ２６０（ＤＮＡ３９９７９−１２１３）は１９９８年４月２１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７８９が付与されている。
全長ＰＲＯ２９６ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが肉腫−増幅ＳＡＳタンパク質と有意な配列類似性を持ち、それによりＰＲＯ２２９６が新規なＳＡＳ類似物となりうることを示唆している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析はＰＲＯ２９６アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、Ｉ５８３９１， ＧＥＮ１１０６１， ＳＳＣ２Ｂ０４＿１， ＨＳＵ８１０３１＿２， ＣＤ６３＿ＲＡＴ， ＣＤ６３＿ＭＯＵＳＥ， ＣＤ６３＿ＨＵＭＡＮ， ＡＦ０２２８１３＿１， ＣＤ６３＿ＲＡＢＩＴ及びＣＯ０２＿ＨＵＭＡＮとの間に有意な相同性があることを明らかにした。
【０４３７】
実施例８：ヒトＰＲＯ３２９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３５６１２と命名される。ＤＮＡ３５６１２コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３２９の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１（３５６１２ｆ１）　５’−ＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＣＡＴＧＧ−３’
（配列番号：４６）
正方向ＰＣＲプライマー２（３５６１２．ｆ２）　５’−ＴＴＴＣＣＡＧＣＧＣＣＡＡＴＴＣＴＣ−３’
（配列番号：４７）
逆方向ＰＣＲプライマー１（３５６１２．ｒ１）　５’−ＡＧＴＴＣＴＴＧＧＡＣＴＧＴＧＡＴＡＧＣＣＡＣ−３’
（配列番号：４８）
逆方向ＰＣＲプライマー２（３５６１２．ｒ２）　５’−ＡＡＡＣＴＴＧＧＴＴＧＴＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＴＧ−３’
（配列番号：４９）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３５６１２配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ（３５６１２．ｐ１）
５’−ＧＴＧＡＧＧＧＡＣＣＴＧＴＣＴＧＣＡＣＴＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＧ−３’（配列番号：５０）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３２９遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肝臓組織（ＬＩＢ６）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３２９の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ２９１（ＤＮＡ４０５９４−１２３３）と命名される］（配列番号：４４）及びＰＲＯ３２９の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ２９１（ＤＮＡ４０５９４−１２３３）の全核酸配列をＦｉｇ１９（配列番号：４４）に示す。クローンＵＮＱ２９１（ＤＮＡ４０５９４−１２３３）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置９−１１に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１０８６−１０８８の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１９）。予測されるポリペプチド前駆体は３５９アミノ酸長である（Ｆｉｇ２０）。Ｆｉｇ２０に示した全長ＰＲＯ３２９タンパク質は、約３８，８９９の分子量及び約５．２１のｐＩを有する。クローンＵＮＱ２９１（ＤＮＡ４０５９４−１２３３）は、１９９８年２月５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６１７が付与されている。
全長ＰＲＯ３２９ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが高親和性免疫グロブリンＦｃレセプタータンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）はＰＲＯ３２９アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＦＣＧ１＿ＨＵＭＡＮ， ＦＣＧ０＿ＨＵＭＡＮ， Ｐ＿Ｒ９１４３９， Ｐ＿Ｒ２２５４９， Ｐ＿Ｒ９１４３８， Ｐ＿Ｗ００８５９， Ｐ＿Ｒ２０８１１， Ｐ＿Ｒ２５５５０， ＨＵＭＣＤ６４０６＿１及びＦＣＧ１＿ＭＯＵＳＥとの間の有意な相同性を明らかにした。
【０４３８】
実施例９：ヒトＰＲＯ３６２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４２２５７と命名される。ＤＮＡ４２２５７コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３６２の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１（４２２５７．ｆ１）　５’−ＴＡＴＣＣＣＴＣＣＡＡＴＴＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＧ−３’
（配列番号：５３）
正方向ＰＣＲプライマー２（４２２５７．ｆ２）　５’−ＧＴＣＧＧＡＡＧＡＣＡＴＣＣＣＡＡＣＡＡＧ−３’
（配列番号：５４）
逆方向ＰＣＲプライマー１（４２２５７．ｒ１）　５’−ＣＴＴＣＡＣＡＡＴＧＴＣＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＣ−３’
（配列番号：５５）
逆方向ＰＣＲプライマー２（４２２５７．ｒ２）　５’−ＡＧＣＣＡＡＡＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＣＴＴＡＣ−３’
（配列番号：５６）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４２２５７配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ（４２２５７．ｐ１）
５’−ＴＧＧＡＴＧＡＣＣＧＧＡＧＣＣＡＣＴＡＣＡＣＧＴＧＴＧＡＡＧＴＣＡＣＣＴＧＧＣＡＧＡＣＴＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号：５７）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３６２遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児脳組織（ＬＩＢ１５３）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３６２の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３１７（ＤＮＡ４５４１６−１２５１）と命名される］（配列番号：５１）及びＰＲＯ３６２の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３１７（ＤＮＡ４５４１６−１２５１）の全核酸配列をＦｉｇ２１（配列番号：５１）に示す。クローンＵＮＱ３１７（ＤＮＡ４５４１６−１２５１）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１１９−１２１に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１０８２−１０８４の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ２１）。予測されるポリペプチド前駆体は３２１アミノ酸長である（Ｆｉｇ２２）。Ｆｉｇ２に示した全長ＰＲＯ３６２タンパク質は、約３５，５４４の分子量及び約８．５１のｐＩを有する。Ｆｉｇ２２に示すように、全長ＰＲＯ３６２ポリペプチドの分析は、およそアミノ酸１４９からおよそアミノ酸１５２におけるグリコサミノグリカン結合部位及び約アミノ酸２７６〜約アミノ酸３０６の膜貫通ドメインの存在を明らかにした。クローンＵＮＱ３１７（ＤＮＡ４５４１６−１２５１）は、１９９８年２月５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６２０が付与されている。
全長ＰＲＯ３６２ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがＡ３３抗原タンパク質及びＨＣＡＲタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）はＰＲＯ３６２アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＡＢ００２３４１＿１， ＨＳＵ５５２５８＿１， ＨＳＣ７ＮＲＣＡＭ＿１， ＲＮＵ８１０３７＿１， Ａ３３＿ＨＵＭＡＮ， Ｐ＿Ｗ１４１５８， ＮＭＮＣＡＭＲＩ＿１， ＨＳＴＩＴＩＮＮ２＿１， Ｓ７１８２４＿１及びＨＳＵ６３０４１＿１との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４３９】
実施例１０：ヒトＰＲＯ３６３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４２８２８と命名される。ＤＮＡ４２８２８コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３６３の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー（４２８２８．ｆ１）　５’−ＣＣＡＧＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＣＡＡＣＧＡＡＧＣ−３’
（配列番号：６０）
逆方向ＰＣＲプライマー（４２８２８．ｒ１）　５’−ＡＣＴＡＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＧＴＧＧＧＣ−３’
（配列番号：６１）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４２８２８配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ（４２８２８．ｐ１）
５’−ＧＴＡＴＧＴＡＣＡＡＡＧＣＡＴＣＧＧＣＡＴＧＧＴＴＧＣＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＡＣＡＧＧＣ−３’（配列番号：６２）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３６３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３６３の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３１８（ＤＮＡ４５４１９−１２５２）と命名される］（配列番号：５８）及びＰＲＯ３６３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３１８（ＤＮＡ４５４１９−１２５２）の全核酸配列をＦｉｇ２３（配列番号：５８）に示す。クローンＵＮＱ３１８（ＤＮＡ４５４１９−１２５２）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１９０−１９２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１３０９−１３１１の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ２３）。予測されるポリペプチド前駆体は３７３アミノ酸長である（Ｆｉｇ２４）。Ｆｉｇ２４に示した全長ＰＲＯ３６３タンパク質は、約４１．２８１の分子量及び約８．３３のｐＩを有する。Ｆｉｇ２４（配列番号：５９）に示したアミノ酸配列のアミノ酸２２１〜２５４に膜貫通ドメインが存在する。またＰＲＯ３６３ポリペプチドは、約アミノ酸１５〜５６及び約アミノ酸８７〜１１６に少なくとも２つのミエリンＰ０タンパク質ドメインを有する。クローンＵＮＱ３１８（ＤＮＡ４５４１９−１２５２）は、１９９８年２月５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６１６が付与されている。
全長ＰＲＯ３６３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが細胞表面タンパク質ＨＣＡＲと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ３６３が新規なＨＣＡＲ相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ３６３アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＨＳ４６ＫＤＡ＿１， ＨＳＵ９０７１６＿１， ＭＭＣＡＲＨ＿１， ＭＭＣＡＲＨＯＭ＿１， Ａ３３＿ＨＵＭＡＮ， Ｐ＿Ｗ１４１４６， Ｐ＿Ｗ１４１５８， Ａ４２６３２，及びＢ４２６３２との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４４０】
実施例１１：ヒトＰＲＯ８６８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３８１３３と命名される。ＤＮＡ３８１３３コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ８６８の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー（３８１３３．ｆ１）　５’−ＧＴＡＧＣＡＧＴＧＣＡＣＡＴＧＧＧＧＴＧＴＴＧＧ−３’
（配列番号：６５）
逆方向ＰＣＲプライマー（３８１３３．ｒ１）　５’−ＡＣＣＧＣＡＣＡＴＣＣＴＣＡＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣ−３’
（配列番号：６６）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３８１３３配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ（３８１３３．ｐ１）
５’−ＡＣＧＡＴＧＡＴＣＧＣＧＧＧＣＴＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＧＡＴＴＣＣＴＴＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣ−３’
（配列番号：６７）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ８６８遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ８６８の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４３７（ＤＮＡ５２５９４−１２７０）と命名される］（配列番号：６３）及びＰＲＯ８６８の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４３７（ＤＮＡ５２５９４−１２７０）の全核酸配列をＦｉｇ２５（配列番号：６３）に示す。クローンＵＮＱ４３７（ＤＮＡ５２５９４−１２７０）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３２５−３２７に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２２９０−２２９２の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ２５）。予測されるポリペプチド前駆体は６５５アミノ酸長である（Ｆｉｇ２６）。Ｆｉｇ２６に示した全長ＰＲＯ８６８タンパク質は、約７１，８４５の分子量及び約８．２２のｐＩを有する。全長ＰＲＯ８６８ポリペプチド配列の分析は、Ｆｉｇ２６（配列番号：３）に示した配列の約アミノ酸６６〜約アミノ酸７８及び約アミノ酸１２３〜約アミノ酸１３４の保存されたシステイン含有ドメイン、約アミノ酸８５〜薬アミノ酸１１０のＴＮＦＲ死亡ドメイン、約アミノ酸１５９〜約アミノ酸１７５のＦＡＳＡ＿マウス死亡ドメイン及び約アミノ酸３４７〜約アミノ酸３７５の膜貫通ドメインの存在を示している。クローンＵＮＱ４３７（ＤＮＡ５２５９４−１２７０）は、１９９８年３月１７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６７９が付与されている。
全長ＰＲＯ８６８ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが腫瘍壊死因子レセプタータンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ８６８が腫瘍壊死因子ファミリーの新規なメンバーとなりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ８６８アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＲＮＵ９４３３０＿１， Ｐ＿Ｒ９９９３３， Ｐ＿Ｒ９９９４５， Ｐ＿Ｒ９９９５０， ＨＳＵ９４３３２＿１， ＣＤ４０＿ＨＵＭＡＮ， Ｓ６３３６８＿１， ＴＮＲ２＿ＨＵＭＡＮ， ＭＶＵ８７８４４＿１及びＣＶＵ８７８３７＿１との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４４１】
実施例１２：ヒトＰＲＯ３８２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３０８９２と命名される。ＤＮＡ３０８９２コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３８２の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＧＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＴＡＴＧＡＡＧＣＴＧＧＣ−３’（配列番号：７０）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＡＣＡＣＧＴＣＣＣＴＧＴＧＧＴＴＧＣＡＧＡＴＣ−３’（配列番号：７１）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３０８９２配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＧＴＴＣＡＡＴＧＣＡＧＡＡＡＴＧＡＴＣＣＡＧＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＣＣＡＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧ−３’（配列番号：７２）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３８２遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３８２の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３２３（ＤＮＡ４５２３４−１２７７）と命名される］（配列番号：６８）及びＰＲＯ３８２の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３２３（ＤＮＡ４５２３４−１２７７）の全核酸配列をＦｉｇ２７（配列番号：６８）に示す。クローンＵＮＱ３２３（ＤＮＡ４５２３４−１２７７）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１２６−１２８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１４８５−１４８７の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ２７）。予測されるポリペプチド前駆体は４５３アミノ酸長である（Ｆｉｇ２８）。Ｆｉｇ２８に示した全長ＰＲＯ３８２タンパク質は、約４９，３３４の分子量及び約６．３２のｐＩを有する。Ｆｉｇ２８（配列番号：６９）に示した全長ＰＲＯ３８２ポリペプチド配列の分析は、約アミノ酸２４０〜約アミノ酸２８４の推定膜貫通ドメイン、約アミノ酸１〜約アミノ酸２０の推定シグナルペプチド、約アミノ酸３８６〜約アミノ酸４１９の推定アップルドメイン、約アミノ酸３９４〜約アミノ酸４０６の推定クリングル（Ｋｒｎｇｌｅ）ドメイン及び約アミノ酸２５３〜約アミノ酸２５８のヒスチジン含有プロテアーゼ活性部位の存在を示している。クローンＵＮＱ３２３（ＤＮＡ４５２３４−１２７７）は、１９９８年３月５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６５４が付与されている。
全長ＰＲＯ３８２ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがセリンプロテアーゼタンパク質と有意な配列相同性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ３８２が新規なセリンプロテアーゼとなりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ３８２アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＨＳＵ７５３２９＿１， ＥＮＴＫ＿ＭＯＵＳＥ， ＨＥＰＳ＿ＨＵＭＡＮ， ＡＦ０３００６５＿１， ＨＥＰＳ＿ＲＡＴ， ＰＬＭＮ＿ＰＩＧ， Ｐ＿Ｒ８９４３０， Ｐ＿Ｒ８９４３５， ＰＬＭＮ＿ＨＯＲＳＥ， ＰＬＭＮ＿ＢＯＶＩＮ及びＰ＿Ｒ８３９５９との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４４２】
実施例１３：ヒトＰＲＯ５４５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４４７０６と命名される。ジェネンテクが独自に開発したＥＳＴをコンセンサス構築に用い、ここにＤＮＡ１３２１７（Ｆｉｇ３１；配列番号：７５）と命名する。ＤＮＡ４４７０６コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ５４５の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＧＴＣＴＣＡＧＣＡＣＧＴＧＴＴＣＴＧＧＴＣＴＣＡＧＧＧ−３’
（配列番号：７６）
正方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＣＡＴＧＡＧＣＡＴＧＴＧＣＡＣＧＧＣ−３’　 （配列番号：７７）
正方向ＰＣＲプライマー３　５’−ＴＡＣＣＴＧＣＡＣＧＡＴＧＧＧＣＡＣ−３’　 （配列番号：７８）
正方向ＰＣＲプライマー４　５’−ＣＡＣＴＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＴＴＣ−３’　 （配列番号：７９）
逆方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＣＡＡＧＴＣＣＴＴＣＣ−３’
（配列番号：８０）
逆方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＴＣＣＣＴＧＴＴＧＧＡＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣ−３’（配列番号：８１）
逆方向ＰＣＲプライマー３　５’−ＣＴＴＣＧＣＴＧＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧ−３’（配列番号：８２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４４７０６配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＴＧＣＡＡＣＣＡＡＣＡＧＡＴＡＣＡＡＡＣＴＣＴＴＣＣＣＡＧＣＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＡＧＣＧＴＣ−３’（配列番号：８３）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ５４５遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎盤組織（ＬＩＢ９０）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ５４５の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３４６（ＤＮＡ４９６２４−１２７９）と命名される］（配列番号：７３）及びＰＲＯ５４５の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３４６（ＤＮＡ４９６２４−１２７９）の全核酸配列をＦｉｇ２９（配列番号：７３）に示す。クローンＵＮＱ３４６（ＤＮＡ４９６２４−１２７９）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３１１−３１３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２５１６−２５１８の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ２９）。予測されるポリペプチド前駆体は７５３アミノ酸長である（Ｆｉｇ３０）。Ｆｉｇ３０に示した全長ＰＲＯ５４５タンパク質は、約８０，１７７ダルトンの見積もり分子量及び約７．０８のｐＩを有する。ＰＲＯ５４５アミノ酸配列の重要な領域は、アミノ酸１−２８に相当するシグナルペプチド、およそアミノ酸１１１−１１４、アミノ酸１４６−１４９、アミノ酸３４８−３５１、アミノ酸４４９−４５２、及びアミノ酸６４８−６５１に相当する５つの潜在的Ｎ−−グリコシル化部位、及びおよそアミノ酸３４４−３５３の中性亜鉛メタロペプチダーゼ、亜鉛結合領域シグネーチャー配列を含む。クローンＵＮＱ３４６（ＤＮＡ４９６２４−１２７９）は、１９９８年３月５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６５５が付与されている。
【０４４３】
実施例１４：ヒトＰＲＯ６１７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４２７９８と命名される。ＤＮＡ４２７９８配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ６１７の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＣＧＧＧＣＡＣＡＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＡＡＴＧ−３’（配列番号：８６）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＧＴＡＧＡＧＡＴＧＴＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＡＧＡＣＣ−３’
（配列番号：８７）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４２７９８配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＣＴＣＣＣＴＡＣＣＣＧＴＧＣＡＧＧＴＴＴＣＴＴＣＡＴＴＴＧＴＴＣＣＴＴＴＡＡＣＣＡＧＴＡＴＧＣＣＧ−３’（配列番号：８８）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ６１７遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ６１７の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３５３（ＤＮＡ４８３０９−１２８０）と命名される］（配列番号：１）及びＰＲＯ６１７の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３５３（ＤＮＡ４８３０９−１２８０）の全核酸配列をＦｉｇ３２（配列番号：８４）に示す。クローンＵＮＱ３５３（ＤＮＡ４８３０９−１２８０）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置７２３−７２５に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９２４−９２６の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ３２）。予測されるポリペプチド前駆体は６７アミノ酸長である（Ｆｉｇ３３）。Ｆｉｇ３３に示した全長ＰＲＯ６１７タンパク質は、約６，９８１ダルトンの分子量及び約７．４７のｐＩを有する。また、ＰＲＯ６１７アミノ酸配列の分析は、約アミノ酸１５〜約アミノ酸２７の推定シグナルペプチド及び約アミノ酸４１〜約アミノ酸４３の推定タンパク質キナーゼＣリン酸化部位の存在を明示している。クローンＵＮＱ３５３（ＤＮＡ４８３０９−１２８０）は、１９９８年３月５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６５６が付与されている。
全長ＰＲＯ６１７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがＣＤ２４タンパク質と有意な配列相同性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ６１７が新規なＣＤ２４相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ６１７アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＣＤ２４＿ＨＵＭＡＮ， ＣＤ２４＿ＭＯＵＳＥ， Ｓ１５７８５， ＣＤ２４＿ＲＡＴ， ＶＧＥ ＢＰＧ４， ＭＳＥ５＿ＨＵＭＡＮ， ＨＳＭＨＣ３Ｗ３６Ａ＿２， ＭＬＵ１５１８４＿８， Ｐ Ｒ８５０７５， ＳＥＰＬ＿ＨＵＭＡＮ及びＭＴＣＹ６３＿１３との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４４４】
実施例１５：ヒトＰＲＯ７００をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３０８３７と命名される。ＤＮＡ３０８３７配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７００の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＡＴＧＴＴＣＴＴＣＧＣＧＣＣＣＴＧＧＴＧ−３’（配列番号：９１）
正方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＣＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＣＡＣＴＣＴＡＣＡＧ−３’（配列番号：９２）
逆方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＡＡＧＴＧＧＴＣＧＣＣＴＴＧＴＧＣＡＡＣＧＴＧＣ−３’（配列番号：９３）
逆方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＧＧＴＣＡＡＡＧＧＧＧＡＴＡＴＡＴＣＧＣＣＡＣ−３’（配列番号：９４）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３０８３７配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＣＡＴＧＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＧＴＣＴＡＴＧＴＧＧＣＴＡＡＡＧＴＧＧＡＣＴＧＣＡＣＧＧＣＣＣＡ−３’（配列番号：９５）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７００遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７００の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３６４（ＤＮＡ４６７７６−１２８４）と命名される］（配列番号：８９）及びＰＲＯ７００の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３６４（ＤＮＡ４６７７６−１２８４）の全核酸配列をＦｉｇ３４（配列番号：８９）に示す。クローンＵＮＱ３６４（ＤＮＡ４６７７６−１２８４）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３３−３５に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１３２９−１３３１の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ３４）。予測されるポリペプチド前駆体は４３２アミノ酸長である（Ｆｉｇ３５）。Ｆｉｇ３５に示した全長ＰＲＯ７００タンパク質は、約４７，６２９ダルトンの見積もり分子量及び約５．９０のｐＩを有する。ＰＲＯ７００のアミノ酸配列の重要な領域は、約アミノ酸１〜３３に相当するシグナルペプチド、アミノ酸約８２−９９、２１０−２５５及び３４５−３６０に相当するジスルフィドイソメラーゼに相同な領域、アミノ酸約１４３−１５１に相当するチロシンキナーゼリン酸化部位、アミノ酸約４２９−４３２に相当する小胞体標的化配列を含む。クローンＵＮＱ３６４（ＤＮＡ４６７７６−１２８４）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７２１が付与されている。
【０４４５】
実施例１６：ヒトＰＲＯ７０２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３６６２３と命名される。ＤＮＡ３６６２３コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７０２の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー（３６６２３．ｆ１）　５’−ＣＧＣＴＧＡＣＴＡＴＧＴＴＧＣＣＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
（配列番号：９８）
逆方向ＰＣＲプライマー（３６６２３．ｒ１）　５’−ＧＡＴＧＡＴＧＧＡＧＧＣＴＣＣＡＴＡＣＣＴＣＡＧ−３’
（配列番号：９９）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３６６２３配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ（３６６２３．ｐ１）
５’−ＧＴＧＴＴＣＡＴＴＧＧＣＧＴＧＡＡＴＧＡＣＣＴＴＧＡＡＡＧＧＧＡＧＧＧＡＣＡＧＴＡＣＡＴＧＴＴＣＡＣ−３’
（配列番号：１００）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７０２遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肝臓組織（ＬＩＢ２２９）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７０２の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３６６（ＤＮＡ５０９８０−１２８６）と命名される］（配列番号：９６）及びＰＲＯ７０２の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３６６（ＤＮＡ５０９８０−１２８６）の全核酸配列をＦｉｇ３６（配列番号：９６）に示す。クローンＵＮＱ３６６（ＤＮＡ５０９８０−１２８６）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２２−２４に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置８５３−８５５の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ３６）。予測されるポリペプチド前駆体は２７７アミノ酸長である（Ｆｉｇ３７）。Ｆｉｇ３７に示した全長ＰＲＯ７０２タンパク質は、約３０，６４５ダルトンの見積もり分子量及び約７．４７のｐＩを有する。また、ＰＲＯ７０２アミノ酸配列の分析は、約アミノ酸１〜約アミノ酸２５の推定シグナルペプチド、約アミノ酸２３０〜約アミノ酸２３３及び約アミノ酸２５８〜約アミノ酸２６１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、及び約アミノ酸２４８〜約アミノ酸２７０のＣ型レクチンドメインシグネーチャー配列の存在を明示している。クローンＵＮＱ３６６（ＤＮＡ５０９８０−１２８６）は、１９９８年３月３１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７１７が付与されている。
全長ＰＲＯ７０２ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがコングルチニンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ７０２が新規なコングルチニン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ７０２アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、Ｓ３２４３６， Ｐ＿Ｒ７５６４２， Ｐ＿Ｗ１８７８０， Ｐ＿Ｗ１８７８１， Ａ５３３３０， ＡＣ００２５２８＿１， ＨＳＰＰＡ２ＩＣ０＿１， ＣＡ２１＿ＨＵＭＡＮ， ＣＡ１４＿ＨＵＭＡＮ及びＡ６１２６２との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４４６】
実施例１７：ヒトＰＲＯ７０３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４３０４７と命名される。ＤＮＡ４３０４７コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７０３の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　　５’−ＧＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号：１０３）
逆方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＧＧＡＧＡＡＴＧＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣ−３’（配列番号：１０４）
逆方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＣＣＡＴＡＧＡＣＧ−３’
（配列番号：１０５）
逆方向ＰＣＲプライマー３　５’−ＡＴＣＣＡＣＴＴＣＡＧＣＧＧＡＣＡＣ−３’（配列番号：１０６）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４０６５４配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＧＡＴＡＣＣＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＴＡＡＣＡＧＡＣＡＣＧ−３’（配列番号：１０７）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７０３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７０３の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３６７（ＤＮＡ５０９１３−１２８７）と命名される］（配列番号：１０１）及びＰＲＯ７０３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３６７（ＤＮＡ５０９１３−１２８７）の全核酸配列をＦｉｇ３８（配列番号：１０１）に示す。クローンＵＮＱ３６７（ＤＮＡ５０９１３−１２８７）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１１５−１１７に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２３０５−２３０７の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ３８）。予測されるポリペプチド前駆体は７３０アミノ酸長である（Ｆｉｇ３９）。Ｆｉｇ３９に示した全長ＰＲＯ７０３タンパク質は、約７８，６４４ダルトンの見積もり分子量及び約７．６５のｐＩを有する。ＰＲＯ７０３アミノ酸配列の重要な領域は、シグナル配列、ｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位、ＣＵＢドメインタンパク質モチーフ、Ｎ−グリコシル化部位及び推定ＡＭＰ−結合ドメインシグネーチャーを含む。クローンＵＮＱ３６７（ＤＮＡ５０９１３−１２８７）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７１６が付与されている。
【０４４７】
実施例１８：ヒトＰＲＯ７０５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４３４３７と命名される。ＤＮＡ４３４３７コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７０５の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＡＧＣＧＴＧＡＣＡＧＣＧＧＧＣＡＣＧＴＣ−３’（配列番号：１１０）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＧＣＡＣＡＧＴＣＴＣＴＧＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＧ−３’（配列番号：１１１）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４３４３７配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ（４３４３７．ｐ１）
５’−ＧＡＡＴＧＣＴＧＧＡＡＣＧＧＧＣＡＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＴＡＣＴＴＧＣＣＴＧ−３’（配列番号：１１２）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７０５遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７０５の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３６９（ＤＮＡ５０９１４−１２８９）と命名される］（配列番号：１０８）及びＰＲＯ７０５の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３６９（ＤＮＡ５０９１４−１２８９）の全核酸配列をＦｉｇ４０（配列番号：１０８）に示す。クローンＵＮＱ３６９（ＤＮＡ５０９１４−１２８９）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５５６−５６８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２２３１−２２３３の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ４０）。予測されるポリペプチド前駆体は５５５アミノ酸長である（Ｆｉｇ４１）。Ｆｉｇ４１に示した全長ＰＲＯ７０５タンパク質は、約６２，７３６ダルトンの見積もり分子量及び約５．３６のｐＩを有する。Ｆｉｇ４１に示した全長ＰＲＯ７０５配列の分析は、以下のものの存在を明示した：約アミノ酸１〜約アミノ酸２３に対応するシグナルペプチド、約アミノ酸４１８〜約アミノ酸４３６の真核生物ＤＮＡトポイソメラーゼＩ活性部位、及び約アミノ酸２３７〜約アミノ酸２７９、約アミノ酸４２１〜約アミノ酸４５８、約アミノ酸５３〜約アミノ酸７４、約アミノ酸４６６〜約アミノ酸５０４、約アミノ酸３０８〜約アミノ酸３５５、約アミノ酸１０４〜約アミノ酸１５６、及び約アミノ酸３７９〜約アミノ酸４１０の種々のグリピカンタンパク質に相同な種々の領域。クローンＵＮＱ３６９（ＤＮＡ５０９１４−１２８９）は、１９９８年３月３１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７２２が付与されている。
全長ＰＲＯ７０５ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがＫ−グリピカンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ７０５が新規なグリピカンタンパク質のメンバーとなりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ７０５アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＧＰＣＫ＿ＭＯＵＳＥ， ＧＬＹＰ＿ＣＨＩＣＫ， ＧＬＹＰ＿ＲＡＴ， ＧＬＹＰ＿ＨＵＭＡＮ， ＧＰＣ２＿ＲＡＴ， ＧＰＣ５＿ＨＵＭＡＮ， ＧＰＣ３＿ＨＵＭＡＮ， ＧＰＣ３＿ＲＡＴ， Ｐ＿Ｒ３０１６８及びＣＥＣ０３Ｈ１２＿２との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４４８】
実施例１９：ヒトＰＲＯ７０８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３４０２４と命名される。ＤＮＡ３４０２４コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７０８の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＣＡＡＣＣＣＡＡＣＴＧＴＴＴＡＣＣＴＣＴＧＧ−３’（配列番号：１１５）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＴＣＴＣＴＧＡＧＴＧＴＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＧ−３’（配列番号：１１６）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３４０２４配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＣＣＡＣＣＣＴＡＣＣＴＣＡＧＡＡＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＧＴＴＧＧＮＴＡＴＴＣＡＡＣＧＣＡＴＡＴＧＧＴＣＧＧ−３’
（配列番号：１１７）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７０８遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト骨髄組織（ＬＩＢ２５５）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７０８の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３７２（ＤＮＡ４８２９６−１２９２）と命名される］（配列番号：１１３）及びＰＲＯ７０８の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３７２（ＤＮＡ４８２９６−１２９２）の全核酸配列をＦｉｇ４２Ａ−Ｂ（配列番号：１１３）に示す。クローンＵＮＱ３７２（ＤＮＡ４８２９６−１２９２）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８９１−８９３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２４３６−２４３８の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ４２Ａ−Ｂ）。予測されるポリペプチド前駆体は５１５アミノ酸長である（Ｆｉｇ４３）。Ｆｉｇ４３に示した全長ＰＲＯ７０８タンパク質は、約５６，８８５ダルトンの見積もり分子量及び約６．４９のｐＩを有する。Ｆｉｇ４３に示した全長ＰＲＯ７０８アミノ酸配列の分析は、約アミノ酸１〜約アミノ酸３７の推定シグナルペプチド、約アミノ酸１２０〜約アミノ酸１３２及び約アミノ酸１６８〜約アミノ酸１７７の推定スルファターゼシグネーチャー配列、約アミノ酸１６３〜約アミノ酸１６９の推定チロシンキナーゼリン酸化部位、及び約アミノ酸１５７〜約アミノ酸１６０、約アミノ酸３０６〜約アミノ酸３０９、及び約アミノ酸３１８〜約アミノ酸３２１の推定Ｎ−グリコシル化部位の存在を実証している。クローンＵＮＱ３７２（ＤＮＡ４８２９６−１２９２）は、１９９８年３月１１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６６８が付与されている。
全長ＰＲＯ７０８ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがアリールスルファターゼタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ７０８が新規なアリールスルファターゼ相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ７０８アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＡＲＳＢ＿ＨＵＭＡＮ， ＣＥＬＣ５４Ｄ２＿２， Ｇ０２８５７， ＳＴＳ＿ＨＵＭＡＮ， Ｉ３７１８６， Ｉ３７１８７， ＧＥＮ１２６４８， ＣＥＬＤ１０１４＿７， ＧＡ６Ｓ＿ＨＵＭＡＮ及びＳＰＨＭ＿ＨＵＭＡＮとの間の有意な相同性を明らかにした。
【０４４９】
実施例２０：ヒトＰＲＯ３２０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ２８７３９と命名される。ＤＮＡ２８７３９コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３２０の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＴＣＡＧＴＧＧＣＣＡＣＡＴＧＣＴＣＡＴＧ−３’（配列番号：１２０）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＧＣＴＧＣＡＣＧＴＡＴＧＧＣＴＡＴＣＣＡＴＡＧ−３’（配列番号：１２１）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ２８７３９配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＡＴＡＡＡＣＴＧＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＴＧＴＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＧＧＣＣＡＣＡＧＴＧＣＣ−３’（配列番号：１２２）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３２０遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト骨髄組織（ＬＩＢ２５）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３２０の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ２８１（ＤＮＡ３２２８４−１３０７）と命名される］（配列番号：１１８）及びＰＲＯ３２０の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ２８１（ＤＮＡ３２２８４−１３０７）の全核酸配列をＦｉｇ４４（配列番号：１１８）に示す。クローンＵＮＱ２８１（ＤＮＡ３２２８４−１３０７）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１３５−１３７に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１１４９−１１５１の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ４４）。予測されるポリペプチド前駆体は３３８アミノ酸長である（Ｆｉｇ４５）。Ｆｉｇ４５に示した全長ＰＲＯ３２０タンパク質は、約３７，１４３ダルトンの見積もり分子量及び約８．９２のｐＩを有する。ＰＲＯ３２０アミノ酸配列の重要な領域は、アミノ酸１−２１に相当するシグナルペプチド、アミノ酸８０−９１に相当するＥＧＦ様ドメインシステインパターンシグネーチャー、各々アミノ酸１０３−１２４、２３０−１５１及び１８５−２０６に相当する３つのカルシウム結合ＥＧＦ様ドメインを含む。クローンＵＮＱ２８１（ＤＮＡ３２２８４−１３０７）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６７０が付与されている。
【０４５０】
実施例２１：ヒトＰＲＯ３２４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３４３４７と命名される。ＤＮＡ３４３４７コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３２４の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＧＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＧＧＡＧＣＴＧＣ−３’ （配列番号：１２５）
正方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＣＴＧＴＧＡＡＴＡＧＣＡＴＣＣＴＧＧＧ−３’ （配列番号：１２６）
正方向ＰＣＲプライマー３　５’−ＣＴＴＴＴＣＡＡＧＣＣＡＣＴＧＧＡＧＧＧ−３’（配列番号：１２７）
逆方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＣＴＧＴＡＧＡＣＡＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＴＡＴＣＣ−３’
（配列番号：１２８）
逆方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＡＡＧＡＧＴＣＴＧＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＡＣＴＣ−３’（配列番号：１２９）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３４３４７配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＡＣＣＴＧＡＣＧＣＴＡＣＴＡＴＧＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＣＡＧＧＧＡＣＧＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＴＧ−３’（配列番号：１３０）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３２４遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肝臓組織（ＬＩＢ６）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３２４の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ２８５（ＤＮＡ３６３４３−１３１０）と命名される］（配列番号：１２３）及びＰＲＯ３２４の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ２８５（ＤＮＡ３６３４３−１３１０）の全核酸配列をＦｉｇ４６（配列番号：１２３）に示す。クローンＵＮＱ２８５（ＤＮＡ３６３４３−１３１０）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１４４−１４６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１０１１−１０１３の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ４６）。予測されるポリペプチド前駆体は２８９アミノ酸長である（Ｆｉｇ４７）。Ｆｉｇ４７に示した全長ＰＲＯ３２４タンパク質は、約３２，２６８ダルトンの見積もり分子量及び約９．２１のｐＩを有する。Ｆｉｇ４７（配列番号：１２４）に示した全長ＰＲＯ３２４アミノ酸配列の分析は以下のものの存在を実証している：約アミノ酸１〜約アミノ酸３１のシグナルペプチド、約アミノ酸１３６〜約アミノ酸１５７の膜貫通ドメイン、約アミノ酸１０６又は約アミノ酸１０７〜約アミノ酸１１３のチロシンキナーゼリン酸化部位、約アミノ酸８０〜約アミノ酸９０、約アミノ酸１３１〜約アミノ酸１６８、約アミノ酸１〜約アミノ酸１３、及び約アミノ酸１７６〜約アミノ酸１８５の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ領域に相同な領域。クローンＵＮＱ２８５（ＤＮＡ３６３４３−１３１０）は、１９９８年３月３０日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７１８が付与されている。
全長ＰＲＯ３２４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがオキシドレダクターゼと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ３２４が新規なオキシドレダクターゼ相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ３２４アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、Ｂ６１２０９， Ａ６９９６５， ＹＱＪＱ＿ＢＡＣＳＵ， Ｄ６９９３０， Ｓ７６１２４， ＦＡＢＧ＿ＥＣＯＬＩ， Ｃ７００２３， Ｓ７７２８０， ＦＡＢＧ＿ＶＩＢＨＡ，及びＭＴＶ０１３＿６との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４５１】
実施例２２：ヒトＰＲＯ３５１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３５９５０と命名される。ＤＮＡ３５９５０コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３５１の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＣＧＡＧＣＣＴＧＡＣ−３’（配列番号：１３３）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＴＧＧＧＣＡＧＣＡＧＴＴＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＣ−３’（配列番号：１３４）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３５９５０配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＧＣＴＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＧＣＴＴＴＧＣＡＴＣＡＡＧＣＴＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＧＣ−３’（配列番号：１３５）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３５１遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肝臓組織（ＬＩＢ２３０）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３５１の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３０８（ＤＮＡ４０５７１−１３１５）と命名される］（配列番号：１３１）及びＰＲＯ３５１の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３０８（ＤＮＡ４０５７１−１３１５）の全核酸配列をＦｉｇ４８（配列番号：１３１）に示す。クローンＵＮＱ３０８（ＤＮＡ４０５７１−１３１５）は、２つのオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１８９−１９１に見かけの翻訳開始部位を持ち、第２のオープンリーディングフレームはヌクレオチド４７０で開始され、２つのオープンリーディングフレームは、各々ヌクレオチド位置３６３−３６５及び２００９−２０１１の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ４８）。予測されるポリペプチド前駆体は５７１アミノ酸長である（Ｆｉｇ４９）。ＰＲＯ３５１のアミノ酸配列の重要な領域は、シグナルペプチド、トリプシンファミリーのセリンプロテアーゼと配列類似性を持つ領域、２つのＮ−グリコシル化部位、及びクリングルドメインを含む。クローンＵＮＱ３０８（ＤＮＡ４０５７１−１３１５）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７８４が付与されている。
【０４５２】
実施例２３：ヒトＰＲＯ３５２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３６９５０と命名される。ＤＮＡ３６９５０コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３５２の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＣＴＧＧＣＡＣＡＧＣＴＣＡＡＣＣＴＣＡＴＣＴＧＧ−３’
（配列番号：１３８）
正方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＧＣＴＧＴＣＴＧＴＣＴＧＴＣＴＣＡＴＴＧ−３’（配列番号：１３９）
正方向ＰＣＲプライマー３　５’−ＧＧＡＣＡＣＡＧＴＡＴＡＣＴＧＡＣＣＡＣ−３’（配列番号：１４０）
逆方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＴＧＣＧＡＡＣＣＡＧＧＣＡＧＣＴＧＴＡＡＧＴＧＣ−３’
（配列番号：１４１）
逆方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＴＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＧＧＴＧＧＴＧＡＴＧＴＧＧ−３’
（配列番号：１４２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３６９５０配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＡＧＣＴＧＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＡＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＣＡＧＴＴＴＣＡＣＣＧＡＡＧＧＣ−３’ （配列番号：１４３）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３５２遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３５２の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３０９（ＤＮＡ４１３８６−１３１６）と命名される］（配列番号：１３６）及びＰＲＯ３５２の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３０９（ＤＮＡ４１３８６−１３１６）の全核酸配列をＦｉｇ５０（配列番号：１３６）に示す。クローンＵＮＱ３０９（ＤＮＡ４１３８６−１３１６）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１５２−１５４に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１１００−１１０２の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ５０）。予測されるポリペプチド前駆体は３１６アミノ酸長である（Ｆｉｇ５１）。Ｆｉｇ２に示した全長ＰＲＯ３５２タンパク質は、約４．６２の見積もられたｐＩを有する。全長ＰＲＯ３５２配列の分析は、約アミノ酸１〜約アミノ酸２８のシグナルペプチド、約アミノ酸２５１〜約アミノ酸２７０の膜貫通ドメイン、約アミノ酸９１〜約アミノ酸９４、約１０４〜約アミノ酸１０７、約アミノ酸１８９〜約アミノ酸１９２及びアミノ酸２１５〜約アミノ酸２１８のＮ−グリコシル化部位、及び約アミノ酸２１７〜約アミノ酸２３４の免疫グロブリン及びＭＨＣに相同性を有する領域の存在を実証している。クローンＵＮＱ３０９（ＤＮＡ４１３８６−１３１６）は、１９９８年３月２６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７０３が付与されている。
全長ＰＲＯ３５２ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがブチロフィリンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ３５２が新規なブチロフィリン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ３５２アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＢＵＴＹ＿ＨＵＭＡＮ， ＨＳＢ７３＿１， ＧＧＣＤ８０＿１， Ｉ４６６９０， Ａ３３＿ＨＵＭＡＮ， Ｐ＿Ｒ６７９８８， ＣＤ８６＿ＭＯＵＳＥ， Ｐ＿Ｒ７１３６０， Ｂ３９３７１， 及びＤ５０５５８＿１との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４５３】
実施例２４：ヒトＰＲＯ３８１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３９６５１と命名される。ＤＮＡ３９６５１コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３８１の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＴＴＴＣＣＴＴＧＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＡＧＧＣ−３’
（配列番号：１４６）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＣＣＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＧＡＴＧＡＧＣ−３’（配列番号：１４７）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３９６５１配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＴＧＧＡＡＣＧＣＧＧＴＣＴＴＧＡＣＴＣＴＧＴＴＣＧＴＣＡＣＴＴＣＴＴＴＧＡＴＴＧＧＧＧＣＴＴＴＧ−３’（配列番号：１４８）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３８１遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３８１の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３２２（ＤＮＡ４４１９４−１３１７）と命名される］（配列番号：１４４）及びＰＲＯ３８１の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３２２（ＤＮＡ４４１９４−１３１７）の全核酸配列をＦｉｇ５２（配列番号：１４４）に示す。クローンＵＮＱ３２２（ＤＮＡ４４１９４−１３１７）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１７４−１７６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置８０７−８０９の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ５２）。予測されるポリペプチド前駆体は２１１アミノ酸長である（Ｆｉｇ５３）。Ｆｉｇ５３に示した全長ＰＲＯ３８１タンパク質は、約２４，１７２ダルトンの見積もり分子量及び約５．９９のｐＩを有する。Ｆｉｇ５３（配列番号：１４５）に示した全長ＰＲＯ３８１ポリペプチドの分析は、以下のものの存在を実証した：約アミノ酸１〜約アミノ酸２０のシグナルペプチド、約アミノ酸１７６〜約アミノ酸１７９の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、膜貫通ドメイン、約アミノ酸１４３〜約アミノ酸１４６、約１５６〜約アミノ酸１５９、約アミノ酸１７８〜約アミノ酸１８１及びアミノ酸２００〜約アミノ酸２０３の潜在的カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、約アミノ酸７８〜約アミノ酸１１４及び約アミノ酸１１８〜約アミノ酸１３１のＦＫＢＰ−型ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ部位、約アミノ酸１９１〜約アミノ酸２０３、約アミノ酸１８４〜約アミノ酸２０３及び約アミノ酸１４０〜約アミノ酸１５９のＥＦ−腕カルシウム結合ドメイン、及び約アミノ酸１８３〜約アミノ酸２０３のＳ−１００／ＩＣａＢＰ型カルシウム結合ドメイン。クローンＵＮＱ３２２（ＤＮＡ４４１９４−１３１７）は、１９９８年４月２８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８０８が付与されている。
全長ＰＲＯ３８１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがＦＫＢＰ免疫グロブリンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ３８１が新規なＦＫＢＰ免疫グロブリン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ３８１アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＡＦ４０２５２＿１， Ｉ４９６６９， Ｐ＿Ｒ９３５５１， Ｓ７１２３８， ＣＥＬ０５Ｃ８＿１， ＣＥＵ２７３５３＿１， ＭＩＰ＿ＴＲＹＣＲ， ＣＥＺＣ４５５＿３， ＦＫＢ４＿ＨＵＭＡＮ及びＩ４０７１８との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４５４】
実施例２５：ヒトＰＲＯ３８６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４０６７４と命名される。２つのジェネンテクが独自に開発したＥＳＴ配列をコンセンサス構築に使用し、これらＥＳＴ配列は、ここにＤＮＡ２３３５０（Ｆｉｇ５６；配列番号：１５１）及びＤＮＡ２３５３６（Ｆｉｇ５７；配列番号：１５２）と命名する。ＤＮＡ４０６７４コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３８６の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＣＧＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＧＴＡＣ−３’（配列番号：１５３）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＣＡＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＣＡＴＣＡＣＣＧＡＣ−３’（配列番号：１５４）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４０６７４配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＣＡＣＣＴＴＣＡＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＣＡＣＡＧＴＧＡＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡＧＴＴ−３’
（配列番号：１５５）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３８６遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児脳組織（ＬＩＢ１５３）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３８６の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３２６（ＤＮＡ４５４１５−１３１８）と命名される］（配列番号：１４９）及びＰＲＯ３８６の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３２６（ＤＮＡ４５４１５−１３１８）の全核酸配列をＦｉｇ５４（配列番号：１４９）に示す。クローンＵＮＱ３２６（ＤＮＡ４５４１５−１３１８）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１４６−１４８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置７９１−７９３の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ５４）。予測されるポリペプチド前駆体は２１５アミノ酸長である（Ｆｉｇ５５）。Ｆｉｇ５５に示した全長ＰＲＯ３８６タンパク質は、約２４，３２６の見積もり分子量及び約６．３２のｐＩを有する。Ｆｉｇ５５（配列番号：１５０）に示した全長ＰＲＯ３８６配列の分析は、以下のものの存在を実証した：約アミノ酸１〜約アミノ酸２０のシグナルペプチド、約アミノ酸１６１〜約アミノ酸１７９の膜貫通ドメイン、約アミノ酸８３〜約アミノ酸１２７の免疫グロブリン様折りたたみ、及び約４２〜約アミノ酸４５、約アミノ酸６６〜約アミノ酸６９及びアミノ酸７４〜約アミノ酸７７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位。クローンＵＮＱ３２６（ＤＮＡ４５４１５−１３１８）は、１９９８年４月２８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８１０が付与されている。
全長ＰＲＯ３８６ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがナトリウムチャンネルベータ−２サブユニットと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ３８６がその新規な相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ３８６アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、Ａ５７８４３， ＭＹＰ０＿ＨＵＭＡＮ， ＧＥＮ１４５３１， ＪＣ４０２４， ＨＳ４６ＫＤＡ＿１， ＨＳＵ９０７１６＿１， Ｄ８９９６＿２， ＭＵＳＩＧＬＶＤ＿１， ＤＭＵ４２７６８＿１， 及びＳ１９２４７との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４５５】
実施例２６：ヒトＰＲＯ５４０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３９６３１と命名される。ＤＮＡ３９６３１コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ５４０の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＴＧＧＧＧＣＴＡＣＡＣＡＣＧＧＧＧＴＧＡＧＧ−３’（配列番号：１５８）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＧＴＧＣＣＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＴＡＧＡＧＣＧ−３’（配列番号：１５９）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４０６５４配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＣＣＣＣＡＡＡＴＧＡＡＡＡＣＧＧＧＣＣＣＴＡＣＴＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＣＣＧＣＧＡＧＡＴＧ−３’（配列番号：１６０）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ５４０遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ５４０の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３４１（ＤＮＡ４４１８９−１３２２）と命名される］（配列番号：１５６）及びＰＲＯ５４０の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３４１（ＤＮＡ４４１８９−１３２２）の全核酸配列をＦｉｇ５８（配列番号：１５６）に示す。クローンＵＮＱ３４１（ＤＮＡ４４１８９−１３２２）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２１−２３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１２５７−１２５９の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ５８）。予測されるポリペプチド前駆体は４１２アミノ酸長である（Ｆｉｇ５９）。Ｆｉｇ５９に示した全長ＰＲＯ５４０タンパク質は、約４６，６５８ダルトンの見積もり分子量及び約６．６５のｐＩを有する。ＰＲＯ５４０のアミノ酸配列の重要な領域は、シグナルペプチド、潜在的Ｎ−グリコシル化部位、潜在的脂肪基質結合部位、リパーゼ及びセリンタンパク質に典型的な配列、及びベータ伝達ファミリーＴｒｐ−Ａｓｐリピートを含む。クローンＵＮＱ３４１（ＤＮＡ４４１８９−１３２２）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６９９が付与されている。
【０４５６】
実施例２７：ヒトＰＲＯ６１５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４２２４０と命名される。ＤＮＡ４２２４０コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ６１５の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＧＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＧＡＴＣＧＴＧＴＴＣＴ−３’（配列番号：１６３）
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＴＧＴＡＣＴＧＡＧＣＧＧＣＧＧＴＴＡＧ−３’　　（配列番号：１６４）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＣＣＣＴＣＡＣ−３’ （配列番号：１６５）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＡＧＧＡＧＧＣＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＧＴＣＣ−３’ （配列番号：１６６）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４２２４０配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＣＡＣＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＧＡＴＧＴＡＣＴＧＣＧＴＧＴＴＣＡＡＣＣＧＣＡＡＣＧＡＧＧＡＴＧＣＣＴ−３’
（配列番号：１６７）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ６１５遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト骨髄組織（ＬＩＢ２５５）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ６１５の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３５２（ＤＮＡ４８３０４−１３２３）と命名される］（配列番号：１６１）及びＰＲＯ６１５の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３５２（ＤＮＡ４８３０４−１３２３）の全核酸配列をＦｉｇ６０（配列番号：１６１）に示す。クローンＵＮＱ３５２（ＤＮＡ４８３０４−１３２３）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５１−５３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置７２３−７２５の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ６０）。予測されるポリペプチド前駆体は２２４アミノ酸長である（Ｆｉｇ６１）。Ｆｉｇ６１に示した全長ＰＲＯ６１５タンパク質は、約２４，８１０ダルトンの見積もり分子量及び約４．７５のｐＩを有する。ＰＲＯ６１５のアミノ酸配列の重量な領域は、約アミノ酸２４−４３に相当するＩＩ型膜貫通ドメイン、各々約アミノ酸７４−９０，１０８−１２６及び１４５−１６１に相当する他の膜貫通ドメイン、及び約アミノ酸９７−１００に相当する潜在的Ｎ−グリコシル化部位を含む。クローンＵＮＱ３５２（ＤＮＡ４８３０４−１３２３）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８１１が付与されている。
【０４５７】
実施例２８：ヒトＰＲＯ６１８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３０９００と命名される。ＤＮＡ３０９００コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ６１８の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＡＡＣＡＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴＣＣＡＧＧ−３’（配列番号：１７１）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＡＡＴＣＣＡＧＣＡＧＴＧＣＡＧＧＣＣＧＧＧ−３’（配列番号：１７２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３０９００配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＡＴＧＧＣＣＴＣＣＡＣＧＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＴＧＧＣＡＧＡＡ−３’
（配列番号：１７３）
上記のライブラリのスクリーニングは、ここでＤＮＡ３５５９７（配列番号：１７０）と命名される部分的ｃＤＮＡクローンを生じた。この配列のＢＬＡＳＴ及びｐｈｒａｐの繰り返しサイクルを用いた発現は、ここでＤＮＡ４３３３５と命名される核酸配列を生じた。次いで、ＤＮＡ４３３３５コンセンサス配列に基づいて以下のプライマーを調製した。
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＧＣＣＴＡＴＧＣＡＣＴＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＡＡＧ−３’（配列番号：１７４）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＧＧＣＡＧＧＧＡＣＡＣＡＧＡＧＴＣＣＡＴＴＣＡＣ−３’（配列番号：１７５）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４３３３５配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＡＧＴＡＴＧＡＴＴＴＧＣＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＧＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＣＧＡＴＣＣＡＧＡＡＣＡＧＧＡＧＧ−３’
（配列番号：１７６）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ６１８遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肝臓組織（ＬＩＢ２２９）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ６１８の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３５４（ＤＮＡ４９１５２−１３２４）と命名される］（配列番号：１６８）及びＰＲＯ６１８の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３５４（ＤＮＡ４９１５２−１３２４）の全核酸配列をＦｉｇ６２（配列番号：１６８）に示す。クローンＵＮＱ３５４（ＤＮＡ４９１５２−１３２４）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置７３−７５に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２４７９−２４８１の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ６２）。予測されるポリペプチド前駆体は８０２アミノ酸長である（Ｆｉｇ６３）。Ｆｉｇ６３に示した全長ＰＲＯ６１８タンパク質は、約８８，８４６ダルトンの見積もり分子量及び約６．４１のｐＩを有する。ＰＲＯ６１８のアミノ酸配列の重量な領域は、ＩＩ型膜貫通ドメイン、プロテアーゼに典型的な配列、トリプシンファミリー、ヒスチジン活性部位、複数のＮ−グリコシル化部位、２つのクリングルドメインに典型的な配列、２つのカリクレイン軽鎖に類似する配列を持つ領域、及び低密度リポタンパク質レセプターに類似する配列を持つ領域を含む。クローンＵＮＱ３５４（ＤＮＡ４９１５２−１３２４）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８１３が付与されている。
【０４５８】
実施例２９：ヒトＰＲＯ７１９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４４８５１と命名される。ＤＮＡ４４８５１コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７１９の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＴＧＡＧＣＡＴＧＡＧＣＧＡＧＣＣＧＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：１７９）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＣＴＡＴＴＡＣＡＡＣＧＧＴＴＣＴＴＧＣＧＧＣＡＧＣ−３’
（配列番号：１８０）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４４８５１配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＴＴＧＡＣＴＣＴＣＴＧＧＴＧＡＡＴＣＡＧＧＡＣＡＡＧＣＣＧＡＧＴＴＴＴＧＣＣＴＴＣＣＡＧ−３’（配列番号：１８１）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７１９遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎盤組織（ＬＩＢ９０）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７１９の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３８７（ＤＮＡ４９６４６−１３２７）と命名される］（配列番号：１７７）及びＰＲＯ７１９の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３８７（ＤＮＡ４９６４６−１３２７）の全核酸配列をＦｉｇ６５（配列番号：１７７）に示す。クローンＵＮＱ３８７（ＤＮＡ４９６４６−１３２７）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２２３−２２５に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１２８５−１２８７の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ６５）。予測されるポリペプチド前駆体は３５４アミノ酸長である（Ｆｉｇ６６）。Ｆｉｇ６６に示した全長ＰＲＯ７１９タンパク質は、約３９，３６２ダルトンの見積もり分子量及び約８．３５のｐＩを有する。全長ＰＲＯ７１９配列の分析は、Ｆｉｇ６６（配列番号：１７８）に示したように約アミノ酸１〜約アミノ酸１６のシグナルペプチド、約アミノ酸１６３〜約アミノ酸１７２のリパーゼ関連セリン含有活性部位、及び約アミノ酸８０〜約アミノ酸８３及び約アミノ酸１３６〜約アミノ酸１３９の２つの潜在的Ｎ−グリコシル化部位の存在を明らかにした。クローンＵＮＱ３８７（ＤＮＡ４９６４６−１３２７）は、１９９８年３月２６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７０５が付与されている。
全長ＰＲＯ７１９ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがリポタンパク質リパーゼＨタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ７１９が新規なリポタンパク質リパーゼ相同体となりうることが示されている。より詳細にはＤａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ７１９アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＬＩＰＬ＿ＨＵＭＡＮ， ＬＩＰＨ＿ＨＵＭＡＮ， Ｄ８３５４８＿１， Ａ２４０５９＿１， Ｐ＿Ｒ３０７４０， Ｄ８８６６６＿１， Ａ４３３５７， Ａ４６６９６， Ｂ４３３５７及びＡ４９４８８との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４５９】
実施例３０：ヒトＰＲＯ７２４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３５６０３と命名される。ＤＮＡ３５６０３コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７２４の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＧＧＣＴＧＴＣＡＣＴＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣ−３’（配列番号：１８４）
正方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＧＣＡＡＧＧＴＣＡＴＴＡＣＡＧＣＴＧ−３’（配列番号：１８５）
逆方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＡＧＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＣＡＧＴＣＣＣＡＣＴＣ−３’（配列番号：１８６）
逆方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＴＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＡＴＣＴＣＡＧ−３’（配列番号：１８７）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３５６０３配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＧＣＴＡＴＴＧＣＴＴＧＣＣＴＴＧＧＧＡＣＡＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＣＴＴＡＧＧＣＴＣＴＧＧＣ−３’（配列番号：１８８）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７２４遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肺組織（ＬＩＢ２６）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７２４の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３８９（ＤＮＡ４９６３１−１３２８）と命名される］（配列番号：１８２）及びＰＲＯ７２４の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３８９（ＤＮＡ４９６３１−１３２８）の全核酸配列をＦｉｇ６７（配列番号：１８２）に示す。クローンＵＮＱ３８９（ＤＮＡ４９６３１−１３２８）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５４６−５４８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２６８５−２６８７の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ６７）。予測されるポリペプチド前駆体は７１３アミノ酸長である（Ｆｉｇ６８）。Ｆｉｇ６８に示した全長ＰＲＯ７２４タンパク質は、約７６，１９３ダルトンの見積もり分子量及び約５．４２のｐＩを有する。Ｆｉｇ６８（配列番号：１８３）に示した全長ＰＲＯ７２４配列の分析は、以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸１６のシグナルペプチド、約アミノ酸４４２〜約アミノ酸４６２の膜貫通ドメイン、約アミノ酸１５２〜約アミノ酸１７１、約アミノ酸３３１〜約アミノ酸３５０、約アミノ酸３７４〜約アミノ酸３９３及び約アミノ酸４４１〜約アミノ酸４３０のＬＤＬレセプタークラスＡドメイン領域。クローンＵＮＱ３８９（ＤＮＡ４９６３１−１３２８）は、１９９８年４月２８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８０６が付与されている。
全長ＰＲＯ７２４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがヒトＬＤＬレセプタータンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ７２４が新規なＬＤＬレセプター相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ７２４アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、Ｐ＿Ｒ４８５４７， ＭＭＡＭ２Ｒ＿１， ＬＲＰ２＿ＲＡＴ， Ｐ＿Ｒ６０５１７， Ｐ＿Ｒ４７８６１， Ｐ＿Ｒ０５５３， Ａ４４５１３＿１， Ａ３０３６３， Ｐ＿Ｒ７４６９２， 及びＬＭＬＩＰＯＰＨＯ＿１との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４６０】
実施例３１：ヒトＰＲＯ７７２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例２に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて１つのｃＤＮＡ配列が単離され、このｃＤＮＡ配列を、ここにＤＮＡ４３５０９（Ｆｉｇ７１参照）と命名する。ＤＮＡ４３５０９配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを生成させ、実施例２のパラグラフ１に記載したように調製したヒト胎児肺ライブラリ（ＬＩＢ２５）のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１））、ｃＤＮＡサイズ切断は２８００ｂｐ未満であった。
ＤＮＡ４３５０９配列に基づいてＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）の対を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＧＴＴＴＴＧＣＡＧＡＡＣＣＴＡＣＴＣＡＧＧＣＡＧ−３’（配列番号：１９２）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＴＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＧ−３’（配列番号：１９３）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４３５０９配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＡＡＡＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＴＣＴＧＣＡＧＡＣＧＣＧＡＴＧＧＡＴＡＡＣＧＴ−３’（配列番号：１９４）
上記のプライマー及びライブラリを用いて全長クローンを同定し、それは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１３１−１３３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置５８７−５８９に見られる停止コドンで終端する（Ｆｉｇ６９；配列番号：１８９）。予測されるポリペプチド前駆体は１５２アミノ酸長であり、約１７，１７０ダルトンの計算上の分子量及び約９．６２の見積もられたｐＩを有する。Ｆｉｇ７０（配列番号：１９０）に示した全長ＰＲＯ７７２配列の分析は、以下のものの存在を明示している：約アミノ酸２６〜約アミノ酸４２の潜在的ＩＩ型膜貫通ドメイン、約アミノ酸４４〜約アミノ酸６５、約アミノ酸８１〜約アミノ酸１０１及び約アミノ酸１０９〜約アミノ酸１２９の他の膜貫通ドメイン、約アミノ酸７８〜約アミノ酸９９及び約アミノ酸８５〜約アミノ酸１０６のロイシンジッパーパターン配列。クローンＵＮＱ４１０（ＤＮＡ４９６４５−１３４７）は、１９９８年４月２８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８０９が付与されている。
全長ＰＲＯ７７２ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがヒトＡ４タンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ７７２が新規なＡ４タンパク質相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ７７２アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＨＳＵ９３３０５＿１， Ａ４Ｐ＿ＨＵＭＡＮ， ＣＥＬＢ０４５４＿２， ＶＰＵ＿ＪＳＲＶ， ＣＥＬＣ１２Ｄ＿２， ＯＣＣＭ＿ＡＧＴ１， ＬＢＰＨＩＧ１Ｅ＿５０， ＹＩＧＫ＿ＥＣＯＬＩ， Ｓ７６２４５及びＰ＿Ｒ５９８０７との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４６１】
実施例３２：ヒトＰＲＯ８５２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３４３６４と命名される。ＤＮＡ３４３６４コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ８５２の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＣＧＣＡＧＡＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＴＣＴＣＧ−３’（配列番号：１９７）
正方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＧＧＡＡＡＴＴＧＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＣ−３’（配列番号：１９８）
正方向ＰＣＲプライマー３　５’−ＧＧＡＴＧＴＡＧＣＣＡＧＣＡＡＣＴＧＴＧ−３’（配列番号：１９９）
正方向ＰＣＲプライマー４　５’−ＧＣＣＴＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣＴＴＣ−３’（配列番号：２００）
正方向ＰＣＲプライマー５　５’−ＧＧＴＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧ−３’（配列番号：２０１）
逆方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＧＡＣＡＡＧＡＣＴＡＣＣＴＣＣＧＴＴＧＧＴＣ−３’（配列番号：２０２）
逆方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＴＧＡＴＧＣＡＣＡＧＴＴＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＴＧ−３’
（配列番号：２０３）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３４３６４配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＧＣＴＣＣＡＡＧＧＧＣＴＴＴＧＡＣＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＡＧＴＡＣＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＧＣＴＧ−３’（配列番号：２０４）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ８５２遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２８）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ８５２の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４１８（ＤＮＡ４５４９３−１３４９）と命名される］（配列番号：１９５）及びＰＲＯ８５２の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４１８（ＤＮＡ４５４９３−１３４９）の全核酸配列をＦｉｇ７２（配列番号：１９５）に示す。クローンＵＮＱ４１８（ＤＮＡ４５４９３−１３４９）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置９４−９６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１６７４８−１６５０の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ７２）。予測されるポリペプチド前駆体は５１８アミノ酸長である（Ｆｉｇ７３）。Ｆｉｇ７３に示した全長ＰＲＯ８５２タンパク質は、約５６，１８０ダルトンの見積もり分子量及び約５．０８のｐＩを有する。Ｆｉｇ７３（配列番号：１９６）に示した全長ＰＲＯ８５２配列の分析は、以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸２０のシグナルペプチド、約アミノ酸４６６〜約アミノ酸４９４の膜貫通ドメイン、約アミノ酸１７０〜約アミノ酸１７３及び約アミノ酸３６６〜約アミノ酸３６９のＮ−グリコシル化部位、約アミノ酸１０〜約アミノ酸３１及び約アミノ酸１９７〜約アミノ酸２１８のロイシンジッパー配列パターンブロック、及び約アミノ酸１０９〜約アミノ酸１１８、約アミノ酸２５２〜約アミノ酸２６１及び約アミノ酸２９８〜約アミノ酸３１０の真核生物及びウイルスアスパラギン酸プロテアーゼに相同な配列を有するアミノ酸のブロック。クローンＵＮＱ４１８（ＤＮＡ４５４９３−１３４９）は、１９９８年４月２８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８０５が付与されている。
全長ＰＲＯ８５２ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが種々のプロテアーゼタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ８５２が新規なプロテアーゼタンパク質又はその相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ８５２アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＰＥＰＣ＿ＨＵＭＡＮ， Ｓ６６５１６， Ｓ６６５１７， ＰＥＰＥ＿ＣＨＩＣＫ， ＣＡＴＤ＿ＨＵＭＡＮ， Ｐ＿Ｒ７４２０７， ＣＡＲＰ＿ＹＥＡＳＴ， ＰＥＰ２＿ＲＡＢＩＴ， ＣＡＴＥ＿ＨＵＭＡＮ及びＲＥＮＩ＿ＭＯＵＳＥとの間の有意な相同性を明らかにした。
【０４６２】
実施例３３：ヒトＰＲＯ８５３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４３０５０と命名される。ＤＮＡ４３０５０コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ８５３の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＴＴＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＧＡＣＴＴＧＧＣＣＡＧ−３’（配列番号：２０７）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＣＧＣＣＡＧＴＧＧＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＴＧ−３’（配列番号：２０８）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４３０５０配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＴＴＴＣＴＧＡＧＣＴＣＴＧＡＧＣＣＡＣＧＧＴＴＧＧＡＣＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣ−３’（配列番号：２０９）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ８５３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２８）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ８５３の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４１９（ＤＮＡ４８２２７−１３５０）と命名される］（配列番号：２０５）及びＰＲＯ８５３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４１９（ＤＮＡ４８２２７−１３５０）の全核酸配列をＦｉｇ７４（配列番号：２０５）に示す。クローンＵＮＱ４１９（ＤＮＡ４８２２７−１３５０）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１２８−１３０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１２５９−１２６１の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ７４）。予測されるポリペプチド前駆体は３７７アミノ酸長である（Ｆｉｇ７５）。Ｆｉｇ７５に示した全長ＰＲＯ８５３タンパク質は、約４０，８４９ダルトンの見積もり分子量及び約７．９８のｐＩを有する。ＰＲＯ８５２配列のアミノ酸配列の重要な領域は、配列番号：２０６の約アミノ酸１〜約アミノ酸１６に相当するシグナルペプチド、配列番号：２０６の約アミノ酸４６〜約アミノ酸４９に相当するグリコサミノグリカン結合部位、配列番号２０６の約アミノ酸３７〜約アミノ酸４９及び約１１４〜約１２４に各々相当する２つの短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリーに典型的な配列を含む。クローンＵＮＱ４１９（ＤＮＡ４８２２７−１３５０）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８１２が付与されている。
【０４６３】
実施例３４：ヒトＰＲＯ８６０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３８１３７と命名される。ＤＮＡ３８１３７コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ８６０の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
正方向及び逆方向のプライマーを合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＡＡＧＧＧＡＣＣＴＡＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＣＣ−３’（配列番号：２１２）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＣＴＧＡＣＣＴＴＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＣＡＣＡＣ−３’（配列番号：２１３）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４０６５４配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＧＧＡＧＣＣＴＧＴＧＧＡＧＣＴＴＣＴＧＧＣＴＧＴＧＣＧＡＡＴＴＣＡＧＣＴＧＧＡＡ−３’
（配列番号：２１４）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ８５２遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肺組織（ＬＩＢ２６）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ８６０の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４２１（ＤＮＡ４１４０４−１３５２）と命名される］（配列番号：２１０）及びＰＲＯ８６０の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４２１（ＤＮＡ４１４０４−１３５２）の全核酸配列をＦｉｇ７６Ａ−Ｂ（配列番号：２１０）に示す。クローンＵＮＱ４２１（ＤＮＡ４１４０４−１３５２）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５８−６０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置３０１３−３０１５の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ７６Ａ−Ｂ）。予測されるポリペプチド前駆体は９８５アミノ酸長である（Ｆｉｇ７７）。Ｆｉｇ７７に示した全長ＰＲＯ８６０タンパク質は、約１０５，３３６ダルトンの見積もり分子量及び約６．５５のｐＩを有する。ＰＲＯ８６０のアミノ酸配列の重要な領域は、約アミノ酸４４８−４６７に相当する膜貫通ドメイン、約アミノ酸１−４４７に相当する細胞外ドメイン、幾つかのＮ−グリコシル化部位、多数のＮ−ミリストイル化部位およびホスホチロシン相互作用ドメインタンパク質に典型的な配列を含む。クローンＵＮＱ４２１（ＤＮ Ａ４１４０４−１３５２）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８４４が付与されている。
【０４６４】
実施例３５：ヒトＰＲＯ８４６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３９９４９と命名される。ＤＮＡ３９９４９コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ８４６の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
正方向及び逆方向のプライマーを合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＧＧＡＡＧ−３’（配列番号：２１７）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＴＧＴＣＴＴＣＣＣＣＴＧＣＴＴＧＧＣＴＧＴＧＧ−３’（配列番号：２１８）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３９９４９配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＧＴＧＣＡＧＧＡＡＧＧＧＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴＣＧＣＴＧＣＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＴＣ−３’（配列番号：２１９）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ８４６遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ８４６の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４２２（ＤＮＡ４４１９６−１３５３）と命名される］（配列番号：２１５）及びＰＲＯ８４６の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４２２（ＤＮＡ４４１９６−１３５３）の全核酸配列をＦｉｇ７８（配列番号：２１５）に示す。クローンＵＮＱ４２２（ＤＮＡ４４１９５−１３５３）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２５−２７に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１０２１−１０２３の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ７８）。予測されるポリペプチド前駆体は３３２アミノ酸長である（Ｆｉｇ７９）。Ｆｉｇ７９に示した全長ＰＲＯ８４６タンパク質は、約３６，１４３ダルトンの見積もり分子量及び約５．８９のｐＩを有する。ＰＲＯ８４６のアミノ酸配列の重要な領域は、Ｆｉｇ７９に示したように、シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、Ｎ−グリコシル化部位、フィブリノーゲンベータ及びガンマ鎖Ｃ末端ドメインに典型的な配列、及びＩｇ様Ｖ型ドメインに典型的な配列を含む。クローンＵＮＱ４２２（ＤＮＡ４４１９６−１３５３）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８４７が付与されている。
【０４６５】
実施例３６：ヒトＰＲＯ８６２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４７３７０と命名される。ＤＮＡ４７３７０コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ８６２の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
正方向及び逆方向のプライマーを合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＧＧＡＴＣＡＴＧＴＴＧＴＴＧＧＣＣＣＴＧＧＴＣ−３’（配列番号：２２２）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＣＡＡＧＧＣＡＧＡＣＣＣＡＧＴＣＡＧＣＣＡＧ−３’（配列番号：２２３）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４７３７０配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＴＧＣＣＴＧＣＴＡＣＣＣＴＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＣＣＡＡＧＣＴＣＴＡＣＧＧＴＣＧＴＴＧＴＧ−３’（配列番号：２２５）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ８６２遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト膵臓組織（ＬＩＢ５５）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ８６２の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４２４（ＤＮＡ５２１８７−１３５４）と命名される］（配列番号：２２０）及びＰＲＯ８６２の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４２４（ＤＮＡ５２１８７−１３５４）の全核酸配列をＦｉｇ８０（配列番号：２２０）に示す。クローンＵＮＱ４２４（ＤＮＡ５２１８７−１３５４）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４１０−４１２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置８４８−８５０の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ８０）。予測されるポリペプチド前駆体は１４６アミノ酸長である（Ｆｉｇ８１）。Ｆｉｇ８１に示した全長ＰＲＯ８６２タンパク質は、約１６，４３０ダルトンの分子量及び約５．０５のｐＩを有する。ＰＲＯ８６２のアミノ酸配列の重要な領域は、Ｆｉｇ８１に示したように、シグナルペプチド、Ｎ−ミリストイル化部位、及びアルファ−ラクトアルブミン／リソザイムＣタンパク質の領域と類似性を持つ配列を含む。クローンＵＮＱ４２４（ＤＮＡ５２１８７−１３５４）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８４５が付与されている。
【０４６６】
実施例３７：ヒトＰＲＯ８６４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４０６６６と命名される。ＤＮＡ４０６６６コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ８６４の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
正方向及び逆方向のプライマーを合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＡＡＴＴＣＣＡＣＴＧＧ−３’（配列番号：２２７）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＧＧＴＧＧＧＡＧＡＣＴＧＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＣＧＧＣＣ−３’
（配列番号：２２８）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４０６６６配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＴＧＣＴＴＣＧＴＣＡＡＧＴＧＣＣＧＧＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＣＧＴＧＧＡＧＴＴ−３’（配列番号：２２９）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ８６４遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児脳組織（ＬＩＢ１５３）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ８６４の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４２６（ＤＮＡ４８３２８−１３５５）と命名される］（配列番号：２２５）及びＰＲＯ８６４の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４２６（ＤＮＡ４８３２８−１３５５）の全核酸配列をＦｉｇ８２（配列番号：２２５）に示す。クローンＵＮＱ４２６（ＤＮＡ４８３２８−１３５５）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３７−３９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１０９０−１０９２０の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ８２）。予測されるポリペプチド前駆体は３５１アミノ酸長である（Ｆｉｇ８３）。Ｆｉｇ８３に示した全長ＰＲＯ８６４タンパク質は、約３９，０５２ダルトンの分子量及び約８．９７のｐＩを有する。ＰＲＯ８６４のアミノ酸配列の重要な領域は、Ｆｉｇ８３に示したように、シグナルペプチド、Ｎ−グリコシル化部位、Ｗｎｔファミリーシグネーチャー配列、Ｗｎｔ−１ファミリータンパク質に相同な配列領域を含む。クローンＵＮＱ４２６（ＤＮＡ４８３２８−１３５５）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８４３が付与されている。
【０４６７】
実施例３８：ヒトＰＲＯ７９２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３８１０６と命名される。ＤＮＡ３８１０６コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７９２の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＣＧＡＧＡＡＣＴＧＴＧＴＣＡＴＧＡＴＧＣＴＧＣ−３’（配列番号：２３２）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＧＧ−３’（配列番号：２３３）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３８１０６配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＡＣＣＧＴＧＴＧＡＣＡＧＣＧＡＧＡＡＧＧＡＣＧＧＣＴＧＧＡＴＣＴＧＴＧＡＧＡＡＡＡＧＧＣＡＣＡＡＣ−３’
（配列番号：２３４）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７９２遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト骨髄組織（ＬＩＢ２５５）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７９２の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４３１（ＤＮＡ５６３５２−１３５８）と命名される］（配列番号：２３０）及びＰＲＯ７９２の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４３１（ＤＮＡ５６３５２−１３５８）の全核酸配列をＦｉｇ８４（配列番号：２３０）に示す。クローンＵＮＱ４３１（ＤＮＡ５６３５２−１３５８）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６７−６９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９４６−９４８の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ８４）。予測されるポリペプチド前駆体は２９３アミノ酸長である（Ｆｉｇ８５）。Ｆｉｇ８５に示した全長ＰＲＯ７９２タンパク質は、約３２，５６２ダルトンの見積もり分子量及び約６．５３のｐＩを有する。Ｆｉｇ８５（配列番号：２３１）に示した全長ＰＲＯ７９２配列の分析は以下のものの存在を明示している：約アミノ酸３１〜約アミノ酸５４のＩＩ型膜貫通ドメイン、約アミノ酸７３〜約アミノ酸７６及び約アミノ酸１５９〜約アミノ酸１６２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、約アミノ酸１０２〜約アミノ酸１２３のロイシンジッパーアミノ酸配列パターン、約アミノ酸１８〜約アミノ酸２３、約アミノ酸１３３〜約アミノ酸１３８及び約アミノ酸２４２〜約アミノ酸２４７のＮ−ミリストル化部位、及び約アミノ酸２６４〜約アミノ酸２８７のＣ型レクチンドメインシグネーチャーブロック。クローンＵＮＱ４３１（ＤＮＡ５６３５２−１３５８）は、１９９８年５月６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８４６が付与されている。
全長ＰＲＯ７９２ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがＣＤ２３タンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ７９２が新規なＣＤ２３相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ７９２アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、Ｓ３４１９８， Ａ０７１００＿１， Ａ０５３０３＿１， Ｐ＿Ｒ４１６８９， Ｐ＿Ｐ８２８３９， Ａ１０８７１＿１， Ｐ＿Ｒ１２７９６， Ｐ＿Ｒ４７１９９， Ａ４６２７４及びＰ＿Ｒ３２１８８との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４６８】
実施例３９：ヒトＰＲＯ８６６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４４７０８と命名される。ＤＮＡ４４７０８コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ８６６の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＣＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＧＧＧＧＡＡＧＡＧＧＧ−３’（配列番号：２３７）
正方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＣＡＧＧＡＣＴＣＧＣＴＡＣＧＴＣＣＧ−３’（配列番号：２３８）
正方向ＰＣＲプライマー３　５’−ＣＡＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣ−３’
（配列番号：２３９）
逆方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＧＣＡＧＴＴＡＴＣＡＧＧＧＡＣＧＣＡＣＴＣＡＧＣＣ−３’
（配列番号：２４０）
逆方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＣＣＡＧＣＧＡＧＡＧＧＣＡＧＡＴＡＧ−３’（配列番号：２４１）
逆方向ＰＣＲプライマー３　５’−ＣＧＧＴＣＡＣＣＧＴＧＴＣＣＴＧＣＧＧＧＡＴＧ−３’（配列番号：２４２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４４７０８配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＡＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＡＣＧＴＣＣＴＡＴＣＴＧＣＣＴＣＴＣ−３’（配列番号：２４３）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ８６６遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２８）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ８６６の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４３５（ＤＮＡ５３９７１−１３５９）と命名される］（配列番号：２３５）及びＰＲＯ８６６の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４３５（ＤＮＡ５３９７１−１３５９）の全核酸配列をＦｉｇ８６（配列番号：２３５）に示す。クローンＵＮＱ４３５（ＤＮＡ５３９７１−１３５９）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２７５−２７７に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１２６８−１２７０の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ８６）。予測されるポリペプチド前駆体は３３１アミノ酸長である（Ｆｉｇ８７）。Ｆｉｇ８７に示した全長ＰＲＯ８６６タンパク質は、約３５，８４４ダルトンの見積もり分子量及び約５．４５のｐＩを有する。Ｆｉｇ８７（配列番号：２３６）に示した全長ＰＲＯ８６６配列の分析は、以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸２６のシグナルペプチド。クローンＵＮＱ４３５（ＤＮＡ５３９７１−１３５９）は、１９９８年４月７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７５０が付与されている。
全長ＰＲＯ８６６ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがミンジン（ｍｉｎｄｉｎ）／スポンジン（ｓｐｏｎｄｉｎ）ファミリーと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ８６６が新規なミンジン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ８６６アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＡＢ００６０８５＿１， ＡＢ００６０８４＿１， ＡＢ００６０８６＿１， ＡＦ０１２６７＿１， ＣＷＵ４２２１３＿１， ＡＣ００４１６０＿１， ＣＰＭＩＣＲＰ＿１， Ｓ４９１０８， Ａ４８５６９及びＩ４６６８７との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４６９】
実施例４０：ヒトＰＲＯ８７１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４０３２４と命名される。ＤＮＡ４０３２４コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ８７１の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＴＧＣＧＧＡＧＡＴＣＣＴＡＣＴＧＧＣＡＣＡＧＧＧ−３’
（配列番号：２４６）
正方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＣＧＡＧＴＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＡＴＧ−３’（配列番号：２４７）
正方向ＰＣＲプライマー３　５’−ＣＡＧＡＴＧＧＴＧＣＴＧＴＴＧＣＣＧ−３’（配列番号：２４８）
逆方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＣＡＡＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＡＡＣＴＧＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＣ−３’
（配列番号：２４９）
逆方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＣＡＡＧＧＧＴＣＴＧ−３’
（配列番号：２５０）
逆方向ＰＣＲプライマー３　５’−ＣＣＴＣＴＣＣＧＡＴＴＡＡＡＡＣＧＣ−３’（配列番号：２５１）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４０３２４配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＡＧＡＧＧＡＣＴＧＧＴＴＧＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＴＧＣＴＧＧＴＴＣＴＣＡＴＧＡＴＡＡＴＧＧ−３’（配列番号：２５２）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ８７１遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ８７１の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４３８（ＤＮＡ５０９１９−１３６１）と命名される］（配列番号：２４４）及びＰＲＯ８７１の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４３８（ＤＮＡ５０９１９−１３６１）の全核酸配列をＦｉｇ８８（配列番号：２４４）に示す。クローンＵＮＱ４３８（ＤＮＡ５０９１９−１３６１）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１９１−１９３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１６０７−１６０９の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ８８）。予測されるポリペプチド前駆体は４７２アミノ酸長である（Ｆｉｇ８９）。Ｆｉｇ８９に示した全長ＰＲＯ８７１タンパク質は、約５３，８４７ダルトンの見積もり分子量及び約５．７５のｐＩを有する。Ｆｉｇ８９（配列番号：２４５）に示した全長ＰＲＯ８７１配列の分析は、以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸２１のシグナルペプチド、約アミノ酸１０９〜約アミノ酸１１２及び約アミノ酸２０１〜約アミノ酸２０４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、約アミノ酸４９〜約アミノ酸６６のサイクロフィリン型ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼシグネーチャー配列、及び、約アミノ酸９６〜約アミノ酸１４０、約アミノ酸４９〜約アミノ酸８９及び約アミノ酸２２〜約アミノ酸５１のサイクロフィリン型ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼに相同な領域。クローンＵＮＱ４３８（ＤＮＡ５０９１９−１３６１）は、１９９８年５月６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８４８が付与されている。
全長ＰＲＯ８７１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがタンパク質のサイクロフィリンファミリーと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ８７１が新規なサイクロフィリンタンパク質ファミリーメンバーとなりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ８７１アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＳＰＢＣ１６Ｈ５＿５， Ｓ６４７０５， ＹＡＬ５＿ＳＣＨＰＯ， ＣＹＰ４ ＣＡＥＥＬ， ＣＥＬＣ３４Ｄ４＿７， ＣＹＰＡ＿ＣＡＥＥＬ， ＨＵＭＯＲＦ００６＿１， ＣＹＰＩ＿ＭＹＣＴＵ， ＡＦ０４３６４２＿１及びＨＳＳＲＣＹＰ＿１との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４７０】
実施例４１：ヒトＰＲＯ８７３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３９６２１と命名される。ＤＮＡ３９６２１コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ８７３の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＧＧＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＧＧ−３’（配列番号：２５５）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＡＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＡＧＡＴＧＣＣ−３’（配列番号：２５６）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３９６２１配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＡＡＣＧＧＴＡＣＡＡＧＴＧＧＣＴＧＣＧＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＧＡＣＴＧＴＣＴＧＴＡＣＣＴＧ−３’（配列番号：２５７）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ８７３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肝臓組織（ＬＩＢ２２９）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ８７３の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４４０（ＤＮＡ４４１７９−１３６２）と命名される］（配列番号：２５３）及びＰＲＯ８７３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４４０（ＤＮＡ４４１７９−１３６２）の全核酸配列をＦｉｇ９０（配列番号：２５３）に示す。クローンＵＮＱ４４０（ＤＮＡ４４１７９−１３６２）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１３９−１４１に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１７７４−１７７６の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ９０）。予測されるポリペプチド前駆体は５４５アミノ酸長である（Ｆｉｇ９１）。Ｆｉｇ９１に示した全長ＰＲＯ８７３タンパク質は、約５８，９３４ダルトンの見積もり分子量及び約９．４５のｐＩを有する。Ｆｉｇ９１（配列番号：２５４）に示した全長ＰＲＯ８７３配列の分析は、以下の特徴の存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸２９のシグナルペプチド；約アミノ酸３１２〜約アミノ酸３２７のカルボキシルエステラーゼＢ型セリン活性部位；約アミノ酸２１８〜約アミノ酸２２８のカルボキシエステラーゼＢ型シグネーチャー２モチーフ；及び各々約アミノ酸３１８〜約アミノ酸３２１、約アミノ酸３８０〜約アミノ酸３８３及び約アミノ酸４６５〜約アミノ酸４６８の３つのＮ−グリコシル化部位。クローンＵＮＱ４４０（ＤＮＡ４４１７９−１３６２）は、１９９８年５月６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８５１が付与されている。
全長ＰＲＯ８７３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがタンパク質のヒト肝臓カルボキシルエステラーゼと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ８７３が新規なカルボキシルエステラーゼとなりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ８７３アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列：ＥＳ１０＿ＲＡＴ， ＧＥＮ１２４０５， ＡＢ１０６３３＿１， ＥＳＴ４＿ＲＡＴ， Ａ４８８０９， ＳＡＳＢ＿ＡＮＡＰＬ， ＲＮＵ４１６６２＿１， ＲＮＵ２２９５２＿１， ＢＡＬ＿ＲＡＴ， ＧＥＮ１３５２２との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４７１】
実施例４２：ヒトＰＲＯ９４０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４７４４２と命名される。ＤＮＡ４７４４２コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ９４０の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＡＡＡＧＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＧＴＣＴＧＴＧ−３’（配列番号：２６０）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＴＣＴＧＧＡＧＣＣＣＡＧＡＧＧＧＴＧＣＴＧＡＧ−３’（配列番号：２６２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４７４４２配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＧＡＧＣＴＧＣＣＡＣＣＣＡＴＴＣＡＡＡＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＡＧＧＡＧＡＧＴＴＣＡＣＣＴＧ−３’（配列番号：２６３）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ９４０遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肝臓組織（ＬＩＢ２２９）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ９４０の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４７７（ＤＮＡ５４００２−１３６７）と命名される］（配列番号：２５８）及びＰＲＯ９４０の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４７７（ＤＮＡ５４００２−１３６７）の全核酸配列をＦｉｇ９２（配列番号：２５８）に示す。クローンＵＮＱ４７７（ＤＮＡ５４００２−１３６７）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４６−４８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１６７８−１６８０の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ９２）。予測されるポリペプチド前駆体は５４４アミノ酸長である（Ｆｉｇ９３）。Ｆｉｇ９３に示した全長ＰＲＯ９４０タンパク質は、約６０，２６８ダルトンの見積もり分子量及び約９．５３のｐＩを有する。Ｆｉｇ９３（配列番号：２５９）に示した全長ＰＲＯ９４０配列の分析は、以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸１５のシグナルペプチド、約アミノ酸１００〜約アミノ酸１０３、約アミノ酸２９７〜約アミノ酸３００及び約アミノ酸３０６〜約アミノ酸３０９のＮ−グリコシル化部位、及び約アミノ酸３６５〜約アミノ酸３７１の免疫グロブリン及び主要組織適合性複合体シグネーチャー配列ブロック。クローンＵＮＱ４７７（ＤＮＡ５４００２−１３６７）は、１９９８年４月７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７５４が付与されている。
全長ＰＲＯ９４０ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがＣＤ３３及びＯＢ結合タンパク質−２と有意な配列類似性を有することを示唆している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ９４０アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＣＤ３３＿ＨＵＭＡＮ， ＨＳＵ７１３８２＿１， ＨＳＵ７１３８３＿１， Ｄ８６３５９＿１， ＰＧＢＭ＿ＨＵＭＡＮ， ＭＡＧＳ＿ＭＯＵＳＥ， Ｄ８６９８３＿１， Ｃ２２Ｂ＿ＨＵＭＡＮ， Ｐ＿Ｗ０１００２及びＨＶＵ２４１１６＿１との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４７２】
実施例４３：ヒトＰＲＯ９４１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３５９４１と命名される。ジェネンテクが独自に開発したＥＳＴ配列を構築に使用し、それはここにＤＮＡ６４１５（Ｆｉｇ９６；配列番号：２６５）と命名する。ＤＮＡ３５９４１コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ９４１の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＴＴＧＡＣＴＧＴＣＴＣＴＧＡＡＴＣＴＧＣＡＣＣＣ−３’（配列番号：２６６）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＡＧＴＧＧＴＧＧＡＡＧＣＣＴＣＣＡＧＴＧＴＧＧ−３’（配列番号：２６７）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３５９４１配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＣＡＣＴＡＣＧＧＴＡＴＴＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＴＧＧＴＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧＣ−３’
（配列番号：２６８）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ９４１遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ９４１の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４７８（ＤＮＡ５３９０６−１３６８）と命名される］（配列番号：２６３）及びＰＲＯ９４１の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４７８（ＤＮＡ５３９０６−１３６８）の全核酸配列をＦｉｇ９４（配列番号：２６３）に示す。クローンＵＮＱ４７８（ＤＮＡ５３９０６−１３６８）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３７−３９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２３５３−２３５５の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ９４）。予測されるポリペプチド前駆体は７７２アミノ酸長である（Ｆｉｇ９５）。Ｆｉｇ９５に示した全長ＰＲＯ９４１タンパク質は、約８７，００２ダルトンの見積もり分子量及び約４．６４のｐＩを有する。Ｆｉｇ９５（配列番号：２６４）に示した全長ＰＲＯ９４１配列の分析は、以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸２１のシグナルペプチド、約アミノ酸５７〜約アミノ酸６０、約アミノ酸７４〜約アミノ酸７７、約アミノ酸４１９〜約アミノ酸４２２、約アミノ酸４３７〜約アミノ酸４４０、約アミノ酸５０８〜約アミノ酸５１１、約アミノ酸５１５〜約アミノ酸５１８、約アミノ酸５１６〜約アミノ酸５１９及び約アミノ酸５３４〜約アミノ酸５３７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、約アミノ酸１３６〜約アミノ酸１４６及び約アミノ酸２４４〜約アミノ酸２５４のカドヘリン細胞外繰り返しドメインシグネーチャー配列。クローンＵＮＱ４７８（ＤＮＡ５３９０６−１３６８）は、１９９８年４月７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７４７が付与されている。
全長ＰＲＯ９４１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがカドヘリンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ９４１が新規なカドヘリンタンパク質ファミリーメンバーとなりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ９４１アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、Ｉ５０１８０， ＣＡＤＡ＿ＣＨＩＣＫ， Ｉ５０１７８， ＧＥＮ１２７８２， ＣＡＤＣ＿ＨＵＭＡＮ， Ｐ＿Ｗ２５６３７， Ａ３８９９２，　　 Ｐ Ｒ４９７３１， Ｄ３８９９２及びＧ０２６７８との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４７３】
実施例４４：ヒトＰＲＯ９４４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４７３７４と命名される。ジェネンテクが独自に開発した種々のＥＳＴ配列を構築に使用し、それはＦｉｇ９９−１０７に示した。ＤＮＡ４７３７４コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ９４４の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＧＡＧＣＧＡＧＴＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＧＣ−３’（配列番号：２８０）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＴＧＴＣＡＣＡＣＧＴＡＧＴＣＴＴＴＣＣＣＧＣＴＧＧ−３’
（配列番号：２８１）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４７３７４配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＴＣＧＣＣＴＴＣＣＴＧＧＧＡＴＧＧＡＴＣＧ−３’（配列番号：２８２）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ９４４遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ９４４の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４８１（ＤＮＡ５２１８５−１３７０）と命名される］（配列番号：２６９）及びＰＲＯ９４４の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４８１（ＤＮＡ５２１８５−１３７０）の全核酸配列をＦｉｇ９７（配列番号：２６９）に示す。クローンＵＮＱ４８１（ＤＮＡ５２１８５−１３７０）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２１９−２２１に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置８５２−８５４の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ９７）。予測されるポリペプチド前駆体は２１１アミノ酸長である（Ｆｉｇ９８）。Ｆｉｇ９８に示した全長ＰＲＯ９４４タンパク質は、約２２，７４４ダルトンの見積もり分子量及び約８．５１のｐＩを有する。Ｆｉｇ９８（配列番号：２７０）に示した全長ＰＲＯ９４４配列の分析は以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸２１のシグナルペプチド、約アミノ酸８２〜約アミノ酸１０２、約アミノ酸１１８〜約アミノ酸１４２及び約アミノ酸１６１〜約アミノ酸１８７の膜貫通ドメイン、約アミノ酸７２〜約アミノ酸７５のＮ−グリコシル化部位、約アミノ酸７０〜約アミノ酸１１１のタンパク質のＰＭＰ−２２／ＥＭＰ／ＭＰ２０ファミリーに相同性を持つ配列ブロック、及び約アミノ酸１１９〜約アミノ酸１３３のＡＢＣ−２型膜貫通系複合膜タンパク質。クローンＵＮＱ４８１（ＤＮＡ５２１８ ５−１３７０）は、１９９８年５月１４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８６１が付与されている。
全長ＰＲＯ９４４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがＣＰＥ−Ｒタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ９４４が新規なＣＰＥ−Ｒ相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ９４４アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＡＢ０００７１３＿１， ＡＢ０００ ７１４＿１， ＡＦ０３５８１４＿１， ＡＦ０００９５９＿１， ＨＳＵ８９９１６＿１， ＥＭＰ２＿ＨＵＭＡＮ， ＪＣ５７３２， ＣＥＬＦ５３Ｂ３＿６， ＰＭ２２＿ＭＯＵＳＥ及びＣＧＵ４９７９７＿１との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４７４】
実施例４５：ヒトＰＲＯ９８３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４７４７３と命名される。ジェネンテクが独自に開発した種々のＥＳＴ配列を構築に使用し、それらのＥＳＴ配列はＦｉｇ１１０−１１６に示した。ＤＮＡ４７４７３コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ９８３の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＣＡＣＣＡＣＣＧＴＡＧＧＴＡＣＴＴＧＴＧＴＧＡＧＧＣ−３’
（配列番号：２９２）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＡＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＣＡＡＧＡＧＣＣＧＧＧ−３’（配列番号：２９３）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４７４７３配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＡＧＣＧＧＡＡＴＣＡＴＣＧＡＴＧＣＡＧＧＧＧＣＣＴＣＡＡＴＴＡＡＴＧＴＡＴＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＡＣ−３’
（配列番号：２９４）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ９８３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト骨髄（ＬＩＢ２５６）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ９８３の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４８４（ＤＮＡ５３９７７−１３７１）と命名される］（配列番号：２８３）及びＰＲＯ９８３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４８４（ＤＮＡ５３９７７−１３７１）の全核酸配列をＦｉｇ１０８（配列番号：２８３）に示す。クローンＵＮＱ４８４（ＤＮＡ５３９７７−１３７１）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２３４−２３６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９６３−９６５の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１０８）。予測されるポリペプチド前駆体は２４３アミノ酸長である（Ｆｉｇ１０９）。Ｆｉｇ１０９に示した全長ＰＲＯ９８３タンパク質は、約２７，２２８ダルトンの見積もり分子量及び約７．４３のｐＩを有する。Ｆｉｇ１０９（配列番号：２８４）に示した全長ＰＲＯ９８３配列の分析は以下の特徴の存在を明示している：約アミノ酸２２４〜約アミノ酸２３９の推定膜貫通ドメイン、約アミノ酸６８〜約アミノ酸７１の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、約アミノ酸５９〜約アミノ酸６４、約アミノ酸６４〜約アミノ酸６９及び約アミノ酸２３５〜約アミノ酸２４０の３つの潜在的Ｎ−ミリストイル化部位。クローンＵＮＱ４８４（ＤＮＡ５３９７７−１３７１）は、１９９８年５月１４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８６２が付与されている。
全長ＰＲＯ９８３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが小胞関連タンパク質、ＶＡＰ−３３と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ９８３が新規な小胞関連膜タンパク質となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ９８３アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＶＰ３３＿ＡＰＬＣＡ， ＣＥＬＦ３３Ｄ１１＿１２， ＣＥＬＦ４２Ｇ２＿２， Ｓ５０６２３， ＹＤＦＣ＿ＳＣＨＰＯ， ＣＥＬＦ５４Ｈ５＿２， ＣＥＬＺＣ１９６＿８， ＣＥＦ５７Ａ１０＿３， ＭＳＰ３＿ＧＬＯＲＯ， ＣＥＣ１５Ｈ１１＿１との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４７５】
実施例４６：ヒトＰＲＯ１０５７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４９８０８と命名される。ＤＮＡ４９８０８コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１０５７の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＣＧＡＡＧＧＧ−３’（配列番号：２９７）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＡＴＣＧＴＴＣＣＣＧＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＧＧＣ−３’（配列番号：２９８）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４９８０８配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＡＡＧＧＧＡＧＧＣＣＴＴＣＣＴＴＴＣＡＧＴＧＧＡＣＣＣＧＧＧＴＣＡＡＧＡＡＴＡＣＣＣＡＣ−３’（配列番号：２９９）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１０５７遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１０５７の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ５２２（ＤＮＡ５７２５３−１３８２）と命名される］（配列番号：２９５）及びＰＲＯ１０５７の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ５２２（ＤＮＡ５７２５３−１３８２）の全核酸配列をＦｉｇ１１７（配列番号：２９５）に示す。クローンＵＮＱ５２２（ＤＮＡ５７２５３−１３８２）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２７５−２７７に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１５１４−１５１６の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１１７）。予測されるポリペプチド前駆体は４１３アミノ酸長である（Ｆｉｇ１１８）。Ｆｉｇ１１８に示した全長ＰＲＯ１０５７タンパク質は、約４７，０７０ダルトンの見積もり分子量及び約９．９２のｐＩを有する。Ｆｉｇ１１８（配列番号：２９６）に示した全長ＰＲＯ１０５７配列の分析は以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸１６のシグナルペプチド、約アミノ酸９０〜約アミノ酸９３、約アミノ酸１１０〜約アミノ酸１１３及び約アミノ酸１９３〜約アミノ酸１９６の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、約アミノ酸２３６〜約アミノ酸２３９のグリコサミノグリカン結合部位、及び約アミノ酸１６５〜約アミノ酸１７０のセリンプロテアーゼヒスチジン含有活性部位。クローンＵＮＱ５２２（ＤＮＡ５７２５３−１３８２）は、１９９８年５月１４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８６７が付与されている。
全長ＰＲＯ１０５７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが種々のプロテアーゼタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ１０５７が新規なプロテアーゼとなりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ１０５７アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＴＲＹＥ＿ＤＲＯＥＲ， Ｐ＿Ｒ１４１５９， Ａ６９６６０， ＥＢＮ１＿ＥＢＶ， Ｓ６５４９４， ＧＥＮ１２６８８， Ａ５１０８４＿１， Ｐ＿Ｒ９９５７１， Ａ５７５１４及びＡＦ００３２００＿１との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４７６】
実施例４７：ヒトＰＲＯ１０７１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ５３０３５と命名される。ＤＮＡ５３０３５コンセンサス配列に基づいて、コンセンサス配列が、概観したところ全長タンパク質をコードすることがわかったクローンであるＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２８７２５６９と有意な配列同一性を有していることが同定された。そのようにして、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２８７２５６９を購入し、その挿入物を得て配列決定し、正しい配列を確認した。この配列を、ここにＵＮＱ５２８又はＤＮＡ５８８４７−１３８３と命名する。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１０７１の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ５２８（ＤＮＡ５８８４７−１３８３）と命名される］（配列番号：３００）及びＰＲＯ１０７１の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ５２８（ＤＮＡ５８８４７−１３８３）の全核酸配列をＦｉｇ１１９（配列番号：３００）に示す。クローンＵＮＱ５２８（ＤＮＡ５８８４７−１３８３）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１３３−１３５に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１７０８−１７１０の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１１９）。予測されるポリペプチド前駆体は５２５アミノ酸長である（Ｆｉｇ１２０）。Ｆｉｇ１２０に示した全長ＰＲＯ１０７１タンパク質は、約５８，４１６ダルトンの見積もり分子量及び約６．６２のｐＩを有する。Ｆｉｇ１２０（配列番号：３０１）に示した全長ＰＲＯ１０７１配列の分析は以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸２５のシグナルペプチド、約アミノ酸２５１〜約アミノ酸２５４の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、約アミノ酸３８５〜約アミノ酸３９９のトロンボスポンジン−１相同ブロック、約アミノ酸３８５〜約アミノ酸３９９、約アミノ酸４４５〜約アミノ酸４５９及び約アミノ酸４２〜約アミノ酸５６のウィリブランズ（Ｗｉｌｌｉｂｒａｎｄｓ）因子Ｃ型相同ブロック。クローンＵＮＱ５２８（ＤＮＡ５８８４７−１３８３）は、１９９８年５月２０日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８７９が付与されている。
全長ＰＲＯ１０７１７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが種々のトロンボスポンジンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ１０７１が新規なトロンボスポンジン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ１０７１アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＡＢ００２３６４＿１， Ｄ６７０７６＿１， ＢＴＰＣＩＮＰＧＮ＿１， ＣＥＴ１３Ｈ１０＿１， ＣＥＦ２５Ｈ８＿５， ＣＥＦ５３Ｂ６＿２， ＣＥＣ２６Ｃ６＿６， ＨＳＳＥＭＧ＿１， ＣＥＴ２１Ｂ６＿４及びＢＴＹ０８５６１＿１との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４７７】
実施例４８：ヒトＰＲＯ１０７２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ５３１２５と命名される。ＤＮＡ５３１２５コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１０７２の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＡＧＧＡＡＡＴＧＣＴＣＣＡＧＧＡＡＧＡＧＣＣ−３’（配列番号：３０５）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＣＣＣＡＴＧＡＣＡＣＣＡＡＡＴＴＧＡＡＧＡＧＴＧＧ−３’
（配列番号：３０６）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ５３１２５配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＡＡＣＧＣＡＧＧＧＡＴＣＴＴＣＣＡＧＴＧＣＣＣＴＴＡＣＡＴＧＡＡＧＡＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＧ−３’（配列番号：３０７）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１０７２遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肺組織（ＬＩＢ２６）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１０７２の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ５２９（ＤＮＡ５８７４７−１３８４）と命名される］（配列番号：３０２）及びＰＲＯ１０７２の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ５２９（ＤＮＡ５８７４７−１３８４）の全核酸配列をＦｉｇ１２１（配列番号：３０２）に示す。クローンＵＮＱ５２９（ＤＮＡ５８７４７−１３８４）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６５−６７に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１０７３−１０７５の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１２１）。予測されるポリペプチド前駆体は３３６アミノ酸長である（Ｆｉｇ１２２）。Ｆｉｇ１２２に示した全長ＰＲＯ１０７２タンパク質は、約３６，８６５ダルトンの見積もり分子量及び約９．１５のｐＩを有する。Ｆｉｇ１２２（配列番号：３０３）に示した全長ＰＲＯ１０７２配列の分析は以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸２１のシグナルペプチド、約アミノ酸１３４〜約アミノ酸１４４、約アミノ酸４４〜約アミノ酸５６及び約アミノ酸２３９〜約アミノ酸２４８の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼタンパク質相同ブロック、及び約アミノ酸２１２〜約アミノ酸２１５及び約アミノ酸２３９〜約アミノ酸２４２の潜在的Ｎ−グリコシル化部位。クローンＵＮＱ５２９（ＤＮＡ５８７４７−１３８４）は、１９９８年５月１４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８６８が付与されている。
全長ＰＲＯ１０７２ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがタンパク質のレダクターゼファミリーと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ１０７２が新規なレダクターゼとなりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ１０７２アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、Ｐ＿Ｗ０３１９８， Ｐ＿Ｗ１５７５９， Ｐ＿Ｒ６０８００， ＭＴＶ０３７＿３， ＣＥＣ１５Ｈ１１＿６， ＡＴＡＣ００２３４３１４， ＭＴＶ０２２＿１３， ＳＣＵ４３７０４＿１， ＯＸＩＲ＿ＳＴＲＡＴ及びＣＥＬＣ０１Ｇ８＿３との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４７８】
実施例４９：ヒトＰＲＯ１０７５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３４３６３と命名される。ＤＮＡ３４３６３配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１０７５の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＧＡＧＡＧＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＡＡＧＴＴＧ−３’（配列番号：３１２）
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＴＣＡＧＣＧＡＴＣＡＧＴＧＡＡＡＧＣ−３’　 （配列番号：３１３）
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＡＧＡＡＴＧＡＡＧＴＡＧＣＴＣＧＧＣ−３’　（配列番号：３１４）
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＧＡＣＴＣＡＡＡＡＴＧＣＡＴＴＧＴＣ−３’　（配列番号：３１５）
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＡＴＴＴＧＧＣＡＧＧＡＡＴＴＧＴＣＣ−３’　 （配列番号：３１６）
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＧＴＧＣＴＡＴＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧ−３’　　（配列番号：３１７）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＴＧＴＡＴＣＴＣＴＧＧＧＣＴＡＴＧＴＣＡＧＡＧ−３’ （配列番号：３１８）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＴＡＣＡＴＡＴＡＡＴＧＧＣＡＣＡＴＧＴＣＡＧＣＣ−３’（配列番号：３１９）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３４３６３配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＣＣＴＴＡＣＣＣＧＡＣＣＴＣＡＧＡＴＧＣＴＣＣＣＴＴＣＴＧＣＴＣＣＴＧ−３’（配列番号：３２０）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１０７５遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト皮膚腫瘍組織（ＬＩＢ３２４）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１０７５の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ５３２（ＤＮＡ５７６８９−１３８５）と命名される］（配列番号：３０８）及びＰＲＯ１０７５の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ５３２（ＤＮＡ５７６８９−１３８５）の全核酸配列をＦｉｇ１２４（配列番号：３０８）に示す。クローンＵＮＱ５３２（ＤＮＡ５７６８９−１３８５）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１３７−１３９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１３５５−１３５７の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１２４）。予測されるポリペプチド前駆体は４０６アミノ酸長である（Ｆｉｇ１２５）。Ｆｉｇ１２５に示した全長ＰＲＯ１０７５タンパク質は、約４６，９２７ダルトンの見積もり分子量及び約５．２１のｐＩを有する。Ｆｉｇ１２５（配列番号：３０９）に示した全長ＰＲＯ１０７５配列の分析は以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸２９のシグナルペプチド、約アミノ酸４０３〜約アミノ酸４０６の小胞標的化配列、約アミノ酸２０３〜約アミノ酸２１１のチロシンキナーゼリン酸化部位、及び約アミノ酸５０〜約アミノ酸６６のタンパク質のチオレドキシンファミリーに相同性を持つ配列ブロック。クローンＵＮＱ５３２（ＤＮＡ５７６８９−１３８５）は、１９９８年５月１４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８６９が付与されている。
全長ＰＲＯ１０７５ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ１０７５が新規なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとなりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ１０７５アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＣＥＬＣ３０Ｈ７＿２， ＣＥＬＣ０６Ａ６＿３， ＣＥＬＦ４２Ｇ８＿３， Ｓ５７９４２， ＥＲ７２＿ＣＡＥＥＬ， ＣＥＬＣ０７Ａ１２＿３， ＣＥＨ０６Ｏ０１＿４及びＰ＿Ｒ５１６９６との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４７９】
実施例５０：ヒトＰＲＯ１８１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたｃＤＮＡ配列が、ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントにより、コルニコン（ｃｏｒｎｉｃｈｏｎ）タンパク質をコードする核酸配列に対して配列相同性を有していることが見出された。このｃＤＮＡ配列を、ここにＤＮＡ１３２４２（Ｆｉｇ１３０；配列番号：３２３）と命名する。相同性に基づいて、ＤＮＡ１３２４２分子の配列からオリゴヌクレオチドプローブを調製し、実施例２のパラグラフ１に記載したように調製したヒト胎盤ライブラリ（ＬＩＢ８９）のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１））、ｃＤＮＡサイズ切断は２８００ｂｐ未満であった。
用いたオリゴヌクレオチドプローブは次のものを含む：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＴＧＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＴＴＡＣＡ−３’（配列番号：３２６）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧ−３’（配列番号：３２７）
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＡＴＡＴＴＣＴＡＧＣＡＴＡＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＧＡＡＧＧＡＴＧＧＴＧＣＡＡＡＴＴＡＧＣＴ−３’（配列番号：３２８）
全長クローンを同定し、それは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１４−１６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置４４６−４４８に見られる停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１２８；配列番号：３２１）。予測されるポリペプチド前駆体は１４４アミノ酸長であり、約１６，６９９ダルトンの計算上の分子量及び約５．６の見積もられたｐＩを有する。Ｆｉｇ１２９（配列番号：３２２）に示した全長ＰＲＯ１８１配列の分析は、以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸２０のシグナルペプチド、約アミノ酸１１〜約アミノ酸３１の推定ＩＩ型膜貫通ドメイン、及び約アミノ酸５７〜約アミノ酸７７及び約アミノ酸１２３〜約アミノ酸１４３の他の膜貫通ドメイン。クローンＵＮＱ１５５（ＤＮＡ２３３３０−１３９ ０）は、１９９８年４月１４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７７５が付与されている。
全長ＰＲＯ１８１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがコルニコンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ１８１が新規なコルニコン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ１８１アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＡＦ０２２８１１＿１， ＣＥＴ０９ Ｅ８＿３， Ｓ６４０５８， ＹＧＦ４＿ＴＥＡＳＴ， ＹＢ６０＿ＹＥＡＳＴ， ＥＢＵ８９４５５＿１， ＳＩＵ３６３８３及びＰＨ１３７１との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４８０】
実施例５１：ヒトＰＲＯ１９５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいてｃＤＮＡ配列を単離し、ここでＤＮＡ１３１９９（Ｆｉｇ１３４；配列番号：３３２）と命名した。ＤＮＡ１３１９９配列は、次いで、公的ＥＳＴデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）を含む種々の発現されたタグ配列（ＥＳＴ）データベースと比較し、存在する相同性を同定した。相同性検索は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ及びＧｉｓｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６））を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、ＢＬＡＳＴスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ； ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．　ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）でクラスター形成してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ２２７７８と命名する。
ＤＮＡ２２７７８配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを生成させ、上記実施例２のパラグラフ１に記載したように調製したヒト胎盤ライブラリ（ＬＩＢ８９）のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１））、ｃＤＮＡサイズ切断は２８００ｂｐ未満であった。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡＣＡＧ−３’（配列番号：３３３）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＧＡＴＴＣＴＧＧＣＡＡＣＣＡＡＧＡＴＧＧＣ−３’（配列番号：３３４）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ２２７７８配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＡＴＧＧＣＣＴＴＧＧＣＣＧＧＡＧＧＴＴＣＧＧＧＧＡＣＣＧＣＴＴＣＧＧＣＴＧＡＡＧ−３’（配列番号：３３５）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１９５遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置７０−７２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１０３９−１０４１の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１３２；配列番号：３３０）。予測されるポリペプチド前駆体は３２３アミノ酸長であり、約３６，２２３の計算された分子量及び約５．０６の見積もられたｐＩを有する。Ｆｉｇ１３２（配列番号：３３０）に示した全長ＰＲＯ１９５の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸３１のシグナルペプチド、約アミノ酸２４１〜約アミノ酸２６０の膜貫通ドメイン、及び約アミノ酸９０〜約アミノ酸９３の潜在的Ｎ−グリコシル化部位。クローンＵＮＱ１６９（ＤＮＡ２６８４７−１３９５）は１９９８年４月１４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７７２が付与されている。
全長ＰＲＯ１９５ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが任意の公知のタンパク質と有意な配列類似性を持たないことを示唆している。しかしながら、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析はＰＲＯ１９５アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、Ｐ＿Ｐ９１３８０， ＡＦ０３５１１８＿１， ＨＵＭＴＲＯＰＣＳ＿１， ＮＯＵＤ＿ＳＡＬＴＹ及びＥ７０００２との間に或る程度の相同性があることを明らかにした。
【０４８１】
実施例５２：ヒトＰＲＯ８６５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたｃＤＮＡ配列を、ここにＤＮＡ３７６４２（Ｆｉｇ１３７；配列番号：３３８）と命名する。ＤＮＡ３７６４２配列は、次いで、公的データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）及び独自に開発したデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ＜ＳＵＰ＞ＴＭ＜／ＳＵＰ＞、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を含む種々の発現されたタグ配列（ＥＳＴ）データベースと比較し、それらの間に存在する相同性を同定した。相同性検索は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ及びＧｉｓｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６））を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、ＢＬＡＳＴスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ；　ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）でクラスター形成してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ４８６１５と命名する。
ＤＮＡ４８６１５コンセンサス配列に基づいてプローブを生成させ、上記実施例２のパラグラフ１に記載したように調製したヒト腎臓ライブラリ（ＬＩＢ２２７）をスクリーニングするのに使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１）参照）、ｃＤＮＡサイズ切断は２８００ｂｐ未満であった。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＡＡＧＣＴＧＣＣＧＧＡＧＣＴＧＣＡＡＴＧ−３’ （配列番号：３３９）
正方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＴＴＧＣＴＴＣＴＴＡＡＴＣＣＴＧＡＧＣＧＣ−３’（配列番号：３４０）
正方向ＰＣＲプライマー３　５’−ＡＡＡＧＧＡＧＧＡＣＴＴＴＣＧＡＣＴＧＣ−３’ （配列番号：３４１）
逆方向ＰＣＲプライマー１　５’−ＡＧＡＧＡＴＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＧ−３’
（配列番号：３４２）
逆方向ＰＣＲプライマー２　５’−ＴＧＴＣＣＡＧＡＡＡＣＡＧＧＣＡＣＡＴＡＴＣＡＧＣ−３’
（配列番号：３４３）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４８６１５配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＡＧＡＣＡＧＣＧＧＣＡＣＡＧＡＧＧＴＧＣＴＴＣＴＧＣＣＡＧＧＴＴＡＧＴＧＧＴＴＡＣＴＴＧＧＡＴＧＡＴ−３’（配列番号：３４４）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ８６５遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１７３−１７５に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１５７７−１５７９の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１３５；配列番号：３３６）。予測されるポリペプチド前駆体は４６８アミノ酸長であり、約５４，３９３の計算された分子量及び約５．６３の見積もられたｐＩを有する。Ｆｉｇ１３６（配列番号：３３７）に示した全長ＰＲＯ８６５の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２３のシグナルペプチド、約アミノ酸２８０〜約アミノ酸２８３及び約アミノ酸３８４〜約アミノ酸３８７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、約アミノ酸９４〜約アミノ酸９７の潜在的アミド化部位、約アミノ酸２０〜約アミノ酸２３及び約アミノ酸２２３〜約アミノ酸２２６のグリコサミノグリカン結合部位、約アミノ酸２１６〜約アミノ酸２２２のアミノトランスフェラーゼクラスＶピリドキシルホスフェートアミノ酸配列ブロック、及び約アミノ酸３３８〜約アミノ酸３４３のインターロイキン−７に見られるものと類似するアミノ酸配列ブロック。クローンＵＮＱ４３４（ＤＮＡ５３９７４−１４０１）は１９９８年４月１４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７７４が付与されている。
全長ＰＲＯ８６５ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが任意の公知のタンパク質と有意な配列類似性を持たないことを示唆している。しかしながら、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析はＰＲＯ８６５アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＹＭＮ０＿ＹＥＡＳＴ， ＡＴＦＣＡ４＿４３， Ｓ４４１６８， Ｐ＿Ｗ１４５４９及びＲＡＢＴＣＲＧ４＿１との間に或る程度の相同性があることを明らかにした。
【０４８２】
実施例５３：ヒトＰＲＯ８２７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたｃＤＮＡ配列が、ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントにより、種々のインテグリンタンパク質をコードする核酸配列に対して配列相同性を有していることが見出された。このｃＤＮＡ配列を、ここにＤＮＡ４７７５１（Ｆｉｇ１４０；配列番号：３４７）と命名する。配列相同性に基づいて、ＤＮＡ４７７５１分子の配列からプローブを調製し、実施例２のパラグラフ１に記載したように調製したヒト胎児色素上皮ライブラリ（ＬＩＢ１１３）のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１）参照）、ｃＤＮＡサイズ切断は２８００ｂｐ未満であった。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＧＧＧＡＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣ−３’ （配列番号：３４８）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＡＧＧＴＧＣＡＴＡＴＴＣＡＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧ−３’（配列番号：３４９）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４７７５１配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＧＡＡＣＴＣＣＣＣＴＴＣＧＴＣＡＣＴＣＡＣＣＴＧＴＴＣＴＴＧＣＣＣＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＴ−３’（配列番号：３５０）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ８２７遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンを同定し、それは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１３４−１３６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置５０６−５０８に見られる停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１３８；配列番号：３４５）。予測されるポリペプチド前駆体は１２４アミノ酸長であり、約１３，３５２ダルトンの計算上の分子量及び約５．９９の見積もられたｐＩを有する。Ｆｉｇ１３９（配列番号：３４６）に示した全長ＰＲＯ８２７配列の分析は、以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸２２のシグナルペプチド、約アミノ酸７０〜約アミノ酸７２の細胞接着配列、約アミノ酸９８〜約アミノ酸１０１のＮ−グリコシル化部位、及び約アミノ酸６７〜約アミノ酸８１のインテグリンアルファ鎖タンパク質相同配列。クローンＵＮＱ４６８（ＤＮＡ５７０３９−１４０２）は、１９９８年４月１４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７７７が付与されている。
全長ＰＲＯ８２７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがＶＬＡ−２インテグリンタンパク質及び他の種々のインテグリンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ８２７が新規なインテグリン又はそのスプライシング変異体となりうることが示されている。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ８２７アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、Ｓ４４１４２， ＩＴＡ２＿ ＨＵＭＡＮ， ＩＴＡ１＿ＲＡＴ， ＩＴＡ１＿ＨＵＭＡＮ， ＩＴＡ４＿ＨＵＭＡＮ， ＩＴＡ９＿ＨＵＭＡＮ， ＡＦ０３１０８＿１， ＩＴＡＭ＿ＭＯＵＳＥ， ＩＴＡ８＿ＣＨＩＣＫ及びＩＴＡ６＿ＣＨＩＣＫとの間の有意な相同性を明らかにした。
【０４８３】
実施例５４：ヒトＰＲＯ１１１４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたｃＤＮＡ配列が、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ配列アラインメントコンピュータプログラムにより、他の公知のインターフェロンレセプターと或る程度の配列同一性を有していることが見出された。このｃＤＮＡ配列を、ここにＤＮＡ４８４６６（Ｆｉｇ１４３；配列番号：３５２）と命名する。配列相同性に基づいて、ＤＮＡ４８４６６分子の配列からプローブを調製し、実施例２のパラグラフ１に記載したように調製したヒト乳癌ライブラリー（ＬＩＢ１３５）のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１）参照）、ｃＤＮＡサイズ切断は２８００ｂｐ未満であった。
用いたオリゴヌクレオチドプローブは以下の通り：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＧＧＣＴＴＣＧＣＴＧＣＧＡＣＴＡＧＡＣＣＴＣ−３’ （配列番号：３５４）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＡＧＧＴＣＧＧＧＴＡＡＧＧＡＴＧＧＴＴＧＡＧ−３’（配列番号：３５５）
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＴＴＴＣＴＡＣＧＣＡＴＴＧＡＴＴＣＣＡＴＧＴＴＴＧＣＴＣＡＣＡＧＡＴＧＡＡＧＴＧＧＣＣＡＴＴＣＴＧＣ−３’
（配列番号：３５６）
全長クローンを同定し、それは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２５０−２５２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１１８３−１１８５に見られる停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１４１；配列番号：３５１）。予測されるポリペプチド前駆体は３１１アミノ酸長であり、約３５，０７６ダルトンの計算上の分子量及び約５．０４の見積もられたｐＩを有する。Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）に示した全長ＰＲＯ１１１４配列の分析は、以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸２９のシグナルペプチド、約アミノ酸２３０〜約アミノ酸２５５の膜貫通ドメイン、約アミノ酸４０〜約アミノ酸４３及び約アミノ酸１３４〜約アミノ酸１３７の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、約アミノ酸９２〜約アミノ酸１１９の組織因子タンパク質に相同性を持つアミノ酸配列ブロック、及び約アミノ酸２３２〜約アミノ酸２６２のインテグリンアルファ鎖タンパク質に相同性を持つアミノ酸配列ブロック。クローンＵＮＱ５５７（ＤＮＡ５７０３３−１４０３）は、１９９８年５月２７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９０５が付与されている。
Ｆｉｇ１４２（配列番号：３５２）に示した全長配列の、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析を用いた、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）の分析は、ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターアミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列：Ｇ０１４１８， ＩＮＲ１＿ＭＯＵＳＥ， Ｐ＿Ｒ７１０３５， ＩＮＧＳ＿ＨＵＭＡＮ， Ａ２６５９５＿１， Ａ２６５９３＿１， Ｉ５６２１５及びＴＦ＿ＨＵＭＡＮとの間の有意な相同性を明らかにした。
【０４８４】
実施例５５：ヒトＰＲＯ２３７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３０９０５と命名される。ＤＮＡ３０９０５コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ２３７の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＣＴＧＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＣＡＴＴＣＡＣ−３’（配列番号：３５９）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＣＴＧＡＧＡＴＧＧ−３’（配列番号：３６０）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３０９０５配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＣＣＴＣＴＴＴＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＣＣＡＧＴＡＣＣＴＣＴＡＡＣＣＣＡＴＴＣＣＴＣＡＧＴＣＧＣＣＴＣ−３’
（配列番号：３６１）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１０７５遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児脳組織（ＬＩＢ１５３）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ２３７の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ２１１（ＤＮＡ３４３５３−１４２８）と命名される］（配列番号：３５７）及びＰＲＯ２３７の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ２１１（ＤＮＡ３４３５３−１４２８）の全核酸配列をＦｉｇ１４４（配列番号：３５７）に示す。クローンＵＮＱ２１１（ＤＮＡ３４３５３−１４２８）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５８６−５８８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１５７０−１５７２の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１４４）。予測されるポリペプチド前駆体は３２８アミノ酸長である（Ｆｉｇ１４５）。Ｆｉｇ１４５に示した全長ＰＲＯ２３７タンパク質は、約３６，２３８ダルトンの見積もり分子量及び約９．９０のｐＩを有する。Ｆｉｇ１４５（配列番号：３５８）に示した全長ＰＲＯ２３７配列の分析は以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸２３のシグナルペプチド、約アミノ酸１７７〜約アミノ酸１９９の膜貫通ドメイン、約アミノ酸１１８〜約アミノ酸１２１、約アミノ酸１７０〜約アミノ酸１７３及び約アミノ酸２６０〜約アミノ酸２６３のＮ−グリコシル化部位、及び約アミノ酸２２２〜約アミノ酸２７０、約アミノ酸１２８〜約アミノ酸１６４及び約アミノ酸４５〜約アミノ酸９２の真核生物型炭酸脱水酵素配列相同性ブロック。クローンＵＮＱ２１１（ＤＮＡ３４３５３−１４２８）は、１９９８年５月１２日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８５５が付与されている。
全長ＰＲＯ２３７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが炭酸脱水酵素タンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ２３７アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＡＦ０５５０１０６＿１， ＯＡＣＡＬＰ＿１， ＣＥＬＤ１０２２＿８， ＣＡＨ２＿ＨＵＭＡＮ， １ＣＡＣ， ＣＡＨ５＿ＨＵＭＡＮ， ＣＡＨＰ＿ＨＵＭＡＮ， ＣＡＨ３＿ＨＵＭＡＮ， ＣＡＨ１＿ＨＵＭＡＮ及び２ＣＡＢとの間の有意な相同性を明らかにした。
【０４８５】
実施例５６：ヒトＰＲＯ５４１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４２２５９と命名される。ＤＮＡ４２２５９コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ５４１の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＧＡＣＡＧＡＡＴＴＴＧＧＧＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧ−３’ （配列番号：３６４）
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＡＡＧＡＧＴＡＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＧ−３’　　 （配列番号：３６５）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＣＴＣＴＡＣＡＧＣＣＣＣＣ−３’（配列番号：３６６）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＡＣＣＡＣＴＣＣＡＧＣＡＴＧＴＡＣＴＧＣＴＧＣ−３’ （配列番号：３６７）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４２２５９配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＣＡＴＴＣＡＧＧＴＧＴＴＣＴＧＧＣＣＣＴＧＴＡＴＧＴＡＣＡＣＡＴＴＡＴＡＣＡＣＡＧＧＴＣＧＴＧＴＧ−３’（配列番号：３６８）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ５４１遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ５４１の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３４２（ＤＮＡ４５４１７−１４３２）と命名される］（配列番号：３６２）及びＰＲＯ５４１の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３４２（ＤＮＡ４５４１７−１４３２）の全核酸配列をＦｉｇ１４６（配列番号：３６２）に示す。クローンＵＮＱ３４２（ＤＮＡ４５４１７−１４３２）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４６９−４７１に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１９６９−１９７１の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１４６）。予測されるポリペプチド前駆体は５００アミノ酸長である（Ｆｉｇ１４７）。Ｆｉｇ１４７に示した全長ＰＲＯ５４１タンパク質は、約５６，８８８ダルトンの見積もり分子量及び約８．５３のｐＩを有する。Ｆｉｇ１４７（配列番号：３６３）に示した全長ＰＲＯ５４１配列の分析は以下のものの存在を明示している：約アミノ酸１〜約アミノ酸２０のシグナルペプチド、約アミノ酸１６５〜約アミノ酸１８６、約アミノ酸１９６〜約アミノ酸２１８、約アミノ酸１３４〜約アミノ酸１４６、約アミノ酸９６〜約アミノ酸１０８及び約アミノ酸５８〜約アミノ酸７７の細胞外タンパク質ＳＣＰ／Ｔｐｘ−１／ＰＲ−１／Ｓｃ７に相同性を持つアミノ酸配列ブロック、及び約アミノ酸２８〜約アミノ酸３１のＮ−グリコシル化部位。クローンＵＮＱ３４２（ＤＮＡ４５４１７−１４３２）は、１９９８年５月２７日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９１０が付与されている。
全長ＰＲＯ５４１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがトリプシンインヒビタータンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ５４１が新規なトリプシンインヒビターとなりうることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ５４１アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、Ｄ４５０２７＿１， ＡＢ００９６０９＿１， ＪＣ５３０８， ＣＲＳ３＿ＨＯＲＳＥ， ＴＰＸ１＿ＨＵＭＡＮ， ＨＥＬＯ＿ＨＥＬＨＯ， ＧＥＮ１４３５１， Ａ２８１１２＿１， ＣＥＴ０５Ａ１０＿１及びＰ＿Ｗ１１４８５との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４８６】
実施例５７：ヒトＰＲＯ２７３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３６４６５と命名される。ＤＮＡ３６４６４コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ２７３の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＡＧＣＧＣＣＣＴＣＣＣＣＡＴＧＴＣＣＣＴＧ−３’　（配列番号：３７１）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＣＣＣＡＡＣＴＧＧＴＴＴＧＧＡＧＴＴＴＴＣＣＣ−３’（配列番号：３７２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３６４６５配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＴＣＣＧＧＴＣＡＧＣＡＴＧＡＧＧＣＴＣＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＧＣＴＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号：３７３）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ２７３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ２７３の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ２４０（ＤＮＡ３９５２３−１１９２）と命名される］（配列番号：３６９）及びＰＲＯ２７３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ２４０（ＤＮＡ３９５２３−１１９２）の全核酸配列をＦｉｇ１４８（配列番号：３６９）に示す。クローンＵＮＱ２４０（ＤＮＡ３９４２３−１１９２）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１６７−１６９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置５００−５０２の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１４８）。予測されるポリペプチド前駆体は１１１アミノ酸長である（Ｆｉｇ１４９）。クローンＵＮＱ２４０（ＤＮＡ３９４２３−１１９２）はＡＴＣＣに寄託されている。寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供した配列は現在の配列技術に基づいた単なる代表例であると理解される。さらに、ここに提供された配列及び全遺伝子コードの知識が与えられれば、任意の与えられたアミノ酸についての対応するヌクレオチドは日常的に同定でき、その逆も可能である。
全長ＰＲＯ２７３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がヒトマクロファージ炎症タンパク質−２、サイトカイン誘発性ニューロフィル化学誘引物質２、及びニューロフィル化学誘引因子２−ベータと配列同一性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ２７３が新規なケモカインであることを示している。
後で更に議論するように、ｃＤＮＡはバキュロウイルスベクターにサブクローニングされ、Ｃ−末端タグＩｇＧ融合タンパク質として発現される。得られたタンパク質のＮ−末端配列は、７７アミノ酸の成熟ポリペプチドを生成するシグナル配列切断部位を決定する。成熟配列は、他のヒトＣＸＣケモカインと３１−４０％の同一性を示し、４つの正準システイン残基を含むがＥＬＲモチーフを欠く。ノーザン分析は、少なくとも小腸、結腸、脾臓、リンパ節及び腎臓での発現を示した。これも後で詳細に記載するインサイツハイブリッド形成によると、ｍＲＮＡは、腸絨毛の固有層及び尿細管に局在化している。
【０４８７】
実施例５８：ヒトＰＲＯ７０１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３９８４８と命名される。ＤＮＡ３９８４８コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７０１の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＧＣＡＡＧＣＴＡＣＧＧＡＡＡＣＧＴＣＡＴＣＧＴＧ−３’（配列番号：３７６）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＡＣＣＣＣＣＧＡＧＣＣＡＡＡＡＧＡＴＧＧＴＣＡＣ−３’（配列番号：３７７）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３９８４８配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＴＡＣＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＡＡＣＴＡＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＧＡＴＣＡＧ−３’（配列番号：３７８）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７０１遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７０１の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３６５（ＤＮＡ４４２０５−１２８５）と命名される］（配列番号：３７４）及びＰＲＯ７０１の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３６５（ＤＮＡ４４２０５−１２８５）の全核酸配列をＦｉｇ１５０（配列番号：３７４）に示す。クローンＵＮＱ３６５（ＤＮＡ４４２０５−１２８５）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５０−５２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２４９８−３０００の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１５０）。予測されるポリペプチド前駆体は８１６アミノ酸長である（Ｆｉｇ１５１）。Ｆｉｇ１５１に示した全長ＰＲＯ７０１タンパク質は、約９１，７９４ダルトンの見積もり分子量及び約５．８８のｐＩを有し、ＮＸ（Ｓ／Ｔ）は４であった。クローンＵＮＱ３６５（ＤＮＡ４４２０５− １２８５）は、１９９８年３月３１日にＡＴＣＣに寄託された。寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供した配列は現在の配列技術に基づいた単なる代表例であると理解される。
さらに、Ｆｉｇ１５１に示したアミノ酸配列について、およそアミノ酸２５に潜在的シグナルペプチド切断部位が存在する。アミノ酸位置８３、５１１、７１６及び８０３に潜在的Ｎ−グリコシル化部位が存在する。カルボキシルエステラーゼＢ型シグネーチャー２配列は、およそ残基１２５〜１３５である。カルボキシルエステラーゼＢ型に相同な領域は、およそ残基５４−７４、１９７−２１２及び２２１−２６１である。潜在的な膜貫通領域は、およそアミノ酸６７１〜およそ７００に相当する。対応する核酸は、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
全長ＰＲＯ７０１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがクマネズミ属ノルベギカス（ｎｏｒｖｉｇｉｃｕｓ）からのニューロリジン（ｎｅｕｒｏｌｉｇｉｎ）と有意な配列類似性を有することを示唆し、ＰＲＯ７０１が新規なヒトニューロリジンであることを示している。
【０４８８】
実施例５９：ヒトＰＲＯ７０４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４３０３３と命名される。ＤＮＡ４３０３３コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７０４の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＴＴＧＧＧＴＣＧＴＧＧＣＡＧＣＡＧＴＧＧ−３’（配列番号：３８１）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＡＣＴＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＣＡＴＧＣＴＣＡＧＧ−３’（配列番号：３８２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４３０３３配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＴＣＡＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＡＡＣＧＧＧＡＧＣＡＣＴＣＧＣＴＧＴＣＧＡＡＧＣ−３’（配列番号：３８３）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７０４遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７０４の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３６８（ＤＮＡ５０９１１−１２８８）と命名される］（配列番号：３７９）及びＰＲＯ７０４の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３６８（ＤＮＡ５０９１１−１２８８）の全核酸配列をＦｉｇ１５２（配列番号：３７９）に示す。クローンＵＮＱ３６８（ＤＮＡ５０９１１−１２８８）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８−１０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１０５２−１０５４の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１５２）。予測されるポリペプチド前駆体は３４８アミノ酸長である（Ｆｉｇ１５３）。Ｆｉｇ１５３に示した全長ＰＲＯ７０４タンパク質は、約３９，７１１ダルトンの見積もり分子量及び約８．７のｐＩを有する。クローンＵＮＱ３６８（ＤＮＡ５０９１１−１２８８）は、１９９８年３月３１日にＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供した配列は現在の配列技術に基づいた単なる代表例であると理解される。
全長ＰＲＯ７０４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが小胞複合膜タンパク質３６と有意な配列相同性を有することを示唆し、ＰＲＯ７０４が新規な小胞複合膜タンパク質となりうることを示している。
配列番号：３８０のさらなる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号：３８０のおよそアミノ酸１−３９である。膜貫通ドメインは、配列番号：３８０のアミノ酸３１０−３３５である。潜在的Ｎ−グリコシル化部位は、配列番号：３８０のおよそアミノ酸１８０−１８３である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列が与えられれば日常的に決定できる。
【０４８９】
実施例６０：ヒトＰＲＯ７０６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４０６６９と命名される。ＤＮＡ４０６６９コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７０６の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＡＡＧＣＡＧＣＴＴＡＧＡＧＣＴＣＣＡＧＡＣＣ−３’（配列番号：３８６）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＴＣＣＣＴＡＴＧＣＴＣＴＧＴＡＴＴＧＧＣＡＴＧＧ−３’（配列番号：３８７）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４０６６９配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＣＣＡＣＴＴＣＴＧＣＣＡＣＡＡＴＧＴＣＡＧＣＴＴＴＣＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＡＡＡＴＧＧＣＴＧＴＧＴＴ−３’
（配列番号：３８８）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７０６遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児脳組織（ＬＩＢ１５３）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７０６の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３７０（ＤＮＡ４８３２９−１２９０）と命名される］（配列番号：３８４）及びＰＲＯ７０６の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３７０（ＤＮＡ４８３２９−１２９０）の全核酸配列をＦｉｇ１５４（配列番号：３８４）に示す。クローンＵＮＱ３７０（ＤＮＡ４８３２９−１２９０）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２７９−２８１に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１７１９−１７２１の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１５４）。予測されるポリペプチド前駆体は４８０アミノ酸長である（Ｆｉｇ１５５）。Ｆｉｇ１５５に示した全長ＰＲＯ７０６タンパク質は、約５５，２３９ダルトンの見積もり分子量及び約９．３０のｐＩを有する。クローンＵＮＱ３７０（ＤＮＡ４８３２９−１２９０）は、１９９８年４月２１日にＡＴＣＣに寄託された。
さらに、Ｆｉｇ１５５に示したアミノ酸配列について、およそアミノ酸１９に潜在的シグナルペプチド切断部位が存在する。アミノ酸位置３０５及び３５４に潜在的Ｎ−グリコシル化部位が存在する。潜在的チロシンキナーゼリン酸化部位は、およそアミノ酸３３３に存在する。ヒスチジン酸ホスファターゼと相同な領域は、およそ残基８７−１０２である。対応する核酸領域は提供された配列が与えられれば日常的に決定できる、即ち、コドンは与えられた特定の名称のアミノ酸から決定できる。
全長ＰＲＯ７０６ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがヒト前立腺酸ホスファターゼ前駆体と有意な配列相同性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ７０６が新規なヒト前立腺酸ホスファターゼとなりうることを示している。
【０４９０】
実施例６１：ヒトＰＲＯ７０７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４２７７５と命名される。ＤＮＡ４２７７５に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７０７の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＣＣＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＣＣＧＣＣＣＣＡＣ−３’ （配列番号：３９１）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＴＣＧＧＧＣＧＣＡＴＴＧＴＣＧＴＴＣＴＧＧＴＣ−３’（配列番号：３９２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４２７７５配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＣＧＡＣＴＧＴＧＡＡＡＧＡＧＡＡＣＧＣＣＣＣＡＧＡＴＣＣＡＣＴＴＧＴＴＣＣＣＣ−３’（配列番号：３９３）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７０７遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７０７の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３７１（ＤＮＡ４８３０６−１２９１）と命名される］（配列番号：３８９）及びＰＲＯ７０７の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３７１（ＤＮＡ４８３０６−１２９１）の全核酸配列をＦｉｇ１５６（配列番号：３８９）に示す。クローンＵＮＱ３７１（ＤＮＡ４８３０６−１２９１）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、配列番号：３８９のヌクレオチド位置３７１−３７３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置３１１９−３１２１の停止コドンで終端する。予測されるポリペプチド前駆体は９１６アミノ酸長である（Ｆｉｇ１５７）。Ｆｉｇ１５７に示した全長ＰＲＯ７０７タンパク質は、約１００，２０４ダルトンの見積もり分子量及び約４．９２のｐＩを有する。クローンＵＮＱ３７１（ＤＮＡ４８３０６−１２９１）は、１９９８年５月２７日にＡＴＣＣに寄託された。クローンＵＮＱ３７１はＰＲＯ７０７をコードし、そして、ここの配列は、些細な誤差を生ずるかもしれない現在の配列技術に基づいた単なる代表例であると理解される。
アミノ酸配列の分析に関して、シグナル配列は配列番号：３９０のおよそ１〜３０に現れる。カドヘリン細胞外繰り返しドメインシグネーチャー配列は、配列番号：３９０のおよそアミノ酸１２１−１３１、２３０−２４０、３３５−３４５、４４０−４５０及び５５０−５６０である。チロシンキナーゼリン酸化部位は、配列番号：３９０のおよそアミノ酸１２４−１３２及び５８０−５８６である。潜在的膜貫通ドメインは、およそアミノ酸６８２−７１５±５である。核酸位置は、命名されたアミノ酸の対応するコドンを参照して誘導できる。
全長ＰＲＯ７０７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、ヒト繊維芽細胞で発現されるカドヘリンＦＩＢ３タンパク質と有意な相同性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ７０７が新規なカドヘリンとなりうることを示している。
【０４９１】
実施例６２：ヒトＰＲＯ３２２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４８３３６と命名される。ＤＮＡ４８３３６コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３２２の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＡＧＣＣＴＡＣＡＧＡＡＴＡＡＡＧＡＴＧＧＣＣＣ−３’（配列番号：３９６）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＧＴＧＣＡＡＴＧＡＴＣＴＧＣＣＡＧＧＣＴＧＡＴ−３’（配列番号：３９７）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４８３３６コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＡＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＡＧＴＣＣＡＴＣＣＣＡＡＡＣＣＣＣＴＧＣＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＧ−３’
（配列番号：３９８）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３２２遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３２２の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ２８３（ＤＮＡ４８３３６−１３０９）と命名される］（配列番号：３９４）及びＰＲＯ３２２の誘導タンパク質配列を与えた。ＵＮＱ２８３（ＤＮＡ４８３３６−１３０９）は実際にＰＲＯ３２２をコードし、配列番号：３９４はこの分野で知られた配列技術に基づく配列の代表例であると理解される。
ＵＮＱ２８３（ＤＮＡ４８３３６−１３０９）の全核酸配列をＦｉｇ１５８（配列番号：３９４）に示す。クローンＵＮＱ２８３（ＤＮＡ４８３３６−１３０９）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１６６−１６８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９４６−９４８の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１５８）。予測されるポリペプチド前駆体は２６０アミノ酸長である（Ｆｉｇ１５９）。Ｆｉｇ１５９に示した全長ＰＲＯ３２２タンパク質は、約２８，０２８ダルトンの見積もり分子量及び約７．８７のｐＩを有する。クローンＵＮＱ２８３（ＤＮＡ４８３３６−１３０９）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６６９が付与されている。
Ｆｉｇ１５９のアミノ酸配列に関して、潜在的Ｎ−グリコシル化部位は配列番号：３９５のアミノ酸１１０である。セリンプロテアーゼ、チロシンファミリー及びヒスチジン活性部位は、配列番号：３９５のアミノ酸６９〜７４に同定され、コンセンサス配列は配列番号：３９５のアミノ酸２０７〜２１７に同定される。クリングルドメインタンパク質モチーフは、配列番号：３９５のアミノ酸２０５〜２１７に同定される。推定シグナルペプチドは、およそアミノ酸１−２３でコードされる。
全長ＰＲＯ３２２ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、ニューロプシン及び他のセリンプロテアーゼと有意な相同性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ３２２が新規なセリンプロテアーゼ関連ニューロプシンとなりうることを示している。
【０４９２】
実施例６３：ヒトＰＲＯ５２６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３９６２６と命名される。ＤＮＡ３９６２６コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ５２６の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＧＧＣＴＧＣＣＣＴＧＣＡＧＴＡＣＣＴＣＴＡＣＣ−３’（配列番号：４０１）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＡＴＴＧＧＣＡＧＣＴＡＧＧ−３’（配列番号：４０２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３９６２６コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＡＧＧＣＡＣＴＧＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡＣＣＴＴＣＣＧＣＧＡＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＣＴＣＡＣＡＣ−３’（配列番号：４０３）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ５２６遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肝臓組織（ＬＩＢ２２８）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ５２６の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３３０（ＤＮＡ４４１８４−１３１９）と命名される］（配列番号：３９９）及びＰＲＯ５２６の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３３０（ＤＮＡ４４１８４−１３１９）の全核酸配列をＦｉｇ１６０（配列番号：３９９）に示す。クローンＵＮＱ３３０（ＤＮＡ４４１８４−１３１９）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５１４−５１６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１９３３−１９３５の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１６０）。予測されるポリペプチド前駆体は４７３アミノ酸長である（Ｆｉｇ１６１）。Ｆｉｇ１６１に示した全長ＰＲＯ５２６タンパク質は、約５０，７０８ダルトンの見積もり分子量及び約９．２８のｐＩを有する。クローンＵＮＱ３３０（ＤＮＡ４４１８４−１３１９）は１９９８年３月２６日にＡＴＣＣに寄託された。このクローンは実際の配列を含み、ここに提供される配列は現在の配列技術に基づく代表例であると理解される。
全長ＰＲＯ５２６ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、ＡＬＳ、ＳＬＩＴ、カルボキシペプチダーゼ及び血小板糖タンパク質Ｖを含むロイシンリピート豊富なタンパク質と有意な相同性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ５２６がタンパク質−タンパク質相互作用に含まれる新規なタンパク質であることを示している。
配列番号：４００の更なる分析により、シグナルペプチドはおよそアミノ酸１−２６にある。ロイシンジッパーパターンはおよそアミノ酸１３５−１５６にある。グリコサミノグリカン結合部位は、およそアミノ酸４３６−４３９にある。Ｎ−グリコシル化部位は、およそアミノ酸８２−８５、１７９−１８２、２３７−２４０及び４２３−４２６にある。フォンウィルブランド因子（ＶＷＦ）型Ｃドメインは、およそアミノ酸４１１−４２５に見られる。当業者は、ここに提供した配列に基づいて、これらのアミノ酸に対応するヌクレオチドを理解できる。
【０４９３】
実施例６４：ヒトＰＲＯ５３１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＥＣＤデータベースを検索し、プロトカドヘリン３と相同性を示す発現配列タグ（ＥＳＴ）をＬＩＦＥＳＥＱ（商品名）、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡから同定した。この配列に基づいて、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ及びＧｉｓｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６））を用いて、ＥＳＴ配列の６フレーム翻訳に対するＥＣＤタンパク質配列の比較として検索を実施した。公知のタンパク質をコードせず、ＢＬＡＳＴスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ； ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／　ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）でクラスター形成してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。
他のＥＳＴ配列に対してｐｈｒａｐを用いてコンセンサス配列を構築した。得られたコンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ５３１の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＴＧＡＧＡＡＣＧＣＧＣＣＴＧＡＡＡＣＴＧＴＧ−３’（配列番号：４０６）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＧＣＧＴＴＧＴＣＡＴＴＧＡＣＡＴＣＧＧＣＧ−３’ （配列番号：４０７）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＴＴＡＧＴＴＧＣＴＣＣＡＴＴＣＡＧＧＡＧＧＡＴＣＴＡＣＣＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＡＡＡＴＣＣＧＣＧＧＡＡ−３’
（配列番号：４０８）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅でスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ５３１遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児脳組織（ＬＩＢ１５３）から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するのに用いたｃＤＮＡライブラリは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１）参照にこと）に、独特のＸｏｌ及びＮｏｔＩ部位でクローニングした。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ５３１の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３３２（ＤＮＡ４８３１４−１３２０）と命名される］（配列番号：４０４）及びＰＲＯ５３１の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３３２（ＤＮＡ４８３１４−１３２０）の全代表的核酸配列をＦｉｇ１６２（配列番号：４０４）に示す。実際の配列は、ＡＴＣＣにＤＮＡ４８３１４−１３２０として寄託されたクローン内にあると理解される。クローンＵＮＱ３３２（ＤＮＡ４８３１４−１３２０）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１７１−１７３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２５６５−２５６７の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１６２）。予測されるポリペプチド前駆体は７８９アミノ酸長である（Ｆｉｇ１６３）。Ｆｉｇ１６３に示した全長ＰＲＯ５３１タンパク質は、約８７，５５２ダルトンの見積もり分子量及び約４．８４のｐＩを有する。クローンＵＮＱ３３２（ＤＮＡ４８３１４−１３２０）は１９９８年３月２６日にＡＴＣＣに寄託された。
全長ＰＲＯ５３１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、プロトカドヘリン３と有意な相同性を有することを示唆している。さらに、ＰＲＯ５３１は他のプロトカドヘリンと同様に脳に見出され、それによりＰＲＯ５３１がカドヘリンスーパーファミリーの新規なメンバーであることを示している。
配列番号：４０５の更なる分析により、カドヘリン細胞外繰り返しドメインシグネーチャーは、配列番号：４０５のおよそアミノ酸１２２−１３２、２３１−２４１、３３６−３４６、４３９−４４９及び５４９−５５９に見られる。ＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位モチーフ（Ｐ−ループ）は、配列番号：４０５のおよそアミノ酸２８５−２９２に見られる。Ｎ−グリコシル化部位は、配列番号：４０５のおよそアミノ酸５６７−５７０、７８６−７９０、４１８−４２１及び３３６−３３９に見られる。シグナルペプチドは配列番号：４０５のおよそアミノ酸１−２６、膜貫通ドメインはおよそアミノ酸６８５−７１２にある。
【０４９４】
実施例６５：ヒトＰＲＯ５３４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４３０３８と命名される。ＤＮＡ４３０４８コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ５３４の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＡＣＡＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＧＣＧＧＡＡＴＣ−３’（配列番号：４１１）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＡＣＡＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＧＴＣＣＴＧＧ−３’（配列番号：４１２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４３０３８配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＧＧＴＡＧＴＧＡＣＴＧＴＡＣＴＣＴＡＧＴＣＣＴＧＴＴＴＴＡＣＡＣＣＣＣＧＴＧＧＴＧＣＣＧ−３’（配列番号：４１３）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ５３４遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肺組織（ＬＩＢ２６）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ５３４の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３３５（ＤＮＡ４８３３３−１３２１）と命名される］（配列番号：４０９）及びＰＲＯ５３４の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３３５（ＤＮＡ４８３３３−１３２１）の全核酸配列をＦｉｇ１６４（配列番号：４０９）に示す。クローンＵＮＱ３３５（ＤＮＡ４８３３３−１３２１）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８７−８９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１１６７−１１６９の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１６４）。予測されるポリペプチド前駆体は３６０アミノ酸長である（Ｆｉｇ１６５）。Ｆｉｇ１６５に示した全長ＰＲＯ５３４タンパク質は、約３９，８８５ダルトンの見積もり分子量及び約４．７９のｐＩを有する。クローンＵＮＱ３３５（ＤＮＡ４８３３３−１３２１）は１９９８年３月２６日にＡＴＣＣに寄託された。寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供される配列は現在の配列技術に基づく代表例であると理解される。
全長ＰＲＯ５３４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと有意な配列同一性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ５３４が新規なジスルフィドイソメラーゼとなりうることを示している。
ＰＲＯ５３４のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号：４１０のおよそアミノ酸１−２５である。膜貫通ドメインは配列番号：４１０のおよそアミノ酸３２１−３４０である。ジスルフィドイソメラーゼ対応領域は配列番号：４１０のおよそアミノ酸２１２−３０２である。チオレドキシンドメインは配列番号：４１０のおよそ亜物酸２１１−２２７である。Ｎ−グリコシル化部位は、配列番号：４１０の１６５−１６８、１８１−１８４、１８７−１９０、１９４−１９７、２０６−２０９、２７８−２８１及び２９３−２９６にある。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。ＰＲＯ５３４は、他のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと同様にＥＲ保持ペプチドではなく膜貫通ドメインを有する。さらに、ＰＲＯ５３４は５プライム末端にイントロンを有してもよい。
【０４９５】
実施例６６：ヒトＰＲＯ６９７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４３０５２と命名される。このコンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ６９７の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＴＧＧＣＴＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣ−３’ （配列番号：４１６）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＴＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＴＧＣＡＡＧＣＴＧＴＣ−３’（配列番号：４１７）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４３０５２配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＴＣＴＴＣＣＴＣＴＴＴＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＴＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＡＡＴＴＧＣ−３’（配列番号：４１８）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ６９７遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ６９７の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３６１（ＤＮＡ５０９２０−１３２５）と命名される］（配列番号：４１４）及びＰＲＯ６９７の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３６１（ＤＮＡ５０９２０−１３２５）の全核酸配列をＦｉｇ１６６（配列番号：４１４）に示す。クローンＵＮＱ３６１（ＤＮＡ５０９２０−１３２５）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４４−４６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９２９−９３１の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１６６）。予測されるポリペプチド前駆体は２９５アミノ酸長である（Ｆｉｇ１６７）。Ｆｉｇ１６７に示した全長ＰＲＯ６９７タンパク質は、約３３，５１８ダルトンの見積もり分子量及び約７．７４のｐＩを有する。クローンＵＮＱ３６１（ＤＮＡ５０９２０−１３２５）は１９９８年３月２６日にＡＴＣＣに寄託された。寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供される配列は現在の配列技術に基づく代表例であると理解される。
全長ＰＲＯ６９７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、ｓＦＲＰｓと有意な配列同一性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ６９７が新規なｓＦＲＰファミリーメンバーとなりうることを示している。
ＰＲＯ６９７のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号：４１５のおよそアミノ酸１−２０である。縮れた（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）Ｎ−末端と同一性を持つシステイン富化ドメインは配列番号：４１５のおよそアミノ酸６−１５３である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０４９６】
実施例６７：ヒトＰＲＯ７１７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４２８２９と命名される。ＤＮＡ４２８２９コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７１７の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＧＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣＡＧ−３’（配列番号：４２１）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＧＧＧＴＣＡＡＴＡＡＡＣＣＴＧＧＡＣＧＣＴＴＧＧ−３’（配列番号：４２２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４２８２９配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＴＡＴＧＴＧＧＡＣＣＧＧＡＣＣＡＡＧＣＡＣＴＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＡＡＧＡＴＴＧ−３’（配列番号：４２３）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７１７遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肝臓組織（ＬＩＢ２２９）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７１７の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３８５（ＤＮＡ５０９８８−１３２６）と命名される］（配列番号：４１９）及びＰＲＯ７１７の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３８５（ＤＮＡ５０９８８−１３２６）の全核酸配列をＦｉｇ１６８（配列番号：４１９）に示す。クローンＵＮＱ３８５（ＤＮＡ５０９８８−１３２６）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１７−１９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１６９７−１６９９の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１６８）。予測されるポリペプチド前駆体は５６０アミノ酸長である（Ｆｉｇ１６９）。Ｆｉｇ１６９に示した全長ＰＲＯ７１７タンパク質は、約５８，４２７ダルトンの見積もり分子量及び約６．８６のｐＩを有する。クローンＵＮＱ３８５（ＤＮＡ５０９８８−１３２６）は１９９８年４月２８日にＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は現在の配列技術に基づいていると理解される。
全長ＰＲＯ７１７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ＰＲＯ７１７が新規な１２膜貫通レセプターとなりうることを示している。ＤＮＡ５０９８８の逆補体鎖は、ヒト調節性ミオシン軽鎖と同一的に適合する伸展を有する。
配列番号：４２０のアミノ酸配列の更なる分析により、膜貫通ドメインは配列番号：４２０のおよそアミノ酸３０−５０、６１−７９、９８−１１２、１２６−１４６、１６９−１８２、２０１−２１５、２４８−２６８、２８０−３００、３１８−３３７、３４１−３５７、３７５−３８７、及び４２０−４４１である。Ｎ−グリコシル化部位は配列番号：４２０のおよそアミノ酸４０−４３及び４３−４６である。グリコサミノグリカン結合部位は配列番号：４２０のおよそアミノ酸４６８−４７１である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０４９７】
実施例６８：ヒトＰＲＯ７３１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースの検索にデータベースを使用した。ここで用いたＥＳＴデータベースは、独自に開発されたＥＳＴ ＤＮＡデータベース、ＬＩＦＥＳＥＱ（商品名）、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡである。Ｉｎｃｙｔｅクローン２５８１３２６を、ここでＤＮＡ４２８０１と命名する。ＤＮＡ４２８０１配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７３１の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＴＡＡＧＣＡＣＡＴＧＣＣＴＣＣＡＧＡＧＧＴＧＣ−３’（配列番号：４２６）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＴＧＡＣＧＴＧＧＡＴＧＣＴＴＧＧＧＡＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：４２７）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４２８０１配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＴＧＧＡＣＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＴＴＧＡＴＧＣＣＡＡＧＡＣＡＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＴＴＣＴＧＣＧＴＣＧＡ−３’
（配列番号：４２８）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７３１遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト骨髄組織（ＬＩＢ２５５）から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するのに用いたｃＤＮＡライブラリは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１）参照）に、独特のＸｏｌ及びＮｏｔＩ部位でクローニングした。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７３１の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３９５（ＤＮＡ４８３３１−１３２９）と命名される］（配列番号：４２４）及びＰＲＯ７３１の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３９５（ＤＮＡ４８３３１−１３２９）の全核酸配列をＦｉｇ１７０Ａ−Ｂ（配列番号：４２４）に示す。クローンＵＮＱ３９５（ＤＮＡ４８３３１−１３２９）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３２９−３３１に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置３８８１−３８８３の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１７０Ａ−Ｂ）。予測されるポリペプチド前駆体は１１８４アミノ酸長である（Ｆｉｇ１７１）。Ｆｉｇ１７１に示した全長ＰＲＯ７３１タンパク質は、約１２９，０２２ダルトンの見積もり分子量及び約５．２のｐＩを有する。クローンＵＮＱ３９５（ＤＮＡ４８３３１−１３２９）は１９９８年３月３１日にＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ７３１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、多数のプロトカドヘリンファミリーと有意な同一性及び類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ７３１が新規なプロトカドヘリンとなりうることを示している。
配列番号：４２５のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号：４２５のおよそアミノ酸１−１３である。膜貫通ドメインは配列番号：４２５のおよそアミノ酸７１９−７３９である。配列番号：４２５のＮ−グリコシル化部位は次の通りである：４１５−４１８、５８２−５８６、６５９−６６２、６６２−６６５及び８５７−８６０。カドヘリン細胞外繰り返しドメインシグネーチャーは（配列番号：４２５の）およそアミノ酸１２３−１３３、２３２−２４２、３４０−３５０、４４８−４５８及び５５３−５６３である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０４９８】
実施例６９：ヒトＰＲＯ２１８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ１７４１１と命名される。２つの独自に開発したジェネンテクＥＳＴ配列をコンセンサス構築に使用し、それらをＦｉｇ１７４及び１７５に示した。ＤＮＡ１７４１１コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ２１８の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＡＧＴＧＧＡＧＣＣＧＧＡＧＣＣＴＴＣＣ−３’（配列番号：４３３）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＣＧＴＴＧＴＴＴＡＴＧＣＡＧＴＡＧＴＣＧＧ−３’（配列番号：４３４）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ１７４１１配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＡＴＴＧＴＴＴＡＡＡＧＡＣＴＡＴＧＡＧＡＴＡＣＧＴＣＡＧＴＡＴＧＴＴＧＴＡＣＡＧＧ−３’（配列番号：４３５）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ２１８遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２８）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ２１８の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ１９２（ＤＮＡ３０８６７−１３３５）と命名される］（配列番号：４２９）及びＰＲＯ２１８の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ１９２（ＤＮＡ３０８６７−１３３５）の全核酸配列をＦｉｇ１７２（配列番号：４２９）に示す。クローンＵＮＱ１９２（ＤＮＡ３０８６７−１３３５）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１５０−１５２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１５１５−１５１７の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１７２）。予測されるポリペプチド前駆体は４５５アミノ酸長である（Ｆｉｇ１７３）。Ｆｉｇ１７３に示した全長ＰＲＯ２１８タンパク質は、約５２，９１７ダルトンの見積もり分子量及び約９．５のｐＩを有する。クローンＵＮＱ１９２（ＤＮＡ３０８６７−１３３５）は１９９８年４月２８日にＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ２１８ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ＰＲＯ２１８が新規な膜貫通タンパク質となりうることを示している。
配列番号：４３０のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号：４３０のおよそアミノ酸１〜２３である。膜貫通ドメインは潜在的に配列番号：４３０のおよそアミノ酸３７−５５、８１−１０２、１５０−１６８、２８８−３１１、３３８−３５６、３７５−３９８及び４２５−４４４である。Ｎ−グリコシル化部位は配列番号：４３０のおよそアミノ酸６７、１８０及び２４３にある。真核生物コバラミン（ｃｏｂａｌａｍｉｎ）結合タンパク質は配列番号：４３０のおよそアミノ酸１５１−１６０である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０４９９】
実施例７０：ヒトＰＲＯ７６８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４３４４８と命名される。ＤＮＡ４３４４８コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７６８の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＧＣＴＧＡＣＡＣＣＧＣＡＧＴＧＣＴＣＴＴＣＡＧ−３’（配列番号：４３８）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＣＴＧＣＡＡＴＧＴＡＧＣＴ−３’（配列番号：４３９）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４３４４８配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＡＴＣＣＴＣＣＡＴＧＴＣＴＣＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＴＣＴＡＴＴＧＣＴＣＣＡＣＧＡＡＧＣＡＴＣ−３’（配列番号：４４０）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７６８遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト骨髄組織（ＬＩＢ２５５）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７６８の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４０６（ＤＮＡ５５７３７−１３４５）と命名される］（配列番号：４３６）及びＰＲＯ７６８の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４０６（ＤＮＡ５５７３７−１３４５）の全核酸配列をＦｉｇ１７６Ａ−Ｂ（配列番号：４３６）に示す。クローンＵＮＱ４０６（ＤＮＡ５５７３７−１３４５）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２０−２２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置３４４３−３４４５の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１７６Ａ−Ｂ）。予測されるポリペプチド前駆体は１１４１アミノ酸長である（Ｆｉｇ１７７）。Ｆｉｇ１７７に示した全長ＰＲＯ７６８タンパク質は、約１２４，６７１ダルトンの見積もり分子量及び約５．８２のｐＩを有する。クローンＵＮＱ４０６（ＤＮＡ５５７３７−１３４５）は１９９８年４月６日にＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ７６８ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がインテグリン７と有意な配列同一性及び類似性を有することを示唆している。
配列番号：４３７のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号：４３７のおよそアミノ酸１−３３である。膜貫通ドメインは配列番号：４３７のアミノ酸１０３９−１０６４にある。Ｎ−グリコシル化部位は配列番号：４３７のアミノ酸：８６−８９、７４６−７４９、９４９−９５２、９８５−９８８、及び１００５−１００８にある。インテグリンアルファ鎖タンパク質ドメインは配列番号：４３７のおよそアミノ酸：１０６４−１０７１、３８４−４０９、１０４１−１０７１、３１７−３４６、４４３−４６５、３８５−４０７、２１５−２２４、６３４−６４７、８５−９９、３２２−３４６、４７０−４７９、４４２−４６６、３７９−４０８及び１０３１−１０４７である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０５００】
実施例７１：ヒトＰＲＯ７７１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４３３３０と命名される。ＤＮＡ４３３３０配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７７１の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＡＧＣＡＡＴＡＴＴＣＡＧＡＡＧＣＧＧＣＡＡＧＧＧ−３’（配列番号：４４３）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＡＴＣＡＴＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣ−３’
（配列番号：４４４）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４３３３０コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＧＴＴＡＣＴＡＣＡＡＧＣＣＡＡＣＡＣＡＡＴＧＴＣＡＴＧＧＣＡＧＴＧＴＴＧＧＡＣＡＧＴＧＣＴＧＧ−３’ （配列番号：４４５）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７７１遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２８）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７７１の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４０９（ＤＮＡ４９８２９−１３４６）と命名される］（配列番号：４４１）及びＰＲＯ７７１の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４０９（ＤＮＡ４９８２９−１３４６）の全核酸配列をＦｉｇ１７８（配列番号：４４１）に示す。クローンＵＮＱ４０９（ＤＮＡ４９８２９−１３４６）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１３４−１３６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１４４２−１４４４の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１７８）。予測されるポリペプチド前駆体は４３６アミノ酸長である（Ｆｉｇ１７９）。Ｆｉｇ１７９に示した全長ＰＲＯ７７１タンパク質は、約４９，４２９ダルトンの見積もり分子量及び約４．８のｐＩを有する。クローンＵＮＱ４０９（ＤＮＡ４９８２９−１３４６）は１９９８年４月７日にＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ７７１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がテスチカ（ｔｅｓｔｉｃａｎ）タンパク質と有意な相同性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ７７１が新規なテスチカン相同体となりうることを示している。
配列番号：４４２のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチド、ロイシンジッパーパターン、Ｎ−ミリストイル化部位、及びチログロブリン（ｔｈｙｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）１型リピートもＦｉｇ１７９に示した。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０５０１】
実施例７２：ヒトＰＲＯ７３３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４５６００と命名される。ＤＮＡ４５６００コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７３３の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＣＣＡＧＣＡＧＧＧＡＴＧＧＧＣＧＡＣＡＡＧＡ−３’（配列番号：４４８）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＴＣＴＴＣＣＡＧＴＴＴＣＡＴＡＴＣＣＡＡＴＡ−３’（配列番号：４４９）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４５６００コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＣＡＧＡＡＧＧＡＧＣＡＣＧＧＧＧＡＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＣＴＴＧＴＣＧＣＣＣＡＴ−３’（配列番号：４５０）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７３３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト骨髄組織（ＬＩＢ２５５）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７３３の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４１１（ＤＮＡ５２１９６−１３４８）と命名される］（配列番号：４４６）及びＰＲＯ７３３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４１１（ＤＮＡ５２１９６−１３４８）の全核酸配列をＦｉｇ１８０Ａ−Ｂ（配列番号：４４６）に示す。クローンＵＮＱ４１１（ＤＮＡ５２１９６−１３４８）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１０６−１０８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置７９３−７９５の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１８０Ａ−Ｂ）。予測されるポリペプチド前駆体は２２９アミノ酸長である（Ｆｉｇ１８１）。Ｆｉｇ１８１に示した全長ＰＲＯ７３３タンパク質は、約２６，０１７ダルトンの見積もり分子量及び約４．７３のｐＩを有する。クローンＵＮＱ４１１（ＤＮＡ５２１９６−１３４８）は１９９８年４月７日にＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ７３３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がＴ１／ＳＴ２レセプター結合タンパク質前駆体と有意な配列同一性及び類似性を有し、従って細胞シグナル伝達において類似の機能を有することを示唆している。それがサイトカインである場合、炎症及び癌の治療に有用であろう。
配列番号：４４７のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、Ｎ−ミリストイル化部位、及びチロシンキナーゼ部位もＦｉｇ１８１に示した。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０５０２】
実施例７３：ヒトＰＲＯ１６２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベースを検索し、ヒト膵炎関連タンパク質と相同性を示すＥＳＴ　ＡＡ３９７５４３を同定した。ＥＳＴ　ＡＡ３９７５４３コール（ｃｏｌｅ）を購入し、その挿入物を得て配列決定し、得られた配列をＦｉｇ１８２（配列番号：４５１）に示した。
ＰＲＯ１６２の全核酸配列をＦｉｇ１８２（配列番号：４５１）に示す。このクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１６２の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４２９（ＤＮＡ５６９６５−１３５６）と命名される］（配列番号：４５１）及びＰＲＯ１６２の誘導タンパク質配列を与えた。クローンＵＮＱ４２９（ＤＮＡ５６９６５−１３５６）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８６−８８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置６１１−６１３の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１８２）。予測されるポリペプチド前駆体は１７５アミノ酸長である（Ｆｉｇ１８３）。Ｆｉｇ１８３に示した全長ＰＲＯ１６２タンパク質は、約１９，３３０ダルトンの見積もり分子量及び約７．２５のｐＩを有する。クローンＵＮＱ４２９（ＤＮＡ５６９６５−１３５６）はＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ１６２ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がヒト膵炎関連タンパク質と有意な相同性する事を示唆し、それによりＰＲＯ１６２が新規な膵炎関連タンパク質となりうることを示している。
配列番号：４５２のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号：４５２のおよそアミノ酸１−２６である。Ｃ型レクチンドメインシグネーチャーは配列番号：４５２のおよそアミノ酸１４６−１７１である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０５０３】
実施例７４：ヒトＰＲＯ７８８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載したように、ｐｈｒａｐを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ４９３０８と命名する）を構築した。ＤＮＡ４９３０８コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン番号２７７７２８２との間に観察された相同性に基づき、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン番号２７７７２８２を購入し、その挿入物を得て配列決定し、ＰＲＯ７８８の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４３０（ＤＮＡ５６４０５−１３５７）と命名される］（配列番号：４５３）及びＰＲＯ７８８の誘導タンパク質配列を与えた。
クローンＵＮＱ４３０（ＤＮＡ５６４０５−１３５７）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８４−８６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置４５９−４６１の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１８４）。予測されるポリペプチド前駆体は１２５アミノ酸長である（Ｆｉｇ１８５）。Ｆｉｇ１８５に示した全長ＰＲＯ７８８タンパク質は、約１３，１１５ダルトンの見積もり分子量及び約５．９０のｐＩを有する。クローンＵＮＱ４３０（ＤＮＡ５６４０５−１３５７）はＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
Ｆｉｇ１８５の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号：４５４のおよそアミノ酸１−１７に見られる。Ｎ−グリコシル化部位は配列番号：４５４のおよそアミノ酸４６−４９である。
【０５０４】
実施例７５：ヒトＰＲＯ１００８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載したように、ｐｈｒａｐを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列をＤＮＡ４９８０４と命名する。ジェネンテクが独自に開発したＥＳＴをコンセンサス構築に用い、ここでＤＮＡ１６５０８（Ｆｉｇ１８８；配列番号：４５７）と命名する。ＤＮＡ４９８０４配列とＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号ＡＡ１４３６７０との間に観察された相同性に基づき、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号ＡＡ１４３６７０を購入し、その挿入物を得て配列決定した。ここで、この配列はＦｉｇ１８６（配列番号：４５５）に示す。
配列決定は、ＰＲＯ１００８の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４９２（ＤＮＡ５７５３０−１３７５）と命名される］（配列番号：４５５）及びＰＲＯ１００８の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４９２（ＤＮＡ５７５３０−１３７５）の全核酸配列をＦｉｇ１８６（配列番号：４５５）に示す。クローンＵＮＱ４９２（ＤＮＡ５７５３０−１３７５）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１３８−１４０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９３６−９３８の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１８６）。予測されるポリペプチド前駆体は２６６アミノ酸長である（Ｆｉｇ１８７）。Ｆｉｇ１８７に示した全長ＰＲＯ１００８タンパク質は、約２８，６７２ダルトンの見積もり分子量及び約８．８５のｐＩを有する。クローンＵＮＱ４９２（ＤＮＡ５７５３０−１３７５）は１９９８年５月２０日にＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ１００８ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がｍｄｋｋ−１と有意な配列同一性及び／又は類似性を有し、それによりＰＲＯ１００８がこのファミリーの新規なメンバーであり、ヘッド誘発活性を有することを示している。
配列番号：４５６のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号：４５６のおよそアミノ酸１−２３である。Ｎ−グリコシル化部位は配列番号：４５６のおよそアミノ酸２５６−２５９であり、真菌ｚｎ−（２）−ｃｙｓ（６）二核クラスタードメインは配列番号：４５６のおよそアミノ酸１１０−１２６である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０５０５】
実施例７６：ヒトＰＲＯ１０１２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４９３１３と命名される。ＤＮＡ４９３１３コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１０１２の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＣＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＡＣＡＣＴＧＣＣ−３’（配列番号：４６０）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＡＴＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡＡＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号：４６１）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４９３１３コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＴＧＧＴＧＡＴＧＡＴＡＧＡＡＴＧＣＴＴＴＧＣＣＧＡＡＴＧＡＡＡＧＧＡＧＴＣＡＡＣＡＧＣＴＡＴＣＣＣ−３’
（配列番号：４６２）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１０１２遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１０１２の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４９５（ＤＮＡ５６４３９−１３７６）と命名される］（配列番号：４５８）及びＰＲＯ１０１２の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４９５（ＤＮＡ５６４３９−１３７６）の全核酸配列をＦｉｇ１８９Ａ−Ｂ（配列番号：４５８）に示す。クローンＵＮＱ４９５（ＤＮＡ５６４３９−１３７６）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４０４−４０６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２６４５−２６４７の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１８９Ａ−Ｂ）。予測されるポリペプチド前駆体は７４７アミノ酸長である（Ｆｉｇ１９０）。Ｆｉｇ１９０に示した全長ＰＲＯ１０１２タンパク質は、約８６，１２７ダルトンの見積もり分子量及び約７．４６のｐＩを有する。クローンＵＮＱ４９５（ＤＮＡ５６４３９−１３７６）は１９９８年５月１４日にＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ１０１２ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がジスルフィドイソメラーゼと有意な配列同一性を有し、それによりＰＲＯ１０１２が新規なジスルフィドイソメラーゼ関連タンパク質となりうることを示している。
配列番号：４５９のアミノ酸配列の更なる分析により、チトクロムＣファミリーヘム結合部位シグネーチャーは配列番号：４５９のおよそアミノ酸１５８−１６３である。Ｎｔ−ＤＮＡＪドメインシグネーチャーは配列番号：４５９のおよそアミノ酸７７−９６である。Ｎ−グリコシル化部位は配列番号：４５９のおよそアミノ酸４８４−４８７である。ＥＲ標的配列は配列番号：４５９のおよそアミノ酸７４４−７４７である。開示したポリペプチド及び核酸は、これに換わる実施例において、必要に応じてこれらの部分有り又は無しで日常的に作成できると理解される。例えば、ＥＲ標的配列無しのＰＲＯ１０１２を生成するのが好ましい場合もある。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０５０６】
実施例７７：ヒトＰＲＯ１０１４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載したように、ｐｈｒａｐを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築し、得られたコンセンサス配列をＤＮＡ４９８１１と命名する。ＤＮＡ４９８１１配列とＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン番号２６１２２０７との間に観察された相同性に基づき、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン番号２６１２２０７を購入し、その挿入物を得て配列決定し、得られた配列をＦｉｇ１９１（配列番号：４６３）に示す。
配列決定は、ＰＲＯ１０１４の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４９７（ＤＮＡ５６４０９−１３７７）と命名される］（配列番号：４６３）及びＰＲＯ１０１４の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４９７（ＤＮＡ５６４０９−１３７７）の全核酸配列をＦｉｇ１９１（配列番号：４６３）に示す。クローンＵＮＱ４９７（ＤＮＡ５６４０９−１３７７）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６６−６８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９６６−９６８の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１９１）。予測されるポリペプチド前駆体は３００アミノ酸長である（Ｆｉｇ１９２）。Ｆｉｇ１９２に示した全長ＰＲＯ１０１４タンパク質は、約３３，６５５ダルトンの見積もり分子量及び約９．３１のｐＩを有する。クローンＵＮＱ４９７（ＤＮＡ５６４０９−１３７７）は１９９８年５月２０日にＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ１０１４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がレダクターゼと有意な配列同一性を有し、それによりＰＲＯ１０１４がレダクターゼファミリーの新規なメンバーとなることを示している。
配列番号：４６４のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号：４６４のおよそアミノ酸１−１９である。ｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位は配列番号：４６４のおよそアミノ酸３０−３３である。短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリータンパク質は配列番号：４６４のおよそアミノ酸１６５−２０２、３７−４９、１１２−１２２及び２１０−２１９である。これらのドメイン及び他のここに提供したアミノ酸の対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０５０７】
実施例７８：ヒトＰＲＯ１０１７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載したように、ｐｈｒａｐを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築し、このコンセンサス配列をＤＮＡ５３２３５と命名する。ＤＮＡ５３２３５配列とＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号ＡＡ２４３０８６との間に観察された相同性に基づき、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号ＡＡ２４３０８６を購入し、その挿入物を得て配列決定し、得られた配列をＦｉｇ１９３（配列番号：４６５）に示した。ＤＮＡ配列決定は、ＰＲＯ１０１７の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ５００（ＤＮＡ５６１１２−１３７９）と命名される］（配列番号：４５６）及びＰＲＯ１０１７の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ５００（ＤＮＡ５６１１２−１３７９）の全核酸配列をＦｉｇ１９３（配列番号：４６５）に示す。クローンＵＮＱ５００（ＤＮＡ５６１１２−１３７９）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１２８−１３０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１３７０−１３７２の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１９３）。予測されるポリペプチド前駆体は４１４アミノ酸長である（Ｆｉｇ１９４）。Ｆｉｇ１９４に示した全長ＰＲＯ１０１７タンパク質は、約４８，４１４ダルトンの見積もり分子量及び約９．５４のｐＩを有する。クローンＵＮＱ５００（ＤＮＡ５６１１２−１３７９）はＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ１０１７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がＨＮＫ−１、スルホトランスフェラーゼと配列同一性を有し、それによりＰＲＯ１０１７が新規なスルホトランスフェラーゼとなりうることを示している。
配列番号：４６６のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号：４６６のおよそアミノ酸１−３１である。Ｎ−グリコシル化部位は配列番号：４６６のおよそアミノ酸１３４−１３７、２０９−２１２、２８０−２８３及び３７０−２７３である。ＴＮＦＲ／ＮＧＦＲファミリーシステイン富化領域タンパク質は配列番号：４６６のおよそアミノ酸３２９−３３２である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０５０８】
実施例７９：ヒトＰＲＯ４７４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載したように、ｐｈｒａｐを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築し、得られたコンセンサス配列をＤＮＡ４９８１８と命名する。ＤＮＡ４９８１８配列とＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号Ｈ７７８８９との間に観察された相同性に基づき、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号Ｈ７７８８９を購入し、その挿入物を得て配列決定し、得られた配列をＦｉｇ１９５（配列番号：４６７）に示した。ＤＮＡ配列決定は、ＰＲＯ４７４の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ５０２（ＤＮＡ５６０４５−１３８０）と命名される］（配列番号：４６７）及びＰＲＯ４７４の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ５０２（ＤＮＡ５６０４５−１３８０）の全核酸配列をＦｉｇ１９５（配列番号：４６７）に示す。クローンＵＮＱ５０２（ＤＮＡ５６０４５−１３８０）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１０６−１０８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９１６−９１８の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１９５）。予測されるポリペプチド前駆体は２７０アミノ酸長である（Ｆｉｇ１９６）。Ｆｉｇ１９６に示した全長ＰＲＯ４７４タンパク質は、約２８，３１７ダルトンの見積もり分子量及び約６．０のｐＩを有する。クローンＵＮＱ５０２（ＤＮＡ５６０４５−１３８０）はＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号：４６８のアミノ酸配列の更なる分析により、Ｎ−グリコシル化部位は配列番号：４６８のおよそアミノ酸１３８−１４１である。短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリータンパク質は配列番号：４６８のおよそアミノ酸１０−２２、８１−９１、１３４−１７１及び１７６−１８５である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０５０９】
実施例８０：ヒトＰＲＯ１０３１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載したように、ｐｈｒａｐを用いて他のＥＳＴ配列に対して最初のコンセンサスＤＮＡ配列を構築し、このコンセンサス配列をＤＮＡ４７３３２と命名する。ＤＮＡ４７３３２配列とＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号Ｗ７４５５８との間に観察された相同性に基づき、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号Ｗ７４５５８を購入し、その挿入物を得て配列決定し、得られた配列をＦｉｇ１９７（配列番号：４６９）に示した。ＤＮＡ配列決定は、ＰＲＯ１０３１の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ５１６（ＤＮＡ５９２９４−１３８１）と命名される］（配列番号：４６９）及びＰＲＯ１０３１の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ５１６（ＤＮＡ５９２９４−１３８１）の全核酸配列をＦｉｇ１９７（配列番号：４６９）に示す。クローンＵＮＱ５１６（ＤＮＡ５９２９４−１３８１）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４２−４４に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置５８２−５８４の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１９７）。予測されるポリペプチド前駆体は１８０アミノ酸長である（Ｆｉｇ１９８）。Ｆｉｇ１９８に示した全長ＰＲＯ１０３１タンパク質は、約２０，４３７ダルトンの見積もり分子量及び約９．５８のｐＩを有する。クローンＵＮＱ５１６（ＤＮＡ５９２９４−１３８１）はＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ１０３１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが新規なサイトカインであることを示唆している。
配列番号：４７０のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号：４７０のおよそアミノ酸１−２０である。Ｎ−グリコシル化部位は配列番号：４７０のおよそアミノ酸７５−７８である。ＩＬ−１７と配列同一性を持つ領域はおよそアミノ酸９６−１８０である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０５１０】
実施例８１：ヒトＰＲＯ９３８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載したように、ｐｈｒａｐを用いて他のＥＳＴ配列に対して最初のコンセンサスＤＮＡ配列を構築し、このコンセンサス配列をＤＮＡ４９７９８と命名する。ＤＮＡ４９７９８ＤＮＡコンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ９３８の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＴＣＣＡＧＣＣＣＡＴＧＡＣＣＧＣＣＴＣＣＡＡＣ−３’（配列番号：４７３）逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＣＴＣＴＣＣＴＣＡＴＣＣＡＣＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣ−３’（配列番号：４７４）さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４９７９８コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＴＧＧＡＴＧＣＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＣＧＣＣＣＣＡＴＧＧＴＧＴＣＣＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＣ−３’（配列番号：４７５）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ９３８遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ９３８の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４７５（ＤＮＡ５６４３３−１４０６）と命名される］（配列番号：４７１）及びＰＲＯ９３８の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４７５（ＤＮＡ５６４３３−１４０６）の全核酸配列をＦｉｇ１９９（配列番号：４７１）に示す。クローンＵＮＱ４７５（ＤＮＡ５６４３３−１４０６）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１３４−１３６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１１８１−１１８３の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ１９９）。予測されるポリペプチド前駆体は３４９アミノ酸長である（Ｆｉｇ２００）。Ｆｉｇ２００に示した全長ＰＲＯ９３８タンパク質は、約３８，９５２ダルトンの見積もり分子量及び約４．３４のｐＩを有する。Ｆｉｇ２００（配列番号：４７２）に示す全長ＰＲＯ９３８配列の分析により以下の特徴が明らかとなった：約アミノ酸１〜約アミノ酸２２のシグナルペプチド、約アミノ酸１９１〜約アミノ酸２１１の膜貫通ドメイン、約アミノ酸４６〜約アミノ酸４９の潜在的Ｎ−グリコシル化部位、約アミノ酸５６〜約アミノ酸７２のジスルフィドイソメラーゼ相同領域、及び約アミノ酸１７３〜約アミノ酸１８７のフラボドキシンタンパク質と配列同一性を持つ領域。
クローンＵＮＱ４７５（ＤＮＡ５６４３３−１４０６）は１９９８年５月１２日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ登録番号２０９８５７が付与されている。
全長ＰＲＯ９３８ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと有意な配列類似性を有し、それによりＰＲＯ９３８が新規なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとなりうることを示している。Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ９３８アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、Ｐ＿Ｗ０３６２６， Ｐ＿Ｗ０３６２７， Ｐ＿Ｒ７０４９１， ＧＡＲＰ＿ＰＬＡＦＦ， ＸＬＵ８５９７０＿１， ＡＣＡＤＩＳＰＲＯＡ＿１， ＩＥ６８＿ＨＳＶＳＡ， ＫＳＵ５２０ ６４＿１， Ｕ９３８７２＿８３， Ｐ＿Ｒ９７８６６との間の有意な相同性を明らかにした。
【０５１１】
実施例８２：ヒトＰＲＯ１０８２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
実施例１に記載したように、ｐｈｒａｐを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築し、このコンセンサス配列をＤＮＡ３８０９７と命名する。このコンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１０８２の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＴＣＣＡＣＡＧＡＣＡＧＴＣＡＴＣＴＣＡＧＧＡＧＣＡＧ−３’
（配列番号：４７８）
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＣＡＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＣＡＡＣＣＴＧ−３’（配列番号：４７９）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＡＴＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＴＡＣＣＴＣ−３’（配列番号：４８０）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３８０９７コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＣＣＡＡＧＧＡＴＡＧＣＴＧＴＴＧＴＴＴＣＡＧＡＧＡＡＡＧＧＡＴＣＧＴＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＣＣＴＣＣＴ−３’
（配列番号：４８１）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１０８２遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１０８２の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ５３９（ＤＮＡ５３９１２−１４５７）と命名される］（配列番号：４７６）及びＰＲＯ１０８２の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ５３９（ＤＮＡ５３９１２−１４５７）の全核酸配列をＦｉｇ２０１（配列番号：４７６）に示す。クローンＵＮＱ５３９（ＤＮＡ５３９１２−１４５７）は、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１６０−１６２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置７６３−７６５の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ２０１）。予測されるポリペプチド前駆体は２０１アミノ酸長である（Ｆｉｇ２０２）。Ｆｉｇ２０２に示した全長ＰＲＯ１０８２タンパク質は、約２２，５６３ダルトンの見積もり分子量及び約４．８７のｐＩを有する。クローンＵＮＱ５３９（ＤＮＡ５３９１２−１４５７）はＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号：４７７のアミノ酸配列の更なる分析により、膜貫通ドメインは配列番号：４７７のおよそアミノ酸４５−６５である。ｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位は配列番号：４７７のおよそアミノ酸１９７−２００である。Ｎ−ミリストイル化部位は配列番号：４７７のおよそアミノ酸３５−４０及び１５１−１５６である。ＬＤＬレセプターと配列同一性を持つ領域は配列番号：４７７のおよそアミノ酸３４−６７及び７０−２００である。これらのアミノ酸領域及び他に対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０５１２】
実施例８３：ヒトＰＲＯ１０８３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したアミラーゼスクリーニング技術を用いてｃＤＮＡを同定し、そのｃＤＮＡをここでＤＮＡ２４２５６（Ｆｉｇ２０５；配列番号：４８４）と命名する。次いで、上記実施例１に記載したように、このｃＤＮＡを他のＥＳＴ配列と比較して整列させてコンセンサスＤＮＡ配列を得て、それをＤＮＡ４３４２２と命名する。ＤＮＡ４３４２２コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１０８３の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＧＧＣＡＴＴＧＧＡＧＣＡＧＴＧＣＴＧＧＧＴＧ−３’（配列番号：４８５）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧＡＴＧＣＧＧＣＴＧＧＡＣＧ−３’（配列番号：４８６）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１０８３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１０８３の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ５４０（ＤＮＡ５０９２１−１４５８）と命名される］（配列番号：４８２）及びＰＲＯ１０８３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ５４０（ＤＮＡ５０９２１−１４５８）の全核酸配列をＦｉｇ２０３（配列番号：４８２）に示す。クローンＵＮＱ５４０（ＤＮＡ５０９２１−１４５８）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２１４−２１６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２２９３−２２９５の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ２０３）。予測されるポリペプチド前駆体は６９３アミノ酸長である（Ｆｉｇ２０４）。Ｆｉｇ２０４に示した全長ＰＲＯ１０８３タンパク質は、約７７，７３８ダルトンの見積もり分子量及び約８．８７のｐＩを有する。クローンＵＮＱ５４０（ＤＮＡ５０９２１−１４５８）はＡＴＣＣに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号：４８３のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号：４８３のおよそアミノ酸１−２５である。膜貫通ドメインは配列番号：４８３のおよそアミノ酸３８２−３９８、４０２−４２０、４４５−４６８、４７３−４９１、５１９−５３７、５６８−５９０及び６３４−６５７である。微小体Ｃ−末端標的化シグナルは配列番号：４８３のおよそアミノ酸６９１−６９３である。ｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位は配列番号：配列番号：４８３のおよそアミノ酸１９８−２０１及び３７０−３７３である。Ｎ−グリコシル化部位は配列番号：４８３のおよそアミノ酸３９−４２、１４８−１５１、１７１−１７４、２３４−２３７、３０３−３０６、３２４−２２７及び３４１−３４４である。Ｇ−プロテイン結合ファミリードメインは配列番号：４８３のおよそアミノ酸４７５−５０４である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【０５１３】
実施例８４：ヒトＰＲＯ２００をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＶＥＧＦとの相同性に基づいてＩｎｃｙｔｅ　Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓデータベースから同定された発現配列タグ（ＥＳＴ）に基づくプローブを、ヒト神経膠腫細胞系Ｇ６１から誘導されたｃＤＮＡライブラリのスクリーニングに使用した。特に、Ｉｎｃｙｔｅクローン「ＩＮＣ１３０２５１６」は以下のプローブを生成するのに用いた：
（配列番号：４８９）ＡＣＴＴＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＡＴＡＡＧＧＧ；
（配列番号：４９０）ＧＡＡＣＴＡＡＡＧＡＧＡＡＣＣＧＡＴＡＣＣＡＴＴＴＴＣＴＧＧＣＣＡＧＧＴＴＧＴＣ；
（配列番号：４９１）ＣＡＣＣＡＣＡＧＣＧＴＴＴＡＡＣＣＡＧＧ；及び
（配列番号：４９２）ＡＣＡＡＣＡＧＧＣＡＣＡＧＴＴＣＣＣＡＣ。
９つのポジティブを同定し特徴付けした。３つのクローンが全コード化領域を含み、配列で一致した。胎児肺ライブラリから部分的クローンも同定し、コードされるアミノ酸を変化させない１つのヌクレオチド変化を除いて神経膠腫誘導配列と一致した。
【０５１４】
実施例８５：ＰＲＯ２００の発現作成物
哺乳動物タンパク質発現のために、全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をＣＭＶ−ベース発現ベクターにクローニングした。エピトープタグ（ＦＬＡＧ， Ｋｏｄａｋ）及びヒスチジンタグ（Ｈｉｓ８）をＯＲＦと停止コドンの間に挿入した。ＶＥＧＦ−Ｅ−Ｈｉｓ８及びＶＥＧＦ−Ｅ−ＦＬＡＧを、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によりヒト胚腎臓２９３細胞に形質移入し、［３５Ｓ］メチオニン及び［３５Ｃ］システインで３時間パルス標識した。１５倍濃縮無血清条件培地２０マイクロリットルをドデシル硫酸ナトリウムバッファー中においてポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で電気泳動させたとき、両方のエピトープタグタンパク質を同時泳動させた（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。ヒトＦｃ（ＩｇＧ）配列の前でＯＲＦにクローニングすることによりＶＥＧＦ−Ｅ−ＩｇＧ発現プラスミドを作成した。
ＶＥＧＦ−Ｅ−ＩｇＧプラスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて、１０％ウシ胎児血清を添加したハンクのＴＮＭ−ＦＨ培地（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において成長させた１０５Ｓｆ９細胞にＢａｃｕｌｏｇｏｌｄバキュロウイルスＤＮＡ（Ｐｈａｒｍａｇｅｎ）で同時形質移入した。細胞を２８℃で５日間インキュベートした。上清を回収し、次いで約１０の感染多発性（ＭＯＩ）でのＳｆ９細胞感染による第１のウイルス増幅に使用した。細胞を３日間インキュベートし、次いで上清を回収し、１ｍｌの上清の３０μｌのプロテインＡセファロースＣＬ−４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）への結合、続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により組換えプラスミドの発現を決定した。第１の増幅の上清を、ＥＳＦ−９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＬＬＣ）で約０．１のＭＯＩで成長させたＳｆ９細胞のスピナー培地５００ｍｌの感染に使用して。回収した上清を無菌濾過した以外は細胞を上記のように処理した。特定のタンパク質を、プロテインＡセファロース４ファストフロー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに結合させることにより精製した。
【０５１５】
実施例８６：ＰＲＯ２００のノーザンブロット分析
複数の成人及び胎児組織及び腫瘍細胞系からヒトポリ（Ａ）＋ＲＮＡのブロットをＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ ａｌｔｏ， ＣＡ）から得た。ハイブリッド形成は、全コード化領域を含む３２Ｐ−標識プローブを用いて実施し、０．１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６３℃において洗浄した。
ＶＥＧＦ−ＥｍＲＮＡは、胎児肺、腎臓、脳、肝臓及び成人心臓、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、及び膵臓で検出可能であった。またＶＥＧＦ−ＥｍＲＮＡは、Ａ５４９肺腺癌及びＨｅＬａ頸部腺癌細胞系でも見られた。
【０５１６】
実施例８７：ＰＲＯ２００についてのヒト胎児組織切片のインサイツハイブリッド形成
ホルマリン固定、パラフィン包埋したヒト胎児脳、肝臓、下肢、小腸、甲状腺、リンパ腺、胸腺、副腎、心臓、大動脈、及び皮膚を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼＫ（２０μｇ／ｍｌ）で３７℃において１５分間脱タンパクし、さらに、Ｌｕ ＬＨ及びＧｉｌｌｅｔｔ ＮＡ（Ｃｅｌｌ Ｖｉｓｉｏｎ １： １６９−１７６， １９９４）に記載されているようにインサイツハイブリッド形成のために加工した。［α−３３−Ｐ］ＵＴＰ−標識アンチセンスリボプローブを９８ｂｐのＰＣＲ産物（プライマーＧＧＣＧＧＡＡＴＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＴＡＧ及びＧＣＧＧＣＴＡＴＣＣＴＣＣＴＧＴＧＣＴＣ、各々配列番号：４９３及び４９４）から生成した。スライドをＫｏｄａｋ ＮＴＢ２核トラックエマルションに浸漬し４週間露出した。
ＶＥＧＦ−ＥｍＲＮＡ発現は成長プレート領域での局在化及び胎児筋細胞の包囲を含んでいた。
【０５１７】
実施例８８：ＰＲＯ２００についての筋細胞肥大アッセイ
新生ハーランＳＤラット心室（妊娠２３日）からの筋細胞を、９６−ウェルプレートにおいて７５０００細胞／ｍｌで２通りに配した。細胞を。２０００、２００、２０、又は２ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ｅ−ＩｇＧで４８時間処理した。筋細胞をクリスタルバイオレットで染色して形態を可視化し、３を無刺激及び７を完璧な肥大として３から７の評点付けをした。
２０００ｎｇ／ｍｌ及び２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ｅは肥大を生じ、５に評点付けされた。
【０５１８】
実施例８９：ＰＲＯ２００についての細胞増殖アッセイ
マウス胚繊維芽細胞Ｃ３ＨｌＯＴ１／２細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む５０：５０のハムＦ−１２：低グルコースＤＭＥＭ培地で成長させた。細胞を２４−ウェルペレットにおいて１０００、２０００及び４０００細胞／ウェルで２通りには配した。４８時間後、細胞を２％ＦＣＳを含む培地に移し、２００、８００、又は２０００ｎｇ／ｍｌＶＥＧＦ−Ｅと共に、又は成長因子を添加せずに７２時間インキュベートした。
３種の細胞密度の全てにおいて、２００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ｅが存在すると、それが無い場合より約１．５倍多数の細胞が測定された。
【０５１９】
実施例９０：ＰＲＯ２００についての内皮細胞生存アッセイ
ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ， Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を完全培地（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中に維持し、４８−ウェルプレートに２０，０００細胞／ウェルで、無血清培地（Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍからの基本培地、０．１％ＢＳＡ含有）に３回蒔いた。細胞を、２００又は４００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ−Ｅ−ＩｇＧ、１００ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌの塩基性ＥＧＦと共に、又は無添加で５日間インキュベートした。
ＶＥＧＦ−Ｅでは、成長因子無添加に比較して２−３倍の多くが生存していた。ＶＥＧＦ及びＥＧＦは正の対照に含まれる。
【０５２０】
実施例９１：ヒトＰＲＯ２８５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
独自に開発された発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ（商品名）、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を検索して、ショウジョウバエＴｏｌｌタンパク質と相同性を示すＥＳＴ（＃２２４３２０９）を同定した。
ＥＳＴに基づいて、ＰＣＲプローブの対：
ＴＡＡＡＧＡＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＡＣＣＧ（配列番号：４９９）
ＡＴＣＣＡＴＧＡＧＣＣＴＣＴＧＡＴＧＧＧ （配列番号：５００）、及び
プローブ：
ＡＴＴＴＡＴＧＴＣＴＣＧＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＣＴＧＧＴＴＡＣＣＡＧＧＧＣＡＧＣＣＡＧＴＴＣ（配列番号：５０１）を合成した。
ｃＤＮＡライブラリを作成するためのｍＲＮＡはヒト胎盤組織から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するのに用いたｃＤＮＡライブラリは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ（Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ ２）からのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｉｎｃ．）に、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ（Ｓｕｐｅｒ ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）からの試薬及びプロトコールを用いてクローニングした。２本鎖ｃＤＮＡを１０００ｂｐより大きなものにサイズ分類し、ｃＤＮＡをＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＣＲ２．１は市販のプラスミドであり、ＰＣＲ断片の容易なクローニングのために設計され、選択のためのＡｍｐＲ及びＫａｎＲ遺伝子及び青−白選択のためのＬａｃＺ遺伝子を保有する。
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ２８５遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡクローン全体を配列決定した。ＤＮＡ４００２１−１１５４（ＰＲＯ２８５をコードする）の全核酸配列をＦｉｇ２０８（配列番号：４９５）に示す。クローンＤＮＡ４００２１−１１５４は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６１−６３に見かけの翻訳開始部位を持つ（Ｆｉｇ２０８）。予測されるポリペプチド前駆体は１０４９アミノ酸長であり、アミノ酸位置１−２９に推定シグナルペプチド、アミノ酸位置８３７−８６０に推定膜貫通ドメイン、及び各々アミノ酸位置１３２−１５３及び７０４−７２５にロイシンジッパーパターンを有する。表示した境界はおよそのものであり、表示した領域の正確な境界は数アミノ酸異なる可能性があることを注記しておく。クローンＤＮＡ４００２１−１１５４はＡＴＣＣに寄託され（命名：ＤＮＡ４００２１−１１５４）、ＡＴＣＣ寄託番号２０９３８９が付与された。
（ＡＬＩＧＮコンピュータプログラムを用いた）ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメント分析に基づいて、全長配列は、ショウジョウバエＴｏｌｌタンパク質のヒト相同体であり、以下のヒトＴｏｌｌタンパク質の相同体である：Ｔｏｌｌ（ＤＮＡＸ＃ ＨＳＵ８８５４０−１これはランダム配列した全長ｃＤＮＡ ＃ＨＵＭＲＳＣ７８６−１と同一である）；Ｔｏｌｌ３（ＤＮＡＸ＃ ＨＳＵ８８８７９−１）；及びＴｏｌｌ４（ＤＮＡＸ＃ ＨＳＵ８８８８０−１）。
【０５２１】
実施例９２：ヒトＰＲＯ２８６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
独自に開発された発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ（商品名）、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を検索して、ショウジョウバエＴｏｌｌタンパク質と相同性を示すＥＳＴ（＃６９４４０１）を同定した。
ＥＳＴに基づいて、ＰＣＲプローブの対（正及び逆方向）：
ＧＣＣＧＡＧＡＣＡＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＣＣ（配列番号：５０２）
ＣＡＴＣＣＡＴＧＴＴＣＴＣＡＴＣＣＡＴＴＡＧＣＣ（配列番号：５０３）、及び
プローブ：
ＴＣＧＡＣＡＡＣＣＴＣＡＴＧＣＡＧＡＧＣＡＴＣＡＡＣＣＡＡＡＧＣＡＡＧＡＡＡＡＣＡＧＴＡＴＴ（配列番号：５０４）を合成した。
ｃＤＮＡライブラリを作成するためのｍＲＮＡはヒト胎盤組織から単離した。このＲＮＡは、ベクターｐＲＫ５ＤにおいてオリゴｄＴプライムしたｃＤＮＡライブラリを、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｉｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ（Ｓｕｐｅｒ ｓｃｒｉｐｔ Ｐｌａｓｍｉｄ ｓｙｓｔｅｍ）からの試薬及びプロトコールを用いて生成するのに使用した。ｐＲＫ５は、ＸｈｏＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位の前にＳｆｉＩ制限酵素部位に続くｓｐ６転写開始部位を持つクローニングベクターである。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動で約１０００ｂｐより大きなサイズ分類し、所定の方向でＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ−切断ｐＲＫＤにクローニングした。
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ２８６遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡクローン全体を配列決定した。ＤＮＡ４２６６３−１１５４（ＰＲＯ２８６をコードする）の全核酸配列をＦｉｇ２１０Ａ−Ｂ（配列番号：４９７）に示す。クローンＤＮＡ４２６６３−１１５４は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５７−５９に見かけの翻訳開始部位を持つ（Ｆｉｇ２１１）。予測されるポリペプチド前駆体は１０４１アミノ酸長であり、アミノ酸位置１−２６に推定シグナルペプチド、アミノ酸位置８２６−８４８に推定膜貫通ドメイン、及び各々アミノ酸位置１３０−１５１、２０６−２２７、６６２−６８４、６６９−６９０及び６９３−６１４にロイシンジッパーパターンを有する。表示した境界はおよそのものであり、表示した領域の正確な境界は数アミノ酸異なる可能性があることを注記しておく。クローンＤＮＡ４２６６３−１１５４はＡＴＣＣに寄託され（命名：ＤＮＡ４２６６３−１１５４）、ＡＴＣＣ寄託番号２０９３８６が付与された。
ＰＲＯ２８６の全長配列の（ＡＬＩＧＮコンピュータプログラムを用いた）ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメント分析に基づいて、それがショウジョウバエＴｏｌｌタンパク質のヒト相同体であり、以下のヒトＴｏｌｌタンパク質の相同体である：Ｔｏｌｌ１（ＤＮＡＸ＃ ＨＳＵ８８５４０−１これはランダム配列した全長ｃＤＮＡ ＃ＨＵＭＲＳＣ７８６−１と同一である）；Ｔｏｌｌ２（ＤＮＡＸ＃ ＨＳＵ８８８７８−１）；Ｔｏｌｌ３（ＤＮＡＸ＃ ＨＳＵ８８８７９−１）；及びＴｏｌｌ４（ＤＮＡＸ＃ ＨＳＵ８８８８０−１）。
【０５２２】
実施例９３：ＰＲＯ２８５及びＰＲＯ２８６についてのＮＦ−κＢアッセイ
ＮＦ−κＢ経路を通したＴｏｌｌタンパク質シグナルと同様に、それらの生物学的活性はＮＦ−κＢアッセイで試験できる。このアッセイにおいて、ジャーカット細胞は、製造者の指示に従ってリポフェクタミン試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて一過的に形質移入される。ＮＦ−κＢ制御ルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＢ２ＸＬｕｃプラスミドの１μｇを、ＰＲＯ２８５又はＰＲＯ２８６をコードする挿入物有又は無のｐＳＲαＮ発現ベクターと同時形質移入する。正の対照として、細胞をＰＭＡ（ホルボールミリスチルアセテート；２０ｎｇ／ｍｌ）及びＰＨＡ（フィトヘマグルチニン；２μｇ／ｍｌ）で３から４時間処理した。細胞は、２から３日後に、Ｐｒｏｍｅｇａからの試薬を用いたルシフェラーゼ活性の測定のために溶解させた。
【０５２３】
実施例９４：ヒトＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及びＰＲＯ１４４９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したようにｐｈｒａｐを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を作成した。このコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ２８７３５と命名される。ＤＮＡ２８７３５コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー　５’−ＴＧＧＡＧＣＡＧＣＡＡＴＡＴＧＣＣＡＧＣＣ−３’（配列番号：５１１）
逆方向ＰＣＲプライマー　５’− ＴＴＴＴＣＣＡＣＴＣＣＴＧＴＣＧＧＧＴＴＧＧ−３’（配列番号：５１２）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ２８７３５配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
５’−ＧＧＴＧＡＣＡＣＴＴＧＣＣＡＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＧＡＴＧＡＡＴＧＣＡＧＴＧＣＴＡＧＧＡＧＧＧ−３’（配列番号：５１３）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肺組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ２１３−１、ＰＲＯ１３３０及び／又はＰＲＯ１４４９ＰＲＯ２３７の全長ＤＮＡ配列［各々、ＤＮＡ３０９４３−１−１１６３−１（配列番号：５０５）、ＤＮＡ６４９０７−１１６３−１（配列番号：５０７）及びＤＮＡ６４９０８−１１６３−１（配列番号：５０９）と命名される］を与えた。
各々ＤＮＡ３０９４３−１−１１６３−１（配列番号：５０５）、ＤＮＡ６４９０７−１１６３−１（配列番号：５０７）及びＤＮＡ６４９０８−１１６３−１（配列番号：５０９）に対応する全核酸配列。ＤＮＡ３０９４３−１１６３、ＤＮＡ６４９０７−１１６３−１及びＤＮＡ６４９０８−１１６３−１は、単一のオープンリーディングフレームを含み、各々ヌクレオチド位置３３６−３３８、４８８−４９０及び３２６−３２８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そして各々ヌクレオチド位置１２２１−１２２３、１３０７−１３０９及び１１４５−１１４７の停止コドンで終端する（Ｆｉｇ２１２、２１４及び２１６）。予測されるポリペプチド前駆体は、各々２９５、２７３及び２７３アミノ酸長である（Ｆｉｇ２１３、２１５及び２１７）。ＤＮＡ３０９４３−１−１１６３−１、ＤＮＡ６４９０７−１１６３−１及びＤＮＡ６４９０８−１１６３−１はＡＴＣＣに寄託され、各々ＡＴＣＣ寄託番号２０９７９１、２０３２４２及び２０３２４３が付与された。
全長ＰＲＯ２１３−１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がヒト成長静止−特異的遺伝子６タンパク質と有意な相同性を有することを示唆している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．４５ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ２１３アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、ＨＳＭＨＣ３Ｗ５Ａ＿６及びＢ４８０８９との間の有意な相同性を明らかにした。
全長ＰＲＯ１３３０及びＰＲＯ１４４９ポリペプチドのアミノ酸配列の更なる分析は、ｎｏｔｃｈ４との有意な同一性を示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（ｖｅｒｓｉｏｎ ３５．１３０ ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ３５）は、ＰＲＯ１３３０と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列、Ｄ８６５６６＿１及びＮＥＬ＿ＨＵ ＭＡＮとの間の有意な相同性を明らかにした。
【０５２４】
実施例９５：ヒトＰＲＯ２９８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したようなアミラーゼスクリーニングで単離されたｃＤＮＡを、ここでＤＮＡ２６８３２（Ｆｉｇ２２０；配列番号：５１６）と命名する。ＤＮＡ２６８３２の配列を発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ）及び独自に開発されたＥＳＴデータベース（ＬＩＦＥＳＥＱ（商品名）、Ｉｎｃｙｔｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を含む。検索は、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ及びＧｉｓｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２６６： ４６０−４８０ （１９９６））を用いて実施した。タンパク質をコードせず、ＢＬＡＳＴスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「ｐｈｒａｐ」（Ｐｈｉｌ Ｇｒｅｅｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ；　ｈｔｔｐ：／／ｂｏｚｅｍａｎ．ｍｂｔ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｐｈｒａｐ．ｄｏｃｓ／ｐｈｒａｐ．ｈｔｍｌ）でクラスター形成してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。
他のＥＳＴ配列に対してｐｈｒａｐを用いてコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。コンセンサス配列を同定し、次いでそれをＢＬＡＳＴ及びｐｈｒａｐの繰り返しサイクルを用いて拡張し、コンセンサス配列を上記のＥＳＴ配列の供給源を使用する限りできるだけ拡張した。拡張した構築体配列をＤＮＡ３５８６１コンセンサス配列のＤＮＡ３５８６１．Ｂａｓｅｄと命名する。１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ２９８の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向プライマーは一般に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるように設計されることが多い。プローブ配列は典型的には４０−５５ｂｐ長である。或る場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいとき付加的オリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡをＡｕｓｕｂｅｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた対象とする遺伝子クローンの単離に使用した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）及びハイブリッド形成プローブを合成した：
正方向ＰＣＲプライマー１　ＣＡＡＣＧＴＧＡＴＴＴＣＡＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＣ（配列番号：５１７）
正方向ＰＣＲプライマー２　ＧＣＣＴＣＧＴＡＴＣＡＡＧＡＡＴＴＴＣＣ（配列番号：５１８）
正方向ＰＣＲプライマー３　ＡＧＴＧＧＡＡＧＴＣＧＡＣＣＴＣＣＣ（配列番号：５１９）
逆方向ＰＣＲプライマー１　ＣＴＣＡＣＣＴＧＡＡＡＴＣＴＣＴＣＡＴＡＧＣＣＣ（配列番号：５２０）
ハイブリッド形成プローブ１　ＣＧＣＡＡＡＡＣＣＣＡＴＴＴＴＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＡＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＴＧＡＴＧＧＴＧＧ（配列番号：５２１）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ２９８遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肺組織（ＬＩＢ２５）から単離した。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Ｈｏｌｍｅｓ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ ， ２５３： １２７８−１２８０ （１９９１）参照）に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ２９８の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ２６１（ＤＮＡ３９９７５−１２１０）と命名される］（配列番号：５１４）及びＰＲＯ２９８の誘導タンパク質配列を与えた（配列番号：５１５）。
ＵＮＱ２６１（ＤＮＡ３９９７５−１２１０）の全核酸配列をＦｉｇ２１８（配列番号：５１４）に示す。クローンＤＮＡ３９９７５−１２１０は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３７５−３７７に見かけの翻訳開始部位を持つ。予測されるポリペプチド前駆体は３６４アミノ酸長である。タンパク質は、各々アミノ酸位置３６−５５（ＩＩ型ＴＭ）、６５−８４、１８８−２０８及び２２９−２４５に４つの膜貫通ドメインを有する。推定Ｎ−結合グリコシル化部位はアミノ酸位置２５３で開始する。さらに、タンパク質中に以下の特徴が同定された：ｃＡＭＰ−及びｃＧＭＰ−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位は位置８で開始する；Ｎ−ミリストイル化部位は位置１７３及び２６２で開始する；そしてＺｐドメインは位置４５−６０の間である。クローンＤＮＡ３９９７５−１２１０はＡＴＣＣに寄託され（１９９８年４月２１日）、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７８３が付与された。
【０５２５】
実施例９６：ヒトＰＲＯ３３７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したようなアミラーゼスクリーニングで単離されたｃＤＮＡを、ここでＤＮＡ４２３０１（Ｆｉｇ２２３；配列番号：５２４）と命名する。上記実施例１に記載した用にｐｈｒａｐを用いてＤＮＡ４２３０１の配列をＥＳＴ配列と比較し、ここでＤＮＡ２８７６１と命名するコンセンサス配列を同定した。このコンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３３７遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児脳組織から単離した。
ｃＤＮＡクローンは、その全体を配列決定した。ＤＮＡ４３３１６−１２３７の全核酸配列をＦｉｇ２２１（配列番号：５２２）に示す。クローンＤＮＡ４３３１６−１２３７は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１３４−１３６に見かけの翻訳開始部位を持つ（Ｆｉｇ２２１；配列番号：５５２）。予測されるポリペプチド前駆体は３４４アミノ酸長である。クローンＤＮＡ４３３１６−１２３７はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４８７が付与された。
全長配列のＢＬＡＳＴ−２及びＦａｓｔＡ配列アラインメント分析に基づいて、ＰＲＯ３３７はラットニューロトリミンとアミノ酸配列同一性（９７％）を示す。
【０５２６】
実施例９７：ヒトＰＲＯ４０３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
導入：
ヒトトロンボポエチン（ＴＨＰＯ）は、２つのドメインからなる３５２アミノ酸のグリコシル化ホルモンである。Ｎ−末端ドメインはエリスロポエチンと５０％類似性を持ち、生物学的活性を負っている。Ｃ−末端領域は分泌に必要とされる。トロンボポエチン（ＴＨＰＯ）についての遺伝子はヒト染色体３ｑ２７−ｑ２８にマッピングされ、そこでこの遺伝子の６つのエクソンはゲノムＤＮＡの７キロベース塩基対をスピンさせる（Ｃｈａｎｇ等， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６： ６３６−７ （１９９５）； Ｆｏｓｔｅｒ等， Ｒｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｃｓｉ． ＵＳＡ ９１： １３０２３−７ （１９９４）； Ｇｕｒｎｅｙ等， Ｂｌｏｏｄ ８５： ９８１−９８８ （１９９５））。ＴＨＰＯの直近に位置するＴＨＰＯ相同体をコードする任意の遺伝子が存在するか否かを決定するため、この領域からのゲノムＤＮＡ断片を同定して配列決定した。ＴＨＰＯ遺伝子座を含む３つのＰ１クローン及び１つのＰＡＣクローン（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ． ＭＯ；カタログ番号Ｐ１−２５３５及びＰＡＣ−６５３９）が単離され、１４０ｋｂ領域をＰＣＲベースのギャップ充填法と組み合わせた規則的ショットガン法（Ｃｈｅｎ等， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １７： ６５１−６５６ （１９９３））を用いて配列決定した。分析によりこの領域がＴＨＰＯに極めて近く位置する４つの付加的遺伝子腫瘍壊死因子レセプター１関連タンパク質２（ＴＲＡＰ２）及び伸長開始因子ガンマ（ｅｌＦ４０）、塩化物チャンネル２（ＣＬＣＮ２）及びＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニットｈＲＰＢ１７を持つ遺伝子富化であることが明らかとなった。この領域のＴＨＰＯ相同体は見られなかったが、４つの新規な遺伝子がコンピュータ補助遺伝子検出（ＧＲＡＩＬ）により予測された（Ｘｕ等， Ｇｅｎ． Ｅｎｇｉｎ． １６： ２４１−２５３ （１９９４）， ＣｐＧ島の存在（Ｃｒｏｓｓ， Ｓ．及びＢｉｒｄ， Ａ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． ＆　Ｄｅｖｅｌ． ５： １０９−３１４ （１９９５）， 及び公知の遺伝子との相同性（ＷＵ−ＢＬＡＳＴ２．０（Ａｌｔｓｃｈｕｌ及びＧｉｓｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６： ４６０−４８０ （１９９６）（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ））による検出））。
方法：
Ｐ１及びＰＡＣクローン：
最初のヒトＰ１クローンはゲノムＰ１ライブラリ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ； カタログ番号Ｐ１−２５３５）から単離され、ＴＨＰＯ下のみ配列から設計されたＰＣＲプライマーでスクリーニングされた。ＰＣＲプライマーは、このＰ１クローンから誘導された末端配列から設計され、次いでＰ１及びＰＡＣライブラリ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ　カタログ番号Ｐ１−２５３５びＰＡＣ−６５３９）のスクリーニングに用い、重複クローン（ＰＡＣ１、ｐｌ．ｔ及びｐ１．ｕ）を同定した。ＰＡＣ．ｚからの３’末端配列を、ヒトＢＡＣライブラリ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ； カタログ番号： ＢＤＴＷ−４５３３Ａ）のスクリーニングに使用するプライマーの同定に用いた。
規則的ショットガン法：
規則的ショットガン法（ＯＳＳ）（Ｃｈｅｎ等， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １７： ６５１−６５６ （１９９３））は、階層的方法での大きなゲノムＤＮＡクローンのマッピング及び配列を含む。Ｐ１又はＰＡＣクローンを超音波処理し、断片をラムダベクター（λＢｌｕｅｓｔａｒ）にサブクローニングした（Ｎｏｖｅｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｍａｄｉｓｏｎ， ＷＩ： カタログ番号６９２４２−３）。ラムダサブクローン挿入物は長範囲ＰＣＲ（Ｂａｒｎｅｓ， Ｗ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： ２２１６−２２２０ （１９９４））により単離し、末端を配列決定した。ラムダ末端配列を重複させ、最初のクローンの部分的マップを作成した。重複末端配列を持つこれらのラムダクローンを同定し、インセットをプラスミドベクター（ｐＵＣ１８又はｐＵＣ１９， Ｈｏｅｆｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ， カタログ番号 ２７−４９４９−０１及び２７−４９５１−０１）にサブクローニングし、プラスミドサブクローンの末端を配列決定し、組み立てて近接配列を生成した。この方向性を持った配列決定法は、必要な無駄を最小にし、対象とする領域をスキャンし集中するのを可能にする。
よりよいＴＨＰＯ遺伝子座を同定し、ヘマトポエチンファミリーに関連する他の遺伝子を検索するために、５つのゲノムクローンを、ヒトＰ１及びＰＡＣライブラリのＰＣＲスクリーニングによりこの領域から単離した（Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ． Ｉｎｃ．， カタログ番号： Ｐ１−２５３５及びＰＡＣ−６５３９）。
遺伝子断片のサイズは次に通り：Ｐ１．ｔは４０ｋｂ；Ｐ１．ｇは７０ｋｂ；Ｐ１．ｕは７０ｋｂ；ＰＡＣ．ｚは２００ｋｂ；及びＢＡＣ．１は８０ｋｂ。１９０ｋｂゲノムＤＮＡ領域の約７５％（１４０ｋｂ）を、規則的ショットガン法（ＯＳＳ）（Ｃｈｅｎ等， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １７： ６５１−５６ （１９９３））を用いて配列決定し、自動整列器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， カタログ番号９０３２２７）を用いてコンティグに構築した。これらのコンティグの予備的順序を手動分析で決定した。１４０ｋｂ領域に４７のコンティグが存在した。コンティグの順序づけ及びギャップの充填のためのＰＣＲベースの方法を採用した。以下に、ギャップの数及びサイズをまとめる。ＢＡＣ．１に特有の５０ｋｂの配列を、１０倍の冗長性を持つ全ショットガン法で配列決定した。
ギャップのサイズ　　　　　数
＜５０ｂｐ　　　　　　　　　１３
５０−１５０ｂｐ　　　　　　　７
１５０−３００ｂｐ　　　　　　７
３００−１０００ｂｐ　　　　１０
１０００−５０００ｂｐ　　　　７
＞５０００ｂｐ　　　　　　　２（１５，０００ｂｐ）
【０５２７】
ＤＮＡ配列決定：
ＡＢＩ ＤＹＥ−プライマーＴＭ化学（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ；カタログ番号： ４０２１１２）を、ラムダ及びプラスミドサブクローンの末端配列決定に用いた。ＡＢＩ ＤＹＥ−プライマーＴＭ化学（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ；カタログ番号： ４０３０４４）を、ＰＣＲ産物のその対応するＰＣＲプライマーでの配列決定に用いた。配列は、ＡＢＩ３７７装置で収集した。１ｋｂより大きなＰＣＲ産物について、歩行プライマーを用いた。自動整列器（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ ）でのＯＳＳ法により生成されたコンティグの配列及びギャップ充填配列決定跡ファイルを、重複及び終端についてＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商品名）（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ）に入力した。全ショットガン法により生成された配列は、ＰｈｒｅｄおよびＰｈｒａｐを用いて構築し、Ｃｏｎｓｅｄ（ｈｔｔｐ：／／ｃｈｉｍｅｒａ．ｂｉｏｔｅｃｈ．　ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ｕｗｇｃ／ｐｒｏｊｅｃｔｓ．ｈｔｍ）およびＧＦＰ（Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｆｏｒ Ｐｈｒａｐ）， ｖｅｒｓｉｏｎ １．２（ｈｔｔｐ：／／ｓｔｏｒｋ．ｃｅｌｌｂ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｇｆｐ／）を用いて編集した。
ＰＣＲ−ベースギャップ充填法：
各コンティグの配列決定された５’及び３’末端に基づいてプライマーを設計し、反復及び低品質配列領域を避けた。全てのプライマーを５０−７０％のＧ／Ｃ量を持つ１９−２４量体であるように設計した。オリゴを合成し、標準的な方法によりゲル精製した。
コンティグの配向と順序は未知であったので、プライマーの順列を増幅反応において使用した。二つのＰＣＲキットを使用した：第１に、およそ１０分の伸展時間でのＸＬ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ； カタログ番号：Ｎ８０８０２０５）；第２に、ＸＬ ＰＣＲキットで汚れた又は複数の生成物が観察された場合にはＴａｑポリメラーゼＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ 　Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ；カタログ番号：２０１２２３）を高緊縮性条件下で使用した。それぞれの成功した反応からの主要なＰＣＲ産物は０．９％の低溶融アガロースゲルから抽出し配列決定前にＧｅｎｅｃｌｅａｎ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキットで精製した。
分析：
コード領域の同定及び特徴付けは以下のように実施した：第１に、反復配列をＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒ（Ａ．Ｆ．Ａ． Ｓｍｉｔ ＆ Ｐ． Ｇｒｅｅｎ， ｈｔｔｐ：／／ｆｔｐ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ＲＭ／ＲＭ＿ｄｅｔａｉｌｓ．ｈｔｍｌ）でマスクし、それを反復成分のライブラリに対してＦａｓｔＡ方式でＤＮＡ配列スクリーニングし、マスクしたクエリー配列に戻した。マスクされていないリピートは、配列をＧｅｎＢａｎｋデータベースとＷＵＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕ， Ｓ．及びＧｉｓｈ， Ｗ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６： ４６０−４８０（１９９６））を用いて比較することにより同定し、手動でマスクした。
次に、ジェネンテクのタンパク質データベースに対してゲノム領域をＷＵＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを用いて比較することにより既知の遺伝子を明らかにし、各遺伝子についてゲノム及びｃＤＮＡ配列を各々、さもないと大きく異なる配列間の局所的同一性の領域を見つけるためにＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｃｈ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３−４５３ （１９７０））アルゴリズムを用いて整列させることにより注釈をつけた。該方法は、該領域の５つの既知の遺伝子、ＴＨＰＯ、ＴＲＡＰ２、ｅｌＦ４ｇ、ＣＬＣＮ２及びｈＲＰＢ１７の全てのエクソンの検出をもたらした（表８）。
分析：
コード化領域の同定及び特徴付けは以下のように実施した：第１に、反復配列をＲｅｐｅａｔｍ Ｍａｓｔｅｒ（Ａ．Ｆ．Ａ． Ｓｍｉｔ ＆ Ｐ．Ｇｒｅｅｎ， ｈｔｔｐ：／／ｆｔｐ．ｇｅｎｏｍｅ．ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．ｅｄｕ／ＲＭ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｈｔｍｌ）でマスクし、それを反復成分のライブラリに対してＦａｓｔＡ方式でＤＮＡ配列スクリーニングし、マスクしたクウィアリー（ｑｕｉｅｒｙ）配列に戻した。マスクしていないリピートは、配列をＧｅｎＢａｎｋデータベースとＷＯＢＬＡＳＴ２．０［Ａｌｔｓｃｈｕ， Ｓ．及びＧｉｓｈ， Ｗ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６： ４６０−４８０ （１９９６）； ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ｂｌａｓｔＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ］を用いて比較することにより同定し、手動でマスクした。
次に、ジェネンテクのタンパク質データベースに対してゲノム領域をＷＵＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを用いて比較することにより公知の遺伝子を明らかにし、各遺伝子についてゲノム及びｃＤＮＡ配列各々を、配列間の局所的同一性の領域を見つけるためのニードルマン−バンチ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３−４５３ （１９７０））アルゴリズムを用いて整列させることにより注釈をつけた。この方法は、この領域の５つの公知の遺伝子、ＴＨＰＯ、ＴＲＡＰ２、ｅｌＦ４ｇ、ＣＬＣＮ２及びｈＲＰＢ１８の全てのエクソンの検出をもたらした（下記参照）。
公知の遺伝子　　　　　　　　　　　　　　　マップ位置
真核生物翻訳開始因子４ガンマ　　　　　　　３ｑ２７−ｑｔｅｒ
トロンボポエチン　　　　　　　　　　　　　３ｑ２６−ｑ２７
塩化物チャンネル２　　　　　　　　　　　　３ｑ２６−ｑｔｅｒ
ＴＮＦレセプター関連タンパク質２　　　　　未だマッピングされていない
ＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニットｈＲＰＢ１７　　未だマッピングされていない
最後に、新規な転写単位を多数の方法を用いて予測した。ＣｐＧ島（Ｓ． Ｃｒｏｓｓ及びＢｉｒｄ， Ａ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅ． Ｄｅｖ． ５： １０９−３１４ （１９９５））島をプロモーター同定に使用し、ＧＣ−富化、６−又は８−ｍｅｒ回文構造配列を認識する酵素によって切断される部位のクラスターとして同定した（ＮｏｔＩ、ＮａｒＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＸｈｏＩ）。ＣｐＧ島は通常、遺伝子のプロモーター領域を付随している。短いゲノム領域（１０−２０ｋｂ）のＧｅｎＢａｎｋに対するＷＵＢＬＡＳＴ２．０分析は、ＥＳＴに一致することを示した。個々のＥＳＴ配列（或いは可能ならば、それらの配列クロマトグラムファイル）を検索し、シーケンサーで構築して理論的ｃＤＮＡ配列を与えた（ＤＮＡ３６４４３）。新規のエクソンを予測するためにＧＲＡＩＬ２（ＡｐｏＣｏｍ Ｉｎｃ．， Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ， ＴＮ， ＤＥＣ アルファに対するコマンドラインバージョン）を用いた。この領域の５つの公知の遺伝子は、ＧＬＡＩＬアルゴリズムの成功のための内部コントロールとして与えた。
【０５２８】
単離：
部分的エンドセリン変換酵素−２（ＥＣＥ−２）ｃＤＮＡクローンを、ゲノム配列の予測されるＥＣＥ−２エクソンを最初にシリコ（ｓｉｌｉｃｏ）でスプライシングして推定配列を生成することにより単離した（ＤＮＡ３６４４３）。オリゴヌクレオチドプローブ： ＧＡＡＧＣＡＧＴＧＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＴＡＧＡＧＡＧＧＣＡＣＣＴＧＣＴＡＡＧＡ（配列番号：５３０）を設計し、ヒト胎児小腸ライブラリ（ＬＩＢ１１０）のスクリーニングに使用し、内部ＰＣＲプライマー（３６４４３ｆ１）（ＥＣＥ２．ｆ： ＡＣＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＴＣＴＴＡＧＣＡ）（配列番号：５３１）及び（３６４４３ｒ１）（ＥＣＥ２．ｒ）（ＧＧＴＡＣＴＧＧＡＣＣＣＣＴＡＧＧＧＣＣＡＣＡＡ）（配列番号：５３２）を用いて配列決定前にプローブにハイブリッド形成するクローンを確認した。１つのポジティブクローンが得られたが、このｃＤＮＡ（ＤＮＡ４９８３０）は、適当にスプライシングされたエクソン１から６、次いでイントロン６配列を含む部分的にスプライシングされた転写物を表示した。オリゴｄＴプライマー、イントロン６に存在するＡｌｕ成分内でのポリＡ−伸展までアニーリングした。更なるＥＣＥ−２ｃＤＮＡ断片（ＤＮＡ４９８３１）は、ヒト胎児腎臓ライブラリ（ＬＩＢ２２７）から、推定ｃＤＮＡ配列から設計したプライマー［３６４４３ｆ３： ＣＣＴＣＣＣＡＧＣＣＧＡＧＡＣＣＡＧＴＧＧ（配列番号：５３３）及び３６４４３ｒ２： ＧＧＴＣＣＴＡＴＡＡＧＧＧＣＣＡＡＧＡＣＣ （配列番号：５３４）］でのＰＣＲによって得た。このＰＣＲ産物をエクソン１３からエクソン１８の３’ 非翻訳領域まで拡張した。
全長エンドセリン変換酵素２（ＥＣＥ２）ｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ５５８００−１２６３）をオリゴ−ｄＴ−プライムヒト胎児脳ライブラリから単離した。ヒト胎児脳組織からのＲＮＡ（妊娠２０週、＃２８３００５）（ＳＲＣ１７５）をグアニジンチオシアネートにより単離し、５μｇを二本鎖ｃＤＮＡの生成に使用し、それをベクターｐＲＫ５Ｅにクローニングした。３’−プライマー（ｐＧＡＣＴＡＧＴＴＣＴＡＧＡＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ）（配列番号：５３５）及び５’−リンカー（ｐＣＧＧＡＣＧＣＧＴＧＧＧＴＣＧＡ）（配列番号：５３６）をＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位に導入するために設計した。ライブラリを、部分的ヒトＥＣＥ−２ｃＤＮＡ配列（ＤＮＡ４９８３０及びＤＮＡ４９８３１）から設計したＰＣＲプライマー［３６４４３ｐｃｒｆ１： ＣＧＧＣＣＧＴＧＡＴＧＧＣＴＧＧＴＧＡＣＧ（配列番号：５３７）及び３６４４３ｒ３： ＧＧＣＡＧＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＡＴＧＧＧ（配列番号：５３８）］でスクリーニングした。ＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ， カタログ番号Ｋ４５００−０１）にクローニングし、上記したようなＤＹＥ−ターミネーター化学で配列決定した。
【０５２９】
実施例９８：ＰＲＯ４０３のノーザンブロット及びインサイツＲＮＡハイブリッド形成分析
ヒト組織におけるＰＲＯ４０３ｍＲＮＡの発現をノーザンブロット分析により試験した。ヒト胎児及び成人組織から誘導したヒトポリＡ＋ＲＮＡブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ； Ｃａｔ． Ｎｏｓ． ７７６０−１， ７７５６−１及び７７５５−１）を、全長ＰＲＯ４０３ｃＤＮＡに基づくプローブからの［３２Ｐ−α］ｄＡＴＰ標識ｃＤＮＡ断片にハイブリッド形成させた。ブロットをプローブとともにハイブリッド形成バッファー（５Ｘ ＳＳＰＥ； ２Ｘ デンハード液； １００ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡ； ５０％のホルムアミド； ２％のＳＤＳ）中、４２℃で１８時間インキュベートし、高緊縮性（０．１Ｘ ＳＳＣ； ０．１％ ＳＤＳ， ５０℃）まで洗浄してオートラジオグラフ分析した。終夜露出の後にブロットをホスホイメージャ分析（Ｆｕｊｉ）により展開した。
ＰＲＯ４０３ｍＲＮＡ転写物を検出した。発現パターンの分析は、成人脳（小脳、被殻、側頭葉及び中頭葉で最大、及び大脳皮質、後頭葉及び前頭葉でより低い）、脊髄、肺及び膵臓において３．３ｋｂと予測される転写物の最も強いシグナル、胎児脳及び腎臓における４．５ｋｂ転写物の高いレベルを示した。
【０５３０】
実施例９９：ハイブリッド形成プローブとしてのＰＲＯポリペプチドコード化核酸の使用
以下の方法は、ＰＲＯをコードする核酸配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記載する。
ここに開示する対象とするＰＲＯポリペプチドのコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリにおける同種ＤＮＡ類（ＰＲＯポリペプチドの天然発生変異体をコードするものなど）のスクリーニングのためのプローブとして又はそれからプローブを調製する塩基として用いられる。
いずれかのライブラリＤＮＡを含むフィルターのハイブリッド形成及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射性標識ＰＲＯポリペプチドコード化核酸誘導プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８、２ｘデンハード液、及び１０％デキストラン硫酸の溶液中で、４２℃において２０時間行った。フィルターの洗浄は、０．１ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳの水溶液中、４２℃で行った。
次いで、全長天然配列ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【０５３１】
実施例１００：大腸菌におけるＰＲＯポリペプチドの発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現による所望のＰＲＯポリペプチドの非グリコシル化形態の調製を例示する。
所望のＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Ｂｏｌｉｖａｒ等， Ｇｅｎｅ， ２：９５ （１９７７）参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ｐｏｌｙｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、特定のＰＲＯポリペプチドコード領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等， 上掲に記載された方法を用いた選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を最適密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を採集して遠心分離できる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、可溶化ＰＲＯポリペプチドを金属キレート化カラムを用いてポリペプチドを緊密に結合させる条件下で精製できる。
ＰＲＯ１８１、ＰＲＯ１９５、ＰＲＯ２００、ＰＲＯ２３７、ＰＲＯ５４０、ＰＲＯ３２２、ＰＲＯ１０１７、ＰＲＯ９３８、ＰＲＯ１６２、ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ８２７及びＰＲＯ１００８は、以下の手法を用いて、大腸菌においてポリＨｉｓタグ形態で発現させた。ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅された、ポリ−Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（Ｗ３１１０ ｆｕｈＡ（ｔｏｎＡ） ｌｏｎ ｇａｌＥ ｒｐｏＨｔｓ（ｈｔｐＲｔｓ） ｃｌｌｐＰ（ｌａｃＩｑ））に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に５０ｍｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有するＬＢ中、３０℃で振盪しながら３−５のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させた。ついで培地をＣＲＡＰ培地（３．５７ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム・２Ｈ２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５００ｍＬ水中の５．３６ｇのＳｈｅｆｉｅｌｄ ｈｙｃａｓｅ ＳＦ、並びに１１０ｍＭのＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（ｗ／ｖ）のグルコース及び７ｍＭのＭｇＳＯ４の混合で調製）中に５０−１００倍希釈し、３０℃で振盪させながら約２０−３０時間成長させた。試料を取り出してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより発現を確認し、バルク培地を遠心分離して細胞のペレットとした。細胞細胞ペレットを精製及び再折りたたみまで凍結させた。
【０５３２】
０．５から１Ｌの発酵（６−１０ｇペレット）からの大腸菌ペーストを、７Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８バッファー中で１０容量（ｗ／ｖ）で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々０．１Ｍ及び０．０２Ｍとし、溶液を４℃で終夜撹拌した。この工程により、亜硫酸によりブロックされたシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされた。溶液をＢｅｃｋｍａｎ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ中で４０，０００ｒｐｍで３０分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー（６Ｍのグアニジン、２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）の３−５容量で希釈し、０．２２ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた５ｍｌのＱｉａｇｅｎ Ｎｉ−ＮＴＡ金属キレートカラムに負荷した。カラムを５０ｍＭのイミダゾール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｕｔｒｏｌ ｇｒａｄｅ）を含む添加バッファー、ｐＨ７．４で洗浄した。タンパク質を２５０ｍＭのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて２８０ｎｍにおけるその吸収により見積もった。
試料を、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．６、０．３ＭのＮａＣｌ、２．５Ｍの尿素、５ｍＭのシステイン、２０ｍＭのグリシン及び１ｍＭのＥＤＴＡからなる新たに調製した再折りたたみバッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再折りたたみさせた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が５０〜１００マイクログラム／ｍｌとなるように選択した。リフォールデｌイング溶液を４℃で１２−３６時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はＴＦＡを採取濃度０．４％（約３のｐＨ）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を０．２２ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度２−１０％で添加した。再折りたたみされたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ Ｒ１／Ｈ逆相カラムで、０．１％ＴＦＡの移動バッファーと１０〜８０％のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。Ａ２８０吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再折りたたみされたタンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どのタンパク質の正しく再折りたたみされた種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤って折りたたまれた形態を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折りたたまれたＰＲＯタンパク質を含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、０．１４Ｍの塩化ナトリウム及び４％のマンニトールを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ６．８に調製した。
【０５３３】
実施例１０１：哺乳動物細胞におけるＰＲＯポリペプチドの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現によるＰＲＯポリペプチドの調製を例示する。
発現ベクターとしてｐＲＫ５（１９８９年３月１５日発行のＥＰ ３０７，２４７参照）を用いた。場合によっては、ＰＲＯコード化ＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等， 上掲に記載されたような結合方法を用いてＰＲＯポリペプチドＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、ｐＲＫ５−ＰＲＯと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １５７３）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約１０μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドＤＮＡを約１μｇのＶＡ　ＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ等， Ｃｅｌｌ， ３１：５４３ （１９８２））］と混合し、５００μｌの１ｍＭトリス−ＨＣｌ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２２７ＭＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状の、５００μｌの５０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＮａＰＯ４を添加し、２５℃で１０分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて３７℃で約４時間定着させた。培養培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを３０分間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートした。
形質移入の約２４時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ３５Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換した。１２時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
【０５３４】
これに換わる技術において、ＰＲＯポリペプチドは、Ｓｏｍｐａｒｙａｃ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， １２：７５７５ （１９８１）に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、７００μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートした。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインシュリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約４日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＰＲＯポリペプチドを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、ＰＲＯポリペプチドをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ−メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約６日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯポリペプチドを含む培地を濃縮して、選択した方法にとって精製することができる。
また、エピトープタグＰＲＯポリペプチドは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＰＲＯポリペプチドはｐＲＫ５ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物は、次いで、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ−ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ−ｈｉｓタグＰＲＯポリペプチド挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ−ｈｉｓタグＰＲＯポリペプチドを含む培養培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
【０５３５】
ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それは対応するタンパク質の可溶化形態及び／又はポリ−Ｈｉｓタグ形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含む定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）として発現された。ＰＣＲ増幅に続いて、対応するＤＮＡを、Ａｕｓｕｂｅｌ等， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｕｎｉｔ ３．２６， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ （１９９７）に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’ 及び３’ に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Ｌｕｃａｓ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ ｒｅｓ． ２４： ９， １７７４−１７７９ （１９９６）に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの１２マイクログラムを、市販の形質移入試薬Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（登録商標）（Ｑｕｉａｇｅｎ）， Ｄｏｓｐｅｒ（登録商標）及びＦｕｇｅｎｅ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）約一千万のＣＨＯ細胞に導入した。細胞は、上掲のＬｕｃａｓ等に記載されているように成長させた。約３ｘ１０７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を１０ｍＬの媒質を含む遠心管にピペットして、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を１０ｍＬの選択培地（０．２μｍ濾過ＰＳ２０、５％の０．２μｍ透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を９０ｍＬの選択培地を含む１００ｍｌスピナーに分けた１−２日後、細胞を１５０ｍＬの選択培地を満たした２５０ｍＬスピナーに移し、３７℃でインキュベートした。さらに２−３日後、２５０ｍＬ、５００ｍＬ及び２０００ｍＬのスピナーを３ｘ１０５細胞／ｍＬで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には１９９２米国特許第５，１２２，４６９号に記載された生産培地を使用した。３Ｌの生産スピナーを１．２ｘ１０６細胞／ｍＬで播種した。０日目に、細胞数とｐＨを測定した。１日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。２日目に、スピナーをサンプルし、温度を３３℃に変え、５００ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｍＬの１０％消泡剤（例えば３５％ポリジメチルシロキサンエマルション、Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ ３６５ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｒａｄｅ Ｅｍｕｌｓｉｏｎ）の３０ｍＬとした。生産を通して、ｐＨは７．２近傍に調節し維持した。１０日後、又は生存率が７０％を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して０．２２μｍフィルターを通して濾過した。濾過物は、４℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに負荷された。
【０５３６】
ポリ−Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質はＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に５ｍＭの濃度まで添加した。条件培地を、０．３ＭのＮａＣｌ及び５ｍＭイミダゾールを含む２０ｍＭのＨｅｐｅｓ， ｐＨ７．４バッファーで平衡化した６ｍｌのＮｉ−ＮＴＡカラムに４−５ｍｌ／分の流速で４℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を０．２５Ｍイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１４ＭのＮａＣｌ及び４％のマンニトールを含む貯蔵バッファー中で２５ｍｌのＧ２５ Ｓｕｐｅｒｆｉｎｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて脱塩し、−８０℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー， ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌのプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸， ｐＨ３．５で溶離した。溶離したタンパク質は、１ｍｌの画分を２７５μｌの１Ｍトリスバッファー， ｐＨ９を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Ｈｉｓタグタン菣꾂돨ꮁ臣蒁臣誸꣨鞁臣꾲铨邃菣閃苣벃룤ꞁ蓨ꦡ臣龁胣螝룤Ꞁ臣뎼볯뎼菣ꪃ苣꾂菣ꮃ苣龃菣늂菣ꞁꧨ鎨臣膀苣覃菣뎃볯ꖼ뷯趽뷯躽볯蚈꟨ꮁ苣誂볯銈鳦꾫苣龃菣뢅藩鞈뇦骮臣龁胣㲂牢ਾ臣鎁臣誁臣ꚁ雩몤臣貂臣骤臣꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁胣誸꣨ꮁꓧ鞁臣袂臣ꮁ裦龊ꏨꮁ駧뺏臣貂臣芀戼㹲邀볯閼볯鞼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯銼볯떅꿦貏臣꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁駧뺏戼㹲ꖻ룤꺁雦閳臣膀藩趯迨궸臣꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁뗧鮏臣몙迧銂꣨覼臣讂胣㲂牢ਾ곧醼臣膀볯꒼볯銼볯Ꞽ볯낼볯ꢼ菣궃菣벃苣벃臣覂臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣내菨薆铧ꎔ迥꾁裥貳臣龁苣꺁藩趯迨몙迧馃苣뾂菣銂뷤邈臣讂胣肉鳦꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣銂苣벃菣馁苣꒼볯ꆼ胣뢁諦閁苣龁苣낂菣ꮃ菣鞃菣覃迥뎁菣궃菣벃苣벃苣뢁諦鞁臣鞃菣릂菣覃臣ꦁ뷥ꪁ裥邙藩ꂴ菩趽臣뾌藥鞁臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣내菨薆駧뺏苣螌ꓧ馁苣芀裥貳臣龁苣ꮁ胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂볯꺼볯銂臩麊臣龁菣ꦃ苣龃菣ꮁ胣ꆼ볯ꢼ볯込볯ꆼ볯꒼볯鞃菣ꊃ菣뾂菣銂苣벃菣馁苣꒼볯ꆼ胣떅꿦貏苣ꮃ菣ꆂ鯥邭裥貳苣낂菣ꮃ볯ꪃ菣肃菣超裥膀迥뎁볯薿ꛨꪁ苣낁볯낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣몙迧꺁臣膂臣ꪃ菣ꮂ菣超裥ꢁ臣节臣꾂菣벃菣뎃苣馁苣鎁臣貁臣趁苣芀戼㹲떅꿦貏ꃦꆼ볯醼볯邼귧꺁藩趯迨꾁胣ꆬ臣ꞁ룤風臣몙迧鞃菣릂菣覃臣ꊽ돨ꊻ迦鞁胣뢁諦閁苣龁駧떅鿥난룤ꞁ鿥誤臣趁苣芀뷥ꪳ믨鮏臣龁藩趯迨誸룦꾁胣醼볯薼菣ꪃ苣궃菣ꊅ藩ꞁ臣袲駩誏臣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯ꮁ苣讂裥ꊛ臣蚈黦鞁胣ꆬ臣ꞁ苣麃苣벃菣ꮃ菣鎟觨ꞁ苣ꮃ臣鎟觨銂臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ뛧蒁臣蒵迦袁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꾁胣몙藩릟鳥讁苣ꂁ뿥蚈鯩ꮁ苣誂藩趯迨내菨銂駩뮎臣膀곦蒁臣뢁諦閁苣龁苣벃菣ꪃ菣뢂菣ꎂ菣뾂菣銂铧蒁臣릟鳥銂뿦꺸臣讂臣ꢁ臣袂臣ꚁ跥ꊛ迥뎁닧붣臣趁苣芀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣銂郥肂뿦꺸觧꾁胣뢁諦閁苣龁苣ꦃ菣꾂菣麃菣낂菣閃苣벃꣦芄苣ꢔ臣ꚁ臣覂臣뺲ꏨ鞁臣节苣蒁胣㲂牢���臣鎁臣誁臣ꚁ雩몤臣貂臣骤臣꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁胣誸꣨ꮁꓧ鞁臣袂臣ꮁ裦龊ꏨꮁ駧뺏臣貂臣芀戼㹲邀볯閼볯颼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯鎼볯邃苣ꖃ菣Ꚃ苣ꮃ苣龄鿦蚘駨내菨ꞁ臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣몙迧㲾牢ਾ믤许臣릖돦꾁胣邃苣ꖃ菣Ꚃ苣ꮃ苣龄鿦蚘駨내菨궸臣誁臣讂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁뗧鮏臣몙迧銂꣨覼臣讂胣㲂牢ਾ触鮜臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣膀菣궂菣궃苣ꒂ菣릂駧뺏菣꾂苣벃臣ꮐ臣貂苣ꢂ菣袃菣鞃苣낂臣誸뗦ꮁ黨袐臣鮁臣芀臣꺁苣蚁臣ꢂ菣袃菣鞃苣낂臣膀菣ꪃ裢袽뷯鎽苣낂迥뎁藥ꮖ苣궃菣ꪃ菣뾂苣袼볯螽볯꺁볯莽ꃩ龟臣ꦁ볯銂郥肂胣邽볯겼볯鎼볯鎼볯꺼뷯隽뷯螽뷯躽볯ꪁ臣꺁룥ꦲ臣貂臣蒁苣鞃菣릂菣覃臣覂ꫨ躰臣貂苣鞃菣릂菣覃苣ꮐ苣꺨胣꺁菣ꦃ苣龃菣銂铧蒁苣鎁臣貁臣趁苣芀냧颍臣꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃迥꾁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁触骮菩蚈볯鲆단骀苣뎃菣꾂돨꺁듧麃ꓥ覃菣ꒂ菣銂苣벃菣馁苣超裥ꪁ臣覼臣膀볯馀誏臣鎼胢ₙꃩ龟臣뢛ꏨ蒚臣鞃菣ꒂ菣벃臣꺁볯ꎼ볯ꮁ苣誂ꋥ薹臣貂苣芀볯馀鞃菣ꒂ菣벃臣膀髩ꖎ臣讂볯뢁諦閁苣龁볯뚈駩떅듧ꢃ뷤銂賥ꮐ臣ꚁ臣ꚁ苣袂臣芀铧ꎔ觧꾁胣ꆬ臣ꞁ胣뢁諦閁苣龁裥邙藩ꂴ臣袶賥閁苣膀駧뺏菣꾂苣벃臣떂菣꾂菣벃菣뎃苣閁苣讂胣㲂牢ਾ뗧鮏臣邃苣ꖃ菣Ꚃ苣ꮃ苣꾁胣誸꣨꺁菣ꦃ苣龃菣誏臣ꊼ뷯莽뷯貽뷯Ꞽ뷯貽뷯袼闥膓郥覼苣ꒂ菣릂볯꺼볯袼볯袽뷯銽뷯覽뷯螽뷯躽볯銂胣뎼뷯辽뷯辽뷯钽뷯銽뷯₁뷯銽뷯螽뷯邽뷯銽뷯膽볯貀볯蚽볯趀볯내菨袼볯뒼볯ꎼꎼ볯겼醼볯醼볯覼룤ꮁ菣鶃菣Ꞃ苣膃菣袼볯ꦼ볯ꎼ볯銈볯늼볯讁苣芸단覼苣ꢔ臣ꚁ郥芙뷥ꪳ꟧ꖅ臣讂臣ꢁ臣袂苣鲽裦閁苣讂胣銼볯莄臣钼臣覂볯ꖗ苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣貾胣뺔蟥閁苣龁苣ꒂ菣릂苣麛迥鞁胣뒛臣讂ꋥ薹臣ꢔ臣龁胣Ꚃ苣ꮃ苣龄鿦誏臣뾂菣醃苣ꪳ駧뺏臣膀볯馀볯薽뷯貽뷯薽뷯覭볯₌볯膽뷯閽뷯辽뷯覽뷯閽뷯ₓ뷯颽뷯銽뷯鎽뷯覽뷯躽隽뷯莽뷯辽뷯鎽볯ₚ볯₡뷯膽뷯辽뷯膽뷯辽뷯馽궼뷯躽뷯膽뷯貼꾼뷯蚽뷯銽뷯骼꾼뷯蚽뷯銽뷯₄볯躽뷯隽뷯銽뷯覽뷯馽낼뷯薽뷯鎽袼볯馼볯钼볯ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣袂臣ꮁ껥붖臣讂胣㲂牢ਾ곦ꮁ胣몙迧閁苣龁菣ꪃ裢袽뷯鎽苣낂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꾁胣设臣낁볯覽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼볯㲋猯灵銈苣것菣袃苣閃苣讃菣ꎂ苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣ꮁ苣誂곦꺁苣蚁臣뺲ꏨ閁苣讂胣붊蟥꾁胣늼뷯邽뷯銽뷯覭볯₌볯膽뷯閽뷯薽볯₌볯隼볯骼볯鞼볯���銈볯鞼볯ₙ볯醼볯馼볯覼臣風볨閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣膀苣ꒂ菣릂蓦鎟臣龁뗧뾁迦袁볯蚽볯내菨讁苣뾪ꏨ鞁臣芀냧颍臣꾁胣뎼뷯馼듧麃苣鞴뗦鞁胣薶鿩ꊳ蟥蚐铧邃菣閃苣벃볯銼볯趽볯꺁볯薽뷯薽뷯膀뷯ꢼ볯躼볯鮼볯銼볯閼뷯궼臣궼뷯ꎼ뷯㲌畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵鮼볯躼볯趽볯肀볯꒼볯ꆼ볯醼볯薼苣ꪃ苣궃菣ꮃ볯邼볯醼볯꺁볯낼裢钼볯鮼볯躼볯궼臣ꮼ볯貽볯궸臣趆蟦膿臣膀냦誸臣銼鯥銼볯銧雩薶鿩ꊳ蟥蚐臣龁胣薶鿩ꊳ蟥蚐觧銂臩莿裥ꊛ臣辀飦隌臣膀룤薸苣ꂲ跨邃菣閃苣벃볯閼볯趽볯ꪃ菣뢅ꇥ膀볯邼볯趽볯꺁볯膽볯貽胣醼볯薼苣ꪃ苣궃菣ꮃ胣邽볯鞼볯颼볯ꞁ볯邼胥貸蟩鞁胣邼볯钼볯캕趽菣ꎂ菣뾂菣ꞁ뿦躁臣龁胣꺼뷯㲉畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯讼⼼畳㹰裢꺼볯ꆼ苣겂菣벃苣ꮂ菣ꂃ볯놼뷯膽뷯薽뷯讁苣芸단覼苣閼뷯겼臣辷껥趩臣뾪ꏨ鞁胣銼볯趽볯꺁냦ꞁ듦蒵臣膀볯閼뷯겼臣ꂲ跨邃菣閃苣벃臣뎹ꇨ閁臣讂胣뺿臩鞁臣내菨붊蟥ꦉ臣膀꿦蚈볯躼볯趽볯ꞁ苣ꦃ菣ꮁ단랍臣讂胣ꮂ菣ꂃ苣膀裥뮔鯥躏臣讧臣讂苧ꞁ臣讂볯㲡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯颼볯㲐猯扵꺁菣벃苣ꦃ苣뎃臣ꞁ단랍菣莃菣ꆂ菣ꞁ듦蒵臣讂胣ꆬ臣膀苣ꦃ菣銂胣邵郥뾂菣醃苣ꪳ苣麝觧낕髧ꮁ뫦ꊛ臣讂뫤ꆬ듦蒵菣莃菣ꆂ菣袼볯邼뷯궼菣뎃藩ꦡ볯鎼볯邼뷯궼臣꺼뷯ꎼ뷯膀볯邼볯낂菣뮂菣벃菣膀뷯ꢼ볯躼볯覼臣鞴뗦馁苣芀볯㲡畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯颼볯㲐猯扵꺁菣벃苣ꦃ苣뎃臣趆뫥낈臩鞁臣貾胣ꮂ菣ꂃ苣貺곦鞴뗦邃菣閃苣벃룤ꞁ볯讁苣閼볯邼뷯궼苣龃菣뺂菣ꮃ该超臣閱雩鞁臣芀볯趽볯꺁裥뮔苣麛迥鞁胣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯誏臣肊鿦늉迥꾁苣ꮃ苣ꪃ菣릂菣ꆂ苣벃苣袼볯覽뷯螽뷯躽볯ꮁꓨ袐臣龁볯覽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼볯㲋猯灵銈볯뒼볯ꞁ臣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃臣蚈黦馁苣芀뫦ꊛ臣龁볯覽뷯㲓畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯邼⼼畳㹢裢뾂苣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣ꮐ苣뮔裥銂菣벃菣鞁臣ꂲ跨邃菣閃苣벃臣辀黦馁苣芀戼㹲芁苣蒁臣膀볯螽볯뾂苣袼迥꾁볯莽苣낂볯낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣뺲ꏨ꾁胣设臣낁胣鞃菣蚃苣뎃볯袏臣鞃菣蚃苣뎃볯ꮂ菣ꂃ苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣銂郥肂藥ꖟ臣꾂菣麃菣낂菣閃苣벃諦鎡苣ꢔ臣ꚁ껥붖臣趁苣芀戼㹲邀볯閼볯馼胣㲑牢ਾ볯늼볯醼볯閼胣낼볯꾼볯銼볯膀볯늼볯閼볯邼胣낼볯꾼볯钼볯膀볯늼볯鎼볯銼胣낼볯꾼볯隼볯膀볯늼볯鞼볯邼胣낼볯꾼볯邼볯膀볯늼볯鎼볯銼胣낼볯꾼볯醼볯膀볯���늼볯醼볯颼볯膀볯늼볯颼볯颼胣낼볯꾼볯隼볯膀볯늼볯鞼볯颼胣낼볯꾼볯颼볯膀볯늼볯馼볯颼胣낼볯꾼볯銼볯膀迥뎁볯늼볯醼볯鎼볯꾁胣邃苣ꖃ菣Ꚃ苣ꮃ苣龄鿦뎼뷯馼飦ꮙ듧麃臣邈諥辣臣몙迧閁苣龁胣몙迧꾁胣龮髩ꮁ臣邼볯閼裢銼볯릂苣벃菣ꞁ껥붖臣龁臣膀苣誂ꓥ趁臣袼뻤袁臣颼볯覼臣꺁ꫨ붣臣릮飦ꮁ苣놂菣ꮃ苣莃菣ꞁ臣讂胣뾂菣醃苣ꪳ臣膀꿥鲿臣讂苣뎃菣꾂돨꺁迥뚺賥ꊽ藦誏臣込迥꾁菣ꪃ裢ꢼ뷯鎽苣낂뷥讅臣뎂菣覃賥超裥袼뻤袁臣膀듧麃ꓥ覃菣ꒂ菣覼臣ꦼ뷯Ꞽ볯꺁菣뎃苣膀볯ꢼ볯誏臣ꎼ볯鎼菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣骮룥颠鿥超裥ꮁ黨袐臣龁볯螽볯鲽裦ꦉ볯ꒂ菣躃苣覃菣랂菣覼臣鞁臣몙迧閁苣龁胣㲂牢ਾ菣궂菣궃苣ꒂ菣릂蓦鎟볯蚽볯내菨ꞁ臣몙迧꺁臣膂臣膀볯ꎼ볯鞢맥ꮁ뛧蒁臣膀꿥鲿臣讂苣벃菣隌藩鞈苣邃苣ꖃ菣Ꚃ苣ꮃ苣몙迧馃苣뾂菣袼볯螽볯趞郥ꦉ臣뺯臣讂뷯芽볯낼볯躼볯螽볯誏臣鶃菣ꢼ뷯鎽苣낂臣뺯臣讂볯ꢼ볯ꢼ뷯鎽볯莽볯ꮁ苣隃苣궃菣讃菣낂臣膀臣꺁菣꾂苣벃迥뎁볯膽뷯閽뷯辽뷯辽뷯蒽볯뮙賩蚕꣦覼菣궂菣궃苣ꒂ菣릂볯꺼볯袼볯袽뷯銽뷯覽뷯螽뷯躽볯銂볯邼볯릂菣覃菣蚃菣낂菣銃菣ꮃ菣袼볯邽뷯蒽뷯邽뷯薽뷯膽蚽뷯閽뷯覽뷯薽뷯蒽뷯覼볯貀볯蚽볯趀볯내菨袼볯뒼볯ꎼꎼ볯겼醼볯醼볯覼臣ꪃ菣閃苣꾂菣뎃볯Ꞽ뷯芽뷯辽ꊼ볯겼볯銂铧蒁臣貐駦ꊽ돨뮧藥鞁臣芀뷯芽볯낼볯躼볯螽볯誏臣낼볯躼볯覽뷯躼뷯꾁胣芸단꺁菣궂菣궃苣ꒂ菣릂駧뺏菣꾂苣벃뷯뚼볯鎼볯鎼볯낼뷯膽뷯趽뷯躽뷯薽뷯覼臣꺿ꏩꦉ臣芁苣膀볯覽뷯袏臣ꚼ뷯뾂苣超裥銂郥肂苣蚁臣꺿ꏩ閁苣龁菣ꪃ菣뎃苣벃ꃩ龟苣膌臣芀듧麃苣膀볯邼볯꺁볯ꊼ볯袼볯馽뷯貽뷯躽뷯覼苣뮷諥鞁臣ꢼ뷯躽뷯꺁볯꺼볯銈볯궼鿥난臣邈闩閁臣龁胣내菨꾁胣銼볯莄臣閼韦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀룤薸苣麛迥鞁胣骶臣ꚁ볯邼볯ꚼ볯뎼苣뮷諥鞁臣ꢼ뷯躽뷯꺁볯꺼볯銈볯ꢼ鿥난臣誁臣讂볯蚽볯내菨龄鿦ꮁ苣讂듧醼볯꺁蓦鎟諥螎볯궼볯ꦼ볯ꞁ臣肜裥꺁苣ꒂ菣릂ꋥ薹臣ꢔ臣龁胣내菨銂볯颼蓢ꞁ볯ꖗ雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣誸룦銂鯥躏臣膀菣궂菣궃苣ꒂ菣릂駧뺏菣꾂苣벃臣誁臣讂뷤邈觧꺁駧뺏苣膀볯趽뷯꺁룤薸臣銼볯趽볯꺁菣릂菣뢂菣뾂苣뾂菣醃苣ꪳ铧꺁볯覽裢꺼볯ꆼ菣벃苣袼볯ꦼ볯Ꞽ볯꺼볯袏臣ꦼ뷯Ꞽ苣낂苣뎃菣꾂돨ꢔ臣鞃菣蚃苣뎃볯뮂菣ꆂ菣벃苣ꎼ볯銈볯ꊼ菣벃苣袼볯袽뷯銽뷯膽뷯覽뷯覼臣꺁菣莃菣邵郥膀곦蒁臣꾂菣���랂菣隃菣벃鿦늉臣袂苣ꢑ鿧꺁뿦ꚺ臣뾂菣醃苣ꪳ꣦隺臣钯볨馁苣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯蚈黦ꮁ苣誂룦骮臣龁胣㲂牢ਾ곧醼臣鞢맥誸룦銂볯뎼볯銈볯銼鿥난볯ꖼ뷯邽뷯薽뷯鎽뷯辽뷯₎볯馽뷯钽뷯趽겼볯ꎼ볯ꞁ裦랕臣鮁臣뎼뷯馼듧麃臣릂菣誃菣릟鳥袼볯邼볯趽뷯覼臣蒴볯躼볯꺁볯꾼볯ꞁ臣龄鿦ꮁ뷤ꢔ臣龁胣내菨꾁볯颼蓢ꞁ볯ꖗ雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣誸룦銂鯥躏臣ꚁ뿦躁臣龁胣邃菣膃뗧袐迥뎁볯꒼볯銈볯ꆼ볯ꖼ苣膀苣钃菣벃鿥난臣몙迧貁ꋧ趪臣貂苣뺁臣膀뿥膦臣鲿臣ꚁ맧誂뿨鞁臣芀戼㹲ꊽ돨뮧藥내菨讁苣꺁鷦뚻鿥난볯邼볯閼胣鎼볯覼苣膀臩莿裥ꊛ臣袂苣내菨銂駩뮎臣邼볯銼볯龃苣궃菣閃苣ꮃ苣벃苣骀臣ꚁ뿦躁臣讂臣ꢁ臣袂苣麛迥鞁臣芀菣ꪃ裢ꢼ뷯鎽苣낂뷤邈觧ꮁ臣蒁臣꾁胣뾂菣醃苣ꪳ뷤邈觧銂볯覽裢꺼볯ꆼ苣ꦃ菣袼볯覽뷯螽뷯躽볯銂铧蒁臣뺲ꏨ鞁臣芀닧붣觥ꮁ胣ꒂ菣肃苣벃菣銂鷦뚻鿥난臣閼뷯궼臣莿뫥뺁臣뮷諥鞁臣芀鷦뚻鿥난苣膀볯躼볯궼臣꺼뷯ꎼ뷯誏臣閼뷯궼苣龃菣뺂菣ꮃ苣ꮐ苣銼볯趽볯꺁볯薽뷯薽뷯貼邽볯鞼볯钼菣莃菣ꆂ菣ꞁ맥ꆡ賥鞁臣隼뷯貽臣꺼뷯銈볯뒼볯ꮂ菣ꂃ臣钼裢閼뷯貽볯蚈臣膵胩ꞁ볯莄臣誁臣ꚁ菣뎃菣鮾뗧鞁臣芀단랍뻥膀苣ꦃ菣銂臣覂臣뎹ꇨ邃菣閃苣벃臣鞴뗦鞁胣뾂菣醃苣ꪳ苣邼볯銼볯궼苣龃菣뺂菣ꮃ苣ꮐ苣뎹ꇨ邃菣閃苣벃臣뚺鯩鞁臣芀ꯩꚺ臣뺲ꏨ閁苣龁苣뎃菣꾂돨꾁胣骶臣ꚁ볯邼뷯궼臣ꢼ뷯邽뷯鎽胣邼볯醼볯궼臣꺼뷯ꎼ뷯誏臣钼볯꺁菣뎃菣袃菣ꮃ苣ꮐ苣꾲铨邃菣閃苣벃볯₌뷯ꢼ볯躼볯궸臣銼볯趽뷯꺁볯銼볯ₕ볯閽뷯薽뷯蚽뷯躽뷯袼볯袽뷯銽뷯膽뷯覽뷯覼苣ꢔ臣ꚁ蓨ꦡ臣膀裢颼볯莄臣꾲铨鞁臣芀戼㹲뾂菣醃苣ꪳ臣ꒂ菣躃苣覃菣랂菣袼볯莽郥覜볯鲽裦ꦉ苣ꖻ룤꺁苣蚁臣鞁臣ꆝ믤릟鳥讁苣뺲ꏨ鞁臣芀鷦뚻鿥난苣膀볯邼뷯궼臣ꪃ菣뢅菣袃菣Ꚃ菣邃菣閃苣벃볯₌뷯ꢼ볯躼볯ꞁ맥ꆡ賥鞁臣閼뷯貽臣鞃菣蚃苣뎃볯ꮂ菣ꂃ볯낼뷯膽뷯趽뷯莽뷯膽볯ꮁ단랍臣龁胣ꂲ跨貾胣ꮂ菣ꂃ苣뎹ꇨ邃菣閃苣벃臣랼臣鞴뗦鞁臣貾胣醼볯邼뷯궼臣꾂苣뎃藩貼邽볯鎼볯閼臣뚺鯩鞁臣芀뫦ꊛ臣龁苣뎃菣꾂돨꾁胣醼뷯貽臣뮔裥銂볯鞼볯趽볯꺁볯궼菣ꪃ苣邃菣閃苣벃볯₌뷯ꢼ볯銂郥肂껧ꮁ鯥躏臣讂臣ꢁ臣袂苣뎍뫥ꮁ룤Ꞁ賥鞁臣芀ꯩꚺ臣뺲ꏨ閁苣龁苣뎃菣꾂돨꾁胣骶臣ꚁ菣ꪃ裢ꢼ뷯鎽苣낂苣뎃菣꾂돨ꮁ臣蒁臣誸꣨鞁臣꾲铨邃菣閃苣벃룤ꞁ蓨ꦡ臣龁胣螝룤Ꞁ臣뎼볯뎼菣ꪃ苣꾂菣ꮃ���龃菣늂菣袼볯ꖼ볯覼鯩鞰돦開臣ꚩ꣩鞁胣ꢂ菣麃菣袼볯蒽뷯膽뷯覼裥ꎧ臣袂苣꺼裢ꮜꯧꊂ菣躃藩超裥몱껥鞁臣芀戼㹲낼볯꾼볯颼볯膀볯늼볯醼볯閼胣낼볯꾼볯邼볯膀볯늼볯鎼볯邼胣낼볯꾼볯鎼볯膀볯늼볯銼볯鎼胣낼볯꾼볯颼볯膀볯늼볯鎼볯鞼胣낼볯꾼볯銼볯膀볯늼볯閼볯邼胣낼볯꾼볯钼볯膀볯늼볯鎼볯銼胣낼볯꾼볯隼볯膀볯늼볯隼볯鞼胣낼볯꾼볯銼볯膀볯늼볯醼볯颼볯膀볯늼볯颼볯颼胣鞼볯颼胣낼볯꾼볯馼볯膀볯늼볯鞼볯颼胣낼볯꾼볯隼볯膀볯늼볯醼볯醼볯膀볯늼볯颼볯鞼胣낼볯꾼볯邼볯閼胣誏臣낼볯꾼볯邼볯醼臣邃苣ꖃ菣Ꚃ苣ꮃ苣龄鿦ꢼ뷯閼飦ꮙ듧麃臣誁臣ꚁ裦龊ꏨꮁ駧뺏臣貂臣芀駧뺏臣膀껥鮚臣꾁볯躼볯銈볯겼苣놂菣ꮃ臣龮雦鞁臣貁胣袂苣Ꞥ臣ꪁ볯设臣낁볯겼볯ꞁ臣뾪ꏨꮁ껥鎘臣릂苣벃菣ꊂ菣鞃臣趁苣芀戼㹲邀볯閼볯邼胣㲑牢ਾ菣궂菣궃苣ꒂ菣릂蓦鎟볯覽볯내菨ꮁ臣醁苣몙迧ꮁ臣蒁臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣뎂菣覃賥꒼볯ꆼ臣膀볯蚽뷯袼볯钽뷯膽뷯膽뷯薽뷯薽볯覭臣ꦁ뷥ꪁ돧ꞁꋥ薹臣貂臣节胣袏臣邃苣ꖃ菣Ꚃ苣ꮃ苣몙迧馃苣뾂菣꺁郥뺁苣讂苣钃菣벃菣뾂苣꺁룤膵볯閼胢銈볯ꮁ黨袐臣鮁臣节苣蒁胣鎁臣袂臣ꪁ苣钃菣벃菣뾂苣꾁胣鶃菣銈볯覽뷯뾂苣誏臣超雧낂菣隃菣뎃苣낂볯ꦼ뷯Ꞽ臣ꚼ뷯颠鿥覭볯銂郥肂胣꺨胣꺁菣ꦃ苣龃菣銂铧蒁苣鎁臣貁臣趁胣邽볯겼볯鎼볯鎼볯꺼뷯隽뷯螽뷯躽볯覭臣芸단꺁菣ꦃ苣龃菣讁苣颪냥閁苣龁菣ꦃ苣龃菣銂郥肂胣ꆰ跥ꮁ臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣袏臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣肉鳦꺁菩蚈볯鲆단骀苣뎃菣꾂돨꺁듧麃ꓥ覃菣ꒂ菣銂苣벃菣馁苣超裥ꪁ臣覼苣膀볯馀誏臣鎼胢ₙꃩ龟臣뢛ꏨ蒚臣鞃菣ꒂ菣벃臣꺁볯ꎼ볯ꮁ苣誂ꋥ薹臣讂胣閼胢ₙ菣ꦃ苣麃菣꾁髩ꖎ臣讂볯뢁諦閁苣龁볯뚈駩떅듧ꢃ뷤銂냥ꖅ臣ꚁ苣袂臣芀铧邈觧꾁胣ꆬ臣ꞁ胣뢁諦閁苣龁裥邙藩ꂴ臣袶賥鞁臣몙迧馃苣뾂菣ꮁ苣隃苣궃菣讃菣낂臣貂苣芀뻤袁臣膀뷯뚼볯醼볯馼볯꺁ꫨ躰뷤꾁菣袃볯螽볯袼뷯芽볯낼볯躼볯螽볯覼臣ꚼ뷯颠鿥袏臣꺼볯궼볯超裥꺁볯銃苣膃苣뎃볯邽뷯躼볯ꢼ볯ꢼ뷯鎽볯뾂苣许뗦袼볯馀裢覼苣ꮐ苣鎁臣貁臣趁苣芀戼㹲ꢼ뷯閼듧麃臣膀볯鞼蓢膀볯꾼볯ꆄ臣膀菣뎃볯릂菣것菣袃蓧鞁臣ꆝ믤许臣閼볯薼臣蚛꿥ꚺ臣ꞁ裦랕臣鮁臣芀볯閼볯趽뷯鞃菣벃菣蒐胣ꮁ臣蒁臣膀볯邼볎뷯꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣銂郥肂뷯ꦼ볯馃菣릂菣꾂苣벃苣醼뷯貽臣ꖼ뷯銈듧麃鿥난볯銪돨���骼볯颽裢내菨钼볯醼볯醼볯醼볯邼臣겼裢Ꞽ뷯閽ꪼ볯ꢼ肀볯覽뷯鎽뷯覽뷯躽뷯薽莼볯钼볯邼볯銈볯颼볯袼돦骼臣꺁ꫥꪳ臣붻蓦鞏胦覼볯ꢁ럦袐臣膀裥꺁껧ꮁ臣蒁臣膀볯邼볯캐貽臣뮂菣閃苣꾂菣뎃볯ꎼ뷯貽뷯ꚼ볯ꎼ볯ꦼ볯袼볯覽뷯莽뷯₏볯늼볯€볯醼볯鎼볯銼裢邼볯邼볯袼菣ꮃ菣莃苣릂臣랷郥覼볯銂볯趽뷯꺁볯颽裢내菨릟鳥ꢁ럦袐臣讂胣銼臣꺁뫦늶苣랷郥鞁胣꒮룦ꞁ볯閼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣鞁臣芀볯趽뷯꺁볯颽裢내菨릟鳥銂볯趽뷯꺁볯꺼볯込苣ꮃ菣Ꞃ苣膃菣랷郥ꦉ臣뮷諥鞁胣ꖼ뷯銈듧麃鿥난臣醼鯥鞴뗦鞁臣ꢼ뷯閼듧麃룤ꮁ뇥ꊽ裦閁苣芀곦蒁臣鞃菣벃菣銂髦궸껥ꦸ臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣ꆬ臣ꞁ볯꺼볯込苣ꮃ菣Ꞃ苣膃菣랷郥ꦉ苣뢐볥鞁胣내菨銂볯颽裢내菨ꞁ볯麛裦鞹臣ꚁ臩낉臣뮂菣閃苣꾂菣뎃苣꒙軥馁苣芀볯邼뷯貽臣낖껩ꪁ볯颽裢내菨릟鳥銂럦ꂊ臣膀듧麃苣銼볯莄臣鎼韦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀룤薸苣麛迥鞁臣膀菣궂菣궃苣ꒂ菣릂蓦鎟菣꾂苣벃臣꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁駧뺏苣膀볯趽뷯꺁룤薸臣銼볯趽볯꺁菣릂菣뢂菣뾂苣뾂菣醃苣ꪳ铧꺁볯覽裢꺼볯ꆼ菣벃苣袼볯ꦼ볯Ꞽ볯꺼볯袏臣ꦼ뷯Ꞽ苣낂苣뎃菣꾂돨ꢔ臣鞃菣蚃苣뎃볯뮂菣ꆂ菣벃苣ꎼ볯銈볯ꊼ菣벃苣袼볯袽뷯銽뷯膽뷯覽뷯覼臣꺁菣莃菣邵郥膀곦蒁臣꾂菣랂菣隃菣벃鿦늉臣袂苣ꢑ鿧꺁뿦ꚺ臣뾂菣醃苣ꪳ꣦隺臣钯볨馁苣뎼볯뎼裢낼볯Ꞽ볯蚈黦ꮁ苣誂룦骮臣趁苣芀戼㹲ꊽ돨뮧藥내菨讁苣꺁鷦뚻鿥난볯邼볯閼胣鎼볯覼苣膀臩莿裥ꊛ臣袂苣내菨銂駩뮎臣邼볯銼볯龃苣궃菣閃苣ꮃ苣벃苣骀臣ꚁ뿦躁臣讂臣ꢁ臣袂苣麛迥馁苣芀菣ꪃ裢ꢼ뷯鎽苣낂뷤邈觧ꮁ臣蒁臣꾁胣뾂菣醃苣ꪳ뷤邈觧銂볯覽裢꺼볯ꆼ苣ꦃ菣袼볯覽뷯螽뷯躽볯銂铧蒁臣뺲ꏨ馁苣芀닧붣觥ꮁ胣ꒂ菣肃苣벃菣銂鷦뚻鿥난臣閼뷯궼臣莿뫥뺁臣뮷諥馁苣芀鷦뚻鿥난苣膀볯躼볯궼臣꺼뷯ꎼ뷯誏臣閼뷯궼苣龃菣뺂菣ꮃ苣ꮐ苣銼볯趽볯꺁볯薽뷯薽뷯貼邽볯鞼볯钼菣莃菣ꆂ菣ꞁ맥ꆡ賥鞁臣隼뷯貽臣꺼뷯銈볯뒼볯ꮂ菣ꂃ臣钼裢閼뷯貽볯蚈臣膵胩ꞁ볯莄臣誁臣ꚁ菣뎃菣鮾뗧馁苣芀단랍뻥膀苣ꦃ菣銂臣覂臣뎹ꇨ邃菣閃苣벃臣鞴뗦鞁胣뾂菣醃苣ꪳ苣邼볯銼볯궼苣龃菣뺂菣ꮃ苣ꮐ苣뎹ꇨ邃菣閃苣벃臣뚺鯩馁苣芀ꯩꚺ臣뺲ꏨ閁苣龁苣뎃菣꾂돨꾁胣骶臣ꚁ볯邼뷯궼臣ꢼ뷯邽뷯鎽胣邼볯醼볯궼臣꺼뷯ꎼ뷯誏臣钼볯꺁菣뎃菣袃菣ꮃ苣ꮐ苣꾲铨邃菣閃苣벃볯₌뷯ꢼ볯躼볯궸���銼볯趽뷯꺁볯銼볯ₕ볯閽뷯薽뷯蚽뷯躽뷯袼볯袽뷯銽뷯膽뷯覽뷯覼苣ꢔ臣ꚁ蓨ꦡ臣膀裢颼볯莄臣꾲铨馁苣芀戼㹲뾂菣醃苣ꪳ臣ꒂ菣躃苣覃菣랂菣袼볯莽郥覜볯鲽裦ꦉ苣ꖻ룤꺁苣蚁臣鞁臣ꆝ믤릟鳥讁苣뺲ꏨ馁苣芀鷦뚻鿥난苣膀볯邼뷯궼臣ꪃ菣뢅菣袃菣Ꚃ菣邃菣閃苣벃볯₌뷯ꢼ볯躼볯ꞁ맥ꆡ賥鞁臣閼뷯貽臣鞃菣蚃苣뎃볯ꮂ菣ꂃ볯낼뷯膽뷯趽뷯莽뷯膽볯ꮁ단랍臣讂胣ꂲ跨貾胣ꮂ菣ꂃ苣뎹ꇨ邃菣閃苣벃臣랼臣鞴뗦鞁臣貾胣醼볯邼뷯궼臣꾂苣뎃藩貼邽볯鎼볯閼臣뚺鯩馁苣芀뫦ꊛ臣龁苣뎃菣꾂돨꾁胣醼뷯貽臣뮔裥銂볯鞼볯趽볯꺁볯궼菣ꪃ苣邃菣閃苣벃볯₌뷯ꢼ볯銂郥肂껧ꮁ鯥躏臣讂臣ꢁ臣袂苣뎍뫥ꮁ룤Ꞁ賥馁苣芀ꯩꚺ臣뺲ꏨ閁苣龁苣뎃菣꾂돨꾁胣骶臣ꚁ菣ꪃ裢ꢼ뷯鎽苣낂苣뎃菣꾂돨ꮁ臣蒁臣誸꣨鞁臣꾲铨邃菣閃苣벃룤ꞁ蓨ꦡ臣讂胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣螝룤Ꞁ臣뎼볯뎼菣ꪃ苣꾂菣ꮃ苣龃菣늂菣誏臣ꢂ菣麃菣袼볯蒽뷯膽뷯覼裥ꎧ臣袂苣꺼裢ꮜꯧꊂ菣躃藩超裥몱껥誏臣肉鳦袏臣薿ꛨꮁ뿥颁臣隻臣蚈黦讉돦ꮁ苣誂ꧨꆾ臣趁苣芀戼㹲鎁臣ꮁ臣蒁臣讖ꓧ閁苣龁ꓥ辁臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀룤風臣몤臣龁苣蚁臣邈諥辣臣몙迧閁苣龁胣㲂牢ਾ胣邼볯钼볯醀戼㹲龮雦设볯邼볯骼볯늼볯鶃菣骃菣膃菣ꮁ뗧袐臣讂諦鎽臣뾪ꏨ㲽牢ਾ臣꺁껥붖뻤꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣릉闧蒚臣邵郥ꞁ臣讂菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤꺁ꫨ붣苣设ꓧ馁苣芀戼㹲ꊃ菣꾂菣벃菣ꮃ諦鎽臣龔铧꺁臣膂臣肊ꇨ꾁胣鎁臣蚈蟩ꞁ鿧覂苣ꚁ臣誂胣设臣낁胣Ꞽ뷯蒽뷯躽뷯貼룤늎臣風볨閁苣ꚁ臣讂胣ꢔ臣覂苣鞾苣超雧龎臣膀닧붣볯늼볯鶃菣骃菣膃菣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣銂郥肂黨袐苣뎃菣꾂돨膀듧麃ꇨꊝ臣蒵迦袁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣銂駧뺏臣讂듧麃苣ꮐ苣芀藥ꮖ軥꺁臩麊臣膀뷥궥胨貁臩ꚺ臣龮꣩銂臣讂臣ꢁ臣辁臣馁臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ볯膽뷯芽볯莽귧꺁菣Ꚃ苣銂胣貮藥閃菣ꒂ菣袃苣뢂菣邃菣袃臣뎹賥鞁臣꺚룤袏臣릅藨薆臣醼裢醼볯邼菣ꒂ苣궃苣ꦃ菣ꞁ돦ꖅ臣龁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣超雧龎臣超雧隌臣讂胣芁苣蒁臣膀藥ꮖ軥銂볯낼볯銈볯꒼볯ꊂ苣ꖃ菣뎃菣袼볯覽뷯覽ꦼ뷯趽뷯躽뷯莽뷯薽뷯覽뷯膽뷯₌볯薽뷯薽뷯銽뷯貼ꢼ뷯趽뷯貽뷯辽뷯貼궼볯覼臣뎹賥鞁胣開觧꺁뻥뎶맨ꮁ돦ꖅ臣ꚁ苣袂臣芀藥ꮖ賥鞁臣麃苣릂臣膀곦蒁臣醼볯讁苣醼볯ꖗ뻥ꮁ胣뢁諦鞁臣ꊂ苣ꖃ菣뎃菣궸臣뎹賥鞁臣颻諥蒚藥ꮖ뫦ꞁ뿨ꂊ藥ꮖ臣讂胣鶁臣貾胣낕胩鎖胣���麃苣릂苣閁苣ꪁ苣超雧隌돦蒰臣붿諥超雧馁苣芀諦銈볯늼볯鶃菣骃菣膃菣鞊뷤꺁ꓦ몇臣龁苣꺁볯겼볯뎼볯ꊂ菣뮂苣ꞁꧨ鎨臣讂臣膂臣膀菣袃菣ꪂ菣鎃苣ꮃ蟥股臣覂臣股룦ꚩ雦銂菣Ꚃ苣讁苣ꢑ鳦蒚臣ꆎ迥鞁臣节苣蒁胣㲂牢ਾ臩鎽臣鞊뷤鮊뻤貁ꓦ몇臣貂臣貾胣鞊뷤ꮁ胣붙胦趀臣開觧ꮁ胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃鷩袄蛥ꢳ냥꺁鳦貾臣ꢳ藥銂臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣讂胣鎼臣覂볯ꖗ뻥膀菣Ꚃ苣銂뇥몮臣膀蓨鎇苣随苣몇臣龁胣ꆬ臣ꞁ蓨鎇듧麃苣袼볯閼볯鶃菣ꢂ菣것菣낂菣뎂菣ꮃ苣ꢔ臣ꚁ볯膀볯ꎼ볯뒼臣覂闧랏볯늼볯醼볯馼볯ꞁ藥讉迥붃臣낼볯뢼볯鎼볯螽볯躼볯覭臣뢁諦閁苣龁菣Ꚃ苣ꢪꯩꮅꃦ隌듧麃臣趞郥閁臣龁胣趞郥ꮁ苣誂菣ꒂ菣ꪃ菣벃菣내菨貁铧邈臣貂胣ꆬ臣ꞁ胣ꢼ볯뒼볯銃菣궂苣뎃菣뎃胣ꊂ菣躃菣蚃菣뎃胣誏臣膃菣뢂菣覼鿥난苣ꮐ苣馼볯Ꚃ苣ꮃ뗧钹鿥誤菣것菣袃臣钒臣膀鷩趞郥내菨膀ꫩ蒫藨较苣隃菣莃菣膀迥뎁蓨鎇듧麃菣ꒂ菣ꪃ菣覃臣鞢껦銂飩뎮臣龁胣㲂牢ਾ菣ꒂ菣ꪃ菣벃菣내菨꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣뺯臣讂迥鲿胦ꮁ臣蒁臣꺁볯겼볯뎼볯ꞁ苣꾂菣벃菣뎃苣閁苣讂胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣뺯臣讂菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤銂裥貳臣讂胣붙胦趀菣ꒂ菣ꪃ菣벃菣내菨꺁뇦骮臣膀諦鎡룥颭臣蒯鯥薆臣芁苣芀戼㹲붙胦较苣隃菣覃菣麃듧麃苣貐돧꺁볯膽뷯芽볯莽菣Ꚃ苣ꮁ藨钅蛥ꢳ藥鞁胣鞊裢낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤銂郥肂藨뒰苣龔裦閁臣讂胣芁苣蒁臣膀菣ꒂ菣ꪃ菣벃菣내菨銂胣蒵맧릟ꓩ閃菣릂苣袏臣궃菣ꦃ菣鲃菣ꮃ臣邈闩閁臣讂臣ꢁ苣ꞁ臣讂胣릅냦궸臣龔裦閁苣龁菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤꺁닧붣臣膀ꇧ뢅苣뎃菣讃苣ꂃ닦趙胣鶁苣ꮁ뛧辁苣ꮃ軦꒙苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ裢銂铧蒁臣財臣鎁臣貁臣趁苣芀臣讂臣꾁胣鞊뷤꺁菣궃菣ꒂ菣ꆼ迥꾁菣궃菣ꒂ菣Ꞽ臣꺁ꛨ貒胦ꮁ鿥ꖁ臣ꊂ菣ꎂ菣蚃苣꾂菣麃菣낂菣閃苣벃苣ꢔ臣讂臣ꢁ苣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣邼볯钼볯醀戼㹲龮雦设볯邼볯骼苣ꆃ菣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃戼㹲낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀苣뎃菣꾂돨뺲ꏨ銂뿤늀臣讂臣膂臣肸迥꾁ꓨ낕臣颻諥蒚菣ꪃ菣鞃菣覃菣ꆃ苣뎃苣膌臣궂菣ꦃ苣뎃菣꾂돨ꢁ臣ꚁ駧뺏臣鮁臣节苣蒁胣鎁臣袂臣ꪁ닧붣뿤늀菣ꆃ苣뎃臣膀臣貂苣ꮁ駩覂苣ꪁ臣貁胣몛껥隌蟩麱臣꺁닧붣苣꾏菨ꮁ臣讂菣릂菣뢂菣銈菣ꪃ菣袃菣ꆂ菣ꊃ苣ꖃ菣ꮃ귧꺁蟩麱苣것菣袃뷥邈菣鞃菣覃胣몛껥隌藥ꮖ苣궃菣ꪃ菣ꞁ臣뺲ꏨ銂迥붃臣馁苣鞃菣蚃苣뎃볯���覃菣ꒂ菣膀迥뎁볯겼볯Ꞽ볯袼闥膓郥覼볤閱볯ꪦ鋥Ꞁ닧붣돧袼볯趽뷯閽뷯薽뷯ₘ볯辽뷯邽볯貼뎼뷯膽뷯钽뷯薽볯₌볯膽뷯袽볯覼臣ꦈ铧閁苣讂菣ꆃ苣뎃苣ꮐ苣芀닧붣菣ꆃ苣뎃迥뎁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣超裥꺁雩ꮁ鯥邭볯ꆼ迥꾁苣뎃菣궃苣誃菣벂볯ꦼ뷯隽뷯钽뷯辽뷯薽뷯貼뎼뷯躽꒼뷯薽뷯辽ꎼ뷯貽뷯蚽볯覼귧꺁裥궖迥붃臣ꪃ菣ꮂ菣超裥銂郥肂臣ꢁ臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣銂苣벃菣馁苣꒼볯ꆼ臣몙迧莿胩ꮁ鳦ꢔ臣芁苣蚁胣㲂牢ਾ胣邼볯钼볯醀戼㹲龮雦设볯邼볯骼觧낕髧鞊뷤銂铧蒁臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣뺲ꏨ㲽牢ਾꓥ뚄迥꾁뗧鮏臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀臣꺁裥躇臣꺨胣꺁꣦隺髧ꪁ苣뎃菣꾂돨뺲ꏨ릖돦ꮁ苣ꎁ臣뺲ꏨꞁ臣讂胣设臣낁胣鞃菣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃胣邈蛧鶃菣骃菣膃菣膀迥꾁菣것볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꾁胣뺯뇨ꢁ臣讂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣ꮁ觧낕髧ꪁ諦鎽苣ꢔ臣龁藥ꮖꛨ貒胦꾂菣麃菣낂菣閃苣벃臣袂臣ꚁ닧붣臣貂苣芀룤겈臣膀藥ꮖꛨ貒胦ꮂ菣ꂃ臣鞊裢낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃諦鎽苣뮴胦隌苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣릨蓨ꮁ藥覜뗧袐臣鮁臣鲽裦閁苣讂胣㲂牢ਾ菣ꪃ苣궃菣誃菣超雧낂菣隃菣뎃臣膀ꇧ뢅苣뎃菣讃苣ꂃ臣꺁닦뾮迥꾁鯥骮賥鞃菣蚃苣뎃볯袼볯袽뷯銽뷯膽뷯覽뷯₁볯ꮼ볯₢볯覽뷯钽뷯莽뷯躽뷯貽뷯螽뷯貼낼뷯鎽뷯膽뷯膽뷯膽뷯貼꺼볯ꪼ볯覼臣꺁닧붣臣蒁臣貂臣ꮁ苣誂藥ꮖꇨ薸臣覂ꫨ붣臣貂苣芀郥颧臣膀菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤꾁胣ꮡ藩ꊂ菣ꊃ菣Ꚃ菣袲껦袏臣몛껥隌菣궃菣ꒂ菣ꆼ臣꺁苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣ꮁ苣誂菣Ꚃ苣릅냦늶臣覂ꫨ붣臣貂苣芀菩蚈髧ꮁ닧붣臣貂臣超雧낂菣隃菣뎃臣膀볯躽볯銽裢뮴胦隌苣閃苣궃菣릂볯蚕鏥趐볯袼볯袽뷯銽뷯膽뷯覽뷯₁볯ꮼ볯₢볯覽뷯钽뷯莽뷯躽뷯貽뷯螽뷯覼귧꺁苣궃菣袃苣ꦃ菣ꎂ菣릨蓨ꮁ藥覜뗧袐臣貂苣芀諦鎽臣릨蓨ꮁ뗧袐臣貂胣릨蓨貁菣궃菣꾂臣貂胣颪냥鎽꣦芄臣붣胩薀臣螌ꓧꮁ뻥ꎁ臣鞴뗦閁苣讂胣㲂牢ਾ臣꺁苣蚁臣超雧ꪦ鋥Ꞁ苣ꦃ菣꾁胣꾏뫦隌뷥讅臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣ꮐ鳦馁苣내菨讁苣꺁铧蚈苣뾪ꏨ馁苣鎁臣ꮁ苣讂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁닧붣臣誁臣ꚁ裥ꢔ臣貂苣芀臣꺁ꫨ붣觧꾁胣鞴뗦ꒉ臣뮷諥袏臣鎁臣蚈蟩ꞁ藥ꖟ臣릖돦ꮁ苣誂뻥蚈臩莿裥ꊛ苣讻臣ꚁ뻥覂苣讂藥내菨袏臣내菨邈裥뮔裥꺁迥뚺賥ꮁ苣誂ꫨ躰臣貂苣芀臣讂臣꾁胣랂苣誃菣超裥銂郥肂迥뚺賥낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀듧麃臣邈闩馁苣릟鳥궸臣릲꟦ꪁ蟩ꞁ裥貳臣貂苣���戼㹲꾏뫦隌볯늼볯鶃菣骃菣膃菣ꮐ鳦뾪ꏨꦉ臣膀藥ꮖꛨ貒胦ꮂ菣ꂃ苣骀臣貂胣ꮂ菣ꂃ臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣붥臣鞁臣뢐鷧銂臣鮁苣ꆝ믤许볯设臣낁胣鞴뗦ꒉ귥ꢜ룤꺁ꯩꒂ苣뎃볥ꚺ菣莃菣ꆂ菣覼臣鞴뗦閁苣讂胣ꆬ臣ꞁ胣ꮂ菣ꂃ臣膀諦鎽볯낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃뗧袐苣蚈꟨馁苣ꆝ믤许볯设臣낁胣蒴볯銈볯ꢁ臣ꎁ臣躽뷯ꢼ胣颫뿦ꚺ臣뾰듧袏臣膃苣랂苣뎃藩ꒂ苣뎃귧꺁苣ꪂ菣궃菣鞃볯ꞁ뫦ꊛ臣貂胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣麛迥閁苣讂胣㲂牢ਾ胣邼볯钼볯醀戼㹲龮雦设볯邼볯骼雨ꒉ苣꾂菣벃菣뎃苣㲰牢ਾ鳦몙飦꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃迥꾁臣꺁뗧袐雦螉苣꺨胣꺁雨ꒉ苣꾂菣벃菣뎃苣肊ꇨꮁ臣蒁臣뾽铧馁苣鎁臣ꮁ苣讂賥袐觧꺁苣꾂菣벃菣뎃苣ꮁ觧ꮁ鳦ꢔ臣芁苣芀臣꺁苣蚁臣몈꣦膨铧蒁苣貂苣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃迥꾁雦螉臣膀뫦늶룤꺁蟨놔諧讅臣节胣몛뷤꾔賦鎽臣몛껥閁苣ꚁ苣膀듧麃ꇨꊝ臣趽뷧鞁臣节胣내菨薆臣肱鳥隌臣ꚁ臣ꚁ苣袂臣芀雨ꒉ苣꾂菣벃菣뎃苣꺁볯ꒁ臣릖돦꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃迥꾁雦螉苣몙迧馁苣蒵迦袁ꃦ뢅臣覮껥ꮁ뷥ꪳ꟧ꖅ臣貂苣龜ꃦ龔觧袏臣龎ꃦ龔觧뾮룤내菨銂裥ꢔ臣讂胣겖觥꾁胣鶁臣袂臣ꪁ뷥ꪳ꟧ꖅ듧麃臣뺯臣ꚁ胣뚫郥蒚뗧袐苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ苣꾂菣벃菣뎃苣閁苣讂胣鶁臣袂臣ꪁ듧麃臣膀铧颭迥붃迥꾁鯥骮賥ꊽ藦꺁臣骁苣讁臣誁臣ꚁ胣馨뫦蒚臣邵郥ꊂ菣뮂苣ꮁ뷤ꢔ臣趁苣芀뻤袁臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣袏臣궖觧ꢁꧨ鎨臣貂苣ꚩ雨꺁雩ꞁ臣螤郥鎽뷥邈苣겸껥鞁臣袂臣芀臣讂臣꾁胣ꚩ꣩馁苣ꚩ雨ꮁ苣ꎁ臣龔臣讂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣ꢁ臣꺁꣦蒚듧麃臣꺁雩꺁ꓨ袐뷤ꊽ裦ꮁ臣醁苣鮸냥銂ꧨ鎨臣讂뫤节臣趁苣芀戼㹲뎍臣겜駧躘臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣ꊖ胩뺖苦袏臣鲚껥ꮁ뷥뾟苣躸臣蚁苣겖觥袏臣뮻蓦꺁믤꺁ꧨ겖臣릂苣ꪃ菣讃菣낂雦閳苣邏뻤馁苣芀臣貂苣꺁雦閳臣膀臣꺁ꧨ겖苣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃迥꾁雦螉臣ꖎ꟨閁臣膀볯覽볯ꚩ雨ꢁ볯늼볯鶃菣骃菣膃菣袏臣궖觧ꢁ臣鎖臣螤郥鎽臣颭鳥ꮁ臣蒁臣膀迥꾁볯覽뷯覼볯늼볯鶃菣骃菣膃菣袏臣궖觧ꢁ듧麃臣꺁雩꺁ꓨ袐뷤꺁귥ꢜ臣ꒁ臣ꚁꓦ骮臣讂臣ꢁ苣ꮐ苣芀臣貂苣꺁ꯧ袐뗧袐苣莃苣ꒂ臣꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃迥꾁雦螉臣뢅黥蒚臣꾁꣦颭臣貂苣芀臩螈臣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃臣貾胣閃菣벃臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃迥꾁雦螉苣邵郥ꊽ藦꺁苣꺁臣覂裥ꊛ臣膀菣ꪃ菣袏臣ꪜꓨ袐臣馨귨꺁蟩貁胣릉껥꺁ꧨ겖臣낼볯꾼���ꪃ菣鞃菣覃臣邵郥馁苣袏臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃볯내菨螤郥鎽苣뮘껥馁苣붃諥꺁냥ꚺ臣ꪁ苣芀戼㹲겖觥릂苣ꪃ菣讃菣낂臣龁苣꺁믤꺁諦鎡臣膀菣ꪃ菣鞃菣覃臣뺯臣ꚁ臩鎽臣邵郥ꪦ鋥Ꞁ苣膌臣隌郥ꦉ臣ꒁ臣ꚁ臣颫苣ꮃ菣鞃菣袃苣꾂菣벃菣뎃苣銂迦鮾臣膀볯馼볯钼맥馼鳦醼볯ꖗ臣몙ꇨ閁苣龁볯꾼颼볯込볯鎼볯隼볯ꮁꧨ내臣風볨閁苣ꚁ臣讂胣ꆰ跥ꮁ뿨릁苣낁胣骤闦꺁闧ꪁ苣辰黥骃菣膃菣ꚩ꣩隌郥ꦉ臣膀菣ꦃ苣膃菣꾂菣뎃귧꺁鯥鎽铦膌뷤袏臣뺹臣讁臣隻臣ꢡ鷩誸臣袐裦閁苣讂胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꦁ铧馁苣ꢁ胣骃菣膃菣ꚩ꣩隌郥ꦉ臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣趏뿥鞁臣鞴뗦閁苣讂胣邵郥鞁臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣鎁臣蚈蟩ꞁ觨辁鿧覂苣龁雦閳臣袂苣鲤蟥閁苣讂胣뺲ꏨ鞁臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀룤風臣겖觥릂苣ꪃ菣讃菣낂諦鎡臣뾽铧馁苣龁苣ꮁ菣것菣袃룤ꮁ鯧ꖎꋨ蚦臣讂臣ꢁ苣ꞁ臣讂胣閁苣ꮁ胣麝룤貒諦鎽臣膀菣鞃菣覃苣閍跦鞁胣鶁苣銂鯥鎽铦膌뷤誸臣몛껥隌臣讂臣ꮁ뷤ꢔ臣趁苣芀戼㹲뺁臣膀鳦몙飦꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣邵郥꾏菨ꪁ룤貒諦鎽臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣袏臣鶁臣궖觧ꮁ臣蒁臣ꚩ꣩隌郥ꦉ臣릉闧蒚臣뚫郥馁苣뚫郥겖觥릂苣ꪃ菣讃菣낂苣莃苣ꒂ苣莀藦馁苣芀臣꺁雦閳臣誁臣ꚁ胣鞊뷤꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀룤袏臣螤闦꺁諦龎뇦骮鿥銂賦ꒁ믤辄臣骃菣膃菣꺁귥ꢜ苣鲤蟥馁苣꺁臣뾽铧ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣邼볯钼볯醀戼㹲龮雦设볯邼볯骼郥蚐髧겖觥궨꣨㲈牢ਾ郥蚐髧겖觥궨꣨꺁鯧蒚臣膀꿥ꆱ臣馁苣龔觧ꚭ髧뮴胦鶃菣骃菣膃菣袼뻤袁臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣覼迥꾁臣貂苣貁鯧銺뷤ꢔ臣讂냥蚈귥膀뻤袁臣ꊂ苣讃苣袃胣ꊂ菣뾂苣讃苣袃胣袏臣ꒂ菣銃菣뾂菣꺁꟦ꂀ髧麡볤ꦉ苣붣胩馁苣鎁臣ꞁ臣讂胣鎁苣覂臣设臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁苣誂듦Ꞁ臣覮껥ꪁ뷥讅迥꾁苣뎃菣鲃臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣龩菨銂뿤늀迥꾁飩뎮臣讂雨ꒉ臣떉뷤ꮁ뷤ꢔ臣趁苣袼迥莀胣ꢼ뷯蒽뷯鎽뷯躽볯₌볯覽뷯込볯薽뷯袽뷯辽뷯辽뷯馽볯₌볯骼醼볯銈볯醼袼볯馼볯醼볯覼胣㲂牢ਾ볯ꒁ臣릖돦ꮁ臣蒁臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣膀迥꾁볯늼볯銈苣뎃菣鎃苣벃ꓨ袐뷤꺁룤ꆬ藥讧胩貁胣颽럧邵駦ꚭ臣袂苣膀苣뎃菣ꖃ菣뾂菣螃菣隌臣袂苣膀鳦节藥讞髧ꮁ臣銼臣꺁雦閳臣蒵臣袐苣鮁臣袂苣몱껥馁苣芀裥邭臣讧胩銂꟨躘臣뮴胦ꢃ뷤銂뇦骮臣讂臣膂臣꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꊽ諧誏臣뮛跨꺁룤릖臣���ꫨ閁苣ꪁ臣貂臣ꪁ苣ꪁ臣芀闦꾁냥ꪁ臣貁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣讧胩ꮁ雩馁苣覜铧ꪁ菦놠臣뢛郥뾂菣醃苣ꪳ臣讧胩ꮁ鿥ꖁ臣龁菣螃菣隌臣袂臣ꚁ뻥覂苣讂臣ꢁ苣芁苣芀룤릖臣뒠郥ꮁ臣蒁臣膀雩ꎀ臣讂꟦ꂀ菦놠臣膀ꇩ벼볯늼볯鶃菣骃菣膃菣颧裥邭臣궨꣨袏臣財臣蚁臣ꒂ菣銃菣뾂菣꺁郥骮臣뾽铧閁苣讂胣袐郧蒚臣겖觥궨꣨꺁鳦ꢔ臣设臣膀볯銽뷯颽뷯辽뷯誏臣랼뷯貽뷯鎽볯₌볯覽뷯莽뷯薽뷯覽뷯钽뷯馽볯₌볯醼볯ₚ볯鞼볯隼裢鞼볯邼볯ₑ볯醼볯馼볯覼臣몤臣貂臣蒁苣袂臣ꪁ郥誸臣龁듦Ꞁ迥꾁껥骮胦銂賦ꒁ裥邭胣袏臣ꆼ뷯袽뷯閽뷯膽귧貼ꪼ볯₎볯覽뷯莽뷯薽뷯躼볯₌볯醼볯骼鞼볯銼裢鞼볯隼袼볯馼볯鎼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣ꦤ蓧骃菣膃菣꺁苣뎃菣鎃苣벃胣ꊂ苣讃苣袃胣袏臣ꊂ菣뾂苣讃苣袃臣鞁臣鲽铧馁苣蚈귥銂郥肂胣㲂牢ਾ臣龁胣誸꣨꺁苣蚁臣龩菨ꊂ菣뮂苣ꮁ苣ꎁ臣뢁諦閁苣龁꣦蒚觧낕髧ꪁ諦鎽苣颍鯩鞁臣꺁뇦鮁苣蚁꟦ꂀ苣ꎧ飦馁苣鎁臣节臣趁苣芀臣꺁雦閳臣膀軥蚐髧ꮁ臣膀臣貂臣骶臣겖觥궨꣨貁鿥躤苣誁臣鎁臣꺁臣趁苣閃苣벃菣뎂苣袼뷯袽뷯銽뷯膽뷯辽뷯薽볯銂铧邈臣讂胣龩菨蒚臣겖郧ꚭ髧ꮁ듦Ꞁ臣鞊뷤ꮁ꿥馁苣鞊裢ꒂ菣ꎂ苣뾂苣鞃諦鎽볯鞊裢覽뷯鎽볯銂铧邈臣讂臣ꢁ臣袂苣膀苣뎃菣꾂돨邵駦ꚭ苣邃苣醃苣馁苣鎁臣貁臣趁苣芀迩较臣ꆏ菥ꢁ臣ꚁ胣鞊裢覽뷯鎽臣邵郥ꢃ뷤꾁鳦鶈臣것苣鞃苣벃臣麡볤ꦉ臣芁苣ꢁ뫤겸臣趁苣芀諦銈뷯蒽뷯꾁胣ꆬ臣ꞁ胣隌귥蒚迥꾁铧ꦉ귥蒚臣붣胩鞁臣骃菣膃菣꺁菣뎃苣讁苣骃菣膃菣銂郥骮迥뎁跥ꊛ臣讂臣ꮁ뷤ꢔ臣趁苣芀跥ꊛ臣貂臣骃菣膃菣꾁胣閃苣벃菣뎂苣ꢁ臣ꚁꧦ붃臣讂臣芁苣蚁胣㲂牢ਾ鳦몙飦ꮁ苣誂胣膍裥ꪁ蟩꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁볯骷뗧뚙귥ꪁ臣꺁裥邞껥鎨苣龮雦馁苣龁苣ꮁ藥讉迥붃臣芁苣芀臣覂臣膀臣鎁臣邏뻤鞁臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣龃菣뢅藩鞈臣ꖟ귨꾁胣뢼럧邵駦ꚭ臣鮏臣讂胣袏臣鶁苣ꮁ諥袁苣뎂菣钃菣벃苣ꊃ菣ꮃ賥肊ꇨꞁ铧蒁苣貂苣ꖟ귨銂迦鮾臣讂胣㲂牢ਾ胣邼볯钼볯醀戼㹲龮雦设볯邼볯骼ꇨꆮ蛥꺚裦랕鯥邭볯뚼볯Ꞽ볯覼裥肿臣薆髧내菨邈闩꺁ꋥ隮苣뮘껥馁苣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣붃諥袼苣莃苣ꒂ볯覼戼㹲뚼볯Ꞽ볯ꮁ裥肿臣貂臣薆髧내菨꺁ꋥ隮苣뮘껥馁苣꺨胣꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁菨鮊苣ꚩ꣩鞁臣芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ菣ꪃ菣鞃菣覃ꧨ鎨臣鶃苣蚃苣隃臣芁苣ꢁ鏥뎹ꇩ꺁蛥꺚듧麃臣뮘껥ꮁ鳦ꢔ臣芁苣膀���꺁苣蚁臣릊黦꾁胣设臣낁藨趘裦랕臣뮘껥馁苣覭臣ꦁ臦ꢁ臣讂胣㲂牢ਾ觧ꮁ胣Ꚃ苣꾉藨꺚돨Ꞁ꿦내껧薆髧袼볯ꎼ볯覼듧麃볯肸곦릟鳥讁苣膀鳦Ꞥ볯銼裢醼볯馶믤覼苣馼볯銈苣Ꞃ菣꺁볯邼볯麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣ꮁ볯邼볯내菨込苣Ꞃ菣ꞁ鋨蒁臣芀苣莃苣ꒂ铧릟鳥꾁胣躽苣ꮃ苣벃苣꒼볯ꖼ볯膀볯邼볯꺁苣랂ꇨ薸胣銼뷯궼臣낂菣뾂菣뎃胣醼뷯骃菣랂菣뎃볯릂菣것菣袃菣ꒂ苣뎃볯閃菣꺂苣뎃苣ꮐ鳦馁苣芀꿥ꞅ苣Ꞃ菣꾁곦꺁苣꺁苣ꮐ苣骼볯醼볯ꆼ볯ꖼ듧麃苣뮷諥鞁臣蒁苣꺁볯袼볯覼볯ꎼ볯내菨颍诧鮼볯鎼볯ꆼ볯ꖼ듧麃菣ꦃ苣閼뷯螽볯趽뷯꺁볯Ꞽ볯鮼볯钼볯ꆼ볯ꖼ듧麃菣ꦃ苣鎼뷯螽볯趽뷯꺁볯ꖼ볯ꚼ볯袼볯覼볯ꎼ볯내菨鞃菣릂볯躽뷯込뷯貽臣뚼볯Ꞽ볯鞃菣릂볯躽뷯込뷯貽臣뒼볯ꚼ裢馃菣뾂볯誏臣袼볯覼볯ꎼ볯내菨鞃菣릂볯躽뷯込뷯貽臣뚼볯Ꞽ볯鞃菣릂볯躽뷯込뷯貽臣겼볯ꚼ胣ꒁ臣ꞁ胣ꚩ꣩ꢔꧨ首臣芁苣鶃菣銈뷯覽뷯뾂苣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃볯醼볯邼菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃껥辇룤覼苣Ꚃ苣ꮃ볯鶁苣麁苣醼볯膀볯躼볯薼迥뎁볯躼볯邼볯薼臣貸蟩覼臣뮷諥鞁臣芀듧麃苣鎼볯莄볯閼볯꺁볯꾼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢臣隼裢鞼韦ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣ꒂ菣궂菣馃菣袃뻥膀苣Ꞃ菣꺁鿥난苣뢐볥鞁胣내菨銂볯颽볯ꊼ볯ꞁ듦蒵臣龁胣뢅菣릂菣ꆂ苣벃苣趏뿥랷郥ꦉ볯醼볯邼菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃胣邼볯醼볯꺁藩뢅菣袃菣Ꚃ菣膀뷯ꢼ볯躼볯膀볯躼볯薼臣袃菣袃菣뢼裢醼볯邼胣醼볯趽볯꺁뷯銈菣袃菣閃苣讃菣鮃苣閃苣벃菣覼苣蒐苣Ꞃ菣ꮁ럦ꂊ臣龁胣鎼볯莄臣銼駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣貾胣醼볯麃苣꾂菣뾂苣뾂菣꺁볯꺼臣꺼뷯꾼볯꺁럦ꂊ臣趏뿥銂臥ꊭ臣龁胣覅귥蚯뫥袼볯꒼볯銂菣ꒂ苣궃菣것菣袃菣벃菣벃臣钼볯閼뷯趽臣誁臣ꚁ룦骮臣龁胣㲂牢ਾ볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁듦Ꞁ苣膀裥肿蓧鞁臣내菨ꮁ꿥馁苣뚼볯Ꞽ볯袼볯躽뷯込뷯貽볯몈뿦鞢껦꺁菣벃苣뎃菣뮘껥袼볯꒼볯邼볯躽뷯ꮁ臣醁苣뢅菣릂菣ꆂ苣벃苣뮴胦銂룦骮臣讂臣ꢁ臣袂苣몱껥覼臣鞁臣鞮蟥鞁臣芀볯Ꞽ볯銈菣벃苣꾁볯ꖼ볯ꚼ裥肿볯ꎼ볯내菨鞢껦銂볯邼裢馼볯薼飩ꊭ臣讂臣ꞁ胣醼뷯螽볯趽뷯ꞁ듦Ꞁ迥ꞅ臣鞁臣뾽铧鞁臣芀뗧鲞臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁駧뮲駧膀觧ꮁ藨趘雦袄껧ꊽ裦꺁飩뎮臣誁臣讂鳦ꢔ胦銂ꓧ鞁臣蒁苣芀闦ꒀ볯뢛꿥뮘껥ꚺ볯꾁裥肿臣鞁듧麃臣뺯臣讂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣ꮁ苣讂볯ꖼ볯ꚼ裥肿ꋥ隮臣醃菣뮂菣���飩뎮苣鞮蟥鞁胣ꒁ臣ꞁ볯躽뷯込뷯貽뿦ꚺ臣꺁볯Ꞽ볯銈닎臣膀볯ꖼ볯ꚼ裥肿듧麃ꋥ隮苣鞼볯銈볯邼볯뮘귦馁苣鎁臣貁鿧覂苣ꚁ臣讂臣ꢁ臣鞾苣貂臣醃菣뮂菣袃飩뎮苣醃菣뮂菣蚃菣뢂臣꒙臣讂臣ꢁ臣몱껥閁苣讂胣邵黦꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣薆髧내菨邈闩꺁볯ꖼ볯ꚼ裥肿苣鎼볯薼迥꾁臣貂믤誸볯뢛꿥뮘껥ꚺ볯邼볯袏臣鶁苣ꖻ룤覼苣뮘껥鞁臣ꢁ臣ꮁ菣뢂菣ꎂ菣ꢁ胨袁苣芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨菣ꪃ菣鞃菣覃臣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣鶃苣蚃苣隃臣芁臣龁볯낼볯꾼볯邼볯膀볯늼볯鎼볯銼迥뎁볯늼볯鎼볯邼胣㲂牢ਾ胣邼볯钼볯醀戼㹲龮雦设볯醼볯骼뛧鲆菣ꖃ菣궃菣龔귥袼苣莃苣ꒂ볯銼볯㲉牢ਾ臣꺁껥붖뻤꾁꣧薀臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣늶蛨讃菣벃菣뎃듧麃臣龔귥꺁뿤늀臣誁臣ꚁ鳦릊胦銂鳦馁苣鎁臣銂ꓧ鞁胣鶁苣薕臣膀뻤袁臣늶蛨늉듧覤胦螗胣ꆼ볯꒼귧ꮁ苣讂鏥뎹ꇩ꺁ꛨ鮊雥놤臣뮲駧銂郥肂뛧鲆雧ꎂ迥꾁郦랂臣뮲駧蒚蟥꺽臣覜铧ꞁ臣讂臣ꢁ苣몤臣芀戼㹲誦꣥鞼韦꺁볯꒼菣莃菣躃藥袼럦袐鯩ꎛ볯낂菣ꊂ迥뎁뛧鲆菣ꖃ菣궃菣讞볯銂볯꾼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢뫩钅臣骶臣ꚁ雦궠臣袂苣ꂱ껦鞁胣ꆄ迨ꆝ믤许臣벜苣随苣몇臣龁胣麥뗧늶蛨銂觨ꂴ룤꺚臣覂裥꒙臣膀믤꺁鳧蒵맧銂볯膽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼볯㲋猯灵膀볯螽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼볯㲋猯灵ꆄ臣꺁볯ꊼ볯궸臣邼볯銼볯薼菣ꪃ菣랂菣銂铧蒁臣颍듧麃蟦膿觧궸臣ꎧ鯩閁臣龁胣늶蛨銂볯鞼蓢ꞁ볯銈볯邼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁胣鶁臣貾볯趽뷯꺁菣ꒂ苣袃菣鞃苣뎃苣뎃菣鎃苣벃苣뮷諥馁苣鎁臣ꮁ苣誂菣ꪃ菣랂菣銂룤뮴胦隌臣龁胣내菨銂胣꺼볯銂럦ꂊ臣膀觧낕髧ꪁꧨ鎨볯늼볯鶃菣骃菣膃菣覜苣袏臣ꆄ臣꺁볯궼볯궼볯ꚼ볯銼룤膀볯隼裢Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃臣Ꚃ苣ꮃ뷥龁苣醼볯邼볯邼볯邼듧麃臣钒臣龁胣ꢅ臣꺁껥鎨臣ꒁ臣ꚁ胣내菨꾁볯薼볯꾼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢臣뒰ꏩ貒鯩늛냦许胣鎼볯莄臣邈闩閁臣龁胣릟鳥궸臣銼裢鎼韦貾臣내菨銂苣ꮃ苣ꒂ菣ꆼ볯ꞁ鿦늉臣膀곦蒁臣钼볯꺁菣ꦃ菣ꮃ菣ꊂ菣螃菣覃臣몛껥鞁胣ꢅ듧麃苣Ꚃ菣袃臣겸껥꺁臣膂臣꒼볯낼볯ꞁ鿦늉臣龁胣ꢅ듧麃볯趛藥覼臣膀볯ꎼ볯ꮂ菣ꦃ迥뎁볯膽뷯ꦼ뷯钽뷯鎽뷯ꢔ볯ꦼ볯뮔菥붂菣袃苣Ꞃ苣銂铧蒁臣銼볯뢼꿥ꦉ胥螎臣骮蟩隌臣龁胣Ꚃ苣ꮃ臣隦蟩꾁蓧鲽苧ꮁ臩麊臣龁胣㲂牢ਾ꣧薀臣莿뫥꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁諥鲞臣膀鿥난룤銼裢鎼韦ꞁ臣ꮂ菣���苣뎃볯궼菣뢂菣ꎂ菣내菨꺁郥袨闦銂胣릟鳥궸볯銈볯ꖗ臣꒼볯낼볯馨귨내菨꺁郥袨闦ꞁ駩馁苣鎁臣ꮁ苣誂꣨鞮臣龁胣鎼볯薼苣誶臣讂铧颭苣鶃苣蚃苣隃臣莀臣讂胣㲂牢ਾ믤许臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀臣꺁苣莃苣ꒂ臣邼볯邼볯薼裢醼볯邼볯꺁꿧늛臣鶃菣骃菣膃菣莿뫥꺁뷤ꢔ臣鶃苣蚃苣隃臣芁臣龁볯낼볯꾼볯邼볯膀볯늼볯鎼볯銼胣낼볯꾼볯钼볯膀볯늼볯颼볯隼迥뎁볯늼볯隼볯鞼胣㲂牢ਾ胣邼볯钼볯醀戼㹲龮雦设볯醼볯骼鷦뚊뷤覅迥릮뷤내菨꺁铧颭볯ꊂ菣뮂苣閼볯覼戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁胣겜駧躘臣肉껥꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣蚝諧鎽藥鞏껥鎽듧麃臣龔귥込ꋥ隮苣颫苣讂苣蚁臣鲽铧鞁胣袂臣ꚁ胣设臣낁觨ꂴ胦늶蛨躂胣ꆼ볯꒼귧ꮁ苣讂鏥뎹ꇩ꺁ꛨ鮊雥놤臣뮲駧銂郥肂뛧鲆雧ꎂ迥꾁郦랂臣뮲駧蒚蟥꺽臣覜铧ꞁ臣讂臣ꢁ苣몤臣芀戼㹲誦꣥鞼韦꺁볯邽뷯膽뷯閽뷯₅볯膽뷯貽뷯馽菣莃菣躃藥袼럦袐鯩ꎛ볯낂菣ꊂ迥뎁뛧鲆菣ꖃ菣궃菣내菨讞볯銂볯꾼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢뫩钅臣骶臣ꚁ雦궠臣袂苣ꂱ껦鞁胣ꆄ迨ꆝ믤许臣벜苣随苣몇臣龁胣麥뗧늶蛨銂觨ꂴ룤꺚迥뎁믤꺁鳧蒵맧讁苣螈駩鞁胣ꒁ臣ꞁ볯膽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼볯㲋猯灵膀볯螽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼볯㲋猯灵ꆄ臣꺁볯ꊼ볯궸臣邼볯銼볯薼菣ꪃ菣랂菣銂铧蒁臣颍듧麃蟦膿觧궸臣ꎧ鯩閁臣龁胣늶蛨銂볯鞼蓢ꞁ볯銈볯邼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁胣鶁臣貾볯趽뷯꺁菣ꒂ苣袃菣鞃苣뎃苣뎃菣鎃苣벃苣뮷諥馁苣鎁臣ꮁ苣誂菣ꪃ菣랂菣銂룤뮴胦隌臣龁胣내菨銂胣꺼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢苣뮷諥鞁臣꒼볯ꖼ볯込볯醼볯궸胣馼볯銈苣Ꞃ菣鞃菣벃菣ꮁ苣Ꞃ菣鎽臣誂볯邼볯貼볯邼볯내菨ꞁ鋨蒁臣芀藥ꚁ臣龮꣩ꮁ臣蒁臣膀듧麃臣閼볯ꎼ볯㲯畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵꺁냦붣鋥낛鯥鞰룤膀볯鞼蓢ꞁ裦랕臣鮁臣芀鿥난룤ꞁ볯銈볯ꖗ뻥ꮁ듧麃苣钼볯꺁菣ꦃ菣ꮃ菣ꊂ菣螃菣覃臣몛껥鞁胣ꆬ臣ꞁ苣ꮃ菣ꦃ菣ꮂ菣낂菣벃菣ꎼ볯ꚼ볯ꆼ鿦늉臣龁胣늼뷯辽钼볯銼볯릅냦袏臣ꦼ뷯Ꞽ볯骼볯邼볯覼胣꾏ꛨ늉듧궃菣鞃苣뎃臣뺯臣讂菣躃苣궃菣誃菣鞊뷤銂胣鎖軦蒚藥ꮖ鯨覅돦ꮁ苣讂鷦뚊뷤覅迥릮뷤꺁ꓦ몇臣뾽铧鞁臣芀뗧鲞臣薼铧颭볯릟鳥궸볯銈볯ꖗ臣ꮂ菣뮂苣뎃裢궃菣鞃苣뎃菣뢂菣ꎂ菣내菨꺁藥낕苣膀鿥난룤銼裢鎼韦ꞁ臣ꮂ菣뮂苣뎃裢궃菣鞃苣뎃菣뢂菣ꎂ菣내菨꺁藥낕臣꒙臣讂苣꺁臣鞁臣袨껧馁苣芀藥내菨袼鯨覅볯꾁胣ꎼ볯���꒼苣ꆃ菣誏臣궼뷯莽볯躽뷯辽뷯袽铧꺼볯ꢼ铧较苣閃菣Ꚃ苣ꊂ苣ꢔ臣ꚁ볯邼볯뺯觧趀軧ꞁ껥辇賥鞁臣芀苣Ꞃ菣꺁ꛨ躇臣ꆄ뷤몂臣뢁諦鞁臣芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨菣ꪃ菣鞃菣覃臣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ菣뢂菣ꎂ菣ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯銼볯邼胣낼볯꾼볯銼볯膀볯늼볯閼볯邼胣낼볯꾼볯钼볯誏臣낼볯꾼볯醼볯芀戼㹲邀볯閼볯馼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯銼볯龻ꫩ讁苣꺁菣궃菣ꪂ苣ꪃ苣뎃铦몇苣몈뿦馁苣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣붃諥袼苣莃苣ꒂ볯鞼볯㲉牢ਾ볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁믨ꢪ뗧钹臣覂菣궃菣ꪂ苣ꪃ苣뎃臣뺔蟥銂裥肿臣讂菨鮊苣ꖻ룤꺁苣蚁臣鞁臣ꚩ꣩鞁臣芀戼㹲钼裢隼鳦ꊽ臣隃苣꺁触螌꿧ꊖ꿧銂蓧貏臣螈駩鞁胣ꊖ꿧龻ꫩ銂룤꺁ꫩ銂돦辄럦辁臩醁臣閃菣벃菣뎃菣릂菣ꒂ苣ꮁ苣ꎁ臣随苣꒙臣龁胣龻ꫩ銂듧讁臣螈苣뮈臣膀볯躼볯薼볯뎼볯誏臣醼볯邼볯込뷯貽菣讃苣ꪃ菣誏臣醼볯邼볎뷯込뷯貽苣袃菣鞃菣麃苣랂菣銂럦ꂊ臣龁蓧股룦袼볯ꚼ볯릟鳥袼볯궼볯込볯醼볯ₒ볯骼볯覼룤膀볯閼볯목냦膀볯薼볯꾼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢鯩늛냦ꮁ臣蒁臣邃菣꾂臣銼볯芙雩릟ꓩ鞁臣芀볯麛듦蒵臣龁뻥膀듧醼볯邼뷯螽臣ꊖ꿧龻ꫩ銂菣꾂菣讃苣릂볯趽뷯莽뷯辽뷯覽뷯鎽볯ꆮ臣蚈臣膀룤風볯ꚼ鿥난룤ꞁ臣覂臣銼볯芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣ꆬ臣ꞁ胣낼볯꾼볯钼볯鶃菣骃菣膃菣꺁볯薼苣膀跥겋臣讂臣꾁藥ꖟ臣龻ꫩ蒵맧讁苣꺁菣궃菣ꪂ苣ꪃ苣뎃铦몇裥肿觥ꞁ臣讂苣뎃苣벃菣ꒂ苣뎃裢醼뇎臣醼볯躽뷯込뷯貽臣ꢁ苣ꮁ럦ꂊ臣龁胣ꆬ臣ꞁ룤薸苣麛迥鞁胣醼볯馼裢뢂菣膃菣銈菣膃菣뎃菣ꮃ菣袼볯궼볯覼꿦늉苣莃苣ꒂ볯ꚼ뷯銽뷯蒽뷯貽뷯誁苣뎁볯閽뷯钽뷯薽볯₌볯覽뷯莽뷯薽뷯躼ꊼ뷯辽뷯袽뷯鎽볯₎볯莽뷯膽颼볯鎼볯ₚ볯鞼볯銈볯鞼볯ₗ볯醼볯颼볯覼볯銂铧蒁臣鞃菣蚃苣낂菣ꮂ菣꺁蟩銂ꓦ骮臣龁胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣醁苣鶃苣蚃苣隃臣邵黦꾁胣ꚩ꣩鶃菣骃菣膃菣貁胣设臣낁胣讁该ꊖ胩ꊖ꿧辕ꇩꞁ臣讂雩肯믨ꢪ髩뎮胣覤뷥Ꞁ雩肯韧袏臣ꊅ胦ꊖ꿧ꪃ苣麃菣꺁닦芙臣꺁뷤ꢔ臣讦蟥閁苣讂臣ꢁ苣몤臣芀戼㹲誸꣨꺁苣莃苣ꒂ臣꺨胣꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣銂ꧨ鎨臣龁臣趁胣鎁臣鶃菣骃菣膃菣꾁胣릠鳦蒚臣誁苣뎁苣뎃苣벃菣ꒂ苣뎃裢醼뇎臣꺁裥肿뻥誁苣뎁蟥蚐뻥銼볯誁苣뎁볯銼駦鎖臣龻ꫩ蒵맧讁苣꺁菣궃菣ꪂ苣ꪃ苣뎃铦몇苣몈뿦馁苣閡釨ꪁ菨鮊苣몤臣膀뻥ꎁ臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꾁믨ꢪ뗧钹臣覂臣鞃菣蚃苣낂菣ꮂ菣꺁铦몇���肿臣覜铧ꞁ臣讂苣鎁臣몤臣ꚁ臣讂胣鎁臣袂臣ꮁ胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣讁该ꊖ胩ꊖ꿧辕ꇩꞁ臣讂雩肯믨ꢪ髩뎮胣覤뷥Ꞁ雩肯韧袏臣ꊅ胦ꊖ꿧ꪃ苣麃菣꺁닦芙臣覜铧ꞁ臣讂胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ菣뢂菣ꎂ菣ꞁ臣ꎁ臣鶃菣骃菣膃菣꾁볯낼볯꾼볯邼볯芀戼㹲邀볯閼볯邼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯鎼볯ꒂ菣鎃菣궃諦鞢껦Ꞁ苣莃苣ꒂ볯ꊂ菣뮂苣醼볯醼볯㲉牢ਾ꣧薀臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣鞊ꋥ隮듦Ꞁ苣膀鳦ꪳ髧ꮁ볯讽뷯袽뷯躽귧貼ꪼ볯₎볯膽뷯貽볯₎볯膽뷯莽뷯銽ꦼ뷯鎽뷯躼颼볯骼醼볯邼볯銈볯醼볯銼袼볯馼볯邼볯ꮁ꣨覼臣貂臣릂菣鮃菣벃菣龃菣ꊼ볯뎼볯ꊼ볯鎟雦邵郥ꊂ菣뮂苣銂铧蒁苣붛ꯧ貙ꃧ뚩触袼볯ꎼ볯覼臣龮꣩蒚胣뺖苦螌郥蒚苣뎃菣袃菣鞊駧겖駧讦苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ룦骮臣龁胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ铧蒁臣隼볯꺁藨趘듧麃돧袼胣꺼볯ꦼ菣趃菣趀볯膀룤뎁臣鶁苣覂臣궶賦誁苣뎁苣뎃菣袃菣릟ꓩ꺁鷦뚻臣膀볯辽뷯讽뷯覭볯₌볯躼꺼뷯钽뷯躼ꎼ뷯躽뷯薽뷯ₒ볯躽뷯钽볯₎볯鎼볯ₚ볯閼볯銈볯隼볯ₖ볯醼볯馼볯覼臣風볨閁苣ꚁ臣讂胣鎁臣릂苣ꪃ菣讃菣낂臣꺛髧꾁胣낕臣讂黥꺁藨趘臣뺯臣讂ꧨ鎨賥袐觧꺁듧麃꿦Ꞁ迥뎁볯袏臣내菨蚈ꏨ鲁귦뮴胦銂鳦鶈臣閩뻤馁苣鎁臣ꞁ臣讂볯궼뷯躽뷯鎽귧貼誸軦鮼ꊼ뷯馽뷯貼ꎼ뷯躽뷯薽뷯骼낼뷯覽뷯莽볯₎볯銽뷯莽뷯躼꾼뷯莽뷯貽볯₎볯邽뷯膽뷯薽鎼볯醼볯覼볯ₚ볯銈볯銼볯醼볯颼볯붼볯芀戼㹲蒴볯邼臣銃菣ꮅ飧내菨뮳臣覂臣내菨銂菣ꪃ菣랂菣込볯꒼볯ꆼ볯Ꞽ뷯芽뷯辽볯ꞁ鯥躏臣膀볯麛듦蒵臣膀볯궼볯궼룤ꮁ蛥뢇뿦鞁胣鶁苣覂臣龔귥銂룦骮臣龁胣내菨뢇뿦ꦉ苣钃菣莃菣袼볯邼볯캐겼껥辇볯ꞁ裥꺁볯隼裢Ꚃ苣ꮃ菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃臣뮷諥鞁臣芀볯ꖗ苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣꺁듧麃꿥ꚺ臣銼韦ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃苣誂냥閁臣躁觥邈闩꾁飩ꊭ臣貂臣芀鋦꺨뻥膀껥骮賥꺁臣膂臣鎼볯莄臣銼볯芙雩鞃菣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃臣龁胣꺛髧ꢁ臣讂ꧨ鎨뿦ꚺ臣銼胥貸蟩銂苣궃駦ꮁ볯邼볯캐貽臣ꊂ菣뎂菣袃臣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣Ꚃ苣ꮃ臣뮷諥鞁臣袼볯骼볯貸蟩覼胣ꚩ꣩隌郥ꦉ苣銼裥꺁볯貽뷯螽룥袇볯醼볯邼볯鲀볯邼볯貼볯邼볯趀볯ꞁꧨꆾ臣龁胣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃臣閼볯ꎼ볯㲯畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵낛鯥鞰臣袂臣醼볯邼볯뾹뫥ꞁ볯ꖗ臣袂臣隼韦龮雦鞁臣芀戼㹲ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃뻥膀鿥난苣꒙軥鞁胣내菨銂볯邼볯袃菣꾂菣궃藩뢅臣邼볯醼뷯貽臣���볯莄臣誁臣ꚁ鯥骮臣龁胣鞃菣벃菣銂蓨ꒂ苣뎃냦ꞁ볯麛듦蒵臣膀매ꖇ臣鮁胣醼볯ꊅ藩ꮁ뫦ꎧ臣龁볯躼볯薼苣ꮃ菣궃菣肃菣뎃볯鎟雦袼볯覽뷯趽뷯覼臣邼볯醼뷯貽臣鎼볯蚈雩鎟觨鞁胣醼볯ꊅ藩ꞁ볯麛듦蒵臣ꚁ鷩邵郥鎟雦銂駩뮎臣膀매ꖇ臣鮁胣鎟觨ꦉ苣醼볯趽볯袃菣릂ꇥ몟볯袃菣릂볯銃菣궃苣랂菣膃菣覼苣龃菣ꆃ苣뎃볯貼邽볯醼볯躼볯꺁볯躼볯趽뷯ꞁ볯蚈雩붊蟥鞁臣芀苣ꮃ菣궃菣肃菣뎃볯꺁볯馼볯躽뷯ꮁ臣醁苣뢐迥袼볯꒼볯銂胣뎂菣钃菣벃苣ꖎ뛧馼볯銈苣Ꞃ菣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣ꪃ菣肃菣銂뷤ꢔ臣ꚁ룦骮臣龁胣㲂牢ਾꧨ鎨ꧨ首臣膀룤袏臣螤闦꺁뿦ꚺ臣醰臣辁臣节볯邼볯꺁裦랕飩뎮苣몤臣ꢁ臣ꮁ菣뢂菣ꎂ菣ꢁ胨袁苣芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ菣뢂菣ꎂ菣銂ꓧ鞁臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀ꇨ鞼臣몤臣貂臣誁苣膀闧麪臣ꖻ룤꺁胩誂臣芁苣骼戼㹲꺼볯ꎼ볯鶼鷩辰듧麃苨貙藨㲫牢ਾ볯꺼볯鶼룤ꊞꗧ貵돧㲻牢ਾ胣邼볯閼볯醀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈰㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㘲⼼㹡⼼䥄㹖鎁苣覂臣ꊂ菣뮂苣꺁뗧鲞臣꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣骤臣꺁闧ꪁ苣내菨뮳臣낖铧ꦉ裦랕臣뮘껥ꮁ鳦ꢔ臣芁苣膀닦芙髧ꮁ뷤ꢔ臣趁苣鎁臣貁ꓧ閁苣ꚁ臣讂胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣뺯臣讂諦鎽臣膀臣貂苣꺁鳦ꢔ臣鶃菣骃菣膃菣꺁苣閃苣讃菣ꎂ닧붣臣覜铧ꞁ臣讂胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂ꃦ뢅臣鎁苣覂臣鶃菣骃菣膃菣꺁뗧鮏臣뾪ꏨꮁ鳦ꢔ臣芁苣芀戼㹲邀볯閼볯銼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯钼볯ꮅ飧꺁臩鶼귥鞢맥㲅牢ਾ臣꺁껥붖뻤꾁胣꺨胣꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣銂苣벃菣馁苣몁볤邭臣隈苣꺨臣銃菣貙臣늂菣ꂃ臣鞢맥閁苣讂臣ꢁ苣몤臣芀ꋥ薹臣몁볤邭铧ꦉ臣躁觥몙迧銂볤蒁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣邵藨膀苨誏臣隻臣貙귧꺁裦讂꣧꺁駧ꮁ臣蒁臣뮲駧蒚믤ꖅ臣覜铧ꪁ꣦蒚臣芁苣鎁臣銂ꓧ鞁臣蒁苣芀닦芙雨꾁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣뎂菣覃賥몁볤邭臣ꊂ菣뾂苣讃苣袃胣设臣낁菣Ꚃ苣銈菣袃苣ꆃ菣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣ꮁ꿥馁苣銃菣隌迥꾁菣袃諦鎽臣ꊽ藦銂臣誂臣讂胣㲂牢ਾ苣꾂菣벃菣뎃苣꺁蟥몙觧ꪳ臣꺨胣꺁駧讁苣颍鯩鞁臣늂菣ꂃ볯꺼볯ꞁ臣讂胣꒼볯ꆼ臣膀껥辇髧膀뻤袁臣趛藥骮蟩蒚臣ꎭꋧꞁ臣讂胣趃苣蚃苣隃꿥ꞅ臣鞁臣膀볯꺼볯銂볯邼臣ꎭ룥ꖁ룥讀뷤讁苣꒼볯ꆼ苣颍鯩鞁胣鶁苣銂菣벃菣鞁臣ꖁ룥讀뷤ꮁ臣醁苣몁볤邭苣钃菣꺁苣莃苣ꒂ꿥ꞅ臣鞁臣뾽铧鞁臣袼ꓧ閁���覼胣閼胢ₙ菣꾂菣ꊂ菣벂苣莃苣ꒂ볯设臣낁볯膽뷯궼뷯躽볯蚕鏥趐볯覼迥뎁껥芙雩骮蟩蒚볯ꎼ볯袼뻤袁臣膀볯ꊼ볯₩볯銽뷯骽뷯₍볯鞼볯邼뎼뷯醽뷯薽뷯莽뷯₅볯薽뷯薽뷯钽뷯辽뷯₎볯馽뷯钽뷯趽볯蚕鏥趐볯袼볯薽뷯讽뷯躽ꖼ뷯趽뷯銽볯₌뷯邽뷯貽뷯薽뷯₄볯覽뷯鎽뷯鎽뷯薽뷯鎽꒼뷯隽뷯鎽뷯辽뷯貼ꚼ뷯鎽뷯薽뷯ₒ볯覽뷯馽볯₌볯ꆼ볯覼苣膀裦讂꣧꺁駧ꞁ뷦ꢜ髧ꮁꋥ薹臣貂苣몁볤邭臣몙ꛨꮁ뷤ꢔ臣龁胣邵黦꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣릂苣ꪃ菣讃菣낂臣龁苨誏臣邵藨貙臣誁臣ꚁ臩낉駧뺏臣貂臣讁郥讁臣몱껥ꮁ铧蒁臣芀軥몙胦몂駧꾁胣ꢡ볯ꮁꓧ鞁臣芁苣袂臣ꮁ胣讀胣꺁藨趘臣讞迥뎁껦躚臣覂뻥龁胣ꢡ볯꺁軥몙胦ꮅ飧꺁釥趐臣ꢔ臣龁鳧ꖕ뷥꺁ꫨ躘迥뎁鳦龮雦设苣骀臣ꚁ꣨誏臣貂臣蒁苣龎駧Ꞁ藨趘臣내菨ꪠ臣膀룤風臣몤臣貂臣蒁苣芀戼㹲뒼뷯醽볯膽뷯袼闥膓郥覼臣邵黦꾁菣ꮃ苣ꎼ볯颍뷤ꞁꃥ誑臣龁胣醼跥趽臣醼볯ꎼ볯떂苣꾂菣袏臣ꎭ룥ꮁ꿥鞁臣蒴볯趀臣鞢맥ꮁ鯧鎽臣膀볯颍뷤꾁볯趀胣鎼跥趽臣颼胥覭胣ꮁ鯧鎽臣讂胣骮蟩隌臣鞃菣ꒂ菣벃迥뎁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣뎂菣覃賥몁볤邭臣覂ꫨ躰臣龁볯膽뷯궼뷯躽볯蚕鏥趐볯趛藥銂铧蒁臣鞾臣芀鳦节诧릉臣뢠藩超裥銂郥肂臣鶀苣貂胣릂菣ꦃ苣랂菣낂臣貂臣ꒂ菣袃菣뎃苣肜苣膌臣ꪁ臣ꢁ胦辂苣讂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁ꃩ龟胣设臣낁볯馀銈鷩뮿꣨颠鿥貁菣ꦃ苣麃菣颪냥ꮁꗥ뺁臣蒁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣몁볤邭ꋥ薹裥邞臣뾽铧閁苣龁菣ꦃ苣麃菣誏臣鞃菣벃菣袼귦膀胩誏臣鞃菣벃菣覼臣龁苣꺁藩鞈臣膀믤许臣骀苣ꞁ臣ꎁ臣骼戼㹲邀볯閼볯鎼胣㲑牢ਾ볯늼볯颼볯鎼볯꒼볯ꆼ볯颼볯銼볯銈볯鎼볯邼볯㲉牢ਾ볯颼볯銼볯躼뷯趽볯蚽볯㲑牢ਾ볯馀裢Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ볯뒼볯ꆼ볯ꆼ裢鎼胢ₙ볯超裥ꪕ迥骼볯鎼볯覼戼㹲钼볯銼볯鞼볯钽뷯躼뷯醼戼㹲閼胢銈볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯邼볯㲉牢ਾ볯颼볯銼볯躼뷯趽볯銽볯㲑牢ਾ볯馀裢Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꆼ볯ꆼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯钼볯覼戼㹲낼볯꾼볯邼볯鞼볯꒼볯ꆼ볯隼볯醼볯銈볯鎼볯馼볯骼戼㹲閼볯醼볯銼볯钽뷯躼뷯醼戼㹲閼胢銈볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯钼볯覼戼㹲閼볯醼볯銼볯钽뷯躼뷯醼戼㹲閼胢銈볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯뒼볯뒼볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ裢鎼胢袼藩鞈闧���랏볯閼볯鎼볯㲉牢ਾ볯隼볯醼볯躼뷯趽볯銽볯㲑牢ਾ볯馀裢Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯钼볯㲉牢ਾ볯늼볯銼볯鎼裢醼볯꒼볯ꆼ볯邼볯钼볯銈볯醼볯鎼裢醼볯骼戼㹲鎼볯馼볯鎼볯钽뷯躼뷯鎼볯㲚牢ਾ볯馀裢ꎼ볯뒼볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯閼볯㲉牢ਾ볯邼볯钼볯躼뷯趽볯邽볯骼戼㹲閼胢銈볯뒼볯ꎼ볯뒼볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯隼볯㲉牢ਾ볯邼볯钼볯躼뷯趽볯銽볯骼戼㹲閼胢銈볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯钼볯覼戼㹲鎼볯馼볯鎼볯钽뷯躼뷯醼볯㲚牢ਾ볯馀裢ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯颼볯㲉牢ਾ볯邼볯钼볯躼뷯趽볯邽볯骼戼㹲閼胢銈볯뒼볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯뒼볯Ꞽ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯馼볯㲉牢ਾ볯邼볯钼볯躼뷯趽볯銽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯覼戼㹲鎼볯馼볯鎼볯鎼뷯銽뷯銈볯骼戼㹲閼胢銈볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯覼戼㹲鎼볯馼볯鎼볯鎼뷯銽뷯銈뷯銽뷯芽뷯骼戼㹲閼胢銈볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯覼戼㹲鎼볯馼볯鎼볯鎼뷯銽뷯銈볯骼戼㹲閼胢銈볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯뒼裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯鎼볯㲉牢ਾ볯늼볯銼볯鞼볯꒼볯ꆼ볯钼볯閼볯銈볯钼볯颼볯骼戼㹲鎼볯鎼볯鎼볯钽뷯躼뷯骼戼㹲閼胢銈볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯뒼볯뒼볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯钼볯㲉牢ਾ볯钼볯閼볯躼뷯趽볯邽볯㲚牢ਾ볯馀裢ꎼ볯뒼볯ꆼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯閼볯㲉牢ਾ볯钼볯閼볯躼뷯趽볯銽볯㲚牢ਾ볯馀裢뒼볯Ꞽ볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯隼볯㲉牢ਾ볯늼볯鎼볯钼볯꒼볯ꆼ볯隼볯钼볯銈볯鎼볯邼볯骼戼㹲鎼볯鎼볯鎼볯钽뷯蚽볯骼戼㹲閼胢銈볯Ꞽ볯뒼볯Ꞽ볯뒼볯ꆼ볯ꎼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯Ꞽ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯鞼볯㲉牢ਾ볯隼볯钼볯躼뷯趽뷯醼볯㲚牢ਾ볯馀裢Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯ꆼ볯銈볯馀胣袼藩鞈闧랏볯閼볯颼볯㲉牢ਾ볯隼볯钼볯躼뷯趽뷯醼볯㲚牢ਾ볯馀裢ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ볯���볯뒼볯뒼볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯覼戼㹲낼볯꾼볯閼볯袼볯꺼볯钼볯閼볯醼裢醼볯醼볯覼볯㲚牢ਾ볯邼볯鞼볯躼뷯趽볯蚽볯骼戼㹲閼胢銈볯Ꞽ볯ꎼ볯ꆼ볯뒼볯뒼볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꆼ볯ꆼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼戼㹲钼볯閼볯醼볯钽뷯躼뷯醼볯㲚牢ਾ볯馀裢ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯뒼볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼戼㹲钼볯閼볯醼볯钽뷯躼뷯醼볯㲚牢ਾ볯馀裢뒼볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯ꆼ볯ꆼ裢鎼胢ₙ볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼戼㹲낼볯꾼볯隼볯袼볯꺼볯钼볯钼볯隼裢醼볯閼볯覼볯㲚牢ਾ볯閼볯醼볯躼뷯趽볯蚽볯骼戼㹲閼胢銈볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼裢鎼胢ₙ볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼戼㹲钼볯钼볯隼볯钽뷯躼뷯醼볯㲚牢ਾ볯馀裢Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯뒼裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯钼볯㲉牢ਾ볯閼볯醼볯躼뷯趽볯銽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯뒼볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼戼㹲낼볯꾼볯醼볯袼볯꺼볯钼볯鎼볯钼裢醼볯銼볯覼볯㲚牢ਾ볯颼볯邼볯躼뷯趽볯蚽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯뒼볯뒼볯뒼볯ꆼ볯ꎼ볯Ꞽ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼戼㹲钼볯鎼볯钼볯钽뷯躼뷯醼볯㲚牢ਾ볯馀裢ꎼ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯鞼볯㲉牢ਾ볯颼볯邼볯躼뷯趽볯銽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ볯뒼裢鎼胢ₙ볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼戼㹲낼볯꾼볯鎼볯袼볯꺼볯钼볯鎼볯钼裢醼볯銼볯覼볯㲚牢ਾ볯颼볯醼볯躼뷯趽볯蚽볯骼戼㹲閼胢銈볯뒼볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯ꆼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼戼㹲钼볯颼볯钼볯钽뷯躼뷯醼볯㲚牢ਾ볯馀裢ꎼ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯뒼裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯邼볯㲉牢ਾ볯颼볯醼볯躼뷯趽볯銽볯骼戼㹲閼胢銈볯뒼볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯뒼볯뒼볯ꎼ볯뒼볯뒼볯뒼裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯醼볯㲉牢ਾ볯늼볯隼볯颼볯꒼볯ꆼ볯馼볯閼볯銈볯鎼볯钼볯骼戼㹲钼볯醼볯銼볯钽뷯躼뷯醼볯㲚牢ਾ볯馀裢ꎼ볯ꎼ볯뒼볯뒼볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯覼戼㹲钼볯醼볯銼볯钽뷯躼뷯醼볯㲚牢ਾ볯馀裢뒼볯뒼볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯ꎼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯覼戼㹲钼볯醼볯銼볯钽뷯躼뷯���醼볯㲚牢ਾ볯馀裢뒼볯ꆼ볯ꎼ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯覼戼㹲낼볯꾼볯鞼볯袼볯꺼볯钼볯隼볯閼裢醼볯钼볯覼볯㲚牢ਾ볯馼볯钼볯躼뷯趽볯蚽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯뒼볯Ꞽ볯뒼볯ꆼ裢鎼胢ₙ볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯覼戼㹲钼볯隼볯閼볯钽뷯躼뷯銼볯㲚牢ਾ볯馀裢ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯銈볯馀胣袼藩鞈闧랏볯閼볯隼볯㲉牢ਾ볯馼볯钼볯躼뷯趽볯銽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯뒼볯뒼볯ꆼ볯ꆼ볯뒼볯ꆼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯鞼볯㲉牢ਾ볯馼볯钼볯躼뷯趽볯蚽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꎼ볯뒼볯뒼볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯뒼볯銈볯馀袼藩鞈闧랏볯閼볯颼볯㲉牢ਾ볯馼볯钼볯躼뷯趽볯邽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯뒼볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯馼볯㲉牢ਾ볯馼볯钼볯躼뷯趽볯銽볯骼戼㹲閼胢銈볯뒼볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯뒼볯뒼볯Ꞽ볯ꆼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯覼戼㹲낼볯꾼볯邼볯袼볯꺼볯閼볯馼볯鎼裢醼볯颼볯覼볯㲚牢ਾ볯邼볯醼볯躼뷯趽볯蚽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯醼볯㲉牢ਾ볯邼볯醼볯躼뷯趽볯邽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯銈볯馀胣袼藩鞈闧랏볯閼볯銼볯㲉牢ਾ볯邼볯醼볯躼뷯趽볯銽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯覼戼㹲낼볯꾼볯馼볯袼볯꺼볯閼볯鎼볯銼裢醼볯閼볯覼볯㲚牢ਾ볯隼볯閼볯躼뷯趽볯蚽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯覼戼㹲閼볯鎼볯銼볯钽뷯躼뷯醼볯㲚牢ਾ볯馀裢ꎼ볯ꎼ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꆼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯閼볯㲉牢ਾ볯隼볯閼볯躼뷯趽볯銽볯躼戼㹲閼胢銈볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯覼戼㹲낼볯꾼볯鞼볯袼볯꺼볯閼볯邼볯閼裢醼볯颼볯覼볯㲚牢ਾ볯隼볯钼볯躼뷯趽볯蚽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯뒼볯뒼볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯鞼볯㲉牢ਾ볯隼볯钼볯躼뷯趽볯邽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꎼ볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ볯뒼볯ꆼ볯ꆼ볯뒼볯뒼볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ裢鎼胢肀볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯覼戼㹲閼볯邼볯���볯钽뷯躼뷯醼볯㲚牢ਾ볯馀裢Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯ꎼ裢鎼胢ₙ볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯覼戼㹲낼볯꾼볯鞼볯袼볯꺼볯鎼볯馼볯鞼裢醼볯颼볯覼볯㲚牢ਾ볯馼볯颼볯躼뷯趽볯蚽볯㲚牢ਾ볯馀裢Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯ꆼ볯ꆼ裢鎼胢ₙ볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯覼戼㹲鎼볯馼볯鞼볯钽뷯躼뷯骼戼㹲閼胢銈볯뒼볯Ꞽ볯ꎼ볯뒼볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯뒼볯뒼볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ裢鎼胢肀袼藩鞈闧랏볯閼볯醼볯㲉牢ਾ볯馼볯颼볯躼뷯趽볯銽볯㲚牢ਾ볯馀裢ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯銼볯㲉牢ਾ볯늼볯鎼볯醼볯꒼볯ꆼ볯钼볯馼볯銈볯鎼볯鞼볯骼戼㹲钼볯醼볯钼볯钽뷯躼뷯骼戼㹲閼胢銈볯뒼볯뒼볯ꆼ볯뒼볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯뒼볯뒼裢鎼胢ₙ볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯覼戼㹲钼볯醼볯钼볯钽뷯躼뷯骼戼㹲閼胢銈볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯뒼볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ볯뒼볯ꆼ볯ꆼ裢鎼胢ₙ볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯覼戼㹲钼볯醼볯钼볯钽뷯躼뷯骼戼㹲閼胢銈볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯뒼볯뒼볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼裢鎼胢肀볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯覼戼㹲钼볯醼볯钼볯钽뷯躼뷯銼볯㲚牢ਾ볯馀裢Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯Ꞽ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯覼戼㹲钼볯醼볯钼볯钽뷯躼뷯銼볯㲚牢ਾ볯馀裢뒼볯ꎼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯ꆼ볯뒼볯뒼볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯閼볯鞼볯㲉牢ਾ볯钼볯馼볯躼뷯趽볯銽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꆼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ볯銈볯馀袼藩鞈闧랏볯閼볯颼볯㲉牢ਾ볯늼볯鞼볯鞼볯꒼볯ꆼ볯邼볯颼볯銈볯鎼볯隼볯骼戼㹲閼볯馼볯颼볯钽뷯躼뷯鎼볯㲚牢ਾ볯馀裢ꎼ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯뒼볯Ꞽ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯覼戼㹲閼볯馼볯颼볯钽뷯躼뷯鎼볯㲚牢ਾ볯馀裢Ꞽ볯ꎼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯覼戼㹲閼볯馼볯颼볯钽뷯躼뷯鎼볯㲚牢ਾ볯馀裢ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯ꎼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯隼볯醼볯㲉牢ਾ볯늼볯醼볯鎼볯誏臣낼볯꾼볯钼볯馼볯蒐胣膀볯꺼볯隼볯馼볯鞼裢醼볯隼볯誏臣꒼볯ꆼ볯钼볯邼볯銈볯醼볯鎼볯骼戼㹲鎼볯馼볯鎼볯钽뷯躼뷯鎼볯㲚牢ਾ볯馀裢ꎼ볯뒼볯ꎼ볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯隼볯銼볯㲉牢ਾ볯邼볯钼볯躼뷯趽볯邽볯骼戼㹲閼胢銈볯뒼볯ꎼ볯뒼볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯���볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯隼볯鎼볯㲉牢ਾ볯邼볯钼볯躼뷯趽볯銽볯骼戼㹲閼胢銈볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯覼戼㹲鎼볯馼볯鎼볯钽뷯躼뷯醼볯㲚牢ਾ볯馀裢ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯隼볯閼볯㲉牢ਾ볯邼볯钼볯躼뷯趽볯邽볯骼戼㹲閼胢銈볯뒼볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯뒼볯Ꞽ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯隼볯隼볯㲉牢ਾ볯邼볯钼볯躼뷯趽볯銽볯骼戼㹲閼胢銈볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯覼戼㹲鎼볯馼볯鎼볯鎼뷯銽뷯銈볯骼戼㹲閼胢銈볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯覼戼㹲鎼볯馼볯鎼볯鎼뷯銽뷯銈뷯銽뷯芽뷯骼戼㹲閼胢銈볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯覼戼㹲鎼볯馼볯鎼볯鎼뷯銽뷯銈볯骼戼㹲閼胢銈볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯뒼裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯隼볯邼볯㲉牢ਾ胣邼볯閼볯醀戼㹲閼胢ₙ菣꾂菣ꊂ菣벂苣莃苣ꒂ迥鲿臣趛藥낼볯늼菣벃苣꺁諦鎡臣芁苣膀껥芙雩ꞁ臣鞢맥ꎛꛨ꺁臣膂臣뒼뷯醽볯꺼볯鶃菣ꆃ菣벃苣떅듧꺁볯馀ꢂ苣붂菣꾂菣ꊂ菣벂듦Ꞁ苣뾽铧馁苣芀볯ꎼ볯趏뿥ꮁ藥讞髧ꪁ跥趽ꓨ붣藩鞈臣龔裦ꮁ볯ꒁ臣ꪂ菣뒂菣꾂菣ꪂ菣覃菣ꦃ苣麃菣袼귦뮼볯蚽볯誏臣蚀볯躼뷯붼볯銂뷤ꢔ臣龁胣견볯꺁苣ꪃ苣貃苣것苣膃菣膀迥꾁菣궃菣隃볯躼뷯覼臣膀볯ꒁ臣낼볯늼菣ꦃ苣麃菣꺁雩ꮁ뷤꺽臣讂ꃦ뢅藩鞈苣鲤蟥馁苣龁苣ꮁ꣨袨臣貂臣芀菣궃菣隃臣뒼뷯醽볯꺼볯鶃菣ꆃ菣벃苣떅듧ꮁ苣誂鷩뢼뇥Ꞁ臣芁苣膀菣鶃菣뾂菣趛藥鎟雦誏臣袶藥ꒉ鯨覅鿦首臣馨귨閁苣讂胣銼臣꺁鿦首臣鞃菣벃菣誸臣ꖎ뿨鞁臣趽뷧馁苣뒠郥膀菣鶃菣뾂菣鎟雦讁苣꺁菣벃苣벃ꫨ躰駧覅臣袶藥鎟雦ꮁ苣ꎁ臣袶藥閁苣讂胣鞢맥趏뿥꺁雩膀菣궃菣隃臣뒼뷯醽볯꺼볯鶃菣ꆃ菣벃苣떅듧ꮁ苣誂菣뎃菣것菣袃뻤颭髧릖볥ꞁ裥궖臣貂苣芀뻥覂苣龁菣궃菣隃雦螉臣뚺뛦궸臣ꎧ鯩鞁胣뺔蟥閁苣龁菣鶃菣뾂菣鎟雦讁苣꺁苣낂菣ꮃ臣견볯꺁菣ꮃ苣궃菣ꊂ臣覂臣袶藥릊黦銂迥醁臣蒁胣것菣벃苣벃鿦首臣肸裥邭臣膀雦龁臣袐裦閁苣龁郥蚈귥ꮁ臣蒁臣馨귨閁苣膀鷩袶藥것菣벃苣벃鿦首臣鲤蟥貁菣벃苣꺁껥辇髧ꎧ蟩꺁鿥躤苣邏뻤馁苣芀戼㹲閼胢ₙ菣꾂菣ꊂ菣벂돦꾁胣ꆼ볯ꦼ���낼뷯覽뷯趽鞼볯邼볯뒼볯超裥鲤蟥ꪁ臣꺁껥芙雩骮蟩蒚볯ꎼ볯薣뷧ꞁ껥붖臣貂苣芀돧꾁룦ꚺ苣ꒂ苣ꮃ駥膀菣벃苣벃胣뮛跨邵郥薣뷧袼볯ꎼ볯覼苣ꆃ菣誏臣뎂菣钃菣벃苣讁苣ꪁ苣芀돧꾁룦ꚺ苣ꒂ苣ꮃ駥誸臣馼볯銈苣Ꞃ菣ꞁ臣ꚩ雦銂ꋥ薹臣鮁苣芀ꋥ薹룤ꮁ胣것菣뚂菣颪냥趛藥랂苣誃菣꾁藥閃苣ꒂ菣벃苣벃菣ꮃ臣馼볯Ꚃ苣ꮃ臣蚛苣覂苣膀볯ꎼ볯ꞁꓦ몇臣貂苣芀돧꾁ꏨ꺽臣龮ꇨ誏臣螃菣뾂臣蚈黦꺁臣膂臣붂菣袃苣Ꞃ苣銂郥肂胣㲂牢ਾ볯馀貃苣것苣벃苣ꊂ菣뮂苣螃菣뾂臣膀鳦鶈臣ꎼ뷯袏臣莢闧떂苣꾂菣ꞁꇨ뺏臣貂苣芀臣貂臣膀菣鶃菣뾂菣랂苣誃菣貁鯨覅臣邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣銂뛨袁臣蒓ꧧ閁苣讂苣ꒂ苣ꮃ臣鞁臣骮뻧閁苣讂胣貙볯꺼볯꺁뗧鲞臣ꎭ룥銃菣꒼볯ꆼ臣邵黦銂꿦莼臣讂ꃥ袐胣ꎼ뷯ꒀ臣뢠藩ꚩ雦ꮁ臣醁苣릉껥꺁꣦蒚藩鞈臣꺨駧뎂菣벃鯧뺯闦꺁껥辇髧몰뫥ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣閁苣讂胣㲂牢ਾꇨ颼臣膀鳦몙飦꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣隌郥ꦉ臣릂苣ꪃ菣讃菣낂臣ꢔ臣覂苣龁꣧薀臣龎駧ꮅ飧꺁볯떮髩誏臣꺼껦躚苣몤臣芀戼㹲邀볯閼볯閼胣㲑牢ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㜲⼼㹡⼼䥄㹖邀볯閼볯隼胣㲑牢ਾ볯꺼볯뾪ꏨ骼戼㹲꒼볯ꆼ臣릟ꓩ鞁臣내菨뮳胣肸곦ꮅ飧膀귦뢸菣袃ꇨ늶臣覂ꫨ붣臣龁胣颍鯩꾁胣ꢅ臣놼뷯覽뷯螽뷯躽臣覂臣膀닧붣苣莃菣膀菣莃菣ꆂ菣뮂菣袃迥뎁菣궃菣ꊂ菣벂苣ꢔ臣膀ꏨꂀ胨꺁賦몤臣许꣨ꮁ뻥ꎁ臣龮雦鞁臣芀戼㹲내菨릟ꓩ뚺꟨骼戼㹲내菨銂듦蒵臣膀菣莃菣鎽臣誂볯躼볯颽볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰颼⼼畳㹰臣莿뫥ꞁ菣ꪃ菣랂菣隌臣膀볯莄臣閼裥鎖볯邼볯邼뷯邽뷯ꞁ臩莿裥ꊛ臣ꚁ菣것菣袃賥鞁胣ꆬ臣ꞁ볯込볯릮蟩꺁볯ꊼ볯趆臩莿臣鞴뗦鞁臣芀菣것菣袃苣鎼鯥鞴뗦鞁胣뢇뿦내菨銂鯥躏臣ꚁ볯颽볯ꊼ볯ꞁ듦蒵臣龁胣ꆬ臣ꞁ듧麃苣醼볯趽볯꺁볯ꊼ볯ꮁ蟦膿臣鮁臣芀菣莃菣ꆂ菣ꎼ볯銂볯莄臣뎹ꇨ隌臣鮁臣芀볯閽뷯膽뷯薽뷯鞃菣蚃苣벃苣莼볯馼볯閼볯銂볯躼볯閼뷯貽臣랆뷯蒽볯銼볯ꞁ鳦芵뿦ꚺ볯邼뷯螽볯趽뷯뺁臣貸蟩鞁臣钼蓢ꞁ맥ꆡ賥閁臣龁胣醼볯趽볯꺁볯銼菣莃菣ꆂ菣銂胣놼뷯覽뷯螽뷯躽볯꺼볯鎽뷯ꆼ苣袃菣꾂볯醼볯邼뷯螽볯趽뷯覼苣銼볯邼볎뷯込뷯貽臣肜뗧莿뫥뺁臣貸蟩鞁臣뾪ꏨ鞁臣芀戼㹲邃菣閃苣벃볯醼볯醼볯趽볯膀볯莄볯誏臣蒽뷯ꢼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢볯袼볯邼뷯겼胣钼蓢覼苣膀곦蒁臣醼볯趽볯꺁듧麃蟦膿觧ꮁ럦ꂊ臣膀迥ꊻ臣鮁臣랷郥���鞁胣랰룤ꞁ볯邼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀듧麃ꃦ銂볯薽뷯讽뷯膽뷯릂苣뎃苣邃苣莃菣궃菣뾂臣钼蓢ꮁ臣蒁臣銼볯邼볯銽뷯趽臣醼볯蚈雩ꂁ뿥蚈鯩馁苣鎁臣ꮁ苣誂菣것菣袃賥鞁臣芀룤薸苣ꢍ臣膀ꃦ銂菣ꮃ菣莃苣릂臣ꪁ臣覂볯趽볯꺁菣莃菣ꆂ菣ꎼ볯袼볯莄볯誏臣隼뷯겼臣蒽뷯ꢼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢볯ꮁ蟦膿臣膀볯銧뻥ꮁ볯莄臣誁臣ꚁ볯閼볯邼뷯邽뷯ꞁ볯閼裥鎖臩莿裥ꊛ臣龁胣ꆬ臣ꞁꃦ銂껦誂臣邃菣閃苣벃룤ꮁ菣莃菣鎽臣誂볯邼볯캐貽苣ꢔ臣ꚁ蛥뢇뿦鞁臣芀볯銼菣莃菣ꆂ菣袼볯邼뷯貽볯銂蟦膿臣龁ꃦꮁ럦ꂊ臣ꪁ臣覂럧蒁菣ꮃ菣莃苣릂苣ꦁ铧鞁臣芀菣莃菣ꆂ菣뮷諥貁껥蚺臣龁苣膀볥蒁菣ꮃ菣莃苣릂苣鎼볯銧雩ꦁ铧鞁臣芀볯閽뷯膽뷯薽뷯鞃菣蚃苣벃苣袼볯邼볯캐貽룤風臣袂臣ꮁꫨ붣볯銂럦ꂊ臣膀볯邼蓢ꞁ볯邼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣誏臣ꂁ뿥蚈鯩銂胣뚺꟨ꦉ臣辀飦ꮁ臣讂臣ꞁ맧誂뿨鞁臣袼뻤袁臣膀臣覂臣鎼볯銈볯邼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁胣钼蓢ꞁ볯邼裥鎖볯邼볯邼뷯螽臣骃菣莃菣隌臣讂볯芀戼㹲邀볯閼볯鞼胣㲑牢ਾ鯥鎽菣袃藨趘ꧨ首臣뾪ꏨ誏臣뚺꟨骼戼㹲ꮅ飧ꚩ雦銂꟧辇臣閼볯趽뷯꺁苣讃苣ꮃ껧ꮁ藩鞁臣랰룤ꮁ뿤膌臣龁胣ꂊ럥꾁ꫨ붣뷥龁苣銼볯邼뷯螽臣蒵맧ꪜ뫦ꮁ裥邙臣龁볯醼菣莃菣込ꫨ붣볯芀菣궃菣ꊂ菣벂뫦늶苣隼볯銼볯趽뷯꺁蛥蒽뷯ꢼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢볯궸臣肜뗧莿뫥銼볯趽뷯込뷯貽臣ꞁ룥袇臣讂臣ꢁ臣袂苣낖臣ꮁꫨ붣臣ꚁ볯莄臣꾲铨鞁臣芀볯꺼볯鎽뷯ꆼ苣肜뗧莿뫥銼볯邼뷯螽볯趽뷯뺁臣貸蟩馁苣鎁臣ꮁ苣誂볯銼菣莃菣ꆂ菣袼볯邼뷯貽볯銂ꫨ붣臣龁볯醼볯邼뷯螽볯趽뷯꺁苣袃菣꾂臣覂볯芀苣ꊂ菣뺂菣꺁郥ꖅ苣뾁臣讂臣膂臣꒱뗦뒼菣벃菣薆臣鶃菣袃菣뎃臣Ꞥ臣ꪁ菣莃菣銂铧蒁臣膀藨趘뗧钹苣醼볯趽뷯꺁볯銼菣莃菣ꆂ菣궸臣隼볯銧雩螝룤隌臣膀껥ꦸ臣鶿賦鞁臣芀ꧨ首雩ꞁ胣蒐胣銼볯꺁뷯蒽볯㲨畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵꾼臣銼뷯鎼볯銧雩膀곦蒁臣Ꞽ볯邃菣閃苣벃볯閼볯趽뷯覼臣릂菣뎃臣鮁苣鎁臣ꮁ苣誂菣ꪃ菣궃菣銂胩躘賥鞁臣芀뗧钹臣뢂苣趃菣벃苣膃菣鞃룤ꮁ귥ꢜ臣讂ꃥ袐臣膀ꏨ꺽苣蚈꟨鞁臣薸뗦隌臣龁胣㲂牢ਾ볯閽뷯膽뷯薽뷯鞃菣蚃苣벃苣袼룤風臣ꢔ臣뾪ꏨ膀볯躼볯趽뷯覼苣뮷諥鞁胣ꆬ臣ꞁ菣ꮃ菣莃苣릂臣ꚁ볯邼蓢ꞁ볯芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃迥뎁臩莿裥ꊛ苣膀뫦���ꎧ觧貁胩躘臣ꪁ苣뺁臣낹苣钿臣龁볯设臣낁胣閁苣ꮁ볯邼裢隼볯蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣膀볯莄臣醼볯蚈雩鎼볯邼볯颽뷯ꞁ菣것菣袃賥馁苣覼胣㲂牢ਾ胣邼볯閼볯醀戼㹲銃菣股뛦뾪ꏨ誏臣뚺꟨骼戼㹲ꖁ룥ꪁ菣ꦃ菣蚃苣ꊂ臣覂꣦隺髧ꪁ蓦鎟雨鞃菣袃苣벃菣銂铧蒁臣股뛦銂軦誂臣鞁胣膃菣鞃뷥龁苣醼볯趽뷯꺁ꧨ首臣꾂苣뎃藩隌臣龁胣놼뷯覽뷯螽뷯躽菣궃菣ꊂ菣벂苣隼볯銼볯趽뷯꺁蛥蒽뷯ꢼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢볯궸臣肜뗧莿뫥銼볯趽뷯込뷯貽臣ꞁ룥袇臣讂臣ꢁ臣袂苣낖臣ꮁꫨ붣臣ꚁ볯莄臣꾲铨鞁臣芀볯꺼볯鎽뷯ꆼ苣醼볯邼뷯螽볯趽뷯꺁苣袃菣꾂臣覂鳦芵뿦ꚺ볯邼볯趽뷯込뷯貽臣ꞁ룥袇臣讂臣ꢁ臣袂苣Ꞽ볯邃菣閃苣벃볯銼볯趽뷯覼苣뾪ꏨ鞁臣芀ꇨ늶볯醼볯趽뷯覼苣閼볯趽뷯꺁苣讃苣ꮃ껧ꮁ藩鞁胣醼볯趽뷯꺁볯醼菣莃菣ꆂ菣誏臣鎼볯趽뷯꺁뷯蒽볯㲨畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵꾼볯ꢁ苣ꮁ볯莄臣뎹ꇨ隌臣龁苣꺁볯銂럦ꂊ臣膀迥ꊻ臣鮁臣랷郥鞁臣랰룤ꮁ볯邼裥鎖뿤膌臣龁胣ꊼ뷯莽뷯趽뷯躽苣ꒂ菣낂菣놂菣袃菣벃苣벃臣膀볯莄臣誁臣ꚁ볯閼볯邼뷯邽뷯ꞁ볯閼裥鎖ꃦ銂菣것菣袃賥鞁胣誸룦銂跦ꚁ臣芀菣ꮃ菣莃苣릂臣ꪁ臣覂胣뢠苣銼뷯貽臣ꎼ볯邃菣閃苣벃볯钼蓢覼迥뎁볯趽뷯꺁뷯蒽볯㲨畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵꾼볯钼蓢覼룤ꮁ蟦膿臣鮁臣芀菣ꮃ菣莃苣릂臣骃菣莃菣貁駧辁臣讂臣ꞁ맧誂뿨鞁臣芀곦蒁臣뢠苣议苣꺁菣莃菣ꆂ菣궸臣銼볯邼볎뷯膃菣鞃苣ꢔ臣ꚁ蟦膿臣鮁臣芀볯銼菣莃菣ꆂ菣袼볯邼뷯貽볯銂蟦膿ꃦꮁ럦ꂊ臣ꪁ臣覂럧辁菣ꮃ菣莃苣릂臣膀곦蒁臣鎼볯銧雩랼臣鲃菣蚃菣꾂苣鞁臣芀볯閽뷯膽뷯薽뷯鞃菣蚃苣벃苣銂럦ꂊ볯銼볯邼볎뷯覼臣膀볯邼蓢ꞁ볯邼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣誏臣ꂁ뿥蚈鯩銂胣뚺꟨ꦉ臣辀飦ꮁ臣讂臣ꞁ맧誂뿨鞁臣袼뻤袁臣膀臣覂臣鎼볯銈볯邼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁胣钼蓢ꞁ볯邼裥鎖볯邼볯邼뷯螽臣骃菣莃菣隌臣讂볯芀戼㹲邀볯閼볯馼胣㲑牢ਾ胩躘賥뚺꟨ꦉ臣뺲ꏨ骼戼㹲袼볯覼苣躃菣꒼볯ꆼ臣颍鯩骼戼㹲늂菣ꂃ볯꺼볯銂볯邼뷯貽臣놼볯뒼菣莃菣ꆂ菣ꞁ맥ꆡ賥鞁臣袼鳦Ꞥ菣莃菣뾪ꏨ鎽臣誂볯ꚩ雦覼胣놼볯뚺鯩邃菣閃苣벃苣閼볯莄臣뎹ꇨ隌臣龁胣ꚩ雦銂볯邼꟧鎖菣ꮃ菣莃苣릂臣膀곦蒁臣뎹ꇨ隌菣莃菣ꮁ단랍臣ꚁ蟩鮊臣袂苣銎뛦鞁臣芀菣莃菣銂볯颽볯閼뷯貽臣놼볯邃菣閃苣벃臣鞴뗦鞁臣芀볯꺼볯銂胣鎼볯趽뷯���꺁苣ꦃ菣隌臣龁苣벃菣꾂菣벃菣鎼볯趽뷯ꎼ뷯銽뷯薽뷯ꆮ臣醼볯趽뷯꺁볯ꚼ菣莃菣ꆂ菣袼볯邼蓢覼臣뚺鯩鞁臣芀苣붂菣궃菣躃菣ꮃ볯醼볯躼볯趽뷯覼苣蒐ꧨ首臣뮷諥鞁胣ꆮ苣醃菣閃苣뎃臣ꮢꛨ鞁胣꒼볯ꆼ臣袲껦馁苣뺁臣낹苣钿臣趏믨閁臣ꚁ럦袐臣龁胣ꚩ雦銂胣뎼볯銈볯钼菣벃苣ꞁ볯莄臣誁臣ꚁ볯閼볯邼볯邼뷯邽뷯ꞁ볯邼裥鎖臩莿裥ꊛ臣ꚁ菣것菣袃賥鞁臣芀菣것菣袃뷤꺽苣麃菣꾂臣ꚁ룤薸苣ꢍ臣膀볯邼뷯貽臣鞼볯薼苣뾂菣벃菣袼볯莄볯銂럦ꂊ臣龁胣ꚩ雦銂胣뎼볯銈볯钼菣벃苣ꞁ볯莄臣誁臣ꚁ볯邼볯邼볯邼뷯邽뷯ꞁ볯邼裥鎖臩莿裥ꊛ臣ꚁ蛥ꚺ菣것菣袃賥鞁臣芀菣것菣袃뷤꺽苣麃菣꾂臣ꚁ룤薸苣ꢍ臣龁胣ꆬ臣ꞁ껧銂매ꖇꏦ꺁郥ꊝ臣꺽臣膀볯鞼蓢ꞁ볯邼裥鎖매ꖇ臣鮁臣貁胣뾽铧꺁臩낉매ꖇ臣꾁돦辄臣龁胣㲂牢ਾ매ꖇ뻥膀菣것菣袃苣醼볯邼뷯貽臣뒼볯袼뷯ꢼ볯躼볯覼臣뚺꟨鞁胣閼볯莄臣醼裢銼駦鎖뷧蒁臣芀ꧨ首苣钼蓢ꮁ뗧鲤뿤膌臣ꚁ뫦ꎧ苣骶臣龁胣ꆬ臣ꞁ볯꺼볯뚺뛦銂胣蒃菣ꮃ苣ꪃ菣랂菣뎃苣誸臣銼볯늂菣뢂臣鶇苣랅若馁苣醼볯閼뷯貽껧ꮁ꟧鞁臣芀볯꺼볯銂觥궖臣讂臣膂臣뮧ꇨ銂볯颽맧誂뿨鞁臣芀곦蒁臣ꚩ雦銂볯邼蓢ꮁ볯銈볯芙雩꺽臣龁胣㲂牢ਾ胣邼볯隼볯醀戼㹲袼볯覼苣躃菣꒼볯ꆼ臣骮蟩誏臣몁볤邭ꋥ薹苣莃苣ꒂ臣龁苣꺁ꫨ붣볯㲚牢ਾ郥ꆮ臣꒼볯ꆼ菣馃菣銂볯骼볯邼룥袇볯閼볎뷯꒼볯ꆼ볯馼볯캕貽뷯蒽볯㲨畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵꾼볯ꞁ臣馨뫦蒚臣ꆼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼볯邼⼼畳㹢胣ꆼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼볯邼⼼畳㹢苣骃苣袃菣ꮁ苣誂胣ꊼ뷯莽뷯趽뷯躽꒼볯隼볯邼裥覅藥ꚺ꣨꺁볯躼볯趽뷯뎟诨궂菣馃菣袃苣ꢔ臣ꚁ껥辇臣龁胣ꆼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼볯邼⼼畳㹢볯ꆼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼볯邼⼼畳㹢꿦螎臣醼볯颼裢醼볯馼臣蒯鯥ꞁ臣ꎁ臣芀곦蒁臣蒐볯꺼볯ꚩ雦銂볯ꖼ볯邽볯颼볯閼볯궸臣蒴볯邼볯躽뷯込뷯貽臣ꞁ룥袇臣龁胣肜裥꺁鷦首臣颫뿦ꚺ볯蒴볯邼볯躽뷯込볎뷯覼臣芁苣뒠郥膀鷦首苣閼볯莄臣趆蟦膿臣讂臣ꞁ闦芙雩꺽臣龁胣㲂牢ਾ곦蒁臣膀룥袇臣龁鷦首볯銼볯銈볯邼볯躽뷯込뷯貽볯ꮁ꿥鞁臣膀ꏨꂀ胨꺁賦몤苣ꖻ룤꺁苣蚁臣릔ꓥ鞁臣趛藥꒼볯ꆼ껥辇苣龮雦鞁臣芀臣貂臣膀볯辽뷯蚽뷯薽뷯ₒ볯馽볯ꆼ놼뷯膽뷯钽銼볯邼鯨覅꣨銂듧醼볯蚈雩隚苣ꚁ껥붖臣龁胣ꢼ뷯薽뷯袽뷯钽鿦首뷤궥뫦늶볯莼볯鎼볯銼볯颼胣醼볯캐貽胣뾽铧꺁볯���銼駦鎖믤薆臣뾪ꏨ覼苣醼볯邼뷯貽臣醼뷯뒼볯ꖼ菣莃菣ꆂ菣ꮁ룥袇臣龁胣銼뷯貽苣ꖃ菣莃菣銂鯨覅꣨뚺뛦ꞁ뫦龁臣膀ꧦ낢臣超臣膀ꧦ낢苣벂菣뾪꿧鞁臣芀뷯Ꞽ볯궼볯몼뷯袼볯覼볯銼볎뷯膀菣莃菣莼볯隼볯颼볯醼볯銼볯覼苣銼뷯貽臣趛藥袨뫦늶臣뮷諥鞁臣銼볯邼跥趽臣ꆠ귦鞁臣芀곦蒁臣膀臣覂臣銼볎뷯꺁뷯Ꞽ볯궼볯몼뷯袼볯覼볯꺼볯銂ꧨ鎨臣膀볯邼볯讼볯銈볯邼跥趽臣궪臣銂ꋧ趪臣龁胣ꆬ臣ꞁ郥ꚩ雦銂냥ꪁ臣ꢁ苣鎼鯥궪苣ꂁ胣鎼ꧨ首臣銺臣ꮁ볯邼볯ꖻ蛥ꞁ臣讂臣ꢁ臣讦苣貂臣ꢁ臣膀臣貂苣꺁맥螝苣ꢁ苣膀臣꺁胥銂껥辇賥ꒀ臣鞁臣ꢔ臣龁胣㲂牢ਾ곦蒁臣膀鯨覅룦骮臣몱껥鞁臣莿뫥銂胣蒐ꧨ首苣蒽뷯ꢼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢볯궸臣醼볯躽뷯込볎뷯뺁臣貸蟩馁苣꺁臣ꢔ臣龁胣鎁苣꾁胣醼鯥꺁볯膽뷯궼뷯躽菣것菣袃苣莃苣ꒂ臣ꒁ臣ꚁ藥ꚁ臣蚃菣鞃菣벃菣ꚩ雦ꮁ臣蒁臣貐駦ꮁꇨ蒁胣閼볯邼裢醼볯邼볯ꊂ菣뮂苣銂껥붖臣讂臣ꮁ跥蚈臣邝雦ꞁꇨꎁ臣芀ꧨ首臣膀볯膽뷯趽뷯躽볯蚕鏥趐볯鞃菣ꒂ菣벃迥뎁菣궃菣隃臣鎼鯥ꚩ꣩鞁胣ꊼ裢ꊂ苣膃菣誏臣Ꞽ볯낼볯ꢼ臣节臣ꎭ룥ꪁ菣袃볯꺼볯銂賦ꆁ菣뎃菣것菣袃꿥ꞅ苣膌臣ꪁ臣颍룤꺁菣것菣袃룤ꮁ臣讂胣貸蟩鞁臣ꚩ雦銂铧蒁臣貁胣ꚩ꣩꒼볯ꆼ臣覂룦鞮臣龁귦뢸菣袃볯꺼볯꺁볯뒼胥꾁볯込裢醼볯뒼臣芁臣龁胣貸蟩鞁臣膀菣莃菣骮胦隌臣龁苣躃菣꒼볯ꆼ苣膀볯躼볯趽뷯ꊂ菣뎂菣袃臣銈볯邼蓢ꮁ臣蒁臣鶿귥鞁臣芀뛧蒁臣몁볤鞁ꋥ薹苣莃苣ꒂ臣뾽铧馁苣ꊂ菣뎂菣袃臣膀볯莄臣鶿귥鞁臣芀郥醼뷯貽臣ꊂ菣뎂菣袃臣膀볯銈볯鞃菣벃菣袏臣隼볯ꚩ꣩ꮁ跥蚈臣芁苣芀戼㹲邀볯閼볯醼胣㲑牢ਾ臩鶼귥鞢맥ꊂ菣뮂苣骼戼㹲겜駧躘臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃賥袐觧銂믤许臣龎駧ꮅ飧ꞁ苣꾂菣벃菣뎃苣鞁胣醼볯邼믤誸臣鞾苣貂臣캟ꎼ뷯ꒀ苣ꢡ볯ꮁꃥ誑臣讂胣㲂牢ਾ胣邼볯隼볯醀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈰㰸愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㤲⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌰㰰愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌰㰲愯㰾䐯噉ਾ胣邼볯隼볯醀戼㹲膦듧㲄牢ਾ룤風臣風볨鞁臣꺨胣꺁볯꺼볯꺁ꋥ薹臣꺨胣꺁藨趘臣誁臣ꚁ铧颁苣龁苣膀꣧薀볯꺼볯꺁ꋥ薹臣ꮅ飧꺁뷥邈迥뎁볯袏臣邈闩ꢁ雩ꎀ臣ꚁ臣讂苣蚁臣芁苣芀뗧鲞臣鞁臣膀臣貂苣鶃菣骃菣膃菣銂꣦蒚臣鞁臣ꊂ菣뾂苣���苣袃볯设臣낁諦鎽볯꾁胣貙닦芙臣誁臣ꚁ鳦ꢔ臣芁苣ꢁ鳦薾臣貂苣芀戼㹲邀볯閼볯钼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯閼볯薆髧내菨ꮁ臣醁苣莽裢蚽뷯鎽臣颪냥袼苣莃苣ꒂ볯钼볯㲉牢ਾ臣꺁苣莃苣ꒂ臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣薆髧내菨ꮁ臣蒁臣莽裢蚽뷯鎽苣颪냥馁苣붃諥銂ꓧ馁臣Ꚑ苣몱껥馁苣龁苣ꮁ꣨袨臣貂臣蒁苣芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ駩Ꞁ臣閩뻤閁苣龁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꾁胣设臣낁觥랂닦銙苣鶁苣ꮁꇩ벼臣节臣銂郥肂ꇨꆮ雦龔臣覜鯧ꪁ韧뚊苣뺖苦꺁닦芙룤꺁蟥꺽臣ꢁ臣ꚁ鳦ꢔ臣芁苣ꢁ鳦薾臣貂苣袼臣貂苣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꊂ苣讃苣袃臣袂臣ꮁ볯芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ駩Ꞁ臣閩뻤閁苣龁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁苣뎃苣뒂菣릂菣꾁胣貙胦꺁藨趘臣뮲駧誸臣ꚇ뷧ꮁ臣ꎁ臣覜铧ꞁ臣讂臣龜뻥閁苣讂胣㲂牢ਾ裦랕鿥난볯閼볯薼臣较菣꺁볯醼볯鞽볯辽볯ꢼ볯骼뷤낂菣뎂菣릂胣誏臣낂菣랂菣ꪁ臣꺁볯邼볯꒼볯ꖼ볯骼볯膽볯ꎼ볯㲯畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯扵膀볯薼苣ꮃ苣龃菣膀볯邼뷯궼臣ꢼ볯낼볯뎼胣醼볯薼臣ꚼ볯뎼胣醼볯躽뷯込뷯貽臣芽볯Ꞽ볯覼룤꺁菣袃鷩袄蟨馝蓨薆髧내菨袼볯떼볯ꖼ볯貼ꎼ뷯貽뷯₌볯馽뷯钽뷯趽뷯覼苣醼뷯醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲔猯灵내菨込苣Ꞃ菣꺁듧麃꿥ꚺ臣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣ꮁ菣것菣蚃苣뎃苣鞁臣芀菣것菣蚃苣뎃苣꺁곦꺁韦膀裦랕鿥난苣꒙臣膀듧麃苣醼볯邼볎뷯込苣Ꞃ菣꺁ꧨ鎨ꧨ首臣뺯藧袼菣뢂菣ꎂ菣뺯藧鶼裦랕鿥난볯趃苣蚃苣隃꿥ꞅ볯鞃菣蚃苣뎃볯銼菣莃菣ꆂ菣鶼볯邼뷯궼臣ꢼ볯낼볯뎼胣醼볯邼뷯궼臣꺼뷯ꎼ뷯膀볯薼볯鞽볯隽볯麃菣讃菣벃菣膀뷯ꢼ볯躼볯覼臣ꚇ郧馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣내菨銂ꏩ鎤臣鮁臣芀듧麃苣閼볯ꎼ볯㲯畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵궸臣鎼볯莄臣誁臣ꚁ볯邼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀ꧨ首苣随苣꒙臣ꚁ胣꒼볯ꆼ苣莃菣鞃菣袃苣벃菣袼볯袽뷯銽뷯躽꒼뷯膽뷯躽뷯鎽뷯覽뷯鎽볯₌뷯膽뷯躼볯隼볯邼볯銈볯鎼볯覼臣肜裥꺁菩蚈臣鎾臣龁胣鎁臣ꞁ胣许꣨꺁郥Ꞥ雦鞭臣ꚩ雨込菣莃菣ꆂ菣꾁苣莃菣讁苣ꦈ铧꾏菨ꞁ臣ꎁ臣芀戼㹲ꆰ跥ꮁ臣膀ꧨ鎨臣薿ꛨꪁ볯궼뫦貏菣莃菣ꆂ菣誏臣鞃菣벃菣꺁蟩銂ꏨꂀ胨ꮁ苣誂迦鮾臣貂臣薃ꃥꮁ鿥ꖁ臣ꚁ꣨鞮臣龁胣ꦁ뷥ꪁ蟩꺁꟨趇菣궃菣隃苣뒼볯뚺迨邃菣閃苣벃臣뮷諥鞁臣芀跦늍菣ꒂ菣ꪃ菣覃뷥邈菣莃菣ꆂ菣袼볯膽뷯钽뷯銽뷯₅볯馽뷯銽뷯蒽뷯骽뷯钽뷯辽뷯₎볯閽뷯蚽뷯���볯銂껥ꦸ臣ꞁ룦膂臣芀뷯꒼볯ꆼ鷦螉苣醇뇥ꆝ觧鮃菣肃菣ꮁ苣莃菣ꊂ菣鞃臣膀볯邼볯캐貽臣閍跧较苣隃菣莃菣ꊽ裦邃菣閃苣벃苣薿ꛨꪁ郥芽裢꒼볯ꆼ苣Ꞃ菣ꮁ럦ꂊ臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣鎼볯蚈苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀듧麃蛥꺁ꧨ鎨菣것菣袃苣ꒂ菣궂菣馃菣뾂臣覂迥誂駩趁胣龜ꧧ麃菣閃苣벃菣覃苣뾽铧鞁臣릟鳥銂ꧧ蒂臣ꮁ駩蒁臣芀菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃臣蒐苣Ꞃ菣ꮁ볯邼볯캐貽臣鞃菣벃菣銂볤蚁뫦貏菣ꒂ菣ꪃ菣覃뷥邈菣莃菣ꆂ菣銂郥芽裢꒼볯ꆼ苣Ꞃ菣ꮁ菣骃菣袃臣ꂴ韦辁럦ꂊ臣龁胣ꒁ臣ꞁ胣鞃菣벃菣銂볯閼裥鎖볯閼蓢ꞁ苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀苣뎃苣ꖃ菣벃苣벃臣覂臣随苣몇臣膀菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃苣肃菣뾂菣颃菣覃苣馂臣龁菣ꮃ菣莃苣릂菣궂苣벃臣鞃菣벃菣銂藩鞁胣醼裥꺁雩膀볯銼臣궨껥ꞁ菣ꮃ菣莃苣릂臣龁胣颼볯캐貽臣뚺迨늶苣随苣꒙臣膀跦늍菣ꒂ菣ꪃ菣覃뷥邈菣莃菣ꆂ菣銂郥肂뷯꒼볯ꆼ苣Ꞃ菣ꮁ럦ꂊ臣膀菣骃菣袃臣誸룤鞁臣랷郥鞁臣芀菣것菣袃苣醰臣辁臣节볯隼駦鎖臣鎖볯鎼蓢ꞁ苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀戼㹲邀볯閼볯閼胣㲑牢ਾ곦꺁韦ꮁ胣芽볯꺼볯궂菣袃菣궃菣뎂菣ꮃ臣견볯꺁菩蚈臣鎾臣龁胣馁臣辂臣膀菣것菣袃苣ꒂ菣궂菣馃菣뾂菣讁苣随苣꒙臣膀菣뎃菣ꮁ藩꺽臣ꚁ볯邼裥鎖蛥뒍臣龁胣薿ꛨꪁ럦ꂊ臣릮ꧧ꾁ꏨꂀ胨ꮁ苣誂臩ꢔ臣貂臣薃ꃥꮁ鿥ꖁ臣ꚁ꣨鞮臣龁胣ꆼ볯较苣隃菣莃菣ꊽ裦邃菣閃苣벃룤ꮁ볯骼볯邼볯꺁룥袇臣ꊂ菣鞃菣閃苣ꒂ苣벃뿦꺸觧袼볯趽뷯貽뷯蚽뷯薽뷯ₒ볯辽뷯莽뷯躽뷯銽뷯钽뷯覼볯銼볯蚽뷯込볎뷯覼苣鲽裦馁苣鎁臣ꮁ苣誂볯邼볎뷯꺁苣뎃菣ꪃ菣ꆂ苣ꊂ菣鲽铧늶苣뾪ꏨ鞁臣芀臣蒁臣膀菣것菣袃苣ꒂ菣궂菣馃菣뾂菣讁苣随苣꒙臣ꚁ볯邼裥鎖蛥뒍臣龁胣馨귨鞃菣벃菣鲽铧늶苣膀볯겼菣ꒂ菣ꪃ菣覃뷥邈菣莃菣ꆂ菣궸臣醼볯醼볯邼臣貸蟩ꞁ꣦颭뿦꺸觧袼볯邼뷯趽뷯貽뷯鎽볯캏貽볯銂뷤邈臣讂臣ꢁ臣袂苣뾪ꏨ鞁臣芀볯邼裥꺁蛥뒍鳦鎖뻥膀苣뎃菣ꪃ菣ꆂ苣ꊂ菣较苣隃菣莃菣ꊽ裦랷郥ꦉ苣꒙軥鞁胣鞃菣벃菣銂듦蒵觥ꆼ臣銼鯥鞴뗦鞁臣芀볯邼볎뷯꺁꣦颭菣궃菣隃뷤ꢔ뛦銂郥Ꚃ苣ꮃ臣뮷諥鞁胣Ꚃ苣ꮃ苣閼볯莄臣醼볯蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣醼볯蚈雩꺁蛥뒍뻥膀鿥ꪳ苣꒮룦뺁臣ꦸ苣龁胣ꊂ菣뮂苣ꮁ뿥膦臣蒐菣ꮃ臣몟돨ꮁ볯캓貽臣몟돨ꢂ菣较菣떂菣銂럦ꂊ臣ꚁ胣鞃菣벃菣銂볯邼裥鎖蛥뒍臣膀꣦颭菣ꒂ菣ꪃ菣覃뷥邈럦袐觧銂迥誂駩趁胣鞃菣벃菣銂듦蒵觥ꆼ臣���鯥膀듦蒵觥꒼臣鎼鯥鞴뗦鞁臣芀볯邼볎뷯꺁苣뎃菣뎃苣벃苣뒼臣몟돨뚺뛦銂郥Ꚃ苣ꮃ臣뮷諥鞁臣芀菣것菣袃苣鎼볯莄臣鎼볯蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣膀볯겼볯銂臩鎽臣ꞅ뫥袨臣궪臣ꢁ臣龁胣㲂牢ਾꓨ붣苣뎹鷥隌臣覤该芿闦銂뇦骮臣龁胣趃苣蚃苣隃꿥ꞅ볯誸뿨꺁菣궃菣ꒂ菣鎼볯込볯ꖼ볯ꖼ볯邃菣閃苣벃볯ꒀ臣뺯臣讂ꋥꂊ胥낕臣뮴胦꺁룦骮臣隌귥몙藥颍뷤袼볯겼볯覼臣袂臣ꚁꓧ閁苣龁胣邵黦銂룤風臣ꢡ볯ꮁꓧ鞁胣趃苣蚃苣隃꿥ꞅ胥ꮁ꿥鞁臣醰臣辁臣节볯趀臣ꒀ苣몤臣ꚩ雦꾁菣뢂菣ꎂ菣ꢁ胨袁臣芀菣겂菣ꎂ菣뺯藧鶼볯躼볯邼볯貸蟩ꞁ볯躼볯邼볯겼볯芀菣뢂菣ꎂ菣뺯藧鶼볯躼볯邼볯貸蟩ꞁ볯躼볯馼볯겼볯芀戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ臣膀믤许臣ꚩ꣩낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣붙胦ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯馼볯颼胣낼볯꾼볯邼볯膀볯늼볯颼볯閼胣낼볯꾼볯颼볯膀迥뎁볯늼볯醼볯醼볯芀戼㹲邀볯閼볯隼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯隼볯ꦃ菣袃跥ꊽ髥꾔賦내菨꺁ꋥ隮볯ꊂ菣뮂苣閼볯覼戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁胣겜駧躘臣芁苣鶃菣骃菣膃菣貁胣뒁ꛨꞀ鳦鮯듧麃觥蚧뷤ꞁ臣讂蛥뎀铦膌듧麃臣뺯臣ꚁ뷦ꢜ髧ꮁ菣ꒂ菣뢂苣뎃臣鞁臣鲽铧鞁胣鶁苣薕臣뒁꿦내菨꺁蛥龔臣颪냥誏臣몓매麡臣뒁諥趐ꓥ꺁닦芙臣覜铧ꞁ臣讂臣ꢁ苣몤臣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾ鳦ꊂ菣뮂苣꾁胣ꆬ臣袂臣ꮁꇨ辂苣讂胣ꦃ菣袃볯ꖼ볯銈볯떍뷥ꊚ蛥꺚듧麃苣膀볯鎼蓢ꮁ臣醁苣銼볯邼볎뷯꺁ꇨ薸郥覜鿥난룤膀볯邼볯邼듧麃볯Ꚃ苣ꮃ臣蚯뫥ꞁ볯隼苣Ꞃ菣鞃菣벃菣ꮁ裥醁苣芀룤ꦙ臣貾胣鎼볯莄臣誁臣ꚁ鿥난苣ꆄꇨ薸鿥난臣覤臣讂胣鶁臣ꚁ볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁꣧薀臣貸蟩袼迥꾁苣뎃菣궃菣ꮃ蓧鞁볯銂鿥난臣뮷諥鞁胣내菨銂볯钼駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀볯钼駦鎖臣ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃臣貾胣鎼볯銈菣龃苣뎃볯醼볎볯覽볯Ꚃ苣ꮃ볯銂럦ꂊ臣膀듧麃苣뒛臣銼볯芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣ꆬ臣ꞁ鿥난苣鞴뗦鞁臣随苣벾臣貂臣蒁臣蒁铦蒰菨馨귨銂迥誂駩趁胣내菨꾁鯥躏臣膀볯邽뷯込苣Ꞃ菣銂룦骮臣龁胣뎂菣袃菣벃菣릟鳥ꢁ꿦莼臣ꚁ胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃蟥蚐鿥난臣궸臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣鎼볯薼迥꾁臣貂苣誂ꯩ蒁볯邽뷯銂臣꺁苣莃苣ꒂ臣꺁菣뢂菣ꎂ菣ꢁ胨袁苣芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁臣꺁苣莃苣ꒂ臣붙胦ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯鎼볯鞼胣낼볯꾼볯隼볯誏臣낼볯꾼볯邼볯銼胣㲂牢ਾ胣邼볯隼볯醀戼㹲龮雦设볯醼볯骼裥龜菣莃菣芄苨내菨ꮁ苣讂苣ꮃ苣벃苣袏臣ꚼ볯���迥誂뻨뾁臣놽鿩銂룤袁苣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣鲤蟥袼苣莃苣ꒂ볯钼볯㲉牢ਾ臣꺁苣莃苣ꒂ臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁蓨ꪂ듧麃臣袂苣낂菣뎂菣릂迥꾁볯ꚼ볯随苣뾁臣놽鿩銂迥벁臣붃諥銂ꓧ馁臣ꦁ臣讁苣몱껥馁苣龁苣ꮁ꣨袨臣貂臣蒁苣芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ駩Ꞁ臣閩뻤閁苣龁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꾁胣设臣낁苨肺胣隳냥薗迥꾁ꯩ隈臣꾁뷤ꒂ菣랂菣ꪃ菣股韧銂郥肂蓨ꪂ듧麃臣袂苣낂菣뎂菣릂迥誂뻨뾁臣몈뿦袏臣뮘껥ꞁ臣讂雧ꎂ臣뮲駧誸臣ꚇ뷧ꮁ臣ꎁ臣覜铧ꞁ臣讂臣龜뻥閁苣讂胣㲂牢ਾ볯隼苣Ꞃ菣閃苣벃菣莃菣ꮁ臣蒁臣膀苣莃苣ꒂ臣貂苣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣鶈鳦ꦃ菣袃蓨ꪂ듧麃臣ꂊ臣覂苣膀臣鞁臣肸駦ꒂ菣궂菣馃菣袃臣貂苣芀볯誏臣醼볯芙雩꺛臣膀苣ꪃ苣궃菣ꮃ胣낂菣뎂菣릂迥뎁볯ꚼ볯随苣벾臣꺁苣莃苣ꒂ臣龁苣꺁ꧨ首臣随苣貂苣芀볯隼駦鎖臣ꒂ苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣貾胣ꒂ苣ꖃ菣뎃苣릟鳥뢁諥袁胣钼駦鎖臣ꒂ菣궂菣馃菣袃苣誁臣ꪁ臣芀臣꺁駦膀ꧨ首臣随苣貂臣膀苣ꪃ苣궃菣ꮃ胣낂菣뎂菣릂迥뎁볯ꆼ볯꺁迥誂뻨뾁臣겸껥閁苣讂胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꆄ臣ꒂ菣랂菣ꪃ菣銂郥肂鿥난苣膀駩Ꞁ臣몟뫦뎂菣袃菣벃菣ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣ꚩ꣩閁苣讂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁苣ꮃ苣벃苣袏臣ꚼ볯ꆼ迥誂뻨뾁苣몈뿦隈臣꾁飩뎮臣龁ꃥ袐胣ꒂ菣랂菣ꪃ菣꺁苣뎃菣궃菣ꮃ苣誂볯躼볯趀苣誂ꯩ蒁迥꾁볯躼볯趀苣誂뷤蒁臣膀뗧鲞臣붙胦ꢁ꣨늌臣貂苣芀戼㹲㰊牢ਾ믤许臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ苣ꮃ苣벃苣誏臣込迥꾁볯ꆼ볯꺁迥誂뻨뾁臣몈뿦ꒉ臣鞁臣붙胦ꢁꧨꆾ臣貂臣骼볯늼볯醼볯醼胣낼볯꾼볯邼볯膀볯늼볯鎼볯鞼胣낼볯꾼볯隼볯膀볯늼볯鎼볯鎼胣낼볯꾼볯鎼볯膀볯늼볯閼볯钼胣낼볯꾼볯醼볯钼迥뎁볯늼볯邼볯閼胣㲂牢ਾ믤许臣ꚩ꣩낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ苣ꮃ苣벃苣誏臣込迥꾁볯ꆼ볯꺁迥誂뻨뾁臣뮘껥ꒉ臣鞁臣붙胦ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯醼볯閼胣낼볯꾼볯銼볯膀볯늼볯颼볯銼胣낼볯꾼볯隼볯膀볯늼볯颼볯閼胣誏臣낼볯꾼볯隼볯芀戼㹲邀볯閼볯颼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯颼볯ꢪꃦ训臣낂菣뎂菣릂迥꾁볯ꚼ볯随苣벾臣ꮁ뷥뾟苣躸臣讂菣ꪃ菣鞃菣覃臣鲤蟥袼苣莃苣ꒂ볯邼볯覼戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꢪꃦ训臣낂菣뎂菣릂迥꾁볯ꚼ볯随苣벾臣놽鿩銂迥벁臣붃諥銂ꓧ馁臣ꦁ臣讁苣몱껥馁苣龁苣ꮁ꣨袨臣貂臣蒁苣芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ���Ꞁ臣閩뻤閁苣龁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꾁胣设臣낁돧뾰韧袏臣颫裦蒁臣躽苣뎃苣ꖃ菣뎃ꇨ螗苣ꮐ苣ꢪꃦ训臣袂苣낂菣뎂菣릂迥誂뻨뾁臣몈뿦袏臣뮘껥ꞁ臣讂雧ꎂ臣뮲駧誸臣ꚇ뷧ꮁ臣ꎁ臣覜铧ꞁ臣讂臣龜뻥閁苣讂胣㲂牢ਾ볯隼苣Ꞃ菣閃苣벃菣莃菣ꮁ臣蒁臣膀苣莃苣ꒂ臣貂苣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣鶈鳦ꦃ菣袃裥隌黥ꢪꃦ训臣ꂊ臣覂苣膀臣鞁臣肸駦ꒂ菣궂菣馃菣袃臣貂苣芀臣蒁臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣誏臣讼볯銈苣뎃苣ꖃ菣뎃苣ꮐ苣낖껩ꪁ鿥난臣Ꚃ苣ꮃ臣ꂊ臣覂苣讂胣鶁臣貾胣ꚩ雦릟鳥꾁胣ꢪꃦ训臣袂苣낂菣뎂菣릂迥꾁볯ꚼ볯随苣벾臣銂룦骮臣讂臣膂臣ꎛꛨ閁苣讂胣ꒂ苣ꖃ菣뎃臣膀ꫩ베귧ꮁ苣讂苣ꮃ苣벃苣袏臣ꚼ볯ꆼ迥誂뻨뾁苣몈뿦鞁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣ꮐ臣ꪁ臣ꒂ菣랂菣ꪃ菣銂郥肂鿥난苣膀駩Ꞁ臣몟뫦뎂菣袃菣벃菣誏臣릂苣벃菣뎃苣뚈駩ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣ꚩ꣩閁苣讂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁苣ꮃ苣벃苣袏臣ꚼ볯ꆼ迥誂뻨뾁苣몈뿦隈臣꾁飩뎮臣龁ꃥ袐胣ꒂ菣랂菣ꪃ菣꺁苣뎃菣궃菣ꮃ苣誂볯躼볯趀苣誂ꯩ蒁迥꾁볯躼볯趀苣誂뷤蒁臣膀뗧鲞臣붙胦ꢁ꣨늌臣貂苣芀戼㹲㰊牢ਾ믤许臣ꚩ꣩낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ苣ꮃ苣벃苣誏臣込迥꾁볯ꆼ볯꺁迥誂뻨뾁臣몈뿦ꒉ迥꾁飩뎮觥ꢁ臣ꚁ駩Ꞁ臣芁臣龁볯낼볯꾼볯颼볯膀볯늼볯銼볯邼胣낼볯꾼볯邼볯鎼胣낼볯꾼볯隼볯膀볯늼볯醼볯銼胣낼볯꾼볯邼볯颼迥뎁볯늼볯醼볯鎼볯芀戼㹲邀볯閼볯馼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯馼볯莿蟨낖铧邅苨Ꞥ臣몈뿦袼苣莃苣ꒂ볯覼戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁雦龔藥莿蟨꺁苨Ꞥ苣몈뿦馁苣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣붃諥銂룦骮臣讂苣蚁臣궨꣨閁苣ꚁ臣讂胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣붙胦ꢁꧨꆾ臣貂臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀꣧薀臣莿蟨龩菨趸藥뺖苦꺁닦芙룤꺁蟥꺽臣ꢁ臣ꚁ鳦ꢔ臣芁苣ꢁ鳦薾臣貂苣芀戼㹲醼韦ꊽ臣ꢼ뷯銽뷯膽뷯₎볯邽뷯膽뷯閽뷯₅볯膽뷯貽뷯馽菣莃菣讁苣训듧麃苣鞾臣芀듧麃볯鞼볯閼뷯醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲔猯灵込뷯貽臣醼볯邼볎뷯膀ꇨ薸볯邼볯醼볯膀雦龁臣颍鯩覼苣꒼볯ꖼ볯込볯醼볯讼볯薼볯ꎼ볯ꞁ뫤膂苣벃菣鞁臣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃臣醼韦꺛臣뮷諥馁苣芀ꧨ鎨볯늼볯鶃菣骃菣膃菣袏臣邈闩릟鳥꺁臣袼단꺁꿥ꞅ볯袼볯邼볎뷯込苣Ꞃ菣覼苣ꮐ苣ꚩ꣩ꚩ雦銂볯ꖗ鯧ꮁ苣Ꞃ菣ꮁ鯧ꖎ럦ꂊ臣讂胣ꒁ臣ꞁ胣낼볯ꚼ볯銼볯캐貽볯Ꚃ苣ꮃ볯銂볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲖猯���궼臣肜뗧莿뫥뺁臣銼韦꺛臣뮷諥馁苣芀臣蒁臣膀듧麃苣钼韦꺛臣鎟觨鞁胣閼韦꺛臣隦ꛨ蒚臣릂苣ꊂ苣ꒁ臣膀단꺁꿥ꞅ臣钯볨鞁臣떂苣몂臣鞢諥貁臣蒁듧麃苣릂苣ꊂ臣邼볯邼臣鞁胣ꂲ臣뺯藧ꢁ꿦莼臣ꚁ苣ꒂ苣貁냥讁苣궸꣧ꚺꋥꂊ臣ꚁ臣讂듧麃苣醼볯邼臣鞁胣ꂲ臣뺯藧ꢁ꿦莼臣ꚁ苣ꒂ苣貁ꓥ趁臣鞢諥鞁臣蒁苣내菨銂볯躼볯꺁苣뎂苣ꢁ臣讂胣鎁臣ꊂ菣뮂苣꺁駩Ꞁ臣膀苣뎂苣貁볯躼볯袏臣鶁苣ꖻ룤ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ믤许臣ꚩ꣩낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ駩Ꞁ臣芁臣龁볯낼볯꾼볯馼볯膀볯늼볯銼볯邼胣낼볯꾼볯銼볯誏臣낼볯꾼볯馼볯芀戼㹲邀볯閼볯邼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯邼볯ꚼ볯膽臣袂苣颪냥閁苣龁뿥鎇雦龔藥ꖂꓥ꺁뿤늀볯ꊂ菣뮂苣鎼볯覼胣鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁雦龔藥莿蟨꺁苨Ꞥ苣몈뿦馁苣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣붃諥銂룦骮臣讂苣蚁臣궨꣨閁苣ꚁ臣讂胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣붙胦ꢁꧨꆾ臣貂臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀꣧薀臣莿蟨龩菨趸藥뺖苦꺁닦芙룤꺁蟥꺽臣ꢁ臣ꚁ鳦ꢔ臣芁苣ꢁ鳦薾臣貂苣芀戼㹲醼韦ꊽ臣ꢼ뷯銽뷯膽뷯₎볯邽뷯膽뷯閽뷯₅볯膽뷯貽뷯馽菣莃菣讁苣训듧麃苣鞾臣芀듧麃볯鞼볯閼뷯醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲔猯灵込뷯貽臣醼볯邼볎뷯膀ꇨ薸볯邼볯醼볯膀雦龁臣颍鯩覼苣꒼볯ꖼ볯込볯醼볯ₒ볯钼볯ꚼ볯뎼臣袺苣뎂菣袃臣龁볯隼苣Ꞃ菣鞃菣벃菣ꮁ볯ꖗ鯧ꮁ럦ꂊ臣讂胣ꚩ꣩낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃볯銼볯캐貽볯Ꚃ苣ꮃ볯銂郥覜臣讂ꧨ鎨ꧨ首苣醼韦꺛臣Ꚃ苣ꮃ臣뒛軦뮷諥馁苣芀곦蒁臣銼韦貾臣낼볯ꚼ볯銼볯캐貽볯Ꚃ苣ꮃ볯銂鳦芵뿦ꚺ볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲖猯灵궼臣뮷諥馁苣芀곦蒁臣내菨銂볯ꖗ鯧ꮁ鿦늉臣膀볯ꖗ鯧ꮁ苣뎂苣銂臣醁苣芀ꛨ骦髧릂苣ꊂ臣내菨떂苣몂臣몟臣趁胣趃苣蚃苣隃꿥ꞅ臣钯볨鞁臣떂苣몂臣鞢諥銂ꓧ閁臣蒁듧麃苣邼볯邼臣릂苣ꊂ믤醁臣膀菣겂菣ꎂ菣뺯藧ꮁ꿦莼臣ꚁ苣ꒂ苣꺁냥讁苣궸꣧ꚺ臣鞢諥銂ꓧ馁듧麃苣醼볯邼臣릂苣ꊂ믤醁臣膀菣겂菣ꎂ菣뺯藧ꮁ꿦莼臣ꚁ苣ꒂ苣꺁ꓥ趁臣鞢諥銂ꓧ馁듧麃苣銼볯邼臣릂苣ꊂ믤醁臣讂胣醼볯邼迥꾁臣貂믤誸臣릂苣ꊂ苣鶃苣蚃苣隃臣莀臣讂胣㲂牢ਾ苣莃苣ꒂ迥鲿臣ꎼ뷯莿뫥貁蟩膦臣芁苣龁苣낼볯뎼臣ꮐ鳦鞁臣蒁胣鞃菣벃菣꾁볯궼볯궼볯ꚼ볯銼讼볯薼볯ꎼ볯袼볯邼볯캐貽볯Ꚃ苣ꮃ볯ꞁ苣벃菣鞁臣芀苣莃苣ꒂꫥ鎽臣ꖻ룤銂郥肂볯꒼볯ꖼ볯込볯醼볯袼볯躼볯钼뷯趽臣趇苧뢅ꇥ銂郥肂���膀볯邼볎뷯込뷯貽臣袃菣뎃苣閃苣ꪃ菣膀볯캑螽볯趽뷯꺁苣뎃苣ꖃ菣뎃胣醼볎뷯込뷯貽臣ꊂ菣궃菣讃菣膀볯趽뷯辽뷯込볯꺁苣ꮃ苣龃菣膀볯邼볯떼볯趽뷯꺁菣讃苣ꪃ菣Ꞽ胣醼볯邼볎뷯込뷯貽臣릂菣것菣袃菣ꒂ苣뎃胣麃菣讃菣벃菣袼볯薼볯銂郥肂苣뎃菣꾂돨邃菣閃苣벃臣醼볯醼볯袼볯躼볯薼볯誏臣醼볯醼볯邼볯邼볯邼볯薼볯ꞁ臣鶃苣蚃苣隃苣낂菣ꮃ볯릂苣ꊂ볯躼볯覼苣躸臣龁臣膀볯込볯邼볯邼볯邼볯邼볯钼볯覼臣꾁룤袁臣讁臣龁胣鎾臣ꚁ胣麃菣讃菣벃菣銂郥肂ꧨ鎨ꧨ首菣莃菣ꆂ菣꾁껥財臣ꪁ臣ꎁ臣芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣붙胦ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯醼볯閼胣邀볯閼볯醼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯醼볯ꊃ菣ꊃ菣袃ꇨꆮ볦ꦴ볯ꊂ菣뮂苣鎼볯誏臣閼볯覼戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁鳦몙飦꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁ꇨꆮ胩躁胦銂ꫨ躰臣讂菨鮊苣몤臣讁臣蚁臣銂뇦骮臣讂臣膂臣节臣ꞁ臣讂胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣붙胦ꢁꧨꆾ臣貂臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀뻤袁臣ꖂꓥ鞁臣肱触超雧뮳듧麃뗦꒽臣覂臦떁苣鞏臣讂諧讅苣ꮐ苣ꖂꓥ股껧辀臩Ꞁ戼㹲ꮁ苣ꎁ臣誛苣鞏臣讂諧讅臣뮲駧誸臣ꚇ뷧ꮁ臣ꎁ臣覜铧ꞁ臣讂臣龜뻥閁苣讂胣㲂牢ਾ볯閼볯螽迥꾁臣貂믤誸臣ꆄ꿦ꊃ菣ꊃ菣袃臣놂苣龃菣袼볯邼裢颼볯趽뷯込뷯螽볯ꢁ볯趽뷯込뷯螽臣궂苣ꦃ苣뎃苣训苨薆諦躸臣ꚁ뫩钅苣讁臣讂胣낼볯꾼볯邼볯鶃菣骃菣膃菣袏臣ꚩ꣩鶃菣骃菣膃菣銂郥뺁臣蒁铧蚐럧鶡뛦銂郥肂ꧨ鎨ꧨ首苣膀돦蒰菩趽뷥龁苣醼볯邼볎뷯ꞁꧨ鎨该ꦉ臣貃臣꺚蛨ꮁ髧薆돦蒰臣讂胣開觧鎽臣誂臣袂臣醼볯銈볯钼臣ꢳ냥ꢃ뷤貁臣ꎁ臣芀臣蒁臣醼뷯貽臣ꢂ菣뎃苣隃菣벃鿦首볯낼볯뎼룤醼볯覼苣莿蟨薆돦蒰臣讂胣隌郥ꦉ臣뺯臣讂髧骆ꇨꆮ胩躁胦鲿귧袼臣ꪁ苣ꆁ胣ꢳ냥ꢃ뷤꺁雦릂볯ꮁ臣蒁臣膀ꧨ鎨该ꦉ臣閊룤醼迥뎁볯芙雩貾臣ꢳ냥ꢃ뷤讁苣꺁鷩늉臣込蟥꺁鯧蒾볯趽뷯覼苣겸껥馁苣鎁臣ꞁꛨ骦臣袂苣릂苣ꊂ苣ꒁ臣讂胣ꢳ냥ꢃ뷤꺁鷩閁臣趽뷯뒛뻥銂ꛨ龯臣膀ꇨꆮ볦몇臣趇韧ꚺ臣놅臣風賩馁苣芀냥ꪁ臣ꢁ苣閼뷯趽臣뒛뻥꺁雦릂臣膀닧붣苣뎃菣꾂돨銂ꧨ鎨臣讂ꃥ袐臣ꊂ菣뮂苣ꞁ臣붙胦ꞁ臣讂臣莀臣覂苣膀ꇨꆮ볦몇迥꾁胩躁胦銂ꫨ躰臣讂菨鮊苣몤臣ꚁ臣讂胣鞼뷯趽臣뒛뻥袂苣Ꞥ臣ꪁ뿥钭臣膀鷦뚻믤醁苣貂臣릟鳥ꚩ雦ꮁ꿥鞁臣붙胦ꞁ臣讂臣莀臣覂苣讂胣邼볯醼볎뷯込볯邼볯캐貽臣銃菣뚼볯Ꞽ볯貁귦꺁꿥ꞅ臣鞁臣뾽铧閁���膀볯閼裢銼볯趽뷯뒛뻥꺁뿥钭苣颪냥鞁臣芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣붙胦ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯銼볯邼胣㲂牢ਾ胣邼볯鞼볯醀戼㹲龮雦设볯銼볯骼髧骆ꇨꆮ胩躁胦ꊂ菣뮂苣袼苣莃苣ꒂ볯钼볯㲉牢ਾ臣꺁苣莃苣ꒂ臣膀鳦몙飦꺁臣讂菣ꪃ菣鞃菣覃臣超雧뮳苣몈뿦鞁胣몓매麡臣ꢳ냥꺁菩趽臣꺁跥뢠郧膀ꗥ뢅郧誏臣낼볯꺼뗦꒽苣颪냥馁苣鎁臣ꮁ苣讂苧螗苣颪냥馁苣鎁臣銂ꓧ馁胣超雧鲿귧銂裥肿臣讂賥袐觧꾁胣超雧鲿귧貁鳦誛臣芁苣뒠郥ꮁ臣뮲駧蒚臣覜铧ꞁ臣讂胣鎁臣꺚蛨股껧辀臩Ꞁ苣莃苣ꒂ臣貼믤许臣袂臣ꮁ臣鎁臣辂苣讂胣鎼볯邼뷯袏臣鶁苣ꖻ룤꺁蓧鮯菣ꮃ菣莃菣ꮁ苣뾂菣뎃볯鞼볯銈볯邼뷯螽볯讽뷯覼臣閼뷯螽볯讽뷯꺁苣랂菣뢂菣銂귧覂蛥閊룤鞁臣뮺藩銂臣醁苣袼볯궼볯芀鳦몙飦꺁닧붣菣ꪃ菣鞃菣覃迥꾁鷦뚻믤ꚩ꣩ꚩ雦銂胣ꢳ냥ꢃ뷤鎽臣誂볯邼볯캐貽臣ꚩ꣩開觧꺁菨꺁髧骆臣꺚蛥ꢳ냥馁苣芀该ꦉ뷥龁苣誁苣鶁볯邼裢鎼볯膀ꗥ뺁臣辁臣醼볯銈볯钼臣ꢳ냥ꢃ뷤銂鳦馁苣꾏菨Ꞁ臣芁苣芀臣蒁臣醼볎뷯꺁苣邃菣릂菣ꮃ菣鎟雦袼볯薼臣ꦷꇨ隌臣貂臣龔郧蒚ꏩꦡ냦覼苣莿蟨薆돦蒰臣讂胣鶁臣ꚁ胣ꢳ냥ꢃ뷤꺁雦릂苣ꢳ냥貾볯誏臣隼駦鎖뻥ꮁ룦骮臣讂볯趽뷯뒛뻥覼胣開觧꾁胣ꢳ냥讁苣隼駦鎖뻥ꮁ諧늉臣ꪁ臣龁胣蒐胣꺁髧骆돦蒰菩趽臣膀铧鲤臣貂臣鮃菣麃菣뎃臣몛껥閁苣讂胣鶁臣ꚁ胣鎁臣꺚蛨꾁胣蒵맧薗郧ꚭ髧閩뻤꺁臣膂臣뾪闦閁苣讂胣蒐胣꺁菩趽臣膀髧骆臣꺁苧螗듧麃맦꒽臣龁苣ꮁꧨꆾ臣貂苣芀迥隦髧ꪁ苧螗듧麃맦꒽臣ꢃ뷤꾁胣붙胦ꢁ苣뎂苣閁苣讂胣躂韧내菨꾁胣붥룤莐胣붥藩莐胣颍ꃦ莐迥꾁菣뎃菣Ꞁ臣芁苣꾏菨Ꞁ臣芁苣芀냥ꪁ臣ꢁ苣膀돦蒰菩趽臣肜냥股껧ꢑ鯥뾹뷦ꦉ臣붙胦ꢁ苣뎂苣閁苣膀돦蒰臣ꢃ뷤꺁맦꒽觧ꞁ臣蒁苣꺁臣膀駩Ꞁ臣릂苣ꊂ臣貂苣芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣붙胦ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯銼볯邼胣낼볯꾼볯隼볯誏臣낼볯꾼볯邼볯醼胣㲂牢ਾ胣邼볯鞼볯醀戼㹲龮雦设볯銼볯骼髧ꪳ胦讃菣벃菣뎃臣꺁뷯銈뷯辽뷯꺁ꫨ躰볯ꊂ菣뮂苣颼볯覼戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣꺚돨Ꞁ菣ꖃ菣궃菣ꞁ臣莽裢蚽뷯鎽苣颪냥馁苣붃諥銂ꓧ馁臣ꦁ臣讁苣겸껥馁苣龁苣ꮁ꣨袨臣貂臣蒁苣芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ駩Ꞁ臣閩뻤閁苣龁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꾁胣麥뗧뮳雧ꎂ臣뮲駧誸臣ꚇ뷧誏臣讃菣벃菣뎃ꋥ隮臣���鯧ꞁ臣讂郦랂臣ꢁ臣ꚁ鳦ꢔ臣芁苣ꢁ鳦薾臣貂苣芀戼㹲꺚돨Ꞁ菣ꖃ菣궃菣꾁胣蚈鯩閁苣ꚁ볯隼苣Ꞃ菣鞃菣벃菣꺁볯Ꚃ苣ꮃ뷥龁苣醼볯貼볯邼볯내菨ꞁ裦랕鿥난臣鞃菣벃菣閁苣讂胣銼듧麃裥芣臣貾胣내菨꾁볯邼裥鎖臣ꆸ苣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣ꚇ郧閁苣讂臣膀뷤节蟥蚐臣貂臣蒁볯ꂲ臣뺯藧覼胣ꆬ臣膀듧麃臣閼裥鎖臣ꆸ苣랆菣뾂菣벃菣ꞁ鯥骮賥閁苣膀菣뎃藩隌볯늼볯ꊼ苣馨髧ꢁ臣讂諦鎽臣袂臣ꚁ鿦늉臣貂苣芀臣鞁臣膀뷯늼볯ꆼ菣馃菣貁賥ꚭ駧覅苣뾽铧鞁臣鞮껥閁苣讂胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣醁苣붙胦꾁胣ꂲ臣뺯藧ꢁ꿦莼臣ꚁ뷯銈뷯辽뷯꺁菣莃苣벃苣貁냥ꪁ臣ꢁ苣銼胥꺁ꋥꂊ臣ꪁ臣龁藥ꚁ臣ꂛ귥ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ믤许臣ꚩ꣩鶃菣骃菣膃菣貁胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ菣뢂菣ꎂ菣ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯銼볯邼胣㲂牢ਾ胣邼볯鞼볯醀戼㹲龮雦设볯銼볯骼菣Ꚃ苣躅菣떂菣꺂苣ꂃ듧麃ꋥ隮苣莃苣ꒂ볯ꊂ菣뮂苣馼볯覼戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣鎼볯꾁胣겜駧躘臣芁苣骃菣膃菣貁胣몓매麡臣躅菣떂菣꺂苣ꂃ듧麃臣鞢껦銂ꫨ躰臣讂苣蚁臣鲽铧鞁胣鶁苣薕臣邃菣겂菣薗迥꾁苣Ꞃ菣뎃菣ꒂ菣銈菣躃菣鮃듧醖韧膀苣ꪃ苣莃苣薗胣놖雧뚊髧骆苧袏臣꾂菣벃菣薗臣ꊖ胩馁苣隻臣躅髩뎮臣袂臣ꪁ菣떂菣꺂苣ꂃ듧麃臣龩菨躽룤ꢁ雩ꎀ臣讂藨뺖苦꺁닦芙臣覜铧ꞁ臣讂胣鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁믤许臣袂臣ꮁ臣鎁臣辂苣讂胣醼韦꺛胣麃苣릂藨ꆃ苣뎃苣Ꚃ菣내菨銂胣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃룤꺁裦랕鿥난볯肃菣馃菣뎂臣릔ꓥꒂ菣낂菣릟鳥誏臣较菣ꚼ볯銼鿥난臣鎼볯醼럦袐胣馼볯薼苣랂菨邅ꇨ薸胣閼볯醼볯趽볯₭볯ꖼ볯ꖼ볯鲣藥覼臣鞃菣벃菣鞁胣肸駦龔苨閁臣讂胣銼韦꺛臣꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣ꆄꇨ薸鿥난臣貺臣꺁뿦ꚺ볯醼볯誏臣閼볯覼臣貸蟩鞁胣내菨뢁럦ꂊ臣讂胣뺯藧ꚩ雦꾁蓧股룦릟鳥ꞁ臣讂胣钼韦꺛臣꾁胣銼볯캐貽臣ꎼ뷯貽뷯₌볯覽뷯薽뷯ₒ볯隼ꆼ뷯閽뷯辽뷯鎽辽뷯薽鎽뷯貽뷯钽뷯辽뷯₎뷯薽뷯螽뷯躽뷯袼볯銽뷯螽뷯趽뷯覼苣蒐胣꺁苣Ꞃ菣뢁럦ꂊ臣膀꿦覅裥邞迥鲿苣銼駦鎖臣ꆸ苣馶뛧閁臣讂胣鶁臣ꚁ胣뢐藥ꚺ苣钼볯邼뷯趽臣겸껥鞁臣芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣讂駩Ꞁ臣膀냥ꪁ臣ꢁ苣뺯藧ꚩ雦꺁ꓧꚺ苣誂苣醼볯薼룤꺁郥覅뫥몤뫥銂룤袁苣ꢅ臣꺁苣꺁臣芁苣芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀臣꺁苣莃苣ꒂ臣鶃苣蚃苣隃臣芁臣龁볯낼볯꾼볯邼볯膀볯늼볯鎼볯鎼胣낼볯꾼볯鎼볯膀볯늼볯閼볯钼胣낼볯꾼볯隼볯誏臣낼볯꾼볯邼볯醼胣㲂���ਾ胣邼볯鞼볯醀戼㹲龮雦设볯銼볯骼釥꺚듧麃뷯銈뷯辽뷯颪냥袼苣莃苣ꒂ볯鎼볯㲉牢ਾ臣꺁苣莃苣ꒂ臣膀鳦몙飦꺁触骮臣鶃菣骃菣膃菣貁釥꺚듧麃臣誁臣讂뷯銈뷯辽뷯꺁駧뺏苣颪駧馁苣袂臣ꮁ뷤ꢔ臣膀苣ꎁ臣릉껥꺁꣧麡臣ꢑ髧내菨邵郥ꮅ飧꺁꣨궖铧麃菣ꮂ菣ꢁ臣ꚁ鳦ꢔ臣芁苣낁臣誂臣ꪁ臣膀釥꺚듧麃뗧袐藨趘臣뮲駧蒚蟥꺽臣覜铧ꞁ臣讂臣袺鳦閁苣讂苣뎃苣뒂菣릂菣銂铧颁臣鞁苣讂臣ꢁ苣몤臣芀觧ꮁ볯ꖗ鯧ꮁ胣ꢑ髧내菨銂볯ꖼ볯₣볯薽뷯袽뷯辽뷯辽뷯覽뷯鎽臣覂뻥膀볯趽뷯꺁鿥난믤隤苣閃菣릂苣讁苣随苣몇臣芀볯ꖗ鯧ꮁ釥꺚듧麃苣袃菣鞃苣뎃賥鞁胣鞴뗦鞁胣릂菣뎃臣鮁胣ꒁ臣ꞁ볯隼苣Ꞃ菣鞃菣벃菣ꮁ鋨辁胣鞼韦꺛臣릟鳥銂迥誂蟥鞁胣ꢑ髧내菨銂볯邼볯캐貽臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃菣릂菣ꢔꧨ首迥뎁꿥ꞅ뷤袼귦꺁꿥ꞅ뷤鶼볯ꖼ볯讼볯薼ꇨ薸볯込裢閼볯邼뷯螽볯趽뷯꺁볯꒼볯ꚼ볯ꂲ臣뺯藧鎽볯鞃菣蚃苣뎃볯銼볯ꞁ蟥蚐臣讂胣螤ꏨ銂맥螝臣膀볯꒼볯ꎼ볯銂뇦骮臣讂胣趛藥ꮃ菣趃苣뎃苣颍뷤袼볯겼볯覼藧ꚺ꣨ꪃ菣螃苣뎃苣邃菣릂ꃩꚺ臣袂苣몤臣貂臣鞃菣蚃苣뎃볯銼胥銂뛨袁苣颊苣뎕臣鞢諥袼菣莃菣ꆂ菣뺯藧覼苣銃苣袃苣ꦃ菣誸臣鞃菣莃菣鞁胣誸꣨꺁菣궃菣ꒂ菣鎼볯ꒀ苣銼胥誶臣讂臣膀苣莃苣ꒂ臣ꒁ臣ꚁ菣뢂菣ꎂ菣ꞁ臣讂臣莀臣覂苣讂胣ꆼ볯림菣袃菣莃苣릂볯邈闩릟鳥鶼뷤낂菣뎂菣릂볯궼볯궼볯銼볯薼볯ꊼ볯讼볯颽菣뎃苣袃菣莃菣袼뷯薽뷯₎뷯钽뷯薽뷯覼볯醼볯閃菣꺂苣뎃볯蚽뷯躽뷯覽뷯辽뷯薽볯芀苣莃苣ꒂ铧릟鳥鶼뷤낂菣뎂菣릂볯궼볯궼볯閼볯ꚼ볯뎼胣㲂牢ਾ믤许臣ꚩ꣩鶃菣骃菣膃菣貁臣꺁苣莃苣ꒂ臣鶃苣蚃苣隃臣芁臣龁볯낼볯꾼볯邼볯芀戼㹲邀볯閼볯隼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯隼볯龻ꫩ내菨趆裥隌苣莃苣ꒂ볯ꊂ菣뮂苣醼볯邼볯㲉牢ਾ臣꺁苣莃苣ꒂ臣膀鳦몙飦꺁臣讂菣鞃菣覃臣龻ꫩ내菨꺁蛥蚈賥銂ꫨ躰臣膀臣貂闦ꮁ뻤袁臣膀苣鶃菣蒃若뎮迥뎁雩肯苧ꪁ臣꺁꣧薀臣ꢪ迥뎁볯袏臣龻ꫩ蒵맧뺖苦꺁닦芙臣覜铧ꞁ臣讂臣龜뻥閁苣讂臣ꢁ苣몤臣芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣膀믤许臣袂臣ꮁ臣鎁臣辂苣讂胣隃苣龻ꫩ내菨銂胣钼裢隼菣袜臣뒹闩貛菣뾂臣궸触螌꿧ꊖ꿧꺁雩肯믨ꢪ苣誂룤ꦙ臣ꆸ苣뎂菣늂菣벃苣袶賥ꮁ苣ꎁ臣颍鯩馁苣芀臣鞁臣膀跥ꊛ臣貂臣내菨銂胣醼볯薼볯ꊼ볯誏臣钼볎뷯込뷯貽苣뎃苣麃苣랂菣銂郥肂菣ꂃ볯銈볯銼臣銼볯貼볯邼볯내菨込뷯趽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹰臣���郥ꞁ軦꺨臣讂胣릟鳥꾁胣鎼韦钁臣ꮁ迦袁苣貂胣鶁臣ꚁ듧麃苣股룦銂郥뺁臣蒁볯邼볯캐貽臣貐臣릟鳥뢁볯貼볯邼볯내菨込苣Ꞃ菣ꢁ臣讂苣蚁볯隼苣Ꞃ菣鞃菣벃菣뢁軦꺨臣膀볯邼볯캐貽臣ꚩ꣩낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃胣閼뷯궼苣뾂苣궃苣鶃菣뎃볯ꎭ臣뺯藧覼迥꾁鿥난臣뾁볯ꂲ臣뺯藧覼苣뮷諥鞁臣肜뗧릮蟩銂볯邼볯캐貽볯Ꚃ苣ꮃ臣馁苣芀볯ꖗ雩꺁苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣貾胣蒐苣Ꞃ菣꺁蛥龜苣꺒苣膀믨ꢪ듧麃臣蚈賥떮髩銂룦骮臣讂胣龻ꫩ내菨꺁蛥蚈賥貁단꺁꿥ꞅ苣誂苣ꎭ臣뺯藧뢁볤ꚁ臣讂ꃥ袐臣꾁胣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣붙胦꺁뗧鲞臣龔臣龁臣鞁臣芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨菣ꪃ菣鞃菣覃臣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ菣뢂菣ꎂ菣ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯銼볯邼胣낼볯꾼볯颼볯膀볯늼볯鎼볯鞼胣낼볯꾼볯銼볯膀볯늼볯鎼볯銼胣낼볯꾼볯隼볯膀볯늼볯閼볯醼胣낼볯꾼볯邼볯鎼胣낼볯꾼볯隼볯膀볯늼볯鞼볯鎼胣낼볯꾼볯邼볯鞼胣낼볯꾼볯馼볯膀볯늼볯鞼볯颼胣낼볯꾼볯邼볯颼胣낼볯꾼볯邼볯閼胣낼볯꾼볯銼볯膀迥뎁볯늼볯醼볯鎼볯芀戼㹲邀볯閼볯鞼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯鞼볯꒵諨莐듧麃돧ꮁ臣醁苣躃藥颃菣낂菣鎃菣颪駧袼苣莃苣ꒂ볯邼볯覼戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁胣邈뫤꺁菣ꊃ苣궃菣뎃臣覂뗨붊郧내菨뮳臣誁臣讂菨邅菣ꊃ苣궃菣뎃臣꺁裥뾛苣颪駧馁苣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁菨鮊苣릂苣ꪃ菣讃菣낂臣讂臣ꮁ鳦ꢔ臣芁苣芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁꧨ鎨臣讂裥邭臣鶃苣蚃苣隃臣芁苣ꢁ胣꺨胣꺁苣ꦃ苣龃苣覭臣膀ꓥ颧臣몓매麡菣ꊃ苣궃菣뎃雩ꎀ雧ꎂ苣뮲駧蒚臣ꚇ뷧馁苣꺁臣覜铧ꞁ臣讂臣ꢁ臣龜뻥閁苣讂胣鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁믤许臣袂臣ꮁ臣ꚁꇨ辂苣讂胣꒵諨莐듧麃苣馨뫦蒚裦랕鿥난臣誁臣ꚁ胣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣ꦂ菣麃菣袃臣醼볯邼볯내菨込苣Ꞃ菣ꞁ鋨辁胣邼볯銼볯袏臣銼볯꺁뿦ꚺ臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣邈闩릟鳥ꮁ럦ꂊ臣膀듧麃苣鎼볯莄臣閼韦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀귦꺁꿥ꞅ뷤ꢁ臣ꚁ胣내菨銂볯邼볯캐궼臣颃菣뎃臣ꚇ郧鞁胣ꂲ臣뺯藧鎽臣鞁臣膀듧麃苣ꚇ郧鞁臣蒁胣閼韦貾胣내菨뚺꟨ꦉ苣뾪ꏨ鞁胣겂菣麃苣궃菣ꪃ菣꺁駧뺏臣ꒁ臣ꚁ裥邞臣讂볯躃藥ꢔ菣벃苣벃볯芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ菣뢂菣ꎂ菣ꢁ臣膀苣뎃菣낂菣隃菣뎃菣馃菣貁단꺁꿥ꞅ뷤꺁냥ꪁ臣ꢁ苣銼胥ꞁ臣讂臣ꢁ臣芁苣芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨菣ꪃ菣鞃菣覃臣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ菣뢂菣ꎂ菣ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯銼볯鞼胣낼볯꾼볯颼볯膀볯늼볯鎼볯銼胣낼볯꾼볯銼볯膀볯���볯颼볯隼胣낼볯꾼볯醼볯钼胣낼볯꾼볯銼볯誏臣낼볯꾼볯邼볯醼胣㲂牢ਾ胣邼볯鞼볯醀戼㹲龮雦设볯銼볯骼蛨鎇닎듧麃觥蚧뷤꺁ꋥ隮臣颪냥袼苣莃苣ꒂ볯醼볯覼戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁胣겜駧躘臣芁苣骃菣膃菣貁蛨鎇닎듧麃觥蚧뷤꺁ꋥ隮苣颪냥鞁胣鶁苣薕臣隳냥薗苣ꮐ苣몓매麡臣誁臣讂꣧薀臣ꒂ菣랂菣ꪃ菣ꂬ매뚊藦꺁닦芙臣覜铧ꞁ臣讂臣龜뻥閁苣讂臣ꢁ苣몤臣芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣膀믤许臣袂臣ꮁ臣鎁臣辂苣龁胣鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁胣麃苣릂菨邅蛨鎇듧麃臣肸곦릟ꓩ銂뷤ꢔ臣膀룤ꆬ꣨겸臣膀닎듧麃觥蚧뷤袏臣邈蛧캟내菨꺁臣骁苣讁苣몤臣麃菣ꮂ菣꺁駧뺏臣覤賥ꞁ臣讂胣麃菣ꮂ菣몙迧꾁胣龮駦鎖闦辇賥낼볯늼볯늼볯銈볯ꎼ볯膀뷯薽뷯貽钽뷯趽뷯₅뷯閽뷯钽뷯钽뷯钽뷯隽뷯₅볯ꎼ볯覼臣袂臣ꚁ룦骮臣讂볯閩뻤閁苣讂菣벃苣벃臣膀볯蒽뷯醼臣벑臣貂苣ꊻ蛥ꂛ귥ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ蛨鎇臣膀볯醼볯骃볯ꎼ볯醼菣Ꚃ苣覼臣覂꟨隉臣貂臣芀臣鞁臣膀蛨鎇臣ꚼ볯銼볯꒼볯ꖼ볯궸臣뎂菣늂菣벃苣込菣릂菣벃苣袼뷯覽뷯邽뷯鎽뷯覼臣鎼볯莄胣钼볯銈볯邼裥ꞁ뛦隌臣貂臣袼苣ꦃ苣誃菣벂볯螃苣醃菣벂볯蒽뷯鎽뷯膽뷯薽볯膀볯躼볯鞼뷯螽볯趽뷯膀臣벃菣뎃苣벃菣뎃菣ꒂ菣膀볯醼볯馼볯醼볯鎼볯芀곦ꮁ胣袶賥ꦉ苣覭蟩꺁볯薼볯뎼볯ꮁ苣ꎁ臣궸鋥鞁胣내菨銂胣肸뫥膀볯낼볯ꦼ볯隼볯邼臣鞴뗦馁苣芀곧醼韦꺛胣내菨銂볯銼苣Ꞃ菣꺁뗧钹鿥誤菣것菣袃볯낼볯뎼룤꺁볯邼볎뷯込뷯貽臣ꦃ菣讃菣膀臣벃菣뎃苣벃菣뎃菣ꒂ菣膀볯醼볯钼볯醼볯ꮁ苣ꎁ臣貼觥ꮢꛨ閁苣龁볯뢁軦꺨臣讂胣醼裢銼臣骃臣覂臣떆蟨꺁듧麃苣肸臣꺁苣Ꞃ菣ꮁ裥莸臣鮁苣芀臣꺁룤ꆬ鿥誤臣몂臣릟鳥꾁胣醼볯ꚼ볯醼볯钼볯ꞁ臣讂胣견볯ꖗ鯧ꮁ臣膀鿥난苣随苣꒙臣膀볯낼볯ꦼ볯醼볯钼볯ꮁ苣ꎁ臣颻鷧내菨銂듦蒵臣讂胣ꚩ꣩閁苣讂苣뎃菣꾂돨ꮁ諥袁臣膀볯趽뷯꺁鳦辰鿥난苣뮷諥馁苣芀곧钼韦꺛臣꾁胣릟鳥銂迥誂駩趁胣내菨袂苣늼볯ꆼ苣뾪ꏨ鞁胣麃菣ꮂ菣몙迧銂껥낕駦鎖闦辇賥蚀믨馆볯ꎼ볯袼뷯薽뷯貽钽뷯趽뷯₅뷯閽뷯躽뷯覽뷯膽뷯覽뷯薽늼볯銈볯늼볯覼臣袂臣ꚁ裥邞臣讂胣뾂菣醃苣ꪳ臣膀雩ꎀ臣讂닎듧麃菣벃苣벃臣몙迧貁鳦ꚇ郧뺯藧ꮁ꿦莼臣ꚁꋥꂊ臣龁ꃥ袐胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣뮴胦貁臣讂苣꺁臣莀臣讂胣㲂牢ਾ볯钼볯込볯隼볯邼臣膀믤许臣节臣ꂊ臣龁볯낼볯ꦼ볯隼볯邼臣芁苣骼戼㹲낂菣벃菣ꆼ볯骼볯邼볯邼戼㹲낂菣벃菣ꊼ볯骼볯邼볯邼뗧���뾁迦袁菣袃苣뎃苣ꖃ菣뎃볯邼볎뷯込뷯貽戼㹲ꊂ菣궃菣讃菣袼볯邼볎뷯込뷯貽볯醼볯銼볯邼볯袼臣벃菣뎃苣벃菣뎃菣ꒂ菣莼볯颼볯閼볯銼볯㲉牢ਾ苣랂룤芞뷤붊蟥ꦉ볯ꊼ볯ꖼ볯隼볯캐螽볯趽뷯㲌牢ਾ苣뎃苣麃苣랂菣醼볯邼뷯螽볯趽뷯㲌牢ਾ苣ꮃ菣鞃볯骼볯醼볯趽뷯₌볯ꊼ볯궸볯㲉牢ਾ菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣뎃胣醼볯邼뷯螽볯랂苣麃胣뒼볯銼볯銼볯㲉牢ਾ룤꺚듧麃裦랕鯥邭胣醼볯邼볎뷯袼볯늼볯肀볯邼볯邼볯钼볯㲉牢ਾ菣ꪃ菣벃菣膃菣讃菣膀볯颽볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲖猯灵궼臣醼볯캐貽볯랂苣麃胣뒼볯閼볯隼볯㲉牢ਾ苣뾂菣벃菣ꊂ菣뎃胣醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢裢醼⼼畳㹰볯꺁볯邼볯캐貽볯랂苣麃ꖼ볯醼볯閼볯㲉牢ਾ菣릂菣ꢂ苣躃菣ꮃ苣龃菣膀볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲑猯灵궼臣醼볯邼볎뷯袼苣낂菣肀볯邼볯邼볯覼戼㹲뮂菣讃苣ꂃ胣钼볎뷯꺁볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲑猯灵궼臣醼볯邼볎뷯袼볯薽뷯膽뷯ₒ볯醼볯閼볯钼볯㲉牢ਾ苣ꮃ菣鞃볯骼볯醼볯趽뷯₌볯邼볯薼苣뾂菣벃菣궸볯㲉牢ਾ菣覃菣뎂菣膃苣뎃胣閼뷯醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢裢鎼⼼畳㹰볯袼苣낂菣₞볯ꢼ볯醼볯閼볯㲉牢ਾ菣궃苣Ꞃ苣蚃菣뎃胣醼뷯醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢裢鎼⼼畳㹰볯袼苣낂菣₞볯邼볯邼볯覼戼㹲閃苣ꮃ苣뎂菣뎃胣銼볯趽볯꺁볯邼볯캐貽볯ꮂ菣邃苣ꪂ苣ꂃ莼볯钼볯銼볯邼볯㲉牢ਾ鳦辰鿥난볯㲚牢ਾ볯낼볯ꦼ볯隼볯邼菣ꦃ苣袃菣뎃苣閃苣ꪃ菣袼볯邼볎뷯込뷯貽볯膀苣뎃苣ꖃ菣뎃볯醼볎뷯込뷯貽볯膀苣뎃苣麃苣랂菣袼볯邼볯躽뷯込뷯貽볯膀苣鞃菣膃菣뎃볯閼볯캐螽볯趽뷯覼迥뎁볯낼볯袼볯閼볎뷯込뷯貽볯芀戼㹲邙껥릟鳥骼戼㹲늼볯궼볯醼볯钼볯鞃菣릂菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣뎃볯醼볯캐螽볯趽뷯覼胣ꒂ菣랂菣ꪃ菣袼볯캑螽볯趽뷯覼胣늂菣뾂菣ꒂ苣뎃볯醼볯邼뷯螽볯趽뷯覼迥뎁苣鞃菣膃菣뎃볯閼볯캐螽볯趽뷯覼戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨菣ꪃ菣鞃菣覃臣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ菣뢂菣ꎂ菣ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯銼볯鞼迥뎁볯늼볯鞼볯醼胣㲂牢ਾ胣邼볯鞼볯醀戼㹲龮雦设볯銼볯骼럦袐菣뎃菣莐迥鲿볯궼볯늼볯ꊂ菣뮂苣ꮁ臣醁苣몈뿦Ꞁ듦Ꞁ볯ꊂ菣뮂苣銼볯覼戼㹲鎁臣龮雦设臣膀鳦몙飦꺁臣讂菣鞃菣覃臣膀裥肿臣貂臣뒼裢ꪃ菣醃郧꺁ꋥ隮臣몈뿦ꒉ臣鞁臣뮴胦ꞁ臣讂臣ꢁ苣몤臣芀菣뎃菣莐臣鞢껦銂裥肿臣讂賥袐觧꾁胣超雧鲿귧꺁ꋥ랼臣覜鯧ꪁ뒠郥膀닦芙髧ꮁ鳦誛臣覜铧ꞁ臣讂胣뮲駧ꒉ臣膀鳦몙飦꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꊂ菣뾂苣讃苣袃���ꊽ苣ꢁ苣膀뻤袁臣膀菣ꪃ菣鞃菣覃臣뺯臣讂菣Ꚃ苣銈菣袃苣ꆃ菣膀菣袃賥袏臣銃菣鞊뷤ꞁ臣讂胣鎁臣ꊂ菣뮂苣꺁鿥겜髧鞃菣袃苣벃菣꾁胣ꎼ뷯銽뷯薽뷯钽낼뷯辽뷯辽뷯辽뷯鎽覽뷯₎볯趽뷯閽뷯辽뷯辽뷯馽볯₌뷯躽뷯钽볯躼볯銼볯ꪼꖼꎼ뷯貽뷯螽뷯躽볯₌볯₡볯₭볯銽뷯覽뷯芽뷯薽뷯貼꒼ꢼ궼뷯銽뷯貽뷯薽뷯貼ꖼ궼뎼뷯薽뷯膽뷯袽볯₌볯₷볯钽뷯辽뷯薽뷯ꢷ볯₌鯥讫ꇨ龔ꃧ뚩触貼ꪼ뷯袽뷯₎볯覽뷯薽뷯ₙ볯膽뷯邽볯ₛ볯辽뷯鎽볯₌볯躽뷯讁苣몇觧ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣芀戼㹲閁苣ꮁ藥鎽髧ꮁ臣膀臣꺁苣莃苣ꒂ臣肸ꓥꊽ뻤ꞁ臣膀鳦ꊢꇨ늶跥뢠듧麃볯낼볯궼볯覼苣讀胣꺁鏥뎹ꇩ膀뻤袁臣銃菣꺁菣ꦃ菣蚃苣ꊂ臣覂菣ꒂ苣閃苣것菣랂苣ꮁ苣誂跥ꊛ臣讂볯肸뫤꺁菣誃菣ꮁ臣몈뿦ꦉ볯ꊼ볯ꎼ苣鮾뗧鞁胣隻臣覃菣벃臣꾁菣릂菣뎃菣벃볯ꊼ볯ꎼ苣鮾뗧馁苣覼胣肉鳦馁苣ꪁ苣낁胣颍鯩貾臣膀듧麃苣Ꚃ苣躃藥股룦誏臣꒼볯뎼볯궸臣趇뗧馁苣芀蟥邵듧麃苣ꊂ菣뮂苣ꢔ鿥난볯鎼볯莄胣閼볯ꎼ볯㲯畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵覼臣肸駦ꎧ蟥鞁胣ꒁ臣ꞁ듦蒵臣膀苣莃苣ꒂ铧릟鳥袼볯낼볯ꦼ볯醼볯薼苣랂菨邅ꇨ薸胣醼볯骃菣랂菣뎃볯릂菣것菣袃菣ꒂ苣뎃胣醼볯낂菣뾂菣뎃胣醼볯ꢼ볯낼볯뎼胣醼볯麝뿥袠苣龃菣뢅胣醼볯钃菣鎃菣뢅ꇥ覼臣鎼뷯醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲖猯灵내菨込뷯貽臣趆蟦膿臣鮁苣芀裥肿觧낼볯궼볯꾁듧麃苣覅臣閁苣馁볯蒴볯邼볯ꦃ菣覼臣ꢁ臣袂苣뾪ꏨ閁苣讂胣㲂牢ਾ臣꺁苣莃苣ꒂ臣랷郥ꦉ볯㲚牢ਾ볯邼볯骼볯꺁볯薼迥꾁볯躼볯薼臣貸蟩閁苣龁ꧨ鎨雦ꚩ雦膀戼㹲閼볯骼볯꺁藥ꮁ臣覂臣貂臣몈뿦ꦉ듧麃胣誏臣㲳牢ਾ볯邼볯醼臣것苣鶃菣肃菣낼볯궼볯내菨膀戼㹲銂룤趇苣Ꞃ菣ꮁ鋨辁臣ꢁ臣袂苣뾪ꏨ閁苣讂胣醼볯邼菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃臣내菨릟ꓩ릟鳥袏臣醼볯邼菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃臣ꎼ볯钼裢ꦼ뷯Ꞽ苣뺯藧鎽臣鞁臣뾽铧馁苣芀臣蒁臣膀苣Ꞃ菣銂볯鞼蓢膀볯薼볯꾼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢臣钼韦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀볯ꖗ鯧膀郥Ꚃ苣ꮃ臣袃菣膃苣ꂃ賥膃菣뢂菣袼볯躼볯ₐ뷯ꎼ볯Ꚃ苣ꮃ볯ꆼ뷯薽뷯鎽뷯膽뷯覼苣ꦁ铧馁苣芀볯芙雩貾胣내菨銂볯麛듦蒵臣膀臣蒁臣馨귨꺁迥벾苣閩뻤馁苣芀戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣꺁믤꺁ꓥꊽ뻤ꞁ臣膀볯ꊼ볯ꎼ苣ꊼ뷯貽뷯込뷯麃苣릂迥뎁볯閼볯ꊼ볯麃苣릂臣뺄蟨讁苣颍鯩馁苣芀듧麃苣膀苣莃苣ꒂ铧릟鳥袼볯낼볯ꦼ볯醼볯薼苣랂菨邅ꇨ薸胣醼볯骃菣���菣뎃볯릂菣것菣袃菣ꒂ苣뎃胣醼볯낂菣뾂菣뎃胣醼볯ꢼ볯낼볯뎼胣醼볯麝뿥袠苣龃菣뢅胣醼볯钃菣邃菣袃볯ꮁ臣蒁臣낖臣ꮁ鯥躏臣貂臣뺄蟨讁苣閡뻥ꆏꓦ뮟铧ꮁ듧讁臣螈雦鞁胣ꪃ菣醃菣ꒂ菣궼볯겼뷯趽뷯袽뷯貽뷯钽뷯₅볯覼볯꾼뷯螽뷯躽뷯躽뒼뷯讽뷯覽뷯膽볯誸臣鎁苣覂臣내菨銂苣벃菣벃菣ꒂ臣讂臣ꢁ臣袂苣낼볯ꊼ볯銂跥ꊛ臣膀볯邼볯邼銽뷯趽臣銼볯蚈雩ꂁ뿥蚈鯩鞁胣蚛苣膀苣莃苣ꒂ铧릟鳥ꮁ臣醁苣颍ꃦ내菨꒱苣鞴뗦鞁胣ꊂ菣뮂苣ꢔ鿥난臣醼뷯醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲗猯灵내菨込뷯貽臣ꪁ苣袂臣ꮁ듧麃苣趆蟦膿臣鮁苣芀臣蒁臣膀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誸꣨꺁苣蚁臣財苣貂苣芀戼㹲뺯藧鎽臣뺯臣讂ꋥꂊ臣붙胦ꞁ臣讂臣莀臣覂苣膀ꗥ뺁臣辁臣醼볯邼볯ꖻ룤袏臣醼볯邼볯ꢁ郥覭臣鞢諥貁ꗥ뺁臣蒁胣鞁臣鞁臣貁苣膀꿥ꞅ뷤袂苣Ꞥ臣蒁藥ꚁ臣ꒀ臣膀ꧨ鎨铧뾂菣醃苣ꪳ臣ꒁ臣ꚁ裥肿諥鲞苣몤臣芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨菣ꪃ菣鞃菣覃臣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ菣뢂菣ꎂ菣ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯銼볯鎼胣낼볯꾼볯銼볯膀볯늼볯鎼볯醼胣낼볯꾼볯醼볯膀볯늼볯颼볯隼胣誏臣낼볯꾼볯邼볯醼胣㲂牢ਾ胣邼볯颼볯醀戼㹲龮雦设볯鎼볯骼럦袐菣뎃菣莐迥鲿볯궼볯늼볯ꮁ臣醁苣뮘껥뮴胦ꊂ菣뮂苣袼苣莃苣ꒂ볯鞼볯㲉牢ਾ臣꺁껥붖뻤꾁胣겜駧躘臣肸迥꾁ꓨ낕臣鶃菣骃菣膃菣貁裥肿臣貂臣뒼菣뎃菣莐臣鞢껦뮘껥ꒉ臣鞁臣뮴胦ꞁ臣讂臣ꢁ苣몤臣芀菣뎃菣莐臣鞢껦銂飩뎮臣讂賥袐觧꾁胣超雧趏뿥꺁諦뚈臣붥臣鞁臣뮲駧ꮁ臣蒁臣覜铧ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ臣꺁苣莃苣ꒂ臣몟鳦蒚菣궃菣뎂菣ꮃ臣膀볯趽뷯閽뷯辽뷯辽뷯馽볯₌뷯躽뷯钽볯躼볯銼볯ꪼꖼꎼ뷯貽뷯螽뷯躽볯₌볯₡볯₭볯銽뷯覽뷯芽뷯薽뷯貼꒼ꢼ궼뷯銽뷯貽뷯薽뷯貼ꖼ궼뎼뷯薽뷯膽뷯袽볯₌볯₷볯钽뷯辽뷯薽뷯ꢷ볯₌鯥讫ꇨ龔ꃧ뚩触貼ꪼ뷯袽뷯₎볯覽뷯薽뷯ₙ볯膽뷯邽볯ₛ볯辽뷯鎽볯₌볯躽뷯讁苣몇觧꺁볯閽뷯銽뷯躽뷯ₔ볯銽뷯钽뷯莽뷯貽뷯ꮁ꣨覼臣貂臣蒁苣芀戼㹲閁苣ꮁ胣鎁臣ꊂ菣뮂苣꺁룤覤뷥设臣꾁胣ꮜꋦ股뛦颍ꃦ내菨袼볯ꊼ볯ꎼ볯銂胥薀臣몓매麡胣设臣낁菣袃臣鲃菣뎃菣ꎂ苣讁苣궃苣뎂菣Ꞃ菣벃苣릂臣袂苣颍鯩馁苣袼룤몺臣覃菣벃臣꾁裥肿觧낼볯궼볯銂뻤ꚵ臣膀믤꺁菣誃菣ꮁ臣것苣鶃菣肃菣낼볯궼볯銂뻤ꚵ臣讂볯芀触鮜臣讂臣覂臣膀跥ꊛ뻥ꮁ胣내菨銂苣랂菨邅ꇨ薸迥뎁볯궼볯꾼룤ꞁ蟥邵臣讂胣趇뗧내菨銂苣莃苣ꒂ铧릟鳥袼볯鞼蓢膀볯薼볯꾼猼扵砠汭獮樺㵰栢���㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢볯ꞁ룤ꦙ꟨趇臣膀臣蒁臣鞴뗦鞁胣ꊂ菣뮂苣ꢔ鿥난볯늼볯궼볯鮼볯邼볯Ꚃ苣躃藥股룦膀볯薼菣讃苣ꪃ菣込苣袃菣鞃菣麃苣랂菣膀볯薼苣ꮃ苣龃菣膀볯薼볯ꖼ볯ꖼ볯膀볯薼鷩薿ꃩꊂ菣躃藩膀볯薼菣ꮃ菣뎃藩ꦡ볯ꮁ볯颽볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰隼⼼畳㹰듧麃볯趽뷯ꮁ蛥뢇뿦閁臣讂胣몈뿦ꦉ볯ꊼ볯ꎼ臣내菨銂藥ꮁ臣覂臣袼듧鎼볯邼菣覃볯鎁臣ꮁ苣誂ꫨ붣臣貂苣芀戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁럦袐觧骼戼㹲醼볯邼볯醼臣醼볯袏臣邼볯醼볯ꮁ룥袇臣貂臣ꚩ꣩首ꧨ首胣㲁牢ਾ볯邼볯醼臣覅臣閁苣閁苣龁裥肿觧내菨膀迥뎁戼㹲閼볯骼볯꺁菣릂菣뎃菣벃볯ꊼ볯ꎼ듧麃胣㲁牢ਾ苣覸蟩Ꚃ苣ꮃ臣钒臣鎁臣ꮁ苣誂ꫨ붣臣貂苣芀볯邼볯麃苣꾂菣뾂苣뾂菣꺁듧麃鿥誤鿥난迥꾁볯邼볯麃苣꾂菣뾂苣뾂菣꺁볯꒼볯銈볯螽볯銂꿥ꞅ뷤ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣讂胣ꒁ臣ꞁ胣Ꚃ苣ꮃ苣鎼볯莄胣閼볯ꎼ볯㲯畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵ꞁ볯ꖗ雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣閼韦꺛胣蒐苣Ꞃ菣ꮁ菣ꪃ菣Ꚃ菣隌菣龃苣뎃볯醼볯邼뷯ꎼ볯Ꚃ苣ꮃ볯ꆼ뷯薽뷯鎽뷯膽뷯覼苣ꦁ铧馁苣芀볯芙雩貾胣내菨銂볯麛듦蒵臣膀臣蒁臣馨귨꺁迥벾苣閩뻤馁苣芀戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣꺁믤꺁ꓥꊽ뻤ꞁ臣膀볯ꊼ볯ꎼ苣ꊼ뷯貽뷯込뷯麃苣릂迥뎁볯閼볯ꊼ볯麃苣릂臣뺄蟨讁苣颍鯩馁苣芀듧麃苣膀苣莃苣ꒂ铧릟鳥袼볯낼볯ꦼ볯醼볯薼苣랂菨邅ꇨ薸胣醼볯骃菣랂菣뎃볯릂菣것菣袃菣ꒂ苣뎃胣醼볯낂菣뾂菣뎃胣醼볯ꢼ볯낼볯뎼胣醼볯麝뿥袠苣龃菣뢅胣醼볯钃菣鎃菣뢅ꇥ覼臣誁臣ꚁ雦龁臣麛迥閁苣龁蓨鎇臣覂ꇩ꺾迩鲤鿦ꢔ臣내臣辁裥궖臣膀菣뎃菣ꦃ苣袃볯袼볯馽뷯邽뷯辽뷯馽뷯薽궼볯袼볯銽뷯膽뷯辽뷯₎볯薽뷯躽뷯讽뷯覼룤ꮁ臣貂苣꺁듧麃苣ꪂ菣邃菣것苣馁苣鎁臣ꮁ苣誂볯궼볯ꎼ苣颍鯩鞁胣銼볯邼볯銽뷯趽臣銼볯蚈雩ꂁ뿥蚈鯩鞁胣蚛苣膀苣莃苣ꒂ铧릟鳥ꮁ臣醁苣颍ꃦ내菨꒱苣鞴뗦鞁胣ꊂ菣뮂苣ꢔ鿥난臣醼뷯醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲗猯灵내菨込뷯貽臣ꪁ苣袂臣ꮁ듧麃苣趆蟦膿臣鮁苣芀臣蒁臣膀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誸꣨꺁苣蚁臣財苣貂苣芀戼㹲뮻蓦ꮁ믤许臣뺯藧鎽臣鮸냥馁苣鎁臣꾁胣뮘껥ꢔ賥袐觧ꮁ臣蒁臣꺁菣뢂菣ꎂ菣ꪁ뗧鲞臣芁苣ꢁ胨袁苣貂胣颼볯薼鳦肺臣鮸냥貁ꗥ뺁臣蒁胣鞁臣鞁臣貁苣膀믤辄臣ꒀ臣뺯藧鎽鳦肺臣芁苣ꪁ苣膀ꧨ鎨铧뾂菣醃苣ꪳ臣ꒁ臣ꚁ飩뎮諥鲞苣몤臣芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨菣ꪃ菣鞃菣覃臣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ菣뢂���ꎂ菣ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯銼볯鎼胣낼볯꾼볯銼볯膀볯늼볯鎼볯醼胣낼볯꾼볯邼볯膀볯늼볯鎼볯鎼胣낼볯꾼볯鎼볯膀볯늼볯醼볯颼볯膀볯늼볯颼볯閼胣낼볯꾼볯颼볯膀迥뎁볯늼볯醼볯醼볯芀戼㹲邀볯閼볯醼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯醼볯誹뛧붊듧麃볯ꊼ볯ꮼ裢銼볯覼臣鞢껦袼苣莃苣ꒂ볯颼볯㲉牢ਾ臣꺁苣莃苣ꒂ臣膀鳦몙飦꺁臣讂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁胣릟ꓩꮁ臣蒁臣몓매麡臣誹뛧붊듧麃臣鞢껦꺁ꫨ躰臣膀臣貂闦ꮁ鏥뎹ꇩ꺁苣릂菣ꂃ臣誁臣ꚁ鳦ꢔ臣邈闩ꂛ귥ꢁ臣ꚁꧦ붃臣讂臣ꢁ苣몤臣芀볯ꢼ볯銈볯醼맧궶諨내菨銂꣦隺裦랕鿥난臣膀藥릮蟩醼볯邼볎뷯ꞁ볯閼볯邼듧麃볯Ꚃ苣ꮃ臣鞃菣벃菣鞁臣芀臣鞁臣膀藥릮蟩銼볯邼볎뷯ꞁ볯캑螽볯趽뷯꺁菣醃菣뎃臣颭鳥许臣Ꚃ苣ꮃ臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃胣캁銈볯Ꞽ볯袼귦꺁꿥ꞅ볯袏臣ꆄ郥覜볯ꂲ臣뺯藧覼苣뮷諥馁苣芀臣蒁臣膀듧麃苣鎼볯莄臣隼裢鞼韦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꖃ菣貾胣릟鳥銂迥誂駩趁胣내菨銂볯ꊼ볯ꞁ듦蒵臣龁뻥ꮁ藩Ꞁ菣릂菣ꆂ苣벃苣몟돨랷郥ꦉ볯醼볯邼볎뷯込苣Ꞃ菣覼苣ꂊ臣讂胣鶁臣ꚁ볯내菨銂볯鞼蓢ꞁ볯芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂胣ꆬ臣膀볯Ꚃ苣ꮃ臣ꒁ臣醼볯캐貽臣醼볯₮볯膽볯ꢼ苣뮷諥鞁胣뢅胦鮃苣閃苣뾂菣벂迥鲿苣ꊭ苣讂胣鶁臣ꚁ胣鞃菣벃菣銂볯꒼钼볯邼뷯趽臣겸껥馁苣芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣붙胦꾁胣醰臣辁臣节단꺁꿥ꞅ苣誂볯邼볯誸臣뢅胦鮃苣閃苣뾂菣벂듦Ꞁ臣芁苣芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨菣ꪃ菣鞃菣覃臣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ菣뢂菣ꎂ菣ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯銼볯鎼迥뎁볯늼볯鞼볯醼胣㲂牢ਾ胣邼볯颼볯醀戼㹲龮雦设볯鎼볯骼戼㹲薆髧내菨ꊂ菣袃菣랂苣꺁ꫨ躰볯ꖼ볯ꦼ볯ꆼ볯袼苣莃苣ꒂ볯邼볯覼戼㹲薆髧내菨ꮁ臣蒁臣ꊂ菣袃菣랂苣銂ꫨ躰臣讂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁菨鮊苣膀볯邼볯躽뷯込뷯貽臣뚼볯Ꞽ볯膀볯躼볯薼臣ꊼ볯ꆼ胣醼볯邽뷯躽뷯込뷯钽뷯薽뷯銂ꏨ薅臣龁볯薼ꇨ薸鿥난룤ꞁ볯隼苣Ꞃ菣閃苣벃菣莃菣銂뷤ꢔ臣ꚁ胣銃菣馝蓨꺁蟨馝蓨薆髧내菨袼볯떼볯ꖼ볯貼ꎼ뷯貽뷯₌볯馽뷯钽뷯趽뷯覼룤ꞁꧨ鎨臣龁胣뾽铧鞁臣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃臣ꚼ뷯貽뷯辽뷯ꮁ苣誂ꏨꂀ臣貂臣袼闧랏볯邼볯銼볯芀볯隼苣Ꞃ菣꺁苣벃菣ꎂ菣낂臣膀볯ꊼ볯뚺뛦궸臣邼볯銼볯벂菣膃菣醼볯邼볎뷯ꞁ볯鎼볯蚈雩벂菣膃菣隌苣략臣馁臣ꢁ臣袂苣뾪ꏨ鞁臣芀苣ꦃ菣뎃럦袐觧銂藥ꢃ郥閼臣龁뻥膀볯邼볯股룦ꮐ鳦릟鳥궸臣肜뗧莿뫥銼뷯醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨���⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲔猯灵내菨込뷯貽臣肜뗧莿뫥銈苣Ꞃ菣鎽臣誂볯邼볯캐貽껥辇臣鞃菣벃菣ꎂ菣낂臣龁胣뺯뇨ꢁ臣讂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣銂郥覜臣讂ꧨ鎨ꧨ首苣뮷諥馁苣趉臣내菨銂볯钼駦鎖裦랕臣鮁臣芀戼㹲ꢅ臣꺁苣Ꞃ菣ꮁ胣醼볯邼뷯螽볯趽뷯꺁볯ꖼ볯ꚼ胣邼볯醼볯꺁볯뎼볯膀볯뢼뷯薽뷯躽볯鎽뷯銽뷯邽苣鲣藥鞁臣邼볯股룦릟鳥궸볯邼볯캐貽苣뮷諥鞁臣芀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣銂郥覜臣讂ꧨ鎨ꧨ首苣醼볯膀볯躼볯鎼볯誏臣邼볯醼볯薼臣貸蟩ꞁ룤ꒁ뗧ꞁ럦ꂊ臣龁胣내菨꺁蓧蒁苣Ꞃ菣銂菣ꦃ菣꾂臣鞁臣뾽铧鞁胣내菨ꂁ臣꺁苣Ꞃ菣銂菣겂菣ꎂ菣뺯藧ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣龁胣鶃苣蚃苣隃꿥ꞅ臣鞁臣膀볯颽軥늶臣릂苣Ꚃ菣릂菣ꪃ菣꺁볯邼볎뷯꺁볯骼볯꺁胩骶룥袇觧銂뷤ꢔ臣龁胣ꖼ볯ꦼ볯ꆼ臣袅ꯧꎁ臣膀듧麃苣銼볯讁苣鎼볯芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣㲂牢ਾ볯겼볯뎼볯銂胣ꊼ뷯薽뷯銽뷯躽뷯薽뷯ₒ菣讃菣ꊂ菣뮼볯辽뷯袽뷯覽뷯螽뷯銽볯₌듧麃귦鲤蟥ꖼ볯ꦼ볯ꆼ邽뷯閽뷯貼ꮂ苣궃苣ꪕ迥醼볯銼볯隼볯閼볯ꮁ뻥ꎁ臣ꊂ菣袃菣랂苣뾪ꏨ뚺뛦꺁菣馃菣銂뇦骮臣讂臣ꮁ뷤ꢔ臣龁胣ꚩ雦뾪ꏨ骼볯隼苣Ꞃ菣鞃菣벃菣銂볯讽뷯邽뷯ꞁ볯邼裥鎖苣钃菣袲駩閁臣袼볯邼볯螽볯膀ꯩ龀迥ꊻ臣袂苣誸룦銂駩뮎臣膀菣것菣袃苣骃菣醃菣뾂苣ꮃ룤ꮁ룤许胩ꮁ뷧蒁臣议苣꺁뛦鎽苣꒙軥鞁臣芀郥Ꚃ苣ꮃ臣膀볯邼볯캐貽臣醼볯뚺迨邃菣閃苣벃苣뮷諥鞁臣꾌鯧閁臣骁臣鎼볯蚈雩꒮룦ꞁ苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀菣것菣袃苣醼뷯銽뷯趽臣醼볯蚈雩릂菣뎃닦趙臣鮁胣銼볯캐貽臣뚺迨늶볯내菨ꪳ铧蚈볯銂苣袃菣鞃菣ꊂ菣뢂菣ꮢꛨ궼볯낼臣뮧臣龁胣颼볯캐貽臣超雧ꚩ雨랷郥ꦉ苣蒐苣Ꞃ菣ꞁ볯邼볎뷯뚺迨늶臣ꂊ臣龁胣궼볯낼苣颲鷧Ꞁ菣ꒂ菣ꞁ苣邃菣鞁胣鶁苣銂믨鎁賦ꪛꧦ袼볯邼볯ₐ뷯邽뷯覼臣超臣讂臣ꢁ臣袂苣銼駦鎖껥ꦸ臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣銼駦鎖뻥膀룤薸苣뢐볥ꮁ苣誂駩뮎臣膀苣Ꞃ菣鎽臣誂볯閼볯캐貽臣醼볯ꒂ菣궂菣릁菣랂菣뎃菣莃菣ꆂ菣ꞁ볯麛苣Ꞃ菣銂菣뎃苣鞁臣袼郥閼臣꒙軥鞁臣覼胣蒐苣Ꞃ菣ꮁ鿥ꪳ뫦늶苣뮷諥鞁볯醼볯邼볎뷯覼胣費臩꾌鯧龩臣꒮룦ꮁ臣蒁臣銼볯邼銽뷯趽臣膀藥ꚺ룦骮裥邞臣膍裥ꪁ駧늉臣閁苣讂臣ꞁ苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣袼듧醼볯銈볯邼裥貾볯芀迥ꞅ돦랕볯馼볯躽뷯ꢁ臣ꚁ볯邼볯躽뷯ꞁ菣것菣袃苣궪苣꺁臣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣벃菣벃苣ꢔ臣龁胣낼볯꺼볯銼볯뺯藧邃菣閃苣벃볯ꮁ臣蒁臣鞾苣貂臣것菣ꮃ苣醼���邼볯ꮁ꣨骮臣龁胣것菣ꮃ볯醼볯邼볯꺁ꧨ首苣ꊂ菣袃菣랂苣颪냥ꮁ臣蒁臣꺁菣뢂菣ꎂ菣ꢁ胨袁臣芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨菣ꪃ菣鞃菣覃臣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ菣뢂菣ꎂ菣ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯颼볯钼볯芀戼㹲邀볯閼볯鎼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯鎼볯肀蛥꺚듧麃苣鶃菣벃苣릂臣颪냥袼볯겼볯뎼볯覼볯ꊂ菣뮂苣鞼볯覼戼㹲薆髧내菨ꮁ臣蒁臣ꊂ菣袃菣랂苣銂ꫨ躰臣讂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁菨鮊苣銃菣馝蓨꺁蟨馝蓨薆髧내菨袼볯떼볯ꖼ볯貼ꎼ뷯貽뷯₌볯馽뷯钽뷯趽뷯覼룤ꞁꧨ鎨臣龁胣㲂牢ਾ듧麃苣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣ꒂ苣궃臣벃臣벃菣것菣袃볯ꆼ뷯薽뷯鎽뷯膽뷯₍볯覽뷯薽뎼뷯覽뷯躽뷯薽볯₌뷯馽뷯辽뷯钽뷯銽裢뒼苣뎃菣것菣蚃苣뎃苣麃苣꾂菣鞃菣벃菣膀蓧貏胣蒵맧릟鳥ꚇ郧膀胥薀臣ꦃ菣钃菣낂볯ꞁ볯邼볯꺁ꇨ薸볯ꎼ볯Ꞽ裢銪뷤膀볯薽뷯貽뎼뷯鎽뷯薽뷯鎽볯궸胣Ꚃ苣ꮃ뷥龁苣銼뷯醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲔猯灵내菨꺁꿥ꚺ臣ꢅ껥辇볯邼볯캐貽臣鞃菣벃菣ꎂ菣낂臣龁胣銼韦꺛臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣銂郥覜臣讂ꧨ鎨ꧨ首苣醼볯膀볯躼볯鎼볯誏臣邼볯醼볯薼룥袇臣鎼껦躚臣뮷諥鞁臣芀듧麃蓧鞁臣Ꚃ苣ꮃ苣隃菣뎃苣ꢁ臣ꚁ铧蒁胣내菨꺁臣꺁苣Ꞃ菣銂菣겂菣ꎂ菣뺯藧ꢁ臣ꚁ铧蒁臣芀菣뢂菣ꎂ菣뺯藧ꢁ臣ꚁ苣뾂苣궃苣鶃菣뎃臣鎼뷯릂菣莃苣꺁볯骼볯ꎀ뛧貸蟩閼볯캐貽苣ꢔ臣龁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꊂ菣袃菣랂苣銂ꫨ躰臣讂菨鮊臣膀苣ꮃ苣Ꚃ菣誏臣ꪃ菣芄돨邵郥뾂菣醃苣ꪳ臣ꆃ菣邃菣ꞁ臣讂苣趃苣랂菣뚼볯ꆼ뷯躽뷯颽뷯躽볯覼臣鲤蟥꺁臣膂臣馼볯Ꚃ苣ꮃ苣鞃菣뮂菣랂菣낂臣ꚁ苣鶃菣벃苣릂苣鲤蟥馁苣鎁臣ꮁ苣誂뇦骮臣龁胣㲂牢ਾ볯躼볯趽뷯꺁苣趃苣랂菣뚼裢鎃苣膃菣꺁苣袃菣꾂뫦늶볯醼볯邼볎뷯込뷯貽볯銂胣钼볯隼뷯貽臣銼颽ꎼ뷯㲁畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯讼⼼畳㹰뗧袐菣莃菣ꆂ菣誏臣銼볯閼볯ꊼ볯ꆼ룤ꮁ룥袇臣龁볯醼볯銼볯貸蟩覼胣閼볯캐貽臣貸蟩ꊂ菣궂苣뎃볯銈菣ꪂ菣뎃뛦銂胣醼볯邼볎뷯込뷯貽臣肜뗧莿뫥ꮁ臣讂臣ꞁ郥Ꚃ苣ꮃ볯뺯藧銂駩辁볯ꮁ럦ꂊ臣龁胣ꚩ雦銂猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼볯㲕猯灵뎼裢릂菣것菣袃苣鎃苣뎃臣뒛軦뮷諥꺁觥ꮁ苣趃苣랂菣銈菣ꪂ菣뎃臣놅臣醼볯銈볯閼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼볯㲕猯灵뎼裢릂菣것菣袃苣鎃苣뎃臣銼颽ꎼ뷯㲁畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯讼⼼畳㹰뗧袐菣莃菣ꆂ菣膀볯躼볯薼볯뎼볯궸臣貸蟩鞁胣肜뗧莿뫥貁볯���뷯ₘ볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰钼⼼畳㹰뷯邽뷯込苣Ꞃ菣ꮁ臣讂臣ꞁ藥ꚁ臣Ꚃ苣ꮃ臣뮷諥鞁臣芀곦蒁臣鞃菣벃菣銂꿥膰臣膀볯邼볯邼銽뷯趽臣醼볯蚈雩ꂁ뿥蚈鯩鞁胣銼駦鎖臣鎖胣費臩랂苣ꒂ苣벃룤ꮁ藩鞁臣芀裥邞臣醼볯閼볯궼뷯莽뷯辽뷯薽뷯膽뒼뷯覽뷯閽뷯ₘ볯랼뷯貽뷯膽뷯覼臣龮雦鞁臣芀菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃苣誶臣讂菣벃苣뎃菣貁菣겂菣ꎂ菣뺯藧銂뛨袁苣躯裥鎽臣誂臣ꮂ苣뎃菣꺁菣벃苣뎃菣辇苣ꢡ臣芀菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃苣誶臣讂菣벃苣뎃菣貁볯邼볯ꖻ룤꺁苣꺁臣鶃苣蚃苣隃臣芁苣ꢁ胨袁苣貂苣芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨菣ꪃ菣鞃菣覃臣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ菣뢂菣ꎂ菣ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯鞼볯馼胣㲂牢ਾ胣邼볯颼볯醀戼㹲龮雦设볯鎼볯骼菣袃鷩袄蛥꺚듧麃볯膽菣ꦃ菣꾂苣ꊂ菣뮂苣袼苣莃苣ꒂ볯颼볯㲉牢ਾ臣꺁苣莃苣ꒂ臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁菣袃臣趇鷩袄蛥꺚듧麃볯ꢼ볯뚼볯ꎼ볯₌볯薽뷯貽뎼뷯鎽뷯薽뷯鎽볯ꮁ臣醁苣ꮂ菣랂苣ꂃ菣ꦃ菣꾂苣銂裥肿臣讂菨鮊苣몤臣讁郥讁苣몱껥馁苣龁苣ꮁ꣨袨臣貂臣蒁苣芀볯膽뗦ꖅ볯覽뷯蚽뷯閽뷯覼臣膀臣讂꣧꺁菣겂菣覃臣鶁臣것苣鞃苣벃臣邵郥馁苣鮚臣꾉ꗥꮁ껥벨臣貂臣趏뿥ꞁ臣讂胣鎁臣ꎼ뷯膵藥ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣鶃苣蚃苣隃迥鲿苣节臣覂臣ꚩ꣩隌郥ꦉ臣膀觧骮臣것苣鞃苣벃臣邵郥鞁臣銃菣薆髧내菨ꮁ臣醁苣龔觧ꚭ髧랂苣誃菣鶼臩貵럨銂듦Ꞁ賥馁苣ꢁ꣨袁苣芀臣貂臣뚩ꗦ蒚臣膀뻤袁臣내菨蚈ꏨ膀듧麃ꋥ隮臣뮘껥膀蛥꺚껧ꊽ裦膀듧麃돦開胣ꊂ菣袃菣랂苣銂ꫨ躰臣蚁苣芀戼㹲邈闩릟鳥袼볯邼볯閼볯낂菣랂菣ꆄ臣膀볯薼苣ꮃ苣龃菣膀볯邼뷯궼臣ꢼ뷯邽뷯鎽胣醼볯薼볯ꊼ볯膀볯邼躽뷯込뷯貽臣芽볯Ꞽ볯覼룤꺁菣袃鷩袄臣趇鷩袄蛥꺚듧麃볯ꢼ볯뚼볯ꎼ볯₌볯薽뷯貽뎼뷯鎽뷯薽뷯鎽볯銂胣馼볯Ꚃ苣ꮃ臣趽뷯莽뷯辽뷯覽뷯薽뷯ₒ볯覽뷯鞽낼뷯膽뷯薽裢馼볯袼볯膽뷯讽뷯銽뷯₄볯躽뷯钽뷯閽뷯薽뷯钽ꎼ뷯趽뷯膽뷯馽낼뷯銽뷯肀볯隼볯邼볯醼볯銼볯麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣ꮁ볯颽볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰钼⼼畳㹰듧麃볯Ꚃ苣ꮃ臣내菨蚯뫥ꞁ菣것菣蚃苣뎃苣鞁臣芀菣것菣蚃苣뎃苣꺁곦꺁韦膀듧麃苣邃菣閃苣벃볯ꢼ볯뎼볯讼볯邼뷯궼臣ꢼ뷯邽뷯鎽볯ꞁ볯麛듦蒵臣膀볯邼볯캐貽볯Ꚃ苣ꮃ苣议臣龁胣ꆬ臣ꞁ볯邼볯캐貽볯Ꚃ苣ꮃ臣颼볎볯꺁볯貽뷯辽裢鎼볯銼뷯覼苣뮷諥鞁臣芀듧麃苣鎼볯莄볯閼볯ꎼ볯㲯畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯灵ꮁ臣蒁臣���볯閼駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀苣뎃苣ꖃ臣벃苣ꞃ菣꺁뻥膀듧麃苣邃菣閃苣벃볯誸꣨覼臣鎼뷯鞴뗦鞁胣醼볯邼볎뷯込苣Ꞃ菣銂껦鞁臣芀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁ꧨ鎨ꧨ首臣膀闧ꪁ苣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃룤ꞁ胣邃菣閃苣벃룤閼뷯莿뫥ꞁꫨ붣臣龁胣鶃苣蚃苣隃꿥ꞅ臣閼볯캐궼苣ꪂ菣麃苣랂菣袼볯颽볯ꮁ鯧鎽臣鮼菣겂菣ꎂ菣뺯藧꾁菣궃菣ꒂ菣鎼볯ꮁ鯧鎽臣讂胣내菨鞃菣벃菣誏臣ꚩ雦鞃菣벃菣銂볯겼볯낼볯袼볯辽뷯薽뷯閽뷯膽뷯ₒ볯薽뷯覽뷯薽뷯覼菣랂菣ꞁ뗨覂臣龁胣ꚼ볯ꦼ볯늼菣랂菣꾁볯閼볎뷯꺁ꧨ鎨ꧨ首苣내菨ꮁ럦ꂊ臣膀볯銧臣ꢁ臣醼裥鎖胣ꆬ臣ꞁ볯銧臣ꢁ臣鎼裥鎖ꫨ뾁迥誂苣財臣龁胣㲂牢ਾ鯦骷臣馃菣릂菣ꒂ菣讁苣肜ꓥꒀ臣ꞁ룤螘臣讂鯨覅ꓥ隌볯캈覤賥覼苣袨껧鞁胣螤ꏨ銂맥螝賥鞁臣芀鯨覅ꋥꂊ臣龀뫥銂鯧隦臣膀볯邼볯邼苣誂ꓥ趁臣캪覤賥誏臣隼볯銧믤薆臣誸飦銂鳦馁苣ꚩ雦꺁臣銂菣뢂菣ꎂ菣ꢁ胨袁臣芀룤風臣ꢡ볯ꮁ臣蒁臣膀뗧鲞臣鶃苣蚃苣隃꿥ꞅ臣뺯臣ꚁꇨ뺏臣龁胣㲂牢ਾ믤许臣ꚩ꣩鶃菣骃菣膃菣貁臣꺁苣莃苣ꒂ臣鶃苣蚃苣隃臣芁臣龁볯낼볯꾼볯鞼볯芀戼㹲邀볯閼볯閼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯閼볯薆髧내菨ꞁ臣莽裢蚽뷯鎽臣颪냥袼苣莃苣ꒂ볯钼볯㲉牢ਾ臣꺁苣莃苣ꒂ臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣薆髧내菨ꮁ臣蒁臣莽裢蚽뷯鎽苣颪냥馁苣붃諥銂ꓧ馁臣Ꚑ苣몱껥馁苣龁苣ꮁ꣨袨臣貂臣蒁苣芀臣꺁ꧨ鎨臣誁臣ꚁ駩Ꞁ臣ꚩ꣩閁苣龁菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀뻤袁臣떉若뮲駧膀迥뎁臣貂臣麡볤꺁苣꺁苣ꮐ臣膀ꇨꆮ雦龔臣覜鯧ꞁ臣讂韧뚊苣뺖苦꺁닦芙髧ꚇ뷧ꮁ臣蒁臣覜铧ꞁ臣讂臣龜뻥閁苣讂볯鎁苣覂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁苣뒂菣릂菣貁臣蚁臣趂臣袂臣ꮁ볯芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ駩Ꞁ臣ꚩ꣩閁苣龁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁苣뎃苣뒂菣릂菣꾁胣貙胦ꮅ飧꺁닦芙髧ꚇ뷧ꮁ臣蒁臣覜铧ꞁ臣讂臣龜뻥閁苣讂胣㲂牢ਾ裦랕鿥난볯閼볯薼臣较菣꺁볯醼볯鞽볯辽볯ꢼ볯骼뷤낂菣뎂菣릂胣誏臣낂菣랂菣ꪁ臣꺁볯邼볯꒼볯ꖼ볯骼볯膽볯ꎼ볯㲯畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲓猯灵膀볯薼苣ꮃ苣龃菣膀볯邼뷯궼臣ꢼ볯낼볯뎼胣醼볯薼臣ꚼ볯뎼胣醼볯躽뷯込뷯貽臣芽볯Ꞽ볯覼룤꺁菣袃鷩袄蟨馝蓨薆髧내菨袼볯떼볯ꖼ볯貼ꎼ뷯貽뷯₌볯馽뷯钽뷯趽뷯覼苣醼뷯醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲔猯灵내菨込苣Ꞃ菣꺁듧麃꿥ꚺ臣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣ꮁ菣것菣蚃苣뎃苣鞁臣芀菣것菣蚃苣뎃苣꺁곦꺁韦膀裦랕鿥���苣꒙臣膀듧麃苣醼볯邼볎뷯込苣Ꞃ菣꺁ꧨ鎨ꧨ首臣뺯藧袼菣뢂菣ꎂ菣뺯藧鶼裦랕鿥난볯趃苣蚃苣隃꿥ꞅ볯鞃菣蚃苣뎃볯銼芽뷯蚽뷯薽뷯鶼볯邼뷯궼臣ꢼ볯낼볯뎼胣醼볯邼뷯궼臣꺼뷯ꎼ뷯膀볯薼볯鞽볯隽볯麃菣讃菣벃菣膀뷯ꢼ볯躼볯覼臣ꚇ郧馁苣鎁臣ꮁ苣誂胣내菨銂ꏩ鎤臣鮁臣芀듧麃苣閼볯ꎼ볯㲯畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯灵궸臣鎼볯莄臣誁臣ꚁ볯邼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀ꧨ首苣随苣꒙臣ꚁ胣꒼볯ꆼ苣莃菣鞃菣袃苣벃菣袼볯袽뷯銽뷯躽꒼뷯膽뷯躽뷯鎽뷯覽뷯鎽볯₌뷯膽뷯躼볯隼볯邼볯銈볯鎼볯覼臣肜裥꺁菩蚈臣鎾臣龁胣鎁臣ꞁ胣许꣨꺁郥Ꞥ雦鞭臣ꚩ雨込菣莃菣ꆂ菣꾁苣莃菣讁苣ꦈ铧꾏菨ꞁ臣ꎁ臣芀戼㹲ꆰ跥ꮁ臣膀ꧨ鎨臣薿ꛨꪁ볯궼뫦貏菣莃菣ꆂ菣袼볯궼겼뷯鎽뷯鎽ꊼ뷯蚽뷯薽뷯覼迥뎁菣궃菣隃臣辇苣붣胩薀臣袂苣邏뻤閁苣龁菦놠臣몟臣蒁臣袨껧鞁臣芀臩鎽臣辇臣ꎧ蟥鞃菣벃菣銂볯궼뫦貏菣莃菣ꆂ菣ꮁ럦ꂊ臣龁胣閍跧较苣隃菣莃菣ꊽ裦邃菣閃苣벃볯ꎼ뷯邽뷯閽뷯薽ꢼ뷯芽뷯覽뷯覽뷯膽뷯覽뷯躽ꊼ뷯蚽뷯薽뷯覼苣꒮룦뺁臣ꦸ苣龁胣芽볯꺼볯ꆝ觧銂蟩麱鷦螉菣ꮃ菣벃臣뮂菣袃苣莃菣鞁胣醼볯邼볎뷯꺁跦늍菣ꒂ菣ꪃ菣覃뷥邈菣莃菣ꆂ菣銂뿥膦臣蒐뷯銈볯꺼볯Ꚃ苣ꮃ臣뮷諥鞁胣醰臣辁臣节볯邼裥ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣내菨薆臣ꚩ꣩鞃菣벃菣銂苣뎃苣ꖃ菣벃苣讁苣随苣꒙臣膀鳧목菣讃菣ꦂ菣ꮃ菣銂뷤ꢔ臣ꚁ鿥난苣辩苣讁臣꒙臣龁胣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣鞃菣벃菣꺁郥Ꚃ苣ꮃ臣醼볯邼볎뷯꺁菣궃菣隃苣뒼臣뚺迨较苣隃菣莃菣ꊽ裦邃菣閃苣벃苣蒐뷯銈볯꺼볯Ꚃ苣ꮃ臣钃菣莃菣ꞁ듧ꦗ臣뮷諥鞁臣芀臣蒁臣膀菣것菣袃苣醼볯蚈雩閼볯莄臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣ꒂ菣궂菣馃菣뾂菣讁苣꺁迥誂蟥鞁胣麃苣꾂菣뾂苣뾂菣ꊂ菣鞃苣벃菣莃菣銂若袁臣鲃菣蚃菣꾂苣龃苣떂菣ꮁ菣것菣袃苣超臣膀볯蚈臣鎖胣莼볯꺁꣨骮臣鲃菣蚃菣꾂苣鞁臣芀볯邼볎뷯꺁뫦貏뛦銂迥誂駩趁胣閍跧较苣隃菣莃菣ꊽ裦邃菣閃苣벃苣ꮐ苣芽볯꺼볯Ꚃ苣ꮃ臣뮷諥鞁胣钃菣莃菣ꞁ룤许臣ꚁ럦袐臣龁胣鞃菣벃菣銂냥ꪁ臣ꢁ苣醼볯芙雩꺁雩閼볯莄臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣㲂牢ਾ胣邼볯颼볯醀戼㹲ꆬ臣ꖗ臣膀뷯꒼볯ꆼ苣莃菣鞃菣袃苣벃菣꺁곧銼臣ꢃ裥ꮁ뻥ꎁ臣芀臣ꪁ苣ꆁ胣鞃菣벃菣銂苣뎃苣ꖃ菣벃苣벃臣覂迥誂駩趁胣馃菣膃臣超뷧鞁臣醼볯蚈雩랆跥鞁臣芀뿥膦臣뮷諥꺁껥趩臣붣胩薀臣袂苣邏뻤閁苣龁菦놠���몟臣蒁臣袨껧鞁臣芀볯겼菣ꒂ菣ꪃ菣覃뷥邈菣莃菣ꆂ菣궸臣醼볯醼볯邼臣貸蟩꺁苣뎃菣ꪃ菣ꆂ苣ꊂ菣莿룧ꦉ볯ꆼ뷯邽뷯覽뷯覽뷯銽ꎼ뷯躽뷯薽뷯钽뷯膽뷯薽볯袼볯邼蚽뷯込볎뷯覼苣鲽裦馁苣鎁臣ꮁ苣誂苣뎃菣ꪃ菣ꆂ苣ꊂ菣鲽铧늶苣뾪ꏨ鞁臣芀菣ꒂ菣ꪃ菣ꒂ苣벃苣ꞃ菣랷郥ꦉ苣鞃菣벃菣讁苣随苣꒙臣貂胣鞴뗦ꒉ볯ꞁ볯麛듦蒵臣龁胣閼볯캐貽臣ꊂ菣鞃菣閃苣ꒂ苣벃뷤ꢔ뛦銂郥Ꚃ苣ꮃ臣뮷諥鞁胣Ꚃ苣ꮃ苣閼볯莄臣鎼볯蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣ꒁ臣ꞁ胣鞃菣벃菣銂苣뎃苣ꖃ菣벃苣벃臣覂迥誂駩蒁臣醼볯蚈雩랆跥鞁臣芀꣦颭菣궃菣隃뷤ꢔ뛦銂胣ꆼ볯较苣隃菣莃菣ꊽ裦邃菣閃苣벃룤ꮁ볯骼볯邼볯꺁룥袇臣馨귨莿룧ꦉ볯钼볯ₐ뷯趽뷯貽뷯鎽볯캏貽볯銂뷤邈臣讂臣ꢁ臣袂苣뾪ꏨ鞁臣芀볯邼裥꺁蛥뒍鳦鎖뻥膀苣뎃菣ꪃ菣ꆂ苣ꊂ菣较苣隃菣莃菣ꊽ裦랷郥ꦉ苣꒙軥鞁胣鞃菣벃菣銂듦蒵觥ꆼ臣銼鯥鞴뗦鞁臣芀볯邼볎뷯꺁꣦颭菣궃菣隃뷤ꢔ뛦銂郥Ꚃ苣ꮃ臣뮷諥鞁胣Ꚃ苣ꮃ苣閼볯莄臣醼볯蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣醼볯蚈雩꺁蛥뒍뻥膀鿥ꪳ苣꒮룦뺁臣ꦸ苣龁胣ꊂ菣뮂苣ꮁ뿥膦臣蒐菣ꮃ臣몟돨ꮁ볯캓貽臣몟돨ꢂ菣较菣떂菣銂럦ꂊ臣ꚁ胣鞃菣벃菣銂볯邼裥鎖蛥뒍臣膀꣦颭菣ꒂ菣ꪃ菣覃뷥邈럦袐觧銂迥誂駩趁胣鞃菣벃菣銂듦蒵觥ꆼ臣銼鯥膀듦蒵觥꒼臣鎼鯥鞴뗦鞁臣芀볯邼볎뷯꺁苣뎃菣뎃苣벃苣뒼臣몟돨뚺뛦銂郥Ꚃ苣ꮃ臣뮷諥鞁臣芀菣것菣袃苣鎼볯莄臣鎼볯蚈雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣膀볯겼볯銂臩鎽臣ꞅ뫥袨臣궪臣ꢁ臣龁胣㲂牢ਾꓨ붣苣뎹鷥隌臣覤该芿闦銂뇦骮臣龁胣ꂲ臣뺯藧袼룤낿臣鞃菣蚃苣뎃볯銼볯ꢼ볯낼볯뎼菣莃菣ꆂ菣覼胥ꮁ꿥馁苣鞢諥趀闦꺁듦Ꞁ臣겸껥꾁賥ꚭ駧覅跥趽볯늼볯떼볯ꮁ苣ꎁ臣몤臣貂臣芀뗧鲞臣膀단꺁菣莃菣ꆂ菣뺯藧꺁胥ꮁ꿥鞁臣醰臣辁臣节볯趀臣ꒀ苣몤臣ꚩ雦꾁駩Ꞁ臣莀臣龁胣㲂牢ਾ단꺁꿥ꞅ볯醼볯邼볯薼룥袇臣醼볯邼볯늼볯떼胣ꎭ臣뺯藧鶼볯躼볯邼볯貸蟩ꞁ볯躼볯馼볯겼볯芀戼㹲邀볯閼볯鞼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯隼볯떆蟨캓내菨趉꟩鎽裥隌臣颪냥袼苣莃苣ꒂ볯馼볯㲉牢ਾ臣꺁苣莃苣ꒂ臣膀鳦몙飦꺁臣讂菣鞃菣覃臣떆蟨캓내菨趉꟩鎽臣蚈賥銂ꫨ躰臣膀臣貂闦ꮁ돧뾰韧銂郥肂鏥뎹ꇩꮁ臣醁苣꺨胣꺁苣뎃苣ꖃ菣뎃곦边諧讅臣뮲駧ꮁ鳦ꢔ臣芁苣ꢁ鳦薾臣貂苣鎁臣銂ꓧ馁胣鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁胣ꖻ룤꺁苣蚁臣誁臣ꪁ苣貂臣芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣膀菣Ꚃ苣躃藥떆蟨내菨꺁룤ꆬ鿥誤苣뾽铧���胣肸곦袨룦꾁胣캁내菨趉꟩鎽迥꾁裦龆닎듧麃臣蒁臣貂臣銂ꓧ馁菣벃苣벃臣몙迧꺁ꓥ隌臣芁苣芀菣벃苣벃駧뺏臣膀껥芙雩낕蟩隌볯ꎼ볯袼볯뒼볯銈볯ꎼ볯膀뷯薽뷯貽钽뷯趽뷯₅뷯閽뷯钽뷯钽뷯钽뷯隽뷯₅볯ꎼ볯覼臣袂臣ꚁ룦骮臣貂苣骼ꧨꆾ臣貂苣麃菣ꮂ菣꾁胣ꒂ菣랂菣ꪃ菣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ蛨鎇臣膀볯醼볯骃볯ꎼ볯醼菣Ꚃ苣覼臣覂꟨隉臣貂苣芀臣鞁臣膀蛨鎇臣ꚼ볯銼볯꒼볯ꖼ볯궸臣뎂菣늂菣벃苣込菣릂菣벃苣袼뷯覽뷯邽뷯鎽뷯覼臣鎼볯莄胣钼볯銈볯邼裥ꞁ뛦隌臣貂苣袼苣ꦃ苣誃菣벂볯螃苣醃菣벂볯蒽뷯鎽뷯膽뷯薽볯膀볯躼볯鞼뷯螽볯趽뷯膀臣벃菣뎃苣벃菣뎃菣ꒂ菣膀볯醼볯馼볯醼볯鎼볯芀곦ꮁ胣袶賥ꦉ苣覭蟩꺁볯薼볯뎼볯ꮁ苣ꎁ臣궸鋥鞁胣내菨銂胣肸뫥膀볯낼볯ꦼ볯隼볯邼臣鞴뗦馁苣芀곧醼韦꺛胣내菨銂볯銼苣Ꞃ菣꺁뗧钹鿥誤菣것菣袃볯낼볯뎼룤꺁볯邼볎뷯込뷯貽臣ꦃ菣讃菣膀臣벃菣뎃苣벃菣뎃菣ꒂ菣膀볯醼볯钼볯醼볯ꮁ苣ꎁ臣貼觥ꮢꛨ閁苣龁볯뢁軦꺨臣讂胣醼裢銼臣骃臣覂臣떆蟨꺁듧麃苣肸臣꺁苣Ꞃ菣ꮁ裥莸臣鮁苣芀臣꺁룤ꆬ鿥誤臣몂臣릟鳥꾁胣醼볯ꚼ볯醼볯钼볯ꞁ臣讂胣견볯ꖗ鯧ꮁ臣膀鿥난苣随苣꒙臣膀볯낼볯ꦼ볯醼볯钼볯ꮁ苣ꎁ臣颻鷧내菨銂듦蒵臣讂胣ꚩ꣩閁苣讂苣뎃菣꾂돨ꮁ諥袁臣膀볯趽뷯꺁鳦辰鿥난苣뮷諥馁苣芀곧钼韦꺛臣꾁胣릟鳥銂迥誂駩趁胣내菨袂苣늼볯ꆼ苣뾪ꏨ鞁胣麃菣ꮂ菣몙迧銂껥낕駦鎖闦辇賥蚀믨馆볯ꎼ볯袼뷯薽뷯貽钽뷯趽뷯₅뷯閽뷯躽뷯覽뷯膽뷯覽뷯薽늼볯銈볯늼볯覼臣袂臣ꚁ裥邞臣讂胣뾂菣醃苣ꪳ臣膀雩ꎀ臣讂닎듧麃菣벃苣벃臣몙迧貁鳦ꚇ郧뺯藧ꮁ꿦莼臣ꚁꋥꂊ臣龁ꃥ袐胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣뮴胦貁臣讂苣꺁臣莀臣讂胣㲂牢ਾ볯钼볯込볯隼볯邼볯Ꞽ뷯芽뷯辽볯꾁胣ꖻ룤꺁苣꺁苣ꂊ臣龁볯낼볯ꦼ볯隼볯邼볯㲚牢ਾ苣ꮃ菣鞃볯醼볯醼볯邼볯㲐牢ਾ苣ꮃ菣鞃볯醼볯醼볯邼볯㲐牢ਾ뗧뾁迦袁菣袃苣뎃苣ꖃ菣뎃볯邼볎뷯込뷯貽戼㹲ꊂ菣궃菣讃菣袼볯邼볎뷯込뷯貽볯醼볯銼볯邼볯袼臣벃菣뎃苣벃菣뎃菣ꒂ菣莼볯颼볯閼볯銼볯㲉牢ਾ苣랂룤芞뷤붊蟥ꦉ볯ꊼ볯ꖼ볯隼볯캐螽볯趽뷯㲌牢ਾ苣뎃苣麃苣랂菣醼볯邼躽뷯込뷯貽戼㹲낂菣벃菣ꆼ볯袼볯邼趽뷯낼볯뎼룤覼戼㹲袃菣뎃苣閃苣ꪃ菣膀볯邼볯ₐ뷯螽볯랂苣麃胣뒼볯銼볯銼볯㲉牢ਾ룤꺚듧麃裦랕鯥邭胣醼볯邼볎뷯袼볯늼볯肀볯邼볯邼볯钼볯㲉牢ਾ菣ꪃ菣벃菣膃菣讃菣膀볯颽볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯���猯灵궼臣醼볯캐貽볯랂苣麃胣뒼볯閼볯隼볯㲉牢ਾ苣뾂菣벃菣ꊂ菣뎃胣醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢裢醼⼼畳㹰볯꺁볯邼볯캐貽볯랂苣麃胣ꖼ볯醼볯閼볯㲉牢ਾ菣릂菣ꢂ苣躃菣ꮃ苣龃菣膀볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲑猯灵궼臣醼볯邼볎뷯袼苣낂菣肀볯邼볯邼볯覼戼㹲뮂菣讃苣ꂃ胣钼볎뷯꺁볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲑猯灵궼臣醼볯邼볎뷯袼볯薽뷯膽뷯ₒ볯醼볯閼볯钼볯㲉牢ਾ苣ꮃ菣鞃볯骼볯醼볯ₐ뷯貽醼볯邼볯ꢂ苣躃菣ꮃ룤覼戼㹲銃菣궃苣ꮃ菣뺂菣膀볯颽볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲓猯灵궼볯랂苣麃莼볯邼볯鎼볯覼戼㹲鞃菣뢂苣릂菣궃菣膀볯ₑ뷯ₘ볯邼猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銈볯㲓猯灵궼볯랂苣麃胣낼볯閼볯鎼볯㲉牢ਾ菣ꦂ菣릂苣ꪃ菣膀볯邼趽볯꺁볯邼볯캐貽볯ꮂ菣邃苣ꪂ苣ꂃ胣莼볯钼볯銼볯邼볯㲉牢ਾ鳦辰鿥난볯㲚牢ਾ볯낼볯ꦼ볯隼볯邼菣ꦃ苣袃菣뎃苣閃苣ꪃ菣袼볯邼볎뷯込뷯貽볯膀苣뎃苣ꖃ菣뎃볯醼볎뷯込뷯貽볯膀苣뎃苣麃苣랂菣袼볯邼볯躽뷯込뷯貽볯膀苣鞃菣膃菣뎃볯閼볯캐螽볯趽뷯覼迥뎁볯낼볯袼볯閼볎뷯込뷯貽볯芀戼㹲邙껥릟鳥骼戼㹲늼볯궼볯醼볯钼볯鞃菣릂菣ꦃ菣릂菣Ꞃ菣뎃볯醼볯캐螽볯趽뷯覼胣ꒂ菣랂菣ꪃ菣袼볯캑螽볯趽뷯覼胣늂菣뾂菣ꒂ苣뎃볯醼볯邼躽뷯込뷯貽볯誏臣ꊂ菣궃菣讃菣袼볯邼볎뷯込뷯貽볯芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨菣ꪃ菣鞃菣覃臣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ菣뢂菣ꎂ菣ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯醼볯銼胣㲂牢ਾ胣邼볯颼볯醀戼㹲龮雦设볯鎼볯骼蛥꺚듧麃ꋥ隮臣몈뿦袼苣莃苣ꒂ볯覼戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁胣겜駧躘臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣꾉藨꺚돨鮯듧ꆮ蛥꺚듧麃볯ꆼ볯ꖼ볯邈闩銂裥肿臣讂菨鮊苣몤臣讁郥讁苣겸껥馁苣ꢔ臣궨꣨閁苣ꚁ臣讂胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣붙胦ꢁꧨ鎨臣貂臣鶃菣骃菣膃菣꾁胣设臣낁觥랂닦銙胣誏臣鎁苣ꮁꇩ벼臣节臣銂郥뾁胣股껧낖铧貁鳦誛臣芁苣螗諧蒂雧ꎂ臣뮲駧蒚蟥꺽臣誁臣ꚁ鳦ꢔ臣芁苣ꢁ鳦薾臣貂苣袼臣貂苣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꊂ苣讃苣袃臣鶁臣芁苣蚁苣蚁臣覼胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣붙胦ꢁꧨ鎨臣貂臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꊂ菣뾂苣讃苣袃臣膀駧Ꞁ藨趘臣뮲駧蒚蟥꺽臣뺯臣ꚁ鳦ꢔ臣芁苣ꢁ鳦薾臣貂苣芀戼㹲Ꚃ苣꾉藨꺚돨鮯듧ꆮ蛥꺚볯ꆼ볯ꖼ볯내菨袼裥ꎻ鿥誤臣覂臣节臣膀鳦Ꞥ볯銼裢醼볯馶믤覼苣馼볯Ꚃ苣ꮃ臣鞃菣벃菣ꮁ臣蒁臣醼볯邼菣ꒂ苣궃菣莃菣ꮃ뷥龁苣閼볯邼듧麃볯Ꚃ苣ꮃ臣鞃菣벃菣ꎂ菣낂臣龁胣ꊂ菣뮂苣銪���꾁胣躽苣ꮃ苣벃苣꒼볯ꖼ볯膀볯邼볯邭苣랂ꇨ薸胣銼뷯궼苣ꮃ苣龃菣膀迥뎁볯颽菣讃苣ꪃ菣込苣袃菣鞃菣麃苣랂菣込菣ꆂ菣꺂苣뎃苣ꮐ苣芀꿥ꞅ苣Ꞃ菣꾁믤许苣ꮐ苣骼볯醼볯ꆼ볯ꖼ듧麃蓧뮷諥鮼볯銼볯ꆼ볯ꖼ듧麃臣뾁볯袼볯覼볯ꎼ볯내菨讼볯ꖼ볯ꚼ볯閼躽뷯込뷯貽볯鮼迥뎁볯钼볯ꆼ볯ꖼ듧麃볯ꚼ볯ꚼ볯閼躽뷯込뷯貽볯芀곦蒁臣膀꿥ꞅ迥뎁ꧨ鎨ꧨ首볯醼볯邼菣ꒂ苣궃菣莃菣ꮃ껥辇볯銂苣Ꞃ菣ꮁ럦ꂊ臣龁볯蒐胣膀볯薼胣邼볯醼볯誏臣邼볯邼볯薼룥袇볯芀듧麃鿥난苣鎼볯莄볯閼볯ꎼ볯㲯畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯灵ꞁ볯銈볯ꖗ雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣ꒂ菣궂菣릁菣랂菣뎃臣貾胣Ꚃ苣ꮃ룤꺁鿥난苣뢐볥鞁臣내菨銂볯ꊼ볯ꞁ볯颽듦蒵臣龁胣ꆬ臣ꞁ胣뢅菣릂菣ꆂ苣벃苣趏뿥랷郥ꦉ볯醼볯邼菣ꒂ苣궃菣莃菣ꮃ胣邼볯醼볯ꊅ藩誃菣ꪃ苣ꂃ볯₌뷯ꢼ볯躼볯貼볯躼볯薼胣袃菣袃菣뢼裢醼볯邼胣醼볯趽볯꺁菣뎃藩邽裢讃菣궃菣Ꞃ菣ꮃ볯銂껦Ꚃ苣ꮃ臣뮷諥鞁臣芀볯鞼蓢ꞁ볯芙雩꺁苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣貾臣膀볯邼菣ꒂ苣궃菣莃菣ꮃ臣醼볯꺁볯膽볯ꢼ臣뮷諥ꮁ苣誂迥鲿苣鲁귦閁臣龁胣覅귥蚯뫥袼볯꒼볯銂볯邼볯躽뷯ꞁ菣ꒂ苣궃苣ꒂ苣벃菣것菣袃臣겸껥鞁臣芀戼㹲낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣뮴胦꾁胣袼볯覼듧麃臣뾁臣邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣ꮁ꿥馁苣膀迥뎁볯銼볯뚼볯Ꞽ볯ꮁ苣讂鳦Ꞥ裥肿臣뺯臣讂볯뢅菣릂菣ꆂ苣벃苣뮴胦膀볯꒼볯邼볯躽뷯ꞁ룦骮臣龁볯鞢껦鞢諥꺁胥낕臣鞁臣袨껧鞁臣芀鳦Ꞥ裥肿臣ꒁ臣ꚁ臣뮴胦芏藧ꢁ臣ꚁ볯ꖼ볯ꚼ볯鎼裢醼볯躽뷯込뷯貽볯誏臣ꚼ볯ꚼ볯醼裢閼뷯螽볯趽뷯覼苣뾽铧鞁臣芀苣莃苣ꒂ臣邵黦꾁胣뎦꿥閁苣龁裥肿臣邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣銂뛨袁臣㲦⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲞甯閼볯薼臣芁苣뒠郥ꮁ胣붙胦趀臣莀臣龁胣뚼볯Ꞽ볯袼볯ₕ뷯螽볯趽뷯覼꿥ꞅ臣醼볯貸蟩ꮁ臣蒁臣醼볯銼볯趀臣몈뿦銂룤袁볯ꚼ볯ꊼ볯閼躽뷯込뷯貽볯뺯藧꾁볯薼룥袇臣誁臣ꚁ볯躼볯隼胥꺁裥肿苣躸臣龁胣㲂牢ਾ믤许臣ꚩ꣩鶃菣骃菣膃菣貁臣꺁苣莃苣ꒂ臣鶃苣蚃苣隃臣芁臣龁볯낼볯꾼볯邼볯閼胣㲂牢ਾ胣邼볯颼볯醀戼㹲龮雦设볯鎼볯骼菣Ꚃ苣궼뷯鎽뷯躽뷯覽뷯貽듧麃飩뎮苣莃苣ꒂ볯ꊂ菣뮂苣醼볯钼볯㲉牢ਾ臣꺁苣莃苣ꒂ臣膀鳦몙飦꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁鿥誤臣誁臣ꚁ菣Ꚃ苣궼뷯鎽뷯躽뷯覽뷯貽듧麃臣鞢껦銂飩뎮臣讂菨鮊苣몤臣讁郥讁苣겸껥馁苣蚁臣궨꣨閁苣ꚁ臣讂胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣���붙胦ꢁꧨ鎨臣貂臣鶃菣骃菣膃菣꾁胣设臣낁髥麃胦躅뷥邈룤ꢅ胣骤駧Ꞁ髥麃藨뺖苦膀迥꾁볯薽뷯薽뷯螽뷯膽뷯내菨꺁闧뢸ꋥ隮臣ꊖ胩馁苣隻臣躅雧ꎂ胣躅藨趘胣誏臣鶁苣ꮁꇩ벼臣节臣ꪁ臣꺁볯薽뷯薽뷯螽뷯膽뷯내菨鞢껦꺁飩뎮臣覜鯧ꞁ臣讂韧뚊苣뺖苦꺁닦芙髧ꚇ뷧ꮁ꿥鞁臣覜铧ꞁ臣讂臣龜뻥閁苣讂胣㲂牢ਾ戼㹲醼韦꺛胣麃苣릂볯薽뷯薽뷯螽뷯膽뷯내菨銂胣馼볯Ꚃ苣ꮃ菣것菣袃룤꺁裦랕鿥난볯肃菣馃菣뎂臣릔ꓥꒂ菣낂菣릟鳥誏臣较菣ꚼ볯銼鿥난臣鎼볯醼럦袐胣馼볯薼苣랂菨邅ꇨ薸胣閼볯醼볯趽볯₭볯ꖼ볯ꖼ볯鲣藥覼臣鞃菣벃菣鞁胣肸駦龔苨閁臣龁胣銼韦꺛臣꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣ꆄꇨ薸鿥난臣貺臣꺁闧ꪁ臣龁뿦ꚺ볯醼볯誏臣邼볯醼볯覼臣貸蟩鞁胣내菨뢁럦ꂊ臣龁胣뺯藧ꚩ雦꾁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁蓧뮷諥꺁裦랕鿥난臣芁苣芀볯颼駦鎖臣ꆸ苣내菨銂苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꞃ菣鞁臣貾胣銼볯캐貽臣ꎼ뷯貽뷯₌볯覽뷯薽뷯ₒ볯隼ꆼ뷯閽뷯辽뷯鎽辽뷯薽鎽뷯貽뷯钽뷯辽뷯₎뷯薽뷯螽뷯躽뷯袼볯銽뷯螽뷯趽뷯覼苣蒐胣꺁苣Ꞃ菣뢁럦ꂊ臣膀꿦覅裥邞迥鲿苣銼駦鎖臣ꆸ苣馶뛧閁臣龁胣鶁臣ꚁ胣뢐藥ꚺ苣钼볯邼躽뷯ꞁ룦骮臣龁胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣醁苣붙胦꾁胣醰臣辁臣节꿥ꞅꧨ首臣몤뫥袂苣节볯邼볯誸臣뢐藥ꚺꓧꚺ苣躸臣讂藥ꚁ臣节臣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ믤许臣ꚩ꣩鶃菣骃菣膃菣貁胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ菣뢂菣ꎂ菣ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯銼볯邼胣낼볯꾼볯馼볯芀戼㹲邀볯閼볯邼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯馼볯龻ꫩ내菨鞢껦ꊂ菣뮂苣袼苣莃苣ꒂ볯醼볯覼戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣꾁胣겜駧躘臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣릟ꓩꮁ臣蒁臣龻ꫩ내菨꺁ꋥ隮苣뮘껥馁苣붃諥銂ꓧ馁臣Ꚑ臣銂룦骮臣讂苣蚁臣궨꣨閁苣ꚁ臣讂胣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣붙胦ꢁꧨ鎨臣貂臣鶃菣骃菣膃菣꾁胣设臣낁苣鶃菣蒃若뎮迥뎁雩肯苧ꪁ臣꺁꣧薀臣ꢪ迥뎁볯袏臣龻ꫩ蒵맧뺖苦꺁닦芙髧ꚇ뷧ꮁ꿥鞁臣覜铧ꞁ臣讂臣龜뻥閁苣讂胣㲂牢ਾ菣뾂믨ꢪ듧麃苣膀볯銈볯뚃鳦꺁맥랕鯩隃苣꺁룤讉賦肯雩肯臣ꊖ꿧龻ꫩ袂苣肸駦ꮁ룦讂苣ꦃ苣誃菣벂뛦隌臣袂臣ꚁ跥ꊛ臣龁胣鶁臣ꚁ胣颍鯩閁苣龁듧麃苣銼볯貼볯邼볯내菨込뷯趽猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹰臣늉郥ꞁ胣醼볯薼볯ꊼ볯誏臣钼볎뷯込뷯貽苣뎃苣麃苣랂菣銂郥肂菣ꂃ볯銈볯銼臣ꖎ꣧馁苣芀鿥난臣鎼韦钁臣ꮁ迦袁苣貂胣내菨꾁볯閼볯邼볯邼듧麃볯莽뷯㲍畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯灵ꢁ臣讂苣蚁臣���韦钁臣ꮁ蛥ꖎ꣧閁苣龁胣醼볯ꖗ鯧ꮁ胣내菨銂볯貼볯邼볯내菨込苣Ꞃ菣꺁觥袐臣股룦銂郥뺁臣蒁볯邼볯캐貽臣貐臣릟鳥꺁볯隼苣Ꞃ菣鞃菣벃菣뢁軦꺨臣膀蓧股룦릟鳥袼단꺁꿥ꞅ볯膀苣뾂苣궃苣鶃菣뎃볯肜뗧莿뫥閼뷯궼볯ꎭ臣뺯藧覼迥꾁ꧨ鎨볯늼볯鶃菣骃菣膃菣銂럦ꂊ臣ꚁ볯邼볯캐貽볯Ꚃ苣ꮃ臣肜뗧릮蟩ꢁ臣龁胣鎼볯莄臣閼韦鎖臣貾胣銼볯캐貽臣ꊂ菣麃菣隃菣벃볯ꆼ뷯膽뷯膽뷯ₒ뷯貽뷯薽볯銂郥Ꚃ苣ꮃ臣뮷諥鞁胣鞃菣벃菣銂臣覂臣鎼駦鎖胣鎼볯莄臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣鶁臣ꚁ胣蒐苣Ꞃ菣꺁鯨覅苣겸껥鞁臣袼볯颽볯閼볯邼躽뷯鮼볯趽볯閼볯邼躽뷯覼胣邃菣꾂苣ꦃ苣뎃菣銂뻥讂臣膂臣膀볯邼볯캐貽臣ꆄꇨ薸鿥난苣ꮐ苣鞃菣벃菣꺁鯨覅苣겸껥鞁臣芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣붙胦꺁뗧鲞臣膀볯늼볯鶃菣骃菣膃菣ꚇ郧ꚩ雦꺁鯨覅臣ꂲ臣뺯藧꺁臣貂苣誂苣ꎭ臣뺯藧꺁臣貂臣袂臣ꪁꃥ袐臣誁臣ꚁ뻥覂苣讂胣㲂牢ਾ믤许臣ꚩ꣩鶃菣骃菣膃菣貁臣꺁苣莃苣ꒂ臣鶃苣蚃苣隃臣芁臣龁볯낼볯꾼볯颼볯膀볯늼볯銼볯邼迥뎁볯늼볯鎼볯銼胣㲂牢ਾ胣邼볯馼볯醀戼㹲龮雦设볯钼볯骼菣莃菣꒼볯Ꞽ菣ꖃ菣궃菣龔귥뮘껥ꊂ菣뮂苣㲤牢ਾ臣꺁苣莃苣ꒂ臣膀鳦몙飦꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣貁鿥誤臣誁臣ꚁ菣ꖃ菣궃菣내菨龔귥銂飩뎮臣讂菨鮊苣몤臣讁郥讁苣겸껥馁苣袂臣ꮁ꣨袨臣貂臣蒁苣芀臣꺁苣莃苣ꒂ臣誁臣ꚁ駩Ꞁ臣ꚩ꣩閁苣龁菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀뻤袁臣麥뗧붊듧麃藨膀ꗧ貵蛨ꮅ胣낂菣ꊂ諨내菨ꮅ胣誏臣麡볤꺁韧뚊苣ꮐ苣肉鳦閁苣ꪁ臣麥뗧내菨鞢껦ꮁ雩ꎀ臣讂ꗧ貵髩뎮胦螗諧꺁닦芙髧ꚇ뷧ꮁ꿥鞁臣覜铧ꞁ臣讂臣龜뻥閁苣讂胣㲂牢ਾ볯醼볯ꦃ菣袃菨邅臣貃臥麥뗧肯臣覂雦龁臣颍鯩閁苣龁ꗧ貵듧麃臣낕꣧Ꞁ鯩ꎛ苣ꚼ볯銼껥ꢅ鿥난臣貸蟩鞁胣閼볯캐貽臣ꚼ볯銼껥ꢅ鿥난苣ꮐ臣鶃菣ꪂ菣讃菣뎃臣趉蟥蚐臣貂臣鞃菣벃菣ꮁ볯邼볯邼듧麃볯Ꚃ苣ꮃ臣超臣讂胣鶁臣ꚁ胣閼볯캐貽믤ꂊ髧ꊂ菣뮂苣릟鳥銂볤蚁ꧨ鎨볯늼볯鶃菣骃菣膃菣袼볯邼볎뷯膀볯莿뫥覼苣膀铧颭飩뎮듦Ꞁ臣ꚩ꣩꺁苧ꮁ럦ꂊ臣讂胣ꢅ뷤ꞁ볯邼볯캐貽臣뒛臣讂鿥난臣뮷諥鞁臣芀단꺁꿥ꞅ臣膀볯邼볯캐貽臣貮藥릟鳥꺁臣ꞁ蟥蚐臣貂苣芀볯ꖗ雩꺁苣뎃苣ꖃ菣벃苣ꖃ菣꺁뻥膀듧麃苣ꎼ볯ꚼ볯ꆼ臣鎟觨鞁胣醼駦鎖臣钼볯醃菣鮃菣ꂃ苣ꮃ菣銃菣ꚇ郧꺁뻥ꮁ鯥骮臣龁胣ꒁ臣ꞁ胣내菨꾁胣꺼볯ꢼ苣ꆃ菣뢂裥邞臣袂臣ꚁ闦辇賥閁苣龁胣겜苣莃苣ꒂ臣붙胦꾁胣ꚇ郧Ꚃ苣ꮃ룤꺁���麃闦貁鳦ꚇ郧뺯藧袼苣뎃菣궃菣ꮃ볯Ꚃ苣ꮃ臣邼볯閼苣誂뷤蒁ꃥ袐臣芁苣芀戼㹲ꖻ룤꺁ꧨ鎨菣ꪃ菣鞃菣覃臣鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ菣뢂菣ꎂ菣ꞁ臣ꎁ臣骼볯늼볯醼볯閼迥뎁볯늼볯鞼볯醼胣㲂牢ਾ胣邼볯馼볯醀戼㹲龮雦设볯钼볯骼뗧钹駧뺏裥莸戼㹲ꪂ菣뒂菣꾂菣ꪂ菣覃菣궃菣隃苣膀껥辇볯ꎼ볯鞢맥趏뿥꺁뷤ꢔ臣誁臣ꚁ胣颻髩馁苣뎛臣몤臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣벃菣隌菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣覂꟦覯臣龁胣ꪂ菣뒂菣꾂菣ꪂ菣覃菣궃菣隃苣膀꣦隺髧낼볯늼迥鲿臣ꊖ胩鞁臣蚃菣鞃菣벃菣꺁볯馀ꮜꯧ讁苣膀듧銼볯邼裢隼볯邼ꇥ몟꿥꺁ꋥ薹臣貂臣궖觧貁믤躸臣貂苣袂臣ꮁ臩麊臣龁胣ꪂ菣뒂菣꾂菣ꪂ菣覃菣궃菣隃苣膀闧ꪁ苣銃菣邈뫤誏臣込迥꾁菨邅臣蒵맧邺臣覂跥ꊛ臣貂臣莽볯꺼볯ꦃ苣隃菣ꪃ菣銂铧蒁臣馨뫦蒚臣骮蟩낼볯늼ꋥ薹迥鲿臣뾽铧鞁胣ꚩ꣩鞁臣꺨胣꺁뗧钹臣誁臣讂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣뎂菣覃賥뢠藩꺁駧뺏菣馃菣銂껥辇髧겸껥銂뻥讂臣膂臣ꊂ苣궃菣릂苣ꮃ鯩鞰돦開臣袂苣蚈黦鞁臣芀꣧薀臣낕臣讂菣袃뗧钹黥ꮁ臣醁苣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣벃菣隌ꃦ뢅臣몙迧醃苣벃菣꺁鿧颭臣膀믨뮧藨趘귧꺁룤ꆬ뗧钹뫦銂뇦骮臣讂臣膂臣膀믤꺁뗧钹觧낕髧麃菣ꮂ菣銂铧蒁臣袏臣ꢔ臣ꪁ臣蒵맧蚈ꇩ蚈臣ꮁ鳦ꢔ臣모雦ꢔ菣벃苣벃臣邏뻤閁苣讂胣鎁苣覂臣ꊂ菣뮂苣꾁胣ꖻ룤꺁뗧鲞苣邏뻤馁苣芀戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌰㰳愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㐳⼼㹡⼼䥄㹖邀볯閼볯鎼胣㲑牢ਾ껥붖뻤₋볯钼볯骼苣뎃苣ꒂ菣较苣隃菣肃苣벂菣랂菣뎃戼㹲ꒂ菣떂苣蒃菣ꒂ菣ꪃ菣覃뷥邈臣膀듧麃迥꾁뗧钹ꫨ붣觧薆臣꺁ꃦ뢅藩鞈臣鲤蟥誏臣肱鳥隌臣龁苣꺁볥鮊臣骤铧钀臣肊ꇨꞁ臣讂胣鶁苣꾁胣设臣낁胣몁볤邭駧뺏菩趽臣貐껥膀믨馆觧꺁뗧钹裥莸臣蚈黦膀苣ꒂ菣릂蓦鎟臣貐껥誏臣肱鳥隌胣릉껥趽볯꺼볯袐裦誏臣鎟觨鎽菣莃菣뎃苣ꮁ臣醁苣붿럨ꮁ鳦ꢔ臣芁苣芀戼㹲ꒂ菣떂苣蒃菣ꒂ菣ꪃ菣覃뷥邈臣膀볯閽迥뎁볯覽뷯貽뷯钽뷯貼ꎼ뷯貽뷯₌볯覽뷯覽뷯躽醼볯ₚ볯隼볯銈볯鞼볯ₖ볯醼볯馼볯覼臣鞃菣袃苣벃菣꺁鳦ꦁ臣覤뷥ꮁ뻥ꎁ臣膀볯ꎼ볯龔裦㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯鎼⼼畳㹰볯銈꣦颭菣鲃菣궃菣隃苣ꢔ臣ꚁ껥붖臣貂苣芀냧颍臣꾁胣鮃菣麃菣뎃鯥骮胣醃菣閃苣뎃賥讟菣袃뗧钹苣螈觧隌臣膀蓨醃菣閃苣뎃臣膀菣궃菣ꒂ菣벃苣ꮼ볯銼볯螽볯趽뷯覼臣醼볯蚈雩鎼볯莄臣놄苣뎃菣꾂臣膀臣覂臣誸���꺁볯閽迥뎁볯覽뷯貽뷯钽뷯ꮁ꣨覼臣貂臣袂臣ꮁ苣뎃苣ꒂ菣较苣隃菣莃菣ꊽ裦馁苣芀볯㲻畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯鎼⼼畳㹰볯붼볯뒼볯銈꣦颭苣뎃菣뮂菣릂菣鲃菣궃菣隃苣낼볯늼铧ꦉ臣覂铧邈臣膀볯閼蓢ꞁ뗧鲤菣ꒂ菣ꪃ菣覃뷥邈臣讂胣릂菣ꒂ菣銂볯辽뷯膽뷯₋볯뒼볯銼ꃦ袃菣莃苣ꢂ菣ꮃ苣ꞃ菣ꮁ뗦겼臣ꚁ볯놀雩늜蟥馁苣芀戼㹲邀볯閼볯钼胣㲑牢ਾ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼볯㲓猯灵낼裢ꪃ菣鞃菣벃菣袐裦㲐牢ਾ볯躼볯캐貽볯醼볯閼뷯ꎼ뷯覼臣㲮畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯鎼⼼畳㹰볯銈볯뒼볯袼볯趽뷯銽뷯袽뷯趽ꊼ볯₦볯邼볯銼볯₌볯ꆼ볯銼볯邼볯ₐ볯覽볯趽뷯辽뷯覼苣릂菣벃菣龜ꧧ뺹蟧閁臣龁胣뺹蟧㲥畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯鎼⼼畳㹰볯銈볯뒼볯銂郥肂껧ꮁ믤许臣邈裥銂럦ꂊ臣龁볯㲚牢ਾ볯躼볯캐貽臣閼뷯ꊻ蛥邃菣閃苣벃戼㹲醼볯邼볎뷯꺁볯뒼볯袼볯邼볯趽볯覼戼㹲銼볯邼볎뷯꺁볯뒼볯랷郥ꦉ볯銼볯閼뷯궼볯ₚ볯邼볎볯ₛ볯邼뷯궼臣Ꞽ볯낼볯₌볯뒼볯蚼볯뒼볯讼볯邼볎뷯꺁볯㲨畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵꾼볯㲉牢ਾ볯躼볯캐貽臣떼볯낼볯閼볯캐궼볯㲉牢ਾ볯躼볯캐貽臣늼뷯膽뷯覽뷯㲎牢ਾ볯躼볯캐貽臣꒼볯ꆼ菣뎃菣것菣袃볯醼볎뷯覼戼㹲醼볯邼볎뷯꺁볯㲨畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵꾼戼㹲醼볯邼볎뷯꺁볯꺼볯鶃菣ꦃ菣벂볯낼볯늼铧ꦉ臣ꒁ臣ꚁ볯鎼볯ꆼ볯貼뒼볯鶼볯貼胩뢸볯㲉牢ਾ껧銂볯鞼蓢ꞁ볯芙雩ꒂ菣궂菣馃菣袃臣膀볯躼볯캐貽臣늼볯醼꒼볯膽뷯薽苣뮷諥鞁胣ꆬ臣ꞁ볯鞼蓢ꞁ볯閼裥鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀볯邼볎뷯꺁볯ꖼ볯醼볯趽볯袃菣릂뷯ꢼ볯躼볯込볯趽볯꺁볯꒼볯ꆼ뷯ꢼ볯躼볯覼苣뮷諥鞁胣랷郥ꦉ苣꒼볯颼볯馴臣钃菣莃菣鞁臣芀껦誂臣뚺뛦銂볯覽뷯銽뷯莽뷯躽裢閼볯邙ꓥ뺿臩ꚃ菣莃菣ꮁ단랍臣膀菣궃苣ꦃ菣醼볯銂铧蒁臣릂菣뎃臣鮁臣袼볯蚈雩覼胣뺿臩ꚃ菣莃菣銂곧銼臣ꆮ臣覤迦鞁胣鞃菣낂菣ꂃ볯銂铧蒁臣릂菣뎃臣鮁臣袼볯蚈雩覼胣肜뗧麛迥릂菣뎃臣貾胣醼볯邼볎뷯꺁볯ꖼ苣뮷諥鞁臣芀볯캑貽臣肜뗧龔裦ꦉ苣꒼볯颼볯馴臣钃菣莃菣鞁볯趽뷯꺁볯覽뷯蚽뷯閽뷯銽ꦼ볯ꞁ闦袁臣芀戼㹲鞃菣벃菣銂볯ꊼ볯込냥ꂴ苣ꮃ룤ꞁ뗨覂臣龁胣醼裢鎼볎뷯꺁菣궃菣隃迥꾁볯캕貽臣늼볯ꆼ궼뷯讽볯ꦼ볯銂볯캓貽臣ꂲ跨邃菣閃苣벃臣뮷諥鞁臣芀諥놆菣궃菣꾂룤ꞁ볯閼蓢ꮁ볯蚈雩ꂊ蛧鞁臣貾胣늂菣銂跥Ꞻ臣랰룤ꮁ뷧蒁臣芀苣ꮃ臣Ꚃ苣ꮃ苣閃菣莃苣뎃苣鞁胣ꚩ雦銂단랍臣膀볯颼볯銈볯閼���鲃菣袃臣钼볯蚈雩낵苣鮁臣芀苣ꮃ苣떂菣뎃菣莃菣ꞁ菣莃菣鞁胣銈볯鞼蓢랆蟥龩蛥ꞁꏨ랼苣꾂菣벃菣銂賦ꒁ볯ꆼ볯閃苣ꮃ菣ꮁ볯芙雩讁苣芵ꓥ늜蟥鞁臣芀戼㹲邀볯閼볯閼胣㲑牢ਾ猼灵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰鎼볯㲓猯灵낼裢较苣隃菣莃菣ꊽ裦㲐牢ਾ볯躼蟥邵裥螉臣趉蟥蚐戼㹲릂菣ꒂ菣銂蛥趇ꧦ讁苣随苣몇臣膀苣ꮃ菣讃苣ꂃ菣것苣ꮁ藩꺽臣ꚁ껥ꦸ臣閼裥鎖꟨趇臣龁胣袃菣ꒂ苣閼볯莄臣ꒂ菣궂菣馃菣뾂臣閼裥鎖藩꺽臣ꚁ蟥邵苣鮸苣鞁臣芀苣ꦃ苣覃苣뢒냦閃菣覃蛥ꮁ臣蒁臣钼볯醃菣鮃菣ꂃ苣ꮃ菣銃菣궸臣閼裥鎖鯥骮臣膀볯躼볯颽볯뎼볯ꞁ볯蚈雩꒮룦ꞁ듦蒵臣龁볯銼볯趽뷯₌볯邼뷯뎼볯ꎼ讼馼볯閼뷯貽뎼볯₱볯㲨畳⁢浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲒猯扵꾼볯芀볯躼볯캕螽볯趽뷯꺁菣궃菣ꒂ菣벃苣궸胣鎼볯莄臣醼볯蚈雩꺁蓨뾂菣醃苣꺁뻥袼볯閼볯ₐ뷯貽臣袺若ꂊ蛧늼볯膽뷯薽蓧鞁볯꺼뷯鎽뷯邃菣閃苣벃룤꺁볯邼趽뷯込뷯貽苣袃菣꾂볯銼볯閼볎뷯覼胣螈觧銂볯躼볯颽볯뎼볯ꞁ볯邼裥鎖껥ꦸ臣鞴뗦鞁臣芀裥螉苣膀볯邼볯膀볯閼볯膀볯邼볯薼苣뾂菣벃菣궸胣蒐볯蚈雩놄냦鞁臣芀戼㹲ꊼ볯醃菣閃苣뎃賥讟裥螉臣趉蟥蚐戼㹲릂菣ꒂ菣銂蓨醃菣閃苣뎃臣膀볯놼ꢼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢볯궸臣超뷧鞁胣銼뷯뎼볯ꎼ臣꒮룦ꮁ臣蒁臣蒐胣閼裥鎖볯麛菣뎃苣鞁臣芀裥螉苣銼볯캐螽볯趽뷯꺁菣궃菣ꒂ菣벃苣ꮼ볯銼볯邼뷯貽臣늼볯膽뷯薽蓧鞁볯꺼뷯鎽뷯邃菣閃苣벃룤醼볯ₐ뷯螽볯趽뷯銂볯邼볯캐貽볯鎼볯莄胣醼볯蚈雩覼裢銃菣骃迥꾁볯颽菣궃菣ꒂ菣벃苣ꮼ볯銼볯邼뷯貽臣늼볯膽뷯薽菣莃菣ꆂ菣궸볯邼볯캐貽胣鎼볯莄胣鎼볯蚈雩覼裢鮃菣麃菣뎃뗧钹臣놄苣뎃菣꾂臣龁胣骶臣邼볯閼뷯뎼볯ꎼ臣꺁菣뎃苣誏臣놄냦꾁룤風臣袂臣ꮁ껥붖臣龁胣㲂牢ਾ볯躼菣것菣ꒂ菣ꪃ菣覃賥㲖牢ਾ苣ꦃ苣覃苣ꊼ뷯颽菣莃菣ꆂ菣袼볯颽볯뎼볯膀볯邼볯鮃菣ꂃ苣龃菣覼裢붣鋥뺿듧ꞁ裥銂뷤ꎁ臣鞃菣릂菣莃苣鲃菣꾂苣ꮁ룤릁臣芀뗧钹苣閼볯캐貽臣较苣隃菣莃菣ꊽ裦邃菣閃苣벃볯鎼볯鞼볯螽菣궂苣袃菣뎃ꇧ뢅볯隼뷯貽볯놼ꢼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢볯覼臣ꮢꛨ鞁胣鲃菣蚃菣꾂苣鞁胣궂菣莃菣銂ꓥ鞁臣銼裥鎖菣ꒂ苣궃돦ꞁ諥놆臣龁胣랰룤ꞁ蛥뒍臣龁뻥膀볯颼볯鞼볯趽뷯꺁菣ꮃ菣ꊂ菣覃胣鎼볯鞼볯趽뷯꺁볯邼뷯뎼볯ꎼ迥뎁볯趽뷯꺁볯놼ꢼ猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銼⼼畳㹢볯銂럦ꂊ臣膀뗧钹苣꾉臣鲃菣蚃菣꾂苣鞁胣���볯莄臣醼裢钼駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣鞁臣芀戼㹲꒼볯较苣隃菣莃菣ꊽ裦㲐牢ਾ苣ꦃ苣覃뷥龁苣醼볯邼뷯醼볯㲐畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯㲖猯灵莽뷯趽臣鞃菣벃菣誏臣醼볯邼볎뷯꺁뷯늼볯ꆼ볯閼볯趽뷯込뷯貽苣袃菣꾂볯銂볯閼蓢ꞁ볯蚈雩ꂊ蛧鞁臣芀苣ꦃ苣覃苣랰룤ꞁ蛥뒍臣膀苣ꦃ苣覃뷥龁苣钼볯캘貽臣较苣隃菣莃菣ꊽ裦邃菣閃苣벃苣뮷諥鞁臣芀菣ꮃ菣莃苣릂臣貾胣閼볯캐貽臣㲮畳⁰浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯鎼⼼畳㹰볯랷郥ꦉ苣릂菣ꒂ菣誸臣鞃菣较苣隃菣莃菣閼볯캐貽臣뮷諥鞁臣芀苣ꦃ苣覃苣閼볯莄臣芵ꓥꒂ菣궂菣馃菣袃臣龁胣㲂牢ਾ볯躼듦蒵볯㲚牢ਾ듦蒵臣膀볯颽볯뎼볯膀볯꒼볯ꆼ臣銼뷯醼볯蚈雩膀껥ꦸ臣龮雦鞁볯钼볯邼뷯貽臣銼볯颽볯뎼볯讼볯隼뷯貽臣邼볯銼볯궼胣ꖼ볯뒼볯膀볯蚽鶼钼볯覼胣ꆬ臣ꞁ볯꺼뷯鎽뷯ꆼ蟥蚐苣鎼볯莄臣鎼볯蚈雩財臣龁볯銼볯邼趽뷯₌볯꺼뷯鎽뷯邃菣閃苣벃룤醼볯ₐ뷯螽볯趽뷯銂볯邼볯캐貽볯銼볯캐螽볯趽뷯覼胣릂菣ꒂ菣銂볯颽볯邼裥鎖胣ꖼ볯뒼볯ꞁ껥ꦸ臣誁臣ꚁ듦蒵臣龁胣誷룧Ꞁ듦蒵鷦뚻臣ꆬ臣骀苣骼볯閼蓢ꞁ볯芙雩膀볯躼볯颽볯뎼볯膀볯꒼볯ꆼ볯銼볯趽뷯꺁볯邼뷯ₘ볯뎼볯讼볯隼趽뷯꺁볯꒼볯ꆼ胣뚼猼扵砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰蚽⼼畳㹢볯钼볯覼胣㲂牢ਾ볯躼苣ꪃ苣貃苣것苣膃菣㲉牢ਾ臣鎁臣讖ꓧ鞁臣꺨胣꺁볯꺼볯超裥ꮁ臣蒁臣ꒂ菣떂苣蒃裥邞苣龮雦鞁臣芀臣貂苣꺁裥邞臣ꢔ臣龁苣ꪃ苣貃苣것苣膃菣꾁胣鎁臣ꮁ雩몤臣龁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣覂듦龔臣龁苣꺁臣膀룤겈髧ꮁ듧钼볯讁苣閼볯貃苣것苣膃菣꺁闩閁臣芁苣芀戼㹲邀볯閼볯隼胣㲑牢ਾ볯躼뗧鲞戼㹲鎁臣ꮁ雩몤臣龁꣧薀臣꒼볯ꆼ藩鞈臣ꒁ臣ꚁ苣뎃苣ꒂ菣蚈黦銂껥붖臣龁胣鎁苣覂臣蚈黦꺁뗧鲞臣膀믤许臣骀苣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ볯醼볯꒼볯ꆼ볯馼볯邼볯銈볯醼볯銼볯낼볯꾼볯邼볯覼戼㹲躃藥骼戼㹲龻ꫩ龎鿥꺁룧袼뻤袁臣隤룧ꢑ뻨覼臣誁臣讂駧늂룤꺁룤ꊂꫩ膀駧늂룤꺁藨膀ꇨꆮ맥ꆾ胩ꒋ迥뎁듧麃賥ꮐ駧늂룤꺁ꫩ베귧训듧麃迥뎁귧ꆮ臣誁臣讂룤ꊂ駧뺏胣몙迧꾁胣ꢪꯧ꺁裦랕鷦ꞁ苣뎦꿥閁苣龁胣몙臩궸臣ꪃ菣醃꿧꺁釥膸듦ꮁ臣醁苣ꪃ菣醃꿧몙迧芀菨명髧ꪳ臣ꮢ蛨许ꃩ龟臣誁臣讂菨명駧뺏胣誁臣覂臣膀ꋨ鲆룤薆髧내菨袏臣鎁臣颠鿥ꞁꛨ覂苣讂ꋥ隮룤꺁뫤趇菣겂菣ꎂ菣뢃藨꺁臣骁苣讁胣뺄蟨꾁菣겂菣ꎂ菣ꞁ臣讂胣뎹믦训臣誁臣讂냦ꆮ駧뺏胣꺚돨讃菣벃菣뎃臣誁臣讂蓨袼냥뎄髧ꪳ볯薗럥몙迧芀蓨蒫臣趃苣蚃���隃胣뎹믦训臣誁臣讂냥뢅駧뺏胣는諧명裢는諧명蛥꺚苣誶臣讂룤겈賥몙迧芀觥躅臣趃苣蚃苣隃胣ꆮ鷦내菨ꮁ臣醁苣鶂蟨몙迧芀ꏥ뎹믦训臣誁臣讂菨몙迧芀뇩뚊蛥꺚臣몟뫥꒱臣誁臣讂菨邅髧骆駧뺏胣蒠ꓩ鲆뗧鮯臣莃藨내菨ꮁ臣醁苣떆蟨몙迧芀该袄迥뎁鷩袄臣膣臣誁臣讂듧몙迧芀戼㹲뎂菣뎃菣骼駧뺏菣뾂菣뎃臣膀볯늼볯銼볯邼臣내菨蚈賥込ꋥ隮臣ꮐ臣貂臣蒁苣鎁臣銂ꓧ蚔臣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾꯩ몙迧꾁믤许臣颻諥蒚菩趽臣뎦꿥閁苣龁볯膃菣醃菣뢂菣떍럥銈裦龆냥麃臣蚡닧鲆듧麃胣躽볥ꚺ苣낂菣ꮃ臣薌蛨내菨ꞁꛨ龯臣貂臣芀菣뎃菣뎃苣벃룤꺚냥鎽裢뮸듧麃藥鎽臣颫駧뺏胣銃菣躃藥뺲럥銈駧늂룤꺁듧ꆮ苣늛苣鎖돨내菨ꢅ뷤ꮁ룤讨뫥꺁駧뺏胣銃菣躃藥몂裢몙苨궸臣鞰껧꾔臣龻ꫩ내菨ꢅ뷤꺁ꯩ몙迧膀迥뎁裥邲臣ꚁ臣讂냦ꆮ铦薆髧ꮁ臣醁苣躽菣馃菣몙迧芀藨鎇듧麃胣莃藨誏臣邵藨覂藨ꞁ臣릉껥꺁駧뺏臣뎦꿥閁苣ꪁ臣ꎁ臣芀ꧨ鎨臣龁菨邅뗧钹볯ꖼ볯銼裢ꖼ볯隼胩覼臣ꖻ룤銂郥肂볯躃鯧膀蟨꾸胣鶂蟨膀藨鎇胣꾉藨膀铧뚊藨膀苨膀뿥鎇胣Ꞥꇨꆮ胣龣臩膀菨膀냥뢅胣뺄蟨膀菨명胣떆蟨膀蓨膀鳧膀蓨蒫胣鎽ꏥ膀ꫩ꒛胣誏臣许苨芀ꧨ鎨臣龁裦몺뗧钹臣骼苨鎇胣躅蟨膀觥躅胣莿귧꒱胣Ꞥ该袄胣뺄蟨膀菣뎃菣肯胣떆蟨膀苨膀髧骆胣Ꞥ蓨꺚돨袼뷯趽볯膀뗦겦볯銽뷯覼胣辰蓨袼뷯趽볯膀駩躌胣벜胣肆菨膀菨膀菨뢅苨ꮅ胣邵藨膀뗧뢅苨ꮅ迥뎁ꫩ꒛苨ꮅ苣ꮐ苣芀苣뮂菣龃菣閃苣뎃볯膽뷯薽뷯辽뷯覽뷯辽뷯袽뷯覼臣鶂蟨鲚껥誏臣鶂ꇧ覤苣颪駧鞁臣芀戼㹲袼볯覼볯꺼볯鎼볯颼볯鞼裢醼볯鎼볯袼볯늼볯銼볯颼볯㲉牢ਾ菨邅냥뢅胣躃藥뢃藨膀菣뎃菣뎃苣벃菨뢅蛥꺚苣ꮐ苣骤闦꺁蛥꺚藥鎽臣躽菣馃菣꺁駧뺏胣몙迧꾁胣릹듧麃駧꺁苦Ꞁ듧麃藥鎽臣节ꛨ覂苣龁胣躃藥뎄胣꺚돨ꢅ뷤꺁駧뺏胣蚈룥꾁飦覂臣ꪁꧦ붃苣몤铥鞁臣蒁臣蒁胣ꚩ꣩鞁臣銃菣躃藥蒵맧袼볯醼볯銈볯醼볯놀볯꾁볯躃鯧膀蟨꾸胣鶂蟨膀藨鎇胣꾉藨膀铧뚊藨膀苨膀뿥鎇胣Ꞥꇨꆮ胣龣臩膀菨膀냥뢅胣뺄蟨膀菨명胣떆蟨膀蓨膀鳧膀蓨蒫胣鎽ꏥ膀ꫩ꒛迥뎁룤ꊂ苣ꮐ苣芀ꧨ鎨臣龁裦몺뗧钹臣膀藨鎇볯ꎭ룥誏臣ꮜ鳦覼胣肆菨膀觥躅胣뺄蟨膀菣뎃菣肯胣떆蟨膀苨膀髧骆胣벜볯늶蛨銂郥肂볯膀뗧뢅胣肆菨膀苨鎇볯ꎭ룥膀苨겡ꓥ膀胦Ꞁ룤ꢅ볯膀뿥鎇胣躅蟨꺁飦내菨貙胣莃藨명駧膀뗧뢅鯧뢅駧銂郥肂胣ꚩ꣩鞁臣麝菣袃鳩랕ꇩ蒵맧꾁믤许苣ꮐ苣骼菣뎃菣뎃苣���뗧钹볯뺔뛦명胣莃胣는諧명胣릅铧뚊藨膀裨膀菨명胣떍럥膀菣뎃菣肯胣ꮜꋦ麥뗧芀苣ꮂ苣뚂菣蒵맧骼ꓥ뎄髧ꪳ胣략ꛩ膀냥뎄胣낙賨芀戼㹲袼볯覼볯꺼볯钼볯邼볯醼裢醼볯閼볯袼볯늼볯銼볯閼볯㲉牢ਾ뷤것菣ꮃ駧뺏臣膀ꫩ꒛迥뎁菣Ꚃ苣躃藥鶂蟨꺁胩股듧麃臣뎦꿥閁苣龁胣銃菣躃藥膀裦몺迥꾁菣뎃菣뎃苣벃菣뎃菣肯臣蒁臣貂臣节駧뺏臣鲤蟥閁苣骁胣銃菣躃藥袏臣銃菣邈뫤뺄蟨ꞁ駧뺏臣鲤蟥閁苣ꪁ臣ꎁ臣芀ꧨ鎨臣龁菨邅뗧钹볯ꖼ볯銼裢ꖼ볯隼胩覼臣ꖻ룤銂郥肂볯躃鯧膀蟨꾸胣鶂蟨膀藨鎇胣꾉藨膀铧뚊藨膀苨膀뿥鎇胣Ꞥꇨꆮ胣龣臩膀菨膀냥뢅胣뺄蟨膀菨명胣떆蟨膀蓨膀鳧膀蓨蒫胣鎽ꏥ膀ꫩ꒛迥뎁룤ꊂ胣ꚩ꣩鞁臣邈뫤蒵맧骼苨鎇胣躅蟨膀觥躅胣莿귧꒱胣Ꞥ该袄胣뺄蟨膀菣뎃菣肯胣떆蟨膀苨膀髧骆胣Ꞥ蓨꺚돨袼뷯趽볯膀뗦겦볯銽뷯覼胣辰蓨袼뷯趽볯膀蓨鞢ꇥ袼菣袃볯膀ꓥ뎄볯銃菣覼胣낙賨膀鳧膀蛨놃胣莃胣莃駧膀뗧뢅胣邵藨貙胣는諧명볯膃菣醃菣뢂菣覼胣꾉铧뚊藨袼菣뎃菣뎃苣벃볯膀跥ꎷ볯膃菣醃菣뢂菣覼迥뎁믨ꢪ苨ꮅ胣ꊂ苣袃菣躃菣Ꞃ菣꾁苨鎇髩뎮迥뎁苨겡ꓥ銂ꫨ몙臣龁胣㲂牢ਾ胣邼볯馼볯醀戼㹲袼볯覼볯꺼볯鎼볯閼볯鎼裢醼볯馼볯袼볯늼볯銼볯鎼볯㲉牢ਾ菣Ꚃ苣骃髧骆臣薆髧ꢅ뷤ꚸ臣ꮁ菣袃菨邅髧骆臣몟뫥薆髧誏臣誸髧ꢅ뷤꺁駧뺏胣膃菣醃菣뢂菣貈臣鞱諧颲蛨꺁鿥閺蛥꺚菣莃苣袼뷯薽뷯鎽볯节菣뢂菣ꎂ菣ꞁ臣ꎁ臣芀菨邅藨鎇臣몙苨궸臣뢳郧鎽胣邈뫤躅蟨내껧膀迥뎁鳦龜藨鎇雧ꎂ臣貀铧뚊藨隌胣薆髧꺁듧麃臣떂菣뮂菣袃藥鎽臣몙迧膀藨내菨貙胣誁臣覂臣薆髧내菨ꢅ뷤꺁뷤몙迧芀菨邅苨꺁雩ꪳ듧麃藥鎽臣躽菣馃菣몙迧芀菨뢅藨꺁藥꾫菩蚈臣誁臣讂雩ꪳ듧麃藥鎽臣몙迧芀菨邅냥뢅뗧鮯臣몛鳦꒱胣ꎭ룥邵藨颲蛨膀迥뎁뗧뢅駧ꮁ臣醁苣鎖돨내菨ꢅ뷤꺁ꯩ몙迧芀苨ꮅ臣銃菣뎃賥袼뷯馽뷯膽뷯覽뷯薽뷯覼铦ꪳ臣誁臣讂觨Ꞁ뗧袐뗧钹듧麃藥鎽臣랼臣몙迧芀菨꒛뗧鮯迥뎁蓨꒵ꯩꮁ臣醁苣꾔돨내菨ꢅ뷤꺁駧뺏胣뎄臣誁臣ꚁ臣膀髧ꪳ菣ꖃ菣궃菣ꢅ뷤꺁駧뺏胣몙苨궸臣ꢪ苣늛苣邵郥蒵맧誏臣躃藥꺁ꗧ貵黩내菨ꢅ뷤芀ꧨ鎨臣龁菨邅뗧钹볯ꖼ볯銼裢ꖼ볯隼볯꾁믤许苣ꮐ苣骼菨꒛胣趇룥膀苨鎇胣躅蟨膀觥躅胣는諧명胣몂胣莿蟨膀ꓥ股껧膀ꏩ鎁胣莃胣辰藨膀蓨鎇胣뢃藨膀蛨鎇胣뎄胣벜胣誄ꯩ膀뷤膣胣ꢪ鯧誏臣许苨芀ꧨ鎨臣龁裦몺뗧钹볯鶂蟨膀藨鎇胣꾉藨膀뿥训뇥膀ꓥ開蓨膀蓨鎇胣ꪃ���醃꿧膀觥讫藨膀苨膀髧骆胣Ꞥ蓨꺚돨袼뷯趽볯膀뗦겦볯銽뷯覼胣벜胣莃胣莃駧膀뗧뢅胣邵藨貙胣는諧명볯膃菣醃菣뢂菣覼胣꾉铧뚊藨袼菣뎃菣뎃苣벃볯膀跥ꎷ볯膃菣醃菣뢂菣覼迥뎁믨ꢪ苨ꮅ胣ꊂ苣袃菣躃菣Ꞃ菣꾁苨鎇髩뎮迥뎁苨겡ꓥ銂ꫨ몙臣龁胣㲂牢ਾ苣ꮃꓥ뎄髧ꪳ臣隤뇥袼볯誏臣ꦼ볯覼臣誁臣讂ꓥ낕臣내菨ꮁ駧뺏臣颭鳥鞁臣芀苣誂럦蒁髧ꪳ뇥꺁듧麃臣辰臣ꪁ苣隃苣莃菣节胣鎁臣놂菣ꮂ苣뎃鯧貐뷤꺁뷯늼볯ꆼ苣몙迧鞁臣芀뗦겦臣蚈귥꒱蛥꺁闦놹듧麃迥뎁귦뚊鯥꺁蛥ꢃ뻨膸臣莢闧꾁苣ꊃ苣ꒂ菣뢛郥鎽뷯늼볯ꆼ苣ꮐ苣ꞁ臣龁胣Ꞥ蓨꺚돨薆臣꾁駧뺏臣鲤蟥閁苣ꪁ臣ꎁ臣芀苣ꊃ苣ꒂ菣뢛郥鎽駧뺏臣膀苣ꊃ苣ꒂ菣뢛郥鎽臣ꎭ룥ꮁ駧뺏臣貂苣颠鿥ꮁ臣蒁臣내菨뮭臣략臣ꎁ臣鞢ꇥ뎄臣꾁ꛨ龯臣貂臣讁臣龁胣鎁臣鞃菣벃菣꾁胣Ꞥ蓨꺚돨꺁ꓥ꒱臣讃菣벃菣뎃臣떂菣뮂菣袃臣麃菣ꮂ菣ꢁ臣ꚁ迦鮾臣貂胣讃菣벃菣뎃꟧開髩뎮苣躘苣讁臣ꞁ臣讂胣낕룥ꪁ菣ꖃ菣궃菣뮧该꾁胣뺹臣讁臣몙뷤Ꞁ雧ꎂ迥뎁닧麥裥芣韧꺁軥ꂛ臣ꪁ苣蚁苣芀臣꺁뷯늼볯ꆼ臣蚈룥꺁苣誂苣蒁郧ꎧ苣莿胩馁苣龁苣ꮁ胣醈胣꾁胣鎁臣鞃菣벃菣貁菣Ꚃ苣뎄뗧钹臣꒺럥较苣隃菣莃菣ꊽ裦馁苣讁郥讁苣ꚩ꣩鞁臣芀戼㹲뺁臣膀铧貾볯낼볯醼볯ꖗ迥뎁裦龆菣Ꚃ苣뎄蛥ꮁ苣뎃菣ꪃ苣ꖃ菣ꒂ菣낂볯覽뷯钽뷯覽뷯閽뷯躽뷯覼迥뎁觧骮臣较苣隃菣莃菣ꊽ裦銂ꓧ鞁臣芀볯醼볯麃苣릂臣醼臣꺁鿧뚊裥궖臣誁臣ꚁ胣략ꛩ꺁裥邭뇥誏臣꾭諧麛臣薆뻨膸臣ꎕ매鞁臣랼臣랂苣誃菣貁ꛨ龯臣貂臣芀菣것觩뚊鯥ꮁ臣醁苣내菨꾁룤讨뫥ꮁ꣦颭臣貂볯랂苣誃菣꾁볥蒁룥궸苣膀뻥ꢃ鷦뚊髧ꪳ臣隤뇥銂胩ꎁ臣貾ꃩ꺚돨뺁臣뢼臣膀臣鎁臣랂苣誃菣꾁菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃菣馃菣꺁뷤许臣讂胣鶃苣蚃苣隃菣ꖃ菣궃菣꺁냥뮂菣袃臣낼볯邼臩開髧ꪳ臣놷臣颠鿥ꞁꓦ몇臣貂臣芀볯醼볯꺚돨꺁ꓥ꒱蛥꺁菣ꖃ菣궃菣꾁菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃苣誶臣讂苣낂菣ꮃ苣몤臣ꪁ臣ꎁ臣芀룤讨뫥꺁菣ꒂ菣ꪃ菣覃뷥邈苣낂菣ꮃ苣许룤ꞁꓦ몇臣貂臣芀裦龆菣Ꚃ苣뎄臣誁臣讂苣ꊃ苣ꒂ菣뢛郥鎽苣낂菣ꮃ臣膀闧ꪁ苣것菣ꮃ臣鎼臣꺁蛥뚊雦ꊝ臣閩뻤鞁臣芀볥蒁苣낂菣ꮃ臣钚ꏥ誏臣让ꃦ꺁闦놹菣ꖃ菣궃菣誏臣覸迥麥뗧꺁臩開ꃦꞁꓦ몇臣貂臣鮼룤讨뫥꺁苣낂菣ꮃ臣략ꛩ꺁裥邭뇥誏臣貾菩뾝諧꺚돨꺁ꓥ꒱臣讦苣貂臣芀戼㹲邀볯閼볯颼胣㲑牢ਾ볯閼볯꒼볯ꆼ볯馼볯鞼볯銈볯銼볯鎼볯낼볯꾼볯馼볯覼戼㹲���躃藥誏臣邈뫤蒵맧ꞁ臣莺꿧ꪁ駧뺏胣꺨胣꺁菨邅迥뎁裦몺蛥꺚胣ꢪꃦ誏臣莿귧膀駧钁룤꺁볯늶蛨銂郥肂볯誏臣邈뫤ꎼ볯뎼胣는諧명蛥꺚胣躃鯧ꢵ꿦膀ꇧ覤臣鶂듧麃迥뎁苣뮂菣ꊂ菣躃菣Ꞃ菣颪駧銯듧ꞁ駧뺏臣龁胣몙臩궸臣ꢪꃦ뮳臣龻ꫩ내菨ꮁ臣蒁臣颫뫥ꮁ駧뺏臣貂臣芀藥몙迧醃苣벃菣꾁胣貮藥ꮁ蟩螤臣ꚁ臣ꪁ臣貁볯뢳郧鎽臣몙迧鮁臣膀볯꺼볯ꞁ苣誂뫥辁駧뺏臣讂볯膀볯ꖼ볯ꚼ臣麝ꇩ벼臣꾁臣蒁胣鎾臣ꚁ胣낖蓨ꆮ뷥邈臣誁臣讂迥붃臣립觥貁胨袁苣貂苣릁臣ꞁ臣讂胣ꚩ꣩鞁臣銃菣躃藥蒵맧袼볯醼볯銈볯醼볯놀볯꾁믤许苣ꮐ苣骼菨꒛胣趇룥膀苨鎇胣躅蟨膀觥躅胣는諧명胣몂胣Ꞥꇨꆮ胣莃胣辰藨膀蓨鎇胣뢃藨膀觥讫藨膀蓨膀鳧膀蓨蒫胣鎽ꏥ膀ꫩ꒛胣뺲럥膀迥뎁룤ꊂ胣ꚩ꣩鞁臣銃菣邈뫤蒵맧骼藨鎇볯ꎭ룥誏臣ꮜ鳦覼胣꾉藨膀蓨鎇胣ꪃ菣醃꿧膀蛨鎇胣몂胣벜볯늶蛨銂郥肂볯膀蛨놃胣鶂蟨袼귦뢸胣겡ꓥ膀胦Ꞁ룤ꢅ볯芀ꧨ鎨臣龁鷩銃菣誜闩麡뗧钹볯膃菣醃菣뢂菣蒵맧骼觥躅胣ꊂ苣늂苣ꮃ뗧钹볯Ꞥ軧꺚돨膀뗦겦胣辰蓨芀戼㹲袼볯覼볯꺼볯閼볯閼볯钼裢醼볯鞼볯袼볯늼볯颼볯颼볯㲉牢ਾ菨邅蓨蒫ꗧ貵꿧膀蓨蒫胣몙臩궸臣뢅菣ꖃ菣궃菣膀髧ꪳ胦讃菣벃菣뎃臣誁臣讂菣ꖃ菣궃菣내菨ꢅ뷤꺁駧뺏胣邈뫤蒵맧ꞁ臣膀ꇩ鞑臣몙迧貁ꛨ龯臣貂臣꾔룤꺁菩趽臣ꎭ룥邈뫤趉ꯧ명臣芁苣鮼臣貂臣趉ꯧ명듧麃ꇨꊝ菣뮂菣뾂菣馨髧鞊軥銂ꇨ몤臣蚁苣芀裦몺뗧钹臣誁臣讂駧뺏苣閁苣ꮁ觧뒾믤醁苣钠ꧧ꾁臩ꎭ臣芁臣龁臣鶀苣貂苣芀蓨ꪂ苨ꮅ臣誁臣ꚁ苣躽菣馃菣몙迧貁ꛨ龯臣貂臣芀ꧨ鎨臣龁菨邅뗧钹볯ꖼ볯銼裢ꖼ볯隼胩覼臣ꖻ룤銂郥肂볯躃鯧膀蟨꾸胣鶂蟨膀藨鎇胣꾉藨膀铧뚊藨膀苨膀뿥鎇胣Ꞥꇨꆮ胣龣臩膀菨膀냥뢅胣뺄蟨膀菨명胣떆蟨膀蓨膀鳧膀蓨蒫胣鎽ꏥ膀ꫩ꒛迥뎁룤ꊂ胣ꚩ꣩鞁臣邈뫤蒵맧骼苨鎇胣躅蟨膀觥躅胣莿귧꒱胣Ꞥ该袄胣뺄蟨膀苨膀髧骆胣龻ꫩ覂藨膀鳧膀菨膀菨貙胣邵藨膀뗧뢅駧膀苨내菨貙胣趉ꯧ명胣肆菨颲蛨誏臣蚃髥芀苣뮂菣ꊂ菣躃菣Ꞃ菣꾁胣鶂蟨鲚껥誏臣鶂ꇧ覤苣颪駧鞁臣芀ꧨ鎨臣龁苣ꮂ苣뚂菣蒵맧骼ꓥ뎄髧ꪳ볯銽뷯覼胣략ꛩ袼뷯趽볯膀냥뎄胣ꚩ꣩鞁臣膃菣醃菣뢂菣蒵맧骼铧뚊藨膀觥는諧명胣떍럥膀ꗧ貵胣貈胣뢃藨膀觥躅胣莃藨颲蛨誏臣뺔뛦명胣銃菣뎹駧誏臣ꎭ룥뎹裦蒵맧ꮁ臣醁苣랼볯Ꞽ裢醼볯랼볯뎼볯銈볯覼볯₌볯ꦼ볯銈볯袼볯ꦼ볯낼裢銼볯誏臣랼볯Ꞽ裢閼볯랼볯뎼볯銈���覼臣몙迧膀苨貙臣誁臣讂볯覽뷯銈볯誏臣邵藨貙臣誁臣讂볯覽뷯銈볯芀戼㹲邀볯閼볯馼胣㲑牢ਾ볯鞼볯꒼볯ꆼ볯钼볯邼볯銈볯醼볯鎼볯낼볯꾼볯鎼볯邼볯㲉牢ਾ菣袃菨邅뗧钹臣誁臣ꚁ胣躃藥뎄苣꒙臣ꚩ꣩鞁臣ꢅ臣꺁뗧钹臣膀该袄胣馝蓨膀꿦내ꇨꆮ迥뎁듦颧꿦내ꇨꆮ蛥꺚藥鎽臣랼臣릉闧蒚駧뺏臣颭鳥鞁臣芀귦뢸裦몺뗧钹臣꾁胣몙迧꾁뷤蒁臣ꆄ臣ꎁ臣貁胣몙迧貁迧貂臣뒠郥ꮁ臣袄껧讧胩ꮁꋧ趪臣貂臣芀裦몺뗧钹臣誁臣讂鳦节ꯩ蒁駧뺏臣膀苣ꮂ苣뚂菣뎄臣붙돨薆苣낵苣股껧꺁ꃩ龟臣芁苣銈臣꺁菣뾂菣뎃臣辄뻧꾁飦몢臣꾁臣蒁胣ꮅ飧袄껧讧胩銂郥肂ꓥ辁臣躂韧Ꞁ迥뎁髩뎮胦蒵맧꺁蓨ꆮ꟦ꂀ臣醐룤鞁臣몙迧貁ꛨ龯臣貂臣芀臣貂苣꺁뗧钹臣뺹臣讁臣꾁胣몙迧貁ꇨꆮ蛥꺚臣뾁臣몢ꫨ閁苣讂臣Ꚑ臣꾁룤躘臣芁臣龁胣ꚩ꣩鞁臣醼볯꺁苨ꮅ飧ꞁ臣膀苦Ꞁ蛥꺚藥鎽臣몙迧꾁ꛨ覂苣ꪁ臣ꎁ臣貁胣股껧몙迧꾁藨趘迥뎁髩ꖎ苨蒵맧꺁ꓥ辁臣뎦꿥閁苣龁胣궸꣧ꚺ臣躘苣讁臣麝觧낕髧ꪁ菣莃苣낂菣Ꚃ菣覃臣膀臣꺁菣궃菣隃臣膀菣ꊂ菣뎃賥뎂菣벃苣뎃迥뎁뗧钹ꏥ뮭臣ꢃ뷤ꞁꛨ覂苣龁胣鞁臣鞁胣뮂菣릂苣뎃菣궃菣ꮃ蓧鞁臣꾁胣鎁苣覂藥ꚁ臣랂苣誃菣貁鷩릉闧蒚臣芁苣鎁臣銂껥ꢅ臣몢臣膂苣꺁臣趸迥붃臣芁苣芀臣龁胣麝觧낕髧ꢁ胨袁苣貂苣뺹臣讁臣랂苣誃菣꾁胣膃菣醃菣뢂菣莃닧鲆藥鎽胣銃菣邈뫤肆菨꺁꟧財듧麃蛥꺚迥뎁菨邅뛧鲆臣讦苣貂臣芀戼㹲袼볯覼볯꺼볯钼볯隼볯钼裢醼볯鞼볯袼볯늼볯閼볯閼볯㲉牢ਾ볯꒼볯궼菣ꆂ菣ꪃ菣蚈귥ꞁ臣讂볯꒼볯궼醼볯袼볯꺼볯钼볯隼볯钼裢醼볯鞼볯覼臣몙迧꾁胣ꎭ룥銃菣骃胣몂藨趘胣ꎭ룥邵藨誏臣邵藨貙臣뎦꿥閁苣龁胣㲂牢ਾ볯馼볯꒼볯ꆼ볯馼볯馼볯銈볯鎼볯醼볯낼볯꾼볯邼볯醼볯㲉牢ਾ臣꺁볯겼볯鞼鯧貐뷤꺁駧뺏臣膀귦뢸裦몺迥뎁菨邅뗧钹迥뎁苧螗胣뮸臣ꊅ胦ꪃ菣醃郧躂韧銂賦ꒁ뗧钹臣覂臣讂菣趃菣ꞁꧨꆾ臣龁胣鎁臣醃菣ꮃ臣膀볯ꪃ菣醃郧鲽铧銂ꫥ讻볯몈뿦Ꞁ迥꾁飩뎮胦覼臣讂雦辦臣뾂菣醃苣ꪳ臣超雧銪믤뺖苦ꮁ臣醁苣몙迧醃苣벃菣銂觧낕髧ꮁꧨꆾ臣讂臣膂臣궨꣨鞁臣芀臣꺁苣뎃菣꾂돨꾁胣ꦼ뷯銈黨袐苣뎃菣꾂돨ꢁ臣ꚁ駧뺏臣貂臣뒠郥꾁胣銃菣랷郥ꪃ菣醃郧趏뿥袼볯겼볯覼臣誁臣ꚁ铧辇뻤颭髧ꮁ藥ꮖ裥肿胦ꞁ臣誂볯銼臣꺁闧ꪁ苣莿뫥袼볯躼볯薼迥뎁볯躼볯薼臣閼볯邼躽볯릂菣莃苣覼臣ꢔ臣覂苣龁臣趁胣馃菣릂菣ꒂ菣몈뿦螌闦袂苣銼볯閼볯誏臣醼볯���鞼볯ꢁ臣蚁ꋥꂊ苣龔臣讂胣膦韦骼駧뺏臣膀귧覂胣邈뫤꺁裦讂꣧꺁黥꺁맥醻귧誏臣銃菣躃藥꺁맥醻귧ꮁ裥邙臣貂臣芀菣袃裦몺臣誁臣讂駧뺏臣膀뗧뢅迥뎁菨ꊚ苣ꮐ苣ꆮ駥颮臣뎹믦训臣誁臣ꚁꧨꆾ臣貂臣芀ꇨꆮ迥뎁냦ꆮ铦꺁맥醻귧ꞁ臣몙迧閁苣ꪁ臣ꎁ臣芀菣袃裦몺ꫩ베귧꾁ꧨꆾ臣ꪁ臣ꎁ臣芀菨邅뗧钹臣誁臣ꚁ胣ꢪꃦ训胣鎽맥ꢪꃦ誏臣ꊂ臣誁臣讂룤讨뫥讁苣颫뫥꺁详ꎕ駧뺏臣芁臣龁胣뢅ꏥ꺁맥醻귧ꞁ臣놼臣몙迧貁臣ꎁ臣貁胣莿귧ꞁ臣몙迧閁苣ꪁ臣ꎁ臣芀駧뺏臣龁菣袃裦몺뗧钹볯邵藨膀藦Ꞁ苧螗胦뢅雧ꎂ苣膌臣閼ꓦ鎽臣誁臣ꚁ맥醻귧袼귧꒱볯ꞁ뷤것菣ꮃ臣ꆋ闦몙迧貁臣ꎁ臣芀菨ꊚ볯蚃髥꺁맥醻귧ꞁ볥讁苣躽菣馃菣꺁駧뺏臣芁臣龁胣몙迧鞁臣銃菣躃藥蒵맧骼ꫩ베귧ꮁ臣蒁臣궸꣧ꚺ臣ꆋ闦몙迧誏臣뎹믦训臣誁臣ꚁ볥讁苣躽菣馃菣몙迧貁臣ꎁ臣鮼菨邅뿥鎇迥꾁苨鎇胣뺄蟨膀볯꺼볯膀藨鎇胣뢅胣몂苣ꮐ苣隻臣뮻蓦꺁駥颮臣꾁駧뺏臣ꆄ臣ꎁ臣芀駧뺏臣ꆄ臣銃菣蒵맧骼藦Ꞁ苨붊藨躂韧誏臣ꊅ胦鞰껧꾔苧袼볯ꎂ胨覼臣몂胣ꮜꋦ麥뗧膀뿥鎇胣躃鯧膀苨鎇볯뺖苦骤蟩隃菣莃苣覼胣뎄볯Ꞥ蓨誏臣辰蓨覼胣膉ꇦ袼迥鲿胦躁뷥邈볯膀鳦ꊢ菣뎃菣肯胣뢃藨芀戼㹲邀볯隼볯邼胣㲑牢ਾ볯醼볯覼볯꺼볯钼볯钼볯隼裢醼볯閼볯袼볯늼볯鎼볯銼볯㲉牢ਾ臣꺁雦辦臣뾂菣醃苣ꪳ臣몙迧꾁胣꺨胣꺁菣袃迥뎁鷩銃菣誜闩麡뗧钹臣閩뻤鞁胣颫뫥ꮁ裥邙臣貂臣蒁苣鎁臣貁ꛨ몇臣貂臣芀駧뺏臣膀苨꺁苨麃菣꾂菣閃苣벃苣誏臣鶂蟨麴꟦鮯듧股껧꺁苣莃菣閃苣벃듧麃臣꺁臣颭鳥鞁臣芀臣貂苣꺁듧麃臣꺁駧뺏臣膀臣貂苣颭裥꾏菨ꪁ듧麃鯩ꎛ臣뮴胦隌臣貂臣ꢁ臣ꮁ鳦辄臣鞢諥鞁臣芀뗧钹菣꾂菣閃苣벃苣꺁臣貂苣銼臣꺁뫤蚛鯥꾁闧ꪁ苣ꢙ껥ꮁ뇥ꢜ賥鞁胣鶁苣覂臣麡볤꺁铧ꦉ귥蒚ꧦ붃苣覜臣讂胣鎁苣覂룤릖臣讞臣龣듧麃臣膀韧龎胣膀賥내菨誏臣뾂菣醃苣ꪳ苣ꮐ苣股뗦袏臣鞰臩讁苣꺁觧ꪳ苣꒙軥馁苣閃苣ꮃ苣벃臣鞁臣鲽铧鞁胣ꢁ苣ꮁ뫥蒯臣趇ꛨꪁ菣궃苧螗苣ꒂ菣ꮂ苣뎃苣蚈돦馁苣鎁臣貁臣趁苣芀苧螗胦몂볯鞼苦薀苣뎃菣ꮃ볯ꞁ臣膀駧뺏臣趏뿥Ꞁ苨麃菣꾂菣閃苣벃苣내菨蚛鯥ꮁ臣蒁臣閡釨ꞁ臣誂胣몂菨薆臣醼胥袏臣鶇鯩鎽臣颭鳥馁苣Ꞥ臣辁臣銝駧辁胣鞁臣鞁臣목菨銂賦ꒁ듧麃臣袂臣ꚁ껥뺁苣膀귦뢸臣麝迥鲿胦麃苣궃菣ꆂ菣뢂볯ꎭ룥떂苣몂臣颍룤꺁闦놹듧麃볯ꮁ臣蒁臣꾁볥讁苣趃苣蚃苣隃臣芁臣龁胣몂菨麃苣궃菣���ꆂ菣뢂臣꺁駧뺏臣膀臣貂苣꺁듧麃臣낕迥뎁苣ꒂ苣ꢁ苣ꮁꋥꞤ볯뮴胦隌볯鞁臣ꢁ臣膀苧螗臣鎖臣鞢諥鞁臣芀臣貂苣꺁뗧钹臣鎖돨躂韧誏臣鞰껧꾔釥몾菣뎃菣내菨躁뷥邈臣颠鿥ꮁ뗧钹郧貁귥ꢜ臣讂臣节雩辂苣骁胣몙迧꾁苨麃菣꾂菣閃苣벃苣ꮁ裥邙臣貂臣蒁臣芀ꓥ辁臣躂韧Ꞁ苨节맥蚈臣躂韧醊裥銂鳦鞁볯몙迧꾁ꗧ貵郥Ꞁ臣蚡닧莐臣颭鳥鞁臣讁臣龁胣鶂蟨ꮁ臣蒁臣꾁胣ꖀ胦궸뿥辰釨Ꞁꏥ뮭볯ꊂ苣袃苣龃菣閃苣뎃꿦Ꞁ볯袏臣讁臣誂ꇩ鞑臣肖蓨ꢑ鯥꺁苧螗苣膌臣鶂蟨ꮁ臣蒁臣趏뿥Ꞁ볯뮴胦隌苣莃菣閃苣벃듧麃臣랼臣몙迧貁臣ꎁ臣芀臣讁臣ꪁ臣覂胣ꎭ룥鶂蟨袏臣辩鋥讁苣궸꣧ꚺ臣辰釨躁뷥邈볯ꖂꓥ꺁臣銂賦ꒁ苨鎇臣誁臣讂苣莃菣閃苣벃듧麃臣꾁駧뺏臣ꆄ臣ꎁ臣芀跥ꆁ胣몂臣貐꟦ꮁ胣뮴胦隌볯趏뿥Ꞁ듧麃臣誁臣ꚁ駧뺏臣鞢諥貁臣ꎁ臣芀苧螗胦뢅雧ꎂ胣躁뷥邈볯趏뿥Ꞁ触莡迥꾁귦뢸菣뎃菣肯臣颭鳥馁苣蒵맧莐볯麃苣궃菣ꆂ菣뢂臣誁臣ꚁ胣鎁臣蚈귥꺁駧뺏臣ꆄ臣ꎁ臣芀藥ꚁ臣蒵맧莐苧螗迥꾁룥ꢜ胦麃苣궃菣ꆂ菣뢂鯩ꎛ苣ꮐ苣鎁苣覂臣蒵맧ꞁ駧뺏臣ꆄ臣鎁臣꾁胣몂菨麃苣궃菣ꆂ菣뢂迥뎁苨鎇苣莃菣閃苣벃듧麃臣鞁臣骮뻧閁苣讂诧릉臣麃苣궃菣ꆂ菣뢂苣隃苣莃菣蚛鯥ꮁ裥邙臣貂臣몙迧銂볥辁铦膌臣讂胣뺄蟨袏臣ꢪꯩ꾁胣閩뻤ꞁ臣ꪁ臣ꎁ臣芀ꓦ몇迥붃臣몙迧銂ꓧ閁臣讁臣龁ꧨꆾ臣龁菣袃뗧钹臣ꖻ룤銂郥肂볯躂韧Ꞁ藨뺖苦袼룤讨뫥讁苣趇韧꺁볯ꎂ胨떂菣鞃菣覼胣趏뿥Ꞁ臩ꊽ裦銂賦ꒁ触莡胣ꮜꋦꪃ菣醃꿧膀매겙髧骆볯辩鋥讁苣궸꣧ꚺ臣뺖苦銂賦ꒁ볯ꎂ胨떂菣鞃菣覼胣莿蟨膀鳦ꊢꗧ貵胣鲤蟥꾏菨ꪁ駧뺏苣몤臣ꪁ臣ꎁ臣閩뻤鞁臣膃菣醃菣뢂菣蒵맧꾁믤许苣ꮐ苣骼裨膀菨膀菨명胣㲂牢ਾ볯醼볯覼볯꺼볯閼볯醼볯隼裢醼볯钼볯袼볯늼볯鞼볯鎼볯㲉牢ਾꓥ낕臣蒵맧誏臣骤闦꺁듧麃黥ꮁ臣醁苣肸裨隌臣貂臣躽菣馃菣꺁苣낂菣ꮃ胣薆髧내菨몙迧貁ꛨ龯臣貂臣貁胣鶁苣꾁胣躃藥膀귦뢸迥꾁雧ꎂ뗧钹臣誁臣ꚁ룤膦臣릉뻥ꞁ臣ꪁ臣ꎁ臣芀菣袃뗧钹볯躃藥鶂蟨袼룤ꮁ苨내菨覼藥鎽胣몂胣꺚蛨膀觥躅迥뎁뿥鎇臣誁臣讂룤讨뫥꺁駧뺏胣躃藥뺄蟨膀냥뢅胣뎄迥뎁鳧꾁菣겂菣ꎂ菣芀裦몺귦뢸藨鎇胣肆菨薆髧膀苨膀觥躅胣떆蟨膀髧骆裢ꢅ臣趃苣蚃苣隃胣銃菣邈뫤鶂蟨袼귦뢸迥뎁雧ꎂ볯膀鳦龜藨鎇雧ꎂ臣躅蟨내껧膀蓨ꪂ뗧钹胣覂藨膀뗧뢅胣躅듧麃駧膀苨내菨貙胣鞱諧내菨貙胣麝菣袃鳩랕ꇩ蒵맧骼菣뎃菣���苣벃铥늶藨膀蓨ꆮ胣莃胣貈胣ꮜꋦ麥뗧膀菨명胣ꪃ菣醃꿧膀铧뚊藨誏臣릅铧뚊藨芀苣ꮂ苣뚂菣誄ꯩ꾁菣겂菣ꎂ菣膀髧ꪳ迥뎁뗦겦菣ꖃ菣궃菣꾁菣뢂菣ꎂ菣芀戼㹲邀볯隼볯醼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯鎼볯銃菣낼볯꾼볯馼볯鎼苣뎂菣覃臣讂뷯꒼볯ꆼ苣궃菣뎃臣颍鯩㲢牢ਾ껥붖뻤醼臣風볨鞁臣袂臣ꮁ胣邽뷯銽뷯邽苣ꢔ臣ꚁ믤꺁볯뎼볯超裥ꮁ雩ꎀ臣龁苣뎃苣뎃苣릂볯꺼볯超裥銂꟦覯臣龁胣鎁臣뎂菣뮂菣떂苣超裥꾁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣꒼볯ꆼ볯閼볯钼볯ꢁ釥趐臣貂臣芀臣讂ꃥ袐胣꒼볯ꆼ볯閼볯钼볯뎂菣뮂菣떂苣超裥꾁胣ꊼ볯ꆼ볯뒼臣낹苣钿臣떂苣꾂菣誏臣邽뷯銽뷯邽苣誸꣨ꞁꯨ颁苣貂臣ꖼ볯뒼藩鞈臣략뫦銂뷤ꢔ臣꾏菨ꪁ駩誂臣꺁볯꺼볯꺁룤鎖뷤뎂菣뮂菣떂苣超裥銂믥랕臣讂臣膂臣뾽铧鞁臣뚻闩閁苣龁룤鎖뷤뎂菣뮂菣떂苣꒼볯ꆼ藩鞈苣誂듦龔臣讂胣꒼볯ꆼ볯閼볯钼볯ꮁ鿥ꖁ臣ꚁ胣ꪂ菣뒂菣꾂菣ꪂ菣覃臣骼볯覼볯ꎼ볯ꮁ苣ꎁ臣뺯뇨ꢁ臣讂藩鞈苣ꮐ苣ꞁ臣龁뷯꒼볯ꆼ菣ꒂ菣ꦃ菣벃苣貐껥馁苣膀臣鞁臣銼볯낼볯꾼볯馼볯鎼臣龁苣꺁藥랕苣벃菣隌藩鞈臣꾂菣벃菣銂跥ꊛ臣讂臣膂臣鞃菣벃菣ꢁ臣ꚁ臣뾽铧꺁臣膂臣袐裦閁苣龁胣㲂牢ਾ볯ꎼ볯鞃菣ꒂ菣벃볯ꎭ迥뎁胩覼臣袐裦閁苣龁볯㲚牢ਾ귦릖郥꺁볯ꎼ볯鞃菣ꒂ菣벃胣閼胢銈볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ裢鎼胢㲙牢ਾ볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼戼㹲蚀雦醐臣낼볯늼菣ꦃ苣麃菣肀볯馀裢Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯ꆼ볯뒼볯ꎼ裢鎼胢㲙牢ਾ볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯覼戼㹲閁苣ꮁ臣膀郥邈苣ꪃ苣貃苣것苣膃菣较苣隃菣肃苣벂菣랂菣뎃菣궃菣隃苣膀믤许臣貃苣것苣膃菣超裥銂鳦馁苣뎂菣뮂菣떂苣꒼볯ꆼ볯閼볯钼볯超裥讁苣讧꿧鞁臣芀戼㹲较苣隃菣肃苣벂菣랂菣뎃菣궃菣隃戼㹲閼胢銈볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯ꆼ볯뒼볯Ꞽ볯ꎼ裢鎼胢㲙牢ਾ볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯覼戼㹲莽볯꺼볯ꦃ苣隃菣ꪃ菣꺁꟦覯臣龁苣꺁볯꺼볯貁菣袃菨邅蓨蒵맧讁苣颍鯩閁苣龁胣㲂牢ਾ룤風臣風볨鞁臣袂臣ꪁ跥ꊛ臣貂臣꾂菣벃菣꺁볯꺼볯랂菣놂菣랂菣낂臣膀藥랕볯늼볯钼볯馼볯鶃菣骃菣膃菣袼臣鎁臣誁臣ꚁ臣꒼볯ꆼ볯钼볯鎼볯銈볯隼볯馼볯ꚼ뷯螽뷯銽뷯₅볯銼볯膀藩鞈闧랏볯醼볯붼臣붑郥覼臣龁苣꺁藥랕볯꺼볯超裥誏臣뺴铧鞁臣낼볯꾼볯馼볯鎼菣ꪃ菣鞃菣覃臣龁苣꺁苣뎃菣꾂돨超裥銂룤袁苣���芀戼㹲誸꣨꺁郥骮臣貂臣ꢅ闩꾂菣벃菣꾁胣貃苣것苣膃菣趽뷧鎼볯閼裢鎼볯鞼臣躘駧ꪁ뿧뎨雩讧苧誏臣貃苣것苣膃菣趽뷧醼볯隼볯銈볯鎼볯鎼臣芵귦랂苣誃菣袼볯覽뷯閽뷯薽銼볯馼볯超裥ꪕ迥隼볯醼볯銂郥鎂臣芀뫤뎃臣貂臣鶃菣骃菣膃菣趉꟩鎽臣鎼볯銼苣龃菣뢅闩ꞁ胣誁苣鶁볯颼볯钼볯馼菣ꮃ菣뎃臣袨껧閁苣龁裥邭蟩誏臣誁苣鶁볯躼볯钼臣讦ꧧ节苣邽볯銂鳦馁苣芀볯覽뷯閽뷯薽볯鎼볯袼藩鞈闧랏볯隼볯銼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藥랕볯늼볯钼볯馼볯꺁裥邞臣膀蟩膦臣鶃菣骃菣膃菣覃菣ꒂ菣뢁룤袁苣貂臣趽뷧貁룤風臣風볨閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣誁臣袂臣ꞁ臣讂볯覽뷯閽뷯薽볯鎼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂꣧薀臣趇ꛨꪁ菣ꪃ菣鞃菣覃菣ꆃ苣뎃臣颭鳥銂飦몤臣讂胣꒼볯ꆼ볯钼볯鎼볯銈볯隼볯馼苣궃菣뎃臣醼볯馼볯뒹볯袜볯閼韦ꮁ볯뒼볯ꎼ臣蒯꣨閁苣膀볯뒼볯ꎼ꿥鞨闧랏뷯辽볯銼볯邼裢낼볯ꆼ臣躸臣覂苣龁胣㲂牢ਾ볯覽뷯閽뷯薽볯鎼볯袼藩鞈闧랏볯隼볯銼볯ꮁꓧ閁苣龁藥랕藩鞈臣ꆼ볯ꦼ볯꺼裢銼藩鞈苣ꦃ苣뎃菣뎃菣蚈黦銂铧蒁臣꒼뷯馽뷯辽뷯蚽菣벃苣馃菣릂볯邃菣뢂菣뎃볯閼볯钼볯ₕ볯鞽뷯鎽뷯낼뷯辽뷯ₔ볯閼볯꺁裥邞臣膀볯늼볯钼볯馼볯鎼苣龃菣뢅藩鞈臣ꖻ룤꺁볯膽뷯袽뷯蚽뷯超裥骼볯뾼볯邼볯醼볯銼볯겼볯궼볯뾼볯떼볯ꆼ볯鮼볯뾼볯邼볯醼볯鞼볯낼볯랼볯閼볯閼볯鮼볯閼볯閼볯醼볯꾼볯ꎼ볯뾼볯ꆼ볯鮼볯궼볯겼볯꒼볯꾼볯ꖼ볯꒼볯떼볯颼볯鞼볯뾼볯鮼볯鎼볯銼볯隼볯誏臣꺼볯ꆼ볯醼볯떼볯ꆼ볯ꢁ臣鎖臣超裥꺁鯧貐胦銂飦몤臣龁胣㲂牢ਾ胣邼볯邼볯醀戼㹲龮雦设볯钼볯骼菣袃볯늼볯醼볯閼볯膀볯늼볯鞼볯閼迥뎁볯늼볯鞼볯馼苣뎂菣覃臣讂뷯꒼볯ꆼ苣궃菣뎃臣颍鯩㲢牢ਾ껥붖뻤醼臣風볨鞁臣袂臣ꮁ胣隻臣ꖼ볯뒼藩鞈臣ꊖ胩鞁臣뎂菣뮂菣떂苣꒼볯ꆼ藩鞈苣讧꿧鞁臣芀臣꺁苣뎃苣뎃苣릂藩鞈臣ꦼ뷯莽뷯钽뷯ꖼ볯뒼苣궃菣뎃볯辽볯钼볯钼볯邼볯邼臣ꮐ臣貂苣ꖼ볯뒼藩鞈臣꺁雩ꮁꛨ龯臣貂臣뢛郥Ꞁ臣몟臣蒁臣膀볯躽뷯馽뷯薽볯뎼볯꾂菣벃菣꺼뷯躼볯銼볯銼볯馼볯銂迥鞾臣膀臣꺁賦ꖅ雦螉苣鞾臣超裥銂뇦骮臣龁胣뾌藥궖觧超裥貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣낼볯꾼볯閼볯馼볯ꚼ뷯螽뷯銽뷯銼볯銼볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼臣붑郥閁苣龁藥랕苣뎃菣꾂돨銂苣벃菣馁苣鎁臣貁駧讦臣貂臣芀賦ꖅ雦螉볯꒼볯ꆼ볯颼볯颼볯覼臣꒼볯ꆼ藩鞈臣膀볯覽뷯閽뷯薽볯鎼볯袼藩鞈闧랏볯隼볯鎼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾ룤���風臣龮雦设볯ꮁ꣨覼臣ꊂ菣ꦃ菣벂苣꾂菣벃菣ꞁ跥ꊛ臣貂臣莽볯꺼볯超裥꾁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣꒼볯ꆼ볯鎼볯邼볯ꢁ釥趐臣貂臣芀臣鞁臣膀볯꺼볯钼볯鎼볯醼臣膀藥놅臣ꖼ볯뒼菣벃苣벃菣벃苣袼뻤袁臣Ꞽ뷯躽볯膽뷯讽볯誏臣ꪇꓧ꺁볯뎼볯₴볯꺼볯螃菣뾂菣馃菣릂볯겼볯ꚼ볯뎼볯놼볯蚕鏥趐볯膀볯躽뷯馽뷯薽낼뷯膽뷯趽뷯莽뷯閽뷯覽뷯膽뷯鎽胣낼뷯貽뷯₏볯貽뷯辽胣ꎼ볯覼苣ꮐ苣ꂁ迧颭臣뢛郥Ꞁ苣貐껥馁苣龁苣꺁꣧薀臣몙迧超裥钽뷯螽볯ꖼ볯뒼볯螃菣뾂菣馃菣릂臣钯볨閁苣龁胣뢛郥Ꞁ臣鲤듧꾁胣뎂菣钃菣벃苣벃菣궃苣ꦃ菣ꊼ볯ꆼ볯뒼迥꾁볯겼볯뎼볯銼볯ꆼ뷯钽뷯袽뷯貽귧躼볯궼뷯钽뷯辽뷯鎽覽뷯₎볯躽뷯馽뷯辽뷯辽뷯馽銼볯隼볯钼볯邼裢钼볯邼볯醼볯馼볯覼볯銂뷤ꢔ臣ꚁ臣鎁臣辂苣龁胣ꊗ鿧꺁苣뎃菣꾂돨銂苣벃菣鞁臣蒁볯邼볯袏臣芁苣뒠郥꾁볯邼볯袏臣鶁苣ꖻ룤꺁볯겼볯뎼볯릂苣ꊂ臣ꪁ臣龁臣貂苣꺁꿦莼臣膀菣궃苣ꦃ菣貀뷯袽뷯銽뷯趀볯낼뷯覽뷯₌볯銽뷯薽뷯貼떼뷯覽뷯薽뷯鎽뷯钽뷯ₙ뷯蚽랼뷯鎽뷯覽뷯螽뷯辽뷯貼뎼뷯膽뷯钽뷯薽볯₌볯膽뷯袽뷯躽뷯钽뷯躽볯ꮁ苣ꎁ臣뎂菣뮂菣떂苣꒼볯ꆼ藩鞈臣ꢁ鯩膂苣貂뗧뾁ꯧꚁ苣貂臣芀臣貂臣覂뻥覂苣龁苣뎃苣뎃苣릂藩鞈臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ볯꺼볯钼볯钼볯颼臣붑郥閁苣龁胣꒼볯ꆼ볯閼볯閼볯뎂菣뮂菣떂苣超裥ꮁ鿥ꖁ臣ꚁ胣ꪂ菣뒂菣꾂菣ꪂ菣覃菣궃菣隃臣鲽苣貂胣誸꣨꺁껥붖뻤銼臣醃菣낂菣閃볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂苣蚁臣뾪ꏨ閁苣龁菣袃菨邅蓨袼볯ꦼ볯醼볯鎼볯ꦃ苣隃菣ꪃ菣꺁臩ꖈ臣뾽铧閁苣龁胣꾂菣벃菣뎃苣馃苣뾂菣꾁뷯늼볯閼볯袼뷯늼볯閼볯꾁胣邽볯ꮼ볯꒼臣趉꟩鎽臣뎼뷯覽볯ꢃ뷤銂郥뺁臣蒁볯ꢼ뷯貽뷯薽뷯覭볯貼볯莽뷯薽뷯莽뷯貼볯閼볯骼볯銼볯颼裢醼볯颼볯袼볯馼볯醼볯銂迥ꞅ臣鎁臣覼臣膀裥誂蟥閁苣龁뷯꒼볯ꆼ臣떂苣몂臣銼볯邼볯芽뷯袂苣辰臣蒁胣㲂牢ਾ볯ꎼ볯鞃菣ꒂ菣벃볯ꎭ迥뎁胩릖郥覼苣袐裦鞁臣骼戼㹲ꎭ雦醐볯ꎼ볯鞃菣ꒂ菣벃볯钼볯钼볯颼볯蚽뷯覼볯馀裢ꎼ볯ꆼ볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯ꎼ볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯뒼볯뒼볯ꆼ볯ꎼ裢鎼胢㲙牢ਾ볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼戼㹲蚀雦醐볯ꎼ볯鞃菣ꒂ菣벃볯钼볯钼볯颼볯銽뷯覼볯馀裢뒼볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯Ꞽ볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯ꎼ裢鎼胢㲙牢ਾ볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯覼戼㹲閁苣ꮁ臣膀郥邈苣ꪃ苣貃苣것苣膃菣较苣隃菣肃苣벂菣랂菣뎃菣궃菣隃苣膀믤许臣貃苣것苣膃菣超裥銂鳦���馁苣뎂菣뮂菣떂苣꒼볯ꆼ볯閼볯閼볯超裥讁苣讧꿧鞁臣芀戼㹲较苣隃菣肃苣벂菣랂菣뎃菣궃菣隃볯钼볯钼볯颼볯邽볯覼戼㹲閼胢銈볯뒼볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯Ꞽ볯뒼볯ꆼ볯뒼볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ裢鎼胢㲙牢ਾ볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯覼戼㹲邀볯隼볯鎼胣㲑牢ਾ藥랕苣궃菣뎃臣략뫦꺁苧꺁맥ꒁ臣꺁菣ꒂ菣ꦃ菣벃苣뢁裥馁苣龁苣ꮁ胣ꦃ苣隃菣ꪃ菣讁苣꺁볯꺼볯銂룤風臣貐껥鞁臣낼볯늼菣ꦃ苣麃菣뺯臣袂苣낼볯늼ꋥ薹臣袂臣ꚁ臩ꖈ臣龁胣鶁臣ꚁ胣붙胦꺁菣ꒂ菣ꦃ菣벃苣膀菣궃菣隃苣ꪃ苣貃苣것苣膃菣誏臣낼볯늼菣ꦃ苣麃菣꺁룤ꒁ苣銂뷤ꢔ臣讂볯늼볯鞼볯閼苣뎂菣覃臣讂苣궃菣뎃臣颍鯩ꮁ뷤ꢔ臣龁胣㲂牢ਾ藥랕苣궃菣뎃臣膀飦붙臣뮿꣨讖꟥趽뷧銂菣꾂菣ꪂ菣覃볯隼볯銈볯隼볯ꮁ賦ꆁ胣貃苣것苣膃菣趽뷧钼볯閼裢钼볯鞼臣讦蟥閁苣讂뗧ꊭ苣覃菣ꞁ뗧蚺臣讂跥肸臣ꪂ菣鞃菣ꪃ菣螃菣낂菣것菣ꂃ苣ꮐ苣ꢁ郥骮臣貂臣袼볯覽뷯閽뷯薽볯鎼볯鮼藩鞈闧랏볯隼볯閼볯芀뫤뎃臣貂苣鶃菣骃菣膃菣趉꟩鎽臣馼볯ꊂ菣躃藩랕臣膀臣誁苣鶁볯醼볯邼볯醼菣ꮃ菣뎃臣袨껧閁苣龁裥邭蟩ꢁ臣誁苣鶁볯躼볯颼臣讦ꧧ节苣邽볯銂鳦馁苣芀볯覽뷯閽뷯薽볯鎼볯袼藩鞈闧랏볯隼볯隼볯ꮁꓧ閁苣龁藥랕볯늼볯鞼볯閼藩鞈臣ꎧ黦꾁胣ꖻ룤꺁臣ꢁ苣躘ꓧ鞁臣骼듧ꊂ菣躃藩醼臣覂듧ꊂ菣躃藩銼볯꺁跥肸菣鞃菣覃胣蒴苣龃菣뢅볯銼臣覂듧ꊂ菣躃藩鞼볯꺁뷦ꢜ髧꺼裢낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤膀迥뎁듧ꊂ菣躃藩隼볯讁苣蒴苣龃菣뢅볯邼臣膃菣랂菣궂菣벃苣ꪃ菣뢅賥ꢃ뷤芀苣궃菣뎃볯꺼볯閼볯鞼볯颼裢醼볯馼볯꾁胣醼볯馼볯뒹볯袜볯钼韦ꮁ볯뒼볯ꎼ臣蒯꣨閁苣膀볯뒼볯ꎼ꿥鞨闧랏뷯辽볯銼볯馼볯鞼볯銂룤袁苣貂臣芀戼㹲ꢅ闩낼볯꾼볯銼볯꺁苣龃菣뢅藩鞈臣ꎧ黦꾁胣낼볯꾼볯銼볯貁臣覂苣讂韦ꖟ臣뾂菣醃苣ꪳ臣뺯臣ꚁ鳦辄臣超裥뢛郥Ꞁ苣覜臣ꪁ臣鎁臣銂ꓧ蚔臣讂胣鞁臣鞁胣꒼뷯馽뷯辽뷯蚽菣벃苣馃菣릂볯邃菣뢂菣뎃볯閼볯钼볯ₕ볯鞽뷯鎽뷯낼뷯辽뷯ₔ볯閼볯꾁胣낼볯꾼볯銼볯ꊂ菣躃藩超裥ꢁ믤许臣꒼뷯馽뷯辽뷯蚽藩鞈볯낼볯겼볯㲿牢ਾ볯겼볯ꆼ볯膀볯뎼볯낼볯늼볯뒼胣ꎼ볯겼볯鎼볯ꎼ볯뾼볯膀볯ꚼ볯醼볯銼볯钼볯醼胣ꦼ볯颼볯隼볯膀볯뾼볯醼볯钼볯颼胣낼볯낼볯邼볯銼볯膀볯뾼볯銼볯颼볯醼胣ꆼ볯钼볯銼볯誏臣낼볯랼볯邼볯馼볯ꢁ臣鎖臣芁苣讨뫥꺁鯧貐胦銂飦몤臣龁胣㲂牢ਾ���覽뷯閽뷯薽볯鎼볯袼藩鞈闧랏볯隼볯鞼볯ꮁꓧ閁苣膀臣鞁臣ꦤ蓧낼볯꾼볯鎼볯鶃菣骃菣膃볯ꚼ뷯螽뷯銽뷯銼볯隼볯超裥ꪕ迥隼볯颼볯銂苣벃菣馁苣꒼볯ꆼ볯銼볯閼볯貁볯薽뷯ꊼ뷯躽뷯讁苣鞾苣貂臣芀戼㹲邀볯隼볯钼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯閼볯鞏껥鎽볯ꪃ苣뎃菣뢛뫤鲽铧꺁郥骮戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣ꞁ臣膀迥릮뷤込菣겂菣覃鯧銺뷤ꢔ臣貐껥銂鯧蒚臣鞁臣膀꣧薀臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃臣鲽鳥蒚迥릮뷤蚈귥꺁菣趃菣ꢁ臣邵郥馁苣붃諥貁ꧨ鎨臣貂苣芀韦ꖟ臣鞏껥鎽臣꺁菣겂菣覃胣ꊗ鿧꺁菣겂菣覃臣꺁迥릮뷤袏臣낖ꛨ꺁迥릮뷤込菣겂菣覃꿥꺁郥骮臣膀뻤袁臣鞏껥鎽迥꾁菣겂菣覃苣몙迧馁苣鎁臣貁鿧覂苣ꚁ臣讂듧麃苣꺁铧ꦉ듦Ꞁ裥邭볯ꪃ苣뎃菣袏臣鞏껥鎽臣ꎀ뗧鞁臣蒁苣覼臣馨髧ꮁ臣讂臣ꢁ胣蒵裦ꦉ臣ꪃ苣뎃菣袏臣鞏껥鎽苣몙迧馁苣鎁臣貁軦骮臣貂苣내菨銂郥肂ꃥ袐臣ꪃ苣뎃菣袏臣鞏껥鎽苣銂郥肂臣ꢎ룦閁苣讂뗧邈觧꺁룤ꮁ菣겂菣覃迥꾁迥릮뷤꺁귥ꢜ苣鲤蟥馁苣몂臣鞏껥鎽迥꾁菣겂菣覃苣ꚩ雨ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣讂臣ꢁ胣鞏껥鎽迥꾁菣겂菣覃苣몙迧隈臣꾁臣貂苣뢁迥鲿臣讂臣ꢁ臣ꖟ苣貂臣내菨꺁铧늂迥꾁臣꺁믤꺁铧ꦉ귥蒚裦蒁臣超雧ꚭ髧뮴胦銂ꫨ肯臣讂臣ꢁ胣鞏껥鎽迥꾁菣겂菣覃苣몙迧馁苣내菨꺁藥ꮖ뿥钭裦蒁臣鎁苣覂듧麃臣꺁藥ꮖ뿥钭苣뾪꿧馁苣鎁臣膀迥릮뷤袏臣ꪃ苣뎃菣銂駧뺏臣讂듧麃臣龔苨袏臣龔觧ꚭ髧隈臣꾁藥ꮖ귥蒚듦Ꞁ苣뾪꿧馁苣鞏껥鎽迥꾁菣겂菣覃臣뺯臣ꚁ郥醁苣貂臣ꊂ苣讃苣袃胣ꊂ菣뾂苣讃苣袃迥뎁볯袏臣鞊뷤꺁ꫨ붣苣꾏菨馁苣鎁臣膀迥뎁駦骀臣龆럧鞁臣肊ꇨ薀臣꾁껥鎘臣蚐꟨ꞁ臣讂ꓥ颧臣隻臣螌ꓧ銂郥肂꣧薀臣螌ꓧꮁ臣ꎁ臣覜铧ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ臣꺁苣莃苣ꒂ臣膀믤许臣袂臣ꮁ臣ꚁ臣鎁臣辂苣龁胣鞏껥鎽臣ꪃ苣뎃菣ꢁ軦겸臣貂苣겜駧躘臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣膀菣袃볯螽볯袼苣ꂃ菣ꊂ菣颃苣뎃볯覽뷯趽뷯躽뷯膽뷯袽뷯鎽뷯躽볯覼臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣銂郥肂黨袐苣뎃菣꾂돨ꢁ臣ꚁ駧뺏臣讂胣鞏껥鎽裢ꪃ苣뎃菣邵郥꾁胣ꒂ菣躃苣覃菣랂菣鶃菣骃菣膃菣ꢁ胥鲣볯늼볯鶃菣骃菣膃菣鞏껥鎽苣몙迧馁苣내菨袼뻤袁臣ꎼ뷯鎽듧麃볯ꢁ臣뢛뫤鲽铧誏臣邵郥ꒂ菣躃苣覃菣랂菣銂볯莽黨袐菣ꆃ苣뎃苣뺯뇨ꢁ臣讂鯨覅ꧨ겖臣袂苣隦ꛨ隌胣鶁臣ꚁꇩ꺾迩ꞁ臣鲤껥銂迥붃臣馁苣鎁臣ꮁ苣ꎁ臣鲤蟥閁苣讂胣馀ꏨ鞏껥鎽苣몙迧鞁臣蒁苣내菨꾁胣貐駦ꮁ胣鞏껥鎽裥邭臣鞁臣龩菨馁苣���볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣뎂菣覃臣讂뷯꒼볯ꆼ駧뺏菣꾂苣벃臣ꦃ苣隃菣ꪃ菣꺁飦몢臣肸뗧꺁臩ꚺ髧ꪁ뷥ꪳ냥ꖅ臣袂臣ꚁ铧邈臣貂苣芀곦ꮁ胣내菨銂胣鞏껥鎽뗧袐臣꾏菨Ꞁ臣ꒁ臣ꚁꧨ鎨臣貂臣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣ꂃ菣ꊂ菣颃苣뎃臣颭鳥许臣醼駦鎖苣뎃苣ꖃ菣벃菣馁苣芀臣鞁臣膀듧麃苣鞴뗦鞁胣醃菣鮃菣ꂃ苣ꮃ菣銃菣ꞁ鯥骮臣讂胣ꆬ臣膀듧麃苣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣ꂃ菣ꊂ菣颃苣뎃臣ꚼ뷯ꢃ裥銂꿥ꆱ臣鞁臣趛藥놅뷥鞊뷤ꢁ臣节臣ꒂ菣궂菣馃菣袃臣讂볯设臣낁볯ꦼ볯ꎼ藥립菣꺂諦銈菣袃裢ꚼ뷯鞊뷤覼胣鶁臣ꚁ胣趆臣내菨銂듦蒵臣膀ꇩ꺾迩ꮁ苣ꎁ臣鲤鿦馁苣芀駩Ꞁ臣뢛뫤鲽铧꾁胣릉껥꺁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣鞏껥鎽迥꾁迥릮뷤鞃菣ꮃ苣뎂菣覃臣ꚁ臣讂뷯꒼볯ꆼ臣袂臣ꚁ뷥ꪳ꟧ꖅ臣貂臣내菨꺁鯨覅菣馃菣뎃苣꺁귥ꢜ胣誏臣隻臣莽볯꺼볯袏臣莽볯꺼볯꺁菣벃菣ꮁ苣ꎁ臣ꊽ돨뮧藥閁苣ꚁ臣讂郥颁苣蚁臣뾪ꏨ閁苣龁듧麃臣貐臣袂臣ꪁ鯨覅菣馃菣뎃苣꺁룤ꢜ臣袂臣ꚁ裥궖臣貂苣芀駩骮臣貂臣莽볯꺼볯몙迧馃苣뾂菣꺁菣벃菣貁볯늼볯鶃菣骃菣膃菣ꒂ菣躃苣覃菣랂菣ꢁ臣뢛뫤鲽铧꺁苧ꮁ駩Ꞁ臣ꒈ雦閁苣龁ꃥ袐胣鞃菣ꮃ苣讧裦馁苣讀胣꺁뷯꒼볯ꆼ꣧꾁胣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃苣ꂃ菣ꊂ菣颃苣뎃臣뢛뫤鲽铧馁苣鎁臣貁臣趁苣鞏껥鎽苣뎂菣覃臣讂觧骮臣莽볯꺼볯銂뇦骮臣讂臣膂臣讀胣袼菣벃菣꾁胣誣苣ꚁ臣讂胣覼臣ꚩ꣩閁苣讂胣㲂牢ਾ胣邼볯邼볯醀戼㹲鎁臣ꊂ菣뮂苣꺁臣꺁믤꺁껥붖藦颧臣꾁胣ꢂ菣袃菣鞃裢뾂菣낂뷦ꢜ胦ꪃ苣뎃菣낼볯꾼菣ꪃ菣鞃菣覃볯设臣낁볯銃苣膃苣뎃胣ꢼ뷯鎽胣뾂菣낂볯꾁胣銃菣ꦼ뷯Ꞽ볯ꒂ菣躃苣覃菣랂菣覼臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣ꢁ臣趞郥ꦉ臣鞁臣몙迧閁苣讂뷦ꢜ胦것苣鞃苣벃볯늼볯鶃菣骃菣膃菣꺁菣趃菣ꢁ鯧銺뷤ꢔ臣讂臣ꢁ臣꾏菨ꢁ臣貂苣芀苣钃菣벃菣뾂菣낂볯늼볯鶃菣骃菣膃菣ꢁ臣醼駦鎖臣놅郥ꒂ菣궂菣馃菣랂菣뎃臣貾胣馀ꏨ鞏껥鎽臣膀郥薀菣궃菣ꒂ菣ꆼ菣벃苣ꮁ苣ꎁ臣超雧袲駩閁苣ꚁ菣벃苣꾁듦蒵臣貂苣芀뷦ꢜ髧ꪃ苣뎃菣뢛뫤鲽铧꾁胣超雧袲駩螤郥ꦉ臣ꢂ菣袃菣鞃苣莃苣銂꿥ꆱ臣鞁臣鞊뷤꺁苣ꢂ苣뾂菣隃菣궃菣ꎧ黦ꮁ苣ꎁ臣몱껥閁苣讂胣뢛뫤鲽铧꾁胣ꢂ菣袃菣鞃苣莃苣뾂菣醃苣ꪳ臣龜뻥閁苣讂裥邭蟩꺁菣뎃菣貁胥鲣迥릮뷤ꢁ臣节臣Ꚃ苣릂苣뎃菣궃菣袃꟨邞臣誁臣ꚁꛨ龯臣貂苣貁胣鲽鳥蒚迥릮뷤꺁菣趃菣꺁믤꺁菣뎃菣벃臣ꢁ苣ꮁ铧颁苣鎁臣貁ꛨ龯臣貂���蒁ꃥ袐胣뢛뫤鲽铧꾁铧颁苣ꢁ裥궖臣貂苣芀戼㹲鎁苣覂臣ꊂ菣뮂苣銂뷤ꢔ臣ꚁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣ꖻ룤꺁迥릮뷤込菣겂菣覃鯧銺뷤ꢔ臣貐껥閁苣龁볯낼볯꾼볯鎼볯貁볯늼볯钼볯馼볯ꮁ뗧袐胣낼볯꾼볯閼볯馼臣낼볯꾼볯銼볯ꮁ뗧袐胣낼볯꾼볯閼볯馼臣낼볯꾼볯邼볯ꮁ뗧袐胣誏臣낼볯꾼볯閼볯馼臣낼볯꾼볯鎼볯ꮁ뗧袐胣㲂牢ਾ胣邼볯邼볯醀戼㹲邝雦꺁꿥鞨戼㹲ꆬ臣邝雦銂苣ꆃ菣ꮂ菣뮃苣ꒂ菣뮃苣ꮃ菣ꎃ菣뮃苣것苣랂菣뎃볯醼볯鎼볯醼醃菣꾂菣Ꚃ菣覃菣ꒂ菣膀菣莃苣鎃菣膀볯꒼胣떼볯ꆼ볯ꆼ볯ꎼ볯覼臣蒯꣨鞁臣骼戼㹲㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌰㰵愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㘳⼼㹡⼼䥄㹖㰊䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌰㰷愯㰾䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㠳⼼㹡⼼䥄㹖邀볯隼볯鞼胣㲑牢ਾ臣꺁꿥鞨臣膀觧놨触骶臣誸臣꺾铧ꦉ臣蒯꣨꺁鯥鮚髧뾉ꫨꮁ雩馁苣隃菣骃苣袃鷦蒴迥뎁臣꺁ꛨ螉볯隃菣骃苣袃鷦蒴볯꺁ꛨ骮臣鎾臣ꚁꇨ辂苣龁胣鎁苣꾁胣蒯꣨꺁韦颻臣覂볯邼맥鎖胣蒯꣨꺁铧颭迥붃臣릟ꓩ貁뛧膌臣貂苣鎁臣銂뿤벨臣讂苣꺁臣芁苣芀꿥鞨觧꾁菣肃菣릂菣ꆝ듧꺁鷦薠臣鎾臣膀臣龁苣Ꞃ菣뎃菣꾂ꓧꢁ볯뒼볯ꎼ臣꺁雩꺁郥辄臣鎾臣膀볯뒼볯ꎼ臣覂藥讉臣讂臣ꢁ臣ꞁ臣膀臣貂臣膀臣貂臣肜裥ꞁ臣趂臣ꢁ苣膀雩ꎀ臣龁뇧붛觧놨臣몙ꇨ芙迥꾁믤辄臣뎱鯥袏臣隤鯥릉꣨몇ꇩ꺁藥讖駦ꮁ胣蒯꣨릟ꓩꦉ臣貾믤銂냦薹臣ꒁ鷩뚈駩蒚臣ꖅ触꾏菨ꢁ臣讂臣ꢁ苣鶿꣨鞁胣뎱鯥릉꣨閳곧醼볯銼鷦誏臣鶁苣ꮁ뻥蚁觧놨뫥랕껥辦觥袼觧ꮁ迥ꞅ闧랏볯颼볯꾼Ꞽ볯鎼볯꺁볯鞼볯ꚼ볯견볯躼볯钼鷦銂郥肂볯ꮁ뻥ꎁ臣ꦨ裥銂鳦馁苣ꢁ뇧붛觧놨뫥랕껥貁뇦骮臣龁胨ꮁ귥ꮭ苣ꖅ触꾏菨ꢁ臣讂臣ꢁ苣鶿꣨馁苣节臣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ鳦몇ꇩ꺁귨鞏뫤꾁胣蒯꣨鞁臣邝雦貁胣ꦁ裥ꪁ鷦뚻룤ꞁ鿥誤臣貂臣蒁臣뒠郥ꮁ귦ꆺ苣鞁臣꾁郦놤迥꾁ꃧ誣臣貂臣ꪁ苣낁胣邝雦꾁胩ꖟ駦ꮁ郥肸臣隻臣节臣ꢁ跥Ꞻ臣随苣뾛臣讂臣ꢁ臣貐蓦馁苣芀꿥鞨鷦首臣ꖅ触꾏菨Ꞁ臣膀觧놨돦ꮁ뻥蒁臣覂苣讂铦鲺臣ꦨ駩许臣趪苣覂苣龁꣦ꦈ臣閁迥鞁臣膀鳦몙飦銂껥붖臣讂菣ꒂ苣뎃苣ꞁ臣讂臣뾁臣閁苣讂苣꺁臣꾁臣蒁胣㲂牢ਾ룤風臣螖鯦ꮁ苣讂飦내鯦꾁胣鎽ꗦ薀臣겜駧躘苣龮雦ꞁ臣讂苣蚁臣馁苣龁苣ꮁ跥蚈臣芁苣ꢁ胨袁苣貂苣芀꿥鞨臣龁藦颧臣膀鳦몙飦꺁臣讂臥ꊝ臣肸臣꺁ꫨ躘臣鞁臣辄鯥閁苣ꚁ臣誂胣龩菨蒚臣覭뻤ꪁ���覂苣讂뷤邈觧貁臣꺁駧躘臣蒯鯥薆臣芁苣龁苣膀꿥鞨臣貂臣鲽裦ꦉ臣袂苣膀鳦몙飦꺁꿧늛臣邙껥閁苣讂苣꺁臣꾁臣蒁胣鎁臣ꞁ臣ꦉ돨꺁꿥鞨臣膀臣鎁臣ꮐ臣貂苣螖鯦ꮁ苣讂ꫨ躘臣膀臣꺁菣릂菣ꊃ菣覃苣ꮐ苣膀鳦몙飦꺁믤辄臣뒁鷩꺁껥붖苣꾏菨ꮁ臣讂臣膂臣趸跥蚈臣芁苣鎁臣銂ꫨ膂苣节臣ꞁ臣ꪁ臣鞁胣鶁苣貁ꇨ馁觧骮臣设꣨ꮁ꿥鞁臣讫뇦꺁꿧늛苣뚈駩馁苣节臣ꢁ꟨袇臣貂苣节臣ꞁ苣ꪁ臣芀껥鮚胣鎁臣ꮁꓧ鞁꣨覼臣龁苣꺁臣ꂊ臣ꚁ胣겜駧躘苣颧胣ꮁ铦覤臣讂臣ꢁ臣膀觥風臣風볨讁苣鎽ꗦ薀臣ꢁ臣ꚁ臣躘苣讁臣节臣ꞁ臣誂胣뮷믤꺁ꯨ花臣蒯鯥薆臣ꖅ苣节臣ꞁ臣讂胣㲂牢ਾ胣뎛臣ꆰ跥ꪁꫨ躘胣㲑牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醀藩鞈闧랏볯醼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯颼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯鎼볯馼볯鎼裢醼볯隼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯銼볯鎼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醀볯覽뷯醼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯鎼胣超裥ꪕ迥骼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯銼볯醼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯馼볯颼볯銈볯醼볯钼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯鞼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯钼胣ꚼ뷯螽볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯隼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯鞼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醀볯꺼볯醼볯颼볯鎼볯超裥ꪕ迥骼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯隼胣꒼볯ꆼ볯隼볯閼볯袼藩鞈闧랏볯馼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醀볯꺼볯銼볯馼볯馼볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醀藩鞈闧랏볯醼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯銼볯鎼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯隼볯銼볯銈볯醼볯馼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯邼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醀볯覽뷯颼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯颼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯醀藩鞈闧랏볯銼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯銼볯鞼胣誏臣���込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯鎼볯醼볯銈볯銼볯醼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯颼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醼胣ꚼ뷯螽볯邼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯鞼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯銼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯醀볯꺼볯醼볯馼볯銼볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鎼胣꒼볯ꆼ볯閼볯颼볯袼藩鞈闧랏볯鎼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯醀藩鞈闧랏볯鎼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯銼볯邼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯馼볯鞼볯銈볯銼볯鎼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯馼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯閼胣ꚼ뷯螽볯钼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯閼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯醀볯꺼볯銼볯邼볯邼볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鞼胣꒼볯ꆼ볯醼볯鞼볯袼藩鞈闧랏볯鎼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯醀볯꺼볯銼볯邼볯鞼볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯馼胣超裥ꪕ迥骼볯钼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯馼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯钼볯閼볯钼裢醼볯鎼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯鎼볯馼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯醀볯覽뷯醼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯钼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醼胣超裥ꪕ迥骼볯醼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯醼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯钼볯钼볯隼裢醼볯閼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯鎼볯銼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯閼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯醀볯覽뷯銼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯閼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鎼胣超裥ꪕ迥骼볯颼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯醼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼���钼볯钼볯馼裢醼볯閼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯鎼볯鎼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯閼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯醀볯覽뷯銼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯閼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯閼胣超裥ꪕ迥骼볯鎼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯鎼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯閼볯閼볯钼裢醼볯鞼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯颼볯颼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯隼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯醀볯覽뷯銼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯隼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯钼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鞼胣超裥ꪕ迥骼볯颼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯銼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯钼볯銼볯钼裢醼볯鞼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯鎼볯銼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯隼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯醀볯覽뷯銼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯隼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯馼胣膀藩鞈闧랏볯鞼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯隼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯馼볯銼볯銈볯銼볯馼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯钼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鎼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯邼胣ꚼ뷯螽볯馼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯鎼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯鞼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯鎼볯醀볯꺼볯醼볯銼볯鞼볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼胣超裥ꪕ迥骼볯钼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯閼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯钼볯鎼볯馼裢醼볯颼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯隼볯鞼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯颼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯鎼볯醀볯覽뷯鎼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯颼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯钼胣膀藩鞈闧랏볯颼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯钼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯隼볯鞼볯銈볯銼볯钼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯邼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯���超裥ꪕ迥骼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯閼胣ꚼ뷯螽볯钼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯馼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯馼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯鎼볯醀藩鞈闧랏볯馼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯隼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯邼볯颼볯銈볯銼볯隼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯邼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鞼胣ꚼ뷯螽볯隼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯隼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯馼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯鎼볯醀藩鞈闧랏볯醼볯醼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯隼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯閼볯馼볯鎼裢醼볯颼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯鞼볯鎼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯醼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯馼胣ꚼ뷯螽볯颼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯邼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯钼볯醀藩鞈闧랏볯醼볯颼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯隼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯閼볯馼볯钼裢醼볯颼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯鞼볯閼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯颼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醼胣ꚼ뷯螽볯邼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯邼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯钼볯ꆼ裢ꊼ胣超裥ꪕ迥骼볯醼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯銼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯颼볯馼볯銈볯銼볯銼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯邼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯钼볯醀볯覽뷯钼볯ꆼ裢ꊼ臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯醼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯钼볯醀胣超裥ꪕ迥骼볯醼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯銼볯醼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯銼볯颼볯銈볯鎼볯鞼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯銼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯钼볯醀볯覽뷯钼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯醼볯颼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯隼胣���超裥ꪕ迥骼볯銼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯銼볯閼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯隼볯钼볯銈볯鎼볯邼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯銼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯钼볯醀볯覽뷯钼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯醼볯鎼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯钼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯颼胣超裥ꪕ迥骼볯鎼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯颼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯邼볯鞼볯銈볯鎼볯閼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯閼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鎼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯钼볯醀볯覽뷯钼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯醼볯醼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯銼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯邼胣超裥ꪕ迥骼볯鎼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯馼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯醼볯颼볯銈볯鎼볯隼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯閼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鎼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯閼볯醀볯覽뷯閼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯醼볯隼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯鞼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼胣超裥ꪕ迥骼볯钼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯銼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯钼볯馼볯銈볯鎼볯鞼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯颼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯钼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯閼볯醀볯覽뷯閼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯醼볯钼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯钼胣超裥ꪕ迥骼볯钼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯隼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯閼볯醼볯銈볯鎼볯颼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯颼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯钼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯閼볯醀볯覽뷯閼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯醼볯馼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯邼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯隼胣꒼볯ꆼ볯鎼볯閼볯袼藩鞈闧랏볯醼볯醼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鞼胣꒼볯ꆼ볯鎼볯鎼볯袼藩鞈闧랏볯醼볯銼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣���볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯颼胣超裥ꪕ迥骼볯閼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯醼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯钼볯颼볯銈볯鎼볯銼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯钼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯閼볯醀볯覽뷯閼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯醼볯隼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯鞼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯邼胣超裥ꪕ迥骼볯隼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯銼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯颼볯邼볯銈볯鎼볯鎼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯醼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯隼볯醀볯覽뷯隼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯醼볯醼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯銼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼胣超裥ꪕ迥骼볯隼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯钼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯馼볯閼볯銈볯鎼볯钼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯醼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯隼볯醀볯覽뷯隼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯醼볯颼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯钼胣꒼볯ꆼ볯閼볯馼볯袼藩鞈闧랏볯醼볯邼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯閼胣超裥ꪕ迥骼볯鞼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯鞼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯馼볯钼볯銈볯鎼볯鞼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯醼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯隼볯醀볯覽뷯隼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯醼볯鞼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯颼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鞼胣超裥ꪕ迥骼볯颼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯馼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯馼볯鎼볯銈볯鎼볯颼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯銼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯隼볯醀볯覽뷯隼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯醼볯銼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯鎼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯馼胣超裥ꪕ迥骼볯颼볯���胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯邼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯馼볯钼볯銈볯鎼볯鞼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯鞼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯鞼볯醀볯覽뷯隼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯醼볯馼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯邼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醼胣꒼볯ꆼ볯鎼볯邼볯袼藩鞈闧랏볯醼볯醼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼胣超裥ꪕ迥骼볯馼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯颼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯閼볯馼볯銈볯鎼볯馼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯閼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯鞼볯醀볯覽뷯鞼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯醼볯閼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯醼볯隼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯钼胣超裥ꪕ迥骼볯邼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯馼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯颼볯銼볯銈볯鎼볯邼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯閼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯鞼볯醀볯覽뷯鞼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯銼볯閼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯銼볯隼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯隼胣超裥ꪕ迥骼볯醼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯醼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯醼볯邼볯銈볯鎼볯銼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯隼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯鞼볯醀볯覽뷯鞼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯銼볯邼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯銼볯醼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯颼胣超裥ꪕ迥骼볯醼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯銼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯钼볯馼볯銈볯鎼볯鎼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯钼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯鞼볯醀볯覽뷯鞼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯銼볯閼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯銼볯隼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯邼胣超裥ꪕ迥骼볯銼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯钼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯銼볯颼볯銈���鎼볯钼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯隼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯颼볯醀볯覽뷯颼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯銼볯邼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯銼볯醼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼胣超裥ꪕ迥骼볯銼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯隼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯颼볯銼볯銈볯鎼볯閼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯隼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯颼볯醀볯覽뷯颼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯銼볯閼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯銼볯隼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯钼胣超裥ꪕ迥骼볯鎼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯醼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯隼볯閼볯銈볯鎼볯颼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯馼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鎼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯颼볯醀볯覽뷯颼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯銼볯邼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯銼볯醼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯隼胣超裥ꪕ迥骼볯鎼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯閼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯鎼볯鞼볯銈볯鎼볯馼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯隼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鎼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯颼볯醀볯覽뷯颼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯銼볯閼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯銼볯隼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯颼胣超裥ꪕ迥骼볯钼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯颼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯邼볯醼볯銈볯鎼볯醼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯鞼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯钼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯颼볯醀볯覽뷯颼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯銼볯钼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯銼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯邼胣超裥ꪕ迥骼볯閼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯邼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯钼볯鞼볯銈볯鎼볯銼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯鞼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯馼볯醀볯覽뷯馼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯銼볯���鎼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯銼볯钼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼胣超裥ꪕ迥骼볯閼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯鞼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯钼볯邼볯銈볯鎼볯鞼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯钼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯馼볯醀볯覽뷯馼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯銼볯颼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯銼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯钼胣超裥ꪕ迥骼볯隼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯颼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯鎼볯邼볯銈볯鎼볯颼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯钼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯馼볯醀볯覽뷯馼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯銼볯鎼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯銼볯钼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯隼胣꒼볯ꆼ볯钼볯閼볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯馼볯醀藩鞈闧랏볯銼볯馼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯颼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯閼볯醼볯閼裢醼볯鞼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯馼볯钼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯銼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯颼胣ꚼ뷯螽볯鞼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯隼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯馼볯醀볯꺼볯醼볯邼볯鞼볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯邼胣꒼볯ꆼ볯銼볯鞼볯袼藩鞈闧랏볯銼볯銼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯邼볯醀볯꺼볯醼볯鞼볯隼볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯銼胣꒼볯ꆼ볯銼볯鎼볯袼藩鞈闧랏볯銼볯钼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯邼볯醀볯꺼볯醼볯颼볯隼볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯钼胣꒼볯ꆼ볯鎼볯邼볯袼藩鞈闧랏볯銼볯隼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯���볯醀볯꺼볯醼볯銼볯馼볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯隼胣꒼볯ꆼ볯鎼볯閼볯袼藩鞈闧랏볯銼볯颼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯邼볯醀볯꺼볯醼볯馼볯醼볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯颼胣超裥ꪕ迥骼볯颼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯钼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯鎼볯鞼볯銈볯鎼볯醼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯颼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯馼胣ꚼ뷯螽볯邼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯銼볯鎼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯銼볯钼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醼볯醀볯꺼볯醼볯醼볯邼볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯醼胣꒼볯ꆼ볯鎼볯隼볯袼藩鞈闧랏볯銼볯隼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醼볯醀볯꺼볯銼볯颼볯颼볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯鎼胣꒼볯ꆼ볯鞼볯醼볯袼藩鞈闧랏볯銼볯颼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醼볯醀볯꺼볯钼볯鞼볯銼볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯閼胣꒼볯ꆼ볯閼볯颼볯袼藩鞈闧랏볯銼볯邼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醼볯醀볯꺼볯钼볯鎼볯銼볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯鞼胣超裥ꪕ迥骼볯馼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯閼볯銼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯鞼볯閼볯銈볯鎼볯銼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯邼볯鞼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯銼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醼볯醀볯覽뷯醼볯鞼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯馼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯馼胣鎁臣ꮁ臣蒁臣膀藩鞈闧랏볯鎼볯邼臣貀볯꺼볯閼볯颼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ���颼볯钼볯銈볯鎼볯鎼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯邼볯醼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯邼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼볯醀볯覽뷯醼볯馼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯邼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯醼胣超裥ꪕ迥骼볯邼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯閼볯馼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯颼볯钼볯銈볯鎼볯钼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯邼볯銼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯銼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼볯醀볯覽뷯醼볯醼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯邼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯鎼胣꒼볯ꆼ볯邼볯醼볯袼藩鞈闧랏볯鎼볯钼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼볯醀藩鞈闧랏볯鎼볯颼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯鎼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯閼볯隼볯馼裢醼볯颼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯醼볯鞼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯閼胣ꚼ뷯螽볯銼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯鎼볯颼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼볯醀볯꺼볯醼볯邼볯馼볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯鞼胣꒼볯ꆼ볯馼볯隼볯袼藩鞈闧랏볯鎼볯醼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼볯醀藩鞈闧랏볯鎼볯醼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯閼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯銼볯鎼볯邼裢醼볯馼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯醼볯醼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯醼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼볯醀볯覽뷯醼볯颼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯銼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯邼胣꒼볯ꆼ볯鎼볯钼볯袼藩鞈闧랏볯鎼볯鎼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鎼볯醀藩鞈闧랏볯鎼볯馼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯隼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯銼볯颼볯鞼裢醼볯馼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃���뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯醼볯閼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鎼볯醀볯覽뷯醼볯醼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯銼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鎼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯鎼胣꒼볯ꆼ볯閼볯隼볯袼藩鞈闧랏볯鎼볯醼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鎼볯醀볯꺼볯醼볯醼볯馼볯超裥ꪕ迥骼볯鎼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯閼胣超裥ꪕ迥骼볯鎼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯钼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯鎼볯鞼볯銈볯钼볯醼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯隼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鎼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯隼胣ꚼ뷯螽볯鎼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯鎼볯隼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯鞼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鎼볯醀볯꺼볯鎼볯隼볯銼볯超裥ꪕ迥骼볯鎼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯颼胣超裥ꪕ迥骼볯钼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯颼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯鞼볯鎼볯銈볯钼볯銼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯銼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯钼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯馼胣ꚼ뷯螽볯鎼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯鎼볯閼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯隼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯钼볯醀볯꺼볯钼볯鞼볯醼볯超裥ꪕ迥骼볯钼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯醼胣超裥ꪕ迥骼볯閼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯閼볯鞼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯鞼볯鎼볯銈볯钼볯鎼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯醼볯钼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯醼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯钼볯醀볯覽뷯醼볯醼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯閼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯鎼胣꒼볯ꆼ볯颼볯隼볯袼藩鞈闧랏볯鎼볯鎼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯钼볯醀藩鞈闧랏볯鎼볯鞼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯���볯醼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯鎼볯鎼볯鎼裢醼볯銼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯銼볯鞼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯鞼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯钼볯醀볯覽뷯醼볯钼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯閼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯隼胣超裥ꪕ迥骼볯隼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯銼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯閼볯醼볯銈볯钼볯銼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯閼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯鞼胣ꚼ뷯螽볯钼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯鎼볯銼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯鎼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯钼볯醀藩鞈闧랏볯鎼볯馼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯钼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯鎼볯閼볯鎼裢醼볯馼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯銼볯鎼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯钼볯醀볯覽뷯醼볯颼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯隼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯邼胣超裥ꪕ迥骼볯鞼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯閼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯钼볯邼볯銈볯銼볯閼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯邼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯醼胣ꚼ뷯螽볯閼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯鎼볯钼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯閼볯醀藩鞈闧랏볯鎼볯馼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯隼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯閼볯馼볯醼裢醼볯颼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯鞼볯钼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯閼볯醀볯覽뷯醼볯銼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯鞼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯钼胣超裥ꪕ迥骼볯颼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯邼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯颼볯銼볯銈볯銼볯邼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯邼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯���颼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯閼胣ꚼ뷯螽볯閼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯鎼볯钼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯閼볯醀藩鞈闧랏볯鎼볯馼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯鞼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯钼볯鎼볯隼裢醼볯馼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯鞼볯鞼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯閼볯醀볯覽뷯醼볯隼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯颼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯颼胣超裥ꪕ迥骼볯馼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯銼볯鎼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯颼볯鎼볯銈볯鎼볯馼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯銼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯馼胣ꚼ뷯螽볯閼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯鎼볯钼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯隼볯醀藩鞈闧랏볯鎼볯馼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯鎼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯钼볯醼볯钼裢醼볯醼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯閼볯隼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯鎼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯隼볯醀볯覽뷯醼볯邼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯馼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯銼胣超裥ꪕ迥骼볯邼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯銼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯颼볯醼볯銈볯鎼볯邼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯鎼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯鎼胣ꚼ뷯螽볯隼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯钼볯钼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯隼볯醀藩鞈闧랏볯钼볯馼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯鎼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯钼볯鎼볯鎼裢醼볯銼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯閼볯钼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯隼볯醀볯覽뷯醼볯钼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯邼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼苣���臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯隼胣超裥ꪕ迥骼볯醼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯醼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯邼볯銼볯銈볯鎼볯閼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯馼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯鞼胣ꚼ뷯螽볯隼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯钼볯钼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯隼볯醀藩鞈闧랏볯钼볯馼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯颼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯閼볯馼볯颼裢醼볯銼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯鞼볯鞼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯隼볯醀볯覽뷯醼볯颼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯醼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯邼胣超裥ꪕ迥骼볯銼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯閼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯颼볯鎼볯銈볯鎼볯馼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯鎼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯醼胣ꚼ뷯螽볯鞼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯钼볯钼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鞼볯醀藩鞈闧랏볯钼볯馼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯馼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯鎼볯颼볯鞼裢醼볯鎼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯銼볯颼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鞼볯醀볯覽뷯醼볯銼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯銼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鎼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯钼胣꒼볯ꆼ볯钼볯鞼볯袼藩鞈闧랏볯钼볯醼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鞼볯醀볯꺼볯醼볯颼볯隼볯超裥ꪕ迥骼볯鎼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯隼胣超裥ꪕ迥骼볯鎼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯隼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯閼볯鎼볯銈볯鎼볯閼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯隼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鎼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯鞼胣ꚼ뷯螽볯鞼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣���藩鞈闧랏볯钼볯隼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯鞼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鞼볯醀藩鞈闧랏볯钼볯醼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯邼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯钼볯颼볯馼裢醼볯钼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯鞼볯醼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯醼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鞼볯醀볯覽뷯醼볯颼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯钼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯钼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯邼胣超裥ꪕ迥骼볯钼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯醼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯銼볯馼볯銈볯鎼볯颼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯鎼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯钼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯醼胣ꚼ뷯螽볯颼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯钼볯隼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯鞼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯颼볯醀藩鞈闧랏볯钼볯醼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯銼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯閼볯馼볯閼裢醼볯閼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯醼볯銼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯醼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯颼볯醀볯覽뷯醼볯銼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯閼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯钼胣超裥ꪕ迥骼볯閼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯邼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯隼볯邼볯銈볯鎼볯鞼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯颼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯閼胣ꚼ뷯螽볯颼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯钼볯鎼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯钼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯颼볯醀藩鞈闧랏볯钼볯閼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯馼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯閼볯閼볯邼裢醼볯鞼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯醼볯邼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯鞼胣ꚼ뷯螽볯颼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯钼볯閼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯隼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯颼볯醀볯꺼볯醼볯閼볯颼볯超裥ꪕ迥骼볯閼���覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯馼胣超裥ꪕ迥骼볯閼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯閼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯隼볯鎼볯銈볯鎼볯隼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯邼볯銼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯颼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯馼볯醀볯覽뷯醼볯馼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯閼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯醼胣超裥ꪕ迥骼볯隼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯鞼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯隼볯邼볯銈볯鎼볯鞼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯邼볯钼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯鎼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯馼볯醀볯覽뷯醼볯醼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯隼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯鎼胣超裥ꪕ迥骼볯隼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯閼볯邼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯隼볯醼볯銈볯鎼볯馼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯邼볯鞼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯馼볯醀볯覽뷯醼볯鎼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯隼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯閼胣超裥ꪕ迥骼볯隼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯閼볯銼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯隼볯钼볯銈볯鎼볯邼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯鞼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯隼胣ꚼ뷯螽볯馼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯钼볯鞼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯颼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯馼볯醀藩鞈闧랏볯钼볯馼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯醼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯閼볯銼볯钼裢醼볯颼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯醼볯鎼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯醼볯颼胣ꚼ뷯螽볯馼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯钼볯馼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯邼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯馼볯醀藩鞈闧랏볯钼볯醼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯鞼볯趀迥뎁볯���袏臣貀볯꺼볯閼볯钼볯鎼裢醼볯邼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯馼볯颼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯醼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯邼볯醀볯覽뷯醼볯馼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯鞼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯醼胣超裥ꪕ迥骼볯鞼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯閼볯馼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯鎼볯醼볯銈볯钼볯鞼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯邼볯銼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯隼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯邼볯醀볯覽뷯銼볯醼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯鞼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯鞼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯鎼胣超裥ꪕ迥骼볯颼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯閼볯邼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯邼볯銼볯銈볯钼볯颼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯邼볯鎼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯銼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯邼볯醀볯覽뷯銼볯鎼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯颼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯閼胣꒼볯ꆼ볯钼볯閼볯袼藩鞈闧랏볯钼볯钼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯邼볯醀藩鞈闧랏볯钼볯鞼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣떼볯놼볯鞼볯趀迥뎁볯袏臣貀볯꺼볯銼볯醼볯醼裢醼볯銼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯銼볯邼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯鞼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯邼볯醀볯覽뷯銼볯隼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯颼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯颼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯颼胣超裥ꪕ迥骼볯馼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯邼볯醼裢醼볯閼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯銼볯閼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯邼볯醀볯覽뷯銼볯颼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯馼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯邼胣超裥ꪕ迥骼볯馼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯隼볯鎼裢醼볯閼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯���볯隼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯钼볯鞼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醼볯醀볯覽뷯銼볯邼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯馼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯馼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯銼胣超裥ꪕ迥骼볯邼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯鎼볯馼볯鎼裢醼裢醼볯隼볯銈볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯銼볯鎼裢醼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯閼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醼볯醀볯覽뷯銼볯銼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯邼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯钼胣超裥ꪕ迥骼볯邼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯隼볯馼볯鞼裢醼볯隼볯銈볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯醼볯鎼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯邼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯閼胣ꚼ뷯螽볯醼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯閼볯鞼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯閼볯颼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醼볯醀藩鞈闧랏볯閼볯馼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣꒼볯ꆼ볯钼볯邼볯銈볯醼볯鎼裢醼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯钼볯馼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯閼볯馼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯醼볯醀볯覽뷯銼볯隼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯邼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯颼胣超裥ꪕ迥骼볯醼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯銼볯醼胣誏臣込迥꾁胣꒼볯ꆼ볯馼볯鞼볯銈볯銼볯邼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯馼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯馼胣ꚼ뷯螽볯醼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯閼볯钼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯閼볯閼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼볯醀볯꺼볯銼볯颼볯銼볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯醼胣超裥ꪕ迥骼볯銼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯钼볯鎼볯隼裢醼볯鎼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯鎼볯鞼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯閼볯銼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼볯醀볯覽뷯銼볯醼臣몤臣貂臣蒁苣超裥���迥骼볯銼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯鎼胣꒼볯ꆼ볯銼볯邼볯袼藩鞈闧랏볯閼볯钼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼볯醀藩鞈闧랏볯閼볯閼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣꒼볯ꆼ볯閼볯邼볯銈볯銼볯鎼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯邼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯閼胣ꚼ뷯螽볯銼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯閼볯閼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯閼볯隼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼볯醀볯꺼볯鎼볯钼볯閼볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯鞼胣꒼볯ꆼ볯馼볯鎼볯袼藩鞈闧랏볯閼볯颼볯ꢁ胣鎁臣ꮁ臣蒁臣붑郥閁苣龁볯뎼볯貃苣것苣膃菣銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯銼볯醀볯꺼볯钼볯颼볯醼볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯覼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ釥趐臣貂臣ꖼ볯뒼菣꾂菣ꪂ菣覃苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯馼胣超裥ꪕ迥骼볯醼볯貁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣貀볯꺼볯馼볯颼볯銼裢銼볯閼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯钼볯馼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯邼胣ꚼ뷯螽볯銼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯隼볯醼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯隼볯銼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鎼볯醀藩鞈闧랏볯隼볯鎼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣꒼볯ꆼ볯颼볯颼볯趀臣붑郥閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯醼볯閼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯銼胣ꚼ뷯螽볯鎼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯隼볯鎼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯隼볯钼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鎼볯醀藩鞈闧랏볯隼볯閼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣꒼볯ꆼ볯銼볯閼볯銈볯鎼볯馼胣ꢁ釥趐臣貂臣꾂菣벃菣ꞁ臣讂胣ꦤ蓧超裥낼볯꾼볯銼볯莽볯꺼볯꺁菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼苣몤臣芀戼㹲邀볯覽뷯銼볯钼胣ꚼ뷯螽볯鎼볯ꮁꓧ閁苣ꚁ臣讂藩鞈闧랏볯隼볯閼臣뎂菣覃賥超裥讁苣뺴铧鞁臣ꊂ菣躃藩超裥袼藩鞈闧랏볯隼볯隼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鎼볯醀藩鞈闧랏볯隼볯鞼臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ胣꒼볯ꆼ볯銼볯閼볯趀臣붑郥���閁苣龁苣궃菣뎃臣芁苣膀ꓥ뚄藩鞈볯늼볯鞼볯馼뷯꒼볯ꆼ臣貃苣것苣膃菣超裥袼藩鞈闧랏볯隼볯鞼볯銂ꓧ馁胣㲂牢ਾ胣ꚼ뷯螽볯鎼볯醀볯覽뷯銼볯閼臣몤臣貂臣蒁苣超裥ꪕ迥骼볯醼볯꺁苣벃菣隌藩鞈臣覂듦龔臣龁苣龃菣뢅藩鞈볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼苣몤臣芀⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀鯥醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㤳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐰㰰愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰ㄴ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐰㰲愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㌴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐰㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㔴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐰㰶愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㜴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㠴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㤴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰〵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰ㄵ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㈵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㌵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㐵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㔵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㘵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㜵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㠵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㤵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰〶⼼㹡⼼䥄��� †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰ㄶ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㈶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㌶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㐶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㔶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㘶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㜶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㠶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㤶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰〷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰ㄷ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㈷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㌷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㐷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㔷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㘷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㜷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㠷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㤷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠰㰰愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥钼볯ꊼ胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰ㄸ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㈸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㌸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㐸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰���㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㔸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㘸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㜸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㠸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㤸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰〹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰ㄹ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㈹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㌹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㐹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㔹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㘹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㜹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㠹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰〰㤹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰〰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㄰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㈰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㌰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㐰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㔰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㘰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㜰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㠰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㤰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽���㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰〱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㈱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㌱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㐱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㔱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㘱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㜱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㠱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㤱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰〲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㈲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㌲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㐲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㔲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㘲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㜲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㠲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㤲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰〳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㈳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㌳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㐳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼胣㲑䐯噉ਾ†††���††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㔳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㘳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㜳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㠳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌱㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰〴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐱㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㈴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐱㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㐴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐱㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㘴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐱㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㠴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐱㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰〵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔱㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㈵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔱㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯閼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㐵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔱㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㘵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔱㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯馼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㠵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱���⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔱㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯醼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰〶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘱㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㈶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘱㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㐶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘱㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㘶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘱㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㠶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘱㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰〷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜱㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㈷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜱㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㐷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜱㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㘷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜱㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㠷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜱㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰〸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠱㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㈸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶���楴쉦゠〰㠱㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㐸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠱㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㘸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯钼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠱㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㠸⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠱㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰〹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤱㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㈹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤱㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㐹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤱㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㘹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯閼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤱㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㄰㠹⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤱㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰〰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〲㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㈰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〲㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㐰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〲㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㘰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯隼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〲㰷愯㰾���噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㠰⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〲㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰〱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄲ㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㈱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄲ㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㐱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄲ㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㘱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鞼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄲ㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㠱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄲ㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰〲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈲㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㈲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈲㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㐲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈲㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㘲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯颼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈲㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㠲⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈲㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰〳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌲㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉���邀鯥醼볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㈳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌲㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㐳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌲㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㘳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯馼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌲㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㠳⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌲㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰〴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐲㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㈴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐲㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㐴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐲㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㘴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯邼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐲㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㠴⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐲㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰〵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔲㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㈵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔲㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㐵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔲㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯颼胣���䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㘵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯醼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔲㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㠵⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔲㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰〶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘲㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㈶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘲㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㐶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘲㰵愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯颼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㘶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯銼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘲㰷愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯邼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㠶⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘲㰹愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯銼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰〷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜲㰱愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯钼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㈷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖胣뎛볯鎼볯醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜲㰳愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥銼볯隼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㐷⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䐯噉ਾ††††䐼噉邀鯥鮚藥讖菣뎃菣것菣袃胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㔷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜲㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㜷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜲㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㤷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠲㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰ㄸ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖���栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠲㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㌸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠲㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㔸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠲㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㜸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠲㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㤸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤲㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰ㄹ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤲㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㌹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤲㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㔹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤲㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㜹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤲㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㈰㤹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〳㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㄰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〳㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㌰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〳㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㔰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〳㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㜰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〳㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㤰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄳ㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄳ㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㌱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄳ㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㔱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄳ㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㜱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴���〶⸲楴쉦゠〰ㄳ㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㤱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈳㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈳㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㌲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈳㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㔲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈳㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㜲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈳㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㤲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌳㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌳㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㌳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌳㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㔳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌳㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㜳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌳㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㤳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐳㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰ㄴ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐳㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㌴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐳㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㔴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐳㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㜴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐳㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㤴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔳㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰ㄵ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔳㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㌵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔳㰴愯㰾䐯噉ਾ†���††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㔵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔳㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㜵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔳㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㤵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘳㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰ㄶ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘳㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㌶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘳㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㔶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘳㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㜶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘳㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㤶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜳㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰ㄷ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜳㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㌷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜳㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㔷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜳㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㜷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜳㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㤷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠳㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰ㄸ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠳㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㌸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠳㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㔸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠳㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㜸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠳㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㤸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤳㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ���㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰ㄹ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤳㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㌹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤳㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㔹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤳㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㜹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤳㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㌰㤹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〴㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㄰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㌰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㔰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㜰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〴㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㤰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄴ㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄴ㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㌱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄴ㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㔱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄴ㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㜱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄴ㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㤱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈴㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㌲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㔲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰���⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈴㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㤲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌴㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㌳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㔳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㜳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌴㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㤳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐴㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰ㄴ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㌴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㔴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㜴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐴㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㤴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔴㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰ㄵ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㌵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㔵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㜵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔴㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㤵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘴㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰ㄶ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㌶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖���栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㔶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㜶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘴㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㤶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜴㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰ㄷ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㌷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㔷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㜷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜴㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㤷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠴㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰ㄸ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㌸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㔸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㜸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠴㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㤸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤴㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰ㄹ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤴㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㌹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤴㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㔹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤴㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㜹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤴㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㐰㤹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴���〶⸲楴쉦゠〰〵㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㄰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〵㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㌰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〵㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㔰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〵㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㜰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〵㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㤰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄵ㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄵ㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㌱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄵ㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㔱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄵ㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㜱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄵ㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㤱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈵㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈵㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㌲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈵㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㔲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈵㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㜲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈵㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㤲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌵㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌵㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㌳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌵㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㔳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌵㰶愯㰾䐯噉ਾ†���††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㜳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌵㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㤳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐵㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰ㄴ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐵㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㌴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐵㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㔴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐵㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㜴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐵㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㤴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔵㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰ㄵ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔵㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㌵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔵㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㔵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔵㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㜵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔵㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㤵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘵㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰ㄶ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘵㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㌶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘵㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㔶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘵㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㜶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘵㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㤶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜵㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰ㄷ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜵㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ���㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㌷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜵㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㔷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜵㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㜷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜵㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㤷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠵㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰ㄸ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠵㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㌸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠵㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㔸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠵㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㜸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠵㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㤸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤵㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰ㄹ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤵㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㌹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤵㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㔹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤵㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㜹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤵㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㔰㤹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〶㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㄰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〶㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㌰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〶㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㔰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〶㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㜰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〶㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰���⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄶ㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄶ㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㌱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄶ㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㔱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄶ㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㜱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄶ㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㤱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈶㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈶㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㌲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈶㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㔲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈶㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㜲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈶㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㤲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌶㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌶㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㌳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌶㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㔳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌶㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㜳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌶㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㤳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐶㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰ㄴ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐶㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㌴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐶㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㔴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖���栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐶㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㜴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐶㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㤴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔶㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰ㄵ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔶㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㌵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔶㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㔵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔶㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㜵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔶㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㤵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘶㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰ㄶ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘶㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㌶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘶㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㔶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘶㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㜶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘶㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㤶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜶㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰ㄷ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜶㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㌷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜶㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㔷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜶㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㜷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜶㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㤷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠶㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰ㄸ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴���〶⸲楴쉦゠〰㠶㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㌸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠶㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㔸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠶㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㜸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠶㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㤸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤶㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰ㄹ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤶㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㌹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤶㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㔹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤶㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㜹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤶㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㘰㤹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〷㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㄰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〷㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㌰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〷㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㔰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〷㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㜰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〷㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㤰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄷ㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄷ㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㌱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄷ㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㔱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄷ㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㜱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄷ㰸愯㰾䐯噉ਾ†���††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㤱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈷㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈷㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㌲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈷㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㔲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈷㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㜲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈷㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㤲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌷㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌷㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㌳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌷㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㔳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌷㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㜳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌷㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㤳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐷㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰ㄴ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐷㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㌴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐷㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㔴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐷㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㜴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐷㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㤴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔷㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰ㄵ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔷㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㌵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔷㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ���㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㔵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔷㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㜵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔷㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㤵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘷㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰ㄶ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘷㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㌶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘷㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㔶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘷㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㜶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘷㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㤶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜷㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰ㄷ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜷㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㌷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜷㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㔷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜷㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㜷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜷㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㤷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠷㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰ㄸ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠷㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㌸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠷㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㔸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠷㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㜸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠷㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㤸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤷㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰���⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤷㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㌹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤷㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㔹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤷㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㜹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤷㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㜰㤹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〸㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㄰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〸㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㌰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〸㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㔰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〸㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㜰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〸㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㤰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄸ㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄸ㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㌱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄸ㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㔱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄸ㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㜱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄸ㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㤱⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈸㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰ㄲ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈸㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㌲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈸㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㔲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈸㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㜲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖���栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈸㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㤲⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌸㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰ㄳ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌸㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㌳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌸㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㔳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌸㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㜳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㌸㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㤳⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐸㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰ㄴ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐸㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㌴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐸㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㔴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐸㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㜴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㐸㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㤴⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔸㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰ㄵ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔸㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㌵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔸㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㔵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔸㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㜵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㔸㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㤵⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘸㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰ㄶ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘸㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㌶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴���〶⸲楴쉦゠〰㘸㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㔶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘸㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㜶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㘸㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㤶⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜸㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰ㄷ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜸㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㌷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜸㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㔷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜸㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㜷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㜸㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㤷⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠸㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰ㄸ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠸㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㌸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠸㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㔸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠸㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㜸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㠸㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㤸⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤸㰰愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰ㄹ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤸㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㌹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤸㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㔹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤸㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㜹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㤸㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㠰㤹⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〹㰰愯㰾䐯噉ਾ†���††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㤰㄰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〹㰲愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㤰㌰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〹㰴愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㤰㔰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〹㰶愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㤰㜰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰〹㰸愯㰾䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㤰㤰⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄹ㰰愯㰾䐯噉ਾ†††† †††㰠䥄㹖胣붛髩겅雩醃菣閃菣莃菣袼苣것苣袃菣벃苣ꞃ菣覼胣㲑䐯噉ਾ††††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㤰ㄱ⼼㹡⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄹ㰲愯㰾䐯噉ਾ†††† †ਠ††††䐼噉邀触骶ꏨꎭ鯦醀⼼䥄㹖 †††††㰠䥄㹖胣邏蟥ꖗ胣뎹裦㆐뒹〱鳦㊈ꖗ㈨〰⸰〱㈮⤷⼼䥄㹖 †††††ਠ††††††††䐼噉邀触骶ꏨꎭ볯醀⼼䥄㹖 †††††††††㰠䥄㹖胣鲣귦뺯뇨뢛ꇩ趐胣躘듧뢛⼼䥄㹖 †††††††††㰠䥄㹖胣鲣귦뺯뇨薠鯧趐胣邼볯隼볯㲕䐯噉ਾ††††††††††䐼噉邀ꏨꎭ雦閳胣覤鯦㲴䐯噉ਾ††††††††††䐼噉邀ꏨꎭ臣薆껥醀⼼䥄㹖 †††††††††††邀볯钼볯閼胣㲑牢ਾ껥붖뻤鎼볯骼菣袃볯늼볯颼볯銼苣뎂菣覃臣讂뷯꒼볯ꆼ苣궃菣뎃臣颍鯩㲢牢ਾ룤風껥붖뻤醼臣風볨鞁臣袂臣ꮁ꣧薀臣ꖼ볯뒼藩鞈臣뺯臣ꚁ苣뎃苣뎃苣릂藩鞈臣鞾苣貂胣鞾苣貂臣뎂菣뮂菣떂苣超裥꾁胣鎁臣ꮁ볯꺼볯钼볯鎼볯邼臣붑郥閁苣讂胣꒼볯ꆼ볯鞼볯鞼볯뎂菣뮂菣떂苣超裥ꮁ鿥ꖁ臣ꚁ胣醼볯낼볯늼臣袂苣뺯뇨ꢁ臣讂藩鞈苣ꮐ苣莽볯꺼볯ꦃ苣隃菣ꪃ苣貐껥馁苣龁苣膀迥뎁볯覼볯늼볯颼볯銼臣ꢅ闩뎂菣覃賥超裥꺁苣궃菣뎃苣颍鯩馁苣鞃菣벃菣ꢁ臣ꚁ뷤ꢔ臣讂臣膂臣膀苣ꪃ苣貃苣것苣膃菣銂郥邈臣龁胣㲂牢ਾ귦릖郥誏臣蚀雦醐臣鞃菣ꒂ菣벃苣袐裦鞁臣骼戼㹲ꎭ雦醐볯ꎼ볯鞃菣ꒂ菣벃胣閼胢銈볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯뒼볯Ꞽ볯뒼볯Ꞽ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯ꎼ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯銼볯銼볯㲉牢ਾ胩릖郥낼볯늼菣ꦃ苣麃菣肀볯馀裢Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯銼볯鎼볯㲉牢ਾ臣覂臣膀郥邈苣ꪃ苣貃苣것苣膃菣较苣隃菣莃菣ꊽ裦鞃菣벃菣꾁胣ꖻ룤꺁ꃦ뢅藩鞈苣膌臣뎂菣뮂菣떂苣꒼볯ꆼ볯鞼볯鞼볯超裥讁苣鲽裦鞁臣芀戼㹲较苣隃菣���莃菣ꊽ裦鞃菣벃菣㲖牢ਾ볯馀裢ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯Ꞽ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯㲚⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銼볯㲔甯覼戼㹲ꢅ闩꾂菣벃菣꺁뻤ꚵ뫦ꮁ臣蒁臣뺹臣讁臣ꦃ苣隃菣ꪃ苣릂苣ꪃ菣讃菣낂臣讂臣膂臣膀菣ꒂ菣ꦃ菣讁苣꺁볯꺼볯銂룤ꞁ郥骮臣龁볯ꎼ볯鞃菣ꒂ菣벃꿥ꞁ볯ꎼ볯鞢맥鞁臣芀곦蒁臣膀菣뢂菣ꎂ菣ꦃ苣隃菣ꪃ苣膀菣궃菣隃苣ꪃ苣貃苣것苣膃菣誏臣낼볯늼菣ꦃ苣麃菣뺯臣肸雦銂铧蒁臣낼볯꾼볯隼볯몁볤邭苣뎂菣覃臣讂苣궃菣뎃苣颍鯩馁苣꺁臣뾽铧鞁臣芀뷯꒼볯ꆼ菣ꒂ菣ꦃ菣벃뷤邈臣龁苣꺁볯꺼볯꾁胣銃菣떆蟨蒵맧袼볯ꦼ볯閼볯覼臣覂跥ꊛ臣龁胣㲂牢ਾ룤風臣袂臣ꮁ跥ꊛ臣龁苣궃菣뎃臣꒼볯ꆼ藩鞈臣膀볯늼볯颼볯銼臣ꢅ闩꒼볯ꆼ藩鞈볯鎁臣ꞁ胣떼볯놼볯銼볯袼볯꺼볯閼볯醼볯鞼裢醼볯閼볯覼臣붑郥閁苣讂볯袼藩鞈闧랏볯銼볯邼볯誏臣낼볯꾼볯隼볯꺁ꫨ躰苣뎃菣꾂돨超裥銂룤袁臣芀戼㹲떼볯놼볯銼볯袼볯꺼볯閼볯醼볯鞼裢醼볯閼볯覼臣ꢅꃦ뢅藩鞈苣ꚼ뷯螽볯邼볯超裥ꪕ迥骼볯銼볯覼臣몤臣芀苣궃菣뎃볯꺼볯钼볯钼볯꒼볯ꆼ볯銼볯颼볯銈볯鎼볯钼볯꾁胣颍룤꺁苣벃菣뎃菣벃菣ꎂ菣낂菣것菣ꂃ菣벃菣ꎂ菣낂菣것菣ꂃ苣ꮐ臣膀菣꾂菣ꪂ菣覃뷤꺽볯醼볯銈볯醼볯ꮁꛨ讁臣꺁뿧뎨雩讧菩趽苣膌臣膀臣鞁臣貃苣것苣膃菣趽뷧颼볯颼裢颼볯邼臣鲁귦뎂菣뎃臣芵ꯧ馁苣袼볯覽뷯颼볯覼胣袺룦閁苣讂菣ꪃ菣鞃菣覃觥蚧뷤꾁볯钼볯ꊂ菣躃藩랕臣芁苣袼볯覽뷯颼볯覼胣ꚼ뷯螽볯醼臣몤臣龁藥랕볯늼볯颼볯銼苣뎃菣꾂돨꾁胣蒴볯隼볯钼볯邼菣ꮃ菣뎃臣蚈귥辇迥뎁듧閼볯邼볯꺁뷯ꦼ苣覜臣讂胣낼볯꾼볯隼볯꺁苣龃菣뢅藩鞈臣趇ꛨꪁꃩ龟臣膀볯覽뷯颼볯ꮁꓧ鞁臣袂臣ꮁ胣랂苣誃菣骃菣膃菣膀볯銈菣ꪃ苣袃苣ꮃ賥ꢃ뷤膀迥뎁苣ꮃ菣ꆂ裢ꦃ苣袃苣ꮃ菣龃菣込菣붂苣ꒂ菣ꎼ苣뎃菣꾂돨꺁ꃩ龟臣麡볤Ꞁ苣膌臣超裥銂郥肂胣꾂菣벃菣떼볯놼볯銼볯袼볯꺼볯閼볯醼볯鞼裢醼볯閼볯覼臣ꆼ볯ꎼ볯ꮁ꿥鞨臣貂胣ꆼ볯ꎼ볯蒯꣨ꪕ迥銼볯馼볯钼볯貁믤躸臣貂臣蒁苣芀 †††††††††ਠ†††††††† †††††††㰠䥄㹖胣讉뛧鲣귦銼胣㲑䐯噉ਾ††††††††††䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱ鯦麡郥醀飦내鯦㲸䐯噉ਾ††††††††††䐼噉邀ꏨꎭ꿥ꆱꃩ꺛郥醀볯钼볯醼⼼䥄㹖 †††††††††㰠䥄㹖胣鲣귦릖돦醀ꓥ뒛⼼䥄㹖 †††††††††㰠䥄㹖胣鲣귦꺁蛥릮胣㲑���噉ਾ††††††††††††胣邼볯鞼볯醀戼㹲龮雦设볯銼볯銃菣낼볯꾼볯钼볯銂苣벃菣馁苣莽볯꺼볯꾂菣벃菣꺁跥ꊛ戼㹲誸꣨龮雦设볯ꮁ꣨覼臣龁苣蚁臣꺨胣꺁볯뎼볯超裥ꮁ꿥鞁臣뎂菣뮂菣떂苣超裥貁뻥覂苣膀뻥覂苣龁苣뎃苣뎃苣릂藩鞈臣膀臣鎁臣꒼볯ꆼ볯鞼볯钼볯ꢁ釥趐臣貂苣芀볯꺼볯钼볯钼볯銼苣뎃苣뎃苣릂藩鞈臣몟臣蒁臣膀볯覼볯ꎼ볯ꮁ苣誂꿥ꆱ臣馁苣超裥銂郥肂뷯꒼볯ꆼ菣ꒂ菣ꦃ菣銂郥骮臣讂臣膂胣誏臣銼볯낼볯꾼볯钼볯꺁藥랕苣벃菣隌藩鞈臣꾂菣벃菣銂跥ꊛ臣讂菣궃菣隃臣鞁臣뾽铧馁苣龁苣ꮁ胣ꪂ菣뒂菣꾂菣ꪂ菣覃苣袐裦鞁臣芀戼㹲낼볯늼菣ꦃ苣麃菣꺁꿥袼귦릖郥誏臣蚀雦醐볯銂郥邈臣龁볯㲚牢ਾ귦릖郥낼볯늼菣ꦃ苣麃菣肀볯馀裢ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯뒼볯銈볯馀볯超裥ꪕ迥骼볯隼볯覼戼㹲蚀雦醐볯ꎼ볯鞃菣ꒂ菣벃胣閼胢銈볯뒼볯뒼볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꎼ볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ裢鎼胢袼藩鞈闧랏볯㲚⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯隼볯㲑甯覼戼㹲閁苣ꮁ胣袐裦ꪂ菣뒂菣꾂菣ꪂ菣覃菣ꒂ菣ꪃ菣覃뷥邈菣궃菣隃臣膀믤许臣뢠藩超裥銂賦ꒁ苣뎃苣뎃苣릂볯꺼볯钼볯钼볯銼藩鞈臣覂뷤邈臣龁胣㲂牢ਾ菣ꒂ菣ꪃ菣覃뷥邈菣궃菣隃戼㹲閼胢銈볯Ꞽ볯Ꞽ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯ꎼ볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯ꎼ볯뒼볯銈볯馀戼㹲袼藩鞈闧랏볯㲚⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯隼볯㲒甯覼戼㹲ꢅ闩꾂菣벃菣꺁뻤ꚵ뫦ꮁ臣蒁臣뺹臣讁臣ꦃ苣隃菣ꪃ苣릂苣ꪃ菣讃菣낂臣讂臣膂臣膀菣ꒂ菣ꦃ菣讁苣꺁볯꺼볯銂룤ꞁ郥骮臣龁볯ꎼ볯鞃菣ꒂ菣벃꿥ꞁ볯ꎼ볯鞢맥鞁臣芀곦蒁臣膀菣뢂菣ꎂ菣ꦃ苣隃菣ꪃ苣膀菣궃菣隃苣ꪃ苣貃苣것苣膃菣誏臣낼볯늼菣ꦃ苣麃菣뺯臣肸雦銂铧蒁臣낼볯꾼볯钼볯몁볤邭苣뎂菣覃臣讂苣궃菣뎃苣颍鯩馁苣꺁臣뾽铧鞁臣芀뷯꒼볯ꆼ菣ꒂ菣ꦃ菣벃뷤邈臣龁苣꺁볯꺼볯꾁胣銃菣躃藥鶂蟨蒵맧袼볯ꦼ볯銼볯馼볯讁苣颍鯩鞁臣芀戼㹲誸꣨꺁苣蚁臣颍鯩鞁臣꾂菣벃菣꺁볯꺼볯超裥꾁胣낼볯꾼볯钼볯꺁藥랕볯꺼볯超裥뮼臣鎁臣膀볯꺼볯钼볯鞼볯꒼볯ꆼ볯钼볯邼볯銈볯鎼볯鞼볯ꢁ釥趐臣貂苣붼볯超裥ꪕ迥骼볯閼볯覼迥뎁볯늼볯馼볯邼臣颪냥뾂菣醃苣ꪳ藩鞈苣躸臣龁胣㲂牢ਾ볯꺼볯钼볯鞼볯꒼볯ꆼ볯钼볯邼볯銈볯鎼볯鞼볯꺁藥뢠藩超裥銂볯覽뷯馼볯袼藩鞈闧랏볯銼볯颼볯ꮁꓧ馁胣꾂菣벃菣떼볯놼볯鞼볯袼볯꺼볯閼볯邼볯銼裢醼볯隼���覼臣膀跥肸臣ꪂ菣鞃菣ꪃ菣螃苣뎃苣閃菣벃菣ꪃ菣螃苣뎃苣閃菣벃菣銂郥뾁胣貃苣것苣膃菣趽뷧钼볯銈볯颼臣讦臣醁臣뮿꣨讖꟥ꢃ뷤銂賦ꆁ胣鶁臣ꚁ菣꾂菣ꪂ菣覃뷤꺽볯隼볯颼裢醼볯颼볯꺁臥ꊭ苣覃菣ꞁ뗧꾫臣讂볯ꚼ뷯螽볯銼볯芀뫤겸臣貂苣鶃菣骃菣膃菣趉꟩鎽臣閼볯钼苣龃菣뢅闩ꞁ臣讂볯ꚼ뷯螽볯鎼볯芀볯覽뷯馼볯ꮁꓧ鞁臣ꢅ闩낼볯꾼볯钼볯뾂菣醃苣ꪳ臣膀듧隼볯貼볯隼볯肃菣袃菣꺁ꛨ趩苣誂裥邭蟩誏臣蒴볯躼볯鎼臣邽볯銂鳦馁苣芀볯覽뷯馼볯袼藩鞈闧랏볯銼볯馼볯ꮁꓧ鞁臣ꢅ闩낼볯꾼볯钼볯超裥꺁裥邞臣膀믤许臣节臣꺁귥ꢜ苣躘ꓧ鞁臣蒁苣骼듧ꊂ菣躃藩醼胣蒴苣龃菣뢅볯閼臣랂苣誃菣骃菣膃菣膀듧ꊂ菣躃藩醼볯邼胣蒴苣龃菣뢅볯邼볯膀듧ꊂ菣躃藩銼볯鞼胣蒴苣龃菣뢅볯邼볯誏臣蒴苣龃菣뢅볯邼볯鲀듧ꊂ菣躃藩鎼볯馼臣꺼裢낂菣뎂苣ꮃ賥ꢃ뷤膀迥뎁듧ꊂ菣躃藩鎼볯閼胣蒴苣龃菣뢅볯鞼볯꺁藥ꮖ苣궃菣ꪃ菣誏臣뮸ꛨ蒵맧ꦁ郥Ꞁꓨ袐뷤랂苣趃菣膃菣벃藩鞈菣궃菣꾂胣꾂菣벃菣떼볯놼볯鞼볯袼볯꺼볯閼볯邼볯銼裢醼볯隼볯覼臣膀볯馼볯颼맥钼鳦鞼韦ꮁ볯뒼볯ꎼ臣蒯꣨閁苣膀볯뒼볯ꎼ꿥鞨闧랏볯邼볯鞼볯钼臣颻룤閁苣ꚁ臣讂胣㲂牢ਾ藥랕볯늼볯馼볯邼菣ꪃ菣鞃菣覃臣ꊂ菣躃藩超裥꺁裥邞臣膀臣貂臣ꎼ볯鎼볯誏臣꾼볯邵郥뾂菣醃苣ꪳ裢銼臣覜蓦ꪁ藩鞈ꇩ벼胦銂鳦馁苣鎁臣銂ꓧ蚔臣ꚁ臣讂胣袂苣뎩듧ꮁ臣膀볯膽뷯袽뷯蚽뷯螃菣뾂菣벃苣袼뷯薽뷯鎽뷯辽뷯₎볯閼볯钼볯ₕ볯鞽뷯鎽뷯낼뷯辽뷯ₔ볯閼볯꾁胣낼볯꾼볯钼볯ꊂ菣躃藩超裥ꢁ믤许臣꒼뷯馽뷯辽뷯蚽藩鞈胣ꎼ볯鎼볯뾼볯떼볯ꆼ볯貼ꢼ볯떼볯醼볯颼볯뾼볯貼ꢼ볯떼볯醼볯颼볯뾼볯貼꒼볯隼볯閼볯뾼볯貼낼볯ꊼ볯뾼볯떼볯ꆼ볯貼궼볯Ꞽ볯뾼볯꾼볯뎼볯貼꒼볯隼볯颼볯뾼볯貼ꎼ볯銼볯뾼볯떼볯ꆼ볯貼낼볯랼볯醼볯邼볯誏臣ꢼ볯떼볯钼볯醼볯뾼볯ꢁ臣鎖臣覜蓦ꪁ鯧貐胦銂飦覂臣ꮁ臣龁胣ં†††††††††† †††††††ਠ††††††††䐼噉邀触骶ꏨꎭ볯醀⼼䥄㹖 †††††††††㰠䥄㹖胣鲣귦뺯뇨뢛ꇩ趐胣躘듧뢛⼼䥄㹖 †††††††††㰠䥄㹖胣鲣귦뺯뇨薠鯧趐胣邼볯邼볯㲒䐯噉ਾ††††††††††䐼噉邀ꏨꎭ雦閳胣覤鯦㲴䐯噉ਾ††††††††††䐼噉邀ꏨꎭ臣薆껥醀⼼䥄㹖 †††††††††††邀볯隼볯銼胣㲑牢ਾ껥붖뻤醼볯钼볯銃菣낼볯꾼볯閼볯馼胣낼볯꾼볯銼볯誏臣낼볯꾼볯鎼볯銂苣벃菣馁苣莽볯꺼볯꾂菣벃菣꺁跥ꊛ戼㹲龮雦设볯ꮁ꣨���臣龁苣蚁臣膀믤꺁볯뎼볯超裥ꮁ雩ꎀ臣龁苣뎃苣뎃苣릂볯꺼볯超裥銂꟦覯臣龁胣鎁臣뎂菣뮂菣떂苣超裥ꢁ볯躽뷯馽뷯薽볯뎼볯꾂菣벃菣꺼뷯躼볯銼볯銼볯馼볯ꮁ郥뺁苣讂볯뎼볯超裥ꢁ臣鎖臣뎦꿥閁苣龁鯧貐胦ꮁ鿥ꖁ臣ꚁ胣ꦼ뷯莽뷯钽뷯ꖼ볯뒼苣궃菣뎃볯辽볯钼볯钼볯邼볯邼苣随뻥鞁胣鶁臣뾌藥궖觧銂뻥ꚁ藩鞈苣몱껥鞁臣芀賦ꖅ雦螉藩鞈臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ볯늼볯醼볯閼볯袼볯覽뷯閽뷯薽볯鎼볯鮼藩鞈闧랏볯隼볯钼볯ꢁ釥趐臣貂臣ꢅ闩뾂菣醃苣ꪳ苣뎂菣覃臣讂臣ꢁ臣몙ꛨ閁苣龁胣뾌藥궖觧袼볯꺼볯隼볯颼볯隼볯꺁볯꺼볯超裥꾁胣ꚼ뷯螽뷯銽뷯銼볯醼볯超裥ꪕ迥骼볯醼볯覼臣몤臣貂臣蒁苣芀戼㹲誸꣨꺁껥붖뻤銼臣風볨꺁苣龃菣벃苣릂苣ꪃ菣뎃臣颍鯩閁苣龁뷯꒼볯ꆼ藩鞈臣膀臣鎁臣誁臣ꚁ볯꺼볯钼볯鎼볯醼臣붑郥閁苣龁胣鶁臣ꚁ胣꒼볯ꆼ볯鎼볯邼볯꾁胣겅藥꺁볯뎼볯螃菣뾂菣馃菣릂볯设臣낁볯薽뷯ꊼ뷯躽뷯覼迥뎁蟨뺤臣ꖼ볯뒼꒼볯ꆼ菣벃苣벃菣벃苣袼볯ꦼ볯ꖼ볯ꖼ볯袼闥膓郥覼胣ꦼ뷯莽뷯钽뷯₅볯袽뷯銽뷯膽뷯薽뷯钽뷯莽뷯貽뷯膀볯膽뷯辽ꆼ뷯钽뷯膀볯ꆼ볯銂郥鎂臣뺏귥꺁鯧貐胦銂郥骮臣讂臣膂臣꺨胣꺁駧뺏藩鞈뷯膽뷯袼볯뎼볯覼菣벃苣벃菣벃苣ꢁ꿦莼臣貂臣芀鯧貐胦꺁ꓦꊴ臣膀苣뎃菣ꖃ菣뾂菣鞃菣낂菣ꂃ볯겼볯뎼볯袏臣ꊼ볯ꆼ볯뒼볯袼볯貽뷯鎽뷯閽뷯覭볯貼볯薽뷯袽뷯蒽뷯ₓ뷯躽ꖼ뷯骽뷯趽뷯貽뷯螽뷯ₙ볯隼볯骼볯隼볯銈볯颼볯袼볯馼볯隼볯覼苣뾽铧鞁臣誁臣ꪁ苣貂臣芀韦ꖟ臣뾂菣醃苣ꪳ苣뎂菣覃臣ꪁ臣鞼볯袼迥꾁臣讂ꃥ袐臣馼볯覼迥꾁臣貂믤誸臣ꊼ볯ꆼ볯뒼苣뎂苣ꢁ臣ꎁ臣鎁苣覂臣钯볨꾁胣鞃菣낂菣ꂃ胣邽뷯膽뷯邽胣袼볯袽뷯貽Ꞽ뷯薽뷯躽볯₌볯躽뷯隽뷯銽뷯覽뷯馽辽뷯₆볯膽뷯袽뷯躽뷯钽뷯躽볯₌볯薽뷯钽뷯貽뷯貼랼뷯鎽뷯覽뷯螽뷯辽뷯覼臣袂臣ꚁ苣뎃苣뎃苣릂볯꺼볯超裥뢁臣蚛苣覂苣蒵臣讫臣覂苣龁胣鶁苣讁苣鞾苣貂臣뎂菣뮂菣떂苣超裥꾁胣鎁臣ꮁ臣蒁臣꒼볯ꆼ볯閼볯閼볯ꢁ釥趐臣貂臣芀볯꺼볯钼볯钼볯颼苣뎃苣뎃苣릂藩鞈臣몟臣蒁臣膀苣ꪃ苣貃苣것苣膃菣鞃菣벃菣貁뷤覂苣膀룤風臣龮雦设볯꺁菣ꦃ苣ꦃ菣醼臣몤臣貂臣蒁苣袂臣ꮁꫨ붣臣貂臣銃菣躃藥뎄볯겼볯ꊼ볯閼볯覼菣ꒂ菣ꦃ菣벃臣뢁裥ꮁ뷤ꢔ臣貂臣芀苣궃菣讃菣낂菣꾂苣벃臣邽볯ꮼ볯ꊼ볯邽볯ꮼ볯꒼臣膀뷯늼볯閼볯꺁觥蚧뷤ꞁ볯蚽뷯ꦼ菩趽苣ꮐ臣ꪁ臣鮼볯辽뷯趽뷯鎽귧躼볯뎼뷯���覽뷯躽뷯薽볯銼볯鎼볯醼볯鞼볯銈볯銼볯邼볯醼볯馼볯覼苣芏藧꺁臣ꢁ볯ꞁ胣螈苣몇臣貂臣莽볯꺼볯꺁苣ꒂ苣꾁볯颼볯邼뷯邽苣誂냥閁臣芀戼㹲낼볯늼菣ꦃ苣麃菣袼귦誏臣蚀雦醐볯銂郥邈臣龁볯㲚牢ਾ귦릖郥낼볯늼菣ꦃ苣麃菣袼볯閼볯閼볯躼뷯貽볯閼胢銈볯ꎼ볯ꆼ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯ꎼ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯Ꞽ볯銈볯馀胣肀胣肀胣肀胣肀胣肀胣肀胣肀胣肀胣肀胣肀胣肀肀胣肀胣肀胣肀볯超裥ꪕ迥骼甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰隼볯銼⼼㹵볯㲉牢ਾ胩릖郥낼볯늼菣ꦃ苣麃菣袼볯閼볯閼볯躼뷯貽볯閼胢銈볯Ꞽ볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯ꆼ볯Ꞽ볯ꆼ볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯ꎼ볯ꎼ볯銈볯馀戼㹲袼藩鞈闧랏볯㲚⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢볯銼볯㲓甯覼戼㹲閁苣ꮁ臣膀郥邈苣ꪃ苣貃苣것苣膃菣较苣隃菣肃苣벂菣랂菣뎃菣궃菣隃苣膀믤许臣貃苣것苣膃菣超裥銂鳦馁苣뎂菣뮂菣떂苣꒼볯ꆼ볯閼볯閼볯超裥讁苣讧꿧鞁臣芀戼㹲较苣隃菣肃苣벂菣랂菣뎃菣궃菣隃볯钼볯钼볯颼볯邽볯覼戼㹲閼胢銈볯뒼볯Ꞽ볯뒼볯뒼볯ꆼ볯ꎼ볯뒼볯Ꞽ볯Ꞽ볯뒼볯ꆼ볯뒼볯뒼볯ꎼ볯Ꞽ볯뒼볯Ꞽ볯ꆼ볯뒼볯ꎼ볯ꆼ볯ꎼ볯ꆼ볯Ꞽ볯ꎼ裢鎼胢㲙牢ਾ볯超裥ꪕ迥骼甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰隼볯钼⼼㹵볯ઉ†††††††††† †††††††ਠ†††††† †††ਠ††䐼噉邀鯥鮚ꫨ뮟ꃥ誑胣㲑䐯噉ਾ††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㤰㌱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄹ㰴愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㤰㔱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄹ㰶愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㤰㜱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰ㄹ㰸愯㰾䐯噉ਾ††††䐼噉㰾⁡牨晥∽〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩㸢〲㐰ㄵ㘳㈰琮晩ꃂ〰㤰㤱⼼㹡⼼䥄㹖 †††㰠䥄㹖愼栠敲㵦㈢〰㔴㌱〶⸲楴≦㈾〰㔴㌱〶⸲楴쉦゠〰㈹㰰愯㰾䐯噉ਾ††⼼潢祤ਾ⼼瑨汭ਾ