(57)【要約】本発明は、新生骨の形成を必要とする多様な病的状態を、有効量のＲＡＮＫアンタゴニストの投与により処置する方法を提供する。本発明方法に適したアンタゴニストには、ＲＡＮＫＬを結合する可溶性ＲＡＮＫポリペプチド、ＲＡＮＫ活性を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬに特異的な抗体、およびオステオプロテゲリンが含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
その必要がある患者を処置する方法であって、ＲＡＮＫアンタゴニストを、新生骨形成速度の亢進を刺激するのに十分な量および頻度で患者に投与することを含み、その際
（ａ）ＲＡＮＫアンタゴニストはＲＡＮＫがＮＦ−κＢを誘導する能力を阻害でき、ＲＡＮＫはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸１〜６１６からなるタンパク質であり；
（ｂ）患者は、急性敗血症性関節炎、骨軟化症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、脊髄損傷を伴う患者、歯周再構築を必要とする患者、および癌に対する放射線療法コースを終了した患者よりなる群から選択され；
（ｃ）ＲＡＮＫアンタゴニストは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸３３〜１９６を含むＲＡＮＫポリペプチドを特異的に結合できる抗体；ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬ  ｍＲＮＡの転写または翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬ  ｍＲＮＡを開裂するリボザイム；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸６９〜３１７を含むＲＡＮＫＬポリペプチドを特異的に結合できる抗体；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２２〜１８５を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸１〜３１７からなるＲＡＮＫＬポリペプチドを結合できるＯＰＧポリペプチド、よりなる群から選択される、前記方法。
【請求項２】
患者が処置開始前の少なくとも１カ月間、骨密度低下を生じたことがない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
処置を施している期間中、処置の充足度を骨密度の反復測定によりモニターする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＲＡＮＫアンタゴニストが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸６９〜３１７を含むＲＡＮＫＬポリペプチドを特異的に結合できる抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＲＡＮＫアンタゴニストが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２２〜１８５を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸１〜３１７からなるＲＡＮＫＬポリペプチドを結合できる、ＯＰＧポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
その必要がある患者を処置する方法であって、ＲＡＮＫアンタゴニストを、新生骨形成速度の亢進を刺激するのに十分な量および頻度で患者に投与することを含み、その際
（ａ）ＲＡＮＫアンタゴニストはＲＡＮＫがＮＦ−κＢを誘導する能力を阻害でき、ＲＡＮＫはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸１〜６１６からなるタンパク質であり；
（ｂ）ＲＡＮＫアンタゴニストは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸６９〜３１７を含むＲＡＮＫＬポリペプチドを結合できる可溶性ＲＡＮＫポリペプチドであり、該可溶性ＲＡＮＫポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸３３〜１９６を含むＲＡＮＫポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を有し；
（ｃ）患者は、急性敗血症性関節炎、骨軟化症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、脊髄損傷を伴う患者、歯周再構築を必要とする患者、および癌に対する放射線療法コースを終了した患者よりなる群から選択される、前記方法。
【請求項７】
可溶性ＲＡＮＫポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示すヌクレオチド配列からなる核酸分子またはその相補体とストリンジェント条件下でハイブリダイズできる核酸分子によりコードされ、その際ストリンジェント条件が６×ＳＳＣ中、６３℃でのハイブリダイゼーション、および３×ＳＳＣ中、５５℃での洗浄を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
可溶性ＲＡＮＫポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸３３〜１９６を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
可溶性ＲＡＮＫポリペプチドがさらに、免疫グロブリンＦｃドメイン、ＦＬＡＧ（商標）タグ、少なくとも約６個のＨｉｓ残基を含むペプチド、ロイシンジッパー、ポリエチレングリコールおよびその組合わせよりなる群から選択される部分を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
追加部分が免疫グロブリンＦｃドメインを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
可溶性ＲＡＮＫポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸３０〜４３３からなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
可溶性ＲＡＮＫポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸３０〜４３３からなり、ただし残基３５２のアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され、かつ残基３５４のロイシンがメチオニンにより置換されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
患者が処置開始前の少なくとも１カ月間、骨密度低下を生じたことがない、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
処置を施している期間中、処置の充足度を骨密度の反復測定によりモニターする、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
その必要があるヒト患者を処置する方法であって、ＲＡＮＫアンタゴニストを、新生骨形成速度の亢進を刺激するのに十分な量および頻度で患者に投与することを含み、その際
（ａ）ＲＡＮＫアンタゴニストは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸６９〜３１７を含むＲＡＮＫＬポリペプチドを結合できる可溶性ＲＡＮＫポリペプチドであってＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸３３〜１９６を含むＲＡＮＫポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を有する可溶性ＲＡＮＫポリペプチド；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸３３〜１９６を含むＲＡＮＫポリペプチドを特異的に結合できる抗体；ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬ  ｍＲＮＡの転写または翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬ  ｍＲＮＡを開裂するリボザイム；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸６９〜３１７を含むＲＡＮＫＬポリペプチドを特異的に結合できる抗体；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２２〜１８５を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸１〜３１７からなるＲＡＮＫＬポリペプチドを結合できるＯＰＧポリペプチドよりなる群から選択され；
（ｂ）患者は、人工関節レシピエント、骨移植片レシピエントおよび靭帯移植片レシピエントよりなる群から選択され；
（ｃ）１回目のアンタゴニストを、人工関節、骨移植片または靭帯移植片の外科移植の１カ月以内に投与する、前記方法。
【請求項１６】
処置を施している期間中、処置の充足度を骨密度の反復測定によりモニターする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＡＮＫアンタゴニストが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸６９〜３１７を含むＲＡＮＫＬポリペプチドを特異的に結合できる抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＲＡＮＫアンタゴニストが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２２〜１８５を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸１〜３１７からなるＲＡＮＫＬポリペプチドを結合できる、ＯＰＧポリペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ＲＡＮＫアンタゴニストが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸３３〜１９６を含む可溶性ＲＡＮＫポリペプチドである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
可溶性ＲＡＮＫポリペプチドがさらに、免疫グロブリンＦｃドメイン、ＦＬＡＧ（商標）タグ、少なくとも約６個のＨｉｓ残基を含むペプチド、ロイシンジッパー、ポリエチレングリコールおよびその組合わせよりなる群から選択される部分を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
可溶性ＲＡＮＫポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すアミノ酸配列からなる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
可溶性ＲＡＮＫポリペプチドが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸３０〜４３３からなり、ただし残基３５２のアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され、かつ残基３５４のロイシンがメチオニンにより置換されている、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９のもとに米国仮特許出願Ｎｏ．６０／２９１，９１９の優先権を主張し、その開示内容を本明細書に援用する。
発明の技術分野
本発明は一般に、新生骨の形成を必要とする病的状態におけるＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ相互作用のアンタゴニストの療法使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＲＡＮＫ（ＮＦ−κＢの受容体アクチベーター）およびそのリガンド（ＲＡＮＫＬ）は、免疫応答および骨代謝において重要な役割を果たす受容体／リガンド対である。ＲＡＮＫおよびＲＡＮＫＬはネズミおよびヒトの両方においてクローニングおよび解明された（たとえばＵ．Ｓ．６，０１７，７２９、ＷＯ９８／２５９５８、ＥＰ０  ８７３  ９９８、ＥＰ０  ９１１  ３４２、Ｕ．Ｓ．５，８４３，６７８、ＷＯ９８／４６７５１およびＷＯ９８／５４２０１参照）。
【０００３】
ＲＡＮＫＬはＲＡＮＫだけでなく、腫瘍壊死因子受容体ファミリーのメンバーであるオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）と呼ばれる天然ＲＡＮＫデコイタンパク質にも結合することが示されている（たとえばＵ．Ｓ．６，０１５，９３８およびＷＯ９８／４６７５１参照）。ＯＰＧは可溶性分子であり、骨代謝におけるその役割はＨｏｆｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ  Ｒｅｓ  １５（１）：２−１２（２０００）に概説されている。ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬおよびＯＰＧの生物学的作用についての観点は、さらにたとえばＳｉｍｏｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８９：３０９−３１９（１９９７）；Ｋｏｄａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ２３０：１２１−２７（１９９９）；Ｕ．Ｓ．５，８４３，６７８；およびＵ．Ｓ．６，０１５，９３８に述べられている。ＲＡＮＫと対比してＯＰＧは、”ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド”、すなわち”ＴＲＡＩＬ”として知られる第２結合パートナーをも結合する。ＴＲＡＩＬはトランスフォームした多様なヒト細胞系においてインビトロでアポトーシスを誘導し、ヒト腫瘍の治療におけるその療法能について試験が行われている。ＯＰＧは、ＲＡＮＫＬに結合してこれがＲＡＮＫを結合するのを阻害することによりＲＡＮＫ活性を抑制する作用をもち、骨損失を特色とするさまざまな状態に対する療法薬として提唱されている（ＷＯ９８／４６７５１；ＷＯ０１／０３７１９；ＷＯ０１／１６２９９；ＷＯ０１／１７５４３；およびＷＯ０１／０３７１９）。
【０００４】
Ｉ型膜貫通タンパク質ＲＡＮＫは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーである（たとえばＵ．Ｓ．６，０１７，７２９参照）。全長ヒトＲＡＮＫポリペプチドは６１６個のアミノ酸をもつ。ヒトＲＡＮＫＬは、腫瘍壊死因子リガンドファミリーの３１７アミノ酸のタンパク質であり、シグナルペプチドを欠如し、短い細胞質ドメインおよびＲＡＮＫと特異的に結合する細胞外領域をもつ、ＩＩ型膜タンパク質である（たとえばＵ．Ｓ．６，０１７，７２９参照）。ＲＡＮＫＬは”オステオプロテゲリン結合性タンパク質”、”破骨細胞形成（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）分化因子”および”ＴＲＡＮＣＥ”とも呼ばれる（たとえばＫｏｄａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｙａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：３５９７（１９９８）；およびＷｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（４３）：２８３５５−５９（１９９８）参照）。
【０００５】
ＲＡＮＫタンパク質は、種々のＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）との相互作用により細胞内事象を起こさせる（たとえばＧａｌｉｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（５１）：３４１２０−２７（１９９８）；Ｄａｒｎａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（３２）：２０５５１−５５（１９９８）；およびＷｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８参照）。たとえばＲＡＮＫとそのリガンドＲＡＮＫＬの相互作用によりＲＡＮＫがトリガーされると、ＴＲＡＦ仲介による細胞内事象が活性化し、その結果、免疫系の細胞において広範に用いられる遍在性転写因子である転写因子ＮＦ−κＢがアップレギュレートされる。
【０００６】
ＲＡＮＫは主に、上皮細胞、ＢおよびＴ細胞系、線維芽細胞、樹状細胞ならびに破骨細胞およびそれらの前駆体の表面に発現する。可溶形でも存在するＲＡＮＫＬは、主に造血組織、たとえば骨髄、胸腺および脾臓、ならびにＴ細胞および骨芽細胞系列の細胞に発現する。ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ相互作用により仲介される信号は、骨再吸収に関与する細胞である破骨細胞の分化および機能の刺激に関係する（たとえばＬａｎｃｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９３：１６５−７６（１９９８）；Ｙａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８参照）。このプロセスは、ＲＡＮＫＬを発現する細胞と破骨細胞前駆体の直接接触に関係すると思われる。したがって、ＲＡＮＫＬ結合を遮断するオステオプロテゲリンまたは可溶形ＲＡＮＫを投与して破骨細胞活性を阻害し、これにより、骨粗鬆症、悪性高カルシウム血症、リウマチ性関節炎、補綴具の緩みなどに関連する骨損失速度を低下させることができると提唱された（たとえばＷＯ９８／４６７５１、ＷＯ９９／５８６７４、ＷＯ０１／１６２９９およびＨｏｆｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００参照）。
【０００７】
ＲＡＮＫタンパク質に由来するＲＡＮＫアンタゴニストのインビボ作用について幾つかの研究が報告された（たとえばＵＳＰ６，０１５，９３８およびＷＯ９８／４６７５１参照）。そのほか、ヒト疾患のマウスモデルにおいて可溶性ＲＡＮＫの投与により骨破壊が低減したと報告されている（Ｏｙａｊｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ  Ｒｅｓ  １５（ｓｕｐｐｌ．１）：Ｓ１７６，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃１１５１（Ｓｅｐ．，２０００）；Ｏｙａｊｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６１：２５７２−７８（２００１）；Ｃｈｉｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ，Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，サンフランシスコ，２００１参照）。
【０００８】
骨疾患を治療するための療法は近年著しく改善された（Ｒｏｄａｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１５０８−１５１４（２０００）参照）。たとえば、骨沈着を促進するペプチドが同定された（ＷＯ００／７５１８５）。しかし、新たな骨の形成が望ましい多様な病的状態に対するより良い療法を提供することが、依然として要望されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
発明の概要
本発明は、新たな骨の形成が要求される多様な病的状態を処置するための方法および組成物を提供する。本発明の療法薬および組成物は、実際に骨損失が起きていない患者に骨形成を刺激するために投与できる。これらの療法薬が有益な患者には、以前に骨密度低下を生じたことがあるが現在は骨損失がみられない患者が含まれる。これらの処置が有益な患者には、その症状が骨密度低下を特色とするものではないにもかかわらず新たな骨の形成が要求される患者、たとえば外傷性傷害のため骨を失った事故被害者が含まれる。
【００１０】
本発明の方法および組成物に使用するのに適したＲＡＮＫアンタゴニストには、下記のものが含まれる：ＲＡＮＫを特異的に結合でき、かつＲＡＮＫをトリガーしない抗体；ＲＡＮＫＬを特異的に結合できる抗体；ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬ  ｍＲＮＡの翻訳または転写を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド；オステオプロテゲリンポリペプチド；およびＲＡＮＫＬを結合できる可溶性ＲＡＮＫポリペプチド。ＲＡＮＫアンタゴニストとして有用な可溶性ＲＡＮＫタンパク質は、ＲＡＮＫポリペプチドの細胞外領域のＲＡＮＫＬ結合性部分を含むであろう；これには、ＲＡＮＫＬ結合能を保持する限り、対立遺伝子バリアントおよびムテイン（ｍｕｔｅｉｎ、変異タンパク質）が含まれる。
【００１１】
本発明の具体的態様には下記のものが含まれる。
本発明は、下記の患者にＲＡＮＫアンタゴニストを投与する処置方法を提供する：急性敗血症性関節炎、骨軟化症（リケッチア症および壊血病を含む）、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、脊髄損傷の病的状態のうちいずれかを伴う患者、歯周再構築を必要とする患者、および癌に対する放射線療法コースを終了した患者。ＲＡＮＫアンタゴニストを、新生骨形成速度の亢進を刺激するのに十分な量および頻度で患者に投与する。本発明方法に使用されるＲＡＮＫアンタゴニストは、ＲＡＮＫがＮＦ−κＢを誘導する能力を阻害できるものである。ＲＡＮＫはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸１〜６１６からなるタンパク質であり、ＲＡＮＫアンタゴニストは、下記のいずれかである：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸３３〜１９６を含むＲＡＮＫポリペプチドを特異的に結合できる抗体；ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬ  ｍＲＮＡの転写または翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸６９〜３１７を含むＲＡＮＫＬポリペプチドを特異的に結合できる抗体；またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２２〜１８５を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸１〜３１７からなるＲＡＮＫＬポリペプチドを結合できる、ＯＰＧポリペプチド。この方法の１態様において、患者は処置開始前の少なくとも１カ月間、骨密度低下を生じたことがない。ＲＡＮＫアンタゴニストを投与している期間中、処置の充足度を骨密度の反復測定によりモニターすることができる。本発明方法に使用するのに適したＲＡＮＫアンタゴニストの１つは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸６９〜３１７を含むＲＡＮＫＬポリペプチド（ヒトＲＡＮＫＬの細胞外ドメイン）を特異的に結合できる抗体である。同様にＲＡＮＫアンタゴニストとして使用するのに適したものは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２２〜１８５を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸１〜３１７からなるＲＡＮＫＬポリペプチドを結合できる、ＯＰＧポリペプチドである。
【００１２】
本発明の他の態様は、急性敗血症性関節炎、骨軟化症、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、単骨性線維性骨異形成症、多骨性線維性骨異形成症、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球増殖症、脊髄損傷を伴う患者、歯周再構築を必要とする患者、および癌に対する放射線療法コースを終了した患者を処置する方法を提供する。この方法では、ＲＡＮＫアンタゴニストを、新生骨形成速度の亢進を刺激するのに十分な量および頻度で患者に投与する。この方法で使用するＲＡＮＫアンタゴニストは、ＲＡＮＫがＮＦ−κＢを誘導する能力を阻害できるものである。ＲＡＮＫはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸１〜６１６からなるタンパク質である。この方法において、ＲＡＮＫアンタゴニストはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸６９〜３１７を含むＲＡＮＫＬポリペプチドを結合できる可溶性ＲＡＮＫポリペプチドであり、該可溶性ＲＡＮＫポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸３３〜１９６を含むＲＡＮＫポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性をもつ。本発明の１態様において、患者は処置開始前の少なくとも１カ月間、骨密度低下を生じたことがない。この方法の他の態様において、可溶性ＲＡＮＫポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示すヌクレオチド配列からなる核酸分子またはその相補体とストリンジェント条件下でハイブリダイズできる核酸分子によりコードされ、その際ストリンジェント条件は６×ＳＳＣ中、６３℃でのハイブリダイゼーション、および３×ＳＳＣ中、５５℃での洗浄を含む。１態様において、可溶性ＲＡＮＫポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸３３〜１９６を含む。さらに他の態様において、可溶性ＲＡＮＫポリペプチドはさらに、免疫グロブリンＦｃドメイン、ＦＬＡＧ（商標）タグ、少なくとも約６個のＨｉｓ残基を含むペプチド、ロイシンジッパー、ポリエチレングリコールおよびその組合わせよりなる群から選択される部分を含む。１態様において、可溶性ＲＡＮＫポリペプチドは免疫グロブリンＦｃドメインに共有結合している。本発明の１態様において、ＲＡＮＫアンタゴニストはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸３０〜４３３からなるＲＡＮＫ：Ｆｃ融合タンパク質であるか、あるいはこの融合タンパク質のバリアントであって、残基３５２のアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され、かつ残基３５４のロイシンがメチオニンにより置換されたものである。処置を施している期間中、処置の充足度を骨密度の反復測定によりモニターする。
【００１３】
本発明は、人工関節レシピエント、骨移植片レシピエントおよび靭帯移植片レシピエントである患者を処置する方法であって、ＲＡＮＫアンタゴニストを、新生骨形成速度の亢進を刺激するのに十分な量および頻度で患者に投与することを含む方法をも提供する。その際、ＲＡＮＫアンタゴニストは下記のいずれかである：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸６９〜３１７を含むＲＡＮＫＬポリペプチドを結合できる可溶性ＲＡＮＫポリペプチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸３３〜１９６を含むＲＡＮＫポリペプチドに対して少なくとも９０％の同一性を有する可溶性ＲＡＮＫポリペプチド；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸３３〜１９６を含むＲＡＮＫポリペプチドを特異的に結合できる抗体；ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬ  ｍＲＮＡの転写または翻訳を遮断するアンチセンスオリゴヌクレオチド；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸６９〜３１７を含むＲＡＮＫＬポリペプチドを特異的に結合できる抗体；またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２２〜１８５を含み、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸１〜３１７からなるＲＡＮＫＬポリペプチドを結合できる、ＯＰＧポリペプチド。たとえば、ＲＡＮＫアンタゴニストはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸３３〜１９６を含む可溶性ＲＡＮＫポリペプチドである。可溶性ＲＡＮＫポリペプチドをＲＡＮＫアンタゴニストとして使用する場合、アンタゴニストタンパク質はさらに他の部分、すなわち免疫グロブリンＦｃドメイン、商標ＦＬＡＧタグ、少なくとも約６個のＨｉｓ残基を含むペプチド、ロイシンジッパー、ポリエチレングリコールまたはその組合わせを含むことができる。本明細書の記載に従って使用するのに適したＲＡＮＫ：Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すアミノ酸配列からなるもの、またはこのタンパク質のバリアントであって、残基３５２のアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され、かつ残基３５４のロイシンがメチオニンにより置換されているものである。これらの患者を処置する際、１回目のアンタゴニストを、人工関節、骨移植片または靭帯移植片の外科移植の１カ月以内に投与する。この方法の１態様においては、処置を施している期間中、処置の充足度を骨密度の反復測定によりモニターする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、新生骨形成の必要性を特色とする病的状態を処置するための方法および組成物を提供する。好ましくは患者はヒトであるが、本発明方法はペットおよび農場動物などの家畜を含めたいかなる動物にも適用できる。本明細書中で用いる”新生骨形成”とは、患者の１以上の骨における硬質石灰化骨組織の量の正味増加を意味する。本発明方法は、新生骨形成を刺激するのに有効な量のＲＡＮＫアンタゴニストを、その必要がある患者に投与することを伴う。ＲＡＮＫアンタゴニストは、好ましくは患者と同一種の動物に由来するタンパク質である。”ＲＡＮＫアゴニスト”は、ＲＡＮＫをトリガーするのに関連する生物学的活性を誘導する薬剤、たとえばＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤である。本明細書中で用いる”ＲＡＮＫアンタゴニスト”は、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬの相互作用を遮断または低減する薬剤であり、これにはＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬの合成を阻害する薬剤が含まれる。ＲＡＮＫアンタゴニストは、一般にＲＡＮＫをトリガーするのに関連する生物学的活性を低減する。ある態様において、ＲＡＮＫアンタゴニストは可溶性ＲＡＮＫを含むか、あるいはＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬに対する抗体であって、ＲＡＮＫとＲＡＮＫＬの相互作用を阻害もしくは遮断し、かつＲＡＮＫをトリガーするのに関連する生物学的活性を刺激しない抗体を含む。他の適切なＲＡＮＫアンタゴニストは、ＯＰＧまたはその可溶性誘導体であり、これには二量体またはより高次の多量体が含まれる。ＲＡＮＫアンタゴニストは、一般にＲＡＮＫをトリガーするのに関連する生物学的活性のうち少なくとも１つを阻害または遮断するであろう。
【００１５】
たとえば膜結合もしくは可溶性ＲＡＮＫＬとの接触またはアゴニスト作用性抗ＲＡＮＫ抗体との接触によりＲＡＮＫがトリガーされると、ＲＡＮＫ仲介による細胞性応答が誘発される；これはＲＡＮＫタンパク質の細胞質テイルのコンホメーション変化を誘導する受容体オリゴマー化により起きる。これらの細胞性応答には、免疫系の細胞に広く用いられる遍在性転写因子である転写因子ＮＦ−κＢの活性化、ｃ−ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化、またはアクチベータータンパク質１（ＡＰ−１）の活性化を含めることができる；たとえばＧａｌｉｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：３４１２０−２７（１９９８）またはＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５５：１５３６−４５（２０００）参照。破骨前駆細胞においてＲＡＮＫがトリガーされると、前駆細胞から成熟破骨細胞への分化が誘導される。ＲＡＮＫが活性化されると、成熟破骨細胞の骨再吸収活性も高まる。ＲＡＮＫ活性のアンタゴニストは、適切なアッセイ系、たとえば破骨細胞の生物学的活性を測定するアッセイにおいて、上記のようなトリガーされたＲＡＮＫの表示（ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ）のいずれかをそれらが阻害または阻止する能力により同定できる。
【００１６】
推定ＲＡＮＫアンタゴニストがＲＡＮＫと拮抗する活性をもつかを判定するアッセイを実施できる。ある分子がＲＡＮＫと拮抗する能力は、たとえばＲＡＮＫを発現する細胞においてＮＦ−κＢの量または活性を測定するアッセイ法（たとえばＵＳＰ６，０１７，７２９に記載）、またはＪＮＫもしくはＡＰ−１の量または活性を測定するアッセイ法（たとえばＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）に記載）によって容易に判定できる。ＮＦ−κＢのアッセイにおいては、ＲＡＮＫを発現する細胞、たとえば２９３／ＥＢＮＡ細胞を用いる。２９３／ＥＢＮＡ細胞は、エプスタイン・バーウイルス核抗原−１をコードする遺伝子で２９３細胞系をトランスフェクションすることにより誘導した細胞系である。そのようなアッセイを実施するためには、２９３／ＥＢＮＡ細胞その他のＲＡＮＫ発現被験細胞を、推定ＲＡＮＫアンタゴニストの存在下または不存在下でＲＡＮＫトリガーに曝露する。ＲＡＮＫトリガーは、ＲＡＮＫＬもしくは可溶性ＲＡＮＫＬを発現する細胞、またはＲＡＮＫ活性を増強する抗体であってよい。推定アンタゴニストに曝露した後、トリガーされた被験細胞におけるＮＦ−κＢの量または活性を測定する。ＲＡＮＫがトリガーされるのを推定アンタゴニストが阻害した場合、トリガーされた被験細胞におけるＮＦ−κＢの量または活性は増大しないであろう。推定ＲＡＮＫアンタゴニストに曝露した被験細胞において、その分子に曝露しなかった細胞より少量のＮＦ−κＢが検出されれば、その分子はＲＡＮＫアンタゴニストであると判定される。あるいは、ＪＮＫまたはＡＰ−１の活性化をＲＡＮＫ活性の尺度として利用できる。ＲＡＮＫアンタゴニスト活性を測定するのに適した他のアッセイ法には、たとえば酵素イムノアッセイ法もしくはドットブロット法、固定化もしくは細胞表面ＲＡＮＫＬへの標識ＲＡＮＫの結合を漸増量のそのフラグメントの存在下で検出するアッセイ法、あるいは標識ＲＡＮＫＬフラグメントの存在下で固定化もしくは細胞表面ＲＡＮＫへの結合を検出するアッセイ法が含まれる。そのような方法は当技術分野で周知である。
【００１７】
ネズミＲＡＮＫをコードするヌクレオチド配列の例をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に示し；ヒトＲＡＮＫをコードするヌクレオチド配列の例をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示し；対応する全長ＲＡＮＫポリペプチドをそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および４に示す。ヒトＲＡＮＫタンパク質は６１６個のアミノ酸残基をもち、一方ネズミＲＡＮＫは６２５個のアミノ酸をもち、それぞれＲＡＮＫＬを結合できる細胞外ドメイン、膜貫通領域および細胞質ドメインを含む。ＲＡＮＫの細胞質ドメインは、ＴＲＡＦ１、２、３、５および６を結合できる。ヒトＲＡＮＫの細胞外ドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸１〜２１３に相当し、ネズミＲＡＮＫの細胞外ドメインはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１〜２１４に相当する。ヒトＲＡＮＫタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の残基２４〜３３の間のいずれかのアミノ酸の後で開裂できる、好ましくはアミノ酸２９の後で開裂できる、シグナル配列をもつ。ネズミＲＡＮＫタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の残基２５〜３５の間のいずれかのアミノ酸の後で開裂できる、好ましくはアミノ酸３０の後で開裂できる、シグナル配列をもつ。
【００１８】
ヒトおよびネズミＲＡＮＫおよびＲＡＮＫＬをコードするＤＮＡの単離がＵＳＰ６，０１７，７２９に記載されており、これを本明細書に援用する。本発明の実施に有用なＲＡＮＫアンタゴニストには、ＲＡＮＫＬを結合でき、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＮＯ：４に示すＲＡＮＫタンパク質の細胞外領域のＲＡＮＫＬ結合性部分をコードする核酸（またはその相補体）にストリンジェント条件下でハイブリダイズできる核酸分子によりコードされる、可溶性ＲＡＮＫポリペプチドが含まれる。そのようなＲＡＮＫアンタゴニストは、療法薬として使用した場合に該タンパク質の合成、精製または臨床有効性を高めるヘテロロガスシグナルペプチドもしくは免疫グロブリンＦｃ領域または他のいずれかの部分をさらに含むことができる。適切なハイブリダイゼーション条件の選択方法は当技術分野で周知であり、多数の方法が記載されている。たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー；１９８９）；ｐ．９．５０−９．５７および１１．４５−１１．５７参照；これを本明細書に援用する）。一般に、複雑な核酸を標識ハイブリダイゼーションプローブとして用いる場合、それらを使用前にアルカリ処理または機械的剪断によりフラグメント化して、長さ５０〜６００ヌクレオチドのフラグメントを得る。長さが約５０ヌクレオチドを超えるプローブについては、ストリンジェント条件は融解温度（Ｔｍ）より２０〜２５℃低い温度でハイブリダイズすることにより達成され、一方、オリゴヌクレオチド（一般に長さ１４〜３０ヌクレオチド）については、ストリンジェント条件は一般に融解温度より５〜１０℃低い温度でハイブリダイズすることを伴う（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｐ．１１．４５参照）。長さが約１４ヌクレオチドを超えるプローブについては、Ｔｍは式Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ10［Ｎａ+］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）を用いて妥当な精度で計算できる。式中、Ｎはハイブリッドデュプレックス中の塩基数であり、［Ｎａ+］はハイブリダイゼーション緩衝液のナトリウムイオン濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ+］は０．１６５Ｍ）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｐ．１１．４６参照）。ハイブリダイゼーション溶液にホルムアミドを添加する場合、Ｔｍ（したがって最適ハイブリダイゼーション温度）は各１％ホルムアミドについて約０．６３℃低下する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｐ．９．５１参照）。ターゲット核酸を固体支持体に固定する場合、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、たとえば６×ＳＳＣ中、６３℃でのハイブリダイゼーション、および３×ＳＳＣ中、５５℃での洗浄により達成できる。あるいは、ストリンジェント条件は、６×ＳＳＣプラス５０％ホルムアミド中、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ中、室温（約２２℃）での洗浄、次いで０．２×ＳＳＣ中、６８℃での洗浄により達成できる。
【００１９】
ＲＡＮＫアンタゴニストとして使用するのに適したＲＡＮＫＬ結合性可溶性ＲＡＮＫポリペプチドをコードする核酸の例には、下記のものが含まれる：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸ｘ〜ｙを含むポリペプチドをコードする核酸分子、ここでｘはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸１〜３３よりなる群から選択され、ｙはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸１９６〜２１３よりなる群から選択される；ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸ｘ〜ｙを含むポリペプチドをコードする核酸分子、ここでｘはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１〜３５よりなる群から選択され、ｙはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１９７〜２１４よりなる群から選択される；ならびにこれらの核酸分子またはその相補体のいずれかにストリンジェント条件下でハイブリダイズできる核酸分子、その際、ストリンジェント条件は６×ＳＳＣ中、６３℃でのハイブリダイゼーション、および３×ＳＳＣ中、５５℃での洗浄を伴う。
【００２０】
本発明の１態様において、本発明のＲＡＮＫアンタゴニストとして使用するための可溶性ＲＡＮＫをコードする核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１（ネズミＲＡＮＫ）のヌクレオチド９１〜６４２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３（ヒトＲＡＮＫ）のヌクレオチド１２６〜６７７を含むであろう。これらの核酸分子によりコードされる可溶性ＲＡＮＫは、ＲＡＮＫＬに確実に結合するのに十分な量のＲＡＮＫ細胞外領域が存在しかつ該タンパク質がＲＡＮＫ膜貫通領域を含有しない限り、全長ＲＡＮＫポリペプチドのいずれの目的部分に対応するものであってもよい。
【００２１】
本発明の１態様においては、ＲＡＮＫＬを結合でき、ＲＡＮＫタンパク質の細胞外ドメインの全部または一部を含む可溶性ＲＡＮＫタンパク質を含むＲＡＮＫアンタゴニストを投与することにより、その必要がある患者を処置する。可溶性ＲＡＮＫは、本明細書に開示したヒトまたはネズミＲＡＮＫポリペプチド例のシグナルペプチドおよび細胞外ドメインを含むことができ、あるいはシグナルペプチドを除去した成熟形タンパク質を使用できる。
【００２２】
本発明の１態様において、ＲＡＮＫＬを結合できる可溶性ＲＡＮＫポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または４に示した天然ＲＡＮＫタンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列（それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１〜２１４およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸１〜２１３）に対して少なくとも約７０％同一である。他の態様において、可溶性ＲＡＮＫポリペプチドはＲＡＮＫＬを結合し、かつそのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または４に示したＲＡＮＫポリペプチドの細胞外領域に対して少なくとも約８０％同一である。ＲＡＮＫＬを結合でき、かつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または４に示した天然形ＲＡＮＫのＲＡＮＫＬ結合性部分に対して少なくとも約９０％同一であるＲＡＮＫポリペプチドも、有用である。同一性％は、コンピュータープログラム、たとえばＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）に記載され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手できるＧＡＰコンピュータープログラムを用いて決定できる。ＲＡＮＫタンパク質に由来するフラグメントを含有するポリペプチドについては、同一性はそのポリペプチド中に存在するＲＡＮＫタンパク質部分に基づいて計算される。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および４のネズミおよびヒトＲＡＮＫタンパク質を本明細書の記載に従ってアラインすると、それらは約７０％同一であることが分かる。
【００２３】
本明細書の記載に従って使用するのに適したＲＡＮＫポリペプチドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸１〜２１３またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１〜２１４を含むポリペプチドが含まれ、あるいはそのＲＡＮＫＬ結合性フラグメントが含まれてもよい。患者がヒトである場合、可溶性ＲＡＮＫは好ましくはヒトＲＡＮＫポリペプチドに由来する。ヒトＲＡＮＫについて、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の少なくともアミノ酸３３〜１９６を含有するポリペプチドはＲＡＮＫＬを結合できる。有用なＲＡＮＫアンタゴニストの１つは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸３０〜２１３を含むポリペプチドである。所望により、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸３０〜２１３を含むＲＡＮＫアンタゴニストを、二量体化を促進する他のタンパク質に融合させてもよい。
【００２４】
可溶性ＲＡＮＫポリペプチドを含むＲＡＮＫアンタゴニストは、細胞外ドメインのほかに他の部分を含有してもよいが、膜貫通領域は含有しない。ヒトおよびネズミＲＡＮＫの膜貫通領域は、それぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のほぼアミノ酸２１４からほぼアミノ酸２３４まで、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のほぼアミノ酸２１５からほぼアミノ酸２３５までに位置する。したがって、本発明方法に適した可溶性ＲＡＮＫアンタゴニストには、たとえばＲＡＮＫ細胞内領域に直接融合したＲＡＮＫ細胞外領域を含むタンパク質、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のほぼアミノ酸２３５に始まってアミノ酸６１６まで続くセグメントに直接融合したＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸３０〜２１３を含むタンパク質、またはそのＲＡＮＫＬ結合性部分が含まれる。
【００２５】
所望により、組換えＤＮＡ法を用いて天然リーダーをヘテロロガスシグナルペプチドで置換することができる。ＲＡＮＫＬを結合できる可溶性ＲＡＮＫは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のアミノ酸１〜３３のアミノ末端からアミノ酸２１３まで続くヒトＲＡＮＫ部分を含むことができる。そのようなタンパク質部分を含むＲＡＮＫＬ結合性フラグメントはＲＡＮＫアンタゴニストとして有用であり、本明細書に記載するような種々の結合アッセイ法により同定できる。あるいは、当技術分野で既知のユニーク制限部位またはＰＣＲ法を用いて、ＲＡＮＫＬ結合活性を発現および分析しうる多数のトランケート形ＲＡＮＫをコードする核酸を調製できる。
【００２６】
ＲＡＮＫのＲＡＮＫＬ結合性バリアントおよび対立遺伝子は、ＵＳＰ６，０１７，７２９において提供された方法および試薬を用いて得ることができる。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示したアミノ酸配列とごくわずかに異なるヒトＲＡＮＫ対立遺伝子バリアントの単離が報告されている（ＷＯ９８／５４２０１）。たとえばこのＷＯ９８／５４２０１のバリアントは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の残基１９２に相当する位置にアラニンの代わりにバリン、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４の残基５１３に相当する位置にセリンの代わりにイソロイシンをもつ。このＲＡＮＫバリアントはＴＲＡＦを結合でき、かつＮＦ−κＢおよびＪＮＫを刺激できる。ＵＳＰ６，０１７，７２９またはＷＯ９８／５４２０１に記載されたヒトＲＡＮＫタンパク質、あるいはＲＡＮＫの他のいずれかのＲＡＮＫＬ結合性ムテインまたは対立遺伝子バリアントを用いて、本発明においてアンタゴニストとして用いるための可溶性ＲＡＮＫタンパク質を誘導できる。ＲＡＮＫアンタゴニストとして用いる可溶性ＲＡＮＫの誘導にＲＡＮＫ類似体またはムテインを使用できる可能性は、たとえばＵＳＰ６，０１７，７２９の記載に従って、類似体またはムテインがＲＡＮＫＬを結合する能力を試験することにより判定できる。
【００２７】
同様に療法薬として有用なものは、該タンパク質またはそれらのフラグメントと他のタンパク質またはポリペプチドとの共有または凝集結合体を含む可溶性ＲＡＮＫタンパク質、たとえば組換え体培養においてＮ末端またはＣ末端融合体として合成されるものである。たとえば結合ペプチドは、翻訳と同時にまたは翻訳後に該タンパク質の合成部位から細胞膜または細胞壁の内側または外側にあるその機能部位への移動を指令する、該タンパク質のＮ末端領域にあるシグナル（またはリーダー）ポリペプチド配列（たとえば酵母α−因子リーダー）であってよい。タンパク質融合体は、ＲＡＮＫタンパク質および同族体の精製または同定を容易にするために付加したペプチド、たとえばポリ（Ｈｉｓ）を含むことができる。たとえばポリ（Ｈｉｓ）6タグを使用できる（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）。本発明タンパク質のアミノ酸配列を同定用ペプチド、たとえばＨｏｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，１９８８に記載のもの（ＦＬＡＧ商標）に結合させることもできる。抗原性の高いこのペプチドは、特異的モノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、迅速なアッセイおよび発現した組換えタンパク質の円滑な精製を可能にする。Ｈｏｐｐらの配列はウシ粘膜エンテロキナーゼによっても特異的に開裂し、精製タンパク質からペプチドを分離できる。
【００２８】
可溶性ＲＡＮＫのほかに、そのような融合タンパク質はたとえば免疫グロブリンＦｃドメイン、ロイシンジッパー、ポリエチレングリコールまたはその組合わせなどの部分を含むことができる。ＲＡＮＫＬ結合性形の可溶性ＲＡＮＫを含む、本明細書に記載されたように使用するのに適した融合タンパク質は、組換え発現法により作製できる。そのような融合タンパク質は、二量体またはより高次の多量体形を形成してもよい。重合形はＲＡＮＫ活性阻害能が高い。重合可能な融合タンパク質の例には、二量体を形成しうるＲＡＮＫ：Ｆｃ融合タンパク質、およびジッパー部分の融合タンパク質（すなわちロイシンジッパー）が含まれる。他の有用な融合タンパク質は、当技術分野で既知の種々のタグを含むことができる。
【００２９】
本発明の１態様において、アンタゴニストは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合した可溶性ＲＡＮＫを含む融合タンパク質である。ヒト患者を処置する場合、融合タンパク質のＲＡＮＫおよびＦｃ部分は、好ましくはヒト源に由来する。この目的に有用なＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ1免疫グロブリンに由来するものである。Ｆｃ領域のフラグメントおよびＦｃムテインも使用できる。たとえば、Ｆｃ領域のヒンジ部内の特定の残基がＦｃγＲＩへの高親和性結合にとって必須である。Ｃａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３（１９９１））は、Ｕ９３７細胞上に存在するＦｃγＲＩへのＩｇＧ3の高親和性結合にとってＬｅｕ(234)およびＬｅｕ(235)が必須であると報告している。同様な結果がＬｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：２６５７（１９９１）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：５３（１９９１））により得られた。そのような変異（単独または組合わせ）をＩｇＧ1のＦｃ領域に形成して、ＦｃＲに対するＩｇＧ1の親和性を低下させることができる。用いるＦｃ領域の部分によっては、鎖間ジスルフィド結合の形成により融合タンパク質を二量体として発現させることができる。抗体の重鎖と軽鎖の両方を含む融合タンパク質を作製する場合、４つものＲＡＮＫ領域を含むタンパク質オリゴマーを形成することができる。療法用組成物の調製に使用するのに適したＲＡＮＫ：Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すものである。これは、ヒトＲＡＮＫの細胞外ドメインをアミノ酸１〜２１３に、ヒトＩｇＧ1免疫グロブリン由来のＦｃ領域をアミノ酸２１４〜４４３に含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸１〜２９はリーダー配列に相当し、哺乳動物細胞においてタンパク質が翻訳された後、離脱する。療法薬として使用するのに適したＲＡＮＫ：Ｆｃ融合タンパク質の例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すアミノ酸配列からなるもの、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸３０〜４４３からなるものである。本発明の他の態様において療法薬として使用するＲＡＮＫ：Ｆｃ融合タンパク質の配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のアミノ酸３０〜４４３と同一であって、ただし残基３５２のアスパラギン酸がグルタミン酸により置換され、かつ残基３５４のロイシンがメチオニンにより置換されている。
【００３０】
本明細書の記載に従って使用するのに適した他の可溶性ＲＡＮＫタンパク質誘導体は、オリゴマー形成性ペプチド、たとえばジッパードメインに融合した可溶性ＲＡＮＫポリペプチドを含む。ロイシンジッパーは、幾つかのＤＮＡ結合性タンパク質中に最初に同定され、ｆｏｓ、ｊｕｎおよびｃ−ｍｙｃタンパク質中に存在する（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９（１９８８））。”ジッパードメイン”は、これらの（および他の）タンパク質中に存在する、タンパク質の多量体化に関与する保存ペプチドドメインを表わすのに用いる用語である。ジッパードメインは、４または５個のロイシン、イソロイシンまたはバリン残基が他のアミノ酸の間に分布した繰返し７残基反復を含む。ジッパードメインの例は、酵母転写因子ＧＣＮ４およびラット肝中にある熱安定ＤＮＡ結合性タンパク質中にみられるものである（Ｃ／ＥＢＰ；Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８１（１９８９））。核癌遺伝子ｆｏｓおよびｊｕｎの生成物は、優先的にヘテロ二量体を形成するジッパードメインを含む（Ｏ’Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：６４６（１９８９）；Ｔｕｒｎｅｒ  ａｎｄ  Ｔｊｉａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：１６８９（１９８９））。これらの目的に有用なジッパー部分は、たとえばＵＳＰ５，７１６，８０５に記載されている。
【００３１】
本発明の他の態様において、ＲＡＮＫアンタゴニストはヒトＯＰＧまたはそのＲＡＮＫＬ結合性誘導体である。ヒトＯＰＧをコードするヌクレオチド配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示し、対応するアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示す。本発明方法に使用するのに適したＯＰＧポリペプチドには、ＵＳＰ６，３６９，０２７（その全体を本明細書に援用する）に記載のものが含まれる。本明細書の記載に従って用いられるＯＰＧポリペプチドには、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８に示したアミノ酸配列の誘導体であって、ポリペプチドがＲＡＮＫＬ結合能を保持した状態で１以上のアミノ酸を付加、欠失、挿入または置換したものが含まれる。たとえばＯＰＧは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸残基１８６〜４０１のうち全部または一部の欠失またはカルボキシ末端トランケーション；ＯＰＧのシステインに富むドメインの全部または一部の欠失；およびシステインに富むドメインの１以上のアミノ酸の交換を含むことができる。１態様において、ＯＰＧは１〜約１０個のアミノ酸が成熟アミノ末端（アミノ酸残基２２の位置）から欠失し、かつ所望により１〜約２１６個のアミノ酸が成熟カルボキシ末端から欠失している。トランケート形タンパク質の分析により、ＯＰＧの生物学的活性はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８の残基２２〜１８５にある約１６４個のアミノ酸を含有するＯＰＧ部分により保持されることが示された。したがって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸２２〜１８５を含むＯＰＧポリペプチドを用いて、本明細書に記載する目的で投与しうる療法用組成物を調製できる。前記ＯＰＧポリペプチドのいずれも、免疫グロブリン分子のＦｃ領域と融合させることができる。全長ＯＰＧは自然に二量体または三量体を形成し、これらは生物学的活性をもち、本発明の目的で投与できる。
【００３２】
本明細書に記載する目的に有用な他のＲＡＮＫアンタゴニストには、小型の有機分子が含まれる。
本発明のさらに他の態様においては、内因性ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬ遺伝子発現レベルを低下させるように設計されたアンタゴニストが用いられる。そのようなアンタゴニストは、ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬ  ｍＲＮＡ転写体の翻訳を阻害または阻止する周知のアンチセンス法またはリボザイム法；およびＲＡＮＫ若しくはＲＡＮＫＬ遺伝子の転写を阻害する三重らせん法を用いて調製される。そのような分子の製造および使用は当業者に周知である。
【００３３】
ＲＡＮＫアンタゴニストとして有用なアンチセンスＲＮＡおよびＤＮＡ分子は、ターゲティングする内因性ｍＲＮＡにハイブリダイズして翻訳を阻止することにより、ｍＲＮＡの翻訳を直接遮断する作用をもつ。これは、ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬ  ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、たとえばＵ．Ｓ．６，１７１，８６０に記載の抗ＲＡＮＫアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて達成できる。有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドには、ｍＲＮＡの５’末端に相補的なもの、たとえばＡＵＧ開始コドンまでを含めた５’側−非翻訳配列が含まれる。しかしながら、ＲＡＮＫもしくはＲＡＮＫＬ遺伝子転写体の５’側もしくは３’側−非翻訳、非コード領域に相補的なオリゴヌクレオチド、またはコード領域に相補的なオリゴヌクレオチドも使用できる。アンチセンス核酸は、少なくとも６ヌクレオチドの長さでなければならず、好ましくは６〜約５０ヌクレオチドの長さである。これらのオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそのキメラ混合物もしくは誘導体もしくは修飾形であってよい（一本鎖または二本鎖）。本発明のキメラオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド、または混合オリゴヌクレオチド／オリゴヌクレオシドは、幾つかの異なるタイプのものであってもよい。これらには、ヌクレオチドの”ギャップ”セグメントが結合ヌクレオチドの５’側と３’側の”ウイング”セグメント間にある第１タイプ、および”ギャップ”セグメントがオリゴマー化合物の３’末端または５’末端のいずれかにある第２の”開末端”タイプが含まれる（たとえばＵＳＰ５，９８５，６６４参照）。オリゴヌクレオチドを、たとえば塩基部分、糖部分またはホスフェート主鎖において修飾して、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改良することができる。オリゴヌクレオチドが他の付加基（ａｐｐｅｎｄｅｄ  ｇｒｏｕｐｓ）、たとえばペプチド（たとえば宿主細胞受容体をインビボでターゲティングするためのもの）、または細胞膜輸送を促進する剤、またはハイブリダイゼーションによりトリガーされる開裂剤、または挿入剤を含んでもよい。
【００３４】
ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬを発現する細胞へ送達するために、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを組織または細胞誘導部位へ直接注入してもよく、あるいは目的細胞をターゲティングするように設計した修飾アンチセンス分子（たとえば、ターゲット細胞表面に発現する受容体または抗原を特異的に結合するペプチドまたは抗体に結合したアンチセンス）を全身投与してもよい。１方法では、アンチセンスオリゴヌクレオチドを強力なｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下に置いた組換えＤＮＡ構築体で、ターゲット細胞をトランスフェクションすることができる。そのようなベクターは、転写されて目的アンチセンスＲＮＡを生成する限り、エピソーム状態にとどまってもよく、染色体に組み込まれてもよい。ベクターは、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物の細胞における複製および発現に用いられるプラスミド、ウイルス、または当技術分野で既知の他のものであってよい。
【００３５】
ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬ  ｍＲＮＡ転写体を接触開裂するように設計されたリボザイム分子も、ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬ  ｍＲＮＡの翻訳およびＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬポリペプチドの発現を阻止するために使用できる（たとえばＷＯ９０／１１３６４またはＵＳＰ５，８２４，５１９参照）。本発明においてＲＡＮＫに療法拮抗するのに使用できるリボザイムには、ハンマーヘッドリボザイム（Ｈａｓｅｌｏｆｆ  ａｎｄ  Ｇｅｒｌａｃｈ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３４：５８５−５９１）、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以下、”Ｃｅｃｈ型リボザイム”）、たとえば天然にテトラヒメナ・サーモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）にみられ（ＩＶＳ、またはＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られる）、広く記載されているもの（たとえばＷＯ８８／０４３００；Ｂｅｅｎ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ，Ｃｅｌｌ，４７：２０７−２１６（１９８６）参照）が含まれる。リボザイムは修飾オリゴヌクレオチドからなってもよく（たとえば安定性、ターゲティングなどの改良のため）、ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬポリペプチドをインビボで発現する細胞へ送達すべきである。好ましい送達方法は、強力なｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターの制御下でリボザイムをコードするＤＮＡ構築体の使用を伴い、したがってトランスフェクションした細胞は内因性ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬメッセンジャーを破壊するのに十分な量のリボザイムを生成する。
【００３６】
本発明に有用な他のＲＡＮＫアンタゴニストには、ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬに特異的な抗体が含まれる。ＲＡＮＫアンタゴニストとして用いられる抗体は、それらのターゲットと特異的に免疫反応する。すなわちそれらは抗体の抗原結合性部位によりターゲットタンパク質に結合し（非特異的ではなく）、無関係なタンパク質に有意に結合することはない。したがって、ＲＡＮＫの特異的な抗体はＲＡＮＫを結合するが、たとえば検出可能なほどにはＲＡＮＫＬに結合しないであろう。同様に、ＲＡＮＫＬに特異的な抗体は検出可能なほどにはＲＡＮＫに結合しないであろう。特異的結合性抗体は、ターゲットＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬポリペプチド、たとえば本明細書に記載するもの、またはそのサブ部分、同族体およびバリアントを特異的に認識して結合するであろう。ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬに特異的なアンタゴニスト抗体は、それぞれ内因性ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬを結合し、したがってその各コグネイトへの結合に用いられる内因性ターゲットポリペプチドの量が減少するであろう。
【００３７】
アンタゴニスト性抗ＲＡＮＫ抗体が膜結合ＲＡＮＫの細胞外ドメインと結合すると、ＲＡＮＫの生物学的活性はトリガーされないであろう。したがって、たとえばそのような抗体はＲＡＮＫ発現細胞においてＮＦ−κＢ活性の増大を誘導しないであろう。
【００３８】
本発明方法に使用するのに適したＲＡＮＫアンタゴニストには、ＲＡＮＫＬに特異的な抗体が含まれる。そのような抗体は、本明細書に記載の方法または当技術分野でルーティンな他の方法により調製できる。ヒトＲＡＮＫＬをコードする核酸例のヌクレオチド配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９に示し、このヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列をＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０に示す。ヒトＲＡＮＫＬは、推定４７アミノ酸の細胞内ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸１〜４７に相当）、２１アミノ酸の膜貫通ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸４８〜６８に相当）、および２４９アミノ酸の細胞外ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸６９〜３１７に相当）を含む。ヒトＲＡＮＫＬのＲＡＮＫ結合性ドメインは、ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のほぼアミノ酸１６２からほぼアミノ酸３１７に相当する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸配列をもつ精製ポリペプチドまたはそのサブ部分を用いて、ＲＡＮＫＬと特異的に結合してそれがＲＡＮＫに結合する能力を遮断するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生できる。本発明の抗体を産生するのに用いられるＲＡＮＫＬポリペプチドを、所望により合成または精製を容易にする他の部分、たとえばロイシンジッパー、免疫グロブリンのＦｃドメイン、ポリ（Ｈｉｓ）6、ＦＬＡＧ（登録商標）、または他のタグと融合させてもよい。本発明の１態様において、抗ＲＡＮＫＬ抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０のアミノ酸６９〜３１７（ＲＡＮＫＬの細胞外ドメインに相当）を含むポリペプチド中に存在するエピトープを指向する。ＲＡＮＫＬ特異的抗体がＲＡＮＫＬへの結合を遮断する能力は、いずれか簡便なアッセイ法、たとえばＵＳＰ６，２４２，２２１３に記載のもの、またはＲＡＮＫＬに曝露されたＲＡＮＫ発現細胞が仲介する生物学的活性を測定するいずれかのアッセイ法により判定できる。
【００３９】
本発明の１態様において、抗体産生に用いられるＲＡＮＫＬポリペプチドのアミノ酸配列は、それぞれ前記ＲＡＮＫＬタンパク質のアミノ酸配列に対して約７０％同一であり、本発明の他の態様において、それらは約８０％同一であり、本発明のさらに他の態様において、それらは前記ＲＡＮＫＬポリペプチドに対して約９０％同一である。同一性％は、コンピュータープログラム、たとえばＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７，１９８４）に記載され、ウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）から入手できるＧＡＰコンピュータープログラムを用いて決定できる。ＲＡＮＫＬタンパク質に由来するフラグメントを含有するポリペプチドについては、同一性はＲＡＮＫＬに由来するポリペプチド部分に基づいて計算される。
【００４０】
同様に本発明の療法薬として使用するのに適したものは、そのような抗体の生物学的活性フラグメントである。たとえば抗体の生物学的活性フラグメントは、無傷の抗体と対比してトランケートしているが、それのターゲットを特異的に結合する能力およびそのターゲットとそれのコグネイトとの相互作用を遮断する能力は保持された、抗体タンパク質である。抗体の抗原結合性フラグメントにはＦａｂおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。これらは常法により調製できる。
【００４１】
本発明による療法用組成物に有用な抗体には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡＢ）、ヒト化もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、およびこれらのいずれかのエピトープ結合性フラグメント。ヒトＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬ中に存在するがネズミＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬ中には存在しないエピトープに特異的な、ＲＡＮＫアンタゴニストとして使用するモノクローナル抗体を選択できる。ネズミおよびヒトＲＡＮＫの両方を結合する、またはネズミおよびヒトＲＡＮＫＬの両方を結合するモノクローナル抗体も、本発明の療法のためのＲＡＮＫアンタゴニストとして使用できる。目的とする特異性をもつモノクローナル抗体を得る方法は当技術分野で周知であり、たとえばＵＳＰ６，０１７，７２９に記載のものである。本明細書に記載するＲＡＮＫおよびＲＡＮＫＬポリペプチド、フラグメント、バリアントおよびＲＡＮＫ融合ポリペプチドを、ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬと特異的に免疫反応する抗体の産生に際し免疫源として使用できる。
【００４２】
ＲＡＮＫアンタゴニストの合成
精製した可溶形ＲＡＮＫ、ＯＰＧ、アンタゴニスト作用抗体、およびその同族体若しくは類似体などのタンパク質を含むＲＡＮＫアンタゴニストは、そのアンタゴニストをコードするＤＮＡの組換え転写生成物を発現するのに適した宿主／ベクター系を培養し、次いでこれを培地または細胞抽出物から精製することにより製造される。好ましくは少なくとも１つの発現制御配列に機能可能な状態で結合した本発明の単離核酸を含む宿主細胞は”組換え宿主細胞”であり、”形質転換”されたと言われる。モノクローナル抗体は標準法により調製できる。
【００４３】
ポリペプチドであるＲＡＮＫアンタゴニストを組換え発現させるために、そのアンタゴニストをコードする単離核酸を、発現制御配列、たとえばｐＤＣ４０９ベクター（Ｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１３：２８２１）または誘導体ｐＤＣ４１２ベクター（Ｗｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３：６７３）に機能可能な状態で結合させることができる。ｐＤＣ４００系列のベクターは、一過性哺乳動物発現系、たとえばＣＶ−１または２９３細胞に有用である。あるいは、単離核酸をｐＤＣ３１２、ｐＤＣ３１６またはｐＤＣ３１７ベクターのような発現ベクターに結合させることができる。ｐＤＣ３００系列のベクターはすべて、ＳＶ４０複製起点、ＣＭＶプロモーター、アデノウイルス三部分リーダー、ならびにＳＶ４０ポリＡおよび終止シグナルを含み、安定な哺乳動物発現系、たとえばＣＨＯ細胞またはそれらの誘導体に有用である。あるいは、内部ポリアデニル化シグナル、たとえばＷＯ０１／２７２９９に記載のものをもつベクターを用いて、アンタゴニストをコードする核酸を発現させることができる。他の発現制御配列およびクローニング技術、たとえばｐＭＴ２またはｐＥＤ発現ベクター（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４４８５−４４９０；およびＰｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ニューヨーク州エルゼビル）およびＧＡＴＥＷＡＹベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；メリーランド州ロックビル）を用いて、ポリペプチドを組換え法で製造することもできる。ＧＡＴＥＷＡＹ系では、ａｔｔＢ配列でフランキングされた本発明の単離核酸をインテグラーゼ反応によりＧＡＴＥＷＡＹベクター、たとえばａｔｔＰ配列を含むｐＤＯＮＲ２０１と組み換えることができる。これにより、本発明の単離核酸を含むＧＡＴＥＷＡＹ系のエントリーベクターが得られる。このエントリーベクターを、さらに他の適切に調製した発現制御配列、たとえば前記のｐＤＣ４００およびｐＤＣ３００系列のものと組み換えることができる。多数の適切な発現制御配列が当技術分野で知られている。組換えポリペプチドを発現させる一般法は、Ｒ．Ｋａｕｆｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５３７−５６６（１９９０）にも記載されている。本明細書中で用いる”機能可能な状態で結合した”とは、適切な分子（たとえばポリメラーゼ）が存在するとき核酸がコードするポリペプチドが発現する状態で、本発明の核酸と発現制御配列が構築体、ベクターまたは細胞内に配置されていることを意味する。本発明の１態様として、核酸および／または発現制御配列がたとえば形質転換もしくはトランスフェクションまたは他の適切な方法で導入された組換え宿主細胞またはその子孫において、少なくとも１つの発現制御配列が本発明の核酸に機能可能な状態で結合している。本発明の他の態様として、少なくとも１つの発現制御配列が、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に機能可能な状態で結合して組換え宿主細胞のゲノムに組み込まれている。本発明の他の態様においては、インビトロまた���組換え宿主細胞において、少なくとも１つの発現制御配列がトランス作用因子、たとえば転写因子の作用により、本発明の核酸に機能可能な状態で結合している。
【００４４】
ＲＡＮＫアンタゴニスト活性をもつポリペプチドの組換え発現に適した宿主細胞として、多数のタイプの細胞を使用できる。適切な哺乳動物宿主細胞には、たとえば下記のものが含まれる：ＣＯＳ−７系のサル腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２３：１７５，１９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞系、ＭｃＭａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：２８２１，１９９１）に記載のアフリカミドリザル腎細胞系ＣＶ１由来のＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、ヒト腎２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、形質転換した他の霊長類細胞系、正常二倍体細胞、初代組織、一次外植片のインビトロ培養により得られた細胞株、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはジャーカット細胞。あるいは、下等真核細胞、たとえば酵母、または原核細胞、たとえば細菌において、ポリペプチドを産生させることができる。適切な酵母株には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）株、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属ｓｐｐ、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属ｓｐｐ、またはヘテロロガスポリペプチドを発現できる任意の酵母株が含まれる。適切と思われる細菌株には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、またはヘテロロガスポリペプチドを発現できる任意の細菌株が含まれる。ポリペプチドを酵母または細菌において調製する場合、機能性ＲＡＮＫアンタゴニストを得るためには、それらにおいて産生されるポリペプチドを、たとえば適切な部位のリン酸化またはグリコシル化により修飾する必要があるかもしれない。そのような共有結合は既知の化学的方法または酵素法により達成できる。
【００４５】
ポリペプチドは、本発明の単離核酸を１以上の昆虫発現ベクター内で適切な制御配列に機能可能な状態で結合させ、昆虫発現系を用いることによっても製造できる。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に関する材料および方法はキットの形で市販されている；たとえばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州サイディエゴ（ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）。そのような方法は、Ｓｕｍｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）、およびＬｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：４７（１９８８）に記載されるように、当技術分野で周知である。
【００４６】
本明細書に開示する核酸構築体に由来するＲＮＡを用いる無細胞翻訳系も、ポリペプチドの製造に使用できる。
本発明のポリペプチドは、形質転換した宿主細胞を組換えポリペプチドの発現を支持するのに適した培養条件下で培養することにより製造できる。次いで得られた発現ポリペプチドをそのような培養から（すなわち培地または細胞抽出物から）既知の精製法、たとえば種々の塩類による選択的沈殿、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィーにより精製できる。ポリペプチドの精製法には下記のものも含まれる：ポリペプチドに結合する剤を収容したアフィニティーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）もしくはＣｈｉｂａｃｒｏｍブルー３ＧＡセファロース（登録商標）などのアフィニティー樹脂上での１以上のカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテルもしくはプロピルエーテルなどの疎水性相互作用クロマトグラフィーを伴う１以上の工程；あるいはＲＡＮＫアンタゴニストの１以上のエピトープを特異的に結合する抗体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィー。
【００４７】
ポリペプチドＲＡＮＫアンタゴニストを収穫するには、組換えタンパク質を培地中へ分泌する系からの上清をまず市販のタンパク質濃縮フィルター、たとえばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットにより濃縮することができる。濃縮工程後、濃縮物を適切な精製マトリックスに付与できる。たとえば適切なアフィニティーマトリックスは、適切な支持体に結合したカウンター構造タンパク質またはレクチンもしくは抗体分子であってよい。あるいは、アニオン交換樹脂、たとえばペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基をもつマトリックスまたは支持体を使用できる。マトリックスは、タンパク質精製に慣用されるアクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、または他のタイプのものであってよい。あるいは、カチオン交換工程を採用できる。適切なカチオン交換体には、スルホプロピルまたはカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。ゲル濾過クロマトグラフィーも本発明タンパク質の精製手段となる。
【００４８】
アフィニティークロマトグラフィーは、ＲＡＮＫアンタゴニストおよびその同族体を精製するための有用な方法である。たとえば免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質として発現するＲＡＮＫは、プロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。さらに、オリゴマー形成性ジッパードメインを含むＲＡＮＫタンパク質は、そのオリゴマー形成性ジッパードメインに特異的な抗体を含む樹脂上で精製できる。ＲＡＮＫタンパク質に対するモノクローナル抗体も、当技術分野で周知の方法を用いるアフィニティークロマトグラフィー精製に有用である。リガンドを用いて、可溶性ＲＡＮＫタンパク質または他のＲＡＮＫアンタゴニストのアフィニティー精製用アフィニティーマトリックスを調製することもできる。
【００４９】
最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体、たとえばペンダントメチル基その他の脂肪族基をもつシリカゲルを用いる１以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を採用して、ＲＡＮＫアンタゴニストをさらに精製することができる。適切な方法には、Ｕｒｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，１９８４）に記載の方法と類似のものが含まれる。以上の精製工程の幾つかまたは全部を多様な組み合わせで用いて、均質な組換えタンパク質を得ることもできる。
【００５０】
細菌培養において産生された組換えタンパク質は、通常はまず細胞ペレットからの抽出、続いて濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー工程のうち１以上により単離される。最後に、最終精製工程のために高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を採用できる。組換えタンパク質の発現に用いた微生物細胞は、好都合な任意の方法で破壊できる。これには凍結−融解の繰返し、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用が含まれる。本発明タンパク質を分泌タンパク質として発現する酵母の発酵は、精製を著しく簡単にする。
【００５１】
組換え培養において合成されたタンパク質は、培養から本発明タンパク質を回収するために採用した精製工程に応じた量および性質の細胞成分（タンパク質を含む）の存在を特色とする。これらの成分は通常は酵母、原核細胞、またはヒト以外の高等真核細胞に由来するものであり、約１重量％未満程度の無害な汚染物質量で存在することが好ましい。さらに、組換え細胞培養によれば、普通はタンパク質に付随する他のタンパク質（自然界で起源種中にみられる）を含まない本発明タンパク質を製造できる。
【００５２】
療法
本発明は、新たな骨の形成を必要とする患者を処置する療法を提供する。これには、骨移植片レシピエント、靭帯移植片レシピエント、人工関節レシピエント、骨折患者、脊髄損傷を伴う患者、および癌の放射線療法コースを終了した患者が含まれるが、これらに限定されない。後者の患者には、本質的に癌が治癒した患者、すなわちＲＡＮＫアンタゴニストによる処置を開始する時点で悪性組織を検出できない患者が含まれる。本発明の１態様においては、処置する時点では骨密度低下を生じていないが、骨損傷の早期修復または骨間隙の充填のために新生骨形成が必要である患者に療法を施す。ＲＡＮＫアンタゴニストによる処置が有益な他の患者には、急性敗血症性関節炎（ライター症候群を含む）、骨関節炎、骨軟化症（リケッチア症および壊血病を含む）、副甲状腺機能亢進症、クッシング症候群、多骨性線維性骨異形成症、ゴーシェ病およびランゲルハンス細胞組織球増殖症などの症状を伴う患者が含まれる。これらの状態を処置するのに適したＲＡＮＫアンタゴニストには、本明細書に記載する種々の可溶性ＲＡＮＫポリペプチドおよびＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬに特異的な抗体が含まれる。使用できる他のＲＡＮＫアンタゴニストには、オステオプロテゲリン、リボザイムおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００５３】
毎年数百万人の患者が骨移植を必要とする。そのような患者には、骨格欠損（先天性欠損を含む）を伴う患者、関節の損傷または不安定さを安定化するために関節癒合を必要とする患者、および骨の一部が失われて置換を要するほど骨損傷が著しい患者が含まれる。骨移植片レシピエントには、修正関節手術、骨腫瘍切除または口腔／顎顔面手術のため１以上の骨に間隙のある患者も含まれる。本発明の１態様において、骨移植患者には、処置の時点で異常な高レベルの破骨細胞活性がみられない患者、すなわち異常な速度の骨損失がみられない患者が含まれる。そのような患者には、たとえば事故被害者、癌の治療に成功してもはや癌を伴わない患者、美粧上の理由で自発的に骨再構築を受けている者、および骨格欠損の修正のため手術を受けている者が含まれる。骨格欠損を伴う患者には、たとえば先天的に骨変形した患者、骨関節炎を伴う患者、およびポリオウイルス感染症から回復した患者が含まれる。
【００５４】
骨移植のためには、外科医が骨または合成材料を罹患領域に適合するように造形し、健康な骨を移植材料に対してピンまたはネジで適所に保持する。宿主の骨形成細胞が移植片中へ浸潤し、これにより新生骨、血球および軟組織が移植片マトリックスを充填して移植片を宿主骨へ接続するのに伴って、それらの内植を支持する構造枠組みが提供される。骨移植が成功すると最終的には、移植片を接続した宿主骨へ浸潤移植片が中実癒合を示すであろう。こうして移植片マトリックスの充填と既存の宿主骨への移植片癒合の両方により、新生骨が形成される。したがって骨移植片レシピエントには、新生骨形成を促進する薬剤、たとえば本発明により提供されるＲＡＮＫアンタゴニストによる処置が有益であろう。
【００５５】
同様に宿主骨への人工関節の固定は新生骨形成を必要とする処置であり、したがって人工関節の移植手術を受けた患者の処置には本発明の療法処置が有用である。人工関節は、たとえば骨関節炎、すなわち関節軟骨の変性や辺縁骨の肥大および滑膜の変化を特色とする症状を伴う患者にしばしば付与される。約２０％の人工関節レシピエントが、２０年の間に摩耗−挫滅による骨分解の結果、次第に人工関節が緩むのを経験している。ただし本発明の療法は、移植後、長く経ってから起きる補綴具の緩みに起因する骨損傷の軽減ではなく、移植したばかりの補綴具の組込みおよび固定を促進することを目標とする。本発明の処置は、補綴具設置の途中または直後に施される。本発明により処置する人工関節レシピエントに、１回目のＲＡＮＫアンタゴニストを手術当日または人工関節移植後１〜６日以内または移植後１〜４週間以内に投与する。そのような処置の期間は多様であるが、一般に補綴具が患者の組織に結合する期間を通して反復投与する。通常このプロセスは移植手術後、約１〜６か月以内に終了する。
【００５６】
本発明の１態様においては、骨移植を受けた患者に、移植片マトリックスの浸潤および接続した宿主骨への移植片の中実癒合を促進するのに有効な量および頻度でＲＡＮＫアンタゴニストを投与する。人工関節レシピエントには、宿主骨および／または宿主腱もしくは靭帯への人工関節の結合を促進するのに有効な量および頻度でＲＡＮＫアンタゴニストを投与する。そのような患者に、移植片または補綴具の移植手術の前、途中もしくは直後、あるいは手術後に移植片の浸潤および中実癒合または補綴具結合が起きている期間の任意の時点で、ＲＡＮＫアンタゴニストを投与できる。
【００５７】
さらに、靭帯移植を受けた患者においてＲＡＮＫアンタゴニストを用いて骨への靭帯結合を増強する。これには膝傷害後に十字靭帯移植を必要とする患者が含まれるが、これに限定されない。成功すると、移植した靭帯は最終的に宿主骨に結合する。そのような結合には新生骨を含めた新生組織の形成が必要である。したがって、靭帯移植片の移植手術の前、途中もしくは直後、または手術後に宿主骨への移植片の結合が起きている期間の任意の時点で、ＲＡＮＫアンタゴニストの投与により靭帯移植片を処理できる。
【００５８】
骨移植片または靭帯移植片レシピエントに、１回目のＲＡＮＫアンタゴニストを手術当日または移植後１〜６日以内または移植後１〜４週間以内に投与する。そのような処置の期間は多様であるが、一般に移植片が浸潤を受けて患者の組織に結合する期間を通して反復投与する。浸潤／結合プロセスは一般に手術後、約１〜６か月以内に終了する。
【００５９】
前記療法の処理が十分であるかを、理学検査または種々のラジオグラフィー法［通常のＸ線撮影、ラジオグラフィーイメージ増強、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）が含まれる］または他の任意の手段で担当医がモニターする。
【００６０】
歯周再構築療法を用いて歯周骨欠損または歯周傷害を修復し、あるいは新生骨形成を必要とする頭蓋顎顔面手術を強化することができる。さらに、歯槽裂を修復するための骨移植は長い間、唇および歯槽の片側性および両側性披裂を伴う者の治療と一体であった。本発明の療法薬を投与すると、そのような患者における歯周再構築を促進できる。
【００６１】
脊髄損傷後にはしばしば全身骨損失が起きる。この骨損失は、股関節または四肢の骨を含めた骨折しやすい脆弱骨の発生をもたらす可能性がある。そのような患者は、新生骨形成を促進する薬剤、たとえば本発明のＲＡＮＫアンタゴニストによる処置が有益となる可能性がある。本発明の１態様においては、脊髄損傷を受けた患者に新生骨形成を促進するのに有効な量および頻度でＲＡＮＫアンタゴニストを投与する。ＲＡＮＫアンタゴニストは、そのような患者に傷害直後に、またはその後の任意の時点で投与でき、そのような傷害の治療に用いられる理学療法または他の投薬と組み合わせて投与できる。
【００６２】
本発明はさらに、放射線療法に伴う骨損失を生じた癌患者の骨再生療法を提供する。放射線療法に伴う骨損失は、腫瘍の存続がない状態でも起きる。すなわち腫瘍の除去に成功した場合ですら骨損失が起きる可能性がある。このタイプの骨損失は頭頸部癌の放射線治療に伴うことが多いが、他のタイプの癌についても起きる可能性がある。この状態の処置には、放射線療法コースが終了した後のＲＡＮＫアンタゴニスト投与を伴い、この状態の管理に用いられる他の処置、たとえば骨移植と併用してもよい。
【００６３】
前記の各療法について、新生骨形成を増強するのに有効な量および頻度でアンタゴニストを投与する。
併用療法
本発明は、ＲＡＮＫアンタゴニストと、種々の可溶性サイトカイン受容体もしくはサイトカイン、または他の破骨細胞／骨芽細胞調節分子、または骨損失の再生を必要とする患者の処置に用いられる他の薬物との共投与をも考慮する。”共投与”には、組合わせの各成分による同時または逐次処置、および薬物を交互に使用する方式、または１成分を長期間投与し、他の成分を間欠的に投与する方式が含まれる。そのような他の薬物には、たとえばビスホスホナート、または１種類より多いＲＡＮＫアンタゴニストの共投与による使用が含まれる。共投与される薬物の例には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：抗ウイルス薬、抗生物質、鎮痛薬、コルチコステロイド、炎症性サイトカインのアンタゴニスト、ＤＭＡＲＤ、種々の全身化学療法、ならびに非ステロイド系抗炎症薬、たとえばＣＯＸ  ＩまたはＣＯＸ  ＩＩ阻害薬。
【００６４】
有用な組合わせには、ＲＡＮＫアンタゴニストと炎症反応に関連するサイトカインＴＮＦαのアンタゴニストとの共投与が含まれる。ＴＮＦαを単独で用いて前記状態のいずれも処置でき、あるいはＲＡＮＫアンタゴニストと併用してもよい。使用できるＴＮＦα阻害薬には、たとえばＴＮＦα受容体（ＴＮＦＲ）の細胞外領域を含む可溶性タンパク質が含まれ、これらはＴＮＦＲ  ＩまたはＩＩその他のＴＮＦＲから誘導できる。これらの目的に有用なＴＮＦα阻害薬はエタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）である。これはｐ７５  ＴＮＦα受容体の細胞外部分２分子の二量体であり、各分子は２３５アミノ酸のＴＮＦＲ由来ポリペプチドがヒトＩｇＧ1の２３２アミノ酸Ｆｃ部分に融合したものからなる。エタネルセプトは現在Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから商品名ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）で販売されており、一般に週１〜３回、皮下注射により２５もしくは５０ｍｇ／回の均一用量または５〜１２ｍｇ／ｍ2の用量で投与される。他の適切なＴＮＦα阻害薬には、ＴＮＦαに対する抗体（ヒト化抗体を含む）が含まれる。ＲＡＮＫ阻害薬との共投与に用いるヒト化抗体の例は、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（ＣｅｎｔｏｃｏｒがＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）として販売）であり、これはキメラＩｇＧ１κモノクローナル抗体である。他の適切な抗ＴＮＦα抗体には、ヒト化抗体Ｄ２Ｅ７およびＣＤＰ５７１、ならびにＥＰ  ０  ５１６  ７８５  Ｂ１、Ｕ．Ｓ．５，６５６，２７２、ＥＰ  ０  ４９２  ４４８  Ａ１に記載の抗体が含まれる。さらにＴＮＦαは、ＴＮＦαの競合阻害薬として作用するＴＮＦα由来ペプチド（たとえばＵ．Ｓ．５，７９５，８５９またはＵ．Ｓ．６，１０７，２７３に記載のもの）、エタネルセプト以外のＴＮＦα−ＩｇＧ融合タンパク質、たとえばｐ５５  ＴＮＦα受容体の細胞外部分を含有するもの、ＩｇＧ融合タンパク質以外の可溶性ＴＮＦＲ、または内因性ＴＮＦαレベルを低下させる他の分子、たとえばＴＮＦα変換酵素の阻害薬（たとえばＵ．Ｓ．５，５９４，１０６参照）、またはペントキシフィリンもしくはサリドマイドなどの小分子の投与により阻害できる。
【００６５】
同様に、炎症性サイトカインＩＬ−１の阻害薬を単独で用いて前記のいずれかの状態を処置でき、あるいはＲＡＮＫアンタゴニストと共投与できる。適切なＩＬ−１阻害薬には、たとえば下記のものが含まれる：ＩＬ−１の受容体結合性ペプチドフラグメント、ＩＬ−１（ＩＬ−１αもしくはＩＬ−１βまたは他のＩＬ−１ファミリーメンバー）に対する抗体、ＩＬ−１受容体Ｉ型に対するアンタゴニスト抗体、ならびにＩＬ−１に対する受容体の全部もしくは一部を含む組換えタンパク質またはそのバリアント：遺伝子修飾によるムテイン、多量体形および徐放性製剤を含む。他の有用なＩＬ−１アンタゴニストには、ＩＬ−１ｒａポリペプチド、ＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ）阻害薬、ＩＬ−１結合形のＩ型ＩＬ−１受容体およびＩＩ型ＩＬ−１受容体、ならびにＩＬ−１トラップとして知られる療法薬が含まれる。ＩＬ−１ｒａポリペプチドには、ＵＳ５，０７５，２２２に記載される形のＩＬ−１ｒａ、ならびにＵ．Ｓ．５，９２２，５７３、ＷＯ９１／１７１８４、ＷＯ９２  １６２２１およびＷＯ９６  ０９３２３に記載の修飾形およびバリアントが含まれる。ＩＬ−１β変換酵素（ＩＣＥ）阻害薬には、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９１／１５５７７；ＷＯ９３／０５０７１；ＷＯ９３／０９１３５；ＷＯ９３／１４７７７およびＷＯ９３／１６７１０；ならびにＥＰ  ０  ５４７  ６９９に記載のものを含めたペプチジルおよび小分子ＩＣＥ阻害薬が含まれる。非ペプチジル化合物には、ＷＯ９５／２６９５８、Ｕ．Ｓ．５，５５２，４００、Ｕ．Ｓ．６，１２１，２６６およびＤｏｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３９：２４３８−２４４０（１９９６）に記載のものが含まれる。他のＩＣＥ阻害薬は、ＵＳＰ６，１６２，７９０、６，２０４，２６１、６，１３６，７８７、６，１０３，７１１、６，０２５，１４７、６，００８，２１７、５，９７３，１１１、５，８７４，４２４、５，８４７，１３５、５，８４３，９０４、５，７５６，４６６、５，６５６，６２７、５，７１６，９２９に記載されている。ＩＬ−１結合性形のＩ型ＩＬ−１受容体およびＩＩ型ＩＬ−１受容体はＵ．Ｓ．４，９６８，６０７、ＵＳ４，９６８，６０７、ＵＳ５，０８１，２２８、Ｕ．Ｓ．Ｒｅ  ３５，４５０、Ｕ．Ｓ．５，３１９，０７１および５，３５０，６８３に記載されている。ＩＬ−１トラップはＷＯ０１８９３２に記載されている。
【００６６】
さらに、適切なＩＬ−１アンタゴニストには、抗体分子とＩＬ−１アンタゴニスト分子の両方の部分を含むキメラタンパク質が含まれる。そのようなキメラ分子は単量体、二量体またはより高次の多量体を形成してもよい。他の適切なＩＬ−１アンタゴニストには、ＩＬ−１シグナリング受容体ＩＬ−１Ｒ  Ｉ型に競合結合できるＩＬ−１由来のペプチドが含まれる。
【００６７】
本発明方法は、ＩＬ−１（特にＩＬ−１β）を結合してＩＬ−１信号伝達を遮断し、これによりＩＬ−１（特にＩＬ−１β）の前炎症作用および免疫調節作用を妨害する形のＩＩ型ＩＬ−１受容体を使用できる。Ｕ．Ｓ．５，３５０，６８３には、ＩＩ型ＩＬ−１受容体ポリペプチドが記載されている。有用な形のＩＩ型ＩＬ−１受容体ポリペプチドには、ＩＬ−１（特にＩＬ−１β）結合能を保持したトランケート形可溶性フラグメントが含まれる。ＩＬ−１アンタゴニストとして有用な可溶性のＩＩ型ＩＬ−１受容体分子には、たとえば天然分子の膜貫通領域を欠如し、かつＩＬ−１（特にＩＬ−１β）を結合しうる、天然ＩＩ型ＩＬ−１受容体の類似体またはフラグメントが含まれる。
【００６８】
ＩＩ型ＩＬ−１受容体に由来するアンタゴニスト（たとえばＩＬ−１βを結合する可溶形）はＩＬ−１に対して細胞表面のＩＬ−１受容体と競合し、したがってＩＬ−１が細胞に結合するのを阻害し、これによりその生物学的活性を発現するのを阻止する。可溶性ＩＩ型ＩＬ−１受容体、またはＩＬ−１もしくはＩＬ−１βのフラグメントの結合は、ＥＬＩＳＡその他の好都合なアッセイ法によりアッセイできる。注射する場合、成人１人当たりの可溶性ＩＩ型ＩＬ−１受容体の有効量は１〜２０ｍｇ／ｍ2、好ましくは約５〜１２ｍｇ／ｍ2であろう。あるいは均一量を投与でき、その量は５〜１００ｍｇ／回、より好ましくは２０〜５０ｍｇ／回であろう。
【００６９】
本発明の実施に適した可溶性ＩＩ型ＩＬ−１受容体ポリペプチドまたはフラグメントを第２ポリペプチドと融合させて、キメラタンパク質を形成してもよい。そのようなキメラタンパク質の１態様において、第２ポリペプチドはキメラタンパク質による二量体、三量体またはより高次の多量体の自然形成を促進するものであってよい。これらはＩＬ−１分子を結合して、ＩＬ−１シグナリングを促進する細胞結合受容体への結合を阻止することができる。アンタゴニストとして用いるキメラタンパク質は、抗体分子と可溶性ＩＩ型ＩＬ−１受容体の両方の部分を含有するタンパク質であってよい。
【００７０】
さらに、本発明により投与される療法薬は、骨細胞の移動、増殖および分化を促進する合成または天然生物材料を罹患骨へ局所適用するのと併用できる。
骨密度モニタリングのためのアッセイ法
本明細書に記載する種々の処置を施す際、処置の開始時および処置の途中で患者の骨密度を測定することにより、処置の充足度をモニターするのがしばしば好都合である。そのような患者において、骨密度を標準法により測定する。これには、たとえば単一光子吸光光度法、二光子吸光光度法、二エネルギーＸ線吸光光度法、定量コンピューター断層撮影法およびラジオグラフィー吸光光度法が含まれる。モニタリングに有用な方法は二エネルギーＸ線吸光光度法である。同一骨の反復骨密度測定により、医師は処置中の骨形成速度を推定でき、したがってＲＡＮＫアンタゴニスト投与の量および頻度を調整して骨形成を最適化できる。有効なＲＡＮＫアンタゴニスト投与方式では、たとえば少なくとも２％、より好ましくは少なくとも５％、最も好ましくは少なくとも１０％以上の骨密度増大が誘導されるであろう。
【００７１】
処置期間中、骨形成が増大すると期待され、したがって任意の好都合な間隔で骨密度を反復測定することにより処置の充足度をモニターできる。たとえば、１週間毎、２週間毎、３週間毎、１カ月毎、３カ月毎、またはより長い月毎、もしくはより少ない頻度で密度を測定してもよい。
【００７２】
投与様式
療法用として、ＲＡＮＫアンタゴニストを個体、好ましくはヒトに、適応症に適切な様式で処置のために投与する。全身投与は、一般に骨成長の全般的促進が必要な適応症の処置、たとえば脊髄傷害患者または放射線療法レシピエントを処置する際に適切である。あるいは、ＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬアンタゴニストを局所適用できる。これは移植片レシピエントに適切であるが、これらの患者を所望により全身処置してもよい。そのような患者には、ＲＡＮＫアンタゴニストを所望により手術の時点で移植片に直接適用してもよい。局所投与の手段には、たとえば局所注射、またはこの目的に適した徐放性マトリックス（多数が知られている）と混和もしくは重合したアンタゴニストの適用が含まれる。
【００７３】
本発明はさらに、多数の疾患を処置するための医薬の製造における、ＲＡＮＫアンタゴニストおよびＲＡＮＫアンタゴニストと共投与される薬物の使用を提供する。ＲＡＮＫアンタゴニストおよび他の薬物を配合して、有効量のアンタゴニストを含む療法用組成物にすることができる。本発明の１態様においては、ＲＡＮＫアンタゴニスト活性をもつ精製した可溶性タンパク質を生理学的に許容できるキャリヤー、賦形剤または希釈剤と組み合わせて含む医薬組成物の形で、療法薬を投与する。そのようなキャリヤーは、用いる投与量および濃度でレシピエントに対し無毒性のものである。医薬組成物に用いるＲＡＮＫ／ＲＡＮＫＬ相互作用の阻害薬をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、金属イオンと複合体形成させ、あるいはポリマー化合物、たとえばポリ酢酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル、デキストランなどに取り込ませ、あるいはリポソーム、マイクロエマルション、ミセル、単層もしくは多層ビヒクル、赤血球ゴーストまたはスフェロプラストに取り込ませることができる。ＰＥＧと複合体形成したタンパク質は、既知の方法、たとえばＵＳＰ５，８４９，８６０、ＵＳＰ５，７６６，８９７に記載の方法、または他の適切な方法で調製できる。リポソーム形成に適した脂質には、モノグリセリド、ジグリセリド、コレステロール、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、胆汁酸などが含まれるが、これらに限定されない。リポソーム配合物の調製は当業者が容易になしうるものであり、たとえばＵＳＰ４，２３５，８７１；ＵＳＰ４，５０１，７２８；ＵＳＰ４，８３７，０２８；ＵＳＰ４，７３７，３２３；およびＵＳＰ５，８５８，３９７に開示されている。そのような組成物は、物理的状態、溶解度、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を与え、したがって意図する用途に従って選択されるので、キャリヤーの特性は選択する投与経路に依存するであろう。
【００７４】
本発明の１態様においては、徐放形のＲＡＮＫアンタゴニストを使用する。本発明方法に使用するのに適した徐放形には、溶解速度の遅い生体適合性ポリマー（たとえばＵ．Ｓ．６，０３６，９７８に記載のアルギナート微粒子）に封入された、徐放性ポリマー（局所適用ヒドロゲルを含む）と混和した、および／または生体適合性半透過性移植片に取り込ませた、可溶性ＲＡＮＫポリペプチド、オステオプロテゲリンおよびアンタゴニスト性抗ＲＡＮＫまたは抗ＲＡＮＫＬ抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
１回当たりのＲＡＮＫアンタゴニスト投与量は、使用するアンタゴニストおよび投与様式に応じて異なるであろう。アンタゴニストが可溶性ＲＡＮＫであり、注射により投与される場合、成人１人当たりの有効量は０．５〜２０ｍｇ／ｍ2、好ましくは５〜１２ｍｇ／ｍ2であろう。あるいは均一量を投与でき、その量は５〜１００ｍｇ／回であろう。皮下注射により投与される均一量の用量範囲例は、５〜２５ｍｇ／回、２５〜５０ｍｇ／回および５０〜１００ｍｇ／回である。特に慢性症状には選択した量を反復投与できる。あるいは、処置の進行に伴って１回当たりの量を増減してもよい。小児患者（４〜１７歳）に適切な投与方式は、０．４ｍｇ／ｋｇ、最大量２５ｍｇ、週１回以上の皮下注射を伴う。ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫＬに対する抗体をＲＡＮＫアンタゴニストとして用いる場合、好ましい用量範囲には０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．７５〜７．５ｍｇ／ｋｇおよび１〜１０ｍｇ／ｋｇ（体重）が含まれる。ヒト化抗体、すなわち抗体分子の抗原結合性部分のみがヒト以外の供給源に由来する抗体が望ましい。抗体を注射（静脈内注入を含む）により投与できる。適量は試験により決定できる。投与の量および頻度は、もちろん処置される適応症の性質および重症度、目的とする応答、患者の状態などの要因に依存するであろう。
【００７６】
通常、ＲＡＮＫアンタゴニストを含む医薬組成物の調製は、療法用タンパク質と、緩衝剤、酸化防止剤、たとえばアスコルビン酸、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（ブドウ糖、ショ糖またはデキストリンを含む）、キレート化剤、たとえばＥＤＴＡ、グルタチオン、ならびに他の安定剤および賦形剤とを混和することを伴う。中性緩衝化食塩水または同種血清アルブミンは、適切な希釈剤の例である。好ましくは、適切な賦形剤溶液（たとえば無菌の水またはショ糖溶液）を希釈剤として用いて、製品を凍結乾燥品として配合する。本発明の１態様は、凍結乾燥ＲＡＮＫアンタゴニストを投与単位の形で包装することを伴い、これを再構成すると１包装当たり１〜３回分が得られる。
【００７７】
本発明の化合物は、所望により一般的な無毒性の医薬的に許容できるキャリヤー、アジュバントおよびビヒクルを含有する投与単位剤形で、経口、非経口、舌下、吸入、噴霧、直腸または局所投与できる。局所投与には、経皮投与、たとえば経皮パッチまたはイオントフォレーゼ器具の使用も含まれる。注射が好ましい投与経路であり、これには非経口注射が含まれる。非経口注射には、皮下、髄腔内、クモ膜下、眼窩内、静脈内、動脈内、筋肉内、胸骨内への注射および注入法が含まれる。ＲＡＮＫアンタゴニストを含む組成物を、ボーラス注射または連続注入により投与できる。有用な全身投与経路は皮下注射および静脈内点滴である。
【００７８】
本発明の他の態様においては、ＲＡＮＫアンタゴニストを発現するように遺伝子修飾した細胞を用いる。たとえば可溶性ＲＡＮＫまたはＲＡＮＫアンタゴニスト活性をもつ他のタンパク質をコードするＤＮＡを、患者の身体から採取した細胞に導入し、次いでその細胞を患者に戻す。ＤＮＡは、アンタゴニストの発現を促進する形で、すなわちコード領域を細胞での発現のために機能可能な状態で適切な調節要素に結合させて、レシピエント細胞に導入される。ＤＮＡを適切なベクター、たとえばレトロウイルスもしくはアデノウイルスベクターにより、またはリポソームに封入して導入できる。この薬物投与様式に適した細胞には、罹患組織へ戻る細胞、たとえば骨髄細胞（造血前駆細胞を含む）が含まれる。他の同様な態様においては、ＲＡＮＫアンタゴニストをコードするＤＮＡの導入によりアンタゴニストを発現するように細胞系を修飾し、次いでその細胞を患者に導入する。そのような細胞は、ＲＡＮＫアンタゴニストの安定発現または一過性発現を促進するＤＮＡ構築体で形質転換できる。あるいはアンタゴニストをコードするＤＮＡをリポソームに封入して患者に導入できる。これを全身投与するか、あるいは罹患組織へ局所投与することができる。
【００７９】
処置すべき疾患の種々の動物モデルが当技術分野で知られている；したがって、ＲＡＮＫアンタゴニストの最適な投与量および投与経路を判定するためのルーティン実験を、まず動物モデルに、次いでヒト患者に適用できる。新生骨が高品質であって正常な骨と類似するように、投与方式を調整するのが適切であろう。個々の患者に対する具体的な投与方式は、用いる具体的化合物の活性、年齢、体重、全般的健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排出速度、薬物組合わせ、および患者の症状の重症度を含めた多様な要因に依存するであろう。最適結果を得るのに必要な投与量および投与頻度は、担当医が調整するであろう。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004536056.tif 000054
【国際調査報告】
2004536056.tif 000055
2004536056.tif 000056