(57)【要約】本発明はアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子も本発明に含まれ、同様に、該核酸を含有するベクター、該核酸ベクターで形質転換された宿主細胞、本発明のアルブミン融合タンパク質の調製方法、ならびに、上記核酸、ベクターおよび／または宿主細胞の使用方法も含まれる。さらに、本発明は、アルブミン融合タンパク質を含有する医薬組成物、および本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて疾患、障害または症状を治療、予防、あるいは改善する方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用タンパク質Ｘと、配列番号１８のアミノ酸配列を含むアルブミンと、を含んでなるアルブミン融合タンパク質。
【請求項２】
治療用タンパク質Ｘと、アルブミン活性を有する配列番号１８のアミノ酸配列の断片または変異体と、を含むアルブミン融合タンパク質。
【請求項３】
前記アルブミン活性が、非融合状態の治療用タンパク質Ｘの貯蔵寿命と比較して、治療用タンパク質Ｘの貯蔵寿命を長引かせる能力である、請求項２に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項４】
前記断片または変異体が、配列番号１８のアミノ酸１〜３８７のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項５】
治療用タンパク質Ｘの断片または変異体と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むアルブミンと、を含んでなるアルブミン融合タンパク質であって、該断片または変異体が治療用タンパク質Ｘの生物活性を有するものである、上記アルブミン融合タンパク質。
【請求項６】
治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体が、アルブミンのＮ末端、またはアルブミンの断片もしくは変異体のＮ末端に融合されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項７】
治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体が、アルブミンのＣ末端、またはアルブミンの断片もしくは変異体のＣ末端に融合されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項８】
治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体が、アルブミンのＮ末端とＣ末端、またはアルブミンの断片もしくは変異体のＮ末端とＣ末端に融合されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項９】
第１の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体、および第２の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体を含み、その際、第１の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体は、第２の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体と異なるものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１０】
治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体が、リンカーによってアルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体から分離されている、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１１】
アルブミン融合タンパク質が次式：
Ｒ１−Ｌ−Ｒ２、Ｒ２−Ｌ−Ｒ１、またはＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１
［式中、Ｒ１は治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体であり、Ｌはペプチドリンカーであり、Ｒ２は配列番号１８のアミノ酸配列を含むアルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体である］
で表される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１２】
アルブミン融合タンパク質の貯蔵寿命が、非融合状態の治療用タンパク質Ｘの貯蔵寿命より長い、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１３】
アルブミンまたはその断片もしくは変異体に融合された、治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性が、非融合状態の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性よりも高い、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１４】
アルブミンまたはその断片もしくは変異体に融合された、治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体のｉｎ ｖｉｖｏ生物活性が、非融合状態の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体のｉｎ ｖｉｖｏ生物活性よりも高い、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１５】
配列番号１８のアミノ酸配列を含むアルブミンまたはその断片もしくは変異体に挿入された、治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質。
【請求項１６】
下記のアミノ酸配列：
（ａ） 配列番号１８のアミノ酸５４〜６１、
（ｂ） 配列番号１８のアミノ酸７６〜８９、
（ｃ） 配列番号１８のアミノ酸９２〜１００、
（ｄ） 配列番号１８のアミノ酸１７０〜１７６、
（ｅ） 配列番号１８のアミノ酸２４７〜２５２、
（ｆ） 配列番号１８のアミノ酸２６６〜２７７、
（ｇ） 配列番号１８のアミノ酸２８０〜２８８、
（ｈ） 配列番号１８のアミノ酸３６２〜３６８、
（ｉ） 配列番号１８のアミノ酸４３９〜４４７、
（ｊ） 配列番号１８のアミノ酸４６２〜４７５、
（ｋ） 配列番号１８のアミノ酸４７８〜４８６、
（ｌ） 配列番号１８のアミノ酸５６０〜５６６、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むアルブミンに挿入された、治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質。
【請求項１７】
アルブミン融合タンパク質が、非融合状態の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体の貯蔵寿命と比較して、該治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体の貯蔵寿命を長引かせるのに十分なアルブミンの部分を含む、請求項１５または１６に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１８】
アルブミン融合タンパク質が、非融合状態の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性と比較して、アルブミンに融合した治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体のｉｎ ｖｉｔｒｏ生物活性を長引かせるのに十分なアルブミンの部分を含む、請求項１５または１６に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項１９】
アルブミン融合タンパク質が、非融合状態の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体のｉｎ ｖｉｖｏ生物活性と比較して、アルブミンに融合した治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体のｉｎ ｖｉｖｏ生物活性を長引かせるのに十分なアルブミンの部分を含む、請求項１５または１６に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項２０】
グリコシル化されていない、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項２１】
酵母において発現させたものである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項２２】
前記酵母がグリコシル化に欠陥がある、請求項２１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項２３】
前記酵母がグリコシル化およびプロテアーゼに欠陥がある、請求項２１に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項２４】
哺乳動物細胞において発現させたものである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項２５】
アルブミン融合タンパク質が培養下の哺乳動物細胞において発現させたものである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項２６】
アルブミン融合タンパク質が分泌リーダー配列をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質。
【請求項２７】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質および製薬上許容される担体を含有する組成物。
【請求項２８】
請求項２７に記載の組成物を含むキット。
【請求項２９】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質を投与することを含んでなる、患者における疾患または障害の治療方法。
【請求項３０】
前記疾患または障害が適応症Ｙを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
有効量の請求項１〜２６のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質を投与することを含んでなる、治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体によりモジュレートされる疾患または障害をもつ患者の治療方法。
【請求項３２】
前記疾患または障害が適応症Ｙを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
非融合状態の治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体の貯蔵寿命と比較して、治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体の貯蔵寿命を引き延ばすのに十分なアルブミンまたはその断片もしくは変異体に、治療用タンパク質Ｘまたはその断片もしくは変異体を融合させることを含んでなる、治療用タンパク質Ｘの貯蔵寿命を引き延ばす方法。
【請求項３４】
請求項１〜２６のいずれか１項に記載のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項３５】
請求項３４に記載の核酸分子を含有するベクター。
【請求項３６】
請求項３５に記載の核酸分子を含有する宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
本発明は、一般的には、アルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体に融合された治療用タンパク質（ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体を含むが、これらに限らない）に関する。本発明はさらに、溶解状態（溶液中）で長期の貯蔵寿命および／または長期の治療活性を示す、アルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体に融合された治療用タンパク質（ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらの断片もしくは変異体を含むが、これらに限らない）に関する。本明細書では、これらの融合タンパク質をまとめて「本発明のアルブミン融合タンパク質」と呼ぶことにする。本発明は、治療用のアルブミン融合タンパク質、組成物、医薬組成物、製剤およびキットを包含する。本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子も本発明に含まれ、同様に、これらの核酸を含有するベクター、これらの核酸ベクターで形質転換された宿主細胞、ならびに、これらの核酸、ベクターおよび／または宿主細胞を用いて本発明のアルブミン融合タンパク質を調製する方法も含まれる。
【０００２】
さらに、本発明は、治療用タンパク質をアルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体に融合または結合させることによって、治療用タンパク質をｉｎ ｖｉｔｒｏで安定化する方法に関する。
【０００３】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡまたはＨＡ）は、その成熟形態では（図１５または配列番号１８に示されるように）５８５アミノ酸からなるタンパク質であって、血清の浸透圧の大部分に関与しており、また、内因性および外因性のリガンドのキャリアーとしても機能している。現在のところ、臨床用のＨＡはヒト血液からの抽出により生産されている。微生物による組換えＨＡ（ｒＨＡ）の生産は、ＥＰ ３３０ ４５１およびＥＰ ３６１ ９９１に記載されている。
【０００４】
キャリアー分子としてのアルブミンの役割ならびにその不活性な性質は、ｉｎ ｖｉｖｏでポリペプチドの担体および輸送体として使用するのに望ましい性質である。アルブミン融合タンパク質の一成分としてのアルブミンを、各種タンパク質のキャリアーとして使用することは、ＷＯ ９３／１５１９９、ＷＯ ９３／１５２００、およびＥＰ ４１３ ６２２に提案されている。また、ポリペプチドへの融合のためにＨＡのＮ末端断片を使用することもすでに提起されている（ＥＰ ３９９ ６６６）。アルブミンの治療用タンパク質への融合は、ＨＡまたはその断片をコードするＤＮＡを、治療用タンパク質をコードするＤＮＡに接合させるといった、遺伝子操作により達成しうる。次いで、融合ポリペプチドを発現するように適切なプラスミド上に配置された融合ヌクレオチド配列を用いて、適切な宿主の形質転換またはトランスフェクションを行う。発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで（例えば、原核もしくは真核細胞から）行うことも、ｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、トランスジェニック生物から）行うこともできる。
【０００５】
インターフェロンや成長ホルモンなどの治療用タンパク質は、その天然の状態でまたは組換え法で生産したとき、一般的に短い貯蔵寿命を示す不安定な分子であり、特に水溶液として製剤化したときにはそうである。投与用に製剤化した場合のこれら分子の不安定性は、こうした分子の多くを貯蔵中ずっと凍結乾燥および冷蔵しなければならないことを意味し、したがって、これらの分子の輸送および／または貯蔵はやっかいである。貯蔵の問題は、医薬製剤を病院の環境外で貯蔵し分配する必要があるときには、なおさら深刻である。また、多数のタンパク質およびペプチド薬物は、タンパク質が容器に付着することによる損失を少なくしたり防止するために、アルブミンなどの他のタンパク質を高濃度で添加する必要がある。このことは、ＩＦＮのようなタンパク質に関しては大きな関心事となっている。こうした理由のため、多くの治療用タンパク質は高割合のアルブミンキャリアー分子（１００〜１０００倍過剰）と組み合わせて製剤化されるが、これはその製剤にとってコストのかかる特徴であり、好ましくない。
【０００６】
不安定なタンパク質分子の貯蔵問題に対する実際的な解決策は、これまでほとんど提案されていない。したがって、容易に（好ましくは、最低限の貯蔵後操作を必要とする単純な製剤を用いて）分配されるタンパク質治療用分子の安定化された持続性のある製剤が必要とされている。
【０００７】
発明の概要
本発明は、一部には、治療用タンパク質を、該タンパク質および／またはその活性を安定化するのに十分なアルブミンまたはアルブミンの断片（部分）もしくは変異体に遺伝的にまたは化学的に融合させることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、溶解状態でその治療用タンパク質の貯蔵寿命を引き延ばすように、および／または長期間にわたりその活性を保持するように、治療用タンパク質を安定化しうるという発見に基づいている。加えて、アルブミン融合タンパク質またはアルブミン結合タンパク質を使用すると、容器への付着といった治療用タンパク質の損失を防止できるために、大過剰のキャリアータンパク質（例えば、融合されていないアルブミン）を用いてタンパク質溶液を製剤化する必要性が少なくなることが判明した。
【０００８】
本発明は、アルブミンまたはアルブミンの断片（部分）もしくは変異体に融合された治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはその断片もしくは変異体）からなるアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、溶解状態の（または医薬組成物中の）治療用タンパク質の貯蔵寿命を長引かせ、かつ／または治療用タンパク質および／またはその活性を安定化するのに十分である、アルブミンまたはアルブミンの断片（部分）もしくは変異体に融合された治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはその断片もしくは変異体）からなるアルブミン融合タンパク質を包含する。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子も本発明により包含され、同様に、これらの核酸を含有するベクター、これらの核酸ベクターで形質転換された宿主細胞、および本発明のアルブミン融合タンパク質の調製方法ならびにこれらの核酸、ベクターおよび／または宿主細胞の使用方法も本発明に含まれる。
【０００９】
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および製薬上許容される希釈剤または担体を含有する医薬製剤を包含する。そのような製剤はキットまたは容器の中に収容される。そのようなキットまたは容器は、治療用タンパク質の延長された貯蔵寿命に関する説明書と共に包装されうる。かかる製剤は、患者（好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒト）における疾患または症状を、該患者にその医薬製剤を投与することによって治療、予防、改善、または診断する方法に使用することができる。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、疾患または障害の予防、治療または改善方法を包含する。好ましい実施形態では、本発明は、表１の「好適な適応症Ｙ」の欄に挙げた疾患または障害の処置方法を包含し、この方法は、そのような治療、予防または改善が必要な患者に、（表１の「好適な適応症Ｙ」の欄に挙げた処置すべき疾患または障害と同じ列にある）表１の「治療用タンパク質Ｘ」の欄に開示した治療用タンパク質（またはその断片もしくは変異体）に相当する治療用タンパク質部分を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を、該疾患または障害を治療、予防または改善するのに有効な量で、投与することを含む。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはその断片もしくは変異体）の貯蔵寿命を引き延ばす方法を包含し、この方法は、治療用タンパク質を、該タンパク質の貯蔵寿命を引き延ばすのに十分であるアルブミンまたはアルブミンの断片（部分）もしくは変異体に融合または結合させることを含む。好ましい実施形態では、この方法に従って用いられる治療用タンパク質が、アルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体に融合される。最も好ましい実施形態では、この方法に従って用いられる治療用タンパク質が、組換えＤＮＡ法または遺伝子工学的手法により、アルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体に融合される。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、溶解状態（溶液中）の治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはその断片もしくは変異体）を安定化する方法を包含し、この方法は、治療用タンパク質を、該タンパク質を安定化するのに十分であるアルブミンまたはアルブミンの断片（部分）もしくは変異体に融合または結合させることを含む。好ましい実施形態では、この方法に従って用いられる治療用タンパク質が、アルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体に融合される。最も好ましい実施形態では、この方法に従って用いられる治療用タンパク質が、組換えＤＮＡ法または遺伝子工学的手法により、アルブミンまたはアルブミンの断片もしくは変異体に融合される。
【００１３】
本発明はさらに、本発明の核酸分子を含むように改変された、好ましくは、該核酸分子によりコードされるアルブミン融合タンパク質を発現するように改変された、トランスジェニック生物を包含する。
【００１４】
図面の説明
図１は、細胞培地中で最大５週間にわたり３７℃でインキュベートした後に残存しているＨＡ−ｈＧＨの生物学的活性（Ｎｂ２細胞増殖）に基づいて、ＨＡ融合タンパク質の貯蔵寿命の延長を示した図である。これらの条件下で、ｈＧＨは２週目までに活性がまったく認められなくなる。
【００１５】
図２は、細胞培地中で最大３週間にわたり４℃、３７℃または５０℃でインキュベートした後に残存しているＨＡ−ｈＧＨの安定な生物学的活性（Ｎｂ２細胞増殖）に基づいて、ＨＡ融合タンパク質の貯蔵寿命の延長を示した図である。データは、ゼロ時における生物学的活性に対して標準化してある。
【００１６】
図３Ａおよび３Ｂは、Ｎｂ２細胞増殖アッセイで、ＨＡ−ｈＧＨの生物学的活性をｈＧＨと比較した図である。図３Ａは、各種濃度のｈＧＨまたはアルブミン融合タンパク質と共に２４時間インキュベートした後の増殖を示し、図３Ｂは、各種濃度のｈＧＨまたはアルブミン融合タンパク質と共に４８時間インキュベートした後の増殖を示す。
【００１７】
図４は、ＨＡ融合体を形成するために治療用タンパク質（ポリペプチドまたはその断片もしくは変異体を含む）をコードするポリヌクレオチドをクローニングすることができる基本ベクターとして使用可能なプラスミド（ｐＰＰＣ０００５）の地図を示した図である。プラスミド地図の略語解：　ＰＲＢ１ｐ：Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロモーター；ＦＬ：融合リーダー配列；ｒＨＡ：ＨＡをコードするｃＤＮＡ；ＡＤＨ１ｔ：ＡＤＨ１ Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅターミネーター；Ｔ３：Ｔ３配列決定プライマー部位；Ｔ７：Ｔ７配列決定プライマー部位；Ａｍｐ Ｒ：β−ラクタマーゼ遺伝子；ｏｒｉ：複製起点。本出願の優先権の基となった仮出願では、図４に示したプラスミドがｐＰＰＣ０００５ではなくｐＰＰＣ０００６と呼ばれていることに注意されたい。さらに、このプラスミド図には、このベクター中のいくつかの関連する制限部位が示されなかった。したがって、本出願では、この図をｐＰＰＣ０００５と呼ぶことにし、同ベクターのより多くの制限部位を示してある。
【００１８】
図５は、バイアル中で４８または７２時間貯蔵した後の、各種濃度のＨＡ−ＩＦＮ溶液の回復をストック溶液と比較した図である。
【００１９】
図６は、ＩＶまたはＳＣでサルに投与した後のＨＡ−α−ＩＦＮ融合タンパク質の活性を比較した図である。
【００２０】
図７は、ＨＡ−α−ＩＦＮ融合タンパク質の生物学的利用能および安定性を示した図である。
【００２１】
図８は、ＨＡ−α−ＩＦＮ生産用の発現ベクターの地図を示した図である。
【００２２】
図９は、ＨＡ中のループの位置を示した図である。
【００２３】
図１０は、ＨＡループの改変の例を示した図である。
【００２４】
図１１は、ＨＡループを示した図である。
【００２５】
図１２は、ＨＡループＩＶを示した図である。
【００２６】
図１３は、ＨＡの三次構造を示した図である。
【００２７】
図１４は、ｓｃＦｖ−ＨＡ融合体の例を示した図である。
【００２８】
図１５は、成熟型のヒトアルブミンのアミノ酸配列（配列番号１８）およびそれをコードするポリヌクレオチド（配列番号１７）を示した図である。
【００２９】
詳細な説明
上述したように、本発明は、一部には、治療用タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを、該タンパク質およびその活性を安定化させるのに十分なアルブミンの全部または一部に遺伝的に融合させるか、または化学的に結合させることによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、溶解状態の（または医薬組成物中の）治療用タンパク質の貯蔵寿命を引き延ばし、かつ／または治療用タンパク質の活性を長期間保持するように治療用タンパク質（例えば、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはその断片もしくは変異体）を安定化しうる、という発見に基づくものである。
【００３０】
本発明は、一般的には、アルブミン融合タンパク質ならびに疾患または障害の予防、治療または改善方法に関する。本明細書で用いる「アルブミン融合タンパク質」とは、少なくとも１分子のアルブミン（またはその断片もしくは変異体）の少なくとも１分子の治療用タンパク質（またはその断片もしくは変異体）への融合により形成されたタンパク質をさす。本発明のアルブミン融合タンパク質は、少なくとも治療用タンパク質の断片または変異体と少なくともヒト血清アルブミンの断片または変異体とを含み、これらは互いに結合されており、好ましくは遺伝的融合（すなわち、アルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質の全部または一部をコードするポリヌクレオチドがアルブミンの全部または一部をコードするポリヌクレオチドと同じ読み枠で連結されている核酸の翻訳により生成される）または化学的結合により互いに結合されている。治療用タンパク質およびアルブミンタンパク質は、ひとたびアルブミン融合タンパク質の一部となれば、そのアルブミン融合タンパク質の「部分」、「領域」または「成分」（例えば、「治療用タンパク質部分」または「アルブミンタンパク質部分」）と呼ぶことができる。
【００３１】
一つの実施形態では、本発明は、治療用タンパク質（例えば、表１に記載したもの）と血清アルブミンタンパク質と、を含む、あるいは、から成る、アルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質の生物活性および／または治療活性のある断片と血清アルブミンタンパク質と、を含む、あるいは、から成る、アルブミン融合タンパク質を提供する。別の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質の生物活性および／または治療活性のある変異体と血清アルブミンタンパク質と、を含む、あるいは、から成る、アルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパク質の血清アルブミンタンパク質成分は血清アルブミンの成熟部分である。
【００３２】
さらなる実施形態では、本発明は、治療用タンパク質と血清アルブミンの生物活性および／または治療活性のある断片と、を含む、あるいは、から成る、アルブミン融合タンパク質を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、治療用タンパク質と血清アルブミンの生物活性および／または治療活性のある変異体と、を含む、あるいは、から成る、アルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は治療用タンパク質の成熟部分である。さらに好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は治療用タンパク質の細胞外の可溶性ドメインである。別の実施形態では、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は治療用タンパク質の活性形態である。
【００３３】
さらなる実施形態では、本発明は、治療用タンパク質の生物活性および／または治療活性のある断片または変異体と、血清アルブミンの生物活性および／または治療活性のある断片または変異体と、を含む、あるいは、から成る、アルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、治療用タンパク質の成熟部分と血清アルブミンの成熟部分と、を含む、あるいは、から成る、アルブミン融合タンパク質を提供する。
【００３４】
治療用タンパク質
上述したように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、好ましくは遺伝的融合または化学的結合により、互いに結合された、少なくとも治療用タンパク質の断片または変異体と少なくともヒト血清アルブミンの断片または変異体とを含む。
【００３５】
本明細書で用いる「治療用タンパク質」とは、１つ以上の治療活性および／または生物活性を有するタンパク質、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはその断片もしくは変異体をさす。本発明により包含される治療用タンパク質としては、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、および生化学的薬剤があり、これらに限定されない。（ペプチド、タンパク質、ポリペプチドという用語は、本明細書では相互交換可能に用いられる。）特に「治療用タンパク質」という用語は、抗体とそのフラグメントおよび変異体を含む。かくして、本発明のアルブミン融合タンパク質は、少なくとも治療用タンパク質の断片または変異体および／または少なくとも抗体のフラグメントまたは変異体を含みうる。さらに、「治療用タンパク質」という用語は、治療用タンパク質の内在性のまたは天然に存在する対応物をさすこともある。
【００３６】
「治療活性」を示すポリペプチドまたは「治療上活性」のあるタンパク質とは、治療用タンパク質と関連した既知の生物活性および／または治療活性を１以上保有するポリペプチド、例えば、本明細書に記載した、さもなくば、当技術分野で知られている治療用タンパク質をさす。非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、疾患、症状または障害を治療、予防または改善するのに有用なタンパク質である。非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、特定の細胞型（正常（例：リンパ球）または異常（例：癌細胞））と特異的に結合するものであり、それゆえ、化合物（薬物または細胞毒性物質）をその細胞型へ特異的にターゲッティングするために使用することができる。
【００３７】
別の非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、生物活性のあるタンパク質、特に疾患を治療、予防または改善するのに有用な生物活性をもつタンパク質である。治療用タンパク質がもちうる生物活性の非包括的なリストとして、免疫応答の増強、血管形成の促進、血管形成の抑制、造血機能の調節、神経成長の刺激、免疫応答の増強、免疫応答の抑制、または以下の「生物活性」の項に記載する生物活性のうちの１以上が挙げられる。
【００３８】
本明細書中で用いる「治療活性」または「活性」とは、その作用がヒトにおける望ましい治療結果と一致する活性、あるいは、ヒト以外の哺乳動物または他の種もしくは生物における所望の効果を意味しうる。治療活性はｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで測定可能である。例えば、望まれる効果を細胞培養でアッセイすることができる。一例として、ｈＧＨが治療用タンパク質である場合は、実施例１に記載するような、ｈＧＨの細胞増殖に及ぼす影響が、治療活性を測定するためのエンドポイントとして用いられる。そのようなｉｎ ｖｉｔｒｏまたは細胞培養アッセイは、通常、当技術分野で記載されるように、多くの治療用タンパク質に利用可能である。アッセイの例には、限定するものではないが、本明細書中の「実施例」の項または表１の「代表的活性アッセイ」の欄に記載されるものが含まれる。
【００３９】
本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質（例えば、細胞表面および分泌タンパク質）は、１個以上のオリゴ糖基の結合によって修飾されていることが多い。かかる修飾は、グリコシル化と呼ばれるもので、タンパク質の物理的性質に劇的な影響を及ぼし、タンパク質の安定性、分泌および局在において重要でありうる。グリコシル化はポリペプチド骨格に沿った特定の位置で起こる。通常、グリコシル化には２つの主要なタイプがある。すなわち、Ｏ−結合オリゴ糖（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列（ここで、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸である）中のセリンまたはトレオニン残基に結合）を特徴とするグリコシル化と、Ｎ−結合オリゴ糖（Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列中のアスパラギン残基に結合）を特徴とするグリコシル化である。通常は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアル酸ともいう）がＮ−結合オリゴ糖とＯ−結合オリゴ糖の両方の末端残基となる。タンパク質構造や細胞型などの変動要因が鎖内の様々なグリコシル化部位での炭水化物単位の数および性質に影響する。また、グリコシル化異性体が所定の細胞型内の同一の部位に普通に存在する。
【００４０】
例えば、ヒトインターフェロンのいくつかのタイプはグリコシル化されている。天然のヒトインターフェロン−α２はトレオニン１０６でＯ−グリコシル化され、インターフェロン−α１４ではアスパラギン７２でＮ−グリコシル化が起こる（Ａｄｏｌｆら， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ２７６：５１１ （１９９１）； Ｎｙｍａｎ ＴＡら， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ３２９：２９５ （１９９８））。天然のインターフェロン−β１αのアスパラギン８０にあるオリゴ糖は、このタンパク質の溶解性と安定性にとって重要な役割を果たしうるが、その生物活性にとっては必須のものではない。したがって、安定性を高めるための配列修飾を行った非グリコシル化類似体（インターフェロン−β１ｂ）の遺伝子工学的作製が可能である（Ｈｏｓｏｉら， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ． ８：３７５ （１９８８）； Ｋａｒｐｕｓａｓら， Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ５４：１２０３ （１９９８）； Ｋｎｉｇｈｔ， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ． ２：４２１ （１９８２）； Ｒｕｎｋｅｌら， Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ １５：６４１ （１９９８）； Ｌｉｎ， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． Ｓｔａｎｄ． ９６：９７ （１９９８））。インターフェロン−γは２５位と９７位にＮ−結合オリゴ糖鎖を含むが、これらは両方とも生物活性のある組換えタンパク質を効率よく生成させるのに重要であり、このタンパク質の薬物動態学的特性に影響を及ぼす（Ｓａｒｅｎｅｖａら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ ２４２：１９１ （１９９６）； Ｓａｒｅｎｅｖａら， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ３０３：８３１ （１９９４）； Ｓａｒｅｎｅｖａ ら， Ｊ． Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ． １３：２６７ （１９９３））。例えばヒトエリトロポエチンでは、Ｏ−結合とＮ−結合の混合グリコシル化が起こり、Ｎ−結合グリコシル化は２４位、３８位および８３位にあるアスパラギン残基で起こり、一方、Ｏ−結合グリコシル化は１２６位のセリン残基で起こる（Ｌａｉら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６１：３１１６ （１９８６）； Ｂｒｏｕｄｙら， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２６５：３２９ （１９８８））。
【００４１】
本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質、ならびにその類似体および変異体は、１以上の部位でのグリコシル化が、その核酸配列の操作の結果として、それを発現する宿主細胞により改変されるか、または他の発現条件により改変されるように、修飾することができる。例えば、グリコシル化異性体は、グリコシル化部位の除去または導入（例えば、アスパラギンをグルタミンで置換するといった、アミノ酸残基の置換または欠失）により作製することができ、また、非グリコシル化タンパク質は、グリコシル化を行わない宿主細胞（例えば、大腸菌またはグリコシル化欠損酵母）で発現させることによって作製することができる。これらのアプローチは以下で詳しく説明するが、当技術分野で公知である。
【００４２】
治療用タンパク質（特に表１に記載したもの）およびそれらの核酸配列は当技術分野で公知であって、表１に示すようなケミカル・アブストラクト・サービス・データベース（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｄａｔａｂａｓｅｓ）（例えば、ＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙ）、ＧｅｎＢａｎｋ、およびＧｅｎＳｅｑのような公共のデータベースから入手可能である。
【００４３】
本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する追加の治療用タンパク質には、限定するものではないが、表１の「治療用タンパク質Ｘ」の欄に記載した治療用タンパク質もしくはペプチド、またはその断片もしくは変異体の１種以上が含まれる。
【００４４】
表１は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質の非包括的リストを提供する。「治療用タンパク質Ｘ」の欄には、治療用タンパク質分子と、そのあとの括弧内に、治療用タンパク質分子またはその断片もしくは変異体を含むか、あるいは、治療用タンパク質分子またはその断片もしくは変異体から成る科学的名称および商標名が記載されている。本明細書中で用いる「治療用タンパク質Ｘ」とは、個々の治療用タンパク質分子（ＣＡＳおよびＧｅｎＢａｎｋ登録番号から入手できるアミノ酸配列により規定される）をさすか、あるいは、その欄に記載される所定の治療用タンパク質分子と関連した治療用タンパク質の全グループをさす。「代表的識別番号」の欄は、ケミカル・アブストラクト・サービス（ＣＡＳ）登録番号（米国化学会により公開）および／またはＧｅｎＢａｎｋ登録番号（例えば、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブページ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ から入手可能な、遺伝子座番号、ＮＰ ＸＸＸＸＸ （基準配列タンパク質）、およびＸＰ ＸＸＸＸＸ （モデルタンパク質）識別番号）を提供し、これらは治療用タンパク質分子または治療用タンパク質分子の断片もしくは変異体のアミノ酸配列を含むＣＡＳ ＲｅｇｉｓｔｒｙまたはＧｅｎＢａｎｋデータベースへのエントリーに相当する。さらに、ＧｅｎＳｅｑ登録番号および／または定期刊行物の引用は、いくつかのポリペプチドの代表的アミノ酸配列を確認するために提供される。これらのＣＡＳおよびＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＳｅｑ登録番号ならびに引用定期刊行物（例えば、ＰｕｂＭｅｄ ＩＤ 番号（ＰＭＩＤ））のそれぞれと関連した概略頁は、その全体を（特にそこに記載されたアミノ酸配列に関して）参照することにより本明細書中に組み入れるものとする。「ＰＣＴ／特許文献」の欄は、その治療用タンパク質分子を記載している特許および／または公開特許出願に相当する米国特許番号またはＰＣＴ国際公開番号を提供する。「ＰＣＴ／特許文献」の欄に引用された特許および／または公開特許出願のそれぞれは、その全体を参照することにより本明細書に組み入れるものとする。特に、各引用「ＰＣＴ／特許文献」の配列表に示された特定のポリペプチドのアミノ酸配列、例えば各引用「ＰＣＴ／特許文献」の詳細な説明に示されたこれらのアミノ酸配列の変異体（突然変異体、断片など）、例えば各引用「ＰＣＴ／特許文献」の詳細な説明に示された治療適応症、および各引用「ＰＣＴ／特許文献」の詳細な説明（特に実施例）に示された特定のポリペプチドの活性アッセイは、その全体を参照することにより本明細書に組み入れるものとする。「生物活性」の欄は、治療用タンパク質分子と関連した生物活性を記載している。「代表的活性アッセイ」の欄は、治療用タンパク質または治療用タンパク質Ｘ部分を含む本発明のアルブミン融合タンパク質の治療および／または生物活性を試験するために使用できるアッセイを記載している文献を提供する。「代表的活性アッセイ」の欄に引用された文献はそれぞれ、特に表１の「生物活性」の欄に示された対応する生物活性をアッセイするためのその文献に記載されたそれぞれの活性アッセイの説明に関して、その全体を参照（例えば、「方法」の項を参照）することにより本明細書に組み入れるものとする。「好適な適応症Ｙ」の欄は、治療用タンパク質Ｘまたは治療用タンパク質Ｘ部分を含む本発明のアルブミン融合タンパク質により治療、予防または改善される疾患、障害および／または症状について記載している。
【００４５】
「好ましい適応症Ｙ」の欄における「癌」という記載は、対応する治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体を含む融合タンパク質を、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、白血病、癌、および／または以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）を、例えば診断、治療、予防および／または緩和するために用いることができることを示す。
【００４６】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「癌」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、大腸、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、前立腺、腹膜、肺、血液（例えば、白血病）、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、子宮、眼、頭部頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸郭、ならびに泌尿生殖器からなる群より選択される組織に位置する新生物の、例えば診断、治療、予防および／または緩和に使用しうる。
【００４７】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「癌」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、前新生物状態、例えば、過形成（例えば、子宮内膜過形成および／または 以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、メタプラシア（例えば、結合組織メタプラシア、異型メタプラシア、および／または以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、ならびに／あるいはディスプラシア（例えば、子宮頸ディスプラシア、および気管支肺ディスプラシア）からなる群より選択されるものを、例えば診断、治療、予防および／または緩和するために使用しうる。
【００４８】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「癌」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、良性異常増殖性疾患、例えば良性腫瘍、線維嚢胞症、組織肥大、および／または以下の「高増殖性疾患」に記載されるものからなる群より選択されるものを、例えば診断、治療、予防および／または緩和するために使用しうる。
【００４９】
「好ましい適応症Ｙ」の欄における「免疫／造血性」という記載は、対応する治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体を含む融合タンパク質を、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、血液疾患（例えば、以下の「免疫活性」、「心血管系疾患」および／または「血液関連疾患」に記載されるもの）、および／または感染症（例えば、以下の「感染性疾患」に記載されるもの）の、例えば診断、治療、予防および／または緩和に使用しうることを示す。
【００５０】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「免疫／造血性」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、貧血、汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症、白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性白血病（ＡＬＬ）、形質細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、関節炎、喘息、ＡＩＤＳ、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、慢性肉芽腫症、免疫不全、炎症性腸疾患、敗血症、好中球減少症、好中球増加症、乾癬、移植器官および／もしくは組織に対する免疫反応、全身性 紅斑性狼瘡、血友病、凝固能亢進、真性糖尿病、心内膜炎、髄膜炎、ライム病、ならびにアレルギーからなる群より選択される疾患および／または障害を、例えば診断、治療、予防および／または緩和するために使用しうる。
【００５１】
「好ましい適応症Ｙ」の欄における「生殖系」という記載は、治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体を含む融合タンパク質を、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、および／または生殖系疾患（例えば、以下の「生殖系疾患」に記載されるもの）の、例えば診断、治療、予防および／または緩和に使用しうることを示す。
【００５２】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「生殖系」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、停留精巣、前立腺炎、鼡径ヘルニア、精索静脈瘤、ライディヒ細胞腫瘍、ゆうぜい癌、前立腺炎、マラコプラキア、ペーロニー病、陰茎癌、扁平上皮 過形成、月経困難、卵巣腺癌、ターナー症候群、粘液膿性子宮頸炎、セルトリ−ライディヒ腫瘍、卵巣癌、子宮癌、骨盤炎症性疾患、精巣癌、前立腺癌、クラインフェルター症候群、ヤング症候群、早発射精、真性糖尿病、嚢胞性線維症、カルタゲナー症候群、精巣萎縮症、精巣性女性化症候群、無精巣症、異所睾丸、精巣上体炎、精巣炎、淋病、梅毒、精巣捻転、結節性精管炎、生殖細胞腫瘍、間質腫瘍、月経困難、後傾子宮、子宮内膜症、類線維腫、腺筋症、無排卵出血、無月経、クッシング症候群、胞状奇胎、アッシェルマン症候群、早期閉経、性的早熟、子宮ポリープ、不正子宮出血、子宮頸炎、慢性 子宮頸炎、粘液膿性子宮頸炎、子宮頸 ディスプラシア、子宮頸ポリープ、ナーボト嚢胞、子宮頸びらん、子宮頸不全、子宮頸 新生物、偽半陰陽、ならびに月経前症候群、からなる群より選択される疾患および／または障害を、例えば診断、治療、予防および／または緩和するために使用しうる。
【００５３】
「好ましい適応症Ｙ」の欄における「筋骨格系」という記載は、治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体を含む融合タンパク質を、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、および／または免疫系疾患（例えば、以下の「免疫活性」に記載されるもの）の、例えば診断、治療、予防および／または緩和に使用しうることを示す。
【００５４】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「筋骨格系」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、骨癌（例えば、骨軟骨腫、良性 軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、巨細胞腫、多発性骨髄腫、および骨肉腫）、パジェット病、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、全身性紅斑性狼瘡、骨髄炎、ライム病、痛風、滑液包炎、腱炎、骨粗鬆症、変形性関節症、筋ジストロフィー、ミトコンドリア性筋障害、悪液質、ならびに多発性硬化症、からなる群より選択される疾患および／または障害を、例えば診断、治療、予防および／または緩和するために使用しうる。
【００５５】
「好ましい適応症Ｙ」の欄における「心臓血管系」という記載は、治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体を含む融合タンパク質を、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、および／または心血管系疾患（例えば、以下の「心血管系疾患」に記載されるもの）の、例えば診断、治療、予防および／または緩和に使用しうることを示す。
【００５６】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「心臓血管系」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、粘液腫、線維腫、横紋筋腫、心血管異常 （例えば、先天性心欠陥、脳動静脈奇形、中隔欠損）、心臓疾患（例えば、心不全、先天性心臓疾患、不整脈、頻脈、原線維性、心膜疾患、心内膜炎）、心停止、心臓弁疾患（例えば、狭窄、逆流、脱出症）、血管疾患（例えば、高血圧、冠状動脈疾患、アンギナ、動脈瘤、動脈硬化症、末梢血管疾患）、低ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、ならびに高カリウム血症、からなる群より選択される疾患および／または障害を、例えば診断、治療、予防および／または緩和するために使用しうる。
【００５７】
「好ましい適応症Ｙ」の欄における「混合胎児」という記載は、治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体を含む融合タンパク質を、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）の、例えば診断、治療、予防および／または緩和に使用しうることを示す。
【００５８】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「混合胎児」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、二分脊椎、水無脳症、神経線維腫症、胎児性アルコール症候群、真性糖尿病、ＰＫＵ、ダウン症候群、パトー症候群、エドワーズ症候群、ターナー症候群、アペール症候群、カーペンター症候群、コンラーディ症候群、クルゾン症候群、弛緩性皮膚、コルネリア・ド・ランゲ症候群、エリス−ファン・クレフェルト症候群、ホールト−オーラム症候群、カータゲナー症候群、メッケル−グルーバー症候群、ヌーナン症候群、パリスター−ホール症候群、ルービンスタイン−テービ症候群、シミター症候群、スミス−レムリ−オピッツ症候群、血栓性血球減少がない橈骨（ＴＡＲ）症候群、トレチャー・コリンズ症候群、ウィリアムズ症候群、ヒルシュスプルング病、臍腸間膜憩室、多発性嚢胞腎疾患、ターナー症候群、ならびに、生殖器発育不全、クリペル−フェーユ症候群、骨発生不全症、筋ジストロフィー、テイ−サックス病、ウィルムス腫、神経芽細胞腫、および網膜芽腫、からなる群より選択される疾患および／または障害を、例えば診断、治療、予防および／または緩和するために使用しうる。
【００５９】
「好ましい適応症Ｙ」の欄における「排泄器官」という記載は、治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体を含む融合タンパク質を、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、および／または腎疾患（例えば、以下の「腎疾患」に記載のもの）の、例えば診断、治療、予防および／または緩和に使用しうることを示す。
【００６０】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「排泄器官」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、膀胱癌、前立腺癌、良性前立腺過形成、膀胱疾患（例えば、尿失禁、尿貯留、尿閉塞、尿管感染症、間質性膀胱炎、前立腺炎、神経因性膀胱障害、血尿）、腎疾患（例えば、水腎症、蛋白尿、腎不全、腎盂腎炎、尿石症、逆流性腎症、および片側閉塞性尿路疾患）、からなる群より選択される疾患および／または障害を、例えば診断、治療、予防および／または緩和するために使用しうる。
【００６１】
「好ましい適応症Ｙ」の欄における「神経／感覚」という記載は、治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体を含む融合タンパク質を、新生物疾患に関連する疾患および／もしくは障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、および／または神経系の疾患もしくは障害（例えば、以下の「神経活性および神経疾患」に記載のもの）の、例えば診断、治療、予防および／または緩和に使用しうることを示す。
【００６２】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「神経／感覚」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、脳の癌（例えば、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳神経膠星状細胞腫、および脳神経膠星状細胞腫、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、クロイツフェルトヤコブ病、パーキンソン病（ＰＤ）、および突発性早期痴呆）、脳脊髄炎、大脳マラリア、髄膜炎、代謝性脳疾患（例えば、フェニルケトン症およびピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症）、小脳性運動失調、毛細血管拡張性運動失調、およびＡＩＤＳ痴呆合併症、精神分裂病、注意欠陥障害、過活動注意欠陥障害、自閉症、および強迫性障害、からなる群より選択される疾患および／または障害を、例えば診断、治療、予防および／または緩和するために使用しうる。
【００６３】
「好ましい適応症Ｙ」の欄における「呼吸器」という記載は、治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体を含む融合タンパク質を、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、および／または呼吸系の疾患もしくは障害（例えば、以下の「呼吸器疾患」に記載のもの）の、例えば診断、治療、予防および／または緩和に使用しうることを示す。
【００６４】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「呼吸器」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、呼吸系の癌（例えば、喉頭癌、咽頭癌、気管癌、喉頭蓋癌、肺癌、扁平上皮癌、小細胞（燕麦細胞）癌、大細胞癌、および腺癌）、アレルギー反応、嚢胞性線維症、サルコイドーシス、原因不明性組織球増殖症、浸潤性肺疾患（例えば、肺線維症およびリンパ球性間質性肺炎）、閉塞性気管疾患（例えば、喘息、気腫、慢性もしくは急性気管支炎）、職業性肺疾患（例えば、珪肺症および石綿肺症）、肺炎、ならびに胸膜炎、からなる群より選択される疾患および／または障害を、例えば診断、治療、予防および／または緩和するために使用しうる。
【００６５】
「好ましい適応症Ｙ」の欄における「内分泌系」という記載は、治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体を含む融合タンパク質を、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、呼吸系の疾患または障害（例えば、以下の「呼吸器疾患」に記載されるもの）、腎疾患（例えば、以下の「腎疾患」に記載されるもの）、および／または内分泌系障害（例えば、以下の「内分泌系疾患」に記載されるもの）の、例えば診断、治療、予防および／または緩和に使用しうることを示す。
【００６６】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「内分泌系」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、内分泌組織および／または器官の癌（例えば、視床下部、下垂体腺、甲状腺、副甲状腺、膵臓、副腎腺、卵巣、および精巣の癌）、糖尿病（例えば、尿崩症、Ｉ型およびＩＩ型真性糖尿病）、肥満、下垂体腺に関連する疾患（例えば、下垂体機能亢進、下垂体機能低下、および下垂体小人症）、甲状腺機能亢進、甲状腺機能低下、甲状腺腫、生殖系疾患（例えば男性および女性の不妊症）、副腎腺に関連する疾患（例えば、アジソン病、副腎性コルチコイド欠損症、およびクッシング症候群）、腎臓癌（例えば、副腎腫、移行上皮癌、およびウィルムス腫）、糖尿病性腎症、間質性腎炎、多発性嚢胞腎疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＭメサンギウム増殖性糸球体腎炎、および自己免疫疾患、例えばグッドパスチャー症候群などにより引き起こされる糸球体腎炎）、ならびに腎石灰症、からなる群より選択される疾患および／または障害を、例えば診断、治療、予防および／または緩和するために使用しうる。
【００６７】
「好ましい適応症Ｙ」の欄における「消化系」という記載は、治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体を含む融合タンパク質を、例えば、新生物疾患（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）および／または胃腸系の疾患もしくは障害（例えば、以下の「胃腸系疾患」に記載されるもの）に関連する疾患および／または障害の、例えば診断、治療、予防および／または緩和に使用しうることを示す。
【００６８】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「消化系」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、潰瘍性大腸炎、虫垂炎、クーロン病、肝炎、肝性脳障害、門脈高血圧、胆石症、消化系の癌（例えば、胆管癌、胃癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胆管の癌、大腸の癌（例えば、ポリープもしくは癌）、および肝硬変）、膵炎、潰瘍性疾患、幽門狭窄、胃腸炎、胃炎、胃萎縮症、十二指腸の良性腫瘍、拡張、腸過敏症、吸収不良、小腸の先天性疾患、細菌および寄生虫の感染症、巨大結腸、ヒルシュスプルング病、神経節細胞欠損性巨大結腸、後天性巨大結腸、大腸炎、肛門直腸疾患（例えば、肛門フィステル、痔）、肝臓の先天性疾患（例えば、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、嚢胞性線維症、胆道閉鎖症、およびα１アンチトリプシン欠損症）、門脈高血圧、胆石症、および黄疸、からなる群より選択される疾患および／または障害を、例えば診断、治療、予防および／または緩和するために使用しうる。
【００６９】
「好ましい適応症Ｙ」の欄における「結合／上皮性」という記載は、治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体を含む融合タンパク質を、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、細胞および／もしくは遺伝子の異常（例えば、以下の「細胞レベルにおける疾患」に記載されるもの）、血管新生（例えば、以下の「抗血管形成活性」に記載されるもの）の例えば診断、治療、予防および／または緩和、ならびに／あるいは、再生（例えば、以下の「再生」に記載されるもの）、および／または創傷治癒（例えば、以下の「創傷治癒および上皮細胞増殖」に記載されるもの）の促進または抑制、に使用しうることを示す。
【００７０】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「結合／上皮性」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、結合組織メタプラシア、混合結合組織疾患、局所性上皮肥厚、上皮メタプラシア、粘膜上皮形成異常、移植片対宿主病、多発性筋炎、嚢胞性増殖症、終脳形成異常、組織肥大、アルツハイマー病、リンパ増殖障害、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、クーロン病、悪性貧血、突発性アジソン病、糸球体腎炎、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、真性糖尿病、嚢胞性線維症、骨芽細胞腫、破骨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周疾患、創傷治癒、再発性多発性軟骨炎、脈管炎、結節性多発性動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、小胞炎、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎、円板状紅斑性狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、ＣＲＥＳＴ症候群、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、混合結合組織疾患、再発性多発性軟骨炎、脈管炎、ヘーノホ−シェーンライン症候群、結節性紅斑、結節性多発性動脈炎、側頭（巨大細胞）動脈炎、高安動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、ライター症候、ベーチェット症候群、強直性脊椎炎、小胞炎、ケロイド、エーレルス−ダンロー症候群、マルファン症候群、弾性線維性仮性黄色腫、骨形成不完全症、軟骨形成不全、表皮水疱症、アルポート症候群、ならびに弛緩性皮膚、からなる群より選択される疾患および／または障害を、例えば診断、治療、予防および／または緩和するために使用しうる。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
好ましい実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質は表１の対応する行に示されているアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質の治療活性および／もしくは生物活性に対応する治療活性および／もしくは生物活性を示すことができる。さらに好ましい実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療上活性なタンパク質部分は、表１の「代表的識別番号」の列中に引用している参照配列の断片もしくは変異体であり、対応している治療用タンパク質の治療活性および／もしくは生物活性を示すことができる。
【００７３】
ポリペプチドおよびポリヌクレオチド断片ならびに変異体
断片：
本発明はさらに、表１に示した治療用タンパク質、アルブミンタンパク質、および／もしくは本発明のアルブミン融合タンパク質の断片に向けられたものである。
【００７４】
あるタンパク質のＮ末端から１個以上のアミノ酸が欠失し、その結果その治療用タンパク質、アルブミンタンパク質、および／もしくはアルブミン融合タンパク質の１種以上の生物学的機能が改変もしくは失われたとしても、その他の治療活性および／もしくは機能的活性（例えば、生物活性、多量体化能、リガンド結合能）を保持したままのものとすることができる。例えば、Ｎ末端に欠失のあるポリペプチドの抗体（それはそのポリペプチドの完全なもしくは成熟形態のものを認識する）を誘導するおよび／もしくは結合する能力は通常は、Ｎ末端から完全なポリペプチドの残基の大多数ではない数の残基を除去した場合には保持されるだろう。完全なポリペプチドのＮ末端の残基を欠いているある特定のポリペプチドがそのような免疫活性を保持しているか否かは本明細書に記載した日常的な方法および当業界で公知のその他の方法によって容易に測定することができる。Ｎ末端のアミノ酸残基の多数が欠失した突然変異タンパク質が何らかの生物もしくは免疫活性を保持しうるということはあり得ないことではない。実際に、たった６個のアミノ酸残基からなるペプチドが免疫応答を引き起こしうることが多い。
【００７５】
従って、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質断片には、その全長タンパク質ならびに参照ポリペプチド（すなわち、表１に開示しているような治療用タンパク質）のアミノ酸配列のアミノ末端から１個以上の残基が欠失しているポリペプチドが含まれる。特に、Ｎ末端の欠失は一般式ｍ−ｑで示すことができ、ここでｑは参照ポリペプチド（例えば、表１で参照される治療用タンパク質）中のアミノ酸残基の総数を示す整数値であり、ｍは２からｑ−６の範囲の任意の整数と定義される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【００７６】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応する血清アルブミンポリペプチドの断片には、その全長タンパク質ならびに参照ポリペプチド（すなわち血清アルブミン）のアミノ酸配列のアミノ末端から１個以上の残基が欠失しているポリペプチドが含まれる。特に、Ｎ末端の欠失は一般式ｍ−５８５で示すことができ、ここで５８５は血清アルブミン（配列番号１８）のアミノ酸残基の総数を示す整数であり、ｍは２から５７９の範囲の任意の整数と定義される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【００７７】
その上、本発明のアルブミン融合タンパク質の断片には、その全長アルブミン融合タンパク質ならびにそのアルブミン融合タンパク質のアミノ末端から１個以上の残基が欠失しているポリペプチドが含まれる。特に、Ｎ末端の欠失は一般式ｍ−ｑで示すことができ、ここでｑはそのアルブミン融合タンパク質のアミノ酸残基の総数を示す整数であり、ｍは２からｑ−６の範囲の任意の整数と定義される。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【００７８】
また、上述のとおり、参照ポリペプチド（例えば治療用タンパク質および／もしくは血清アルブミンタンパク質）のＮ末端もしくはＣ末端から１個以上のアミノ酸を欠失させたことによってそのタンパク質の１種以上の生物学的機能の改変もしくは失われたとしても、その他の機能的活性（例えば生物活性、多量体化能、リガンド結合能）および／もしくは治療活性は保持されたままでありうる。例えば、Ｃ末端に欠失のあるポリペプチドの抗体（それはそのポリペプチドの完全なもしくは成熟形態を認識する）を誘導するおよび／もしくは結合する能力は、通常は、Ｃ末端から完全なもしくは成熟なポリペプチドの残基の大多数ではない数の残基を除去した場合には保持されるだろう。参照ポリペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端の残基を欠いているある特定のポリペプチドが治療活性を保持しているか否かは本明細書に記載した日常的な方法および当業界で公知のその他の方法によって容易に測定することができる。
【００７９】
本発明はさらに、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質（例えば、表１で参照される治療用タンパク質）のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１個以上の残基が欠失しているポリペプチドを提供する。特に、Ｃ末端の欠失は一般式１−ｎで示すことができ、ここでｎは６からｑ−１の範囲の任意の整数であり、ここでｑは参照ポリペプチド（例えば、表１で参照される治療用タンパク質）中のアミノ酸残基の総数を示す整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【００８０】
さらに、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質（例えば、血清アルブミン）のアミノ酸配列のカルボキシ末端から１個以上の残基が欠失しているポリペプチドを提供する。特に、Ｃ末端の欠失は一般式１−ｎで示すことができ、ここでｎは６〜５８４の範囲の任意の整数であり、ここで５８４は血清アルブミン（配列番号１８）のアミノ酸残基の総数を示す整数から１を引いたものである。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【００８１】
さらに本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質のカルボキシ末端から１個以上の残基が欠失しているポリペプチドを提供する。特に、Ｃ末端の欠失は一般式１−ｎで示すことができ、ここでｎは６からｑ−１の範囲の任意の整数であり、ここでｑは本発明のアルブミン融合タンパク質中のアミノ酸残基の総数を示す整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【００８２】
さらに、上述のＮ末端もしくはＣ末端欠失のいずれかを組み合わせてＮ末端およびＣ末端欠失参照ポリペプチドを産生することができる。本発明はまた、アミノ末端およびカルボキシル末端の双方から１個以上のアミノ酸を欠失させたポリペプチドをも提供し、それは参照ポリペプチド（例えば、表１で参照される治療用タンパク質、もしくは血清アルブミン（例えば、配列番号１８）、または本発明のアルブミン融合タンパク質）の一般にｍ−ｎ個の残基を有するものとして示すことができ、ここでｎおよびｍは上述の整数である。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【００８３】
本出願はまた、本明細書に記載の参照ポリペプチド配列（例えば、治療用タンパク質、血清アルブミンタンパク質、もしくは本発明のアルブミン融合タンパク質）またはその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のポリペプチドを含んでいるタンパク質に向けられる。好ましい実施形態においては、本出願は、Ｎ末端およびＣ末端に上述のとおり欠失のあるアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるポリペプチドを含んでなるタンパク質に向けられる。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【００８４】
本発明の好ましいポリペプチド断片は、そのアミノ酸配列が断片である治療用タンパク質もしくは血清アルブミンタンパク質のポリペプチド配列の治療活性および／もしくは機能的活性（例えば、生物活性）を示すアミノ酸配列を含んでなる、あるいはそのアミノ酸配列からなる断片である。
【００８５】
他の好ましいポリペプチド断片とは、生物学的に活性な断片である。生物学的に活性な断片とは、本発明のポリペプチドの活性と同一である必要はないが類似の活性を示すものである。断片の生物活性は所望の活性の改良されたもの、もしくは望ましくない活性を低減させたものを含むことができる。
【００８６】
変異体：
「変異体」とは参照核酸もしくはポリペプチドとは異なるポリヌクレオチドもしくは核酸であるが、その本質的な特性は保持しているものを意味する。通常は、変異体は全体としてその参照核酸もしくはポリペプチドに対して非常に類似していて、多くの領域において同一である。
【００８７】
本明細書で用いている「変異体」とは、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分、もしくはアルブミン融合タンパク質であって、それぞれ治療用タンパク質（例えば、表１の「治療用」の列を参照されたい）、アルブミンタンパク質、および／もしくは本発明のアルブミン融合タンパク質とは配列が異なっているが、本明細書の他の箇所に述べられているかもしくは当業界で知られているようなそれらの少なくとも１種の機能的および／もしくは治療的特性は保持しているものを意味する。通常は、変異体は全体として、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質、および／もしくは本発明のアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列と非常に類似しており、多くの領域においては同一である。これらの変異体をコードする核酸も本発明によって包含される。
【００８８】
本発明はまた、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質のアミノ酸配列（例えば、表１の「代表的識別番号」の列中に開示されているアミノ酸配列、またはそれの断片もしくは変異体）、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質のアミノ酸配列（例えば、配列番号１８またはそれの断片もしくは変異体）、ならびに／または本発明のアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一なアミノ酸配列を含んでなる、もしくはそのアミノ酸配列から成るタンパク質に向けられる。これらのポリペプチドの断片も提供される（例えば、本明細書に記載の断片）。本発明によって包含されるポリペプチドとしてはさらに、本発明のアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドがあり、そのハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、６Ｘ 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルターに結合させたＤＮＡと４５℃でハイブリダイズさせ、その後０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ中で約５０〜６５℃で１回以上洗浄する）、高度にストリンジェントな条件下（例えば、６Ｘ 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でフィルターに結合させたＤＮＡと４５℃でハイブリダイズさせ、その後０．１Ｘ ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ中で約６８℃で１回以上洗浄する）、またはその他の当業者には公知のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ．Ｍ．ら編， １９８９ 「分子生物学の今日のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」， Ｇｒｅｅｎ ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， Ｉｎｃ．，およびＪｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ６．３．１−６．３．６およびｐ２．１０．３を参照せよ）で行われる。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明によって包含される。
【００８９】
本発明のクエリー（ｑｕｅｒｙ）アミノ酸配列に対して例えば少なくとも９５％「同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドによって、対象とするポリペプチドのアミノ酸配列が、その対象ポリペプチド配列がクエリーアミノ酸配列の各アミノ酸１００個あたり５個までの変更を含みうることを除いてはそのクエリー配列と同一であることを意図している。言い換えれば、クエリーアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象の配列のアミノ酸残基の５％までを挿入、欠失、または別のアミノ酸と置換することができる。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノ末端もしくはカルボキシ末端の位置で生じることができ、またはこれら２つの末端の間のどこでも、参照配列内の残基の中でに個々に散在するか、もしくはその参照配列内の１つ以上の連続した群で散在することができる。
【００９０】
実際的な問題として、任意の特定のポリペプチドが、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列もしくはその断片（例えば該アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分もしくは該アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分）と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一か否かは、既知のコンピュータープログラムを用いて慣例的に決定することができる。クエリー配列（本発明の１配列）と対象配列との間の全体として最も良好なマッチを決定するための好ましい方法は、グローバルシークエンスアラインメントとも呼ばれ、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ． ６：２３７−２４５ （１９９０））のアルゴリズムに基づいてＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて決定することができる。配列アラインメントにおいてクエリー配列と対象配列は双方ともヌクレオチド配列であるかもしくは双方ともアミノ酸配列である。前記グローバルシークエンスアラインメントの結果は同一性パーセントで表される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで用いられる好ましいパラメーターは以下の通りである：マトリックス（Ｍａｔｒｉｘ）＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティー（Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝１、ジョイニングペナルティー（Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝２０、ランダム化グループ長（Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ）＝０、カットオフスコア（Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ）＝１、ウインドウサイズ（Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ）＝配列の長さ、ギャップペナルティー（Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝５、ギャップサイズペナルティー（Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ）＝０．０５、ウインドウサイズ＝５００もしくは対象アミノ酸配列の長さのうちの短い方。
【００９１】
対照配列がＮ末端もしくはＣ末端の欠失のために（内部での欠失のためではなく）クエリー配列よりも短い場合には、結果に手動で補正を行わなければならない。これはＦＡＳＴＤＢプログラムが全体的な同一性パーセントを計算する際に対象配列のＮ末端およびＣ末端の末端切断を考慮しないためである。クエリー配列と比較したＮ末端およびＣ末端で末端切断されている対象配列については、同一性パーセントは、対象配列のＮ末端およびＣ末端であるクエリー配列の残基数であって対応する対象残基とマッチ／アラインメントしないものの数をクエリー配列の全塩基のパーセントとして計算することによって補正する。ある残基がマッチ／アラインメントしているか否かはＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって決定される。次いでこのパーセンテージを、上述のＦＡＳＴＤＢプログラムで特定のパラメーターを用いて計算した同一性パーセントから差し引いて最終的な同一性パーセントスコアが求められる。この最終的同一性パーセントスコアが本発明の目的で用いるものである。、クエリー配列とマッチ／アラインメントしない対象配列のＮ末端およびＣ末端に対する残基が、同一性パーセントスコアの手動による調整のために考慮される。すなわち、対象配列のＮ末端およびＣ末端残基の最も遠い位置にあるものの外側にあるクエリー残基の位置のみである。
【００９２】
例えば、９０アミノ酸残基の対象配列を１００残基のクエリー配列とアラインメントさせて同一性パーセントを決定する。対象配列のＮ末端に欠失が生じており、従ってＦＡＳＴＤＢアラインメントはＮ末端の最初の１０残基のマッチング／アラインメントを示さない。１０個の対をなさない残基は配列の１０％を占めることとなり（マッチしなかったＮ末端およびＣ末端の残基数／クエリー配列の残基の総数）、この１０％はＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算された同一性パーセントスコアから差し引かれる。もし残りの９０％の残基が完全にマッチしているとすれば最終的な同一性パーセントは９０％となろう。別の例では、９０残基の対象配列を１００残基のクエリー配列と比較する。今回は欠失は内部的欠失であり、クエリーとマッチ／アラインメントしないような対象配列のＮ末端およびＣ末端の残基はない。この場合には、ＦＡＳＴＤＢによって計算された同一性パーセントを手動で補正はしない。再度述べれば、ＦＡＳＴＤＢアラインメントで示された対象配列のＮ末端およびＣ末端の最後の残基の外側に位置する残基で、クエリー配列とマッチ／アラインメントしないもののみについて手動による補正を行う。本発明の目的のためにはその他の手動による補正は行うべきでない。
【００９３】
変異体は、その変異体と同じ長さである正常なＨＡもしくは治療用タンパク質と通常は少なくとも７５％（好ましくは少なくとも約８０％、９０％、９５％、もしくは９９％）の配列同一性を有するだろう。ヌクレオチド配列レベルもしくはアミノ酸配列レベルでの相同性もしくは同一性は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘプログラムで行われるアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）分析で決定され（Ｋａｒｌｉｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：２２６４−２２６８（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３６：２９０−３００（１９９３）、これらは参照により完全に組み入れる）、これらは配列類似性検索に適するように作られたものである。
【００９４】
ＢＬＡＳＴプログラムに用いられている手法は、最初にクエリー配列とデータベース配列間の類似のセグメントを考慮し、次いで同定された全てのマッチの統計学的有意性を評価し、最後にあらかじめ選択した有意性の閾値を満足するマッチのみを要約するものである。配列データベースの類似性検索の基本的事項の考察に関しては、Ａｌｔｓｃｈｕｌらの論文 （Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：１１９−１２９（１９９４）、これは参照により完全に組み入れる）を参照せよ。ヒストグラム、説明（ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）、アラインメント、期待（ｅｘｐｅｃｔ）（すなわち、データベース配列に対するマッチを報告するための統計学的有意性の閾値）、カットオフ、マトリックス、およびフィルターのための検索パラメーターはデフォルトの設定としている。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘで用いられるデフォルトスコアリングマトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）、これは参照により完全に組み入れる）。ｂｌａｓｔｎについては、スコアリングマトリックスはＭ（すなわち、マッチしている残基のペアについての報酬（ｒｅｗａｒｄ）スコア）対Ｎ（すなわち、ミスマッチの残基についてのペナルティースコア）の比率をによって設定され、そこではＭとＮのデフォルト値はそれぞれ５と−４である。４つのｂｌａｓｔｎパラメーターは次のとおり調整することができる：Ｑ＝１０（ギャップクリエーションペナルティー）；Ｒ＝１０（ギャップエクステンションペナルティー）；ｗｉｎｋ＝１（クエリーに沿ってｗｉｎｋｔｈの各位置毎にワードヒット（ｗｏｒｄ ｈｉｔ）を作製する）；およびｇａｐｗ＝１６（ウインドウ（ｗｉｎｄｏｗ）幅を設定しその中にギャップ化されたアラインメントを作製する）。等価なＢｌａｓｔｐパラメーターの設定はＱ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；およびｇａｐｗ＝３２であった。ＧＣＧパッケージバージョン１０．０において利用可能な配列間のベストフィット比較は、ＤＮＡパラメーターＧＡＰ＝５０（ギャップクリエーションペナルティー）およびＬＥＮ＝３（ギャップエクステンションペナルティー）を用いており、タンパク質の比較における等価な設定はＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
【００９５】
本発明のポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、もしくはその双方に変更を含むものとすることができる。特に好ましいものは、サイレントな置換、付加、もしくは欠失を産生するがコードされるポリペプチドの特性もしくは活性は変えないような変更を含んだポリヌクレオチド変異体である。遺伝コードの縮重によるサイレントな置換によって産生されるヌクレオチド変異体が好ましい。さらに、ポリペプチド変異体であって、５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１０未満、もしくは５〜５０、５〜２５、５〜１０、１〜５、もしくは１〜２個のアミノ酸がどのような組み合わせでも置換、欠失、もしくは付加されているポリペプチド変異体も好ましい。ポリヌクレオチド変異体は様々な理由、例えば、ある特定の宿主でのコドンの発現を最適化するために（ヒトｍＲＮＡ中のコドンを酵母または大腸菌などの細菌宿主に好ましいものへと変更する）、産生することができる。
【００９６】
好ましい実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分をコードするポリヌクレオチドは酵母もしくは哺乳類細胞中での発現のために最適化される。さらに好ましい実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは酵母もしくは哺乳類細胞中での発現のために最適化される。またさらに好ましい実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、酵母もしくは哺乳類細胞中での発現のために最適化される。
【００９７】
また別の実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチドは、本明細書に記載のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、その治療用タンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドとはハイブリダイズしない。さらなる実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチドは、本明細書に記載のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、そのアルブミンタンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチドとはハイブリダイズしない。別の実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするコドンを最適化したポリヌクレオチドは、本明細書に記載のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下では、その治療用タンパク質部分もしくはアルブミンタンパク質部分をコードする野生型ポリヌクレオチドとはハイブリダイズしない。
【００９８】
さらなる実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分をコードするポリヌクレオチドは、該治療用タンパク質の天然の配列を含んでなるものでも、またはあるいはその配列から成るものでもない。さらなる実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分をコードするポリヌクレオチドはアルブミンタンパク質の天然の配列を含んでなるものでも、またはあるいはその配列から成るものでもない。別の実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、治療用タンパク質部分もしくはアルブミンタンパク質部分の天然の配列を含んでなるものでも、またはあるいはその配列から成るものでもない。
【００９９】
天然の変異体は「対立遺伝子変異体」と呼ばれ、それはある生物体の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子のいくつかの取りうる形態のうちの１つであることを意味している。（Ｇｅｎｅｓ ＩＩ， Ｌｅｗｉｎ， Ｂ．編， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５））。これらの対立遺伝子変異体はポリヌクレオチドレベルおよび／もしくはポリペプチドレベルで異なることができ、本発明に含まれる。あるいは、非天然の変異体を突然変異誘発法、もしくは直接的合成法によって産生することができる。
【０１００】
タンパク質工学および組換えＤＮＡ技術の既知の方法を用いて本発明のポリペプチドの特徴を改善もしくは変更させるために変異体を作製することができる。例えば、生物学的機能の実質的な損失を伴うことなく本発明のポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端から１個以上のアミノ酸を欠失させることができる。例として、Ｒｏｎら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：２９８４−２９８８（１９９３））は、変異体のＫＧＦタンパク質ではアミノ末端のアミノ酸残基を３個、８個、または２７個を欠失させてもヘパリン結合活性を有していたと報告した。同様に、インターフェロンγでは、このタンパク質のカルボキシ末端から８〜１０個のアミノ酸残基を欠失させると活性が１０倍まで高くなることが示された（Ｄｏｂｅｌｉら， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：１９９−２１６（１９８８））。
【０１０１】
さらに、変異体がそれの天然のタンパク質の生物活性と類似の活性を維持していることが多いことは多数の証拠によって示されている。例えば、Ｇａｙｌｅと共同研究者ら（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６８：２２１０５−２２１１１（１９９３））はヒトサイトカインＩＬ−１ａの詳細にわたる突然変異分析を行った。彼らはランダムな突然変異誘発を用いて３，５００種を超える個々のＩＬ−１ａ突然変異体を作製し、それらはその分子の全長にわたって変異体当たり平均２．５個のアミノ酸の変化のあるものであった。起こりうる各アミノ酸の位置について複数の突然変異が調べられた。研究者は「この分子の大部分は「結合活性もしくは生物活性」にほとんど影響を与えることなく変化させうる」ことを見出した。実際、３，５００を超えるヌクレオチド配列を調べ、そのうち２３個のユニークなアミノ酸配列のみが、野生型の活性とは著しく異なるタンパク質を生じた。
【０１０２】
さらに、あるポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端から１個以上のアミノ酸を欠失させることが１種以上の生物学的機能の改変もしくは損失をもたらしたとしても、その他の生物活性が保持されたままでありうる。例えば、欠失変異体の、その分泌形態を認識する抗体を誘導および／もしくはそれと結合する能力は、Ｎ末端もしくはＣ末端からその分泌形態の大多数ではない残基を除去しても保持されることは起こりうる。あるタンパク質のＮ末端もしくはＣ末端の残基を欠いている特定のポリペプチドがそのような免疫原性活性を保持しているか否かは、本明細書中に記載の日常的な方法および当業界で公知のその他の方法によって容易に決定することができる。
【０１０３】
従って、本発明はさらに、機能的活性（例えば、生物活性および／もしくは治療活性）を有するポリペプチド変異体を含んでいる。非常に好ましい実施形態においては、本発明は、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質の１種以上の生物活性および／もしくは治療活性に対応する機能的活性（例えば、生物活性および／もしくは治療活性）を有するアルブミン融合タンパク質の変異体を提供する。そのような変異体は、活性にほとんど影響を及ぼさないように当業界で公知の一般的な規則に従って選択された、欠失、挿入、反転、反復、および置換を含んでいる。
【０１０４】
好ましい実施形態においては、本発明の変異体は保存的置換を有する。「保存的置換」とは、脂肪族もしくは疎水性アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの置換；塩基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換などの群内での交換を意図するものである。
【０１０５】
表現型としてサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関するガイダンスは、例えば、Ｂｏｗｉｅら「タンパク質配列におけるメッセージの解読：アミノ酸置換に対する寛容性（Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｅｓｓａｇｅ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ）」， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供されており、その論文で著者らはアミノ酸配列を変化させることによる寛容性を研究するためには２つの主なストラテジーがあることを示している。
【０１０６】
第１のストラテジーは進化の過程での自然選択によるアミノ酸置換の寛容性を利用するものである。様々な種のアミノ酸配列を比較することによって、保存されているアミノ酸を同定することができる。これらの保存されているアミノ酸はそのタンパク質の機能にとっておそらく重要なものである。これに対して、自然選択で置換が寛容されるアミノ酸の位置は、それらの位置がそのタンパク質の機能にとって決定的に重要なものではないことを示している。従って、アミノ酸置換に寛容な位置は、そのタンパク質の生物活性を維持しつつ改変することができよう。
【０１０７】
第２のストラテジーは、遺伝子工学を用いてクローン化された遺伝子の特定の位置にアミノ酸の変化を導入してタンパク質の機能に決定的に重要な領域を同定するものである。例えば、部位特異的突然変異誘発もしくはアラニンスキャンニング突然変異誘発（その分子の全残基において単一のアラニン突然変異を導入する）を用いることができる。ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍとＷｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−１０８５（１９８９）を参照せよ。次いで、得られた突然変異分子を生物活性について試験することができる。
【０１０８】
著者らが述べているとおり、これらの２つのストラテジーは、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど寛容であることを明らかにした。著者らはさらに、タンパク質の特定のアミノ酸の位置でどのアミノ酸の変化が許容しうるものとなりうるかということを示している。例えば、最も埋め込まれた（そのタンパク質の３次構造内で）アミノ酸残基は非極性の側鎖を必要とするが、一方、表面の側鎖の特徴は通常ほとんど保存されない。その上、寛容な保存的アミノ酸置換には、脂肪族もしくは疎水性アミノ酸であるＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの置換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの置換；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの置換；塩基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの置換；芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの置換、ならびに小さなサイズのアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの置換が含まれる。保存的アミノ酸置換に加えて、本発明の変異体には、（ｉ）１つ以上の非保存的アミノ酸残基の置換を含んでいるポリペプチドであって、その置換されたアミノ酸残基は遺伝コードによってコードされたものである可能性もそうでない可能性もあるもの、または（ｉｉ）置換基を有する１つ以上のアミノ酸残基の置換を含んでいるポリペプチド、または（ｉｉｉ）別の化合物と融合させた、もしくは化学的にコンジュゲートさせたポリペプチドであって、その化合物はそのポリペプチドの安定性および／もしくは溶解性を増大させる化合物など（例えば、ポリエチレングリコール）であるもの、（ｉｖ）例えばＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドなどの、付加的アミノ酸を含んでいるポリペプチドが含まれる。そのような変異体ポリペプチドは、本明細書の教示から当業者の範囲内であると考えられる。
【０１０９】
例えば、電荷を有するアミノ酸と他の電荷を有するもしくは中性のアミノ酸とのアミノ酸置換を含んでいるポリペプチド変異体は、より凝集の少ないものなどの特性を改良したタンパク質を産生することができる。医薬製剤の凝集は活性の低下および凝集物の免疫原性活性によるクリアランスの増大の双方をもたらす。Ｐｉｎｃｋａｒｄら， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：３３１−３４０（１９６７）；Ｒｏｂｂｉｎｓら， Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−８４５（１９８７）；Ｃｌｅｌａｎｄら， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ １０：３０７−３７７（１９９３）を参照せよ。
【０１１０】
特定の実施形態においては、本発明のポリペプチドは、本明細書に記載の治療用タンパク質、および／もしくはヒト血清アルブミン、および／もしくは本発明のアルブミン融合タンパク質のアミノ酸配列の断片もしくは変異体を含んでなるものであるか、またはあるいはそれらから成るものであり、その断片もしくは変異体は参照アミノ酸配列と比較すると、１〜５、５〜１０、５〜２５、５〜５０、１０〜５０、もしくは５０〜１５０個のアミノ酸残基の付加、置換、および／もしくは欠失を有している。好ましい実施形態においては、そのアミノ酸置換は保存的である。これらのポリペプチドをコードする核酸も本発明によって包含される。
【０１１１】
本発明のポリペプチドはペプチド結合もしくは改変されたペプチド結合によってお互いが連結されたアミノ酸からなるもの、すなわちペプチド同配体から成ることができ、遺伝子によってコードされる２０種類のアミノ酸以外のアミノ酸を含むことができる。そのポリペプチドは、天然のプロセス、例えば翻訳後プロセシングなどによって、もしくは当業界で周知の化学的改変技法によって改変することができる。そのような改変については基礎的な教科書およびより詳細なモノグラフに、ならびにおびただしい量の研究論文に十分述べられている。改変はポリペプチドのどこの位置でも生じさせることができ、その位置には、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシル末端が含まれる。所定のポリペプチド中のいくつかの部位に同程度もしくは種々の程度で同じタイプの改変が存在しうることは理解されよう。また、所定のポリペプチドが多くのタイプの改変を含むこともできる。ポリペプチドは、たとえばユビキチン化の結果として分枝したものとすることができ、また、分岐を有するもしくは有さない環状のものとすることができる。環状、分枝、および分枝のある環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセスの結果もたらされるか、もしくは合成法で作製することができる。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合による付加、ヘム部分の共有結合による付加、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合による付加、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合による付加、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合による付加、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合性の架橋の形成、システインの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ポリエチレングリコール修飾（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化（ｓｅｌｅｎｏｙｌａｔｉｏｎ）、硫酸化、アルギニル化などの転移ＲＮＡが介在するタンパク質へのアミノ酸の付加、およびユビキチン化が含まれる。（例えば、「タンパク質−構造と分子的性質（ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ）」，第２版， Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ編， Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；「タンパク質の翻訳後の共有結合性の改変（ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ）」， Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．１−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら， Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２（１９９２）を参照せよ）。
【０１１２】
機能的活性
「機能的活性を有するポリペプチド」とは、ある治療用タンパク質の全長のもの、プロタンパク質、および／もしくは成熟形態のものに伴う１種以上の既知の機能的活性を示すことのできるポリペプチドを意味する。そのような機能的活性としては、限定はされないが、生物活性、抗原性（抗ポリペプチド抗体と結合する（もしくはあるポリペプチドが結合することと競合する）能力）、免疫原性（本発明の特定のポリペプチドと結合する抗体を作製する能力）、本発明のポリペプチドと多量体を形成する能力、およびあるポリペプチドの受容体もしくはリガンドと結合する能力が含まれる。
【０１１３】
「生物活性を有するポリペプチド」とは、本発明の治療用タンパク質の活性と類似の、それは必ずしも同一である必要はないが、そのような活性を示す、成熟形態のものを含むポリペプチドを意味し、その活性は特定の生物学的アッセイで測定されるもので、用量依存性であってもそうでなくてもよい。用量依存性がある場合には、それは該ポリペプチドの用量依存性と同一である必要はなく、本発明のポリペプチドと比較したときに所定の活性において実質的に類似の用量依存性であればよい（すなわち、該候補ポリペプチドは本発明のポリペプチドと比較してより強い活性を示すか、または、せいぜい約２５分の１、好ましくはせいぜい約１０分の１、最も好ましくはせいぜい約３分の１の活性を示すこととなろう）。
【０１１４】
好ましい実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質は治療用タンパク質（またはその断片もしくは変異体）がアルブミンと融合していない場合にその治療用タンパク質に伴う生物活性および／もしくは治療活性の少なくとも１つを有するものである。
【０１１５】
本発明のアルブミン融合タンパク質はその機能的活性（例えば生物活性）について、当業界では公知のアッセイ法、ならびに本明細書に記載のアッセイ法を用いて、もしくは日常的に改変して用いてアッセイすることができる。さらに、当業者であれば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質の断片を、表１の対応する行で参照するアッセイを用いてその活性を日常的にアッセイすることができる。さらに、当業者であれば、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミンタンパク質部分に対応するアルブミンタンパク質の断片を、当業界では公知の、および／もしくは下記の実施例の節に記載したようなアッセイを用いてその活性を日常的にアッセイすることができる。
【０１１６】
例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の、抗治療用ポリペプチド抗体および／もしくは抗アルブミン抗体との結合の能力もしくは治療用タンパク質との競合能力をアッセイしようとする１実施形態においては、当業界では公知の種々のイムノアッセイを用いることができ、そのようなものとしては、限定はされないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫放射定量測定法、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕイムノアッセイ（例えば金コロイド、酵素、もしくは放射性同位元素標識を用いて）、ウエスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えば、ゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、および免疫電気泳動アッセイなどの技法を用いた競合的および非競合的アッセイ系が含まれる。１実施形態においては、抗体の結合は一次抗体上の標識を検出することによって検出される。別の実施形態においては、一次抗体は二次抗体の結合もしくは一次抗体に対する試薬を検出することによって検出される。さらなる実施形態においては、二次抗体は標識されている。イムノアッセイで結合を検出するためには多数の手段が当業界で知られており、それらは本発明の範囲内に含まれる。
【０１１７】
治療用タンパク質の結合パートナー（例えば、受容体もしくはリガンド）が同定されている好ましい実施形態においては、その結合のパートナーとの、その治療用タンパク質を融合体の治療用タンパク質部分として含んでいるアルブミン融合タンパク質による結合は、例えば還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、およびアフィニティーブロッティングなどの当業界で周知の手段でアッセイすることができる。総説として、Ｐｈｉｚｉｃｋｙら， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ５９：９４−１２３（１９９５）を参照せよ。別の実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質と生理学的に関連のあるものが、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用部分に対応する治療用ポリペプチドの基質と結合する能力は、当業界では公知の技法を用いて日常的にアッセイすることができる。
【０１１８】
本発明のアルブミン融合タンパク質の多量体化する能力を評価する別の実施形態においては、その多量体のその他の構成成分との会合を、例えば還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、およびアフィニティーブロッティングなどの当業界で周知の手段でアッセイすることができる。総説としては上述のＰｈｉｚｉｃｋｙらの文献を参照せよ。
【０１１９】
好ましい実施形態においては、治療用タンパク質と結合する抗体の全体もしくは部分を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質（またはそれの断片もしくは変異体）と、それがアルブミンと融合されていない場合には、結合する抗体に伴う生物活性および／もしくは治療活性（例えば、あるポリペプチドもしくはエピトープと特異的に結合する）を少なくとも１つ有する。他の好ましい実施形態においては、治療用タンパク質と結合する抗体の全体もしくは部分を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質の生物活性および／もしくは治療活性は、治療用タンパク質と結合する抗体によって特異的に結合するポリペプチドに伴う１種以上の生物活性および／もしくは治療活性の阻害（すなわちアンタゴニズム）もしくは活性化（すなわちアゴニズム）である。
【０１２０】
本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、治療用タンパク質と結合する、抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質）は種々の方法で特徴を調べることができる。とりわけ、治療用タンパク質と結合する、抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質は、そのアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質と結合する抗体によって特異的に結合する同じ抗原と特異的に結合する能力について、本明細書に記載の技法、もしくは当業界で公知の日常的に改変される技法を用いてアッセイすることができる。
【０１２１】
本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含んでなる）の特定のタンパク質もしくはエピトープと（特異的に）結合する能力のアッセイは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１（１９９２））、ビーズ上で（例えば、Ｌａｍ， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ上で（例えば、Ｆｏｄｏｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６（１９９３））、細菌で（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子で（例えば、米国特許第５，５７１，６９８号、第５，４０３，４８４号、および第５，２２３，４０９号）、プラスミド上で（例えば、Ｃｕｌｌら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９（１９９２））、もしくはファージ上で（例えば、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６（１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２（１９９０）；およびＦｅｌｉｃｉ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１−３１０（１９９１））実施することができる（これらの参照文献の各々は本明細書に参照によりその全体を組み入れる）。また治療用抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質は、ある特定のタンパク質もしくはエピトープについての特異性およびアフィニティーを、本明細書に記載のもしくは当業界で公知の技法を用いてもしくは日常的に改変してアッセイすることもできる。
【０１２２】
治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質は、他の抗原（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質（またはそれの断片もしくは変異体）に結合する抗体と特異的に結合する分子で保存されている配列／構造を有する分子）との交差反応性について当業界で公知のいずれの方法でもアッセイすることができる。
【０１２３】
（免疫特異的な）結合および交差反応性を分析するために用いることのできるイムノアッセイとしては、限定はされないが、いくつかを挙げれば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの技法を用いた競合的および非競合的アッセイ系が含まれる。そのようなアッセイは当業界では日常的に行われており、周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編， １９９４， 「分子生物学の今日のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，第１巻， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照すればよいが、これは本明細書に参照によりその全体を組み入れる）。代表的なイムノアッセイを下記に簡潔に説明する（しかし限定することは意図していない）。
【０１２４】
免疫沈降のプロトコールは通常は、細胞集団をタンパク質ホスファターゼおよび／もしくはプロテアーゼインヒビター（例えばＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補足したＲＩＰＡバッファー（１％ ＮＰ−４０もしくはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、１％ トラジロール）などの溶解バッファー中で溶解させ、その細胞溶解物に本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、治療用タンパク質と結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含んでなる）を添加し、一定時間（例えば１〜４時間）４０℃でインキュベートし、その細胞溶解物に例えば抗アルブミン抗体をカップリングさせたセファロースビーズを添加し、約１時間以上４０℃でインキュベートし、そのビーズを溶解バッファーで洗浄し、そのビーズをＳＤＳ／サンプルバッファー中に再懸濁することを含む。本発明のアルブミン融合タンパク質のある特定の抗原を免疫沈降させる能力は、例えばウエスタンブロット分析で評価することができる。当業者であればそのアルブミン融合タンパク質の抗原との結合を増加させ、バックグラウンドを減少させるように改変することのできるパラメーターに関して知識があるであろう（例えば、セファロースビーズを用いる細胞溶解物の前清浄化）。免疫沈降法のプロトコールについてのより詳細な論考は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編， １９９４， 「分子生物学の今日のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，第１巻， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの１０．１６．１．節を参照せよ。
【０１２５】
ウエスタンブロット分析は通常は、タンパク質サンプルを調製し、そのタンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じて、８％〜２０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で電気泳動し、そのタンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース、ＰＶＤＦ、もしくはナイロンなどの膜に転写し、その膜をブロッキング溶液（例えば、３％ ＢＳＡもしくは無脂乳を添加したＰＢＳ）でブロッキングし、膜を洗浄バッファー（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄し、その膜に本発明のアルブミン融合タンパク質（ブロッキングバッファーで希釈したもの）をアプライし、洗浄バッファーでその膜を洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈した酵素基質（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）または放射性分子（例えば、３２Ｐもしくは１２５Ｉ）にコンジュゲートさせた二次抗体（アルブミン融合タンパク質を認識するもの、例えば抗ヒト血清アルブミン抗体）をアプライし、その膜を洗浄バッファー中で洗浄し、抗原の存在を検出することを含んでなる。当業者であれば検出されるシグナルを増加させ、バックグラウンドノイズを減少させるように改変することのできるパラメーターに関して知識があるであろう。ウエスタンブロットのプロトコールについてのより詳細な論考は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編， １９９４， 「分子生物学の今日のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，第１巻， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの１０．８．１．節を参照せよ。
【０１２６】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製し、９６ウエルのマイクロタイタープレートのウエルをその抗原でコーティングし、ウエルに結合しなかった抗原を洗い流し、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物とコンジュゲートさせた本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば治療用タンパク質と結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含んでなる）をウエルに添加し、一定時間インキュベートし、結合しなかった、もしくは非特異的に結合したアルブミン融合タンパク質を洗い流し、ウエルにコーティングされた抗原と特異的に結合したアルブミン融合タンパク質の存在を検出することを含んでなる。ＥＬＩＳＡではアルブミン融合タンパク質は検出可能な化合物とコンジュゲートさせる必要はない；その替わりに、検出可能な化合物にコンジュゲートさせた二次抗体（この抗体がアルブミン融合タンパク質を認識する）をウエルに添加することができる。さらに、ウエルを抗原でコーティングする替わりにアルブミン融合タンパク質をウエルにコーティングすることができる。この場合には、検出可能な分子は酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼもしくはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物にコンジュゲートさせた抗原としうる。当業者であれば検出されるシグナルを増加させるように改変することのできるパラメーター、ならびに当業界では公知のその他のＥＬＩＳＡのバリエーションに関して知識があるであろう。ＥＬＩＳＡについてのより詳細な論考は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編， １９９４， 「分子生物学の今日のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」，第１巻， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋの１１．２．１．節を参照せよ。
【０１２７】
アルブミン融合タンパク質のタンパク質、抗原、もしくはエピトープに対する結合アフィニティー、ならびにアルブミン融合タンパク質−タンパク質／抗原／エピトープ相互作用の解離速度は競合的結合アッセイによって測定することができる。競合的結合アッセイの１例はラジオイムノアッセイであり、それは標識抗原（例えば、３Ｈもしくは１２５Ｉ）と本発明のアルブミン融合タンパク質とを非標識抗原の増大した量の存在下でインキュベーションし、標識抗原に結合した抗体を検出することを含んでなるものである。本発明のアルブミン融合タンパク質の特定のタンパク質、抗原、もしくはエピトープに対するアフィニティー、および結合の解離速度は、Ｓｃａｔｃｈａｒｄプロット分析によるデータから決定することができる。アルブミン融合タンパク質と同じタンパク質、抗原、もしくはエピトープと結合する二次タンパク質との競合も、ラジオイムノアッセイを用いて測定することができる。この場合には、そのタンパク質、抗原、もしくはエピトープを、標識化合物（例えば、３Ｈもしくは１２５Ｉ）にコンジュゲートさせた本発明のアルブミン融合タンパク質と、本発明のアルブミン融合タンパク質と同じタンパク質、抗原、もしくはエピトープと結合する非標識二次タンパク質の増大した量の存在下でインキュベートする。
【０１２８】
好ましい実施形態においては、ＢＩＡｃｏｒｅ反応速度論分析が本発明のアルブミン融合タンパク質のタンパク質、抗原、もしくはエピトープへの結合の結合速度および解離速度を測定するために用いられる。ＢＩＡｃｏｒｅ反応速度論分析は、固定化特異的ポリペプチド、抗原、もしくはエピトープ、またはアルブミン融合タンパク質をそれぞれその表面に有するチップからのアルブミン融合タンパク質、特異的ポリペプチド、抗原、もしくはエピトープの結合および解離を分析することを含んでなるものである。
【０１２９】
また本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質と結合する抗体は、それらの所定のタンパク質もしくは抗原、好ましくはそれらが特異的に結合する抗原に対する結合アフィニティーで説明されるか、もしくは特定することができる。好ましい結合アフィニティーとしては、解離定数すなわちＫｄが、５ Ｘ １０−２ Ｍ、１０−２ Ｍ、５ Ｘ １０−３ Ｍ、１０−３ Ｍ、５ Ｘ １０−４ Ｍ、１０−４ Ｍ未満のものが挙げられる。より好ましい結合アフィニティーとしては、解離定数すなわちＫｄが、５ Ｘ １０−５ Ｍ、１０−５ Ｍ、５ Ｘ １０−６ Ｍ、１０−６ Ｍ、５ Ｘ １０−７ Ｍ、１０７ Ｍ、５ Ｘ １０−８ Ｍ、もしくは１０−８ Ｍ未満のものが挙げられる。さらにより好ましい結合アフィニティーとしては、解離定数すなわちＫｄが、５ Ｘ １０−９ Ｍ、１０−９ Ｍ、５ Ｘ １０−１０ Ｍ、１０−１０ Ｍ、５ Ｘ １０−１１ Ｍ、１０−１１ Ｍ、５ Ｘ １０−１２ Ｍ、１０−１２ Ｍ、５ Ｘ １０−１３ Ｍ、１０−１３ Ｍ、５ Ｘ １０−１４ Ｍ、１０−１４ Ｍ、５ Ｘ １０−１５ Ｍ、もしくは１０−１５ Ｍ未満のものが挙げられる。好ましい実施形態においては、治療用タンパク質と結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質は、所定のタンパク質もしくはエピトープへのアフィニティーを有しており、それは、アルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質と結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含んでなる）の結合価および対応する抗体の結合価を考慮するとき、治療用タンパク質と結合する対応する抗体（アルブミンと融合していない）のアフィニティーと類似したものである。
【０１３０】
さらに、本明細書に記載のアッセイ（実施例および表１を参照せよ）およびその他の当業界で公知のアッセイは、本発明のアルブミン融合タンパク質およびそれらの断片、変異体、および誘導体の、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分および／もしくはアルブミン部分のいずれかに関連する生物活性および／もしくは治療活性（ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでの）を引き出す能力を測定するために日常的に適用することができる。その他の方法は当業者には公知であり、本発明の範囲内に含まれるものである。
【０１３１】
アルブミン
上記のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は治療用タンパク質の少なくとも断片もしくは変異体を含んでなり、ならびにヒト血清アルブミンの少なくとも断片もしくは変異体を含んでなるが、それらは、好ましくは遺伝子的な融合もしくは化学的コンジュゲーションによってお互いに会合している。
【０１３２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒトアルブミン（ＨＡ）という用語は本明細書では相互に交換可能なものとして用いられている。「アルブミン」および「血清アルブミン」という用語はより広義であり、ヒト血清アルブミン（ならびにその断片および変異体）ならびに他の種由来のアルブミン（ならびにその断片および変異体）を包含する。
【０１３３】
本明細書で用いている「アルブミン」とは集合的にアルブミンタンパク質もしくはアミノ酸配列、またはアルブミン断片もしくは変異体であって、アルブミンの１種以上の機能的活性（例えば、生物活性）を有するものを意味する。とりわけ、「アルブミン」とはヒトアルブミンもしくはその断片であって（ＥＰ２０１２３９、ＥＰ３２２０９４、ＷＯ９７／２４４４５、ＷＯ９５／２３８５７を参照せよ）、特に図１５および配列番号１８に示すヒトアルブミンの成熟形態、もしくは他の脊椎動物由来のアルブミンもしくはその断片、またはこれらの分子もしくはその断片の類似体もしくは変異体を意味する。
【０１３４】
好ましい実施形態においては、本発明のアルブミン融合タンパク質に用いられるヒト血清アルブミンタンパク質は、配列番号１８を参照して述べれば次のセットの点突然変異のうちの１つもしくはその双方を含んでいる：Ｌｅｕ−４０７をＡｌａに、Ｌｅｕ−４０８をＶａｌに、Ｖａｌ−４０９をＡｌａに、およびＡｒｇ−４１０をＡｌａに；またはＡｒｇ−４１０をＡに、Ｌｙｓ−４１３をＧｌｎに、およびＬｙｓ−４１４をＧｌｎに（例えば、国際公開番号ＷＯ９５／２３８５７を参照すればよいが、これは本明細書に参照によりその全体を組み入れる）。より一層好ましい実施形態においては、上述の点突然変異の１つもしくはその双方を含んでいる本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母Ｙａｐ３ｐタンパク分解による切断に対して安定性／抵抗性が改良されており、それによって酵母宿主細胞中で発現される組換えアルブミン融合タンパク質の産生の増加が可能となる。
【０１３５】
本明細書で用いられている治療用タンパク質の治療活性もしくは貯蔵寿命を長引かせるために十分なアルブミンの部分とは、そのタンパク質の治療活性を安定化もしくは長引かせるために十分な長さもしくは構造を有するアルブミンの部分を意味し、それによってそのアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分の貯蔵寿命が、非融合状態の貯蔵寿命と比較すると、長引かされるかもしくは延長されることとなるものである。そのアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、上述のもしくは図１５に示すようなＨＡ配列の全長のものを含んでなるものとすることができ、またはその治療活性を安定化もしくは長引かせることのできる、ＨＡ配列の１種以上の断片を含むことができる。そのような断片は長さが１０個以上のアミノ酸のものとすることができ、またはＨＡ配列からの約１５、２０、２５、３０、５０、もしくはそれ以上の連続したアミノ酸を含むことができ、またはＨＡの特定のドメインの一部もしくは全てを含むことができる。例えば、ＨＡの最初の２つの免疫グロブリン様ドメインにまたがるＨＡの１つ以上の断片を用いることができる。
【０１３６】
本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は正常ＨＡの変異体とすることができる。本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分はまた、本明細書に記載の治療用タンパク質の変異体とすることもできる。「変異体」という用語には、挿入、欠失、および置換、それは保存的もしくは非保存的のいずれかであるが、それらを含み、そのような変化は、膨張圧（ｏｎｃｏｔｉｃ）、有用なリガンド結合性およびアルブミンの非免疫原性、または治療用タンパク質の治療活性を付与する活性部位もしくは活性ドメインのうちの１つ以上のものに実質的に変更を加えないものである。
【０１３７】
特に、本発明のアルブミン融合タンパク質は天然の、ヒトアルブミンの多型性変異体およびヒトアルブミンの断片を含むことができ、例えばＥＰ３２２０９４で開示されている断片（すなわちＨＡ（Ｐｎ）、ｎは３６９〜４１９である）が挙げられる。そのアルブミンはいずれの脊椎動物から、特にいずれの哺乳動物から、例えばヒト、ウシ、ヒツジ、もしくはブタ由来のものとすることができる。非哺乳動物のアルブミンとしては、限定はされないが、ニワトリおよびサケのものが含まれる。アルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は治療用タンパク質部分とは異なる動物由来のものとすることができる。
【０１３８】
一般的に述べれば、ＨＡ断片もしくは変異体は少なくともアミノ酸１００個の長さのものであり、好ましくは少なくともアミノ酸１５０個の長さのものであろう。ＨＡ変異体は、例えばドメイン１（配列番号１８のアミノ酸１−１９４）、２（配列番号１８のアミノ酸１９５−３８７）、３（配列番号１８のアミノ酸３８８−５８５）、１＋２（配列番号１８のアミノ酸１−３８７）、２＋３（配列番号１８のアミノ酸１９５−５８５）、もしくは１＋３（配列番号１８のアミノ酸１−１９４＋配列番号１８のアミノ酸３８８−５８５）などのＨＡのドメインの少なくとも１個全体から成るかもしくはそれを含んでなるものとすることができる。各ドメインそれ自体は２つの相同なサブドメインすなわち１−１０５、１２０−１９４、１９５−２９１、３１６−３８７、３８８−４９１、および５１２−５８５からできており、Ｌｙｓ １０６からＧｌｕ １１９、Ｇｌｕ ２９２からＶａｌ ３１５、およびＧｌｕ ４９２からＡｌａ ５１１の残基を含んでなるフレキシブルなサブドメイン間リンカー領域を有している。
【０１３９】
好ましくは、本発明のアルブミン融合タンパク質のアルブミン部分は、ＨＡの少なくとも１つのサブドメインもしくはドメイン、またはその保存的に改変したものを含んでなる。その融合がサブドメインに基づいたものである場合には、好ましくは隣接するリンカーのいくつかもしくは全てが治療用タンパク質部分に連結させるために用いられる。
【０１４０】
治療用タンパク質と特異的に結合する抗体も治療用タンパク質である
本発明はまた、表１に開示されている治療用タンパク質と特異的に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質をも包含するものである。「治療用タンパク質」という用語が治療用タンパク質（例えば、表１のカラム１に記載されたものなど）に結合する抗体およびそのフラグメントおよび変異体を包含することを特に意図している。従って、本発明のアルブミン融合タンパク質は治療用タンパク質の少なくとも断片もしくは変異体、および／または、治療用タンパク質に結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含むことができる。
【０１４１】
抗体の構造とバックグラウンド
基本的な抗体構造ユニットは４量体を含んでなることが知られている。各４量体はポリペプチド鎖の２つの同一のペアから構成され、各ペアには１個の「軽」鎖（約２５ ｋＤａ）および１個の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）がある。各鎖のアミノ末端部分は約１００〜１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含み、それは主として抗原認識を行っている。各鎖のカルボキシル末端は定常領域を規定し、主としてエフェクター機能を行っている。ヒトの軽鎖はκおよびλ軽鎖として分類される。重鎖はμ、δ、γ、α、εとに分類され、それぞれ抗体のアイソタイプをＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして規定する。総説として「基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」第３−５章（Ｐａｕｌ， Ｗ．編， 第４版， Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ． （１９９８））（全ての目的でその全体を参照により組み入れる）を参照せよ。各軽鎖／重鎖ペアの可変領域は抗体結合部位を形成する。
【０１４２】
従って、無傷なＩｇＧ抗体は２つの結合部位を有する。二官能性（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）もしくは二重特異性抗体を除いて、２つの結合部位は同一である。
【０１４３】
これらの鎖は全て、３つの超可変領域と連結された比較的良く保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の同じ一般構造を示しており、相補性決定領域もしくはＣＤＲとも呼ばれる。ＣＤＲ領域は一般的には抗原と接触し、その特異性を決定する抗体の部分である。各ペアの重鎖および軽鎖からのＣＤＲはフレームワーク領域によって整列され、ある特定のエピトープとの結合を可能とする。Ｎ末端からＣ末端へ軽鎖と重鎖の可変領域は双方とも、ドメインＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含んでなるものである。可変領域は重鎖または軽鎖定常領域に連結される。各ドメインに対するアミノ酸の割り当ては「免疫学的対象となるタンパク質のＫａｂａｔ配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．（１９８７および１９９１））の定義、またはＣｈｏｔｉａおよびＬｅｓｋ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１−９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８−８８３（１９８９）の定義に従ったものである。
【０１４４】
本明細書で用いている「抗体」とは、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、ある抗原と特異的に結合する抗原結合部位を含んでいる分子（例えば、抗体の１つ以上のＣＤＲ領域を含んでいる分子）を意味する。アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応することのできる抗体としては、限定はされないが、モノクローナル、多重特異性、ヒト、ヒト化、もしくはキメラ抗体、一本鎖抗体（例えば、一本鎖Ｆｖｓ）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリーによって産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に特異的な抗Ｉｄ抗体を含む）、および上記のもののいずれかのエピトープ結合フラグメント（例えば、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、もしくは１つ以上のＣＤＲ領域）が含まれる。
【０１４５】
治療用タンパク質と結合する抗体
本発明は、治療用タンパク質（例えば、表１に開示したもの）またはその断片もしくは変異体と結合する抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質を包含する。
【０１４６】
治療用タンパク質（またはその断片もしくは変異体）と結合する抗体は、鳥類および哺乳動物を含むいかなる動物起源に由来するものとすることもできる。好ましくは、抗体はヒト、ネズミ科の動物（例えば、マウスおよびラット）、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、もしくはニワトリの抗体である。最も好ましくは、抗体はヒト抗体である。本明細書で用いている「ヒト」抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を含み、およびヒト免疫グロブリンライブラリー、およびヒト抗体を産生するように遺伝子操作されたゼノマウス（ｘｅｎｏｍｉｃｅ）もしくはその他の生物から単離された抗体を含む。
【０１４７】
治療用タンパク質に結合し、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる抗体分子は、免疫グロブリン分子のいずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）、またはサブクラスとすることができる。好ましい実施形態においては、治療用タンパク質に結合し、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる抗体分子はＩｇＧ１である。他の好ましい実施形態においては、治療用タンパク質に結合し、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる免疫グロブリン分子はＩｇＧ２である。他の好ましい実施形態においては、治療用タンパク質に結合し、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる免疫グロブリン分子はＩｇＧ４である。
【０１４８】
最も好ましくは、治療用タンパク質に結合し、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる抗体は、本発明のヒト抗原結合抗体フラグメントであり、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィドで連結したＦｖｓ（ｓｄＦｖ）、およびＶＬもしくはＶＨドメインのいずれかを含んでなるフラグメントを含む。一本鎖抗体を含む抗原結合抗体フラグメントは、可変領域単独もしくは次のものの全体もしくは部分と組み合わされてものを含んでなるものとすることができる：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン。
【０１４９】
治療用タンパク質に結合し、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、もしくはより大きな多重特異性なものとすることができる。多重特異性抗体は治療用タンパク質の種々のエピトープについて特異的なものとすることができ、もしくは治療用タンパク質ならびに異種エピトープ、例えば異種ポリペプチドもしくは固相支持体材料などの双方に対して特異的なものとすることができる。例えば、ＰＣＴ 公開ＷＯ９３／１７７１５； ＷＯ９２／０８８０２； ＷＯ９１／００３６０； ＷＯ９２／０５７９３； Ｔｕｔｔら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０−６９（１９９１）； 米国特許第４，４７４，８９３号； 第４，７１４，６８１号； 第４，９２５，６４８号； 第５，５７３，９２０号； 第５，６０１，８１９号； Ｋｏｓｔｅｌｎｙら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照せよ。
【０１５０】
治療用タンパク質（またはその断片もしくは変異体）と結合する抗体は二重特異性もしくは二重官能性とすることができ、そのことはその抗体が２つの異なる重鎖／軽鎖のペアおよび２つのことなる結合部位を有する人工のハイブリッド抗体であることを意味する。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合、もしくはＦａｂ’フラグメントの連結を含む種々の方法で産生させることができる。例えば、ＳｏｎｇｓｉｖｉｌａｉおよびＬａｃｈｍａｎｎ， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７９：３１５−３２１（１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１５４７−１５５３（１９９２）を参照せよ。さらに、二重特異性抗体は「ジアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら， 「ジアボディ： ２価で二重特異的な小さな抗体フラグメント（Ｄｉａｂｏｄｉｅｓ：ｓｍａｌｌ ｂｉｖａｌｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」 ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３））もしくは「ジャニュシン（Ｊａｎｕｓｉｎｓ）」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら， 「二重特異性一本鎖分子（ジャニュシン）はＨＩＶ感染細胞に対する細胞傷害性リンパ球を標的とする（Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｇｌｅ ｃｈａｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ（Ｊａｎｕｓｉｎｓ） ｔａｒｇｅｔ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｏｎ ＨＩＶ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌｓ）」 ＥＭＢＯ Ｊ． １０：３６５５−３６５９（１９９１）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら， 「ジャニュシン：二重特異的な試薬のための新しい分子設計（Ｊａｎｕｓｉｎ：ｎｅｗ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｓｉｇｎ ｆｏｒ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｒｅａｇｅｎｔｓ）」 Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｓｕｐｐｌ． ７：５１−５２（１９９２））として形成することができる。
【０１５１】
本発明はまた、本明細書に記載の、もしくは当業界で公知の抗体のフラグメントもしくは変異体（誘導体を含む）を含んでなるアルブミン融合タンパク質をも提供する。当業者には公知の標準的な技法を、本発明の分子をコードするヌクレオチド配列中に突然変異を導入するために用いることができる。そのような方法としては、例えば、アミノ酸の置換をもたらす部位特異的突然変異誘発、およびＰＣＲ介在型突然変異誘発が含まれる。好ましくは、その変異体（誘導体を含む）は、標準のＶＨドメイン、ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬドメイン、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、もしくはＶＬＣＤＲ３に対して５０個未満のアミノ酸の置換、４０個未満のアミノ酸の置換、３０個未満のアミノ酸の置換、２５個未満のアミノ酸の置換、２０個未満のアミノ酸の置換、１５個未満のアミノ酸の置換、１０個未満のアミノ酸の置換、５個未満のアミノ酸の置換、４個未満のアミノ酸の置換、３個未満のアミノ酸の置換、２個未満のアミノ酸の置換をコードする。特定の実施形態においては、その変異体はＶＨＣＤＲ３の置換をコードする。好ましい１実施形態においては、その変異体は１カ所以上の非必須であると予言されているアミノ酸残基の位置での保存的アミノ酸置換を有する。
【０１５２】
治療用タンパク質に結合し、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる抗体は、それらの抗体が認識するもしくは特異的に結合する治療用タンパク質のエピトープもしくは部分によって説明もしくは特定することができる。治療用タンパク質もしくは治療用タンパク質の特異的エピトープに特異的に結合する抗体を排除することもできる。従って、本発明は治療用タンパク質と特異的に結合する抗体を包含し、その同じ抗体の排除もできる。好ましい実施形態においては、治療用タンパク質に結合する抗体のフラグメントもしくは変異体を少なくとも含んでなるアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質と結合する対応する抗体（アルブミンと融合していない）と同じエピトープと結合する。
【０１５３】
治療用タンパク質に結合し、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる抗体はまた、その交差反応性によって説明もしくは特定することができる。治療用タンパク質の他の類似体、オーソログ体、もしくは相同体のいずれとも結合しない抗体も含まれる。治療用タンパク質と少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の同一性（当業界では公知の方法および本明細書中で説明した方法を用いて計算）を有するポリペプチドと結合する抗体も本発明に含まれる。特定の実施形態においては、治療用タンパク質と結合し、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる抗体は、ヒトタンパク質のマウス、ラット、および／もしくはウサギでの相同体、ならびにその対応するエピトープと交差反応する。治療用タンパク質と９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の同一性（当業界では公知の方法および本明細書中で説明した方法を用いて計算）を有するポリペプチドとは結合しない抗体も本発明に含まれる。特定の１実施形態においては、上述の交差反応性は、単一の特異的な抗原性もしくは免疫原性ポリペプチド、または本明細書に開示した２、３、４、５個もしくはそれ以上の特異的抗原性および／もしくは免疫原性ポリペプチドの組み合わせに関してのものである。好ましい実施形態においては、治療用タンパク質と結合する抗体のフラグメントもしくは変異体を少なくとも含んでなるアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質と結合する対応する抗体（アルブミンと融合していないもの）と比較して類似のもしくは実質的に同一の交差反応性を有している。
【０１５４】
さらに、本発明には治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下（本明細書に記載したとおりの条件）でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと結合する抗体が含まれる。治療用タンパク質に結合し本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる抗体はまた、それらの抗体の本発明のポリペプチドに対する結合親和性によって説明もしくは特定することもできる。好ましい結合親和性としては、解離定数すなわちＫｄが５ Ｘ １０−２ Ｍ、１０−２ Ｍ、５ Ｘ １０−３ Ｍ、１０−３ Ｍ、５ Ｘ １０−４ Ｍ、１０−４ Ｍ未満のものである。より好ましい結合親和性としては、解離定数すなわちＫｄが、５ Ｘ １０−５ Ｍ、１０−５ Ｍ、５ Ｘ １０−６ Ｍ、１０−６ Ｍ、５ Ｘ １０−７ Ｍ、１０−７ Ｍ、５ Ｘ １０−８ Ｍ、もしくは１０−８ Ｍ未満のものである。さらにより好ましい結合親和性としては解離定数すなわちＫｄが、５ Ｘ １０−９ Ｍ、１０−９ Ｍ、５ Ｘ １０−１０ Ｍ、１０−１０ Ｍ、５ Ｘ １０−１１ Ｍ、１０−１１ Ｍ、５ Ｘ １０−１２ Ｍ、１０−１２ Ｍ、５ Ｘ １０−１３ Ｍ、１０−１３ Ｍ、５ Ｘ １０−１４ Ｍ、１０−１４ Ｍ、５ Ｘ １０−１５ Ｍ、もしくは１０−１５ Ｍ未満のものである。好ましい実施形態においては、治療用タンパク質を結合する抗体のフラグメントもしくは変異体を少なくとも含んでなるアルブミン融合タンパク質は、ある与えられたタンパク質もしくはエピトープへの親和性を有しており、この親和性は、アルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質と結合する抗体のフラグメントもしくは変異体を少なくとも含んでなる）の結合価および対応する抗体の結合価を考慮したとき、治療用タンパク質と結合する対応する抗体（アルブミンと融合していない）の親和性と類似するものである。
【０１５５】
本発明はまた、競合的結合を測定するためのものとして当業界では公知の方法（例えば本明細書に記載のイムノアッセイ）のいずれかにより測定できるような、治療用タンパク質エピトープへの抗体の結合を競合的に阻害する抗体を提供する。好ましい実施形態においては、その抗体は、エピトープへの結合を少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、もしくは少なくとも５０％、競合的に阻害する。好ましい実施形態においては、治療用タンパク質と結合する抗体のフラグメントもしくは変異体を少なくとも含んでなるアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害し、ならびに治療用タンパク質と結合する対応する抗体（アルブミンと融合していないもの）は治療用タンパク質のエピトープに対する抗体の結合を競合的に阻害する。別の好ましい実施形態においては、治療用タンパク質と結合する抗体のフラグメントもしくは変異体を少なくとも含んでなるアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質を結合する対応する抗体（アルブミンと融合していないもの）の治療用タンパク質エピトープへの結合を少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、もしくは少なくとも５０％、競合的に阻害する。
【０１５６】
治療用タンパク質に結合し、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる抗体は、治療用タンパク質のアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用することができる。例えば、本発明は、受容体／リガンドと本発明のポリペプチドとの相互作用を部分的にもしくは完全に崩壊させる抗体を含む。本発明は、受容体特異的抗体およびリガンド特異的抗体を含むことを特徴とする。本発明はまた、リガンドの結合を妨害しないが受容体の活性化を妨げる受容体特異的抗体を含むことも特徴とする。受容体の活性化（すなわち、シグナル伝達）は、本明細書に記載の技法もしくは当業界で公知の技法によって測定することができる。例えば、受容体の活性化は、受容体のリン酸化（例えば、チロシンもしくはセリン／トレオニン）、もしくはその基質を免疫沈降を行った後にウエスタンブロット分析（例えば、上述したような方法で）を行うことで検出することによって測定することができる。特定の実施形態においては、リガンド活性もしくは受容体活性を、抗体が存在しない状態での活性の少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、もしくは少なくとも５０％阻害する抗体が提供される。好ましい実施形態においては、治療用タンパク質と結合する抗体のフラグメントもしくは変異体を少なくとも含んでなるアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質と結合する対応する抗体（アルブミンと融合していないもの）と比較するとき、リガンド結合を妨げること、および／もしくは受容体活性化を妨げることに関して類似した、もしくは実質的に類似した特性を有している。
【０１５７】
本発明はまた、リガンド結合および受容体活性化の双方を妨げる受容体特異的抗体、ならびに受容体−リガンド複合体を認識し、好ましくは未結合の受容体もしくは未結合のリガンドは特異的に認識しないような抗体を含むことを特徴とする。同様にして、本発明には、リガンドに結合してリガンドの受容体への結合を妨げる中和抗体、ならびにリガンドに結合してそのことによって受容体の活性化を妨げるが、リガンドが受容体と結合することは妨げない抗体が含まれる。本発明にはさらに、受容体を活性化させる抗体が含まれる。それらの抗体は受容体アゴニスト、すなわちリガンドがメディエートする受容体の活性化によって起こる生物活性の全てもしくはサブセットのいずれかを増強もしくは活性化を、例えば受容体の２量体化を誘導することによって行う受容体のアゴニストとして作用するものとすることができる。それらの抗体はその治療用タンパク質の特定の生物活性（例えば、表１に開示しているようなもの）を含んでなる生物活性についてのアゴニスト、アンタゴニスト、もしくはインバースアゴニストとして特定することができる。上述の抗体アゴニストは当業界では公知の方法を用いて作製することができる。例えば、ＰＣＴ 公開ＷＯ９６／４０２８１： 米国特許第５，８１１，０９７号； Ｄｅｎｇら， Ｂｌｏｏｄ ９２（６）：１９８１−１９８８（１９９８）； Ｃｈｅｎら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８（１６）：３６６８−３６７８（１９９８）； Ｈａｒｒｏｐら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６１（４）：１７８６−１７９４（１９９８）； Ｚｈｕら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８（１５）：３２０９−３２１４； Ｙｏｏｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６０（７）：３１７０−３１７９（１９９８）； Ｐｒａｔら， Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｓｃｉ． １１１（Ｐｒ２）：２３７−２４７； Ｐｉｔａｒｄら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０５（２）：１７７−１９０（１９９７）； Ｌｉａｕｔａｒｄら， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ９（４）：２３３−２４１（１９９７）； Ｃａｒｌｓｏｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２（１７）：１１２９５−１１３０１（１９９７）； Ｔａｒｙｍａｎら， Ｎｅｕｒｏｎ １４（４）：７５５−７６２（１９９５）； Ｍｕｌｌｅｒら， Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６（９）：１１５３−１１６７（１９９８）； Ｂａｒｔｕｎｅｋら， Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ８（１）：１４−２０（１９９６）を参照されたい（これらは全て本明細書中にその全体を参照により組み入れる）。好ましい実施形態においては、治療用タンパク質と結合する抗体のフラグメントもしくは変異体を少なくとも含んでなるアルブミン融合タンパク質は、治療用タンパク質と結合するがアルブミンとは融合していない対応する抗体と類似のもしくは実質的に同一のアゴニストもしくはアンタゴニスト特性を有している。
【０１５８】
治療用タンパク質に結合し本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる抗体は、例えば治療用タンパク質を精製、検出、および標的とするために用いることができるが、それにはｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ双方での診断方法および治療方法が含まれる。例えば、生物サンプル中の治療用タンパク質のレベルを定量的および定性的に測定するためのイムノアッセイで用いることができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗら， 「抗体：実験室マニュアル」”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， 第２版 １９８８）を参照されたい：これは本明細書中に参照によりその全体を組み入れる。同様にして、治療用タンパク質と結合する抗体のフラグメントもしくは変異体を少なくとも含んでなるアルブミン融合タンパク質を精製、検出、および標的とするために用いることができるが、それにはｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ双方での診断方法および治療方法が含まれる。
【０１５９】
治療用タンパク質に結合しアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる抗体には、改変された、すなわちどのようなタイプの分子でも共有結合でその抗体に結合させた誘導体を含んでいる。例えば、限定するものではないが、そのような抗体の誘導体としては、グリコシル化、アセチル化、ＰＥＧによる修飾、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質加水分解による開裂、細胞性リガンドもしくはその他のタンパク質との連結、その他によって改変された抗体が含まれる。既知の技法によって膨大な数の化学的改変のいずれでも行うことができるが、そのようなものとしては、限定するものではないが、特異的な化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝による合成、その他が含まれる。さらに、その誘導体は１個以上の古典的アミノ酸を含むことができる。本発明のアルブミン融合タンパク質も上述のとおりの方法で改変することができる。
【０１６０】
治療用タンパク質と結合する抗体の作製方法
治療用タンパク質に結合し、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる抗体は、当業界で公知の適切な方法のどの方法でも作製することができる。対象の抗原に対するポリクローナル抗体を、当業界で周知の種々の方法によって産生させることができる。例えば、治療用タンパク質を種々の宿主動物に投与して、その抗原に対して特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導することができ、そのような動物としては、限定するものではないが、ウサギ、マウス、ラット等が含まれる。免疫応答を増強させるために宿主の種に応じて種々のアジュバントを用いることができ、そのようなアジュバントとしては、限定するものではないが、フロイント（完全および不完全アジュバント）、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油性エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコリネバクテリウム・パルブム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）などのヒトアジュバントで有用である可能性のあるものが含まれる。このようなアジュバントは当業界でもよく知られている。
【０１６１】
モノクローナル抗体は当業界で公知の様々な技法を用いて調製することができ、そのような技法としては、ハイブリドーマの使用、組換え、およびファージディスプレイ法、もしくはそれらの組み合わせが含まれる。例えば、モノクローナル抗体はハイブリドーマ技法を用いて産生させることができ、そのような技法には、当業界で公知のものと、たとえば、Ｈａｒｌｏｗら，「抗体：実験室マニュアル」”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， 第２版 １９８８）； Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら， 「モノクローナル抗体とＴ細胞ハイブリドーマ」”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， １９８１）中に教示されているものが含まれる（これらの参照文献はその全体を本明細書に参照により組み入れる）。本明細書で使用する「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技法によって産生された抗体に限定されるものではない。「モノクローナル抗体」という用語は単一のクローンに由来する抗体を意味し、それには真核生物のクローン、原核生物のクローン、もしくはファージクローンが含まれるが、それが産生される方法は含まれない。
【０１６２】
ハイブリドーマ技法を用いて特定の抗体を産生しスクリーニングする方法は日常的に行われており当業界ではよく知られている。非限定的な１例においては、マウスを治療用タンパク質またはその断片もしくは変異体で、または治療用タンパク質またはその断片もしくは変異体を発現している細胞で免疫することができる。免疫応答が検出された後、例えばその抗原に特異的な抗体がマウス血清中に検出された後に、そのマウスの脾臓を摘出し脾臓細胞を単離する。次いでその脾臓細胞を周知の技法によって適切な骨髄腫細胞、例えばＡＴＣＣから入手可能なＳＰ２０細胞系統から得られた細胞と融合させる。ハイブリドーマは限界希釈法によって選択されクローン化される。次いでそのハイブリドーマクローンが、本発明のポリペプチドと結合することのできる抗体を分泌する細胞であるか否かを当業界で公知の方法によってアッセイする。腹水は通常は高レベルの抗体を含有しており、それは陽性を示したハイブリドーマクローンを用いてマウスを免疫することによって作製することができる。
【０１６３】
従って、本発明は、モノクローナル抗体ならびに抗体を分泌しているハイブリドーマ細胞を培養することを含んでなる方法によって産生される抗体を作製する方法を提供し、好ましくはそのハイブリドーマは、本発明の抗原で免疫したマウスから単離した脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させ、次いでその融合物からもたらされるハイブリドーマを、本発明のポリペプチドに結合することのできる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングすることによって作製される。
【０１６４】
ポリクローナルおよびモノクローナルヒトＢ細胞系統の双方を産生するための別の公知の方法は、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）を用いる形質転換である。ＥＢＶによって形質転換されたＢ細胞系統を作製するためのプロトコールは当業界では一般的に知られており、それは例えば、Ｃｏｌｉｇａｎら編， 「免疫学の今日のプロトコール」”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ” １９９４， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎ．Ｙ．の第７．２２章に概説されており、これは本明細書にその全体を参照により組み入れる。形質転換のためのＢ細胞の供給源としては一般的にはヒトの末梢血であるが、形質転換のためのＢ細胞はその他の供給源由来のものとすることもでき、そのような供給源としては限定するものではないが、リンパ節、扁桃、脾臓、腫瘍組織、および感染組織が含まれる。組織は通常はＥＢＶで形質転換する前に単一細胞浮遊液とする。さらに、Ｂ細胞含有サンプル中のＴ細胞を物理的に除去もしくは不活化（例えば、シクロスポリンＡでの処理によって）するステップを行うことができるが、それは抗ＥＢＶ抗体について血清が陽性の個体由来のＴ細胞はＥＢＶによるＢ細胞の不死化を抑制しうるからである。
【０１６５】
通常は、ヒトＢ細胞を含有するサンプルにＥＢＶを接種し、３〜４週間培養する。ＥＢＶの供給源として典型的なものは、Ｂ９５−８細胞系統（ＡＴＣＣ ＃ＶＲ−１４９２）の培養上清である。ＥＢＶによる形質転換の物理的徴候は通常は３〜４週間の培養期間の終わり頃に認められる。位相差顕微鏡で形質転換細胞は大きく明確で、毛様であり、細胞の密な塊をなして凝集する傾向がある。当初、ＥＢＶ系統はポリクローナルであるのが一般的である。しかし細胞培養が長くなると、ＥＢＶ系統は特定のＢ細胞クローンの選択的増殖の結果としてモノクローナルもしくはポリクローナルとなりうる。あるいは、ポリクローナルＥＢＶ形質転換系統はサブクローン化（例えば、限界希釈培養によって）または適切な融合パートナーと融合させて限界希釈濃度でプレートしてモノクローナルＢ細胞系統を得ることができる。ＥＢＶで形質転換した細胞系統のための適切な融合パートナーとしては、マウス骨髄腫細胞系統（例えば、ＳＰ２／０、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３）、ヘテロ骨髄腫細胞系統（ヒト ｘ マウス；例えば、ＳＰＡＭ−８、ＳＢＣ−Ｈ２０、およびＣＢ−Ｆ７）、ならびにヒト細胞系統（例えば、ＧＭ１５００、ＳＫＯ−００７、ＲＰＭＩ ８２２６、およびＫＲ−４）が含まれる。従って、本発明はまた、ＥＢＶによるヒトＢ細胞の形質転換を含んでなる、本発明のポリペプチドもしくはその断片に対するポリクローナルまたはモノクローナルヒト抗体を作製する方法をも提供する。
【０１６６】
特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは公知の技法で作製することができる。例えば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは免疫グロブリン分子のタンパク質加水分解による開裂によって作製することができ、その開裂にはパパイン（Ｆａｂフラグメントを産生させるため）もしくはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを産生させるため）などの酵素を用いる。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、可変領域、軽鎖定常領域、および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。
【０１６７】
例えば、治療用タンパク質に結合する抗体はまた、当業界で公知の種々のファージディスプレイ法を用いて作製することもできる。ファージディスプレイ法では、抗体の機能を有するドメインがファージ粒子の表面上に提示されるが、そのファージはそれらのドメインをコードするポリヌクレオチド配列を運ぶものである。特定の１実施形態においては、そのようなファージはレパートリーもしくはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトもしくはマウス）から発現される抗原結合ドメインを提示させるために用いることができる。対象の抗原と結合する抗原結合ドメインを発現しているファージは、抗原を用いて、例えば、固体表面もしくはビーズに結合したもしくは捕捉された標識抗原もしくは抗原を用いて、選択または同定することができる。これらの方法で用いられるファージは典型的には線維状ファージであり、該ファージには、ファージ遺伝子ＩＩＩもしくは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかと組換えによって融合させたＦａｂ、Ｆｖ、もしくはジスルフィド結合で安定化させたＦｖ抗体ドメインを有するファージから発現させた、ｆｄおよびＭ１３結合ドメインが含まれている。治療用タンパク質に結合する抗体を作製するために用いることのできるファージディスプレイ法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１−５０（１９９５）； Ａｍｅｓら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７−１８６（１９９５）； Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２４：９５２−９５８（１９９４）； Ｐｅｒｓｉｃら， Ｇｅｎｅ １８７：９−１８（１９９７）； Ｂｕｒｔｏｎら， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１−２８０（１９９４）； ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４； ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９； ＷＯ９１／１０７３７； ＷＯ９２／０１０４７； ＷＯ９２／１８６１９； ＷＯ９３／１１２３６； ＷＯ９５／１５９８２； ＷＯ９５／２０４０１； および米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３号、および第５，９６９，１０８号中に開示されているものを含む；これらの各々はその全体を本明細書に参照により組み入れる。
【０１６８】
上述の参照文献中に記載されているとおり、ファージの選択を行った後、例えば、下記に詳述するように、ファージから抗体をコードする領域を単離し、ヒト抗体、もしくはその他のいかなる所望の抗原結合フラグメントをも含む、全抗体を作製するために用い、所望の宿主、それには例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌が含まれるが、そのような宿主中で発現させることができる。例えば、組換えでＦａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製する技法は、当業界で公知の方法を用いても行うことができ、そのような方法としては、ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２２３２４； Ｍｕｌｌｉｎａｘら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １２（６）：８６４−８６９（１９９２）； およびＳａｗａｉら， ＡＪＲＩ ３４：２６−３４（１９９５）； ならびにＢｅｔｔｅｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１−１０４３（１９８８）などがある（これらの参照文献はその全体を本明細書に組み入れる）。
【０１６９】
一本鎖Ｆｖおよび抗体を産生させるために用いることのできる技法の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号； Ｈｕｓｔｏｎら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０３：４６−８８（１９９１）； Ｓｈｕら， ＰＮＡＳ ９０：７９９５−７９９９（１９９３）； およびＳｋｅｒｒａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）中に記載されているものが挙げられる。いくつかの用途においては、それにはヒトにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの抗体の使用およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの検出アッセイを含むが、そのような使用には、キメラ、ヒト化、もしくはヒト抗体の使用が好ましい。キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる動物種に由来するものであり、例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体等が挙げられる。キメラ抗体を作製する方法は当業界では公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）； Ｏｉら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）； Ｇｉｌｌｉｅｓら， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１−２０２（１９８９）； 米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、および第４，８１６，３９７号を参照されたい、またこれらはその全体を本明細書に参照により組み入れる。ヒト化抗体は、所望の抗原と結合するヒト以外の動物種の抗体から得られた抗体分子であって、ヒト以外の動物種からの１個以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有するものである。ヒトフレームワーク領域中のフレームワーク残基は、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換されて抗原との結合に変化、好ましくは改善をもたらすことが多い。これらのフレームワーク置換は当業界では周知の方法、例えば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基間の相互作用のモデリングと、特定の位置における通常は見られないフレームワーク残基を同定するための配列比較によって同定することができる。（例えば、Ｑｕｅｅｎら， 米国特許第５，５８５，０８９号； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）を参照されたい、またこれらは本明細書にその全体を参照により組み入れる）。抗体は当業界では公知の種々の技法を用いてヒト化することができ、そのような技法としては、例えば、ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｉｎｇ（ＥＰ ２３９，４００； ＰＣＴ 公開ＷＯ９１／０９９６７； 米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、および第５，５８５，０８９号）、ｖｅｎｅｅｒｉｎｇもしくはｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ（ＥＰ ５９２，１０６； ＥＰ ５１９，５９６； Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）； Ｓｔｕｎｄｎｉｃｋａら， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５−８１４（１９９４）； Ｒｏｇｕｓｋａら， ＰＮＡＳ ９１：９６９−９７３（１９９４））、ならびにｃｈａｉｎ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ（米国特許第５，５６５，３３２号）が含まれる。
【０１７０】
完全ヒト抗体はヒトの患者の治療における使用には特に望ましい。ヒト抗体は当業界では公知の種々の方法で作製することができ、そのような方法としては、ヒト免疫グロブリン配列由来の抗体ライブラリーを用いた上述のファージディスプレイ法が含まれる。また、米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号； ならびにＰＣＴ公開ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１を参照されたい、これらの各々はその全体を本明細書に参照により組み入れる。
【０１７１】
ヒト抗体はまた、機能を有する内因性免疫グロブリンは発現できないがヒト免疫グロブリン遺伝子は発現できるトランスジェニックマウスを用いて産生させることもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体をマウス胚性幹細胞中にランダムに導入するかもしくは相同組換えによって導入することができる。あるいは、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域をマウス胚性幹細胞中にヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて導入することができる。マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別々にもしくは同時に機能を有しないものとなる。特に、ＪＨ領域のホモ接合性欠失によって内因性の抗体産生が妨げられる。改変された胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞中にマイクロインジェクションしてキメラマウスを作製する。次いでそのキメラマウスを生育させて、ヒト抗体を発現するホモ接合体の子供が作られる。そのトランスジェニックマウスを、選択した抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全てもしくは一部で普通の方法で免疫する。その抗原に対して作製されたモノクローナル抗体は、免疫したトランスジェニックマウスから慣用のハイブリドーマ技法を用いて得ることができる。トランスジェニックマウスの有するヒト免疫グロブリントランスジーンはＢ細胞の分化の際に再構成され、その後クラススイッチングおよび体細胞突然変異が起こる。従って、この技法を用いて、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ抗体を産生させることができる。ヒト抗体を産生させるためのこの技法の概要に関しては、ＬｏｎｂｅｒｇとＨｕｓｚａｒ， Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３：６５−９３（１９９５）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生させるためのこの技法について、ならびにそのような抗体を産生させるためのプロトコールについての詳細な論考は、たとえば、ＰＣＴ公開 ＷＯ９８／２４８９３； ＷＯ９２／０１０４７； ＷＯ９６／３４０９６； ＷＯ９６／３３７３５； 欧州特許第０ ５９８ ８７７号； 米国特許第５，４１３，９２３号、第５，６２５，１２６号、第５，６３３，４２５号、第５，５６９，８２５号、第５，６６１，０１６号、第５，５４５，８０６号、第５，８１４，３１８号、第５，８８５，７９３号、第５，９１６，７７１号、第５，９３９，５９８号、第６，０７５，１８１号、および第６，１１４，５９８号を参照されたい、またこれらはその全体を本明細書に参照により組み入れる。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ， Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ， 米国カリフォルニア州）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ， 米国カリフォルニア州）などの企業は、上述のものと類似の技法を用いて、ある選択された抗原に対するヒト抗体を提供することを受託することができる。
【０１７２】
ある選択されたエピトープを認識する完全なヒト抗体は、「ガイドされた選択（ｇｕｉｄｅｄ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技法を用いて作製することができる。このアプローチでは、ある選択されたヒト以外のモノクローナル抗体（例えばマウス抗体）が、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドするために用いられる。（Ｊｅｓｐｅｒｓら， Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：８９９−９０３（１９８８））。
【０１７３】
抗体をコードするポリヌクレオチド
本発明はさらに抗体およびそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、例えば、上記で定義したようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、もしくはより低いストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件下で、抗体、好ましくは治療用タンパク質に特異的に結合する抗体、より好ましくは表１の「代表的識別番号」の欄に開示されている「治療用タンパク質Ｘ」のアミノ酸配列を有するポリペプチドに結合する抗体をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドを包含する。
【０１７４】
当業界で公知のいかなる方法によっても、そのようなポリヌクレオチドを得ることができ、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。例えば、その抗体のヌクレオチド配列が既知の場合には、その抗体をコードするポリヌクレオチドは化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから組立てることができ（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １７：２４２（１９９４中に記載されているように））、その操作には、簡潔に記せば、その抗体をコードする配列の部分をむオーバーラップしているオリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングと連結、ならびに連結されたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅が含まれる。
【０１７５】
あるいは、ある抗体をコードするポリヌクレオチドは、適切な供給源から得られた核酸から作製することができる。ある特定の抗体をコードする核酸を含むクローンは入手できないが、その抗体分子の配列が既知である場合には、その免疫グロブリンをコードする核酸は化学的に合成するか、もしくは適切な供給源（例えば、その抗体を発現しているいずれかの組織もしくは細胞（例えばある抗体を発現するものとして選択されたハイブリドーマ細胞など）から作製された抗体ｃＤＮＡライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー、またはそれらの組織もしくは細胞から単離された核酸で、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から得ることができ、それは、その配列の３’および５’末端とハイブリダイズしうる合成プライマーを用いたＰＣＲによって行うか、もしくは、例えば、その抗体をコードするｃＤＮＡライブラリーから得られたｃＤＮＡクローンを同定する特定の遺伝子配列に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いたクローニングによって行う。次いで、ＰＣＲによって作製された増幅核酸は、当業界で周知であるいずれかの技法を用いて、複製可能なクローニングベクター中にクローニングすることができる（実施例６０を参照されたい）。
【０１７６】
その抗体のアミノ酸配列と対応するヌクレオチド配列が決定されれば、その抗体のヌクレオチド配列は、異なるアミノ酸配列を有する抗体の作製、例えばアミノ酸の置換、欠失、および／もしくは挿入を行うために、当業界でよく知られたヌクレオチド配列操作方法を用いて操作することができ、そのような方法としては、例えば、組換えＤＮＡ技法、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲ等が挙げられる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９９０， 「分子クローニング：実験室マニュアル」”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ、およびＡｕｓｕｂｅｌら編， １９９８， 「分子生物学の今日のプロトコール」”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹを参照されたい、またこれらはその全体を本明細書に参照により組み入れる）。
【０１７７】
特定の１実施形態においては、当業界で周知の方法によって、相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を同定するために、重鎖および／もしくは軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列を調べることができるが、そのような方法には、例えば、配列の可変性が高い領域を判定するために、他の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列で既知のものと比較することなどが挙げられる。慣用の組換えＤＮＡ技法を用いて、上述したとおり、フレームワーク領域内部に、例えばヒトフレームワーク領域内部に１個以上のＣＤＲを挿入して、ヒト以外の動物の抗体をヒト化することができる。そのフレームワーク領域は天然のもしくはコンセンサスフレームワーク領域であり、好ましくはヒトフレームワーク領域である（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７８：４５７−４７９（１９９８）のヒトフレームワーク領域の一覧を参照されたい）。好ましくは、該フレームワーク領域およびＣＤＲの組み合わせによって作製されたポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドと特異的に結合する抗体をコードするものである。好ましくは、上述のとおり、１個以上のアミノ酸の置換がそのフレームワーク領域内部でなされて、好ましくはそのアミノ酸置換が抗体の抗原との結合を改善するものとなることである。さらに、鎖内ジスルフィド結合を１個以上欠いている抗体分子を作製するために、鎖内ジスルフィド結合に関与している１個以上の可変領域システイン残基のアミノ酸置換もしくは欠失を行うためにそのような方法を用いることができる。該ポリペプチドに対してその他の変更を加えることは本発明の範囲内であり、当業界で既知の技術の範囲内である。
【０１７８】
さらに、「キメラ抗体」を産生させるために開発された技法（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８１：８５１−８５５（１９８４）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ３１２：６０４−６０８（１９８４）； Ｔａｋｅｄａら， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：４５２−４５４（１９８５））これは、適切な抗原特異性を有するマウス抗体分子の遺伝子を、適切な生物活性を有するヒト抗体分子の遺伝子と共にスプライシングすることによるものである）を用いることができる。上述のとおり、キメラ抗体とは、異なる部分が異なる動物種由来である分子であって、例えばマウスモノクローナル抗体由来の可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するもの、例えばヒト化抗体などである。
【０１７９】
あるいは、一本鎖抗体を産生させるためのものとして報告されている技法（米国特許第４，９４６，７７８号； Ｂｉｒｄ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４４２（１９８８）； Ｈｏｕｓｔｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３（１９８８）； およびＷａｒｄら， Ｎａｔｕｒｅ ３３４：５４４−５５４（１９８９））を、一本鎖抗体産生のために適用することができる。一本鎖抗体は、アミノ酸の架橋を介してＦｖ領域の重鎖フラグメントと軽鎖フラグメントを連結させ、それによって単鎖ポリペプチドがもたらされることによって形成される。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での、機能性Ｆｖフラグメントのアセンブリーのための技法（Ｓｋｅｒｒａら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：１０３８−１０４１（１９８８））も用いることができる。
【０１８０】
抗体の組換えによる発現
抗体、またはそのフラグメント、誘導体、もしくは類似体（例えば、抗体の重鎖もしくは軽鎖、または一本鎖抗体）の組換えによる発現には、その抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。本発明の抗体分子、または抗体の重鎖もしくは軽鎖、またはその部分（好ましくは、重鎖および軽鎖の可変ドメインを含むもの）をコードするポリヌクレオチドが得られれば、その抗体分子を産生させるためのベクターは、当業界ではよく知られた技法を用いた組換えＤＮＡ技術によって作製することができる。従って、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現させることによってタンパク質を調製する方法を本明細書に記載する。抗体をコードする配列および適切な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために、当業者にはよく知られた方法を用いることができる。そのような方法としては、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技法、合成技法、およびｉｎ ｖｉｖｏ遺伝的組換えが挙げられる。本発明は、従って、プロモーターに機能的に連結された、本発明の抗体分子、またはその重鎖もしくは軽鎖、または重鎖もしくは軽鎖の可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含んでなる複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターには抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含ませることができ（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８６／０５８０７； ＰＣＴ公開ＷＯ８９／０１０３６； および米国特許第５，１２２，４６４号参照）、また、該抗体の可変ドメインは、重鎖もしくは軽鎖の全体を発現させるために、そのようなベクター中にクローンニングすることができる。
【０１８１】
発現ベクターは宿主細胞へ慣用の技法で移入され、次いでそのトランスフェクトされた細胞を慣用の技法で培養することにより抗体が産生される。従って、本発明は、本発明の抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖、または一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドであって、異種性のプロモーターに機能的に連結されたものを含有する宿主細胞を含んでいる。２本鎖抗体の発現に好ましい実施形態においては、下記に述べるとおり、重鎖および軽鎖の双方をコードするベクターは免疫グロブリン分子全体を発現させるために宿主細胞中で共発現させることができる。
【０１８２】
本発明の抗体分子を発現させるために様々な宿主−発現ベクター系を用いることができる。そのような宿主−発現ベクター系とは、それによって対象のコード配列が産生され、その後精製されることとなるビヒクルを意味し、また、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換もしくはトランスフェクトした場合に、本発明の抗体分子をｉｎ ｓｉｔｕで発現することのできる細胞をも意味する。そのような系としては、限定するものではないが、抗体をコードする配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；抗体をコードする配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、 Ｐｉｃｈｉａ）；抗体をコードする配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；抗体をコードする配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ）を感染させた、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換させた、植物細胞系；または、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、もしくは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を有している哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞）が含まれる。好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、より好ましくは、特に組換え抗体分子全体の発現のために真核細胞が、組換え抗体分子の発現のために用いられる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞を、ヒトサイトメガロウイルスから得られた主要前初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと共に用いるものは抗体の効果的な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇら， Ｇｅｎｅ ４５：１０１（１９８６）； Ｃｏｃｋｅｔｔら， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２（１９９０））。
【０１８３】
細菌の系では、発現させる抗体分子の目的の用途に応じて、多数の発現ベクターを有利に選択することができる。例えば、抗体分子を含む医薬組成物の作製のためにそのようなタンパク質を多量に産生させようとする場合には、容易に精製しうる高いレベルの融合タンパク質産物の発現を指令するようなベクターが望ましいであろう。そのようなベクターとしては、限定するものではないが、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら， ＥＭＢＯ Ｊ． ２：１７９１（１９８３））、このベクターでは抗体をコードする配列は個々にベクターのｌａｃ Ｚコード領域と同じフレームに連結されて融合タンパク質が産生される；ｐＩＮベクター（ＩｎｏｕｙｅとＩｎｏｕｙｅ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ ＨｅｅｋｅとＳｃｈｕｓｔｅｒ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４：５５０３−５５０９（１９８９））；および類似のものが含まれる。ｐＧＥＸベクターも、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために用いることができる。通常、そのような融合タンパク質は可溶性であり、溶解させた細胞をマトリクスグルタチオン−アガロースビーズに吸着および結合させた後、遊離のグルタチオンの存在下で溶出させることによって容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターはトロンビンもしくは第Ｘａ因子のプロテアーゼ開裂部位を含むようにデザインされているので、クローニングされた標的遺伝子産物はＧＳＴ部分から放出されうる。
【０１８４】
昆虫の系では、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が外来遺伝子を発現させるためのベクターとして用いられる。このウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。抗体をコードする配列はこのウイルスの非必須領域（例えばポリヘドリン遺伝子）中に個々にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれる。
【０１８５】
哺乳動物宿主細胞では、ウイルスをベースとした多数の発現系を用いることができる。アデノウイルスが発現ベクターとして用いられる場合には、対象の抗体をコードする配列はアデノウイルスの転写／翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよびトリパータイトリーダー配列に連結させることができる。次いでこのキメラ遺伝子をｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏ組換えによってアデノウイルスゲノム中に挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１もしくはＥ４領域）への挿入によって、感染させた宿主中で生存可能かつ抗体分子を発現することのできる組換えウイルスがもたらされる（例えば、ＬｏｇａｎとＳｈｅｎｋ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：３５５−３５９（１９８４）を参照されたい）。挿入された抗体をコードする配列の効率的な翻訳には特異的な開始シグナルも必要となりうる。それらのシグナルとしてはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、インサート全体の翻訳を確実なものにするためには、その開始コドンは所望のコード配列のリーディングフレームと同じフレームでなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の種々の起源のものとすることができる。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーター、その他を含めることによって増強することができる（Ｂｉｔｔｎｅｒら， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５３：５１−５４４（１９８７）を参照されたい）。
【０１８６】
さらに、所望の特定な様式で、挿入された配列の発現を調節する、もしくは遺伝子産物を改変およびプロセシングするような宿主細胞株を選択することができる。タンパク質産物のそのような改変（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、開裂）はそのタンパク質の機能にとって重要なものとなりうる。種々の宿主細胞が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび改変のための、特有で特異的なメカニズムを有している。発現された外来タンパク質の正しい改変とプロセシングを確実なものとするために、適切な細胞系統もしくは宿主系を選択することができる。この目的のために、一次転写産物の適切なプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を備えている真核生物宿主細胞を用いることができる。そのような哺乳動物細胞としては、限定するものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、および特に、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０、およびＴ４７Ｄなどの乳癌細胞系統、ならびに、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなどの正常乳腺細胞系統が含まれる。
【０１８７】
組換えタンパク質の長期間にわたる、高収率の産生には安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞系統を作製することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを用いるよりは、宿主細胞を適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、その他）で制御されるＤＮＡおよび選択マーカーで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後に、遺伝子操作された細胞を栄養素を添加した培地中で１〜２日間増殖させることができ、次いで選択培地に転換する。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する抵抗性を付与し、細胞がその染色体中に組換えプラスミドを安定に組み入れて、増殖して細胞巣を形成することができ、それが次いで細胞系統中へのクローン化および細胞数の増加を行うことができる。この方法は抗体分子を発現する細胞系統を遺伝子操作するために有利に用いることができる。そのような遺伝子操作された細胞系統は、該抗体分子と直接的もしくは間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価に特に有用でありうる。
【０１８８】
多数の選択系を用いることができるが、そのようなものとしては、限定するものではないが、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら， Ｃｅｌｌ １１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＳｚｙｂａｌｓｋａとＳｚｙｂａｌｓｋｉ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら， Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））遺伝子を、それぞれｔｋ−細胞、ｈｇｐｒｔ−細胞、ａｐｒｔ−細胞中で用いることができる。また、代謝拮抗物質に対する抵抗性を下記の遺伝子についての選択の基準として用いることができる：ｄｈｆｒ、これはメトトレキセートに対する抵抗性を付与する（Ｗｉｇｌｅｒら， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：３５７（１９８０）； Ｏ’Ｈａｒｅら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：１５２７（１９８１））； ｇｐｔ、これはミコフェノール酸に対する抵抗性を付与する（ＭｕｌｌｉｇａｎとＢｅｒｇ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ、これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗性を付与する（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５； ＷｕとＷｕ， Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ， ３：８７−９５（１９９１）； Ｔｏｓｔｏｓｈｅｖ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ３２：５７３−５９６（１９９３）； Ｍｕｌｌｉｇａｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）； およびＭｏｒｇａｎとＡｎｄｅｒｓｏｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２：１９１−２１７（１９９３）； Ｍａｙ， １９９３， ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３））；ならびにｈｙｇｒｏ、これはハイグロマイシンに対する抵抗性を付与する（Ｓａｎｔｅｒｒｅら， Ｇｅｎｅ ３０：１４７（１９８４））。組換えＤＮＡ技術の業界で一般的に知られている方法を所望の組換えクローンを選択するために日常的に適用することができ、そのような方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編， 「分子生物学の今日のプロトコール」”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”　Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ（１９９３）； Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， 「遺伝子導入および発現、実験室マニュアル」”Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ（１９９０）； およびＤｒａｃｏｐｏｌｉら編， 「ヒト遺伝学の今日のプロトコール」”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ” Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ＮＹ（１９９４）の第１２章と１３章； Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １５０：１（１９８１）に記載されているが、これらはその全体を本明細書に参照により組み入れる。
【０１８９】
抗体分子の発現レベルはベクターの増幅によって増加させることができる（総説として、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎとＨｅｎｔｓｃｈｅｌ， 「ＤＮＡクローニングにおける、哺乳動物細胞中でのクローニングされた遺伝子の発現のための遺伝子増幅に基づくベクターの使用」”Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ” 第３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８７）参照）。抗体を発現しているベクター系中のマーカーが増幅可能なものである場合には、宿主細胞の培養液中に存在するインヒビターのレベルを増加させると、マーカー遺伝子のコピー数の増加が起こる。その増幅される領域は抗体遺伝子を伴っているものであるので、抗体の産生も増加することとなる（Ｃｒｏｕｓｅら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：２５７（１９８３）。
【０１９０】
グルタミンシンターゼ（ＧＳ）もしくはＤＨＦＲを選択マーカーとして用いるベクターは、それぞれメチオニンスルホキシミン、もしくはメトトレキセートの存在下で増幅することができる。グルタミンシンターゼをベースとするベクターの利点はグルタミンシンターゼを持たない細胞系統（例えば、マウス骨髄腫細胞系統、ＮＳＯ）が利用できることである。グルタミンシンターゼ発現系はまた、グルタミンシンターゼを発現している細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）中でも、内因性の遺伝子が機能することを妨げる追加のインヒビターを提供することによって機能することができる。グルタミンシンターゼの発現系およびその系の構成成分については、次のＰＣＴ公開に詳述されている：ＷＯ８７／０４４６２； ＷＯ８６／０５８０７： ＷＯ８９／０１０３６； ＷＯ８９／１０４０４； およびＷＯ９１／０６６５７、これらはその全体を本明細書に参照により組み入れる。さらに、本発明に従って用いることのできるグルタミンシンターゼ発現系は、供給業者から市販されており、それらとしては例えば、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ， 米国ニューハンプシャー州）が含まれる。マウスの骨髄腫細胞におけるＧＳ発現系を用いたモノクローナル抗体の発現と産生については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら， Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９（１９９２）およびＢｉｂｌｉａとＲｏｂｉｎｓｏｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． １１：１（１９９５）中に記載されており、これらはその全体を本明細書に参照により組み入れる。
【０１９１】
宿主細胞は本発明の２つの発現ベクター、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターで同時にトランスフェクトすることができる。その２つのベクターは同一の選択マーカーを含んでいるものとすることができ、それによって重鎖のポリペプチドと軽鎖のポリペプチドとの等量の発現が可能となる。あるいは、重鎖と軽鎖のポリペプチドの双方をコードし、双方を発現することのできる単一のベクターを用いることができる。そのような状況においては、毒性のある遊離の重鎖が過剰となることを避けるために軽鎖は重鎖の前に置かれる必要がある（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ， Ｎａｔｕｒｅ ３２２：５２（１９８６）； Ｋｏｈｌｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７７：２１９７（１９８０））。重鎖および軽鎖をコードする配列はｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡを含んでなるものとすることができる。
【０１９２】
本発明の抗体分子が、動物、化学的合成、もしくは組換えたものの発現によって産生されてからは、その抗体を、免疫グロブリン分子の精製のための方法として当業界で公知の方法の何らかのものを用いて、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、特にプロテインＡでのアフィニティーの後に特異的抗原を用いたアフィニティーを行うこと、分子サイズのカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度、もしくはタンパク質の精製のためのその他の標準的な技法の何らかのものを用いて、精製することができる。さらに、治療用タンパク質に結合し本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる抗体、もしくはそのフラグメントは本明細書に記載の異種のポリペプチド配列、もしくは当業界で既知のその他のポリペプチドと、精製を容易なものとするために融合させることができる。
【０１９３】
抗体の修飾
治療用タンパク質またはその断片もしくは変異体を結合する抗体は、精製を容易にするために、マーカー配列、例えばペプチドなどと融合させることができる。好ましい実施形態においては、マーカーアミノ酸配列は、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， 米国カリフォルニア州 ９１３１１）中で提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、多数のものが市販されている。Ｇｅｎｔｚら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）が述べているとおり、例えば、ヘキサヒスチジンにより融合タンパク質の精製が都合よく行える。精製に有用なその他のペプチドタグとしては、限定するものではないが、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質由来のエピトープに対応するものである「ＨＡ」タグ（Ｗｉｌｓｏｎら， Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））、および「ｆｌａｇ」タグが含まれる。
【０１９４】
本発明はさらに、診断薬もしくは治療薬とコンジュゲートさせた抗体もしくは抗体のフラグメントを包含する。その抗体は、例えばある治療計画の有効性を決定するための臨床的検査手法の一部として、腫瘍の発達もしくは進行をモニターするための診断用途に用いることができる。検出は、その抗体を検出可能な物質とカップリングさせることによって容易なものとすることができる。検出可能な物質の例としては、各種の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、放射活性物質、種々の陽電子放射断層撮影に用いる陽電子放射金属、および非放射性常磁性金属イオンが挙げられる。検出可能な物質は、抗体（もしくはそのフラグメント）と直接的に、もしくは中間物（例えば、当業界では既知のリンカーなど）を介して間接的に、当業界では既知の技法を用いてカップルもしくはコンジュゲートさせることができる。例えば、本発明に従って診断用として用いるために抗体とコンジュゲートされうる金属イオンについては、米国特許第４，７４１，９００号を参照されたい。適切な酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、もしくはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子団の複合体としては、ストレプトアビジン／ビオチン、およびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、もしくはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としてはルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、もしくは９９Ｔｃが挙げられる。その他の検出可能な物質の例は本明細書の別のところに述べている。
【０１９５】
さらに、本発明の抗体は、細胞毒、例えば細胞増殖抑制剤もしくは細胞破壊剤、治療用剤、または例えば２１３Ｂｉなどのα線放射体などの放射性金属イオンとコンジュゲートさせることができる。細胞毒もしくは細胞傷害剤には細胞にとって有害ないかなる作用物をも含む。例としては、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトザントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシンおよびそれらの類似体もしくは相同体が挙げられる。治療用剤としては、限定するものではないが、代謝拮抗剤（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロルエタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロソスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、およびｃｉｓ−ジクロロジアミンプラチナム（ＩＩ）（ＤＤＰ シスプラチン））、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前はダウノマイシンと呼ばれていた）、およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシンと呼ばれていた）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
【０１９６】
本発明のコンジュゲートは与えられた生物学的応答を調節するために用いることができ、該治療用剤もしくは薬剤部分は古典的な化学的治療用剤に限定されるものと見なすべきではない。例えば、該薬剤部分は所望の生物活性を有するタンパク質もしくはポリペプチドとすることができる。そのようなタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素や；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノゲンアクチベーター、アポトーシス剤たとえばＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開ＷＯ９７／３３８９９を参照されたい）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開ＷＯ９７／３４９１１を参照）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら， Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開ＷＯ９９／２３１０５を参照）などのタンパク質、血栓形成剤もしくは例えばアンジオスタチンまたはエンドスタチンなどの血管新生抑制剤、；または例えば、リンフォカイン、インターロイキン−１（”ＩＬ−１”）、インターロイキン−２（”ＩＬ−２”）、インターロイキン−６（”ＩＬ−６”）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（”ＧＭ−ＣＳＦ”）、顆粒球コロニー刺激因子（”Ｇ−ＣＳＦ”）、もしくはその他の成長因子などの生物学的応答調節剤が含まれる。
【０１９７】
抗体は固体の支持体に付着させることもでき、それはイムノアッセイもしくは標的抗原の精製には特に有用である。そのような固体支持体としては、限定するものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、もしくはポリプロピレンが含まれる。
【０１９８】
このような治療用のものと抗体とをコンジュゲートさせるための技法はよく知られている。例えば、Ａｒｎｏｎら， 「癌の治療における薬剤のイムノターゲッティングのためのモノクローナル抗体」”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”（「モノクローナル抗体と癌治療」”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”中の記載， Ｒｅｉｓｆｅｌｄら編， ｐｐ２４３−２５６（Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ． １９８５）； Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら）；「薬剤送達のための抗体」”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”（「制御された薬剤の送達」”Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ”（第２版）中の記載， Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、ｐｐ．６２３−６５３， （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｉｎｃ． １９８７））；Ｔｈｏｒｐｅ， 「癌治療における細胞傷害剤の抗体キャリアー：総説」” Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃａｒｒｉｅｒｓ Ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”（「モノクローナル抗体 ’８４：生物学的および臨床的応用」”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”中の記載， Ｐｉｎｃｈｅｒａら編，　ｐｐ．４７５−５０６（１９８５））； 「癌治療における放射性標識抗体の治療での使用の分析、結果、および将来の見通し」”Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｒｅｓｕｌｔｓ， Ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｏｆ Ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ Ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”（「癌の検出と治療のためのモノクローナル抗体」”Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ”中の記載， Ｂａｌｄｗｉｎら編、ｐｐ．３０３−３１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９８５））、ならびにＴｈｏｒｐｅら， 「抗体−毒素コンジュゲートの調製および細胞傷害性」”Ｔｈｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ”， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ６２：１１９−１５８（１９８２）を参照されたい。
【０１９９】
あるいはまた、Ｓｅｇａｌらが米国特許第４，６７６，９８０号で述べているように（これはその全体を本明細書中に参照により組み入れる）、抗体を二次抗体とコンジュゲートさせて抗体のヘテロコンジュゲートを形成することができる。
【０２００】
抗体にコンジュゲートされた治療用部分を有する、もしくは有さない抗体を単独で、もしくは細胞傷害性因子および／もしくはサイトカインと組み合わせて治療剤として用いることができる。
【０２０１】
抗体−アルブミンの融合
治療用タンパク質に結合し本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応しうる抗体としては、限定するものではないが、表１の「治療用タンパク質Ｘ」列に開示されている治療用タンパク質、またはその断片もしくは変異体と結合する抗体が含まれる。
【０２０２】
特別な実施形態においては、治療用タンパク質と免疫特異的に結合し、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する、抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＨドメインを含んでなるか、もしくはＶＨドメインから構成されている。他の実施形態においては、治療用タンパク質と免疫特異的に結合し、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する、抗体のフラグメントもしくは変異体は、１、２、もしくは３個のＶＨ ＣＤＲを含んでなるか、または１、２、もしくは３個のＶＨ ＣＤＲから構成されている。他の実施形態においては、治療用タンパク質と免疫特異的に結合し、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する、抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＨ ＣＤＲ１を含んでなるか、もしくはＶＨ ＣＤＲ１から構成されている。他の実施形態においては、治療用タンパク質と免疫特異的に結合し、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する、抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＨ ＣＤＲ２を含んでなるか、もしくはＶＨ ＣＤＲ２から構成されている。他の実施形態においては、治療用タンパク質と免疫特異的に結合し、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する、抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＨ ＣＤＲ３を含んでなるか、もしくはＶＨ ＣＤＲ３から構成されている。
【０２０３】
特別な実施形態においては、治療用タンパク質と免疫特異的に結合し、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する、抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＬドメインを含んでなるか、もしくはＶＬドメインから構成されている。他の実施形態においては、治療用タンパク質と免疫特異的に結合し、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する、抗体のフラグメントもしくは変異体は、１、２、もしくは３個のＶＬ ＣＤＲを含んでなるか、または１、２、もしくは３個のＶＬ ＣＤＲから構成されている。他の実施形態においては、治療用タンパク質と免疫特異的に結合し、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する、抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＬ ＣＤＲ１を含んでなるか、もしくはＶＬ ＣＤＲ１から構成されている。他の実施形態においては、治療用タンパク質と免疫特異的に結合し、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する、抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＬ ＣＤＲ２を含んでなるか、もしくはＶＬ ＣＤＲ２から構成されている。他の実施形態においては、治療用タンパク質と免疫特異的に結合し、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する、抗体のフラグメントもしくは変異体は、ＶＬ ＣＤＲ３を含んでなるか、もしくはＶＬ ＣＤＲ３から構成されている。
【０２０４】
他の実施形態においては、治療用タンパク質と免疫特異的に結合し、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する、抗体のフラグメントもしくは変異体は、１、２、３、４、５、もしくは６個のＶＨおよび／もしくはＶＬ ＣＤＲを含んでなるか、または１、２、３、４、５、もしくは６個のＶＨおよび／もしくはＶＬ ＣＤＲから構成されている。
【０２０５】
好ましい実施形態においては、治療用タンパク質と免疫特異的に結合し、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する、抗体のフラグメントもしくは変異体は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３などのペプチドリンカーによって治療用タンパク質のＶＬドメインと連結された、治療用タンパク質のＶＨドメインを含んでなるｓｃＦｖを含んでなるか、またはそのｓｃＦｖから構成されている（配列番号３６）。
【０２０６】
免疫表現型の分類
本発明の抗体、または、治療用タンパク質（またはその断片もしくは変異体）と結合する抗体のフラグメントもしくは変異体を少なくとも含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質は細胞系統および生物学的サンプルの免疫表現型の分類のために用いることができる。本発明の治療用タンパク質は細胞特異的マーカー、より詳細には、特定の細胞タイプの分化および／もしくは成熟の種々のステージで差のある発現がなされる細胞性マーカーとしておそらく有用であろう。特定のエピトープ、もしくはエピトープの組み合わせに対して作製されたモノクローナル抗体（または治療用タンパク質と結合する抗体のフラグメントもしくは変異体を少なくとも含んでなるアルブミン融合タンパク質）は、そのマーカーを発現している細胞集団のスクリーニングを可能とする。モノクローナル抗体（または治療用タンパク質と結合する抗体のフラグメントもしくは変異体を少なくとも含んでなるアルブミン融合タンパク質）を用いてマーカーを発現している細胞集団のスクリーニングを行うためには、種々の技法を用いることができ、そのような技法としては、抗体をコートした磁性ビーズを用いる磁気分離法、固体マトリクス（すなわち、プレート）へ付着させた抗体を用いた「パンニング」、およびフローサイトメトリーが含まれる（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号； Ｍｏｒｒｉｓｏｎら， Ｃｅｌｌ ９６：７３７−７４９（１９９９）を参照されたい）。
【０２０７】
これらの技法は、例えば血液の悪性腫瘍（すなわち、急性白血病患者における微少残存病変）で認められうる特定の細胞集団や、移植において移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するための「非自己」細胞のスクリーニングを可能とする。あるいはまた、これらの技法は、ヒトの臍帯血中に認められうるような、増殖および／もしくは分化を行うことのできる造血系の幹細胞および前駆細胞のスクリーニングを可能とする。
【０２０８】
治療用タンパク質と結合する抗体、ならびに、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質の特性決定
本発明の抗体、または、少なくとも、治療用タンパク質（あるいは、その断片または変異体）と結合する抗体の断片もしくは変異体を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質の特性決定は多様な方法で実施することができる。特に、少なくとも、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質は、本明細書に記載する技法、あるいは、当業者には公知である技法を慣例的に変更して使用することにより、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分と結合する抗体に対応する治療用タンパク質と結合する抗体により、特異的に結合された同じ抗原に、特異的に結合する能力について、アッセイすることができる。
【０２０９】
本発明の抗体、または、少なくとも、治療用タンパク質（あるいは、その断片または変異体）と結合する抗体の断片もしくは変異体を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質が、特定のタンパク質またはエピトープと（特異的に）結合する能力についてのアッセイは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２−４２１（１９９２））、ビーズ上（例えば、Ｌａｍ， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４（１９９１））、チップ上（例えば、Ｆｏｄｏｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５−５５６（１９９３））で、ならびに、細菌（例えば、米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（例えば、特許第５，５７１，６９８号；第５，４０３，４８４号；および第５，２２３，４０９号）、プラスミド（例えば、Ｃｕｌｌら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１８６５−１８６９（１９９２））またはファージ（例えば、ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０（１９９０）；Ｄｅｖｌｉｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６ （１９９０）；Ｃｗｉｒｌａら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２（１９９０）；およびＦｅｌｉｃｉ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２：３０１−３１０（１９９１））（これら参照文献の各々は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる）で実施することができる。加えて、本発明の抗体、または、少なくとも、治療用タンパク質（あるいは、その断片または変異体）と結合する抗体の断片もしくは変異体を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質は、本明細書に記載する、もしくは当業者には公知である技法を用いて、あるいは、これらを通常に変更して、特定のタンパク質またはエピトープに対する特異性およびアフィニティーについて、アッセイすることも可能である。
【０２１０】
少なくとも、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質は、当業者には公知のあらゆる方法を用いて、他の抗原（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質（あるいは、その断片または変異体）と結合する抗体により、特異的に結合された分子と配列／構造保存性を有する分子）との交差反応性について、アッセイすることができる。
【０２１１】
（免疫特異的）結合および交差反応を分析するのに用いることができる免疫アッセイとして、限定するものではないが、ウエスタンブロット、放射免疫アッセイ法、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソルベントアッセイ法）、「サンドイッチ」免疫アッセイ法、免疫沈降アッセイ法、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ法、凝集アッセイ法、補体結合アッセイ法、免疫放射線アッセイ法、蛍光免疫アッセイ法、ならびに、プロテインＡ免疫アッセイ法などの技法を用いた競合的および非競合的アッセイ系が挙げられ、他にも多数ある。このようなアッセイは、通常の方法であり、当技術分野ではよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， ニューヨークを参照。尚、この文献は、参照により全文を本明細書に組み込む）。例示的免疫アッセイについて、以下に簡単に説明する（ただし、限定を意図するものではない）。
【０２１２】
免疫沈降プロトコルは一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を補充したＲＩＰＡバッファー（１％ ＮＰ−４０またはトリトンＸ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ＳＤＳ、０．１５ Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ ７．２の０．０１ Ｍリン酸ナトリウム、１％トラシロール（Ｔｒａｓｙｒｏｌ））のような溶解バッファー中で細胞の集団を溶解させ、この細胞溶解物に、本発明の抗体、または、少なくとも、治療用タンパク質（あるいは、その断片または変異体）と結合する抗体の断片もしくは変異体を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質を添加し、所定時間（例えば、１〜４時間）４０℃でインキュベートし、上記細胞溶解物に、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズ（あるいは、少なくとも、治療用抗体の断片または変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質の場合には、適当な抗イディオタイプ抗体または抗アルブミン抗体でコーティングしたビーズ）を添加し、約１時間以上の間４０℃でインキュベートし、溶解バッファー中のビーズを洗浄した後、該ビーズをＳＤＳ／サンプルバッファー中で再懸濁させることを含む。本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質が、特定の抗原を免疫沈降させる能力は、例えば、ウエスタンブロット分析によりアッセイすることができる。当業者であれば、抗体またはアルブミン融合タンパク質と抗原との結合を増加させたり、バックグラウンドを減少させたりする（例えば、セファロースビーズを含むセル溶解物を前浄化する）のに改変することができるパラメーターについては十分な知識を備えているであろう。免疫沈降プロトコルに関してさらに詳しくは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， （ニューヨーク）の１０．１６．１を参照されたい。
【０２１３】
ウエスタンブロット分析は一般に、タンパク質サンプルを作製し、該タンパク質サンプルをポリアクリルアミドゲル（例えば、抗原の分子量に応じて８％〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）中で電気泳動させ、ポリアクリルアミドゲルからタンパク質サンプルを、ニトロセルロース、ＰＶＤＦまたはナイロンなどの膜に転写し、該膜をブロッキング溶液（例えば、３％ＢＳＡを含むＰＢＳまたは無脂肪乳）中でブロッキングし、洗浄バッファー（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ２０）で膜を洗浄し、本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質（ブロッキングバッファーで希釈）を上記膜に塗布し、洗浄バッファーで膜を洗浄してから、ブロッキングバッファー中に希釈された、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）もしくは放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）に結合した二次抗体（上記アルブミン融合タンパク質を認識するもので、例えば、抗ヒト血清アルブミン抗体）を塗布した後、洗浄バッファーで膜を洗浄して、上記抗体の存在を検出することからなる。当業者であれば、検出しようとするシグナルを増加させたり、バックグラウンドノイズを減少させたりするために変更することができるパラメーターについては熟知しているであろう。ウエスタンブロットプロトコルに関してさらに詳しくは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， （ニューヨーク）の１０．８．１を参照されたい。
【０２１４】
ＥＬＩＳＡは、抗原を作製し、９６−ウェルマイクロプレートのウェルを該抗原でコーティングし、ウェルに結合しなかった抗原を洗い流し、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物に結合した本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質（少なくとも、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含んでなる）を上記ウェルに添加し、次に、所定時間インキュベートして、非結合の、もしくは非特異的に結合したアルブミン融合タンパク質を洗い流した後、抗体をコーティングしたウェルに特異的に結合した抗体またはアルブミン融合タンパク質の存在を検出することからなる。ＥＬＩＳＡでは、抗体またはアルブミン融合タンパク質は、必ずしも検出可能な化合物に結合する必要はなく、その代わりに、検出可能な化合物に結合された二次抗体（これが、抗体またはアルブミン融合タンパク質をそれぞれ認識する）をウェルに添加してもよい。さらに、ウェルを抗原でコーティングするのではなく、抗体またはアルブミン融合タンパク質でコーティングしてもよい。この場合、検出可能な分子は、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出可能な化合物にコンジュゲートした抗体でよい。当業者であれば、検出しようとするシグナルを増加するために変更することができるパラメーターや、その他、当技術分野では公知のＥＬＩＳＡの変更事項については、熟知しているであろう。ＥＬＩＳＡに関してさらに詳しくは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， 第１巻、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， （ニューヨーク）の１１．２．１を参照されたい。
【０２１５】
タンパク質、抗原またはエピトープに対するアルブミン融合タンパク質の結合アフィニティー、ならびに、抗体−またはアルブミン融合タンパク質−タンパク質／抗原／エピトープ相互作用のオフ比率（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）は、競合結合アッセイにより測定することができる。競合結合アッセイの一例として、放射免疫アッセイがあり、これは、量が増加する非標識抗原の存在下で、本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質と一緒に、標識抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）をインキュベートし、標識抗原と結合した抗体を検出することからなる。特定のタンパク質、抗原またはエピトープに対する本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質のアフィニティー、ならびに、結合オフ（ｂｉｎｄｉｎｇ−ｏｆｆ）率は、スキャッチャードプロット分析によるデータから決定することができる。上記抗体またはアルブミン融合タンパク質と同じタンパク質、抗原またはエピトープと結合する二次タンパク質との競合も、放射免疫アッセイを用いて、決定することができる。この場合、本発明のアルブミン融合タンパク質と同じタンパク質、抗原またはエピトープと結合する非標識二次タンパク質の量を増加させながら、その存在下で、標識化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）に結合した本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質と一緒に、タンパク質、抗原またはエピトープをインキュベートする。
【０２１６】
好ましい実施形態では、ＢＩＡコア速度論的分析を用いて、タンパク質、抗原またはエピトープに対する本発明の抗体またはアルブミン融合タンパク質の結合オンおよびオフ率を決定することができる。ＢＩＡコア速度論的分析は、特定のポリペプチド、抗原またはエピトープ、抗体もしくはアルブミン融合タンパク質をそれぞれ表面に固定化したチップから、抗体、アルブミン融合タンパク質、もしくは特定のポリペプチド、抗原またはエピトープの結合および解離を分析することからなる。
【０２１７】
治療用途
本発明はさらに、本発明の抗体、または、少なくとも、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を、動物、好ましくは、哺乳動物、ならびに、最も好ましくは、ヒトの患者に投与することにより、開示された疾患、障害または病状のいずれか１つ以上を治療することを含んでなる、抗体に基づく治療法に関する。本発明の治療化合物として、限定するものではないが、本発明の抗体（本明細書に記載するように、その断片、類似体および誘導体を含む）、本発明の抗体（本明細書に記載するように、その断片、類似体および誘導体、ならびに、抗イディオタイプ抗体を含む）をコードする核酸、少なくとも、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質、ならびに、このようなアルブミン融合タンパク質をコードする核酸が挙げられる。本発明の抗体、または少なくとも治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて、治療用タンパク質の異常発現および／または活性に関連する疾患、障害または病状（限定するものではないが、本明細書に開示された疾患、障害または病状のいずれか１つ以上）を治療、抑制または予防することができる。治療用タンパク質の異常発現および／または活性に関連する疾患、障害または病状の治療または予防には、限定するものではないが、これら疾患、障害または病状に関連する症状の軽減が含まれる。本発明の抗体、または、少なくとも、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、当技術分野では公知の、あるいは、本明細書に記載するような製薬上許容される組成物として提供することができる。
【０２１８】
特定の好ましい実施形態では、本発明は、本発明の抗体、または、少なくとも、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を、動物、好ましくは、哺乳動物、ならびに、最も好ましくは、ヒトの患者に投与することにより、限定するものではないが、：神経疾患、免疫系疾患、筋疾患、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心臓血管障害、腎障害、増殖障害、および／または癌性疾患および病状、ならびに、本明細書に記載した疾患、障害または病状のうちいずれか１つ以上の疾患、障害または病状を治療することを含む、抗体に基づく治療法に関する。本発明の治療化合物としては、限定するものではないが、本発明の抗体（例えば、哺乳動物細胞の細胞表面で発現される全長タンパク質に対する抗体；治療用タンパク質のエピトープに対する抗体）や、本発明の抗体（本明細書に記載するように、その断片、類似体および誘導体、ならびに、抗イディオタイプ抗体を含む）をコードする核酸が挙げられる。本発明の抗体を用いて、治療用タンパク質の異常発現および／または活性に関連する疾患、障害または病状（限定するものではないが、本明細書に開示された疾患、障害または病状のいずれか１つ以上を含む）を治療、抑制または予防することができる。治療用タンパク質の異常発現および／または活性に関連する疾患、障害または病状の治療および／または予防には、限定するものではないが、これら疾患、障害または病状に関連する症状の軽減が含まれる。本発明の抗体、または、少なくとも、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、当業者には公知の、あるいは、本明細書に記載するような製薬上許容される組成物として提供することができる。
【０２１９】
本発明の抗体、または、少なくとも、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を治療に用いることができる方法には、身体の局所もしくは全身における、あるいは、例えば、補体（ＣＤＣ）またはエフェクター細胞（ＡＤＣＣ）により媒介されるような、抗体の直接細胞傷害性による、治療用タンパク質の結合が含まれる。これら手法のいくつかについては、以下にさらに詳細に記載する。本明細書に記載する教示から、当業者であれば、過度の実験を必要とせずに、診断、モニタリングまたは治療目的のため、いかにして、本発明の抗体、または、少なくとも、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を用いるかがわかるであろう。
【０２２０】
本発明の抗体、または、少なくとも、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、その他のモノクローナルまたはキメラ抗体、もしくはリンホカインまたは造血増殖因子（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−７）と組み合わせて用いるのが有利である。これらは、例えば、抗体と相互作用するエフェクター細胞の数または活性を増加する働きをする。
【０２２１】
本発明の抗体、または、少なくとも、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、単独で、あるいは、その他の種類の治療（例えば、放射線治療、化学療法、ホルモン療法、免疫療法および抗腫瘍薬）と組み合わせて投与してもよい。一般に、患者と同じ種の供給源および反応性（抗体の場合）の産物を投与するのが好ましい。従って、好ましい実施形態では、ヒトの患者の治療または予防のためには、ヒト抗体、断片誘導体、類似体または核酸を投与する。
【０２２２】
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（その断片を含む）に対する免疫アッセイ、あるいは、これらに関連する障害の治療の両方を目的として、治療用タンパク質に対する、ｉｎ ｖｉｖｏで高アフィニティーおよび／または強力な阻害抗体および／または中和抗体、その断片もしくは領域、（あるいは、このような抗体のアルブミン融合タンパク質相関物）を用いるのが好ましい。このような抗体、断片または領域は、好ましくは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド（その断片も含む）に対するアフィニティーを有する。好ましい結合アフィニティーとして、５ Ｘ １０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５ Ｘ １０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５ Ｘ １０−４Ｍ、１０−４Ｍより小さい解離定数すなわちＫｄが挙げられる。さらに好ましい結合アフィニティーとしては、５ Ｘ １０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５ Ｘ １０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５ Ｘ １０−７Ｍ、１０７Ｍ、５ Ｘ １０−８Ｍもしくは１０−８Ｍより小さい解離定数すなわちＫｄが挙げられる。さらにまた好ましい結合アフィニティーとしては、５ Ｘ １０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５ Ｘ １０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５ Ｘ １０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５ Ｘ １０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５ Ｘ １０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５ Ｘ １０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５ Ｘ １０−１５Ｍ、１０−１５Ｍより小さい解離定数すなわちＫｄが挙げられる。
【０２２３】
遺伝子治療
特定の実施形態では、治療用タンパク質と結合する抗体、または、少なくとも、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質をコードする配列を含む核酸を投与することにより、遺伝子治療として、治療用タンパク質の異常発現および／または活性に関連する疾患もしくは障害を治療、抑制または予防することができる。遺伝子治療とは、発現された、あるいは、発現可能な核酸の被検体に対する投与により実施される治療を意味する。本発明のこの実施形態では、核酸は、それがコードするタンパク質を生産し、このタンパク質が、治療効果を媒介する。
【０２２４】
当技術分野で利用可能な遺伝子治療の方法のいずれを本発明に従い用いてもよい。この方法の例を本明細書で詳細に説明する。
【０２２５】
治療または予防活性の証明
本発明の化合物もしくは医薬組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで試験し、次に、ヒトに使用する前に、所望の治療または予防活性についてｉｎ ｖｉｖｏで試験するのが好ましい。例えば、化合物もしくは医薬組成物の治療または予防への有用性を証明するｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイには、化合物または組成物が細胞系または組織サンプルに及ぼす影響に関するアッセイが含まれる。化合物が細胞系または患者組織サンプルに及ぼす影響は、当業者には公知の技法を用いて決定することができ、このような方法として、限定するものではないが、ロゼット形成アッセイや細胞溶解アッセイがある。本発明に従い、特定の化合物の投与が指示されているかどうかを決定するのに使用できるｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイとしては、患者組織サンプルを培地で増殖させ、化合物に暴露するかあるいは化合物を投与した後、このような化合物が組織サンプルに及ぼす影響を観察するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイがある。
【０２２６】
治療／予防上の投与および組成物
本発明は、有効量の本発明の化合物または医薬組成物、好ましくは、抗体を被験者に投与することによる、治療、阻害および予防方法を提供する。好ましい実施形態では、化合物は実質的に純水である（例えば、その効果を制限する、あるいは、不要な副作用を生じる物質を実質的に含まない）。被験者は、好ましくは、動物であり、そのような動物として、限定するものではないが、雌牛、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌなどの動物が挙げられ、好ましくは、哺乳動物であり、最も好ましくは、ヒトである。
【０２２７】
化合物が、核酸またはイムノグロブリンを含むとき、用いることができる製剤および投与方法は、前述の通りであり、それ以外の好適な製剤および投与経路は、以下に記載するものから選択することができる。
【０２２８】
様々な送達系が知られており、これらを用いて、本発明の化合物を投与することができ、例えば、リポソームでの被包、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、ＷｕおよびＷｕ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２：４４２９−４４３２（１９８７））、レトロウイルスまたはその他のベクターの一部としての核酸の構築などが挙げられる。導入方法としては限定するものではないが、内皮、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜内、および経口経路が挙げられる。化合物または組成物は、あらゆる好適な経路、例えば、注入もしくはボーラス注射により、上皮もしくは粘膜皮膚ライニング（例えば、口粘膜、直腸および腸粘膜など）からの吸収により投与することができ、また、その他の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することもできる。投与は、全身または経口経路のいずれでもよい。加えて、心室内やクモ膜下腔内注入などの好適な経路により、中枢神経系に本発明の医薬化合物または組成物を導入するのが望ましい。心室内注入は、例えば、オマヤレザバーのようなレザバーに取り付けた心室内カテーテルにより、容易にすることができる。肺投与は、例えば、吸入器またはネブライザー、ならびに、エーロゾル剤を含む製剤を用いて、実施することができる。
【０２２９】
特定の実施形態では、治療を必要とする部位に局所的に本発明の医薬化合物または組成物を投与することが望ましい。これは、限定するものではないが、例えば、手術中の局所注入、局所適用（例えば、手術後の創傷包帯と併用して）、注射、カテーテルの使用、座薬の使用、もしくは移植片の使用により、達成することができる。尚、この移植片は、シアラステッィク（ｓｉａｌａｓｔｉｃ）膜のような膜または線維などの多孔質、非孔質、もしくはゼラチン質材料からなる。好ましくは、本発明のタンパク質（抗体など）を投与する際、該タンパク質が吸収しない材料を用いるよう注意しなければならない。
【０２３０】
別の実施形態では、化合物または組成物は、小胞、特にリポソームに送達することができる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ， ニューヨーク州、ｐｐ． ３５３−３６５（１９８９）；Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ、同書、ｐｐ．３１７−３２７を参照のこと；概要は同書参照）。
【０２３１】
また別の実施形態では、化合物または組成物は、制御放出系で伝達することができる。一実施形態では、ポンプを用いることができる（例えば、Ｌａｎｇｅｒ、前掲；Ｓｅｆｔｏｎ， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１：５７４（１９８９）を参照）。別の実施形態では、ポリマー材料を用いることができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ， ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， フロリダ州（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ， Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ， ニューヨーク州（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ， Ｊ．， Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｓｃｉ． Ｒｅｖ． Ｍａｃｒｏｍｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２３：６１（１９８３）；Ｌｅｖｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０（１９８５）を参照；Ｄｕｒｉｎｇら、Ａｎｎ． Ｎｅｕｒｏｌ． ２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄら、Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ． ７１：１０５（１９８９））。さらに別の実施形態では、制御放出系を治療標的、例えば、脳の近傍に配置することができるため、全身用量の一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ， Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｉｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ、前掲、第２巻、ｐｐ． １１５−１３８（１９８４）を参照）。
【０２３２】
その他の制御放出系については、Ｌａｎｇｅｒによる論文に記載されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０））。
【０２３３】
本発明の化合物が、タンパク質をコードする核酸である特定の実施形態では、好適な核酸発現ベクターの一部としてこの核酸を構築し、ｉｎ ｖｉｖｏで投与して、それがコード化したタンパク質の発現を促進することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ投与は、例えば、レトロウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号）を用いて、または直接注射により、もしくは微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子ガン；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、デュポン）を用いて、あるいは、脂質または細胞表面受容体もしくはトランスフェクト剤でコーティングして、あるいはまた、核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチド（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１８６４−１８６８（１９９１））などと連結させて、これを投与することにより、細胞内に入るようにする。これ以外に、相同的組換えにより、核酸を細胞内に導入したり、発現用の宿主細胞ＤＮＡ内に組み込んだりすることも可能である。
【０２３４】
本発明はまた、医薬組成物を提供する。このような組成物は、治療に有効な量の化合物と、製薬上許容される担体とを含んでなる。特定の実施形態では、「製薬上許容される」とは、連邦または政府の取締り機関、もしくは米国薬局方、あるいは、一般に認識されている薬局方により、動物、さらに具体的にはヒトへの使用が承認されていることを意味する。「担体」という用語は、一緒に治療薬を投与する手段である稀釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを意味する。このような製薬担体は、水や油のような無菌液体であり、石油、動物、植物を供給源とするもの、または合成によるものがあり、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる。医薬組成物を静脈内投与する場合には、水が好ましい担体である。食塩水や、デキストロースおよびグリセロール水溶液も、液体担体、特に注射液用の液体担体として用いることができる。好適な製薬賦形剤として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。所望であれば、上記組成物は、少量の湿潤剤または乳化剤、もしくはｐＨ緩衝剤を含んでいてもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、持続放出製剤などの形態をとりうる。組成物は、伝統的な結合剤や、トリグリセリドのような担体を含む座薬として調製してもよい。経口製剤には、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を含有させることができる。好適な製薬担体の例は、Ｅ． Ｗ． Ｍａｒｔｉｎによる”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。このような組成物は、適量の担体と一緒に、好ましくは、精製された形態で、治療に有効な量の化合物を含有することにより、患者に対する適正な投与形態を達成する。製剤は、投与様式に適したものでなければならない。
【０２３５】
好ましい実施形態では、上記組成物は、ヒトに対する静脈内投与に適合させた医薬組成物として、通常の手順に従い、調製する。典型的には、静脈内投与用の製剤は、無菌等張水性バッファー中の溶液である。必要であれば、この組成物は、可溶化剤や、注射部位での痛みをやわらげるリグノカインのような局所麻酔薬を含んでもよい。一般に、処方成分は、個別にまたは混合して、例えば、活性薬剤の量を示すアンプルまたはサシェットなどの密封した容器中の乾燥した凍結乾燥粉末もしくは無水濃縮物として、単位用量形態で供給される。上記組成物を注入により投与する場合には、無菌製薬グレードの水または食塩水が入った注入瓶を用いて、調剤することができる。組成物を注射により投与する場合には、注射用の無菌水または食塩水が入ったアンプルを提供し、これによって、投与前に処方成分を混合できる。
【０２３６】
本発明の化合物は、中性または塩形態として調製することができる。製薬上許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、蓚酸、酒石酸などから誘導されたようなアニオンとともに形成されたもの、ならびに、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第２鉄、イソプロプイルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのカチオンとともに形成されたものが挙げられる。
【０２３７】
治療用タンパク質の異常発現および／または活性に関連する疾患もしくは障害の治療、抑制および予防に有効な本発明の化合物の量は、標準的臨床技法により決定することができる。加えて、場合によっては、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを、最適用量の範囲の決定に役立てることもできる。また、製剤に用いるべき正確な用量は、投与経路、疾患もしくは障害の重篤度によっても変動し、専門家の判断と、それぞれの患者の状況に応じて決定しなければならない。有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から導き出した用量−応答曲線から推定することができる。
【０２３８】
抗体については、患者に投与する用量は、典型的に、患者の体重１ｋｇあたり０．１ ｍｇ〜１００ ｍｇである。好ましくは、患者に投与する用量は、患者の体重１ｋｇあたり０．１ ｍｇ〜２０ ｍｇ、さらに好ましくは、患者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ ｍｇである。一般に、ヒト抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫応答のために、他の種からの抗体よりもヒトの身体において、長い半減期を有する。従って、ヒト抗体は、前記より用量または投与頻度を低くすることも可能である。さらに、本発明の抗体の用量および投与頻度は、例えば、脂質化などの修飾により抗体の取込みおよび組織透過性（例えば、脳への）を増強することによって、減らすことができる。
【０２３９】
診断およびイメージング
治療用タンパク質（もしくはその断片または変異体）と結合する標識抗体、その誘導体および類似体（少なくとも、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質を含む）を診断の目的に用いて、治療用タンパク質の異常発現および／または活性に関連する疾患、障害および／または病状を検出、診断、またはモニタリングすることができる。本発明は、治療用タンパク質の異常発現の検出を可能にし、これは、（ａ）目的とするポリペプチドに特異的な１以上の抗体を用いて、個体の細胞または体液中の治療用タンパク質の発現をアッセイし、（ｂ）遺伝子発現のレベルを標準的遺伝子発現のレベルと比較することを含んでなり、そして、標準発現レベルと比較して、アッセイした治療用タンパク質発現レベルの増加または減少が、異常発現を示す。
【０２４０】
本発明は、障害を診断するための診断アッセイであって、（ａ）治療用タンパク質に特異的な１以上の抗体、または、少なくとも、治療用タンパク質に特異的な抗体の断片または変異体を含むアルブミン融合タンパク質を用いて、個体の細胞または体液中の治療用タンパク質の発現をアッセイし、（ｂ）遺伝子発現のレベルを標準的遺伝子発現のレベルと比較することを含んでなり、そして、標準発現レベルと比較して、アッセイした治療用タンパク質遺伝子発現レベルの増加または減少が、特定の障害を示す、上記診断アッセイを提供する。癌に関しては、個体から生検した組織における比較的高い量の転写産物の存在が、疾患発生の素因を示す、あるいは、実際の臨床的症状の出現前に疾患を検出する手段を提供すると考えられる。このタイプのさらに決定的な診断により、医療の専門家は、予防措置または攻撃的治療を用いて、より迅速に癌の発生またはさらに進行を予防することができる。
【０２４１】
本発明の抗体、または、少なくとも、治療用タンパク質に特異的な抗体の断片または変異体を含むアルブミン融合タンパク質を用いて、当業者には公知の伝統的免疫組織学的方法（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０５：３０８７−３０９６（１９８７））を用いて、生体サンプルにおけるタンパク質レベルをアッセイすることができる。これ以外にも、タンパク質遺伝子発現を検出するのに有用な抗体に基づく方法として、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）や放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）のような免疫アッセイがある。好適な抗体アッセイ標識は、当技術分野では公知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識；ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）およびテクネチウム（９９Ｔｃ）などの放射性同位元素；ルミノールなどの発光標識；フルオレセインやローダミンのような蛍光標識、ならびに、ビオチンが挙げられる。
【０２４２】
本発明の一形態は、動物、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくは、ヒトにおける、治療用タンパク質の異常発現に関連する疾患もしくは障害の検出および診断である。一実施形態では、診断は、ａ）目的とするポリペプチドに特異的に結合する有効量の標識分子を被験者に投与し（例えば、非経口、皮下もしくは腹腔内に）；ｂ）投与してから、治療用タンパク質を発現させる被験者の部位に、標識分子が優先的に濃縮するように（ならびに、非結合標識分子が、バックグランドレベルまで浄化されるように）しばらく待機し；ｃ）バックグランドレベルを測定し；ｄ）被験者における標識分子を検出することからなり、検出された標識分子がバックグランドレベルより高ければ、被験者は、治療用タンパク質の異常発現に関連する特定の疾患もしくは障害を有する。バックグランドレベルは、検出された標識分子の量を、特定の系について予め測定した標準値と比較するなど、様々な方法により決定することができる。
【０２４３】
当業者であれば被験者の大きさや、用いるイメージング装置に応じて、診断画像の作成に必要な画像化成分の量が決定されることが理解されよう。放射性同位元素成分の場合には、ヒト被験者に対して、注射される放射能の量は、通常約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ ｍＴｃである。その後、標識抗体、抗体断片、あるいは、少なくとも、治療用タンパク質と結合する抗体の断片もしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質は、特異的治療用タンパク質を含む細胞の位置で優先的に蓄積する。ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍イメージングについては、Ｓ．Ｗ． Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、”Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｓ． Ｗ． ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ． Ａ． Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載されている。
【０２４４】
用いた標識の種類および投与様式など、様々な変数に応じて、投与から、被験者における部位に標識分子が優先的に濃縮し、非結合標識分子がバックグランドレベルまで浄化されるまでの時間間隔は、６〜４８時間、または６〜２４時間、もしくは６〜１２時間である。別の実施形態では、投与からの時間間隔は、５〜２０日または５〜１０日である。
【０２４５】
一実施形態では、疾患もしくは障害のモニタリングは、例えば、最初の診断から１ヵ月後、６ヵ月後、１年後等々に、疾患もしくは障害を診断する方法を繰り返すことにより、実施する。
【０２４６】
標識分子の存在は、ｉｎ ｖｉｖｏスキャニングのための当技術分野では公知の方法を用いて、患者において検出することができる。これらの方法は、用いる標識の種類に応じて変わる。当業者であれば、特定の標的を検出するのに適した方法を決定することができるだろう。本発明の診断方法で用いることができる方法および装置としては、限定するものではないが、コンピューター連動断層撮影（ＣＴ）、陽電子射出断層撮影法（ＰＥＴ）のような全身スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、ならびに、超音波検査法が挙げられる。
【０２４７】
特定の実施形態では、上記分子を放射性同位元素で標識した後、放射線応答手術装置（Ｔｈｕｒｓｔｏｎら、米国特許第５，４４１，０５０号）を用いて、患者において検出する。別の実施形態では、この分子を蛍光化合物で標識し、蛍光応答スキャニング装置を用いて、患者において検出する。別の実施形態では、この分子を陽電子放出金属で標識し、陽電子射出断層撮影法を用いて、患者において検出する。さらに別の実施形態では、この分子を常磁性標識で標識し、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を用いて、患者において検出する。
【０２４８】
キット
本発明は、前記方法で用いることができるキットを提供する。一実施形態では、キットは、１以上の容器中に、抗体、好ましくは、精製された抗体を含む。特定の実施形態では、本発明のキットは、キットに含まれる抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含有する実質的に単離されたポリペプチドを含む。好ましくは、本発明のキットは、さらに、目的とするポリペプチドと反応しない対照抗体を含む。別の特定の実施形態では、本発明のキットは、目的とするポリペプチドと抗体の結合を検出する手段を含む（例えば、該抗体は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光化合物などの検出可能な基質に結合する、あるいは、第１の抗体を認識する第２の抗体を、検出可能な基質に結合してもよい）。
【０２４９】
別の特定の実施形態では、本発明のキットは、増殖性および／または癌性ポリヌクレオチドおよびポリペプチドに対して特異的な抗体を含む血清をスクリーニングするのに用いるための診断キットである。このようなキットは、目的とするポリペプチドと反応しない対照抗体を含んでいてもよい。このようなキットは、少なくとも１つの抗ポリペプチド抗原抗体と特異的に免疫反応性であるエピトープを含有する、実質的に単離されたポリペプチド抗原を含む。さらに、このようなキットは、抗原と上記抗体の結合を検出する手段を含む（例えば、該抗体は、フローサイトメトリーにより検出することができるフルオレセインまたはローダミンなどの蛍光化合物に結合することができる）。特定の実施形態では、上記キットは、組換えにより作製された、または化学的に合成されたポリペプチド抗原を含んでいてもよい。また、このキットのポリペプチド抗原は、固体支持体に結合させてもよい。
【０２５０】
さらに具体的な実施形態では、前述のキットの検出手段は、上記ポリペプチド抗原を結合させる固体支持体を含む。このようなキットは、非結合のリポーター標識抗ヒト抗体を含んでいてもよい。この実施形態では、ポリペプチド抗原と抗体の結合は、上記リポーター標識抗体の結合により検出することができる。
【０２５１】
別の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドの抗原を含む血清をスクリーニングするのに用いるための診断キットを含む。この診断キットは、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド抗原と特異的に免疫反応性である、実質的に単離された抗体と、該抗体とポリヌクレオチドまたはポリペプチド抗原の結合を検出する手段とを含む。一実施形態では、抗体を固体支持体に結合させる。特定の実施形態では、上記抗体は、モノクローナル抗体でよい。上記キットの検出手段は、第２の標識モノクローナル抗体を含んでいてもよい。これに代わり、あるいは、これに加えて、上記検出手段は、標識された競合抗原を含んでいてもよい。
【０２５２】
一診断形態では、本発明の方法により得られた表面結合抗原を有する固相試薬と、試験血清を反応させる。特定の抗原抗体を上記試薬と結合させ、洗浄により非結合血清成分を洗浄により除去した後、試薬をリポーター標識抗ヒト抗体と反応させることにより、リポーターを、固体支持体上に結合した抗抗原抗体の量に比例する試薬と結合させる。この試薬を再度洗浄することにより、非結合標識抗体を除去し、試薬と結合するリポーターの量を決定する。典型的には、上記リポーターは酵素であり、この酵素は、適当な蛍光、発光または比色分析基質（Ｓｉｇｍａ、ミズーリ州セントルイス）の存在下で固相をインキュベートすることにより検出される。
【０２５３】
前記アッセイにおける固体表面試薬は、ポリマービーズ、浸漬スティック、９６−ウェルプレートまたはフィルター材料のような固体支持体材料にタンパク質材料を付着させる公知の技法によって、作製する。これらの付着方法には、一般に、支持体へのタンパク質の非特異的吸着、または、典型的には、遊離アミン基を介した、活性化カルボキシル、ヒドロキシル、もしくはアルデヒド基のような固体支持体上の化学的に反応性の基へのタンパク質の共有結合がある。これ以外に、ストレプトアビジンをコーティングしたプレートをビオチニル化抗原と一緒に用いてもよい。
【０２５４】
従って、本発明は、この診断方法を実施するためのアッセイ装置またはキットを提供する。上記キットは、一般に、表面に組換え抗原が結合した支持体と、表面に結合した抗抗原抗体を検出するためのリポーター標識抗ヒト抗体とを含む。
【０２５５】
アルブミン融合タンパク質
本発明は、アルブミン融合タンパク質、ならびに、疾病もしくは障害を治療、予防、または改善する方法に関する。本明細書で用いる「アルブミン融合タンパク質」とは、少なくとも１分子の治療用タンパク質（またはその断片もしくは変異体）に対する、少なくとも１分子のアルブミン（またはその断片もしくは変異体）の融合により形成されるタンパク質を意味する。本発明のアルブミン融合タンパク質は、少なくとも治療用タンパク質の断片または変異体と、少なくともヒト血清アルブミンの断片または変異体とを含んでなり、両者は、好ましくは、遺伝的融合（すなわち、治療用タンパク質の全部または一部をコードするポリヌクレオチドを、アルブミンの全部または一部をコードするポリヌクレオチドとインフレームで結合させる、核酸の翻訳により、上記アルブミン融合タンパク質が産生される）、あるいは、相互の化学的共役により、互いに会合させる。治療用タンパク質とアルブミンタンパク質が、いったんアルブミン融合タンパク質の一部となったら、アルブミン融合タンパク質の「部分」、「領域」または「成分」と称することができる。
【０２５６】
一実施形態では、本発明は、治療用タンパク質（例えば、表１に記載する通り）と血清アルブミンタンパク質を含む、あるいは、これらから構成されるアルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質の生物活性および／または治療活性断片を含む、あるいは、これらから構成されるアルブミン融合タンパク質を提供する。他の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質および血清アルブミンタンパク質の生物活性および／または治療活性変異体を含む、あるいは、これらから構成されるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパク質の血清アルブミンタンパク質成分は、血清アルブミンの成熟部分である。
【０２５７】
さらに別の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質と、血清アルブミンの生物活性および／または治療活性断片を含む、あるいは、これらから構成されるアルブミン融合タンパク質を提供する。また別の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質と、血清アルブミンの生物活性および／または治療活性の変異体を含む、あるいは、これらから構成されるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分は、治療用タンパク質の成熟部分である。
【０２５８】
さらに別の実施形態では、本発明は、治療用タンパク質の生物活性および／または治療活性断片または変異体と、血清アルブミンの生物活性および／または治療活性の断片または変異体とを含む、あるいは、これらから構成されるアルブミン融合タンパク質を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、治療用タンパク質の成熟部分と血清アルブミンの成熟部分とを含む、あるいは、これらから構成されるアルブミン融合タンパク質を提供する。
【０２５９】
好ましくは、上記アルブミン融合タンパク質は、Ｎ末端部分としてのＨＡと、Ｃ末端部分としての治療用タンパク質とを含む。これに代わり、Ｃ末端部分としてのＨＡと、Ｎ末端部分としての治療用タンパク質とを含むアルブミン融合タンパク質を用いてもよい。
【０２６０】
他の実施形態では、アルブミン融合タンパク質は、アルブミンのＮ末端およびＣ末端の両方に融合した治療用タンパク質を有する。好ましい実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端に融合した治療用タンパク質は、同じ治療用タンパク質である。好ましい実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端に融合した治療用タンパク質は、異なる治療用タンパク質である。別の実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端に融合した治療用タンパク質は、同じ疾患、障害または病状（例えば、表１の「好適な適応症Ｙ」の列に記載した通り）を治療もしくは予防するのに用いることができる異なる治療用タンパク質である。別の好ましい実施形態では、Ｎ末端およびＣ末端に融合した治療用タンパク質は、当技術分野で、一般に患者において同時に発生することが知られている疾患または障害（例えば、表１の「好適な適応症Ｙ」の列に記載した通り）を治療もしくは予防するのに用いることができる、異なる治療用タンパク質である。
【０２６１】
アルブミン部分が、治療用タンパク質部分のＮ末端および／またはＣ末端に融合しているアルブミン融合タンパク質以外にも、本発明のアルブミン融合タンパク質は、目的とする治療用タンパク質またはペプチド（例えば、表１に開示した治療用タンパク質Ｘ、あるいは、治療用タンパク質、またはその断片もしくは変異体と結合する抗体）をＨＡの内部領域に挿入することにより、生産することができる。例えば、ＨＡ分子のタンパク質配列内では、多数のループまたはターンが、αヘリックスの終点と始点の間に存在するが、これらは、ジスルフィド結合によって安定化される（図９〜１１参照）。ＨＡの結晶構造から決定されるループ（図１３）（ＰＤＢアイデンティファイアー１Ａ０６、１ＢＪ５、１ＢＫＥ、１ＢＭ０、１Ｅ７Ｅ〜１Ｅ７Ｉおよび１ＵＯＲ）は、大部分が、分子本体から離れて延びる。これらのループは、治療活性ペプチドの挿入、または内部融合に有用であり、特に、二次構造が機能的である、もしくは、治療用タンパク質が特定の生物学的活性を有するアルブミン分子を本質的に産生することが必要なものに有用である。
【０２６２】
ペプチドまたはポリペプチドを挿入することにより、本発明のアルブミン融合タンパク質を産生できるヒトアルブミン構造におけるループとして、下記が挙げられる：Ｖａｌ５４−Ａｓｎ６１、Ｔｈｒ７６−Ａｓｐ８９、Ａｌａ９２−Ｇｌｕ１００、Ｇｌｎ１７０−Ａｌａ１７６、Ｈｉｓ２４７−Ｇｌｕ２５２、Ｇｌｕ２６６−Ｇｌｕ２７７、Ｇｌｕ２８０−Ｈｉｓ２８８、Ａｌａ３６２−Ｇｌｕ３６８、Ｌｙｓ４３９−Ｐｒｏ４４７、Ｖａｌ４６２−Ｌｙｓ４７５、Ｔｈｒ４７８−Ｐｒｏ４８６、およびＬｙｓ５６０−Ｔｈｒ５６６。さらに好ましい実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドは、成熟ヒトアルブミン（配列番号１８）のＶａｌ５４−Ａｓｎ６１、Ｇｌｎ１７０−Ａｌａ１７６、および／またはＬｙｓ５６０−Ｔｈｒ５６６ループに挿入する。
【０２６３】
挿入しようとするペプチドは、特定の生物学的活性についてスクリーニングされたファージ展示もしくは合成ペプチドライブラリー、あるいは、所望の機能を有する分子の活性部分のいずれに由来するものでもよい。加えて、特定のループ内で、あるいは、アミノ酸の考えられるすべての組合せが表示されるＨＡ分子の特定のループ中にランダム化ペプチドを挿入することにより、ランダムペプチドライブラリーを作製してもよい。
【０２６４】
このようなライブラリーは、以下に記載する方法の１つにより、ＨＡまたはＨＡのドメイン断片上で作製することができる：
（ａ）ＨＡまたはＨＡドメイン断片の１以上のペプチドループ内でのアミノ酸のランダム化突然変異。このようにして、１ループ内の１以上または全部の残基を突然変異させることができる（例えば、図１０ａを参照）；
（ｂ）１以上のループへの、長さＸｎ（ただし、Ｘはアミノ酸であり、ｎは残基の数である）のランダム化ペプチドのＨＡまたはＨＡのドメイン断片（すなわち、内部融合）の置換または挿入（例えば、図１０ｂを参照）；
（ｃ）（ａ）および／または（ｂ）に加えて、Ｎ−、Ｃ−またはＮ−およびＣ末端ペプチド／タンパク質融合。
【０２６５】
ＨＡまたはＨＡドメイン断片は、様々な標的に対する様々なループの様々なスクリーニングに由来するペプチド断片を、同じＨＡまたはＨＡドメイン断片へ融合することにより多機能性にすることができる。
【０２６６】
好ましい実施形態では、ヒト血清アルブミンのループに挿入されるペプチドは、表１に開示される治療用タンパク質のペプチド断片またはペプチド変異体である。さらに具体的には、本発明は、ヒト血清アルブミンのループに挿入され、長さが、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、もしくは少なくとも４０アミノ酸のペプチド断片またはペプチド変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明はまた、ヒト血清アルブミンのＮ末端に融合され、長さが、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、もしくは少なくとも４０アミノ酸のペプチド断片またはペプチド変異体を含んでなるアルブミン融合タンパク質を包含する。本発明はさらに、ヒト血清アルブミンのＣ末端に融合され、長さが、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、もしくは少なくとも４０アミノ酸のペプチド断片またはペプチド変異体を含むアルブミン融合タンパク質を包含する。
【０２６７】
一般に、本発明のアルブミン融合タンパク質は、１つのＨＡ由来領域と１つの治療タンパク質由来領域とを有してもよい。しかし、各タンパク質の複数の領域を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製することも可能である。同様に、１以上の治療用タンパク質を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製してもよい。例えば、治療用タンパク質をＨＡのＮ−およびＣ末端の両方に融合させることができる。このような形態では、治療用タンパク質部分は、同じまたは異なる治療用タンパク質分子でよい。二官能性アルブミン融合タンパク質の構造は、Ｘ−ＨＡ−ＹまたはＹ−ＨＡ−Ｘとして表示することができる。
【０２６８】
例えば、抗ＢｌｙＳ（商標登録）ｓｃＦｖ−ＨＡ−ＩＦＮα−２ｂ融合物を作製し、抗ＢｌｙＳ（商標登録）によるＩＦＮα−２ｂに対する免疫応答をモジュレートすることができる。これ以外に、二（あるいは多）官能用量のＨＡ融合物、例えば、機能や半減期に応じて異なる比で、ＨＡ−抗ＢｌｙＳ（商標登録）ｓｃＦｖ融合物またはその他のＨＡ融合物と混合した ＨＡ−ＩＦＮα−２ｂ融合物を作製することもできる。
【０２６９】
また、二または多官能アルブミン融合タンパク質を作製して、ＨＡの反対側の末端に位置するタンパク質またはペプチドにより、融合物の治療用タンパク質部分を標的の器官もしくは細胞タイプにターゲッティングすることもできる。
【０２７０】
公知の治療分子の融合物に代わり、典型的には、６、８、１２、２０もしくは２５またはＸｎ（ただし、Ｘはアミノ酸（ａａ）であり、ｎは、残基の数に等しい）のランダム化アミノ酸で、かつ、ＨＡのＮ−、Ｃ−またはＮ−およびＣ末端、あるいは、ＨＡのドメイン断片との融合物として構築されたライブラリーであって、考えられるあらゆるアミノ酸の組合せが表示されるものをスクリーニングすることにより、上記ペプチドを得ることができる。この手法の特に有利な点は、ペプチドをＨＡ分子上でｉｎ ｓｉｔｕで選択できること、従って、該ペプチドの特性を、他のいずれかの方法で誘導した後ＨＡに結合させたペプチドの場合と同様に変更するのではなく、選択できることである。
【０２７１】
加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、融合された部分の間にリンカーペプチドを含有させ、部分間の物理的距離を増加させることによって、治療用タンパク質が、例えば、そのコグネイト受容体と結合するための接近可能性を最大化することができる。リンカーペプチドは、その柔軟性または剛性を高めるようなアミノ酸から構成することができる。
【０２７２】
リンカー配列は、プロテアーゼにより、あるいは化学的に切断が可能であり、これによって、成長ホルモン関連成分が得られる。好ましくは、プロテアーゼは、宿主により自然に生産されるもので、例えば、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロテアーゼｋｅｘ２もしくは同等のプロテアーゼである。
【０２７３】
従って、前述のように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、次の式：Ｒ１−Ｌ−Ｒ２；Ｒ２−Ｌ−Ｒ１；またはＲ１−Ｌ−Ｒ２−Ｌ−Ｒ１（式中、Ｒ１は、少なくとも１つの治療用タンパク質、ペプチドまたはポリペプチド配列であるが、必ずしも同じ治療用タンパク質でなくてもよく、また、Ｌは、リンカーで、Ｒ２は血清アルブミン配列である）を有するものでよい。
【０２７４】
好ましい実施形態では、治療用タンパク質を含んでなる本発明のアルブミン融合タンパク質は、アルブミンに融合していない状態の同じ治療用タンパク質より貯蔵寿命が長い。貯蔵寿命とは、溶液またはその他の貯蔵組成物中の治療用タンパク質の治療活性が、過度の治療活性の喪失を起こすことなく、安定している期間を意味する。治療用タンパク質の多くは、非融合状態では非常に不安定である。以下に説明するように、これら治療用タンパク質の典型的貯蔵寿命は、本発明のアルブミン融合タンパク質に組み込んだ場合、顕著に長引かせることができる。
【０２７５】
貯蔵寿命が「長引いた」または「延長された」本発明のアルブミン融合タンパク質は、同じ貯蔵および取扱い条件を受けた標準型と比較して、優れた治療活性を示す。標準型は、非融合の全長治療用タンパク質であると考えられる。アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分が類似体、変異体である、あるいは、改変されているか、または、該タンパク質についての完全な配列を含んでいない場合には、治療活性の延長を、上記類似体、変異体、改変ペプチドまたは不完全配列の非融合等価物と比較することができる。例として、本発明のアルブミン融合タンパク質は、標準型と同じ貯蔵および取扱い条件を受けた場合、所与の時点で比較すると、標準型の治療活性の約１００％、または約１０５％、１１０％、１２０％、１３０％、１５０％もしくは２００％以上を保持することができる。
【０２７６】
貯蔵寿命はまた、貯蔵後に保持される治療活性に関して評価し、貯蔵開始時点の治療活性に基準化することも可能である。長引いた、または延長された治療活性により呈示されるように、貯蔵寿命が長引いた、または延長された本発明のアルブミン融合タンパク質は、同じ条件を受けた同等の非融合治療用タンパク質の治療活性と比較して、約５０％、約６０％、７０％、８０％もしくは９０％以上高い治療活性を保持することができる。例えば、実施例１に記載するように、全長ＨＡ配列に融合されたｈＧＨを含む本発明のアルブミン融合タンパク質は、様々な温度条件下で、５週間以上もの間、溶液中の最初の活性の約８０％以上を保持することができる。
【０２７７】
融合タンパク質の発現
本発明のアルブミン融合タンパク質は、酵母、細菌のような微生物、あるいは、ヒトまたは動物細胞系からの分泌により組換え分子として生産することができる。好ましくは、ポリペプチドは、宿主細胞から分泌される。我々は、ｈＧＨコード配列をＨＡコード配列の５’末端または３’末端のいずれかに融合することにより、酵母由来のプロ配列を必要とせずに、酵母からのアルブミン融合タンパク質を分泌することが可能であることを見出した。これは、他の研究者らが、酵母におけるｈＧＨの効率的分泌には、酵母由来のプロ配列が必要であることを見出していたことから、驚くべきことであった。
【０２７８】
例えば、Ｈｉｒａｍａｔｓｕら（Ａｐｐ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５６：２１２５（１９９０）；Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ５７：２０５２（１９９１））は、Ｍｕｃｏｒ ｐｕｓｉｌｌｕｓレンニン（ｒｅｎｎｉｎ）プレ−プロリーダーにおけるプロ配列のＮ末端部分が重要であることを見出した。他の著者は、ＭＦα−１シグナルを用いて、ｈＧＨを分泌するに際し、常にＭＦα−１プロ配列を挙げた。プロ配列は、分子内シャペロンとして作用することにより、ｈＧＨのフォールディングを助けると考えられていた。本発明は、ＨＡまたはＨＡ断片が、同じ機能を果たし得ることを明らかにするものである。
【０２７９】
従って、本発明の具体的実施形態は、酵母における分泌を指令するのに有効なシグナル配列、特に、酵母由来のシグナル配列（特に、酵母宿主に相同的なもの）をコードするＤＮＡ構築物と、本発明の第１の態様の融合分子とを含んでなり、シグナルと成熟ポリペプチドとの間には酵母由来のプロ配列はない。
【０２８０】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼシグナルは、酵母由来のシグナル配列の好ましい実施形態である。
【０２８１】
Ｐｏｚｎａｎｓｋｙら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２３９：１８（１９８８））により作製されたタイプのコンジュゲート（個別に作製したポリペプチドを化学的架橋で結合する）は、考慮しない。
【０２８２】
本発明はまた、細胞、好ましくは、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現するように形質転換された酵母細胞を含む。形質転換した宿主細胞自体に加えて、本発明は、栄養素培地における、これら細胞の培養物、好ましくは、モノクローナル（クローン的に同種）培養物、あるいは、モノクローナル培養物由来の培養物を考慮する。ポリペプチドを分泌する場合には、上記培地は、細胞と一緒にポリペプチドを含有するが、細胞が、ろ過もしくは遠心分離により除去されている場合には、細胞は含まない。多数の公知の発現系を使用することができ、このような発現系として、細菌（例えば、大腸菌や枯草菌）、酵母（例えば、サッカロミセスセレビシエ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、糸状真菌（例えば、アスペルギルス属）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞を挙げることができる。
【０２８３】
アルブミン融合タンパク質の生産に用いられる好ましい酵母菌株は、Ｄ８８、ＤＸＹ１およびＢＸＰ１０である。Ｄ８８［ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４］は、親株ＡＨ２２ｈｉｓ＋の誘導体である（ＤＢ１としても知られる；例えば、Ｓｌｅｅｐら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：４２−４６（１９９０）を参照）。上記株は、ｌｅｕ２突然変異を含んでおり、これは、ＬＥＵ２遺伝子を含む２ミクロン単位のプラスミドの栄養要求性選択を可能にする。Ｄ８８はまた、グルコース過剰におけるＰＲＢ１の抑制解除を示す。ＰＲＢ１プロモーターは、通常、グルコースレベルと成長段階をモニターする２つのチェックポイントにより制御される。このプロモーターは、グルコースが欠失し、かつ定常期に入ると、野生型酵母において活性化する。株Ｄ８８は、グルコースによる抑制を示すが、定常期に入ると誘導を維持する。ＰＲＡ１遺伝子は、酵母液胞プロテアーゼであるＹｓｃＡエンドプロテアーゼＡをコードし、これが、ＥＲに局在化する。ＵＢＣ４遺伝子は、ユビキチン化経路に存在し、ユビキチン依存性分解のために短命および異常なタンパク質のターゲッティングに関与する。このｕｂｃ４突然変異を単離することにより、細胞中の発現プラスミドのコピー数を増加し、プラスミドから発現された所望のタンパク質の発現レベルを増加させることがわかっている（例えば、国際公開ＷＯ９９／００５０４を参照。尚、この文献は、参照により本明細書に全文を組み込むものとする）。
【０２８４】
Ｄ８８の誘導体であるＤＸＹ１は、次の遺伝子型を有する：［ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３：：ｙａｐ３］。Ｄ８８で単離した突然変異のほかに、この株は、ＹＡＰ３プロテアーゼのノックアウトも有する。このプロテアーゼは、ほとんど二塩基性の残基（ＲＲ、ＲＫ、ＫＲ、ＫＫ）の切断を引き起こすが、タンパク質における一塩基性残基での切断も促進することができる。このｙａｐ３突然変異の単離は、全長ＨＳＡ生産レベルの上昇をもたらした（例えば、米国特許第５，９６５，３８６号およびＫｅｒｒｙ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｙｅａｓｔ １４：１６１−１６９（１９９８）を参照、この文献は、参照により本明細書に全文を組み込むものとする）。
【０２８５】
ＢＸＰ１０は、次の遺伝子型を有する：ｌｅｕ２−３、ｌｅｕ２−１２２、ｃａｎ１、ｐｒａ１、ｕｂｃ４、ｕｒａ３、ｙａｐ３：：ＵＲＡ３、ｌｙｓ２、ｈｓｐ１５０：：ＬＹＳ２、ｐｍｔ１：：ＵＲＡ３。ＤＸＹ１で単離した突然変異のほかに、この株は、ＰＭＴ１遺伝子およびＨＳＰ１５０遺伝子のノックアウトも有する。ＰＭＴ１遺伝子は、ドリキル−ホスフェート−Ｄ−マンノースタンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｐｍｔ）の進化において保存されたファミリーのメンバーである。Ｐｍｔ１ｐの膜間トポロジーから、これは、Ｏ−連結グリコシル化に役割を有する小胞体の不可欠な膜タンパク質であると考えられる。この突然変異は、ＨＳＡ融合物のＯ−連結グリコシル化を抑制／排除する働きをする（例えば、国際公開ＷＯ００／４４７７２を参照。尚、この文献は、参照により本明細書に全文を組み込むものとする）。様々な研究により、イオン交換クロマトグラフィーでは、ｒＨＡからのＨｓｐ１５０タンパク質の分離が非効率的であることが明らかにされた。ＨＳＰ１５０遺伝子における突然変異は、潜在的汚染物を除去するが、この汚染物は、標準的精製技法では除去が困難であることが証明されている。例えば、米国特許第５，７８３，４２３号参照。尚、この文献は、参照により本明細書に全文を組み込むものとする。
【０２８６】
所望のタンパク質は、通常の方法で、例えば、宿主染色体に挿入されるコード配列から、あるいは、遊離プラスミド上で生産する。酵母は、通常のいずれかの方法、例えば、電気穿孔により、所望のタンパク質のコード配列で形質転換する。電気穿孔による酵母の形質転換方法は、ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １９４， １８２に開示されている。
【０２８７】
好適に形質転換した細胞、すなわち、本発明のＤＮＡ構築物を含む細胞は、公知の技法により確認することができる。例えば、発現構築物の導入により得られる細胞を増殖させて、所望のポリペプチドを生産することができる。細胞を回収し、溶解させた後、そのＤＮＡ内容物を分析してＤＮＡの存在を調べることができる。その際、Ｓｈｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ９８， ５０３またはＢｅｒｅｎｔら（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３、２０８により記載されているような方法を用いる。あるいは、抗体を用いて、上清におけるタンパク質の存在を検出することもできる。
【０２８８】
有用な酵母プラスミドベクターとして、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６が挙げられ、一般に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ ９２０３７， ＵＳＡ）から市販されている。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は、酵母組込みプラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、７ＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を含む。プラスミドｐＲＳ４１３〜４１６は、酵母動原体プラスミド（Ｙｃｐｓ）である。
【０２８９】
酵母での発現用のアルブミン融合タンパク質を作製するのに好ましいベクターとしては、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＣ４：ＨＳＡが挙げられ、これらについては実施例２に詳しく説明する。図４は、基本ベクターとして用いることができるｐＰＰＣ０００５プラスミドのマップを示し、このプラスミドに、治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングすることにより、ＨＡ融合物を形成することができる。これは、ＰＲＢ１ Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅプロモーター（ＰＲＢ１ｐ）、融合リーダー配列（ＦＬ）、ＤＮＡコードＨＡ（ｒＨＡ）およびＡＤＨ１ Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅターミネーター配列を含む。融合リーダー配列の配列は、ヒト血清アルブミン（配列番号２９）のシグナルペプチドの最初の１９アミノ酸と、接合因子α１プロモーター（ＳＬＤＫＲ、欧州特許出願第３８７，３１９号参照。尚、この文献は、参照により本明細書に全文を組み込むものとする）の最後の５アミノ酸とから構成される。
【０２９０】
プラスミドｐＰＰＣ０００５、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡおよびｐＣ４：ＨＳＡは、アメリカンタイプカルチャーコレクション（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９）に２００１年４月１１日に寄託され、それぞれ受託番号ＡＴＣＣ　　、　　、　　、および　　を受けた。酵母でアルブミン融合タンパク質を発現するのに有用な別のベクターとして、ｐＳＡＣ３５ベクターがあり、これについては、Ｓｌｅｅｐら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：４２（１９９０）（参照により本明細書に全文を組み込まれる）に記載されている。
【０２９１】
相補的付着末端を介してベクターに機能しうる形でＤＮＡを結合する様々な方法が開発されている。例えば、ベクターＤＮＡに挿入しようとするＤＮＡセグメントに相補的ホモポリマー領域を付加する。次に、相補的ホモポリマーテール間の水素結合により、上記ベクターとＤＮＡセグメントを連結して、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【０２９２】
１以上の制限部位を含む合成リンカーは、ＤＮＡセグメントとベクターとの連結する別の方法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化により生成されるＤＮＡセグメントをバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩで処理する。これらの酵素が、３’， ５’−エキソヌクレアーゼ活性をもつ、突出した一本鎖末端を除去し、その重合活性によって、くぼんだ３’末端を充填する。
【０２９３】
従って、これら活性の組合せにより、平滑末端のＤＮＡセグメントが生成される。次に、平滑末端ＤＮＡ分子の連結反応を触媒することができる酵素（バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼなど）の存在下で、上記平滑末端セグメントを、モル大過剰のリンカー分子と一緒にインキュベートする。従って、反応の産物が、その末端にポリマーリンカー配列を保有するＤＮＡセグメントである。これらのＤＮＡセグメントを適当な制限酵素で切断した後、ＤＮＡセグメントのものと適合する末端を生成する酵素で切断された発現ベクターに連結する。
【０２９４】
多様な制限エンドヌクレアーゼ部位を含む合成リンカーが、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＣＴ， ＵＳＡ）など、多数の供給源から市販されている。
【０２９５】
例えば、ＨＡ変異体を作製しようとする場合、本発明に従いＤＮＡを修飾するのに望ましい方法は、Ｓａｉｋｉら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９， ４８７−４９１により開示されているポリメラーゼ連鎖反応を用いるものである。この方法では、酵素により増幅しようとするＤＮＡを２つの特定のオリゴヌクレオチドプライマーと隣接させ、これを増幅ＤＮＡに組み込ませる。特定のプライマーは、当業者には公知の方法を用いて、発現ベクターにクローニングするのに用いることができる制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含んでいてよい。
【０２９６】
本発明を実施するに際し、アルブミン融合タンパク質を発現するための宿主として有用であると考えられる酵母属の例として、次のものが挙げられる：ピキア属（ハンセヌラ属）、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、カンジダ属、トルロプシス属、トルラスポラ属、シゾサッカロミセス属、サイテロミセス属、パキソレン属、デバロミセス属、メチニコウィア属、ロドスポリジウム属、ロイコスポリジウム属、ボトリオアスクス属（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ）、スポリディオボルス属、エンドミコプシス属など。好ましい属は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クルイベロミセス属、ピキア属およびトルラスポラ属からなる群より選択されたものである。サッカロミセス属種の例として、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ． ｉｔａｌｉｃｕｓおよびＳ． ｒｏｕｘｉｉがある。
【０２９７】
クルイベロミセス属種の例として、Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋ． ｌａｃｔｉｓおよびＫ． ｍａｒｘｉａｎｕｓが挙げられる。好適なトルラスポラ属種は、Ｔ． ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである。ピキア（ハンセヌラ）属種の例としては、Ｐ． ａｎｇｕｓｔａ（以前はＨ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Ｐ． ａｎｏｍａｌａ（以前は、Ｈ． ａｎｏｍａｌａ）およびＰ． ｐａｓｔｏｒｉｓがある。Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの形質転換方法は、ＥＰ ２５１ ７４４、ＥＰ ２５８ ０６７およびＷＯ９０／０１０６３に概要が記載されている。尚、これらの文献はすべて、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０２９８】
サッカロミセス属の好ましい種の例として、Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ． ｉｔａｌｉｃｕｓ、Ｓ． ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、ならびに、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉが挙げられる。クルイベロミセス属の好ましい種の例は、Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋ． ｌａｃｔｉｓである。ハンセヌラの好ましい種の例としては、Ｈ． ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ（現在はＰｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ）、Ｈ． ａｎｏｍａｌａ（現在は、Ｐｉｃｈｉａ ａｎｏｍａｌａ）、およびＰｉｃｈｉａ ｃａｐｓｕｌａｔａである。ピキア属種の好ましい別の例として、Ｐ． ｐａｓｔｏｒｉｓがある。アスペルギルス属の好ましい種の例として、Ａ． ｎｉｇｅｒとＡ． ｎｉｄｕｌａｎｓが挙げられる。ヤロウィア属の好ましい種の例としては、Ｙ． ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａがある。多くの好ましい酵母種がＡＴＣＣから入手可能である。例えば、下記の好ましい酵母種がＡＴＣＣから入手可能であり、アルブミン融合タンパク質の発現に有用である：サッカロミセスセレビシエハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）、テレオモルフ株ＢＹ４７４３ ｙａｐ３突然変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２２７３１）；サッカロミセスセレビシエハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）、テレオモルフ株ＢＹ４７４３ ｈｓｐ１５０突然変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２１２６６）；サッカロミセスセレビシエハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）、テレオモルフ株ＢＹ４７４３ ｐｍｔ１突然変異体（ＡＴＣＣ受託番号４０２３７９２）；サッカロミセスセレビシエハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）、テレオモルフ（ＡＴＣＣ受託番号２０６２６；４４７７３；４４７７４および６２９９５）；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ Ａｎｄｒｅｗｓ ｅｔ Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ ｅｘ ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ、テレオモルフ（ＡＴＣＣ受託番号６２９８７）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ（Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ）ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ、テレオモルフ（ＡＴＣＣ受託番号７６４９２）；Ｐｉｃｈｉａ ａｎｇｕｓｔａ（Ｔｅｕｎｉｓｓｏｎら）Ｋｕｒｔｚｍａｎ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ｄｅ Ｍｏｒａｉｓ ｅｔ Ｍａｒｉａとして寄託されたテレオモルフ、テレオモルフ（ＡＴＣＣ受託番号２６０１２）；Ａｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｖａｎ Ｔｉｅｇｈｅｍ、アナモルフ（ＡＴＣＣ受託番号９０２９）；Ａｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｖａｎ Ｔｉｅｇｈｅｍ、アナモルフ（ＡＴＣＣ受託番号１６４０４）；Ａｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｅｉｄａｍ）Ｗｉｎｔｅｒ、アナモルフ（ＡＴＣＣ受託番号４８７５６）；ならびに、Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｗｉｃｈｋｅｒｈａｍら）ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａｌｔ ｅｔ ｖｏｎ Ａｒｘ、テレオモルフ（ＡＴＣＣ受託番号２０１８４７）。
【０２９９】
サッカロミセスセレビシエの好適なプロモーターとして、ＰＧＫＩ遺伝子、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子、ならびに、ＣＹＣＩ、ＰＨＯ５、ＴＲＰＩ、ＡＤＨＩ、ＡＤＨ２、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、α接合因子フェロモン、［接合因子フェロモン］用の遺伝子に関連するもの、ＰＲＢＩプロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、ＧＰＤＩプロモーター、５’調節領域の部分とその他のプロモーターの５’ 調節領域の部分とのハイブリッドを含む、あるいは、上流活性化部位を有するハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ−Ａ−２５８ ０６７のプロモーター）が挙げられる。
【０３００】
シゾサッカロミセスポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）に用いるのに好適な調節プロモーターは、Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ（１９９０）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５、１０８５７−１０８６４に記載されているｎｍｔ遺伝子に由来するチアミン−抑制プロモーター、ならびに、ＨｏｆｆｍａｎおよびＷｉｎｓｔｏｎ（１９９０）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １２４， ８０７−８１６に記載されているグルコース抑制ｊｂｐｌ遺伝子プロモーターである。
【０３０１】
外来遺伝子の発現のためにピキア属を形質転換する方法は、例えばＣｒｅｇｇら（１９９３）、ならびに、様々なフィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）特許（米国特許第４，８５７，４６７号、参照により本明細書に組み込まれる）に教示されており、ピキア属発現キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢＶ（Ｌｅｅｋ， Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）から市販されている。好適なプロモーターとして、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２がある。Ｇｌｅｅｓｏｎら（１９８６）Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３２， ３４５９−３４６５には、ハンセヌラ属ベクターおよび形質転換に関する情報が記載され、好適なプロモーターは、ＭＯＸ１とＦＭＤ１である。また、ＥＰ ３６１，９９１号、Ｆｌｅｅｒら（１９９１）ならびに、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒによるその他の出版物には、クルイベロミセス種において外来タンパク質を発現させる方法、その際の好適なプロモーターがＰＧＫＩであることが教示されている。
【０３０２】
転写終結シグナルは、転写終結およびポリアデニル化の適正なシグナルを含む真核生物の遺伝子の３’隣接配列であるのが好ましい。好適な３’隣接配列は、例えば、用いられる発現制御配列に自然に連結した遺伝子の配列、すなわち、プロモーターと一致するものでよい。あるいは、これらの配列は異なっていてもよく、その場合、サッカロミセスセレビシエＡＤＨＩ遺伝子の終結シグナルが好ましい。
【０３０３】
所望のアルブミン融合タンパク質は、初めに分泌リーダー配列で発現させることができ、このリーダー配列は、選択された酵母で有効な任意のリーダーでよい。サッカロミセスセレビシエで有用なリーダーとして、接合因子αポリペプチド（ＭＦα−１）に由来するものと、ＥＰ−Ａ−３８７ ３１９のハイブリッドリーダーがある。このようなリーダー（またはシグナル）を酵母で切断した後、成熟アルブミンを周囲培地へと放出させる。さらにこのようなリーダーとして、ＪＰ ６２−０９６０８６（９１１０３６５１６として特許された）に開示されたサッカロミセスセレビシエイベルターゼ（ＳＵＣ２）のリーダー、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）、ＭＦα−１の前配列、０グルカナーゼ（ＢＧＬ２）およびキラー毒素；Ｓ． ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓグルコアルニラーゼＩＩ；Ｓ． ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓα−ガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）；Ｋ． ｌａｃｔｉｓキラー毒素；ならびに、カンジダグルコアルニラーゼなどが挙げられる。
【０３０４】
アルブミン融合タンパク質の別の組換え的および合成的生産方法
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、宿主細胞、ならびに、合成および組換え技法によるアルブミン融合タンパク質の生産に関する。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターでよい。レトロウイルスベクターは、複製能力または複製欠損性のいずれでもよい。後者の場合、ウイルス増殖は、一般に、宿主細胞を補う際にしか起こらない。
【０３０５】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主における増殖の選択マーカーを含むベクターと結合することができる。一般に、プラスミドベクターをリン酸カルシウム沈殿物のような沈殿物、あるいは、荷電脂質を含む複合体中に導入する。ベクターがウイルスである場合には、適当なパッケージング細胞系を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージングした後、宿主細胞に形質転換することができる。
【０３０６】
ポリヌクレオチドインサートは、適当なプロモーターに機能しうる形で結合しなければならない。このようなプロモーターとして、ファージλＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡおよびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびに、レトロウイルスＬＴＲのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。その他の好適なプロモーターは、当業者には公知であろう。発現構築物は、さらに、転写開始、終結のための部位を有し、しかも、転写された領域には、翻訳のためのリボソーム結合部位を含んでいる。構築物が発現した転写物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの開始地点に翻訳開始コドンを、また、その終了地点に適切に位置する終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含んでいるのが好ましい。
【０３０７】
前述のように、発現ベクターは、少なくとも１つの選択マーカーを含むのが好ましい。このようなマーカーとして、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、Ｇ４１８、グルタミンシンターゼ、あるいは、真核細胞培養のためのネオマイシン耐性、ならびに、大腸菌その他の細菌での培養のためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。好適な宿主の代表的例として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：大腸菌、ストレプトミセスおよびネズミチフス菌細胞のような細菌細胞；酵母細胞（例えば、サッカロミセスセレビシエまたはＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８）のような真菌細胞；ショウジョウバエＳ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ Ｓｆ９細胞のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、２９３、およびバウズ（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫細胞のような動物細胞；ならびに、植物細胞。上記宿主細胞のための好適な培養培地および条件は、当技術分野で公知である。
【０３０８】
細菌で用いるのに好ましいベクターとして、下記のものが挙げられる：ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．から入手可能なｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；ならびに、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｉｎｃ． から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５。好ましい真核生物ベクターとしては、下記のものが挙げられる：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；ならびに、Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ。酵母系で用いるのに好ましい発現ベクターとしては、限定するものではないが、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ．およびＰＡＯ８１５（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｂａｄ， ＣＡから入手可能）が挙げられる。その他の好適なベクターは、当業者には明らかであろう。
【０３０９】
一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをシグナル配列に融合することができ、このシグナル配列が、原核または真核細胞の特定のコンパートメントへの本発明のタンパク質の局在化を指令するおよび／または原核または真核細胞からの本発明のタンパク質の分泌を指令する。例えば、大腸菌では、周辺腔へのタンパク質の発現を指令させようとすることができる。細菌の周辺腔へのポリペプチドの発現を指令するために、本発明のアルブミン融合タンパク質と融合させることができるシグナル配列またはタンパク質（もしくはその断片）の例として、限定するものではないが、ｐｅｌＢシグナル配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）シグナル配列、ＭＢＰ、ｏｍｐＡシグナル配列、ペリプラズム大腸菌非耐熱性エンテロトキシンＢ−サブユニットのシグナル配列、ならびに、アルカリホスファターゼのシグナル配列が挙げられる。融合タンパク質の構築用に、タンパク質の局在化を指令する数種のベクターが市販されており、例えば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能なｐＭＡＬシリーズのベクター（特に、ｐＭＡＬ−ｐシリーズ）がある。特定の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドアルブミン融合タンパク質をｐｅｌＢペクチン酸リアーゼシグナル配列と融合することにより、グラム陰性菌におけるポリペプチドの発現および精製の効率を高めることができる。米国特許第５，５７６，１９５号および第５，８４６，８１８号を参照されたい。尚、その内容は、参照により本明細書に全文を組み込むものとする。
【０３１０】
哺乳動物細胞での分泌を指令するために、本発明のアルブミン融合タンパク質と融合させることができるシグナルペプチドの例として、限定するものではないが、下記のものを挙げることができる：ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１−２１）、スタンニオカルシン（ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ）シグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ、配列番号３４）、ならびに、共通シグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ、配列番号３５）。バキュロウイルス発現系と一緒に用いることができる好適なシグナル配列は、ｇｐ６７シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受諾番号ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１〜１９）である。
【０３１１】
選択マーカーとしてグルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを用いるベクターは、それぞれ、メチオニンスルホキシミンまたはメトトレキセートの薬剤存在下で、増幅させることができる。グルタミンシンターゼを用いたベクターの利点は、グルタミンシンターゼ陰性である細胞系（例えば、ネズミ骨髄腫細胞系、ＮＳＯ）が利用できることである。グルタミンシンターゼ発現系は、別の阻害物質を賦与して、内因性遺伝子の機能を阻止することにより、グルタミンシンターゼを発現する細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）でも機能させることができる。グルタミンシンターゼ発現系およびその成分については、次に挙げるＰＣＴ公開：ＷＯ８７／０４４６２；ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／０１０３６；ＷＯ８９／１０４０４；およびＷＯ９１／０６６５７（これらの内容は、参照により本明細書に全文を組み込む）に詳細に記載されている。さらに、グルタミンシンターゼ発現ベクターは、Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ． Ｉｎｃ．（Ｐｏｔｓｍｏｕｔｈ， ＮＨ）から取得が可能である。ネズミ骨髄腫細胞でＧＳ発現系を用いるモノクローナル抗体の発現および生産については、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９（１９９２）およびＢｉｂｌｉａおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ Ｂｉｏｔｅｓｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． １１：１（１９９５）（これらの内容は、参照により本明細書に全文を組み込む）に記載されている。
【０３１２】
本発明はまた、本明細書に記載する前記ベクター構築物を含む宿主細胞に関し、加えて、当業者には公知の技法を用いて、１以上の異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と操作可能に会合した本発明のヌクレオチド配列を含む宿主細胞を包含する。宿主細胞は、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来の細胞）などの高等真核生物細胞、または、酵母細胞のような下等真核生物細胞でよい。あるいは、宿主細胞は、細菌細胞のような原核生物細胞でもよい。宿主株は、挿入された遺伝子配列の発現を所望の特定様式でモジュレートする、あるいは、遺伝子産物を所望の特定様式で修飾およびプロセッシングするものを選択する。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導物質の存在下で高めることができるため、遺伝子工学的に操作したポリペプチドの発現を制御することができる。さらに、様々な宿主細胞が、タンパク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾（例えば、リン酸化、切断）のための特性および特定の機構を備えている。好適な細胞系を選択することにより、発現させる外来タンパク質の所望の修飾およびプロセッシングを確実に達成することができる。
【０３１３】
宿主細胞への本発明の核酸および核酸構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、陽イオン系脂質媒介トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染、もしくはその他の方法により実施することができる。このような方法は、多数の標準的実験マニュアル（Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６））に記載されている。特に、組換えベクターを欠失した宿主細胞によって、本発明のポリペプチドを実際に発現させることが考えられる。
【０３１４】
本明細書に記載するベクター構築物を含む宿主細胞を包含する以外に、本発明はまた、脊椎動物、特に哺乳動物に由来する初代、二代目、および不死化宿主細胞を包含する。尚、この宿主細胞は操作により、内因性の遺伝材料が欠失または置換されており（例えば、治療用タンパク質に対応するコード配列を、治療用タンパク質に対応するアルブミン融合タンパク質で置換する）、および／または遺伝材料を含有する（例えば、治療用タンパク質に対応する本発明のアルブミン融合タンパク質のような異種ポリヌクレオチド配列を含有させる）。内因性ポリヌクレオチドと操作可能に会合した遺伝材料は、内因性ポリヌクレオチドを活性化、改変および／または増幅することができる。
【０３１５】
さらに、当技術分野では公知の技法を用いて、異種ポリヌクレオチド（例えば、アルブミンタンパク質をコードするポリヌクレオチド、もしくはその断片または変異体）および／または異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と、治療用タンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列とを、相同組換えにより、操作可能に会合することができる（例えば、１９９７年６月２４日に発行された米国特許第５，６４１，６７０号；国際公開番号ＷＯ９６／２９４１１；国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；ならびに、Ｚｉｊｉｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照。尚、これら文献の各々は、参照により本発明に全文を組み込むものとする）。
【０３１６】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、公知の方法により、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。このような方法として、硫酸アルミニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性荷電相互作用クロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を精製に用いる。
【０３１７】
好ましい実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質は、限定するものではないが、以下に挙げるようなアニオン交換クロマトグラフィーを用いて精製する：Ｑ−セファロース、ＤＥＡＥセファロース、ｐｏｒｏｓ ＨＱ、ｐｏｒｏｓ ＤＥＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＡＥ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＱＥＡＥ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ ＱおよびＤＥＡＥ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＱおよびＤＥＡＥでのクロマトグラフィー。
【０３１８】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質は、限定するものではないが、以下に挙げるようなカチオン交換クロマトグラフィーを用いて精製する：ＳＰ−セファロース、ＣＭセファロース、ｐｏｒｏｓ ＨＳ、ｐｏｒｏｓ ＣＭ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＳＰ、トーヨーパールＣＭ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅ ＳおよびＣＭ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ ＳおよびＣＭカラム、ならびに、それらの同等物。
【０３１９】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質は、限定するものではないが、以下に挙げるような疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて精製する：フェニル、ブチル、メチル、オクチル、ヘキシル−セファロース、ｐｏｒｏｓフェニル、ブチル、メチル、オクチル、ヘキシル、トーヨーパールフェニル、ブチル、メチル、オクチル、ヘキシルＲｅｓｏｕｒｃｅ／Ｓｏｕｒｃｅフェニル、ブチル、メチル、オクチル、ヘキシル、フラクトゲルフェニル、ブチル、メチル、オクチル、ヘキシルカラム、ならびに、それらの同等物。
【０３２０】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質は、限定するものではないが、以下に挙げるようなサイズ排除クロマトグラフィー：セファロースＳ１００、Ｓ２００、Ｓ３００、スーパーデックス樹脂カラム、およびこれらの同等物、を用いて精製する。
【０３２１】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質は、限定するものではないが、以下に挙げるアフィニティークロマトグラフィー：ＨＳＡまたは「融合標的」分子のいずれかについて選択性である、模擬色素（Ｍｉｍｅｔｉｃ Ｄｙｅ）アフィニティー、ペプチドアフィニティーおよび抗体アフィニティーカラム、を用いて精製する。
【０３２２】
好ましい実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質は、上に挙げた１種以上のクロマトグラフィーを用いて精製する。他の好ましい実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質は、以下に挙げる１種以上のクロマトグラフィーカラム：ＱセファロースＦＦカラム、ＳＰセファロースＦＦカラム、Ｑセファロース高性能カラム、ブルーセファロースＦＦカラム、ブルーカラム、フェニルセファロースＦＦカラム、ＤＥＡＥセファロースＦＦ、もしくはメチルカラムを用いて精製する。
【０３２３】
加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ００／４４７７２（参照により、その全文を本明細書に組み込む）に記載された方法を用いて精製してもよい。当業者であれば、本発明のアルブミン融合タンパク質の精製に用いるため、上記方法を容易に変更することができるだろう。
【０３２４】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、下記のもの、化学的合成工程の産物；例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞から、組換え技法により生産した産物から回収することができる。組換え工程に用いた宿主に応じて、本発明のポリペプチドをグルコシル化、あるいは、非グルコシル化することができる。加えて、本発明のアルブミン融合タンパク質は、宿主媒介過程の結果として、開始改変メチオニン残基を含んでいる場合もある。従って、翻訳開始コドンによりコードされるＮ−末端メチオニンは、一般に、すべての真核細胞における翻訳後に、あらゆるタンパク質から高い効率で除去されることが当技術分野では知られている。いくつかのタンパク質については、大部分のタンパク質上のＮ末端メチオニンもほとんどの原核生物で効率的に除去されるが、Ｎ末端メチオニンを共有結合するアミノ酸の種類によっては、この原生生物除去工程は不十分である。
【０３２５】
一実施形態では、酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）を用いて、真核生物系において本発明のアルブミン融合タンパク質を発現させる。ピチア・パストリスは、その唯一の炭素源として、メタノールを代謝することができるメチロトローフ酵母である。メタノール代謝経路における主な段階は、Ｏ２を用いた、メタノールのホルムアルデヒドへの酸化である。この反応は、酵素アルコールオキシダーゼにより触媒される。メタノールをその唯一の炭素源として代謝するために、ピチア・パストリスは、部分的には、Ｏ２に対するアルコールオキシダーゼのアフィニティーが比較的低いために、高レベルのアルコールオキシダーゼを産生しなければならない。その結果、主な炭素源としてメタノールに依存する生育培地では、２つのアルコールオキシダーゼ遺伝子のうち一方（ＡＯＸ１）のプロモーター領域が非常に活性が高い。メタノールの存在下で、ＡＯＸ１遺伝子から生産されたアルコールオキシダーゼは、ピチア・パストリスの全可溶性タンパク質の約３０％にまで及ぶ。Ｅｌｌｉｓ， Ｓ． Ｂ．ら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：１１１１−２１（１９８５）；Ｋｏｕｔｚ， Ｐ． Ｊ．ら、Ｙｅａｓｔ ５：１６７−７７（１９８９）；Ｔｃｈｏｐｐ， Ｊ． Ｆ．ら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：３８５９−７６（１９８７）を参照。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチドのような異種コード配列は、ＡＯＸ１調節配列の全部または一部の転写調節を受けて、メタノールの存在下で生育させたピチア酵母で、極めて高いレベルで発現する。
【０３２６】
一例では、主に”Ｐｉｃｈｉａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”， Ｄ．Ｒ． ＨｉｇｇｉｎｓおよびＪ． Ｃｒｅｇｇ編、Ｔｈｅ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， １９９８に記載されているように、プラスミドベクターｐＰＩＣ９Ｋを用いて、ピチア酵母系において、本明細書に記載した本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを発現させる。この発現ベクターにより、多重クローニング部位の上流に位置するＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓアルカリホスファターゼ（ＰＨＯ）分泌シグナルペプチド（すなわち、リーダー）に連結された強力なＡＯＸ１プロモーターによって、本発明のポリペプチドの発現および分泌が可能になる。
【０３２７】
当業者には容易に理解されるように、考案した発現構築物が、適切に位置した転写、翻訳、分泌（所望であれば）用のシグナルや、必要に応じてフレーム内ＡＵＧなどを提供するのであれば、ｐＰＩＣ９Ｋの代わりに多数の他の酵母ベクターを用いることができ、例えば、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、およびＰＡＯ８１５が挙げられる。
【０３２８】
別の実施形態では、本発明の異種ポリヌクレオチドを発現ベクター（例えば、ｐＧＡＰＺまたはｐＧＡＰＺα）にクローニングした後、メタノールの不在下で酵母培養物を生育させることにより、例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのような異種コード配列の高レベル発現を達成することができる。
【０３２９】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、当業者には公知の技法を用いて、化学的に合成することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， １９８３， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ − Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ． Ｎ．Ｙ．、およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ， ３１０：１０５−１１１（１９８４））。例えば、ペプチド合成装置を用いて、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドを合成することができる。また、所望であれば、古典的アミノ酸以外のアミノ酸または化学的アミノ酸類似体を、置換または付加物としてポリペプチド配列に導入してもよい。、古典的アミノ酸以外のアミノ酸として、限定するものではないが、共通アミノ酸のＤ−異性体、２，４−ジアミノブチル酸、ａ−アミノイソブチル酸、４−アミノイソブチル酸、Ａｂｕ、２−アミノブチル酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソブチル酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロ−アミノ酸；ｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸；ならびに、一般にアミノ酸類似体など。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）のいずれでもよい。
【０３３０】
本発明は、公知の保護／遮断基、タンパク質分解切断、抗体分子またはその他の細胞リガンドとの連結などを用いた、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、誘導体化により、それぞれ別様に修飾される本発明のアルブミン融合タンパク質を包含する。多数の化学的修飾のいずれも公知の技法により実施することができ、このような技法として、限定するものではないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学的切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元；ツニカマイシンの存在下での代謝合成などが挙げられる。
【０３３１】
本発明に包含される別の翻訳後修飾として、例えば、Ｎ−連結またはＯ−連結炭水化物鎖、Ｎ末端（またはＣ末端）のプロセッシング、化学成分とアミノ酸骨格との結合、Ｎ−連結またはＯ−連結炭水化物鎖の化学的修飾、ならびに、原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失。アルブミン融合タンパク質を、酵素、蛍光、同位体またはアフィニティー標識などの検出可能な標識で修飾することにより、該タンパク質の検出および単離を可能にすることもできる。
【０３３２】
好適な酵素の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、もしくはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の例として、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン；好適な蛍光材料の例として、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられる。また、発光材料の例として、ルミノールがあり、好適な放射性材料の例としては、ヨウ素（１２１Ｉ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、および９７Ｒｈが挙げられる。
【０３３３】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質またはその断片もしくは変異体を、マクロサイクル（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ）キレート剤と結合させるが、該キレート剤は、ポリペプチドに対する放射性金属イオン（限定するものではないが、１７７Ｌｕ、９０Ｙ、１６６Ｈｏ、および１５３Ｓｍなど）と会合する。好ましい実施形態では、マクロサイクルキレート剤と会合する放射性金属イオンは、１１１Ｉｎである。別の好ましい実施形態では、マクロサイクルキレート剤と会合する放射性金属イオンは、９０Ｙである。特定の実施形態では、マクロサイクルキレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である。別の特定の実施形態では、ＤＯＴＡは、リンカー分子を介して、本発明の抗体またはそのフラグメントと結合する。ＤＯＴＡをポリペプチドにコンジュゲートさせるのに有用なリンカー分子の例は、当業者には一般に知られており、例えば、ＤｅＮａｒｄｏら、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４（１０）：２４８３−９０（１９９８）；Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ． １０（４）：５５３−７（１９９７）；ならびに、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２６（８）：９４３−５０（１９９９）（すべて、参照により本明細書にその全文を組み込む）を参照されたい。
【０３３４】
既述したように、本発明のアルブミン融合タンパク質は、翻訳後プロセッシングのような自然の過程、あるいは、当業者には公知の化学修飾技法のいずれで修飾してもよい。同じタイプの修飾が、所与のポリペプチドにおいて、同じまたはまちまちの度合いで存在してもよいことは理解されよう。本発明のポリペプチドは、例えば、ユビキチン化により、分枝していてもよいし、分枝を伴なう、もしくは伴なわない環状をしていてもよい。環状、分枝状、および分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセッシングで生じたものでも、合成方法によって得られたものでもよい。修飾としては、下記のものが挙げられる：アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、結晶化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、システインの形成、ピログルタミン酸塩の形成、ホルミル化、γカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペギル化、タンパク質分解プロセッシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化やユビキチン化のようなタンパク質への転移ＲＮＡ媒介によるアミノ酸添加（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ， 第２版、Ｔ． Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯＶＡＬＥＮＴ ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ ＯＦ ＰＲＯＴＥＩＮＳ， Ｂ． Ｃ． Ｊｏｈｎｓｏｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、第１〜１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒら、Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２：６２６−６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎら、Ａｎｎ． Ｎ． Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６６３：４８−６２（１９９２））。
【０３３５】
治療用タンパク質またはその断片もしくは変異体と結合する本発明のアルブミン融合タンパク質および抗体をペプチドのようなマーカー配列に融合することにより、精製を容易にすることができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は多く市販されているが、中でも、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．， ９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ， ９１３１１）に賦与されるタグのようなヘキサ−ヒスチジンペプチドが挙げられる。Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：８２１−８２４（１９８９）に記載されているように、例えば、ヘキサ−ヒスチジンは、融合タンパク質の簡便な精製を可能にする。精製に有用なその他のペプチドタグとして、限定するものではないが、インフルエンザ赤血球凝集素に由来するエピトープに対応する”ＨＡ”タグ（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７（１９８４））、ならびに、”フラッグ”タグがある。
【０３３６】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質は、細胞毒素（例えば、細胞分裂抑制または細胞致死因子）、治療薬または放射性金属イオン（例えば、２１３Ｂｉのようなα放射体）とコンジュゲートさせることができる。細胞毒素または細胞傷害因子は、細胞に有害なあらゆる因子を含む。例として、パクリタキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、ミトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびプロマイシン、ならびに、それらの類似体または相同体が挙げられる。治療薬としては、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：抗代謝物（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、サイタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロールエタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ミトマイシンＣ、ならびに、シス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、ならびに、アントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに、抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）。
【０３３７】
本発明のコンジュゲートを用いて、所与の生物学的応答を修飾することができるが、治療薬または薬剤が、古典的化学的治療剤に限定されると解釈すべきではない。例えば、薬剤成分は、所望の生物活性を有するタンパク質またはポリペプチドでよい。このようなタンパク質として、例えば、下記のものを挙げることができる：アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、αインターフェロン、βインターフェロン、神経成長因子、血小板に由来する成長因子、組織プラスミノーゲンアクチベーター、アポトーシス因子、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ Ｉ（国際公開番号ＷＯ９７／３３８９９を参照）、ＡＩＭ ＩＩ（国際公開番号ＷＯ９７／３４９１１を参照）、Ｆａｓリガンド（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ６：１５６７−１５７４（１９９４））、ＶＥＧＩ（国際公開番号ＷＯ９９／２３１０５を参照）、血栓因子または抗血管新生因子、例えば、アンジオスタチンまたはエンドスタチン；あるいは、生体応答調節剤、例えば、リンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ならびに、その他の成長因子など。このような治療成分をタンパク質（例えば、アルブミン融合タンパク質）にコンジュゲートするための技法は、当技術分野ではよく知られている。
【０３３８】
また、アルブミン融合タンパク質を固体支持体に結合させることもでき、これは、本発明のアルブミン融合タンパク質が結合する、もしくは該タンパク質に結合する、あるいは、該タンパク質と会合するポリペプチドの免疫アッセイまたは精製に特に有用である。このような固体支持体として、限定するものではないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、塩化ポリビニルまたはポリプロピレンが挙げられる。
【０３３９】
治療成分をコンジュゲートした、またはしていないアルブミン融合タンパク質を単独、もしくは細胞傷害因子および／またはサイトカインと組み合わせて、治療薬として投与することができる。
【０３４０】
本発明のアルブミン融合タンパク質が、治療用タンパク質と結合する抗体のＶＨドメインだけしか含まない実施形態では、治療用タンパク質と結合する同じ抗体のＶＬドメインと一緒に、上記融合タンパク質を共発現させ、これによって、ＶＨ−アルブミン融合タンパク質とＶＬタンパク質とを、翻訳後会合させる（共有または非共有により）ことが必要である、および／または望ましい。
【０３４１】
本発明のアルブミン融合タンパク質が、治療用タンパク質と結合する抗体のＶＬドメインだけしか含まない実施形態では、治療用タンパク質と結合する同じ抗体のＶＨドメインと一緒に、上記融合タンパク質を共発現させ、これによって、ＶＬ−アルブミン融合タンパク質とＶＨタンパク質とを、翻訳後会合させる（共有または非共有により）ことが必要である、および／または望ましい。
【０３４２】
いくつかの治療用抗体は、二重特異性抗体である。すなわち、治療用タンパク質と結合する抗体は、２つの異なる重／軽鎖対と２つの異なる結合部位とを備えた人工的ハイブリッド抗体である。治療用タンパク質に対応するアルブミン融合タンパク質を作製するために、アルブミンタンパク質成分のＮおよびＣ末端の両方に融合したｓｃＦｖ断片を有するアルブミン融合タンパク質を作製することができる。さらに具体的には、アルブミンのＮ末端に融合したｓｃＦｖは、治療用タンパク質と結合する本来の抗体の重／軽鎖（ＶＨ／ＶＬ）対の一方に対応し、アルブミンのＣ末端に融合したｓｃＦｖは、治療用タンパク質と結合する本来の抗体の重／軽鎖（ＶＨ／ＶＬ）対の他の１つに対応する。
【０３４３】
さらに、本発明により、ポリペプチドの溶解性、安定性および循環時間の増加、あるいは、免疫原性の低下という別の利点をもたらす、本発明のアルブミン融合タンパク質の化学的に修飾した誘導体が提供される（米国特許第４，１７９，３３７号を参照）。誘導体化のための化学的成分は、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコールなどの水溶性ポリマーから選択することができる。アルブミン融合タンパク質は、分子内のランダム位置、あるいは、分子内の所定の位置のいずれかで修飾されていてもよく、１、２または３以上の化学的成分と結合していてもよい。
【０３４４】
上記ポリマーは、どんな分子量のものでもよく、分枝または非分枝のいずれでもよい。ポリエチレングリコールについて、取扱いおよび製造を容易にするのに好ましい分子量は、約１ｋＤａ〜約１００ ｋＤａ（「約」という用語は、ポリエチレングリコール調製物中においては、記載した分子量より多いか、または少ない分子が存在することを意味する）の範囲にある。所望する治療プロフィール（例えば、所望する持続放出時間、効果、もしあれば、生物活性、取扱いの容易さ、抗原性の程度または欠如、ならびに、ポリエチレングリコールが治療用タンパク質または類似体に及ぼすその他既知の影響）に応じて、その他のサイズを用いてもよい。例えば、ポリエチレングリコールは、下記のような平均分子量を有していてよい：約２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、１５，５００、１６，０００、１６，５００、１７，０００、１７，５００、１８，０００、１８，５００、１９，０００、１９，５００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、５５，０００、６０，０００、６５，０００、７０，０００、７５，０００、８０，０００、８５，０００、９０，０００、９５，０００、または１００，０００ ｋＤａ。
【０３４５】
既述のように、ポリエチレングリコールは、分枝構造をしているものでよい。分枝ポリエチレングリコールについては、例えば、米国特許第５，６４３，５７５号；Ｍｏｒｐｕｒｇｏら、Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５６：５９−７２（１９９６）；Ｖｏｒｏｂｊｅｖら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ １８：２７４５−２７５０（１９９９）；ならびに、Ｃａｌｉｃｅｔｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ． Ｃｈｅｍ． １０：６３８−６４６（１９９９）に記載されている。尚、これらの文献はすべて、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０３４６】
ポリエチレングリコール分子（又は他の化学成分）は、タンパク質が機能または抗原ドメインに及ぼす影響を考慮しながら、該タンパク質と結合しなければならない。当業者が利用可能な多数の結合方法があり、例えば、ＥＰ ０ ４０１０ ３８４（ＰＥＧをＧ−ＣＳＦに結合）（参照により本明細書に組み込む）が挙げられる。また、塩化トレシルを用いたＧＭ−ＣＳＦのペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）を記載している、Ｍａｌｉｋら、Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ． ２０：１０２８−１９２５（１９９２）も参照されたい。例えば、ポリエチレングリコールは、遊離アミノまたはカルボキシル基のような反応基を介したアミノ酸残基により、共有結合させることができる。反応基は、活性化ポリエチレングリコール分子が結合できる基である。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基として、リシン残基およびＮ末端アミノ酸残基が挙げられ；遊離カルボキシル基を有するアミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、およびＣ末端アミノ酸残基が挙げられる。スルフヒドリル基は、ポリエチレングリコール分子を結合する反応基としても用いることができる。治療目的には、Ｎ末端またはリシン基での結合のようなアミノ基での結合が好ましい。
【０３４７】
すでに示したように、ポリエチレングリコールは、多数のアミノ酸残基のいずれかとの連結を介して、タンパク質に結合させることができる。例えば、ポリエチレングリコールは、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン残基との共有結合を介してタンパク質に結合させることができる。１以上の反応ケミストリーを用いて、ポリエチレングリコールを、タンパク質の特定のアミノ酸残基（例えば、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはシステイン）と、もしくはタンパク質の１種以上のアミノ酸残基（例えば、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、ならびに、これらの組合せ）と結合させることができる。
【０３４８】
具体的に、Ｎ末端で化学的に修飾されたタンパク質が所望される場合もある。本発明の組成物の例として示すポリエチレングリコールを用いて、（分子量、分枝などの）さまざまなポリエチレングリコール分子から、反応混合物におけるポリエチレングリコール分子とタンパク質（ポリペプチド）分子の比率、実施しようとするペギル化の種類、ならびに、選択したＮ末端ペギル化タンパク質を取得する方法を選択することができる。Ｎ末端ペギル化調製物を取得する（すなわち、必要に応じて、この成分を他のモノペギル化成分から分離する）方法は、ペギル化タンパク質分子の集団からＮ末端ペギル化物質を精製することからなる。Ｎ末端修飾で化学的に修飾された選択性タンパク質は、還元的アルキル化によって達成することができる。これは、特定のタンパク質での誘導体化に使用可能な各種一次アミノ基（リシン対Ｎ末端）の示差反応性を利用するものである。適した反応条下で、ポリマーを含むカルボニル基を有するＮ末端でのタンパク質の実質的に選択性の誘導体化が達成される。
【０３４９】
前述のように、本発明のアルブミン融合タンパク質ペギル化は、複数の手段を用いて達成できる。例えば、ポリエチレングリコールを直接、または介在リンカーにより、アルブミン融合タンパク質に結合させることができる。ポリエチレングリコールをタンパク質に結合させるリンカーなしの方法は、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ． ９：２４９−３０４（１９９２）；Ｆｒａｎｃｉｓら、Ｉｎｔｅｒｎ． Ｊ． ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌ． ６８：１−１８（１９９８）；米国特許第４，００２，５３１号；米国特許第５，３４９，０５２号；ＷＯ９５／０６０５８；ならびに、ＷＯ９８／３２４６６（すべて、参照により本明細書に組み込む）に記載されている。
【０３５０】
介在リンカーなしにポリエチレングリコールを直接アミノ酸残基に結合させる方法の１つでは、トレシル化（ｔｒｅｓｙｌａｔｅｄ）ＭＰＥＧを用いる。このＭＰＥＧは、トレシル塩化物（ＣＩＳＯ２ＣＨ２ＣＦ３）を用いて、モノメトキシポリエチレングリコール（ＭＰＥＧ）を修飾することにより、生成される。タンパク質とトレシル化ＭＰＥＧとの反応後、ポリエチレングリコールをタンパク質のアミン基に直接結合させる。従って、本発明は、本発明のタンパク質を２，２，２−トリフルオロエタンスルホニル基を有するポリエチレングリコール分子と反応させることによって生成されるタンパク質−ポリエチレングリコールコンジュゲートを含む。
【０３５１】
また、多数の様々な介在リンカーを用いて、ポリエチレングリコールをタンパク質に結合することもできる。例えば、米国特許第５，６１２，４６０号（その全文を参照により本明細書に組み込む）は、ポリエチレングリコールをタンパク質に結合するためのウレタンリンカーを開示している。また、リンカーによりポリエチレングリコールをタンパク質に結合させたタンパク質−ポリエチレングリコールは、ＭＰＥＧ−スクシン酸スクシンイミジル、１，１’−カルボニルジイミダゾールで活性化したＭＰＥＧ、ＭＰＥＧ−２，４，５−炭酸トリクロロペニル、ＭＰＥＧ−ｐ−炭酸ニトロフェノール、ならびに、様々なＭＰＥＧ−スクシン酸塩誘導体などの化合物とタンパク質の反応によっても生成することができる。上記以外にも、ポリエチレングリコールをタンパク質に結合するための多数のポリエチレングリコール誘導体および反応ケミストリーが、国際公開番号ＷＯ９８／３２４６６（その全文を参照により本明細書に組み込む）に記載されている。本明細書に記載する反応ケミストリーを用いて、生成されたペギル化タンパク質は、本発明の範囲に含まれる。
【０３５２】
本発明の各アルブミン融合タンパク質に結合させるポリエチレングリコール成分の数（すなわち、置換度）も同様に様々である。例えば、本発明のペギル化タンパク質は、平均して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０個以上のポリエチレングリコール分子と結合させることができる。同様に、平均置換度は、タンパク質１分子当たり、１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、５〜７、６〜８、７〜９、８〜１０、９〜１１、１０〜１２、１１〜１３、１２〜１４、１３〜１５、１４〜１６、１５〜１７、１６〜１８、１７〜１９、もしくは１８〜２０個の範囲のポリエチレングリコール分子である。置換度を決定する方法は、例えば、Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓ． ９：２４９−３０４（１９９２）に記載されている。
【０３５３】
本発明のポリペプチドは、標準的方法により、化学的合成物および組換え細胞培養物から回収および精製することができる。このような方法として、限定するものではないが、硫酸アルミニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーが挙げられる。最も好ましくは、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を精製に用いる。単離および／または精製中、ポリペプチドが変性した場合には、タンパク質を再生する公知の方法を用いて、活性コンホメーションを再生することも可能である。
【０３５４】
本発明のアルブミン融合タンパク質の存在および量は、当技術分野では公知の免疫アッセイ法であるＥＬＩＳＡを用いて決定することができる。本発明のアルブミン融合タンパク質を検出／定量するのに有用なＥＬＩＳＡプロトコルの１つは、下記の段階を含んでなる：ＥＬＩＳＡプレートを抗ヒト血清アルブミン抗体でコーティングし、プレートをブロッキングすることにより非特異的結合を阻止し、ＥＬＩＳＡプレートを洗浄し、本発明のアルブミン融合タンパク質を含む溶液（１以上の異なる濃度）を添加し、次に、検出可能な標識に結合した二次抗治療用タンパク質特異的抗体（本明細書に記載した、あるいは、当業者には公知の）を添加した後、二次抗体の存在を検出する。上記プロトコルの別の形態では、ＥＬＩＳＡプレートを抗治療用タンパク質特異的抗体でコーティングし、標識された二次試薬は、抗ヒトアルブミン特異的抗体でよい。
【０３５５】
ポリヌクレオチドの使用
本明細書に記載したポリヌクレオチドの各々は、試薬として様々な方法で用いることができる。以下の記載は、例示として考えるべきであり、公知の技法を使用している。
【０３５６】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のアルブミン融合タンパク質を調製するのに有用である。以下にさらに詳しく説明するように、本発明のポリヌクレオチド（アルブミン融合タンパク質をコードする）を、遺伝子工学に有用な組換えＤＮＡ法に用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによってコードされるアルブミン融合タンパク質を発現する細胞、細胞系、または組織を作製することができる。
【０３５７】
本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子治療にも有用である。遺伝子治療の目的の１つは、欠陥遺伝子を有する生物に、正常遺伝子を挿入することにより、遺伝子欠陥を修正することである。本発明で開示されたポリヌクレオチドは、極めて正確に、このような遺伝子欠陥をターゲッティングする手段を提供する。もう１つの目的は、宿主ゲノムには存在しない新しい遺伝子を挿入し、これにより、宿主細胞に新しい特性を形成することである。本発明が包含する遺伝子治療のその他の非制限的例示について、さらに詳細が本明細書に記載されている（例えば、「遺伝子治療」と題する節、ならびに、実施例１７および１８を参照）。
【０３５８】
ポリペプチドの使用
本明細書に記載したポリペプチドの各々は、様々な方法で用いることができる。以下の記載は、例示として考えるべきであり、公知の技法を使用している。
【０３５９】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、組織の識別（例えば、ＡＢＣ免疫ペルオキシダーゼ（Ｈｓｕら、Ｊ． Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ． Ｃｙｔｏｃｈｅｍ． ２９：５７７−５８０（１９８１）のような免疫組織化学アッセイ）または細胞型（例えば、免疫細胞化学アッセイ）のための免疫プローブを提供する上で有用である。
【０３６０】
アルブミン融合タンパク質を用いて、生物学的サンプルにおけるポリペプチドのレベルをアッセイすることができ、その際、当業者には公知の伝統的免疫組織学的方法を用いる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０５：３０８７−３０９６（１９８７））。タンパク質遺伝子発現を検出するのに有用なその他の方法として、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）のような免疫アッセイが挙げられる。好適なアッセイ標識は、当技術分野には公知であり、グルコースオキシダーゼのような酵素標識；ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、および９７Ｒｕのような放射性同位元素；ルミノールのような発光標識；ならびに、フルオレセインやローダミンのような蛍光標識、ならびに、ビオチンが挙げられる。
【０３６１】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、イメージングによりｉｎ ｖｉｖｏで検出することも可能である。タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏイメージング用の標識またはマーカーは、Ｘ線撮影、核磁気共鳴（ＮＭＲ）または電子スピン緩和（ＥＳＲ）により検出可能なものである。Ｘ線ラジオグラフィーに好適な標識としては、検出可能な放射線を放出するが、被験者に過度に有害でないバリウムまたはセシウムなどの放射性同位元素が挙げられる。ＮＭＲまたはＥＳＲに好適なマーカーには、重水素のような検出可能な特有のスピンを有するものがあり、このようなマーカーを、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現する細胞系に賦与した栄養素の標識により、アルブミン融合タンパク質に組み込むことができる。
【０３６２】
放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、１２１Ｉ、９９ｍＴｃ、（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５ｍＩｎ、１１３ｍＩｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ、９９ｍＴｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｈ）、放射線不透過物質、あるいは、核磁気共鳴により検出可能な物質などの好適な検出可能な画像化成分で標識したアルブミン融合タンパク質を、免疫系障害について検査しようとする哺乳動物に導入する（例えば、非経口、皮下もしくは腹腔内に導入）。当業者には、被験体のサイズおよび用いたイメージング装置によって、診断画像を作成するのに必要な画像化成分の量を決定するということは理解されよう。ヒト被験者に、放射性同位体成分を用いる場合には、注射する放射能の量は、通常、約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ｍＴｃである。次に、標識したアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、１以上の受容体、リガンドまたは基質（本発明のアルブミン融合タンパク質を調製するのに用いられるものに対応する）が位置する身体内の位置（例えば、器官、細胞、細胞外空間またはマトリックス）に蓄積する。あるいは、アルブミン融合タンパク質が、少なくとも治療用抗体のフラグメントまたは変異体を含む場合には、標識したアルブミン融合タンパク質は、好ましくは、治療用抗体（本発明のアルブミン融合タンパク質を調製するのに用いられた）が結合したものに対応するポリペプチド／エピトープが位置する身体内の位置（例えば、器官、細胞、細胞外空間またはマトリックス）に蓄積する。Ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍イメージングについては、下記の文献に記載されている：Ｓ．Ｗ． Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、”Ｉｍｍｏｎｏｐｈａｒｍｏｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇの第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｓ．Ｗ．　ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ． Ａ． Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））。上記文献に記載されているプロトコルは、本発明のアルブミン融合タンパク質と共に用いるために、当業者が容易に改変することができる。
【０３６３】
一実施形態では、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と会合した本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または抗体をコードするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド）を投与することにより、細胞に本発明のアルブミン融合タンパク質を特異的に送達する方法を提供する。一実施形態では、本発明は、治療用タンパク質を標的細胞に送達する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、標的細胞に、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）もしくは二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込まれるか、またはエピソームにより複製することができ、転写することができるＤＮＡ）を標的細胞に送達する方法を提供する。
【０３６４】
別の実施形態では、本発明は、毒素または細胞傷害性プロドラッグと共に、本発明のアルブミン融合タンパク質を投与することにより、細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）を行う方法を提供する。
【０３６５】
「毒素」とは、内因性細胞傷害エフェクター系、放射性同位体、ホロトキシン、修飾された毒素、毒素の触媒サブユニットと結合してこれらを活性化する１以上の化合物、あるいは、細胞の表面に通常は存在せず、一定の条件下で細胞の死を引き起こすあらゆる分子または酵素を意味する。本発明の方法に従い用いることができる毒素としては、限定するものではないが、当技術分野では公知の放射性同位体、例えば、固有または誘導内因性細胞傷害エフェクター系と結合する抗体（またはその部分を固定および含有する補体）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ、αトキシン、リシン、アブリン、シュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒素、サポリン、モモルジン、ゲロニン、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、αサルシンおよびコレラ毒素などの化合物が挙げられる。また、「毒素」には細胞分裂抑制または細胞致死因子、治療薬もしくは放射性金属イオン、例えば、２１３Ｂｉのようなアルファ放射体、もしくは例えば、１０３Ｐｄ、１３３Ｘｅ、１３１Ｉ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、３５Ｓ、９０Ｙ、１５３Ｓｍ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、９０イットリウム、１１７スズ、１８６レニウム、１６６ホルミウム、および１８８レニウムなど、その他の放射性同位元素；ルミノールのような発光標的；ならびに、フルオレセインおよびローダミンのような蛍光標的、ならびに、ビオチンも含まれる。特定の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を、放射性同位元素９０Ｙと共に投与することにより、細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）を行う方法を提供する。別の特定の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を、放射性同位元素１１１Ｉｎと共に投与することにより、細胞の特異的破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）を行う方法を提供する。さらに別の特定の実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体を、放射性同位元素１３１Ｉと共に投与することにより、特定の細胞の破壊（例えば、腫瘍細胞の破壊）を行う方法を提供する。
【０３６６】
当技術分野では公知の方法を用いて、本発明のポリペプチドを標識することができる。このような技法として、限定するものではないが、二重特異性連結因子が挙げられる（例えば、米国特許第５，７５６，０６５号；第５，７１４，６３１号；第５，６９６，２３９号；第５，６５２，３６１号；第５，５０５，９３１号；第５，４８９，４２５号；第５，４３５，９９０号；第５，４２８，１３９号；第５，３４２，６０４号；第５，２７４，１１９号；第４，９９４，５６０号；ならびに、第５，８０８，００３号を参照。尚、これら文献各々の内容は、参照により本明細書にその全文を組み込むものとする）。
【０３６７】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、哺乳動物、好ましくは、ヒトにおける様々な障害の診断、治療、予防および／または予後判定に有用である。このような障害には、以下に「生物活性」と題する節で記載するものが含まれる。
【０３６８】
従って、本発明は、障害の診断方法であって、（ａ）本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて、個体の細胞または体液における特定のポリペプチドの発現レベルをアッセイし、（ｂ）アッセイしたポリペプチドの発現レベルを標準ポリペプチドのレベルと比較することを含んでなり、ここで、標準発現レベルに対する、アッセイしたポリペプチド発現レベルの増加または減少が障害の指標となる、上記診断方法を提供する。癌に関しては、個体から生検した組織における比較的高い量の転写物の存在が、疾患進行の素因を示すか、または実際の臨床的症状の出現前に疾患を検出する手段を提供すると考えられる。このタイプのさらに決定的な診断により、医療の専門家は、より早期に、予防措置または攻撃的治療を用いて、癌の発生または進行を予防することができる。
【０３６９】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて、例えば、神経障害、免疫系障害、筋障害、生殖障害、胃腸障害、肺障害、心臓血管障害、腎障害、増殖障害、および／または癌性疾患および病状などの疾患もしくは病状を治療または予防することができる。例えば、患者に、本発明のポリペプチドを投与して、該ポリペプチド（例えば、インスリン）の欠失または低下レベルを補う；異なるポリペプチド（例えば、ヘモグロビンＢについてのヘモグロビンＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ、ＤＮＡ修復タンパク質など）の欠失または低下レベルを補充する；ポリペプチド（例えば、癌遺伝子または腫瘍抑制物質）の活性を阻害する；ポリペプチドの活性を活性化（例えば、受容体と結合することにより）する；遊離リガンド（例えば、炎症を抑制するのに用いられる可溶性ＴＮＦ）について競合することにより、膜結合受容体の活性を抑制する；あるいは、所望の応答（例えば、血管成長阻害、増殖細胞または組織に対する免疫応答の増強）をもたらすことができる。
【０３７０】
特に、少なくとも治療用抗体のフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質を用いても、疾患（本明細書の前掲およびその他の箇所に記載したもの）を治療することができる。例えば、少なくとも治療用抗体のフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質を投与することにより、ポリペプチドを結合させる、および／または中和することができ、このポリペプチドに、アルブミン融合タンパク質調製のために用いた治療用抗体が免疫特異的に結合し、および／またはアルブミン融合タンパク質調製のために用いた治療用抗体が免疫特異的に結合したポリペプチドの過剰生産を抑制する。同様に、少なくとも治療用抗体のフラグメントまたは変異体を含むアルブミン融合タンパク質を投与して、膜（受容体）に結合したポリペプチドに結合させることにより、アルブミン融合タンパク質調製のために用いた治療用抗体が免疫特異的に結合したポリペプチドを活性化することができる。
【０３７１】
少なくとも、本発明のアルブミン融合タンパク質は、当業者には公知の方法により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルまたは分子ふるいゲルろ過カラム上の分子量マーカーとして用いることができる。また、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて、抗体を誘起させた後、この抗体を用いて、宿主細胞または生物学的サンプルでの形質転換を評価する方法として、組換え細胞から得た本発明の治療用タンパク質、アルブミンタンパク質、および／またはアルブミン融合タンパク質のタンパク質発現を測定することも可能である。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて、本明細書に記載した生物活性を試験することもできる。
【０３７２】
診断アッセイ
本発明の化合物は、哺乳動物、好ましくはヒトにおける様々な障害の診断、治療、予防および／または予後判定に有用である。このような障害として、限定するものではないが、表１の対応する列に、治療用タンパク質の各々について記載したもの、ならびに、本明細書の下記標題を掲げた節で記載したものが挙げられる：「免疫活性」、「血液関連疾患」、「過増殖性疾患」、「腎障害」、「心血管障害」、「呼吸器障害」、「抗脈管新生活性」、「細胞レベルでの疾患」、「創傷治癒および上皮細胞増殖」、「神経活性および神経疾患」、「内分泌障害」、「生殖系障害」、「感染症」、「再生」および／または「胃腸障害」（後掲）。
【０３７３】
多数の障害に関して、そのような障害を有する個体から採取した組織、細胞または体液（血清、血漿、尿、精液、滑液または髄腋）において、「標準的」遺伝子発現レベル、すなわち、そのような障害のない個体から採取した組織または体液における発現レベルと比較して、実質的に変化（増加または減少）したレベルの遺伝子発現を検出することができる。従って、本発明は、障害の診断の際に有用な診断方法であって、個体から採取した組織、細胞または体液においてポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを測定し、測定した遺伝子発現レベルを標準的遺伝子発現レベルと比較することを含んでなり、ここで、標準と比較した遺伝子発現レベルの増加または減少が障害の指標となる、上記方法を提供する。これらの診断アッセイは、例えば、血液サンプル、生検もしくは剖検組織について、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで実施することができる。
【０３７４】
本発明は、遺伝子発現が増加または低下した患者が、より悪化した臨床転帰を被るという予後判定の指標としても有用である。
【０３７５】
「ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルをアッセイする」とは、特定のポリペプチド（例えば、表１に開示した治療用タンパク質に対応するポリペプチド）のレベル、または第１の生物学的サンプルにおいて本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルを、直接（例えば、絶対タンパク質レベルもしくはｍＲＮＡレベルを測定または推定することにより）、または相対的（例えば、第２の生物学的サンプルにおけるポリペプチドレベルもしくはｍＲＮＡレベルと比較することにより）に、定性または定量的に測定することを意味する。好ましくは、第１生物学的サンプルにおけるポリペプチドレベルもしくはｍＲＮＡレベルを測定または推定し、標準的ポリペプチドレベルもしくはｍＲＮＡレベルと比較する。その際、標準レベルは、障害のない個体から採取した第２生物学的サンプルから取得するか、または障害を有していない個体の集団から得たレベルを平均化することにより決定する。当業者には理解されるように、いったん標準的ポリペプチドレベルまたはｍＲＮＡレベルを得れば、それを比較基準として繰返し用いることができる。
【０３７６】
「生物学的サンプル」とは、個体、細胞系、組織培養物、または、本発明のポリペプチド（その部分を含む）もしくはｍＲＮＡを含有するその他の供給源から取得したあらゆる生物学的サンプルを意味する。既述したように、生物学的サンプルとしては、全長のポリペプチドまたはｍＲＮＡもしくはその断片を発現することが認められた体液（血清、血漿、尿、滑液および髄液など）および組織に由来するものがある。哺乳動物から組織生検および体液を取得する方法は、当技術分野ではよく知られている。生物学的サンプルがｍＲＮＡを含有することが望ましい場合には、組織生検が好ましい供給源である。
【０３７７】
ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １６２：１５６−１５９（１９８７）に記載されている単一工程グアニジウム−チオシアン酸−フェノール−クロロホルム法等の任意の好適な技法を用いて、生物学的サンプルから細胞全ＲＮＡを単離することができる。本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡのレベルは、任意の好適な方法を用いて、アッセイする。このような方法として、ノーザンブロット分析、Ｓ１ヌクレアーゼマッピング、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応と組み合わせた逆転写反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ならびに、リガーゼ連鎖反応と組み合わせた（ＲＴ−ＬＣＲ）が挙げられる。
【０３７８】
本発明はまた、生物学的サンプル（例えば、細胞および組織）において、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドのレベルを検出する定量的および診断アッセイなどの診断アッセイであって、ポリペプチドの正常および異常レベルの測定を含んでなる上記アッセイに関する。従って、例えば、正常の対照組織アッセイと比較して、上記アルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドのレベルを検出するための本発明による診断アッセイを用いて、腫瘍の存在を検出することができる。宿主に由来するサンプルにおいて、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合、結合される、または会合するポリペプチドのレベルを検出するのに用いることができるアッセイ技法は、当業者にはよく知られている。このようなアッセイ方法として、ラジオイムノアッセイ、競合結合アッセイ、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。生物学的サンプルにおけるポリペプチドレベルのアッセイは、いずれかの公知の方法を用いて、実施することができる。
【０３７９】
生物学的サンプルにおけるポリペプチドレベルのアッセイは、様々な技法を用いて実施することができる。例えば、組織におけるポリペプチド発現は、古典的な免疫組織学的方法（Ｊａｌｋａｎｅｎら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ， Ｍ．ら、Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １０５：３０８７−３０９６（１９８７））を用いて調べることができる。ポリペプチド遺伝子発現を検出するのに有用なその他の方法に、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）やラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などの免疫アッセイがある。好適な抗体アッセイの標識は、当分野では公知であり、例えば、グルコースオキシダーゼのような酵素標識；ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、イオウ（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１２Ｉｎ）およびテクネチウム（９９ｍＴｃ）などの放射性同位元素；フルオレセインやローダミンのような蛍光標識、ならびに、ビオチンが挙げられる。
【０３８０】
分析しようとする組織または細胞型としては、一般に、目的とする遺伝子を発現することがわかっているか、またはその疑いのあるもの（例えば、癌）が挙げられる。本明細書で使用するタンパク質単離方法は、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（Ｈａｒｌｏｗ， Ｅ．およびＬａｎｅ， Ｄ．， １９８８， ”Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）（参照によりその全文を本明細書に組み込む）に記載されているものでよい。単離される細胞は、細胞培養物または患者に由来するものでよい。培養物から取得した細胞の分析は、細胞に基づく遺伝子治療法の一環として用いることができる細胞の評価または遺伝子発現に化合物が及ぼす影響の試験において、必要な段階である。
【０３８１】
例えば、アルブミン融合タンパク質を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドの存在を定量または定性的検出することができる。これは、例えば、蛍光標的アルブミン融合タンパク質を用いる、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光定量検出と組み合わせた免疫蛍光技法により達成することができる。
【０３８２】
好ましい実施形態では、少なくとも本明細書に開示した治療用タンパク質（例えば、表１に開示した治療用タンパク質）と免疫特異的に結合する抗体、または少なくとも、当技術分野では公知の抗体のフラグメントもしくは変異体を含むアルブミン融合タンパク質を用いて、遺伝子産物もしくはその保存変異体またはペプチド断片の存在を定量または定性的検出することができる。これは、例えば、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光定量検出と組み合わせた、蛍光標的抗体を用いる免疫蛍光技法により達成することができる。
【０３８３】
さらには、免疫蛍光、免疫電子顕微鏡法もしくは非免疫アッセイと同様に、本発明のアルブミン融合タンパク質を組織学的に用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合、結合される、または会合するポリペプチドのｉｎ ｓｉｔｕ検出を実施することができる。ｉｎ ｓｉｔｕ検出は、患者から組織サンプルを採取し、そこに本発明の標識抗体またはポリペプチドを反応させることにより達成される。標識アルブミン融合タンパク質を生物学的サンプルに重層することにより、アルブミン融合タンパク質を反応させるのが好ましい。このような手順を用いて、アルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドの存在だけでなく、被検組織におけるその分布も決定することが可能である。本発明を用いて、当業者は、非常に多様な組織学的方法（染色方法など）のうち任意のものを改変することにより、このようなｉｎ ｓｉｔｕ検出を達成できることを容易に認識するであろう。
【０３８４】
アルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドを検出する免疫アッセイおよび非免疫アッセイは、典型的に、遺伝子産物またはその保存された変異体もしくはペプチド断片と結合する能力を有する検出可能標識化抗体の存在下で、サンプル（例えば、生物の体液、組織抽出物、新しく採取した細胞、もしくは細胞培養物中でインキュベートしておいた細胞の溶解物など）をインキュベートした後、当分野ではよく知られた多数の技法のいずれかにより、結合した抗体を検出することを含んでなる。
【０３８５】
生物学的サンプルは、ニトロセルロースなどの固相支持体もしくは担体、または細胞、細胞粒子もしくは可溶性タンパク質を固定化することができる他の固相支持体と接触させ、これに固定化する。次に、この支持体を適当なバッファーで洗浄した後、検出可能に標識化した本発明のアルブミン融合タンパク質で処理する。続いて、固相支持体を再度バッファーで洗浄することにより、結合していない抗体またはポリペプチドを除去する。場合によっては、その後、上記抗体を標識する。そして、固相支持体に結合した標識の量を通常の手段により検出する。
【０３８６】
「固相支持体または担体」とは、ポリペプチド（例えば、アルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチド）と結合することのできるあらゆる支持体を意味する。よく知られた支持体または担体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、斑レイ岩および磁鉄鉱が挙げられる。担体の性質は、本発明の目的に応じて、ある程度可溶性であるか、不溶性のいずれかである。支持体材料は、結合した分子が、ポリペプチドと結合することができれば、ほぼどんな構造形状をしていてもよい。従って、支持体の形状は、ビーズのように球状でもよいし、試験管の内側面または棒の外側面のように円筒状でもよい。あるいは、シートや試験ストリップなどのように平板な表面をしていてもよい。好ましい支持体として、ポリスチレンビーズが挙げられる。当業者は、抗体または抗原と結合するのに好適なその他多数の担体を認識しており、通常の実験によりそれを確認することができるだろう。
【０３８７】
所与ロットのアルブミン融合タンパク質の結合活性は、公知の方法に従って測定することができる。当業者は、通常の実験を用いて、各測定に最適な操作条件を決定することができるだろう。
【０３８８】
個体から得られた生物学的サンプルでのポリペプチドレベルをアッセイする以外に、イメージングにより、ポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで検出することも可能である。例えば、本発明の一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて、患部細胞または新生物細胞を画像化する。
【０３８９】
本発明のアルブミン融合タンパク質をｉｎ ｖｉｖｏ画像化するための標識またはマーカーには、Ｘ線撮影、ＮＭＲ、ＭＲＩ、ＣＡＴスキャンまたはＥＳＲにより検出可能なものがある。Ｘ線撮影に好適な標識としては、検出可能な放射線を放出するが、被験者に過度に有害でないバリウムまたはセシウムなどの放射性同位元素が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲに好適なマーカーには、重水素のような検出可能な独特のスピンを有するものがあり、このようなマーカーを、遺伝子操作した細胞系（もしくは細菌または酵母菌株）の栄養源を標識して、アルブミン融合タンパク質に取り込むことができる。
【０３９０】
さらに、その存在が検出可能な本発明のアルブミン融合タンパク質を投与してもよい。例えば、標識抗体について述べたように、放射線非透過性またはその他の適当な化合物で標識した本発明のアルブミン融合タンパク質を投与し、ｉｎ ｖｉｖｏで可視化することができる。また、このようなポリペプチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ診断方法にも使用することができる。
【０３９１】
放射性同位元素（例えば、１３１Ｉ、１１２Ｉｎ、９９ｍＴｃ）、放射線非透過性物質、もしくは核磁気共鳴により検出可能な物質など、適した検出可能な画像化成分で標識しておいたポリペプチド特異的抗体または抗体フラグメントを、障害について検査しようとする哺乳動物に導入する（例えば、非経口、皮下または腹腔内経路で）。当業者であれば、被験者の大きさや、用いるイメージング装置に応じて、診断画像を作成するのに必要な画像化成分の量を決定することわかるであろう。放射性同位元素成分の場合には、ヒト被験者に対して、注射される放射能の量は、通常約５〜２０ミリキュリーの範囲の９９ ｍＴｃである。その後、標識されたアルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質に結合する、結合される、または会合するポリペプチドもしくはその他の物質を含む身体内の位置に優先的に蓄積する。ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍イメージングについては、Ｓ．Ｗ． Ｂｕｒｃｈｉｅｌら、”Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ”（Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ第１３章：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ， Ｓ． Ｗ． ＢｕｒｃｈｉｅｌおよびＢ． Ａ． Ｒｈｏｄｅｓ編、Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２））に記載されている。
【０３９２】
本発明のアルブミン融合タンパク質を検出可能に標識する方法の１つは、このタンパク質をリポーター酵素と結合させ、結合した産物を酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）で用いることからなる（Ｖｏｌｌｅｒ， Ａ． “Ｔｈｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）”， １９７８， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ ２：１−７， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＭＤ）；Ｖｏｌｌｅｒら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐａｔｈｏｌ． ３１：５０７−５２０（１９７８）；Ｂｕｔｌｅｒ， Ｊ． Ｅ．， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ７３：４８２−５２３（１９８１）；Ｍａｇｇｉｏ， Ｅ．（編）、１９８０、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ， Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ， ＦＬ，；Ｉｓｈｉｋａｗａ， Ｅ．ら、（編）、１９８１、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ， Ｋａｇａｋｕ Ｓｈｏｉｎ、東京）。抗体に結合させるリポーター酵素は、好適な基質、好ましくは、発色性基質と反応し、これによって、例えば、分光学的定量、蛍光定量もしくは視覚的手段により検出が可能な化学的成分を生成するようにする。抗体を検出可能に標識するのに用いることができるリポーター酵素としては、限定するものではないが、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロコッカスヌクレアーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸、デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。加えて、リポーター酵素用の発色性基質を用いた比色分析方法により、検出を実施することもできる。さらには、同様に調製した標準物に対して、基質の酵素反応の程度を目視比較することにより、検出を達成することも可能である。
【０３９３】
また、アルブミン融合タンパク質を放射標識し、上記以外の各種免疫アッセイに用いてもよい。例えば、アルブミン融合タンパク質を放射標識することにより、このアルブミン融合タンパク質を放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）に用いることができる（例えば、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｂ．， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ， Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ， Ｍａｒｃｈ， １９８６を参照。尚、この文献は、参照により本明細書に組み込む）。放射性同位元素は、限定するものではないが、γカウンター、シンチレーションカウンター、またはオートラジオグラフィーなどの手段により、検出することができる。
【０３９４】
また、アルブミン融合タンパク質を蛍光化合物で標識することも可能である。蛍光標識した抗体を適正な波長の光に暴露すると、その存在を蛍光により検出することができる。最も一般的に用いられる蛍光標識化合物として、フルオレセインイソチアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オフトアルデヒドおよびフルオレスカミンが挙げられる。
【０３９５】
これ以外にも、１５２Ｅｕのような蛍光放出金属、もしくはランタニドシリーズのその他の金属を用いて、アルブミン融合タンパク質を検出可能に標識することもできる。これらの金属は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のようなキレート基を用いて、抗体に結合させることができる。
【０３９６】
さらには、アルブミン融合タンパク質を化学発光化合物に結合することにより、検出可能に標識することもできる。次に、化学反応の過程で生ずる蛍光の存在を検出することにより、化学発光化合物で標識したアルブミン融合タンパク質の存在を測定する。特に有用な化学発光標識化合物の例として、ルミノール、イソルミノール、テロマティック（ｔｈｅｒｏｍａｔｉｃ）アクリジウムエステル、イミダゾール、アクリジウム塩およびシュウ酸エステルがある。
【０３９７】
同様に、生物発光化合物を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質を標識してもよい。生物発光は、生物系に認められる化学発光の１種であり、その際、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加する。生物発光タンパク質の存在は、ルミネセンスの存在を検出することにより測定される。標識用途に重要な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンである。
【０３９８】
トランスジェニック生物
本発明のアルブミン融合タンパク質を発現させるトランスジェニック生物も本発明に含まれる。トランスジェニック生物は、遺伝学的に改変された生物であり、この生物には、組換え、外因性もしくはクローニングされた遺伝物質が伝達されている。このような遺伝物質は、よくトランスジーンと呼ばれる。このトランスジーンの核酸配列は、コードされたタンパク質の最適な発現および分泌に必要な１以上の転写調節配列、ならびにイントロンのようなその他の核酸配列を含んでいてもよい。トランスジーンは、生物、あるいは、生物が産生する産物、例えば、生物の乳、血液、尿、卵、毛または種子からのその回収を容易にするように、コードされたタンパク質の発現を指令することもできる。トランスジーンは、標的動物と同じ種または異なる種のゲノムに由来する核酸配列からなるものでよい。トランスジーンは、特定の核酸配列が正常に認められないゲノムの遺伝子座、あるいは、トランスジーンの正常遺伝子座のいずれに組み込んでもよい。
【０３９９】
「生殖細胞系トランスジェニック生物」という用語は、遺伝的改変または遺伝情報を生殖細胞系に導入することにより、トランスジェニック生物が、遺伝情報を子孫に伝達する能力を賦与したトランスジェニック生物を意味する。このような子孫が、上記の改変または遺伝情報の一部もしくは全部を実際に含んでいれば、これら子孫もトランスジェニック生物である。前記の改変または遺伝情報は、レシピエントが属する生物の種にとって外来であるか、特定の個体のレシピエントにとってのみ外来であるか、またはレシピエントがすでに持っていた遺伝情報である可能性もある。最後のケースでは、改変または導入された遺伝子は、元来の遺伝子とは異なる発現を呈すると考えられる。
【０４００】
トランスジェニック生物は、トランスジェニック動物またはトランスジェニック植物でよい。トランスジェニック動物は、トランスフェクション、電気穿孔、微量注射、胚性幹細胞および組換えウイルスおよびレトロウイルス感染などの多様な方法により産生することができる（例えば、米国特許第４，７３６，８６６号；米国特許第５，６０２，３０７号；Ｍｕｌｌｉｎｓら（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２２（４）：６３０−６３３；Ｂｒｅｎｉｎら（１９９７）Ｓｕｒｇ． Ｏｎｃｏｌ． ６（２）９９−１１０；Ｔｕａｎ（編）、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、６２、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）を参照）。核酸断片を組換え能力哺乳動物細胞に導入する方法は、多数の核酸分子の共形質転換に有利であれば、どんな方法によるものでもよい。トランスジェニック動物を生産する詳細な手順については、当業者はすでに公知であり、例えば、米国特許第５，４８９，７４３号および米国特許第５，６０２，３０７号に開示されているものがある。
【０４０１】
多数の組換えまたはトランスジェニック動物が産生されており、例えば、下記のものが挙げられる：活性型癌配列を発現するもの（米国特許第４，７３６，８６６号）；サルＳＶ４０ Ｔ抗原を発現するもの（米国特許第５，７２８，９１５号）；インターフェロン調節因子１（ＩＲＦ−１）の発現を欠失させたもの（米国特許第５，７３１，４９０号）；ドーパミン作動性不全を呈示するもの（米国特許第５，７２３，７１９号）；血圧制御に関与する少なくとも１つのヒト遺伝子を発現するもの（米国特許第５，７３１，４８９号）；自然発症性アルツハイマー病に見られる状態との高い類似性を展示するもの（米国特許第５，７２０，９３６号）；細胞接着を媒介する能力が低下したもの（米国特許第５，６０２，３０７号）；ウシ成長ホルモン遺伝子を有するもの（Ｃｌｕｔｔｅｒら（１９９６）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １４３（４）：１７５３−１７６０）；あるいは、十分なヒト抗体応答を発生する能力があるもの（ＭｃＣａｒｔｈｙ（１９９７）Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ３４９（９０４９）：４０５）。
【０４０２】
マウスおよびラットがやはり、ほとんどのトランスジェニック実験に適した動物ではあるが、別の動物種を用いるのが好ましい、あるいは、必要でさえある場合もある。トランスジェニック法は、ネズミ以外の多様な動物、例えば、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ハムスター、ウサギ、ウシおよびモルモットなどで用いられ、成功している（例えば、Ｋｉｍら（１９９７）Ｍｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ． Ｄｅｖ． ４６（４）：５１５−５２６；Ｈｏｕｄｅｂｉｎｅ（１９９５）Ｒｅｐｒｏｄ． Ｎｕｔｒ． Ｄｅｖ． ３５（６）：６０９−６１７；Ｐｅｔｔｅｒｓ（１９９４）Ｒｅｐｒｏｄ． Ｆｅｒｔｉｌ． Ｄｅｖ． ６（５）：６４３−６４５；Ｓｃｈｎｅｉｋｅら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８（５３４６）：２１３０−２１３３；およびＡｍｏａｈ（１９９７）Ｊ． Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ７２（２）：５７８−５８５を参照）。
【０４０３】
トランスジェニック動物の乳への本発明のトランスジーンがコードするタンパク質の分泌を指令するためには、哺乳動物上皮細胞で優先的に活性化されるプロモーターの制御下にトランスジーンを配置すればよい。その際、乳タンパク質をコードする遺伝子を制御するプロモーターが好ましく、例えば、カゼイン、βラクトグロブリン、乳漿タンパク質、もしくはラクトアルブミンのプロモーター（例えば、ＤｉＴｕｌｌｉｏ（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７４−７７；Ｃｌａｒｋら（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：４８７−４９２；Ｇｏｒｔｏｎら（１９８７）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５：１１８３−１１８７；ならびに、Ｓｏｕｌｉｅｒら（１９９２）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ． ２９７：１３を参照）が挙げられる。好適なトランスジェニック哺乳動物は、多量の乳汁を生産し、かつ乳汁分泌期間が長いもの、例えば、ヤギ、ウシ、ラクダまたはヒツジである。
【０４０４】
また、本発明のアルブミン融合タンパク質をトランスジェニック植物、例えば、ＤＮＡトランスジーンを核またはプラスチドゲノムに挿入した植物において発現させることもできる。外来核酸を植物細胞またはプロトプラストに導入するのに用いられる植物形質転換方法は当分野では公知である（例えば、実施例１９を参照）。概略については、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． １５３（組換えＤＮＡ Ｐａｒｔ Ｄ）１９８７， ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ＥＰ ６９３５５４を参照。遺伝子工学的に操作した植物の生産方法についてさらに詳しくは、米国特許第５，２８３，１８４号、米国特許第５，４８２，８５２号および欧州特許出願ＥＰ ６９３ ５５４号に記載されており、これらはすべて参照により本発明に組み込む。
【０４０５】
医薬または治療用組成物
本発明のアルブミン融合タンパク質またはその製剤は、非経口（例えば、皮下または筋内）注射もしくは静脈内注入を含むあらゆる通常の方法により投与することができる。治療は、単一用量、または所定時間をかけた複数回用量のいずれからなるものでもよい。
【０４０６】
本発明のアルブミン融合タンパク質を単独で投与することもできるが、１種以上の許容され得る担体と一緒に医薬製剤の形態をしていることが好ましい。この担体は、アルブミン融合タンパク質と適合性であり、かつ、その受容者に有害ではないという点で「許容され得る」ものでなければならない。典型的には、担体は、無菌かつ発熱物質を含まない水または食塩水である。本発明のアルブミン融合タンパク質は、溶液中でのその貯蔵寿命が長いことから、発熱物質を含有しない無菌水、食塩水もしくはその他の等張液のような水性担体中の製剤に特によく適している。例えば、本発明の医薬組成物は、水性形態の製剤として事前に調製し、販売までに例えば、数週間、数ヶ月、あるいは、それ以上の期間置いておくことができる。
【０４０７】
例えば、治療用タンパク質が、ｈＧＨ、ＥＰＯ、α−ＩＦＮまたはβ−ＩＦＮである場合には、アルブミン融合タンパク質を含む製剤は、水性製剤中のアルブミン融合タンパク質の貯蔵寿命が引き延ばされることを考慮して、調剤することができる。表２に示すように、ほとんどの治療用タンパク質は、水性担体を用いて製剤した後は、不安定で貯蔵寿命も短い。前述したように、これら治療用タンパク質の多くの貯蔵寿命は、ＨＡとの融合後、顕著に増加または延長される。
【０４０８】
【表２】
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【０４０９】
エーロゾル投与が好適な場合には、標準的方法を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質をエーロゾルとして調製することができる。「エーロゾル」という用語は、本発明のアルブミン融合タンパク質のあらゆるガス中（ｇａｓ−ｂｏｒｎｅ）懸濁相を包含し、細気管支または鼻腔に吸入させることが可能なものである。具体的に、エーロゾルには、計量式吸入器もしくはネブライザーまたは噴霧器中で生成し得るような本発明のアルブミン融合タンパク質小滴のガス中懸濁物がある。さらに、エーロゾルには、空気またはその他の担体ガス中に懸濁させた本発明の化合物の乾燥粉末組成物があり、これは、例えば吸入装置からの吹込みにより送達することができる。ＧａｎｄｅｒｔｏｎおよびＪｏｎｅｓ， Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｔｈｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｔｒａｃｔ， Ｅｌｌｉｓ Ｈｏｒｗｏｏｄ（１９８７）；Ｇｏｎｄａ（１９９０）Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ６：２７３−３１３；Ｒａｅｂｕｒｎら（１９９２）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７：１４３−１５９を参照。
【０４１０】
また、本発明の製剤は、一つには、適正な種に由来するアルブミン融合タンパク質の成分を使用するため、典型的には、非免疫原性である。例えば、ヒトに使用する場合、アルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質およびアルブミン部分の両方が、典型的にはヒト由来である。いずれか一方の成分が、ヒト由来ではない場合には、鍵となるアミノ酸を置換してその成分をヒト化することにより、ヒト免疫系にとって、特定のエピトープが、外来ではなく生来ヒトであるようにしてもよい。
【０４１１】
製剤は、単位用量形態であるのが便利であり、製薬の分野ではよく知られた方法のいずれを用いても調製することができる。このような方法は、アルブミン融合タンパク質を、１以上の補助成分を構成する担体と結合させる段階を含む。一般に、製剤は、液体担体もしくは微粉状の固体担体、あるいは、その両方と、活性成分を均一かつ密に結合させた後、必要であれば、生成物を造形することにより、調製する。
【０４１２】
非経口投与に適した製剤として、下記のものが挙げられる：対象受容者に適した製剤にする酸化防止剤、バッファー、静菌薬および溶質を含むことができる水性および非水性無菌注射液；ならびに、懸濁剤および増粘剤を含むことができる水性および非水性無菌懸濁物。製剤は、単位用量または複数回用量容器、例えば、密封されたアンプル、バイアルもしくは注射器に入った状態をしていてもよいし、また、使用する直前に無菌液体担体、例えば、注射用の水を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）状態で貯蔵することもできる。すぐ使える（ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ）注射溶液および懸濁液は、無菌粉末から調製することができる。本発明のアルブミン融合タンパク質の多くが長い血清半減期を示していることから、本発明の投与製剤には、治療用タンパク質の非融合標準製剤と比較して、低いモル濃度または低い用量で治療用タンパク質部分を含有させることができる。
【０４１３】
例として、本発明のアルブミン融合タンパク質が、１以上の治療用タンパク質領域として、成長ホルモンを含んでいる場合には、天然のｈＧＨと比較したアルブミン融合タンパク質の血清半減期および貯蔵寿命が長くなっていることを考慮しながら、ｈＧＨの効力に対するアルブミン融合タンパク質の効力に基づいて、投与形態を計算することができる。成長ホルモンは、１年以上の期間にわたり、典型的には０．３〜３０．０ ＩＵ／ｋｇ／週、例えば０．９〜１２．０ ＩＵ／ｋｇ／週の用量で、例えば３または７回に分けて投与する。全長ＧＨに融合した全長ＨＡからなるアルブミン融合タンパク質の場合には、単位に関しては同等の用量でも、上記より大きい薬剤重量を示すことになるが、投与頻度は、例えば、週２回、週１回以下にまで減らすことができる。
【０４１４】
本発明の製剤または組成物は、アルブミン融合タンパク質成分の引き延ばされた貯蔵寿命について記載した説明書またはパッケージ挿入書と一緒に、パッケージングするか、あるいは、キットに納めることができる。例えば、このような説明書またはパッケージ挿入書には、本発明のアルブミン融合タンパク質の引き延ばされた、すなわち長くなった貯蔵寿命を考慮に入れて、期間、温度および光などの推奨される貯蔵条件について記載することができる。また、このような説明書またはパッケージ挿入書には、例えば、管理された病院、診療所もしくは事務所条件以外の現場での使用が必要となり得る製剤の貯蔵しやすさなど、本発明のアルブミン融合タンパク質の具体的利点を記載することもできる。前述したように、本発明の製剤は水性形態でもよく、治療活性の有意な損失を起こすことなく、理想的ではない条件下で保存することができる。
【０４１５】
また、本発明のアルブミン融合タンパク質を栄養補給食品に含有させることも可能である。例えば、本発明のある種のアルブミン融合タンパク質は、アルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック動物から取得した乳または乳製品などの天然物質に入れて投与してもよい。このような組成物はまた、アルブミン融合タンパク質を発現するトランスジェニック植物から取得した植物または植物産物を含んでもよい。さらに、アルブミン融合タンパク質は、その他公知の添加剤、担体、充填剤および稀釈剤を含む、もしくは含まない粉末または錠剤の形態で提供することもできる。栄養補給食品については、Ｓｃｏｔｔ Ｈｅｇｅｎｈａｒｔ， Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ， Ｄｅｃ． １９９３に記載されている。
【０４１６】
本発明はまた、製薬上許容される担体と混合して、有効量の本発明のアルブミン融合タンパク質、または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（「アルブミン融合ポリヌクレオチド」）を被験者に投与することにより、疾患または障害（例えば、本明細書に記載した疾患または障害のいずれか１つ以上）を治療および／または予防する方法を提供する。
【０４１７】
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、それぞれの患者の臨床状態（特に、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドだけによる治療の副作用）、送達部位、投与方法、投与計画、ならびに、医療実施者が知っているその他の要因を考慮して、好適な医療実施にかなうように、処方・投薬する。従って、本明細書に記載する目的のための「有効用量」はこれらを考慮して決定する。
【０４１８】
一般的な計画案として、非経口投与されるアルブミン融合タンパク質の、用量当たりの製薬上の合計有効量は、患者の体重の約１ｕｇ／ｋｇ／日〜１０ ｍｇ／ｋｇ／日であるが、すでに指摘したように、これは、治療によって変動する。さらに好ましくは、この用量は、少なくとも０．０１ ｍｇ／ｋｇ／日であり、ヒトについて最も好ましくは、ホルモンの場合、約０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。連続的に投与する場合には、アルブミン融合タンパク質は、典型的に、約１ｕｇ／ｋｇ／時〜約５０ ｕｇ／ｋｇ／時の用量速度で、１日につき１〜４回の注射により、もしくは例えばミニポンプを用いた連続的皮下注入により、投与する。また、静脈内バッグ（ｂａｇ）溶液を用いることもできる。変化を観察するのに必要な治療期間、ならびに、治療から応答が現れるまでの時間は、所望する効果に応じて違ってくるようである。
【０４１９】
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、経口、直腸、非経口、槽内、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、ゲル、ドロップもしくは経皮パッチによる）、口腔経路（ｂｕｃａｌｌｙ）により、あるいは、経口または鼻内スプレーとして、投与することができる。「製薬上許容される担体」とは、あらゆるタイプの非毒性で固体、半固体または液体の充填剤、稀釈剤、被包材料もしくは製薬補助剤を意味する。本明細書で用いる「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内注射および注入などを含む投与方法を意味する。
【０４２０】
また、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、持続放出系により好適に投与することもできる。持続放出アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、例えば、経口、直腸、非経口、槽内、膣内、腹腔内、局所（粉末、軟膏、ゲル、ドロップもしくは経皮パッチによる）、口腔経路により、あるいは、経口または鼻内スプレーとして、投与する。「製薬上許容される担体」とは、あらゆるタイプの非毒性で固体、半固体または液体の充填剤、稀釈剤、被包材料もしくは製薬補助剤を意味する。本明細書で用いる「非経口」という用語は、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内注射および注入などを含む投与方法を意味する。持続放出アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドの別の例として、好適なポリマー材料（例えば、造形した物品、例えば、フィルムもしくはマイクロカプセルの形態をした半透過性ポリマーマトリックスなど）、好適な疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルションなど）もしくはイオン交換樹脂、ならびに、難溶性の誘導体（例えば、難溶性の塩など）が挙げられる。
【０４２１】
持続放出マトリックスとしては、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とＬ−グルタミン酸γ−エチルのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３））、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｍａｔｅｒ． Ｒｅｓ． １５：１６７−２７７（１９８１））、ならびに、Ｌａｎｇｅｒ， Ｃｈｅｍ． Ｔｅｃｈ． １２：９８−１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、同上）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸（ＥＰ １３３，９８８号）が挙げられる。
【０４２２】
さらに、持続放出アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドには、リポソームに内包された本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドもある（概要は、Ｌａｎｇｅｒ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）；Ｔｒｅａｔら、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ， Ｌｏｐｅｚ−ＢｅｒｅｓｔｅｉｎおよびＦｉｄｌｅｒ（編）、Ｌｉｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ３１７−３２７および３５３−３６５（１９８９）を参照）。アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを含むリポソームは、それ自体公知の方法により調製する：ＤＥ ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（米国）８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（米国）７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ ５２，３２２；ＥＰ ３６，６７６；ＥＰ ８８，０４６；ＥＰ １４３，９４９；ＥＰ １４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびにＥＰ １０２，３２４号参照。通常、リポソームは、薄い（約２００〜８００オングストローム）単層型で、その脂質含有率は、約３０モル％コレステロールより大きく、選択する比率は、最適な治療用タンパク質に応じて調節する。
【０４２３】
さらに別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ポンプで送達する（Ｌａｎｇｅｒ、前掲；Ｓｅｆｔｏｎ， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２１：５７４（１９８９）を参照）。
【０４２４】
その他の制御された放出系について詳しくは、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７−１５３３（１９９０）により記載されている。
【０４２５】
非経口投与の場合、一実施形態では、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、一般に、単位用量の注射可能な形態（溶液、懸濁液またはエマルション）に、所望の純度の上記タンパク質と、製薬上許容される担体、すなわち、使用した用量および濃度で受容者に非毒性で、かつ、その他の製剤成分と適合する担体とを混合することにより、調製する。例えば、製剤は、治療用タンパク質に有害なことがわかっている酸化剤その他の化合物は含有しないのが好ましい。
【０４２６】
一般に、製剤は、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを、液体担体もしくは微粉固体担体、またはその両方と均一かつ密に接触させることにより、調製する。次に、必要であれば、得られた生成物を所望の製剤に造形する。好ましくは、上記担体は、非経口担体であり、さらに好ましくは、受容者の血液と等張の溶液である。このような担体の例として、水、食塩水、リンガー液、およびデキストロース液が挙げられる。また、不揮発性油やオレイン酸エチルのような非水性ビヒクル、ならびに、リポソームも有用である。
【０４２７】
担体は、等張性や化学的安定性を増強する物質などの添加剤を少量含んでいるのが好適である。このような物質は、用いた用量および濃度では受容者に非毒性であり、例えば、下記のものが挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、ならびに、その他の有機酸もしくはその塩などのバッファー；アスコルビン酸のような酸化防止剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド、例えば、ポリアルギニンまたはトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水ポリマー；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンなどのアミノ酸；単糖、二糖、ならびに、セルロースまたはその誘導体、グルコース、マンノースもしくはデキストリンなどその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのようなカウンターイオン；および／またはポリソルベート、ポリオキサマー、またはＰＥＧなどのノニオン系界面活性剤。
【０４２８】
アルブミン融合タンパク質は、典型的には、濃度が約０．１ ｍｇ／ｍｌ〜１００ ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、１〜１０ ｍｇ／ｍｌ、ｐＨが約３〜８として上記ビヒクル中で調製される。前記の賦形剤、担体または安定剤のいくつかを使用するとポリペプチド塩が生成することは理解されるであろう。
【０４２９】
治療投与に用いるどんな製剤成分も無菌にすることができる。無菌性は、無菌ろ過膜（例えば、０．２ミクロンの膜）を介したろ過により容易に達成される。アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、一般に、無菌の進入口を有する容器、例えば、皮下組織注射針により貫通可能なストッパーを備える静脈内溶液バッグもしくはバイアルに装入する。
【０４３０】
アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、通常、単位または複数回用量容器、例えば、密封されたアンプルまたはバイアルに、水溶液もしくは再形成のための凍結乾燥製剤として保存する。凍結乾燥製剤の例として、１０−ｍｌバイアルを５ｍｌの無菌ろ過１％（ｗ／ｖ）アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド水溶液で充填し、得られた混合物を凍結乾燥する。注入溶液は、注射用静菌性水を用いて、凍結乾燥したアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを再形成することにより調製する。
【０４３１】
特定の好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパク質製剤は、ｐＨ ７．２で、０．０１ Ｍリン酸ナトリウムと、０．１５ Ｍ塩化ナトリウムと、融合タンパク質１ミリグラム当たり０．１６ マイクロモルのオクタン酸ナトリウムと、１ミリリットル当たり１５マイクログラムのポリソルベート８０とを含んでなる。別の特定の好ましい実施形態では、アルブミン融合タンパク質製剤は、ｐＨ ７．２で、０．０１ Ｍリン酸ナトリウムと、０．１５ Ｍ塩化ナトリウムと、融合タンパク質１ミリグラム当たり０．１６ マイクロモルのオクタン酸ナトリウムと、１ミリリットル当たり１５マイクログラムのポリソルベート８０とを含んでなる。ｐＨおよびバッファーは、生理的条件と適合するように選択し、張度調節剤として塩を添加する。オクタン酸ナトリウムは、溶液中のタンパク質の熱安定性を高める能力があると報告されていることから、選択した。最後に、ポリソルベートは、一般的表面活性剤として添加され、これは、溶液の表面張力を低下させると共に、容器密閉系へのアルブミン融合タンパク質の非特異的吸着を低減する。
【０４３２】
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドの１以上の成分を充填した１以上の容器を含んでなる医薬パックまたはキットを提供する。このような容器には、医薬または生物製品の製造、使用もしくは販売を取り締まる政府機関により規定された形式の注意書きを備えることができる。尚、このような注意書きは、当局による、ヒトへの投与のための製造、使用および販売の承認を示すものである。加えて、アルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、他の治療用化合物と一緒に使用してもよい。
【０４３３】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独、もしくはアジュバントと組み合わせて投与することができる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができるアジュバントとして、限定するものではないが、ミョウバン、ミョウバンとデオキシコール酸塩（ＩｍｍｕｎｏＡｇ）、ＭＴＰ−ＰＥ（Ｂｉｏｃｉｎｅ Ｃｏｒｐ．）、ＱＳ２１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｉｎｃ．）、ＢＣＧ（例えば、ＴＨＥＲＡＣＹＳ（登録商標））、ＭＰＬ、ならびに、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍの無生育性調製物が挙げられる。特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ミョウバンと組み合わせて投与する。別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＱＳ−２１と組み合わせて投与する。上記以外に、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができるアジュバントとして、限定するものではないが、モノホスホリル脂質イムノモジュレーター、ＡｄｊｕＶａｘ １００ａ、ＱＳ−２１、ＱＳ−１８、ＣＲＬ１００５、アルミニウム塩、ＭＦ−５９、ならびに、ヴィロソマル（Ｖｉｒｏｓｏｍａｌ）アジュバント技法が挙げられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができるワクチンとして、限定するものではないが、ＭＭＲ（麻疹、ムンプス、風疹）、ポリオ、水痘、破傷風／ジフテリア、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｂ型インフルエンザ菌、百日咳、肺炎、インフルエンザ、ライム病、ロタウイルス、コレラ、黄熱、日本脳炎、ポリオ（灰白髄炎）、狂犬病、チフス熱、および百日咳を防御するワクチンが挙げられる。このような組合せは、同時に、例えば、混合物として、または、別々だが同時に；あるいは、逐次的に、のいずれの方式で投与してもよい。これには、組み合わせた薬剤を治療混合物として投与する形態、また、組み合わせた薬剤を別々だが同時に、例えば、別々の静脈内経路を介して同じ患者に投与する処置が含まれる。「組合せ式」投与には、さらに、最初に化合物または薬剤の１つを投与した後、次のものを投与する個別投与が含まれる。
【０４３４】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、単独、もしくはその他の治療薬剤と組み合わせて投与することができる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができるアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチド薬剤として、限定するものではないが、化学療法薬、抗生物質、ステロイドおよび非ステロイド系抗炎症剤、通常の免疫治療薬、および／または以下に記載する治療薬が挙げられる。このような組合せは、同時に、例えば、混合物として、または、別々だが同時に；あるいは、逐次的に、のいずれの方式で投与してもよい。これには、組み合わせた薬剤を治療混合物として投与する形態、また、組み合わせた薬剤を別々だが同時に、例えば、別々の静脈内経路を介して同じ患者に、投与する処置が含まれる。「組合せ式」投与には、さらに、最初に化合物または薬剤の１つを投与した後、次のものを投与する個別投与が含まれる。
【０４３５】
一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗凝固剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と組み合わせて投与することができる抗凝固剤として、限定するものではないが、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ワルファリンナトリウム（例えば、ＣＯＵＭＡＤＩＮ（登録商標））、ジクマロール（ｄｉｃｕｍａｒｏｌ）、４−ヒドキシクマリン、アニシンジオン（例えば、ＭＩＲＡＤＯＮ（商標））、アセノクマロール（例えば、ニクマロン、ＳＩＮＴＨＲＯＭＥ（商標））、インダン−１，３−ジオン、フェンプロクモン（例えば、ＭＡＲＣＵＭＡＲ（商標））、ビスクマ酢酸エチル（例えば、ＴＲＯＭＥＸＡＮ（商標））、ならびに、アスピリンが挙げられる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、ヘパリンおよび／またはワルファリンと組み合わせて投与する。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ワルファリンと組み合わせて投与する。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ワルファリンおよびアスピリンと組み合わせて投与する。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ヘパリンと組み合わせて投与する。さらに別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ヘパリンおよびアスピリンと組み合わせて投与する。
【０４３６】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、血栓崩壊剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と組み合わせて投与することができる血栓崩壊剤として、限定するものではないが、プラスミノーゲン、リシン−プラスミノーゲン、α２−抗プラスミン、ストレプトキナーゼ（例えば、ＫＡＢＩＫＩＮＡＳＥ（商標））、抗レスプラス（ａｎｔｉｒｅｐｌａｃｅ）（例えば、ＥＭＩＮＡＳＥ（商標））、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ、アルテバーゼ、ＡＣＴＩＶＡＳＥ（商標））、ウロキナーゼ（例えば、ＡＢＢＯＫＩＮＡＳＥ（商標））、ソールプラーゼ（プロウロキナーゼ、一本鎖ウロキナーゼ）、ならびに、アミノカプロン酸（例えば、ＡＭＩＣＡＲ（商標））が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、組織プラスミノーゲンアクチベーターおよびアスピリンと組み合わせて投与する。
【０４３７】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗血小板剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と共に投与することができる抗血小板剤として、限定するものではないが、アスピリン、ジピリダモール（例えば、ＰＥＲＳＡＮＴＩＮＥ（商標））、ならびに、チクロピジン（例えば、ＴＩＣＬＩＤ（商標））が挙げられる。
【０４３８】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせた、抗凝固剤、血栓崩壊剤および／または抗血小板剤は、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、血栓塞栓症、肺塞栓症、アテローム硬化症、心筋梗塞、一時性虚血発作、不安定狭心症の予防、診断、および／または治療を目的とする使用が考えられる。特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせた、抗凝固剤、血栓崩壊剤および／または抗血小板剤は、伏在移植片の閉塞の予防、血管形成術に伴う恐れのある手術周辺血栓症の危険性の低減、非リウマチ性心房細動のような心房細動を有する患者の発作の危険性の軽減、機械心臓弁および／または僧帽弁疾患に関連する塞栓症の危険性の低減を目的とする使用が考えられる。その他、本発明の治療薬を単独で、または、抗血小板剤、抗凝固剤、および／または血栓崩壊剤と組み合わせた用途には、限定するものではないが、体外装置（例えば、血管内カニューレ、血液透析患者における血管進入シャント、血液透析機、ならびに、心肺バイパス機）におえける閉塞の予防がある。
【０４３９】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗レトロウイルス剤、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転酵素写阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、および／またはプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができるＮＲＴＩとして、限定するものではないが、ＲＥＴＲＯＶＩＲ（商標）（ジドブジン／ＡＺＴ）、ＶＩＤＥＸ（商標）（ジダノシン／ｄｄＩ）、ＨＩＶＩＤ（商標）（ザルシタビン／ｄｄＣ）、ＺＥＲＩＴ（商標）（スタブジン／ｄ４Ｔ）、ＥＰＩＶＩＲ（商標）（ラミブジン／３ＴＣ）、ならびにＣＯＭＢＩＶＩＲ（商標）（ジドブジン／ラミブジン）が挙げられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができるＮＮＲＴＩとして、限定するものではないが、ＶＩＲＡＭＵＮＥ（商標）（ネビラピン）、ＲＥＳＣＲＩＰＴＯＲ（商標）（デラビルジン）、およびＳＵＳＴＩＶＡ（商標）（エファビレンツ）が挙げられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができるプロテアーゼ阻害剤として、限定するものではないが、ＣＲＩＸＩＶＡＮ（商標）（インジナビル）、ＮＯＲＶＩＲ（商標）（リトナビル）、ＩＮＶＩＲＡＳＥ（商標）（サキナビル）およびＶＩＲＡＣＥＰＴ（商標）（ネルフィナビル）が挙げられる。特定の実施形態では、抗レトロウイルス剤、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤、および／またはプロテアーゼ阻害剤は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて、ＡＩＤＳの治療および／またはＨＩＶ感染の予防または治療に用いることができる。
【０４４０】
これ以外のＮＲＴＩとして、下記のものが挙げられる：ＬＯＮＤＥＮＯＳＩＮＥ（商標）（Ｆ−ｄｄＡ；酸安定性アデノシンＮＲＴＩ；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）；ＣＯＶＩＲＡＣＩＬ（商標）（エントリシタビン／ＦＴＣ；ラミブジン（３ＴＣ）と構造的に関連するが、ｉｎ ｖｉｔｒｏで活性が３〜１０倍高い；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）；ｄＯＴＣ（ＢＣＨ−１０６５２、これもラミブジンと構造的に関連するが、実質的比率のラミブジン耐性単離物に対して、活性を保持する；Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａ）；アデフォビル（Ａｄｅｆｏｖｉｒ）（抗ＨＩＶ療法についての承認をＦＤＡにより拒絶された；Ｇｉｌｅａｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＰＲＥＶＥＯＮ（登録商標）（アデフォビルジピボキシル（Ａｄｅｆｏｖｉｒ Ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ、アデフォビルの活性プロドラッグ；その活性形態は、ＰＭＥＡ−ｐｐ）；ＴＥＮＯＦＯＶＩＲ（商標）（ビス−ＰＯＣ ＰＭＰＡ、ＰＭＰＡプロドラッグ；Ｇｉｌｅａｄ）；ＤＡＰＤ／ＤＸＧ（ＤＡＰＤの活性代謝物；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）；Ｄ−Ｄ４ＦＣ（３ＴＣに関連し、ＡＺＴ／３ＣＴ耐性ウイルスに対する活性を有する）；ＧＷ４２０８６７Ｘ（Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）；ＺＩＡＧＥＮ（商標）（アバカビル（ａｂａｃａｖｉｒ）／１５９Ｕ８９；Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｉｎｃ．）；ＣＳ−８７（３’アジド−２’，３’−ジデオキシウリジン；ＷＯ９９／６６９３６）；ならびに、Ｓ−アシル−２−チオエチル（ＳＡＴＥ）含有プロドラッグ形態のβ−Ｌ−ＦＤ４Ｃおよびβ−Ｌ−ＦｄｄＣ（ＷＯ９８／１７２８１を参照）。
【０４４１】
その他のＮＮＲＴＩとして、下記のものが挙げられる：ＣＯＡＣＴＩＮＯＮ（商標）（エミビリン（Ｅｍｉｖｉｒｉｎｅ）／ＭＫＣ−４４２、ＨＥＰＴクラスの効力のあるＮＮＲＴＩ；Ｔｒｉａｎｇｌｅ／Ａｂｂｏｔｔ）；ＣＡＰＲＡＶＩＲＩＮＥ（商標）（ＡＧ−１５４９／Ｓ−１１５３、Ｋ１０３Ｎ突然変異を含むウイルスに対する活性を有する次世代ＮＮＲＴＩ；Ａｇｏｕｒｏｎ）；ＰＮＵ−１４２７２１（その先祖デラビルジンより２０〜５０倍高い活性を有し、Ｋ１０３Ｎ突然変異体に対して活性である；Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）；ＤＰＣ−９６１およびＤＰＣ−９６３（エファビレンツの第２世代誘導体で、Ｋ１０３Ｎ突然変異を有するウイルスに対して活性であるように設計されている；ＤｕＰｏｎｔ）；ＧＷ−４２０８６７Ｘ（ＨＢＹ０９７の２５倍高い活性を有し、Ｋ１０３Ｎ突然変異体に対して活性である；Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ）；ＣＡＬＡＮＯＬＩＤＥ Ａ（ラテックスツリーからの天然に存在する物質；Ｙ１８１ＣおよびＫ１０３Ｎ突然変異のいずれかまたは両方を含むウイルスに対して活性である）；ならびに、プロポリス（Ｐｒｏｐｏｌｉｓ）（ＷＯ９９／４９８３０を参照）。
【０４４２】
前記以外のプロテアーゼ阻害剤として、下記のものが挙げられる：ＬＯＰＩＮＡＶＩＲ（商標）（ＡＢＴ３７８／ｒ；Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）；ＢＭＳ−２３２６３２（アザペプチド；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｒｅｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；ＴＩＰＲＡＮＡＶＩＲ（商標）（ＰＮＵ−１４０６９０、非消化性ジヒドロピロン；Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＆ Ｕｐｊｏｈｎ）；ＰＤ−１７８３９０（非ペプチドジヒドロピロン；Ｐａｒｋｅ−Ｄａｖｉｓ）；ＢＭＳ ２３２６３２（アザペプチド；Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；Ｌ−７５６，４２３（インジナビル類似体；Ｍｅｒｃｋ）；ＤＭＰ−４５０（環状尿素化合物；Ａｖｄ ＆ ＤｕＰｏｎｔ）；ＡＧ−１７７６（プロテアーゼ阻害剤耐性ウイルスに対してｉｎ ｖｉｔｒｏ活性をもつペプチド模擬物；Ａｇｏｕｒｏｎ）；ＶＸ−１７５／ＧＷ−４３３９０８（アンプレナビルのリン酸プロドラッグ；Ｖｅｒｔｅｘ ＆ Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｃｏｍｅ）；ＣＧＰ６１７５５（Ｃｉｂａ）；ならびに、ＡＧＥＮＥＲＡＳＥ（商標）（アンプレナビル；Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｉｎｃ．）。
【０４４３】
他の抗レトロウイルス剤に、融合阻害剤／ｇｐ４１結合剤がある。融合阻害剤／ｇｐ４１結合剤としては、Ｔ−２０（その休止状態で、ｇｐ４１と結合し、融合誘導状態への形質転換を阻止するＨＩＶ ｇｐ４１膜貫通タンパク質ｅｃｔｏｄｏｍａｉｎの残基６４３−６７８由来のペプチド；Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）と、Ｔ−１２４９（第２世代融合阻害剤；Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）が挙げられる。
【０４４４】
別の抗レトロウイルス剤に、融合阻害剤／ケモカイン受容体アンタゴニストがある。融合阻害剤／ケモカイン受容体アンタゴニストとしては、ＡＭＤ３１００（ビシクラム）、ＳＤＦ−１およびその類似体、ならびに、ＡＬＸ４０−４Ｃ（カチオンペプチド）、Ｔ２２（１８アミノ酸ペプチド；Ｔｒｉｍｅｒｉｓ）、Ｔ２２類似体Ｔ１３４およびＴ１４０などのＣＸＣＲ４アンタゴニスト；ＲＡＮＴＥＳ（９−６８）、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ、およびＴＡＫ−７７９などのＣＣＲ５アンタゴニスト；ならびに、ＮＳＣ ６５１０１６（ジスタマイシン類似体）のようなＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４アンタゴニストが挙げられる。また、ＣＣＲ２Ｂ、ＣＣＲ３およびＣＣＲ６アンタゴニストも含まれる。また、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１βなどのケモカイン受容体アゴニストも融合を阻害する。
【０４４５】
別の抗レトロウイルス剤に、インテグラーゼ阻害剤がある。インテグラーゼ阻害剤としては、下記のものが挙げられる：ジカフェオイルキン酸（ＤＦＱＡ）；Ｌ−キコル（Ｌ−ｃｈｉｃｏｒｉｃ）酸（ジカフェオイル酒石酸（ＤＣＴＡ））；キナリザリン（ＱＬＣ）および関連アントラキノン；ＺＩＮＴＥＶＩＲ（商標）（ＡＲ １７７、真性インテグラーゼ阻害剤としてよりは、細胞表面で作用すると考えられるオリゴヌクレオチド；Ａｒｏｎｄｅｘ）；ならびに、ＷＯ９８／５０３４７に開示されたものなどのナフトール。
【０４４６】
別の抗レトロウイルス剤として、下記のものが挙げられる：ＢＣＸ−３４（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；Ｂｉｏｃｒｙｓｔ）のようなヒドロキシ尿素様化合物；ＤＩＤＯＸ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ Ｈｅａｌｔｈ）のようなリボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤；ＶＸ−４９７（Ｖｅｒｔｅｘ）のようなイノシンモノリン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）阻害剤；およびＣｅｌｌＣｅｐｔ（ミコフェノール酸モフェチル；Ｒｏｃｈｅ）のようなミコフェノール酸。
【０４４７】
別の抗レトロウイルス剤として、下記のものが挙げられる：ウイルスインテグラーゼの阻害剤、アリーレンビス（メチルケトン）化合物のようなウイルスゲノム核転座の阻害剤；ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ、ＲＡＶＴＥＳ−ＩｇＧ融合タンパク質、ＲＡＮＴＥＳの可溶性複合体およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、ならびにＡＭＤ−３１００などのＨＩＶ侵入の阻害剤；ジチアン化合物のようなヌクレオキャプシドジンクフィンガー阻害剤；ＨＩＶ ＴａｔおよびＲｅｖの標的；ならびに、ＡＢＴ−３７８のような薬理エンハンサー。
【０４４８】
その他抗レトロウイルス治療薬および補助治療薬として、下記のものが挙げられる：ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＳＤＦ−１α、ＩＬ−２、ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（商標）（アルデスロイキン／Ｌ２−７００１；Ｃｈｉｒｏｎ）、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１３などのサイトカインおよびリンホカイン；ＩＦＮ−α２ａのようなインターフェロン；ＴＮＦ、ＮＦкＢ、ＣＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＩＬ−１０のアンタゴニスト；シクロスポリンおよびプレドニソンなど、免疫活性化をモジュレートする物質；Ｒｅｍｕｎｅ（商標）（ＨＩＶ免疫原）、ＡＰＬ ４００−００３（Ａｐｏｌｌｏｎ）、組換えｇｐ１２０および断片、二価（Ｂ／Ｅ）組換えエンベロープ糖タンパク質、ｒｇｐ１２０ＣＭ２３５、ＭＮ ｒｇｐ１２０、ＳＦ−２ ｒｇｐ１２０、ｇｐ１２０／可溶性ＣＤ４複合体、デルタＪＲ−ＦＬタンパク質、不連続ｇｐ１２０ Ｃ３／Ｃ４ドメインから誘導された分枝合成ペプチド、融合−コンピテント免疫原、ならびに、Ｇａｇ、Ｐｏｌ、ＮｅｆおよびＴａｔワクチンなどのワクチン；遺伝子抑制エレメント（ＧＳＥ；ＷＯ９８／５４３６６）、イントラカイン（新しく合成されたＣＣＲ５の表面発現を阻止するため、ＥＲにターゲッティングされた遺伝子修飾ＣＣケモカイン）（Ｙａｎｇら、ＰＮＡＳ ９４：１１５６７−７２（１９９７）；Ｃｈｅｎら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ３：１１１０−１６（１９９７））などの遺伝子に基づく治療薬；抗ＣＸＣＲ４抗体１２Ｇ５、抗ＣＣＲ５抗体２Ｄ７、５Ｃ７、ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２およびＰＡ１４、抗ＣＤ４抗体Ｑ４１２０およびＲＰＡ−Ｔ４、抗ＣＣＲ３抗体７Ｂ１１、抗ｇｐ１２０抗体１７ｂ、４８ｄ、４４７−５２Ｄ、２５７−Ｄ、２６８−Ｄおよび５０．１、抗Ｔａｔ抗体、抗ＴＮＦ−α抗体、およびモノクローナル抗体３３Ａなどの抗体；ＴＣＤＤ、３，３’，４，４’，５−ペンタクロロビフェニル、３，３’，４，４’−テトラクロロビフェニル、およびαナフトホフラボン（ＷＯ ９８／３０２１３参照）などのアリール炭化水素（ＡＨ）受容体アゴニストおよびアンタゴニスト；ならびに、γ−Ｌ−グルタミル−Ｌ−システインエチルエステル（γ−ＧＣＥ；国際公開番号ＷＯ９９／５６７６４）などの酸化防止剤。
【０４４９】
さらに別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを、抗ウイルス剤と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができる抗ウイルス剤として、限定するものではないが、アシクロビル、リバビリン、アマンタジンおよびレマンチジンが挙げられる。
【０４５０】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗日和見感染剤と組み合わせて投与することができる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができる抗日和見感染剤として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ（商標）、ＤＡＰＳＯＮＥ（商標）ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥ（商標）、ＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ（商標）、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤ（商標）、ＲＩＦＡＭＰＩＮ（商標）、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥ（商標）、ＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ（商標）、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮ（商標）、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ（商標）、ＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ（商標）、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ（商標）、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴ（商標）、ＣＩＤＯＦＯＶＩＲ（商標）、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）、ＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ（商標）、ＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲ（商標）、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥ（商標）、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ（商標）、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（商標）（フィルグラスチム／Ｇ−ＣＳＦ）、ならびにＬＥＵＫＩＮＥ（商標）（サルグラモスチム／ＧＭ−ＣＳＦ）。特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＴＲＩＭＥＴＨＯＰＲＩＭ−ＳＵＬＦＡＭＥＴＨＯＸＡＺＯＬＥ（商標）、ＤＡＰＳＯＮＥ（商標）、ＰＥＮＴＡＭＩＤＩＮＥ（商標）、および／またはＡＴＯＶＡＱＵＯＮＥ（商標）のいずれかと組み合わせて用いることにより、日和見ニューモサイティスカリニ肺炎感染を予防的に治療もしくは予防する。別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＩＳＯＮＩＡＺＩＤ（商標）、ＲＩＦＡＭＰＩＮ（商標）、ＰＹＲＡＺＩＮＡＭＩＤＥ（商標）、および／またはＥＴＨＡＭＢＵＴＯＬ（商標）のいずれかと組み合わせて用いることにより、日和見トリ結核菌複合感染を予防的に治療もしくは予防する。別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＲＩＦＡＢＵＴＩＮ（商標）、ＣＬＡＲＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ（商標）、および／またはＡＺＩＴＨＲＯＭＹＣＩＮ（商標）のいずれかと組み合わせて用いることにより、日和見ヒト結核菌複合感染を予防的に治療もしくは予防する。別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＧＡＮＣＩＣＬＯＶＩＲ（商標）、ＦＯＳＣＡＲＮＥＴ（商標）、および／またはＣＩＤＯＦＯＶＩＲ（商標）のいずれかと組み合わせて用いることにより、日和見サイトメガロウイルス感染を予防的に治療もしくは予防する。別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＦＬＵＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）、ＩＴＲＡＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）、および／またはＫＥＴＯＣＯＮＡＺＯＬＥ（商標）のいずれかと組み合わせて用いることにより、日和見真菌感染を予防的に治療もしくは予防する。別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＡＣＹＣＬＯＶＩＲ（商標）、および／またはＦＡＭＣＩＣＯＬＶＩＲ（商標）のいずれかと組み合わせて用いることにより、日和見単純ヘルペスＩ型および／またはＩＩ型感染を予防的に治療もしくは予防する。別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＰＹＲＩＭＥＴＨＡＭＩＮＥ（商標）、および／またはＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ（商標）のいずれかと組み合わせて用いることにより、日和見トキソプラスマ感染を予防的に治療もしくは予防する。別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＬＥＵＣＯＶＯＲＩＮ（商標）、および／またはＮＥＵＰＯＧＥＮ（商標）のいずれかと組み合わせて用いることにより、日和見細菌感染を予防的に治療もしくは予防する。
【０４５１】
さらに別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを、抗生物質と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができる抗生物質として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：アモキシシリン、β−ラクタマーゼ、アミノグリコシド、β−ラクタム（グリコペプチド）、β−ラクタマーゼ、クリンダマイシン、クロラムフェニコール、セファロスポロリン、シプロフロキサシン、エリトロマイシン、フルオロキノロン、マクロリド、メトロニダゾール、ペニシリン、キノロン、ラパマイシン、リファンピン、ストレプトマイシン、スルフォンアミド、テトラサイクリン、トリメトプリム、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、およびバンコマイシン。
【０４５２】
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを、免疫刺激剤と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができる免疫刺激剤として、限定するものではないが、レバミソール（例えば、ＥＲＧＡＭＩＳＯＬ（商標））、イソプリノシン（例えば、ＩＮＯＳＩＰＬＥＸ（商標））、インターフェロン（例えば、インターフェロンα）、およびインターロイキン（例えば、ＩＬ−２）が挙げられる。
【０４５３】
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを、免疫抑制剤と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができる免疫抑制剤として、限定するものではないが、下記のものを挙げることができる：ステロイド、シクロスポリン、シクロスポリン類似体、シクロホスファミド、メチルプレドニゾン、プレドニゾン、アザチオプリン、ＦＫ−５０６、１５−デオキシスペルグアリン、ならびに、Ｔ細胞に応答する機能を抑制することより作用するその他の免疫抑制剤。これ以外に、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができる免疫抑制剤として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：プレドニゾロン、メトトレキセート、タリドミド、メトクスサレン、ラパマイシン、レフルノミド、ミゾリビン（ＢＲＥＤＩＮＩＮ（商標））、ブレキナール、デオキシスペルグアリン、およびアザスピラン（ＳＫＦ １０５６８５）、ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ ＯＫＴ（登録商標）３（ムロモノナブ−ＣＤ３）、ＳＡＮＤＩＭＭＵＮＥ（商標）、ＮＥＯＲＡＬ（商標）、ＳＡＮＧＤＹＡ（商標）（シクロスポリン）、ＰＲＯＧＲＡＦ（登録商標）（ＦＫ５０６、タクロリマス）、ＣＥＬＬＣＥＰＴ（登録商標）（ミコフェノール酸モテフィル、その活性代謝物は、ミコフェノール酸）、ＩＭＵＲＡＮ（商標）（アザチオプリン）、グルココルチコステロイド、ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（商標）（プレドニゾン）およびＨＹＤＥＬＴＲＡＳＯＬ（商標）（プレドニゾロン）などの副腎皮質ステロイド、ＦＯＬＥＸ（商標）およびＭＥＸＡＴＥ（商標）（メトトレキセート）、ＯＸＳＯＲＡＬＥＮ−ＵＬＴＲＡ（商標）（メトクスサレン）ならびにＲＡＰＡＭＵＮＥ（商標）（シロリマス）。特定の実施形態では、器官または骨髄移植の拒絶を防止するために、免疫抑制剤を用いることができる。
【０４５４】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを、単独で、または１種以上の静脈内免疫グロブリン製剤と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができる静脈内免疫グロブリン製剤として、限定するものではないが、ＧＡＭＭＡＲ（商標）、ＩＶＥＥＧＡＭ（商標）、ＳＡＮＤＯＧＬＯＢＬＩＮ（商標）、ＧＡＭＭＡＧＡＲＤ Ｓ／Ｄ（商標）、ＡＴＧＡＭ（商標）（抗胸腺細胞グルブリン）、およびＧＡＭＩＮＵＮＥ（商標）を挙げることができる。特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、静脈内免疫グロブリン製剤と組み合わせて、移植治療（例えば、骨髄移植）に際して投与する。
【０４５５】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを単独で、または抗炎症剤と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと組み合わせて投与することができる抗炎症剤として、限定するものではないが、下記のものを挙げることができる：コルチコステロイド（例えば、ベタメタゾン、ブデソニド、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニソロン、プレドニソロン、プレドニソン、およびトリアムシノロン）、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、フェノプロフェン、フロクタフェニン、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、メクロフェナム酸塩、メフェナム酸、メロキシカム、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、テノキシカム、チアプロフェン酸、およびトルメチン）、ならびに、抗ヒスタミン剤、アミノアリールカルボン酸誘導体、アリール酢酸誘導体、アリールブチル酸誘導体、アリールカルボン酸、アリールプロピオン酸誘導体、ピラゾール、ピラゾロン、サリチル酸誘導体、チアジンカルボキサミド、ｅ−アセトアミドカプロン酸、Ｓ−アデノシルメチオニン、３−アミノ−４−ヒドロキシブチル酸、アミキセトリン、ベンダザク、ベンジドアミン、ブコロム、ジフェンピルアミド、ジタゾール、エモルファゾン、グアイアズレン、ナブメトン、ニメスリド、オルゴテイン、オキサセプロール、パラニリン、ペリソキサル、ピホキシム、プロカゾン、プロキサゾール、およびテニダプ。
【０４５６】
別の実施形態では、本発明の組成物は、単独で、または抗血管新生剤と組み合わせて投与する。本発明の組成物と一緒に投与することができる抗血管新生剤としては、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：アンジオスタチン（Ｅｎｔｒｅｍｅｄ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）、トロポニン−１（Ｂｏｓｔｏｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ）、抗侵襲因子剤（ａｎｔｉ−Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｆａｃｔｏｒ）、レチン酸およびその誘導体、パクリタクセル（Ｔａｘｏｌ）、スラミン（Ｓｕｒａｍｉｎ）、メタロプロテイナーゼ−１の組織阻害剤（Ｔｉｓｓｕｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１）、メタロプロテイナーゼ−２の組織阻害剤、ＶＥＧＩ、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−１（Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１）、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤−２、ならびに、様々な形態の軽「ｄ族」遷移金属。
【０４５７】
軽「ｄ族」遷移金属には、例えば、バナジウム、モリブデン、タングステン、チタン、ニオブ、およびタンタルの種がある。このような遷移金属種は、遷移金属錯体を形成することもできる。上記遷移金属種の好適な錯体として、オキソ遷移金属錯体が挙げられる。
【０４５８】
バナジウム錯体の代表例として、バナジン酸塩やバナジル錯体のようなオキソバナジウム錯体がある。好適なバナジン酸塩錯体として、例えば、メタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウム、およびオルトバナジン酸ナトリウムなどのメタバナジン酸塩およびオルトバナジン酸塩錯体が挙げられる。好適なバナジル錯体として、例えば、アセチルアセトン酸バナジルや、一および三水和硫酸バナジルのような水和硫酸バナジルなどの硫酸バナジルが挙げられる。
【０４５９】
タングステンおよびモリブデン錯体の代表例として、やはりオキソ錯体が挙げられる。好適なオキソタングステン錯体には、タングステン酸塩および酸化タングステン錯体がある。好適なタングステン酸塩錯体として、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、二水和タングステン酸ナトリウム、およびタングステン酸が挙げられる。好適な酸化タングステンとして、酸化タングステン（ＩＶ）および酸化タングステン（ＶＩ）がある。好適なオキソモリブデン錯体として、モリブデン酸塩、酸化モリブデン、およびモリブデニル錯体がある。好適なモリブデン酸塩錯体としては、モリブデン酸アンモニウムとその水和物、モリブデン酸ナトリムとその水和物、モリブデン酸カリウムとその水和物が挙げられる。好適な酸化モリブデンとして、酸化モリブデン（ＩＶ）、酸化モリブデン（ＶＩ）およびモリブデン酸がある。好適なモリブデニル錯体には、例えば、アセチルアセトン酸モリブデニルがある。その他の好適なタングステンおよびモリブデン錯体として、例えば、グリセロール、酒石酸、および糖に由来するヒドロキソ（ｈｙｄｒｏｘｏ）誘導体が挙げられる。
【０４６０】
上記以外にも、非常に多様な抗血管新生因子を本発明に関して用いることができる。その代表例として、限定するものではないが、血小板第４因子；硫酸プロトアミン；硫酸化キチン誘導体（クイーンクラブの殻から調製した）（Ｍｕｒａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１：２２−２６（１９９１））；硫酸化多糖ペプチドグリカン錯体（ＳＰ−ＰＧ）（この化合物の機能は、エストロゲンやクエン酸タモキシフェンのようなステロイドの存在により増強することができる）；ストーロスポリン；マトリックス代謝のモジュレーター、例えば、プロリン類似体、シスヒドロキシプロリン、ｄ， Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、α，α−ジピリジル、フマル酸アミノプロピオニトリル；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキセート；ミトキサントロン；ヘパリン；インターフェロン；２マクログロブリン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら、Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１７３２１−１７３２６， （１９９２））；キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２８６：４７５−４８０、（１９９２））；テトラデカ硫酸シクロデキストリン；エポネマイシン；カンプトテシン；フマギリン（Ｉｎｇｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５５−５５７、（１９９０））；金チオリンゴ酸ナトリウム（”ＧＳＴ”；ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７９：１４４０−１４４６、（１９８７））；抗コラゲナーゼ血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２（４）：１６５９−１６６４、（１９８７））；ビサントレン（Ｂｉｓａｎｔｒｅｎｅ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンザリト（Ｌｏｂｅｎｚａｒｉｔ）二ナトリウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸二ナトリウム、すなわち”ＣＣＡ”；（Ｔａｋｅｕｃｈｉら、Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ３６：３１２−３１６、（１９９２））；ならびに、ＢＢ９４のようなメタロプロテイナーゼ阻害剤。
【０４６１】
本発明の範囲内で使用できるさらに別の抗血管新生因子として、下記のものが挙げられる：タリドミド（Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）（Ｃｅｌｇｅｎｅ， Ｗａｒｒｅｎ， ＮＪ）；アンジオスタティックステロイド；ＡＧＭ−１４７０（Ｈ． ＢｒｅｍおよびＪ． Ｆｏｌｋｍａｎ， Ｊ Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｓｕｒｇ． ２８：４４５−５１（１９９３））；インテグリンアルファｖベータ３アンタゴニスト（Ｃ． Ｓｔｏｒｇａｒｄら、 Ｊ Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０３：４７−５４（１９９９））；カルボキシアミノールミダゾール；カルボキシアミドトリアゾール（ＣＡＩ）（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）；コンブレタスタチンＡ−４（ＣＡ４Ｐ）（ＯＸｉＧＥＮＥ， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＤ）；スクアラミン（Ｍａｇａｉｎｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ， ＰＡ）；ＴＮＰ−４７０（Ｔａｐ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ， ＩＬ）；ＺＤ−０１０１ ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ（Ｌｏｎｄｏｎ， ＵＫ）；ＡＰＲＡ（ＣＴ２５８４）；ベネフィン、バイロスタチン−１（ＳＣ３３９５５５）；ＣＧＰ−４１２５１（ＰＫＣ４１２）；ＣＭ１０１；デキスラゾキサン（ＩＣＲＦ１８７）；ＤＭＸＡＡ；エンドスタチン；フラボプリジオール；ゲネステイン；ＧＴＥ；ＩｍｍＴｈｅｒ；イレッサ（Ｉｒｅｓｓａ）（ＺＤ１８３９）；オクトレオチド（Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）；パンレチン；ペナシルアミン；フォトポイント（Ｐｈｏｔｏｐｏｉｎｔ）；ＰＩ−８８；プリノマスタート（Ｐｒｉｎｏｍａｓｔａｔ）（ＡＧ−３３４０）プルリチン；スラジスタ（ＦＣＥ２６６４４）；タモキシフェン（Ｎｏｌｖａｄｅｘ）；タザロテン；テトラチオモリブデン酸塩；キセロダ（カペシタビン）；および５−フルオロウラシル。
【０４６２】
本発明の化合物と一緒に投与することができる抗血管新生剤は、限定するものではないが、以下に挙げるような様々な機構により作用する：細胞外マトリックスのタンパク質分解を阻害する；上皮細胞−細胞外マトリックス接着分子の機能を阻止する；増殖因子などの血管新生誘発物質の機能に対抗する；増殖上皮細胞に発現されるインテグリン受容体を阻害する。細胞外マトリックスタンパク質分解を妨害するもので、本発明の組成物と組み合わせて投与することができる抗血管新生剤の例として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：ＡＧ−３３４０（Ａｇｏｕｒｏｎ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）、ＢＡＹ−１２−９５６６（Ｂａｙｅｒ， Ｗｅｓｔ Ｈａｖｅｎ， ＣＴ）、ＢＭＳ−２７５２９１（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， ＮＪ）、ＣＧＳ−２７０３２Ａ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ， Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ， ＮＪ）、マリマスタート（Ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ， Ｏｘｆｏｒｄ， ＵＫ）、およびメタスタート（Ｍｅｔａｓｔａｔ）（Ａｅｔｅｒｎａ， Ｓｔ−Ｆｏｙ， Ｑｕｅｂｅｃ）。上皮細胞−細胞外マトリックス接着分子の機能を阻害することにより作用するもので、本発明の組成物と組み合わせて投与することができる抗血管新生剤の例として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：ＥＭＤ−１２１９７４（Ｍｅｒｃｋ ＫｃｇａＡ Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）およびビタキシン（Ｖｉｔａｘｉｎ）（Ｉｘｓｙｓ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ／Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）。血管新生誘発物質に直接対抗する、もしくは血管新生を阻害するもので、本発明の組成物と組み合わせて投与することができる抗血管新生剤の例として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：アンギオジーム（Ａｎｇｉｏｚｙｍｅ）（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ， Ｂｏｕｌｄｅｒ， ＣＯ）、抗ＶＥＧＦ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ， Ｓ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）、ＰＴＫ−７８７／ＺＫ−２２５８４６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ， Ｂａｓｅｌ， Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＳＵ−１０１（Ｓｕｇｅｎ， Ｓ． Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）、ＳＵ−５４１６（Ｓｕｇｅｎ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｕｐｊｏｈｎ， Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ， ＮＪ）、ならびにＳＵ−６６６８（Ｓｕｇｅｎ）。その他の抗血管新生剤は、間接的に血管新生を阻害する。本発明の組成物と組み合わせて投与することができる、血管新生の間接的阻害剤の例としては、ＩＭ−８６２（Ｃｙｔｒａｎ， Ｋｉｒｋｌａｎｄ， ＷＡ）、インターフェロン−α、ＩＬ−２（Ｒｏｃｈｅ， Ｎｕｔｌｅｙ， ＮＪ）、およびポリ硫酸ペントサン（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， ＤＣ）が挙げられる。
【０４６３】
特定の実施形態では、抗血管新生剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、例えば、本明細書に記載する自己免疫疾患などの自己免疫疾患の治療、予防、および／または改善を目的として考えられる。
【０４６４】
特定の実施形態では、抗血管新生剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、関節炎の治療、予防、および／または改善を目的として考えられる。さらに具体的な実施形態では、抗血管新生剤と組み合わせた本発明の組成物の使用は、リウマチ様関節炎の治療、予防、および／または改善を目的として考えられる。
【０４６５】
別の実施形態では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、血管新生タンパク質、または血管新生タンパク質をコードするポリヌクレオチドと組み合わせて、投与する。本発明の組成物と組み合わせて投与することができる血管新生タンパク質の例として、限定するものではないが、酸性および塩基性繊維芽細胞成長因子、ＶＥＧＦ−１、ＶＥＧＦ−２、ＶＥＧＦ−３、表皮成長因子αおよびβ、血小板由来の上皮細胞成長因子、血小板由来の成長因子、腫瘍壊死因子α、肝細胞成長因子、インスリン様成長因子、コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子、およびＮＯシンターゼが挙げられる。
【０４６６】
別の実施形態では、本発明の組成物は、化学治療薬と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができる化学治療薬として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、シクロホスファミドイフォスファミド、メルファラン（Ｌ−サルコリシン）、およびクロルアンブシル）などのアルキル化剤、エチレンイミンおよびメチルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミンとチオテパ）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル−ＣＣＮＵ）、およびストレプトゾシン（ストレプトゾトシン））、トリアゼン（例えば、ダカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾールカルボキサミド））、葉酸類似体（例えば、メトトレキセート（アメトプテリン））、ピリミジン類似体（例えば、フルオロウラシル（５−フルオロウラシル；５−ＦＵ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン；ＦｕｄＲ）、およびシタラビン（シトシンアラビノシド））、プリン類似体および関連阻害剤（例えば、メルカプトプリン（６−メルカプトプリン；６−ＭＰ）、チオグアニン（６−チオグアニン；ＴＧ）、およびペントスタチン（２’−デオキシコフォルマイシン）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン（ＶＬＢ、硫酸ビンブラスチン））およびビンクリスチン（硫酸ビンクリスチン））、エピポドフィルロトキシン（例えば、エトポシドおよびテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、およびマイトマイシン（マイトマイシンＣ）、酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）、生体応答調節剤（例えば、インターフェロン−αおよびインターフェロン−α−２ｂ）、白金配位化合物（例えば、シスプラチン（シス−ＤＤＰ）およびカルボプラチン）、アントラセネジオン（ミトキサントロン）、置換尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン（Ｎ−メチルヒドラジン；ＭＩＨ）、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニソン）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール）、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、二リン酸ジエチルスチルベストロール、エストラジオール、およびエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン）、アンドロゲン（プロピオン酸テストステロン、およびフルオキシメステロン）、抗アンドロゲン（例えば、フルトアミド）、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体（例えば、ロイプロリド）、その他のホルモンおよびホルモン類似体（例えば、メチルテストステロン、エストラムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、クロロトリアニセン、およびテストラクトン）、ならびにその他（例えば、ジカルバジン、グルタミン酸およびミトタン）。
【０４６７】
一実施形態では、本発明の組成物は、以下に挙げる薬剤の１種以上と組み合わせて投与する：インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（また、Ｒｅｍｉｄａｄｅ（商標）としても知られる。Ｃｅｎｔｏｃｏｒ， Ｉｎｃ．）、トロカド（Ｒｏｃｈｅ， ＰＯ−３２−３５５５）、レフルノミド（また、Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｍａｒｉｏｎ Ｒｏｕｓｓｅｌ製のＡｒａｖａ（商標）としても知られる）、キネレト（Ｋｉｎｅｒｅｔ）（商標）（Ａｍｇｅｎ， Ｉｎｃ．製のＡｎａｋｉｎｒａとしても知られるＩＬ−１受容体アンタゴニスト）。
【０４６８】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドクソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニソン）、あるいは、ＣＨＯＰの１以上の成分と組み合わせて投与する。一実施形態では、本発明の組成物は、抗ＣＤ２０抗体、ヒトモノクローナル抗ＣＤ２０抗体と組み合わせて投与する。別の実施形態では、本発明の組成物は、抗ＣＤ２０抗体およびＣＨＯＰと組み合わせて、もしくは抗ＣＤ２０抗体およびＣＨＯＰの１以上の成分の組合せ、特に、シクロホスファミドおよび／またはプレドニソンと一緒に投与する。特定の実施形態では、本発明の組成物は、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）と組み合わせて投与する。さらに別の実施形態では、本発明の組成物は、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）およびＣＨＯＰと組み合わせて、あるいは、リツキシマブおよびＣＨＯＰのいずれか１以上の成分の組合せ、特に、シクロホスファミドおよび／またはプレドニソンと一緒に投与する。特定の実施形態では、本発明の組成物は、トシツモマブ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）と組み合わせて投与する。特定の実施形態では、本発明の組成物は、トシツモマブと組み合わせて投与する。さらに別の実施形態では、本発明の組成物は、トシツモマブおよびＣＨＯＰと一緒に、あるいは、トシツモマブおよびＣＨＯＰのいずれか１以上の成分の組合せ、特に、シクロホスファミドおよび／またはプレドニソンと一緒に投与する。上記抗ＣＤ２０抗体は、場合によっては、放射性同位元素、毒素または細胞傷害性プロドラッグと結合させてもよい。
【０４６９】
別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、ゼバリン（Ｚｅｖａｌｉｎ）（商標）と組み合わせて投与する。さらに別の実施形態では、本発明の組成物は、ゼバリン（商標）およびＣＨＯＰと一緒に、あるいは、ゼバリン（商標）およびＣＨＯＰのいずれか１以上の成分の組合せ、特に、シクロホスファミドおよび／またはプレドニソンと一緒に投与する。ゼバリン（商標）は、１以上の放射性同位元素と結合させてもよい。特に好ましい放射性同位元素は、９０Ｙと１１１Ｉｎである。
【０４７０】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、サイトカインと組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができるサイトカインは、限定するものではないが、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１５、抗ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αが挙げられる。別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、限定するものではないが以下に挙げるいずれかのインターロイキンと一緒に投与することができる：ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、およびＩＬ−２１。
【０４７１】
一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、ＴＮＦファミリーのメンバーと組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができるＴＮＦ、ＴＮＦ関連またはＴＮＦ様分子としては、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：可溶性形態のＴＮＦ−α、リンホトキシン−α（ＬＴ−α、また、ＴＮＦ−βとしても知られる）、ＬＴ−β（複雑なヘテロ三量体ＬＴ−α２−βに存在する）、ＯＰＧＬ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＤｃＲ３、ＯＸ４０Ｌ、ＴＮＦ−γ（国際公開ＷＯ ９６／１４３２８）、ＡＩＭ−Ｉ（国際公開ＷＯ９７／３３８９９）、エンドカイン−α（国際公開ＷＯ ９８／０７８８０）、ＯＰＧ、およびニュートロカイン−α（国際公開ＷＯ９８／１８９２１）、ＯＸ４０、および神経成長因子（ＮＧＦ）、ならびに、可溶性形態のＦａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ２７、ＣＤ４０および４−ＩＢＢ、ＴＲ２（国際公開ＷＯ９６／３４０９５）、ＤＲ３（国際公開ＷＯ９７／３３９０４）、ＤＲ４（国際公開ＷＯ９８／３２８５６）、ＴＲ５（国際公開ＷＯ９８／３０６９３）、ＴＲＡＮＫ、ＴＲ９（国際公開ＷＯ９８／５６８９２）、ＴＲ１０（国際公開ＷＯ９８／５４２０２）、３１２Ｃ１２（国際公開ＷＯ ９８／０６８４２）、およびＴＲ１２、ならびに、可溶性形態のＣＤ１５４、ＣＤ７０およびＣＤ１５３。
【０４７２】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、血管新生タンパク質と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができる血管新生タンパク質としては、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：欧州特許ＥＰ−３９９８１６に開示されているようなグリオーマ由来増殖因子（ＧＤＧＦ）；欧州特許ＥＰ−６８２１１０に開示されているような血小板由来増殖Ａ因子（ＰＤＧＦ−Ａ）；欧州特許ＥＰ−２８２３１７に開示されているような血小板由来増殖Ｂ因子（ＰＤＧＦ−Ｂ）；国際公開ＷＯ９２／０６１９４に開示されているような胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）；Ｈａｕｓｅｒら、Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， ４：２５９−２６８（１９９３）に開示されているような胎盤成長第２因子（ＰｌＧＦ−２）；国際公開ＷＯ９０／１３６４９に開示されているような血管上皮成長因子（ＶＥＧＦ）；欧州特許ＥＰ−５０６４７７に開示されているような血管上皮成長Ａ因子（ＶＥＧＦ−Ａ）；国際公開ＷＯ９６／３９５１５に開示されているような血管上皮成長第２因子（ＶＥＧＦ−２）；血管上皮成長Ｂ因子（ＶＥＧＦ−３）；国際公開ＷＯ ９６／２６７３６に開示されているような血管上皮成長Ｂ−１８６因子（ＶＥＧＦ−Ｂ−１８６）；国際公開ＷＯ９８／０２５４３に開示されているような血管上皮成長Ｄ因子（ＶＥＧＦ−Ｄ）；国際公開ＷＯ９８／０７８３２に開示されているような血管上皮成長Ｄ因子（ＶＥＧＦ−Ｄ）；ドイツ国特許ＤＥ１９６３９６０１に開示されているような血管上皮成長Ｅ因子（ＶＥＧＦ−Ｅ）。尚、上記の参照文献は、その全文を参照により本明細書に組み込むものとする。
【０４７３】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、繊維芽細胞成長因子と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができる繊維芽細胞成長因子として、限定するものではないが、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、およびＦＧＦ−１５が挙げられる。
【０４７４】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、造血成長因子と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができる造血成長因子として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（サルグラモスチム、ＬＥＵＫＩＮＥ（商標）、ＰＲＯＫＩＮＥ（商標））、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（フィルグラスチム、ＮＥＵＰＯＧＥＮ（商標））、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＣＳＦ−１）、エリトロポエチン（エポエチンα、ＥＰＯＧＥＮ（商標）、ＰＲＯＣＲＩＴ（商標））、幹細胞因子（ＳＣＦ、ｃキットリガンド、スチール因子）、巨核球コロニー刺激因子、ＰＩＸＹ３２１（ＧＭＣＳＦ／ＩＬ−３融合タンパク質）、インターロイキン、特に、ＩＬ−１からＩＬ−１２のいずれか１以上のインターロイキン、インターフェロン−γ、もしくはトロンボポエチン。
【０４７５】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、アドレナリン作用遮断薬、例えば、アセブトロール、アテノロール、ベタクソロール、ビソプロロール、カルテオロール、ラベタロール、メトプロロール、ナドロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ピンドロール、プロプラノロール、ソタロールおよびチモロールなどと組み合わせて投与する。
【０４７６】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、抗不整脈薬（例えば、アデノシン、アミドアロン、ブレチリウム、ジギタリス、ジゴキシン、ジギトキシン、ジリアゼム、ジソピラミド、エスモロール、フレカイニド、リドカイン、メキシレチン、モリシジン、フェニトイン、プロカインアミド、Ｎ−アセチルプロカインアミド、プロパフェノン、プロプラノロール、キニジン、ソタロール、トカイニドおよびベラパミル）と組み合わせて投与する。
【０４７７】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、以下に挙げるような利尿薬と組み合わせて投与する：炭酸アンヒドラーゼ阻害剤（例えば、アセタゾールアミド、ジクロルフェンアミド、およびメタゾールアミド）のような利尿薬、浸透圧性利尿薬（例えば、グリセリン、イソソルビド、マンニトール、および尿素）、Ｎａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ−共輸送を阻害する利尿薬（例えば、フロセミド、ブメタニド、アゾセミド、ピレタニド、トリパミド、エタクリン酸、ムゾルイミン、およびトルセミド）、チアジドおよびチアジド様利尿薬（例えば、ベンドロフルメチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、ポリチアジド、トリクロルメチアジド、クロルタリドン、インダプアミド、メトラゾン、およびキネタゾン）、カリウム保持性利尿薬（例えば、アミロリドおよびトリアムテレン）、ならびに、鉱質コルチコイド受容体アンタゴニスト（例えば、スピロノラクトン、カンレノン、およびカンレノン酸カリウム）。
【０４７８】
一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、内分泌および／またはホルモン不均衡障害の治療薬と組み合わせて投与する。内分泌および／またはホルモン不均衡障害の治療薬としては、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：１２７Ｉ、１３１Ｉおよび１２３Ｉのようなヨウ素の放射性同位元素；ＨＵＭＡＴＲＯＰＥ（商標）（組換えソマトロピン）のような組換え成長ホルモン；ＰＲＯＴＲＯＰＩＮ（商標）（ソマトレム）のような成長ホルモン類似体；ＰＡＲＬＯＤＥＬ（商標）（ブロモクリプチン）のようなドーパミンアゴニスト；ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（商標）（オクトレオチド）のようなソマトスタチン類似体；ＰＲＥＧＮＹＬ（商標）、Ａ．Ｐ．Ｌ． （商標）およびＰＲＯＦＡＳＩ（商標）（絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ））、ＰＥＲＧＯＮＡＬ（商標）（メノトロピン）、およびＭＥＴＲＯＤＩＮ（商標）（ウロフォリトロピン（ｕＦＳＨ）などの性腺刺激ホルモン製剤；ＦＡＣＴＲＥＬ（商標）およびＬＵＴＲＥＰＵＬＳＥ（商標）（塩酸ゴナドレリン）のような合成ヒト性腺刺激ホルモン放出ホルモン製剤；ＬＵＰＲＯＮ（酢酸ロイプロリド）、ＳＵＰＰＲＥＬＩＮ（商標）（酢酸ヒストレリン）、ＳＹＮＡＲＥＬ（商標）（酢酸ナファレリン）、およびＺＯＬＡＤＥＸ（商標）（酢酸ゴセレリン）などの合成性腺刺激ホルモンアゴニスト；ＲＥＬＥＦＡＣＴ ＴＲＨ（商標）およびＴＨＹＰＩＮＯＮＥ（商標）（プロチレリン）のようなチロトロピン放出ホルモンの合成製剤；ＴＨＹＲＯＧＥＮ（商標）のような組換えヒトＴＳＨ；Ｌ−Ｔ４（商標）、ＳＹＮＴＨＲＯＩＤ（商標）およびＬＥＶＯＴＨＲＯＩＤ（商標）（レボチロキシンナトリウム）、Ｌ−Ｔ３（商標）、ＣＹＴＯＭＥＬ（商標）およびＴＲＩＯＳＴＡＴ（商標）（リオチロインナトリウム）、およびＴＨＹＲＯＬＡＲ（商標）（リオトリクス）のような甲状腺ホルモンの天然異性体のナトリウム塩の合成製剤；６−ｎ−プロピルチオウラシル（プロピルチオウラシル）、１−メチル−２−メルカプトイミダゾールおよびＴＡＰＡＺＯＬＥ（商標）（メチマゾール）、ＮＥＯ−ＭＥＲＣＡＺＯＬＥ（商標）（カルビマゾール）のような抗甲状腺化合物；プロプラノロールおよびエスモロールのようなβアドレナリン作用受容体アンタゴニスト；Ｃａ２＋チャネル遮断剤；デキサメタソン、ならびに、ＴＥＬＥＰＡＱＵＥ（商標）（ヨーパン酸）およびＯＲＡＧＲＡＦＩＮ（商標）（ヨーパン酸ナトリウム）のようなヨウ素化放射線造影剤。
【０４７９】
これ以外の内分泌および／またはホルモン不均衡障害の治療薬として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：ＥＳＴＲＡＣＥ（商標）（エストラジオール）、ＥＳＴＩＮＹＬ（商標）（エチニルエストラジオール）、ＰＲＥＭＡＲＩＮ（商標）、ＥＳＴＲＡＴＡＢ（商標）、ＯＴＲＨＯ−ＥＳＴ（商標）、ＯＧＥＮ（商標）およびエストロピペート（エストロン）、ＥＳＴＲＯＶＩＳ（商標）（キネストロール）、ＥＳＴＲＡＤＥＲＭ（商標）（エストラジオール）、ＤＥＬＥＳＴＲＯＧＥＮ（商標）およびＶＡＬＥＲＧＥＮ（商標）（吉草酸エストラジオール）、ＤＥＰＯ−ＥＳＴＲＡＤＩＯＬ ＣＹＰＩＯＮＡＴＥ（商標）およびＥＳＴＲＯＪＥＣＴ ＬＡ（商標）（シピオン酸エストラジオール）などのエストロゲンもしくはコンジュゲートエストロゲン；ＮＯＬＶＡＤＥＸ（商標）（タモキシフェン）、ＳＥＲＯＰＨＥＮＥ（商標）およびＣＬＯＭＩＤ（商標）（クロミフェン）などの抗エストロゲン；ＤＵＲＡＬＵＴＩＮ（商標）（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン）、ＭＰＡ（商標）およびＤＥＰＯ−ＰＲＯＶＥＲＡ（商標）（酢酸メドロキシプロゲステロン）、ＰＲＯＶＥＲＡ（商標）およびＣＹＣＲＩＮ（商標）（ＭＰＡ）、ＭＥＧＡＣＥ（商標）（酢酸メゲストロール）、ＮＯＲＬＵＴＩＮ（商標）（ノルエチンドロン）、ならびにＮＯＲＬＵＴＡＴＥ（商標）およびＡＹＧＥＳＴＩＮ（商標）（酢酸ノルエチンドロン）などのプロゲスチン；ＮＯＲＰＬＡＮＴ ＳＹＳＴＥＭ（商標）（ノルゲストレルの皮下移植片）のようなプロゲステロン移植片；ＲＵ ４８６（商標）（ミフェプリストン）のような抗プロゲスチン；ＥＮＯＶＩＤ（商標）（ノルエチノドレルとメストラノール）、ＰＲＯＧＥＳＴＡＳＥＲＴ（商標）（プロゲステロンを放出する子宮内装置）、ＬＯＥＳＴＲＩＮ（商標）、ＢＲＥＶＩＣＯＮ（商標）、ＭＯＤＩＣＯＮ（商標）、ＧＥＮＯＲＡ（商標）、ＮＥＬＯＮＡ（商標）、ＮＯＲＩＮＹＬ（商標）、ＯＶＡＣＯＮ−３５（商標）およびＯＶＡＣＯＮ−５０（商標）（エチニルエストラジオール／ノルエチンドロン）、ＬＥＶＬＥＮ（商標）、ＮＯＲＤＥＴＴＥ（商標）、ＴＲＩ−ＬＥＶＬＥＮ（商標）およびＴＲＩＰＨＡＳＩＬ−２１（商標）（エチニルエストラジオール／レボノルゲストレル）ＬＯ／ＯＶＲＡＬ（商標）およびＯＶＲＡＬ（商標）（エチニルエストラジオール／ノルゲストレル）、ＤＥＭＵＬＥＮ（商標）（エチニルエストラジオール／二酢酸エチノジオール）、ＮＯＲＩＮＹＬ（商標）、ＯＲＴＨＯ−ＮＯＶＵＭ（商標）、ＮＯＲＥＴＨＩＮ（商標）、ＧＥＮＯＲＡ（商標）、およびＮＥＬＯＶＡ（商標）（ノルエチンドロン／メストラノール）、ＤＥＳＯＧＥＮ（商標）およびＯＲＴＨＯ−ＣＥＰＴ（商標）（エチニルエストラジオール／デソゲストレル）、ＯＲＴＨＯ−ＣＹＣＬＥＮ（商標）およびＯＲＴＨＯ−ＴＲＩＣＹＣＬＥＮ（商標）（エチニルエストラジオール／ノルゲスチメート）、ＭＩＣＲＯＮＯＲ（商標）およびＮＯＲ−ＱＤ（商標）（ノルエチンドロン）、およびＯＶＲＥＴＴＥ（商標）（ノルゲストレル）のようなホルモン避妊薬。
【０４８０】
その他の内分泌および／またはホルモン不均衡障害の治療薬として、限定するものではないが、下記のものを挙げることができる：酢酸メテノロンおよびウンデカン酸テストステロンなどのテストステロンエステル；ＴＥＳＴＯＪＥＣＴ−５０（商標）（テストステロン）、ＴＥＳＴＥＸ（商標）（プロピオン酸テストステロン）、ＤＥＬＡＴＥＳＴＲＹＬ（商標）（テストステロンエナンタート）ＤＥＰＯ−ＴＥＳＴＯＳＴＥＲＯＮＥ（商標）（シピオン酸テストステロン）、ＤＡＮＯＣＲＩＮＥ（商標）（ダナゾール）、ＨＡＬＯＳＴＥＳＴＩＮ（商標）（フルオキシメステロン）、ＯＲＥＴＯＮ ＭＥＴＨＹＬ（商標）、ＴＥＳＴＲＥＤ（商標）およびＶＩＲＩＬＯＮ（商標）（メチルテストステロン）、およびＯＸＡＮＤＲＩＮ（商標）（オキサンドロロン）などの非経口および経口アンドロゲン；ＴＥＳＴＯＤＥＲＭ（商標）のようなテストステロン経皮系；ＡＮＤＲＯＣＵＲ（商標）（酢酸シプロテロン）、ＥＵＬＥＸＩＮ（商標）（フルトアミド）、およびＰＲＯＳＣＡＲ（商標）（フィナステリド）などのアンドロゲン受容体アンタゴニストおよび５−α−レダクターゼ阻害剤；ＣＯＲＴＲＯＳＹＮ（商標）（コシントロピン）のような副腎皮質刺激ホルモン製剤；ＡＣＬＯＶＡＴＥ（商標）（ジプロピオン酸アルクロメタソン）、ＣＹＣＬＯＣＯＲＴ（商標）（アムシノニド）、ＢＥＣＬＯＶＥＮＴ（商標）およびＶＡＮＣＥＲＩＬ（商標）（ジプロピオン酸ベクロメタソン）、ＣＥＬＥＳＴＯＮＥ（商標）（ベータメタソン）、ＢＥＮＩＳＯＮＥ（商標）およびＵＴＩＣＯＲＴ（安息香酸ベータメタソン）、ＤＩＰＲＯＳＯＮＥ（商標）（ジプロピオン酸ベータメタソン）、ＣＥＬＥＳＴＯＮＥ ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ（商標）（リン酸ベータメタソンナトリウム）、ＣＥＬＥＳＴＯＮＥ ＳＯＬＵＳＰＡＮ（商標）（リン酸および酢酸ベータメタソンナトリウム）、ＢＥＴＡ−ＶＡＬ（商標）およびＶＡＬＩＳＯＮＥ（商標）（吉草酸ベータメタソン）、ＴＥＭＯＶＡＴＥ（商標）（プロピオン酸クロベータソル）、ＣＬＯＤＥＲＭ（商標）（クロコルトロンピバレート）、ＣＯＲＴＥＦ（商標）およびＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥ（商標）（コルチソル（ヒドロコルチゾン））、ＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥ ＡＣＥＴＡＴＥ（商標）（酢酸コルチソル（ヒドロコルチゾン））、ＬＯＣＯＩＤ（商標）（酪酸コルチソル（ヒドロコルチゾン））、ＨＹＤＲＯＣＯＲＴＯＮＥ ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ（商標）（リン酸コルチソル（ヒドロコルチゾン）ナトリウム）、Ａ−ＨＹＤＲＯＣＯＲＴ（商標）およびＳＯＬＵ ＣＯＲＴＥＦ（商標）（スクシン酸コルチソル（ヒドロコルチゾン）ナトリウム）、ＷＥＳＴＣＯＲＴ（商標）（吉草酸コルチソル（ヒドロコルチゾン））、ＣＯＲＴＩＳＯＮＥ ＡＣＥＴＡＴＥ（商標）（酢酸コルチゾン）、ＤＥＳＯＷＥＮ（商標）およびＴＲＩＤＥＳＩＬＯＮ（商標）（デソニド）、ＴＯＰＩＣＯＲＴ（商標）（デソキシメタゾン）、ＤＥＣＡＤＲＯＮ（商標）（デキサメタゾン）、ＤＥＣＡＤＲＯＮ ＬＡ（商標）（酢酸デキサメタゾン）、ＤＥＣＡＤＲＯＮ ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ（商標）およびＨＥＸＡＤＲＯＬ ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ（商標）（リン酸デキサメタゾンナトリウム）、ＦＬＯＲＯＮＥ（商標）およびＭＡＸＩＦＬＯＲ（商標）（二酢酸ジフロラゾン）、ＦＬＯＲＩＮＥＦ ＡＣＥＴＡＴＥ（商標）（酢酸フルドロコルチゾン）、ＡＥＲＯＢＩＤ（商標）およびＮＡＳＡＬＩＤＥ（商標）（フルニソリド）、ＦＬＵＯＮＩＤ（商標）およびＳＹＮＡＬＡＲ（商標）（フルオシノロンアセトニド）、ＬＩＤＥＸ（商標）（フルオシノニド）、ＦＬＵＯＲ−ＯＰ（商標）およびＦＭＬ（商標）（フルオロメトロン）、ＣＯＲＤＲＡＮ（商標）（フルランドレノリド）、ＨＡＬＯＧ（商標）（ハルシノニド）、ＨＭＳ ＬＩＺＵＩＦＩＬＭ（商標）（メドリゾン）、ＭＥＤＲＯＬ（商標）（メチルプレドニソロン）、ＤＥＰＯ−ＭＥＤＲＯＬ（商標）およびＭＥＤＲＯＬ ＡＣＥＴＡＴＥ（商標）（酢酸メチルプレドニソン）、Ａ−ＭＥＴＨＡＰＲＥＤ（商標）およびＳＯＬＵＭＥＤＲＯＬ（商標）（スクシン酸メチルプレドニソロンナトリウム）、ＥＬＯＣＯＮ（商標）（モメタゾンフロエート）、ＨＡＬＤＲＯＮＥ（商標）（酢酸パラメタゾン）、ＤＥＬＴＡ−ＣＯＲＴＥＦ（商標）（プレドニソロン）、ＥＣＯＮＯＰＲＥＤ（商標）（酢酸プレドニソロン）、ＨＹＤＥＬＴＲＡＳＯＬ（商標）（リン酸プレドニソロンナトリウム）、ＨＹＤＥＬＴＲＡ−Ｔ．Ｂ．Ａ（商標）（プレドニソロンテブテート）、ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（商標）（プレドニソン）、ＡＲＩＳＴＯＣＯＲＴ（商標）およびＫＥＮＡＣＯＲＴ（商標）（トリアムシノロン）、ＫＥＮＡＬＯＧ（商標）（トリアムシノロンアセトニド）、ＡＲＩＳＴＯＣＯＲＴ（商標）およびＫＥＮＡＣＯＲＴ ＤＩＡＣＥＴＡＴＥ（商標）（二酢酸トリアムシノロン）、ならびにＡＲＩＳＴＯＳＰＡＮ（商標）（トリアムシノロンヘキサアセトニド）などの副腎皮質ステロイドおよびその合成類似体；ＣＹＴＡＤＲＥＮ（商標）（アミノグルテチミド）、ＮＩＺＯＲＡＬ（商標）（ケトコナゾール）、ＭＯＤＲＡＳＴＡＮＥ（商標）（トリロスタン）、およびＭＥＴＯＰＩＲＯＮＥ（商標）（メチラポン）などの副腎皮質ステロイドの生合成および作用の阻害剤；ウシ、ブタまたはヒトインスリンもしくはそれらの混合物；インスリン類似体；ＨＵＭＵＬＩＮ（商標）およびＮＯＶＯＬＩＮ（商標）のような組換えヒトインスリン；ＯＲＡＭＩＤＥ（商標）およびＯＲＩＮＡＳＥ（商標）（トルブタミド）、ＤＩＡＢＩＮＥＳＥ（商標）（クロルプロパミド）、ＴＯＬＡＭＩＤＥ（商標）およびＴＯＬＩＮＡＳＥ（商標）（トラザミド）、ＤＹＭＥＬＯＲ（商標）（アセトヘキサミド）、グリベンクラミド、ＭＩＣＲＯＮＡＳＥ（商標）、ＤＩＢＥＴＡ（商標）およびＧＬＹＮＡＳＥ（商標）（グリブリド）、ＧＬＵＣＯＴＲＯＬ（商標）（グリピジド）、およびＤＩＡＭＩＣＲＯＮ（商標）（グリクラジド）、ＧＬＵＣＯＰＨＡＧＥ（商標）（メトフォルミン）、シグリタゾン、ピオグリタゾン、およびαグルコシダーゼ阻害剤などの経口血糖低下剤；ウシまたはブタグルカゴン；ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（商標）（オクトレオチド）のようなソマトスタチン；ならびに、ＰＲＯＧＬＹＣＥＭ（商標）（ジアゾキシド）のようなジアゾキシド。
【０４８１】
一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、子宮運動性（ｍｏｔｉｌｉｔｙ）障害の治療薬と組み合わせて投与する。子宮運動性障害の治療薬として、限定するものではないが、次のものが挙げられる：抱合卵胞ホルモン（例えば、ＰＲＥＭＡＲＩＮ（登録商標）およびＥＳＴＲＡＴＡＢ（登録商標））、エストラジオール（例えば、ＣＬＩＭＡＲＡ（登録商標）およびＡＬＯＲＡ（登録商標））、エストロピペート、およびクロロトリアニセンのようなエストロゲン薬剤；プロゲスチン薬剤（例えば、ＡＭＥＮ（登録商標）（メドロキシプロゲステロン）、ＭＩＣＲＯＮＯＲ（登録商標）（酢酸ノレチドロン）、ＰＲＯＭＥＴＲＩＵＭ（登録商標）プロゲステロン、および酢酸メゲストロール）；ならびに、例えば、抱合卵胞ホルモン／メドロキシプロゲステロン（例えば、ＰＲＥＭＰＲＯ（商標）およびＰＲＥＭＰＨＡＳＥ（登録商標））および酢酸ノルエチンドロン／エチニルエストラジオール（例えば、ＦＥＭＨＲＴ（商標））のようなエストロゲン／プロゲステロン。
【０４８２】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、鉄欠損症および低色性貧血を治療するのに有効な薬剤と組み合わせて投与する。このような治療薬として、限定するものではないが、次のものが挙げられる：硫酸第一鉄（硫酸鉄、ＦＥＯＳＯＬ（商標））、フマル酸第一鉄（例えば、ＦＥＯＳＴＡＴ（商標））、グルコン酸第一鉄（例えば、ＦＥＲＧＯＮ（商標））、多糖−鉄錯体（例えば、ＮＩＦＥＲＥＸ（商標））、鉄デキストラン注射（例えば、ＩＮＦＥＤ（商標））、硫酸銅、ピロキシジン、リボフラビン、ビタミンＢ１２、シアンコバラミン注射（例えば、ＲＥＤＩＳＯＬ（商標）、ＲＵＢＲＡＭＩＮ ＰＣ（商標））、ヒドロキソコバラミン、葉酸（例えば、ＦＯＬＶＩＴＥ（商標））、ロイコボリン（フォリン酸、５−ＣＨＯＨ４ＰｔｅＧｌｕ、シトロボラム（ｃｉｔｒｏｂｏｒｕｍ）因子）もしくはＷＥＬＬＣＯＶＯＲＩＮ（ロイコボリンのカルシウム塩）、トランスフェリンまたはフェリチン。
【０４８３】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、精神障害を治療するのに用いられる薬剤と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができる精神薬として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：抗精神病薬（例えば、クロルプロマジン、クロルプロチキセン、クロザピン、フルフェナジン、ハロペリドール、ロキサピン、メソリダジン、モリンドン、オランザピン、ペルフェナジン、ピモジド、ケチアピン、リスペリドン、チオリダジン、チオチキセン、トリフルオペラジン、およびトリフルプロマジン）、抗躁病薬（例えば、カルバマゼピン、ジバルプロエックスナトリウム、炭酸リチウム、クエン酸リチウム）、抗うつ薬（例えば、アミトリプチリン、アモキサピン、ブプロピオン、シタロプラム、クロミプラミン、デシプラミン、ドキセピン、フルボキサミン、フルオキセチン、イミプラミン、イソカルボキサジド、マプロチリン、ミルタザピン、ネファゾドン、ノルトリプチリン、パロキセチン、フェネルジン、プロトリプチリン、セルトラリン、トラニルシプロミン、トラゾドン、トリミプラミン、およびベンラファキシン）、抗不安薬（例えば、アルプラゾラム、ブスピロン、クロルジアゼポキシド、クロラゼペート、ジアゼパム、ハラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、およびプラゼパム）、ならびに、刺激薬（例えば、ｄ−アンフェタミン、メチルフェニデート、およびペモリン）。
【０４８４】
他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、神経障害を治療するのに用いられる薬剤と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができる神経薬として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：抗痙攣薬（例えば、カルバマゼピン、クロナゼパム、エトスキシミド、フェノバルビタル、フェニトイン、プリミドン、バルプロ酸、ジバルプロックスナトリウム、フェルバメート、ガパペンチン、ラモトリギン、レベチラセタム、オキシカルバゼピン、チアガビン、トピラメート、ゾニサミド、ジアゼパム、ロラゼパム、およびクロナゼパム）、抗パーキンソン病薬（例えば、レボドパ／カルビドパ、セレギリン、アマンチジン、ブルモクリプチン、ペルゴリド、ロピニロール、プラミペキソール、ベンズトロピン；ビペリデン；エトプロパジン；プロシクリジン；トリヘキシフェニジル、トルカポン）ならびにＡＬＳ治療薬（例えば、リルゾール）。
【０４８５】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、血管拡張薬および／またはカルシウムチャネル遮断薬と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができる血管拡張薬として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤（例えば、パラベリン、イソクススプリン、ベナゼプリル、カプトプリル、シラザプリル、エナラプリル、エナラプリラト、フォシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル、トランドラプリル、およびニリドリン）、ならびに、硝酸塩（例えば、二硝酸イソソルビド、一硝酸イソソルビド、およびニトログリセリン）。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができるカルシウムチャネル遮断薬の例として、限定するものではないが、アムロジピン、ベプリジル、ジルチアゼム、フェロジピン、フルナリジン、イスラジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニモジピン、およびベラパミルを挙げることができる。
【０４８６】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、胃腸障害の治療薬と組み合わせて投与する。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドと一緒に投与することができる胃腸障害の治療薬として、限定するものではないが、下記のものが挙げられる：Ｈ２ヒスタミン受容体アンタゴニスト（例えば、ＴＡＧＡＭＥＴ（商標）（シメチジン）、ＺＡＮＴＡＣ（商標）（ラニチジン）、ＰＥＰＣＩＤ（商標）（ファモチジン）、およびＡＸＩＤ（商標）（ニザチジン））；Ｈ＋， Ｋ＋ ＡＴＰアーゼの阻害剤（例えば、ＰＲＥＶＡＣＩＤ（商標）（ランソプラゾール）およびＰＲＩＬＯＳＥＣ（商標）（オメプラゾール））；ビスマス化合物（例えば、ＰＥＰＴＯ−ＢＩＳＭＯＬ（商標）（サブサリチル酸ビスマス）およびＤＥ−ＮＯＬ（商標）（サブクエン酸ビスマス））；各種制酸薬；スクラルファート；プロスタグラジン類似体（例えば、ＣＹＴＯＴＥＣ（商標）（ミソプロストール））；ムスカリン性コリン作用アンタゴニスト；緩下薬（例えば、サーファクタント緩下薬、刺激緩下薬、塩水および浸透圧性緩下薬）；下痢止め剤（例えば、ＬＯＭＯＴＩＬ（商標）（ジフェノキシレート）、ＭＯＴＯＦＥＮ（商標）（ジフェノキシン）、およびＩＭＯＤＩＵＭ（商標）（塩酸ロペラミド）、ＳＡＮＤＯＳＴＡＴＩＮ（商標）（オクトレオチド）のようなソマトスタチンの合成類似体、制吐薬（例えば、ＺＯＦＲＡＮ（商標）（オンダンセトロン）、ＫＹＴＲＩＬ（商標）（塩酸グラニセトロン）、トロピセトロン、ドラセトロン、メトクロプラミド、クロルプロマジン、ペルフェナジン、プロクロルペラジン、プロメタジン、チエチルペラジン、トリフルプロマジン、ドムペリドン、ハロペリドール、ドロペリドール、トリメトベンザミド、デキサメタソン、メチルプレドニソロン、ドロナビノールおよびナビロン）；Ｄ２アンタゴニスト（例えば、メトクロプラミド、トリメトベンザミドおよびクロルプロマジン）；胆汁塩；ケノデオキシコール酸；ウルソデオキシコール酸；ならびに、パンクレアチンおよびパンクレリパーゼのような膵酵素製剤。
【０４８７】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、例えば、放射線治療など、その他の治療または予防方法と組み合わせて投与する。
【０４８８】
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質を含む医薬組成物の１以上の成分を充填した１以上の容器を含んでなる医薬パックまたはキットを提供する。場合によっては、このような容器に、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売を取り締まる政府機関により規定された形式の注意書きを備え付けることができる。このような注意書きは、ヒトへの投与を目的とする製造、使用または販売について、当局による承認を表すものである。
【０４８９】
遺伝子治療
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする構築物を遺伝子治療プロトコルの一環として使用することにより、治療に有効な用量のアルブミン融合タンパク質を送達することができる。細胞への核酸のｉｎ ｖｉｖｏ導入のための好ましい手法は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸を含むウイルスベクターを使用するものである。ウイルスベクターによる細胞の感染には、標的細胞が高い比率で、核酸を取り込むという利点がある。その上、例えば、ウイルスベクターに含まれるｃＤＮＡにより、ウイルスベクター内でコードされた分子は、ウイルスベクターの核酸を取り込んだ細胞に効率的に発現する。
【０４９０】
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏでアルブミン融合タンパク質をコードする外来性核酸分子を輸送するための組換え遺伝子送達系として用いることができる。これらのベクターは、細胞への核酸の効率的送達を達成し、輸送された核酸は、宿主の染色体ＤＮＡに安定して組み込まれる。複製能欠損レトロウイルスだけを生産する特殊細胞系（「パッケージング細胞」と呼ぶ）の開発により、遺伝子治療用のレトロウイルスの有用性が高まったことから、欠損レトロウイルスは遺伝子治療を目的とする遺伝子輸送における使用のために特性付けられている（詳しくは、例えば、Ｍｉｌｌｅｒ， Ａ， Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７ １を参照）。複製欠陥レトロウイルスをビリオンにパッケージングし、このビリオンを用いて、標準的技法で、ヘルパーウイルスの使用により、標的細胞を感染させることができる。組換えレトロウイルスの生産プロトコル、ならびに、このようなウイルスで細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで感染させるプロトコルについては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｍ．ら（編）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ， （１９８９）， Ｓｅｃｔｉｏｎｓ ９．１０−９．１４、ならびに、その他の標準的実験室マニュアルに記載されている。
【０４９１】
本発明で有用な別のウイルス遺伝子送達系では、アデノウイルス由来のベクターを使用する。アデノウイルスのゲノムを操作して、目的の遺伝子産物をコードおよび発現するが、正常な溶菌ウイルス生活環で複製するその能力については不活性化させることができる。例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒら、ＢｉｏＴｅｃｈｉｎｉｑｕｅｓ ６：６１６（１９８８）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４（１９９１）；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）を参照されたい。アデノウイルス株Ａｄ ５ ｄ１３２４型またはその他のアデノウイルス株（例えば、Ａｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７など）に由来する好適なアデノウイルスベクターは、当業者には公知である。組換えアデノウイルスは、それらが非分裂細胞に感染することができない特定の状況で有利であり、上皮細胞（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、（１９９２）前掲）などの非常に多種の細胞を感染させるのに用いることができる。さらに、ウイルス粒子は、精製および濃縮に対して安定しており、これらを実施しやすいため、前述のように、修飾することにより、感染のスペクトルに影響を与えることもできる。しかも、導入されたアデノウイルスＤＮＡ（およびそこに含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムには組み込まれず、エピソームのままであるため、導入されたＤＮＡが、宿主ゲノムに組み込まれた状態（例えば、レトロウイルスＤＮＡ）における挿入突然変異誘発の結果起こり得る潜在的な問題を回避することができる。さらに、アデノウイルスゲノムが外来ＤＮＡを保有する容量は、他の遺伝子送達ベクター（Ｂｅｒｋｎｅｒら、前掲：Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄら、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５７：２６７（１９８６））と比較して、大きい（８キロベースまで）。
【０４９２】
別の実施形態では、本発明の非ウイルス遺伝子送達系は、標的細胞による対象ヌクレオチド分子の取込みのために、エンドサイトーシス経路を利用する。このタイプの遺伝子送達系の例として、リポソーム誘導系、ポリ−リシンコンジュゲート、および人工ウイルスエンベロープがある。代表的実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする核酸分子は、表面に陽電荷を有し（例えば、リポフェクチン）、かつ（場合に応じて）標的組織の細胞表面抗原に対する抗体をタグとして有するリポソーム中に捕獲することができる（Ｍｉｚｕｎｏら、（１９９２）Ｎｏ Ｓｈｉｎｋｅｉ Ｇｅｋａ ２０：５４７−５ ５ １；ＰＣＴ公開番号 ＷＯ９１／０６３０９；日本国出願第１０４７３８１号；ならびに、欧州特許公開番号ＥＰ−Ａ−４３０７５）。
【０４９３】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子送達系は、多数の方法のいずれかにより、患者に導入することができる。例えば、遺伝子送達系の医薬製剤を全身的に、例えば、静脈内注射により導入すると、標的細胞へのタンパク質の特異的形質導入が起こる。これは、遺伝子送達ビヒクルにより達成されるトランスフェクションの特異性、受容体遺伝子の発現を制御する転写調節配列による細胞タイプまたは組織タイプ発現、あるいは、これらの組合せから、主として起こるものである。他の実施形態では、組換え遺伝子の初期送達は、動物への導入がかなり限局化されるなど、さらに制限される。例えば、遺伝子送達ビヒクルをカテーテル（例えば、米国特許第５，３２８，４７０号）または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：３ ０５４−３ ０５７）により導入することができる。遺伝子治療構築物の医薬製剤は、主に、許容される稀釈剤中の遺伝子送達系からなるもの、または、遺伝子送達ビヒクルを包埋した低速放出マトリックスを含むもののいずれでもよい。アルブミン融合タンパク質が組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターからインタクトで生産できる場合には、医薬製剤は、アルブミン融合タンパク質を生産する１以上の細胞を含んでいてもよい。
【０４９４】
その他の遺伝子治療法
また、障害、疾患および症状を治療または予防する遺伝子治療法も本発明に包含される。このような遺伝子治療法は、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を動物に導入し、本発明のアルブミン融合タンパク質の発現を達成することに関する。この方法は、標的組織による融合タンパク質の発現に必要なプロモーターおよびその他の遺伝エレメントに機能的に結合した本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを必要とする。このような遺伝子治療および送達技法は、当業界では公知であり、例えば、ＷＯ９０／１１０９２（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０４９５】
従って、例えば、ｅｘ ｖｉｖｏで、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能的に結合したプロモーターを含むポリヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で、患者からの細胞を操作した後、この操作された細胞を患者に投与することにより、本発明の融合タンパク質で治療することができる。このような方法は、当技術分野では公知である。例えば、Ｂｅｌｌｄｅｇｒｕｎ， Ａ．ら、Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ８５：２０７−２１６（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ， Ｍ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５３：１１０７−１１１２（１９９３）；Ｆｅｒｒａｎｔｉｎｉ， Ｍ．ら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３：４６０４−４６１５（１９９４）；Ｋａｉｄｏ， Ｔ．ら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６０：２２１−２２９（１９９５）；Ｏｇｕｒａ， Ｈ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０：５１０２−５１０６（１９９０）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ， Ｌ．ら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ７：１−１０（１９９６）；Ｓａｎｔｏｄｏｎａｔｏ， Ｌ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２４６−１２５５（１９９７）；およびＺｈａｎｇ， Ｊ．−Ｆ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：３１−３８（１９９６）を参照。尚、これらの文献は、参照により本明細書に組み込むものとする。一実施形態では、操作される細胞は、動脈細胞である。動脈細胞は、動脈や、動脈を囲む組織への直接注射により、またはカテーテル注射により、患者に再導入することができる。
【０４９６】
以下にさらに詳しく説明するように、ポリヌクレオチド構築物は、動物の細胞に、注射可能な物質を送達するあらゆる方法、例えば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓など）の間隙への注射などにより送達することができる。ポリヌクレオチド構築物は、製薬上許容される液体または水性担体中で送達してもよい。
【０４９７】
一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、裸ポリヌクレオチドとして送達する。「裸」ポリヌクレオチド、ＤＮＡまたはＲＮＡという用語は、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチン、または沈降剤のように、細胞への侵入を補助、促進または容易にすべく作用する送達ビヒクルも含まない配列を意味する。しかし、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、リポソーム製剤およびリポフェクチン製剤中において送達することもでき、これらの製剤は、当業者によく知られた方法で調製することができる。このような方法は、例えば、米国特許第５，５９３，９７２号、第５，５８９，４６６号、および第５，５８０，８５９号に記載されており、これらの文献は、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０４９８】
遺伝子治療方法で用いられるポリヌクレオチドベクター構築物は、宿主ゲノムには組み込まず、しかも、複製を可能にする配列も含まない構築物であるのが好ましい。好適なベクターとして、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ；Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ；ならびに、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐＥＦ１／Ｖ５、ｐｃＤＮＡ３．１、およびｐＲｃ／ＣＭＶ２がある。その他の好適なベクターは、当業者には容易に理解されよう。
【０４９９】
当業者には公知のあらゆる強力なプロモーターを用いて、ポリヌクレオチド配列を発現させることができる。好適なプロモーターとして、下記のものが挙げられる：アデノウイルス主要後期プロモーターのようなアデノウイルスプロモーター；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのような異種プロモーター；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター；ＭＭＴプロモーター、メタロチネインプロモーターのような誘導性プロモーター；熱ショックプロモーター；アルブミンタンパク質；ＡｐｏＡＩプロモーター；ヒトグロビンプロモーター；単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターのようなウイルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロウイルスＬＴＲ；ｂ−アクチンプロモーター；ならびに、ヒト成長ホルモンプロモーター。また、このプロモーターは、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療タンパク質部分に対応する遺伝子用の天然のプロモーターでもよい。
【０５００】
他の遺伝子治療とは異なり、標的細胞にネイキッド核酸配列を導入する主な利点の１つは、細胞におけるポリヌクレオチド合成の一過性の性質である。様々な研究から、非複製ＤＮＡ配列を細胞に導入することにより、６ヶ月までの間、所望のポリペプチドを生産できることがわかっている。
【０５０１】
ポリヌクレオチド構築物は、動物内の組織の間隙空間に送達することができ、そのような組織として、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺、および結合組織が挙げられる。組織の間隙空間には、細胞間、液体、器官組織の細網繊維間のムコ多糖類、血管または室の壁内の弾性繊維、繊維組織のコラーゲン繊維、あるいは、筋細胞を覆う結合組織内または骨の小腔中の同じマトリックスがある。同様に、循環血漿や、リンパチャネルのリンパ液が占める空間もある。以下に述べる理由から、筋組織の間隙空間への送達が好ましい。上記構築物は、これらの細胞を含む組織への注射により好適に送達することができる。これらは、分化している永続型非分裂細胞に送達し、発現させるが、送達および発現は、例えば、血液または皮膚繊維芽細胞の幹細胞のような非分化、もしくは完全には分化していない細胞に実施してもよい。ｉｎ ｖｉｖｏ筋肉細胞は、特に、ポリヌクレオチドを取り込み、発現する能力が高い。
【０５０２】
裸核酸配列の注射に際しては、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効用量は、約０．０５ ｍｇ／ｋｇ体重から５０ ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。好ましくは、用量は、約０．００５ ｍｇ／ｋｇ〜２０ ｍｇ／ｋｇ、さらに好ましくは、約０．０５ ｍｇ／ｋｇ〜５ ｍｇ／ｋｇの間である。もちろん、当業者には理解されるように、この用量は、注射する組織部位に応じて変わる。核酸配列の適切かつ有効な量は、当業者が容易に決定することができ、治療しようとする症状および投与経路に応じて異なる。
【０５０３】
好ましい投与経路は、組織の間隙空間への注射という非経口経路である。しかし、それ以外の非経口経路を用いてもよく、そのような経路として、肺または気管支組織、喉もしくは鼻粘膜への送達専用のエーロゾル剤の吸入がある。加えて、裸ＤＮＡ構築物は、手術で用いられるカテーテルにより、血管形成中に動脈に送達することができる。
【０５０４】
裸ポリヌクレオチドは、限定するものではないが、送達部位での直接針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、ならびに、いわゆる「遺伝子銃」など、当業者には公知のあらゆる方法により送達される。これらの送達方法は、当技術分野では公知である。
【０５０５】
上記構築物はまた、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチン、沈降剤などの送達ビヒクルと共に送達することも可能である。このような送達方法は、当技術分野では公知である。
【０５０６】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチド構築物は、リポソーム製剤として複合体化する。本発明で使用するリポソーム製剤には、カチオン（陽電荷）、アニオン（陰電荷）および中性製剤がある。しかし、カチオンリポソームとポリアニオン核酸との間に緊密な電荷複合体を形成することができることから、カチオンリポソームが好ましい。カチオンリポソームは、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６。参照により本明細書に組み込まれる）；ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８９）８６：６０７７−６０８１。参照により本明細書に組み込まれる）；ならびに、精製された転写因子（Ｄｅｂｓら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９９０）２６５：１０１８９−１０１９２。参照により本明細書に組み込まれる）の細胞内送達を機能形態で媒介することが明らかにされている。
【０５０７】
カチオンリポソームは容易に入手可能である。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイロキシ］プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームが特に有用であり、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ（ニューヨーク州グランドアイランド）から、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎの商標で市販されている（再度Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１６を参照。参照により本明細書に組み込まれる）。その他の市販されているリポソームには、トランスフェクタース（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）がある。
【０５０８】
その他のカチオンリポソームは、当技術分野ではよく知られた技法を用いて、容易に入手可能な材料から調製することができる。例えば、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイロキシ）−３−（トリメチルアミノ）プロパン）リポソームの合成について記載したＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１０９２（参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ＤＯＴＭＡリポソームの調製については、文献に説明されており、例えば、Ｐ． Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ（１９８７）８４：７４１３−７４１７を参照されたい。尚、この文献は、参照により本明細書に組み込むものとする。類似した方法を用いて、その他のカチオン脂質材料からリポソームを調製することも可能である。
【０５０９】
同様に、アニオンおよび中性リポソームは、例えば、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（アラバマ州バーミンガム）などから容易に入手可能であり、また、容易に入手可能な材料から調製することもできる。このような材料として、中でも、ホスファチジル、コリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が挙げられる。また、これらの材料を、ＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰ出発材料と適当な比率で混合してもよい。上記材料を用いたリポソームの調製方法は当業者には公知である。
【０５１０】
例えば、市販されているジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を様々な組合せで用いることにより、コレステロールを添加して、または添加せずに、通常のリポソームを調製することができる。従って、例えば、超音波処理バイアルへの窒素ガス流下で、各々５０ ｍｇのＤＯＰＧおよびＤＯＰＣを乾燥することにより、ＤＯＰＧ／ＤＯＰＣ小胞を調製することができる。サンプルを真空ポンプ下に一晩置き、翌日脱イオン水で水和する。次に、最大設定で、逆転カップ（槽タイプ）プローブを備えたヒートシステムズ（Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）モデル３５０ソニケーターを用いて、キャップしたバイアル中でサンプルを２時間超音波処理すると同時に、この槽を１５ＥＣで循環させる。あるいは、超音波処理せずに、陰荷電小胞を作製して、多層小胞を生成することができ、または、ヌクレオポア（ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）膜を介した押し出しにより作製して、別々のサイズの単層小胞を生成することもできる。その他の方法は、当技術分野において公知であり、利用可能である。
【０５１１】
上記リポソームは、多層小胞（ＭＬＶ）、小さな単層小胞（ＳＵＶ）、もしくは大きな単層小胞（ＬＵＶ）からなり、ＳＵＶが好ましい。当技術分野において公知の方法を用いて、様々なリポソーム−核酸複合体を作製することができる。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８３）、１０１：５１２−５２７（参照により本明細書に組み込まれる）を参照。例えば、核酸を含むＭＬＶは、ガラス管の壁に薄いフィルム状のリン脂質を付着させた後、被包しようとする物質の溶液で水和することにより、作製することができる。ＳＵＶは、ＭＬＶの超音波処理を長引かせて、単層リポソームの均質な集団を形成することにより作製する。捕獲しようとする物質をあらかじめ形成させたＭＬＶの懸濁体に添加した後、超音波処理する。カチオン脂質を含むリポソームを用いる場合には、乾燥した脂質フィルムを無菌水、もしくは１０ ｍＭ トリス／ＮａＣｌのような等張バッファー溶液などの適当な溶液中に再懸濁させ、超音波処理してから、前調製したリポソームをＤＮＡと直接混合する。リポソームとＤＮＡは、陽荷電リポソームとカチオンＤＮＡとの結合により、非常に安定した複合体を形成する。ＳＵＶは、小さな核酸断片を用いて得られる。ＬＵＶは、当技術分野ではよく知られた多数の方法により、作製される。一般に用いられる方法として、下記のものが挙げられる：Ｃａ２＋−ＥＤＴＡキレート化（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ（１９７５）３９４：４８３；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ １７：７７（１９７９））；エーテル注射（Ｄｅａｍｅｒ， Ｄ．およびＢａｎｇｈａｍ， Ａ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ ４４３：６２９（１９７６）；Ｏｓｔｒｏら、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ７６：８３６（１９７７）；Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６：３３４８（１９７９））；デタージェント透析（Ｅｎｏｃｈ， Ｈ．およびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ， Ｐ．． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６：１４５（１９７９））；ならびに、逆相蒸発（ＲＥＶ）（Ｆｒａｌｅｙら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５５：１０４３１（１９８０）；Ｓｚｏｋａ， Ｆ．およびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ． Ｄ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７５：１４５（１９７８）；Ｓｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２１５：１６６（１９８２））。尚、これらの文献は、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０５１２】
一般に、ＤＮＡとリポソームの比は、約１０：１〜約１：１０の間である。好ましくは、この比は、約５：１〜約１：５の間である。さらに好ましくは、この比は、約３：１〜約１：３の間である。さらにまた好ましくは、この比は約１：１である。
【０５１３】
米国特許第５，６７６，９５４号（参照により本明細書に組み込む）は、カチオンリポソームキャリアーと複合体化した遺伝材料のマウスへの注射を報告している。また、米国特許第４，８９７，３５５号、第４，９４６，７８７号、第５，０４９，３８６号、第５，４５９，１２７号、第５，５８９，４６６号、第５，６９３，６２２号、第５，５８０，８５９号、第５，７０３，０５５号、および国際公開番号ＷＯ９４／９４６９（これらの文献はすべて、参照により本明細書に組み込む）は、ＤＮＡを細胞および哺乳動物にトランスフェクトするのに用いるカチオン脂質を提供する。米国特許第５，５８９，４６６号、第５，６９３，６２２号、第５，５８０，８５９号、第５，７０３，０５５号、および国際公開番号ＷＯ９４／９４６９は、ＤＮＡ−カチオン脂質複合体を哺乳動物に送達する方法を提供する。
【０５１４】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする配列からなるＲＮＡを含むレトロウイルス粒子を用いて、細胞をｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで操作する。レトロウイルスプラスミドベクターが得られるレトロウイルスとして、限定するものではないが、モロニーネズミ白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、鳥類白血症ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、ならびに、哺乳動物腫瘍ウイルスが挙げられる。
【０５１５】
レトロウイルスプラスミドベクターを用いて、パッケージング細胞系を形質導入し、プロデューサー細胞系を形成する。トランスフェクトすることができるパッケージング細胞の例として、限定するものではないが、Ｍｉｌｌｅｒ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：５−１４（１９９０）（参照によりその全文を本明細書に組み込む）に記載されているように、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、Ｒ−２、Ｒ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ＲＣＲＥ、ＲＣＲＩＰ、ＧＰ＋Ｅ−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２、およびＤＡＮ細胞系が挙げられる。ベクターは、当技術分野では公知のあらゆる手段を用いて、パッケージング細胞を形質導入することができる。このような手段として、限定するものではないが、エレクトロポレーション、リポソームの使用、ＣａＰＯ４沈降がある。別の実施形態では、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソームに被包するか、あるいは、脂質に結合させた後、宿主に導入する。
【０５１６】
プロデューサー細胞系は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む感染性レトロウイルスベクター粒子を産生する。このようなレトロウイルスベクター粒子を用いて、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで真核生物細胞を形質導入することができる。形質導入された真核生物細胞は、本発明の融合タンパク質を発現する。
【０５１７】
他の実施形態では、アデノウイルスベクターに含まれるポリヌクレオチドを用いて、細胞をｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで操作する。アデノウイルスは、それが本発明の融合タンパク質をコードおよび発現すると同時に、正常の溶菌ウイルス生活環において複製する能力に関しては不活性化されるように、操作することができる。アデノウイルス発現は、宿主細胞染色体へのウイルスＤＮＡの組込みを必要とせずに達成されるため、挿入突然変異誘発に関する懸念が軽減される。さらに、アデノウイルスは、優れた安全プロフィールで、長年にわたり腸溶性生ワクチンとして用いられている（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ａｍ． Ｒｅｖ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｄｉｓ． １０９：２３３−２３８（１９７４））。最後に、アデノウイルス媒介遺伝子輸送が、多くの実験例で証明されており、一例として、コットンラットの肺へのα−１−アンチトリプリシンおよびＣＦＴＲの輸送が挙げられる（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ， Ｍ． Ａ．ら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１−４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５）。さらに、アデノウイルスをヒト癌における誘発因子（ｃａｕｓａｔｉｖｅ ａｇｅｎｔ）として証明しようとする広範な実験は一様に否定的であった（Ｇｒｅｅｎ， Ｍ．ら（１９７９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６：６６０６）。
【０５１８】
本発明で有用な好適なアデノウイルスベクターについては、例えば、ＫｏｚａｒｓｋｙおよびＷｉｌｓｏｎ， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｇｅｎｅｔ． Ｄｅｖｅｌ． ３：４９９−５０３（１９９３）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｃｅｌｌ ６８：１４３−１５５（１９９２）；Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ． Ｔｈｅｒ． ４：７５９−７６９（１９９３）；Ｙａｎｇら、ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔ． ７：３６２−３６９（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３６５：６９１−１９２（１９９３）；および米国特許第５，６５２，２２４号に記載されている。尚、これらの文献は参照により本明細書に組み込むものとする。例えば、アデノウイルスベクターＡｄ２が有用であり、ヒト２９３細胞で増殖させることができる。これらの細胞は、アデノウイルスのＥ１領域を含み、Ｅ１ａおよびＥ１ｂを構成的に発現し、Ｅ１ａおよびＥ１ｂは、ベクターから欠失された遺伝子の産物を提供することにより、欠陥アデノウイルスを補完する。Ａｄ２以外にも、他の多様なアデノウイルス（例えば、Ａｄ３、Ａｄ５およびＡｄ７）も本発明では有用である。
【０５１９】
好ましくは、本発明で用いるアデノウイルスは複製能欠損性である。複製能欠損アデノウイルスは、感染性粒子を形成するのに、ヘルパーウイルスおよび／またはパッケージング細胞系の助けを必要とする。こうして得られたウイルスは、細胞を感染させる能力があり、プロモーターに機能的に結合した目的のポリヌクレオチドを発現することができるが、ほとんどの細胞で複製することができない。複製能欠損アデノウイルスは、次の遺伝子：Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ２ａ、またはＬ１〜Ｌ５のいずれか１以上、もしくは全部または一部を欠失させてもよい。
【０５２０】
特定の他の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いて、細胞をｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで操作する。ＡＡＶは、感染性粒子を生産するのに、ヘルパーウイルスを必要とする、天然に存在する欠陥ウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｎ．， Ｃｕｒｒ． Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５８：９７（１９９２））。このウイルスはまた、そのＤＮＡを非分裂細胞に組み込むことができる数少ないウイルスの１つでもある。ＡＡＶの３００という少ない塩基対を含むベクターをパッケージし、組み込むことができるが、外因性ＤＮＡのための空間は、約４．５ ｋｂに限られている。このようなＡＡＶの調製および使用方法は当技術分野では公知である。例えば、米国特許第５，１３９，９４１号、第５，１７３，４１４号、第５，３５４，６７８号、第５，４３６，１４６号、第５，４７４，９３５号、第５，４７８，７４５号、および第５，５８９，３７７号を参照されたい。
【０５２１】
例えば、本発明で使用するのに好適なＡＡＶベクターとして、ＤＮＡ複製、キャプシド形成、および宿主細胞組込みに必要な配列すべてが挙げられる。ポリヌクレオチド構築物は、標準的クローニング方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている方法を用いて、ＡＡＶベクターに挿入する。次に、組換えＡＡＶベクターをヘルパーウイルスに感染しているパッケージング細胞に標準的方法、例えば、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降などのいずれかを用いて、トランスフェクトする。好適なヘルパーウイルスとして、アデノウイルス、サイトメガロウイルス、ワクシナウイルス、もしくはヘルペスウイルスがある。いったんパッケージング細胞がトランスフェクトされ、感染したら、ポリヌクレオチド構築物を含む感染性ＡＡＶウイルス粒子を生産する。これらのウイルス粒子を用いて、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで真核生物細胞を形質導入する。形質導入された細胞は、そのゲノムに組み込まれたポリヌクレオチド構築物を含み、本発明の融合タンパク質を発現することになる。
【０５２２】
遺伝子治療の別の方法は、相同的組換えにより、異種対照領域と、内因性ポリヌクレオチド配列（例えば、本発明のポリペプチドをコードする）を機能的に結合することからなる（例えば、１９９７年６月２４日発行された米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日に公開された国際公開番号ＷＯ９６／２９４１１；１９９４年８月４日に公開された国際公開番号ＷＯ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒら、Ｐｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−４３８（１９８９）を参照。尚、これらの文献は、参照により本明細書に組み込む）。この方法は、標的細胞に存在するが、正常に細胞に発現されない、もしくは所望レベルより低いレベルで発現される遺伝子の活性化を含む。
【０５２３】
当分野では公知の標準的技法を用いて、標的配列が隣接して位置するプロモーターを含むポリヌクレオチド構築物を作製する。好適なプロモーターについては、本明細書に記載する。標的配列は、内因性配列によるプロモーター・標的配列の相同的組換えを可能にするように、内因性配列に十分相補的なものである。標的配列は、所望の内因性ポリヌクレオチド配列の５’末端に十分近接させ、相同的組換え時に、プロモーターが内因性配列と機能的に結合するようにする。
【０５２４】
プロモーターおよび標的配列は、ＰＣＲを用いて増幅することができる。好ましくは、増幅したプロモーターは、５’および３’末端で別々の制限酵素部位を含む。好ましくは、第１標的配列の３’末端は、増幅プロモーターの５’末端と同じ制限酵素部位を有し、第２標的配列の５’末端は、増幅プロモーターの３’末端と同じ制限部位を有する。増幅プロモーターおよび標的配列を一緒に消化および連結させる。
【０５２５】
プロモーター・標的配列構築物は、ネイキッドポリヌクレオチドとしてか、あるいは、既に詳しく記載したように、リポソーム、ウイルス配列、ウイルス粒子、全ウイルス、リポフェクション、沈降剤などのトランスフェクション促進剤と一緒に細胞に送達する。Ｐプロモーター・標的配列は、直接針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、粒子加速器などのいずれの方法でも送達することができる。これらの方法については、以下にさらに詳しく説明する。
【０５２６】
プロモーター・標的配列構築物は、細胞によって取り込まれる。構築物と内在性配列との間の相同的組換えは、内在性配列がプロモーターの制御下におかれるように起こる。その後、このプロモーターが、内在性配列の発現を駆動する。
【０５２７】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、タンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含んでいてよい。典型的には、シグナル配列は、コード領域の５’末端に向けて、または５’末端で発現させようとするポリヌクレオチドのコード領域に位置する。シグナル配列は、目的とするポリヌクレオチドに対して同一源であっても異種であってもよいし、トランスフェクトさせる細胞に対して同一源であっても異種であってもよい。加えて、シグナル配列は、当分野では公知の方法を用いて、化学的に合成することも可能である。
【０５２８】
治療効果をもたらすのに十分な量の１以上の分子の発現を達成するのであれば、前記ポリヌクレオチド構築物のいずれかを投与するあらゆる様式を用いることができる。このような様式として、下記のものが挙げられる：直接針注射、全身注射、カテーテル注入、バイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）注射器、粒子加速器（すなわち、「遺伝子銃」）、ゲルフォームスポンジデポー、その他の市販されている貯蔵材料、浸透圧ポンプ（例えば、アルザ（Ａｌｚａ）ミニポンプ）、経口または座薬固形（錠剤もしくは丸薬）医薬製剤、ならびに、手術中のデカントもしくは局所適用。例えば、ラット肝臓およびラット脾臓へのネイキッドリン酸カルシウム沈降プラスミド、あるいは、門脈へのタンパク質コーティングプラスミドの直接注射により、ラット肝臓における外来遺伝子の遺伝子発現が起こった（Ｋａｎｅｄａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４３：３７５（１９８９））。
【０５２９】
局所投与の好ましい方法は、直接注射によるものである。好ましくは、送達ビヒクルと複合体化させた本発明のアルブミン融合タンパク質を、動脈領域への直接注射により、または、動脈領域内に局所的に投与する。動脈領域内への組成物のに局所的投与とは、動脈内に数センチメートル、好ましくは、数ミリメートルで上記組成物を注射することを意味する。
【０５３０】
局所投与の別の方法では、手術による創傷内または周辺に、本発明のポリヌクレオチド構築物を接触させる。例えば、患者が手術を受けると、創傷内部の組織表面にポリヌクレオチド構築物を塗布するか、あるいは、該構築物を創傷内部の組織領域に注射し得る。
【０５３１】
全身投与に有用な治療組成物として、本発明の標的送達ビヒクルと複合体化させた本発明の融合タンパク質が挙げられる。全身投与に用いるのに好適な送達ビヒクルは、ビヒクルを特定部位にターゲッティングするためのリガンドを含むリポソームからなる。特定の実施形態では、全身投与に用いるのに好適な送達ビヒクルは、ビヒクルを特定部位にターゲッティングするための本発明のアルブミン融合タンパク質を含むリポソームを含む。
【０５３２】
全身投与の好ましい方法は、静脈内注射、エーロゾル、経口および経皮（局所）送達を含んでなる。静脈注射は、当分野では標準的な方法を用いて、実施することができる（例えば、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ １８９：１１２７７−１１２８１， １９９２参照。尚、この文献は、参照により本明細書に組み込む）。経口送達は、本発明のポリヌクレオチド構築物を、動物の腸内の消化酵素による分解に耐えることができるキャリアーと複合体化することにより、実施することができる。このようなキャリアーの例として、当分野では公知のものなどを含む、プラスチックカプセルまたは錠剤が挙げられる。局所送達は、本発明のポリヌクレオチド構築物を、皮膚に浸透可能な親油性試薬（例えば、ＤＭＳＯ）と混合することにより、実施することができる。
【０５３３】
送達しようとする物質の有効量の決定は、例えば、該物質の化学構造および生物活性、動物の年齢および体重、治療を必要とする正確な症状およびその重篤度、ならびに、投与経路など、多数の要因に応じて変動する。治療の頻度は、一投与当たりのポリヌクレオチド構築物の量、ならびに、被験体の健康状態および病歴など、多数の要因に応じて変動する。正確な投与量、投与回数、および投与タイミングは、担当の医師または獣医により決定される。
【０５３４】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、あらゆる動物、好ましくは、哺乳動物および鳥類に投与することができる。好ましい動物として、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ウマおよびブタが挙げられるが、中でもヒトが特に好ましい。
【０５３５】
生物活性
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１以上の生物活性を試験するアッセイに用いることができる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドが、特定のアッセイで活性を呈示する場合には、該融合タンパク質に対応する治療タンパク質は、上記生物活性に関連する疾患に関与している可能性がある。従って、この融合タンパク質を用いて、関連する疾患を治療することができる。
【０５３６】
分泌されたタンパク質ファミリーのメンバーは、例えば、細胞シグナル伝達に関連する生物活性に関与していると考えられる。従って、本発明のアルブミン融合タンパク質および該タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、分泌されたポリペプチドの異常活性に関連する疾患および／または障害の診断、予後判定、予防および／または治療に用いることができる。
【０５３７】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質は、下記の疾患および障害の診断、予後判定、予防および／または治療に用いることができる：内分泌系、神経系（例えば、以下の「神経障害」の項を参照）、免疫系（例えば、以下の「免疫活性」の項を参照）、呼吸器系（例えば、以下の「呼吸器障害」の項を参照）、心臓血管系（例えば、以下の「心血管障害」の項を参照）、生殖系（例えば、以下の「生殖系障害」の項を参照）、ならびに消化器系（例えば、以下の「胃腸障害」の項を参照）に関する疾患および／または障害、細胞増殖に関する疾患および／または障害（例えば、以下の「過増殖性疾患／癌」の項を参照）、および／または血液に関する疾患または障害（例えば、以下の「血液関連疾患」の項を参照）。
【０５３８】
好ましい実施形態では、本発明は、表１の「好適な適応症Ｙ」列に記載した疾患または障害を治療する方法であって、このような治療、予防または改善が必要な患者に、表１の「治療用タンパク質Ｘ」列（治療しようとする疾患または障害が、表１の「好適な適応症Ｙ」列に記載されるのと同じ列中）に開示された治療タンパク質に対応する治療タンパク質部分を含む本発明のアルブミン融合タンパク質を、上記疾患または障害を治療、予防または改善するのに有効な量投与することを含んでなる方法を包含する。
【０５３９】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「癌」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、白血病、癌、および／または以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）を治療するために用いることができる。
【０５４０】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「癌」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、大腸、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、前立腺、腹膜、肺、血液（例えば、白血病）、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、子宮、眼、頭部頸部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸郭、ならびに泌尿生殖器からなる群より選択される組織に位置する新生物の治療に使用しうる。
【０５４１】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「癌」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、前新生物状態、例えば、過形成（例えば、子宮内膜過形成および／または 以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、メタプラシア（例えば、結合組織メタプラシア、異型メタプラシア、および／または以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、ならびにディスプラシア（例えば、子宮頸ディスプラシア、および気管支肺ディスプラシア）からなる群より選択されるものを治療するために使用しうる。
【０５４２】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「癌」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、良性異常増殖性疾患、例えば良性腫瘍、線維嚢胞症、組織肥大、および／または以下の「高増殖性疾患」に記載されるものからなる群より選択されるものを治療するために使用しうる。
【０５４３】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「免疫／造血性」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、血液疾患（例えば、以下の「免疫活性」、「心血管系疾患」および／または「血液関連疾患」に記載されるもの）、および／または感染症（例えば、以下の「感染性疾患」に記載されるもの）の治療に使用しうる。
【０５４４】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「免疫／造血性」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、貧血、汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症、白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、急性白血病（ＡＬＬ）、形質細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、関節炎、喘息、ＡＩＤＳ、自己免疫疾患、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、慢性肉芽腫症、免疫不全、炎症性腸疾患、敗血症、好中球減少症、好中球増加症、乾癬、移植器官および／もしくは組織に対する免疫反応、全身性 紅斑性狼瘡、血友病、凝固能亢進、真性糖尿病、心内膜炎、髄膜炎、ライム病、ならびにアレルギーからなる群より選択される疾患および／または障害を治療するために使用しうる。
【０５４５】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「生殖系」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、および／または生殖系疾患（例えば、以下の「生殖系疾患」に記載されるもの）の治療に使用しうる。
【０５４６】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「生殖系」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、停留精巣、前立腺炎、鼡径ヘルニア、精索静脈瘤、ライディヒ細胞腫瘍、ゆうぜい癌、前立腺炎、マラコプラキア、ペーロニー病、陰茎癌、扁平上皮 過形成、月経困難、卵巣腺癌、ターナー症候群、粘液膿性子宮頸炎、セルトリ−ライディヒ腫瘍、卵巣癌、子宮癌、骨盤炎症性疾患、精巣癌、前立腺癌、クラインフェルター症候群、ヤング症候群、早発射精、真性糖尿病、嚢胞性線維症、カルタゲナー症候群、精巣萎縮症、精巣性女性化症候群、無精巣症、異所睾丸、精巣上体炎、精巣炎、淋病、梅毒、精巣捻転、結節性精管炎、生殖細胞腫瘍、間質腫瘍、月経困難、後傾子宮、子宮内膜症、類線維腫、腺筋症、無排卵出血、無月経、クッシング症候群、胞状奇胎、アッシェルマン症候群、早期閉経、性的早熟、子宮ポリープ、不正子宮出血、子宮頸炎、慢性 子宮頸炎、粘液膿性子宮頸炎、子宮頸 ディスプラシア、子宮頸ポリープ、ナーボト嚢胞、子宮頸びらん、子宮頸不全、子宮頸 新生物、偽半陰陽、ならびに月経前症候群、からなる群より選択される疾患および／または障害を治療するために使用しうる。
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「筋骨格系」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、および／または免疫系疾患（例えば、以下の「免疫活性」に記載されるもの）の治療に使用しうる。
【０５４７】
さらなる実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「筋骨格系」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、骨癌（例えば、骨軟骨腫、良性 軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫、巨細胞腫、多発性骨髄腫、および骨肉腫）、パジェット病、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、全身性紅斑性狼瘡、骨髄炎、ライム病、痛風、滑液包炎、腱炎、骨粗鬆症、変形性関節症、筋ジストロフィー、ミトコンドリア性筋障害、悪液質、ならびに多発性硬化症、からなる群より選択される疾患および／または障害を治療するために使用しうる。
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「心臓血管系」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、および／または心血管系疾患（例えば、以下の「心血管系疾患」に記載されるもの）の治療に使用しうる。
【０５４８】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「心臓血管系」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、粘液腫、線維腫、横紋筋腫、心血管異常 （例えば、先天性心欠陥、脳動静脈奇形、中隔欠損）、心臓疾患（例えば、心不全、先天性心臓疾患、不整脈、頻脈、原線維性、心膜疾患、心内膜炎）、心停止、心臓弁疾患（例えば、狭窄、逆流、脱出症）、血管疾患（例えば、高血圧、冠状動脈疾患、アンギナ、動脈瘤、動脈硬化症、末梢血管疾患）、低ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、ならびに高カリウム血症、からなる群より選択される疾患および／または障害を治療するために使用しうる。
【０５４９】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「混合胎児」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）の治療に使用しうる。
【０５５０】
さらなる実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「混合胎児」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、二分脊椎、水無脳症、神経線維腫症、胎児性アルコール症候群、真性糖尿病、ＰＫＵ、ダウン症候群、パトー症候群、エドワーズ症候群、ターナー症候群、アペール症候群、カーペンター症候群、コンラーディ症候群、クルゾン症候群、弛緩性皮膚、コルネリア・ド・ランゲ症候群、エリス−ファン・クレフェルト症候群、ホールト−オーラム症候群、カータゲナー症候群、メッケル−グルーバー症候群、ヌーナン症候群、パリスター−ホール症候群、ルービンスタイン−テービ症候群、シミター症候群、スミス−レムリ−オピッツ症候群、血栓性血球減少がない橈骨（ＴＡＲ）症候群、トレチャー・コリンズ症候群、ウィリアムズ症候群、ヒルシュスプルング病、臍腸間膜憩室、多発性嚢胞腎疾患、ターナー症候群、ならびに、生殖器発育不全、クリペル−フェーユ症候群、骨発生不全症、筋ジストロフィー、テイ−サックス病、ウィルムス腫、神経芽細胞腫、および網膜芽腫、からなる群より選択される疾患および／または障害を治療するために使用しうる。
【０５５１】
さらなる実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「排泄器官」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、および／または腎疾患（例えば、以下の「腎疾患」に記載のもの）の治療に使用しうる。
【０５５２】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「排泄器官」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、膀胱癌、前立腺癌、良性前立腺過形成、膀胱疾患（例えば、尿失禁、尿貯留、尿閉塞、尿管感染症、間質性膀胱炎、前立腺炎、神経因性膀胱障害、血尿）、腎疾患（例えば、水腎症、蛋白尿、腎不全、腎盂腎炎、尿石症、逆流性腎症、および片側閉塞性尿路疾患）、からなる群より選択される疾患および／または障害を治療するために使用しうる。
【０５５３】
さらなる実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「神経／感覚」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、新生物疾患に関連する疾患および／もしくは障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、および／または神経系の疾患もしくは障害（例えば、以下の「神経活性および神経疾患」に記載のもの）の治療に使用しうる。
【０５５４】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「神経／感覚」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、脳の癌（例えば、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳神経膠星状細胞腫、および脳神経膠星状細胞腫、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、クロイツフェルトヤコブ病、パーキンソン病（ＰＤ）、および突発性早期痴呆）、脳脊髄炎、大脳マラリア、髄膜炎、代謝性脳疾患（例えば、フェニルケトン症およびピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症）、小脳性運動失調、毛細血管拡張性運動失調、およびＡＩＤＳ痴呆合併症、精神分裂病、注意欠陥障害、過活動注意欠陥障害、自閉症、および強迫性障害、からなる群より選択される疾患および／または障害を治療するために使用しうる。
【０５５５】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「呼吸器」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、および／または呼吸系の疾患もしくは障害（例えば、以下の「呼吸器疾患」に記載のもの）の治療に使用しうる。
【０５５６】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「呼吸器」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、呼吸系の癌（例えば、喉頭癌、咽頭癌、気管癌、喉頭蓋癌、肺癌、扁平上皮癌、小細胞（燕麦細胞）癌、大細胞癌、および腺癌）、アレルギー反応、嚢胞性線維症、サルコイドーシス、原因不明性組織球増殖症、浸潤性肺疾患（例えば、肺線維症およびリンパ球性間質性肺炎）、閉塞性気管疾患（例えば、喘息、気腫、慢性もしくは急性気管支炎）、職業性肺疾患（例えば、珪肺症および石綿肺症）、肺炎、ならびに胸膜炎、からなる群より選択される疾患および／または障害を治療するために使用しうる。
【０５５７】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「内分泌系」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、呼吸系の疾患または障害（例えば、以下の「呼吸器疾患」に記載されるもの）、腎疾患（例えば、以下の「腎疾患」に記載されるもの）、および／または内分泌系障害（例えば、以下の「内分泌系疾患」に記載されるもの）の治療に使用しうる。
【０５５８】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「内分泌系」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、内分泌組織および／または器官の癌（例えば、視床下部、下垂体腺、甲状腺、副甲状腺、膵臓、副腎腺、卵巣、および精巣の癌）、糖尿病（例えば、尿崩症、Ｉ型およびＩＩ型真性糖尿病）、肥満、下垂体腺に関連する疾患（例えば、下垂体機能亢進、下垂体機能低下、および下垂体小人症）、甲状腺機能亢進、甲状腺機能低下、甲状腺腫、生殖系疾患（例えば男性および女性の不妊症）、副腎腺に関連する疾患（例えば、アジソン病、副腎性コルチコイド欠損症、およびクッシング症候群）、腎臓癌（例えば、副腎腫、移行上皮癌、およびウィルムス腫）、糖尿病性腎症、間質性腎炎、多発性嚢胞腎疾患、糸球体腎炎（例えば、ＩｇＭメサンギウム増殖性糸球体腎炎、および自己免疫疾患、例えばグッドパスチャー症候群などにより引き起こされる糸球体腎炎）、ならびに腎石灰症、からなる群より選択される疾患および／または障害を治療するために使用しうる。
【０５５９】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「消化系」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、例えば、新生物疾患（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）および／または胃腸系の疾患もしくは障害（例えば、以下の「胃腸系疾患」に記載されるもの）に関連する疾患および／または障害の治療に使用しうる。
【０５６０】
他の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「消化系」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、潰瘍性大腸炎、虫垂炎、クーロン病、肝炎、肝性脳障害、門脈高血圧、胆石症、消化系の癌（例えば、胆管癌、胃癌、大腸癌、胃癌、膵臓癌、胆管の癌、大腸の癌（例えば、ポリープもしくは癌）、および肝硬変）、膵炎、潰瘍性疾患、幽門狭窄、胃腸炎、胃炎、胃萎縮症、十二指腸の良性腫瘍、拡張、腸過敏症、吸収不良、小腸の先天性疾患、細菌および寄生虫の感染症、巨大結腸、ヒルシュスプルング病、神経節細胞欠損性巨大結腸、後天性巨大結腸、大腸炎、肛門直腸疾患（例えば、肛門フィステル、痔）、肝臓の先天性疾患（例えば、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、嚢胞性線維症、胆道閉鎖症、およびα１アンチトリプシン欠損症）、門脈高血圧、胆石症、および黄疸、からなる群より選択される疾患および／または障害を治療するために使用しうる。
【０５６１】
さらなる実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「結合／上皮性」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、新生物疾患に関連する疾患および／または障害（例えば、以下の「高増殖性疾患」に記載されるもの）、細胞および／もしくは遺伝子の異常（例えば、以下の「細胞レベルにおける疾患」に記載されるもの）、血管新生（例えば、以下の「抗血管形成活性」に記載されるもの）の治療、ならびに／あるいは、再生（例えば、以下の「再生」に記載されるもの）、および／または創傷治癒（例えば、以下の「創傷治癒および上皮細胞増殖」に記載されるもの）の促進または抑制、に使用しうる。
【０５６２】
特定の実施形態において、表１の「好ましい適応症」の欄に「結合／上皮性」と記載された治療タンパク質、治療タンパク質ならびにその断片または変異体に相当する治療タンパク質部分を含むアルブミン融合タンパク質は、結合組織メタプラシア、混合結合組織疾患、局所性上皮肥厚、上皮メタプラシア、粘膜上皮形成異常、移植片対宿主病、多発性筋炎、嚢胞性増殖症、終脳形成異常、組織肥大、アルツハイマー病、リンパ増殖障害、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、クーロン病、悪性貧血、突発性アジソン病、糸球体腎炎、水疱性類天疱瘡、シェーグレン症候群、真性糖尿病、嚢胞性線維症、骨芽細胞腫、破骨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周疾患、創傷治癒、再発性多発性軟骨炎、脈管炎、結節性多発性動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、小胞炎、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬性関節炎、円板状紅斑性狼瘡、全身性紅斑性狼瘡、強皮症、ＣＲＥＳＴ症候群、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、混合結合組織疾患、再発性多発性軟骨炎、脈管炎、ヘーノホ−シェーンライン症候群、結節性紅斑、結節性多発性動脈炎、側頭（巨大細胞）動脈炎、高安動脈炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、ライター症候、ベーチェット症候群、強直性脊椎炎、小胞炎、ケロイド、エーレルス−ダンロー症候群、マルファン症候群、弾性線維性仮性黄色腫、骨形成不完全症、軟骨形成不全、表皮水疱症、アルポート症候群、ならびに弛緩性皮膚、からなる群より選択される疾患および／または障害を治療するために使用しうる。
【０５６３】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて、本発明の治療タンパク質部分に対応する遺伝子を発現させる組織に関連する疾患および／または障害を診断および／または予後判定することができる。
【０５６４】
従って、本発明の融合タンパク質、および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定するものではないが、プロホルモン活性化、神経伝達物質活性、細胞シグナル伝達、細胞増殖、細胞分化、ならびに細胞移動などの活性に関する疾患および／または障害の診断、検出および／または治療に有用である。
【０５６５】
さらに一般的には、本発明の融合タンパク質、および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、以下に記載する系に関連する疾患および／または障害の診断、予後判定、予防および／または治療に有用である。
【０５６６】
免疫活性
本発明のアルブミン融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、免疫細胞の増殖、分化、もしくは動員（化学走性）を活性化または阻害することにより、免疫系の疾患、障害および／または病状を治療、予防、診断、および／または予後するのに有用である。免疫細胞は、造血と呼ばれる過程を通して成長し、多能性幹細胞から、骨髄性（血小板、赤血球、好中球、およびマクロファージ）およびリンパ系（ＢおよびＴリンパ球）細胞を生産する。これら免疫疾患、障害、および／または症状の病因は、癌のように遺伝的、体因性のものと、後天性（例えば、化学的治療または毒素により）もしくは感染性の何らかの自己免疫疾患であると考えられる。さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の免疫系疾患または障害のマーカーもしくは検出因子として用いることができる。
【０５６７】
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、免疫系の疾患または障害を治療する、および／または本発明のポリペプチドを発現させる組織と関連する細胞により生じた免疫応答を阻害もしくは増強することができる。
【０５６８】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、先天性および後天性いずれの免疫不全も含む、免疫不全の治療、予防、診断および／または予後判定に有用である。免疫グロブリンレベルＢ細胞機能および／またはＢ細胞数が減少するＢ細胞免疫不全の例としては、下記のものが挙げられる：Ｘ連鎖性無γグロブリン血症（ブルトン症）、Ｘ連鎖性乳児無γグロブリン血症、高ＩｇＭを伴なうＸ連鎖性免疫不全、高ＩｇＭを伴なう非Ｘ連鎖性免疫不全、Ｘ連鎖性リンパ増殖症候群（ＸＬＰ）、先天性および後天性無γグロブリン血症を含む無γグロブリン血症、成人性無γグロブリン血症、遅発性無γグロブリン血症、異常γグロブリン血症、低γグロブリン血症、非特定（ｕｎｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）低γグロブリン血症、劣性無γグロブリン血症（スイス型）、選択的ＩｇＭ欠損症、選択的ＩｇＡ欠損症、選択的ＩｇＧサブクラス欠損症、ＩｇＧサブクラス欠損症（ＩｇＡ欠損症を伴なうかまたは伴なわない）、ＩｇＭの増加を伴なうＩｇ欠損症、ＩｇＭの増加を伴なうＩｇＧおよびＩｇＡ欠損症、正常または増加Ｉｇを伴なう抗体欠損症、Ｉｇ重鎖欠失、κ鎖欠損症、Ｂ細胞リンパ増殖障害（ＢＬＰＤ）、分類不能原発性免疫不全（ＣＶＩＤ）、分類不能型免疫不全（ＣＶＩ）（後天性）、ならびに、乳児一時性低γグロブリン血症。
【０５６９】
特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、毛細管拡張性失調症、もしくは毛細管拡張性失調症に関連する病状を治療、予防、診断および／または予後判定する。
【０５７０】
Ｔ細胞および／もしくはＢ細胞機能ならびに／または数が減少する先天性免疫不全の例として、限定するものではないが、次のものが挙げられる：ディジョージ異常症、重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）（限定するものではないが、Ｘ連鎖性ＳＣＩＤ、常染色体劣性ＳＣＩＤ、アデノシンデアミナーゼ欠損症、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）欠損症、ＩＩ型ＭＨＣ欠損症（裸リンパ球症候群）、ウィスコット・アルドリッチ症候群、および毛細管拡張性失調症）、胸腺低形成、ＩＩＩ， ＩＶ鰓弓症候群、２２ｑ１１．２欠失、慢性粘膜皮膚カンジダ症、ナチュラルキラー細胞欠損症（ＮＫ）、特発性ＣＤ４＋Ｔ−リンパ球減少、主要Ｔ細胞欠損（非特定）を伴う免疫不全、ならびに、細胞性免疫の非特定免疫不全。
【０５７１】
特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、ディジョージ異常症またはディジョージ異常症に関連する病状を治療、予防、診断および／または予後判定する。
【０５７２】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、治療、予防、診断および／または予後判定することができるその他の免疫不全としては、下記のものを挙げることができる：慢性肉芽腫性病変、チェディアック−東症候群、白血球グルコース６フォスフェートデヒドロゲナーゼ欠損症、Ｘ連鎖性リンパ増殖症候群（ＸＬＰ）、白血球接着不全症、補体成分欠損症（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ７、Ｃ８および／またはＣ９欠損症など）、細網発育不全、胸腺リンパ無形成−無形成症、胸腺腫を伴なう免疫不全、重症先天性白血球減少、免疫不全を伴なう形成不全、新生児好中球減少症、短肢小人症、ならびに、Ｉｇｓを伴なうネゼロフ症候群複合型免疫不全。
【０５７３】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、免疫不全および／または前記の免疫不全に関連する病状を治療、予防、診断および／または予後判定することができる。
【０５７４】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫不全症の個体における免疫応答性を高める薬剤として用いることができる。特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ細胞および／またはＴ細胞免疫不全症の個体における免疫応答性を高める薬剤として用いることができる。
【０５７５】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、自己免疫障害の治療、予防、診断および／または予後判定に有用である。多くの自己免疫障害は、免疫細胞が自己を外来物質と不適切に認識することから発生する。この不適切な認識により、免疫応答が起こり、宿主組織の破壊を引き起こす。従って、免疫応答、特にＴ細胞の増殖、分化または化学走性を阻害することができる本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、自己免疫障害を予防する有効な治療薬になると考えられる。
【０５７６】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより治療、予防、診断および／または予後判定が可能な自己免疫疾患または障害として、限定するものではないが、以下に挙げる１以上のものが含まれる：全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、自己免疫性溶血性貧血、溶血性貧血、血小板減少症、自己免疫性血小板減少性紫斑症、自己免疫新生児血小板減少症、特発性血小板減少性紫斑症、紫斑症（例えば、ヘーノホ−シェーライン紫斑症）、自己免疫性血球減少症、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、グレーブス病（甲状腺機能亢進症）、ならびに、インスリン耐性糖尿病。
【０５７７】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより治療、予防および／または診断が可能な自己免疫成分を有すると考えられる別の疾患として、限定するものではないが、下記のものを挙げることができる：ＩＩ型コラーゲン誘発性関節炎、抗リン脂質症候群、皮膚炎、アレルギー性脳脊髄炎、心筋炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ性心臓疾患、腎炎、ブドウ膜炎眼炎、多発性内分泌腺症、レーター病、スティフマン症候群、自己免疫性肺炎、自閉症、ギヤン−バーレ症候群、インスリン依存性糖尿病、ならびに、自己免疫性炎症性眼障害。
【０５７８】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより治療、予防、診断および／または予後判定が可能な、自己免疫成分を有すると考えられる別の疾患として、限定するものではないが、下記のものを挙げることができる：抗コラーゲン抗体を伴なう強皮病（多くの場合、例えば、核小体およびその他の核抗体を特徴とする）、混合性結合組織疾患（多くの場合、例えば、抽出可能な核抗原（リボ核タンパク質）に対する抗体を特徴とする）、多発性筋炎（多くの場合、例えば、非ヒストンＡＮＡを特徴とする）、悪性貧血（多くの場合、例えば、抗旁細胞、ミクロソーム、および内因子抗体を特徴とする）、特発性アジソン病（多くの場合、例えば、体液および細胞性副腎細胞傷害性を特徴とする）、不妊症（多くの場合、例えば、抗精子抗体を特徴とする）、糸球体腎炎（多くの場合、例えば、糸球体基底膜抗体または免疫複合体を特徴とする）、水疱性類天疱瘡（多くの場合、例えば、基底膜中のＩｇＧおよび補体を特徴とする）、シェーグレン症候群（多くの場合、例えば、多様な組織抗体、および／または特定の非ヒストンＡＮＡ（ＳＳ−Ｂ）を特徴とする）、糖尿病（多くの場合、例えば、細胞媒介および体液膵島細胞抗体を特徴とする）、ならびに、アドレナリン性薬剤耐性（喘息または嚢胞性線維症を伴なうアドレナリン性薬剤耐性など）（多くの場合、例えば、βアドレナリン性受容体抗体を特徴とする）。
【０５７９】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより治療、予防、診断および／または予後判定が可能な、自己免疫成分を有すると考えられるその他の疾患として、限定するものではないが、下記のものを挙げることができる：慢性活性肝炎（多くの場合、例えば、平滑筋抗体を特徴とする）、原発性胆汁性肝硬変（多くの場合、例えば、ミトコンドリア抗体を特徴とする）、その他の内分泌腺不全（例えば、特定の組織抗体を特徴とする場合もある）、白斑（多くの場合、例えば、メラニン細胞抗体を特徴とする）、脈管炎（多くの場合、例えば、脈管壁中のＩｇおよび補体および／または低血清補体を特徴とする）、心筋梗塞後（ｐｏｓｔ−ＭＩ）（多くの場合、例えば、心筋抗体を特徴とする）、心臓切開症候群（多くの場合、例えば、心筋抗体を特徴とする）、じんま疹（多くの場合、例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を特徴とする）、アトピー性皮膚炎（多くの場合、例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を特徴とする）、喘息（多くの場合、例えば、ＩｇＥに対するＩｇＧおよびＩｇＭ抗体を特徴とする）、ならびに、その他多数の炎症性、肉芽腫性、変性、および萎縮性障害。
【０５８０】
好ましい実施形態では、例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、自己免疫性疾患および障害および／または前記の疾患および障害に関連する病状を治療、予防、診断および／または予後判定する。具体的な好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、リウマチ様関節炎を治療、予防、診断および／または予後判定する。
【０５８１】
別の具体的な好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、全身性エリテマトーデスを治療、予防および／または診断する。別の具体的な好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、特発性血小板減少紫斑症を治療、予防および／または診断する。
【０５８２】
別の具体的な好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、ＩｇＡニューロパシーを治療、予防および／または診断する。
【０５８３】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、自己免疫性疾患および障害および／または前記の疾患および障害に関連する病状を治療、予防、診断および／または予後判定する。
【０５８４】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを免疫抑制剤として用いる。
【０５８５】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、造血細胞の疾患、障害および／または病状の治療、予防、予後判定および／または診断に有用である。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、多能性幹細胞などの造血細胞の分化および増殖を増加することにより、特定（もしくは多）タイプの造血細胞の減少に関連する疾患、障害および／または病状を治療または予防することができる。このような疾患、障害および／または病状として、限定するものではないが、白血球減少症、好中球減少症、貧血および血小板減少症がある。あるいは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、多能性幹細胞などの造血細胞の分化および増殖を増加することにより、特定（もしくは多）タイプの造血細胞の増加に関連する疾患、障害および／または病状（限定するものではないが、組織増加症など）を治療または予防することができる。
【０５８６】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、喘息（特にアレルギー性喘息）のようなアレルギー性反応および病状を治療、予防、診断および／または予後判定することもできる。さらに、これらの分子を用いて、アナフィラキシー、抗原分子に対する過敏症、もしくは血液群不適合を治療、予防、予後判定および／または診断することができる。
【０５８７】
加えて、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、ＩｇＥ媒介アレルギー性反応を治療、予防、診断および／または予後判定することもできる。このようなアレルギー性反応として、限定するものではないが、喘息、鼻炎および湿疹がある。特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、ＩｇＥ濃度をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでモジュレートする。
【０５８８】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、炎症性症状の診断、予後判定、予防および／または治療に用途を有する。例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、炎症性応答に関与する細胞の活性化、増殖および／または分化を阻害することができ、これらの分子を用いて、慢性および急性炎症性症状を予防および／または治療することができる。このような炎症性症状として、限定するものではないが、例えば、下記のものが挙げられる：感染に関連する炎症（例えば、敗血性ショック、敗血症、もしくは全身性炎症性応答症候群）、虚血−再灌流損傷、内毒素、致死疾患（ｌｅｔｈａｌｉｔｙ）、補体媒介超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘導性肺損傷、炎症性腸疾患、クローン病、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＬ−１．）の過剰生産、呼吸障害（例えば、喘息およびアレルギー）；胃腸障害（例えば、炎症性腸疾患）；癌（例えば、胃、卵巣、肺、膀胱、肝臓および乳房）；ＣＮＳ障害（例えば、多発性硬化症；虚血性脳損傷および／または卒中、外傷性脳損傷、神経変性障害（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）；ＡＩＤＳ関連痴呆；およびプリオン病）；心臓血管障害（例えば、アテローム硬化症、心筋炎、心臓血管病、および心肺バイパス合併症）；ならびに、炎症を特徴とするその他多くの疾患、病状および障害（例えば、肝炎、リウマチ様関節炎、痛風、外傷、膵炎、サーコイドーシス、皮膚炎、腎虚血−再灌流損傷、グレーブス病、全身性エリテマトーデス、糖尿病、および同種異系移植拒絶）。
【０５８９】
炎症は、基礎的な防御機構であるため、炎症性障害は、身体のほぼあらゆる組織に影響を及ぼし得る。従って、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、組織特異的炎症性障害の治療に用途を有する。このような障害として、限定するものではないが、下記のものを挙げることができる：副腎炎、肺胞炎、胆管炎、盲腸炎、亀頭炎、眼瞼炎、気管支炎、滑液包炎、心臓炎、蜂巣炎、子宮頚炎、胆嚢炎、声帯炎、蝸虫炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、皮膚炎、憩室炎、脳炎、心内膜炎、食道炎、耳管炎、結合組織炎、毛包炎、胃炎、胃腸炎、歯肉炎、舌炎、肝脾炎、角膜炎、迷路炎、喉頭炎、リンパ管炎、乳腺炎、中耳炎、髄膜炎、子宮炎、粘膜炎、心筋炎、筋炎、鼓膜炎、腎炎、神経炎、精巣炎、骨軟骨炎、耳炎、心膜炎、腱周囲炎、腹膜炎、咽頭炎、静脈炎、ポリオ、前立腺炎、歯髄炎、網膜炎、鼻炎、卵管炎、強膜炎、強膜脈絡膜炎、陰嚢炎、静脈洞炎、脊椎炎、脂肪組織炎、口内炎、滑膜炎、耳管炎、腱炎、扁桃炎、尿道炎、および膣炎。
【０５９０】
特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、器官移植片拒絶および対移植片病の診断、予後判定、予防および／または治療に有用である。器官拒絶は、免疫応答を介した移植組織の宿主細胞破壊により起こる。同様に、免疫応答は、ＧＶＨＤにも関与し、この場合、外来移植細胞は、宿主組織を破壊する。本発明のポリペプチド、抗体、もしくはポリヌクレオチド、および／またはそれらのアゴニストもしくはアンタゴニストは、免疫応答、特に、Ｔ細胞の活性化、増殖、分化、または化学走性を阻害することから、器官拒絶もしくはＧＶＨＤを予防するのに有効な治療薬になると考えられる。特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫応答、特に、Ｔ細胞の活性化、増殖、分化、または化学走性を阻害することから、実験上のアレルギーおよび超急性異種移植片拒絶を予防するのに有効な治療薬になると考えられる。
【０５９１】
他の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定するものではないが、血清疾患、連鎖球菌後糸球体腎炎、結節性多発動脈炎、および免疫複合体誘導性脈管炎の診断、予後判定、予防および／または治療に有用である。
【０５９２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、感染因子を治療、検出および／または予防することができる。例えば、免疫応答を高める、特に、Ｂおよび／またはＴ細胞の増殖活性化および／または分化を増加することにより、感染性疾患を治療、検出および／または予防することができる。免疫応答は、既存の免疫応答を増強するか、あるいは、新しい免疫応答を開始する、いずれかにより、高めることができる。その他にも、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫応答を必ずしも誘発することなく、感染病原体（ａｇｅｎｔ）、（感染病原体を列挙した適用の項を参照）を直接阻害することも可能である。
【０５９３】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗原に対する免疫応答性を増強するワクチンアジュバントとして用いる。特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、腫瘍特異的免疫応答性を増強するアジュバントとして用いる。
【０５９４】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗ウイルス免疫応答性を増強するアジュバントとして用いる。本発明の組成物をアジュバントとして用いることにより増強することができる抗ウイルス免疫応答には、本明細書に記載した、もしくは当分野では公知のウイルスおよびウイルス関連の疾患または症状が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物をアジュバントとして用いて、ＡＩＤＳ、髄膜炎、デング熱、ＥＢＶおよび肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）からなる群より選択されるウイルス、疾患、もしくは症候に対する免疫応答を増強する。別の特定の実施形態では、本発明の組成物をアジュバントとして用いて、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、呼吸器合胞体ウイルス、デング熱、ロタウイルス、日本Ｂ型脳炎、インフルエンザＡおよびＢ型、パラインフルエンザ、麻疹、サイトメガロウイルス、狂犬病、ジュニン（Ｊｕｎｉｎ）、チクングンヤ（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）、リフトバレー熱、単純ヘルペス、および黄熱からなる群より選択されるウイルス、疾患、もしくは症状に対する免疫応答を増強する。
【０５９５】
別の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、抗細菌または抗真菌免疫応答性を増強するアジュバントとして用いる。本発明の組成物をアジュバントとして用いることにより増強することができる抗細菌または抗真菌免疫応答には、本明細書に記載した、もしくは当分野では公知の細菌または真菌、あるいは、細菌または真菌関連の疾患または症状が含まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物をアジュバントとして用いて、破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、およびＢ型髄膜炎からなる群より選択される細菌または真菌、疾患、もしくは症状に対する免疫応答を増強する。
【０５９６】
別の特定の実施形態では、本発明の組成物をアジュバントとして用いて、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ）、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、パラチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｐａｒａｔｙｐｈｉ）、Ｍｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｂ群連鎖球菌、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．）、腸毒素産生性大腸菌、腸出血性大腸菌、およびヒトライム病（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）からなる群より選択される細菌または真菌、疾患、もしくは症状に対する免疫応答を増強する。
【０５９７】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをアジュバントとして用いて、抗寄生体免疫応答を増強する。アジュバントとして本発明の組成物を用いて増強することができる抗寄生体免疫応答としては、本明細書に記載した、もしくは当分野では公知の寄生体、ならびに、寄生体関連疾患または症状がある。特定の実施形態では、本発明の組成物をアジュバントとして用いて、寄生体に対する免疫応答を増強する。別の特定の実施形態では、本発明の組成物をアジュバントとして用いて、プラスモジウム（マラリア）またはリーシュマニアに対する免疫応答を増強する。
【０５９８】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、単核食細胞のリクルートおよび活性化を阻止することにより、珪肺症、サルコドーシス、および特発性肺線維症などの感染性疾患を治療することもできる。
【０５９９】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを抗体産生の抗原として用いることにより、本発明のポリペプチドに対する免疫媒介応答を阻害もしくは増強する。
【０６００】
一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、小型ブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ニワトリ、ラクダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、ならびにヒト、最も好ましくは、ヒト）に投与することにより、免疫系を増強して、１以上の抗体（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）の生産量を増加させ、より高いアフィニティー抗体生産およびイムノグロブリンクラススイッチング（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ）を誘導し、および／または免疫応答応答を高める。
【０６０１】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、病原体に対するＢ細胞応答性の刺激剤として用いる。
【０６０２】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、Ｔ細胞のアクチベーターとして用いる。
【０６０３】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫抑制治療薬の投与前に、個体の免疫状態を高める薬剤として用いる。
【０６０４】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、より高いアフィニティー抗体を誘導する薬剤として用いる。
【０６０５】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血清イムノグロブリン濃度を高める薬剤として用いる。
【０６０６】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫無防備状態の個体の回復を促進する薬剤として用いる。
【０６０７】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、高齢の集団および／または新生児における免疫応答性を高める薬剤として用いる。
【０６０８】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、骨髄移植および／またはその他の移植（同種異型もしくは異種器官移植）の前、最中、または、後に、免疫系エンハンサーとして用いる。移植に関しては、本発明の組成物を移植前、移植と同時に、および／または移植後に投与する。特定の実施形態では、本発明の組成物は、移植後、Ｔ細胞集団の回復開始の前に投与する。別の特定の実施形態では、本発明の組成物は、移植後、Ｔ細胞集団の回復開始後であるが、Ｂ細胞集団の完全な回復前に投与する。
【０６０９】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、後天性Ｂ細胞機能欠失を有する個体における免疫応答性を高める薬剤として用いる。後天性Ｂ細胞機能欠失による病状は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与することにより改善もしくは治療することができ、このような病状として、限定するものではないが、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、骨髄移植、ならびに、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）が挙げられる。
【０６１０】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、一時性免疫欠損を有する個体における免疫応答性を高める薬物として用いる。一時性免疫欠損による病状は、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質を投与することにより改善もしくは治療することができ、このような病状として、限定するものではないが、ウイルス感染（例えば、インフルエンザ）からの回復、栄養失調に関連する症状、感染性単核細胞症からの回復、もしくはストレスに関連する症状、麻疹からの回復、輸血からの回復、ならびに、手術からの回復が挙げられる。
【０６１１】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単球、樹状細胞、および／またはＢ細胞による抗原提示の調節剤として用いる。一実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの抗原提示を増強する、あるいは、抗原提示に拮抗する。さらに、関連する実施形態では、このような抗原提示の増強または拮抗作用は、抗腫瘍治療手段として、あるいは、免疫系をモジュレートする上で有用となると考えられる。
【０６１２】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＴＨ１細胞性応答とは反対に、体液性応答（例えば、ＴＨ２）の発生に向けて、個体の免疫系を指令する薬剤として用いる。
【０６１３】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、腫瘍増殖を誘導することにより、抗腫瘍形成剤に対する腫瘍の感受性を高める薬剤として用いる。例えば、多発性骨髄腫は、低速分裂疾患であるため、抗腫瘍形成療法に対して耐性である。これらの細胞をより高速に増殖させれば、それらの感受性プロフィールも同様に変化すると考えられる。
【０６１４】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＡＩＤＳ、慢性リンパ球障害および／または分類不能原発性免疫不全などの疾病におけるＢ細胞産生の刺激剤として用いる。
【０６１５】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、手術、外傷または遺伝的欠陥によるリンパ系組織の産生および再生のための治療薬として用いる。別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、移植前の骨髄サンプルの前処理に用いる。
【０６１６】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＳＣＩＤ患者に認められるような免疫不能／免疫不全を引き起こす遺伝的障害に対する遺伝子治療薬として用いる。
【０６１７】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、単球／マクロファージを活性化する手段として用いることにより、リーシュマニア属のような単球に影響を与える寄生体性疾患を防御する。
【０６１８】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドにより誘発される分泌サイトカインを調節する手段として用いる。
【０６１９】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、これらが、獣医学に適用可能であることから、本明細書に記載した１以上の用途に用いる。
【０６２０】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、外来病原体または自己に対する様々な形態の免疫応答を阻止する手段として用いる。特定形態の免疫応答の阻止が望まれる疾患もしくは病状として、例えば、狼瘡および関節炎のような自己免疫障害、ならびに、皮膚アレルギー、炎症、腸疾患、損傷、および病原体に関連する疾患／障害などの免疫応答性が挙げられる。
【０６２１】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特発性血小板減少性紫斑、全身性エリテマトーデスおよび多発性硬化症などの自己免疫疾患に関連するＢ細胞増殖およびＩｇ分泌を防止する治療薬として用いる。
【０６２２】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、上皮細胞におけるＢおよび／またはＴ細胞移動の阻害剤として用いる。この活性は、組織アーキテクチャーもしくはコグネート応答を破壊し、例えば、免疫応答を破壊し、敗血症を阻止するのに有用である。
【０６２３】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、重症度が不確かな単一クローン性高γグロブリン血症（ＭＧＵＳ）、ワンデンシュトレーム病、関連する特発性単一クローン性高γグロブリン血症、およびプラズマ細胞腫などの疾患に明らかな慢性高γグロブリン血症の治療薬として用いる。
【０６２４】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、特定の自己免疫疾患、慢性炎症性および感染性疾患において、マクロファージおよびその前駆体、ならびに、好中球、好塩基球、Ｂリンパ球および数種のＴ細胞サブセット、例えば、活性化およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞、ならびにナチュラルキラー細胞のポリペプチド化学走性および活性化を阻害することができる。自己免疫疾患の例は、本明細書に記載されており、多発性硬化症やインスリン依存性糖尿病が挙げられる。
【０６２５】
また、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、例えば、好酸球生産および移動を阻止することにより、特発性高好酸球症候群を治療することもできる。
【０６２６】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、補体媒介細胞溶解を増強もしくは阻害する。
【０６２７】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、抗体依存性細胞傷害を増強もしくは阻害する。
【０６２８】
別の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて、タンパク質と動脈壁への単球浸潤を阻止することにより、動脈硬化を治療することもできる。
【０６２９】
もう１つの特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは成人性呼吸障害症候群（ＡＲＤＳ）の治療に用いることができる。
【０６３０】
もう１つの特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは創傷および組織修復の刺激、脈管形成の刺激、および／または血管またはリンパ系疾患または障害の修復に有用であり得る。さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは粘膜表面の再生を刺激するのに用いられる。
【０６３１】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、先天的または後天的免疫不全、欠陥のある血清免疫グロブリン産生、再発感染および／または免疫系不全を特徴とする障害の診断、予後判定、治療および／または予防に使用される。さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、関節、骨、皮膚および／または耳下腺の感染、血液−骨感染（例えば、敗血症、髄膜炎、敗血性関節炎および／または骨髄炎）、自己免疫疾患（例えば、本明細書に開示されるもの）、炎症性疾患、および悪性腫瘍、および／または限定されるものではないが、ＣＶＩＤ、その他の先天性免疫不全、ＨＩＶ疾患、ＣＬＬ、再発性気管支炎、副鼻腔炎、中耳炎、結膜炎、肺炎、肝炎、髄膜炎、帯状疱疹（例えば、重症性帯状疱疹）、および／またはカリニ肺炎をはじめとする、これらの感染症、疾患、障害および／または悪性腫瘍に関連するいずれかの疾患または障害または症状の治療または予防に用いられる。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで予防、診断、予後判定、および／または治療され得るその他の疾患および障害としては、限定されるものではないが、ＨＩＶ感染症、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ感染症、リンパ球減少症、食細胞殺菌不全性貧血、血小板減少症、および血色素尿症が挙げられる。
【０６３２】
もう１つの特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、分類不能型免疫不全症（「ＣＶＩＤ」「後天性無γグロブリン血症」および「後天性低γグロブリン血症」とも呼ばれる）またはこの疾患のサブセットを有する者の治療および／または診断のために使用される。
【０６３３】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、免疫細胞もしくは免疫組織関連の癌または腫瘍をはじめとする癌または腫瘍の診断、予後判定、予防および／または治療に用いられる。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって予防、診断または治療され得る癌または腫瘍の例としては、限定されるものではないが、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、ホジキン病、非ホジキン性リンパ腫、急性リンパ性貧血（ＡＬＬ）、 慢性リンパ球白血病、 形質細胞腫、多発性骨髄腫、バーキットリンパ腫、ＥＢＶ変換疾患、および／または本明細書の別の場所「過増殖性疾患」と題した節に記載されている疾患および障害が挙げられる。
【０６３４】
もう１つの特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、大Ｂ細胞リンパ腫の細胞内増殖を低下させる療法として用いられる。
【０６３５】
もう１つの特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、Ｂ細胞および慢性骨髄性白血病関連のＩｇの介在を低下させる手段として用いられる。
【０６３６】
特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば部分的または完全脾臓摘出術を受けた者のようなＢ細胞免疫不全者の免疫応答性を高める薬剤として用いられる。
【０６３７】
血液関連疾患
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、止血（出血の停止）または血栓崩壊（血餅溶解）活性をモジュレートするのに用いることができる。例えば、止血活性または血栓溶解活性を高めることによって本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血液凝固の疾患、障害および／または症状（例えば、無フィブリノーゲン血症、因子欠損症、血友病）、血小板性の疾患、障害および／または症状（例えば、血小板減少症）、または外傷、外科術もしくは他の理由による創傷の治療または予防に使用できる。あるいは、止血活性または血栓溶解活性を低下させ得る本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、凝固を阻害または溶解するのに使用できる。これらの分子は心臓発作（梗塞）、卒中または瘢痕形成の治療または予防に重要であり得る。
【０６３８】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血栓症、動脈血栓症、静脈血栓症、血栓塞栓症、肺塞栓症、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、一過性脳虚血発作、不安定狭心症の予防、診断、予後判定および／または治療に用いられる。特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、伏在移植片の閉塞の予防のため、血管形成術に付随し得るものとしての手術前後の血栓症のリスクを軽減するため、非リウマチ性心房細動をはじめとする心房細胞を有する患者における卒中のリスクを軽減するため、機械的心臓弁および／または僧帽弁の疾患に関連する塞栓症のリスクを軽減するために用いてもよい。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのその他の使用としては、限定されるものではないが、体外装置（例えば、血管内カニューレ、血液透析患者の血管挿入シャント、血液透析機、および心肺バイパス装置）における閉塞の予防がある。
【０６３９】
もう１つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血液および／または本発明のポリペプチドが発現する組織と関連した器官をめぐる血液の疾患および障害の予防、診断、予後判定および／または治療のために用いられる。
【０６４０】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、造血（血球の形成）活性をモジュレートするのに用いてもよい。例えば、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば赤血球、リンパ球（ＢまたはＴ細胞）、骨髄性細胞（例えば、好塩基球、好酸球、好中球、マスト細胞、マクロファージ）および血小板などの血球の全てまたはサブセットの量を増やすために用いられる。血球または血球サブセットの量を減らす能力は下記の貧血症および／または白血球減少症の予防、検出、診断および／または治療に有用であり得る。あるいは、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば赤血球、リンパ球（ＢまたはＴ細胞）、骨髄性細胞（例えば、好塩基球、好酸球、好中球、マスト細胞、マクロファージ）および血小板などの血球の全てまたはサブセットの量を減らすために用いてもよい。血球または血球サブセットの量を減らす能力は例えば好酸球増加症などの白血球増加症の予防、検出、診断および／または治療に有用であり得る。
【０６４１】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは血液疾患の予防、治療または診断に用いてもよい。
【０６４２】
貧血症は赤血球の数またはヘモグロビン（酸素を輸送するタンパク質）の量が正常値を下回る症状である。貧血症は過剰な出血、赤血球生産の低下、または赤血球破壊（溶血）の増加を原因とする。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは貧血症の治療、予防および／または診断に有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって治療、予防または診断され得る貧血症としては、鉄欠乏性貧血、低色素性貧血、小球子性貧血、萎黄病、遺伝性鉄赤芽球性貧血、特発性後天性鉄赤芽球性貧血、赤血球形成不全、巨赤芽球性貧血（例えば、悪性貧血、（ビタミンＢ１２欠乏症）および葉酸欠乏性貧血）、再生不良性貧血、溶血性貧血（例えば、自己免疫性溶血性貧血、細血管性溶血性貧血、および発作性夜間血色素尿症）が挙げられる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、全身性紅斑性狼瘡、癌、リンパ腫、慢性腎疾患、および脾臓肥大に関連する貧血症をはじめとする疾患に関連の貧血症の治療、予防および／または診断に有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、メチルドーパ、ダプソン、および／またはスルファ剤に関連する貧血症のような薬剤治療から起こる貧血症の治療、予防および／または診断に有用であり得る。さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、遺伝性球状赤血球症、遺伝性楕円赤血球症、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ欠乏症、および鎌状赤血球貧血をはじめとする、異常な赤血球構造に関連する貧血症の治療、予防および／または診断に有用であり得る。
【０６４３】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヘモグロビン異常（例えば、鎌状赤血球貧血、ヘモグロビンＣ症、へのグロビンＳ−Ｃ症、およびヘモグロビンＥ症）の治療、予防および／または診断に有用であり得る。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、多数型および少数型α−地中海貧血症およびβ−地中海貧血症をはじめとする地中海貧血症の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。
【０６４４】
もう１つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、血小板減少症（例えば、特発性血小板減少性紫斑、および血栓性血小板減少性紫斑）、フォン・ビルブラント病、遺伝性血小板障害（例えば、チェディアック・東症候群およびヘルマンスキー・パドラック症候群などの貯蔵プール疾患、トロンボキサンＡ２機能不全、血小板無力症、およびベルナール・スリエ症候群）、溶血性尿毒症候群、Ａ型血友病もしくは因子ＶＩＩ欠乏症およびクリスマス病もしくは因子ＩＸ欠乏病などの血友病、ランデュー・オスラー・ウェーバー症候群としても知られる遺伝性出血性毛細血管拡張症、アレルギー性紫斑（ヘノッホ・シェーンライン紫斑）および汎発性血管内凝固をはじめとする出血性疾患の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。
【０６４５】
血液の凝固時間に対する、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの作用は、限定されるものではないが、全血部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ａＮＴ）、活性化凝固時間（ＡＣＴ）、カルシウム再沈着活性化凝固時間、またはリー・ホワイト凝固時間をはじめとする、当技術分野で公知の凝固試験のいずれによってモニターしてもよい。
【０６４６】
いくつかの疾患および種々の薬剤が血小板機能不全を引き起こし得る。従って特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは腎不全、白血病、多発性骨髄腫、肝硬変および全身性紅斑性狼瘡を伴う血小板機能不全、ならびにアスピリン、チクロピジン、非ステロイド系抗炎症薬（関節炎、痛みおよび捻挫に用いられる）、および高用量ペニシリンによる治療をはじめとする薬剤治療に関連する血小板機能不全といった後天性血小板機能不全の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。
【０６４７】
もう１つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、白血球数の増加または減少を特徴とする、またはそれと関連する疾患および障害の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。白血球減少症は白血球の数が正常値以下に減少する場合に起こる。血球減少症としては、限定されるものではないが、好中球減少症およびリンパ球減少症がある。正常値に比べたときの白血球の数の増加は白血球増加症として知られる。身体では感染中に白血球数の増加が起こる。このように白血球増加症は容易に、感染を反映する通常の生理学的パラメーターとなる。あるいは、白血球増加症は傷害または癌などのその他の疾患の指標にもなる。白血球増加症としては、限定されるものではないが、好酸球増加症およびマクロファージの集積が挙げられる。特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは白血球減少症の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。他の特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは白血球増加症の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。
【０６４８】
白血球減少症はあらゆる種類の白血球の全般的な減少である場合もあるし、あるいは特定の種類の白血球の特異的消耗の場合もある。このように特定の実施形態では、 本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは好中球減少症として知られる好中球数の減少の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって診断、予後判定、予防および／または治療され得る好中球減少症としては、限定されるものではないが、小児遺伝性顆粒球減少症、家族性好中球減少症、周期性好中球減少症、栄養不足（例えば、ビタミンＢ１２欠乏症または葉酸欠乏症）による、または関連する好中球減少症、薬剤治療（例えば、ペニシリン治療などの抗生物質投与、スルホンアミド治療、抗凝固剤治療、抗痙攣薬、抗甲状腺薬および抗癌化学療法）による、または関連する好中球減少症、および数種の細菌またはウイルス感染、アレルギー性障害、自己免疫疾患、脾臓肥大者の症状（例えば、フェルティ症候群、マラリアおよび類肉腫症）およびいくつかの薬剤治療法に付随して起こる好中球破壊の増加を原因とする好中球減少症が挙げられる。
【０６４９】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、ストレス、薬剤治療（例えば、コルチコステロイド、癌化学療法および／または放射線療法）、エイズ感染、および／または、例えば癌、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、慢性感染、いくつかのウイルス感染および／または遺伝性疾患（例えば、ディジョージ症候群、ヴィスコット・オールドリッチ症候群、重症性複合型免疫欠損、毛細血管拡張性運動失調）などの他の疾患による、または関連するリンパ球減少症をはじめとするリンパ球減少症（Ｂおよび／またはＴリンパ球数の減少）の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。
【０６５０】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病、レテラー・ジーヴェ病およびハンド・シュラー・クリスチャン病をはじめとする、マクロファージ数および／またはマクロファージ機能に関連する疾患および障害の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。
【０６５１】
もう１つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、特発性過好酸球増加症候群、好酸球増加性筋肉痛症候群、およびハンド・シュラー・クリスチャン病をはじめとする、好酸球数および／または好酸球機能に関連する疾患および障害の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。
【０６５２】
なおもう１つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、急性リンパ球性（リンパ芽球性）白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性（骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）、骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）、骨髄芽球性、または骨髄単球性）白血病、慢性リンパ球性白血病（例えば、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞白血病、セザール症候群、およびヘアリー細胞白血病）、慢性骨髄性（骨髄性（ｍｙｅｌｏｉｄ）、骨髄性（ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ）、または顆粒球性）白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、および菌状息肉腫をはじめとする白血病およびリンパ腫の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。
【０６５３】
その他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、形質細胞悪液質、単一クローン性高γグロブリン血症、重症度が不確かな単一クローン性高γグロブリン血症、多発性骨髄腫、マクログロブリン血症、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、寒冷グロブリン血症、およびレイノー現象をはじめとする、形質細胞の疾患または障害の診断、予後判定、予防および／または治療に有用であり得る。
【０６５４】
その他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、真性赤血球増加症、相対的赤血球増加症、続発性赤血球増加症、骨髄繊維症、急性骨髄繊維症、原因不明骨髄様化生、血小板減少症（原発生および続発生血小板減少症の両者を含む）、および慢性骨髄性白血病をはじめとする骨髄増殖生疾患の治療、予防および／または診断に有用であり得る。
【０６５５】
その他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、外科手術に先立ち赤血球生産を増強する処置として有用であり得る。
【０６５６】
その他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好中球、好酸球およびマクロファージの移動、食作用、スーパーオキシド生産、それらの細胞傷害性に依存する抗体を増強する薬剤として有用であり得る。
【０６５７】
その他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは幹細胞のフェレーシスに先立ち循環中の幹細胞の数を増やす薬剤として有用であり得る。もう１つの特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血小板のフェレーシスに先立ち循環中の幹細胞の数を増やす薬剤として有用であり得る。
【０６５８】
その他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはサイトカイン生産を増強する薬剤として有用であり得る。
【０６５９】
その他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、原発生造血障害の予防、診断および／または治療に有用であり得る。
【０６６０】
過増殖性疾患
ある実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、腫瘍をはじめとする過増殖性疾患の治療または検出に使用できる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、相互作用を指示するまたは指示しないことによってのこの障害の増殖を阻害し得る。あるいは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、過増殖性疾患を阻害し得る他の細胞を増殖させ得る。
【０６６１】
例えば、免疫応答を増強する、特に過増殖性疾患の抗原性を増強することにより、またはＴ細胞を増殖、分化もしくは可動化することにより、過増殖性疾患は治療できる。この免疫応答は既存の免疫応答を増強すること、または新たな免疫応答を誘導することのいずれかにより増強され得る。あるいは、化学療法薬など、免疫応答を低下させることも過増殖性疾患の治療方法となり得る。
【０６６２】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって治療または検出できる過増殖性疾患の例としては、限定されるものではないが、結腸、腹部、骨、乳房、消化系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部および頚部、神経（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部および泌尿生殖管に存在する腫瘍が挙げられる。
【０６６３】
同様に、その他の過増殖性疾患も本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって治療または検出できる。かかる過増殖性疾患の例としては、限定されるものではないが、急性小児リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質癌、成人性（原発性）肝細胞癌、成人性（原発性）肝癌、成人性急性リンパ球性白血病、成人性急性骨髄性白血病、成人性ホジキン病、成人性ホジキン白血病、成人性リンパ球性白血病、成人性非ホジキンリンパ腫、成人性原発性肝癌、成人性軟組織肉腫、エイズ関連リンパ腫、エイズ関連悪性腫瘍、肛門癌、星状膠細胞腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、腎盂および尿管の癌、中枢神経系（原発性）リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星状膠細胞腫、大脳星状膠細胞腫、子宮頚癌、小児（原発性）肝細胞癌、小児（原発性）肝癌、小児急性リンパ芽急性白血病、小児急性骨髄性白血病、小児脳幹神経膠腫、小児小脳星状膠細胞腫、小児大脳星状膠細胞腫、小児頭蓋外生殖細胞腫瘍、小児ホジキン病、小児ホジキンリンパ腫、小児視床下部・視覚経路神経膠腫、小児リンパ芽球性白血病、小児髄芽腫、小児非ホジキンリンパ腫、小児松果体・テント上原始神経板外胚葉腫瘍、小児原発性肝癌、小児網紋筋肉腫、小児軟組織肉腫、小児視覚経路・視床下部神経膠腫、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、内分泌性膵島細胞腫、子宮内膜癌、上衣細胞腫、上皮癌、食道癌、ユーイング肉腫および関連腫瘍、外分泌性膵臓癌、頭蓋外生殖細胞腫瘍、生殖腺外生殖細胞腫瘍、肝臓外胆管癌、眼癌、女性の乳癌、ゴーシェ病、胆嚢癌、胃癌、胃腸類癌腫、胃腸癌、生殖細胞癌、妊娠栄養膜癌、ヘアリー細胞白血病、頭部・頚部癌、肝細胞癌、ホジキン病、ホジキンリンパ腫、高γグロブリン血症、下咽頭癌、腸管癌、眼内黒色腫、島細胞癌腫、島細胞膵癌、カポジ肉腫、腎臓癌、咽頭癌、口唇・口腔癌、肝臓癌、肺癌、リンパ増殖性疾患、マクログロブリン血症、男性乳癌、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、転移性潜伏原発性扁平上皮頚癌、転移性原発性扁平上皮頚癌、転移性扁平上皮頚癌、多発性骨髄腫、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、脊髄形成不全症候群、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄性白血病（Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ）、骨髄増殖性疾患、鼻腔・副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、妊娠中非ホジキンリンパ腫、非黒色腫皮膚癌、非小細胞肺癌、潜伏原発性転移性扁平上皮頚癌、口咽頭癌、骨／悪性繊維肉腫、骨肉腫／悪性繊維組織球腫、骨肉腫／骨の悪性腫瘍繊維組織球腫、卵巣上皮癌、卵巣生殖細胞癌、卵巣低悪性潜在癌、膵臓癌、異常蛋白血症、紫斑病、副甲状腺癌、陰茎癌、クロム親和性細胞腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性肝臓癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎盂・尿管癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、類肉腫症肉腫、セザール症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟組織肉腫、扁平上皮頚癌、胃癌、テント上原始神経板外胚葉・松果体腫瘍、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、胸腺��、胸腺癌、腎盂・尿管の移行細胞癌、移行腎盂・尿管癌、栄養膜腫瘍、尿管・腎盂細胞癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、視覚経路・視床下部神経膠腫、陰門癌、ワルデンシュトレーム性マクログロブリン血症、ビルムス腫瘍、および上記の臓器系に存在する腫瘍以外のその他の過増殖性疾患が挙げられる。
【０６６４】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが上記の疾患をはじめ、前悪性症状の診断、予後判定、予防および／または治療に、また、腫瘍または悪性状態への進行の予防に用いられる。かかる使用は、特に過形成、化生、または最も特には形成異常からなる非腫瘍性細胞増殖が起こっている腫瘍または癌への上記進行に先行することが知られている、または先行すると予測される症状に指示される（かかる異常増殖症状の総説としては、ＲｏｂｂｉｎｓおよびＡｎｇｅｌｌ， １９７６， Ｂａｓｉｃ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ， 第２版， Ｗ． Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ６８−７９頁を参照）。
【０６６５】
過形成は、構造または機能に有意な変化を伴わない組織または器官の細胞数の増加を含む、制御された細胞増殖の一形態である。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで診断、予後判定、予防および／または治療され得る過形成疾患としては、限定されるものではないが、血管濾胞性縦隔リンパ節過形成、好酸球増加症随伴血管類リンパ組織増殖症、非定型メラニン細胞過形成、基底細胞過形成、良性巨リンパ節過形成、セメント質過形成、先天性副腎過形成、先天性皮脂過形成、嚢胞性過形成、乳房嚢胞性過形成、義歯過形成、腺管過形成、子宮内膜過形成、繊維筋過形成、限局性上皮過形成、歯肉過形成、炎症性繊維過形成、炎症性乳頭過形成、血管内乳頭内皮過形成、結節性前立腺過形成、結節性再生過形成、偽上皮腫性増殖症、老人性脂腺増殖症、およびいぼ状過形成が挙げられる。
【０６６６】
化生は、ある種類の成熟細胞、または完全に分化した細胞が別の種類の成熟細胞に置き換わる、制御された細胞増殖の一形態である。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで診断、予後判定、予防および／または治療され得る化生疾患としては、限定されるものではないが、原因不明骨髄様化生、アポクリン化生、非定型化生、自己実質化生、結合組織化生、上皮化生、腸化生、化生性貧血、変形骨化、化生性ポリープ、骨髄性化生、原発性骨髄性化生、続発生骨髄性化生、扁平上皮化生、羊膜扁平上皮化生、および症候性骨髄性化生が挙げられる。
【０６６７】
形成異常は癌の前兆であることが多く、主として上皮に見られ、個々の細胞の均一性および細胞の構造的な配向の欠如を含む、非腫瘍性細胞増殖の最も病的な形態である。形成異常細胞はしばしば異常に大きく、濃く染まる核を有し、多形態性を示す。特徴的には、形成異常は慢性的な刺激または炎症が存在する場所で起こる。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで診断、予後判定、予防および／または治療され得る形成異常疾患としては、限定されるものではないが、無発汗性外胚葉性形成異常、前後形成異常、窒息性胸郭形成異常、心房指形成異常、気管支肺形成異常、大脳形成異常、 子宮頚形成異常、軟骨外胚葉性形成異常、鎖骨頭蓋骨形成不全、先天性外胚葉性形成異常、頭蓋骨幹形成異常、頭蓋手根骨足根骨形成異常、 頭蓋骨幹端形成異常、象牙質形成異常、骨幹形成異常、外胚葉性形成異常、エナメル質形成異常、脳眼球形成異常、骨端形成異常性半肢症、多発性骨端形成異常、点状骨端形成異常、上皮形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、家族性繊維性顎形成異常、家族性白色襞形成異常、繊維筋性形成異常、繊維性骨形成異常、根尖性骨形成異常、遺伝性腎臓網膜形成異常、発汗性外胚葉性形成異常、低発汗性外胚葉性形成異常、リンパ球減少性胸腺形成異常、乳房形成異常、下顎顔面骨形成不全、骨幹端形成異常、モンディーニ形成異常、単発性維性形成異常、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼歯指形成異常、歯原性形成異常、眼下顎四肢形成異常、歯根尖周囲セメント質形成異常、多発性繊維性形成異常、偽軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、眼中隔形成不全、脊椎骨端形成異常、および心室橈骨形成異常が挙げられる。
【０６６８】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドで診断、予後判定、予防および／または治療され得るさらなる前腫瘍性疾患としては、限定されるものではないが、良性増殖異常（例えば、良性腫瘍、繊維嚢胞性症状、組織肥大、腸ポリープ、結腸ポリープ、および食道形成異常）、白斑病、角化症、ボーエン病、農夫肌、日光性角化症が挙げられる。
【０６６９】
もう１つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを発現する組織に関連する疾患の診断および／または予後判定に用いられる。
【０６７０】
もう１つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または上記のような毒素または放射性同位元素と共役した本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、本明細書の上記のものをはじめとする癌および腫瘍の治療に用いられる。さらなる好ましい実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または上記のような毒素または放射性同位元素と共役した本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、急性骨髄性白血病の治療に用いられる。
【０６７１】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはアポトーシスに作用することから、細胞の生存の上昇またはアポトーシスの阻害の上昇に関連するいくつかの疾患を治療するのに有用であり得る。例えば、本発明のポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはアゴニストもしくはアンタゴニストによって診断、予後判定、予防および／または治療され得る細胞の生存またはアポトーシスの阻害の上昇に関連する疾患としては、癌（限定されるものではないが、結腸癌、心腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽腫、粘液腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺癌、乳癌、前立腺癌、カポジ肉腫、および卵巣癌などをはじめとする濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌腫、およびホルモン依存性腫瘍）、多発性硬化症、シューグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性紅斑性狼瘡、ならびに免疫関連の糸球体腎炎および慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患、およびウイルス感染症（ヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルスなど）、炎症、移植片対宿主病、急性移植拒絶、および慢性移植拒絶が挙げられる。
【０６７２】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌、特に上記のものの増殖、進行および／または転移の阻害に用いられる。
【０６７３】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって診断、予後判定、予防および／または治療され得る細胞の生存の上昇に関連するさらなる疾病または症状としては、限定されるものではないが、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽性、前骨髄性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む）および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性白血病））、真性赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、および限定されるものではないが、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ血管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、脊髄癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、繊毛上皮癌、精上皮癌、胎生期癌、ビルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状膠細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、 松果体腫、血管芽細胞種、聴神経腫、乏突起神経膠腫、血管腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫などの肉腫および癌腫をはじめとする固形腫瘍といった悪性腫瘍および関連疾患の進行および／または転移が挙げられる。
【０６７４】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって診断、予後判定、予防および／または治療できるアポトーシスの上昇に関連する疾患としては、エイズ；神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、大脳変性および脳腫瘍または先の関連疾患など）；自己免疫疾患（多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性紅斑性狼瘡、ならびに免疫関連の糸球体腎炎および慢性関節リウマチなど）、骨髄形成不全症候群（再生不良性貧血など）、移植片対宿主病、虚血性傷害（心筋梗塞、卒中および再潅流傷害によって引き起こされるものなど）、肝傷害（例えば、肝炎関連肝傷害、虚血性／再潅流傷害、胆汁うっ滞（胆管傷害）および肝臓癌）；毒素誘発性肝疾患（アルコールにより引き起こされるものなど）、敗血症性ショック、悪液質および拒食症が挙げられる。
【０６７５】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって診断、予後判定、予防および／または治療できる過増殖性疾患または障害としては、限定されるものではないが、肝臓、腹部、骨、乳房、消化系、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、下垂体、精巣、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭部および頚部、神経系（中枢および末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部および泌尿生殖管に存在する腫瘍が挙げられる。
過増殖性疾患の例としては、限定されるものではないが、高γグロブリン血症、リンパ増殖性障害、パラプロテイン血症、紫斑病、類肉腫症、セザール症候群、ワルデンシュトレーム性マクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、および上記の臓器系に存在する腫瘍以外のその他の過増殖性疾患が挙げられる。
【０６７６】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明、および／またはタンパク質融合物もしくはその断片を用いた遺伝子療法により、異常細胞分裂を阻害するのに用いられる。
【０６７７】
よって、本発明では異常増殖細胞にその発現を抑制する本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することにより細胞増殖性障害を治療する方法が提供される。
【０６７８】
本発明のもう１つの実施形態では、本発明の１以上の活性遺伝子コピーの異常増殖細胞への投与を含んでなる個体において細胞増殖性障害を治療する方法が提供される。好ましい実施形態では、本発明のポリヌクレオチドはそのポリヌクレオチドをコードするＤＮＡ配列を発現するのに有効な組換え発現ベクターを含んでなるＤＮＡ構築物である。本発明のもう１つの好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物が細胞に挿入され、それがレトロウイルス、さらに好ましくはアデノウイルスベクターを用いて治療される（参照により本明細書に組み入れる、Ｇ． Ｊ． Ｎａｂｅｌら， ＰＮＡＳ １９９９ ９６： ３２４−３２６参照）。最も好ましい実施形態では、ウイルスベクターは欠損しており、非増殖細胞を形質転換しないで増殖細胞だけを形質転換する。さらに、好ましい実施形態では、単独またはその他のポリヌクレオチドとの組合せもしくはそれとの融合状態で増殖細胞へ挿入された本発明のポリヌクレオチドは、さらに、そのポリヌクレオチドのプロモーター上流で作用してコードされたタンパク質産物の発現を誘導する外部刺激（すなわち、磁性物質、特定小分子、化学物質または薬剤投与、他）を介してモジュレートされ得る。本発明の有益な治療効果自体がその外部刺激に基づいて明白にモジュレート（すなわち、本発明の発現を増強、低下または阻害すること）され得る。
【０６７９】
本発明のポリヌクレオチドは発癌遺伝子または抗原の発現の抑制に有用であり得る。「発癌遺伝子の発現の抑制」とは、遺伝子転写の抑制、遺伝子転写物（プレメッセージＲＮＡ）の破壊、スプライシングの阻害、メッセンジャーＲＮＡの破壊、タンパク質の翻訳後修飾の阻害、タンパク質の破壊、またはタンパク質の正常な機能の阻害を意味するものである。
【０６８０】
異常増殖細胞への局所投与では、本発明のポリヌクレオチドが、限定されるものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、細胞のミクロ注入、またはリポソーム、リポフェクチンなどのビヒクルで、もしくは裸のポリヌクレオチドとしてなどの当業者には公知のいずれかの方法により、あるいは明細書に記載されるいずれか他の方法により投与され得る。本発明のポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、レトロウイルスベクター（Ｇｉｌｂｏａ， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４４：８４５ （１９８２）； Ｈｏｃｋｅ， Ｎａｔｕｒｅ ３２０：２７５ （１９８６）； Ｗｉｌｓｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８５：３０１４）、ワクシニアウイルス系（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｙら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５：３４０３ （１９８５）または当業者に公知のその他の効率的なＤＮＡ送達系（Ｙａｔｅｓら， Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１２ （１９８５））などの公知の遺伝子送達系により送達され得る。これらの参照文献は単なる例示であり、参照により本明細書に組み入れる。異常増殖している細胞を特異的に送達またはトランスフェクトし、非分裂細胞のスペアを作るためには、当業者に公知のレトロウイルス、またはアデノウイルス （当技術分野で、本明細書の別の場所でも記載される）送達系を用いることが好ましい。レトロウイルスＤＮＡでは、組み込みに宿主ＤＮＡ複製が必要であるが、レトロウイルスはその生活環に必要なレトロウイルス遺伝子が欠失しているために自己複製することができない。本発明のポリヌクレオチドのかかるレトロウイルス送達系を用いてその遺伝子および構築物を異常増殖細胞に導き、非分裂正常細胞のスペアを作る。
【０６８１】
本発明のポリヌクレオチドは、注射針を患部に直接誘導するのに使用する画像装置を用いて内臓、体腔等の細胞増殖性障害／疾患部位に直接送達され得る。また、本発明のポリヌクレオチドは手術的介入の際にも患部に投与され得る。
【０６８２】
「細胞増殖性疾患」とは、良性または悪性いずれかの、細胞、細胞群、または組織の単一または多数の局所的異常増殖を特徴とする器官、腔、または体の一部のいずれか１つまたはいずれかの組合せに作用するヒトまたは動物疾患もしくは障害のいずれかを意味するものである。
【０６８３】
本発明のポリヌクレオチドは処置される細胞の増殖に生物学的阻害効果を及ぼし得るいずれもの量が投与され得る。さらに、１以上の本発明のポリヌクレオチドを同時に同じ部位に投与することが可能である。「生物学的阻害」とは、部分的または完全成長阻害ならびに細胞の増殖または成長速度の低下を意味するものである。生物学的阻害量は本発明のポリヌクレオチドの、組織培養物における標的悪性または異常増殖細胞成長、動物および細胞培養物における腫瘍成長に及ぼす効果の評価により、または当業者に公知のいずれか他の方法により決定され得る。
【０６８４】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは本明細書の別の場所で記載されるように単独で、融合タンパク質として、または他のポリペプチドとの組み合わせてのいずれかで、増殖細胞または組織の脈管形成の直接または間接的阻害に有用である。
【０６８５】
最も好ましい実施形態では、その抗脈管形成効果は間接的に、例えば腫瘍関連マクロファージなどの造血性、腫瘍特異的細胞の阻害によって達成され得る（参照により本明細書に組み入れる、Ｊｏｓｅｐｈ ＩＢら， Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ， ９０（２１）：１６４８−５３ （１９９８）参照）。
【０６８６】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、アポトーシスの誘導により増殖性細胞または組織の阻害に有用であり得る。これらの融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは直接または間接的のいずれかで作用して、例えば腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体−１、ＣＤ９５ （Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）、ＴＮＦ受容体関連アポトーシス媒介タンパク質（ＴＲＡＭＰ）ならびにＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）受容体−１および−２などのデスドメイン受容体の活性化において増殖性細胞および組織のアポトーシスを誘導し得る（参照により本明細書に組み入れる、Ｓｃｈｕｌｚｅ−Ｏｓｔｈｏｆｆ Ｋら， Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２５４（３）：４３９−５９ （１９９８）参照）。さらに本発明のもう１つの好ましい実施形態では、これらの融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドは、アポトーシスを活性化するその他のタンパク質の活性化において、またはこれらのタンパク質の発現をアポプトニン、ガレクチン、チオレドキシン、抗炎症性タンパク質などの小分子薬剤もしくは補助的薬剤単独またはそれらの組合せで刺激することによるなどのその他の機構によりアポトーシスを誘導し得る（例えば、Ｍｕｔａｔ Ｒｅｓ ４００（１−２）：４４７−５５ （１９９８）， Ｍｅｄ Ｈｙｐｏｔｈｅｓｅｓ．５０（５）：４２３−３３ （１９９８）， Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ Ｉｎｔｅｒａｃｔ． Ａｐｒ ２４：１１１−１１２：２３−２４ （１９９８）， Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．７６（６）：４０２−１２ （１９９８）， Ｉｎｔ Ｊ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅａｃｔ；２０（１）：３−１５ （１９９８）参照、なおこれらは全て参照により本明細書に組み入れられる）。
【０６８７】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは増殖性細胞または組織の転移の阻害に有用である。阻害はこれらのアルブミン融合タンパク質および／またはポリヌクレオチドを投与するといった直接的な結果として、または転移を阻害することが知られているタンパク質、例えばα４ インテグリンの発現の活性化など、間接的にも起こり得る（例えば、参照により本明細書に組み入れる、Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９８；２３１：１２５−４１参照）。本発明のかかる治療効果は小分子薬剤もしくは補助的薬剤単独またはそれらの組合せで達成され得る。
【０６８８】
もう１つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する組成物を、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合する、またはそれと会合する、それによって結合されるポリペプチドを発現する標的化された細胞に送達する方法が提供される。本発明のアルブミン融合タンパク質は疎水、親水、イオンおよび／または共有結合によって異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグと会合し得る。
【０６８９】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、本発明のアルブミン融合タンパク質を「ワクチン注射」して増殖性抗原および免疫原に応じた免疫応答が起こるといったように直接的に、またはその抗原および免疫原に対する免疫応答を増強することが知られているタンパク質（例えば、ケモカイン）の発現の活性化など間接的に、増殖細胞または組織の免疫原性および／または抗原性の増強に有用である。
【０６９０】
腎障害
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは腎臓系統の障害の治療、予防、診断および／または予後判定に用いられる。本発明の組成物を用いて診断、予後判定、予防、および／または治療できる腎障害としては、限定されるものではないが、腎不全、 腎炎、腎臓の血管障害、代謝性および先天性腎障害、腎臓の泌尿器障害、自己免疫疾患、硬化および壊死、電解質平衡異常、ならびに腎臓癌が挙げられる。
【０６９１】
本発明の組成物を用いて診断、予後判定、予防、および／または治療できる腎疾患としては、限定されるものではないが、急性腎不全、慢性腎不全、アテローム塞栓性腎不全、末期腎疾患、炎症性腎疾患（例えば、急性糸球体腎炎、感染後糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎、ネフローゼ症候群、膜性糸球体腎炎、家族性ネフローゼ症候群、膜性増殖性糸球体腎炎ＩおよびＩＩ、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、急性尿細管間質性腎炎、慢性尿細管間質性腎炎、溶連菌感染後急性糸球体腎炎（ＰＳＧＮ）、腎盂腎炎、ループス腎炎、慢性腎炎、間質性腎炎、ならびに溶連菌感染後糸球体腎炎）、腎臓の血管障害（例えば、腎臓梗塞、アテローム塞栓性腎疾患、腎皮質壊死、悪性腎硬化症、腎静脈血栓症、腎潅流不全、腎性網膜症、腎虚血再灌流、腎動脈塞栓症、および腎動脈狭窄）、ならびに尿路疾患（例えば、腎盂腎炎、水腎症、尿石症（腎結石症、腎石病）、逆流性腎症、尿路感染症、尿閉、および急性または慢性片側性閉塞性尿路疾患）が原因となる腎障害が挙げられる。
【０６９２】
さらに、本発明の組成物は代謝性および先天性腎障害（例えば、尿毒症、アミロイド腎症、腎性骨異栄養症、尿細管性アシドーシス、腎性糖尿、腎性尿崩症、シスチン尿症、ファンコーニ症候群、腎性線維嚢胞性骨組織形成（腎性くる病）、ハルトナップ病、バーター症候群、リドル症候群、多嚢胞性腎疾患、髄質嚢胞性疾患、海綿腎、アルポート症候群、爪膝蓋骨症候群、先天性ネフローゼ症候群、 ＣＲＵＳＨ症候群、馬蹄腎、糖尿病性腎症、腎性尿崩症、鎮痛薬性腎症、腎石、および膜性腎症）、ならびに腎臓の自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、グッドパスチャー症候群、ＩｇＡ腎症、およびＩｇＭメサンギウム増殖性糸球体腎炎）の診断、予後判定、予防、および／または治療に使用できる。
【０６９３】
また、本発明の組成物は硬化性または壊疽性腎障害（例えば、糸球体硬化症、糖尿病性腎症、巣状分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、壊死性糸球体腎炎、および腎乳頭壊死）、腎臓癌（例えば、腎腫、副腎腫、腎芽腫、腎細胞癌、移行細胞癌、腎腺癌、扁平上皮細胞癌、およびウィルムス腫瘍）、および電解質平衡異常（例えば、腎石灰化症、膿尿症、浮腫、水腎炎、蛋白尿、低ナトリウム血症、高ナトリウム血症、低カリウム血症、高カリウム血症、低カルシウム血症、高カルシウム血症、低リン酸血症、および高リン酸血症）の診断、予後判定、予防、および／または治療にも使用できる。
【０６９４】
本発明の組成物は、限定されるものではないが、送達部位での注射針による直接注入、静脈注射、局所投与、カテーテル注入、バイオリスティックインジェクター（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ｉｎｊｅｃｔｏｒ）、粒子加速器、ジェルフォームスポンジデポー、その他の商業的に入手可能なデポー剤、浸透圧ポンプ、経口または坐剤用固形医薬製剤、手術中のデカンティングまたは局所適応、エアゾール送達などの当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて投与され得る。かかる方法は当技術分野で公知である。本発明の組成物は以下でさらに詳細に記載する治療用物質の一部として投与され得る。本発明のポリヌクレオチドを送達する方法については本明細書でさらに詳細に記載する。
【０６９５】
心血管障害
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、四肢虚血などの末梢動脈疾患をはじめとする心血管障害の治療、予防、診断、および／または予後判定にも用いられる。
【０６９６】
心血管障害としては、限定されるものではないが、動脈−動脈性フィステル、動静脈フィステル、脳動静脈奇形、先天性心欠陥、肺動脈弁閉鎖症、およびシミター症候群などの心血管異常が挙げられる。 先天性心欠陥としては、限定されるものではないが、大動脈縮狭症、心縮狭症、冠状血管奇形、十字心、右胸心、動脈管開存症、エブシュタイン奇形、アイゼンメンガー複合、左心室発育不良症候群、左胸心、ファロー四徴症、大血管転移症、両大動脈右室起始症、三尖弁閉鎖症、動脈管遺残、ならびに大動脈肺動脈中隔欠損症、心内膜床欠損症、リュタンバッシュ症候群、ファロー三徴症、心室心中隔欠損症などの心中隔欠損症が挙げられる。
【０６９７】
心血管障害としてはまた、限定されるものではないが、不整脈、カルチノイド心疾患、高心拍出量、低心拍出両、心タンポナーデ、心内膜炎（細菌性を含む）、心臓動脈瘤、心停止、うっ血性心不全、うっ血性心筋症、発作性呼吸困難、心浮腫、心肥大、うっ血性心筋症、左心室肥大、右心室肥大、梗塞後心臓破裂、心室中隔断裂、心臓弁疾患、心筋性疾患、心筋虚血、心膜滲出、心膜炎（狭窄性および結核性を含む）、気心膜症、心膜切開後症候群、肺動脈性心疾患、リウマチ性心疾患、心室不全、充血、妊娠性心血管合併症、シミター症候群、心血管梅毒、および心血管結核などの心疾患が挙げられる。
【０６９８】
不整脈としては、限定されるものではないが、洞性不整脈、心房細動、心房粗動、徐脈、期外収縮、アダムズ−ストークス症候群、脚ブロック、洞房ブロック、長期ＱＴ症候群、副収縮、ローン−ギャノング−レバイン症候群、マハイム型異常早期興奮症候群、ウォルフ−パーキンソン−ホワイト症候群、洞機能不全症候群、頻脈、および心室細動が挙げられる。頻脈としては、発作性頻脈、上室性頻脈、急速心室固有調律、房室結節性再入頻脈、異所性心房頻脈、異所性接合部頻脈、洞房結節性頻脈、洞性頻脈、トルサード・ド・ポワント、および心室頻脈が挙げられる。
【０６９９】
心臓弁疾患としては、限定されるものではないが、大動脈弁不全、大動脈弁狭窄、心雑音、大動脈弁脱出症、僧帽弁脱出症、三尖弁脱出症、僧帽弁不全、僧帽弁狭窄、肺動脈弁閉鎖症、肺動脈弁不全、肺動脈弁狭窄、三尖弁閉鎖症、三尖弁不全、および三尖弁狭窄が挙げられる。
【０７００】
心筋性疾患としては、限定されるものではないが、アルコール性心筋症、うっ血性心筋症、肥大性心筋症、大動脈性弁下狭窄、肺動脈性弁下狭窄、限局性心筋症、シャガス心筋症、心内膜繊維弾性症、心内膜心筋繊維症、キーンズ症候群、心筋再潅流傷害および心筋炎が挙げられる。
【０７０１】
心筋虚血としては、限定されるものではないが、狭心症、冠状動脈瘤、冠状動脈硬化症、冠状動脈血栓症、冠状動脈血管痙攣、心筋梗塞および心筋性気絶などの冠状動脈性疾患が挙げられる。
【０７０２】
心血管疾患としてはまた、動脈瘤、脈管形成異常、血管腫症、細菌性血管腫症、ヒッペル−リンダウ病、クリベル−トルノネー−ウェーバー症候群、スタージ−ウェーバー症候群、血管神経性浮腫、大動脈病、高安動脈炎、大動脈炎、レリッシェ症候群、動脈閉塞性疾患、動脈炎、動脈内膜炎（ｅｎａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、結節性多発性動脈炎、脳血管障害、糖尿病性血管障害、糖尿病性網膜症、塞栓症、血栓症、先端紅痛症、痔、肝静脈閉塞症、高血圧症、低血圧症、虚血、末梢血管症、静脈炎、肺静脈閉塞症、レイノー病、ＣＲＥＳＴ症候群、網膜静脈閉塞症、シミター症候群、上大静脈症候群、毛細管拡張症、毛細血管拡張性運動失調症、遺伝性出血性毛細管拡張症、精索静脈瘤、拡張蛇行静脈、静脈瘤性潰瘍、 脈管炎および静脈不全などの血管性疾患が挙げられる。
【０７０３】
動脈瘤としては、限定されるものではないが、解離性動脈瘤、偽動脈瘤、 感染性動脈瘤、破裂性動脈瘤、大動脈瘤、脳動脈瘤、冠状動脈瘤、心動脈瘤および回腸動脈瘤が挙げられる。
【０７０４】
動脈閉塞性疾患としては、限定されるものではないが、動脈硬化症、間欠性跛行、頸動脈狭窄、繊維筋性形成異常、腸間膜血管閉塞症、モヤモヤ病、腎動脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、および閉塞性血栓血管炎が挙げられる。
【０７０５】
脳血管障害としては、限定されるものではないが、頸動脈疾患、脳アミロイド血管症、脳動脈瘤、脳無酸素症、脳動脈硬化症、脳動静脈奇形、脳動脈疾患、脳塞栓血栓症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンバーグ症候群、脳溢血、硬膜上血腫、硬膜下血腫、クモ膜下出血、脳梗塞、脳虚血（一過性を含む）、鎖骨下動脈盗血症候群、周室白血球軟化症、血管性頭痛、群発性頭痛、偏頭痛、および基底椎骨不全が挙げられる。
【０７０６】
塞栓症としては、限定されるものではないが、空気塞栓症、羊水塞栓症、コレステロール塞栓症、ブルートウ症候群、脂肪塞栓症、肺動脈塞栓症、および血栓塞栓症が挙げられる。血栓症としては、限定されるものではないが、冠状動脈血栓症、肝静脈血栓症、網膜静脈閉塞症、頸動脈血栓症、洞血栓症、ヴァレンバーグ症候群、および血栓性静脈炎が挙げられる。
【０７０７】
虚血性障害としては、限定されるものではないが、脳虚血、虚血性大腸炎、仕切り症候群、前仕切り症候群、心筋虚血、再潅流傷害、および末梢四肢虚血が挙げられる。血管炎としては、限定されるものではないが、大動脈炎、動脈炎、ベーチェット症候群、チャーグ−ストラウス症候群、皮膚粘膜リンパ節症候群、閉塞性血栓血管炎、過敏感性血管炎、シェンライン−ヘノッホ紫斑、アレルギー性皮膚血管炎、およびウェジナー肉芽腫が挙げられる。
【０７０８】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、送達部位での注射針による直接注入、静脈注射、局所投与、カテーテル注入、バイオリスティックインジェクター、粒子加速器、ジェルフォームスポンジデポー、その他の商業的に入手可能なデポー剤、浸透圧ポンプ、経口または坐剤用固形医薬製剤、手術中のデカンティングまたは局所適応、エアゾール送達などの当技術分野で公知のいずれかの方法を用いて投与され得る。かかる方法は当技術分野で公知である。ポリヌクレオチドを送達する方法については本明細書でさらに詳細に記載する。
【０７０９】
呼吸器障害
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは呼吸器系疾患および／または障害の治療、予防、診断、および／または予後判定に用いられる。
【０７１０】
呼吸器系の疾患および障害としては、限定されるものではないが、鼻前庭炎、 非アレルギー性鼻炎（例えば、急性鼻炎、慢性鼻炎、萎縮性鼻炎、 血管運動神経性鼻炎）、鼻ポリープ、および副鼻腔炎、若年性血管線維腫、鼻の癌および若年性乳頭腫、声帯ポリープ、結節（歌手結節）、接触潰瘍、声帯麻痺、喉頭炎、喉頭気腫、咽頭炎（例えば、ウイルス性および細菌性）、扁桃炎、扁桃性蜂巣炎、傍咽頭膿腫、咽頭炎、咽頭気腫、および咽頭癌（例えば、鼻咽頭癌、扁桃癌、喉頭癌）、肺癌（例えば、扁平上皮細胞癌、小細胞（燕麦細胞）癌、大細胞癌、および腺癌）、アレルギー性疾患（好酸球性肺炎、過敏感性肺炎（例えば、外因性アレルギー性肺胞炎、アレルギー性間質性肺炎、有機質塵肺、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、喘息、ウェジナー肉芽腫（肉芽腫性脈管炎）、グッドバスチャー症候群））、肺炎 （例えば、細菌性肺炎（例えば、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ） （肺炎球菌性肺炎）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ブドウ球菌性肺炎）、グラム陰性菌肺炎（例えば、クレブシェラ種（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．）およびシュードモナス種（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．）により引き起こされるもの）、肺炎マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）性肺炎、インフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）性肺炎、レジェネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）（在郷軍人病）、およびオウム病クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ （オウム病））およびウイルス性肺炎（例えば、インフルエンザ、水痘）が挙げられる。
【０７１１】
さらなる呼吸器系の疾患および障害としては、限定されるものではないが、細気管支炎、ポリオ（灰白髄炎）、クループ、呼吸シンシチアルウイルス感染症、流行性耳下腺炎、伝染性紅斑（第五病）、小児バラ疹、進行性風疹全脳炎、風疹、および亜急性硬化性全脳炎、真菌性肺炎（例えば、ヒストプラズマ症、コクシジオイデス症、ブラストミセス症、免疫系が著しく抑制された人々の真菌感染（例えば、 クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）により引き起こされるクリプトコックス症、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）により引き起こされるアスペルギルス症、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）により引き起こされるカンジダ症、およびムコール菌症））、ニューモシスティス・カリニ（Ｐｎｅｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ）（ニューモシスティス肺炎）、 非定型肺炎（例えば、マイコプラズマ種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｐｐ．）およびクラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｐ．））、日和見感染肺炎、 院内肺炎、化学性肺炎および嚥下性肺炎、胸膜性疾患（例えば、胸膜炎、滲出性胸膜炎、および気胸（例えば、単純性一過性気胸、合併型一過性気胸、緊張性気胸））、 閉塞性気道疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、気腫、慢性または急性気管支炎）、職業性肺疾患（例えば、珪肺症、黒色肺（石炭労働者塵肺症）、アスベスト肺、ベリリウム症、職業性喘息、綿肺症、および良性塵肺症）、浸潤性肺疾患（例えば、肺繊維症（例えば、繊維性肺胞炎、一般間質性肺炎）、特発性肺繊維症、剥離性間質性肺炎、リンパ性間質性肺炎、原因不明性組織球増殖症（例えば、レタラー−シウェ病、ハンド−シュラークリスチャン病、好酸球性肉芽腫）、特発性肺血鉄症、類肉腫症および肺胞タンパク質症）、急性呼吸困難症候群（例えば、成人性呼吸困難症候群とも呼ばれる）、浮腫、肺塞栓症、気管支炎（例えば、ウイルス性、細菌性）、気管支拡張症、無気肺、肺膿瘍（例えば、黄色ブドウ球菌またはレジェネラ・ニューモフィラにより引き起こされるもの）、および嚢胞性繊維症が挙げられる。
【０７１２】
抗脈管新生活性
脈管形成の内因性刺激物質と阻害剤との天然に存在する均衡状態では阻害的作用が優勢である。Ｒａｓｔｉｎｅｊａｄら， Ｃｅｌｌ ５６： ３４５−３５５ （１９８９）。血管新生が創傷治癒、器官再生、胚発生、および女性生殖プロセスなどの通常の生理的条件下で起こるという稀な場合では、脈管形成は厳格に調節されており、空間的および時間的に範囲が定められる。固形腫瘍成長を特徴とするなどの病的脈管形成条件下ではこれらの調節制御はできない。脈管形成が調節されないことから病的状態となり、数多くの腫瘍性および非腫瘍性疾患の進行が続く。数多くの重大な疾患としては、固形腫瘍成長および転移などの異常血管新生、関節炎、いくつかの種類の眼障害、ならびに乾癬が主なものである。例えば、 Ｍｏｓｅｓら， Ｂｉｏｔｅｃｈ． ９：６３０−６３４ （１９９１）； Ｆｏｌｋｍａｎら， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．， ３３３：１７５７−１７６３ （１９９５）； Ａｕｅｒｂａｃｈら， Ｊ． Ｍｉｃｒｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ２９：４０１−４１１（１９８５）； Ｆｏｌｋｍａｎ， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ＫｌｅｉｎおよびＷｅｉｎｈｏｕｓｅ編， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １７５−２０３頁 （１９８５）； Ｐａｔｚ， Ａｍ． Ｊ． Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ． ９４：７１５−７４３ （１９８２）；およびＦｏｌｋｍａｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２１：７１９−７２５ （１９８３）による総説を参照されたい。数多くの病的状況において、脈管形成プロセスがその病状の一因となっている。例えば、固形腫瘍の成長が脈管形成によるものであることを示唆する有意なデータが蓄積されている。ＦｏｌｋｍａｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：４４２−４４７ （１９８７）を参照されたい。
【０７１３】
本発明は本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの投与により血管新生に関連する疾患または障害の治療を提供する。本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチド、またはアゴニストもしくはアンタゴニストを用いて治療できる悪性症状および転移症状としては、限定されるものではないが、本明細書に記載される悪性腫瘍、固形腫瘍、および癌、ならびに当技術分野で公知のその他のものが挙げられる（かかる疾患の総説としては、Ｆｉｓｈｍａｎ ら， Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， 第２版， Ｊ．Ｂ． Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （１９８５）参照）。よって、本発明は、治療上有効な量の、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをそれを必要とする個体に投与することを含んでなる、脈管形成に関連する疾患および／または障害を治療する方法を提供する。例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌または腫瘍を治療するための種々の更なる方法において用いてよい。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療し得る癌としては、限定されるものではないが、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、胃癌、膵臓癌、喉頭癌、食道癌、精巣癌、肝臓癌、耳下腺癌、胆管癌、結腸癌、直腸癌、子宮頸癌、子宮癌、子宮内膜癌、腎臓癌、膀胱癌、甲状腺癌などの固形腫瘍；原発性腫瘍および転移性腫瘍；黒色腫；神経膠芽腫；カポジ肉腫；平滑筋腫；非小細胞肺癌；結腸直腸癌； 進行した悪性腫瘍；ならびに白血病などの血中腫瘍が挙げられる。例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚癌などの癌、頭部腫瘍および頚部腫瘍、乳房腫瘍、ならびにカポジ肉腫を治療するために局所的に送達し得る。
【０７１４】
なお他の態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、表在型膀胱癌を例えば膀胱腔内投与により治療するために利用し得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは注射またはカテーテルによって腫瘍、または腫瘍部位近くに直接送達し得る。もちろん当業者には明らかなように、治療しようとする癌により好適な投与様式は異なる。その他の送達様式については本明細書に記載される。
【０７１５】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、癌のほかに脈管形成に関連するその他の障害の治療に有用であり得る。これらの障害としては、限定されるものではないが、良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ、および 化膿性肉芽腫；アテローム硬化性プラーク；眼脈管形成疾患、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後方繊維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎および眼の表皮爪膜（異常血管成長）；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延創傷治癒；子宮内膜症；脈管形成；肉芽； 肥厚性瘢痕（ケロイド）；骨癒着不全骨折；硬皮症；トラコーマ；血管癒着；心筋脈管形成； 側副冠状動脈（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、側副脳 （ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；動静脈奇形；虚血性四肢脈管形成；オスラー−ウェバー症候群；プラーク新血管形成；毛細管拡張症；血友病関節症； 血管線維腫；線維筋性形成異常；外傷性肉芽；クローン病；ならびにアテローム性動脈硬化が挙げられる。
【０７１６】
例えば、本発明のある態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを肥厚性瘢痕またはケロイドに投与するステップを含んでなる、肥厚性瘢痕およびケロイドを治療する方法が提供される。
【０７１７】
本発明のある実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、肥厚性瘢痕またはケロイドにこれらの障害の進行を予防する目的で直接に注射し得る。この治療は肥厚性瘢痕およびケロイド（例えば、火傷）が現われることが知られている症状の予防治療においては特に価値があり、好ましくは増殖相が進行する時間を経過した後（最初の損傷後約１４日）であるが肥厚性瘢痕またはケロイドが現われる前に開始する。上記のように、本発明では、例えば角膜血管新生、血管新生緑内障、増殖性糖尿病性網膜症、水晶体後方繊維増殖症および黄斑変性などの眼の血管新生疾患を治療する方法も提供される。
【０７１８】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療できる血管新生に関連する眼障害としては、限定されるものではないが、血管新生緑内障、糖尿病性網膜症、網膜芽細胞腫、水晶体後方繊維増殖症、ブドウ膜炎、未熟児黄斑変性網膜症、角膜移植片血管新生、ならびにその他の炎症性眼疾患、眼腫瘍および脈絡膜または虹彩血管新生に関連する疾患が挙げられる。例えば、Ｗａｌｔｍａｎら， Ａｍ． Ｊ． Ｏｐｈｔｈａｌ． ８５：７０４−７１０ （１９７８）およびＧａｒｔｎｅｒら， Ｓｕｒｖ． Ｏｐｈｔｈａｌ． ２２：２９１−３１２（１９７８）による総説を参照されたい。
【０７１９】
従って、本発明のある態様では、血管形成が阻害されるよう患者に治療上有効な量の化合物（例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を角膜投与するステップを含んでなる、角膜血管新生（角膜移植片血管新生を含む）などの眼の血管新生疾患を治療する方法が提供される。簡潔には、角膜は通常血管のない組織であるが、ある病的状態では周辺の角膜周囲血管網から毛細血管が角膜に広がることがある。角膜に血管新生が起こると角膜が曇り、患者の視力低下が起こる。角膜が完全に混濁した場合には失明することがある。例えば角膜感染（例えば、トラコーマ、単純疱疹、角膜炎、リーシュマニア症および糸状虫症）、免疫プロセス（例えば、移植片拒絶反応およびスティーヴンズ−ジョンソン症候群）、アルカリ火傷、外傷、（何らかの原因による）炎症、中毒性および栄養欠乏状態を含む種々の障害、ならびにコンタクトレンズ着装による合併症によって角膜血管新生が起こり得る。
本発明の特に好ましい実施形態では、局所投与用に生理食塩水中で（眼用製剤に一般に用いられるいずれかの防腐剤および抗細菌薬を組み合わせて）調製し、点眼形態で投与し得る。液剤または懸濁剤を純粋形態で調製し、１日に数回投与し得る。また、上記のように調製した抗脈管形成組成物はまた直接角膜に投与し得る。好ましい実施形態では、抗脈管形成組成物は角膜と結合する粘膜付着高分子物質とともに調製し得る。さらなる実施形態では、抗脈管形成因子または抗脈管形成組成物を、補助的薬剤として通常のステロイド治療に用いる。局所治療は脈管形成応答が高確率で誘導されることが知られている角膜損傷（化学火傷など）の予防にも有用であり得る。これらの場合、望ましくはステロイドと組み合わせた治療を直ちに始め、その後に起こる合併症の予防を手助けし得る。
【０７２０】
その他の実施形態では、眼科医が上記の化合物を顕微鏡使用下で角膜基質に直接注入し得る。好ましい注入部位は個々の損傷の形態によって異なるが、投与の目的は脈管構造の発達の最前線に組成物を注入する（すなわち、血管および正常な角膜間に散在させる）ことである。このことは、多くの場合、発達しつつある血管から角膜を保護するべく辺縁周囲角膜へ注入することを含む。この方法は、角膜血管新生を予防的に阻害するために角膜損傷後直ちに用いる。この状況においては、この物質を角膜損傷部とその望ましくない可能性を有する辺縁血液供給源との間に散在する辺縁周囲角膜に注入できる。かかる方法はまた、移植角膜の毛細血管侵入を防ぐために同様に使用してもよい。徐放性形態では、年に２〜３回の注入しか必要でない。注入自体が原因で起こる炎症を抑えるために注入液にステロイドを添加し得る。
【０７２１】
本発明のもう１つの態様では、血管形成が阻害されるよう患者に本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの治療上有効な量を経眼投与するステップを含んでなる、血管新生緑内障を治療する方法が提供される。ある実施形態では、化合物を早期血管新生緑内障を治療するために眼に局所投与し得る。その他の実施形態では、化合物を前房角の領域への注入により埋め込んでもよい。その他の実施形態では、化合物を、該化合物が房水に持続的に放出されるように、いずれかの部位に注入する。本発明のもう１つの態様では、血管形成が阻害されるよう患者に本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの治療上有効な量を経眼投与するステップを含んでなる、増殖性糖尿病性網膜症を治療する方法が提供される。
【０７２２】
本発明の特に好ましい実施形態では、増殖性糖尿病性網膜症を、網膜におけるポリヌクレオチド、ポリペプチド、アンタゴニストおよび／またはアゴニストの局所濃度を高めるために房水またはガラス体への注入により治療し得る。好ましくは、光凝固が必要な重篤な疾患となる前にこの治療を開始するべきである。
【０７２３】
本発明のもう１つの態様では、血管形成が阻害されるよう患者に本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの治療上有効な量を経眼投与するステップを含んでなる、水晶体後方繊維増殖症を治療する方法が提供される。化合物をガラス体内への注入および／または眼内への移植によって局所的に送達し得る。
【０７２４】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療できる障害としては、限定されるものではないが、血管腫、関節炎、乾癬、血管線維腫、アテローム硬化性プラーク、遅延創傷治癒、肉芽、血友病関節症、肥厚性瘢痕、骨癒着不全骨折、オスラー−ウェバー症候群、 化膿性肉芽腫、硬皮症、トラコーマ、および血管癒着が挙げられる。
【０７２５】
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療、予防、診断および／または予測できる障害および／または状態としては、限定されるものではないが、固形腫瘍、白血病など血中腫瘍、腫瘍転移、カポジ肉腫、良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫、慢性関節リウマチ、乾癬、眼脈管形成疾患、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶反応、血管新生緑内障、水晶体後方繊維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、およびブドウ膜炎、遅延創傷治癒、子宮内膜症、脈管形成、肉芽、肥厚性瘢痕（ケロイド）、骨癒着不全骨折、硬皮症、トラコーマ、血管癒着、心筋脈管形成、側副冠状動脈（ｃｏｒｏｎａｒｙ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、側副脳 （ｃｅｒｅｂｒａｌ ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）、動静脈奇形、虚血性四肢脈管形成、オスラー−ウェバー症候群、プラーク新血管形成、毛細管拡張、血友病関節症、血管線維腫、線維筋性形成異常、外傷性肉芽、クローン病、アテローム性動脈硬化、胎芽着床に必要な脈管新生の阻害により月経を制御する避妊薬、猫ひっかき病（ロシェル・ミナリア キントーサ（Ｒｏｃｈｅｌｅ ｍｉｎａｌｉａ ｑｕｉｎｔｏｓａ））、潰瘍（ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ））、バルトネラ症および細菌性血管腫症などの病気の結果として脈管形成を受ける疾患が挙げられる。
【０７２６】
避妊法のもう１つの態様では、性交および受精の前または後に胎芽着床を妨害するのに十分な化合物量を投与することによって、効果的な受胎調節法、あるいは「モーニングアフター（事後避妊）」法が提供される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、月経の制御に用いてもよく、または、子宮内膜症の治療においては腹膜洗浄液または腹膜植込みのいずれかとして投与してもよい。
【０７２７】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは縫合部肉芽腫を予防するために外科用縫糸に組み込んでもよい。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは多様な外科的処置に用いてよい。例えば、本発明のある態様では、組成物（例えば、スプレーまたはフィルム形態）は、正常な周囲組織を悪性組織から分離するために、および／または周囲組織への疾患の転移を防ぐために、腫瘍除去前にある領域を被覆または噴霧するのに用いられる。本発明のその他の態様では、組成物（例えば、スプレー形態）は腫瘍を被覆する、または所望の場所での脈管形成を阻害するために内視鏡による処置を介して送達され得る。本発明のさらに他の態様では、本発明の抗脈管形成組成物で被覆した外科用メッシュを外科用メッシュを使用するあらゆる処置において用いてよい。例えば、本発明のある実施形態では、抗脈管形成組成物を含めた外科用メッシュを、（例えば、結腸切除後の）腹部癌切除術中にその構造を支持し、かつ大量の抗脈管形成因子を放出するために用いてよい。
【０７２８】
本発明のさらなる態様では、癌の局所的再発およびその部位での新血管の形成が阻害されるように本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを摘出後の腫瘍を切除した周辺部分に投与することを含んでなる、腫瘍摘出部位を処置する方法が提供される。本発明のある実施形態では、抗脈管形成化合物を腫瘍摘出部位に直接投与する（例えば、抗脈管形成化合物をスワビング、はけ塗り、または被覆により腫瘍を切除した周辺部分に塗布する）。別法として、抗脈管形成化合物を投与前に公知の外科用ペーストと混合してもよい。本発明の特に好ましい実施形態では、抗脈管形成化合物を肝臓の悪性腫瘍切除後および神経外科手術後に適用する。
【０７２９】
本発明のある態様では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば乳房、結腸、脳および肝臓の腫瘍などの多様な腫瘍を切除した周辺部分に投与し得る。例えば、本発明のある実施形態では、その部位での新血管の形成が阻害されるように抗脈管形成化合物を摘出後の神経腫瘍部位に投与し得る。
【０７３０】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはその他の抗脈管形成因子とともに投与し得る。他の抗脈管形成因子の代表例としては、抗侵襲性因子、レチノイン酸およびその誘導体、パクリタキセル、スラミン、メタロプロテイナーゼ−１の組織阻害剤、メタロプロテイナーゼ−２の組織阻害剤、プラスミノゲンアクチベーター阻害剤−１、プラスミノゲンアクチベーター阻害剤−２、ならびに種々の形態の低密度「ｄ族」遷移金属が挙げられる。
【０７３１】
低密度「ｄ族」遷移金属としては、例えば、バナジウム、モリブデン、タングステン、チタン、ニオブ、およびタンタル種が挙げられる。かかる遷移金属種は遷移金属錯体を形成し得る。上記の遷移金属種の好適な錯体としては、オキソ遷移金属錯体が挙げられる。
【０７３２】
バナジウム錯体の代表例としては、バナジン酸錯体およびバナジル錯体などのオキソバナジウム錯体が挙げられる。好適なバナジン酸錯体としては、例えばメタバナジン酸アンモニウム、メタバナジン酸ナトリウム、およびオルトバナジン酸ナトリウムなどのメタバナジン酸錯体およびオルトバナジン酸錯体が挙げられる。好適なバナジル錯体としては、例えばバナジルアセチルアセトネートならびに硫酸バナジル一および三水和物などの硫酸バナジル水和物を含む硫酸バナジルが挙げられる。
【０７３３】
タングステンおよびモリブデン錯体の代表例としても、オキソ錯体が挙げられる。好適なオキソタングステン錯体としては、タングステン酸錯体および酸化タングステン錯体が挙げられる。好適なタングステン酸錯体としては、タングステン酸アンモニウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸ナトリウム二水和物およびタングステン酸が挙げられる。好適な酸化タングステンとしては、酸化タングステン（ＩＶ）および酸化タングステン（ＶＩ）が挙げられる。好適なオキソモリブデン錯体としては、モリブデン酸、酸化モリブデン、およびモリブデニル錯体が挙げられる。好適なモリブデン酸錯体としては、モリブデン酸アンモニウムおよびその水和物、モリブデン酸ナトリウムおよびその水和物、ならびにモリブデン酸カリウムおよびその水和物が挙げられる。好適な酸化モリブデンとしては、酸化モリブデン（ＶＩ）、酸化モリブデン（ＶＩ）、およびモリブデン酸が挙げられる。好適なモリブデニル錯体としては、例えばモリブデニルアセチルアセトネートが挙げられる。その他の好適なタングステンおよびモリブデン錯体としては、例えばグリセロール、酒石酸、および糖類から誘導されたヒドロキソ誘導体が挙げられる。
【０７３４】
多様な他の抗脈管形成因子もまた本発明の脈絡の中で用いてよい。代表例としては、血小板因子 ４；硫酸プロタミン；硫酸化キチン誘導体（ズワイガニ殻より製造）、（Ｍｕｒａｔａら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１：２２−２６， １９９１）；硫酸化多糖ペプチドグリカン複合体（ＳＰ−ＰＧ）（エストロゲンおよびクエン酸タモキシフェンなどのステロイド類の存在によって化合物の機能が高められていてもよい）；スタウロスポリン；例えばプロリン類似体、シスヒドロキシプロリン、ｄ，Ｌ−３，４−デヒドロプロリン、チアプロリン、α，α−ジピリジル、フマル酸アミノプロピオニトリルなどの基質代謝のモジュレーター；４−プロピル−５−（４−ピリジニル）−２（３Ｈ）−オキサゾロン；メトトレキサート；ミトキサントロン；ヘパリン；インターフェロン；２ マクログロブリン−血清；ＣｈＩＭＰ−３（Ｐａｖｌｏｆｆら， Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１７３２１−１７３２６， （１９９２））； キモスタチン（Ｔｏｍｋｉｎｓｏｎら， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２８６：４７５−４８０， （１９９２））； シクロデキストリンテトラデカスルフェート；エポンマイシン；カンプトテシン；フマギリン（Ｉｎｇｂｅｒら， Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５５−５５７， １９９０）；チオマレイン酸金ナトリウム（「ＧＳＴ」； ＭａｔｓｕｂａｒａおよびＺｉｆｆ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７９：１４４０−１４４６， （１９８７））；抗コラゲナーゼ血清；α２−抗プラスミン（Ｈｏｌｍｅｓら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２（４）：１６５９−１６６４， （１９８７））；ビスアントレン（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；ロベンサリット二ナトリウム（Ｎ−（２）−カルボキシフェニル−４−クロロアントロニル酸二ナトリウムまたは「ＣＣＡ」； Ｔａｋｅｕｃｈｉら， Ａｇｅｎｔｓ Ａｃｔｉｏｎｓ ３６：３１２−３１６， （１９９２））； サリドマイド； 血管拡張性のステロイド；ＡＧＭ−１４７０；カルボキシアミノイミダゾール；およびＢＢ９４などのメタロプロテイナーゼ阻害剤が挙げられる。
【０７３５】
細胞レベルでの疾患
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療、予防、診断および／または予後判定できる細胞生存の上昇またはアポトーシスの阻害に関連する疾患としては、癌（例えば、限定されるものではないが、結腸癌、心腫瘍、膵臓癌、黒色腫、網膜芽細胞腫、神経膠芽腫、肺癌、腸癌、精巣癌、胃癌、神経芽腫、粘液腫、筋腫、リンパ腫、内皮腫、骨芽腫、骨巨細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、腺癌、乳癌、前立腺癌、カポジ肉腫、および卵巣癌を含む濾胞性リンパ腫、ｐ５３変異を伴う癌腫、およびホルモン依存性腫瘍）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性紅斑性狼瘡、ならびに免疫関連の糸球体腎炎および慢性関節リウマチ）、およびウイルス感染症（例えばヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルス）、炎症、対宿主性移植片病、急性移植片拒絶、および慢性移植片拒絶が挙げられる。
【０７３６】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは癌、特に上記のものの増殖、進行および／または転移を阻害するのに用いられる。
【０７３７】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって治療または検出し得る、細胞の生存の上昇に関連する他の疾患および症状としては、限定されるものではないが、白血病（急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病 （骨髄芽性、前骨髄性、骨髄単球性、単球性および赤白血病を含む））および慢性白血病（例えば、慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ球性 白血病））、真正赤血球増加症、リンパ腫（例えば、ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、バルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、並びに限定されるものではないが、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ血管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸肉腫、膵臓癌、乳癌、子宮癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原生癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、繊毛上皮癌、精上皮腫、胎生期癌、ウイルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状膠細胞腫、骨髄細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、 松果体腫、血管芽細胞種、聴神経腫、乏突起神経膠腫、血管腫、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫などの肉腫および癌腫をはじめとする固形腫瘍といった悪性腫瘍および関連疾患の進行および／または転移が挙げられる。
【０７３８】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって治療、予防、診断および／または予後判定できるアポトーシスの上昇に関連する疾患としては、エイズ；神経変性疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、色素性網膜炎、大脳変性および脳腫瘍または先の関連疾患など）；自己免疫疾患（多発性硬化症、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、胆汁性肝硬変、ベーチェット病、クローン病、多発性筋炎、全身性紅斑性狼瘡、ならびに免疫関連の糸球体腎炎および慢性関節リウマチなど）、骨髄形成不全症候群（再生不良性貧血など）、対宿主性移植片病、虚血性傷害（心筋梗塞、卒中および再潅流傷害によって引き起こされるものなど）、肝傷害（例えば、肝炎関連肝傷害、虚血性／再潅流傷害、胆汁鬱滞（胆管傷害）および肝臓癌）；毒素誘発性肝疾患（アルコールにより引き起こされるものなど）、敗血症性ショック、悪液質および拒食症が挙げられる。
【０７３９】
創傷治癒および上皮細胞増殖
本発明のなおさらなる態様によれば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、治療目的で、例えば創傷治癒目的で上皮細胞増殖および基底ケラチン生成細胞を刺激するために使用する方法、および毛包発生および皮膚創傷の治癒を刺激するために使用する方法が提供される。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、外科的創傷、摘出による創傷、真皮および表皮の損傷を含む深い創傷、眼組織創傷、歯組織創傷、口腔創傷、糖尿病性潰瘍、皮膚潰瘍、肘潰瘍、動脈潰瘍、静脈鬱血潰瘍、熱への曝露または化学薬品による火傷、ならびに、尿毒症、 栄養不良、ビタミン欠乏、ならびにステロイド類、放射線療法、ならびに抗腫瘍薬および代謝拮抗物質を用いた全身性治療に関連する合併症などのその他の異常な創傷治癒症状を含む創傷治癒を刺激するのに臨床的に有用であり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質は、コードするポリヌクレオチドは皮膚喪失後の皮膚再生を早めるのに用いることができる。
【０７４０】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮膚移植片の創傷床への接着性を高め、さらに創傷床の再上皮化を刺激するのに用いる。以下のものは、創傷床への接着性を高めるのに本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが使用できる移植片の種類である：自家移植片、人工皮膚、同種移植片、自己移植片、無血管性移植片、ブレア−ブラウン移植片、 骨移植片、胚胎組織移植片、皮膚移植片、遅延移植片、真皮移植片、表皮移植片、筋膜移植片、全層移植片、異種構造移植片、異種移植片、同種移植片、増殖性移植片、表層移植片、網状移植片、粘膜移植片、オリア−ティールシュ移植片、大網移植片、パッチ移植片、茎状移植片、穿通性移植片、スプリット（ｓｐｌｉｔ）皮膚移植片、シックスプリット（ｔｈｉｃｋ ｓｐｌｉｔ）移植片。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは皮膚の強度を強め、老化した皮膚の外観を改善するのに使用できる。
【０７４１】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、肝細胞増殖、ならびに肺、乳房、膵臓、胃、小腸、および大腸の上皮細胞増殖に変化をもたらすであろうと考えられている。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、皮脂細胞、毛包、肝細胞、ＩＩ型肺胞上皮細胞、ムチン生成杯状細胞、およびその他の上皮細胞などの上皮細胞、ならびに皮膚、肺、肝臓、および胃腸管内にあるそれらの前駆体の増殖を増進することができる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは上皮細胞、ケラチン生成細胞、および基底ケラチン生成細胞の増殖を増進し得る。
【０７４２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは放射線、化学療法による治療、またはウイルス感染によって起こる腸毒性の副作用の低下にも使用できる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは小腸粘膜に対して細胞保護効果があり得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは化学療法およびウイルス感染によって起こる粘膜炎（口腔潰瘍）の治癒も刺激し得る。
【０７４３】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは火傷をはじめとする全体的および部分的層皮膚欠損における皮膚の完全再生（すなわち、毛包、汗腺、および皮脂腺の再生）、乾癬などのその他の皮膚欠損の治療にさらに使用できる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、表皮水疱症（幾つもの、開いた、痛みを伴う水疱を引き起こすことになる、表皮の下層にある真皮への接着不足）をこれらの損傷の再上皮化を加速することにより治療するのに使用できる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはより迅速な粘膜内層の瘢痕形成および腺粘膜および十二指腸粘膜内層の再生により胃潰瘍および十二指腸潰瘍を治療し、さらに治癒を助けるのにも使用できる。クローン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患は小腸または大腸各々の粘膜表面の破壊をもたらす疾患である。よって、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、粘膜表面の再生を促してより迅速な治癒に向かわせ、さらに炎症性腸疾患の進行を妨げるのに使用できる。本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いた治療は胃腸管内の粘液の生成に重大な効果を与えるものと考えられ、摂取された毒性物質からの、または手術後の腸粘膜の保護に使用できる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは発現不足に関連する疾患の治療に使用できる。
【０７４４】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは種々の病的状態による肺損傷の予防および治癒に使用できる。増殖および分化を刺激できる本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは肺胞および気管支上皮の修復を助けて急性または慢性肺損傷を予防または治療する。例えば、肺胞の進行性損傷を起こす肺気腫、ならびに気管支上皮および肺胞の壊死を起こす、すなわち煙吸入および火傷による吸入損傷は本発明のポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストを用いて効果的に治療できる。また、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはＩＩ型肺胞上皮細胞の増殖および分化を刺激するのに使用でき、これは幼児呼吸障害症候群および気管支肺形成異常などのヒアリン膜症などの早産児の疾患の治療または予防を助け得る。
【０７４５】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは肝細胞の増殖および分化を刺激できるため、硬変、ウイルス性肝炎が原因となる肝臓損傷および毒性物質（すなわち、アセトアミノフェン、四塩化炭素および当技術分野で公知のその他の肝細胞毒素）によって起こる電撃性肝機能不全などの肝疾患および病状の緩和または治療に使用できる。
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは真性糖尿病の徴候の治療または予防に使用できる。新たにＩおよびＩＩ型糖尿病と診断された膵島細胞の機能がいくぶんか残っている患者では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは疾患の一定の症状を緩和、遅延または予防するために膵島機能を維持するのに使用できる。また、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは膵島細胞の機能を改善または助けるために膵島細胞移植での補助的薬剤として使用できる。
【０７４６】
神経活性および神経疾患
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは脳および／または神経系の疾患、障害、損傷、または創傷の診断および／または治療に用いられる。本発明の組成物 （例えば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）を用いて治療できる神経系障害としては、限定されるものではないが、軸索の断絶、ニューロンの減少もしくは変性、または脱髄のいずれかを生ずる神経系創傷および疾患または障害が挙げられる。本発明の方法により患者（ヒトおよび非ヒト哺乳動物患者を含む）において治療し得る神経系損傷としては、限定されるものではないが、中枢神経系（脊髄、脳を含む）または末梢神経系のいずれかの以下の損傷：（１）神経系の一部における酸素欠乏により脳梗塞もしくは脳虚血、または脊髄梗塞もしくは脊髄虚血などのニューロンの損傷または死を引き起こす虚血性損傷；（２）物理的創傷によって起こるまたは手術に伴う損傷などの外傷性損傷、例えば神経系の一部を断絶する損傷、または圧迫損傷；（３）神経系の一部が神経系関連悪性腫瘍または非神経系組織に由来する悪性腫瘍のいずれかである悪性組織によって破壊されるまたは損傷を受ける悪性損傷；（４）神経系の一部が感染の結果として、例えば膿瘍により、またはヒト免疫不全ウイルス、帯状疱疹ウイルス、もしくは単純疱疹ウイルスによる感染症またはライム病、結核、もしくは梅毒と関連して破壊されるまたは損傷を受ける感染損傷；（５）神経系の一部が、限定されるものではないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病、または筋萎縮性側索硬化症 （ＡＬＳ）に関連する変性などの変性プロセスの結果として、破壊されるまたは損傷を受ける変性損傷；（６）神経系の一部が、限定されるものではないが、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ヴェルニッケ疾患、タバコ−アルコール弱視、マルキアファーバ−ビニャーミ病（脳梁の原発性変性）、およびアルコール性小脳変性などの栄養性障害または代謝性障害により破壊されるまたは損傷を受ける、栄養性疾患または障害に関連する損傷；（７）限定されるものではないが、糖尿病（糖尿病性神経障害、ベル麻痺）、全身性エリテマトーデス、癌腫、または類肉腫症などの全身性疾患に関連する神経損傷；（８）アルコール、鉛、または特定の神経毒などの毒性物質よって起こる損傷、ならびに（９）神経系の一部が、限定されるものではないが、多発性硬化症、ヒト免疫不全ウイルス関連脊髄障害、横断性脊髄障害、または種々の病因などの脱髄疾患、進行性多病巣性白質脳障害、ならびに橋中央ミエリン溶解により破壊されるまたは損傷を受ける脱髄損傷、が挙げられる。
【０７４７】
ある実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは低酸素症による有害な効果から神経細胞を保護するのに用いられる。さらに好ましい実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは脳低酸素症による有害な効果から神経細胞を保護するのに用いられる。この実施形態によれば、本発明の化合物は脳低酸素症に関連する神経細胞損傷の治療または予防に用いられる。この実施形態のある非限定的な態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは脳虚血に関連する神経細胞損傷の治療または予防に用いられる。この実施形態のもう１つの非限定的な態様では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは脳梗塞に関連する神経細胞損傷の治療または予防に用いられる。
【０７４８】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは発作に関連する神経細胞損傷の治療または予防に用いられる。特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは発作に関連する脳神経細胞損傷の治療または予防に用いられる。
【０７４９】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは心臓発作に関連する神経細胞損傷の治療または予防に用いられる。特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは心臓発作に関連する脳神経細胞損傷の治療または予防に用いられる。
【０７５０】
神経系障害の治療または予防に有用な本発明の組成物はニューロンの生存または分化を促進する生物活性を調べることにより選択し得る。例えば、限定されるものではないが、本発明によれば、以下のいずれかの効果を示す本発明の組成物が有用であり得る：（１）低酸素症または低酸素症状の存在または不在のいずれかにおける培養中のニューロンの生存時間の延長；（２）培養におけるまたはｉｎ ｖｉｖｏにおけるニューロンの成長の増大；（３）培養におけるまたはｉｎ ｖｉｖｏにおけるニューロン関連分子、例えば運動ニューロンに関係するコリンアセチルトランスフェラーゼまたはアセチルコリンエステラーゼの産生の増大；または（４）ｉｎ ｖｉｖｏにおけるニューロン機能障害症状の緩和。かかる効果は当技術分野で公知のいずれかの方法により測定し得る。好ましい非限定的な実施形態では、ニューロンの生存の延長は本明細書に記載の、または、例えば、Ｚｈａｎｇら， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：３６３７−４２ （２０００）またはＡｒａｋａｗａら， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， １０：３５０７−１５ （１９９０）などの当技術分野で公知の方法を用いて定型的に測定し得る。ニューロンの成長の増大は、例えばＰｅｓｔｒｏｎｋら， Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ．， ７０：６５−８２ （１９８０）、またはＢｒｏｗｎら， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．， ４：１７−４２ （１９８１）に記載の方法などの当技術分野で公知の方法により検出し得る。ニューロン関連分子の産生の増大は当技術分野で公知の技術を用いて、測定しようとする分子に応じて、バイオアッセイ、酵素アッセイ、抗体結合ノーザンブロットアッセイなどにより測定し得る。さらに、運動ニューロン機能障害は運動ニューロン障害の身体上の徴候、例えば脱力、運動ニューロン伝導速度、または機能障害．を評価することによりにより測定し得る。
【０７５１】
特定の実施形態では、本発明により治療し得る運動ニューロン障害としては、限定されるものではないが、運動ニューロン、ならびに神経系のその他の構成部分に影響を及ぼし得る梗塞、感染症、毒素への暴露、外傷、外科的損傷、変性疾患または悪性腫瘍などの障害、ならびにニューロンに選択的に影響を及ぼし得る　筋萎縮性側索硬化症などの障害が挙げられ、さらに、限定されるものではないが、進行性脊髄筋萎縮症、進行性延髄麻痺、原発性側索硬化症、小児筋萎縮症および若年性筋萎縮症、小児性進行性延髄麻痺（ファチオ−ロンド症候群）、灰白髄炎およびポリオ後症候群を含む障害、ならびに遺伝性運動感覚神経障害（シャルコー−マリー・トゥース病）が挙げられる。
【０７５２】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはニューロン生存；シナプス形成；伝導性；神経分化等において役割を果たし得る。よって、本発明の組成物（本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む）はこれらの役割に関連した、限定されるものではないが、学習障害および／または認識障害を含む疾患または障害の診断および／または治療もしくは予防に用いられる。本発明の組成物は神経変性疾患状態および／または行動障害の治療または予防にも有用であり得る。かかる神経変性疾患状態および／または行動障害としては、限定されるものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、 ハンティングトン舞踏病、トゥーレット症候群、精神分裂病、躁病、痴呆、偏執症、強迫神経障害、恐慌性障害、学習不能症、ＡＬＳ、精神病、自閉症、ならびに摂食、睡眠パターン、平衡および知覚における障害などの異常行動が挙げられる。さらに、本発明の組成物は発生胚、または性関連障害と関係のある発達障害の治療、予防および／または検出における役割もまた果たし得る。
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、頸動脈疾患（例えば、頸動脈血栓症、頸動脈狭窄、またはもやもや病）、脳アミロイド血管症、脳動脈瘤、脳無酸素症、脳動脈硬化症、脳動静脈奇形、脳動脈疾患、脳塞栓血栓症（例えば、頸動脈血栓症、洞血栓症、またはヴァレンバーグ症候群）、脳溢血（例えば、硬膜上血腫または硬膜下血腫、またはクモ膜下出血）、脳梗塞、脳虚血（例えば、一過性脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群、または基底椎骨不全）、血管性痴呆（例えば、多発梗塞性痴呆症）、脳室周囲白血球軟化症、および血管性頭痛（例えば、群発性頭痛または片頭痛）などの脳血管障害に関連した疾患、損傷、障害、または創傷から神経細胞を保護するのに有用であり得る。
【０７５３】
本発明のなおさらなる態様によれば、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、治療目的で、例えば神経細胞増殖および／または分化を刺激するために使用する方法が提供される。よって、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは神経疾患の治療および／または検出に用いられる。さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは特定の神経系疾患または障害のマーカーまたはデテクターとして使用できる。
【０７５４】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できる神経疾患の例としては、フェニルケトン尿症（母性フェニルケトン尿症など）、ピルビン酸カルボキシラーゼ欠損症、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体欠損症（ウェルニッケ脳障害、脳浮腫）を含む代謝性脳疾患、脳腫瘍テント下腫瘍を含む小脳腫瘍、脳室腫瘍（脈絡膜叢腫瘍など）、視床下部腫瘍、テント上腫瘍など）、カナバン病、小脳疾患（脊髄小脳変性症（毛細血管拡張性運動失調症など）を含む小脳性運動失調症、小脳性共同運動失調、フリートライヒ運動失調、マシャド−ジョセフ病、オリーブ橋小脳萎縮症、小脳腫瘍（テント下腫瘍など）、汎発性脳硬化症（軸索周囲性脳炎など）など）、球様細胞性白質萎縮症、異染性白質萎縮症ならびに亜急性硬化性汎脳炎などの脳疾患が挙げられる。
【０７５５】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できるさらなる神経疾患としては、脳血管障害（頸動脈血栓症、頸動脈狭窄およびもやもや病を含む頸動脈疾患など）、脳アミロイド血管症、脳動脈瘤、脳無酸素症、脳動脈硬化症、脳動静脈奇形、脳動脈疾患、脳塞栓および脳血栓症（頸動脈血栓症、洞血栓症、およびヴァレンバーグ症候群など）、脳出血（硬膜上血腫、硬膜下血腫およびクモ膜下出血など）、脳梗塞、脳虚血（一過性脳虚血、鎖骨下動脈盗血症候群および基底椎骨不全など）、血管性痴呆（多発脳梗塞性痴呆症など）、脳室周囲白血球軟化症、血管性頭痛（群発性頭痛および片頭痛など）などが挙げられる。
【０７５６】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できるさらなる神経疾患としては、ＡＩＤＳ性痴呆症症候群、初老期痴呆（アルツハイマー病およびクロイツフェルト−ヤーコプ症候群など）、老人性痴呆（アルツハイマー病および進行性核上性麻痺など）、血管性痴呆（多発脳梗塞性痴呆症など）などの痴呆、軸索周囲性脳炎、ウイルス性脳炎（流行性脳炎、日本脳炎、セントルイス脳炎、ダニ（媒介）脳炎、および西ナイル熱など）、急性播種性脳脊髄炎、髄膜脳炎（ブドウ膜脳炎症候群、脳炎後パーキンソン病および亜急性硬化性汎脳炎など）、脳軟化症（脳室周囲白血球軟化症など）を含む脳炎、癲癇（小児痙攣を含む全般癲癇、欠損癲癇、ＭＥＲＲＦ症候群含む筋間代癲癇、緊張性間代癲癇、部分癲癇（複雑部分癲癇など）、前頭葉癲癇および側頭葉癲癇、外傷後癲癇、痙攣重積状態（持続性部分癲癇、およびハラーフォルデン−シュパッツ症候群など）が挙げられる。
【０７５７】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できるさらなる神経疾患としては、水頭症（ダンディ−ウォーカー症候群および正常圧水頭症など）、視床下部疾患（視床下部腫瘍、脳性マラリア、脱力発作を含む睡眠発作、延髄灰白髄炎、偽脳腫瘍、レット症候群、レイ症候群、視床疾患、脳トキソプラズマ症、頭蓋内結核およびツェルウェガー症候群など）、中枢神経系感染症（ＡＩＤＳ性痴呆症症候群など）、脳膿瘍、硬膜下蓄膿、脳脊髄炎（馬脳脊髄炎、ベネズエラ馬脳脊髄炎、壊死性出血脳脊髄炎、ビスナおよび脳性マラリアなど）が挙げられる。
【０７５８】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できるさらなる神経疾患としては、髄膜炎（クモ膜炎、無菌性髄膜炎（リンパ球性脈絡髄膜炎を含むウイルス性髄膜炎など）、ヘモフィルス髄膜炎、リステリア菌髄膜炎、髄膜炎菌髄膜炎（ウォータハウス−フリーデリクセン症候群、肺炎双球菌髄膜炎および髄膜結核など）を含む細菌性髄膜炎、真菌性髄膜炎（クリプトコックス髄膜炎など）など）、硬膜下滲出、髄膜脳炎（ブドウ膜脳炎症候群など）、脊髄炎（横断性脊髄炎など）、神経梅毒（脊髄癆など）、延髄灰白髄炎および灰白髄炎後症候群を含む灰白髄炎、プリオン病（クロイツフェルトヤコブ症候群、牛スポンジ様脳症、ゲルストマン−シュトロイスラー症候群、クールー、スクレーピーなど）、ならびに脳トキソプラズマ症が挙げられる。
【０７５９】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できるさらなる神経疾患としては、中枢神経系腫瘍（小脳腫瘍（テント下腫瘍など）、脳室腫瘍（脈絡膜叢腫瘍など）、視床下部腫瘍およびテント上腫瘍を含む脳腫瘍など）、髄膜腫瘍、硬膜外腫瘍を含む脊髄腫瘍、脱髄疾患（カナバン病など）、副腎白質ジストロフィーを含む汎発性脳硬化症、軸索周囲性脳炎、球様細胞性白質萎縮症、汎発性脳硬化症（異染性白質萎縮症など）、アレルギー性脳脊髄炎、壊死性出血性脳脊髄炎、進行性多病巣性白質脳障害、多発性硬化症、橋中心性髄鞘崩壊、横断性脊髄炎、視神経脊髄炎、スクラピー、脊柱前湾症、慢性疲労症候群、ビスナ、高圧神経症候群、髄膜症、脊髄疾患（先天性筋無緊張症など）、筋萎縮性側索硬化症、脊髄筋萎縮症（ウェルドニッヒ−ホフマン病など）、脊髄圧迫症、脊髄腫瘍（硬膜外腫瘍など）、脊髄空洞症、脊髄癆、スティッフマン症候群、精神薄弱（アンジェルマン症候群など）、猫鳴き症候群、ド・ランゲ症候群、ダウン症候群、ガングリオシド症（ガングリオシド症 Ｇ（ＭＩ）など）、サンドホフ病、テイ−サックス病、ハルトナップ病、ホモシスチン尿症、ローレンス・ムーン・ビードル症候群、レッシュ−ナイハン症候群、かえで糖尿症、ムコ脂質症（フコシドーシス）など）、ニューロンセロイド脂褐素症、眼脳腎症候群、フェニルケトン尿症（母性フェニルケトン尿症など）、プラダー−ウィリー症候群、レット症候群、ルビンスタイン・テイビー症候群、結節硬化症、ＷＡＧＲ症候群、神経系異常（全前脳症など）、神経管欠損症（水無脳症）含む無脳症など）、アルノルト−キアーリ奇形、脳ヘルニア、髄膜瘤、髄膜脊髄瘤、脊椎閉鎖不全（嚢胞性二分脊椎および潜在性二分脊椎など）が挙げられる。
【０７６０】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できるさらなる神経疾患としては、シャルコー−マリー病、遺伝性視神経萎縮症、レフスム病、遺伝性痙性対麻痺、ウェルドニッヒ−ホフマン病、遺伝性の感覚神経障害および自律神経障害（先天性痛覚脱失および家族性自律神経障害など）を含む遺伝性の運動神経障害および感覚神経障害、神経学的症状発現（ゲルストマン症候群含む失認症など）、健忘症（逆行性健忘症など）、失行症、神経因性膀胱障害、脱力発作、コミュニケーション障害（難聴、部分的聴力喪失、ラウドネス・レクルートメントおよび耳鳴りを含む聴力障害、言語障害（失書症、名称失語症、ブローカ失語症、およびヴェルニッケ失語症を含む失語症、失読症（後天性失読症など）、言語発達障害、言語障害（名称失語症、ブローカ失語症およびヴェルニッケ失語症を含む失語症など）、構音障害など）、コミュニケーション障害（構語障害、反響言語、無言症およびどもりを含む言語障害、発音障害 （失声症および嗄声など）など）、除脳状態、譫妄、線維束性攣縮、幻覚、髄膜症、運動障害（アンジェルマン症候群など）、運動失調症、無定位運動症、舞踏病、失調症、運動低下症、筋肉緊張低下、筋間代、チック、斜頚および震顫、筋肉緊張亢進（筋肉硬直 （スティッフマン症候群など）など）、筋肉痙攣、麻痺（耳部帯状疱疹含む顔面麻痺など）、胃不全麻痺、片麻痺、眼筋麻痺（複視など）、デュアン症候群、ホルネル症候群、慢性進行性外眼筋麻痺（キーンズ症候群など）、延髄麻痺、熱帯性強直性対麻痺、対麻痺（ブラウンセカール症候群など）、四肢麻痺、呼吸麻痺および声帯麻痺、不全麻痺、幻想肢、味覚障害（無味覚症および味覚不全など）、視覚障害（弱視、失明、色盲、複視、片側視野欠損、暗点および正常以下の視力など）、睡眠障害（クライン−レヴィン症候群、不眠症、および夢遊症を含む睡眠過剰など）、痙攣（開口障害など）、意識消失（昏睡、永続性植物状態ならびに失神およびめまいなど）、神経筋疾患（先天性筋無緊張症など）、筋萎縮性側索硬化症、ランバート−イートン筋無力症候群、運動ニューロン疾患、筋萎縮症（棘筋萎縮症、シャルコー−マリー病およびウェルドニッヒ−ホフマン病など）、灰白髄炎後症候群、筋ジストロフィー、重症性筋無力症、萎縮性筋緊張症、先天性筋緊張症、ネマリン筋障害、家族性周期性麻痺、多発性パラミオクロヌス、熱帯性痙攣性不全対麻痺およびスティッフマン症候群、末梢神経系疾患（先端疼痛症など）、アミロイド神経障害、自律神経系疾患（エーディ症候群、バレー・リーウー（Ｂａｒｒｅ−Ｌｉｅｏｕ）症候群、家族性自律神経障害、ホルナー症候群、反射交感神経ジストロフィーおよびシャイ−ドレーガー症候群など）、脳神経疾患（聴神経疾患（神経繊維腫症 ２を含む聴神経腫など）など）、顔面神経疾患（顔面神経痛など）、メルカーソン−ローゼンタール症候群、弱視を含む眼球運動障害、眼振盪、眼球運動神経麻痺、眼筋麻痺（デュアン症候群など）、ホルネル症候群、キーンズ症候群を含む慢性進行性外眼筋麻痺、斜視（内斜視および外斜視など）、眼球運動神経麻痺、視神経疾患（遺伝性視神経萎縮症を含む視神経萎縮症など）、視神経円板晶洞、視神経炎（視神経脊髄炎など）、乳頭水腫、三叉神経痛、声帯麻痺、脱髄疾患（視神経脊髄炎および脊柱前湾症など）、ならびに糖尿病性神経障害（糖尿病性足病変など）が挙げられる。
【０７６１】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療または検出できるさらなる神経疾患としては、神経圧迫症候群（手根管症候群、足根管症候群など）、胸郭出口症候群（頚肋症候群など）、尺骨神経圧迫症候群、神経痛（灼熱痛、頚腕神経痛、顔面神経痛および三叉神経痛など）、神経炎（実験的アレルギー性神経炎、視神経炎、多発性神経炎、多発性神経根神経炎など）および神経根炎（多発性神経根炎など）、遺伝性の運動神経障害および感覚神経障害（シャルコー−マリー病、遺伝性視神経萎縮症、レフスム病、遺伝性強直性対麻痺およびウェルドニッヒ−ホフマン病など）、先天性痛覚脱失および家族性自律神経障害を含む遺伝性の感覚神経障害および自律神経障害、ＰＯＥＭＳ症候群、座骨神経痛、味覚性発汗ならびにテタニーが挙げられる。
【０７６２】
内分泌障害
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはホルモン平衡失調に関連する障害および／もしくは疾患、ならびに／または内分泌系の障害もしくは疾患の治療、予防、診断、および／または予後判定に用いられる。
【０７６３】
内分泌腺から分泌されるホルモンが身体の成長、生殖機能、代謝機能およびその他の機能を制御している。障害は、ホルモン産生の混乱およびホルモンに応答する組織の無能力の二通りに分類し得る。これらのホルモン平衡失調または内分泌系疾患、障害もしくは症状の原因は遺伝子性、体性（癌およびいくつかの自己免疫疾患など）、後天性（例えば、化学療法、創傷、または毒素による）、または感染性であり得る。さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、内分泌系および／またはホルモン平衡失調に関連する特定の疾患または障害のマーカーまたはデテクターとして使用できる。
【０７６４】
内分泌系ならびに／またはホルモン平衡失調および／もしくは疾患は、限定されるものではないが、妊娠および出産による合併症（例えば、早期分娩、過期妊娠、自然流産、および緩慢な分娩または分娩の停止）を含む子宮運動性障害；ならびに月経周期障害および／または疾患 （例えば、月経困難症および子宮内膜症）を包含する。
【０７６５】
内分泌系ならびに／またはホルモン平衡失調障害および／もしくは疾患としては、例えば真性糖尿病、 尿崩症、先天性膵臓非形成、クロム親和性細胞腫−膵島細胞腫瘍症候群などの膵臓障害および／または疾患；例えばアジソン病、コルチコイド欠乏症、男性化疾患、多毛性早熟症、クッシング症候群、高アルドステロン症、クロム親和性細胞腫などの副腎障害および／または疾患；例えば下垂体機能亢進症、下垂体機能低下症、下垂体性小人症、下垂体腺腫、汎下垂体機能低下症、 先端巨大症、巨人症などの下垂体の障害および／または疾患；限定されるものではないが、甲状腺機能亢進症、甲状腺機能低下症、プラマー病、グレーヴズ病（中毒性汎発性甲状腺腫）、中毒性結節性甲状腺腫、甲状腺炎 （橋本甲状腺炎、亜急性肉芽腫性甲状腺炎および無症候性リンパ球性甲状腺炎）、ペンドレッド症候群、粘液水腫、クレチン病、甲状腺中毒症、甲状腺ホルモン縮合障害、胸腺形成不全症、甲状腺のヒュルトレ細胞腫瘍、甲状腺癌、甲状腺癌腫、甲状腺髄様癌などの状腺障害および／または疾患；例えば副甲状腺機能亢進症、副甲状腺機能低下症などの副甲状腺障害および／または疾患；視床下部障害および／または疾患が挙げられる。
【０７６６】
さらに、内分泌系ならびに／またはホルモン平衡失調障害および／もしくは疾患は癌をはじめとする精巣または卵巣の障害および／または疾患も含む。さらに、その他の精巣または卵巣の障害および／または疾患としては、例えば、卵巣癌、多嚢胞性卵巣症候群、クラインフェルター症候群、消失精巣症候群（両側無睾丸症）、先天性ライディヒ細胞欠損症、潜在睾丸、ヌーナン症候群、筋緊張性ジストロフィー、精巣の毛細血管腫（良性）、精巣腫瘍および新生精巣 （ｎｅｏ−ｔｅｓｔｉｓ）が挙げられる。
【０７６７】
さらに、内分泌系ならびに／またはホルモン平衡失調障害および／もしくは疾患はまた、例えば多腺性欠陥症候群、クロム親和性細胞腫、神経芽細胞腫、多発性内分泌性腫瘍形成、ならびに内分泌組織の障害および／または癌などの障害および／または疾患を包含する。
【０７６８】
もう１つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のアルブミンタンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質が発現される組織に関連する内分泌疾患および／または障害の診断、予後判定、予防および／または治療に用いられる。
【０７６９】
生殖系障害
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、生殖系疾患および／または障害の診断、治療、または予防に用いられる。本発明の化合物により治療できる生殖系障害としては、限定されるものではないが、生殖系損傷、感染症、腫瘍性障害、先天性欠損症、ならびに不妊症、妊娠、出産または分娩による合併症、および分娩後の問題を引き起こす疾患または障害が挙げられる。
【０７７０】
生殖系障害および／または疾患としては、精巣萎縮症、精巣性女性化症、潜在睾丸（片側性および両側性）、無睾丸症、異所性睾丸、副睾丸炎および睾丸炎（典型的には感染 （例えば、淋病、耳下腺炎、結核および梅毒など）の結果として起こる）、精巣捻転、結節性精管炎、生殖細胞腫瘍 （例えば、精上皮腫、胎生期細胞癌腫、奇形癌、絨毛上皮癌、卵黄嚢腫瘍、および奇形腫）、ストロマ腫瘍（例えば、ライディヒ細胞腫瘍）、水瘤、血瘤、精索静脈瘤、精液瘤、鼠蹊ヘルニア、および精子産生障害（例えば、線毛不動症候群、無精液症、精子無力症、無精子症、精子過少症および奇形性無精子症）を含む精巣疾患および／または障害が挙げられる。
【０７７１】
生殖系障害としてはまた、急性非細菌性前立腺炎、慢性非細菌性前立腺炎、急性細菌性前立腺炎、慢性細菌性前立腺炎、前立腺失調症、前立腺炎、肉芽腫性前立腺炎、マラコプラキア、良性前立腺肥大または過形成および、腺癌、移行上皮癌、腺管癌腫、および扁平上皮細胞癌腫を含む前立腺腫瘍性障害などの前立腺障害も挙げられる。
【０７７２】
さらに、本発明の化合物は亀頭包皮炎、閉塞性乾燥性亀頭炎、包茎、嵌頓包茎、梅毒、単純疱疹ウイルス、淋病、非淋菌性尿道炎、クラミジア感染症、マイコプラズマ症、トリコモナス症、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、ライター症候群、尖形コンジローム、扁平コンジローム、および光沢陰茎丘疹などの炎症性障害；尿道下裂、尿道上裂、および包茎などの尿道異常；ケーラー紅色肥厚症、ボーエン病、ボーエン病様の症状、ブシュケ・レーベンシュタインの巨大コンジローム、およびいぼ状癌を含む前悪性病変；扁平上皮細胞癌腫、上皮内癌、いぼ状癌、および散在性陰茎癌腫を含む陰茎癌；陰茎尿道癌、尿道球膜癌、および前立腺尿道癌を含む尿道腫瘍性障害；ならびに持続勃起症、ペイロニー病、勃起不全、および性不能症などの勃起障害をはじめとする陰茎および尿道障害または疾患の診断、治療、および／または予防に有用であり得る。
【０７７３】
さらに、精管の疾患および／または障害としては、脈管炎およびＣＢＡＶＤ（先天性 両側性精管欠如症）が挙げられ；さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、嚢腫疾患、先天性塩素下痢、および多嚢胞性腎疾患をはじめとする精嚢の疾患および／または障害の診断、治療、および／または予防に用いられる。
【０７７４】
その他の男性生殖系の障害および／または疾患としては、例えばクラインフェルター症候群、ヤング症候群、早漏、真性糖尿病、嚢胞性繊維症、カルタゲナー症候群、高熱、多発性硬化症、および女性化乳房が挙げられる。
【０７７５】
さらに、本発明のポリヌクレオチド、融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、細菌性膣症、カンジダ膣炎、単純疱疹ウイルス、軟性下疳、鼡径性肉芽腫、性病性リンパ肉芽腫、疥癬、ヒト乳頭腫ウイルス、膣外傷、外陰部外傷、腺疾患、クラミジア膣炎、淋病、トリコモナス膣炎、尖形コンジローム、梅毒、伝染性軟属種、萎縮性膣炎、パジェット病、硬化性苔癬、扁平苔癬、外陰痛、毒性ショック症候群、膣痙、外陰膣炎、外陰部前庭炎、ならびに扁平上皮過形成、透明細胞癌、基底細胞癌、黒色腫、バルトリン腺癌、および外陰部上皮内腫瘍形成などの腫瘍性障害をはじめとする膣および外陰部疾患および／または障害の診断、治療、および／または予防に用いられる。
【０７７６】
子宮障害および／または疾患としては、月経困難症、子宮後傾症、子宮内膜症、子宮類腺腫、子宮腺筋症、無排卵性出血、無月経、クッシング症候群、胞状奇胎、アッシェルマン症候群、早期閉経、早発思春期、子宮ポリープ、機能不全性不正子宮出血（例えば、異常なホルモンシグナルによる）、ならびに腫瘍性子宮疾患（例えば、子宮腺癌、子宮平滑筋肉腫および子宮肉腫など）が挙げられる。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、双角子宮、中隔子宮、単純単角子宮、非空洞形成性不完全発育角を有する単角子宮、非伝達性空洞形成性不完全発育角を有する単角子宮、伝達性空洞形成性子宮角を有する単角子宮、弓状子宮、完全重複子宮、およびＴ型子宮などの先天性子宮異常のマーカーまたはデテクターとして、ならびに診断、治療、および／または予防に有用であり得る。
【０７７７】
卵巣疾患および／または障害としては、無排卵、多嚢胞性卵巣症候群（ステイン−レベンサル症候群）、 卵巣嚢腫、卵巣機能低下、性腺刺激ホルモンに対する卵巣無反応、アンドロゲンの卵巣過剰生産、右卵巣静脈症候群、無月経、女性内分泌障害性多毛症、および卵巣癌（限定されるものではないが、原発性および続発性癌増殖、セルトリ−ライジヒ腫瘍、卵巣内膜癌、卵巣乳頭状漿液性腺癌、卵巣粘液性腺癌、および子宮クルーケンベルク腫を含む）が挙げられる。
【０７７８】
子宮頸部疾患および／または障害としては、子宮頸管炎、慢性子宮頸管炎、粘液膿性子宮頸管炎、子宮頸部形成異常、子宮頸管ポリープ、ナーボト嚢胞、子宮頸管糜爛、子宮頸部機能不全、および子宮頸部腫瘍（例えば、子宮頸癌、扁平上皮化生、扁平上皮細胞癌、腺扁平細胞腫瘍、および円柱細胞腫瘍を含む）が挙げられる。
【０７７９】
さらに、生殖系疾患および／または障害としては、流産および死産（早期流産、後期流産、自然流産、誘導流産、治療的流産、切迫流産、稽留流産、不完全流産、完全流産、習慣性流産、および敗血性流産など）；子宮外妊娠、貧血症、Ｒｈ不適合、妊娠中の膣内出血、妊娠性糖尿病、子宮内成長遅延、羊水過多症、ＨＥＬＬＰ症候群、常位胎盤早期剥離、前置胎盤、悪阻、子癇前症、子癇、妊娠性疱疹、および妊娠性蕁麻疹をはじめとする妊娠性障害および／または疾患が挙げられる。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは心疾患、心不全、リウマチ性心疾患、先天性心疾患、僧帽弁脱出症、高血圧症、貧血症、腎疾患、感染症（例えば、風疹、サイトメガロウイルス、トキソプラズマ症、感染性肝炎、クラミジア、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、および 陰部ヘルペス）、真性糖尿病、グレーヴズ病、甲状腺炎、甲状腺機能低下症、橋本甲状腺炎、慢性活動性肝炎、肝硬変、原発性 胆汁性肝硬変、喘息、全身深在性紅斑狼瘡、慢性関節リウマチ、重症性筋無力症、特発性血小板減少性 紫斑病、虫垂炎、卵巣嚢胞、胆嚢障害、および腸閉塞をはじめとする妊娠を困難なものにする可能性のある疾患の診断、治療、および／または予防に用いられる。
【０７８０】
陣痛および分娩に関連する合併症としては、子宮膜の早期破裂、早期分娩、過期妊娠、過熟妊娠、進行遅延分娩、胎児仮死（例えば、異常心拍 （胎児または母親）、呼吸困難、および異常胎児位、肩難産、臍帯脱出症、羊水塞栓症、および異常子宮出血が挙げられる。
【０７８１】
さらに、子宮内膜症、子宮筋層炎、子宮傍結合組織炎、腹膜炎、骨盤血栓静脈炎、肺塞栓症、内毒素血症、腎盂腎炎、伏在血栓静脈炎、 乳腺炎、膀胱炎、産後出血、および子宮反転症をはじめとする分娩前疾患および／または障害が挙げられる。
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより診断、治療、および／または予防し得るその他の女性生殖系障害および／または疾患としては、例えばターナー症候群、偽雌雄同体現象、月経前緊張症候群、炎症性骨盤疾患、骨盤内鬱血（血管充溢）、性交無欲症、無オルガスム症、性交疼痛症、輸卵管破裂、および中間痛が挙げられる。
感染性疾患
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは感染病原体の治療または検出に使用できる。例えば、免疫応答を増強する、特にＢおよび／またはＴ細胞の増殖および分化を増強することにより、感染症は治療し得る。免疫応答は既存の免疫応答を増強すること、または新たな免疫応答を誘導することのいずれかにより増強され得る。あるいは、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは免疫応答を必ずしも誘導することなく、感染病原体を直接阻害し得る。
【０７８２】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドによって治療または検出できる疾患または症状の原因となる感染病原体の１つの例がウイルスである。ウイルスの例としては、限定されるものではないが、以下のＤＮＡおよびＲＮＡウイルス、ならびにウイルス科：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、アルテリウイルス、ビルナウイルス科、ブニヤウイルス科、カルシウイルス科、サーコウイルス科、コロナウイルス科、デングウイルス、ＥＢＶ、ＨＩＶ、フラビウイルス科、 ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（サイトメガロウイルス、単純疱疹、帯状疱疹など）、モノネガウイルス（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルトミクソウイルス科（例えば、Ａ型インフルエンザ、Ｂ型インフルエンザ、およびパラインフルエンザ）、パピローマウイルス、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（天然痘または種痘症など）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）、ならびにトガウイルス科 （例えば、ルビウイルス）が挙げられる。これらの科に属するウイルスは、限定されるものではないが、関節炎、細気管支炎、呼吸器合胞体ウイルス症、脳炎、眼感染症（例えば、結膜炎、角膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｅ型、慢性活動性、デルタ）、日本脳炎、アルゼンチン出血熱、チクングンヤ、リフトバレー熱、黄熱、髄膜炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキットリンパ腫、水疱瘡、出血熱、麻疹、耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、感冒、ポリオ、白血病、風疹、性交感染症、皮膚疾患（例えば、カポジ肉腫、疣贅）、およびウイルス血症をはじめとする種々の疾患または症状を引き起こし得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはこれらの症状または疾患のいずれかの治療または検出に使用できる。特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは髄膜炎、デング熱、ＥＢＶ、および／または肝炎（例えば、Ｂ型肝炎）の治療に用いられる。さらなる特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、１種以上のその他の商業的に入手可能な肝炎ワクチンに応答しない患者の治療に用いられる。さらなる特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはＡＩＤＳの治療に用いられる。
【０７８３】
同様に、疾患または症状を引き起こし、かつ本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより治療または検出できる細菌および真菌病原体としては、限定されるものではないが、以下のグラム陰性およびグラム陽性細菌、細菌科、ならびに真菌：アクチノミセス属（例えば、Ｎｏｒｃａｒｄｉａ）、アシネトバクター属、クリプトコックス・ネオフォルマンス、アスペルギルス属、バチルス属（例えば、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｓｉｓ））、バクテロイデス属（例えば、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ブラストミセス、ボルデテラ属、ボレリア属（例えば、ライム病ボレリア）、ブルセラ属、カンジダ属、カンピロバクター菌、クラミジア、クロストリディウム属（例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｉｃｉｌｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）、コクシジオイデス菌、コリネバクテリア菌（例えば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｔｈｅｒｉａｅ）、クリプトコックス、Ｄｅｒｍａｔｏｃｙｃｏｓｅｓ、大腸菌（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉおよびＥｎｔｅｒｏｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ Ｅ． ｃｏｌｉ）、エンテロバクター菌（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、腸内細菌科（クレブシェラ菌）、サルモネラ菌（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、腸内菌科セラチア属、エルシニア属、シゲラ）、エリジペロスリックス属、ヘモフィリス属（例えば、インフルエンザＢ型）、ヘリコバクター菌、レジオネラ属（例えば、レジェネラ・ニューモフィラ）、レプトスピラ菌、リステリア菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、マイコプラズマ属、マイコバクテリウム属（例えば、ライ菌およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ビブリオ属（例えば、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ナイセリア属（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、パスツレラ属、プロテウス属、シュードモナス（例えば、Ｐｓｅｕｄｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、リケッチア属、スピロヘータ（例えば、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐｐ．、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｓｐｐ．、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｓｐｐ．）、シゲラ種、ブドウ球菌（例えば、黄色ブドウ球菌）、Ｍｅｎｉｎｇｉｏ球菌、肺炎双球菌および連鎖球菌（例えば、肺炎連鎖球菌ならびにＡ、Ｂ、およびＣ群連鎖球菌）、およびウレアプラスマ属が挙げられる。これらの細菌、寄生体、および真菌科は、限定されるものではないが、抗生物質耐性感染症、菌血症、心内膜炎、敗血症、眼感染症（例えば、結膜炎）、ブドウ膜炎、結核、歯肉炎、細菌性下痢、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連感染症）、爪囲炎、補綴関連感染症、齲食症、ライター病、気道感染症（百日咳または蓄膿症など）、敗血症、ライム病， 猫ひっかき病、赤痢、 パラチフス、食中毒、レジオネラ症、慢性および急性炎症、紅���、酵母感染症． チフス、肺炎、淋病、髄膜炎（例えば、ＡおよびＢ型髄膜炎）、クラミジア感染症、梅毒、ジフテリア、ハンセン病、ブルセラ病、消化性潰瘍、炭疽、自然流産、先天的欠損症、肺炎、肺感染症、耳感染症、難聴、失明、無気力、倦怠感、嘔吐、慢性下痢、クローン病、大腸炎、膣症、不妊症、炎症性骨盤疾患、カンジダ症、副結核症、結核、ループス、ボツリヌス中毒、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ性熱、猩紅熱、性交感染症、皮膚疾患（例えば、蜂巣炎、皮膚嚢腫）、妊娠中毒症、尿路感染症、創傷感染症、院内感染症をはじめとする疾患または症状を引き起こし得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはこれらの症状または疾患のいずれかの治療または検出に使用できる。特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは破傷風、ジフテリア、ボツリヌス中毒、および／または髄膜炎Ｂ群の治療に用いられる。
【０７８４】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドにより治療、予防および／または診断できる疾患または症状を引き起こす寄生病原体としては、限定されるものではないが、以下の系統または種：アメーバ症、バベシア病、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症、媾疫、外部寄生虫症、 ランブル鞭毛虫症、蠕虫病、リーシュマニア症、住血吸虫症、タイレリア症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ症、およびトリコモナス症、ならびに胞子虫症（例えば、三日熱マラリア原虫、熱帯熱マラリア原虫、四日熱マラリア原虫および卵形マラリア原虫）が挙げられる。これらの寄生体は、限定されるものではないが、疥癬、ツツガムシ病、眼感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア鞭毛虫症）、肝疾患、肺疾患、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症、およびトキソプラズマ症をはじめとする種々の疾患または症状を引き起こし得る。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはこれらの症状または疾患のいずれかの治療、予防、および／または診断に使用できる。特定の実施形態では、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはマラリアの治療、予防、および／または診断に用いられる。
【０７８５】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、本発明のアルブミン融合タンパク質の有効量を患者に投与すること、または患者の細胞を取り出し、その細胞に本発明のポリヌクレオチドを与え、その培養細胞を患者に戻すこと（ｅｘ ｖｉｖｏ治療）のいずれかにより使用できる。さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、感染症に対する免疫応答を高めるワクチンの抗原としても使用できる。
【０７８６】
再生
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは細胞を分化、増殖、および誘引して組織の再生をもたらすために使用できる。（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：５９−８７ （１９９７）参照）． 組織再生は先天性欠損症、外傷（創傷、火傷、切開、または潰瘍）、加齢、疾患（例えば、骨粗鬆症、変形性関節炎、歯周疾患、肝機能不全）、手術（美容形成外科を含む）、繊維形成、再潅流傷害、または全身性サイトカイン傷害により損傷を受けた組織を修復、移植、または保護するために使用できる。
【０７８７】
本発明を用いて再生できる組織としては、器官（例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、皮膚、内皮）、筋肉（平滑筋、骨格筋、または心筋）、脈管構造（血管およびリンパ管を含む）、神経、造血および骨格（骨、軟骨、腱、および靭帯）組織が挙げられる。好ましくは瘢痕がなくまたはわずかな瘢痕で再生がもたらされる。再生には脈管形成も含まれる。
【０７８８】
さらに、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは治癒が困難な組織の再生を増進し得る。例えば、腱／靭帯再生を増進することで損傷後の再生時間が早まる。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは損傷を防ぐための予防にも使用できる。治療できる特定の疾患としては、腱炎、手根管症候群、およびその他の腱または靱帯欠損が挙げられる。非治癒性創傷の組織再生のさらなる例としては、圧迫性潰瘍、血管不全に関連した潰瘍、外科的創傷、および外傷的創傷が挙げられる。
【０７８９】
同様に、神経および脳組織は神経細胞を増殖および分化する本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて再生できる。この方法を用いて治療できる疾患としては、中枢および末梢神経系疾患、神経障害、または物理的および外傷性障害（例えば、脊髄障害、頭部外傷、脳血管疾患、および脳卒中）が挙げられる。特に、末梢神経損傷、末梢神経障害、（例えば、化学療法またはその他の医学療法の結果として起こる）、局在性神経障害、および中枢神経系 疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンティングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、およびシャイ−ドレガー症候群）に関連する疾患は総て、本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いて治療できる。
【０７９０】
胃腸障害
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、炎症性疾患および／または症状， 感染症、癌（例えば、腸腫瘍（小腸の類癌腫瘍 、小腸の非ホジキン性リンパ腫、小腸リンパ腫））、および潰瘍（消化性潰瘍など）をはじめとする胃腸障害の治療、予防、診断、および／または予後判定に用いられる。
【０７９１】
胃腸障害としては、嚥下困難、嚥下痛、食道の炎症、消化性食道炎、胃逆流、粘膜下組織繊維症と狭窄症、マロリー−ワイス病巣、平滑筋腫、脂肪腫、表皮癌、腺癌、胃停留障害、胃腸炎、胃萎縮症、胃癌、胃のポリープ、自己免疫疾患（悪性貧血など）、幽門狭窄、胃炎（細菌性、ウイルス性、エオシン好性、ストレス性、慢性糜爛性、萎縮性、プラズマ細胞性、およびメネトリエ）、および腹膜疾患（例えば、乳び腹膜、血管腹膜、腸間膜 嚢胞、腸間膜リンパ節炎、腸間膜血管閉塞、皮下脂肪組織炎、腫瘍、腹膜炎、肺腹膜、下横隔膜膿瘍）が挙げられる。
【０７９２】
胃腸障害としては、吸収不良症候群、腹部膨張、過敏性腸症候群、糖不耐性、小児脂肪便症、十二指腸潰瘍、十二支腸炎、熱帯性スプルー、ホイップル病、腸リンパ管拡張症、クローン病、虫垂炎、回腸閉塞、メッケル憩室症、多発性憩室症、小腸および大腸の完全回転不全、リンパ腫、ならびに細菌性および寄生体性疾患（旅行者下痢、チフスおよびパラチフス、コレラ、回虫（Ａｓｃａｒｉａｓｉｓ ｌｕｍｂｒｉｃｏｉｄｅｓ）、十二指腸虫（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ ｄｕｏｄｅｎａｌｅ）、線虫（Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓ ｖｅｒｍｉｃｕｌａｒｉｓ）、条虫（Ｔａｅｎｉａ ｓａｇｉｎａｔａ， Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍ ｓｐｐ．、およびＴ． ｓｏｌｉｕｍ）による感染症など）などの小腸に関連する障害も挙げられる。
【０７９３】
肝疾患および障害としては、肝内胆汁鬱血（ａｌａｇｉｌｌｅ 症候群、胆汁性肝硬変）、脂肪肝（アルコール性脂肪肝、レイ症候群）、肝静脈血栓症、肝レンズ核変性症、肝腫、肝肺症候群、肝腎症候群、門脈圧亢進症（食道および胃静脈瘤）、肝臓膿瘍（アメーバ性肝臓膿瘍）、肝硬変（アルコール性、胆汁性および経験性）、アルコール性肝疾患（脂肪肝、肝炎、硬変）、寄生体性（肝性包虫症、肝蛭症、アメーバ性肝臓膿瘍）、黄疸（溶血性、肝細胞性、および胆汁鬱帯性）、胆汁鬱血、門脈圧亢進症、肝肥大、腹水症、肝炎（アルコール性肝炎、動物肝炎、慢性肝炎（自己免疫、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、薬剤性）、毒性肝炎、 ウイルス性ヒト 肝炎 （Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎）、ウィルソン病、肉芽腫性肝炎、続発性胆汁性硬変、肝性脳症、門脈圧亢進症、静脈瘤、原発性胆嚢硬変、原発性硬化性胆管炎、肝細胞性腺腫、血管腫、 胆石、肝機能不全（肝性脳症、急性肝機能不全）、および肝臓腫瘍（血管筋脂肪腫、石灰化肝臓転移、嚢胞性肝臓転移、上皮腫瘍、繊維性層状肝癌、限局性結節性過形成、肝性腺腫、肝胆汁性嚢胞腺腫、肝芽細胞腫、肝細胞癌、肝腫瘍、肝臓癌、肝臓 血管内皮腫、間充織過誤腫、間充織肝腫瘍、結節性再生過形成、良性肝臓腫瘍（肝臓嚢胞［単純嚢胞、多嚢胞性肝疾患、肝胆汁性嚢胞腺腫、総胆管嚢胞］、間充織腫瘍［間充織過誤腫、小児血管内皮腫、血管腫、肝臓紫斑病、脂肪腫、炎症性偽腫瘍、その他］、上皮腫瘍［胆管上皮（胆管過誤腫、胆管腺腫）、肝細胞（腺腫、限局性結節性過形成、結節性再生過形成）］、悪性肝臓腫瘍 （肝細胞、肝芽細胞腫、肝細胞癌、胆管細胞、胆管癌、嚢胞腺癌、血管腫瘍、血管肉腫， カポジ肉腫、血管内皮腫、その他の腫瘍、胎生期肉腫、繊維肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、癌肉腫、奇形腫、類癌腫、扁平上皮癌腫、原発性リンパ腫）、肝臓紫斑病、エリスロヘパティック・ポルフィリン症、肝性ポルフィリン症（急性間欠性ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症）、ツェルウェガー症候群）が挙げられる。
【０７９４】
膵臓疾患および／または障害としては、急性膵炎、慢性膵炎（急性壊死性膵炎、アルコール性膵炎）、腫瘍 （膵臓腺癌、嚢胞腺癌、インスリノーマ、ガストリノーマ、およびグルカゴノーマ、嚢胞性腫瘍、島細胞腫瘍、膵芽細胞腫）、およびその他の膵臓疾患（例えば、嚢胞性繊維症、嚢胞（膵臓偽嚢胞、膵臓フィステル、機能不全））が挙げられる。
【０７９５】
胆嚢疾患としては、胆石（胆石症および総胆管結石症）、胆嚢切除後症候群、胆嚢憩室症、急性胆嚢炎、慢性胆嚢炎、胆管腫瘍、および粘液嚢胞腫が挙げられる。
【０７９６】
大腸疾患および／または障害としては、抗生物質関連大腸炎、憩室炎、潰瘍性大腸炎、後天性巨大結腸症、膿瘍、真菌および細菌感染症、肛門直腸障害（例えば、裂溝、痔核）、結腸疾患（大腸炎、結腸腫瘍［結腸癌、腺腫様結腸ポリープ（例えば、絨毛腺腫）、結腸癌腫、結腸直腸癌］、結腸憩室炎、結腸憩室症、巨大結腸症［ヒルシュスプラング病、中毒性巨大結腸症］；Ｓ状結腸疾患［直腸結腸炎、Ｓ状腫瘍］）；便秘症、クローン病、下痢（小児下痢、赤痢）、十二指腸疾患（十二指腸腫瘍、十二指腸閉塞、十二指腸潰瘍、十二指腸炎）、腸炎（全腸炎）、ＨＩＶ腸疾患、回腸疾患（回腸腫瘍、回腸炎）、免疫増殖性小腸疾患、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）、腸閉鎖症、寄生体性疾患（アニサキス症、バランチジウム症、胚盤胞感染症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバ症、アメーバ性腸炎、ランブル鞭毛虫症）、腸フィステル （直腸フィステル）、腸腫瘍（盲腸腫瘍、結腸腫瘍、十二指腸腫瘍、回腸腫瘍、腸ポリープ、空腸腫瘍、直腸腫瘍）、腸閉塞（輸入脚症候群、十二指腸閉塞、嵌入糞便、腸偽閉塞 ［盲腸捻転］、腸重積症）、腸穿孔、腸ポリープ（結腸ポリープ、ガードナー症候群、ポイツ−ジェガーズ症候群）、空腸疾患（空腸腫瘍）、吸収不良症候群（盲嚢症候群、セリアック病、乳糖不耐性、短腸症候群、熱帯性スプルー、ホイップル病）、腸間膜血管閉塞、腸壁嚢胞状気腫、タンパク質喪失性腸症（腸リンパ管拡張症）、直腸疾患（肛門疾患、大便失禁、痔核、直腸炎、直腸フィステル、直腸脱出症、直腸瘤）、消化性潰瘍（十二指腸潰瘍、消化性食道炎、出血、穿孔、胃潰瘍、ゾリンジャー−エリソン症候群）、胃切除後症候群（ダンピング症候群）、胃疾患（例えば、無塩酸症、十二指腸胃逆流（胆汁逆流）、胃洞血管拡張症、胃フィステル、胃出口閉塞、胃炎（萎縮性または肥大性）、胃不全麻痺、胃拡張症、胃憩室疾患、胃腫瘍 （胃癌、胃ポリープ、胃腺癌、過形成性胃ポリープ）、胃破裂、胃潰瘍、胃捻転）、結核、内臓下垂症、嘔吐（例えば、吐血、妊娠悪阻、術後悪心および嘔吐）および出血性大腸炎が挙げられる。
【０７９７】
さらに、胃腸系疾患および／または障害としては、胆管疾患（胃壁破裂症、フィステル（例えば、胆嚢フィステル、食道フィステル、胃フィステル、腸フィステル、膵臓フィステル）、腫瘍（例えば、胆管腫瘍、食道腫瘍（食道腺癌など）、食道扁平上皮細胞癌、胃腸腫瘍、膵臓腫瘍（膵臓腺癌 など）、粘液性嚢胞性膵臓腫瘍、膵臓嚢胞性腫瘍、膵芽細胞腫、および腹膜腫瘍など）、食道疾患（例えば、水疱性疾患、カンジダ症、糖原性表皮肥厚症、潰瘍、バレット食道静脈瘤、閉鎖症、嚢胞、憩室 （例えば、ツェンカー憩室）、フィステル（例えば、気管食道フィステル）、運動性障害（例えば、ＣＲＥＳＴ症候群、嚥下障害、噴門無弛緩症、痙攣、胃食道逆流）、腫瘍、穿孔（例えば、ブールハーフェ症候群、マロリー−ワイス症候群、狭窄、食道炎、横隔膜ヘルニア（例えば、裂孔ヘルニア））；胃腸疾患（胃腸炎（例えば、コレラ病、ノーウォークウイルス感染症）、出血（例えば、吐血、黒色便、消化性潰瘍性出血）、胃腫瘍 （胃癌、胃ポリープ、胃腺癌、胃癌））、ヘルニア（例えば、先天性 横隔膜ヘルニア、大腿ヘルニア、鼠蹊ヘルニア、閉塞膜ヘルニア、臍ヘルニア、腹壁ヘルニア））、ならびに腸疾患（例えば、盲腸疾患（虫垂炎、盲腸腫瘍））など）が挙げられる。
【０７９８】
走化性
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは走化性を有している。走化性分子は細胞（例えば、単球、繊維芽細胞、好中球、Ｔ細胞、マスト細胞、好酸球、上皮および／または内皮細胞）を炎症、感染、あるいは過剰増殖部位のような体の特定部位、へと誘引するまたは移動させる。移動した細胞はその後、特定の外傷または異常と闘いおよび／またはそれを治癒することができる。
【０７９９】
本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、特定の細胞の走化性を高め得る。それゆえ、これらの走化性分子は、体の特定部位に標的化される細胞の数を高めることによる炎症、感染症、過剰増殖性障害、またはいずれかの免疫系障害の治療に使用できる。例えば、走化性分子は、免疫細胞を損傷部位に誘導することにより組織の創傷およびその他の外傷の治療に使用できる。本発明の走化性分子は創傷の治療に使用できる繊維芽細胞も誘引することができる。
【０８００】
本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、走化性を阻害し得ることもまた考えられる。このような分子も障害の治療に使用できる。それゆえ、本発明の融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、走化性の阻害剤として使用できる。
【０８０１】
結合活性
本発明のアルブミン融合タンパク質は、融合タンパク質の治療用タンパク質部分と結合する分子、または融合タンパク質の治療用タンパク質部分が結合する分子をスクリーニングするのに使用できる。融合タンパク質とこの分子の結合はこの融合タンパク質または結合したこの分子を活性化（アゴニスト）し、その活性を増強、阻害（アンタゴニスト）または低下させ得る。かかる分子の例としては、抗体、オリゴヌクレオチド、タンパク質（例えば、受容体）、または小分子が挙げられる。
【０８０２】
好ましくはこの分子は、本発明の融合タンパク質の治療用タンパク質部分の天然リガンド、例えば、リガンド断片、または天然基質、リガンド、構造または機能ミメティックに密接に関連している（Ｃｏｌｉｇａｎら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １（２）：Ｃｈａｐｔｅｒ ５ （１９９１）参照）。同様に、この分子は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分が結合する天然受容体、または少なくとも本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分によって結合され得る受容体の断片（例えば、活性部位）に密接に関連し得る。いずれの場合も、この分子は公知の技術を用いて合理的に設計することができる。
【０８０３】
好ましくは、これらの分子のスクリーニングには、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現する適当な細胞を作出することが含まれる。好ましい細胞としては、哺乳類、酵母、ショウジョウバエまたは大腸菌からの細胞が挙げられる。
【０８０４】
このアッセイは、単に候補化合物の本発明のアルブミン融合タンパク質への結合を試験するものであり、ここで結合は標識によるか、あるいは標識された競合物との競合を含むアッセイで検出する。さらにこのアッセイでは、候補化合物が、融合タンパク質に結合することで生じるシグナルをもたらすかどうかを試験してもよい。
【０８０５】
あるいは、このアッセイは、細胞フリー調製物、固相支持体に固定した融合タンパク質／分子、化学ライブラリー、または天然産物混合物を用いて行うこともできる。このアッセイはまた単に、候補化合物をアルブミン融合タンパク質を含有する溶液と混合するステップ、融合タンパク質／分子の活性または結合を測定するステップ、融合タンパク質／分子の活性または結合を標品と比較するステップを含んでなってもよい。
好ましくは、ＥＬＩＳＡアッセイは、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いてサンプル（例えば、生物サンプル）中の融合タンパク質のレベルまたは活性を測定することができる。この抗体は、融合タンパク質のレベルまたは活性を、直接または間接的にアルブミン融合タンパク質と結合させるか、あるいは基質に関してアルブミン融合タンパク質と競合させるかのいずれかによって測定することができる。
【０８０６】
あるいは、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分が結合する受容体は、当業者に公知の多くの技術、例えばリガンドパンニングＦＡＣＳソーティング（Ｃｏｌｉｇａｎら， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎ．， １（２）， Ｃｈａｐｔｅｒ ５， （１９９１））によって同定することができる。例えば、融合タンパク質の治療用タンパク質部分がＦＧＦに相当する場合には発現クローニングを用いてもよく、ここではアルブミン融合タンパク質に応答する細胞、例えばＦＧＦファミリーのタンパク質に対する複数の受容体を含むことが知られているＮＩＨ３Ｔ３細胞、およびＳＣ−３細胞からポリアデニル化ＲＮＡを調製し、さらに、このＲＮＡから作製したｃＤＮＡライブラリーをプールに分割してＣＯＳ細胞または、アルブミン融合タンパク質に応答しないその他の細胞をトランスフェクトするのに用いる。スライドグラス上で増殖させたトランスフェクト細胞を、標識した後の本発明のアルブミン融合タンパク質に曝す。アルブミン融合タンパク質は、ヨウ素化または部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位を含めることなどの種々の手段で標識することができる。
【０８０７】
固定化またはインキュベーションの後、これらのスライドに対してオートラジオグラフィー分析を行う。陽性プールを確認し、サブプールを調製し、そしてサブプールの調製と再スクリーニングのプロセスを繰り返して再トランスフェクトすると、最終的に推定受容体をコードする単一のクローンが得られる。
【０８０８】
受容体を同定する別のアプローチとしては、標識したアルブミン融合タンパク質を、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質成分の受容体分子を発現する細胞膜または抽出調製物と光親和性結合させてもよく、この結合した材料はＰＡＧＥ解析によって分解し、Ｘ線フィルムに露光してもよい。融合タンパク質の受容体を含む標識複合体は切り出してペプチド断片に分解し、タンパク質マイクロシーケンシグを行うことができる。 マイクロシーケンシングから得られたアミノ酸配列を用いて、推定受容体をコードする遺伝子を同定するためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることを目的とした縮重したオリゴヌクレオチドのプローブセットを設計する。
【０８０９】
さらに、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリングおよび／またはコドンシャッフリング（ひとまとめにして「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる）の技術を用いて、融合タンパク質の活性および／または本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分もしくはアルブミン成分をモジュレートし、それにより本発明のアルブミン融合タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストを効果的に作出してもよい。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号および同第５，８３７，４５８、およびＰａｔｔｅｎ， Ｐ．Ａ．ら， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ８：７２４−３３ （１９９７）； Ｈａｒａｙａｍａ， Ｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６−８２ （１９９８）； Ｈａｎｓｓｏｎ， Ｌ． ０．ら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８７：２６５−７６ （１９９９）；ならびにＬｏｒｅｎｚｏ， Ｍ． Ｍ．およびＢｌａｓｃｏ， Ｒ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８−１３ （１９９８）参照、なお、これらの特許および刊行物の各々は参照により本明細書に組み入れられる。ある実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、従ってそれによってコードされているアルブミン融合タンパク質の変更はＤＮＡシャッフリングによって達成できる。ＤＮＡシャッフリングは相同組換えまたは部位特異的組換えによって所望の分子へ２以上のＤＮＡセグメントを組み込むことを含む。他の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、従ってそれによってコードされているアルブミン融合タンパク質を、組換えに先立ち、誤りがちなＰＣＲによるランダム突然変異誘発、ランダムヌクレオチド挿入またはその他の技術を行うことで変更することができる。もう１つの実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質の１以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などを、１以上の異種分子の１以上の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組み合わせてもよい。好ましい実施形態では、これらの異種分子はファミリーのメンバーである。さらに好ましい実施形態では、これらの異種分子は、例えば血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＴＧＦ−β、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、アクチビンＡおよびＢ、デカペンタプレジック（ｄｐｐ）、６０Ａ、ＯＰ−２、ドーサリン、増殖分化因子（ＧＤＦ）、ノーダル、ＭＩＳ、インヒビン−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β５および神経膠細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）などの増殖因子である。
【０８１０】
他の好ましい断片としては、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分および／またはアルブミン成分の生物学的に活性な断片がある。生物学的活性断片は、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分および／またはアルブミン成分の活性と同一である必要はないが、同等の活性を示すものである。これら断片の生物活性には、望ましい活性の増強または望ましくない活性の低下が含まれる。
【０８１１】
さらに本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質の作用をモジュレートするものを同定するための化合物のスクリーニング法を提供する。かかるアッセイの例としては、哺乳類繊維芽細胞、本発明のアルブミン融合タンパク質およびスクリーニングする化合物を、繊維芽細胞が通常増殖する細胞培養条件下で、３［Ｈ］チミジンと組み合わせることを含む。スクリーニングする化合物の不在下で対照アッセイを行い、化合物の存在下での繊維芽細胞の増殖量と比較して、各場合の３［Ｈ］チミジンの取り込みを測定することでその化合物が増殖を刺激するかどうかを調べる。繊維芽細胞の増殖量は３［Ｈ］チミジンの組み込みを測定する液体シンチレーションクロマトグラフィーによって測定する。アゴニストおよびアンタゴニスト化合物はいずれもこの手順によって同定することができる。
【０８１２】
別法では、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質成分の受容体を発現する哺乳類細胞または膜調製物を該化合物の存在下、標識した本発明の融合タンパク質とともにインキュベートする。そうすることでこの相互作用を増強または遮断する化合物の能力を測定することができる。あるいは、スクリーニングする化合物と受容体の相互作用の後、公知の第二のメッセンジャー系の応答を測定し、受容体と結合して第二のメッセンジャー応答を誘起する化合物の能力を測定して、その化合物が可能性のある融合タンパク質であるかどうかを調べる。かかる第二のメッセンジャー系としては、限定されるものではないが、ｃＣＡＭＰグアニル酸シクラーゼ、イオンチャネルまたはホスホイノシチド加水分解が挙げられる。
【０８１３】
これら上記のアッセイは全て、診断または予後判定マーカーとして使用できる。これらのアッセイを用いて発見された分子を用い、融合タンパク質／分子を活性化または阻害することで患者において疾患を治療したり、特定の結果（例えば、血管増殖）をもたらしたりすることができる。さらに、これらのアッセイは、適宜操作した細胞または組織からの本発明のアルブミン融合タンパク質の産生を阻害または増強し得る薬物を発見することもできる。
【０８１４】
従って本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合する化合物を同定する方法であって、（ａ）候補化合物を本発明のアルブミン融合タンパク質とともにインキュベートするステップ、さらに（ｂ）結合が起こったかどうかを調べるステップを含んでなる方法を含む。さらに本発明は、（ａ） 候補化合物を本発明のアルブミン融合タンパク質とともにインキュベートするステップ、（ｂ）生物活性をアッセイするステップ、さらに（ｃ）その融合タンパク質の生物活性が変更されたかどうかを調べるステップを含んでなる、アゴニスト／アンタゴニストの同定方法を含む。
【０８１５】
標的送達
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質の成分に対する受容体を発現する標的細胞に組成物を送達する方法を提供する。
【０８１６】
本明細書で論じるように、本発明の融合タンパク質は、疎水性相互作用、親水性相互作用、イオン相互作用および／または共有結合相互作用を介して異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグと結合し得る。１つの実施形態では、本発明は、異種ポリペプチドまたは核酸と結合している本発明の融合タンパク質（抗体を含む）を投与することで、細胞に本発明の組成物を特異的に送達する方法を提供する。１つの実施例では、本発明は、治療用タンパク質を標的細胞に送達する方法を提供する。別の実施例では、本発明は、一本鎖核酸（例えば、アンチセンスまたはリボザイム）または二本鎖核酸（例えば、細胞のゲノムに組み込まれるか、あるいはエピソームとして複製でき、かつ、転写可能なＤＮＡ）を標的細胞へ送達する方法を提供する。
【０８１７】
もう１つの実施形態では、本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質（例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明の抗体）を毒素または細胞傷害性プロドラッグと結合させて投与することで特異的に細胞を破壊する（例えば、腫瘍細胞の破壊）方法を提供する。
【０８１８】
「毒素」とは、内在性の細胞傷害性エフェクター系と結合して活性化する化合物、放射性同位元素、ホロトキシン、変性毒、毒素の触媒サブユニット、または細胞内または細胞表面に通常には存在せず定義された条件下で細胞死を引き起こす、分子もしくは酵素を意味する。本発明の方法に従って使用できる毒素としては、限定されるものではないが、当技術分野で公知の放射性同位元素、例えば固有の、または誘導型の内在性細胞傷害性エフェクター系と結合する抗体（またはその部分を含む相補的固定）、チミジンキナーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡアーゼ、αトキシン、リシン、アブリン、シュードモナス外毒素Ａ、ジフテリア毒、サポリン、モモルジン、ゲロニン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、α−サルシンおよびコレラ毒などの化合物が挙げられる。「細胞傷害性プロドラッグ」とは、細胞に通常存在する酵素によって細胞傷害性化合物へ変換される無毒の化合物を意味する。本発明の方法に従って使用できる細胞傷害性プロドラッグとしては、限定されるものではないが、安息香酸マスタードアルキル化剤のグルタミル誘導体、エトポシドまたはマイトマイシンＣのリン酸誘導体、シトシンアラビノシド、ダウノルビシン、およびドキソルビシンのフェノキシアセトアミド誘導体が挙げられる。
【０８１９】
薬物スクリーニング
さらに、本発明のアルブミン融合タンパク質またはアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当するタンパク質の活性を改変する分子をスクリーニングするための、本発明のアルブミン融合タンパク質またはこれらの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用も考えられる。かかる方法は、本融合タンパク質と、アンタゴニストまたはアゴニスト活性を有すると思われる選択された化合物とを接触させること、および結合させた後にその融合タンパク質の活性をアッセイすることを含む。
【０８２０】
本発明は、種々の薬物スクリーニング技術において、本発明のアルブミン融合タンパク質またはその結合断片を用いて治療用化合物をスクリーニングするのに特に有用である。かかる試験で用いるアルブミン融合タンパク質は固相支持体に固定してもよいし、細胞表面で発現させてもよいし、液相に遊離していてもよいし、あるいは細胞内に存在していてもよい。ある薬物スクリーニング法では、アルブミン融合タンパク質を発現する組換え核酸で安定的に形質転換した真核または原核宿主細胞を用いる。薬物は、かかる形質転換細胞または、かかる細胞を培養することで得られる上清に対して、競合結合アッセイでスクリーニングする。例えば、試験する薬物と本発明のアルブミン融合タンパク質との間の複合体の形成を測定すればよい。
【０８２１】
このように本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質が媒介する活性に作用する薬物または他のいずれかの物質のスクリーニング法を提供する。これらの方法は、かかる物質を本発明のアルブミン融合タンパク質またはその断片と接触させること、そしてその物質とアルブミン融合タンパク質またはその断片との間の複合体の存在を、当技術分野で周知の方法によってアッセイすることを含んでなる。かかる競合結合アッセイでは、スクリーニングのために物質は通常標識される。インキュベーション後、遊離の物質を、結合形態で存在しているものから分離し、遊離の、または複合体を形成していない標識の量が、本発明のアルブミン融合タンパク質へ結合する特定の物質の能力の尺度となる。
【０８２２】
薬物スクリーニングのもう１つの技術は、本発明のアルブミン融合タンパク質に対して適切な結合親和性を有する化合物のハイスループットスクリーニングを提供するが、これは、１９８４年９月１３日公開の欧州特許出願８４／０３５６４に詳細に記載されている（これは、参照により本明細書に組み入れる）。簡単に述べると、多数の異なる小ペプチド試験化合物を、プラスチックピンまたは他の何らかの表面などの固相支持体上で合成する。これらのペプチド試験化合物を本発明のアルブミン融合タンパク質と反応させて洗浄する。次ぎに結合したペプチドを当技術分野で周知の方法によって検出する。精製したアルブミン融合タンパク質は、上記の薬物スクリーニング技術 で用いるプレートに直接コーティングする。さらに、非中和性抗体を用いてペプチドを捕捉して固相支持体上にそれを固定化してもよい。
【０８２３】
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合し得る中和性抗体が、本アルブミン融合タンパク質またはその断片との結合に関して、試験化合物と特異的に競合するという競合的薬物スクリーニングアッセイの使用も意図している。このようにして、抗体は、本発明のアルブミン融合タンパク質と、１以上の抗原エピトープを共有するペプチドの存在を検出するのに用いられる。
【０８２４】
結合ペプチドおよびその他の分子
本発明はまた、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合するポリペプチドおよび非ポリペプチドを同定するスクリーニング法、およびそれによって同定された結合分子を包括する。これらの結合分子は例えば本発明のアルブミン融合タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストとして有用である。かかるアゴニストおよびアンタゴニストは本発明に従い、以下、詳細に記載される治療の実施形態で使用できる。
【０８２５】
本方法は、
本発明のアルブミン融合タンパク質を複数の分子と接触させ、さらに
そのアルブミン融合タンパク質と結合する分子を同定する、
ステップを含んでなる。
【０８２６】
本発明のアルブミン融合タンパク質を複数の分子と接触させるステップはいくつかの方法で達成できる。例えば、アルブミン融合タンパク質を固相支持体に固定化し、複数の分子の溶液をその固定化したポリペプチドと接触させることが考えられる。かかる方法は、アフィニティーマトリックスが、固定化した本発明のアルブミン融合タンパク質から構成され、アフィニティークロマトグラフィー法に類似している。従って本アルブミン融合タンパク質に対して選択的親和性を有する分子はアフィニティー選択によって精製することができる。固相支持体の性質、アルブミン融合タンパク質の固相支持体への結合プロセス、溶媒、アフィニティー単離または選択の条件は概ね常套的なものであり、当業者には周知である。
【０８２７】
あるいはまた、複数のポリペプチドを、ポリペプチドのサブセットまたは単独のポリペプチドを含んでなる実質的に個別の画分に分離してもよい。例えば、複数のポリペプチドはゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、またはポリペプチドの分離に関して当業者に公知の同様の方法で分離することができる。個々のポリペプチドはまた形質転換宿主細胞によって、その外表上またはその周辺で発現させるような方法で作製することもできる（例えば、組換えファージ）。個々の単離物は次ぎに、発現が必要とされる場合はインデューサーの存在下で、本発明のアルブミン融合タンパク質によって「プロービング」し、アルブミン融合タンパク質と個々のクローン間で選択的親和性相互作用が生じるかどうかを調べることができる。アルブミン融合タンパク質を個々のポリペプチドを含む各画分と接触させる前に、これらのポリペプチドをさらに便宜となるようにまず固体支持体へ移すことができる。かかる固体支持体は、単にニトロセルロースまたはナイロン製のもののようなフィルターメンブレンであってもよい。このようにして、陽性クローンは発現ライブラリーの形質転換宿主細胞コレクションから同定することができ、それらは本発明のアルブミン融合タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ構築物を含んでいる。また、本発明のアルブミン融合タンパク質に対して選択的親和性を有するポリペプチドのアミノ酸配列は従来の手段によって直接決定してもよいし、あるいはそのポリペプチドをコードするＤＮＡのコード配列はより便宜に決定できることもしばしばある。次ぎにこの一次配列を対応するＤＮＡ配列から推定することができる。アミノ酸配列をそのポリペプチド自体から決定しようとする際には、マイクロシーケンシング技術を用いればよい。このシーケンシング技術は質量分析法を含み得る。
【０８２８】
状況によっては、選択的親和性相互作用の存在を決定または検出する試みの前に本発明のアルブミン融合タンパク質と複数のポリペプチドの混合物から結合していないポリペプチドを洗い流すことが望ましい場合がある。かかる洗浄ステップは、本発明のアルブミン融合タンパク質または複数のポリペプチドが固体支持体に結合している場合に特に望ましいものであり得る。
【０８２９】
本方法で提供される複数の分子は、本発明のアルブミン融合タンパク質と特異的に結合する分子をスクリーニングできるランダムまたはコンビナトリアルペプチドまたは非ペプチドライブラリーなどの多様なライブラリーによって提供することができる。使用できる多くのライブラリーが当技術分野で公知であり、例えば化学合成ライブラリー、組換え（例えば、ファージディスプレーライブラリー）およびｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳に基づくライブラリーがある。化学合成ライブラリーの例は、Ｆｏｄｏｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：７６７−７７３ （１９９１）； Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８４−８６ （１９９１）； Ｌａｍら， Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２−８４ （１９９１）； Ｍｅｄｙｎｓｋｉ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２：７０９−７１０ （１９９４）； Ｇａｌｌｏｐら， Ｊ． Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７（９）：１２３３−１２５１ （１９９４）； Ｏｈｌｍｅｙｅｒら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１０９２２−１０９２６ （１９９３）； Ｅｒｂら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１１４２２−１１４２６ （１９９４）； Ｈｏｕｇｈｔｅｎら， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２ （１９９２）； Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１６１４−１６１８ （１９９４）； Ｓａｌｍｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１１７０８−１１７１２ （１９９３）； ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２０２４２；ならびにＢｒｅｎｎｅｒおよびＬｅｒｎｅｒ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３８１−５３８３ （１９９２） に記載されている。
【０８３０】
ファージディスプレーライブラリーの例は、Ｓｃｏｔｔら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０ （１９９０）； Ｄｅｖｌｉｎら， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４９：４０４−４０６ （１９９０）； Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら， １９９２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２７：７１１−７１８ （１９９２）； Ｌｅｎｓｔｒａ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈ． １５２：１４９−１５７ （１９９２）； Ｋａｙら， Ｇｅｎｅ １２８：５９−６５ （１９９３）；および１９９４年８月１８日付けのＰＣＴ公開ＷＯ９４／１８３１８に記載されている。
【０８３１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳に基づくライブラリーとしては、限定されるものではないが、 １９９１年４月１８日付けのＰＣＴ公開ＷＯ９１／０５０５８；およびＭａｔｔｅａｋｉｓら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：９０２２−９０２６ （１９９４）に記載されている。
【０８３２】
非ペプチドライブラリーの一例としては、ベンゾジアゼピンライブラリー（例えば、Ｂｕｎｉｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：４７０８−４７１２ （１９９４） 参照） が使用に適している。ペプトイドライブラリー（Ｓｉｍｏｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９３６７−９３７１（１９９２）） も使用できる。化学的に変換されたコンビナトリアルライブラリーを作製するためにペプチドのアミド官能基が過メチル化された、使用可能なライブラリーの他の一例が、Ｏｓｔｒｅｓｈら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１： １１１３８−１１１４２ （１９９４）） により記載されている。
【０８３３】
本発明で有用な非ペプチドライブラリーにはいろいろなものがある。例えば、ＥｃｋｅｒおよびＣｒｏｏｋｅ（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３：３５１−３６０ （１９９５）） は、種々のライブラリーの基礎となる化学種の中で、ベンゾジアゼピン、ヒダントイン、ピペラジンジオン、ビフェニル、糖類似体、β−メルカプトケトン、酢酸アリール、アシルピペリジン、ベンゾピラン、クバン、キサンチン、アミンイミド、およびオキサゾロンを挙げている。
【０８３４】
非ペプチドライブラリーは大きく分けて修飾モノマーとオリゴマーの２つのタイプに分類できる。修飾モノマーライブラリーでは、種々の官能基が付加される比較的単純な足場構造を用いる。この足場は既知の有用な薬理活性を有する分子であることが多い。例えばこの足場はベンゾジアゼピン構造であってもよい。
【０８３５】
非ペプチドオリゴマーライブラリーでは多数のモノマーを用いるが、モノマーを組み合わせて新しい形状が作り出され、この形状は組み合わされるモノマーの順序に基づいて決まる。今までに使用されたモノマーユニットとしては、カルバメート、ピロリノンおよびモルホリノがある。側鎖がα炭素ではなくαアミノ基に結合しているペプチド様オリゴマーであるペプトイドは、非ペプチドオリゴマーライブラリーのもう１つの形式の基礎となる。初期の非ペプチドオリゴマーライブラリーでは単一タイプのモノマーを用いていたことから繰り返しの主鎖を含んでいた。最近のライブラリーでは１種以上のモノマーが用いられているので、ライブラリーには柔軟性がある。
【０８３６】
ライブラリーをスクリーニングするは一般に公知の多様な方法のいずれによって達成してもよい。例えば、ペプチドライブラリーのスクリーニングを開示している以下の参照文献：Ｐａｒｍｌｅｙら， Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． ２５１：２１５−２１８ （１９８９）； Ｓｃｏｔｔら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６−３９０ （１９９０）； Ｆｏｗｌｋｅｓら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７ （１９９２）； Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：５３９３−５３９７ （１９９２）； Ｙｕら， Ｃｅｌｌ ７６：９３３−９４５ （１９９４）； Ｓｔａｕｄｔら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５７７−５８０ （１９８８）； Ｂｏｃｋら， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：５６４−５６６ （１９９２）； Ｔｕｅｒｋら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６９８８−６９９２ （１９９２）； Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら， Ｎａｔｕｒｅ ３５５：８５０−８５２ （１９９２）； 米国特許第５，０９６，８１５号、同第５，２２３，４０９号および同第５，１９８，３４６（全てＬａｄｎｅｒら）； Ｒｅｂａｒら， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３：６７１−６７３ （１９９３）；およびＰＣＴ公開ＷＯ９４／１８３１８を参照。
【０８３７】
特定の実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質と結合する分子を同定するためのスクリーニングは、そのライブラリーのメンバーを、固相に固定化した本発明のアルブミン融合タンパク質と接触させ、アルブミン融合タンパク質と結合するライブラリーのメンバーを回収することで行うことができる。「パンニング」技術と呼ばれるかかるスクリーニング法の例は、Ｐａｍｌｅｙら， Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８ （１９８８）； Ｆｏｗｌｋｅｓら， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４２２−４２７ （１９９２）； ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１８３１８；および本明細書に挙げられた参照文献に例として記載されている。
【０８３８】
もう１つの実施形態では、酵母において相互作用タンパク質を選択するためのツーハイブリッド系（Ｆｉｅｌｄｓら， Ｎａｔｕｒｅ ３４０：２４５−２４６ （１９８９）； Ｃｈｉｅｎら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：９５７８−９５８２ （１９９１） を用いて、本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子を同定することができる。
【０８３９】
結合分子がポリペプチドである場合、このポリペプチドは、ランダムペプチドライブラリー、コンビナトリアルペプチドライブラリー、またはバイアスペプチドライブラリーをはじめとするいずれのペプチドライブラリーからも便宜に選択することができる。「バイアス」とは本明細書においては、得られる分子（この場合はペプチド）のコレクションの多様性を司る１以上のパラメーターを制限するよう、ライブラリーを作製する方法を操作することをさして用いる。
【０８４０】
従って真のランダムペプチドライブラリーでは、ペプチドのある位置で特定のアミノ酸が見られる確率が、２０種のアミノ酸の全てについて同じであるペプチドのコレクションが作製される。しかし、例えばリジンが５番目ごとのアミノ酸にくるよう、あるいはデカペプチドライブラリーの４番目、８番目および９番目の位置を固定してアルギニンのみを含むように指定することで、ライブラリーにバイアスを組み込むことができる。明らかに多くの種類のバイアスが考えられるが、本発明はいずれかの特定のバイアスに制限されるものではない。さらに本発明では、ファージディスプレーペプチドライブラリーおよびＤＮＡインサートを有するλファージベクターを含むＤＮＡ構築物を用いるものなど、特定の種類のペプチドライブラリーが考えられる。
【０８４１】
上記のように、結合分子がポリペプチドである場合、このポリペプチドは、約６個ないし約６０個未満のアミノ酸残基、好ましくは約６個ないし約１０個のアミノ酸残基、最も好ましくは約６個ないし約２２個のアミノ酸を含み得る。別の実施形態では、結合ポリペプチドは１５ないし１００個の範囲のアミノ酸、または２０ないし５０個の範囲のアミノ酸を有する。
【０８４２】
選択された結合ポリペプチドは化学合成または組換え発現によって得ることができる。
【０８４３】
その他の活性
本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、血栓症、動脈硬化症、およびその他の心血管症状などの種々の病態による虚血組織の血管再開を刺激する処置に用いてもよい。本発明のアルブミン融合タンパク質および／または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、上記のような脈管形成および四肢再生の刺激に用いてもよい。
【０８４４】
本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、繊維芽細胞および骨格筋細胞などの種々の源の種々の細胞に対して細胞分裂誘発性があることから、また従って損傷組織または罹患組織の修復または置換を促進するので、傷害、火傷、術後の組織修復、および潰瘍による創傷の治療に用いてもよい。
【０８４５】
本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、ニューロンの増殖を刺激するために、またある種のニューロン性障害、またはアルツハイマー病、パーキンソン病、およびエイズ関連合併症などの神経変性症状において起こるニューロンの損傷を治療または予防するために用いてもよい。本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、軟骨細胞増殖を刺激する能力を有し得ることから、それらは骨および歯根の再生の増強のため、および組織移植または骨移植を助けるために用いてもよい。
【０８４６】
本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、ケラチノサイトの増殖を刺激することで日焼けによる皮膚の老化を予防するために用いてもよい。
【０８４７】
本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、ＦＧＦファミリーのメンバーが毛髪形成細胞を活性化し、メラノサイトの増殖を促進することから、脱毛の予防に用いてもよい。同様に、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、他のサイトカインと併用する場合には、造血系細胞および骨髄細胞の増殖および分化を刺激するのに用いてもよい。
【０８４８】
本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、移植前の器官を維持するため、または一次組織の細胞培養を助けるために用いてもよい。本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、初期の胚における分化のために中胚葉起点の組織を誘導するのに用いてもよい。
【０８４９】
本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、上記で述べた造血系の他、胚幹細胞の分化および増殖を増強または低下させ得る。
【０８５０】
本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、身長、体重、毛の色、眼の色、皮膚、脂肪組織のパーセンテージ、色素沈着、大きさ、および形状（例えば、美容整形）などの哺乳類の特徴をモジュレートするのに用いてもよい。同様に、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、エネルギーの異化作用、同化作用、処理、利用および貯蔵に作用する哺乳類の代謝をモジュレートするのに用いてもよい。
【０８５１】
本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、バイオリズム、ｃａｒｉｃａｄｉｃ ｒｈｙｔｈｍｓ、意気消沈（鬱病を含む）、暴力傾向、痛みの許容、生殖能（好ましくはアクチビンまたはインヒビン様活性）、ホルモンまたは内分泌物レベル、食欲、性衝動、記憶、ストレス、またはその他の認識できる特性に影響を及ぼすことにより哺乳類の精神状態または身体状態を変化させるために用いてもよい。
【０８５２】
本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、貯蔵能、脂肪含量、脂質、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、補因子またはその他の栄養成分の低下または増強など、食品添加物または保存剤として用いてもよい。
【０８５３】
上記に挙げた用途は広範な種類の宿主に使用しうる。かかる宿主としては、限定されるものではないが、ヒト、ネズミ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、マイクロピッグ、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ヒト以外の霊長類、およびヒトが挙げられる。特定の実施形態では、宿主はマウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット、ハムスター、ブタ、ヒツジ、イヌ、またはネコである。好ましい実施形態では、宿主は哺乳類である。最も好ましい実施形態では、宿主はヒトである。
【０８５４】
以上、本発明を概括的に説明したが、以下の実施例を参照すればさらに容易に理解できるであろう。なお以下の実施例は説明のためのものであって、限定を意図するものではない。
【０８５５】
さらなる記載がなくとも、当業者ならば上記の説明および下記の例示的な実施例を用いて、本発明に記載された変更を行ったり利用したりすること、また特許請求の範囲の方法を実施したりすることができると思われる。以下、実施例を挙げて本発明の好ましい実施形態を具体的に示すが、本開示以外の他の部分を何ら限定するものではない。
【０８５６】
実施例
実施例１：　ＨＡ−ｈＧＨ融合タンパク質の調製
ＨＡ−ｈＧＨ融合タンパク質は、次のように調製した。
【０８５７】
ｈＧＨ ｃＤＮＡのクローニング
ＰＣＲ増幅によりヒト脳下垂体ｃＤＮＡライブラリー（カタログ番号ＨＬ１０９７ｖ， Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ）からｈＧＨ ｃＤＮＡを得た。Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３８０Ｂ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いて、ｈＧＨ ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅に好適な２種のオリゴヌクレオチドＨＧＨ１およびＨＧＨ２を合成した。
【０８５８】
2004506407.tif 000156
【０８５９】
ＨＧＨ１およびＨＧＨ２は、それぞれ２つおよび３つのヌクレオチドがｈＧＨ ｃＤＮＡ配列（Ｍａｒｔｉａｌ ｅｔ． ａｌ．， １９７９）の等価な部分と異なっていた。すなわち、ＰＣＲ増幅後、ＥｃｏＲＩ部位をｃＤＮＡの５’末端に導入し、ＢａｍＨ１部位をｃＤＮＡの３’末端に導入するようにした。さらに、ＨＧＨ２は、ｈＧＨ配列のすぐ下流にＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有していた。
【０８６０】
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ９６００およびＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ ＰＣＲキットを用いて、ｃＤＮＡライブラリーのファージ粒子から以下のように単離された一本鎖ＤＮＡ鋳型を用いてＰＣＲ増幅を行った。すなわち、１０μＬのファージ溶解緩衝液（２８０μｇ／ｍＬのＴＥ緩衝液中プロテイナーゼＫ）の添加、５５℃で１５分間、続いて８５℃で１５分間のインキュベーションを行うことにより、１０μＬのファージ粒子を溶解させた。氷上で１分間インキュベートした後、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心することによりファージの破砕物をペレット化した。ＰＣＲ混合物は、このＤＮＡ鋳型６μＬ、各プライマー０．１μＭおよび各デオキシリボヌクレオチド２００μＭを含有していた。ＰＣＲは、９４℃で３０秒間の変性、６５℃で３０秒のアニーリング、および７２℃で３０秒間の伸長を３０サイクルで行ったが、伸長時間は１サイクルごとに１秒ずつ増加させた。
【０８６１】
ゲル電気泳動により反応液を分析したところ、予想されたサイズ（５８９塩基対）の単一の産物が得られたことがわかった。
【０８６２】
Ｗｉｚａｒｄ ＰＣＲ Ｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ）を用いてＰＣＲ産物を精製し、次に、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させた。ゲル電気泳動によりＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片のさらなる精製を行った後、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＵＣ１９（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）中に産物をクローン化してｐＨＧＨ１を得た。ＥｃｏＲＩ ＨｉｎｄＩＩＩ領域のＤＮＡ配列決定を行ったところ、それぞれＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ部位の導入された５’および３’末端を除くと、ＰＣＲ産物はｈＧＨ配列（Ｍａｒｔｉａｌ ｅｔ ａｌ．， １９７９）と配列が同一であることがわかった。
【０８６３】
ｈＧＨ ｃＤＮＡの発現
２つの７５ｍｅｒオリゴヌクレオチドのアニーリングにより形成されたオリゴヌクレオチドリンカーをＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間に挿入することによって、ファージミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｂｅ（＋）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のポリリンカー配列を置換し、ｐＢＳＴ（＋）を形成させた。新しいポリリンカーは、特有のＮｏｔＩ部位を含んでいた。
【０８６４】
ＰＲＢＩプロモーター、ＨＡ／ＭＦα−１ハイブリッドリーダー配列をコードするＤＮＡ、ＨＡをコードするＤＮＡおよびＡＤＨ１ターミネーターを含むｐＡＹＥ３０９のＮｏｔＩ ＨＡ発現カセット（ＥＰ ４３１ ８８０）をｐＢＳＴ（＋）に移入してｐＨＡ１を形成させた。ＨｉｎｄＩＩＩによる消化それに続く再連結により、このプラスミドからＨＡコード配列を除去してｐＨＡ２を形成した。
【０８６５】
実施例１に記載されているようにｈＧＨ ｃＤＮＡのクローニングを行い、プロｈＧＨ配列および成熟ｈＧＨ配列の最初の８塩基対（ｂｐ）が欠如しているｈＧＨコード領域を得た。酵母からｈＧＨを分泌させるための発現プラスミドを構築するために、酵母プロモーター、シグナルペプチドおよびｈＧＨ配列の最初の８ｂｐを、クローン化されたｈＧＨ配列の５’末端に次のように連結させた。すなわち、２種の合成オリゴヌクレオチドＨＧＨ３およびＨＧＨ４（これらは、ＳｆａＮＩおよびＥｃｏＲＩ付着末端とアニーリングすることができる付着末端を有するＤＮＡの二本鎖断片を生成するように互いにアニーリングすることができる）を介してｐＨＡ１由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｆａＮＩ断片をｐＨＧＨＩ由来のＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片の５’末端に連結させた。
【０８６６】
2004506407.tif 000157
【０８６７】
以上のように形成されたＨｉｎｄＩＩＩ断片をＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＨＡ２中にクローン化してｐＨＧＨ２を作製し、ｈＧＨ ｃＤＮＡがＰＲＢＩプロモーターおよびＨＡ／ＭＦα−１融合リーダー配列（たとえば、国際公開ＷＯ ９０／０１０６３号を参照されたい）の下流に位置するようにした。ｈＧＨ ｃＤＮＡの下流にＡＤＨ１ターミネーターを含む、ｐＨＧＨ２に含まれるＮｏｔＩ発現カセットを、ＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５（Ｓｌｅｅｐ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：４２ （１９９０））中にクローン化してｐＨＧＨ１２を作製した。このプラスミドには、複製機能を提供するための２μｍの全プラスミドと形質転換体を選択するためのＬＥＵ２遺伝子とが含まれていた。
【０８６８】
形質転換によりｐＨＧＨ１２をＳ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｄ８８に導入し、１０ｍＬのＹＥＰＤ（１％ ｗ／ｖ酵母抽出物、２％ ｗ／ｖペプトン、２％ ｗ／ｖデキストロース）中、３０℃で個々の形質転換体を３日間増殖させた。
【０８６９】
細胞を遠心分離した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により上清を検査し、予想されたサイズのかつウェスタンブロットで抗−ｈＧＨ抗血清（Ｓｉｇｍａ， Ｐｏｏｌｅ， ＵＫ）により確認されるタンパク質を含有することを確認した。
【０８７０】
ＨＡ−ｈＧＨ融合タンパク質のクローニングおよび発現
ｈＧＨ ｃＤＮＡの５’末端にＨＡ ｃＤＮＡを融合するために、２種のオリゴヌクレオチドＨＧＨ７およびＨＧＨ８を介してｐＨＧＨ１ ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ｈＧＨ ｃＤＮＡの大部分を含む）にｐＨＡ１ ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂｓｕ３６１断片（ＨＡ ｃＤＮＡの大部分を含む）を連結させた。
【０８７１】
2004506407.tif 000158
【０８７２】
以上のように形成されたＨｉｎｄＩＩＩ断片をＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＨＡ２中にクローン化してｐＨＧＨ１０を作製し、このプラスミドのＮｏｔＩ発現カセットをＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５中にクローン化してｐＨＧＨ１６を作製した。
【０８７３】
ｐＨＧＨ１６を用いてＳ．セレビシエＤ８８を形質転換し、培養物の上清を上述したように分析した。ＨＡとｈＧＨとの合計質量に対応する約８８ｋＤの分子量を有する主要なバンドが観測された。抗−ＨＡおよび抗−ｈＧＨ抗血清（Ｓｉｇｍａ）を用いたウェスタンブロッティングにより、アルブミン融合タンパク質の２つの構成部分の存在を確認した。
【０８７４】
陽イオン交換クロマトグラフィーとそれに続く陰イオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィーにより培養液上清からアルブミン融合タンパク質を精製した。アミノ酸の配列決定を行ってタンパク質のＮ末端を分析することにより、予想されたアルブミン配列の存在を確認した。
【０８７５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ成長ホルモン活性アッセイ（Ｅａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ５：３６ （１９９５））を行ったところ、アルブミン融合タンパク質が十分なｈＧＨ活性を有することがわかった。本質的にヨーロッパ薬局方（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ；１９８７年， モノグラフ５５６）に記載されているように行った下垂体の切除されたラットの体重増加モデルにおいて、同一の活性単位数（上記のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを基準とする）で毎日投与した場合、融合分子はｈＧＨよりも効力が高かった。アルブミン融合タンパク質を４日に１回投与した別の実験では、ｈＧＨを毎日投与したときと類似した全体的成長応答を示した。１２５Ｉで標識されたタンパク質をラットに投与した薬物動態学的実験では、アルブミン融合タンパク質の循環半減期がｈＧＨと比較して約１０倍増加することが示された。
【０８７６】
Ｓ．セレビシエのインベルターゼ（ＳＵＣ２）リーダー配列をコードするＤＮＡでハイブリッドリーダーの配列を置き換えた類似のプラスミドを構築し、コードされるリーダー、およびＨＡ配列との結合（↓）が以下のとおりになるようにした。
【０８７７】
2004506407.tif 000159
　このプラスミドをＳ．セレビシエＤＢＩ中に導入したところ、このプラスミドは、ｐＨＧＨ１６で得られたのと同様のレベルでアルブミン融合タンパク質の発現および分泌を指令した。アルブミン融合タンパク質のＮ末端を分析したところ、成熟タンパク質からリーダー配列が正確かつ効率的に開裂されることがわかった。
【０８７８】
ｈＧＨ−ＨＡ融合タンパク質のクローニングおよび発現
ＨＡ ｃＤＮＡの５’末端にｈＧＨ ｃＤＮＡを融合するために、最初に部位特異的突然変異誘発法により、コード領域の５’末端の近傍にＥｃｏＮＩ部位を導入するようＨＡ ｃＤＮＡを改変した。これは、ｐＨＡＩから調製された一本鎖ＤＮＡ鋳型および合成オリゴヌクレオチドＬＥＵ４を用いてＫｕｎｋｅｌらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｕｚｙｍｏｌ． １５４：３６７ （１９８７））により行った。
【０８７９】
2004506407.tif 000160
【０８８０】
このオリゴヌクレオチドを用いた部位特異的突然変異誘発により、ＨＡ ｃＤＮＡのコード配列がＬｙｓ４からＬｅｕ４に変化した（Ｋ４Ｌ）。しかしながら、この変化は、２種のオリゴヌクレオチドＨＧＨ５およびＨＧＨ６を介してｐＨＧＨ２のＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を突然変異型ｐＨＡＩのＥｃｏＮＩ−ＮｏｔＩ断片に連結することによりｈＧＨ ｃＤＮＡをその後の５’末端への連結時に修復された。
【０８８１】
2004506407.tif 000161
【０８８２】
以上のように形成されたＮｏｔＩ断片をＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５中にクローン化してｐＨＧＨ１４を作製した。ｐＨＧＨ１４を用いてＳ．セレビシエＤ８８を形質転換し、培養液の上清を上述したように分析した。ｈＧＨとＨＡとの合計質量に対応する約８８ｋＤの分子量を有する主要なバンドが観測された。抗−ＨＡおよび抗−ｈＧＨ抗血清を用いたウェスタンブロッティングにより、アルブミン融合タンパク質の２つの構成部分の存在を確認した。
【０８８３】
陽イオン交換クロマトグラフィーとそれに続く陰イオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィーにより培養液上清からアルブミン融合タンパク質を精製した。アミノ酸の配列決定を行ってタンパク質のＮ末端を分析することにより、予想されたｈＧＨ配列の存在を確認した。
【０８８４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで調べたところ、このアルブミン融合タンパク質はｈＧＨ活性を保持しているが、Ｎ末端部分として全長ＨＡ（１〜５８５）およびＣ末端部分としてｈＧＨを含む上述したアルブミン融合タンパク質よりもかなり効力が低いことがわかった。
【０８８５】
ＨＡのドメインへのｈＧＨ融合物を発現させるためのプラスミドの構築
ＨＡの最初の２つのドメイン（残基１〜３８７）にｈＧＨ分子を融合させた融合ポリペプチドを作製した。オリゴヌクレオチドＨＧＨ１１およびＨＧＨ１２を介して、ＨＡのドメイン１および２に対するコード配列の大部分を含有するｐＨＡ１のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｓａｐｌ断片をｐＨＧＨＩのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に連結させることにより、ｈＧＨのＮ末端への融合を行った。
【０８８６】
2004506407.tif 000162
【０８８７】
以上のように形成されたＨｉｎｄＩＩＩ断片をＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＨＡ２中にクローン化してｐＨＧＨ３７を作製し、このプラスミドのＮｏｔＩ発現カセットをＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５中にクローン化した。
【０８８８】
得られたプラスミドｐＨＧＨ３８には、Ｓ．セレビシエＤＢ １中に形質転換したときに上清中への融合ポリペプチドの分泌を指令することが見いだされた発現カセットが含まれていた。抗−ＨＡおよび抗−ｈＧＨ抗血清を用いたウェスタンブロッティングにより、アルブミン融合タンパク質の２つの構成部分の存在を確認した。
【０８８９】
陽イオン交換クロマトグラフィーとそれに続くゲル浸透クロマトグラフィーにより培養液上清からアルブミン融合タンパク質を精製した。
【０８９０】
精製済みのタンパク質を用いてｉｎ ｖｉｖｏ試験を行ったところ、その循環半減期はｈＧＨの循環半減期よりも長く、Ｎ末端部分として全長ＨＡ（１〜５８５）およびＣ末端部分としてｈＧＨを含む上述したアルブミン融合タンパク質の循環半減期と同程度であることがわかった。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の結果、アルブミン融合タンパク質がｈＧＨ活性を保持していることが判明した。
【０８９１】
先に詳述したのと類似の手法を用いて、Ｎ末端部分としてＨＡの第１のドメイン（残基１〜１９４）およびＣ末端部分としてｈＧＨを含むアルブミン融合タンパク質をクローン化してＳ．セレビシエＤＢＬ中で発現させた。抗−ＨＡおよび抗−ｈＧＨ抗血清を用いた培養液上清のウェスタンブロッティングにより、アルブミン融合タンパク質の２つの構成部分の存在を確認した。
【０８９２】
フレキシブルリンカー配列を用いるｈＧＨへのＨＡの融合
オリゴヌクレオチドＨＧＨ１６、ＨＧＨ１７、ＨＧＨ１８およびＨＧＨ１９のクローニングにより、［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ〔式中、ｎは２または３のいずれかである〕の反復単位を含むフレキシブルリンカーをＨＡとｈＧＨアルブミンとの融合タンパク質の間に導入した。
【０８９３】
2004506407.tif 000163
【０８９４】
ＨＧＨ１６とＨＧＨ１７とのアニーリングによりｎ＝２のものが得られ、一方、ＨＧＨ１８をＨＧＨ１９にアニーリングさせることによりｎ＝３のものが得られた。アニーリングの後、ｐＨＧＨ１から単離されたＥｃｏＲＩ−Ｂｓｕ３６１断片と共に二本鎖オリゴヌクレオチドをＢｓｕ３６１で消化したｐＨＧＨ１０中にクローン化してそれぞれｐＨＧＨ５６（ｎ＝２）およびｐＨＧＨ５７（ｎ＝３）を作製した。これらのプラスミド由来のＮｏｔＩ発現カセットをＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５中にクローン化してそれぞれｐＨＧＨ５８およびｐＨＧＨ５９を作製した。
【０８９５】
ｐＨＧＨ５６およびｐＨＧＨ５７を作製するためのオリゴヌクレオチドのクローニングでは、リンカー配列中にＢａｍＨＩ部位を導入した。したがって、ｐＨＧＨ５６由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片とをｐＨＧＨ５７由来のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片とを連結させるか（ｎ＝１になる）またはｐＨＧＨ５７由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片とｐＨＧＨ５６由来のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片とを連結させる（ｎ＝２になる）ことにより、ｎ＝１およびｎ＝４であるリンカー配列を構築することが可能であった。これらの断片をｐＨＡ２のＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローン化することにより、ｐＨＧＨ６０（ｎ＝１）およびｐＨＧＨ６１（ｎ＝４）を得た。ｐＨＧＨ６０およびｐＨＧＨ６１由来のＮｏｔＩ発現カセットをＮｏｔＩで消化したｐＳＡＣ３５中にクローン化してそれぞれｐＨＧＨ６２およびｐＨＧＨ６３を作製した。
【０８９６】
ｐＨＧＨ５８、ｐＨＧＨ５９、ｐＨＧＨ６２およびｐＨＧＨ６３でＳ．セレビシエを形質転換することにより、上清中に融合ポリペプチドを分泌する形質転換体を得た。抗−ＨＡおよび抗−ｈＧＨ抗血清を用いたウェスタンブロッティングにより、アルブミン融合タンパク質の２つの構成部分の存在を確認した。
【０８９７】
陽イオン交換クロマトグラフィーとそれに続く陰イオン交換およびゲル浸透クロマトグラフィーにより培養液上清からアルブミン融合タンパク質を精製した。アミノ酸の配列決定を行ってタンパク質のＮ末端を分析することにより、予想されたアルブミン配列の存在を確認した。エレクトロスプレー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）質量分析法により精製済みタンパク質を分析したところ、上記のＨＡ−ｈＧＨ融合タンパク質と比較して３１５Ｄ（ｎ＝１）、６３０Ｄ（ｎ＝２）、９４５Ｄ（ｎ＝３）および１２６０Ｄ（ｎ＝４）の質量増加が確認された。精製済みタンパク質はｉｎ ｖｉｔｒｏで活性であることがわかった。
【０８９８】
ＨＡ−ｈＧＨ融合タンパク質の貯蔵寿命の増大： 方法
５％のウマ血清を含有する細胞培養培地中でＨＡ−ｈＧＨおよびｈＧＨを別々に１００〜２００μｇ／ｍｌの最終濃度になるように希釈し、４℃、３７℃または５０℃でインキュベートした。時間ゼロで、およびその後１週間ごとに、サンプルのアリコートをそれらの生物活性に関してＮｂ２細胞増殖アッセイで試験し、対照（時間ゼロのｈＧＨ溶液）の生物活性でデータを基準化した。他のアッセイでは、４℃、３７℃および５０℃のリン酸緩衝化生理食塩水中でｈＧＨおよびＨＡ−ｈＧＨをインキュベートした。
【０８９９】
Ｎｂ２細胞増殖アッセイ： これらの細胞の増殖は、ｈＧＨまたは他の乳腺刺激ホルモンに依存する。典型的な実験では、５〜１０％のウマ血清を含有するＤＭＥＭのような培地中、異なる濃度のｈＧＨまたはＨＡ−ｈＧＨの存在下で、１０４細胞／ウェルを９６ウェルプレートにプレーティングして、インキュベーター中に２４〜４８時間入れる。インキュベーション期間の後、１：１０容量のＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ、Ｈ２０中）をそれぞれのウェルに添加し、プレートをさらに６〜１６時間インキュベートする。増殖する細胞は、ＭＴＴを不溶性ホルマザンに変換する。このホルマザンを酸性イソプロパノールにより可溶化させ、生成した色をマイクロタイタープレートリーダーにより５７０ｎｍで測定する。ホルマザンの生成の程度は、細胞増殖のレベルを表す。
【０９００】
ＨＡ−ｈＧＨ融合タンパク質の貯蔵寿命の増大： 結果
アルブミンに治療用タンパク質を融合させると、水溶液中または他の溶液中での安定性が付与される。図１は、細胞培養培地中に３７℃で５週間まで保存した後に残存するＨＡ−ｈＧＨの生物活性の点からｈＡ融合タンパク質の貯蔵寿命の延長を示している。５％のウマ血清を含有する組織培養培地中に２００μｇ／ｍｌのＨＡ−ｈＧＨ溶液を調製し、この溶液を時間ゼロから開始して３７℃でインキュベートした。所定の時間でサンプルを採取し、２ｎｇ／ｍｌの最終濃度でＮｂ２細胞アッセイによりその生物活性を調べた。図１に示されているように、ＨＡ−ｈＧＨの生物活性は、３７℃で５週間インキュベートした後でも、本質的に完全な状態（実験変動の範囲内）のままである。この実験の対照として使用した組換えｈＧＨは、実験の第１週目でその生物活性を失った。
【０９０１】
図２は、４℃、３７℃または５０℃で細胞培養培地中に３週間まで保存した後のＨＡ−ｈＧＨの安定性を示している。時間ゼロで、５％のウマ血清を含有する組織培養培地中にＨＡ−ｈＧＨ溶液を調製し、４℃、３７℃および５０℃でインキュベートした。指定の期間でサンプルを採取して６０ｎｇ／ｍｌの最終濃度でＮｂ２細胞増殖アッセイにおいてその生物活性を測定した。ＨＡ−ｈＧＨは、インキュベーション後、試験したすべての温度で少なくとも３週間にわたりその初期活性の９０％超を保持しているのに対して、ｈＧＨは、１週間以内にその生物活性を失う。この活性レベルはさらに、３７℃で少なくとも７週間および５０℃で５週間保持される。これらの結果は、ＨＡ−ｈＧＨが温度ストレス下でさえも水溶液中でかなり安定であることを示している。
【０９０２】
図３Ａおよび３Ｂは、Ｎｂ２細胞増殖アッセイにおいてｈＧＨと比較したときのＨＡ−ｈＧＨの安定な生物活性を示している。時間ゼロで添加される段階的に増加させた濃度の組換えｈＧＨまたはＨＡ−ｈＧＨの存在下でＮｂ２細胞を増殖させた。ＭＴＴ方法により増殖の程度を測定する前に細胞を２４または４８時間インキュベートした。アッセイにおけるＨＡ−ｈＧＨの安定性が増大した結果として、２４時間での増殖活性（図３Ａ）が４８時間での増殖活性（図３Ｂ）と本質的に同じになるが、ｈＧＨでは、４８時間のインキュベーションの後、その増殖活性のかなりの減少がみられる（図３Ａおよび３Ｂ）。ｈＧＨと比較して、ＨＡ−ｈＧＨは、１日後、より低い生物学的効力を有しており、アルブミン融合タンパク質は、効力がｈＧＨの約１／５である。しかしながら、２日後、ＨＡ−ｈＧＨは、アッセイにおけるｈＧＨの短寿命が原因でｈＧＨと本質的に同一の効力を示す。アルブミン融合タンパク質としてのｈＧＨの安定性のこの増加は、タンパク質の生物活性に大きな予想外の影響を有する。アルブミン融合タンパク質の効力は短期間バイオアッセイでは融合されていない対応物よりもわずかに低いが、より長期のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイでは、その生物学的安定性のおかげではるかに高い生物活性が得られる。
【０９０３】
実施例２： ＨＡ融合タンパク質の調製
図４は、ＨＡ融合物を形成すべく治療用パートナーのｃＤＮＡをクローン化するためのベースベクターとして使用することができるプラスミド（ｐＰＰＣ０００５）のマップを示している。たとえば、このベクターを制限酵素Ｂｓｕ３６１／部分的ＨｉｎｄＩＩＩで消化させれば、Ｂｓｕ３６１部位を含むＨＡの最後の５アミノ酸をコードするように５’末端が改変されかつ２重停止コドンおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むように３’末端が改変されたｃＤＮＡを挿入することが可能になるであろう。他の例として、このベクターを制限酵素Ｂｓｕ３６１／， ＳｐｈＩで消化させれば、Ｂｓｕ３６１部位を含むＨＡの最後の５アミノ酸をコードするように５’末端が改変されかつ２重停止コドン、ＨｉｎｄＩＩＩ部位、およびＳｐｈＩ部位を含めてＳｐｈＩ部位までのＡＤＨＩターミネーター配列を含むように３’末端が改変されたｃＤＮＡを挿入することが可能になる。
【０９０４】
このプラスミドは、本発明のアルブミン融合タンパク質を作製する目的で治療用タンパク質またはその断片もしくは変異体をより容易にベクター中にクローン化しうるように、たとえば、制限部位を改変、付加または除去すべく当業者であれば容易に改変することが可能である。
【０９０５】
たとえば、治療用部分が（成熟）アルブミンタンパク質のＮ末端に配置されたアルブミン融合タンパク質を作製する目的で、図４に示されたｐＰＰＣ０００５中のＨＡをコードするＤＮＡの５’末端に制限部位を付加した。
【０９０６】
ｐＰＰＣ０００５中のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡの５’末端に、特有のＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位を付加することが望ましかったので、最初に、それらの同一部位をプラスミドから切り出すことが必要であった（ＡＤＨ１ターミネーター配列の３’側に位置する）。これは、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩでｐＰＰＣ０００５を切断し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで付着末端を充填し、そして平滑末端を再連結してｐＰＰＣ０００６を作製することにより達成された。
【０９０７】
ｐＰＰＣ０００６中のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡのちょうど５’側にある融合リーダー配列中へのＸｈｏおよびＣｌａ Ｉ制限部位の遺伝子操作は、２ラウンドのＰＣＲを用いて行った。第１のペアのオリゴヌクレオチドは、配列番号１９および配列番号２０のオリゴヌクレオチドである。配列番号１９は、融合リーダー配列およびＨＡタンパク質の開始部分をコードするＤＮＡ配列に関して４つの点突然変異を含有する。これらの突然変異は、融合リーダー配列中にＸｈｏＩ部位を形成しＨＡタンパク質をコードするＤＮＡのちょうど開始部分にＣｌａ Ｉ部位を形成するのに必要である。これらの４つの突然変異は以下に示されている配列中に下線を付している。ｐＰＰＣ０００６中で、これらの４つの位置のヌクレオチドは、５’から３’方向にＴ、Ｇ、Ｔ、およびＧである。
【０９０８】
2004506407.tif 000164
次に、上流フランキングプライマー５’−ＴＡＣＡＡＡＣＴＴＡＡＧＡＧＴＣＣＡＡＴＴＡＧＣ−３’（配列番号２１）および下流フランキングプライマー５’−ＣＡＣＴＴＣＴＣＴＡＧＡＧＴＧＧＴＴＴＣＡＴＡＴＧＴＣＴＴ−３’（配列番号２２）を用いて第２ラウンドのＰＣＲを行う。その後、得られたＰＣＲ産物を精製し、次いでＡｆｌＩおよびＸｂａＩで消化し、そしてｐＰＰＣ０００６中の同一部位に連結することによりｐＳｃＣＨＳＡを作製する。得られたプラスミドは、融合リーダー配列に遺伝子操作により導入されたＸｈｏＩ部位を有するであろう。ＸｈｏＩ部位が存在すると、融合リーダー配列の末端でＬＤＫＲからＬＥＫＲへの単一アミノ酸変化を生じる。５’ＳａｌＩ付着末端（ＸｈｏＩ末端との適合性がある）および３’ＣｌａＩ末端を有する治療用部分を含む断片をＸｈｏＩおよびＣｌａ Ｉ部位に連結させた場合、ＤからＥへの変化は、最終的なアルブミン融合タンパク質発現プラスミド中には存在しないであろう。ＳａｌＩにＸｈｏＩを連結させると、融合リーダー配列の元のアミノ酸配列が回復する。治療用タンパク質部分は、Ｋｅｘ２部位（Ｋｅｘ２は、融合リーダー配列の末端にある二塩基性アミノ酸配列ＫＲの後を開裂させる）の後かつＣｌａＩ部位の前に挿入されうる。
【０９０９】
さらに、治療用部分が（成熟）アルブミンタンパク質のＣ末端に配置されたアルブミン融合タンパク質を作製する目的で、ｐＳｃＣＨＳＡ中のＨＡをコードするＤＮＡの３’末端に４つの８塩基対制限部位を付加した。例として、ｐＳｃＣＨＳＡ中のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡの末端にあるＢｓｕ３６ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位の間にＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ、およびＰｍｅＩ制限部位を組み込むことが望ましいと思われた。これは、所望の制限部位を含有する２種の相補的合成オリゴヌクレオチド（配列番号１９および配列番号２０）を使用することにより達成された。
【０９１０】
2004506407.tif 000165
当技術分野で公知の方法を用いて、これらのオリゴヌクレオチドをアニーリングしてＢｓｕ３６ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ｐＳｃＣＨＳＡ中のＨＡタンパク質をコードするＤＮＡの末端に位置する同一部位に連結させることにより、ｐＳｃＮＨＳＡを作製することが可能である。
【０９１１】
アルブミン部分が治療用部分のＮ末端にあるアルブミン融合タンパク質を含むベクターの作製
ＨＡの最後の５アミノ酸をコードする（およびＢｓｕ３６Ｉ部位を含有する）ＤＮＡを、治療用タンパク質をコードするＤＮＡの５’末端に付加し、かつ停止コドンおよび適切なクローニング部位をコード配列の３’末端に付加するプライマーを用いて、治療用部分をコードするＤＮＡをＰＣＲ増幅することが可能である。たとえば、治療用タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するために使用されるフォワードプライマーは、配列５’−ａａｇｃｔＧＣＣＴＴＡＧＧＣＴＴＡ（Ｎ）１５−３’（配列番号２５）を有しうる。ここで、下線の付された配列はＢｓｕ３６Ｉ部位であり、大文字のヌクレオチドは成熟ＨＡタンパク質の最後の４アミノ酸（ＡＬＧＬ）をコードし、（Ｎ）１５は、対象の治療用タンパク質をコードする最初の１５ヌクレオチドと同じである。同様に、治療用タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するために使用されるリバースプライマーは、次の配列を有しうる。
【０９１２】
2004506407.tif 000166
ここで、イタリック体のヌクレオチドはＰｍｅＩ部位であり、２重下線の付されたヌクレオチドはＦｓｅＩ部位であり、１重下線の付された部分はＰｍｅＩ部位であり、枠で囲まれたヌクレオチドは２つの直列停止コドンの逆方向相補配列であり、（Ｎ）１５は、対象の治療用タンパク質をコードする最後の１５ヌクレオチドの逆方向相補配列と同じである。ＰＣＲ産物が増幅されれば、それをＢｓｕ３６Ｉおよび（ＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ、またはＰｍｅＩ）のうちの１つで切断してｐＳｃＮＨＳＡ中に連結させることが可能である。
【０９１３】
アルブミン部分が治療用部分のＮ末端にあるアルブミン融合タンパク質を含むベクターの作製
融合リーダー配列の最後の３アミノ酸をコードする（およびＳａｌＩ部位を含有する）ＤＮＡを、治療用タンパク質およびＨＡの最初の数個のアミノ酸をコードする（およびＣｌａＩ部位を含有する）ＤＮＡの５’末端に付加するプライマーを用いて、治療用部分をコードするＤＮＡをＰＣＲ増幅することが可能である。たとえば、治療用タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するために使用されるフォワードプライマーは、配列５’−ａｇｇａｇｃｇｔｃＧＡＣＡＡＡＡＧＡ（Ｎ）１５−３’（配列番号２７）を有しうる。ここで、下線の付された配列はＳａｌＩ部位であり、大文字のヌクレオチドは融合リーダー配列の最後の３アミノ酸（ＤＫＲ）をコードし、（Ｎ）１５は、対象の治療用タンパク質をコードする最初の１５ヌクレオチドと同じである。同様に、治療用タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するために使用されるリバースプライマーは、以下の配列を有しうる。
【０９１４】
2004506407.tif 000167
ここで、イタリック体のヌクレオチドはＣｌａＩ部位であり、下線の付されたヌクレオチドは、ＨＡの最初の９アミノ酸（ＤＡＨＫＳＥＶＡＨ）をコードするＤＮＡの逆方向相補配列であり、（Ｎ）１５は、対象の治療用タンパク質をコードする最後の１５ヌクレオチドの逆方向相補配列と同じである。ＰＣＲ産物が増幅されれば、それをＳａｌＩおよびＣｌａＩで切断して、ＸｈｏＩおよびＣｌａ Ｉで消化されたｐＳｃＣＨＳＡに連結させることが可能である。
【０９１５】
酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現
次に、ｐＳｃＣＨＳＡまたはｐＳｃＮＨＳＡから作製された、Ｎ末端またはＣ末端アルブミン融合タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡを含有するＮｏｔ Ｉ断片を、ｐＳＡＣ３５のＮｏｔＩ部位にクローン化することが可能である。
【０９１６】
哺乳動物細胞系からのアルブミン融合タンパク質の発現
このほかに、哺乳動物培養系により好適なｐＣ４ベクター中にＨＳＡ遺伝子をクローン化してプラスミドｐＣ４：ＨＳＡを形成した。より具体的には、ＨＳＡタンパク質の成熟形態をコードするＤＮＡ（たとえば、プラスミドｐＳｃＣＨＳＡ中のＤＮＡ）の５’末端にアニーリングし、ＢａｍＨＩ（イタリック体で以下に示されている）およびＨｉｎｄＩＩＩ（１重下線を付して以下に示されている）クローニング部位が組み込まれ、コザック配列（２重下線を付して以下に示されている）および天然ＨＳＡシグナルペプチド（ＭＫＷＶＳＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳＲＳＬＤＫＲ、配列番号２９）をコードするＤＮＡ（以下に太字で示されている）が連結された５’プライマー（配列番号３０）と、ＨＳＡタンパク質の成熟形態をコードするＤＮＡの３’末端にアニーリングし、Ａｓｐ７１８制限部位（以下に太字で示されている）が組み込まれた３’プライマー（配列番号３１）とを用いて、成熟ＨＳＡ遺伝子をＰＣＲ増幅することにより、ｐＣ４ＨＳＡを作製した。配列番号３０中の天然ヒト血清アルブミンリーダー配列をコードするＤＮＡにはまた、以下で枠に囲まれたＸｈｏＩ部位を導入する改変が含まれている。
【０９１７】
2004506407.tif 000168
次に、このＰＣＲ産物（１．８５ｋｂ）を精製してＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８で消化し、そしてｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）中の同一部位にクローン化してｐＣ４：ＨＳＡを生成させる。
【０９１８】
アルブミン部分が治療用部分のＣ末端にあるアルブミン融合タンパク質を含むベクターの、ｐＣ４：ＨＳＡベクターを用いた作製
治療用タンパク質部分がアルブミン配列のＮ末端にあるアルブミン融合タンパク質に関して、ｐＣ４：ＨＳＡを用いて、それ自体のシグナル配列を有する治療用タンパク質をコードするＤＮＡをＢａｍ ＨＩ（またはＨｉｎｄＩＩＩ）とＣｌａＩ部位との間にクローン化することができる。ＢａｍＨＩまたはＨｉｎｄ ＩＩＩ部位のいずれかにクローン化する場合、サブクローン化される治療用タンパク質をコードするＤＮＡの翻訳開始コドンの前にコザック配列（ＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧ）を組み込むことを忘れないようにする。治療用タンパク質がシグナル配列を有していない場合には、その治療用タンパク質をコードするＤＮＡをＸｈｏＩとＣｌａＩ部位との間にクローン化してもよい。ＸｈｏＩ部位を用いる場合、次の５’（配列番号３２）および３’（配列番号３３）ＰＣＲプライマーを使用することが可能である。
【０９１９】
2004506407.tif 000169
【０９２０】
配列番号３２において、下線の付された配列はＸｈｏＩ部位であり、ＸｈｏＩ部位およびＸｈｏＩ部位に続くＤＮＡは、天然ヒト血清アルブミンのリーダー配列の最後の７アミノ酸をコードする。配列番号３３において、下線の付された配列はＣｌａＩ部位であり、ＣｌａＩ部位およびそれに続くＤＮＡは、成熟ＨＳＡタンパク質（配列番号１８）の最初の１０アミノ酸をコードするＤＮＡの逆方向相補配列である。配列番号３２において、「（Ｎ）１８」は、対象の治療用タンパク質をコードする最初の１８ヌクレオチドと同じＤＮＡである。配列番号３３において、「（Ｎ）１８」は、対象の治療用タンパク質をコードする最後の１８ヌクレオチドをコードするＤＮＡの逆方向相補配列である。これらの２種のプライマーを用いて、対象の治療用タンパク質をＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物を精製し、それをＸｈｏＩおよびＣｌａＩ制限酵素で消化し、次に、それをｐＣ４：ＨＳＡベクター中のＸｈｏＩおよびＣｌａＩ部位にクローン化する。
【０９２１】
アルブミン部分が治療用部分のＮ末端にあるアルブミン融合タンパク質を含むベクターの、ｐＣ４：ＨＳＡベクターを用いた作製
治療用タンパク質部分がアルブミン配列のＮ末端にあるアルブミン融合タンパク質に関して、ｐＣ４：ＨＳＡを用いて、治療用タンパク質をコードするＤＮＡをＢｓｕ３６ＩとＡｓｃＩ制限部位との間にクローン化することができる。Ｂｓｕ３６ＩおよびＡｓｃＩ中にクローン化する場合、酵母ベクター系にクローン化するために使用されるのと同一のプライマー設計（配列番号２５および２６）を利用することが可能である。
【０９２２】
ｐＣ４ベクターは、ＣＨＯ細胞からアルブミン融合タンパク質を発現させるのに特に好適である。発現に関して、ＮＳＯ細胞などの他の種類の哺乳動物細胞では、アルブミン融合タンパク質をコードするＤＮＡを含有するＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片（治療用タンパク質をコードするＤＮＡがすでにヒト血清アルブミン（の成熟形態）をコードするＤＮＡとフレームをあわせてクローン化されているｐＣ４ベクターに由来する）を他の発現ベクター（たとえば、本明細書に記載されている任意の哺乳動物発現ベクター）中にサブクローン化することが有用なこともある。
【０９２３】
実施例３： ＨＡ−サイトカインまたはＨＡ−増殖因子融合タンパク質の調製（ＥＰＯ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦなど）
対象のサイトカインまたは増殖因子、たとえばＥＰＯ、のｃＤＮＡは、さまざまな手段により単離することができる。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによりおよびＰＣＲにより、いずれも標準的方法で単離することができる。これらのタンパク質のいずれについてもそのヌクレオチド配列は公知であり、たとえば、米国特許第４，７０３，００８号、同第４，８１０，６４３号および同第５，９０８，７６３号に記載のものが利用できる。ＨＡのｃＤＮＡを含有するベクター中に上記ｃＤＮＡをクローン化すべく、オリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、ｃＤＮＡの５’および３’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずにＮまたはＣ末端で行うことができる。ＥＰＯ（または他のサイトカイン）ｃＤＮＡは、ｐＰＰＣ０００５（図４）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローン化され、次いで、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドｐＳＡＣ３５に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現が可能となる。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製し、その生物活性に関して試験を行うことができる。哺乳動物細胞系における発現でも、使用する発現カセットとして哺乳動物のプロモーター、リーダー配列およびターミネーターを利用する点を除けば、類似の手順を踏む（実施例２参照）。その場合、この発現カセットを切り出して、哺乳動物細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
【０９２４】
実施例４： ＨＡ−ＩＦＮ融合タンパク質（ＩＦＮαなど）の調製
対象のインターフェロン（ＩＦＮαなど）のｃＤＮＡは、さまざまな手段により単離することができる。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによりおよびＰＣＲにより、いずれも標準的方法で単離することができる。ただし、これらに限定されるものではない。ＩＦＮαのようなインターフェロンのヌクレオチド配列は公知であり、たとえば、米国特許第５，３２６，８５９号および同第４，５８８，５８５号、ＥＰ ３２ １３４号、ならびにＧｅｎＢａｎｋのような公共のデータベース中のものが利用できる。ＨＡのｃＤＮＡを含有するベクター中に上記ｃＤＮＡをクローン化すべくオリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、ｃＤＮＡの５’および３’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずに、ＨＡ配列のＮまたはＣ末端で行うことができる。ＩＦＮα（または他のインターフェロン）ｃＤＮＡは、ｐＰＰＣ０００５（図４）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローン化され、次いで、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドｐＳＡＣ３５に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現が可能となる（図８参照）。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製し、その生物活性に関して試験を行うことができる。哺乳動物細胞系における発現でも、使用する発現カセットとして哺乳動物のプロモーター、リーダー配列およびターミネーターを利用する点を除けば、類似の手順を踏む（実施例２参照）。その場合、この発現カセットを切り出して、哺乳動物細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
【０９２５】
バイアルからの最大のタンパク質回収率
本発明のアルブミン融合タンパク質は、低濃度でパッケージングした場合でさえも、高度の安定性を有する。さらに、低いタンパク質濃度にもかかわらず、バイアル壁への結合を最小限に抑えるべく添加される他のタンパク質を水溶液が含んでいない場合でさえも、良好な融合タンパク質回収率が観測される。図５は、バイアルに保存されたＨＡ−ＩＦＮ溶液の回収率をストック溶液の場合と比較している。６または３０μｇ／ｍｌのＨＡ−ＩＦＮ溶液をバイアルに入れて４℃で保存した。４８または７２時間後、最初の１０ｎｇに相当する容量のサンプルを取り出し、ＩＦＮサンドイッチＥＬＩＳＡで測定した。その推定値を、高濃度ストック溶液の場合と比較した。示されているように、これらのバイアル中では本質的にサンプルの損失はない。このことから、バイアル壁へのサンプル損失を防止するためにアルブミンのような外因性物質を添加することは必要ではないことがわかる。
【０９２６】
ＨＡ−α−ＩＦＮ融合物のｉｎ ｖｉｖｏ安定性および生物学的利用能
ＨＡ−α−ＩＦＮ融合分子のｉｎ ｖｉｖｏ安定性および生物学的利用能を調べるために、図６および７に記載されている用量および時間点で精製済みの融合分子（酵母由来）をサルに投与した。ＨＡ−α−ＩＦＮ融合物から製剤化された医薬組成物は、図６および７に例示される血清半減期の延長および生物学的利用能を呈する可能性がある。したがって、医薬組成物は、天然のα−インターフェロン分子と比較して、より低いα−インターフェロン活性のより低い用量を含有するように製剤化しうる。
【０９２７】
ＨＡ−α−ＩＦＮ融合物を含有する医薬組成物は、α−ＩＦＮの投与によりモジュレートすることのできる任意の疾患または症状を示す患者において疾患を治療または予防するために使用しうる。そのような疾患としては、ヘアリー細胞白血病、カポジ肉腫、生殖器および肛門疣贅、慢性Ｂ型肝炎、慢性非Ａ型非Ｂ型肝炎（特に、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎）、慢性骨髄性白血病、腎細胞癌、膀胱癌、卵巣および子宮頚癌、皮膚癌、再発性呼吸器乳頭腫症、非ホジキンおよび皮膚Ｔ細胞リンパ腫、黒色腫、多発性骨髄腫、ＡＩＤＳ、多発性硬化症、膠芽細胞腫など（Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ａｌｐｈａ， ＡＨＦＳ Ｄｒｕｇ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ， １９９７を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０９２８】
したがって、本発明は、ヒトに投与するのに適切な用量で製剤化されたＨＡ−α−ＩＦＮ融合型のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含有する医薬組成物を包含する。本発明はまた、少なくとも１種のＨＡ−α−ＩＦＮ融合型のタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを含有する医薬組成物を投与するステップを少なくとも含む、そのような治療の必要な患者の治療方法をも包含する。
【０９２９】
二機能性ＨＡ−α−ＩＦＮ融合物
二機能性ＨＡ−α−ＩＦＮ融合タンパク質を発現させるための挿入を行うために、図８のＨＡ−α−ＩＦＮ発現ベクターを改変する。たとえば、二重停止コドンを除去するかまたはコード配列の下流に移動させた後、対象の第２のタンパク質のｃＤＮＡを「ｒＨＡ−ＩＦＮ」配列の下流にフレームをあわせて挿入しうる。
【０９３０】
二機能性ＨＡ−α−ＩＦＮ融合タンパク質の１形態では、Ｂリンパ球刺激性タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号４４５５１３９）またはポリペプチドに対する抗体またはフラグメントを融合分子のＨＡ部分の一方の末端に融合させうる。この二機能性タンパク質は、融合物のα−ＩＦＮ部分により引き起こされるいかなる免疫応答をもモジュレートするのに役立つ。
【０９３１】
実施例５： ＨＡ−ホルモン融合タンパク質（インスリン、ＬＨ、ＦＳＨなど）の調製
対象のホルモン（インスリンなど）のｃＤＮＡは、さまざまな手段により単離することができる。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによりおよびＰＣＲにより、いずれも標準的方法で単離することができる。ただし、これらに限定されるものではない。これらのタンパク質はいずれもそのヌクレオチド配列が公知であり、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋのような公共のデータベース中のものが利用できる。ＨＡのｃＤＮＡを含有するベクター中に上記ｃＤＮＡをクローン化すべく、オリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、ｃＤＮＡの５’および３’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずにＮまたはＣ末端で行うことができる。ホルモンｃＤＮＡは、ｐＰＰＣ０００５（図４）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローン化され、次いで、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドｐＳＡＣ３５に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現が可能となる。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製し、その生物活性に関して試験を行うことができる。哺乳動物細胞系における発現でも、使用する発現カセットとして哺乳動物のプロモーター、リーダー配列およびターミネーターを利用する点を除けば、類似の手順を踏む（実施例２参照）。その場合、この発現カセットを切り出して、哺乳動物細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
【０９３２】
実施例６： ＨＡ−ＴＮＦ受容体のようなＨＡ−可溶性受容体またはＨＡ−結合性タンパク質型の融合タンパク質の調製
対象の可溶性受容体または結合性タンパク質（ＴＮＦ受容体など）のｃＤＮＡは、さまざまな手段により単離することができる。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによりおよびＰＣＲにより、いずれも標準的方法で単離することができる。ただし、これらに限定されるものではない。これらのタンパク質はいずれもそのヌクレオチド配列が公知であり、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ中のものが利用できる。ＨＡのｃＤＮＡを含有するベクター中に上記ｃＤＮＡをクローン化すべく、オリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、ｃＤＮＡの５’および３’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずにＮまたはＣ末端で行うことができる。受容体ｃＤＮＡは、ｐＰＰＣ０００５（図４）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローン化され、次いで、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドｐＳＡＣ３５に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現が可能となる。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製し、その生物活性に関して試験を行うことができる。哺乳動物細胞系における発現でも、使用する発現カセットとして哺乳動物のプロモーター、リーダー配列およびターミネーターを利用する点を除けば、類似の手順を踏む（実施例２参照）。その場合、この発現カセットを切り出して、哺乳動物細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
【０９３３】
実施例７： ＨＡ−ＩＧＦ−１融合タンパク質のようなＨＡ−増殖因子の調製
対象の増殖因子（ＩＧＦ−１など）のｃＤＮＡは、さまざまな手段により単離することができる。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによりおよびＰＣＲにより、いずれも標準的方法で単離することができる（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０００６０９参照）。ただし、これらに限定されるものではない。ＨＡのｃＤＮＡを含有するベクター中に上記ｃＤＮＡをクローン化すべく、オリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、ｃＤＮＡの５’および３’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずにＮまたはＣ末端で行うことができる。増殖因子ｃＤＮＡは、ｐＰＰＣ０００５（図４）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローン化され、次いで、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドｐＳＡＣ３５に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現が可能となる。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製し、その生物活性に関して試験を行うことができる。哺乳動物細胞系における発現でも、使用する発現カセットとして哺乳動物のプロモーター、リーダー配列およびターミネーターを利用する点を除けば、類似の手順を踏む（実施例２参照）。その場合、この発現カセットを切り出して、哺乳動物細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
【０９３４】
実施例８： ＨＡ−一本鎖抗体融合タンパク質の調製
一本鎖抗体は、いくつかの方法で作製される。たとえば、ファージライブラリーからの選択、抗体のｃＤＮＡをクローン化し、可変領域をクローン化するためのプライマーとしてフランキング定常領域を用いるかまたは任意の特異的抗体の可変領域に対応するオリゴヌクレオチドを合成することによる特異的抗体の可変領域のクローニングによって作製される。ただし、これに限定されるものではない。ＨＡのｃＤＮＡを含有するベクター中に上記ｃＤＮＡをクローン化すべく、オリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、ｃＤＮＡの５’および３’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずにＮまたはＣ末端で行うことができる。細胞ｃＤＮＡは、ｐＰＰＣ０００５（図４）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローン化され、次いで、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドｐＳＡＣ３５に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現が可能となる。
【０９３５】
本発明の融合分子において、ＶＨおよびＶＬは、以下の手段のうちの１つまたはそれらの組み合わせにより連結させることができる：すなわちＶＨのＣ末端とＶＬのＮ末端との間のペプチドリンカー；分泌時に２つが開裂分離され次いで自己会合するように設けられたＶＨとＶＬとの間のＫｅｘ２ｐプロテアーゼ開裂部位；ならびにＶＨおよびＶＬがそれらの間にジスルフィド結合を形成して両者が互いに連結できるように配置されたシスチン残基（図１４を参照）。他の手段としては、ＨＡまたはＨＡドメイン断片のＮ末端にＶＨを、ＨＡまたはＨＡドメイン断片のＣ末端にＶＬを配置することがある。
【０９３６】
次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製し、その生物活性に関して試験を行うことができる。哺乳動物細胞系における発現でも、使用する発現カセットとして哺乳動物のプロモーター、リーダー配列およびターミネーターを利用する点を除けば、類似の手順を踏む（実施例２参照）。その場合、この発現カセットを切り出して、哺乳動物細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。このように産生された抗体を培地から精製し、そして標準的な免疫化学的方法を用いて、その抗原への抗体の結合に関して試験を行うことができる。
【０９３７】
実施例９： ＨＡ−細胞接着分子融合タンパク質の調製
対象の細胞接着分子のｃＤＮＡは、さまざまな手段により単離することができる。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによりおよびＰＣＲにより、いずれも標準的方法で単離することができる。ただし、これらに限定されるものではない。既知の細胞接着分子のヌクレオチド配列は公知であり、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ中のものが利用できる。ＨＡのｃＤＮＡを含有するベクター中に上記ｃＤＮＡをクローン化すべく、オリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、ｃＤＮＡの５’および３’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずにＮまたはＣ末端で行うことができる。細胞接着分子ｃＤＮＡは、ｐＰＰＣ０００５（図４）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローン化され、次いで、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドｐＳＡＣ３５に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現が可能となる。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製し、その生物活性に関して試験を行うことができる。哺乳動物細胞系における発現でも、使用する発現カセットとして哺乳動物のプロモーター、リーダー配列およびターミネーターを利用する点を除けば、類似の手順を踏む（実施例２参照）。その場合、この発現カセットを切り出して、哺乳動物細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
【０９３８】
実施例１０： ＨＡ融合タンパク質としての抑制性因子およびペプチド（ＨＡ−抗ウイルス薬、ＨＡ−抗生物質、ＨＡ−酵素阻害剤およびＨＡ−抗アレルギー性タンパク質など）の調製
対象のペプチド（抗生物質ペプチドなど）のｃＤＮＡは、さまざまな手段により単離することができる。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによりおよびＰＣＲにより、いずれも標準的方法で単離することができる。ただし、これらに限定されるものではない。ＨＡのｃＤＮＡを含有するベクター中に上記ｃＤＮＡをクローン化すべく、オリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、ｃＤＮＡの５’および３’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずにＮまたはＣ末端で行うことができる。ペプチドｃＤＮＡは、ｐＰＰＣ０００５（図４）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローン化され、次いで、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドｐＳＡＣ３５に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現が可能となる。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製し、その生物活性に関して試験を行うことができる。哺乳動物細胞系における発現でも、使用する発現カセットとして哺乳動物のプロモーター、リーダー配列およびターミネーターを利用する点を除けば、類似の手順を踏む（実施例２参照）。その場合、この発現カセットを切り出して、哺乳動物細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
【０９３９】
実施例１１： ターゲティングＨＡ融合タンパク質の調製
対象のタンパク質に対するｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリーから単離するかまたはいくつかの重複オリゴヌクレオチドを用いて標準的な分子生物学的方法で合成的に作製することができる。都合のよい制限部位を形成すべく、さらにまたｈＧＨについて記載した方法と同じようにしてアルブミンｃＤＮＡへのタンパク質ｃＤＮＡの結合を可能にすべく、適切なヌクレオチドを遺伝子工学的にｃＤＮＡに導入することができる。また、細胞内部のタンパク質に向かうことのできる一本鎖抗体またはペプチド（たとえば、核局在化シグナル）のようなターゲッティングタンパク質またはペプチドｃＤＮＡをアルブミンの他方の末端に融合させることができる。対象のタンパク質およびターゲッティングペプチドは、アルブミンｃＤＮＡとの融合を可能にするｐＰＰＣ０００５（図４）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローン化される。このようにして、アルブミンのＮ−およびＣ−末端の両方を他のタンパク質に融合させる。次いで、融合されたｃＤＮＡをｐＰＰＣ０００５から切り出して、ｐＳＡＣ３５のようなプラスミドに挿入し、酵母においてアルブミン融合タンパク質を発現させる。上記の手順はすべて、分子生物学における標準的方法を用いて行うことができる。酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製し、その生物活性およびそのターゲッティング活性に関して適切な生化学的および生物学的試験により調べることができる。
【０９４０】
実施例１２： ＨＡ−酵素融合物の調製
対象の酵素のｃＤＮＡは、さまざまな手段により単離することができる。たとえば、ｃＤＮＡライブラリーから、一連の重複する合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲによりおよびＰＣＲにより、いずれも標準的方法で単離することができる。ただし、これらに限定されるものではない。ＨＡのｃＤＮＡを含有するベクター中に上記ｃＤＮＡをクローン化すべく、オリゴヌクレオチドリンカーを使用できるように、ｃＤＮＡの５’および３’末端を遺伝子操作して制限部位を形成することができる。これは、スペーサー配列を用いてまたは用いずにＮまたはＣ末端で行うことができる。酵素ｃＤＮＡは、ｐＰＰＣ０００５（図４）、ｐＳｃＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、またはｐＣ４：ＨＳＡのようなベクター中にクローン化され、次いで、それらから完全な発現カセットが切り出され、プラスミドｐＳＡＣ３５に挿入されて、酵母におけるアルブミン融合タンパク質の発現が可能となる。次に、酵母から分泌されたアルブミン融合タンパク質を培地から回収して精製し、その生物活性に関して試験を行うことができる。哺乳動物細胞系における発現でも、使用する発現カセットとして哺乳動物のプロモーター、リーダー配列およびターミネーターを利用する点を除けば、類似の手順を踏む（実施例２参照）。その場合、この発現カセットを切り出して、哺乳動物細胞系のトランスフェクションに好適なプラスミドに挿入する。
【０９４１】
実施例１３： アルブミン融合タンパク質の細菌における発現
ＤＮＡ配列の５’および３’末端に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、細菌シグナル配列を含む本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを増幅し、挿入断片（インサート）を合成する。インサートをコードするポリヌクレオチドを増幅するために使用されるプライマーは、好ましくは、増幅された産物を発現ベクター中にクローン化するためにプライマーの５’末端にＢａｍＨＩおよびＸｂａＩのような制限部位を含有しているとよい。たとえば、ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩは、細菌発現ベクターｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）上の制限酵素部位に相当する。このプラスミドベクターは、抗生物質耐性（Ａｍｐｒ）、細菌複製起点（ｏｒｉ）、ＩＰＴＧ調節性プロモーター／オペレーター（Ｐ／Ｏ）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、６−ヒスチジンタグ（６−Ｈｉｓ）、および制限酵素クローニング部位をコードしている。
【０９４２】
ｐＱＥ−９ベクターをＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで消化し、そして細菌ＲＢＳで開始されるリーディングフレームを保持するｐＱＥ−９ベクター中に増幅断片を連結させる。次に、連結混合物を用いて、プラスミドｐＲＥＰ４の複数のコピーを含有する大腸菌Ｍ１５／ｒｅｐ４株（Ｑｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．）を形質転換する。ｐＲＥＰ４は、ｌａｃＩリプレッサーを発現するとともにカナマイシン耐性（Ｋａｎｒ）を付与する。ＬＢプレートにおけるそれらの増殖能力により形質転換体を同定し、アンピシリン／カナマイシン耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離して制限分析により確認する。
【０９４３】
所望の構築物を含有するクローンを、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方を添加したＬＢ培地中で液体培養により一晩（Ｏ／Ｎ）増殖させる。一晩（Ｏ／Ｎ）培養物を用いて１：１００から１：２５０の比で大量培養液に接種する。０．４〜０．６の間の光学濃度６００（Ｏ．Ｄ．６００）になるまで細胞を増殖させる。次に、１ｍＭの最終濃度になるようにＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加する。ＩＰＴＧは、ｌａｃＩリプレッサーを不活性化することによりＰ／Ｏ除去を誘発して遺伝子発現の増大をもたらす。
【０９４４】
細胞をさらに３〜４時間増殖させる。次に、遠心分離（６０００×ｇで２０分間）により細胞を回収する。４℃で３〜４時間攪拌することにより、カオトロピック剤６モル当量のグアニジンＨＣｌ中にまたは好ましくは８Ｍ尿素および濃度０．１４Ｍ超の２−メルカプトエタノール中に細胞ペレットを可溶化させる（たとえば、Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １７９：３７９−３８７（１９８９）を参照されたい）。遠心分離により細胞破砕物を除去し、ポリペプチドを含有する上清をニッケル−ニトリロ−トリ−酢酸（「Ｎｉ−ＮＴＡ」）アフィニティー樹脂カラム（ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．，前掲から入手可能）上に充填する。６×Ｈｉｓタグを有するタンパク質は、高い親和力でＮｉ−ＮＴＡ樹脂に結合するので、単純なワンステップ手順で精製することができる（詳細についてはＴｈｅ ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｔ （１９９５） ＱＩＡＧＥＮ， Ｉｎｃ．，前掲を参照されたい）。
【０９４５】
簡潔に述べると、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ， ｐＨ８中のカラム上に上清を充填する。最初に１０倍量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ（ｐＨ８）でカラムを洗浄し、次に１０倍量の６Ｍグアニジン−ＨＣｌ ｐＨ６で洗浄し、最後に６Ｍグアニジン−ＨＣｌ， ｐＨ５でポリペプチドを溶出させる。
【０９４６】
次に、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）または５０ｍＭ 酢酸ナトリウム， ｐＨ６緩衝液＋２００ｍＭ ＮａＣｌに対して透析することにより、精製済みのタンパク質を再生する。あるいは、Ｎｉ−ＮＴＡカラムに固定した状態で、タンパク質をうまくリフォールディングさせることもできる。条件は、たとえば、次のとおりである。すなわち、プロテアーゼ阻害剤を含有する５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７．４中の直線的６Ｍ−１Ｍ尿素勾配を用いて再生する。再生は１．５時間以上かけて行わなければならない。再生の後、２５０ｍＭイミダゾールの添加によりタンパク質を溶出させる。ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６緩衝液＋２００ｍＭ ＮａＣｌに対する最終透析ステップによりイミダゾールを除去する。精製済みのタンパク質は、４℃で保存するかまたは−８０℃で凍結させる。
【０９４７】
上記の発現ベクターに加えて、本発明にはさらに、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたファージオペレーターおよびプロモーターエレメントを含有するｐＨＥ４ａ（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４５、１９９８年２月２５日寄託）と呼ばれる発現ベクターが包含される。このベクターは、１）選択マーカーとしてのネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、２） 大腸菌複製起点、３） Ｔ５ファージプロモーター配列、４） ２つのｌａｃオペレーター配列、５） シャイン・ダルガーノ配列、および６）ラクトースオペロンリプレッサー遺伝子（ｌａｃＩｑ）を含有する。複製起点（ｏｒｉＣ）は、ｐＵＣ１９（ＬＴＩ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）に由来する。プロモーターおよびオペレーター配列は、合成により作製される。
【０９４８】
ＮｄｅＩと、ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８を用いてベクター（ｐＨＥ４ａ）を制限切断し、制限切断された産物をゲル上で泳動させ、そしてより大きな断片を単離することにより、ＤＮＡをｐＨＥ４ａ中に挿入することができる（スタッファー断片は約３１０塩基対でなければならない）。本明細書に記載のまたは当技術分野で公知のＰＣＲプロトコルに従って、ＮｄｅＩ（５’プライマー）およびＸｂａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ、またはＡｓｐ７１８（３’プライマー）に対する制限部位を有するＰＣＲプライマーを用いて、ＤＮＡインサートを作製する。ＰＣＲインサートをゲル精製し、適合する酵素で制限切断する。標準的なプロトコルに従って、インサートとベクターとを連結させる。
【０９４９】
遺伝子工学的に操作されたベクターを上記のプロトコルで代用して、細菌系でタンパク質を発現させてもよい。
【０９５０】
実施例１４： 哺乳動物細胞におけるアルブミン融合タンパク質の発現
本発明のアルブミン融合タンパク質は、哺乳動物細胞中で発現させることができる。典型的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーターエレメント、タンパク質コード配列、ならびに転写の終了および転写産物のポリアデニル酸付加に必要なシグナルを含有している。さらなるエレメントとしては、エンハンサー、コザック配列、ならびにＲＮＡスプライシングのための供与部位と受容部位とに挟まれた介在配列が挙げられる。高効率の転写は、ＳＶ４０由来の初期および後期プロモーター、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＨＴＬＶＩ、ＨＩＶＩなど）由来の長末端反復配列（ＬＴＲ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターにより達成される。しかしながら、細胞エレメントを使用することもできる（たとえば、ヒトアクチンプロモーター）。
【０９５１】
本発明を実施する際に使用される好適な発現ベクターとしては、たとえば、ｐＳＶＬおよびｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＲＳＶｃａｔ（ＡＴＣＣ ３７１５２）、ｐＳＶ２ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ ３７１４６）、ｐＢＣ１２ＭＩ（ＡＴＣＣ ６７１０９）、ｐＣＭＶＳｐｏｒｔ ２．０およびｐＣＭＶＳｐｏｒｔ ３．０のようなベクターが挙げられる。使用しうる哺乳動物宿主細胞としては、ヒトＨｅｌａ、２９３、Ｈ９およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、Ｃｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶＩ、ウズラＱＣ１−３細胞、マウスＬ細胞ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０９５２】
このほか、アルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを染色体中に組み込まれた状態で含有する安定な細胞系において、アルブミン融合タンパク質を発現させることもできる。ＤＨＦＲ、ｇｐｔ、ネオマイシン、またはハイグロマイシンのような選択可能なマーカーと共に共トランスフェクションを行うと、トランスフェクトされた細胞の同定および単離が可能になる。
【０９５３】
融合タンパク質をコードするトランスフェクトされたポリヌクレオチドを増幅することにより、コードされる融合タンパク質を大量に発現させることもできる。ＤＨＦＲ（ジヒドロ葉酸レダクターゼ）マーカーは、対象の遺伝子の数百またはさらには数千のコピーを有する細胞系を確立するのに有用である。（たとえば、Ａｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５３：１３５７−１３７０（１９７８）； Ｈａｍｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ， １０９７：１０７−１４３（１９９０）； Ｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：６４−６８（１９９１）を参照されたい）。他の有用な選択マーカーは、酵素グルタミンシンターゼ（ＧＳ）である（Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２２７：２７７−２７９（１９９１）； Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６９−１７５（１９９２））。これらのマーカーを用いて、哺乳動物細胞を選択培地中で増殖させ、最大の耐性を有する細胞を選択する。これらの細胞系は、染色体中に組み込まれた増幅遺伝子を含有する。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）およびＮＳＯ細胞は、タンパク質の産生のためによく使用される。
【０９５４】
プラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ受託番号３７１４６）、発現ベクターｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）およびｐＣ６（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４７）の誘導体は、ラウス肉腫ウイルスの強力なプロモーター（ＬＴＲ） （Ｃｕｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ４３８−４４７ （Ｍａｒｃｈ， １９８５））とＣＭＶ−エンハンサーの断片（Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ４１：５２１−５３０ （１９８５））とを含有する。多重クローニング部位、たとえば、制限酵素開裂部位ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８を有する多重クローニング部位は、対象の遺伝子のクローニングを容易にする。このベクターはまた、ラットプレプロインスリン遺伝子の３’イントロン、ポリアデニル酸付加および終止シグナル、ならびにＳＶ４０初期プロモーターの制御下のマウスＤＨＥＲ遺伝子を含有する。
【０９５５】
具体的には、たとえば、プラスミドｐＣ６を適切な制限酵素で消化させ、次いで、当技術分野で公知の手順により仔ウシ腸ホスフェートを用いて脱リン酸化する。次に、１％アガロースゲルからベクターを単離する。
【０９５６】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の方法を用いて生成され、そしてこのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知のＰＣＲ法を用いて増幅される。天然に存在するシグナル配列を用いて本発明の融合タンパク質を産生する場合、ベクターは第２のシグナルペプチドを必要としない。このほか、天然に存在するシグナル配列を用いない場合、異種シグナル配列が含まれるようにベクターを改変することができる。（たとえば、国際公開ＷＯ ９６／３４８９１号を参照されたい。）
本発明の融合タンパク質をコードする増幅断片は、市販のキット（”Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ，” ＢＩＯ １０１ Ｉｎｃ．， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， Ｃａ．）を用いて１％アガロースゲルから単離される。その後、断片は適切な制限酵素で消化され、１％アガロースゲルを用いて再び精製される。
【０９５７】
この場合、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする増幅断片は、同一の制限酵素で消化され、１％アガロースゲルを用いて精製される。次に、単離された断片と脱リン酸化されたベクターとをＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結させる。その後、大腸菌ＨＢ １０１またはＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞を形質転換し、プラスミドｐＣ６中に挿入された断片を含有する細菌を、たとえば制限酵素分析を用いて同定する。
【０９５８】
活性ＤＨＦＲ遺伝子を欠損するチャイニーズハムスター卵巣細胞をトランスフェクションに使用する。リポフェクチンを用いて０．５μｇのプラスミドｐＳＶｎｅｏと共に５μｇの発現プラスミドｐＣ６またはｐＣ４を共トランスフェクトする（Ｆｅｌｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，前掲）。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏは、Ｇ４１８を含む１群の抗生物質に対する耐性を付与する酵素をコードしているＴｎ５由来のｎｅｃ遺伝子である優性選択性マーカーを含有する。１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を添加したアルファマイナスＭＥＭに細胞を接種する。２日後、細胞をトリプシン処理し、１０、２５、または５０ｎｇ／ｍｌメトトレキセート＋１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を添加したアルファマイナスＭＥＭを入れたハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に接種する。約１０〜１４日後、単一クローンをトリプシン処理し、次いで、さまざまな濃度のメトトレキセート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を用いて６ウェルペトリディッシュまたは１０ｍｌフラスコに接種する。次に、最高濃度のメトトレキセートで増殖するクローンを、さらに高濃度のメトトレキセート（１μＭ、２μＭ、５μＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ）を含有する新しい６ウェルプレートに移す。１００〜２００μＭの濃度で増殖するクローンが得られるまで、同一の手順を繰り返す。所望の融合タンパク質の発現は、たとえばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットによりまたは逆相ＨＰＬＣ分析により解析される。
【０９５９】
実施例１５： 多重融合型融合物
アルブミン融合タンパク質（たとえば、アルブミン（またはそれらの断片もしくは変異体）と融合した治療用タンパク質（またはそれらの断片もしくは変異体）を含有するもの）をさらに他のタンパク質に融合させて「多重融合タンパク質」を生成することが可能である。これらの多重融合タンパク質は、さまざまな用途に使用することができる。たとえば、本発明のアルブミン融合タンパク質をＨｉｓタグ、ＨＡタグ、プロテインＡ、ＩｇＧドメイン、およびマルトース結合性タンパク質に融合させると、精製が容易になる。（たとえば、ＥＰ Ａ ３９４，８２７； Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３３１：８４−８６（１９８８）を参照されたい）。本発明のポリペプチドに融合された核局在化シグナルは、特定の細胞小器官の局在位置にタンパク質をターゲッティングすることができ、一方、共有結合性ヘテロダイマーまたはホモダイマーは、アルブミン融合タンパク質の活性を増大または低減させることができる。このほか、本発明のアルブミン融合タンパク質に追加のタンパク質配列を融合させると、融合タンパク質の溶解性および／または安定性がさらに増大する可能性がある。上記の融合タンパク質は、当技術分野で公知の方法を用いるかもしくは慣例に従ってそれを改変することにより、および／またはＩｇＧ分子へのポリペプチドの融合について概説している以下のプロトコルを修正することにより、作製することができる。
【０９６０】
簡潔に述べると、ＩｇＧ分子のヒトＦｃ部分は、以下に記載されている配列の５’および３’末端を含むプライマーを用いてＰＣＲ増幅することができる。これらのプライマーはまた、発現ベクター、好ましくは哺乳動物または酵母発現ベクター中へのクローニングを容易にする都合のよい制限酵素部位を有していなければならない。
【０９６１】
たとえば、ｐＣ４（ＡＴＣＣ受託番号２０９６４６）を使用する場合、ヒトＦｃ部分はＢａｍＨＩクローニング部位に連結することができる。３’ＢａｍＨＩ部位が破壊される必要があることに留意されたい。次に、ヒトＦｃ部分を含有するベクターをＢａｍＨＩで再び制限切断してベクターを線状化し、そして本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（当技術分野で公知の方法を用いて生成および単離されたもの）を、このＢａｍＨＩ部位に連結させる。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは停止コドンなしでクローン化されることに留意されたい。それ以外の場合には、融合タンパク質を含有するＦｃは産生されないであろう。
【０９６２】
天然に存在するシグナル配列を用いて本発明のアルブミン融合タンパク質を産生する場合、ｐＣ４は第２のシグナルペプチドを必要としない。このほか、天然に存在するシグナル配列を使用しない場合には、ベクターは異種シグナル配列が含まれるように改変することができる。（たとえば、国際公開ＷＯ ９６／３４８９１号を参照されたい）
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域：
2004506407.tif 000170
【０９６３】
実施例１６： アルブミン融合タンパク質からの抗体の産生
ａ） ハイブリドーマ法
本発明のアルブミン融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分（たとえば、融合タンパク質の治療用タンパク質部分またはアルブミン部分）に結合する抗体をさまざまな方法で調製することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２を参照されたい）。そのような方法の一例として、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分の調製物は、天然の夾雑物が実質的に含まれないように調製および精製される。次に、特異的活性ができるだけ高いポリクロナール抗血清を産生すべく、そのような調製物を動物に導入する。
【０９６４】
本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分に特異的なモノクロナール抗体は、ハイブリドーマ法を用いて調製される（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）； Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：５１１（１９７６）； Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ６：２９２（１９７６）； Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔ−Ｃｅｌｌ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ， Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎ．Ｙ．， ｐｐ．５６３−６８１（１９８１））。一般的には、動物（好ましくはマウス）を本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分で免疫する。そのようなマウスの脾細胞を抽出して好適な骨髄腫細胞系と融合させる。本発明においては任意の好適な骨髄腫細胞系を利用しうる。しかしながら、ＡＴＣＣから入手可能な親骨髄腫細胞系（ＳＰ２Ｏ）を利用することが好ましい。融合後、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地中で選択的に保持し、次いでＷａｎｄｓら（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ８０：２２５−２３２ （１９８１））により記載されたような限界希釈によりクローン化する。次に、そのような選択により得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分に結合することのできる抗体を分泌するクローンを同定する。
【０９６５】
このほか、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分に結合することのできる他の抗体は、抗イディオタイプ抗体を用いて２段階法で作製することもできる。そのような方法では、抗体がそれら自体で抗原であるという事実が利用される。したがって、第２抗体に結合する抗体を得ることが可能である。この方法によれば、タンパク質特異的抗体を用いて、動物、好ましくはマウスを免疫する。次に、そのような動物の脾細胞を用いてハイブリドーマ細胞を作製し、そしてハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、本発明の融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分により阻害されうる、本発明のアルブミン融合タンパク質（または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分）に特異的な抗体に結合する能力、を有する抗体を産生するクローンを同定する。そのような抗体は、本発明の融合タンパク質（または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分）に特異的な抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、これを用いて動物を免疫すると本発明の融合タンパク質（または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分）に特異的な別の抗体の形成が誘発される。
【０９６６】
ヒトにおいて抗体をｉｎ ｖｉｖｏで使用するために、抗体は「ヒト化」される。そのような抗体は、上記のモノクロナール抗体を産生するハイブリドーマ細胞に由来する遺伝子構築物を用いて作製することができる。キメラおよびヒト化抗体の作製方法は、当技術分野で公知であり、本明細書でも論じられている。（概説に関しては次の文献を参照されたい。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２（１９８５）； Ｏｉ ｅｔ ａｌ．， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４（１９８６）； Ｃａｂｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号； Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ １７１４９６； Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＰ １７３４９４； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＷＯ ８６０１５３３； Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， 国際公開ＷＯ ８７０２６７１号； Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３ １２：６４３（１９８４）； Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２６８（１９８５））。
【０９６７】
ｂ） ｓｃＦｖのライブラリーからの、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分に対する抗体フラグメントの単離
ヒトＰＢＬから単離された天然に存在するＶ遺伝子から、ドナーが暴露されたものであってもなくてもよい本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分に対する反応性を含有する抗体フラグメントのライブラリーを構築する（たとえば、米国特許第５，８８５，７９３号を参照されたい。参照により該特許全体が本明細書に組み入れられるものとする）。
【０９６８】
ライブラリーのレスキュー：　国際公開ＷＯ ９２／０１０４７号に記載されているように、ヒトＰＢＬのＲＮＡからｓｃＦｖのライブラリーを構築する。ファージを提示する抗体フラグメントをレスキューするために、ファージミドを保有する約１０９個の大腸菌を用いて、１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する５０ｍｌの２×ＴＹ（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵ）に接種し、振盪しながらＯ．Ｄ．が０．８になるまで増殖させる。この培養物５ｍｌを用いて５０ｍｌの２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＧＬＵに接種し、２×１０８ＴＵのデルタ遺伝子３ヘルパー（Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩ、国際公開ＷＯ ９２／０１０４７号参照）を添加し、そして振盪せずに３７℃で４５分間、次に振盪しながら３７℃で４５分間、培養物をインキュベートする。培養物を４０００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間遠心分離し、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含有する２リットルの２×ＴＹ中にペレットを再懸濁させ、そして一晩増殖させる。国際公開ＷＯ ９２／０１０４７号に記載されているようにファージを調製する。
【０９６９】
Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩを次のように調製する。Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩヘルパーファージは遺伝子ＩＩＩタンパク質をコードしていないので、ファージ（ミド）を提示する抗体フラグメントは、抗原に対するより大きな結合アビディティーを有する。感染性Ｍ１３デルタ遺伝子ＩＩＩ粒子は、ファージ形態形成過程で野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質を供給するｐＵＣ１９誘導体を保有する細胞中でヘルパーファージを増殖させることにより作製される。振盪せずに３７℃で１時間、次に振盪しながら３７℃でさらに１時間、培養物をインキュベートする。細胞を遠心沈降させ（ＩＥＣ−Ｃｅｎｔｒａ ８，４００ｒ．ｐ．ｍ．で１０分間）、１００μｇアンピシリン／ｍｌおよび２５μｇカナマイシン／ｍｌを含有する３００ｍｌの２×ＴＹブロス（２×ＴＹ−ＡＭＰ−ＫＡＮ）中に再懸濁させ、３７℃で振盪しながら一晩増殖させる。２回のＰＥＧ沈殿（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， １９９０）により培養培地からファージ粒子を精製および濃縮し、２ｍｌ ＰＢＳ中に再懸濁させ、そして０．４５μｍフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ ＮＭＬ； Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）に通して、約１０１３形質導入単位／ｍｌの最終濃度とする（アンピシリン耐性クローン）。
【０９７０】
ライブラリーのパニング：　ＰＢＳ中で一晩かけて、１００μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分４ｍｌでイムノチューブ（Ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ、Ｎｕｎｃ）をコーティングする。このチューブを２％ Ｍａｒｖｅｌ−ＰＢＳを用いて３７℃で２時間ブロッキングし、次いでＰＢＳ中で３回洗浄する。約１０１３ＴＵのファージをチューブに適用し、上下ターンテーブルを用いてタンブリングさせながら室温で３０分間インキュベートし、次いでさらに１．５時間放置する。ＰＢＳ ０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で１０回、ＰＢＳで１０回、チューブを洗浄する。１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミンを添加し、上下ターンテーブルを用いて１５分間回転することにより、ファージを溶出させ、その後、直ちに０．５ｍｌの１．０Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ７．４で溶液を中和する。次に、ファージを使用して、溶出されたファージを細菌と共に３７℃で３０分間インキュベートすることにより、１０ｍｌの中間対数増殖期大腸菌ＴＧ１に感染させる。次に、１％グルコースおよび１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＴＹＥプレート上に大腸菌をプレーティングする。次に、得られた細菌ライブラリーを上記のデルタ遺伝子３ヘルパーファージでレスキューして、後続の選択ラウンド用のファージを調製する。次に、このプロセスを繰り返して合計４ラウンドのアフィニティー精製を行う。その際、ラウンド３および４に対するチューブの洗浄を、ＰＢＳ、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０で２０回、ＰＢＳで２０回に増大させる。
【０９７１】
結合物の特性決定：　第３および第４ラウンドの選択から溶出されたファージを用いて大腸菌ＨＢ ２１５１に感染させ、単一コロニーから可溶性ｓｃＦｖを産生さてアッセイにかける（Ｍａｒｋｓ， ｅｔ ａｌ．， １９９１）。５０ｍＭ重炭酸塩ｐＨ ９．６中の１０ｐｇ／ｍｌの本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質の一部分のいずれかでコーティングされたマイクロタイタープレートを用いてＥＬＩＳＡを行う。ＥＬＩＳＡで陽性のクローンをＰＣＲフィンガープリント法（たとえば、国際公開ＷＯ ９２／０１０４７号参照）により、次に配列決定により、さらに特性決定する。これらのＥＬＩＳＡ陽性クローンはまた、たとえば、エピトープマッピング、結合アフィニティー、受容体シグナル伝達、抗体／抗原結合を阻止または競合的に阻害する能力、および競合的アゴニストまたはアンタゴニスト活性のような当技術分野で公知の方法により、さらに特性決定することが可能である。
【０９７２】
実施例１７： ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子治療を用いる治療方法
遺伝子治療の１方法では、本発明のアルブミン融合タンパク質を発現することのできる繊維芽細胞が患者に移植される。一般的には、皮膚生検により被験者から繊維芽細胞を得る。得られた組織を組織培養培地に配置し、小片に分割する。組織の小塊を組織培養フラスコの湿潤表面上に配置する。約１０片をそれぞれのフラスコ中に配置する。フラスコを上下逆さまにし、密閉して室温で一晩放置する。室温で２４時間後、フラスコは反転させ、組織塊をフラスコの底部に固定された状態に保持し、新たな培地（たとえば、１０％ ＰＢＳ、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有するＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地）を添加する。次に、フラスコを３７℃で約１週間インキュベートする。
【０９７３】
この時点で、新たな培地を添加し、さらに数日ごとに交換する。さらに２週間培養した後、繊維芽細胞の単層が現れる。単層をトリプシン処理して、より大きなフラスコにスケールアップする。
【０９７４】
Ｍｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウィルスの長末端反復配列によりフランキングされたｐＭＶ−７（Ｋｉｒｓｃｈｍｅｉｅｒ， Ｐ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．， ＤＮＡ， ７：２１９−２５（１９８８））をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化させ、続いて仔ウシ腸ホスファターゼで処理する。アガロースゲル上で線状ベクターを分画し、ガラスビーズを用いて精製する。
【０９７５】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、当技術分野で公知の方法により作製し、５’および３’末端の配列に対応しておりさらに所要であれば適切な制限部位および開始／停止コドンを任意に有するＰＣＲプライマーを用いて増幅することができる。好ましくは、５’プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含有し、３’プライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含む。等量のＭｏｌｏｎｅｙマウス肉腫ウィルスの線状バックボーンと、増幅されたＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ断片とを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で一緒に添加する。得られた混合物を２種の断片のライゲーションにふさわしい条件下に保持する。次に、ライゲーション混合物を用いて細菌ＨＢ１０１を形質転換し、次いでそれを、適切に挿入された対象遺伝子をベクターが有していることを確認する目的で、カナマイシンを含有する寒天上にプレーティングする。
【０９７６】
１０％仔ウシ血清（ＣＳ）、ペニシリンおよびストレプトマイシンを有するＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で、アンホトロピックなｐＡ３１７またはＧＰ＋ａｍ１２パッケージング細胞を集密濃度まで組織培養により増殖させる。次に、上記遺伝子を含有するＭＳＶベクターを培地に添加して、ベクターをパッケージング細胞に形質導入する。こうすると、パッケージング細胞は、上記遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子を産生するようになる（この時点のパッケージング細胞は、プロデューサー細胞と呼ばれる）。
【０９７７】
形質導入されたプロデューサー細胞に新たな培地を添加し、続いて、集密的なプロデューサー細胞が含まれる１０ｃｍプレートから培地を取り出す。感染性ウイルス粒子を含有する使用済み培地をミリポアフィルターに通して濾過し、分離されたプロデューサー細胞を除去する。そして次にこの培地を用いて繊維芽細胞に感染させる。繊維芽細胞を有する半集密的プレートから培地を除去し、プロデューサー細胞からの培地とすばやく交換する。この培地を除去し、新たな培地と交換する。ウイルスの力価が高い場合、実質的にすべての繊維芽細胞が感染しているであろうから、選択の必要はない。力価が非常に低い場合、ｎｅｏまたはｈｉｓのような選択マーカーを有するレトロウイルスベクターを使用する必要がある。繊維芽細胞に効率的に感染させた後、繊維芽細胞を分析してアルブミン融合タンパク質が産生されるかどうかを調べる。
【０９７８】
次に、遺伝子工学的に操作された繊維芽細胞を、そのままでまたはｃｙｔｏｄｅｘ ３マイクロキャリアービーズ上で集密的になるまで増殖させた後で、宿主に移植する。
【０９７９】
実施例１８： ｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子治療を用いる治療方法
本発明の他の態様は、障害、疾患および病的状態を治療するためにｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子治療法を用いることである。遺伝子治療法は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする裸の核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列を動物に導入することに関連する。本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、標的組織によるポリペプチドの発現に必要なプロモーターまたは任意の他の遺伝的エレメントに機能しうるように連結させる（すなわち、結合する）ことが可能である。そのような遺伝子治療および送達の技術および方法は、当技術分野で公知であり、たとえば、次の文献を参照されたい。ＷＯ ９０／１１０９２， ＷＯ ９８／１１７７９； 米国特許第５６９３６２２号， 同第５７０５１５１号， 同第５５８０８５９号； Ｔａｂａｔａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ． Ｒｅｓ． ３５（３）：４７０−４７９（１９９７）； Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｒｅｓ． ３５（６）：５１７−５２２（１９９７）； Ｗｏｌｆｆ， Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ． Ｄｉｓｏｒｄ． ７（５）：３１４−３１８（１９９７）； Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ３（５）：４０５−４１１（１９９６）； Ｔｓｕｒｕｍｉ ｅｔ ａｔ．， Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９４（１２）：３２８１−３２９０（１９９６） （参照により本明細書に組み入れられるものとする）。
【０９８０】
ポリヌクレオチド構築物は、注射可能な物質を動物の細胞に送達する任意の方法により、たとえば、組織（心臓、筋肉、皮膚、肺、肝臓、腸など）の間質空間への注射により、送達することが可能である。ポリヌクレオチド構築物は、製薬上許容される液体または水性キャリアー中に入れて送達することができる。
【０９８１】
「裸」のポリヌクレオチドＤＮＡまたはＲＮＡという用語は、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチン、または沈澱剤などの、細胞への進入を支援、促進、または容易化するように作用するいかなる送達ビヒクルをも有してない配列を意味する。しかしながら、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当業者に周知の方法により調製することのできるリポソーム製剤（たとえば、Ｆｅｌｇｎｅｒ Ｐ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７７２：１２６−１３９およびＡｂｄａｌｌａｈ Ｂ． ｅｔ ａｌ． （１９９５） Ｂｉｏｌ． Ｃｅｌｌ ８５（１）：１−７中で教示されているもの）中に入れて送達することも可能である。
【０９８２】
遺伝子治療法で使用されるポリヌクレオチドベクター構築物は、好ましくは、宿主ゲノム中に組み込まれずかつ複製を可能にする配列を含有しない構築物である。ＤＮＡの発現を駆動するために、当業者に公知の任意の強力なプロモーターを使用することができる。他の遺伝子治療技術と異なり、裸の核酸配列を標的細胞に導入することの１つの主要な利点は、細胞中におけるポリヌクレオチド合成の一過的な性質である。非複製性ＤＮＡ配列を細胞に導入することにより所望のポリペプチドの産生が最大６ヶ月間提供されることが研究から明らかになった。
【０９８３】
ポリヌクレオチド構築物を、筋肉、皮膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子宮、直腸、神経系、眼、腺および結合組織を含む動物内の組織の間質空間に送達することができる。組織の間質空間は、細胞間液；器官組織の細網繊維間、脈管もしくは房室の壁中の弾性繊維間または繊維組織の膠原繊維間にムコ多糖マトリックス；あるいは結合組織鞘膜保持筋肉細胞内または骨小腔中に同マトリックス、を含有する。それは、同様に、循環系の血漿およびリンパ管のリンパ液により占有された空間である。以下に述べた理由により、筋肉組織の間質空間への送達が好ましい。これらの細胞を含む組織に注射することによりポリヌクレオチド構築物を都合よく送達することが可能である。分化した永続的に非分裂性の細胞に送達してそこで発現させることが好ましいが、たとえば血液の幹細胞や皮膚の繊維芽細胞のような未分化または不完全分化細胞で送達および発現を行ってもよい。ｉｎ ｖｉｖｏの筋肉細胞は、ポリヌクレオチドを取り込んで発現させる能力が特に大きい。
【０９８４】
裸のポリヌクレオチドを注射する場合、ＤＮＡまたはＲＮＡの有効投与量は、約０．０５ｇ／ｋｇ体重から約５０ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲であろう。好ましくは、用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまで、より好ましくは約０．０５ｍｇ／ｋｇから約５ｍｇ／ｋｇまでであろう。もちろん、当業者であればわかるであろうが、この用量は、注射対象の組織部位によって変化するであろう。核酸配列の適切な有効用量は、当業者により容易に決定することができ、治療対象の病的状態および投与経路に依存する可能性がある。好ましい投与経路は、組織の間質空間に注射する非経口経路によるものである。しかしながら、他の非経口経路を使用してもよく、たとえば、特に、肺もしくは気管支組織、咽頭または鼻の粘膜に送達するために、エーロゾル製剤の吸入を行ってもよい。さらに、血管形成術を施す際、その処置に用いられるカテーテルにより、裸のポリヌクレオチド構築物を動脈に送達することができる。
【０９８５】
ｉｎ ｖｉｖｏで筋肉に注射されたポリヌクレオチドの用量応答効果は、次のように決定される。本発明のポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡの産生に好適な鋳型ＤＮＡを、標準的な組換えＤＮＡ法に従って調製する。環状であっても直鎖状であってもよい鋳型ＤＮＡを、裸のＤＮＡとして使用するかまたはリポソームと複合化させる。次に、マウスの四頭筋に種々の量の鋳型ＤＮＡを注射する。
【０９８６】
０．３ｍｌの２．５％ Ａｖｅｒｔｉｎを腹腔内注射することにより、５〜６週齢の雌および雄Ｂａｌｂ／Ｃマウスに麻酔をかける。大腿前部に１．５ｃｍの切開を行い、四頭筋を直接肉眼視できるようにする。筋肉の遠位挿入部位から膝中に約０．５ｃｍ入った深さ約０．２ｃｍの位置に、１ｃｃシリンジ内の０．１ｍｌのキャリアー中に含まれる鋳型ＤＮＡを２７ゲージ針で１分間かけて注射する。あとで位置が特定されるように注射部位上で縫合を行い、ステンレス鋼クリップで皮膚を閉鎖する。
【０９８７】
適切なインキュベーション時間（たとえば、７日間）の後、四頭筋全体を切除することにより筋肉摘出物を調製する。それぞれの四頭筋の１５μｍ横断切片を５片ごとに組織化学的に染色してタンパク質発現を調べる。様々な時間に切除された別々のマウスからの四頭筋を用いること以外は同様にして、融合タンパク質発現の時間的経過を調べることも可能である。注射後の筋肉内でのＤＮＡの持続性については、注射されたマウスおよび対照のマウスから全細胞ＤＮＡおよびＨＩＲＴ上清を調製した後、サザンブロット分析により調べることが可能である。マウスにおける上記の実験の結果を用いて、ヒトおよび他の動物において裸のＤＮＡを使用したときの適切な用量および他の治療パラメーターを推定することができる。
【０９８８】
実施例１９： トランスジェニック動物
本発明のアルブミン融合タンパク質は、トランスジェニック動物中で発現させることもできる。トランスジェニック動物を作製するために、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、ミニブタ（ｍｉｃｒｏ−ｐｉｇ）、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ならびに非ヒト霊長類、たとえば、ヒヒ、サルおよびチンパンジーを含めて任意の種の動物を使用することが可能であるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の方法を用いて、遺伝子治療プロトコルの一部としてヒトにおいて本発明の融合タンパク質を発現させる。
【０９８９】
本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを動物に導入してトランスジェニック動物の創始者系統（ｆｏｕｎｄｅｒ ｌｉｎｅ）を作製するために、当技術分野で公知の任意の技術を使用することが可能である。そのような技術としては、前核マイクロインジェクション（Ｐａｔｅｒｓｏｎ ｅｔ ａＬ， Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４０：６９１−６９８（１９９４）； Ｃａｒｖｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ） １１：１２６３−１２７０（１９９３）； Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ） ９：８３０−８３４（１９９１）；およびＨｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．， 米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９））； 生殖細胞系へのレトロウイルス媒介遺伝子導入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８２：６１４８−６１５２ （１９８５））、胚盤胞または胚へのレトロウイルス媒介遺伝子導入； 胚幹細胞における遺伝子ターゲッティング（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５６：３１３−３２１（１９８９））； 細胞または胚のエレクトロポレーション（Ｌｏ， １９８３， Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３：１８０３−１８１４（１９８３））； 遺伝子銃を用いる本発明のポリヌクレオチドの導入（たとえば、Ｕｌｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５９：１７４５（１９９３）を参照されたい）； 多能性胚幹細胞への核酸構築物の導入および胚盤胞へのその幹細胞の戻し移入； ならびに精子媒介遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ５７：７１７−７２３（１９８９）；などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。このような方法の概説に関しては、Ｇｏｒｄｏｎ，「トランスジェニック動物（Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｎｉｍａｌｓ）」 Ｉｎｔｌ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ． １１５：１７１−２２９（１９８９）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれるものとする）を参照されたい。
【０９９０】
当技術分野で公知の任意の方法を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するトランスジェニッククローンを作製することが可能であり、そのような方法としてはたとえば、静止期に誘導されている培養された胚性細胞、胎児細胞、または成体細胞から核を除核した卵母細胞に、核を移入すればよい（Ｃａｍｐｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８０：６４−６６ （１９９６）； Ｗｉｌｍｕｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３８５：８１０−８１３ （１９９７））。
【０９９１】
本発明は、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをすべての細胞中に有するトランスジェニック動物、ならびにすべての細胞中ではなく一部の細胞中にこれらのポリヌクレオチドを有する動物、すなわち、モザイク動物またはキメラ動物を提供する。トランスジーンは、単独のトランスジーンとして、または頭部−頭部タンデム、頭部−尾部タンデムなどのコンカテマーのような複数コピーとして、組み込むことが可能である。トランスジーンはまた、たとえば、Ｌａｓｋｏら（Ｌａｓｋｏ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：６２３２−６２３６（１９９２））の教示に従って、特定の細胞型に選択的に導入して、そこで活性化させることも可能である。そのような細胞型特異的活性化に必要な調節配列は、対象の特定の細胞型に依存するであろう。またそうした調節配列は、当業者には自明であろう。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、本発明の融合タンパク質の治療用タンパク質部分またはアルブミン部分に対応する内因性遺伝子の染色体部位に組み込むことが望まれる場合は、遺伝子ターゲッティングが好ましい。簡潔に述べると、そのような技術を利用する場合、染色体配列との相同的組換えにより内因性遺伝子のヌクレオチド配列中に組み込んでその機能を破壊する目的で、その内因性遺伝子に相同な何らかのヌクレオチド配列を含有するベクターをデザインする。トランスジーンはまた、たとえば、Ｇｕら（Ｇｕ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：１０３−１０６（１９９４））の教示に従うことにより、特定の細胞型に選択的に導入して、その結果その細胞型においてだけ内因性遺伝子を不活性化することができる。そのような細胞型特異的不活性化に必要な調節配列は、対象の特定の細胞型に依存するであろう。またそうした調節配列は、当業者には自明であろう。
【０９９２】
トランスジェニック動物が作製されたならば、標準的な技術を利用して組換え遺伝子の発現をアッセイすることが可能である。サザンブロット分析またはＰＣＲ法により最初のスクリーニングを行って動物組織を分析して、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの組込みが起こったことを確認することが可能である。限定されるものではないが、動物から得られた組織サンプルのノーザンブロット分析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析、逆転写酵素−ＰＣＲ（ｒｔ−ＰＣＲ）などの技術を用いて、トランスジェニック動物の組織中における本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドのｍＲＮＡ発現のレベルを評価することも可能である。融合タンパク質発現組織のサンプルは、融合タンパク質に特異的な抗体を用いて免疫細胞化学的または免疫組織化学的に評価することも可能である。
【０９９３】
創始者動物が作製されれば、それらを交配、同系交配、異系交配、異種交配して、特定の動物のコロニーを作り出すことが可能である。そのような交配ストラテジーの例としては、たとえば、別個の系統を樹立するために、２ヶ所以上の組込み部位を有する創始者動物を異系交配すること；それぞれのトランスジーンの相加的発現の効果によってより高レベルでトランスジーンを発現する複合トランスジェニック動物を作製するために、別個の系統を同系交配すること；発現を増大させてかつＤＮＡ分析による動物のスクリーニングの必要性をなくすべく、所与の組込み部位に関してホモ接合である動物を作製するために、ヘテロ接合性トランスジェニック動物を交配すること；複合ヘテロ接合系統またはホモ接合系統を作製するために、別個のホモ接合系統を交配すること；および、対象の実験モデルに適した明確なバックグラウンドにトランスジーン（すなわち、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド）が配置されるように、交配することが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０９９４】
本発明のトランスジェニック動物は、本発明の融合タンパク質ならびに本発明の融合タンパク質の治療用タンパク質成分および／またはアルブミン成分の生物学的機能を詳細に検討したり、正常でない発現に関連づけられる病的状態および／または障害を調べたり、そのような病的状態および／または障害を改善するのに有効な化合物をスクリーニングしたりするのに有用な動物モデル系を含む用途を有するが、これらの用途に限定されるものではない。
【０９９５】
実施例２０： Ｂ細胞増殖および分化の刺激または阻害を検出するアッセイ
機能的体液性免疫応答の生起は、Ｂ系列細胞とその微小環境との間の可溶性かつコグネイトの両方のシグナリングを必要とする。シグナルは、Ｂ系列細胞のプログラムされた発生を継続させる正の刺激を付与することもあれば、その現在の発生経路を阻止するように細胞に指示する負の刺激を付与することもある。これまでに、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４およびＩＬ−１５を含めて、多数の刺激性および抑制性シグナルがＢ細胞の応答性に影響を及ぼすことがわかっている。興味深いことに、これらのシグナルは、それ自体、弱いエフェクターであるが、種々の共刺激性タンパク質と一緒になって、Ｂ細胞集団の活性化、増殖、分化、ホーミング、免疫寛容および死滅を引き起こすことができる。
【０９９６】
Ｂ細胞共刺激性タンパク質のうち最もよく研究されたクラスの１つは、ＴＮＦスーパーファミリーである。このファミリーのうち、ＣＤ４０、ＣＤ２７、およびＣＤ３０は、それらのそれぞれのリガンドＣＤ１５４、ＣＤ７０、およびＣＤ１５３と一緒になって、さまざまな免疫応答を調節することが判明している。これらのＢ細胞集団およびそれらの前駆体の増殖および分化の検出および／または観測を可能にするアッセイは、種々のタンパク質が増殖および分化に関してこれらのＢ細胞集団に及ぼしうる効果を調べるうえで価値あるツールである。Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体の分化、増殖、または阻害の検出を可能にするようにデザインされた２つのアッセイを以下に示す。
【０９９７】
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ−Ｂ細胞集団およびそれらの前駆体の活性化、増殖、分化あるいは阻害および／または死滅を誘発する能力に関して、本発明のアルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質および／もしくはアルブミンの断片または変異体あるいはアルブミンの断片または変異体を含有する融合タンパク質を含む）を評価することができる。０．１から１０，０００ｎｇ／ｍＬまでの用量範囲にわたり定性的に測定される、精製済みヒト扁桃Ｂ細胞に対する本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を、標準的なＢリンパ球共刺激アッセイで評価する。このアッセイでは、精製済み扁桃Ｂ細胞を、プライミング剤としてのホルマリン固定スタフィロコッカス＝アウレウス＝コーワンＩ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ）（ＳＡＣ）または固定化された抗ヒトＩｇＭ抗体のいずれかの存在下で培養する。ＩＬ−２およびＩＬ−１５のような第２シグナルは、ＳＡＣおよびＩｇＭ架橋と相乗作用して、トリチウム化チミジン取り込みにより測定されるＢ細胞増殖を誘発する。新規な相乗剤は、このアッセイを用いて容易に同定することができる。アッセイには、ＣＤ３陽性細胞の磁性ビーズ（ＭＡＣＳ）枯渇によるヒト扁桃Ｂ細胞の単離が含まれる。得られる細胞集団は、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）の発現により評価した場合、９５％超のＢ細胞である。
【０９９８】
それぞれのサンプルの種々の稀釈液を９６ウェルプレートの個々のウェルに入れ、全容量１５０μｌとなるように培養培地（１０％ ＦＢＳ、５×１０−５Ｍ ２ＭＥ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０−５稀釈のＳＡＣを含有するＲＰＭＩ １６４０）中に懸濁された１０５個のＢ細胞をウェルに添加する。因子添加の７２時間後に開始される３Ｈ−チミジン（６．７ Ｃｉ／ｍＭ）を用いた２０時間パルス（１μＣｉ／ウェル）により、増殖または阻害を定量する。正および陰性対照は、それぞれＩＬ２および培地である。
【０９９９】
ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ−緩衝剤のみまたは２ｍｇ／ｋｇの本発明のアルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質および／もしくはアルブミンの断片または変異体あるいはアルブミンの断片または変異体を含有する融合タンパク質を含む）を、ＢＡＬＢ／ｃマウスに１日２回注射する（腹腔内）。マウスがこの処置を４日連続して受けた時点で、分析のためにマウスを屠殺して種々の組織および血清を採取する。正常な脾臓と本発明のアルブミン融合タンパク質で処理された脾臓から得られたＨ＆Ｅ切片とを比較することにより、Ｂ細胞集団の分化および増殖の活性化を示していると考えられる動脈周囲リンパ鞘の拡散および／または赤色髄領域の有核細胞性の著しい増加のような脾臓細胞に対する前記融合タンパク質の活性の結果を同定する。Ｂ細胞マーカーである抗ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）を用いた免疫組織化学的研究を使用して、脾臓組織崩壊のような脾臓細胞に対するなんらかの生理学的な変化が、樹立Ｔ細胞領域に浸潤する境界の不明瞭なＢ細胞ゾーン内での増大されたＢ細胞提示が原因であるかどうかを調べる。
【１０００】
アルブミン融合タンパク質で処理されたマウスの脾臓のフローサイトメトリー分析を用いることにより、アルブミン融合タンパク質がＴｈＢ＋， ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）ｄｕｌｌ Ｂ細胞の割合を対照マウス中で観測されるものを上回って特異的に増大させるかどうかを調べる。
【１００１】
同様に、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて増大された成熟Ｂ細胞提示から推定される結果は、血清Ｉｇ力価の相対的増加である。したがって、血清ＩｇＭおよびＩｇＡレベルを、緩衝剤で処理されたマウスと融合タンパク質で処理されたマウスとの間で比較する。
【１００２】
この実施例に記載した研究は、本発明の融合タンパク質の活性を試験するものであった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質およびポリヌクレオチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変することができるであろう（たとえば、遺伝子治療）。
【１００３】
実施例２１： Ｔ細胞増殖アッセイ
ＰＢＭＣについてＣＤ３誘導増殖アッセイを行い、３Ｈ−チミジンの取り込みによる測定を行う。アッセイは次のように行う。ＣＤ３に対するｍＡｂ（ＨＩＴ３ａ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）またはアイソタイプが一致した対照ｍＡｂ（Ｂ３３．１）を１００μｌ／ ｍｌ用いて４℃で一晩かけて９６ウェルプレートをコーティングし（．０５Ｍ重炭酸塩緩衝液， ｐＨ９．５中、１μｇ／ｍｌ）、次いでＰＢＳで３回洗浄する。Ｆ／Ｈグラジエント遠心分離によりヒト末梢血からＰＢＭＣを単離し、１０％ ＦＣＳおよびＰ／Ｓを含有するＲＰＭＩ中に加えて、さまざまな濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質（治療用タンパク質および／もしくはアルブミンの断片または変異体あるいはアルブミンの断片または変異体を含有する融合タンパク質を含む）の存在下で（全容量２００μｌ）、ｍＡｂでコーティングされたプレートの四重反復試験ウェルに添加する（５×１０４／ウェル）。該当するタンパク質緩衝液および培地単独が対照である。３７℃で４８時間培養した後、プレートを１０００ｒｐｍで２分間スピンして、１００μｌの上清を取り出し、増殖に対する影響が観測される場合には、それをＩＬ−２（または他のサイトカイン）の測定のために−２０℃で保存する。ウェルに０．５μＣｉの３Ｈ−チミジンを含有する１００μｌの培地を添加し、３７℃で１８〜２４時間培養する。ウェルの内容物を回収し、３Ｈ−チミジンの取り込みを増殖の尺度として使用する。抗ＣＤ３単独が増殖に関する陽性対照である。増殖を促進する対照として、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）をも使用する。本発明の融合タンパク質の効果に対する陰性対照として、Ｔ細胞の増殖を誘導しない対照抗体を使用する。
【１００４】
この実施例に記載した研究は、本発明の融合タンパク質の活性を試験するものであった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質およびポリヌクレオチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変することができるであろう（たとえば、遺伝子治療）。
【１００５】
実施例２２： ＭＨＣクラスＩＩ、共刺激性および接着分子の発現ならびに単球および単球由来ヒト樹状細胞の細胞分化に及ぼす本発明の融合タンパク質の効果
末梢血で見いだされる増殖性前駆体を増殖させることにより、樹状細胞を生成する。すなわち、接着性ＰＢＭＣまたは水簸単球画分を、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ）と共に７〜１０日間培養する。これらの樹状細胞は、非成熟細胞の特徴的表現型を有する（ＣＤ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０およびＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現）。ＴＮＦ−αのような活性化因子で処理すると、表面表現型の急速な変化（ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ、共刺激性および接着分子の発現、ＦＣγＲＩＩのダウンレギュレーション、ＣＤ８３のアップレギュレーション、の増加）が起こる。これらの変化は、抗原提示能力の増加および樹状細胞の機能的成熟と関連する。
【１００６】
表面抗原のＦＡＣＳ分析を次のように実施する。漸増濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質またはＬＰＳ（陽性対照）を用いて細胞を１〜３日間処理し、１％ ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで１：２０希釈した適切なＦＩＴＣまたはＰＥ標識モノクローナル抗体と共に４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄を行った後、標識された細胞をフローサイトメトリーによりＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析する。
【１００７】
サイトカインの産生に対する効果：　樹状細胞により生成されるサイトカイン、特にＩＬ−１２は、Ｔ細胞依存性免疫応答の開始に重要である。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１ヘルパーＴ細胞免疫応答の生起に強く影響し、そして細胞傷害性ＴおよびＮＫ細胞機能を誘導する。ＥＬＩＳＡを用いて、次のようにＩＬ−１２放出を測定する。漸増濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて樹状細胞（１０６／ｍｌ）を２４時間処理する。陽性対照として細胞培養物にＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）を添加する。次に、細胞培養物からの上清を採取し、そして市販のＥＬＩＳＡキット（例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））を用いてＩＬ−１２含量について分析する。キットに提供されている標準的なプロトコルを用いる。
【１００８】
ＭＨＣクラスＩＩ、共刺激性分子および接着分子の発現に対する効果：　細胞表面抗原の３つの主要なファミリー、すなわち、接着分子、抗原提示に関与する分子、およびＦｃ受容体を、単球上で同定することができる。ＭＨＣクラスＩＩ抗原および他の共刺激性分子、たとえば、Ｂ７およびＩＣＡＭ−１の発現がモジュレートされると、単球の抗原提示能力およびＴ細胞活性化を誘導する能力が結果として変化する可能性がある。Ｆｃ受容体の発現の増大は、単球の細胞傷害活性、サイトカイン放出および食作用の改善と相関しうる。
【１００９】
次のようにＦＡＣＳ分析を用いて表面抗原を調べる。漸増濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質またはＬＰＳ（陽性対照）を用いて単球を１〜５日間処理し、１％ ＢＳＡおよび０．０２ｍＭアジ化ナトリウムを含有するＰＢＳで洗浄し、次いで１：２０希釈の適切なＦＩＴＣまたはＰＥ標識モノクローナル抗体と共に４℃で３０分間インキュベートする。さらなる洗浄を行った後、標識された細胞をフローサイトメトリーによりＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析する。
【１０１０】
単球の活性化および／または増大された生存：　単球を活性化する（もしくは不活化する）および／または単球の生存を増大させる（もしくは単球生存を低下させる）分子のアッセイは、当該技術分野で公知であり、本発明の分子が単球のインヒビターまたはアクチベーターとして機能するかを調べるために慣用的に適用しうる。本発明のアルブミン融合タンパク質は、以下に記載の３つのアッセイを用いてスクリーニングすることができる。これらのアッセイのそれぞれで、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ）を通した遠心分離により単一のｄｏｎｏｒ ｌｅｕｋｏｐａｃｋ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｄ Ｃｒｏｓｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ， ＭＤ）から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を精製する。向流遠心水簸によりＰＢＭＣから単球を単離する。
【１０１１】
単球生存アッセイ：　ヒト末梢血単球は、血清または他の刺激物の不在下で培養した場合、次第に生存能力を失う。それらの死は、内的に調節された過程（アポトーシス）から生じる。活性化因子、たとえばＴＮＦ−αを培養物に添加すると、細胞の生存は劇的に改善され、ＤＮＡの断片化が防止される。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色を用いて、次のようにアポトーシスを調べる。ポリプロピレンチューブ内の無血清培地（陽性対照）中、１００ｎｇ／ｍｌ ＴＮＦ−α（陰性対照）の存在下かつ試験される種々の濃度の融合タンパク質の存在下で、単球を４８時間培養する。５μｇ／ｍｌの最終濃度でＰＩを含有するＰＢＳ中に２×１０６／ｍｌの濃度で細胞を懸濁させ、次いで室温で５分間インキュベートしてからＦＡＣＳｃａｎ分析にかける。ＰＩ取り込みは、この試験状況でＤＮＡの断片化と相関することがわかっている。
【１０１２】
サイトカイン放出に対する効果：　単球／マクロファージの重要な機能は、刺激後のサイトカイン放出を介した免疫系の他の細胞集団に対する調節活性である。サイトカイン放出を測定するためにＥＬＩＳＡを次のように実施する。漸増濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質と共に、および同一条件下であるが該融合タンパク質の不在下で、ヒト単球を５×１０５細胞／ｍｌの濃度でインキュベートする。ＩＬ−１２産生を調べるために、前記融合タンパク質の存在下でＩＦＮ（１００Ｕ／ｍｌ）を用いて細胞を一晩プライミングする。次いで、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。２４時間後、馴化培地を採取して使用するまで凍結保存する。その後、市販のＥＬＩＳＡキット（たとえば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ））を用いてかつキットに提供されている標準的プロトコルを適用して、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１０、ＭＣＰ−１およびＩＬ−８の測定を行う。
【１０１３】
酸化的バースト：　精製済みの単球を９６ウェルプレートに２〜１×１０５細胞／ウェルでプレーティングする。漸増濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質を、ウェルの全容量０．２ｍｌの培養培地（ＲＰＭＩ １６４０ ＋ １０％ ＦＣＳ、グルタミンおよび抗生物質）中に添加する。３日間インキュベートした後、プレートを遠心分離にかけて、ウェルから培地を取り出す。マクロファージの単層に、１ウェルあたり０．２ｍｌのフェノールレッド溶液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、５．５ｍＭデキストロース、０．５６ｍＭフェノールレッドおよび１９Ｕ／ｍｌのＨＲＰＯ）を刺激物質（２００ｎＭ ＰＭＡ）と共に添加する。プレートを３７℃で２時間インキュベートし、そして１ウェルあたり２０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを添加することにより反応を停止させる。６１０ｎｍで吸光度を読み取る。マクロファージにより生成されたＨ２Ｏ２の量を計算するために、既知のモル濃度のＨ２Ｏ２溶液の標準曲線をそれぞれの実験に適用する。
【１０１４】
この実施例に記載した研究は、本発明の融合タンパク質の活性を試験するものであった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質またはポリヌクレオチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変することができるであろう（たとえば、遺伝子治療）。
【１０１５】
実施例２３： 本発明の融合タンパク質の生物学的効果
星状細胞およびニューロンアッセイ
皮質ニューロン細胞の生存、神経突起伸長、または表現型分化を促進する活性に関して、およびグリア繊維酸性タンパク質免疫陽性細胞である星状細胞の増殖の誘導に関して、本発明のアルブミン融合タンパク質を試験することができる。バイオアッセイに用いる皮質細胞の選択は、皮質構造中でのＦＧＦ−１およびＦＧＦ−２の優勢な発現ならびに既に報告されているＦＧＦ−２処理から生じる皮質ニューロン生存の増強に基づく。たとえば、チミジン取り込みアッセイを用いて、これらの細胞に対する本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を解明することができる。
【１０１６】
さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける皮質または海馬ニューロンに対するＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）の生物学的効果を記載した既報により、ニューロン生存および神経突起伸長の両方の増大が実証されている（Ｗａｌｉｃｋｅ ｅｔ ａｌ．，「繊維芽細胞増殖因子は分離された海馬ニューロンの生存を促進し、神経突起伸長を増強する」Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８３：３０１２−３０１６（１９８６）、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるアッセイ）。しかしながら、ＰＣ−１２細胞で行われた実験の報告からは、これらの２つの応答が、必ずしも同義的なものでないこと、およびどのＦＧＦが試験されているかだけでなくどの受容体が標的細胞で発現されるかにも依存しうることが示唆される。皮質ニューロン初代培養パラダイムを用いれば、本発明のアルブミン融合タンパク質が神経突起伸長を誘導する能力を、たとえばチミジン取り込みアッセイを用いて、ＦＧＦ−２で得られた応答と比較することができる。
【１０１７】
繊維芽細胞および内皮細胞アッセイ
ヒト肺繊維芽細胞をＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から入手し、そしてＣｌｏｎｅｔｉｃｓ製の増殖培地中で保持する。真皮微小血管内皮細胞をＣｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）から入手する。増殖アッセイのために、ヒト肺繊維芽細胞および真皮微小血管内皮細胞を、９６ウェルプレートの増殖培地中、５，０００細胞／ウェルで１日培養すればよい。次いで、０．１％ ＢＳＡ基本培地中で細胞を１日インキュベートする。培地を新たな０．１％ ＢＳＡ培地と交換した後、本発明のタンパク質の試験融合タンパク質と共に細胞を３日間インキュベートする。Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ（Ａｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ， ＣＡ）を１０％の最終濃度になるように各ウェルに添加する。細胞を４時間インキュベートする。ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーで読み取ることにより細胞生存能力を測定する。ＰＧＥ２アッセイのために、９６ウェルプレート中、５，０００細胞／ウェルでヒト肺繊維芽細胞を１日培養する。培地を０．１％ ＢＳＡ基本培地と変換した後、ＩＬ−１αを用いてまたは用いずにＦＧＦ−２または本発明の融合タンパク質と共に細胞を２４時間インキュベートする。上清を採取し、そしてＥＩＡキット（Ｃａｙｍａｎ， Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ， ＭＩ）によりＰＧＥ２に関してアッセイする。ＩＬ−６アッセイのために、９６ウェルプレート中、５，０００細胞／ウェルでヒト肺繊維芽細胞を１日培養する。培地を０．１％ ＢＳＡ基本培地と変換した後、ＦＧＦ−２と共にまたは本発明のアルブミン融合タンパク質および／またはＩＬ−１αと共にまたはそれを用いずに、細胞を２４時間インキュベートする。上清を採取し、そしてＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）によりＩＬ−６に関してアッセイする。
【１０１８】
ヒト肺繊維芽細胞をＦＧＦ−２または本発明のアルブミン融合タンパク質と共に基本培地中で３日間培養した後、Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを添加して繊維芽細胞の増殖に対する効果を評価する。ＦＧＦ−２は、１０〜２５００ｎｇ／ｍｌで刺激を示すはずであり、この値を本発明の融合タンパク質による刺激と比較することができる。
【１０１９】
［３Ｈ］チミジン取り込みに基づく細胞増殖
次の［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを用いて、繊維芽細胞、上皮細胞または未熟筋肉細胞のような細胞の増殖に対する増殖因子タンパク質などの治療用タンパク質の効果を測定することができる。無血清培地中で１８時間インキュベートすることにより、半集密的培養物をＧ１期で停止させる。次に、治療用タンパク質を２４時間にわたり添加し、その最後の４時間で、培養物を０．３３μＭの最終濃度の［３Ｈ］チミジン（２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ， Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）で標識する。組み込まれた［３Ｈ］チミジンを氷冷された１０％トリクロロ酢酸で２４時間かけて沈澱させる。続いて、氷冷された１０％トリクロロ酢酸で、次いで氷冷水で、連続的に細胞をすすぐ。０．５Ｍ ＮａＯＨ中で溶解させてから、溶解物およびＰＢＳリンス（５００ｍｌ）をプールして、放射活性の量を測定する。
【１０２０】
パーキンソンモデル
パーキンソン病における運動機能の喪失は、黒質線条体のドーパミン作動性投射ニューロンの変性から生じる線条体ドーパミンの欠乏に起因する。広範に特性づけされたパーキンソン病の動物モデルは、１−メチル−４フェニル１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の全身的投与を伴う。ＣＮＳの場合、ＭＰＴＰは、星状細胞に取り込まれ、そしてモノアミンオキシダーゼＢにより１−メチル−４−フェニルピリジン（ＭＰＰ＋）に異化され、そして放出される。続いて、ＭＰＰ＋は、ドーパミンの高親和性再取り込みトランスポーターによりドーパミン作動性ニューロンに能動的に蓄積される。次いで、ＭＰＰ＋は、電気化学的勾配によりミトコンドリア中に濃縮され、そしてニコチン酸アミドアデニン二リン酸：ユビキノン酸化還元酵素（複合体Ｉ）を選択的に阻害することにより、電子伝達を妨害して最終的に酸素ラジカルを生成する。
【１０２１】
ＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ）は黒質のドーパミン作動性ニューロンへの栄養活性を有することが組織培養状況で実証されている（Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ． １９８９）。最近、Ｕｎｓｉｃｋｅｒ博士のグループは、ゲル形態インプラントとしてＦＧＦ−２を線条体に投与すると、ＭＰＴＰ曝露に関連づけられる毒性から黒質のドーパミン作動性ニューロンがほぼ完全に保護されることを実証した（Ｏｔｔｏ ａｎｄ Ｕｎｓｉｃｋｅｒ， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ， １９９０）。
【１０２２】
ＦＧＦ−２で得られたデータに基づいて、本発明のアルブミン融合タンパク質を評価し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるドーパミン作動性ニューロンの生存を増強するＦＧＦ−２の作用と類似の作用を有するかどうかを調べることができ、さらにまた、線条体においてＭＰＴＰ処理に関連づけられる損傷からドーパミン作動性ニューロンを保護することに関してｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。ドーパミン作動性ニューロン細胞培養状況において本発明のアルブミン融合タンパク質の潜在的効果を最初にｉｎ ｖｉｔｒｏで試験する。妊娠１４日目のＷｉｓｔｅｒラット胚由来の中脳底板を切り取ることにより、培養物を調製する。組織をトリプシンで分離し、そしてポリオルニチン−ラミニンでコーティングされたカバーガラス上に２００，０００細胞／ｃｍ２の密度で接種する。ホルモン添加物（ＮＩ）を含有するＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地およびＦ１２培地中で細胞を保持する。８日後、パラホルムアルデヒドにより培養物をｉｎ ｖｉｔｒｏで固定し、そしてドーパミン作動性ニューロンに対する特異的マーカーであるチロシンヒドロキシラーゼの免疫組織化学的染色のための処理を施す。胎児期ラットから解離細胞培養物を調製する。培養培地を３日ごとに交換し、因子もその時点で添加する。
【１０２３】
ドーパミン作動性前駆細胞が増殖する段階を過ぎている発生時期である妊娠１４日目にドーパミン作動性ニューロンを動物から単離するので、チロシンヒドロキシラーゼ免疫陽性ニューロンの数の増加は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生存するドーパミン作動性ニューロンの数の増加を表すであろう。したがって、本発明の治療用タンパク質がドーパミン作動性ニューロンの生存を延長するように作用するならば、前記融合タンパク質がパーキンソン病に関与しうることが示唆されよう。
【１０２４】
この実施例に記載した研究は、本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を試験するものであった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質およびポリヌクレオチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変することができるであろう（たとえば、遺伝子治療）。
【１０２５】
実施例２４： 血管内皮細胞の増殖に対する本発明のアルブミン融合タンパク質の効果
１日目、４％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１６ユニット／ｍｌヘパリン、および５０ユニット／ｍｌ内皮細胞増殖添加物（ＥＣＧＳ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， Ｉｎｃ．）を含有するＭ１９９培地中に、２〜５×１０４細胞／３５ｍｍディッシュの濃度でヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を接種する。２日目、培地を、１０％ ＦＢＳ、８ユニット／ｍｌヘパリンを含有するＭ１９９と置換する。本発明のアルブミン融合タンパク質および陽性対照、たとえば、ＶＥＧＦおよび塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を種々の濃度で添加する。４日目および６日目、培地を置換する。８日目、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒを用いて細胞数を測定する。
【１０２６】
ＨＵＶＥＣ細胞数の増加は、前記融合タンパク質が血管内皮細胞を増殖させうることを示し、一方、ＨＵＶＥＣ細胞数の減少は、前記融合タンパク質が血管内皮細胞を阻害することを示す。
【１０２７】
この実施例に記載した研究は、本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を試験するものであった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質およびポリヌクレオチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変することができるであろう。
【１０２８】
実施例２５： ラット角膜創傷治癒モデル
この動物モデルは、新血管形成に対する本発明のアルブミン融合タンパク質の効果を示す。実験プロトコルは、以下を含む。
【１０２９】
角膜の中心から間質層へ１〜１．５ｍｍの長さの切開を行う。
【１０３０】
眼の外端に面する切開の唇縁の下にスパーテルを挿入する。
【１０３１】
ポケットを作る（その底面は眼の縁から１〜１．５ｍｍである）。
【１０３２】
５０ｎｇ〜５μｇの本発明のアルブミン融合タンパク質を含むペレット剤を、ポケット内に配置する。
【１０３３】
本発明のアルブミン融合タンパク質を用いる治療は、２０ｍｇ〜５００ｍｇの用量範囲で角膜創傷に局所的に適用することもできる（５日間毎日治療）。
【１０３４】
この実施例に記載した研究は、本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を試験するものであった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質およびポリヌクレオチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変することができるであろう（たとえば、遺伝子治療）。
【１０３５】
実施例２６： 糖尿病マウスおよびグルココルチコイド障害性創傷治癒モデル
糖尿病のｄｂ＋／ｄｂ＋マウスモデル
本発明のアルブミン融合タンパク質が治癒過程を促進することを実証するために、創傷治癒の遺伝的糖尿病マウスモデルを使用する。ｄｂ＋／ｄｂ＋マウスにおける全層創傷治癒モデルは、障害性創傷治癒の十分に特性づけられた臨床的に関連する再現性のあるモデルである。糖尿病性創傷の治癒は、収縮に依存するのではなく肉芽組織の形成および再上皮形成に依存する（Ｇａｒｔｎｅｒ， Ｍ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ． ５２：３８９（１９９２）； Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ， Ｄ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １３６：１２３５（１９９０））。
【１０３６】
糖尿病動物は、ＩＩ型真性糖尿病で観察される特徴的特性の多くを有する。ホモ接合性（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、それらの正常なヘテロ接合性（ｄｂ＋／＋ｍ）同腹仔と比較して肥満である。突然変異体糖尿病（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスは、第４染色体上に単一の常染色体劣性突然変異（ｄｂ＋）を有する（Ｃｏｌｅｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：２８３−２９３（１９８２））。動物は、多食症、多渇症、および多尿症を示す。突然変異体糖尿病マウス（ｄｂ＋／ｄｂ＋）は、上昇した血中グルコース、増加したかまたは正常なインスリンレベル、および抑制された細胞媒介免疫を示す（Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２０：１３７５（１９７８）； Ｄｅｂｒａｙ−Ｓａｃｈｓ，Ｍ． ｅｔ ａｔ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１（１）：１−７（１９８３）； Ｌｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ． １１４：４６−５５（１９８５））。末梢神経障害、心筋合併症、および微小血管病変、基底膜肥厚、および糸球体濾過異常が、これらの動物で報告されている（Ｎｏｒｉｄｏ， Ｆ． ｅｔ ａｌ．， Ｅｘｐ． Ｎｅｕｒｏｌ． ８３（２）：２２１−２３２（１９８４）； Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２９（１）：６０−６７（１９８０）； Ｇｉａｃｏｍｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ． ４０（４）：４６０−４７３（１９７９）； Ｃｏｌｅｍａｎ， Ｄ．Ｌ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１（Ｓｕｐｐｌ）：１−６（１９８２））。これらのホモ接合性糖尿病マウスは、ヒトＩＩ型糖尿病に類似したインスリン耐性のある高血糖症を発症する（Ｍａｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２０：１３７５−１３７７（１９７８））。
【１０３７】
これらの動物で観察される特徴から、このモデルにおける治癒は、ヒト糖尿病で観察される治癒に類似している可能性があることがわかる（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ， ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． ｏｆ Ｐａｔｈｏｌ． １３６： １２３５−１２４６（１９９０））。
【１０３８】
遺伝的糖尿病の雌Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ（ｄｂ＋／ｄｂ＋）マウスおよびそれらの非糖尿病（ｄｂ＋／＋ｍ）へテロ接合性同腹仔を、この研究で用いる（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。これらの動物は６週齢で購入し、研究の開始時は８週齢である。動物を個別に収容し、そして自由に食物と水を与える。すべての操作を、無菌技法を用いて行う。実験は、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．の「Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」の規則および指針に従って行う。
【１０３９】
既報の方法に従って創傷プロトコルを実施する（Ｔｓｕｂｏｉ， Ｒ． ａｎｄ　Ｒｉｆｋｉｎ， Ｄ ．Ｂ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７２：２４５−２５１（１９９０））。簡潔に述べると、創傷を行う日に、脱イオン水に溶解したＡｖｅｒｔｉｎ（０．０１ｍｇ／ｍＬ）、２，２，２−トリブロモエタノールおよび２−メチル−２−ブタノールを腹腔内注射することにより、動物を麻酔する。動物の背面領域を剃毛し、そして７０％エタノール溶液およびヨードで皮膚を洗浄する。手術領域を滅菌ガーゼで拭ってから創傷させる。次いで、Ｋｅｙｅｓ組織パンチを用いて８ｍｍの全層創傷を形成する。創傷させた直後、創傷の拡大を止めるように周囲の皮膚を穏やかに伸ばす。実験の間、創傷は開放したままにしておく。治療剤の適用は、創傷日から開始して５日間連続で局所的に行う。処置の前に、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに創傷を洗浄する。
【１０４０】
手術日およびその後２日間隔で、創傷を目視検査し、固定距離で写真撮影する。１〜５日目の毎日および８日目に測定を行って、創傷閉鎖を判定する。目盛り付きＪａｍｅｓｏｎカリパスを用いて水平方向および垂直方向に創傷を測定する。肉芽組織がもはや肉眼で見えずかつ創傷が連続した上皮で覆われている場合、創傷は治癒したとみなされる。
【１０４１】
１日あたり創傷ごとに４ｍｇから５００ｍｇまでの範囲のさまざまな用量で本発明のアルブミン融合タンパク質をビヒクルに加えて８日間にわたり投与する。ビヒクル対照グループには、５０ｍＬのビヒクル溶液を与えた。
【１０４２】
８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して動物を安楽死させる。次いで、組織学的および免疫組織化学的に調べるために、創傷および周囲の皮膚を採取する。さらなる処理に付すべく、生検スポンジ間の組織カセット内の１０％中性緩衝化ホルマリン中に組織標本を入れる。
【１０４３】
それぞれ１０匹の動物（５匹は糖尿病であり、５匹は糖尿病でない対照である）を含む３つのグループ、すなわち、１）ビヒクルプラセボ対照、２）非処置グループ、および３）処置グループを評価する。
【１０４４】
垂直軸および水平軸で面積を測定して創傷の合計面積を求めることにより、創傷閉鎖を解析する。次いで、最初の創傷面積（０日目）と処置後の創傷面積（８日目）との差を求めることにより、縮小を評価する。１日目の創傷面積は６４ｍｍ２であり、これは皮膚パンチのサイズに対応する。計算は次式を用いて行う。
［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］
【１０４５】
１０％緩衝化ホルマリン中で標本を固定し、そしてパラフィン包埋塊を創傷表面に対して垂直方向に切片を切り出し（５ｍｍ）、そしてＲｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇミクロトームを用いて切断する。二等分された創傷の横断切片に対して、慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行う。創傷の組織学的検査を用いて、治癒過程および修復された皮膚の形態学的外観が、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いた処置によって変化したかどうかを評価する。この評価は、細胞蓄積、炎症細胞、毛細血管、線維芽細胞、再上皮形成、および表皮成熟の存在の検証を含むものであった（Ｇｒｅｅｎｈａｌｇｈ， Ｄ．Ｇ． ｅｔ ａｌ．， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １３６：１２３５ （１９９０））。目盛り付きレンズマイクロメーターが盲検観察者により使用される。
【１０４６】
組織切片にはまた、ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ検出システムを使用してポリクローナルウサギ抗ヒトケラチン抗体で免疫組織化学的に染色を施す。ヒト皮膚を陽性組織対照として使用し、一方、非免疫ＩｇＧを陰性対照として使用する。目盛り付きレンズマイクロメーターを用いて創傷の再上皮形成の程度を評価することにより、ケラチノサイト増殖を判定する。
【１０４７】
ＡＢＣ Ｅｌｉｔｅ検出システムで抗ＰＣＮＡ抗体（１：５０）を使用することにより、皮膚標本中の増殖細胞核抗原／サイクリン（ＰＣＮＡ）を実証する。ヒト大腸癌は、陽性組織対照としての役割を果たし、そしてヒト脳組織は、陰性組織対照として使用される。各標本は、一次抗体の欠落および非免疫マウスＩｇＧとの置換を有する切片を含んでいた。これらの切片のランクづけは、増殖の程度に基づいて、わずかな増殖を反映するスケールのより低い側から、激しい増殖を反映するより高い側まで０〜８のスケールで行われる。
【１０４８】
片側ｔ検定を用いて実験データを解析する。＜０．０５のｐ値は、有意であるとみなされる。
【１０４９】
ステロイド障害性ラットモデル
ステロイドによる創傷治癒の阻害は、種々のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ系で詳細に報告されている（Ｗａｈｌ， Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ Ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ． Ｉｎ： Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ： Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ． ２８０−３０２ （１９８９）； Ｗａｈｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１５： ４７６−４８１（１９７５）； Ｗｅｒｂ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １４７：１６８４−１６９４（１９７８））。グルココルチコイドは、血管形成を阻害すること、血管透過性（Ｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ａｎ． Ｉｎｔｅｒｎ． Ｍｅｄ． ３７：７０１−７０５（１９５２））、繊維芽細胞増殖、およびコラーゲン合成（Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ． ５： ２９５−３０４（１９９１）； Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ６１： ７０３−７９７（１９７８））を低下させること、ならびに循環性単球の一過的減少を生じること（Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ６１： ７０３−７９７（１９７８）； Ｗａｈｌ， ”Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ”， Ｉｎ： Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ： Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ．２８０−３０２（１９８９））によって創傷治癒を遅延させる。障害性創傷治癒に対するステロイドの全身的投与は、ラットにおいて十分に確立された現象である（Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ． ５： ２９５−３０４（１９９１）； Ｈａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ６１： ７０３−７９７（１９７８）； Ｗａｈｌ， ”Ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ ａｎｄ ｗｏｕｎｄ ｈｅａｌｉｎｇ”， Ｉｎ： Ａｎｔｉｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｓｔｅｒｏｉｄ Ａｃｔｉｏｎ： Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ｐｐ． ２８０−３０２（１９８９）； Ｐｉｅｒｃｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ２２２９−２２３３（１９８９））。
【１０５０】
本発明のアルブミン融合タンパク質が治癒過程を促進しうることを実証するために、治癒がメチルプレドニゾロンの全身的投与により損なわれたラットにおいて全層切除皮膚創傷に対する融合タンパク質の複数回の局所適用の効果を評価する。
【１０５１】
体重２５０〜３００ｇの若年成体の雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、この実験に用いる。動物は、８週齢で購入し、研究の開始時は９週齢である。ラットの治癒応答は、創傷の時点で、メチルプレドニゾロンの全身的投与（１７ｍｇ／ｋｇ／ラット、筋肉内）により損なわれる。動物を個別に収容し、そして自由に食物と水を与える。すべての操作を、無菌技法を用いて行う。この研究は、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．の「Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ」の規則および指針に従って行う。
【１０５２】
創傷プロトコルは、上記のプロトコルに準じる。創傷を行う日に、ケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ）を筋肉内注射することにより、動物を麻酔する。動物の背面領域を剃毛し、そして７０％エタノールおよびヨード溶液で皮膚を洗浄する。手術領域を滅菌ガーゼで拭ってから創傷させる。Ｋｅｙｅｓ組織パンチを用いて８ｍｍの全層創傷を形成する。実験の間、創傷を開放したままにしておく。試験物質の適用は、創傷させ、続いてメチルプレドニゾロンを投与した日から開始して、１日１回、７日間連続で、局所的に行う。処置の前に、滅菌生理食塩水およびガーゼスポンジを用いて穏やかに創傷を洗浄する。
【１０５３】
創傷を行う日および処置終了時に、創傷を目視検査し、固定距離で写真撮影する。１〜５日目の毎日および８日目に測定を行って、創傷閉鎖を判定する。目盛り付きＪａｍｅｓｏｎカリパスを用いて水平方向および垂直方向に創傷を測定する。肉芽組織がもはや肉眼で見えずかつ創傷が連続した上皮で覆われている場合、創傷は治癒したとみなされる。
【１０５４】
１日あたり創傷ごとに４ｍｇから５００ｍｇまでの範囲のさまざまな用量で本発明の融合タンパク質をビヒクルに加えて８日間にわたり投与する。ビヒクル対照グループには、５０ｍＬのビヒクル溶液を与えた。
【１０５５】
８日目にペントバルビタールナトリウム（３００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射して動物を安楽死させる。次いで、組織学的に調べるために、創傷および周囲の皮膚を採取する。さらなる処理に付すべく、生検スポンジ間の組織カセット内の１０％中性緩衝化ホルマリン中に組織標本を入れる。
【１０５６】
それぞれ１０匹の動物（５匹はメチルプレドニゾロンで処置し、５匹はグルココルチコイドで処置しない）を含む３つのグループ、すなわち、１）非処置グループ、２）ビヒクルプラセボ対照、および３）処置グループを評価する。
【１０５７】
垂直軸および水平軸で面積を測定して創傷の合計面積を求めることにより、創傷閉鎖を解析する。次いで、最初の創傷面積（０日目）と処置後の創傷面積（８日目）との差を求めることにより、閉鎖を評価する。１日目の創傷面積は６４ｍｍ２であり、これは皮膚パンチのサイズに対応する。計算は次式を用いて行う。
［８日目の開放面積］−［１日目の開放面積］／［１日目の開放面積］
【１０５８】
１０％緩衝化ホルマリン中で標本を固定し、そしてパラフィン包埋塊を創傷表面に対して垂直方向に切片を切り出し（５ｍｍ）、そしてＯｌｙｍｐｕｓミクロトームを用いて切断する。二等分された創傷の横断切片に対して、慣用的なヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行う。創傷の組織学的検査により、治癒過程および修復された皮膚の形態学的外観が、本発明のアルブミン融合タンパク質を用いた処置によって改善されたかどうかを評価することができる。目盛り付きレンズマイクロメーターが、創傷の切れ目の距離を測定するために盲検観察者により使用される。
【１０５９】
片側ｔ検定を用いて実験データを解析する。＜０．０５のｐ値は、有意であるとみなされる。
【１０６０】
この実施例に記載した研究は、本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を試験するものであった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質およびポリヌクレオチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変することができるであろう（たとえば、遺伝子治療）。
【１０６１】
実施例２７： リンパ浮腫動物モデル
この実験アプローチの目的は、ラット後肢におけるリンパ管形成およびリンパ循環系の再確立における本発明のアルブミン融合タンパク質の治療効果を試験するための適切かつ一貫したリンパ浮腫モデルを作製することである。有効性は、罹患した肢の腫脹体積、リンパ管構造の量の定量、総血漿タンパク質、および組織病理学により測定される。急性リンパ浮腫は、７〜１０日間観察される。おそらく、より重要なことには、浮腫の慢性進行は、３〜４週間まで続く。
【１０６２】
手術を始める前に、タンパク質濃度分析のために血液サンプルを採取する。体重約３５０ｇの雄ラットにペントバルビタールを投与する。続いて、右肢を膝から股関節部まで剃毛する。剃毛した範囲を、７０％ ＥｔＯＨに浸したガーゼで払拭する。血清全タンパク質試験のために血液を採取する。周径および体積を測定してから２つの測定レベル（踵の０．５ｃｍ上、足背の中間点）に印をつけ、その後、足に色素を注射する。右足背および左足背の両方の皮内に、０．０５ｍｌの１％ Ｅｖａｎ’ｓ Ｂｌｕｅを注射する。次に、足への色素注射に続いて、周径および体積の測定を行う。
【１０６３】
目印として膝関節を用いて、大腿血管の位置が確認できるように中肢鼡径部に周囲状に切開を行う。鉗子および止血剤を用いて、皮膚弁を切開して分離する。大腿血管の位置を確認した後、血管の側面に沿って血管の下を走るリンパ管の位置を確認する。次いで、この範囲の主要なリンパ管を電気的に凝固または縫合糸結紮する。
【１０６４】
顕微鏡を用いて、肢の背部の筋肉（半腱様筋および内転筋の付近）を平滑に切開する。次いで、膝窩リンパ節の位置を確認する。次に、２つの近位リンパ管および２つの遠位リンパ管ならびに膝窩節の遠位血液供給部を縫合糸により結紮する。次いで、結合組織を切断することによって、膝窩リンパ節および任意の付随する脂肪組織を切り取る。
【１０６５】
この手順により生じるいかなる軽度の出血をも抑制するように留意すること。リンパ管を閉塞させた後、液状皮膚（Ｖｅｔｂｏｎｄ）（ＡＪ Ｂｕｃｋ）を用いることによって、皮膚弁をシールする。解離した皮膚縁は、脚の周囲に約０．５ｃｍの間隙を残した状態で、その下の筋肉組織へシールする。皮膚はまた、必要なときにその下の筋肉に縫合することによって係留しうる。
【１０６６】
感染を防ぐために、金網を用いて動物を個別に収容する（床敷きなし）。最適な浮腫ピークを通過して、回復中の動物を毎日チェックする。このピークは、通常は５〜７日以内に生じる。次いで、プラトー浮腫ピークを観察する。リンパ浮腫の強度を評価するために、各肢の２つの指定部位の周径および体積を手術前および７日間毎日測定する。リンパ浮腫に対する血漿タンパク質の効果を調べ、そしてタンパク質分析が有用な試験周界であるかどうかもまた検査する。対照肢および浮腫肢の両方の重量を２部位について評価する。分析は盲検方式で行う。
【１０６７】
周径測定：肢の動きを阻止するための短時間のガス麻酔のもとで、布巻尺を使用して、肢の周径を測定する。２人の異なる人物により距骨および足背で測定を行い、次いで、これらの２つの読み取り値を平均する。対照肢および浮腫肢の両方から読み取る。
【１０６８】
体積測定：手術日にペントバルビタールで動物を麻酔し、そして手術の前に試験する。毎日の体積測定のために、動物を短時間ハロタン麻酔（迅速な不動化およびすばやい回復）の下におき、両方の脚を剃毛し、そして耐水性マーカーを用いて脚に同等に印をつける。最初に脚を水に漬け、次いでそれぞれの印をつけたレベルまで装置内に浸漬し、次いでＢｕｘｃｏ浮腫ソフトウェア（Ｃｈｅｎ／Ｖｉｃｔｏｒ）によって測定する。一人の人物がデータを記録し、もう一人の人物が、印をつけた領域まで脚を浸漬させる。
【１０６９】
血液−血漿タンパク質測定：手術前に採血し、遠心分離し、そして血清を分離し、その後手術を行い、最終的には、全タンパク質およびＣａ２＋の比較を行う。
【１０７０】
肢重量比較：採血した後、この動物に対して組織収集のための準備を行う。キリチン（ｑｕｉｌｌｉｔｉｎｅ）を用いて肢を切断し、次いで、実験脚と対照脚の両方を結紮線で切断し、重量を測定する。２回目の秤量は、脛踵の関節を外した状態で行い、足の重量を測定する。
【１０７１】
組織学的調製物：膝（膝窩）領域の後ろに位置する横筋を切り出し、そして金型中に配置し、ｆｒｅｅｚｅＧｅｌで満たし、冷却メチルブタンに浸漬し、切片化するまで−８０ＥＣにてラベルつきサンプルバッグに入れておく。切片化の際、蛍光顕微鏡下でリンパ管に関して筋肉を観察する。
【１０７２】
この実施例に記載した研究は、本発明の融合タンパク質の活性を試験するものであった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質およびポリヌクレオチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変することができるであろう（たとえば、遺伝子治療）。
【１０７３】
実施例２８： 本発明のアルブミン融合タンパク質によるＴＮＦα誘導性接着分子発現の抑制
炎症および血管形成の領域へのリンパ球の動員には、リンパ球上の細胞表面接着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特異的な受容体−リガンド相互作用が関与する。接着過程は、通常の環境および病理学的環境のいずれにおいても、内皮細胞（ＥＣ）上での細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、および内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチン）の発現を含む多段階カスケードに従う。血管内皮上でのこれらの分子および他の分子の発現は、白血球が局所血管構造に接着して炎症応答の生起の際に局所組織中に血管外溢出しうる効率を決定する。サイトカインおよび増殖因子の局所濃度は、これらのＣＡＭの発現のモジュレートに関与する。
【１０７４】
強力な前炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−ａ）は、内皮細胞における３種すべてのＣＡＭの刺激因子であり、多種多様な炎症応答に関与する可能性があり、しばしば、病的状態を引き起こす。
【１０７５】
ＴＮＦ−ａ誘導性ＣＡＭ発現の抑制を媒介する本発明のアルブミン融合タンパク質の能力を調べることができる。固相吸着剤としてＥＣを使用する改変型ＥＬＩＳＡアッセイを利用して、ＦＧＦファミリーのタンパク質のメンバーを用いて共刺激したときのＴＮＦ−ａ処理ＥＣにおけるＣＡＭ発現の量を測定することができる。
【１０７６】
この実験を行うために、プールした臍帯採取物からヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）培養物を取得し、５％ ＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーター内の、１０％ ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加した増殖培地（ＥＧＭ−２； Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）中に、保持する。９６ウェルプレートのＥＧＭ培地中に１×１０４細胞／ウェルの濃度でＨＵＶＥＣを接種し、３７℃で１８〜２４時間または集密状態になるまで置く。続いて、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＲＰＭＩ−１６４０の無血清溶液で単層を３回洗浄し、そして所定のサイトカインおよび／または増殖因子を用いて３７℃で２４時間処理する。インキュベーション後、続いて、ＣＡＭ発現に関して細胞を評価する。
【１０７７】
標準的な９６ウェルプレートでヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を集密状態になるまで増殖させる。細胞から増殖培地を取り除き、そして９０μｌの１９９培地（１０％ＦＢＳ）に置き換える。試験用サンプルおよび正または陰性対照を３重反復試験方式でプレートに添加する（１０μｌ容量）。プレートを３７℃で５時間（セレクチンおよびインテグリン発現）または２４時間（インテグリン発現のみ）のいずれかでインキュベートする。プレートを吸引して培地を除去し、そして１００μｌの０．１％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含有する）を各ウェルに添加する。プレートを４℃で３０分間保持する。
【１０７８】
次いで、固定液をウェルから除去し、そしてＰＢＳ（＋Ｃａ，Ｍｇ）＋０．５％ ＢＳＡを用いてウェルを１回洗浄し、そして排水する。ウェルを乾燥させないこと。１０μｌの希釈した一次抗体を試験ウェルおよび対照ウェルに添加する。抗ＩＣＡＭ−１−ビオチン、抗ＶＡＣＭ−１−ビオチンおよび抗Ｅ−セレクチン−ビオチンを１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ／ｍｌストック抗体の１：１０希釈）で使用する。加湿した環境において細胞を３７℃で３０分間インキュベートする。ＰＢＳ（＋Ｃａ，Ｍｇ）＋０．５％ ＢＳＡを用いてウェルを３回洗浄する。
【１０７９】
次に、２０μｌの希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ（希釈度１：５，０００）を各ウェルに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。ＰＢＳ（＋Ｃａ，Ｍｇ）＋０．５％ ＢＳＡを用いてウェルを３回洗浄する。１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェートｐＮＰＰを５ｍｌのグリシン緩衝液（ｐＨ１０．４）に溶解させる。ｐＮＰＰ基質を含むグリシン緩衝液１００μｌを各試験ウェルに添加する。ＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅの使用希釈物を含むグリシン緩衝液から３重反復試験方式で標準ウェルを調製する（１：５，０００（１００）＞１０−０．５＞１０−１＞１０−１．５）。５μｌの各希釈物を３重反復試験ウェルに添加し、各ウェル中のＡＰ含量が、５．５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇになるようにする。次いで、１００μｌのｐＮＮＰ試薬を標準ウェルのそれぞれに添加しなければならない。プレートを３７℃にて４時間インキュベートしなければならない。容量５０μｌの３Ｍ ＮａＯＨをすべてのウェルに添加する。得られた液をプレートリーダーにより４０５ｎｍで定量する。グリシン緩衝液のみで満たしたブランクウェルに対してバックグラウンド差引きオプションを用いる。それぞれの標準ウェル中のＡＰ−コンジュゲート濃度が［５．５０ｎｇ； １．７４ｎｇ； ０．５５ｎｇ； ０．１８ｎｇ］になるようにテンプレートを構成する。結果は、各サンプル中の結合したＡＰ−コンジュゲートの量として示す。
【１０８０】
この実施例に記載した研究は、本発明の融合タンパク質の活性を試験するものであった。しかしながら、当業者は、本発明の融合タンパク質およびポリヌクレオチドの活性を試験するように例示された研究を容易に改変することができるであろう（たとえば、遺伝子治療）。
【１０８１】
実施例２９： ＧＡＳリポーター構築物の構築
細胞の分化および増殖に関与する１つのシグナル伝達経路は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路と呼ばれる。Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路で活性化されたタンパク質は、多くの遺伝子のプロモーターに存在するガンマ活性化部位「ＧＡＳ」エレメントまたはインターフェロン感受性応答エレメント（「ＩＳＲＥ」）に結合する。これらのエレメントへのタンパク質の結合は、関連する遺伝子の発現を変化させる。
【１０８２】
ＧＡＳおよびＩＳＲＥエレメントは、転写のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター、すなわち「ＳＴＡＴ」と呼ばれるクラスの転写因子によって認識される。ＳＴＡＴファミリーには６つのメンバーが存在する。Ｓｔａｔ１およびＳｔａｔ３は、Ｓｔａｔ２と同様に多くの細胞型に存在する（ＩＦＮαに対する応答が広範であるので）。Ｓｔａｔ４は、より限定されており、多くの細胞型には存在しないが、ＩＬ−１２で処理した後のＴヘルパークラスＩの細胞に見いだされている。Ｓｔａｔ５は、当初、乳房増殖因子と呼ばれたが、骨髄性細胞を含む他の細胞において、より高い濃度で見いだされている。これは、多くのサイトカインによって組織培養細胞において活性化されうる。
【１０８３】
ＳＴＡＴは、Ｊａｎｕｓ Ｋｉｎａｓｅ（「Ｊａｋ」）ファミリーとして公知のキナーゼのセットによりチロシンリン酸化を受けると、活性化されて細胞質から核へ移行する。Ｊａｋは、可溶性チロシンキナーゼの別個のファミリーであり、Ｔｙｋ２、Ｊａｋ１、Ｊａｋ２、およびＪａｋ３を含む。これらのキナーゼは、顕著な配列類似性を示し、そして一般的には休止細胞中では触媒的に不活性である。
【１０８４】
Ｊａｋは、以下の表によりまとめられる多種多様な受容体によって活性化される。（Ｓｃｈｉｄｌｅｒ ａｎｄ Ｄａｒｎｅｌｌ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６４：６２１−５１（１９９５）によるレビューから抜粋編集）。Ｊａｋを活性化しうるサイトカイン受容体ファミリーは、２つのグループに分けられる：（ａ）クラス１は、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、Ｅｐｏ、ＰＲＬ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、およびトロンボポエチンに対する受容体を含み；そして（ｂ）クラス２は、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−ｇ、およびＩＬ−１０を含む。クラス１受容体は、保存されたシステインモチーフ（４つの保存されたシステインおよび１つのトリプトファンのセット）およびＷＳＸＷＳモチーフ（Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｘａａ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（配列番号３７）をコードする膜近接領域）を共有する。
【１０８５】
したがって、受容体へのリガンドの結合が起こると、Ｊａｋが活性化され、これにより次にＳＴＡＴが活性化され、その後、移行してＧＡＳエレメントに結合する。この全過程は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路に包含される。したがって、ＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントの結合によりもたらされるＪａｋ−ＳＴＡＴ経路の活性化は、細胞の増殖および分化に関与するタンパク質を指定するために使用されうる。たとえば、増殖因子およびサイトカインは、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路を活性化することが知られている（以下の表を参照されたい）。したがって、リポーター分子に連結したＧＡＳエレメントを使用することにより、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ経路のアクチベーターを同定することができる。
【１０８６】
2004506407.tif 000171
【１０８７】
実施例３２〜３３に記載の生物学的アッセイに使用されるプロモーターエレメント含有合成ＧＡＳを構築するために、ＰＣＲに基づくストラテジーを利用してＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーター配列を作製する。５’プライマーには、ＩＲＦ１プロモーター中に見いだされ、一定範囲のサイトカインによる誘導を受けるとＳＴＡＴに結合することが既に実証されている、ＧＡＳ結合部位の４つのタンデムコピーが含まれるが（Ｒｏｔｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １：４５７−４６８（１９９４））、他のＧＡＳまたはＩＳＲＥエレメントを代わりに使用することもできる。５’プライマーはまた、ＳＶ４０初期プロモーター配列に相補的な１８ｂｐの配列を含み、そしてＸｈｏＩ部位でフランキングされている。５’プライマーの配列は次のとおりである。
2004506407.tif 000172
【１０８８】
下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターに相補的であり、そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位でフランキングされている： ５’：ＧＣＧＧＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ：３’ （配列番号３９）。
【１０８９】
Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したＢ−ｇａｌ：プロモータープラスミド中に存在するＳＶ４０プロモーター鋳型を用いてＰＣＲ増幅を行う。得られたＰＣＲ断片をＸｈｏＩ／Ｈｉｎｄ ＩＩＩで消化させ、そしてＢＬＳＫ２−．（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中にサブクローン化する。フォワードおよびリバースプライマーを用いる配列決定により、インサートが以下の配列を含有することを確認する。
2004506407.tif 000173
【１０９０】
このＧＡＳプロモーターエレメントをＳＶ４０プロモーターに連結させたら、次に、ＧＡＳ：ＳＥＡＰ２リポーター構築物を遺伝子工学的に作製する。ここで、リポーター分子は、分泌アルカリホスファターゼ、すなわち「ＳＥＡＰ」である。しかしながら、明らかに、この実施例または他の実施例のいずれにおいても、任意のリポーター分子がＳＥＡＰの代わりになりうる。ＳＥＡＰの代わりに使用しうる周知のリポーター分子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または抗体により検出可能な任意のタンパク質が挙げられる。
【１０９１】
上記の配列の確認された合成ＧＡＳ−ＳＶ４０プロモーターエレメントをＣｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＳＥＡＰ−プロモーターベクター中に、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩを用いてサブクローン化し、増幅させたＧＡＳ： ＳＶ４０プロモーターエレメントでＳＶ４０プロモーターを効率的に置換して、ＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターを作製する。しかしながら、このベクターはネオマイシン耐性遺伝子を含んでおらず、したがって、哺乳動物の発現系には好ましくない。
【１０９２】
したがって、ＧＡＳ−ＳＥＡＰリポーターを発現する哺乳動物の安定な細胞株を作製するために、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いてＧＡＳ−ＳＥＡＰカセットをＧＡＳ−ＳＥＡＰベクターから切り出し、そしてマルチクローニングサイトのこれらの制限部位を用いて、ネオマイシン耐性遺伝子を含むバックボーンベクター、たとえば、ｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入することにより、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製する。このベクターを哺乳動物細胞にトランスフェクトすれば、このベクターは、次に実施例３２〜３３に記載されているようにＧＡＳ結合に対するリポーター分子として使用することができる。
【１０９３】
上記の説明を使用してＧＡＳを異なるプロモーター配列で置換することにより、他の構築物を作製することができる。たとえば、ＥＧＲおよびＮＦ−ＫＢプロモーター配列を含むリポーター分子の構築について、実施例３４および３５に記載する。しかしながら、これらの実施例に記載のプロトコルを使用して、多くの他のプロモーターを置換することができる。具体的には、ＳＲＥ、ＩＬ−２、ＮＦＡＴ、またはオステオカルシンプロモーターを単独でまたは組み合わせて（たとえば、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ／ＥＧＲ、ＧＡＳ／ＮＦ−ＫＢ、Ｉｌ−２／ＮＦＡＴ、またはＮＦ−ＫＢ／ＧＡＳ）置換することができる。同様に、ＨＥＬＡ（上皮細胞）、ＨＵＶＥＣ（内皮細胞）、Ｒｅｈ（Ｂ細胞）、Ｓａｏｓ−２（骨芽細胞）、ＨＵＶＡＣ（大動脈細胞）、または心筋細胞のような他の細胞株を用いてリポーター構築物の活性を試験することができる。
【１０９４】
実施例３０： ＳＥＡＰ活性のアッセイ
本明細書に開示されている実施例に記載のアッセイのためのリポーター分子として、ＳＥＡＰ活性を、以下の一般的な手順に従ってＴｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔ（カタログ番号ＢＰ−４００）を用いてアッセイする。Ｔｒｏｐｉｘ Ｐｈｏｓｐｈｏ−ｌｉｇｈｔ Ｋｉｔは、以下で使用される希釈、アッセイ、および反応緩衝液を供給する。
【１０９５】
ディスペンサーに２．５×希釈緩衝液を満たし、そして本発明のアルブミン融合タンパク質を含有する３５μｌ溶液の入ったオプティプレート（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ）中に１５μｌの２．５×希釈緩衝液を分配する。プラスチックシーラーでプレートをシールし、そして６５℃で３０分間インキュベートする。不均一な加温を避けるためにオプティプレートを離間させて置く。
【１０９６】
サンプルを室温まで１５分間冷却する。ディスペンサーを空にしてアッセイ緩衝液で満たす。５０ｍｌのアッセイ緩衝液を添加し、室温で５分間インキュベートする。ディスペンサーを空にして反応緩衝液で満たす（以下の表を参照されたい）。５０μｌの反応緩衝液を添加して室温で２０分間インキュベートする。化学発光シグナルの強度は時間依存的であり、ルミノメーターで５つのプレートを読み取るのに約１０分かかるので、各回に５つのプレートを処理し、１０分後に２つ目のセットを開始しなければならない。
【１０９７】
ルミノメーターで相対光量単位の値を読み取る。ブランクとしてＨ１２をセットし、そして結果を印刷する。化学発光の増加は、リポーター活性を示す。
【１０９８】
2004506407.tif 000174
【１０９９】
実施例３１： ニューロン活性を同定するアッセイ
細胞が分化および増殖を起こす場合、一群の遺伝子が多くの異なるシグナル伝達経路を介して活性化される。これらの遺伝子の１つであるＥＧＲ１（初期増殖応答遺伝子１）は、活性化の際に種々の組織および細胞型で誘導される。ＥＧＲ１のプロモーターはそのような誘導の役割を担う。リポーター分子に連結されたＥＧＲ１プロモーターを使用して、細胞を活性化する本発明の融合タンパク質の能力を評価することができる。
【１１００】
特に、以下のプロトコルを用いてＰＣ１２細胞系におけるニューロン活性を評価する。ＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫（ｐｈｅｎｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ）細胞）は、ＴＰＡ（テトラデカノイルホルボールアセテート）、ＮＧＦ（神経増殖因子）、およびＥＧＦ（表皮増殖因子）のような多くのマイトジェンにより活性化されて増殖および／または分化することが知られている。この処置の間にＥＧＲ１遺伝子発現が活性化される。したがって、ＳＥＡＰリポーターに連結されたＥＧＲプロモーターを含む構築物でＰＣ１２細胞を安定にトランスフェクトすることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質によるＰＣ１２細胞の活性化を評価することができる。
【１１０１】
以下のプロトコルによりＥＧＲ／ＳＥＡＰリポーター構築物をアセンブルする。以下のプライマーを用いてＥＧＲ−１プロモーター配列（−６３３〜＋１）（Ｓａｋａｍｏｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ．， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：８６７−８７１（１９９１））をヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅することができる。
【１１０２】
2004506407.tif 000175
【１１０３】
次いで、実施例２９で産生させたＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを用いて、このベクターにＥＧＲ１増幅産物を挿入することができる。制限酵素ＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを用いてＧＡＳ：ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを線状化し、ＧＡＳ／ＳＶ４０スタッファーを取り出す。これらと同一の酵素を用いて、ＥＧＲ１増幅産物を制限切断する。ベクターとＥＧＲ１プロモーターとを連結させる。
【１１０４】
細胞培養のための９６ウェルプレートを作製するために、コーティング溶液（３０％エタノール（滅菌濾過）中のＩ型コラーゲン（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ．カタログ番号０８−１１５）の１：３０希釈液）を１つの１０ｃｍプレートあたり２ｍｌまたは９６ウェルプレートの１つのウェルあたり５０ｍｌ添加し、そして２時間空気乾燥させる。
【１１０５】
あらかじめコーティングされている１０ｃｍ組織培養ディッシュ上において、１００ユニット／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足した、１０％ウマ血清（ＪＲＨ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ、カタログ番号１２４４９−７８Ｐ）、５％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中でＰＣ１２細胞を慣例に従って増殖させる。１／４分割を３〜４日ごとに行う。細胞を掻き取ることによりプレートから取り出し、そしてピペットによる吸上および滴下を１６回以上行って再懸濁させる。
【１１０６】
当技術分野で公知の方法を用いて、ＥＧＲ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物をＰＣ１２にトランスフェクトする。３００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８中で細胞を増殖させることにより、ＥＧＲ−ＳＥＡＰ／ＰＣ１２安定細胞を得る。通常の増殖では、Ｇ４１８を含まない培地を使用するが、１〜２ヶ月ごとに２、３回の継代で３００μｇ／ｍｌのＧ４１８中で細胞を再増殖させなければならない。
【１１０７】
ニューロン活性をアッセイするために、古い培地を除去して約７０〜８０％の集密度で細胞を有する１０ｃｍプレートをスクリーニングする。ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）で細胞を１回洗浄する。次いで、一晩かけて低血清培地（抗生物質と共に１％ウマ血清および０．５％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０）中で細胞を飢餓状態にする。
【１１０８】
翌朝、培地を除去し、そして細胞をＰＢＳで洗浄する。プレートから細胞を掻き取り、２ｍｌ低血清培地中で細胞を十分に懸濁させる。細胞数をカウントし、そして５×１０５細胞／ｍｌの最終細胞濃度になるように、より低血清の培地を添加する。
【１１０９】
２００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルプレートの各ウェルに添加する（１×１０５細胞／ウェルに相当）。一連のさまざまな濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質を３７℃で４８〜７２時間添加する。ＥＧＲを介してＰＣ１２細胞を活性化することが知られている増殖因子、たとえば、５０ｎｇ／μｌの神経増殖因子（ＮＧＦ）を、陽性対照として使用することができる。典型的には、５０倍を超えるＳＥＡＰ誘導が陽性対照で観察される。当技術分野で公知の方法を用いておよび／または実施例３０の記載に従って、上清をＳＥＡＰアッセイする。
【１１１０】
実施例３２： Ｔ細胞活性のアッセイ
以下のプロトコルを使用して、因子を同定し、そして本発明のアルブミン融合タンパク質がＴ細胞を増殖および／または分化させるかを調べることによって、Ｔ細胞活性を評価する。実施例２９で産生させたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いてＴ細胞活性を評価する。したがって、ＳＥＡＰ活性を増加させる因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化する能力を示す。このアッセイに使用したＴ細胞は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＴＩＢ−１５２）であるが、Ｍｏｌｔ−３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５５２）およびＭｏｌｔ−４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８２）細胞を使用することもできる。
【１１１１】
Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、リンパ芽球ＣＤ４＋Ｔｈ１ヘルパー細胞である。安定な細胞系を産生するために、ＤＭＲＩＥ−Ｃ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて約２００万個のＪｕｒｋａｔ細胞をＧＡＳ−ＳＥＡＰ／ｎｅｏベクターでトランスフェクトする（以下に記載のトランスフェクション手順）。トランスフェクトした細胞を１ウェルあたり約２０，０００個の密度で接種し、そして１ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（ｇｅｎｔｉｃｉｎ）に対して耐性であるトランスフェクタントを選択する。耐性コロニーを増殖させ、次いで、漸増濃度のインターフェロンγに対するそれらの応答について試験する。選択されたクローンの用量応答が示される。
【１１１２】
詳細には、以下のプロトコルにより、２００μｌの細胞を含む７５個のウェルで十分な細胞が得られるであろう。したがって、スケールアップするか、または複数の９６ウェルプレートで十分な細胞を産生するように複数で実施する。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、１％ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐを含むＲＰＭＩ＋１０％血清中で維持する。Ｔ２５フラスコ中で２．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１０μｇのプラスミドＤＮＡと混合する。５０μｌのＤＭＲＩＥ−Ｃを含む２．５ｍｌ ＯＰＴＩ−ＭＥＭを添加し、そして、室温で１５〜４５分間インキュベートする。
【１１１３】
インキュベート時間中、細胞濃度をカウントし、所要の細胞数（１トランスフェクションあたり１０７個）を遠心沈降させ、そして１０７細胞／ｍｌの最終濃度になるようにＯＰＴＩ−ＭＥＭ中に再懸濁させる。次いで、１×１０７細胞を有する１ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭをＴ２５フラスコに添加し、そして３７℃で６時間インキュベートする。インキュベーション後、１０ｍｌのＲＰＭＩ＋１５％血清を添加する。
【１１１４】
ＲＰＭＩ＋１０％血清、１ｍｇ／ｍｌジェネティシン（Ｇｅｎｔｉｃｉｎ）、および１％ Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で、Ｊｕｒｋａｔ：ＧＡＳ−ＳＥＡＰ安定リポーター系を維持する。これらの細胞をさまざまな濃度の本発明の１種以上の融合タンパク質で処理する。
【１１１５】
融合タンパク質で処理する日に、細胞を洗浄し、そして１ｍｌあたり５００，０００個の細胞濃度となるように新鮮なＲＰＭＩ＋１０％血清中に再懸濁させなければならない。必要となる正確な細胞数は、融合タンパク質の数、およびスクリーニングされる融合タンパク質の異なる濃度の数に依存する。１枚の９６ウェルプレートについて、およそ１０００万個の細胞（１０枚のプレートについて１億個の細胞）を必要とする。
【１１１６】
融合タンパク質で処理したＪｕｒｋａｔ細胞を含むウェルディッシュをインキュベーターに４８時間入れる（注：この時間は４８〜７２時間の間で変更可能である）。次いで、１２チャンネルのピペットを用いて、各ウェルから３５μｌのサンプルを不透明な９６ウェルプレートに移す。不透明なプレートをカバーで覆い（セロファンカバーを用いて）、そして実施例３０に従ってＳＥＡＰアッセイを行うまで、−２０℃で保存しなければならない。残存する処理済み細胞を含むプレートを４℃に置き、そして、所望により、特定のウェルでアッセイを繰り返すための物質の供給源として役立てる。
【１１１７】
陽性対照として、１００ユニット／ｍｌインターフェロンγを使用することができる。これは、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を活性化することが知られている。典型的には、３０倍を超える誘導が、陽性対照のウェルで観察される。
【１１１８】
当業者には自明なことであろうが、上記のプロトコルは、一過性のトランスフェクト細胞および安定なトランスフェクト細胞の両方の生成に使用することが可能である。
【１１１９】
実施例３３： Ｔ細胞活性のアッセイ
ＮＦ−ＫＢ（核因子ＫＢ）は、転写因子であって、炎症性サイトカインであるＩＬ−１およびＴＮＦ、ＣＤ３０およびＣＤ４０、リンホトキシン−αおよびリンホトキシン−βを含めて、多種多様な物質により、ＬＰＳまたはトロンビンへの曝露により、ならびに特定のウイルス遺伝子産物の発現により活性化される。転写因子として、ＮＦ−ＫＢは、免疫細胞の活性化に関与する遺伝子の発現、アポトーシスの制御（ＮＦ−ＫＢは、アポトーシスから細胞を防御するようである）、Ｂ細胞およびＴ細胞の発生、抗ウイルス応答および抗微生物応答、ならびに複数のストレス応答を調節する。
【１１２０】
無刺激条件では、ＮＦ−ＫＢは、Ｉ−ＫＢ（インヒビターＫＢ）と共に細胞質に保持される。しかしながら、刺激されると、Ｉ−ＫＢは、リン酸化および分解されて、核へのＮＦ−ＫＢの往復を引き起こすことにより、標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−ＫＢにより活性化される標的遺伝子としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣＡＭ−１およびクラス１ ＭＨＣが挙げられる。
【１１２１】
その中心的な役割および一定の範囲の刺激に応答する能力のために、ＮＦ−ＫＢプロモーターエレメントを利用するリポーター構築物は、融合タンパク質のスクリーニングに使用される。ＮＦ−ＫＢのアクチベーターまたはインヒビターは、疾患の治療、予防、および／または診断に有用である。たとえば、ＮＦ−ＫＢのインヒビターは、ＮＦ−ＫＢの急性または慢性活性化に関連する疾患、たとえば、慢性関節リウマチ、を処置するために使用しうる。
【１１２２】
ＮＦ−ＫＢプロモーターエレメントを含むベクターを構築するために、ＰＣＲに基づいたストラテジーを利用する。上流プライマーは、ＮＦ−ＫＢ結合部位（ＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ）（配列番号４３）の４つのタンデムコピー、ＳＶ４０初期プロモーター配列の５’末端に相補的な１８ｂｐの配列を含み、そしてＸｈｏＩ部位でフランキングされている。
2004506407.tif 000176
　下流プライマーは、ＳＶ４０プロモーターの３’末端に相補的であり、そしてＨｉｎｄＩＩＩ部位でフランキングされている。
2004506407.tif 000177
【１１２３】
Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手したｐＢ−ｇａｌ：プロモータープラスミドに存在するＳＶ４０プロモーター鋳型を使用して、ＰＣＲ増幅を行う。得られたＰＣＲ断片をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢＬＳＫ２−（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローン化する。Ｔ７およびＴ３プライマーを用いる配列決定により、インサートが以下の配列を含むことを確認する。
2004506407.tif 000178
【１１２４】
次に、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＳＥＡＰ２−プロモータープラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に存在するＳＶ４０最小プロモーターエレメントをこのＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０断片で置換する。しかしながら、このベクターはネオマイシン耐性遺伝子を含んでおらず、したがって、哺乳動物の発現系には好ましくない。
【１１２５】
安定な哺乳動物細胞系を作製するために、制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを使用して、上記のＮＦ−ＫＢ／ＳＥＡＰベクターからＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットを取り出し、そしてネオマイシン耐性を含むベクターに挿入する。特定的には、ＳａｌＩおよびＮｏｔＩでｐＧＦＰ−１を制限切断した後、ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰカセットをｐＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入してＧＦＰ遺伝子を置換した。
【１１２６】
ＮＦ−ＫＢ／ＳＶ４０／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏベクターを作製した後、実施例３２に記載のプロトコルに従って、安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を作製し、維持する。これらの安定なＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を用いて融合タンパク質をアッセイする方法についても、同様に、実施例３２に記載される。陽性対照として、外因性ＴＮＦα（０．１、１、１０ｎｇ）をウェルＨ９、Ｈ１０、およびＨ１１に添加すると、典型的には、５〜１０倍の活性化が観察される。
【１１２７】
実施例３３： 骨髄活性を同定するアッセイ
以下のプロトコルを用いて、融合タンパク質が骨髄細胞を増殖および／または分化させるかを調べることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質の骨髄活性を評価する。実施例２９で産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物を用いて骨髄細胞活性を評価する。したがって、ＳＥＡＰ活性を増大させる因子は、Ｊａｋｓ−ＳＴＡＴＳシグナル伝達経路を活性化させる能力を示す。このアッセイに使用した骨髄細胞は、前単球細胞系Ｕ９３７であるが、ＴＦ−１、ＨＬ６０、またはＫＧ１を使用することもできる。
【１１２８】
実施例２９で産生されたＧＡＳ／ＳＥＡＰ／Ｎｅｏ構築物でＵ９３７細胞を一過性にトランスフェクトするために、ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（Ｋｈａｒｂａｎｄａ ｅｔ ａｌ， １９９４， Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ＆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ， ５：２５９−２６５）を使用する。最初に、２×１０７個のＵ９３７細胞を採取し、そしてＰＢＳで洗浄する。通常、１００ユニット／ｍｌペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足した１０％熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ １６４０培地中でＵ９３７細胞を増殖させる。
【１１２９】
次に、０．５ｍｇ／ｍｌ ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ、８μｇ ＧＡＳ−ＳＥＡＰ２プラスミドＤＮＡ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３７５μＭ Ｎａ２ＨＰＯ４．７Ｈ２Ｏ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、および６７５μＭ ＣａＣｌ２を含有する１ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液中に細胞を懸濁させる。３７℃で４５分間インキュベートする。
【１１３０】
１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を洗浄し、次いで、１０ｍｌ 完全培地中に再懸濁させ、そして３７℃で３６時間インキュベートする。
【１１３１】
４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８中で細胞を増殖させることにより、ＧＡＳ−ＳＥＡＰ／Ｕ９３７安定細胞を得る。通常の増殖では、Ｇ４１８を含まない培地を使用するが、１〜２ヶ月ごとに２、３回の継代で４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８中で細胞を再増殖させなければならない。
【１１３２】
これらの細胞を試験するため、１×１０８個の細胞（これは１０枚の９６ウェルプレートでアッセイするのに十分である）を採取してＰＢＳで洗浄する。上記の増殖培地２００ｍｌ中に５×１０５細胞／ｍｌの最終濃度で細胞を懸濁させる。９６ウェルプレートで１ウェルあたり２００μｌの細胞（すなわち、１×１０５細胞／ウェル）をプレーティングする。
【１１３３】
さまざまな濃度の融合タンパク質を添加する。３７℃で４８〜７２時間インキュベートする。陽性対照として、１００ユニット／ｍｌインターフェロンγを使用することができる。これはＵ９３７細胞を活性化させることが知られている。典型的には、３０倍を超える誘導が、陽性対照のウェルで観察される。当技術分野で公知の方法および／または実施例３０に記載のプロトコルに従って上清をＳＥＡＰアッセイする。
【１１３４】
実施例３４： 小分子の濃度および膜透過性の変化を同定するアッセイ
受容体へのリガンドの結合は、カルシウム、カリウム、ナトリウムのような小分子およびｐＨの細胞内レベルを変化させるだけでなく膜電位をも変化させることが知られている。特定の細胞の受容体に結合する融合タンパク質を同定するアッセイで、これらの変化を測定することができる。以下のプロトコルは、カルシウムのアッセイについて記載したものであるが、このプロトコルは、カリウム、ナトリウム、ｐＨ、膜電位、または蛍光プローブにより検出可能な他の小分子に関する変化を検出するように容易に改変されうる。
【１１３５】
以下のアッセイでは、蛍光イメージングプレートリーダー（「ＦＬＩＰＲ」）を用いて、小分子と結合する蛍光分子（分子プローブ）の変化を測定する。明らかなように、ここで使用されているカルシウム蛍光分子ｆｌｕｏ−４ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．； カタログ番号Ｆ−１４２０２）の代わりに、小分子を検出する任意の蛍光分子を使用することができる。
【１１３６】
付着細胞の場合、透明な底を有するＣｏ−ｓｔａｒ黒色９６ウェルプレートに１０，０００〜２０，０００細胞／ウェルで細胞を接種する。ＣＯ２インキュベーター内でプレートを２０時間インキュベートする。２００μｌのＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ平衡塩類溶液）を用いてＢｉｏｔｅｋ洗浄器中で付着細胞を２回洗浄し、最終洗浄の後、１００μｌの緩衝液を残すようにする。
【１１３７】
１ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−４のストック溶液を１０％プルロニック酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）ＤＭＳＯで調製する。細胞にｆｌｕｏ−４を供給するため、５０μｌの１２μｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−４を各ウェルに添加する。ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で、プレートを６０分間インキュベートする。ＨＢＳＳを用いてＢｉｏｔｅｋ洗浄器中でプレートを４回洗浄し、１００μｌの緩衝液を残すようにする。
【１１３８】
非付着細胞の場合、培養培地から細胞を遠心沈降させる。細胞を、ＨＢＳＳを用いて５０ｍｌコニカルチューブ中で２〜５×１０６細胞／ｍｌになるように再懸濁させる。細胞懸濁液１ｍｌあたり４μｌの量で１０％プルロニック酸ＤＭＳＯ中の１ｍｇ／ｍｌ ｆｌｕｏ−４溶液を添加する。次に、チューブを３７℃の水浴中３０〜６０分間入れる。細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌになるように再懸濁させ、そしてマイクロプレートに１００μｌ／ウェルで分配する。プレートを１０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかける。次に、２００μｌを用いてＤｅｎｌｅｙ Ｃｅｌｌ Ｗａｓｈでプレートを１回洗浄した後、吸引処理により最終容量を１００μｌにする。
【１１３９】
非細胞ベースのアッセイでは、各ウェルにｆｌｕｏ−４のような蛍光分子を入れる。本発明の融合タンパク質をウェルに添加し、そして蛍光の変化を検出する。
【１１４０】
細胞内カルシウムの蛍光を測定するために、ＦＬＩＰＲを以下のパラメーターに設定する： （１）システムのゲインは３００〜８００ｍＷである； （２）露出時間は０．４秒間である； （３）カメラのＦ／絞りはＦ／２である； （４）励起は４８８ｎｍである； （５） 発光は５３０ｎｍである； および（６）サンプル添加は５０μｌである。５３０ｎｍにおける発光の増加は、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質により誘導された分子によって引き起こされた細胞外シグナル伝達事象を表し、この伝達事象が細胞内Ｃａ＋＋濃度の増加をもたらした。
【１１４１】
実施例３５： チロシンキナーゼ活性を同定するアッセイ
プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、さまざまなグループの膜貫通および細胞質キナーゼを代表するものである。受容体プロテインチロシンキナーゼ（ＲＰＴＫ）グループの中には、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＨＧＦおよびインスリン受容体サブファミリーを含めて、一定の範囲の分裂促進性および代謝性増殖因子に対する受容体がある。さらに、対応するリガンドが知られていない大きなＲＰＴＫファミリーが存在する。ＲＰＴＫのリガンドとしては、主に、分泌される小タンパク質が含まれるが、膜結合および細胞外マトリックスタンパク質も含まれる。
【１１４２】
リガンドによるＲＰＴＫの活性化は、結果として受容体サブユニットのトランスリン酸化および細胞質チロシンキナーゼの活性化を生じさせるリガンド媒介受容体二量体化を含む。細胞質チロシンキナーゼとしては、ｓｒｃファミリー（たとえば、ｓｒｃ、ｙｅｓ、ｌｃｋ、ｌｙｎ、ｆｙｎ）の受容体関連チロシンキナーゼ、ならびにＪａｋファミリーのような非受容体結合および細胞質ゾルプロテインチロシンキナーゼが挙げられる。これらのメンバーは、受容体のサイトカインスーパーファミリー（たとえば、インターロイキン、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦおよびレプチン）によりトリガーされるシグナル伝達を媒介する。
【１１４３】
チロシンキナーゼ活性を刺激しうる既知の因子は広範にわたるので、本発明のアルブミン融合タンパク質または本発明の融合タンパク質により誘導される分子が、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化しうるかの同定は、興味深いものである。したがって、チロシンキナーゼシグナル伝達経路を活性化しうるそのような分子を同定するために、以下のプロトコルが考えられる。
【１１４４】
Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ（Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ， ＩＬ）から購入した９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅに標的細胞（たとえば、初代ケラチノサイト）を約２５，０００細胞／ウェルの濃度で接種する。プレートを１００％エタノールで３０分間ずつ２回すすいで滅菌し、水ですすぎ、そして一晩乾燥させる。いくつかのプレートを、１００ｍｌの細胞培養用のＩ型コラーゲン（５０ｍｇ／ｍｌ）、ゼラチン（２％）またはポリリシン（５０ｍｇ／ｍｌ）（これらはすべて、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から購入することができる）、またはＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）から購入した１０％ Ｍａｔｒｉｇｅｌ、あるいは仔ウシ血清で、２時間コーティングし、ＰＢＳですすぎ、そして４℃で保存する。増殖培地に５，０００細胞／ウェルで接種し、４８時間後に、製造業者Ａｌａｍａｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｉｎｃ．（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ， ＣＡ）により記載されているようにａｌａｍａｒＢｌｕｅを使用して細胞数を間接計量することによって、これらのプレート上での細胞増殖をアッセイする。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡ）製のＦａｌｃｏｎプレートカバー＃３０７１を使用して、Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ Ｓｉｌｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎ Ｐｌａｔｅを覆う。いくつかの増殖実験では、Ｆａｌｃｏｎ Ｍｉｃｒｏｔｅｓｔ ＩＩＩ細胞培養プレートを使用することもできる。
【１１４５】
抽出物を調製するために、Ａ４３１細胞をＬｏｐｒｏｄｙｎｅプレートのナイロン膜上に接種し（２０，０００／２００ｍｌ／ウェル）、そして完全培地中で一晩培養する。無血清基本培地中で２４時間インキュベートすることにより、細胞を静止状態にする。ＥＧＦ（６０ｎｇ／ｍｌ）またはさまざまな濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質で５〜２０分間処理した後、培地を除去し、そして１００ｍｌの抽出緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％ ＳＤＳ、２ｍＭ Ｎａ３ＶＯ４、２ｍＭ Ｎａ４Ｐ２Ｏ７およびＢｏｅｈｅｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）から入手したプロテアーゼ阻害剤のカクテル（＃１８３６１７０））を各ウェルに添加し、そしてプレートを回転振盪器にかけて４℃で５分間振盪する。次に、プレートを真空トランスファーマニホールドに入れ、そしてハウスバキュームを使用して抽出物を各ウェルの０．４５ｍｍ膜底に通して濾過する。抽出物をバキュームマニホールドの底の９６ウェルキャッチ／アッセイプレートに集め、そして直ちに氷上に置く。遠心分離により清澄化させた抽出物を得るために、界面活性剤で５分間可溶化させた後、各ウェルの内容物を取り出して、４℃において１６，０００×ｇで１５分間遠心分離する。
【１１４６】
チロシンキナーゼ活性のレベルに関して濾過抽出物を試験する。チロシンキナーゼ活性を検出する方法は多数知られているが、本明細書においては１つの方法を記載する。
【１１４７】
一般的には、特定の基質（ビオチン化ペプチド）のチロシン残基をリン酸化する能力を調べることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質のチロシンキナーゼ活性を評価する。この目的に使用されうるビオチン化ペプチドとしては、ＰＳＫ１（細胞分裂キナーゼｃｄｃ２−ｐ３４のアミノ酸６〜２０に相当）およびＰＳＫ２（ガストリンのアミノ酸１〜１７に相当）が挙げられる。両方のペプチドは、ある範囲のチロシンキナーゼの基質であり、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍから入手可能である。
【１１４８】
以下の成分を順に添加することにより、チロシンキナーゼ反応を開始させる。まず、１０μｌの５μＭビオチン化ペプチドを添加し、次いで、１０μｌのＡＴＰ／Ｍｇ２＋（５ｍＭ ＡＴＰ／５０ｍＭ ＭｇＣｌ２）、次いで１０μｌの５×アッセイ緩衝液（４０ｍＭ塩酸イミダゾール、ｐＨ７．３、４０ｍＭ β−グリセロリン酸塩、１ｍＭ ＥＧＴＡ、１００ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）、次いで５μｌのバナジン酸ナトリウム（１ｍＭ）、次いで５μｌの水を添加する。成分を穏やかに混合し、反応混合物を３０℃で２分間プレインキュベートする。１０μｌの対照酵素または濾過上清を加えることにより反応を開始させる。
【１１４９】
次に、１０μｌの１２０ｍｍ ＥＤＴＡを添加することによりチロシンキナーゼアッセイ反応を停止させ、反応液を氷上に置く。
【１１５０】
チロシンキナーゼ活性を測定するには、反応混合物の５０μｌアリコートをマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）モジュールに移し、３７℃で２０分間インキュベートする。これにより、ストレプトアビジンでコーティングされた９６ウェルプレートをビオチン化ペプチドと会合させることができる。ＭＴＰモジュールを３００μｌ／ウェルのＰＢＳで４回洗浄する。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させた抗ホスホチロシン（ｐｈｏｓｐｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）抗体（抗Ｐ−Ｔｙｒ−ＰＯＤ（０．５ｕ／ｍｌ））７５μｌを各ウェルに添加し、そして３７℃で１時間インキュベートする。ウェルを上記のように洗浄する。
【１１５１】
次に、１００μｌのペルオキシダーゼ基質溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加え、室温で少なくとも５分間（最長３０分間）インキュベートする。ＥＬＩＳＡリーダーを使用して、４０５ｎｍにおけるサンプルの吸光度を測定する。結合したペルオキシダーゼ活性のレベルをＥＬＩＳＡリーダーを使用して定量する。これは、チロシンキナーゼ活性のレベルを反映する。
【１１５２】
実施例３６：リン酸化活性を同定するアッセイ
実施例３５に記載のプロテインチロシンキナーゼ活性のアッセイに対する可能性のある代替手段および／または補助手段として、主要な細胞内シグナル伝達中間体の活性化（リン酸化）を検出するアッセイを使用することもできる。たとえば、下記のように、１つの特定のアッセイでは、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２キナーゼのチロシンリン酸化を検出することができる。しかしながら、Ｒａｆ、ＪＮＫ、ｐ３８ ＭＡＰ、Ｍａｐキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）、ＭＥＫキナーゼ、Ｓｒｃ、筋肉特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）、ＩＲＡＫ、ＴｅｃおよびＪａｎｕｓのような他の分子、ならびに他の任意のホスホセリン、ホスホチロシン、またはホスホスレオニン分子のリン酸化は、以下のアッセイにおいてこれらの分子をＥｒｋ−１またはＥｒｋ−２の代わりに用いることにより検出することができる。
【１１５３】
詳細には、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルを、０．１ｍｌのプロテインＧ（１μｇ／ｍｌ）により室温（ＲＴ）で２時間コーティングすることにより、アッセイプレートを作製する。次に、プレートをＰＢＳですすぎ、そして３％ ＢＳＡ／ＰＢＳによりＲＴで１時間ブロッキングする。次に、プロテインＧプレートをＥｒｋ−１およびＥｒｋ−２に対する２つの市販のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェル）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で処理する（ＲＴで１時間）。（他の分子を検出するために、上記の分子のいずれかを検出するモノクローナル抗体を用いることにより、このステップを容易に改変することができる）。ＰＢＳで３〜５回すすいだ後、使用時まで、プレートを４℃で保存する。
【１１５４】
Ａ４３１細胞を２０，０００個／ウェルで９６ウェルＬｏｐｒｏｄｙｎｅフィルタープレートに接種し、そして増殖培地中で一晩培養する。次に、基本培地（ＤＭＥＭ）中で４８時間かけて細胞を飢餓状態にし、次いでＥＧＦ（６ｎｇ／ウェル）またはさまざまな濃度の本発明の融合タンパク質で５〜２０分間処理する。次に、細胞を可溶化し、そして抽出物を濾過して直接アッセイプレート中に入れる。
【１１５５】
抽出物をＲＴで１時間インキュベートした後、ウェルを再びすすぐ。陽性対照として、市販のＭＡＰキナーゼ調製物（１０ｎｇ／ウェル）をＡ４３１抽出物の代わりに使用する。次に、Ｅｒｋ−１およびＥｒｋ−２キナーゼのリン酸化エピトープを特異的に認識する市販のポリクローナル（ウサギ）抗体（１μｇ／ｍｌ）でプレートを処理する（ＲＴで１時間）。この抗体を標準的な手順によりビオチン化する。次に、Ｗａｌｌａｃ ＤＥＬＦＩＡ装置で、結合されたポリクローナル抗体を、ユーロピウム−ストレプトアビジンおよびユーロピウム蛍光増強剤と共に連続的にインキュベートすることによって定量する（時間分解蛍光）。バックグラウンドを超える蛍光シグナルの増加は、本発明の融合タンパク質または本発明のアルブミン融合タンパク質により誘導された分子によるリン酸化を示す。
【１１５６】
実施例３７： 骨髄ＣＤ３４＋細胞増殖の刺激のアッセイ
このアッセイは、ヒトＣＤ３４＋が造血増殖因子の存在下で増殖する能力に基づくものであり、本発明の融合タンパク質がＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する能力を評価するものである。
【１１５７】
ほとんどの成熟前駆体は単一のシグナルだけに応答することが既に明らかにされている。より未熟な前駆体は、少なくとも２つの応答シグナルを必要とする。したがって、広範にわたる前駆細胞の造血活性に対する本発明の融合タンパク質の効果を試験するために、アッセイは、造血増殖因子の存在下もしくは不在下の本発明の所与の融合タンパク質を含む。単離した細胞を試験されるサンプルと組み合わせて、幹細胞因子（ＳＣＦ）の存在下で５日間培養する。ＳＣＦは、単独では、骨髄（ＢＭ）細胞の増殖に対して非常に限られた効果を有し、そのような条件では「生存」因子としてのみ作用する。しかしながら、これらの細胞に対して刺激作用を呈する任意の因子（たとえば、ＩＬ−３）と組み合わせると、ＳＣＦは、相乗効果を引き起こすであろう。したがって、試験される融合タンパク質が造血前駆細胞に対して刺激作用をもつならば、そのような活性は容易に検出することができる。正常なＢＭ細胞は、低レベルの細胞周期進行中の細胞を有するので、所与の融合タンパク質の阻害効果はなんら検出されない可能性が大きい。したがって、前駆細胞に対する阻害効果のアッセイは、好ましくは、最初にＳＣＦ＋ＩＬ−３によるｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激にさらされ、次にそのような誘導増殖の阻害について評価しようとする化合物と接触させた細胞で、試験される。
【１１５８】
簡潔に述べると、当技術分野で公知の方法を用いてＣＤ３４＋細胞を単離する。細胞を解凍して、培地（１％ Ｌ−グルタミン（５００ｍ１）を有するＱＢＳＦ ６０無血清培地、Ｑｕａｌｉｔｙ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ， Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ カタログ番号１６０−２０４−１０１）中に再懸濁させる。２００×ｇで穏やかな遠心分離工程を数回行った後、細胞を１時間静置する。細胞数を２．５×１０５細胞／ｍｌになるように調節する。この間、１００μｌの滅菌水を９６ウェルプレートの周壁に添加する。このアッセイにおいて本発明のアルブミン融合タンパク質を用いて試験することのできるサイトカインは、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ， カタログ番号２５５−ＳＣ）単独、またはｒｈＳＣＦと３０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ， カタログ番号２０３−ＭＬ）との組合せ物である。１時間後、１０μｌの調製済みサイトカイン、さまざまな濃度の本発明のアルブミン融合タンパク質、および２０μｌの希釈した細胞を、１００μｌの最終全容量になるようにウェル中に既に存在する培地に添加する。次に、３７℃／５％ＣＯ２のインキュベーター中にプレートを５日間入れる。
【１１５９】
アッセイ物を取り出す１８時間前、増殖速度を決定するために０．５μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジンを１０μｌの容量で各ウェルに添加する。Ｔｏｍｔｅｃ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ ９６を用いて、それぞれの９６ウェルプレートからフィルターマットに細胞を取り出すことにより、実験を終了する。採取後、フィルターマットを乾燥させ、トリミングし、そして１つのＯｍｎｉＦｉｌｔｅｒプレートと１つのＯｍｎｉＦｉｌｔｅｒトレーとからなるＯｍｎｉＦｉｌｔｅｒアセンブリー中に入れる。６０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔを各ウェルに添加し、ＴｏｐＳｅａｌ−Ａ ｐｒｅｓｓ−ｏｎシーリングフィルムでプレートを密封する。カウント数を測定するために、バーコード１５ステッカーを第１のプレートに取り付ける。次に、密封されたプレートを装填して、Ｐａｃｋａｒｄ Ｔｏｐ Ｃｏｕｎｔにより放射能のレベルを測定し、プリントされたデータを収集して解析する。放射能のレベルは、細胞増殖の量を反映する。
【１１６０】
この実施例に記載した研究は、骨髄ＣＤ３４＋細胞増殖を刺激する所与の融合タンパク質の活性を試験するものである。当業者は、本発明の融合タンパク質およびポリヌクレオチドの活性（たとえば、遺伝子治療）ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストを試験するための、例示された研究を容易に改変することができよう。骨髄ＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激する本発明のアルブミン融合タンパク質の能力は、アルブミン融合タンパク質および／または該融合タンパク質に対応するポリヌクレオチドが、免疫系および造血に影響を及ぼす障害の診断および治療に有用であることを示す。代表的な使用は、先の「免疫活性」および「感染症」の項ならびに本明細書の他の箇所に記載されている。
【１１６１】
実施例３８： 細胞外マトリックス増強細胞応答（ＥＭＥＣＲ）のアッセイ
細胞外マトリックス増強細胞応答（ＥＭＥＣＲ）アッセイの目的は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）誘導シグナルに関連して造血幹細胞に作用する本発明の融合タンパク質の能力を評価することである。
【１１６２】
細胞は、周囲の微小環境から受け取ったシグナルに関連して調節因子に応答する。たとえば、繊維芽細胞ならびに内皮および上皮幹細胞は、ＥＣＭからのシグナルの不在下では複製されない。造血幹細胞は、骨髄中では自己再生を行うことができるが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ懸濁培養では行うことができない。幹細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで自己再生を行う能力は、間質細胞およびＥＣＭタンパク質フィブロネクチン（ｆｎ）との相互作用に依存する。ｆｎへの細胞の接着は、ヒトおよびマウス造血幹細胞により発現されるα５．β１およびα４．β１インテグリン受容体により媒介される。ＥＣＭ環境と一体となって幹細胞自己再生の刺激に関与する因子は、まだ同定されていない。そのような因子の発見は、遺伝子治療および骨髄移植の用途において大きな関心がもたれるはずである。
【１１６３】
簡潔に述べると、組織培養処理されていないポリスチレン製９６ウェルプレートを、０．２μｇ／ｃｍ２のコーティング濃度でｆｎ断片を用いてコーティングする。マウス骨髄細胞を０．２ｍｌの無血清培地中にプレーティングする（１，０００細胞／ウェル）。ＩＬ−３（５ｎｇ／ｍｌ）＋ＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した細胞は、陽性対照として役立つであろう。この条件下では、幹細胞は自己再生をほとんど行わないが、顕著な分化を起こすことが予想される。本発明のアルブミン融合タンパク質は、ＳＣＦ（５．０ｎｇ／ｍｌ）の存在下および不在下で適切な陰性対照と一緒に試験する。ここで、本発明のアルブミン融合タンパク質を含有する投与組成物の容量は、全アッセイ容量の１０％を占める。次に、低酸素環境（５％ ＣＯ２、７％ Ｏ２および８８％ Ｎ２）組織培養インキュベーター中で７日間インキュベートすることにより、プレーティングされた細胞を増殖させる。次に、細胞ＤＮＡ中へのチミジン取り込みを測定することにより、ウェル内の増殖細胞数を計量する。アッセイにおける陽性ヒットを検証するには、細胞の表現型の特性づけが必要であろう。この特性づけは、培養系をスケールアップして、細胞表面抗原に対する適切な抗体試薬とＦＡＣＳｃａｎとを用いて、行うことができる。
【１１６４】
当業者は、本発明のアルブミン融合タンパク質およびポリヌクレオチドの活性（たとえば、遺伝子治療）を試験するための、例示された研究を容易に改変することができるであろう。
【１１６５】
本発明の特定の融合タンパク質が造血前駆細胞の刺激物質であることが判明すれば、その融合タンパク質および融合タンパク質に対応するポリヌクレオチドは、たとえば、免疫系および造血に影響を及ぼす障害の診断および治療に有用である可能性がある。代表的な使用は、先の「免疫活性」および「感染症」の項および本明細書の他の箇所に記載されている。融合タンパク質はまた、種々の血液系列の幹細胞および決定付けられている前駆細胞の増殖ならびに種々の細胞型の分化および／または増殖に有用である可能性がある。
【１１６６】
このほか、本発明のアルブミン融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、造血細胞の増殖および分化を阻害するために利用することも可能であり、したがって、化学療法において化学療法剤から骨髄幹細胞を保護するために利用できる可能性がある。この抗増殖効果は、化学療法剤のより高用量の投与を可能にしうるので、より有効な化学療法処置を行える可能性がある。
【１１６７】
さらに、本発明の融合タンパク質および本発明のアルブミン融合タンパク質をコードするとポリヌクレオチドはまた、間質細胞が造血系列の細胞の産生に重要であるので、貧血症、汎血球減少症、白血球減少症、血小板減少症または白血病のような造血関連障害の治療および診断に役立つ可能性がある。その使用例としては、骨髄細胞のｅｘ ｖｉｖｏ培養、骨髄移植、骨髄再形成、新形成物の放射線療法あるいは化学療法が挙げられる。
【１１６８】
実施例３９： ヒト皮膚繊維芽細胞および大動脈平滑筋細胞の増殖
正常なヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）およびヒト大動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）の培養物に本発明のアルブミン融合タンパク質を添加し、それぞれのサンプルで２つの共アッセイを行う。第１のアッセイでは、正常なヒト皮膚繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）または大動脈平滑筋細胞（ＡｏＳＭＣ）の増殖に対する融合タンパク質の効果を調べる。繊維芽細胞または平滑筋細胞の正常でない増殖は、繊維症を含むいくつかの病的過程および再狭窄の一部である。第２のアッセイでは、ＮＨＤＦおよびＳＭＣの両方によるＩＬ６産生を調べる。ＩＬ６産生は、機能的活性化の指標である。活性化された細胞は、いくつかのサイトカインおよび他の因子の産生を増大させているだろう。そしてその結果として、前炎症または免疫調節の成果を生じる可能性がある。共刺激性または抑制性活性を調べるために、共ＴＮＦα刺激を用いてまたは用いずにアッセイを行う。
【１１６９】
簡潔に述べると、１日目、１００μｌの培養培地中に１０００細胞／ウェル（ＮＨＤＦ）または２０００細胞／ウェル（ＡｏＳＭＣ）を有する９６ウェル黒色プレートを用意する。ＮＨＤＦ培養培地は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ ＦＢ基本培地、１ｍｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ、５ｍｇ／ｍｌインスリン、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、２％ ＦＢＳを含有し、一方、ＡｏＳＭＣ培養培地は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ ＳＭ基本培地、０．５μｇ／ｍｌ ｈＥＧＦ、５ｍｇ／ｍｌインスリン、１μｇ／ｍｌ ｈＦＧＦ、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、５％ ＦＢＳを含有する。３７℃で少なくとも４〜５時間インキュベートした後、培養培地を吸引して、増殖停止培地と交換する。ＮＨＤＦに対する増殖停止培地は、繊維芽細胞基本培地、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、２％ ＦＢＳを含有し、一方、ＡｏＳＭＣに対する増殖停止培地は、ＳＭ基本培地、５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン、５０μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ、０．４％ ＦＢＳを含有する。２日目まで３７℃でインキュベートする。
【１１７０】
２日目、培地対照および公知のタンパク質対照が常に含まれるように、本発明のアルブミン融合タンパク質の段階希釈液およびテンプレートをデザインする。刺激および阻害の両方の実験において、増殖停止培地でタンパク質を希釈する。阻害実験では、２ｎｇ／ｍｌ（ＮＨＤＦ）または５ｎｇ／ｍｌ（ＡｏＳＭＣ）の最終濃度になるように、ＴＮＦａを添加する。対照または本発明のアルブミン融合タンパク質を含有する１／３倍容量の培地を添加し、５日目まで３７℃／５％ ＣＯ２でインキュベートする。
【１１７１】
それぞれのウェルから６０μｌを、ラベルのつけられた別の９６ウェルプレートに移し、プレートシーラーで覆い、６日目まで４℃で保存する（ＩＬ６ ＥＬＩＳＡ用）。細胞培養プレート中の残りの１００μｌに、培養容量の１０％に等しい量（１０μｌ）でＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅを無菌状態で添加する。プレートを３〜４時間インキュベーターに戻す。次に、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒを用いて、５３０ｎｍ励起および５９０ｎｍ発光の条件で蛍光を測定する。これにより増殖促進／阻害データを得る。
【１１７２】
５日目、ＩＬ６ ＥＬＩＳＡを行うため、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した５０〜１００μｌ／ウェルの抗ヒトＩＬ６モノクロナール抗体で９６ウェルプレートをコーティングし、室温でインキュベートを開始する。
【１１７３】
６日目、シンクに注いでプレートを空にし、ペーパータオルで吸い取る。４％ ＢＳＡを有するＰＢＳを含むアッセイ緩衝液を調製する。ＰＢＳ中のＰｉｅｒｃｅ Ｓｕｐｅｒ Ｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液２００μｌ／ウェルでプレートを１〜２時間ブロッキングし、次に、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）でプレートを洗浄する。プレートをペーパータオルで吸い取る。次に、０．５０ｍｇ／ｍｌに希釈された抗ヒトＩＬ−６モノクロナールビオチン標識抗体５０μ１／ウェルを添加する。培地でＩＬ−６ストックの稀釈液を作製する（３０、１０、３、１、０．３、０ｎｇ／ｍｌ）。プレートの最上列に２回反復サンプルを添加する。プレートを覆い、振盪器にかけてＲＴで２時間インキュベートする。
【１１７４】
プレートは洗浄緩衝液で洗浄し、ペーパータオルで吸い取る。ＥＵで標識されたストレプトアビジンをアッセイ緩衝液で１：１０００に希釈し、１００μｌ／ウェルを添加する。プレートを覆い、ＲＴで１時間インキュベートする。洗浄緩衝液でプレートを再び洗浄し、ペーパータオルで吸い取る。
【１１７５】
１００μｌ／ウェルの増強溶液を添加する。５分間振盪する。Ｗａｌｌａｃ ＤＥＬＦＩＡ フルオロメーターを用いてプレートを読み取る。それぞれのアッセイの３回反復サンプルから得られた読み取り値を表にして平均値を求める。
【１１７６】
このアッセイにおいて陽性の結果は、ＡｏＳＭＣ細胞増殖を示唆するとともに、アルブミン融合タンパク質が皮膚繊維芽細胞増殖および／または平滑筋細胞増殖に関与している可能性があることを示唆する。陽性の結果はまた、アルブミン融合タンパク質と該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドとが多くの有望な用途をもつことを示唆する。たとえば、本明細書全体にわたり詳述されている炎症および免疫応答、創傷治癒、ならびに血管形成に利用できる。特に、融合タンパク質は、創傷治癒および皮膚再生ならびに脈管形成の促進（血管およびリンパ管の両方）に使用することが可能である。脈管の成長は、たとえば、心血管疾患などの治療に使用することができる。さらに、このアッセイでアンタゴニスト活性を示す融合タンパク質は、抗血管剤（たとえば、抗血管形成剤）として機能することによって、血管形成が関与する疾患、障害、および／または症状の治療に有用である可能性がある。これらの疾患、障害、および／または症状は、当技術分野で公知であるか、かつ／または本明細書に記載されており、たとえば、悪性疾患、固形腫瘍、良性腫瘍、具体的には、血管腫、聴神経腫、神経繊維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫；動脈硬化斑；眼の血管形成疾患、具体的には、糖尿病網膜症、末熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後繊維増殖症、ルベオーシス、網膜芽細胞腫、ブドウ膜炎および眼の翼状斑（Ｐｔｅｒｙｇｉａ）（異常血管増殖）；慢性関節リウマチ；乾癬；遅延創傷治癒；子宮内膜症；脈管形成；肉芽形成；過形成性瘢痕（ケロイド）；偽関節骨折；強皮症；トラコーマ；血管癒着；心筋血管形成；冠状動脈側副枝（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；大脳側副枝（ｃｏｌｌａｔｅｒａｌｓ）；動静脈奇形；虚血性肢血管形成；Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群；プラーク新生血管形成；毛細管拡張症；血友病関節；血管繊維腫；繊維筋性形成異常；創傷肉芽化；クローン病；およびアテローム性動脈硬化症が挙げられる。さらに、このアッセイでアンタゴニストとして機能するアルブミン融合タンパク質は、当技術分野で公知のおよび／または本明細書に記載の抗過増殖性疾患および／または抗炎症性疾患の治療にも有用である可能性がある。
【１１７７】
実施例４０： 内皮細胞での細胞接着分子（ＣＡＭ）の発現
炎症および血管形成の領域へのリンパ球の動員には、リンパ球上の細胞表面接着分子（ＣＡＭ）と血管内皮との間の特異的な受容体−リガンド相互作用が関与する。接着過程は、通常の環境および病理学的環境のいずれにおいても、内皮細胞（ＥＣ）での細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）、血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）、および内皮白血球接着分子−１（Ｅ−セレクチン）の発現を含む多段階カスケードに従う。血管内皮におけるこれらの分子および他の分子の発現は、白血球が局所血管系に接着して炎症応答の発生中に局所組織中に溢出しうる効率を決定する。サイトカインおよび増殖因子の局所濃度は、これらのＣＡＭの発現の調節に関与する。
【１１７８】
簡潔に述べると、標準的な９６ウェルプレートで集密状態になるまで内皮細胞（たとえば、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））を増殖させ、細胞から増殖培地を取り除き、そして１００μｌの１９９培地（１０％ウシ胎児血清ＦＢＳ）に置き換える。試験用サンプル（本発明のアルブミン融合タンパク質を含有する）および陽性または陰性対照を３回反復試験方式でプレートに添加する（１０μｌ容量）。次に、プレートを３７℃で５時間（セレクチンおよびインテグリン発現）または２４時間（インテグリン発現のみ）インキュベートする。プレートを吸引して培地を除去し、そして１００μｌの０．１％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳ（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含有）を各ウェルに添加する。プレートを４℃で３０分間保持する。固定液をウェルから除去し、ＰＢＳ（＋Ｃａ，Ｍｇ）＋０．５％ ＢＳＡを用いてウェルを１回洗浄し、そして排水する。１０μｌの希釈した１次抗体を試験ウェルおよび対照ウェルに添加する。抗ＩＣＡＭ−１−ビオチン、抗ＶＣＡＭ−１−ビオチンおよび抗Ｅ−セレクチン−ビオチンを１０μｇ／ｍｌの濃度（０．１ｍｇ／ｍｌストック抗体の１：１０希釈）で使用する。加湿した環境において細胞を３７℃で３０分間インキュベートする。ＰＢＳ（＋Ｃａ，Ｍｇ）＋０．５％ ＢＳＡを用いてウェルを３回洗浄する。２０μｌの希釈したＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−アルカリホスファターゼ（希釈度１：５，０００、本明細書中では使用希釈度と呼ぶ）を各ウェルに添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートする。ＰＢＳ（＋Ｃａ，Ｍｇ）＋０．５％ ＢＳＡを用いてウェルを３回洗浄する。グリシン緩衝液（ｐＨ１０．４） ５ｍｌあたり１錠のｐ−ニトロフェノールホスフェートｐＮＰＰを溶解させる。ｐＮＰＰ基質を有するグリシン緩衝液１００μｌを各試験ウェルに添加する。使用希釈度でＥｘｔｒＡｖｉｄｉｎ−アルカリホスファターゼを含むグリシン緩衝液から３回反復試験方式で標準ウェルを調製する（１：５，０００（１００）＞１０−０．５＞１０−１＞１０−１．５）。５μｌの各希釈物を３回反復試験ウェルに添加し、各ウェル中のＡＰ含量が、５．５０ｎｇ、１．７４ｎｇ、０．５５ｎｇ、０．１８ｎｇになるようにする。次いで、１００μｌのｐＮＮＰ試薬を標準ウェルのそれぞれに添加する。プレートを３７℃にて４時間インキューベートする。容量５０μｌの３Ｍ ＮａＯＨをすべてのウェルに添加する。グリシン緩衝液のみで満たしたブランクウェルに対してバックグラウンド減算オプションを使用して、プレートリーダーにより４０５ｎｍでプレートを読み取る。さらに、それぞれの標準ウェル中のＡＰ−コンジュゲート濃度［５．５０ｎｇ； １．７４ｎｇ； ０．５５ｎｇ； ０．１８ｎｇ］を示すテンプレートを構成する。各サンプル中の結合したＡＰ−コンジュゲートの量として結果を示す。
【１１７９】
実施例４１： Ａｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ内皮細胞増殖アッセイ
このアッセイは、ウシリンパ内皮細胞（ＬＥＣ）、ウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）またはヒト微小血管子宮筋層細胞（ＵＴＭＥＣ）のｂＦＧＦ−誘導増殖のタンパク質媒介阻害を定量的に調べるために使用される。このアッセイには、代謝活性の検出に基づくフルオロメトリック増殖指示薬が組み込まれる。標準的なＡｌａｍａｒ Ｂｌｕｅ増殖アッセイは、内皮細胞刺激源として添加される１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦを有するＥＧＭ−２ＭＶ中で行われる。このアッセイは、増殖培地および細胞濃度をわずかに変化させてさまざまな内皮細胞で使用することが可能である。試験されるタンパク質バッチの稀釈液は、適宜、希釈される。ｂＦＧＦを含まない無血清培地（ＧＩＢＣＯ ＳＦＭ）を無刺激対照として使用し、アンギオスタチンまたはＴＳＰ−１を公知の阻害対照として使用する。
【１１８０】
簡潔に述べると、ＬＥＣ、ＢＡＥＣまたはＵＴＭＥＣを、５０００〜２０００細胞／ウェルの濃度で９６ウェルプレート中の増殖培地に接種し、３７℃で一晩置く。細胞を一晩インキュベートした後、増殖培地を除去し、ＧＩＢＣＯ ＥＣ−ＳＦＭに置き換える。１０ｎｇ／ｍｌの濃度になるように追加されたｂＦＧＦを有する３回反復試験ウェルで、本発明のアルブミン融合タンパク質または対照タンパク質サンプルの適切な稀釈液（ＳＦＭ中に調製）で細胞を処理する。サンプルで細胞を処理した後、プレートを３７℃のインキュベーターに戻して３日間置く。３日後、１０ｍｌのストックａｌａｍａｒ ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅカタログ番号ＤＡＬ１１００）をそれぞれのウェルに添加し、そしてプレートを３７℃のインキュベーターに戻して４時間置く。次に、ＣｙｔｏＦｌｕｏｒ蛍光リーダーを用いて５３０ｎｍ励起および５９０ｎｍ発光の条件でプレートを読み取る。直接出力を相対的な蛍光単位で記録する。
【１１８１】
ａｌａｍａｒ ｂｌｕｅは、細胞増殖から生じる増殖培地の化学的還元に応じて蛍光放出および色変化の両方を生じる酸化還元指示薬である。細胞が培養下で増殖するにつれて、生来の代謝活性により、ごく近傍の周囲環境の化学還元が生じる。増殖に関連して還元が起こると、指示薬は、酸化（非蛍光青色）型から還元（蛍光赤色）型に変化する（すなわち、増殖が刺激されると、より強力なシグナルが生じ、増殖が阻害されると、より弱いシグナルが生じ、全シグナルは、全細胞数および細胞の代謝活性に比例する）。バックグラウンドの活性レベルは、飢餓培地単独で観測する。これを、陽性対照サンプル（増殖培地中のｂＦＧＦ）およびタンパク質稀釈液から観測された出力と比較する。
【１１８２】
実施例４２： 混合リンパ球反応の阻害の検出
このアッセイを用いることにより、本発明の融合タンパク質による混合リンパ球反応（ＭＬＲ）の阻害を検出し評価することができる。ＭＬＲの阻害は、細胞の増殖および生存能力に対する直接的影響、相互作用細胞に対する共刺激分子の調節、リンパ球とアクセサリー細胞との間の接着の調節、またはアクセサリー細胞によるサイトカイン産生の調節に起因するものと考えられる。このアッセイで使用される末梢血単核性画分はＴ、Ｂおよびナチュラルキラーリンパ球、ならびに単球および樹状細胞を含んでいるので、ＭＬＲを阻害するアルブミン融合タンパク質により、複数の細胞が標的化される可能性がある。
【１１８３】
ＭＬＲを阻害することが見いだされた本発明のアルブミン融合タンパク質は、リンパ球および単球の活性化または増殖に関連づけられる疾患に適用できる可能性がある。これらの例としては、喘息、関節炎、糖尿病、炎症性皮膚症状、乾癬、湿疹、全身性紅斑性狼瘡、多発性硬化症、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、動脈硬化症、肝硬変、移植片対宿主疾患、宿主対移植片疾患、肝炎、白血病およびリンパ腫のような疾患が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【１１８４】
簡潔に述べると、リンパ球分離培地（ＬＳＭ（登録商標）、濃度１．０７７０ｇ／ｍｌ、Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ， ＰＡ）を用いて密度勾配遠心分離法により、ヒトドナー由来のＰＢＭＣを精製する。２名のドナー由来のＰＢＭＣを、１０％ ＦＣＳおよび２ｍＭグルタミンを補足したＲＰＭＩ−１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）中に２×１０６細胞／ｍｌとなるように調整する。３人目のドナー由来のＰＢＭＣを２×１０５細胞／ｍｌとなるように調整する。５０マイクロリットルのそれぞれのドナー由来のＰＢＭＣを９６ウェル丸底マイクロタイタープレートのウェルに添加する。融合タンパク質試験物質の稀釈液（５０μｌ）を３回反復試験方式でマイクロタイターウェルに添加する。（対象のタンパク質の） 試験サンプルは、１：４の最終稀釈となるように添加し； ｒｈｕＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ， カタログ番号２０２−ＩＬ）は、１μｇ／ｍｌの最終濃度となるように添加し； 抗ＣＤ４ ｍＡｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ｃｌｏｎｅ ３４９３０．１１， カタログ番号ＭＡＢ３７９）は、１０μｇ／ｍｌの最終濃度となるように添加する。５％ ＣＯ２中、３７℃で、細胞を７〜８日間培養し、そして１μＣの［３Ｈ］チミジンを最後の１６時間の培養のためにウェルに添加する。細胞を採取し、そしてＰａｃｋａｒｄ ＴｏｐＣｏｕｎｔを用いてチミジン取り込みを測定する。データは、３回反復試験の測定値の平均および標準偏差として表す。
【１１８５】
対象の融合タンパク質のサンプルを個別の実験でスクリーニングし、そしてリンパ球の増殖を阻害する陰性対照の処理剤である抗ＣＤ４ ｍＡｂ、およびリンパ球の増殖を増強する陽性対照の処理剤であるＩＬ−２（組換え物質または上清のいずれか）と比較する。
【１１８６】
実施例４３： プロテアーゼ活性のアッセイ
次のアッセイを用いることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質のプロテアーゼ活性を評価することが可能である。
【１１８７】
実質的に記載されるとおりに（Ｈｅｕｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １０２：１９６−２０２（１９８０）； Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｕｒｏｌｏｇｙ， １４９：６５３−６５８（１９９３））、ゼラチンおよびカゼインザイモグラフィーを行う。１％ゼラチンまたはカゼインを含有する１０％ポリアクリルアミド／０．１％ ＳＤＳゲルを用いてサンプルを泳動させ、室温で２．５％トリトン中に１時間、さらに３７℃で０．１Ｍグリシン， ｐＨ８．３中に５〜１６時間浸漬する。アミドブラックで染色した後、タンパク質分解領域は、青黒色のバックグラウンドに対して透明な領域として現われる。トリプシン（Ｓｉｇｍａ Ｔ８６４２）を陽性対照として使用する。
【１１８８】
プロテアーゼ活性はまた、ｎ−ａ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニンエチルエステル（ＢＡＥＥ）（Ｓｉｇｍａ Ｂ−４５００）の切断をモニターすることによっても調べられる。反応は（２５ｍＭ ＮａＰＯ４、ｌｍＭ ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＢＡＥＥ）， ｐＨ ７．５中で行う。サンプルを添加し、タイム−ドライブモードでＢｅｃｋｍａｎ ＤＵ−６分光光度計を用いて２６０ｎｍの吸光度の変化をモニターする。トリプシンを陽性対照として使用する。
【１１８９】
２８０ｎｍの吸光度としてまたはＦｏｌｉｎ法を用いて比色定量により測定されるカゼインまたはヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づくさらなるアッセイは、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ａｎａｌｙｓｉｓ， ５ （１９８４）の記載に従って行う。他のアッセイとしては、クロモゲン基質の可溶化が挙げられる（Ｗａｒｄ， Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５１−３１７ （１９８３））。
【１１９０】
実施例４４： セリンプロテアーゼ基質特異性の同定
当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の方法を用いることにより、セリンプロテアーゼ活性を有する本発明のアルブミン融合タンパク質の基質特異性を調べることが可能である。基質特異性を調べる好ましい方法は、ＧＢ ２ ３２４ ５２９（その全体を本明細書に組み入れる）に記載されているようなホジショナルスキャニング合成コンビナトリアルライブラリーを用いるものである。
【１１９１】
実施例４５： リガンド結合アッセイ
次のアッセイを用いることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質のリガンド結合活性を評価することが可能である。
【１１９２】
リガンド結合アッセイは、受容体の薬理学的挙動を確認するための直接的方法を提供し、ハイスループット方式に適用可能である。結合を調べるために、本発明のアルブミン融合タンパク質に対する精製リガンドを高い比放射能（５０〜２０００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）になるように放射能標識する。次に、放射能標識化プロセスが融合タンパク質に対するリガンドの活性を低減させないことを確かめる。膜および全細胞ポリペプチド源の両方に対して使用可能なシグナル対ノイズ比が得られるように、緩衝液、イオン、ｐＨ、およびヌクレオチドのような他のモジュレーターに関するアッセイ条件を最適化する。これらのアッセイでは、特異的ポリペプチド結合は、全結合放射能から過剰の非標識競合リガンドの存在下で測定した放射能を差し引いた値として定義される。可能な場合には、２種以上の競合リガンドを用いて、残存する非特異的結合を規定する。
【１１９３】
実施例４６： ツメガエル卵母細胞における機能アッセイ
標準的な手順に従ってＲＮＡポリメラーゼを用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質をコードする線状化プラスミド鋳型からのキャップ付きＲＮＡ転写産物をｉｎ ｖｉｔｒｏで合成する。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写産物を０．２ｍｇ／ｍｌの最終濃度で水中に懸濁させる。成体の雌カエルから卵巣葉を取り出し、第Ｖ期脱濾胞（ｄｅｆｏｌｌｉｃｕｌａｔｅｄ）卵母細胞を取得し、そしてマイクロインジェクション装置を用いてＲＮＡ転写産物（１０ｎｇ／卵母細胞）を５０ｎｌボーラスで注入する。２つの電極電圧クランプを用いて、融合タンパク質およびポリペプチドアゴニストの暴露に応答して流れる個々のツメガエル卵母細胞からの電流を測定する。読み取りは、Ｃａ２＋不含のＢａｒｔｈ’ｓ培地中で室温にて行う。ツメガエル系は、既知のリガンドおよび組織／細胞抽出物を活性化リガンドについてスクリーニングするために使用することができる。
【１１９４】
実施例４７： ミクロフィジオメトリックアッセイ
多種多様な２次メッセンジャー系の活性化により、細胞から少量の酸が排出される。生成される酸は、主に、細胞内シグナル伝達過程を刺激するのに必要な代謝活性が増大された結果として生じるものである。細胞を取り囲む培地のｐＨ変化は非常に小さいが、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲミクロフィジオメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｌｔｄ．， Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， Ｃａｌｉｆ．）により検出可能である。したがって、ＣＹＴＯＳＥＮＳＯＲは、エネルギーを利用する細胞内シグナル伝達経路に連動した２次メッセンジャーを活性化させる本発明のアルブミン融合タンパク質の能力を検出することができる。
【１１９５】
実施例４８： 抽出物／細胞上清スクリーニング
いまだに対応するコグネイトな活性化リガンド（アゴニスト）が見いだされていない多数の哺乳動物受容体が存在する。このため、これらの受容体に対して活性なリガンドは、これまでに同定されたリガンドバンク内には含まれていない可能性がある。したがって、本発明のアルブミン融合タンパク質の治療用タンパク質部分および／またはアルブミンタンパク質部分に対する天然のリガンドを同定するために、（カルシウム、ｃＡＭＰ、ミクロフィジオメーター、卵母細胞電気生理学など、機能的スクリーニングを用いて）本発明のアルブミン融合タンパク質を組織抽出物に対して機能的にスクリーニングすることもできる。活性化リガンドが単離・同定されるまで、陽性の機能応答を生じる抽出物を逐次的にサブ分画することができる。
【１１９６】
実施例４９： ＡＴＰ結合アッセイ
次のアッセイを用いることにより、本発明の融合タンパク質のＡＴＰ結合活性を評価することが可能である。
【１１９７】
本発明のアルブミン融合タンパク質のＡＴＰ結合活性は、参照により全体が本明細書に組み入れられる米国特許第５，８５８，７１９号に記述されているＡＴＰ結合アッセイを用いて検出することが可能である。簡潔に述べると、競合アッセイで８−アジド−ＡＴＰを用いるフォトアフィニティー標識付けにより、本発明のアルブミン融合タンパク質へのＡＴＰ結合を測定する。１ｍｇ／ｍｌのＡＢＣ輸送タンパク質を含有する反応混合物を、さまざまな濃度のＡＴＰまたは非加水分解性ＡＴＰ類似体アデニル−５’−イミド二リン酸と共に、４℃で１０分インキュベートする。８−アジド−ＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ． Ｃｏｒｐ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ．）と、８−アジド−ＡＴＰ（３２Ｐ−ＡＴＰ）（５ ｍＣｉ／μｍｏｌ， ＩＣＮ， Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ．）との混合物を、１００μＭの最終濃度になるように添加し、そして０．５ｍｌアリコートを氷上の磁器スポットプレートのウェルに入れる。プレートから２．５ｃｍの距離で短波長２５４ｎｍ ＵＶランプを用いて１分間の冷却時間をはさんでプレートへの１分間の照射を２回行った。２ｍＭの最終濃度になるようにジチオトレイトールを添加することにより、反応を停止させる。インキュベートした混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動にかけ、乾燥させ、そしてオートラジオグラフィーを行う。本発明のアルブミン融合タンパク質に対応するタンパク質バンドを切り出して、放射能を定量した。ＡＴＰまたはアデニル−５’−イミド二リン酸の増加に伴う放射能の減少は、融合タンパク質に対するＡＴＰの親和性の尺度となる。
【１１９８】
実施例５０： リン酸化アッセイ
本発明のアルブミン融合タンパク質のリン酸化活性をアッセイするために、米国特許第５，９５８，４０５号（参照により本明細書に組み入れる）に記載されているようなリン酸化アッセイを利用する。簡潔に述べると、γ標識３２Ｐ−ＡＴＰを用いてタンパク質基質をリン酸化し、γ放射性同位体カウンターを用いて取り込まれた放射能を計数することにより、リン酸化活性を測定することが可能である。タンパク質基質、３２Ｐ−ＡＴＰ、およびキナーゼ緩衝液と共に本発明の融合タンパク質をインキュベートする。次に、基質に取り込まれた３２Ｐを、電気泳動により遊離の３２Ｐ−ＡＴＰから分離し、取り込まれた３２Ｐを計数し、そして陰性対照と比較する。陰性対照を超える放射能カウント数は、融合タンパク質のリン酸化活性を表す。
【１１９９】
実施例５１： ポリペプチドリガンドの存在下における本発明のアルブミン融合タンパク質のリン酸化活性（活性化）の検出
当技術分野で公知のまたは本明細書に記載の方法を用いることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質のリン酸化活性を調べることができる。リン酸化活性を調べる好ましい方法は、米国特許第５，８１７，４７１号（参照により本明細書に組み入れる）に記載されているようなチロシンリン酸化アッセイを用いるものである。
【１２００】
実施例５２： 本発明のアルブミン融合タンパク質と相互作用するシグナル伝達タンパク質の同定
本発明のアルブミン融合タンパク質は、シグナル伝達経路タンパク質または受容体タンパク質の同定、特性づけおよび精製を行うための研究ツールとして役立つ可能性がある。簡潔に述べると、本発明の標識された融合タンパク質は、それと相互作用する分子を精製するための試薬として有用である。アフィニティー精製の１実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質をクロマトグラフィーカラムに共有結合させる。癌腫組織のような推定上の標的細胞に由来する無細胞抽出物をカラムに通し、適切な親和性を有する分子をアルブミン融合タンパク質に結合させる。タンパク質複合体をカラムから回収し、解離させ、そして回収された分子をＮ末端タンパク質配列決定処理に付す。次に、このアミノ酸配列を用いて、捕捉された分子を同定するか、または適切なｃＤＮＡライブラリーから該当する遺伝子をクローン化するための縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計する。
【１２０１】
実施例５３： ＩＬ−６ バイオアッセイ
本発明のアルブミン融合タンパク質の増殖効果を試験するためのさまざまなアッセイが、当技術分野で公知である。たとえば、そのようなアッセイの１つはＭａｒｚら（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９５：３２５１−５６ （１９９８）、参照により本明細書に組み入れる）により記載されたようなＩＬ−６バイオアッセイである。３７℃で６８時間後、テトラゾリウム塩チアゾリルブルー（ＭＴＴ）を添加して３７℃でさらに４時間インキュベートすることにより、生細胞の数を測定する。Ｂ９細胞をＳＤＳにより溶解させ、５７０ｎｍで光学濃度を測定する。対照は、ＩＬ−６を含有するもの（陽性対照）およびサイトカインを含有しないもの（陰性対照）である。簡潔に述べると、ＩＬ−６依存性Ｂ９マウス細胞をｌＬ−６不含の培地で３回洗浄し、５０μｌ中５，０００細胞／ウェルの濃度でプレーティングし、そして５０μｌの本発明の融合タンパク質を添加して利用する。陰性対照と比べた、試験サンプル（本発明のアルブミン融合タンパク質を含有する）での増強された増殖は、融合タンパク質により媒介される増殖効果を表す。
【１２０２】
実施例５４： ニワトリ胚ニューロン生存の支援
交感ニューロン細胞の生存能力が本発明のアルブミン融合タンパク質により支援されるかを試験するために、Ｓｅｎａｌｄｉらのニワトリ胚ニューロン生存アッセイを利用することが可能である（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｉ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．， ９６：１１４５８−６３（１９９８）、参照により本明細書に組み入れる）。簡潔に述べると、運動および交感ニューロンをニワトリ胚から単離し、それぞれＬ１５培地（１０％ ＦＣＳ、グルコース、亜セレン酸ナトリウム、プロゲステロン、コナルブミン、プトレシンおよびインスリンを含む； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ．）およびＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変イーグル培地［１０％ ＦＣＳ、グルタミン、ペニシリン、および２５ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ ７．２）を含む； Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ．］に再懸濁させ、そしてさまざまな濃度の本発明の精製融合タンパク質の存在下で、ならびに、いかなるサイトカインをも含んでいない陰性対照として、５％ ＣＯ２中、３７℃でインキュベートする。３日後、細胞の形態を評価することにより、およびＭｏｓｍａｎｎ （Ｍｏｓｍａｎｎ， Ｔ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， ６５：５５−６３（１９８３））の比色アッセイを使用することにより、ニューロン生存を調べる。サイトカインを含まない対照と比較して増強されたニューロン細胞の生存能力は、ニューロン細胞の生存を増強するアルブミン融合タンパク質の能力を表す。
【１２０３】
実施例５５： ホスファターゼ活性のアッセイ
次のアッセイを用いることにより、本発明のアルブミン融合タンパク質のセリン／トレオニンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）活性を評価することが可能である。
【１２０４】
セリン／トレオニンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）活性をアッセイするために、当業者に広く知られているアッセイを利用することができる。たとえば、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ製のＰＳＰａｓｅアッセイキットを用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質のセリン／トレオニンホスファターゼ（ＰＳＰａｓｅ）活性を測定することが可能である。ＰＳＰａｓｅの基質であるミエリン塩基性タンパク質（ＭｙＢＰ）を、［３２Ｐ］ＡＴＰの存在下でｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼを用いてセリンおよびトレオニン残基上でリン酸化する。次に、３２Ｐ標識ＭｙＢＰからの無機リン酸の放出を測定することにより、タンパク質セリン／トレオニンホスファターゼ活性を求める。
【１２０５】
実施例５６： セリン／トレオニンホスファターゼと他のタンパク質との相互作用
セリン／トレオニンホスファターゼ活性（たとえば、実施例５５で測定される活性）を有する本発明の融合タンパク質は、たとえば、さらなる相互作用タンパク質または受容体タンパク質あるいは他のシグナル伝達経路タンパク質の同定、特性づけおよび精製を行うための研究ツールとして有用である。簡潔に述べると、本発明の標識された融合タンパク質は、それと相互作用する分子を精製するための試薬として有用である。アフィニティー精製の１実施形態では、本発明のアルブミン融合タンパク質をクロマトグラフィーカラムに共有結合させる。神経細胞または肝細胞のような推定上の標的細胞に由来する無細胞抽出物をカラムに通し、適切な親和性を有する分子を融合タンパク質に結合させる。融合タンパク質複合体をカラムから回収し、解離させ、そして回収された分子をＮ末端タンパク質配列決定処理に付す。次に、このアミノ酸配列を用いて、捕捉された分子を同定するか、または適切なｃＤＮＡライブラリーから該当する遺伝子をクローン化するための縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計する。
【１２０６】
実施例５７： ヘパラナーゼ活性のアッセイ
本発明のアルブミン融合タンパク質のヘパラナーゼ活性をアッセイするのに利用しうる当技術分野で公知の多数のアッセイが存在する。１例を挙げると、本発明のアルブミン融合タンパク質のヘパラナーゼ活性は、Ｖｌｏｄａｖｓｋｙら（Ｖｌｏｄａｖｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ５：７９３−８０２（１９９９））により記載されたようにアッセイされる。簡潔に述べると、細胞溶解物、馴化培地、インタクト細胞（３５ｍｍ培養皿あたり１×１０６個）、細胞培養上清、または精製された融合タンパク質を、３５Ｓ標識ＥＣＭまたは可溶性ＥＣＭ誘導ピークＩプロテオグリカンと共に、ｐＨ ６．２〜６．６、３７℃で１８時間インキュベートする。インキュベーション培地を遠心分離し、上清をＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂカラム（０．９×３０ｃｍ）でゲル濾過することにより分析する。画分をＰＢＳで溶出させ、それらの放射能を測定する。ヘパラン硫酸側鎖の分解断片を、０．５＜Ｋａｖ＜０．８でＳｅｐｈａｒｏｓｅ ６Ｂから溶出させる（ピークＩＩ）。それぞれの実験を少なくとも３回行う。Ｖｌｏｄａｖｓｋｙらにより記載された「ピークＩＩ」に対応する分解断片は、ヘパラン硫酸の切断における本発明のアルブミン融合タンパク質の活性を表す。
【１２０７】
実施例５８： 生体分子の固定化
この実施例は、非宿主細胞脂質二重層構築物中で本発明のアルブミン融合タンパク質を安定化させる方法を提供する（たとえば、Ｂｉｅｒｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：１１０５−１１０８（１９９９）を参照されたい。参照によりその全体を本明細書に組み入れる）。この方法は、上記の種々の機能アッセイにおける本発明の融合タンパク質に関する研究に適合させることが可能である。簡潔に述べると、ビオチン化のための炭水化物特異的化学を用いて、ビオチンタグを本発明のアルブミン融合タンパク質に拘束し、固定化後に均一な配向が得られるようにする。洗浄された膜中の本発明のアルブミン融合タンパク質の５０μＭ溶液を、２０ｍＭ ＮａＩＯ４および１．５ｍｇ／ｍｌ（４ｍＭ）ＢＡＣＨまたは２ｍｇ／ｍｌ（７．５ｍＭ）ビオチン−ヒドラジドと共に、室温で１時間インキュベートする （反応容量１５０μｌ）。その後、５００ｍｌの緩衝液Ｒ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７）に対して、１時間ごとに緩衝液を交換しながらサンプルを４℃で最初に５時間透析し、最後に１２時間透析する（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｌｉｄｅａｌｉｚｅｒ Ｃａｓｓｅｔｔ， １０ｋＤａカットオフ； Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ）。キュベットに添加する直前、緩衝液ＲＯＧ５０（５０ｍＭオクチルグルコシドを補充した緩衝液Ｒ）でサンプルを１：５希釈する。
【１２０８】
実施例５９： メタロプロテイナーゼ活性のアッセイ
メタロプロテイナーゼは、触媒機構としてＺｎ２＋のような金属イオンを使用するペプチドヒドロラーゼである。本発明のアルブミン融合タンパク質のメタロプロテイナーゼ活性は、当技術分野で公知の方法に従ってアッセイすることができる。次の例示的な方法を提供する。
【１２０９】
α−２−マクログロブリンのタンパク質分解：
プロテアーゼ活性を確認するために、本発明の精製融合タンパク質を、１×アッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．５、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、２５μＭ ＺｎＣｌ２および０．０５％ Ｂｒｉｊ−３５）中で基質α−２−マクログロブリン（０．２ユニット／ｍｌ； Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）と混合し、３７℃で１〜５日間インキュベートする。
【１２１０】
トリプシンを陽性対照として使用する。陰性対照はアッセイ緩衝液中にα−２−マクログロブリンのみを含有する。サンプルを採取し、５％ ２−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で５分間煮沸し、次に、８％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにローディングする。電気泳動後、銀染色法によりタンパク質を視覚化する。陰性対照と比較して、より低分子量のバンドが現れたことから、タンパク質分解が実証される。
【１２１１】
メタロプロテイナーゼの阻害剤によるα−２−マクログロブリンタンパク質分解の阻害：
既知のメタロプロテイナーゼ阻害剤（金属キレート化剤（ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、およびＨｇＣｌ２）、ペプチドメタロプロテイナーゼ阻害剤（ＴＩＭＰ−１およびＴＩＭＰ−２）ならびに市販の小分子ＭＭＰ阻害剤）を用いて、本発明のアルブミン融合タンパク質のタンパク質分解活性を特性づけることも可能である。使用しうる３種の合成ＭＭＰ阻害剤は、次のとおりである： ＭＭＰ阻害剤Ｉ、［ＭＭＰ−１およびＭＭＰ−８に対するＩＣ５０＝１．０μＭ； ＭＭＰ−９に対するＩＣ５０＝３０μＭ； ＭＭＰ−３に対するＩＣ５０＝１５０μＭ］； ＭＭＰ−３（ストロメリシン−１）阻害剤Ｉ［ＭＭＰ−３に対するＩＣ５０＝５μＭ］、ならびにＭＭＰ−３阻害剤ＩＩ［ＭＭＰ−３に対するＫｉ＝１３０ｎＭ］； Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手可能な阻害剤、それぞれカタログ番号４４４２５０、４４４２１８および４４４２２５）。簡潔に述べると、さまざまな濃度の小分子ＭＭＰ阻害剤を、２２．９μｌの１×ＨＥＰＥＳ緩衝液（５０ ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．５、０．２ Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、２５μＭ ＺｎＣｌ２および０．０５％ Ｂｒｉｊ−３５）中で本発明の精製融合タンパク質（５０μｇＩｍｌ）と混合し、室温で（２４℃）で２時間インキュベートし、次に７．１μｌの基質α−２−マクログロブリン（０．２ユニット／ｍｌ）を添加し、３７℃で２０時間インキュベートする。４×サンプル緩衝液を添加するにより、反応を停止させ、直ちに５分間煮沸する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後、タンパク質バンドを銀染色により視覚化する。
【１２１２】
合成蛍光性ペプチド基質の切断アッセイ：
メタロプロテイナーゼ活性が実証されている本発明の融合タンパク質の基質特異性は、合成蛍光性ペプチド基質（ＢＡＣＨＥＭ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃから購入した）を使用するなどの、当技術分野で公知の方法を用いて調べることが可能である。試験基質としては、Ｍ−１９８５、Ｍ−２２２５、Ｍ−２１０５、Ｍ−２１１０、およびＭ−２２５５が挙げられる。最初の４つはＭＭＰ基質であり、最後の１つは、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）転換酵素（ＴＡＣＥ）の基質である。これらの基質は、好ましくは、１：１ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および水で調製される。ストック溶液は、５０〜５００μＭである。蛍光アッセイは、恒温水浴を備えたＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＬＳ ５０Ｂルミネセンス分光計を用いて行う。励起λは３２８ｎｍであり、発光λは３９３ｎｍである。簡潔に述べると、１７６μｌの１×ＨＥＰＥＳ緩衝液（０．２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５％ Ｂｒｉｊ−３５および５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．５）を４μｌの基質溶液（５０μＭ）と共に２５℃で１５分間インキュベートし、次に２０μｌの本発明の精製融合タンパク質をアッセイキュベットに添加するにより、アッセイを行う。基質の最終濃度は１μＭである。初期の加水分解速度を３０分間モニターする。
【１２１３】
実施例６０： ＶＨおよびＶＬドメインの同定およびクローニング
特定の抗体を発現する細胞系に由来するＶＨおよびＶＬドメインを同定およびクローン化する１つの方法は、抗体発現細胞系から作製されたｃＤＮＡに対してＶＨおよびＶＬに特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行うことである。簡潔に述べると、ＲＮＡを細胞系から単離し、そしてＥＢＶ細胞系により発現される抗体のＶＨおよびＶＬドメインを増幅するように設計されたＲＴ−ＰＣＲ用の鋳型として使用する。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ； Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）で細胞を溶解して、１／５容量のクロロホルムで抽出することが可能である。クロロホルムの添加後、溶液を室温で１０分間インキュベートし、そして１４，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃の条件で卓上用遠心機により遠心分離する。上清を収集し、そして等容量のイソプロパノールを用いてＲＮＡを沈澱させる。１４，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃の条件で卓上用遠心機により遠心処理することにより、沈澱させたＲＮＡをペレット化する。遠心処理に続いて、上清を廃棄し、７５％エタノールで洗浄する。洗浄に続いて、８００ｒｐｍ、５分間、４℃の条件でＲＮＡを再び遠心処理する。上清を廃棄し、ペレットを空気乾燥させる。ＲＮＡをＤＥＰＣ水に溶解させ、１０分間で６０℃まで加熱する。ＲＮＡの量は、光学濃度測定を用いて算出することができる。
【１２１４】
ｃＤＮＡは、逆転写酵素およびランダムヘキサマープライマーを用いて１．５〜２．５マイクログラムのＲＮＡから、当技術分野で周知の方法に従って合成することが可能である。次に、ＶＨおよびＶＬドメインのＰＣＲ増幅のための鋳型としてｃＤＮＡを使用する。ＶＨおよびＶＬ遺伝子の増幅に使用されるプライマーを表３に示す。典型的には、ＰＣＲ反応では、単一の５’プライマーおよび単一の３’プライマーが利用される。時々、利用可能なＲＮＡ鋳型の量が限られている場合、または効率を高めるために、５’および／または３’プライマーのグループを使用してもよい。たとえば、時々、全部で５種のＶＨ５’プライマーおよびすべてのＪＨ３’プライマーが、単一のＰＣＲ反応で使用される。ＰＣＲ反応は、１×ＰＣＲ緩衝液、２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．７ユニットの高忠実性Ｔａｑポリメラーゼ、５’プライマーミックス、３’プライマーミックスおよび７．５マイクロリットルのｃＤＮＡを含む５０マイクロリットル容量で行う。ＶＨおよびＶＬの両方の５’および３’プライマーミックスは、それぞれ、個々のプライマーのそれぞれの２２ ｐｍｏｌｅおよび２８ ｐｍｏｌｅを一緒にプールすることにより、作製することができる。ＰＣＲ条件は次のとおりである： ９６℃で５分間； 続いて９４℃で１分間、５０℃で１分間、および７２℃で１分間を２５サイクル； 続いて７２℃で１０分間の伸長サイクル。反応が終了した後、サンプルチューブを４℃で保存する。
【１２１５】
【表３】
ＶＨおよびＶＬドメインの増幅に使用されるプライマー配列
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【１２１６】
次に、ＰＣＲサンプルを１．３％アガロースゲルで電気泳動させる。予想されるサイズ（ＶＨドメインに対しては約５０６塩基対およびＶＬドメインに対しては３４４塩基対）のＤＮＡバンドをゲルから切り取って、当技術分野で周知の方法を用いて精製することができる。精製されたＰＣＲ産物は、ＰＣＲクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ製のＴＡベクター）中に連結することができる。Ｅ． ｃｏｌｉのトランスフェクションおよび青／白の色選択を行った後、個々のクローン化されたＰＣＲ産物を単離することができる。次に、クローン化されたＰＣＲ産物を、一般に当技術分野で公知の方法を用いて配列決定することが可能である。
【１２１７】
ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含有するＰＣＲバンドを用いて、全長Ｉｇ発現ベクターを作製することもできる。適切な宿主細胞にトランスフェクトしたときに、これらのベクターから完全な重鎖もしくは軽鎖分子を発現させることができるように、ＶＨおよびＶＬドメインを、重鎖（たとえば、ヒトＩｇＧ１もしくはヒトＩｇＧ４）または軽鎖（ヒトκもしくはヒトλ）定常領域のヌクレオチド配列を含有するベクター中にクローン化することができる。さらに、クローン化された重鎖および軽鎖の両方を１つの細胞系で（１種もしくは２種のベクターから）発現させる場合は、細胞培養培地中に分泌される完全な機能性抗体分子にアセンブルさせることができる。完全な抗体分子をコードする発現ベクターを作製するＶＨおよびＶＬ抗体ドメインをコードするポリヌクレオチドを用いる方法は、当技術分野の範囲内で周知である。
【１２１８】
以上の説明および実施例に特に記載されている以外の方法を用いて本発明を実施しうることは明らかであろう。本発明の多くの修正および変更が上記の教示に照らして可能であり、したがって、それらは特許請求の範囲内に含まれる。
【１２１９】
引用された各文献（特許、特許出願、特許刊行物、雑誌論文、要約、実験マニュアル、書籍、または他の開示物を含む）ならびに本出願で言及されているＧｅｎＢａｎｋ、ＧｅｎｅＳｅｑ、またはＣＡＳ Ｒｅｇｉｓｔｒｙのようなデータベースに特有の識別番号を介して利用可能な情報の全開示内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする。以下の米国特許出願のそれぞれの明細書および配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする。
【１２２０】
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【１２２１】
さらに、１９９８年６月２５日出願の出願第０９／０９１，８７３号；２０００年４月１２日出願の出願第６０／２２９，３５８号；２０００年４月２５日出願の出願第６０／１９９，３８４号および２０００年１２月２１日出願の出願第６０／２５６，９３１号に記載の内容および配列表は、その全体を参照により本明細書に組み入れるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
細胞培地中で最大５週間にわたり３７℃でインキュベートした後に残存しているＨＡ−ｈＧＨの生物学的活性（Ｎｂ２細胞増殖）に基づいて、ＨＡ融合タンパク質の貯蔵寿命の延長を示した図である。
【図２】
細胞培地中で最大３週間にわたり４℃、３７℃または５０℃でインキュベートした後に残存しているＨＡ−ｈＧＨの安定な生物学的活性（Ｎｂ２細胞増殖）に基づいて、ＨＡ融合タンパク質の貯蔵寿命の延長を示した図である。
【図３】
各種濃度のｈＧＨまたはアルブミン融合タンパク質と共に２４時間（Ａ）または４８時間（Ｂ）インキュベートするＮｂ２細胞増殖アッセイで、ＨＡ−ｈＧＨの生物学的活性をｈＧＨと比較した図である。
【図４】
ＨＡ融合体を形成するために治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングすることができる基本ベクターとして使用可能なプラスミド（ｐＰＰＣ０００５）の地図を示した図である。
【図５】
バイアル中で４８または７２時間貯蔵した後の、各種濃度のＨＡ−ＩＦＮ溶液の回復をストック溶液と比較した図である。
【図６】
ＩＶまたはＳＣでサルに投与した後のＨＡ−ＩＦＮα融合タンパク質の活性を比較した図である。
【図７】
ＨＡ−ＩＦＮα融合タンパク質の生物学的利用能および安定性を示した図である。
【図８】
ＨＡ−ＩＦＮα生産用の発現ベクターの地図を示した図である。
【図９】
ＨＡ中のループの位置を示した図である。
【図１０】
ＨＡループの改変の例を示した図である。
【図１１】
ＨＡループを示した図である。
【図１２】
ＨＡループＩＶを示した図である。
【図１３】
ＨＡの三次構造を示した図である。
【図１４】
ｓｃＦｖ−ＨＡ融合体の例を示した図である。
【図１５】
成熟型のヒトアルブミンのアミノ酸配列（配列番号１８）およびそれをコードするポリヌクレオチド（配列番号１７）を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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