(57)【要約】本発明は、ポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインならびにその製造方法および使用方法に関する。本発明の生物活性な合成ケモカインは、ポリマー修飾されたポリペプチドケモカイン骨格を含む。本発明の化合物および方法は、天然に存在するケモカインを伴う障害を処置するために有用であり、例えば、ＨＩＶおよびＡＩＤＳ関連障害を処置するために、そして喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム／アテローム性動脈硬化、臓器移植拒絶および慢性関節リウマチを処置するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性ポリマーが結合している合成ケモカインであって、該合成ケモカインが結合するケモカイン受容体のダウンモジュレーション（ｄｏｗｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を生じさせることを特徴とするｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を有する合成ケモカイン。
【請求項２】
前記水溶性ポリマーを有しない前記合成ケモカインと比較して１０倍よりも大きいｉｎ  ｖｉｖｏ血清循環半減期を有する、請求項１に記載の合成ケモカイン。
【請求項３】
（Ａ）脂肪族鎖、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってＮ末端が修飾されているか、または（Ｂ）脂肪族鎖、多環、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってＣ末端が修飾されているか、または（Ｃ）脂肪族鎖、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってＮ末端が修飾され、かつ脂肪族鎖、多環、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってＣ末端が修飾されている、請求項１に記載の合成ケモカイン。
【請求項４】
脂肪族鎖、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってＮ末端が修飾されている、請求項３に記載の合成ケモカイン。
【請求項５】
脂肪族鎖、多環、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群から選択された部分によってそのＣ末端が修飾されている、請求項３に記載の合成ケモカイン。
【請求項６】
脂肪族鎖、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってＮ末端が修飾され、かつ脂肪族鎖、多環、アミノ酸およびアミノ酸誘導体からなる群の中から選択された部分によってＣ末端が修飾されている、請求項３に記載の合成ケモカイン。
【請求項７】
前記水溶性ポリマーが、Ｃ末端部位、凝集部位、グリコシル化部位およびグリコサミノグリカン（「ＧＡＧ」）結合部位からなる群の中から選択された部位において前記合成ケモカインに結合している、請求項１または請求項３に記載の合成ケモカイン。
【請求項８】
Ｒａｎｔｅｓ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＳＤＦ−１、ＩＬ−８またはＭＣＰ−１の類似物である、請求項１または請求項３に記載の合成ケモカイン。
【請求項９】
前記合成ケモカインがＲａｎｔｅｓの類似物であり、前記水溶性ポリマーがＣ末端部位に結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項１０】
前記合成ケモカインがＲａｎｔｅｓの類似物であり、前記水溶性ポリマーが凝集部位において結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項１１】
前記合成ケモカインがＲａｎｔｅｓの類似物であり、前記水溶性ポリマーがグリコシル化部位において結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項１２】
前記合成ケモカインがＲａｎｔｅｓの類似物であり、前記水溶性ポリマーがＧＡＧ部位において結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項１３】
前記合成ケモカインがＭＩＰ−１αの類似物であり、前記水溶性ポリマーがＣ末端部位に結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項１４】
前記合成ケモカインがＭＩＰ−１αの類似物であり、前記水溶性ポリマーが凝集部位において結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項１５】
前記合成ケモカインがＭＩＰ−１αの類似物であり、前記水溶性ポリマーがグリコシル化部位において結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項１６】
前記合成ケモカインがＭＩＰ−１αの類似物であり、前記水溶性ポリマーがＧＡＧ部位において結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項１７】
前記合成ケモカインがＭＩＰ−１βの類似物であり、前記水溶性ポリマーがＣ末端部位に結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項１８】
前記合成ケモカインがＭＩＰ−１βの類似物であり、前記水溶性ポリマーが凝集部位において結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項１９】
前記合成ケモカインがＭＩＰ−１βの類似物であり、前記水溶性ポリマーがグリコシル化部位において結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項２０】
前記合成ケモカインがＭＩＰ−１βの類似物であり、前記水溶性ポリマーがＧＡＧ部位において結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項２１】
前記合成ケモカインがＳＤＦ−１の類似物であり、前記水溶性ポリマーがＣ末端部位に結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項２２】
前記合成ケモカインがＳＤＦ−１の類似物であり、前記水溶性ポリマーがＧＡＧ部位において結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項２３】
前記合成ケモカインがＩＬ−８の類似物であり、前記水溶性ポリマーがＣ末端部位に結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項２４】
前記合成ケモカインがＩＬ−８の類似物であり、前記水溶性ポリマーがＧＡＧ部位において結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項２５】
前記合成ケモカインがＭＣＰ−１の類似物であり、前記水溶性ポリマーがＣ末端部位に結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項２６】
前記合成ケモカインがＭＣＰ−１の類似物であり、前記水溶性ポリマーが凝集部位において結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項２７】
前記合成ケモカインがＭＣＰ−１の類似物であり、前記水溶性ポリマーがグリコシル化部位において結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項２８】
前記合成ケモカインがＭＣＰ−１の類似物であり、前記水溶性ポリマーがＧＡＧ部位において結合している、請求項８に記載の合成ケモカイン。
【請求項２９】
前記水溶性ポリマーが、下記式：
Ｕ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊ
を有し、
該式中、
Ｕは、前記合成ケモカインに共有結合により結合した官能基の残基を含み、
Ｂは、３つ以上のアームを有する分岐コアであり、存在していても存在していなくてもよく、
Ｐｏｌｙｍｅｒは、実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり、
Ｊは、負、正および中性からなる群の中から選択された正味の荷電を生理学的条件下で有するペンダント基の残基である、請求項１に記載の合成ケモカイン。
【請求項３０】
Ｕ、Ｂ、ＰｏｌｙｍｅｒおよびＪの１つまたは複数が、スペーサーまたはリンカーによって隔てられ、前記スペーサーまたはリンカーは、下記式：
Ｕ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｓ３−Ｊ
を有し、
該式中、ｓ１、ｓ２およびｓ３は、同じまたは異なっていてよいスペーサー部分またはリンカー部分であり、それぞれ存在していても存在していなくてもよい、請求項２９に記載の合成ケモカイン。
【請求項３１】
Ｕが、オキシム、アミド、アミン、ウレタン、エーテル、チオエーテル、エステル、ヒドラジド、オキサゾリジンおよびチアゾリジンの中から選択された結合の残基である、請求項２９に記載の合成ケモカイン。
【請求項３２】
Ｂの１つのアームがＵに結合し、Ｂの別のアームがＰｏｌｙｍｅｒに結合している、請求項２９に記載の合成ケモカイン。
【請求項３３】
Ｂが４つ以上のアームを含む、請求項２９に記載の合成ケモカイン。
【請求項３４】
前記アームの２つ以上が、オキシム、アミド、アミン、ウレタン、チオエーテル、エステル、ヒドラジド、オキサゾリジンおよびチアゾリジンの中から選択された結合の残基を含む、請求項３３に記載の合成ケモカイン。
【請求項３５】
Ｂが、アミノ、カルボキシルおよび混合したアミノ−カルボキシルの中から選択された分岐コア成分を含む、請求項３３に記載の合成ケモカイン。
【請求項３６】
Ｐｏｌｙｍｅｒが、ポリアルキレンオキシドおよびポリアミドアルキレンオキシドからなる群の中から選択される、請求項２９に記載の合成ケモカイン。
【請求項３７】
Ｐｏｌｙｍｅｒが、下記式：
−［Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−  または
−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）］ｎ−
のポリアミドであり、
該式中、ＸおよびＹは、同じまたは異なっていてもよく、かつ分枝状または直鎖状であってもよい二価の基であり、ｎは１〜１００の整数である、請求項２９に記載の合成ケモカイン。
【請求項３８】
ＸおよびＹのいずれかまたはその両方が、下記式：
−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−  および
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−
の中から選択された繰り返しユニットを含み、
該式中、ｎは１〜１００の整数である、請求項３７に記載の合成ケモカイン。
【請求項３９】
Ｊがイオン性の基である、請求項２９に記載の合成ケモカイン。
【請求項４０】
前記イオン性の基が、カルボキシル、アミンおよびヒドロキシルの中から選択される、請求項３９に記載の合成ケモカイン。
【請求項４１】
前記水溶性ポリマーが負の正味の荷電を有する、請求項３９に記載の合成ケモカイン。
【請求項４２】
前記水溶性ポリマーが正の正味の荷電を有する、請求項３９に記載の合成ケモカイン。
【請求項４３】
前記水溶性ポリマーが中性の正味の荷電を有する、請求項３９に記載の合成ケモカイン。
【請求項４４】
結合した水溶性ポリマーを含み、かつウイルス感染の阻害を含む生物学的応答について、対応する野生型ケモカインのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＣ５０と等しいか、またはそれよりも小さいｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＥＣ５０を有する生物活性な合成ケモカインであって、前記ＥＣ５０が、前記生物活性な合成ケモカインがその対応するケモカイン受容体の１つまたは複数に結合することを特徴とするｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系アッセイにおいて測定され、前記受容体の１つまたは複数がウイルス感染に対する共受容体である、生物活性な合成ケモカイン。
【請求項４５】
前記ＥＣ５０が、１０００ｎＭ、７００ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭおよび１ｎＭからなる群の中から選択される濃度よりも小さい、請求項４４に記載の生物活性な合成ケモカイン。
【請求項４６】
結合した水溶性ポリマーを含む生物活性な合成ケモカインであって、かつ
（１）対応する野生型ケモカインのＥＣ５０と等しいか、またはそれよりも小さいＥＣ５０を有し、前記ＥＣ５０は、前記生物活性な合成ケモカインがその対応するケモカイン受容体の１つまたは複数に結合することを特徴とするｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系アッセイにおいて測定され、前記受容体の１つまたは複数がウイルスの共受容体であり
（２）前記水溶性ポリマーを有しない前記合成ケモカインと比較して１０倍よりも大きい血清循環半減期を有する生物活性な合成ケモカイン。
【請求項４７】
前記ＥＣ５０が、１０００ｎＭ、７００ｎＭ、５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭおよび１ｎＭからなる群の中から選択される濃度よりも小さい、請求項４６に記載の生物活性な合成ケモカイン。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、ポリマー修飾された生物活性な合成ケモカイン（特に、ケモカインのアンタゴニストおよびアゴニスト）、ならびにその製造方法および使用方法に関する。
【０００２】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許出願第６０／２１７，６８３号（２０００年７月１２日出願）（これは引用により本明細書中に組み込まれる）の一部継続出願である。
【０００３】
（発明の背景）
ケモカインは、白血球の輸送および様々な他の生物学的プロセスに関与する小さいタンパク質である（Ｍｕｒｐｈｙ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．（２０００）５１（１）：１４５〜１７６；Ｒｏｌｌｉｎｓ，ＢＪ．、Ｂｌｏｏｄ（１９９７）９０（３）：９０９〜９２８；Ｗｅｌｌｓ他、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．（１９９９）４８：３５３〜３６２）。ほとんどのケモカインは局在しており、炎症部位に典型的に存在する種々のタイプの炎症性細胞の走化性および細胞活性化を誘導することによって炎症を増強している。一部のケモカインは、走化性のほかに、例えば、キラー細胞の増殖および活性化の誘導、造血始原細胞タイプの増殖の調節、炎症状態において骨髄の内外へ造血前駆細胞の輸送、血管形成および腫瘍増殖などの様々な性質を有する（例えば、Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ他、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９７）１５：６７５〜７０５；Ｚｌｏｔｎｉｋ他、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９９）１９（１）：１〜４；Ｗａｎｇ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９９８）２２０（１−２）：１〜１７；Ｍｏｓｅｒ他、Ｉｎｔｌ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６（３−４）：３２３〜３４４を参照のこと）。
【０００４】
多くのケモカインのアミノ酸配列、構造および機能が知られている。ケモカインは、分子量が約８ｋＤａ〜１０ｋＤａであり、タンパク質レベルでは相互間で約２０％〜５０％の配列相同性を示す。これらのタンパク質はまた、共通した三次構造をともに有する。すべてのケモカインは、分子内ジスルフィド結合の形成に関与する多数の保存されたシステイン残基を有しており、これらは、ケモカインの同定および分類のために利用されている。例えば、最初の２つのシステイン残基が１個のアミノ酸によって隔てられているケモカインは、「Ｃ−Ｘ−Ｃ」ケモカインと呼ばれている（これはまた「α」ケモカインと呼ばれている）。最初の２つのシステイン残基が隣接しているケモカインは、「ＣＣ」ケモカインと呼ばれている（これはまた「β」ケモカインと呼ばれている）。「Ｃ」ケモカインは、１個のシステイン残基が存在しないことによって、それ以外のケモカインとは異なる（これはまた「γ」ケモカインと呼ばれている）。Ｃケモカインは、ＣＣケモカインのいくつかのメンバーに対して類似性を示すが、ＣＣケモカインおよびＣＸＣケモカインに特徴的な第１および第３のシステイン残基を有していない。最初の２つのシステイン残基が３つのアミノ酸によって隔てられているケモカインの小さいグループのメンバーは、「ＣＸＸＸＣ」ケモカインと呼ばれている（これはまた「ＣＸ３Ｃ」ケモカインまたは「δ」ケモカインと呼ばれている）。ケモカインのサブグループもまた存在する。例えば、２つのさらなる保存されたシステイン残基を含有するＣＣケモカインが知られており、用語「Ｃ６−β」ケモカインがこのサブグループに対して使用されることがある。今日までに同定されたほとんどのケモカインは、ＣＣケモカインクラスおよびＣＸＣケモカインクラスのメンバーである。
【０００５】
ケモカインは、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、ガン、ウイルス性疾患、アテローム／アテローム性動脈硬化、慢性関節リウマチおよび臓器移植拒絶などの重要な疾患経路に関係している。しかしながら、多くのケモカインおよび治療薬としてのそれらの潜在的な使用に関する１つの一般的な問題は、白血球の炎症性応答および感染を促進または悪化させるというそれらの固有の性質に関連する。この目的のために、ケモカインの数多くの修飾が、対応する野生型ケモカインのアンタゴニストを生成しようとする試みにおいてなされている。Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１（５）：２５９９〜２６０３）；Ｓｉｍｍｏｎｓ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７６：２７６〜２７９）；Ｇｏｎｇ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１（１８）：１０５２１〜１０５２７）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ他（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９７）１８６（８）：１１８９〜１１９１）、Ｐｏｌｏ他（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）３０：３１９０〜３１９８）、Ｎｉｂｂｓ他（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１６４：１４８８〜１４９７）およびＴｏｗｎｓｏｎ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）２７６（５０）：３９２５４〜３９２６１）は、Ｎ末端が修飾された様々なケモカインについて報告している。
【０００６】
古典的、かつ代表的な一例が、ＲＡＮＴＥＳに対する状況である。ある種の条件下において、野生型ＲＡＮＴＥＳは炎症およびＨＩＶ感染を増強し得る（Ｇｏｒｄｏｎ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）７３：６８４〜６９４；Ｃｚａｐｌｅｗｓｋｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：１６０７７〜１６０８４）。対照的に、ＲＡＮＴＥＳポリペプチド鎖の２６位の置換（Ｅ２６Ａ）および６６位の置換（Ｅ６６Ｓ）により、分子はその非炎症性の形態に変換され、ＨＩＶに対するその受容体と競合するその能力が改善されている（Ａｐｐａｙ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４（３９）：２７５０５〜２７５１２；米国特許第６，２１４，５４０号（これはＨＩＶ感染を阻害するケモカインおよびそれの基づく方法を開示する）もまた参照のこと）。さらに、ＨＩＶ−１感染を阻止し得るアンタゴニストをもたらすＲＡＮＴＥＳの様々なＮ末端修飾がなされており、これらには、Ｎ末端の短縮化［ＲＡＮＴＥＳ９−６８］、メチオニンの付加（「Ｍｅｔ−ＲＡＮＴＥＳ」）、アミノオキシペンタンの付加（「ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ」）またはノナノイルの付加（「ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ」）が含まれる（Ａｒｅｎｚａｎａ−Ｓｅｉｓｄｅｄｏｓ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８３：４００；Ｍａｃｋ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８７：１２１５〜１２２４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：２５９９〜２６０３；Ｗｅｌｌｓ他、国際特許出願公開ＷＯ９６／１７９３５；Ｓｉｍｍｏｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：２７６〜２７９；Ｏｆｆｏｒｄ他、国際特許出願公開ＷＯ９９／１１６６６；およびＭｏｓｉｅｒ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９９）７３（５）：３５４４〜３５５０）。米国特許第６，１６８，７８４号には、ケモカイン類似物ＮＮＹ−Ｒａｎｔｅｓが開示され、そしてＰＥＧ鎖をＣ末端に有する類似物の修飾が示唆されている。Ｗｉｌｋｉｎ他（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９９）９：４１２〜４２６）はタンパク質の化学合成を概説している。
【０００７】
ケモカインの生物学的活性は受容体によって媒介される（Ｍｕｒｐｈｙ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．（２０００）５１（１）：１４５〜１７６；Ｒｏｌｌｉｎｓ，ＢＪ．、Ｂｌｏｏｄ（１９９７）９０（３）：９０９〜９２８；Ｗｅｌｌｓ他、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．（１９９９）４８：３５３〜３６２）。これには、ケモカイン特異的受容体、ならびにＣＣケモカインまたはＣＸＣケモカイン群のいずれかに属するいくつかの異なるケモカインと結合し、リガンド特異性が重複する受容体が含まれる。例えば、ＣＣケモカインのＳＤＦ−１αはＣＸＣＲ４受容体に対して特異的であり、これに対して、ＣＸＣケモカインのＲＡＮＴＥＳは、ＣＣＲ１受容体、ＣＣＲ３受容体およびＣＣＲ５受容体に結合する。別の例として、ＣＣＲ３（これはＣＫＲ３としても知られている）の受容体に対するリガンドであるケモカインのエオタキシンが挙げられる（例えば、Ｃｙｓｔｅｒ，Ｊ．Ｇ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）２８６：２０９８〜２１０２；Ｐｏｎａｔｈ他、Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（１９９６）１８３（６）：２４３７〜２４４８；Ｐｏｎａｔｈ他、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（１９９６）９７（３）：６０４〜１２；およびＹａｍａｄａ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９７）２３１（２）：３６５〜３６８を参照のこと）。
【０００８】
ケモカインがその同族の受容体を活性化する能力は、ケモカインのＮ末端領域に対する修飾によって大きく影響を受ける。これらの変化は、タンパク質分解の方法、変異誘発または化学的修飾から生じ得る（例えば、Ｐｒｏｕｄｓｆｏｏｔ，Ａ．Ｅ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：２５９９；Ｇｒｚｅｇｏｒｚｅｗｓｋｉ他、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ（２００１）１３（４）：２０９〜２１９；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１）２６６（３４）：２３１２８〜２３１３４；Ｍｏｓｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：７１２５〜７１２８；Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９８）９５：１０８９６；Ｍａｃｋ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９８）１８７：１２１５；Ｇｏｎｇ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：１０５２１；Ｓｔｒｕｙｆ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９８）２８：１２６２；Ｗｅｂｅｒ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９６）１８３：６８１；Ｐｒｏｏｔ他（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６０：４０３４；Ｙａｎｇ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）７３（６）：４５８２〜４５８９；Ｒｕｓｃｏｎｉ他、Ａｎｔｉｖｉｒ  Ｔｈｅｒ．（２０００）５（３）：１９９〜２０４；Ｗｙｕｔｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６３（１１）：６１５５〜６６１３；Ｄｅｔｈｅｕｘ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（２０００）１９２：１５０１〜１５０８；Ｎｉｂｂｓ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２０００）１６４：１４８８〜１４９７；ＭｃＣｏｌｅ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６３（５）２８２９〜２８３５；Ｎｕｆｅｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９９）３８（２）：６３６〜６４２；およびＷｙｕｔｓ他、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）２６０（２）：４２１〜４２９を参照のこと）。
【０００９】
これらの修飾されたタンパク質の多くは、ケモカイン受容体によって媒介される効果にｉｎ  ｖｉｔｒｏで拮抗し、ウイルス感染を阻害し、そしていくつかの動物モデルにおいて炎症を著しく低下させることができる。いくつかの場合には、そのようなタンパク質は、その受容体を活性化する能力を保持し、そして初代細胞においては、この活性は受容体の発現レベルを反映している。Ｎ末端領域に対するある種の修飾はまた、ケモカイン受容体の輸送において顕著な効果を有している。したがって、そのような修飾されたケモカインは、その受容体および対応する野生型ケモカインに拮抗することができるが、アンタゴニスト、アゴニストまたはその変化体であるかの分類は異なり得る。
【００１０】
ケモカインが治療薬として提案されているが、その潜在的な大きい欠点の１つは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのその循環半減期が典型的にはほんの数分と良くないことである。循環半減期を改善するために、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの水溶性ポリマーをタンパク質に結合させることができることが知られているが、様々な混じり合った結果は、制御された様式で、そして使用者によって規定される精密さで水溶性ポリマーを結合させることが困難さを与える種々の結果が伴う（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９５）６：１５０〜１６５；Ｍｅｈｖａｒ，Ｒ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．（２０００）３（１）：１２５〜１３６；およびＭｏｎｆａｒｄｉｎｉ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９８）９：４１８〜４５０）。
【００１１】
これに関して、ＰＥＧ鎖をタンパク質のＮ末端残基に部位特異的に結合させるための技術が、増殖因子の顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）およびケモカインのＩＬ−８の場合について開発され、実証された（Ｇａｅｒｔｎｅｒ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）７（１）：３８〜４４）。その両方はその活性の大部分を保持していることが報告されていた。しかしながら、効力は、受容体に基づくウイルス感染阻害剤として使用される薬物など、アンタゴニストとして用いられる薬物にとっては特に重要である。したがって、ＩＬ−８以外のケモカイン（特にケモカインアンタゴニスト）のＮ末端残基にＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーを結合することは、Ｎ末端残基の感受性ならびに活性および効力に対するその寄与を考えた場合には、好適であるとは考えられない。国際特許出願公開ＷＯ００／５３２２３は、報告によれば、新規なケモカインを開示している点で多数のケモカイン文献の多くを網羅しており、またアンタゴニストを生成することができること、そしてＰＥＧまたは他の水溶性ポリマーを結合させることができることを報告しているが、鎖をどこに結合すべきであるかに関して、もしくはどのようなタイプの鎖を結合すべきであるかに関して何らの特異性、またはそれに伴う何らの活性をも報告していない。
【００１２】
野生型のケモカインを治療剤として使用する際の別の潜在的な不都合は、高濃度で凝集しやすい傾向、ならびにケモカイン受容体の非選択的な結合および差のある活性化を持っていることである（Ｍｕｒｐｈｙ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．（２０００）５１（１）：１４５〜１７６；Ｒｏｌｌｉｎｓ，ＢＪ．、Ｂｌｏｏｄ（１９９７）９０（３）：９０９〜９２８；およびＷｅｌｌｓ他、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．（１９９９）４８：３５３〜３６２）。凝集は処方に対して問題になり得るし、場合によっては病状を悪化させ得る（Ｃｚａｐｌｅｗｓｋｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４（２３）：１６０７７〜１６０８４；Ｃｚａｐｌｅｗｓｋｉ他、「ｈＭＩＰ−１αの操作、生物学および臨床的開発」（１９９９）、Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｃ．Ａ．Ｈｅｒｂｅｒｔ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｔｗａ、ＮＪ）；Ｔｒｋｏｌａ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）７３（８）６３７０〜６３７９；Ａｐｐａｙ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４（３９）２７５０５〜２７５１２；Ｈｕｎｔｅｒ他、Ｂｌｏｏｄ（１９９５）８６（１２）：４４００〜４４０８；Ｌｏｒｄ他、Ｂｌｏｏｄ（１９９５）８５（１２）：３４１２〜３４１５；Ｌｏｒｄ他、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９６）７４：１０１７〜１０２２）。非選択的な結合はケモカインの特徴であり、いくつかの治療的状況ではあまり望ましいことではないと考えられる。それにも関わらず、ケモカインは治療剤として重要な有望性を保っている（Ｍｕｒｐｈｙ他、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖ．（２０００）５１（１）：１４５〜１７６；Ｒｏｌｌｉｎｓ，ＢＪ．、Ｂｌｏｏｄ（１９９７）９０（３）：９０９〜９２８；およびＷｅｌｌｓ他、Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．（１９９９）４８：３５３〜３６２）。
【００１３】
そのような取組みにより、いくつかの場合にはアンタゴニストに関連した効力が改善されてきたが、ケモカインアンタゴニストを製造する際の課題の１つは、薬物動態学などの他の薬物特性を改善しながら効力を増大させることである。また、ケモカインの強力な阻害剤およびその対応するケモカイン阻害剤化合物を製造するための一般的な方策および方法、ならびに疾患の予防および／または処置において使用される医薬品の調製にそれらの使用を見出すことが望まれている。
【００１４】
したがって、改善された循環半減期ならびに所望する活性および効力を含む改善された治療的特性を有する新規なケモカインおよび修飾されたケモカイン、特に、天然に存在するケモカインの活性を阻害またはその活性に拮抗するように機能し得る新規なケモカインおよび修飾されたケモカインが求められている。改善された循環半減期ならびに変化した受容体活性および効力を有するケモカインおよび修飾されたケモカインを提供することもまた求められている。
【００１５】
（発明の概要）
本発明は、ポリマー修飾された生物活性な合成ケモカイン、特に、Ｎ末端および／またはＣ末端が修飾されたケモカイン、ならびにそれらの製造方法および使用方法に関する。本発明のＮ末端修飾された生物活性な合成ケモカインは、脂肪族鎖および１つまたは複数のアミノ酸誘導体によってそのＮ末端が修飾されているケモカインポリペプチド鎖を含む。本発明のＣ末端修飾された生物活性な合成ケモカインは、脂肪族鎖または多環によってそのＣ末端が修飾されているケモカインポリペプチド鎖を含む。本発明のＮ末端修飾およびＣ末端修飾された生物活性な合成ケモカインは、また、Ｎ末端およびＣ末端の両方における修飾を組合せで含むことができる。本発明の生物活性な合成ケモカインの製造方法および使用方法もまた提供される。本発明は、対応する天然に存在する野生型ケモカインまたはその受容体の強力なアンタゴニストである化合物を生成するための一般的な方策を提供するという点で重要である。
【００１６】
（好適な実施形態の説明）
本発明は、生物活性な合成ケモカインに関し、特に、Ｎ末端および／またはＣ末端が修飾されたケモカイン分子に関する。本発明の新規な生物活性な合成ケモカインは、適切なケモカイン・バイオアッセイによって測定されたとき、天然に存在するケモカインの活性を好ましくは阻害する。そのような分子は、それらが結合するケモカイン受容体の性質の１つまたは複数に拮抗することによって作用することができ（例えば、ウイルス感染を阻害し、受容体のダウンモジュレーションを生じさせ、受容体の内在化を生じさせ）、それにより、細胞表面に再生利用される受容体の正常な循環に「拮抗」することができる。他の生物学的応答に関連して、そのような分子は受容体のアゴニストとして作用することができ、例えば、カルシウム流動の誘導、走化性の開始などを行わせることができる。したがって、本発明の生物活性な合成ケモカインはアンタゴニスト（部分的な拮抗作用を含む）として作用することができるが、場合によりアゴニスト（部分的なアゴニストを含む）として、または両者の混合体としても作用することができる。少なくとも１つのアンタゴニスト特性、すなわち、それらが結合するケモカイン受容体の１つまたは複数の生物学的性質に拮抗する能力（例えば、（１）ウイルス感染、（２）走化性、（３）受容体循環などを阻止するか、または部分的に阻止する能力）を示す分子が好ましい。そのような分子は、ケモカインの受容体を活性化するのではなく、ケモカインの受容体に結合（または関与）することによって作用することができ、または他の手段によってその作用を媒介することができる。
【００１７】
Ａ．Ｎ末端およびＣ末端が修飾された本発明の生物活性な合成ケモカイン
本発明は特に、対応する天然に存在するケモカインの活性を阻害する生物活性な合成されたケモカインに関する。好ましくは、そのような分子はＮ末端修飾および／またはＣ末端修飾を有する。本発明のＮ末端修飾された生物活性な合成ケモカインは、脂肪族鎖および１つまたは複数のアミノ酸誘導体によってそのＮ末端が修飾されているケモカインポリペプチド鎖を含む。本発明のＮ末端修飾された生物活性な合成ケモカインは、Ｎ末端からＣ末端の方向で読んだとき、下記の式を有する：Ｊ１−Ｘ１−Ｚ１−ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ（式中、Ｊ１は脂肪族鎖であり、Ｘ１は、ケモカインポリペプチド鎖のＮ末端アミノ酸配列の０個または１個以上のアミノ酸を含むスペーサーであり、Ｚ１はアミノ酸誘導体であり、ＣＨＥＭＯＫＩＮＥはケモカインポリペプチド鎖の残りのアミノ酸配列であり、ダッシュ（「−」）は共有結合による結合を表す）。このような化合物は、ポリペプチド鎖のＮ末端領域の全長を考慮して設計される。したがって、疎水性の脂肪族鎖の長さおよびアミノ酸誘導体の位置に依存して、Ｎ末端アンタゴニストは、対応する天然に存在するケモカインポリペプチド鎖に対して、１つまたは複数の置換、挿入または欠失をＮ末端において含むことができる。
【００１８】
本発明のＣ末端修飾された生物活性な合成ケモカインは、脂肪族鎖または多環によってそのＣ末端が修飾されているケモカインポリペプチド鎖を含む。このような化合物は、Ｎ末端からＣ末端の方向で読んだとき、下記の式を有する：ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ−Ｘ２−Ｊ２（式中、Ｘ２は、ケモカインポリペプチド鎖のＣ末端アミノ酸配列の０個または１個以上のアミノ酸を含むスペーサーであり、Ｊ２は脂肪族鎖または多環であり、ＣＨＥＭＯＫＩＮＥはケモカインポリペプチド鎖の残りのアミノ酸配列であり、ダッシュ（「−」）は共有結合による結合を表す）。ケモカインのＣ末端領域は実質的な修飾を容易に行うことができ、このような修飾には、挿入、欠失、または対応する野生型分子と比較して、ポリペプチド鎖のＣ末端端部を延長するための１個以上のアミノ酸または他の化学的部分の付加、ならびに蛍光標識および生体適合性ポリマーの付加、そして小さい有機分子、ペプチド、タンパク質などの他の化合物との結合が含まれる。
【００１９】
本発明のＮ末端修飾およびＣ末端修飾された生物活性な合成ケモカインはＮ末端領域およびＣ末端領域の両方において修飾を含むことができ、特に参照されるときに、Ｎ末端／Ｃ末端が修飾された生物活性な合成ケモカインと呼ばれる。このような化合物は下記の式を有する：Ｊ１−Ｘ１−Ｚ１−ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ−Ｘ２−Ｊ２（式中、Ｊ１、Ｘ１、Ｚ１、ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ、Ｘ２、Ｊ２および「−」は上記に記載される通りである）。このような化合物は、所与の最終的な使用に依存して相乗的な様式でＮ末端修飾およびＣ末端修飾の利点を併せ持つ。
【００２０】
「ケモカインポリペプチド鎖」により、天然に存在する野生型ケモカインのポリペプチド鎖に対して実質的に相同的であるポリペプチド鎖が意図される。「Ｎ末端アミノ酸配列」により、天然に存在するケモカインポリペプチド鎖の最初のジスルフィド形成システインに隣接してＮ末端側にあるケモカインポリペプチド鎖のアミノ酸配列が意図される。「Ｃ末端アミノ酸配列」により、天然に存在するケモカインポリペプチド鎖の最後のジスルフィド形成システインに隣接してＣ末端側にあるケモカインポリペプチド鎖のアミノ酸配列が意図される。ケモカインポリペプチド鎖、Ｎ末端アミノ酸配列、Ｃ末端アミノ酸配列、ならびに本発明の生物活性な合成ケモカインの基礎を形成する最初および最後のジスルフィド形成システインは、天然に存在するケモカインの対応するアミノ酸配列から容易に推定することができ、そして同様に、知られているＣケモカイン、ＣＣケモカイン、ＣＸＣケモカインおよびＣＸＸＸＣケモカインのアミノ酸配列と比較することなどの、同じクラスの他のケモカインとの相同性モデリングによっても容易に推定することができる。
【００２１】
例えば、下記は、知られている天然に存在するケモカインの例であり、その多くは異なる名称で記載され、したがって数回現れる：６Ｃｋｉｎｅ、９Ｅ３、ＡＴＡＣ、ＡＢＣＤ−１、ＡＣＴ−２、ＡＬＰ、ＡＭＡＣ−１、ＡＭＣＦ−１、ＡＭＣＦ−２、ＡＩＦ、ＡＮＡＰ、Ａｎｇｉｅ、β−Ｒ１、β−トロンボグロブリン、ＢＣＡ−１、ＢＬＣ、ｂｌｒ−１リガンド、ＢＲＡＫ、Ｃ１０、ＣＣＦ１８、Ｃｋ−β−６、Ｃｋ−β−８、Ｃｋ−β−８−１、Ｃｋ−β−１０、Ｃｋ−β−１１、ｃＣＡＦ、ＣＥＦ−４、ＣＩＮＣ、Ｃ７、ＣＫＡ−３、ＣＲＧ−２、ＣＲＧ−１０、ＣＴＡＰ−３、ＤＣ−ＣＫ１、ＥＬＣ、エオタキシン、エオタキシン−２、エキソダス−１、エキソダス−２、ＥＣＩＰ−１、ＥＮＡ−７８、ＥＤＮＡＰ、ＥＮＡＰ、ＦＩＣ、ＦＤＮＣＦ、ＦＩＮＡＰ、フラクタルカイン、Ｇ２６、ＧＤＣＦ、ＧＯＳ−１９−１、ＧＯＳ−１９−２、ＧＯＳ−１９−３、ＧＣＦ、ＧＣＰ−２、ＧＣＰ−２様、ＧＲＯ１、ＧＲＯ２、ＧＲＯ３、ＧＲＯ−α、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、Ｈ４００、ＨＣ−１１、ＨＣ−１４、ＨＣ−２１、ＨＣＣ−１、ＨＣＣ−２、ＨＣＣ−３、ＨＣＣ−４  Ｈ１７４、ヘパリン中和タンパク質、Ｈｕｍｉｇ、Ｉ−３０９、ＩＬＩＮＣＫ、Ｉ−ＴＡＣ、Ｉｆｉ１０、ＩＬ８、ＩＰ−９、ＩＰ−１０、ＩＲＨ、ＪＥ、ＫＣ、リンホタクチン、Ｌ２Ｇ２５Ｂ、ＬＡＧ−１、ＬＡＲＣ、ＬＣＣ−１、ＬＤ７８−α、ＬＤ７８−β、ＬＤ７８−γ、ＬＤＣＦ、ＬＥＣ、Ｌｋｎ−１、ＬＭＣ、ＬＡＩ、ＬＣＦ、ＬＡ−ＰＦ４、ＬＤＧＦ、ＬＤＮＡＰ、ＬＩＦ、ＬＩＸ、ＬＵＣＴ、ランカイン、ＬＹＮＡＰ、マンチェスター阻害剤、ＭＡＲＣ、ＭＣＡＦ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＣＰ−５、ＭＤＣ、ＭＩＰ−１−α、ＭＩＰ−１−β、ＭＩＰ−１−δ、ＭＩＰ−１−γ、ＭＩＰ−３、ＭＩＰ−３−α、ＭＩＰ−３−β、ＭＩＰ−４、ＭＩＰ−５、モノタクチン−１、ＭＰＩＦ−１、ＭＰＩＦ−２、ＭＲＰ−１、ＭＲＰ−２、Ｍ１１９、ＭＤＮＡＰ、ＭＤＮＣＦ、巨核球刺激因子、ＭＧＳＡ、Ｍｉｇ、ＭＩＰ−２、ｍｏｂ−１、ＭＯＣ、ＭＯＮＡＰ、ＮＣ２８、ＮＣＣ−１、ＮＣＣ−２、ＮＣＣ−３、ＮＣＣ−４  Ｎ５１、ＮＡＦ、ＮＡＰ−１、ＮＡＰ−２、ＮＡＰ−３、ＮＡＰ−４、ＮＡＰ  Ｓ、ＮＣＦ、ＮＣＰ、ニューロタクチン、オンコスタチンＡ、Ｐ１６、Ｐ５００、ＰＡＲＣ、ｐＡＴ４６４、ｐＡＴ７４４、ＰＢＰ、ＰＢＰ様、ＰＢＳＦ、ＰＦ４、ＰＦ４様、ＰＦ４−ＡＬＴ、ＰＦ４Ｖ１、ＰＬＦ、ＰＰＢＰ、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＣＭ−１−α、ＳＣＩ、ＳＣＹ  Ａ２６、ＳＬＣ、ＳＭＣ−ＣＦ、ＳＴ３８、ＳＴＣＰ−１、ＳＤＦ−１−α、ＳＤＦ−１−β、ＴＡＲＣ、ＴＣＡ−３、ＴＣＡ−４、ＴＤＣＦ、ＴＥＣＫ、ＴＳＧ−８、ＴＹ５、ＴＣＦ、ＴＬＳＦ−α、ＴＬＳＦ−β、ＴＰＡＲ−１、ＴＳＧ−１。
【００２２】
限定としてではなく例示として、上記に列記された野生型ケモカインポリペプチド鎖ならびにそれらの対応するＮ末端アミノ酸配列およびＮループアミノ酸配列およびＣ末端アミノ酸配列のいくつかの例が図１０Ａ〜図１０Ｄに示される。理解され得るように、さらなるケモカインポリペプチド鎖が知られており、それらは、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ大学、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ国立研究所＆Ｒｕｔｇｅｒｓ大学、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、米国）、Ｅｎｔｒｅｚ（国立衛生研究所、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）、ＮＲＬ  ３Ｄ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ  Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃａｒｎｅｇｉｅ  Ｍｅｌｌｏｎ大学、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、米国）、ＣＡＴＨ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｌｏｎｄｏｎ、Ｌｏｎｄｏｎ、英国）、ＮＩＨ  Ｇｏｐｈｅｒ  Ｓｅｒｖｅｒ（ＮＩＨ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）、ＰｒｏＬｉｎｋ（Ｂｏｓｔｏｎ大学、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、米国）、Ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ（Ｒｕｔｇｅｒｓ大学、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、米国）、Ｇｅｎｅｂａｎｋ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）、Ｅｘｐａｓｙ（Ｓｗｉｓｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｇｅｎｅｖａ、スイス）などの公開されているデータベースを含む多くの種々の提供元から得ることができる。また、新しいケモカイン、例えば、様々な遺伝子配列決定プログラムおよびタンパク質配列決定プログラムから得られるケモカインを、データベースおよびこの目的を達成するための関連ツールを含むこの分野で知られている標準的な技術に従った相同性マッチングおよびパターン・マッチングによって同定することができる。
【００２３】
本発明の１つの実施形態において、ファージ・ディスプレイおよびモジュラー・シャフリングなどの制御された進歩した技法を使用して、受容体特異性を増大させたケモカインを生成することができる。ファージ・ディスプレイを使用してケモカイン受容体と結合する能力についてケモカインの誘導体または類似物を試験することが、ＨＩＶの処置および防止において記載されている（米国特許第６，２１４，５４０号；ＤｅＶｉｃｏ他）。ファージ・ディスプレイ技術はまた、ＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）に対する受容体タンパク質のリガンド、阻害剤または促進因子を検出または同定するために使用されている（米国特許第６，１４０，０６４号、Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ他）。これらの受容体は、細胞応答を誘導する能力を有する１つまたは複数のケモカインが選択的に結合することを特徴とする（米国特許第６，１８４，３５８号、Ｌｏｅｔｓｃｈｅｒ他）。ファージ・ディスプレイの使用は、分子の標識および選択（米国特許第６，１８０，３３６号、Ｏｓｂｏｕｒｎ他）において、特定の抗原に結合する分子の標識付けおよびその後の精製（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９２／０１０４７を参照のこと）において、そしてＨＩＶ感染および免疫障害を防止および処置するためのペプチド組成物の決定（米国特許第６，０９０，３８８号、Ｗａｎｇ）において記載されている。
【００２４】
Ｇタンパク質を結合した受容体を伴うファージ・ディスプレイ法もまた記載されている（例えば、Ｄｏｏｒｂａｒ，Ｊ．他、「ファージ・ディスプレイを使用するトロンビン受容体に対するペプチドアンタゴニストの単離」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４４：３６１〜９（１９９４）を参照のこと）。これは、Ｎループ領域における制御された進化に対する好ましい領域（Ｋｏｎｉｇｓ，Ｃ．、「ファージ・ディスプレイによるランダムペプチドライブラリーの２モノクローナル抗体スクリーニングによりケモカイン受容体ＣＣＲ５のミモトープが解明される：ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０に対する受容体の三次構造およびＨＩＶ−１  ｇｐ１２０に対するＮ末端結合部位の関係」、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００（４月）：３０（４）：１１６２〜７１；Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．他、「機能的選択のためのファージにおける大きいタンパク質の高コピーディスプレイ」、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２０００（２月１８日）：２９６（２）：４８７〜９５；Ｆｉｅｌｄｉｎｇ，Ａ．Ｋ．他、「過融合性のテナガザル白血病エンベロープ糖タンパク質：リガンドディスプレイによる細胞傷害性遺伝子の標的化」、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２０００（４月１０日）：１１（６）：８１７〜２６）、ＮループとＣ末端との間の領域、およびＣ末端（Ｃａｉｎ，Ｓ．Ａ．他、「分子全体のランダム変異化Ｃ５ａライブラリーからの新規なリガンドの選択」、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ、２００１（３月）：１４（３）：１８９〜９３；Ｈｅｌｌｅｒ，Ｔ．他、「免疫複合疾患および虚血／再潅流傷害における炎症性応答を弱めるＣ５ａ受容体アンタゴニストのファージライブラリーからの選択」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９（７月１５日）：１６３（２）：９８５〜９４；Ｃｈａｎｇ，Ｃ．他、「コンビナトリアルペプチドライブラリーを使用するＬＸＸＬＬ核受容体−活性化補助因子相互作用モチーフの分析：エストロゲン受容体αおよびβのペプチドアンタゴニストの発見」、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、１９９９（１２月）；１９（１２）：８２２６〜３９）を伴っている。
【００２５】
Ｊ１およびＪ２の好適な疎水性の脂肪族鎖には、長さが５炭素（Ｃ５）〜２２炭素（Ｃ２２）である疎水性の脂肪族鎖が含まれるが、これに限定されない。鎖は不飽和および／または非分枝状であってもよく、あるいは様々な程度の飽和度および／または分岐度を有してもよい。疎水性の脂肪族鎖は一般式Ｃｎ（Ｒｍ）−を有し、この式において、Ｃｎは炭素の数であり、Ｒｍは、水素、アルキル、アシル、芳香族またはそれらの組合せから選択される置換基の数であり、ｎおよびｍは同じまたは異なっていてよい。Ｊ１基およびＪ２基は、任意の好適な共有結合した連結を介して、Ｘ１、Ｘ２またはケモカインポリペプチド鎖に結合する。好適な共有結合した連結の例には、アミド、ケトン、アルデヒド、エステル、エーテル、チオエーテル、チオエステル、チオゾリジン、オキシム、オキシゾリジン、シッフ塩基およびシッフ塩基型連結（例えば、ヒドラジド）が含まれるが、これらに限定されない。限定されないが、そのような連結には下記が含まれ得る：
−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＮＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−ＯＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＮＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−ＯＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−ＮＨ−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＯＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ−（Ｏ）−（ＣＨ２）ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−ＣＨ＝ＣＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＣＨ＝ＣＨ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−ＳＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−ＮＨ−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＳＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；
−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｃ−（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−ＮＨ−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｓ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［（ＣＨ２）ｘ−ＮＨ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）ｘ］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ３Ｈ６ＯＮ−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）−［ＮＨ−（ＣＨ２）］ｙ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−；−Ｃ（Ｏ）−
または共有結合（式中、ｘおよびｙは２、３、４またはそれ以上であり、そして同じまたは異なっていてよい）。
【００２６】
連結システムのために好適な様々な化学反応がよく知られており、これらはこの目的のために利用することができる（例えば、“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ”、Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９３）；Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｃｌａｕｄｅ  Ｆ．Ｍｏｄｒｅｓ編、ＡＣＳ（１９９３）を参照のこと）。
【００２７】
Ｊ１およびＪ２をＸ１、Ｘ２またはケモカインポリペプチド鎖に結合させることに加えて、用いられる連結システムは、得られる分子がそのアンタゴニスト特性を保持しているならば、標的分子の物理化学的性質および／または生物学的性質を調節するために選択することができる。これは、例えば、半減期などを調節するために、あるいは様々な長さ、剛性、荷電および／またはキラリティの連結システムを利用することにより効力および特異性などを調節するために、別の連結システムと比較して、あるタイプの条件のもとでの安定性がより大きい（または、より小さい）連結システムを取り込むことによって達成することができる。炭化水素鎖をケモカインポリペプチド鎖に結合する連結ユニットは、Ｊ１および／またはＪ２の全体的な長さおよび空間充填が、最も好ましくは、天然に存在するケモカインの全体的な長さおよび空間充填に近づくならば、実質的に変化させることができる。
【００２８】
好ましい実施形態において、疎水性の脂肪族鎖Ｊ１は、長さが５炭素（Ｃ５）から１０炭素（Ｃ１０）の炭化水素鎖であり、疎水性の脂肪族鎖Ｊ２は、長さが１２炭素（Ｃ１２）から２０炭素（Ｃ２０）の脂質である。Ｊ１のＣ５〜Ｃ１０炭化水素鎖の例には、下記が含まれるが、それらに限定されない：
−Ｃ５Ｈ１１，−Ｃ５Ｈ９，−Ｃ５Ｈ７，−Ｃ５Ｈ５，−Ｃ５Ｈ３，−Ｃ６Ｈ１３，−Ｃ６Ｈ１１，−Ｃ６Ｈ９，−Ｃ６Ｈ７，−Ｃ６Ｈ５，−Ｃ６Ｈ３，−Ｃ７Ｈ１５，−Ｃ７Ｈ１３，−Ｃ７Ｈ１１，−Ｃ７Ｈ９，−Ｃ７Ｈ７，−Ｃ７Ｈ５，−Ｃ７Ｈ３，−Ｃ８Ｈ１７，−Ｃ８Ｈ１５，−Ｃ８Ｈ１３，−Ｃ８Ｈ１１，−Ｃ８Ｈ９，−Ｃ８Ｈ７，−Ｃ８Ｈ５，−Ｃ８Ｈ３，−Ｃ９Ｈ１９，Ｃ９Ｈ１７，−Ｃ９Ｈ１５，−Ｃ９Ｈ１３，−Ｃ９Ｈ１１，−Ｃ９Ｈ９，−Ｃ９Ｈ７，−Ｃ９Ｈ５，−Ｃ９Ｈ３，−Ｃ１０Ｈ２１，−Ｃ１０Ｈ１９，Ｃ１０Ｈ１７，−Ｃ１０Ｈ１５，−Ｃ１０Ｈ１３，−Ｃ１０Ｈ１１，−Ｃ１０Ｈ９，−Ｃ１０Ｈ７，−Ｃ１０Ｈ５，および−Ｃ１０Ｈ３．
【００２９】
好適なＪ２脂質には、脂肪酸に由来する脂質および多環ステロイドに由来する脂質が含まれるが、これらに限定されない。脂肪酸には、飽和脂肪酸および不飽和脂肪酸が含まれるが、これらに限定されない。飽和脂肪酸の例には、ラウリン酸（Ｃ１２）、ミリスチン酸（Ｃ１４）、パルミチン酸（Ｃ１６）、ステアリン酸（Ｃ１８）およびアラキジン酸（Ｃ２０）が挙げられる。不飽和脂肪酸の例には、オレイン酸（Ｃ１８）、リノレイン酸（Ｃ１８）、リノレン酸（Ｃ１８）、エレオステリン酸（Ｃ１８）およびアラキドン酸（Ｃ２０）が挙げられる。多環には、アルドステロン、コレスタノール、コレステロール、コール酸、コプロスタノール、コルチコステロン、コルチゾン、デヒドロコレステロール、デスモステロール、ジギトゲニン、エルゴステロール、エストラジオール、ヒドロキシコルチコステロン、ラソステロール、プレドニゾン、プレグネノロン、プロゲステロン、テストステロン、チモステロールなどが含まれるが、これらに限定されない。脂肪酸は、通常、酸成分を介してケモカインポリペプチド鎖に結合し、それにより、アシル結合した成分をもたらすが、他の連結を用いることができる。炭化水素鎖をケモカインポリペプチド鎖に結合する連結ユニットは、Ｎ末端領域の全体的な長さおよび空間充填が、天然に存在するケモカインの全体的な長さおよび空間充填に近づくならば、実質的に変化させることができる。Ｃ末端領域は、この点に関してより柔軟であることが見出されているので、全体的な長さおよび空間充填を、Ｎ末端領域の場合よりも大きく変化させることができる。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、Ｊ１成分およびＪ２成分は、本発明の生物活性な合成ケモカインに含まれるとき、ノナノイル、ノネノイル、アミノオキシペンタン、ドデカノイル、ミリストイル、パルミテート、ラウリル、パルミトイル、エイコサノイル、オレオイルまたはコリルなどのＣ５〜Ｃ２０の飽和アシル鎖または不飽和アシル鎖を含む。例えば、Ｊ１置換基はノナノイルまたはアミノオキシペンタンであることができ、Ｊ２置換基は飽和脂肪酸もしくは不飽和脂肪酸（好ましくはＣ１２〜Ｃ２０脂肪酸）または多環ステロイド脂質（コレステロールなど）であることができる。
【００３１】
疎水性の脂肪族鎖の性質および長さに依存して、本発明の生物活性な合成ケモカインは、疎水性の脂肪族成分に対するスペーサー基および／または離れた結合部位を提供するために、特にＣ末端端部においてポリペプチド鎖に付加されるさらなるアミノ酸または他の成分を含むことができる。
【００３２】
「アミノ酸誘導体」により、遺伝子によってコードされる２０個の天然に存在するアミノ酸とは異なるアミノ酸またはアミノ酸様の化学的実在物が意図される。具体的には、アミノ酸誘導体Ｚ１は、遺伝子によってコードされる２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれでもなく、式−（Ｎ−ＣｎＲ−ＣＯ）−を有する（式中、Ｃｎは１炭素〜２２炭素であり、Ｒは、水素、アルキルまたは芳香族であり、ＮおよびＣｎ、ＮおよびＲ、またはＣｎおよびＲは環状構造を形成することができる）。また、Ｎ、ＣｎおよびＲはそれぞれ、アミノ酸誘導体に依存するその還元型形態において１個以上の水素を有することができる。上記のアルキル成分は置換体または非置換体であり得るし、直鎖状または分枝状または環状であり得るし、１個以上のヘテロ原子を含んでもよい。上記の芳香族は置換または非置換であり得るし、１個以上のヘテロ原子を含むことができる。上記のアミノ酸誘導体は新たに生成することができ、または市販元から得ることができる（例えば、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ＡＧ（スイス）；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ（Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ、ＫＹ、米国）；Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｗｉｎｄｈａｍ、ＮＨ、米国）；Ｂａｃｈｅｍ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．（Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ、米国）；Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ、米国）を参照のこと）。アミノ酸誘導体の例には、アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−ＣＯＯＨ（Ｔｉｃ）、インドリン−２−カルボン酸（ｉｎｄｏｌ）、４−ジフルオロプロリン（Ｐ（４，４ＤｉＦ））、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸（Ｔｈｚ）、Ｌ−ホモプロリン（ＨｏＰ）、３，４−デヒドロプロリン（ΔＰｒｏ）、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｆ（３，４−ＤｉＯＨ））、ｐＢｚｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｆ（３，４−ＤｉＯＨ，ｐＢｚｌ））、ベンゾフェノン（ｐ−Ｂｚ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、３−（２−ナフチル）アラニン（βＮａｌ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）およびフェニルグリシン（Ｐｈｇ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
Ｘ１、ＣＨＥＭＯＫＩＮＥおよびＸ２に関して、これらの成分のアミノ酸配列は、対応する天然に存在する野生型分子と実質的に相同的である。用語「実質的に相同的」は、本明細書中で使用される場合、所与の配列との配列相同性が少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％であるアミノ酸配列を包含する（９５％〜９９％が好ましい）。この用語は、得られるポリペプチドが、対応する天然に存在するケモカインのアンタゴニストとして作用するならば、所与の配列に対して１個〜２０個、１個〜１０個または１個〜５個の単一アミノ酸の欠失、挿入または置換を有するアミノ酸配列を包含し得るが、これに限定されない。
【００３４】
例えば、いくつかのアミノ酸は、ポリペプチドの性質の実質的な変化を生じさせない他のアミノ酸で置換できることがこの分野では十分に知られている。これには、アミノ酸の保存的置換が含まれるが、これに限定されない。そのような可能性は本発明の範囲内である。ポリペプチドの性質を実質的に変化させないアミノ酸の欠失または挿入が多くの場合には行われることにもまた留意しなければならない。本発明は、（例えば、長さが、対応する天然に存在するケモカインの特異的なアンタゴニストの配列の１０％までであり得るか、または２０％までであり得るか、または５０％までであり得る）そのような欠失体または挿入体を含む。さらに、ケモカインは、さらなる多様性を作り出すために異なるケモカインポリペプチドセグメントを混合し、組み合わせることを含む実質的な修飾に供することができ、例えば、国際特許出願公開ＷＯ９９／１１６５５（その参照はその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されるモジュラー「クロスオーバー」合成法などに供することができる。
【００３５】
Ｎ末端および／またはＣ末端における変化に加えて、本発明の生物活性な合成ケモカインはまた、ポリペプチド鎖内のどこかに、すなわち、上記の式においてＣＨＥＭＯＫＩＮＥによって表されるポリペプチド鎖内のどこかに、１つまたは複数のアミノ酸置換、アミノ酸挿入またはアミノ酸欠失を含むことができる。好ましい実施形態において、変化を、標的受容体に対するその特異性／選択性を増大させるためにケモカインのＮループにおいて行うことができる。このようにして、本発明の生物活性な合成ケモカインのＮループは、特異的な受容体を阻止することができ、同時に、他の受容体に対するその可能な共受容体のアンタゴニスト効果を最小限に抑えることができる。「Ｎループ」により、所与のケモカインポリペプチド鎖のＮ末端領域を規定する最初の保存されたシステイン・パターンに対する隣接／Ｃ末端側の２０〜２６アミノ酸の配列領域が意図される（図９および図１０Ａ〜図１０Ｄを参照のこと）。例えば、ケモカインポリペプチド鎖のＮ末端からＣ末端への方向で読んだとき、ＣＣケモカインのＮループは、第１および第２の保存されたシステインアミノ酸に対する隣接／Ｃ末端側と、第３の保存されたシステインアミノ酸に対する隣接／Ｎ末端側との間に位置するアミノ酸の領域である。
【００３６】
別の実施形態において、置換体および挿入体は、天然アミノ酸、ならびにアミノ酸誘導体、またはポリマーで修飾されたアミノ酸を含むことができる。ポリマー結合のための好ましい位置はケモカインのＣ末端部分である。天然のグリコシル化部位を有するケモカインの場合、ポリマーを、グリコシル化のためにコードされているアミノ酸（例えば、Ｎ−結合型グリコシル化部位のアルギニン）の１つまたは複数に結合させることができる。ポリマーの結合は、天然に存在するアミノ酸や天然に存在するアミノ酸の代わりに使用されているアミノ酸誘導体の側鎖に対して、または標的グリコシル化位置におけるアミノ酸の側鎖に結合している炭水化物もしくは他の成分に対して行うことができる。これらの目的のために好適なポリマーは生体適合性であり、すなわち、そのようなポリマーは生物学的系に対して非毒性であり、多くのそのようなポリマーが知られている。そのようなポリマーは、本質的には疎水性もしくは親水性であり、生分解性、非生分解性またはそれらの組合せであり得る。これらのポリマーには、コラーゲン、ゼラチン、セルロース、ヒアルロン酸、多糖類およびポリアミノ酸などの天然ポリマー、ならびにポリエステル、ポリオルトエステル、ポリ無水物などの合成ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。疎水性の非分解性ポリマーの例には、ポリジメチルシロキサン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニルおよびポリメタクリル酸メチルが含まれる。親水性の非分解性ポリマーの例には、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリビニルアルコール、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアルキレン、ポリアクリルアミド、およびそれらのコポリマーが含まれる。好ましいポリマーは、連続した繰り返しユニットとして、式−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎ−（式中、ｎ＝エチレンオキシドユニットの数）のエチレンオキシドを含む。好ましいエチレンオキシド含有ポリマーの例には、例えば、下記および国際特許出願公開ＷＯ００／１２５８７にそれぞれ記載されるようなポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）およびポリアミドエチレンオキシドがある。
【００３７】
例えば、ＰＥＧ型鎖は、両親媒性で、非免疫原性であり、そしてタンパク質分解酵素による切断を受けない。ＰＥＧまたはＰＥＧ型鎖によって修飾されている物質の調製物は、免疫原性および抗原性が低下している。例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９７７）２５２（１１）：３５７８〜３５８１；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ他、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９４）８５：９〜１２；Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＡＣＳシンポジウムシリーズ６８０、Ｊ．Ｍ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ編、アメリカ化学会、１９９７；およびＰｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９２を参照のこと。ＰＥＧはまた、ＰＥＧが結合している物質の分子サイズを増大させ、それにより、その生物学的半減期を増大させるために役立つ。ＰＥＧで修飾された物質のこれらの有益な性質により、ＰＥＧで修飾された物質は様々な治療的適用において非常に有用になる。したがって、本発明はまた、タンパク質にその固有の生物学的活性を保持させていると考えられる部位においてポリペプチドを修飾または「ＰＥＧ化」することによって本発明のポリペプチドの薬物動態学を改善することを包含する。そのような部位には、ポリペプチドのＣ末端が含まれるが、これに限定されない。ＰＥＧ鎖またはＰＥＧ型鎖をタンパク質にグラフト結合させることは知られている。例えば、Ｚａｌｉｐｓｋｙの米国特許第５，１２２，６１４号を参照のこと。これには、ＰＥＧがそのＮ−スクシンイミドカーボネート誘導体に変換されることが記載されている。タンパク質に対するグラフトを容易にするための反応性基で修飾されたＰＥＧ鎖もまた知られている。例えば、Ｈａｒｒｉｓの米国特許第５，７３９，２０８号（これは、分子上および表面上のチオール成分に選択的に結合するスルホン成分で活性化されているＰＥＧ誘導体を記載する）、そしてＨａｒｒｉｓ他の米国特許第５，６７２，６６２号（これは、１つのプロピオン酸成分または酪酸成分を有するＰＥＧ酸の活性エステルを開示する）を参照のこと。この分野は、Ｚａｌｉｐｓｋｙ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９５）６：１５０〜１６５に広範囲に概説されている。ＰＥＧの使用に加えて、Ｗｒｉｇｈｔの欧州特許ＥＰ０６０５９６３Ａ２には、タンパク質上のアルデヒド基とのヒドラゾン連結を形成する水溶性ポリマーを含有する連結試薬が記載される。上記の参考文献はすべて参考として本明細書中に組み込まれる。
【００３８】
Ｂ．本発明の生物活性な合成ケモカインのポリマー修飾
本発明はさらに、ポリマー付加化合物によって修飾されている生物活性な合成ケモカインに関し、そしてその製造方法および使用方法に関する。本発明は特に、そのＮ末端領域の１つまたは複数の残基における変化を有するそのような合成ケモカインに関する。そのような変化を有する修飾されたケモカインは、典型的には、その対応する受容体の強力なアンタゴニストである。一般に、今日までに見出されている最も強力な変化は本質的には疎水性であり、例えば、それぞれの主要なカテゴリーのケモカインのＮ末端に対するメチオニン−（Ｍｅｔ−）修飾、アミノオキシペンタン−（ＡＯＰ−）修飾およびノナノイル−（ＮＮＹ−）修飾である：効力のさらなる増大を、Ｎ末端領域内の野生型アミノ酸をアミノ酸または疎水性誘導体で置換することによって行うことができる（例えば、Ｒａｎｔｅｓ、ＭＣＰおよびＭＩＰなどのＣＣケモカイン、ならびにＳＤＦ１およびＩＬ−８などのＣＸＣケモカイン）（米国特許出願第６０／２１７，６８３号を参照のこと、これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。さらに、ケモカインのＣ末端領域に対する疎水性の修飾を導入することにより、効力がなおさらに増大する。このことは、Ｎ末端領域およびＣ末端領域の両方の疎水性が効力に影響を及ぼすという考えを裏付けている（米国特許出願第６０／２１７，６８３号を参照のこと）。したがって、所与のケモカインのＮ末端およびＣ末端の疎水性を増大させることによってダウンモジュレーションが増強され得るとすれば、水溶性ポリマーの結合は、通常、そのようなケモカインの所望するアンタゴニスト活性、特に、ポリマー修飾されたケモカインが結合する対応する受容体のダウンモジュレーションを著しく低下させるか、破壊さえすることが予想される。Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｓ．（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９５）６：１５０〜１６５）、Ｍｅｈｖａｒ，Ｒ．（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．（２０００）３（１）：１２５〜１３６）およびＭｏｎｆａｒｄｉｎｉ他（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９８）９：４１８〜４５０）は、様々な水溶性ポリマー、ペプチドおよびタンパク質に対するそれらの結合、ならびに生物学的効果を概説している。
【００３９】
本発明の１つの態様は、生物活性な合成ケモカインに対する水溶性ポリマーの結合は、上記の一般論が示すように、効力に影響を及ぼすが、結合部位、結合するポリマーの性質、およびポリマー修飾のために標的化された前駆体ケモカインに依存して、効力および受容体特異性が制御され得るという発見から得られる。本発明はまた、生物活性な合成ケモカインの効力が、所望するアンタゴニスト特性と循環半減期とのバランスを系統的に改善することによって増大し得るという発見からも得られる。この最適化は３要素のプロセスを伴い、このプロセスは、これらの要素を連続して組み合わせたときに、効力および循環半減期が増大している合成ケモカインをもたらす。このプロセスは、すべてのケモカインに対して一般に適用することができる。それぞれの要素もまた、水溶性ポリマーが結合している生物活性な合成ケモカインで、合成ケモカインが結合する対応するケモカイン受容体をダウンモジュレーションするｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を有する生物活性な合成ケモカインの生成における一般的な適用性を有するからである。本明細書中で使用される用語「ケモカイン受容体をダウンモジュレーションする」は、カルシウムシグナル伝達、白血球走化性およびウイルス感染の１つまたは複数を特徴とするケモカイン受容体の正常な基礎活性を低減させることが、ケモカインまたはケモカイン類似物に対するその結合の後に生じることを意味することを意図する。これには、細胞表面からの受容体の長期間除去または増強された除去が含まれ得る。
【００４０】
第１の要素は、前駆体の生物活性な合成ケモカインを、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を保持する１つまたは複数の部位において、目的とする水溶性ポリマーで精密に修飾することに関する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性は、機能を評価するための良好な基準であり、個々のケモカインに対する標準的なアッセイがこの目的のために十分に知られている（例えば、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第１巻、リガンド（宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要）、Ｊ．Ｊ．ＯｐｐｅｎｄｈｅｉｍおよびＭ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ編、Ａｃｅｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００１；およびＣｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第２巻、受容体（宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要）、Ｊ．Ｊ．ＯｐｐｅｎｄｈｅｉｍおよびＭ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ編、Ａｃｅｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００１を参照のこと）。好ましい結合部位は、Ｃ末端部位、凝集部位、グリコシル化部位およびグリコサミノグリカン（「ＧＡＧ」）結合部位に対応する前駆体ケモカインの残基から選択される。Ｋｕｓｃｈｅｒｔ他（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）３８：１２９５９〜１２９６８）、Ｋｏｐｐｍａｎ他（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６３：２１２０〜２１２７）、およびＰｒｏｕｄｆｏｏｔ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６（１４）：１０６２０〜１０６２６）はＧＡＧ結合およびケモカインについて報告している。
【００４１】
第２の要素は、結合しているポリマーの性質に関する。ポリマーは、好ましくは、式Ｕ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊを有しており、この式において、Ｕは、タンパク質に結合する官能基の残基であり、Ｂは、３つ以上のアームを有する分岐コアであり、存在または非存在であってもよく、Ｐｏｌｙｍｅｒは、１０００ダルトン（「Ｄａ」）以上の分子量を有する実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり、Ｊは、負、中性または正から選択される所望する正味の荷電を生理学的条件下で有するペンダント基である。
【００４２】
本発明のポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインに関して予想外の発見は、約１０００Ｄａ〜１５００Ｄａほどの小さい水溶性ポリマー構造物が、前駆体ケモカインの血清循環半減期を約１０倍増大させるためには十分であり得るということである。別の予想外の発見は、小さい直鎖状ポリマー構造物およびはるかに大きい分枝状ポリマー構造物が、同じ部位に結合したときに、効力および受容体ダウンモジュレーションに対して類似する効果を有し得るということである。別の発見は、ポリマー構造物におけるペンダント基Ｊの性質および数が、生物活性な合成されたポリマー修飾ケモカインのダウンモジュレーションおよび受容体特異性に影響を及ぼし得るということである。
【００４３】
例えば、複数のイオン化性のペンダント基Ｊを有する分枝状ポリマー構造物の使用により、ＧＡＧおよび受容体の結合を意図的に変化させることができる。例として、ＲＡＮＴＥＳの類似物である合成ケモカインが挙げられる。この場合、負に荷電した基を（生理学的条件下で）有する分枝状ポリマーは、負である正味の静電的表面を有するＣＣＲ１とは対照的に、中性であるような正味の静電的表面を有するＣＣＲ５に対する結合に傾く。したがって、複数の負に荷電したペンダント基Ｊを含む水溶性ポリマーを有するポリマー修飾された生物活性な合成Ｒａｎｔｅｓ類似物は、正味の中性表面または正味の正荷電表面を有する受容体と優先的に相互作用することができる。同様に、ＧＡＧは典型的には正味の負荷電を示すので、ＧＡＧとの相互作用を操作することができる。当然のことではあるが、上記に記されるように、ポリマーの結合部位は、目的とする生物活性な合成されたポリマー修飾ケモカインの所与の最終的な使用に依存して、受容体結合およびＧＡＧ結合のエレメントを細かく調節するために利用することができる。
【００４４】
第３の要素は、それが結合するケモカイン受容体のダウンモジュレーションを特徴とする最適なｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を有するポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインの生成に関する。これには、（関連するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系アッセイにおけるＥＣ５０によって見積もられる場合）、ポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインの所望する効力の範囲よりも約１倍〜５倍以上大きく、好ましくは約５倍〜１０倍以上大きい効力を有する前駆体ケモカイン（すなわち、水溶性ポリマーを結合させる相手として選ばれる天然ケモカインまたは修飾ケモカイン）の選択が伴う。そのような前駆体ケモカインの選択により、効力とｉｎ  ｖｉｖｏ血清循環半減期との所望するバランスを示すポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインが得られることが見出されている。用語「ＥＣ５０」は、用量応答（または濃度応答）曲線において基礎的応答と最大応答との半分の応答を引き起こす化合物の濃度を意味することが意図される。例えば、ＥＣ５０は効力の１つの尺度である。この場合、測定される所与の応答に対するＥＣ５０がより小さいことは、より大きいＥＣ５０を有する化合物と比較して、より強力な化合物であることを表している。ＥＣ５０はまた、ＥＤ５０またはＩＣ５０と一般には呼ばれており、ウイルス感染に関連しては、ウイルス産生の５０％、ウイルス感染性の５０％、またはウイルス誘導による細胞変性効果の５０％を阻止する有効濃度である。
【００４５】
これらの要素（すなわち、ポリマー結合部位、ポリマーの性質、およびポリマー修飾のための前駆体ケモカインの選択）のそれぞれから単独または組合せで得ることできる合成ケモカインが提供されることが理解される。ポリマー結合部位はまた、合成ケモカインにおいて重なってもよく、または１つであり得る。例えば、凝集部位およびＧＡＧ部位が隣接するか、または同じ部位において局在化する。さらに、２つ以上のポリマーが結合している合成ケモカインが提供される。例えば、本発明にはまた、ケモカインポリペプチド鎖と、ＧＡＧ部位から選択される第１の部位において、そして凝集部位およびＣ末端部位から選択される第２の部位においてケモカインポリペプチド鎖に結合している水溶性ポリマーとを含む生物活性な合成ケモカインが含まれる。本発明のこの態様により、特に、分子量および水溶性を増大させることができ（したがって、循環半減期、および水溶性ポリマーによってもたらされる他の望ましい性質を改善することができ）、同時に、ポリマー結合部位における凝集および特定のタイプのＧＡＧ結合などのあまり望ましくない性質を除くことができる。
【００４６】
１．ポリマー結合部位
本発明の好ましい生物活性な合成ケモカインは、Ｃ末端部位、凝集部位、グリコシル化部位およびＧＡＧ結合部位から選択される１つまたは複数の部位の残基において本発明の生物活性な合成ケモカインタンパク質を目的の水溶性ポリマーで精密に修飾することによって生成することができる。これらの部位における残基は、それらがポリマー結合を受けやすい側鎖（すなわち、官能基を有するアミノ酸の側鎖、例えば、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、ヒスチジンなど）を有するならば、結合のために使用することができる。あるいは、これらの部位における残基は、ポリマー結合を受けやすい側鎖を有する異なるアミノ酸で置換することができる。また、遺伝子によってコードされるアミノ酸の側鎖をポリマー結合のために化学修飾することができ、または適切な側鎖官能基を有する非天然アミノ酸を用いることができる。好ましい結合方法では、ペプチド合成および化学的連結の組合せが用いられる。
【００４７】
本発明のそのような生物活性な合成ケモカインは、好ましくは、アミノ酸残基を縮合することによって合成される。そのようなアミノ酸残基は、核酸によってコードされ、リボソームに取り込まれる下記のアミノ酸であり得る：アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、システイン、グルタミン酸塩、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン。１つの実施形態において、本発明の生物活性な合成ケモカインの特定部分について選択されるアミノ酸配列は、そのタンパク質の配列におけるその位置において見出される本来のアミノ酸残基、すなわち、天然に存在するアミノ酸残基である。代わりの実施形態において、選択されたアミノ酸配列は、そのタンパク質の本来の配列または天然の配列に存在するアミノ酸残基の代わりにＮ末端システイン残基を含有し得るポリペプチドフラグメントから構成されるか、またはそのようなポリペプチドフラグメントから構築される。そのような残基を含むことにより、天然の化学的連結、ペプチド合成および／または収束的合成の原理および方法を使用して、ポリペプチドを、（カルボキシチオエステル基を含有するように修飾された）別のポリペプチドに連結することができる（米国特許出願第６０／２３１，３３９号、同６０／２３６，３７７号および同０９／０９７，０９４号を参照のこと；これらはすべて参考として本明細書中に組み込まれる）。そのような原理は、好ましくは、本発明の生物活性な合成ケモカインを合成するために用いられる。
【００４８】
さらなる実施形態において、本発明の合成された生物活性なタンパク質は「非通常型」のアミノ酸残基を含むことができる。本明細書中で使用される用語「非通常型」のアミノ酸残基は、ＲＮＡによってコードされず、リボソームに取り込まれないアミノ酸を示すことが意図される。これに関して、本発明は、合成された生物活性なタンパク質の設計および／または構築における広い選択性および柔軟性を可能にする。本発明に従って使用され得る、リボソームに取り込まれないアミノ酸の例には、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、プソイドグルタミン酸塩、γ−アミノ酪酸塩、オルニチン、ホモシステイン、Ｎ−置換アミノ酸（Ｒ．Ｓｉｍｏｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９９２）８９：９３６７〜７１；国際特許出願公開ＷＯ９１／１９７３５（Ｂａｒｔｌｅｔｔ他）、米国特許第５，６４６，２８５号（Ｂａｉｎｄｕｒ）、α−アミノメチレンオキシ酢酸（アミノ酸−Ｇｌｙのジペプチド等電子配置体）、およびα−アミノオキシ酸などが含まれる。チオアミド、ビニル性アミド、ヒドラジノ、メチレンオキシ、チオメチレン、ホスホンアミド、オキシアミド、ヒドロキシエチレン、還元アミドおよび置換された還元アミドの等電子配置体ならびにβ−スルホンアミドを含有するペプチド類似物を用いることができる。
【００４９】
特に、天然型をまねた（ｐｓｅｕｄｏ−ｎａｔｉｖｅ）化学的連結の使用は好都合である。なぜなら、Ｒ鎖の修飾は、合成されたタンパク質へのポリマー付加物の結合を可能にするからである。同様に、Ｎ末端のＮα−置換された２炭素鎖もしくは３炭素鎖のアルキルチオールアミノ酸またはアリールチオールアミノ酸を用いることができる。そのような残基は、（末端端部またはポリペプチドに存在する場合）、本明細書中に記載される拡張された天然の化学的連結の方法に従って、そのようなポリペプチドを、カルボキシチオエステル成分を有するポリペプチドに連結するために都合よく使用することができる。
【００５０】
ペプチド合成は、標準的な自動化されたペプチド合成機を使用する、１９６０年代の初期に開発された「メリーフィールド」化学の段階的な固相ペプチド合成プロトコルに好ましくは基づいている。ペプチド連結段階では固相連結法または溶液相連結法を用いることができる。化学的連結には、第１の化学的成分と第２の化学的成分との間で選択的な共有結合した連結を形成させることが含まれる。第１の化学的成分および第２の化学的成分に存在する特徴的な相互反応性の官能基を、連結反応を化学選択的にするために使用することができる。例えば、ペプチドおよびポリペプチドの化学的連結は、適合し得る特徴的な相互反応性のＣ末端アミノ酸残基およびＮ末端アミノ酸残基を有するペプチドセグメントまたはポリペプチドセグメントを化学選択的に反応させることを伴う。
【００５１】
１つの実施形態において、合成された生物活性なタンパク質のアミノ酸残基のすべてをペプチド結合（すなわち、アミド結合）によって結合させることができる。あるいは、２つのアミノ酸残基（または２つのポリペプチドのＣ末端残基およびＮ末端残基）を非アミド結合（チオエステル結合、オキシム結合、チオエーテル結合、制御されたジスルフィド結合、チオゾリジン結合、ヒドラゾン形成連結、オキサゾリジン形成連結など）によって相互に連結することができ（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ．およびＫｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：２２１〜２２５；Ｒｏｓｅ，Ｋ．、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：３０〜３３；Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ，Ｄ．Ｒ．他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３６：８８７１〜８８７４；Ｂａｃａ，Ｍ．他、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９５）１１７：１８８１〜１８８７；Ｌｉｕ，Ｃ．Ｆ．他、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：４１４９〜４１５３；Ｌｉｕ，Ｃ．Ｆ．他、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９６）１１８：３０７〜３１２；Ｄａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６〜７７９；Ｇａｅｒｔｎｅｒ他、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）５（４）：３３３〜３３８；Ｚｈａｎｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）９５（１６）：９１８４〜９１８９；Ｔａｍ他、国際特許出願公開ＷＯ９５／００８４６；米国特許第５，５８９，３５６号）、または他の方法によって相互に連結することができる（Ｙａｎ，Ｌ．Ｚ．およびＤａｗｓｏｎ，Ｐ．Ｅ．、「脱イオウと組み合わせた天然の化学的連結によるシステイン残基を有しないペプチドおよびタンパク質の合成」、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１、１２３、５２６〜５３３（これは参考として本明細書中に組み込まれる）；Ｇｉｅｓｅｌｎａｎ他、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１、３（９）：１３３１〜１３３４；Ｓａｘｏｎ，Ｅ．他、「アミド結合の化学選択的合成に対する「無痕跡」スタウジンガー連結」、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００、２、２１４１〜２１４３）。したがって、本発明により、様々なペプチド結合修飾、代用体および等電子配置的置換を、生物活性なタンパク質の調製において利用することができる。
【００５２】
連結が、Ｎ末端システイン残基を有するポリペプチドの結合を伴う場合には、天然の化学的連結の手法が好ましくは用いられる（Ｄａｗｓｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６〜７７９；Ｋｅｎｔ他、国際特許出願公開ＷＯ９６／３４８７８；Ｋｅｎｔ他、国際特許出願公開ＷＯ９８／２８４３４）。この方法論は、天然のアミド結合を連結部位において生じさせるための、影響を受けにくい方法論であることが証明されている。天然の化学的連結は、Ｃ末端のα−カルボキシチオエステル成分を有する第１のペプチドセグメントまたはポリペプチドセグメントと、Ｎ末端システイン残基を有する第２のペプチドまたはポリペプチドとの間での化学選択的な反応を伴う。チオール交換反応により、最初のチオエステル連結された中間体が生じ、これは自発的に転位して、天然のアミド結合を連結部位においてもたらし、同時にシステイン側鎖チオールを再生する。多くの場合、Ｎ末端システイン残基を有するポリペプチドフラグメントが合成され、天然の化学的連結反応において使用され得るように、天然タンパク質の配列は、好適に設置されたシステイン残基を含む。他の場合には、ペプチド合成を、この目的のためにシステイン残基をポリペプチドに導入するように行うことができる。
【００５３】
しかしながら、システイン残基がポリペプチドのＮ末端において導入されるように天然タンパク質の配列を修飾することが不都合であるか、またはそのような修飾が望ましくない場合には、天然の化学的連結の方法は、Ｎ置換（好ましくは、Ｎα−置換）された２炭素鎖または３炭素鎖のアミノアルキルチオールまたはアミノアリールチオールを含有するようにそのＮ末端が修飾されているポリペプチドを使用して伸張することができる。そのような「拡張された天然の化学的連結」が米国特許出願第６０／２３１，３３９号および同第６０／２３６，３７７号（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されている。
【００５４】
簡単に記載すると、この方法は、カルボキシルチオエステル（より好ましくは、α−カルボキシルチオエステル）を含む第１の成分を、酸に安定なＮ置換（好ましくは、Ｎα−置換）された２炭素鎖または３炭素鎖のアミノアルキルチオールまたはアミノアリールチオールを含む第２の成分と連結することを伴う。第１の成分のカルボキシチオエステルと、第２の成分のＮ置換された２炭素鎖または３炭素鎖のアルキルチオールまたはアリールチオールのチオールとの間での化学選択的な反応が、チオエステル連結された中間体を経て進行し、最初の連結生成物を生じさせる。より詳細には、ＣＯＳＲチオエステル成分とアミノアルキルチオール成分との間で生じるチオール交換により、チオエステル連結された中間体の連結生成物が生じ、これは、自発的に転位した後、アミノアルキルチオール成分が下記の式Ｉまたは式ＩＩをそれぞれ有するかどうかに依存して、５員環または６員環の中間体を介して、アミドで連結された最初の連結生成物をもたらす：
2004517040.tif 000002
（式中、Ｊ１は、場合により保護された１つまたは複数のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、色素、好適に官能化された表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張された天然の化学的連結と適合し得る任意の他の化学的成分であり；Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、水素、またはＣ１に結合した電子供与基であり、ただし、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の少なくとも１つは、Ｃ１に結合した電子供与基を含み；およびＪ２は、場合により保護された１つまたは複数のアミノ酸側鎖を有するペプチドもしくはポリペプチド、またはそのようなペプチドもしくはポリペプチドの成分、ポリマー、色素、好適に官能化された表面、リンカーもしくは検出可能なマーカー、または化学的ペプチド合成もしくは拡張された天然の化学的連結と適合し得る任意の他の化学的成分である）。
【００５５】
連結部位におけるＮ置換された２炭素鎖または３炭素鎖のアルキルチオールまたはアリールチオール［ＨＳ−Ｃ２−Ｃ１（Ｒ１）−］または［ＨＳ−（Ｃ３（Ｒ３）−Ｃ２（Ｒ２）−Ｃ１（Ｒ１）−）は、生成物に対する損傷を伴うことなく、ペプチドに適合し得る条件のもとで除去することが容易であり、連結部位に天然のアミド結合を有する下記の式ＩＩＩの最終的な連結生成物をもたらす：
Ｊ１−Ｃ（Ｏ）−ＨＮ−Ｊ２                          ＩＩＩ
（式中、Ｊ１、Ｊ２、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は上記に定義される通りである）。
【００５６】
Ｒ１基、Ｒ２基およびＲ３基は、ペプチドと適合し得る切断条件のもとでのＮ−Ｃ１結合の切断を容易にするために選択される。例えば、Ｃ１に結合している場合には特に、電子供与基を、切断を容易にする共鳴安定化されたカチオンをＣ１において形成させるために使用することができる。化学的連結反応は、好ましくは、添加剤としてチオール触媒を含み、水性条件または混合有機水性条件におけるほぼ中性ｐＨの条件において行われる。第１の成分および第２の成分の化学的連結は、Ｎ置換されたアミド連結の連結生成物を生じさせる自発的な転位を受ける５員環または６員環を経由して進行し得る。第１の成分および第２の成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、Ｎ置換されたアミド連結の連結生成物は下記の式ＩＶまたは式Ｖを有する：
2004517040.tif 000003
（式中、Ｊ１、Ｊ２およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３は上記に定義される通りであり、Ｚ２はアミノ酸側鎖であるか、またはそのような側鎖の誘導体である）。
【００５７】
Ｎ置換されたアミド結合の連結生成物の結合している電子供与基のＲ１、Ｒ２またはＲ３は、Ｎ−Ｃ１結合の切断、およびＮ置換されたアミド結合の連結生成物からの２炭素鎖または３炭素鎖のアルキルチオールまたはアリールチオールの除去を促進する。ペプチドに適合し得る切断条件のもとでＮのアルキルチオール鎖またはアリールチオール鎖を除去することにより、天然のアミド結合を連結部位において有する連結生成物が得られる。第１の成分および第２の成分がペプチドまたはポリペプチドである場合、連結生成物が下記の式を有する：
Ｊ１−ＣＯＮαＨ−ＣＨ（Ｚ２）−Ｃ（Ｏ）−Ｊ２        ＶＩ
【００５８】
Ｃ末端部位への結合の利点は、そのような結合は、ほとんどのケモカインの知られている機能的領域から最大限に分離されるために、活性の潜在的な喪失を最小限に抑えることができるということである。１つまたは複数の凝集部位を有するケモカインへの結合の利点は、水溶性ポリマーが、活性の潜在的な喪失を最小限にしながら凝集を破壊することができ、そして取扱い／配合およびｉｎ  ｖｉｖｏ効力を改善することができるということである。グリコシル化部位への結合は、天然のポリマー結合部位における合成ポリマーの結合による活性の潜在的な喪失を最小限にしながら、その部位において通常的に見出される糖鎖の正の効果を模倣するという利点を有する。グリコシル化部位におけるポリマー修飾の別の利点は、グリコシル化部位がＮ末端のファルマコホア領域またはその近くに存在する場合には特に、合成ケモカインがプロドラッグの形態で提供されるように切断可能なリンカーを含むポリマーが用いられ得るということである。ＧＡＧ結合部位への結合の利点は、上記ポリマーを利用して、その部位におけるＧＡＧ結合を破壊することができ、またそのような部位が重なっているいくつかの場合には凝集を破壊することができ、同時に活性の潜在的な喪失を最小限にし、そしてＧＡＧ成分を有する望ましくない表面に対する結合を低下させることによって循環半減期を改善することができ、そして取扱い／配合およびｉｎ  ｖｉｖｏ効力を改善することができるということである。あるいは、結合のために用いられる水溶性ポリマーに依存して、ＧＡＧ結合を増強することができ、または特定タイプのＧＡＧの結合を増強することができる。当然のことではあるが、修飾される標的ケモカインに依存して、ポリマー結合の部位が他の部位よりも好ましい場合がある。例えば、すべてのケモカインはＣ末端領域および１つまたは複数のＧＡＧ結合部位を有する一方で、必ずしもすべてのケモカインが凝集部位およびグリコシル化部位を有しないようである。
【００５９】
都合が良いことには、水溶性ポリマーの結合は、特にタンパク質のＮ末端領域において生分解性リンカーを介して行われる。そのような修飾は、リンカーが分解したとき、ポリマー修飾を有しないタンパク質を放出する前駆体（または「プロドラッグ」）の形態でタンパク質を提供するように作用する。生分解性連結（エステル連結など）による結合およびその使用は十分に知られており、下記においてより詳細に記載される。
【００６０】
ａ．Ｃ末端部位
本発明の好ましい生物活性な合成ケモカインは、水溶性ポリマーがＣ末端部位において結合している。「Ｃ末端部位」により、ケモカインのＣ末端からＣ末端α−らせんまでのケモカインポリペプチド鎖の残基が意図される。これには、自由なα−カルボン酸塩を有するペンダントＣ末端残基、およびそれに隣接する残基が含まれる。すべてのケモカインの顕著な二次構造上の特徴は、疎水性のＣ末端α−らせんが拡がるシート面を形成する三重鎖の逆平行β−シートである。したがって、Ｃ末端α−らせんは、例えば、知られているケモカインの一次配列および／または三次元構造、あるいは分子置換アルゴリズムおよびエネルギー最小化アルゴリズムによる予測構造を比較することによる、例えば、相同性モデリングおよび相同性比較によって、容易に同定可能なケモカインの一環した特徴である（例えば、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第１巻、リガンド（宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要）、Ｊ．Ｊ．ＯｐｐｅｎｄｈｅｉｍおよびＭ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００１を参照のこと）。
【００６１】
好ましいＣ末端部位は、ポリマー修飾のために標的化された前駆体ケモカインのペンダントＣ末端残基に隣接する部位である。一例として、Ｒａｎｔｅｓの類似物の場合が挙げられる。野生型Ｒａｎｔｅｓ（１−６８）のＣ末端残基は６８位におけるセリン（すなわち、Ｓｅｒ６８またはＳ６８）である。ＮＮＹ−Ｒａｎｔｅｓ（２−６８）などの前駆体ケモカインのペンダントＣ末端残基に隣接する残基に対する水溶性ポリマーの結合には、６７位におけるメチオニン（Ｍ６７）、ならびにＭ６７および／またはＳ６８に対応する残基に結合するリンカー部分が含まれる。例えば、目的とするケモカインのＣ末端への水溶性ポリマーをカップリングするための機能的な側鎖を有するリンカー部分またはスペーサー部分の付加は、そのような位置またはその近くにおける元のＣ末端基の機能に対する潜在的な影響を最小限に抑える。例えば、ジペプチドリンカーＬｙｓ６９−Ｌｅｕ７０などの、ＲａｎｔｅｓのＳ６８位へのリンカーの付加は、Ｒａｎｔｅｓ（（１−６８）−（Ｋ６９−Ｌ７０））を生じさせ、そしてリンカー部分Ｌｙｓ６９の側鎖上のε−窒素へのポリマー結合のための機能的なカップリング基、および新しく生成したＣ末端における自由なα−カルボン酸塩を有するアミノ酸をもたらす。６７位に対応する残基に対するスペーサーまたはリンカーの付加（例えば、Ｌｙｓ６７によるＭｅｔ６７の置換、およびε−側鎖アミノ基に対するリンカーの結合）もまた可能である。両者は生物活性を保持することが見出されており、この設計は、他のケモカインに対して一般に適用されると考えられる。例えば、ＳＤＦ−１αまたはＳＤＦ−１βの類似した修飾により、所望する生物活性を保持するポリマー修飾されたＳＤＦ−１類似物を生成することができる。さらに別の例において、合成ケモカインがＭＣＰ−１またはエオタキシンの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがＣ末端に隣接する残基において結合する場合、ポリマー結合部位は、それぞれ、ＭＣＰ−１のＤ６８またはエオタキシンのＤ６６に対応するアミノ酸を含む。ここで再度ではあるが、これらの位置に隣接するＣ末端部位における残基（ＭＣＰ−１のＫ６９またはエオタキシンのＫ６８など）はポリマー結合のために利用することができる。さらに、リンカー部分またはスペーサー部分の付加により、Ｃ末端またはその近くにおける他の成分（脂質または多環のような疎水性成分など）を付加する際のより大きい柔軟性が可能になる。したがって、本発明のさらなる好ましいポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインは、リンカー部分またはスペーサー部分の側鎖を介してＣ末端部位において結合している水溶性ポリマーを含む。
【００６２】
ｂ．凝集部位
水溶性ポリマーが１つまたは複数の凝集部位に結合している合成ケモカインは特に注目される。「凝集部位」により、タンパク質分子の自己会合を生じさせる残基（１つまたは複数）が意図される。ほとんどのケモカインは、ホモニ量体を形成する能力を有しているが、多くは四量体を形成することができ、そして一部はさらに大きい多量体を形成することができる（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第１巻、リガンド（宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要）、Ｊ．Ｊ．ＯｐｐｅｎｄｈｅｉｍおよびＭ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００１）。ケモカインの凝集部位は、典型的には、高濃度で二量体および多量体の複合体を形成することができるケモカインにおいて見出されている（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第１巻、リガンド（宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要）、Ｊ．Ｊ．ＯｐｐｅｎｄｈｅｉｍおよびＭ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００１）。例えば、ＲａｎｔｅｓおよびＭＩＰ−１βなどのケモカインは高濃度で分子の自己会合による凝集体を形成し、これに対して、ＩＬ−８、ＳＤＦ−１αおよびｖＭＩＰなどのケモカインは何ら著しい程度でこの傾向を有していない。凝集部位は、相同性モデリング、アラニン走査、および溶液における高濃度での活性な化合物の比較、およびこの分野で知られている様々な技術を使用して自己会合である凝集についてモニターリングすることなどの多数のよく知られている方法によって同定することができる（例えば、Ｃｚａｐｌｅｗｓｋｉ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４（２３）：１６０７７〜１６０８４；Ｃｚａｐｌｅｗｓｋｉ他、「ｈＭＩＰ−１αの操作、生物学および臨床的開発」、（１９９９）、Ｉｎ：Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ：Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃ．Ａ．Ｈｅｒｂｅｒｔ編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．、Ｔｏｔｗａ、ＮＪ；Ｔｒｋｏｌａ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）７３（８）：６３７０〜６３７９；Ａｐｐａｙ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４（３９）：２７５０５〜２７５１２；Ｈｕｎｔｅｒ他、Ｂｌｏｏｄ（１９９５）８６（１２）：４４００〜４４０８；Ｌｏｒｄ他、Ｂｌｏｏｄ（１９９５）８５（１２）：３４１２〜３４１５；Ｌｏｒｄ他、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９６）７４：１０１７〜１０２２を参照のこと）。そして上記に記されるように、多くのケモカインの凝集部位が知られており、そして推定される凝集部位を同定するための技術もよく知られている（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第１巻、リガンド（宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要）、Ｊ．Ｊ．ＯｐｐｅｎｄｈｅｉｍおよびＭ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００１もまた参照のこと）。したがって、ケモカインの凝集部位は、好評された情報、相同性モデリングから、スクリーニングによって、またはそれぞれの組合せによって同定することができる。したがって、本明細書中に示されている例は本発明の例示であり、したがって本発明を限定することを意図していない。
【００６３】
例として、凝集部位が、上記の技術などの様々な技術によって多数のケモカインにおいて同定されている。例えば、野生型Ｒａｎｔｅｓは、凝集に関与する少なくとも２つの残基を有する：２６位および６６位の残基位置におけるグルタミン酸（すなわち、Ｇｌｕ２６およびＧｌｕ６６、またはＥ２６およびＥ６６）。したがって、合成ケモカインがＲａｎｔｅｓの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーが凝集部位において結合する場合、凝集部位は、Ｅ２６およびＥ６６から選択されるＲａｎｔｅｓの残基に対応するアミノ酸を含むことができる。例えば、本発明者らは、ＲａｎｔｅｓのＥ６６に隣接する残基において、すなわち、メチオニン６７（すなわち、Ｍｅｔ６７またはＭ６７）に対応する位置において水溶性ポリマーを結合させている。このポリマー修飾により、凝集が破壊され、そして全体的な取扱い性が改善される。これは、おそらくは、隣接するグルタミン酸残基の凝集性を破壊するポリマーによってもたらされる大きい疎水性の殻のためである。したがって、本発明に関連して、Ｒａｎｔｅｓにおける凝集部位は、Ｅ２６およびＥ６６にだけ対応するのではなく、それらに隣接するアミノ酸にも対応する。したがって、Ｒａｎｔｅｓにおける凝集部位は、Ｍ６７を含む、Ｅ２６およびＥ６６から選択されるＲａｎｔｅｓの残基に対応するアミノ酸を含む。
【００６４】
別の例として、合成ケモカインがＭＩＰ−１αの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがその凝集部位において結合する場合、凝集部位は、Ｄ２６およびＥ６６から選択されるＭＩＰ−１αの残基に対応するアミノ酸を含む。同様に、合成ケモカインがＭＩＰ−１βの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがその凝集部位において結合する場合、そのような凝集部位は、Ｄ２７位置およびＥ６７位置から選択されるＭＩＰ−１βの残基に対応するアミノ酸を含む。さらに別の例において、合成ケモカインがＭＣＰ−１またはエオタキシンの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーが凝集部位において結合する場合、凝集部位は、ＭＣＰ−１の残基Ｐ８および残基Ｄ６８またはエオタキシンの残基Ｄ６６にそれぞれ対応するアミノ酸を含む。ここで再度ではあるが、これらの位置に隣接する残基（ＭＣＰ−１のＫ６９またはエオタキシンのＫ６８など）は、凝集を破壊するために、ポリマー結合のために利用することができ、したがって水溶性ポリマーがその凝集部位に結合している本発明の生物活性な合成ケモカインに含まれる。理解され得るように、凝集部位は容易に同定することができ、ポリマー修飾するための好ましい部位であり、そして所望する生物活性に対する日常的なスクリーニングによって優先的な結合のために選択することができる。
【００６５】
より好ましい実施形態において、水溶性ポリマーは、目的とするケモカインのＣ末端領域に位置する凝集部位において結合する。ポリマー結合のためのさらにより好ましい凝集部位は、ケモカインのＣ末端α−らせんのＣ末端側にある部位であり、例えば、ＲａｎｔｅｓのＥ６６およびＭ６７、ＭＩＰ−１αのＥ６６、ＭＩＰ−１βのＥ６７、ＭＣＰ−１のＤ６８、またはエオタキシンのＤ６６などである。したがって、本発明の好ましい生物活性な合成ケモカインは、水溶性ポリマーが、そのＣ末端α−らせんのＣ末端側にあるＣ末端凝集部位において結合している合成ケモカインである。本発明のこの態様の最も好ましい生物活性な合成ケモカインは、そのＣ末端α−らせんのＣ末端側にあるＣ末端凝集部位で、前駆体ケモカインのペンダントＣ末端残基に隣接するＣ末端凝集部位において水溶性ポリマーが結合している合成ケモカインである。
【００６６】
ｃ．グリコシル化部位
別の好ましい実施形態において、水溶性ポリマーがグリコシル化部位において結合している本発明の生物活性な合成ケモカインが提供される。「グリコシル化部位」により、Ｎ−結合型グリコシル化部位およびＯ−結合型グリコシル化部位などの、炭水化物（オリゴ糖）鎖の酵素的結合をコードする残基が意図される。より好ましいグリコシル化部位は、ケモカインのＣ末端領域において存在するグリコシル化部位である。Ｎ−結合型グリコシル化部位が最も好ましい部位である。グリコシル化部位は天然の部位であり得るか、または標的タンパク質に操作して入れることができる。グリコシル化部位は、多糖およびその結合部位の存在に対する分析的試験、相同性比較、または遺伝子データベースおよびタンパク質データベースに対するコンセンサス配列および／もしくはコンセンサス構造を調べることによって野生型分子において同定することができる。グリコシル化部位を標的タンパク質に操作して入れることの利点は、操作された部位が目的とする所望の生物活性を破壊しないならば、ポリマー結合のためのさらなる好ましい部位が同定され得るということである。
【００６７】
具体的には、粗面小胞体のリボソームによって合成されるほとんどのタンパク質は短い鎖の炭水化物（オリゴ糖）を含有しており、糖タンパク質と呼ばれている（例えば、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｓｔｅｅｎ他、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９８）３３（３）：１５１〜２０８を参照のこと）。そして、多くのケモカインがグリコシル化されること、またはＮ−結合型および／またはＯ−結合型のグリコシル化のコンセンサス部位を含有することが知られている。実際、多くの天然において産生されるケモカインは非常にグリコシル化されている。このことにより、ケモカインのグリコシル化部位がポリマー修飾のために特に注目される。例えば、糖タンパク質は、タンパク質の多くの重要な性質（例えば、ｐＩ、分子サイズ、溶解性、安定性、構造および静電的表面荷電）、および真核生物細胞表面の多くの重要な性質（例えば、細胞−細胞の認識および接着、「すり切れ」からの細胞表面の荷電保護、血液型特異的抗原、ウイルスおよび細菌および原生動物の受容体、移植（組織適合性）抗原、イオンチャンネルなど）に関わっている。したがって、そのような部位における水溶性ポリマーの結合を利用して、改善された性質を有する薬物化合物を生成するために、好都合な性質（例えば、ｐＩ、サイズ、溶解性、安定性、低下した抗原性、延長された循環半減期）を模倣することができ、同時に、他の性質（例えば、異種性、糖類媒介によるクリアランス、および望ましくない接着）を除くことができる。
【００６８】
さらに、１つまたは複数のグリコシル化部位における水溶性ポリマーの結合は、一般に、生物活性に対する影響を低下させ、そしておそらくは生物活性を改善させるはずである。これは、自然が、そのような部位を大きい水溶性ポリマーの結合のために選択しているからである。糖タンパク質の炭水化物含有物（多くの場合、総重量の５０％以上である）は、４個〜１５個の糖を典型的には含有するオリゴ糖側鎖としてポリペプチドに共有結合により結合している。いくつかの側鎖が同じポリペプチドに存在することがあり、そしてその鎖が分岐している場合がある。そして、本発明者らは、グリコシル化部位が、ポリマー結合、特に、グリコシル化を介して結合したオリゴ糖鎖の正味荷電の寄与を模倣するペンダント荷電基を有する比較的大きい分子量の分枝状水溶性ポリマーの結合を容易に行うことができる部位の比較的良好な指標であることを見出した。
【００６９】
グリコシル化部位の同定において、糖タンパク質のオリゴ糖には、Ｏ−結合型およびＮ−結合型の２つの主要なタイプがある。Ｏ−結合型オリゴ糖は、一般には、セリンおよびトレオニンの側鎖のＯＨ基に対するＯ−グリコシド結合を介してタンパク質に結合している。Ｎ−結合型オリゴ糖は、アスパラギンの側鎖のＮＨ２基に対するＮ−グリコシド結合を介してタンパク質に結合しており、この場合、アスパラギンは、配列の中のＸがプロリンおよびアスパラギン酸塩を除く任意のアミノ酸である位置に存在している。
【００７０】
Ｎ−グリコシル化された炭水化物鎖は、上記に述べられたように、ポリペプチド内のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸である）におけるＡｓｎ残基に結合している。しかし、多くのタンパク質には、グリコシル化されていないＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列が１つまたは複数含まれており、この配列の存在は必ずしもそれに対する炭水化物鎖の付加をもたらさない。しかしながら、Ｎ−グリコシル化の有無は容易に調べることができる（Ｂｉｌｌｅｒ，Ｍ．他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９８（１２月）：７６（１−２）：８７〜１００；Ｔａｖｅｒｎａ，Ｍ．他、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９９（２月５日）：６８（１）：３７〜４８；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｙ．他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９５（７月１日）：２２８（２）：２２１〜５）。一方、Ｏ−グリコシル化された炭水化物鎖はポリペプチド内のＳｅｒ残基またはＴｈｒ残基に結合しているが、Ｎ−グリコシル化の場合とは異なり、グリコシル化のために要求されるアミノ酸配列に対する規則はない。しかし、Ｐｒｏが近くに存在するとき、例えば、Ｐｒｏ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ−ＰｒｏおよびＴｈｒ／Ｓｅｒ−Ｘ１〜３−Ｐｒｏ（Ｘは任意のアミノ酸である）の配列において、グリコシル化に対する傾向が増大することが知られている（Ｔａｋａｈａｓｈｉ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：２０２１）。ここで再度ではあるが、Ｏ−結合型グリコシル化は容易に調べることができる。
【００７１】
多くのケモカインがグリコシル化されること、または推定的なグリコシル化部位を含むことが知られている（例えば、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第１巻、リガンド（宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要）、Ｊ．Ｊ．ＯｐｐｅｎｄｈｅｉｍおよびＭ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００１を参照のこと）。したがって、ケモカインのグリコシル化部位を発表された情報から同定することができる。予測される部位について、Ｎ−結合型グリコシル化部位および／またはＯ−結合型グリコシル化部位を確認する好ましい方法は、（例えば、この目的のために好適なデータベース・マッチング・システムおよびパターン・マッチング・システム（例えば、Ｘｉａｎｇ，Ｙ．他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９９（５月１０日）：２５７（２）：２９７〜３０２；Ｈｏｏｐｓ，Ｔ．Ｃ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９１（３月５日）：２６６（７）：４２５７〜６３；Ａｐｗｅｉｌｅｒ，Ｒ．他、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１９９９（１２月６日）：１４７３（１）：４〜８を参照のこと）を使用して）相同性比較を行い、その後、酵母細胞または哺乳動物細胞の発現システムにおいて前駆体サイトカインを試験し、そして糖類含有物および結合部位を特徴付ける分析試験を行うことによる。あるいは、相同性比較によって同定された推定的な部位は、目的とする水溶性ポリマーで修飾することができ、その後、この目的のために好適な標準的なプロトコルに従って目的とする生物活性（例えば、カルシウム流動、走化性、および／またはウイルス進入の阻害）について、関連するｉｎ  ｖｉｔｒｏバイオアッセイにおいて単にスクリーニングすることができる。
【００７２】
例として、相同性モデリングにより、推定的なＯ−結合型グリコシル化部位が、Ｒａｎｔｅｓにおける５位のセリン（すなわち、Ｓｅｒ５またはＳ５）において同定される。この位置は、グリコシル化された形態が２ｎＭ〜１０ｎＭの範囲で走化活性を有することを示す他の研究により裏付けられている（Ｋａｍｅｙｏｓｈｉ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９２）１７６（２）：５８７〜５９２）。アンタゴニストであるＲａｎｔｅｓ類似物（ＮＮＹ−Ｒａｎｔｅｓ類似物など）の場合、Ｒａｎｔｅｓの５位のセリンをＧｌｕまたはＬｙｓなどの荷電した可溶性基成分に変化させると、ウイルス感染／融合に対する細胞系アッセイにおいて測定されたとき、効力が低下し、これに対して、ｔ−ブチルアラニン（ｔＢｕＡ）などのアミノ酸成分の導入は効力を保持している。したがって、Ｒａｎｔｅｓアンタゴニストの場合、野生型ＲａｎｔｅｓにおけるＳ５位置に対応する部位における水溶性ポリマーの結合は、好ましくは、生分解性リンカーによって、例えば、セリンの側鎖ヒドロキシルまたは類似する基に対するエステル連結によってなされ、これにより、Ｒａｎｔｅｓアンタゴニスト化合物は実質的にはプロドラッグ形態でもたらされる。ｉｎ  ｖｉｖｏ環境における水溶性ポリマーからのＲａｎｔｅｓ類似物の分解および放出により、その後、その活性形態が得られる。エステル連結などの生分解性連結による結合およびその使用は十分に知られており、下記においてより詳しく記載される。
【００７３】
類似する状況が、１つまたは２つの潜在的なＯ−結合型グリコシル化部位をそれぞれ有するＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βなどの他のケモカインについて見出されている。例えば、ＭＩＰ−１αは、残基Ｔ７に対応するアミノ酸を含む予測されるグリコシル化部位を有し、そしてＭＩＰ−１βについては、予測されるグリコシル化部位は、残基Ｓ５に対応するアミノ酸を含む。これらの２つの例は、Ｏ−結合型グルコシル化部位が予測される点でＲａｎｔｅｓと類似しており、したがってＭＩＰのアンタゴニスト類似物の場合、好ましい結合は、ポリマーがｉｎ  ｖｉｖｏで放出された後でその活性形態の形成が可能になるような生分解性連結による。
【００７４】
多くの他のケモカインはグリコシル化部位を有しており、本発明に従って合成することができ、そして１つまたは複数の水溶性ポリマーで修飾することができる。したがって、本明細書中に示される例は本発明の例示であり、したがって本発明を限定することを意図していない。例えば、リホタクチンは、８個のＯ−結合型グリコシル化部位を含有する９３残基のケモカインである。この化合物は、天然の化学的連結を使用して合成され、１個のＧａｌＮＡｃ残基が、標準的なＦｍｏｃ化学を使用してそれぞれのグリコシル化部位において取り込まれている（Ｍａｒｃａｕｒｅｌｌｅ他、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００１）７（５）：１１２９〜１１３２）。ＭＣＰ−１などの他のケモカインでは、グリコシル化部位は、ＭＣＰ−１の残基Ｔ７１に対応するアミノ酸を含む。一般的なＮ−グリコシル化配列がＭＣＰ−１にはＮ１４位置に存在するが、Ｎ−結合型の糖を検出することができない。それどころか、少量のシアリル化されたＯ−結合型炭水化物がタンパク質のＣ末端に付加されている（Ｚｈａｎｇ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）２６９：１５９１８〜１５９２４）。その予測される部位はＴ７１である。そのグリコシル化された形態は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単球走化性アッセイにおいて、非グリコシル化ＭＣＰ−１の１／２〜１／３の効力を有するだけであると報告されている（Ｐｒｏｏｓｔ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９８）１６０：４０３４〜４０４１）。別のグリコシル化ケモカインはＨＣＣ−１であり、これは、ヒト血漿中にナノモル濃度水準で循環しているこれまでに知られている唯一のＣＣケモカインである（Ｒｉｃｈｔｅｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００）３９（３５）：１０７９９〜１０８０５）。ＨＣＣ−１は様々なプロセシングされた形態で存在し、７４アミノ酸の全長型形態は、２つのＮ−アセチルノイラミン酸および二糖のＮ−アセチルガラクトサミンガラクトースとともにＯ−グリコシル化を７位（Ｓｅｒ７）において有する。
【００７５】
より好ましい実施形態において、水溶性ポリマーは、目的とするケモカインのＣ末端領域に位置するグリコシル化部位において結合する。ポリマー結合のための最も好ましいグリコシル化部位は、ケモカインのＣ末端α−らせんのＣ末端側にあるグリコシル化部位である。例えば、合成ケモカインがＭＣＰ−１であるとき、水溶性ポリマーは、好ましくは、野生型ＭＣＰ−１の残基位置Ｔ７１に対応するグリコシル化部位において結合する。したがって、本発明の好ましい生物活性な合成ケモカインには、そのＣ末端α−らせんのＣ末端側にあるＣ末端グリコシル化部位において水溶性ポリマーが結合しているものが含まれる。
【００７６】
ｄ．ＧＡＧ結合部位
本発明の別の好ましい実施形態において、水溶性ポリマーがそのＧＡＧ結合部位において結合している生物活性な合成ケモカインが提供される。「ＧＡＧ結合部位」により、ＧＡＧ結合をコードする残基、すなわち、典型的には、一級アミンおよび二級アミンを有する残基（リジンおよびアルギニンなど）、そして場合によりタンパク質の表面に正の荷電クラスターを形成するヒスチジンが意図される。ケモカインは、ヘパリン、硫酸ヘパラン、硫酸コンドロイチンおよび硫酸デルマタン（これらは、天然には内皮細胞表面および細胞外マトリックスに存在する）を含むＧＡＧと結合することが知られている（例えば、Ｗｅｌｌｓ他、Ｉｎｆｌａｍｍ．Ｒｅｓ．（１９９９）４８：３５３〜３３６２；Ｌａｌａｎｉ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１：４３５６〜４３６３；Ｒｏｔ，Ａ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）２３：３０３〜３０６；Ｗｉｔｔ他、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．（１９９４）４：３９４〜４００；Ｈｏｏｇｅｗｅｒｆ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）３６：１３５７０〜１３５７８；Ｍａｒｑｕｅｚｉｎｉ他、Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ（１９９５）８６：１４３〜１４６；Ｗａｓｔｙ他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（１９９３）３６：３１６〜３２２）。Ｋｕｓｃｈｅｒｔ他（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）３８：１２９５９〜１２９６８）、Ｋｏｐｐｍａｎ他（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９）１６３：２１２０〜２１２７）およびＰｒｏｕｄｆｏｏｔ他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６（１４）：１０６２０〜１０６２６）はＧＡＧ結合およびケモカインについて報告している）。
【００７７】
機能には必須ではないが、ケモカインのＧＡＧ結合能により、受容体相互作用、およびマトリックスタンパク質および細胞面を覆う受容体保有細胞のハプトタクティック（ｈａｐｔｏｔａｃｔｉｃ）遊走が調節されることが報告されている（例えば、Ｒｏｔ，Ａ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）２３：３０３〜３０６；Ｗｉｔｔ他、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１９９４）４：３９４〜４００；Ｈｏｏｇｅｗｅｒｆ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９７）３６：１３５７０〜１３５７８；Ｍａｒｑｕｅｚｉｎｉ他、Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ（１９９５）８６：１４３〜１４６；Ｗａｓｔｙ他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（１９９３）３６：３１６〜３２２；Ｋｕｓｃｈｅｒｔ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９７）２８７：３６９〜３７８；Ｋｕｓｃｈｅｒｔ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７：１１１９３〜１１２０１；Ｋｕｓｃｈｅｒｔ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）３８：１２９５９〜１２９６８）。ケモカインを可溶性ＧＡＧと結合することにより、ほとんどの場合、ケモカインのその受容体に対する結合が妨げられる（Ｋｕｓｃｈｅｒｔ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９９）３８：１２９５９〜１２９６８）。しかし、少数の場合ではあるが、ケモカインとＧＡＧとの相互作用により、活性が強化されることが報告されている（Ｗｂｂ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：７１５８〜７１６２；Ｗａｇｎｅｒ他、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（１９８９）９：２１〜３２）。したがって、水溶性ポリマーがそのＧＡＧ結合部位に結合している合成ケモカインは、結合およびその意図された最終的な使用のために選ばれた部位に依存して、ＧＡＧの結合を低下させること、または特定のＧＡＧの結合に傾かせることのいずれかによって生物学的機能を調節するために利用することができる。したがって、本発明の好ましい実施形態は、水溶性ポリマーがＧＡＧ結合部位において結合している生物活性な合成ケモカインであって、それが結合するケモカイン受容体をダウンモジュレーションするｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を有する生物活性な合成ケモカインに関する。
【００７８】
上記のように、すべての知られているケモカインは、異なる親和性ではあるが、ヘパリンと結合することができ、したがってそれらはすべてＧＡＧ結合部位を有する。ＧＡＧ部位をポリマー修飾のために選択する際には、多くの種々の技術がこの目的のためには好適である。例えば、ＢＢＸＢモチーフおよびＢＢＢＸＸＢモチーフ（式中、Ｂは塩基性残基を表す）が、いくつかのケモカインを含むいくつかのタンパク質について共通するヘパリン結合モチーフであることが示されている（例えば、Ｃａｒｄｉｎ他、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（１９８９）９：２１〜３２；Ｈｉｌｅｍａｎ他、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ（１９９８）２０（２）：１５６〜１６７；およびＰｒｏｕｄｆｏｏｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６（１４）：１０６２０〜１０６２６を参照のこと）。しかし、ＧＡＧ結合部位はＢＢＸＢモチーフまたはＢＢＢＸＸＢモチーフに限定されない。例えば、ＲａｎｔｅｓにおけるＧＡＧ結合部位（４４ＲＫＮＲ４７および５５ＫＫＷＶＲ５９）、ＳＤＦ−１におけるＧＡＧ結合部位（２４ＫＨＬＫ２７）、ＭＩＰ−１αにおけるＧＡＧ結合部位（４５ＫＲＳＲ４８）およびＭＩＰ−１βにおけるＧＡＧ結合部位（４５ＫＲＳＫ４８）はＢＢＸＢモチーフを有しており、これに対して、ＩＬ−８における主要なＧＡＧ結合残基（Ｌｙｓ２０、Ｌｙｓ６４およびＡｒｇ６８）およびＭＣＰ−１における主要なＧＡＧ結合残基（Ｌｙｓ５９およびＡｒｇ６６）は空間的に離れているが、タンパク質表面において塩基性の荷電クラスターを形成している。したがって、これらのリガンドの塩基性荷電により、それらのヘパリン結合特性が説明される。
【００７９】
ＧＡＧ部位はまた、塩基性残基（例えば、Ｌｙｓ、ＨｉｓおよびＡｒｇ）のアラニン走査、ＮＭＲ、およびＧＡＧ／ヘパリン結合アッセイにおける活性な化合物の比較、ならびにこの目的のために適合したＮＭＲ研究によって同定することができる（例えば、Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００１）２７６（１４）：１０６２０〜１０６２６；Ｔｒｋｏｌａ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）７３（８）：６３７０〜６３７９；Ａｐｐａｙ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４（３９）：２７５０５〜２７５１２；Ｈｕｎｔｅｒ他、Ｂｌｏｏｄ（１９９５）８６（１２）：４４００〜４４０８；Ｌｏｒｄ他、Ｂｌｏｏｄ（１９９５）８５（１２）：３４１２〜３４１５；Ｌｏｒｄ他、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９６）７４：１０１７〜１０２２を参照のこと）。そして、上記のように、多くのケモカインのＧＡＧ結合部位が知られており、そして推定されるＧＡＧ部位を同定する技術も十分に知られている（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第１巻、リガンド（宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要）、Ｊ．Ｊ．ＯｐｐｅｎｄｈｅｉｍおよびＭ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００１もまた参照のこと）。したがって、ケモカインのＧＡＧ結合部位を、発表された情報、相同性モデリングから、またはスクリーニングによって、またはそれらの組合せによって同定することができる。さらに、ＧＡＧ結合に関与する残基の側鎖の少なくとも１つがＮ末端のファルマコホア領域から離れて分子表面に位置するので、これらの部位は、一般に水溶性ポリマーの結合を容易に行うことができるはずである。
【００８０】
例として、野生型Ｒａｎｔｅｓは少なくとも２つの主要なＧＡＧ結合部位を有しており、これらは、Ｌｙｓ４４、Ｌｙｓ４５、Ａｒｇ４７、Ｌｙｓ５５、Ｌｙｓ５６、およびＡｒｇ５９（すなわち、Ｋ４４、Ｋ４５、Ｒ４７、Ｋ５５、Ｋ５６、およびＲ５９）から選択されるＲａｎｔｅｓの残基に対応するアミノ酸を含む。したがって、合成ケモカインがＲａｎｔｅｓの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがそのＧＡＧ結合部位において結合する場合、ＧＡＧ結合部位は、Ｋ４４、Ｋ４５、Ｒ４７、Ｋ５５、Ｋ５６、およびＲ５９から選択されるＲａｎｔｅｓの残基に対応するアミノ酸を含む。好ましい実施形態において、水溶性ポリマーは、Ｋ４４、Ｋ４５、Ｒ４７から選択されるＲａｎｔｅｓの残基に対応する位置において結合するが、Ｋ４５の位置がより好ましい。この実施形態において、４５位におけるポリマー結合は、ＣＣＲ５に対する結合を実質的に保持する一方で、ＣＣＲ１受容体に対する合成Ｒａｎｔｅｓケモカイン類似物の結合を低下させるという効果を有する。
【００８１】
別の例として、合成ケモカインがＭＩＰ−１αの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがそのＧＡＧ結合部位において結合する場合、ＧＡＧ結合部位は、Ｒ１７、Ｒ４５およびＲ４７から選択されるＭＩＰ−１αの残基に対応するアミノ酸を含む。同様に、合成ケモカインがＭＩＰ−１βの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがそのＧＡＧ結合部位において結合する場合、そのような凝集部位は、Ｒ１８、Ｒ４５およびＲ４６から選択されるＭＩＰ−１βの残基に対応するアミノ酸を含む。これらの２つの例において、ポリマー結合のための好ましい部位はＭＩＰ−１αのＲ４５であり、ＭＩＰ−１βのＲ４６である。Ｒａｎｔｅｓの場合と同様に、これらの修飾は、ＣＣＲ５に対するケモカイン類似物の結合にバイアスをかけるために計画される。
【００８２】
さらなる例において、合成ケモカインがＳＤＦ１−αの類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがそのＧＡＧ結合部位において結合する場合、ＧＡＧ結合部位は、ＳＤＦ１−αのＫ２４、Ｈ２５およびＫ２７の残基に対応するアミノ酸を含む。ここで再度ではあるが、これらの位置に隣接する残基（Ｎ２２またはＮ３０またはＮ３３など、特にＮ３３）は、実質的に同じ結果を達成するために、ポリマー結合のために利用することができ、したがって、水溶性ポリマーがそのＧＡＧ結合部位において結合している本発明の生物活性な合成ケモカインに含められる。
【００８３】
さらに別の例において、合成ケモカインがＩＬ−８の類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがそのＧＡＧ結合部位において結合する場合、ＧＡＧ部位は、Ｋ２０、Ｒ６０、Ｋ６４、Ｋ６７およびＲ６８から選択されるＩＬ−８の残基に対応するアミノ酸を含む。ＩＬ−８の合成類似物に対するポリマー結合の好ましい部位はそのＫ６４位置に対応する。別の例はＭＣＰ−１であり、したがって、合成ケモカインがＭＣＰ−１の類似物であるとき、そして水溶性ポリマーがそのＧＡＧ部位において結合する場合、ＧＡＧ部位は、Ｋ５８およびＨ６６から選択されるＭＣＰ−１の残基に対応するアミノ酸を含み、Ｋ５８が好ましい。
【００８４】
理解され得るように、ＧＡＧ結合部位は、容易に同定することができ、そしてＧＡＧ結合部位は、ポリマー結合のための好ましい部位であり、所望する生物活性に対する日常的なスクリーニングによって優先的な結合のために選択することができる。この目的のために好適な様々なバイオアッセイが十分に知られており、文献に多数記載されている（Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第１巻、リガンド（宿主防御のサイトカインおよび他の媒介因子の概要）、Ｊ．Ｊ．ＯｐｐｅｎｄｈｅｉｍおよびＭ．Ｆｅｌｄｍａｎｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００１）。
【００８５】
２．水溶性ポリマー
好ましくは、本発明の生物活性な合成ケモカインに結合する本発明のポリマー修飾は水溶性ポリマーである。本明細書中で使用される用語「水溶性ポリマー」は、水に溶解し得る実質的に非抗原性のポリマー構築物を意味することが意図される。生物学的な水溶性ポリマーの例には、（ａ）デキストラン、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストリン；（ｂ）グリコサミノグリカン、例えば、ヘパリン、硫酸ヘパラン、硫酸コンドロイチンおよび硫酸デルマタンなど；（ｃ）ヒアロロニンおよびヒアルロン酸；（ｄ）ポリラクチドおよびオリゴアクチル−アクリレート；（ｅ）セルロース、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロース；（ｆ）コラーゲン；（ｇ）ゼラチン；（ｈ）アルギン酸；ならびに（ｉ）デンプンが含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明の水溶性ポリマーは、直鎖状または分枝状または星型形状またはそのような高次構造の組合せであってもよく、広範囲の分子量および様々なポリマーサブユニットを有することができる。これらのサブユニットには、生物学的ポリマー、合成ポリマーまたはそれらの組合せを挙げることができる。
【００８７】
そのような生物学的水溶性ポリマーの誘導体が多く知られており、本明細書中に含まれる。合成された水溶性ポリマーの例には、下記が含まれるが、それらに限定されない：（ａ）ポリアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、エチレン／無水マレイン酸コポリマーおよびそれらの誘導体を含むポリマー（それらのホモポリマーおよびコポリマーを含む）、例えば、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、およびそれらの誘導体など、この場合、そのようなホモポリマーおよびコポリマーは非置換であるか、または１つの末端においてアルキル基で置換される；（ｂ）ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル；（ｃ）ポリビニルピロリドン；（ｄ）ポリオキシエチル化ポリオール（プルロニックポリオールを含む）；（ｅ）ポリエステル、例えば、ポリ（グリコール酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸）、ラクチド／グリコリドコポリマー、ポリ−１，３，６−トリオキサン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ（ｐ−ジオキサノン）およびコポリマー、ポリカプロラクトン、ＰＥＧ−ポリエステルコポリマー、ポリ（リン酸エステル）など；（ｆ）ポリ（オルトエステル）；（ｇ）ポリ無水物；（ｈ）プソイドポリ（アミノ酸）（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）；（ｉ）ポリグリセロール；（ｊ）デキストラン、カルボキシメチルセルロース；その他。
【００８８】
上記のポリマーなどの水溶性ポリマーはよく知られており、そしてペプチドおよびポリペプチドおよび他の化合物に対する連結のために、生体安定性構築物、生分解性構築物ならびにプロドラッグ構築物として様々な結合化学反応、連結システムおよび構造とともに用いられる（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９０／１３５４０、同ＷＯ９２／００７４８、同ＷＯ９２／１６５５５、同ＷＯ９４／０４１９３、同ＷＯ９４／１４７５８、同ＷＯ９４／１７０３９、同ＷＯ９４／１８２４７、同ＷＯ９４／２８９３７、同ＷＯ９５／１１９２４、同ＷＯ９６／０００８０、同ＷＯ９６／２３７９４、同ＷＯ９８／０７７１３、同ＷＯ９８／４１５６２、同ＷＯ９８／４８８３７、同ＷＯ９９／３０７２７、同ＷＯ９９／３２１３４、同ＷＯ９９／３３４８３、同ＷＯ９９／５３９５１、同ＷＯ０１／２６６９２、同ＷＯ９５／１３３１２、同ＷＯ９６／２１４６９、同ＷＯ９７／０３１０６、同ＷＯ９９／４５９６４、および米国特許第４，１７９，３３７号、同第５，０７５，０４６号、同第５，０８９，２６１号、同第５，１００，９９２号、同第５，１３４，１９２号、同第５，１６６，３０９号、同第５，１７１，２６４号、同第５，２１３，８９１号、同第５，２１９，５６４号、同第５，２７５，８３８号、同第５，２８１，６９８号、同第５，２９８，６４３号、同第５，３１２，８０８号、同第５，３２１，０９５号、同第５，３２４，８４４号、同第５，３４９，００１号、同第５，３５２，７５６号、同第５，４０５，８７７号、同第５，４５５，０２７号、同第５，４４６，０９０号、同第５，４７０，８２９号、同第５，４７８，８０５号、同第５，５６７，４２２号、同第５，６０５，９７６号、同第５，６１２，４６０号、同第５，６１４，５４９号、同第５，６１８，５２８号、同第５，６７２，６６２号、同第５，６３７，７４９号、同第５，６４３，５７５号、同第５，６５０，３８８号、同第５，６８１，５６７号、同第５，６８６，１１０号、同第５，７３０，９９０号、同第５，７３９，２０８号、同第５，７５６，５９３号、同第５，８０８，０９６号、同第５，８２４，７７８号、同第５，８２４，７８４号、同第５，８４０，９００号、同第５，８７４，５００号、同第５，８８０，１３１号、同第５，９００，４６１号、同第５，９０２，５８８号、同第５，９１９，４４２号、同第５，９１９，４５５号、同第５，９３２，４６２号、同第５，９６５，１１９号、同第５，９６５，５６６号、同第５，９８５，２６３号、同第５，９９０，２３７号、同第６，０１１，０４２号、同第６，０１３，２８３号、同第６，０７７，９３９号、同第６，１１３，９０６号、同第６，１２７，３５５号、同第６，１７７，０８７号、同第６，１８０，０９５号、同第６，１９４，５８０号、同第６，２１４，９６６号を参照のこと）。好適なポリマーに関するさらなる情報が下記により提供される：Ｔｕｒｎｂｕｌｌ，Ｗ．Ｂ．他（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（２０００）、「大きいオリゴ糖型デンドリマーの合成について」、１：７０〜７４）、ｖａｎ  Ｄｕｉｊｖｅｎｂｏｄｅ，Ｒ．Ｃ．他（Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０００）、「カルボキシラート官能化ポリ（プロピレンイミン���デンドリマーの合成およびプロトン化挙動」、３３：４６〜５２）、Ｍａｒｃａｕｒｅｌｌｅ，Ｌ．Ａ．（「ムチン型糖タンパク質の合成における最近の進歩」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈｅｍ．ｕｎｔ．ｅｄｕ／ａｃｓ／ｐｄｆ／ｍａｒｃａｕｒ．ｐｄｆ）、Ｄｏｍｅｎｅｋ，Ｓ．（「ヒトゲノム・プロジェクト：社会および化学に対する挑戦」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｒｇｃ．ｔｕｇｒａｚ．ａｔ／ｏｒｇｃ／ｈｏｅｇｒｏｕｐ／ｃｈｅｍ＿ｇｅｓ／ｄｏｍｅｎｅｋ．ＰＤＦ）、Ｉｍｐｅｒｉａｌｉ，Ｂ．他（「糖ペプチド構造および糖タンパク質構造に対するＮ−結合型グリコシル化の効果」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９、３：６４３〜６４９）、Ｒｕｄｄ，Ｐ．Ｍ．他（「グリコシル化および免疫系」、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２９１：２３７０〜２３７６）、Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｓｔｅｅｎ，Ｐ．他（「Ｏ−結合型グリコシル化の概念および原理」、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３３（３）：１５１〜２０８（１９９８））、Ｋｎｉｓｃｈｋａ，Ｒ．他（「ポリグリセロールコアに基づく星型形状ポリマー：合成、特徴付けおよび架橋」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｉｃｓ．ｕ−ｓｔｒａｓｂｇ．ｆｒ／〜ｅｑｕｉｐｅ３／Ｐｏｓｔｅｒ４．ｐｄｆ）、Ｒｕｄｄ，Ｐ．Ｍ．他（「細胞性免疫認識に関与する細胞表面受容体のグリコシル化に対する役割」、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）２９３、３５１〜３６６）、およびＤａｖｉｓ，Ｂ．Ｇ．（「糖結合体における最近の開発」、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ、１９９９（２２）３２１５〜３２３７）。
【００８９】
本発明の水溶性ポリマーは、好ましくは、有効流体力学的分子量が１０，０００ダルトン（「Ｄａ」）よりも大きく、より好ましくは約２０，０００Ｄａ〜５００，０００Ｄａであり、最も好ましくは約４０，０００Ｄａ〜３００，０００Ｄａである。「有効流体力学的分子量」により、水系のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって測定されるようなポリマー鎖の有効水溶媒和サイズが意図される。水溶性ポリマーが、エチレンオキシドの繰り返しユニットを有するポリマー鎖を含む場合、それぞれの鎖が、約２００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａ（好ましくは約１，５００Ｄａ〜約４２，０００Ｄａ、最も好ましくは約２，０００Ｄａ〜約２０，０００Ｄａ）の、原子に基づく分子量を有することが好ましい。特に指定されない限り、分子量は、原子に基づく分子量を示すことが意図される。
【００９０】
そのような水溶性ポリマーは、生物安定性または生分解性であるポリマー鎖を含むことができる。例えば、反復した連結を有するポリマーは、結合の不安定性に依存して、生理学的条件下で様々な程度の安定性を有する。そのような結合を有するポリマーは、低分子量類似物の知られている加水分解速度に基づいて、生理学的条件下でのそれらの相対的加水分解速度によって、例えば、安定性がより小さいからより大きいまで分類することができる：ポリカーボネート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ポリエステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ポリウレタン（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ポリオルトエステル（−Ｏ−Ｃ（（ＯＲ）（Ｒ’））−Ｏ−）＞ポリアミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）。同様に、水溶性ポリマーを標的分子に結合させている連結システムは生物安定性または生分解性であってもよく、例えば、安定性がより小さいからより大きいまでであり得る：カーボネート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞エステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞ウレタン（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）＞オルトエステル（−Ｏ−Ｃ（（ＯＲ）（Ｒ’））−Ｏ−）＞アミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）。これらの結合は例として示されており、本発明の水溶性ポリマーのポリマー鎖または連結システムにおいて用いることができる結合のタイプを限定することを意図していない。上記のように、本発明の合成タンパク質の生物活性は、それに結合する水溶性ポリマーの性質を変化させることによって改変することができる。
【００９１】
この目的のための好ましい水溶性ポリマーは下記の式を有する：
Ｕ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊ
式中、Ｕは、標的分子に結合し得る官能基の残基、または標的分子に結合する官能基の残基であり、Ｂは、３つ以上のアームを有する分岐コアであり、存在しても存在しなくてもよく、Ｐｏｌｙｍｅｒは、１０００Ｄａ以上の分子量を有する実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり、Ｊは、負または中性または正から選択される正味の荷電を生理学的条件下で有するペンダント基である。そのようなポリマーには、米国特許出願第６０／２３６，３７７号（これはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されるポリマーが含まれる。
【００９２】
Ｕ、Ｂ、ＰｏｌｙｍｅｒおよびＪの各成分は、１つまたは複数のスペーサー部分またはリンカー部分によって水溶性ポリマーの他の基から分離されていてもよい。したがって、水溶性ポリマーＵ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊは下記の式によって表すことができる：
Ｕ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｓ３−Ｊ
式中、ｓ１、ｓ２およびｓ３は、同じまたは異なっていてよいスペーサー部分またはリンカー部分であり、個々に存在していても存在していなくてもよい。好ましいスペーサー部分またはリンカー部分には、水溶性ポリマーにおいて用いられる１つまたは複数の繰り返しユニットを含む直鎖状または分枝状の部分、ジアミノおよび／または二酸のユニット、天然アミノ酸または非天然アミノ酸またはそれらの誘導体、ならびに１８個までの炭素原子を好ましくは含有する、アルキル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール、アルコキシなどを含む脂肪族成分が含まれ、あるいはさらなるポリマー鎖さえ含まれる。
【００９３】
上記に記されるように、成分Ｕは、標的分子（ペプチドまたはポリペプチドなど）に結合し得る官能基の残基、または標的分子（ペプチドまたはポリペプチドなど）に結合する官能基の残基である。Ｕが標的分子に対する結合のための官能基の残基である場合、Ｕは求核基または求電子基を含み、標的分子は相互に反応し得る求電子基または求核基をそれぞれ含む。
【００９４】
上記のポリマーは、水溶性ポリマーで修飾され、且つタンパク質−Ｗの式を含むタンパク質を製造するために使用することができる：この場合、Ｗは式−ｓ０−Ｕ−ｓ１−Ｂ−ｓ２−Ｐｏｌｙｍｅｒ−ｓ３−Ｊの水溶性ポリマー基であり、式中、Ｕは、タンパク質において直接的に結合する官能基の残基、またはｓ０を介してタンパク質に結合されている官能基の残基であり、Ｂは、３つ以上のアームを有する分岐コアであり、存在していても存在していなくてもよく、Ｐｏｌｙｍｅｒは、１０００Ｄａ以上の分子量を有する実質的に非抗原性の水溶性ポリマーであり、Ｊは、負、中性または正から選択される正味の荷電を生理学的条件下で有するペンダント基であり、そしてｓ０、ｓ１、ｓ２およびｓ３は、同じまたは異なっていてよいスペーサー部分またはリンカー部分であり、個々に存在していても存在していなくてもよい。
【００９５】
多くのそのような相互反応性の官能基が知られており、ペプチドおよびポリペプチドに共通する側鎖官能基に、または誘導体化された側鎖官能基に結合させることができる（Ｚａｌｉｐｓｋｙ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９５）６：１５０〜１６５；“Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、Ｃ．Ｆ．Ｍｅａｒｅｓ編、ＡＣＳ、１９９３；“Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ”、Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（１９９３））。官能基の例には、アミノ基と反応し得る基が含まれ、例えば、（ａ）ｐ−ニトロフェニルまたはスクシンイミジルなどのカルボナート；（ｂ）カルボニルイミダゾール；（ｃ）アズラクトン；（ｄ）環状イミドチオン；および（ｅ）イソシアナートまたはイソチオシアナートなどが挙げられる。カルボン酸基および反応性カルボニル基と反応し得る官能基の例には、（ａ）一級アミン；または（ｂ）ヒドラジンおよびヒドラジドの官能基（アシルヒドラジド、カルバザート、セミカルバマート、チオカルバザート、アミノオキシなど）が含まれる。メルカプト基またはスルフヒドリル基と反応し得る官能基の例には、フェニルグリオキサール類、マレイミドおよびハロゲンが含まれる。ヒドロキシル基（例えば、（カルボン）酸など）と反応し得る官能基、または求電子中心と反応し得る他の求核種の例には、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、チオール基、活性メチレンなどが含まれる。
【００９６】
例えば、標的分子に対する結合のための官能基としての成分Ｕを有する水溶性ポリマーを調製することができる。この場合、上記の官能基は、アクリラート、アルデヒド、ケトン、アミノオキシ、アミン、カルボン酸、エステル、チオエステル、ハロゲン、チオール、シアノアセタート、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、エポキシド、ヒドラジド、アジド、イソシアナート、マレイミド、メタクリラート、ニトロフェニルカルボナート、オルトピリジルジスルフィド、シラン、スルフヒドリル、ビニルスルホン類、スクシンイミジルグルタラート、スクシンイミジルスクシナート、コハク酸、トレシラートなどである。Ｕはまた、活性化可能な形態で、例えば、アミンなどの求核種と反応し得るその活性エステルに変換され得るカルボン酸で提供され得る。
【００９７】
好ましい実施形態において、Ｕは、標的分子に１つしか存在しない官能基と選択的に反応し得る１つしか存在しない官能基の残基である。本発明のこの態様には、ペプチド合成（保護基法）および化学的連結（部分保護基法または無保護基法）の原理が包含される。保護基法の場合、Ｕと、標的分子に存在するその相互反応性の官能基とを除く、すべての潜在的に反応し得る官能基が好適な保護基でブロックされる。多くの保護基がこの目的のために知られており、好適である（例えば、“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（第３版）、Ｔ．Ｗ．ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、１９９９；ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍカタログ２０００；“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ａ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ”、Ｇ．Ａ．Ｇｒａｎｔ編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９２；“Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ＆Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”、Ｗ．Ｄ．Ｂｅｎｎｅｔ、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、Ｌ．Ｋ．Ｈａｍａｋｅｒ、Ｍ．Ｌ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ｍ．Ｒ．Ｒｈｏｄｅｓ、およびＨ．Ｈ．Ｓａｎｅｉｉ編、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ、１９９８；“Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版）”、Ｍ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９３；“Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版）”、Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＡ．Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、１９９４；および“Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ”、Ｐ．Ｊ．Ｋｏｃｉｅｎｓｋｉ編、Ｇｅｏｒｇ  Ｔｈｉｅｍｅ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ（ドイツ）、１９９４を参照のこと）。
【００９８】
したがって、Ｕは、上記のような広範囲の官能基の残基を表すことができる。部分保護基法または無保護基法の場合、Ｕ、および標的分子に存在するその相互反応性の官能基には、他の官能基が反応系に存在してもよいが、反応性を有しない化学選択的な反応対が用いられる。これには、アミン捕獲法（例えば、ヘミアミナール形成による連結、イミン形成による連結およびマイケル付加による連結）、チオール捕獲法（例えば、メルカプチド形成による連結、ジスルフィド交換による連結）、天然の化学的連結法（例えば、システインまたはチオールを含有する側鎖アミノ酸誘導体を伴うチオエステル交換による連結）、および直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）連結カップリング法（例えば、チアゾリジン形成による連結、チオエステル交換による連結、チオエステル形成による連結、ジスルフィド交換による連結、およびアミド形成による連結）が容易であるＵ基が含まれる（例えば、Ｃｏｌｔａｒｔ，ＤＭ．、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２０００）５６：３４４９〜３４９１を参照のこと）。
【００９９】
好ましいＵは、天然の化学的連結（Ｄａｗｓｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６〜７７９；Ｋｅｎｔ他、国際特許出願公開ＷＯ９６／３４８７８）、拡張された一般的な化学的連結（Ｋｅｎｔ他、国際特許出願公開ＷＯ９８／２８４３４）、オキシム形成の化学的連結（Ｒｏｓｅ他、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：３０〜３３）、チオエステル形成の連結（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：２２１〜２２５）、チオエーテル形成の連結（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．（１９９５）３６（４８）：８８７１〜８８７４）、ヒドラゾン形成の連結（Ｇａｅｒｔｎｅｒ他、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）５（４）：３３３〜３３８）、ならびにチアゾリジン形成の連結およびオキサゾリジン形成の連結（Ｚｈａｎｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）９５（１６）：９１８４〜９１８９；Ｔａｍ他、国際特許出願公開ＷＯ９５／００８４６）などの水性の適合し得る連結化学反応において用いられる１つしか存在しない官能基の残基を含むか、または他の方法（Ｙａｎ，Ｌ．Ｚ．およびＤａｗｓｏｎ．Ｐ．Ｅ．、「脱イオウと組み合わせた天然の化学的連結によるシステイン残基を有しないペプチドおよびタンパク質の合成」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００１、１２３、５２６〜５３３（これは参考として本明細書中に組み込まれる）；Ｇｉｅｓｅｌｎａｎ他、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２００１、３（９）：１３３１〜１３３４；Ｓａｘｏｎ，Ｅ．他、「アミド結合の化学選択的合成に対する「無痕跡」スタウジンガー連結」、Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．２０００、２、２１４１〜２１４３）によって用いられる１つしか存在しない官能基の残基を含む。
【０１００】
上記のような様々な結合化学反応を考えた場合、Ｕが標的分子に結合する官能基の残基であるとき、Ｕは、カルボナート、エステル、ウレタン、オルトエステル、アミド、アミン、オキシム、イミド、ウレア、チオウレア、チオエーテル、チオウレタン、チオエステル、エーテル、チアゾリジン、ヒドラゾン、オキサゾリジンなどから選択される結合の残基を含み得ることが明らかである。好ましい結合はオキシム結合およびアミド結合である。
【０１０１】
上記のように、Ｂは、３つ以上のアームを有する分岐コア成分であり、存在していても非存在していなくてももよい。Ｂが存在するとき、１つのアームがＵに結合しているか、またはＵに結合したスペーサーもしくはリンカーに結合しており、他のアームはそれぞれ、Ｐｏｌｙｍｅｒに結合しているか、またはＰｏｌｙｍｅｒに結合したスペーサーもしくはリンカーに結合している。分岐コアＢの例には、アミノ、アミド、カルボン酸およびそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。これらには、リジンおよび／またはアルギニンのオリゴアミドまたはその組合せ、あるいはアルカンジアミンおよびアクリル酸から調製されるオリゴマー（「ポリアミドアミン」）が含まれ、後者は、分岐コアにおいて正味の正荷電をもたらす（例えば、Ｚｅｎｇ他、Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．（１９９６）２：６６〜７２；Ｒｏｓｅ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．（１９９６）７（５）：５５２〜５５６；ＮｏｖｏＢｉｏｃｈｅｍカタログおよびＰｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎ、２００１；Ｗｅｌｌｓ他、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（１９９８）４７：３８１〜３９６；Ｍａｈａｊａｎ他、（１９９９）４０：４９０９〜４９１２；Ｊｕｄｓｏｎ他、（１９９８）３９：１２９９〜１３０２；Ｓｗａｌｉ他、（１９９７）６２：４９０２〜４９０３；米国特許第５，９３２，４６２号、同第５，９１９，４５５号、同第５，６４３，５７５号、同第５，６８１，５６７号を参照のこと）。多くの他の種々の分岐コアをこの目的のために使用することができ、そして好適であり、これには、置換されたジアミン、置換された二酸、グリセロールなどのアルキル酸、そして多価のアルキル成分、アリール成分、ヘテロアルキル成分、ヘテロアリール成分およびアルコキシ成分などを含む３つ以上の官能基または活性化可能な基を有する他の成分、そしてオリゴ糖が含まれる（例えば、Ｎｉｅｒｅｎｇａｒｔｅｎ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．（１９９９）４０：５６８１〜５６８４；Ｍａｔｔｈｅｗｓ他、Ｐｒｏｇ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．（１９９８）１〜５６；Ｓｕｎｅｒ他、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０００）３３：２５３；Ｆｉｓｃｈｅｒ他、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（１９９９）３８：８８４；Ｓｕｎｄｅｒ他、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．（２０００）１２：２３５；Ｍｕｌｄｅｒｓ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．（１９９７）３８：６３１〜６３４；Ｍｕｌｄｅｒｓ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．（１９９７）３８：３０〜３０８８；およびＴｕｒｎｂｕｌｌ他、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ（２０００）１（１）：７０〜７４）。
【０１０２】
好ましい分岐コアは、アミノ、カルボキシル基、ならびに混合アミノおよび混合カルボキシル基である。さらにまた、好ましい分枝状ポリマー構築物は、分岐が１つの分岐コア（例えば、オリゴアミドコアまたはポリアミドアミンコア）から生じているポリマー構築物である。しかし、他のクラスの分枝状構築物を用いることができ、例えば、ポリマー骨格に沿って分布する一連の多数の分岐コアから分岐が生じているイモムシ様構造体を用いることができる（Ｓｃｈｌｕｔｅｒ他、Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．（２０００）３９：８６４）。化学的組成および／またはポリマー骨格および繰り返しユニットの嵩高さに依存して、得られるイモムシ様構造体は、水溶性であるように、または液晶組織を誘導しやすいように設計することができ（Ｏｕａｌｉ他、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（２０００）３３：６１８５）、これは、配送用途、安定性および作用継続期間のためには好都合であり得る。本発明の他の分枝状ポリマー構築物の場合と同様に、このイモムシ様構築物は、Ｕを含むペンダント官能基を含有するように生成される。
【０１０３】
式Ｕ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊの水溶性ポリマーの成分であるＰｏｌｙｍｅｒには、上記のような水溶性ポリマーが含まれる。好ましいＰｏｌｙｍｅｒ成分は下記から選択される：（ａ）ポリアルキレンオキシド（ポリエチレンオキシド）およびその誘導体を含むポリマー（それらのホモポリマーおよびコポリマーを含む）、例えば、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、およびそれらの誘導体など、この場合、そのようなホモポリマーおよびコポリマーは非置換であるか、または１つの端部においてアルキル基で置換される；（ｂ）ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル；（ｃ）ポリビニルピロリドン；（ｄ）ポリオキシエチル化ポリオール（プルロニックポリオールを含む）；（ｅ）ポリエステル、例えば、ポリ（グリコール酸）、ポリ（Ｌ−乳酸）、ポリ（Ｄ−乳酸）、ポリ（ＤＬ−乳酸）、ラクチド／グリコリドコポリマー、ポリ（ｐ−ジオキサノン）およびコポリマー、ポリカプロラクトン、ＰＥＧ−ポリエステルコポリマー、ポリ（リン酸エステル）；（ｆ）ポリ（オルトエステル）；（ｇ）ポリ無水物；（ｈ）プソイド−ポリ（アミノ酸）；および（ｉ）ポリグリセロール；その他。これらの中で、好ましいＰｏｌｙｍｅｒはポリアルキレンオキシドを含み、特に、式（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎまたは式（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｎ（式中、ｎは２以上である）のポリエチレンオキシドおよびその誘導体（それらのホモポリマーおよびコポリマーを含む）を含む（例えば、“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ｊ．Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）；および“Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”、Ｊ．Ｍ．ＨａｒｒｉｓおよびＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ編、ＡＣＳ（１９９７）を参照のこと）。
【０１０４】
より好ましいＰｏｌｙｍｅｒ成分は、水溶性ポリマーであるＵ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊの全てが段階的な合成で製造される場合である。このことは、これらのポリマーが正確な分子量および規定された構造を有することを意味する。対照的に、重合プロセスである通常のポリマー合成は、鎖が種々の長さを有する混合物をもたらし、したがって、分離することが不可能ではないが困難である様々な分子量およびサイズの分布が存在する。分子的純度の制御が可能であることは、水溶性ポリマーが結合している単分散の合成タンパク質が構築され得るという点で好都合である。このことは、不均一な化合物から生じる性質が変動するのを避けることができ、そして最も好ましい性質を有するそのような化合物のみを比較的容易に調製および単離することができるという点で重要な利点を表している。
【０１０５】
最も好ましいＰｏｌｙｍｅｒ成分は、国際特許出願公開ＷＯ００／１２５８７に記載されるような式−［Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］ｎ−または式−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｘ−Ｃ（Ｏ）］ｎ−（式中、ｎは１〜１００（より好ましくは２〜１００）の正の整数であり、ＸおよびＹは、例えば、アミド結合により連結される精密な構造の生体適合性の繰り返しエレメントである）のポリアミドを含む。ＸおよびＹは二価の基などであり得る。ＸおよびＹは同じまたは異なっていてもよく、分枝状または直鎖状であってもよい。非常に好ましい例においては、ＸおよびＹの少なくとも１つが水溶性ポリマーの繰り返しユニットを含む。
【０１０６】
Ｘ、Ｙに対する好ましい水溶性の繰り返しユニットは、ポリアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、およびそれらの誘導体（それらのホモポリマーおよびコポリマーを含む）を含む。この場合、そのようなホモポリマーおよびコポリマーは非置換または置換で、直鎖状または分枝状であり得るし、そしてアルキル基、アリール基、アリールアルキル基などを含む隣接基、例えば、ポリオキシエチル化ポリオール（プルロニックポリオールを含む）、およびＣ１〜Ｃ１８の脂肪族隣接基を含むことができる。小さい変化には、式−［Ｃ（Ｏ）−Ｘ−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｙ−ＮＨ］ｎ−または式−［ＮＨ−Ｙ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）］ｎのポリアミドが含まれることが理解される。Ｘ’およびＹ’は、ＸおよびＹの下位実施形態であって、この場合、Ｘ＝Ｘ’−ＮＨまたはＮＨ−Ｘ’で、Ｙ＝Ｙ’−ＮＨまたはＮＨ−Ｙ’である。Ｘ’、Ｙ’に対するより好ましい水溶性の繰り返しユニットは式（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）ｎまたは式（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−）ｎ（式中、ｎは２〜５０、３〜２５、３〜１０で、より好ましくは３〜５である）のポリエチレンオキシドを含む。
【０１０７】
上記のように、成分Ｊは、中性または正または負から選択される正味の荷電を生理学的条件下で有する任意の基であり得る。これには、置換または非置換のアルキル基、アリール基、アリールアルキル基、アシル基およびカルボニル基、そして同様にそれらの塩が含まれる。そのような基は、アミノ酸、核酸、脂肪酸、炭水化物およびそれらの誘導体の要素であり得るし、そしてキチン、キトサン、ヘパリン、硫酸ヘパラン、コンドロイチン、硫酸コンドロイチン、デルマタンおよび硫酸デルマタン、シクロデキストリン、デキストラン、ヒアルロン酸、リン脂質、シアル酸などである成分であり得る。Ｊは、好ましくは、カルボキシル、アミノ、チオール、ヒドロキシル、ホスホリル、グアニジニウム、イミダゾールおよびそれらの塩から選択されるイオン性の成分を含む。最も好ましいものは、Ｊがイオン性のカルボキシラート成分を含み、かつ生理学的条件下で正味の負荷電を有する場合である。
【０１０８】
本発明によれば、ポリマーの不均一性、多様性および不適合性の問題に対する好ましい解決は、ポリペプチド（精密な長さ、便利な合成）およびグリコシル化模倣基（「糖模倣基」、プロテアーゼ感受性を有しない柔軟な両親媒性の非免疫原性ポリマー）の両方の利点を併せ持つ新しいクラスの生体適合性ポリマーを製造することを伴う（Ｒｏｓｅ，Ｋ．他、米国特許出願第０９／３７９，２９７号；これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１０９】
そのような好ましいＰｏｌｙｍｅｒの好ましい実施形態において、−［Ｃ（Ｏ）−Ｘ−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｙ−ＮＨ］ｎ−または−［ＮＨ−Ｙ−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｘ−Ｃ（Ｏ）］ｎ、ＸおよびＹは、反応性の官能基を有しない二価有機基であるか、または非存在であり、そして同じまたは異なっていてもよく、そしてそれぞれの繰り返しユニット（ｎ）について独立的に変化させることができる。好ましくは、ｎ＝２であるとき、ＸまたはＹの少なくとも１つは、置換、非置換、分枝状および直鎖状の脂肪族基および芳香族基からなる群から選択される。より好ましくは、そのような二価有機基は、フェニル基、Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン部分、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、ヘテロ原子含有フェニル基、ヘテロ原子含有Ｃ１〜Ｃ１０アルキレン部分、ヘテロ原子含有Ｃ１〜Ｃ１０アルキル基、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【０１１０】
特に好ましい糖模倣部分は、下記の式：
−｛ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ｝ｎ−
（式中、ｎは、好ましくは１から１００まで変化し、より好ましくは２から１００まで変化する）
または
−｛ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ２）２−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（ＯＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−｝ｎ−
（式中、ｎは、好ましくは１から５０まで変化し、より好ましくは２から５０まで変化する）
によって表すことができる。特に好ましい糖模倣基はｎ＝１２を有し、Ｘは−（ＣＨ２）２−であり、Ｙは、
−（ＣＨ２）３Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）３−
である。
【０１１１】
本発明の糖模倣部分は様々な方法のいずれかによっても合成することができる。しかし、そのような成分は、好ましくは、重合プロセスより、むしろ、ユニットの固相での段階的な鎖組立て法を使用して生成される。そのような組立てプロセスの使用により、調製物の成分が、それらの長さ、それらのＸ置換基およびＹ置換基の性質、分岐点の位置（存在する場合）、ならびに任意の分岐の長さ、Ｘ置換基およびＹ置換基、そして位置に関して、規定され且つ均一な構造を得るることができる。好ましくは、そのような成分は、例えば、下記のステップによって合成される：
（ａ）式Ｚ−Ｑ−担体の化合物のアミノ基またはヒドロキシル基を、式ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨを有する二酸の誘導体のモル過剰量でアシル化するステップ（こで、ＺはＨ２Ｎ−またはＨＯ−であり、Ｑはリンカーまたは標的分子であり、担体は固相、マトリックスまたは表面である）；
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物の自由なカルボキシル基を活性化するステップ；
（ｃ）ステップ（ｂ）の生成物を、式ＮＨ２−Ｙ−ＮＨ２を有するジアミンのモル過剰量でアミノリシスするステップ；および
（ｄ）場合により、ステップ（ａ）〜ステップ（ｃ）を、ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨおよびＮＨ２−Ｙ−ＮＨ２を使用して繰り返すステップ（ここで、上記のＸおよびＹは二価有機基であるか、非存在であり、そして同じまたは異なり、そして上記の場合により繰り返されるユニットのそれぞれについて独立して変化させることができ、そして以前のアシル化ステップおよびアミノリシスステップのいずれにおいても使用されたＸ置換基およびＹ置換基と同じまたは異なる）。
【０１１２】
好ましい実施形態において、上記繰り返しユニットの６量体、１２量体、１８量体および３２量体が用いられる。所望する場合には、繰り返しユニットは、例えば、分枝状の糖模倣構造を形成させるために、リジンのアミノ基との組合せで使用することができる。糖模倣基は、チオエーテル連結形成、オキシム連結形成およびアミド連結形成を含む様々な化学反応によって本発明の合成タンパク質に結合させることができる。
【０１１３】
１つの実施形態において、ユニットの固相での段階的な鎖組立ては下記のステップを含む：
ステップ１：保護または非保護の二酸を樹脂上のアミノにカップリングして、連結部位においてアミド結合を生じさせること（この場合、ＰＧは、用いられる二酸に依存して存在または非存在である保護基である）：
ＰＧ−ＯＯＣ−Ｘ−ＣＯＯＨ  ＋  ＮＨ２−Ｙ−ＮＨ−樹脂
ステップ２：存在する場合には、樹脂上の保護基（ＰＧ）を除去すること：
ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−樹脂
ステップ３：保護または非保護のジアミノを樹脂上のカルボキシにカップリングして、連結部位においてアミド結合を生じさせること（ここで、ＰＧは、用いられるジアミノに依存して存在または非存在である）：
ＰＧ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ  ＋  ＨＯＯＣ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−樹脂
ステップ４：存在する場合には、樹脂上の保護基（ＰＧ）を除去すること：
−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−ＯＣ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ−樹脂
ステップ５：ステップ１〜ステップ４を「ｎ」回繰り返して、「ｎ」個のユニットを付加し、その後、樹脂から切断すること：
−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］−［ＣＯ−Ｘ−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−ＮＨ］−
【０１１４】
３．本発明の水溶性ポリマーの合成
本発明の水溶性ポリマーは様々な方法のいずれによっても合成することができる。図１Ａ〜図１Ｅは、水溶性ポリマー（本明細書中に定義されるようなＵ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊ＊）を、連結前または連結後またはその組合せで、部分的または完全に保護されていないペプチドセグメント
【化１】
2004517040.tif 000004
に結合することを含む連結スキームを示す。図１Ａ〜図１Ｄにおいて、Ｙａａは、Ｙａａとの化学選択的な化学的連結が可能な１つしか存在せず且つ相互反応性のＮ末端アミノ酸Ｘａａ（例えば、アミノ末端システイン）成分を有する第２のペプチドセグメントに対する化学的連結のための１つしか存在しない化学選択的な成分を有する第１のペプチドセグメントにおけるＣ末端アミノ酸（例えば、α−カルボキシルチオエステルを有するアミノ酸）を表す。ＹａａとＸａａとの間での化学選択的な反応により、共有結合による連結（例えば、アミド結合）がそれらの間に生じる。したがって、ＹａａおよびＸａａは化学選択的な連結対形成を形成する。これらの図に示されるように、Ｕｎ−は、第２の１つしか存在しない化学選択的な成分を表し、この化学選択的な成分は、アミノ酸の側鎖において使用者によって規定される正確な部位において取り込まれており、そして水溶性ポリマーＵ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊ＊の基Ｕ−に対して化学選択的であり、基Ｕ−と相互に反応し得る。例えば、Ｕｎが、ケトン基を有するように修飾されている側鎖であるとき、水溶性ポリマーＵ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊ＊のＵ−は、ケトンと反応するための化学選択的な基であり、例えば、オキシム結合をそれらの間に生じさせるアミノオキシ基である。Ｕｎ−の添え字「ｎ」は、化学選択的な基Ｕを有するように設計されたアミノ酸およびその側鎖の数を表し、例えば、使用者によって規定される２つの特異的な部位がポリマー修飾される場合、ｎ＝２であり、これはまた、Ｕ２またはＵｎ＝２として表すことができる。すべての場合において、ｎは、意図的に精密に制御される正の整数である。したがって、ＵｎおよびＵは、ＸａａおよびＹａａの化学選択的な基との適合性および非反応性を有する第２の化学選択的な連結対形成を表す。図１Ａおよび図１Ｂには、２つの異なる潜在的な反応が例示されている。第１の示された反応では、Ｕｎ官能性を有するポリペプチド鎖が第２のポリペプチドに連結され、その後、ポリマー修飾されたポリペプチドを得るためにＵ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊ＊成分と反応させられる。第２の示された反応では、Ｕｎ官能性を有するポリペプチド鎖が、ポリマー修飾されたポリペプチドを得るためにＵ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊ＊成分と反応させられ、その後、より大きいポリマー修飾されたポリペプチドを得るために第２のポリペプチドに連結される。これらの図は、図１Ａでは、Ｘａａ残基を有するポリペプチドがポリマー修飾を受けることになり、これに対して、図１Ｂでは、Ｙａａ残基を有するポリペプチドがポリマー修飾を受けるという点で異なる。図１Ｃは、多数のポリペプチド鎖が、より大きいポリペプチドを形成させるためにそれらの連結前またはそれらの連結後のいずれかで本発明によって修飾され得ることを例示している。図１Ｄにおいて、ＰＧおよびＰＧ’は保護基を表しており、ＰＧ’は直交的に保護する基を示す。すなわち、ＰＧおよびＰＧ’は、異なる条件のもとで除去可能であり、したがって異なる水溶性ポリマーがＵｎ基に対して同じ化学反応によって結合する場合、またはＵｎ基が、ポリマーで修飾することが望まれない側鎖官能基（例えば、水溶性ポリマーのＵ基が一級���ミノまたは側鎖チオールともっぱら反応するように設計されている場合、反応性の−ＮＨ２または−ＳＨを有する側鎖）を表す場合には有用である。図１Ｄは、本発明の方法に従って連結されているポリペプチドの所望する側鎖を保護するために、保護基が用いられ得ることを示している。
【０１１５】
図１Ｅには、図１Ａ〜図１Ｄに従った連結およびポリマー修飾において用いられるペプチドセグメントに存在していても存在していなくてもよい基の多様性が例示される。
【０１１６】
図２Ａ〜図２Ｃには、本発明の合成された生物活性なタンパク質を調製するためのプロセスのさらなる概略図が示される。具体的には、図２Ａ〜図２Ｂには、水溶性ポリマーＵ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊ＊を連結部位においてアミノ末端基Ｘａａの側鎖（例えば、システインの側鎖チオール）に結合させることを伴う連結スキームが示される。図２Ｃには、図２Ａ〜図２Ｂに従った連結およびポリマー修飾において用いられるペプチドセグメントに存在していても存在していなくてもよい基の多様性が例示される。
【０１１７】
図３Ａ〜図３Ｂには、３つ以上の重複しないペプチドセグメントの化学的連結を伴う多セグメント連結を達成するためのプロセスのさらなる概略図が示される（すなわち、少なくとも１つのセグメントが、最終的な全長の連結生成物に対応する中央のセグメントである）。この様式で調製されるペプチドは、例えば、図１Ａ〜図１Ｅ、図２Ａ〜図２Ｃおよび図４Ａ〜図４Ｃに示されるように、別の連結反応に関与するペプチドセグメントを調製するために使用することができる。一般に、多セグメント連結の場合、中央のセグメント（１つまたは複数）は、用いられる連結化学反応に依存するペプチドの環化またはコンカトテマー（ｃｏｎｃａｔｏｍｅｒ）形成を避けるために、保護されたＸａａ基または保護されたＹａａ基のいずれかを有する。逐次的または連続的な連結のために、中央セグメントのＸａａ基は保護され（例えば、Ｃｙｓ（Ａｃｍ））、一方、Ｙａａ基は保護されない（例えば、Ｙａａ−ＣＯＳＲ、式中、−ＣＯＳＲはα−カルボキシルチオエステルである）。この場合、Ｙａａ基は、保護されていないＸａａ基を有し、かつ自由なＹａａ基を有しない別のペプチドと自由に反応することができる。連結後、保護基は除かれ、Ｘａａ基が次の連結反応のために再生される。このプロセスは必要に応じて続けることができ、それにより、伸長したペプチド鎖が生じる。Ｙａａ基の保護は、４つ以上のセグメントから構成される最終的な連結生成物を製造することを伴う収束的な化学的連結には特に有用である。例えば、４つのセグメントを連結すること（すなわち、３回の連結反応）から得られるタンパク質標的の場合、タンパク質の一方の端部に対応する２つのセグメントと、タンパク質の他方の端部に対応する２つのセグメントとを、逐次的とは対照的に、同時に連結させることができ、そしてこの２つの端部を最後の連結反応において結合させることができる。そのような収束的化学的連結スキームが、米国特許出願第６０／２３１，３３９号（これは参考として組み込まれる）において、チオエステル媒介による化学的連結反応（例えば、天然の化学的連結および拡張された天然の化学的連結）のために記載されている。ここで再度ではあるが、そのようなペプチドセグメントに存在していても存在していなくてもよい基の多様性が図１Ｅ、図２Ｃおよび図４Ｃに例示される。
【０１１８】
図４Ａ〜図４Ｃには、生じる側鎖チオールの天然の化学的連結および化学的修飾が、本発明の原理に従っていかに達成され得るかが例示される。具体的には、図４Ａ〜図４Ｂには、チオアルキル化、そしてチオエーテル結合を含む化学修飾された（Ψで示される）側鎖の生成を介して（ΨＸａａで示される）「プソイドアミノ酸」を形成させるために、連結部位（１つまたは複数）における生じたシステイン側鎖チオールの天然の化学的連結および化学的修飾を使用することが示される。示されていない別の実施形態において、側鎖チオールは脱イオウ反応でアラニンに変換することができる（Ｌｉａｎｇ他、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００１）１２３（４）：５２６〜５３３）。両反応の重要な面は、カルボキシ末端Ｙａａ基を有するセグメントが保護されたアミノ末端Ｘａａ基を含む場合（すなわち、例として、図４Ｂにおいて示されるＰＧ−Ｘａａ−ペプチド）、変換または修飾することが望まれないどちらかの側鎖チオールが好適な保護基（ＰＧ）で保護されるか、または多セグメント連結および直交的な保護基（ＰＧ’）で保護されるということである。図４Ｃには、図４Ａ〜図４Ｂならびに図１Ａ〜図１Ｅ、図２Ａ〜図２Ｃおよび図３Ａ〜図３Ｂに従った連結およびポリマー修飾に用いられるペプチドセグメントの中に存在していても存在していなくてもよい基の多様性が例示される。
【０１１９】
図５Ａ〜図５Ｂには、本発明の水溶性ポリマーＵ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊ＊の分岐コア（Ｂ）および１つしか存在しない化学選択的な官能基（Ｕ）を生成するための固相プロセスが示される。示されるような固相法が好ましいが、このプロセスは溶液中で行うことができる。具体的には、図５Ａは、反応性基
【化２】
2004517040.tif 000005
を有する直交的に保護されたＵ−Ｂ前駆体成分を示しており、そのような構築の基本的な幾何構造が、結合で連結されたドット：
【化３】
2004517040.tif 000006
によって示されている；この基本的な幾何構造は、用いられる化学的連結または基のタイプに限定することを意図するのではなく、構造を組み立てるための幾何学的な相対的な点および本発明のＵ−Ｂ成分を生成するための好適な化学的処理点を単に例示しているにすぎない。直交的に保護されたＵ−Ｂ前駆体は、Ｕ−Ｂ前駆体に対する共有結合による連結が可能である活性化の後、好適な切断可能なリンカー基および共反応性基
【化４】
2004517040.tif 000007
を含むポリマー担体／樹脂にカップリングされる：
【化５】
2004517040.tif 000008
【０１２０】
このシステムでは、ポリマー担持による有機化学の原理が用いられる。カップリング後、分岐コアが、所望するＰｏｌｙｍｅｒ成分（実質的に非抗原性の水溶性直鎖状ポリマーなど）のその後の結合のための好適な分岐コアを生成するために、例示されるように処理される（第１の分岐点のみが示されているが、さらなる分岐点は存在していても存在していなくてもよい）。Ｕ基もまた示されているが、これは、直交的に保護されたＵ−Ｂ前駆体の一部として合成の最初で提供され得るか、または分岐コアＢを処理中もしくはその処理後において処理することができる。Ｐｏｌｙｍｅｒ成分の結合を、樹脂上で、すなわち、切断に先立って達成することができるが、好ましい経路は、Ｐｏｌｙｍｅｒ成分のその後の結合のために精製することができるＵ−Ｂコアが生じるようにＵ−Ｂ成分をポリマー担体／樹脂から切断することである。例示されているように、コア基Ｂのペンダント状の分岐点は、官能基（Ｆｕｎｃ）を含むように組み立てられる。この官能基（Ｆｕｎｃ）は同じまたは異なっていてもよく、そして可逆的に保護され得るか（ＰＧ、ＰＧ’またはＰＧ”）、または非保護であり得る。それぞれの場合において、Ｐｏｌｙｍｅｒ成分を結合するための最終的な段階は、ペンダント状の分岐点における官能基（Ｆｕｎｃ）の生成、および基Ｕの生成を伴う（図７を参照のこと）。図５Ｂには、保護されたＵ−Ｂ前駆体が、切断時に所望する保護されたＵ基または非保護のＵ基をもたらすリンカーを有するポリマー担体と組み合わせて用いられる別のプロセスが示される。図５Ｂにはまた、事前に組み立てられた分岐コアＢをポリマー担体に結合すること、およびＰｏｌｙｍｅｒ成分のその後の結合のためにＵ−Ｂ成分を生成するためのＵ基生成樹脂の使用が示される。
【０１２１】
図６Ａ〜図６Ｄには、Ｕ−Ｂコアへのその後の結合のための本発明の好ましい実質的に非抗原性の水溶性ポリアミドＰｏｌｙｍｅｒ−Ｊ＊成分を生成するための固相プロセスが示される。好ましいプロセスである固相プロセスが例示されているが、液相プロセスを適合させて、同じ最終結果を達成することができる。図６Ａおよび図６Ｂでは、二酸ユニットおよびジアミノユニットが、固相有機化学の原理を使用してカップリングされる。場合により、保護されたアミノ−Ｘ’−酸ユニットおよび／またはアミノ−Ｙ’−酸ユニットを、式−［ＮＨ−Ｙ−ＮＨＣＯ−Ｘ−ＣＯ］−のポリアミド構造を有する最終的な切断生成物における基Ｘおよび基Ｙのさらなる多様性のために取り込むことができる。図６Ａは合成をＮ末端からＣ末端の方向で示しているが、図６Ｂは合成をＣ末端からＮ末端の方向で示している。図６Ｃおよび図６Ｄでは、保護されたアミノ−Ｘ’−酸ユニットおよび／またはアミノ−Ｙ’−酸ユニットが、固相有機化学の原理を使用してカップリングされる。図６Ｃは合成をＮ末端からＣ末端の方向で示しているが、図６Ｄは合成をＣ末端からＮ末端の方向で示している。図６Ａ〜図６Ｄから明らかであるように、最終的なポリアミド生成物の性質を精密に制御することができ、その性質は、合成のために行われるサイクル数に依存している。さらに、ペンダント基Ｊ＊は、使用者によって規定される事実上すべての仕様に合わせて組み立てることができる。単分散の繰り返しユニットＸ、Ｙ、Ｘ’およびＹ’が用いられる場合、最終的なポリアミド生成物の正確な分子構造を精密に制御することができる。
【０１２２】
式Ｕ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊ＊の本発明の好ましい合成ポリマー構築物を生成するためにＵ−Ｂ成分をＰｏｌｙｍｅｒ−Ｊ＊成分にカップリングするための好ましいプロセスが図７に示される。例示されているように、様々な保護基が提供され得るが、それらは、所与構築物の意図された最終的な使用に依存して必要に応じて使用される。また、所望するＵ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊ＊構築物を製造するための種々の経路が例示されているが、これには、固相法および液相法が含まれる。
【０１２３】
図８には、本発明の生物活性な合成タンパク質の連結および製造のために用いることができるペプチドセグメントに水溶性ポリマーを精密に結合させるための別の経路が示される。最初の段階では、ポリマー結合のために標的化されたアミノ酸側鎖が直交的な保護基で保護されている固相ペプチド合成（「ＳＰＰＳ」）（例えば、Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳまたはＢｏｃ  ＳＰＰＳ）が用いられる（例えば、Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳを使用する場合には、Ｂｏｃ基を、ポリマー結合部位を保護するために使用することができ、またはＢｏｃ  ＳＰＰＳを使用する場合には、Ｆｍｏｃ基を直交的な保護基として用いることができる）。ペプチド合成の後、ペプチドのそれ以外の部分が保護されたまま、直交的な保護基が選択的に除かれる。これにより、単一の結合部位が次の段階（すなわち、固相ポリマー合成）のために得られる。直交的な保護基が除かれると、ポリマー鎖が前駆体として結合させられる。より好ましくは、ポリマー鎖は、図６Ａ〜図６Ｄに示されるいずれかのプロセスを使用するポリマー合成を連続して繰り返すことによって組み立てられる。１つのポリマー結合部位が示されているが、２つ以上が提供され得る。
【０１２４】
４．前駆体ケモカイン
第３の要素は、結合するケモカイン受容体のダウンモジュレーションを特徴とする最適なｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性を有するポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインの生成に関する。これには、（効力が、関連するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系アッセイにおけるＥＣ５０によって見積もられる場合）、ポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインの所望する効力の範囲よりも約１倍〜約５倍以上大きく、好ましくは約５倍〜１０倍以上大きい効力を有する前駆体ケモカイン（すなわち、それに対する水溶性ポリマーの結合のために選ばれる標的ケモカイン）を選択することが含まれる。
【０１２５】
例として、ウイルス感染の阻害に対して所望するＥＤ５０を有するポリマー修飾されたＲａｎｔｅｓ類似物を含む合成ケモカインを同定する際、非ポリマーで修飾された前駆体類似物のパネルが合成され、ＨＩＶ感染について細胞融合アッセイにおいてスクリーニングされた。ポリマー修飾された形態の標的抗融合効力は、約２０ｎＭ以上である野生型Ｒａｎｔｅｓと比較して、１０ｎＭ以下の範囲に設定された。所望する前駆体Ｒａｎｔｅｓケモカインを生成する際には、一連の修飾が、（１）Ｎ末端残基、（２）Ｎ末端領域までの内部、そして（３）Ｃ末端領域に対して行われた。特に強力な前駆体類似物が見出され、これは、野生型Ｒａｎｔｅｓの１位に対応するセリンがｎ−ノナノイル部分で置換され、野生型Ｒａｎｔｅｓの３位に対応するチロシンがＬ−シクロヘキシルグリシンで置換され、そして脂肪酸成分が、ジペプチド（Ｌｙｓ６９−Ｌｅｕ７０）リンカー部分を介してＣ末端残基に結合していた。さらにより強力な類似物が見出され、これは、これらの変化を、野生型Ｒａｎｔｅｓの２位に対応するプロリンをＬ−チオプロリンで置換することとの組合せを含んでいた。これらの変化の１つまたは複数を含有するそのようなＲａｎｔｅｓ類似物のＣ末端部位において直鎖状または分枝状の水溶性ポリマーを結合させたときに、ポリマー修飾された形態の所望する標的抗融合効力が達成できることが見出された。すなわち、ウイルス感染の阻害に対するＥＤ５０が１０ｎＭ以下の範囲にある、Ｒａｎｔｅｓの類似物を含む一連の合成ケモカインが得られた。具体的には、直鎖状水溶性ポリマー構築物および分枝状水溶性ポリマー構築物の両方を、野生型Ｒａｎｔｅｓにおける知られている凝集部位（野生型Ｒａｎｔｅｓの６６位のグルタミン酸に対応する６６位）に隣接するＣ末端部位（野生型Ｒａｎｔｅｓの６７位のメチオニンに対応する６７位）に結合させた。水溶性ポリマーをそのような部位において付加することにより、望ましくない凝集が破壊されただけでなく、ポリマー修飾された形態は効力の範囲を１０ｎＭ以下の標的範囲に有していた。この観測結果は、ポリマー修飾のために標的化された前駆体ケモカインが、（関連するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系アッセイにおけるＥＣ５０によって効力が見積もられる場合）、ポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインの所望する開始効力の範囲よりも約１倍〜約５倍以上大きく、好ましくは約５倍〜１０倍以上大きい効力を好ましくは有するという発見と一致している。さらに、Ｒａｎｔｅｓのポリマー修飾された類似物のそれぞれが、関連する動物モデル（例えば、ラットまたはマウス）において測定されたときに著しく改善された循環半減期を有することが見出された。前駆体ケモカインの効力を増大させる様々な変化を含むこの系統的な方法は他のケモカインに対して一般に適用可能である。したがって、そのような前駆体ケモカインの選択は、効力とｉｎ  ｖｉｖｏ血清循環半減期との好ましいバランスを示すポリマー修飾された生物活性な合成ケモカインを得るために利用することができる。
【０１２６】
Ｃ．本発明のケモカインの検出可能な標識
本発明の生物活性な合成ケモカインはまた、特定の選ばれた部位に導入された検出可能な標識（発蛍光団など）および他の置換基を含むことができ、これらは、ケモカインの作用、ウイルスの阻害などと関連した膜および細胞の生物学的事象のプローブに分子を変換し、同様に薬物動態学などをモニターするために分子を変換する。検出可能な標識は、好ましくは、本発明の生物活性な合成ケモカインのＣ末端領域に結合される。検出可能な標識はケモカインポリペプチド鎖の合成時またはケモカインポリペプチド鎖の合成後に取り込むことができる。一例として、検出可能な標識を、鎖組立てのときに連結前のペプチドセグメントに取り込むことができ、例えば、樹脂に結合しているペプチドにおける非保護の反応性基に発蛍光団を結合させ、その後、他の保護基を除去し、そして標識されたペプチドを樹脂から遊離させることは好都合であり得る。検出可能な標識を含むアミノ酸誘導体、およびそれらをペプチド配列またはポリペプチド配列に取り込むために使用された化学合成技術は十分に知られており、この目的のために使用することができる。この方法では、得られるケモカインポリペプチド鎖連結生成物は、予め選ばれた所定位置に１つまたは複数の検出可能な標識を含有するように設計することができる。あるいは、検出可能な標識は反応性の基に付加することができ、好ましくは、連結前のペプチドセグメントの所与アミノ酸に存在するか、または連結後のポリペプチド鎖にさえ存在する化学選択的な反応性の基（部位特異的な結合を可能にするケト基またはアルデヒド基など）に付加することができる。
【０１２７】
この目的のために好適な検出可能な標識には、光活性な基、ならびに発蛍光団および他の色素を含む発色団、またはビオチンなどのハプテンが含まれる。そのような標識は多くの種々の市販元から入手することができる（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｏｒｅｇｏｎ、米国）、Ｓｉｇｍａおよび支社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）、などを参照のこと）。樹脂上で標識する場合、フルオレセイン、エオシン、オレゴングリーン、ローダミングリーン、ロードルグリーン、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、クマリンおよびＮＢＤ発蛍光団、ダブシル発色団およびビオチンはすべて、フッ化水素（ＨＦ）ならびにほとんどの他の酸に対して適度に安定であり、したがって固相合成を介して取り込むことに対して適している（Ｐｅｌｅｄ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４）３３：７２１１；Ｂｅｎ−Ｅｆｒａｉｍ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４）３３：６９６６）。クマリンを除いて、これらの発蛍光団は、Ｆｍｏｃ化学を使用して合成されたペプチドの脱保護のために使用される試薬に対してもまた安定である（Ｓｔｒａｈｉｌｅｖｉｔｚ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９４）３３：１０９５１）。ε−ダブシル−Ｌ−リジンのｔ−Ｂｏｃ誘導体およびα−Ｆｍｏｃ誘導体もまた、ポリペプチド配列における選択された部分においてダブシル発色団を取り込むために使用することができる。ダブシル発色団は広い可視吸収を有しており、消光基として使用することができる。ダブシル基はまた、ダブシルスクシンイミジルエステルを使用することによってＮ末端において取り込むことができる（Ｍａｇｇｉｏｒａ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）３５：３７２７）。ＥＤＡＮＳは、ＦＲＥＴ実験におけるダブシル消光剤と対形成させるための一般的な発蛍光団である。この発蛍光団は、５−（（２−（ｔ−Ｂｏｃ）−γ−グルタミルアミノエチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸を使用することによって、自動化されたペプチド合成のときに都合よく導入される（Ｍａｇｇｉｏｒａ他、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）３５：３７２７）。α−（ｔ−Ｂｏｃ）−ε−ダンシル−Ｌ−リジンは、化学合成時にダンシル発蛍光団をポリペプチドに取り込むために使用することができる（Ｇａｕｔｈｉｅｒ他、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．（１９９３）３０６：３０４）。ＥＤＡＮＳの場合と同様に、この発蛍光団の蛍光はダブシルの吸収と重なる。ペプチドの部位特異的なビオチン化を、ビオシチンのｔ−Ｂｏｃ保護誘導体（Ｇｅａｈｌｅｎ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２）２０２：６８）または他のよく知られているビオチン化誘導体（ＮＨＳ−ビオチンなど）を使用して達成することができる。ラセミのベンゾフェノンフェニルアラニン類似物もまた、そのｔ−Ｂｏｃ保護またはＦｍｏｃ保護の後においてペプチドに取り込むことができる（Ｊｉａｎｇ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．（１９９５）４５：１０６）。ジアステレオマーの分割を生成物のＨＰＬＣ精製のときに達成することができる。非保護のベンゾフェノンもまた、この分野での標準的な技術によって分割することができる。���キシムカップリングのためにケトを有するアミノ酸、アザ／ヒドロキシトリプトファン、ビオチル−リじンおよびＤ−アミノ酸は、特に、樹脂上での標識のために利用することができるアミノ酸の例である。自動化されたペプチド合成のための他の保護されたアミノ酸は、この分野での標準的な技術に従ったカスタム合成によって調製することができる。別の実施形態において、本発明の生物活性な合成ケモカインは、それに結合した薬物を含むことができる（例えば、国際特許出願公開ＷＯ００／０４９２６を参照のこと）。
【０１２８】
Ｄ．本発明のケモカインの合成および水溶性ポリマーの結合
本発明の生物活性な合成ケモカインを製造する方法もまた提供される。この方法は、（ｉ）天然に存在するケモカインの類似物で、天然に存在するケモカインに対して実質的に相同的であるアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む類似物を合成すること、この場合、ポリペプチド鎖は、そのＮ末端、ＮループおよびＣ末端の１つまたは複数において、脂肪族鎖およびアミノ酸誘導体から選択された部分で修飾されている；そして（ｉｉ）対応する天然に存在するケモカインと比較して、ケモカイン類似物をアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることを伴う。
【０１２９】
具体的には、本発明のＮ末端修飾された生物活性な合成ケモカインを製造するための方法は、（ｉ）天然に存在するケモカインの類似物で、天然に存在するケモカインに対して実質的に相同的であるアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む類似物を合成すること、この場合、ポリペプチド鎖は、そのＮ末端において脂肪族鎖および１つまたは複数のアミノ酸誘導体で修飾されている；そして（ｉｉ）対応する天然に存在するケモカインと比較して、ケモカイン類似物をアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることを含む。本発明のＣ末端修飾された生物活性な合成ケモカインを製造するための方法は、（ｉ）天然に存在するケモカインの類似物で、天然に存在するケモカインに対して実質的に相同的であるアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む類似物を合成すること、この場合、ポリペプチド鎖は、そのＣ末端において脂肪族鎖または多環で修飾されている；そして（ｉｉ）対応する天然に存在するケモカインと比較して、ケモカイン類似物をアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることを含む。本発明のＮ末端修飾／Ｃ末端修飾された生物活性な合成ケモカインを製造するための方法は、（ｉ）天然に存在するケモカインの類似物で、天然に存在するケモカインに対して実質的に相同的であるアミノ酸配列を有するポリペプチド鎖を含む類似物を合成すること、この場合、ポリペプチド鎖は、そのＮ末端において脂肪族鎖および１つまたは複数のアミノ酸誘導体で修飾され、かつそのＣ末端において脂肪族鎖または多環で修飾されている；そして（ｉｉ）対応する天然に存在するケモカインと比較して、ケモカイン類似物をアンタゴニスト活性についてスクリーニングすることを含む。
【０１３０】
本発明の生物活性な合成ケモカインの合成は、化学的合成（すなわち、リボソームを伴わない合成）によって、または生物学的合成（すなわち、リボソームによる合成）と化学的合成との組合せによって達成される。化学的合成の場合、本発明の生物活性な合成ケモカインは、Ｆｍｏｃ法およびｔＢｏｃ法を使用する固相ペプチド合成または液相ペプチド合成などの段階的な鎖組立て技術またはフラグメント縮合技術によって全体を生成することができ、あるいは鎖組立てによるか、または鎖組立てと生物学的製造との組合せにより全体が生成されたペプチドセグメントの化学的連結によって全体を生成することができる。そのような段階的な鎖組立て技術またはフラグメント縮合技術および連結技術はこの分野では十分に知られている（例えば、Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８８）５７：９５７〜９８９；Ｄａｗｓｏｎ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９７）２８７：３４〜４５；Ｍｕｉｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９７）２８９：２６６〜２９８；Ｗｉｌｋｅｎ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９８）９：４１２〜４２６；Ｉｎｇｅｎｉｔｏ他、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９）１２１（４９）：１１３６９〜１１３７４；およびＭｕｉｒ他、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６：Ｒ２４７〜Ｒ２５６を参照のこと）。
【０１３１】
化学的連結の場合、Ｎ末端官能基を有する第１のペプチドセグメントが、Ｎ末端官能基と反応して、それらにおいてその間で共有結合による結合を形成するＣ末端官能基を有する第２のペプチドセグメントに連結される。選択された官能基に依存して、連結反応により、天然のアミド結合または非天然の共有結合による結合を連結部位において有する生成物が得られる。化学的連結のために用いられる第１のペプチドセグメントまたは第２のペプチドセグメントは、典型的には、段階的な鎖組立てまたはフラグメント縮合を使用して生成される。具体的には、本発明の生物活性な合成ケモカインがペプチドセグメントの連結によって生成されるとき、セグメントは、連結のために使用されると意図された化学選択的な反応化学に関して適切なペンダント状の化学選択的な反応性基を含有するように生成される。これらの化学反応には、天然の化学的連結（Ｄａｗｓｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６〜７７９；Ｋｅｎｔ他、国際特許出願公開ＷＯ９６／３４８７８）、拡張された一般的な化学的連結（Ｋｅｎｔ他、国際特許出願公開ＷＯ９８／２８４３４）、オキシム形成の化学的連結（Ｒｏｓｅ他、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：３０〜３３）、チオエステル形成の連結（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：２２１〜２２５）、チオエーテル形成の連結（Ｅｎｇｌｅｂｒｅｔｓｅｎ他、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔｓ．（１９９５）３６（４８）：８８７１〜８８７４）、ヒドラゾン形成の連結（Ｇａｅｒｔｎｅｒ他、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．（１９９４）５（４）：３３３〜３３８）、ならびにチアゾリジン形成の連結およびオキサゾリジン形成の連結（Ｚｈａｎｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９８）９５（１６）：９１８４〜９１８９；Ｔａｍ他、国際特許出願公開ＷＯ９５／００８４６）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３２】
特定の連結化学反応に対する反応条件は、連結成分の所望する相互作用を維持するように選択される。例えば、ｐＨおよび温度、ペプチドおよび成分の水溶性、ペプチドの比率、個々のペプチドの水分含有量および組成を、連結を最適化するために変化させることができる。ペプチドを種々の程度に可溶化する試薬の添加または排除を、所望する連結反応の特異性および速度を制御するためにさらに使用することができる。反応条件は、１つまたは複数の内部コントロールおよび／または外部コントロールと比較して、所望する化学選択的な反応生成物についてアッセイすることによって容易に決定される。
【０１３３】
化学的合成の好ましい方法では、天然の化学的連結が用いられ、これはＫｅｎｔ他の国際特許出願公開ＷＯ９６／３４８７８に開示され、そしてＮ末端および／またはＣ末端が化学修飾されたタンパク質を調製する方法がＯｆｆｏｒｄ他の国際特許出願公開ＷＯ９９／１１６６６に開示されている（これらの開示は参考として本明細書中に組み込まれる）。一般に、Ｃ末端チオエステルを含有する第１のペプチドが、酸化されていないスルフヒドリル側鎖を有するＮ末端システインを有する第２のペプチドと反応させられる。Ｎ末端システインの酸化されていないスルフヒドリル側鎖は、触媒量のチオール（好ましくは、ベンジルメルカプタン、チオフェノール、２−ニトロチオフェノール、２−チオ安息香酸、２−チオピリジンなど）の存在下でＣ末端チオエステルと縮合する。中間体のペプチドが、β−アミノチオエステル結合を介して第１のペプチドおよび第２のペプチドを連結することによって生成されるが、これは転位して、アミド結合により連結された第１のペプチドおよび第２のペプチドを含むペプチド生成物が生成される。
【０１３４】
化学的製造と生物学的製造との組合せの場合、１つのペプチドセグメントが化学的合成により生成され、一方、他方のペプチドセグメントが組換え法を使用して生成され、その後、これらのセグメントが、全長の生成物を生成するために、化学的連結を使用して結合させられる。例えば、インテイン（ｉｎｔｅｉｎ）発現システムを、「インテイン」タンパク質スプライシングエレメントの誘導可能な自己切断活性を利用して、Ｃ末端チオエステルペプチドセグメントを生成するために利用することができる。具体的には、インテインは、ＤＴＴ、ｂ−メルカプトエタノールまたはシステインなどのチオールの存在下で特異的な自己切断を受け、Ｃ末端チオエステルを有するペプチドセグメントをもたらす（例えば、Ｍｕｉｒ他、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６：Ｒ２４７〜Ｒ２５６；Ｃｈｏｎｇ他、Ｇｅｎｅ（１９９７）１９２：２７７〜２８１；Ｃｈｏｎｇ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９８）２６：５１０９〜５１１５；Ｅｖａｎｓ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）７：２２５６〜２２６４；およびＣｏｔｔｏｎ他、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６（９）：２４７〜２５６を参照のこと）。このＣ末端チオエステル含有ペプチドセグメントは、その後、Ｎ末端のチオエステル反応性官能基を有する第２のペプチド、例えば、天然の化学的連結のために用いられるようなＮ末端システインを有するペプチドセグメントなどを連結するために利用することができる。
【０１３５】
疎水性の脂肪族鎖およびアミノ酸誘導体を、鎖組立てのときに、または鎖組立ての後に、またはその組合せで取り込むことができる。鎖組立てのときに取り込まれる場合、アミノ酸誘導体および／または脂肪族鎖が結合しているアミノ酸が、段階的もしくはフラグメントの縮合プロセス、および／または連結鎖組立てプロセスにおいて取り込まれる。これらのアミノ酸は、ペプチド合成時における成長中のペプチド鎖に、または連結のために標的化された組み立てられているペプチドセグメントに段階的な様式で付加させることができ、あるいはいくつかの場合には、ペンダント状のＮ末端修飾体またはＣ末端修飾体をポリマー担体からの切断によって得ることができ、それにより、切断生成物が所望する疎水性の脂肪族鎖をもたらす。鎖組立ての後の場合、反応性の官能基を有するアミノ酸またはその誘導体が、（保護された形態または非保護の形態で）鎖組立てのときに取り込まれ、これらは、その後、所望する疎水性成分を結合させるためにその非保護の形態で、すなわち、ペプチド合成後の結合反応において利用される。鎖組立ての後の結合は、変性させた直鎖状ペプチド鎖上で行うことができ、またはポリペプチド鎖を折り畳ませた後に行うことができる。好ましい実施形態において、アミノ酸誘導体が、ペプチド合成時に目的とするアミノ酸位置において付加され、これに対して、Ｎ末端、Ｃ末端および／またはＮ末端／Ｃ末端の疎水性の脂肪族鎖は、ペプチド合成の後に結合反応によって付加される。多数の結合化学反応はどれも、所望する共有結合による連結に依存して、連結化学反応と同様に利用することができる（例えば、Ｐｌａｕｅ，Ｓ．他、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ．（１９９０）１８（３）：１４７〜５７；Ｗａｄｅ，Ｊ．Ｄ．他、Ａｕｓｔｒａｌａｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３）３（６）：３３２〜６；Ｄｏｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｓ．、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９７７）４７：５７８〜６１７；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｄ．Ｃ．他、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）４（１）：７３〜８６；Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，Ｆ．他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９７）２８９：３１３〜３６を参照のこと）。本発明の生物活性な合成ケモカインの折り畳みはこの分野での標準的な技術に従って達成することができる（例えば、国際特許出願公開ＷＯ９９／１１６５５、同ＷＯ９９／１１６６６；Ｄａｗｓｏｎ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．（１９９７）２８７：３４〜４５を参照のこと）。
【０１３６】
合成されたケモカイン化合物をアンタゴニスト活性についてスクリーニングする場合、化合物は、ケモカインリガンドがその対応する受容体に直接的または間接的に結合することを特徴とするｉｎ  ｖｉｔｒｏ型アッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏ型アッセイによって調べられる。ケモカイン受容体およびその対応する野生型ケモカインの例には、ＣＸＸＸＣＲ１（フラクタルカイン）；ＸＣＲ１（ＳＣＭ−１）；ＣＸＣＲ２（ＧＲＯ、ＬＩＸ、ＭＩＰ−２）；ＣＸＣＲ３（ＭＩＧ、ＩＰ−１０）；ＣＸＣＲ４（ＳＤＦ−１）；ＣＸＣＲ５（ＢＬＣ）；ＣＣＲ１（ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−３）；ＣＣＲ２（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−５）；ＣＣＲ３（エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α）；ＣＣＲ４（ＭＤＣ、ＴＡＲＣ）；ＣＣＲ５（ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β）；ＣＣＲ６（ＭＩＰ−３α）；ＣＣＲ７（ＳＬＣ、ＭＩＰ−３β）；ＣＣＲ８（ＴＣＡ−８）；およびＣＣＲ９（ＴＥＣＫ）が含まれる。これらの系に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは十分に知られており、容易に利用することができ、または新たに創出することができる。例えば、米国第５，６５２，１３３号、同第５，８３４，４１９号、国際特許出願公開ＷＯ９７／４４０５４、同ＷＯ００／０４９２６および同ＷＯ００／０４９２を参照のこと。例えば、１つまたは複数のケモカイン受容体を発現する天然の細胞株、形質転換細胞株および／または遺伝子導入細胞株が、典型的には、本発明の生物活性な合成ケモカインにさらされたときのケモカイン誘導による走化性の効果またはこの事象の阻害をモニターするために使用される。動物モデルもまた、例えば、本発明の生物活性な合成ケモカインを用いた処置と組み合わせて応答プロフィルをモニターするために、または化合物の薬物動態学的性質および薬効学的性質を特徴付けるために用いることができる。本発明の化合物をウイルス感染の阻害剤として特徴付けるために、標的細胞株およびエンベロープ細胞株を用いるエンベロープ媒介による細胞融合アッセイを、ＨＩＶ感染を防止するその能力について本発明の生物活性な合成ケモカインをスクリーニングするために用いることができる。当然のことではあるが、無細胞ウイルス感染アッセイもまたこの目的のために用いることができる。
【０１３７】
一例として、一般に走化性の拮抗作用を評価する場合、末梢血白血球を用いることができる。例えば、単球、Ｔリンパ球および好中球を精製するために確立されたプロトコルに従って正常なドナーから単離された末梢血白血球などを用いることができる。Ｃケモカイン、ＣＣケモカイン、ＣＸＸＸＣケモカインおよびＣＸＣケモカインの受容体を発現する試験細胞のパネルを構築することができ、そして本発明の個々の化合物の一連の希釈物にさらした後に評価することができる。天然のケモカインをコントロールとして使用することができる。例えば、様々なケモカイン受容体をコードする発現カセットでトランスフェクションされた細胞のパネルはこの目的のためには好適である。例えば、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ−１αまたはＳＤＦ−１βおよびＭＩＰなどのケモカインのアンタゴニストを、ＣＸＣＲ４／融合／ＬＥＳＴＲ、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５、ＣＸＣ４を発現する形質転換体を使用してスクリーニングすることができる（そのような細胞は様々な市販元および／または学術的供給元から入手することができ、あるいは標準的なプロトコルに従って調製することができる；例えば、Ｒｉｓａｕ他、Ｎａｔｕｒｅ、３８７：６７１〜６７４（１９９７）；Ａｎｇｉｏｌｏｌｏ他、Ａｎｎａｌｓ  ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９６）７９５：１５８〜１６７；Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９５）８７０：１５００〜１５０２を参照のこと）。その結果は、コントロール培地に対して、刺激によって誘導される細胞遊走の増大倍数を表す走化性指数（「ＣＩ」）として表すことができ、そして統計学的有意性を決定することができる。
【０１３８】
受容体結合アッセイもまた、例えば、受容体再生利用効果に対する競合的阻害を評価するために行うことができる（Ｓｉｇｎｏｒｅｔ，Ｎ．他、「ＨＩＶ共受容体ＣＣＲ５のエンドサイトーシスおよび再生利用」、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０００、１５１（６）：１２８１〜９４；Ｓｉｇｎｏｒｅｔ，Ｎ．他、「ケモカイン受容体のエンドサイトーシスおよび再生利用の分析」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０００、１３８：１９７〜２０７；Ｐｅｌｃｈｅｎ−Ｍａｔｔｈｅｗｓ，Ａ．他、「ケモカイン受容体の輸送およびウイルス複製」、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．１９９９（４月）、１６８：３３〜４９；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｂ．Ｌ．他、「放射能標識されたケモカインの結合アッセイ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０００、１３８：１２９〜３４；Ｍａｃｋ，Ｍ．他、「ケモカイン受容体のダウンモジュレーションおよび再生利用」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０００、１３８：１９１〜５を参照のこと；これらはすべて参考として本明細書中に組み込まれる）。この方法は十分に知られており、この方法では、典型的には、標識された本発明の生物活性な合成ケモカインが、濃度を増大させながら非標識の天然ケモカインの存在下、標準的なプロトコルに従って用いられる。当然のことではあるが、標識はいずれかのリガンドまたは両方のリガンドにおいて行うことができる。このタイプのアッセイでは、結合データを、例えば、ＬＩＧＡＮＤ（Ｐ．Ｍｕｎｓｏｎ、Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＩＨ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）などのコンピュータ・プログラムを用いて分析することができ、そして天然の白血球と比較するか、または標的のケモカイン受容体を発現する受容体トランスフェクション細胞のパネルと比較して、「一部位」モデルおよび「二部位」モデルの両方を用いてスキャッチャード・プロット分析に供することができる。その後、非標識のリガンドによる結合に対する競合速度を次の式によって計算することができる：  阻害％＝１−（非標識ケモカイン存在下での結合／培地単独の存在下での結合）ｘ１００。
【０１３９】
ウイルス感染および疾患を防止または緩和するその能力について化合物をスクリーニングする場合、化合物は、様々なウイルス株およびコントロールにさらされた、適切な受容体のいずれかを安定的に発現する細胞のパネルに対してスクリーニングすることができる。例えば、ＣＣＲ３受容体、ＣＣＲ５受容体、ＣＸＣ４受容体またはＣＸＣＲ４受容体を発現するＵ８７／ＣＤ４細胞を、Ｍ親和性ＨＩＶ株、Ｔ親和性ＨＩＶ株および二重親和性ＨＩＶ株の感染をスクリーニングするために用いることができる。ウイルス感染の阻害は、ケモカインの濃度に対する感染とコントロール濃度に対する感染との割合として評価することができる（例えば、ＭｃＫｎｉｇｈｔ他、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９４）２０１：８〜１８；およびＭｏｓｉｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３）２６０：６８９〜６９２；Ｓｉｍｍｏｎｓ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：２７６〜２７９；Ｗｕ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９７）１８５：１６８〜１６９；およびＴｒｋｏｌａ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８４：１８４〜１８６を参照のこと）。カルシウム動態化アッセイは、例えば、好中球および好酸球に対して走化性である天然ケモカインのアンタゴニストを同定するために、受容体結合のアンタゴニストについてスクリーニングするための有用な別の例である（Ｊｏｓｅ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：８８１〜８８７（１９９４））。もう１つの例として、本発明の化合物の血管形成活性を、ヒヨコの漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイによって評価することができる（Ｏｉｋａｗａ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．（１９９１）５９：５７〜６６）。
【０１４０】
本発明の生物活性な合成ケモカインには、多くの使用法があり、これには、研究用具、診断剤および治療剤としての使用が含まれる。具体的には、本発明の生物活性な合成ケモカインは有益な薬理学的性質を有することが見出されており、そして対応する野生型分子（すなわち、これらの分子は、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム／アテローム性動脈硬化、臓器移植拒絶および慢性関節リウマチを含む様々な障害に関与している）に関連した炎症効果を効果的に阻止することが示されている。したがって、本発明の生物活性な合成ケモカインは、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム／アテローム性動脈硬化、臓器移植拒絶および慢性関節リウマチを処置するために有用である。例えば、本発明の生物活性な合成ケモカインのいくつか、例えば、ＲＡＮＴＥＳアンタゴニストおよびＳＤＦ−１αアンタゴニストまたはＳＤＦ−１βアンタゴニストなどもまた、ＨＩＶ−１感染を阻害することが示されており、そしてアンタゴニスト（例えば、ｖＭＩＰ−ＩＩ類似物）を同じ目的のために使用することができる。したがって、本発明のＲＡＮＴＥＳアンタゴニストまたはＳＤＦ−１αアンタゴニストまたはＳＤＦ−１βアンタゴニストおよびｖＭＩＰ−ＩＩ類似物を、哺乳動物においてＨＩＶ−１を阻害するために使用することができる。ＨＩＶ−１に対して有用であるためにこれらの化合物の可能性が、下記の実施例に記載される方法によって明らかにされる。炎症作用に対して有用であるためにこれらの化合物の可能性が、当業者に十分に知られている方法によって明らかにされる。さらに、本発明の生物活性な合成ケモカインは単独で、または相互に組み合わせて、そして同様に所与の疾患を処置する際に相乗的である他の非ケモカイン薬物と組み合わせて利用できることが理解される。
【０１４１】
限定としてではなく、例として、以下は、本発明の生物活性な合成ケモカインを生成することの一般的な有用性を例示するための、野生型ケモカイン分子およびその関連した生物学的性質の具体的な例のいくつかである。例えば、ＳＣＭ−１は、脾臓で発現しているＣケモカインである。ＳＣＭ−１はＣＣケモカインおよびＣＸＣケモカインに対して実質的に近縁であり、主要な違いは、これらのタンパク質において保存されている４つのシステインのうちの第２および第４のシステインを有するだけであるということである（Ｙｏｓｈｉｄａ他、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９５）３６０（２）：１５５〜１５９；Ｙｏｓｈｉｄａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３（２６）：１６５５１〜１６５５４）。ヒトには、２つの非常に相同的なＳＣＭ−１タンパク質（ＳＣＭ−１αおよびＳＣＭ−１β）が存在しており、これらは、２つのアミノ酸置換によって異なる。ＳＣＭ−１は、ネズミのリンパ球特異的ケモカインであるリンホタクチンと約６０％同一であることが見出されている。したがって、ＳＭＣ−１およびリンホタクチンは、Ｃケモカインまたはγ−ケモカインのヒト原型またはネズミ原型を表していると考えられる。両方のＳＣＭ−１分子は、様々なヒト組織の中で主に胎盤で、そして弱く脾臓および胸腺で発現しているオーファン受容体ＧＰＲ５を発現するように操作されたネズミＬ１．２細胞において遊走を特異的に誘導する。したがって、ＳＣＭ−１のアンタゴニストには、ＧＰＲ４の正常な機能を阻止する際の使用が見出される。
【０１４２】
別の例として、可溶性形態のフラクタルカイン（７６アミノ酸のＣＸＸＸＣケモカイン）は、好中球に対してではなく、Ｔ細胞および単球に対する強力な化学誘因剤である。フラクタルカインは、ＴＮＦまたはＩＬ−１による刺激後に顕著に増大する。フラクタルカインに対するヒト受容体はＣＸ３ＣＲ１と呼ばれている。この受容体はフラクタルカインの接着機能および遊走機能の両方を媒介する。ヒト受容体は、好中球、単球、Ｔリンパ球およびいくつかの充実器官（脳を含む）において発現している。この受容体は、ＨＩＶ−１の一次単離体に由来するエンベロープタンパク質に対する共受容体としてＣＤ４と一緒に機能することが示されている。細胞−細胞融合アッセイにより、フラクタルカインが融合を強力かつ特異的に阻害することが明らかにされている（例えば、Ｂａｚａｎ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９９７）３８５（６６１７）：６４０〜６４４；Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３（３７）：２３７９９〜２３８０４；Ｒｏｓｓｉ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（１９９８）４７（２）：１６３〜１７０；およびＦａｕｒｅ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８７：２２７４〜２２７７を参照のこと）。したがって、フラクタルカインのアンタゴニストには、ＴＮＦ経路またはＩＬ−１経路を伴う様々な関節性障害（関節炎など）の処置における使用が見出され得ること、同様にＨＩＶ感染の阻止剤としての使用が見出され得ることは明らかである。
【０１４３】
エオタキシンはさらなる例である。このタンパク質は、長さが７４化のアミノ酸であり、その特徴的なシステイン・パターンのためにＣＣケモカインとして分類されている。エオタキシンは、アレルギー性炎症のモデルとして使用されているモルモットの気管支肺胞洗浄検査で見出されており、喘息関連障害に関係している。エオタキシンは、好中球の蓄積に著しい影響を及ぼすことなく、皮膚において１ｐＭ〜２ｐＭの用量で実質的な好酸球の蓄積を誘導する。エオタキシンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるモルモット好酸球およびヒト好酸球の両方の強力な刺激因子である。この因子は、モルモット好酸球において、ＲＡＮＴＥＳとの結合部位を有するようである。エオタキシンは、好中球または単球においてではく、正常なヒト好酸球におけるカルシウム流動応答を誘導する。この応答は、他のＣＣケモカインを用いた好酸球の前処理によって脱感作され得ない。好塩基球において、エオタキシンは、ＲＡＮＴＥＳよりも大きいレベルの走化性応答を誘導するが、ヒスタミン放出またはロイコトリエンＣ４生成のいずれに対しても限界ぎりぎりの影響を有するだけである。エオタキシンはまた、Ｂ細胞リンパ腫細胞の走化性において役割を果たし得る。エオタキシンに対する主要な受容体はＣＣＲ３である（例えば、Ｂａｒｔｅｌｓ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９９６）２２５（３）：１０４５〜５１；Ｊｏｅｓ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９４）１７９：８８１〜８８７；Ｐｏｎａｔｈ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（１９９６）９７（３）：６０４〜６１２；Ｐｏｎａｔｈ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９６）１８３（６）：２４３７〜２４４８；Ｙａｍａｄａ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９９７）２３１（２）：３６５〜３６８を参照のこと）。したがって、エオタキシンのアンタゴニストは、喘息および他の好酸球関連のアレルギー性障害の強力な調節因子として使用することができる。
【０１４４】
ＲＡＮＴＥＳは、そのアンタゴニストが特に注目される標的ケモカインの別の例である。ＲＡＮＴＥＳは、炎症、臓器拒絶からＨＩＶ感染にまで及ぶ多くの障害に関与しているＣＣケモカインである。ＲＡＮＴＥＳの合成はＴＮＦ−αおよびＩＬ１−αによって誘導されるが、ＴＧＦ−β、ＩＮＦ−γおよびＩＬ−６によっては誘導されない。ＲＡＮＴＥＳは、培養においてＴ細胞およびＴ細胞クローンを循環させることによって産生されるが、これまでに試験されたどのＴ細胞株によっても産生されない。ＲＡＮＴＥＳの発現はＴリンパ球の刺激後に阻害される。ＲＡＮＴＥＳは、Ｔ細胞、ヒトの好酸球および好塩基球に対して走化性であり、白血球を炎症部位に動員する際において活発な役割を果たしている。ＲＡＮＴＥＳはまた好酸球を活性化して、例えば、好酸球性のカチオン性タンパク質を放出させる。これは好酸球の密度を変化させ、好酸球を低密度にする。これは、全身性細胞活性化の状態を表していると考えられ、そしてほとんどの場合には喘息およびアレルギー性鼻炎などの疾患と関連している。ＲＡＮＴＥＳはまた、酸化性代謝の強力な好酸球特異的活性化因子である。ＲＡＮＴＥＳは、内皮細胞に対する単球の接着を増大させる。ＲＡＮＴＥＳは、細胞表面マーカーのＣＤ４およびＵＣＨＬ１を発現する単球およびＴリンパ球の遊走を選択的に助けている。これらの細胞は、メモリーＴ細胞の機能を有する事前に刺激されたヘルパーＴ細胞であると考えられる。ＲＡＮＴＥＳは、数人の選択された好塩基球ドナーに由来するヒト好塩基球を活性化して、ヒスタミンの放出を生じさせる。他方で、ＲＡＮＴＥＳはまた、最も強力なヒスタミン誘導因子の１つであるＭＣＡＦを含むいくつかのサイトカインによって誘導された好塩基球からのヒスタミンの放出を阻害することができる。
【０１４５】
最近、ＲＡＮＴＥＳは、走化性以外の生物学的活性を示すことが明らかにされている。ＲＡＮＴＥＳは、ＩＬ−２によって活性化された細胞に類似するＣＨＡＫ（Ｃ−Ｃ−ケモカインにより活性化されたキラー）として知られているキラー細胞の増殖および活性化を誘導することができる。ＲＡＮＴＥＳは、ヒトの滑液繊維芽細胞によって発現されており、慢性関節リウマチにおける進行中の炎症プロセスに関与していると考えられる。ＲＡＮＴＥＳに対する高親和性受容体（細胞あたり約７００個の結合部位；Ｋｄ＝７００ピコＭ）が、走化性アッセイおよびカルシウム動態化アッセイにおいてＲＡＮＴＥＳに応答するヒト単球性白血病細胞株ＴＨＰ−１上に同定されている。ＲＡＮＴＥＳに対するＴＨＰ−１細胞の走化性応答は、ＭＣＡＦ（単球の走化性因子で、かつ活性化因子）またはＭＩＰ−１α（マクロファージ炎症性タンパク質）を用いたプレインキュベーションによって顕著に阻害される。単球細胞に対するＲＡＮＴＥＳの結合はＭＣＡＦおよびＭＩＰ−１αによって競合する。ＲＡＮＴＥＳに対する受容体は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ３およびＣＣＲ５である。ＲＡＮＴＥＳのアンタゴニストの臨床的使用および重要性は多種多様である。例えば、天然型ＲＡＮＴＥＳに対する抗体は、実験的なメサンギウム増殖性腎炎に伴う細胞浸潤を劇的に阻害することができる。さらに、天然型ＲＡＮＴＥＳは、腎臓の移植拒絶に関連する細胞拒絶を受けているヒト腎臓移植片において非常に発現しているようである（Ｐａｔｔｉｓｏｎ他、Ｌａｎｃｅｔ（１９９４）３４３（８８９１）：２０９〜１１（１９９４））。ＲＡＮＴＥＳの化学修飾された形態（アミノオキシペンタン−ＲＡＮＴＥＳまたはＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ；およびｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳまたはＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ）は、ケモカインのＣＣＲ−５受容体に対するアンタゴニストとして作用すること、そしてＨＩＶ−１感染を阻害する能力を有することが示されている。したがって、本発明によるアンタゴニストであり、Ｎ末端修飾およびＣ末端修飾およびＮ末端修飾／Ｃ末端修飾されたＲＡＮＴＥＳの類似物は、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、臓器移植、アテローム／アテローム性動脈硬化および慢性関節リウマチなどの疾患を処置する際の抗炎症剤として有用である。
【０１４６】
ＳＤＦ−１αおよびＳＤＦ−１βのケモカインのアンタゴニストはさらなる例であり、これらはＣＸＣクラスのケモカインに属する。ＳＤＦ−１βは、４つのさらなるアミノ酸をＣ末端に有することによって異なる。これらのケモカインは、それらの非ヒト対応体に対する同一性が９２％を越える。ＳＤＦ−１は、血液細胞を除く至るところで発現している。ＳＤＦ−１は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、好中球ではなく、リンパ球および単球に作用し、そしてｉｎ  ｖｉｖｏでは単核細胞に対する非常に強力な化学誘因物質である。ＳＤＦ−１はまた、リンパ球において細胞内のアクチン重合を誘導する。ＳＤＦ−１は、ヒト造血始原細胞に対する化学誘因物質としてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で作用し、混合タイプの始原細胞およびより原始のタイプを生じさせる。ＳＤＦ−１はまた、心室中隔形成に関与しているようである。ＣＤ３４＋細胞の走化性が、ＳＤＦ−１とＩＬ−３との組合せに応答して増大する。ＳＤＦは、これらの細胞における細胞質カルシウムの一時的な上昇を誘導することもまた示されている。ＳＤＦ−１に対する主要な受容体はＣＸＣＲ４であり、これはまた、ＨＩＶ−１に対する主要なＴリンパ球共受容体として機能する（例えば、Ａｉｕｔｉ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９７）１８５（１）：１１１〜１２０；Ｂｌｅｕｌ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９６）１８４（３）：１１０１〜１１０９（１９９６）；Ｂｌｅｕｌ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８２（６５９４）：８２９〜８３３；Ｄ’Ａｐｕｚｚｏ他、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７）２７（７）：１７８８〜１７９３；Ｎａｇａｓａｗａ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８２：６３５〜６３８；Ｏｂｅｒｌｉｎ他、Ｎａｔｕｒｅ（１９９６）３８２（６５９４）：８３３〜８３５を参照のこと）。したがって、例えば、本発明のＳＤＦ−１αアンタゴニストまたはＳＤＦ−１βアンタゴニストは、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、アテローム／アテローム性動脈硬化および慢性関節リウマチなどの疾患を処置する際の抗炎症剤として有用である。さらに、本発明のＳＤＦ−１αアンタゴニストまたはＳＤＦ−１βアンタゴニストは、前炎症性細胞の動員および／または活性化に関して哺乳動物におけるＳＤＦ−１、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１αおよび／またはＭＩＰ−１βの作用を阻止するために、あるいはＨＩＶ−１感染を処置または阻止するために、単独で、または他の化合物（例えば、本発明のＲＡＮＴＥＳアンタゴニスト類似物など）と組み合わせて使用することができる。
【０１４７】
したがって、本発明の別の態様は、薬学的組成物に関し、そして本発明の１つまたは複数のケモカインまたはその薬学的に受容可能な塩を含む配合物の治療効果的な量を投与することによって、それを必要としている哺乳動物を処置する方法に関する。「薬学的に受容可能な塩」により、本発明のポリペプチドの生物学的な有効性および性質を保持する塩であって、生物学的に、またはそれ以外の場合にも望ましくない塩を意味することが意図される。様々な塩を酸または塩基から得ることができる。酸付加塩が、無機酸から、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸（硫酸塩および重硫酸塩をもたらす）、硝酸、リン酸などから、そして有機酸から、例えば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸などから得られる。塩基付加塩を無機塩基から得ることができ、これには、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などが含まれる。有機塩基から得られる塩には、一級アミン、二級アミンおよび三級アミン、置換アミン（天然に存在する置換アミンを含む）、ならびに環状アミンから形成される塩が含まれる。そのようなアミンには、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、Ｎ−アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン類、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジンなどが含まれる。好ましい有機塩基には、イソプロピルアミン、ジエチルアミン、エタノールアミン、ピペリジン、トロメタミンおよびコリンが挙げられる。
【０１４８】
本明細書中で使用される用語「処置」は、哺乳動物（特に、ヒト）における疾患の任意の処置を包含し、これには、（ｉ）疾患に対する素因を有し得るが、疾患を有するとまだ診断されていない被験者に疾患を発生させないこと；（ｉｉ）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を停止させること；または（ｉｉｉ）疾患を緩和させること、すなわち、疾患の退行を生じさせることが含まれる。
【０１４９】
本明細書中で使用される用語「本発明の生物活性な合成ケモカインを用いた処置によって防止または緩和される哺乳動物における疾患状態」により、一般に本発明の生物活性な合成ケモカインを用いて有用に処置され得ることがこの分野で一般的に認められているすべての疾患状態であって、本発明の特定の化合物を用いた処置によって有用に防止または緩和させられることが見出されているそのような疾患状態を包含することが意図される。これらには、限定としてではなく、例示として、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、ウイルス性疾患、アテローム／アテローム性動脈硬化、慢性関節リウマチおよび臓器移植拒絶が含まれる。
【０１５０】
本明細書中で使用される用語「治療効果的な量」は、それを必要とする哺乳動物に投与されたときに、例えば、抗炎症剤、抗喘息剤、免疫抑制剤、または哺乳動物におけるウイルス感染を阻害するための抗自己免疫疾患剤として、（上記に定義されるような）処置を発揮させるためには十分である本発明の生物活性な合成ケモカインのそのような量を示す。「治療効果的な量」を構成する量は、ケモカイン誘導体、状態または疾患およびその重篤度、処置される哺乳動物、その体重、年齢などに依存して変化するが、現代の知識および本開示に関連して当業者によって日常的に決定することができる。本明細書中で使用される用語「ｑ．ｓ．」は、例えば、溶液を所望する容量（例えば、１００ｍＬ）にするために、述べられた機能を達成するために十分な量を加えることを意味する。
【０１５１】
本発明のケモカインおよびその薬学的に受容可能な塩（すなわち、有効成分）は、治療効果的な投薬量で、すなわち、上記に記載されるように、それを必要とする哺乳動物に投与されたときに、処置を発揮させるために十分であるそのような量で投与される。本明細書中に記載される本発明の生物活性な合成ケモカインの投与は、類似する有用性をもたらす薬剤について受け入れられている投与様式のいずれかによって行うことができる。本明細書中で使用される用語「本発明の生物活性な合成ケモカイン」、用語「本発明のポリペプチド［の薬学的に受容可能な塩］」および用語「有効成分」は互いに交換可能に使用することができる。
【０１５２】
本発明の生物活性な合成ケモカインの配合物中のレベルは、当業者によって用いられる最大範囲内で変化させることができ、例えば、配合物全体に基づいて約０．０１重量パーセント（％ｗ）〜９９．９９％ｗの本発明の生物活性な合成ケモカインおよび約０．０１％ｗ〜９９．９９％ｗの賦形剤であり得る。より典型的には、本発明の生物活性な合成ケモカインは約０．５％ｗ〜約８０％ｗのレベルで存在する。
【０１５３】
ヒト投薬量レベルは、本発明の生物活性な合成ケモカインについては依然として最適化されなければならないが、一般には、１日あたりの用量は約０．０５〜２５ｍｇ／キログラム体重／日であり、最も好ましくは約０．０１〜１０ｍｇ／キログラム体重／日である。したがって、７０ｋｇの人間に投与する場合、投薬量範囲は１日あたり約０．０７ｍｇ〜３．５ｇであり、好ましくは１日あたり約３．５ｍｇ〜１．７５ｇであり、最も好ましくは１日あたり約０．７ｍｇ〜０．７ｇである。投与されるアンタゴニストの量は、当然のことではあるが、患者、ならびに防止または緩和のために対象である疾患状態、苦痛の性質または重篤度、投与様式および投与スケジュール、ならびに処方医師の判断に依存している。そのような使用最適化は十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１５４】
投与は、例えば、錠剤、ピル、カプセル、粉末剤、液体剤、溶液剤、エマルジョン、注射剤、懸濁物、坐薬、エアロゾルなどの固体投薬形態または半固体投薬形態または液体投薬形態またはエアロゾル投薬形態で、任意の受け入れられる全身的経路または局所的経路によって、例えば、非経口的経路、経口的経路（特に幼児用配合物の場合）、静脈内経路、鼻腔内経路、気管支吸入経路（すなわち、エアロゾル配合物）、経皮的経路または局所的経路によって行うことができる。本発明の生物活性な合成ケモカインはまた、所定の速度でポリペプチドを長期間にわたって投与するために、デポ注射剤、浸透圧ポンプ、ピル、経皮パッチ（電気輸送パッチを含む）などを含む持続放出投薬形態または制御放出投薬形態で、好ましくは、正確な投薬量を単回投与するために好適なユニット投薬形態で投与することができる。組成物は、従来の薬学的キャリアまたは賦形剤および本発明の生物活性な合成ケモカインを含み、さらには、他の医学的薬剤、薬学的薬剤、キャリア、アジュバントなどを含むことができる。キャリアは、石油起源、動物起源、植物起源または合成起源のオイルを含む様々なオイル、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などから選択することができる。水、生理的食塩水、デキストロース水溶液およびグリコール類が、特に注射用溶液に対する好ましい液体キャリアである。好適な薬学的キャリアには、デンプン、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアラート、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。他の好適な薬学的キャリアおよびそれらの配合物がＥ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。
【０１５５】
所望する場合には、投与される薬学的組成物はまた、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアートなどの湿潤化剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤などの非毒性の補助的な物質を少量含有することができる。
【０１５６】
より多くの活性成分が要求され得るが、経口投与を、所望される防止の程度に従って調節され得るか、または苦痛の緩和において調節され得る都合のよい日常的な投薬法を使用して本発明の生物活性な合成ケモカインを送達するために使用することができる。そのような経口投与のために、薬学的に受容可能な非毒性の組成物が、通常的に用いられる賦形剤のいずれか、例えば、製薬規格のマンニトール、ラクトース、デンプン、ポビドン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、クロスカルメロースナトリウム、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどを配合することによって形成される。そのような組成物は、溶液剤、懸濁液、分散性錠剤、ピル、カプセル、粉末剤、持続放出配合物などの形態を取る。経口用配合物が、胃腸障害を処置するためには特に好適である。一般的な全身的目的のための経口生物学的利用能を、全身循環に対する取り込みを改善する賦形剤、例えば、アセチル化アミノ酸を含む配合物などを利用することによって調節することができる。例えば、米国特許第５，９３５，６０１号および米国特許第５，６２９，０２０号を参照のこと。
【０１５７】
組成物は、カプセル、ピルまたは錠剤の形態を取ることができ、したがって、組成物は、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウムなどの希釈剤；クロスカルメロースナトリウム、デンプンまたはその誘導体などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑剤；そして、デンプン、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、ゼラチン、セルロースおよびその誘導体などの結合剤などを、有効成分と一緒に含有することができる。
【０１５８】
液体の薬学的に投与可能な組成物は、例えば、本発明の生物活性な合成ケモカイン（約０．５％〜約２０％）および必要に応じて使用される薬学的アジュバントをキャリア（例えば、水、生理的食塩水、デキストロース水溶液、グリセロール、グリコール類、エタノール、保存剤など）に溶解、懸濁などし、それにより溶液または懸濁物を形成することによって調製することができる。所望する場合には、投与される薬学的組成物はまた、例えば、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ポリオキシエチレン、ソルビタンモノラウラートまたはソルビタンステアラートなどの湿潤化剤、懸濁剤、乳化剤、または可溶化剤、ｐＨ緩衝化剤などの非毒性の補助的な物質を少量含有することができる。そのような投薬形態物を調製する実際の方法は当業者に知られているか、または当業者には明らかである（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を参照のこと）。投与される組成物または配合物は、いかなる場合でも、有効成分の量を、処置されている患者の症状を防止または緩和するために効果的な量で含有する。幼児に対する経口投与のためには液体の配合物（シロップまたは懸濁液など）が好ましい。
【０１５９】
液体を含有する固体投薬形態物の場合、例えば、プロピレンカーボネート、植物油またはトリグリセリドにおける溶液または懸濁物が、好ましくは、ゼラチンカプセルにカプセル化される。液体投薬形態物の場合、例えば、ポリエチレングリコールにおける溶液は、投与のために容易に計量されるように十分な量の薬学的に受容可能な液体キャリア（例えば、水）で希釈することができる。
【０１６０】
あるいは、液体または半固体の経口用配合物は、植物油、グリコール類、トリグリセリド、プロピレングリコールエステル（例えば、プロピレンカーボナート）などに有効成分を溶解または分散し、そしてこれらの溶液または懸濁液を硬ゼラチン・カプセル・シェルまたは軟ゼラチン・カプセル・シェルにカプセル化することによって調製することができる。
【０１６１】
本発明の生物活性な合成ケモカインを上記状態の処置に適用する際には、本明細書中に記載される有効成分の投与は、好ましくは非経口投与される。非経口投与は、注射（皮下、筋肉内または静脈内のいずれか）によって一般には特徴付けられ、皮内注射または腹腔内注射ならびに胸骨内注射または注入技術を含むことができる。注射剤は、従来の形態で調製することができ、液体の溶液もしくは懸濁物として、注射前の液体における溶液もしくは懸濁物のために好適な固体形態として、エマルジョンとして、そのいずれでも調製することができ、または生体適合性ポリマーに基づくマイクロスフェア（例えば、リポソーム、ポリエチレングリコール誘導体、ポリ（Ｄ，Ｃ）ラクチドなど）で調製することができる。好適な賦形剤は、例えば、水、生理的食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。さらに、所望する場合には、投与される薬学的組成物はまた、例えば、酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレン、ソルビタンモノラウラート、トリエタノールアミンオレアート、シクロデキストリン類、血清アルブミンなどの湿潤化剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、溶解性増強剤、タンパク質キャリアなどの非毒性の補助的な物質を少量含有することができる。
【０１６２】
本発明の生物活性な合成ケモカインは、例えば、そのような分子を（水または生理的食塩水などの）好適な溶媒に溶解し、またはリポソーム配合物に配合し、その後、受容可能な注入液に分散させることによって非経口投与することができる。本発明のポリペプチドの典型的な１日用量は、１回の注入によって、または周期的な間隔で間が置かれた一連の注入によって投与することができる。非経口投与のためには、水溶性の形態（例えば、水溶性塩の形態）にある有効成分の水溶液、または粘度増大物質（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールおよび／またはデキストラン）および所望する場合には安定化剤を含有する水性の注射用懸濁物が特に好適である。場合により賦形剤と一緒にされた有効成分はまた、凍結乾燥物の形態にすることができ、そして好適な溶媒を加えることによって、非経口投与の前に溶液にすることができる。
【０１６３】
非経口投与のためのより近年に考案された方法では、一定したレベルの投薬が維持されるような徐放性システムまたは持続放出システムの埋め込みが用いられる。例えば、米国特許第３，７１０，７９５号、米国特許第５，７１４，１６６号および米国特許第５，０４１，２９２号（これらは本明細書に参考として組み込まれる）を参照のこと。
【０１６４】
そのような非経口用組成物に含有される有効成分の割合は、ポリペプチドの活性および患者の必要性だけでなく、その特異的な性質に非常に依存している。しかし、溶液における０．０１％〜１０％の有効成分の割合を用いることができ、そして組成物が固体で、これが、その後、上記の割合に希釈される場合には、その割合はより大きくされる。好ましくは、組成物は、０．０２％〜８％の有効成分を溶液において含む。
【０１６５】
本発明の生物活性な合成ケモカインを投与する別の方法では、ボーラス注射および連続注入の両方が利用される。これは、治療的処置がＨＩＶ−１感染の防止のためであるときには特に好ましい方法である。
【０１６６】
エアロゾル投与は、本発明の生物活性な合成ケモカインを気道に対して直接的に送達するための効果的な手段である。この方法の利点のいくつかには次のものがある：１）この方法により、酵素的分解の影響、胃腸管からの良好でない吸収、または肝臓を最初に通過する作用による治療剤の喪失が避けられる；２）この方法により、その分子サイズ、電荷、または肺以外の部位に対する親和性のために気道内のその標的部位に他の方法では到達することができない有効成分が投与される；３）この方法により、肺の肺胞を介した体内への迅速な吸収がもたらされる；そして４）この方法により、他の臓器系を有効成分にさらすことが避けられ、このことは、暴露が望ましくない副作用を生じさせるときには重要である。これらの理由から、エアロゾル投与は、喘息、肺の局所的感染、そして肺および気道の他の疾患または疾患状態を処置するためには特に好都合である。
【０１６７】
３タイプの薬学的吸入デバイスがある：ネブライザー吸入器、用量計量吸入器および乾燥粉末吸入器。ネブライザーデバイスは、患者の気道に運ばれるミストとしてケモカイン誘導体（これは液体形態で配合される）を噴霧させる高速度の空気流を生じさせる。用量計量吸入器は、典型的には、配合物が、圧縮されたガスとともに容器に入れられており、作動時に、計量された量のポリペプチドが圧縮ガスによって放出され、したがって、設定量の薬剤を投与する確実な方法をもたらす。乾燥粉末吸入器では、ポリペプチドが、このデバイスにより呼吸時に患者の気流中に分散され得る自由に流動する粉末の形態で投与される。自由に流動する粉末を達成するために、ケモカイン誘導体はラクトースなどの賦形剤とともに配合される。計量された量のケモカイン誘導体はカプセル形態で貯蔵され、そして作動毎によって患者に分配される。上記の方法はすべて、本発明物を投与するために使用することができる。
【０１６８】
リポソームに基づく薬学的配合物もまた、本発明のケモカインの使用に好適である。例えば、米国特許第５，６３１，０１８号、米国特許第５，７２３，１４７号および米国特許第５，７６６，６２７号を参照のこと。リポソームの利点は、薬物がリポソームに包まれることから生じる組織分布および薬物動態学的パラメータの有利な変化に関連すると考えられており、当業者によって本発明のポリペプチドに適用され得る。注射または経口投与のための制御放出リポソーム液体薬学的配合物もまた使用することができる。
【０１６９】
坐薬による全身投与の場合、従来からの結合剤およびキャリアには、例えば、ポリエチレングリコールまたはトリグリセリドが含まれ、例えば、ＰＥＧ１０００（９６％）およびＰＥＧ４０００（４％）が含まれる。そのような坐薬は、約０．５ｗ／ｗ％〜約１０ｗ／ｗ％（好ましくは約１ｗ／ｗ％〜約２ｗ／ｗ％）の範囲で有効成分を含有する混合物から生成することができる。
【０１７０】
上記のように、そして以下の具体的な実施例においてさらに例示されるように、本発明の生物活性な合成ケモカインには、天然に存在するケモカインのアンタゴニストとしての使用が見出される。特に、アンタゴニストとしての効力が増強されている本発明の生物活性な合成ケモカインには、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、臓器移植拒絶、ウイルス疾患、アテローム／アテローム性動脈硬化、慢性関節リウマチおよび臓器移植拒絶などの様々な疾患状態の分析および処置における使用が見出される。本発明の生物活性な合成ケモカインはまた、それらの同族受容体の小分子アンタゴニストの設計およびスクリーニングにおいて利用することができる。例えば、本発明の化合物に操作されて入れられている構造的多様性は、ケモカイン受容体の天然の活性を伴う疾患を処置する際の医薬品として使用されるためのより良好な小分子化合物の設計、スクリーニングおよび微調節におけるより合理的な方法を容易にする。
【０１７１】
（実施例）
下記の調製および実施例は、当業者が本発明をより明瞭に理解することができるように、そして本発明を実施することができるように示される。下記の調製および実施例は、本発明の範囲を限定するものとしてではなく、本発明を単に例示し、かつ表すものとして考慮されなければならない。
2004517040.tif 000009
2004517040.tif 000010
【０１７２】
実施例１：本発明のケモカインの一般的な合成法
本発明の生物活性な合成ケモカインのペプチドは固相ペプチド合成によって生成された。固相合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから得られる、使用者により改変された４３０Ａペプチド合成機において、段階的なＢｏｃ化学鎖伸長のための中和／２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾル−１−イル）−１，１，１，３，３−テトラメチルウロニウム・ヘキサフルオロホスファート活性化プロトコル（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．（１９９２）４０：１８０〜１９３）をそのまま使用して行われた。Ｎ末端ペプチドフラグメントはチオエステル生成樹脂において合成された。この樹脂は、調べられた位置（Ｃ末端からＮ末端への伸長）の前に位置する残基を結合した後に分離された。ペプチドは０．０３ｍｍｏｌスケールで手動により伸長された。それぞれの合成サイクルは、純ＴＦＡを用いた１分間〜２分間の処理によるＮα−Ｂｏｃの除去、ＤＭＦによる１分間のフロー洗浄、過剰なＤＩＥＡの存在下における１．０ｍｍｏｌの予備活性化Ｂｏｃアミノ酸を用いた１０分間〜２０分間のカップリング、ＤＭＦによる２回目のフロー洗浄からなった。Ｎα−Ｂｏｃ−アミノ酸（１．１ｍｍｏｌ）の予備活性化は、過剰なＤＩＥＡ（３ｍｍｏｌ）の存在下、１ｍｍｏｌのＨＢＴＵ（ＤＭＦにおいて０．５Ｍ）で３分間行われた。それぞれの手動カップリング段階の後、残留する未反応アミンをニンヒドリン・アッセイ（Ｓａｒｉｎ他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８１）１１７：１４７〜１５７）で評価した。Ｃ末端フラグメントを含むアミノ酸は標準的な−Ｏ−ＣＨ２−フェニルアセトアミドメチル樹脂において合成された。鎖の組立てが完了した後、ペプチドは脱保護され、そしてスカベンジャとして５％のｐ−クレゾールを用いた０℃で１時間の無水ＨＦによる処理によって樹脂から切断された。すべての場合において、このＤＮＰ除去手順はＣ末端チオエステル基に関しては不適合であるので、イミダゾール側鎖のＤＮＰ保護基はＨｉｓ残基に残留した。しかし、ＤＮＰは連結反応中にチオールによって徐々に除去され、非保護のＨｉｓをもたらした。切断後、両方のペプチドを氷冷ジエチルエーテルで沈殿させ、水性アセトニトリルに溶解して、凍結乾燥した。これらのペプチドは、緩衝液Ａ（Ｈ２Ｏ／０．１％トリフルオロ酢酸）における緩衝液Ｂ（アセトニトリル／１０％Ｈ２Ｏ／０．１％トリフルオロ酢酸）の直線勾配および２１４ｎｍにおけるＵＶ検出を使用することにより、Ｗａｔｅｒｓから得られるＣ１８カラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣによって精製された。サンプルは、ＰｌａｔｆｏｒｍＩＩ装置（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、英国）を用いたエレクトロスプレー質量分析によって分析された。ペプチドは、天然の化学的連結（Ｄａｗｓｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）２６６：７７６〜７７９；Ｗｉｌｋｅｎ他、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）６：４３〜５１；Ｃａｍａｒｅｒｏ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９）１８．４．１〜１８．４．２１）を使用して全長のケモカインポリペプチド鎖を生成するための連結のために利用された。ポリペプチド鎖の折畳みは、標準的な技術（Ｗｉｌｋｅｎ他、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）６：４３〜５１）に従ってＣｙｓ−ＳＨ／（Ｃｙｓ−Ｓ）２の存在下で達成された。
【０１７３】
実施例２：ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳおよびＳＤＦ−１のＮ末端類似物、Ｃ末端類似物およびＮ末端／Ｃ末端類似物の合成
ＲＡＮＴＥＳ（１−６８）およびＳＤＦ−１β（１−７２）の類似物を実施例１のように調製した。これらは、本発明のＣＣケモカインおよびＣＸＣケモカインを生成する一般的な方法を例示するために本明細書中に記載される。具体的には、Ｎ末端、Ｃ末端およびＮ末端／Ｃ末端が修飾されたＲＡＮＴＥＳ類似物は、ケモカイン化合物ＣＨ３−（ＣＨ２）７−Ｃ（Ｏ）−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）（これはまたｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）または「ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ」として示される）およびケモカイン化合物ＣＨ３−（ＣＨ２）４−Ｏ−Ｎ＝ＣＨ−ＣＯ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）（これはまたアミノオキシペンタン−ＲＡＮＴＥＳまたは「ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ」として示される）に対する修飾に基づいていた。ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ、およびこの目的のために利用されるさらなるＲＡＮＴＥＳ誘導体分子は国際特許出願公開ＷＯ９９／１１６６６（その参照は参考として本明細書中に組み込まれる）に記載される。ＳＤＦ−１のＮ末端類似物、Ｃ末端類似物およびＮ末端／Ｃ末端類似物は、ＲＡＮＴＥＳ類似物の場合と同じ基本的設計法を使用して構築された。
【０１７４】
所与の標的ケモカインに対するＮ末端修飾（ＲＡＮＴＥＳに対するＮＮＹ修飾およびＡＯＰ修飾など）の場合、化学的変化体が、上記ならびに国際特許出願公開ＷＯ９９／１１６６６およびＷｉｌｋｅｎ他、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）６：４３〜５１に記載されるように調製され、その調製には、ペンダント状のＮ末端修飾（例えば、ＮＮＹまたはＡＯＰ）を生成するための、連結のために用いられるＮ末端ペプチドセグメントの樹脂上での処理、それに続く切断／脱保護、精製、および全長の生成物を形成させるためのＣ末端ペプチドセグメントに対する天然の化学的連結における非保護のＮ末端修飾ペプチドα−チオエステルの使用が用いられた。様々なペプチドが合成され、そしてアミノ酸誘導体を含む様々なアミノ酸置換が、実施例１に記載されるようなペプチド合成のときに取り込まれた。実施例１におけるような天然の化学的連結が、直鎖状の生成物を生成するために利用された。この場合、連結が、ＲＡＮＴＥＳ類似物についてはＬｙｓ３１−Ｃｙｓ３２部位に存在し、ＳＤＦ−１類似物についてはＡｓｎ３３−Ｃｙｓ３４部位に存在した。等モル量のペプチドフラグメント（２〜２．５ｍＭ）を６Ｍ  ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．５）、１％ベンジルメルカプタンおよび３％チオフェノールに溶解した。反応は、通常の場合には一晩行われた。得られたポリペプチド生成物は、ペプチドセグメントについて上記に記載されるように精製および分析された。折り畳まれたタンパク質を生成するために、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ類似物の精製されたポリペプチド鎖（約０．５〜１ｍｇ／ｍＬ）を、８ｍＭシステイン、１ｍＭシスチンおよび１０ｍＭメチオニンを含有する２Ｍ  ＧｕＨＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に溶解した。穏やかに一晩撹拌した後、タンパク質溶液を、上記に記載されるようにＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。他の折畳み条件が、ＳＤＦ−１類似物の場合には使用された：ＳＤＦ−１およびＭｅｔ０−ＳＤＦ−１は、空気の存在下、室温で、１Ｍ  ＧｕＨＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）において０．５ｍｇ／ｍＬで酸化された。一晩の撹拌を行った後、折畳みは完了した。ＡＯＰ−ＳＤＦ−１、カプロイル−ＳＤＦ−１およびＮＮＹ−ＳＤＦ−１は、同じ緩衝液ではあるが、２ＭのＧｕＨＣｌの存在下で酸化された。
【０１７５】
折り畳まれた所与のタンパク質に対する脂肪酸の化学的結合のために、２つの基本的な段階が含まれた。最初に、脂肪酸がアミノオキシ基で官能基化された。次に、反応性のカルボニル基が、タンパク質のカルボキシル末端ドメイン内に、すなわち、ケモカインの活性には重要でないと考えられる領域内に特異的に導入された。この目的のために、Ｃ末端脂肪酸修飾のために標的化されるケモカイン類似物が、Ｃ末端のＬｙｓ（Ｓｅｒ）Ｇｌｙ配列の伸長を伴って合成された。したがって、例えば、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）が、Ｌｙｓ（Ｓｅｒ）Ｇｌｙ配列の伸長をＣ末端に含有するように合成された。反応性のカルボニル基は、リフォールディングされたタンパク質をＮａＩＯ４処理することによって生成され、したがって、これにより、安定なオキシム結合による脂肪酸成分の部位特異的な結合が可能になった。
【０１７６】
脂肪酸による官能基化のために、０．２ｍｍｏｌの脂肪酸（パルミチン酸、オレイン酸、アラキドン酸、コール酸）を０．５ｍｌのＤＭＦ／ＤＣＭ混合物（１：１、ｖ：ｖ）中で等モル量のＤＣＣおよびＨＯＡｔで活性化して、０．２５ｍｍｏｌのＢｏｃ−ＡｏＡ―ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２の０．５ｍｌのＤＭＦ溶液に加え、見かけのｐＨをＮ−エチルモルホリンでｐＨ８．０に調節した。コレステリル誘導体については、０．２ｍｍｏｌのクロロギ酸コレステリルを０．５ｍｌのＤＣＭに溶解して、０．２５ｍｍｏｌのＢｏｃ−ＡｏＡ―ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２のエタノール性溶液に加え、見かけのｐＨをトリエチルアミンでｐＨ９．０に調節した。一晩インキュベーションした後、揮発成分を真空下で除き、生成物をフラッシュ・クロマトグラフィまたはＣ４カラムでの調製用ＨＰＬＣによって単離した。Ｂｏｃ基をＴＦＡ処理によって除き、生成物をＥＳＩ−ＭＳによって確認した。
【０１７７】
タンパク質を酸化するために、標的タンパク質（２ｍｇ／ｍｌ）を、６Ｍ塩化グアニジンを含有する０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、そしてスカベンジャがタンパク質に対して１００倍モル過剰量になるようにメチオニンを添加した。その後、１０倍過剰量の過ヨウ素酸ナトリウムを加え、溶液を暗所で１０分間インキュベーションした。反応を、過ヨウ素酸塩に対して１０００倍モル過剰量のエチレングリコールの添加によって停止させ、さらに室温で１５分間インキュベートした。その後、溶液を０．１％酢酸に対して透析し、最後に凍結乾燥した。例えば、Ｃ末端側方セリンの酸化はＥＳＩ−ＭＳによってほぼ定量的であることが明らかにされた。ＥＳＩ−ＭＳでは、グリオキシリル誘導体を形成させるための３１Ｄａの喪失に対応する８１４１．８±０．７Ｄａの質量がＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ−Ｋ（Ｓ）Ｇの場合に得られ、そして出発物質の質量に対応するピークは認められなかった。
【０１７８】
脂肪酸のケモカインとの結合は、０．１％サルコシル、２０ｍＭメチオニン、およびタンパク質に対して２０倍過剰量の官能基化脂肪酸の存在下で、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．３）中で達成された。３７℃で１６時間〜２０時間撹拌した後、脂肪酸のアミノオキシ基とケモカインのアルデヒドとの間で形成されたオキシム結合としての結合体を、逆相ＨＰＬＣを使用して精製して、生成物をＥＳＩ−ＭＳによって特徴付けた。すべての類似物について、酸化されたタンパク質に対するアミノオキシ官能基化脂肪酸のカップリングは、分析ＨＰＬＣによって確認されたとき、ほぼ定量的であった。
【０１７９】
実施例３：ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳおよびＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳのＮ末端類似物
Ｎ末端ＲＡＮＴＥＳ誘導体については、修飾を、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）またはＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳＮ（２−６８）の最初の８個のアミノ酸残基に対応するアミノ酸のＮ末端領域の１つまたは複数に対して行った。この最初の８個のアミノ酸残基は次の配列を有する：−ＰＹＳＳＤＴＴＰ−。これらは、図１０Ａ〜図１０Ｄに示される６８アミノ酸残基の野生型ＲＡＮＴＥＳポリペプチド鎖（すなわち、ＲＡＮＴＥＳ（１−６８））のアミノ酸残基２〜９に対応する。天然に存在するＲＡＮＴＥＳ（１−６８）の最初の残基（Ｓｅｒ）は、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）ではｎ−ノナノイル置換基によって置換され、そしてＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）ではアミノオキシペンタンによって置換されているからである。したがって、例えば、アミノ酸位置２におけるＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）での置換体は、下記では、一般化合物式「ＮＮＹ−Ｐ２Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）」によって示される：式中、ＮＮＹはｎ−ノナノイルであり、Ｘは、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）の２位のプロリン（Ｐ）の代わりに置換されたアミノ酸であり、ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）は、Ｎ末端からＣ末端の方向で読んだときのＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）の残りの６６アミノ酸を表す。別の例として、アミノ酸位置３におけるＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）での置換体は、一般化合物式「ＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）」によって示される：式中、ＮＮＹはｎ−ノナノイルであり、Ｘは、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）の３位のチロシン（Ｙ）の代わりに置換されたアミノ酸であり、ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）は、Ｎ末端からＣ末端の方向で読んだときのＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）の残りの６５アミノ酸を表す。多重置換されたＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ類似物については、アミノ酸位置２、３および９におけるＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）での三置換体に対する化合物式の下記の例が、一般化合物式「ＮＮＹ−Ｐ２Ｘ−Ｙ３Ｘ−ＳＳＤＴＴ−Ｐ９Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（１０−６８）」によって示される：式中、ＮＮＹはｎ−ノナノイルであり、Ｘは、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）の２位のプロリン（Ｐ）、３位のチロシン（Ｙ、および９位のプロリン（Ｐ）の代わりに置換された同じまたは異なるアミノ酸であり、ＳＳＤＴＴはＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）のアミノ酸４〜８に対応し、ＲＡＮＴＥＳ（１０−６８）は、Ｎ末端からＣ末端の方向で読んだときのＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）の残りの５９アミノ酸を表わす。
【０１８０】
下記は、調製されたＮＮＹ−Ｐ２Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（３−６８）類似物の例である。
2004517040.tif 000011
【０１８１】
下記は、調製されたＮＮＹ−Ｐ−Ｙ３Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）類似物の例である。
2004517040.tif 000012
【０１８２】
下記の化合物は、調製されたＮＮＹ−ＰＹ−Ｓ４Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（５−６８）類似物の例である。
2004517040.tif 000013
【０１８３】
下記の化合物は、調製されたＮＮＹ−ＰＹＳ−Ｓ５Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（６−６８）類似物の例である。
2004517040.tif 000014
【０１８４】
下記の化合物は、調製されたＮＮＹ−ＰＹＳＳ−Ｄ６Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（７−６８）類似物の例である。
2004517040.tif 000015
【０１８５】
下記の化合物は、調製されたＮＮＹ−ＰＹＳＳＤ−Ｔ７Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（８−６８）類似物の例である。
2004517040.tif 000016
【０１８６】
下記の化合物は、調製されたＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴ−Ｔ８Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（９−６８）類似物の例である。
2004517040.tif 000017
【０１８７】
下記の化合物は、調製されたＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴ−Ｐ９Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ類似物の例である。
2004517040.tif 000018
【０１８８】
下記の化合物は、調製された二重置換類似物ＮＮＹ−Ｐ２Ｘ−Ｙ３Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（４−６８）および三重置換類似物ＮＮＹ−Ｐ２Ｘ−Ｙ３Ｘ−ＳＳＤＴＴ−Ｐ９Ｘ−ＲＡＮＴＥＳ（１０−６８）の例である。
2004517040.tif 000019
【０１８９】
実施例４：ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳのＮ末端Ｎ−ループ類似物
下記の化合物は、ＣＣＲ１およびＣＣＲ３を介したシグナル伝達に影響を及ぼすことなく、ＣＣＲ５に対する効力を増大させるために、Ｎ−ループ（ＲＡＮＴＥＳの残基１２〜２０）が修飾されているさらなるＮＮＹ置換ＲＡＮＴＥＳ類似物を例示することを意図している。
【０１９０】
Ｎ末端Ｎ−ループのＲＡＮＴＥＳ類似物については、Ｎ−ループ修飾をＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）に対して行った。この場合、Ｎ−ループはアミノ酸１２〜２０に対応する。ＲＡＮＴＥＳのＮ−ループは−ＦＡＹＩＡＲＰＬＰ−（配列番号２９）のアミノ酸配列を有する。したがって、例えば、アミノ酸位置１２におけるＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ（２−６８）での置換体は一般化合物式「ＮＮＹ−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣ−Ｆ１２ｐＢｚ−ＲＡＮＴＥＳ（１３−６８）」を有する：式中、ＮＮＹはｎ−ノナノイルであり、ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣはＲＡＮＴＥＳ（１−６８）のアミノ酸２〜１１に対応し、Ｆ１２ｐＢｚは、ＲＡＮＴＥＳ（１−６８）の１２位のフェニルアラニン（Ｆ）の代わりにアミノ酸誘導体ｐＢＺへの置換を示し、ＲＡＮＴＥＳ（１３−６８）は、Ｎ末端からＣ末端の方向で読んだときのＲＡＮＴＥＳ（１−６８）の残りのアミノ酸残基１３〜６８を表す。
2004517040.tif 000020
2004517040.tif 000021
【０１９１】
実施例５：ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳのＮ末端ＲＡＮＴＥＳ類似物
下記の化合物は、異なる疎水性の脂肪族鎖がＮＮＹ置換基の代わりに用いられたさらなるＮＮＹ置換ＲＡＮＴＥＳ類似物を例示することを意図している：
2004517040.tif 000022
【０１９２】
実施例６：ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳおよびＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳのＣ末端類似物およびＮ末端／Ｃ末端類似物
Ｌｙｓ−ＧｌｙのＣ末端伸長を有し、Ｌｙｓのε−アミノ基がセリン残基によってアシル化されているＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ類似物およびＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳを調製した。これらの誘導体を、セリン伸長物の過ヨウ素酸酸化の後、発蛍光団（ＦＩＴＣ、ＮＢＤ、Ｃｙ−５およびＢＯＤＩＰＹ−Ｆｌ）または脂質を含むアミノオキシアセチル官能基化化合物と結合した。これらのＣ末端標識されたケモカインはその生物学的性質を保持しており、そしてＣＨ３−（ＣＨ２）１４−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨＣＯ−ＣＨ２−Ｏ−ＮＨ２と同じように、脂肪族成分の導入は、ケモカインの効力を改善することが明らかにされた。最も効果的な化合物を見出すために、種々の脂肪酸塩および脂質（ラウリン酸塩、パルミチン酸塩、オレイン酸塩、エイコサン酸塩、コール酸およびクロロギ酸コレステリル）を、Ｂｏｃ−ＡｏＡ−ＮＨ−（ＣＨ２）２ＮＨ２とのカップリング、その後のＢｏｃ除去によってアミノオキシ基で官能基化した。これらの誘導体の１つまたは複数を、酸化されたＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ−Ｋ（Ｓ）ＧまたはＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ−Ｋ（Ｓ）Ｇに結合させた。ＡＯＰ類似物を下記に例示する：
2004517040.tif 000023
【０１９３】
脂質成分の化学的変化体はまた別の方法により調製された。そのような化合物は、脂肪酸をＦｍｏｃ脱保護されたＢｏｃ−ペプチド−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−樹脂に結合することによってＣ末端セグメントを樹脂上で処理し、その後、切断、精製、および全長のポリペプチドを形成させるための化学的連結において使用することによって合成された。
【０１９４】
これらの化合物を設計することにおいて、脂質カップリングが利用された主要な理由は２つあった。第１に、ＲＡＮＴＥＳ化合物の抗ＨＩＶ−１阻害活性が、受容体をダウンモジュレーションする能力に関連しているという証拠が、今や、ますます多くなっている。このことは、一旦内在化されると、受容体の再生利用に伴って初期のエンドソームにおいて通常の場合には解離するはずのリガンド−受容体複合体がまた、形質膜またはいくつかの細胞質の脂肪酸分岐タンパク質と相互作用し得ることを意味している。したがって、リガンドの脂質修飾により、単に疎水性相互作用によって複合体への標的を特定の細胞内サブドメインへの標的に変えることができ、したがって受容体の再生利用を遅らせることができる。細胞内のタンパク質輸送を取り扱ったいくつかの最近の論文は、アシル化が、界面活性剤耐性膜に対するタンパク質の親和性を増大させる共通した機構であり、そして膜貫通部を有しないタンパク質に対する主要な標的化機構であり得るという考えを裏付けている（例えば、Ｍｅｌｋｏｎｉａｎ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）２７４：３９１０〜３９１７；Ｚｌａｔｋｉｎｅ他、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．（１９９７）１１０：６７３〜６７９；Ｚｈａｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．（１９９８）４６：５５〜６０を参照のこと）。第２に、この修飾はまた、化合物の薬物動態学的性質を変化させるために行われた。いくつかの最近の論文はこの概念を裏付けている（例えば、Ｈｏｎｅｙｃｕｔｔ他、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９６）１３：１３７３〜１３７７；Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９９７）８６：１３６５〜１３６８；Ｍａｒｋｕｓｓｅｎ他、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ（１９９６）３９：２８１〜２８８を参照のこと）。
【０１９５】
下記の実施例において明らかにされるように、薬物動態を変化させることを修飾は意図していたので、活性の増強は驚くべきことであり、かつ予想外のことであった。予想される結果は、活性が低下するということであったが、それにも関わらず、薬物動態における期待される改善は受け入れられるほどの有望性をもたらしている。
【０１９６】
実施例７：ＳＤＦ−１αおよびＳＤＦ−１βのＮ末端類似物
下記のＮ末端ＳＤＦ−１β（１−７２）誘導体は、本発明のＣＸＣケモカインを生成する一般的な方法を例示するために調製された。例として、ＳＤＦ−１βのＮ末端を、疎水性の脂肪族鎖をＮ末端に有する化合物を生成するために修飾した。Ｎ末端領域におけるアミノ酸誘導体および／またはＣ末端領域における脂肪族鎖をさらに含む化合物が、ＲＡＮＴＥＳ化合物について上記に記載されるように調製される。具体的には、好適なＮ末端置換基が調製され、試験された。これには、限定としてではなく、例として、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ−Ｌｙｓ、カプロイル−Ｌｙｓ、ＣＨ３−（ＣＨ２）７−Ｃ（Ｏ）およびＣＨ３−（ＣＨ２）４−Ｏ−ＮＨ−グリオキシリルが含まれた。下記の化合物は、調製されたＳＤＦ−１α類似物およびＳＤＦ−１β類似物のいくつかの例である。
2004517040.tif 000024
【０１９７】
実施例８：スクリーニング・アッセイ
実施例３〜７およびその他で調製されたＲＡＮＴＥＳ類似物およびＳＤＦ類似物のいくつかを、ＲＡＮＴＥＳおよびＳＤＦ−１において使用が見出されるこの特に示される阻止機能を特徴付けるためのＨＩＶ系アッセイを使用してアンタゴニスト活性についてスクリーニングした。一般に、これらの化合物は、ＨＩＶエンベロープ媒介による細胞融合を阻害するそれらの能力に対する予備スクリーニングを通した。これらの化合物の中で最も有望な化合物を、続いて、標的細胞株の無細胞ウイルス感染を阻害するその能力について試験した。これらのアッセイが選ばれたが、これは、細胞融合アッセイおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ無細胞ウイルス感染アッセイが、ＳＣＩＤマウス・モデルで測定されるようなｉｎ  ｖｉｖｏでの効力の有用な指標であることが見出されているからである（Ｍｏｓｉｅｒ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９９）７３：３５４４〜３５５０）。さらに、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳを上回るＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳの抗ウイルス効力の増大が、ＣＣＲ５に対する親和性の増大とは異なる要因のためであることが見出されているので、化合物は、ＣＣＲ５に対する親和性ではなく、細胞融合アッセイにおける活性に関して評価した。
【０１９８】
実施例９：エンベロープ媒介による細胞融合アッセイ
ＣＣＲ５に依存する細胞融合を阻害する実施例３〜７の化合物の所与のパネルの能力を、ウイルスエンベロープタンパク質に対して操作された細胞であって、ＣＤ４およびＣＣＲ５を有する細胞と融合し、かつレポータ・システムを含有する細胞を使用して測定した。ＣＣＲ５親和性のウイルスエンベロープにより媒介される細胞融合アッセイは、本質的にはＳｉｍｍｏｎｓ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９７）２７６：２７６〜２７９）に記載されるように、ＨｅＬａ−Ｐ５Ｌ細胞株およびＨｅＬａ−Ｅｎｖ−ＡＤＡ細胞株（これらはともに、Ｍ．Ａｌｉｚｏｎ（Ｐａｒｉｓ）の研究室から厚意により提供された）を使用して行われた。簡単に記載すると、ＨｅＬａ−Ｐ５Ｌ細胞を９６ウエルプレートに播種した（１００μｌにおいてウエルあたり１０４細胞）。２４時間後、培地を除き、ウエルあたり１０４個のＨｅＬａ−Ｅｎｖ−ＡＤＡ細胞およびケモカインを含有する培地を加えた（２００μｌの最終容量）。さらに２４時間後、細胞をＰＢＳで１回洗浄して、５０μｌのＰＢＳ／０．５％ＮＰ−５０において室温で１５分間溶解した。溶解液を、５０μｌの２Ｘ  ＣＰＲＧ基質（１６ｍＭクロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド；１２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、８０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＭｇＳＯ４および１０ｍＭのβ−メルカプトエタノール）を添加し、その後、室温で暗所において１時間〜２時間インキュベーションすることによってβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。その後、５７５ｎｍでの吸光度をＬａｂｓｙｓｔｅｍマイクロプレート・リーダで読み取った。これらの値から、阻害率［１００ｘ（ＯＤ（試験）−ＯＤ（負のコントロール））／（ＯＤ（正のコントロール）−ＯＤ（負のコントロール））］をそれぞれの阻害剤濃度で計算した。阻害剤濃度に対する融合阻害率のプロットから、それぞれの化合物に対するＩＣ５０値を計算することができた。
【０１９９】
重要なことに、試験された化合物の大部分は、野生型ＲＡＮＴＥＳに対して、より大きい効力を示した。選択されたＲＡＮＴＥＳアンタゴニスト類似物に対する結果を下記の表１に示す。
【表１】
2004517040.tif 000025
【０２００】
表１において、平均相対的効力について、融合アッセイでのＩＣ５０の絶対値は、異なる日に行われた実験において変動しているが、活性の順位は変わらないままである。結果を正規化するために、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳをそれぞれの実験におけるコントロールとして使用した。したがって、それぞれの実験におけるＩＣ５０は、１００の値が随意的に与えられたＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳのＩＣ５０に対して表された。試験された化合物のほとんどすべてが、野生型ＲＡＮＴＥＳに対して、より大きい効力を示したが、化合物番号１９、２３、４０および４２などのいくつかの化合物の効力は、５０％を超える阻害が系列内の最低希釈においてさえ得られるほどであった。
【０２０１】
実施例１０：無細胞ウイルス感染アッセイ
無細胞ウイルス感染アッセイを、この場合にはエンベロープ細胞株をＲ５親和性ウイルスで置き換えたことを除いて、エンベロープ媒介細胞融合アッセイと同じように行った。ＨＥＫ２９３−ＣＣＲ５細胞（７、Ｔ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）によって厚意により提供された）を２４ウエルプレートに播種した（１．２ｘ１０５細胞／ウエル）。一晩インキュベーションした後、競合的結合を、０．５ｍｌの「結合緩衝液」（１ｍＭのＣａＣｌ２、５ｍＭのＭｇＣｌ２および０．５％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミンが補充された５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４））において１２ｐＭの［１２５Ｉ］ＭＩＰ−１−α（Ａｍｅｒｓｈａｍ）および様々な量の非標識リガンドを使用して、４℃で３時間、細胞全体に対して行った。インキュベーション後、細胞を、０．５ＭのＮａＣｌが補充された氷冷の結合緩衝液で４回素早く洗浄した。細胞を、３Ｍ酢酸、８Ｍ尿素および２％ＮＰ−４０からなる１ｍｌに溶解した。溶解物を、Ｂｅｃｋｍａｎガンマ４０００シンチレーション・カウンタを使用して１分間計数した。測定を二連で行い、ＩＣ５０値を、Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して近似された単相の濃度阻害曲線から得た。表２には、化合物番号１９および２３により予備スクリーニングで示された、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳを上回る効力の増大が例示される。
【表２】
2004517040.tif 000026
【０２０２】
実施例１１：抗ＣＣＲ５化合物および抗ＣＸＣＲ４化合物による組合せ処置
下記の実施例では、ＨＩＶ感染を阻止するために、そしてＨＩＶのＲ５株からＸ４株への潜在的な変換を阻止するために、抗ＣＣＲ５（例えば、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳ）および抗ＣＸＣＲ４（例えば、ＳＤＦ−１アンタゴニストまたはＡＭＤ３１００）を組み合わせて用いることの保護効果が例示される。ＳＣＩＤマウス・モデルがこの目的のために利用された。具体的には、ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳおよびＡＭＤ３１００（小さい有機分子の抗Ｘ４剤）の保護効果をＳＣＩＤマウスで試験した。この場合、ＳＣＩＤマウスは、Ｍｏｓｉｅｒ、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９６）６３：７９〜１２５；Ｐｉｃｃｈｉｏ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）７１：７１２４〜７１２７；Ｐｉｃｃｈｉｏ他、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９８）７２：２００２〜２００９；Ｏｆｆｏｒｄ他、国際特許出願公開ＷＯ９９／１１６６６に記載される方法に従って、ヒト末梢血白血球とともに再度飼育され、ＨＩＶ−１で抗原刺激された。ＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳは表Ｘのように投与され、ＡＭＤ３１００は２００ｍｇ／ｍｌの溶液として使用された。抗原刺激は、ＡＭＤ３１００群単独を除き、Ｒ５のＨＩＶウイルスを用いて行われた。回避変異体は組合せ療法では認められず、そして適切に処置されたマウスはすべて、実験期間を通してウイルスを有しないままであった。このことは、本発明のＮ末端ＲＡＮＴＥＳ誘導体、Ｃ末端ＲＡＮＴＥＳ誘導体およびＮ末端／Ｃ末端ＲＡＮＴＥＳ誘導体が、哺乳動物におけるＨＩＶ感染を阻止するために、ＡＭＤ３１００またはＳＤＦ−１アンタゴニスト（本明細書中に記載される化合物など）などの抗Ｘ４株化合物との組合せで使用できることを示している。
【０２０３】
実施例１２：ＲＡＮＴＥＳ類似物Ｇ１７５５−０１の調製
図１１に示されるＲＡＮＴＥＳ類似物Ｇ１７５５−０１は下記のように合成された。
【０２０４】
１．ＡＯＰ−［ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）］−チオエステルの調製
配列：アミノオキシペンタン−グリオキサリル−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣ  ＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲ  ＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ  ＧＫ−チオエステル（配列番号３０）  Ｎ末端のアミノオキシペンタン−グリオキサリル−オキシム成分（ＡＯＰ）を含有するＮ末端ペプチドセグメントのＡＯＰ−［ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）］−αチオエステル（これはまた−Ｃ（Ｏ）ＳＲとして示される）を、チオエステル生成樹脂（Ｈａｃｋｅｎｇ他、ＰＮＡＳ（１９９９）９６：１００６８〜１００７３）上でＲＡＮＴＥＳ（２−３３）配列を組み立てることによって合成し、その後、標準的なプロトコル（Ｗｉｌｋｅｎ他、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６（１）：４３〜５１）に従ってアミノオキシペンタン−グリオキサリルオキシム成分［すなわち、ＣＨ３（ＣＨ２）４−Ｏ−Ｎ＝ＣＨＣＯＯＨ］を樹脂に直接カップリングすることによってＮ末端において修飾した。ペプチド−樹脂をフッ化水素で切断し、逆相ＨＰＬＣによって精製して、α−カルボキシチオエステルペプチドのＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）−チオエステルを得た。測定質量＝４１７９．６４Ｄａ；計算質量＝４１７８．５７Ｄａ（平均同位体組成）。
【０２０５】
２．［ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）］−Ｌｙｓ６９（ＧＰ６）−Ｌｅｕ７０の調製
配列：ＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴ  ＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰ  ＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮ  ＳＬＥＭＳＫ（ＧＰ６）Ｌ（配列番号３１）（式中、ＧＰ６はＬｙｓ６９のεＮに結合している）：
【化６】
2004517040.tif 000027
【０２０６】
ａ．固相ペプチド合成および｛ペプチド樹脂｝上での水溶性ポリマー合成
Ｃ末端ペプチドセグメントの［ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）］−Ｌｙｓ６９（Ｆｍｏｃ）−Ｌｅｕ７０を、Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．４０：１８０〜１９３に記載されるようなＢｏｃ化学固相ペプチド合成のためのインシトゥー中和／ＨＢＴＵ活性化プロトコルを使用してＢｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂における通常の固相ペプチド合成によって合成した。
【０２０７】
鎖の組立てが完了した後、Ｌｙｓ６９のε−窒素におけるＦｍｏｃ基を、２０％のピペリジンを含むＤＭＦで処理することによって保護ペプチド−樹脂から除いた。その後、無水コハク酸（Ｓｕｃｃ）を、ＤＩＥＡを含有するＤＭＦにおけるＨＯＢＴ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）溶液中でＬｙｓ６９のε−窒素にカップリングした。洗浄後、樹脂に結合したコハク酸の自由なカルボキシル基を、カルボニルジイミダゾールを含むＤＭＦを添加することによって活性化した。もう１回の洗浄サイクルの後、０．５ＭのＨＯＢＴを含むＤＭＦにおける５０％の（４，７，１０）−トリオキサトリデカン−１，１３−ジアミン（ＴＴＤ）を付加させた。洗浄後、樹脂に結合したポリマーは、次サイクルの無水コハク酸カップリング／ＣＤＩ活性化／ＴＴＤカップリングに使用することができた。６回のサイクルの後、無水コハク酸をＨＯＢＴ／ＤＭＦ＝ＤＩＥＡ溶液において最後のＴＴＤアミンにカップリングして、アミド連結した−（Ｓｕｃｃ−ＴＴＤ）６−Ｓｕｃｃ−ＯＨポリマーを有するＬｙｓ６９修飾化合物を得た。
【０２０８】
ペプチド／直鎖状水溶性ポリマー樹脂をフッ化水素で樹脂から切断し、生成物を調製用の逆相ＨＰＬＣによって精製して、［ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）］−Ｌｙｓ６９（ＧＰ６）−Ｌｅｕ７０を得た。測定質量＝６２５３Ｄａ；計算質量＝６２５２Ｄａ（平均同位体組成）。
【０２０９】
３．Ｇ１７５５−０１の調製
配列：アミノオキシペンタン−グリオキサリル−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣ  ＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲ  ＲＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ  ＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦ  ＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡ  ＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹ  ＩＮＳＬＥＭＳＫ（ＧＰ６）Ｌ（配列番号３２）
上記に記載されるＮ末端完全非保護ペプチドセグメントおよびＣ末端完全非保護ペプチドセグメントを、Ｄａｗｓｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６６：７７６〜７７９（１９９４）により記載されるような天然の化学的連結によって連結させた。還元型の全長のポリペプチド生成物を、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水に対するアセトニトリルの直線グラジエントを用いて逆相ＨＰＬＣを使用して精製した。測定質量＝１０，０６０Ｄａ。
【０２１０】
ＧＰ６が結合している全長のポリペプチドを、標準的なプロトコル（Ｗｉｌｋｅｎ他、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９９）６（１）：４３〜５１）に従って、システイン−シスチンのレドックス対を含有する水性緩衝液において２つのジスルフィド結合を同時に形成させることによって折り畳ませ、逆相ＨＰＬＣによって精製した。折り畳まれた生成物はＨＰＬＣで均一であった。測定質量＝１０，０５６Ｄａ；計算質量＝１０，０５８Ｄａ（平均同位体組成）。
【０２１１】
実施例１３：ＲＡＮＴＥＳ類似物Ｇ１７５５の調製
図１２に示されるＧ１７５５化合物は下記のように合成された。
【０２１２】
１．ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）の調製
配列：ｎ−ノナノイル−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣ  ＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲ  ＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ  ＧＫ−チオエステル（配列番号３３）
ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）を、上記に記載されるようなチオエステル生成樹脂上で合成し、その後、ｎ−ノナン酸を樹脂に直接カップリングすることによってＮ末端において修飾した。ペプチド樹脂をフッ化水素で切断し、逆相ＨＰＬＣによって精製して、ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）を得た。測定質量＝４１７７Ｄａ；計算質量＝４１７７．６２Ｄａ（平均同位体組成）。
【０２１３】
２．ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）−Ｌｙｓ６９（ＧＰ６）−Ｌｅｕ７０の調製配列：ＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴ  ＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰ  ＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮ  ＳＬＥＭＳＫ（ＧＰ６）Ｌ（配列番号３４）
ａ．固相ペプチド合成および｛ペプチド樹脂｝上での水溶性ポリマー合成
ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）−Ｌｙｓ６９（Ｆｍｏｃ）−Ｌｅｕ７０を、上記に記載されるようなＢｏｃ化学固相ペプチド合成のためのインシトゥー中和／ＨＢＴＵ活性化プロトコルを使用して、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂における通常の固相ペプチド合成によって合成した。
【０２１４】
鎖の組立てが完了した後、上記に記載されるように、Ｌｙｓ６９のε−窒素におけるＦｍｏｃ基を保護ペプチド−樹脂から除き、ＧＰ６構築物をペプチド樹脂上で合成した。ペプチド／直鎖状水溶性ポリマー樹脂をフッ化水素で切断し、生成物を調製用の逆相ＨＰＬＣによって精製して、ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）−Ｌｙｓ６９（ＧＰ６）−Ｌｅｕ７０を得た。測定質量＝６２５２．８７Ｄａ；計算質量＝６２５２．２４Ｄａ（平均同位体組成）。
【０２１５】
３．Ｇ１７５５の調製
配列：ｎ−ノナノイル−ＰＹＳＳＤＴＴＰＣＣ  ＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲ  ＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ  ＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦ  ＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡ  ＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹ  ＩＮＳＬＥＭＳＫ（ＧＰ６）Ｌ（配列番号３５）
ａ．天然の化学的連結による全長ポリペプチドの組立て
Ｎ末端完全非保護ペプチドセグメントおよびＣ末端完全非保護ペプチドセグメントを、実施例１８において上記に記載されるような天然の化学的連結によって連結させた。還元型の全長のポリペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水に対するアセトニトリルの直線グラジエントを用いて逆相ＨＰＬＣを使用して精製した。測定質量＝１００６０．７４Ｄａ；計算質量＝１００５８．６７Ｄａ（平均同位体組成）。
【０２１６】
ｂ．水溶性ポリマーで修飾されたポリペプチドの折畳みおよび精製
ＧＰ６が結合している全長のポリペプチドを、上記に記載されるように、システイン−シスチンのレドックス対を含有する水性緩衝液において２つのジスルフィド結合を同時に形成させることによって折り畳ませ、逆相ＨＰＬＣによって精製した。折り畳まれた生成物はＨＰＬＣで均一であった。測定質量＝１００５７．４３Ｄａ；計算質量＝１００５４．６７Ｄａ（平均同位体組成）。
【０２１７】
実施例１４：ＲＡＮＴＥＳ類似物Ｇ１８０５の調製
図１３に示されるＧ１８０５化合物は下記のように合成された。
【０２１８】
１．ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）（Ｔｙｒ３Ｃｈｇ）−チオエステルの調製
配列：ｎ−ノナノイル−ＰＸＳＳＤＴＴＰＣＣ  ＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲ  ＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ  ＧＫ−チオエステル（配列番号３６）（式中、Ｘ＝Ｌ−シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ））
ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）（Ｔｙｒ３Ｃｈｇ）を、上記に記載されるようなチオエステル生成樹脂上で合成し、その後、ｎ−ノナン酸を樹脂に直接カップリングすることによってＮ末端において修飾した。ペプチド樹脂をフッ化水素で切断し、逆相ＨＰＬＣによって精製して、ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）（Ｔｙｒ３Ｃｈｇ）を得た。測定質量＝４１５１．９８Ｄａ；計算質量＝４１５２．６Ｄａ（平均同位体組成）。
【０２１９】
２．ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）（Ｍｅｔ６７Ｌｙｓ（Ｌｅｖ））−Ｌｙｓ６９−Ｌｅｕ７０の調製
配列：ＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴ  ＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰ  ＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮ  ＳＬＥＫ（Ｌｅｖ）ＳＫＬ（配列番号３７）
ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）（Ｍｅｔ６７Ｌｙｓ）−Ｌｙｓ６９（Ｆｍｏｃ）−Ｌｅｕ７０を、上記に記載されるようなＢｏｃ化学固相ペプチド合成のためのインシトゥー中和／ＨＢＴＵ活性化プロトコルを使用して、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂における通常の固相ペプチド合成によって合成した。
【０２２０】
鎖の組立てが完了した後、Ｌｙｓ６７のε−窒素におけるＦｍｏｃ基を、２０％のピペリジンを含むＤＭＦで処理することによって保護ペプチド−樹脂から除いた。レブリン酸を１，３−ジイソプロピルカルボジイミドで対称的な無水物として活性化して、Ｌｙｓ６７のε−窒素にカップリングした。ペプチド−樹脂をフッ化水素で切断し、生成物を調製用の逆相ＨＰＬＣによって精製して、ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）（Ｍｅｔ６７Ｌｙｓ（Ｌｅｖ））−Ｌｙｓ６９−Ｌｅｕ７０を得た。測定質量＝４４３３．２２Ｄａ；計算質量＝４４３４．１９Ｄａ（平均同位体組成）。
【０２２１】
３．Ｇ１８０５の調製
配列：ｎ−ノナノイル−ＰＸＳＳＤＴＴＰＣＣ  ＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲ  ＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ  ＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦ  ＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡ  ＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹ  ＩＮＳＬＥＫ（Ｌｅｖ−ＧＰ２９）ＳＫＬ（配列番号３８）（式中、Ｘ＝Ｌ−シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、ＧＰ２９＝図１３および図１４に示される分枝状のオキシム連結した水溶性ポリマー構築物）
ａ．天然の化学的連結による全長ポリペプチドの組立て
Ｎ末端完全非保護ペプチドセグメントおよびＣ末端完全非保護ペプチドセグメントを、上記に記載されるような天然の化学的連結によって連結させた。還元型の全長ポリペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水に対するアセトニトリルの直線グラジエントを用いて逆相ＨＰＬＣを使用して精製した。測定質量＝８２１３．６２Ｄａ；計算質量＝８２１６．６４Ｄａ（平均同位体組成）。
【０２２２】
ｂ．水溶性ポリマーＧＰ２９の合成
ｉ．多数のチオール基を有するテンプレートＧＲＦＮＰ１７の合成
分岐コアテンプレートのＧＲＦＮＰ１７を、０．４ｍｍｏｌスケールで、アミド生成（４−メチル）ベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）−樹脂上で手作業により合成した。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを、標準的なカップリング・プロトコル（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ．、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．（１９９２）４０：１８０〜９３）、３．８ｍｌの０．５Ｍ  ＨＢＴＵにおける４．２ｍｍｏｌのアミノ酸および１０％のＤＩＥＡ（すなわち、５倍過剰のアミノ酸）を使用してカップリングした。Ｆｍｏｃ保護基を除いた後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを、標準的なカップリング・プロトコル（３．８ｍｌの０．５Ｍ  ＨＢＴＵにおける２．１ｍｍｏｌのアミノ酸および１０％のＤＩＥＡ（すなわち、５倍過剰のアミノ酸）を使用してカップリングした。次のＦｍｏｃ除去ステップの後、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを、標準的なカップリング・プロトコル（７．６ｍｌの０．５Ｍ  ＨＢＴＵにおける４．２ｍｍｏｌのアミノ酸および１０％のＤＩＥＡ（すなわち、自由なアミンに対して５倍過剰のアミノ酸）を使用してカップリングした。最後のＦｍｏｃ脱保護ステップの後、（自由なアミンに対して）５倍過剰のＳ−アセチルチオグリコール酸ペンタフルオロフェニルエステル（ＳＡＭＡ−ｏＰｆｐ）をＤＭＦ中で３０分間カップリングした。Ｃ末端リシル残基のｔ−Ｂｏｃ保護基を、純ＴＦＡを用いた１分間のバッチ洗浄を２回行い、その後、１０％のＤＩＥＡを含むＤＭＦで洗浄することによる樹脂の中和により除いた。２ｍｍｏｌのＢｏｃ−アミノオキシ酢酸および２ｍｍｏｌのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を３ｍｌのＤＭＦに溶解した。２ｍｍｏｌのＤＩＣ（ジイソプロピルカルボジイミド）を加えた後、酸を３０〜６０分間活性化した。この溶液を中和後の樹脂に加え、カップリングを１時間行った。最後に、Ｓ−連結しているアセチル基の除去を、２０％のピペリジンを含むＤＭＦを用いて３０分間行った。テンプレートを、自由なアルデヒドに対するスカベンジャとしてのシステインの存在下での標準的なＢｏｃ化学手法（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ．、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．（１９９２）４０：１８０〜９３）に従ってＨＦ／ｐ−クレゾールを使用して脱保護し、同時に樹脂担体から切断した。５０％Ｂ［すなわち、０．１％のＴＦＡを含有する５０％の水性アセトニトリル］（アルデヒド含まず）における回収されたポリアミドを凍結し、凍結乾燥した。精製のために、テンプレートの粗生成物を２ｍｌの５０％Ｂに溶解して、１００ｍｌの１００％Ａ［すなわち、０．１％のＴＦＡを含む水］を加えて、サンプルを希釈した（アルデヒドの付加が保証されているので、塩化グアニジニウムまたは酢酸塩の添加を避ける）。テンプレートを、３％のＢでＴ＝４０℃において平衡化された調製用のＣ４逆相ＨＰＬＣカラムに負荷した。塩をアイソクラティック溶出して、所望するテンプレートのＧＲＦＮＰ１７を直線グラジエントで精製した。所望する生成物を含有する画分をＥＳ−ＭＳによって同定して、集め、凍結乾燥した。
【０２２３】
ｉｉ．分枝状水溶性ポリマーＧＲＦＮＰ２９の合成
ＧＲＦＮＰ２９、すなわち、１５ｋＤの分子量を有する分枝状の（ＴＴＤ−Ｓｕｃｃ）１２ポリマーを、精製されたチオール含有テンプレートＧＲＦＮＰ１７と直鎖状ポリマーＧＲＦＮＰ３１のＢｒ−アセチル−（ＴＴＤ−Ｓｕｃｃ）１２−カルボキシラートとのチオエステル生成連結によって合成した。ＧＲＦＮＰ３１は、標準的なプロトコル（Ｒｏｓｅ他、米国特許出願第０９／３７９，２９７号；Ｒｏｓｅ他、Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．（１９９９）１２１：７０３４）に従ってＳａｓｒｉｎカルボキシ生成樹脂上で合成され、ブロモアセチル化され、そして精製された。
【０２２４】
（全チオールに対して）１．３倍モル過剰の精製されたＧＲＦＮＰ３１のＢｒ−アセチル化（ＥＤＡ−Ｓｕｃｃ）１２と、精製されたチオール含有テンプレートＧＲＦＮＰ１７とを０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／６Ｍ塩化グアニジニウム（ｐＨ８．７）に約１０ｍＭの濃度で一緒に溶解した。溶解後、溶液を０．１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．７）緩衝液で３倍（ｖ／ｖ）に希釈した。連結混合物を室温で撹拌し、反応を逆相ＨＰＬＣおよびＥＳ／ＭＳによってモニタした。所望する反応生成物が主生成物になるまで、さらなるＧＲＦＮＰ３１反応物を必要に応じて加えた。処理のために、３倍（ｖ／ｖ、連結混合物に対して）の０．１Ｍ酢酸塩／６Ｍ塩化グアニジニウム（ｐＨ４）を加え、溶液を調製用のＣ４逆相ＨＰＬＣカラムに負荷し、直線グラジエントを用いて精製した。ＧＲＦＮＰ２９構築物を含有する画分を、ＥＳ−ＭＳを使用して同定し、集めて、凍結乾燥した。
【０２２５】
ｃ．連結された全長のポリペプチドに対するＧＰ２９の結合
凍結乾燥された全長のポリペプチドを溶解して、０．１％のＴＦＡを含有する５０％水性アセトニトリルにおける等モル量のアミノオキシアセチル（ＡＯＡ）含有分枝状水溶性ポリマー構築物ＧＰ２９とともに同時に凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、逆相ＨＰＬＣによって精製して、６７位のリジンの修飾された側鎖におけるケト官能基へのオキシム結合によってＧＰ２９が共有結合的に結合している全長のポリペプチドを得た。このポリマー修飾されたペプチドは、調製的なグラジエントＣ４逆相ＨＰＬＣによって非修飾のペプチドおよび未反応のポリマーから分離された。所望するポリマー修飾生成物を含有する画分をＥＳ−ＭＳによって同定して、集めた。測定質量＝２３，８３５．９２Ｄａ；計算質量＝２３，８４４．６４Ｄａ（平均同位体組成）。あるいは、ＧＰ２９を、ポリペプチドの折畳みの後に共有結合的に結合させたが、この場合には、低い収率がもたらされることが認められた。
【０２２６】
ｄ．オキシム連結によるＧＰ２９を含有するポリペプチドの折り畳みおよび精製
ＧＰ２９が結合している全長のポリペプチドを、上記に記載されるように、システイン−シスチンのレドックス対を含有する水性緩衝液において２つのジスルフィド結合を同時に形成させることによって折り畳ませ、逆相ＨＰＬＣによって精製した。折り畳まれた生成物はＨＰＬＣで均一であった。測定質量＝２３，８３２Ｄａ；計算質量＝２３，８４０Ｄａ（平均同位体組成）。
【０２２７】
実施例１５：ＲＡＮＴＥＳ類似物Ｇ１８０６の調製
図１４に示されるＲＡＮＴＥＳ類似物Ｇ１８０６は下記のように合成された。
【０２２８】
１．ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）（Ｔｙｒ３Ｃｈｇ）−チオエステルの調製
配列：ノナノイル−ＰＸＳＳＤＴＴＰＣＣ  ＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲ  ＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ  ＧＫ−チオエステル（配列番号３９）（式中、Ｘ＝Ｌ−シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ））
ペプチドセグメントのｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）（Ｔｙｒ３Ｃｈｇ）−チオエステル（−ＣＯＳＲ（式中、Ｒはアルキル基である）として示されるチオエステル）を、上記に記載されるようなチオエステル生成樹脂上で合成し、その後、ｎ−ノナン酸を樹脂に直接カップリングすることによってＮ末端において修飾した。ペプチド樹脂をフッ化水素で切断し、逆相ＨＰＬＣによって精製して、ｎ−ノナノイル−ＲＡＮＴＥＳ（２−３３）Ｔｙｒ３Ｃｈｇを得た。測定質量＝４１５１．９８Ｄａ；計算質量＝４１５２．６Ｄａ（平均同位体組成）。
【０２２９】
２．ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）（Ｍｅｔ６７Ｌｙｓ（Ｌｅｖ））−Ｌｙｓ６９（Ｐａｌｍ）−Ｌｅｕ７０の調製
配列：ＣＳＮＰＡＶＶＦＶＴ  ＲＫＮＲＱＶＣＡＮＰ  ＥＫＫＷＶＲＥＹＩＮ  ＳＬＥＫ（Ｌｅｖ）ＳＫ（Ｐａｌｍ）Ｌ（配列番号４０）
式中、Ｋ（Ｌｅｖ）は、野生型ＲＡＮＴＥＳからのＭｅｔ６７Ｌｙｓ変化体のＬｙｓ６７のレブリン酸修飾されたε−窒素であり、Ｋ（Ｐａｌｍ）は、下記の構造を有するアミノオクタン酸成分を介して結合してＬｙｓ６９のパルミチン酸修飾されたε−窒素である：
［Ｌｙｓ６９のε−窒素］−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３
ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）（Ｍｅｔ６７Ｌｙｓ）−Ｌｙｓ６９（Ｐａｌｍ）−Ｌｅｕ７０を、上記に記載されるようなＢｏｃ化学固相ペプチド合成のためのインシトゥー中和／ＨＢＴＵ活性化プロトコルを使用して、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＣＨ２−Ｐａｍ−樹脂における通常の固相ペプチド合成によって合成した。Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを６９位においてカップリングした後、Ｆｍｏｃ基を、２０％のピペリジンを含むＤＭＦ中で切断した。Ｆｍｏｃ−８−アミノオクタン酸をＨＢＴＵ／ＤＩＥＡで活性化して、Ｌｙｓ６９のε−窒素にカップリングした。Ｆｍｏｃ基を除いた後、パルミチン酸を１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＡＴＵ）および１，３−ジイソプロピルカルボジイミドで活性化して、樹脂にカップリングした。その後、鎖の組立てを、上記に記載されるような標準的なＢｏｃ化学ＳＰＰＳ法を使用して完了させた。鎖の組立てが完了した後、Ｌｙｓ６７のε−窒素におけるＦｍｏｃ基を、２０％のピペリジンを含むＤＭＦ中での処理により除いた。レブリン酸を１，３−ジイソプロピルカルボジイミドで対称的な無水物として活性化して、Ｌｙｓ６７のε−窒素にカップリングした。ペプチド樹脂をフッ化水素で切断し、生成物を調製用の逆相ＨＰＬＣによって精製して、ＲＡＮＴＥＳ（３４−６８）（Ｍｅｔ６７Ｌｙｓ（Ｌｅｖ））−Ｌｙｓ６９（パルミタート）−Ｌｅｕ７０を得た。測定質量＝４８１３．７２Ｄａ；計算質量＝４８１３．８１Ｄａ（平均同位体組成）。
【０２３０】
３．Ｇ１８０６の調製
配列：ノナノイル−ＰＸＳＳＤＴＴＰＣＣ  ＦＡＹＩＡＲＰＬＰＲ  ＡＨＩＫＥＹＦＹＴＳ  ＧＫＣＳＮＰＡＶＶＦ  ＶＴＲＫＮＲＱＶＣＡ  ＮＰＥＫＫＷＶＲＥＹ  ＩＮＳＬＥＫ（Ｌｅｖ−ＧＰ２９）ＳＫ（Ｐａｌｍ）Ｌ（配列番号４１）式中、Ｘ＝Ｌ−シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、パルミタート（「Ｐａｌｍ」）脂肪酸結合は下記のアミノオクタン酸成分を介してである：
［Ｌｙｓ６９のε−窒素］−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）１４−ＣＨ３
ａ．天然の化学的連結による脂肪酸修飾全長ポリペプチドの組立て
Ｎ末端完全非保護ペプチドセグメントおよびＣ末端完全非保護ペプチドセグメントを、上記に記載されるような天然の化学的連結によって連結させた。還元型の全長ポリペプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸を含有する水に対するアセトニトリルの直線グラジエントを用いた逆相ＨＰＬＣを使用して精製した。測定質量＝８５９８．２１Ｄａ；計算質量＝８５９６．２７Ｄａ（平均同位体組成）。
【０２３１】
ｂ．連結された脂肪酸修飾全長ポリペプチドに対する水溶性ポリマーＧＰ２９の結合
凍結乾燥された全長のポリペプチドを溶解して、等モル量のＡＯＡ含有ポリマーＧＰ２９とともに同時に凍結乾燥した。乾燥粉末を溶解し、逆相ＨＰＬＣによって精製して、６７位のリジンの修飾された側鎖におけるケト官能基へのオキシム結合によりＧＰ２９が共有結合的に結合している全長のポリペプチドを得た。測定質量＝２４２１７Ｄａ；計算質量＝２４，２２４Ｄａ（平均同位体組成）。あるいは、ＧＰ２９は、ポリペプチドの折畳みの後に共有結合的に結合させることができるが、この場合には、低い収率がもたらされることが認められた。
【０２３２】
ｃ．オキシム連結によるＧＰ２９および脂肪酸を含有するポリペプチドの折畳みおよび精製
ＧＰ２９が結合している全長のポリペプチドを、上記に記載されるように、システイン−シスチンのレドックス対を含有する水性緩衝液において２つのジスルフィド結合を同時に形成させることによって折り畳ませ、逆相ＨＰＬＣによって精製した。折り畳まれた生成物はＨＰＬＣで均一であった。測定質量＝２４２１０．１０Ｄａ；計算質量＝２４，２２０．１７Ｄａ（平均同位体組成）。
【０２３３】
図１５には、精製後の最終的な折り畳まれた合成Ｒａｎｔｅｓ類似物を表す分析データが示される。具体的には、還元条件下（Ｒ）および非還元条件下（Ｎ）において合成ケモカイン類似物ＲＡＮＴＥＳのＧ１８０６に対する野生型（Ｗｔ）ＲＡＮＴＥＳの相対的分子量を比較する代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルが図１５に示される。相対的分子量はそれぞれのゲルの左側に示され、これは、同じゲルで泳動された分子量標準物（示されず）に対応する。折り畳まれた精製後のＧ１８０６生成物の代表的なＲＰ−ＨＰＬＣクロマトグラムもまた示される。これは、野生型の天然ＲＡＮＴＥＳと比較して、精密にポリマー修飾された構築物の純度および増大した相対的分子量を例示している。
【０２３４】
実施例１６：Ｇ１７５５−０１、Ｇ１７５５、Ｇ１８０５およびＧ１８０６に対する細胞融合アッセイ
細胞融合アッセイを、これらの様々なポリマー修飾されたＲＡＮＴＥＳ類似物の抗ＨＩＶ活性を調べるために行った。用いられた手順は実施例９に記載される通りである。代表的な結果を下記の表３に示す。
【表３】
2004517040.tif 000028
【０２３５】
これらの結果は、抗融合活性が直鎖状の水溶性ポリマー構築物または分枝状の水溶性ポリマー構築物のいずれかによる部位特異的な修飾の後で実質的に保持されていることを明らかにしている。この結果は、脂肪酸などの疎水性の成分がＣ末端に結合しているときに様々なＲＡＮＴＥＳ類似物の活性の増大が認められたことを考えれば驚くべきことであったが、このことは、ＲＡＮＴＥＳ類似物の疎水性を増大させることは一般に抗融合活性を増大させるという仮説を裏付けていた。対照的に、修飾のために使用された水溶性ポリマー（特に、分枝状の水溶性ポリマー）は非常に親水性で、負に荷電しているが、それにもかかわらず、ｉｎ  ｖｉｖｏ活性について求められている標的の効力範囲内に十分に含まれる活性のわずかな低下が認められただけであった。さらにより予想外のことは、負に荷電した大きい分枝状の水溶性ポリマー構築物で修飾されたＲＡＮＴＥＳ類似物の活性が、より小さい直鎖状の水溶性ポリマー構築物と比較して相対的に保持されていたことであり、そして小さい直鎖状ポリマーおよび分枝状ポリマーで修飾された類似物が活性に対して実質的に同じ効果を有していたことであった。この後者の観測結果は、部分的には、水溶性ポリマーによる修飾が、設計されたように、凝集部位における野生型ＲＡＮＴＥＳのペンダントＣ末端残基に対して内側で行われるときの抗凝集性のためであり、かつ／または水溶性ポリマーの局在化した抗融合性のためであると考えられる。
【０２３６】
効力を増大させるさらなる変化により、ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳおよびＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳに対して、水溶性ポリマーの結合から生じる大きくない活性喪失が補償された。これらの変化には、１つまたは複数の疎水性アミノ酸誘導体をＮ末端に導入すること、疎水性の脂肪酸成分をＣ末端に付加することが含まれた。これらの結果は、単分散のポリアミドエチレンポリマー（または他の水溶性ポリマー）と組み合わせたさらなる変化は、ＮＮＹ型およびＡＯＰ型の修飾ケモカイン分子、例えば、Ｎ末端に対するＰｒｏ２ＴｈｚとＴｙｒ３Ｃｈｇとの混合型変化、および／またはＣ末端に対する脂質成分の付加を有するＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳまたはＮＮＹ−ＲＡＮＴＥＳなどの全体的な効力を改善し得ることを示している。
【０２３７】
実施例１７：Ｇ１７５５、Ｇ１８０５およびＧ１８０６に対する薬物動態学的研究
ポリマー修飾されたＲＡＮＴＥＳ類似物の薬物動態学的研究をオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットで下記のように行った。上記に記載されるように調製されたＲＡＮＴＥＳ類似物のＧ１７５５、Ｇ１８０５およびＧ１８０６（およびコントロールとしてのＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ）を、ｐＨ７．０のリン酸塩緩衝化生理的食塩水における凍結乾燥タンパク質保存物から注射直前に静脈内（ＩＶ）注射のために配合した。配合物は、個々の試験動物に対して等モル量のＲＡＮＴＥＳ類似物が与えられるように調製された［４００μｇ／ｋｇ（ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳ）；５１０μｇ／ｋｇ（Ｇ１７５５）；１２１０μｇ／ｋｇ（Ｇ１８０５）；および１２２５μｇ／ｋｇ（Ｇ１８０６）（μｇ類似物／ｋｇ動物）］。最終濃度物は、それぞれの動物について１ｍｌ／ｋｇの総投薬容量が与えられるように、必要な場合には調節された（すなわち、投薬容量は一定に保たれた）。それぞれの配合された類似物は実験の１日目にラットの尾を介して静脈内投与された。それぞれの動物は１回の投薬を受けた。
【０２３８】
注射後、約０．２５ｍｌの血液が、実験期間中、それぞれのサンプル採取時点で尾静脈／動脈から採取され、そして血漿サンプルまたは血清サンプルが、抗凝固剤としてＥＤＴＡを使用して調製された。これらは標準的なプロトコルおよび国立衛生研究所動物管理指針および推奨される試験手順に従った。サンプル採取回数は、（国立衛生研究所動物管理指針によって確立されているように）３週間以内にどの動物からも０．２５ｍｌの１４個を超えるサンプルの採取を避けるために、最初のデータ収集に基づいて調節された。さらなるサンプルは、検出可能な血中レベルが最初のサンプルを超えて持続している場合には１週間の間隔で採取された。各時点におけるそれぞれのＲＡＮＴＥＳ類似物の血漿中濃度は、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥｌｉｓａのヒトＲＡＮＴＥＳ免疫アッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓカタログ＃ＤＲＮ００）を製造者の説明書に従って使用して測定された。体重、摂食癖、習性、外観などを含む動物の全体的な健康状態が実験期間中モニタされたが、明らかな副作用は認められなかった。代表的な結果が図１６に示される。
【０２３９】
これらの結果は、循環半減期の実質的な増大が、水溶性ポリマーを様々な前駆体ＲＡＮＴＥＳ類似物に結合することによってもたらされ、半減期の見かけの増大がＧ１８０５＞Ｇ１８０６＞Ｇ１７５５＞ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳであることを明らかにしている。ＡＯＰ−ＲＡＮＴＥＳに対して、増大は、Ｇ１８０５については約４０倍であり、Ｇ１８０６については２０倍であり、Ｇ１７５５については１０倍であった。まとめると、水溶性ポリマーで修飾されたＲＡＮＴＥＳ類似物の保持された大きい効力と著しく改善された循環半減期とのバランスは、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境におけるこれらの化合物の治療効力を増強し、そして処置のために必要とされる投薬回数および投薬量を低下させることが期待される。
【０２４０】
本明細書中で言及されるすべての刊行物および特許出願明細書は、それぞれの個々の刊行物または特許出願明細書が参考として組み込まれることが具体的かつ個々に示されたかのように同じ程度に参考として本明細書中に組み込まれる。
【０２４１】
本発明はこのように詳しく記載されているので、多くの変化および改変が、添付された特許請求の範囲の精神または範囲を逸脱することなく本発明に対して行われ得ることは当業者には明らかである。
に有用である。
【０２４２】
【配列表】
2004517040.tif 000029
2004517040.tif 000030
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【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】
本発明のポリマー修飾された生物活性な合成タンパク質を調製するための方法の概略を示す図である。
【図１Ｂ】
図１Ａと同様な図である。
【図１Ｃ】
図１Ａと同様な図である。
【図１Ｄ】
図１Ａと同様な図である。
【図１Ｅ】
図１Ａと同様な図である。
【図２Ａ】
本発明の合成された生物活性タンパク質を調製するための方法の概略を示す図である。
【図２Ｂ】
図２Ａと同様な図である。
【図２Ｃ】
図２Ａと同様な図である。
【図３Ａ】
３つ以上の重複しないペプチドフラグメントの化学的連結を伴う多セグメント連結プロセスの概略を示す図である（すなわち、少なくとも１つのセグメントは、最終的な全長の連結生成物に対応する中央のセグメントである）。
【図３Ｂ】
図３Ａと同様な図である。
【図４Ａ】
生じる側鎖チオールの天然の化学的連結および化学的修飾を例示する図である。
【図４Ｂ】
図４Ａと同様な図である。
【図４Ｃ】
図４Ａと同様な図である。
【図５Ａ】
本発明の水溶性ポリマーＵ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊ＊の分岐コア（Ｂ）および１つしか存在しない化学選択的な官能基（Ｕ）を生じさせるための固相法を示す図である。
【図５Ｂ】
図５Ａと同様な図である。
【図６Ａ】
Ｕ−Ｂコアに対するその後の結合のための本発明の好ましい実質的に非抗原性の水溶性ポリアミドＰｏｌｙｍｅｒ−Ｊ＊成分を生じさせるための固相法を示す図である。
【図６Ｂ】
図６Ａと同様な図である。
【図６Ｃ】
図６Ａと同様な図である。
【図６Ｄ】
図６Ａと同様な図である。
【図７】
式Ｕ−Ｂ−Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｊ＊の本発明の好ましい合成ポリマー構築物を生成するためにＵ−Ｂ成分をＰｏｌｙｍｅｒ−Ｊ＊成分にカップリングするための方法を示す図である。
【図８】
本発明の生物活性な合成タンパク質の連結および製造のために用いることができるペプチドセグメントに水溶性ポリマーを精密に結合させるための代わりの経路を示す図である。
【図９】
４種類の天然に存在するケモカインの一般構造、ならびに保存されているシステインのパターンによって規定されるそれらの対応するＮ末端領域、Ｎループ領域およびＣ末端領域を示す概略図である。本図において、「Ｃ」はシステインに対する１文字コードであり、「Ｘ」はシステイン以外の任意のアミノ酸を表す。
【図１０Ａ】
様々なケモカインポリペプチド鎖の天然に存在するアミノ酸配列の例を、これらのケモカインの対応するＮ末端領域、Ｎループ領域およびＣ末端領域を含めて示す図である。遺伝子によってコードされる２０個のアミノ酸に対する標準的な１文字アミノ酸コードが使用される。
【図１０Ｂ】
図１０Ａと同様な図である。
【図１０Ｃ】
図１０Ａと同様な図である。
【図１０Ｄ】
図１０Ａと同様な図である。
【図１１】
Ｒａｎｔｅｓのポリマー修飾された類似物であるＲａｎｔｅｓＧ１７５５−０１と名付けられた合成ケモカインを示す図である。
【図１２】
Ｒａｎｔｅｓのポリマー修飾された類似物であるＲａｎｔｅｓＧ１７５５と名付けられた合成ケモカインを示す図である。
【図１３】
Ｒａｎｔｅｓのポリマー修飾された類似物であるＲａｎｔｅｓＧ１８０５と名付けられた合成ケモカインを示す図である。
【図１４】
Ｒａｎｔｅｓのポリマー修飾された類似物であるＲａｎｔｅｓＧ１８０６と名付けられた合成ケモカインを示す図である。
【図１５】
合成ケモカイン類似物のＲａｎｔｅｓＧ１８０６に対する野生型Ｒａｎｔｅｓの相対的分子量を還元条件下（Ｒ）および非還元条件下（Ｎ）で比較する代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。相対的分子量が各ゲルの左側に示される。これは、同じゲルで泳動された分子量標準物に対応する。
【図１６】
分単位の時間に対する所与Ｒａｎｔｅｓ類似物のピコグラム／ミリリットル（ｐｇ／ｍｌ）単位での血漿中濃度を比較する代表的な薬物動態学的プロフィルを示す図である。本図に例示されている化合物は、ＡＯＰ−ＲａｎｔｅｓならびにＲａｎｔｅｓＧ１７５５、同Ｇ１８０６および同Ｇ１８０５である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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