(57)【要約】ＶＥＧＦ−Ｂ欠損動物は、房室（ＡＶ）伝導欠陥及び心筋層の虚血によって引き起こされるものと考えられる心臓異常を示す。ＶＥＧＦ−Ｂ欠損非ヒト動物を使用して房室伝導又は虚血調節活性に関して化合物をスクリーニングし、房室伝導欠陥又は虚血を治療又は軽減し、心臓疾患を診断するための方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
房室伝導調節活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、前記方法は、前記化合物をＶＥＧＦ−Ｂ欠損非ヒト動物に導入する工程と、前記動物の房室伝導に対するその作用をアッセイする工程とを有する、房室伝導調節活性に関して化合物をスクリーニングする方法。
【請求項２】
虚血調節活性に関して化合物をスクリーニングする方法であって、前記方法は、前記化合物をＶＥＧＦ−Ｂ欠損非ヒト動物に導入する工程と、前記動物の虚血に対するその作用をアッセイする工程とを有する、虚血調節活性に関して化合物をスクリーニングする方法。
【請求項３】
哺乳動物における房室伝導欠陥の治療又は軽減の方法であって、有効房室伝導欠陥軽減量の、ＶＥＧＦ−Ｂ又は、ＶＥＧＦ−Ｂの生物活性を有するそのフラグメント又はアナログを投与する工程を有する、哺乳動物における房室伝導欠陥の治療又は軽減の方法。
【請求項４】
哺乳動物における虚血の治療又は軽減の方法であって、有効虚血軽減量の、ＶＥＧＦ−Ｂ又は、ＶＥＧＦ−Ｂの生物活性を有するそのフラグメント又はアナログを投与する工程を有する、哺乳動物における虚血の治療又は軽減の方法。
【請求項５】
房室伝導欠陥又は虚血の治療又は軽減の方法であって、有効量の、ＶＥＧＦ−Ｂ又は、ＶＥＧＦ−Ｂの生物活性を有するそのフラグメント又はアナログをコードする核酸配列を投与する工程を有し、前記核酸は、房室伝導欠陥又は虚血を治療又は軽減するべく、有効量の、ＶＥＧＦ−Ｂ又はそのフラグメント又はアナログをコードすることができる、房室伝導欠陥又は虚血の治療又は軽減の方法。
【請求項６】
前記核酸配列はプロモーター配列に作動可能にリンクされている、請求項５の方法。
【請求項７】
前記核酸配列はベクターにクローニングされ、プロモーター配列に作動可能にリンクされている、請求項５の方法。
【請求項８】
前記ベクターは発現ベクターである、請求項７の方法。
【請求項９】
前記発現ベクターは、アデノウイルス、ワクシニア又はレトロウイルスベースのベクターから成るグループから選択される、請求項８の方法。
【請求項１０】
被験体におけるＶＥＧＦ−Ｂ発現の喪失によって特徴付けられる心臓疾患を診断する方法であって、
前記被験体からの第１ＤＮＡ試料を準備する工程と、
ＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡを含む第２ＤＮＡ試料を準備する工程と、
前記第１ＤＮＡ試料を、ポリメラーゼに作動可能に結合されたＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡに対して特異的なプライマー対に接触させる工程と、
前記第２ＤＮＡ試料を、ポリメラーゼに作動可能に結合されたＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡに対して特異的なプライマー対に接触させる工程と、
前記第１及び第２ＤＮＡ試料とポリメラーゼ連鎖反応を行う工程と、そして
前記第１ＤＮＡ試料中のＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡの増幅の欠如を検出するべく、前記第１及び第２ＤＮＡ試料のポリメラーゼ連鎖反応を比較する工程を有する、心臓疾患を診断する方法。
【請求項１１】
被験体におけるＶＥＧＦ−Ｂ発現の喪失によって特徴付けられる心臓疾患を診断する方法であって、
前記被験体からの生体試料を準備する工程と、
前記試料をＶＥＧＦ−Ｂに対する特異的結合試薬と接触させる工程と、そして
前記特異的結合試薬の結合の欠如を検出する工程を有する心臓疾患を診断する方法。
【請求項１２】
前記特異的結合試薬は、ＶＥＧＦ−Ｂに対する抗体である、請求項１１の方法。
【請求項１３】
被験体の心臓におけるＶＥＧＦ−Ｂ欠損を診断する方法であって、
前記被験体の心電図を採る工程と、そして
前記心電図を、正常な心電図との比較に於いて、ＰＱ間隔の延長又はＳＴ複合の低下に関して評価する工程を有する、被験体の心臓におけるＶＥＧＦ−Ｂ欠損を診断する方法。
【請求項１４】
被験体の心臓におけるＶＥＧＦ−Ｂ欠損を検出する方法であって、
前記被験体の心電図を採る工程と、そして
前記心電図を、正常な心電図との比較に於いて、ＰＱ間隔の延長又はＳＴ複合の低下に関して評価する工程を有する、被験体の心臓におけるＶＥＧＦ−Ｂ欠損を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ＶＥＧＦ−Ｂ欠損動物及びそれらの心臓異常に関する。ＶＥＧＦ−Ｂ欠損動物を使用して、心臓異常を阻止する物質をスクリーニングする方法、及び、心臓疾患、特にＶＥＧＦ−Ｂ発現の減失によって特徴付けられる疾患、を診断する方法が提供される。
【０００２】
哺乳動物の血管系の二つの主要な構成要素は、内皮細胞と平滑筋細胞である。内皮細胞は、哺乳動物のすべての血管とリンパ管との内表面のライニングを形成する。新しい血管の形成は、二つの異なるプロセス、即ち、脈管形成（ｖａｓｃｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）又は新脈管形成（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）によって起こりうる（リソー，ダブリュ（Ｒｉｓａｕ，Ｗ．），Ｎａｔｕｒｅ　３８６：６７１−６７４（１９９７）を参照）。脈管形成は、初期胚の一次血管網の形成に於いて起こるもののような、内皮細胞前駆体の、成熟内皮細胞への目的部位での（ｉｎ　ｓｉｔｕ）分化と、これらの細胞の血管を形成するための融合作用、とによって特徴付けられる。これに対して、新脈管形成、即ち、既存の血管の増殖と分岐とによる血管の形成、は、後の胚形成に於いて重要であり、成体に於いて起こる血管の増殖の原因となる。新脈管形成は、内皮細胞の増殖、細胞外マトリクスの分解、血管の分岐、それに続く細胞接着事象、を含む生理学的に複雑なプロセスである。成体に於いて、新脈管形成は、タイトに制御され、正常な状況では女性の生殖系に限定される。しかしながら、新脈管形成は、組織損傷に応答してスイッチ・オンされることが可能である。重要な事実として、固形腫瘍は、周囲の組織に於いて新脈管形成を誘発させることができ、これによって、腫瘍の増殖を維持し転移の形成を容易にする（フォークマン，ジェイ（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．）Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．１：２７−３１，（１９９５））。複雑な新脈管形成プロセスの背後に存在する分子機構についてはほとんど理解されていない。
【０００３】
新脈管形成は、又、それが疾患の様々な余病に役割を果す、又は、それらに直接関わる、多数の病理状態にも関係している。いくつかの具体例として、種々の肝臓疾患に関連する新生血管形成（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、糖尿病の新生血管形成余病、高血圧症の新生血管形成余病、外傷後の新生血管形成、慢性肝感染（たとえば、慢性肝炎）の新生血管形成、高温又は低温外傷による新生血管形成、ホルモンの過多に関連する機能障害、血管腫の形成、及び血管形成術後の再狭窄、が挙げられる。
【０００４】
新脈管形成は、非常に多くの生理的又は病理的プロセスに於いて重要な役割を果すものである為、新脈管形成の制御に関連するファクターについて鋭意研究されてきた。新脈管形成の調節には、多数の増殖因子が関連していることが示されており、これらには、線維芽細胞生長因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、及び肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が含まれる。たとえば、フォークマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２）を参照。
【０００５】
内皮細胞特異的増殖因子の特定のファミリー、即ち、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）とそれらに対応するレセプター、とが、内皮細胞増殖及び分化の刺激と、分化細胞の或る種の機能とに主に寄与していることが示唆された。これらの因子は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ増殖因子のメンバーであり、内皮レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を介して作用するものと考えられる。前記ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子は、システイン−ノットスーパーファミリーの増殖因子に属し、それは、又、ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ）とトランスフォーミング増殖因子βを含む。
【０００６】
ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ増殖因子に於いて８種類のタンパク質が同定されている。即ち、二つのＰＤＧＦ（Ａ及びＢ）と、ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦに密接に関連する５つのメンバーである。ＶＥＧＦに密接に関連する５つのメンバーとは、Ｌｕｄｗｉｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈとヘルシンキ大学の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６，０２９５７（ＷＯ９６／２６７３６）及び米国特許第５，８４０，６９３号及び５，６０７，９１８号に記載のＶＥＧＦ−Ｂ、ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）他のＥＭＢＯ　Ｊ．１５：２９０−２９８（１９９６）、リー（Ｌｅｅ）他のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１９８８−１９９２（１９９６）及びＨｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社の米国特許第５，９３２，５４０号及び第５，９３５，５４０号に記載のＶＥＧＦ−Ｃ又はＶＥＧＦ２、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）及びアチェン（Ａｃｈｅｎ）他のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：５４８−５５３（１９９８）に記載のＶＥＧＦ−Ｄ、マグリオーネ（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）他のＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：９２６７−９２７１（１９９１）に記載の胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、そしてＨｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７２８３（ＷＯ９６／３９４２１）に記載のＶＥＧＦ３である。各ＶＥＧＦファミリーメンバーは、ＶＥＧＦに対して３０％ないし４５％のアミノ酸配列同一性を有する。これらＶＥＧＦファミリーメンバーは、前記システイン−ノットモチーフを形成する６つのシステイン残基を含むＶＥＧＦホモロジードメインを共有している。ＶＥＧＦファミリーの機能的特徴としては、内皮細胞に対する様々なレベルのマイトジェン活性、血管透過性の誘発、及び新脈管形成及びリンパ形成特性がある。
【０００７】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、その名が暗示するように、内皮細胞特異性マイトジェンである。それは、強力な新生血管形成活性を有する。即ち、それは、新しい血管の増殖を促進する。重要な生理プロセスである新脈管形成には、血液と血管の細胞の多数のタンパク質が関連している。新脈管形成プロセス中、ＶＥＧＦのようなマイトジェン因子が重要な役割を果す。しかしながら、これらの因子の役割の生化学的詳細は、必ずしも入手可能ではない。
【０００８】
ＶＥＧＦの同定と特徴付け以来、多くの重要な知見は、新脈管形成因子の活性と新しい因子の解明とに集中している。初期の知見は、新脈管形成が正常な発達と生理機能とに必要とされることを示した。胚形成、損傷治癒、黄体形成等のプロセスは、すべて新脈管形成及び新脈管形成因子に関連している。たとえば損傷治癒中に於いて、ＶＥＧＦｍＲＮＡのレベルが増加し、これは、ＶＥＧＦの発現と治癒プロセスとの間の直接的な相互関連を示唆している。又、ＶＥＧＦ調節の欠陥は、損傷治癒障害と関連しているかもしれない（フランク，エス（Ｆｒａｎｋ，Ｓ．）他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０５：１２６０７−１２６１３（１９９５））。
【０００９】
新脈管形成因子に関連するその他の重要は知見は、持続性で調節されない新脈管形成によって疾患が悪化および／又は発生するということを示している。たとえば、関節炎は、関節に侵入し軟骨組織を破壊する新しい毛細血管が関係している。糖尿病に於いて、網膜の新しい毛細血管が、硝子体液に侵入し、出血と盲目状態を引き起こす（フォークマン，ジェイ（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．）及びシン，ワイ（Ｓｈｉｎｇ，Ｙ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２））。これら及びその他の疾患における新脈管形成因子の役割は、まだはっきりとは確立されていない。
【００１０】
別の重要な知見は、新脈管形成と腫瘍発達との間の関連に関係している。腫瘍の増殖と転移は、共に、新脈管形成依存プロセスである（フォークマン，ジェイ（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．）及びシン，ワイ（Ｓｈｉｎｇ，Ｙ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２））。たとえば、腫瘍細胞が動物に導入された時、ＶＥＧＦｍＲＮＡの発現パターンは、壊死性の、腫瘍増殖領域の周囲の細胞に於いて最も高いレベルを示す。これらの領域内に於いて多数の血管が同定された。これらの領域におけるＶＥＧＦの発現は、低酸素血症、即ち、酸素（ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ）の不足状態、によって、壊死性腫瘍中のＶＥＧＦの発現と放出を引き起こす（ｔｒｉｇｇｅｒ）ことを示唆している。後により詳細に記載する、別の血管内皮細胞マイトジェン、ＶＥＧＦ−Ｂ、の発現は、腫瘍の増殖、特にメラノーマ、と直接に相関している（米国特許第５，８４０，６９３号を参照）。
【００１１】
ＶＥＧＦは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）に構造的に関連するタンパク質ファミリーのメンバーである。ＰＤＧＦは、平滑筋細胞、グリア細胞、及びその他いくつかの細胞タイプに対する強力なマイトジェンである。一つの側面に於いて、ＰＤＧＦファミリーのメンバーは、８つの保存システイン残基の存在によって特徴付けられる。その活性生理状態に於いて、これらタンパク質は、前記８つのシステイン残基に於いて、分子間結合と分子内結合との両方による、ジスルフィド結合によって形成されるダイマーである。別の側面に於いて、これらファミリーメンバーは、そのマイトジェン活性、特に、内皮及びその他の関連細胞タイプに関連している。
【００１２】
血管内皮増殖因子Ｂ（ＶＥＧＦ−Ｂ）、非グリコシル化、高塩基性増殖因子、は、ＰＤＧＦファミリーのもう一つのメンバーである。ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−Ａ，ＰＤＧＦ−Ｂ及びＰｌＧＦ（胎盤増殖因子）に対する密接な構造的類似性に依り、ＶＥＧＦ−Ｂは、成体及び胚組織、特に筋組織、における脈管形成に役割を果している。ＶＥＧＦ−Ｂは、又、新脈管形成マイトジェンでもある。ノーザンブロットは、心臓、脳、及び骨格筋を含む種々のマウス及びヒト組織におけるＶＥＧＦ−ＢｍＲＮＡを示している。ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって、メラノーマ、正常な皮膚、及び筋肉におけるＶＥＧＦ−ＢｍＲＮＡの存在が示された。
【００１３】
このように、ＶＥＧＦ−Ｂは、哺乳動物における多くの組織で、但し、心臓、骨格筋及び膵臓に於いて最も豊富に、発現される。ＶＥＧＦ−Ｂの発現パターンは、ＶＥＧＦのそれと異なるが、これらは共に、多く組織に於いて発現される（オロフソン，ビー（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，Ｂ．）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：２５７６−２５８１（１９９６））。
【００１４】
ＶＥＧＦ−Ｂのマウスとヒトの遺伝子は、ほとんど同一であって、これらは共に約４ｋｂのＤＮＡに及ぶ。これらの遺伝子は７つのエキソンから構成され、そのエキソン−イントロン構成は、ＶＥＧＦ及びＰｌＧＦ遺伝子のそれに類似している（グリモンド（Ｇｒｉｍｍｏｎｄ）他、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．６：１２４−１３１（１９９６）；（オロフソン，ビー（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，Ｂ．）他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９３１０−１９３１７（１９９６）；タウンソン（Ｔｏｗｎｓｏｎ）他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２０：９２２−９２８（１９９６））。現在、ｍＲＮＡの選択的スプライシングによって生成されるＶＥＧＦ−Ｂの二つのアイソフォームが認識されている（グリモンド（Ｇｒｉｍｍｏｎｄ）他、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．６：１２４−１３１（１９９６）；（オロフソン，ビー（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，Ｂ．）他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１９３１０−１９３１７（１９９６）；タウンソン（Ｔｏｗｎｓｏｎ）他、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２０：９２２−９２８（１９９６））。これらのふたつの分泌型のＶＥＧＦ−Ｂは、それぞれ、１６７（ＶＥＧＦ−Ｂ１６７）及び１８６（ＶＥＧＦ−Ｂ１８６）のアミノ酸残基を有している。これらアイソフォームは、シグナル配列を除き、１１５のアミノ酸残基の同じＮ末端ドメインを有し、これに対してＣ末端ドメインは異なっている。共通のＮ末端ドメインはエキソン１−５によってコード化されている。残りの３つのエキソンの使用の違いによって、前記二つのスプライシングアイソフォームが生じている。エキソン６の選択的スプライシング−アクセプター部位の使用により、１０１ｂｐの挿入によってＶＥＧＦ−Ｂ１６７ｃＤＮＡのコード領域のフレームシフトと、停止とがもたらせる。このように、二つのＶＥＧＦ−Ｂアイソフォームは異なるＣ末端ドメインを有する。
【００１５】
前記ＶＥＧＦ−Ｂの二つのスプライシングアイソフォームの異なるＣ末端ドメインは、それらの生化学的及び細胞生物学的特性に影響する。ＶＥＧＦ−Ｂ１６７のＣ末端ドメインは、ＶＥＧＦの対応する領域に構造的に関係し、複数の保存システイン残基と塩基性アミノ酸残基の伸展（ｓｔｒｅｔｃｈ）とを有する。このように、このドメインは、親水性が高く、塩基性であり、従って、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７は、生成する細胞がヘパリン又は高い塩濃度で処理されない限り、分泌に於いて細胞会合性（ｃｅｌｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）を維持する。ＶＥＧＦ−Ｂ１６７に結合する細胞会合分子は、恐らく、細胞表面又は細胞周囲ヘパリン硫酸プロテオグリカンである。このアイソフォームの細胞会合は、おそらく、その特異な塩基性Ｃ末端領域を介して起こる。
【００１６】
ＶＥＧＦ−Ｂ１８６のＣ末端ドメインは、データベース中の公知のアミノ酸配列に対して有意な類似性を持たない。ＶＥＧＦ−Ｂ１８６のＣ末端ドメインの疎水性は、ＶＥＧＦ−Ｂ１６７の塩基性Ｃ末端ドメインの親水性と対照的である。このことは、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６は、その分泌に於いて細胞会合性を維持しないという観察によって裏付けられている。最近の証拠は、このアイソフォームが、蛋白分解処理され、これによって、タンパク質の生物学的特性が調製されるということを示している（オロフソン，ビー（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，Ｂ．）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１１７０９−１１７１４（１９９８））。
【００１７】
ヒト及びマウスのＶＥＧＦ−Ｂと、各アイソフォームとに対する、ヌクレオチド及びアミノ酸配列を含む単離と特徴は、Ｌｕｄｗｉｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈとヘルシンキ大学の米国特許第５，８４０，６９３号及び５，６０７，９１８号とオロフソン，ビー（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，Ｂ．）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：２５７６−２５８１（１９９６）とに詳細に記載されている。国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）、米国特許第５，８４０，６９３号及び第５，６０７，９１８号の全開示をここに参考文献として合体させる。
【００１８】
その関連するマイトジェンタンパク質と同様、ＶＥＧＦ−Ｂは、イン・ヴィヴォではジスルフィド結合ホモダイマーとして存在する。ＶＥＧＦ−Ｂの両アイソフォームは又、ＶＥＧＦとヘテロダイマーを形成し、これは、ＰＤＧＦ様タンパク質の分子間及び分子内ジスルフィド結合に関連する前記８つのシステイン残基の保存と一致する。更に、多くの組織におけるＶＥＧＦ−ＢとＶＥＧＦとの同時発現は、ＶＥＧＦ−Ｂ−ＶＥＧＦヘテロダイマーが自然発生することを示唆している。ＶＥＧＦ−Ｂ１６７−ＶＥＧＦヘテロダイマーは、細胞会合状態に維持される。これに対して、ＶＥＧＦ−Ｂ１８６とＶＥＧＦとのヘテロダイマーは、培養培地中に於いて細胞から遊離して分泌される。ＶＥＧＦは、ＰｌＧＦともヘテロダイマーを形成する（ジサルヴォ（ＤｉＳａｌｖｏ）他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：７７１７−７７２３（１９９５））。このファミリーの増殖因子のメンバー間のヘテロダイマー複合体の生成は、新脈管形成性又は調節分子の多様なアレイの為の基盤を提供しているのかもしれない。
【００１９】
上述したように、前記ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーメンバーは、主として、レセプターチロシンキナーゼに結合することによって作用する。一般に、レセプターチロシンキナーゼは、糖タンパク質であって、これは、特定の増殖因子（単数又は複数）と結合できる細胞外ドメインと、通常そのタンパク質のアルファ−ヘリカル部分である膜貫通ドメイン、そのレセプターがたとえば、タンパク質燐酸化によって調節可能である膜近傍ドメイン、前記レセプターの酵素成分であるチロシンキナーゼドメイン、そして、多くのレセプターに於いては、チロシンキナーゼに対する基質の認識と結合とに関連しているカルボキシ−末端尾、から成る。
【００２０】
５つの内皮細胞特異性レセプターチロシンキナーゼが同定されている。即ち、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）、ＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）、Ｔｉｅ及びＴｅｋ／Ｔｉｅ−２である。これらのレセプターは、その特異性とアフィニティーとに於いて異なっている。これらのすべてが、シグナル伝達に必要な固有のチロシンキナーゼ活性を有する。
【００２１】
ＶＥＧＦに結合することが知られているレセプターチロシンキナーゼは、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３だけである。ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２とは、高いアフィニティーでＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦＲ−１はＰｌＧＦにも結合する。ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦＲ−１に高いアフィニティで結合するが、ＶＥＧＦＲ−２や−３には結合しない（オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：１１７０９−１１７１４（１９９８））。ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−３に対するリガンドであることが示されており、これは、更に、ＶＥＧＦＲ−２を活性化する（ヨウコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）他、ＥＭＢＯ　Ｊ．１５：２９０−２９８（１９９６））。ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３との両方に結合する（アチェン（Ａｃｈｅｎ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：５４８−５５３（１９９８））。Ｔｅｋ／Ｔｉｅ−２のリガンドは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社の国際特許出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２９３５（ＷＯ９６／１１２６９）に記載されている。Ｔｉｅのリガンドはまだ同定されていない。
【００２２】
最近、新規な１３０−１３５ｋＤａのＶＥＧＦアイソフォーム特異性レセプターが精製されクローニングされた（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）他、Ｃｅｌｌ　９２：７３５−７４５（１９９８）。このＶＥＧＦレセプターは、ヘパリンに対して弱いアフィニティーを示す、エキソン７コード配列を介してＶＥＧＦ１６５アイソフォームに特異的に結合することが判った（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）他、Ｃｅｌｌ　９２：７３５−７４５（１９９８））。驚くべきことに、このレセプターは、初期段階の神経形態形成（ｎｅｕｒｏｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）に関連するレセプターである、ヒトのニューロピリン（ＮＰ−１）と同一であることが示された。ＰｌＧＦ−２も、ＮＰ−１と作用するようである（ミグダール（Ｍｉｇｄａｌ）他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２２２７２−２２２７８（１９９８））。
【００２３】
ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３は、内皮細胞によって発現が異なる。一般に、ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２は、共に、血管内皮に発現される（エールリッヒス（Ｏｅｌｒｉｃｈｓ）他、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　８：１１−１８（１９９２）；カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：２０７７−２０８８（１９９３）；デュモン（Ｄｕｍｏｎｔ）他、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０３：８０−９２（１９９５）；フォン（Ｆｏｎｇ）他、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０７：１−１０（１９９６））、そしてＶＥＧＦＲ−３は、ほとんど成体組織のリンパ内皮に発現される（カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９：３５６６−３５７０（１９９５））。ＶＥＧＦＲ−３は、又、腫瘍の周囲の血管網にも発現される。
【００２４】
ＶＥＧＦＲ−１は、主として発達中に内皮細胞に発現されるが、これは、又、胚形成の初期段階に於いて造血前駆細胞中にも見つけることができる（フォン（Ｆｏｎｇ）他、Ｎａｔｕｒｅ　３７６：６６−７０（１９９５））。成体に於いては、単球とマクロファージもこのレセプターを発現する（バーレオン（Ｂａｒｌｅｏｎ）他、Ｂｌｏｏｄ　８７：３３３６−３３４３（１９９５））。胚に於いては、ＶＥＧＦＲ−１は、全部ではないが大半の血管によって発現される（ブライアー（Ｂｒｅｉｅｒ）他、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０４：２２８−２３９（１９９５）；フォン（Ｆｏｎｇ）他、Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２０７：１−１０（１９９６））。
【００２５】
タンパク質の機能と生物活性を研究するためにトランスジェニック動物が有用なツールであり、そのような様々な動物がこの目的の為に作られている。トランスジェニック動物を作る一つの具体的な方法は、相同組換えに関するものである。相同組換えに於いて、ゲノム配列の全部又は一部が、ホモロガスな配列を含む別のＤＮＡと置き換えられる。トランスジェニック操作と相同組換えによって、動物の細胞の遺伝子、又は遺伝子の一部を変化させることができる。遺伝子をもはや元のタンパク質として機能しないタンパク質をコードするように変化させることによって、ヌルミュータント又はヌルアレルが作り出される（たとえば、米国特許第５，５５７，０３２号を参照）。
【００２６】
ＶＥＧＦの機能と生理機能を研究するために、ＶＥＧＦ遺伝子に対するヌルミュータントを含むトランスジェニック胚が報告されている（カーメリエット（Ｃａｒｍｅｔｌｉｅｔ）Ｐ他、Ｎａｔｕｒｅ，３８０：４３５−４３９（１９９６））。それによっていくつかの重要な知見が得られた。前記ＶＥＧＦヌルミュータントについてのヘテロの胚に於いて血管の形成は異常ではあったが無くならなかった。前記ＶＥＧＦヌルミュータントについてのホモの胚は、新脈管形成に於いて更に大きな障害を示す。ホモ胚は、懐胎期間中に死亡した。生殖系列遺伝（ｇｅｒｍ　ｌｉｎｅ　ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ）によって作り出されたヘテロ子胚に於いても同様な表現型が観察された。しかしながら、（カーメリエット（Ｃａｒｍｅｔｌｉｅｔ）の研究が胚に制限されたことから、表現型又は動物の使用は報告されなかった。更に、ＶＥＧＦトランスジェニック胚の生成によって、すべてのＶＥＧＦ様タンパク質の新脈管形成特性又は腫瘍増殖調節特性に関する知見が得られたわけではない。
【００２７】
このように、新脈管形成因子の機能と生理機能とを解明しようとする当該技術の努力にも拘わらず、これらの因子は、まだ、理解が不完全であり、ＶＥＧＦ−Ｂ等の新脈管形成増殖因子の活性、又、上述した種々の病状におけるそれらの役割、を解明するために使用することが可能で、および／又は、その他の新脈管形成ペプチドを開発および／又は評価するために有用な、手段が今だ必要とされている。
【００２８】
発明の要旨
その一態様に於いて、本発明は、変異ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子を含むトランスジェニック動物の利用法に関する。ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子は、相同組換えプロセスによって変異される。これらのトランスジェニック動物は様々な利用法を有する。たとえば、これらの動物を研究することによって、ＶＥＧＦ−Ｂポリペプチド、そのフラグメント、又は、小分子等のアナログ、の治療に関連した使用及び投与に関する重要な情報が提供される。特に、本発明の前記トランスジェニック動物は、透過性、炎症および／又は組織修復等の生理現象に対するＶＥＧＦ−Ｂおよび／又は他のサイトカインの影響を解明するのに有効である。これらの動物又はこれら動物由来の細胞は、新脈管形成および／又は腫瘍増殖調節化合物を同定するためのスクリーニングアッセイに有用である。これらの動物は、又、ＶＥＧＦ−Ｂアゴニストのイン・ヴィヴォ分布、機能及び非毒性及びＶＥＧＦ−Ｂ含有分子をテストする方法に於いて有用である。
【００２９】
別の態様に於いて、本発明は、少なくとも一つの非機能性変異ＶＥＧＦ−Ｂアレルを含有するトランスジェニック非ヒト動物を使用する方法を提供する。前記トランスジェニック動物は、非ヒト動物、好ましくはマウスの胚幹細胞にトランスジェニックＤＮＡを導入することによって作られる。前記トランスジェニックＤＮＡは、ＶＥＧＦ−Ｂの配列とホモロガスな領域を有する。次に、前記トランスジェニックＤＮＡが少なくとも一つの内因性のゲノムＶＥＧＦ−Ｂ配列の複製の部位に於いて、前記幹細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれた、細胞を選択する。この細胞を、増殖過程の動物の胚盤胞に導入し、トランスジェニック動物に増殖させる。
【００３０】
本発明の前記方法において有用なトランスジェニック動物を作る方法に使用される前記トランスジェニックＤＮＡは、公知の様々な方法で変化、変異又は修飾されたＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子からのヌクレオチド配列を有する。これにより、前記トランスジェニック動物を作り出すのに使用される前記ＤＮＡは、多種のＤＮＡ配列を含むことができる。適当な配列の選択は、所望の効果に依存する。たとえば、システインに対する少なくとも一つのコドンを変化又は欠失させることができる。その結果得られる動物は、改変された、天然ＶＥＧＦ−Ｂ又は別のＰＤＧＦ様タンパク質とダイマーを形成する能力を有するＶＥＧＦ−Ｂを生成することができる。一好適実施例に於いて、ＶＥＧＦ−Ｂの８つのシステイン残基の内の７つが欠失され、ＶＥＧＦ−Ｂのヌルミュータントが得られた。
【００３１】
更に別の態様に於いて、本発明は、化合物の、トランスジェニック動物に於いて、脈管形成を行う、又は、腫瘍増殖又は進行を調節する、又は、心臓の筋系を増加させる能力をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、前記化合物をトランスジェニック動物に導入する工程と、その動物の血管発達を検出する工程とを有する。或いは、前記方法は、トランスジェニック動物に腫瘍細胞を導入する工程と、この同じ動物に化合物を導入する工程と、その動物の腫瘍発達を検出する工程とを有する。
【００３２】
上述した方法の様々な実施例が本発明の範囲に含まれる。たとえば、化合物の、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子産物の活性を回復又は検出可能に作用する能力をスクリーニングする方法であって、適当な細胞ラインに化合物を添加する、又は、その化合物をトランスジェニック動物に導入する工程を有する方法を考案することが可能である。本発明によって作られるトランスジェニック動物及び細胞ラインは、これらの方法に使用することができる。そのような動物又は細胞ライン系は、又、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子の活性および／又は新脈管形成を回復又は調節する能力を有する化合物を選択するために使用することも可能である。この化合物は、タンパク質（たとえば、組換え又はイン・ヴィトロで合成されたもの）、又は、ＶＥＧＦ−ＢをコードするＤＮＡ又はＶＥＧＦ−Ｂのアナログとすることができる。これは、そのままの（ｎａｋｅｄ）ゲノムＤＮＡ又はプロモーターに作動可能にリンクされたｃＤＮＡとすることができ、これを更に、ウイルス又はバクテリアベクターにリンクさせることが可能である。前記ＤＮＡは、ルイ（Ｌｕｉ）他、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：１６７−１７２（１９９７）に例示されているように、リポソームコンストラクトに導入することができる。前記ＤＮＡ又はタンパク質は、更に、８−１６の胚細胞段階でＶＥＧＦ−Ｂノックアウトマウス胚に供給することができる。
【００３３】
前記ミュータントＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子配列（野生型又はその変異フラグメント）によって得られたトランスジェニック動物を使用して、二重トランスジェニック動物を作り出すことができる。この目的の為に、前記ミュータントＶＥＧＦ−Ｂトランスジェニック動物を、同じ種の他のトランスジェニック動物又は、同じ種の自然発生ミュータント動物と交配することができる。その結果得られる二重トランスジェニック動物、又はそれから由来の細胞は、前記ミュータント親トランスジェニック動物と同じ用途に使用することが可能である。
【００３４】
核酸配列を変異又は修飾する公知の方法を使用して、本発明に於いて有用な、ＶＥＧＦ−Ｂミュータント動物、細胞ライン又は配列を作り出すことができる。そのような方法は、非限定的に、点突然変異、部位特異的突然変異誘発、挿入突然変異、相同組換えによって得ることが可能な変異、及び、ＤＮＡ又はそのＤＮＡを有する細胞の化学的又は放射線処理によって得られる変異、を含む。所望又は必要な場合には、ＰＣＲ分析又はＤＮＡシークエンシングを使用して、その産生した変異を検出することができる。次に、前記ミュータント動物、細胞ライン又は配列を、前述した、ＤＮＡ配列、システム、アッセイ、方法又はプロセスに使用する。変異又は修飾されたＤＮＡは、その定義により、ゲノムＤＮＡと異なる又は同じではないものとなる。ミュータント動物は、ここに記載の又は、本発明によって利用可能とされる前記配列を含む第１のトランスジェニック動物を第２の動物と交配させることによっても作り出される。前記第２動物は、前記第１動物に含まれるＤＮＡとは異なるＤＮＡを含むものとすることができる。このように、種々のミュータント動物を作り出すことができる。
【００３５】
更に、ここに記載のＤＮＡ配列を変異させ、前述したように、これらＤＮＡ配列を発現ベクターにリンクさせ、ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質又はミュータントを発現するために組換えＤＮＡ技術を利用することができる。これにより、前記ＶＥＧＦ−Ｂミュータントの、生化学的又は作用活性を分析することができる。このように、効果的なＶＥＧＦ−Ｂの発現を妨げる変異ＤＮＡ配列を作り出すことができる。
【００３６】
本発明の「修飾ＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡ」とは、イン・ヴィトロ又は組換えＤＮＡ技術によって修飾されたＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子からのヌクレオチド配列をいう。この修飾ＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡは、トランスジェニックＤＮＡが導入される前記胚幹細胞からの遺伝子と全く同じヌクレオチド配列は含まない。前記ＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡ配列へのヌクレオチドの欠失、置換、挿入を含む修飾が具体的に含まれる。一例として、一つの具体例の修飾ＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡは、マウスＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡの、エキソン３の一部とエキソン４の全部との欠失を含む。ＶＥＧＦ−Ｂ座の制限地図（図１及び３）を使用して、少なくとも一つの制限フラグメントを欠失させることにより、様々な修飾ＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡを設計することができる。
【００３７】
本発明の前記方法は、ＶＥＧＦ−Ｂ等の新脈管形成増殖因子を含む、種々の物質の新脈管形成及び腫瘍増殖調節活性を解明するための有用なモデルを提供するものである。改変されたＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子を有するトランスジェニック動物を使用したモデルシステムから、ＶＥＧＦ−Ｂのための治療、診断及び制御利用法を決定することができる。特に、前記トランスジェニック動物は、本発明により、ＶＥＧＦ−Ｂが透過性、炎症および／又は組織修復等の生理現象に対して影響を与える能力に基づく、処置プロトコルの開発に使用することができる。更に、本発明の方法は、他のポリペプチド又は小分子の、新脈管形成活性や、ＶＥＧＦ−Ｂが、血液流から特定の組織への栄養素の摂取量等のその基本的特性に影響を与えうる内皮細胞遺伝子発現に基いて有する活性等の、ＶＥＧＦ−Ｂ様活性を評価するのに有用である。
【００３８】
前記トランスジェニック動物は、本発明に依り、野生型（＋／＋）ヘテロ（＋／−）及びヌルアレル（−／−）動物に対する様々な生理的ストレスの影響をモニター又は比較することによって、ＶＥＧＦ−Ｂの発達的及びホメオスタシス機能を解明するために利用することができる。たとえば、ＶＥＧＦ−Ｂの凝血時間に対する影響を、損傷アッセイを使用してモニターすることができ、ＶＥＧＦ−Ｂの腫瘍増殖に対する影響を移植された腫瘍細胞の増殖をモニターすることによって測定することができ、ＶＥＧＦ−Ｂの身体的活性（ｐｈｙｓｉｃａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）に対する影響を、比較身体的活性研究によって発見することができ、および／又は、ＶＥＧＦ−Ｂのストレス反応に対する影響を、圧縮空気の暴露等の過酷なストレスの適用によって測定することができる。更に、ＶＥＧＦ−Ｂの心拍数、心拍出量（たとえば、血圧）、および／又は血行力学的（ｈａｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ）特性を、ゾウ（Ｚｈｏｕ）他、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　４：２０１−０７（１９９８）によって記載されたものに類似の手順で、本発明のトランスジェニック動物を使用してアッセイすることができる。
【００３９】
正常な心臓機能におけるＶＥＧＦ−Ｂの役割を、ＶＥＧＦ−Ｂ欠損マウス（−／−）と、正常（＋／＋）な同腹仔とを比較することによって調査することができる。ＶＥＧＦ−Ｂ発現の喪失は、いくつかの有意な相違を示す。これらの相違は、欠損マウスが房室（ＡＶ）伝導欠損と、心筋層の虚血を示す兆候を有していることを示している。
【００４０】
本発明の更に別の態様は、房室伝導欠損と虚血調節活性とに関して化合物をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、スクリーニングされる前記化合物をＶＥＧＦ−Ｂ欠損非ヒト動物に導入する工程と、この動物における房室伝導欠損又は虚血に対するその影響をアッセイする工程とを有する。この方法は、たとえば、ファージ、ペプチド又はコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする時に、房室伝導欠損と虚血調節活性とに関して一種類以上の化合物をスクリーニングするために使用することができる。可溶性ペプチドライブラリーとその利用法の具体例は、ホーテン（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ），Ｇｅｎｅ，１３７：７−１１（１９９３）である。ランダムペプチド−提示系ファージライブラリーの一例は、バリー（Ｂａｒｒｙ）他、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：２９９−３０５（１９９６）である。コンビナトリアルライブラリー一般及びそれらの利用法は、ケイ・エス・ラム（Ｋ．Ｓ．Ｌａｍ）、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓ．１２：１４５−１６７（１９９７）；ネフツィ（Ｎｅｆｚｉ）他、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ，８：２２７３−２２７８（１９９８）；コッフェン（Ｃｏｆｆｅｎ）他、Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８：２０６−２１８（１９９８）；リ（Ｌｉ）他、Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｔｏｄａｙ，３：１０５−１１２（１９９８）に記載されている。
【００４１】
更に別の関連する態様は、房室伝導欠損又は虚血を治療又は軽減する方法であって、房室伝導欠損又は虚血を軽減する量の、ＶＥＧＦ−Ｂ、又は、ＶＥＧＦ−Ｂの生物活性を有するそのフラグメント又はアナログ、を投与する工程を有する方法に関する。
【００４２】
前記「アナログ」又は「機能的アナログ」という用語は、少なくとも一つのアミノ酸置換が、そのアナログが、イン・ヴィヴォおよび／又はイン・ヴィトロで、その非修飾型全長又はそのフラグメントと実質的に同じ生物活性を保持するように行われた、ＶＥＧＦ−Ｂの非修飾型全長又はそのフラグメントをいう。
【００４３】
「ＶＥＧＦ−Ｂの生物活性」という表現は、内皮細胞増殖、分化、遊走、生存又は新脈管形成又は血管透過性の内の単数又は複数を刺激する能力を意味するものと理解される。
【００４４】
房室伝導欠損又は虚血の治療又は軽減に使用される前記ＶＥＧＦ−Ｂポリペプチド及びＶＥＧＦ−Ｂアナログは、又、その薬学的に許容可能な非毒性塩と、薬学的に許容可能な固体又は液体キャリア又はアジュバントと組み合わせて使用することも可能である。
【００４５】
そのようなキャリア又はアジュバントの具体例としては、非限定的に、塩水、緩衝食塩水、リンゲル溶液、ミネラルオイル、タルク、コーンスターチ、ゼラチン、ラクトース、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸カルシウム、塩化ナトリウム、アルギン酸、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、増粘剤、安定剤、懸濁剤、及びこれらの組み合わせが含まれる。そのような組成物は、溶液、懸濁液、タブレット、カプセル、クリーム、軟膏（ｓａｌｖｅ）、エリキシル、シロップ、ウエハ、擦剤（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、又はその他の従来形状とすることができる。その処方は、投与方法に適したものとされる。本発明のペプチドを含有する組成物は、前記活性化合物（単数又は複数種）を、重量比で、０１％〜９０％、最も一般的には、約１０％〜３０％含むものとされる。
【００４６】
筋肉内投与用の調合物としては、滅菌製剤、好ましくは、塩酸塩等の、適当な可溶性塩状態のＶＥＧＦ−Ｂ、をパイロジェンを取り除いた水（希釈）、生理食塩水、又は５％グルコース溶液などの薬用希釈液中に溶解させて投与することができる。前記化合物の適当な不溶性のものは、水性基剤、又は、オレイン酸エチル等の長鎖脂肪酸エステル等の、薬用許容可能な油性基剤、中の懸濁物として調合し投与することができる。
【００４７】
その投与量と投与経路とは、治療されるべき患者の特徴と状態とに依存し、担当の医師又は獣医の自由裁量とされる。適当な経路としては、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内注射、非経口的、局所塗布、移植、等が含まれる。たとえば、有効量の本発明のペプチド又は抗体を、それを必要とする生体に対して、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、の投与量、投与される。治療の進行、患者の副作用、及び循環ポリペプチドレベルをモニターすることによって、最適投与養生法のための追加のガイダンスが提供される。ＶＥＧＦ−Ｂ又はそのフラグメント又はアナログの局所塗布は、ＶＥＧＦに類似の方法で使用することができる。
【００４８】
房室伝導欠損又は虚血の治療又は軽減の別の方法は、ＶＥＧＦ−Ｂ、又は、ＶＥＧＦ−Ｂの生物活性を有するそのフラグメント又はアナログをコードする核酸配列の有効量を、投与する工程を有し、ここで、前記核酸は、有効量の前記ＶＥＧＦ−Ｂ又はそのフラグメント又はアナログをコードして、房室伝導欠損又は虚血を治療又は軽減することが可能である。前記核酸配列は、好ましくは、プロモーター配列に作動可能にリンクされている。
【００４９】
前記核酸は、そのままで（ｎａｋｅｄ）あってもよいし、或いは、ベクター又はリポソーム内にあるものであってもよい。本発明の好適なベクターは、本発明に依る核酸が単数又は複数の適当なプロモーターおよび／又はその他の制御配列に作動可能にリンクされ、適当な細胞が、前記ベクターにクローニングされた前記核酸によってトランスフォーム又はトランスフェクトされた時に、それが、本発明の前記ポリペプチドを発現することが可能であるような、発現ベクターである。最も好ましいベクターはアデノウイルス−、ワクシニア−、レトロウイルス−ベースのベクター、リポソームのような遺伝子療法のためのトランスフェクションに適したものである。そのようなベクターは様々なものが知られている。
【００５０】
本発明の更に別の態様は、被験体の心臓疾患を診断する方法であって、心電図を採る工程と、ＰＱ間隔の延長および／又はＳＴ複合（又はＵ波）の低下を検索する工程とを有する方法を提供する。
【００５１】
本発明の更に別の態様は、被験体におけるＶＥＧＦ−Ｂ発現の喪失によって特徴付けられる心臓疾患を診断する方法を提供する。これらの方法は、ポリメラーゼ連鎖反応を使用したＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡの増幅の欠如、又は、ＶＥＧＦ−Ｂに対する特異的結合試薬との結合の検出の欠如、のいずれかを検索することによって、ＶＥＧＦ−Ｂ発現の損失を検索する工程を含むことができる。前記特異的結合試薬は、好ましくは、ＶＥＧＦ−Ｂに対する抗体である。最も好適な抗体は、ＶＥＧＦ−Ｂに対するモノクローナル抗体である。
【００５２】
本発明の前記抗体は、検出可能な標識によって標識することができる。この抗体は、画像化の為に、適当な、超磁性、常磁性、高電子密度、エコジェニック（ｅｃｏｇｅｎｉｃ）、又は放射性又は非放射性物質／標識に結合させることができる。放射性物質／標識の具体例としては、１２５Ｉや３２Ｐ等の放射性原子又は、原子団、がある。非放射性物質／標識の具体例としては、ホースラディシュペルキシダーゼ等の酵素標識又は、フルオレセイン−５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等の蛍光標識がある。標識は、直接的又は間接的、共有結合的又は非共有結合的に行うことができる。
【００５３】
例示的実施例の詳細な説明
次に本発明を、添付の図面を参照しながらより詳細に説明する。下記の記載と例とは、本発明の実施例と範囲とを例示するものである。本発明は、この記載の範囲に限定されるものではない。当業者は、以下の例と実施例とが、公知の技術を使用して改変可能であるということを理解するであろう。たとえば、記載又は請求項されている核酸配列のバリエーションを、本発明者等が示した作用又は利点を変えることなく、公知の方法によって作り出すことが可能である。従って、そのようなバリエーションは、この記載と発明の範囲に含まれるものである。公知技術の多くのための詳細なプロトコルは、オースベル，エフ・エム（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．）他、Ｅｄｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ及びＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｃｅ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ボストン、マサチューセッツ（１９８９）、及び、以後“Ａｕｓｕｂｅｌ（１９８９）”と称するＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ，１９９７年１月、更に、サムブルック，ジェイ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．）他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ．　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，第２版、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ニューヨーク（１９８９）、以後「Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）」、そしてビー・ホーガン（Ｂ．Ｈｏｇａｎ）、アール・ベディントン（Ｒ．Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ）、エフ・コンスタンチーニ（Ｆ．Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ）及びイー・レイシー（Ｅ．Ｌａｃｙ）編集の、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ．Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、（１９９４）、以後、「Ｈｏｇａｎ（１９９４）」に、記載されている。これらの文献を具体的にここに参考文献として合体させる。これらの文献を参照して当業者は、本発明の実施例を実施することが可能である。
【００５４】
ここでの使用に於いて、「ヌルアレル」、「ヌル変異」及び「ヌルミュータント」とは、野生型タンパク質との比較に於いて、変質したタンパク質をコードする遺伝子配列をいう。一般に、「ヌルミュータント」は、その主要な機能（ｐｒｉｍａｒｙ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ）が実質的に不能なタンパク質を作り出すように改変される。たとえば、ＶＥＧＦ−Ｂヌルミュータントは、血管内皮細胞の増殖をもはや刺激しない、或いは、上述したＶＥＧＦ−Ｂのその他の作用のいずれも示さないタンパク質をコードするＤＮＡ配列である。しかしながら、ヘパリン結合や二量化等の、ＶＥＧＦ−Ｂのその他の生化学的機能に関連する構造は、前記ヌルアレルによってコードされるタンパク質において存在するかもしれない。更に、前記「ヌルミュータント」という用語は、上述したように、変質されたタンパク質の遺伝子配列を有する動物又は細胞も指すことがある。
【００５５】
トランスジェニックＤＮＡとは、細胞に導入されて、このＤＮＡがその細胞のゲノムに組み込まれることが可能なＤＮＡを指す。前記細胞は、前記トランスジェニックＤＮＡを含む、トランスジェニック動物を作り出すことができる。一般に、前記トランスジェニックＤＮＡは、特定の細胞への投与のために、ベクター、又はトランスジェニックベクターとして構築される。そのようなベクターは、環状等の、特定の構造形状である必要はない。
【００５６】
組換え遺伝子又は配列とは、単に、その遺伝子又は配列が、多数の公知の組換えＤＮＡ技術のいずれかによって操作されたということを意味する。
【００５７】
ここでの使用に於いて、「修飾ＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡ」という用語は、点突発変異、部位特異的突然変異誘発、欠失突然変異、挿入突然変異、相同組換えから得られる変異、および／又は、前記ＤＮＡ又はＤＮＡを有する細胞の化学的又は放射性処理から得られる変異のいずれか一つ又は複数によって修飾された、又は、天然状態に於いては野生型ＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡと会合しない、マーカ配列等の別のＤＮＡ配列にリンクされた、動物由来のＶＥＧＦ−Ｂヌクレオチド配列を指す。前記修飾ＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡは、たとえば、Ｆｌｔ−１レセプター結合モチーフ等の、野生型ＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡの活性の一部又は全部を保持しうる。
【００５８】
ここで言及されているＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子及びＤＮＡ配列は、マウス又はヒトからの遺伝子又は配列に限定されるものではない。すべての動物種を、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子のソースとして使用することが可能である。トランスジェニックＤＮＡに組み込まれた前記組換え配列に於いて、特定の胚細胞のＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子とホモロガスな配列は、その胚細胞と同じ種からのものである必要はない。
【００５９】
トランスジェニック動物を作り出す方法は、関連する種の如何に関わらず実質的に同じである。簡単に説明すると、トランスフェクト細胞を、それらがそのトランスフェクト細胞を組み込みできる段階、たとえば、胚盤胞期に於いて、胚に注入する。次に、前記胚を、代理母に再度移植し、これによって、前記トランスフェクトＤＮＡを有するキメラ産仔が得られる。このように、必要なのは、動物からの適当な胚幹細胞のみである。
【００６０】
種々の動物からの胚幹（ＥＳ）細胞の生成は、当業者にとって周知である。胚幹細胞は、多数のソースから入手可能である。それらには、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ヒツジ、及びその他の動物が含まれる。たとえば、ジョイナー，エイ・エル（Ｊｏｙｎｅｒ，Ａ．Ｌ．）（１９９３）、Ｇｅｎｅ　Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，　Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ，ウッド，アール（Ｗｏｏｄ，Ｒ．）及びハメス，ビー・ディ（Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．）Ｔｈｅ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　Ｓｅｒｉｅｓ，第１２６巻、Ｏｘｆｏｒｄ　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ（具体的にここに参考文献として合体させる）は、ＥＳ細胞を作り出す方法を記載している。又、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ．　Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，ビー・ホーガン（Ｂ．Ｈｏｇａｎ）、アール・ベディントン（Ｒ．Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ）、エフ・コンスタンチーニ（Ｆ．Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ）及びイー・レーシー（Ｅ．Ｌａｃｙ）編、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９４）は、マウス胚の操作を記載している。更に、クーリー（Ｃｏｕｌｙ）とル・ドーリン（Ｌｅ　Ｄｏｕａｒｉｎ）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０８：５４３−５５５（１９９０）は、鶏とウズラの胚を単離し操作する方法を記載している。キンメル（Ｋｉｍｍｅｌ）とワルガ（Ｗａｒｇａ）、Ｎａｔｕｒｅ　３２７：２３４−２３７（１９８７）は、ゼブラフィッシュの胚の単離と操作を記載している。そして、ウェア（Ｗａｒｅ）他、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｌｉｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｆａｒｍ　Ａｎｉｍａｌｓ”，Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｓｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，３８：２４１（１９８８）は、マウス、畜牛（ｃａｔｔｌｅ）、ブタ、ヒツジ等の多くの種用に適用可能な胚幹細胞培養条件を記載している。従って、本発明は、具体的に例示したマウスに対してと同様、その他の動物にも適用することが可能である。
【００６１】
動物の細胞にＤＮＡを挿入する様々な方法が知られている。たとえば、トランスジェニックＤＮＡを、適当な細胞にマイクロインジェクションすることができる。ウイルスベクターを使用して、ＤＮＡを、適当な細胞及びそれら細胞のゲノムに導入することができる（たとえば、ツクイ（Ｔｓｕｋｕｉ）他、Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１４：９８２−９８５（１９９６）を参照）。細胞は、又、トランスフェクションや電気穿孔法によってイン・ヴィトロで操作することも可能である（オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）（１９８９）とホーガン（Ｈｏｇａｎ）（１９９４）とを参照）。
【００６２】
一般に、トランスジェニックＤＮＡは、ランダムインテグレーション又は相同組換えのいずれかによって細胞ゲノムに組み込まれる。相同組換えが発生した細胞を同定し単離するために、ＥＳ細胞及びその他の細胞に於いて、ランダムインテグレーションに対して相同組換えの相対頻度を増加させるためのストラテジーは当業者にとって周知である（たとえば、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）（１９８９）、米国特許第５，５５７，０２３号、及びホーガン（Ｈｏｇａｎ）（１９９４）を参照）。トランスジェニックＤＮＡベクターの構築は、細胞配列の一部のトランスジェニックＤＮＡへの組み込み、又は前記細胞配列とホモロガスな配列を含むものであってよい。その部分は、相同組換えが起こるために、前記トランスジェニックＤＮＡと細胞ＤＮＡとがイン・ヴィヴォでハイブリダイズすることを許容する程度に前記細胞配列に対してホモロガスなものでなければならない。
【００６３】
胚幹細胞に挿入される前記トランスジェニックＤＮＡは、好ましくは、ホモロジー５’及び３’領域を有する。これらのホモロジー領域は、胚幹細胞における相同組換えのプロセスを促進する作用を有する。当業者が拠り所とすることが可能な多数の刊行物が、相同組換えでの使用のために、いかにホモロジー領域を構築するかを記載している。たとえば、トーマス（Ｔｈｏｍａｎ）＆カペッチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）、Ｃｅｌｌ，５１：５０３−５１２（１９８７）、マンスール（Ｍａｎｓｏｕｒ）他、Ｎａｔｕｒｅ，３１７：３４８−３５２（１９８８）及びカペッチ（Ｃａｐｅｃｃｈｉ）の米国特許第５，４８７，９９２号は、それぞれ、相同組換え技術におけるホモロジー領域の構築のためのストラテジーを記載している。このように、相同組換えの為に配列を構成する方法は公知である。
【００６４】
しかしながら、トランスジェニックＤＮＡが導入された各細胞については、相同組換えが起こらない。更に、多くの場合、一つ以上のアレルを有する遺伝子におけるように、相同組換えによって改変又は置換されることが望まれる細胞性のＤＮＡ配列の一つ以上のコピーが細胞内に存在する。従って、相同組換えによって、それらの細胞のいくつかは、一つの細胞性の配列に於いてのみトランスジェニックＤＮＡが組み込まれ、他の細胞は、一以上の細胞性の配列、或いは、すべての細胞性の配列においてトランスジェニックＤＮＡを組み込むかもしれない。従って、トランスジェニックＤＮＡで相同組換えを受けたＥＳ細胞から、ホモとヘテロの両方の動物が作り出されるかもしれない。ホモ動物を、トランスジェニックＤＮＡについてヘテロな別のトランスジェニック動物を作り出すことために、野生型動物と交配させることができる。
【００６５】
（実施例）
正常及び疾患状態における、イン・ヴィヴォでの血管系の発達と維持におけるＶＥＧＦ−Ｂの役割を分析するために、ミュータントＶＥＧＦ−Ｂアレルを有するマウスを、作った。これらマウスの一つのＶＥＧＦ−Ｂアレルを、相同組換えの技術によって機能的に不活性化させた。これにより、これらの細胞からつくられたマウスは、一つのミュータントと一つの野生型ＶＥＧＦ−Ｂアレルとを有していた。
【００６６】
図１は、４つの小部分、１Ａ〜１Ｄから構成され、これは、前記マウスＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子のヌル変異を作り出すために使用されたストラテジーの略図である。図１Ａは、前記マウスＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子のエキソンイントロン編成の略図である。図１Ｂは、多数の制限酵素のための切断部位が示されているＶＥＧＦ−Ｂ座の制限地図である。図面に於いて、前記制限酵素は、次のように示されている。Ｎ＝ＮｏｔＩ；Ｓ＝ＳｐｅＩ；Ｋ＝ＫｐｎＩ；Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ；そしてＥ＝ＥｃｏＲＩ。下記の例示トランスジェニックＤＮＡコンストラクトにおいて除去された前記ＳｐｅＩ−ＫｐｎＩフラグメントは、黒塗りのボックスによって示されている。図１（Ｃ）のトランスジェニックＤＮＡコンストラクトを使用して、ミュータントＶＥＧＦ−Ｂアレルを作った。このコンストラクトは、ｐＰＧＫ−ネオカセット（ｎｅｏｃａｓｓｅｔｔｅ）（ｎｅｏ）を挟む、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子の、５’ホモロガスなフラグメント（ＮｏｔＩ／平滑ＳｐｅＩ）と３’ホモロガスなフラグメント（平滑ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ）とを含んでいる。図１Ｄは、サザン・ブロット分析に於いてＶＥＧＦ−Ｂの野生型及びミュータントアレルを同定するために使用されたＤＮＡプローブの位置を示している。
【００６７】
図２に於いて、増幅された野生型バンド（ｗｔ）と、ネオマイシンカセット（ｎｅｏ）からの増幅バンドとの移動が右側に示されている。
【００６８】
以下の項に於いて、ＶＥＧＦ−Ｂアレルを有する動物が作られた詳細な手順及び得られたマウス表現型の一次分析が記載される。
【００６９】
実施例１：　導入遺伝子として有用なＶＥＧＦ−Ｂの選択
トランスジェニック動物を作るのに使用されるＤＮＡは、様々なＤＮＡ配列を含むことができる。適当な配列の選択は、その望まれる作用に依存する。たとえば、もしもＶＥＧＦ−Ｂのヌルミュータントを有する動物が望まれるのであれば、そのトランスジェニックＤＮＡは、血管内皮細胞マイトジェンとしてのＶＥＧＦ−Ｂの主要な機能を持たないタンパク質をコードする配列を含んだものとなる。変異タンパク質のマイトジェン活性を測定するたのアッセイを使用することも可能であるが、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子の構造情報を使用して、特定の変異機構（ｓｃｈｅｍｅ）の作用を正確に推定することも可能である。
【００７０】
この実施例に於いては、ＶＥＧＦ−Ｂマウス遺伝子の一部を欠失させた。この欠失部分は、ジスルフィド結合のために重要な８つのシステイン残基の内の７つを含んでいる。上述したように、ＶＥＧＦ−Ｂは、ＰＤＧＦファミリーの増殖因子のメンバーである。このファミリーのメンバーは構造的に関連しているので、ＶＥＧＦ−Ｂに対する影響を示すために他のＰＤＧＦファミリーメンバーに対する変異の作用を補外することができる。
従って、特定の作用を作り出すＶＥＧＦの変異によって、ＶＥＧＦ−Ｂにも同じ又は類似の作用が及ぼされる可能性が高い。同様に、ＰＤＧＦファミリーの他のメンバーにおける変異を使用して、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子の変異を作り出すことができる。これは、特に、すべてのファミリーメンバー、或いは、もう一つの別のファミリーメンバー、に関する構造情報が、特定の活性に関連する保存構造を示す場合である。これらの事項を考慮に入れて、８つのシステイン残基の内の７つが欠失されたヌルミュータントを作った。前記システイン残基は、ＰＤＧＦファミリーに関するデータから、ジスルフィド結合及び二量化に関連していることが知られていたので、これら残基の内の７つの欠失によって、非機能性変異ＶＥＧＦ−Ｂタンパク質が得られることが予想される。本発明の為に使用されるトランスジェニックＤＮＡの配列の選択に関する更なる詳細を以下に示す。
【００７１】
本発明に於いて修飾されるＤＮＡ配列を選択するために、マウスＶＥＧＦ−Ｂの遺伝子を、先ず、ｐｃｉｆ−２をプローブとして使用してマウスλＦＩＸＩＩ−ライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）からクローニングした。この手順の詳細は、オロフソン，ビー（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ，Ｂ．）他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１９３１０−１９３１７（１９９６）（ここに参考文献として合体させる）に記載されている。それぞれ約２０ｋｂのマウスゲノムＤＮＡを有する、１０，１１及び１２として示す三つのλ−クローンが、単離され特徴付けられた。前記ゲノムＤＮＡの詳細な制限地図を、前記λＤＮＡを、様々な制限酵素によって消化し、その後、制限フラグメントをサザンブロッティングによって同定することによって作成した。前記マウスｃＤＮＡクローンの配列から得られた種々の３２Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブをサザンブロッティングに使用した。
【００７２】
前記ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子に潜む（ｈａｒｂｏｒｉｎｇ）前記λＤＮＡの制限地図から得られた情報を使用して、遺伝子導入のためのＤＮＡを選択した。この選択されたＤＮＡは、トランスジェニック動物が有するべき性質、特性、遺伝子型、又は表現型に依存する。様々な性質、特性、遺伝子型又は表現型が望まれるかもしれない。たとえば、ＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡが、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、又は、ルシフェラーゼ、又は、その他公知の類似物、等のマーカ配列にリンクされた動物が、発現したＶＥＧＦ−Ｂタンパク質の局在性を測定するためのアッセイのために望ましいかもしれない。高誘導性プロモーター又は乳房組織に於いて発現を指示するプロモーターに作動可能にリンクされたＶＥＧＦ−Ｂ　ＤＮＡを有する動物が、その動物からＶＥＧＦ−Ｂタンパク質を得る目的のために望ましいかもしれない。使用可能な多くのプロモーター又は発現システムは、公知である。更に、ミュータントＶＥＧＦ−Ｂ配列は、一旦、トランスジェニック動物に作動挿入されると、新脈管形成又は腫瘍発達の分子的基盤（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂａｓｉｓ）を測定するための研究動物を提供することができる。
【００７３】
一つのトランスジェニックプロトコルに於いて、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子のヌルアレルが望まれる。前記ヌルアレルの遺伝子産物は、ＶＥＧＦ−Ｂの脈管形成特性に関して非機能性となるであろう。ＶＥＧＦ−Ｂのヌルアレルを有する動物は、たとえば、動物に於いて新脈管形成作用を有する化合物を同定するための様々なアッセイに有用なものとなる。
【００７４】
ヌルアレルを作る一つの方法は、分子内又は分子間ジスルフィド結合、或いは、これらの両方の形成を妨げるべくＤＮＡ配列を欠失させる又は修飾する工程を含む。具体的には、ジスルフィド結合に関連していることが知られている、又は、関連していると考えられるシステイン残基をコードする領域が欠失される。或いは、個々のシステイン残基を、その内の多くが公知である、点突然変異又は部位特異的突然変異誘発法によって変異する。しかしながら、ヌルアレルは、その他様々な方法でも作ることが可能である。たとえば、ＶＥＧＦ−Ｂの制限地図から、欠失ミュータントを作るために好適な制限部位を選択することができる。
【００７５】
原則的に、非限定的に、（ｉ）全遺伝子の欠失、（ｉｉ）重要なタンパク質コード配列の欠失、及び（ｉｉｉ）転写調節配列の欠失を含む、ヌル変異を作る多くの方法がある。ヌル変異は、又、もしもその変異がスプライシング、ｍＲＮＡ安定性、等に影響する場合にも発生する可能性がある。更に、リーディングフレームを改変する、又は、早期停止コドンを導入する挿入又は置換によってもヌル変異が起こりうる。
【００７６】
図１に示した制限地図から、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子にヌル変異を導入するターゲットトランスジェニックコンストラクトを作る一つの方法は、制限フラグメントを欠失させることによる方法である。エキソン１の“Ｂ”部位へのＰＴＫｎｅｏの挿入は、好ましく、ヌル変異を作り出すことができる。より詳細な制限地図、図３、から、その他のストラテジーも考案することができる。たとえば、エキソン１，２，３，４又は５の欠失、そして一つ以上のエキソンの組み合わせの欠失も考案することができる。
【００７７】
ヌルミュータントを作る別の方法は、レセプター結合に関連する領域を欠失させる方法である。ＰＤＧＦとＶＥＧＦとの両方に於いて、レセプター結合に関する構造情報が存在しており、それは公知である。その情報を使用して、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子の関連部分を欠失させて、ヌルアレルを作ることが可能である。同様に、レセプターＦｌｔ−１に結合するＶＥＧＦ−ＢとレセプターＦｌｔ−１に結合するＶＥＧＦ−Ｂアナログを同定する方法とが、ここに参考文献として合体させる同時係属米国出願０８／９９４，５４０号に記載されている。この情報を使用して、ＶＥＧＦ−Ｂのヌルアレルを作ることも可能である。
【００７８】
上記記載から、当業者は、ＶＥＧＦ−Ｂのヌルアレルを構成するために公知の多くの技術を使用することが可能であることを理解するであろう。従って、本発明は、ＶＥＧＦ−Ｂのヌルアレルを有するトランスジェニック動物を作るここに具体的に例示した欠失に限定されるものではない。
【００７９】
実施例２：　ＶＥＧＦ−Ｂ欠失ミュータントによるトランスジェニックベクターの作成
本発明の一実施例に於いて、ＶＥＧＦ−Ｂのアミノ酸末端ドメインの８つのシステイン残基の内の７つが除去された。この欠失は、三つの分子内ジスルフィド結合、更に、成熟ＶＥＧＦ−Ｂ分子の共有結合性二量化に使用される二つの分子間ジスルフィド結合を分裂させる。これを行うために、３３０ｂｐ　ＳｐｅＩ−ＫｐｎＩフラグメントを欠失させた。このフラグメントは、ＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子のエキソン３の一部とエキソン４の全部とを含む。具体的には、エキソン３の３’部分によってコードされる３３のアミノ酸と、エキソン４の２４のアミノ酸全部とが欠失された。前記ターゲットアレルからのその結果得られたＶＥＧＦ−Ｂタンパク質は、これらの重要なアミノ酸を欠如しているが故に、非機能性であり、このアレルはヌルアレルである。
【００８０】
ＶＥＧＦ−Ｂの前記ＳｐｅＩ／ＫｐｎＩフラグメントを欠如する組換えトランスジェニックベクターの作成のための出発物質は、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にサブクローニングされた１０ｋｂ　ＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント（コンストラクトＡ）と、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングされた１．７ｋｂ　ｐＰＧＫ−ネオカセット（Ｓｉｂｉｌｉａ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６９：２３４−２３８（１９９５）（コンストラクトＢ）とであった。
【００８１】
前記トランスジェニックベクターの３’領域を作るために使用された前記１．２ｋｂ　ＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントは、コンストラクトＡからの前記１０ｋｂ　ＶＥＧＦ−Ｂフラグメントを、ＫｐｎＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼによってＫｐｎＩ粘着末端から平滑末端を作り、最後に、ＨｉｎｄＩＩＩで切断することによって単離された。このフラグメントと、それに続くすべてのフラグメントとは、１ｘＴＢＥ（トリスホウ酸ＥＤＴＡ）緩衝液中で作られた低ゲル化温度（ＬＧＴ）アガロースゲル上で単離された。次に、単離された１．２ｋｂフラグメントを、ＥｃｏＲＶ及びＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターにライゲーションし、これによってコンストラクトＣを得た。
【００８２】
トランスジェニックベクターの５´フラグメントはＮｏｔＩ／ＳｐｅＩで切断することによって、コンストラクトＡから単離された。単離されたフラグメントをＮｏｔ／ＳｐｅＩ消化コンストラクトＣへライゲーションし、コンストラクトＤを作り出した。
【００８３】
前記ｐＰＧＫネオカセットは、コンストラクトＢをＮｏｔＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、クレノウフラグメントで平滑末端を作ることによって単離された。その結果得られたフラグメントを、ゲル精製し、次に、ＥｃｏＲＩで消化され、クレノウフラグメントで平滑化されたコンストラクトＤにライゲーションし、コンストラクトＥを得た。順方向に挿入された前記ｐＰＧＫ−ネオカセットを有するこの１１．２ｋｂのベクターを、遺伝子導入のためのターゲッティングベクターとして選択した。前記コンストラクトＡ−Ｅの概略を図４に示す。
【００８４】
サザン・ブロットアッセイを使用して、野生型対変異アレルのアイデンティティーを確認した。ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ブロッティング用に調製した。上述したスクリーニング手順に於いてプローブとして使用された４５０ｂｐの放射性標識フラグメントは、主として、ＶＥＧＦ−ＢｃＤＮＡのエキソン７と３’非−翻訳領域をコードする配列を含んでいた。このプローブは、クローン１０からのＤＮＡをテンプレートとして使用したＰＣＲによって作られた。このＰＣＲに使用されたプライマーは、５’−ＧＴＧＡＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣＧＡＧＣＡ（センスストランド）（配列識別番号１）と、５’−ＴＡＧＴＧＴＣＴＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＴ（アンチセンスストランド）（配列識別番号２）であった。前記ミュータントアレルは、６．５ｋｂのゲノムＥｃｏＲＩ制限フラグメントを作り出したのに対して、前記野生型アレルはこれらの条件に於いて＞２０ｋｂのフラグメントを作り出した。
【００８５】
実施例３：　トランスジェニックベクターの動物細胞への挿入
前記ミュータントＶＥＧＦ−Ｂ（コンストラクトＥ）を含む前記ベクターを、電子穿孔法により、１２９／ＳＷマウス（キューン（Ｋｕｈｎ）Ｒ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５４：７０７−７１０（１９９１））由来のＥ１４．１細胞にトランスフェクトした。ネオマイシン耐性クローンを、標準手順によって単離し、特徴付けた。ビー・ホーガン（Ｂ．Ｈｏｇａｎ）、アール・ベディントン（Ｒ．Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ）、エフ・コンスタンチーニ（Ｆ．Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ）及びイー・レイシー（Ｅ．Ｌａｃｙ）編集の、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ．Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓは、胚を単離し操作するための手順を記載している（ここに参考文献として合体させる）。数百のクローンからのゲノムＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ消化し、サザン・ブロッティングによって分析した。これらの手順を使用して、１ａ，８ｆ及び９ｈとして示される三つの陽性のクローンが、６．５ｋｂのバントと更に、野生型２０ｋｂバンドとを検出することによって同定された。サザンブロットを、放射線標識ＰＫＧ−ネオカセットによって探索する（ｐｒｏｂｉｎｇ）ことによって、更に、クローン１ａ及び９ｈの予想された６．５ｋｂのバンドが得られた。これらのデータは、ＥＳ細胞の二つのＶＥＧＦ−Ｂアレルの内の一つのアレルが、前記コンストラクトによって正確にターゲッティングされたこと、そして、ＶＥＧＦ−Ｂのヌルアレルを含むＥＳ細胞が生成されたことを示している。
【００８６】
実施例４：　トランスジェニック動物の作成
細胞ライン９ｈからの細胞を、標準手続を使用してマウス胚盤胞に注入した。ビー・ホーガン（Ｂ．Ｈｏｇａｎ）、アール・ベディントン（Ｒ．Ｂｅｄｄｉｎｇｔｏｎ）、エフ・コンスタンチーニ（Ｆ．Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ）及びイー・レイシー（Ｅ．Ｌａｃｙ）編集の、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ．Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、（１９９４）は、細胞を注入するための手順を記載している（ここに参考文献として合体させる）。前記胚盤胞を、偽妊娠（ｐｓｅｕｄｏｐｒｅｇｎａｎｔ）養母に移植した。その結果得られたキメラマウス、即ち、前記トランスジェニックＤＮＡを有するマウスを、産仔の毛の色で同定した。
【００８７】
たとえば、ＥＳ細胞は、チンチラ（白黄）の毛皮とアグーチ（Ａｇｏｕｔｉ）座のキャリアとを有する１２９／ＳＷマウス由来であり、宿主の胚盤胞は、黒色の皮を有しアグーチ座を有さないＣ５７Ｂｌ／６マウス由来であったので、キメラは、チンチラ（ＥＳ細胞のみが寄与する皮膚の斑点）と、黒色（宿主細胞のみが寄与する斑点）と、茶色又はアグーチ（１２９ＳＷ細胞とＣ５７Ｂｌ／６細胞との混合物が存在する斑点）との混合物となる。これらのキメラ動物は、１２９／ＳＷ細胞から分泌されたアグーチタンパク質は、Ｃ５７Ｂｌ／６毛包細胞を、その毛が茶色になるようにメラニン（黒色色素）を処理するように刺激するので、茶色である。
【００８８】
オスのキメラマウスを、Ｃ５７Ｂｌ／６野生型メスと交配させた。これらのメスのマウスからの産仔のおける茶色のマウスの存在は、前記トランスジェニックＤＮＡの生殖細胞遺伝を示した。
【００８９】
これらＦ１マウスの尾から調製されたＤＮＡを、上述したようにサザン・ブロッティングによって分析した。概略を説明すると、０．５ｃｍの尾組織を、外科除去し、これらを使用してＤＮＡ試料を作成した。茶色マウスの５０％に６．５ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントが存在していたので、これは、ＶＥＧＦ−Ｂのターゲットヌルアレルに対する選択が無いことを示した。ターゲットＶＥＧＦ−Ｂ座を有するＦ１マウスは、ＶＥＧＦ−Ｂの野生型アレルも有しているので、ヘテロ接合体である。ＶＥＧＦ−Ｂの一つの不活性化アレルを有する正常に発達したＦ１マウスの存在は、ＶＥＧＦ−Ｂにおいて遺伝子量（ｇｅｎｅ　ｄｏｓａｇｅ）は、生存の為に必須ではないということを示している。
【００９０】
ヘテロＦ１マウスを交配させ、その産仔からの尾ＤＮＡを、サザン・ブロッティングとＰＣＲとによって分析した。これら二つの技法を使用して得られた結果は同じであり、ＰＣＲ遺伝子型分類（ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）手順の詳細を記載する。ＰＣＲ増幅は、Ｆ２産仔からの尾ＤＮＡをテンプレートとして標準条件を使用して行われた。前記野生型アレルは、エキソン３及びエキソン４に位置する二つのプライマーを使用して３１６ｂｐの増幅バンドとして同定された。これらのプライマーは、それぞれ、５’−ＧＣＣＣＡＧＣＴＧＴＧＴＧＡＣＴＧＴ（順方向）（配列識別番号３）と５’−ＣＣＣＡＣＣＣＣＡＴＧＣＴＡＣＡＣＴ（逆方向）（配列識別番号４）であった。ターゲットアレルは、ネオマイシン耐性遺伝子に位置する二つのプライマーを使用して１４０ｐｂのバンドとして同定された。これらのプライマーは、それぞれ、５’−ＴＧＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＴＣＡＴＣＴＣＣ（順方向）（配列識別番号５）と５’−ＡＴＴＧＴＣＴＧＴＴＧＴＧＣＣＣＡＧＴＣ（逆方向）（配列識別番号６）とであった。これらＰＣＲ増幅から得られた結果は図２にまとめられている。これらの分析は、ＶＥＧＦ−Ｂのターゲットアレルに関してホモなマウスが生育可能であることを示した。そして、Ｆ２世代の多数の動物は、１：２：１の、野生型、前記ヌルアレルを有するヘテロ、及びホモ、の比率を示した。このように、ヌルアレルは、古典的なメンデル法則に従って遺伝する。
【００９１】
ＶＥＧＦ−Ｂの成体ノックアウトマウスの最初の外部観察からは、野生型マウスに対してなんら大きな構造的変化は示されなかった。しかしながら、一部のトランスジェニックＶＥＧＦ−Ｂミュータントマウスの心臓は、奇形になっていることが観察された。これらの心臓は、一般に野生型よりもサイズが小さく、大きな血管はより拡張しているようであった。これらの表現型は、ＶＥＧＦ−Ｂノックアウトマウスが、心臓組織増殖又は発達に対する影響を与える化合物をスクリーニングするためのモデルとして使用可能であることを示している。
【００９２】
実施例５：細胞又は組織標本中のＶＥＧＦ−Ｂ核酸の検出
細胞又は組織標本は、公知の多くの簡便な方法によって得ることができる。一般に、遠心分離された細胞ペレット又は組織試料を即座に冷凍する。トータルＲＮＡを、グアニジニウムイソチオシアネート法［チョムジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）他、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２：１５６−１５９（１９８７）］によって単離する。０．２μｇのランダムヘキサデオキシヌクレオチドプライマー、５単位のマウス逆転写酵素、テンプレートとしての５μｇのトータルＲＮＡ、そして一本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用してｃＤＮＡを合成する。３７℃で１時間のインキュベーション後、その反応混合物を−７０℃で保存する。逆転写酵素を添加しなかったことを除いて、同様に、ＰＣＲ増幅の陰性対照試料を調製した。β−アクチンも、それは構成的に高いレベルに於いて発現され、その発現は異なる細胞に於いて大きな変化を示さないため、内部標準としてテストした。
【００９３】
ＰＣＲ増幅のために、プライマー配列を、下記のようにＶＥＧＦ−Ｂ及びβ−アクチン遺伝子から選択する。
ＶＥＧＦ−Ｂセンス：５’−ＧＣＣＡＴＧＴＧＴＣＡＣＣＴＴＣＧＣＡＧ−３’（配列識別番号７）、
ＶＥＧＦ−Ｂアンチセンス：５’−ＴＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＣＡＣＡＧＣＣ−３’（配列識別番号８）
β−アクチン　センス：５’−ＣＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴ−３’（配列識別番号９）
β−アクチン　アンチセンス：５‘−ＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＧＴＡＧＴＴＴＣＧＴＧ−３’（配列識別番号１０）［β−アクチン配列は、エング（Ｎｇ）他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．，５：２７２０−７３２（１９８５）からのヌクレオチド２１０５−２１２５と２４１１−２４３２とから成る］。前記ｃＤＮＡ反応産物の４μｌのアリコットを、９４℃まで５分間加熱し、これを、２０ｐｍｏｌのプライマー、１０ｘＰＣＲ緩衝液、１μｌの２０ｍＭ　ｄＮＴＰ及び２．５ＵのＴａｑポリメラーゼを使用したＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用する。最終ボリュームを、ＤＥＰＣ処理水によって１００μｌに調節する。９５℃で１分間の変性と、６２℃で４５秒間のアニーリングと、７２℃で５０秒間の重合を、ＶＥＧＦ−Ｂについては全部で３５サイクル、β−アクチンについては全部で２５サイクル行う。５サイクル後毎に、１５μｌのアリコットを分析のために採取する。
【００９４】
５μｌの前記ＰＣＲ反応混合物の電気泳動を、エチジウムブロマイドを含有する２％アガロースゲル中で行った。サイズマーカＤＮＡフラグメントの長さの範囲は、２４〜７２６塩基対であった（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン，ＵＳＡのφＸ１７４　ＤＮＡ／Ｈｉｎｆ　Ｉマーカ）。
【００９５】
実施例６：トランスジェニック動物からの細胞と組織の用途
上述したように、ＶＥＧＦ−Ｂノックアウトマウスの心臓は、野生型よりも小さいように見え、これは、とりわけ、心臓細胞増殖アッセイ、心拍数アッセイ、心臓拍出量アッセイ、及び、その他の血行力学的特性のアッセイにおける有用性を示唆している。当業者は、スクリーニングアッセイにおけるその他の用途も理解するであろう。
【００９６】
そのようなスクリーニング法に於いてトランスジェニック動物の細胞及び組織を使用するために、トランスジェニック動物由来の少なくとも一つの細胞を含む、トランスジェニック動物からの細胞又は組織の培養株を使用することができる。それらの細胞は外植片として増殖されるか、又は、機械的分散によって分離され、一次培養物として増殖される。或いは、それらの細胞を、公知の形質転換法によって、或いは、最初に、そのトランスフォームマウスを、たとえば、ジャット（Ｊａｔ）他、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８８：５０９６−５１００（１９９１）によって記載されているＨ−２ＫｔｓＡ５８マウスと交配させたり、その他公知の関連する方法（たとえば、マクリーン，ジェイ・エス（ＭｃＣｌｅａｎ，Ｊ．Ｓ．），Ｔｉｂｔｅｃｈ　１１：２３２（１９９３）を参照）によって、細胞ラインにトランスフォームする。このように、ノックアウトミュータントとＨ−２ＫｂｔｓＡ５８トランスジェニックマウスとの交配は様々な細胞の不死化ラインを条件付で作り出す。具体的には、細胞は、ｔｓ（温度感受性）Ａ５８Ｔ−抗原の許容条件下ではじめに増殖するので、それらの細胞が多くの継代のための培養ができる。Ｔ−Ａｇは細胞を不死化する。細胞をＴ−Ａｇの活性を不能にする非許容温度に変えると、細胞は分化し、それによって、様々な組織から多くの様々な細胞が潜能的に作り出される。
【００９７】
実施例７：　新脈管形成性および／または腫瘍増殖調節活性のアッセイ
応答細胞も含まれているＶＥＧＦ−Ｂノックアウトマウスからの心臓体外移植組織のような組織サンプルをＶＥＧＦアナログをテストするために使用することができる。技術分野で知られているように組織サンプル又は体外移植組織を溶液中に維持する。ＶＥＧＦ−Ｂのアナログまたは小分子のような化合物を組織サンプル又は体外移植組織に添加し、組織サンプル又は体外移植組織における作用を分析した。このように、新脈血管形成性、腫瘍増殖の抑制又は促進、筋系の増加、又は、ＶＥＧＦ−Ｂに関連するその他の作用をアッセイすることができる。当業者は、特定の実施例を考案するために、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）（１９９８）やホーガン（Ｈｏｇａｎ）（１９９４）等の、公知の方法を拠り所とすることができる。
【００９８】
実施例８：　ＶＥＧＦ−Ｂ転写物の発現の研究
心臓及び骨格筋におけるＶＥＧＦ−Ｂ転写物の発現を、野生型（＋／＋）、ヘテロマウス（＋／−）及びホモノックアウトマウス（−／−）におけるノザン・ブロッティングによって調べた。ＶＥＧＦ−Ｂ欠損及び野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスを殺し、異なる組織をスナップ凍結（ｓｎａｐ　ｆｒｏｚｅｎ）し、使用時まで−８０℃で保存した。トータル細胞性ＲＮＡを、グアニジニウムイソチオシアネート／酸フェノール法［チョムジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）他、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６２：１５６−１５９（１９８７）］によって作成した。各試料からの２０μｇのＲＮＡを、１％アガロースゲル中で各レーン毎に使用し、８０Ｖで約３時間ランさせた。次に、ゲルを、ナイロン膜（ＨｙｂｏｎｄＴＭ−Ｎ＋，Ａｍｅｒｓｈａｍ）にトランスファーし、その後ＵＶクロスリンクを行った。プレハイブリダイゼーションを、製造業者のプロトコル（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に依り、２時間、５ｘＳＳＣ，５ｘデンハルト溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの一本鎖ＤＮＡ中で行い、その後、６５℃で特定プローブによってハイブリダイゼーションを一晩行った。
【００９９】
使用された二つのプローブは、（ａ）全長マウスＶＥＧＦ−ＢｃＤＮＡと（ｂ）ヌルアレルに於いてＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子の欠失部分をカバーするプローブとであった。１．８ｋｂのＶＥＧＦ−Ｂ１６７ｃＤＮＡフラグメントを使用して、推奨されているプロトコルに従って、ランダム標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して前記第１プローブを作成した。ノーザン分析に使用された前記第２プローブは、前記ヌル／ターゲッティングベクター中でＮｅｏ遺伝子によって置換された、ＶＥＧＦ−Ｂのエキソン３及び４中の１４８ｂｐのフラグメントを使用して作成し、これを、ＰＣＲ法によって標識した［コナート（Ｋｏｎａｔ）他、ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｐｐ３７−４２，Ｇｒｉｆｆｉｎ　ｅｄｓ．，ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ（１９９４）］。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼと３２Ｐ−ｄＣＴＰとを、９４℃で１分間、５８℃で２分間、そして７２℃で３分間の、３０サイクルの標識化ＰＣＲに使用した。
【０１００】
洗浄後、膜を、２〜６日間、Ｘ線フィルムに露出させた。膜を、煮沸０．５ＳＤＳ中で剥離（ｓｔｒｉｐ）させ、完全な剥離を保証するべく、一晩、蛍光イメージャ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ　ｉｍａｇｅｒ）に露出した。図５ａは、前記全長マウスＶＥＧＦ−ＢｃＤＮＡプローブを使用したノーザン・ブロットからの結果を示している。図５ｂは、前記ヌルアレルの欠失部分をカバーするプローブからの結果を示している。
【０１０１】
これらの結果は、両プローブが前記＋／＋マウスから得られた豊富な１．４ｋｂＶＥＧＦ−Ｂ　ｍＲＮＡにハイブリダイズすること、そして、より少量の二つの更なる転写物も検出されたことを示している。これら二つの小さな転写物は、それぞれ、その長さは３．０ｋｂと６ｋｂであった。＋／−マウスに於いてはハイブリダイゼーションシグナルのはっきりした減少が得られたのに対して、両プローブは、いずれも、−／−マウスから得られたＲＮＡ試料中にはなんのＶＥＧＦ−Ｂ転写物も検出しなかった。このことは、ターゲットＶＥＧＦ−Ｂアレルがノックアウトされてヌルアレルが形成されたこと、そして、−／−マウスはＶＥＧＦ−Ｂタンパク質の合成を有さないこと、を示すものである。ヘテロ接合体中のＶＥＧＦ−Ｂ転写体のレベル低下は、又、残りの無傷のＶＥＧＦ−Ｂアレルの転写はその代償としてアップレギュレーションされない、ということも示している。
【０１０２】
実施例９：　腫瘍の移植と測定
腫瘍の増殖と転移は、腫瘍組織の新生血管形成に依存することが知られているので、移植された腫瘍の増殖を、同腹仔の、野生型（＋／＋）及びＶＥＧＦ−Ｂ欠損（−／−）マウスに於いて調べた。このテストには、オスのＶＥＧＦ−Ｂ欠損（−／−）マウスと、同腹仔のホモＣ５７Ｂｌ／６マウス（＋／＋）とを使用した。マウスＴ２４１線維肉腫細胞を、皮内注射した。６〜８週齢のマウスを、腫瘍細胞の移植前に、メトキシフルランによって麻酔した。次に、対数期増殖中の１ｘ１０６のＴ２４１マウス線維肉腫細胞を、１００μｌのＰＢＳ中に懸濁させ、各マウスの中背部に皮下移植した。これらの動物のそれぞれにおける腫瘍の増殖を測定した。腫瘍は、ノギスを使用して一日毎に観察、測定した。腫瘍の体積を、式：幅２ｘ長さｘ０．５２を使用して計算した［ベーム（Ｂｏｅｈｍ）他，Ｎａｔｕｒｅ，３９０：４０４−４０７（１９９７）を参照］。
【０１０３】
その結果を図６のグラフに示す。このグラフから、腫瘍の増殖は、＋／＋動物と比較して−／−動物に於いて大幅に遅いことが理解される。それは、ミュータント動物における方が長い（＋／＋動物の場合には約１８−２０日間であるのに対して−／−動物の場合には３０−３２日間）、指数増殖期前の、初位相（ｉｎｉｔｉａｌ　ｐｈａｓｅ）であるように思える。このことは、ＶＥＧＦ−Ｂが、恐らくは腫瘍ストロマに影響を与えることによって、腫瘍の脈管形成に影響するということを示している。この結論は、その影響がミュータント動物に於いて観察される間に、腫瘍細胞が恐らく内因性のＶＥＧＦ−Ｂを発現することから、引き出すことができる。
【０１０４】
この結果は、内皮細胞増殖に対する直接的影響又は、遊走、細胞外マトリクスの分解等の間接的影響に起因するものであるかもしれない。いずれにせよ、これらの結果は、ＶＥＧＦ−Ｂが、腫瘍増殖を促進するのに役割を果すことを示しており、たとえば、モノクローナル抗体を使用して、ＶＥＧＦＲ−１に対するＶＥＧＦ−Ｂ結合の阻止、又は、ＶＥＧＦＲ−１に対する小分子の結合、又は、アンチＶＥＧＦ−Ｂ療法、或いは、これらの二つ以上の組み合わせによって、ＶＥＧＦ−Ｂの作用の抑制に基づいて、抗腫瘍ストラテジーを開発することが可能であること、を示している。
【０１０５】
実施例１０：　正常及びＶＥＧＦ−Ｂ欠損マウスからの心臓組織の組織学的検査
正常マウスとＶＥＧＦ−Ｂ欠損マウスからの心臓組織の組織学的検査は、大きな相違点を示さなかった。又、ミュータント動物の心筋層断面における毛細管密度は、正常であった。このことは、ＶＥＧＦ−Ｂが、心筋層の脈管形成を制御する新脈管形成プロセスに於いて重要な役割を演じていないかもしれないことを示唆している。
【０１０６】
実施例１１：　ＶＥＧＦ−Ｂ欠損マウスにおける新脈管形成因子の発現の分析
放射性標識ｃＲＮＡプローブを使用したＲＮＡｓｅプロテクションアッセイ（ＲＮａｓｅ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）による、正常及びＶＥＧＦ−Ｂ欠損マウスの心臓における遺伝子発現の分析は、調べられた遺伝子の大半が、ミュータント動物に於いて正常に発現されることを示した。正常に発現された遺伝子は、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、ＰＤＧＦ　Ａ、ＰＤＧＦレセプターａ及びｂ、ＶＥＧＦレセプター１及び２、ニューロピリン１，Ｔｉｅ１レセプター、ウロキナーゼ　プラスミノーゲンアクチベーター、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビタ１及び血小板内皮細胞接着分子を含んでいた。その発現がミュータントマウスに於いて変化した唯一の遺伝子は、ＰＤＧＦ　Ｂ（約３０％低下，ｐ＞０．０５）であった。現時点に於いて、このＰＤＧＦ　Ｂの発現の変化が何を意味するのかは明らかではない。
【０１０７】
実施例１２：　ＶＥＧＦ−Ｂ欠損マウスにおける心臓異常
正常な心臓の機能におけるＶＥＧＦ−Ｂの役割を調べるために、テレメトリーシステム（ＤＡＴＡ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ミネソタ、ＵＳＡ）を使用して心臓異常を探索するべく、ＶＥＧＦ−Ｂ欠損マウスと正常な同腹仔とを比較した。前記テレメトリーシステムは、植え込み型送信機（ＴＡ１０ＥＴＡ−Ｆ２０）と、テレメトリー受信機（ＲＡ１０１０）と、前記テレメトリー受信機から情報を中継する統合マトリクス（ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ　ｍａｔｒｉｘ）（ＢＣＭ１００）とから成る。心電図（ＥＣＧ）とその他のパラメータとを記録するために、送信機を動物の腹に埋め込んだ。二つの電極を、心尖（ｈｅａｒｔ　ａｐｅｘ）の近傍と、皮下的に右肩とにそれぞれ配置した。データ取得システムは、データ翻訳（ＤＴ２８０１）ＡＤコンバータと、コンピュータプログラムＰＣ−ＬＡＢ　ｖ．５．０（Ａｘｅｎｂｏｒｇ　ａｎｄ　Ｈｉｒｓｃｈ，　Ｃｏｍｐ．Ｍｅｔｈ．Ｐｒｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．４１：５５−６７（１９９３））とから成る。得られたデータを、Ｅｘｃｅｌマイクロプログラムを使用して更に分析し、そのデータを、毎分の発運動量カウント値、体温、及び毎分の心拍数として提示した。ＥＣＧアレイを使用して、心調律を調べた。前記コンピュータプログラムＰＣ−ＬＡＢ　ｖ．５．０を使用して、平均的なＥＣＧから、ＰＱ，ＱＲＳ及びＱＴ間隔をミリ秒単位で計算した。使用された手順は、ヨハンソン（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ）及びトーレン（Ｔｏｒｅｎ）、Ａｃｔａ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．１６０：１３３−１３８（１９９７）に記載されており、これをここに参考文献として合体させる。
【０１０８】
正常マウス（＋／＋）とＶＥＧＦ−Ｂ欠損マウス（−／−）の平均ＥＣＧの分析は、いくつかの大きな違いを示している。その結果を図７のグラフに示す。
【０１０９】
ＰＱ間隔は、＋／＋動物と比較して−／−動物に於いて長くなっている（表１も参照：３９．７ミリ秒に対して３５．７ミリ秒，ｐ＞０．０５）。これは、欠損動物が房室（ＡＶ）伝導欠陥を有することを示している。この理由は明らかではないが、ヒトのＡＶ伝導の低下は、ＡＶ束線維の虚血、瘢痕組織又は心臓の石灰化に依るＡＶ束の圧縮、ＡＶ接合部のＡＶ束又は、線維の炎症、或いは、迷走神経に依る心臓の過度の刺激によって引き起こされうる。
【０１１０】
ＱＲＳ複合は正常のように見えるのに対して、マウスのＵ波は、僅かな低下を有して異常であるように見える。Ｕ波のこの僅かな低下は、虚血の徴候であるかもしれない。というのは、ヒトに於いて見られる対応するＳＴ複合の類似の低下は心筋虚血を示すことがあるからである。Ｕ波の面積と振幅とを表１に示すとともに、図７Ａ及び７Ｂに図示する。−／−マウスにおけるＵ波の低下は、図７Ｂ中、斜線領域によって示されている。これは−／−動物におけるその他の異常を示している。ヒトに於いては、ＳＴ群の低下は、心筋の虚血を示すものである。大半の場合、虚血は、不十分な冠状循環によって引き起こされる。心拍数と体温との両方は、−／−動物に於いて正常であった。
【０１１１】
【表１】
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【０１１２】
以上の説明及び実施例は、単に、本発明を例示するために提供されたものであり、限定的なものではない。当業者は本発明の精神及び要旨を組み込んだ、ここに開示された実施例の改造を想到するであろう故、本発明は、添付の請求項の範囲内のすべて及びそれらの均等物を含むものと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
マウスＶＥＧＦ−Ｂ遺伝子のヌル変異を作り出すためのストラテジーの略図
【図２】
同腹仔の、ホモＶＥＧＦ−Ｂ（＋／＋）、ヘテロ（＋／−）及びＶＥＧＦ−Ｂ座のホモノックアウトマウス（−／−）のＦ２世代からの尾ＤＮＡのＰＣＲ増幅のアガロースゲル電気泳動を示している図
【図３】
マウスＶＥＧＦ−Ｂ座の詳細な制限地図を示す図であり、制限酵素と対応の記号は下にリストされている
【図４】
前記マウスＶＥＧＦ−Ｂ座をターゲットとしたトランスジェニックベクターを生成するのに使用された手順の略図であり、後述するコンストラクトＡ−Ｅのそれぞれが、前記マウスＶＥＧＦ−Ｂ座をターゲットとしたトランスジェニックベクターを作る方法例に示されている
【図５ａ】
野生型（＋／＋）、ヘテロ（＋／−）及びノックアウト（−／−）マウスの心臓及び骨格筋組織からのＲＮＡのノーザンブロットを示す図
【図５ｂ】
野生型（＋／＋）、ヘテロ（＋／−）及びノックアウト（−／−）マウスの心臓及び骨格筋組織からのＲＮＡのノーザンブロットを示す図
【図６】
同腹仔の、ホモＶＥＧＦ−Ｂ（＋／＋）及びＶＥＧＦ−Ｂ欠損（−／−）マウスにおける移植された腫瘍の増殖を比較するグラフ
【図７Ａ】
同腹仔の、ホモＶＥＧＦ−Ｂ（＋／＋）及びＶＥＧＦ−Ｂ欠損（−／−）マウスの典型的な心電図
【図７Ｂ】
同腹仔の、ホモＶＥＧＦ−Ｂ（＋／＋）及びＶＥＧＦ−Ｂ欠損（−／−）マウスの典型的な心電図
【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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