(57)【要約】本発明は動物の粘膜細胞もしくは組織中で調節可能な様式でタンパク質を産生させることによって治療可能な疾患を治療するために有用な組成物および方法を提供する。その治療法には、該タンパク質を分泌するｉｎ ｖｉｔｒｏで形質転換された細胞を哺乳類の被験体中に移植することを含む、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｅｘ ｖｉｖｏ法が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
栄養素に応答してタンパク質を産生する粘膜細胞を作成する方法であって；
（ａ）  粘膜細胞を、タンパク質をコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含んでなるポリヌクレオチドと、該細胞の形質転換が可能な条件下で接触させること；および
（ｂ）  該タンパク質を栄養素によって調節可能な様式で産生する細胞の形質転換体を同定し、それにより栄養素に応答してタンパク質を産生する粘膜細胞を作成すること、
を含んでなる方法。
【請求項２】
栄養素によって調節可能なタンパク質を産生する、単離されたまたは培養された粘膜細胞であって、該タンパク質の発現が該タンパク質をコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含んでなるトランスジーンによってもたらされる粘膜細胞。
【請求項３】
栄養素が該タンパク質の発現または分泌を増加させる、請求項２に記載の粘膜細胞。
【請求項４】
栄養素が、糖、脂肪、炭水化物もしくはデンプン、アミノ酸もしくはポリペプチド、トリグリセリド、ビタミン、ミネラル、またはセルロースを含んでなる、請求項２に記載の粘膜細胞。
【請求項５】
発現制御エレメントが栄養素で調節可能なエレメントを含んでなる、請求項２に記載の粘膜細胞。
【請求項６】
栄養素で調節可能な該エレメントが腸管の内分泌プロモーターを含んでなる、請求項５に記載の粘膜細胞。
【請求項７】
腸管内分泌プロモーターがグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）プロモーターを含んでなる、請求項６に記載の粘膜細胞。
【請求項８】
核酸がインスリンをコードするものである、請求項２に記載の粘膜細胞。
【請求項９】
核酸がレプチン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、コレシストキニン、グルカゴンアンタゴニスト、成長ホルモン、凝固因子、もしくは抗体をコードするものである、請求項２に記載の粘膜細胞。
【請求項１０】
粘膜細胞が被験体から得たものである、請求項２に記載の粘膜細胞。
【請求項１１】
被験体がヒトである、請求項１１に記載の粘膜細胞。
【請求項１２】
粘膜細胞が消化管の組織もしくは器官から得たもの、または腸管を起源とする細胞系統から由来するものである、請求項２に記載の粘膜細胞。
【請求項１３】
組織が胃である、請求項１２に記載の粘膜細胞。
【請求項１４】
組織が十二指腸である、請求項１２に記載の粘膜細胞。
【請求項１５】
粘膜細胞が内分泌細胞である、請求項２に記載の粘膜細胞。
【請求項１６】
内分泌細胞がＫ細胞である、請求項１５に記載の粘膜細胞。
【請求項１７】
粘膜細胞が幹細胞である、請求項２に記載の粘膜細胞。
【請求項１８】
粘膜細胞が非内分泌細胞である、請求項２に記載の粘膜細胞。
【請求項１９】
核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントがさらにベクターを含んでなる、請求項２に記載の粘膜細胞。
【請求項２０】
ベクターがウイルスベクターを含んでなる、請求項１９に記載の粘膜細胞。
【請求項２１】
ある組織中であるタンパク質を産生させることによって治療可能な疾患を有する、もしくは有する危険性のある被験体を治療する方法であって、請求項２に記載の１個以上の粘膜細胞を該組織中に該疾患を治療するために十分な量移植することを含んでなる方法。
【請求項２２】
疾患が高血糖状態を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２３】
高血糖状態が糖尿病を含んでなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
被験体の絶食時の血漿中グルコースレベルが１１０ｍｇ／ｄＬを超えるものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
疾患が肥満または望ましくない体重を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
粘膜細胞がインスリンを発現するものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
粘膜細胞がレプチン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、コレシストキニン、グルカゴンアンタゴニスト、成長ホルモン、凝固因子、または抗体を発現するものである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
組織が粘膜組織である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
組織が非粘膜組織である、請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
非粘膜組織が肝臓、膵臓、もしくは筋肉である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ある粘膜組織中である治療用タンパク質を産生させることによって治療可能な疾患を有する、もしくは有する危険性のある被験体を治療する方法であって、該治療用タンパク質をコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含んでなるポリヌクレオチドで形質転換された被験体の体内の粘膜組織細胞を、該疾患を治療するために有効な量の該タンパク質の産生を誘導する栄養素と接触させることを含んでなる方法。
【請求項３２】
疾患が高血糖状態を含んでなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
高血糖状態が糖尿病を含んでなる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
糖尿病がＩ型糖尿病を含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
被験体の絶食時の血漿中グルコースレベルが１１０ｍｇ／ｄＬを超えるものである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
糖尿病がインスリン依存性糖尿病を含んでなる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
該疾患が肥満もしくは望ましくない体重を含んでなる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
栄養素が該タンパク質の発現もしくは分泌を増加させるものである、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項３９】
タンパク質の発現が非内分泌細胞中で増加する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
タンパク質の分泌が内分泌細胞中で増加する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
栄養素が糖、脂肪、炭水化物もしくはデンプン、アミノ酸もしくはポリペプチド、トリグリセリド、ビタミン、ミネラル、またはセルロースを含んでなる、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項４２】
発現制御エレメントが栄養素で調節可能なエレメントを含んでなる、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項４３】
栄養素で調節可能なエレメントが腸管の内分泌プロモーター、それの機能的な変異体、またはそれの機能的な部分配列を含んでなる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
腸内分泌プロモーターがグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）プロモーターを含んでなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
核酸がインスリンをコードするものである、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項４６】
核酸がレプチン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、コレシストキニン、グルカゴンアンタゴニスト、成長ホルモン、凝固因子、または抗体をコードするものである、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項４７】
粘膜細胞が被験体の消化管の組織または器官に存在するものである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４８】
組織が腸である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
組織が腸管である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
粘膜細胞が内分泌細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項５１】
内分泌細胞がＫ細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
粘膜細胞が幹細胞である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
粘膜細胞が非内分泌細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項５４】
ある核酸と機能しうる形で連結された該発現制御エレメントがさらにベクターを含んでなる、請求項１または３１に記載の方法。
【請求項５５】
ベクターがウイルスベクターを含んでなる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
粘膜組織中でインスリンを産生する非ヒトトランスジェニック動物であって、インスリン産生が該動物の該粘膜組織中で天然に生ずるものではなく、インスリン産生が粘膜組織細胞中に存在するトランスジーンによってもたらされるもので、該トランスジーンがインスリンをコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含むポリペプチドを含んでなり、該動物の該粘膜組織中でのインスリン産生が栄養素に応答するものである、トランスジェニック動物。
【請求項５７】
動物がマウスである、請求項５６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５８】
発現制御エレメントが栄養素で調節可能なエレメントを含んでなる、請求項５６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項５９】
栄養素で調節可能なエレメントがグルコースで誘導可能なプロモーター、それの機能的な変異体、またはそれの機能的な部分配列を含んでなる、請求項５６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６０】
グルコースで誘導可能なプロモーターがグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド（ＧＩＰ）プロモーターを含んでなる、請求項５９に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６１】
インスリンをコードする核酸がインスリンの機能的な部分配列をコードするものである、請求項５６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６２】
粘膜組織が腸管の組織もしくは器官である、請求項５６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６３】
粘膜組織が胃である、請求項６１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６４】
粘膜組織が十二指腸である、請求項６１に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６５】
粘膜組織が内分泌細胞を含んでいる、請求項５７に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６６】
内分泌細胞がＫ細胞である、請求項６５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６７】
粘膜細胞が幹細胞である、請求項６５に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６８】
動物が高血糖状態の発症に対して抵抗性である、請求項５６に記載のトランスジェニック動物。
【請求項６９】
高血糖状態が糖尿病を含んでなる、請求項６８に記載のトランスジェニック動物。
【請求項７０】
栄養素に応答してインスリンを産生する請求項５６のトランスジェニック動物から単離された細胞。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は腸管内でのタンパク質の調節可能な産生に関し、より詳しく述べれば、栄養素によって調節されるグルコース低下因子の腸管の内分泌細胞からの産生に関する。
【０００２】
本発明の背景
ペプチドとタンパク質はそのコンホメーションの多様性と機能の特異性によって、糖尿病、血友病、癌、心血管疾患、感染性疾患、および関節炎を含む疾患の宿主の治療に用いられてきた（Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｃ．Ｓ．とＣｌａｒｋｅ， Ｌ．Ａ．， Ｃｌｉｎ． Ｇｅｎｔ． ５５（６）：３８９（１９９９）； Ｒｙｆｆｅｌ， Ｂ． Ｂｉｏｍｅｄ ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｓｃｉ． １０：６５（１９９７）； Ｋｏｔｈｓ， Ｋ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６：６８１（１９９５）； Ｂｕｃｋｅｌ， Ｐ．， Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｓｃｉ． １７：４５０（１９９６））。現在、バイオテクノロジーを利用した医薬品として承認されたもののうちの３分の２以上が全身用タンパク質薬剤である。機能ゲノム科学、プロテオミクス、および遺伝子工学の分野の最近の進歩によって、バイオ医薬品のマーケットに参入するタンパク質薬剤の数はますます増えている。
【０００３】
当初はタンパク質薬剤は動物の組織もしくはヒト血清から精製されていた。タンパク質をベースとする医薬品は数段階の改良を経て現在の臨床適用ができる状態に至っている。例えば、バイオ医薬品産業において、現在は遺伝子操作された酵母および細菌を組換えヒトタンパク質の製造のために用いている（Ｓｃｏｐｅｓ， Ｒ．Ｋ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２３：１９７（１９９６））。この革新的な技術は、第１世代のタンパク質薬剤が抱えていた健康への危険性と薬剤不足という悩みを克服し、その結果、タンパク質の治療的価値を向上させた。しかし、これらの前進はあったが、タンパク質を治療薬として広範囲に用いることにおいて、組換えタンパク質を活性型に精製することの困難性、および製造工程のコストが高いことは依然として障害となっている（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ， Ｗ．とＷａｌｔｅｒ， Ｊ．， Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ２２：１３５（１９９４）； Ｓｃｏｐｅｓ， Ｒ．Ｋ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２３：１９７（１９９６））。さらに、タンパク質薬剤は体内への侵入に際してバリアに直面する。経口的に摂取した場合には、消化管内の酵素によって分解されやすい（Ｗａｎｇ， Ｗ．， Ｊ． Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔ． ４：１９５（１９９６）； Ｗｏｏｄｌｅｙ， Ｊ．Ｆ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １１：６１（１９９４））。
【０００４】
これまでに探求されたタンパクを送達するための他の経路としては、輸注ポンプ（Ｂｒｅｍｅｒら， Ｐｈａｒｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １０：２３９（１９９７））、経皮経路（Ｂｕｒｋｏｔｈ， Ｔ．Ｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １６：３３１（１９９９））、マイクロカプセル化（Ｃｌｅｌａｎｄ， Ｊ．Ｌ．， Ｐｈａｒｍａ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０：１（１９９７））、および吸入（Ｇｏｎｄａ， Ｉ．， Ｊ． Ｐｈａｒｍａ． Ｓｃｉ． ８９：９４０（２０００））が含まれる。現在のところ、注射針による皮下および静脈内への投与がタンパク質治療剤の送達のための選択すべき経路となっている。不運なことに、この送達様式は治療が行いうる範囲にタンパク質の濃度が維持されないことがしばしばあり、もしくは適切な送達速度をもたらさないので理想的とは言えない。さらに、タンパク質薬剤を用いて有効な治療を行うには通常は頻繁に注射針による注射を必要とし、それによって局所反応および不快感が生じ、患者のコンプライアンスが悪くなる（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ， Ｊ．Ｔ．， Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．， ７：１７５（１９９４））。これらの要素およびその他の要素が多数の薬剤の治療への適用を制限し、究極的にはそれらの商業上の価値の発揮を妨げる。従って、タンパク質治療剤のための新たな送達方法を見出すことが必要なことは自明のことである。
【０００５】
特定の治療用タンパク質をコードする遺伝子の体内の細胞への導入は、疾患の治療における上述の送達の問題点を解決するために用いられてきた。この方法は遺伝子治療と名付けられ、その方法はタンパク質送達の新たな方向を示すものとされている。このアプローチによって、体内の細胞は「バイオリアクター」に変換され、それが十分な量の治療用タンパク質を産生し、頻繁に注射する必要が無くなる。現在のところ、遺伝子治療は２つ一般的なアプローチに分類することができる（Ｄｒｅｗ， Ｊ．とＭａｒｔｉｎ， Ｌ−Ａ．：Ｌｅｍｏｉｎｅ， Ｎ．Ｒ．編「遺伝子治療を理解する」”Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， 第１章， ｐｐ１−１０（１９９９））。
【０００６】
第１のアプローチ、これはｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療と呼ばれているが、このアプローチでは、遺伝子が生体宿主中に位置している細胞によってその遺伝子が吸収されるような形で導入される。例えば、治療用遺伝子は、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、もしくはアデノウイルスなどのウイルスのゲノム中にパッケージされる。次いで、その治療用遺伝子を含んでいる組換えウイルスを生体中に導入し、その生体内で細胞に感染させる。その感染プロセスによってウイルスはその治療用遺伝子を含んでいるゲノムを宿主細胞のゲノム構造中に組み入れる。その結果、感染細胞は治療用遺伝子を発現する。
【０００７】
第２のアプローチには、宿主の生物体から取り出した細胞への遺伝物質のｉｎ ｖｉｔｒｏでの移送によるものである。その細胞のゲノム中に遺伝子がうまく組み込まれた後、その形質転換された細胞を宿主に戻すために移植する。この遺伝子移送法はｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療と呼ばれる。
【０００８】
ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子治療は双方とも医師に特定の遺伝子を追加もしくは改変する力を与え、その結果、疾患の治癒に至る（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ， Ｔ．：Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ， Ｔ．編， 「ヒト遺伝子治療の発展」”Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， 第１章 ｐｐ１−２０（１９９９））。この技法の臨床適用は現在広範な疾患について研究中であり、そのような疾患としては、癌、心臓血管疾患、代謝性疾患、神経変性性疾患、免疫疾患、およびその他の遺伝的もしくは後天的疾患が含まれる（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ， Ｔ．：Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ， Ｔ．編， 「ヒト遺伝子治療の発展」”Ｔｈｅ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， 第１章 ｐｐ１−２０（１９９９）； Ｄｒｅｗ， Ｊ．とＭａｒｔｉｎ， Ｌ−Ａ．：Ｌｅｍｏｉｎｅ， Ｎ．Ｒ．編「遺伝子治療を理解する」”Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， 第１章， ｐｐ１−１０（１９９９））。タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子治療の方法によって細胞中に安定に導入した後、そのような多数のタンパク質の治療に用いる濃度を持続させることができた。しかし、いくつかの疾患では治療用タンパク質の調節された送達が必要である。例えば、糖尿病患者に対するインスリン置換療法では理想的には食事中に適切な量のインスリンが送達されることが必要である。同様に、食欲抑制剤が食事依存性に放出されれば、その薬剤の最適な有効性が達成される。従って、そのような治療用タンパク質を送達するためには、例えば食事などのシグナルもしくは刺激によって引き金を引かれる放出システムが最適である。
【０００９】
時間を調節した送達を行うことが非常に適した特別な疾患は、インスリンの膵臓β細胞からの産生がないか（Ｉ型）もしくは不十分な（ＩＩ型）ことによって生ずる衰弱性代謝性疾患である糖尿病である（Ｕｎｇｅｒ， Ｒ．Ｈ．ら，「ウイリアムズの内分泌学教科書」”Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ”， Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９８））。β細胞は、食事後にインスリンを放出するためにインスリンを生産し貯蔵する特殊化された内分泌細胞であり（Ｒｈｏｄｅｓら， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １０５：１４５（１９８７））、インスリンは血液からグルコースを必要とする組織へのグルコースの移送を助けるホルモンである。糖尿病の患者は血中グルコースレベルを頻繁にモニターしなければならず、患者の多くは生存していくために毎日多数回のインスリン注射を必要とする。しかし、そのような患者でインスリン注射によって理想的な血中グルコースレベルに到達する患者はまれである（Ｔｕｒｎｅｒ， Ｒ．Ｃ．ら， ＪＡＭＡ， ２８１：２００５（１９９９））。さらに、インスリンのレベルの上昇が長引くと、低血糖ショックおよびインスリンに対する体の応答性の低下などの有害な副作用をもたらしうる。その結果、糖尿病患者はさらに、心血管疾患、腎疾患、失明、神経疾患、および創傷治癒疾患などの長期にわたる合併症の発症が見られる（ＵＫ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｓｔｕｄｙ（ＵＫＰＤＳ） Ｇｒｏｕｐ， Ｌａｎｃｅｔ， ３５２：８３７（１９９８））。
【００１０】
遺伝子治療は糖尿病治療のためのインスリンなどの治療用ペプチドの生理学的送達を行うために有望な手段であることが示されている（Ｌｅｉｂｏｗｉｔｚ， Ｇ．とＬｅｖｉｎｅ， Ｆ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｖ． ７：１２４（１９９９））。取り込まれた遺伝子を発現している代理の細胞はその遺伝子によってコードされたタンパク質を産生して貯蔵し、調節された様式でインスリンを分泌し、それによって糖尿病の治療に役立つこととなる。インスリンの産生を生体の栄養素要求性の変化と組み合わせることによる血漿中インスリンレベルの制御によっても、インスリン注射に伴う副作用が低減される。ヒトの糖尿病およびその他の疾患の効果的な治療を行うために、タンパク質の制御された放出を行いたいとのニーズがある。本発明はこのニーズを満足させ、それに関連する種々の利点を提供するものである。
【００１１】
要旨
本発明は、部分的には、グルコースに応答してインスリンを産生する形質転換された腸管細胞の産生に基づくものである。動物の腸管に存在する形質転換されたグルコース応答性細胞は、糖尿病動物において正常なグルコースのホメオスタシスを復活させる生理学的なレベルのインスリンを分泌することができる。従って腸管の内分泌細胞はタンパク質をコードする核酸をｅｘ ｖｉｖｏでもしくはｉｎ ｖｉｖｏで治療用に導入するために適切な標的であり、シグナルもしくは刺激（例えば、ある栄養素）に応答して行われるそのタンパク質の動物体内での産生によって治療的有益性が提供される。
【００１２】
従って本発明はある栄養素に応答してタンパク質を産生する粘膜細胞の作成方法、およびある栄養素に応答してタンパク質を産生する粘膜細胞を含む組成物を提供する。１実施形態においては、その方法とは、あるタンパク質をコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含むポリヌクレオチドと粘膜細胞とを、その細胞が形質転換しうる条件下で接触させ；栄養素で制御しうる様式でそのタンパク質を産生する形質転換体の細胞を同定し、それによってある栄養素に応答してタンパク質を産生する粘膜細胞を作成することを含んでいる。別の１実施形態においては、組成物は、栄養素で調節可能なタンパク質を産生する、単離された、または培養した粘膜細胞を含んでおり、その細胞ではそのタンパク質の発現は、タンパク質をコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含むトランスジーンによってもたらされる。
【００１３】
従って、本発明はまた、組織中でタンパク質を産生させることによって治療しうる疾患を有する、もしくはその疾患を有する危険性のある被験体を治療する方法を提供する。１実施形態においては、方法は、栄養素に応答してタンパク質を産生する１種以上の粘膜細胞を、その疾患を治療するために有効な量、組織中に埋め込むことを含んでいる。埋め込みの可能な組織の例としては、粘膜組織（例えば、消化管）、および非粘膜性組織（例えば、肝臓、膵臓、もしくは筋肉）が含まれる。
【００１４】
本発明に含まれる粘膜細胞には栄養素に応答する細胞が含まれ、それらはタンパク質の発現を増加させる（例えば、栄養素で調節可能な発現制御エレメントを介して）、もしくはタンパク質の分泌を増加させる（例えば、シグナルもしくは刺激、すなわち”分泌促進物質”に応答して合成タンパク質を分泌する）。
【００１５】
栄養素としては、糖、脂肪、炭水化物もしくはデンプン、アミノ酸もしくはポリペプチド、トリグリセリド、ビタミン、ミネラル、またはセルロースなどの天然および非天然の摂取可能な化合物が含まれる。栄養素で調節可能なエレメントとしては、グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチド（ＧＩＰ）プロモーターなどの腸管の内分泌プロモーターが含まれる。栄養素で調節可能なエレメントには、それの機能的な変異体（例えば点突然変異）または完全長の調節可能なエレメントの機能的な部分配列（欠失配列）が含まれる。該タンパク質をコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントとしてはさらに、ベクター（例えば、ウイルスベクター）を含むことができる。
【００１６】
本発明に含まれる粘膜細胞は、哺乳類（例えばヒト）などの被験体から得られ、消化管の組織もしくは器官から得られ、または腸管を起源とする培養細胞系に由来する。粘膜細胞が得られる組織の例としては、消化管、大腸もしくは小腸（空腸、十二指腸）、胃、食道、頬、もしくは口腔組織が含まれる。粘膜細胞としては、短期間であっても粘液での増殖に適応できるもしくは適応している細胞をも含んでいる。粘膜細胞としては、内分泌細胞および非内分泌細胞、Ｋ細胞、幹細胞、Ｌ細胞、Ｓ細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、Ｉ細胞、Ｍｏ細胞、Ｇｒ細胞、および腸−内分泌細胞（ｅｎｔｅｒｏ−ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ）が含まれる。
【００１７】
本発明の組成物と方法には、インスリン、レプチン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、コレシストキニン、グルカゴンアンタゴニスト、グレリン、成長ホルモン、凝固因子、もしくは抗体が含まれる。
【００１８】
従って、本発明はまた、粘膜組織中で治療用タンパク質を産生させることによって治療しうる疾患を有する、またはその疾患を有する危険性のある被験体を治療する方法を提供する。１実施形態においては、その方法には例えば、その治療用タンパク質をコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含むポリヌクレオチドで形質転換された粘膜細胞をその疾患を治療するために有効な量の該タンパク質の産生を誘導する栄養素と接触させることを含んでいる。
【００１９】
本発明の方法と組成物を用いて治療しうる状態および疾患としては、インスリン依存性および非依存性糖尿病または絶食時の血漿中グルコースレベルが１１０ｍｇ／ｄＬを超える場合などの高血糖状態；肥満もしくは望ましくない体重が含まれる。
【００２０】
従って、本発明はまた、動物モデルおよび遺伝的モデルをも提供する。１実施例においては、粘膜細胞中で治療用タンパク質（例えば、インスリン）を産生する非ヒトトランスジェニック動物が提供される。１態様においては、治療用タンパク質の産生はその動物の粘膜組織中で自然には起こらず、その粘膜組織中に存在するトランスジーンによってもたらされ、そのトランスジーンには該タンパク質をコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含むポリヌクレオチドが含まれており、その動物の粘膜組織でのタンパク質の産生はその栄養素に応答して行われる。１態様においては、該タンパク質はインスリンを含んでなる。従ってそのトランスジェニック動物は高血糖状態の発症に対して抵抗性のものとすることができる。従って、高血糖状態を有している、もしくはそのような状態となる危険性のあるトランスジェニック動物は体内のグルコースがより少ないか、もしくは高血糖によりなりにくいものとすることができる。別の１態様においては、その動物はマウスである（例えば、糖尿病もしくは高血糖、または肥満のマウス）。また別の１態様においては、発現をもたらす発現制御エレメントは、栄養素で制御されるエレメント、それらの機能的な変異体、またはそれらの機能的な部分配列を含んでなる。また別の１態様においては、該発現制御エレメントにはグルコースを誘導しうるプロモーター、例えば、グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチド（ＧＩＰ）プロモーターを含んでいる。動物におけるそのタンパク質の発現は消化管、腸、胃にもたらされる。栄養素に応答してインスリンを産生するトランスジェニック動物の細胞もしくは組織は単離することができる。タンパク質を発現し、また単離することもできる細胞としてはＫ細胞、幹細胞、および内分泌細胞もしくは非内分泌細胞が含まれる。
【００２１】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は図面および下記の説明に示す。本発明のその他の特徴、目的、および利点はこれらの説明および図面、ならびに特許請求の範囲の記載から明白なものとなろう。
【００２２】
詳細な説明
本発明は部分的には、治療を提供するために十分なレベルで動物の組織におけるターゲティングされたタンパク質の産生に基づいたものである。より具体的には、本発明は対象とするタンパク質の発現を被験体の消化管中の内分泌細胞にターゲティングする方法であって、そのタンパク質が調節された様式で被験体の血流中に放出されるようにする前記方法を含む。治療用タンパク質をコードする核酸と機能しうる形で連結された、遺伝子発現を腸管の内分泌細胞にターゲティングする発現制御エレメント（例えば、プロモーター）を含んでいる遺伝子構築物を用いることができる。その遺伝子構築物が内分泌細胞に組み込まれると、そのコードされたタンパク質は調節された様式で発現され、分泌されるだろう。対象の核酸でコードされたタンパク質を発現している形質転換された内分泌細胞は、そのタンパク質の治療上有効な量を、そのタンパク質の産生を増加させる物質（例えば、栄養素）を与えることで被験体の血流中に分泌することができる。
【００２３】
ヒトインスリン遺伝子と機能しうる形で連結されたＧＩＰプロモーターを含んでいる遺伝子構築物のマウス中での送達は、トランスジェニック動物の子孫の消化管中のＫ細胞によるヒトインスリンの発現および分泌をターゲティングすることで、成功を収めた。さらに、トランスジェニック動物でのヒトインスリンの産生は食事で調節されるものであった。細胞によって分泌されるインスリンの量は、そのトランスジェニックマウスを膵臓β−細胞の破壊後の糖尿病の発症から保護するのに十分なものであった。またインスリンの産生は正常なグルコースのホメオスタシスを提供するためにも十分なものであった。従って、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏ法のいずれかによって、インスリンなどの治療用タンパク質をコードする遺伝子の、動物の腸管における食事によって調節される内分泌細胞中への導入（例えば、インスリンを分泌する形質転換された細胞を動物中へｉｎ ｖｉｔｒｏで移植すること）を、タンパク質の産生によって治療可能な疾患の治療のために用いることができる。
【００２４】
本発明では、ある栄養素によって調節可能なタンパク質を産生する粘膜細胞を作成する方法が提供される。本発明の方法は、タンパク質をコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含んでいるポリヌクレオチドと粘膜細胞とを形質転換を可能とする条件下で接触させ、そのタンパク質を栄養素で調節可能な様式で産生する形質転換された細胞を同定することを含む。１実施形態においては、粘膜細胞はｉｎ ｖｉｖｏでポリヌクレオチドと接触させる。別の実施形態においては、粘膜細胞はポリヌクレオチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させる。さらに別の実施形態においては、ポリヌクレオチドとｉｎ ｖｉｔｒｏで接触した粘膜細胞は動物中への移植に適している。さらなる実施形態においては、粘膜細胞は内分泌細胞（例えば、Ｋ細胞）、または非内分泌細胞である。またさらなる実施形態においては、粘膜細胞は幹細胞または分化多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）もしくは多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）前駆細胞である。
【００２５】
別の実施形態においては、本発明で用いられる核酸発現構築物は消化管の内分泌細胞中でのタンパク質の産生をターゲティングするように設計されている。この構築物は所望の核酸配列と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含有している。発現制御エレメントとしては、連結された対象の核酸の発現を腸管の内分泌細胞にターゲティングすることができるプロモーターが挙げられる。構築物の標的細胞への導入は当業界では周知の従来法（浸透圧ショック（例えば、リン酸カルシウム法）、電気穿孔法、ウイルスベクター、小胞もしくは脂質キャリアー（例えば、リポフェクション）、直接的マイクロインジェクションなど）で行うことができる。
【００２６】
典型的には細胞の形質転換にはベクターを用いる。「ベクター」という用語は、例えば、遺伝子操作のためにポリヌクレオチドの挿入もしくは組み込みによって操作することができる（すなわち、「クローニングベクター」）、または挿入されたポリヌクレオチドの転写もしくは翻訳のために用いることができる（すなわち「発現ベクター」）、プラスミド、ウイルスベクターなどのウイルス、またはその他の当業界では公知のビヒクルを意味する。そのようなベクターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで細胞中にポリヌクレオチド（核酸と機能しうる形で連結された栄養素で調節可能な発現制御エレメントを含む）を導入し、および転写されたアンチセンスもしくはコードされたタンパク質を発現させるために有用である。
【００２７】
通常はベクターは少なくとも、細胞中での増殖のための複製起点を含んでいる。本明細書中で説明した発現制御エレメント（例えば、栄養素で調節可能なもの）を含む、ベクター内に存在する制御エレメントは、転写および翻訳を容易にするために含まれている。「制御エレメント」という用語は、その存在が発現に影響を及ぼすことができる最小限でも１つ以上の構成成分を含むことを意図しており、プロモーターもしくはエンハンサー以外のまたはそれらに加えて別の構成成分を含むことができるが、そのようなものとしては、例えば特にリーダー配列および融合パートナー配列、多重遺伝子またはポリシストロニックなメッセージを作製するための内部リボソーム結合部位（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅ：ＩＲＥＳ）エレメント、ｍＲＮＡのインフレームの翻訳が可能となるように遺伝子の正しいリーディングフレームを維持するためのイントロンのためのスプライシングシグナル、対象の遺伝子の転写産物の適切なポリアデニル化を提供するためのポリアデニル化シグナル、停止コドンが挙げられる。
【００２８】
ベクターは選択マーカーを含むことができる。当業界で知られているとおり、「選択マーカー」もしくはその等価物は該遺伝子を含んでいる細胞を選択することを可能にする遺伝子を意味する。「正の選択」とは、正の選択マーカーを含んでいる細胞のみが、正の選択作用物に対して暴露された上で生存するか、またはマークされるプロセスを意味する。例えば、薬剤耐性は一般的な正の選択マーカーである；正の選択マーカーを含んでいる細胞は選択薬剤を含んでいる培地中で生存し、耐性遺伝子を含んでいない細胞は死滅するだろう。
【００２９】
好適な薬剤耐性遺伝子としては、ｎｅｏ（これはＧ４１８に対する耐性を付与する）、またはｈｙｇｒ（これはハイグロマイシンに対する耐性を付与する）、またはｐｕｒｏ（これはピューロマイシンに対する耐性を付与する）が挙げられる。その他の正の選択マーカー遺伝子としては、細胞のソーティングまたはスクリーニングを可能にする遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子としては、特に蛍光タンパク質の遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、およびＣＤ８などの表面マーカーが挙げられる。
【００３０】
本発明に含まれるベクターは、負の選択マーカーを含むことができる。「負の選択」とは、負の選択マーカーを含んでいる細胞が、負の選択マーカーを含んでいる細胞を殺滅する適切な負の選択作用物に対して暴露されると死滅するプロセスを意味する。例えば、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子を含んでいる細胞は薬剤ガンシクロビル（ＧＡＮＣ）に対して感受性である。同様に、ｇｐｔ遺伝子は細胞を６−チオキサンチンに対して感受性にする。
【００３１】
本発明に含まれるベクターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）もしくはウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）などのウイルスベクターに基づいたものであり、それらは染色体外エレメントとして複製する能力を有している（「真核生物ウイルスベクター（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ）」， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｇｌｕｚｍａｎ編， １９８２； Ｓａｒｖｅｒら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １：４８６（１９８１））。ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、レオウイルス、レンチウイルス、ロタウイルスのゲノムなどで、粘膜細胞中でのポリヌクレオチドまたはトランスジーンの導入および直接的発現のために改変されたものが挙げられる（Ｃｏｎｅら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：６３４９（１９８４））。
【００３２】
「発現制御エレメント」には、機能しうる形で連結された核酸の発現に影響を及ぼすプロモーターおよびエンハンサーなどのポリヌクレオチドが含まれる。発現制御エレメントおよびプロモーターには、特定の組織もしくは細胞型中で活性のあるものが含まれ、それらは本明細書では「組織特異的発現制御エレメント／プロモーター」と呼ぶ。組織特異的発現制御エレメントは典型的には、特定の細胞または組織型に特有の転写アクチベータータンパク質、またはその他の転写調節因子によって認識されるので、特定の細胞または組織で活性である。
【００３３】
組織特異的プロモーターの特定のクラスは「腸管内分泌細胞特異的プロモーター」であり、これらは腸管の内分泌細胞中で、機能しうる形で連結された核酸の発現を駆動する。ＧＩＰプロモーターは腸内分泌細胞プロモーターの具体例である。ＧＩＰプロモーターには、消化管での特異的発現をもたらす複数の調節配列が含まれている（Ｔｓｅｎｇ， Ｃ．Ｃ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１９９２（１９９３）； Ｙｅｎｇ， Ｃ．Ｍ．ら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １５４：１６１（１９９９））。長さ約２．５Ｋｂ（−１〜約−２５００ｂｐ）のサイズのＧＩＰプロモーターは、トランスジーンの発現を胃および十二指腸にターゲティングした（図９および１０）。より短いＧＩＰプロモーター（−１〜約−１２００ｂｐ）は胃でのトランスジーンの発現に寄与するが、十二指腸では寄与せず、トランスジーンの発現を膵臓にターゲティングしなかった（Ｙｅｎｇ， Ｃ．Ｍ．ら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １５４：１６１（１９９９））。従って、−１２００〜−２５００ｂｐの間の調節配列は、トランスジーンの発現を腸内のＧＩＰ産生細胞にターゲティングするために必要なものと考えられる。
【００３４】
ＧＩＰプロモーター内の転写エレメントの特徴を調べたところ、２つのＴＡＴＡボックス（−２７〜−２３、および−１１５〜−１１１）および２つのＣＣＡＡＴ様ボックス（−１５８〜−１５４、および−１７０〜−１６７）、潜在的なＡＰ−１およびＡＰ−２部位、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、ならびに転写開始部位と推定される位置の上流にある潜在的なインスリン応答エレメント（ＩＲＥ）が見出された。２つのＧＡＴＡ結合モチーフと推定されるものもＧＩＰプロモーター中に同定されたが（−１７８〜−１７２（近位ＧＡＴＡ）；ＣＡＧＡＴＡＣ、および−１９０〜−１８４（遠位ＧＡＴＡ）；ＣＡＧＡＴＡＡ）、これらはコンセンサスＧＡＴＡ結合モチーフ配列である、（Ａ／Ｔ）ＧＡＴＡ（Ａ／Ｇ）に一致する。ＧＩＰプロモーターの遠位および近位ＧＡＴＡモチーフでの特異的突然変異は、ルシフェラーゼリポーターの発現で調べるとそれぞれ約９０％および３５％のＧＩＰプロモーター活性の低減をもたらした（Ｂｏｙｌａｎら， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７３：１７４３８（１９９７））。しかし、ＧＡＴＡモチーフを双方とも突然変異させたＧＩＰプロモーターは、遠位ＧＡＴＡモチーフのみを変えたプロモーターと同じ挙動を示した。このように、１個以上の上述のヌクレオチド配列もしくは変異体を含んでいるＧＩＰプロモーターは、機能しうる形で連結された核酸のグルコースで調節可能な発現、または組織特異的（腸管）発現を保持することができる部分配列の１例である。このような部分配列および変異体は、機能しうる形で連結された核酸のｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏでのグルコースで調節可能な発現または細胞特異的発現をもたらすために用いることができる。
【００３５】
組織特異的制御エレメントのさらなる例としては、プログルカゴン遺伝子のプロモーターがある。ＧＩＰプロモーターと同様に、プログルカゴンプロモーターは消化管もしくは脳および膵臓のいずれかでの発現をもたらす複数の制御配列を有する（Ｌｅｅ， Ｙ．Ｃ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１０７０５（１９９２）； ＧａｊｉｃおよびＤｒｕｃｋｅｒ， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３２：１０５５（１９９３））。１３００ｂｐ部分の上流ラットプログルカゴンプロモーター配列は、トランスジーンの脳および膵臓中での発現をターゲティングしたものであったが、消化管にはターゲティングしなかった（Ｅｆｒａｔ， Ｓ．ら， Ｎｅｕｒｏｎ １：６０５（１９８８））。より長いプログルカゴン遺伝子プロモーター（−１〜約−２０００ｂｐ）は脳および膵臓に加えて、腸内でのトランスジーンの発現を指令するものであった（Ｌｅｅ， Ｙ．Ｃ．ら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１０７０５（１９９２））。このように、腸管での発現に寄与する部分はプログルカゴン遺伝子の上流の１３００〜２０００ｂｐとの間に位置するプロモーターの７００ｂｐの領域内にあるものと考えられる。
【００３６】
対象の核酸の発現を腸管の内分泌細胞にターゲティングするために用いうる、付加的な組織特異的発現制御エレメントを表１に挙げる。これらのプロモーターの多くは、栄養素で調節可能なエレメントでもある。例えば、ＧＩＰプロモーターには、機能しうる形で連結された核酸が、栄養素に応答して発現を行えるようにする複数の調節配列が含まれている。
【００３７】
このリストは、腸管の内分泌細胞中での遺伝子の発現を駆動するために有用な発現制御エレメントとなりうるもの全てを完全に挙げることを意図したものではなく、単に例示したものである。
【００３８】
組織特異的発現制御エレメントは他の組織で活性である可能性もあり、例えば腸管特異的発現制御エレメントは非腸管組織でも活性である可能性もあるが、発現は腸管組織内に比べて著しく低い（例えば、非腸管組織では腸管組織における発現に比べて６分の１〜１０分の１である）。ベクターの腸管組織へターゲティングした送達は、体内の他の場所（例えば、ターゲティングされていない組織）での発現の可能性を制限することができる。従って、本明細書に含まれる組織特異的エレメントには発現の完全な組織特異性を持つことは必要でない。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
付加的な発現制御エレメントは、調節可能な、すなわち、シグナルもしくは刺激を与えることで機能しうる形で連結された核酸の発現を増加もしくは減少させる様式で発現をもたらすことができる。機能しうる形で連結された核酸の発現をシグナルもしくは刺激に応答して増加させる調節可能なエレメントは「誘導可能なエレメント」とも呼ばれる（すなわち、シグナル、例えば栄養素によって誘導される）。機能しうる形で連結された核酸の発現をシグナルもしくは刺激に応答して減少させる調節可能なエレメントは「抑制可能なエレメント」とも呼ばれる（すなわち、シグナルは発現を減少させるが、それはそのシグナルが取り除かれるかもしくはシグナルがない場合に発現が増加することとなる）。典型的には、そのようなエレメントによってもたらされる増加もしくは減少の量は、存在するシグナルもしくは刺激の量に比例する：シグナルもしくは刺激の量が大きくなれば、発現の増加もしくは減少が大きくなる。
【００４１】
調節可能な発現制御エレメントの特定の例は、栄養素の存在に応答して、もしくは栄養素の除去に応答して機能しうる形で連結された核酸の発現を増加もしくは減少させるエレメントであり、その場合にはこのエレメントは「栄養素で調節可能なエレメント」と呼ばれる。栄養素で誘導可能な、もしくは抑制可能なエレメントは通常では転写の基底レベル（すなわち刺激もしくはシグナルの不在下での発現レベル）を提供する。典型的には、転写の基底レベルは抑制可能なエレメントでは誘導可能なエレメントより高い。
【００４２】
本明細書で用いる「栄養素」という用語は、任意の摂取可能な、もしくは消費可能な物質、例えば食料もしくは飲料中に存在するものを意味する。多数の、おそらくは何十億もの様々な有機および無機物質が食料または飲料には存在するので、本明細書ではこの用語は広義に用いられる。栄養素の特定の例としては糖（例えば、グルコース、ラクトース、ショ糖、フルクトース、マンノースなど）、炭水化物、デンプン、脂肪（飽和もしくは不飽和）、脂質、脂肪酸、トリグリセリド、ポリペプチド、アミノ酸、セルロース、ホルモン、ビタミン、およびミネラルが挙げられる。
【００４３】
栄養素はタンパク質の翻訳または安定性をモジュレートすることもできる。従って、「栄養素で調節可能な」とはその栄養素が転写、その転写産物のタンパク質への翻訳、またはそのタンパク質の安定性をモジュレートするような状況を含み、そのことによって転写産物またはタンパク質の量を増加もしくは減少させる。
【００４４】
発現制御エレメントは「構成的」であることができ、そうすることによって機能しうる形で連結された核酸の転写がシグナルもしくは刺激の存在なしで起こる。さらに、発現制御エレメントにはまた、細胞周期または細胞分化の特定の段階での発現をもたらすエレメントが含まれる。従って、本発明はさらに、構成的、調節可能な（例えば栄養素で調節可能な）、組織特異的、細胞周期特異的、および分化段階特異的な発現をもたらす発現制御エレメントを含む。
【００４５】
発現制御エレメントには、天然のプロモーターおよびエンハンサーエレメントなどの全長配列、ならびに全長のもしくは非変異体の機能の全てもしくは一部分を保持している（例えば、栄養素で調節または細胞特異的発現のいくらかの量を保持している）部分配列またはポリヌクレオチド変異体が含まれる。本明細書で用いる「機能的」という用語およびその文法的に変えた用語は、核酸もしくはポリペプチド配列、部分配列もしくは断片、または、ヌクレオチドもしくはアミノ酸配列変異体に関して用いられる場合には、配列が天然の核酸もしくはポリペプチド配列（例えば、非変異配列もしくは非修飾配列）の機能の１つ以上を有していることを意味する。本明細書で用いる「変異体」という用語は、配列（ヌクレオチドもしくはアミノ酸）置換（例えば、点突然変異）、欠失（内部もしくは外部）、または付加（例えば、キメラポリペプチド）、あるいはその他の点突然変異による改変（例えば、プロテアーゼもしくはヌクレアーゼに耐性の改変型などの化学的誘導体）を意味する。典型的には、アミノ酸変異体は、１つ以上の保存的アミノ酸置換、もしくは変異体中に保持されることが望ましい機能性（例えば、インスリンについてはグルコース低下機能）にとってきわめて重要なドメインの外部の非保存的アミノ酸置換などの、２、３個のもしくは数個のアミノ酸の変化（例えば、１〜１０個、１０〜２０個、２０〜５０個）を有する。
【００４６】
栄養素で調節可能なエレメントなどの発現制御エレメントはまた、機能的変異体、または部分配列をも含む。例えば、グルコースで調節可能な約２．５Ｋｂ ＧＩＰプロモーターの部分配列（例えば、２Ｋｂ、１Ｋｂ、０．５Ｋｂ、０．２５Ｋｂ、０．２０Ｋｂ、１００ｂｐもしくはそれ未満）は、機能しうる形で連結された核酸の、グルコースで調節可能な、または組織特異的な（腸管または膵臓または脳での）発現を保持することができる。既知の特性を有している種々のプロモーターの機能的ドメインは、機能しうる形で連結された核酸の発現の量とパターンを最適化するために配置することができる。
【００４７】
本明細書に含まれる発現制御エレメントは、それらのエレメントが機能しうる形で連結された核酸の発現制御をもたらすように機能するものである限りは、細菌、酵母、植物または動物（哺乳類または非哺乳類）に由来するものであることができる。従って、任意の生物に由来する、ある物質もしくは刺激（例えば、栄養素）によって誘導される任意の発現制御エレメントを用いて、粘膜細胞中での機能しうる形で連結された核酸の転写を、また適切であれば、本明細書で述べたとおり、物質もしくは刺激に応答してコードされたタンパク質の翻訳をモジュレートすることができる。
【００４８】
栄養素で調節可能な発現制御エレメントは、例えば、解糖、脂質代謝、炭水化物代謝、およびコレステロール（例えば、ステロイド）代謝に関与する酵素の発現を調節するプロモーターとして存在し、それらはそれぞれ糖、脂肪、炭水化物、およびコレステロールでモジュレートされるものであり、本発明に適用できる。栄養素で調節可能な制御エレメントの特定の例としては、Ｌ−ピルビン酸キナーゼ、アセチル−ＣｏＡ−カルボキシラーゼ、ｓｐｏｔ−１４、脂肪酸シンターゼ、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、ホスホ−エノール−ピルビン酸カルボキシキナーゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、およびホスホフルクトキナーゼの発現を駆動する、グルコースで誘導可能なエレメントがある（また、例えば、Ｒｕｔｔｅｒ， ＧＡら， Ｎｅｗｓ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｓｃｉ． １５：１４９（２０００）を参照されたい）。栄養素で調節可能な制御エレメントの別の１例としては、アルコール−デヒドロゲナーゼ遺伝子調節エレメントがある。栄養素で調節可能な制御エレメントのまた別の例としては、ビタミンＤ応答エレメントがあり、これはビタミンＤの存在下での発現をもたらす。哺乳類メタロチオネイン遺伝子プロモーターは金属によって誘導可能な発現制御エレメントである。組織特異的制御エレメントと同様に、栄養素で調節可能な制御エレメントは複数の栄養素に対して応答することができる。例えば、グルコースで誘導可能なエレメントはラクトースに対しても応答することができる。従って、特定の栄養素（例えばグルコース）は、他の栄養素がその制御エレメントの活性を、程度はより低いものの、モジュレートすることができる（増加または減少）点で、他の栄養素を排他するものであることを意味しない。
【００４９】
細菌性の栄養素で調節可能な発現制御エレメントの例としては、ｌａｃリプレッサーがあり、これはβ−ガラクトシドで誘導可能である。酵母の栄養素で調節可能な発現制御エレメントの例としては、ＧＡＬ１およびＧＡＬ１０遺伝子中に存在するｇａｌプロモーターがあり、これはガラクトースで誘導可能な発現をもたらす。これらのエレメントは、ある核酸に機能しうる形で連結され、粘膜細胞に導入されることで、そのコードされたタンパク質の栄養素で調節可能な産生をもたらすことができる。
【００５０】
含まれるさらなる発現制御エレメントとしては、非栄養素に対して応答性のものがある。特定の例としては、経口的に活性があるが、通常は食品中には見出せない化学物質もしくは薬剤がある。非栄養素薬剤もしくは化学物質は消費されると、非栄養素発現制御エレメントと機能しうる形で連結された核酸の発現を刺激する。特定の量の薬剤もしくは化学物質を摂取することにより、産生される（転写もしくは分泌を介して）核酸もしくはタンパク質の量の制御が提供される。例えば、薬剤で誘導可能な発現制御エレメントがインスリンをコードする核酸の発現をもたらす場合では、薬剤の消費量を増加させることによってより多い量のインスリンを腸管内で産生させることができる。そのような非栄養素発現制御系の特定の例については、例えば、米国特許第５，９８９，９１０号、第５，９３５，９３４号、第６，０１５，７０９号、および第６，００４，９４１号中に見出すことができる。
【００５１】
本明細書で用いる「機能しうる形での連結」という用語およびそれの文法的に変化した用語は、構成成分が意図した様式で機能することができることを説明したその構成成分の物理的もしくは機能的並置を意味する。ある核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントの例においては、その関係はその制御エレメントがその核酸の発現をモジュレートすることとなるものである。
【００５２】
発現制御は、転写、翻訳、スプライシング、メッセージの安定性などのレベルで達成することができる。典型的には、転写をモジュレートする発現制御エレメントは転写される核酸の５’末端の近傍（すなわち「上流」）に並置される。発現制御エレメントはまた、転写される配列の３’末端（すなわち「下流」）もしくはその転写産物中（例えばイントロン中）に位置させることもできる。発現制御エレメントは転写される配列からある距離をおいて離れたところに（例えば、その核酸から、１００〜５００、５００〜１０００、２０００〜５０００、もしくはそれ以上のヌクレオチド）位置させることができる。機能しうる形で連結された核酸の発現は少なくとも部分的にはそのエレメント（例えばプロモーター）によって制御可能で、それによってそのエレメントはその核酸の転写を、および適切であれば、その転写産物の翻訳をモジュレートする。発現制御エレメントの具体例は、プロモーターであり、通常は転写される配列の５’の位置に置かれる。発現制御エレメントの別の１例としてはエンハンサーがあり、転写される配列の５’、３’に位置させることができ、または転写される配列内に位置させることができる。
【００５３】
本明細書で用いる「産生する」もしくは「産生」という用語は、粘膜細胞または組織で発現されるタンパク質に関連して用いられる場合には、粘膜細胞によるそのタンパク質の発現または分泌のいずれかを意味する。従って、粘膜細胞が栄養素などのシグナルまたは刺激に応答してタンパク質を産生する場合には、そのタンパク質の発現または分泌はそのシグナルまたは刺激が与えられる前の量よりも増加する。粘膜細胞または組織によるタンパク質の産生はおそらく核酸の転写の増加、その転写産物の翻訳、転写産物もしくはタンパク質の安定性、またはコードされたタンパク質の分泌の増加によるものであろう。典型的には、シグナルまたは刺激（すなわち、分泌促進物質）によって増加した、細胞によるタンパク質の分泌によって、その細胞中で既に翻訳されたタンパク質の放出が刺激される。分泌が調節されているタンパク質は、典型的には内分泌細胞内部の分泌小胞中に貯蔵される。
【００５４】
あるいは、タンパク質をコードする核酸の転写または翻訳および続く翻訳されたタンパク質の分泌は、シグナルまたは刺激によって増加させることができる。従って、非内分泌細胞の例では、シグナルまたは刺激（例えば栄養素）は、栄養素で誘導可能な発現制御エレメントを介してタンパク質（例えばインスリン）をコードする核酸の転写を刺激することができ、その後その細胞はその翻訳後にコードされたタンパク質を分泌するであろう。腸管の内分泌細胞（例えば、Ｋ細胞、Ｌ細胞など）などの内分泌細胞の例では、タンパク質の発現をもたらすために用いられる発現制御エレメントは調節可能でもそうでなくともよいが、どちらの場合でもシグナルまたは刺激は典型的には細胞からのタンパク質の分泌を調節するだろう。この場合には、シグナルまたは刺激はタンパク質の分泌を刺激または増加させる分泌促進物質として機能する。従って、内分泌細胞においては、発現が栄養素で調節可能なものであってもそうでなくとも（例えば、構成的プロモーター）、そのタンパク質の分泌が栄養素によってモジュレートされるので、その細胞によるタンパク質の産生は栄養素で調節可能なものである。従って、また「栄養素で調節可能な」とは、細胞からのタンパク質の栄養素でモジュレートする分泌を意味する。
【００５５】
シグナルまたは刺激に応答した内分泌細胞によるタンパク質の分泌の増加は、非内分泌細胞におけるように、そのタンパク質をコードする核酸の転写を増加させてその後の分泌を増加させることによって産生されるタンパク質の増加に比べて、シグナルまたは刺激に対してより迅速な応答を提供する。これに対して、非内分泌細胞では、栄養素などのシグナルまたは刺激はタンパク質をコードする核酸の転写を増加させることができ、その後その翻訳されたタンパク質はシグナルまたは刺激（例えば栄養素）を必要とせずに細胞によって分泌される。従って、栄養素で調節可能なトランスジーンを用いて形質転換された非内分泌粘膜細胞では、トランスジーンの転写は栄養素で誘導可能であろうが、分泌にはその栄養素は必要としない。
【００５６】
核酸は、インスリン、グルカゴンアンタゴニスト、レプチン、ＧＬＰ−１、またはコレシストキニンなどの治療用ポリペプチドをコードすることができる。例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでグルコース低下活性をいくらかは保持し、正常なグルコースホメオスタシスを提供し、または慢性もしくは急性高血糖に伴う組織病理学的状態を低減させる、全長インスリンの部分配列は、それの全長対応物の１つ以上の活性を有する機能的部分配列のほんの１例である。同様にして、食欲を抑制し、または体重の安定化もしくは体重減少を誘導し、成長を刺激し、凝固時間もしくは出血エピソードを低減し、または外来性抗原（例えば、ヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈ． ｐｙｌｏｒｉ））に対する受動的保護を提供する、能力を全てもしくはいくらか保持している、レプチン、またはＣＣＫ、または成長ホルモン、または凝固因子、または抗体の部分配列もしくは変異体は、治療的利益を提供するために動物の粘膜組織中で発現させることができる、機能的配列または変異体のさらなる例である。
【００５７】
従って、「核酸」によってコードされる「ポリペプチド」、「タンパク質」、および「ペプチド」には、天然のタンパク質と同様の全長天然配列、ならびに機能的部分配列、改変した形態、または配列変異体（その部分配列、改変した形態または変異体は、天然の全長タンパク質の機能性がある程度保持されているものに限る）が含まれる。
【００５８】
本明細書で用いる「トランスジーン」という用語は、技術によって細胞または生物中に導入されるポリヌクレオチドを意味する。例えば、トランスジーンを有している粘膜細胞はトランスジーンを細胞の遺伝子操作または「形質転換」によって導入されたものである。トランスジーンが導入された細胞またはその子孫は「形質転換された細胞」または「形質転換体」と呼ばれる。典型的には、そのトランスジーンは形質転換体の子孫中に含まれるか、またはその細胞から発生した生物の一部となる。トランスジーンを染色体ＤＮＡ中に挿入するか、または自己複製プラスミド、ＹＡＣ、ミニクロモソームなどとして維持することができる。
【００５９】
トランスジーンにはアンチセンスに転写されるか、またはポリペプチドをコードするいかなる遺伝子も含まれる。トランスジーンによってコードされる特定のポリペプチドとしては、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ｉｎ ｖｉｖｏでの非侵襲性の検出のため）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃｈｌｏｒａｍｐｅｎｉｃｏｌａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）などの検出可能なタンパク質、または検出可能であるタンパク質（例えば免疫学的に検出可能である）が挙げられる。検出可能なタンパク質は、細胞の形質転換の効率（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子導入における）、例えば細胞の生存または増殖によって測定される細胞の埋め込みの成功（例えば、形質転換された細胞の動物粘膜への埋め込み後の）を評価するために有用である。
【００６０】
治療用タンパク質としては、インスリンが挙げられ、特定のトランスジーンは糖尿病などの高血糖状態を治療するために有用である。インスリンはグルコース代謝の主要なホルモン性モジュレーターであり、グルコースの血液から筋肉、肝臓、脂肪などの主要代謝器官への輸送を容易にする。実施例ＩＩＩに示すとおり、トランスジェニックマウスの腸管における、インスリントランスジーンによるインスリンの産生は、マウスにおいて糖尿病を防止する。インスリンは耐糖能を回復させるために十分な量で産生され、インスリン放出のタイミングは正常なグルコースホメオスタシスを回復させる。
【００６１】
高血糖状態を治療するための治療用タンパク質をコードするトランスジーンの別の１例としては、グルカゴンアンタゴニストがある。グルカゴンはランゲルハンス島のα−細胞によって産生されるペプチドホルモンで、グルコース代謝の主要な調節因子である（Ｕｎｇｅｒ， Ｒ．Ｈ．およびＯｒｃｉ， Ｌ． Ｎ．， Ｅｎｇ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３０４：１５１８（１９８１）： Ｕｎｇｅｒ， Ｒ．Ｈ．， Ｄｉａｂｅｔｅｓ ２５：１３６（１９７６））。インスリンの場合と同様に、血糖濃度はグルカゴンの分泌に介在する。しかし、インスリンとは異なりグルカゴンは血中のグルコースの減少に応答して分泌される。従って、グルカゴンの循環濃度は絶食期間中に最高となり、食事中には最低となる。グルカゴンレベルが増加するとインスリンがグルコース貯蔵を促進することを低減させ、肝臓を刺激してグルコースを血液中に放出させる。グルカゴンアンタゴニストの具体例としては、［ｄｅｓ−Ｈｉｓ１， ｄｅｓ−Ｐｈｅ６， Ｇｌｕ９］ グルカゴン−ＮＨ２が挙げられる。ストレプトゾトシン糖尿病ラットでは、血糖レベルはこのグルカゴンアンタゴニストの静脈内ボーラス（０．７５μｇ／ｇ体重）後１５分以内に約３７％低下した（Ｖａｎ Ｔｉｎｅ， Ｂ．Ａ．ら， Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３７：３３１６（１９９６））。
【００６２】
高血糖状態または望ましくない体重（例えば肥満）を治療するための治療用タンパク質をコードするトランスジーンの別の１例としては、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）が挙げられる。ＧＬＰ−１は食事中に腸のＬ細胞から放出されるホルモンで、膵臓のβ−細胞を刺激してインスリン分泌を増加させる。ＧＬＰ−１は、それを肥満および糖尿病を治療するための魅力的な治療剤とする、付加的な活性を有している。例えば、ＧＬＰ−１は胃内容排出（ｇａｓｔｒｉｃ ｅｍｐｔｙｉｎｇ）を低減し、食欲を抑制し、グルカゴン濃度を低減させ、β−細胞質量を増加させ、インスリン生合成および分泌をグルコース依存的に刺激し、インスリンに対する組織の感受性を増大させると考えられる（Ｋｉｅｆｆｅｒ， Ｔ．Ｊ．， Ｈａｂｅｎｅｒ， Ｊ．Ｆ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎ． Ｒｅｖ． ２０：８７６（２０００））。従って、食事と同時に起こる腸管内でのＧＬＰ−１の調節された放出によって高血糖状態または望ましくない体重に対しての治療的利益を提供することができる。
【００６３】
ジペプチジルペプチダーゼ（ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ ｐｅｐｔｉｄａｔｅ）ＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）に耐性のＧＬＰ−１類似体はより長い作用持続時間と改善された治療的価値を提供する。従って、作用持続時間を延長するＧＬＰ−１類似体をコードするトランスジーンを、本明細書に記載の本発明を用いて腸管にターゲティングすることで、高血糖状態または望ましくない体重を治療するための、ＧＬＰ−１類似体の栄養素で調節される産生を提供することができる。
【００６４】
高血糖状態を治療するための治療用タンパク質をコードするトランスジーンの別の１例としては、ホルモンレジスチン（ｒｅｓｉｓｔｉｎ）に対するアンタゴニストが挙げられる。レジスチンは脂肪細胞由来の因子で、その発現は、食事で誘導される肥満および遺伝的肥満では上昇する。肥満マウスにおいて循環レジスチンを中和すると、血糖およびインスリンの作用が改善される。逆に、正常マウスにレジスチンを投与すると耐糖能およびインスリンの作用が悪化する（Ｓｔｅｐｐａｎ， ＣＭら， Ｎａｔｕｒｅ ４０９：３０７（２００１））。従って、腸管内でレジスチンの生物学的効果と拮抗するタンパク質の産生は、肥満に伴うインスリン耐性および高血糖状態に対する効果的な治療を提供することができる。
【００６５】
望ましくない体重（例えば、肥満）または高血糖状態を治療するための治療用タンパク質をコードするトランスジーンのさらに別の１例としてはレプチンが挙げられる。レプチンは主として脂肪細胞で産生されるが、また少量ではあるが胃の中でも食事依存的に産生される。レプチンは脂肪細胞代謝および体重についての情報を脳の食欲中枢へとリプレーし、そこで脳は食物摂取を減らすシグナルを発し（満腹感を促進）、および体のエネルギー消費を増加させる。レプチンを１日１回皮下注射してもヒトでは体重減少に適度な効果しか示さなかったが、レプチンによる治療はげっ歯類では脂肪量の大きな減少ならびに血糖の低下をもたらす（Ｓｅｕｆｅｒｔ， Ｊ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ９６：６７４（１９９９））。以前の研究では、レプチンが血液循環において急速に分解されることが示されている。従って、調節された様式での腸管からの送達は、食物摂取と体重、ならびに血糖を減少させるレプチンの臨床的利益を高めることとなろう。
【００６６】
望ましくない体重（例えば、肥満）または高血糖状態を治療するための治療用タンパク質をコードするトランスジーンのさらに別の１例としては、脂肪細胞補体関連タンパク質（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ：Ａｃｒｐ３０）のＣ末端の球状ヘッドドメイン（ｇｌｏｂｕｌａｒ ｈｅａｄ ｄｏｍａｉｎ）が挙げられる。Ａｃｒｐ３０は分化した脂肪細胞によって産生されるタンパク質である。球状ヘッドドメインからなるＡｃｒｐ３０のタンパク質分解産物のマウスへの投与によって顕著な体重減少がもたらされる（Ｆｒｕｅｂｉｓ， Ｊ．ら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９８：２００５（２００１））。従って、Ａｃｒｐ３０の球状ドメインをコードするトランスジーンの発現を腸管にターゲティングすることにより、体重減少を促進することができる。
【００６７】
望ましくない体重（例えば、肥満）を治療するための治療用タンパク質をコードするトランスジーンのまた別の１例としては、コレシストキニン（ＣＣＫ）が挙げられる。ＣＣＫは腸管において特定の栄養素に応答して腸から分泌される消化管ペプチドである。ＣＣＫの放出は消費した食物の量に比例しており、脳に対して食事を終わらせるようにシグナルを送ると考えられている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ， Ｍ．Ｗ．ら， Ｎａｔｕｒｅ ４０４：６６１−７１（２０００））。この結果、ＣＣＫの上昇は食事の量を減少させ、体重減少もしくは体重の安定化を促進することができる（すなわち、体重増加を防止または阻害する）。従って、栄養素で調節されるＣＣＫの送達系は、ヒトにおける食物摂取の低減目的に対して治療的利益を提供することができる。
【００６８】
治療用タンパク質をコードするトランスジーンのさらなる例としては、血友病およびその他の凝固（ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ／ｃｌｏｔｔｉｎｇ）障害の治療のための凝固因子（例えば第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子または第Ｘ因子）；成長障害または消耗症候群の治療のための成長因子（例えば、成長ホルモン、インスリン様成長因子−１、血小板由来成長因子、上皮成長因子、酸性および塩基性線維芽細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子−βなど）；ならびに外来抗原もしくは病原体（例えば、ヘリコバクターピロリ菌（Ｈ．Ｐｙｌｏｒｉ））に対する被験体の受動免疫もしくは保護を提供するため、または癌、関節炎もしくは心臓血管疾患の治療を提供するための抗体（例えば、ヒトもしくはヒト化抗体）が挙げられる。
【００６９】
治療用タンパク質をコードするさらなるトランスジーンとしては、サイトカイン、インターフェロン（例えば、インターフェロン（ＩＮＦ）、ＩＮＦ−α２ｂおよび２ａ、ＩＮＦ−αＮ１、ＩＮＦ−β１ｂ、ＩＮＦ−γ）、インターロイキン（例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１０）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）、ケモカイン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ポリペプチドホルモン、抗微生物ポリペプチド（例えば、抗細菌、抗真菌、抗ウイルス、および／もしくは抗寄生虫ポリペプチド）、酵素（例えばアデノシンデアミナーゼ）、ゴナドトロピン、ケモタクチン（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｎ）、脂質結合タンパク質、フィルガスチム（ニューポジェン（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ））、ヘモグロビン、エリスロポエチン、インスリノトロピン（ｉｎｓｕｌｉｎｏｔｒｏｐｉｎ）、イミグルセラーゼ（ｉｍｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、サルブラモスチム（ｓａｒｂｒａｍｏｓｔｉｍ）、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、神経成長因子（ＮＧＦ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、アデノシンデアミダーゼ、カタラーゼ、カルシトニン、エンドセリン（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ）、Ｌ−アスパラギナーゼ、ペプシン、ウリカーゼ、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カルボキシペプチダーゼ、ラクターゼ、スクラーゼ固有因子、カルシトニン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）様、ホルモン、可溶性ＣＤ４、ならびに抗体および／もしくはそれらの抗原結合フラグメント（例えばＦａｂ）（例えば、オルソクローンＯＫＴ−ｅ（抗ＣＤ３）、ＧＰＩＩｂ／ＩＩａモノクローナル抗体）が挙げられる。
【００７０】
本明細書に記載のトランスジーンは本発明の特定の適用についてのものであるが、それに限定することは意図していない。この点において、当業者であれば、治療用のアンチセンスへと転写されるさらなるトランスジーンまたは治療用ポリペプチドをコードするさらなるトランスジーンを容易に想像することができよう。
【００７１】
標的細胞としては、粘膜細胞、または通常は粘膜に存在しないが粘膜で増殖するように適応することができる、もしくは適応させた細胞が挙げられる。本明細書で用いる、「粘膜」または「粘膜の」という用語は、細胞に関して用いられている場合には、粘膜中で増殖することのできる細胞を意味する。粘膜細胞としては、例えば、動物の粘膜中に通常認められる細胞、例えば腸管（例えば口腔（舌および頬側組織）、食道、および胃、小腸および大腸、直腸、肛門）、気道、肺および鼻咽腔ならびにその他の腔（例えば、膣）の細胞が挙げられる。従って、粘膜細胞とは上述の領域に通常生息している種々の細胞型を意味し、それらには分化して種々の粘膜細胞型となる幹細胞、またはその他の多能性もしくは分化多能性細胞が含まれる。粘膜細胞の特定の例としては、内分泌細胞、例えば、Ｋ細胞、Ｌ細胞、Ｓ細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、Ｉ細胞、Ｍｏ細胞、Ｇｒ細胞、および腸−内分泌細胞（ｅｎｔｅｒｏ−ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ ｃｅｌｌ）が挙げられる。内分泌細胞は一般的には、シグナルまたは刺激（「分泌促進物質」）に応答して合成されたタンパク質を血中に分泌する能力によって特徴づけられる。非内分泌粘膜細胞としては、大多数の粘膜組織の外側表面に整列している上皮細胞、粘液細胞、絨毛細胞、円柱細胞、間質細胞、およびパネト細胞が挙げられる。非内分泌細胞は一般的にはシグナルまたは刺激に応答して血中に合成タンパク質を分泌することが知られていない。
【００７２】
腸管のＫ細胞が動物において適切に調節された生理学的レベルのインスリンを産生するための代理の細胞として機能することができるという知見は、被験体をインスリン注射から解放し、関連する衰弱性の合併症を低減または排除さえもする、糖尿病の治療方法を暗示している。ヒトの腸管にはおそらく莫大な数のＫ細胞が存在しているので（Ｓａｎｄｓｔｒｏｍ， Ｏ．， Ｅｌ−Ｓａｌｈｙ， Ｍ．， Ｍｅｃｈ． Ａｇｅｉｎｇ Ｄｅｖ． １０８：３９（１９９９））、これらの細胞のうちの一部からの調節されたインスリンの分泌は、治療的利益（糖尿病に伴う症状および合併症の軽減を含む）を達成するためには十分であろう。
【００７３】
腸管は体内で最も大きな内分泌器官で多量のタンパク質を産生することができ、急速に更新が行われている組織（ここでは分裂細胞が近付きやすい）を含んでいる。Ｋ細胞および幹細胞などの標的細胞は主として上部腸管に位置し、そこは非侵襲的遺伝子治療法で容易に接近可能である。従って、経口製剤、内視鏡による方法、もしくは栄養チューブを改変したものなどの非侵襲的技法によって、宿主ゲノム中へのトランスジーンの組み込みを容易にするベクターの配置が可能となる。幹細胞を含む腸管の細胞へ遺伝子を送達するベクターは既に開発されている（Ｃｒｏｙｌｅら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：６４５（１９９８）； Ｓ．Ｊ．Ｈｅｎｎｉｎｇ， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ． Ｒｅｖ． １７：３４１（１９９７）； 米国特許第５，８２１，２３５号および第６，１１０，４５６号）。これらのベクターの多くはヒトでの研究に対して承認されている。従って、特にインスリン、レプチン、グルカゴンアンタゴニスト、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、グレリン、コレシストキニン、成長ホルモン、凝固因子、抗体などのタンパク質を調節可能な様式で分泌する、Ｋ細胞などの腸管細胞は、粘膜組織でタンパク質を産生させることによって治療可能な糖尿病、肥満、発育不全、およびその他の障害を治療するための１手段である。
【００７４】
数種の型の腸管の内分泌細胞、それらの細胞が特定の栄養素（分泌促進物質）に応答して分泌するタンパク質、および機能の例の部分的なリストを表２に示す。これらのタンパク質、内分泌細胞、および栄養素は全て本発明に適用しうるものである。
【００７５】
【表２】
2004500104.tif 000003
【００７６】
本明細書で用いる「培養された」という用語は、細胞に関連して用いられる場合には、細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖されることを意味する。そのような細胞の特定の例は、被験体から単離し、組織培養で増殖された、または増殖するように適応させた細胞である。別の１例としては、ｉｎ ｖｉｔｒｏで遺伝子操作され、同じもしくは異なる被験体に移植して戻された細胞である。「単離された」という用語は、細胞に関連して用いられる場合には、天然のｉｎ ｖｉｖｏ環境から分離された細胞を意味する。単離された細胞の１例は、ヒトなどの被験体から得られた粘膜細胞であろう。「培養された」および「単離された」細胞は、遺伝子での形質転換など人の手によって操作することができる。これらの用語には細胞の子孫のいかなるものも含まれ、それらには細胞分裂の際に生ずる突然変異によって親の細胞とは同一ではない可能性のある子孫の細胞も含まれる。これらの用語にはヒトの全体は含まれない。
【００７７】
標的粘膜細胞は、例えば腸管（例えば、腸）の粘膜組織もしくは器官などの被験体の粘膜組織もしくは器官中に存在しうる。従って、治療を行うために被験体の粘膜中にタンパク質を導入するための１方法は、タンパク質をコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含むポリヌクレオチドを被験体の粘膜に存在する細胞の細胞内に送達することである。あるいは、粘膜細胞は被験体の適切な組織から単離してトランスジーンでトランスフェクトし、被験体の組織（粘膜組織もしくはそれ以外の組織）中に導入（移植）することができる。従って治療を行うためにタンパク質を被験体に導入する別の１方法は、タンパク質をコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含むポリヌクレオチドを培養粘膜細胞中にトランスフェクトし、その後その形質転換された細胞またはその子孫を被験体へ埋め込むことである。
【００７８】
トランスジーンでトランスフェクトされた粘膜細胞としては、培養によって増殖する内分泌および非内分泌細胞系統を含む。例えば、ＳＴＣ−１またはＧＴＣ−１細胞などの腸管起源もしくは系統の形質転換された細胞は被験体の組織中に埋め込むことができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでトランスジーンを用いてトランスフェクトされる粘膜細胞としては、内分泌細胞（例えば、Ｋ細胞、Ｌ細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、Ｓ細胞、Ｉ細胞もしくはＭｏ細胞、Ｇｒ細胞）および非内分泌性の上皮、円柱、間質、絨毛、パネト、幹細胞、またはその他の動物の粘膜組織中に典型的に存在する細胞型が挙げられる。
【００７９】
標的細胞はまた、粘膜またはその他の組織中で増殖できるかまたは増殖するように適応させた（たとえ限られた時間、例えば数日間または数ヶ月間であっても）非粘膜細胞（内分泌または非内分泌性）とすることもできる。例えば、細胞を被験体の非粘膜組織から得て、トランスジーンまたはポリヌクレオチドで形質転換し、次いで転写されたアンチセンスまたはコードされたタンパク質が産生された場合に、治療が達成するように、被験体（同一もしくは異なる被験体）の組織中に移植することができる。あるいは、一次細胞単離物または確立された非粘膜細胞系統をトランスジーンまたはポリヌクレオチドを用いて形質転換し、次いで被験体の粘膜組織中に移植することもできる。
【００８０】
従って、本発明の単離されたまたは培養された粘膜細胞を産生するために、例えば、被験体の消化管の組織または器官から粘膜細胞を得ることができる。次いでその粘膜細胞を従来の核酸技法でトランスジーンを用いてトランスフェクトし、増殖することができる。例えば腸の幹細胞を単離して、次いでｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、トランスフェクトすることができる（Ｂｏｏｔｈ， Ｃ．ら， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２４１：３５９（１９９９）； Ｋａｗａｇｕｃｈｉ， Ａ．Ｌ．ら， Ｊ． Ｐｅｄｉａｔｒ． Ｓｕｒｇ． ３３：５５９（１９９８））。トランスジーンを含んでいるかまたは発現している細胞は、従来法、例えばサザンブロット、ノーザンブロットまたはウエスタンブロットを単独でまたは選択マーカーを用いる選択と組み合わせて用いて同定することができる。次いで形質転換された細胞は、それらの細胞を元々得た同一の被験体または異なる被験体の同一の組織または異なる組織中に再導入（移植／埋め込み）することができる。
【００８１】
所望により、標的粘膜内分泌細胞は複数のトランスジーン（すなわち、２個以上）を含むことができる。この方法では、その複数のトランスジーンによってコードされる異なるタンパク質の発現によって付加的もしくは相乗的な効果がもたらされ、それが今度はそれらのタンパク質のいずれか単独での発現よりも大きな治療上の有益性をもたらすことができる。さらに、２つのトランスジーンが異なる発現制御エレメントと連結されている場合、もしくは２つのコードされたポリペプチドの分泌が異なるシグナルもしくは刺激（例えば、２つの異なる栄養素）によって調節されている場合には、それらのタンパク質はお互いに独立にもしくは組み合わせて（異なる栄養素の双方が与えられた場合）産生することができる。例えば、２つのトランスジーン、一方はＧＬＰ−１をコードし、他方はインスリンをコードするものは、それらのタンパク質の産生が２つの異なるシグナル、例えばグルコースと薬剤などによってそれぞれ制御されるように構築することができる。グルコースはＧＬＰ−１の産生を刺激し（本明細書で論じてきたとおり、転写もしくは分泌のいずれかを刺激することによって）、一方その薬剤はインスリンの産生を刺激する（本明細書で論じてきたとおり、転写もしくは分泌のいずれかを刺激することによって）。その薬剤を添加するとインスリンの産生を刺激し（これもまた、転写もしくは分泌のいずれかを刺激することによって）、グルコースを添加するとＧＬＰ−１の産生を刺激することができる；その薬剤もしくはグルコースの量を増加させればより多量のインスリンもしくはＧＬＰ−１の産生を誘導しうる。その薬剤を食事（グルコースを含んでいる）とともに添加することによってインスリンとＧＬＰ−１の双方が産生されれば、例えば特に重症の糖尿病の被験体に、より大きな治療上の有益性をもたらすことができる。従って、本発明はさらに複数のトランスジーンを含んでいる粘膜細胞およびその細胞を産生する方法および使用する方法をも含む。
【００８２】
従って、本発明では、栄養素によって調節可能なタンパク質を産生する粘膜細胞が提供され、その細胞ではタンパク質の発現は、そのタンパク質をコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含んでいるトランスジーンによってもたらされる。１実施形態においては、該粘膜細胞は内分泌細胞（例えばＫ細胞）である。別の１実施形態においては、該粘膜細胞は非内分泌細胞である。また別の実施形態においては、該粘膜細胞は幹細胞もしくは多能性前駆細胞である。さらに別の実施形態においては、該発現制御エレメントは栄養素で調節可能な発現をもたらす。１態様においては、栄養素で調節可能な該エレメントは腸管の内分泌プロモーター（例えば、ＧＩＰプロモーター）を含んでなる。また別の実施形態においては、該栄養素は該核酸によってコードされるタンパク質の分泌を増加させる。また別の実施形態においては、該核酸は治療用ポリペプチド（多数あるが例えば、インスリン、レプチン、グルカゴン様ペプチド−１、グルカゴン様ペプチド−２、グルカゴンアンタゴニスト、コレシストキニン、成長ホルモン、凝固因子、抗体）をコードする。また別の実施形態においては、該粘膜細胞は２個以上のトランスジーンを含んでいる。
【００８３】
ある核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含んでいるポリヌクレオチドは、ある生物体の全体の細胞中での安定な発現のために導入することができる。トランスジェニック動物を含むそのような生物体は動物全体での粘膜タンパク質産生の影響および治療上の有益性を調べるために有用である。例えば、本明細書に述べているとおり、トランスジェニックマウスの腸管におけるインスリンの産生によってその動物を糖尿病発症から防護し、膵臓のβ細胞の崩壊後のグルコース不耐性から防護する。特定の疾患（例えば、糖尿病、変性性疾患、癌など）を発症している、もしくは発症しやすいマウスの系統は、それらの疾患に罹患しやすいマウスでの治療用タンパク質の発現の効果を調べるための、本明細書に述べている治療用タンパク質の導入のためにも有用である。特定の疾患もしくは生理学的状態になりやすいトランスジェニックおよび遺伝的動物モデルは当業界では既知であり、腸管内での治療用タンパク質発現の標的として適切である。
【００８４】
このように、本発明では、粘膜組織中でタンパク質を産生するヒト以外のトランスジェニック動物、その動物の粘膜組織中では天然には起こりえない産生、その動物の体細胞もしくは生殖細胞中に存在するトランスジーンによってもたらされる産生が提供される。１実施形態においては、該トランスジーンはポリヌクレオチドであり、それには治療用ポリペプチド（多数あるが例えば、インスリン、レプチン、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、グレリン、ＣＣＫ、グルカゴンアンタゴニスト、成長ホルモン、凝固因子、抗体）をコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントが含まれる。別の１実施形態においては該トランスジェニック動物はマウスである。別の実施形態においては、動物の粘膜組織での治療用ポリペプチドの発現は栄養素に応答するものである。また別の実施形態においては、粘膜組織における治療用ポリペプチドの分泌はある栄養素によって増加する。さらに別の実施形態においては、粘膜組織中での治療用ポリペプチドの発現は、ある栄養素によって増加する（すなわち、インスリンの発現を調節している発現制御エレメントは栄養素で誘導しうるエレメントを含んでなる）。さらに別の１実施形態においては、栄養素で調節されるエレメントはグルコースで誘導されるプロモーター（例えば、グルコース依存性インスリン分泌刺激ペプチドプロモーター）を含んでなる。別の１実施形態においては、該粘膜組織は消化管の組織もしくは器官（例えば腸）、または腸管であり、内分泌細胞を含んでいる。さらに別の実施形態においては、該治療用ポリペプチドを発現する本発明のトランスジェニック動物から単離された細胞が提供される。
【００８５】
「トランスジェニック動物」という用語は、計画的な遺伝子操作を細胞内のレベルで行うことによって、例えばマイクロインジェクションもしくは組換えウイルスによる感染などによって行うことによって、直接的もしくは間接的に受け取った遺伝情報をその体細胞もしくは生殖細胞が有している動物を意味する。「トランスジェニック」という用語はさらに、本明細書で述べているように遺伝子操作されたトランスジェニック動物から得られた細胞もしくは組織（すなわち「トランスジェニック細胞」「トランスジェニック組織」）を含んでいる。本発明の文脈においては、「トランスジェニック動物」には古典的交配もしくはｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精によって作成された動物は包含しないが、ある核酸分子を１個以上の細胞が受け取っている動物はその意味の中に含まれる。本発明のトランスジェニック動物は該トランスジーンに関してヘテロ接合体もしくはホモ接合体のいずれとすることもできる。マウス、ヒツジ、ブタ、およびカエルを含むトランスジェニック動物を作成するための方法は当業界ではよく知られており（例えば、米国特許第５，７２１，３６７号、第５，６９５，９７７号、第５，６５０，２９８号、および第５，６１４，３９６号を参照せよ）、それら自体はさらに本発明に含まれる。
【００８６】
本発明では、粘膜組織中で治療用タンパク質を産生させることによって治療可能な疾患を有する、もしくは疾患を起こす危険性のある被験体を治療する方法を提供する。１実施形態においては、本発明の方法は、治療用タンパク質をコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含んでなるポリヌクレオチドで形質転換（ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、もしくはｉｎ ｖｉｖｏで）された被験体の体内の粘膜組織細胞を、その疾患を治療するために有効な量の該タンパク質の産生を誘導する栄養素と接触させることを含んでいる。別の１実施形態においては、本発明の方法は治療用タンパク質を産生する形質転換（ｉｎ ｖｉｔｒｏもしくはｅｘ ｖｉｖｏで）された１つ以上の粘膜細胞を、被験体の組織中へその疾患を治療するために十分な量移植することによって、その被験体の粘膜組織中で治療用タンパク質を産生させることを含んでいる。
【００８７】
本発明の方法によって治療可能な疾患としては、インスリン依存性（Ｉ型）もしくはインスリン非依存性（ＩＩ型）糖尿病などの高血糖状態、ならびに高血糖状態に伴うか、もしくは高血糖状態から生ずる生理学的状態又は疾患が含まれる。本発明の方法によって治療可能な高血糖状態には、慢性もしくは急性の高血糖（例えば糖尿病）に伴う病理組織学的変化も含まれる。詳細な例としては、膵臓の変性（β細胞の破壊）、尿細管の石灰化、肝臓の変性、眼の障害（糖尿病網膜症）、糖尿病性の下肢障害、口腔および歯肉などの粘膜の潰瘍形成、出血過剰、血液凝固もしくは創傷治癒の遅延、ならびに冠状動脈疾患、脳卒中、末梢血管疾患、異常脂質血症、高血圧、および肥満の危険性の増大が含まれる。
【００８８】
このように、本発明の種々の方法において、グルコースに応答してインスリンもしくはインスリンの機能的な部分配列を産生する粘膜細胞は、インスリンを増加させること、グルコースを減少させること、グルコース耐性を改善すること、高血糖状態（例えば、糖尿病）を治療すること、もしくは高血糖状態に伴うか、もしくは高血糖状態の結果生ずる生理学的疾患の治療に有用である。そのような疾患としては、例えば、糖尿病性神経症（自律神経）、ネフロパシー（腎障害）、皮膚感染およびその他の皮膚疾患、外傷もしくは創傷の治癒の遅延（例えば、糖尿病性癰をもたらす）、失明に至る可能性のある眼の障害（網膜症、白内障）、糖尿病性下肢障害、および加速性歯周炎が含まれる。そのような疾患としてはまた、冠状動脈疾患、脳卒中、末梢血管疾患、異常脂質血症、高血圧、および肥満を発症する危険性の増大をも含む。
【００８９】
本明細書で用いている「高血糖性」もしくは「高血糖症」という用語は、被験体の状態に関連して用いる場合には、被験体の血中に存在する一過性のもしくは慢性の異常に高いレベルのグルコースを意味する。その状態はグルコース代謝もしくは吸収の遅延によって生じうるもので、被験体はグルコース不耐性もしくは正常な被験体では通常は見られない高いグルコース値を示すこととなる（例えば、グルコースに不耐性の糖尿病を発症する危険性のある前糖尿病状態の（ｓｕｂｄｉａｂｅｔｉｃ）被験体、もしくは糖尿病の被験体）。絶食時の血漿中グルコース（ＦＰＧ）レベルは血糖値が正常であれば約１１０ｍｇ／ｄＬ未満であり、グルコース代謝に障害がある場合には約１１０から１２６ｍｇ／ｄＬの間であり、糖尿病では約１２６ｍｇ／ｄＬを超える。
【００９０】
粘膜組織中でタンパク質を産生させることによって治療可能な疾患には肥満、もしくは望ましくない体重が含まれる。レプチン、コレシストキニン、およびＧＬＰ−１は空腹感を減少させ、エネルギー消費を増大させ、体重減少を誘発し、もしくは正常なグルコースホメオスタシスを提供する。従って、種々の実施形態において、肥満、もしくは望ましくない体重、または高血糖を治療するための本発明の方法は、レプチン、コレシストキニン、もしくはＧＬＰ−１をコードするトランスジーンを有する粘膜組織細胞を栄養素と接触させて肥満もしくは望ましくない体重を治療するために有効な量のタンパク質が産生されるようにすることを含んでいる。治療可能な疾患としては、例えば、血清／血漿中のＬＤＬ、ＶＬＤＬ、トリグリセリド、コレステロールの異常な上昇、血管の狭窄もしくは閉塞をもたらすプラーク形成、高血圧／脳卒中の危険性の増大、冠状動脈疾患などの、肥満に典型的に伴う疾患が含まれる。
【００９１】
本明細書で用いている「肥満」もしくは「肥満症」という用語は、ある被験体がその年齢と性別をマッチさせた正常な被験体と比較してその体重が少なくとも３０％増加している被験体を意味する。「望ましくない体重」とは、被験体の体重が条件の合致した正常な被験体より１％から２９％多い被験体、ならびに体重は正常だが体重を減らしたい、もしくは増加を防止したい被験体を意味する。
【００９２】
「被験体」という用語は、動物を意味する。典型的にはその動物は哺乳類であるが、腸管などの粘膜組織を有している動物であればどのような動物であってもこの用語に包含される。哺乳類の詳細な例としては霊長類（ヒト）、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、およびヒツジが挙げられる。被験体には、疾患、例えば糖尿病などの高血糖による疾患を有している被験体、もしくは疾患を有していないが、例えばＦＰＧレベルが約１１０から１２６ｍｇ／ｄＬの間にある前糖尿病状態の被験体のように、疾患を発症する危険性のある被験体が含まれる。疾患を発症する危険性のある被験体としては、例えば、食事が糖尿病もしくは肥満の発症に寄与しているかもしくは関連している被験体、ならびに糖尿病もしくは肥満の発症の家族歴があるかもしくはその発症の遺伝的傾向がある被験体が含まれる。被験体には見かけ上正常な被験体、例えば体重を減らしたいが肥満とは見なされず、正常な体重を超えていない被験体も含まれる。
【００９３】
治療用タンパク質および標的疾患の部分的なリストを表３に示す。
【００９４】
【表３】
2004500104.tif 000004
【００９５】
治療は、通常はその被験体の状態の重篤度もしくは症状の低減もしくは予防、すなわち被験体の状態の改善、すなわち「治療上の効果」をもたらす。従って、治療によってその病状もしくはその病状に伴う疾患の重篤度を低減させ、もしくは１つ以上の症状を予防することができ、その病状もしくはその病状に伴う疾患の進行もしくは悪化を抑制することができ、いくつかの場合ではその病状もしくはその病状に伴う疾患を逆行させることができる。従って、例えば高血糖状態の場合には、治療は血中のグルコースを低減し、グルコース耐性を改善し、正常なグルコースのホメオスタシスを提供し、もしくはその高血糖状態に伴う、もしくはその結果として生ずる病理組織学的変化を予防、改善、もしくは逆行させることができる。
【００９６】
高血糖状態に伴う病理組織学的変化の改善には、例えば尿細管の石灰化の進行の防止もしくは低減、網膜症もしくは白内障の低減もしくは進行停止、創傷もしくは外傷治癒時間の低減、糖尿病性下肢障害の低減、加速性歯周炎の予防もしくは低減、または冠状動脈疾患、脳卒中、末梢血管疾患、異常脂質血症、高血圧、および肥満を発症する危険性の低減が含まれる。肥満での改善としては、例えば、体重の減少、もしくは肥満に伴う疾患の改善として例えば、コレステロール、ＬＤＬ、もしくはＶＬＤＬレベルの低減、血圧の低下、高脂肪食に伴う血管内膜の肥厚の減少、安静時心拍数の減少、肺活量の増加、その他が含まれる。血友病などの出血性疾患での改善では、例えば、凝固時間の短縮、もしくは出血エピソードの頻度／期間の低減を誘導することができる。
【００９７】
本明細書で用いている「改善する」という用語は、被験体の状態の改善、その状態の重篤度の低減、もしくはその状態の進行もしくは悪化の抑制を意味する。高血糖状態（例えば、糖尿病）の場合の改善とは、例えば血中のグルコースの低減、インスリンの増加、グルコース耐性、もしくはグルコースのホメオスタシスの改善とすることができる。高血糖状態の改善にはまた、膵臓機能の改善（例えば、β膵島細胞の破壊を抑制するもしくは予防する）、高血糖状態に伴うもしくはその状態の結果生ずる、例えば影響を受けた組織もしくは器官の病理組織学的所見の改善などの、病態の低減をも含むことができる。肥満の場合には、改善とは例えば、体重増加度の減少、体重の低下もしくは肥満に伴う状態の改善とすることができ、それは本明細書に示すとおりである（例えば、血中のグルコース、コレステロール、ＬＤＬもしくはＶＬＤＬレベルの低下、血圧の低下、血管内膜の肥厚の低減、その他）。血友病もしくはその他の血液凝固／出血性疾患の場合には、改善とは、出血エピソードもしくは出血の頻度もしくは期間の減少とすることができる。改善には同様にして、例えば神経的傷害の減少、欠陥のある組織、および関節の障害などの血液凝固／出血が関与する疾患に伴う慢性的疾患の改善を含む。
【００９８】
被験体を治療するための投与量もしくは「有効量」とは、その疾患もしくは状態の進行もしくは悪化を防止するもしくは抑制することが満足すべき結果であるとはいえ、その状態の症状の１つ、いくつか、もしくは全ての改善が、測定可能な程度に、もしくは検出可能な程度に行われるために十分な量をいう。従って、粘膜組織中でのタンパク質の産生によって治療可能な疾患もしくは状態の場合には、本発明の方法によって治療可能な状態の改善に十分な、産生されるタンパク質、もしくは移植される細胞の量は、その状態および所望の結果の如何により変わり、当業者であれば容易に確認することができる。適切な量とは、治療しようとする状態、所望の治療効果、ならびに被験体個々の違い（例えば、その被験体体内でのバイオアベイラビリティー、性別、年齢、その他）の如何によって変わる。例えば、被験体において、正常なグルコースのホメオスタシスへの部分的な回復によって、インスリン注射から完全に解放されることはできないにしても、インスリン注射の頻度を減らすことができる。
【００９９】
有効量は関連する生理学的効果を測定することによって確認することができる。例えば、糖尿病もしくはその他の高血糖状態の場合には、血中のグルコース値の低減もしくはグルコース耐性試験での改善の程度を、インスリンの量、もしくは動物の粘膜中に移植されたインスリンを発現する細胞の量がその高血糖状態の治療に有効であるかどうかを決めるために用いることができる。例えば、ＦＰＧを１２６ｍｇ／ｄＬから１２０、１１５、１１０、もしくはそれ未満に減少させる量は有効量である。肥満もしくは望ましくない体重の場合には、被験体の体重の減少、食事量もしくは食事のカロリー含有量の減少、ある与えられた食事量での満腹感の増加、および血清／血漿中の脂質、コレステロール、脂肪酸、ＬＤＬもしくはＶＬＤＬの減少、これらのことが認められる量は全て、被験体の肥満もしくは望ましくない体重を改善するための有効量となりうる。血友病の場合には、有効量とは、被験体の凝固時間を短縮するか、もしくは出血エピソードの頻度もしくは期間を低下させる量である。
【０１００】
本発明の被験体を治療する方法は、被験体にある状態、例えば高血糖状態もしくは高血糖に伴う疾患、または肥満もしくは体重増加の発症などの状態が生ずることを防ぐための予防として適用することができる。あるいはまた、本明細書記載のとおり、被験体の治療後にこれらの方法を実施することができる。例えば、治療および体重を所望の重量まで減少させた後、食欲を抑制し、食事量を減らすなどのために、レプチン、ＧＬＰ−１、もしくはＣＣＫを本明細書に記載のとおり、粘膜細胞によって定期的に産生させることができ、そのことによって所望の体重が維持される。
【０１０１】
本発明の治療方法はまた、その他の形態の治療法で補うこともできる。補助的治療法としては、薬物療法、食事療法（低糖、脂肪、その他）、外科的切除、移植、放射線療法などが含まれる。例えば、高血糖状態を治療するための本発明の方法は、被験体のインスリン量を増加させるか、もしくはグルコース量を低下させる薬剤もしくはその他の医薬製剤と組み合わせて用いることができる。糖尿病を治療するための薬剤としては、例えば、ビグアナイドおよびスルホニルウレア（例えば、トルブタミド、クロルプロマジン、アセトヘキサミド、トラザミド、グリベンクラミド、およびグリピジド）が挙げられる。食欲抑制剤もよく知られており、本発明の方法と組み合わせて用いることができる。補助的治療法は、本発明の治療法の前、同時、もしくはその後に行うことができる。当業者であれば本発明の治療法と組み合わせて治療計画で用いることのできる治療法を容易に確認することができる。
【０１０２】
本発明の方法はｉｎ ｖｉｖｏでの送達が含まれており、その送達とは例えば、あるコードされたタンパク質を被験体の体内で産生させるために、核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含んでなるポリヌクレオチドを被験体の粘膜細胞中へｉｎ ｖｉｖｏで送達することが含まれ、発現系にはさらにｉｎ ｖｉｖｏでの送達用に特別にデザインされたベクターが含まれる。遺伝子を腸管の細胞（例えば、幹細胞）に効率的に送達するベクターは既に開発されており、粘膜細胞中へのポリヌクレオチドの送達に用いることが考えられている（例えば、米国特許第５，８２１，２３５号、第５，７８６，３４０号、および第６，１１０，４５６号；Ｃｒｏｙｌｅ， Ｍ．Ａ．ら， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ５：６４５（１９９８）； Ｃｒｏｙｌｅ， Ｍ．Ａ．ら， Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． １５：１３４８（１９９８）； Ｃｒｏｙｌｅ， Ｍ．Ａ．ら， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：５６１（１９９８）； Ｆｏｒｅｍａｎ， Ｐ．Ｋ．ら， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：１３１３（１９９８）； Ｗｉｒｔｚ， Ｓ．ら， Ｇｕｔ ４４：８００（１９９９）を参照せよ）。遺伝子治療に適したアデノウイルスベクターおよびアデノ関連ウイルスベクターについては米国特許第５，７００，４７０号、第５，７３１，１７２号、および第５，６０４，０９０号に述べられている。遺伝子治療に適した他のベクターとしては、単純ヘルペスウイルスベクター（例えば、米国特許第５，５０１，９７９号を参照せよ）、レトロウイルスベクター（例えば米国特許第５，６２４，８２０号、第５，６９３，５０８号、および第５，６７４，７０３号；ならびにＷＯ９２／０５２６６およびＷＯ９２／１４８２９を参照せよ）、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）ベクター（例えば、米国特許第５，７１９，０５４号を参照せよ）、ＣＭＶをベースとしたベクター（例えば米国特許第５，５６１，０６３号を参照せよ）、ならびに、パルボウイルス、ロタウイルス、およびノーワークウイルスベクターが含まれる。レンチウイルスベクターは分裂中の、および分裂していない細胞に感染させるために有用である（米国特許第６，０１３，５１６号を参照せよ）。
【０１０３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、およびｉｎ ｖｉｖｏでの核酸およびポリペプチドの導入は他の技法を用いても行うことができる。例えば、あるタンパク質をコードする核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含んでなるポリヌクレオチドは、ポリエステル、ポリアミン酸、ハイドロゲル、ポリビニルピロリドン、エチレン−酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、または、ラクチド／グリコリドコポリマー、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、もしくはエチレン−ビニル酢酸コポリマーなどの粒子もしくは重合物質中に取り込むことができる。ポリヌクレオチドは、例えば、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル、またはポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルをそれぞれ使用することによるコアセルベーション技法もしくは界面重合によって、またはコロイド状薬剤送達システム中にエントラップすることができる。コロイド状分散システムには巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および、水中油滴型乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースのシステムが含まれる。ポリヌクレオチドを含む種々の組成物を導入するためのリポソームの使用については当業者には既知である（例えば、米国特許第４，８４４，９０４号、第５，０００，９５９号、第４，８６３，７４０号、および第４，９７５，２８２号を参照せよ）。天然のポリマー、または天然のポリマーの誘導体もしくは加水分解物を含んでなる担体、それについてはＷＯ９４／２００７８および米国特許第６，０９６，２９１号に述べられているが、そのような担体は、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどの分子の粘膜への送達に適している。遺伝子治療に適するピペラジンをベースとする両親媒性陽イオン性脂質も既知である（例えば、米国特許第５，８６１，３９７号を参照せよ）。陽イオン性脂質システムも既知である（例えば、米国特許第５，４５９，１２７号を参照せよ）。従って、ベクター（ウイルス性および非ウイルス性、例えば、裸のＤＮＡ）ならびにベクター以外ものを用いる、粘膜細胞もしくは組織中への、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、およびｅｘ ｖｉｖｏでの送達を行うことができ、それらの方法が考慮されている。
【０１０４】
本発明の方法には、被験体の体内に存在する粘膜細胞をポリヌクレオチドと接触させることを含むので、本発明は、トランスジーンもしくは治療用ポリヌクレオチドを含んでいる「製薬上許容される」もしくは「生理学的に許容される」製剤をも提供する。そのような製剤は例えば本発明の治療方法を実施するために被験体にｅｘ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。
【０１０５】
本明細書で用いている「製薬上許容される」および「生理学的に許容される」という用語は、好ましくは過剰な副作用（例えば、悪心、腹部痛、頭痛、その他）を起こすことなく被験体に投与することのできる担体、希釈剤、賦形剤、および類似のものを意味する。そのような投与用の製剤としては、無菌の水性もしくは非水性溶液、懸濁液、および乳剤が含まれる。
【０１０６】
医薬品製剤は、被験体への投与と両立しうる、担体、希釈剤、賦形剤、溶剤、分散溶媒、コーティング、抗菌および抗真菌剤、等張化および吸収遅延剤、ならびに類似のものから作成することができる。そのような製剤は錠剤（コーティングを施されたものもしくはそうでないもの）、カプセル剤（硬もしくは軟カプセル）、ミクロビーズ、乳剤、粉末剤、顆粒剤、結晶、懸濁剤、シロップ剤、またはエリキシル剤中に含有させることができる。補助的な活性化合物および他の添加剤は種々あるが特に保存剤を共存させることができ、そのようなものとしては、例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性気体ならびに類似のものが挙げられる。
【０１０７】
医薬品製剤は剤型化してその意図する投与経路で用いうるものとすることができる。従って医薬品製剤中には、腹腔内、皮内、皮下、経口（例えば、摂取もしくは吸入）、静脈内、腔内、脳室内、経皮（局所）、非経口例えば経粘膜および直腸を含む経路による投与に適する担体、希釈剤、もしくは賦形剤が含まれる。
【０１０８】
非経口、皮内、もしくは皮下への適用に用いられる溶液もしくは懸濁液には次のものを含めることができる：注射用水などの無菌の希釈剤、食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、もしくはその他の合成溶剤；ベンジルアルコールもしくはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸もしくは亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、もしくはリン酸塩などのバッファー、および塩化ナトリウムもしくはグルコースなどの浸透圧調整剤。ｐＨは塩酸もしくは水酸化ナトリウムなどの酸もしくは塩基で調整することができる。非経口製剤はガラスもしくはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブル注射筒、もしくは複数回投与用のバイアル瓶中に入れることができる。
【０１０９】
注射用に適した医薬品製剤としては、無菌の水性溶液（そのものが水溶性であれば）もしくは分散液、および即時に無菌の注射用溶液もしくは分散液を調製できる粉末が含まれる。静脈内投与用には、適切な担体としては生理食塩液、静菌水（ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ ｗａｔｅｒ）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ， Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， 米国ニュージャージー州）、もしくは食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）が含まれる。その担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状のポリエチレングリコール、ならびに類似のもの）、およびそれらの適切な混合物を含有する溶媒もしくは分散媒とすることができる。流動性は、例えば、分散液の場合には必要とされる粒子径をレシチンなどのコーティングの使用によって維持することにより、および界面活性剤の使用によって保持することができる。微生物の活動を防止するには、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール、および類似のものを用いることによって行うことができる。等張化剤、たとえば糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどを組成物中に含めることができる。注射用製剤の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムもしくはゼラチンなどを含有させることによって行うことができる。
【０１１０】
経口投与には組成物中に賦形剤を共存させて錠剤、トローチ剤、もしくはゼラチンカプセルなどのカプセル剤の剤型で用いることができる。製薬上用いうる結合剤および／もしくはアジュバント物質を経口投与用製剤中に含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤、および類似の製剤は次の成分もしくは類似の特性を有する化合物のいかなるものでも含有することができる：微結晶化セルロース、トラガカントゴム、もしくはゼラチンなどの結合剤；デンプンもしくは乳糖などの賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはトウモロコシデンプンなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；ショ糖もしくはサッカリンなどの甘味剤；またはペパーミント、サリチル酸メチル、もしくは香料などの着香剤。
【０１１１】
製剤にはまた、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む放出制御剤型などの、急速な崩壊もしくは生体からの排除に抵抗する担体を含むこともできる。例えば、モノステアリン酸グリセリンもしくはステアリン酸グリセリンを単独でもしくはロウと組み合わせたものなどの放出時間遅延物質を用いることができる。
【０１１２】
さらに別の製剤では、投与される組成物の送達を制御するために、ポリエステル、ポリアミン酸、ヒドロゲル、ポリビニルピロリドン、ポリアンハイドライド、ポリグリコール酸、エチレン−酢酸ビニル、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン、もしくはラクチド／グリコリドコポリマー、ポリラクチド／グリコリドコポリマー、またはエチレン−酢酸ビニルコポリマーなどの、生物分解性もしくは生物親和性の粒子もしくはポリマー性物質が含まれる。そのような製剤の調製方法は当業者であれば明らかであろう。そのような物質はまた、例えばＡｌｚａ ＣｏｒｐｏｔａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｄｃａｌｓ， Ｉｎｃ．から販売されている市販のものを入手することができる。
【０１１３】
組成物の放出速度はそのような高分子の濃度もしくは組成を変えることによって制御することができる。例えば、その組成物はコアセルベーション技法によって、もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル中に、例えばヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル、またはポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルをそれぞれ用いることによって、またはコロイド状薬剤送達システム中でエントラップすることができる。コロイド状分散システムには高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ミクロビーズ、および水中油滴型乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースのシステムが含まれる。これらは、米国特許第４，５２２，８１１号に述べられているような、当業者には既知の方法に従って調製することができる。
【０１１４】
さらに別の投与に適した医薬品製剤は当業界では既知であり、本発明の方法と組成物に適用しうる（例えば、「レミントンの製薬科学」”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ”（１９９０） 第１８版， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， 米国ペンシルベニア州； Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（１９９６） 第１２版， Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ， Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ， 米国ニュージャージー州； および「固形投与剤型の製薬上の原則」”Ｐｈｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ”， Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．， Ｌａｎｃａｓｔｅｒ， 米国ペンシルベニア州（１９９３）を参照せよ）。
【０１１５】
粘膜組織の粘液もしくは内膜は投与前に除去してもよく、あるいは浸透剤もしくはその他のバリア浸透増強剤を用いて調製することができる。バリアを透過させるために適切なそのような浸透剤は当業界では一般に知られており、そのようなものとしては例えば、粘膜を通過する投与のためには、Ｎ−アセチルシステインとのインキュベーション（Ｎａｋａｎｉｓｈｉら， Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ） ４０：１２５２（１９９２）； ＭｅａｎｅｙとＯ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌ， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍ． Ｓｃｉ． ８：１６７（１９９９））；腸のムチンの精製Ｓｉｇｍａ Ｉタンパク質による加水分解と感染性のウイルス以下の粒子（Ｂｉｓａｉｌｌｏｎら， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８６：７５９（１９９９））；脱シアル化（Ｓｌｏｍｉａｎｙら， Ｇｅｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２７：７６１（１９９６）； Ｈｉｒｍｏら， ＦＥＭＳ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２０：２７５（１９９８）；ヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）グリコスルファターゼによる脱硫酸（Ｓｌｏｍｉａｎｙら， Ａｍ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． ８７：１１３２（１９９２））；ノイラミニダーゼによる脱シアル化（Ｈａｎｓｋｉら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５１：５３４２（１９９１））；β−メルカプトエタノールによるジスルフィド結合の開裂（Ｇｗｏｚｄｚｉｎｓｋｉら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． １７：９０７（１９８８））；フコシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、Ｎ−アセチルガラクトサミニダーゼ、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ、およびノイラミニダーゼなどの特異的エキソグリコシダーゼを用いる脱グリコシル化（Ｓｌｏｍｉａｎｙら， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １４２：７８３（１９８７）；０．４Ｎ ＨＣｌによる酸の除去（Ｒｕｇｇｉｅｒｉら， Ｕｒｏｌ． Ｒｅｓ． １２：１９９（１９８４）； Ｄａｖｉｓ， Ｃ．Ｐ．とＡｖｏｔｓ−Ａｖｏｔｉｎｓ， Ａ．Ｅ． Ｓｃａｎ． Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃ． （Ｐｔ２）：８２５−３０（１９８２）； Ｐａｒｓｏｎｓら， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． ９３：４２３（１９７８））が特に挙げられる。粘膜への投与は経鼻スプレーもしくは坐薬の使用によっても行うことができる。吸入による投与のためには、製剤をポンプもしくはエアロゾルスプレーを介して、適切な高圧ガス、例えば二酸化炭素などの気体を含有しているディスペンサーもしくは加圧容器から、またはネブライザーから送達することができる。
【０１１６】
幹細胞の数は細胞傷害性の作用物および成長因子に暴露させることによって増加させることができる。例えば、小腸の照射によってクローン産生性／幹細胞の数が増加する（Ｒｏｂｅｒｔｓ， Ｓ．Ａ．， Ｒａｄｉａｔ． Ｒｅｓ． １４１：３０３（１９９５）； Ｃａｉ， Ｗ．Ｂ．ら， Ｉｎｔｌ． Ｊ． Ｒａｄｉａｔ． Ｂｉｏｌ． ７１：１４５（１９９７））。さらに、とりわけＧＬＰ−２、上皮成長因子、ＴＧＦ−α、インスリン様成長因子、インターロイキンでの処理で粘膜細胞の増殖が促進されることが示されている（Ｐｏｔｔｅｎ， Ｃ．Ｓ．， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｐａｔｈ． ７８：２１９（１９９７））。この方法で標的細胞をさらに産生することができ、それによって形質転換の効率を増加させ、その後の形質転換された細胞によるタンパク質の産生を調節することができる。
【０１１７】
製剤を被験体の腸管の種々の部分に送達するために内視鏡、カニューレ、挿管チューブ、カテーテル、および類似のものを用いることができる。このことによって腸管の特定の領域にベクターを効果的に届かせることができる。
【０１１８】
特に定義しない限りは、本明細書中で用いている技術的および科学的用語は全て、本発明が属する業界の当業者が一般的に理解している意味と同じ意味を有している。本明細書に述べたものと類似もしくは同等の方法および物質を本発明の実施もしくは試験に用いることはできるが、適切な方法および物質については本明細書で述べている。
【０１１９】
本明細書で引用した公表物、特許、およびその他の参照文献はその全体を参照により本明細書に組み入れることとする。不一致がある場合には、定義を含む本明細書が定めるところによる。
【０１２０】
本明細書で用いている単数形の”ａ”、”ａｎ”、および”ｔｈｅ”は、文脈がそうでないことを明確に示していない限りは複数形の対象物をも含んでいる。従って例えば、「１つの粘膜細胞”ａ ｍｕｃｏｓａｌ ｃｅｌｌ”」との言及は、そのような細胞の複数をも含み、「ある核酸と機能しうる形で連結された発現制御エレメントを含んでなる１つのポリヌクレオチド  ”ａ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ａｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｔｒｏｌ ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎ ｏｐｅｒａｂｌｅ ｌｉｎｋａｇｅ ｗｉｔｈ ａ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ”」との言及はそのような構築物の１つ以上に対する言及を含んでいる、などである。
【０１２１】
本発明の多数の実施形態について述べてきた。しかしそれにもかかわらず、本発明の精神と範囲から逸脱することなく種々の改変を行いうることは理解されよう。従って、下記の実施例は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を説明することを意図したものであって限定しようとするものではない。
【０１２２】
実施例Ｉ
この実施例は調節されたインスリン産生を研究するため、およびｉｎ ｖｉｖｏでのインスリン発現をターゲティングとするために有用な腸管の内分泌細胞系統の確立について説明している。この実施例はまた、ヒトインスリン遺伝子発現ベクターの構築についても説明している。
【０１２３】
ＧＩＰプロモーターがＫ細胞でのインスリン遺伝子の発現をターゲティングする際に有効であるか調べるために、ＧＩＰ発現細胞系統を確立した。この細胞系統はマウス腸細胞系統ＳＴＣ−１、これは腸管の内分泌細胞の混合細胞集団であるが、この細胞系統からクローン化されたものである（Ｒｉｎｄｉら， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １３６：１３４９（１９９０））。混合細胞集団中のＫ細胞は、〜２．５ＫｂのラットＧＩＰプロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質発現プラスミドでのトランスフェクションによって肉眼的に同定した。そのラットＧＩＰプロモーターはラットゲノムλＤＡＳＨライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から、ラットＧＩＰ ｃＤＮＡクローンを用いて前述のとおりプラークハイブリダイゼーションを行うことによって得たものであり（Ｂｏｙｌａｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１７４３８（１９９７））、それをプロモーターを含まないｐＥＧＦＰ−１プラスミド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）中にサブクローン化した。この結果得られたリポーターベクターをＳＴＣ−１細胞（Ｄ． Ｄｒｕｃｋｅｒ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒｏｎｔｏから提供を受けた）中にリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯ）を用いてトランスフェクトさせた。細胞をトリプシン／ＥＤＴＡを用いて分散させ、ＥＧＦＰを発現している蛍光細胞を２回厳選し、クローンを増殖させるために個々のディッシュ中に入れた（図１）。
【０１２４】
一過性に蛍光を発するようになった細胞のクローンを増殖させた後、クローンがＧＩＰ ｍＲＮＡを発現しているかどうかをノーザンブロッティングで分析した。簡潔に述べれば、ＧＴＣ−１細胞およびＳＴＣ−１細胞から総ＲＮＡをＴｒｉｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ）を製造者の使用説明書に従って用いて単離した。各サンプルからの総ＲＮＡ（２０μｇ）を電気泳動で分離し、ナイロン膜に移した。ハイブリダイゼーションは、［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰでランダムにプライムされたラットＧＩＰ ｃＤＮＡの６６０ｂｐのＥｄｏＲＩ断片の放射能標識したものを用いて行った。ハイブリダイゼーション後、膜を洗い、Ｘ線フィルムに対して露光させた。１つのクローンでは（ＧＩＰＴｕｍｏｒＣｅｌｌｓ； ＧＴＣ−１）ＧＩＰ ｍＲＮＡのレベルは親のヘテロのＳＴＣ−１細胞と比較して〜８倍高かった（図２）。
【０１２５】
ＧＴＣ−１細胞がヒトゲノムのプレプロインスリンを正確にプロセスするかを調べるために、インスリン遺伝子をラットＧＩＰプロモーターの３’末端に連結させたインスリン発現構築物（図３、ＧＩＰ／Ｉｎｓ）をこれらの細胞中にトランスフェクトさせた。
【０１２６】
ヒトインスリン／ＧＩＰ発現プラスミドを構築するために、上述のとおり、ラットＧＩＰプロモーターの〜２．５Ｋｂの部分をｐＧＬＢＨ中に挿入した（Ｂｏｙｌａｎら， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：１７４３８（１９９７））。ヒトインスリンｃＤＮＡ、それは天然のポリアデニル化部位を含むヌクレオチド２１２７から３７３２へと伸びるゲノム配列の〜１．６Ｋｂを含んでなるものであるが、それをｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５７３９９）からＢａｍＨＩを用いた消化によって切り出し、ＧＩＰ含有のｐＧＬＢＨ構築物のＢｇｌＩＩ部位中に連結した。その発現構築物は図３に示している。
【０１２７】
ＧＩＰ／Ｉｎｓでトランスフェクトされた細胞およびトランスフェクトされていない細胞、ならびにヒトランゲルハンス島（Ｔｒｉｚｏｌ， ＧＩＢＣＯ）から総ＲＮＡを単離した。単離した５μｇのＲＮＡをオリゴｄＴプライマーとともにｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ）を用いて逆転写した。ｃＤＮＡ産物の２μＬをヒトプレプロインスリン遺伝子特異的プライマー（プライマー１および３、図３）を用いて増幅した。この結果はヒトプレプロインスリンｍＲＮＡ転写産物は正しくプロセスされたことを示している（図４、最上部）。
【０１２８】
ＧＩＰ／Ｉｎｓ構築物をβ細胞（ＩＮＳ−１）、肝臓（ＨｅｐＧ２）、およびラット線維芽細胞（３Ｔ３−Ｌ１）の細胞系統中にトランスフェクトした場合には、ヒトプレプロインスリンｍＲＮＡはほとんど検出されなかった。これらの観察結果はＧＩＰプロモーターが細胞特異的であって、ｉｎ ｖｉｖｏでＫ細胞にトランスジーンの発現を行わせようとする際には有効なものとなるであろうということを示唆している。
【０１２９】
次いでプロインスリンを成熟インスリンに変換するためのプロセスを行う酵素が存在するかどうかを調べるため、ＧＴＣ−１細胞のウエスタンブロット分析を行った。簡潔に記せば、ＧＴＣ−１細胞を氷冷ＲＩＰＡバッファー中で溶解させ、上清の総タンパク質含量をＢｒａｄｆｏｒｄ法を用いてアッセイした。細胞溶解物タンパク質（５０μｇ）を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分画し、分画されたタンパク質をニトロセルロース膜上にエレクトロブロッティングし、ＰＣ１／３およびＰＣ２を認識するポリクローナル抗体（Ｄｒ．Ｉｒｉｓ Ｌｉｎｄｂｅｒｇ， Ｌｏｕｉｓｉａｎａ Ｓｔａｔｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒから入手）とインキュベートした。膜を洗い、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させたヤギ抗ウサギ抗血清（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とインキュベートし、化学発光ウエスタンブロッティング検出キットを用いて現像した。その結果は、プロインスリンを成熟インスリンへと正しくプロセスするために必要なプロタンパク質変換酵素（ＰＣ１／３およびＰＣ２； Ｓｔｅｉｎｅｒ， Ｄ．Ｆ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ． ２：３１（１９９８））がＧＴＣ−１細胞内で発現されていることを示している（図４、最下部）。
【０１３０】
プロインスリンが適切にプロセスされたか否かを確認するために、培地中のインスリンおよびＣ−ペプチドのレベルを測定した（図５）。ＧＩＰ／ＩｎｓプラスミドでトランスフェクトされたＧＴＣ−１細胞の培地中には、Ｃ−ペプチドおよびインスリンの双方とも検出された。この結果は、Ｋ細胞がプロインスリンから成熟インスリンへとプロセスすることを示している。
【０１３１】
ＧＩＰ／ＩｎｓプラスミドでトランスフェクトされたＧＴＣ−１細胞からヒトインスリンを産生することがグルコースで調節可能であることを確認するために、種々の濃度のグルコースの細胞培地中において、インスリンのレベルをアッセイした。簡潔に記せば、１２ウエルのプレート中の７０〜８０％コンフルエントなＧＴＣ−１細胞を、１．０ｍＭ グルコースおよび１％仔ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＤＭＥＭ中で２時間栄養素を絶った。細胞を洗い、次いで、０．５ｍＬの放出用培地（１．０もしくは１０．０ｍＭのグルコースおよび１％ ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ）で２時間インキュベートした。各条件下のものの培地を２時間後に集め、ヒト特異的インスリンＥＬＩＳＡキットを用い、キットの供給者（ＡＬＰＣＯ）の使用説明書に従ってアッセイした。さらに、これらの細胞からのインスリンの放出はグルコース依存性であった（図６）。
【０１３２】
実施例ＩＩ
本実施例はグルコースに応答してインスリンを産生するトランスジェニックマウスについて説明する。
【０１３３】
実施例Ｉで述べたヒトインスリン発現構築物ＧＩＰ／Ｉｎｓを用いて、ＧＩＰ／インスリン断片（〜４．１Ｋｂ）をＨｉｎｄＩＩＩで消化することによって取り出した。トランスジェニックマウスは、〜４．１Ｋｂトランスジーンを受精胚中の前核へマイクロインジェクションし偽妊娠雌に埋め込むことによって作成した。トランスジェニックな子孫はサザンブロット分析で同定した。耳の切片から得たＤＮＡをＸｈｏＩおよびＰｖｕｌｌで消化し（図３）、電気泳動で分離し、ナイロン膜へ移した。トランスジーンの検出には、プライマー２および４（図３）を用いてイントロン２をまたいでいる４１６ｂｐのヒトインスリン遺伝子断片を増幅した。そのＰＣＲ産物を［α−３２Ｐ］ｄＣＴＰを用いてランダムに標識することによってプローブとして調製し、バンドはオートラジオグラフィーで検出した。サザンブロット分析の結果はさらにプライマー２および４を用いたゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅によって確認された。陽性の初代動物は野生型のＦＶＢ／Ｎマウスと交雑させて、トランスジェニックな系統を確立した（図８）。
【０１３４】
トランスジェニックマウスの組織をインスリンの発現について調べた。簡潔に述べれば、各マウスの胃および十二指腸、回腸、筋肉、肝臓、脾臓、腎臓、脂肪、脳、肺、心臓、胆嚢、ならびに精巣の総ＲＮＡを分画し、膜に移し、ヒトプレプロインスリン遺伝子のエキソン１および２ならびにエキソン３の一部にまたがる３３３ｂｐのｃＤＮＡ断片をプローブとして用いた。この分析によって、インスリンがトランスジェニック動物から得た胃および十二指腸では発現されるが、回腸、筋肉、肝臓、脾臓、腎臓、脂肪、脳、肺、心臓、胆嚢、もしくは精巣では発現されないことが明らかとなった（図９）。
【０１３５】
十二指腸でのインスリンの産生を確認するために、インスリンのｍＲＮＡについてＲＴ−ＰＣＲを行った。簡潔に述べれば、ヒトプロインスリンに特異的な、フォワードプライマーとして５’−ＣＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＴＴＴＧＴＧＡ−３’およびリバースプライマーとして５’−ＧＧＴＡＣＡＧＣＡＴＴＧＴＴＣＣＡＣＡＡＴＧ−３’；マウスプロインスリンに特異的な、フォワードプライマーとして５’−ＡＣＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＡＧＴＧＡＴ−３’およびリバースプライマーとして５’−ＣＴＡＧＴＴＧＣＡＧＴＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＣ−３’を用いた。ＰＣＲの条件は次のとおり：９４℃での変性を１分間、５０℃でのアニーリングを１分間および７２℃１分間での伸長を４５サイクル。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで分析し、臭化エチジウム染色で可視化した。ヒトおよびマウスに特異的なプライマーのセットを用いることにより、３５０ｂｐおよび３９６ｂｐの産物がそれぞれ得られた。
【０１３６】
インスリンＲＮＡはトランスジェニックマウスから得た十二指腸サンプル中に検出され、これはインスリンが近接するマウスの膵臓からの混入によるものではないことを確認するものであった（図９）。トランスジェニックマウスから得た組織生検サンプル中でのインスリンタンパク質がどのような細胞に局在しているかをインスリンに対する抗体を用いて調べた。インスリンの免疫反応性はトランスジェニック動物の胃から得た切片の内分泌細胞であることが明確な細胞中で検出された（図１０）。
【０１３７】
上述の結果はトランスジェニック動物のインスリン発現の組織分布が、ＧＩＰの組織発現パターンに対応するものであることを示している（Ｔｓｅｎｇら， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：１９９２（１９９３）； Ｙｅｕｎｇら， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １５４：１６１（１９９９））。
【０１３８】
インスリンを発現する細胞がＫ細胞であるか否かを調べるために、組織がＧＩＰ抗血清に対して免疫反応性があるか分析した。簡潔に述べれば、組織をＢｏｕｉｎ液中で１晩固定し、パラフィン中に包埋した。組織切片（厚さ５μｍ）をスライドガラスにマウントした。免疫組織化学的試験にはアビジン−ビオチン複合体法をペルオキシダーゼおよび染色源としてジアミノベンチジンを用いて行った。切片をモルモット抗インスリン（１：５００、Ｌｉｎｃｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ．）もしくはマウス抗ＧＩＰ（１：２００、Ｒ．Ｐｅｄｅｒｓｏｎ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａから入手）と３０分間インキュベートし、適切な２次抗体と室温で２０分間インキュベートした。ビオチン化した２次抗体を免疫組織化学的検討に用い、フルオレセインもしくはＣｙ３をコンジュゲートさせた２次抗体を免疫蛍光法に用いた。その結果は、免疫反応性ＧＩＰの同時発現によって、インスリンを発現する細胞はＫ細胞であったことを示している（図１０）。これらの結果はヒトインスリン産生がマウスの腸管内のＫ細胞を効果的に目標とするものであることを確認するものである。
【０１３９】
実施例ＩＩＩ
本実施例はトランスジェニックマウスにおけるインスリンの産生が正常なグルコースのホメオスタシス、および糖尿病発症に対する防護を提供したことを示している。トランスジェニックマウスの腸管のＫ細胞からのヒトインスリンの産生はまた食事によっても調節される。本実施例は、トランスジェニックマウスによるグルコースで誘導可能なインスリンの産生が膵臓のβ−細胞の破壊後にグルコースのホメオスタシスを提供することを示しているデータについても述べている。
【０１４０】
トランスジェニックマウスの血漿中のヒトインスリンレベルが食事摂取に応答するか分析を行った。簡潔に述べれば、血漿中のインスリンレベルをヒト特異的インスリンＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯ）をキットの供給者の使用説明書に従って用いて測定した。このアッセイはヒトプロインスリンおよびＣ−ペプチドとの交差反応性が０．０１％未満であり、マウスのインスリンは検出しない。血漿中のＣ−ペプチド測定はラット／マウスＣ−ペプチドＲＩＡキット（Ｌｉｎｃｏ）を用いて行った。このアッセイではヒトＣ−ペプチドとの交差反応性は認められなかった。
【０１４１】
経口でのグルコースのチャレンジ後に採取した血漿サンプルをプールしたものでは、インスリンはトランスジェニック動物では３９．０±９．８ｐＭ（ｎ＝１０、平均±ＳＥＭ）であったが、対照の動物（ｎ＝５）では検出されなかった。Ｋ細胞から産生されるヒトインスリンが食事によって調節されるものであることを確認するために、トランスジェニックマウスを絶食させた。４０時間絶食させた後、血液サンプルを尾静脈から採取した。次いでマウスへの給餌を標準的な餌を用いて再開し、その食事開始の２４時間後に再度血液サンプルを採取した。
【０１４２】
図１１Ａに示すとおり、トランスジェニックマウスでは絶食させると循環血液中のヒトインスリンは４０％を超える著しい低下を示した（１３．０±４．２ ｐＭ 対 ７．６±２．３ ｐＭ、ｐ＜０．０３）。食事の制限を解除した後、給餌の再開は循環血液中のヒトインスリンの４００％を超える増加をもたらした。
【０１４３】
腸管のＫ細胞からのヒトインスリンの放出速度を評価するために、絶食トランスジェニックマウスに食事ペレット（０．５ｇ）の形の混合餌もしくは経口グルコースチャレンジ（３ｍｇ／ｇ体重）のいずれかを与えた。図１１Ｂに示すとおり、これらの経口の栄養素チャレンジは双方とも腸管のＫ細胞からのヒトインスリンの放出を、３０分以内に少なくとも２０％刺激した。これらの結果から腸管のＫ細胞からのインスリンの分泌が確かに食事によって調節されていることが確認された。
【０１４４】
興味深いことに、トランスジェニックマウスで経口によりグルコースを与えた後ではマウスＣ−ペプチドのレベルは対照より〜３０％低かった（２２７．１±３１．５ ｐＭ 対 ３６１．５±３１．２ ｐＭ、各群ｎ＝３、平均±ＳＥＭ）。この観察結果は腸管から産生されるヒトインスリンが内因性のインスリンの産生の補償的ダウンレギュレーションをもたらすことを示唆している。
【０１４５】
腸管のＫ細胞からのヒトインスリン産生がトランスジェニックマウスを糖尿病から防護する能力を調べた。ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）、これはβ細胞の毒素であるが、これをトランスジェニックマウスおよび年令をマッチさせた対照動物に投与した。簡潔に述べれば、クエン酸バッファー中のストレプトゾトシン（２００ｍｇ／ｋｇ体重）を８週令のトランスジェニックマウスおよび年令をマッチさせた対照マウスに腹腔内注射によって投与した。ストレプトゾトシンのこの投与量では、典型的にはマウスは注射後３日以内に糖尿を示す。
【０１４６】
対照の動物では、ＳＴＺ処理は絶食時の高血糖（２６．２±１．５２ ｍＭ、ｎ＝３、平均±ＳＥＭ）および尿中のグルコースの存在を３〜４日以内にもたらし、このことは糖尿病の発症を示している。これらの動物を治療せずに放置すれば７〜１０日以内に急速に悪化し死亡した。これに対して、トランスジェニックマウスではＳＴＺ処理後最長３ヶ月間糖尿、絶食時高血糖（９．５２±０．６７ ｍＭ， ｎ＝５， 平均±ＳＥＭ）の双方とも検出されず、これらの動物は正常な体重増加が続いた。
【０１４７】
これらのマウスでＫ細胞からのインスリン産生が経口のグルコース耐性をＳＴＺ処理によるβ細胞の激しいダメージにもかかわらず維持させているか調べるために、ＳＴＺ処理の５日後に経口的にグルコースを与えた。簡潔に述べれば、グルコースは４０％の溶液（ｗｔ／ｖｏｌ）として給餌チューブによって（１．５ｇ／ｋｇ体重）、１４時間絶食させたマウスに経口的に投与した。血液サンプル（４０μＬ）はグルコース投与の後、０、１０、２０、３０、６０、９０および１２０分の時点で尾静脈から採取した。血漿中のグルコースレベルは酵素を用いて、比色アッセイ（Ｓｉｇｍａ）で測定し、血漿中のインスリンレベルはヒト特異的インスリンＥＬＩＳＡキット（ＡＬＰＣＯ）を用いて測定した。
【０１４８】
ＳＴＺを与えられた対照のマウスはグルコース摂取の前および後の双方とも高度な高血糖を示した（図１２）。これに対して、ＳＴＺ処理したトランスジェニックマウスでは、血中グルコースレベルは正常で、年令をマッチさせた正常な対照のマウスと同様の経口的に与えたグルコースが急速に処理された（図１２）。
【０１４９】
これらの実験動物でＳＴＺ処理が効果的にβ細胞を破壊することを確認するために、対照およびＳＴＺ処理トランスジェニック動物から得た膵臓の切片を、前述のとおりマウスインスリンについて免疫染色して調べた。マウスインスリンについて陽性に染色された細胞クラスターの数は、偽の処理をした対照群に比べＳＴＺ処理動物では顕著に低かった（図１３）。ＳＴＺ処理トランスジェニックマウスでの膵臓の総インスリン量は、膵臓をホモゲナイズし、超音波処理を０．２５％ ＢＳＡ含有の２ｍＭの酢酸中で４℃で行うことによって評価した。氷上で２時間インキュベートした後、組織ホモジネートを再度超音波処理し、遠心し（８，０００ｇ， ２０分）、上清をラジオイムノアッセイでインスリンについてアッセイした。その結果は、ＳＴＺ処理トランスジェニックマウスでの膵臓中の総濃度は偽の処置をした対照群の０．５％であった（膵臓あたり、０．１８ 対 ３４．０μｇのインスリン、ｎ＝２）。これらのＳＴＺ処理トランスジェニックマウスが実質的に膵臓のβ細胞を有していないにもかかわらず、経口的に与えたグルコースを正常なマウスと同様に処理するという事実は、腸管で産生されたヒトインスリンが正常なグルコース耐性を維持するのに十分であることを示している。
【０１５０】
これらの知見は、腸管のＫ細胞からのインスリン産生によってそのマウスの糖尿病発症を防止することができ、また、正常なグルコース耐性が回復する程度までの正常なグルコースホメオスタシスをも提供することを示している。従って、腸管でのインスリンの発現は糖尿病などの高血糖状態を治療することのできる手段である。
【０１５１】
実施例ＩＶ
本実施例は栄養素に応答してタンパク質を産生する、形質転換された細胞の哺乳類被験体の組織中への移植について説明する。
【０１５２】
標的となる粘膜細胞を単離するために、被験体の十二指腸から生検によって組織を採取する。その生検組織を０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ； Ｓｉｇｍａ）含有の氷冷Ｈａｎｋ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ塩溶液（ＨＢＳＳ； Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）〜ｐＨ７．４中で洗い、メスを用いて細かく刻んだ後、７５Ｕ／ｍＬのＩ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、７５Ｕ／ｍＬのＸＩ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、０．９ＵのＩＸ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ）、および１Ｕ／ｍＬのトリプシン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ）を含有する酵素混合物中で１時間、３７℃の振盪ウォーターバス中で消化する。総液量をＨＢＳＳ−ＢＳＡで２倍とし、１０分間静置した。離れてきた細胞を含んだ上清を棄てる。残存する組織をさらに酵素の混合物中での消化を４５分間ずつ２回行い、各ステップの後に３００μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加し、１５分間おく。３回目の消化の後に得られる細胞懸濁液をＮｉｔｅｘメッシュ（２００μｍ， Ｂ＆ＳＨ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）を通過させてろ過し、０．０１％ジチオスレイトールおよび０．００１％ ＤＮａｓｅを添加したＨＢＳＳ−ＢＳＡで２回洗い、２００ｘｇで遠心する。次いで、細胞をＮｉｔｅｘメッシュ（６２μｍ， Ｂ＆ＳＨ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）を通過させて２回目のろ過を行い、計数し、懸濁分離法を行うためにＨＢＳＳ−ＢＳＡ−ＤＴＴ−ＤＮａｓｅで希釈して細胞を６ ｘ １０６ 個／ｍＬとする。
【０１５３】
粘膜の内分泌細胞は、細胞のカウンターフロー遠心懸濁分離法（Ｌｉｎｄａｈｌ， Ｐ．Ｅ．， Ｎａｔｕｒｅ １６１：６４８（１９４８））を用いて濃縮されるが、この方法は細胞をその沈降係数に基づいて分離するものである。その細胞懸濁液をポンプで回転チャンバーに注入し、細胞はその沈降速度が分離チャンバーを通過する液体の流れと釣り合うところで保持される。均質な細胞の種々の画分は、そのチャンバーを通過する流速を増加させるかもしくは遠心速度を減少させることのいずれかによって「溶出」される。適切な流速と遠心速度は経験的に決定される。１．５ ｘ １０８個の分散させた細胞からなるバッチをＨＢＳＳ−ＢＳＡの滅菌済みのソースと接続させたＢｅｃｋｍａｎ懸濁分離器（ｍｏｄｅｌ Ｊ２−２１ Ｍ／Ｅ； Ｂｅｃｋｍａｎ）中に、ポンプ（Ｃｏｌｅ Ｐａｌｍｅｒ）で入れる。
【０１５４】
酵素で分散させた粘膜細胞を懸濁分離器のチャンバー中にロードし、ローターの速度を２５００ｒｐｍで流速を２５ｍＬ／分とし、２分間洗う。流速を３０ｍＬ／分に変更した後、１００ｍＬの画分（Ｆ１）を集める。２番目の１００ｍＬの画分（Ｆ２）はローター速度２１００ｒｐｍおよび流速５５ｍＬ／分で得られる。Ｆ２からの細胞を２００ ｘ ｇで１０分間遠心することによって濃縮し、次いで５．５ｍＭのグルコース、５％ウシ胎児血清、２ｎｇ／ｍＬ神経増殖因子、８ｍｇ／Ｌインスリン、ｍｇ／Ｌヒドロコーチゾン、５０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、０．２５ｍｇ／ＬアムホテリシンＢ、５０Ｕ／ｍＬペニシリン、５０ｍｇ／Ｌストレプトマイシン、および２０μＭシトシンβ−Ｄ−アラビノフラノシドを含有する滅菌培地（ＤＭＥＭ（４７．５％））およびＨａｍ’ｓ Ｆ−１２Ｋ中に再懸濁する。
【０１５５】
この結果得られる粘膜の内分泌細胞を、Ｋｏｂａｙａｓｈｉら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１２５８（２０００））の方法に従って条件によって不死化となるようにする。培養粘膜細胞を、ＩＲＥＳおよびＨＳＶ−ｔｋ遺伝子と縦列でフューズさせた腫瘍遺伝子（例えば、特にテロメラーゼ、ｌａｒｇｅ−Ｔ抗原、ｖ−ｍｙｃ、ｒａｓ）と機能しうる形で連結されたＧＩＰプロモーターからなる遺伝子構築物を有している標準的な複製不能なレトロウイルスベクターを用いて形質導入する。インスリンと選択マーカーは別々のシストロンで発現される。この遺伝子構築物はリコンビナーゼ認識部位と近接しており、腫瘍遺伝子を切り出すことができ、その結果移植前に細胞の不死化をはずすことができる。
【０１５６】
不死化されたＫ細胞系統を確立するために、細胞の生き残ったクローン−腫瘍遺伝子に連結されたＧＩＰプロモーターを運ぶレトロウイルスベクターで形質導入されたもの−を免疫蛍光染色とウエスタンブロッティングでＧＩＰの発現を調べる。十分な量のＧＩＰを発現しているクローンはさらに増殖させてＫ細胞系統を確立する。そのＫ細胞系統をさらに、ヒトインスリンおよび正の選択マーカーをコードしている核酸と機能しうる形で連結されているＧＩＰプロモーターからなる遺伝子構築物を運ぶレトロウイルスベクターを用いて形質導入する。インスリンと選択マーカーは別々のシストロンで発現される。そのトランスフェクトされたＫ細胞を適切な選択薬剤とインキュベートする。生き残ったクローンを単離し、ヒトインスリンを発現しているか、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ）で試験する。
【０１５７】
適切なレベルのヒトインスリンを発現しているＫ細胞クローンを十分な細胞数が得られるまで培養する。哺乳類被験体中に移植する前に、ヒトインスリンを発現しているＫ細胞系統を腫瘍遺伝子を切り出すことによって不死化をはずす。このことは、適切なリコンビナーゼ（例えば、特にｃｒｅ、ｆｌｐ）を発現するアデノウイルスで細胞をトランスフェクトすることによって行われる。そのトランスフェクションの２４時間から４８時間後に細胞をガンシクロビルとインキュベートする。ガンシクロビルへの暴露の７８時間後に生き残った細胞（１０６〜１０１２個の細胞）を精製し、哺乳類被験体への移植用に調製する。
【０１５８】
あるいは別法として、粘膜前駆細胞もしくは幹細胞を十二指腸の生検で得て、酵素的に（例えばサーモリシン）解離させ、上述のとおり培養液中で増殖させる（Ｐｅｒｒａｅａｕｌｔ， Ｎ．とＢｅａｕｌｉｅｕ， Ｊ．Ｆ．， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ． ２４５：３４（１９９８）； Ｐｅｒｒａｅａｕｌｔ， Ｎ．とＢｅａｕｌｉｅｕ， Ｊ．Ｆ．， Ｅｘｐ． Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．， ２２４：３５４（１９９６））。これらの幹細胞および前駆細胞をＧＩＰ／Ｉｎｓ構築物を運ぶウイルスベクターを用いてトランスフェクトする。うまくトランスフェクトされた細胞を選択薬剤とインキュベートすることによって選択する。次いでこれらの遺伝子操作された細胞を分化するように誘導し、最後に哺乳類被験体中に移植する。
【０１５９】
要約すれば、本実施例はＫ細胞および粘膜内分泌前駆細胞を操作してヒトインスリンを産生させるためのｅｘ ｖｉｖｏ法を説明するものである。この操作された細胞はその細胞が採取された同じ被験体へ、もしくは異なる被験体へ移植することができる。その移植は本明細書に開示したいくつかの十分に確立された方法によって、もしくは当業界では既知の方法によって行うことができる。例えば、細胞を被包し哺乳類被験体の皮下に移植することができ、もしくは細胞を門脈を経由する送達を行って肝臓に移植することができる。
【０１６０】
本発明の多数の実施形態について述べてきた。だが、本発明の精神と範囲から乖離することなく種々の改変を行いうることは理解されるであろう。従って、その他の実施形態も特許請求の範囲に記載の範囲内にあるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、腫瘍由来腸内分泌細胞であるＳＴＣ−１中でのＧＩＰプロモーターによって駆動される緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現の可視化したものを示している。左側のパネルは明視野での細胞集団のサンプルを示している。同じ視野で左側のパネルは蛍光下でのもので、ＧＦＰ発現細胞の同定ができる。蛍光を発している細胞のクラスターを選択し、培養して増殖させＫ細胞系統のＧＴＣ−１を作成した。
【図２】
図２は、ＳＴＣ−１およびＧＴＣ−１細胞中でのＧＩＰ ｍＲＮＡの代表的なノーザンブロット分析で、ＧＩＰ産生Ｋ細胞でＧＴＣ−１は非常に豊富に認められる集団であることを示している。
【図３】
図３は、ヒトインスリンの発現をＫ細胞にターゲティングするために用いられるＧＩＰ／Ｉｎｓプラスミド構築物を図示したものである。このプラスミドはＧＩＰプロモーター（ＧＩＰ遺伝子の〜２．５ｋｂの５’調節配列。３個のエキソンは黒四角で示されている（Ｅ１、２、および３））と機能しうる形で連結されたヒトインスリン遺伝子のゲノム配列を含んでいる。プロインスリンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる検出に用いられたプライマーの位置は示されている。Ｈｉｎｄ ＩＩＩ（Ｈ）、Ｐｖｕ ＩＩ（Ｐ）、およびＸｈｏ Ｉ（Ｘ）部位は示されている。開始コドン（ＡＴＧ）および終止コドンの位置は示されている。
【図４】
図４は、腫瘍由来のＫ細胞中でのヒトインスリンおよびプロインスリンプロセシング酵素の発現を示している。上部のパネルはヒト膵島細胞（Ｈ）およびＧＴＣ−１細胞でＧＩＰ／Ｉｎｓプラスミドでトランスフェクトしたもの（Ｔ）もしくはトランスフェクトしていないもの（ＵＴ）から得たｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示している。サンプルは逆転写酵素を用いて（＋）もしくは用いずに（−）調製した。下部のパネルは、ＧＴＣ−１細胞およびβ−細胞系統（ＩＮＳ−１）中でのプロタンパク質転換酵素ＰＣ１／３およびＰＣ２発現のイムノブロット分析を示している。矢印はＰＣ１／３アイソフォームの予測された産物のサイズ（６４および８２ｋＤ）、ならびにＰＣ２アイソフォームの予測された産物のサイズ（６６および７５ｋＤ）を示している。
【図５】
図５は、ＧＩＰ／Ｉｎｓ構築物でトランスフェクトされた（Ｔ）またはトランスフェクトされていない（ＵＴ）ＧＴＣ−１細胞からの培地中で検出されたヒトインスリンおよびＣ−ペプチドのレベルを示している。ヒトインスリンおよびＣ−ペプチドはそれぞれ、白の棒グラフおよび黒の棒グラフで示している。
【図６】
図６は、ＧＩＰ／Ｉｎｓプラスミドで安定にトランスフェクトされたＧＴＣ−１細胞からのインスリン分泌に対するグルコースの刺激効果を示したグラフである。
【図７】
図７は、マウス十二指腸切片におけるグルコキナーゼ（ＧＫ、赤）およびＧＩＰ（緑）の同時発現を示している。
【図８】
図８は、トランスジェニック創始系統のゲノムのサザンブロットおよびＰＣＲによる同定を示している。マウス数は最上部に示している。
【図９】
図９は、ＧＩＰ／Ｉｎｓ構築物を含んでいるトランスジェニックマウスの標的をＫ細胞としたヒトインスリン発現を示している。上部パネルはヒト膵島細胞、対照の十二指腸（マウス）およびトランスジェニックマウス組織中でのヒトインスリン遺伝子発現の代表的なノーザンブロット分析を示している。下部パネルは、２匹のトランスジェニックマウスから得たヒト膵島（Ｈ）、マウス膵島（Ｍ）、および十二指腸サンプル（Ｄ）の、ｃＤＮＡのヒトもしくはマウス特異的プロインスリンプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。サンプルは逆転写酵素の存在下（＋）、もしくは不在下（−）で調製した。φはＤＮＡがないことを示し、Ｍはマーカーを示す。
【図１０】
図１０は、トランスジェニックマウスから得た、胃（左のパネル）および十二指腸（中央のパネル）の切片中でのヒトインスリンについての免疫組織化学的染色結果を示している。右側のパネルは同じ動物からの十二指腸切片を、インスリン（ＩＮＳ、緑）およびＧＩＰ（赤）に特異的な抗血清で同時染色した後の免疫蛍光顕微鏡による観察所見を示している。
【図１１】
図１１Ａは、トランスジェニックマウスの腸管のＫ細胞からのヒトインスリンの産生が食事によって調節されるものであることを示すグラフである。
図１１Ｂは、トランスジェニックマウスの腸管のＫ細胞からのヒトインスリンの混合食試験および経口でのグルコースのチャレンジに応答して放出速度を示すグラフである。
【図１２】
図１２は、正常の対照マウス、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）処理対照マウス、およびＳＴＺ処理トランスジェニックマウスの、経口でのグルコースのチャレンジ（１．５ｇ グルコース／ｋｇ体重）後の血中グルコース濃度の変化を示すグラフである。
【図１３】
図１３は、対照マウスおよびＳＴＺ処理トランスジェニックマウスから得た膵臓切片中でのマウスインスリンについての免疫組織化学的染色の結果を示す一連の顕微鏡写真である。矢印は膵島を示す。
【図１４】
図１４は、ラットＧＩＰおよびマウスクロモグラニンＡ遺伝子プロモーター領域のヌクレオチド配列である。
【図１５】
図１５は、マウスセクレトグラニンＩＩ（アクセス番号ＡＦ０３７４５１）のプロモーターおよびエキソン１、ならびにマウスグルコキナーゼ遺伝子プロモーター（アクセス番号Ｕ９３２７５）の５’部分のヌクレオチド配列である。
【図１６】
図１６は、マウスグルコキナーゼ遺伝子プロモーター（アクセス番号Ｕ９３２７５）の３’部分、ヒトアデノシンデアミナーゼ遺伝子プロモーター領域（アクセス番号Ｘ０２１８９）のヌクレオチド配列；ヒトプレプロインスリンのアミノ酸配列、およびプレプロインスリンの５’領域の６０ｂｐである。
【図１７】
図１７は、ヒトプレプロインスリンの残りの３’部分およびヒトレプチン遺伝子ｃＤＮＡの５’部分のヌクレオチド配列である。
【図１８】
図１８は、ヒトレプチンの残りの３’部分、ヒトＣＣＫアミノ酸およびヌクレオチド配列、ならびにラットＣＣＫプロモーターの６０ｂｐである。
【図１９】
図１９は、ラットＣＣＫプロモーターの残りの３’部分のヌクレオチド配列、ならびにヒト成長ホルモンのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。
【図２０】
図２０は、ラットＧＩＰプロモーターの−１から−１８９４ｂｐまでの配列である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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