(57)【要約】本発明は、特異的な組織において核内受容体調節遺伝子を同定する方法に関する。特に、方法はまた組織−特異的様式にてｉｎ ｖｉｖｏでＰＰＡＲγ核内受容体調節標的遺伝子を活性化する方法も提供する。【選択図】図１
2004500894.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の特定の組織において核内受容体により調節される遺伝子を同定する方法であって：
（ａ）ヘルペスウイルスＶＰ１２６タンパク質の転写活性化ドメインにＮ−末端で融合する構成的に活性のある核内受容体遺伝子であって、組織−特異的発現を駆動するプロモーターエレメントと連結する前記の核内受容体遺伝子、を含有する発現ベクターを提供すること；
（ｂ）前記の動物に前記の構成的に活性のある核内受容体遺伝子を転移すること；
（ｃ）前記の動物においてｉｎ ｖｉｖｏで前記の構成的に活性のある核内受容体遺伝子を発現させること；
（ｄ）前記の特定の組織において前記の核内受容体の候補標的遺伝子の発現のレベルを決定すること；および
（ｅ）変化した発現を示す遺伝子を同定すること、
を含む、前記の方法。
【請求項２】
候補標的遺伝子の発現のレベルが前記の構成的に活性のある核内受容体遺伝子を発現しない対照組織と比較される、請求項１の方法。
【請求項３】
前記の構成的に活性のある核内受容体遺伝子がＶＰ−ＰＰＡＲγである、請求項１の方法。
【請求項４】
前記のプロモーターエレメントがクレアチンキナーゼ、主要尿タンパク質、ＡＰ２およびアンカップリングタンパク質１のためのプロモーターから選択される、請求項１の方法。
【請求項５】
前記の特定の組織が骨格筋、褐色脂肪、白色脂肪および肝臓から選択される、請求項１の方法。
【請求項６】
動物の特定の組織において核内受容体により調節される遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏでの発現をモジュレートする方法であって：
（ａ）ヘルペスウイルスＶＰ１２６タンパク質の転写活性化ドメインにＮ−末端で融合する構成的に活性のある核内受容体遺伝子であって、組織−特異的発現を駆動するプロモーターエレメントと連結する前記の核内受容体遺伝子、を含有する発現ベクターを提供すること；
（ｂ）前記の動物に前記の構成的に活性のある核内受容体遺伝子を転移すること；
（ｃ）前記の動物においてｉｎ ｖｉｖｏで前記の構成的に活性のある核内受容体遺伝子を発現させること、
を含む、前記の方法。
【請求項７】
前記の構成的に活性のある核内受容体遺伝子がＶＰ−ＰＰＡＲγである、請求項６の方法。
【請求項８】
前記のプロモーターエレメントがクレアチンキナーゼ、主要尿タンパク質、ＡＰ２およびアンカップリングタンパク質１のためのプロモーターから選択される、請求項６の方法。
【請求項９】
前記のプロモーターエレメントがアンカップリングタンパク質１のためのプロモーターである、請求項８の方法。
【請求項１０】
前記の特定の組織が骨格筋、褐色脂肪組織、白色脂肪組織および肝臓から選択される、請求項６の方法。
【請求項１１】
前記の特定の組織が褐色脂肪組織である、請求項１０の方法。
【請求項１２】
ヘルペスウイルスＶＰ１２６タンパク質の転写活性化ドメインにＮ−末端で融合する構成的に活性のある核内受容体遺伝子であって、組織−特異的発現を駆動するプロモーターエレメントと連結する前記の核内受容体遺伝子、を有するトランスジェニック非ヒト動物。
【請求項１３】
前記の核内受容体遺伝子がＰＰＡＲγである、請求項１２のトランスジェニック動物。
【請求項１４】
前記のプロモーターエレメントが褐色脂肪組織−特異的発現を駆動する、請求項１２のトランスジェニック動物。
【請求項１５】
前記のプロモーターエレメントがアンカップリングタンパク質１のためのプロモーターである、請求項１２のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
褐色脂肪組織を有する哺乳動物において糖尿病を予防するあるいは治療する方法であって：
（ａ）ヘルペスウイルスＶＰ１２６タンパク質の転写活性化ドメインにＮ−末端で融合する構成的に活性のあるＰＰＡＲγ遺伝子であって、褐色脂肪組織−特異的発現を駆動するプロモーターと機能的に結合する前記のＰＰＡＲγ遺伝子、を含有する発現ベクターを提供すること；
（ｂ）前記の哺乳動物に前記の構成的に活性のあるＰＰＡＲγ遺伝子を転移すること；
（ｃ）前記の哺乳動物の褐色脂肪組織において前記の構成的に活性のあるＰＰＡＲγ遺伝子を発現させること、
を含む、前記の方法。
【請求項１７】
褐色脂肪組織−特異的発現を駆動する前記のプロモーターがアンカップリングタンパク質１のためのプロモーターである、請求項１６の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連する申請の相互参照
本出願は、１９９９年６月１８日に出願された仮出願シリアル番号６０／１３９，７１８からの優先権を主張する、２０００年６月１６日に出願された同時係属中の先願出願シリアル番号０９／５９６，０８３の一部継続出願である。
【０００２】
発明の背景
１．  技術分野
本出願は、ＰＰＡＲγ核内受容体により調節される標的遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで活性化する方法に関する。特定の組織におけるＰＰＡＲγの活性化は、十分に糖尿病の発症を予防する。
【０００３】
２．  発明の背景
抗糖尿病薬のチアゾリジンジオン（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ）クラスは、ＮＩＤＤＭを有する患者におけるインスリン抵抗性、高血糖および高脂質血症を軽減するいくつかの糖尿病治療の１つを表す。チアゾリジンジオンは核内受容体スーパーファミリーの一員である、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体−γのリガンドである。この分子の結合は、チアゾリジンジオンがＰＰＡＲγ標的遺伝子を制御することにより、それらのインスリン抵抗性効果を達成することを意味する。しかし、インスリン感受性とＰＰＡＲγ活性化を結合する正確な経路は、謎のままである。特に、ＰＰＡＲγ作用の標的組織は未知である。それゆえ、どのＰＰＡＲγ標的遺伝子がインスリン反応の正常化に寄与するのかは不明である。
【０００４】
分子クローニング研究から、ステロイド、レチノイド、ビタミンＤおよび甲状腺ホルモンの核内受容体は、構造的および機能的に関連する制御タンパク質のスーパーファミリーを含むことが証明された。核内受容体は、それらの標的遺伝子のプロモーター中のシス−作用エレメント（応答エレメント）に結合する中央ＤＮＡ結合ドメインを含有する。一度応答エレメントに結合すると、核内受容体は高い親和性および特異性でホルモンを結合するそれらの保存的Ｃ−末端リガンド結合ドメインを介して、特異的な遺伝子の転写を活性化する。リガンド結合ドメインは、いくつかの内蔵された（ｅｍｂｅｄｄｅｄ）サブドメインを含有する複合エンティティー（ｅｎｔｉｔｙ）である。これらには、Ｃ−末端トランス活性化機能および二量体化インターフェースが含まれる。核内受容体への特異的リガンドの結合は、トランス活性化ドメインおよびいくつかの転写コアクチベーター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ）複合体の間の相互作用を促進する構造変化を引き起こす。これらの複合体はクロマチンを不安定化して、転写を活性化する。この機序を介して、核内受容体はそれらの特異的リガンドに反応して直接的に転写を制御する。
【０００５】
制御タンパク質のこのスーパーファミリーの特徴における重要な前進は、ホルモン受容体の構造的特徴を保持するが既知のリガンドを欠いている遺伝子産物がますます多く発見されていることである。これらはオーファン受容体として知られており、核内受容体スーパーファミリーの古典的な構成分子と同様に、ＤＮＡおよびリガンド結合ドメインを有している。それらは、まだ同定されていないシグナル伝達分子の受容体であると信じられている。
【０００６】
ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体（ＰＰＡＲ）は、構造的に関連する核内受容体のスーパーファミリーを表している。３つのサブタイプが記載されている：ＰＰＡＲα、γ、およびδである。全てのＰＰＡＲサブタイプのためのＤＮＡ認識配列は、１つのヌクレオチドにより分離される直接的に繰り返すコア−部位からなる。共通認識配列はＸＸＸＡＧＧＴＣＡＸＡＧＧＴＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １）であるが、しかし、コア−部位（ＡＧＧＴＣＡ； ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２）は可変であり、１つあるいはそれ以上のヌクレオチドで変化しうる。ＤＮＡに結合するために、ＰＰＡＲは９−シスレチノイン酸受容体（ＲＸＲ）と二量体化を形成しなければならない。
【０００７】
ＰＰＡＲのαサブタイプは肝臓にて高レベルで発現しており、もともと齧歯類においてペルオキシソーム増殖を誘導する薬剤の転写効果を媒介する分子として同定された。加えて、ＰＰＡＲαは脂肪酸の分解（β−およびω−酸化）に関連する様々な遺伝子に結合して転写を制御する。機能的ＰＰＡＲαを欠損するマウスはβ−酸化能力の低下を示し、ＰＰＡＲαリガンドに反応するこの能力を増加させることができない。さらに、これらのマウスは薬理学的な刺激に反応して不適切に脂質を蓄積して、遅発性肥満を発症する。これらのデータをまとめると、ＰＰＡＲαは脂肪酸シグナルに反応して脂質異化を誘導するフィードバックループの中で、センサーおよびエフェクターの両方として作用することが示される。
【０００８】
ＰＰＡＲαに対して、ＰＰＡＲのγサブタイプは脂肪酸貯蔵の反対のプロセスにおいて重要な役割をしている。ＰＰＡＲγは、脂肪細胞において高レベルで発現し、そこでは脂質生成にとって重要であることが示されている。実際、線維芽細胞におけるＰＰＡＲγの強制発現により、脂肪細胞−特異的遺伝子の発現および最終的にはトリグリセリド蓄積を導く転写カスケードが開始する。これは、ＰＰＡＲγ活性をモジュレートするシグナルが、制御的なエネルギーの恒常性に重要な役割をしているかもしれないことを意味する。
【０００９】
ＰＰＡＲδは偏在的に発現され、いくつかの多価不飽和脂肪酸ならびにＰＧＩ２の合成アナログであるカルバプロスタサイクリンに結合する。ＰＰＡＲδは着床の調節、および大腸癌に対する非ステロイド性抗炎症薬の抑制効果に寄与することが示唆された。
【００１０】
ＰＰＡＲが脂質恒常性を制御することは、推定されるＰＰＡＲリガンドが脂質恒常性の内因的な制御因子に相当したことを意味する。ＰＰＡＲγの１つのリガンドは、１５−デオキシ−Δ１２，１４−プロスタグランジンＪ２（１５ｄ−Ｊ２）と同定された。抗糖尿病剤のチアゾリジンジオンクラスは１５ｄ−Ｊ２を模倣しており、強力なリガンドとして作用する。さらに、抗糖尿病剤としてのチアゾリジンジオンの能力は、それらのＰＰＡＲγに対するｉｎ ｖｉｔｒｏでの親和性と相関する（Ｆｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ８３：８０３−８１２ （１９９５）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ３９：６６５−６６８ （１９９６））。これらのデータから、ＰＰＡＲγはこれらの化合物の抗糖尿病活性を媒介することが示唆される。
【００１１】
いくつかのその他の研究により、チアゾリジンジオンはＮＩＤＤＭの齧歯類モデルにおいて同時にインスリン感受性を増進させ、および脂肪細胞の数／大きさを増加させることが示された。同様に、遺伝子解析から、Ｎ−末端ＰＰＡＲγに活性化変異を有するヒトにおいて、肥満およびより低度のインスリン抵抗性の間の関連が示唆された（Ｒｉｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ．３３９：９５３−９５９ （１９９８））。体重増加および肥満とＮＩＤＤＭを関連づける疫学的研究に基づくと、ＰＰＡＲγの活性化が細胞培養において脂肪生成を誘導し、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでインスリン感受性を増進させることができることは、逆説性を表す。しかし、齧歯類での薬理学的データのように、遺伝的データはＰＰＡＲγの活性化はインスリン抵抗性と脂質生成を切り離すことを示唆する。
【００１２】
チアゾリジンジオンは骨格筋、脂肪組織および肝細胞におけるインスリン抵抗性を逆転させる（Ｋｏｍｅｒｓ ａｎｄ Ｖｒａｎａ，Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｓ． ４７（４）：２１５−２２５ （１９９８））。インスリン反応性の増加は、ＮＩＤＤＭと関連する広範な代謝異常の正常化に伴って起こり、その異常にはグルコース、インスリン、トリグリセリド、遊離脂肪酸およびＬＤＬ−コレステロールのレベルの上昇が含まれる。チアゾリジンジオンは糖尿病でない動物ではインスリン分泌を促進せず、および低血糖剤としても作用せず、ＰＰＡＲγがインスリン抵抗性の発生における重要なステップを逆転させる遺伝子を制御することを意味する。
【００１３】
何がインスリン抵抗性を引き起こすのか、およびどのようにＰＰＡＲγ活性化がこのプロセスを逆転させるのかを説明するためにいくつかの興味深い仮説が提唱された。インスリン抵抗性は遊離脂肪酸の循環レベルの増加に起因しうる（ＭｃＧａｒｒｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：７６６−７７０ （１９９２））。もしこの場合、ＰＰＡＲγ活性化は脂肪細胞中の脂肪酸貯蔵の増加を促進することにより、インスリン抵抗性を逆転させると予測されるであろう。しかし、これは、遊離脂肪酸が全ての糖尿病モデルで上昇するわけではないこと、および他の治療を使用して脂肪酸を低下させることがインスリン感受性を増進させるためには十分ではないことを説明しない。あるいは、Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎおよび同僚は、インスリン抵抗性は糖尿病の脂肪組織におけるＴＮＦαの産生の増加に起因することを示唆した（Ｕｙｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３８９：６１０−６１４ （１９９７））。この理論に基づくと、ＰＰＡＲγはインスリンシグナル伝達のＴＮＦα−媒介阻害をブロックすることにより作用するが、しかし、これはＮＩＤＤＭの全てのモデルとは一致しない。このように、どのようにＰＰＡＲγがインスリン抵抗性を正常化するかは不明のままである。
【００１４】
ＰＰＡＲγは、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）および白色脂肪組織（ＷＡＴ）の両方において高レベルで発現する。ＰＰＡＲγのｉｎ ｖｉｖｏでの投与は、両方の脂肪貯蔵物のサイズを増加することを示した。従って、原則的に、これらの組織の両方ともがインスリン反応性の制御に関連する可能性があるだろう。ＢＡＴおよびＷＡＴの両方のレベルが低下したトランスジェニックマウスは、脂肪細胞特異的ａＰ２プロモーターを使用して、これらの組織でジフテリア毒素を発現させることによりつくることができる（Ｂｕｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １００：２９００−２９０８ （１９９７））。月齢８−１０ヶ月までのこれらのマウスは、一見すると皮下あるいは腹腔内トリグリセリド−含有脂肪組織を欠損する。トリグリセリド含有細胞の欠乏は、インスリン抵抗性の増加の進行および糖尿病の発症を伴った。脂肪組織の一見すると明らかな欠乏にもかかわらず、これらのマウスへのチアゾリジンジオンの投与はまだインスリン感受性を引き起こした。これらの知見から、チアゾリジンジオンの抗糖尿病作用はチアゾリジンジオンにより誘導される脂肪細胞トリグリセリド含有量の増加とは独立して起こること、およびおそらく脂肪組織とは独立して起こることが示される（Ｂｕｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １００：２９００−２９０８ （１９９７））。しかし、これはどのように脂肪細胞が定義されるかに依存しうる。ＰＰＡＲγは脂肪生成の過程の早期に誘導されること、およびＰＰＡＲγ発現にはそれに引き続いて脂肪細胞におけるａＰ２プロモーターの活性化が必要であることが知られている。この転写カスケードの後に大量のトリグリセリド蓄積が起こる。Ｇｒａｖｅｓおよび同僚により用いられた“脂肪−フリー”マウスの生成のためのストラテジーは、脂肪−特異的ａＰ２プロモーターの調節下での毒性導入遺伝子の発現に依存する。しかし、脂肪における毒性導入遺伝子の発現にはＰＰＡＲγの存在が必要であるので、これらのマウスは脂肪組織の萎縮性遺残組織においてＰＰＡＲγを発現する脂肪細胞前駆体を保持している必要がある。従って、チアゾリジンジオンの作用は成熟脂肪組織とは独立している、と言うことはより正確でありうる。先の研究では、チアゾリジンジオンの抗糖尿病効果が脂肪細胞系の細胞により媒介されるかどうかの問題に取り組む計画をしていなかった。
【００１５】
ＰＰＡＲγはまた骨格筋および肝臓で発現されうるが、その発現レベルはこれらの組織では脂肪細胞に比べて少なくとも１０倍低い。骨格筋におけるＰＰＡＲγ発現の解析は、筋細胞の間で互いに入り組んだ脂肪細胞の存在のため面倒であった。ＰＰＡＲγは脂肪において高レベルで発現するので、ノーザンブロットで見られるＰＰＡＲγ転写は混入している脂肪細胞から由来している可能性がある。ＰＰＡＲγ−特異的抗体を用いた免疫組織化学的アッセイにより、ＰＰＡＲγが筋細胞核において低レベルで発現することが示された。ｉｎ ｖｉｖｏでの骨格筋のグルコース摂取感受性を増進するチアゾリジンジオンの能力にもかかわらず、これらの化合物は５時間の暴露後グルコース摂取に対する検出可能な効果を示さなかった。チアゾリジンジオンの抗糖尿病効果は治療の１−２週間後にのみ観察されるので、より長期間の暴露が抗糖尿病反応を顕在化するために必要であるかもしれないが、しかし、この長さの時間の間培養にて表現型筋細胞を維持することは困難である。同様な理由のため、肝臓がチアゾリジンジオンの抗糖尿病効果の直接的な標的であるかどうかは不明である。
【００１６】
ＰＰＡＲγ遺伝子を欠損している“ノックアウト”マウスは、胚致死表現型（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｌｅｔｈａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）を有する。従って、これらのマウスは成熟した動物でのＰＰＡＲγの効果を研究するには有用でない。原理的には、ＰＰＡＲγの組織−特異的ノックアウトを生成することにより、胚致死表現型を回避できるかもしれない。実際、このアプローチは標的組織において十分な量のｃｒｅ−リコンビナーゼ（ｃｒｅ−ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ）を発現する必要性のために面倒であった。これらの技術的な困難が克服できると仮定すると、その結果としてのマウスはＰＰＡＲγ機能の欠損から生じる生理学的な結果の解析に有用であるだろう。いずれの場合でも、これらのマウスはＰＰＡＲγ活性化の結果を研究するには有用ではないであろう。薬剤によるＰＰＡＲγの活性化に際してどのような効果が個々の組織にあるだろうか等を研究する方法は、非常に有用であろう。
【００１７】
発明の概要
従って、本発明は動物の特定の組織において核内受容体により調節される遺伝子を同定する方法を提供し、それはヘルペスウイルスＶＰ１２６タンパク質の転写活性化ドメインにＮ−末端で融合し、および組織−特異的発現を駆動するプロモーターエレメントに連結する構成的に活性のある核内受容体遺伝子を含有する発現ベクターを提供すること、構成的に活性のある核内受容体遺伝子を動物へ転移させること、動物において構成的に活性のある核内受容体遺伝子を発現させること、組織において核内受容体の候補標的遺伝子の発現のレベルを決定すること、および変化した発現を提示する遺伝子を同定することを含む。
【００１８】
別な態様では、本発明は動物の特異的な組織にて核内受容体により調節される遺伝子のｉｎ ｖｉｖｏでの発現をモジュレートする方法を提供し、それはヘルペスウイルスＶＰ１２６タンパク質の転写活性化ドメインにＮ−末端で融合し、および組織−特異的発現を駆動するプロモーターエレメントに連結する構成的に活性のある核内受容体遺伝子を含有する発現ベクターを提供すること、構成的に活性のある核内受容体遺伝子を動物へ転移させること、動物において構成的に活性のある核内受容体遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで発現させることを含む。
【００１９】
さらに別な態様では、本発明はヘルペスウイルスＶＰ１２６タンパク質の転写活性化ドメインにＮ−末端で融合し、および組織−特異的発現を駆動するプロモーターエレメントに連結する構成的に活性のある核内受容体遺伝子を有するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。好ましくは、核内受容体遺伝子はＰＰＡＲγであり、プロモーターエレメントは褐色脂肪組織−特異的発現を駆動する。好ましいプロモーターは、プロモーター型アンカップリングタンパク質１である。
【００２０】
さらにさらなる態様では、本発明は活性のあるＰＰＡＲγ発現を褐色脂肪組織中に特異的に含む褐色脂肪組織を有する哺乳動物において、糖尿病を予防する方法を提供する。
【００２１】
発明の詳細な説明
褐色脂肪、白色脂肪、骨格筋あるいは肝臓のいずれかにおいて、ＰＰＡＲγの構成的な活性型を発現するトランスジェニックマウスが開発された。各々のマウス株は、正常あるいは糖尿病誘発状態下でインスリン反応性のパラメーターについて評価されるであろう。これは、組織のいずれか１つ（あるいは組み合わせ）におけるＰＰＡＲγ標的遺伝子の活性化が、ｉｎ ｖｉｖｏでのインスリン抵抗性を軽減するために十分かどうかの決定を可能にするであろう。インスリン抵抗性はＮＩＤＤＭの特徴を定義づけるものあるため、この現象をより深く理解することはさらに効果的な治療的ストラテジーの開発を助けるはずである。
【００２２】
ＰＰＡＲγの構成的な活性型は、ＰＰＡＲγのＮ−末端にヘルペスウイルスＶＰ１２６タンパク質の転写活性化ドメインを融合することにより生成された（ＶＰ−ＰＰＡＲγ）。Ｎ−末端融合が行われたが、これはこれが受容体のＤＮＡ結合あるいは二量体化活性を変化させないからである。ＶＰ１６トランス活性化ドメインは、それが十分に特徴付けられており、核内受容体リガンドとは独立して機能することが知られていたために選ばれた。最近の研究は、ＶＰ１６はＰＰＡＲγおよびその他の核内受容体（ＴＲＡＰ／ＳＭＣＣ）により利用されるものと識別不可能である転写活性化複合体を補充することを示す。変化した受容体は、リガンドの非存在下ではＰＰＡＲγ応答エレメントを介して転写を活性化したが、野生型受容体と同様なＤＮＡ結合およびトランス活性化特異性を有する。ＦＩＧ． １ に示されるように、ＶＰ−ＰＰＡＲγキメラはリガンドの非存在下でＰＰＡＲγ応答エレメントを活性化するが、ＲＸＲホモダイマーに特異的な密接に関連するＤＲ−１型応答エレメント（ＣＲＢＰＩＩ）を含む非ＰＰＡＲγ応答エレメントに対する効果は有していない。
【００２３】
ＶＰ−ＰＰＡＲγの生物学的活性をさらに確認するために、この受容体をＴｏｎｔｏｎｏｚおよびＳｐｉｅｇｅｌｍａｎにより確立された脂肪生成系を使用して、ＰＰＡＲγリガンドの非存在下で脂肪細胞分化の誘導に関してテストした（Ｔｏｎｔｏｎｏｚ ａｎｄ Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ，Ｃｅｌｌ ７９：１１４７−１１５６ （１９９４））。この系におけるＮＩＨ ３Ｔ３細胞はＰＰＡＲγを欠損しており、このため脂肪細胞に分化ができない。しかし、これらの細胞がＰＰＡＲγ−発現レトロウイルスに感染すると、ＰＰＡＲγリガンドの存在下で脂肪細胞分化が行われるだろう。ＶＰ−ＰＰＡＲγは複製欠損レトロウイルス発現ベクター（ｐＢＡＢＥ）中でクローン化された。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞での野生型受容体の発現により、ＰＰＡＲγリガンドに反応してほとんど１００％分化が行われた細胞が生み出された。対して、ＶＰ−ＰＰＡＲγ発現レトロウイルスは、ＰＰＡＲγリガンドの非存在下で同程度に効果的な脂肪細胞転換を導いた（データは示していない）。これらの結果はトランスフェクション研究と一致しており、ＶＰ−ＰＰＡＲγが生物学的に関連した系においてＶＰ−ＰＰＡＲγの構成的な活性型として作用することを確認する。
【００２４】
そして、トランスジェニックマウスのＢＡＴ、ＷＡＴ、骨格筋および肝臓に対して。このキメラの発現を特異的に示すであろうトランスジェニック発現ベクターを構築した。トランスジェニック発現ベクターは、組織−特異的発現を駆動することが知られている以下のプロモーターエレメントに結合するＶＰ−ＰＰＡＲγを含有した：骨格筋中のクレアチンキナーゼ（Ｍｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ． １３７：２３９７−２４０５ （１９９６））；肝臓中の主要尿タンパク質（Ｈｅｌｄ ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ． ８：１８３−１９１ （１９８９））；全脂肪組織中のａＰ２（Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ７：１３１８−１３２４ （１９９３））；および褐色脂肪組織中のアンカップリングタンパク質１（Ｌｏｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３６：７４０−７４２ （１９９３））。これらのプロモーターの組織特異性はよく記載されており、それらは胎児発生中の非常に後期あるいは生後数週間以内に転写される。従って、この方法は組織におけるキメラ受容体の発現、およびトランスジェニック発現に起因する発生欠損の潜在的な問題を回避する時間−特異的様式を可能にする。
【００２５】
上記した導入遺伝子をＣ５７ＢＬ／ＫｓＪマウス由来の接合体に注入して、トランスジェニックマウスのいくつかの系統をつくった。これらのマウスはＮＩＤＤＭの発症を遺伝的に起こしやすいことが知られている。生後、トランスジェニックマウスはＰＣＲプライマーの２つの異なるセットを使用して導入遺伝子の統合に関してスクリーニングした。陽性マウスは、特異的に導入遺伝子を認識するＶＰ１６プローブを使用したサザンブロット解析により確認した。各々のプロモーター構造について、一見するとインタクト（ｉｎｔａｃｔ）な導入遺伝子が組み込まれているいくつかの創始マウス（ｆｏｕｎｄｅｒ）を同定した（ＦＩＧ． ２）。
【００２６】
創始マウス（ｆｏｕｎｄｅｒ ｍｉｃｅ）は、ＰＰＡＲγ−特異的プローブの組織特異的発現に関してスクリーニングした。キメラタンパク質の発現のレベルは、本来のＶＰ−ＰＰＡＲγキメラ内で操作された９アミノ酸エピトープタグを特異的に認識するモノクローナル抗体（１２ＣＡ５）を使用したウエスタンブロット解析により決定されるであろう。インタクトな導入遺伝子を含有するいくつかの系統はさらに、導入遺伝子の５’および３’末端にかかる２つの独立したプライマー対を使用したＲＴ−ＰＣＲ解析により、導入遺伝子の組織特異的発現について解析した。ＦＩＧ． ３に示すように、いくつかの系統は褐色脂肪において導入遺伝子を発現したが、白色脂肪、骨格筋および肝臓を含む、グルコース恒常性にとって重要なその他の組織では発現しなかった。
【００２７】
導入遺伝子の機能性を確認するため、いくつかの既知のＰＰＡＲγ標的遺伝子（例えば、ＵＣＰ、ａＰ２）の発現のレベルを測定した。これらの標的遺伝子の発現のレベルの上昇は、機能的なＶＰ−ＰＰＡＲγを発現するトランスジェニック動物において期待されるであろう。ＶＰ−ＰＰＡＲγを発現するマウスの異なる株は、各々のプロモーター構造に関して選択した。これらのマウスはＲＴ−ＰＣＲにより解析され、その結果は導入遺伝子が期待される発現のパターンを示すことを表す。例えば、ＶＰ−ＰＰＡＲγ導入遺伝子を含有するマウスは、褐色脂肪では導入遺伝子を発現したが、白色脂肪、肝臓、骨格筋あるいは調べたその他の組織では発現しなかった。マウスのコロニーは以下に記載する解析のために増大させた。
【００２８】
マウスの皮相的な（ｃｕｒｓｏｒｙ）表現型解析により、導入遺伝子が適切に発現することが示唆される。具体的には、ＵＣＰ−ＶＰ−ＰＰＡＲγマウスは褐色脂肪のみで発現を有し、アンカップリングタンパク質１の過剰産生傾向が期待されるであろう。Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２９９０９−２９９１４ （１９９６）。ＵＣＰ−１活性は脂肪の燃焼に関係するので、これらのマウスは白色脂肪貯蔵の低下が期待されうる。
【００２９】
糖尿病の発症およびインスリン抵抗性に対する褐色脂肪でのＶＰ−ＰＰＡＲγ発現の効果を調べるために、自然に糖尿病を発症する成熟マウス（１−１．５年）における導入遺伝子発現の代謝効果を調べた。ＦＩＧ． ４に示すように、野生型雌マウスは空腹時グルコース（図４Ａ）およびインスリンレベル（図４Ｂ）が上昇したのに対し、それらのトランスジェニック対応マウスでは正常範囲内の循環グルコース値であった。これらのデータは、褐色脂肪におけるＶＰ−ＰＰＡＲγ発現がインスリン抵抗性および糖尿病の発症を予防することを示す。トランスジェニックマウスはレプチンレベルの低下も示したが（図４Ｃ）、血清トリグリセリド（図４Ｄ）およびコレステロール（図４Ｅ）のレベルにおける違いは示さなかった。体重（図４Ｆ）および食物摂取（図４Ｇ）の試験では、食物摂取は野生型対照よりもトランスジェニックマウスでより高いことを示した。しかし、食物摂取の増加にもかかわらず、これらのマウスは体重上昇を示さず、それらの代謝はより効率的であることが示唆される。トランスジェニックマウスは体温上昇をしており、導入遺伝子が産熱を介してエネルギー消費の増加を促進させることが示唆される（図４Ｈ）。
【００３０】
野生型およびトランスジェニックマウス由来の褐色脂肪の組織学的解析により、トランスジェニックマウスはトリグリセリドの蓄積が低下したより小さい脂肪細胞を有することが示された（図５）。褐色脂肪を採取して、切片を作成してトリグリセリド特異的染色剤であるＯｉｌ−Ｒｅｄ−Ｏで染色した。トランスジェニック褐色脂肪の外見は、より若いマウス由来の褐色脂肪のそれと明らかに同様であった。これらの組織学的特徴は、トランスジェニックマウスにおける褐色脂肪組織の機能の亢進（産熱の増加）と一致している。
【００３１】
上で示したデータにより、褐色脂肪（あるいはＵＣＰ１−発現細胞）におけるＰＰＡＲγの活性化は糖尿病の発症を予防するために十分であることが示される。それゆえ、褐色脂肪において特異的にＰＰＡＲγを活性化するＴＺＤアナログなどの組織−特異的薬剤は、ＰＰＡＲγ活性化のその他の系統的な効果のない、特異的抗糖尿病剤として作用することができる。さらに、ここで開示される本発明は、インスリン反応性のこの推定制御因子を同定するためのスクリーニングに理論的な正当性ならびに重要な試薬を提供する。上記したような、ＰＰＡＲγが褐色脂肪組織にて特異的に活性化される遺伝子療法は、糖尿病の予防および治療に使用されうる。
【００３２】
上で開示したデータは、ＴＺＤｓ／ＰＰＡＲγの抗糖尿病効果をＴＺＤｓに起因することが知られている白色脂肪塊を亢進させる有害な影響から切り離すことができることを示す。さらに、ＰＰＡＲγのインスリン感受性効果をその脂質低下効果と切り離すことは、トリグリセリドレベルの上昇がＮＩＤＤＭの基礎的な原因ではないことを意味する。ここに示したデータはまた、ＰＰＡＲγがレシスチン（ｒｅｓｉｓｔｉｎ）あるいはレプチン遺伝子に対する直接的な効果とは独立してインスリン感受性を増進できることも示す。しかし、褐色脂肪におけるＰＰＡＲγ活性化は、野生型に比べてＵＣＰ１−ＶＰ−ＰＰＡＲγマウスではレプチンレベルがより低かったため、白色脂肪組織に対する間接的な代償性効果を産生することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ＰＰＡＲγおよびＶＰ−ＰＰＡＲγのレポーター−活性を示すヒストグラムである。
【図２】図２Ａ−２Ｄは、サザンプロットで確認することによって、２つのプライマー対を使用したＲＴ−ＰＣＲによって示される外因性ＶＰ−ＰＰＡＲγ遺伝子をどの動物が含有するかを示す。
【図３】図３は、ＲＴ−ＰＣＲ解析を表し（３Ａ：プライマー対Ａ、７４０ｂｐ；３Ｂ：プライマー対Ｂ、６７９ｂｐ）、ここでＶＰ−ＰＰＡＲγ１導入遺伝子が褐色脂肪中で特異的に発現されることが示される。
【図４】図４は、褐色脂肪にてＶＰ−ＰＰＡＲγを発現する成熟雌野生型（ｗｔ）マウスおよびトランスジェニック（Ｔｇ）マウスにおける代謝パラメーターのデータを示す。図４Ａ：空腹時グルコース；図４Ｂ：インスリンレベル；図４Ｃ：レプチンレベル；図４Ｄ：血清トリグリセリド（ｍｇ／ｄＬ）；図４Ｅ：血清コレステロール（ｍｇ／ｄＬ）；図４Ｆ：食物摂取（ｇ）；図４Ｇ：体重（ｇ）；図４Ｈ：日中直腸温度（℃）。
【図５】図５は、野生型およびトランスジェニックマウス由来の褐色脂肪組織を示し、およびＵＣＰ−ＶＰＰ−ＰＰＡＲγ導入遺伝子を発現する褐色脂肪における脂肪変性の減少を説明する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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