(57)【要約】ホモ二量体のディスインテグリンであるコントートロスタチンは、インテグリンを発現している腫瘍細胞の接着、運動性、及び浸潤性を調節する。薬学的に許容される組成物として調合される場合、該タンパク質は、αｖβ３又はαｖβ５インテグリンへのインテグリンの結合が関連する疾病過程を阻害又は崩壊することによって、患者を治療するために使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
αｖβ３インテグリン発現細胞の運動性を減少させる方法であって、前記インテグリン発現細胞上に存在する少なくとも２つのαｖβ３インテグリンを架橋することによって、前記細胞の運動性を阻害することを備えた方法。
【請求項２】
前記インテグリンがホモ二量体のディスインテグリンによって架橋される請求項１の方法。
【請求項３】
前記ホモ二量体のディスインテグリンがコントートロスタチンである請求項２の方法。
【請求項４】
前記架橋がＦＡＫシグナル伝達を破壊する請求項１の方法。
【請求項５】
前記架橋がＦＡＫのチロシンリン酸化を活性化させる請求項１の方法。
【請求項６】
前記架橋がＣＡＳのチロシンリン酸化を活性化させる請求項１の方法。
【請求項７】
前記架橋が細胞形態の変化を誘導する請求項１の方法。
【請求項８】
前記変化が細胞骨格又は局所的接着構造を変化させる請求項７の方法。
【請求項９】
前記αｖβ３インテグリン発現細胞が腫瘍細胞である請求項の方法。
【請求項１０】
インテグリン発現細胞のビトロネクチンへの接着を阻害する方法であって、コントートロスタチンがインテグリンに結合するように、前記細胞をコントートロスタチンに暴露することを備えた方法。
【請求項１１】
前記インテグリンがαｖβ３又はαｖβ５である請求項１０の方法。
【請求項１２】
配列番号２のアミノ酸番号４１９〜４８３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するホモ二量体のディスインテグリンであって、前記コントートロスタチンのアミノ酸配列は、
（ｉ）インテグリンαｖβ５に結合する、及び
（ｉｉ）腫瘍細胞中で、αｖβ３によって媒介されるＣＡＳ及びＦＡＫのチロシンリン酸化を誘導する、
ディスインテグリン。
【請求項１３】
（ａ）配列番号２のアミノ酸番号４１９〜４８３、及び
（ｂ）既定の間隙及びギャップペナルティーと既定のスコアリングマトリックスを用いたＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴによって決定した場合に、（ａ）と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１２のホモ二量体のディスインテグリン。
【請求項１４】
薬学的に許容される担体と請求項１２に記載されたホモ二量体のディスインテグリンとを含む薬学的に許容される組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
関連出願
本出願は、１９９９年１２月１０日に出願された米国特許出願第０９／４６０，２９５号の一部継続出願であり、米国特許出願第０９／４６０，２９５号は、１９９６年１１月８日に出願された米国特許出願第０８／７４５，６０３号（１９９８年９月２９日に米国特許第５，８１４，６０９号が付与された）の一部継続出願である１９９８年９月２９日に出願された米国特許出願第０９／１６３，０４７号の一部継続出願である。前記米国特許出願第０８／７４５，６０３号は、１９９３年１０月２２日に出願された特許出願第０８／１４１，３２１号（既に放棄されている）の継続出願である１９９５日１０月１０日出願された特許出願第０８／５４０，４２３号の分割出願である１９９６年４月１５日に出願された米国出願第０８／６３２，６９１号（１９９８年３月２４日に米国特許第５，７３１，２８８号が付与された、既に放棄されている）の一部継続出願である。これらは全て、本明細書において参考文献として援用される。
【０００２】
【発明の背景】
癌細胞上のインテグリン類は、腫瘍の浸潤及び伝播において重要な役割を果たしている。インテグリンは、多くの細胞種の細胞表面上に見出される、細胞間の相互作用及び細胞と細胞の周囲との相互作用を媒介するタンパク質ファミリーである。インテグリンはヘテロ二量体であり、細胞−細胞間の相互作用、及び細胞−基層間の相互作用に関与するαサブユニットとβサブユニットから構成される。インテグリンは、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、ビトロネクチン、コラーゲン、及びラミニンなどの細胞外マトリックスタンパク質の受容体として機能する。これらの相互作用の中には、マトリックスタンパク質中に存在するＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を介して媒介されるものがあることが示されている。フィブリノーゲンの結合には、αサブユニットとβサブユニットの両者が必要である。例えば、インテグリン細胞表面受容体スーパーファミリーの一員の一つとして、血小板凝集において血漿フィブリノーゲンと相互作用する血小板膜糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａがある。
【０００３】
ＣＮは、血液の血小板の表面上に存在する特異的なインテグリンに結合し、血小板の相互接着能（血小板凝集と称される過程）を妨げる。血小板は、血流中に見出される骨髄細胞の小断片である。血小板は、有益な作用と有害な作用を併有している。血小板の有用な作用は、血餅の形成を促進することによって、傷害後に出血を止めることである。しかしながら、ある種の条件下では、血小板は心臓に栄養素を供給する動脈を閉鎖する（心臓発作を誘発し得る作用である）ことに関与する。
【０００４】
急性心筋梗塞の発症において血小板が冠状動脈の血栓症と再血栓症を媒介する役割に関して、インテグリン細胞表面受容体が研究されてきた［Ｚｕｃｋｅｒ， Ｍ．Ｂ．， Ｓｃｉ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  ２４２： ８６ （１９９０）］。血小板の凝集に関しては、フィブリノーゲン中に存在するＲＧＤ配列が、（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａと相互作用するために不可欠である［Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｍ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓ．５９：１（１９８８）］。ヘビ毒は血小板凝集を阻害する故に、ヘビ毒は様々な研究の対象になってきた。
【０００５】
Ｃｒｏｔａｌｉｄａｅ及びＶｉｐｅｒｉｄａｅ科のヘビの毒から精製された多くのタンパク質は、糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａを介した血小板の凝集を阻害することが見出されている［例えば、Ｈｕａｎｇ，Ｔ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２；１６１５７（１９８７）；Ｇａｎ，Ｚ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：１９８２７（１９８８）；Ｙａｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．１６：７１４（１９９０）；Ｔｒｉｋｈａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ４（Ｓｕｐｐｌ．１）：１０５（１９９０）；Ｔｒｉｋｈａ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ７６（Ｓｕｐｐｌ．１）：４７９ａ（１９９０）；Ｈｏｌａｈａｎ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４２：３４０（１９９１）；Ｓｈｅｂｕｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２：１６９（１９９０）；Ｙａｓｕｄａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８３：１０３８（１９９１）参照］。ディスインテグリンに分類されるこれらのタンパク質は、典型的には、ジスルフィドに富む。さらに、バルブリン（ｂａｒｂｏｕｒｉｎ）［Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ，Ｒ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：９３５９（１９９１）］を除くこれまでに単離された全てのディスインテグリンは、インテグリンによって媒介される相互作用の阻害に関与することが示されているＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）配列を含有する。特に、ディスインテグリンのＲＧＤ配列は、血小板の膜上に存在するフィブリノーゲン結合部位と競合することによって、ＡＤＰ又は他の媒介物によって誘導される血小板の凝集を阻害するかもしれない。
【０００６】
それにもかかわらず、ディスインテグリンは、ＲＧＤ部位のみに基づいた機序以外の機序によってインテグリンとの相互作用を促進するユニークな表面構造を有する可能性が存在するという証拠が増大しつつあるようである。例えば、（ＲＧＤ配列中のアルギニンがアラニンに置換された）エキスタチンの化学的に合成された突然変異誘導体が、なお、幾らかの生物活性を保持しているという知見は、本タンパク質の他の領域が結合に関与している可能性があり、ＲＧＤ結合部位中には幾らかの柔軟性が存在し得ることを示唆している［Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｔ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８２（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩＩ）：６６０（１９９０）］。合成ＲＧＤペプチドは、一般的には、サイズが小さいためにディスインテグリンの分子構造的特徴を有していないので、ディスインテグリンの結合に関与していると思われる複数の機序を介して相互作用することができない。
【０００７】
特に興味深いディスインテグリンの１つが、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ  ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ（ミナミアメリカマムシ）の毒から単離されたＣＮである。最初に報告された精製操作は、セファデックスＧ−１００  ＳＦ上での分子ふるいクロマトグラフィー、セファデックスＧ−２５Ｆ上での脱塩、及び逆相ＨＰＬＣを含むものであった。ヒト血小板に富む血漿を攪拌してＡＤＰで増強される凝集と、ＣＮによるその阻害を３７℃でモニターした。血小板が豊富な血漿（３×１０５／ｍｍ３）を、５μＬのセファデックスＧ−１００　ＳＦにかけた後の低分子量のピークとともに１分間プレインキュベートすると、１０μＭのＡＤＰによって誘導される血小板の凝集が７６％阻害されることが見出された［Ｔｒｉｋｈａ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０）、上記］。
【０００８】
その後の報告で、未精製の毒には血小板凝集活性が存在するために、阻害剤を容易に検出することができないが、精製の第１工程（疎水性相互作用ＨＰＬＣ）の後には、前記毒の中に存在する凝集活性とα鎖分解性繊維素溶解酵素の両者から阻害活性が分離されることが明らかとなった。ＨＰＬＣの後に、阻害活性をプールして、ヒドロキシルアパタイトＨＰＬＣカラムにかけた。精製の最終工程では、Ｃ４逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを使用した。均一なタンパク質の収量は、毒１ｇ当たり３〜５ｍｇであった。ＣＮは、非還元条件下では１８〜２１ｋＤａの分子量を有し、還元条件下では９ｋＤａの分子量を有することが報告されている。このため、該分子は、ジスルフィド結合によって互いに固定された２つのサブユニットを有するホモダイマーであると考えられる。等電点電気泳動によって、該タンパク質が酸性のｐＩを有することが示された。ＣＮは、繊維素溶解活性を示さず、分子サイズと血小板凝集阻害の速度論に基づいて、５’−ヌクレオチダーゼ又はホスホリパーゼではないことが報告された。約１００ｎＭのＣＮを１分間プレインキュベートすると、ＡＤＰによって誘導された血小板の凝集を完全に阻害することが報告された［Ｔｒｉｋｈａ　ｅｔ　ａｌ．（１９９０）、上記］。
【０００９】
さらに、ＣＮは、５〜６個のジスルフィド架橋を持つ７０アミノ酸を有し、ＣＮの配列は、アプラジン（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓ　ｐｉｓｃｉｖｏｒｕｓの毒から得られる血小板凝集阻害剤）の１０アミノ酸下流から始まるようであるということが報告されている。ＣＮは、９つのアミノ酸の挿入及び／又はＣ末端の伸長を有するかもしれないと推測された。０．８μｇ／ｍＬのＣＮによって、及びイヌの血小板の存在下におけるＣＮ２．２μｇ／ｍＬによって、血小板に富む血漿中のヒト血小板凝集の５０％阻害（ＩＣ５０）が観察されることがさらに報告された［Ｔｒｉｋｈａ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６Ｆ：１８０（１９９２）］。
【００１０】
ヒトの繊維肉腫（ＨＴ−１０８０）及びｃ−Ｈａ−ｒａｓをトランスフェクトしたラットの胚（４Ｒ）細胞が、フィブロネクチンによってコートされたプレートに結合するのをＣＮが阻害するが、Ｍａｔｒｉｇｅｌがコートされたプレートに結合するのを阻害しないことが報告された。１μｇ／ｍＬと５μｇ／ｍＬのＣＮの存在下では、４Ｒ細胞のフィブロネクチンへの結合が、それぞれ、４６％及び８８％阻害され、ＨＴ１０８０細胞での阻害は、それぞれ、８９％と８５％であった［Ｔｒｉｋｈａ，Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ：３３：３４（１９９２）］。
【００１１】
ＣＮはインテグリンとそれらの受容体間の相互作用を阻害することができるようなので、ホモ二量体のディスインテグリンはこれらの相互作用が関連する疾病の治療に有用な可能性がある。このため、他のヘビ毒成分が実質的に存在しない精製されたコントートロスタチンを製造し、かつ使用するための改良法が必要とされている。
【００１２】
【発明の概要】
本発明は、血小板凝集、細胞の増殖、接着、転移、及び新血管新生などの生体プロセスを阻害するために使用できるディスインテグリンの要求を充足する。とりわけ、インテグリンを発現している腫瘍細胞の接着、運動性、及び浸潤性を調節するコントートロスタチン等のホモ二量体のディスインテグリンが、方法及び組成物中で利用される。薬学的に許容される組成物として調合される場合には、該タンパク質は、αｖβ３又はαｖβ５インテグリンとリガンドとの結合が関連する疾病過程を阻害又は崩壊させることによって、患者を治療するために使用することができる。
【００１３】
本発明は、αｖβ３インテグリン発現細胞の運動性を減少させる方法であって、前記インテグリン発現細胞上に存在する少なくとも２つのαｖβ３インテグリンを架橋することによって、前記細胞の運動性を阻害することを備えた方法を含む。一つの態様において、前記インテグリン類は、ホモ二量体のディスインテグリン、好ましくはコントートロスタチンによって架橋される。該架橋は、ＦＡＫシグナル伝達を破壊し、ＦＡＫ及びＣＡＳのチロシンリン酸化を活性化させる。さらに、前記架橋は、細胞骨格又は局所的接着構造の変化を含む、細胞の形態の変化を誘導する。最も好ましい態様において、前記αｖβ３インテグリン発現細胞は腫瘍細胞である。
【００１４】
本発明は、インテグリン発現細胞をコントートロスタチンに暴露することによって、インテグリン発現細胞がビトロネクチンに接着することを阻害する方法も含む。コントートロスタチンは、インテグリン（特にαｖβ３又はαｖβ５）に結合することによって、接着を阻害する。
【００１５】
本発明の別の態様は、配列番号２のアミノ酸番号４１９〜４８３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有するホモ二量体のディスインテグリンである。コントートロスタチンのアミノ酸配列は、（ｉ）インテグリンαｖβ５に結合すること、及び（ｉｉ）腫瘍細胞中で、αｖβ３によって媒介されるＣＡＳ及びＦＡＫのチロシンリン酸化を誘導すること、によって特徴づけられる。好ましくは、既定の間隙（ｏｐｅｎｉｎｇ）及びギャップペナルティーと既定のスコアリングマトリックスを用いたＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴによって決定した場合に、前記ホモ二量体のディスインテグリンは、配列番号２のアミノ酸番号４１９〜４８３と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００１６】
本発明のさらに別の態様において、薬学的に許容される担体と、コントートロスタチン等のホモ二量体のディスインテグリンとを含む薬学的に許容される組成物である。
【００１７】
本発明の方法及び組成物は、血小板凝集、腫瘍転移、血管新生、新血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、細胞接着、浸潤性、又は増殖を阻害するために使用することができる。
【００１８】
【発明の詳細な記述】
ＣＮの性質決定、クローニング、及び発現
本発明者らは、ディスインテグリンの一種、すなわち、Ａ．ｃ．ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘの毒から得られたコントートロスタチン（ＣＮ）を精製し、性質決定した。天然タンパク質の場合、ＣＮは質量１３，５０５のホモダイマーであり、還元されてピリジルエチル化されたタンパク質の場合、質量６，９５６である。血小板（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ（フィブリノーゲン受容体）に対する結合親和性を調べるために、ヒト血小板が豊富な血漿（ＰＲＰ）を用いて、（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩＡに対して誘導された抗体である［１２５Ｉ］７Ｅ３とＣＮの競合を分析した。ＣＮは、２５ｎＭのＩＣ５０を示した。従って、ＣＮは強力なβ３インテグリンアンタゴニストである。
【００１９】
さらなる態様において、本発明者らは、強力な抗腫瘍活性を有する南アメリカマムシ（ｓｏｕｔｈｅｒｎ　ｃｏｐｐｅｒｈｅａｄ　ｓｎａｋｅ）の毒から得られたタンパク質であるコントートロスタチンを提供する。南アメリカマムシの毒の中に存在するタンパク質の複雑な混合物から該タンパク質を精製するための洗練された技術を開発した。上述のように、最初、ＣＮは血小板凝集の阻害剤として特徴づけられた。本発明者らは、ヘビ毒から幾つかのディスインテグリンを精製した。コントートロスタチン（ＣＮ）は、南アメリカマムシの毒から精製された。ディスインテグリン類は、主タンパク質コアから突出しているＣｙｓ残基に隣接した約１３アミノ酸残基の柔軟なペプチドループの端に、限定されたＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）配列を有している。例えば、配列番号１又は２のアミノ酸残基４５７〜４６９を参照されたい。この露出したＲＧＤ配列によって、ディスインテグリン類は高い親和性でインテグリン類に結合することが可能となる。
【００２０】
λｇｔ１０中に構築されたＡ．ｃ．ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘの毒腺細胞のライブラリーから、ＣＮのｃＤＮＡを増幅した。ＣＮのアミノ酸組成とアミノ酸配列の一部をエドマン分解によって決定した。図１を参照。この情報を用いて、コントートロスタチン前駆体タンパク質をコードする２，０２７ヌクレオチドの完全長ｃＤＮＡ（配列番号１）をクローニングし、配列を決定した。
【００２１】
ディスインテグリンスーパーファミリーのメンバーとして、ＣＮは、ヌクレオチド配列が公知であったトリグラミンを含む他のディスインテグリンと高い類似性を有している。図１Ａは、エドマン分解アッセイに基づくＣＮの部分アミノ酸配列を示している。また、部分配列を表記されている他のディスインテグリンと比較している。前記ＲＧＤ配列は太字で示す。高度に保存されたＰＣＣＤＡＡＴＣＫＬ配列（これに対するＰＣＲプライマーをデザインした）には下線が付した。ディスインテグリンファミリーの間で相同性が高い配列、並びにｃＤＮＡインサートに隣接する公知のλｇｔ１０配列に基づくプライマーを用いたＰＣＲによって、ＣＮのｃＤＮＡがどのようにクローニングされたかを図１Ａおよび１Ｂに示す。前記ＰＣＲプライマー対は、配列番号５（λｇｔ１０フォワードプライマー）及び配列番号３（ＰＣＲ−１）５’−ＧＡＴＴＴＡＣＡＧＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣ−３’、これは下線が付した保存された配列の一部をコードするトリグラミンｃＤＮＡのアンチセンスである（図１Ａと１Ｂ）、並びにＰＣＲ−１と相補的な配列番号４（ＰＣＲ−２）及び配列番号６（λｇｔ１０リバースプライマー）である。配列番号５と３は、下線を付した部分の上流に位置するアミノ酸をコードするＤＮＡを増幅する。配列番号４と６は、ＣＮの下流部分をコードするアミノ酸を増幅する。完全長のｃＤＮＡは、２つのＰＣＲ産物の重複伸張によって得られる（図１Ｃと２参照）。
【００２２】
コントートロスタチン前駆体のｃＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列を図３に示す。完全長の配列は、２，０２９ヌクレオチドから構成される（配列番号１）。５’末端の８６ヌクレオチド非翻訳領域、４８３アミノ酸をコードするオープンリーディングフレーム（配列番号２）、及び３’非コード領域から構成される。
【００２３】
図４は、他の４つのヘビ毒出血性タンパク質であるトリグラミン、Ｃａｔ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ　ａｔｒｏｘ毒から得られたカトロコラスタチン（ｃａｔｒｏｃｏｌｌａｓｔａｔｉｎ））、ハラルハジン（Ｂｏｔｈｒｏｐｓ　ｊａｒａｒａｃａの毒から得られる）、及びＨｔ−ｅ（Ｃ．Ａｔｒｏｘの毒から得られる）の構造と比較したコントートロスタチンのマルチドメイン構造を示している。ヘビ毒メタロプロテイナーゼの構造的な分類によれば、コントートロスタチンの前駆体は、プロタンパク質（配列番号１又は２のアミノ酸残基１〜１９０）、メタロプロテイナーゼ（配列番号１又は２の残基１９１〜４１０）、及びディスインテグリン（配列番号１又は２の残基４１９〜４８３）ドメインに分けることができる。天然のディスインテグリンの成熟したモノマーは、Ｄ４１９、すなわち４１９位のアスパラギン酸残基から始まる。図４の下線を付した部分は、コントートロスタチンとトリグラミンの両者のＲＧＤ配列と、各分子のメタロプロテイナーゼドメイン中の亜鉛結合モチーフにおいて保存されたＨＥＭＧＨＮＬＧＩＨＨ配列を示している。
【００２４】
従って、本発明によれば、実質的に精製されたコントートロスタチン、又はディスインテグリンの特性を保持した精製されたコントートロスタチンの変種、又はプロタンパク質、メタロプロテイナーゼ、及びディスインテグリンドメインを有するコントートロスタチンの前駆体からなるタンパク質も提供される。このタンパク質は、ヘビ毒のような天然の採取源から精製することができ、又は本明細書の開示を参照して当業者が理解できるとであろう組換え技術によって作製することができる。
【００２５】
さらに、本出願は、天然および合成のアミノ酸及びヌクレオチド配列の両者について権利を主張する。特に修正がなければ、本明細書で使用する「タンパク質」という語は、天然および合成のポリペプチド及びペプチドの両者を包含する。合成タンパク質には、組換えタンパク質および化学的に合成されたタンパク質が含まれる。特に明示されていなければ、「コントートロスタチン」という語は、天然および合成型のタンパク質の両者を含む。
【００２６】
「ヌクレオチド配列」という語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ配列の両者を含む。例えば、コントートロスタチンタンパク質のヌクレオチド配列（「コントートロスタチンヌクレオチド配列」）は、天然の及び前駆体のタンパク質をコードする遺伝子（「コントートロスタチン遺伝子」）、その相補的ＤＮＡ、並びに前記のものに対応するＲＮＡを含み；また、コントートロスタチンタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ、その相補的ＲＮＡ、及び前記のものに対応するＤＮＡも含まれる。さらに、本出願で使用するヌクレオチド配列には、（１）コントートロスタチンタンパク質をコードするＤＮＡ配列、（２）上記配列と相補的なヌクレオチド配列（ＲＮＡ又はＤＮＡであり得る）、（３）ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列であって、開示されたＤＮＡ配列中のチミジン（「Ｔ」）がウラシル（「Ｕ」）に置換された配列、（４）前記配列中のヌクレオチドが、ヌクレオチド類縁体のような本分野で公知の他のヌクレオチドに置換されたヌクレオチド配列、例えば、シトシンが５−メチルシトシンに置換されたヌクレオチド配列、及び（５）例えば、既定の間隙及びギャップペナルティーと既定のスコアリングマトリックスを用いたＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴによって決定した場合に、少なくとも９０％同一である、又はより好ましくは少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列が含まれる。
【００２７】
ヌクレオチドコドンは縮重しているので、コントートロスタチンタンパク質、それらのタンパク質変種、機能的な均等物、もしくは誘導体をコードするか、又はそれらに翻訳され得るヌクレオチド配列を含む均等なヌクレオチド配列も本発明の範囲に属する。これらのヌクレオチド配列は、本発明を実施する際にも使用することができる。
【００２８】
上記に加えて、コントートロスタチンヌクレオチド配列には、（１）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、それぞれのヌクレオチド配列のコード配列にハイブリダイズできるヌクレオチド配列、及び（２）本明細書に開示されているもの（それぞれのコントートロスタチンタンパク質と実質的に同一の生物学的特性／活性、例えば、インテグリンアンタゴニスト、亜鉛結合、プロテイナーゼ、抗血管新生因子、並びにさらなる実施態様および実施例で本明細書に開示されているような活性をさらに有するタンパク質をコードするか、又はタンパク質に翻訳され得るもの）の断片又は変異したヌクレオチド配列も含まれる。
【００２９】
タンパク質と関連して使用される「コントートロスタチンタンパク質」という語には、以下の実施例の部で記載されている各タンパク質、本発明の方法によって得ることができる前駆体タンパク質、最も好ましくは以下に記された実施例の部の単離法によって得ることができるディスインテグリンの特性を示すタンパク質が含まれる。当業者であれば理解できるように、前記コントートロスタチンタンパク質は、対立形質変異を受けてもよい。従って、コントートロスタチンタンパク質には、（１）これらのタンパク質のタンパク質変種（例えば、これらのタンパク質変種は、例えば、前記プロタンパク質の領域、メタロプロテイナーゼ領域、ディスインテグリン領域、及び／又は天然のコントートロスタチン領域の配列と、少なくとも９０％同一であり、又はより好ましくは少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含有し得る）、（２）それぞれ、これらのタンパク質の機能的な均等物及びそれらの変種、並びに（３）それぞれ、コントートロスタチンタンパク質及びそれらの変種（断片を含む）の誘導体が含まれる。コントートロスタチンタンパク質のアミノ酸配列のパーセント同一性は、既定の間隙及びギャップペナルティーと既定のスコアリングマトリックスを用いたＦＡＳＴＡ又はＢＬＡＳＴ（国立生命工学情報センターのウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で使用できる）によって決定される。
【００３０】
前記変種は、例えば、コントートロスタチンタンパク質のアミノ酸配列の置換、挿入、又は欠失から得ることができる。タンパク質及びそれらの変種の誘導体には、コントートロスタチンに対する抗体と特異的に結合するこれらのタンパク質及び免疫反応性ペプチドの断片が含まれる。
【００３１】
インテグリン受容体に対する結合能などの実質的に同一の生物活性を有すれば、２つのアミノ酸配列は機能的に均等である。前記タンパク質は、他のタンパク質に融合させてもよく、例えばシグナル配列融合体は、組換えコントートロスタチンタンパク質の分泌をより迅速に誘導するために利用し得る。
【００３２】
本明細書に開示されたタンパク質の置換変種は、開示された配列中の少なくとも１つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されたものである。好ましくは、アミノ酸の変化は保存的である。このように、コントートロスタチンタンパク質の一次アミノ酸配列の修飾には、保存的な変異も含む。本明細書で使用する「保存的な変異」という語は、生物学的に類似する別の残基によってアミノ酸残基が置換されることを示す。保存的な変異の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンのようなある疎水性残基を別の疎水性残基に置換すること、又は、アルギニンをリシンに、グルタミン酸をアスパラギン酸に、又はグルタミンをアスパラギンに置換することなど、ある極性残基を別の極性残基に置換することが含まれる。また、「保存的な変異」という語は、置換されていない親アミノ酸に代えて置換されたアミノ酸を使用すること（但し、ポリペプチドはその生物活性を保持している）、例えば、置換されたポリペプチドに対して作成された、置換されていないポリペプチドとも免疫反応をする抗体を使用することも含む。
【００３３】
さらに、全てのタンパク質と同様に、正確な化学構造は、多数の要素に依存する。分子中にはイオン化可能なアミノ基とカルボキシル基が存在するので、あるタンパク質は、酸性若しくは塩基性の塩、又は中性形態で得ることができる。適切な環境状態に置いたときに、その活性を保持しているような調製物は、全てこの定義の中に含まれる。さらに、一次アミノ酸配列は、糖部分を用いた誘導体化（グリコシル化）によって、又は脂質、リン酸、アセチル基などのような他の補充的な分子によって、より一般的には、糖の抱合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）によって拡張し得る。一次アミノ酸構造は、凝集して複合体（二量体の場合が最も多い）を形成し得る。このような拡張のある種の側面は、産生宿主の翻訳後修飾系を介して達成される。他のこのような修飾は、インビトロで導入され得る。何れにしても、このような修飾は、タンパク質の活性が破壊されない限り、定義に含まれる。様々なアッセイにおけるタンパク質の活性を増強し、又は減弱することによって、このような修飾が定量的に又は定性的に活性に影響を与え得ると予想される。
【００３４】
鎖中の各アミノ酸残基は、酸化、還元、又は他の誘導体化によって修飾してもよく、活性を保持している断片を得るためにタンパク質を切断してもよい。活性を破壊しないこのような改変によって、前記定義から前記タンパク質配列が除外されるものではない。以下に、例示のためにさらに詳細に幾つかの修飾について論述する。
【００３５】
このように、グリコシル化変種は、コントートロスタチンタンパク質の範囲に含まれる。それらには、グリコシル化を完全に欠く変種（非グリコシル化）と天然の型と比べて、グリコシル化された部位が少なくとも１つ少ない変種（脱グリコシル化）、及びグリコシル化が変化した変種を含む。
【００３６】
実施例に示されているように、天然のＣＮは、比較的分かりやすい方法で、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘの毒から単離され得る。あるいは、ＣＮは、組換えＤＮＡ技術等の現在使用されている様々な生化学的な方法を利用することによって調製してもよい。さらに、本明細書において報告した配列情報は、ＣＮ及びその前駆体と実質的な相同性を有する変種、断片、保存されたドメイン、又はプロタンパク質を同定するためのプローブを作るために使用することができる。一旦同定した後には、遺伝子を単離し、さらに操作し、発現ベクターの中にクローニングすることができる。
【００３７】
本明細書の開示を参照することによって当業者が理解できる技術に従って作られたコントートロスタチンタンパク質をコードするＤＮＡ分子を含有するベクターも提供される。本発明では、コントートロスタチンヌクレオチド配列は、組換え発現ベクター中に挿入され得る。「組換え発現ベクター」という語は、コントートロスタチンの遺伝配列を挿入又は取り込むことによって操作した本分野で公知のプラスミド、ウイルス、又は他の媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）を指す。このような発現ベクターは、宿主中での挿入された遺伝配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含有する。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、及び形質転換された細胞の表現型による選択を可能とする特定の遺伝子を含有する。これらのベクターは、コンピテント宿主を形質転換して、ヘビ毒タンパク質を産生できる形質転換体を製造するために使用され得る。
【００３８】
さらに、前記ベクターによって安定に形質転換又はトランスフェクトされた原核又は真核宿主細胞、コントートロスタチンタンパク質又はその生物学的変種を作製する方法を提供する。まず、該方法は、コントートロスタチンタンパク質をコードするＤＮＡで形質転換した原核又は真核宿主細胞を培養する工程と、続いて、前記コントートロスタチンタンパク質を回収する工程とを含む。前記宿主細胞は、哺乳類細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母及び他の真菌又は細菌であり得る。
【００３９】
前記タンパク質をコードするＤＮＡ配列の採取源には、適切な細胞又は細胞株から得られる単離されたＤＮＡ、ヘビ毒ゲノムライブラリーからクローン化されたＤＮＡ、又は相補的ＤＮＡライブラリーからクローン化されたＤＮＡが含まれ、ここで全ての相補的ＤＮＡをＤＮＡに逆転写して、クローン化する。目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列が一旦同定されると、塩基の配列は、公知の手段［例えば、Ｍａｘａｍ　ａｎｄ　Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７４：５６０（１９７７）］によって決定され得る。さらに、発現を得るために、ハイブリッドＤＮＡ技術を利用してもよい。前記ＤＮＡ配列の制限地図を作成して、切断のための適切な部位を決定してもよい。このように、前記配列を切り出して、適切な制御シグナルを有するベクター中に導入してもよい。ディスインテグリン遺伝子の同定及び発現のための適切な技術についてのさらに詳細な考察は、例えば、Ｍａｒａｇａｎｏｒｅらの米国特許第５，１８２，２６０号、及び第５，１９６，４０３号に記載されており、その開示全体は、本明細書において参照文献として援用される。
【００４０】
さらに、続いて、１以上のアミノ酸の変化が導入された修飾タンパク質を得るために、天然のタンパク質をコードする配列を本分野で周知の方法で（例えば、単一又は複数の変異又は欠失により）処理してもよい。次に、本明細書に記載されている操作に従って、定型的な実験作業では、あるポリペプチドがＣＮに特徴的な活性プロフィールを示すかどうかを決定するであろう。従って、本発明は、本明細書に明記されている特徴的な活性プロフィールを示す天然のＣＮとその変異体の両者を想定している。さらに、ＣＮは、適切な血栓溶解剤との融合タンパク質の形態で利用してもよい。この型の融合タンパク質は、Ｍａｒａｇａｎｏｒｅらの上記米国特許第５，１８２，２６０号、及び第５，１９６，４０３号に、血小板凝集阻害剤／抗トロンビンポリペプチド融合タンパク質の形成について記載されている方法と類似の方法で調製し得る。
【００４１】
コントートロスタチンは、他のディスインテグリン（図１Ａに示されている）［Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ，Ｓ．，ＭｃＬａｎｅ，Ｍ．Ａ．，Ｋｌｏｃｚｅｗｉａｋ，Ｍ．，　ａｎｄ　Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｇ．Ｊ．　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ　ａｎｄ　Ｏｔｈｅｒ　Ｎａｔｕｒａｌｌｙ　Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ　ｏｆ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，　Ｓｅｍｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．　３１：２８９−３００（１９９４）］との間に高い配列相同性が存在するにもかかわらず、約８アミノ酸の末端切断を有するユニークなアミノ末端配列を示す。他のディスインテグリンと比べて、コントートロスタチンのアミノ末端からは、２つのシステイン残基が失われている。モノマーのディスインテグリンが偶数のシステインを有することは十分に確立されており、それらの全ては、ジスルフィド結合の形成が関与している。コントートロスタチン前駆体中の喪失した２つのシステインは、ジスルフィド結合対の崩壊を生じせしめ得る。これによって、次々と２つの同じ鎖の間に２つの分子間ジスルフィド結合が形成されて、ホモ二量体構造のコントートロスタチンを形成させ得る。図５は、二量体ディスインテグリンの構造の仮定的モデルを、ジスルフィド結合の位置が公知のディスインテグリンであるキストリン［Ａｄｌｅｒ，Ｍ．，Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，Ｌａｚａｒｕｓ，Ｒ．Ａ．，　ａｎｄ　Ｗａｇｎｅｒ，Ｇ．　Ｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｐａｉｒｉｎｇ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ＩＩｂ／ＩＩＩａ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ  ｋｉｓｔｒｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ＮＭＲ，  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ，  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：２８２−９（１９９３）］と比較して示している。図５Ａには、２つのインテグリンの配列が比較されている。キストリンは、１２の半シスチンが６つのジスルフィド結合を形成していることが容易に分かるであろう。比較すると、２つの対を成していないシステイン残基を有するコントートロスタチンは、図５Ｂに示されているホモ二量体の構造を形成することができる。本発明者らは、現段階では何れの配列が好ましいか確信を得ていないが、本発明者らは、天然及び還元されたコントートロスタチンの質量分析とＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて、示されている２つのうちの１つと同一である可能性が最も高いホモ二量体構造が形成されていると信じている。
【００４２】
ＣＮは、明らかにアプラジンとは全く異なっている。何故なら、後者は、間違いなくモノマーであると実証されている［Ｗｅｎｃｅｌ−Ｄｒａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）、上記］からである。さらに、ＣＮは、上記Ｍａｒａｇａｎｏｒｅらの米国特許第５，１８２，２６０号、及び第５，１９６，４０３号でアプラジンに関して実証されているように、血小板放出反応を阻害しない。また、最後に、配列の類似性にもかかわらず、開始部位とその後に続く配列の何れについても配列間に有意な差が存在している。
【００４３】
使用方法
インテグリンを発現している腫瘍細胞の接着、運動性、及び浸潤性を調節するために、本発明の方法及び組成物にはコントートロスタチンのようなホモ二量体のディスインテグリンが用いられる。薬学的に許容される組成物として調合される場合には、αｖβ３又はαｖβ５インテグリンとリガンドとの結合が関連する疾病過程を阻害又は崩壊させることによって患者を治療するために、該タンパク質を使用することができる。
【００４４】
本発明は、αｖβ３インテグリン発現細胞の運動性を減少させる方法であって、前記インテグリン発現細胞上に存在する少なくとも２つのαｖβ３インテグリンを架橋することによって、前記細胞の運動性を阻害することを備えた方法を含む。ある態様では、前記インテグリン類は、ホモ二量体のディスインテグリン、好ましくはコントートロスタチンによって架橋される。該架橋は、ＦＡＫシグナル伝達を破壊し、ＦＡＫ及びＣＡＳのチロシンリン酸化を活性化させる。さらに、前記架橋によって、細胞骨格又は局所的接着構造の変化を含む細胞の形態の変化が誘導される。最も好ましい態様では、前記αｖβ３インテグリン発現細胞は腫瘍細胞である。
【００４５】
本発明には、インテグリン発現細胞をコントートロスタチンに暴露することによって、インテグリン発現細胞のビトロネクチンへの接着を阻害する方法も含まれる。コントートロスタチンは、インテグリン（特にαｖβ３又はαｖβ５）に結合することによって接着を阻害する。
【００４６】
ＣＮは、ヒト、ウサギ、及びイヌのインビトロにおける血小板凝集の強力な阻害剤であることが明らかとなっている。しかしながら、アプラジンとは異なり、ＣＮは血小板放出反応を阻害しない。血小板は、血小板が凝集したときにその内容物が放出される様々な複数の顆粒（α顆粒、及び密顆粒を含む）を含んでいる。ＣＮが血小板による顆粒内容物（密顆粒からのＡＴＰを含む）の放出を阻害しないという発見は、凝集が阻害されても、血小板はそれらの内容物をなお放出し得ること（それ故、正常な生理活性の外見を幾つか維持していること）を意味している。対照的に、アプラジンで血小板の凝集を阻害すると（例えば、密顆粒からのセロトニンの放出を阻害することによって測定した場合）、血小板による放出も阻害する。このため、アプラジンを投与すると、正常な血小板の生理的プロセスが必然的にさらに擾乱される。
【００４７】
ＣＮが（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａインテグリン受容体に特異的に結合することによって、血小板の凝集を阻害することを示す証拠が幾つか存在している。例えば、固定化されたフィブリノーゲンに対する精製（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａの結合度を定量することができるフィブリノーゲン−（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ　ＥＬＩＳＡ［Ｄｅｎｎｉｓ，Ｍ．Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，　Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）　８７：２４７１（１９９０）］では、ＣＮが（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａの結合を効果的にブロックする。さらに、ＣＮの部分アミノ酸配列は、（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａに結合することが知られている他のディスインテグリンと、かなりの類似性を示している。最後に、ＣＮは７Ｅ３の（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合をブロックする。７Ｅ３は、（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａと特異的に結合することによって、ヒト及びイヌの血小板凝集を阻害するマウスのモノクローナル抗体である［Ｃｏｌｌｅｒ，Ｂ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  ７２：３２５（１９８３）］。低濃度のＣＮの存在下では、７Ｅ３の血小板への結合は著しく阻害される。
【００４８】
３つのヘビ毒ディスインテグリンである、キストリン［Ｙａｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）、上記］、エチスタチン［Ｈｏｌａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）、上記］、及びビチスタチン［Ｓｈｅｂｕｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）、上記］は、組換え組織プラスミノーゲン活性因子と組み合わせて動脈の血栓溶解を増大し、かつ維持することによって、血栓溶解療法で使用するための抗血栓剤としての役割を有し得ることが実証されている。ＣＮの低いＩＣ５０値に基づいて、抗血栓剤としてのそのインビボでの効力が調べられた。イヌの再閉塞頚動脈血栓症モデルを用いて、ＣＮは、アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体（ＡＰＳＡＣ；ａｎｉｓｏｙｌａｔｅｄ　ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ　ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ｃｏｍｐｌｅｘ）と組み合わせると、頚動脈の開通を効果的に維持することが見出された。ＡＰＳＡＣのみでは、頚動脈の迅速な再閉塞を防止するには不十分であることが見出された。ＡＰＳＡＣと共にＣＮを投与した場合、開通を維持するためにヘパリンを必要としなかった。これは、冠状動脈の血栓症モデルで評価されている他のディスインテグリン（例えば、エチスタチン、ビチスタチン、及びキストリン）と比べて、有意な差である。
【００４９】
本発明の組成物は、単独で、又は１以上の血栓溶解剤と組み合わせて、哺乳類の血栓症を治療するためにとりわけ有用である。特に、本発明の組成物は、動脈、静脈、及び毛細血管の血栓症及び血栓塞栓症を治療し、又は防止するのに有用である。このように、前記組成物は、発作、一過性の虚血性発作、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、肺塞栓症、動脈瘤、及び狭心症を治療するために有用である。とりわけ、前記組成物は、心筋梗塞を防止し、又は治療するために有用である。
【００５０】
本発明の組成物は、メラノーマ、がん腫、及び肉腫患者の転移を阻害するためにも有用である。ＣＮは、ヒトメラノーマＭ２４ｍｅｔ細胞上の少なくとも２つの部位（すなわち１．１（±０．７ｎＭ）の解離定数（Ｋｄ）と細胞当たり９６，０００（±３９，０００）部位を有する高親和性部位と、４１（±１３）ｎＭのＫｄと細胞当たり４８０，０００（±９０，０００）部位を有する、より低親和性の部位）に結合することが観察された。さらに、ＣＮは、ヒトメラノーマＭ２４ｍｅｔ細胞がフィブロネクチン及びビトロネクチンに接着するのを阻害し、これらに比べて程度は低いが、コラーゲン及びラミニンに接着するのを阻害することが明らかとなった。従って、メラノーマ、がん腫、及び肉腫患者の転移を防止するための方法及び組成物も、本発明の範囲に含まれることが想定される。
【００５１】
本発明に従えば、ディスインテグリンのユニークな特性は、がん腫、肉腫、及びメラノーマ患者の転移を防止するための方法及び組成物において利用される。ある態様では、乳癌患者の転移を防止するための位置（ｐｏｓｉｔｉｏｎ）と方法が提供される。
【００５２】
本発明者らは、マウス乳腺の脂肪パッド中にヒト乳癌細胞を移植することにより、転移性の乳癌モデルを開発した。本発明者らが使用するマウスは、その免疫系を欠損し、移植したヒトの癌細胞を拒絶できないように遺伝的操作を施されている。本発明者らは、癌細胞の移植から２週間後に、乳腺の脂肪パッド中に触診可能な腫瘍の塊が発育し、１２週以内に未処置の動物の肺に腫瘍細胞が広がることを観察した。異なる数グループのマウスの腫瘍に、ＣＮ又はプラセボを毎日投与した。処置した後、本発明者らは、ＣＮ処置したマウスで腫瘍の塊のサイズがプラセボ処置したマウスのものと比べて有意に小さくなっていることを見出した。重要なことに、ＣＮ処置群では、プラセボ群と比べて身体の他の部位へ腫瘍が広がるの（転移）を＞９０％阻害することを示した。本発明者らの研究は、ＣＮは、乳癌細胞が血管壁の必須成分であるタンパク質に接着するのをブロックすることを示している。ＣＮは、絨毛尿膜と呼ばれるニワトリ胚の膜状呼吸器官上でインキュベートした後に乳癌細胞によって誘導される新しい血管の形成（新血管新生）も阻害したが、プラセボ処置では阻害しなかった。新血管新生は、増殖している腫瘍が増殖し続けるために極めて重要であるので、新しい血管の増殖を阻害する能力は、ＣＮの重要な抗癌作用である。
【００５３】
これらの研究に基づくと、ヘビ毒タンパク質コントートロスタチンのようなディスインテグリン類は、抗転移活性を有しているものと思われる。本発明者らの発見は、ＣＮが転移における幾つかの重要な段階をブロックするために、単一の段階しか阻害しない他の物質より強力であることを示唆する。
【００５４】
本発明のディスインテグリン含有組成物は、骨粗鬆症の治療にも有用である。破骨細胞は、脊椎動物の石化した組織を再吸収する直径４００μｍを超えない多核細胞である。骨の再吸収は、骨への接着、酸及びプロテアーゼの有極性分泌、並びに骨基質に沿った破骨細胞の活発な移動を含むプロセスの組合せによって進行するようであり、破骨細胞は骨の再吸収における必須のステップとして、ＲＧＤ配列を介して骨に結合し、かつこのＲＧＤ結合性インテグリンが接着構造に存在する［Ｓａｔｏ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１１：１７１３（１９９０）］。破骨細胞が骨に接着する分子的な機序はよく理解されていないが、他の細胞から類推することにより、二価の陽イオン依存性接着分子のインテグリンスーパーファミリーに属する一員が、この相互作用を媒介していると考えられている。エチスタチン［Ｓａｔｏ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，上記］と、おそらくはＣＮのようなディスインテグリンが、分離した破骨細胞による骨の再吸収を阻害する。作用機序は、おそらく接着構造を崩壊することによっている。従って、破骨細胞による骨の再吸収を阻害するために有効な量のＣＮを用いた骨粗鬆症の治療用組成物及び方法も、本発明の範囲に属すると想定される。
【００５５】
最後に、ＣＮは、創傷治癒の促進において有用である。創傷治癒に関与する事象には、インテグリンの発現又は機能的な活性の変化が含まれることが知られており、インテグリン受容体のモジュレーションが、創傷の回復および炎症において中心的な役割を果たしていることが示唆されている。フィブロネクチンも、創傷治癒プロセスにおいて多くの役割を果たすことが知られている。フィブロネクチンの機能は、効果的に創傷治癒するために重要であると考えられているが、その活性の少なくとも１つ（細菌の結合）が逆効果であり得るという報告があるため［Ｇｒｉｎｎｅｌｌ，Ｆ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６：１０７（１９８４）；Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ａ．Ｆ．，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２４：２０１（１９８８）］、創床（ｗｏｕｎｄ  ｂｅｄ）中にフィブロネクチンが存在すると、細菌の接着と感染を促進するかもしれない。フィブロネクチンは、ケロイドの形成に密接に関係しているようにも思われる。ケロイドは、かなりの割合の非白人患者を冒す創傷治癒の病的な結果である。ケロイドは、良性腫瘍であり、元の創傷の境界を超えて増殖し、フィブロネクチンおよびＩ型コラーゲンが豊富な結合組織である［Ｓｉｂｌｅ，Ｊ．Ｃ．＆  Ｏｌｉｖｅｒ，Ｎ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．１６Ｆ：１７０（１９９２）］。ＣＮのようなディスインテグリンは、それらが細胞−細胞及び（フィブロネクチンとの相互作用を含む）細胞−細胞外マトリックス相互作用を阻害することによって、ケロイドの形成を含む創傷の回復に関わるプロセスに対して強い効果を有すると予想されるであろう。
【００５６】
分娩及び婦人科手術後における主たる課題は、癒着の形成である。腹腔の創傷回復において観察されるこの広く見られる現象は、痛み（ｐａｉｎ）、腸閉塞、及び不妊の主要な原因である。癒着の形成には、繊維素溶解性炎症反応と繊維素増殖性の炎症反応の不均衡が関わっているようであり、細胞−細胞又は細胞−細胞外マトリックス相互作用の調節も関わっているかもしれない。癒着の形成の初期段階でフィブリンが重要な役割を果たしているという強固な証拠が存在する［ｄｉＺｅｒｅｇａ，Ｇ．Ｓ．，Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．３８１：１（１９９３）］。血小板を含む細胞要素が存在すると、さらにフィブリンの役割を悪化させる。癒着の形成における血小板とフィブリンの役割の点からみて、ＣＮのようなディスインテグリンを治療剤として使用し得る可能性があることが、最も魅力的なことである。
【００５７】
癒着形成のウサギのモデルにおける予備的研究では、ウサギの子宮角（ｕｔｅｒｉｎｅ  ｈｏｒｎ）の掻爬及び血管除去（ｄｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）を使用して、非処置動物における創傷治癒の際に癒着の形成を誘導した［Ｒｏｄｇｅｒｓ，Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｆｅｒｔｉｌ．３５：４０（１９９０）］。１０μＬ／時間（３６μｇ／ｍＬ）の速度で、ＣＮを継続的に送り込むためにアルゼット（ａｌｚｅｔ）ポンプを使用した。このモデル系では、対照に比べて、被処置動物において癒着の形成が減少することが観察された。したがって、このような治療を必要としている患者に、癒着の形成を防止するのに有効な量のＣＮを投与することによって、癒着の形成を防止するための組成物及び方法も、本発明の範囲に属するものと想定される。
【００５８】
本発明の組成物には、所望の効果（すなわち、血栓形成を防止する、癌患者で転移を防止する、癒着の形成を防止するなど）を達成するのに有効な量のＣＮと、適切な担体又は賦形剤とを最小限含む。一般的に、これらの組成物には、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５０ｍｇ／ｋｇ／日、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約５．０ｍｇ／ｋｇ／日、最も好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜約０．５ｍｇ／ｋｇ／日を与えるのに十分な量のＣＮが存在する。このような組成物は、血栓形成の防止に特に有用である。
【００５９】
あるいは、ＣＮは、血栓溶解を達成するのに有効な量で存在する少なくとも１つの血栓溶解剤と組み合わせて投与される。適切な血栓溶解剤には、以下のもの：アニソイル化プラスミノーゲンストレプトキナーゼ活性化因子複合体（ＡＰＳＡＣ）、組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、Ｍａｒｋｌａｎｄ，Ｊｒらの米国特許第４，６１０，８７９号に記載されているヘビ毒繊維素溶解剤フィブロラーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
ＣＮは、血流中に相当量のＣＮを送り込むのに適したこれまでに知られている様々な手段によって投与し得る。ここでは、適切な液体媒体又は賦形剤中のＣＮを静脈内に投与することが、好適な投与経路として想定されている。ＣＮは、水に可溶性であり、それ故、適切な水溶液（例えば、リン酸緩衝化生理的食塩水）中で効果的に投与され得る。あるいは、ＣＮは、（適切な結合剤若しくは賦形剤成分と調合した錠剤若しくはカプセルの形態で、又は水性若しくは油性の懸濁物、溶液、エマルジョン、シロップ、若しくはエリキシル剤の形態で）経口で、又は、非経口懸濁物として投与し得る。本分野で周知であるように、これらの調合物には何れも、局所麻酔、防腐剤、緩衝剤、潤滑剤、湿潤剤、着色剤、香料、賦形剤、及び希釈剤のようなアジュバントを適切に含有させてもよい。
【００６１】
【実施例】
これらの更なる実施態様は、添付の例を参照することによって、よりよく理解されると思われるが、これらの例は、説明を目的とするものにすぎず、いかなる意味においても、本明細書に付された特許請求の範囲に明記された本発明の範囲を限定するように解釈してはならない。
【００６２】
以下の例を実施する際には、Ｂｉｏｔｏｘｉｎｓ社、Ｓｔ．Ｃｌｏｕｄ，ＦＬから、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ  ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ  ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘから凍結乾燥した毒を入手した。全ての化学薬品は、入手可能な最高級のものであった。タンパク質濃度を決定するためには、ビシンコニン酸を用いたピアースのタンパク質アッセイキットを使用した［Ｓｍｉｔｈ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０：７６（１９８５）］。
【００６３】
疎水性相互作用（ＨＩＣ）ＨＰＬＣのためには、ＬＣ−９５ＵＶ／ＶＩＳ検出器とともに、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ４１０ＬＣポンプを使用した。逆相ＨＰＬＣのためには、ＳＰ８４５０ＵＶ／ＶＩＳ検出器とともに、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ＬＣ８８１０ポンプを用いた。ＨＩＣ−ＨＰＬＣの吸光度は２８０ｎｍでモニターし、ＲＰ−ＨＰＬＣの吸光度は２１５ｎｍでモニターした。疎水性相互作用ＨＰＬＣには、ポリプロピルアスパルタミド（２５０×２１ｍｍ）カラム（Ｐｏｌｙ  ＬＣ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）を使用した。逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）には、Ｃ１８（２１８ＴＰ５４と２１８ＴＰ５１０）カラムを使用した。陽イオン交換クロマトグラフィーには、ＣＭ（カルボキシメチル）３００カラム（ＳｙｎＣｈｒｏｍ，Ｉｎｃ．，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＩＮ）を使用した。
【００６４】
例１
ＣＮの精製と性質決定
ＣＮは、４工程のＨＰＬＣ操作を用いて、Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ（ミナミアメリカマムシ）の毒から精製した。精製の第１段階では、１Ｍの硫酸アンモニウムｐＨ６．８（緩衝液Ａ）を含有する０．１Ｍのリン酸緩衝液の中に、未精製の毒（１ｇ）を溶かして、ポリプロピルアスパルタミドＨＩＣ−ＨＰＬＣカラムにかけた。溶出は、以下のように行った：１００％の緩衝液Ａで５０分間イソクラティック、０．１Ｍリン酸ｐＨ６．８（緩衝液Ｂ）まで９０分間の直線グラジエント、１００％緩衝液Ｂで４０分イソクラティック。５ｍＬ／分の流速を用いて、４℃で、Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｒａｃ　１００フラクションコレクター中に１０ｍＬの画分を採集した。血小板凝集阻害活性を含有する画分をプールし、ＹＭ３膜を備えたＡｍｉｃｏｎ　ｓｔｉｒ　ｃｅｌｌを用いた限外濾過によって濃縮した。タンパク質は、２８０ｎｍで検出した。血小板凝集阻害活性は、フロースルー中に観察された。
【００６５】
さらなる精製は、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣによって達成された。この第２の工程のために、血小板凝集阻害活性を含有する画分をプールし、濃縮した。水中の０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ）９５％と水中の０．１％ＴＦＡ中の８０％アセトニトリル（溶媒Ｂ）５％とでＣ１８カラム（２１８ＴＰ５１０）を平衡化した。溶出は、以下のように行った：９５％の溶媒Ａと５％の溶媒Ｂで１０分間イソクラティック、６５分で４０％の溶媒Ｂまで直線グラジエント、２０分で１００％の溶媒Ｂまで直線グラジエント、１００％の溶媒Ｂで２５分間イソクラティック。画分は、７ｍＬ／分の流速で、１分ごとに手で採集した。ＣＮは、２８％のアセトニトリル（６６分）で溶出した。
【００６６】
血小板凝集阻害活性を含有する画分をプールし、より緩やかなグラジエントを用いて、同じＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣカラムに再度かけた。溶出は、以下のように行った：８０％の溶媒Ａと２０％の溶媒Ｂで２０分間イソクラティック、９０分以上、３０％の溶媒Ｂになるよう直線グラジエント、２５分で１００％の溶媒Ｂまで直線グラジエント。ＣＮは、２２％のアセトニトリル（８２分）の時点で、鋭いピークとして溶出した。ＣＮの直前に溶出する小さなピークも血小板凝集阻害活性を含み、ＣＮの分子量と同様の分子量を有していたが、低収率のために、このピークは、さらに性質決定しなかった。
【００６７】
最後の精製工程は、前の工程で得たプールされた画分を用いて行った。陽イオン交換ＣＭ３００ＨＰＬＣカラムに、これらのプールされた画分をかけ、徐々に増加する塩化ナトリウムのグラジエントによって溶出を達成した。ＣＮは、５２．５分（１６０ｍＭ　ＮａＣｌ）で溶出する。この工程によって、ＣＮのイソフォームが分離された。１ｇの未精製毒当たり１〜２ｍｇの収量で、４工程によって精製されたＣＮが得られた。
【００６８】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のために、還元及び非還元条件下で、公表されたプロトコール［Ｓｃｈａｇｇｅｒ，Ｈ．　＆　Ｖｏｎ　Ｊａｇｏｗ，Ｇ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６６：３６８（１９８７）］に従って、Ｔｒｉｓ−Ｔｒｉｃｉｎｅの１６．５％ゲルを用いた。ＢｉｏＲａｄミニゲルシステムを用いて、このゲルを展開し、銀［Ｍｏｒｒｉｓｅｙ，Ｊ．Ｈ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７：３０７（１９８１）］又はクマシーブルーＲ２５０で染色した。
【００６９】
ＣＮのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、ＣＮは、非還元条件下で、約１５，０００ダルトンの分子量を有し、還元条件下で５，０００〜７，０００ダルトンの分子量を有することが明らかとなった。このことは、ＣＮが２つのサブユニットから構成されることを強く示唆している。あり得にくいことであるが、別の可能性として、移動度の大きな差は、非還元条件と還元条件下で、ＳＤＳの取り込みが異なったことが考えられる。
【００７０】
ＣＮの分子量は、エレクトロスプレーイオン源を有する３重４極子装置を用いた質量分析によって確認した。天然状態のＣＮは、１３，５０７ダルトンの質量であった。この分析も精製が高度であることを示した。還元され、ピリジルエチル化されたタンパク質の質量分析は、７，９９６ダルトンの質量を与えた。６つの還元されたジスルフィド結合中に取りこまれた１２のピリジルエチル基の質量単位が１，２４８であることを考慮に入れると（公知のディスインテグリンとの相同性に基づけば、６つのジスルフィド結合が存在するはずである）、これは、この分子量のホモ二量体の各鎖について予想された値である。これらの発見は、二量体として存在する点で、これまでに報告された全てのディスインテグリンのうちＣＮを特異な位置に置くものである。活性化されていないヒト血小板へのＣＮ結合に対してスキャッチャード分析を行うことによって、３７ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する単一の結合部位と１００，０００に等しい結合部位の数（Ｂｍ）が明らかとなった。ジスルフィド結合を還元すると、ＩＣ５０の１０倍の濃度でも、血小板凝集阻害活性は完全に喪失するので、活性を維持するためには構造的なパラメーターが重要であることが示唆された。
【００７１】
例２
ポリメラーゼ連鎖反応を用いたコントートロスタチンのｃＤＮＡクローニング
エドマン分解法を用いたコントートロスタチンの部分アミノ酸配列分析によって、コントートロスタチンは、サブユニットとＲＧＤ配列が、システイン残基を並列した他のディスインテグリンと相同である（図１Ａ）ことが示唆された［Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ，Ｓ．，ＭｃＬａｎｅ，Ｍ．Ａ．，Ｋｌｏｃｚｅｗｉａｋ，Ｍ．，　ａｎｄ　Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｇ．Ｊ．　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ　ａｎｄ　Ｏｔｈｅｒ　Ｎａｔｕｒａｌｌｙ　Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ　ｏｆ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，　Ｓｅｍｉｎａｒｓ　ｉｎ　Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ　３１：２８９−３００（１９９４）］。ＰＣＲを用いたコントートロスタチンｃＤＮＡのクローニング戦略は、ディスインテグリンファミリー間の構造的な相同性に基づいている。ＰＣＲプライマーのデザインは、図１に図式的に示されている。図１Ａ中の下線を付した配列は、ディスインテグリンファミリーの間で高度に保存されている。ＰＣＲプライマーは、この領域に基づいて合成した。プライマーＰＣＲ−１とＰＣＲ−２を合成するために、Ｔｒｉｍｅｒｅｓｕｒｕｓ　ｇｒａｍｉｎｅｕｓから得られるトリグラミンのｃＤＮＡ中に存在する該領域をコードするヌクレオチド配列を使用した（図１Ｂ）。ＰＣＲ−１とＰＣＲ−２は、ディスインテグリン間のコンセンサス配列ＰＣＣＤＡＡＴＣＫＬのコーディング配列に相当する相補的なプライマーである。それらのヌクレオチド配列は、
ＰＣＲ−１：５’−ＧＴＴＴＡＣＡＧＧＴＴＧＣＡＧＣＡＴＣＧＣ−３’
（配列番号３）
ＰＣＲ−２：５’−ＧＣＧＡＴＧＣＴＧＣＡＡＣＣＴＧＴＡＡＡＣ−３’
（配列番号４）
である。
【００７２】
ＰＣＲのために、ベクターのＥｃｏＲＩ部位に隣接するλｇｔ１０フォワード及びリバースプライマーを使用した。該プライマーのヌクレオチドを以下に記す。
【００７３】
λｇｔ１０フォワードプライマー：５’−ＡＧＣＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＴＧＧＴＴＡＡＧ−３’（配列番号５）
λｇｔ１０リバースプライマー：５’−ＣＴＴＡＴＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＡ−３’（配列番号６）
オリゴヌクレオチドプライマーは、南カリフォルニア大学総合癌センターの微量化学中殻施設によって合成された。プライマーは、脱保護された凍結乾燥形態で調製され、使用前に、水で再懸濁し、適当な濃度まで水で希釈した。
【００７４】
例３
コントートロスタチンｃＤＮＡのＰＣＲ増幅
本発明者らは、λｇｔ１０ベクターのＥｃｏＲＩ部位に構築したＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘの毒腺のｃＤＮＡライブラリーを使用した。該ライブラリーの概算の力価は、１０１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ｍｌであり、複雑性は５０，０００であった。このｃＤＮＡライブラリーファージ溶液５００μＬを、エッペンドルフチューブ中の２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／１Ｍ　ＮａＣｌ溶液５００μＬと混合した。エッペンドルフチューブを２回逆さにし、室温で３０分間インキュベートした。続いて、１４，０００ｒｐｍで１０分間、この溶液を遠心した。上清を捨て、１００μＬの滅菌水の中に沈降物を再懸濁した。５０℃で１時間、１０μＬのプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍＬ）とともに、この懸濁物をインキュベートした。フェノール／クロロホルムを用いて、ファージ粒子懸濁物を２回抽出し、１／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量の無水エタノールでＤＮＡを沈殿した後、８０％エタノールで洗浄した。ＰＣＲの準備のため、１０μＬの滅菌水の中にＤＮＡを再懸濁した。
【００７５】
ＰＣＲ反応は、以下のようにセットアップした。１μＬの２５ｍＭ　ｄＮＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、各１μＬ（１００ｎｇ／μＬ）のフォワード及びリバースＰＣＲプライマー、並びに５μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液と５μＬのＤＮＡ溶液を混合した。水で反応液の最終容量を５０μＬにした。混合した後、液体の上にミネラルオイルを一滴加えた。エッペンドルフチューブを９８℃まで５分間、予め加熱した後、室温まで冷却する前に、７０℃と６０℃で、それぞれ１分間インキュベートした。２．５ユニットのＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を各混合物に加えた。サーマルサイクラーは、以下のようにプログラムした：９６℃１５秒間、５５℃３０秒間、７２℃１分間。ＰＣＲ増幅は、３０サイクル行った。サンプルが３０℃まで冷却する前に、最後のサイクルに続いて、７分間の最後の７２℃での伸長工程を行った。アガロースゲル電気泳動によって分析する前に、クロロホルムでＰＣＲ産物を抽出した。直接ＤＮＡ配列を決定するための製造者によるマニュアルに従って、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキット（Ｂｉｏ　１０１社）を用いて、電気泳動によって分離したバンドをアガロースゲルから回収した。
【００７６】
接着部位の上流領域を増幅するために、λｇｔ１０フォワードプライマーとＰＣＲ−１プライマーを使用した（図１Ｂ）。同様に、ｃＤＮＡの下流部分を増幅するために、ＰＣＲ−２プライマーとλｇｔ１０リバースプライマーを対にした（図１Ｂ）。第１のプライマーの対により、約１３００ｂｐの主要なバンド（ＣＮ−Ｎと表記）が得られ（図２、レーン１）、後者のプライマー対を用いたＰＣＲからは、約７００ｂｐの主要なバンド（ＣＮ−Ｃと表記）が得られた（図２、レーン２）。重複伸長の前に、ＣＮ−ＮとＣＮ−Ｃは、ヌクレオチド配列決定分析にかけた。予想どおり、ＣＮ−Ｎは、そのＮ末端のシグナルペプチドをコードするトリグラミンのｃＤＮＡと高い類似性を示した。ＣＮ−Ｃヌクレオチドの推定アミノ酸配列は、ＲＧＤ部位をコードするディスインテグリンのＣ末端の配列と非常に類似していた。
【００７７】
ＰＣＲ−１とＰＣＲ−２は相補的なので、ＣＮ−ＮとＣＮ−Ｃは、この部位で重複し、それ故、完全長のｃＤＮＡに集合することができる。この目標を達成するために、本発明者らは、図１Ｃに示した重複伸長法を使用した。簡潔に述べれば、等モル量の二本鎖のＰＣＲ産物ＣＮ−ＮとＣＮ−Ｃを、λｇｔ１０フォワード及びリバースプライマーと混合した。両二本鎖の変性後、続く再アニ−リングによって、２種類の分子が得られる。１つは、接着部位に、陥凹（ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ）末端を３’末端としてアニ−リングしたＣＮ−ＮとＣＮ−Ｃである。この分子は、ＰＣＲを用いて、自動的に、完全長の二本鎖に伸長させることができる。他方の分子は、同様にアニ−リングしているが、陥凹末端が５’末端である。これらの分子は、自己伸長しないが、λｇｔ１０プライマーによって各末端からプライミングすることによって、陥凹部を埋めることができる。図２のレーン３は、アガロースゲル電気泳動によって分離された重複伸長産物を示している。主要なバンドのサイズは、ＣＮ−ＮとＣＮ−Ｃの合計に等しい２，０００ｂｐであると見積もられ、このため、「完全長」と表記される。完全長のバンドをゲルから回収し、ＥｃｏＲＩで処理した。続いて、プラスミドベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）の中に、このＤＮＡ片をサブクローニングした。
【００７８】
例４
プラスミドベクター中へのＰＣＲ産物のサブクローニング
ＥｃｏＲＩ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）を消化した後、Ｔ４ホスファターゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて脱リン酸化した。ＰＣＲ重複伸長産物も、ＥｃｏＲＩで消化した。１６℃で１晩のＴ４リガーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いた連結反応によって、直鎖化したベクター中にＰＣＲ産物を挿入した。全ての反応は、標準的なプロトコールに従ってセットアップし、実施した。アンピシリンを含有するプレート上に形質転換したＥ．Ｃｏｌｉ（ＤＨ５α）を播種することによって、上手く連結したものを選択した。インサートを含有するプラスミドをＥ．Ｃｏｌｉ中で増幅した。精製したプラスミドＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎｅ　ＤＮＡ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐカラムを用いて得た。
【００７９】
例５
ｃＤＮＡの配列決定
自動ＤＮＡ配列決定は、微量化学中殻施設によって行われた。ＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物の直接配列決定用の配列決定プライマーとして使用した。プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）中のインサートを配列分析するために、複クローニング部位（ＭＣＳ；ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｉｔｅ）に隣接するＴ７プロモータープライマーとＢＧＨリバースプライマーを用いてアッセイを開始した。典型的な反応は、４００〜６００ｂｐの読み取り可能な配列を与えた。プラスミドＤＮＡの場合には、配列決定反応は、二本鎖ＤＮＡに対して行った。新しい配列決定プライマーを合成して別の配列を取得し、ＤＮＡｓｉｓコンピュータープログラムを用いて、これらを重複する連続配列に集合させた。
【００８０】
図３は、ＥｃｏＲＩ部位の間に挿入された完全長のヌクレオチド配列を示している。それは、２，０２９ヌクレオチドから構成され、重複伸長の完全長バンドのサイズである（図２、レーン３）。８６ヌクレオチドの５’末端非翻訳領域（５’−ＮＴＲ）に続いて、ヌクレオチド番号８７と１５３５の間には、オープンリーディングフレームが存在する。ヌクレオチド１５３６〜１５３８は終止コドンである。３’―ＮＲＴは、３’末端の非コード領域にＡＡＴＡＡＡ部位を有し、ポリ（Ａ）テールで終結しており、重複伸長を用いて本発明者らが取得したｃＤＮＡが確かに完全なｃＤＮＡであったことを示唆している（図３）。前記オープンリーディングフレームは、４８３アミノ酸をコードする。ｃＤＮＡから推定されるアミノ酸配列の構造は、３つのドメインに分けることができる。メチオニンから始まる最初の１９０アミノ酸は、多くのクローニングされたヘビ毒タンパク質のプロタンパク質と非常に類似している（図４に比較が示されている）。アミノ酸１９１〜４１８は、亜鉛結合モチーフＨＥＭＧＨＮＬＧＩＳＨ（アミノ酸３３４〜３４４）を含むメタロプロテイナーゼドメインである。残りの６５アミノ酸は、エドマン法によって決定されたコントートロスタチンの公知の部分アミノ酸配列と同一であるコントートロスタチン単量体に属する。この配列は、その配列が決定されている多くのディスインテグリンの配列と極めて似ている（図４及び１Ａ）。計算された前記ディスインテグリンの分子量は６．７７ｋＤａであり、ＣＮモノマーの分子量と等しい。ＲＧＤ（アミノ酸４６１〜４６３）配列は、太字で記されている。３ドメイン構造は、Ｋｉｎｉら［Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｄｏｍａｉｎｓ　ｉｎ　Ｖｅｎｏｍ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ　ｔｈａｔ　Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ　ａｎｄ　Ｎｏｎｅｎｚｙｍａｔｉｃ　Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ）　ｆｒｏｍ　Ｓｎａｋｅ　Ｖｅｎｏｍｓ　ａｒｅ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　ｂｙ　Ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ　ｆｒｏｍ　ａ　Ｃｏｍｍｏｎ　Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，Ｔｏｘｉｃｏｎ　３０：２６５−２９６，（１９９２）］によって提案されたヘビ毒メタロプロテイナーゼ及びディスインテグリンの前駆体モデルと一致している。ディスインテグリンは、翻訳後タンパク質分解を受ける複ドメイン前駆体として、ヘビの毒腺細胞で合成され、折り畳まれて成熟したディスインテグリンを生じるという証拠が存在する。
【００８１】
例６
ＣＮは乳癌の接着及び浸潤に影響を与える
高い転移性を有するヒト乳癌細胞ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞株のＥＣＭタンパク質への結合に対してＣＮが与える影響について調べた。９６ウェルのマイクロタイタープレートのウェルにヒトフィブロネクチンとビトロネクチンを固定化した。図３と４から明らかなように、ＣＮは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５の両ＥＣＭタンパク質への接着を用量依存的に阻害した。フィブロネクチンへの接着のＩＣ５０は１８ｎＭであり（図６）、ビトロネクチンのＩＣ５０は１．５ｎＭであった（図７）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞によるヒトＩ型コラーゲンへの弱い接着、又はＭＤＡ細胞が比較的強い親和性を有するラットＩ型コラーゲンへの接着に対しては、ＣＮは最小限の効果しか示さなかった。
【００８２】
上記実験の変法では、ＣＮを固定化した。ＣＮは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の結合を用量依存的に補助し得ることが見出された。固定化されたＣＮへのＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の結合は、ＲＧＤペプチドＧＲＧＤＳＰ（ＩＣ５０＝０．４ｍＭ）、及びＥＤＴＡ（ＩＣ５０＝０．８ｍＭ）によってブロックされる。インテグリン受容体のサブユニットは非共有結合的に会合するために金属イオンを必要とするので、本発明者らの発見は、ＲＧＤによって媒介される機序を介してＭＤＡ−ＭＲ−４３５細胞の表面上に存在するインテグリン受容体にＣＮが結合することを示している。固定化されたＣＮがＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の接着を補助し得るという発見は、この結合が腫瘍細胞上の細胞表面受容体を必要とすることを示唆している。図８及び９から明らかなように、ヒト乳癌細胞の固定化ＣＮへの結合を阻害するために、様々な濃度のＧＲＧＤＳＰ（図８）又はＥＤＴＡ（図９）を使用した。ＣＮは０．１μｇ／ウェルの濃度であった。各データの点に位置する縦線は、ｙ軸誤差線を示している。全ての実験で各データ点について３つの測定を行い、これを３回繰り返した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の固定化ＣＮへの接着はＧＲＧＤＳＰ及びＥＤＴＡによって完全にブロックされるので（図８及び９）、ＣＮは、専らＲＧＤ依存性の機序を介してＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のインテグリン受容体に結合する。
【００８３】
例７
コントートロスタチンは、単量体のディスインテグリンよりも腫瘍細胞の運動性を強力に阻害する阻害剤である
インテグリンの封鎖が腫瘍細胞の運動性を阻害し得るという仮説を検証するために、ボイデンチャンバーアッセイ（Ｂｏｙｄｅｎ　ｃｈａｍｂｅｒ　ａｓｓａｙ）を用いて、細胞の運動に対するディスインテグリンの効果を決定した。腫瘍細胞の運動性は、改変ボイデンチャンバーを用いて定量した（Ｒｅｐｅｓｈ，　Ｌ．Ａ．　Ａ　Ｎｅｗ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌ　Ｉｎｖａｓｉｏｎ，　Ｉｎｖａｓｉｏｎ　ａｎｄ　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．　９：　１９２−２０８，　１９８９）。１２μｍの孔径を有するトランスウェルチャンバー（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｃｏｓｔａｒ，　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，　ＭＡ）を、無血清培地で１：１００に希釈したＭａｔｒｉｇｅｌでコートした。処理又は未処理のＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を上方チャンバーに加え、下方チャンバーはＨＴ１０８０馴化培地で満たした。３７℃で１０時間細胞をインキュベートし、移動していない細胞を取り除いた後、コートされた膜の底部の側に移動している細胞の数を固定し、染色し、デジタル画像分析（ＮＩＨ　Ｉｍａｇｅ）を用いて定量した。コントートロスタチンは、これらの条件下において、０．１μＭの濃度で、細胞の移動を７０％阻害するのが観察された（図１０ａ及びｂ）。これに比べて、単量体のｄリスインテグリンであるフラボリディンは、２倍の濃度（０．２μＭ）にしても、僅か４５％しか移動を阻害しなかった。このように、コントートロスタチンは、単量体には存在しない別の阻害活性を保有しているようである。別の単量体ディスインテグリンであるエチスタチンを使用しても同様の結果が得られた（データは示さず）。コントートロスタチンが運動性を阻害する能力はＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞に限定されない。本発明者らは、Ｔ２４膀胱癌、ＫＳＹ−１カポジ肉腫、及び様々な神経膠腫細胞株を含む種々の腫瘍細胞で阻害的効果を観察した（未公開の観察）。
【００８４】
運動性に対するコントートロスタチンの阻害活性は、基層からの剥離によるものではない。４℃で一晩インキュベートして、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１：１００に希釈）又はビトロネクチン（１０μｇ／ｍｌ）を９６ウェル培養プレートのウェル中に固定化することによって、固相基質への細胞の接着を測定した。ＰＢＳで洗浄して未結合のタンパク質を取り除き、１％ＢＳＡ／ＰＢＳとともに、室温で１時間インキュベートすることによって残存する表面をブロックした。細胞を採集し、無血清培地で四回洗浄した。密度を５×１０５細胞／ｍｌに調整した後、様々な濃度のコントートロスタチンで細胞を処理し、コートしたウェルに加える前に、室温で２０分インキュベートした。細胞を３０分間接着させた後、結合していない細胞をこの時点で除去した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ　９６　Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，　ＷＩ）を用いて、残存する細胞の数を比色定量し、Ｐｒｉｓｍ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　（Ｇｒａｐｈ　Ｐａｄ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）を用いてデータ処理を行った。図１１は、コントートロスタチンはビトロネクチンへの細胞の接着を効果的に阻害できるが、Ｔ２４細胞のＭａｔｒｉｇｅｌへの接着に対しては、該ディスインテグリンは効果がないことを示している。これは、検査した全ての細胞株で一貫して観察される。
【００８５】
例８
ＣＮは、ヌードマウス実験モデルで、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌の増殖と転移を阻害する
ヌードマウスの自発的な（同所）転移モデルは、乳腺の脂肪パッド（ｍｆｐ；ｍａｍｍａｒｙ　ｆａｔ　ｐａｄ）にＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（０．１ｍＬ中５×１０５）を移植することによって確立した。移植から１０日目に、触診可能な腫瘍が現れた。移植から１４日目に開始して、各群の腫瘍塊中に毎日ＣＮの投与を行う。移植から８週間後までに、腫瘍を除去した。動物は、ＣＮを投与せずに、さらに２週間生存させた。その後、動物を屠殺し、肺の転移を注意深く調べた。
【００８６】
図１２から明らかなように、本発明者らの発見は、ＣＮの局所投与が、腫瘍の増殖速度をかなり阻害したことを示している。対照（黒い棒）の腫瘍塊の体積（平均±Ｓ．Ｄ．）、低用量（０．５μｇ／日、灰色の棒）のＣＮ処置群、及び高用量（５μｇ／日、灰色の棒）のＣＮ処置群が示されている。左から右への７つの群の棒は、投与前（ＰＩ、移植から１４日目）と投与の第１〜第６週のデータを表している。差の有意性を検定するために、スチューデントのｔ検定を利用した。＊と＊＊は、それぞれ、Ｐ＜０．０５とｐ＜０．０１を示している。高用量（５μｇ／日）のＣＮで処理した腫瘍の平均重量は、対照群と比べて有意に低い（Ｐ＜０．０５）。表１は、肉眼による検査と表面の小結節の計数に基づく肺転移の発生を示している。対照群での転移の広がりは、９０％を超える転移の阻害を示した高用量のＣＮ群に比べて、ずっと広範である。これらのデータは、ヒト乳癌の治療でＣＮが治療的役割を果たし得る可能性を実証している。
【００８７】
【表１】
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例９
ＣＮは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍によって誘導されたＣＡＭ中の血管新生を阻害する
腫瘍の増殖に対する阻害的な効果が、少なくとも部分的には、おそらくはＣＮによる血管新生の阻害から生じるという仮説は、ニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ）上に腫瘍が誘導した血管新生に対するＣＮの効果を観察することによって予備的に確認された。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍塊を、１０日齢のニワトリ胚のＣＡＭに接種した。様々な用量のＣＮを、接種から２日後に、ＣＡＭの中に静脈内投与した。腫瘍によって誘導された血管新生と血管新生に対するＣＮの阻害的な効果は、インキュベーションから３日後に、容易にＣＡＭに観察することができる。図１３に示されているように、血管は、対照胚中の腫瘍塊を中心として、集中的に分布している。ニワトリの胚は免疫不全であり、このため、移植したＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍の増殖を可能とする。胚は、３７℃、６０％の湿度でインキュベートされる。接種から２日後に、様々な用量のＣＮをＣＡＭの中に静脈内投与した。腫瘍によって誘導された血管新生の第３日目の写真が示されている。上図（図１３Ａ）が対照胚である。血管は、腫瘍塊を中心として、集中的に分布している。中央（図１３Ｂ）は、２０μｇのＣＮで処置したＣＡＭである。下図（図１３Ｃ）は、１５０μｇのＣＮで処置したＣＡＭである。２０μｇのＣＮを処置した胚の血管は、対照と比べて、より薄く、密度が低い。対照のＣＡＭと比べて、腫瘍塊はより小さい。１５０μｇのＣＮで処置したＣＭＡでは、血管はさらに薄く、集中的な分布パターンは完全に消失している。おそらくは、血液供給の欠如故に、対照及び低用量のＣＮと比べて有意に小さな体積の壊死した腫瘍塊が存在する（図１３）。
【００８８】
例１０
ＣＮはインビトロでのＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の増殖に対して影響を与えない
ＭＤＡ−ＭＲ−４３５細胞（０．３×１０６／ｍｌ）を、１／１００希釈したＭａｔｒｉｇｅｌでコートした６ウェルの細胞培養プレーとの各ウェルに加えた。次いで、様々な濃度のＣＮで細胞を処理した。ＣＮなし（丸）、１００ｎＭのＣＮの存在下（三角）、及び５００ｎＭのＣＮの存在下（菱形）における、ＭＤＡ−ＭＲ−４３５細胞のインビトロでの増殖曲線が記されている。Ｍａｔｒｉｇｅｌ（１／１００希釈）でコートした６ウェルの細胞培養プレートに、３ｍｌのＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞懸濁液（０．３×１０６／ｍｌ）を播種した。２４時間毎に細胞密度を測定した。図１４から明らかなように、ＣＮの存在下でも、細胞は、対照細胞と同様に増殖する。本結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のインビトロでの培養中に、ＣＮが直接的な細胞毒性を有していないことを示している。
【００８９】
例１１
ＣＮはインビボでも効果的であり、且つ十分使用に耐え得る
上述のヌードマウスを用いた慢性実験から、ＣＮは有毒でないと結論付けることができる。コントートロスタチンは血小板凝集阻害活性を有しているにもかかわらず、実験の間、自然的な出血は観察されない。ただ、ＣＮ処理した動物の投与部位には幾らかの出血が認められた。
【００９０】
ＣＮは新規抗転移剤である。本発明者らは、癌の転移と進行における幾つかの重要な段階（例えば、接着、浸潤、血管新生）をＣＮが阻害するという仮説を立てている。従って、ＣＮは、単一の段階を遮断する他の薬剤よりも強力である。
【００９１】
例１２
コントートロスタチンは、その抗悪性腫瘍活性の機序としてインテグリンαｖβ５に結合する
序論：インテグリン機能の最も強力な公知の阻害剤であるディスインテグリンは、ヘビのＶｉｐｅｒｉｄａｅとＣｒｏｔａｌｉｄａｅ科の毒から単離されたシステインが豊富なペプチド群である。ディスインテグリンは、血小板及びその他の細胞の表面上に存在するインテグリンに高い親和性で結合する。配列ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）は、これらの全ペプチド中に保存されている。該配列は、血小板表面のフィブリノーゲン受容体αＩＩｂβ３に結合し、フィブリノーゲン依存性の血小板凝集を阻害すると考えられている。（ＲＧＤの代わりに）ＫＧＤを含有するディスインテグリンであり、αＩＩｂβ３に対する比較的特異的なアンタゴニストであるバルブリンを除いて、他のディスインテグリンはどちらかといえば非特異的であり、他のβ３のほかβ１インテグリンの機能を遮断することができる。
【００９２】
コントートロスタチンは、Ａｇｋｓｔｒｏｄｏｎ　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ（ミナミアメリカマムシ）の毒から得られるディスインテグリンである。他のディスインテグリンとは異なり、コントートロスタチンは、質量分析によって示されたところによると、非還元状態のタンパク質で質量が１３，５０５のホモ二量体であり、還元され、ピリジルエチル化されたタンパク質の場合、６，９５６の質量である。αＩＩｂβ３への結合による血小板凝集阻害活性に加えて、コントートロスタチンは新規抗血管新生剤でもある。本発明者らの最近の研究は、血管内皮細胞上に存在するαｖβ３が、コントートロスタチンが結合する重要なインテグリンであることを示している。本発明者らは、コントートロスタチンが、癌の転移及び進行における細胞接着、浸潤、及び血管新生を含む幾つかの重要な段階を遮断することを観察した。以前の研究において、本発明者らは、コントートロスタチンがＶＥＧＦによって誘導される血管新生を阻害することを見出し、これは、αｖβ５を解したシグナル伝達経路を介して調節されることが報告される。本例において、本発明者らは、コントートロスタチンがαｖβ５に直接結合し、該インテグリンの機能を抑えることを証明する。
【００９３】
意義：αｖβ５の機能は、多くの研究によって示されている。Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒと共同研究者らは、αｖβ３の封鎖はｂＦＧＦによって誘導される血管新生に影響を与えるにすぎないのに対して、αｖβ５の封鎖は専らＶＥＧＦによって誘導される血管新生を阻害することを見出しており、これらの増殖因子が、異なるインテグリンに依存する別個のシグナル伝達経路を利用することを示唆している。興味深いことに、コントートロスタチンは、雛の胚絨毛尿膜モデルにおいて、ｂＦＧＦとＶＥＧＦの両者によって誘導される血管新生を阻害する。αｖβ５は細胞のビトロネクチンへの接着の開始に関与しているが、細胞の遊走を恒常的に媒介するαｖβ３とは異なり、αｖβ５は、インシュリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、及び形質転換増殖因子−α（ＴＧＦ−α）等の増殖因子によって活性化されたときだけ遊走を媒介する。
【００９４】
増殖因子とαｖβ５依存性の遊走及びシグナル伝達の協調も明らかとなっている。局所的接着キナーゼ（ＦＡＫ、ｆｏｃａｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｋｉｎａｓｅ）は宿主細胞の接着時にαｖβ５とともに局在しているが、ＦＡＫのチロシンリン酸化は、おそらくは、増殖因子受容体による上流のチロシンキナーゼの活性化が起こる結果、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）が活性化されるまで増加しない。特異的なＰＫＣ阻害剤は、ＶＥＧＦによって誘導される血管新生を妨害する。シグナル伝達経路の下流側では、Ｙｅｂｒａらは、αｖβ５によって媒介させる細胞の遊走には、ＮＦκＢによって誘導されるｄｅ　ｎｏｖｏ遺伝子転写とタンパク質合成を含む後発の活性化現象が必要とされることを報告した。同研究者のグループによる最近の研究によって、ＰＫＣの活性化と、その結果起こるαｖβ５依存性細胞の遊走の増加には、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子／ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体（ｕＰＡ／ｕＰＡＲ）複合体とｕＰＡ酵素活性のアップレギュレーションを必要とすることが示された。αｖβ５依存性の細胞内シグナルカスケードは明らかにαｖβ３のシグナルカスケードとは別個のものであり、ビトロネクチンへの遊走を特異的に調節し、他のＥＣＭタンパク質への遊走は調節しない。
【００９５】
これらの知見は、血管新生と転移に際して、細胞の運動性を媒介する上でαｖβ５が重要な役割を果たしているという見解を裏付ける。従って、コントートロスタチンは、αｖβ５のアンタゴニストとして、抗血管新生及び抗転移治療において著しく有用であり得る。本発明者らは、コントートロスタチンの抗転移活性及び抗血管新生活性の新しい作用機序を発見した。これは、腫瘍の転移及び血管新生において重要なインテグリンであるαｖβ５に、ディスインテグリンが結合するという初めての観察である。
【００９６】
細胞接着アッセイ：ＡＴＣＣからヒト膀胱癌Ｔ２４細胞を購入し、５％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で増殖させた。抗αｖβ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＬＭ６０９を用いた負のＦＡＣＳ選択を６回繰り返して、Ｔ２４−β３ｎｅｇ．細胞を単離した。次いで、以下のように、ＦＡＣＳ分析を行った。１×１０７／ｍｌの密度で、細胞を１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ中に再懸濁した。室温で３０分間、抗αｖβ３　ｍＡｂである７Ｅ３又は抗αｖβ５　ｍＡｂであるＰ１Ｆ６（最終濃度５μｇ／ｍｌ）とともに、１００μｌを分取してインキュベートした。前記細胞を二度洗浄し、１％　ＢＳＡ／ＰＢＳ中に再懸濁した。１：２００の最終力価となるように、ＦＩＴＣを抱合したヤギ抗マウスＩｇＧを懸濁液に加えた。室温で暗所にて３０分間インキュベートした後、未結合のＦＩＴＣ抱合ＩｇＧを洗浄除去し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳｃａｎ、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いて、細胞の蛍光強度を分析した。試験は二度繰り返して行い、実験は三度繰り返した。Ｔ２４細胞はインテグリンαｖβ３（多量）とαｖβ５（少量）を何れも発現しているが、Ｔ２４−β３ｎｅｇ．細胞はαｖβ５のみを発現していることを結果は明瞭に示している（図１５）。
【００９７】
４℃で一晩、１００μｌのビトロネクチン（１μｇ／ウェル）で９６ウェルプレートの各ウェルをコートした。リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）で三度洗浄して、過剰なタンパク質を洗浄除去した後、ＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。コートしたウェルに加える前に、一定分量（１００μｌ）の細胞（５×１０５細胞／ｍｌ）を抗体又はコントートロスタチンとともに、室温で２０分間インキュベートした。処理した細胞を、３７℃で３０分間ウェルに接着させた。無血清培地を用いて、結合していない細胞を洗浄除去した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ　９６ＴＭ　Ａｑｕｅｏｕｓ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）の何れかによって、細胞接着を定量した。各阻害剤の濃度は三度繰り返して調べ、少なくとも三回アッセイを行ったが、同一の結果が得られた。
【００９８】
コントートロスタチンは、ヒト乳房細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−４３５）がビトロネクチンでコートされたプレートに接着するのを阻害することが以前に実証された。インテグリンαｖβ３は、該細胞株中のディスインテグリンの結合部位として同定された。同様に、本研究では、コントートロスタチンは、ヒト膀胱癌Ｔ２４細胞が固定化されたビトロネクチンに接着するのを用量依存的に阻害し、１０μｇ／ｍｌ未満の濃度で１００％阻害した（図１５−Ａ）。既に示したように、Ｔ２４細胞はαｖβ３とαｖβ５の両者を発現していることが、ＦＡＣＳ分析によって示された。抗αｖβ３（７Ｅ３）の最大効果は、１００μｇ／ｍｌまでの濃度では、４０％にすぎなかったが（図１６−Ａ）、抗αｖβ５（Ｐ１Ｆ６）の接着に対する効果は、１：１００の希釈で４０％を下回った（図１６−Ｂ）。しかしながら、７Ｅ３（最大の阻害に達する１０μｇ／ｍｌに保った）に、徐々に増加する濃度のＰ１Ｆ６を合わせると、最終的に、ほぼ１００％の接着の阻害がもたらされる。この結果は、αｖβ３とαｖβ５が何れも、Ｔ２４細胞のビトロネクチンへの接着を媒介することを示唆している。細胞のビトロネクチンへの付着を完全に消失させるためには、両インテグリンに対する抗体を組み合わせることが必要である。一方、コントートロスタチンは、これらの細胞株のビトロネクチンへの接着を効果的に阻害する。この知見は、コントートロスタチンがαｖβ５のみならずαｖβ３にも結合するという本発明者らの仮説を強く裏付ける。
【００９９】
コントートロスタチンによる、二つのインテグリンの機能的な封鎖をさらに区別するために、αｖβ３陰性のＴ２４突然変異細胞（Ｔ２４−β３ｎｅｇ．）を接着アッセイに使用した。７Ｅ３による阻害は無視できるものであったが、コントートロスタチンは該細胞株の接着を完全に阻害した（図１６−Ｃ）。Ｔ２４細胞に対する阻害効果は４０％を下回ったのに対して（図１６−Ｂ）、Ｐ１Ｆ６の阻害効果は８０％にも及んだので（図１６―Ｄ）、Ｔ２４−β３ｎｅｇ．細胞のビトロネクチンへの接着は、主として、αｖβ５によって媒介された。Ｐ１Ｆ６の阻害曲線は、７Ｅ３の添加によって変化しなかった（図１５−Ｄ）。該アッセイの結果によって、αｖβ３陰性細胞株であるＴ２４−β３の接着は、αｖβ５によって媒介されることが示された。モノクローナル抗体によるαｖβ５の封鎖は、接着を完全に阻害する。コントートロスタチンは、これらの細胞がビトロネクチンに接着するのを阻止し得ることが示された。このように、コントートロスタチンは、インテグリンαｖβ５に結合することは間違いない。
【０１００】
細胞浸潤アッセイ：コントートロスタチンがαｖβ５に結合することによって、癌細胞の浸潤が阻害されるかどうかを調べるために、高い浸潤性を有するヒト卵巣癌細胞（ＯＶＣＡＲ−５）（αｖβ５を発現しているが、αｖβ３は発現していない）を用いて浸潤アッセイを行った。ＯＶＣＡＲ−５細胞株中でのインテグリンの発現パターンは、モノクローナル抗体抗αｖβ３（７Ｅ３）と抗αｖβ５（Ｐ１Ｆ６）を用いたＦＡＣＳによって分析した。図１７に示されているように、実線のピークはバックグラウンドであり、バックグラウンドと重なっている点線のピークは結合した７Ｅ３を表し、右側の点線のピークはＰ１Ｆ６を表している。このことは、ＯＶＣＡＲ−５細胞がインテグリンαｖβ５を有しているが、αｖβ３は有していないことを決定的に示している。
【０１０１】
浸潤を測定するためには、改変されたボイデンチャンバーを用いた。無血清培地中で１：５０希釈したＭａｔｒｉｇｅｌで、１２μｍの孔サイズを有する１２ｍｍのボイデンチャンバーのフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）をコートした。コントートロスタチンで前処理した細胞（２００μｌの培地中２．５×１０５細胞）、様々なインテグリンに対する抗体、又はビークル（対照）を上方のウェルに加えた。ＨＴ１０８０馴化培地を底部ウェルに加えた。３７℃で８時間、細胞をインキュベートし、８時間の時点で、膜の上側に存在する細胞を濡れた綿棒で除去した。フィルター膜に浸潤した細胞を固定し、Ｄｉｆｆ−ＱｕｉｋＴＭ染色キット（Ｄａｄｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｐ．Ｒ．　Ｉｎｃ．，　Ａｇｕａｄａ，Ｐｕｅｒｔｏ　Ｒｉｃｏ）で染色した。膜をホルダーから取り外し、スライドの上に載せた。顕微鏡を用いて、５つのランダムに選択した高倍率の視野に存在する細胞の数を測定することによって、遊走を定量した。各阻害剤の濃度は二回繰り返して調べ、結果を確認するために実験は三回繰り返した。
【０１０２】
コントートロスタチン、抗体のみ、及び抗体の組合せは何れも、前記細胞のＭａｔｒｉｇｅｌへの付着及び広がりを阻害しなかった。従って、これらのビトロネクチン受容体アンタゴニストの抗浸潤活性は、それらの抗接着効果とは独立していた。図１８は、コントートロスタチン（１０００ｎＭ）によって、ＯＶＣＡＲ−５細胞がＭａｔｒｉｇｅｌに浸潤するのをほぼ完全に阻害したことを示している。１００ｎＭのＰ１Ｆ６でも同等の阻害が得られた。しかしながら、同じモル濃度では、７Ｅ３は浸潤に対する影響を示さなかった。この結果は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ内へのＯＶＣＡＲ−５細胞の浸潤を、インテグリンαｖβ５が媒介することを強く示唆した。コントートロスタチンは、αｖβ５を封鎖することによって、これらの細胞の浸潤を効果的に阻害する。
【０１０３】
コントートロスタチンのαｖβ５への結合の検出：精製されたαｖβ５と改変ＥＬＩＳＡを用いた固相結合アッセイによって、コントートロスタチンがαｖβ５に結合するという直接的な証拠を集めた。９６ウェルプレートのウェル上に、４℃で一晩、可溶性αｖβ５（１００ｎｇ）を固定化した。過剰なタンパク質を洗浄除去し、未結合部位を１％のＢＳＡ／ＰＢＳでブロックした。前記コートしたプレートに、室温で１時間、様々な濃度のコントートロスタチンを結合させた。ＰＢＳで三回洗浄した後、１：１，０００の抗コントートロスタチン抗血清によって、結合したコントートロスタチン分子を検出した。アルカリホスファターゼを抱合させたヤギ抗ウサギ抗体を二次抗体として用いた。基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウムを加え、色素産生反応開始から１５分後に４０５ｎｍの光吸光度を測定することによって、結合した抗体を定量した。抗ディスインテグリン抗血清の固定化αｖβ５への結合をもって、バックグラウンドと定義する。総結合からバックグラウンドを差し引くことによって、特異的な結合を得る。各濃度のリガンドは三回分析した。図１９は、用量依存性且つ飽和性の様式で、コントートロスタチンがαｖβ５に結合することを示し、コントートロスタチンがαｖβ５に特異的に結合することを示唆している。
【０１０４】
要約すれば、本発明者らは、ディスインテグリンであるコントートロスタチンの新規結合部位としてαｖβ５を同定した。αｖβ５の機能的な封鎖は、ビトロネクチンへの癌の接着を阻害するのみならず、人工基底膜であるＭａｔｒｉｇｅｌへの癌細胞の浸潤も遮断する。αｖβ５へのコントートロスタチンの結合は、抗接着及び抗浸潤活性の一部である可能性が最も高い。
【０１０５】
例１３
コントートロスタチンは、腫瘍細胞において、αｖβ３を介したＣＡＳ及びＦＡＫのチロシンリン酸化を誘導する
要約：コントートロスタチンは、インテグリンを封鎖することによって、血小板凝集、及び細胞の細胞外マトリックスタンパク質への接着を阻害するホモ二量体のディスインテグリンである。チロシンリン酸化現象及び特異的なシグナル伝達分子の活性化を調べることによって、腫瘍細胞中でのインテグリンを介したシグナル伝達に対するコントートロスタチンの影響を調査した。本発明者らは、１ｎＭの低濃度で、可溶性コントートロスタチンがインテグリン信号を活性化して、ＦＡＫ及びＣＡＳのチロシンリン酸化を増加させること、及びこれらのシグナルはＳｒｃ活性を阻害すると失われることを見出した。特定のインテグリンを発現している被トランスフェクト２９３細胞を用いて、本発明者らは、コントートロスタチンによって生じたシグナルが、専らαｖβ３によって媒介されることを確定した。αｖβ３を欠如するが、αｖβ５及びα５β１を発現する細胞は、このように、コントートロスタチン処理に対して応答しないことを示すことによって、この観察は拡張された。αｖβ３を発現する細胞では、αｖβ３に対する抗体でコントートロスタチンの結合を遮断することによって、コントートロスタチンのシグナルは完全に消失する。単量体のディスインテグリンであるエチスタチンとフラボリディンは、単独では、チロシンをリン酸化させることはできなかったが、コントートロスタチンと同時に加えると、コントートロスタチンによって開始されるシグナルを完全に阻害した。本発明者らは、コントートロスタチンはホモ二量体であるが故に、αｖβ３インテグリンを架橋することが可能であり、Ｓｒｃの活性化とＦＡＫ及びＣＡＳの過剰リン酸化を引き起こすと提唱する。この活性は、腫瘍細胞の運動性を阻害し得る新規メカニズムに相当する可能性がある。
【０１０６】
序論：インテグリンは、細胞外マトリックスへの物理的な固着と細胞内部へのシグナル情報の両者を与える。これらの機能は何れも、細胞の運動過程にとって決定的なものであり、何れかを破壊すると運動性を減少させることができる（Ａｚｎａｖｏｏｒｉａｎ，　Ｓ．，　Ｓｔｒａｃｋｅ，　Ｍ．Ｌ．，　Ｐａｒｓｏｎｓ，　Ｊ．，　ＭｃＣｌａｎａｈａｎ，　Ｊ．，　ａｎｄ　Ｌｉｏｔｔａ，　Ｌ．Ａ．　Ｉｎｔｅｇｒｉｎ　ａｌｐｈａｖｂｅｔａ３　ｍｅｄｉａｔｅｓ　ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ　ａｎｄ　ｈａｐｔｏｔａｃｔｉｃ　ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　ｐａｔｈｗａｙｓ，　Ｊ　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７１：　３２４７−５４，　１９９６；　Ｗｏｎｇ，　Ｎ．Ｃ．，　Ｍｕｅｌｌｅｒ，　Ｂ．Ｍ．，　Ｂａｒｂａｓ，　Ｃ．　Ｆ．，　Ｒｕｍｉｎｓｋｉ，　Ｐ．，　Ｑｕａｒａｎｔａ，　Ｖ．，　Ｌｉｎ，　Ｅ．Ｃ．，　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，　Ｊ．　Ｗ．　Ａｌｐｈａｖ　ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ；　ｍｅｄｉａｔｅ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｒｅａｓｔ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅｓ，　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｅｘｐ．　Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．　１６：　５０−６１，　１９９８；　ａｎｄ　Ｇａｒｔｏｎ，　Ａ．Ｊ．　ａｎｄ　Ｔｏｎｋｓ，　Ｎ．Ｋ．　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ＰＴＰ−ＰＥＳＴ，　Ｊ　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２　７４：　３　８１１−３　８１８，　１９９９）。運動性を駆動するために必要な機構は複雑であって、高度に制御されているが、分子成分の作用は完全に理解されているわけではない。タンパク質チロシンキナーゼは、インテグリン機能を媒介する際に関与する主たる分子であり、それらの基質は、詳しく研究されているインテグリンシグナル伝達経路の成分である（Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ，　Ｆ．　Ｇ．　ａｎｄ　Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，　Ｅ．　Ｉｎｔｅｇｒｉｎ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２８５：　１０２８−１０３２，　１９９９）。細胞内に存在する何千というタンパク質のうち、チロシンリン酸化をもたらすのは僅かである。局所的接着複合体中のインテグリン細胞質ドメインに、チロシンリン酸化されたタンパク質が多数会合していることが明らかとなっている（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ，　Ｋ．，　Ｆａｔｈ，　Ｋ．，　Ｋｅｌｌｙ，　Ｔ．，　Ｎｕｃｋｏｌｌｓ，　Ｇ．，　ａｎｄ　Ｔｕｒｎｅｒ，　Ｃ．　Ｆｏｃａｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎｓ：　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｒｉｘ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，　Ａ．　Ｒｅｖ．　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　４：　４８７−５２５，　１９８８）。局所的接合キナーゼ（ＦＡＫ）は、インテグリン及び非インテグリン制御性の広範な細胞の工程に関与していると推測される非受容体チロシンキナーゼである（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，　Ｊ．　Ｌ．　Ｗｈｙ　ｄｏ　ｓｏ　ｍａｎｙ　ｓｔｉｍｕｌｉ　ｉｎｄｕｃｅ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＦＡＫ？．　［Ｒｅｖｉｅｗ］　［８１　ｒｅｆｓ］，　Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ．　２１　１０６９−７５，１９９９）。ＦＡＫは、細胞膜の細胞質側の近傍でインテグリンβサブユニットと会合し、ＦＡＫは、インテグリンとクラスターを形成すると、ここで特定のチロシン残基にトランス自己リン酸化を引き起こすことができる（Ｓｃｈａｌｌｅｒ，　Ｍ．　Ｄ．，　Ｈｉｌｄｅｂｒａｎｄ，　Ｊ．Ｄ．，　Ｓｈａｎｎｏｎ，　Ｊ．Ｄ．，　Ｆｏｘ，　Ｊ．Ｗ．，　Ｖｉｎｅｓ，　Ｒ．Ｒ．，　ａｎｄ　Ｐａｒｓｏｎｓ，　Ｊ．Ｔ．　Ａｕｔｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｏｃａｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｋｉｎａｓｅ，ｐｐ１２５ＦＡＫ，　ｄｉｒｅｃｔｓ　ＳＨ２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｐｐ６０ｓｒｃ，Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１４：１６８０−１６８８，　１９９４）。これによって、別のチロシンキナーゼであるＳｒｃのＳＨ２ドメインに対する結合部位が作出され、次いでＳｒｃはＦＡＫの他の部位のリン酸化を触媒することが可能となる（Ｃｏｂｂ，　Ｂ．Ｓ．，　Ｓｃｈａｌｌｅｒ，　Ｍ．Ｄ．，　Ｌｅｕ，　Ｔ．Ｈ．，　ａｎｄ　Ｐａｒｓｏｎｓ，　Ｊ．Ｔ．　Ｓｔａｂｌｅ　ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｐ６０ｓｒｃ　ａｎｄ　ｐｐ５９ｆｙｎ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｆｏｃａｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ，　ｐｐ　１２５ＦＡＫ，　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ．　１４：　１４７−５５，　１９９４）。他のＳｒｃの基質は、リン酸化され得る複数のチロシンを含有するアダプタータンパク質であるＣＡＳである（Ｖｕｏｒｉ，　Ｋ．，　Ｈｉｒａｉ，　Ｈ．，　Ａｉｚａｗａ，　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，　Ｅ．　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ１３０ｃａｓ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｕｐｏｎ　Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ：　ａ　Ｒｏｌｅ　ｆｏｒ　Ｓｒｃ　Ｆａｍｉｌｙ　Ｋｉｎａｓｅｓ，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１６：　２６０６−２６１３，　１９９６）。その機能が完全に理解されているわけではないが、ＣＡＳは運動性の制御に関与していることが示されている（Ｇａｒｔｏｎ，　Ａ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｋｌｅｍｋｅ，　Ｒ．Ｌ．，　Ｌｅｎｇ，　Ｊ．，　Ｍｏｌａｎｄｅｒ，　Ｒ．，　Ｂｒｏｏｋｓ，　Ｐ．Ｃ．，　Ｖｕｏｒｉ，　Ｋ．，　ａｎｄ　Ｃｈｅｒｅｓｈ，　Ｄ．Ａ．　ＣＡＳ／Ｃｒｋ　Ｃｏｕｐｌｉｎｇ　Ｓｅｒｖｅｓ　ａｓ　ａ　”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｗｉｔｃｈ”　ｆｏｒ　Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｅｌｌ　Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１４０：　９６１−９７２，　１９９８；　ａｎｄ　Ｃａｒｙ，　Ｌ．Ａ．，　Ｈａｎ，　Ｄ．Ｃ．，　Ｐｏｌｔｅ，　Ｔ．Ｒ．，　Ｈａｎｋｓ，　Ｓ．Ｋ．，　ａｎｄ　Ｇｕａｎ，　Ｊ．−Ｌ．　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐ１３０Ｃａｓ　ａｓ　ａ　Ｍｅｄｉａｔｏｒ　ｏｆ　Ｆｏｃａｌ　Ａｄｈ���ｓｉｏｎ　Ｋｉｎａｓｅ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ　Ｃｅｌｌ　Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１４０：　２１１−２２１，　１９９８．）。インテグリンのシグナル伝達現象は、細胞がＥＣＭタンパク質に接着することによって開始され、細胞の接着は、形質膜中に存在するインテグリン受容体の二次元的な移転とアクチン細胞骨格の再編成とをもたらす（Ｂｕｒｒｉｄｇｅ，　Ｋ．，　Ｔｕｒｎｅｒ，　Ｃ．Ｅ．，　ａｎｄ　Ｒｏｍｅｒ，　Ｌ．　Ｈ．　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐａｘｉｌｌｉｎ　ａｎｄ　ｐｐ　１２５ＦＡＫ　ａｃｃｏｍｐａｎｉｅｓ　ｃｅｌｌ　ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｔｏ　ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｔｒｉｘ：　Ａ　ｒｏｌｅ　ｉｎ　ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ　ａｓｓｅｍｂｌｙ，　Ｊ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．　１１９：８９３−９０３，１９９２）。これらの現象は、他の局所的接着タンパク質の動員を誘導するとともに、Ｇｒｂ２アダプタータンパク質を動員することによって、ＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路等の拡散性経路を開始させることもできる（Ｓｃｈｌａｅｐｆｅｒ，　Ｄ．　Ｄ．，　Ｊｏｎｅｓ，　Ｋ．Ｃ．，　ａｎｄ　Ｈｕｎｔｅｒ，　Ｔ．　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｇｒｂ２−Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｎｔｅｇｒｉｎ−Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｐａｔｈｗａｙｓ　ｔｏ　ＥＲＫ２／Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ：　Ｓｕｍｍａｔｉｏｎ  ｏｆ　Ｂｏｔｈ　ｃ−Ｓｒｃ−　ａｎｄ　Ｆｏｃａｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｋｉｎａｓｅ−Ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈｂｒｙｌａｔｉｏｎ　Ｅｖｅｎｔｓ，　Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｌ．　１８：　２５７１−２５８５，　１９９８）。ＥＣＭによるインテグリンのクラスタリングは、抗インテグリンモノクローナル抗体で（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，　Ｌ．Ｊ．，　Ｅａｒｐ，　Ｈ．Ｓ．，　Ｔｕｒｎｅｒ，　Ｃ．Ｅ．，　Ｐｒｏｃｋｏｐ，　Ｃ．，　ａｎｄ　Ｊｕｌｉａｎｏ，　Ｒ．Ｌ．　Ｓｉｇｎａｌ　ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｂｙ　ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ：　Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ　ｏｆ　β１　ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ．　８８：８３９２−８３９６，　１９９１）、又はビトロネクチンのような可溶性の多価インテグリンリガンドで（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，　Ｓ．，　Ｆｕ，　Ｃ．，　Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，　Ｊ．，　ａｎｄ　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，　Ｓ．　Ｓｏｌｕｂｌｅ　Ｌｉｇａｎｄｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　αｖβ３　Ｉｎｔｅｇｒｉｎ　Ｍｅｄｉａｔｅ　Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ａｄｈｅｒｅｎｔ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ　Ａｒｔｅｒｙ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌｓ，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７０：　１６７８１−１６７８７，１９９５）受容体を刺激することによって刺激された。これらの方法は何れも、ＦＡＫのリン酸化を含むチロシンリン酸化現象を誘��する。
【０１０７】
癌及び血管新生に関するインテグリンの生物現象に対する関心が増大するにつれて、これらの過程におけるインテグリンの拮抗効果を研究するためにディスインテグリンが使用されている（Ｔｒｉｋｈａ，　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．；　Ｓｈｅｕ，　Ｊ．−Ｒ．，　Ｙｅｎ，　Ｍ．−Ｈ．，　Ｋａｎ，　Ｙ．Ｃ．，　Ｈｕｎｇ，　Ｗ．−Ｃ．，　Ｃｈａｎｇ，　Ｐ．−Ｔ．，　ａｎｄ　Ｌｕｋ，　Ｈ．−Ｎ．　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　ｉｎ　ｖｉｖｏ：　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｒｉｆｌａｖｉｎ，　ａｎ　Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ａｎｄ　ａｎｔｉ−αｖβ３　ｉｎｔｅｇｒｉｎ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ａｎｔｉｂｏｄｙ，　Ｂｉｏｃｈｉｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ａｃｔａ．　１３３６：　４４５−４５４，　１９９７；　Ｙｅｈ，　Ｃ．Ｈ．，　Ｐｅｎｇ，　Ｈ．−Ｃ．，　ａｎｄ　Ｈｕａｎｇ，　Ｔ．−Ｆ．　Ａｃｃｕｔｉｎ，　ａ　Ｎｅｗ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ，　Ｉｎｈｉｂｉｔｓ　Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　ａｎｄ　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ　ｂｙ　Ａｃｔｉｎｇ　ａｓ　Ｉｎｔｅｇｒｉｎ　αｖβ３　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ　ａｎｄ　Ｉｎｄｕｃｉｎｇ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，　Ｂｌｏｏｄ　９２：　３２６８−３２７６，　１９９８；　Ｋａｎｇ，　Ｉ．Ｃ．，　Ｌｅｅ，　Ｙ．−Ｄ．，　ａｎｄ　Ｋｉｍ，　Ｄ．−Ｓ．　Ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　Ｓａｌｍｏｓｉｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｓ　Ｔｕｍｏｒ　Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．　５９：　３７５４−３７６０，　１９９９；　ａｎｄ　Ｚｈｏｕ，　Ｑ．，　Ｎａｋａｄａ，　Ｍ．，　Ａｒｎｏｌｄ，　Ｃ．，　Ｓｈｉｅｈ，　Ｋ．Ｙ．，　ａｎｄ　Ｍａｒｋｌａｎｄ，　Ｆ．Ｓ．　Ｃｏｎｔｏｒｔｒｏｓｔａｔｉｎ，　ａ　Ｄｉｍｅｒｉｃ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ｆｒｏｍ　Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ，　Ｉｎｈｉｂｉｔｓ　Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，　Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ：，　２０００）。インテグリンの一つであるαｖβ３が、癌において果たす役割、特に血管新生において果たす役割が近年注目を集めている。このビトロネクチン受容体は、血管新生に必要であることが示されており、αｖβ３を封鎖すると、新しく発生している血管中で内皮細胞のアポトーシスが誘導される（Ｂｒｏｏｋｓ，　Ｐ．Ｃ．，　Ｃｌａｒｋ，　Ｒ．Ａ．，　ａｎｄ　Ｃｈｅｒｅｓｈ，　Ｄ．Ａ．　Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｉｎｔｅｇｒｉｎ　αｖβ３　ｆｏｒ　Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ．　２６４：　５６９−５７１，　１９９；　ａｎｄ　Ｂｒｏｏｋｓ，　Ｐ．　Ｃ．，　Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，　Ａ．Ｍ．Ｐ．，　Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，　Ｍ．，　Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，　Ｒ．Ａ．，　Ｈｕ，　Ｔ．，　Ｋｌｉｅｒ，　Ｇ．，　ａｎｄ　Ｃｈｅｒｅｓｈ，　Ｄ．Ａ．　Ｉｎｔｅｇｒｉｎ　αｖβ３　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ　Ｐｒｏｍｏｔｅ　Ｔｕｍｏｒ　Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　Ｉｎｄｕｃｉｎｇ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｏｆ　Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ　Ｂｌｏｏｄ　Ｖｅｓｓｅｌｓ，　Ｃｅｌｌ．　７９：　１１５７−１１６４、１９９４）。αｖβ３による血管新生と腫瘍の浸潤性の調節には、αｖβ３が細胞外マトリックス分解性プロテアーゼＭＭＰ２に結合して、移動している細胞の最先端にその活性を局在化させ、マトリックス中への貫通を促進し得ることが寄与している（Ｂｒｏｏｋｓ，　Ｐ．Ｃ．，　Ｓｔｒｏｍｂｌａｄ，　Ｓ．，　Ｓａｎｄｅｒｓ，　Ｌ．Ｃ．，　ｖｏｎ　Ｓｃｈａｌｓｃｈａ，　Ｔ．Ｌ．，　Ａｉｍｅｓ，　Ｒ．Ｔ．，　Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ，　Ｗ．Ｇ．，　Ｑｕｉｇｌｅｙ，　Ｊ．Ｐ．，　ａｎｄ　Ｃｈｅｒｅｓｈ，　Ｄ．Ａ．　Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍａｔｒｉｘ　Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ　ＭＭＰ−２　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｓｕｒｆａｃｅ　ｏｆ　Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　Ｉｎｔｅｇｒｉｎ　αｖβ３，　Ｃｅｌｌ　８５：６８３−６９３，　１９９６）。αｖβ３インテグリンは、腫瘍細胞の運動性と転移に関わっていることが示されており、この受容体のアンタゴニストはこれらのプロセスを阻害する（Ａｚｎａｖｏｏｒｉａｎ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．；　ａｎｄ　Ｂｅｖｉｇｌｉａ，　Ｌ．，　Ｓｔｅｗａｒｔ，　Ｇ．　Ｊ．，　ａｎｄ　Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ，　Ｓ．　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｄｈｅｓｉｖｅ　ａｎｄ　ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　Ｂ１６Ｆ１０　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ａ　ｍｕｒｉｎｅ　ｍｏｄｅｌ，　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ．　７：　７−２０，　１９９５）。ＲＧＤ配列を含有する小ペプチドが、一般的に使用されているインテグリンのアンタゴニストであるが、ディスインテグリンの１０，０００分の１程度の効力でしかない（Ｐｆａｆｆ，　Ｍ．，　ＭｃＬａｎｅ，　Ｍ．　Ａ．，　Ｂｅｖｉｇｌｉａ，　Ｌ．，　Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ，　Ｓ．，　ａｎｄ　Ｔｉｍｐｌ，　Ｒ．　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ　ｗｉｔｈ　Ｌｉｍｉｔｅｄ　Ｖａｒｉａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＲＧＤ　Ｌｏｏｐ　ｉｎ　Ｔｈｅｉｒ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　ｔｏ　Ｐｕｒｉｆｉｅｄ　Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ　αＩＩｂβ３，　αｖβ３　ａｎｄ　α５β１　ａｎｄ　ｉｎ　Ｃｅｌｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，　Ｃｅｌｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｃｏｍｍｕｎ．　２：　４９１−５　０１，　１９９４）。ディスインテグリンを血管新生の阻害剤として用いた報告では（Ｓｈｅｕ，　Ｊ．−Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．；　Ｙｅｈ，　Ｃ．Ｈ．，　ｅｔ　ａｌ．；　ａｎｄ　Ｋａｎｇ，　Ｉ．−Ｃ．，　ｅｔ　ａｌ．）、これらのタンパク質は、αｖβ３がＥＣＭに結合するのを阻止し、該インテグリンによって媒介される正常なシグナルを遮断する受動的なインテグリンアンタゴニストとして記載されている。
【０１０８】
コントートロスタチンは、血管新生の阻害剤でもあるαｖβ３結合性ディスインテグリンであり（Ｚｈｏｕ，　Ｑ．，　ｅｔ　ａｌ．，　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ）、該ファミリーの他のメンバーに比べて特異な構造を有している。該タンパク質は、増加しつつある二量体ディスインテグリン類のサブファミリーに属するが（Ｍａｒｃｉｎｋｉｅｗｉｃｚ，　Ｃ．，　Ｃａｌｖｅｔｅ，　Ｊ．Ｊ．，　Ｍａｒｃｉｎｋｉｅｗｉｃｚ，　Ｍ．　Ｍ．，　Ｒａｉｄａ，　Ｍ．，　Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ，　Ｓ．，　Ｈｕａｎｇ，　Ｚ．，　Ｌｏｂｂ，　Ｒ．Ｒ．，　ａｎｄ　Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ，　Ｓ．　ＥＣ３，　ａ　Ｎｏｖｅｌ　Ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｅｃｈｉｓ　ｃａｒｉｎａｔｕｓ　Ｖｅｎｏｍ，　Ｉｎｈｉｂｉｔｓ　α４　ａｎｄ　α５　Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ　ｉｎ　ａｎ　ＲＧＤ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　Ｍａｎｎｅｒ，　Ｊ　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７４：　１２４６８−１２４７３，　１９９９；　ａｎｄ　Ｍａｒｃｉｎｋｉｅｗｉｃｚ，　Ｃ．，　Ｃａｌｖｅｔｅ，　Ｊ．Ｊ．，　Ｖｉｊａｙ−Ｋｕｍａｒ，　Ｓ．，　Ｍａｒｃｉｎｋｉｅｗｉｃｚ，　Ｍ．Ｍ．，　Ｒａｉｄａ，　Ｍ．，　Ｓｃｈｉｃｋ，　Ｐ．，　Ｌｏｂｂ，　Ｒ．Ｒ．，　ａｎｄ　Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ，　Ｓ．　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＥＭＦ１Ｏ，　ａ　ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｉｃ　ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｅｒｉｓｔｏｃｏｐｈｉｓ　ｍａｃｍａｈｏｎｉ　ｖｅｎｏｍ　ｔｈａｔ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｓ　ａｌｐｈａ　５　ｂｅｔａ　Ｉ　ｉｎｔｅｇｒｉｎ，　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．　３８：１３３０２−９，　１９９９）、コントートロスタチンはホモ二量体なので、ＲＧＤモチーフを含有する各サブユニットとは区別される（Ｔｒｉｋｈａ，　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．；　ａｎｄ　Ｚｈｏｕ，　Ｑ．，　Ｈｕ，　Ｐ．，　Ｒｉｔｔｅｒ，　Ｍ．Ｒ．，　Ｓｗｅｎｓｏｎ，　Ｓ．　Ｄ．，　Ａｒｇｏｕｎｏｖａ，　Ｓ．，　Ｅｐｓｔｅｉｎ，　Ａ．　Ｌ．，　ａｎｄ　Ｍａｒｋｌａｎｄ，　Ｆ．Ｓ．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｎｔｏｒｔｒｏｓｔａｔｉｎ，　ａ　Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｓｏｕｔｈｅｒｎ　Ｃｏｐｐｅｒｈｅａｄ　Ｓｎａｋｅ　Ｖｅｎｏｍ，　Ａｒｃｈｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　３７５：　２７８−２８８，　２０００）。本例において、本発明者らは、コントートロスタチンが腫瘍細胞の運動性の有効な阻害剤として作用することを実証し、コントートロスタチンの機序が細胞の運動性を阻害し得る新しい手段であることを示唆するデータを提示する。受動的なインテグリンの封鎖と能動的なαｖβ３シグナル伝達の破壊とを組み合わせることによって、コントートロスタチンはこのような阻害を実現するが、これはアクチン細胞骨格と局所的接着構造中に大きな変化を引き起こすインテグリン架橋を介して行われるものと思われる。さらに、コントートロスタチンは、腫瘍細胞中に存在する重要なシグナル伝達分子のαｖβ３を介したチロシンリン酸化を刺激することによって、インテグリンアゴニストとして作用する（単量体のディスインテグリンには見出されていない活性）という特有の能力を有する。
【０１０９】
実験の手順：
材料−ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌細胞はＪａｎｅｔ　Ｐｒｉｃｅ（Ｍ．Ｄ．　Ａｎｄｅｒｓｏｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｈｏｕｓｔｏｎ，　ＴＸ）から入手した。Ｔ２４ヒト膀胱癌細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，　ＶＡ）から購入した。β３及びβ５インテグリンサブユニットのｃＤＮＡをトランスフェクトした２９３ヒト胚性腎臓細胞及び親２９３細胞は、Ｊｅｆｆｅｒｙ　Ｓｍｉｔｈ博士から頂いた（Ｔｈｅ　Ｂｕｒｎｈａｍ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）（Ｌｉｎ，　Ｅ．Ｃ．Ｋ．，　Ｒａｔｎｉｋｏｖ，　Ｂ．Ｉ．，　Ｔｓａｉ，　Ｐ．Ｍ．，　Ｃａｒｒｏｎ，　Ｃ．Ｐ．，　Ｍｙｅｒｓ，　Ｄ．Ｍ．，　Ｂａｒｂａｓ，　Ｃ．Ｆ．，　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，　Ｊ．　（１９９７）　Ｊ　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７２（３８），　２３９１２−２３９２０）。ＯＶＣＡＲ−５ヒト卵巣癌細胞は、Ｔｈｏｍａｓ　Ｈａｍｉｌｔｏｎ博士（Ｆｏｘ　Ｃｈａｓｅ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅｎｔｅｒ，　Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，　ＰＡ）から頂いた。コントートロスタチンは、既述のとおり（Ｔｒｉｋｈａ　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９４）　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　ｓｕｐｒａ；　ａｎｄ　Ｔｒｉｋｈａ　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９４）　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　ｓｕｐｒａ）、南アメリカマムシ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ　ｃｏｎｔｏｒｔｒｉｘ）　の毒から精製した。単量体のディスインテグリンであるエチスタチンとフラボリディン、及び溶解緩衝液で使用した一般的なプロテアーゼ阻害剤のカクテルは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。ビトロネクチンは、Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，　ＭＡ）から購入した。ＰＰＩ　Ｓｒｃ阻害剤は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｉｎ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，　ＣＡ）から入手した。抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＰＹ９９は、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，　ＣＡ）から入手した。抗ＦＡＫ及び抗ＣＡＳ　ｍＡｂは、Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，　ＫＹ）から購入し、７Ｅ３　ｍＡｂはＣｅｎｔｏｃｏｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ，　ＰＡ）のものを用いた。
【０１１０】
細胞の培養、調製、及び刺激−Ｔ２４細胞は、５％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ　１６４０培地中に入れ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５及び２９３細胞は、３７℃５％ＣＯ２下で、１０％血清を有するＤＭＥＭ中に入れた。リン酸緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、適切な無血清培地中で、３７℃で６時間、飢餓状態にした。ＰＢＳ中の０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡで短時間処理して細胞を剥離させ、遠心で採集して、大豆トリプシンインヒビター（無血清培地中に１ｍｇ／ｍｌ）中に再懸濁し、２％のウシ血清アルブミン／無血清培地中で洗浄した。逆さにして撹拌しながら、２％のウシ血清アルブミン／無血清培地中に３７℃で１時間、細胞を懸濁状態に保った。懸濁状態のままで、又は処理の間、無血清培地で１：１００に希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に接着させて、静止状態の細胞（３×１０６／ｍｌ）をディスインテグリン又は他の試薬で処理した。
【０１１１】
ライセートの調製及び免疫沈降−冷たいＰＢＳで、懸濁及び接着性細胞を二度洗浄し、冷たい溶解緩衝液（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ｐＨ　８．０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％　Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０、０．５％　デオキシコール酸塩　０．１％　ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤カクテル、１ｍＭ　ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ　オルトバナジン酸ナトリウム　５０　ｍＭ　フッ化ナトリウム）中に溶解した。氷上で１０〜１５分間インキュベートした後、小遠心機の中で１５分間、１４，０００ＲＰＭで遠心して、不溶性の物体を除去した。上清を集め、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって、総タンパク質濃度を標準化した。１．２５μｇの抗ＦＡＫ又は抗ＣＡＳ　ｍＡｂとともに、４℃で４〜６時間、細胞全体のライセート（２００μｇの総タンパク質）をインキュベートした後、４℃で２０μｌのプロテインＧ−アガロースとともに一晩インキュベートして、免疫沈降を行った。阻害剤を加えない溶解緩衝液中で免疫沈降物を四回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を加えることによって解離させ、５分間煮沸した。７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、細胞全体のライセート（３０μｇの総タンパク質）又は免疫沈降物を分離し、ニトロセルロース膜に転写した。
【０１１２】
イムノブロッティング
５％の無脂肪乳／Ｔｒｉｓ緩衝化生理的食塩水／０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０（ブロッキング緩衝液）を用いて、室温で１時間又は４℃で一晩、膜のブロッキングを行った。室温で１時間、ブロッキング緩衝液中にて、一次抗体のインキュベーションを行った。Ｔｒｉｓ緩衝化生理的食塩水／０．１％　Ｔｗｅｅｎ　２０中で洗浄した後、室温で１時間、ブロッキング緩衝液の中で、西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合二次抗体とともに膜をインキュベートした。膜は徹底的に洗浄した。ＰｉｅｒｃｅのＳｕｐｅｒ　Ｓｉｇｎａｒ　Ｗｅｓｔ　Ｐｉｃｏ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを用いて、イムノブロットを展開した。ＵＮ−ＳＣＡＮ−ＩＴＴＭソフトウェア（Ｓｉｌｋ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，　Ｏｒｅｍ，　ＵＴ））を用いて、デンシトメトリーを行った。
【０１１３】
結果：
コントートロスタチン処理は、腫瘍細胞中にタンパク質チロシンリン酸化を誘導する−腫瘍細胞中での包括的なチロシンリン酸化の制御においてコントートロスタチンが果たす役割を調べるために、懸濁した状態で、様々な濃度の可溶性コントートロスタチンともに、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５ヒト乳癌細胞を１０分間処理した。コントートロスタチン処理後に、細胞は、１２０〜１４０ｋＤａの分子量を有するタンパク質のチロシンリン酸化の劇的な増加を示した（図２０）。最大レベルのチロシンリン酸化は、１０ｎＭのコントートロスタチンで観察された。同じ方法を用いたコントートロスタチン処理の後に、このサイズ範囲に含まれるタンパク質のチロシンリン酸化が、Ｔ２４ヒト膀胱癌細胞（図２０）及びＫＳＹ−１カポジ肉腫細胞でも観察された（データは示さず）ので、この現象が細胞種に特異的なものではないことを示している。
【０１１４】
コントートロスタチンによって誘導されるチロシンリン酸化は専らαｖβ３インテグリンによって媒介される−複数の独立した実験によって、コントートロスタチンによって誘導されたシグナルを伝達するのに必要なインテグリン受容体を同定した。２９３ヒト胚性腎臓細胞は、無視し得るレベルのαｖβ３を発現しているのに対して、比較的高レベルのαｖインテグリンサブユニットを発現している（Ｌｉｎ，　Ｅ．Ｃ．Ｋ．，　Ｒａｔｎｉｋｏｖ，　Ｂ．Ｉ．，　Ｔｓａｉ，　Ｐ．Ｍ．，　Ｃａｒｒｏｎ，　Ｃ．Ｐ．，　Ｍｙｅｒｓ，　Ｄ．Ｍ．，　Ｂａｒｂａｓ，　Ｃ．Ｆ．，　ａｎｄ　Ｓｍｉｔｈ，　Ｊ．　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｒｅｇｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｇｒｉｎ　β３　Ｓｕｂｕｎｉｔ　Ｔｈａｔ　Ｃｏｎｆｅｒｓ　Ｌｉｇａｎｄ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，　Ｊ　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２７２：　２３９１２−２３９２０，１９９７）。親２９３細胞にβ３サブユニットをコードするｃＤＮＡをトランスフェクトすることによって（αｖβ３ヘテロ二量体が多量に発現されることになる）（Ｌｉｎ，Ｅ．Ｃ．Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．）αｖβ３の機能を調べる機会が得られる。コントートロスタチンがチロシンリン酸化現象を誘導する能力をこのβ３形質導入体で調べ、β５インテグリンサブユニットをトランスフェクトした細胞と比較した。これらの細胞中でインテグリンが発現されることは、本発明者らの研究室で確認された。チロシンリン酸化の刺激は、αｖβ３を発現している細胞中のみで観察され、αｖβ５発現細胞中では観察されなかった（図２１ａ）。チロシンリン酸化の変化は、親細胞では全く観察されなかった（データは示さず）。同様に、αｖβ３発現を欠くＯＶＣＡＲ−５細胞のホスホチロシンレベルは、コントートロスタチン処理によって変化しなかった（データは示さず）。さらに、ｍＡｂ（７Ｅ３）でコントートロスタチンのαｖβ３への結合を封鎖すると、コントートロスタチンによって誘導されたＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞中のチロシンリン酸化が完全に消失することが示された（図２１ｂ）。
【０１１５】
単量体のディスインテグリンは単独ではチロシンリン酸化に影響を与えないが、コントートロスタチンによって誘導されるリン酸化を完全に遮断する−生化学的なレベルでのコントートロスタチンのホモ二量体構造の重要性を調べるために、単量体のディスインテグリンであるフラボリディンのチロシンリン酸化能を研究した。１μＭの濃度でも、フラボリディン単独では、ＭＤＡ−ＭＤ−４３５細胞中のチロシンリン酸化に影響を与えないことが明らかとなった。しかしながら、２つのディスインテグリンで同時に細胞を処理すると、フラボリディンは、コントートロスタチンによって誘導されたチロシンリン酸化を完全に消滅させることができた（図２２）。これらの知見は、別の単量体ディスインテグリンであるエチスタチンを用いて再現された（Ｒｉｔｔｅｒ，　Ｍ．Ｒ．，　Ｚｈｏｕ，　Ｑ．，　ａｎｄ　Ｍａｒｋｌａｎｄ，　Ｆ．Ｓ．　Ｃｏｎｔｏｒｔｒｏｓｔａｔｉｎ，　Ａ　Ｓｎａｋｅ　Ｖｅｎｏｍ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ，　Ｉｎｄｕｃｅｓ　αｖβ３−ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣＡＳ　ａｎｄ　ＦＡＫ　ｉｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌｓ，　Ｊ　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ，　２０００；　ａｎｄ　Ｒｉｔｔｅｒ，　Ｍ．Ｒ．　ａｎｄ　Ｍａｒｋｌａｎｄ，　Ｆ．Ｓ．　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｔｕｍｏｒ　Ｃｅｌｌｓ　ｂｙ　Ｃｏｎｔｏｒｔｒｏｓｔａｔｉｎ，　ａ　Ｈｏｍｏｄｉｍｅｒｉｃ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ，　ａｎｄ　Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎｓ　Ｅｃｈｉｓｔａｔｉｎ　ａｎｄ　Ｆｌａｖｏｒｉｄｉｎ，　Ｔｏｘｉｃｏｎ．　ｉｎ　ｐｒｅｓｓ，　２０００）。このように、単量体のディスインテグリンは、コントートロスタチンのαｖβ３への結合を拮抗的に阻害して、該受容体の架橋とチロシンリン酸化現象の開始とを阻止することができるので、ホモ二量体構造故に、コントートロスタチンは独特なインテグリンアゴニストとして機能し得ることが強く示唆される。
【０１１６】
コントートロスタチンがαｖβ３に結合すると、ＣＡＳ及びＦＡＫのチロシンがリン酸化される−コントートロスタチン処理に応じて、チロシンがリン酸化されるタンパク質を特定するために、コントートロスタチン処理した細胞から調製したライセートを、ＣＡＳ又はＦＡＫモノクローナル抗体を用いた免疫沈降に供した後、抗ホスホチロシンイムノブロッティングにかけた。細胞全体のライセートを用いた抗ホスホチロシン免疫ブロットで観察された分子量と同様の分子量（それぞれ、１３０及び１２５ｋＤａ）を有していることに基づいて、可能性が高い候補としてＣＡＳ及びＦＡＫを選択した。本発明者らは、コントートロスタチン処理に応じてＣＡＳとＦＡＫのチロシンが何れもリン酸化され（図２０）、免疫沈降したＣＡＳとＦＡＫは、細胞全体のライセートを用いた抗ホスホチロシンイムノブロットの後に観察される主要なバンドと共に移動することを見出した。このことは、これらがコントートロスタチン処理によってリン酸化される主要なタンパク質であることを示している。
【０１１７】
コントートロスタチンによって誘導されるチロシンリン酸化現象にはＳｒｃ活性が必要である−Ｓｒｃチロシンキナーゼは、インテグリンシグナル伝達において中心的な役割を果たしていることが知られている。コントートロスタチンによって誘導されたαｖβ３からのシグナルの伝達にＳｒｃが関与しているかどうかを決定するために、１０ｎＭのコントートロスタチンによる刺激に先立って、Ｓｒｃファミリーの阻害剤であるＰＰＩとともに（Ｈａｎｋｅ，　Ｊ．Ｈ．，　Ｇａｒｄｎｅｒ，　Ｊ．Ｐ．，　Ｄｏｗ，　Ｒ．Ｌ．，　Ｃｈａｎｇｅｌｉａｎ，　Ｐ．　Ｓ．，　Ｂｒｉｓｅｔｔｅ，　Ｗ．Ｈ．，　Ｗｅｒｉｎｇｅｒ，　Ｅ．Ｊ．，　Ｐｏｌｌｏｋ，　Ｂ．Ａ．，　ａｎｄ　Ｃｏｎｎｅｌｌｙ，　Ｐ．Ａ．（１９９６）　Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．　２７１（２），　６９５−７０１）、懸濁状態のＴ２４細胞を３０分間前処理した。図２４（上段）に示されているように、ＰＰＩは、用量依存的にチロシンのリン酸化を阻害し、１００μＭの濃度で、コントートロスタチンによって誘導されるシグナルは完全に消滅した。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のＰＰ１処理後にも同様の結果が得られたが、１０μＭのＰＰ１で完全に阻害された（図２４、下段）。これらの発見は、コントートロスタチンによって刺激されるインテグリンシグナル伝達にＳｒｃが関与していることを確認するものである。
【０１１８】
コントートロスタチンによって誘導されたチロシンリン酸化は細胞の接着には依存しない−接着性細胞（インテグリンの連結と細胞骨格構造とが存在する）中でのチロシンリン酸化にコントートロスタチンが影響を与え得るかどうかを決定するために、ＭａｔｒｉｇｅｌでコートされたプレートにＴ２４細胞を接着させる前に、Ｔ２４細胞をコントートロスタチンで前処理した。コントートロスタチンは、細胞がラミニンに結合するのを有意には阻害しないことに注目されたい。このため、コントートロスタチンは、ラミニンが豊富なＭａｔｒｉｇｅｌへの細胞の結合を阻害しない。ホスホチロシンのイムノブロッティングによって、Ｍａｔｒｉｇｅｌへの接着後に、Ｔ２４細胞はチロシンリン酸化の若干の増加を示すが、接着性細胞をコントートロスタチンで処理すると、ＣＡＳ及びＦＡＫを含有することが示された１２０〜１４０ｋＤａのバンドを含むこれらのシグナルがさらに著しく増加することが明らかとなった（図２５）。高濃度のコントートロスタチン（１０００ｎＭ）がチロシンリン酸化のレベルを減少させることが再度観察された。同様の実験では、コントートロスタチンによる処理の前に、Ｔ２４細胞を３０分間Ｍａｔｒｉｇｅｌに接着させた。コントートロスタチンの存在下で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ上でさらに３０分インキュベートすると、細胞は、同様に１２０〜１４０ｋＤａのバンドのチロシンリン酸化の増加を示した。
【０１１９】
このように、コントートロスタチンによるチロシンリン酸化の誘導は、非接着性細胞中のみならず、ＥＣＭタンパク質からの刺激の存在下にある接着性細胞中でも起こり得る。
【０１２０】
コントートロスタチンは、形態的な変化とアクチン細胞骨格及び局所的接着構造の破壊を引き起こす−コントートロスタチンが細胞の形態と細胞骨格の構造に及ぼす影響を調べるために、本発明者らは、アクチン細胞骨格及び局所的接着構造に注目して、位相差顕微鏡下で腫瘍細胞を調べ、免疫化学的な分析を行った。細胞を採取し、無血清培地で１：１００に希釈され、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／リン酸緩衝化された生理的食塩水（ＰＢＳ）でブロックしたＭａｔｒｉｇｅｌでコートされたカバーガラス上に置いた。３７℃で一晩細胞をインキュベートした。続いて、血清含有培地中のディスインテグリンによって、又は血清含有培地のみによって、３７℃で３０分間、細胞を処理した。カバーガラスをＰＢＳで洗浄し、４％のホルムアルデヒド／ＰＢＳによって３７℃で１０分間固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００／ＰＢＳで１分間、透過化させ、１％のＢＳＡ／ＰＢＳを用いて、３７℃で３０分間ブロックした。次いで、カバーガラスを一次抗体とともに、３７℃で１時間インキュベートした後、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）抱合二次抗体＋ローダミン標識したファロイディン（ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ）とともに１時間インキュベートした。ＰＢＳで洗浄した後、ＳＰＯＴデジタルカメラを取り付けたオリンパスＡＸ７０蛍光顕微鏡の上にカバーガラスを載せて、画像を集めた。
【０１２１】
本発明者らは、Ｍａｔｒｉｇｅｌに接着しているコントートロスタチン処理したＴ２４細胞では、細胞の形態に特有の変化を観察し（細胞の広がりが少なくなるのが観察される）、細胞は細胞体から鋭利な突起を示していた（図２６ａ及びｂ）。本発明者らは、０．５μＭのコントートロスタチンで３０分間処理すると、細胞骨格の外観が劇的に破壊される（対照細胞中に存在するアクチン張力繊維が崩壊しているように見えた）ことも観察した（図２６ｃ、ｄ、ｇ、及びｈ）。細胞骨格の破壊には、ホスホチロシン染色によって示されるように、局所的接着のサイズと数の激減を伴う（図２６ｅ及びｆ）。局所的接着タンパク質ＦＡＫの細胞内の局在も調べた。対照細胞では、ＦＡＫ染色は点状であり、ホスホチロシンに観察された分布と同様の分布を示した（図２６ｉ）。対照的に、コントートロスタチンで処理された細胞中のＦＡＫ染色は散在性であり、対照細胞が有する点状の外観を欠いていた（図２６ｊ）。
【０１２２】
インテグリンαｖβ３は、コントートロスタチンが細胞骨格及び局所的接着を崩壊させるのに必要である−ディスインテグリンは、β１及びβ３インテグリンに結合することが知られている。コントートロスタチン処理後に観察される細胞骨格の崩壊にαｖβ３が関与している可能性を調べるために、既述のように（Ｂｒｏｏｋｓ，　Ｐ．　Ｃ．，　ｅｔ　ａｌ．）、ＦＡＣＳによって、該インテグリンの発現を欠如しているＴ２４細胞を選択し、免疫細胞化学によって分析した。　室温で３０分間、一次抗体とともに細胞をインキュベートして、インテグリンの発現を検出した。ＦＩＴＣ抱合二次抗体とともに３０分間、室温でインキュベートする前に、１％のＢＳＡ／ＰＢＳで細胞を二回洗浄した。ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で分析する前に、細胞を三回洗浄した。
【０１２３】
例１１のように、免疫蛍光染色を行った。αｖβ３を発現している集団とは異なり、該インテグリンの発現を欠如しているＴ２４細胞は、０．５μＭのコントートロスタチンで３０分間処理した後に、アクチン細胞骨格の外観（図２７ａ及びｂ）又は局所的接着（図２７ｃ及びｄ）に変化を示さなかった。これらの知見を敷衍するように、同じくαｖβ３の発現を欠くＯＶＣＡＲ−５ヒト卵巣癌細胞は、コントートロスタチン処理の後、同様に細胞骨格（図２７ｅ及びｆ）又は局所的接着（図２７ｇ及びｈ）の変化を示さなかった。これらの知見は、コントートロスタチンが専らαｖβ３インテグリンを介して構造的な破壊を引き起こすことを示している。
【０１２４】
単量体のディスインテグリンによる処理は、Ｔ２４細胞中の細胞骨格又は局所的接着構造に対して影響を与えない−細胞破壊の誘導における、コントートロスタチンのホモ二量体構造の役割を決定するために、本発明者らは、単量体のディスインテグリンであるフラボリディンで処理した細胞を、コントートロスタチンで処理した細胞と直接比較した。例２に記載されている方法を用いて、１μＭの単量体で処理したＴ２４細胞（図２８ｅ及びｆ）は、対照細胞（図２８ａ及びｂ）と同様の外見を有していたのに対して、コントートロスタチンで処理した細胞（０．５μＭ）は、予想通り、細胞骨格（図２８ｃ）と局所的接着（図２８ｄ）の崩壊を示した。これらの結果は、コントートロスタチンの２倍の濃度のフラボリディンを用いて得たものであるから、観察された崩壊は、コントートロスタチンのホホモ二量体構造に直接関連していることが強く示唆される。
【０１２５】
要約：
本例は、コントートロスタチンが細胞骨格及び局所的接着構造に多大な崩壊を引き起こし、重要な局所的接着タンパク質のチロシンリン酸化を誘導することを実証している。近年、ＦＡＫの局所分布と機能の適切な制御には、リン酸化と脱リン酸化のサイクルが関与していることが示唆されている。このため、コントートロスタチンは、ＦＡＫが、時間的にも空間的にも不適切にリン酸化されている該サイクルの生理的なバランスを崩し（図２９）、正常な局所的接着構造とは相容れない細胞内の局在をＦＡＫに採らせる（図３０）と想定し得る。アクチン細胞骨格も全体的に変化を受けることが観察されるので、明らかに、これらの崩壊は局所的な接着に止まらない。関連する分子の詳細は明らかとなっていないが、局所的接着複合体はアクチン細胞骨格と直接会合することが知られているので、これは不合理とはいえない。生化学的な分析によって、ＣＡＳがコントートロスタチンで処理された細胞内でチロシンをリン酸化させることが示されている。ＣＡＳは前進する運動性細胞の先頭に局在化し、この特異的な局在化の崩壊は運動能の減少をもたらす。免疫蛍光による観察下では細胞は運動性を有しないので、これらの実験中には、本発明者らはこれを実証することはできなかったが、コントートロスタチン処理した細胞ではＣＡＳの局在化が変化する可能性がある。　 αｖβ３インテグリンは両プロセスが起こるのに必要とされるので、本発明者らが得たチロシンリン酸化現象に関する生化学的な結果と、細胞骨格及び局所的接着に対するコントートロスタチンの効果との間には強い関連が確立される。さらに、αｖβ３を結合する単量体のディスインテグリンであるフラボリディンは、アクチン細胞骨格又は局所的接着に対して有意な影響を与えなかった。これは、単量体のディスインテグリンはチロシンリン酸化を刺激することができないという生化学的な知見と非常によく相関する観察である。単量体のディスインテグリンが活性を欠いているということは、コントートロスタチンに特有の構造によって、チロシンリン酸化現象を刺激し、細胞の基礎構造を崩壊させることが可能となることを強く示唆している。チロシンリン酸化の活性化をもたらすインテグリンを架橋する方法を記載している文献報告が幾つか存在するが（１４、１５、３８、３９）、これらの報告は何れも、運動性に対するこれらの活性化の影響を調べていない。コントートロスタチンは、細胞表面上に位置するαｖβ３インテグリンを架橋することによってチロシンのリン酸化を刺激するようであり、この活性は、単量体のディスインテグリン中には明瞭には見出されないであろう。
【０１２６】
これらのデータは、αｖβ３発現細胞に対して大きな影響を与えることができる、インテグリンを介した新規機序を証明している。本発明者らは、コントートロスタチンは腫瘍細胞の運動性を著しく阻害し、一価のインテグリンアンタゴニストより強力にαｖβ３発現細胞の運動性を阻害する阻害剤であることを示した。該プロセスはＦＡＫ及びアクチン細胞骨格の適切な制御にも依存しているので、コントートロスタチンは細胞分裂に対して負の影響を与える可能性もあるが、この可能性については調べなかった。αｖβ３インテグリンは、血管新生能を有する内皮細胞上での発現を増加させ、該プロセスを制御するのに不可欠であることが示されているので、これらの知見は血管新生に対する重要性を有している。このため、αｖβ３がその生理的なリガンドに結合するのを受動的に遮断することによって、及び細胞内の構造を大きく破壊させる不適切なシグナルを積極的に誘導することによって、コントートロスタチンは、血管新生の有効な阻害剤となると予想される。これらの知見は、腫瘍細胞の浸潤と転移を停止させるための代替的アプローチのみならず、シグナル伝達阻害剤を用いて阻害するのではなく、シグナル伝達経路を積極的に破壊することによって血管新生を停止させるための代替的アプローチをも示唆しており、コントートロスタチンが、このアプローチの可能性をさらに調べるための典型的な薬剤であることを明らかにしている。
【０１２７】
結論的には、本研究は、腫瘍細胞中のインテグリンのシグナル伝達を調節することができるディスインテグリンファミリーにとって新規な活性を明らかにする。他の３つのディスインテグリンは、チロシンリン酸化を刺激する能力を欠いていることが分かっていたので（Ｃｌａｒｋ　ｅｔ　ａｌ．，ｓｕｐｒａ）、この活性はコントートロスタチンに特有のものであると思われる。最近、様々なヘビ毒から数多くの新しい二量体のディスインテグリンが精製された（Ｍａｒｃｉｎｋｉｅｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ．，ｓｕｐｒａ）。これらの分子はＲＧＤ配列を欠いており、αｖβ３と相互作用しないようなので、これらの分子がコントートロスタチンと同様の活性を示す可能性は少ない。本発明者らの報告は、αｖβ３の機能をさらに研究するたえに有用な試薬としてコントートロスタチンを同定し、腫瘍細胞の運動性に対しての負の効果を与え得る、インテグリンによって媒介される新規な機序を明らかにしている。αｖβ５、αｖβ１、及びαｖβ３のＥＣＭへの結合をブロックするという複合的な効果と、重要なシグナル伝達分子の過剰リン酸化を引き起こす不適切なシグナルの開始とによって、本来的には運動性と浸潤性を有する腫瘍細胞を不動化させることができると本発明者らは提案する。この提案は、コントートロスタチンがインビトロで腫瘍細胞の浸潤性を阻害するという本発明者らの発見と合致している。ＣＡＳとＦＡＫの細胞内分布及びコントートロスタチン処理された細胞中のアクチン細胞骨格の構造をさらに研究することによって、運動能の減少と一致する擾乱を明らかにすると本発明者らは予測する。
【０１２８】
上記の記述から、当業者であれば、本発明の本質的な特徴を容易に確知することができ、本発明の精神と範囲から逸脱せずに、様々な用途と条件に対して本発明を採用することができる。情況が適宜であることが示唆され、又は適宜であり得るのであれば、形式の変化や均等物の置換が想定される。本明細書では具体的な用語が用いられているが、それらは、説明的な意味を意図したものであり、限定を意図したものではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明は、添付の図面を参照することにより、さらによく理解することができるであろう。図１は、コントートロスタチンｃＤＮＡをクローニングする戦略を示している。図１Ａは、共通するＲＧＤ配列と高度に保存された配列を示しており、他のディスインテグリンと比較したエドマン分解アッセイに基づくＣＮの部分アミノ酸配列（ＣＮ）を示している。図１ＢはＰＣＲプライマーを示し、図１Ｃは、コントートロスタチンの完全長ｃＤＮＡを作製するために使用された重複伸張反応の原理を示している。
【図２】
図２は、ＰＣＲ産物の電気泳動を示しており、約１３００ｂｐの主要なバンドは、λｇｔ１０フォワードとＰＣＲ−２によって開始されたＰＣＲで増幅され（レーン１）、約７００ｂｐのバンドはＰＣＲ−２とλｇｔ１０リバースによって開始されたＰＣＲから生じ（レーン２）、約２０００ｂｐの分子サイズを有する２つの断片の重複する産物はレーン３に示されている。
【図３Ａ】
図３Ａは、８６ヌクレオチドの５’末端非翻訳領域（ＮＴＲ）、ヌクレオチド８７と１５３５の間のオープンリーディングフレーム、ヌクレオチド１５３６〜１５３８の終止コドン、及びＡＡＴＡＡＡ部位を含み、ポリＡテールで終了する３’ＮＴＲを含むＣＮ　ｃＤＮＡの完全長ヌクレオチド配列と推定アミノ酸を示している。
【図３Ｂ】
図３Ａと同じオープンリーディングフレームの配列（続き）を示す。
【図３Ｃ】
図３Ａと同じオープンリーディングフレームの配列（続き）を示す。
【図３Ｄ】
図３Ａと同じオープンリーディングフレームの配列（続き）を示す。
【図４−１】
図４−１は、トリグラミン前駆体と他のヘビ毒の出血性タンパク質と比較したコントートロスタチン前駆体のマルチドメイン構造を示している。
【図４−２】
図４−２は、トリグラミン前駆体と他のヘビ毒の出血性タンパク質と比較したコントートロスタチン前駆体のマルチドメイン構造を示している。
【図５】
図５は、コントートロスタチンのホモダイマーの形成を示している。図５Ａは、Ｎ末端に６アミノ酸の末端切断を有し、２つの不対システイン残基を与える２つの半シスチン残基を含むコントートロスタチンと比較したキストリン（ディスインテグリン）のアミノ酸配列とジスルフィド結合パターンを示している。図５Ｂは、不対システインが、２つの分子間ジスルフィド結合の形成に関与して、ユニークなホモダイマー構造を形成し得ることを示している。２つのモノマーは、平行又は非平行パターンで連結され得る。
【図６】
図６は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５のフィブロネクチンへの接着をＣＮが阻害したことを示している。
【図７】
図７は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５のビトロネクチンへの接着をＣＮが阻害したことを示している。
【図８】
図８は、ＧＲＧ−ＤＳＰによって、ヒト乳癌細胞の固定化されたＣＮへの結合が阻害されることを示している。
【図９】
図９は、ＥＤＴＡによって、ヒト乳癌細胞の固定化されたＣＮへの結合が阻害されることを示している。
【図１０】
図１０はコントートロスタチン及び単量体のディスインテグリンによって運動能が阻害されることを示している。（ａ）ホモ二量体のディスインテグリンである表記のμＭ濃度のコントートロスタチン（ＣＮ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞のＭａｔｒｉｇｅｌ上での運動能を阻害し、その阻害は、単量体のディスインテグリンであるフラボリディン（Ｆｌａｖ）をコントートロスタチンの２倍の濃度で用いた場合より有効である。図示されているデータは、平均値を表している。誤差線はＳＥＭを表している。（ｂ）Ｍａｔｒｉｇｅｌでコートされた膜の底部の方に移動した被染色細胞の像。これらの実験は、結果を確認するために４回行った。
【図１１】
コントートロスタチンは、Ｔ２４細胞のＭａｔｒｉｇｅｌ（白四角）への接着に対して何ら影響を与えないが、ビトロネクチン（黒四角）への接着は完全に遮断する。同様に、αｖβ３インテグリンを発現していないＴ２４細胞を選択した場合、コントートロスタチン（白丸）によって、Ｍａｔｒｉｇｅｌへの結合は影響を受けないが、ビトロネクチン（黒丸）に対しては有効に阻害される。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を用いた接着アッセイでも同様の結果が得られた。
【図１２】
図１２は、実験用ヌードマウスでのＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍の増殖に対するＣＮの影響を示している。
【図１３】
図１３は、対照ニワトリ胚絨毛尿膜（ＣＡＭ；ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ　ｍｅｍｂｒａｎｅ）（図１３Ａ）、２０μｇのＣＮで処理したＣＡＭ（図１３Ｂ）、及び１５０μｇのＣＮで処理したＣＡＭ（図１３Ｂ）中で、腫瘍によって誘導された血管新生を示す写真である。
【図１４】
図１４は、インビトロでのＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の増殖に対するＣＮの影響を示す。
【図１５】
Ｔ２４及びＴ２４−β３ｎｅｇ．細胞株におけるインテグリンαｖβ３及びαｖβ５の発現パターン。本図は、抗体７Ｅ３（抗αｖβ３）及びＰ１Ｆ６（抗αｖβ５）が前記細胞に結合することを示している。抗体の結合は、フローサイトメトリーを使用し、ＦＩＴＣに抱合された二次抗体を用いて検出した。各アッセイ中のバックグラウンドピークは、破線の矢印によって記されている。特異抗体で処理した細胞を表すピークは、実線の矢印によって記されている。７Ｅ３（１０μｇ／ｍｌ）はＴ２４細胞に結合して、ピークの右方へのシフトを引き起こし（Ａ）、Ｐ１Ｆ６（１０μｇ／ｍｌ）もＴ２４細胞に結合して右方への僅かなシフトを引き起こすので（Ｂ）、Ｔ２４はαｖβ３（多量）とαｖβ５（少量）をともに発現していることが示唆される。ピークが重複することによって示されるように、Ｔ２４−β３ｎｅｇ．細胞には、７Ｅ３の結合は見られない（Ｃ）。しかしながらＰ１Ｆ６は該細胞に結合するので（Ｄ）、該細胞はαｖβ５のみを発現していることを示す。ここに示されたデータは、３つの同じ実験のうちの代表的なものである。
【図１６】ビトロネクチン受容体の様々なアンタゴニストによって、Ｔ２４及びＴ２４−β３ｎｅｇ．細胞のビトロネクチンへの接着が阻害される。（Ａ）コントートロスタチンは、Ｔ２４の接着を完全に阻害する（四角）のに対して、７Ｅ３は接着を部分的に阻害するにすぎない（三角）。（Ｂ）Ｐ１Ｆ６だけは（黒丸）、Ｔ２４の接着を部分的に阻害するにすぎなかったが、７Ｅ３（１０μｇ／ｍｌ）と組み合わせると、Ｐ１Ｆ６（菱形）も接着を完全に阻害することができる。（Ｃ）コントートロスタチンは、Ｔ２４−β３ｎｅｇ．の接着を完全に阻害する（四角）のに対して、７Ｅ３は接着に対して影響を有しない（三角）。（Ｄ）Ｐ１Ｆ６（黒丸）だけが、Ｔ２４−β３ｎｅｇ．の接着を有意に阻害する。７Ｅ３（１０μｇ／ｍｌ）の存在はＰ１Ｆ６の阻害能を増大しない（菱形）。各データの点は、３つの各繰り返しの平均±標準偏差を表しており、非線形回帰曲線によって結ばれている。実験は３回繰り返されたが、結果は同じであった。
【図１７】
ＯＶＣＡＲ−５細胞株中でのインテグリンの発現パターン。モノクローナル抗体抗αｖβ３（７Ｅ３）と抗αｖβ５（Ｐ１Ｆ６）を用いたＦＡＣＳによって、ＯＶＣＡＲ−５細胞株中でのインテグリンの発現パターンを分析した。実線のピークはバックグラウンドであり、バックグラウンドと重なっている点線のピークは結合した７Ｅ３を表し、右側の点線のピークはＰ１Ｆ６を表している。このことは、ＯＶＣＡＲ−５細胞がインテグリンαｖβ５を有しているが、αｖβ３は有していないことを決定的に示している。
【図１８】
ＣＮ及びαｖβ５の他のアンタゴニストは、ＯＶＣＡＲ−５細胞のビトロネクチンへの接着を阻害する。マトリックスへの癌細胞の接着は、癌細胞の広がりと転移にとって決定的な段階の一つである。インテグリンαｖβ５が細胞のビトロネクチンへの接着を媒介することは十分に確定されている。接着アッセイにおいて、本発明者らは、ビトロネクチンをコートしたプレートへのＯＶＣＡＲ−５細胞の接着は、ＣＮとαｖβ５に対するｍＡｂ（Ｐ１Ｆ６）の両者によって阻害されることを実証することができた。しかしながら、抗体αｖβ３（７Ｅ３）は細胞接着には影響を与えなかった。本データは、インテグリンαｖβ５を遮断することによって、ＣＮが癌細胞のビトロネクチンへの接着を破壊することを示唆している。
【図１９】
精製されたαｖβ５（すなわち、マイクロタイタープレートの各ウェル中に固定化された精製αｖβ５（１００ｎｇ））へのコントートロスタチンの直接結合。様々な濃度のコントートロスタチンをインテグリンに結合させた。ディスインテグリンに対する抗血清を用いて、結合したコントートロスタチンを総結合（黒丸）として定量した。ウシ血清アルブミンに結合したコントートロスタチン（白四角）を非特異的結合と定義する。総結合から非特異的結合を差し引くことによって、特異的な結合（三角）を算出する。各点は、３回の繰り返し分析から得られた４０５ｎｍの吸光度の平均±ＳＤを表している。結果を確認するために該実験を繰り返した。
【図２０】
コントートロスタチンは、腫瘍細胞の中でチロシンのリン酸化現象を誘導する。懸濁したＴ２４細胞（ａ）又はＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（ｂ）を用いて、１０分間の処理後に、コントートロスタチンが表記の濃度で、１２０〜１４０ｋＤａのタンパク質のチロシンリン酸化を刺激することが示されている。特異的な免疫沈降とホスホチロシン免疫ブロッティングによって、ＦＡＫとＣＡＳは、コントートロスタチン処理に応じて、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞中でチロシンリン酸化をもたらすことが示されている（ｃ及びｅ）。等量のタンパク質が加えられたことを実証するために、免疫沈降に使用した抗体を免疫ブロッティングに使用した（ｄ及びｆ）。
【図２１】
αｖβ３インテグリンは、専ら、コントートロスタチンによって刺激されたチロシンのリン酸化現象を媒介する。αｖβ３を発現する２９３細胞（β３）は、表記の濃度のコントートロスタチンによる処理に応答し、１０分後に１２０〜１４０ｋＤａのタンパク質のチロシンリン酸化を増大させるが、αｖβ５を発現している対照細胞（β５）は応答を示していない（ａ）。表記の濃度の７Ｅ３（抗αｖβ３　ｍＡｂ）によってＴ２４細胞を処理すると、０．０１μＭのコントートロスタチンによる１０分間の処理によって誘導された１２０〜１４０ｋＤａタンパク質のチロシンリン酸化を消失せしめる（ｂ）。
【図２２】
腫瘍細胞におけるチロシンリン酸化に対する単量体ディスインテグリンの影響。表記のように１０分間、表記の濃度のエチスタチン（上段）若しくはフラボリディン（下段）でＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を処理するか、又は単量体のディスインテグリンと１０ｎＭのコントートロスタチンで同時にＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を処理した。実験の手順に記載されているように、イムノブロットによって、ライセートのホスホチロシン含量を分析した。
【図２３】
コントートロスタチンによって誘導されたチロシンリン酸化は、αｖβ３インテグリンによって媒介される。Ａ、αｖβ５（αｖβ５　２９３）又はαｖβ３（αｖβ３　２９３）の何れかを発現する懸濁２９３細胞を、表記の濃度のコントートロスタチン（ＣＮ）で１０分間処理した。β３　２９３細胞はコントートロスタチン処理に応答して、チロシンのリン酸化を増大させたが、β３　２９３細胞は何ら応答を示さなかった。実験の手順に記載されているように、イムノブロットによって、ライセートのホスホチロシン含量を分析した。Ｂ、コントートロスタチン（ＣＮ）と表記の濃度の抗αｖβ３　ｍＡｂ　７Ｅ３によって、Ｔ２４細胞（上段）又はＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（下段）を１０分間同時に処理した。細胞全体のライセートはホスホチロシンイムノブロットによって分析した。
【図２４】
コントートロスタチンによって誘導されるチロシンリン酸化におけるＳｒｃの関与。１０ｎＭのコントートロスタチン（ＣＮ）による刺激の前に、表記の濃度のＳｒｃ阻害剤ＰＰＩによって３０分間、Ｔ２４細胞（上段）又はＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞（下段）を前処理した。ライセートを調製し、抗ホスホチロシンイムノブロットによって分析した。ＰＰＩの原液はＤＭＳＯ中に調製したが、ＤＭＳＯ単独では、コントートロスタチンによって誘導されたチロシンのリン酸化に対して何ら影響を与えなかった（上段）。
【図２５】
コントートロスタチンによって誘導されるチロシンのリン酸化は、細胞接着に依存しない。Ｍａｔｒｉｇｅｌでコートしたプレートに加える前に、表記の濃度のコントートロスタチン（ＣＮ）によって５分間、Ｔ２４細胞を前処理した。対照細胞は懸濁液の中に維持した。Ｍａｔｒｉｇｅｌ上で細胞を２０分間インキュベートした後にライセートを調製し、抗ホスホチロシンイムノブロットによって分析した（上段）。下段は、デンシトメトリーで決定した対応するバンドの相対強度を示している。
【図２６】
コントートロスタチンは、Ｍａｔｒｉｇｅｌに接着しているＴ２４細胞中で細胞の形態の変化、アクチン張力繊維の崩壊、及び局所的接着の分解を引き起こす。０．５μＭのコントートロスタチンで３０分間処理した細胞の位相差顕微鏡（ｂ）は、対照細胞（ａ）に比べて、形態が変化し、細胞の分散が減少していることを示している。対照細胞のＦアクチン染色（ｃ及びｇ）は大きな張力繊維を示しているのに対して、コントートロスタチンで処理した細胞中のアクチン（ｄ及びｈ）は、無定形の凝集物へと崩壊しているように見える。ホスホチロシン染色は、多数の極めて明瞭な局所的接着構造を示している（ｅ）。これに対して、コントートロスタチンで処理した細胞中には、局所的な接着がほぼ完全に欠如している（ｆ）。対照細胞中でＦＡＫに対する特異的染色を行うと、ホスホチロシンで観察されたパターンと同様のパターンが得られたが（ｉ）、コントートロスタチンで処理した細胞におけるＦＡＫ染色（ｊ）は、散在性で間隙の多い斑状の外観であった。
【図２７】
αｖβ３インテグリンの存在は、コントートロスタチンが構造的な崩壊を引き起こすのに必要である。αｖβ３の不存在について選択したＴ２４細胞（ａ〜ｄ）、及びＯＶＣＡＲ−５ヒト卵巣癌細胞（ｅ〜ｈ）の部分集団のＦアクチンとホスホチロシンを、免疫蛍光顕微鏡によって調べた。αｖβ３を発現している細胞（図３）とは対照的に、これらの細胞は、０．５μＭのコントートロスタチン（ｂ、ｄ、ｆ、ｈ）で３０分間処理した後でも、対照細胞（ａ、ｃ、ｅ、ｇ）と比べて、形態、細胞骨格、又は局所的接着構造に変化を示さなかった。
【図２８】
単量体のディスインテグリンであるフラボリディンは、アクチン細胞骨格又は局所的接着構造に対して有意な影響を与えない。コントートロスタチンが細胞内構造に対して影響を与える能力を、単量体のディスインテグリンであるフラボリディンと直接比較した。存在するインテグリン結合性ＲＧＤモチーフの数を等しくするために、コントートロスタチンの二倍の濃度のフラボリディンで細胞を処理した。コントートロスタチン処理の後には、Ｆアクチン（ｃ）とホスホチロシン（ｄ）染色の崩壊が見られるのに対して、フラボリディン処理した細胞（ｅ及びｆ）は対照細胞と同じような外観を有している（ａ及びｂ）。
【図２９】
コントートロスタチンで誘導したチロシンリン酸化現象に対して仮定される機序の模式図。コントートロスタチンのホモ二量体（ＣＮ）は、細胞表面上に位置する２つの各αｖβ３に結合する。これによって、インテグリン関連ＦＡＫ分子は近くに引き寄せられ、トランス自己リン酸化を可能とし、Ｓｒｃの結合部位を作出する。次いで、ＳｒｃはＣＡＳをリン酸化することが可能となり、ＦＡＫをさらにリン酸化する。Ｓｒｃキナーゼ阻害剤であるＰＰ１は、Ｓｒｃによって媒介されるＦＡＫとＣＡＳのリン酸化を遮断することができる。
【図３０】
コントートロスタチン処理後の細胞骨格及び局所的接着に対する仮定的な効果の模式図。（上）未処理の細胞は、整ったアクチン細胞骨格と明瞭な局所的接着を有しつつ十分に広がっている。簡単のために、局所的接着中には、ＦＡＫとインテグリンのみが示されている。（下）コントートロスタチンで処理した細胞では、ＦＡＫの局在化は崩壊し、局所的な接着は分解しており、アクチン細胞骨格は崩壊しているため、形態が変化している。これらの現象は、細胞が接着性を保っている間に起こる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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