(57)【要約】本発明は、未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞を調製するための、リボゾーム及び／又は膜画分の混合物を含む成熟化剤の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞を調製するための、リボゾーム及び／又は膜画分細菌混合物を含む成熟化剤の使用。
【請求項２】
成熟化剤が、インターフェロン−γならびにリボゾーム及び／又は膜画分細菌混合物を含む、請求項１記載の使用。
【請求項３】
未成熟樹状細胞からの成熟樹状細胞の調製方法であって、培養培地中で未成熟樹状細胞を、リボゾーム及び／又は膜画分細菌混合物を含む成熟化剤に接触させる工程を含む方法。
【請求項４】
成熟化剤が、インターフェロン−γならびにリボゾーム及び／又は膜画分細菌混合物を含むことを特徴とする、請求項３記載の成熟樹状細胞の調製方法。
【請求項５】
膜画分が細菌株クレブシエラ・ニューモニエ由来のものである、請求項３又は４記載の成熟樹状細胞の調製方法。
【請求項６】
リボゾーム画分が細菌株クレブシエラ・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネスＡ群及びヘモフィリス・インフルエンザ由来のものである、請求項３〜５のいずれか１項記載の成熟樹状細胞の調製方法。
【請求項７】
前記成熟化剤が、成熟化培地中で約０．０１〜約１００μg/mL、好ましくは約０．１〜約１０μg/mLの用量で用いられるリボゾーム及び/又は膜抽出物細菌混合物を含む、請求項３〜６のいずれか１項記載の成熟樹状細胞の調製方法。
【請求項８】
前記成熟化剤が、成熟化培地中で約１０〜１００００UI/mL、好ましくは約１００〜約１０００UI/mLの用量で使用されるインターフェロン−γを含む、請求項３〜７のいずれか１項記載の成熟樹状細胞の調製方法。
【請求項９】
請求項３〜８のいずれか１項記載の方法により得ることができる樹状細胞。
【請求項１０】
活性物質として請求項９記載の樹状細胞を薬学的に許容し得るビヒクルとともに含有する医薬組成物。
【請求項１１】
活性物質として請求項９の樹状細胞を含む細胞性ワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分化拘束された成熟樹状細胞（ＤＣ）の製造方法、具体的にはＤＣの成熟化に使用されるリボゾーム及び/又は膜細菌抽出物の混合物に関する。
【０００２】
樹状細胞は、特異的外部抗原に対する一次及び二次両免疫応答を刺激し得る最も強力な抗原提示細胞として定義されている（Hart "Dendric cells: unique leucocyte populations which control the primary immune response" Blood, 1997, vol.90, p3245）。in vivoでは、末梢で抗原捕獲した未成熟樹状細胞は、リンパ管を通ってリンパ系器官のＴ細胞ゾーンへと移動し、そこで、ＭＨＣ分子との関連でこれらの抗原に由来するエピトープを提示し、抗原特異的ナイーブＴ細胞を活性化し、増殖させる。
【０００３】
刺激されたリンパ球は、樹状細胞のタイプ及び既に存在していたサイトカインのパターンにより、細胞傷害性又は補助的なリンパ細胞となり得、また制御性又は抑制性リンパ細胞となり得る。
【０００４】
移動の間に、樹状細胞は成熟過程を経て、形態的にも表現型においても変化する。成熟化は、ＤＣの抗原捕獲能の低下及び抗原提示能の増大を誘導する。成熟過程のＤＣは、共刺激分子をさらに高いレベルで発現し、表面上にＣＤ８３を発現するようになり、さらにエフェクターＴ細胞サブタイプを刺激するサイトカインを産生し、移動能を獲得する（総説として、"Immunobiology of dendritic cells", Banchereau et al., 2000, Ann. Rev. Immunol., 18: 767-811を参照）。
【０００５】
ex vivoで大量の樹状細胞を調製する可能性が最近提唱され、その後、これらの細胞を免疫療法において、そして細胞性ワクチンとして使用することに対する関心が高まってきている。
【０００６】
樹状細胞は、種々の組織源又は血液若しくは骨髄に存在する前駆体から得ることができる。未成熟樹状細胞は、血液細胞から、所定の培養条件を用いて単球を分化させるとにより得ることもできる（Boyer et al., "Generatino of phagocytic MAK and MAC-DC for therapeutic use: Characterization and in vitro functional properties", Exp. Hematol. 1999, vol. 27, pp751-761）。樹状細胞前駆体の増殖は、ヒト血液中のＣＤ３４＋細胞小画分中にも認められており（Inaba et al. "Identification of proliferating dendritic cells precursors in mouse blood", 1992, J. Exp. Med., vol. 175, p1157）、これらの細胞を分化させる方法が開発されている。
【０００７】
例えばＩＬ−１３の存在下、血中の単球から分化させた後、樹状細胞は未成熟な表現型を提示する。すなわち、飲作用又は貪食作用による抗原捕獲については強力であり、低レベルの共刺激分子ＣＤ８０を呈し、そして表面マーカーＣＤ８３を発現しない（Boyer et al., 1999）。
【０００８】
成熟樹状細胞は、未成熟樹状細胞よりも強力な免疫調節物質である。具体的には、樹状細胞のin vivo免疫応答誘導能は、それらの成熟度に相関する（Labeur M. S et al. "Generation of tumour immunity by bone-marrow derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage", J Immunol., 1999, 162, 168-175）。
【０００９】
ポリＩＣ、ＣＤ４０リガンド、抗ＣＤ４０抗体、エンドトキシン類、生菌体、培養上清及びＴＮＦαを含む作動性サイトカインの混合物など、研究目的でＤＣの成熟化に使用されるいくつかの公知作用物質が存在する。しかし、ペプチドをパルスした後又は特定の抗原を負荷した後その表面上に外来抗原を提示している細胞を用いて、患者に成熟樹状細胞をワクチン接種するための臨床治験は、開発中である。したがって、所定の免疫調節能を有する分化拘束された樹状細胞を得るために、再現性のある臨床用等級の成熟条件の開発が要求される。
【００１０】
マイコバクテリウム・ボビス・バシルス・カルメッテ−ゲリン（ＢＣＧ：Mycobacteirum bovis bacillus Calmette-Guerin）が樹状細胞を活性化することが示されている（Kim et al., "Enhanced antigen-presenting activity and tumour necrosis factor α-independent activation of dendritic cells following treatment with Mycobacteirum bovis bacillus Calmette-Guerin", Immunology, 1999, vol. 97, pp626-633）。しかし、ＢＣＧは生きた弱毒化菌株であり、細胞性ワクチン中のその使用は、安全性の懸念を含めいくつかの欠点がある。
【００１１】
Ribomunyl（登録商標）（国際非専売名又は一般名：細菌リボゾーム及び膜画分、膜プロテオグリカン）は、その非特異的な自然の免疫刺激作用で知られている。これは、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）由来のプロテオグリカン（１回用量の凍結乾燥物中０．０１５mg）及び４種の異なる細菌株、クレブシエラ・ニューモニエ（３５部）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）（３０部）、ストレプトコッカス・ピオゲネスＡ群（Streptococcus pyogenes group A）（３０部）及びヘモフィリス・インフルエンザ（Haemophilus influenzae）（５部）由来の、７０％ＲＮＡを含有するリボゾーム画分（１回用量の凍結乾燥物中リボゾーム抽出物０．０１mg）の両方を含有する。プロテオグリカンは、アジュバント又は非特異的免疫刺激薬として作用し、リボゾームの免疫原性は、リボゾームに天然に結合しているペプチド、又は膜及び細胞質リボゾームに結合しているエピトープに起因する（Clot et al., "Pharmacology of ribosomal immunotherapy", Drugs, 1997, vol. 54, suppl. 1, pp.33-36）。ＲＢＬとも呼ばれるRibomunyl（登録商標）は、粘膜性免疫応答を誘発する（Bene & Faure, "From Peyer's patches to tonsils", Drugs, 1997, 54, suppl. 1, pp.24-28）。ＲＢＬが多形核細胞（ＰＭＮ）及びマクロファージに作用することにより全身性の自然免疫応答を刺激し、いくつかのサイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＣＳＦ）の産生を増大し、そしてナチュラルキラー細胞の活性化ができるようにすることが明らかにされた。
【００１２】
本発明の目的は、未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞を調製する新規な方法に関する。この方法は、培養培地中で、未成熟樹状細胞を、リボゾーム及び／又は膜画分細菌混合物を含む成熟化剤に接触させる工程を含む。
【００１３】
「成熟化」とは、未成熟な高度貪食性樹状細胞に対する作用であって、細胞の表現型及び／又は機能的変化に至らせる作用と定義される。これに伴う表現型の変化とは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、クラスＩ及びＩＩＭＨＣ分子の細胞表面での発現の増大、及びＣＤ１４の表面での発現の低下である。機能的変化とは、貪食性の喪失、移動能の獲得、同種異系間のＴ細胞刺激効率の上昇、及びサイトカイン及びケモカインの発現特性の変化、具体的にはＩＬ−１２分泌の増大であり得る。ＤＣによるＩＬ−１２産生は、ＤＣのin vivo機能には、必須である。それは、このサイトカインがin vivoで免疫応答をＴｈ１経路に偏向させることが示されているためである。Ｔｈ１タイプの応答は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔリンパ球の刺激が関与する免疫応答と考えられており、一方Ｔｈ２タイプの応答は、むしろ抗体応答の刺激、及び最終的には抗原に対する細胞傷害性リンパ球の不応答性が関与する。
【００１４】
「分化拘束されたＤＣ」とは、免疫応答を、明瞭にＴｈ１免疫刺激又は免疫調節へと方向付ける成熟ＤＣと定義される。
【００１５】
「リボゾーム抽出物」とは、リボゾーム画分、具体的には一本鎖及び／又は二本鎖リボ核酸を含む細菌抽出物と定義される。リボゾーム抽出物又は画分は、細菌培養物から精製又は部分精製された、リボゾームを含有するあらゆる抽出物に相当する。このような抽出物の調製方法は、培養後得られた細菌を溶解する工程、及び全溶解物から細菌リボゾームを含有する画分を、具体的には遠心分離又は濾過により分離する工程を少なくとも含む。
【００１６】
「膜抽出物」とは、膜画分に富んだ細菌抽出物と定義される。膜抽出物又は膜画分は、細菌培養物から精製又は部分精製された、膜を含有するあらゆる抽出物又は画分に相当する。このような抽出物の調製方法は、培養後得られた細菌を溶解するステップ、及び細菌の膜を含有する画分を、具体的には遠心分離又は濾過により分離する工程を少なくとも含む。
【００１７】
様々な細菌の画分を、Haeuw J.F. et al.（Eur. J. Biochem., 255, 446-454, 1998）に記載の方法又はPierre Fabre S.A.により出願された米国特許第4,249,540号に記載の方法などの、当業者に公知の方法によって調製することができる。
【００１８】
「細菌混合物」とは、膜及びリボゾーム画分を含む、おそらくは種々の細菌株に由来する細菌抽出物の混合物と定義される。
【００１９】
「成熟化培地」とは、成熟化剤が添加されている、細胞の生存及び分化に適する培養培地と定義され、培養培地は、補充される場合が多い。
【００２０】
本発明の実施態様によれば、成熟樹状細胞の調製方法は、成熟化剤がリボゾーム及び／又は膜画分細菌混合物ならびにインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を含むことを特徴とする。インターフェロン−γは、成熟化剤に対して相乗効果を有し、ＤＣの成熟化特性及びその刺激表現型を増大させる。樹状細胞の「刺激表現型」は、Ｔｈ１応答を誘導し、細胞傷害性Ｔリンパ球に有利なサイトカインプロフィールを分泌することと定義される。
【００２１】
本発明の別の実施態様によれば、上記方法は、未成熟樹状細胞を、クレブシエラ・ニューモニエ由来の膜画分を含む成熟化剤と接触させることを特徴とする。このような成熟化剤を、成熟化培地中、約０．０１〜約１００μg/mL、好ましくは約０．１〜約１０μg/mLの濃度で使用してもよい。
【００２２】
本発明の別の実施態様では、上記方法は、細菌株、クレブシエラ・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、ストレプトコッカス・ピオゲネスＡ群、及びヘモフィリア・インフルエンザ由来のリボゾーム画分を含む成熟化剤を未成熟樹状細胞と接触させることを特徴とする。このような成熟化剤を、成熟化培地中、約０．０１〜約１００μg/mL、好ましくは約０．１〜約１０μg/mLの濃度で使用してもよい。
【００２３】
本発明の具体的な実施態様では、未成熟樹状細胞を、成熟化培地中、約０．０１〜１００μg/mL、好ましくは約０．１〜約１０μg/mLで使用されるリボゾーム及び膜抽出物細菌混合物を含む成熟化剤と接触させる。
【００２４】
本発明の別の具体的な実施態様では、成熟化剤はRibomunyl（登録商標、Inava Laboratory, Pierre Fabre）である。
【００２５】
本発明の別の実施態様では、未成熟樹状細胞を、リボゾーム及び膜抽出物細菌混合物ならびにインターフェロン−γを１０〜１００００UI/mL、好ましくは約１００〜約１０００UI/mLの用量で含む成熟化剤に接触させる。ＩＦＮ−γの成熟化作用増強能を試験し、特に樹状細胞のＩＬ−１２分泌に効果的であることが見出された（実施例３参照）。Ribomunyl（登録商標、ＲＢＬ）のみを含む成熟化剤、又はＲＢＬ及びＩＦＮ−γを含む成熟化剤、又は抗ＣＤ４０と併用するポリＩ：Ｃなどの公知の成熟化剤と樹状細胞との接触がサイトカイン分泌に及ぼす作用を比較すると、ＲＢＬ及びＩＦＮ−γと細胞の接触により、ＩＬ−１２分泌レベルは他の成熟化剤で得られるものより優るようになり、ＲＢＬと細胞の接触により、他の成熟化剤より優れたＩＬ−１０分泌を誘導した（実施例３を参照）。ＩＬ−１２分泌レベルとＩＬ−１０分泌レベルの比は、ＲＢＬ及びＩＦＮ−γの両方を用いると、細胞は、効果的に免疫刺激成熟樹状細胞表現型へと分化拘束されることを示している。
【００２６】
一方、成熟化剤として例えばＲＢＬのみを用いて、ＩＬ−１０分泌レベルが高く、ＩＬ−１２分泌レベルが低いＤＣ細胞を取得すると、結果として興味深い免疫制御特性、具体的には自己免疫疾患を制御する性質を有する成熟樹状細胞が得られる。
【００２７】
本発明は、抗原負荷成熟樹状細胞の調製方法にも関する。細胞を、貪食作用、飲作用、親和性による結合、融合、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）移入又は受容体介在による取り込みにより、当業者に公知の方法に従って、抗原負荷させてもよい。樹状細胞培養培地は、腫瘍標的細胞若しくは細胞破片、又はそれに対する免疫応答が期待される特異的ペプチドを含む溶解性又は微粒子状抗原としてもよい。培養培地には、免疫応答の調節が望まれるペプチド又はタンパク質をコードする遺伝物質を補充してもよく、このような遺伝物質は、樹状細胞をトランスフェクションさせ得るベクターに連結される。
【００２８】
細胞が貪食作用により抗原を取り込むことが望ましい場合には、樹状細胞成熟化因子を添加する前に未成熟樹状細胞の培養物に抗原を添加することが好ましい。微粒子状抗原、細胞溶解物又は免疫複合体を用いるときは、貪食作用が望ましいかもしれない。溶解性ペプチド抗原を用いるときは、成熟化後に、樹状細胞に抗原を曝露することが好ましい。
【００２９】
本発明は、本明細書記載の方法に従って得ることができる樹状細胞にも関する。
【００３０】
未成熟樹状細胞は、当業者に公知のいかなる方法でも得られる。例えば、単球由来樹状細胞を特許出願WO94/26875、WO96/22781又はWO97/44441に従って調製することができる。樹状細胞は、Banchereau et al（"Immunobiology of dendritic cells" Annu. Rev. Immunol., 2000, 18:767-911）に従って調製してもよい。
【００３１】
本発明の方法に従って得ることができる樹状細胞は、正確なＴ細胞サブポピュレーションに作用することができる。これは、本発明の樹状細胞が、Ｔｈ２／Ｔｈ１免疫応答を刺激又は調節し得ることを意味する。ＤＣは、Ｔ細胞のin vivo抗原特異的増殖を誘導することができ、抗原特異的細胞傷害性及び免疫刺激を上昇させ、又はin vivo制御性Ｔ細胞を誘導し、それにより抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞を抑制し、特異的抗原に対する不応答へと導く。成熟樹状細胞の免疫刺激能と免疫制御能とのバランスは、未成熟細胞に適用した成熟化条件及びこうした条件に置かれたＤＣのタイプに依存する。
【００３２】
誘導された免疫応答の特徴は、特定の病原体又は腫瘍に対するin vivo臨床免疫応答が最終的にこれらの病原体又は腫瘍を減少させ、又は除去する点にある。In vitroでは、樹状細胞について、この応答を、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の免疫刺激アッセイにおいて測定してもよい。本発明に従って処理された樹状細胞の機能性を、標的認識能として、及びサイトカイン及びケモカインの放出を分析することにより測定してもよい。免疫応答の制御は、自己免疫疾患の場合、症状の軽減又は消失によって、臨床的に観察される。In vitroでは、免疫応答を制御し得る抗原提示細胞は、刺激性サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ）分泌の低下及び特定の抑制性サイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β）分泌の増加により特徴付けられる。
【００３３】
Ribomunyl（登録商標）及びＩＦＮγで処理した後の樹状細胞の細胞形態は、樹状突起の存在により特徴付けられ、これは未成熟樹状細胞上には見ることはできない（Banchereau et al., 2000）。
【００３４】
ＲＢＬ単独又はＲＢＬ＋インターフェロンγのいずれかを含む成熟化剤と４０時間接触させた後、細胞の表現型をフローサイトメトリーにより解析したところ、例えばＣＤ８３発現パターン（図３参照）により立証されるように、樹状細胞集団は部分的にのみ成熟化されていることが明らかにされている。こうした部分的成熟は、樹状細胞が患者に注射された後、in vivoでの成熟化プロセスを完遂することをおそらく可能にする。具体的には、そのような細胞は、注射部位からリンパ節に効率的に移動し得る。このような性質により、in vivo治療への応用の興味ある可能性が開かれるかもしれない。
【００３５】
本明細書中に引用する実施例は、４０時間にわたる樹状細胞と成熟化剤との接触を示す。しかし、本発明の方法は、所望される樹状細胞の成熟化レベルに従って、未成熟樹状細胞を成熟化剤と１８時間、又はより短い時間、接触させる工程を含んでもよい。
【００３６】
本発明の方法に従って得ることができる樹状細胞は、免疫療法及びワクチン学に使用し得る。細胞を患者に投与することが可能であり、細胞及び添加物は臨床用等級のものである。
【００３７】
本発明は、活性物質として、本明細書に記載の方法に従って得ることができる樹状細胞を含有する医薬組成物にも関する。
【００３８】
本発明は、活性物質として、本明細書に記載の方法に従って得ることができる樹状細胞を含有する細胞性ワクチン組成物にも関する。
【００３９】
記載された方法に従って調製される抗原提示細胞を含有する医薬組成物、細胞性ワクチン組成物及び免疫療法薬を、皮内、皮下、静脈内、リンパ内、リンパ節内、粘膜内又は筋肉内投与を含む、様々な生薬的形態で患者に投与してもよい。注射される単回投与量中の樹状細胞の数は、患者当たり約１０6〜約１０9細胞、好ましくは約１０7〜約１０8細胞とする。例として、患者は、連続する６週間、各週１回の注射を受けてもよい。
【００４０】
図面の説明
図１：樹状細胞成熟化におけるRibomunyl（登録商標）の用量応答
未成熟ＤＣを、０．００１〜１０μg/mLの用量範囲のRibomunylの存在下、４０時間インキュベートした。成熟化を追跡するため、抗ＣＤ８３抗体、抗ＣＤ８６及び抗ＨＬＡ  ＡＢＣ抗体で染色し、蛍光をフローサイトメーターで解析した。
【００４１】
Ｘ軸は、成熟化培地中のRibomunylの使用用量をmg/mLで示す。マーカーの発現は、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＡＢＣマーカーについては、平均蛍光強度任意単位（左Ｙ軸）で、ＣＤ８３マーカーについては、マーカーを発現している細胞のパーセンテージ（右Ｙ軸）で表した。明色及び濃色のヒストグラムは、それぞれＣＤ８６の発現及びＨＬＡ−ＡＢＣの発現に相当し、曲線はＣＤ８３マーカーを発現する細胞のパーセンテージを示す。
【００４２】
図２：種々の成熟化条件におけるＤＣの回収率及び致死率
未成熟ＤＣを標準的試薬である抗ＣＤ４０（３μg/mL）及びポリ（Ｉ：Ｃ）（１００μg/mL）の存在下、臨床用等級の試薬Ribomunyl（１μg/mL）又はRibomunyl（１μg/mL）及びＩＦＮ−γ１０００UI/mLの存在下、４０時間インキュベートした。培養後の細胞の回収率は、Malassezスライド上で顕微鏡下、生存細胞を計数することにより評価した。細胞の生存率は、ＴＯＰＲＯ−３テクノロジー（Molecular Probes）を用いたＦＡＣＳにより測定した。
【００４３】
Ｘ軸は、用いられた異なる成熟化条件を表し、Ｙ軸は、回収された細胞のパーセンテージ、又は細胞の致死率のパーセンテージを示す。ヒストグラムは、細胞回収率に相当し、菱形は細胞致死率のパーセンテージに相当する。
【００４４】
図３：成熟化処理をしないＤＣ及び種々の成熟化剤とインキュベートした後のＤＣの表現型のＦＡＣＳによる解析
未成熟ＤＣを標準的試薬である抗ＣＤ４０（３μg/mL）及びポリ（Ｉ：Ｃ）（１００μg/mL）存在下、臨床用等級試薬Ribomunyl（１μg/mL）又はRibomunyl（１μg/mL）及びＩＦＮ−γ１０００UI/mLの存在下、４０時間インキュベートした。実線は、イソタイプ対照に相当する。点線は、検体解析に相当する。
【００４５】
図４：成熟ＤＣのＴ細胞同種異系刺激
臨床用等級のＲＢＬ（１μg/mL）、ＲＢＬ（１μg/mL）＋ＩＦＮ−γ（１０００U/mL）、ポリＩ：Ｃ＋抗ＣＤ４０による処理、若しくはＩＦＮ−γ単独（１０００UI/mL）による処理のいずれかによって成熟させたＤＣ、又は未成熟ＤＣに対して、同種異系の混合リンパ球培養反応（ＭＬＲ）を行った。末梢血白血球抽出物中に存在する特定数の同種異系Ｔリンパ球とともに、ＣＤを５日間インキュベートした。細胞増殖は、培養の最後の１８時間に［メチル−3Ｈ］チミジン１μCiとインキュベートした細胞の［3Ｈ］チミジン取込みにより定量した。
【００４６】
Ｘ軸は、種々のＤＣ／Ｔ細胞比に相当し、Ｙ軸は細胞の［3Ｈ］チミジン取込み量を示す。黒菱形は、無処理ＤＣ（＝未成熟ＤＣ）により得られた値を表し、白丸は、ＩＦＮ−γ処理による値、黒三角は、ＲＢＬ単独で処理した細胞に相当し、白三角は、ＲＢＬ＋ＩＦＮ−γにより処理した細胞に相当し、黒四角は、ポリＩ：Ｃ及び抗ＣＤ４０で処理した細胞に相当する。
【００４７】
図５：成熟ＤＣのＩＬ−１２分泌
２×１０6個ＤＣ/mLで４０時間細胞培養をした後、ＩＬ−１２ｐ７０サイトカイン分泌について、培養上清を市販のＥＬＩＳＡキットを用いてアッセイした。
Ｘ軸は、使用した種々の成熟化条件及び対照（無処理細胞）を示し、Ｙ軸は、培養上清中のＩＬ−１２ｐ７０の量をpg/mLで示す。
【００４８】
図６：成熟ＤＣのＩＬ−１０分泌
２×１０6個ＤＣ/mLで４０時間細胞培養をした後、ＩＬ−１０サイトカイン分泌について、培養上清を市販のＥＬＩＳＡキットを用いてアッセイした。
Ｘ軸は、使用した種々の成熟化条件及び対照（無処理細胞）を示し、Ｙ軸は、培養上清中のＩＬ−１０の量をpg/mLで示す。
【００４９】
実施例
実施例１：樹状細胞成熟化におけるRibomunyl（登録商標）の用量応答
樹状細胞
未成熟な樹状細胞（ＣＤ）を、特許出願WO97/44441及びBoyer et al.（"Generation of phagocytic MAK and MAC-DC for therapeutic use: Characterization and in vitro functional properties" Exp. Hematol., 1999, 27, 751-761）の方法に従って、末梢血単球の培養により調製し、洗浄した。ＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦ（Leucomax, Novartis Pharma）５００U/mL及びＩＬ−１３（Sanofi Synthelabo）５０ng/mLを補充したＡＩＭＶ培地（完全ＡＩＭＶ培地）中で分化させ、７日間の培養の後洗浄した。その後、４％ヒトアルブミン及び１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に２×１０7ＤＣ/mLを懸濁させ、液体窒素中で凍結させた。
【００５０】
成熟化
成熟化の前日に、ＤＣを解凍し、ＧＭ−ＣＳＦを５００U/mL及びＩＬ−１３を５０ng/mL含有する完全ＡＩＭＶ培地中に一晩放置した。Ribomunyl（ＲＢＬ）（Inava Laboratory, Pierre Fabre）は、薬局で購入した。凍結ＲＢＬの各バイアルは、リボゾーム画分０．０１０mg及び膜画分０．０１５mgを含有していた。用時、ＲＢＬをＡＩＭＶ培地（０．１mg/mL活性画分）に再懸濁させた。その後、２×１０6個ＤＣ/mLを０．００１、０．０１、０．１、１及び１０μg/mLのRibomunyl存在下、４０時間インキュベートした。
【００５１】
細胞形態学
血液単球の分化及びRibomunyl＋ＩＦＮ−γによるさらなる処理により得られる樹状細胞の形態においては、成熟ＤＣの特徴である樹状突起の出現を示したが、未成熟ＤＣが観察されたときには、これらの樹状突起は見ることはできなかった（データを示さず）。
【００５２】
表現型解析
成熟化を追跡するために、ＣＤ８３、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＡＢＣマーカーの発現についてＤＣを解析した。ＤＣを、ウシ胎児血清１％を補充したリン酸緩衝生理食塩液に４×１０6細胞/mLで懸濁させた。細胞懸濁液１００μL（各チューブ４×１０5細胞）をフルオロクロム結合モノクローナル抗体：ＰＥ−結合抗ＣＤ８３ｍＡｂ  １０μL、ＰＥ結合抗ＣＤ８６ｍＡｂ  １０μL又はＦＩＴＣ結合抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（Immunotech, Marseille, 仏国）１０μLとともに、氷上暗所で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳで再び洗浄し、１４００rpm、２０℃で５分間遠心分離し、３nMＴＯ−ＰＲＯ３を含有するＰＢＳに再懸濁させ、解析から死細胞を排除した。
【００５３】
フローサイトメトリー解析を、CellQuestソフトウェアを備えたBecton  Dickinsonサイトメーターを用いて行った。
【００５４】
結果：
結果を図１に示す。ＣＤ８６マーカー発現及びＨＬＡ−ＡＢＣマーカー発現は、平均蛍光強度任意単位で表し（左Ｙ軸）、ＣＤ８３マーカー発現は、そのマーカーを発現する細胞のパーセンテージで表す（右Ｙ軸）。
【００５５】
１ng/mL〜１０μg/mLの範囲のRibomunyl（登録商標）で試験を行い、可能な限り低い毒性にて４０時間培養した後にＣＤ成熟化を誘導し得るＲＢＬの最適濃度を評価した。
【００５６】
１ng/mL〜０．１μg/mの範囲では、ＣＤ１４、ＣＤ８３、ＨＬＡ−ＡＢ及びＣＤ８６の発現に基づく成熟化は達成されなかった。１μg/mLを超えると、ＣＤ８３発現の出現、ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＡＢＣの上方制御が見られた。細胞致死率は、使用したＲＢＬ濃度に関わらず、上昇しなかった（示さず）。したがって、その後の研究にはＲＢＬ用量１μg/mLで４０時間の成熟化を選択した。
【００５７】
実施例２：種々の条件により調製されたＤＣの解析：細胞の形態、回収率、致死率及びＴ細胞増殖誘導能
【００５８】
細胞
未成熟樹状細胞は、実施例１の記載のとおりに調製した。
２×１０6個のＤＣを、標準的試薬である抗ＣＤ４０（３μg/mL）及びポリ（Ｉ：Ｃ）（１００μg/mL）存在下、臨床用等級試薬Ribomunyl（登録商標）（ＲＢＬ、１μg/mL）又はＲＢＬ（１μg/mL）及びＩＦＮ−γ（Imukin、１０００UI/mL）の存在下、４０時間インキュベートした。２４穴プレート中、２×１０6個ＤＣ/mLで培養を行った。
【００５９】
細胞回収率及び致死率
培養後の細胞回収率を、Malassezスライド上で生存細胞を計数することにより評価した。細胞の生存率は、トリパンブルー排除により評価した。細胞の生存率は、ＴＯＰＲＯ−３を用いるＦＡＣＳによっても測定した。
【００６０】
表現型解析
ＤＣの表現型を実施例１と同じマーカーであるＣＤ８３，ＣＤ８６及びＨＬＡ−ＡＢＣを用い、実施例１と同じ条件を用いて、ＣＤ１４マーカー（ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ１４ｍＡｂ  １０μL、Becton Dickinson）を加えて、二重染色フローサイトメトリー解析によりＤＣの表現型を決定した。
【００６１】
同種異系混合リンパ球培養反応（ＭＬＲ）
種々の数のＤＣ（無処理ＤＣ、臨床等級試薬処理ＤＣ又はポリＩ：Ｃ＋抗ＣＤ４０処理ＤＣ）を、固定数の同種異系Ｔリンパ球とともに５日間インキュベートした。細胞増殖は、培養の最後の１８時間に［メチル−3Ｈ］チミジン１μCiとインキュベートした細胞の［3Ｈ］チミジン取込みにより定量した。
【００６２】
結果：
細胞回収率及び致死率
４０時間のＲＢＬ処理後に収集されたＤＣの数は、無処理ＤＣよりも１．５倍少なかった（図２）。細胞致死率は、回収された細胞のパーセンテージで表した。
【００６３】
ＲＢＬ又はＲＢＬ＋ＩＦＮ−γで処理した後の細胞の回収率は、無処理細胞の回収率に劣り、ＩＦＮ−γの添加では、細胞回収率は有意には変化せず、ポリＩ：Ｃ＋抗ＣＤ４０処理後の細胞回収率よりも依然優れていた。
【００６４】
表現型解析
ＤＣの表現型（図３）は、ＲＢＬ又はＲＢＬ＋ＩＦＮ−γで処理した後、細胞表面上のＣＤ８３マーカーの増加を示した。ＲＢＬ処理後、ＣＤ８３発現の二峰性パターンは、ＣＤ８３発現レベルの異なる、２種の細胞集団が存在することを示す。ＲＢＬ＋ＩＦＮ−γ処理細胞上のＣＤ８３発現レベルは、ポリＩ：Ｃ＋抗ＣＤ４０処理細胞のレベルに匹敵し、この結果は、細胞が成熟したことを示す。
【００６５】
同種異系混合リンパ球培養反応（ＭＬＲ）
図４は、混合リンパ球培養反応において、ＲＢＬ処理ＤＣが、無処理ＤＣ又はＩＦＮ−γ単独処理ＤＣよりも、５倍強力な刺激細胞であったことを示す。この刺激は、ポリＩ：Ｃ＋抗ＣＤ４０処理ＤＣによるものと近似している。
【００６６】
ＲＢＬにＩＦＮ−γを添加しても、ＤＣの同種異系Ｔ細胞増殖誘発能は有意には増大しなかった。
【００６７】
実施例３：種々の条件下で成熟させた樹状細胞のサイトカイン分泌
細胞
未成熟樹状細胞を、実施例１に記載のとおりに調製した。２×１０6個のＤＣを、前記実施例と同じ条件で成熟させた。
【００６８】
サイトカイン検出
２×１０6個ＤＣ/mLで４０時間細胞培養した後、培養上清を、ＩＬ−１２ｐ７０及びＩＬ−１０サイトカインの分泌について市販のＥＬＩＳＡによりアッセイを行った。
【００６９】
サイトカインの産生を、ＤＣ培養上清中、ＩＬ−１２ｐ７０（ＭＡＢ６１１、ＢＡＦ２１９）及びＩＬ−１０（ＭＡＢ２１７、ＢＡＦ２１７）に特異的にマッチさせた抗体を用いて測定した。アッセイは、製造業者の取扱い説明書（Ｒ＆Ｄ systems）に従って行った。
【００７０】
結果
ＲＢＬ処理は、少量のＩＬ−１２ｐ７０の産生を誘導する。ＤＣにＩＦＮ−γ及びＲＢＬを添加すると、ＩＬ−１２ｐ７０細胞分泌の１０倍の増加が誘導される。この値は、ポリＩ：Ｃ＋抗ＣＤ４０処理で得られる値より４倍高かった（図５）。
【００７１】
ＲＢＬは、大量のＩＬ−１０分泌を誘導した。ＤＣにＩＦＮ−γ及びＲＢＬを添加すると、ＲＢＬ処理細胞によるＩＬ−１０分泌に比べ、細胞により分泌されるＩＬ−１０のレベルが有意に低下した。高レベルのＩＬ−１２ｐ７０がＲＢＬ＋ＩＦＮ−γ処理ＤＣの上清中に検出された。ＲＢＬ処理ＤＣにより産生された高レベルのＩＬ−１０は、ＩＦＮ−γの添加により有意に低下した（図６）。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】樹状細胞成熟化におけるRibomunyl（登録商標）用量応答を示す。
【図２】種々の成熟化条件におけるＤＣの回収率及び致死率を示す。
【図３】成熟化処理をしないＤＣ及び種々の成熟化剤とインキュベートした後のＤＣの表現型のＦＡＣＳによる解析を示す。
【図４】成熟ＤＣのＴ細胞同種異系刺激を示す。
【図５】成熟ＤＣのＩＬ−１２分泌を示す。
【図６】成熟ＤＣのＩＬ−１０分泌を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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