(57)【要約】癌関連ＭＵＣ１タンパク質のＭＵＣ１特異的結合メンバーは、ＭＵＣ１のタンパク質コアのエピトープに結合するためのＭＵＣ１結合ドメイン又はその一部を含む。ＭＵＣ１特異的結合メンバーには、種々の抗体分子及びそのフラグメント、例えばＦａｂ抗体、ｓｃＦｖ抗体、二重ｓｃＦｖ抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、組換え完全長免疫グロブリン、及び免疫サイトカイン融合タンパク質などが含まれ、これらは、種々の組織（乳房、卵巣、膀胱、肺など）における癌の診断方法及び治療方法、並びにＭＵＣ１タンパク質の精製方法又は単離方法に用いられる。ＭＵＣ１特異的結合メンバー又はその一部をコードするポリヌクレオチド分子もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合ドメインを含む単離されたＭＵＣ１特異的結合メンバーであって、該抗原結合ドメインが下記式に示されるアミノ酸配列を含む領域を含有するものである、上記ＭＵＣ１特異的結合メンバー：
Ｘ１ Ｘ２ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｘ３ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｘ４ Ｐｒｏ Ｘ５ Ｘ６ Ｘ７ （配列番号２８）
〔式中、
Ｘ１は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＶａｌであり；
Ｘ２は、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、又はＧｌｎであり；
Ｘ３は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、又はＡｌａであり；
Ｘ４は、Ａｓｐ又はＡｓｎであり；
Ｘ５は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、又はＶａｌであり；
Ｘ６は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、又はＴｙｒであり；
Ｘ７は、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、又はＰｒｏである〕
【請求項２】
可変領域が以下に示す配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むものである、請求項１記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー：
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｙｒ（配列番号３のアミノ酸９７−１１０）；
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｙｒ（配列番号２９）；
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｈｉｓ（配列番号３０）；
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｙｒ（配列番号３１）；及び
Ａｌａ Ｉｌｅ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｙｒ（配列番号３２）
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列を含む抗体ＶＬ領域若しくはその一部、及び配列番号３のアミノ酸配列を含む抗体ＶＨ領域若しくはその一部を含有する抗原結合ドメインを含むものである、単離されたＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項４】
抗原結合ドメインを含むＭＵＣ１特異的結合メンバーであって、該抗原結合ドメインが抗体ＶＬ又はＶＨ領域のＣＤＲを含み、該ＣＤＲが、配列番号１のアミノ酸２４−３９、配列番号１のアミノ酸５５−６１、配列番号１のアミノ酸９４−１０２、配列番号３のアミノ酸３１−３５、配列番号３のアミノ酸５０−６６、配列番号３のアミノ酸９９−１１０、上記いずれかの配列の保存的置換を有する配列、及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸配列を有するものである、上記ＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項５】
ＭＵＣ１特異的結合メンバーが融合タンパク質である、請求項１、２、３又は４記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項６】
検出可能な標識又はタグをさらに含むものである、請求項１、２、３又は４記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項７】
検出可能な標識又はタグが、エピトープタグ、蛍光標識、放射性標識、重金属、抗癌剤、トキシン、及び磁気共鳴イメージング用標識からなる群より選択されるものである、請求項６記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項８】
免疫グロブリン、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、ｓｃＦｖ抗体、二重ｓｃＦｖ、Ｆｖ分子、ｄＡｂ、免疫サイトカイン分子、及びイムノトキシン分子からなる群より選択される抗体分子である、請求項１、２、３又は４記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項９】
配列番号５のアミノ酸配列を含むものである、請求項８記載のＭＵＣ１特異的免疫サイトカイン。
【請求項１０】
検出可能な標識又はタグをさらに含むものである、請求項９記載のＭＵＣ１特異的免疫サイトカイン。
【請求項１１】
検出可能な標識又はタグが、エピトープタグ、蛍光標識、放射性標識、及び磁気共鳴イメージング用標識からなる群より選択されるものである、請求項１０記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項１２】
配列番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖ポリペプチド、及び配列番号２６のアミノ酸配列を含む重鎖ポリペプチドを含むものである、請求項８記載のＭＵＣ１特異的免疫グロブリン。
【請求項１３】
検出可能な標識又はタグをさらに含むものである、請求項１２記載のＭＵＣ１特異的免疫グロブリン。
【請求項１４】
検出可能な標識又はタグが、酵素、エピトープタグ、蛍光標識、放射性標識、重金属、抗癌剤、トキシン、及び磁気共鳴イメージング用標識からなる群より選択されるものである、請求項１３記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項１５】
ＤＰ４７生殖系由来の重鎖可変領域又はそのＣＤＲを含む抗体抗原結合ドメインを含有するＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項１６】
ＤＰＫ１５生殖系由来の軽鎖可変領域又はそのＣＤＲを含む抗体抗原結合ドメインを含有するＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項１７】
ＤＰ４７生殖系由来の重鎖可変領域又はそのＣＤＲ、及びＤＰＫ１５生殖系由来の軽鎖可変領域又はそのＣＤＲを含む抗体抗原結合ドメインを含有するＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項１８】
請求項１、２、３又は４記載のアミノ酸配列のいずれかに対し約７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項１９】
請求項１、２、３又は４記載のアミノ酸配列のいずれかに対し約８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項２０】
請求項１、２、３又は４記載のアミノ酸配列のいずれかに対し約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項２１】
請求項１、２、３又は４記載のアミノ酸配列のいずれかに対し約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項２２】
請求項１、２、３又は４記載のアミノ酸配列のいずれかに対し約９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項２３】
請求項１、２、３又は４記載のアミノ酸配列のいずれかに対し約９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むＭＵＣ１特異的結合メンバー。
【請求項２４】
配列番号１、配列番号１のアミノ酸２４−３９、配列番号１のアミノ酸５５−６１、配列番号１のアミノ酸９４−１０２、配列番号３、配列番号３のアミノ酸３１−３５、配列番号３のアミノ酸５０−６６、配列番号３のアミノ酸９９−１１０、及び配列番号５よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対し約７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子。
【請求項２５】
配列番号１、配列番号１のアミノ酸２４−３９、配列番号１のアミノ酸５５−６１、配列番号１のアミノ酸９４−１０２、配列番号３、配列番号３のアミノ酸３１−３５、配列番号３のアミノ酸５０−６６、配列番号３のアミノ酸９９−１１０、及び配列番号５よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対し約８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子。
【請求項２６】
配列番号１、配列番号１のアミノ酸２４−３９、配列番号１のアミノ酸５５−６１、配列番号１のアミノ酸９４−１０２、配列番号３、配列番号３のアミノ酸３１−３５、配列番号３のアミノ酸５０−６６、配列番号３のアミノ酸９９−１１０、及び配列番号５よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対し約９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子。
【請求項２７】
配列番号１、配列番号１のアミノ酸２４−３９、配列番号１のアミノ酸５５−６１、配列番号１のアミノ酸９４−１０２、配列番号３、配列番号３のアミノ酸３１−３５、配列番号３のアミノ酸５０−６６、配列番号３のアミノ酸９９−１１０、及び配列番号５よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対し約９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子。
【請求項２８】
配列番号１、配列番号１のアミノ酸２４−３９、配列番号１のアミノ酸５５−６１、配列番号１のアミノ酸９４−１０２、配列番号３、配列番号３のアミノ酸３１−３５、配列番号３のアミノ酸５０−６６、配列番号３のアミノ酸９９−１１０、及び配列番号５よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対し約９７％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子。
【請求項２９】
配列番号１、配列番号１のアミノ酸２４−３９、配列番号１のアミノ酸５５−６１、配列番号１のアミノ酸９４−１０２、配列番号３、配列番号３のアミノ酸３１−３５、配列番号３のアミノ酸５０−６６、配列番号３のアミノ酸９９−１１０、及び配列番号５よりなる群から選択されるアミノ酸配列に対し約９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド分子。
【請求項３０】
配列番号１、配列番号１のアミノ酸２４−３９、配列番号１のアミノ酸５５−６１、配列番号１のアミノ酸９４−１０２、配列番号３、配列番号３のアミノ酸３１−３５、配列番号３のアミノ酸５０−６６、配列番号３のアミノ酸９９−１１０、配列番号５、及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３１】
配列番号２４及び配列番号２６からなる群より選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３２】
配列番号２のヌクレオチド配列又はその縮重配列を含む、ＶＬ領域をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３３】
配列番号２の配列に対し約７０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、ＶＬ領域をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３４】
配列番号２の配列に対し約８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、ＶＬ領域をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３５】
配列番号２の配列に対し約９０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、ＶＬ領域をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３６】
配列番号２の配列に対し約９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、ＶＬ領域をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３７】
配列番号２の配列に対し約９７％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、ＶＬ領域をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３８】
配列番号２の配列に対し約９９％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、ＶＬ領域をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３９】
配列番号４のヌクレオチド配列又はその縮重配列を含む、ＶＨ領域をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４０】
配列番号４の配列に対し約７０％以上の相同性を有するヌクレオチドを含む、ＶＨ領域をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４１】
配列番号４の配列に対し約８０％以上の相同性を有するヌクレオチドを含む、ＶＨ領域をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４２】
配列番号４の配列に対し約９０％以上の相同性を有するヌクレオチドを含む、ＶＨ領域をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４３】
配列番号４の配列に対し約９５％以上の相同性を有するヌクレオチドを含む、ＶＨ領域をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４４】
配列番号４の配列に対し約９７％以上の相同性を有するヌクレオチドを含む、ＶＨ領域をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４５】
配列番号４の配列に対し約９９％以上の相同性を有するヌクレオチドを含む、ＶＨ領域をコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４６】
配列番号２のヌクレオチド７０−１１７、配列番号２のヌクレオチド１６３−１８３、配列番号２のヌクレオチド２８０−３０６、配列番号４のヌクレオチド９１−１０５、配列番号４のヌクレオチド１４８−１９８、配列番号４のヌクレオチド２９５−３３０、上記ＣＤＲコード配列のいずれかの縮重配列、及びそれらの組合せからなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、抗体可変領域のＣＤＲをコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４７】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２のヌクレオチド７０−１１７、配列番号２のヌクレオチド１６３−１８３、配列番号２のヌクレオチド２８０−３０６、配列番号４のヌクレオチド９１−１０５、配列番号４のヌクレオチド１４８−１９８、及び配列番号４のヌクレオチド２９５−３３０からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対し約６０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４８】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２のヌクレオチド７０−１１７、配列番号２のヌクレオチド１６３−１８３、配列番号２のヌクレオチド２８０−３０６、配列番号４のヌクレオチド９１−１０５、配列番号４のヌクレオチド１４８−１９８、及び配列番号４のヌクレオチド２９５−３３０からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対し約７０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項４９】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２のヌクレオチド７０−１１７、配列番号２のヌクレオチド１６３−１８３、配列番号２のヌクレオチド２８０−３０６、配列番号４のヌクレオチド９１−１０５、配列番号４のヌクレオチド１４８−１９８、及び配列番号４のヌクレオチド２９５−３３０からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対し約８０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５０】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２のヌクレオチド７０−１１７、配列番号２のヌクレオチド１６３−１８３、配列番号２のヌクレオチド２８０−３０６、配列番号４のヌクレオチド９１−１０５、配列番号４のヌクレオチド１４８−１９８、及び配列番号４のヌクレオチド２９５−３３０からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対し約９０％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５１】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２のヌクレオチド７０−１１７、配列番号２のヌクレオチド１６３−１８３、配列番号２のヌクレオチド２８０−３０６、配列番号４のヌクレオチド９１−１０５、配列番号４のヌクレオチド１４８−１９８、ａｎｄ 配列番号４のヌクレオチド２９５−３３０からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対し約９５％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５２】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号２のヌクレオチド７０−１１７、配列番号２のヌクレオチド１６３−１８３、配列番号２のヌクレオチド２８０−３０６、配列番号４のヌクレオチド９１−１０５、配列番号４のヌクレオチド１４８−１９８、及び配列番号４のヌクレオチド２９５−３３０からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対し約９７％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５３】
配列番号６のヌクレオチド配列を含む、ＭＵＣ１特異的結合メンバーをコードする単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項５４】
請求項３０〜５３のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、該ポリヌクレオチド分子が、線状ポリヌクレオチド分子、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージベクター、酵母ディスプレイベクター、及び真核性ウイルスベクターからなる群より選択される分子である、上記ポリヌクレオチド分子。
【請求項５５】
個体における癌の診断方法であって、以下のステップ：
個体から生物学的サンプルを得るステップ；
該個体から得た生物学的サンプルと、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー、上記いずれかの配列の保存的置換を有する配列、及びそれらの組合せとを接触させるステップ；並びに
該ＭＵＣ１特異的結合メンバーの、該個体の生物学的サンプルにおけるＭＵＣ１への結合を検出するステップ；
を含む、上記診断方法。
【請求項５６】
癌が腺癌である、請求項５５記載の個体における癌の診断方法。
【請求項５７】
個体からの生物学的サンプルが、細胞、血液、リンパ、尿、乳房組織、卵巣組織、肺組織、膀胱組織、及びそれらの組合せからなる群より選択されるものである、請求項５５記載の個体における癌の診断方法。
【請求項５８】
ＭＵＣ１特異的結合メンバーのＭＵＣ１への結合を、酵素固定免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、磁気共鳴イメージング、シンチレーションカウンター、及びＸ線フィルムからなる群より選択される検出手段により検出するものである、請求項５５記載の個体における癌の診断方法。
【請求項５９】
個体における癌の治療方法であって、その治療を必要とする個体に、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー、上記いずれかの配列の保存的置換を有する配列、及びそれらの組合せを投与するステップを含む、上記治療方法。
【請求項６０】
癌が腺癌である、請求項５９記載の個体における癌の治療方法。
【請求項６１】
ＭＵＣ１特異的結合メンバーの投与前、投与と同時、又は投与後に個体にサイトカインを投与するステップをさらに含むものである、請求項５９記載の個体における癌の治療方法。
【請求項６２】
癌が、個体の乳房、卵巣、肺、又は膀胱組織に存在するものである、請求項５９記載の個体における癌の治療方法。
【請求項６３】
個体における癌のｅｘ ｖｉｖｏ治療方法であって、以下のステップ：
個体からＭＵＣ１及び／又はＭＵＣ１発現癌細胞を含む体液を採取するステップ；
該体液と、固定化した請求項１〜２３のいずれか１項に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー、上記いずれかの配列の保存的置換を有する配列及びそれらの組合せとを接触させるステップ；
該固定化ＭＵＣ１特異的結合メンバーと結合していない体液を回収するステップ；並びに
該固定化ＭＵＣ１特異的結合メンバーに結合していない回収した体液を該個体に戻すステップ；
を含む、上記ｅｘ ｖｉｖｏ治療方法。
【請求項６４】
個体に体液を戻す前に、１種以上の治療剤を該体液に添加するステップをさらに含むものである、請求項６３記載の癌のｅｘ ｖｉｖｏ治療方法。
【請求項６５】
体液が、骨髄、血液、及び末梢血幹細胞からなる群より選択されるものである、請求項６３記載の癌のｅｘ ｖｉｖｏ治療方法。
【請求項６６】
癌が腺癌である、請求項６３記載の癌のｅｘ ｖｉｖｏ治療方法。
【請求項６７】
抗癌剤がＭＵＣ１特異的結合メンバーである、請求項６３記載の癌のｅｘ ｖｉｖｏ治療方法。
【請求項６８】
ＭＵＣ１特異的結合メンバーの製造方法であって、以下のステップ：
請求項３０〜５４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列、上記いずれかの配列の保存的置換を有する配列、及びそれらの組合せを含む発現ベクターを調製するステップ；
該発現ベクターを宿主細胞に挿入するステップ；並びに
該ＭＵＣ１特異的結合メンバーが該発現ベクターから発現される条件下にて該宿主細胞を培養するステップ；
を含む、上記製造方法。
【請求項６９】
ＭＵＣ１特異的結合メンバーが、免疫グロブリン、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ、二重ｓｃＦｖ、ｄＡｂ、Ｆｖ、イムノトキシン、及び免疫サイトカインからなる群より選択されるものである、請求項６８記載のＭＵＣ１特異的結合メンバーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、全般的には癌の検出及び治療の分野に関する。具体的には本発明は、種々の起源、例えば乳房、卵巣、膀胱及び肺組織に由来するヒトの癌において過剰発現しグリコシル化が低減した、腫瘍関連抗原ムチン−１（ＭＵＣ１）のタンパク質コアのエピトープに特異的に結合する分子について説明する。
【０００２】
発明の背景
腫瘍関連／特異的抗原（ＴＡＡ）を認識する細胞傷害性Ｔ細胞が、腫瘍細胞を選択的に死滅させ得ることを示す証拠が増えており、このため能動的免疫療法が癌治療の魅力的な選択肢となっている（Ｂｏｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， １８：２６７−８ （１９９７）に概説されている）。腫瘍関連糖タンパク質ムチン−１（ＭＵＣ１、ＭＵＣ−１）はまた、多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）としても知られ、最も多く研究されている標的の１つでもある。この理由は、ＭＵＣ１は、正常組織と比較して、腺癌において非極性形態で多量に存在するためである（Ｂｕｒｃｈｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４７：５４７６−５４８２ （１９８７））。このタンパク質コアは、２０アミノ酸の多数かつ可変数の直列反復配列（ＶＮＴＲ）から構成されている（Ｇｅｎｄｌｅｒら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． Ｓｅｐ．， ２６３：１２８２０−１２８２３ （１９８８））。直列反復配列は、腺癌におけるＭＵＣ１の新規なペプチドエピトープとして報告されているが、その理由は、正常組織におけるＭＵＣ１と比較してそのグリコシル化が低減しているためである（Ｂｕｒｃｈｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４７：５４７６−５４８２ （１９８７））。ＭＵＣ１に対するマウスモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、腺癌を標的化するために用いられて成功をおさめており、このことは腫瘍標的としてのＭＵＣ１の有効性を支持している（Ｇｒａｎｏｗｓｋａら、Ｅｕｒ Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ．， ２０：４８３−４８９ （１９９３）；Ｐｅｒｋｉｎｓら、Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １４：５７８−５８６ （１９９３）；Ｍａｒａｖｅｙａｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５５：１０６０−１０６９ （１９９５）；Ｍａｒｉａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５５：５９１１ｓ− ５９１５ｓ （１９９５）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｊ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ．， ３４：１０６７−７４ （１９９３））。
【０００３】
細胞におけるＭＵＣ１に対する細胞傷害性応答が乳癌及び卵巣癌患者において示されている（Ｉｏａｎｎｉｄｅｓら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １５１：３６９３−７０３ （１９９３）；Ｊｅｒｏｍｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５１：２９０８−１６ （１９９１）；Ｐｌｕｎｋｅｔｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ．， ２４：５５−６７ （１９９８））。この応答は、乳癌に対する良好な防御と関連している（Ｊｅｒｏｍｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， ４３：３５５−６０ （１９９７））。ＭＵＣ１に関する能動的免疫療法（Ｐｌｕｎｋｅｔｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ．， ２４：５５−６７ （１９９８）；及びＭｉｌｅｓら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒ．， ８２：９７−１０６ （１９９９）に概説されている）は、ヒトにおいて研究されて様々な成功をおさめており、エピトープ源として、ＭＵＣ１が癌細胞においてグリコシル化形態が低減して発現された際に露出されるＶＮＴＲを含む非グリコシル化ＭＵＣ１ペプチドを用いた能動的免疫感作が主に関与している。（ＭＵＣ１）５とカルメット−ゲラン杆菌（ＢＣＧ）とを用いたヒトの免疫感作（Ｇｏｙｄｏｓら、Ｊ． Ｓｕｒｇ． Ｒｅｓ．， ６３：２９８−３０４ （１９９６））、又はＭＵＣ１提示樹状細胞を用いた動物モデルの免疫感作（例えば、マウス（Ｇｏｎｇら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ９５：６２７９−８３ （１９９８））又はチンパンジー（Ｐｅｃｈｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３：１６９９−７０４ （１９９６））は、それぞれＴ細胞機能の回復、及びＭＵＣ１に対する細胞傷害性Ｔ細胞前駆体の存在頻度の増大の可能性を示した。上記報告にもかかわらず、またマウスにおいて得られた結果とは対照的に、ＭＵＣ１−マンナン融合タンパク質によるヒトの免疫感作によって、弱い細胞傷害性Ｔ細胞応答及び高い抗体力価が観察された（Ｋａｒａｎｉｋａｓら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ．， １００：２７８３−９２ （１９９７））。このＢ細胞応答は、ヒトにおける、ＭＵＣ１との交差反応性を示す天然抗α−ガラクトシル（１→３）ガラクトース抗体の存在に関連していると考えられている（Ａｐｏｓｔｏｌｏｐｏｕｌｏｓら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ４：３１５−２０ （１９９８））。さらに、ＭＵＣ１は、その多くの生物学的機能においてＴ細胞増殖を阻害する機能を有し、これが腺癌患者における抗原性の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の存在についての根拠の１つとなりうると仮定されている（Ａｇｒａｗａｌら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ４：４３−９ （１９９８）；Ａｇｒａｗａｌら、Ｍｏｌ． Ｍｅｄ Ｔｏｄａｙ， ４：３９７−４０３ （１９９８））。この免疫抑制作用又はアネルギーは、腫瘍細胞により発現された可溶性ＭＵＣ１又は表面結合ＭＵＣ１と、多数のＴ細胞−受容体分子との直接的な相互作用（Ｐｌｕｎｋｅｔｔら、Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ． Ｒｅｖ．， ２４：５５−６７ （１９９８）；Ａｇｒａｗａｌら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ４：４３−９ （１９９８））、又は現在同定されていない他のＭＵＣ１関連成分による相互作用（Ｐａｕｌら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｎｕｎｏｔ���ｅｒ．， ４８：２２−８ （１９９９））のいずれかによるものと考えられる。このようなアネルギーは、ＩＬ−２（Ａｇｒａｗａｌら、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ４：４３−９ （１９９８））により逆転することもあり、ＭＵＣ１ペプチド（反復配列を含まない）による能動性免疫とＩＬ−２投与との組合せが、ＭＵＣ１特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を刺激する可能性があることが提唱されている（Ａｇｒａｗａｌら、Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ， ４：３９７−４０３ （１９９８））。しかしながら、ＩＬ−２の全身投与はＴ細胞の好ましくない非特異的活性化を引き起こすことが知られ、また用量依存的な毒性に関連しており、この症状としては倦怠、吐き気、多臓器不全、ショック、及びさらには死が含まれることが知られている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ａｎｎ． Ｓｕｒｇ．， ２１０：４７４−８４；４８４−５の説明（１９８９）を参照のこと）。
【０００４】
免疫サイトカイン（すなわち、抗体−サイトカイン融合タンパク質）によるＩＬ−２のターゲティングは、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞が媒介する抗腫瘍応答が誘導されることにより他の腫瘍細胞の増殖を有効に低減させることが確認されている（Ｒｅｉｓｆｅｌｄら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｌａｂ． Ａｎａｌ．， １０：１６０−６ （１９９６）；及びＭｅｌａｎｉら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４１４６−５４ （１９９８）に概説されている）。確立されているＴＡＡ誘導分子を用いた能動的治療とは対照的に、上述したようなハイブリッド融合タンパク質は、１種のＴＡＡに特異的なＴ細胞だけではなく、腫瘍の局所的環境に存在するＴＩＬに特異的な他のＴ細胞をも刺激しうる（Ｂｅｃｋｅｒら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ９３：７８２６−３１ （１９９６））。さらに、癌腫に存在することが多い腫瘍特異的なアネルギーＴ細胞は、上記分子のＩＬ−２部分によってレスキューされうる（Ｂｅｖｅｒｌｙら、Ｉｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ４：６６１−６７１ （１９９２））。
【０００５】
発明の概要
本発明は、種々の抗体分子及びその誘導体、例えば、ムチン−１（ＭＵＣ１）のタンパク質コアのエピトープに特異的に結合する結合メンバーである、免疫グロブリン分子と免疫サイトカインの融合タンパク質などを提供する。かかるＭＵＣ１特異的結合メンバーは、種々の組織における癌、例えば種々の組織における腺癌、特に乳房、卵巣、膀胱、及び肺における腺癌の診断及び／又は治療に使用しうる。本発明はまた、さらに他の特徴又は部分を有する変異型のＭＵＣ１特異的結合メンバーを提供する。その特徴又は部分によって、該メンバーは、癌の診断、イメージング、又は治療に特に有用なものとなる。変異体としては、他の性質を有する融合タンパク質、例えば、ＭＵＣ１結合ドメインとサイトカインドメインとを有するＭＵＣ１特異的免疫サイトカイン分子などが挙げられ、これは、癌の発症又は拡大にさらに治療的又は予防的効果を提供する。
【０００６】
本発明の一実施形態において、本発明は、Ｆａｂ抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）から形成されるＭＵＣ１抗原結合ドメイン（ＭＵＣ１結合ドメイン）、及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）から形成されるＭＵＣ１抗原結合ドメイン（ＭＵＣ１結合ドメイン）、又はその一部を含むＭＵＣ１特異的結合メンバーを提供する。例えば、本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーは、配列番号１のＶＬアミノ酸配列、及び／又は配列番号３のＶＨ アミノ酸配列、あるいはそれらの一部、特に相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードする部分を含むものとすることができる。従って、本発明はまた、ＭＵＣ１特異的結合ドメインからの単離されたＣＤＲ、例えば、ＶＬ ＣＤＲ１としてＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＴＹＬＤ（配列番号１のアミノ酸２４−３９）；ＶＬ ＣＤＲ２としてＳＧＳＨＲＡＳ（配列番号１のアミノ酸５５−６１）；ＶＬ ＣＤＲ３としてＭＱＧＬＱＳＰＦＴ（配列番号１のアミノ酸９４−１０２）；ＶＨ ＣＤＲ１としてＳＮＡＭＧ（配列番号３のアミノ酸３１−３５）；ＶＨ ＣＤＲ２としてＧＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３のアミノ酸５０−６６）；ＶＨ ＣＤＲ３としてＨＴＧＧＧＶＷＤＰＩＤＹ（配列番号３のアミノ酸９９−１１０）を提供する。上記ＣＤＲのうち１つ以上を用いることにより、本発明の種々のＭＵＣ１特異的結合メンバーにおけるＭＵＣ１結合ドメインを形成させうる。
【０００７】
他の実施形態において、本発明は、抗原結合ドメインを含む単離されたＭＵＣ１特異的結合メンバーを提供するものであり、ここで抗原結合ドメインは、下記式のアミノ酸配列を含むものである：
Ｘ１ Ｘ２ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｘ３ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｘ４ Ｐｒｏ Ｘ５ Ｘ６ Ｘ７ （配列番号２８）
〔式中、
Ｘ１は、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＶａｌであり；
Ｘ２は、Ｌｙｓ、Ｉｌｅ、Ａｒｇ、又はＧｌｎであり；
Ｘ３は、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、又はＡｌａであり；
Ｘ４は、Ａｓｐ又はＡｓｎであり；
Ｘ５は、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、又はＶａｌであり；
Ｘ６は、Ａｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、又はＴｙｒであり；
Ｘ７は、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏである〕。
【０００８】
好ましい実施形態において、本発明は、抗原結合ドメインを含むＭＵＣ１特異的結合メンバーを提供するものであり、ここで抗原結合ドメインは、表９に示すいずれかのアミノ酸配列を含むものである。
【０００９】
さらに他の実施形態において、本発明は、ＤＰ４７ ＶＨ生殖系由来のＶＨ領域若しくはそのＣＤＲ、及び／又はＤＰＫ１５ ＶＬ生殖系由来のＶＬ領域若しくはそのＣＤＲ、を含むＭＵＣ１特異的結合メンバーを提供する。
【００１０】
他の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の１つ以上のＣＤＲを、他の生殖系又は他の抗体に由来する抗原結合ドメインのフレームワーク領域（ＦＲ）に挿入することにより作製されたＭＵＣ１特異的結合メンバーを提供する。
【００１１】
さらに他の実施形態において、本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーは、上述したＶＬ及び／若しくはＶＨ領域、又はそれらの一部を含むＭＵＣ１特異的結合ドメインを有するものであり、かつ完全長免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）、Ｆａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、ダイアボディ、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）分子、Ｆｖ分子、二重（ｄｏｕｂｌｅ）ｓｃＦｖ分子、ドメイン抗体（ｄＡｂ）分子、及び免疫サイトカインからなる群より選択される抗体分子である。本発明のＭＵＣ１に特異的な完全長免疫グロブリン分子としては、ＭＵＣ１特異的Ｆａｂ抗体のＶＬ及び／又はＶＨ領域が遺伝子的に操作されて、完全なヒト免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ１アイソタイプのヒト抗体）を形成する組換え免疫グロブリンタンパク質が挙げられる。このような、Ｆａｂ抗体から誘導したＭＵＣ１結合特異性を有する組換え完全長ヒト免疫グロブリンの利点としては、対応するＦａｂ抗体の単一のＭＵＣ１結合部位と比較した場合の、２つの連続するＭＵＣ１結合部位の存在、ヒトにおける古典的ＨＡＭＡ応答を回避する免疫原性の低下、ヒトにおける半減期の延長、並びに癌細胞及び癌組織、特に卵巣癌及び乳癌の細胞及び組織において発現されたＭＵＣ１に対する親和性の有意な上昇がある。本発明のＭＵＣ１特異的免疫グロブリンとしては、アイソタイプ変異体及びアロタイプ変異体が含まれる。
【００１２】
好ましい実施形態において、本発明により提供されるＭＵＣ１特異的免疫グロブリンとしては、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＬと、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨとを含む免疫グロブリン分子が挙げられる。他の好ましい実施形態において、本発明は、組換えヒト免疫グロブリンであって、配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖（すなわち、ＶＬ及びＣＬκ軽鎖定常領域）と、配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖（ヒトγ−１アイソタイプに関してはＶＨ及びＣＨ重鎖定常領域）を含むものを提供する。
【００１３】
他の好ましい実施形態において、本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーは、ＭＵＣ１特異的結合ドメインと、ＭＵＣ１特異的結合メンバーに免疫調節活性を付与するサイトカインドメインと、を含む免疫サイトカインである。かかるＭＵＣ１特異的結合メンバーに用いるのに好ましいサイトカインとしては、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ、又はそれらの一部が挙げられるが、他のものも使用可能である。より好ましくは、免疫サイトカインは、サイトカイン（例えばＩＬ−２サイトカイン）に融合したダイアボディを含む融合タンパク質である。最も好ましくは、免疫サイトカインは、配列番号５のアミノ酸配列を有する本発明のｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２である。
【００１４】
他の態様において、本発明は、他の分子に結合した、好ましくは共有結合した変異型のＭＵＣ１特異的結合メンバーを提供する。ここで他の分子としては、限定するものではないが、他のタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、例えばサイトカイン又は酵素；抗癌剤；蛍光標識；放射性化合物、例えば磁気共鳴イメージング用化合物又は抗癌性放射性化合物；並びに重金属が挙げられる。このような変異体は、本発明の診断、イメージング、精製、又は治療方法において使用するために特に十分に適している。
【００１５】
本発明はまた、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれかに対し相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、ポリペプチド及びペプチドである、ＭＵＣ１特異的結合メンバーを提供する。そのような相同性タンパク質、ポリペプチド、又はペプチド分子は、ＭＵＣ１に結合するか、又はＭＵＣ１特異的結合ドメインの一部を形成するものであり、本明細書に記載のアミノ酸配列に対し、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％、９５％、９７％、さらには９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む。よりさらに好ましくは、本発明のそのような相同性タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列（ＶＬ領域及びそのＣＤＲ）及び／又は配列番号３のアミノ酸配列（ＶＨ領域及びそのＣＤＲ）に対し、約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％、９５％、９７％、又は９９％以上の相同性を有するＶＨ及び／若しくはＶＬ領域、又はそのＣＤＲを含む。
【００１６】
他の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のアミノ酸配列において、その１つ以上のアミノ酸が他のアミノ鎖と保存的置換されているアミノ酸配列を含む、ＭＵＣ１特異的結合メンバー及びその一部（例えば、ＶＬ若しくはＶＨ領域）、又はＣＤＲを提供する。
【００１７】
本発明はまた、ＭＵＣ１特異的結合メンバー及びその変異体を用いて、ＭＵＣ１を発現する癌（例えば腺癌）を診断する方法を提供する。そのような診断方法には、個体の細胞、組織又は体液と、ＭＵＣ１特異的結合メンバーとを接触させるステップ、及び該個体の細胞若しくは組織上のＭＵＣ１又は体液中に存在するＭＵＣ１に結合したＭＵＣ１特異的結合メンバーを検出するステップが含まれる。好ましくは、本発明の方法は、卵巣癌、乳癌、膀胱癌、及び肺癌を診断するために用いられる。本発明の診断方法には、細胞、組織、及び／又は器官における癌の存在を検出するための、細胞、組織、及び／又は器官をイメージングする方法における、本明細書に記載のＭＵＣ１結合メンバーの使用が含まれる。
【００１８】
他の実施形態において、ＭＵＣ１特異的結合メンバー及びその変異体は、混合物又は抽出物中の癌関連ＭＵＣ１、グリコシル化形態が低減したＭＵＣ１、又は非グリコシル化ＭＵＣ１分子の精製方法において使用することもできる。
【００１９】
さらに他の実施形態において、ＭＵＣ１特異的結合メンバー及びその変異体は、個体においてＭＵＣ１を発現する癌を治療的又は予防的に処置する方法において使用することもできる。本発明の治療（処置）方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ法又はｅｘ ｖｉｖｏ法のいずれでもよい。癌のｉｎ ｖｉｖｏ治療方法には、個体に対し、本明細書に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー又はその変異体を投与するステップが含まれる。ＭＵＣ１特異的結合メンバー又はその変異体は、種々の経路、例えば非経口投与（静脈内若しくは筋内など）、経口投与、吸入による投与、局所投与、又は腫瘍若しくは罹患部位に若しくはその付近への直接注射などの任意の経路により投与することができる。ＭＵＣ１特異的メンバーを含む種々の医薬組成物、特に選択した投与経路に適した医薬組成物を調製することができる。ＭＵＣ１特異的結合メンバーは、好ましくは非経口投与、より好ましくは静脈内投与する。好ましい治療方法において、ＭＵＣ１特異的結合メンバーは、免疫サイトカイン又は免疫グロブリンであり、これは抗腫瘍化合物と結合していてもよい。より好ましくは、本治療方法には、配列番号５のアミノ酸配列を有する免疫サイトカインｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２、又は配列番号２４のアミノ酸配列を有する軽鎖と配列番号２６のアミノ酸配列を有する重鎖とを含有する免疫グロブリンを投与するステップが含まれる。
【００２０】
より好ましくは、本明細書に記載する免疫サイトカインを用いた癌の治療方法には、個体に対し、本明細書に記載の免疫サイトカインの投与前、投与と同時、又は投与後に、非コンジュゲート（フリー）形態のサイトカインを投与するステップが含まれる。
【００２１】
本発明に係る癌の治療方法は、治療が必要な個体に対し、本明細書に記載のＭＵＣ１特異的免疫グロブリンを抗癌化合物（例えば、ドキソルビシン又はトキシン分子の誘導体又は変異体）と結合（好ましくは共有結合）させたものを投与するステップを含むことが好ましい。
【００２２】
本発明の他の態様において、癌のｅｘ ｖｉｖｏ治療方法には、個体から細胞、組織又は体液を抽出するステップ、抽出した細胞、組織又は体液と、本明細書に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー又はその変異体とを接触させるステップ、癌関連ＭＵＣ１及び／又はＭＵＣ１発現癌細胞を枯渇させた又は除去した細胞、組織又は体液を回収するステップ、並びに癌関連ＭＵＣ１を発現又は含有しない得られた残存する細胞、組織又は体液を上記個体に戻すステップ、が含まれる。
【００２３】
本発明の他の態様において、本発明は、本明細書に記載の種々のＭＵＣ１特異的結合メンバー、ＶＬ領域、ＶＨ領域、ＣＤＲ、及びフレームワーク（ＦＲ）領域をコードするポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２４】
好ましい実施形態において、本発明は、ＭＵＣ１特異的結合メンバー（例えば本明細書に記載のＰＨ１ Ｆａｂ抗体など）の結合ドメインのうちＶＬ及び／若しくはＶＨ領域、又はその一部をコードする単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。
【００２５】
他の好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド分子は、配列番号１のアミノ酸配列を有するＶＬ領域をコードする配列番号２のヌクレオチド配列、若しくはその一部、及び／又は、配列番号３のアミノ酸配列を有するＶＨ領域をコードする配列番号４のヌクレオチド配列、若しくはその一部を含むものである。
【００２６】
他の好ましい実施形態において、本発明は、ＰＨ１ Ｆａｂ抗体の抗体ＶＬ領域又はＶＨ領域からの１つ以上のＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を提供するものであり、そのようなヌクレオチド配列としては、以下のものがある：
ＡＧＧＴＣＴＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＣＡＴＡＧＴＡＡＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＴＴＴＧＧＡＴ（配列番号２のヌクレオチド７０−１１７：ＶＬ ＣＤＲ１をコードする）；
ＴＣＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＧＧＧＣＣＴＣＣ（配列番号２のヌクレオチド１６３−１８３：ＶＬ ＣＤＲ２をコードする）；
ＡＴＧＣＡＧＧＧＴＣＴＡＣＡＧＡＧＴＣＣＡＴＴＣＡＣＴ（配列番号２のヌクレオチド２８０−３０６：ＶＬ ＣＤＲ３をコードする）；
ＡＧＴＡＡＣＧＣＣＡＴＧＧＧＣ（配列番号４のヌクレオチド９１−１０５：ＶＨ ＣＤＲ１をコードする）；
ＧＧＴＡＴＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣ（配列番号４のヌクレオチド１４８−１９８：ＶＨ ＣＤＲ２をコードする）；
ＣＡＴＡＣＣＧＧＧＧＧＧＧＧＣＧＴＴＴＧＧＧＡＣＣＣＣＡＴＴＧＡＣＴＡＣ（配列番号４のヌクレオチド２９５−３３０：ＶＨ ＣＤＲ３をコードする）；及び上記の組合せ。
【００２７】
本発明のポリヌクレオチド分子としてはまた、上記ヌクレオチド配列の１つ以上の縮重形態を含み、かつ同じタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするポリヌクレオチド分子が含まれる。
【００２８】
本発明のさらに他の実施形態において、本発明は、本明細書に示すヌクレオチド配列のいずれかに対し相同性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子を提供する。本発明の相同的ポリヌクレオチド分子は、ＭＵＣ１特異的結合メンバー、ＭＵＣ１特異的結合ドメイン、又はその一部（例えば、ＣＤＲ、若しくはＭＵＣ１特異的結合ドメインに隣接するフレームワーク領域における選択されたアミノ酸残基）をコードする本明細書に記載のヌクレオチド配列に対し、約６０％、より好ましくは７０％、さらにより好ましくは８０％、最も好ましくは９０％、９５％、９７％、さらには９９％以上の相同性を有するヌクレオチド配列を含むものである。
【００２９】
本発明はまた、本明細書に記載のポリヌクレオチド分子を用いたＭＵＣ１特異的結合メンバーの製造方法を提供する。かかるポリヌクレオチド分子は、適切な原核又は真核宿主細胞の培養においてＭＵＣ１特異的結合メンバーを産生するための種々の原核又は真核性ベクターの任意のものに挿入することができる。本発明の方法に有用なベクターとしては、プラスミド、ファージ、ファージミド、及び真核性ウイルス（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｖｉｒａｌ）ベクターが挙げられる。
【００３０】
本発明の他の実施形態において、本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーは、細胞又はファージ粒子の表面上で発現及びディスプレイされる。好ましくは、本明細書に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバーは、ファージ、ファージミド、又は酵母ディスプレイベクターを用いて、細胞又はファージ粒子の表面上に発現及びディスプレイされる。
【００３１】
詳細な説明
本発明は、ＭＵＣ１のタンパク質コアに選択的に結合するＭＵＣ１特異的結合メンバーを提供する。本明細書に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバーとしては、ＭＵＣ１抗原結合ドメインを含む結合メンバーが挙げられ、ここで該抗原結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を有する可変軽鎖領域（ＶＬ）若しくはそれらの一部、例えばＶＬの相補性決定領域（ＣＤＲ）の１つ以上、及び／又は配列番号３のアミノ酸配列を有する可変重鎖領域（ＶＨ）若しくはそれらの一部、例えばヒトＦａｂ抗体若しくはモノクローナル抗体（ＭＡｂ）中に形成されるか若しくはそこから単離されるＶＨのＣＤＲの１つ以上を含有するものである。後述するように、本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーは融合タンパク質又は組換えタンパク質であってもよい。このような融合タンパク質としては、ＭＵＣ１特異的結合部分及び免疫調節部分、例えば、サイトカイン（例えばＩＬ−２）、又はそれらの活性フラグメントを有するものが挙げられる。本発明の組換えタンパク質には、Ｆａｂ抗体又は他の結合メンバーのＭＵＣ１特異的結合ドメインを遺伝子操作して免疫グロブリン分子とした組換え免疫グロブリン分子が含まれる。このような組換え免疫グロブリンは、単一のＭＵＣ１結合部位を有するＭＵＣ１結合メンバーを上回る、ＭＵＣ１に対する親和性及び結合活性（ａｖｉｄｉｔｙ）の増強を示す。
【００３２】
本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーは、乳房（例えば、乳癌）、卵巣、肺、及び膀胱を含む様々な組織中に見出すことができ、かつＭＵＣ１の糖付加形態の過剰発現を特徴とする癌（例えば腺癌）の診断又は治療に用いることができる。癌細胞及び組織によって産生されるＭＵＣ１分子（癌関連ＭＵＣ１）はグリコシル化を受け、それによって本明細書に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバーが認識して結合するコアタンパク質エピトープを露出する。
【００３３】
本発明をより十分に理解できるように、以下の用語を定義する：
本明細書で用いられ理解される「特異的結合メンバー」又は「結合メンバー」は、互いに対する結合特異性を有する一対の分子のうちの一方のメンバーを指す。そのような特異的結合対のメンバーは、天然に誘導され得るか、又は完全若しくは部分的に合成することができる。この分子対の一方のメンバーは、その分子対のもう一方のメンバーの三次元幾何及び化学に対し特異的に結合し、したがって、それに対して相補的である領域をその表面又は空洞に有する。したがって、結合対のメンバーは互いに特異的に結合する特性を有する。特異的結合対の種類の例としては、抗原−抗体、ビオチン−ストレプトアビジン若しくはアビジン、ホルモン−ホルモン受容体、受容体−リガンド、酵素−基質がある。例えば、各々の抗体が同じ抗原上の異なる部位（エピトープ）に結合するか、又は同じ部位ではあるが異なる若しくは同じ親和性若しくは結合活性で結合する、抗原性タンパク質及び種々の抗体の場合のように、特異的結合対の１メンバーが他の特異的結合対の１メンバーとなる可能性があることも理解される。本発明は、抗原−抗体型の結合メンバーに関する。より具体的には、本発明はＭＵＣ１特異的結合メンバー分子、例えば、以下に定義される抗体分子からなる特異的結合メンバーの対に関するものであり、これは、ＭＵＣ１ ＶＮＴＲ（可変数の直列反復配列）タンパク質コアのアミノ酸配列を含むタンパク質若しくはポリペプチドである、ヒトＦａｂ抗体に由来し、かつその対の他の結合メンバーのものである可変軽鎖（ＶＬ）領域、若しくはそれらの一部、及び／又は可変重鎖（ＶＨ）領域、若しくはそれらの一部によって形成される抗原結合部位を有する。
【００３４】
本明細書で用いられ理解される「抗体」又は「抗体分子」は、天然に、合成により、又は半合成により生成されたものであろうと、タンパク質分子若しくはそれらの一部又は他のあらゆる分子である特異的結合メンバーを指し、これは免疫グロブリン可変軽鎖領域若しくはドメイン（ＶＬ）、若しくはそれらの一部、及び／又は免疫グロブリン可変重鎖領域若しくはドメイン（ＶＨ）、若しくはそれらの一部によって形成される抗原性結合ドメインを有するものである。また、この用語は、免疫グロブリンの抗体結合ドメインと同一であるか又はそれと相同性を有する抗原結合ドメインを有するあらゆるポリペプチド又はタンパク質分子をも包含する。本明細書で用いられ理解される抗体分子の例としては、公知クラスの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ）及びそれらのアイソタイプの任意のもの；抗原結合ドメインを含む免疫グロブリンのフラグメント、例えば、Ｆａｂ若しくはＦ（ａｂ’）２分子；一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）分子；二重ｓｃＦｖ分子；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）分子；Ｆｄ分子；及びダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）が含まれる。ダイアボディは２つのダイアボディモノマーの会合によって形成され、このモノマーは２つの完全な抗原結合ドメインを含むダイマー（二量体）を形成するが、この各結合ドメインはそれ自体が２つのモノマーの各々に由来する領域の分子間会合によって形成されている（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８ （１９９３）を参照）。
【００３５】
抗体分子、例えば、Ｆａｂ抗体又はモノクローナル抗体（ＭＡｂ）分子を取得し、当該技術分野において利用可能な組換えＤＮＡ技術の技法を用いて、元の（親）抗体の特異性又は元の抗体の特定の領域を保持する他の分子を生成することが可能である。このような技術は、例えば、Ｆａｂ若しくは他のＭＵＣ１特異的抗体の免疫グロブリンの軽鎖可変領域（ＶＬ）及び／又は重鎖可変領域（ＶＨ）をコードするか、又はＶＬ及び／又はＶＨの一部、例えば、１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡを、他のＤＮＡ配列、例えば、免疫グロブリン定常領域若しくは異なる免疫グロブリンの定常領域及びフレームワーク（ＦＲ）領域をコードするヌクレオチド配列と読みとられる部分を合わせて導入することを含み得る（例えば、ＥＰ−Ａ−１８４１８７、ＧＢ ２１８８６３８Ａ、ＥＰ−Ａ−２３９４００を参照）。例えば、新たな組換えＭＵＣ１特異的免疫グロブリンを、１つの（親）ＭＵＣ１結合メンバーに由来するＶＬ及びＶＨ領域をコードするヌクレオチド配列若しくはそれらの一部を、ＩｇＧのような免疫グロブリン分子の軽鎖及び重鎖の発現に用いられるプラスミド発現ベクターにクローニングすることによって生成することができる。その組換えプラスミドを、次に、親分子のＭＵＣ１結合特異性を有する組換え免疫グロブリンの発現に適合する宿主細胞にトランスフェクトする。そのような組換え免疫グロブリンも、ＭＵＣ１に対する二価構造（２つの同一の結合部位）及び／又は他の特徴のため、親分子と比較してＭＵＣ１に対する結合活性の増大を示す（例えば、実施例３を参照）。抗体分子を産生するハイブリドーマ又は他の細胞に、その細胞によって産生される抗体分子の結合特異性又は他の特性を変化させ得る遺伝的突然変異又は他の変化を導入し、本発明の新規ＭＵＣ１結合メンバーを生成することもできる。
【００３６】
抗体は多くの方法で改変することができるため、「抗体」という用語は、あらゆる特異的結合メンバー、又は他のメンバー、すなわちＭＵＣ１に対する必要な特異性を備える、本明細書に記載の結合ドメインを有する物質を包含するものと理解される。したがって、「抗体」又は「抗体分子」は、天然のもの、又は完全若しくは部分的に合成されたものであっても、抗体フラグメント、抗体の誘導体、機能的等価物及び相同体を包含し、これには免疫グロブリン結合ドメインを含むあらゆるポリペプチドが含まれる。他のポリペプチド、例えば、サイトカイン、他の免疫グロブリン、酵素又はタンパク質トキシンと融合させた、免疫グロブリン結合ドメイン若しくはそれらのＣＤＲを含む融合若しくはキメラタンパク質分子、又はその等価物も含まれる。キメラ抗体の幾つかの例のクローニング及び発現がＥＰ−Ａ−０１２０６９４及びＥＰ−Ａ−０１２５０２３に記載されている。
【００３７】
免疫グロブリン分子全体の様々なフラグメントは、一般に、抗原と結合する機能を発揮することができるし、又は、例えば組換えＤＮＡ法を用いて、免疫グロブリン全体と同じ特異性を有するもののサイズがより小さい結合メンバーを生成するように組換えることができることが知られている。例えば、古典的には、Ｆａｂフラグメントは免疫グロブリン分子のパパイン消化によって生成することができ、かつＶＬ、ＶＨ、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）、及び重鎖のＣＨ１定常ドメインからなる単一の抗原結合ドメイン（一価）を有する抗体である。Ｆａｂ抗体は、合成により生成することもできるし、又はその特定のＦａｂ抗体をコードし発現する組換え発現ベクターを含む細胞からｉｎ ｖｉｖｏで生成することもできる。本発明のＦａｂ抗体には、ＭＵＣ１エピトープと結合する能力について、ヒトＦａｂ分子のファージディスプレイライブラリから選択される分子も含まれる（例えば、実施例１及び２を参照）。Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、古典的には、２つの連結されたＦａｂフラグメントを生じさせて、したがって、抗原分子との結合及び架橋が可能となる２つの完全な抗原結合ドメイン（二価）を生じるように、免疫グロブリン分子のペプシン消化によって生成されている抗体である。Ｆｄフラグメント又は抗体は、免疫グロブリン重鎖のＶＨ及びＣＨ１ドメインから構成される。完全長免疫グロブリンと同じ抗原と結合することができる免疫グロブリンの一部の他の例は、単一免疫グロブリンのＶＬ及びＶＨ領域からなる（及び定常ドメインが存在しない）Ｆｖ抗体分子である。完全長免疫グロブリンの他の抗原結合部分は、ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント又は抗体である（Ｗａｒｄ， ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３４１： ５４４−５４６ （１９８９））。加えて、単離されたＣＤＲ領域は、単独で又は免疫グロブリンの他のＣＤＲの１つ以上と共に、抗原結合ドメインを形成することができる。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体分子は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインがペプチドリンカーによって連結している一価分子であり、これは２つの可変ドメインを分子内で会合させて完全な抗原結合部位を形成している（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２：４２３−４２６ （１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：５８７９−５８８３ （１９８８）を参照）。２つの異なるエピトープに結合する二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）ｓｃＦｖ二量体を形成することも可能である（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５を参照）。二価であるか又は多価若しくは多重特異的なダイアボディ（以下で詳細に説明）もまた、典型的には、１つ以上のＶＬドメインをコードするＤＮＡ分子が１つ以上のＶＨドメインをコードするＤＮＡ分子と読みとられる部分を合わせて連結する遺伝子融合によって構築される。
【００３８】
ダイアボディ（又はダイアボディ抗体（ｄｉａｂｏｄｙ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ））は、ポリペプチドの多量体（例えば、二量体、四量体）であって、各々のポリペプチドが免疫グロブリン抗原結合ドメインのＶＬ領域及びＶＨ領域を含み、それらは、例えば比較的短いペプチドリンカーにより、それら２つの領域が分子内で互いに会合して抗原結合部位を形成することができないように互いに連結されている。完全な抗原結合ドメインは一方のポリペプチド（単量体）のＶＬドメインが他方のポリペプチド（単量体）のＶＨドメインと会合することによってのみ分子間で組み立てられ、このドメインは多量体が形成されるときに生じる（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９４／１３８０４；Ｐ． Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０：６４４４−６４４８ （１９９３）を参照）。
【００３９】
二重特異性抗体、すなわち、２つの異なる抗原又はエピトープに対する結合ドメインを有する抗体分子を用いようとする場合、これらは、例えば、化学的修飾によるもの、雑種ハイブリドーマに由来するもの、若しくは適切な宿主細胞にトランスフェクトされた組換え免疫グロブリン発現ベクターによるものを含む様々な技術によって生成することができる通常の二重特異性免疫グロブリン抗体であってもよいし、上述した抗体フラグメントのいずれかであってもよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ４：４４６−４４９ （１９９３））。あるいは、抗体全体ではなく、ｓｃＦｖ二量体又はダイアボディを用いることが好ましいこともある。ダイアボディ及びｓｃＦｖは、抗イディオタイプ反応の潜在的作用を低減させるため、Ｆｃ領域を持たない可変ドメインを用いて構築することができる。二重特異性抗体の他の形態には、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １０：３６５５−３６５９ （１９９１）に記載される一本鎖「Ｊａｎｕｓｉｎｓ」が含まれる。
【００４０】
二重特異性免疫グロブリン分子全体と対立するものとして、二重特異性ダイアボディも特に有用であり、これは、それらを原核細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において都合よく構築し、発現させることができるためである。さらに、適切な結合特異性を有するダイアボディ及び上述の他の多くの抗体フラグメントはファージディスプレイを利用してライブラリから容易に選択することができる（例えば、ＷＯ ９４／１３８０４及び下記実施例を参照）。加えて、二重特異性ダイアボディは、１つの抗原に対する特異性を有するダイアボディの１ドメインを保持し、また他の結合ドメインにおける異なる特異性についてライブラリから選択することにより構築することができる。
【００４１】
本明細書で用いられ理解される「抗原」とは、免疫応答を誘発することができ、及び／又は抗体が結合することができるあらゆる分子を指す。本明細書で用いられる抗原は、分子サイズによって限定されることはなく、天然、合成又は半合成のいずれで生成されようとも、抗体分子が結合し得るあらゆる分子が含まれる。加えて、抗原分子は、抗体が結合し得る１つ、数個、又は多くの異なる部位を有することが理解される。
【００４２】
「抗原決定基」又は「エピトープ」は同義に用いられ、抗体分子が結合する抗原上の特定の部位を指す。抗原の抗原性決定基又はエピトープは、抗体の抗原結合ドメイン（下記参照）と相補的である。抗原は、１つのみ、又は、通常の場合には、幾つかの若しくは多くのエピトープを有することができる。所定の抗原分子のエピトープは、タンパク質中の反復アミノ酸配列の場合のように構造的に同一の部分の複数のコピーとして存在することもあるし、区別可能に異なって存在することもあり、後者の場合、各々のエピトープには異なる抗体が結合し得る。
【００４３】
本明細書で用いられ理解される「抗原結合ドメイン」は、抗体分子に対する特異的結合メンバー又はパートナーである抗原上の特定の部位に特異的に結合しかつそれと相補的であるその抗体分子の領域を指す。抗原結合ドメインは１つ以上の抗体可変領域によってもたらされ得る。免疫グロブリン抗体又はそれらのフラグメント、例えば、Ｆａｂ若しくはＦ（ａｂ’）２抗体の抗原結合ドメインは、その可変領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）からなる抗体ＶＬ領域及び抗体ＶＨ領域を含む。ＣＤＲは、抗体のＶＬ及びＶＨ領域内の高度に可変の領域であり、抗原上の特定の部位（すなわち、エピトープ）に結合するための特異性及び結合活性に重要なアミノ酸配列を含む（例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ４ｔｈ ｅｄ． （Ｐａｕｌ， Ｗｉｌｌｉａｍ Ｅ．， ｅｄ．） （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， １９９９）， ｐａｇｅｓ ５８−６０）。ＣＤＲは、抗原上の特定の部位への結合に必要な可変領域に対し構造的な配置を付与するフレームワーク領域（ＦＲ）の間に位置する。組換えＤＮＡ技術を用いて、各々の可変領域若しくはドメイン（ＶＬ、ＶＨ）をコードし、又は可変領域の一部、例えば、個々のＣＤＲ若しくはＣＤＲ及び隣接するＦＲの近接残基さえもコードするＤＮＡ分子を構築することが可能であり、次に、それを異なる抗体又は他のタンパク質をコードする遺伝子に挿入して新規な抗原結合ドメインを有する組換え抗体タンパク質を生成することができる（例えば、実施例３を参照）。
【００４４】
本明細書で用いられ理解される「特異的」とは、特異的結合対の一方のメンバーが他のメンバーと結合する選択性を指す。この用語は、抗原結合ドメインが、多くの抗原が担持する特定のエピトープに対して特異的である場合にも使用可能であり、その場合、その抗原結合ドメインを担持する特異的結合メンバーはそのエピトープを担持する様々な抗原に結合することができる。同様に、この用語は、抗原結合ドメインが結合メンバーの特定のエピトープに対して特異的であり、かつその同じ抗原結合ドメインが異なるタイプの抗体分子、例えば、ｓｃＦｖ若しくはＦａｂ抗体によって担持される場合にも使用可能であり、その場合、その異なるタイプの抗体分子は同じエピトープに結合することができ、したがって、その同じエピトープに対して「特異的」であるものと理解される。
【００４５】
「機能的に等価の変異体」又は単に「変異体」は、他に注記されない限り、本明細書で用いられ理解される場合、他の分子（親）との構造的相違を有するものの親分子のある程度高い相同性又は少なくとも幾つかの生物学的機能、例えば、ＭＵＣ１の特定の抗原性決定基又はエピトープに結合する能力を保持している分子（変異体）を指す。変異体は、エピトープに対する親の特異性を保持するがそのエピトープに対する結合活性が高められた（又は、幾つかの用途については、おそらくは低下している）、より大きな免疫グロブリン分子のフラグメントであるフラグメント、例えば、Ｆａｂ又はＦ（ａｂ’）２の形態であってもよいし、又は親抗体タンパク質のアミノ酸配列が変異型抗体を生じるように改変されている突然変異抗体タンパク質分子であってもよい。例えば、選択された抗体を、抗原若しくはエピトープに対する親和性を高めるため、当業者に公知であり、また本明細書に説明される手順に従い、親抗体若しくはそれらの一部をコードするポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に多様性を導入するか、ＶＨ若しくはＶＬ遺伝子をＶＨ若しくはＶＬ遺伝子のレパートリーの１つで置換するか、又は突然変異を導入し、次いでファージディスプレイを利用して所望の抗原若しくはエピトープに対して変種を選択することによって親和性成熟させることができる（例えば、実施例２；Ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｖ．， ３１： ５−３１ （１９９８）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ．， １５：６２−７０ （１９９７））。次に、これらの変異体を高められた親和性についてスクリーニングすることができる。
【００４６】
変異型の突然変異タンパク質は、合成により、又は組換えＤＮＡ技術を用いて生物学的に生成することができ、その場合、変異体は突然変異遺伝子の発現産物（突然変異タンパク質）である。変異体タンパク質は、親分子を別のタンパク質又は分子、例えば、サイトカイン、トキシン、エピトープタグ（例えば、ヘマグルチニン若しくはｍｙｃエピトープタグ）、蛍光色素、ストレプトアビジン、ビオチン、酵素、又は放射性化合物、例えば、１２５Ｉ若しくは９９ｍＴｃ等に、好ましくは共有結合で、結合することによって生成することもできる。突然変異タンパク質と同様に、そのような変異形態は、ヌクレオチド又はタンパク質レベルで、当業者によって決定されるように生成することができる。例えば、コードされているポリペプチドはＦａｂフラグメントであってもよく、これを次に別の由来のＦｃテールに連結させるが、このような融合タンパク質は、通常、組換えＤＮＡ法を用いて作製される。その代わりに、マーカー又は標識化合物、例えば、酵素、蛍光分子、放射性化合物、又はビオチンを、通常は、直接親分子に連結させる。
【００４７】
本明細書に記載のＭＵＣ１結合メンバーの「相同性」は、当該技術分野において周知であり、かつ当該技術分野において公知の特定の目的のための方法を用いて、１つ以上のアミノ酸の置換、付加、又は欠失によって形成することができる。このような「相同」タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、そのアミノ酸の置換、付加、又は欠失が、ＭＵＣ１への結合能、又はＭＵＣ１結合ドメインの一部を形成する能力を排除しない限り、本発明の範囲に入ることは理解されるであろう。本明細書で用いられる「相同性」という用語は、２つのポリマー（すなわち、ポリペプチド分子又は核酸分子）の間の配列類似性の程度を指す。同じヌクレオチド又はアミノ酸残基が比較した時に２つのポリマーにおいて１つの配列位置を占めるとき、それらのポリマーはその位置で相同である。例えば、２つのポリペプチド配列において１００のアミノ酸位置のうちの６０でアミノ酸残基が一致する、すなわち「相同である」場合、それら２つの配列は６０％の相同性を有する。本明細書で言及される相同性パーセンテージの数字はその２つのポリマー間で可能性のある最大の相同性、すなわち、それら２つのポリマーが最大数の一致（相同）位置を有するようにアライメントしたときの相同性パーセントを反映する。様々なコンピュータ・プログラムを２つのポリマーのアライメントに利用可能であり、かつそれら２つのポリマー間の相同性パーセントの算出にも利用可能である。例えば、関心のある２つのポリマーの間のアライメント及び／又は相同性パーセントの算出は、ＢＬＡＳＴ配列バンク・コンピュータ・プログラム（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／を参照）又はＭＣＶＥＣＴＯＲ（登録商標）コンピュータ・プログラムを用いて日常的に行われる。生殖系列相同性研究については、Ｖｂａｓｅ（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｉｍｔ−ｄｏｃ／を参照）が、抗体分子の個々のＶＬ又はＶＨ領域の供与源を決定するため、新規及び既知の生殖系列配列の間のアライメントを行う。本発明の範囲内にあるタンパク質、ポリペプチド、及びペプチド相同体は、本明細書に開示されるように、ＣＤＲ又はＣＤＲ及び選択された近接フレームワーク（ＦＲ）残基を含むＭＵＣ１結合メンバー、ＭＵＣ１結合ドメイン、又はそれらの一部に対し、約７０％、好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％以上（約９５％、約９７％、又は約９９％以上さえも含む）の相同性を有する。本発明の範囲内にあるポリヌクレオチド相同体は、本明細書に開示されるように、ＭＵＣ１特異的結合メンバー、ＭＵＣ１結合ドメイン、又はそれらの一部（例えば、ＶＬ、ＶＨ、ＣＤＲ）をコードする、本明細書に記載のヌクレオチド配列に対し、約６０％、好ましくは約７０％、より好ましくは約８０％、さらにより好ましくは約９０％以上（約９５％、約９７％、又は約９９％以上さえも含む）の相同性を有する。
【００４８】
本明細書に記載のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドのアミノ酸配列は、当該技術分野において公知であるアミノ酸の通常の一文字又は三文字略語のいずれかを用いて列挙される。
【００４９】
抗ＭＵＣ１ ＰＨ１ Ｆａｂ抗体
本発明の全てのＭＵＣ１特異的結合メンバーのＭＵＣ１結合ドメインの起源はＰＨ１と呼ばれる抗ＭＵＣ１ヒトＦａｂフラグメント（Ｆａｂ抗体）であり、これは３．７×１０１０の異なるＦａｂフラグメントを含む非改変（非免疫）ファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることにより得られた。ＰＨ１ Ｆａｂフラグメントをディスプレイするファージを、ＭＵＣ１コアタンパク質のＶＮＴＲ配列と結合する能力及びＭＵＣ１発現細胞への結合について選択及びスクリーニングすることによって同定及び単離した。ファージミド上にコードされるＰＨ１のＶＨ及びＶＬ領域をコードする遺伝子を単離し、配列決定した。ＰＨ１ ＶＬ領域は配列番号２のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号１のアミノ酸配列を有する。ＰＨ１ ＶＨ領域は配列番号４のヌクレオチド配列によってコードされ、配列番号３のアミノ酸配列を有する。ＰＨ１ Ｆａｂ抗体の可変領域の各々は構造的フレームワーク（ＦＲ）配列及び高度に可変性のある相補性決定領域（ＣＤＲ）の両者を含み、これがＭＵＣ１のエピトープに対する抗原結合ドメインの特異性及び結合活性を付与している。
【００５０】
ＰＨ１ Ｆａｂ分子のＶＬ領域については、ＣＤＲ１はヌクレオチド配列及びリーディングフレームＡＧＧ ＴＣＴ ＡＧＴ ＣＡＧ ＡＧＣ ＣＴＣ ＣＴＧ ＣＡＴ ＡＧＴ ＡＡＴ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＣＣ ＴＡＴ ＴＴＧ ＧＡＴ（配列番号２のヌクレオチド７０−１１７）によってコードされ、かつＲＳＳＱＳＬＬＨＳＮＧＹＴＹＬＤ（配列番号１のアミノ酸２４−３９）のアミノ酸配列を有し；ＣＤＲ２はヌクレオチド配列及びリーディングフレームＴＣＧ ＧＧＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＣＧＧ ＧＣＣ ＴＣＣ（配列番号２のヌクレオチド１６３−１８３）によってコードされ、かつＳＧＳＨＲＡＳ（配列番号１のアミノ酸５５−６１）のアミノ酸配列を有し；ＣＤＲ３はヌクレオチド配列及びリーディングフレームＡＴＧ ＣＡＧ ＧＧＴ ＣＴＡ ＣＡＧ ＡＧＴ ＣＣＡ ＴＴＣ ＡＣＴ（配列番号２のヌクレオチド２８０−３０６）によってコードされ、かつＭＱＧＬＱＳＰＦＴ（配列番号１のアミノ酸９４−１０２）のアミノ酸配列を有する。ＰＨ１のＶＬ領域のＦＲ１はヌクレオチド配列及びリーディングフレームＧＡＡ ＡＴＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＴＧ ＣＣＣ ＧＴＣ ＡＣＣ ＣＣＴ ＧＧＡ ＧＡＧ ＣＣＧ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＴＧＣ（配列番号２のヌクレオチド１−６９）によってコードされ、かつＥＩＶＬＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣ（配列番号１のアミノ酸１−２３）のアミノ酸配列を有し；ＰＨ１のＶＬ領域のＦＲ２はヌクレオチド配列及びリーディングフレームＴＧＧ ＴＡＣ ＣＴＧ ＣＡＧ ＡＡＧ ＣＣＡ ＧＧＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣＡ ＣＡＧ ＣＴＣ ＣＴＧ ＡＴＣ ＴＡＴ（配列番号２のヌクレオチド１１８−１６２）によってコードされ、かつＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬｌＹ（配列番号１のアミノ酸４０−５４）のアミノ酸配列を有し；ＰＨ１のＶＬ領域のＦＲ３はヌクレオチド配列及びリーディングフレームＧＧＧ ＧＴＣ ＣＣＴ ＧＡＣ ＡＧＧ ＴＴＣ ＡＧＴ ＧＧＣ ＡＧＴ ＧＴＡ ＴＣＡ ＧＧＣ ＡＣＡ ＧＡＴ ＴＴＴ ＡＣＡ ＣＴＧ ＡＧＡ ＡＴＣ ＡＧＣ ＡＧＡ ＧＴＧ ＧＡＧ ＧＣＴ ＧＡＧ ＧＡＴ ＧＴＴ ＧＧＡ ＧＴＴ ＴＡＴ ＴＡＣ ＴＧＣ（配列番号２のヌクレオチド１８４−２７９）によってコードされ、かつアミノ酸配列ＧＶＰＤＲＦＳＧＳＶＳＧＴＤＦＴＬＲＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣ（配列番号１のアミノ酸６２−９３）を有する。
【００５１】
ＰＨ１ Ｆａｂ分子のＶＨ領域については、ＣＤＲ１はヌクレオチド配列及びリーディングフレームＡＧＴ ＡＡＣ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＧＣ（配列番号４のヌクレオチド９１−１０５）によってコードされ、かつＳＮＡＭＧ（配列番号３のアミノ酸３１−３５）のアミノ酸配列を有し；ＣＤＲ２はヌクレオチド配列及びリーディングフレームＧＧＴ ＡＴＴ ＡＧＴ ＧＧＴ ＡＧＴ ＧＧＴ ＧＧＣ ＡＧＣ ＡＣＡ ＴＡＣ ＴＡＣ ＧＣＡ ＧＡＣ ＴＣＣ ＧＴＧ ＡＡＧ ＧＧＣ（配列番号４のヌクレオチド１４８−１９８）によってコードされ、かつＧＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３のアミノ酸５０−６６）のアミノ酸配列を有し；ＣＤＲ３はヌクレオチド配列及びリーディングフレームＣＡＴ ＡＣＣ ＧＧＧ ＧＧＧ ＧＧＣ ＧＴＴ ＴＧＧ ＧＡＣ ＣＣＣ ＡＴＴ ＧＡＣ ＴＡＣ（配列番号４のヌクレオチド２９５−３３０）によってコードされ、かつＨＴＧＧＧＶＷＤＰＩＤＹ（配列番号３のアミノ酸９９−１１０）のアミノ酸配列を有する。ＰＨ１のＶＨ領域のＦＲ１はヌクレオチド配列及びリーディングフレームＣＡＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＴＧ ＧＴＡ ＣＡＧ ＣＣＴ ＧＧＧ ＧＧＧ ＴＣＣ ＣＴＧ ＡＧＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＴＧＴ ＧＣＡ ＧＣＣ ＴＣＴ ＧＧＡ ＴＴＣ ＡＣＧ ＴＴＴ ＡＧＡ（配列番号４のヌクレオチド１−９０）によってコードされ、かつＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＲ（配列番号３のアミノ酸１−３０）のアミノ酸配列を有し；ＰＨ１のＶＨ領域のＦＲ２はヌクレオチド配列及びリーディングフレームＴＧＧ ＧＴＣ ＣＧＣ ＣＡＧ ＧＣＴ ＣＣＡ ＧＧＧ ＡＡＧ ＧＧＧ ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＧＧ ＧＴＣ ＴＣＡ（配列番号４のヌクレオチド１０６−１４７）によってコードされ、かつＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳ（配列番号３のアミノ酸３６−４９）のアミノ酸配列を有し；ＰＨ１のＶＨ領域のＦＲ３はヌクレオチド配列及びリーディングフレームＣＧＧ ＴＴＣ ＡＣＣ ＡＴＣ ＴＣＣ ＡＧＡ ＧＡＣ ＡＡＴ ＴＣＣ ＡＡＧ ＡＡＣ ＡＣＧ ＣＴＧ ＴＡＴ ＣＴＧ ＣＡＡ ＡＴＧ ＡＡＣ ＡＧＣ ＣＴＧ ＡＧＡ ＧＣＣ ＧＡＧ ＧＡＣ ＡＣＧ ＧＣＣ ＧＴＡ ＴＡＴ ＴＡＴ ＴＧＴ ＧＣＧ ＡＡＡ（配列番号４のヌクレオチド１９９−２９４）によってコードされ、かつアミノ酸配列ＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫ（配列番号３のアミノ酸６７−９８）を有する。
【００５２】
間接エピトープ・フィンガープリント法（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−３２ （１９９８））により、ＰＨ１ Ｆａｂ抗体分子に対するＭＵＣ１のタンパク質コアのＶＮＴＲにおける最小結合エピトープがＰｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏのトリペプチドアミノ酸配列を有することが決定された。ＰＨ１ Ｆａｂは３Ｔ３−ＭＵＣ１細胞（ＭＵＣ１を発現する）に結合した。８０−ｍｅｒＭＵＣ１コアタンパク質（すなわち、配列番号７の２０アミノ酸配列を有するポリペプチドの４つのコアタンパク質反復単位）を抗原結合メンバーとして用いるＢＩＡｃｏｒｅ結合研究において、ＰＨ１は、ｓｃＦｖファージ・ライブラリから従来回収される他の抗ＭＵＣ１ ｓｃＦｖ抗体分子、例えば、ｓｃＦｖ−１０Ａ（ｋｏｆｆ＝１×１０−２秒−１）よりも遅い結合解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（ｋｏｆｆ＝１×１０−３秒−１）を示した（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−３２ （１９９８））。
【００５３】
ＰＨ１ Ｆａｂ抗体のＭＵＣ１結合部位の親和性成熟
ＰＨ１ Ｆａｂ抗体を、ビオチン・チップの表面がＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒペプチド抗原（ＮＨ２−（ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ）３−ＣＯＯＨ（すなわち、配列番号８の３つのコピーを含む（ｖｏｎ Ｍｅｎｓｄｏｒｆｆ−Ｐｏｕｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ．， １９：１８６−１９５ （１９９８））で被覆されているＢＩＡｃｏｒｅ ２０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）を用いて表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、そのＭＵＣ１エピトープに対する親和性について評価した。この分析により、ＰＨ１ Ｆａｂ抗体の親和性が、ＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒペプチド抗原に対する解離定数（Ｋｄ）として１．４マイクロモル濃度（μＭ）であることが決定された。本発明により、ＭＵＣ１エピトープに対する一価Ｆａｂ抗体、例えば、一価ＰＨ１ Ｆａｂ抗体の固有親和性を、例えば、ファージディスプレイを行うｉｎ ｖｉｔｒｏ親和性成熟法を用いて、好ましくはより高い親和性でＭＵＣ１と結合する親Ｆａｂ抗体（例えば、ＰＨ１ Ｆａｂ）の変異体（突然変異体）を選択することによって改善することができる。ＰＨ１ Ｆａｂ結合部位の親和性成熟の実際の例の詳細は下記実施例２に示す。
【００５４】
親和性成熟及びファージディスプレイを用いて、ＰＨ１ Ｆａｂ抗体の変異体を選択した。１回の選択（実施例２）で得られたＰＨ１ Ｆａｂ抗体の代表的な変異体のリストを表９（下記）に示しており、これは列挙された変異体が親ＰＨ１ Ｆａｂ抗体のＦＲ３−ＣＤＲ３領域に突然変異を含んでいたことを示す。ＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒペプチド抗原に対する親和性のＢＩＡｃｏｒｅ分析により、それらの変異体について解離定数（Ｋｄ）を算出した。その結果は、ＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒペプチド抗原に対する選択された変異体の親和性が約４００ナノモル濃度（ｎＭ）（すなわちＰＨ１ Ｆａｂの親和性の３．５倍の改善）から約１．４μＭ（すなわち親ＰＨ１ Ｆａｂの親和性に類似）までの範囲をとることを示した。
【００５５】
他のＭＵＣ１特異的結合メンバー分子
上述のＭＵＣ１特異的Ｆａｂ抗体に加えて、本発明は他のＭＵＣ１特異的結合メンバーを提供する。１つのＭＵＣ１特異的結合分子、例えば、ＰＨ１ Ｆａｂ抗体の特定のＶＨ及びＶＬ領域をコードするポリヌクレオチド及びアミノ酸分子を、その分子の各可変領域内の特定のＦＲ及びＣＤＲ配列の知識と共に利用できるということによって、様々な他のＭＵＣ１特異的結合メンバーのいずれか、又はそれらの一部を、組換えＤＮＡ法又はｉｎ ｖｉｔｒｏペプチド合成プロトコルを用いて生成する手段が提供される。例えば、ＰＨ１ Ｆａｂ抗体の抗原結合ドメイン、又はそれらの一部（例えば、ＶＬ、ＶＨ、若しくは１つ以上のＣＤＲ）をコードするＤＮＡ分子を、ベクターに挿入することにより親ＰＨ１ Ｆａｂ抗体の特異性又は結合特性を備える新規なＭＵＣ１特異的結合メンバーを発現させることができる。そのようなさらなるＭＵＣ１特異的結合メンバーには、これらに限定されるものではないが、完全長免疫グロブリン分子（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）、他のＦａｂ抗体、Ｆ（ａｂ’）２抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ分子、二重ｓｃＦｖ分子、Ｆｖ分子、ドメイン抗体（ｄＡｂ）分子、免疫サイトカイン、及びイムノトキシンが含まれる。
【００５６】
ＭＵＣ１特異的免疫グロブリンは、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖を生成するためにＰＨ１ Ｆａｂ抗体のＶＨ及びＶＬ領域をコードするポリヌクレオチドを当該技術分野において利用可能な真核生物発現系にクローニングし、次にそれを完全な免疫グロブリン分子に組み立てることによって生成することができる。そのような発現系の一例は、ベクターのＶＨｅｘｐｒｅｓｓ（ヒトγ−１重鎖定常領域をコードする）及びＶＫｅｘｐｒｅｓｓ（ヒトκ定常ドメインをコードする）を利用するものである（Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １８７：９−１８ （１９９７））。ＰＨ１ Ｆａｂ抗体のＶＨ及びＶＬ領域をコードするＤＮＡから完全ヒト組換えＭＵＣ１特異的ＩｇＧ１抗体（「ＰＨ１−ＩｇＧ１」）を生成するためにこれらの発現ベクターを用いた実施例の詳細が下記実施例３に示されている。このＰＨ１−ＩｇＧ１は、配列番号２５のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号２４のアミノ酸配列を有する免疫グロブリンκ軽鎖（ＶＬ及びＣＬ軽鎖定常領域）；及び配列番号２７のヌクレオチド配列によってコードされる配列番号２６のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン重鎖（ＶＨ及び重鎖定常領域）を含む。ＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒペプチド抗原を用いるＢＩＡｃｏｒｅ分析は、ＰＨ１−ＩｇＧ１分子が親ＰＨ１ ＦａｂのＫｄ（１．４μＭ）と比較して１００倍高い見かけのＫｄ（８．７ｎＭ）を示すことを示した。この改善された親和性は、ＰＨ１の２つの同一のＭＵＣ１結合部位の存在によるものであった。
【００５７】
組換えヒトＰＨ１−ＩｇＧ１抗体は、乳癌及び卵巣癌細胞系のＭＵＣ１のペプチド・コア・エピトープを発現する腫瘍細胞を特異的に認識するが、表面に高度にグリコシル化されたＭＵＣ１を有する大腸癌細胞系は認識しない。ＰＨ１−ＩｇＧ１の免疫組織化学的分析は、この免疫グロブリンが乳房、卵巣、膀胱、及び肺組織中の腫瘍組織を高度に染色（すなわち、結合）することを示した。加えて、ＰＨ１−ＩｇＧ１は、ヒト卵巣癌腫細胞系ＯＶＣＡＲ−３細胞によって小胞内に急速にインターナリゼーションした（実施例３を参照）。腫瘍関連の結合特性、癌細胞におけるインターナリゼーション挙動、及び組換えＰＨ１−ＩｇＧ１分子の完全にヒトの性質によって、この分子及びＰＨ１−ＩｇＧ１に類似する分子が免疫療法、免疫診断、並びに免疫イメージング用組成物及び方法に特に適したものとなる。例えば、様々な薬物、ポリペプチド、及び検出可能な標識（例えば、トキシン若しくはサイトカイン、放射性標識若しくは他の検出可能なシグナル、エピトープタグ、及びイメージング用化合物）を、標準的組換えＤＮＡ法又はｉｎ ｖｉｔｒｏ結合法を用いて、ＭＵＣ１特異的免疫グロブリン分子、例えば、ＰＨ１−ＩｇＧ１に結合させることができる。生じる変異体は、さらなる機能又は標識をもたらす追加部分に連結したＭＵＣ１特異的免疫グロブリンである。このような変異体は、癌細胞及び組織を指向するか、又はそれらを標的とする様々な方法、特には、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、及び肺癌に見出される腫瘍を指向する方法においてＭＵＣ１特異的試薬として用いることができる。
【００５８】
加えて、組換え免疫グロブリンの変異体もまた他のＭＵＣ１結合メンバー、例えば、親ＰＨ１分子を上回る改善された親和性を有するＦａｂ抗体に由来するＶＨ及びＶＬ領域の全て又は一部から調製することができる。
【００５９】
本発明のＭＵＣ１特異的免疫グロブリンが、アイソタイプ変異体、例えば、ガンマ−１、２、３、及び４アイソタイプ若しくはα−１及び２アイソタイプ、及びアロタイプ（種内対立形質）変異体、例えば、γ−１若しくは他のアイソタイプの対立形質変異体などのイムノグロブリン分子の定常重鎖内に変異を含むＭＵＣ１特異的免疫グロブリン変異体を包含することも理解される。
【００６０】
ｂｉｖＰＨ１と呼ばれる抗ＭＵＣ１ダイアボディ分子を生成するため、ＶＨ及びＶＬコード配列がプラスミドベクター中で再構成されている。全てのダイアボディと同様に、ｂｉｖＰＨ１は、通常（生理学的条件）、２つの単量体の二量体であって、その各々の単量体はモチーフ「ＶＨ−Ｌ−ＶＬ」を有し、リンカーペプチドＬは短いペプチド（ｂｉｖＰＨ１については、ＧＧＧＡＬ（配列番号５のアミノ酸１２２−１２６）のアミノ酸配列を有するペンタペプチドである）であり、これはＶＨ及びＶＬ領域からのＭＵＣ１結合ドメインの分子内形成を制限する。このリンカーペプチドの存在は二量体の形成を促進し、これにより２つのＭＵＣ１結合ドメインの分子間再構成が起こる。したがって、各々のｂｉｖＰＨ１ダイアボディ二量体はＭＵＣ１コアタンパク質ＶＮＴＲ配列の２つの同一のエピトープに結合することができる二価抗体である。本発明の抗ＭＵＣ１ダイアボディは、単一のＭＵＣ１タンパク質の２つの同一エピトープで、又は２つの別々のＭＵＣ１分子上の同じエピトープで結合し得る。このような結合特性は本明細書に記載の様々な治療、診断（イメージングを含む）、及び精製方法において都合よく用いられる。
【００６１】
本発明は、ＭＵＣ１と結合するか、又はＭＵＣ１結合ドメインの全て若しくは一部（例えば、ＶＬ、ＶＨ、若しくは１つ以上のＣＤＲ）を形成するタンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを提供する。このようなタンパク質としては、関心のある選択されたタンパク質をＭＵＣ１特異的結合メンバー、又はそれらの一部（例えば、本明細書に記載のＰＨ１ Ｆａｂ抗体に由来するＶＬ、ＶＨ、若しくはＣＤＲ（１つ若しくは複数））と融合させることによって形成される融合タンパク質が含まれる。関心のある選択されたタンパク質は、精製、診断、又は治療用途に有用なさらなるドメインを有する融合タンパク質を提供し得る。したがって、本発明の融合タンパク質に用いるための関心のあるタンパク質は、例えば組換えＤＮＡ法により、本明細書に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー、又はそれらの一部に融合させることができ、かつ融合タンパク質においてその有用な機能、活性、又は他の特性を保持するあらゆるタンパク質、又はそれらの一部であり得る。本発明の融合タンパク質の一例は、ＭＵＣ１特異的結合部分（例えばｂｉｖＰＨ−１ダイアボディ）とＭＵＣ１発現腫瘍細胞に対して毒性を示すトキシン部分とを含むイムノトキシンである。本発明の融合タンパク質の別の例は、下記のように、ＭＵＣ１特異的結合部分（例えばｂｉｖＰＨ１ダイアボディ）と活性サイトカイン部分（例えばＩＬ−２）とを含む免疫サイトカインである。
【００６２】
さらなる構築において、ＩＬ−２をｂｉｖＰＨ１ダイアボディに融合させ、ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２と呼ばれる免疫サイトカイン分子である融合タンパク質を生成した。このｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２は、標準５１Ｃｒ放出アッセイにおいて末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を刺激して卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３の細胞を溶解する能力によって示されるように、ＩＬ−２免疫刺激活性を有する。このアッセイにおいては、ｒＩＬ−２の添加が殺傷の有意な増大を生じるものの、ｂｉｖＰＨ１ダイアボディはＰＨＬによる溶解を刺激しなかった。ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２免疫サイトカインは、ｂｉｖＰＨ１ダイアボディ及びｒＩＬ−２の混合物において見られるレベルを上回って、ＰＢＬによるＯＶＣＡＲ−３標的細胞の溶解を増強した（図５を参照）。驚くべきことに、ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２免疫サイトカインとｒＩＬ−２とを組み合わせて用いることによって、腫瘍細胞の完全な殺傷が達成された（図５）。
【００６３】
ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２免疫サイトカインは、免疫調節タンパク質若しくはペプチド（例えばサイトカイン）を含む免疫調節部分と融合（結合）した特異的ＭＵＣ１結合部分を含むＭＵＣ１特異的免疫サイトカインを代表するものである。ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２のアミノ酸配列は配列番号５に示され、ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２免疫サイトカインをコードするヌクレオチド配列は配列番号６に示される。したがって、ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２において、ＩＬ−２免疫調節部分の代わりに他のサイトカイン（例えば限定されるものではないが、ＧＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦなど）を用いることができる。本発明のＭＵＣ１特異的免疫サイトカインは、この免疫サイトカイン分子が特異的にＭＵＣ１発現癌細胞をサイトカイン送達の標的とすることができるため、癌治療においてより安全な又はより効率的なサイトカインを用いる手段を提供する。非結合（フリー）サイトカインでの抗癌効果を確認するために用いられる用量レベルも生命を脅かす可能性のある望ましくない副作用を生じることがある。しかしながら、本明細書に記載のＭＵＣ１特異的免疫サイトカインは、フリーのサイトカインを単独で用いる治療方法に匹敵する治療上の抗癌の利益を達成するのに、比較的低い若しくはより少ない毒性の用量レベルでサイトカインを用いるための手段をもたらす。
【００６４】
ＭＵＣ１特異的免疫サイトカインは、ＩＬ−２に対して行ったように、関心のあるサイトカインのコード配列を挿入及び融合するための部位をも提供するダイアボディ発現ベクターにＰＨ１ Ｆａｂ抗体分子のＶＨ及びＶＬコード配列をクローニングする組換えＤＮＡ技術を用いることによって容易に生成することができる（詳細については実施例を参照）。このような免疫サイトカイン融合タンパク質は、ＭＵＣ１発現癌細胞をリンパ球集団による殺傷の標的とするのに特に有用である。免疫サイトカイン、例えば、ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２を用いる治療上の効果は、サイトカインの非結合形態（フリーサイトカイン）又は他の化合物をさらに投与して、癌細胞の領域においてしばしば見られるＴ細胞に対するアネルギー若しくは抑制作用を相殺するか、又は抗腫瘍効果を増強することにより、さらに強化することができる。
【００６５】
免疫サイトカインｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２は、本発明によって提供される、ＰＨ１ Ｆａｂ抗体のＶＬ領域及び／又はＶＨ領域（それぞれ、配列番号１及び３）を含むか、又は本明細書に記載のＰＨ１ Ｆａｂ抗体の１つ以上のＣＤＲを含んでいてもよい、ＰＨ１ Ｆａｂ抗体以外の様々なタイプの抗体分子の一例でもある。
【００６６】
本発明のＭＵＣ１結合メンバーには、本明細書に記載のＭＵＣ１結合メンバーの様々な例について説明されるように、ＭＵＣ１結合特性を大きく低下又は破壊することのないアミノ酸変化（欠失、付加又は置換）を含む誘導体タンパク質も含まれる。そのようなＭＵＣ１結合メンバーのアミノ酸配列の変化には、これらに限定されるものではないが、保存的アミノ酸置換として一般に知られるもの、例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ、ＦＲ、及び／又はｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２アミノ酸配列（例えば、配列番号１３、及び５）の１つ以上のアミノ酸の、類似の構造、電荷、又は疎水性を有する他のアミノ酸との置換が含まれる。ＭＵＣ１結合は維持するが他の特性、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｓｉｔｕでの安定性が改善されているＭＵＣ１特異的結合メンバーのアミノ酸配列のあらゆる付加又は置換もまた、本発明の診断、精製、又は治療方法において有用である。
【００６７】
ＰＨ１ Ｆａｂ抗体の分析によって、その重鎖可変（ＶＨ）領域がＤＰ４７ヒト生殖系列のＶＨ領域であり、かつ軽鎖可変（ＶＬ）領域がＤＰＫ１５ヒト生殖系列のＶＬ領域であることが明らかとなった（実施例１、表２を参照）。したがって、本発明はまた、ＶＨ及び／若しくはＶＬ領域、又はそれらの一部（例えば、１つ以上のＣＤＲ）を含む、ＭＵＣ１特異的結合ドメインを含むＭＵＣ１特異的結合メンバーを提供し、このＶＨ及び／又はＶＬ領域はＤＰ４７及び／又はＤＰＫ１５ヒト生殖系列に由来するＤＮＡのポリヌクレオチド配列にコードされるものである。
【００６８】
さらに、本明細書に記載の１つ以上のＣＤＲを、ＶＬ及び／若しくはＶＨ、又はそれらの一部をクローニング及び発現させるため、例えば、様々な組換えＤＮＡ法を用いて、他の既知生殖系列又は他のクローニングされている抗体ドメインに由来するＦＲに挿入してＭＵＣ１特異的抗体分子のさらに別の形態を生成することができる。
【００６９】
また、本発明は、抗原結合ドメインを含む単離されたＭＵＣ１特異的結合メンバーを提供し、ここでこの抗原結合ドメインは下記式のアミノ酸配列を含むものである：
Ｘ１ Ｘ２ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｘ３ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ｘ４ Ｐｒｏ Ｘ５ Ｘ６ Ｘ７（配列番号２８）
〔式中、Ｘ１はＡｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、若しくはＶａｌであり；
Ｘ２はＬｙｓ、ｌｌｅ、Ａｒｇ、若しくはＧｌｎであり；
Ｘ３はＧｌｙ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、若しくはＡｌａであり；
Ｘ４はＡｓｐ若しくはＡｓｎであり；
Ｘ５はＩｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、若しくはＶａｌであり；
Ｘ６はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｖａｌ、若しくはＴｙｒであり；
Ｘ７はＴｙｒ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏである〕。
【００７０】
好ましくは、ＭＵＣ１特異的結合メンバーは、以下の配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む：
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ａｓｐ Ｔｙｒ（配列番号３のアミノ酸９７−１１０）；
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｙｒ（配列番号２９）；
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｈｉｓ（配列番号３０）；
Ａｌａ Ｌｙｓ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｇｌｙ Ｔｙｒ（配列番号３１）；及び
Ａｌａ ｌｌｅ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｒｐ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｌｙｓ Ｔｙｒ（配列番号３２）。
【００７１】
このようなＭＵＣ１特異的結合メンバーには、種々の既知形態の抗体、例えば免疫グロブリン、ｓｃＦｖ、二重ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びダイアボディ抗体の形態などのあらゆる抗体が含まれる。
【００７２】
本発明は、本明細書に記載の特定のアミノ酸配列と、上に定義されるように、同一ではないが相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドも提供する。特に、本発明の組成物及び方法において有用である相同タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、ＭＵＣ１と結合するか、又はＭＵＣ１特異的結合ドメインの全て若しくは一部を形成し、かつ本明細書に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー、ＶＬ、ＶＨ、ＣＤＲ、又はそれらの一部のアミノ酸配列に対し、約７０％、好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％以上（約９５％、約９７％、又は約９９％以上さえも含む）の相同性を有するアミノ酸配列を含むものである。
【００７３】
上述のように、本発明は、望ましい活性又は特性をもたらす追加のドメイン又は分子に連結された他のＭＵＣ１特異的結合メンバーの変異形態であるＭＵＣ１特異的結合メンバーをも提供する。このような変異形態（変異型）は、本明細書に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー分子を特定の部分、例えば１つ以上の他のタンパク質又は分子に、好ましくは共有結合で連結させることによって形成することができる。ここで他のタンパク質又は分子としては、例えば、サイトカイン、受容体タンパク質、トキシン（例えば、ドキソルビシン及び関連薬物、ジフテリアトキシン、炭疽トキシン）、エピトープタグ（例えば、ヘマグルチニン、ポリヒスチジン、若しくはｍｙｃエピトープタグ）、蛍光色素、ストレプトアビジン、ビオチン、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、β−ガラクトシダーゼ、若しくは部位特異性プロテアーゼ）、又は放射性化合物（例えば、１２５Ｉ若しくは９９ｍＴｃ）等が挙げられるがこれらに限定されるものではない。この部分とＭＵＣ１特異的結合メンバーとの連結は、結合メンバーを該部分に接続させる「リンカー分子又はペプチド」の使用により行い得る。このような変異体の用途は、本発明の精製、診断、イメージング、及び治療方法、特には乳房、卵巣、膀胱、及び肺組織中の腺癌腫瘍に関する方法に見出される。
【００７４】
本発明はまた、ＭＵＣ１と結合するか又はＭＵＣ１結合ドメインの全て若しくは一部（例えば、ＶＬ、ＶＨ、若しくはＣＤＲ）を形成する、本明細書に記載の様々なタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドのアミノ酸配列をコードする単離されたポリヌクレオチド分子をも提供する。このようなポリヌクレオチド分子はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい（ここで、ＲＮＡにおいては、チミンの代わりにウラシルを含む）。
【００７５】
本発明のポリヌクレオチド分子は、縮重配列、すなわち、本明細書で具体的に列挙される配列とは異なるヌクレオチド配列であって、遺伝子コードに従って同じアミノ酸をコードする異なるコドンを含有するため、同じタンパク質、ポリペプチド、又はペプチド、例えば、ＭＵＣ１特異的結合メンバー、ＶＬ、ＶＨ、及び／又はそれらの一部、例えば、ＣＤＲ及びＦＲをコードするものである縮重配列を含む。
【００７６】
本発明のポリヌクレオチド分子には、本明細書に記載の特定の配列（例えば、配列番号２、４、６、２５、及び２７）に対して上に定義される通りに相同性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド分子も含まれる。一実施形態において、本発明の相同ポリヌクレオチド分子は、本明細書に記載のヌクレオチド配列に対し、約６０％、好ましくは約７０％、より好ましくは約８０％、さらにより好ましくは９０％以上の相同性を有し、かつＭＵＣ１特異的結合メンバー、ＭＵＣ１特異的結合ドメイン、又はそれらの一部（例えば、ＣＤＲ）をコードするヌクレオチド配列を含みうる。本発明の相同ポリヌクレオチド分子は、上述の縮重ポリヌクレオチド配列を含むものであってもよい。
【００７７】
本発明の単離された核酸分子、特にはＤＮＡ分子は、例えばＰＨ１のＶＬ及び／若しくはＶＨ領域（それぞれ、配列番号２及び４）、又はＶＬ若しくはＶＨ領域の１つ以上のＣＤＲ及び／若しくはＦＲなどの、ＰＨ１ Ｆａｂ抗体のＭＵＣ１結合ドメインの全て又は一部をコードするヌクレオチド配列を含む。ＭＵＣ１結合メンバー若しくはＭＵＣ１結合ドメイン又はそれらの一部をコードするヌクレオチド配列を含む本発明の核酸分子は、様々な形態のものであってよく、これには、原核生物において用いられるクローニング及び発現プラスミドベクターなどのプラスミド；細菌染色体に組み込まれ得る溶原性ファージなどのファージゲノム若しくはファージミド；真核生物用の発現及びクローニングプラスミド若しくはウイルスベクター；直鎖ＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子などの直鎖核酸分子、例えばｍＲＮＡ；及び合成によって製造された核酸分子が含まれるがこれらに限定されるものではない。
【００７８】
上述の様々な核酸分子は、組換え核酸方法論を利用した本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーの生成に用いることができる。例えば、本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーのいずれかをコードするように、標準クローニング法又は化学合成法を用いることにより本明細書に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子を組み合わせるか又はｉｎ ｖｉｔｒｏで合成し、次にそれを適切な発現ベクター、例えば、発現プラスミド、ファージミド、又は他の発現ウイルスベクターに挿入することができる。ＭＵＣ１特異的結合メンバーをコードする配列を有する核酸分子は、発現ベクター中でプロモーターと機能的に連結されている必要がある。その後、ＭＵＣ１特異的結合メンバーのコード配列を含むその組換え発現ベクターを、例えば形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーションにより、ベクター上にコードされるＭＵＣ１特異的結合メンバーを発現する適切な宿主細胞中に配置又は挿入する。宿主細胞は、用いられる発現ベクターのタイプに応じて、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。
【００７９】
加えて、ＭＵＣ１特異的結合メンバーをコードする核酸分子は、ディスプレイベクター中で、発現したＭＵＣ１特異的結合メンバーが特定の遺伝子パッケージ、すなわち、ファージ又は細胞（例えばＭ１３派生ファージ、Ｍ１３派生ファージミド、及び酵母細胞が挙げられるがこれらに限定されるものではない）の表面上にディスプレイされるように、表面タンパク質の全て又は一部をコードするアンカー配列に機能的に連結されていてもよい（例えば、ＶａｎＡｎｔｗｅｒｐ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．， １６：３１−３７ （２０００）；Ｗｉｔｔｒｕｐ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １７：４２３−４２４ （１９９９）；Ｋｉｅｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９６：５６５１−５６５６ （１９９９）を参照）。このようなディスプレイ系は、ＭＵＣ１特異的結合メンバーをコードする遺伝子セグメントに、（例えば、他のＣＤＲ配列を導入することによって）突然変異を導入し、各々が変異遺伝子ファミリーの１メンバーを担持し、かつその変異型ＭＵＣ１特異的結合メンバーをディスプレイする遺伝子パッケージの集団を作製するのに有用である。次に、このディスプレイされた変異体の集団から、優れた特性、例えば、ＭＵＣ１に対する増強された結合活性又は親和性を有する個々の変異体を当該技術分野において公知の方法によって選択することができる。好ましくは、ＭＵＣ１結合メンバーの親和性の増強（親和性成熟）は酵母ディスプレイベクター及び適切な酵母宿主細胞を用いて行う。
【００８０】
本明細書に記載の本発明の様々なポリヌクレオチド分子のいずれにも、例えば対応するＭＵＣ１特異的結合タンパク質又はそれらの一部の対立形質又は変異形態をコードする対立遺伝子又は突然変異遺伝子配列などの、ＭＵＣ１特異的結合タンパク質又はそれらの一部をコードする遺伝子のプローブとしての用途が見出される。
【００８１】
診断、精製、及び治療のための使用方法
本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーは、ＭＵＣ１発現性の癌細胞及び組織の診断及びイメージング；ＭＵＣ１又はＭＵＣ１エピトープ含有分子の非グリコシル形態、グリコシル化が低減した形態、又は癌関連形態の精製又は単離；及び／あるいはＭＵＣ１発現性癌、例えば、腺癌の治療的又は予防的処置（すなわち、抗体に基づく受動的免疫療法）のための方法において用いることができる。
【００８２】
癌（例えば腺癌）の診断には、個体から得たサンプル、例えば、細胞、組織（例えば、生検サンプル）、及び／又は体液（例えば、骨髄、尿、及び／又は血液）を、本明細書に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバーと接触させる。上述のように、本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーは、ＭＵＣ１タンパク質コアのＶＮＴＲにおけるエピトープの結合ドメインを形成するＶＬ及び／若しくはＶＨ領域、又はそれらの一部（例えば、ＣＤＲ）を含む。したがって、本明細書に記載の診断方法は、ＭＵＣ１発現細胞若しくは組織又は個体の血液若しくは他の液体中に存在するＭＵＣ１に対する本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーの結合を検出することにより個体における癌の証拠を試験するために用いることができる。このような診断方法は、多くの標準的な臨床診断試験と同様に、完全にｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。あるいは、診断手順は、ｉｎ ｖｉｖｏで行い、かつ個体へのＭＵＣ１特異的結合メンバーの投与を行うものであってもよい。その後、投与したＭＵＣ１特異的結合メンバーの細胞又は組織への結合をｉｎ ｖｉｖｏ（例えば、イメージング方法により）又はｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかで検出することができる
細胞若しくは組織上又は液体中で抗原に結合した抗体を検出するために様々な検出系を利用することができ、そのような検出系は、本発明の診断方法においては、結合したＭＵＣ１特異的結合メンバーを検出するために当業者であれば採用することができる。結合したＭＵＣ１特異的結合メンバーの検出は、通常、ＭＵＣ１特異的結合メンバーに直接連結又は結合する標識又はタグ、あるいはＭＵＣ１特異的結合メンバーと結合する別の検出分子と連結又は結合する標識又はタグからのシグナルを検出することを含む。ＭＵＣ１特異的結合メンバーに直接連結しようと、又は別の検出分子と連結しようと、本発明の診断方法において有用である標識又はタグとしては、限定されるものではないが、酵素、蛍光標識、放射性標識、重金属、及び磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）用標識、例えば、診断用腫瘍イメージングに用いられるものが挙げられる。標識が酵素である場合、検出可能なシグナルを生じる基質、例えば、発色（ｃｏｌｏｒｉｇｅｎｉｃ）、生物発光、又は化学発光性の基質を用いることによってその結合を検出することができる。酵素標識検出系としては、ビオチン−ストレプトアビジン（又はアビジン）対を用いるもの、例えば、ＭＵＣ１特異的結合メンバー又は検出分子がビオチン（又はストレプトアビジン）に結合し、次にそれが検出系の酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、又はルシフェラーゼなどに結合したストレプトアビジン（ビオチン）に結合する系が挙げられる。例えば、酵素又は放射性標識のような標識又はタグに連結した検出抗体もまた、個体の細胞若しくは組織上又は血液若しくは液体中のＭＵＣ１に結合しているＭＵＣ１特異的結合メンバーの検出に用いることができる。その後、検出抗体上の標識又はタグを検出して結合したＭＵＣ１特異的結合メンバーの量及び／又は位置を決定する。そのような標識化又はタグ付加分子を検出するための様々な方法が当業者に周知であり、例えば限定されるものではないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は免疫沈降プロトコルが挙げられる。このような方法は、完全又は半自動化装置を用いてより効率的に読み取り、かつ複数の試験サンプルを処理することができる。標識又はタグが放射性である場合、検出手段は放射能に感受性であるあらゆるもの、例えば、Ｘ線フィルム、シンチレーション・カウンター、ガイガー・カウンター、又は身体イメージング若しくは走査装置、例えば、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）装置などである。
【００８３】
本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーは、混合物又はサンプル中のＭＵＣ１タンパク質分子の精製又は抽出に用いることもできる。通常の抗体成分の代わりに本発明の特定のＭＵＣ１特異的結合メンバーを用いて、抗原の単離又は精製に抗体を用いる手順を行うことができる。このような手順には、限定されるものではないが、例えば、免疫沈降、ＥＬＩＳＡ、及びアフィニティクロマトグラフィーなどにおける、溶液中でのＭＵＣ１分子への直接結合とそれに続く沈殿が含まれる。アフィニティクロマトグラフィーには、免疫グロブリン及び他の結合タンパク質の結合について既に確立されている方法を用いて本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーを樹脂粒子に結合させた樹脂を調製することができる。あらゆるアフィニティ樹脂と同様に、樹脂上の同族パートナー又はリガンド、例えば、ＭＵＣ１分子と結合する能力は、樹脂に特異的結合メンバーが結合した後に樹脂粒子上に露出するＭＵＣ１エピトープの利用能に依存する。
【００８４】
本明細書に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバーは、癌、例えば腺癌を治療するための治療又は予防用試薬として用いることもできる。本明細書に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバーは、未改変形態で、あるいは癌性細胞若しくは組織に損傷を与えるか若しくは殺傷する、あるいは抗腫瘍免疫応答を刺激若しくは促進するエフェクタ機能を持つ他の部分を有するようにＭＵＣ１特異的結合メンバーが融合タンパク質と結合若しくは接合するか、又はそのものとして遺伝子操作されている変異体として用いることができる。したがって、本発明は、個体において癌、特には腺癌を治療的又は予防的に処置するための方法を提供する。本発明の癌の治療方法はｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏ法の両者を含む。
【００８５】
個体における腺癌を治療する方法の１つは、その個体に完全なヒト組換えＭＵＣ１特異的免疫グロブリン、例えば、ＰＨ１−ＩｇＧ１を投与することを含む（実施例３を参照）。好ましくは、この免疫グロブリンはまた、抗癌機能をもたらす別の部分、例えば、抗癌化合物又はＭＵＣ１特異的免疫グロブリンと結合し、それをインターナリゼーションさせる細胞に対してのみ毒性を有する細胞トキシンに連結されている。
【００８６】
別の治療方法においては、本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーを用いてＭＵＣ１発現癌腫瘍又は癌性組織に特定の細胞を送達する。細胞、例えば、Ｔ細胞又はキラー細胞をＭＵＣ１発現腫瘍又は組織に送達するため、送達しようとする特定の細胞の表面上のマーカー抗原と特異的に結合する別の結合ドメイン（例えば、受容体）にＭＵＣ１結合メンバーを結合又は融合させることができ、それにより得られたＭＵＣ１結合メンバーはＭＵＣ１及び送達しようとする細胞の両者に結合する。
【００８７】
Ｔ細胞が媒介する抗腫瘍免疫応答を促進するため、本発明のＭＵＣ１特異的免疫サイトカイン、例えば、活性ＩＬ−２ドメインを含む融合タンパク質であるｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２免疫サイトカインを個体に投与し、身体内の癌細胞をＩＬ−２免疫刺激機能の標的とすることができる。この抗腫瘍免疫応答は、同じ若しくは関連するサイトカインの非結合形態、例えば組換えＩＬ−２、又は別のより好ましい免疫刺激性化合物を１回以上投与することによってさらに増強することも可能である。このような非結合型サイトカイン又は他の化合物の補足的又は増強的投与は、個体へのＭＵＣ１特異的結合メンバーの投与の前に、投与と同時に、又は投与の後に投与することができる。
【００８８】
本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーは、単独で、又は例えば１種類以上の他の抗癌剤及び／又は放射線治療などのより複雑な抗癌療法における１要素として用いることができる。また、複数の治療処置を個体に施してもよい。好ましくは、複数の処置に用いられる特定のＭＵＣ１特異的結合メンバーは、ヒトに由来するタンパク質又はポリペプチド分子、例えば、ＰＨ１ Ｆａｂ、ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２、又はＰＨ１−ＩｇＧ１であり、そうすることでその個体の免疫系がＭＵＣ１特異的結合メンバーを不活性化するか又は身体から急速に排出する抗体を生じることがない。
【００８９】
したがって、腫瘍又は前癌性細胞若しくは組織を、様々な抗腫瘍エフェクタ機能の標的とするために、本明細書に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバーを用いることができる。ここでその機能としては、例えばＩＬ−２のようなサイトカインの免疫調節活性；抗癌剤；トキシン；放射性化合物；Ｔ細胞；キラー細胞；重金属；及び他の抗癌性分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーは、ＭＵＣ１及びＭＵＣ１発現癌細胞を、細胞、組織、又は体液、例えば、骨髄、血液、又は末梢血幹細胞から枯渇又は排除する、癌を治療するためのｅｘ ｖｉｖｏ法において用いることもできる。例えば、１つの好ましい実施形態において、癌治療のｅｘ ｖｉｖｏ法は、ＭＵＣ１を含む体液及び／又はＭＵＣ１発現癌細胞を個体から抽出するステップ、及び抽出した体液とＭＵＣ１特異的結合メンバーとを接触させるステップを含む。好ましくは、ＭＵＣ１特異的結合メンバーを固相支持体又は表面上に固定化する。それにより、処理された体液は、ＭＵＣ１及び／又はＭＵＣ１発現癌細胞が枯渇又は排除され、個体に戻される。より好ましくは、本発明の癌を治療するｅｘ ｖｉｖｏ法は、配列番号１；配列番号１のアミノ酸２４−３９；配列番号１のアミノ酸５５−６１；配列番号１のアミノ酸９４−１０２；配列番号３；配列番号３のアミノ酸３１−３５；配列番号３のアミノ酸５０−６６；配列番号３のアミノ酸９９−１１０；前記いずれかの配列において保存的置換を有する配列、及びそれらの組合せからなる群より選択されるアミノ酸配列を含む固定化ＭＵＣ１特異的結合メンバーの使用を含む。ＭＵＣ１特異的結合メンバーを表面に固定化するのに用いることができる様々な系が利用可能である。このような系は、固相表面、例えば、プラスチック、セファロース、磁気若しくは常磁性ビーズ、又は様々な他の樹脂に対するＭＵＣ１結合メンバーの直接又は間接結合を含み得る。個体から採取した体液は、固定化ＭＵＣ１特異的結合メンバーと、バッチプロトコルで、又は固定化ＭＵＣ１特異的結合メンバーを含むカラム若しくは他の表面を用いて接触させることができる。ＭＵＣ１特異的結合メンバーの固定化は、個体から採取した細胞、組織、又は体液の添加の前、その間又はその後に行うことができる。本発明のｅｘ ｖｉｖｏ法は、自動、半自動、又は手動操作装置を用いて行うことができる。さらに、体液は、非連続又は連続流過系（ｆｌｏｗ ｓｙｓｔｅｍ）において固定化ＭＵＣ１特異的結合メンバーと接触させてもよい。さらに、抽出した体液は、汚染を防止しなければならず、望ましくない細胞、ウイルス、化学物質、及び／又は抗原による汚染を防止又は排除するためさらに処理することがある。別の実施形態においては、枯渇又は排除済の体液に、それを個体に戻す前に、１種類以上の抗癌剤、抗生物質、又は他の治療用化合物を添加する。このような抗癌剤としては、本明細書に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバーが含まれる。
【００９１】
医薬組成物及び投与様式
ＭＵＣ１特異的結合メンバーは、好ましくは、「治療上有効な量」で個体（ヒト又は他の動物）に投与され、「治療上有効な量」とは患者に対する利益を示すのに十分な量を意味するものと理解される。このような利益は、癌、例えば腺癌の少なくとも１つの症状の少なくとも緩和であり得、これには腫瘍細胞の死、腫瘍の成長の停止、腫瘍サイズの発達の低下、転移の減少若しくは防止、患者の力若しくは活力の増加、健常組織の重量の増加、生存時間の延長、及び再発がないことが挙げられるがこれらに限定されるものではない。
【００９２】
投与される実際の量、並びに投与の割合及び時間経過は、治療対象の癌の性質及び重症度に依存する。患者に用いられる治療の処方及び投与量の選択は熟練した保健医療従事者の知識及び責任の範囲内にある。加えて、免疫グロブリン抗体分子の適切な用量は当該技術分野において周知であり、特定の治療計画において用いようとする本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーの用量又は用量範囲を決定するための指針を提供する（例えば、Ｌｅｄｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．． Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ４７：６５９−６６４ （１９９１）；Ｂａｇｓｈａｗｅ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｂｏｄｙ， Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ａｎｄ Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， ４：９１５−９２２ （１９９１）を参照）。
【００９３】
本発明に係る医薬組成物又は医薬品は、本発明によって提供される少なくとも１種類のＭＵＣ１特異的結合メンバーを活性成分として含み、かつ、活性成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝剤、安定化剤、又は当業者に周知の他の物質を含んでいてもよい。このような物質は、非毒性であり、かつ活性成分の効力を妨害しないもののほうがよい。担体又は他の物質の正確な性質は投与経路に依存し、この投与経路は、経口、局所、又は、例えば静脈内若しくは筋肉内注射による、非経口であり得る。
【００９４】
本発明によって提供される医薬組成物又は医薬品は、様々な剤形のいずれものでも、特には、意図する投与形式に適した剤形で調製することができ、そのような剤形としては、固体、半固体又は液体剤形、例えば、錠剤、ロゼンジ、ピル、カプセル剤、粉剤、座剤、液剤、水性若しくは油性懸濁剤、リポソーム又はポリマー・マイクロカプセル若しくはミクロスフェア、シロップ剤、エリキシル、及び水性溶剤が挙げられる。好ましくは、医薬組成物は正確な投薬量の１回投与に適する単位投与剤形であり、その投薬量は１回用量の１部分であってもその複数回分であってもよく、１回用量は腺癌腫瘍細胞又は患者のＴ細胞媒介性抗腫瘍応答に対する効果を生じるように算出される。組成物は、上述のように、治療上有効な量の選択されたＭＵＣ１特異的結合メンバーを薬学的に許容される担体及び／又は緩衝剤と組み合わせて含み、それに加えて、非毒性の不活性な薬学的に許容される他の医薬及び抗癌剤若しくは薬学的作用物質、担体、希釈剤、充填剤及び製剤化補助剤、又はそれらの組合せを含んでいてもよい。液状混合物又は調製品においては、薬学的に許容される緩衝剤、例えば、リン酸緩衝生理食塩水を用いることができる。「薬学的に許容される」とは、生物学的、化学的、又は他のいかなる方法においても身体の化学及び代謝と不適合ということがなく、かつＭＵＣ１特異的結合メンバー又は医薬組成物中に存在し得る他のいかなる成分にも悪影響を及ぼすことがない物質を意味する。
【００９５】
固体組成物に関して、通常の非毒性固体担体としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等が挙げられる。薬学的に許容される液体組成物は、例えば、本明細書に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバー及び最適な医薬用補助剤を、賦形剤、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等に溶解又は分散させ、それにより、溶剤又は懸濁剤を生成することによって調製することができる。所望であれば、投与しようとする医薬組成物は少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤等、例えば、酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含むこともできる。
【００９６】
静脈内注射又は腫瘍内若しくは罹患部位への直接注射では、好ましくは、選択された本発明のＭＵＣ１特異的結合メンバーを、発熱物質を含まず、かつ適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容される水溶液中に配合する。当業者であれば、例えば、等張性ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸添加リンゲル注射液を用いて適切な溶剤を調製することができる。さらに、安定化剤、緩衝剤、酸化防止剤、及び／又は他の添加物を必要に応じて配合することができる。本明細書に記載のＭＵＣ１特異的結合メンバーを含む製剤はまた、ポンプ又はスロー・ドリップ装置を用いて個体に注射又は注入するために調製することも可能である。
【００９７】
あるいは、ＭＵＣ１特異的結合メンバーは、注射部位から徐々に放出させるための媒染剤（ｍｏｒｄａｎｔ）を含むようなボーラスとして調製できることも本発明の範囲内である。非経口投与の１つの手法としては、一定レベルの投薬量が維持されるような徐放又は持続放出系の使用がある（例えば、米国特許第３，７１０，７９５号を参照）。
【００９８】
本発明のさらなる実施形態及び特徴は、以下のＭＵＣ１特異的結合メンバーの非限定的な例によって提供される教示及び指針から明らかであろう。
【００９９】
実施例
本発明の以下の実施例は、ＭＵＣ１特異的結合メンバー、例えば、ＭＵＣ１特異的Ｆａｂ抗体、完全ヒト抗ＭＵＣ１免疫グロブリン、及び免疫サイトカイン融合タンパク質の作製及び使用を説明する。このようなＭＵＣ１特異的結合メンバーは、ＭＵＣ１のタンパク質コアに対する予期せぬ増強された結合活性を有する。加えて、以下に説明される免疫調節ドメイン、例えば、免疫サイトカインｂｉｖＰＨ−１−ＩＬ−２をも含むＭＵＣ１特異的結合メンバーはＴ細胞を刺激することが可能であり、したがって、Ｔ細胞媒介型抗癌免疫応答に必要なＴ細胞活性化のＭＵＣ１関連阻害に対抗する。
【０１００】
実施例１
ＭＵＣ１のコアタンパク質に対する細胞結合Ｆａｂ ＰＨ１抗体の選択、特性決定、及び使用
ＭＵＣ１陰性ネズミ線維芽細胞系３Ｔ３及びＭＵＣ１をトランスフェクトした３Ｔ３細胞系３Ｔ３−ＭＵＣ１（Ａｃｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， １４：１３６−４３ （１９９３））、配列ＮＨ２−（ＰＡＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰ）５−ＣＯＯＨを有するビオチニル化ＭＵＣ１ １００−ｍｅｒペプチド（すなわち、配列番号７の配列を５コピー含む）（Ｋｒａｍｂｏｖｉｔｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３：１０８７４−１０８７９ （１９９８））及びＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒペプチドＮＨ２−（ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ）３−ＣＯＯＨ（すなわち、配列番号８の配列を３コピー含む）（ｖｏｎ Ｍｅｎｓｄｏｒｆｆ−Ｐｏｕｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ．， １９：１８６−１９５ （１９９８））を選択過程において用いた。ファージ上に発現した、３．７×１０１０の異なる抗体を含む、大きな非改変ヒトＦａｂライブラリ（ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４：１８２１８−１８２３０ （１９９９））を用いた。細胞選択は、ＭＵＣ１を発現しない細胞系を枯渇させた後、記載の通り（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２６０：７７４−８４ （１９９９））に行った。簡単に説明すると、接着性の集密細胞をＰＢＳ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、８ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、７．８ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２）で２回洗浄した後、トリプシン処理（トリプシン／ＥＤＴＡ）した。細胞及びヒトＦａｂライブラリを、１００ｍｌ ＰＢＳ当たり２ｇの脱脂粉乳（Ｍ−ＰＢＳ）中でプレインキュベートした。ＭＵＣ１トランスフェクト細胞結合物（ｂｉｎｄｅｒ）から線維芽細胞結合物を枯渇させるため、５×１０１３ファージを５×１０７ ３Ｔ３細胞と共に５ｍｌ Ｍ−ＰＢＳ中で１時間室温でプレインキュベートした。細胞を遠心し（６１１×ｇで３分）、枯渇したファージライブラリを含む上清液を１×１０７ ３Ｔ３−ＭＵＣ１細胞に室温で１時間かけて添加した。細胞を５ｍｌ Ｍ−ＰＢＳ／１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）で１０回、ＰＢＳで２回洗浄した。最後の洗浄の後、細胞ペレットを０．６ｍｌ Ｈ２Ｏに再懸濁し、０．６ｍｌトリエチルアミン（２００ｍＭ）を添加することによってファージを細胞から放出させた。その懸濁液を０．６ｍｌ １Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）で中和し、２１，０００×ｇで５分間遠心沈殿させた。その上清は選択されるファージを含んでいた。２つの異なる選択手法を比較した：以前に報告されているように、細胞に対する４回の選択、又は細胞に対する２回の選択とそれに続くＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒに対するさらに３回の選択（細胞結合物及び／又はグリコシル化ＭＵＣ１結合物の残留を回避するため）（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−３２ （１９９８））。後者の選択手法（ＭＵＣ１発現細胞に対する選択とそれに続くＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒに対する選択）によって、本明細書に記載のＰＨ１ Ｆａｂ抗体が得られた。
【０１０１】
Ｆａｂライブラリから選択されたクローンのスクリーニング及び特性決定
全細胞ＥＬＩＳＡ、フィンガープリント分析、フローサイトメトリー、配列決定法、間接エピトープ・フィンガープリンティング及び免疫組織化学による細胞結合クローンのスクリーニング及び特性決定を以前に報告されている方法に従って行った（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２６０：７７４−８４ （１９９９）、Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−３２ （１９９８））。スクリーニングの目的で、個々のクローンを拾い出して９６ウェルプレートに移し、Ｍａｒｋｓら（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２： ５８１−５９７ （１９９１））に記載される通りにファージを産生させた。４及び５周目の個々のクローンをそれらの特異性について、ＭＵＣ１陰性ネズミ線維芽細胞系３Ｔ３及びＭＵＣ１トランスフェクト３Ｔ３細胞系に対する全細胞ＥＬＩＳＡ（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２６０：７７４−８４ （１９９９））によって試験した。全細胞ＥＬＩＳＡにおいて、ＭＵＣ１トランスフェクト３Ｔ３細胞系のＡ４５０（セイヨウワサビペルオキシダーゼ染色反応）がＭＵＣ１陰性３Ｔ３細胞系のＡ４５０よりも少なくとも３倍大きい場合、クローンを陽性を考えた。陽性クローンを、フィンガープリント分析において、Ｆａｂ抗体の定常ＣＨ１領域から誘導したプライマーＣＨ１ＦＯＲ（５’−ＧＴＣ ＣＴＴ ＧＡＣ ＣＡＧ ＧＣＡ ＧＣＣ ＣＡＧ ＧＧＣ−３’）（配列番号９）、及びｐＵＣリバース（５’−ＡＧＣ ＧＧＡ ＴＡＡ ＣＡＡ ＴＴＴ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＧ−３’）（配列番号１０）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）と、それに続くＢｓｔＮＩ酵素消化及びアガロースゲル電気泳動による制限フラグメントの分析によって、多様性についてスクリーニングした（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２２：５８１−５９７ （１９９１）、Ｇｕｓｓｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ７７：４０００ （１９８９））。特定の陽性クローンの細胞結合を、選択過程で用いたものと同じ細胞系に対するファージ結合パターンのフローサイトメトリー分析（Ｒｏｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｍａｃｏｌ．， １２５：５−１６ （１９９８））によって評価した。１つのＦａｂ（クローンＰＨ１）のＶ遺伝子をサイクルシークエンシングキットを用いて製造者（Ｅｄｇｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｂｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の指示に従って配列決定した。プライマーはフィンガープリンティングと同じものとした。ヌクレオチド配列及びそれらの対応する推定アミノ酸配列のアライメントを行い、Ｓａｎｇｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ＤａｔａＳｅａｒｃｈ／ｇｑ＿ｓｅａｒｃｈ．ｓｈｔｍｌ）の生殖系列配列と比較した（表２）。表２に示されるように、ＰＨ１ Ｆａｂ抗体のＶＨ領域はＤＰ４７生殖系列に由来するＶＨ領域であり、ＶＬ領域はＤＰＫ１５生殖系列に由来するＶＬ領域である。本明細書で用いられる選択手法を従来記載されているＭＵＣ１に対する選択と比較する（表１；ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ ��ｈｅｍ．， ２７４：１８２１８−１８２３０ （１９９９）、Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−３２ （１９９８）を参照）。同様に、クローン及び構築物のさらなる特性決定を従来記載されている方法（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−３２ （１９９８）を参照）によって行い、簡単にではあるが本明細書に記載する。
【０１０２】
【表１】
2004500828.tif 000002
【表２】
2004500828.tif 000003
ＭＵＣ１細胞結合の特異性を、ネズミ線維芽細胞系３Ｔ３、３Ｔ３ ＭＵＣ１トランスフェクト株ＥＴＡ、乳癌株Ｔ４７Ｄ、卵巣株ＯＶＣＡＲ−３、及び大腸癌細胞系ＬＳ１７４Ｔに対してフローサイトメトリーにおいて試験した。抗体の相対量をドット・ブロットを用いて比較した。ドット・ブロットにおいて決定したように、同じ量のｓｃＦｖ、ＰＨ１、及びｂｉｖＰＨ１、並びに３分の１の量のｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２を用いた。抗体を１００μｇ／ｍｌの合成ＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒと共に室温で１時間プレインキュベートすることによってＭＵＣ１特異性を確認した。乳癌、卵巣癌及び大腸癌のパラフィン包理組織及び正常組織に対する免疫組織化学的分析によって腫瘍組織結合を評価した。精密な特異性は間接エピトープ・フィンガープリンティングによって測定した（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−３２ （１９９８））。
【０１０３】
二価ダイアボディ−ＩＬ−２融合タンパク質ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２、免疫サイトカインＭＵＣ１特異的結合メンバーの産生
Ｆａｂ抗体ＰＨ１を、ＩＬ−２に融合した二量体二価抗体の構築用に選択した。細菌発現プラスミドへの免疫サイトカインのクローニング手順を図１に模式的に示す。第１クローニング工程は、ＳｆｉＩ及びＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＣＡＮＴＡＢ６（ＭｃＧｕｉｎｎｅｓｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １４：１１４９−５４ （１９９６））に２つのフラグメント：（１）ＰＨ１の重鎖可変領域（ＶＨ）（ＳｆｉＩ−ＢｓｔＥＩＩ制限フラグメントとして）、並びに（２）特有の制限部位Ｎｏｔｌ、並びにｍｙｃタグアミノ酸配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡ（配列番号２０）をコードするｍｙｃタグ（ＧＡＡ ＣＡＡ ＡＡＡ ＣＴＣ ＡＴＣ ＴＣＡ ＧＡＡ ＧＡＧ ＧＡＴ ＣＴＧ ＡＡＴ ＧＧＧ ＧＣＣ ＧＣＡ（配列番号２１））、及び６ヒスチジンアミノ酸配列ＨＨＨＨＨＨ（配列番号２２）をコードするポリヒスチジン（“ｈｅｘａＨｉｓ”）タグ（すなわち、ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ ＣＡＴ ＣＡＣ ＣＡＴ（配列番号２３））を有するダイアボディ・ベクターｐＤｉａ１に由来する領域（Ｒｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， １９９９， 未公開）（ＢｓｔＥＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントとして）を挿入してプラスミドｐＣ６−ＰＨ１−ＶＨ（図１Ｂ）を得ることを含んでいた。このタグは、その後行うダイアボディの検出及び精製の取っ掛かりとして必要である。第２工程（図１Ｃ）においては、２段階のＰＣＲを行い、第１増幅ではプライマーＶＬ逆方向３５：５’−ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＡＧＴ ＧＣＡ ＣＴＴ ＧＡＡ ＡＴＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣ（配列番号１１）及びＶＬ順方向：ＡＣＣ ＧＣＣ ＴＣＣ ＡＣＣ ＧＧＧ ＣＧＣ ＧＣＣ ＴＴＡ ＴＴＡ ＡＣＡ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＣＴ ＧＴＴ ＧＡＡ ＧＣＴ ＣＴＴ（配列番号１２）を用いて親Ｆａｂ ＰＨ１のＶＬ−ＣＬを増幅した。ＶＬの第２段階のＰＣＲは、５アミノ酸リンカー（Ｌ１）及び次のクローニング工程に必要な制限部位を付加するように設計されたプライマーを用いて行った。５残基のリンカーはダイアボディとしてのｓｃＦｖｓの折りたたみを可能とする（Ｒｏｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．， １２５： ５−１６ （１９９８））。プライマーは：ＰＨＩ ＶＬ逆方向：５’ＧＣＣＧＡＴＣＧＣＴＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＡＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＴＧＣＡＣＴＴＧＡＡＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧ（配列番号１３）及びＰＨ１ ＶＬ順方向：５’ＧＴＣＴＣＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＡＴＴＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＧＴＣＣＣＡＧＧＧＣＣＧＡＡ）（配列番号１４）とした。このＰＣＲ産物をＢｓｔＥＩＩ／ＮｏｔＩによってｐＣ６−ＰＨ１−ＶＨにクローニングし、プラスミドｐＫａＰａ１を得た。このベクターから、抗体フラグメントＰＨ１が二価ＭＵＣ１特異的ダイアボディｂｉｖＰＨ１として発現する（図１Ｃ）。第３工程において、ＩＬ−２をこのダイアボディ構築体と融合した（図１Ｄ）。ＩＬ−２の最大発現のためにフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で８時間刺激したＰＢＬから誘導した全ＲＮＡ（ＲＮＡｚｏｌ、Ｃａｍｐｒｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ、オランダ）の逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｐｅｒｋ��ｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．により供給されているキット）により、ＩＬ−２コード遺伝子のＰＣＲ増幅用のテンプレートを得た（Ｆａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｄｉａｇｎ． Ｌａｂ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ５： ３３５−４０ （１９９８））。ＩＬ−２遺伝子をダイアボディ・ベクターのＰＨ１ＶＬとタグをコードする断片（すなわち、ｍｙｃタグとそれに続く６ヒスチジン・ペプチド・タグ）との間にＮｏｔＩ／ＥｃｏＲＶによって挿入し、分泌ダイアボディ−ＩＬ−２融合タンパク質（ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２）をコードするファージベクターｐＫａＰａ２を得た（図１Ｄを参照）。４〜３１残基のリンカーを有するｓｃＦｖ−ＩＬ−２融合タンパク質（Ｍｅｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８： ４１４６−５４ （１９９８）、Ｓａｖａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． ６７：３０４−１０ （１９９３））が記載されている。ダイアボディ及びＩＬ−２の２つの抗原結合部位の間の可能性ある立体障害を回避し、かつ酵素開裂を最小限に止めるため、９アミノ酸をコードするリンカー（ＧＧＧ ＧＧＴ ＧＧＡ ＴＣＡ ＧＧＣ ＧＧＣ ＧＧＧ ＧＣＣ ＣＴＡ）（配列番号１５）を選択した。この配列はプライマーにコードした（ＰＨ１−ＩＬ−２逆方向：５’ＡＣＣＡＡＡＧＴＧＧＡＴＡＴＣＡＡＡＣＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＣＣＣＴＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＴＡＣＡ（配列番号１６）；ＰＨ１−ＩＬ−２順方向；５’ＧＴＣＣＣＧＣＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＴＣＡＧＴＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡＴＧＣＴＴＴＧＡＣＡＡＡＡＧＧ）（配列番号１７））。
【０１０４】
ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、及び二価抗体フラグメントのＢＩＡｃｏｒｅ分析
選択されたＦａｂ ＰＨ１及び他の抗体構築物をＢＩＡｃｏｒｅ ２０００装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）での表面プラズモン共鳴によって評価した。ＣＭ−５チップを、ｐＨ４．６の１０ｍＭ酢酸バッファ中９０〜８００応答単位（ＲＵ）の濃度の（４コピーの配列番号７のアミノ酸配列を含む）ＭＵＣ１ ８０−ｍｅｒで被覆した。空の表面、活性化された表面、及び、続いて、不活化した表面を陰性対照として用いた。ＦａｂフラグメントＰＨ１、ｓｃＦｖ １０Ａ（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−３２ （１９９８））、及び遺伝子操作したダイアボディフラグメントをＨＢＳバッファー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）に注入した。抗原結合フラグメントの再結合を最小化するため、２０μｌ／ｓの流速を採用した。
【０１０５】
抗体フラグメントの精製
細胞培養物を含むアッセイのため、固定化金属アフィニティクロマトグラフィーによって抗体フラグメントを精製した（Ｒｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ７８：１４０７−１６ （１９９８））。最終生成物中に存在するフリーのＩＬ−２を遠心濃縮器（３０００ｒｐｍ）（Ｍｒカットオフ３００００、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）においてＰＢＳに対する限外濾過によって除去した。ＰＢＳを添加することによって容量を濃縮器の最大容量まで再構成し、サンプルを遠心によって再度濃縮した。この再構成及び濃縮を２回繰り返した。非結合ＩＬ−２が存在しないことをドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ｐａｇｅ）及びウェスタン・ブロットによってチェックした。
【０１０６】
ＩＬ−２アッセイ
後にｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激アッセイにおいて用いるため、ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２構築体及びＩＬ−２対照（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）のＩＬ−２濃度をＥＬＩＳＡによって定量した。ＥＬＩＳＡは供給者（Ｅｎｄｏｇｅｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）の指示に従って行った。ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２の活性をＩＬ−２依存性ネズミＴ細胞系ＣＴＬＬ−１６の刺激によって測定した（Ｈｅｅｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ．， ７７：２３７−４６ （１９８５）、Ｇｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １２０：２０２７−３２ （１９７８））。ＲＰＭＩ １６４０（１ｍｌ当たり１０％ＦＣＳ、１００Ｕ ＩＬ−２）中で培養した細胞を３回洗浄した。ウ１ェル当たり１０４細胞を０．２〜４ｐｇ／ｍｌの範囲で増加させた濃度のｒＩＬ−２又はｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２と共に丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ、Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ、メイン州）においてインキュベートした。３７℃の加湿インキュベーター内で２４時間インキュベートした後、０．５μＣｉ／ウェル［３］Ｈ−チミジンを培養培地に添加することによりヒトＰＢＬの５％ＣＯ２刺激を試験した。一晩のインキュベーションの後に細胞を回収し、放射能の取り込みを測定した。
【０１０７】
ＰＨＡ刺激ＰＢＬ（Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ４：４３−９ （１９９８））に対するＭＵＣ１関連阻害を研究するため、ＰＨＡ（１０μｌ／１００μｌ）を健常ドナーから新たに調製した１００，０００のＰＢＬ／１００μｌ ＲＰＭＩ，１０％ＰＣＳ／ウエルで丸底マイクロタイタープレートに添加した。ＭＵＣ１によるＴ細胞刺激の阻害を試験するため、２５μｇ／ｍｌ ＭＵＣ１−１００−ｍｅｒペプチドを添加した。ＭＵＣ１特異的ＭＡｂ １Ｇ５を陽性対照として用いた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２、加湿インキュベーター内で６日間インキュベートした後、上述のように細胞を３Ｈ−チミジン標識し、回収してカウントした。
【０１０８】
細胞毒性アッセイ
ＭＵＣ１を発現する標的集団、卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３に対するエフェクタ細胞としてのＰＢＬの細胞毒性活性を５１Ｃｒ放出アッセイによって測定した。標的細胞を、ＰＢＳ単独、又は５μｇ／ｍｌ ｂｉｖＰＨ１若しくはｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２を含むＰＢＳ中でプレインキュベートし、３０分後に１ｍＣｉ／ｍｌ／１０６細胞５１Ｃｒと共に３７℃で６０分インキュベートした。インキュベーション容量は１００μｌとした。標的細胞を３回洗浄し、ＲＰＭＩ、１０％ＦＣＳに５０００細胞／５０μｌで再懸濁させて平底マイクロタイタープレートに接種した。ＰＢＬ（５０μｌ）を標的（５０００細胞／５０μｌ／ウェル）に１：１００、１：５０、１：２５及び１：１２．５のエフェクタ比（Ｔ／Ｅ）となるよう添加した。標的細胞にＴｗｅｅｎ−２０を添加することにより最大放出を測定した。最小放出の測定には、標的細胞にＰＢＬを添加しなかった。ＩＬ−２の影響を測定するため、１００Ｕ／ｍｌ ＩＬ−２を適切なウェルに添加した。一晩インキュベートした後、細胞を上清回収システムで回収し、放出された５１Ｃｒをγシンチレーションカウンターにおいてカウントした。溶解率（％）を１００×（放出された試験５１Ｃｒ ｃｐｍ−放出された最小５１Ｃｒ ｃｐｍ／放出された最大５１Ｃｒ ｃｐｍ−放出された最小５１Ｃｒ ｃｐｍ）として測定した。試験は３連で行い、少なくとも３回繰り返した。
【０１０９】
ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２免疫サイトカインに保持されるＩＬ−２活性
二価抗体をコードする遺伝子カセットをヒトＩＬ−２遺伝子に融合した。その融合タンパク質（ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２）はＢＩＡｃｏｒｅにおいてｂｉｖＰＨ１として、及びフローサイトメトリー（図３Ａ及び３Ｂ）において結合特性を保持しており、免疫組織化学において同じ結合パターンを示した。フローサイトメトリーにおいて、他の抗体に対するものよりも低濃度のｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２を用いたにもかかわらず、ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２はＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒペプチドと競合しなかった（図３Ａ及び３Ｂ）。ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２をｒＩＬ−２と比較することで、この免疫サイトカインが市販のｒＩＬ−２と同じ特異的活性を有し（図４）、ダイアボディｂｉｖＰＨ１がこのＩＬ−２依存性細胞系を刺激しない（データは示さず）ことが示された。これは、類似の免疫サイトカインを研究する他の研究者によって観察された結果と一致する（Ｍｅｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４１４６−５４ （１９９８）、Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ． ８９：１４２８−３２ （１９９２））。ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２はヒトＰＢＬの増殖を未改変ｒＩＬ−２と同じ程度まで刺激した（図５）。Ａｇｒａｗａｌらにより報告されている（Ａｇｒａｗａｌ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ．， ４： ４３−９ （１９９８））ＩＬ−２により刺激されたＰＢＬのＭＵＣ１関連阻害を逆転させる試みにおいて、ＭＵＣ１ １００−ｍｅｒをＰＨＡ及びＩＬ−２と共にＰＢＬに添加した。刺激されたリンパ球のＭＵＣ１による阻害は検出されなかった。標的細胞がｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２で被覆されているときは、休止ＰＢＬによって腫瘍細胞を殺すことが可能であった（図６）。さらに、ＩＬ−２を培養物に添加することで、ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２に加えてｂｉｖＰＨ１被覆標的細胞が影響を受けた。
【０１１０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの休止ＰＢＬによる抗体−ＩＬ−２融合タンパク質（ＩｇＧ−ＩＬ−２）が媒介する殺傷の主因がＮＫ細胞上のＦｃγＲＩＩＩとその抗体の定常領域との相互作用によるＮＫ活性の誘導のためであることが以前に示されている（Ｎａｒａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｌｅｔｔ．， ３９：９１−９ （１９９４）、Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５９：２１５９−６６ （１９９９））。しかしながら、これは、ｂｉｖＰＨ１及びｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２のいずれにもＦｃ領域が存在しないため、これらの実験において観察される殺傷の強化の説明となり得ない。このデータは、殺傷能力が幾つかの作用様式によって影響を受けることを示唆している。第１に、免疫サイトカインは、その免疫サイトカインとＩＬ−２受容体及びＭＵＣ１の両者との相互作用により、Ｔ細胞を腫瘍細胞の近くに引き寄せる。第２に、ＭＵＣ１抗体は細胞性ＭＵＣ１上の潜在的阻害性エピトープを覆い、それにより、Ｔ細胞の阻害を妨げる。そして第３に、免疫サイトカインのＩＬ−２部分はＴ細胞をアネルギーから救済する。この休止ＰＢＬが介在する腫瘍細胞の直接殺傷は、それらの細胞に結合する抗体により影響を受け、これはＮＫ細胞上のＦｃ受容体による抗体依存性細胞介在細胞毒性（ＡＤＣＣ）によっては明らかに生じないものである。
【０１１１】
巨大非免疫ｓｃＦｖ及びＦａｂファージ・ライブラリに由来するヒト抗ＭＵＣ１抗体（ＭＵＣ１特異的結合メンバー）の選択及び特性決定
出発点として、完全ヒト抗ＭＵＣ１抗体を巨大非免疫ヒトＦａｂライブラリからファージディスプレイ技術（ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４：１８２１８−１８２３０ （１９９９））を用いて選択した。注射を反復して行うときに免疫サイトカインの効力が改善されるため（Ｍｅｌａｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４１４６−５４ （１９９８））、その免疫サイトカインに対する最小免疫原性を有する成分を用いることが重要である。ヒト抗体ファージ・ライブラリの使用によってヒト抗ＭＵＣ１抗体を回収することが可能となり（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−３２ （１９９８）、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １２：７２５−７３４ （１９９３））、また抗体の種類（サイズ、親和性若しくは結合活性、多価性、クリアランス等）及び選択された用途に対するエフェクタ機能の設計及び遺伝子操作が可能となる（ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ａｄｖ． Ｄｒｕｇ Ｄｅｌ． Ｒｅｖ．， ３１：５−３１ （１９９８）、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １５：６２−７０ （１９９７））。細胞上に存在するＭＵＣ１に結合する腺癌特異的な高親和性／結合活性抗体を得るため、ＭＵＣ１トランスフェクト細胞系（３Ｔ３−ＭＵＣ１）上に３．７×１０１０の異なる抗体を含む非常に巨大な非免疫（未改変）Ｆａｂライブラリを用いた。これらの細胞選択を、同じライブラリ（ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４：１８２１８−１８２３０ （１９９９））及び６×１０９の異なるｓｃＦｖを有する巨大ｓｃＦｖライブラリ（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−３２ （１９９８）、Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １４：３０９−３１４ （１９９６））を用いてビオチニル化合成ＭＵＣ１ペプチドに対する従来公開されている選択と比較した（表１）。被覆ＭＵＣ１ １００−ｍｅｒペプチドを使用してＥＬＩＳＡシステムを用いて選択を実施した場合、抗体はｓｃＦｖライブラリからのみ回収された。対照的に、ビオチニル化抗原を用い、かつ選択を溶液中で行った場合には、ｓｃＦｖ及びＦａｂライブラリの両者で選択がうまくいった。
【０１１２】
ｓｃＦｖライブラリから単離した抗体は、Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘらにより以前に記載されており（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−３２ （１９９８））、簡単に説明すると、最高ＥＬＩＳＡシグナルを示し、かつ腺癌組織に特異的に結合するｓｃＦｖ １０Ａ及び１０Ｂを含む５種類の異なる抗体が見出され、この両者はＢＩＡｃｏｒｅにおいて比較的迅速な解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）（最良ｋｏｆｆ：１０−２ｓ−１）を有する。選択された異なる抗体の数及び最良解離速度の点ではＦａｂライブラリが優れていた。１４の異なる抗体が見出され、最良解離速度は１０−４ｓ−１の範囲であった。それにもかかわらず、フローサイトメトリーにおいて細胞に結合したＦａｂは得られなかった。最も可能性の高いこととして、フレキシブルなペプチドが、その選択を豊富さに劣る点から遠ざける選択が顕著な（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ−ｄｏｍｉｎａｎｔ）エピトープをディスプレイし（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２６０：７７４−８４ （１９９９））、おそらくは細胞表面上に存在する、ＭＵＣ１上の立体配置的エピトープをディスプレイする。ＭＵＣ１発現細胞を選択に用いた場合、ＭＵＣ１陰性細胞を枯渇させた後でさえ、ＭＵＣ１−ペプチド特異的Ｆａｂ抗体は見出されなかった。ｓｃＦｖライブラリと同様の条件を用いた場合、ＭＵＣ１特異的抗体は検出されなかった。さらに、第１に被覆ＭＵＣ１ １００−ｍｅｒでの選択、次いでｓｃＦｖライブラリを用いるＭＵＣ１発現細胞系Ｔ４７Ｄに対する選抜（パニング）の選択の組合せを用いると、新たなＭＵＣ１特異的抗体もｓｃＦｖ細胞結合抗体１０Ａ及び１０Ｂも得られなかったが、それにもかかわらずこれらはライブラリ中に存在することが知られている。したがって、この選択手法は破棄された。最初の２ラウンドは、非トランスフェクト３Ｔ３細胞での初期枯渇工程の後、ＭＵＣ１トランスフェクト３Ｔ３細胞で行い、ラウンド３〜５は被覆ＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒを用いて行った。Ｆａｂライブラリを用いる第４選択ラウンドの後、ＢｓｔＮＩフィンガープリント・パターンに基づいて６つの異なる抗体が同定され、１つのパターンがその集団で優位を占めた（５８％、クローンＰＨ１として表される）。選択の第５ラウンドにおいて、ＥＬＩＳＡ陽性クローンの９２％がＰＨ１クローン・パターンを有していた。６つのＦａｂ−ＤＮＡフィンガープリントの各々の代表的なクローンのフローサイトメトリーにおいて、Ｆａｂ ＰＨ１のみがＥＴＡ ＭＵＣ１発現細胞に結合した。
【０１１３】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析により、ヒトＦａｂ抗体ＰＨ１がｓｃＦｖライブラリから回収された抗体のいずれよりも遅い解離速度を有することが示され（ｋｏｆｆ：１０−３ｓ−１）、したがって、さらに特性決定を行うことができた。間接エピトープ・フィンガープリンティング（Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−３２ （１９９８））により、最小結合エピトープがＭＵＣ１タンパク質コアのトリペプチドＰｒｏ Ａｌａ Ｐｒｏであることが決定された（データは示さず）。ＤＮＡ配列決定分析により、ＰＨ１ヒトＦａｂ抗体のＶＨは生殖系列セグメントＤＰ４７から誘導されることが見出され、かつＶＬは生殖系列配列ＤＰＫ１５から誘導されることが見出され、両者とも少数のアミノ酸突然変異を有していた（表２を参照）。ＰＨ１に由来するＶＨ領域のヌクレオチド配列及び対応アミノ酸配列が、それぞれ、配列番号４及び３に示される。ＰＨ１に由来するＶＬ領域のヌクレオチド配列及び対応アミノ酸配列は、それぞれ、配列番号２及び１に示される。これらの配列データによって、ＰＨ１ ＶＨ及びＶＬ領域のフレームワーク（ＦＲ）及びＣＤＲ配列が明らかとなった（例えば、表２を参照）。加えて、これらの配列は、この研究所（ｄｅ Ｈａａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７４：１８２１８−１８２３０ （１９９９）、Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−３２ （１９９８））又は他の研究者（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １２：７２５−７３４ （１９９３））によってクローニングされた他の抗ＭＵＣ１抗体の配列には関連しない。
【０１１４】
二価抗ＭＵＣ１ダイアボディ及び免疫サイトカイン分子の構築、発現及び生化学的分析
選択されたＰＨ１ Ｆａｂ抗体Ｖ遺伝子を用いて、ＰＨ１ ＶＨ及びＶＬ領域がリンカーペプチドＬを介して互いに共有結合し、かつＶＨ−Ｌ−ＶＬ部分がそのカルボキシ末端アミノ酸でＩＬ−２タンパク質のアミノ末端アミノ酸残基に共有結合する、一般式（ＶＨ−Ｌ−ＶＬ）−ＩＬ−２の完全ヒト免疫サイトカインを構築した。望ましい抗ＭＵＣ１免疫サイトカイン分子を以下の幾つかの特に有利な特性を有するように設計した：（１）より長い循環半減期を獲得するため、４５ｋＤ ｓｃＦｖ−ＩＬ−２分子量よりも大きい（すなわち、腎濾過閾値より大きく）、（２）同じ分子上に２つの異なる結合部位を有し、それが、一価ＰＨ１ Ｆａｂ抗体とは異なって、ＭＵＣ１抗原の多量体特性を十分に活用することにより、ＭＵＣ１に対するその結合において結合活性の利点を有する、並びに（３）抗体−ＩＬ−２融合産物の効力を否定的に妨害することが近年示された（Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５９：２１５９−６６ （１９９９））Ｆｃ受容体結合ドメインを持たない（すなわち、ＩｇＧのＣＨ２及びＣＨ３ドメインが存在しない）。このような特性は、９０ｋＤ分子量の二価ダイアボディ−ＩＬ−２融合体を構築することによって達成された（図１を参照）。Ｖ遺伝子はダイアボディＶＨ−リンカー−ＶＬ形式で再構成した（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ．， ９０：６４４４−８ （１９９３））。短い５アミノ酸残基リンカー（Ｌ１）が、ダイアボディの選択的形成、すなわち、非共有結合により対をなして２つの機能的結合部位を有する二量体を形成する２つの一本鎖Ｆｖ分子の形成を行う。この二価ダイアボディ遺伝子カセットを、次に、ヒトＩＬ−２遺伝子に融合した。ｂｉｖＰＨ１ダイアボディ及びｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２ダイアボディ免疫サイトカイン融合タンパク質を両者とも大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させ、固定化金属アフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を用いて両融合タンパク質をペリプラズム抽出物から精製した。
【０１１５】
Ｆａｂ ＰＨ１及びｓｃＦｖ １０Ａ抗体の結合特性を、ＢＩＡｃｏｒｅにおいて、２つのダイアボディ構築体、すなわち、二価ｂｉｖＰＨ１抗体及び二価ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２免疫サイトカイン融合体と比較した（図２）。これらの二価ダイアボディは、Ｆａｂの結合（ｋｏｆｆ：１０−３ｓ−１）と比較して少なくとも１０倍強い解離速度で結合した。これらの結合特性は合成ＭＵＣ１ ８０−ｍｅｒペプチド・チップ（９０ＲＵ固定化抗原を有する）で測定した。これらの最適条件下で測定した二価ダイアボディ分子の相対解離速度は１０−４ｓ−１未満であった。この相対解離速度は、測定条件、例えば、チップ上の抗原密度に依存した。ＭＵＣ１の２０アミノ酸ペプチドを、様々な数の直列反復配列として、細胞上で３０〜１００回の反復配列とした（Ｓｗａｌｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３２８：８２−４ （１９８７））。細胞に対する二価ｂｉｖＰＨ１抗体の結合活性作用は、同じ分子に対する結合及び再結合作用のため、少なくとも同じ程度のものであると期待された。したがって、一価抗体対二価抗体の結合作用を細胞に対してフローサイトメトリーで測定した（図３Ａ及び３Ｂ）。同じ量のｓｃＦｖ、ＰＨ１及びｂｉｖＰＨ１を用いたにもかかわらず、ｂｉｖＰＨ１ダイアボディは、ｓｃＦｖ １０Ａ及びＰＨ１ Ｆａｂ抗体よりもかなり良好にＭＵＣ１トランスフェクト３Ｔ３細胞系、卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３、及び乳癌細胞系Ｔ４７Ｄに結合した。この結合は、ｂｉｖＰＨ１をｓｃＦｖ １０Ａと比較したときには１ｌｏｇ高く、Ｆａｂ ＰＨ１と比較したときには約０．５ｌｏｇ良好であった。このより強い細胞への結合は、抗体をＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒと共にプレインキュベートすることにより確認され、ｓｃＦｖ １０Ａ抗体の場合にはＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒによる抗体細胞結合の阻害が完全であり、ＰＨ１ Ｆａｂ抗体の場合にはほぼ完全であり、かつｂｉｖＰＨ１ダイアボディの場合には部分的であった。この部分的な阻害は、非トランスフェクトネズミ線維芽細胞系３Ｔ３又は高度にグリコシル化された大腸細胞系ＬＳ１４７Ｔにも結合した抗体が存在しないため、非特異的結合によるものではない。ＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒペプチドによる阻害は、ＯＶＣＡＲ−３細胞系の場合よりもＴ４７Ｄ細胞系の場合の方がで顕著ではない。
【０１１６】
二価ヒト免疫サイトカインｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２のエフェクタ機能
２つのＭＵＣ１結合領域とＩＬ−２との距離が比較的短いため、この融合形式がＩＬ−２活性を損なうかどうかを試験することが重要であった。したがって、ＩＬ−２依存性ネズミＴ細胞系（ＣＴＬＬ−１６）を、量を増加させた種々の量のｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２で刺激し、刺激効率を市販の組換えＩＬ−２（ｒＩＬ−２）のものと比較した。図４に示されるように、ｒＩＬ−２及びｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２の両者はネズミＴ細胞系を等しい活性で刺激したが、それに対してｂｉｖＰＨ１は刺激しなかった（データは示さず）。同様に、ｒＩＬ−２及びｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２はＰＢＬを等しく十分に刺激した（図５）。ＩＬ−２及びｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２がＴ細胞のＭＵＣ１関連阻害を逆転させることができるかどうかを検証しようとする試みにおいて、ＰＢＬをＰＨＡ及びＭＵＣ１と共に６日間インキュベートし、阻害の逆転を試みた。しかしながら、ＭＵＣ１によるＴ細胞活性化の阻害は観察されず、このプロトコルを用いて阻害の逆転を研究することはできなかった。
【０１１７】
免疫サイトカインの両部位の機能性を立証するため、５１Ｃｒ放出アッセイを行った（図６）。ＭＵＣ１発現標的細胞ＯＶＣＡＲ−３をｂｉｖＰＨ１又はｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２と共にプレインキュベートし、洗浄した。休止ＰＢＬは標的細胞の溶解を媒介せず、１００Ｕ／ｍｌ ｒＩＬ−２の添加は溶解の改善に有効ではなかった。ｒＩＬ−２の添加では溶解がバックグランドレベルよりもかなり上昇したにもかかわらず（ｐ＜０．０５）、ｂｉｖＰＨ１ダイアボディは溶解のレベルを有意に増加させることはなかった。ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２免疫サイトカイン融合タンパク質は非融合の組合せｂｉｖＰＨ１及びｒＩＬ−２よりも休止ＰＢＬによる標的細胞の溶解を増強させ（ｐ＜０．０３）、これはＭＵＣ１結合部位に加えてエフェクタ部位が機能的であることを立証する（図６を参照）。さらに、免疫サイトカインで被覆した標的細胞にｒＩＬ−２を添加することで、完全な殺傷が達成された（ｐ＜０．００１）。フローサイトメトリーにおいてＰＨ１と結合しない（図３Ｂ）大腸細胞系ＬＳ１７４Ｔを同様のアッセイにおいて標的として用いた場合、殺傷は観察されなかった（データは示さず）。
【０１１８】
ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２免疫サイトカインの解離の半減期
フローサイトメトリーにおけるＰＨ１細胞結合特性、腺癌関連免疫組織学的染色パターン、及び試験した全てのクローンの最も遅い解離速度のため、ＰＨ１ Ｆａｂ抗体を免疫サイトカイン構築のためのＶＨ及びＶＬ領域の供与源として選択した。抗体媒介免疫療法については、抗体の高い親和性が抗体が媒介する殺傷に重要であるという証拠がますます蓄積されている（Ｖｅｌｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ７８：４７８−８３ （１９９８））。同様に、結合活性による結合の増大は組換え抗体フラグメントの腫瘍取り込みに役立つ可能性がある（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５３：４０２６−３４ （１９９３））。ＢＩＡｃｏｒｅにおける被覆８０−ｍｅｒでの一価ＰＨ１ Ｆａｂの解離速度は１０−３ｓ−１であり、これは、類似の一価エフェクタ分子の抗原からの解離の半減期が１１分であることを示す。したがって、結合力の改善が望まれた。ＭＵＣ１は様々な数の直列反復配列を有するため、目的は：（１）ＰＨ１ Ｆａｂの二価形態（ｂｉｖＰＨ１）を作製することによって結合活性を改善し、かつ（２）多価受容体について記載される解離効果を得ることであった（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， １７：７７−８０ （１９９６））。実際、ＢＩＡｃｏｒｅにおいて、ｂｉｖＰＨ１ダイアボディ抗体分子は１０倍を上回る遅さの解離速度を有し；結合の半減期はこの抗原表面で約１１分から２時間に改善される（図２を参照）。本明細書に記載のｂｉｖＰＨ１ダイアボディ抗体分子の二価性効果は、フローサイトメトリーによって測定した場合に、ＭＵＣ１のＶＮＴＲを発現する細胞に対して同様に顕著であった（図３を参照）。結合強度はｓｃＦｖ １０Ａと比較して約１ｌｏｇ、ＰＨ１ Ｆａｂ抗体分子と比較して０．５ｌｏｇ増大した。さらに、この結合は１００μｇ／ｍｌのＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒペプチドによって容易に競合を受けるものではなく、ＭＵＣ１分子における反復配列の数が結合の保持に重要であることが確証される。
【０１１９】
ＭＵＣ１のような細胞表面上に発現する多価受容体からの抗体の解離の速度論は十分に研究されている。再結合が生じないと仮定した場合、式ｔ１／２≒１／ｋｏｆｆ（ｌｎＮ−ｌｎ（ｌｎ２）＋ｌｎ２／２Ｎ）で記載される複合体の解離の半減期は、抗原の結合価（Ｎ）に従って増大する（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ， １７：７７−８０ （１９９６））。細胞性ＭＵＣ１上のｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２免疫サイトカインのｔ１／２（解離の半減期）は、この式及びＢＩＡｃｏｒｅで測定したｋｏｆｆの値を用いて算出することができる。ＭＵＣ１糖タンパク質が１００個の直列反復配列を有するものと仮定すると、この解離の推定半減期が１４時間となる。さらに、抗体の再結合は細胞表面上の抗原（ＭＵＣ１）の密度によってさらに影響を受け（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．， ５６：９５５−６６ （１９８９））、これは様々な腺癌において過剰発現する（Ｂｕｒｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４７：５４７６−５４８２ （１９８７））。したがって、細胞上のｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２免疫サイトカインの腫瘍解離半減期は実質的に２時間より長い。
【０１２０】
結論として、ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２はＩＬ−２を腫瘍部位に向けてＴ細胞を活性化するだけではなく潜在的に阻害性のエピトープをも包含するものであり、このエピトープは腫瘍細胞の殺傷が改善され、さらに腺癌のような癌における刺激Ｔ細胞のアネルギーを防止するのに望ましい特性である。
【０１２１】
実施例２
ヒトＭＵＣ１特異的一価ＰＨ１ Ｆａｂ抗体の親和性成熟
本実施例は、上述のＰＨ１ Ｆａｂ抗体に由来する突然変異重鎖分子のライブラリからの、ＭＵＣ１に対する親和性が増強された一価結合部位を含むＦａｂ抗体のｉｎ ｖｉｔｒｏ選択（すなわち、親和性成熟）を実施するためのファージディスプレイ方法論の使用を示す。突然変異誘発は、ｉｎ ｖｉｖｏで頻繁に突然変異する重鎖ＣＤＲ１及びＣＤＲ２領域中の残基（ｉｎ ｖｉｖｏ突然変異誘発の「ホット・スポット」として知られる）、並びに完全重鎖ＣＤＲ３領域に対して行った。
【０１２２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＦ１：Ｋ１２、Ｄ（ｌａｃ−ｐｒｏ）、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓｄＤ５／Ｆ’ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ＋Ｂ＋、ｌａｃＩｑ、ｌａｃＺＤＭ１５をファージディスプレイ親和性選択手順における宿主として用いた。
【０１２３】
ＶＨライブラリの調製
（ａ）ＣＤＲ３ライブラリ
ＰＨ１のＶＬＣＬをファージミドｐＣＥＳ１ベクター（ｄｅ Ｈａａｒｄら、１９９９）におけるＡｐａＬＩ−ＡｓｃＩフラグメントとしてクローニングし、ｐＣＥＳ−ＰＨ１−ＶＬを得た。以下に示されるように、プライマー＃２０６と突然変異導入ＣＤＲ３プライマーのうちの１つとを用いてＰＨ１のＶＨを増幅した（表３を参照）。そのＰＣＲ産物をｐＣＥＳ−ＰＨ１−ＶＬ中にＳｆｉＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片としてクローニングした。
【０１２４】
（ｂ）ホットスポット・ライブラリ
第１ＰＣＲにおいて、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２ライブラリを、ＰＨ１−ＶＨをテンプレートとし、プライマー対＃７０１及び＃８７並びにプライマー対＃２０６及び＃７０２をそれぞれ用いて調製した（表３を参照）。これらのライブラリをコードするＤＮＡを、プライマー対＃２０６及び＃８７を用いるＰＣＲ構築反応によって組合せ、ファージディスプレイ及び選択のため、得られたＶＨ遺伝子をｐＣＥＳ−ＰＨ１−ＶＬ中にＳｆｉＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片としてクローニングした。
【０１２５】
【表３】
2004500828.tif 000004
2004500828.tif 000005
親和姓選択
（ａ）ビオチニル化ＭＵＣ１に対する選択
Ｈａｗｋｉｎｓら（Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２２６：８８９−９６ （１９９２））によって記載されるものに幾らかの変更を加えて、ビオチニル化ＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒに対する選択を行った：ファージはローテータ・ホイール（ｒｏｔａｔｏｒ ｗｈｅｅｌ）上で１時間、２％Ｍ−ＰＢＳＴ（２％脱脂粉乳粉末及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したＰＢＳ）中でインキュベートした。一方、１００μｌのストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、ノルウェー）をローテータ・ホイール上で２時間、２％ Ｍ−ＰＢＳＴ中でインキュベートした。ビオチニル化抗原をプレインキュベートしたファージに添加し、その混合物をローテータ・ホイール上で３０分間インキュベートした。次に、ストレプトアビジン・ビーズを添加し、その混合物をローテータ・ホイール上に１５分間放置した。２％Ｍ−ＰＢＳＴで１４回、ＰＢＳで１回洗浄した後、ファージ粒子を９５０μｌの０．１Ｍトリエチルアミンで５分間かけて溶離した。０．５ｍｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加することによって溶出液を中和し、対数期大腸菌ＴＧ１細胞の感染に用いた。３７℃で３０分間かけてＴＧ１細胞に感染させ、２％グルコース及び１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含む２×ＴＹ（１リットル当たり１６ｇ バクトトリプトン、１０ｇ酵母抽出物及び５ｇ ＮａＣｌ）寒天プレート上にプレーティングした。３０℃で一晩インキュベートした後、コロニーをプレートからかきとり、Ｍａｒｋｓらに記載されるようにファージレスキューに用いた（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２２２， ５８１−５９７ （１９９１））。
【０１２６】
（ｂ）ＭＵＣ１発現細胞に対する選択
他の選択として、両者ともＭＵＣ１の腫瘍関連糖付加形態を発現することが知られるＴ４７Ｄ乳癌細胞系（Ｈａｎｉｓｃｈら、１９９６）及びＯＶＣＡＲ−３卵巣癌細胞系で選択を行った。簡単に説明すると、１０１２ファージ及び細胞（ラウンド１、２、３及び４に、それぞれ、１０７ Ｔ４７Ｄ、５×１０６ ＯＶＣＡＲ、２×１０６ Ｔ４７Ｄ及び２×１０６ ＯＶＣＡＲ）を２％Ｍ−ＰＢＳ（２％脱脂粉乳粉末を添加したＰＢＳ）と共に３０分間プレインキュベートし、次に、ファージを細胞に添加した。１時間のインキュベーションの後、細胞をＭ−ＰＢＳ＋１０％ＦＣＳで１０回洗浄した。前述のように、特定のファージを溶出し、指数関数的に増殖するＴＧ１細胞の感染に用いた。
【０１２７】
ＥＬＩＳＡ及びＢＩＡｃｏｒｅにおける表面プラズモン共鳴を用いる速度論的測定
可溶性ＦａｂをＲｏｏｖｅｒｓらに記載される通りに作製した（Ｒｏｏｖｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ７８：１４０７−１６ （１９９８））。ＥＬＩＳＡを、ビオチニル化ＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒを用いたことを除いて、Ｈｅｎｄｅｒｉｋｘら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−４３３２ （１９９８））によって記載される通りに行った。選択されたＰＨ１及び親和性成熟抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）での表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって親和性について評価した。ビオチン・チップの溝をＨＢＳ−ＥＰバッファ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中の、最小ＰＨ１エピトープであるＰＡＰ（Ａｃ−ＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＬ−ＮＨ２、（配列番号４０）５０ＲＵ若しくは３２０ＲＵ）を含むＭＵＣ１ １５−ｍｅｒ又はＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒ（ＮＨ２−（ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ）３−ＣＯＯＨ（すなわち、配列番号８の３つのコピーを含む（ｖｏｎ Ｍｅｎｓｄｏｒｆｆ−Ｐｏｕｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ．， １９：１８６−１９５ （１９９８）、５０ＲＵ）で被覆した。表面の１つをビオチン（１５ＲＵ）でブロックし、陰性対照として用いた。抗体をＨＢＳ−ＥＰバッファに注入した。抗原結合フラグメントの再結合を最小に止めるため、流速は３０μｌ／秒であった。親和性の算出はＢＩＡｃｏｒｅによって提供されるＢＩＡ評価ソフトウェアで行った。Ｆａｂの親和性は定常状態における１：１化学量論に従って算出した。
【０１２８】
ＤＮＡ配列決定
選択されたＦａｂのヌクレオチド配列を、ジデオキシ配列決定法によって決定した。配列決定反応の生成物を半自動シーケンサ（Ａｌｆ Ｅｘｐｒｅｓｓ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で分析した。ＶＨの配列決定に用いたオリゴヌクレオチドはＣＨ１ＦＯＲ：５’−ＧＴＣ ＣＴＴ ＧＡＣ ＣＡＧ ＧＣＡ ＧＣＣ ＣＡＧ ＧＧＣ−３’（配列番号９）であった。
【０１２９】
ＦＡＣＳ分析
Ｆａｂの特異的結合を、Ｈｅｎｄｅｒｉｋｓら（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−４３３２ （１９９８））によって記載されるように、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ分析（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｏｘｎａｒｄ、ＣＡ）によって測定した。組換えＦａｂを有する細胞での親和性研究のため、以下のフローサイトメトリー実験を行った。Ｒｏｏｖｅｒｓら（Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ７８：１４０７−１４１６ （１９９８））に記載されるように、ＩＭＡＣ及びゲル濾過によってＦａｂフラグメントをペリプラズム画分から精製した。タンパク質濃度をビシンコニン酸法（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で測定した。これらのＦａｂの２倍系列希釈を作製し、各希釈点で、２×１０５／１００μｌ ＥＴＡ細胞（トランスフェクト３Ｔ３細胞（Ａｃｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １４：１３６−１４４３ （１９９３））と共にインキュベートした。トリプシン処理の後、細胞をＲＰＭＩ １０％ＦＣＳ、０．１％ＮａＮ３（インキュベーションバッファー）で１回洗浄した。その後、細胞を適切な希釈液と共に室温（ＲＴ）で１時間、ローテータ上でインキュベートした。陰性対照として、２×１０５ ３Ｔ３マウス線維芽細胞も最高濃度の抗体と共にインキュベートした。第２陰性対照として、一次抗体を含まないＥＴＡ細胞を用いた。６１１×ｇで３分間遠心することにより細胞を遠心沈殿させた。インキュベーションの間に細胞をインキュベーションバッファーで洗浄した。第２インキュベーションにおいて、Ｍｙｃタグ付加Ｆａｂを指向する抗Ｍｙｓ抗体（６μｇ／ｍｌ ９Ｅ１０）を、インキュベーションバッファ中に溶解して室温で３０分間かけて添加した。１回洗浄した後、ウサギ抗マウスＦＩＴＣを室温で３０分間用いた（Ｄａｋｏ）。結合抗体の検出はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｏｘｎａｒｄ）でのフローサイトメトリーによって行い、結果をＣＥＬＬＱｕｅｓｔプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。平均強度を抗体の濃度に対してプロットした。
【０１３０】
結果及び分析
この研究において用いられた親和性成熟選択手順では、ＰＨ１ Ｆａｂ抗体の重鎖可変領域、及びこのＶＨ内の２つのタイプの残基：（１）ｉｎ ｖｉｖｏでの抗体−抗原相互作用により高い親和性を頻繁に付与する残基（「ホットスポット」）：ＶＨ−ＣＤＲ１における残基３１並びにＶＨ−ＣＤＲ２における残基５６及び５；並びに（２）抗原結合部位の心臓部に位置し、その突然変異誘発がしばしばより親和性の高い抗体を生じるＣＤＲ３領域（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， １５： ６２−１０ （１９９７））、に対する突然変異誘発を行った。
【０１３１】
具体的には、４つの異なるライブラリを作製した：配列番号３のアミノ酸位置３１、５７、５９に突然変異を有する１つのＣＤＲ１−２ホットスポット・ライブラリ（ＨＳＰＯＴ）；及び重鎖ＣＤＲ３（Ｈ−ＣＤＲ３）の３つのライブラリ。ＨＳＰＯＴライブラリは、一方がスパイクされた（ｓｐｉｋｅｄ）残基３１を担持するＣＤＲ１領域を有し、他方がスパイクされた残基５７及び５９を有するＣＤＲ２領域と野生型ＣＤＲ３を有する、２つのＤＮＡ断片のアセンブリＰＣＲ、並びにファージ上にディスプレイされるＦａｂフラグメントとしてＰＨ１軽鎖と共に発現させるための、このＶＨ遺伝子のクローニングによって作製した（表３におけるＨＳＰＯＴ ＣＤＲ１及びＨＳＰＯＴ ＣＤＲ２オリゴヌクレオチドを参照）。Ｈ−ＣＤＲ３は１２アミノ酸残基の長さを有するため、この領域の理論的多様性は２０１２である。
【０１３２】
２つの異なるＲＡＮ１及びＲＡＮ２ライブラリを、各ライブラリにおいて５アミノ酸残基のみを完全にランダム化して作製した（表３におけるＣＤＲ３ランダム・オリゴヌクレオチド１及び２を参照）。したがって、これら個々のライブラリの理論的多様性は３．３×１０６であり、コドン当たり３２の可能性を有するライブラリにおいては３．３×１０７変種で表される。
【０１３３】
ＣＤＲ３の隣接残基、配列番号３のアミノ酸残基９７及び９８のＨ３領域に加えて、ＣＤＲ３の最後の２つの結合領域をコードする残基である配列番号３のアミノ酸残基１０９及び１１０におけるさらなる多様性にアクセスするため、野生型を９２．５％含むよう突然変異ヌクレオチドが７．５％のレベルでスパイクされているオリゴヌクレオチドを１４残基の領域の突然変異誘発に用いる、ＳＰＩＫＥと呼ばれるライブラリを作製した。ＣＤＲ３ライブラリは、ＰＨ１ Ｆａｂ抗体のＶＨの突然変異オリゴヌクレオチド（表３におけるＣＤＲ３スパイクド・オリゴを参照）を用いるＰＣＲ、及び得られたＤＮＡをＳｆｉＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片としてｐＣＥＳ１−ＰＨ１−ＶＬにクローニングすることによって作製した。
【０１３４】
実際のライブラリのサイズは全て１０８クローンを越えていた（表４を参照）。
【０１３５】
【表４】
2004500828.tif 000006
選択されなかったライブラリからのクローンを配列決定によって分析して突然変異誘発パターンを確認し、またＥＬＩＳＡによって分析してＭＵＣ１抗原への結合について試験した。驚くべきことではないが、ＨＳＰＯＴライブラリの高頻度のクローンはＭＵＣ１結合のためのファージ抗体として陽性であった。大部分は配列が確かに野生型であり（データは示さず）、このライブラリは３つの残基にわたって８０００種の変異体があるのみであった。同様に、１クローン当たり２−３のアミノ酸変化ではあるが、ＳＰＩＫＥライブラリは高頻度のＰＨ１の抗原結合変異体を生じる（表５を参照）。ＣＤＲ３のストレッチ全体が改変されている、選択されたなかったＲＡＮ１及びＲＡＮ２ライブラリにおいて多くのＥＬＩＳＡ陽性（ＯＤ４５０において検出可能なシグナル）が見出されることがより顕著であった（表５）。ファージ粒子１つ当たり複数の抗体をディスプレイし得るファージ粒子の使用がこのＥＬＩＳＡにおいて強力な結合を促進し、クローン間の親和性の相違が容易に遮蔽されることを心に留めるべきである。
【０１３６】
【表５】
2004500828.tif 000007
2004500828.tif 000008
2004500828.tif 000009
３つのＣＤＲ３ライブラリは、おそらくはＰＣＲ鋳型として用いた元のｐＣＥＳ１−ＰＨ１−Ｆａｂの通過（ｐａｓｓ−ｔｈｒｏｕｇｈ）のため、ＰＨ１−ＶＨの野生型配列を有する低頻度のクローン（３つのライブラリの混合物を含む４／２１クローン、表６を参照）を含んでいた。ＰＨ１のより高親和性の変異体がこれらのライブラリに存在するならば、これらの野生型ファージは親和性成熟プロセスにおいていかなる問題も生じないはずである。
【０１３７】
ＰＨ１に基づくライブラリを含む細菌ストックをヘルパーファージを用いてレスキューし、ファージを様々な選択手法に供した。細胞性ＭＵＣ１を探索する他にこれらのライブラリを可能な限り完全にサンプリングするため、（ａ）量を減少させた種々の量のＭＵＣ１ペプチドでの選択、（ｂ）抗体ＰＨ１を競合体として用いる選択、及び（ｃ）全細胞での選択を含む３つの異なる選択条件に従った。
【０１３８】
ＭＵＣ１ペプチドでの選択
レスキューされたＲＡＮ１、ＲＡＮ２、及びＳＰＩＫＥライブラリからの第１ファージを混合し、ＭＵＣ１−１配列の２０−ｍｅｒ反復配列を３回含むビオチニル化ＭＵＣ−１ ６０−ｍｅｒペプチドで選択した。量を減少させた種々の量の抗原（６０−ｍｅｒ）で３ラウンドの選択を行った。この手法に関するデータを表６に示す。
【０１３９】
【表６】
2004500828.tif 000010
重要な問題は、選択用の抗原の濃度を決定する方法である。Ｆａｂ ＰＨ１は、未改変ファージ抗体ライブラリから選択されたものではあるが、非常に迅速な解離速度で６０−ｍｅｒペプチド抗原に対して１．４マイクロモル濃度（μＭ）の親和性を有する。おそらく、ファージ粒子表面上の複数のＦａｂのディスプレイによって生じる結合活性はその選択に寄与する。その抗体のエピトープで一度だけ１５−ｍｅｒ ＭＵＣ−１ペプチドに結合するＦａｂの親和性定数が６０−ｍｅｒへの結合と等しい（データは示さず）ため、抗原の多価性に重要な役割はないものと思われる。従来の研究では、抗原濃度が抗体のＫｄよりも１００〜１０００倍低いものであり得、それでも依然として選択が可能であることが示された（Ｓｃｈｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２６３：５５１−５６７ （１９９６））。したがって、第１ラウンドの選択は、表６に示されるように、６０−ｍｅｒペプチドを１０ｎＭの初期濃度で用い、その後、次の工程においてこの数値を１０倍低下させて行った。ライブラリにおけるクローンの親和性の範囲がどの程度であるか知らないため、正確な濃度は経験的にのみ決定することができる。
【０１４０】
第１及び第２選択において、ファージ力価の入力／出力（Ｉ／Ｏ）比の急激な低下が認められたが、抗原が少ない第３ラウンドのさらなる選択は再度増加を示した。同様に、Ｆａｂ ＥＬＩＳＡのおける陽性クローンの頻度は、最初、ラウンド２において１０ｎＭ抗原を用いたとき約９０％まで、１ｎＭのみを用いたときには４５％まで増加した。１００及び１０ピコモル濃度（ｐＭ）を用いる第３ラウンドの選択においては頻度は再度減少した。これは、これらの条件下で、多くの低親和性のクローンを選択することに失敗したことを示した。それらの条件下で、最も高い親和性のクローンが選択的に多く存在すべきであることはあり得ることであった。これは、野生型配列を有するクローンの初期選択及び後の頻度の低下によって確認された。
【０１４１】
競合選択
第２の手法において、野生型ＰＨ１ Ｆａｂフラグメントとの競合を利用してＰＨ１の最高親和性変異体を選択することを試みた。ライブラリを、０．２μＭ又は１μＭのＰＨ１ Ｆａｂフラグメントの存在下において、ビオチニル化ＭＵＣ−１ ６０−ｍｅｒで別々に選択した。ファージ、抗原及び可溶性競合体の６時間の同時インキュベーションの後、ストレプトアビジン被覆ビーズを用いてビオチニル化抗原に結合したままのファージを回収した。ファージ力価及び選択データを表７にまとめる。
【０１４２】
【表７】
2004500828.tif 000011
予想される通り、競合がない選択と比較するとＩ／Ｏ比は低下したが（表６）、より顕著には、ＭＵＣ１陽性クローンの頻度が劇的に低下し（混合物についての６０％（表６における１８／３０）から個々のライブラリについての５％（３／６０、表７）まで）、競合を伴う選択がうまく実施できたことが示された。同様に、ＨＳＰＯＴライブラリから選択されたＭＵＣ−１陽性の頻度は選択の１ラウンドの後に低下したが（表４及び７における頻度を比較）、これらのクローンは、依然として、もちろん非選択ライブラリを占める野生型配列である。これもＨＳＰＯＴライブラリに由来する１ｎＭ ＭＵＣ１抗原のみを用いる第２ラウンドの選択においては、クローンは野生型ではないように思われた。
【０１４３】
細胞での選択
他の２つの手順によって、ＭＵＣ１ペプチドに対するＫｄが３．５倍まで増加している変異体を単離した（下記参照）。しかしながら、細胞性ＭＵＣ１をより強力に認識するもののペプチドＭＵＣ１抗原に対しては親和性の僅かな改善のみを示す変異体がライブラリ中に存在している可能性があった。したがって、ＭＵＣ１ペプチドでの選択の代わりとして、ＭＵＣ１抗原の（部分的にグリコシル化された）形態を発現する細胞を選択において用いた。ほぼないと考えられるが理論的には可能なＭＵＣ１以外の抗原に対するクローンの選択を防止するため、２種類の細胞系、すなわちＴ４７Ｄ乳癌及びＯＶＣＡＲ卵巣癌細胞系を交互に用いて選択を行った。選択データを表８に示す。
【０１４４】
【表８】
2004500828.tif 000012
幾らかの変動にもかかわらず、ファージの入力−出力（Ｉ／Ｏ）比は４種の細胞選択の経過全体にわたって実際に増加することはなかった。しかしながら、選択された全てのライブラリにおいて、ＭＵＣ１ペプチドに結合するクローンの頻度に加えて非野生型クローンの出現に増加が見られた（表８）。配列決定することで、おそらくはライブラリ間での交差汚染のため、ＲＡＮライブラリ由来の全てのクローンがＳＰＩＫＥライブラリから誘導されたものであることが明らかとなった。これは、ＲＡＮライブラリにおいては、ＰＨ１の高親和性変異体が多くは存在していなかったことを示唆する。
【０１４５】
ＢＩＡｃｏｒｅ及びＦＡＣＳにおける、配列及び親和性についての代表的なクローンの分析
多くの種々の選択ラウンドからのクローンを、最初に、ＭＵＣ１ペプチドに対する結合の改善についてＢＩＡｃｏｒｅでスクリーニングした。様々な選択手法からの数百のクローンをスクリーニングする大規模なスクリーニングの試みから、さらなる特性決定を行うために最良のクローンを同定した。全ての選択ラウンドからの特性決定を行ったＰＨ１ ＣＤＲ３変異体の概要を表９に示す。
【０１４６】
【表９】
2004500828.tif 000013
2004500828.tif 000014
表９におけるクローン名の最初の数字はその起源を示す：３−４、ＭＵＣ１抗原で直接選択；５−６−７−８、ＰＨ１競合で選択；１０−１１、細胞選択。これらのクローンをそれらの相対ＥＬＩＳＡシグナルに従ってランク付けした（可溶性Ｆａｂフラグメントとして）。クローンの配列決定から、最強シグナルを示すクローンにおいて観察される可変性の大部分がＣＤＲ３の数個の残基のみを標的とし、かつＳＰＩＫＥライブラリから誘導されるものとしてほぼ排他的に見出されることが明らかとなった。実際、これらのクローンにおいて最も頻繁に突然変異を受ける残基はＲＡＮライブラリにおいては標的とされなかった。これらのクローン内には、ＣＤＲ３の大部分のコア領域（ＲＡＮライブラリにおいてランダム化されている領域）の目に見える強力な保存が、ＣＤＲ３のＦＲ３領域及びＪをコードする領域に見ることができる多くの突然変異を伴って存在する。多くのクローンにおいては、（配列番号３における）残基Ｋ９８及び／又は（配列番号３における）Ｄ１０９が高頻度に突然変異を受け、それにより、おそらく、これらの荷電アミノ酸間の推定塩架橋が破壊されている。全ての置換が許容されているわけではない。例えば、バリン又はアラニンに対する突然変異はこの塩架橋を破壊する可能性があるが、より高い親和性を付与することはない。ＶＨの位置１にはある程度の可変性があったが、これはグルタミン酸（Ｅ）又はグルタミン（Ｑ）のいずれかの組み込みを許容するオリゴヌクレオチド＃２０６の使用によって生じる。しばしば、両変異体はＦＲ３−ＣＤＲ３領域に同じ突然変異を担持することが見出されたが、これが親和性に影響を及ぼすことはなかった（データは示さず）。３種類の異なる手順（直接選択、ＭＵＣ１ペプチド抗原との競合を用いる選択、又は細胞での選択）で選択されたクローンの多様性には僅かな偏りがあった。実際、位置１０９にグリシン（Ｇ）又はアスパラギン（Ｎ）への単一の置換を有する変異体が全ての選択手順において頻繁に選択される（表９）。
【０１４７】
ＨＳＰＯＴライブラリからは、２つの変異体を試験した：（競合選択からの）クローン７Ｇ８及び（細胞選択からの）クローン１０Ｇ９。両者はＶＨのＣＤＲ１内の位置３１に突然変異を有し、より具体的には、７Ｇ８及び１０Ｇ９はそれぞれＳ３１Ｎ及びＳ３１Ｒを有していた。これらのクローンのＥＬＩＳＡシグナルはほとんどのＣＤＲ３変異体に見られるシグナルに届かず、これらのクローンをさらに分析することはしなかった。
【０１４８】
ＣＤＲ３変異体をＢＩＡｃｏｒｅにおいてＭＵＣ１ペプチド相互作用の反応速度について徹底的に試験した。野生型クローンの解離速度は分析するには速すぎるために決定することができなかった。しかしながら、Ｋｄ（１．４マイクロモル濃度）に基づくと、１０倍を上回る解離速度の改善はこのアッセイにおいて解離速度の検出可能な変化を生じるはずである。このＦａｂでの解離速度スクリーニングを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）培養物のペリプラズム抽出物において用いて、表９におけるクローンに加えてより多くのものを解離速度の改善についてスクリーニングした。最良のクローンである５Ｃ８は競合選択から誘導され（表７）、解離速度の明瞭な増加を示した。正確な測定値を得るため、ＢＩＡｃｏｒｅでのＫｄアッセイをＭＵＣ１ １５−ｍｅｒと共に用いた（ＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒを用いたときには相互作用の反応速度に相違はなかった。データは示さず）。クローン５Ｃ８は野生型ＰＨ１ Ｆａｂ抗体の３．５倍のＫｄの増加を示した（表１０を参照）。直接選択から得られた、３Ｄ６を含む他の幾つかの候補クローン及びより厳密な競合選択クローンから得られた他の３つのクローン（すなわち、７Ｄ１、７Ｆ３及び７Ｆ９）をＢＩＡｃｏｒｅ及び／又はフローサイトメトリー分析を用いて徹底的に調べた。表１０におけるＢＩＡｃｏｒｅデータは、ＢＩＡｃｏｒｅにおけるペプチド結合のＫｄ値とこれらのクローン間の配列の相違を強調する。全ての変異体のうち、クローン５Ｃ８が最良の親和性を有するものと思われる。クローン７Ｆ９のような単一突然変異Ｄ１０９Ｇによって２倍未満の改善がもたらされるが、クローン５Ｃ８のようなさらなるＧ１０２Ｒ変異は３．５倍の親和性増加をもたらす。
【０１４９】
フローサイトメトリー実験は、データを直接比較することはできないが、細胞性ＭＵＣ１に対するこれらのＦａｂ対野生型の相対親和性を決定するために行った（データは示さず）。最高親和性から最低親和性までのこれら３つのクローンの相対ランキング（すなわち、７Ｄ１＞７Ｆ３＞７Ｆ９）は同じままであるように思われたが、野生型クローンＰＨ１及び最良ＢＩＡｃｏｒｅ突然変異体５Ｃ８の両者の位置取りはＢＩＡｃｏｒｅ親和性に基づいて予想されるものとは異なっているように思われた。このＭＵＣ１ペプチドに対する結合親和性と細胞表面ＭＵＣ１に対する結合親和性の間の明らかな矛盾は、おそらく、細胞上のＭＵＣ１糖タンパク質の抗体エピトープが部分的にグリコシル化されている作用によって生じ、これは抗体の微細な特異性及びＭＵＣ１抗原との相互作用に応じて異なる様式で結合を生じ得る。抗体親和性変異体は抗原のペプチド源よりも細胞性ＭＵＣ１で選択及びスクリーニングすることが好ましいと思われるが、ＰＨ１に基づく抗体ライブラリの細胞での選択は５Ｃ８よりも親和性が高いいかなる変種をも生じなかった。ＭＵＣ１ペプチドの結合で選択された変異体のほとんどに加えて検出可能なペプチド結合なしに選択されたクローンは、ＭＵＣ１ペプチドで選択されたクローンに見い出される配列の変動を有していた（表９及びデータは示さず）。
【０１５０】
実施例３．組換えヒトＭＵＣ１特異的免疫グロブリン分子ＰＨ１−ＩｇＧの作製及び特性決定
実施例１において説明されるように、３．７×１０１０Ｆａｂ抗体分子をディスプレイする非常に巨大なファージライブラリからＭＵＣ１特異的ＰＨ１ Ｆａｂ抗体を選択した。このＰＨ１ Ｆａｂ抗体は、ＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒペプチド抗原を用いるＢＩＡｃｏｒｅ分析において１．４マイクロモル濃度（μＭ）のＫｄを有する。本実施例は、Ｆａｂ抗体の単一（一価）抗原結合部位を免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ）の２つの（二価）結合部位形式に形式を変化させることにより、癌細胞及び組織上に発現する細胞性ＭＵＣ１に対する本発明のＦａｂ抗体の見かけの親和性を増加させる方法を示す。以下に説明されるように、ＰＨ１のＶＨ及びＶＬ遺伝子を哺乳動物発現ベクター系（Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １８７：９−１８ （１９９７））にクローニングすることによって完全ヒト組換えＰＨ１−ＩｇＧ１抗体分子を作製した。次に、この組換え発現ベクターを、発現のため、哺乳動物ＣＨＯ−Ｋ１細胞に共トランスフェクトした。
【０１５１】
ヒトＩｇＧ分子へのＰＨ１ Ｆａｂ抗体のＶＨ及びＶＬのクローニング
ＰＨ１ヒトＦａｂ抗体の重鎖及び軽鎖（すなわち、ＶＨ及びＶＬ）を、完全なヒトγ−１／κＩｇＧ１抗体を作製するため、それぞれ哺乳動物ＶＨｅｘｐｒｅｓｓ及びＶＫｅｘｐｒｅｓｓ発現ベクターに再クローニングした（Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ， １８７：９−１８ （１９９７））。ＰＨ１のＶＨフラグメントを、特定のオリゴヌクレオチドＶＨ１Ｃ Ｂａｃｋ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ（５’−ＧＧＡ ＣＴＡ ＧＴＣ ＣＴＧ ＧＡＧ ＴＧＣ ＧＣＧ ＣＡＣ ＴＣＣ ＣＡＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＴＣＴ ＧＧＧ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＴＧ ＧＴＡ ＣＡＧ−３’（配列番号１１０））及びＭ１３市販配列決定プライマー（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｓａｌａ、スウェーデン）を用いるＰＣＲによって増幅し、ＶＨｅｘｐｒｅｓｓベクターにＢｓｓＨＩＩ／ＢｓｔＥＩＩフラグメントとして導入した。ＰＨ１ ＶＬのＡｐａＬ１／Ｐａｃ１フラグメントを、特異的オリゴヌクレオチドＶＫｅｘｐｒｅｓｓ−ＭＵＣ−ｆｏｒ（５’−ＧＣＧ ＣＴＣ ＧＣＡ ＴＴＴ ＧＣＣ ＴＧＴ ＴＡＡ ＴＴＡ ＡＧＴ ＴＡＧ ＡＴＣ ＴＡＴ ＴＣＴ ＡＣＴ ＣＡＣ ＧＴＴ ＴＧＡ ＴＡＴ ＣＣＡ ＣＴＴ ＴＧＧ ＴＣＣ ＣＡＧ ＧＧＣ Ｃ−３’（配列番号１１１）及びＭＵＣ１−ＶＬ−Ｂａｃｋ−ＡＰＡ（５’−ＣＣＡ ＧＴＧ ＣＡＣ ＴＣＣ ＧＡＡ ＡＴＴ ＧＴＧ ＣＴＧ ＡＣＴ ＣＡＧ ＴＣＴ ＣＣ−３’（配列番号１１２）を用いるＰＣＲによって生成し、これをＶＫｅｘｐｒｅｓｓに挿入した。非リポソーム性トランスフェクション用試薬であるＦｕＧｅｎｅ ６（Ｒｏｃｈｅ、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、ベルギー）を製造者の指示に従って用いて、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）細胞のトランスフェクションを行った。
【０１５２】
ＥＬＩＳＡにおける細胞培養上清のスクリーニング
選択マーカーを含む培地で増殖するクローンの上清をＭＵＣ１に結合する抗体について試験し、ＶＨ／ＶＬ産生レベルを決定した。ＭＵＣ１結合試験については、Ｈｅｎｄｅｒｉｃｋｘらの方法（Ｈｅｎｄｅｒｉｃｋｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２４−４３３２ （１９９８））をこの研究における使用に適合させた。インキュベーション容量は１００μｌとした。ＭＵＣ１ペプチド抗原（すなわち、０．５μｇ／ｍｌビオチニル化ＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒ）を柔軟なマイクロタイタープレートに、そのマイクロタイタープレートのウェル上にコーティングされたビオチニル化ＢＳＡに結合するストレプトアビジンを介して間接的に固定化した。ＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒの固定化は４℃で一晩かけて行った。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）の脱脂粉乳（Ｍａｒｖｅｌ）と共に室温（ＲＴ）で３０分インキュベートすることによってプレートをブロッキングした。プレートをＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で２回、ＰＢＳで１回洗浄した後、上清を室温で１．５時間、振盪しながらインキュベートした（２％（ｗ／ｖ）Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ中１：４に希釈）。続いて、プレートをＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で５回、ＰＢＳで１回洗浄した。結合したＩｇＧを、ウサギ抗ヒトＨＲＰ結合ＩｇＧ（２％ Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ中１：６０００に希釈）で検出した。最後のインキュベーションの後、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）及びＨ２Ｏ２を基質として用いて染色を行い、０．５容量の２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって停止させた。光学密度を４５０ナノメートル（ｎｍ）で測定した。
【０１５３】
ヒトＩｇＧの産生
産生されたヒトＰＨ１−ＩｇＧ１の量を決定するため、ＰＢＳ中０．２５μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒトＶκ免疫グロブリンを用いて３７℃で１時間プレートをコーティングした。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）の準脱脂粉乳（ｓｅｍｉ−ｓｋｉｍ ｍｉｌｋ）粉末（Ｍａｒｖｅｌ）を用いて室温で３０分間、プレートをブロッキングした。プレートをＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で２回、ＰＢＳで１回洗浄した後、上清を室温で１．５時間、振盪しながらインキュベートした（２％（ｗ／ｖ）Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ中１：４に希釈）。ヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ）の２倍希釈列を５００ｎｇ／ｍｌの濃度から開始して標準として用いた。続いて、プレートをＰＢＳ−０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０で５回、ＰＢＳで１回洗浄した。結合したＩｇＧを、ウサギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ（２％ Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌ）で検出した。最後のインキュベーションの後、テトラメチルベンジジン及びＨ２Ｏ２を基質として用いて染色を行い、０．５容量の２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加することによって停止させた。光学密度を４５０ｎｍで測定した。
【０１５４】
ＣＨＯ−Ｋ１クローン７Ｆ細胞の培養培地からのＰＨ１−ＩｇＧ１の生成及び精製
約３×１０８トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ１細胞（クローン７Ｆ）を、加湿インキュベーター内、３７℃で３週間、Ｔ１７５三層フラスコにおいて培養した。培養培地は０．５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含み、毎週１回交換した。各々の回収から約１リットルの培養上清を得た。抗ＭＵＣ１抗体をプロテインＡで精製した。簡単に述べると、１リットルの培養上清を５ｍｌ／分の流速で５ｍｌ ＨｉＴｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に流した。カラムをＰＢＳで十分に洗浄した。結合したＭＵＣ１抗体を１２．５ｍＭクエン酸で溶出し、０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９）で中和した。タンパク質含有画分を合わせ、ＰＨＳに対して透析（１６時間、４℃）して滅菌濾過した。精製した抗ＭＵＣ１抗体をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色、ヒトＩｇＧ特異的ＥＬＩＳＡ、及びＢＣＡ微量タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって分析した。プロテインＡで精製したＰＨ１−ＩｇＧ（１００−２００ｎｇ）を還元条件下において１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し（Ｌａｅｍｍｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ４７：６９−８５ （１９７０））、銀染色によってタンパク質バンドを可視化した。ウェスタンブロットのため、精製したＰＨ１−ＩｇＧを還元条件下において１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、ニトロセルロース上にトランスファーした。ＰＨ１−ＩｇＧ重鎖及び軽鎖を、それぞれ、ヒトＩｇＧに対するＨＲＰ結合ポリクローナル抗体及びヒトκ鎖に対するＨＲＰ結合モノクローナル抗体で同時に検出した。産生量を上述のヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡで測定した。
【０１５５】
表面プラズモン共鳴
選択されたＰＨ１−ＩｇＧ１及びＦａｂ ＰＨ１抗体を、ＢＩＡｃｏｒｅ ２０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）での表面プラズモン共鳴により、それらの結合特性について評価した。ビオチン・チップをＨＢＳ−ＥＰバッファー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中の最小ＰＨ１エピトープであるＰＡＰ（Ａｃ−ＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＬ−ＮＨ２（配列番号４０）（上記実施例２を参照）、５０ＲＵ及び３２０ＲＵ）を含むＭＵＣ１ １５−ｍｅｒ及び６０−ｍｅｒ（ＮＨ２−（ＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨＧ）３−ＣＯＯＨ（配列番号８）（ｖｏｎ Ｍｅｎｓｄｏｒｆｆ−Ｐｏｕｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｒ Ｂｉｏｌ．， １９：１８６−１９５ （１９９８）、５０ＲＵ）でコーティングした。ビオチン（１５ＲＵ）でブロッキングした表面を陰性対照として用いた。Ｆａｂ ＰＨ１及びＰＨ１−ＩｇＧ１をＨＢＳ−ＥＰバッファーに注入した。抗原結合分子の再結合を最小に止めるため、３０μｌ／秒の速度を採用した。ＢＩＡｃｏｒｅに備えられたコンピュータ・プログラム（ＢＩＡＥｖａｌｕａｔｉｏｎ−ｖｅｒｓｉｏｎ３、ＢＩＡＣｏｒｅ ＡＢ）で親和性の算出を行った。不飽和量（５０ＲＵ）のＭＵＣ１ペプチドが結合する２つのチャンネルに関して、χ２が最小のときのフィッティングを受容した。定常状態における１：１ラングミュア化学量論によりＰＨ１ Ｆａｂ抗体の親和性を算出した（χ２：５０．６）。ＰＨ１−ＩｇＧ１上に２つの結合場所があるため、結合活性は物質移動限界を伴う１：１ラングミュア測定を用いて見かけの結合活性定数として算出した（χ２：４２）。
【０１５６】
フローサイトメトリー分析
細胞性ＭＵＣ１と前述のように精製したＰＨ１−ＩｇＧ及びネズミＨＭＦＧ１抗体（Ａｕｔｏｇｅｎ Ｂｉｏｃｌｅａｒ、Ｗｉｌｔｈｓｈｉｒｅ、ＵＫ）との結合をフローサイトメトリーにおいて試験した。約５００，０００細胞を各実験において用いた。トリプシン処理の後、細胞をＲＰＭＩ １０％ＦＣＳ、０．０１％ＮａＮ３（インキュベーション・バッファー）で１回洗浄した。特異性を確認するため、同じ量（１００μｇ／ｍｌ）の特異的抗体又は非結合性ヒト抗体を１００μｇ／ｍｌ ＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒと共に又はそれなしで、室温で１時間用いた。その後、サンプルを細胞に添加し、室温で１時間放置した。６１１×ｇで３分間遠心することにより細胞を遠心沈殿させた。各インキュベーションの間に、細胞をインキュベーション・バッファーで２回洗浄した。抗ヒトＩｇＧ１抗体を細胞に添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、ウサギ抗マウスＦＩＴＣを全てのチューブに添加し、チューブを３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｏｘｎａｒｄ）でのフローサイトメトリーによって結合した抗体の検出を行い、結果をＣＥＬＬＱｕｅｓｔプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｏｘｎａｒｄ）で分析した。
【０１５７】
この研究において用いた細胞系は、マウス線維芽細胞系３Ｔ３、ＭＵＣ１トランスフェクト細胞系３Ｔ３−ＭＵＣ１（ＥＴＡ）（Ａｃｒｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．， １４：１３６−１４３ （１９９３））、乳癌株Ｔ４７Ｄ及びＭＣＦ−７、卵巣癌株ＯＶＣＡＲ−３、大腸癌細胞系ＬＳ１７４Ｔ、大腸細胞系ＣａＣｏ２、並びにＴ細胞系Ｊｕｒｋａｔであった（非トランスフェクト細胞系はＡＴＣＣにより得た）。
【０１５８】
ＰＨ１−ＩｇＧのビオチニル化及びＦＩＴＣ標識
５０ｍＭ ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．５）中２５０μｇ／ｍｌの濃度のＰＨ１−ＩｇＧ１を室温で１時間、穏やかに攪拌しながらスルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）で処理した。４μｇのビオチンエステルを１００μｇの抗体に用いた。最終濃度５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．５で３０分間処理することによって反応を停止させた。ビオチニル化抗体を遊離ビオチンから分離するため、反応混合物をＰＢＳに対して透析した。フローサイトメトリー分析におけるＭＵＣ１陰性３Ｔ３細胞と比較したＭＵＣ１陽性ＯＶＣＡＲ３細胞及びＥＴＡ細胞への抗体の結合により、ＰＨ１−ＩｇＧのビオチニル化を検証した。
【０１５９】
ＦＩＴＣ標識は、ＦＩＴＣタンパク質標識キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）を用いて、２００μｌの反応混合液中２００μｇのＰＨ１−ＩｇＧ１で製造者の指示に従って行った。フローサイトメトリー分析においてＭＵＣ１陽性及び陰性細胞系（ＥＴＡ、ＯＶＣＡＲ−３、３Ｔ３）で標識をチェックした。
【０１６０】
免疫組織化学
様々なホルマリン固定正常及び腫瘍組織をＰＨ１−ＩｇＧ１の結合パターンについて試験した。組織は、診断された腺癌を優先して選択した。ＨＭＦＧ−１を限定された数の腫瘍組織の対照として用いた。ビオチニル化ＰＨ１−ＩｇＧ１抗体を用いた。パラフィン包理組織の切片（５μｍ）を脱パラフィン化し、再度水和し、過酸化水素処理（ＰＢＳ中０．３％のＨ２Ｏ２）し、ＰＢＳ、１５％ＦＣＳ、５％ヒト血清（ＨＳ）と共に２０分間プレインキュベートした。抗体を、ＰＢＳ、１０％ＨＳ中１７μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、室温で１時間インキュベートした。ＰＨ１−ＩｇＧ１については、その後、スライドをアビジン−ビオチン−複合体（ＡＢＣ、Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）と共に３０分間インキュベートした。ＨＭＦＧ１については、まずスライドをビオチニル化ヒツジ抗マウス（ＲＡＭＰＯ、Ｄａｋｏ）と共にＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０、１％ＢＳＡ中で３０分間インキュベートした後、アビジン−ビオチン−複合体と共にインキュベートした。各組織について、非結合性ヒトＩｇＧ１を有する陰性対照を用いた。各抗体インキュベーションの間に、スライドをＰＢＳで５分間、３回洗浄した。染色はジアミノベンジジン（ＤＡＢ）及びＨ２Ｏ２を用いて行った。水でペルオキシダーゼ反応を停止させ、スライドをヘマトキシリンで対比染色した。上皮組織はそれらの結合反応性（散発性：＜１０％、限局性：１０％＜ｆ＜８０％、散在性：＞８０％）及び細胞におけるそれらの所在（ａ：頂端、極性、ｃ：細胞質、脱分極、ｍ：細胞膜上に多量に発現）について評価した。グリコシル化感受性を研究するため、Ｃａｏら（Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．， １９ Ｓｕｐｐｌ． １：８８−９９ （１９９８））に記載されるように、室温で３０分間、暗所において、酢酸バッファー中の過ヨウ素酸（０．０５Ｍ、ｐＨ５）で正常乳房組織片を前処理した。
【０１６１】
共焦点顕微鏡を用いるインターナリゼーションの評価
製造者の指示に従って抗体をＦＩＴＣ標識した（上記参照）。ＦＩＴＣ標識抗体はフローサイトメトリーにおいてＥＴＡ及びＯＶＣＡＲ−３細胞に結合し、ＭＵＣ１陰性３Ｔ３細胞系には結合しなかった（データは示さず）。インターナリゼーション研究には、ヒト腫瘍細胞系ＯＶＣＡＲ−３及びＭＵＣ１トランスフェクトマウス線維芽細胞３Ｔ３細胞系、ＥＴＡを用いた。陰性対照として、大腸細胞系ＣａＣｏ２を用いた。ＦＩＴＣ標識抗体を氷上で１時間のインキュベーション時間、これらの細胞に添加した（１００μｇ／ｍｌの濃度で１０μｇ／１０６細胞）。細胞を洗浄し、抗体が膜に結合したままであるかどうかをチェックするために氷上に置くか、又はインターナリゼーションを研究するために３７℃に置いた。各時点（１、３、６時間及び一晩）で、膜結合及びインターナリゼーションについて細胞を共焦点顕微鏡でチェックした。Ｆｃ結合をヒトＩｇＧ１との競合によってチェックした。染色パターン（膜又は細胞内）を共焦点顕微鏡（Ａｓｃｉｏｐｈａｔ、Ｚｅｉｓｓ、Ａｔｔｏ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で評価した。
【０１６２】
哺乳動物発現ベクターへのＰＨ１−ＩｇＧ１のクローニング及びトランスフェクタントの選択
この研究においては、ＭＵＣ１に対するヒトＰＨ１ Ｆａｂ抗体（実施例１）を完全ヒトγ−１／κ免疫グロブリン抗体として哺乳動物用ＶＨｅｘｐｒｅｓｓ及びＶＫｅｘｐｒｅｓｓ発現ベクターに再クローニングした。ＰＨ１−ＶＨをコードする配列を含むＤＮＡをＶＨｅｘｐｒｅｓｓにクローニングし、ＰＨ１−ＶＬフラグメントをコードする配列を含むＤＮＡをＶＫｅｘｐｒｅｓｓの発現カセットに挿入した。非リポソーム性トランスフェクション用試薬ＦｕＧｅｎｅ６を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞へのＶＨｅｘｐｒｅｓｓ及びＶＫｅｘｐｒｅｓｓ組換えベクターの共トランスフェクションを行った。トランスフェクションの４８時間後、７００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含む培地への限界希釈を行った。細胞を９６ウェルプレートに、ウェル当たり１０細胞、１００細胞及び１０００細胞で塗布した。１００細胞／ウェルのプレートで、９６ウェルのうちの３６ウェルが培養の５日後に細胞増殖を示した。増殖した陽性ウェルの上清をＥＬＩＳＡにおいてヒトγ免疫グロブリンの存在及びＭＵＣ１ペプチドへの結合についてアッセイした。これらのうち、１３がＭＵＣ１への結合について陽性であり、検出されたヒトＩｇＧの範囲は５〜７７ｎｇ／ｍｌであった。クローン７Ｆ（７５ｎｇ／ｍｌ）をさらなる研究のために選択した。クローン性を保証するため、サブクローニングの追加ラウンドを行った（データは示さず）。
【０１６３】
ＰＨ１−ＩｇＧ１の産生及び精製
ＭＵＣ１特異的ＰＨ１−ＩｇＧ１抗体を上述のように０．５％ＦＣＳ含有培養培地から精製した。これらの条件下で、ウシＩｇＧの同時精製は見られず、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥで立証されるように９０％を上回る純度のＰＨ１−ＩｇＧ１タンパク質が得られた。ヒトＩｇＧ１特異的ＥＬＩＳＡ及びＢＣＡ全タンパク質検出アッセイの結果は良好に一致した（データは示さず）。１リットルの培養培地から約０．５ｍｇのＰＨ１−ＩｇＧが精製され、これは、１週間以内に約３×１０８細胞から誘導される、細胞当たり０．３ｐｇの発現レベルにほぼ相当する。
【０１６４】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
抗体の親和性をＢＩＡｃｏｒｅを用いて決定した。Ｆａｂ ＰＨ１の親和性は１５−ｍｅｒ及び６０−ｍｅｒ ＭＵＣ１ペプチド抗原で被覆した表面への結合について平均１．４μＭと算出された。ＰＨ１−ＩｇＧ１（８．７ｎＭ）の平均結合活性をＢＩＡｃｏｒｅソフトウェアで低密度表面での結合曲線から算出したところ、８．３ｎＭ（１５−ｍｅｒ）及び９．０６ｎＭ（６０−ｍｅｒ）であった。ＰＨ１−ＩｇＧ１抗体の結合親和性は親Ｆａｂ ＰＨ１抗体分子よりも１００倍を上回る強さであることが見出された。
【０１６５】
競合フローサイトメトリー分析
ＭＵＣ１抗体の微細特異性の相違が、認知されている組織及び腫瘍のパネルの相違につながり得るため、ＰＨ１−ＩｇＧ１抗体を頻繁に用いられるネズミ抗体、ＨＭＦＧ１と比較した。ＰＨ１ Ｆａｂのエピトープ・フィンガープリント法によって決定されるようにＰＨ１−ＩｇＧ１はＰＡＰエピトープを認識し（上記実施例１；Ｈｅｎｄｅｒｉｃｋｘ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５８：４３２２４−４３３２ （１９９８））、これに対してＨＭＦＧ１はＰＤＴＲ（配列番号７のアミノ酸９−１２）エピトープを認識する。これら２種類の抗体をフローサイトメトリーにおいて種々の腫瘍細胞系で試験した。両抗体は、明らかにＨＭＦＧ１エピトープよりも多くのＰＨ１−ＩｇＧ１エピトープを露出する卵巣癌細胞系ＯＶＣＡＲ−３を除いて、ほとんどの細胞系に同じ結合パターンで結合した。両抗体はＬＳ１７４Ｔ大腸腫瘍細胞系及びＴ細胞系Ｊｕｒｋａｔの小部分集団に結合し、これはＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒで阻害されうる。ＣａＣｏ２大腸細胞系への結合は観察されなかった。細胞へのＭＵＣ１の結合は、競合が定量的ではないように思われはするが、ＭＵＣ１ペプチドで競合排除することができた。
【０１６６】
この研究は、様々なＭＵＣ１エピトープの広がり及び／若しくは密度における相違又は残留グリコシル化によるこれらのエピトープの接近可能性の格差の存在を示す。ＰＨ１−ＩｇＧ１ ＭＵＣ１エピトープの豊富さを理解するため、組織及び腫瘍の多数のセットに対して免疫組織化学分析を実施する必要があった（下記参照）。
【０１６７】
ＰＨ１−ＩｇＧの免疫組織化学分析
免疫組織化学分析を組織及び腫瘍の多数のセットに対して行った（下記表１０を参照）。腫瘍細胞におけるＭＵＣ１局在性の一般的な程度（「染色」）は、（最大染色から最小染色へ）脱分極細胞質（ｃ）＞全細胞の多量膜染色（ｍ）＞分極頂端（ａ）であり、これに対して、正常組織においては局在化パターンはａ＞ｃ＞ｍであった（表１０を参照）。加えて、染色反応性は正常組織よりも腫瘍組織において高かった（データは示さず）。
【０１６８】
【表１０】
2004500828.tif 000015
2004500828.tif 000016
2004500828.tif 000017
様々な組織におけるＰＨ１−ＩｇＧ抗体を用いるＭＵＣ１の局在化の研究の要約を以下に記す。
【０１６９】
正常膀胱は試験した事例において陰性であった。膀胱の腫瘍組織は異なる染色パターンを有し、両腺癌組織は分極染色パターンを有していた。大腸癌、正常組織、及び扁平上皮癌は陰性であった。この研究において試験した粘液性腫瘍は脱分極細胞質染色を示した。子宮内膜において、幾つかの正常組織は脱分極局在化を示した。正常腎臓においては染色パターンは常に同じであり、糸球体及び近位尿細管において染色はなく、遠位尿細管において限局性頂端染色があり、また集合尿細管において散在性頂端染色があった。対照的に、肺組織では、正常肺（陰性）、及び肺の腺癌は分極して強くＭＵＣ１陽性であった。ほとんどの腫瘍において、全細胞膜の広範な染色が見出された。
【０１７０】
組織当たり全ての腫瘍細胞が抗体と反応したわけではない（すなわち、限局性の染色が観察された）。乳癌及び卵巣癌組織においては正常と腺癌の間に染色の格差が存在し、正常においては分極し、腺癌においては膜染色を伴う細胞質性であった（乳癌について６／６、卵巣癌について４／７）。染色の強度は腫瘍組織よりも正常組織のほうが小さかった。反応性は腫瘍組織において散在性から限局性であり、正常組織においては限局性であった。
【０１７１】
膵臓癌は細胞質染色パターンを有していた。正常腺房は頂端にＭＵＣ１を発現し、外分泌腺は極性染色又は細胞性染色を示した。子宮内膜及び皮膚の皮脂腺の正常組織においては、ＭＵＣ１の脱分極染色パターンが観察された。過ヨウ素酸塩処理正常乳房上皮は非処理組織よりも僅かに強く染色され、これは、予想通り、脱グリコシル化がＰＨ１のエピトープを露出させることを示す。
【０１７２】
まとめると、上記研究は、膀胱、肺、乳房、卵巣、膵臓、副甲状腺、及び前立腺組織において正常組織と腫瘍との間にＭＵＣ１の発現の格差が見出されたことを示した。頂端染色は正常組織に加えて腫瘍組織において見出され、脱分極細胞性（細胞質性）染色は腫瘍において最も高頻度に検出され、全細胞膜の異常染色は、皮膚の皮脂腺を除いて、腫瘍においてのみ見出された。
【０１７３】
限定量の組織に対するネズミＨＭＦＧ１抗体との比較を表１１に示す。正常組織は、ＰＨ１−ＩｇＧ１で細胞質染色を示す子宮内膜組織を除いて、主として限局的頂端性に染色された。腫瘍においては、免疫反応性に小さな差異が見られたが、これは組織の多数のパネル（大パネル）で確認することができる。
【０１７４】
【表１１】
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共焦点顕微鏡を用いるＰＨ１−ＩｇＧ１のインターナリゼーションの評価
結合後にＰＨ１−ＩｇＧ１がインターナリゼーションする程度を分析するため、ＦＩＴＣ標識抗体を用いるインターナリゼーション研究を行った。ＦＩＴＣ標識抗体はＦＡＣＳ分析においてＯＶＣＡＲ−３及びＥＴＡ細胞系に結合し、陰性３Ｔ３細胞系には結合しなかった（データは示さず）。ヒト抗体ＰＨ１−ＩｇＧ１と共に氷上で１時間インキュベートした後、ＭＵＣ１発現ＯＶＣＡＲ−３及びＥＴＡ細胞系で膜結合を観察した。フローサイトメトリーと同様に、染色の強度はＯＶＣＡＲ−３細胞系と比較してＥＴＡ細胞系でより顕著であった。ＣａＣｏ２陰性対照細胞系では自己蛍光は観察されず、蛍光は不可視であった。３７℃で、ＥＴＡ細胞及びＯＶＣＡＲ−３細胞の両者についてＰＨ１−ＩｇＧ１−ＦＩＴＣのインターナリゼーションが可視化された。１時間後、５０％を上回るＯＶＣＡＲ−３細胞が小胞中に抗体をインターナリゼーションさせ、これに対してＥＴＡ細胞は主として膜結合抗体を有していた。３時間のインキュベーションの後、８０％を上回るＦＩＴＣ標識抗体がＯＶＣＡＲ−３細胞によってインターナリゼーションした。小胞は可視であったが、低レベルの細胞内蛍光を示す細胞も可視であった。６時間後、全てのＯＶＣＡＲ−３細胞が抗体をインターナリゼーションさせ、ほとんどの細胞が小胞インターナリゼーションパターンを失って弱い細胞質蛍光のみを示した。３又は６時間で、氷上に保持したＯＶＣＡＲ−３細胞は依然として膜のみに結合した抗体を有していた。ＥＴＡ細胞は３時間後に３％未満の抗体をインターナリゼーションさせたが、一晩インキュベートした後、生存細胞は抗体をインターナリゼーションさせ、膜結合抗体は残っていなかった。対照的に、一晩氷上に保持した細胞は膜染色を示した。
【０１７５】
分析
この研究は、ＭＵＣ１特異的Ｆａｂ抗体ＰＨ１のＶＨ及びＶＬ領域をｔｗｏベクター（ｔｗｏ−ｖｅｃｔｏｒ）、新規の完全ヒト全ＩｇＧ１を産生するための哺乳動物細胞発現系に再クローニングすることによって形成される、ＰＨ１ Ｆａｂ親抗体と比較してＭＵＣ１に対する親和性が大きく増強されている組換え抗ＭＵＣ１抗体の特性決定を行う。ＣＨＯ−Ｋ１細胞における他の抗体の産生（概説として、Ｔｒｉｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．， ６：５５３−５６０ （１９９５）を参照）と比較したときの幾らか少ない収量は、おそらく、軽鎖及び重鎖の発現の格差と培養条件の最適化を行っていないことによると考えられる。それにもかかわらず、産生した量は上述の様々な研究室内試験用の抗体の小規模産生に十分である。免疫療法には、特定の抗体が特定の治療に適合するかどうか、又はその逆を決定するため、特には、全てのＭＵＣ１抗体が同じ挙動を示さないため、このような特性決定は重要である（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．， １９ Ｓｕｐｐｌ． １：８８−９９ （１９９８）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｏｔｈｅｒ．， ４４：３２３−３２８ （１９９７））。
【０１７６】
第１に、抗体の親和性は、いかに迅速に腫瘍細胞に結合するか、及び抗原担持腫瘍細胞からいかに迅速にそれ自体を放出するかを確立する上での主要決定因子の１つである。この研究においては、新たに作製した抗体の結合活性をＢＩＡｃｏｒｅにおいて元のＦａｂの親和性と比較した。ＰＨ１ Ｆａｂ及びＰＨ１−ＩｇＧの結合活性はそれぞれ１．４μＭ及び８．７ｎＭであり、これは完全ヒト抗体（ＰＨ１−ＩｇＧ１）について１００倍の増加を示す。この結合活性の変化は、６０−ｍｅｒ及び１５−ｍｅｒチャンネルでの結合が同程度であるため、単に１つの結合部位から２つの結合部位への変化のためである。一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）から得られたダイアボディと異なる親和性を有するＥｒＢ２との比較は、二価分子に対する見かけの解離速度定数（Ｋｄ）の低下の大きさがｓｃＦｖの親和性に反比例することを示した（Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ． Ｒｅｓ．， ６０：６４３４−６４４０ （２０００））。ＰＨ１ Ｆａｂ抗体は比較的低い親和性を有し、対応するＰＨ１−ＩｇＧ分子の見かけの親和性の増加は非常に大きく、上記Ｎｉｅｌｓｅｎの観察結果を証明するものである。フローサイトメトリー分析において、ＰＨ１−ＩｇＧ１を、異なるグリコシル化感受性ＭＵＣ１エピトープを認識することが報告されているＨＭＦＧ１（Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．， １９９８；Ｂｕｒｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．， ２； １５５−１６２ （１９９３））と比較した。腫瘍細胞系に対する結合パターンは、おそらくは異なるエピトープ認識のためにＨＭＦＧ１によってはほとんど染色されなかったＯＶＣＡＲ−３細胞系を除いて、両抗体が大きく異なることはなかった。大腸癌細胞系では、両抗体とも結合をほとんど示さなかった。大腸癌細胞は高度にグリコシル化をうけることができ、グリコシル化感受性抗体はこのグリコシル化大腸ムチンをほとんど染色することがない（Ｓｉｋｕｔ ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．， １９ Ｓｕｐｐｌ． １：１２２−１２６ （１９９８）；Ｂｌｏｃｋｚｊｉｌ ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．， １９ Ｓｕｐｐｌ． １： ４６−５６ （１９９８））。これは、抗体ＰＨ１−ＩｇＧ１が、腫瘍関連であることが予想されるグリコシル化が低減した形態のＭＵＣ１を認識することを示唆する。ＲＰＡＰエピトープと結合する抗体Ｃ５９５は、ＦＡＣＳ分析において、ＨＭＦＧ１と同じパターンでＯＶＣＡＲ−３及びＭＣＦ−７細胞と反応し（Ｒｅｄｄｉｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．， １９ Ｓｕｐｐｌ． １：５７−６６ （１９９８））、したがって、ＰＨ１−ＩｇＧ１とも反応する。これらの抗体は、ＭＵＣ１の異なる糖鎖付加形態を発現することが知られるＴ４７Ｄ乳癌細胞系と良好に結合した（Ｈａｎｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ２３６：３１８−３２７ （１９９６））。正常乳房組織に対する過ヨウ素酸塩の使用は、ＭＵＣ１のタンパク質コア上のエピトープを認識する多くの抗体と同様に、この抗体のグリコシル化感受性を確証する頂端染色を強化した（Ｃａｏら、１９９８）。
【０１７７】
免疫組織化学的染色は腫瘍組織と正常組織との間の染色の差異を明らかにし、グリコシル化感受性抗体について説明されるように、正常組織においては頂端であるか存在せず、腫瘍組織においては分極している（Ｚｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｖ．， １１−１２：５６−１０１ （１９８８）；Ｃａｏら、１９９８）。卵巣及び乳房の正常組織においては、染色はしばしば不均一であり（ｆ）、腫瘍の染色ほど強くはない。乳房及び卵巣腫瘍においては、染色は散在性であるか不均一であり、６／６の乳癌及び４／７の卵巣癌において強い膜染色が見出された。したがって、ＭＵＣ１は細胞膜上に遍在的に存在する。膀胱及び肺においては、腫瘍組織と正常組織との相違が最も大きい。正常組織においては、試験したＰＨ１−ＩｇＧ１エピトープは存在しない。これは、正常肺及び膀胱組織におけるＭＵＣ１コアタンパク質のＰＤＴＲ（配列番号７のアミノ酸９−１２）領域を認識するモノクローナル抗体との弱く限局的な陽性反応性の知見と対照的である（Ｚｏｔｔｅｒら、１９８８；Ｗａｌｓｈら、Ｂｒ． Ｊ． Ｕｒｏｌ．， ７３：２５６−２６２ （１９９４））。腫瘍組織においては、肺及び膀胱の両者において、ほぼ限局的な反応性で不均一な染色が観察された。全ての腺癌組織において、ＰＨ１−ＩｇＧ１エピトープは非極性様式で発現する。
【０１７８】
ＰＨ１エピトープの染色パターンが他のグリコシル化感受性抗体の染色パターンとは異なるものの（Ｚｏｔｔｅｒら、１９８８）、幾つかの場合において、ＰＨ１−ＩｇＧ１は期待を満たすか又はそれを越えさえする。免疫組織化学染色パターンは、フローサイトメトリーと同様に、抗体ＰＨ１−ＩｇＧ１が実際に、腺癌において脱分極様式で多量に発現するグリコシル化が低減した腫瘍関連ＭＵＣ１に結合することを支持する。ＭＵＣ１直列反復配列のエピトープを認識するこのような抗体はネズミ（誘導）抗体について記述され、ヒトにおけるターゲッティング研究において用いられ成功を収めている（ｖｏｎ Ｈｏｆ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５６５：５１７９−５１８５ （１９９６）；Ｂｉａｓｓｏｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ， ７７：１３１−１３８ （１９９８）；Ｋｒａｍｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ４：１６７９−１６８８ （１９９８））。
【０１７９】
ペプチドエピトープがＰＡＰ（配列番号　）であるものの、ＰＨ１−ＩｇＧ１はグリコシル化が低減したＭＵＣ１に特異的かつ選択的に結合する。Ｓｐｅｎｃｅｒら（Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ．， １００：１１−１５ （１９９６））は、抗体結合に対するグリコシル化の影響を最小エピトープＲＰＡＰ（配列番号７のアミノ酸１２−１５）を認識するそれらの抗体を用いて研究し、この抗体がグリコシル化によって明確に影響を受けるものと結論付けた。これは、ＰＤＴＲ（配列番号７のアミノ酸９−１２）モチーフを認識する抗体と対照的である。これは、ＰＨ１−ＩｇＧの異なる微細特異性を説明し得る。Ｆａｂ抗体ＰＨ１を、ファージディスプレイ技術、ＥＴＡ細胞での２ラウンドの選択及びＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒでの３ラウンドの選択によって選択した（実施例１を参照）。おそらく、抗体を選択した方法により、それは直列反復配列のグリコシル化が低減したエピトープＰＡＰへの結合を支持する。
【０１８０】
これらのデータは、ＰＨ１−ＩｇＧ抗体が、ほとんどの場合ＰＨ１−ＩｇＧ１エピトープが脱分極様式で腫瘍細胞上に存在する（表１１におけるｃ、ｍ）膀胱癌、肺癌、乳癌、及び卵巣癌におけるターゲッティング用ツールとして特に有用であることを示す。不均一（限局性）発現の可能性のため、ＰＨ１−ＩｇＧ抗体は、周辺腫瘍細胞に対する傍観者効果を有する免疫療法、例えば、放射免疫療法、放射免疫療法とイムノトキシンとの組合せ（例えば、Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ６：６３１−６４２ （２０００）を参照）において、又は腫瘍浸潤性リンパ球を刺激する融合タンパク質の使用（例えば、Ｌｏｄｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． Ｔｈｅｒａｐ．， ８０：２７７−２９２ （１９９８）を参照）において用いることができる可能性がある。腫瘍細胞の膜上でのＰＨ１−ＩｇＧ１エピトープの大量の発現は不均一に広がる。それらの膜上の大量のＭＵＣ１のため、これらの細胞はＰＨ１−ＩｇＧの優れた標的を提供する。ここでもやはり、傍観者効果を有する治療におけるＰＨ１−ＩｇＧの使用が支持される。
【０１８１】
インターナリゼーション研究は、ＦＩＴＣ標識抗体がＯＶＣＡＲ−３及びＥＴＡ細胞によって、異なる速度ではあるものの、インターナリゼーションすることを示した。最初に、インターナリゼーションパターンは小胞においてほぼ独占的であった。後には、小胞構造は大量には存在せず、僅かな染色が細胞質において見出された。これは、抗体が破壊されて遊離したＦＩＴＣが細胞質中に放出されたためか、又はＦＩＴＣそれ自体の修飾及びその蛍光の消失のためである可能性があった。３７℃で１時間後、半分を上回るＯＶＣＡＲ−３細胞が蛍光性小胞を示し、これは抗体が小胞内に急速にインターナリゼーションしたことを意味する。ＭＵＣ１抗原は１分当たり０．９％の表面画分を再利用することが記述されている（Ｌｉｔｖｉｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６８：２２１３６４−２１３７１ （１９９３））。この研究は、１時間で５０％を上回る細胞が抗体をインターナリゼーションさせているというこの観察結果（データは示さず）を確証する。
【０１８２】
ＭＵＣ１抗体のインターナリゼーションは常に同じではなく、エピトープに依存する可能性がある。Ｐｉｅｔｅｒｓｚら（１９９７）は２種類の抗体をそれらのインターナリゼーション速度について比較し、ＭＵＣ１エピトープＲＰＡＰ（配列番号７のアミノ酸１２−１５）（ＣＴＭ０１）に特異的な抗体はＰＤＴＲ（配列番号７のアミノ酸９−１２）エピトープに特異的な抗体よりも良好にインターナリゼーションした。ペプチドエピトープＰＡＰでアッセイしたとき、ＰＨ１−ＩｇＧ抗体は同様のインターナリゼーション速度を有するように思われる。ＭＵＣ１トランスフェクト３Ｔ３細胞系、ＥＴＡは、ＦＩＴＣ標識抗体をよりゆっくりとインターナリゼーションさせる。一見して、これは、マウス細胞が通常はヒトＭＵＣ１を発現せず、かつインターナリゼーション機構がこの異種化タンパク質に有効ではないという事実によるものと考えられた。幾つかのトランスフェクト細胞系は他のものよりも良好にインターナリゼーションさせることができた（例えば、Ｐｉｅｔｅｒｓｚら、１９９７を参照）。このインターナリゼーションのため、ＰＨ１−ＩｇＧ抗体を様々な治療及び組合せにおいて、例えば、プロドラッグ、薬物、遺伝子治療を用いる免疫療法（このような様々な治療の概説として、Ｓｙｒｉｇｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ， １８：２１９−２２４ （１９９９）を参照）、及び、放射標識のインターナリゼーションを常に必要としなくてもよい放射免疫療法に用いることができる。
【０１８３】
結論として、ヒト抗体ＰＨ１−ＩｇＧ１は腺癌上の腫瘍関連ＭＵＣ１を認識することが示された。その親和性は腫瘍細胞に結合するのに十分な強さであり、ＦＩＴＣ標識抗体が再利用ＭＵＣ１によってインターナリゼーションし得るため、特には肺癌、膀胱癌、卵巣癌、及び乳癌における、治療及び診断用腫瘍ターゲッティング用途の候補分子である。
【０１８４】
上で引用される全ての文献及び刊行物は参照により本明細書に組み入れるものとする。
【０１８５】
本明細書に記載の本発明の他の変形及び実施形態は、本発明の範囲又は特許請求の範囲の精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図１】
二価ダイアボディｂｉｖＰＨ１及びｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２免疫サイトカインを構築するためのクローニング手順の模式図（Ａ〜Ｄ）を示す。図１Ａは、ベクタープラスミドｐＣＥＳ１におけるＰＨ１ Ｆａｂ遺伝子の開始部位を示す模式図である。図１Ｂは、プラスミドベクターｐＣａｎｔａｂ６へのＰＨ１ ＶＨ及び制限部位のクローニングを示す模式図である。図１Ｃは、プラスミドベクターｐＫａＰａ１からｂｉｖＰＨ１ダイアボディを回収するためのＰＨ１ ＶＬの挿入を示す。図１Ｄは、ＩＬ−２コード配列を挿入して二価免疫サイトカインｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２を回収することによるプラスミドｐＫａＰａ２の構築の模式図を示す。
略語：ｐＬａｃＺ（ＬａｃＺプロモーター）、ｒｂｓ（リボソーム結合部位）、Ｓ（シグナル配列）、ＰＨ１ＶＨ（ＦａｂフラグメントＰＨ１の重鎖可変領域）、ＰＨ１ＶＬ（ＦａｂフラグメントＰＨ１の軽鎖可変領域）、Ｈ（６つのヒスチジンをコードするタグ）、ｔａｇ（ｍｙｃ−タグ配列）、＊（終止コドン）、Ｌ１（５アミノ酸からなるＬ１リンカーペプチドをコードするリンカー１ヌクレオチド配列）、Ｌ２（９アミノ酸からなるＬ２リンカーペプチドをコードするリンカー２ヌクレオチド配列）。
【図２】
ＢＩＡｃｏｒｅにおける種々の形態の抗体の結合特性を示すグラフである。
略語：白抜三角△（ｓｃＦｖ １０Ａ）、白抜丸○（Ｆａｂ ＰＨ１）、白抜四角□（二価ダイアボディｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２）。ＭＵＣ１ ８０−ｍｅｒは、９０応答ユニット（ＲＵ）の密度でチップに結合させ、３つのＭＵＣ１抗体の結合を測定した。
【図３】
図３Ａ及び３Ｂは、フローサイトメトリーにおける、抗体ｓｃＦｖ １０Ａ、ＰＨ１ Ｆａｂ、ｂｉｖＰＨ１ダイアボディ、ｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２免疫サイトカインの、細胞系３Ｔ３、３Ｔ３ ＭＵＣ１トランスフェクト細胞系ＥＴＡ、ＯＶＣＡＲ−３、Ｔ４７Ｄ及びＬＳ１７４Ｔへの結合の比較を示す。種々の細胞系に対する抗体の結合特性は、重畳（ｏｖｅｒｌａｙｅｄ）ヒストグラムで示す。細胞に対する抗体の結合強度は、ＦＩＴＣ標識抗体を用いた二次染色により測定し、蛍光を測定した（ＦＬ１−Ｈ）。染色細胞数を測定した（ＣＯＵＮＴＳ）。
実線は抗体の結合を示し、一点鎖線は陰性対照を示し（３Ｔ３ ＭＵＣ１トランスフェクト細胞系ＥＴＡの場合には、陰性対照は非トランスフェクト細胞系３Ｔ３とした）、破線はＭＵＣ１ ６０−ｍｅｒを用いた細胞結合に対する競合を示す。
【図４】
放射性３Ｈ−チミンの取り込みを利用して毎分放射能数（ｃｐｍ）を測定した、ｒＩＬ−２（白抜丸）及びｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２（白抜四角）によるＣＴＬＬ−１６増殖の誘導の結果を示す。
【図５】
３Ｈ−チミジン取り込みアッセイにより測定した、ＭＵＣ１添加又は無添加におけるｒＩＬ−２又はｂｉｖＰＨ１−ＩＬ−２による休止ＰＢＬの刺激結果を示す図である。培地単独（柄棒）、ＭＵＣ１無添加におけるＰＨＡ（白棒）、ＭＵＣ１添加におけるＰＨＡ（斜線棒）。３Ｈ−チミジンの取り込みは、毎分放射能数（ｃｐｍ）で測定した。
【図６】
休止ＰＢＬエフェクター細胞（Ｅ）による、抗体でコーティングしたＯＶＣＡＲ−３標的細胞（Ｔ）を用いた５１クロム放出アッセイの結果を示す図である。Ｅ：Ｔ比＝１００：１（柄棒）、５０：１（白棒）、２５：１（横線棒）、１２．５：１（斜線棒）。ＯＶＣＡＲ−３標的細胞の溶解率（％）は、１００×（試験５１Ｃｒ放出ｃｐｍ−最小５１Ｃｒ放出ｃｐｍ／最大５１Ｃｒ放出ｃｐｍ−最小５１Ｃｒ放出ｃｐｍ）により算出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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