(57)【要約】本発明は、間にスペーサーを有するビタミンＢ１２ （ＶＢ１２）にカップリングした粒状キャリヤー系に装填される薬剤、治療用タンパク質／ペプチド、およびワクチンの経口送達のための新規な複合体であって、スペーサーを有するキャリヤー系が式 ＶＢ１２−Ｒ′／Ｒ″−Ｎ（式中、Ｒ′またはＲ″はスペーサーおよび／またはＮＨ２またはＣＯＯＨまたはＳＨ基を供給するためのＶＢ１２の誘導体形成のための薬剤であり、Ｎは注射可能な薬剤、治療用タンパク質／ペプチド、およびワクチンの送達のための微粒子またはナノ粒子キャリヤーである）を有する複合体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
間にスペーサーを有するビタミンＢ１２ （ＶＢ１２）にカップリングした粒状キャリヤー系に装填される薬剤、治療用タンパク質／ペプチド、およびワクチンの経口送達のための新規な複合体であって、スペーサーを有するキャリヤー系が式 ＶＢ１２−Ｒ′／Ｒ″−Ｎ（式中、Ｒ′またはＲ″はスペーサーおよび／またはＮＨ２またはＣＯＯＨまたはＳＨ基を供給するためのＶＢ１２の誘導体形成のための薬剤であり、Ｎは注射可能な薬剤、治療用タンパク質／ペプチド、およびワクチンの送達のための微粒子またはナノ粒子キャリヤーである）を有する複合体。
【請求項２】
送達しようとする薬剤が非経口経路のみによって投与される在来の薬剤、治療用ペプチド／タンパク質、ヘパリンおよび免疫用のワクチンのような他の生物薬剤である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
送達しようとする薬剤がゲンタマイシンおよびアミカシンから選択される非経口経路のみによって投与される在来の薬剤、インスリン、ＥＰＯ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＩＩＩ因子、ＬＨＲＨ類似体およびインターフェロンから選択される治療用ペプチド／タンパク質、ヘパリン、および「Ｂ」型肝炎表面抗原、腸チフスおよびコレラワクチンから免疫用に選択されたワクチンのような他の生物薬剤である、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
キャリヤー系が、非経口的に投与される薬剤／ワクチンと共に装填される生物分解性ポリマー粒状キャリヤーに結合するＶＢ１２またはその類似体、またはそれらの誘導体を含んでなる薬学上許容可能なキャリヤーである、請求項１に記載の複合体。
【請求項５】
天然摂取ＶＢ１２による回腸またはその付近における受容体依存性エンドサイトーシスの後に、キャリヤー系がトランスサイトーシスを受ける、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
ＶＢ１２が全身的および／またはリンパ球の運命に対する腸のターゲッティングリガンドである、請求項１に記載の複合体。
【請求項７】
ＶＢ１２が天然シアノコバラミン（ｃｙｎｏｃｏｂａｌａｍｉｎｅ）（ＶＢ１２）またはＶＢ１２の様々な類似体、すなわちアココバラミン（ａｑｕｏｃｏｂａｌｉｍｉｎ）、アデノシルコバラミン、メチルコバラミン、ヒドロキシコバラミン、および／またはそれらの誘導体、またはアルキルコバラミンであって、アルキル鎖がＶＢ１２のコバルトに連結しているもの、またはクロロ、スルフェート、ニトロ、チオを有するシアノコバラミン（シアノコバラミン）、またはそれらのアナリド（ａｎａｌｉｄｅ）、ＶＢ１２のエチルアミド、プロピオンアミド、モノカルボン酸、およびジカルボン酸誘導体、およびその類似体、またはモノカルボキシＶＢ１２の「ｅ」異性体のモノカルボン酸、ジカルボン酸およびトリカルボン酸誘導体、およびプロミナミド誘導体、およびＶＢ１２の類似体であってコバルトがこれらの誘導体に結合した他の金属（亜鉛またはニッケルなど）および様々なスペーサーによって置換されているもの、または生物分解性粒状キャリヤーにカップリングした後にＩＦ親和性を保持している誘導体である、請求項１に記載の複合体。
【請求項８】
ＶＢ１２の誘導体がＶＢ１２のリボソーム残基の第一５′−ヒドロキシルおよび２′−ヒドロキシル基および粒状キャリヤーとのカップリングに有用なこの部位で結合した様々なスペーサーの誘導体形成をも含む、請求項７に記載の複合体。
【請求項９】
ＮＨ２またはＣＯＯＨまたはＳＨ基およびそれらの組合せの供給を目的とするＶＢ１２の誘導体形成のためのスペーサーおよび／または薬剤であるＲ′〜 Ｒ″が、二酸またはアルキル二酸（ＣＯＯＨ−ＣＯＯＨ， （ＣＯＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＯ））、アルキルジアミン（（ＣＨ２）ｎＣＯＯ−ＮＨ２）、またはアルキルジアミド（ＮＨＣＯ（ＣＨ）ｎＣＯＮＨ２）、またはヒドラジド（ＮＨ２ＮＨ２）、またはアルキルジヒドラジド（ＮＨ２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＮＨ２）、または置換ＳＨ基を含む薬剤（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートまたはその長鎖アルキル誘導体、または酸無水物［（ＣＨ）ｎＣＯＣＯＯ）］ 、または酸ハロゲン化物スペーサー（Ｒ（ＣＨ２）ｎＣＯＣｌ）、またはアンヒドロキシ活性化エステル官能基（ＮＨＳ）であって、ペプチド結合または界面活性剤誘導体またはポリマー性スペーサーに用いられるものから選択され、総ての場合に「ｎ」は１、２、３、．．．無限大の整数である、請求項１に記載の複合体。
【請求項１０】
微小球またはナノ粒子が生物分解性であり且つ薬学上許容可能なポリマーから構成されている、請求項１に記載の複合体。
【請求項１１】
薬剤を装填したポリマー粒子がイン・ビボで分解して、生物活性応答に対してタンパク質医薬品／ワクチンを放出して送達する、請求項１に記載の複合体。
【請求項１２】
粒状キャリヤーが表面ＣＯＯＨ、無水物、ＮＨ２、ＳＨ基およびそれらの組合せを含む生物分解性、疎水性または親水性ポリマー微小球／ナノ粒子である、請求項１に記載の複合体。
【請求項１３】
粒状キャリヤー系がモノリシック（マトリックス型、架橋）および／または貯蔵所型（マイクロカプセルおよびナノカプセル）または多粒子型（粒子中粒子）であるか、リガンドＶＢ１２のポリマーへの共付加によって形成される粒子、すなわち共役ポリマー粒子である、請求項１に記載の複合体。
【請求項１４】
粒状キャリヤーが、多糖類ポリマー、すなわち澱粉およびそれらの誘導体、ペクチン、アミロース、グアールガムおよびそれらの誘導体、様々な分子量のデキストランおよびそれらの誘導体、キトサンおよびそれらの誘導体、コンドリオタン硫酸およびそれらの誘導体、および最後に多糖類およびそれらのポリマーの他の天然および半合成誘導体を包含する、請求項１に記載の複合体。
【請求項１５】
多糖類の架橋剤が、エピクロルヒドリン、ＰＯＣｌ３、ホウ砂（グアールガム）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、および多糖類ポリマーに架橋して粒状キャリヤーを生成する他の架橋剤を包含する、請求項１４に記載の複合体。
【請求項１６】
親水性の少ない〜疎水性の粒状キャリヤーが、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリラクチド（コグリコール酸）、（フマル酸：セバシン酸、およびポリフマル酸）のポリ（無水物）微小球、およびポリ（ラクチド（コグリコリド）の生物分解性ポリマー、脂肪族アシル化粒子（脂肪族アシル層によって囲まれた親水性コア）、ＬＤＬキャリヤー、多粒子系（異なる親水性または疎水性のポリマーに封入されたポリマー粒子）、および最後にこれらのポリマーの様々な組成物を包含する、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１７】
粒状キャリヤーがアルブミン、ゼラチンのような天然タンパク質ポリマー、半合成またはペプチド基剤の合成ポリマー、およびそれらの誘導体をも包含する、請求項１に記載の複合体。
【請求項１８】
塩化テレフタロイル、グルタルアルデヒドのような架橋剤、およびタンパク質ポリマーを架橋して粒状キャリヤーを生成する架橋剤である、請求項１５に記載の複合体。
【請求項１９】
グルタルアルデヒドのようなモノマーのポリ（グルタルアルデヒド）への重合によって成形される粒子、およびモノマーの重合およびそれらのＶＢ１２．へのカップリングによって形成される粒子である、請求項１に記載の複合体。
【請求項２０】
薬剤、タンパク質およびワクチンの全身送達の系の粒度が数ナノメートル〜１０μｍ以上である、請求項１に記載の複合体。
【請求項２１】
ＶＢ１２結合および／または複合体形成に適するように表面が改質されまたは活性化されている粒子系である、請求項１に記載の複合体。
【請求項２２】
粒子系がＶＢ１２で表面改質されており、ＶＢ１２の生物分解性粒状キャリヤーへのカップリングを包含する、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２３】
ＶＢ１２誘導体と粒子とのカップリングが間にスペーサーを有するおよび持たない生物分解性および非生物分解性結合を包含する、請求項２１に記載の複合体。
【請求項２４】
ＶＢ１２誘導体と粒状キャリヤーまたは表面改質した／活性化した粒子とのカップリングが、１−エチル＝３，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）または１，１′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）またはＮ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）のようなカルボジイミドと他のペプチドカップリング剤を用いるアミド結合、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化カップリング（ＮＨＳ）、または過ヨウ素酸塩カップリング、またはグルタルアルデヒド活性化カップリング、またはＣＮＢＲ依存性カップリング、または酸ハロゲン化物によって誘導されるアミドカップリングによるか、または親水性スペーサーエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）または疎水性スペーサージスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）の使用によるか、またはＮ−スクシンイミジル＝３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびＶＢ１２に対するＩＦ親和性を保持する任意の接合体を用いるチオール開裂可能なスペーサーによる、請求項１に記載の複合体。
【請求項２５】
カップリングが物理的吸着型または複合体形成を伴う、請求項１に記載の複合体。
【請求項２６】
薬剤、治療用ペプチド／タンパク質、およびワクチンが高濃度のＶＢ１２と生物カップリングした分解性粒状キャリヤー内に閉込められている、請求項１に記載の複合体。
【請求項２７】
所期の生物活性薬剤の装填工程が、粒状球の調製の際または粒子とＶＢ１２とのカップリングの際に予備成形した粒状キャリヤー接合体中またはキャリヤー内で行う、請求項２５に記載の複合体。
【請求項２８】
送達しようとする生物活性薬剤を、１） 接合前／後／中に物理的に粒子中に閉込め、２） 吸着し、または３） 共有結合的にカップリングし、または４） イオン的相互作用、または５） 複合体形成およびＶＢ１２粒子系を装填するための任意の他の方法を行う、請求項２６に記載の複合体。
【請求項２９】
界面活性剤、凝集抑制剤、プロテアーゼ阻害剤、および浸透エンハンサーを処方物のアジュバントとして用いる、請求項１に記載の複合体。
【請求項３０】
送達系を、特に内因子（ＩＦ）欠損種についてＶＢ１２の外来ＩＦと共に同時投与する、請求項１に記載の複合体。
【請求項３１】
複合体が注射用薬剤、治療用タンパク質／ペプチド、およびワクチンの経口送達のためのものである、請求項１に記載の複合体。
【請求項３２】
上記送達系を経口送達に適する投薬形態に処方する、請求項１に記載の複合体。
【請求項３３】
経口投薬形態が、溶液、懸濁液、ゲル、ペースト、エリキシル、粘稠なコロイド分散液、錠剤、カプセル、および／または経口制御放出型、および最後に経口経路のための任意の送達形態を包含する、請求項３２に記載の複合体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
本発明は、間にスペーサーを有するビタミンＢ１２（ＶＢ１２）にカップリングした粒状キャリヤー系に装填される薬剤、治療用タンパク質／ペプチド、およびワクチンの経口送達のための複合体である。典型的には、ＶＢ１２は腸を介するエンドサイトーシスのリガンドとして作用し、粒状系は腸内で不安定な薬剤を保護しそれらを全身の送達先および／または必要とされる特異的部位に送達するための積荷として作用する。
【０００２】
背景技術
多くのペプチド／タンパク質、医薬品およびワクチンは現在は注射によって投与されるが、この送達法は多数の欠点を有しており、科学界はこれらの生物薬剤の代替経口送達系を開発すべく努力している。非経口送達の本来の限界としては、（１）患者の従順さ（これらの分子の半減期が短いため繰り返し注射を行う必要がある）、（２）繰り返し行われる長期間の投薬計画の必要によって引起されるこの形態の送達による不快さ、（３）皮下インスリンなどの分子に対する患者内および間でのバイオアベイラビリティの変動が大きいこと、および（４）特に皮下注射の非生理学的送達パターンが挙げられる。更に、投薬および／または送達様式の変化によって送達される実際の薬剤が少し増加することにより、これらの生物活性薬剤のほとんどに対する所望な応答のダウンレギュレーションを引起すことがある。対照的に、ほとんどの場合には、正常な生理学的リズムを模する脈動性または平坦な送達プロフィールが必要である。上記の問題とは異なり、非経口ワクチンは、予防接種を繰返し行う必要があり且つそれらは体液性免疫のみを誘発するため、効力が限定されている。
【０００３】
上記の問題点を解決するために、様々な非侵襲的送達系が試みられてきた。これらの経路に共通する主要な送達バリヤーは、（１） 生物活性薬剤の粒度および親水性が大きいため固有透過性に乏しく、（２） 在来の薬剤の幾つかとは異なり管腔プロテアーゼおよび細胞ペプチダーゼによるＧＩＴの不都合な環境における酵素分解である。これらの確率は経口経路についてはすばらしいものであるが、便宜上、および患者の従順さ、並びに安全性、あまり緊要でない品質管理、治療費用、およびワクチンについては、制限のない頻度の増強の可能性に関して油点を有する。更に、経口ワクチンは、（局在化ｓＩｇＡを産生することによる）腸内病原体だけでなく、通常の普及した粘膜免疫応答を産生することによって他の粘膜（呼吸器および性器）に感染する広汎な病原体に対しても防御力を提供する。更に、経口ワクチンは年配者で特に有用であることを明らかにすることができ、粘膜免疫は、全身性免疫と異なり、年齢に関連した機能障害とは思われないからである。この様式の免疫は極めて若年層でも有益であることがあり、粘膜免疫は全身性免疫より個体発生で早く発現するからである。過去数十年に亙り、透過エンハンサー（ＺＯＴ、長期使用で毒性を有することが明らかになっている）、酵素阻害剤、界面活性剤、エマルション、結腸をターゲットとする系、生物粘着系および粒子系を用いて経口タンパク質／ワクチン系を開発するため、かなりの努力が行われてきた。経口系を開発する試みは多いが、有望な治療薬の要求は、特に新規ペプチドの確認が増加し、バイオテクノロジー領域からの現存するタンパク質薬剤の生産が増加しており、高いままである。
【０００４】
ペプチド／タンパク質薬剤およびワクチンは、ほとんどが非経口経路で投与される。経口投与の問題点は、
１）腸の過酷な環境での消化管プロテアーゼによる上記生物活性薬剤の分解、
２）  それらの大きさが大きく、親水性であるため、腸での透過性の問題が生じ、
３）  これらの生物活性薬剤がもろいため、経口投薬形態として処方されることがなく、最後に
４）  それらのイン・ビボでの半減期が短いことである。
【０００５】
過去三〜四十年に亙り、エマルション、微小球、ナノ粒子、リポソームのような小胞キャリヤーのような様々な処方法を用い、透過エンハンサーおよびプロテアーゼ阻害剤を用いて、タンパク質−キャリヤー接合体により経口経路によってそれらを送達するため、努力が払われてきた。
【０００６】
最近、固有の透過性に乏しいという問題は、腸から循環に医薬品を輸送する特異的キャリヤー機構による送達によって克服することができることが示された。これに関して、Ｒｕｓｓｅｌｌ−Ｊｏｎｅｓおよび共同研究者ら［１９９４］は、全身循環へのＶＢ１２キャリヤーの内因子（ＩＦ）依存性摂取を妨げないやり方でこれらの生物活性薬剤をビタミンＢ１２（ＶＢ１２）とカップリングすることができることを見いだした。 ＬＨＲＨ（Ｒｕｓｓｅｌｌ − Ｊｏｎｅｓ １９９８）、インターフェロン（Ｈａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ ａｎｄ Ｊｅｎｓｅｎ−Ｐｉｐｐｏ ＰＰＯ， １９９６）、Ｇ−ＣＳＦおよびエリトロポエチン（Ｈａｂｂｅｒｆｉｅｌｄ， １９９６）の経口ＶＢ１２接合体では、幾つかの興味深い結果が得られている。しかしながら、このような接合体の経口送達は、ＶＢ１２の摂取が限定されており（１ナノモル／用量）、共有結合により生物活性が失われており、ＶＢ１２のＩＦ親和性が失われ（立体因子）、最後にこれらの接合体がＧＩＴ分解を受けやすいため、多くの他の生物活性薬剤では成功していない。上記の問題点を解決するため、本発明者らは、経口投与の後に回腸細胞によるＶＢ１２−ＩＦ−ＩＦＲリガンド依存性エンドサイトーシスによって全身循環へ標的設定することができる経口送達系（ＶＢ１２−球接合体）を作成すべく努力した。ＶＢ１２をコーティングしたポリスチレンナノ粒子（非生物分解性、疎水性）のイン・ビトロ輸送が、Ｃａｃｏ−２細胞培養物（Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｊｏｎｅｓ， １９９７， １９９９）で示された。しかしながら、輸送のレベルは、一般に他のポリマー粒子にまで敷衍することはできない。これは、疎水性材料が細胞表面の脂質二重層によって一層容易に吸収されるので、疎水性のような様々な物理化学的特性によって説明することができる。また、薬剤送達の必要条件の一つは、ナノ粒子の作成に用いるポリマーは全身環境中でまたは医薬分子を放出することによって生物活性応答を開始する酵素によって容易且つ徐々に分解されるものとすることである。従って、輸送研究について非生物分解性ポリマーの使用は、必ずしも一般の他の生物分解性ポリマーによる摂取を示すものではない。更に、親水性ペプチド／タンパク質またはワクチン生物分解性薬剤の疎水性のポリマーキャリヤーへ装填する系の開発は、確実に明確ではない。
【０００７】
これらの方法の総てで、送達が幾らか増進したが、治療上関連のある用量送達を達成するための主要な障害突破は達成されていない。最近、送達しようとするタンパク質薬剤とカップリングしているキャリヤー分子としてＶＢ１２を用いる送達系、すなわちＶＢ１２−タンパク質接合体が共同発明者の一人によって発明された。
【０００８】
ＶＢ１２は十二指腸で腸の内因子と結合し（ＶＢ１２ ＋ ＩＦ→ＶＢ１２ＩＦ） 、ｔｈｅ 総ＶＢ１２ＩＦ複合体は小腸の回腸で内因子受容体（ＩＦＲ）に結合する。そこから、これがエンドサイトーシスされた後、トランスコボラミン（ＴｃＩＩ）によってトランスサイトーシスを受けて、全身循環に到達する。
【０００９】
従って、タンパク質をＶＢ１２とカップリングするときには、これはＶＢ１２分子と共に同時輸送されて、全身循環に到達する。
【００１０】
この方法については、二つの条件が満足されねばならない。すなわち、
ケース１：  ＶＢ１２分子は、送達しようとするタンパク質にカップリングした後にそのＩＦ親和性をほじしなければならない。
ケース２：  また、タンパク質分子は、ＶＢ１２にカップリングした後にその生物活性を保持しなければならない。
【００１１】
ケース１については、天然のＶＢ１２（シアノコバラミン）はタンパク質に直接カップリングすることはできず、すなわちＶＢ１２はカップリングによりＩＦ親和性を喪失する。
【００１２】
従って、上記の手法では、ＶＢ１２は加水分解し、３個の異性体（ａ、ｂおよびｅ異性体）を形成する。３種類の異性体のうち、「ｅ」異性体は他の分子へカップリングした後にもかなりのＩＦ親和性を保持している。
【００１３】
ケース２：  カップリングを容易にして、適当な基を供給し且つタンパク質薬剤の全生物活性を保持するため、各種のスペーサーを用いるｅ−ＶＢ１２の各種誘導体。これらの誘導体を、送達しようとするタンパク質薬剤にカップリングする。このようなスペーサーは、ｅ異性体のＩＦ親和性も増加させる。この手法について、本願発明者の一人であるＤｒ． Ｇｒｅｇｏｒｙ Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｊｏｎｅｓは、１９９５年の叢書の１章を執筆した（ペプチドに基づくドラッグデザイン、第８章）。この章で、著者はこの手法について詳細に記載し、ＶＢ−ＬＨＲＨ類似体およびＶＢ１２バソプレッシンの結果をまとめ、ＥＰＯおよびＧ−ＣＳＦのような他の生物活性薬剤との接合の可能性についても記載した。１９９５年後半に、２つの研究論文が生物接合体化学に現れた（１） ＶＢ１２−ＬＨＲＨ類似体（第６巻， 第１号， １９９５， ３４−４２）， （２） ＶＢ１２−ＥＰＯおよびＶＢ１２−ＧＣＳＦ（第６巻， 第４号， １９９５， ４６１−４６５）１９９６年後半に、著者の一人はＶＢ１２−ＥＰＯおよびＶＢ１２−ＧＣＳＦ 接合体の特許を取得した（米国特許第５４８０６８号明細書， １９９８年８月）。この特許明細書において、著者は、送達しようとするタンパク質薬剤にカップリングした後にＩＦ親和性を保持するＶＢ１２の誘導体を記載した。後に、１９９６年に同様な系についてもう一つの特許明細書（米国特許第５，５７４，０１８号明細書）がある、すなわちＶＢ１２−ＥＰＯ， ＶＢ１２−ＧＳＣＦおよびＶＢ１２−インターフェロン。しかし、用いた誘導体は、ＶＢ１２のリボースのヒドロキシ部位が異なっている。この部位における誘導体形成およびタンパク質薬剤へカップリングした誘導体もＶＢ１２のＩＦ親和性を保持する。しかし、初期の特許明細書には、の任意の誘導体であって、タンパク質薬剤にカップリングした後にＩＦ親和性を保持しているＶＢ１２が記載されている。他の特許明細書に用いられているタンパク質薬剤も、インターフェロン以外は同一である。
【００１４】
２つの米国特許第５，５８９，４６３号明細書および第５，８０７，８３２号明細書であって、本願の共同発明者の一人が主要な発明者でもあるものに、ＶＢ１２−生物活性化学（共有）接合体が記載されている。生物活性薬剤は、タンパク質、ワクチンまたは抗原であることができ（多糖類性であることができる）、または他の生物医薬品（ヘパリン）または在来の薬剤（ネオマイシン）であることができる。発明者らが記載している上記化学複合体は、経口送達ゲル、分散液、エマルション、カプセル、錠剤などに適する既知の投薬形態で処方するためのものである。これらの特許明細書の手法は、上記した他の特許明細書第５，５４８，０６４号明細書および第５，５７４，０１８号明細書と幾分類似している。
【００１５】
これらの総てにも拘わらず、ＶＢ１２の接合体は下記のような欠点を有する。
１）  タンパク質は、消化管でプロテアーゼによる分解から保護されない。
２）  幾つかのタンパク質生物活性薬剤は、嵩張ったＶＢ１２（立体因子）へカップリングすることにより活性分子コンホメーションを喪失することがあるので、総てのタンパク質をカップリングすることはできない。
３）  ＶＢ１２輸送系の摂取（１ナノグラムｇ／用量）は、半減期が非常に短い、すなわち治療関連用量を達成することができないタンパク質には十分ではない。
【００１６】
【発明の概要】
本発明は、生物活性薬剤（タンパク質／ワクチンまたは薬剤）がＶＢ１２またはその類似体に直接カップリングしない点で全く異なっている。代わりに、ＶＢ１２またはその類似体は、生物活性薬剤が装填されている微小／ナノ粒子表面に共有結合している。微小およびナノ粒子は、生物分解性で薬学上許容可能なポリマーから構成されている。
【００１７】
【発明の具体的説明】
様々なペプチドおよびタンパク質のビタミンＢ１２分子への接合は、腸の上皮細胞を横切るこれらの残基のイン・ビトロおよびイン・ビボ輸送を促進することが示されている。しかしながら、多くのビタミンＶＢ１２−医薬品接合体の薬学関連経口送達は、ＶＢ１２輸送系の摂取容量が限定されており、ＶＢ１２への接合の際に天然タンパク質の生物活性が喪失し、接合体の内因子（ＩＦ）親和性が喪失し、最後に生物活性薬剤がＧＩ分解を受けやすいため、これらの生物活性薬剤の多くでは起こらない。これらの欠点を克服するため、本発明者らはの天然摂取機構によって吸収することができるビタミンＢ１２−粒子（微小球およびナノ粒子）系を開発すべく努力した。様々な生物分解性粒子系（微小球およびナノ粒子）を調製した。これらの粒子をビタミンＢ１２で表面改質し、これらの予備成形した球接合体を治療用タンパク質（インスリン、Ｂ型肝炎ワクチン）と共に装填した。幾つかの場合には、装填工程を変更した。イン・ビトロ研究は、インスリンが胃酵素による分解から保護されることを示した。異なる粒度のこれらの系を糖尿病ラットに給餌し、ラットの血中グルコース濃度を経時的に観察した。これらの系の薬理学的バイオアベイラビリティは５〜２５％であり、経口生物活性だけでなく、これらの生物医薬品の制御放出の証拠をも示した。これらの系は、ワクチンに装填したＶＢ１２微小球およびナノ粒子に関して興味深い結果を示した。例えば、上記キャリヤー系および本明細書に記載した様々な手法は、更に試験および最適化を行ったところ、経口タンパク質の送達について現実性を作ることができる。
【００１８】
本発明は、非経口投与される在来の注射可能な薬剤、ペプチドおよびタンパク質医薬品、例えばワクチン、特に経口送達に適する医薬製剤の分野におけるワクチンなどの医薬製剤の分野に関する。
【００１９】
本発明によれば、図１（図中、Ｄは注射可能な薬剤であり、ＳＰはビタミンＢ１２のＩＦ親和性を保持するためのまたはカップリングを容易にするための長鎖スペーサーであり、ＢＤＣは生物分解性キャリヤー粒子（微小球／ナノ粒子）である）に示されるように、表面をＶＢ１２でコーティングした生物分解性のポリマー粒子内に組込まれたタンパク質薬剤（インスリンおよびＢ型肝炎ワクチン）を含んでなる薬剤送達系が提供される。
【００２０】
経口薬剤送達を成功させるため、ＶＢ１２は腸上皮を通る循環への初期輸送のまたはワクチンの位置特異的送達のターゲッティングリガンドとして作用する。ＶＢ１２は、所望な部位が到達するまで、それと共に粒状球（微小球およびナノ粒子）を有する。
【００２１】
本発明の態様では、ＶＢ１２微小球およびＶＢ１２−ナノ粒子系は、在来の非経口薬剤、ワクチンなどのペプチド／タンパク質を経口経路によって送達する。様々な生物分解性微小球およびナノ粒子が、現存する天然、半合成および合成ポリマーで調製される。これらの粒子系（微小およびナノ粒子）は、表面改質してＶＢ１２接合に適する基を提供することができる。
【００２２】
ビタミンＢ１２誘導体または多数のスペーサーとのそれらの各種誘導体（Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ １９９５ａおよび１９９５ｂ） を、粒状キャリヤーにカップリングした。異なる結合である生物分解性（全身性酵素によって開裂）および非生物分解性共有結合を用いて、ＶＢ１２を粒子に結合する。カップリングは、イオン、配位、共有および強力な物理吸着結合も伴う。
【００２３】
一態様では、送達しようとする薬剤はほとんどの場合に非経口経路によって投与される在来の薬剤、治療用ペプチド／タンパク質、生物医薬品、例えばヘパリンおよび免疫用ワクチンである。
【００２４】
本発明のもう一つの態様では、送達しようとする薬剤は、ゲンタマイシンおよびアミカシンから選択されるほとんどの場合に非経口経路によって投与される在来の薬剤、インスリン、ＥＰＯ、 Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＶＩＩＩ因子、ＬＨＲＨ類似体およびインターフェロンから選択される治療用ペプチド／タンパク質、生物医薬品、例えばヘパリンおよび免疫用にＢ型肝炎表面抗原、腸チフス、およびコレラワクチンから選択されるワクチンである。
【００２５】
更にもう一つの態様では、キャリヤー系は、ＶＢ１２またはその類似体を含んでなる薬学上許容可能なキャリヤーであるか、または非経口投与される薬剤／ワクチンと共に装填されている生物分解性ポリマー粒状キャリヤーにカップリングするそれらの誘導体である。
【００２６】
更にもう一つの態様では、キャリヤー系は、天然摂取ＶＢ１２によって回腸またはその付近における受容体依存性エンドサイトーシスの後にトランスサイトーシスされる。
【００２７】
更にもう一つの態様では、ＶＢ１２は全身および／またはリンパ球の送達先に対する腸のターゲッティングリガンドである。
【００２８】
更にもう一つの態様では、ＶＢ１２は本来のシアノコバラミン（ＶＢ１２）またはＶＢ１２の様々な類似体、すなわちアココバラミン、アデノシルコバラミン、メチルコバラミン、ヒドロキシコバラミン、および／またはそれらの誘導体、またはアルキル鎖がＶＢ１２のコバルトに結合しているアルキルコバラミン、またはクロロ、スルフェート、ニトロ、チオを有するシアノコバラミン、またはそれらのアナリド（ａｎａｌｉｄｅ）、ＶＢ１２のエチルアミド、プロピオンアミド、モノカルボン酸、およびジカルボン酸誘導体、およびその類似体、またはモノカルボキシＶＢ１２の「ｅ」異性体のモノカルボン酸、ジカルボン酸およびトリカルボン酸誘導体、およびプロミナミド誘導体、およびＶＢ１２の類似体であってコバルトがこれらの誘導体に結合した他の金属（亜鉛またはニッケルなど）および様々なスペーサーによって置換されているもの、または生物分解性粒状キャリヤーにカップリングした後にＩＦ親和性を保持している任意の誘導体である。
【００２９】
更にもう一つの態様では、ＶＢ１２の誘導体が、ＶＢ１２のリボソーム残基の第一５′−ヒドロキシルおよび２′−ヒドロキシル基および粒状キャリヤーとのカップリングに有用なこの部位で結合した様々なスペーサーの誘導体形成をも含む。
【００３０】
更にもう一つの態様では、ＮＨ２またはＣＯＯＨまたはＳＨ基およびそれらの組合せの供給を目的とするＶＢ１２の誘導体形成のためのスペーサーおよび／または薬剤であるＲ′〜 Ｒ″が、二酸またはアルキル二酸（ＣＯＯＨ−ＣＯＯＨ， （ＣＯＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＯ））、アルキルジアミン（（ＣＨ２）ｎＣＯＯ−ＮＨ２）、またはアルキルジアミド（ＮＨＣＯ（ＣＨ）ｎＣＯＮＨ２）、またはヒドラジド（ＮＨ２ＮＨ２）、またはアルキルジヒドラジド（ＮＨ２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＮＨ２）、または置換ＳＨ基を含む薬剤（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートまたはその長鎖アルキル誘導体、または酸無水物［（ＣＨ）ｎＣＯＣＯＯ）］ 、または酸ハロゲン化物スペーサー（Ｒ（ＣＨ２）ｎＣＯＣｌ）、またはアンヒドロキシ活性化エステル官能基（ＮＨＳ）であって、ペプチド結合または界面活性剤誘導体またはポリマー性スペーサーに用いられるものから選択され、総ての場合に「ｎ」は１、２、３、．．．無限大の整数である。
【００３１】
更にもう一つの態様では、微小球またはナノ粒子が生物分解性であり且つ薬学上許容可能なポリマーから構成されている。
【００３２】
更にもう一つの態様では、薬剤を装填したポリマー粒子がイン・ビボで分解して、生物活性応答に対してタンパク質医薬品／ワクチンを放出して送達する。
【００３３】
更にもう一つの態様では、粒状キャリヤーが表面ＣＯＯＨ、無水物、ＮＨ２、ＳＨ基およびそれらの組合せを含む生物分解性、疎水性または親水性ポリマー微小球／ナノ粒子である。
【００３４】
更にもう一つの態様では、粒状キャリヤー系がモノリシック（マトリックス型、架橋）および／または貯蔵所型（マイクロカプセルおよびナノカプセル）または多粒子型（粒子中粒子）であるか、リガンドＶＢ１２のポリマーへの共付加によって形成される粒子、すなわち共役ポリマー粒子である。
【００３５】
更にもう一つの態様では、粒状キャリヤーが、多糖類ポリマー、すなわち澱粉およびそれらの誘導体、ペクチン、アミロース、グアールガムおよびそれらの誘導体、様々な分子量のデキストランおよびそれらの誘導体、キトサンおよびそれらの誘導体、コンドリオタン硫酸およびそれらの誘導体、および最後に多糖類およびそれらのポリマーの他の天然および半合成誘導体を包含する。
【００３６】
更にもう一つの態様では、多糖類の架橋剤が、エピクロルヒドリン、ＰＯＣｌ３、ホウ砂（グアールガム）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、および多糖類ポリマーに架橋して粒状キャリヤーを生成する他の架橋剤を包含する。
【００３７】
更にもう一つの態様では、親水性の少ない〜疎水性の粒状キャリヤーが、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリラクチド（コグリコール酸）、（フマル酸：セバシン酸、およびポリフマル酸）のポリ（無水物）微小球、およびポリ（ラクチド（コグリコリド）の生物分解性ポリマー、脂肪族アシル化粒子（脂肪族アシル層によって囲まれた親水性コア）、ＬＤＬキャリヤー、多粒子系（異なる親水性または疎水性のポリマーに封入されたポリマー粒子）、および最後にこれらのポリマーの様々な組成物を包含する。
【００３８】
更にもう一つの態様では、粒状キャリヤーがアルブミン、ゼラチンのような天然タンパク質ポリマー、半合成またはペプチド基剤の合成ポリマー、およびそれらの誘導体をも包含する。
【００３９】
更にもう一つの態様では、塩化テレフタロイル、グルタルアルデヒドのような架橋剤、およびタンパク質ポリマーを架橋して粒状キャリヤーを生成する架橋剤である。
【００４０】
更にもう一つの態様では、グルタルアルデヒドのようなモノマーのポリ（グルタルアルデヒド）への重合によって成形される粒子、およびモノマーの重合およびそれらのＶＢ１２へのカップリングによって形成される粒子である。
【００４１】
薬剤、タンパク質およびワクチンの全身送達の系の粒度が数ナノメートル〜１０μｍ以上である。
【００４２】
更にもう一つの態様では、ＶＢ１２結合および／または複合体形成に適するように表面が改質されまたは活性化されている粒子系である。
【００４３】
更にもう一つの態様では、粒子系がＶＢ１２で表面改質されており、ＶＢ１２の生物分解性粒状キャリヤーへのカップリングを包含する。
【００４４】
更にもう一つの態様では、ＶＢ１２誘導体と粒子とのカップリングが間にスペーサーを有するおよび持たない生物分解性および非生物分解性結合を包含する。
【００４５】
更にもう一つの態様では、ＶＢ１２誘導体と粒状キャリヤーまたは表面改質した／活性化した粒子とのカップリングが、１−エチル＝３，３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＡＣ）または１，１′−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）またはＮ，Ｎ′−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣ）のようなカルボジイミドと他のペプチドカップリング剤を用いるアミド結合、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化カップリング（ＮＨＳ）、または過ヨウ素酸塩カップリング、またはグルタルアルデヒド活性化カップリング、またはＣＮＢＲ依存性カップリング、または酸ハロゲン化物によって誘導されるアミドカップリングによるか、または親水性スペーサーエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）または疎水性スペーサージスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）の使用によるか、またはＮ−スクシンイミジル＝３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）およびＶＢ１２に対するＩＦ親和性を保持する任意の接合体を用いるチオール開裂可能なスペーサーによる。
【００４６】
更にもう一つの態様では、カップリングが物理的吸着型または複合体形成を伴う。
【００４７】
更にもう一つの態様では、薬剤、治療用ペプチド／タンパク質、およびワクチンが高濃度のＶＢ１２と生物カップリングした分解性粒状キャリヤー内に閉込められている。
【００４８】
更にもう一つの態様では、所期の生物活性薬剤の装填工程が、粒状球の調製の際または粒子とＶＢ１２とのカップリングの際に予備成形した粒状キャリヤー接合体中またはキャリヤー内で行う。
【００４９】
更にもう一つの態様では、送達しようとする生物活性薬剤を、１） 接合前／後／中に物理的に粒子中に閉込め、２） 吸着し、または３） 共有結合的にカップリングし、または４） イオン的相互作用、または５） 複合体形成およびＶＢ１２粒子系を装填するための任意の他の方法を行う。
【００５０】
更にもう一つの態様では、界面活性剤、凝集抑制剤、プロテアーゼ阻害剤、および浸透エンハンサーを処方物のアジュバントとして用いる。
【００５１】
更にもう一つの態様では、送達系を、特に内因子（ＩＦ）欠損種についてＶＢ１２の外来ＩＦと共に同時投与する。
【００５２】
更にもう一つの態様では、上記送達系を経口送達に適する投薬形態に処方する。
【００５３】
更にもう一つの態様では、経口投薬形態が、溶液、懸濁液、ゲル、ペースト、エリキシル、粘稠なコロイド分散液、錠剤、カプセル、および／または経口制御放出型、および最後に経口経路のための任意の送達形態を包含する。
【００５４】
ペプチドおよびタンパク質の経口送達は、過去数十年にわたって製薬工業では定義しにくい標的であった。本発明では、モデルの治療用タンパク質、インスリンおよびワクチンであるＢ型肝炎ワクチンをモデルタンパク質として選択した。ＶＢ１２誘導体上での様々な基の存在は、ＩＲスペクトルを元のＶＢ１２のＩＲスペクトルと比較することによって指定した。ＩＦ親和性に対して最高の親和性を有するＶＢ１２の「ｅ」カルボキシレートを分離して、様々なスペーサーに共有結合し、様々なＶＢ１２誘導体を得た（図２）。様々な粒度の様々なＶＢ１２粒子系を調製し、それらの表面をＶＢ１２接合に適する様々な手段によって改質した（粒度を本文に示した）。これらのＶＢ１２にカップリングした粒子系（図１）にインスリンおよびＢ型肝炎ワクチンを装填した。キャリヤー系のあるものがタンパク質（インスリン）の副治療用量を送達しても、その関連性は免疫応答を開始するのに適していると思われる。従って、非経口的にのみ投与される（従って、モデル薬剤が選択されない）在来の薬剤については問題は著しく単純になり、後の段階で装填される。これらの研究について、主目的はこのキャリヤー系の摂取機構を検討することであるので、透過エンハンサーは送達系と共に用いなかった。上記添加剤は、他の機構により吸収することによってキャリヤー系の効果を強化することができると思われる。イン・ビトロでの酵素研究は、インスリンが球内に閉込められているときには腸酵素の消化作用から保護されるが、遊離のインスリン溶液は同一実験条件下では完全に分解されることを示した（図３）。１６０〜２５０ｎｍの粒度範囲の様々なナノ粒子ＶＢ１２接合体は、モデルタンパク質インスリンで興味深い結果を示した。幾つかの代表的なインスリン送達系の抗糖尿病活性を、図４〜８に示す。これらの系は、５時間目の最大血中グルコース減少が４８．４±４．１（初期の％）であった。作用の開始は、総ての送達系について、投与２時間後に観察された。グルコース濃度の最大減少率（％）は、総ての系の微小球接合体について５時間目に見られ、これは６時間目に最大となった。上記結果は、ラットでのＶＢ１２吸収について観察されたのと同様な摂取速度を示し、摂取は特異的なＶＢ１２依存性吸収によるものであり、数時間かかることを示す。異なる系の予備的評価の際に、作用の時間を総ての系（ｎ＝３動物数）について７時間検討したが、後の研究では、摂取は１２時間まで継続した（ｎ＝５）（図９）。単純なインスリンの抗糖尿病活性を、静脈内（ＩＶ）および皮下投与の後に評価した（図１０）。薬理学的利用可能性を、上記の結果によって評価した。ＡＵＣ０−７値は、ｉ．ｖ．経路についてのＡＵＣ０−７値と比較すると、ナノ粒子接合体およびより高いナノ粒子接合体（ｐ＜０．０５）について有意に高かった（ｐ＜０．０１）。微粒子接合体では、ｉ．ｖ．経路と比較すると、３時間、４時間、５時間および６時間目の血中グルコース濃度が減少したことを除きＡＵＣにはほとんど差がなかったが、インスリンのｉ．ｖ．投与では、これらの時間に全く活性を示さなかった。様々な粒子接合体の薬理学的利用可能性は、５％から２３％程度であった。微粒子接合体は、免疫応答を���始する用量は治療用タンパク質を上回ることはないので、粘膜免疫についてのワクチンで良好な結果を得ることができると期待される（Ｂ型肝炎についての検討は進行中である）。１０Ｉ．Ｕ．／ｋｇを含むナノ粒子接合体は、最良の結果を示した。摂取研究は、吸収がＶＢ１２に特異的なキャリヤー依存性タイプであることを示した（図９）。このキャリヤー系および本発明に記載される様々な手法は、注射可能なタンパク質薬剤／ワクチン、および非経口経路のみで投与される他の在来の薬剤についての現在の要求に取って代わる可能性がある。これらの予備知見は、注射可能な薬剤の経口送達のための送達手法を更に試験して、最適化するための十分なプラットフォームを提供する。
【００５５】
理解を容易にするため、本発明と従来技術との相違を図１１に図解的に示す。そこに示されるように、図１１（Ａ）は、従来技術であって、ＶＢ１２、生物活性共有結合複合体が溶液として、または分散液として、またはペーストとして処方され、または適当な投薬形態で錠剤として用いられるものを表し、図１１（Ｂ）は、本発明であって、ＶＢ１２またはその類似体が生物活性成分が装填される微小球／ナノ粒子表面に共有結合的にカップリングして、投薬形態を処方するものを表している。
【００５６】
本発明の理解を容易にするため、初期の特許と本発明の図解表現を図１１に示し、ビタミンＢ１２が生物活性材料に共有結合しており、溶液、分散液、ペースト、および錠剤形態として投与される。本発明では、生物活性薬剤（タンパク質／ワクチンまたは薬剤）はビタミンＢ１２またはその類似体に直接カップリングしておらず、代わりにビタミンＢ１２またはその類似体が生物活性成分を装填する微小球／ナノ粒子に共有結合的にカップリングして、投薬形態を処方する。微粒子およびナノ粒子は、生物分解性であり且つ薬学上許容可能なポリマーから構成されている。
【００５７】
図１１に示されるように、Ｄは生物活性材料であり、ＳＰはビタミンＢ１２のＩＦ親和性を保持し、および／またはカップリングの場合の長鎖スペーサーである。ＢＤＣは生物分解性キャリヤー粒子（微小球／ナノ粒子）であり、ＶＢ１２はビタミンＢ１２である。
【００５８】
様々なＶＢ１２球接合体を、架橋のようにして調製した。下記のものは本発明の例示のために挙げるものであり、従って、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【００５９】
【実施例】
セクション１
１．０ 接合に適するＶＢ１２類似体の合成
元のＶＢ１２（図２， １ａ）に穏和な酸加水分解（０．４Ｍ， ＨＣｌ， ７２時間室温）を施し、コリン環の３個のプロピオンアミド側鎖（ｂ， ｄおよびｅ）の１個から一酸誘導体を生成した。ＩＦに最高の親和性を有するＶＢ１２の「ｅ」モノカルボキシレート（１ｂ） （Ｋｏｌｈｏｕｓｅ ａｎｄ Ａｌｌｅｎ， １９７７） を、ＤＯＷＥＸ ＡＧ １ｘ２ （Ｂｉｏｒａｄ） クロマトグラフィーおよび半調製Ｃ１８−ＲＰ−ＨＰＬＣ（５−１００％／０．１％トリフルオロ酢酸）の組合わせてよってｂおよびｄ異性体混合物から分離した（Ａｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８０）。
【００６０】
１．１ 「ｅ」ＶＢ１２のアミノ誘導体の合成（Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， １９９５）：
「ｅ」 ＶＢ１２のアミノ誘導体を、ＶＢ１２の「ｅ」異性体（１ｂ）を１，２−ジアミノエタン、１，６−ジアミノヘキサン、１，１２−ジアミノドデカン、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン、および１，６−ジアミノ−３，４−ジチアヘキサン（ａ．ｋ．ａシスタミン）と反応させて、それぞれ１ｃ， １ｄ， １ｅ， １ｆ および１ｇのアミノ「ｅ」ＶＢ１２誘導体を生成した。これらの反応は、それぞれ２０倍モル過剰量のジアミンおよび１−エチル−３−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（ＥＤＡＣ）を用いてｐＨ６．５で行った。
【００６１】
別の反応で、１，１２−ジアミノドデカンを元のＶＢ１２（１ａ） にカップリングして、ジイソプロピルエチルアミンを含む乾燥ＤＭＦ中１，１′−カルボニルジイミダゾールを用いてＶＢ１２を活性化した後、アミノ−ドデシル−５′Ｏ−ＶＢ１２ （１ｈ）を生成した。他のアミン誘導体も、この部位で調製することができる（データーは示さず）。
【００６２】
ＶＢ１２の総てのアミノ誘導体を、５〜１００％／０．１％ＴＦＡのグラディエントを用いるＲＰ−ＨＰＬＣ（半調製Ｃ４カラム）によって精製した。溶出した材料をＳ−セファロースに吸着させ、０．１Ｍ ＨＣｌで溶出することによって更に精製した。アミノ誘導体はフェノールに抽出し、フェノール相に塩化メチレンを加えた後水に逆抽出することによって更に精製した。最後に、それぞれの生成物を凍結乾燥し、赤色粉末状生成物として回収した。
【００６３】
１．２ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ジチオピリジル（ＤＴＰ）アミノＶＢ１２誘導体の合成
３種類のジチオピリジル（ＤＴＰ）アミノ−ｅＶＢ１２ 誘導体を、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を２−アミノエチル−ｅＶＢ１２ （１ｃ）、６−アミノヘキシル−ｅＶＢ１２ （１ｄ）、および１２−アミノドデシル−５′ＯＶＢ１２（１ｈ）と反応させて調製し、（１ｉ）、（１ｊ）および（１ｋ）の各誘導体を得た。典型的には、反応はアミノ−ＶＢ１２ 誘導体（５０ ｍｇ／ｍｌ）を０．１ Ｍ ＮａＣｌ を含む０．１ Ｍ ＰＯ４緩衝液， ｐＨ ７．５に溶解した後、ＳＰＤＰ（５０ ｍｇ／ｍｌ、アセトン中）溶液８００μｌをアミノ−ｅＶＢ１２誘導体に加えることによって行った。室温にて一晩反応を行った後、ＤＴＰ−アミノ−ｅＶＢ１２ 生成物を半調製Ｃ４カラム上でＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した後、凍結乾燥した。
【００６４】
１．３ 長鎖ジチオピリジル（ＤＴＰ）アミノ−ＶＢ１２誘導体の合成
これらの誘導体は、６−アミノヘキシル−ｅＶＢ１２（１ｄ）からジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）（［［モノスクシンイミジル）スベリル］ヘキシル］−ｅＶＢ１２を生成）および１，１２−ジアミノドデカンと逐次反応により［［（１２−］アミノドデシル）スベリル］ヘキシル］−ｅＶＢ１２（１ ｌ）を得た。得られたこの生成物を、末端アミノ基でＳＰＤＰを用いて誘導体形成し、ＲＰ−ＨＰＬＣ上で精製し、凍結乾燥して、誘導体（１ ｍ）を得た。
【００６５】
１．４ ｅ−ＶＢ１２カルボキシレートのヒドラジジル誘導体の合成
これらの誘導体は、ＣＯＯＨ粒子にカップリングするために調製した。ヒドラジド−ｅＶＢ１２（１ ｎ）は、第三ブチレートカルバゼートのｅＶＢ１２ カルボキシレートへのカップリングの後、ｔ−Ｂｏｃ基を除去して遊離ヒドラジドを生成させる二段階合成によって調製した。シス−ヒドラジド−ｅＶＢ１２ は、ｅＶＢ１２ シスタミン（１ ｇ）から合成した。この材料のｅＶＢ１２ シス−ヒドラジド（１ ｏ）への転換は、ｅＶＢ１２シスタミンのスクシニル化の後、生成する末端カルボキシル基をｅＶＢ１２ヒドラジドについて上記した手続きによってヒドラジドに転換することによって進行した。（アジピルヒドラジド）−ｅＶＢ１２ 試薬（１ ｐ）は、ｅＶＢ１２カルボキシレートと２０倍過剰量のアジピルヒドラジドからＥＤＡＣの付加によって一段階で容易に調製された。
【００６６】
１．５ ｅＶＢ１２のアニリド誘導体
ｅＶＢ１２ カルボキシレート（１ｂ）をＮＨＳおよびＥＤＡＣで活性化した後、パラーアミノフェニル酢酸にカップリングし、ＶＢ１２アニリド（１ｑ）を得た。
【００６７】
１．６ ヒンダードチオール基を含むＶＢ１２誘導体の形成
アミノエチルｅＶＢ１２（１ｃ）を、標準的な文献条件を用いて４−［（スクシンイミジルオキシ）−カルボニル］−∝−メチル−∝−（２−ピリジルジチオ）トルエンとカップリングした（Ｂｌａｃｋｅｙ ｅｔ ａｌ．， １９８７）。生成物である∝−メチル−∝−（２−ピリジルジチオ）トリル］−ヘキシル］ｅ−ＶＢ１２ （１ｒ）をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【００６８】
１．７ ＶＢ１２のヨードアセタミド誘導体の形成
アミノエチルｅＶＢ１２ を、ヨード酢酸のＮＨＳエステルと反応させることによってヨードアセタミド誘導体に転換した。生成物（１ｓ）をＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【００６９】
１．８ ｅＶＢ１２のテトラペプチドスペーサー誘導体の形成：
ｅＶＢ１２ カルボキシレート（１ｂ）を上記のようにＥＤＡＣおよびＮＨＳで活性化し、テトラペプチドＧＧＥＡ−ＯＭｅを重炭酸塩緩衝液，ｐＨ９．５に溶解したものに加えた。生成物ＶＢ１２−ＧＧＥＡ−ＯＭｅ（１ｔ）を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【００７０】
ＶＢ１２の構造およびＩＦ親和性に対する結合の部位は図２に示した通りであり、
2004517103.tif 000002
【００７１】
セクションＩＩ
薬剤装填のための粒状キャリヤーは、生物分解性の天然、半合成および合成ポリマーを用いて調製した。この部では、様々な手法によって調製したポリマー性粒状キャリヤーについて述べる。
【００７２】
２．０ 架橋した多糖類コアの調製
澱粉（ＤＳＭ／ＤＳＮ）およびデキストラン（ＤＤＭ／ＤＤＮ）の多糖類（ＰＣ）微粒子／ナノ粒子 を、エマルションおよびゲル法によって調製した。
【００７３】
２．１．１ 架橋したポリマーゲルの音波処理によるＰＣコアの調製
ＰＣポリマーコアを、幾つかの点を改質したＳａｍａｉｎ ｅｔ ａｌ （１９８９）の方法に準じて調製した。ポリマー澱粉 （ジャガイモ， 可溶性） ／ デキストラン（分子量 ６６，０００および１０，０００）２ｇを１Ｍ ＮａＯＨに激しく攪拌しながら均質に分散（加水分解）した。次に、エピクロルヒドリン（０．１８〜０．４ｍｌ）を一定攪拌下で加え、架橋した。浸透を停止し、柔らかなゲルが得られるまで（通常は２〜６時間）、反応を７０〜８０℃で進行させた。生成するゲルを水で希釈し、機械的に粉砕し、プローブ音波処理装置（Ｍ／ｓ Ｂｒａｎｓｏｎ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｆｉｅｄ）で音波処理を施した。このようにして得られた粒子を遠心分離によって様々な粒度に分画し、沈澱物（凝集物および大粒子）を廃棄した。
【００７４】
最後に、選択した画分を凍結乾燥によって乾燥し（ＤＤＭ１， ＤＤＭ２およびＤＤＭ３） 、または噴霧乾燥し（ＤＳＭ１ およびＤＳＭ２） ［ミニスプレー乾燥機： 入口温度２００℃、出口温度１４０℃、ポンプ制御 ３、アスピレーター制御 １９、加熱制御 １２、流量表示装置 ７００］、微粉末粒子を得た。
【００７５】
２．１．２ ＰＯＣｌ３を用いる架橋加水分解澱粉
これは、幾つかの点を改質したＩｇｎａｃｉｏ Ｄｅ Ｍｉｇｕｅｌ ｅｔ ａｌ．， １９９５の方法に準じて行った。この手続きでは、可溶性澱粉（ジャガイモ）５ｇを２Ｍ ＮａＯＨ（１０〜１２ｍｌ）に均質化することによって可溶化した。氷槽に浸漬することによって、温度を４℃に調整した後、ＰＯＣｌ３（２．５ｇ，０．３３Ｍ）を１０Ｍ ＮａＯＨ ７．５ｍｌの溶液と共に攪拌下にて滴加した。架橋剤を加えた後、更にレベル３で１５分間攪拌した（ホモジナイザー）。次に、製剤のｐＨを希ＨＣｌで７に調製した。生成するゲルを水で希釈し、音波処理を施し、遠心分離した後、噴霧乾燥（上記と同一条件）により、微粉末（ＤＳＮ１ ａｎｄ ＤＳＮ２）を得た。
【００７６】
２．２ 乳化法による界面間架橋
２．２．１ エピクロルヒドリンを用いる架橋
上記の方法で調製したＰＣコアの幾つかは形状が幾分不規則であり、新たな微粒子をエマルション法によって調製した。典型的には、多糖類（２ｇ， デキストラン分子量１０，０００または可溶性澱粉５ｇ）を、１Ｍ ＮａＯＨ（５〜１０ｍｌ）に可溶化した。ポリマー水相をスパン８０（２％）を含む液状パラフィン（２０〜３０ｍｌ）中で１５，０００〜２２，０００ｒｐｍで１０〜１５分間攪拌することによって乳化し、ポリマー液滴を微細な状態に分散した。次に、エピクロルヒドリン（０．５〜１．０ｍｌ）を７０〜８０℃で２〜３時間１０００〜５０００ｒｐｍで一定攪拌で加えた後、水（２〜５ｍｌ）を加え、断続的に水を加えながら更に２〜３時間攪拌した。白色エマルションが淡黄色に変化し、（攪拌を停止したとき）コロイド粒子系が目に見えるほど分離するまで、攪拌を停止した。生成する粒子を等容の石油エーテル／ヘキサンおよび十分な水で３回洗浄した。有機相を分離し、水性粒子系から油相を除去した。水性粒子系を上記と同様にして凍結乾燥／噴霧乾燥して、ＤＤＮ１／ＤＤＮ２およびＤＤＮ３ ／ ＤＳＮ３を得た。
【００７７】
２．２．２ エマルション法によるＰＯＣｌ３を用いる架橋
澱粉（ジャガイモ、可溶性）を２Ｍ ＮａＯＨ（１２．５ｍｌ）中で可溶化し、２％スワン８０を含む流動パラフィン（４０ｍｌ）中で２２，０００ｒｐｍで１５分間攪拌することにより乳化した。分散水性ポリマーの温度を４℃にし（氷槽浸漬）、架橋を１０Ｍ ＮａＯＨ（７．５ｍｌ）の溶液と共にＰＯＣｌ３（０．６６Ｍ，２．５ｇ）を加えることによって行った。この工程は、低ｒｐｍで攪拌下にて行った。油相を、等容のヘキサン／石油エーテルで３回洗浄することによって除去した（分離漏斗）。水相を十分に希釈して、ｐＨを７．０とし、最後に上記のようにして噴霧乾燥し、微粉末ＤＳＮ４を得た。
【００７８】
２．３ 架橋グアールガム（ＧＧ）およびキトサンヒドロゲルの調製 （Ｋａｂｉｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８）
キトサン５ｇを、０．５Ｍ酢酸溶液（３００ｍｌ）中で可溶化した。同様に、グアールガム４ｇを８００ｍｌ水に４５℃で２時間分散した。架橋を、２５％（ｗ／ｖ）グルタルアルデヒドを加えることによって行った。反応混合物を０．５Ｍ濃Ｈ２ＳＯ４を加えた後、キトサンエマルションおよびグアールガムエマルションについては２５％（ｗ／ｖ）グルタルアルデヒドを同一ｒｐｍで攪拌下にて加えることによって、２２，０００ｒｐｍで３０  間ホモジナイズした。反応混合物を１５，０００ｒｐｍで更に３０分間攪拌し、密封容器（分離漏斗）に４８時間保持した。油相を等容のヘキサンで繰返し洗浄することによって除去した。水相を５％（ｗ／ｖ）ＮａＨＣＯ３と３〜４時間攪拌することによって混合した後、痕跡量のアルデヒドも見られなくなるまで水１リットルで洗浄した。次に、粒子系を噴霧乾燥し、それぞれキトサン生成物（ＤＣＮ１およびＤＣＮ２）、およびグアールガム生成物（ＤＧＭ１ およびＤＧＭ２）を得た。
【００７９】
２．４ 溶媒蒸発法によるナノ粒子の調製
Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．， １９９９ （幾らかの改質有り）の手続き
ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＡＭ／ＰＭＡＮ）、ポリ（ヒドロキシブチレート）（ＰＨＢＭ／ＰＨＢＮ）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（ＰＬＡＭ／ＰＬＡＮ）、および様々な比率のポリ（ＤＬ−ラクチドコグリコール酸）（８５：１５）（ＰＬＧＡＭ／ＰＬＧＡＮ）を水−油−水二重エマルション溶媒蒸発法によって調製した。
【００８０】
タンパク質生物活性薬剤はもろいため、冷凍製剤（低温）および炭水化物（凍結乾燥およびエマルションの浸透圧バランス）によりカプセル封入した。典型的な手続きを、ＰＬＧＡポリマーについて概説する。Ｂ型肝炎表面抗原５００μｌ（５００μｇ）または８０〜１００ｍＭトレハロースを含む１００ＩＵインスリン１００〜２００μｌを、１００ｍｇのＰＬＧＡを含む９〜１０ｍｌジクロロメタン中で４〜６℃で１０秒間音波処理することによって乳化した。主要なエマルション温度を内部水相の凍結温度より低くした後（ドライアイス／アセトン）、１００ｍＭトレハロースを含む５％ＰＶＡ（８８％加水分解）５０〜６０ｍｌで（４〜７℃）で６０００〜９０００ｒｐｍで３０〜５０秒間乳化した。生成する第二のエマルションを１％ＰＶＡ１００ｍｌで希釈し、系を６〜９時間磁気攪拌して、有機相を蒸発させた。コロイド粒子を最終的に遠心分離によって集め、水で３回洗浄し、ＰＶＡ並びにタンパク質生物活性薬剤の過剰量を除去した。粒度は、音波処理／攪拌のレベルを変化させることによって、および遠心分離工程によっても制御して、微小球およびナノ粒子を生成し、最終的に凍結乾燥によって乾燥した。
【００８１】
２．５ アルブミン微小球の調製
２．５．１ 塩化テレフタロイル架橋
３−４ ｍｌ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ （２０−２５％ ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をカーボネート緩衝液（ｐＨ ９．８）に溶解したもの３〜４ｍｌを、４〜５％（ｖ／ｖ）ソルビタントリオレエートを含むクロロホルム：シクロヘキサン（１：４ｗｖ／ｖ）混合物（１５ｍｌ）中で個別に乳化した。次に、塩化テレフタロイルの２０〜３５％溶液を、それぞれ加えた（０．５，１，１．２５および２．５％ｗ／ｖ）。５〜３０分間反応させた後、微小球を洗浄し、遠心分離し、ＰＢＳ７．４に再懸濁し、最終的に凍結乾燥した。条件１） ｐＨ ９．８， ＴＣ ２．５％， 時間５分間、および２） ｐＨ ９．０， ＴＣ ２．５％ および時間３０分間で作成した微小球を、接合に用いた。
【００８２】
２．５．２ エマルション法を用いるグルタルアルデヒド架橋
１００ｍｇＨＳＡ０．５ｍｌを、水性ポリマー相を滴加により徐々に加えることによって綿実油１００ｍｌ中でホモジナイズし、ｗ／ｏエマルションを得た。グルタルアルデヒド（２５％ｗ／ｖ）の水性溶液０．１ｍｌを安定化エマルションに加え、攪拌を１時間継続した後、アセトン５０ｍｌを加えた。１分後、微小球を遠心分離によって集め、水で洗浄し、１０％ｗ／ｖグリシン溶液で反応を停止させて（反応性アルデヒド希を除去し）、適当に遠心分離し、水で洗浄して、凍結乾燥した。２個の遠心分離画分ＨＳＡＭおよびＨＳＡＮを選択した。
【００８３】
２．６ ゼラチンナノ粒子の調製
これらは、Ｌｉｇ ｅｔ ａｌ．， １９９７ の改質法に準じて調製した。７％ｗ／ｖ水性ゼラチンよｍｌを、綿実油９０ｍｌに４０℃で加えた。この二相系を、２２，０００ｒｐｍの速度で７〜９分間ホモジナイズし、ｗ／ｏエマルションを形成した。
【００８４】
エマルションを冷蔵庫に保管することによって４℃（ゼラチンのゲル化点）の温度まで冷却したところ、エマルションはゼラチンナノ粒子の形成を伴いながら懸濁液に変化し、油相をヘキサン／石油エーテルで洗浄した。次に、水性粒子相を凍結乾燥して、ＤＧＮＩを得た。
＊ 架橋が伴うときには、薬剤装填を様々な段階で、すなわち粒子カーゴの調製後またはＶＢ１２誘導体のカップリング後に行う。
【００８５】
２．７ ポリ（無水物）ナノ粒子の調製：ファージ反転ナノ−カプセル封入（ＰＩＮ）法
ポリ（無水物）ＷＰは、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ （１９９７） の手続きによって調製した。カプセル封入しようとするタンパク質（１００ＩＵ／ｍｇ，インスリン／ＨＢｓＡｇ５００μｇ／ｍｇ（カプセル封入しようとする適当量を含む０．５〜１ｍｌ）を、ポリフマル酸とセバシン酸の無水物ポリマー、およびポリ（ＦＡ：ＳＡ，２０：８０）、およびポリフマル酸：ポリラクチド（コグリコール酸）［ポリ（ＦＡ：ＰＬＧＡ）５０：５０］を含むジクロロメタン２〜４％ｗ／ｖで音波処理を４〜６℃で１０〜２０秒間行った。次に、生成する分散液を石油エーテルのような非溶媒の未攪拌槽に速やかに投入し（ポリマー溶媒−非溶媒非：１００）、ポリマーナノ粒子を得た。所望な粒度は、初期ポリマー％，溶媒−非溶媒比および非溶媒の選択を変更することによって調製することができる。選択された最適処方物は、ポリ［ＦＡ：ＳＡ］８０：２０（商標）ＡＦＳＮおよびポリ［ＦＡ：ＰＬＧＡ］５０：５０（商標）ＡＦＰＬＧＡＮであった。
【００８６】
２．８ ポリグルタルアルデヒドナノ粒子
幾つかの改質点を有するＭａｒｇｅｌ， ｅｔ ａｌ．， （１９７９）の方法。１０Ｎ ＮａＯＨを、界面活性剤 （Ｇｕａｒ Ｃ１３ （１％ およびポリエチレンオキシド分子量１０，０００（ｓ）／またはＡｅｒｏｓｏｌ ６０４ （１％））を含むグルタルアルデヒド（３〜２５％）水溶液１００ｍｌの溶液にｐＨがアルカリ性になるまで（７〜１４、好ましくは９〜１１）滴加した。混合物を密封容器中でＮ２ガスで脱気し、機械振盪装置上で周囲温度で２４時間攪拌した。４〜６時間について１時間毎の間隔で、ｐＨを１１に調整した。最後に、系を水で十分に透析し、遠心分離して、ＰＧＬ球（ナノ粒子）を得た。様々な粒度の粒子は、モノマー濃度、界面活性剤、またはｐＨを変化させることによって調節することができる。
【００８７】
様々な最適化条件の２種類の製剤ＰＧＬＮ１（２００ｎｍ）（ＣＯＯＨ）およびＰＧＬＮ２（４００ｎｍ）（ＣＨＯ）をカップリングに用いた。
【００８８】
セクションＩＩＩ
３．０ ＶＢ１２カップリングに適する粒状球の表面誘導体形成
粒状キャリヤー（微小球／ナノ粒子）の表面活性化の様々な方法を、以下に示す。
【００８９】
３．１．１ 過ヨード酸塩酸化による活性化
過ヨード酸酸化に用いた特定の画分は、ＤＳＭ１， ＤＳＭ２， ＤＳＮ１， ＤＳＮ２， ＤＳＮ３， ＤＳＮ４， ＤＣＮ１， ＤＧＮ１およびＤＧＮ２であった。
微粒子の計量分（２５０〜５００ｍｇ）を蒸留水（５〜１０ｍｌ）に懸濁し、マグネチックスターラーで攪拌した。次に、過ヨード酸ナトリウム（粒子と等重量）を加え、混合を暗所で４５〜５０分間継続した。酸化した粒子系を透析または遠心分離によって十分に洗浄し、最後に凍結乾燥した。
【００９０】
３．１．２ ＶＢ１２の酸化粒子とのカップリング
次に、酸化した粒子系（１００〜１５０ｍｇ）を、アミノＶＢ１２誘導体（２０〜３０ｍｇ）と暗所にて４℃で１８〜２４時間反応させた。接合体を水素化ホウ素ナトリウム（４ｍｇ）で４℃で２時間還元し、透析し、最終的に粉末状接合体として凍結乾燥した。
【００９１】
使用したＶＢ１２誘導体および粒子は、下記の通りであった。
（下表に記載の反応の図解表現）
接合体番号    ＶＢ１２誘導体＋粒子 → 接合体  （粒度）
【００９２】
【表１】
2004517103.tif 000003
【００９３】
３．２．１ ＶＢ１２とのカップリングに適するＣＯＯＨ基を供給するための粒子の表面誘導体形成
ＶＢ１２結合の官能基を供給するための球の表面誘導体形成：粒子をＰｅｙｒｏｔ ｅｔ ａｌ， （１９９４） によって記載されている方法を用いてスクシニル化し、アミノＶＢ１２誘導体へ結合するための官能基を提供した。多糖類コアを最初に完全に乾燥した後、５０ｍｇ／ｍｌ トリエチルアミンを含むジクロロメタン（１００ｍｇ／ｍｌ）に分散した。無水コハク酸（３０％ｗ／ｖ）を加え、反応を無水条件下で（３５±２℃）にて２０時間行った。最後に、選択した画分ＤＤＭ３， ＤＤＭ２， ＤＳＭ１， ＤＤＮ１， ＤＤＮ２およびＤＤＮ３を蒸留水に対して透析し、凍結乾燥した。
【００９４】
３．２．２ スクシニル化粒子とＶＢ１２誘導体のカップリング
ＶＢ１２−球接合体を、スクシニル化コア（ＤＤＭ／ＤＤＮ）とＶＢ１２のアミノ誘導体との直接アミド結合によって調製した。一般に、カップリングは、スクシニル化デキストランコアを０．１５Ｍ ＮａＯＨ溶液（ｐＨ４．５）に分散させ、これをＮＨ２−スペーサー ＶＢ１２および１−エチル−３［（ジメチルアミノ）プロピル］カルボジイミド（ＥＤＡＣ）と総量が３ｍｌ中で混合することによって行った。次に、ｐＨをＮａＨＣＯ３で７．５に調整した。反応混合物を３０±２℃で２時間攪拌し、４℃で２０時間インキュベーションし、最後に暗桃色〜赤色粉末状生成物として凍結乾燥した。典型的には、スクシニル化コア１００ｍｇを、等量のアミノＶＢ１２およびＥＤＡＣのモル過剰量とカップリングした。
【００９５】
３．２．３ アミノヘキシル−５′ＯＶＢ１２を用いるＶＢ１２球の代替形成法
１．  スクシニル化デキストランコアを１００ｍｇ／ｍｌで溶液（ｐＨ４．５）に分散させ、等容の５０ｍｇ／ｍｌＮ−ヒドロキシスクシンイミド（５０ｍｇ／ｍｌＤＭＦ）と十分に混合した。
２．  １−エチル−３−｛３−（ジメチルアミノ）プロピル｝カルボジイミド（ＥＤＡＣ）（球に対して等重量）を１００ｍｇ／ｍｌで加え、１５分間反応させた。
３．  （球に対して）等重量のアミノヘキシル−５′ＯＶＢ１２を０．０２５Ｍ Ｋ２ＣＯ３の１００ｍｇ／ｍｌに溶解したものを加え、反応混合物を室温で２０時間攪拌した後、十分に透析した後、凍結乾燥した。
【００９６】
2004517103.tif 000004
【００９７】
３．３．１ ＣＮＢＲ依存性カップリング
ＣＮＢＲ２ｇを、通風室でＰＢＳ（ｐＨ１１．５）２５ｍｌに溶解した。次に、ＣＮＢＲ溶液を、１０〜１５分間激しく攪拌しながら粒子懸濁液に加えた。上記反応で、ｐＨはＮａＯＨを加えることによって保持した。粒子を遠心分離し、氷冷蒸留水および重炭酸ナトリウムで十分に洗浄した。
【００９８】
３．３．２ カップリング
アミノＶＢ１２２５ｍｇを、ＣＮＢＲ活性化粒子（１００ｍｇ）を３ｍｌ重炭酸塩緩衝液ｐＨ７．５に懸濁したものに加え、４℃で７２時間回転により混合し、最後に遠心分離および緩衝液に対する十分な透析によって洗浄した。
2004517103.tif 000005
【００９９】
３．４．１ アミノ基を提供するための多糖類粒子の誘導体形成
ジアミン（１，２−ジアミノエタン）のアミノ基の１個を、５０％ｖ／ｖオキシ塩化ベンジル／無水酢酸を徐々に加えて保護し、Ｄｏｗｅｘクロマトグラフィーによって精製した。モノ保護ジアミンを過ヨード酸活性化粒子／スクシニル化粒子で処理した。ＮＨ２基上の保護基を除き、表面上に粒子のアミノ基を生成した。
【０１００】
３．４．２ チオール基を提供するための表面改質
アミノ基を改質した粒子系をリン酸緩衝液ｐＨ７．５（５０ｍｇ／ｍｌ）に分散した。ＳＰＤＰをアセトン（５０ｍｇ／ｍｌ）に溶解した。相を十分に混合し、室温で一晩反応を進行させ、過剰の試薬を透析によって除去した。遊離のチオールを、β−メルカプトエタノールで還元して誘導し、最後に凍結乾燥した。
【０１０１】
３．４．３  ジスルフィド結合によるＶＢ１２−多糖類接合体の形成
ＳＰＤＰ処理した粒子（２５ｍｇ／ｍｌ；５０ｍｇ／ｍｌ）を、酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５に懸濁した。次に、ＤＴＰアミノエチル誘導体（１０ｍｇ／ｍｌ）２．５ｍｌを、酢酸緩衝液ｐＨ４．５に溶解した。両相を混合し、反応を４℃で４８時間進行させた。接合体を透析し、最後に凍結乾燥した。用いた様々な誘導体および上記反応からのそれらの接合体を、下記に示す。
2004517103.tif 000006
【０１０２】
３．５．０ 非開裂性ＶＢ１２−多糖類コア接合体の形成
１）   表面上のＮＨ２基を含む微粒子（モノ保護ジアミンで予め改質したＤＧＮ１）を、１．５倍モル過剰量のエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）［ＥＧＳ］で室温にて２０分間処理した。アミノｅＶＢ１２（１ｃ）を加え、カップリングを一晩行った。生成物を透析し／遠心分離し、凍結乾燥した。
２）  同様に、粒子系（モノ保護ジアミンで予め改質したＤＧＮ２）を、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）で処理した。反応中間体をアミノＶＢ１２（１ｄ） で処理し、接合体を洗浄して、凍結乾燥した。
３）  ＳＰＤＰ改質粒子（ＤＳＭ１）に、ヨードアセタミドヘキシルｅＶＢ１２（１ｓ） をジイソプロピルエチルアミド／ジエチルホルムアミド（１：２０ｖ／ｖ）に溶解したものを（不活性雰囲気で）室温にて３０分間激しく攪拌しながら加え、チオエーテル接合体を洗浄して、凍結乾燥した。
４）  テトラペプチドｅＶＢ１２（１ｔ）を、重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．５の存在下にて室温で３０分間アミノ基を含む粒子（モノ保護ジアミンで予め改質したＤＣＮ１，３．４．１）に接合し、２％酢酸と混合し、洗浄して、凍結乾燥した。
５）  ｅＶＢ１２（１ｑ）のアニリド誘導体を、重炭酸塩緩衝液ｐＨ９．５中ＥＤＡＣ／ＮＨＳの存在下にて室温で３０分間アミノ基を含む粒子とカップリングし、２％酢酸で希釈し、洗浄して、凍結乾燥した。
【０１０３】
2004517103.tif 000007
【０１０４】
３．６ アミノＶＢ１２ ／ヒドラジドのアミド接合体およびＥＤＡＣによる溶媒蒸発によって調整した微粒子
アミノＶＢ１２／ヒドラジドＶＢ１２およびＥＤＡＣの２０倍モル過剰量を用いて重炭酸塩緩衝液ｐＨ７．５中にＣＯＯＨを含む粒子に接合し、接合は４℃で一晩行い、洗浄して、凍結乾燥した。用いた粒子およびそれらのＶＢ１２誘導体を下記に示す。
【０１０５】
2004517103.tif 000008
【０１０６】
３．６．１ ジスルフィド結合によってカップリングしたＶＢ１２粒子系
ナノ粒子ＰＬＧＡＮ１， ＰＬＧＡＮ２， ＰＨＢＮ１およびＰＬＡＮ１をモノ保護ジアミンで表面改質し、上記のように（３．２．１および３．２．２節）ＳＰＤＰで処理し、ＳＨを含む粒子を得た。
【０１０７】
３．６．２ アミノ基を提供するための粒子の誘導体形成
ジアミン（１，２−ジアミノエタン）のアミノ基の１つを５０％ｖ／ｖオキシ塩化ベンジル／無水酢酸を徐々に加えることによって保護し、ＤＯＷＥＸクロマトグラフィーによって精製した。モノ保護ジアミンを粒子系で処理し、ＮＨ２基上に理由死のアミノ基を生成させた。
【０１０８】
３．６．３ チオール基を提供するための表面改質
アミノ基を改質した粒子系を、リン酸緩衝液ｐＨ７．５（５０ｍｇ／ｍｌ）に分散した。ＳＰＤＰを、アセトン（５０ｍｇ／ｍｌ）に溶解した。両相を十分に混合し、室温で一晩反応を進行させ、過剰の試薬を透析によって除去した。遊離のチオールをβ−メルカプトエタノールで還元することによって導入し、最後に凍結乾燥した。
【０１０９】
３．６．４ カップリング
ＳＰＤＰ処理した粒子（２５ｍｇ／ｍｌ；５０ｍｇ／ｍｌ）を酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．５に懸濁した。次に、ＤＴＰアミノエチル誘導体（１０ｍｇ／ｍｌ）２．５ｍｌを酢酸緩衝液ｐＨ４．５に溶解した。両相を混合し、反応を４℃で４８時間進行させた。接合体を透析した後、凍結乾燥した。
【０１１０】
６．６．５ ナノ粒子（ＰＬＧＡ）に結合するための表面官能基の同時組込み
ＶＢ１２結合に適する表面官能基を、調製中にナノ粒子マトリックスに同時投与する。（Ｌ−α−ホスファチジルエタノールアミン）を含むナノ粒子を、脂質のクロロホルム溶液をポリマーのジクロロメタン溶液に混合することによって調製した（脂質対ポリマー比１：５）。次に、上記の（ＰＬＧＡ溶媒蒸発法）ＰＧＬＡＮ２と同様にして、乳化を行った。形成された粒子をＳＰＤＰで改質し、カップリングに適するようにした。
【０１１１】
これらの系は、ＶＢ１２のジチオピリジル誘導体へ接合するためにデザインした。
2004517103.tif 000009
【０１１２】
３．６．６ コロイド粒子上のＶＢ１２誘導体コポリマーの吸着
これは、ポロキサマー上でのカップリングにより幾らか改質したＮｅａｌ ｅｔ ａｌ．の方法によって行った（Ｎｅａｌ ｅｔ ａｌ．， １９９８）。
工程１：
ポロキサマー４０７およびポロキサミン９０８の末端ヒドロキシル基をアミノ基で置換した後、アミノコポリマーをＶＢ１２でカップリングした。
１）  上記のようなＥＤＡＣの存在下におけるＶＢ１２（１ｂ）のｅ−カルボキシレート。反応を、以前に使用した水性溶媒の代わりに有機溶媒であるテトラヒドロフランを含むように若干改質した。
２）  もう一つの反応では、アミノコポリマーをＳＰＤＰで改質した後、上記のようにｅＶＢ１２ （１ｉ） のジチオピリジル誘導体と結合させた。
【０１１３】
コポリマーのアミノ誘導体についての手続きを概説する（文献：Ｎｅａｌ， Ｊ．Ｃ． ｅｔ ａｌ．， １９９８）。コポリマーをＣＨ２Ｃｌ２に溶解した２０％ｗ／ｖ溶液を、２倍モル過剰量のｐ−とるスルホニルクロリドおよびピリジンと室温で２４時間反応させた。ｐ−トルエンスルホネートエステル生成物を最初に３Ｍ ＨＣｌで洗浄した後、有機層をＮａＨＣＯ３で洗浄し、回転蒸発を用いてコポリマーを得た。第二工程では、ｐ−トルエンスルホネートエステル生成物を加圧反応容器中で２５％ｗ／ｖＮＨ３／Ｈ２Ｏと１２０℃で６時間反応させ、アミノ化コポリマーを生成した。反応生成物を室温まで冷却し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出し、アミノ化コポリマーからトルエンスルホン酸アンモニウムを分離した。次に、生成物を塩基（ＮａＯＨ／Ｈ２Ｏ）で洗浄して、遊離のアミノ生成物を生成した。
【０１１４】
工程２：
ＶＢ１２のアミノ化コポリマーを、ナノ粒子表面に吸着させた。簡単に説明すれば、ＶＢ１２から誘導体形成したコポリマーを等容および濃度の微粒子懸濁液と１２時間インキュベーションした。
【０１１５】
ナノ粒子に吸着した接合体
【０１１６】
【表２】
2004517103.tif 000010
【０１１７】
表面吸着
表面ＣＯＯＨ基を含む粒子系はアニオン性であり、それらをカチオン性薬剤と混合すると、ナノ粒子表面上でイオン結合により吸着する。表面改質剤の必要量を吸着させることができる。典型的には、５〜１０％ＤＭＡＤを有する粒子については、予備成形した粒子９５〜９０ｍｇを含む１０〜２０ｍｌに溶解したこの薬剤５〜１０ｍｇを氷槽上で音波処理により懸濁し、凍結乾燥によって乾燥した。
2004517103.tif 000011
【０１１８】
ナノ粒子のエポキシ活性化： Ｖｉｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， １９９８
予備成形したナノ粒子の試料（８０）を、氷槽上でホウ酸緩衝液（５０ ＭＭ， ｐＨ５） １０ｍｌに懸濁した。次に、テトラフルオロホウ酸亜鉛水和物（触媒２４ｍｇ）およびＤｅｎａｃｏｌ溶液 （２４ ｍｇ／４−ｍｌ ホウ酸緩衝液）３７±１℃で３０〜５０分間攪拌しながら加えた。ナノ粒子を遠心分離によって分離し、Ｈ２Ｏで十分に洗浄して未反応不純物を除去した。
2004517103.tif 000012
アミノ誘導体ＶＢ１２を、１，１′−カルボニルジイミダゾール活性化によってカップリングする。
【０１１９】
３．６．７ ＰＩＮ法によって調製される無水物粒子の接合
ポリ無水物ナノ粒子［ＡＳＳＮ１， ＡＦＰＬＧＡＮ２； それぞれ５０ ｍｇ］秤量分をホウ酸緩衝液［０．２０ Ｍ， ｐＨ ９．０， １０ｍｌ］に懸濁した後、ｅＶＢ１２のヒドラジド誘導体をナノ粒子の無水物基と比較してモル過剰量で加えた。３０分後、酢酸緩衝液［０．２ Ｍ， ｐＨ ５．０， ２５ ｍｌ］ を加えた。接合したナノ粒子を２Ｍ ＮａＣｌ、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥した。
2004517103.tif 000013
【０１２０】
３．６．８ 無水物粒子とｅＶＢ１２のジスルフィド接合
粒子（ＡＦＳＮ１， ＡＦＰＬＧＡＮ２）をモノ保護ジアミンで改質し、保護薬剤を上記の用にして開裂した（３．６．２節）。
【０１２１】
もう一つの反応では、ナノ粒子（ＡＦＳＮ１）をアルギンアミドで表面改質した（文献：Ｇａｏ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， １９９８）。簡単に説明すれば、ナノ粒子５０ｍｇをホウ酸緩衝液に１２ｍＭアルギンアミドを含む溶液に懸濁した（０．２０ Ｍ， ｐＨ ５．０， ９ ｍｌ）。粒子を２Ｍ ＮａＣｌ、蒸留水で洗浄し、凍結乾燥した。
【０１２２】
上記アミノ誘導粒子をＳＰＤＰにカップリングして、上記と同様にＳＨ基を含む粒子を得た（３．６．３節）。
【０１２３】
カップリングは、３．６．４に記載の方法で行った。
2004517103.tif 000014
【０１２４】
３．６．９ タンパク質ポリマーを基剤とする微粒子／ナノ粒子のＶＢ１２への接合
微粒子およびそれらの接合体の様々な画分を、下記に示す。
この反応では、ＨＳＡＭ粒子（１００ｍｇ）を、シッフ塩基を形成し且つ接合のためのＣＨＯ基を生じる２５％ｗ／ｖグルタルアルデヒド／ホウ酸緩衝液の０．２５〜０．５ｍｌで活性化した。粒子とＶＢ１２誘導体との間のジスルフィドカップリングは、３．６．２．、 ３．６．３および３．６．４に記載の方法で行う。
【０１２５】
【表３】
2004517103.tif 000015
【０１２６】
３．７ ポリグルタルアルデヒドナノ粒子のｅＶＢ１２へのカップリング
水性粒子懸濁液 （ＰＧＬＮ２， １００ ｍｇ／ｍｌ； ５ ｍｌ） をＰＢＳ（ｐＨ ７．４， １５ ｍｌ）で希釈した。次に、ヒドラジドＶＢ１２誘導体（１０ ｍｌ， １５−２０ ｍｇ）溶液を、４℃で２時間攪拌しながら加えた後、グリシン （２００ ｍｇ）を加え、反応性アルデヒド基を除去し、攪拌を室温で更に１時間継続した。粒子を透析／遠心分離した後、凍結乾燥した。ＰＧＬＮ１を、カルボジイミド化学によってアミノヘキシルｅＶＢ１２ （１ｄ）とカップリングした。
2004517103.tif 000016
【０１２７】
３．８ ＶＢ１２誘導体の共有結合カップリングによる分解可能なヒドロゲル
文献： Ｚｈａｏ， Ｘ． ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ， Ｊ． （１９９８）
二工程ヒドロゲル調製  二官能性ＰＥＧ−ＣＭ−ＨＢＡ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）２０００（下記参照）の５０ｍｇの二官能性二重エステルＰＥＧから作成された二工程ゲルを、脱イオン水０．２５ｍｌに溶解した。この溶液に、ＦＩＴＣ−ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）を有するまたは含まない緩衝液０．５ｍｌ、および８−アームのＰＥＧ−アミン溶液（２５０ｍｇ／ｍｌ）０．２５ｍｌを加えた。激しく振盪した後、溶液を静置した。ゲルが数分で形成した。適当なｐＨ範囲は、５．５〜８であった。
【０１２８】
ＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネート６８００（下記参照）を含む二官能性エステル５０ｍｇ中でエステルを含む二官能性のＰＥＧ−スクシンイミジルカーボネートから作成された二工程ゲルを、脱イオン水０．３ｍｌに溶解した。この溶液に、８−アームのＰＥＧ−アミン溶液（２５０ｍｇ／ｍｌ）０．３ｍｌを加えた。激しく振盪した後、溶液を静置した。ゲルが数分で形成した。適当なｐＨ範囲は、５．５〜８であった。
【０１２９】
接合体５９および６０：アミノおよびヒドラジド誘導体を、調製中にカップリングする。
【０１３０】
セクションＩＶ
予備成形した接合体へのタンパク質装填（インスリン）
典型的には、単純なウシインスリン溶液（４０ＩＵ／ｍｌ）または５００μｇのＢ型肝炎ワクチンの１００ＩＵを、多糖類コア１００ｍｇを含む予備成形した接合体と混合した。ゲルを凍結乾燥し、暗桃色〜淡赤色粉末を得て、使用まで４〜８℃で保管した。
・架橋が伴うときには、薬剤装填は、異なる段階で行い、すなわち粒子カーゴの調製の後、またはＶＢ１２誘導体のカップリングの後に行う。
【０１３１】
具体的利点
本発明に記載の送達系は、他の報告されているＶＢ１２を基剤とする接合系に比較して利点を有する。（１）送達しようとする医薬品は、生物分解性ポリマー静キャリヤーに装填される。（２）本発明で調製される粒子キャリヤーは生物分解性で且つ薬学上許容可能なキャリヤーからなっているので、イン・ビボで分解して、その薬理学的応答に対して生物活性薬剤を放出し、送達し、これは薬剤送達の必要条件である。（３）親基のみで生じるペプチド／タンパク質医薬品またはワクチンまたは薬剤は、医薬目的のために生物分解性ポリマー内に容易に装填することができる。（４）ポリマー粒子は、腸および消化管酵素の過酷な環境から保護される。（５）ＶＢ１２タンパク質接合系と比較して、摂取は数倍に増幅される。（６）送達しようとする医薬品は化学的に改質されないので、完全な生物活性を保持する。
【０１３２】
イン・ビボ性能
調製された様々なインスリンを装填した薬剤送達系を、ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットでの抗糖尿病活性化について試験し、結果を概説部に記載している。これらのインスリン薬剤送達系は、糖尿病ラット（ｎ＝動物数）に経口投与される。給餌の後、様々な時間間隔で、ラットから採血し、それらの血中グルコース濃度を測定する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＶＢ１２とカップリングした粒子系。
【図２】
ＶＢ１２の構造およびＩＦ親和性についての結合の部位。
【図３】
単純なインスリンおよびインスリンを含むＶＢ１２−微小球接合体でのｐＨの効果およびタンパク質分解を示すグラフ。
【図４】
ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラット（ｎ＝３）でのインスリンを装填したＶＢ１２−球接合体の経口投与の低血糖効果を示すグラフ。
【図５】
ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラット（ｎ＝３）でのインスリンを装填したＶＢ１２−をコーティングした微小球／ナノ粒子接合体の経口投与の低血糖効果を示すグラフ。
【図６】
ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラット（ｎ＝３）でのインスリンを装填したＶＢ１２−をコーティングした微小球／ナノ粒子接合体の経口投与の低血糖効果を示すグラフ。
【図７】
ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラット（ｎ＝３）でのインスリンを装填したＶＢ１２−をコーティングした微小球／ナノ粒子接合体の経口投与の低血糖効果を示すグラフ。
【図８】
ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラット（ｎ＝３）でのインスリンを装填したＶＢ１２−をコーティングした微小球接合体の経口投与の低血糖効果を示すグラフ。
【図９】
効果的送達系（ＤＤＮ１  ＣＯ−ＮＨ「ｅ」ＶＢ１２）およびその摂取研究の用量応答関係を示すグラフ。
【図１０】
ストレプトゾトシン誘発糖尿病ラットでＩ．Ｖ．、Ｓ．Ｃ．および経口経路で投与される単純な接合体およびインスリンの低血糖効果を示すグラフ。
【図１１】
初期の発明と比較した本発明の図解表現。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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