(57)【要約】本発明は、合成化合物、これらの化合物を認識および結合する抗体、これらの化合物をコードするポリヌクレオチド、およびこれらのエピトープの提示に応答して惹起される免疫エフェクター細胞を提供する。本発明は、さらに、免疫応答を誘導し、本発明の化合物の送達によって被験体に免疫治療薬を投与する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の構造を有する化合物：
化合物１
【化１】
2004525072.tif 000021
【請求項２】下記の構造を有する化合物：
化合物２
【化２】
2004525072.tif 000022
【請求項３】下記の構造を有する化合物：
化合物３
【化３】
2004525072.tif 000023
【請求項４】下記の構造を有する化合物：
化合物４
【化４】
2004525072.tif 000024
【請求項５】下記の構造を有する化合物：
化合物５
【化５】
2004525072.tif 000025
【請求項６】下記の構造を有する化合物：
化合物６
【化６】
2004525072.tif 000026
【請求項７】下記の構造を有する化合物：
化合物７
【化７】
2004525072.tif 000027
【請求項８】下記の構造を有する化合物：
化合物８
【化８】
2004525072.tif 000028
【請求項９】下記の構造を有する化合物：
化合物９
【化９】
2004525072.tif 000029
【請求項１０】下記の構造を有する化合物：
化合物１０
【化１０】
2004525072.tif 000030
【請求項１１】下記の構造を有する化合物：
化合物１１
【化１１】
2004525072.tif 000031
【請求項１２】２７位および２８位のアミノ酸がそれぞれＬおよびＳである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項１３】
２７位および２８位のアミノ酸がそれぞれＬおよびＴである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項１４】
２７位および２８位のアミノ酸がそれぞれＶおよびＴである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項１５】
２７位および２８位のアミノ酸がそれぞれＦおよびＡである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項１６】
２７位および２８位のアミノ酸がそれぞれＴおよびＡである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項１７】
２７位および２８位のアミノ酸がそれぞれＧおよびＶである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項１８】
２７〜３４位のアミノ酸がそれぞれＦ、Ｌ、Ｆ、Ｈ、Ｔ、Ｅ、Ｙ、およびＶである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項１９】
２７〜３４位のアミノ酸がそれぞれＦ、Ｌ、Ｆ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｙ、およびＩである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２０】
２７〜３４位のアミノ酸がそれぞれＦ、Ｌ、Ｙ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、およびＶである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２１】
２７〜３４位のアミノ酸がそれぞれＦ、Ｌ、Ｙ、Ｈ、Ｔ、Ｐ、Ｍ、およびＩである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２２】
２７〜３４位のアミノ酸がそれぞれＦ、Ｌ、Ｔ、Ｐ、Ｌ、Ｇ、Ｐ、およびＲである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２３】
配列番号：３のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
配列番号：５のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２５】
配列番号：７のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２６】
配列番号：９のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２７】
配列番号：１１のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２８】
配列番号：１３のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
配列番号：１５のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３０】
配列番号：１７のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３１】
配列番号：１９のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３２】
配列番号：２１のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３３】
配列番号：２３のアミノ酸を含むアミノ酸配列をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３４】
請求項１２から２２のいずれか一項記載のペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３５】
請求項１から１１のいずれか一項記載の化合物を特異的に認識して結合する、抗体。
【請求項３６】
請求項１から１１のいずれか一項記載の有効量の化合物を送達する工程を含む、被験体に免疫応答を誘導する方法。
【請求項３７】
ＭＨＣ分子に関して化合物が送達される、請求項３５記載の方法。
【請求項３８】
ＭＨＣ分子が抗原提示細胞表面上に化合物を提示する、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
化合物が該化合物をコードするポリヌクレオチドとして送達される、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
被験体に請求項３５記載の有効量の抗体を投与する工程を含む、免疫治療法。
【請求項４１】
ＭＨＣ分子に関して請求項１から１１のいずれか一項記載の化合物を提示する抗原提示細胞の存在下で、該細胞を利用して、インビトロまたはインビボで産生される、免疫エフェクター細胞。
【請求項４２】
請求項４１記載の有効量の免疫エフェクター細胞を投与する工程を含む、養子免疫療法。
【請求項４３】
少なくとも２つの免疫原性リガンドを含む組成物であって、該免疫原性リガンドがそれぞれ同一の天然リガンドに対する免疫応答を誘発する能力によって特徴付けられ、該免疫原性リガンドが、
2004525072.tif 000032
からなる群より選択される組成物。
【請求項４４】
免疫原性リガンドに結合した生物活性を有する免疫グロブリン可変ドメインをさらに含む、請求項４３記載の組成物。
【請求項４５】
免疫原性リガンドに結合したＭＨＣ分子をさらに含む、請求項４４記載の組成物。
【請求項４６】
免疫原性リガンドが共有結合している、請求項４３記載の組成物。
【請求項４７】
免疫原性リガンドに共有結合した薬剤をさらに含み、該薬剤が該免疫原性リガンドを抗原提示細胞に標的化することが可能な、請求項４６記載の組成物。
【請求項４８】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項４７記載の組成物。
【請求項４９】
ＭＨＣクラスＩＩ結合ヘルパーペプチドをさらに含む、請求項４７記載の組成物。
【請求項５０】
担体をさらに含む、請求項４３から４９のいずれか一項記載の組成物。
【請求項５１】
担体が薬学的に許容される担体である、請求項５０記載の組成物。
【請求項５２】
少なくとも２つの免疫原性リガンドを含む宿主細胞であって、該免疫原性リガンドがそれぞれ同一の天然リガンドに対する免疫応答を誘発する能力によって特徴付けられ、該免疫原性リガンドが、
2004525072.tif 000033
からなる群より選択される宿主細胞。
【請求項５３】
宿主細胞が抗原提示細胞であり、免疫原性リガンドが該細胞表面上に提示される、請求項５２記載の宿主細胞。
【請求項５４】
抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項５３記載の宿主細胞。
【請求項５５】
請求項５２〜請求項５４のいずれか一項記載の宿主細胞および担体を含む、組成物。
【請求項５６】
担体が薬学的に許容される担体である、請求項５５記載の組成物。
【請求項５７】
被験体の免疫応答を誘導する方法であって、被験体に有効量の２つまたはそれ以上の免疫原性リガンドを含む組成物を送達させる工程を含み、該免疫原性リガンドがそれぞれ同一の天然リガンドに対する免疫応答を誘発する能力によって特徴付けられ、該免疫原性リガンドが、
2004525072.tif 000034
からなる群より選択される方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本発明は、特許法第１１９条（ｅ）の下で、それぞれ２０００年８月４日、２０００年１２月１３日、２００１年１月２５日、および２００１年３月２６日に出願された米国仮特許出願第６０／２２３，６４１号、同第６０／２５５，５０２号、同第６０／２６４，４３２号、および同第６０／２７９，００５号の優先権を主張する。これらの出願の内容が、本発明の開示の参照として本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、ヒト黒色腫に有用な治療化合物分野に関する。
【０００３】
発明の背景
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される抗原性エピトープの認識は、哺乳動物免疫応答の確立、維持、および遂行において中心的役割を果たす。体細胞および抗原提示白血球によって発現される細胞表面ＭＨＣ分子によって提示されるペプチド抗原のＴ細胞による監視および認識は、ウイルス、細菌、および寄生虫などの感染性生物侵入を調節するように機能する。さらに、現在、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、特定の癌細胞抗原を認識して、これらの抗原を発現する細胞を攻撃することができることが証明されている。このＴ細胞の活性により、新規の抗癌ワクチンのストラテジーの開発の基礎が得られる。さらに、不適切なＴ細胞活性化は、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、および喘息などの自己免疫疾患の一定の緩和の中心的役割を果たす。したがって、ＭＨＣ分子によって提示される抗原性エピトープの提示および認識は、複数の病態における免疫応答の媒介に中心的役割を果たす。
【０００４】
癌患者由来の腫瘍特異的Ｔ細胞は、腫瘍細胞に結合してこれを溶解する。この特異性は、ＭＨＣクラスＩ、いくつかの細胞型についてはクラスＩＩ分子によって腫瘍細胞表面に提示された短いアミノ酸配列（エピトープ）を認識する能力に基づく。これらのエピトープは、腫瘍細胞または癌細胞中に特有にまたは異常に発現される遺伝子によってコードされる腫瘍抗原と呼ばれる細胞内タンパク質のタンパク質分解に由来する。
【０００５】
特異的抗腫瘍Ｔ細胞の利用可能性により、腫瘍抗原の同定およびその後の抗腫瘍免疫応答を誘発するように設計された癌ワクチンの作製が可能である。抗腫瘍Ｔ細胞は、癌患者内（末梢血単核細胞画分中に見出すことができる血液内を含む）、一次および二次リンパ組織（例えば、脾臓）、卵巣腫瘍患者の腹水（腫瘍関連リンパ球、すなわちＴＡＬ）、または腫瘍内（腫瘍浸潤リンパ球、すなわちＴＩＬ）を含む）に局在している。これらのうち、ＴＩＬはＴ細胞によって認識される腫瘍抗原および腫瘍抗原由来ペプチドの同定に最も有用である。
【０００６】
従来のＴＩＬ作製法は、腫瘍生検組織を破砕する工程と、Ｔ細胞成長因子インターロイキン２（ＩＬ−２）の存在下でインビトロで細胞懸濁液を培養する工程とを含む。数日間にわたり、腫瘍細胞とＩＬ−２との混合物は、腫瘍細胞を犠牲にして腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖を刺激することができる。この方法で、Ｔ細胞集団が拡大する。第１の拡大由来のＴ細胞を、その後マイトマイシンＣ処理または照射腫瘍細胞のいずれかと混合し、インビトロでＩＬ２と培養して、腫瘍反応性Ｔ細胞のさらなる増殖および富化を促進する。数ラウンドのインビトロ拡大後、強力な抗腫瘍Ｔ細胞集団を回収し、これを使用して従来のものであるが単調な発現クローニング法によって腫瘍抗原を同定することができる。Ｋａｗａｋａｎｉ  Ｙ．ら、１９９４、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１（９）、３５１５〜３５１９。
【０００７】
インビトロでの腫瘍特異的Ｔ細胞の作製に使用された現在使用されている方法は信頼できず、この方法で同定された抗原は、抗腫瘍免疫応答を必ずしも誘導しない。多数の実験により、無力、アネルギー、または物理的欠損のために、成熟Ｔ細胞による抗原の遭遇によって耐性が誘導されることが証明されている。Ｐａｒｄｏｌｌ、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、Ｍｅｄ．、４（５）、５２５〜５３１。
【０００８】
特定のペプチドのＴ細胞エピトープとして機能する能力は、ＭＨＣ分子の抗原提示ドメインに有効に結合すること、およびＴ細胞受容分子によって特異的に認識することができる適切なアミノ酸組を示すことも必要である。抗原性ポリペプチド由来の天然のＴ細胞エピトープを同定することができる一方で、これらのペプチドエピトープは、特定の免疫応答の誘導に最適な抗原を必ずしも提示する必要はない。実際、その配列を変化させる１アミノ酸または多数のアミノ酸置換の導入によって天然のエピトープの有効性を改良可能であることが示されている（Ｖａｌｍｏｒｉら、２０００、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４（２）、１１２５〜１１３１）。伸長に至適化した合成ペプチドエピトープの送達は、有用な免疫応答の誘導法を改良する潜在性を有する。
【０００９】
動物への抗原の導入は、種々の目的の抗原に対する免疫応答の調節または欠如の目的で広範に使用されている。これらには、病原体に対するワクチン接種、癌細胞に対する免疫応答の誘導、アレルギー反応の低減、自己免疫疾患の結果として起こる自己抗原に対する免疫応答の低減、同種移植拒絶の低減、および避妊目的のための自己抗原に対する免疫応答の誘導が含まれる。
【００１０】
癌治療では、腫瘍細胞と特異的に認識して溶解する細胞傷害性Ｔリンパ球集団を作製するための種々の免疫治療アプローチが得られている。これらのアプローチの多くは、一部腫瘍特異的抗原の同定および特徴づけに依存する。
【００１１】
つい最近、一定の病原体関連タンパク質および腫瘍関連タンパク質が、合成ペプチドを使用して免疫学的に模倣され、そのアミノ酸配列は病原体関連タンパク質または腫瘍関連タンパク質の抗原決定ドメインの配列に対応する。これらの進展にもかかわらず、天然の配列に基づくペプチド免疫原は、一般に、免疫応答の誘導に関してあまり適切に作用しない。したがって、免疫調整性の向上した改変合成抗原性ペプチドエピトープが必要である。本発明はこの必要性を満たし、さらに関連する利点を提供する。
【００１２】
発明の開示
本発明は、新規の合成治療化合物を提供する。これらの化合物は、ＭＨＣ分子への結合を増強し、天然の対応物と比較して免疫調節性が増強されるように設計されている。本発明の合成化合物は、合成および天然に存在する化合物に対する免疫応答の調節に有用である。
【００１３】
本発明の化合物をコードするポリヌクレオチド、これらのポリヌクレオチドを含む遺伝子送達用媒体、およびこれらのポリヌクレオチドを含む宿主細胞をさらに提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、本発明の化合物および組成物の送達ならびにＭＨＣに関連するこれらの送達による被験体の免疫応答の誘導法を提供する。
【００１５】
本発明の化合物はまた、これらの分子を特異的に認識し、結合する抗体の作製に有用である。これらの抗体は、さらに、被験体に投与する場合、免疫治療に有用である。
【００１６】
本発明はまた、ＭＨＣ分子に関連する本発明のペプチド組成物を提示する抗原提示細胞の存在下およびこれを犠牲にしたインビボまたはインビトロで産生される免疫エフェクター細胞および有効量のこれらの免疫エフェクター細胞の被験体への投与を含む養子免疫治療法を提供する。
【００１７】
少なくとも２つの免疫原性リガンドを含み、該免疫原性リガンドが、それぞれ同一の天然リガンドに対する免疫応答を誘発する能力によって特徴付けられ、該免疫原性リガンドが、
2004525072.tif 000002
からなる群より選択される組成物が本発明によってさらに得られる。リガンドは、薬学的に許容される担体などの担体中に存在し得る。
【００１８】
少なくとも２つの免疫原性リガンドを含み、該免疫原性リガンドが、それぞれ同一の天然リガンドに対する免疫応答を誘発する能力によって特徴付けられ、該免疫原性リガンドが、
2004525072.tif 000003
からなる群より選択される宿主細胞が本発明によってさらに得られる。１つの局面では、宿主細胞は抗原提示細胞であり、免疫原性リガンドは、細胞表面上に提示される。さらなる局面では、抗原提示細胞は樹状細胞である。宿主細胞は、薬学的に許容される担体などの担体中に存在し得る。
【００１９】
被験体の免疫応答を誘導する方法であって、該被験体に有効量の２つまたはそれ以上の免疫原性リガンドを含む組成物を送達させる工程を含み、該免疫原性リガンドがそれぞれ同一の天然リガンドに対する免疫応答を誘発する能力によって特徴付けられ、該免疫原性リガンドが、
2004525072.tif 000004
からなる群より選択される方法が本発明によってさらに得られる。
【００２０】
配列表の説明
配列番号：１  Ｔ細胞によって認識されるヒト黒色腫抗原（ＭＡＲＴ−１）をコードするｃＤＮＡの完全なヌクレオチド配列である。コード領域は、ヌクレオチド５４〜ヌクレオチド４０７の範囲である。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列はまた、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＵＯ６４５２で利用可能である。
【００２１】
配列番号：２  天然のヒト黒色腫抗原ＭＡＲＴ−１のアミノ酸配列である。本発明の化合物は、天然ペプチド２７〜３５位に基づく変形形態である。
【００２２】
配列番号：３  化合物１のアミノ酸配列である。
【００２３】
配列番号：４  化合物１をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００２４】
配列番号：５  化合物２のアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号：６  化合物２をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００２６】
配列番号：７  化合物３のアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号：８  化合物３をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００２８】
配列番号：９  化合物４のアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号：１０  化合物４をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００３０】
配列番号：１１  化合物５のアミノ酸配列である。
【００３１】
配列番号：１２  化合物５をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００３２】
配列番号：１３  化合物６のアミノ酸配列である。
【００３３】
配列番号：１４  化合物６をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００３４】
配列番号：１５  化合物７のアミノ酸配列である。
【００３５】
配列番号：１６  化合物７をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００３６】
配列番号：１７  化合物８のアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号：１８  化合物８をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００３８】
配列番号：１９  化合物９のアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号：２０  化合物９をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００４０】
配列番号：２１  化合物１０のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号：２２    化合物１０をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００４２】
配列番号：２３  化合物１１のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号：２４  化合物１１をコードするポリヌクレオチド配列である。
【００４４】
配列番号：２５  ヒト黒色腫抗原ＭＡＲＴ−１の天然のエピトープである。
【００４５】
発明の実施様式
本開示を通して、種々の出版物、特許、および公開特許出願が、引例として参照される。これらの刊行物、特許、および公開特許明細書は、本発明が属する技術の現状をより完全に説明するために本開示に参照として本明細書に組み入れられる。
【００４６】
本発明の実施は、特記しない限り、当業者の範囲内である従来の分子生物学技術（組換え技術を含む）、微生物学技術、細胞生物学技術、生化学技術、および免疫学技術を使用する。このような技術は、文献に完全に説明されている。これらの方法は、以下の刊行物に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、１９８９；「現代の分子生物学プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；「酵素学方法論（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」叢書（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「ＰＣＲ：実践アプローチ（ＰＣＲ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）」（Ｍ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９１）；「ＰＣＲ２：実践アプローチ（ＰＣＲ２： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）」（Ｍ。Ｊ。ＭａｃＰｈｅｓｏｎ，  Ｂ．Ｄ．ＨａｍｅｓおよびＧ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、１９９５）；「抗体：実験マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、１９８８）；および「動物細胞培養（Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ）」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）を参照のこと。
【００４７】
定義
本明細書で使用される一定の用語は以下の定義した意味を有し得る。
【００４８】
本明細書および特許請求の範囲で使用される、単数形態「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈上他で明白に指図しない限り複数の基準を含む。例えば、「１つの細胞（ａ ｃｅｌｌ）」という用語は、その混合物を含む複数の細胞を含む。
【００４９】
本明細書で使用される、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、組成物および方法が引用した要素を含むが、他を排除しないことを意味することを意図する。組成物および方法の定義に使用する場合、「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、組み合わせ物に対して任意の本質的な意義からの他の要素の排除を意味するものとする。したがって、本質的に本明細書に定義の要素からなる組成物は、単離および精製法由来の微量の夾雑物および薬学的に許容される担体（リン酸緩衝化生理食塩水、防腐剤など）を排除しない。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、他の成分の微量元素および本発明の組成物の実質的な投与工程以外の排除を意味するものとする。これらの各転換句によって定義された態様は、本発明の範囲内である。
【００５０】
「未変性」または「天然の」抗原は、天然の生体供給源から単離され、抗原受容体（特に、被験体中のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ））に特異的に結合することができるエピトープを含むポリペプチド、タンパク質、または断片である。
【００５１】
「抗原」という用語は、当技術分野において十分に理解されており、免疫原性物質（すなわち、免疫原）および免疫不応答（すなわち、アネルギー）を誘導する物質（すなわち、アネルゲン）が含まれる。
【００５２】
「変化した抗原」は、対応する野生型抗原と異なる一次構造を有する抗原である。変化した抗原を、合成法および組換え法によって作製することができ、例えば、リン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質分解、抗体分子、膜分子、または他のリガンドとの結合によって翻訳中または翻訳後に識別的に改変された抗原ペプチドが含まれるが、これらに限定されない（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、１９８８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５７、２８５〜３２０）。本発明の合成または変化した抗原は、天然のエピトープと同一のＴＣＲに結合することが意図される。
【００５３】
本明細書で天然または野生型抗原とも呼ばれる「自己抗原」は、抗原に対する自己耐性によって被験体で免疫応答をほとんど誘導しないか全く誘導しない抗原ペプチドをいう。自己抗原の例は、黒色腫特異的抗原ｇｐ１００である。
【００５４】
「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」という用語は、腫瘍に関連するかこれに特異的な抗原をいう。既知のＴＡＡの例には、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ、およびＭＡＧＥが含まれる。
【００５５】
「主要組織適合遺伝子複合体」または「ＭＨＣ」という用語は、Ｔ細胞への抗原提示および急速な移植片拒絶に必要な細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体をいう。ヒトでは、ＭＨＣはまた、「ヒト白血球抗原」または「ＨＬＡ」複合体として既知である。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、「ＭＨＣ分子」として既知であり、クラスＩおよびクラスＩＩ ＭＨＣ分子に分類される。クラスＩ ＭＨＣ分子は、β２−ミクログロブリンと非共有結合したＭＨＣでコードされるα鎖から作製された膜ヘテロ二量体タンパク質を含む。クラスＩ ＭＨＣ分子は全有核細胞付近に発現し、ＣＤ８＋Ｔ細胞に対する抗原提示で機能することが示されている。ヒトのクラスＩ分子には、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、およびＣが含まれる。クラスＩＩ ＭＨＣ分子は、非共有結合したαおよびβ鎖からなる膜ヘテロ二量体タンパク質も含まれる。クラスＩＩ ＭＨＣ分子は、ヒトではＣＤ＋４Ｔ細胞で機能することが既知であり、ＨＬＡ−ＤＰ、−ＤＱ、およびＤＲが含まれる。好ましい態様では、本発明の組成物およびリガンドは、任意のＨＬＡ型のＭＨＣ分子と複合体を形成することができる。当業者は、ＨＬＡの血清型および遺伝子型に精通している。ｈｔｔｐ：／／ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ＿ｖｉｅｗｉｎｇ＿ｐａｇｅ．Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ Ｈ．Ｇ．、Ｂａｃｈｍａｎｎ Ｊ．およびＳｔｅｖａｎｏｖｉｃ Ｓ．、「ＭＨＣリガンドおよびペプチドモチーフ（ＭＨＣ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｏｔｉｆｓ）」、１９９７、Ｃｈａｐｍａｎ  ＆  ＨａｌｌＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ  Ｇ．Ｍ．Ｔｈら、「ＨＬＡディクショナリー（Ｔｈｅ ＨＬＡ ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ）」、１９９９、Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ、５４、４０９〜４３７を参照のこと。
【００５６】
本明細書中で使用される、「抗原提示基質」という用語は、抗原をＴ細胞表面上のＴ細胞抗原受容体によって結合することができるような方法において抗原を提示することができる分子を意味する。抗原提示基質は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上、ＡＰＣの小胞調製物上、またはビーズまたはプレートなどの固体支持体上の合成基質の形態で存在し得る。合成抗原提示基質の例は、β２−ミクログロブリンと複合体形成した精製ＭＨＣクラスＩ分子、このような精製ＭＨＣクラスＩ分子の多量体、精製ＭＨＣクラスＩＩ分子、または固体支持体に結合したその機能的部分である。
【００５７】
「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」という用語は、免疫系の特異的エフェクター細胞によって認識可能な抗原−ＭＨＣ複合体の形態で１つまたは複数の抗原を認識することにより提示された抗原に対する有効な細胞性免疫応答を誘導することができる細胞クラスをいう。多数の細胞型がＴ細胞による認識のためにその細胞表面上で抗原を提示することができる一方で、プロＡＰＣは、有効量の抗原を提示し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答のためにＴ細胞をさらに活性化する能力を有する。ＡＰＣは、マクロファージ、Ｂ細胞、および樹状細胞などの無傷のホールセル；またはβ２−ミクログロブリンと複合体を形成した精製ＭＨＣクラスＩ分子などの他の天然もしくはは合成分子であり得る。
【００５８】
「樹状細胞（ＤＣ）」という用語は、種々のリンパ組織および非リンパ組織で見出される形態学的に類似の細胞型の多様な集団をいう（Ｓｔｅｉｎｍａｎ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９、２７１〜２９６）。樹状細胞は、生物中で最も強力且つ好ましいＡＰＣの構成要素である。全てではないが樹状細胞のサブセットは、骨髄前駆細胞由来であり、少数が末梢血を循環し、成熟ランゲルハンス細胞または最終的に分化した成熟細胞のいずれかとして認められる。樹状細胞は単球から分化し得るが、これらは異なる表現型を有する。例えば、特定の分化マーカーＣＤ１４抗原は樹状細胞中で見出されるが、単球はこれを所有しない。また、成熟樹状細胞は食作用を示さないが、単球は強力な食細胞である。ＤＣはＴ細胞の活性化および増殖に必要な全てのシグナルを発生することが示されている。
【００５９】
「抗原提示細胞動員因子」または「ＡＰＣ動員因子」という用語には、無傷のホールセルおよび抗原提示細胞を動員することができる他の分子の両方が含まれる。適切なＡＰＣ動員因子の例には、インターロイキン４（ＩＬ４）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、セプラゲル（ｓｅｐｒａｇｅｌ）、およびマクロファージ炎症タンパク質３α（ＭＩＰ３α）が含まれる。これらは、Ｉｍｍｕｎｅｘ、Ｓｃｈｅｒｉｇｎ−ＰｌｏｕｇｈおよびＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）から利用可能である。これらを、「現代の分子生物学プロトコール」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）を使用して組換え産生することができる。上記因子と同一の生物活性を有するペプチド、タンパク質、および化合物は、本発明の範囲内に含まれる。
【００６０】
「免疫エフェクター細胞」という用語は、抗原を結合することができ、且つ免疫応答を媒介する細胞をいう。これらの細胞には、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、および細胞傷害性Ｔリンパ球（例えば、ＣＴＬ細胞株、ＣＴＬクローン、ならびに腫瘍、炎症、または他の浸潤由来のＣＴＬ）が含まれるが、これらに限定されない。一定の罹患組織は特異的抗原を発現し、これらの抗原に特異的なＣＴＬが同定されている。例えば、約８０％の黒色腫がＧＰ−１００として既知の抗原を発現する。
【００６１】
本明細書で使用される、「免疫エフェクター分子」という用語は、抗原特異的に結合することができる分子をいい、Ｔ細胞抗原受容体ならびにＭＨＣクラスＩ分子およびクラスＩＩ分子が含まれる。
【００６２】
「ナイーブ（ｎａｉｖｅ）」免疫エフェクター細胞は、この細胞を活性化することができる抗原に曝露されていない免疫エフェクター細胞である。ナイーブ免疫エフェクター細胞の活性化には、ペプチド：ＭＨＣ複合体の認識および抗原特異的防御エフェクターＴ細胞の増殖および分化のためのプロＡＰＣによる同時刺激シグナルの同時送達の両方が必要である。
【００６３】
「免疫応答」は、広義で外来物質に対するリンパ球の抗原特異的応答をいう。免疫応答を誘発することができる任意の物質は「免疫原性」と呼ばれ、「免疫原」という。すべての免疫原は抗原であるが、全ての抗原が免疫原性というわけではない。本発明の免疫応答は、体液性（抗体活性を介する）または細胞媒介性（Ｔ細胞活性化を介する）であり得る。
【００６４】
本明細書で使用される、「リガンド」という用語は、別の分子上の特異的部位に結合する任意の分子をいう。言い換えれば、リガンドは、免疫エフェクター細胞との反応におけるタンパク質の特異性を付与する。これは、免疫エフェクター細胞上の補体結合部位と直接組み合わせたタンパク質内のリガンド部位である。
【００６５】
好ましい態様では、本発明のリガンドは、免疫エフェクター細胞（抗体またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ））上の抗原決定基またはエピトープに結合する。リガンドは、本発明の抗原、ペプチド、タンパク質、またはエピトープであり得る。
【００６６】
本発明のリガンドは、抗体上の受容体に結合することができる。１つの態様では、本発明のリガンドは長さが約４〜約８アミノ酸である。
【００６７】
本発明のリガンドは、ＭＨＣクラスＩ分子上の受容体に結合することができる。１つの態様では、本発明のリガンドは長さは約７〜約１１アミノ酸である。
【００６８】
本発明のリガンドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子上の受容体に結合することができる。１つの態様では、本発明のリガンドは長さが約１０〜約２０アミノ酸である。
【００６９】
本明細書で使用される、「教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞」という用語は、先に抗原に遭遇している上記の免疫エフェクター細胞である。ナイーブ相対物と対照的に、教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞の活性化には同時刺激シグナルが必要ない。ペプチド：ＭＨＣ複合体の認識は十分である。
【００７０】
Ｔ細胞に関して使用する場合、「活性化」は、細胞がもはやＧ０期ではなく、１つまたは複数の細胞毒、サイトカイン、および細胞型に特徴がある他の関連する膜結合タンパク質（例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋）を産生し始め、その表面上に特定の抗原を示す任意の標的細胞を認識および結合し、そのエフェクター分子を放出することができることを意味する。
【００７１】
本発明の文脈では、「認識された」という用語は、１つまたは複数のリガンドを含む本発明の組成物は、免疫エフェクター細胞によって認識および結合され、このような結合が有効な免疫応答を起こすことを意図する。リガンドが免疫エフェクター細胞によって認識されるかどうかを同定する活性は、当技術分野において既知であり、本明細書に記載されている。
【００７２】
「好ましくは認識された」という用語は、本発明の組成物またはリガンドの特異性が天然のリガンドを認識および結合する免疫エフェクター細胞に制限されることを意図する。
【００７３】
「交差反応性」という用語は、機能的に重複する本発明の化合物を説明するために使用される。より詳細には、天然のリガンドおよび／またはそれによって活性化された免疫エフェクター細胞の免疫原性は、変化したリガンドが天然のリガンドおよび／またはそれによって活性化された免疫エフェクター細胞と「交差反応性」を示すように変化したリガンドによって一定の範囲で共有している。本発明の目的のために、交差反応性は、以下の複数のレベルで出現する：（ｉ）リガンドレベル（例えば、変化したリガンドがＴＣＲに結合し、天然のリガンドＣＴＬを活性化することができる）；（ｉｉ）Ｔ細胞レベル（すなわち、本発明の変化したリガンドがＴＣＲに結合してＴ細胞集団（天然リガンドＣＴＬ集団とは異なる）を活性化し、天然のリガンドを示す細胞を有効に標的化および溶解することができる）；および（ｉｉｉ）抗体レベル（例えば、変化した「抗」リガンド抗体は天然のリガンドを検出、認識、および結合し、免疫応答においてエフェクター機構を開始し、最終的に宿主から天然のリガンドを除去することができる）。
【００７４】
本明細書で使用される、「被験体の免疫応答を誘導する」という用語は、当技術分野で十分に理解されており、被験体への抗原（またはエピトープ）の導入後の抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答が被験体への抗原（またはエピトープ）の導入前の免疫応答（あるとすれば）の少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約１００倍、さらにより好ましくは少なくとも約５００倍、さらにより好ましくは少なくとも約１０００倍またはそれ以上の増加を検出または測定することができることを意図する。抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答には、抗原特異的（またはエピトープ特異的）抗体の産生、抗原（またはエピトープ）に特異的に結合する分子をその表面上に発現する免疫細胞の産生が含まれるが、これらに限定されない。所与の抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答が誘導されたかどうかを同定する方法は、当技術分野で既知である。例えば、抗原特異的抗体を、当技術分野で既知の任意の種々の免疫アッセイ法（ＥＬＩＳＡ（例えば、固定化抗原（エピトープ）への試料中の抗体の結合を検出可能に標識した二次抗体（例えば、酵素標識マウス抗ヒトＩｇ抗体）で検出する）が含まれるが、これらに限定されない）を使用して検出することができる。
【００７５】
「同時刺激分子」は、抗原提示細胞表面上に発現した受容体−リガンド対とＴ細胞との相互作用に関連する。過去数年にわたり蓄積されてきた研究により、休止期Ｔ細胞は少なくとも２つのサイトカイン遺伝子発現および増殖の誘導シグナルが必要であることが納得いくように証明された（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｒ．Ｈ．、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４８、１３４９〜１３５６およびＪｅｎｋｉｎｓ  Ｍ．Ｋ．、１９９２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ、１３、６９〜７３）。特異性を付与する１つのシグナルを、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と適切なＭＨＣ／ペプチド複合体との相互作用によって得ることができる。第２のシグナルは抗原特異的ではなく、「同時刺激」シグナルと呼ばれる。このシグナルは、最初に、マクロファージおよび樹状細胞などのいわゆる「プロ（ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）」ＡＰＣと呼ばれる骨髄誘導補助細胞によって得られる活性と定義された。いくつかの分子は、同時刺激活性を増強することが示された。これらは、熱安定性抗原（ＨＳＡ）（Ｌｉｕ  Ｙ．ら、１９９２、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１７５、４３７〜４４５）、コンドロイチン硫酸改変ＭＨＣインバリアント鎖（Ｉｉ−ＣＳ）（Ｎａｕｊｕｋａｓ  Ｍ．Ｆ．ら、１９９３、Ｃｅｌｌ、７４、２５７〜２６８）、細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ−１）（Ｖａｎ  Ｓｅｖｅｎｔｅｒ  Ｇ．Ａ．、１９９０、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４４、４５７９〜４５８６）、Ｂ７−１、およびＢ７−２／Ｂ７０（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｒ．Ｈ．、１９９２、Ｃｅｌｌ、７１、１０６５〜１０６８）である。これらの分子は、それぞれＴ細胞上のその同族リガンドとの相互作用によって同時刺激を補助しているようである。同時刺激分子は、通常の生理学的条件下でナイーブＴ細胞の完全な活性化に必要な同時刺激シグナルを媒介する。受容体−リガンド対の１つの例は、ＡＰＣ表面上のＢ７同時刺激分子およびＴ細胞上のカウンター−受容体ＣＤ２８またはＣＴＬＡ−４である（Ｆｒｅｅｍａｎら、１９９３、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６２、９０９〜９１１；Ｙｏｕｎｇら、１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９０、２２９、およびＮａｂａｖｉら、１９９２、Ｎａｔｕｒｅ、３６０、２６６〜２６８）。他の重要な同時刺激分子は、ＣＤ４０、ＣＤ５４、ＣＤ８０、およびＣＤ８６である。「同時刺激分子」という用語は、Ｔ細胞表面上でＴＣＲによって結合したペプチド／ＭＨＣ複合体と共に作用する場合にペプチドに結合するＴ細胞の活性化を達成する同時刺激効果が得られる任意の１つの分子または分子の組み合わせを含む。したがって、この用語は、Ｂ７またはペプチド／ＭＨＣ複合体と共に同族リガンドに結合してＴ細胞表面上のＴＣＲがペプチドと特異的に結合する場合にＴ細胞を活性化するＡＰＣなどの抗原提示基質、その断片（単独、別の分子との複合体、または融合タンパク質として）上の他の同時刺激分子を含む。同時刺激分子は、種々の販売者（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を含む）から市販されている。いつも明確に記載されているわけではないが、野生型または精製同時刺激分子と類似の生物活性を有する分子（組換え物またはその突然変異タンパク質）が本発明の精��および範囲の範囲内で使用されることが意図される。
【００７６】
本明細書中で使用される、互換的に使用される「固相支持体」または「固体支持体」は、特定の支持体の型に制限されない。むしろ、多数の支持体を利用可能であり、これは当業者に既知である。固相支持体には、シリカゲル、樹脂、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲルが含まれる。本明細書で使用される、「固体支持体」には、合成抗原提示基質、細胞、およびリポソームも含まれる。適切な固相支持体を、所望の使用目的および種々のプロトコールとの適合性に基づいて選択することができる。例えば、ペプチド合成には、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．，Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓなどから入手したＰＡＭ樹脂）、ＰＯＬＹＨＩＰＥ（登録商標）樹脂（Ａｍｉｎｏｔｅｃｈ，Ｃａｎａｄａから入手）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手）、ポリエチレングリコールで繋いだポリスチレン樹脂（ＴｅｎｔａＧｅｌ（登録商標）、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、Ｔｕｂｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、またはポリジメチルアシルアミド樹脂（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）などの固相支持体が挙げられる。
【００７７】
本明細書で使用される、「免疫調節剤」という用語は、免疫応答を調節する分子、高分子複合体、または細胞であり、本発明の合成抗原ペプチドのみまたは本明細書に記載の任意の種々の製剤；本発明の合成抗原ペプチドを含むポリペプチド；本発明のペプチドまたはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；抗原提示基質（ＡＰＣおよび合成抗原提示基質（同時刺激分子の存在下または非存在下）を含む）上のクラスＩまたはクラスＩＩ ＭＨＣ分子に結合した本発明の合成抗原ペプチド；別の分子または高分子構造と共有結合または非共有結合によって複合体を形成した本発明の合成抗原ペプチド；および本発明のペプチドに特異的な教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞を含む。
【００７８】
「免疫応答を調節する」という用語には、免疫応答の誘導（亢進、誘発）および免疫応答の減少（抑制）が含まれる。免疫調節法（またはプロトコール）は、被験体の免疫応答を調節するものである。
【００７９】
本明細書で使用される、「サイトカイン」という用語は、細胞に対して種々の効果（例えば、成長または増殖の誘導）を発揮する多数の因子の任意の１つをいう。単独または本発明の実施と組み合わせて使用することができる非限定的なサイトカインの例には、インターロイキン２（ＩＬ−２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン１α（ＩＬ−１Ｉ）、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、ＭＩＰ−１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ−ｋｉｔリガンド、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、およびｆｌｔ３リガンドが含まれる。本発明はまた、１つまたは複数のサイトカインが培地から特異的に排除された条件を含む。サイトカインはいくつかの販売者（例えば、Ｇｅｎｚｙｍｅ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ＣＡ）、Ａｍｇｅｎ（Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ， ＣＡ）、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮ）、およびＩｍｍｕｎｅｘ（Ｓｅａｔｔｌｅ， ＷＡ）など）から市販されている。いつも明確に記載されているわけではないが、野生型または精製サイトカインと類似の生物活性を有する分子（組換え物またはその突然変異タンパク質）が本発明の精神および範囲の範囲内で使用されることが意図される。
【００８０】
「ポリヌクレオチド」および「核酸分子」という用語は、任意の長さのヌクレオチドの重合形態を言及するために互換的に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはその類似体を含み得る。ヌクレオチドは、三次元構造を有し、任意の機能（既知または未知）を発揮することができる。「ポリヌクレオチド」という用語には、例えば、一本鎖、二本鎖、および三重らせん分子、遺伝子もしくは遺伝子断片、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。核酸分子はまた、改変核酸分子を含み得る。
【００８１】
「ペプチド」という用語は、２つまたはそれ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣物の化合物を言及するために広義で使用される。サブユニットを、ペプチド結合で結合することができる。別の態様では、サブユニットを、他の結合（例えば、エステル結合、エーテル結合など）で結合することができる。本明細書中で使用される、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよび他のＤまたはＬ型光学異性体、アミノ酸類似体、およびペプチド模倣物を含む天然および／または非天然もしくは合成アミノ酸のいずれかをいう。ペプチド鎖が短い場合、３つまたはそれ以上のアミノ酸のペプチドを一般にオリゴペプチドと呼ぶ。ペプチド鎖が長い場合、ペプチドは一般にポリペプチドまたはタンパク質と呼ぶ。
【００８２】
「遺伝子改変」という用語は、外来遺伝子または核酸を含有および／または発現し、細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型が改変されたことを意味する。言い換えれば、これは、細胞の内因性ヌクレオチドへの任意の付加、欠失、または破壊をいう。
【００８３】
本明細書で使用される、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される過程をいう。ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡに由来し、適切な真核生物宿主が選択された場合、発現にはｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。発現に必要な調節エレメントには、ＲＮＡポリメラーゼに結合するためのプロモーター配列およびリボゾーム結合のための転写開始配列が含まれる。例えば、細菌発現ベクターには、ｌａｃプロモーターなどのプロモーターならびに転写開始用のシャイン−ダルガルノ配列、よび開始コドンＡＵＧ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前記）が含まれる。同様に、真核生物発現ベクターには、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ用の異種または相同プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボゾーム分離用終止コドンが含まれる。このようなベクターは市販されている、当技術分野で既知の方法（例えば、下記の一般的なベクター構築法）に記載の配列によって構築することができる。
【００８４】
「転写調節下」は、当技術分野で十分に理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列（通常、ＤＮＡ配列）の転写が転写の開始または促進に寄与するエレメントへのその作動可能な連結に依存することを示す。「作動可能に連結された」は、エレメントが機能する配列で存在する並置をいう。
【００８５】
「遺伝子送達用媒体」を、挿入したポリヌクレオチド宿主細胞に運搬することができる任意の分子と定義する。遺伝子送達用媒体の例は、リポソーム、生体適合性ポリマー（天然ポリマーまたは合成ポリマーを含む）；リポタンパク質；ポリペプチド；多糖類；リポ多糖類；人工ウイルスエンベロープ；金属粒子；および細菌、ウイルス（バキュロウイルス、アデノウイルス、およびレトロウイルスなど）、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌のベクターならびに種々の真核生物および原核生物宿主の発現について記載され、遺伝子治療および単純なタンパク質発現に使用することができる当技術分野で典型的に使用される他の組換え媒体である。
【００８６】
本明細書で使用される、「遺伝子送達」、「遺伝子導入」などは、移入方法に無関係な宿主細胞への外因性ポリヌクレオチド（時折、「導入遺伝子」と呼ばれる）の移入を言及する用語である。このような方法には、種々の既知の技術（ベクター媒介遺伝子導入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、または種々の他のタンパク質ベースまたは脂質ベースの遺伝子送達複合体による）ならびに「裸の」ポリヌクレオチドの送達を容易にする技術（エレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達、およびポリヌクレオチド移入に使用される種々の他の技術など）など）が含まれる。移入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞中で安定または一過性に維持され得る。安定な維持には、典型的には、移入ポリヌクレオチドが宿主細胞に適合する複製起点を含むか、染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）などの宿主細胞のレプリコン、核、またはミトコンドリア染色体に組み込まれることが必要である。当技術分野で既知であり、本明細書に記載のように、多数のベクターが遺伝子の哺乳動物への導入を媒介できることが既知である。
【００８７】
「ウイルスベクター」を、インビボ、エクスビボ、またはインビトロのいずれかで宿主細胞に送達すべきポリヌクレオチドを含む組換え産生ウイルスまたはウイルス粒子と定義する。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどが含まれる。アルファウイルスベクター（セムリキ森林熱ウイルスを基にしたベクターおよびシンドビスウイルスを基にしたベクターなど）もまた、遺伝子治療および免疫治療のために開発されている。ＳｃｈｌｅｓｉｎｇｅｒおよびＤｕｂｅｎｓｋｙ、１９９９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５、４３４〜４３９およびＺａｋｓら、１９９９、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、７、８２３〜８２７を参照のこと。遺伝子導入がレトロウイルスベクターによって媒介される態様では、ベクター構築物はレトロウイルスゲノムまたはその一部および治療遺伝子を含むポリヌクレオチドをいう。本明細書で使用される、「レトロウイルス媒介遺伝子導入」または「レトロウイルス形質導入」は同一の意味を有し、細胞に侵入してそのゲノムが宿主細胞ゲノムに組み込まれるウイルスによって遺伝子または核酸配列を宿主細胞に安定に導入する過程をいう。ウイルスはその正常な感染機構を介して宿主細胞に侵入するか、異なる宿主表面受容体またはリガンドに結合して細胞に侵入するように改変することができる。本明細書で使用される、レトロウイルスベクターは、ウイルスまたはウイルス様侵入機構を介して細胞に外因性核酸を移入することができるウイルス粒子をいう。
【００８８】
レトロウイルスは、ＲＮＡの形態でその遺伝情報を保有しているが、一旦ウイルスが細胞に感染すると、ＲＮＡはＤＮＡに逆転写されて、感染細胞のＤＮＡに組み込まれる。ＤＮＡ組み込み形態を、プロウイルスと呼ぶ。
【００８９】
遺伝子導入がＤＮＡウイルスベクター（アデノウイルス（Ａｄ）またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ））によって媒介される態様では、ベクター構築物は、ウイルスゲノムまたはその一部および導入遺伝子を含むポリヌクレオチドをいう。アデノウイルス（Ａｄ）は、比較的十分に特徴付けられた、５０を超える血清型を含む同種のウイルス群である。例えば、国際公開公報第９５／２７０７１号を参照のこと。Ａｄは容易に成長し宿主細胞ゲノムへの組み込みの必要がない。組換えＡｄ由来ベクター、特に野生型ウイルスへの組換えおよび産生の可能性を低下させたものが構築されている。国際公開公報第９５／００６５５号および国際公開公報第９５／１１９８４号を参照のこと。野生型ＡＡＶは、宿主細胞ゲノムへの感染性および組込み特異性が高い。ＨｅｒｍｏｎａｔおよびＭｕｚｙｃｚｋａ、１９８４、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１、６４６６〜６４７０およびＬｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、８、３９８８〜３９９６を参照のこと。
【００９０】
ポリヌクレオチドが作動可能に連結することができるプロモーターおよびクローニング部位の両方を含むベクターは、当技術分野で既知である。このようなベクターは、インビトロまたはインビボでＲＮＡを転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）およびＰｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）などの販売者から市販されている。発現および／またはインビトロ転写を最適にするために、クローンの５’および／または３’非翻訳部分を除去、付加、または変化させて、転写または翻訳レベルのいずれかで余剰の潜在的に不適切な別の転写開始コドンまたは発現を干渉するか減少させることができる他の配列を除去する必要があり得る。あるいは、コンセンサスリボゾーム結合部位を、開始コドンの５’の近くに挿入して発現を増強することができる。
【００９１】
遺伝子送達用媒体には、いくつかの非ウイルスベクター（ＤＮＡ／リポソーム複合体および標的化ウイルスタンパク質−ＤＮＡ複合体を含む）も含まれる。標的抗体またはその断片も含むリポソームを、本発明の方法で使用することができる。細胞への送達を増強するために、本発明の核酸またはタンパク質を、細胞表面抗原（例えば、ＴＣＲ、ＣＤ３、またはＣＤ４）に結合する抗体またはその結合断片に結合することができる。
【００９２】
「ハイブリッド形成」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドがヌクレオチド残基の塩基の間の水素結合を介して安定化する複合体を形成するように反応する反応をいう。水素結合は、ワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）塩基対合、フーグステイン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合、または任意の他の配列特異的様式によって起こり得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２つの鎖、複数鎖の複合体を形成する３つまたはそれ以上の鎖、１つの自己ハイブリッド形成鎖、またはこれらの任意の組み合わせを含み得る。ハイブリッド形成反応は、より範囲の広い方法の１工程（ＰＣＲ反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素切断）を構成し得る。
【００９３】
ストリンジェントなハイブリッド形成条件の例には、以下が含まれる：約２５℃〜約３７℃のインキュベーション温度；約６×ＳＳＣ〜約１０×ＳＳＣのハイブリッド形成緩衝液濃度；約０％〜約２５％のホルムアミド濃度；および約６×ＳＳＣの洗浄溶液。中程度のハイブリッド形成条件の例には、以下が含まれる：約４０℃〜約５０℃のインキュベーション温度；約９×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣのハイブリッド形成緩衝液濃度；約３０％〜約５０％のホルムアミド濃度；および約５×ＳＳＣ〜約２×ＳＳＣの洗浄溶液。抗ストリンジェンシー条件の例には、以下が含まれる：約５５℃〜約６８℃のインキュベーション温度；約１×ＳＳＣ〜約０．１×ＳＳＣのハイブリッド形成緩衝液濃度；約５５％〜約７５％のホルムアミド濃度；および約１×ＳＳＣ、約０．１×ＳＳＣ、または脱イオン水の洗浄溶液。一般に、ハイブリッド形成インキュベーション時間は５分〜２４時間であり、１回、２回、またはそれ以上の洗浄工程を行い、洗浄インキュベーション時間は、約１分、２分、または１５分である。ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を使用した等価のＳＳＣを使用することができることが理解される。
【００９４】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、別の配列手段に対して一定の割合（例えば、８０％、８５％、９０％、または９５％）の「配列同一性」を有し、整列させた場合にその塩基（またはアミノ酸）の割合（％）が２つの配列と比較して同一である。このアラインメントおよび相同性％または配列同一性％を、当技術分野で既知のソフトウェアプログラム（例えば、「現代の分子生物学プロトコール（ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）、増補版３０、７．７．１８節、表７．７．１に記載のもの）を使用して同定することができる。好ましくは、アラインメントにデフォルトパラメータを使用する。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝コード＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；分類＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、Ｇｅｎｂａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋＣＤＳ翻訳物＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細を、以下のインターネットアドレスで見出すことができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ。
【００９５】
本明細書で使用される、「インビボ」遺伝子送達、遺伝子導入、遺伝子治療などは、生物（ヒトまたは非ヒト哺乳動物）の身体への外因性ポリヌクレオチドを含むベクターの直接的移入によって外因性ポリヌクレオチドがこのような生物にインビボで移入されることを言及する用語である。
【００９６】
「単離」という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片を自然界で通常会合している構成要素、細胞、およびその他からの分離を意味する。例えば、ポリヌクレオチドに関して、単離ポリヌクレオチドは、通常染色体に会合している５’および３’配列から分離されたものである。当業者に明らかであるように、非天然ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、その天然相対物と区別するための「単離」は必要ない。さらに、「濃縮」、「分離」、または「希釈」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、その天然に存在する相対物と、体積あたりの分子の濃度または数は、天然に存在する相対物よりも「濃縮物」で高く、「分離物」で低いという点で区別可能である。その一次配列または例えばグリコシル化パターンにおいて天然に存在する相対物と異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、天然に存在する相対物と一次構造あるいはグリコシル化パターンなどの別の特徴で区別可能であるので、その単離形態で存在する必要がない。本明細書に開示される各発明について明白に記載していないにもかかわらず、以下に開示され、且つ適切な条件下での各組成物についての上記態様の全てが本発明によって得られると理解すべきである。したがって、天然に存在しないポリヌクレオチドは、単離された天然に存在するポリヌクレオチド由来の各態様として得られる。細菌細胞中に産生されたタンパク質は、天然に産生された真核細胞から単離された天然に存在するタンパク質の各態様として得られる。
【００９７】
「宿主細胞」、「標的細胞」、または「レシピエント細胞」は、ベクター用、または外因性核酸分子、ポリヌクレオチド、および／もしくはタンパク質の組み込み用レシピエントであり得るかレシピエントであるに似の各細胞または細胞培養物を含むことを意図する。１つの細胞の子孫を含むことも意図され、子孫は、天然、偶発的、または故意の変異のために元の親細胞（形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補物において）と完全に同一である必要はない。細胞は原核細胞または真核細胞であってよく、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞（例えば、マウス、ラット、サル、またはヒト）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９８】
「被験体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、マウス、サル、ヒト、家畜、競技用動物、およびペットが含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
「対照」は、比較目的の実験で使用される代替的被験体または試料である。対照は「正」または「負」であり得る。例えば、実験目的が特定の癌型を有する遺伝子の発現レベルの変化の精度を同定する場合、一般に、正の対照（このような変化を有し、且つこの疾患に特異的な症候群を示す被験体または被験体由来の試料）および負の対照（発現の変化およびこの疾患の臨床的症候群を欠く被験体または被験体由来の試料）を使用することが好ましい。
【０１００】
互換的に使用され、単数または複数形態のいずれかで使用される「癌」、「新生物」、および「腫瘍」という用語は、宿主生物が異常をきたす悪性形質転換を受けた細胞をいう。原発性癌細胞（すなわち、悪性形質転換部位付近から得た細胞）を、十分に確立された技術、特に組織学的試験によって非癌細胞と容易に区別することができる。本明細書で使用される癌細胞の定義には、原発性癌細胞のみだけでなく、癌細胞祖先由来の任意の細胞も含まれる。これには、転移癌細胞、インビトロ培養物、および癌細胞由来の細胞株が含まれる。通常固形腫瘍として発現する癌型をいう場合、「臨床的に検出可能な」腫瘍は、例えば、ＣＡＴスキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波、または触診などの方法による腫瘍体積に基づいて検出可能な腫瘍である。生化学または免疫学的所見のみでは、この定義を満たすには不十分であり得る。
【０１０１】
腫瘍成長の「抑制」は、本明細書に記載の教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞と接触しない成長と比較して小さな成長状態を示す。腫瘍細胞成長を、当技術分野で既知の任意の手段（腫瘍サイズの測定、３Ｈ−チミジン組み込みアッセイ法を使用した腫瘍細胞が増殖しているかどうかの同定、または腫瘍細胞の計数が含まれるが、これらに限定されない）によって評価することができる。腫瘍細胞成長の「抑制」は、以下の任意または全ての状態を意味する：減速、遅延、および「抑制」された腫瘍成長は、腫瘍成長の停止および腫瘍縮小の場合に減少する成長状態を示す。
【０１０２】
「培養」という用語は、種々の種類の培地上または培地中の細胞または生物のインビトロでの増殖をいう。培養での細胞成長の子孫は親細胞と（形態、遺伝子、または表現型）完全に同一ではないことが理解される。「拡大」は、細胞の任意の増殖または分裂を意味する。
【０１０３】
「組成物」は、活性な薬剤と不活性（例えば、検出可能な薬剤または標識）または活性な（アジュバントなど）別の化合物または組成物との組み合わせを意味することが意図される。
【０１０４】
「薬学的組成物」は、活性な薬剤と組成物をインビトロ、インビボ、またはエクスビボでの診断または治療を適切にする不活性または活性な担体との組み合わせを含むことが意図される。
【０１０５】
本明細書で使用される、「薬学的に許容される担体」という用語は、任意の標準的な薬学的担体（リン酸緩衝化生理食塩水、水、および油／水もしくは水／油乳濁液などの乳濁液、および種々の型の湿潤剤など）を含む。組成物はまた、安定剤および防腐剤を含み得る。担体、安定剤、およびアジュバントの例については、Ｍａｒｔｉｎの「レミントンの薬学（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭ． ＳＣＩ．）」、第１５版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ、１９７５）を参照のこと。
【０１０６】
「有効量」は、有利な結果または所望の結果を得るために十分な量である。有効量を、１つまたは複数の投与、適用、または投薬量で投与することができる。
【０１０７】
本発明は、以下の構造を有する化合物を提供する。
化合物１
【化１２】
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化合物２
【化１３】
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化合物３
【化１４】
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化合物４
【化１５】
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化合物５
【化１６】
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化合物６
【化１７】
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化合物７
【化１８】
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化合物８
【化１９】
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化合物９
【化２０】
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化合物１０
【化２１】
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化合物１１
【化２２】
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【０１０８】
本発明はまた、ＭＨＣ分子への結合の増強を示す組成物を提供し、交差反応性を示し、同族リガンドおよびその対応する天然のタンパク質に対する免疫応答の調節に有用である。
【０１０９】
本発明は、さらに、抗癌ワクチン成分として有用であり、ＭＡＲＴ１腫瘍抗原の発現によって特徴付けられる癌に特異的な免疫エフェクター細胞を拡大するための組成物を提供する。
【０１１０】
１つの態様では、本発明の変化したリガンドは、天然のリガンドに匹敵するＭＨＣ結合に対する親和性を有する。ペプチド：ＭＨＣクラスＩ結合特性は免疫原性と相関することが証明されている（Ｓｅｔｔｅ  Ａ．ら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５３、５５８６；ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｕｒｇ  Ｓ．Ｈ．ら、１９９６、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５６、３３０８）。好ましい態様では、本発明の変化したリガンドは、「天然」のリガンドよりも高い親和性でＴＣＲと結合する。天然および本発明の変化したリガンドのＭＨＣクラスＩ分子への結合の比較を、当技術分野で既知の方法（アルゴリズムに基づく親和性の計算（例えば、Ｐａｒｋｅｒら、１９９２、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９、３５８０〜３５８７を参照のこと）および結合親和性の実験的同定（例えば、Ｔａｎら、１９９７、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、２０９、１、２５〜３６を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない）によって測定することができる。例えば、ペプチドとクラスＩ分子との相対的結合を、種々の濃度の試験ペプチド（例えば、１００ｍＭ〜１ｎＭの範囲）を使用した放射性標識した標準ペプチドと界面活性剤溶解ＭＨＣ分子との結合に基づいて測定することができる。クラスＩ重鎖およびβ２−ミクログロブリンを、固定濃度（例えば、５ｎＭ）の放射性標識標準（対照）ペプチドおよび種々の濃度の試験ペプチドと、室温のプロテアーゼインヒビターの混合物の存在下で適切な時間（例えば、２時間〜７２時間）同時インキュベートする。対照チューブは、標準ペプチドおよびＭＨＣ分子を含むが、試験ペプチドは含まない。ＭＨＣ結合放射能％を、ゲル濾過によって同定する。ＩＣ５０（対照ペプチドの結合を５０％阻害する試験ペプチドの濃度）を、各ペプチドについて計算する。ＴＣＲへの結合親和性のさらなる同定方法は、当技術分野で既知であり、ａｌ−Ｒａｍａｄｉら、１９９２、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５、２、６６２〜６７３およびＺｕｅｇｅｌら、１９９８、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１、４、１７０５〜１７０９に記載の方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
別の態様では、本発明の変化したリガンドは、天然のリガンド相対物に匹敵する抗原特異的Ｔ細胞活性化を誘発する。好ましい態様では、本発明の変化したリガンドは、天然のリガンド相対物と比較してより強力な抗原特異的Ｔ細胞活性化を誘発する。本発明のリガンドの免疫原性の同定法は、当技術分野で既知であり、本明細書にさらに記載されている。
【０１１２】
１つの態様では、本発明の組成物は、２つまたはそれ以上の本発明の免疫原性リガンドを含む。１つの局面では、このような組成物は、１つのリガンドの２つまたはそれ以上のコピーを含み得る。別の局面では、このような組成物は、２つまたはそれ以上のリガンドを含むことができ、この２つまたはそれ以上のリガンドは、組成物の中の全ての他のリガンドと異なる。１つの態様では、２つまたはそれ以上の免疫原性リガンドは、共有結合している。
【０１１３】
本発明はまた、ＭＨＣ分子への結合の増強のために設計され、合成ペプチドエピトープおよびそれが由来する対応する天然のペプチドに対する免疫応答の調節に有用な新規の合成抗原ペプチドを提供する。本発明の合成抗原ペプチドエピトープ配列は、これらが天然の配列と比較してＭＨＣへのより強い結合を付与するように設計されたＭＨＣクラスＩ結合ドメイン中のアミノ酸配列が変化しているという点で天然の相対物と異なる。これらは、さらに、Ｔ細胞抗原受容体の親和性が増大するように設計されたＴ細胞授与体結合ドメインの変異を含む。これらの天然の配列との相違は、本発明の合成抗原ペプチドエピトープの免疫調節特性が増大しているという点で本発明の方法において天然の配列を超える利点を付与するように設計されている。
【０１１４】
本発明は、さらに、抗癌ワクチン成分として有用であり、且つＴ細胞によって認識されるヒト黒色腫抗原（ＭＡＲＴ−１）の発現によって特徴付けられる癌に特異的な免疫エフェクター細胞を拡大するための新規の合成抗原ペプチド配列を提供する。ペプチド
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は、天然のエピトープ
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と、これらがＭＨＣ受容体へのより強力な結合を付与する推定ＨＬＡ−Ａ２結合ドメイン（アミノ酸１および２）に変異を含むという点で異なる。
【０１１５】
あるいは、本発明は、天然ＭＡＲＴ−１のアミノ酸配列（配列番号：２）の以下の改変を提供する。本発明は、１）２７位および２８位のアミノ酸がそれぞれＬおよびＳであり、２）２７位および２８位のアミノ酸がそれぞれＬおよびＴであり、３）２７位および２８位のアミノ酸がそれぞれＶおよびＴであり、４）２７位および２８位のアミノ酸がそれぞれＦおよびＡであり、５）２７位および２８位のアミノ酸がそれぞれＴおよびＡであり、６）２７位および２８位のアミノ酸がそれぞれＧおよびＶであり、７）２７〜３４位のアミノ酸がそれぞれＦ、Ｌ、Ｆ、Ｈ、Ｔ、Ｅ、Ｙ、およびＶであり、８）２７〜３４位のアミノ酸がそれぞれＦ、Ｌ、Ｆ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｙ、およびＩであり、９）２７〜３４位のアミノ酸がそれぞれＦ、Ｌ、Ｙ、Ｈ、Ｉ、Ｐ、Ｍ、およびＶであり、１０）２７〜３４位のアミノ酸がそれぞれＦ、Ｌ、Ｙ、Ｈ、Ｔ、Ｐ、Ｍ、およびＩであり、１１）２７〜３４位のアミノ酸がそれぞれＦ、Ｌ、Ｔ、Ｐ、Ｌ、Ｇ、Ｐ、およびＲである、配列番号：２のアミノ酸配列を含むペプチドを提供する。
【０１１６】
本発明の合成抗原ペプチドのＭＨＣクラスＩ分子への結合を、当技術分野で既知の方法（アルゴリズムに基づいた親和性の計算（例えば、Ｐａｒｋｅｒら、１９９２、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９、３５８０〜３５８７を参照のこと）および結合親和性の実験的同定（例えば、Ｔａｎら、１９９７、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、２０９、１、２５〜３６を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない）によって測定することができる。例えば、クラスＩ分子へのペプチドの相対的結合を、種々の濃度の試験ペプチド（例えば、１００ｍＭ〜１ｎＭの範囲）を使用した、界面活性剤溶解ＭＨＣ分子への放射性標準ペプチドの結合に基づいて測定することができる。ＭＨＣクラスＩ重鎖およびβ２−ミクログロブリンを、固定濃度（例えば、５ｎＭ）の放射性標識標準（対照）ペプチドおよび種々の濃度の試験ペプチドと、室温のプロテアーゼインヒビターの混合物の存在下で適切な時間（例えば、２時間〜７２時間）同時インキュベートする。対照チューブは、標準ペプチドおよびＭＨＣ分子を含むが、試験ペプチドは含まない。ＭＨＣ結合放射能％を、ゲル濾過によって同定する。ＩＣ５０（対照ペプチドの結合を５０％阻害する試験ペプチドの濃度）を、各ペプチドについて計算する。
【０１１７】
本発明の合成ペプチドを、「天然」の配列よりも高い親和性でＴＣＲと結合するように設計する。ＴＣＲへの結合親和性の同定方法は、当技術分野で既知であり、ａｌ−Ｒａｍａｄｉら、１９９２、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５、２、６６２〜６７３およびＺｕｅｇｅｌら、１９９８、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１、４、１７０５〜１７０９に記載の方法が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１８】
「合成抗原ペプチド」という用語は、選択的に介在アミノ酸配列ならびに配列
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を含むポリペプチドを含む本発明の合成抗原ペプチドの多量体（コンカテマー）をさらに含む。本発明はまた、これらの配列を含むポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、好ましくは、ヒト癌抗原ＭＡＲＴ−１で教育されたヒト癌抗原ＭＡＲＴ−１細胞傷害性Ｔリンパ球によって認識される。
【０１１９】
本発明のペプチド配列を含むポリペプチドを、天然のヒト黒色腫抗原ＭＡＲＴ−１ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列の変化によって調製することができる。当業者に既知の組換えＤＮＡ法によってこれを行う。例えば、天然のヒト黒色腫抗原ＭＡＲＴ−１配列をコードする組換えポリヌクレオチドに対して部位特異的変異誘発を行って、変化したポリヌクレオチドが本発明のペプチドをコードするようにポリヌクレオチド配列を変化させることができる。
【０１２０】
本発明のタンパク質およびポリペプチドを、市販の自動化ペプチド合成機を使用した化学合成によって得ることができる（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．、モデル４３０Ａまたは４３１Ａ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ、ＵＳＡによって製造されたものなど）。合成タンパク質またはポリペプチドを沈殿させて、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってさらに精製することができる。したがって、本発明はまた、タンパク質配列および試薬（アミノ酸および酵素など）の獲得および適切な方向のアミノ酸およびリンカー配列との結合による、本発明のタンパク質の化学合成法を提供する。
【０１２１】
あるいは、タンパク質およびポリペプチドを、下記の宿主細胞およびベクター系を使用した本明細書に記載の既知の組換え法によって得ることができる。
【０１２２】
ペプチド類似体
本発明のペプチドを改変して性質の変化したペプチドを得ることができることが当業者に既知である。本明細書で使用される、「アミノ酸」という用語は、天然および／または非天然または合成アミノ酸（グリシンおよびＤまたはＬ光学異性体、アミノ酸類似体、およびペプチド模倣物を含む）をいう。ペプチド鎖が短い場合、３つまたはそれ以上のアミノ酸のペプチドを一般にオリゴペプチドと呼ぶ。ペプチド鎖が長い場合、ペプチドは一般にポリペプチドまたはタンパク質と呼ぶ。
【０１２３】
本発明のペプチドを、非天然アミノ酸を含むように改変することができる。したがって、ペプチドは、Ｄ型アミノ酸、Ｄ型とＬ型アミノ酸の組み合わせ、およびペプチドに特別な性質を伝達するための種々の「デザイナー」アミノ酸（例えば、β−メチルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、Ｎ−α−メチルアミノ酸など）を含み得る。さらに、特定のカップリング工程での特定のアミノ酸の割り当てにより、αヘリックス、βターン、βシート、γターン、および環状ペプチドを含むペプチドを作製することができる。一般に、αヘリックスの二次構造または無作為な二次構造が好ましいと考えられている。
【０１２４】
さらなる態様では、有用な化学的および構造的性質を付与するペプチドのサブユニットを選択する。例えば、Ｄ型アミノ酸を含むペプチドは、インビボでＬ型アミノ酸特異的プロテアーゼに耐性を示す。Ｄ型アミノ酸を含む改変化合物を、逆の順番で整列させたアミノ酸を使用して合成して、レトロ逆転ペプチドとして本発明のペプチドを賛成することができる。さらに、本発明は、より良好な定義された構造特性を有するペプチドの調製、新規の性質を有するペプチドを調製するためのペプチド模倣物およびエステル結合などのペプチド模倣結合の使用を想定する。別の態様では、減少したペプチド結合（すなわち、Ｒ１−ＣＨ２ＮＨ−Ｒ２（Ｒ１およびＲ２はアミノ酸残基または配列である））を組み込んだペプチドを作製することができる。ジペプチドサブユニットとして減少したペプチド結合を導入することができる。このような分子は、ペプチド結合の加水分解（例えば、プロテアーゼ活性）に耐性を示すであろう。このような分子により、固有の機能および活性（代謝分解に対する耐性によるインビボでの半減期の延長またはプロテアーゼ活性など）を有するリガンドが得られるであろう。さらに、ペプチドを含む一定の系は機能的活性の増強を示す（Ｈｒｕｂｙ、１９８２、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、３１、１８９〜１９９およびＨｒｕｂｙら、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、２６８、２４９〜２６２）；本発明は、全ての他の位置でランダム配列を組み込まれた拘束されたペプチドを得る方法ことが既知である。
【０１２５】
高次構造上の制約を誘導する非古典的アミノ酸
以下の非古典的アミノ酸を、本発明のペプチドに組み込んで、特定の高次構造モチーフ：１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート（Ｋａｚｒｎｉｅｒｓｋｉら、１９９１、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１３、２２７５〜２２８３）；（２Ｓ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｓ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン、（２Ｒ，３Ｓ）−メチル−フェニルアラニンおよび（２Ｒ，３Ｒ）−メチル−フェニルアラニン（ＫａｚｍｉｅｒｓｋｉおよびＨｒｕｂｙ、１９９１、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、３２、４１、５７６９〜５７７２）；２−アミノテトラヒドロナフタレン−２−炭酸（Ｌａｎｄｉｓ、１９８９、Ｔｈｅｓｉｓ博士、アリゾナ大学）；ヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボキシレート（Ｍｉｙａｋｅら、１９８９、Ｊ．Ｔａｋｅｄａ  Ｒｅｓ．Ｌａｂｓ、４３、５３〜７６）、ヒスチジンイソキノリン炭酸（Ｚｅｃｈｅｌら、１９９１、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．、３８、２、１３１〜１３８）；およびＨＩＣ（ヒスチジン環状尿素）（Ｄｈａｒａｎｉｐｒａｇａｄａら、１９９３、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．、４２、１、６８〜７７および１９９２、Ａｃｔａ．ｃｒｙｓｔ．，Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃ．Ｃｏｍｍ．、４８、ＩＶ、１２３９〜１２４１）を導入することができる。
【０１２６】
以下のアミノ酸類似体およびペプチド模倣物をペプチドに組み込んで、特異的二次構造を誘導または優先することができる：ＬＬ−Ａｃｐ（ＬＬ−３−アミノ−２−プロペニドン−６−炭酸）、βターン誘導ジペプチド類似体（Ｋｅｍｐら、１９８５、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５０、５８３４〜５８３８）；βシート誘導類似体（Ｋｅｍｐら、１９８８、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２９、５０８１〜５０８２）；βターン誘導類似体（Ｋｅｍｐら、１９８８、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２９、５０５７〜５０６０）；αヘリックス誘導類似体（Ｋｅｍｐら、１９８８、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２９、４９３５〜４９３８）；γターン誘導類似体（Ｋｅｍｐら、１９８９、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５４、１０９〜１１５）；以下の参考文献によって得られた類似体：ＮａｇａｉおよびＳａｔｏ、１９８５、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２６、６４７〜６５０、およびＤｉＭａｉｏら、１９８９、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．、１６８７；Ｇｌｙ−Ａｌａターン類似体（Ｋａｈｎら、１９８９、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、３０、２３１７）；アミド結合同配体（Ｃｌｏｎｅら、１９８８、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、２９、３８Ｓ３〜３８Ｓ６）；テトラゾール（Ｚａｂｒｏｃｋｉら、１９８８、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１１０、５８７Ｓ〜５８８０）；ＤＴＣ（Ｓａｍａｎｅｎら、１９９０、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐ．Ｒｅｓ．、３５、５０１〜５０９）；およびＯｌｓｏｎら、１９９０、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、１１２、３２３〜３３３およびＧａｒｖｅｙら、１９９０、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、５６、４３６で開示の類似体。βターンおよびβ突起の高次構造制限模倣物ならびにこれらを含むペプチドは、１９９５年８月８日のＫａｈｎに付与された米国特許第５，４４０，０１３号に記載されている。
【０１２７】
本発明の合成抗原ペプチドエピトープを、意図する使用に依存して変化し得る種々の製剤で使用することができる。
【０１２８】
本発明の合成抗原ペプチドエピトープを、種々の他の分子に共有結合または非共有結合（複合体形成）することができ、その性質を特定の目的に依存して変化させることができる。例えば、本発明のペプチドを、高分子担体（天然および合成ポリマー、タンパク質、多糖類、ポリペプチド（アミノ酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、および脂質が含まれるが、これらに限定されない）に共有結合または非共有結合により複合体化させることができる。リポソームへの導入のために、ペプチドを脂肪酸に結合させることができる。米国特許第５，８３７，２４９号。本発明の合成ペプチドを、共有結合または非共有結合によって固体支持体（種々のものが当技術分野で既知である）と複合体形成することができる。本発明の合成抗原ペプチドエピトープを、以下にさらに詳述する同時刺激分子を使用するかまたは使用しないで抗原提示基質に会合することができる。
【０１２９】
タンパク質担体の例には、スーパー抗原、血清アルビミン、破傷風類毒素、オボアルブミン、サイログロブリン、ミオグロブリン、および免疫グロブリンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
ペプチド−タンパク質担体ポリマーを、カルボジイミドなどの従来の架橋剤を使用して形成することができる。カルボジイミドの例は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−（４−エチル）カルボジイミド（ＣＭＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、および１−エチル−３−（４−アゾニア−４４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。
【０１３１】
他の適切な架橋剤の例は、臭化シアン、グルタルアルデヒド、および無水コハク酸である。一般に、任意の数のホモ二官能性試薬（ホモ二官能性アルデヒド、ホモ二官能性エポキシド、ホモ二官能性イミドエステル、ホモ二官能性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ホモ二官能性マレイミド、ホモ二官能性アルキルハライド、ホモ二官能性ピリジルジスルフィド、ホモ二官能性アリールハライド、ホモ二官能性ヒドラジン、ホモ二官能性ジアゾニウム誘導体、およびホモ二官能性光反応性化合物）を使用することができる。ヘテロ二官能性化合物（例えば、アミン反応基およびスルフヒドリル基を有する化合物、アミン反応基および光反応基を有する化合物、ならびにカルボニル反応基およびスルフヒドリル反応基を有する化合物）もまた含まれる。
【０１３２】
このようなホモ二官能性架橋剤の特定の例には、二官能性Ｎ−ヒドロスクシニミドエステル（ジチオビス（スクシニミジルプロピオネート）、ジスクシニミジルスベレート、およびジスクシンイミジルタートレート）；二官能性イミド−エステル（ジメチルアジピミデート、ジメチルピメリミデート、およびジメチルスベリミデート）；二官能性スルフヒドリル反応性架橋剤（１，４−ジ−［３’−（２’−ピリジルジチオ）プロピオン−アミド］ブタン、ジスマレイミドヘキサン、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン）；二官能性アリールハライド（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、および４，４’−ジフルオロ−３，３’−ジニトロフェニルスルホン）；二官能性光反応薬（ビス［ｂ−（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィドなど）；二官能性アルデヒド（ホルムアルデヒド、マロンジアルデヒド、スクシンアルデヒド、グルタルアルデヒド、およびアジプアルデヒド）；二官能性エポキシド（１，４−ブタネオジオールジグリシジルエーテルなど）；二官能性ヒドラジド（アジピン酸ジヒドロラジド、カルボヒドラジド、およびコハク酸ジヒドラジド）；二官能性ジアゾニウム（ｏ−トリジン、ジアゾ化およびビスジアゾ化ベンジジン）；二官能性アルキルハライド（Ｎ１Ｎ’−エチレン−ビス（ヨードアセタミド）、Ｎ１Ｎ’−ヘキサメチレン−ビス（ヨードアセトアミド）、Ｎ１Ｎ’−ウンデカメチレン−ビス（ヨードアセトアミド））；ならびにベンジルハライドおよびハロマスタード（ａ１ａ’−ジヨード−ｐ−キシレンスルホン酸およびトリ（２−クロロエチル）アミンなど）が含まれる。
【０１３３】
タンパク質とペプチドとの結合に使用することができる共通のヘテロ二官能性架橋剤の例には、ＳＭＣＣ（スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、ＳＩＡＢ（Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート）、ＳＭＰＢ（スクシニミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート）、ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル）、ＭＰＢＨ（４−（４−Ｎ−マレイミドフェニル）酪酸ヒドラジド）、Ｍ２Ｃ２Ｈ（４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジド）、ＳＭＰＴ（スクシニミジルオキシカルボニル−ａ’−メチル−ａ’−（２−ピリジルジチオ）トルエン）、およびＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
還元的アミノ化によるカルボニル基のアミン基またはヒドラジン基への結合によって架橋することができる。
【０１３５】
本発明のペプチドを、イオン、吸着、または生体特異的相互作用によって、単量体の非共有結合として処方することができる。ペプチドの高度に正電荷または負電荷の分子との複合体を、低イオン強度環境下（脱イオン水中など）での塩橋形成によって形成することができる。多数の負電荷および正電荷をそれぞれ含むポリ−（Ｌ−グルタミン酸）またはポリ−（Ｌ−リジン）などの荷電ポリマーを使用して、巨大複合体を作製することができる。ペプチドを微粒子ラテックスビーズまたは他の疎水性ポリマーに吸着させて、架橋タンパク質または化学重合タンパク質を有効に模倣する非共有結合ペプチドスーパー抗原複合体を形成することができる。最後に、ペプチドは、他の分子との二重特異的相互作用の使用により非共有結合し得る。例えば、アビジンまたはストレプトアビジンもしくはその誘導体などのタンパク質に対するビオチンの強力な親和性を使用して、ペプチド複合体を形成することができる。これらのビオチン結合タンパク質は、溶液中でビオチンと相互作用するかまたは別の分子と共有結合することができる４つの結合部位を含む。Ｗｉｌｃｈｅｃｋ、１９８８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１７１、１〜３２。タンパク質上の利用可能なアミン基と反応するＤ−ビオチンのＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステル（ＮＨＳ−ビオチン）などの一般的なビオチン化試薬を使用して、ペプチドをビオチン基を有するように改変することができる。次いで、ビオチン化ペプチドをアビジンまたはストレプトアビジンとインキュベートして、巨大な複合体を作製することができる。このようなポリマーの分子量を、アビジンまたはストレプトアビジンに対するビオチン化ペプチドのモル比の注意深い調節によって制御することができる。
【０１３６】
本出願によって、診断法で使用する検出可能な薬剤に結合した本明細書に記載のペプチドおよびポリペプチドもまた得られる。例えば、検出可能に標識したペプチドおよびポリペプチドをカラムに結合させて、抗体の検出および精製に使用することができる。これらはまた、下記の抗体産生用の免疫原としても有用である。
【０１３７】
本発明のペプチドを、種々の液相担体（滅菌または水溶液、薬学的に許容される担体、懸濁液、および乳濁液など）と組み合わせることもできる。非水性溶媒の例には、プロピルエチレングリコール、ポリエチレングリコール、および植物油が含まれる。抗体の調製に使用する場合、担体は、特異的免疫応答の非特異的増加に有用であるアジュバントを含むこともできる。当業者は、アジュバントが必要であるかを容易に決定し、それを選択することができる。しかし、例示のみを目的として、アジュバントには、フロイント完全および不完全アジュバント、無機塩、およびポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３８】
本発明は、さらに、１つまたは複数の配列
2004525072.tif 000019
を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドならびにこれらのポリヌクレオチドの相補物を提供する。本明細書で使用される、「ポリヌクレオチド」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および核酸模倣物を含む。これらのポリヌクレオチドまたは他の相補物に加えて、本発明はまた、アンチセンスポリヌクレオチド鎖（例えば、これらの配列またはその相補物に対するアンチセンスＲＮＡ）を提供する。配列番号：４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、および２４で提供される配列およびＶａｎ ｄｅｒ Ｋｒｏｌら、１９８８、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６、９５８に記載の方法を使用して、アンチセンスＲＮＡを得ることができる。
【０１３９】
本発明のポリヌクレオチドを、ＰＣＲを使用して複製することができる。ＰＣＲ技術は、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号、および同第４，６８３，２０２号の主題であり、「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ： Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」（Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４）およびその引例に記載されている。
【０１４０】
あるいは、当業者は、本明細書で提供されている配列および市販のＤＮＡ合成機を使用してＤＮＡを複製することができる。したがって、本発明はまた、ポリヌクレオチドの直鎖状配列、適切なプライマー分子、酵素などの化学物質、およびその複製の説明書を獲得し、ポリヌクレオチドを得るために適切な方向でヌクレオチドを化学的に複製および結合することによって本発明のポリヌクレオチドを得る方法を提供する。別の態様では、これらのポリヌクレオチドをさらに単離する。さらに、当業者は、ポリヌクレオチドを適切な複製ベクターに挿入し、複製および増幅のためにベクターを適切な宿主細胞（原核細胞または真核細胞）に挿入することができる。このようにして増幅させたＤＮＡを、当業者に既知の方法によって細胞から単離することができる。本方法によってポリヌクレオチドを得る方法およびこのようにして得られたポリヌクレオチドは本明細書にさらに記載されている。
【０１４１】
適切な宿主細胞へのＤＮＡポリヌクレオチドの第１の挿入によってＲＮＡを得ることができる。任意の適切な方法（例えば、適切な遺伝子送達用媒体（例えば、リポソーム、プラスミド、またはベクター）の使用またはエレクトロポレーション）によってＤＮＡを挿入することができる。細胞が複製されてＤＮＡがＲＮＡに転写された場合、ＲＮＡを、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前記の当業者に既知の方法を使用して単離することができる。例えば、ｍＲＮＡを、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前記の手順に従って種々の溶解酵素または化学溶液を使用して単離するか、製造者の説明にしたがって核酸結合樹脂によって抽出することができる。
【０１４２】
少なくとも４つの連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５つまたは６つの連続するヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも９個の連続するヌクレオチドを有し、且つ配列番号：３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、および２５のペプチドをコードするポリヌクレオチドに相補性または相同性を示すポリヌクレオチドを、ハイブリッド形成プローブとして使用する。
【０１４３】
特異的ハイブリッド形成に「完全に適合した」プローブが必要でないことが当技術分野で既知である。少数の塩基の置換、欠失、または挿入によって達成されるプローブ配列の小さな変化は、ハイブリッド形成特異性に影響を与えない。一般に、２０％ほどの塩基対ミスマッチ（最適に整列している場合）を許容することができる。好ましくは、上記ｍＲＮＡの検出に有用なプローブは、先に特徴付けられた遺伝子に対応する先に同定された配列中に含まれる類似のサイズの相同領域と少なくとも８０％同一である。より好ましくは、相同領域のアラインメント後の対応する遺伝子配列に８５％同一であり、さらにより好ましくは、９０％同一性を示す。
【０１４４】
これらのプローブを、放射性アッセイ法（例えば、サザンおよびノーザンブロット分析）で使用して、これらの細胞を含む種々の細胞または組織を検出することができる。プローブを、本発明の１つまたは複数のポリヌクレオチドに対応する遺伝子発現の検出ためのハイスループットスクリーニングアッセイ用の固体支持体またはチップなどのアレイに結合することもできる。したがって、本発明はまた、ハイスループットスクリーニング用の固体支持体に結合した上記定義の少なくとも１つのプローブおよび／またはこれらの配列の１つの相補物を提供する。本発明のポリヌクレオチドはまた、例えば宿主細胞へのポリヌクレオチドの形質導入を確認するためのＡＰＣ中で発現する遺伝子または遺伝子転写物の検出用のプライマーとして使用することができる。この文脈では、増幅は、妥当な信頼性で標的配列を複製することができるプライマー依存性ポリメラーゼの任意の使用方法を意味する。天然または組換えＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、および逆転写酵素など）によって増幅を行うことができる。好ましいプライマーの長さは、上記プローブと同一の長さである。
【０１４５】
本発明は、さらに、ＲＮＡ転写プロモーターならびにＤＮＡまたはＲＮＡの複製および／または一過性もしくは安定な発現のための他の調節配列に作動可能に連結された単離ポリヌクレオチドを提供する。本明細書で使用される、「作動可能に連結された」という用語は、プロモーターがＤＮＡ分子から離れてＲＮＡの転写を指示するような様式で存在することを意味する。このようなプロモーターの例は、ＳＰ６、Ｔ４、およびＴ７である。一定の態様では、細胞特異的プロモーターを、挿入ポリヌクレオチドの細胞特異的発現に使用する。終結コドンおよび選択マーカー配列と共にプロモーターまたはプロモーター／エンハンサーならびにＤＮＡの挿入片をプロモーターに作動可能に連結することができるクローニング部位を含むベクターは当技術分野で既知であり、市販されている。一般的な方法およびクローニング方法については、「遺伝子発現技術（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（Ｇｏｅｄｄｅｌ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９１）およびその引例ならびに種々の適切なベクターについてのマップ、機能的性質、販売者、およびＧｅｎＥＭＢＬアクセッション番号を含む「ベクター：基本データシリーズ（Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｄａｔａｓｅｒｉｅｓ）」（ＧａｃｅｓａおよびＲａｍｊｉ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、１９９４）を参照のこと。好ましいこれらのベクターは、インビトロまたはインビボでＲＮＡを転写することができる。
【０１４６】
これらの核酸を含む発現ベクターは、タンパク質およびポリペプチドを産生するための宿主ベクター系の獲得に有用である。これらの発現ベクターは、エピソームまたは染色体ＤＮＡの完全な部分のいずれかとして宿主生物中で複製可能であることを意味する。適切な発現ベクターには、プラスミド、ウイルスベクター（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含む）、コスミドなどが含まれる。アデノウイルスベクターは、インビトロおよびインビボでのその発現レベルおよび細胞の有効な形質転換によりインビボでの組織への遺伝子の移入に特に有用である。核酸を適切な宿主細胞（例えば、原核細胞、真核細胞、および宿主細胞複製物）に挿入する場合、タンパク質を組換え的に産生することができる。適切な宿主細胞はベクターに依存し、既知の方法を使用して構築した哺乳動物細胞、動物細胞、ヒト細胞、サル細胞、昆虫細胞、酵母細胞、および細菌細胞を含み得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前記を参照のこと。細胞への外因性核酸の挿入のためのウイルスベクターの使用に加えて、核酸を当技術分野で既知の方法（細菌細胞の形質転換；哺乳動物細胞のリン酸カルシウム沈殿を使用したトランスフェクション；ＤＥＡＥ−デキストラン；エレクトロポレーション；または微量注入）によって宿主細胞に挿入することができる。この方法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前記を参照のこと。したがって、本発明はまた、タンパク質、ポリペプチド、または抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、動物細胞（ラットまたはマウス）、ヒト細胞、または細菌細胞などの原核細胞）を提供する。
【０１４７】
本発明はまた、細胞への本発明のポリヌクレオチドの送達（インビボ、エクスビボ、またはインビトロ）に適切な媒体を提供する。本発明のポリヌクレオチドは、クローニングまたは発現ベクター内に含み得る。これらのベクター（特に、発現ベクター）を、その後、例えば細胞への送達および／または侵入を容易にすることができる任意の多数の形態を想定するように操作することができる。
【０１４８】
ベクターをインビボまたはエクスビボでの遺伝子治療に使用する場合、薬学的に許容される担体（複製能を持たないレトロウイルスまたはアデノウイルスベクター）が好ましい。本発明の核酸を含む薬学的に許容されるベクターを、挿入ポリヌクレオチドの一過性または安定な発現のためにさらに改変することができる。本明細書で使用される、「薬学的に許容されるベクター」という用語には、核酸を選択的に標的して分裂細胞に導入する能力を有するベクターまたは媒体が含まれるが、これらに限定されない。このようなベクターの例は、感染宿主細胞中のベクターの拡大が排除されたウイルスタンパク質産生の無能によって定義される「複製能を持たない」ベクターである。複製能を持たないレトロウイルスベクターの例は、ＬＮＬ６（Ｍｉｌｌｅｒ  Ａ．Ｄ．ら、１９８９、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、７、９８０〜９９０）である。遺伝子マーカーのレトロウイルス媒介遺伝子導入のための複製能を持たないレトロウイルスの使用法は、十分に確立されている（Ｃｏｒｒｅｌら、１９８９、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６、８９１２；Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ、１９８９、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８６、８９１２〜５２；Ｃｕｌｖｅｒ  Ｋ．、１９９１、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８８、３１５５；およびＲｉｌｌ  Ｄ．Ｒ．、１９９１、Ｂｏｏｌｄ、７９、１０、２６９４〜２７００）。
【０１４９】
本発明のポリヌクレオチドを含むこれらの単離宿主細胞は、ポリヌクレオチドの組換え複製およびペプチドの組換え産生に有用である。あるいは、本明細書に記載の方法でこの細胞を使用して被験体の免疫応答を誘導することができる。宿主細胞が抗原提示細胞である場合、これらを使用して、養子免疫療法でも有用な腫瘍浸潤リンパ球などの免疫エフェクター細胞集団を拡大することができる。
【０１５０】
本発明のポリペプチドと特異的に複合体を形成することができる抗体もまた本発明によって得られる。「抗体」という用語には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が含まれる。抗体には、マウス、ラットおよびウサギ、またはヒトの抗体が含まれるが、これらに限定されない。抗体は、ポリペプチドおよびポリペプチドを発現するＡＰＣの同定および精製に有用である。
【０１５１】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の実験的産生法よび対応する核酸配列の推定法は、当技術分野で既知であり、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、前記、およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前記を参照のこと。本発明のモノクローナル抗体を、動物（例えば、マウスまたはウサギ）へのタンパク質またはその断片の導入によって生物学的に産生することができる。動物中の抗体産生細胞を単離し、骨髄腫細胞またはヘテロ骨髄腫細胞に融合して、ハイブリッド細胞（すなわちハイブリドーマ）を産生する。したがって、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞も得られる。
【０１５２】
したがって、タンパク質またはその断片および既知の方法を使用して、当業者はタンパク質またはポリペプチドに結合する能力を有する抗体について本発明のハイブリドーマ細胞および抗体を産生およびスクリーニングすることができる。
【０１５３】
試験されるモノクローナル抗体がタンパク質またはポリペプチドと結合する場合、試験される抗体および本発明のハイブリドーマによって得られた抗体は等価である。過剰な実験を行うことなく、試験される抗体が本発明のモノクローナル抗体が通常反応性を示すタンパク質またはポリペプチドへの結合を防止するかどうかを決定することによって抗体が本発明のモノクローナル抗体と同一の特異性を有するかどうかを同定することも可能である。試験される抗体が本発明のモノクローナル抗体による結合の減少によって示される本発明のモノクローナル抗体と競合する場合、２つの抗体は同一または密接に関連したエピトープに結合する可能性がある。あるいは、本発明のモノクローナル抗体を通常これと反応するタンパク質とプレインキュベートし、試験されるモノクローナル抗体がその抗原と結合する能力を阻害するかどうかを同定することができる。試験されるモノクローナル抗体が阻害される場合、ほぼ確実にこれは本発明のモノクローナル抗体と同一または密接に関連したエピトープ特異性を有する。
【０１５４】
「抗体」という用語はまた、全てのイソ型の抗体を含むことが意図される。モノクローナル抗体の特定のイソ型を、Ｓｔｅｐｌｅｗｓｋｉら、１９８５、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８２、８６５３またはＳｐｉｒａら、１９８４、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、７４、３０７に記載の手順を使用したクラススイッチ変異体を単離するためのｓｉｂ選択技術の使用による異なるイソ型のモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマ由来最初の融合物からの選択によって直接調製するか、二次的に調製することができる。
【０１５５】
本発明はまた、上記のポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の生物学的に活性な断片を提供する。これらの「抗体断片」は、その抗原または免疫原と選択的に結合する能力をいくらか保持している。このような抗体断片には、
（１）Ｆａｂ、
（２）Ｆａｂ’、
（３）Ｆ（ａｂ’）２、
（４）Ｆｖ、および
（５）ＳＣＡ
が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５６】
「生物活性抗体断片」の特定の例は、抗体のＣＤＲ領域である。これらの断片の作製法は、当技術分野で既知であり、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、前記を参照のこと。
【０１５７】
本発明の抗体を、キメラ抗体およびヒト化抗体を作製するように改変することもできる（Ｏｉら、１９８６、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４、３：２１４）。キメラ抗体は、抗体重鎖および軽鎖の種々のドメインが１つを超える種由来のＤＮＡによってコードされる抗体である。
【０１５８】
当業者は、本発明の特異性を有するモノクローナル抗体を分泌する他のハイブリドーマの単離を、抗イディオタイプ抗体の産生によって達成することもできる（Ｈｅｒｌｙｎら、１９８６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３２、１００）。抗イディオタイプ抗体は、目的のハイブリドーマによって産生されたモノクローナル抗体上に存在する固有の決定基を認識する抗体である。
【０１５９】
２つのハイブリドーマのモノクローナル抗体の間のイディオタイプの同一性は、２つのモノクローナル抗体がその同一のエピトープ決定基の認識に関して同一であることを証明する。したがって、モノクローナル抗体上のエピトープ決定基に対する抗体の使用により、同一のエピトープ特異性のモノクローナル抗体を発現する他のハイブリドーマを同定可能である。
【０１６０】
エピトープを模倣するモノクローナル抗体を産生するための抗イディオタイプ技術を使用することも可能である。例えば、第１のモノクロなる抗体に合わせて作製された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第１のモノクローナル抗体によって結合されたエピトープの鏡像である超可変部中に結合ドメインを有する。したがって、この例では、抗イディオタイプモノクローナル抗体を、これらの抗体の産生の免疫化に使用することができる。
【０１６１】
本明細書で使用される、「エピトープ」という用語は、本発明のモノクローナル抗体に対する特異的親和性を有する任意の決定基を含むことを意味する。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基を含み、通常、特異的な三次元構造特異性および特異的な電荷特性を有する。
【０１６２】
本発明の抗体を、検出可能な薬剤または標識に連結することができる。当業者に既知の多数の標識および標識法が存在する。
【０１６３】
低分子量のハプテンへの抗体の結合により、アッセイ法の感度を増加させることができる。次いで、ハプテンを、第２の反応によって特異的に検出することができる。例えば、アビジンと反応するビオチンなどのハプテンまたは特異的抗ハプテン抗体と反応することができるジニトロフェリル、ピリドキサル、およびフルオレセインを使用することが一般的である。ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８、前記を参照のこと。
【０１６４】
本発明のモノクローナル抗体を、多数の異なる担体に結合することもできる。したがって、本発明はまた、活性または不活性な抗体および他の物質を含む組成物を提供する。既知の担体の例には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、および磁鉄鉱が含まれる。担体の性質は、発明の目的によって溶解性でも不溶性でも良い。当業者には、モノクローナル抗体への結合に適切な他の担体が既知であり、これを日常的な実験によって確認することができると思われる。
【０１６５】
抗体、その断片、または抗体を産生する細胞株を含む組成物は、本発明の範囲内である。これらの組成物を薬学的に使用する場合、組成物を、薬学的に許容される担体と組み合わせる。
【０１６６】
本発明の別の態様では、本発明は、ＭＨＣ分子との関連で、本発明の化合物および組成物を送達する工程を含む免疫応答の誘導法を提供する。したがって、本発明のポリペプチドを、本明細書に記載の方法を使用して抗原提示細胞にパルスすることができる。抗原提示細胞には、樹状細胞（ＤＣ）、単球／マクロファージ、Ｂリンパ球、または必要なＭＨＣ／同時刺激分子を発現する他の細胞型が含まれるが、これらに限定されない。下記の方法は、主に、最も強力なＤＣ（好ましくはＡＰＣ）に注目している。ポリペプチドまたはタンパク質を含むこれらの宿主細胞がさらに得られる。
【０１６７】
ＭＨＣ分子との関連で本発明のポリペプチドを提供する単離宿主細胞は、教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞集団の拡大および単離にさらに有用である。免疫エフェクター細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球）を、ＭＨＣ分子との関連でＡＰＣの表面上にポリペプチドを提供する抗原提示細胞とのナイーブ免疫応答エフェクター細胞の培養によって産生する。この集団を、当技術分野で既知の方法（例えば、ＦＡＣＳ分析またはフィコール勾配）を使用して精製することができる。免疫エフェクター細胞の作製および培養法ならびにこれによって産生された集団は、本発明者らの寄与および発明である。細胞および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物は、養子免疫療法で有用である。インビボでの投与前に、免疫エフェクター細胞を、メラノーマ抗原ＭＡＲＴ−１発現腫瘍細胞を溶解する能力についてインビトロでスクリーニングする。
【０１６８】
１つの態様では、免疫エフェクター細胞および／またはＡＰＣを遺伝子改変する。標準的な遺伝子導入を使用して、同時刺激分子および／または刺激サイトカインをコードする遺伝子を、免疫エフェクター細胞の拡大前、拡大と同時、または拡大後に挿入することができる。
【０１６９】
本発明はまた、ポリペプチドに対する免疫応答を誘導する条件下で有効量の上記のポリペプチドを被験体に投与する工程を含む、被験体の免疫応答の誘導法を提供する。ポリペプチドを、製剤またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとして投与することができる。ポリヌクレオチドを、遺伝子送達用媒体または宿主細胞への送達によって投与することができ、その後組換えによって転写され、翻訳され、コードされたポリペプチドがプロセシングされる。したがって、薬学的に許容される担体中に本発明のポリヌクレオチドを含む単離宿主細胞を、有効なワクチン投薬計画のために有効量のアジュバント、サイトカイン、または同時刺激分子と組み合わせることができる。１つの態様では、宿主細胞は樹状細胞などのＡＰＣである。有効量のサイトカインおよび／または同時刺激分子のいずれかまたは両方をコードするポリヌクレオチドの挿入によって、宿主細胞をさらに改変することができる。
【０１７０】
有効量のサイトカインまたは同時刺激分子を被験体へ同時投与することによって、本発明の方法をさらに改変することができる。
【０１７１】
本発明はまた、任意の上記のタンパク質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、抗体およびその断片、ならびに許容される固体または液体担体を含む組成物を提供する。組成物が薬学的に使用される場合、組成物は診断および治療に使用するために「薬学的に許容される担体」と組み合わせる。これらの組成物を、癌などの疾患の診断および治療のための薬物の調製に使用することもできる。
【０１７２】
以下の材料と方法は、例示を目的とするが、本発明を制限せず、上記の発明をどのように作成および使用するかを例示することを目的とする。
【０１７３】
材料と方法
本発明のポリペプチドの産生
最も好ましくは、本発明の単離ペプチドを、適切な固体状態の合成法を使用して合成することができる。ＳｔｅｗａｒｄおよびＹｏｕｎｇ、「固相ペプチド合成（ＳＯＬＩＤ ＰＨＡＳＥ ＰＥＰＴＩＤＥ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）」、Ｆｒｅｅｍａｎｔｌｅ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．、１９６８。好ましい方法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの方法である。Ｍａｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６７、Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅｓ．、２３、４５１を参照のこと。これらのペプチドの抗原活性を、例えば本明細書に記載のアッセイ法を使用して都合よく試験することができる。
【０１７４】
一旦本発明の単離ペプチドが得られると、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、特異的溶解性、または任意の他の標準的なタンパク質精製技術を含む標準的方法によって精製することができる。免疫親和性クロマトグラフィーのために、エピトープを本発明のペプチドまたは関連ペプチドに対して惹起されて固定支持体に固定した抗体を含む親和性カラムへの結合によって単離することができる。
【０１７５】
あるいは、ヘキサ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、マルトース結合ドメイン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、インフルエンザコード配列（Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊら、１９９１、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１９４、５０８〜５０９）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどの親和性タグを本発明のペプチドに結合して適切な親和性カラムへの通過によって容易に精製することができる。単離ペプチドを、タンパク質分解、核磁気共鳴、およびＸ線結晶学などの技術を使用して物理的に特徴付けることもできる。
【０１７６】
例えば、リン酸化、グリコシル化、架橋、アシル化、タンパク質分解、抗体分子、膜分子、または他のリガンドへの結合による翻訳中または翻訳後に特異的に改変された抗原ペプチドもまた本発明の範囲内に含まれる（Ｆｅｒｇｕｓｏｎら、１９８８、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５７、２８５〜３２０）。
【０１７７】
樹状細胞を含むＡＰＣの単離、培養、および発現
以下は、ＡＰＣ単離のための２つの基本的アプローチの簡単な説明である。これらのアプローチは、（１）血液からの骨髄前駆細胞の単離およびこれらのＡＰＣへの分化の刺激または（２）末梢血からの前刺激ＡＰＣの回収を含む。第１のアプローチでは、末梢血中の循環ＣＤ３４＋幹細胞数を追加免疫するために患者をＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインで処理しなけばならない。
【０１７８】
ＡＰＣの第２の単離アプローチは、血液中に循環している比較的多数の前刺激ＡＰＣを回収することである。ヒト末梢血からの以前の刺激ＡＰＣの単離技術は、メトリザマイド勾配および接着／非接着工程（Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌ Ｐ．Ｓ．ら、１９９０、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８７、７６９８〜７７０２）；パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）勾配技術（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉら、１９９４、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５３、９９６〜１００３）；および蛍光細胞分析分離装置（Ｔｈｏｍａｓ Ｒ．ら、１９９３、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１、６８４０〜６８５２）などの物理的手順の組み合わせを含んでいた。
【０１７９】
互いの細胞からの多数の細胞の１つの分離技術は、向流遠心分離洗浄（ＣＣＥ）として既知である。この技術では、細胞を遠心分離および流速を絶えず増加させた緩衝液の洗浄流に同時に供する。絶えず増加させる緩衝液の向流により、主に細胞サイズに基づいて細胞が分別的に分離される。
【０１８０】
本発明の１つの態様では、ＡＰＣは、マウス、サル、またはヒトなどの哺乳動物の白血球画分から単離することができる前刺激または成熟樹状細胞である（例えば、国際公開公報第９６／２３０６０号を参照のこと）。白血球画分は、哺乳動物の末梢血に由来し得る。この方法は、以下の工程を含む：（ａ）当技術分野で既知の方法（白血球搬出法など）による哺乳動物供給源から得た白血球画分を提供する工程と、（ｂ）工程（ａ）の白血球画分を向流遠心分離洗浄によって４つまたはそれ以上のサブ画分に分離する工程と、（ｃ）細胞とカルシウムイオノフォア、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＩＬ−１３またはＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４との接触によって工程（ｂ）由来の１つまたは複数の画分中の単球の樹状細胞への変換を刺激する工程と、（ｄ）工程（ｃ）由来の樹状細胞富化画分を同定する工程と、（ｅ）好ましくは約４℃で工程（ｄ）の富化画分を回収する工程。樹状細胞富化画分の１つの同定法は、蛍光細胞分析分離装置による。白血球画分を、他のサイトカイン（組換え（ｒｈ）ｒｈＩＬ−１２、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、またはｒｈＩＬ−４など）カルシウム透過担体で処理することができる。白血球細胞画分の細胞を、緩衝液中で洗浄し、分離工程前にＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋含まない培地に懸濁する。白血球画分を、白血球搬出法によって得ることができる。樹状細胞を、少なくとも１つのマーカー（ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、またはＢ７．２）の存在およびマーカー（ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６、５６、５７、およびＣＤ１９、２０）の同時非存在によって同定することができる。これらの細胞表面マーカーに特異的なモノクローナル抗体は市販されている。
【０１８１】
より詳細には、この方法は、白血球搬出法からの白血球および血小板が豊富な集団の回収およびその後のさらなる向流遠心分離洗浄（ＣＣＥ）による分画が必要である（Ａｂｒａｈａｍｓｅｎ Ｔ． Ｇ．ら、１９９１、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ．、６、４８〜５３）。細胞試料を、特別な洗浄ローターに置く。次いで、ローターを一定のスピード（例えば、３０００ｒｐｍ）でスピンする。一旦ローターが所望のスピードに到達すると、圧縮空気を使用して細胞の流速を調節する。洗浄器中の細胞を、遠心分離および流速を絶えず増加させた緩衝液の洗浄流に同時に供する。これにより、排他的ではないが主に細胞サイズの相違を基本として細胞が分別的に分離される。
【０１８２】
ＡＰＣ、より詳細にはＤＣ回収よび培養におけるその首尾の良い活性化の確認の品質維持は、単球および樹状細胞亜集団ならびにＴリンパ球夾雑の可能性をモニターする多色ＦＡＣＳ分析技術に依存する。これは、ＤＣが以下のマーカーを発現しないという事実に基づく：ＣＤ３（Ｔ細胞）；ＣＤ１４（単球）；ＣＤ１６、５６、５７（ＮＫ／ＬＡＫ細胞）；ＣＤ１９、２０（Ｂ細胞）。同時に、血中を循環しているときにＤＣは大量のＨＬＡ−ＤＲ、有意なＨＬＡ−ＤＱおよびＢ７．２（しかし、Ｂ７．１はほとんどまたは全く発現しない）を発現する（さらに、ＤＣはＬｅｕＭ７およびＭ９（単球および好中球によっても発現されるミエロイドマーカー）を発現する）。
【０１８３】
死細胞分析用の第３の着色試薬（ヨウ化プロプリジウム（ＰＩ））と組み合わせた場合、全ての細胞亜集団の正の同定を行うことが可能である（表１を参照のこと）。
【０１８４】
【表１】
2004525072.tif 000020
さらなる分析のためにさらなるマーカーを置換することができる。
色番号１：ＣＤ３のみ、ＣＤ４のみ等；Ｌｅｕ Ｍ７またはＬｅｕ Ｍ９；抗クラスＩ等。
色番号２：ＨＬＡ−ＤＱ、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＤ２５（ＩＬ２ｒ）、ＩＣＡＭ、ＬＦＡ−３等。
【０１８５】
回収時のＦＡＣＳ分析の目的は、ＤＣが予想される画分中に豊富に存在することを確認すること、好中球汚染をモニターすること、および確実に適切なマーカーを発現させることである。臨床適用に適切なヒト末梢血からの富化ＤＣのこの迅速なバルク回収は、上記の品質維持のためのＦＡＣＳ分析技術に絶対的に依存する。必要ならば、この時点で、成熟ＤＣを、「カクテル負」細胞についての蛍光分離によって単球から直ちに分離することができる。以下に詳述のように、単球自体は培養において依然としてＤＣまたは機能的ＤＣ様細胞に分化することができるので、単球からＤＣを日常的に分離する必要はない。
【０１８６】
一旦回収されると、ＤＣリッチ／単球ＡＰＣ画分（通常、１５０〜１９０）をプールして後で使用するために低温保存するか、直ちに短期培地に置くことができる。
【０１８７】
あるいは、他の研究者は、樹状細胞の上方制御（活性化）法および単球の活性化樹状細胞表現型への変換法を報告している。この方法は、単球を活性化樹状細胞に変換するための培養培地へのカルシウムイオノフォアの添加を含む。例えば、培養期間の最初の２４〜４８時間のカルシウムイオノフォアＡ２３１８７の添加により、プールした「単球＋ＤＣ」画分が一様に活性化し、樹状細胞表現型に変換し、特徴的には、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７．１、およびＢ７．２を上方制御する。さらに、この活性化バルク集団は、さらに精製した少数の集団と同様に機能する。
【０１８８】
サイトカインの特定の組み合わせを首尾よく使用して、カルシウムイオノフォアを用いて行う活性化／変換を拡大する（または部分的に置換する）：これらのサイトカインには、精製または組換え（「ｒｈ」）ｒｈＧＭ−ＣＳＦ、ｒｈＩＬ−２およびｒｈＩＬ−４が含まれるが、これらに限定されない。各サイトカインは、単独で使用する場合、至適な上方制御には不適切である。
【０１８９】
ＡＰＣへの抗原の提示
免疫化の目的のために、抗原ペプチド（配列番号：３、５、７、９、１１、１５、１７、１９、２１、および２３）を、タンパク質／ペプチドとしてまたはタンパク質／ペプチドをコードするｃＤＮＡの形態で抗原提示細胞に送達することができる。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、樹状細胞（ＤＣ）、単球／マクロファージ、Ｂリンパ球、または必要なＭＨＣ／同時刺激分子を発現する他の細胞型からなり得る。下記の方法は、主に、最も強力な好ましいＡＰＣであるＤＣに注目している。
【０１９０】
本発明の抗原タンパク質またはペプチドへのＡＰＣの曝露によってインビトロ／エクスビボでパルシングを行う。タンパク質またはペプチドを、１〜１０μｍの濃度で約３時間ＡＰＳに添加する。次いで、パルシングしたＡＰＣを、静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内送達経路を介して宿主に投与することができる。
【０１９１】
タンパク質／ペプチド抗原を、アジュバントと共に静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内送達経路を介してインビボにおいて送達させることもできる。
【０１９２】
Ｐａｇｌｉａら、１９９６、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１８３、３１７〜３２２は、インビトロで完全なタンパク質とインキュベートしたＡＰＣはＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬによって認識され、これらのＡＰＣでの動物の免疫化によりインビボで抗原特異的ＣＴＬが得られたことを示した。さらに、ＤＣなどのＡＰＣのサイトゾル中で抗原を発現させるいくつかの異なる技術が記載されている。これらには、（１）腫瘍細胞から単離したＲＮＡのＡＰＣへの移入、（２）抗原の外因性発現を誘導するための組換えベクターでのＡＰＣの感染、および（３）リポソームを使用したＤＣサイトゾルへの腫瘍抗原の移入が含まれる。（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ  Ｄ．ら、１９９６、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１８４、４６５〜４７２；Ｒｏｕｓｅら、１９９４、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．、６８、５６８５〜５６８９；およびＮａｉｒら、１９９２、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１７５、６０９〜６１２を参照のこと）。
【０１９３】
フォスター抗原提示細胞
フォスター抗原提示細胞は、標的細胞として特に有用である。フォスターＡＰＣは、内因性ペプチドと細胞表面ＭＨＣクラスＩ分子との会合を制限する抗原プロセシング経路が変異したＴ２と呼ばれるヒト細胞株１７４×ＣＥＭ．Ｔ２由来である（Ｚｗｅｅｒｉｎｋら、１９９３、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０、１７６３〜１７７１）。これは、ＭＨＣクラス１制限ＣＤ８＋ＣＴＬへの抗原提示に必要な遺伝子ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ１、およびＬＭＰ２を含むＭＨＣクラスＩＩ領域中の巨大なホモ接合性欠失による。実際、「空の」ＭＨＣクラスＩ分子のみがこれらの細胞表面上に提示される。ペプチドが対立遺伝子特異的に結合モチーフを含む場合、培養培地に添加した外因性ペプチドはこれらのＭＨＣ分子に結合する。これらのＴ２細胞を、本明細書では「フォスター」ＡＰＣという。これらを本発明と組み合わせて使用して、抗原を提示することができる。
【０１９４】
特異的な組換えＭＨＣ対立遺伝子でのＴ２細胞の形質導入により、ＭＨＣ制限プロフィールが再指示される。固定残基が内因性対立遺伝子への有効な結合を阻止するので、組換え対立遺伝子のために作製したライブラリーはこれらによって優先的に提示される。
【０１９５】
ＭＨＣ分子の高レベル発現により、ＡＰＣがＣＴＬにより視覚化される。強力な転写プロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）を使用したＴ２細胞中の目的のＭＨＣ対立遺伝子の発現により、ＡＰＣの反応性が増す（細胞表面上のより高い濃度の反応性ＭＨＣ−ペプチド複合体による可能性が最も高い）。
【０１９６】
免疫原性アッセイ法
本発明のリガンドの免疫原性を、既知の方法（下記に例示のものが含まれるが、これらに限定されない）によって同定することができる。１つの態様では、このような方法を使用して、対応する天然リガンドと本発明の変化したリガンドとを比較することができる。例えば、以下のアッセイ法の任意の１つで天然リガンドの活性と優先的に比較した場合、変化したリガンドを「より活性化が高い」とみなすことができる。いくつかの目的のために、当業者は、別の免疫原性リガンドよりも高い活性を示す免疫原性リガンドを選択する（すなわち、治療および／または診断目的のため）。しかし、いくつかの適用のために、天然リガンドに類似の免疫原性リガンドの使用が適切である。他の状況では、活性の低い免疫原性リガンドを使用することが望ましいと考えられる。このような正の活性レベルは免疫原性レベルに相関することが示唆される。
【０１９７】
１．５１Ｃｒ放出アッセイ法：抗原特異的Ｔ細胞によるペプチドパルス５１Ｃｒ標識標的の溶解を、天然または変化したリガンドのいずれかでパルスした標的細胞と比較することができる。機能的に増強されたリガンドは、時間の関数としてより高い標的の溶解を示す。一定時間（例えば、４時間）の溶解速度および完全な標的の溶解を使用して、リガンドの性能を評価することができる（Ｗａｒｅ  Ｃ．Ｆ．ら、１９８３、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３１、１３１２）。
【０１９８】
２．サイトカイン放出アッセイ法：リガンドパルス標的との接触の際にＴ細胞によって分泌されたサイトカインの型および量の分析は、機能活性の尺度であり得る。サイトカインを、ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴによって測定して、サイトカインの産生速度および総産生量を同定することができる（Ｆｕｊｉｈａｓｈｉ  Ｋ．ら、１９９３、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１６０、１８１；Ｔａｎｑｕａｙ  Ｓ．およびＫｉｌｌｉｏｎ  Ｊ．Ｊ．、１９９４）。
【０１９９】
３．インビトロＴ細胞教育：本発明のリガンドを、正常なドナーまたは患者由来のＰＢＭＣ由来のリガンド反応性Ｔ細胞集団を誘発する能力について対応する天然のリガンドと比較することができる。この系では、誘発されたＴ細胞を、溶解活性、サイトカイン放出、ポリクロナリティー、および天然のリガンドに対する交差反応性について試験することができる。（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ  Ｍ．Ｒ．ら、１９９６、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５７、２５３９）。
【０２００】
４．トランスジェニック動物モデル：本発明のリガンドまたは天然のリガンドのいずれかでのＨＬＡトランスジェニックマウスのワクチン接種および誘導された免疫応答の性質および大きさの同定によって免疫原性をインビボで評価することができる。あるいは、ｈｕ−ＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスモデルにより、ヒトＰＢＬの養子導入によってマウスにおいてヒト免疫系を再構築する。これらの動物をリガンドでワクチン接種し、先に記載ように免疫応答について分析することができる（Ｓｈｉｒａｉ  Ｍ．ら、１９９５、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４、２７３３；Ｍｏｓｉｅｒ  Ｄ．Ｅ．ら、１９９３、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０、２４４３）。
【０２０１】
５．増殖：Ｔ細胞は、反応性リガンドに応答して増殖する。例えば、３Ｈ−チミジン取り込みの測定によって、増殖を定量的にモニターすることができる。（Ｃａｒｕｓｏ  Ａ．ら、１９９７、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、２７、７１）。
【０２０２】
６．四量体染色：ＭＨＣ四量体を各リガンドと共にロードし、その適切なエフェクターＴ細胞集団への相対的結合能力を試験することができる。（Ａｌｔｍａｎ  Ｊ．Ｄ．ら、１９９６、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４、５２８４）。
【０２０３】
７．ＭＨＣの安定化：Ｔ２細胞などの一定の細胞株のＨＬＡ結合リガンドへの曝露により、細胞表面上のＭＨＣ複合体が安定化する。細胞表面上のＭＨＣ複合体の定量は、安定化したＨＬＡ対立遺伝子に対するリガンドの親和性と相関していた。したがって、この技術は、リガンドエピトープの相対的ＨＬＡ親和性を同定することができる。（Ｓｔｕｂｅｒ  Ｇ．ら、１９９５、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７、６５３）。
【０２０４】
８．ＭＨＣ競合：リガンドの基準リガンドおよびその同族Ｔ細胞エフェクターの機能的活性を干渉する能力は、どのようにしてリガンドがＭＨＣ結合を競合することができるのかの尺度である。相対阻害レベルの測定は、ＭＨＣ親和性の指標である。（Ｆｅｌｔｋａｍｐ  Ｍ．Ｃ．ら、１９９５、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、４７、１）。
【０２０５】
９．霊長類モデル：最近記載された非ヒト霊長類（チンパンジー）モデル系を利用して、ＨＬＡ制限リガンドの免疫原性をインビボでモニターすることができる。チンパンジーはヒトＭＨＣ分子と重複するＭＨＣリガンド特異性を共有するので、相対的インビボ免疫原性についてＨＬＡ制限リガンドを試験可能であることが証明されている。（Ｂｅｒｔｏｎｉ  Ｒ．ら、１９９８、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６１、４４４７）。
【０２０６】
１０．ＴＣＲシグナル伝達事象のモニタリング：いくつかの細胞内シグナル伝達事象（例えば、リン酸化）は、ＭＨＣ−リガンド複合体による首尾の良いＴＣＲ連結に関連している。これらの事象の定性的および定量的分析は、リガンドのＴＣＲ連結を介したエフェクター細胞を活性化する相対的能力に相関していた。（Ｓａｌａｚａｒ  Ｅ．ら、２０００、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、８５、８２９；Ｉｓａｋｏｖ  Ｎ．ら、１９９５、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．、１８１、３７５）。
【０２０７】
免疫エフェクター細胞の拡大
本発明は、抗原特異的免疫エフェクター細胞の富化集団の産生を刺激するためにこれらのＡＰＣを使用する。抗原特異的免疫エフェクター細胞は、ＡＰＣを犠牲にして（培養中に死滅する）拡大する。ナイーブ免疫エフェクター細胞が他の細胞によって教育される方法は、本質的にＣｏｕｌｉｅ、１９９７、Ｍｏｌｅｃ． Ｍｅｄ． Ｔｏｄａｙ、３、２６１〜２６８に記載されている。
【０２０８】
上記のように調製したＡＰＣを、ナイーブ免疫エフェクター細胞と混合する。好ましくは、サイトカイン（例えば、ＩＬ２）の存在下で細胞を培養することができる。樹状細胞は免疫賦活性サイトカイン（ＩＬ１２など）を分泌するので、第１およびその後の拡大ラウンドの間に補足的サイトカインを添加する必要はない。任意の事象では、培養条件は、ＡＰＣよりもさらに高速で抗原特異的免疫エフェクター細胞が拡大する（すなわち、増殖する）。抗原特異的細胞集団をさらに拡大するために、ＡＰＣおよび選択的サイトカインの複数の注入を行うことができる。
【０２０９】
１つの態様では、免疫エフェクター細胞はＴ細胞である。別の態様では、免疫エフェクター細胞を、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１１、またはＩＬ−１３をコードする導入遺伝子での形質導入によって遺伝子を改変することができる。インビトロ、エクスビボ、およびインビボでの導入遺伝子の導入法は、当技術分野で周知である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、前記を参照のこと。
【０２１０】
遺伝子改変に有用なベクター
一般に、異種または変化した抗原をコードするポリペプチドまたは導入遺伝子を含むベクターの移入によって、本発明で使用した細胞の遺伝子改変を行う。ウイルスおよび非ウイルス系を含む種々の異なる遺伝子導入ベクターを使用することができる。本発明の遺伝子改変に有用なウイルスベクターには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、およびアデノ−レトロウイルスキメラベクターが含まれるが、これらに限定されない。ＡＰＣおよび免疫エフェクター細胞を、下記の方法または当技術分野で既知の他の適切な方法によって改変することができる。
【０２１１】
組換えアデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルスベクターの構築
本発明の遺伝子改変で有用なアデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを、当技術分野で既に開示されている方法に従って産生することができる。例えば、Ｋａｒｌｓｓｏｎら、１９８６、ＥＭＢＯ Ｊ．、５、２３７７；Ｃａｒｔｅｒ、１９９２、Ｃｕｒｒ． Ｏｐ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３、５３３〜５３９；Ｍｕｚｃｙｚｋａ、１９９２、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８、９７〜１２９；「遺伝子ターゲティング：実践アプローチ（ＧＥＮＥ ＴＡＲＧＥＴＩＮＧ： Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ）」、１９９２、Ａ．Ｌ．Ｊｏｙｎｅｒ編、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹを参照のこと。いくつかの異なるアプローチを実行可能である。ヘルパー独立複製欠損ヒトアデノウイルス系が好ましい。
【０２１２】
ヒトアデノウイルス５に基づく組換えアデノウイルスベクター（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６３、６１４〜６１７、１９８８）は、アデノウイルスゲノムの本質的な初期遺伝子（通常、Ｅ１Ａ／Ｅ１Ｂ）を欠くので、トランスで遺伝子産物を欠く許容性細胞株で増殖しない限り複製することができない。アデノウイルスゲノム配列の欠失の代わりに、目的の導入遺伝子をクローン化して複製欠損アデノウイルスに感染した細胞で発現させることができる。アデノウイルスに基づいた遺伝子導入により宿主ゲノムに導入遺伝子が組み込まれないので安定ではないにもかかわらず（０．１％未満のアデノウイルス媒介感染により宿主ＤＮＡに導入遺伝子が組み込まれる）、アデノウイルスベクターを高力価で増殖させて非複製細胞をトランスフェクトすることができる。アデノウイルスＥ１Ａ／Ｅ１Ｂ遺伝子で形質転換したヒト胚腎臓細胞であるヒト２９３細胞は、有用な許容性細胞株の典型である。しかし、複製欠損アデノウイルスベクターを増殖させる他の細胞株（ＨｅＬａ細胞を含む）を使用することができる。
【０２１３】
本発明の方法で使用することができるアデノウイルスベクターおよび他のウイルスベクターを記載しているさらなる参考文献には、以下が含まれる：Ｈｏｒｗｉｔｚ   Ｍ． Ｓ．，「アデノウイルス科およびその複製（ＡＤＥＮＯＶＩＲＩＤＡＥ ＡＮＤ ＴＨＥＩＲ ＲＥＰＬＩＣＡＴＩＯＮ）」、Ｆｉｅｌｄｓ Ｂ．ら編、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２巻、Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１６７９〜１７２１、１９９０；Ｇｒａｈａｍ Ｆ．ら、１０９〜１２８、「分子生物学方法論（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ）」、第７巻：「遺伝子導入および発現プロトコール（ＧＥＮＥ ＴＲＡＮＳＦＥＲ ＡＮＤ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＰＲＯＴＯＣＯＬ）」、Ｍｕｒｒａｙ  Ｅ．編、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｌｉｆｔｏｎ， Ｎ． Ｊ．、１９９１；Ｍｉｌｌｅｒ Ｎ．ら、１９９５、ＦＡＳＥＢ Ｊ．、９、１９０〜１９９；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ Ｈ．、１９９４、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ａｃｔａ Ｈｅｌｖｅｔｉａｅ、６８、１４５〜１５９；ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＦｒｅｎｃｈ、１９９３、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８８、１９３７〜１９４２；Ｃｕｒｉｅｌ Ｄ． Ｔ．ら、１９９２、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、３、１４７〜１５４；Ｇｒａｈａｍ Ｆ． Ｌ．ら、国際公開公報第９５／００６５５号（１９９５年１月５日）；Ｆａｌｃｋ−Ｐｅｄｅｒｓｅｎ Ｅ． Ｓ．、国際公開公報第９５／１６７７２号（１９９５年６月２２日）；Ｄｅｎｅｆｌｅ Ｐ．ら、国際公開公報第９５／２３８６７号（１９９５年９月８日）；Ｈａｄｄａｄａ Ｈ．ら、国際公開公報第９４／２６９１４号（１９９４年１１月２４日）；Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ Ｍ．ら、国際公開公報第９５／０２６９７号（１９９５年１月２６日）；Ｚｈａｎｇ Ｗ．ら、国際公開公報第９５／２５０７１号（１９９５年１０月１２日）。種々のアデノウイルスプラスミドもまた市販されている（例えば、Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ、Ｏｎｔａｒｉｏを含む）（例えば、ミクロビックス製品情報シート：アデノウイルスベクター構築用プラスミド、１９９６を参照のこと）。遺伝子改変に使用することができるアデノ−レトロウイルスキメラベクターの構築および使用が記載されているＶｉｌｅら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５、８４０〜８４１およびＦｅｎｇら、１９９７、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１５、８６６〜８７０の論文もまた参照のこと。
【０２１４】
本発明の方法で使用することができるＡＡＶベクターを記載したさらなる参考文献には以下が含まれる：Ｃａｒｔｅｒ  Ｂ．、「パルボウイルスハンドブック（ＨＡＮＤＢＯＯＫ ＯＦ ＰＡＲＶＯＶＩＲＵＳＥＳ）」、第Ｉ巻、１６９〜２２８、１９９０；Ｂｅｒｎｓ、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、１７４３〜１７６４（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、１９９０）；ＣａｒｔｅｒＢ．、１９９２、Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３、５３３〜５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ Ｎ．、１９９２、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５８、９２〜１２９；Ｆｌｏｔｔｅ Ｔ． Ｒ．ら、１９９２、Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、７、３４９〜３５６；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、１９９５、Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ、７７０、７９〜９０；Ｆｌｏｔｔｅ Ｔ．Ｒ．ら、国際公開公報第９５／１３３６５（１９９５年５月１８日）；Ｔｒｅｍｐｅ Ｊ． Ｐ．ら、国際公開公報第９５／１３３９２号（１９９５年５月１８日）；Ｋｏｔｉｎ Ｒ．、１９９４、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、５、７９３〜８０１；Ｆｌｏｔｔｅ Ｔ． Ｒ．ら、１９９５、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２、３５７〜３６２；Ａｌｌｅｎ Ｊ． Ｍ．、国際公開公報第９６／１７９４７号（１９９６年６月１３日）；およびＤｕら、１９９６、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、３、２５４〜２６１。
【０２１５】
ＡＰＣを、関連ポリペプチドをコードするウイルスベクターで形質導入することができる。最も一般的なウイルスベクターには、ワクシニアおよび鶏痘ウイルス（Ｂｒｏｎｔｅら、１９９７、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９４、３１８３〜３１８８；Ｋｉｍら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２０、２７６〜２８６）などの組換えポックスウイルスが含まれ、アデノウイルス（Ａｒｔｈｕｒら、１９９７、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５９、１３９３〜１４０３；Ｗａｎら、１９９７、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、８、１３５５〜１３６３；Ｈｕａｎｇら、１９９５、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、６９、２２５７〜２２６３）が好ましい。ヒトＡＰＣの形質導入のためにレトロウイルスを使用することもできる（Ｍａｒｉｎら、１９９６、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、７０、２９５７〜２９６２）。
【０２１６】
インビトロ／エクスビボでは、感染多重度（ＭＯＩ）５００での最小体積の無血清培地中で１６〜２４時間のアデノウイルス（Ａｄ）ベクターへのヒトＤＣの曝露により、９０〜１００％のＤＣで導入遺伝子が確実に発現される。ＤＣまたは他のＡＰＣの形質導入効率を、発現した腫瘍抗原に特異的な蛍光抗体を使用した免疫蛍光によって評価することができる（Ｋｉｍら、１９９７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、２０、２７６〜２８６）。あるいは、抗体を酵素（例えば、ＨＲＰ）に結合させて、基質との反応の際に着色した産物を得ることができる。ＡＰＣによる抗原ポリペプチドの実際の発現量を、ＥＬＩＳＡによって評価することができる。
【０２１７】
次いで、形質導入ＡＰＣを、静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内送達経路を介して宿主に投与することができる。
【０２１８】
ＤＣまたは他のＡＰＣのインビボ形質導入を、静脈内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、または皮膚送達を含む異なる経路を介してＡｄ（または他のウイルスベクター）投与によって行うことができる。好ましい方法は、全部で約１×１０１０〜１×１０１２ｉ．ｕ．の用量を使用した複数の部位でのＡｄベクターの皮膚送達である。おおよそのインビボ形質導入レベルを、ＡＰＣマーカーに対しして指向する抗体と発現されるＴＡＡとの同時染色によって評価することができる。投与部位由来の生検試料または流入領域リンパ節またはＡＰＣ（特に、ＤＣ）が移動することができる他の器官由来の細胞に対して染色を行うことができる（Ｃｏｎｄｏｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、２、１１２２〜１１２８およびＷａｎら、１９９７、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、８、１３５５〜１３６３）。注射部位または形質導入ＡＰＣが移動することができる他の器官で発現する抗原の量を、組織ホモジネートに対するＥＬＩＳＡによって評価することができる。
【０２１９】
ウイルス遺伝子送達がより有効であるにもかかわらず、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、またはカチオニックリピド／プラスミドＤＮＡ複合体などの非ウイルス遺伝子導入法によってＤＣをインビボ／エクスビボで形質導入することもできる（Ａｒｔｈｕｒら、１９９７、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、４、１７〜２５）。次いで、形質導入ＡＰＣを、静脈内、皮下、鼻腔内、筋肉内、または腹腔内送達経路を介して宿主に投与することができる。
【０２２０】
静脈内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、または皮膚送達経路を介して送達したカチオニックリピド／プラスミドＤＮＡ複合体の投与によって、ＤＣまたは他のＡＰＣのインビボ形質導入を潜在的に行うことができる。皮膚への裸のプラスミドＤＮＡの遺伝子銃送達または注入により、ＤＣを形質導入することもできる（Ｃｏｎｄｏｎら、１９９６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、２、１１２２〜１１２８；Ｒａｚら、１９９４、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９１、９５１９〜９５２３）。免疫化のためにプラスミドＤＮＡの筋肉内送達を使用することもできる（Ｒｏｓａｔｏら、１９９７、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、８、１４５１〜１４５８）。
【０２２１】
ウイルスベクターについての形質導入効率および導入遺伝子発現レベルを、上記のように評価することができる。
【０２２２】
養子免疫療法およびワクチン
本発明の抗原特異的免疫エフェクター細胞の拡大した集団を、養子免疫療法およびワクチンとしても使用する。
【０２２３】
養子免疫療法は、１つの局面では、上記のＡＰＣとのナイーブ免疫エフェクター細胞の培養によって作製した実質的に純粋な教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞集団の被験体への投与を含む。好ましくは、ＡＰＣは樹状細胞である。
【０２２４】
１つの態様では、本明細書に記載の養子免疫療法は自己由来である。この場合、１つの被験体から単離した親細胞を使用してＡＰＣを作製する。拡大した集団はまた、この被験体から単離したＴ細胞を使用する。最後に、抗原特異的細胞の拡大集団を、同一の患者に投与する。
【０２２５】
さらなる態様では、ＡＰＣまたは免疫エフェクター細胞を、有効量の刺激性サイトカイン（ＩＬ−２など）または同時刺激分子と共に投与する。
【０２２６】
本明細書でその意図する目的に有効であると同定された薬剤を、腫瘍発現黒色腫抗原ＭＡＲＴ−１を有する被験体に投与するか、またはこのような腫瘍の発症の疑いがあるかもしくはリスクを有する個体に加えて投与することができる。薬剤をマウス、ラット、またはヒト患者などの被験体に投与する場合、薬剤を薬学的に許容される担体に添加して被験体に全身または局所投与することができる。有利に治療することができる患者を同定するために、腫瘍抑制をアッセイすることができる。治療量を経験的に同定することができ、これは治療される病態、治療される被験体、および治療の効率および毒性によって変化する。
【０２２７】
インビボでの投与を、単回で投与するか、継続して投与するか、または治療計画を通して断続的に投与することができる。最も有効な手段および投薬量の同定法は、当業者に既知であり、治療で使用した組成物、治療目的、治療される標的細胞、および治療される被験体によって変化する。治療を行う医師によって選択されたレベルおよびパターンを使用して、単回および複数回投与を行うことができる。適切な投薬製剤および薬剤の投与方法を、以下に見出すことができる。
【０２２８】
本発明の薬剤および組成物を、医薬品の製造および従来の手順に関する投与によるヒトおよび他の動物の治療のため（薬学的組成物中の有効成分など）に使用することができる。
【０２２９】
より詳細には、本発明の薬物を本明細書中で有効成分ともいい、治療のために鼻腔、局所（経皮、エアゾール、口内、および舌下を含む）、非経口（皮下、筋肉内、静脈内、および皮内を含む）、および肺を含む任意の適切な経路によって投与することができる。好ましい経路は、レシピエントの状態および年齢ならびに治療される疾患によって変化することも認識される。
【０２３０】
上記の考察および実施例は、当技術分野の例示のみを意図する。当業者に明白なように、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、種々の修正を行うことができる。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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