(57)【要約】本発明は、薬理学的活性をもつ化合物の検出、特にラットの血管内皮増殖因子受容体（ラットＶＥＧＦ−Ｒ２）キナーゼドメインのモジュレーターの検出のためのアッセイに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
順に、
Ａ）ラットＶＥＧＦ−Ｒ２触媒活性を提供するのに適当であり、且つリン酸の起源として３３Ｐ−γ−ＡＴＰを含有する溶液中に、試験化合物、ラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼ融合タンパク質、および親和性部分とラットＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化部位を含有するキナーゼ基質を提供し；
Ｂ）該化合物、キナーゼ融合タンパク質、およびキナーゼ基質を、３３Ｐリン酸化された基質をもたらすのに十分な時間接触させ；
Ｃ）多穴アッセイプレートにおいて、親和力捕捉によって、リン酸化されたキナーゼ基質を分離し；
Ｄ）最初に水溶液を吸引し、次いで、第２の溶液でプレートを洗浄することによって、残っている３３Ｐ−γ−ＡＴＰを除去し；そして
Ｅ）該化合物の存在下でキナーゼによる基質への３３Ｐ転移の速度または絶対量をモニターすることによってキナーゼ活性における変化を検出する：
段階を含む、推定ＶＥＧＦキナーゼ調節化合物の効果を測定する方法。
【請求項２】
基質が、ラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼタンパク質、ラットＶＥＧＦ−Ｒ２のポリペプチドフラグメント、ホスホリパーゼＣγのポリペプチドフラグメント、またはポリグルタミン酸／チロシン（Ｇｌｕ：Ｔｙｒ４：１）からなる群から選ばれる、請求項１の方法。
【請求項３】
基質が、ビオチン、基質内に含まれる抗体エピトープ、大腸菌ｍａｌＥ遺伝子のデキストラン／マルトース結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、およびポリヒスチジンからなる群から選ばれる親和性部分をさらに含有する、請求項２の方法。
【請求項４】
ラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼ融合タンパク質がラットＶＥＧＦ−Ｒ２タンパク質のアミノ酸７８６−１３４３を含有する、請求項１の方法。
【請求項５】
キナーゼ活性における変化が、範囲５〜１０倍のシグナル対ノイズ比をもたらす、請求項１の方法。
【請求項６】
順に、
Ａ）ラットＶＥＧＦ−Ｒ２触媒活性を提供するのに適当であり且つリン酸の起源として３３Ｐ−γ−ＡＴＰを含有する溶液中に、試験化合物、ラットＶＥＧＦ−Ｒ２タンパク質のアミノ酸７８６−１３４３に連結されたＮ末端ヘキサヒスチジンを含有するラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼ融合タンパク質を提供し；
Ｂ）該化合物およびキナーゼ融合タンパク質を、３３Ｐリン酸化された基質をもたらすのに十分な時間接触させ；
Ｃ）ＮＴＡ−ニッケル被覆された多穴アッセイプレートを用いる親和力捕捉によって、リン酸化されたキナーゼ融合タンパク質を分離し；
Ｄ）最初に水溶液を吸引し、次いで、濃度約１ｍＭ〜１００ｍＭの二価のカチオンキレート剤を含有するリン酸緩衝化生理食塩溶液でプレートを洗浄することによって残っている３３Ｐ−γ−ＡＴＰを除去し；そして
Ｅ）該化合物の存在下で自己リン酸化によるキナーゼ融合タンパク質への３３Ｐ転移の速度または絶対量をモニターすることによってキナーゼ活性における変化を検出する：
段階を含む、推定ＶＥＧＦ−Ｒ２調節化合物の効果を測定する方法。
【請求項７】
順に、
Ａ）ラットＶＥＧＦ−Ｒ２触媒活性を提供するのに適当であり且つリン酸の起源として３３Ｐ−γ−ＡＴＰを含有する溶液中に、試験化合物、ラットＶＥＧＦ−Ｒ２タンパク質のアミノ酸７８６−１３４３を含有するラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼ融合タンパク質、およびビオチニル化されたラットＶＥＧＦ−Ｒ２基質を提供し；
Ｂ）該化合物、キナーゼ融合タンパク質、および基質を、３３Ｐリン酸化された基質をもたらすのに十分な時間接触させ；
Ｃ）アビジンもしくはストレプトアビジン被覆された多穴アッセイプレートを用いる親和力捕捉によって、リン酸化された基質を分離し；
Ｄ）最初に水溶液を吸引し、次いで、濃度約１ｍＭ〜１００ｍＭの二価のカチオンキレート剤を含有するリン酸緩衝化生理食塩溶液でプレートを洗浄することによって残っている３３Ｐ−γ−ＡＴＰを除去し；そして
Ｅ）該化合物の存在下で基質への３３Ｐ転移の速度または絶対量をモニターすることによってキナーゼ活性における変化を検出する：
段階を含む、推定ＶＥＧＦ−Ｒ２調節化合物の効果を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．発明の分野
本発明は、薬理学的活性をもつ化合物の検出、特に血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦ−Ｒ２）キナーゼドメインのモジュレーターの検出のためのアッセイに関する。
【０００２】
２．背景
血管形成は、血管系の発達、創傷治癒および雌の生殖系の維持を含む種々のプロセスにおいて役割を演じている。病理的血管形成は、疾病状態、例えば、がん、糖尿病性網膜症、類リューマチ性関節炎、子宮内膜症および乾癬に関連する。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は両正常および病理的血管形成のメディエーターである。ＶＥＧＦは、膜貫通受容体の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）ファミリーに属するそれらの同類の受容体を介して細胞にシグナルを伝達する。これらの受容体は、細胞外リガンド結合ドメイン、細胞の膜に受容体を固定している膜貫通ドメイン、および細胞内チロシンキナーゼドメインからなる三部分に分かれている。ＲＴＫの１つのサブファミリーは、ＶＥＧＦを結合させる受容体Ｆｌｔ１／ＶＥＧＦ−Ｒ１およびＫＤＲ／Ｆｌｋ１／ＶＥＧＦ−Ｒ２を含有する。受容体に対するＶＥＧＦリガンドの結合は、受容体チロシンキナーゼ活性の刺激と細胞中への生物学的シグナルの伝達をもたらす。ＫＤＲ／Ｆｌｋ１／ＶＥＧＦ−Ｒ２受容体は、内皮細胞のマイトジェン生成と増殖という生物学的活性を媒介するが、一方Ｆｌｔ１／ＶＥＧＦ−Ｒ１受容体は、内皮細胞接着のような機能を媒介する。ＫＤＲ／Ｆｌｋ１／ＶＥＧＦ−Ｒ２シグナル伝達の阻害は、血管形成の過程を抑制することが示された。この受容体のインヒビターは、無調節または無制御の血管形成が存在する疾病の治療において有用であろう。
【０００３】
ＶＥＧＦ−Ｒ２のマウス型についての配列は米国特許第５，２８３，３５４号に記述されている。ヒトの配列は米国特許第５，８６１，３０１号に記述されているが、この特許において開示されている配列は、キナーゼドメインにおいてタンパク質を非機能的にさせる不活性化点変異を含む、正しい配列とはいくつかの違いを含んでいる。機能的なヒトＶＥＧＦ−Ｒ２配列は、別の国際特許出願ＰＣＴＷＯ９８／５８０５３に記述されている。ラットのＶＥＧＦ受容体キナーゼドメインは、対応するヒトの配列に類似しており、そして１９９７年３月１３日に公開ドメインに委託され（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ９３３０６およびＵ９３３０７）、そして後に、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２０９０−９７（１９９８）に記述された。ラットの細胞内キナーゼドメインは、Ｎ末端およびＣ末端のチロシンキナーゼ領域においてヒトの配列と９７％同一であり、そして介在するキナーゼインサートドメイン（ＫＩＤ）では８９％同一である。ラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼドメインの可溶形態の記述、または予想されるキナーゼ阻害活性について化合物を試験する方法におけるそのようなタンパク質の使用の記述は存在しない。
【０００４】
シンチレーション近接技術を用いて、同類のアッセイが種々の分子標的について開発された（Ｃｏｏｋ，Ｎ．Ｄ．（１９９６），Ｄｒｕｇ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｔｏｄａｙ　１：２８７−２９４；Ｐｉｃａｒｄｏ，Ｍ．ａｎｄ　Ｈｕｇｈｅｓ，Ｋ．Ｔ．（１９９７），Ｉｎ　Ｈｉｇｈ　Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ［Ｄｅｖｌｉｎ，Ｊ．Ｐ．（ｅｄ）］，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ｐｐ．３０７−３１６）。簡単に言えば、関心のある標的が、蛍光材料を含有する固形支持体にコーティングまたは組み入れのいずれかによって固定化される。固定化標的と会合することによって固相に近接にもたらされた放射性分子が、蛍光材料を励起させ、そして可視光線を放射する。可視光線の放射は、成功したリガンド／標的相互作用の検出の基礎となり、そして適当なモニター器具によって測定される。シンチレーション近接アッセイの例は、１９８６年２月４日に公表された米国特許第４，５６８，６４９号に開示されている。米国特許第５，７７０，１７６号は、機能性受容体が固定化核酸に結合する核受容体についてのアッセイを記述している。これらのタイプのアッセイについての材料はＤｕＰｏｎｔ　ＮＥＮＲ（Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から商品名ＦｌａｓｈＰｌａｔｅＴＭとして市販されている。キナーゼ機能の検出についてのシンチレーション近接アッセイの開発は、ペプチド基質に対する精製ｓｒｃチロシンキナーゼについて記述された（Ｎａｋａｙａｍａ，Ｇ．Ｒ．ｅｔ　ａｌ　Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（１９９８）３：４３−４８；ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｏ．Ｂ．ｅｔ　ａｌ（１９９９），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：３１８−３２９）。本発明者らの知識では。可溶性ＶＥＧＦチロシンキナーゼ機能を記述しているか、または類似の技術を用いて阻害性化合物を試験しているシンチレーション近接アッセイの報告はない。
【０００５】
発明の概要
本発明は、ラットＶＥＧＦキナーゼドメインを含んでなる融合タンパク質によるリン酸化を測定する方法、およびＶＥＧＦキナーゼ活性のモジュレーターを検出するアッセイを提供する。
【０００６】
かくして、本発明は、
Ａ）ラットＶＥＧＦ−Ｒ２触媒活性を提供するのに適当であり且つリン酸の起源として３３Ｐ−γ−ＡＴＰを含有する溶液中に、試験化合物、ラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼ融合タンパク質、および親和性部分とラットＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化部位を含有するキナーゼ基質を提供し；
Ｂ）該化合物、キナーゼ融合タンパク質、およびキナーゼ基質を、３３Ｐリン酸化された基質をもたらすのに十分な時間接触させ；
Ｃ）多穴アッセイプレートにおいて、親和力捕捉によって、リン酸化されたキナーゼ基質を分離し；
Ｄ）最初に水溶液を吸引し、次いで、第２の溶液でプレートを洗浄することによって残っている３３Ｐ−γ−ＡＴＰを除去し；そして
Ｅ）該化合物の存在下でキナーゼによる基質への３３Ｐ転移の速度または絶対量をモニターすることによって、キナーゼ活性における変化を検出すること：
の段階を含む、ＶＥＧＦキナーゼ酵素活性を調節する化合物の検出のための方法およびアッセイを提供する。
【０００７】
詳細な記述
定義：
本明細書で使用される用語「タンパク質ドメイン」は、しばしば、タンパク質のその他の部分とは独立に、安定な三次元構造に折り畳まれ、そして特定の機能をもつタンパク質の領域を指す。この構造は、酵素活性、他の分子に対する認識モチーフの生成を含む元来のタンパク質内にドメインの機能と関連した特定の機能を維持してもよく、あるいはタンパク質ファミリー内および関連するタンパク質スーパーファミリータンパク質ドメイン内の両方に、進化的に保存された領域であってもよい、タンパク質の、特定の環境において存在するタンパク質のための必須構造成分を提供してもよい。
【０００８】
本明細書で使用される用語「タンパク質スーパーファミリー」は、タンパク質の進化的関係が、認められた系統発生の基準によって完全に確立されていなくても、または離れていてもよいが、類似の三次元構造を示すか、または重要なアミノ酸の特有な共通性を表すタンパク質のセットを指す。本明細書で使用される用語「タンパク質ファミリー」は、タンパク質の進化的関係が、認められた系統発生の基準によって確立されたタンパク質を指す。
【０００９】
本明細書で使用される用語「融合タンパク質」は、正常には２つ以上の異なるポリペプチドに伴う機能および認識性を、１つの単一ポリペプチド鎖において組み合わせる目的のために、種々のタンパク質由来の２つ以上のドメインまたはリンカー領域を組み合わせた結果である新規なキメラタンパク質を指す。これは、所望のタンパク質ドメインをコードしているヌクレオチド配列の隣接分子クローニングによってしばしば達成されて、所望のタンパク質をコードしている新しいポリヌクレオチド配列の生成をもたらす。あるいはまた、融合タンパク質の生成は、２つのタンパク質を化学的に一緒に結合することによって達成されてもよい。
【００１０】
本明細書で使用される用語「リンカー領域」または「リンカードメイン」または類似するそのような説明用語は、クローニングベクターまたは融合タンパク質の構築において使用されるポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列の範囲を指す。リンカー領域の機能は、ヌクレオチド配列へのクローニング部位の導入、２つのタンパク質間の可変性成分または空間生成領域の導入、または特異的な分子相互作用のための親和性タグの生成を含んでもよい。リンカー領域は、特別な目的をもたないが、クローニング中になされる選択からもたらされる妥協物として融合タンパク質中に導入されてもよい。
【００１１】
本明細書で使用される用語「クローニング部位」または「ポリクローニング部位」は、１種以上の利用できる制限エンドヌクレアーゼ認識配列を有する、クローニングベクター内に含有されるか、または融合タンパク質内に構築されるヌクレオチド配列の領域を指す。制限エンドヌクレアーゼ部位の適当な操作は、縦並びの２つ以上のヌクレオチド配列におけるクローン化を可能にし、その結果、それぞれのコードされたタンパク質ドメインが、特定の開始コドンに関してフレームにおいて翻訳されて、転写および翻訳後に所望のタンパク質生産物を得る。これらのヌクレオチド配列は、次に、他のクローニングベクター中に導入され、新規な融合タンパク質を生成するために使用されるか、または特定の部位特異的突然変異誘発を導入するために使用されてもよい。クローニング部位が、サイレント突然変異、保存変異、または所望の制限酵素共通配列を含有するリンカー領域の導入によって所望の位置において設計できることは当業者には周知である。また、クローン化されたタンパク質もしくはそのフラグメントの所望の機能が維持される限りは、クローニング部位の正確な位置は柔軟であることができることも当業者には周知である。
【００１２】
本明細書で使用されるように、「発現ベクター」は、遺伝子のクローン化コピーの転写および適当な宿主におけるそれらのｍＲＮＡの翻訳のために要求される核酸配列としてここでは定義される。そのようなベクターは、大腸菌、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、酵母細胞を含む真菌細胞および動物細胞を含む、種々の宿主において真核生物もしくは原核生物の遺伝子を発現するために使用できる。
【００１３】
ＶＥＧＦ−Ｒキナーゼ活性の予想されるモジュレーターに関連して本明細書で使用される用語「試験化合物」は、キナーゼの特異的酵素活性を破壊する能力を有する有機分子を指す。例えば、本発明の範囲を限定するものではないが、化合物は、低有機分子、合成もしくは天然のアミノ酸ペプチド、タンパク質、または合成もしくは天然の核酸配列、または前記のすべての化学的誘導体を含んでもよい。アゴニストである化合物は、キナーゼ基質に転移されるリン酸の速度または総量を増大する。アンタゴニストである化合物は、キナーゼ基質に転移されるリン酸の速度または総量を低下させる。
【００１４】
用語「化学的誘導体』は、正常では基本分子の一部ではない付加的な化学部分を含有する分子を述べる。そのような部分は、基本分子の溶解度、半減期、吸収などを改善できる。あるいはまた、部分は、基本分子の望ましくない副作用を弱めるか、または基本分子の毒性を低下させることができる。そのような部分の例は、種々のテキスト、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓにおいて記述されている。
【００１５】
本発明は、ラットＶＥＧＦキナーゼドメインを含んでなる融合タンパク質によるリン酸化を測定する方法、およびＶＥＧＦキナーゼ活性のモジュレーターを検出するアッセイを提供する。特に、本発明の方法において有用な融合タンパク質は、ラットＶＥＧＦ−Ｒ２の膜貫通ドメインのカルボキシル末端のアミノ酸および場合によっては親和性タグ、例えばポリヒスチジンタグを含有する。特に好適な融合タンパク質は、ポリヒスチジンタグがＮ末端に位置し、そしてラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼドメインがラットＶＥＧＦ−Ｒ２タンパク質のアミノ酸７８６−１３４３を含有する融合タンパク質である。
【００１６】
かくして、本発明は、
Ａ）ラットＶＥＧＦ−Ｒ２触媒活性を提供するのに適当であり且つリン酸の起源として３３Ｐ−γ−ＡＴＰを含有する溶液中に、試験化合物、ラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼ融合タンパク質、および親和性部分とラットＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化部位を含有するキナーゼ基質を提供し；
Ｂ）該化合物、キナーゼ融合タンパク質、およびキナーゼ基質を、３３Ｐリン酸化された基質をもたらすのに十分な時間接触させ；
Ｃ）多穴アッセイプレートにおいて、親和力捕捉によって、リン酸化されたキナーゼ基質を分離し；
Ｄ）最初に水溶液を吸引し、次いで、第２の溶液でプレートを洗浄することによって、残っている３３Ｐ−γ−ＡＴＰを除去し；そして
Ｅ）該化合物の存在下でキナーゼによる基質への３３Ｐ転移の速度または絶対量をモニターすることによってキナーゼ活性における変化を検出すること：
の段階を含む、ＶＥＧＦキナーゼ酵素活性を調節する化合物の検出のための方法およびアッセイを提供する。
【００１７】
本発明の方法において有用なラットＶＥＧＦ−Ｒ２基質は、基質をリン酸化するラットＶＥＧＦ−Ｒ２酵素活性のために十分な時間、本発明の融合タンパク質を適当な溶液中で推定基質とともにインキュベートすることによって決定される。基質は、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分光分析法、ＨＰＬＣ、または本明細書に記述されるアッセイによって分離され、そして基質におけるチロシン残基へのリン酸転移の存在を決定するために分析される。好適な基質は、ラットＶＥＧＦ−Ｒ２のＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼドメイン（自己リン酸化を介する）ポリペプチドフラグメント、ホスホリパーゼＣγのポリペプチドフラグメント、またはポリグルタミン酸／チロシン（Ｇｌｕ：Ｔｙｒ４：１）である。
【００１８】
ここに記述されるアッセイは、基質ペプチドを固定化する方法によって、例えば、親和性部分−親和力捕捉ペア、例えばビオチン化基質ペプチドのストレプトアビジン捕捉の使用によって酵素活性（および酵素活性の調節）を検出する。親和力捕捉ペアは当該技術分野では周知であり、そして例えば、アビジン／ビオチン、基質ペプチドまたはより大きいポリペプチド内に含まれる抗体エピトープ、大腸菌ｍａｌＥ遺伝子のデキストラン／マルトース結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、およびポリヒスチジン／固定化ニッケルを含む。ポリヒスチジンは、３〜１０個の連続するヒスチジン残基、特に６個の連続するヒスチジン残基を含有するポリペプチドを指す。
【００１９】
本発明の特定の親和力捕捉アッセイは、「自己リン酸化アッセイ」および「ポリペプチドリン酸化アッセイ」と呼ばれる。自己リン酸化アッセイでは、ラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼ触媒ドメインおよび少なくとも１つの親和力捕捉ドメインを含有する融合タンパク質が、放射能標識ＡＴＰの存在下で、その酵素活性のために適当なバッファー中でインキュベートされる。キナーゼタンパク質は、融合タンパク質への放射能標識リン酸基の転移をもたらす自己リン酸化（類似分子と相互作用する１つのキナーゼ分子を介して）を行う。次いで、融合タンパク質は、適合する親和力捕捉ペアを介してシンチレーション近接担体の表面に結合する。リン酸化がシンチレーション近接担体からの可視光線の放射によって測定される。ポリペプチドリン酸化アッセイでは、リン酸化ドメインおよび少なくとも１つの親和力捕捉ドメインを含有するラットＶＥＧＦ−Ｒ２基質ペプチドもしくはポリペプチドが、放射能標識ＡＴＰの存在下で、適合するキナーゼの酵素活性のために適当なバッファー中でインキュベートされる。適合するキナーゼタンパク質がその混合液に添加され、そして基質をリン酸化して、基質への放射能標識リン酸基の転移をもたらす。次いで、リン酸化された基質は、適合する親和力捕捉ペアを介してシンチレーション近接担体の表面に結合する。自己リン酸化の検出を避けるためには、ラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼタンパク質は親和力捕捉ペアのドメインを含有することができない。リン酸化がシンチレーション近接担体からの可視光線の放射によって測定される。これらの両方の場合には、親和性ドメインは存在するポリペプチドであってもよいし、また融合タンパク質の一部として導入された異なるドメインもしくは低ペプチドであってもよい。
【００２０】
基質ペプチドにおいて酵素活性を検出する好適な方法は、３３Ｐ−γ−ＡＴＰの加水分解によって基質に３３Ｐを転移することである。この方法は、順に、
１）ラットＶＥＧＦ触媒活性を提供するのに適当であり且つリン酸の起源として３３Ｐ−γ−ＡＴＰを含有する溶液中に、試験化合物、ラットＶＥＧＦキナーゼ融合タンパク質、および親和性部分とラットＶＥＧＦ−Ｒ２リン酸化部位を含有するキナーゼ基質ペプチドを提供し；
２）該化合物、キナーゼ融合タンパク質、およびキナーゼ基質を、３３Ｐリン酸化された基質をもたらすのに十分な時間接触させ；
３）多穴アッセイプレートにおいて、親和力捕捉によって、リン酸化されたキナーゼ基質を分離し；
４）最初に水溶液を吸引し、次いで、第２の溶液でプレートを洗浄することによって、残っている３３Ｐ−γ−ＡＴＰを除去し；
５）該化合物の存在下でキナーゼによる基質への３３Ｐ転移の速度または絶対量をモニターすることによってキナーゼ活性における変化を検出する：
段階を含む。
【００２１】
ラットＶＥＧＦ−Ｒ２のキナーゼ活性に及ぼす推定ＶＥＧＦ−Ｒ２調節化合物の効果を測定するための好適な自己リン酸化方法は、順に、
Ａ）ラットＶＥＧＦ−Ｒ２触媒活性を提供するのに適当であり且つリン酸の起源として３３Ｐ−γ−ＡＴＰを含有する溶液中に、試験化合物、ラットＶＥＧＦ−Ｒ２タンパク質のアミノ酸７８６−１３４３に連結されたＮ末端ヘキサヒスチジンを含有するラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼ融合タンパク質を提供し；
Ｂ）該化合物およびキナーゼ融合タンパク質を、３３Ｐリン酸化された基質を提供するのに十分な時間接触させ；
Ｃ）ＮＴＡ−ニッケル被覆された多穴アッセイプレートを用いる親和力捕捉によってリン酸化されたキナーゼ融合タンパク質を分離し；
Ｄ）最初に水溶液を吸引し、次いで、濃度約１ｍＭ〜１００ｍＭの二価のカチオンキレート剤を含有するリン酸緩衝化生理食塩溶液でプレートを洗浄することによって残っている３３Ｐ−γ−ＡＴＰを除去し；そして
Ｅ）該化合物の存在下で自己リン酸化によるキナーゼ融合タンパク質への３３Ｐ転移の速度または絶対量をモニターすることによってキナーゼ活性における変化を検出する：
段階を含む。
【００２２】
生成物の量における変化は、時間の関数としての総量（停止−時間アッセイ）であってもよく、または時間の関数として酵素反応速度における変化を測定することによる速度論的であってもよい。速度論的アッセイは、酵素と基質の最初の接触の時間から、最大観察生成物の５０％が生成される時点まで測定される。
【００２３】
期待されるラットＶＥＧＦ−Ｒ２酵素機能の量は、用量が酵素機能を阻害しない化合物とともに、あるいは試験化合物のために使用されるがいかなる試験化合物も欠いている媒質に類似する性質を含む溶剤媒質、例えばＤＭＳＯ，ＤＭＦもしくはイソプロピルアルコールとともに、前記アッセイを同時にまたは別々に実施することによって決定することができる。
【００２４】
プレートを洗浄するために使用される溶液は、特に限定されるものではなく、そして洗剤を含有しても含有しなくても生理的緩衝溶液を含む。これらの溶液は当該技術分野では周知である。特に好適な溶液は、二価のカチオンキレート剤、好ましくは、濃度約１ｍＭ〜約１００ｍＭのＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡを含む。キレート剤は、さらなるキナーゼ触媒活性を阻害し、そしてシグナル対ノイズ比を増加することによってアッセイ性能を増大するのに役立つ。
【００２５】
次の実施例は、本発明を具体的に説明するが、それを制約するものではない。
【００２６】
実施例１
ラットＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼドメインは、ラット肝臓ｃＤＮＡからＰＣＲによってクローン化された。正方向プライマー（５−ＡＴＣＣＴＡＧＧＴＡＣＣＧＴＴＡＴＧＣＧＧＧＣＣＡＡＴＧ：配列番号：１）はヒトＶＥＧＦ−Ｒ２配列に対応するよう設計されたが、サブクローニングを容易にするためのＫｐｎＩ部位およびラットのタンパク質のアミノ酸７８６に対応する人工の開始コドンを導入された。逆方向プライマー（５−ＴＧＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＣＧＧＧＴＧＧＴＧＧＡＡＡＧ：配列番号：２）はマウスＶＥＧＦ−Ｒ２配列に対応し、そしてサブクローニングを容易にするためにラット遺伝子の終止コドンの後にＮｏｔＩ部位を導入した。この核酸フラグメントはｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ　Ｃｏ．，Ｃａｒｓｂａｄ，ＣＡ）中にクローン化された。クローンはＣＯＳ細胞において発現され、そして自己リン酸化研究において機能性であることが分かった。ＶＥＧＦ受容体リン酸化の既知インヒビターを用いる実験は、ラットＶＥＧＦ受容体クローンがこの化合物によって阻害されることを示し、その結果、ラットＶＥＧＦ受容体キナーゼドメインが類似するＶＥＧＦ−Ｒキナーゼドメインと同様に機能したことを示した（図１）。
【００２７】
Ｎ末端に付加されたポリヒスチジン（ＨＩＳ）とともにラットＶＥＧＦ−Ｒ２の細胞内ドメインからなる融合タンパク質は、６個のヒスチジン残基へと続く人工の開始コドンをもつフレームにおいて上記ＫｐｎＩ＋ＮｏｔＩフラグメントをｐＦａｓｔＢａｃ発現ベクター（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ　Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中にサブクローニングすることによって生成された。ラットＶＥＧＦ−Ｒ２の可溶性組み換えキナーゼドメイン融合タンパク質は、バクロウイルス発現ベクターｐＦａｓｔＢａｃ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を用いてＨｉ５昆虫細胞において発現され、そして実質的に製造者による説明のとおり金属キレートアフィニティークロマトグラフィー（Ｃａｔ．＃６９６７０およびＣａｔ．＃６９７５５−３，Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて８５％超の均質性に精製された（図２）。
【００２８】
実施例２
スクリーニングアッセイ
スクリーニング法は、ＶＥＧＦ受容体の活性を阻害する化合物の同定のために、ビオチニル化されたペプチド基質をリン酸化する可溶性ラットＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼドメインを用いて開発された。ＰＬＣ−１ペプチド基質は、アミノ酸４６２〜４７５のホスホリパーゼ−Ｃγのフラグメント［（ビオチン）ＫＨＫＫＬＡＥＧＳＡＹＥＥＶ−アミド：配列番号：３］、ＶＥＧＦ−Ｒ２の既知のイン・ビボ基質、あるいはまた、任意にビオチニル化された人工基質ポリＧｌｕ：Ｔｙｒ（４：１）（Ｃａｔ．＃Ｐ−０２７５，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，ＭＯ）０．６μｇからなる。
【００２９】
キナーゼ反応混合液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ＝８、１０ｍＭＭｇＣｌ２、０．１ｍＭＮａ３ＳＯ４、１ｍＭＤＴＴ、１０μＭＡＴＰ、０．２５μＭビオチニル化ＰＬＣ−１ペプチド基質および１ウェル当たり０．８μＣｉ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ［２０００−３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ］を含有して調製された。キナーゼ反応混合液７０μｌはストレプトアビジン被覆のＦｌａｓｈＰｌａｔｅＴＭ（Ｃａｔ．＃ＳＭＰ−１０３，ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）のウェル中に分配された。次いで、１００％ＤＭＳＯ中の試験化合物保存液１μｌが、ウェルに添加されて反応液中の最終濃度１％ＤＭＳＯをもたらした（１００μｌ最終反応液容量は次に酵素溶液を含む）。次いで、可溶性ラットＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼが、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ＝８、０．１％ＢＳＡにおいて濃度１μｌ当たり５ｎｇに希釈され、そして３０μｌ（１試験ウェル当たり１５０ｎｇ）が各ウェルに添加されて反応を開始した。反応液は３０℃で１時間インキュベートされた。１時間のインキュベーションの最後に、反応は、プレートから反応混合液を吸引し、そしてウェルを１００ｍＭＥＤＴＡ含有ＰＢＳで２回洗浄することによって終了された。ビオチニル化基質はＦｌａｓｈＰｌａｔｅＴＭ上に固定化されて留まり、そして３３Ｐ−γ−ＡＴＰの組み込みがシンチレーションカウンターにおいてプレートを読み取ることによって測定された。ＶＥＧＦ−Ｒ２の活性の阻害は、固定化された基質中に組み込まれた３３Ｐ−γ−ＡＴＰの減少量を観察することによって測定された。図４に示されるように、固定化された基質への３３Ｐ−γ−ＡＴＰの組み込みは、既知のインヒビターによる最大阻害に較べて実質的な差異を生じた（約５倍の差異）。かくして、このアッセイは、経済性（試薬使用の点）、強さ（ポジティブとネガティブの結果の明確な線引き）および感度（有用な濃度範囲においてキナーゼ活性を阻害する化合物を検出）の点で、５−１０倍のシグナル対ノイズ（Ｓ／Ｎ）比が好適であるハイスループット・スクリーニングアッセイとして有用である。シグナル対ノイズは、（酵素活性／過剰のインヒビターの存在下の酵素活性）として定義される。
【００３０】
このアッセイの強さをさらに評価するため、キナーゼ活性対時間の直線性を評価するために記述されたように、条件は本来重複された。図５に示されるように、アッセイは少なくとも３．５時間は直線性である。かくして、アッセイ遂行において柔軟性と信頼性を可能にするハイスループットスクリーニングを管理する場合には、このことは有用である。
【００３１】
このアッセイは、ＶＥＧＦ−Ｒ２のキナーゼ活性を阻害する化合物、例えばインヒビター−Ａ（Ｃ１３Ｈ１０Ｎ２Ｏ、Ｃａｔ．＃ＣＤ００８７０，Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）についてＩＣ５０を決定するために使用された（図３）。試験化合物は、８濃度［１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、１００ｐＭ、１０ｐＭ］において２並列でアッセイされた。アッセイについて最大と最小のシグナルが各プレートにおいて決定された。ＩＣ５０（最大シグナルの５０％阻害をもたらす化合物の濃度）は、試験化合物のｌｏｇ濃度に対する阻害パーセントを作図することによって式［ｍａｘシグナル−バックグラウンド／試験化合物シグナル−バックグラウンド（１００）＝％阻害］にしたがって、アッセイにおける最大シグナルの阻害パーセントの用量応答曲線から計算された。
【００３２】
図３に示されるように、インヒビターＡは、ＰＬＣ１基質およびポリグルタミン酸／チロシン（Ｇｌｕ：Ｔｙｒ４：１）基質に対して試験されたラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼ活性を成功裏に阻害した。
【００３３】
実施例３
自己リン酸化
スクリーニングアッセイ
キナーゼ反応混合液は、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ＝８、１０ｍＭＭｇＣｌ２、０．１ｍＭＮａ３ＳＯ４、１ｍＭＤＴＴ、１０μＭＡＴＰ、および１ウェル当たり０．８μＣｉ３３Ｐ−γ−ＡＴＰ［２０００−３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ］を含有して調製された。キナーゼ反応混合液７０μｌはＮＴＡ−ニッケル被覆のＦｌａｓｈＰｌａｔｅＴＭ（Ｃａｔ．＃ＳＭＰ−１０７，ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）のウェル中に分配された。次いで、１００％ＤＭＳＯ中の試験化合物保存液１μｌが、ウェルに添加されて反応液中の最終濃度１％ＤＭＳＯをもたらした（１００μｌ最終反応液容量は次に酵素溶液を含む）。次いで、Ｎ末端６ＸＨＩＳタグを含有する可溶性ラットチロシンキナーゼが、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ　ｐＨ＝８、０．１％ＢＳＡにおいて濃度１μｌ当たり５ｎｇに希釈され、そして３０μｌ（１試験ウェル当たり１５０ｎｇ）が各ウェルに添加されて反応を開始した。反応液は３０℃で１時間インキュベートされた。１時間のインキュベーションの最後に、反応は、プレートから反応混合液を吸引し、そしてウェルを１００ｍＭＥＤＴＡ含有ＰＢＳで２回洗浄することによって終了された。６ＸＨＩＳ−ＶＥＧＦ受容体はＦｌａｓｈＰｌａｔｅＴＭ上に固定化されており、そして自己リン酸化を介する３３Ｐ−γ−ＡＴＰの組み込みがシンチレーションカウンターにおいてプレートを読み取ることによって測定された。ＶＥＧＦ−Ｒ２の酵素活性の阻害は、固定化された酵素中に組み込まれた３３Ｐ−γ−ＡＴＰの減少量を観察することによって測定された。このアッセイの結果は図４および５に示される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ウエスタンブロット：ラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼドメイン＋／−インヒビターの抗ホスホチロシン。
【図２】
精製ラットＶＥＧＦ−Ｒ２キナーゼドメイン。
【図３】
ラットＶＥＧＦ−Ｒ２インヒビターのＩＣ５０。
【図４】
１分当たりのアッセイカウント＋／−インヒビターの棒グラフ。
【図５】
アッセイの直線性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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