(57)【要約】本発明は安定した形質転換色素体を持つ多細胞植物または植物細胞を作製するための方法及びそのためのベクターを記述している。この方法はDNA修飾を可能にするDNA分子による相同組換えにより色素体または植物細胞を形質転換することを含んでおり、それにより該DNA分子は宿主色素体配列要素を発現するために必要な遺伝子の断片を含んでいる。本発明はまた色素体形質転換のための新規選別阻害剤及び耐性遺伝子の蓄積をせずに多数回の形質転換を行なう可能性を含んでいる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定な形質転換色素体を持つ多細胞植物または植物細胞を作製する方法において、
a)  該植物または該植物細胞の色素体を、DNA修飾が可能な少なくとも1つのDNA分子であって、該DNA分子が、該DNA分子中には存在しない宿主色素体の配列要素を形質転換色素体中で発現するために必要な関与遺伝子断片を含むものを使用して、相同組換えにより形質転換し、
b) 該DNA分子を、増殖するのに適する、または該DNA修飾を持つ色素体の同定を可能とする育成条件に置き、
c)  機能的且つ該DNA分子中にコードされた情報を含む色素体を選別または同定する、ステップを含み、
それによって、安定な形質転換色素体を持つ機能的細胞または多細胞植物を生じる上記方法。
【請求項２】
前記DNA分子が、さらに選別マーカー遺伝子を創るための色素体遺伝子の変異断片を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記DNA分子が、独立の相同組換えにより、関与遺伝子断片、および色素体ゲノムにおける色素体遺伝子の変異断片の挿入部位が分離されるように設計されている、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
色素体遺伝子の前記変異断片の変異が、点変異である請求項2または3に記載の方法。
【請求項５】
前記関与遺伝子断片が、発現のために、プローモーター配列、5'-非翻訳領域、開始コドン、完全コード領域、及び3'-非翻訳領域から選択された色素体ゲノム配列要素、またはそれらの部分を必要とする請求項１乃至４の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記DNA修飾が、配列置換を含む請求項１乃至５の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記DNA修飾が、配列挿入を含む請求項１乃至６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
色素体遺伝子の前記変異断片が、色素体23S rRNA遺伝子の変異断片であり、該変異断片が抗生物質耐性を賦与する、請求項２乃至７の何れか一項に記載の方法。
【請求項９】
色素体遺伝子の前記変異断片が、色素体16S rRNA遺伝子の変異断片であり、該変異断片が抗生物質耐性を賦与する、請求項２乃至７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
色素体遺伝子の前記変異断片が、色素体psbA遺伝子の変異断片であり、該変異断片がアトラジン、メトリブジン及び/またはディウロン耐性を賦与する、請求項２乃至７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
色素体遺伝子の前記変異断片が、色素体atpB遺伝子の変異断片であり、該変異断片がテントキシン耐性を賦与する、請求項２乃至７の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
関与遺伝子断片による前記DNA修飾が、5'調節配列及び作動的に結合したコード領域の間で起こり、1以上の追加のシストロンを生じる、請求項１乃至１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
関与遺伝子断片による前記DNA修飾が、コード領域及び作動的に結合した3'調節配列の間で起こり、1以上の追加のシストロンを生じる、請求項１乃至１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
関与遺伝子断片による前記DNA修飾が、3'調節配列の直ぐ下流で起こる、請求項１乃至１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記関与遺伝子断片が、異種遺伝子の断片であり、前記DNA修飾が、既存シストロンを変化して該変化により追加のシストロンを創らないように設計されている、請求項１乃至１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記変化シストロンが、宿主色素体DNAに由来するRNAと、前記関与遺伝子断片のDNAに由来するRNA配列とを含む、ハイブリッドメッセンジャーRNAを形成するように設計されている、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記ハイブリッドメッセンジャーRNAが、1または複数の異種ポリペプチドまたはタンパクをコードしている、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
前記ハイブリッドメッセンジャーRNAの全部または部分の翻訳により、融合タンパクを生じる、請求項16または17に記載の方法。
【請求項１９】
前記融合タンパクが、複数の異種ポリペプチド配列を含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記DNA分子が、さらにそれぞれタンパク分解開裂部位をコードする1以上の配列を含む、請求項１５乃至１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記タンパク分解開裂部位が、自己触媒的である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
さらに、タンパク分解開裂部位を持つ発現融合タンパクを開裂するために必要な、部位特異性タンパク分解酵素を提供する遺伝的若しくは一過性の修飾を含む、請求項20または21に記載の方法。
【請求項２３】
DNA分子が、さらに1以上の組換え部位またはスプライシング部位を含む、請求項１乃至２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
請求項1に記載のステップ（b）及び（c）に引き続きさらに、
形質転換の第一ステップにより得られる前記機能的細胞または前記多細胞植物の前記安定な形質転換色素体を、DNA修飾を可能にする相同組換えにより、形質転換色素体中で、宿主色素体の配列要素または該第一形質転換ステップにおいて導入された関与遺伝子断片を発現するために必要な、関与遺伝子またはその断片を含む、第二DNA分子で形質転換し、
該DNA修飾が、共同してオペロンまたはシストロンを作る、請求項1から15の一つに記載の方法。
【請求項２５】
前記DNA修飾の結果、機能的で転写活性な関与遺伝子を生じる、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
前記共同して作成したオペロンまたはシストロンが、一DNA分子の関与遺伝子断片に由来するRNAと、該第二DNA分子の第二の関与遺伝子断片に由来するRNAとを含むハイブリッドメッセンジャーRNAを形成するように設計されている請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
前記ハイブリッドメッセンジャーRNAの少なくとも一部が、翻訳可能である請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
第一DNA分子の第一の関与遺伝子断片によりコードされるポリペプチドと、第二DNA分子の第二の関与遺伝子断片によりコードされるポリペプチドとを含む機能的ポリペプチドが生産される、請求項26または27に記載の方法。
【請求項２９】
色素体として少なくとも部分的に機能し、さらに1以上の有用な形質を発現する色素体を生じる、請求項１乃至２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３０】
関与遺伝子断片による前記DNA修飾が、前記色素体ゲノムの転写領域に影響を及ぼす、請求項１乃至２９の何れか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が2回行われ、第一回目に創られた点変異が、第二回目には元に戻り、その一方で、同一若しくは異なる色素体遺伝子中で別の点変異を創る、請求項４乃至２８の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記DNA修飾が、前記色素体ゲノム中への関与遺伝子の挿入を含む、請求項１乃至３１の何れか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記DNA修飾が、配列の削除を含む、請求項１乃至３２の何れか一項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１乃至３３の何れか一項に記載の方法を使用して得られた、形質転換色素体、細胞、または多細胞植物及びその子孫。
【請求項３５】
請求項１乃至３３の何れか一項に記載の方法を使用して得られた、野生型色素体及び形質転換色素体の混合物を含む、キメラ形質転換細胞、または多細胞植物及びその子孫。
【請求項３６】
請求項１乃至３３の何れか一項に記載の方法を使用して得られた、少なくとも二つの異なる形質転換色素体の混合物を含む安定キメラ植物。
【請求項３７】
請求項１乃至３３の何れか一項に記載の方法を実施するためのDNA分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的な植物バイオテクノロジー、及び色素体形質転換のための新規な形質転換ベクター及び選別プロトコールに関するものである。本発明は、さらに多重形質転換の新規な方法、及び新規な選別プロトコールに関するものである。
【０００２】
（発明の背景）
色素体形質転換は、核発現遺伝子に対し、膨大な数のコピー、即ち−細胞当たり10000を超える色素体ゲノムのコピーを使用することを利点とし、総可溶性植物タンパクの10％を超える発現レベルに達することがある。さらに、色素体でコードされる形質は花粉伝達性でなく、かくして、遺伝子導入植物の導入遺伝子が野生種へ不慮に漏出する潜在的リスクが著しく減少することから、色素体形質転換は、魅力的とされる。従来の色素体形質転換技術は、Heifetz, 2000及びKoop et al., 1996に記述されている。
【０００３】
従来より色素体形質転換ベクターは、通常少なくとも二つの目的に供し得ることを要する：
（1）色素体の遺伝機構により発現される1以上の所望外来遺伝子の導入、
（2）阻害剤選別、又は検出可能な表現型についてのスクリーニングによる、形質転換色素体ゲノムを含む細胞の選別。
色素体形質転換ベクターは、通常、少なくとも二つの完全遺伝子カセットを含んでおり、それぞれ、作動的に結合した4個の配列、プロモーター配列、5'非翻訳領域、コード領域、及び3'非翻訳領域を含んでいる。この原則の例外として、その遺伝子カセットの一つだけにプロモーター配列を持つベクター示されている（Staub & Maliga, 1995）。しかし、そのベクターは、選別遺伝子カセットに応用されていない。
【０００４】
選別は、完全な常在の色素体遺伝子を、選別用阻害剤に対する耐性を付与する変異遺伝子で置換するか（US5451513）、または阻害剤の酵素的不活化を引き起こす完全発現カセットを導入することにより行われる（US5877402）。
【０００５】
この２以上の遺伝子カセットに加えて、形質転換ベクターは、相同組換えにより色素体ゲノム中に設計配列を導入するために必要な挿入部位の隣接領域を含んでいる。
【０００６】
上記従来の色素体形質転換方法において、新規配列、すなわち、酵素的な阻害剤の不活化を生じる非色素体遺伝子発現カセット、及び所望の追加遺伝子のための発現カセットは、通常、色素体遺伝子の機能を妨害しないように、非転写領域に配置される（US5877402，US5932479，WO9910513，WO9855595，WO9946394，WO9706250，WO0007431）。もし、それらが転写領域に配置されるならば、妨害を生じる。
【０００７】
色素体形質転換用の従来のベクターは、ある特定の不安定性をもって、形質転換を生じる。しばしば外来遺伝子の消失が観察されている。これは、従来の色素体形質転換方法に内在する問題であった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、選択的で極めて応用範囲が広い方法、及びその方法によって安定性を増した形質転換を生じるベクターを提供することである。
【０００９】
本発明のもう一つの課題は、生物学的安全性を高めた色素体形質転換方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要約）
これらの課題は、安定な形質転換色素体を持つ多細胞植物または植物細胞を作製する方法において、
a)  該植物または植物細胞の色素体を、DNA修飾を可能にする少なくとも一のDNA分子であって、該DNA分子が、形質転換色素体中で発現するために、該DNA分子中に存在しない宿主色素体の配列部分を必要とする遺伝子の断片を含むものを用いて、相同組換えにより、形質転換するステップ；
b)  該色素体を、該DNA修飾を持つ色素体を複製し易い増殖条件下、或いは該DNA修飾を持つ色素体を同定できる条件下で処理するステップ；並びに
c)  機能的であり且つ該DNA分子にコードされた情報を含む色素体を、選別または同定するステップを含み、
それによって、安定な形質転換色素体を持つ機能的な細胞及び多細胞植物を生じる、上記方法により解決される。
【００１１】
望ましい態様は、サブクレーム中に示される。
【００１２】
さらに、本発明は、上記操作のためのベクターを提供する。
【００１３】
驚くべきことに、色素体形質転換及び色素体中での機能的導入遺伝子の発現のための、完全遺伝子発現カセットを含むベクターを使用する必要が無いことを見出した。このことは、自律的な機能のために、形質転換配列が、全ての配列、特に調節配列をも備える必要がないという利点を有している。むしろ、形質転換配列が、色素体遺伝子またはオペロンの配列要素、特に調節配列要素によることができる。驚くことに、そのような新規な形質転換方法は、非常に高い安定性の形質転換を生じることが見出されている。このような高い安定性を生じる正確な機序は未だ明らかになってはいない。相同配列の減少による相同組換えの可能性が減少するためであると考えられている。簡素化されたベクターは、殆ど制約を受けることなく、従来の方法では達成できなかった形質転換の新しい道を開く。
【００１４】
DNA修飾は、配列の挿入、置換及び/または削除である。
【００１５】
当該DNA分子の遺伝子断片は、標的配列と重複してもよく、重複していなくとよい。当該DNA遺伝子は、形質転換ベクターとして機能する。
【００１６】
本発明は、多数の形質転換ベクター及びそれを適用する方法を提供する。本発明によれば、不完全遺伝子発現カセットである「遺伝子断片」は、選択性に関する利点及び所望の外来配列の発現を可能にする。本発明はまた、色素体形質転換のための新規な選別用阻害剤の使用を含んでおり、最も重要なのは、耐性遺伝子を蓄積すること無く、色素体ゲノムの1以上の遺伝子座に、制限なく無数の導入遺伝子の挿入を可能とする、数回の連続した一連の形質転換を行なうことができることである。
【００１７】
本発明の方法及びベクターは、転写を生じる転写領域、またはプロモーターのように転写を生じない配列に向けて使用することができる。それらは、色素体遺伝子の機能を不当に阻害すること無く、色素体ゲノムの転写領域に特に良く適合する。
【００１８】
形質転換された色素体における当該遺伝子断片の作動のために必要な宿主色素体の当該配列要素は、宿主色素体のいかなる配列であってもよい。それは、転写配列または非転写配列であってもよいが、望ましくは、遺伝子発現に必要な調節配列である。
【００１９】
遺伝子断片は、完全な遺伝子発現カセットに含まれる下記4要素の少なくとも1以上を完全にまたは部分的に失っている：
（1）プロモーター配列、
（2）5'非翻訳領域（5'-UTR）、
（3）タンパクまたはRNAの完全配列をコードするコード領域、及び
（4）3'非翻訳領域（3'-UTR）。
遺伝子断片は、少なくともプロモーター領域を、完全にまたは部分的に、失っていることが望ましい。望ましい態様を以下に示す。
【００２０】
（実施の形態1）プロモーター領域を失った遺伝子断片のためのベクター
本発明のこの実施の形態における第一のセットのベクターは、元来の遺伝子の発現を妨げることなく、新規DNA配列を既存のオペロンに導入するために設計される。これは、プロセッシングシグナルを持つ及び/または持たない短い相同スペーサー領域とともに、有効なリボソーム結合部位（Shinozaki & Sugiura, 1982）に従って設計された合成スペーサー領域、または色素体中で作用することが示されているウイルス翻訳開始部位を使用することにより行なうことができる（Hefferon et al., 2000）。その構造においては、発現マーカーとしてのuidA及び選別マーカーとしてのaadAを含むことができる。これらはいずれも、異なるスペーサー領域を、前に配置することができる。発現マーカー及び選別マーカーは、目的の他の配列で容易に置換することができるし、または追加の配列で拡張することもできる。
【００２１】
第二のセットのベクターは、強く発現し終結が明確でない単シストロン性遺伝子（Stern & Gruissem, 1987）の3'-UTRの後ろに新規配列を挿入するために設計される。その操作により元来の単シストロン性遺伝子の強力なプロモーターが転写を開始する新規多シストロン性オペロンを作製することができる。第一のセットのベクターと同様に、スペーサー領域は、発現マーカー及び選別マーカーの前に配置することができる。任意に、この新規オペロンの後ろに有効な3'-UTRを続けてもよい。
【００２２】
（実施の形態2）完全なコード領域及びプロモーター領域を消失した遺伝子断片のためのベクター
本発明における第二の実施の形態は、種々の阻害剤または抗生物質に対する耐性を付与する色素体ゲノム点変異体を創製するために利用することができる。色素体形質転換体の選別において使用できる阻害剤としては、スペクチノマイシン及びストレプトマイシン（Maliga et al. 1973, Svab et al. 1990）、リンコマイシン
2004520032.tif 000002
アトラジン（Sato et al. 1988）、テントキシン（Durbin and Uchytil 1977, Klotz1988）、メトリブジン（Schwenger-Erger et al. 1993, Perewoska et al. 1994, Schwenger-Erger et al. 1999)及びディウロン（Renger 1976, Wolber et al. 1986, Sato et al. 1988, Erickson et al. 1989）並びにそれらの機能的同族体または誘導体が含まれる。点変異は、相同組換えにより、色素体ゲノムに導入することができる（Svab et al. 1990）。ベクターは、相同組換えに必要な隣接配列の一つで、変異配列を含むことができる。その隣接配列は、点変異を含むコード領域の一部において始めることができる、すなわち、ベクターは、プロモーターも5'-UTRも含まず、当該変異遺伝子のコード領域の一部のみを含むものとすることができる。それで、1以上の所望の外来配列は、実施の形態１で記述したように、プロモーターを分離することなく導入することができ、ベクターは、相同組換えに必要な第二の隣接配列を加えることにより完成させることができる。
【００２３】
（実施の形態３）選別に使用される配列とは異なる色素体ゲノム遺伝子座に1以上の導入遺伝子を挿入することを可能にする（完全なコード配列及びプロモーター領域を消失した）遺伝子断片のためのベクター
本発明における第三の実施の形態は、実施の形態２で記述したように、種々の阻害剤に対する耐性を付与する、色素体ゲノム点変異を利用することができる。それぞれの点変異を持つ遺伝子断片は、組換えに必要な相同領域を提供する。関与配列は、マーカー断片に作動的に結合させずに同じベクターの別の位置に配設することができる。これら関与配列は、色素体ゲノムの所望の位置に、相同組換えのための隣接配列を移入するものであり、a）元来の遺伝子の発現を障害せずに存在するオペロンに新規配列を挿入するか、またはb）強く発現しそして終結が明確でない単シストロン性遺伝子（Stern & Gruissem, 1987）の3'-UTRの後ろに新規配列を挿入するか、またはc）実施の形態1に記述したように予め存在するシストロンを修飾することにより、発現することができる。関与配列及び点変異を持つマーカー断片は、物理的に分離された二つの色素体ベクターに位置させることもできる。点変異を持つ遺伝子断片及び関与列を持つDNA断片は、二つの独立した組換え反応により色素体ゲノムに組み込むことができる（共形質転換）。共形質転換は色素体形質転換に有効であることが報告されている（Carrer and Maliga 1995）。類似の実験において、aadA及びGFP遺伝子は30％の効率で別々の色素体において共形質転換されることが認められている。
【００２４】
（実施の形態４）調節配列を修飾、除去または置換する遺伝子断片のベクター
本発明における第四の実施の形態において、色素体ゲノム中に含まれる配列の発現調節を修飾するために、配列要素を、色素体ゲノムから除去または色素体ゲノム中へ導入することができる。その配列要素は、完全な5'-若しくは3'-調節配列、その部分、または遺伝子発現を修飾する新規配列に相当するものとすることができる。導入される配列としては、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、mRNA安定性を修飾する配列、または色素体中において作用することが示されているウイルス転写開始部位（Hefferon et al., 2000）がある。また、これらの配列の機能としては、標的配列をそれら調節配列から分離することによって、標的配列の発現を阻止することもある。この方法は、先に行なった形質転換により導入された配列の発現を修飾するために使用することもできる。
【００２５】
（実施の形態５）シストロンを創造することなく、既存のシストロンを変化させるための遺伝子断片
重要な態様において、当該DNA修飾が、既存シストロンを変化させるために設計され、当該関与遺伝子断片は、望ましくは異種遺伝子の断片である。この態様において、当該DNAの変化は、既存シストロン中への関与遺伝子断片の挿入によるため、追加のシストロン（定義参照）は、創られない。関与遺伝子断片は、既存シストロンの何処にでも挿入することができる。また、関与遺伝子断片は、既存シストロンの始点で既存シストロンと結合することができるが、望ましくは、既存シストロンの終点で既存シストロンと結合することができる。当該変化させたシストロンは、宿主色素体DNAから誘導したRNA配列及び当該関与遺伝子断片のDNAから誘導したRNA配列を含むハイブリッドメッセンジャーRNAを形成するように設計されることが望ましい。当該ハイブリッドメッセンジャーRNAは、1または多数の異種ポリペプチドまたはタンパクをコードすることができる。当該ハイブリッドメッセンジャーRNAの全部または一部の翻訳により、融合タンパクを生じることができる。当該融合タンパクは、既存シストロンの遺伝子産物と関与遺伝子断片の遺伝子産物とを含むことができる（例12及び13参照）。当該融合タンパクは、多数の異種ポリペプチド配列を含むことができる。関与遺伝子断片または当該DNA分子は、発現後に、融合タンパクから得た所望のタンパクを開裂することを可能とするタンパク分解開裂部位をそれぞれコードする1以上の配列を持つことができる。当該タンパク分解開裂部位は、自己触媒的なものでもよい。例としては、関与遺伝子断片に、発現した融合タンパクからの関与タンパクを、翻訳後調整による切断を可能とするインテイン配列を付与することができる（例12参照）。
【００２６】
関与遺伝子断片は、リボソームRNA（rRNA）のように翻訳されないRNAをコードする既存シストロン中に挿入することもできる。この場合、転写により、既存シストロンの転写産物及び関与遺伝子断片のmRNAを含むハイブリッドmRNAを、生じる。関与遺伝子断片は、当該関与遺伝子断片によりコードされている関与タンパクの生産を可能にするために、リボソーム結合部位のように翻訳を可能にする配列を付与されていることが望ましい。関与遺伝子断片は、例えば、いずれかのrRNAをコードしているいずれかの既存シストロンに挿入することができる。rRNAをコードする当該既存シストロンへの当該挿入は、色素体の重大な機能を破壊しないことが望ましい。そのようなシストロンの望ましい例は、sprA（Sugita et al.,1997; Vera and Sugiura, 1994）である。
【００２７】
（実施の形態６）多ステップ形質転換を使用する、関与機能遺伝子の作製
この態様において、機能的細胞または多細胞植物からの安定的形質転換色素体は、本発明の方法よる形質転換の第一のプロセス若しくはステップにおいて得られる。この第一のステップにおいて、色素体ゲノムには、機能しない第一遺伝子断片が賦与される、すなわち、当該第一遺伝子は、形質を発現しないことが望ましい。そのような機能しない遺伝子の例としては、コード領域の部分、第二形質転換ステップにおける相同組換えのための標的配列（「ランディングパッド」）として有用な配列を挙げることができる。選別は、安定した形質転換色素体を持つ機能的細胞を得るための第一形質転換ステップの後に行なう。また、多細胞植物を再生することもできる。第二ステップにおいて、安定な形質転換色素体を持つ細胞または植物は、第二DNA修飾を可能にする相同組換えにより、第二DNA分子で形質転換されるため、当該第二DNA分子は、宿主色素体の配列要素、または当該第一形質転換ステップにおいて導入された遺伝子断片の配列要素を、形質転換色素体中で発現するために必要な、関与遺伝子、望ましくはその断片、を含んでいる。必要があれば、当該第二形質転換ステップは、請求項１に記載のステップ（b）及び（c）に定義した選別方法によって行なうことができる。この態様において、当該第一ステップ及び当該第二ステップにおける当該DNA修飾は、共同して、望ましい機能を持ったオペロンまたはシストロンを作製する（例14参照）。当該望ましい機能としては、例えば、二つの当該形質転換ステップのうち一つが省略された場合に発現することができない所望の関与遺伝子を発現させることである。当該第二DNA分子は、付加的に、レポーター遺伝子のような追加の関与遺伝子を含むことができる。この態様の重要な利点の一つは、1回の形質転換操作では、機能的関与遺伝子を生じないので、生物学的安全性に大きく貢献することである。
【００２８】
上記二つのステップにおけるプロセスの原理は、付加的に所望の機能を発揮する2以上の形質転換ステップ（例えば、３ステップ）へ容易に拡張することができる。
【００２９】
本発明の種々の実施の形態は、同時に実施することもできるし（例えば、共形質転換によって）、あるいは続けて実施することもでき、それとともに、以前では想像もできなかった色素体ゲノム修飾のための多様な手段を提示する。それらの手段は、ほぼ思い通りに色素体を修飾することを可能にする。一例は、色素体中に、総ての生合成経路を挿入することである。
【００３０】
（定義）
以下の定義は、本発明の詳細な説明中で使用されている特定の用語の意味を明確にするものである。
【００３１】
3'-UTRとは、（-）遺伝子の（-）コード領域の下流にある、転写されるが翻訳されない領域である。（-）色素体（-）遺伝子において、3'-UTRは、とりわけ3'から5'へのエキソヌクレアーゼ分解に対するmRNAの安定化に寄与している。
【００３２】
5'-UTRとは、（-）遺伝子の（-）コード領域の上流にある、転写されるが翻訳されない領域である。（-）色素体（-）遺伝子において、5'-UTRは、その3'末端近くに翻訳開始（リボソーム結合部位、（-）RBS）のための配列情報を含んでいる；
【００３３】
aadAとは、抗生作用による（-）選別阻害剤であるスペクチノマイシン及び/またはストレプトマイシンを解毒するために良く使用されるタンパクである（-）細菌アミノグリコシドアデニル転移酵素のコード領域である。
【００３４】
クロロプラストとは、クロロフィルを含む（-）色素体である。
【００３５】
シストロンとは、一つの機能的RNA（メッセンジャーRNAと反対に）または一つのポリペプチドをコードする遺伝子座にあるDNA配列である。ポリペプチドをコードする配列は、1以上の非コード領域（（-）イントロン）を含むことがある。1  を超えるシストロンを、（-）オペロン中に配置することができる。
【００３６】
コード領域とは、a）ポリペプチドのアミノ酸配列、またはb）機能的RNAのヌクレオチドに関する情報を含むヌクレオチド配列である。コード領域は、任意に1以上の（-）イントロンにより中断されている。
【００３７】
所望の遺伝子（配列）とは、修飾したまたは新規に導入した配列である。（-）形質転換の目的で試みられる。
【００３８】
隣接、隣接領域とは、（-）色素体（-）形質転換（-）ベクター中に挿入された配列の5'及び3'末端に存在するDNA配列であり、これらは、二重相互（-）相同組換えにより、隣接配列間にある配列の標的（-）色素体ゲノム中への組み込みを媒介する。同じ機構により、配列は修飾され、あるいは標的（-）色素体ゲノムから除去される。このように、（-）色素体（-）形質転換（-）ベクターの隣接配列は（-）、形質転換により標的（-）色素体ゲノムに変化を生じる場所を決定する。
【００３９】
遺伝子発現とは、配列情報を機能に変換する過程である。後にポリペプチドに翻訳される（-）メッセンジャーRNAをコードしている（-）遺伝子において生じる。RNAをコードしている遺伝子において、（-）プロモーターが媒介するRNAポリメラーゼの作用によりコードされたRNAを生じる。
【００４０】
遺伝子断片とは、独立した機能、すなわち発現のような自律機能、を確保するために要求される要素より短い要素をコードするヌクレオチド配列である。（-）遺伝子は、少なくとも一つの完全な（-）コード領域を含む（-）オペロンに配置される。ポリペプチドをコードする（-）遺伝子において、これらの配列は、（1）（-）プロモーター、（2）5'非翻訳領域（（-）5'-UTR）、（3）（-）完全コード領域、（4）3'非翻訳領域（（-）3'-UTR）である。
RNAをコードする（-）遺伝子において、（-）5'-UTR及び（-）3'-UTRは、消失している。１を超える（-）コード領域からなる（-）オペロンにおいて、二つの連続完全（-）コード領域は、（-）スペーサーによって分離されている。（-）プロモーター、（-）5'-UTR、及び（-）3'-UTR配列が、そのオペロンの（-）コード領域によって共有されている。
【００４１】
遺伝子とは、例えば、独立して発現する機能を確保するために必要な全ての要素をコードしているヌクレオチド配列である。
遺伝子は、少なくとも一つの完全（-）コード配列を含む（-）オペロン中に配置されている。
ポリペプチドをコードする（-）遺伝子において、これらの配列は、（1）（-）プロモーター、（2）5'非翻訳領域（（-）5'-UTR）、（3）完全（-）コード領域、（4）3'非翻訳領域（（-）3'-UTR）である。
RNAをコードする（-）遺伝子において、（-）5'-UTR及び（-）3'-UTRは消失している。
１を超えるコード領域からなる（-）オペロンにおいて、二つの連続完全（-）コード領域は、（-）スペーサーによって分離されている。（-）プロモーター、（-）5'-UTR、及び（-）3'-UTR配列は、その（-）オペロンの（-）コード領域によって共有されている。
【００４２】
ゲノムとは、細胞の核または細胞小器官の完全DNA配列である。
【００４３】
相同組換えとは、（-）ゲノムの標的部位に対して充分な配列相同性を持つ（-）隣接配列の存在により、配列の交換、挿入または削除を生じる過程である。
【００４４】
挿入部位とは、新規配列が導入される（-）色素体ゲノムの遺伝子座である。
【００４５】
遺伝子間領域とは、（-）ゲノム中の二つの（-）遺伝子間の配列である。その領域は（-）オペロン間領域または（-）オペロン内領域として生じ、その場合にそれらは（-）スペーサーとも呼ばれる。
【００４６】
オペロン間領域とは、（-）オペロン間の配列である。
【００４７】
オペロン内領域とは、（-）オペロンの内部の配列である。
【００４８】
遺伝子内領域とは、（-）遺伝子の内部の配列である。
【００４９】
イントロンとは、（-）コード配列を中断する配列である。
【００５０】
非転写領域とは、発現に必要な全ての調節配列を含む自律的配列を持つベクターにより機能的発現をさせるために標的とすることができるのみであるゲノム領域である。
【００５１】
オペロンとは、一つのプロモーターを共有する数個の（-）遺伝子の有機的構造体である。
【００５２】
植物とは、その細胞中に（-）色素体を含む生物である。本発明は特に多細胞（-）植物に関係し、多細胞（-）植物には、裸子植物（例えば、マツ、トウヒ、及びモミなど）及び被子植物（例えば、単子葉植物作物、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、ライムギ、Triticale、モロコシ、サトウキビ、アスパラガス、ニンニク、ヤシなど、及び非作物単子葉植物、双子葉植物作物、タバコ、ジャガイモ、トマト、アブラナ、サトウダイコン、カボチャ、キュウリ、メロン、コショウ、柑橘類、ナス、ブドウ、ヒマワリ、ダイズ、アルファルファ、ワタなど）及び非作物双子葉植物並びにシダ、ゼニゴケ類、スギゴケ類、及び多細胞性緑色、赤色及び褐色藻類の群が含まれる。
【００５３】
色素体とは、（-）植物細胞中において自身の遺伝機構を持つ小器官である。機能的及び形態的に種々の形で存在し、例えば、アミロプラスト、（-）クロロプラスト、クロモプラスト、エチオプラスト、ジェロントプラスト、ロイコプラスト、プロプラスチドなどがある。
【００５４】
色素体ゲノムとは、（-）色素体の完全DNA配列である。
【００５５】
プロセッシングシグナルとは、RNA転写物はしばしば機能性を有するものに到達する前に、成熟を必要とする（「プロセッシング」、すなわち、切出し/再結合による現象である）。プロセッシングの情報は、DNA配列中の「プロセッシングシグナル」の中にある。
【００５６】
プロモーターとは、転写を開始し、調節する機能を持つヌクレオチド配列である。
【００５７】
リボソーム結合部位（RBS）とは、（-）コード領域の（-）翻訳開始コドンの上流にあるDNA配列であり、リボソーム結合を仲介し、個々のRNA転写物から翻訳を開始する部位である。リボソーム結合部位（RBS）配列は、（-）5'-UTRまたは（-）スペーサーの部分である。
【００５８】
選別阻害剤とは、形質転換したものよりも強く、非形質転換細胞または細胞小器官の増殖及び発育を抑制する化合物である。
【００５９】
スペーサーとは、（-）オペロンの一つの（-）コード領域の3'末端ともう一つの（-）コード領域の5'末端の間にある（-）遺伝子間領域である。
【００６０】
本発明の説明において、「終結」とは、DNA配列からRNAの転写を中止することである。
【００６１】
転写領域とは、少なくとも部分的に転写領域の配列に依存している非自律的配列を持つベクターにより機能的発現のために標的となり得るゲノムの領域である。そのような転写領域の中で、標的となる位置は、遺伝子内位置またはオペロン内スペーサー位置またはオペロンのすぐ下流の位置である。
【００６２】
形質転換ベクターとは、（-）ゲノムの（-）形質転換を媒介するために作製されたクローン化DNA分子である。
【００６３】
形質転換とは、少なくとも一つの（-）形質転換ベクターを使用することを含む（-）植物または植物細胞の処理によりDNA配列の導入、切出しまたは修飾を導くための方法である。
【００６４】
導入遺伝子とは、ある一の（-）ゲノムから誘導され、他のゲノムに導入されるDNA配列である。
【００６５】
翻訳開始コドンとは、ポリペプチドの最初のアミノ酸をコードする配列要素である。
【００６６】
翻訳停止コドンとは、翻訳の中止を引き起こす配列要素である。
【００６７】
uidAとは、細菌βグルクロニダーゼの（-）コード領域である。細菌βグルクロニダーゼは、しばしば使用されるレポータータンパクである。
【００６８】
（発明の詳細な説明）
色素体は自身の遺伝機構を持っている
一般的に認められた知識によると、2種類の細胞小器官、すなわち色素体及びミトコンドリアは、別々の内部共生現象により今日の真核細胞の先祖中に取込まれ、最初は独立していた原核生物から誘導された（Gray，1991）。その結果として、これらの小器官は、自身のDNA、メッセンジャーRNAの形でのDNA転写物、リボソーム、及び遺伝情報を解読するのに必要なtRNAの少なくとも一部を含んでいる（Marechal-Drouard et al., 1991）。
【００６９】
原核的生命を維持するのに必要な要素をすべて包含しているために、共生取り込みの直後は、これらの小器官は遺伝的に自律していたが、進化の過程において遺伝情報を細胞の核へ移転することによりその自立性は減少した。しかし、その遺伝情報は非常に複雑であり、その細胞小器官を遺伝子操作技術の魅力的な対象にする。特に色素体がこれに相当し、この小器官は植物細胞内における主要な機能である光合成に必要なタンパクの約50％をコードしている。また色素体は自身のリボソームRNA、自身のtRNAの大部分及びリボソームタンパクもコードしている。全部で、色素体ゲノム中の遺伝子の数は120程度である（Palmer, 1991）。しかし、色素体中に認められるタンパクの大部分は、核/サイトゾル遺伝区画から導入されている。
【００７０】
色素体を遺伝的に形質転換することができる
一般的な分子クローニング技術の発展に伴って、形質転換により高等植物を遺伝的に修飾することが可能になった。細胞核中に見出される多くの遺伝子について（シロイヌナズナの場合に約26,000）、その完全配列が最近公表されたことから（シロイヌナズナInitiative, 2000）、植物の形質転換において特に強調すべきことは、核形質転換であったし、依然そうである。核形質転換は、容易に行なうことができる。何故ならAgrobacterium tumefaciensのような生物学的ベクターを入手でき、核形質転換を効率良くできるように修飾することが可能であるからである（Gelvin, 1998）。さらに、核には外来核酸が直接侵入し易いが、一方小器官は、一般的に言って、DNAのような大分子に対して透過性がない二重のエンベロープ膜に包まれている。
【００７１】
導入遺伝子の非常に高い発現レベルを潜在的に持っているこの小器官の莫大な遺伝子量‐細胞当たり色素体ゲノムの10000を超えるコピーが存在し得る‐を使用することができるので、色素体形質転換が可能になることは非常に望まれている。さらに、色素体がコードする形質は花粉伝達性でないので、色素体形質転換は魅力的である。そのため、導入遺伝子が野生同類植物へ不慮に漏出する潜在的リスクを著しく減少する。色素体形質転換のその他の潜在的利点は、多シストロン単位として多数の遺伝子を同時に発現する可能性及び核形質転換の後に生じ得る位置効果及び遺伝子沈黙の除去である。
【００７２】
色素体の形質転換方法は、最初は単細胞緑藻（Boynton et al., 1988）に対して、次いで高等植物に対しても開発された。現在では、二つの異なる方法を使用することができる、すなわち、組織に対する微粒子発射法、特に葉の組織（Svab et al., 1990）、及び適当な形質転換ベクターの存在下にプロトプラストをポリエチレングリコール（PEG）で処理する方法（Koop et al., 1993）。両方法ともに二重のエンベロープ膜を通して小器官のストロマ中へプラスミドDNAを輸送する。
【００７３】
色素体形質転換ベクターは共通の構造を有している
小器官中にDNAを導入する方法を開発するに際して、色素体形質転換を完成させるために遭遇するさらに二つの条件がある。すなわち、遺伝子発現の調節及び相同組換えによる新規配列または修飾配列の位置指定組み込みを可能にする色素体配列要素の使用である。相同組換えは標的挿入部位の上流及び下流の色素体ゲノム配列に由来する隣接配列が形質転換ベクター中に存在することを必要とする（Zoubenko et al., 1994）。これらの条件の結果として、高等植物色素体のゲノム中に外来遺伝子を導入するために使用する色素体形質転換ベクターは、以下の配列を共有する：
（1）5'隣接配列、
（2）プロモーター配列、
（3）5'非翻訳領域、
（4）コード領域（これはタンパク遺伝子または非タンパク遺伝子（例えばRNA遺伝子）の完全配列をコードする。）、
（5）3'非翻訳領域、
（6）3'隣接配列。
加えて、（7）色素体複製始点が必要であることが示された（US5693507）。
【００７４】
相同性の余分な延長は遺伝的不安定性を生じる
上記配列の（1）から（3）、及び（5）から（7）は、色素体由来であり、色素体中で非常に有効であることが知られている、相同組換えの基質として色素体において潜在的に寄与することが予想されている（Kavanagh et al., 1999）。組み込みに必要なこれらの配列に追加した相同配列は、遺伝的不安定を生じ、形質転換された色素体ゲノム及び形質転換されていない色素体ゲノムが同じ小器官内に共存する場合には、特に遺伝的不安定を生じるであろう（Eibl et al., 1999）。
【００７５】
本発明の新規ベクターは余分な相同配列を回避する
本発明は二つの重要な特徴を持つ点で特徴付けられる。即ち、（1）完全な発現カセットでなく遺伝子断片を含む関与配列または関与遺伝子を包含する新規色素体形質転換ベクターが開示され、（2）多数の新規選別方法が記述されている、点である。
【００７６】
この新規ベクターは、従来の色素体形質転換ベクターよりも少ない配列要素から成り立っている。別の態様において、プロモーター、5'非翻訳領域、完全コード領域、及び3'非翻訳領域の配列要素の少なくとも一つは、完全にまたは部分的に消失している。新規ベクターは、選別を可能にする遺伝子をコード領域と分離する相同隣接配列を必要としない。言い換えると、標的配列として使用された相同隣接配列は少なくとも部分的に上記要素の一の配列と重複してもよい。形質転換ベクターに上記要素の一つだけが含まれる実施の形態も提供される。このように、一例として、コード領域の一部のみの相同組換え置換により選別試薬に対する耐性を賦与することができる。同様に、プロモーター、翻訳開始シグナルまたはUTRのような一つの調節配列要素の置換、削除または修飾により遺伝子発現パターンを変えることができる。
【００７７】
結果として、少ない相同配列を使用することにより、本発明は、安定な色素体修飾、特に安定した細胞系及び植物において機能的に受け継がれ、組み込まれることができるような、導入遺伝子配列の安定した挿入を可能にする。
【００７８】
色素体ゲノム構造体は、遺伝子断片の使用を可能にする
これらの方法の実現は、色素体ゲノム及びその発現の少なくとも3つの特徴に基づいている。
（1）相同組換えは、非常に効率が良く（Kavanagh et al., 1999）、非常に限定された長さの相同隣接配列のみを必要とする（Staub & Maliga, 1994）。したがって、完全な発現カセットで構成されない隣接配列を使用することができる。
（2）色素体遺伝子の大部分は、1より多いシストロンを含むオペロン中で配置されている（Shinozaki et al., 1986）。したがって、追加のシストロンを既存オペロン中に導入することができる。
（3）「読み過ごし」転写は、色素体遺伝子では良く見られる（Stern ＆ Gruissem, 1987）。したがって、追加のシストロンを既存オペロンの後に導入することができる。
【００７９】
本発明のベクターは作製及び遺伝的安定性を改善することが容易である
遺伝子断片を使用することは、多数の配列要素を含む完全発現カセットを使用するよりベクター構築作業は簡素化される。あらゆる配列要素は、クローン化され、原則として、適当な制限部位を別々に供給される必要がある。そのような方法は多数のクローニングステップを必要とするので時間を要する。遺伝子断片ベクターは、色素体ゲノム中に既に存在する配列が新規配列の発現を行なうために使用されるので、かなり短時間で作製することができる。
【００８０】
さらに重要なのは、遺伝子断片ベクターは、従来の色素体形質転換ベクターよりも少ない相同性の領域を含んでいるので、遺伝的安定性が改善される。配列の望ましくない消失（Eibl et al., 1999）が回避される。
【００８１】
本発明のベクターは新規選別方法を提供する
aadA遺伝子は、日常的に使用される唯一の選別マーカー遺伝子であり（Heifetz, 2000）、カナマイシン耐性を賦与するnptII遺伝子は、高等植物色素体形質転換において作用することが示されている唯一の選択肢である（Carrer et al., 1993）。aadA遺伝子もnptII遺伝子も普遍的に使用することはできないので、色素体ゲノムにおける形質転換が行われた高等植物の数は、まだ非常に少ない（Heifetz, 2000）。高等植物における色素体形質転換は、現在のところその完全な能力を利用することができない。1を超える所望の配列を続けてまたは同時に導入するような方法は、より多くの選別マーカー遺伝子を必要とする。本発明のベクターは、選別マーカー遺伝子の不足を克服する。ここで、色素体形質転換のための新規な選別阻害剤は、リンコマイシン、テントキシン、アトラジン、メトリブジン、及びディウロンである。ここに列記した阻害剤の中で後者の4剤は、抗菌性の抗生物質でないことは注目に値する。ヒトあるいは動物の病気の治療にとって医療上重要な抗菌性の抗生物質を使用することは、批判的な公の論議の対象であり、植物遺伝子技術の社会的支持に障害を生じる（Daniell, 1999）。
【００８２】
本発明のベクターは、種々のマーカーの間で交換して選択マーカーを再使用する新しい方法を提供する
本発明による色素体形質転換のための遺伝子断片のその他の応用は、それぞれの耐性を賦与する点変異が同じ遺伝子内に配置される二つの選択阻害剤間で交換できることである。この変異は一つの遺伝子内の二つの異なる位置に配置することもできるし、同じ位置に配置することもできる。一例として、第一形質転換に使用するベクターは、点変異を一つだけ含む遺伝子断片を含むことができる。第二形質転換に使用するベクターは、両点変異の位置を含むことができるが、第二変異のみを含み、その一方で第一耐性の位置に関しては野生型とすることができる。この第二ベクターによる形質転換により第一変異は除去され、その一方、第二変異が、同時に導入される。その後形質転換において、第二変異は、同様に除去され再び第一変異が導入される。この方法により植物中に複数の耐性を蓄積すること無く一つの色素体ゲノムの複数回連続形質転換を可能にする。即ち、一つの耐性のみが各ステップ毎に存在することになる。この方法は、少なくとも二つの阻害剤に対する耐性を賦与することが認められている遺伝子であればいずれにも適用することができる。ここに記述されている例には、rrn16遺伝子（スペクチノマイシン及びストレプトマイシン）、及びpsbA遺伝子（アトラジン及びメトリブジン）が含まれる。
【００８３】
本発明のベクターは、選別マーカー及び関与配列を独立した遺伝子座に導入することを可能にする
修飾されている色素体遺伝子の点変異体または変異体が、他の状態で色素体形質転換の選別マーカーとして使用された場合には、色素体ゲノム中の選別マーカーの位置は固定される。従来の形質転換は、同じ組換え反応を利用するので、選別マーカーと同じ遺伝子座に関与配列をさらに挿入する。実施の形態3及び4の方法は（発明の要約を参照）、マーカー遺伝子及び関与配列の２つの主用部位が物理的に分離されている形質転換ベクターを使用することにより、これらマーカー遺伝子及び関与配列の挿入位置を分離することを可能にする。選別マーカー及び関与遺伝子の分離の原理は、二つの独立したプラスミドによる共形質転換により示されており（Carrer and Maliga, 1995）、二つの異なるプラスミド上のaadA選別マーカー遺伝子及びGFP遺伝子を使用したわれわれ自身の実験により確認されている。この二つの遺伝子の共形質転換の効率は30％を超えた
2004520032.tif 000003
【００８４】
二つの独立した相同組換え反応を、単一のベクター中で組合せているので、我々の方法は新規である。これにより高い効率が達成され、わずか一つのベクター分子を色素体に取込むことにより両配列の存在が保証される。
【００８５】
記述した方法は、異なる組込み部位を使用できるので、例えば、選別マーカー及び/または関与遺伝子といった関与配列の発現を別々に調節することができる。さらに、色素体遺伝子の発現を妨害する可能性がある、変異誘発部位のすぐ近くへのマーカー遺伝子の組込みを伴わずに、色素体遺伝子の変異誘起を制御することができる。また、この方法は、選別マーカーの遺伝子座にある関与遺伝子及び異なる遺伝子座にある他の関与遺伝子を同時に挿入するために使用することができる。本出願において記述された選別マーカーは、いずれもこのシステムに使用することができる。
【００８６】
二つの異なる選別試薬の交換と組合わせて（上記参照）、関与する多数の追加配列を、形質転換植物に存在する唯一の選別マーカーを持つ色素体ゲノムのいずれの遺伝子座にも挿入することができる。
【００８７】
本発明の方法は、この変化により、追加のシストロンを創ること無く既存シストロンを変化させることができる
本発明において意図される更に他の方法としては、既存シストロンについて目的の修飾を行なうために遺伝子断片の使用を可能にする方法、すなわち、追加のシストロンを創らない方法である。そのような色素体DNAの形質転換介在修飾により、既存遺伝子及び関与遺伝子の転写可能部分を含むハイブリッドメッセンジャーRNA（mRNA）、または関与遺伝子のmRNAを発現するために既存遺伝子の転写シグナルを使用し、更に既存遺伝子の転写された部分を廃棄するmRNAを、転写により生産する組換え体を創出することが、当業者にとって可能になる。そのmRNAは翻訳され、当該mRNAの全部または部分の翻訳により機能的ポリペプチドを生産することができる。ここで、異なる可能性が考慮される。もし、そのハイブリッドmRNAが、それ自体は翻訳されない色素体遺伝子（例えば、リボソームRNA遺伝子）を含んでいる時には、ハイブリッドRNAは、依然翻訳されることができ、翻訳可能な配列をコードするキメラの部分からタンパク生産物を生じる。そのハイブリッドRNAの非翻訳部分も未だ機能を保持している。他方、もし、組換えに関与する既存遺伝子が翻訳可能であるならば、ハイブリッドRNAの翻訳により融合タンパクを生じるであろう。融合タンパクの機能により、そのような修飾した形態において既存遺伝子の機能が示されると共に、関与遺伝子断片にコードされた新規に追加された機能を提供することができるであろう。もし、融合生成物が色素体遺伝子の機能に負の影響を与えるなら、その機能が重要でない既存遺伝子（例えば、sprA）を標的にする方法を設計することが考えられる。その他には、融合タンパクを、融合タンパクの二つの部分の間に切断可能な配列を含むように操作して、タンパク翻訳の後に融合タンパクの二つの成分を切り離すことができるタンパク分解酵素またはその他の因子で切断可能部位を処理することができる。
【００８８】
ここに提供したような融合タンパクの方法の例の中に以下の例がある。
レポーター遺伝子のコード部分をycf9遺伝子と融合して大きなキメラペプチドを作製する。選別は、点変異（Spec/Strep）を持つ遺伝子断片で共形質転換することにより行なうことができる。この単純な変法により、融合タンパクは関与遺伝子断片のコード部分を発現することにより新しい特性を創出する。他方、ycf9遺伝子によりコードされたタンパクの機能は必要でない。その方法のより洗練された変法は以下の特別な態様によって示される。
修飾されたインテインが高度に発現したpsbA遺伝子またはその他の適当な遺伝子中に導入される。インテインのエンドヌクレアーゼ部分を除去し、aadA選別マーカーと交換することができる。インテイン介在スプライシングによりAADA-タンパクが放出されることになる。
【００８９】
我々の発明におけるこの実施の形態は、多数の潜在的用途を有している。追加の転写単位または翻訳単位に代え、転写融合を創出するように設計された方法の最も明瞭な利点の一つは、生じる色素体染色体が、追加の調節配列及び相同性配列の追加の延長配列を持たないことである。そのため、そのような色素体ゲノムの安定性及び機能性は、操作の結果として、影響をほとんど受けない。また、一つには、二つまたは多数の目的のために、強力なプロモータ及び染色体の転写活性部分のいずれも使用できることである。更に、一つには、その機能が必須でない。または核の制御化で作動させることができる色素体の遺伝子を置換することができることである。その天然の染色体環境において、特別な発現プロフィールをもつ転写配列を使用することにより、関与遺伝子の発現を生物の特別な生理的または発育条件、例えば、光と関連させ、それにより調節された発現を可能にする。
【００９０】
関与する機能遺伝子を作製するために、複数ステップにおいて2以上の遺伝子断片を使用する方法
本発明において意図される更に他の方法としては、関与遺伝子の2以上の断片を使用することができる方法であり、その断片は、分離されている時は機能しないが、2以上の独立したDNA組込みステップを伴うプロセスにおいて、機能的遺伝子に復元される。そのようなプロセスは、少なくとも二つの別々の組込み操作が必要であり、最終的に、精密に組み立てられた転写機能単及び翻訳機能単位を生じるが、それが機能するためには、既存色素体DNAの一部を必要とすることもあるし、必要としないこともある。
【００９１】
上記発明を代表する実験において、マーカー遺伝子（aphA-6）の断片は、例えば、Spec点変異との共形質転換を使用して第一形質転換ステップにおいて挿入される。第二形質転換ステップにおいて、レポーター遺伝子が挿入され、そして機能的aphA-6は完全な機能状態に復元される。第二ステップ選別は、カナマイシン耐性を使用して行なわれ、その結果関与遺伝子の機能性が示される。
【００９２】
複数のステップに基づくそのような遺伝子再構築過程の利点及び有用性は、明白である。ベクターに特定の相同領域を設計する必要があり、そのようなベクターによって、特定の色素体染色体及び特定の挿入部位が考慮されるので、野生型色素体ゲノムの形質転換は、多くの場合、一の形質転換ステップにおいて達成することは困難である、
【００９３】
したがって、改良された色素体形質転換技術は二ステップまたは多ステップ過程であり、野生型染色体を、後に行なう挿入のために改良された「ランディングパッド」を創るように修飾する。
その技術は、
a）より容易であり、適用範囲が広く（すなわち、第二形質転換が一つの標準的ベクターによる）、
b）第一形質転換ステップで導入された望ましくない遺伝子（すなわち、選別マーカー遺伝子）を容易に不活化することが可能であり、
c）正規の組換え体のみが機能的関与遺伝子を生じるように過程をよりよく調節することが可能であり、
d）関与遺伝子の機能は相同組換えによってのみ復元するので、すなわち、この過程は特別な組込み及び復元されるために必須である他の遺伝子断片の存在が必要であるので、核形質転換でのコンタミの問題を排除することが可能である。
【００９４】
本発明の内容は、安定したあるいは不安定に形質転換された色素体を持つ植物細胞及び植物を作るために使用することができる。多種類の植物種の色素体を形質転換することができる。本発明は単子葉植物及び双子葉植物に適用することが可能である。作物植物は特に望ましい。その作物植物の例は、トウモロコシ、コメ、コムギ、エンバク、ライムギ、オオムギ、ダイズ、タバコ、トマト、ジャガイモ、ブドウ、ピーナッツ、サツマイモ、アルファルファ、モロコシ、エンドウ、及びワタである。
【実施例】
【００９５】
本発明を、以下の詳細な例を引用してさらに説明する。これらの例は説明の目的だけに提示されるものであり、これに限定することは意図していない。ここに使用されている標準的組換えDNA及び分子クローニング技術は当業者に熟知されており、またAusubel, 1999, Maniatis et al., 1989, 及びSilhavy et al., 1984により記述されている。
【００９６】
（実施例1）既存転写単位（psbA）に配列を挿入するためのベクターの構築及びそれを用いた色素体形質転換
色素体形質転換ベクターpIC500の構築
1 nmolのリンカー1P, 1 nmolのリンカー2M , 20 nmol dNTP, 50 U クレノーポリメラーゼを、100μlの1x Y+-緩衝液（MBI, Vilnius, Lithuania）中で、34℃ 30分間インキュベートする。ポリメラーゼを70℃ 10分間で不活化し、34℃に冷却し、生じた二本鎖オリゴヌクレオチドを50 U PaeI (MBI) で34℃ 2時間制限切断する。50 U EcoRIを加え、そしてY+-緩衝液濃度を2xに増加し、全体容量を200μlとする。34℃で1時間インキュベーション後、混合物をQiagen（Hilden、ドイツ）のPCR-精製キットを使用して精製し、精製117 bpリンカーE/Pの30μlを得る。1μgのプラスチドpUC19（MBI）を50 U Pael (MBI) で100μlの1x Y+-緩衝液（MBI）中34℃ 2時間制限切断し、そしてさらに200μlの2x Y+-緩衝液中30分間50 U EcoRI（MBI）で処理する。制限プラスミドを5μlのアルカリ性ホスファターゼ（ロッシュ、バーゼル、スイス）で34℃ 30分間処理し、最後にQiagenのPCR-精製キットで精製し、30μlの制限プラスミドpUC-E/P/APを得る。1μlのリンカーE/P及び5μlのプラスミドpUC-E/P/APを0.5μlのT4-リガーゼ（Promega, Madison, WI, USA）で20μlの1x T4-リガーゼ緩衝液（Promega）中4℃終夜リゲーションを行ない、クローニングベクターplC500（図1）を得る。
【００９７】
pIC500のE. coli細胞中への電気的形質転換
電気適合性細胞の調製：1リットルのLB培地（1％(w/v)カゼイン水解物、0.5％(w/v)イースト抽出物、0.5％(w/v)NaCl）にE. coli JM109 (Promega, Madison, WI, USA)の新鮮終夜培養の1：100を接種する。細胞を37℃ 220rpmの振とう下に600 nmで光学密度0.5になるまで増殖する。細胞を氷上で20分間冷却し、15分間（4000rpm、4℃）遠心分離する。上清を除去し、ペレットを1リットルの氷冷滅菌10％（v/v）グリセロールに再懸濁する。細胞を2回上記のように遠心分離し、それぞれ500 ml及び20 mlの氷冷滅菌10％（v/v）グリセロールに再懸濁する。細胞をもう一度遠心分離し、ペレットを2 mlの氷冷滅菌10％（v/v）グリセロールに再懸濁する。この懸濁を80μlに分割して凍結し‐80℃で保存する。
【００９８】
Bio-Rad（Hercules, CA, USA）Micro Pulser電気穿孔装置を使用する電気的形質転換
電気適合細胞を氷上で解凍する。40μlの細胞懸濁を2μlのリゲーション混合物と混合し、予冷した滅菌0.2 cmキュベット（Bio-Rad）に移す。懸濁を揺すって底に落とし、キュベットをチャンバースライドに入れる。チャンバースライドをチャンバーの中に押し込み、そして細胞に2.5 kVのパルスをかける。キュベットをチャンバーから取出し、細胞を1 mlのSOC-培地（2％(w/v) カゼイン水解物、0.5％(w/v)イースト抽出物、10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2及び 20 mMグルコース）に懸濁する。懸濁を37℃ 1時間振とうし、100μlの懸濁を150 mg/lのアンピシリンを含むLBプレートに入れた。
【００９９】
プラスミドpIC500の分析
10形質転換体のプラスミドDNAを標準的方法により単離した。200 ngのプラスミドDNAを5 UのNcoI（MBI）で20μlの1x  Y+-緩衝液（MBI）中34℃1時間消化し、次いで0.8％アガロース-ゲル上で分析した。挿入リンカーを持つプラスミドだけがNcoIで消化された。試験したプラスミドのうち4個がNcoIで消化された。その一つ（pIC5001）についてさらに配列分析を行なった（MWG, Ebersberg, ドイツ）。
【０１００】
N. tabacum DNAの単離
タバコ（Nicotiana tabacum; cv. petite havana）の新鮮葉組織100 mgを、3 mmタングステンカーバイドビーズ一個をいれた1.5 mlマイクロ遠心試験管中ミキサーミルMM300（Retsch）を使用して200μl AP1緩衝液（DNeasy plant  mini kit, QIAGEN）/1μl試薬DX（泡抑制、QIAGEN）中で粉砕した（25Hzで2x1分）。次いでDNAはDNeasy plant mini kitを使用して精製した。
【０１０１】
プラスミドplC519（aadA-HisTag+3'-UTRrpl32）の構築
E. coli aadA-配列を標準的PCR条件下に、1 U Pfu-ポリメラーゼ（Promega）、0.1μMプライマーoSH4 (TGAATTCCCATGGCTCGTGAAGCGG)、0.1μMプライマーoSH5 (TATGGATCCTTGCCAACTACCTTAGTGATCTC)及鋳型として30 ng pFaadA II (Koop et al., 1996)を使用して増幅する。PCR混合物を95℃ 5分間変性し、次いで30サイクルの95℃ 30秒、55℃ 45秒、及び72℃ 3分を行う。合成は最後に72℃ 7分間のインキュベーションで完了する。混合物はQiagenのPCR精製キットで精製し、そして30 U NcoI及び30 U BamHIで全量100μlの2x  Y+-緩衝液（MBI）中で37℃ 2時間消化して、aadA-N/Bを得る。1μgのプラスミドpIC500（E. coli JM110株から単離）を30 U NcoI及び 30 U BcIIで全量100μlの2x  Y+-緩衝液（MBI）中で37℃ 2時間消化する。消化したプラスミドをQiagenのPCR精製キットで精製し、T4-リガーゼ（Promega）を使用して精製PCR-産物aadA-N/Bと連結する。2μlのリゲーション混合物を電気適合性E. coli細胞に導入してプラスミドplC506を得る。N. tabacum rpl32 3'-UTRを標準的PCR条件下に1 U Pfu-ポリメラーゼ（Promega）、0.1μMプライマーoSH32 (ACAAGAGCTCATAAGTAATAAAACGTTCGAATAATT)、0.1μMプライマーoSH33 (AATTCCTCGAGTAGGTCGATGGGGAAAATG)及び鋳型として30 ng N. tabacum DNAを使用して増幅する。PCR混合物を95℃ 5分間変性し、次いで30サイクルの95℃ 30秒、50℃ 30秒、及び72℃ 1分を行う。合成は最後に72℃ 7分間のインキュベーションで完了する。混合物はQiagenのPCR精製キットで精製し、そして30 U SacI及び30 U XhoIで全量100μlの1x  Y+-緩衝液（MBI）中で37℃ 2時間消化して、TrpI32-S/Xを得る。1μgのプラスミドpIC506を30 U SacI及び 30 U XhoIで全量100μlの1x  Y+-緩衝液（MBI）中で37℃ 2時間消化する。消化したプラスミドをQiagenのPCR精製キットで精製し、T4-リガーゼ（Promega）を使用して精製PCR-産物TrpI32-S/Xと連結する。2μlのリゲーション混合物を電気適合性E. coli細胞に導入してプラスミドpIC519を得る。
【０１０２】
プラスミドpIC569（隣接領域psbA-3'）の構築
N. tabacum  psbA-3'-領域の左隣接領域を標準的PCR条件下に1 U Pfu-ポリメラーゼ(Promega)、0.1 μMプライマーoSH84 (tatagggcccagctataggtttacatttttaccc)、0.1μMプライマーoSH85 (catgctgcagcaagaaaataacctctccttc)及び鋳型として30 ng N. tabacum DNAを使用して増幅する。PCR混合物を95℃ 5分間変性し、次いで35サイクルの95℃ 30秒、50℃ 45秒、及び72℃ 3分を行う。合成は最後に72℃ 7分間のインキュベーションで完了する。N. tabacum  psbA-3'-領域の右隣接領域を標準的PCR条件下に1 U Pfu-ポリメラーゼ(Promega)、0.1 μMプライマーoSH86 (tttcctgcagttattcatgattgagtattc)、0.1μMプライマーoSH87 (ccagaaagaagtatgctttgg)及び鋳型として30 ng N. tabacum DNAを使用して増幅する。PCR混合物を95℃ 5分間変性し、次いで35サイクルの95℃ 30秒、50℃ 45秒、及び72℃ 3分を行う。合成は最後に72℃ 7分間のインキュベーションで完了する。混合物はQiagenのPCR精製キットで精製し、それぞれ50μl LFpsbA及び50μl RFpsbAを得る。LFpsbAを40 U PstI及び40 U Bsp120Iで全量100μlの1x  Y+-緩衝液（MBI）中で37℃ 2.5時間消化する。RFpsbAを40 U PstI及び40 U HindIIIで全量100μlの1x  R+-緩衝液（MBI）中で37℃ 2.5時間消化する。消化したLFpsbA及びRFpsbAをQiagenのPCR精製キットで精製し30μlのLFpsbA-P/B及び30μlのRFpsbA-P/Hをそれぞれ得る。10μgのプラスミドpIC500を100 U HindIII及び100 U Bsp120Iおよび100 U XbaIで全量300μlの1x  Y+-緩衝液（MBI）中で37℃ 3時間消化する。5μlアルカリ性ホスファターゼ（MBI）を加えて、37℃ 30分間インキュベートする。消化したプラスミドを0.8％アガロースゲル上で精製する。2640 bpのベクター断片を切り出し、Qiagenゲル精製キットで精製して、50μl  pIC500-B/H/APを得る。76 fmol pIC500-B/H/AP、190 fmol LFpsbA-P/B及び170 fmol RFpsbA-P/Hを0.5 U T4-リガーゼ（Promega）で10μl  T4-リガーゼ緩衝液（Promega）中4℃終夜リゲーションを行なう。2μlのリゲーション混合物を電気適合性E. coli細胞中に導入する（上記参照）。望む挿入を含むプラスミドを持つ形質転換体は制限分析により同定される。得られたベクターpIC569の構造を図2に示す。
【０１０３】
色素体形質転換ベクターpIC567の構築
1μgのプラスミドpIC500を30 U KpnIで全量の1x  KpnI緩衝液（MBI）中37℃3時間消化する。消化したプラスミドをQiagenのPCR精製キットで精製し、プラスミドを50μM dNTPを含む1x  クレノー緩衝液（MBI）中37℃ 20分間1 Uクレノーポリメラーゼで処理してKpnI制限部位を除去する。生じた分子をQiagenのPCR精製キットで精製し、10μl T4リガーゼ緩衝液（Promega）中4℃終夜0.5 U T4リガーゼ（Promega）で再度連結する。2μlのリゲーション混合物を電気適合性E. coli細胞に導入する。望む修飾をしたプラスミドを含む形質転換体を制限分析により同定する。
【０１０４】
プラスミドpIC574（SpsaA/B＋uidA+SRBS+aadA+TrpI32）の構築
このベクターに使用される用語及び以下に記述される構築
S              スペーサー配列
SpsaA/B        psaA及びpsaBの間の25 bp非コード配列
SpsbD/C        プロセッシング部位を含むpsbCの50 bpコード配列
Srps19/rpI22    rps19及びrpI22の間の60 bp非コード配列
RBS            翻訳開始配列として作用する18 bp合成配列
T              3'UTR（ターミネーター）
TrpI32         rpI32コード領域下流の293 bp断片
【０１０５】
E. coli aadA配列及び N. tabacum rpI32-3'-UTRを標準的PCR条件下に1 U Pfuポリメラーゼ (Promega)、 0.1μMプライマーoSH88 (ggatccatgcgtgaagcggttatcgccg)、0.1μMプライマー oSH33 (aattcctcgagtaggtcgatggggaaaatg)及び鋳型として 30 ng pIC519を使用して増幅する。PCR混合物を95℃ 5分間変性し、次いで95℃ 30秒、55℃ 45秒、72℃ 3分を30サイクル行なう。合成は最後の72℃ 7分間のインキュベーションで完了する。
E. coli uidA配列を標準的PCR条件下に1 U Pfuポリメラーゼ (Promega)、 0.1μMプライマーoSH98 (ctgggtaccttattgtttgcctccctgctgcg)、0.1μMプライマーoSH74 (catgccatggtccgtcctgtagaa)及び鋳型として 30 ng pRAJ275 (Mike Bevan, 遺伝子バンク登録番号U02456.1)を使用して増幅する。PCR混合物を95℃ 5分間変性し、次いで95℃ 30秒、50℃ 45秒、72℃ 3分を30サイクル行なう。合成は最後の72℃ 7分間のインキュベーションで完了する。PCR産物をQiagenのPCR精製キットで精製し、50μl aadA+TrpI32及び50μl uidAをそれぞれ得る。6 pmol aadA+TrpI32及び50 pmol oSH97 (ggggtaccagttgtagggagggatccatgcgtgaagc)を0.2 mM dNTP含有1x-Taq緩衝液（MBI）中1 U Taqポリメラーゼと72℃ 20分間インキュベートする。生成した断片は5'-RBS領域を含んでおり、QiagenのPCR精製キットで精製し、50μlのRBS+aadA+TrpI32を得る。これを全量100μlの1x  Y+-緩衝液（MBI）中30 U KpnI及び30 U XhoIで37℃ 3時間消化し、次いでQiagenのPCR精製キットで精製し、50μlのRBS+aadA+TrpI32-K/Xを得る。PCR生成物uidAを全量100μlの1x  Y+-緩衝液（MBI）中30 U KpnI及び30 U NcoIで37℃ 3時間消化し、次いでQiagenのPCR精製キットで精製し、50μlのuidA-N/Kを得る。10μgのプラスミドpIC567を全量300μlの1x  Y+-緩衝液（MBI）中100 U PstI及び100 U XbaIで37℃ 3時間消化する。消化したプラスミドを0.8％アガロースゲル上で精製する。2690 bpのベクター断片を切り出し、Qiagenゲル精製キットで精製し、50μl pIC567-P/Xを得る。0.6 pmol pIC567-P/X及び300 pmolの合成オリゴヌクレオチドSpsaA/B（ctataccatggtgcttttcaaatcctcctagcctgca）を50μl  T4-リガーゼ緩衝液（Promega）中4℃終夜3U T4リガーゼとインキュベートする。混合物をQiagenのPCR精製キットで精製し、次いで0.2 mM dNTP含有1x-Taq-緩衝液（MBI）中1 U Taqポリメラーゼで72℃ 10分間処理して第二鎖を補充する。生成したプラスミドをQiagenのPCR精製キットで精製し、全量100μlの1x  Y+-緩衝液（MBI）中30 U NcoI及び30 U XhoIで37℃ 2時間消化し、次いでQiagenのPCR精製キットで精製し、50μl  pIC567-N/Xを得る。25 fmol pIC567-N/X, 25 fmol uidA-N/K及び 25 fmol RBS+aadA+TrpI32-K/Xを10μl  T4-リガーゼ緩衝液（Promega）中0.5 U T4リガーゼ（Promega）で4℃終夜連結する。2μlのリゲーション混合物を電気適合性E. coli細胞に導入する。望む挿入を含むプラスミドを持つ形質転換体を制限分析により同定する。生成したベクターplC574の構造を図3に示す。
【０１０６】
プラスミドpIC579（SpsbD/C＋uidA+SRBS+aadA+TrpI32）及びpIC576（Srps19/rpI22+uidA+SRBS+aadA+TrpI32）の構築
プラスミドpIC579（図4）の構築は、psaA/Bスペーサーの代わりにプロセッシング部位を含んでいる71 bpのpsbD/C領域（ctataccatggggtagaacctcctcagggaatataaggttttgatgaggctgatcttgagccgccactgca）を使用する以外は、pIC574について記述したのと同様に行なった。したがって、pIC576（図5）はrps19/rpI22遺伝子間領域の非コード領域の60 bp断片（ctataccatggtttgcctcctactactgaatcataagcatgtagattttttttatctgca）を使用して構築した。
【０１０７】
pIC584, pIC583,及びpIC582（オペロン＋隣接領域）の構築
5μg  pIC574を全量100μlの1x  Y+-緩衝液（MBI）中30 U PstI及び30 U Mph1103Iで37℃ 2時間消化する。消化したpIC574を0.8％アガロースゲル上で精製する。SpsaA/B＋uidA+RBS+aadA+TrpI32を含む断片を切り出し、Qiagenゲル抽出キットで精製し、30μl SpsaA/B＋uidA+RBS+aadA+TrpI32-P/Mを得る。1μg  pIC569を全量100μlの1x  O+-緩衝液（MBI）中30 U PstIで37℃ 2時間消化する。pIC569の制限混合物に1μlのアルカリ性ホスファターゼを加えて30分間インキュベートする。消化したpIC569をQiagenのPCR精製キットで精製し、30μlのpIC569-P/APを得る。75 fmol pIC569-P/AP及び100 fmol SpsaAB+uidA+RBS+aadA+TrpI32-P/Mを10μl  T4-リガーゼ緩衝液（Promega）中0.5 U T4-リガーゼ（Promega）で4℃終夜連結する。2μlのリゲーション混合物を電気適合性E. coli細胞に導入する。望む挿入を含むプラスミドを持つ形質転換体を制限分析により同定する。生成したベクターpIC584の構造を図6に示す。
【０１０８】
pIC583（図7）及びpIC582（図8）の構築は（pIC583に対して）pIC579及び（pIC582に対して）pIC576のPstI及びMph 103I消化DNSを使用して同様に行なった。
【０１０９】
Biolistic particle輸送システムによるN. tabacum色素体の形質転換
タバコ種子（Nicotiana tabacum cv. petite havana）を表面滅菌し（70％エタノール1分間、5％ Dimanin C, Bayer, Leverkusen, ドイツ、10分間）、3回滅菌水で10分間洗い、B5培地（下記参照）上においた。植物を25℃ 16時間照明/8時間暗期サイクル（0.5-1 W/m2, Osram L85W/25 Universal-White fluorescent lamps）の条件で育成した。
【０１１０】
4週間滅菌育成したNicotiana tabacum植物の葉6枚を切り、RMOP-培地（調製は下記参照）に入れた。35μlの金懸濁
2004520032.tif 000004
を滅菌エッペンドルフ試験管（Treff, Fisher Scientific, Ingolstadt, ドイツ）に入れ、遠心分離により集め、1 mlの滅菌水で洗う。金ペレットを230μl滅菌水に再懸濁し、250μlの2.5 M CaCl2及び25μgのDNA（形質転換ベクターpIC584、pIC583及びpIC582をそれぞれ）を加える。混合物を完全に再懸濁した後、50μlの0.1 Mスペルミジンを加え、混合して10分間氷上でインキュベートする。次いで遠心分離（1分間、10000 rpm）により金を集め、600μlエタノール（100％、分析用）で2回洗う。金を遠心分離（1分間、10000 rpm）により集め、最終的に72μlエタノール（100％、分析用）に懸濁する。マクロキャリアーをマクロキャリアーホルダーに挿入し、5.4μlの金懸濁を適用する。発射はBio-Rad（Hercules, CA, 米国）PDS-1000/He Biolistic particle delivery systemで以下のパラメーターを使用して行なった：
-  ラプチャーディスク  900 psi
-  ヘリウム圧  1100 psi
-  減圧  26-27  インチHg
-  マクロキャリアー  トップレベル
-  葉切片  第三レベル
6枚の葉の切片はそれぞれ5.4μl金懸濁の発射を受ける。発射後葉切片
をRMOP培地上で25℃ 2日間インキュベートする。
【０１１１】
発射の2日後葉を小片（約33 mm）に切り、そして500μg/mlスペクチノマイシンを含有する固形RMOP培地に移した。2週間後に、その後は新たな再生が認められなくなるまで3週間毎に葉切片を再び切り、新鮮培地に移した。緑の再生体を取出し、個別のプレートに移した。系統には500μg/mlスペクチノマイシンを含有するRMOP培地上で再生した葉を細切して発芽させるサイクルを繰り返して行なった。選別した再生体の発根は500μg/mlスペクチノマイシンを含有するB5培地上で行なった。
【０１１２】
RMOP（KOHでpH5.8）
NH4NO3           1650  μg/ml
KNO3            1900  μg/ml
CaCl2x2H2O        440  μg/ml
MgSO4x7H2O        370  μg/ml
KH2PO4            170  μg/ml
EDTA-Fe(III)Na    40  μg/ml
KI                0.83  μg/ml
H3BO3              6.2  μg/ml
MnSO4xH2O          22.3  μg/ml
ZnSO4x7H2O         8.6  μg/ml
Na2MoO4x2H2O        0.25  μg/ml
CuSO4x5H2O          0.025  μg/ml
CoCl2x6H2O          0.025  μg/ml
イノシトール       100  μg/ml
塩酸チアミン          1  μg/ml
ベンジルアミノプリン  1  μg/ml
ナフタレン酢酸      0.1  μg/ml
スクロース          30000  μg/ml
精製寒天            8000  μg/ml
【０１１３】
B5（KOHでpH5.7）
KNO3                2500  μg/ml
CaCl2x2H2O           150  μg/ml
MgSO4x7H2O           250  μg/ml
NaH2PO4 xH2O         150  μg/ml
(NH4)2SO4            134  μg/ml
EDTA-Fe(III)Na       40  μg/ml
KI                 0.75  μg/ml
H3BO3                  3  μg/ml
MnSO4xH2O             10  μg/ml
ZnSO4x7H2O             2  μg/ml
Na2MoO4x2H2O         0.25  μg/ml
CuSO4x5H2O          0.025  μg/ml
CoCl2x6H2O          0.025  μg/ml
イノシトール         100  μg/ml
塩酸ピリドキシン       1  μg/ml
塩酸チアミン          10  μg/ml
ニコチン酸             1  μg/ml
スクロース         20000  μg/ml
精製寒天            7000  μg/ml
【０１１４】
サザン分析による色素体形質転換体候補の分子分析
被検植物の総植物DNAの3 mgを適当な制限酵素で消化し、TBE-アガロースゲル（1％）で分離する。DNAを変性し、Ausubel et al., 1999: Short protocols in molecular biology, Wiley, 4th edition, Unit 2.9Aに記述されているように正荷電ナイロン膜（Hybond-N+，Amersham）に移転する。フィルターをDIG Easy Hyb緩衝液（Roche Diagnostics GmbH, マンハイム、ドイツ）中ジゴキシゲニン-標識プローブとハイブリド形成し、ハイブリド形成シグナルをDIG発光検出キット（Roche）を使用して検出する。膜を室温でX-OMAT LSフィルムに露光する。
【０１１５】
野生型と形質転換色素体ゲノムを区別するのに適した断片をQIAquickゲル抽出キット（QIAgen，Hilden，ドイツ）を使用して精製し、Roche DIG DNA標識キットを使用してジゴキシゲニンで標識して、ハイブリッド形成に使用する。
【０１１６】
（実施例2）既存オペロン（atpE）に配列を挿入するためのベクターの構築とそれによる色素体の形質転換
色素体形質転換ベクターpIC500，pIC567及びpIC574の構築は例1に記述してある。
【０１１７】
プラスミドpIC570（隣接領域atpE-オペロン）の構築
N. tabacum atpE-オペロン-3'-領域の左隣接領域を標準的PCR条件下に1 U Pfu-ポリメラーゼ(Promega)、0.1 μMプライマーoSH89 (tatagggcccgaagtatcggccttattgg)、0.1μMプライマーoSH90 (catgctgcagttatgaaatcggattgatagcc)及び鋳型として30 ng N. tabacum DNAを使用して増幅する。PCR混合物を95℃ 5分間変性し、次いで35サイクルの95℃ 30秒、50℃ 45秒、及び72℃ 3分を行う。合成は最後に72℃ 7分間のインキュベーションで完了する。N. tabacum atpE-オペロン-3'-領域の右隣接領域を標準的PCR条件下に1 U Pfu-ポリメラーゼ(Promega)、0.1 μMプライマーoSH91 (catgctgcagttggtacgttcgaataataaaaag)、0.1μMプライマーoSH92 (tatagaagcttgcattgggctctttcattaactg)及び鋳型として30 ng N. tabacum DNAを使用して増幅する。PCR混合物を95℃ 5分間変性し、次いで35サイクルの95℃ 30秒、50℃ 45秒、及び72℃ 3分を行う。合成は最後に72℃ 7分間のインキュベーションで完了する。PCR混合物はQiagenのPCR精製キットで精製し、それぞれ50μl LFatpE及び50μl RFatpEを得る。LFatpEを40 U PstI及び40 U Bsp120Iで全量100μlの1x  Y+-緩衝液（MBI）中で37℃ 2.5時間消化する。RFatpEを40 U PstI及び40 U HindIIIで全量100μlの1x  R+-緩衝液（MBI）中で37℃ 2.5時間消化する。消化したLFatpE及びRFatpEをQiagenのPCR精製キットで精製し30μlのLFatpE-P/B及び30μlのRFatpE-P/Hをそれぞれ得る。10μgのプラスミドpIC500を100 U HindIII及び100 U Bsp120Iおよび100 U XbaIで全量300μlの1x  Y+-緩衝液（MBI）中で37℃ 3時間消化する。5μlアルカリ性ホスファターゼ（MBI）を加えて、37℃ 30分間インキュベートする。消化したプラスミドを0.8％アガロースゲル上で精製する。2640 bpのベクター断片を切り出し、Qiagenゲル精製キットで精製して、50μl  pIC500-B/H/APを得る。76 fmol pIC500-B/H/AP、140 fmol LFatpE-P/B及び140 fmol RFatpE-P/Hを0.5 U T4-リガーゼ（Promega）で10μl  T4-リガーゼ緩衝液（Promega）中4℃終夜リゲーションを行なう。2μlのリゲーション混合物を電気適合性E. coli細胞中に例1に従って導入する。得られたベクターpIC570の構造を図9に示す。
【０１１８】
プラスミドpIC581（オペロン＋隣接領域）の構築
5μgのPIC576を30 U PstI及び30 U Mph1103Iで全量100μlの1x  Y+-緩衝液（MBI）中37℃ 2時間消化する。消化したpIC576 DNAを0.8％アガロースゲル上で分離する。Srps19+uidA+RBS+aadA+TrpI32を含む断片を切り出し、Qiagenゲル抽出キットで精製し、30μl Srps19+uidA+RBS+aadA+TrpI32-P/Mを得る。1μg pIC570を30 U PstIで全量100μlの1x  O+-緩衝液（MBI）中37℃ 2時間消化する。1μlのアルカリ性ホスファターゼをpIC570の制限混合物に加え30分間インキュベートする。消化したpIC570をQiagenのPCR精製キットで精製し、30μlのpIC570-P/APを得る。60 fmol pIC570-P/AP及び60 fmol   Srps19+uidA+RBS+aadA+TrpI32-P/Mを10μl  T4-リガーゼ緩衝液（Promega）中0.5 U T4-リガーゼ（Promega）で4℃終夜連結する。2μlのリゲーション混合物を電気適合性E. coli細胞に導入する。望む挿入を含むプラスミドを含む形質転換体を制限分析により同定する。生成したベクターpIC581の構造を図10に示す。
【０１１９】
色素体形質転換及び形質転換体の分析は例1に記述したのと同様に行なう。
【０１２０】
（実施例３）スペクチノマイシン耐性を賦与する16S  rDNAの断片を使用する色素体形質転換
全てのクローニング方法は標準的なプロトコールを使用して行なった（Ausubel et al., 1999: Short protocols in molecular biology, Wiley, 4th edition）。
【０１２１】
スペクチノマイシン耐性を賦与するタバコ16S  rDNAの断片を作製するために、16S  rDNA（pos. 102796から104274）（登録番号Z00044）の3'-部分を単離タバコ（N. tabacum cv. Petite Havana）DNAからプライマー16S-li (5'-gctggcggcatgcttaacac-3') 及びプライマー16S-re（5'-ccagcatgcattagctctccctg-3'）を使用してPCRで増幅した。プライマー16S-reはSphI制限部位を創るためにrrn16-trnIスペーサー領域に2塩基交換を導入する。PCR反応を100μl容量中Pfuポリメラーゼ（Promega Cooporation, Madison, 米国）によりPromegaによって推奨されているHybaid PCRサイクル95℃/30秒、57℃/30秒、及び72℃/3分35サイクルの条件を使用して行なった。生成した断片の両側をSphIで切断し、クローニングベクターpIC500（例1参照）のSphI-部位に連結した。rrn16配列の3'-末端がKpnI部位の隣りに局在するクローンを選別した。スペクチノマイシン耐性を賦与する点変異（Svab and Maliga, 1991: タバコ色素体ゲノム位置による103898位置のAからC,登録番号Z00044）を導入するために、838 bp AccIII-BsrGI断片を、変異が存在するプラスミドpUC19-Spec（例4参照）の対応断片と置換した。
【０１２２】
相同組換えのための第二隣接として、タバコ色素体DNA配列104273から105269を、プライマーFLR-li（5'-cctctagagggtattttggtttgacactga-3'）及びFRL-re（5'-agctgcagtccaaccaattgggagagaatc-3'; PCR条件は上記と同様）を使用して、単離タバコ（N. tabacum cv. Petite Havana）DNAからPCRで増幅した。生成した断片をXbaI及びPstIで両端を切断し、上記のプラスミドの対応制限部位に連結し、プラスミドpICspecTFを得た。構築を配列分析し、色素体DNAを含む領域の正しい配列であることを確認した。
pICspecTFにレポーター配列を挿入するために、色素体リボソーム結合部位に連結したuidA配列をpIC582（例1参照）からPstI及びKpnIで切り出し、T4  DNAポリメラーゼで処理し、そしてT4  DNAポリメラーゼ処理プラスミドpICspecTFのNotI-部位に連結し、プラスミドpIC588を得た（図11参照）。形質転換後の色素体DNA中の外来配列の挿入部位はrrn16 -オペロン内のrrn16配列の下流である。
【０１２３】
構築pIC588によるタバコの色素体形質転換は例1に記述したのと同様に行なわれる。形質転換色素体を含む再生体の選別は500μg/mlスペクチノマイシン添加RMOP-培地上で行なう。
【０１２４】
（実施例4）二つの異なる部位へ外来配列の組込みを可能にするベクターpIC587による色素体形質転換
全てのクローニング方法は標準的なプロトコールを使用して行なった（Ausubel et al., 1999: Short protocols in molecular biology, Wiley, 4th edition）。
【０１２５】
スペクチノマイシン及びストレプトマイシン耐性を賦与するタバコ16S rDNAの断片を作製するために、16S  rDNA（pos. 103261から104121）（登録番号Z00044）の3'-部分を単離タバコ（N. tabacum cv. Petite Havana）DNAからプライマーrrn16-li (5'-tccggaatgattgggcgtaaa-3') 及びプライマーrrn16-re（5'-ggcggtgtgtacaaggcccg-3'）を使用してPCRで増幅した。 PCR反応を100μl容量中Pfuポリメラーゼ（Promega Cooporation, Madison, 米国）によりPromegaによって推奨されているHybaid PCRサイクル95℃/30秒、57℃/30秒、及び72℃/3分35サイクルの条件を使用して行なった。生成した断片をクローニングベクターpUC19のSmaI部位へ連結した（pUC19-rrn16Frag）。
【０１２６】
スペクチノマイシン耐性（Svab et al., 1990）を賦与する位置103899（タバコ色素体ゲノムの位置による、Z00044）の点変異（CからT）を導入するために、完全プラスミドを5'-リン酸化変異プライマーspec1 (5'-agtaggagtggaaggaggcc-3')及びspec2 (5'-acagttcagtagtacgggga-3'; 延長時間7分以外は上記と同じPCR条件)を使用する逆PCRにより増幅し、精製し、そして連結して、pUC19-Specを得た。
【０１２７】
ストレプトマイシン耐性（Svab et al., 1990）を賦与する位置103620（タバコ色素体ゲノムの位置による、Z00044）の点変異（CからA）を導入するために、完全プラスミドを5'-リン酸化変異プライマーstrep1 (5'-tcaaagtaagaacgcttgca-3')及びstrep2 (5'-ttttccttaactgcccccgg-3'; 延長時間7分以外は上記と同じPCR条件)を使用する逆PCRにより増幅し、精製し、そして連結して、pUC19-Strepを得た。これらの構築を配列分析し、色素体DNAを含む領域の正しい配列であることを確認した。
【０１２８】
両点変異を持つ断片を構築するために、プラスミドpUC19-Strepの460 bp Apal-BsrGI断片をプラスミドpUC19-Specの対応する断片で置換して、プラスミドpUC19-Strep-Specを得た。
【０１２９】
色素体形質転換ベクターpIC586は次のように構築した：プラスミドpIC582のaadAコード配列をSacI及びKpnIで切り出し、プラスミドをT4  DNAポリメラーゼで処理して、連結した。
【０１３０】
スペクチノマイシン及びストレプトマイシン耐性をもたらす両点変異を持つrrn16断片をpIC586へ挿入するために、pUC19-Strep-SpecからAccIII及びBsrGIで断片を切り出し、T4  DNAポリメラーゼで処理し、そしてT4  DNAポリメラーゼで処理したプラスミドpIC586のAatII-部位に連結し、プラスミドpIC587（図12参照）を得た。
【０１３１】
構築pIC587によるタバコの色素体形質転換は例1の記述と同様に行なう。形質転換色素体を含む再生体の選別は500μg/mlスペクチノマイシン含有RMOP培地上で行なう。
【０１３２】
（実施例５）スペクチノマイシン及びストレプトマイシン耐性の反復交換による繰り返し色素体形質転換
形質転換ベクターpUC19-Spec（例4参照）による例1に記述したようなタバコ植物の色素体形質転換はrrn16配列における点変異を持つスペクチノマイシン耐性植物を生じる。得られた色素体ゲノム変換植物を次いでベクターpUC19-Strep（例4参照）で形質転換し、500μg/mlストレプトマイシンで選別する。色素体ゲノムと形質転換ベクターの間の相同組換えによりストレプトマイシン耐性を賦与する点変異が導入されるが、他方スペクチノマイシン耐性を賦与する変異は同時に除去される。スペクチノマイシンに対する感受性を再度導入されたことを試験するために、植物または葉切片をスペクチノマイシンに10日間曝露したところ、葉の脱色を生じたが植物は死なず、その後スペクチノマイシンを含まない培地に戻して育成することができる。2回目の形質転換により生じた色素体ゲノム変換植物は次いでpUC19-Spec及び選別試薬としてスペクチノマイシンを使用して形質転換することができる：相同組換えによりスペクチノマイシン耐性を賦与する点変異の再導入を生じ、他方ストレプトマイシン耐性は除去される。この方法により二つの抗生物質耐性の交互交換による植物の複数回の色素体形質転換を可能にする。関心の追加の配列を同じベクターで導入することができ、あるいは色素体形質転換ベクターと共形質転換により導入することができる。反復色素体形質転換過程の模式図は図13参照。
【０１３３】
（実施例6）リンコマイシン耐性を賦与する23S  rDNAの断片を使用する色素体形質転換
全てのクローニング方法は標準的なプロトコールを使用して行なった（Ausubel et al., 1999: Short protocols in molecular biology, Wiley, 4th edition）。リンコマイシン耐性を賦与するタバコ23S  rDNAの変異種を作製するために、23S  rDNAの3'-部分（位置 107700から109223）（登録番号Z00044）を単離タバコ（N. tabacum cv. Petite Havana）DNAからプライマー105 (5'-AGGCATGCAAACTTCTGTCGCTCCATCC-3') 及びプライマー106（5'-AGGCATGCTAAGATCAGGCCGAAAGGC-3'）を使用してPCRで増幅した。 PCR反応を100μl容量中Pfuポリメラーゼ（Promega Corporation, Madison, 米国）によりPromegaによって推奨されているHybaid PCRサイクル95℃/30秒、55℃/30秒、及び72℃/3分35サイクルの条件を使用して行なった。生成した断片の両端をSphIで切断し、クローニングベクターpIC500のSphI部位へ連結した（例1参照）。23S配列の3'-末端がKpnI-部位の隣りに局在するクローンを選別した。リンコマイシン耐性を賦与する点変異（Cseplo et al., 1988: タバコ色素体ゲノムによる位置108375, 108401及び108402, Z00044）を導入するために、完全プラスミドを5'-リン酸化変異プライマー82 (5'-GTCCATCAGGCGTAAAAGTGTCTGTACAGATAAAG-3')及び104 (5'-GTGGACCTGTCCCTCTGGGATACTTCGAAG-3'; 延長時間7分以外は上記と同じPCR条件)を使用する逆PCRにより増幅し、精製し、そして連結して、プラスミドpIClincを得た。
【０１３４】
相同組換えのための第二隣接として、タバコ色素体DNA配列109139 から110151 を、プライマー107（5'-CCTCTAGATTCCGACTTCCCCAGAGCC-3'）及び108 (5'-ACCTGCAGACAAAAGACCCACACCCAAG-3'; PCR条件は上記と同様、延長時間3分）を使用して、単離タバコ（N. tabacum cv. Petite Havana）DNAからPCRで増幅した。生成した断片をXbaI及びPstIで両端を切断し、プラスミドpIClincの対応制限部位に連結し、プラスミドpIClincTFを得た。構築を配列分析し、色素体DNAを含む領域の正しい配列であることを確認した。
pIClincTFにレポーター配列を挿入するために、色素体リボソーム結合部位に連結したuidAコード配列をプラスミドpIC582（例1参照）からPstI及びKpnIで切り出し、T4  DNAポリメラーゼで処理し、そしてT4  DNAポリメラーゼ処理プラスミドpIClincTFのNotI-部位に連結し、プラスミドpIC591 を得た（図14参照）。形質転換後の色素体DNA中の外来配列の挿入部位はrrn16 -オペロン内のrrn23配列の下流である。
【０１３５】
構築pIC591によるタバコの色素体形質転換は例1に記述したように行なう。形質転換色素体を含む再生体の選別は1から3 mg/mlリンコマイシンを含むRMOP培地上で行なう。
【０１３６】
アトラジン耐性を賦与するpsbA遺伝子の断片を使用する色素体形質転換
全てのクローニング方法は標準的なプロトコールを使用して行なった（Ausubel et al., 1999: Short protocols in molecular biology, Wiley, 4th edition）。
ベクターpIC582（例1参照）を出発ベクターとして使用した。それは右隣接断片中にpsbA遺伝子の部分を含んでいる。アトラジン耐性を生じるpsbAコード領域中の特異的点変異（コドン264の最初の塩基がAGT[セリン]からGGT[グリシン]に変化している、Sato et al., 1988）をPCRにより導入した。一つのプライマーは特異的点変異及びコードするD1タンパクのアミノ酸配列を変えずに新しい制限部位を生ずる二つの他の塩基変化を含むように設計された。プライマーoSK109-pm-atrazine (tactttcaacaactcgcgatcgttacacttcttcc)及びoSH85 (catgctgcagcaagaaaataacctctccttc)を使用して約450 bpの断片を増幅した。得られた断片（アトラジン耐性の点変異及び新しい制限部位、Nrul、を含む）及びプライマーoSH84 (tatagggcccagctataggtttacatttttaccc)を第二のPCRに使用して、変異を含む右隣接配列全体を増幅した。変異のない野生型断片を新しい変異を含むPCR断片で置換した。構築を配列分析し正しい配列及び変異の導入を確認した。
【０１３７】
構築pIC592（図15）によるタバコの色素体形質転換は例1に記述したように行なうことができる。形質転換色素体を含む再生体の選別はスクロース濃度を低下させ（0.3％）そして50-100μMアトラジンを含むRMOP培地上で行なうことができる（Sato et al., 1988）。
【０１３８】
（実施例8）テントキシン耐性を賦与するatpB遺伝子の断片を使用する色素体形質転換
全てのクローニング方法は標準的なプロトコールを使用して行なった（Ausubel et al., 1999: Short protocols in molecular biology, Wiley, 4th edition）。
【０１３９】
テントキシン耐性を賦与するタバコatpBコード配列の断片を作製するために、最初にatpBの1部分（左隣接領域、開始コドンから約1 kb）並びに右隣接領域（atpB 5' 領域の約1 kbを含む）をPCRにより増幅する。左隣接プライマーのPCR増幅には、oSK...-fatpB3'hs (gggaattccatatgagaatcaatcctactacttct)及びoSK...-ratpB3'hs (aaaactgcagaatcgtctgcgggtacataaac)を使用し、断片末端に二つの新しい制限部位（NdeI及びPstI）を作製する。右隣接プライマーのPCR増幅には、oSK...-fatpB5'hs (agtcgagctcatgtaccagtagaagattcg)及びoSK...-ratpB5'hs (cgggatccaataataaaataaataaatatgtcgaaa)を使用し、末端に同様に二つの新しい制限部位（SacI及びBamHI）を作製する。
【０１４０】
最初のクローニングステップはNdeI/PstI消化左隣接のpUC19への連結である。特異的点変異（コドン83の第三塩基をGAC[アスパラギン]からGAG[グルタミン]へ変更する；Avni et al., 1992; Hu et al., 1997）を、プライマーoSK...-fatpB3'hs, oSK...-ratpB3'hs及びoSK...-pm-tentoxinを使用するPCRによりこの断片に導入する; プライマーoSK...-pm-tentoxin (ctctgtagcgctcatagctaca)はテントキシン耐性を生じる特異的塩基交換及び新しい制限部位（Eco47III）を含んでいる。Eco47III部位を作るための変異はatpB遺伝子産物のアミノ酸配列を変えない。最初の増幅ステップにおいて、約250 bpの断片がプライマーoSK...-fatpB3'hs及び oSK...-pm-tentoxinを使用して増幅される。この断片及びプライマーoSK...-ratpB3'hsを第二PCRのプライマーとして使用して、全ての変異を含む左隣接配列を増幅する。
3断片（右隣接、変異左隣接、及び関心の配列）の全てを対応する酵素で消化し、一ステップでベクターpUC19に連結し、色素体形質転換ベクターpIC593（図16）を得る。配列分析によりPCR増幅及び変異隣接の正しい配列を確認する。
【０１４１】
重要なステップは、atpBコード領域の翻訳開始のためのRBSが必要なので、関心の配列（例えば、aadA, 図16）の下流に人工リボソーム結合部位（RBS，ベクター「pUC16S aadA Sma vollst」, Koop et al., 1996）を連結することである。このクローニングステップの後関心の配列及びRBSを一断片として切り出し、そしてpUC19中にクローニングすることができる。このクローニング過程はaadAコード配列を「pUC16S aadA Sma vollst」ベクター中のRBSの上流にクローニングすることにより行われる。次いでaadA配列及びRBS両者を含む断片をこのベクターから切り出し、右/左隣接と共にpUC19中に上記と同様にクローニングする。
【０１４２】
構築pIC593（図16）による色素体形質転換は例1に記述したように行なうことができる。標的植物としてテントキシンに感受性のNicotiana plumbaginifoliaを使用することができる（これに対してNicotiana tabacumは元来テントキシン耐性である）。形質転換色素体を含む再生体の選別は低濃度スクロース
2004520032.tif 000005
及び約10-20μg/mlテントキシン（Avni and Edelman, 1991）を含有するRMOP培地上で行なうことができる。
【０１４３】
（実施例9）メトリブジン耐性を賦与するpsbA遺伝子の断片を使用する色素体形質転換
全てのクローニング方法は標準的なプロトコールを使用して行なった（Ausubel et al., 1999: Short protocols in molecular biology, Wiley, 4th edition）。
【０１４４】
どのようにpsbAコード配列における特異的点変異が色素体形質転換の選別マーカーとして使用し得るかが、例1及び7に詳細に記述されている。psbAコード配列における多数の点変異が文献（Hock and Elstner, 1995,を総説として参照）に記述されているように色素体形質転換の選別マーカーとして使用することができる。その他の例は選別試薬としてメトリブジンを使用することである。Schwenger-Erger et al.,1993及びSchwenger-Erger et al.,1999に記述されているように、psbAコード配列におけるいくつかの点変異（位置219及び272の間のアミノ酸配列における2または3の変化；位置184におけるアミノ酸交換［ile→asn］）はChenopodium rubrumにおいてメトリブジン耐性を生じる。これらの変異は色素体ゲノムの非常に保存的領域中にある。したがって、同じ点変異はタバコ及びその他の感受性植物にも耐性を賦与するはずである。
クローニング方法及び点変異の導入は例7に記述したと同様に行なう。
【０１４５】
構築pIC594によるタバコの色素体形質転換は例1に記述したように行われるであろう。形質転換色素体を含む再生体の選別は低濃度スクロース（0.3％）及び0.01-1.0μMメトリブジン（最終耐性濃度：1-10μM；Schwenger-Erger et al., 1993）含有RMOP培地上で行なうことができる。
【０１４６】
（実施例１０）ディウロン耐性を賦与するpsbA遺伝子の断片を使用する色素体形質転換
全てのクローニング方法は標準的なプロトコールを使用して行なった（Ausubel et al., 1999: Short protocols in molecular biology, Wiley, 4th edition）。
【０１４７】
どのようにpsbAコード配列における特異的点変異が色素体形質転換の選別マーカーとして使用し得るかが、例1及び7に詳細に記述されている。psbAコード配列における多数の点変異が文献（Hock and Elstner, 1995,を総説として参照）に記述されているように色素体形質転換の選別マーカーとして使用することができる。その他の例は選別試薬としてディウロンの使用である。Wolber et al., 1986に記述されているように、バリン-219の点変異はC. reinhardtiiにおいてディウロン耐性を生じる。タバコにおいてアトラジン耐性を生じる点変異もディウロンに対する交差耐性を賦与する（Sato et al., 1988; コドン264の最初の塩基がAGT［セリン］からGGT［クリシン］に変化）。
【０１４８】
クローニング及び点変異の導入は例7に記述したと同様に行なわれる。
【０１４９】
構築pIC595によるタバコの色素体形質転換は例1に記述したように行われるはずである。形質転換色素体を含む再生体の選別は低濃度スクロース（0.3％）及び1-5μMディウロン（野生型Sato et al., 1988と比較して20倍高いディウロン耐性）含有RMOP培地上で行なうことができる。
【０１５０】
（実施例１１）選別マーカーを不活化する調節配列を使用する色素体形質転換
この例には調節配列と交換してマーカーを不活化することにより選別マーカーを「再使用」する可能性を示す。
【０１５１】
この例はベクターpIC582で形質転換され、したがってpsbAオペロンに挿入されたaadAマーカー及び追加の関心の配列を持つ植物に基づいている。続く形質転換において、aadAでなくカナマイシン耐性（Batemann and Purton, 2000）を賦与する選別マーカーaph6を持つpIC581に基づく形質転換ベクターを使用してatpEオペロンのような別の遺伝子座に別の関心の配列を導入する；aph6はChlamydomonas reinhardtiiの色素体形質転換の選別マーカーとして使用されており、高等植物における使用について現在我々の研究室で最適化を行なっている。同時に、aadA発現は、aadAの上流のRBSが該終結配列により置換されているpIC582に基づく形質転換ベクターを使用してaadAコード配列の上流にtrnS (Stern and Gruissem, 1987)のような強力な終結作用を持つ配列の導入により抑制される。この二つの形質転換カセットは例5に記述したように一つのプラスミド上にあることが望ましい。その結果として遺伝子導入植物はもはやスペクチノマイシン耐性ではないので、RBS配列に対する終結配列を交換することによりaadA発現が回復することができる再度の形質転換にスペクチノマイシン選別を使用することができる；関心の追加の配列はその上流に導入することができる。同時に、カナマイシン耐性は記述した方法で除去することができ、さらに形質転換を行なう道を開く。
【０１５２】
（実施例１２）psbA中に修飾インテインの挿入
Saccharomyces cerevisiaeの空胞ATP分解酵素サブユニット（VMA）のタンパクスプライシング因子（インテイン）を元来のエンドヌクレアーゼドメインを選別マーカーaadAで置換することにより修飾する。この修飾インテインをタバコ色素体psbAオープン読み枠中に挿入する。色素体ゲノムに組み込んだ後aadAを発現したpsbA遺伝子から翻訳後切り出しを行ない、色素体内の機能的選別マーカーを得る。
【０１５３】
VMAインテインの5'-部分を標準的条件下にオリゴ5'-CATCTAGACTGCTTTGCCAAGGGTACCAATG-3'及び5'-GACCATGGAACCTTCAATGGTGAGATGAAAC-3'及び鋳型としてS. cervisiae DNAを使用してPCRで増幅する。生成した630 bpのPCR産物を精製し、XbaI及びNcoIで消化してVMA1を得る。VMAインテインの3'-部分を標準的条件下にオリゴ5'-GAGGATCCTGGAGATGTTTTGCTTAACG-3'及び5'-GATCTAGACAATTATGGACGACAACCTGG-3'及び鋳型としてS. cervisiae DNAを使用してPCRで増幅する。生成した220 bpのPCR産物を精製し、XbaI及びBamHIで消化してVMA2を得る。aadA遺伝子を標準的条件下にオリゴ5'-ATGCCATGGCTCGTGAAGCGG-3'及び5'-GAGGATCCTTGCCAACTACCTTAGTG-3'及び鋳型としてpIC519を使用してPCR増幅する。生成した804 bpのPCR産物を精製し、NcoI及びBamHIで消化し、aadAIを得る。ベクターpIC569をXbaIで消化し、アルカリ性ホスファターゼで脱リン酸化し、制限断片VMA1,  aadAI及びVMA2と連結してベクターpICINT（図18）を得る。ベクターpICINTによるタバコの色素体形質転換及び再生体の選別は例1に記述したように行なう。
【０１５４】
（実施例１３）色素体性YCF9及び異種GUSの融合タンパクの創製
uidA遺伝子を色素体のycf9遺伝子と融合してycf9調節配列の調節下に融合タンパクを創る。選別のためにrrn16遺伝子中の点変異を例4に記述したように創る。
【０１５５】
rrn16点変異を含むベクター骨格は標準的条件下にオリゴ5'-CAGGATCCACTGGCCGTCGTTTTAC-3'及び5'-GATGAAGCTTGGTCATAGCTGTTTCCTG-3'を使用してpIC587のベクター骨格のPCR増幅により作製する。生成した3474 bp PCR産物を精製し、BamHI及びHindIIIで消化してpICLを得る。タバコ色素体ゲノムbp 37053からbp 37780までの配列を標準的条件下にオリゴ5'-CAGGATCCGGTGGGATAGCCGAGCC-3'及び5'-GACCATGGAAGAGATGAGAGAATTAAGG-3'及び鋳型としてタバコ色素体ゲノムDNAを使用してPCRにより増幅する。生成したPCR生成物を精製し、BamHI及びNcoIで消化してLFycf9を得る。タバコ色素体ゲノムbp 37780からbp 38641までの配列を標準的条件下にオリゴ5'-CTACTCGAGTGAACCTATTCGTCGCAGACC-3'及び5'-GATGAAGCTTCACATACTTCGTGAAATGGTTC-3'及び鋳型としてタバコ色素体ゲノムDNAを使用してPCR増幅する。生成したPCR産物を精製し、HindIII及びXhoIで消化してRFを得る。uidA遺伝子をpIC587からNcoI及びXhoIで切り出す。制限産物をアガロースゲル上で精製し、2107 bpのバンドを集めて精製してRuidAを得る。断片pICL，LFycf9，RuidA及びRFをT4-リガーゼで連結してpICFUS（図19）を得、そしてE. coliに遺伝子導入する。形質転換体のDNAを単離して制限分析する。正しいpICFUSをタバコの色素体形質転換に使用し、再生体の選別は例4に記述したように行なう。
【０１５６】
（実施例１４）第二形質転換ステップにおいて活性化される沈黙遺伝子断片の挿入。uidA-発現カセットは第二ステップにおいて導入される。
5'-調節配列の無いaphA6遺伝子の断片を形質転換の第一ステップにおいてタバコ色素体ゲノムに挿入する。スペクチノマイシン及びストレプトマイシンに対する耐性を利用する選別は点変異を含むマーカー遺伝子の共組込みにより行なう。マーカー遺伝子断片及びaphA6断片は色素体ゲノムの異なる部位に挿入する。第二形質転換ステップにおいて、終結配列の代わりにスペーサー断片を持つuidAレポーター遺伝子はaphA6断片の上流に挿入する。挿入により、以前は沈黙していたaphA6断片は活性化し、カナマイシン耐性に基づく選別が可能になる。
【０１５７】
プラスミドpIC587はHindIII及びNdeIで消化し、アガロースゲル上で分離する。マーカーの断片を持つ3261 bpベクター断片をゲルから切り出し、精製する。鋳型としてタバコ総DNAを使用してタバコ色素体ゲノムの1000 bp断片（位置114700-115700）を標準的PCR条件下にオリゴPrF1；5'-CGAAGCTTTTTTCTTTTTATTAAGTTCA-3'及びPrF2；5'-CATATGCCTGCAGGTATATAATAATTCAGAGAAA-3'で増幅する。プライマーにHindIII,  NdeI及びSdaI制限部位が導入される。精製1062 bp  PCR断片をHindIII及びNdeIで消化し、再度精製する。HindIII及びNde消化pIC587ベクター断片をHindIII及びNde消化PCR断片を連結し、細菌に遺伝し導入して、プラスミドpIC587-rpI32を得る。クローン化プラスミドをSdaI及びXmaIで消化する。約4280 bpのベクター断片をゲルから切り出し、精製する。1303 bp  NdeI/XbaI断片をプラスミドpSK.KmR（Bateman and Purton, 2000）から酵素消化を使用して単離し、アガロース精製する。この断片はaphA6遺伝子のコード領域及びChlamydomonas reinhardtii rbcL遺伝子からの3’-配列を含む。
【０１５８】
鋳型としてタバコの総DNAを使用してタバコ色素体ゲノムの1000 bp断片（位置115701-116700）を標準的PCR条件下にオリゴPrF3：5'-GTCTAGAAGATACCCATGTATATCTTG-3'及びPRF4：5'-GCCCGGGAGTTAAAATACCTGACGTAGC-3'で増幅する。このプライマーはXbaI及びXmaI制限部位を導入する。精製1054 bp PCR断片をXbaI及びXmaIで消化し、再度精製する。aphA6断片及びPCR断片をSdaI/XmaIで切り出したpIC587-rpI32ベクターと連結し、細菌に導入して、色素体形質転換ベクターpIC-aphA6-rpI32（図20）を得る。ベクターpIC-aphA6-rpI32によるタバコの色素体形質転換及びスペクチノマイシン及び/またはストレプトマイシン含有培地上での再生体の選別は例1に記述したように行なう。
【０１５９】
色素体ゲノム変換植物を回収し、aphA6遺伝子断片が正しく組込まれていることを分析する。
【０１６０】
プラスミドpIC587-rpI32をSdaI及びXmaIで消化する。約4280 bpベクタープラグメントをゲルから切り出し、精製する。鋳型としてプラスミドpsb::rbc（Eibl et al, 1999）を使用して約2040 bp断片を標準的PCR条件下にプライマーPrGus1：5'-GCCTGCAGGGCCGTCGTTCAATGAGAATG-3'及びPrGus2：5'-GCCCGGGTTAATTAATCATTGTTTGCCTCCCTGCT-3'で増幅する。このプライマーはSdaI，PacI及びXmaI制限部位を導入する。増幅された断片は色素体16Sプロモーター断片、5'-psbAリーダー断片及びuidA遺伝子のコード領域を含む。PCR断片をSdaI及びXmaIで消化し、精製し、SdaI及びXmaIで消化したpIC587-rpI32ベクター断片に連結する。連結反応生成物を細菌に導入して、プラスミドpIC587-rpI32-GUSを得る。プラスミドpIC587-rpI32-GUSをPacI及びXmaIで消化する。約6300 bpベクター断片をゲル精製する。オリゴOpsaA/B（5'-TTAATTAATGGCTAGGAGGATTTGA-AAAGCATTCATATGCCG-3'、5'-末端にPacI制限部位及び3'-末端近傍にNdeI部位を含む）を1本鎖分子としてベクター断片に連結する。このオリゴは色素体psaA及びpsaB遺伝子の間にスペーサー領域を含んでいる。連結反応生成物はゲル精製し、Taqポリメラーゼ及びdNTPと72℃10分間処理して、第二鎖を合成する。反応を精製し、線状断片をNdeIで消化する。1303 bp NdeI/XmaI断片をプラスミドpSK.KmR（Bateman and Purton, 2000）から単離し、電気泳動で精製し、上記線状NdeI消化ベクター断片に連結する。連結生成物を細菌に導入して、色素体形質転換ベクターpIC-uidA-aphA6（図21）を得る。
【０１６１】
形質転換ステップ1（ベクターpIC-aphA6-rpI32を使用）により修飾された望む色素体を含む植物の葉を第二形質転換ステップの材料として使用する。
【０１６２】
ベクターpIC-uidA-aphA6によるタバコの色素体形質転換及びカナマイシン含有培地上での再生体の選別は例1に記述したように行なう。検査陽性の色素体ゲノム変換体はuidAレポーター遺伝子の発現を示す。
【０１６３】
（実施例１５）第二形質転換ステップにおいて活性となる沈黙遺伝子断片の挿入。uidAのコード領域を含む遺伝子断片が第二ステップで挿入される。
【０１６４】
実施例14と同様に、5'-調節配列の無いaphA6遺伝子の断片を形質転換第一ステップにおいてタバコ色素体ゲノムに挿入する。スペクチノマイシンまたはストレプトマイシン耐性による選別は点変異を含むマーカー遺伝子断片の共組込みにより行なう。マーカー遺伝子断片及びaphA6断片を色素体ゲノムの別の位置に挿入する。第二形質転換ステップにおいて、終結配列に代わってスペーサー配列を持つuidAレポーター遺伝子の断片をベクターpIC-uidA-aphA6-frag（図22）を使用してaphA6断片の上流に挿入する。例14と異なり、uidA断片にはプロモーターが含まれていない。
【０１６５】
rps19及びrpI22遺伝子（位置86.403−位置86.351）の間の非コード配列に由来する53 bp色素体スペーサー断片をuidAコード領域の5'-末端に融合する。uidA断片及びaphA6断片は内在性sprAプロモーターにより転写され、3シストロン（sprA，uidA及びaphA6）からなる人工的オペロンを生じる。この人工的オペロンはそれまで沈黙していたaphA6断片を活性化し、カナマイシン耐性に基づく選別を可能にする。
【０１６６】
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WO9910513
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WO0007431
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１】ベクターpIC500の模式図。
【図２】ベクターpIC569の模式図。
【図３】ベクターpIC574の模式図。
【図４】ベクターpIC579の模式図。
【図５】ベクターpIC576の模式図。
【図６】ベクターpIC584の模式図。
【図７】ベクターpIC583の模式図。
【図８】ベクターpIC582の模式図。
【図９】ベクターpIC570の模式図。
【図１０】ベクターpIC581の模式図。
【図１１】色素体形質転換ベクターpIC588の模式図及びタバコ色素体DNA中の標的部位。
【図１２】色素体形質転換ベクターpIC587の模式図及びタバコ色素体DNA中の標的部位。
【図１３】スペクチノマイシンまたはストレプトマイシン耐性を賦与するベクターによる交互形。質転換の模式図
【図１４】色素体形質転換ベクターpIC591の模式図及びタバコ色素体DNA中の標的部位。
【図１５】アトラジン耐性植物を完成するための形質転換ベクターの説明図。
【図１６】テントキシン耐性植物を完成するための形質転換ベクターの説明図。
【図１７】調節配列の交換による選別マーカーの不活化に基づくaadAおよびaph6による交互形質転換の模式図。
【図１８】ベクターpICINTの模式図（例12参照）。
【図１９】ベクターpICFUSの模式図（例13参照）。
【図２０】色素体形質転換ベクターpIC-aphA6-rpI32の模式図。
【図２１】色素体形質転換ベクターpIC-uidA-aphA6の模式図。
【図２２】色素体形質転換ベクターpIC-uidA-aphA6-fragの模式図。
【図４】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年9月11日(2003.9.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
安定な形質転換色素体を持つ多細胞植物または植物細胞を作製する方法において、
a)  DNA修飾が可能な少なくとも1つのDNA分子であって、該DNA分子中には存在しない宿主色素体の配列要素を形質転換色素体中で発現するために必要な関与遺伝子断片を含み、該関与遺伝子断片が異種遺伝子の断片であり、該DNA修飾により既存シストロンを変化させて該変化により追加のシストロンを創らないように設計され、該変化シストロンが、宿主色素体DNAに由来するRNAと、該関与遺伝子断片のDNAに由来するRNA配列とを含むハイブリッドメッセンジャーRNAを形成するように設計されている、該DNA分子を使用して、該植物または該植物細胞の色素体を、相同組換えにより形質転換し、
b)  該DNA分子を、増殖するのに適する、または該DNA修飾を持つ色素体の同定を可能とする育成条件に置き、
c)  機能的且つ該DNA分子中にコードされた情報を含む色素体を選別または同定する、ステップを含み、
それによって、安定な形質転換色素体を持つ機能的細胞または多細胞植物を生じる上記方法。
【請求項２】
前記ハイブリッドメッセンジャーRNAの全部または部分の翻訳により、融合タンパクを生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記融合タンパクが、複数の異種ポリペプチド配列を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記DNA分子が、さらにそれぞれタンパク分解開裂部位をコードする1以上の配列を含む、請求項１乃至３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク分解開裂部位が、自己触媒的である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
さらに、タンパク分解開裂部位を持つ発現融合タンパクを開裂するために必要な、部位特異性タンパク分解酵素を提供するための遺伝的若しくは一過性の修飾を含む、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記DNA分子が、さらに選別マーカー遺伝子を創るための色素体遺伝子の変異断片を含む、請求項1乃至６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記DNA分子が、独立の相同組換えにより、関与遺伝子断片、および色素体ゲノムにおける色素体遺伝子の変異断片の挿入部位が分離されるように設計されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
色素体遺伝子の前記変異断片の変異が、点変異である請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記関与遺伝子断片が、発現のために、プローモーター配列、5'-非翻訳領域、開始コドン、完全コード領域、及び3'-非翻訳領域から選択された色素体ゲノム配列要素、またはそれらの部分を必要とする請求項１乃至９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記DNA修飾が、配列置換を含む請求項１乃至１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記DNA修飾が、配列挿入を含む請求項１乃至１１の何れか一項に記載の方法。
【請求項１３】
色素体遺伝子の前記変異断片が、色素体23S rRNA遺伝子の変異断片であり、該変異断片が抗生物質耐性を賦与する、請求項７乃至１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１４】
色素体遺伝子の前記変異断片が、色素体16S rRNA遺伝子の変異断片であり、該変異断片が抗生物質耐性を賦与する、請求項７乃至１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１５】
色素体遺伝子の前記変異断片が、色素体psbA遺伝子の変異断片であり、該変異断片がアトラジン、メトリブジン及び/またはディウロン耐性を賦与する、請求項７乃至１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
色素体遺伝子の前記変異断片が、色素体atpB遺伝子の変異断片であり、該変異断片がテントキシン耐性を賦与する、請求項７乃至１２の何れか一項に記載の方法。
【請求項１７】
関与遺伝子断片による前記DNA修飾が、5'調節配列及び作動的に結合したコード領域の間で起こる、請求項１乃至１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
関与遺伝子断片による前記DNA修飾が、コード領域及び作動的に結合した3'調節配列の間で起こる、請求項１乃至１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１９】
関与遺伝子断片による前記DNA修飾が、3'調節配列の直ぐ下流で起こる、請求項１乃至１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記DNA分子が、さらに1以上の組換え部位またはスプライシング部位を含む、請求項１乃至１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
色素体として少なくとも部分的に機能し、さらに1以上の有用な形質を発現する色素体を生じる、請求項１乃至２０の何れか一項に記載の方法。
【請求項２２】
関与遺伝子断片による前記DNA修飾が、前記色素体ゲノムの転写領域に影響を及ぼす、請求項１乃至２１の何れか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が2回行われ、第一回目に創られた点変異が、第二回目には元に戻り、その一方で、同一若しくは異なる色素体遺伝子中で別の点変異を創る、請求項９乃至２２の何れか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記DNA修飾が、前記色素体ゲノム中への関与遺伝子の挿入を含む、請求項１乃至２３の何れか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記DNA修飾が、配列の削除を含む、請求項１乃至２４の何れか一項に記載の方法。
【請求項２６】
安定な形質転換色素体を持つ多細胞植物または植物細胞を作製する方法において、
a)  該植物または該植物細胞の色素体を、DNA修飾が可能な少なくとも1つのDNA分子であって、該DNA分子が該DNA分子中には存在しない宿主色素体の配列要素を形質転換色素体中で発現するために必要な関与遺伝子断片を含むものを用いて、相同組換えにより形質転換し、
b)  該DNA分子を、増殖するのに適する、または該DNA修飾を持つ色素体の同定を可能とする育成条件に置き、
c)  機能的且つ該DNA分子中にコードされた情報を含む色素体を選別または同定する、
ステップを含むことによって、安定な形質転換色素体を持つ機能的細胞または多細胞植物を生じ、
更に、ｂ）及びｃ）に記載のステップに引き続いて、
形質転換の第一ステップにより得られる該機能的細胞または該多細胞植物の該安定な形質転換色素体を、DNA修飾を可能にする相同組換えにより、関与遺伝子またはその断片を含む第二DNA分子を用いて、形質転換し、
該DNA修飾が、共同して、所望の機能を持ったオペロンまたはシストロンを作る、上記方法。
【請求項２７】
前記DNA修飾の結果、機能的で転写活性な関与遺伝子を生じる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記共同して作成したオペロンまたはシストロンが、一DNA分子の関与遺伝子断片に由来するRNAと、該第二DNA分子の第二の関与遺伝子断片に由来するRNAとを含むハイブリッドメッセンジャーRNAを形成するように設計されている請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ハイブリッドメッセンジャーRNAの少なくとも一部が、翻訳可能である請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
第一DNA分子の第一の関与遺伝子断片によりコードされるポリペプチドと、第二DNA分子の第二の関与遺伝子断片によりコードされるポリペプチドとを含む機能的ポリペプチドが生産される、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第二DNA分子が、宿主色素体、または形質転換の前記第一のステップにより誘導された関与遺伝子断片の配列要素を、形質転換色素体中で発現するために必要な関与遺伝子またはその断片を含む、請求項２６乃至３０の何れか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１乃至３１の何れか一項に記載の方法を使用して得られた、形質転換色素体、細胞、或いは多細胞植物及びその子孫。
【請求項３３】
請求項１乃至３１の何れか一項に記載の方法を使用して得られた、野生型色素体及び形質転換色素体の混合物を含む、キメラ形質転換細胞、或いは多細胞植物及びその子孫。
【請求項３４】
請求項１乃至３１の何れか一項に記載の方法を使用して得られた、少なくとも二つの異なる形質転換色素体の混合物を含む安定キメラ植物。
【国際調査報告】
2004520032.tif 000087
2004520032.tif 000088
2004520032.tif 000089