(57)【要約】本発明は、一実施例においては、マイクロリットル未満の試料を対象とした、液体又は気体を介した迅速な透析又はサーマルサイクリングを容易にするための毛管カセットを提供する。一実施例においては、本発明は、自動化された高スループットの処理のための流体処理機と組み合わせて使用されるべく形成されている。前記毛管カセットが前記流体処理機に取り付けられている時に、透析又はサーマルサイクリングを実施してもよい。しかし、本発明の別の一実施例は、ホテルを使用して複数の毛管カセットを同時に処理することにより、より高いスループットを実現する。ホテルの機能には、透析、サーマルサイクリング、洗浄及び化学的再生が含まれる。
2004500552.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内部チャンバを規定している枠と、
それぞれが第１の端部と第２の端部とを有する複数の毛管と、
を備え、
前記複数の毛管のそれぞれの前記第１の端部と前記第２の端部とのうちの少なくとも一方が、前記複数の毛管がそれぞれ前記枠の外表面に流体により結合されるような具合に前記枠に取り付けられていることを特徴とする、生物試料処理における使用に適した毛管カセット。
【請求項２】
前記複数の毛管のうちの少なくとも１つの前記第１の端部と前記第２の端部とのうちの一方に流体結合されたドッキングポートを更に有する、請求項１に記載の毛管カセット。
【請求項３】
前記ドッキングポートが、前記毛管内に針を案内すべく形成されたガイドキャップを更に備えたことを特徴とする、請求項２に記載の毛管カセット。
【請求項４】
前記ドッキングポートが、前記針の除去後に前記針を収容して液密シールを保持することの可能な液密シーリング要素を更に備えたことを特徴とする、請求項２に記載の毛管カセット。
【請求項５】
前記シーリング要素が圧縮したＯリング型グランドシールであることを特徴とする、請求項４に記載の毛管カセット。
【請求項６】
前記シーリング要素が、前記ガイドキャップ内に形成された空洞内に取り付けられていることを特徴とする、請求項５に記載の毛管カセット。
【請求項７】
前記枠が複数の枠から形成されていることと、前記複数の毛管の一部が、前記複数の枠のそれぞれの枠に取り付けられていることと、を特徴とする、請求項１に記載の毛管カセット。
【請求項８】
前記複数の枠に取り付けられ、前記複数の枠に圧縮力を加えてこれらを互いに固定すべく設けられた細長い圧縮部材を更に備えた、請求項７に記載の毛管カセット。
【請求項９】
前記複数の枠を貫通して取り付けられた固定具であって、前記複数の枠を前記固定具の軸に沿って保持するための固定具を更に備えた、請求項７に記載の毛管カセット。
【請求項１０】
前記複数の枠のうちの２つの枠の間に液密シールを形成するために前記２つの枠の間に取り付けられたガスケットを更に備えた、請求項７に記載の毛管カセット。
【請求項１１】
前記枠の一方の端部を封止するために前記枠の前記端部に取り付けられたエンドキャップを更に備えた、請求項１に記載の毛管カセット。
【請求項１２】
前記枠と前記エンドキャップとの間に取り付けられ、前記エンドキャップと前記枠との間に液密シールを形成しているガスケットを更に備えた、請求項１１に記載の毛管カセット。
【請求項１３】
前記エンドキャップに少なくとも１つのポートが設けられ、前記ポートが前記内部チャンバと流体により連通しており、前記内部チャンバと、前記内部チャンバの外部の場所との間の流体の通行を容易にしていることを特徴とする、請求項１１に記載の毛管カセット。
【請求項１４】
前記枠に少なくとも１つのポートが設けられ、前記ポートが前記内部チャンバと流体により連通しており、前記内部チャンバと、前記内部チャンバの外部の場所との間の気体又は液体の通行を容易にしていることを特徴とする、請求項１に記載の毛管カセット。
【請求項１５】
前記複数の毛管のうちの少なくとも１つがガラス製の毛管であることを特徴とする、請求項１に記載の毛管カセット。
【請求項１６】
前記複数の毛管のうちの少なくとも１つに、透析を実施するためのフィルタが含まれることを特徴とする、請求項１に記載の毛管カセット。
【請求項１７】
前記複数の毛管のうちの少なくとも１つが、石英ガラス製の毛管であることを特徴とする、請求項１に記載の毛管カセット。
【請求項１８】
前記複数の毛管のうちの少なくとも１つが、ポリイミド材料により被覆されていることを特徴とする、、請求項１に記載の毛管カセット。
【請求項１９】
前記複数の毛管のうちの少なくとも１つに、温度処理を容易にするためのＴＥＦＬＯＮ（商標名）コーティングが含まれることを特徴とする、請求項１に記載の毛管カセット。
【請求項２０】
前記複数の毛管のうちの少なくとも１つが、温度処理を容易にするためのポリイミド材料で被覆されていることを特徴とする、請求項１に記載の毛管カセット。
【請求項２１】
前記複数の毛管のうちの少なくとも１つが、体積１μｌ未満の前記生物試料を保持する大きさ及び形状であることを特徴とする、請求項１に記載の毛管カセット。
【請求項２２】
前記枠が流体処理機に使用するための寸法であることを特徴とする、請求項１に記載の毛管カセット。
【請求項２３】
前記毛管カセットがホテルに使用するための形状であることを特徴とする、請求項１に記載の毛管カセット。
【請求項２４】
前記複数の毛管が９６本の毛管からなることを特徴とする、請求項１に記載の毛管カセット。
【請求項２５】
前記複数の毛管が、中心間の寸法が９ｍｍである長方形の格子状に配列されていることを特徴とする、請求項２４に記載の毛管カセット。
【請求項２６】
前記複数の毛管が、３８４本の毛管からなることを特徴とする、請求項１に記載の毛管カセット。
【請求項２７】
生物試料の処理における使用に好適な試料処理カセットであって：
第１の端部と第２の端部とを有する枠であって、前記第２の端部が前記第１の端部に対向し、通路が前記第１の端部から前記枠を通って前記第２の端部へと延伸している枠と、
前記枠の前記第１の端部に沿って設けられ、前記通路と連通している、第１の平膜層と、
前記枠の前記第２の端部に沿って設けられ、前記通路と連通している、第２の平膜層と、
前記枠の前記通路と、前記第１の平膜層と、前記第２の平膜層とにより規定され、第１の端部と第２の端部とを有する、試料処理チャンバと、
を備え、
前記試料処理チャンバの前記第１の端部と前記第２の端部とのうちの少なくとも一方が、前記枠の外表面と流体により結合していることを特徴とする、試料処理カセット。
【請求項２８】
複数の前記試料処理チャンバを更に有することを特徴とする、請求項２７に記載の試料処理カセット。
【請求項２９】
前記第１の平膜と、前記第２の平膜とが、前記複数の試料処理チャンバのそれぞれの試料処理チャンバ間で接着剤により前記枠に結合されていることを特徴とする、請求項２８に記載の試料処理カセット。
【請求項３０】
生物試料処理における使用に好適なドッキングポートであって、凹形の端部を有するガイドキャップを備え、前記凹形の端部が、前記ガイドキャップの、前記凹形の端部に対向する端部内に規定された通路に針を案内すべく形成されているドッキングポートにおいて、前記ガイドキャップが、生物試料処理装置に取り付けられるべく形成されていることを特徴とする、ドッキングポート。
【請求項３１】
請求項３０に記載のドッキングポートであって、前記ガイドキャップの、前記凹形の端部に対向する前記端部内に空洞が設けられたことを特徴とし：
前記空洞内に取り付けられ、針を収容して、前記針の除去後に液密シールを保持することの可能な液密シールを更に備えたことを特徴とする、請求項３０に記載のドッキングポート。
【請求項３２】
前記シールが、前記空洞内で放射状に圧縮されたＯリングシールであることを特徴とする、請求項３１に記載のドッキングポート。
【請求項３３】
生物試料を対象とした透析を行う方法であって：
前記試料を毛管カセットの複数の毛管内に導入するステップであって、前記各毛管が、前記試料を分子サイズ差を利用して精製するためのフィルタを有するステップと、
前記試料を、前記試料の透析が達成されるのに十分な時間、前記各毛管内に滞留させるステップと、
を含む方法。
【請求項３４】
前記透析が、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡシーケンシング反応、オリゴヌクレオチド伸長反応、エキソヌクレアーゼ反応、ＯＬＡ反応、ハイブリダイゼーション反応及び対立遺伝子特異性ポリメラーゼ連鎖反応からなる群から選択される反応の所望でない成分を除去すべく実施されることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記複数の毛管のうちの少なくとも１本に、前記試料が複数収容され、前記少なくとも１本の毛管内の前記複数の試料が気体によって隔てられていることを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
生物試料を対象として温度処理を行う方法であって：
前記試料を、毛管カセット中の複数の毛管内に導入するステップであって、前記複数の毛管が、前記毛管カセットの内部チャンバと連通しているステップと、
温度制御された流体を前記内部チャンバ内に導入して前記複数の毛管と接触させるステップと、
を含む方法。
【請求項３７】
前記温度制御された流体が液体であることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記温度制御された流体が気体であることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
液体処理機と組み合わせて使用するための生物試料処理システムであって：
複数の毛管を有し、前記液体処理機に組み込まれた第１の複数の針の集合が前記複数の毛管と流体により連通するように選択的に配置されるような具合に、前記複数の針を前記毛管カセットの上面内に受容すべく設けられた、毛管カセットと、
第２の複数の針の集合を有し、前記毛管カセットの下側に取外し可能に取り付けられた針床であって、前記第２の複数の針の集合が前記複数の毛管と流体により連通するように選択的に配置されるような具合に、前記毛管カセットの底面と嵌合すべく設けられた、針床と、
を備えたシステム。
【請求項４０】
前記針床の下側に配置されたウェルプレートを更に備え、
前記針床の前記第２の複数の針の集合が、前記針床の下側で、前記ウェルプレートの方向に延伸することにより、前記第１の複数の針の集合が、溶液を、前記ウェルプレートから、前記第２の複数の針の集合を介して、前記複数の毛管のそれぞれの毛管内に導入することを特徴とする、請求項３９に記載の生物試料処理システム。
【請求項４１】
前記複数の毛管の各毛管の第１の端部と第２の端部とに設けられたシーリング要素であって、前記複数の毛管の前記第１及び第２の端部を液密にシールするためのシーリング要素を更に備えた、請求項４０に記載の生物試料処理システム。
【請求項４２】
前記毛管カセットの上面に沿って配置され、前記第１の複数の針の集合を前記複数の毛管内に案内すべく設けられた、第１の複数のドッキングポートの集合と、
前記毛管カセットの底面に沿って配置され、前記第２の複数の針の集合を前記複数の毛管内に案内すべく設けられた、第２の複数のドッキングポートの集合と、
を更に備えた、請求項３９に記載の生物試料処理システム。
【請求項４３】
前記毛管カセットが、前記第１の複数の針の集合に固定されていることを特徴とする、請求項３９に記載の生物試料処理システム。
【請求項４４】
前記針床が前記毛管カセットの前記底面に固定されていることを特徴とする、請求項３９に記載の生物試料処理システム。
【請求項４５】
前記毛管カセットと前記針床とが、前記毛管カセットを前記針床に対して位置合せすることの可能な位置合せ機構に取外し可能に取り付けられていることを特徴とする、請求項３９に記載の生物試料処理システム。
【請求項４６】
前記複数の毛管のうちの少なくとも１本の中に配置されたフィルタを更に備え、前記フィルタが、前記生物試料を分子サイズ差を利用して精製すべく設けられている、請求項３９に記載の生物試料処理システム。
【請求項４７】
前記フィルタの分画分子量が約１００Ｋｄａｌであることを特徴とする、請求項４６に記載の生物試料処理システム。
【請求項４８】
流体を通過させて内部チャンバ内に導入し、前記毛管カセットの前記複数の毛管の外側と連通させて、前記生物試料の温度処理を容易にするためのマニホールドを更に備えた、請求項３９に記載の生物処理システム。
【請求項４９】
前記生物試料に、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物またはこれらの混合物が含まれることを特徴とする、請求項３９に記載の生物試料処理システム。
【請求項５０】
前記ポリヌクレオチドにＤＮＡが含まれることを特徴とする、請求項４９に記載の生物試料処理システム。
【請求項５１】
前記顕微試料の体積が１０μｌから０．０５μｌであることを特徴とする、請求項３９に記載の生物試料処理システム。
【請求項５２】
生物試料を対象として透析を行う方法であって：
前記試料を、ウェルプレートから毛管カセット中の複数の毛管内に吸引するステップであって、前記毛管のそれぞれが、前記試料を分子サイズ差を利用して精製するためのフィルタを有するステップと、
前記試料を、前記試料の透析が達成されるのに十分な時間、前記毛管内に滞留させるステップと、
を含む方法。
【請求項５３】
前記透析が、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡシーケンシング反応、オリゴヌクレオチド伸長反応、エキソヌクレアーゼ反応、ＯＬＡ反応、ハイブリダイゼーション反応及び対立遺伝子特異性ポリメラーゼ連鎖反応からなる群から選択される反応の所望でない成分を除去すべく実施されることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記試料を、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡシーケンシング反応、オリゴヌクレオチド伸長反応、エキソヌクレアーゼ反応、ＯＬＡ反応、ハイブリダイゼーション反応及び対立遺伝子特異性ポリメラーゼ連鎖反応からなる群から選択される反応の不要な成分を除去すべく透析することを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記複数の毛管のうちの少なくとも１本に、前記試料が複数収容され、前記少なくとも１本の毛管内の前記複数の試料が気体によって隔てられていることを特徴とする、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
生物試料を対象として温度処理を行う方法であって：
前記試料を、毛管カセット中の複数の毛管内に導入するステップであって、前記複数の毛管が、前記毛管カセットのの内部チャンバと連通しているステップと、
温度制御された流体を前記内部チャンバ内に導入して前記複数の毛管と接触させるステップと、
を含む方法。
【請求項５７】
多数の生物試料を処理するためのホテルであって：
複数の毛管を有する毛管カセットを取外し可能に収容すべく形成されたハウジングであって、前記毛管カセットが内部チャンバを有する、ハウジングと、
前記ハウジングに結合され、前記内部チャンバ内に温度制御された流体を通過させて、前記複数の毛管中の前記多数の生物試料の温度処理を行うべく形成された、流体管理システムと、
を備えたホテル。
【請求項５８】
前記流体が液体であることを特徴とする、請求項５７に記載のホテル。
【請求項５９】
前記流体が気体であることを特徴とする、請求項５７に記載のホテル。
【請求項６０】
前記ハウジングがシェルフを備えたことを特徴とする、請求項５７に記載のホテル。
【請求項６１】
前記ハウジングが、複数の毛管カセットを取外し可能に備え、前記複数の毛管カセットの内部チャンバ内に温度制御された流体を通過させるべく形成されたことを特徴とする、請求項５７に記載のホテル。
【請求項６２】
前記複数の毛管が、マイクロリットル未満の複数の毛管からなることを特徴とする、請求項５７に記載のホテル。
【請求項６３】
多数の生物試料を処理するためのホテルであって：
毛管カセットを取外し可能に収容すべく形成されたハウジングであって、前記毛管カセットに、内側にフィルタが配置された複数の毛管が含まれる、ハウジングと、
前記フィルタに透析流体を通過させて、前記複数の毛管内で生物試料の透析を行うべく形成された流体管理システムと、
を備えたホテル。
【請求項６４】
前記透析流体が、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡシーケンシング反応、オリゴヌクレオチド伸長反応、エキソヌクレアーゼ反応、ＯＬＡ反応、ハイブリダイゼーション反応及び対立遺伝子特異性ポリメラーゼ連鎖反応からなる群から選択される反応の所望でない成分を除去すべく実施されることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記透析流体が、ポリメラーゼ連鎖反応、ＤＮＡシーケンシング反応、オリゴヌクレオチド伸長反応、エキソヌクレアーゼ反応、ＯＬＡ反応、ハイブリダイゼーション反応及び対立遺伝子特異性ポリメラーゼ連鎖反応からなる群から選択される反応の不要な成分を除去すべく実施されることを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記区画がシェルフを有することを特徴とする、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
１つ又は複数の生物試料を処理するためのホテルであって：
複数の毛管を有する毛管カセットを取外し可能に収容すべく形成されたハウジングと、
前記ハウジング内に取り付けられ、前記複数の毛管の各毛管の内部と流体により連通すべく設けられた針床と、
前記針床に流体を通過させるべく形成された流体管理システムと、
を備えたホテル。
【請求項６８】
前記流体が透析流体であることを特徴とする、請求項６７に記載のホテル。
【請求項６９】
前記流体が洗浄溶液であることを特徴とする、請求項６８に記載のホテル。
【請求項７０】
前記流体が、前記複数の毛管内に配置されたフィルタを化学的に再生させることの可能な化学再生溶液であることを特徴とする、請求項６７に記載のホテル。
【請求項７１】
前記流体管理システムが前記ハウジングに結合され、前記複数の毛管カセットのそれぞれの内部チャンバ内に温度制御された流体を通過させて、前記複数の毛管内で前記多数の生物試料を温度処理すべく形成されたことを特徴とする、請求項６７に記載のホテル。
【請求項７２】
前記複数の毛管がマイクロリットル未満の毛管からなることを特徴とする、請求項７１に記載のホテル。
【請求項７３】
前記複数の毛管がマイクロリットル未満の毛管からなることを特徴とする、請求項６７に記載のホテル。
【請求項７４】
前記ホテルが自動化された試料処理システムと組み合わせて使用すべく設けられたことを特徴とする、請求項６７に記載のホテル。
【請求項７５】
流体処理装置に取り付けられた毛管カセットと、
前記毛管カセットと連通した加熱器と、
前記毛管カセットの下側に取り付けられたウェルプレートを操作するための器具管理装置と、
を備えた、鋳型作製モジュール。
【請求項７６】
前記器具管理装置が、前記毛管カセットがウェルプレート中に収容された生物試料を得た後に前記ウェルプレートをフィルタマニホールドと交換することが可能であるように前記ウェルプレートを配置すべく設けられ、前記フィルタ材料の一部が、互いに上下に重ねられたロールと受け皿との上に配置されていることを特徴とする、請求項７５に記載の鋳型作製モジュール。
【請求項７７】
前記器具管理装置が、洗浄リザーバを収容すべく設けられていることを特徴とする、請求項７６に記載の鋳型作製モジュール。
【請求項７８】
前記毛管カセットが複数の毛管からなり、前記複数の毛管のそれぞれが、１００μｌの生物試料に適合すべく形成されていることを特徴とする、請求項７５に記載の鋳型作製モジュール。
【請求項７９】
生物試料を、ウェルプレートから毛管カセット中の複数の毛管内に吸引するステップと、
前記生物試料を加熱するステップと、
前記ウェルプレートを取り除くステップと、
前記毛管カセットの下側に濾過マニホールドを配置するステップと、
前記マニホールドに沿ってフィルタ材料を取り付けるステップと、
前記フィルタ材料に陰圧を印加することにより、前記生物試料を、前記フィルタ材料を介して受け皿に吸引するステップと、
前記フィルタ材料を前記マニホールドから外すステップと、
を含む、鋳型作製方法。
【請求項８０】
生物試料を、ウェルプレートから毛管カセット中の複数の毛管内に吸引するステップと、
前記生物試料を加熱するステップと、
前記ウェルプレートを取り除くステップと、
前記毛管カセットの下側に濾過マニホールドを配置するステップと、
前記マニホールドに沿ってフィルタ材料を取り付けるステップと、
前記前記マニホールドを加圧して、前記生物試料を、前記フィルタ材料を介して受け皿内に押し出すステップと、
前記フィルタ材料を前記マニホールドから外すステップと、
を含む、鋳型作製方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、１９９９年９月２１日に提出された米国仮出願６０／１５５，２９９に基づく優先権を主張する。上述の出願及びこれに記載の参考文献は、本願中に参考文献として編入したものである。
【０００２】
発明の分野
本発明は、ゲノム分野において、ＤＮＡシーケンシング、遺伝分析及び遺伝子発現分析を含めた様々な処理に有用な、微量の試料を高速で自動的に処理するための装置及び方法に関する。本発明は、製薬用の高スループットの化合物スクリーニングのためのアッセイのセットアップ及び実施のための装置及び方法にも関する。
【０００３】
発明の背景
実験の自動化は、この１０年間のゲノム研究及び創薬の進歩において重要な役割を果たしてきた。初期のゲノム研究の中心となったのは、ピペッティングロボット及び画像収集システムを適用したフィンガープリンティング及びＳＴＳマッピング処理の自動化 （Ｇａｒｃｉａ他、１９９５、Ｋｗｏｋ他、１９９２、Ｌａｍｅｒｄｉｎ及びＣａｒｒａｎｏ、１９９３、ＭａｃＭｕｒｒａｙ他、１９９１、Ｎｉｚｅｔｉｃ他、１９９４、Ｓｌｏａｎ他、１９９３）であった。興味深い一例として、インテリジェント・オートメーション・システムズ社と、マサチューセッツ州ケンブリッジのホワイトヘッド・インスティテュート・ゲノム・センターとの共同開発によるＳＴＳ／ＥＳＴマッピング用「Ｇｅｎｏｍａｔｒｏｎ」（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ他、１９９５、Ｈｕｄｓｏｎ他、１９９５）が挙げられる。このシステムは、高速ＰＣＲセットアップ、サーマルサイクリング、反応生成物をナイロン膜に写し取るための試料処理及び、ビオチン標識したプローブとのハイブリダイゼーションによるＣＣＤ利用光学信号検出に必要な全ての手順を実行するものである。しかし、この機械は大型で、稼働費用が高く、他の作業への応用が困難であった。１９９０年以降、発展の著しい計測機器業界各社からの多数かつ多種の自動化装置の入手が可能となった。現在、多くの大規模なシーケンシング施設において、自動化システムを用いた高スループットのＤＮＡシーケンシング試料作製が行われている。
【０００４】
シーケンシング施設で実施される様々な作業の自動化の度合いは、マニュアル操作により動作させるシステムから、完全な統合型の処理方法まで、様々に異なる。これらの構成はそれぞれ、シーケンシング施設における円滑な作業の実施に貢献するような有利な特性を有することが示されている。しかし、マニュアル操作によるセットアップでは、人的ミスによりシーケンシングの読取り結果が誤って認識されてしまうという重大な問題があり、また一方、完全な統合型の処理方法では、モジュールのうちの１つが壊れるとシステム全体が故障してしまう可能性が高い。
【０００５】
現在の自動化に対する取り組みの流れは、大規模な完全統合型システムから、シーケンシング処理の中の特定の機能を個別に果たすより小さなワークステーションへと移行しつつある。このことは、１つのワークステーションに不具合が生じても、システム全体の故障には至らないことを意味している。更に、このような手法には、シーケンシング処理の方法が、時を経るに従って変化し改善されても、要求される機能の変化に対応可能であるという柔軟性もある。具体的には、自動化ユニットの構築には時間がかかるが、柔軟性を有することにより、様々な部品を、これらの改善が可能となった時点で取り替えたり修正したりすることができる。高スループットのシーケンシング設備では、時間がかかり、効率が悪くミスを起こしやすい機能がいくつかある。その例として挙げられるのが、コロニーピッキング、鋳型の作製、シーケンシング反応のセットアップ、クローン検索及びゲルローディングである。
【０００６】
最新の研究施設では、部分的に自動化された試料処理方法を採用している。このような処理方法では、試薬と鋳型とを、マニュアル操作で動かす９６チャネルの分注器で混合し、サーマルサイクリングプレートに分注する。同じ作業を、テカン社製のＧｅｎｅｓｉｓ（Ａｈｍａｄｉ、１９９７年）などのピペッティングロボットを用いて実施している研究施設もある。様々なピペッティングロボット、プレートからプレートへの液体の移送、プレートシーリング、及び、磁気ビーズを用いたプレート式サーマルサイクリング又は濾過式精製処理を利用した統合型システムが構築されている。しかし、これらのシステムは複雑で、設置費用が高額であり、試料の蒸発の問題があり、また容量が制限される。
【０００７】
ガラス製の毛管を用いて多数のＤＮＡシーケンシング試料を取り扱う方法が、複数のグループにより提案されている。例えば、Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔにより開発された化学シーケンシング法の最初のプロトコル（１９７７年）では、封止したガラス製の毛管を試料処理に用いた。一例では、これらの毛管を、コンベヤベルト型の装置に載せ、この装置が複数の機能「ステーション」を通過するのに伴い、試料の充填、混合及び処理を各毛管に対して個別に行う（Ｆｒｉｅｄｍａｎ及びＭｅｌｄｒｕｍ、１９９８年）。別の開発プロジェクトでは、試料を加熱要素に対して上下させてＰＣＲを実施できるような具合に、９６本の毛管がＨｙｄｒａディスペンサ（ロビンズ・サイエンティフィック社）に取り付けられている（Ｈｕｎｉｃｋｅ−Ｓｍｉｔｈ、１９９７年）。この装置を修正したものでは、銅製の加熱要素を、試料の位置に対して上下させるような構成となっている（スタンフォード技術研究所、１９９８年）。
【０００８】
標準的な５−１０μｌのシーケンシング反応の大きな欠点の一つは、試料のうち少なくとも５０％が、ゲルにロードされることなく無駄になってしまうという点である。
【０００９】
発明の概要
本発明は、内部チャンバを規定する枠と、それぞれが第１の端部と第２の端部とを有する複数の毛管とを有し、前記複数の毛管のそれぞれが流体により前記枠の外表面と連通するような具合に、前記第１の端部と前記第２の端部とのうちの少なくとも一方が前記枠に取り付けられている毛管カセットを提供することにより、上記の問題を解決しようとするものである。
【００１０】
本発明の別の一実施例によれば、本発明は、第１の端部と第２の端部とを有する枠を含み、前記第１の端部から前記第２の端部へと、前記枠内に通路が延伸し、前記枠の対向する両側にわたって配置された第１の平膜層と前記枠とが試料処理チャンバを規定する、試料処理カセットを提供する。
【００１１】
本発明の別の一実施例によれば、凹形の端部と、任意の液密シールとを有するガイドキャップを含むドッキングポートが設けられている。
【００１２】
本発明の別の一実施例によれば、生物試料の透析を実施するための、毛管カセットを使用した方法が提供される。
【００１３】
本発明の別の一実施例によれば、生物試料の温度処理を行うための、毛管カセットを使用した方法が提供される。
【００１４】
本発明の別の一実施例によれば、液体処理機と組み合わせて使用するための、毛管カセットと針床とを使用した方法が提供される。
【００１５】
本発明の別の一実施例によれば、多数の生物試料を処理するための、ハウジングと流体管理システムとを含むホテルが提供される。本発明の前記ホテルが、複数の毛管カセットを処理可能であってもよい。
【００１６】
本発明の別の一実施例によれば、器具管理装置と毛管カセットとを用いた鋳型作製モジュールが提供される。
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、当該技術分野において必要とされている、好適には再利用可能な部品を用いた微量ＤＮＡ精製方法であって、毛管を利用した試料処理方法の組み合わせが容易であり、遠心分離を必要としない方法を実現しようとするものである。本発明は、毛管を利用した洗浄装置及び、空気駆動サーマルサイクリングに代わる試料処理方法と、費用を大幅に節減する目的で、それぞれの区分ごとに十分な量の試料を効率的に処理する方法と、も提供する。
【００１８】
本発明の更なる開示の前に、本明細書、例及び請求項で使用される用語を、参考のために下記に集めた。
【００１９】
「生物試料」という用語は、生物体の細胞内又は細胞外成分のうちの１つ又は複数を含有する試料を言う。そのような成分には、ヌクレオチド（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの断片及びプラスミドなど）、ペプチド（例えば各種構造蛋白質及びこれらの断片、酵素など）、炭水化物などが含まれるが、これらに限定されることはない。ここに記載する生物試料に、上述の処理を実施するための、当業で周知の輸送媒体、生物学的緩衝剤及びその他の試薬が更に含まれていてもよい。本発明の方法は、いかなる量の生物試料を対象としても実施可能であるが、好適には、本発明に基づく生物試料は、マイクロリットル（μＬ）単位の量であり、従って、例えば生物学的顕微試料などの顕微試料を指すものとしてもよい。
【００２０】
「カセット」という用語は、例えば９６個以上の試料を処理することの可能な構造体又は「モジュール」を言う。
【００２１】
「透析」という用語は、当業で周知であり、溶液中の複数の物質を、膜を通過する拡散性の違いを利用して分離することを指すものととして理解されている。ここで使用する「平衡透析」という用語は、透析物質の交換又は流れを伴わない透析を指す。「並流透析」という用語は、透析物質の並流（又は向流）を伴う透析を指す。「交換透析」という用語は、膜の周囲の透析物質の少なくとも１つの変化を伴う透析を指す。
【００２２】
「枠」という用語は、毛管の機械的支持に適した任意の構造を指す。
【００２３】
「ホテル」という用語は、１つ又は複数のカセットを収容し、試料処理の作業台として機能する装置を指す。一実施例においては、前記ホテルは、例えば水又は空気などの流体を循環させることにより温度を管理する試料のサーマルサイクリングに使用される。前記ホテルは、試料の精製のための作業台としても機能する。例えば、一実施例においては、前記ホテルは、透析液を循環させる試料透析に使用される。更に別の一実施例においては、前記ホテルは、カセットの洗浄時に試料の損失を防止できるような、又はカセットの再生処理が可能であるような具合に液体（例えば水又は化学洗浄液など）を循環させるための洗浄作業台として有利に機能する。
【００２４】
「フィルタ」及び「膜材」という用語は、例えばサイズ排除などの、拡散性の違いを利用した溶液中の物質の分離に使用可能な物質を指す。例として挙げられる膜材及びフィルタは、半透性である；即ち、前記膜材又はフィルタが、透析を起こさせることが可能である。
【００２５】
「精製」という用語は、その様々な文法形及び同義語（例えば、精製、精製すること、洗浄など）を含め、所望の成分から所望でない成分を分離するあらゆる作業を包含するものとして意図されている。そのような作業には、濾過、限外濾過、透析／平衡透析、クロマトグラフ法などが含まれるが、これらに限定されることはない。複数の実施例においては、生物試料中の複数の成分を分子サイズで区別することにより、精製を行う。分子サイズ差による精製は、いかなる数の当業で周知の様々な多孔度の材料を用いても実施可能であり、そのような材料には、フィルタ、膜及び半透性の限外濾過繊維材料が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００２６】
ここで互換可能に使用される「温度処理」、「温度加工」及び「熱処理」という用語は、実施中の処理の種類に応じて様々な温度条件を試料に与えることを指し、例えば変性、アニーリング、インキュベーション、沈降などの連続的及び非連続的加熱管理が含まれるが、これらに限定されることはない。例えば、これらの用語には、広義にはＰＣＲ及び類似の処理方法に関連したサーマルサイクリングが包含される。
【００２７】
「限外濾過」という用語は、試料が透析物質に対して相対的に陽圧下にある任意の透析方法を指す。
【００２８】
本発明によれば、生物試料の精製を、透析、濾過、限外濾過及びクロマトグラフ法を含めた様々な方法で行うことが可能である。本発明は、選択した精製方法に応じて異なる、精製を実施するための様々な構成を更に提供する。例えば、精製方法が平衡透析である場合には、本発明の装置は、例えば水などの透過物質と作用可能に接触している膜材を有する、少なくとも１本の毛管を提供する。精製方法が交換透析である場合には、毛管を連続的に少なくとも２つの透析物質に曝してもよい。精製方法として並流透析を用いる場合には、毛管カセット１０に、透析物質を流入及び／又は流出させるための１つ又は複数のポートが更に含まれてもよい。
【００２９】
本発明には、微小透析を利用した試料洗浄及びプラスミド洗浄が更に含まれる。
【００３０】
ここに述べるように、本発明には透析方法が含まれるが、この方法を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及びサイクルシーケンシング反応の「洗浄」に有効に用いてもよい。従来の透析の問題の一つは、規模の問題であった。通常、透析は、少なくとも１ｍＬ以上の比較的大規模な量の試料を対象に行われる。一方、通常のＰＣＲ又はシーケンシング反応で用いる試料の量は、一般にはおよそ１０μＬ以下であり、この量は、従来の透析方法の試料の量よりも大幅に少ない。
【００３１】
本発明は、例えば前記複数の毛管のうちの１つの内部に一本又は複数のマイクロファイバなどの膜材を任意に挿入することにより、この不均衡を解決しようとするものである。前記マイクロファイバは、遙かに大規模な透析と同じ分離機能を、遙かに少量の試料を対象として発揮することが可能であり、しかも遠心分離が不要である。前記マイクロファイバを、市販の濾過カートリッジから１本又は複数の中空繊維を抜き出すことによって作成又は製造してもよい。通常のカートリッジは、例えば１ｍＬ以上の大規模な量の試料を対象とした透析のみを目的として設計されているので、何百本もの繊維を収容している。様々な種類及び大きさの中空繊維濾過カートリッジが、例えばマサチューセッツ州のミリポア・コーポレーション社又はカリフォルニア州のスペクトラム・ラブズ・ラグーナ社などの製造業者から入手できる。通常、これらのカートリッジは、限外濾過装置に使用される。このような装置では、透析膜がフィルタとして作用し、システムに圧力又は陰圧が加えられると、所望の生成物を通過させずに、所望でない成分を通過させる。本発明は、各生物試料毎に１本の繊維を使用することにより、少量の生物試料からの成分の濾過又は分離を適切に行う。このような方法で、１０μＬから０．０５μＬの試料を対象とした透析を行う。
【００３２】
一実施態様によれば、本発明は、０．０５μＬから１０μＬの大きさの反応試料を対象とした適切な精製を行うために、最初に、カリフォルニア州フォスターシティのピーイー・アプライド・バイオシステムズ社の標準的なビッグ・ダイ・ターミネータ・サイクル・シーケンシング・レディ・リアクション・キット、部品番号４３０３１５４を使用する。カリフォルニア州のスペクトラム・ラブズ・ラグーナ社のＳｐｅｃｔｒｕｍカートリッジ、カタログ番号１３２２２９から切り出した中空繊維フィルタ中に、前記試料を吸引する（図２を参照のこと）。次に、ここに記載の様々な方法のうちのいずれかに従い、精製を行う。
【００３３】
従来の透析は、優れた方法ではあるものの、少量の試料を対象として行う場合には、試料の損失を避けることは困難であった。小さな成分を自由に通過させる一方で、より大きな成分を選択的に保持する、様々な多孔度の半透性のマイクロファイバを用いた限外濾過材料が入手できる。これらの濾過材料は、蛋白質の限外濾過に広く使用されているが、毛管を利用した透析に使用できるのはこれらのうちの一部のみである。ＰＣＲ及びＤＮＡシーケンシングで除去される反応成分は全て、所望の生成物よりも遙かに小さいので、本発明の処理方法は、これらの反応における「洗浄」方法として最適である。
【００３４】
本発明は、ＤＮＡ反応混合物から汚染物質を迅速かつ効率的に除去するための精製及び洗浄方法にも関する。現在のシーケンシング機器は、ゲルを用いた電気泳動法により、適切に標識された様々に異なる長さのＤＮＡを分離及び検出する。これらの機器がより速くかつより正確に結果を提供できるようにするために、ゲル分離培地の形状は、以前の分厚いゲルから、薄い毛管に入れたゲルへと変化してきた。しかし、この方法には、シーケンシングされるＤＮＡ中の汚染物質により、毛管が物理的に塞がれてしまい、前記様々に異なる長さのＤＮＡの正確な検出が妨げられることが多いという大きな欠点がある。ＤＮＡ試料中の汚染物質の主な源の一つは、このＤＮＡ試料を精製するサーマルサイクリング反応の副産物である。反応の間にＤＮＡ鎖に組み込まれなかった通常の及び染料で標識されたヌクレオチドは、双方とも、ＤＮＡシーケンサを劣化させる汚染物質となる。加えて、反応中に存在する試薬のイオン成分（例えば塩など）も、機器を劣化させる。
【００３５】
一実施態様においては、本発明は、サーマルサイクリング反応における汚染物質を効果的に除去する。反応混合物のサーマルサイクリング後、前記混合物を、イオン成分濃度のより低い溶液と接触している中空の膜材の中に入れることにより、精製を行ってもよい。前記膜の内側と外側との間の浸透圧の違いにより、前記生成物中の汚染物質が前記膜を通過して前記水溶液中に拡散し、これらの汚染物質を前記生成物から効果的に除去する。
【００３６】
別の一実施態様においては、本発明は、宿主細胞中で産生されたＤＮＡ分子を精製するための装置及び方法を提供する。
【００３７】
本発明が関与する処理には、鋳型精製、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＤＮＡシーケンシング、ポリヌクレオチドライゲーション、クローニング、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、一塩基伸長反応、エキソヌクレアーゼ処理及びオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション反応が含まれるが、これらに限定されることはない。これらの処理に関連する処理手順には、例えば、吸引、混合、インキュベーション、精製、例えば加熱又は冷却などの温度処理及び、生物試料を単独で又は生体親和性の担体流体に入れて、選択された方法で送達することが含まれる。
【００３８】
図１に示すように、本発明の第１の実施例は、例えば中心間の寸法が９ｍｍである８×１２列の要素などの標準的なマイクロタイタプレート形状に基づく、既存の実験自動化装置及び毛管電気泳動（ＣＥ）シーケンシング機器に直接に組み込むことの可能な毛管カセット１０に関する。この実施例の設置面は、９６ウェル・プレートと同じ寸法であろうが、高さは毛管材料の適切な長さに合わせて増加させることが可能であってもよい。この実施例により、例えばロビンズ社製のＨｙｄｒａなどの既存の９６チャネルのピペッティング装置を、更に液体処理作業にも使用することが可能となる。本発明の毛管カセット１０を、いかなる数のチャネルを有するピペッティング装置に合わせて形成してもよい。その他の装置には、３８４以上の数のチャネルが設けられていてもよい。
【００３９】
本発明の毛管カセット１０には、複数の毛管１２が含まれる。各毛管１２は、第１の端部１４と、第２の端部１５とを有し、これらのそれぞれが、枠１６の内側に固定支持されている。枠１６は、９６本の毛管１２を収容可能に形成されていてもよいし、又は、図１に示すように、毛管カセット１０の複数の毛管１２を小分けにしたセットの１つを収容可能に形成されていてもよい。複数の毛管１２の間に間隙１８が設けられていることにより、液体又は気体などの流体が、毛管カセット１０の内部で、またはこれを通って流れることが可能となっている。
【００４０】
従って、組み立てた毛管カセット１０は、複数の毛管がその中に配置された内部チャンバ３０を規定し、前記内部チャンバ３０中に空気又は水を導入して毛管の周囲を循環させることにより、サーマルサイクリング又は透析を実施することが可能である。
【００４１】
好適な一実施例においては、前記複数の毛管は、およそ１マイクロリットル未満の量の流体に適した内容積を有することが望ましい。本発明の方法は、およそ０．０５μＬ以上、好適には０．１μＬから３μＬまでの容積を有する生物試料を対象として有利に実施される。
【００４２】
前記新規なマイクロリットル未満の毛管を用いることの利点の一つは、最小限の量の高額なシーケンシング試薬と、比較的少量の生物試料とを、自動化された試料処理フォーマットで使用することが可能であるという点にある。本発明を、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物の精製処理、シーケンシングラダーの作製、及び前記シーケンシングラダーの適切なマイクロタイタプレート中への注入、又は前記生物学的生成物の吸引に使用してもよい。
【００４３】
本発明の毛管カセット１０には、第１及び第２の端部２０、２２が設けられている。前記毛管カセット１０のこれらの第１及び第２の端部２０、２２は、開いていてもよし、又は端板２４により閉じられていてもよい。前記端板２４に、毛管カセット１０の内部チャンバ３０内を通過する気体又は液体などの流体の出入りを容易にする複数のポートが更に設けられていてもよい。好適には、シーリングガスケット２６が、枠１６と、前記端板２４との間に更に設けられている。図１に示すように、複数の枠１６を使用する場合には、前記複数の枠１６の間にシーリングガスケット２６が更に設けられていてもよい。
【００４４】
毛管カセット１０が複数の枠１６から形成されている本発明の変更例においては、前記複数の枠１６を互いに固定するための、例えば複数のピン２８などの１つ又は複数の固定具を収容するための複数の孔が、前記複数の枠に更に設けられている。前記複数のピン２８は、複数の更なる端板２４も前記枠１６に固定している。好適には、図１に示すように、それぞれがねじ山を有し、対応する複数のナットが使用される４つのピン２８が、複数の枠１６の外辺部に間隔を空けて配置されている。ねじ、リベット又はその他の圧縮固定具を、前記複数のピン２８と組み合わせて、又はこれらの代わりに、更に使用してもよい。前記複数のピン２８又はこれらの代替物は、ステンレススチール製であることが望ましい。
【００４５】
毛管カセット１０中の複数の毛管１２の総数を小分けにしたセットを収容する複数の枠１６を使用することにより、一本の毛管が破損した場合に、前記複数の毛管１２の一部を取り替えることが可能である。従って、毛管カセット１０中の全ての毛管１２を廃棄する必要がなく、破損した毛管と枠１６を共有している複数の毛管１２のみを廃棄する。
【００４６】
図２に、本発明の第１の実施例の変更例に基づく枠１６を図示する。本発明の第１の実施例に基づき、ドッキングポート４０が設けられていてもよい。前記ドッキングポート４０が、毛管１２の前記第１の端部１４と前記第２の端部１５とに流体により接続すべく、枠１６に取り付けられていてもよい。ドッキングポート４０が、毛管１２の一方の端部のみに設けられていてもよいし、もしくは全く設けられていなくてもよい。
【００４７】
図３及び図４に示すように、前記ドッキングポート４０には、ガイドキャップ４２が含まれる。前記ガイドキャップ４２には、前記毛管１２と同軸に位置合せされた針４４を案内すべく、前記毛管１２から離れる方向に面している凹形の表面が設けられていてもよい。前記針４４は、先の尖っていない注入針であることが望ましいであろう。前記ガイドキャップ４２が、前記枠１６に固定支持されていてもよい。前記ガイドキャップ４２が、前記枠１６の一部分の中に圧入されていてもよい。しかし、前記ガイドキャップ４２を前記枠１６の一部分の中に取り付けるためには、接着剤を用いることが望ましい。シーリング要素４６がドッキングポート４０中に設けられていてもよい。前記シーリング要素４６は、好適にはアップル・ラバー・コーポレーション社のゴム製のＯリング型グランドシールであり、ガイドキャップ４２の空洞４７内に圧入される。前記シーリング要素４６及び空洞４７は、前記シーリング要素４６を損傷することなく前記先の尖っていない針４４が前記シーリング要素４６を貫通して挿入される一方で、同時に前記毛管１２の対応する端部を液密にシールすることが可能であるような寸法に形成されている。先の尖っていない針４４を使用することにより、前記シーリング要素４６に与える損傷を軽減すると共に、前記ドッキングポート４０を多くの回数にわたって繰り返し使用することが可能である。
【００４８】
異なる溶液（例えば、ＤＮＡと、ビッグ・ダイ・ターミネータ・サイクル・シーケンシング・レディ・リアクション・ミックス（ＤＴ−ｍｉｘ））を、僅かな空間を隔てた（ことにより相互汚染を最低限に抑える）別々の「塊」の形で吸引してもよい。このような場合、各毛管１２のそれぞれの端部にドッキングポート４０が取り付けられていることが望ましい。
【００４９】
好適な複数の実施例においては、前記毛管は、ガラス、石英ガラス、ポリイミドで被覆した石英ガラス又はＴＥＦＬＯＮ（商標名）から作成されている。前記枠と前記端板とは、射出成形された部品として製作されていることが望ましい。
【００５０】
複数の毛管を、様々な方法で本発明の装置の中へ組み込むことが可能である。一実施例においては、複数の毛管を適切な大きさに切断し、鋳造した溝の中に嵌め込み、所定の位置に固定する。複数の毛管を、耐水性かつ耐熱性の接着剤を用いて固定してもよい。
【００５１】
多数の毛管を使用することの大きな利点は、前記毛管内で処理される担体流体全体のうち、蒸発する流体の容積が比較的小さいため、各毛管の試料容積が、非常に少量の試料の処理が可能であるような容積であるという点である。この試料保全性の高さにより、選択された試料処理を行うために必要な試料の容積が大幅に減少されると同時に、信号強度及び解像度の良好なシーケンシングラダーを有する試料が得られる。一例として、このシーケンシング機器で検出可能な蛍光標識ＤＮＡの量は、通常の処理量よりも遙かに少なく、０．５μＬから１μＬの試料で十分である。
【００５２】
図５は、前記試料処理チャンバの構成を変更した、本発明の第２の実施例を図示したものである。本発明の前記第２の実施例では、複数の毛管の代わりに平膜６１を使用する。平膜６１が、枠６２の両側にわたって設けられている。図５では、前記枠６２の切込みと、平膜６１の２つの層とにより、試料処理チャンバ６４が形成されている。図５に示すように、第１の平膜の層６６が、前記枠６２の前面に沿って設けられている。図５に示すように、第２の平膜の層６８が、前記枠６２の後面に沿って設けられている。
【００５３】
本発明の第１及び第２の実施例中に、中空の繊維７０が取り付けられていてもよい。
【００５４】
上述のように、本発明の第２の実施例は、持続性及び経済性が高い。毛管を使用しないので、前記枠６２を粗雑に扱っても、ガラスが割れることがない。更に、前記平膜６１を用いて複数の試料処理チャンバ６４を形成するので、各枠を迅速かつ容易に形成可能である。
【００５５】
本発明の第３の実施例によれば、毛管カセット１０を、液体処理機８０と組み合わせて使用する。米国のロビンズ・サイエンティフィック社製の一連のＨｙｄｒａ液体処理機は、並列な複数のチャネルから、選択された容積を同時に、正確に、かつ安定に吸引することが可能であるという利点を有する。これらのシステムにより、ＲＳ２３２ポートを介した物理的プレート処理システム及びＰＣ利用プログラミングシステムとの統合が容易となる。ロビンズ社製のＨｙｄｒａは、注入器のプランジャがテフロン（登録商標）でシールされており、３８４チャネルのモデルがあり、全体に比較的低コストである点でも好適である。
【００５６】
本発明の第３の実施例によれば、前記液体処理機８０は、複数の針４４と、針位置合せ枠８２とを有する。前記針位置合せ枠８２は、前記複数の針４４を、前記毛管カセット１０の前記複数の毛管と同軸に位置合せすべく構成されていることが望ましい。複数のドッキングポート４０が、前記複数の毛管１２の第１の端部１４に設けられて、前記複数の針４４の前記複数の毛管１２に対する位置合せを補助してもよい。
【００５７】
複数の針９２を備えた針床９０が前記毛管カセット１０の下側に設けられていてもよい。針９２は、それぞれ、前記毛管カセット１０の方向に面した第１の端部９４と、前記毛管カセット１０とは反対の方向に面した第２の端部９６とを有する。図８に示すように、複数の針９２の前記第１の端部９４は、毛管１２の前記第２の端部１５と流体により接触しているドッキングポート４０を貫通して挿入可能であるように、前記毛管１２の前記第２の端部１５と同軸に位置合せされている。前記複数の針９２の第２の端部９６が、マイクロタイタプレート１００のウェル１０２内に挿入可能であるように構成されていてもよい。
【００５８】
前記液体処理機８０は、前記複数の針４４、前記針位置合せ枠８２、前記毛管カセット１０、前記針床９０及び前記マイクロタイタプレート１００が垂直に相対移動可能であるように構成されていることが望ましい。好適には、前記液体処理機８０には、前記マイクロタイタプレート１００を支持するためのテーブル表面８４が設けられている。
【００５９】
図９は、本発明の第２の実施例の、毛管を使用せずに針床９０とマイクロタイタプレート１００とを使用した構成の断面斜視図である。図１０は、中空の繊維７０と複数のガイドキャップ４０とが設けられた試料処理チャンバ６４の一例を示す斜視図である。上述のように、第１の平膜層６６が枠６２の前面に沿って設けられ、第２の平膜層６８が枠６２の後面に沿って設けられている。
【００６０】
温度制御及びサーマルサイクリングのために、適切に配置された複数の弁を有する二温度流体循環システムを用いて、広範囲の温度を迅速に得られるようにしてもよい。例えば、加熱源４０を使用して、毛管１２内に配置した試料を加熱してもよい。前方から後方、側方から側方、全体的な循環などの様々な流れのパターンを生成してもよい。
【００６１】
前記サーマルサイクラーにおいて、高温及び低温の流体を組み合わせて用いて試料の温度を変化させてもよい。或いは、単に送風機により、又は流体ポンプにより、又は周囲の空気もしくは抵抗加熱器により加熱された空気を前記毛管に吹き付けることにより、温度を変化させてもよい。温度を、標準的な比例積分微分（ＰＩＤ）コントローラにより測定及び制御してもよい。加熱速度を、例えば加熱サイクルの最初の段階では過熱流体を用いて必要に応じて増加させ、その後冷却流体を用いて前記毛管の温度の過剰な上昇を防止してもよい。
【００６２】
光センサを本発明と関連させて用いることにより、１つ又は複数の時点における流体レベルを検出し、必要な場合には、開ループ又はフィードバック制御により試料又は流体の体積レベルを調節してもよい。
【００６３】
本発明は、所望の場合には、標準的なマイクロタイタプレートを試薬源として使用して、多くの試料を並列に処理することが可能である。毛管を本発明と関連させて使用することは、液体の体積のうちの僅かな留分のみが大気に曝されるので、蒸発が最小限に抑えられるという点で有利である。このことにより、試料の処理効率が向上すると同時に、試料の損失が防止又は軽減される。前記システムの毛管を、例えば圧電要素、可動ピストン又は注入器型プランジャなどの空気又は液体充填容積測定装置と組み合わせて、流体の回収、混合及び分配に使用してもよい。
【００６４】
多くの場合、ＤＮＡシーケンシング生成物を精製して、余分な塩、ヌクレオチド、プライマ及び鋳型を前記生物試料から除去する。図示されたマイクロファイバ７０をＤＮＡの濾過処理に用いて、前記処理装置の基部に近い方の端部が陽圧又は陰圧状態に曝されている時に、所望の生成物は通過させずに所望でない生成物を通過させるようにしてもよい。前記ＤＮＡ試料が、前記装置中で発生する圧力により前記マイクロファイバを通って循環することにより、比較的少量の成分、ひいては前記試料が、前記中空のファイバから濾出される。１本又は複数のマイクロファイバ７０が収容された毛管を使用することにより、およそ１０マイクロリットルから０．０５マイクロリットルの非常に少量の平衡透析を行うことが可能である。
【００６５】
前記カセットの上部に取り付けたピペットが、マイクロタイタプレートなどのウェルプレートから処理用の毛管内へと試料を吸引できるような具合に、前記ウェルプレートを配置してもよい。次に、複数の針を前記カセットの上部及び底部から引き抜いて、グランドシールを閉じることにより、前記カセットの前記毛管を有効にシールしてもよい。前記複数のカセットのサーマルサイクリング又は透析を、そのままの位置で、又は、下記のように別々のホテルに移動させてから行ってもよい。
【００６６】
本発明の別の一実施例においては、複数のカセットが９６チャネルの複数のピペッタに固定されており、針床が前記カセットの底部に固定されている。試料処理の間、前記複数の毛管の上部は注入器によりシールされており、前記複数の毛管の底部は、下側の注入器の先端をガスケット材料に嵌め込むことによりシールされている。
【００６７】
本発明の一変更例は、透析物質（例えば水など）を流入又は流出させるための複数のポートを有する毛管カセットに関する。前記複数のポートは、前記カセットの互いに対向する端部に位置することが望ましい。
【００６８】
図１４は、ホテルの一実施例を図示したものである。サーマルサイクリング及び／又は透析の実施中に、ホテルを用いて、洗浄、試料の相互汚染の防止、及び／又は適切に機能しないカセットの化学的再生処理を図ってもよい。この実施例においては、前記システムが、前記サーマルサイクリング又は透析用の複数の毛管の空隙を通して、水又は他の何らかの溶液（酸、塩基又は洗剤）を再循環させてもよい。別の一実施例においては、前記水又はその他の溶液を加熱する。
【００６９】
本発明は、複数の並列処理用のカセットを収容可能な「ホテル」を提供することにより、透析又はサーマルサイクリング処理中に多数の試料を効率的に処理する。一実施例においては、ホテルはカセットを１５−２０個まで処理可能である。前記ホテルの各ハウジングは、それぞれに別個のカセットを収容及び処理する。前記ホテルには、個別のカセットに対応し、そのカセットと、透析、サーマルサイクリング又は洗浄媒体とを流体により適切に接続するための取付け具が含まれる。好適な一実施例においては、前記複数のカセットの前記端板には、前記ホテル内の同様の器具と嵌合する専用の流体コネクタが含まれる。前記カセットは、処理の間前記カセットを把持し、かつこれを前記ホテルの前記ハウジングに対して固定保持するための手段が含まれるトレイ上に載置されていてもよい。
【００７０】
一実施例においては、透析ホテルが、透析溶液を前記複数のカセットに再循環させ、またこの機能を実行するためのリザーバ及びポンプを有する。前記ポンプは、前記溶液を、前記ホテルのすべてのステーションを通過するように常に再循環させる。カセットを取り付けると、弁が開いて、この再循環している透析物質の流れが前記カセットを通過し、前記リザーバに戻ってくる。図１５は、本発明に基づく透析ホテルの一実施例を図示したものである。透析物質を供給するための針床３９０を用いてもよい。
【００７１】
別の一実施例においては、サーマルサイクリングホテルが、複数の閉じた導管を通して、例えば空気又は液体などの高温及び低温の流体を再循環させる。前記高温の空気の源は、例えば電気抵抗要素により約１００℃に保たれ、また前記低温の空気の源は、周囲空気であってもよい。別の複数の実施例においては、前記低温の空気の源は、冷却装置である。ホテルの各ハウジングに、前記高温空気源と低温空気源とを選択的に混合することにより、前記カセットを通過して循環している空気の温度を制御する比例混合弁が設けられている。カセットを取り付けると、弁が開いて前記混合空気が前記カセットを通過して流れる。本発明は、前記カセットに流入する（又はここから流出する）空気流中に温度センサを任意に配置することにより、サーマルサイクリング時に前記混合弁を操作して温度及び時間プロフィールを制御するコントローラに正のフィードバックを与える。前記ホテルの各ステーション内の制御ユニットが、予め設定されたサーマルサイクリングプロトコルを開始させ、好適には、終了するまで継続させる。別の一実施例においては、水などの液体を空気の代わりに熱伝達媒体として用いて、前記カセット内の全ての毛管の温度特性の均一化を図ってもよい。
【００７２】
更に別の一実施例においては、洗浄ホテルが、前記複数の毛管の内表面を使用の度に洗浄することにより、試料の相互汚染を最小限に抑制及び／又は防止すると共に、前記膜要素の微孔特性を保持する。好適な一実施例においては、前記洗浄ホテルは、カセットがあるステーションに設置される度に洗浄液を循環させ、その後水ですすぐ。前記複数のカセットを、サーマルサイクリングホテルの場合とは異なる方法で前記洗浄ステーション内に配置し、前記循環している溶液が、毛管の外側ではなく内側に向かうようにしてもよい。循環ポンプは、好適には、毛管壁から沈殿物を除去するために、約１５ｐｓｉの圧力を発生可能であることが望ましい。適切な再生化学物質を用いて、化学的再生を行ってもよい。
【００７３】
図１１−１３に示すように、本発明の一実施例は、プラスミド鋳型作製用の透明溶解液を生成するシステムまたは「鋳型作製モジュール」に関する。このシステムはＨｙｄｒａに取り付けられ、細胞をディープウェルプレートから処理するための加熱及び濾過機能を有する。このユニットは、トランスファー（原語ｔｒａｎｓｆｅｒ）Ｈｙｄｒａの設計に基づくが、マルチウェルフィルタプレートの代わりにフィルタ材料のロールを用いた専用の濾過マニホールドを有する。好適な一実施例においては、溶解緩衝液に再懸濁した細胞を入れたディープウェルプレートを前記システムに配置し、試料を大容量（１００μＬ）のサーマルサイクリングカセット中に吸引する。試料を９５−１００℃で１分間加熱し、前記ディープウェルプレートを取り除く。前記濾過マニホールドを前記カセットの下側に配置し、前記フィルタ材料を前記マニホールドを用いて適切な位置に固定して（各ウェルを有効にシールし）、試料を、前記フィルタ材料を通して、前記マニホールドの下側の受け皿に陰圧吸引する（約３分間）。又は、前記試料に陽圧を印加することにより、濾過を行ってもよい。次に、前記フィルタ材料を前記マニホールドから外して前進させ、前記マニホールドとカセットとを洗浄して、次の試料に備える（約１分間）。この濾過装置が前記カセット及び針床に対して横方向に動き、前記フィルタ材料のロールが出入りするので、前記カセット、複数の針及びマニホールドの洗浄が可能である。図１６は、鋳型作製モジュールの一実施例を図示したものである。
【００７４】
器具管理装置３００を好適に用いて、処理の間、上述の複数の部品を操作する。
【００７５】
本発明によれば、市販のハードウェア及びソフトウェアにより、自動処理を行ってもよい。シーケンシング及び仕上げ処理の主な作業の簡便化を図るためのカスタマイズされた自動化システムが開発されており、当業者に知られている。そのようなシステムには、好適には：１）シリカビーズを用いた鋳型作製、定量、並びにＣＲＳシステムズ社製のロボット、テカン社製の２つの液体処理ステーション、蛍光測定器、サギアン社製の９６チャネルピペッタ、及び複数のプレートスタッカ及びシーラーを利用した試料再構成のためのロバストプラットフォームと、２）セイコー社製のＤ−Ｔｒａｎロボットと、インテリジェント・オートメーション・システムズ社により、マイクロアレイスポッティンッグ用に設計されＧＴＣ用に構築されたプレート操作システムとを用いた、「ペーパーコーム（原語ｐａｐｅｒ　ｃｏｍｂ）」の自動作成及びスポッティングのためのカスタムプラットフォームと、３）高性能記憶及び検索システム（Ｇｉｒａ）、テカン社製の液体処理ステーション、クアドラ社製の９６チャネルのピペッタ、２つのプレートスタッカ及びプレートシーラーを中心とした仕上げ自動化システムと、が含まれる。加えて、当業者は、既知のデータベース及びソフトウェアツールを用いて、本発明の装置及び方法を自動化することが可能である。
【００７６】
好適な一実施例においては、本発明は、標準的なアルカリ溶解化学と、シリカビーズを用いた可逆的捕獲（原語ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　ｃａｐｔｕｒｅ）（Ｅｎｇｅｌｓｔｅｉｎ、１９９８年）との組合せに基づくプラスミド単離方法（「自動鋳型作製」又は「ＡＴＰ」）を提供する。この方法は、キアゲン社が開発した作製方法に比肩する、又はこれを上回る質のデータを得られる鋳型を作製することの可能な濾過利用方法の設計基準を満たすものであり、試料を４℃で６ヶ月間安定に保存することができる。ＡＴＰハードウェアには、好適には、ロボットマニピュレータ（ＲｏＭａ）を備えたテカン社製のＧｅｎｅｓｉｓ　２００、ＣＲＳ社製のＴ４７５、サギアン社製のＭｕｌｔｉｐｅｔｔｅ　９６チャネルピペッタ、テカン社製のシェーカ、サイテック社製の真空マニホールド及び乾燥ステーションが含まれる。
【００７７】
自動マイクロプレートヒートシーラー（マーシュ・バイオメディカル社、ニューヨーク）は、ＲＳ２３２性能を有し、複数の異なる可塑性材料から形成されたプレートに対応可能である。これらのプレートをシールするために用いる材料は、可塑性の薄膜で補強したアルミニウム箔であり、シールするマイクロプレートの組成によって異なる。シール処理としては、シールを各ウェルの縁に溶接し、前記可塑性の薄膜の温度と厚さとによって前記シールの強度を調節する。このことにより、永続的かつ除去可能なシールを処理に用いることが可能である。又は、より薄い箔を用いて、ピペッティングロボットがシールに穴を開けて試料に到達できる（「簡易穿孔シール」）ようにしてもよい。
【００７８】
試料処理装置を、積み重ね可能な複数の独立したモジュールとして構成してもよいし、又は液体処理手順を実行するために一時的に液体処理装置に取り付けてもよい。この方法の利点は、多数の透析モジュール及びサーマルサイクリングモジュールを用いた試料処理に、システム中で最も構築費用のかかる部分である液体処理装置をより最適に用いることが可能であろうという点である。次に、後者のモジュールを、複数のプレートを通常の統合自動化システムで処理するのと同様の方法で処理し、各ユニットが前記液体処理装置から切り離された時に自動的に有利にシールされ、また、プレートからプレートへの移送の代わりに毛管から毛管への移送を行う（ことにより、周囲空気との接触を避ける）ようにしてもよい。
【００７９】
毛管内で加熱された１００ナノリットル試料の目視検査（顕微鏡を使用）により、毛管の両端がシールされていないと急速に試料が分散する（急速な気体放出又は局部的な沸騰によると思われる）ことが判明した。管の一方のみを注入器によって有効にシールした、より量の多い試料を用いた実験では、サーマルサイクリングの間、試料スラグの急速な前後運動が観察された。これは、毛管内の閉じた空間における蒸気圧の変化によるものと思われる。毛管の開いている方の端部に圧力を僅かに加えることにより、この動きを防止し、長型ＴＥＦＬＯＮ（商標名）毛管でサーマルサイクリングを良好に行うことができた。従って、シール手段、弁又は圧力制御システムは、ロバスト流通毛管サーマルサイクリングシステムの部品として望ましい。
【００８０】
本発明は、毛管を利用した生物試料の吸引、インキュベーション、生成及び送達を目的とした、多数の試料を並列に処理可能な統合型の毛管利用試料処理システムに関する。本発明は、操作が簡単で何度も再利用できる、統合型のピペッティング、混合、温度処理及び試料精製装置を更に提供する。
【００８１】
別の一実施例においては、本発明は、既存の実験用自動化装置及びシーケンシング機器との統合が可能な毛管カセットシステムを提供する。前記カセットには、上部と底部とに複数の開口部を有する複数の開放した枠が含まれる。好適な一実施例においては、前記枠の上部と底部とには、開口部が１２箇所設けられている。前記枠のそれぞれの角には、複数の枠を接続するための、例えばピンなどの手段のための穴が設けられている。一実施例においては、前記複数の枠は、シーリングガスケットにより隔てられている。
【００８２】
本発明の別の一実施例においては、毛管は、例えばシーリングにより漏出を防止すると同時に、例えば注入器による穿孔が可能であるように設計されている。このような構成により、陽圧又は陰圧の印加が可能である。例えば、この構成により、試料をマイクロタイタプレートから毛管に吸引し、その後更なる処理のためにプレートに戻すことが可能である。
【００８３】
本発明の更なる一実施例においては、空隙と、好適には毛管の各端部に設けられたシーリング要素とを使用することにより、一本の毛管内で複数の試料のサーマルサイクリングを行う。
【００８４】
本発明の別の一実施例においては、ＤＮＡとシーケンシング試薬とを、一本の毛管内で計量及び混合する。
【００８５】
本発明の更に別の一実施例においては、本発明は、各毛管の上部と底部とに設けられたシール上にガイドキャップを設ける。この構成により、注入器の針が前記毛管の開口部中に案内される。
【００８６】
本発明の更に別の一実施例においては、カセットに、空気又は水がサーマルサイクリング及び透析のために前記毛管内を通って流れることを可能にする開放した枠が含まれる。
【００８７】
本発明の別の一実施例においては、複数のカセットを、例えばサーマルサイクリング又は透析のための気温又は水温制御ステーション、或いは前記複数のカセットの再生処理のための洗浄ステーションなどのホテル中で処理する。
【００８８】
ここには明示していないが、ここに述べた複数の毛管にわたって、１つ又は複数の調整要素を配置すると好適であろう。
【００８９】
参考文献
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【００９０】
参考文献として編入
本願で開示された特許、公開特許出願及びその他の文献の内容はすべて、参考文献として特に編入したものである。
【００９１】
等価物
当該分野の熟練技術者は、本明細書に記載した発明の実施例の等価物を数多く、通常の実験で理解し、あるいは確認することが可能であろう。そのような等価物については、請求項に含まれるものとする。
【図面の簡単な説明】
本発明の以上の及びその他の目的、特徴及び長所は、添付の図面と関連させながら以下の詳細な説明を参考にすることにより、より十二分に理解されることであろう。前記の図面において、異なる図面を通じ、同様の参照記号は同様な要素を言及するものである。図面は、実寸ではないが、本発明の原理の実例を挙げたものであり、相対的な寸法を示したものである。
【図１】図１は、本発明の第１の実施例の変更例に基づく毛管カセットの斜視図である。
【図２】図２は、本発明の第１の実施例に基づく枠の斜視図である。
【図３】図３は、本発明の第１の実施例に基づくドッキングポートの拡大斜視図である。
【図４】図４は、本発明の第１の実施例に基づくドッキングポートの断面図である。
【図５】図５は、本発明の第２の実施例に基づく試料処理カセットの一部分の断面図である。
【図６】図６は、本発明の第３の実施例に基づく、液体処理機と組み合わせて用いる毛管カセットの斜視図である。
【図７】図７は、本発明の第３の実施例に基づく、液体処理機と組み合わせて用いる毛管カセットの斜視図である。
【図８】図８は、本発明の第３の実施例の断面図である。
【図９】図９は、本発明の第３の実施例に基づく針床及びマイクロタイタプレートと組み合わせて使用する、本発明の第２の実施例に基づく試料処理カセットの断面斜視図である。
【図１０】図１０は、本発明の第３の実施例に基づく針床及びマイクロタイタプレートと組み合わせて使用する、本発明の第２の実施例に基づく試料処理カセットの断面斜視図である。
【図１１】図１１は、本発明の第４の実施例に基づく鋳型作製モジュールの斜視図である。
【図１２】図１２は、本発明の第４の実施例に基づく鋳型作製モジュールの拡大斜視図である。
【図１３】図１３は、本発明の第４の実施例に基づく鋳型作製モジュールの拡大斜視図である。
【図１４】図１４は、本発明の第５の実施例に基づくホテルの斜視図である。
【図１５】図１５は、本発明の第６の実施例に基づくホテルの斜視図である。
【図１６】図１６は、本発明の第６の実施例に基づく毛管カセット及びホテルの拡大斜視図である。
【図１２】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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