(57)【要約】本発明は韓国ヘビであるアグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブ（韓国七点ヘビ：Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｓａｘａｔｉｌｉｓ ｅｍｅｌｉａｎｏｖ）の毒液に由来する蛋白であるサクサチリン、サクサチリンの製造方法、及び血小板凝集抑制剤及び抗腫瘍剤としてのその医薬的用途に関するものである。本発明者らはサクサチリンをアグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブの毒液から精製し、ｃＤＮＡをクローニングし、当該ｃＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換された微生物を培養することにより組換えサクサチリンを製造した。サクサチリンは血小板凝集及び腫瘍細胞の脈管形成を効果的に抑制するため、血小板凝集抑制剤及び抗腫瘍剤の活性成分としての実用が可能である。
2004506424.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のヌクレオチド配列で表されるｃＤＮＡであって、アグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブの毒液に由来する蛋白であるサクサチリンをコードするｃＤＮＡ。
【請求項２】
請求項１に記載のｃＤＮＡに由来し、配列番号１のアミノ酸配列で表されるサクサチリン。
【請求項３】
以下の工程：
（ｉ） アグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブから採取した毒液をゲル濾過して活性分画を得る工程；及び
（ｉｉ）上記活性分画を高速液体クロマトグラフィーにかけてサクサチリンを精製する工程
を含むサクサチリンの製造方法。
【請求項４】
請求項１に記載のｃＤＮＡを含む発現ベクター ｐＰＳＡＸ。
【請求項５】
請求項４に記載の発現ベクター ｐＰＳＡＸをピキア・パストリス ＧＳ１１５中に形質転換して得られたピキア・パストリス Ｙ／ｐＰＳＡＸ （ＫＣＣＭ−１０２０１）の生物学的純粋培養物。
【請求項６】
請求項１に記載のｃＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換された微生物を培養して組換えサクサチリンを得る工程を含む、組換えサクサチリンの製造方法。
【請求項７】
発現ベクターが ｐＰＳＡＸである、請求項６に記載の組換えサクサチリンの製造方法。
【請求項８】
形質転換された微生物がピキア・パストリス Ｙ／ｐＰＳＡＸ （ＫＣＣＭ−１０２０１）である、請求項６に記載の組換えサクサチリンの製造方法。
【請求項９】
形質転換された微生物をｐＨ５．５ないし６．５及び２５ないし３５℃の条件下で１２ないし２４時間培養して、遠心分離により採集し、０．５ないし１．５％（ｖ／ｖ）のメタノールを含む培地上でｐＨ５．５ないし６．５及び２５ないし３５℃の条件下で７２ないし１２０時間再び培養する、請求項８に記載の組換えサクサチリンの製造方法。
【請求項１０】
形質転換された微生物を含む培養物を疎水性カラム及び高速液体クロマトグラフィーにかけてサクサチリンを精製する、請求項８に記載の組換えサクサチリンの製造方法。
【請求項１１】
活性成分としてのサクサチリン及び医薬上許容しうる担体を含む血小板凝集抑制剤。
【請求項１２】
活性成分としてのサクサチリン及び医薬上許容しうる担体を含む抗腫瘍剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（技術分野）
本発明は韓国ヘビ、アグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブ（韓国七点ヘビ：Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｓａｘａｔｉｌｉｓ ｅｍｅｌｉａｎｏｖ）、に由来する蛋白であるサクサチリン（Ｓａｘａｔｉｌｉｎ）、サクサチリンの製造方法、及びその医薬的用途に関するものであり、より詳しく言えば、韓国ヘビ、アグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブ、の毒液に由来する蛋白であるサクサチリン、サクサチリンの製造方法、並びに血小板凝集抑制剤及び抗腫瘍剤としてのその医薬的用途に関する。
【０００２】
（背景技術）
腫瘍の侵食と転移は原発腫瘍から全身に腫瘍細胞が増殖し最終的に患者を死に到らしめる過程として定義されている。原発性悪性新生物（主に内皮）から剥がれた癌細胞が癌細胞とそれ以外の組織を分離する基底膜を通過する。通過細胞のあるものは内皮だけでなく血管を囲む基底膜にも侵入できるため、血管を経由して自由に移動でき最終的に毛細血管に定着することもある。癌細胞が再び毛細血管を通過すれば、それらは二次腫瘍を形成することもありうる。転移及び侵食により原発腫瘍から二次腫瘍が形成される確率は１／１０，０００以下である（参照： Ｅｒｋｋｉ Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ、７２−７７、１９９６）。
【０００３】
腫瘍の侵食と転移には細胞と細胞外基質（ＥＣＭ）の相互作用が必要である。転移に際して、腫瘍細胞は内皮に細胞死を誘導し、それにより基底膜を露出させて周辺間質中のＥＣＭ蛋白への腫瘍細胞の付着を容易にさせる（参照： Ｈｙｎｅｓ、Ｒ．Ｏ．、Ｃｅｌｌ、４８：５４９、１９８７）。これらの基質蛋白はインテグリンファミリーを含む細胞表面受容体と結合することにより細胞癒着を促進する。
【０００４】
構造的には、各インテグリンは非共有結合で連結されたαサブユニット及びβサブユニットにより形成されたヘテロダイマーである。β１サブファミリーは主要な接触媒体として細胞−ＥＣＭ基質癒着の場合と同様に細胞−細胞相互作用においても直接的な役割を果たしているという報告がある（参照： Ｌａｒｊａｖａ、Ｈ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１１０：８０３−８１５、１９９０）。白血球中に分布するβ２サブファミリーは細胞−細胞相互作用を媒介する受容体を含む。ビトロネクチン受容体及び血小板糖蛋白 ＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体を含むβ３サブファミリーは腫瘍の浸食性の発達と悪性腫瘍への進行において機能を果たす可能性がある（参照： Ａｌｂｅｌｄａ、Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５０：６７５７−６７６４、１９９０）。
【０００５】
細胞膜を横切って広がるインテグリン受容体複合体は細胞骨格ネットワークと細胞外基質を連結させる役割を持つ。フィブリノーゲン、ビトロネクチン及びラミニンのような細胞癒着分子に共通のコア配列が細胞の癒着、展開及び統合に寄与することが知られている。一方、癌の成長と転移はインテグリンの役割と密接な関係があるらしいということが示唆されている（参照： Ｇｉａｎｃｏｔｔｉ、Ｆ．Ｇ．ａｎｄ Ｒｏｕｓｌａｈｔｉ、Ｅ．、Ｃｅｌｌ、６０：８４９−８５９、１９９０； Ｈｙｎｅｓ、Ｒ．Ｏ．、Ｃｅｌｌ、６９：１１−２５、１９９２； Ｎｉｐ、Ｊ．ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９６：２０９６−２１０３、１９９５）。フィブロネクチン受容体α５β１の過剰発現はＣＨＯ（チャイニーズ・ハムスター卵巣）細胞の変異表現型を減少させ、ｒａｓに変異された齧歯類細胞におけるインテグリンα５β１の発現レベルを低下させることが知られている（参照： Ｐｌａｎｔｅｆａｂｅｎ、Ｌ．Ｃ．ａｎｄ Ｈｙｎｅｓ、Ｒ．Ｏ．、Ｃｅｌｌ、５６：２８１−２９０、１９８９）。フィブロネクチンポリマーであるスーパーフィブロネクチンは癌の成長と転移を妨げることが報告されている（参照： Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ、Ｒ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２：１１９７−１２０３、１９９６）。
【０００６】
インテグリンαＶβ３は殆んどの悪性腫瘍細胞のマーカーとして役立てることができ、そのことは悪性ヒトメラノーマの成長におけるインテグリンの役割を示している（参照： Ａｌｂｅｌｄａ、Ｓ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５０：６７５７−６７６４、１９９０）。インテグリンαＶ遺伝子の発現とそれによる癒着性表現型はヒトメラノーマのインビボでの増殖に直接的な相関関係を持つ（参照： Ｆｅｌｄｉｎｇ−Ｈａｂｅｒｍａｎｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８９：２０１８−２０２２、１９９２）。
【０００７】
一方、脈管形成とは既存の血管から新たな血管が発生することにより新たな血管が形成される過程のことである（参照： Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｊ．ａｎｄ Ｄ’Ａｍｏｒｅ、Ｐ．Ａ．、Ｃｅｌｌ、８７：１１５３−１１５５、１９９６）。脈管形成は発達、傷の治癒及び炎症に際して起こり、腫瘍の成長において必須の過程である。細胞癒着分子は平滑筋細胞及び毛細血管内皮細胞において脈管形成を調節する（参照： Ｎｇｕｙｅｎ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３６５：２６７、１９９３）。
【０００８】
腫瘍脈管形成のターンオーバーは刺激性調節因子と抑制性調節因子間のバランス変化により決定される。これに関連して、腫瘍脈管には二つのサイトカイン依存性経路が存在しており、これらは別個の血管細胞インテグリンであるαＶβ３及びαＶβ５によって区別される。これらの二種のインテグリンは新たに形成された血管内で発現され、ｂＦＧＦ（基本腺維芽細胞成長因子）、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）及び人間腫瘍断片により刺激される脈管形成において重要な役割を果たす（参照： Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７０：１５００−１５０２、１９９５）。αＶβ３インテグリンの活性化は血管の増殖と分化を誘導する生存信号を刺激し、このことはサイトカインとインテグリン受容体による信号伝達が脈管形成と関係を持つことを証明している（参照： Ｂｒｏｏｋｓ、Ｐ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、７９：１１５７−１１６４、１９９４）。
【０００９】
インテグリンの強力なアンタゴニストとして知られているジスインテグリンはヘビ毒液に由来する小蛋白である（参照： Ｎｉｅｗｉａｒｏｗｓｋｉ、Ｓ．ｅｔ ａｌ．、Ｓｅｍｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、３１：２８９−３００、１９９４）。殆んどのジスインテグリンは血小板フィブリノーゲン受容体であるα２ｂβ３により認識されるＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）又はＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＫＧＤ）モチーフを含む。ＲＧＤ配列を含むジスインテグリンはインテグリンが媒介する転移性細胞とＥＣＭの癒着を阻害し、最終的に転移を妨げることが報告されている（参照： Ｔｒｉｋｈａ、Ｍ．ｅｔ ａｌ．、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５４（８）：４９９３−４９９８、１９９４）。インテグリンαＶβ３はニワトリ胚とヒト細胞における血管原性脈管のマーカーとして同定されている（参照： Ｂｒｏｏｋｓ、Ｐ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４：５６９−５７１、１９９４）。インテグリンαＶβ３のモノクローナル抗体は新たに形成された血管の内皮細胞にアポトーシスを誘導することにより脈管形成を中断させる。インテグリンαＶβ３がリガンドに結合するのを妨げることが知られているＲＧＤ配列を含む合成ペプチドはＣＡＭ（ニワトリ絨毛尿膜）の腫瘍誘導性脈管形成を阻害する（参照： Ｂｒｏｏｋｓ、Ｐ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｃｅｌｌ、９９：１１５７−１１６４、１９９４）。さらに、内皮細胞の癒着と増殖を補助因子として助けることが知られているアンギオゲニンも合成ＲＧＤペプチドによって阻害される。最近、ヘビ毒液由来のジスインテグリンであるトリフラビンがＴＮＦ−αにより刺激される脈管形成を阻害することが報告されている。これらの結果はジスインテグリンである、合成ＲＧＤペプチド及び抗−αＶβ３モノクローナル抗体を抗癌剤として開発しうる可能性を提示するものである。
【００１０】
一方、ヘビ毒液は血栓症及び止血に影響を与える多種の蛋白を含むことが知られている。異常な血小板凝集の結果起こる血栓形成は致命的な血栓症を引き起こすため、血小板凝集アンタゴニスト又はアゴニストがヘビ毒液から単離され、同定された。凝集メカニズムとして、血小板凝集には血小板の糖蛋白であるＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体へのフィブリノーゲンの結合が介在し、フィブリノーゲン結合部位のＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）アミノ酸配列がフィブリノーゲンのＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体への結合に極めて重要であることが報告されている（参照： Ｒｏｕｓｌａｇｔｉ Ｅ． ａｎｄ Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ Ｍ． Ｄ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８：４９１−４９７、１９８７）。従って、上記配列を含む蛋白はＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体にフィブリノーゲンが結合することを拮抗的に阻害し、それにより血小板凝集の抑制を導く。当初、ヘビ毒液から単離されたＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対する阻害剤は５ｋＤないし９ｋＤの小蛋白であった（参照： Ｈｕａｎｇ， Ｔ． Ｆ． ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２：１６１５７−１６１６３、１９８７）。その後、分子量の大きいアンタゴニストを含む多種類の血小板凝集阻害剤がヘビ毒液から単離された。これらの阻害剤はシステインに富んでおり、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）アミノ酸配列との相互作用によりＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に結合することが共通している。加えて、キストリン（参照： Ａｌｄｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５３：４４５−４４８、１９９１； Ａｌｄｅｒ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３２：２８２−２８９、１９９３）、フラボリジン（参照： Ｋｌａｕｓ， Ｗ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３２：８９７−９０６、１９９３； Ｓｅｎｎ， Ｈ． ａｎｄ Ｋｌａｕｓ， Ｗ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２３２：９０７−９２５、１９９３）、アルボラブリン（参照： Ｊａｓｅｊａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２１８：８５３−８６０、１９９３）及びエキスタチン（参照： Ｃｈｅｎ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：１１６２５−１１６３６、１９９１； Ｃｏｏｋｅ， Ｒ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０２：３２３−３２８、１９９１； Ｃｏｏｋｅ， Ｒ． Ｍ． ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．、５：４７３−４７７、１９９２； Ｓａｕｄｅｋ， Ｖ． ｅｔ ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０：７３６９−７３７２、１９９１； Ｄａｌｖｉｔ， Ｃ． ｅｔ ａｌ．、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０２：３１５−３２１、１９９１）の構造は核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法により同定されている。また、これらのアンタゴニストによるＧＰ ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体へのフィブリノーゲン結合の阻害は動物モデルを用いて確認された（参照： Ｃｏｌｌｅｎ， Ｂ． Ｓ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、７６：１０１−１０８、１９８５； Ｇｏｌｄ， Ｈ． Ｋ． ｅｔ ａｌ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、７７：６７０−６７７、１９８８； Ｙａｓｕｄａ， Ｔ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８１：１２８４−１２９１、１９８８�� Ｃｏｌｌａｒ， Ｂ． Ｓ． ｅｔ ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ、６８：７８３−７８６、１９８６； Ｈａｎｓｏｎ， Ｓ． Ｒ． ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８１：１４９−１５８、１９８８））。
【００１１】
これに関連して、アグキストロドン・ハリス・ブレビカウダス （Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ ｂｒｅｖｉｃａｕｄｕｓ）又はカリギノサス（Ｃａｌｉｇｉｎｏｓｕｓ）の毒液について広範な研究がなされてきた。アグキストロドン・ハリス・ブレビカウダス （Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｈａｌｙｓ ｂｒｅｖｉｃａｕｄｕｓ）の毒液に由来するサルモシン（Ｓａｌｍｏｓｉｎ）は約７．５ｋＤの蛋白であるが、強力な血小板凝集阻害剤であることが提唱されている（参照： 韓国特許第１４２６０６号）。しかしながら、アグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｓａｘａｔｉｌｉｓ ｅｍｅｌｉａｎｏｖ）は他のヘビに比べて稀少種であるためにアグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブの毒液についてはほとんど知られていない。この発明は、アグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブの毒液の強力な毒性及び高い致死率が出血と密接に関連しているという推定のもとに行われた。
【００１２】
（発明の開示）
本発明者らは韓国ヘビ、アグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ ｓａｘａｔｉｌｉｓ ｅｍｅｌｉａｎｏｖ）、の毒液から血小板凝集阻害剤としての役割を演じる蛋白の存在を調査し、新規の蛋白であるサクサチリンを発見した。次いで、サクサチリンｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターで形質転換された微生物を調製して酵母細胞から組換えサクサチリンを大量生産した。さらに、本発明者らは上記組換えサクサチリンが血小板凝集に対する阻害作用と、腫瘍の転移と増殖に必須の脈管形成に対する阻害作用を、正常な内皮細胞増殖に悪影響を及ぼすことなく有することを見出し、当該蛋白が抗腫瘍剤として開発しうるものであることを確認した。
【００１３】
すなわち、本発明の第一の目的は韓国ヘビ、アグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブの毒液に由来するサクサチリンを提供することにある。
本発明の第二の目的はサクサチリンをコードするｃＤＮＡを提供することにある。
本発明の第三の目的は上記ｃＤＮＡから導かれるサクサチリンのアミノ酸配列を提供することにある。
【００１４】
本発明の第四の目的は酵母細胞内でサクサチリンを製造する組換え発現ベクターを提供することにある。
本発明の第五の目的は上記発現ベクターで形質転換された組換え微生物を提供することにある。
本発明の第六の目的は上記形質転換微生物から組換えサクサチリンを製造する方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の第七の目的はサクサチリンを含む血小板凝集抑制剤を提供することにある。
本発明の第八の目的はサクサチリンを含む抗腫瘍剤を提供することにある。
【００１６】
本発明の上記及び他の目的及び特徴は添付の図面と合わせて以下の説明から明らかになるであろう：
【００１７】
（発明の実施の形態）
本発明者らは韓国ヘビ、アグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブの毒液からサクサチリンを単離し、サクサチリンをコードするｃＤＮＡ、当該ｃＤＮＡを含む組換え発現ベクター、及び当該組換え発現ベクターで形質転換された組換え微生物をクローニングし、この形質転換体を培養することにより組換えサクサチリンを製造した。
【００１８】
以下に、アグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブからサクサチリンを単離する方法及び組換えサクサチリンを製造する方法をさらに具体的に説明する。
【００１９】
アグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブの毒液を採取し、ゲル濾過カラム及び逆相ＨＰＬＣを用いて精製し、血小板凝集阻害作用を有する蛋白を得た。その蛋白のアミノ酸配列を分析した結果、新規な蛋白であることが確認されサクサチリンと命名した。本発明者らはアグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブの毒液に由来するｃＤＮＡライブラリーからサクサチリンをコードするｃＤＮＡをクローニングした。このサクサチリンｃＤＮＡはＮ−末端領域に ＸｈｏＩ制限部位とプロテアーゼ ＫＥＸ２ 認識部位の両方を含むように設計され、発現ベクターである ｐＰＩＣ９ （８．０ ｋｂ）のα−因子分泌信号蛋白のＣ−末端領域にある ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位中に導入された。このサクサチリンをコードする発現ベクターを ｐＰＳＡＸと命名した。この発現ベクターはピキア属（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、ハンセヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）などの酵母中に形質転換することができるが、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ１１５、ＳＭＤ１１６８及びＫＭ７１のようなピキア属が好ましい。
【００２０】
上記で作成したｐＰＳＡＸをピキア・パストリスＧＳ１１５中に形質転換し、形質転換細胞を「ピキア・パストリス Ｙ／ｐＰＳＡＸ」と命名し、これを２０００年７月２１日付けで、韓国ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１番地に所在の国際寄託機関である韓国種菌協会附設韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０２０１として寄託した。
【００２１】
組換えサクサチリンを製造する方法は、上記の形質転換された微生物を培養して組換えサクサチリンを得る工程を含む：形質転換された細胞は最小グリセロール培地に接種し、１．０のＯ．Ｄ６００ユニットになるまでインキュベートし、遠心分離で採集し、最小メタノール培地に再懸濁してバッチ供給式で培養した。上記最小グリセロール培地（ｐＨ６．０）は窒素源としての０．５ないし１．５％の酵母抽出物又はペプトン、炭素源としての０．５ないし２．５％のグリセロール、デキストロース又はグルコース、及び極微量のビオチンを含んでいた。上記最小メタノール培地は上記最小グリセロール培地に炭素源として０．１ないし１．０％（ｖ／ｖ）、好ましくは０．３ないし０．８％（ｖ／ｖ）、最も好ましくは０．５％（ｖ／ｖ）のメタノールを加えた培地であった。最小グリセロール培地中での細胞培養の際に、温度条件は２５ないし３５℃、好ましくは２８ないし３２℃、最も好ましくは３０℃で、時間は１２ないし２４時間、好ましくは１６ないし２０時間、最も好ましくは１８時間であった。最小メタノール培地中での細胞培養の際には、温度条件は２５ないし３５℃、好ましくは２８ないし３２℃、最も好ましくは３０℃で、時間は７２ないし１２０時間、好ましくは８４ないし１０８時間、最も好ましくは９６時間であった。
【００２２】
組換えサクサチリンを精製するために、細胞培養液から遠心により得られた上清を疎水性カラム及びＨＰＬＣにかけた。この疎水性カラムはフェニルセファロース樹脂を充填したものであって、好ましくは０．５ないし２Ｍの硫酸アンモニウム溶液で溶出し、ＨＰＬＣにはソース３０ＲＰＣカラムを取り付け、好ましくはアセトニトリル中０．０１ないし０．２％（ｖ／ｖ）ＴＦＡで溶出した。
【００２３】
組換えサクサチリンの血小板凝集阻害作用を公知の血小板凝集阻害剤である組換えサルモシンの作用と比較した。その結果、組換えサクサチリンの血小板凝集阻害作用は組換えサルモシンの作用と同等であることが分かった。さらに、酵母細胞中で発現させる場合、サクサチリンの発現効率はサルモシンより優れていた。組換えサクサチリンのアミノ酸配列をサルモシンのものと比較すると、２つの蛋白の４９番目のアミノ酸の差が２つの蛋白における発現様式及び効率の差をもたらしていることが確認された。組換えサルモシンは４８番目及び４９番目にアルギニンを含むため、酵母中に存在しＬｙｓ及びＡｒｇのアミノ酸配列を認識するシグナルペプチダーゼの影響を容易に受けるが、組換えサクサチリンは４９番目がＭｅｔであり同酵素の攻撃をほとんど受けない。従って、組換えサクサチリンにおける４９番目のアミノ酸が発現効率及び安定性の改善に重要な役割を果たしていることが理解された。
【００２４】
サクサチリンが腫瘍の転移を阻害するかどうかを調べるために、脈管形成を研究するためのモデルシステムとして開発されたＨＵＶＥＣ（ヒト臍静脈内皮細胞）アッセイ及びＣＡＭ（ニワトリ絨毛尿膜）アッセイにより脈管形成に対するサクサチリンの効果を測定した。その結果、サクサチリンは腫瘍により誘導される脈管形成を阻害することが証明された。サクサチリンによるＨＵＶＥＣ増殖阻害は、ＨＵＶＥＣ表面に存在するビトロネクチン受容体であるαＶβ３インテグリンとサクサチリンの直接的相互作用によるものであった。ジスインテグリンが腫瘍細胞の内皮への結合を妨げ、それにより転移性腫瘍のコロニー形成を抑制することは既に知られている。しかしながら、既に侵食している転移性腫瘍の成長が阻害されるかどうかについてはほとんど知られていない。これについて、転移性腫瘍の成長に対するサクサチリンの効果を調べた結果、サクサチリンが細胞毒性なしに転移性腫瘍の成長を効率よく阻害することが明らかになった。
【００２５】
以下の実施例を通して本発明をさらに説明するが、これら実施例は本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【００２６】
実施例１：サクサチリンの精製
アグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブの毒液からサクサチリンを単離するために、このヘビから採取した粗毒液 ３０２．４ｍｇをＰＢＳバッファーで平衡化したセファデックスＧ−７５ゲル濾過カラム（１．８×１００ｃｍ）にのせ、２０ｍｌ／ｈの流速で分画化した。サクサチリンの活性は血小板凝集阻害アッセイにより測定した：すなわち、４００ｍｌのヒト血液から得られ濃縮されているヒト多血小板血漿（ＰＲＰ）を３００，０００血小板／μｌの濃度に希釈した。希釈されたＰＲＰ（４５０μｌ）を５０μｌのＰＢＳと混合した後、アグリゴメーター（Ｃｈｒｏｍｏ−Ｌｏｇ， ＵＳＡ）中、３７℃で３分間インキュベートした。このＰＲＰ溶液中にコラーゲン（２ｎＭ）を添加して血小板凝集を誘発した後、光透過率の差を測定した。
【００２７】
血小板凝集に対する阻害効果を示す活性分画には Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥゲル中で７ｋＤないし１０ｋＤの分子量範囲の蛋白が含まれていた。活性分画を合わせて０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含む蒸留水で平衡化した逆相ＨＰＬＣ（Ｃ１８）カラム（７．８×３００ｍｍ）にのせ、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含む５−４５％の線形アセトニトリル勾配で溶出した。サクサチリンは２１％アセトニトリルの時点で溶出され、精製収率は０．２％であった。
【００２８】
実施例２：サクサチリンのアミノ酸配列分析
サクサチリンのアミノ酸配列を分析するため、精製されたサクサチリンを還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動し、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレン（ＢｉｏＲａｄ， ＵＳＡ）上にエレクトロブロッティングした。自動蛋白配列分析機によりサクサチリンのＮ−末端アミノ酸の配列は、ＧＥＥＣＤＣＧＡＰＡＮＰ （配列番号９）であることが判明した。
【００２９】
実施例３：質量分析計によるサクサチリンの分子量測定
サクサチリンの分子量が質量分析計（Ｋｒａｔｏｓ Ｋｏｍｐａｃｔ Ｍｏｌｄ ＩＩ， Ｋｒａｔｏｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ， Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ， Ｕ．Ｋ．）により、７，４４４、７，５１５及び７，６４７Ｄａの３つの異なる形態で測定され、これは‘ＧＥＥ’に加えて‘ＥＡＧＥＥ’及び‘ＡＧＥＥ’のＮ−末端配列を含む３つの型のイソフォームの存在によるものである。
【００３０】
実施例４：サクサチリンをコードするＤＮＡ配列の決定
サクサチリンｃＤＮＡをクローニングするために、アグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブの毒液分泌腺からオリゴ−ｄＴセルロースを用いてｍＲＮＡを抽出した。上記毒液分泌腺から得られたｍＲＮＡを鋳型にしてオリゴ−ｄＴプライマー及び逆転写酵素を用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。次いで、Ｎ−末端配列に基づき５’−プライマーが、５’−ＧＧＮＧＡＲＧＡＲＴＧＹＧＡＹＴＧＹＧＧ−３’（配列番号３）：プライマー１と設計された。また、サブクローニング過程で決定されたＣ−末端配列に基づき３’−プライマーが、５’−ＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＧＧＡＴＴＴＣＴＧＧ−３’（配列番号４）：プライマー２と設計された。上記５’−プライマー、３’−プライマー及び毒液分泌腺の合成ｃＤＮＡライブラリーの鋳型を用いてポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を行った。アガロースゲル電気泳動上で分離された２２０ｂｐのＰＣＲ産物を ｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ， ＵＳＡ）ベクター中にサブクローニングし、サクサチリンをコードするＤＮＡ配列（配列番号２）の分析に用いた。クローニングされたｃＤＮＡ配列からサクサチリンの全アミノ酸配列が導かれた（配列番号１）。
【００３１】
実施例５：サクサチリンと血小板凝集阻害活性を有する公知のペプチドの、阻害効果の比較
サクサチリンの阻害効果を、血小板凝集阻害活性を有する他の公知のペプチドであるサルモシン（参照：韓国特許第１４２６０６号、配列番号１０）及びＧＲＧＤＳＰ（配列番号７）の阻害効果と比較するために、血小板凝集阻害アッセイを以下のように行った：２２５μｌのヒト多血小板血漿（３００，０００血小板／Ｌ）を血小板凝集阻害ペプチドのＰＢＳ溶液２５μｌと混合した後、アグリゴメーター（Ｃｈｒｏｍｏ−Ｌｏｇ， ＵＳＡ）中、２５℃で５分間インキュベートした。各ＰＲＰ溶液中にＡＤＰを加えて血小板凝集を誘導した後、濁度をそれぞれ測定した（参照：図１）。図１で、（●）はサクサチリン；（○）はサルモシン（配列番号１０）；及び（■）はＧＲＧＤＳＰ（配列番号７）の血小板凝集阻害の度合を表す。図１に示すように、サクサチリンのＩＣ５０値は１７９ｎＭであったが、これはサルモシンの１７３ｎＭに匹敵しており、ＧＲＧＤＳＰペプチドより１，０００倍強力な阻害効果である。
【００３２】
実施例６：サクサチリンＤＮＡのクローニング
実施例４で調製したサクサチリンｃＤＮＡを含むプラスミドを鋳型とし、以下の２個のプライマー：
Ｎ−末端プライマー、ＸｈｏＩ 制限部位及びプロテアーゼ ＫＥＸ２ 認識部位の両方を含む、
５’−ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＧＴ−３’ （配列番号５）
Ｃ−末端プライマー、ＥｃｏＲＩ 制限部位及び２つの停止コドンの両方を含む、
５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＴＧＧＡＡＧＧＧＡ−３’ （配列番号６）
を用いてＰＣＲ（ＲｏｂｏｃｙｃｌｅｒＴＭ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）を行った。
【００３３】
上記ＰＣＲは９４℃で１分（変性）、５５℃で１分（アニーリング）、及び７２℃で１分（重合化）を３０サイクル行った。ＰＣＲ生成物である約２５０ｂｐのＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡリガーゼとの反応によりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（２．９ｋｂ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）中にクローニングして組換えプラスミドを作製した。この組換えプラスミドを大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅの形質転換に使用した。形質転換された大腸菌をＬＢ（ルリア・ボタニ）プレート上で１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを加えてインキュベートし、形成された白色コロニーにより選別した。この白色コロニーから抽出されたプラスミドを制限地図分析及びＤＮＡ配列分析（ＡＬＦシステム、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＳＡ）を用いて調べ、それによりＰＣＲによる２５０ｂｐのＤＮＡ断片がサクサチリンｃＤＮＡであることを確認した。上記プラスミドの ＥｃｏＲ Ｉ／Ｘｈｏ Ｉ 断片を発現ベクター ｐＰＩＣ９ （８．０ｋｂ）のα−因子分泌信号蛋白のＣ−末端領域中にクローニングしてサクサチリンをコードするｃＤＮＡを含む発現ベクター ｐＰＳＡＸ （８．３ｋｂｐ）を作製した（参照： 図２）。
【００３４】
上記 ｐＰＳＡＸをＳａｌＩで切断して線形のＤＮＡ断片とし、これをＴＥバッファー中に０．５μｇ／μｌの濃度に溶解した。次いでこれを８０μｌの ピチア・パストリス （Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ） ＧＳ１１５ コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ）と混合して、エレクトロポレーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ、ＵＳＡ）により１．５ＫＶの条件下で形質転換を行った。この形質転換された細胞をヒスチジン欠損寒天プレート上に塗抹し、３０℃で３日間インキュベートした。コロニーを選別して１Ｌの最小グリセロール培地（１００ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ ６．０、酵母窒素ベース １．３４％、ビオチン ４×１０−５％、グリセロール １％）に接種し、０．Ｄ６００ ユニットが１．０のレベルに到達するまで３０℃でインキュベートした。インキュベート期間終了時に、細胞を３，０００ｘｇで遠心分離して採取し、最小メタノール培地（１００ｍＭ リン酸ナトリウム ｐＨ６．０、酵母窒素ベース １．３４％、ビオチン ４×１０−５％、メタノール ０．５％を含む）に再懸濁した。これらの細胞を３０℃で成育させ、組換えサクサチリンの発現を誘導した。この細胞をさらに２４時間間隔で０．５％メタノールを添加しながら９６時間インキュベートし、インキュベート期間中に培地内にサクサチリンが蓄積されていることを確認した。サクサチリン発現ベクター、ｐＰＳＡＸを含む上記形質転換細胞を「ピキア・パストリス Ｙ／ｐＰＳＡＸ（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ Ｙ／ｐＰＳＡＸ）」と命名し、２０００年７月２１日に韓国ソウル市西大門区弘済１洞３６１−２２１番地に所在の国際寄託機関である韓国種菌協会附設韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ、ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ−１０２０１として寄託した。
【００３５】
サクサチリンを精製するために、培養液を５，０００ｘｇで遠心分離して得た上清を、１．５Ｍ硫酸アンモニウム溶液で平衡化した１．３×２０ｃｍのフェニルセファロースカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）にのせ、１Ｍ硫酸アンモニウム溶液で２０ｍｌ／時の流速で溶出させてサクサチリンの活性分画を得た。サクサチリンの活性は実施例１と同様の方法で測定した。上記活性分画を０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含む蒸留水で平衡化したＨＰＬＣカラム（ソース ３０ ＲＰＣ カラム、７．８×３００ｍｍ）にのせ、０−５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの線形勾配溶液で溶出し、純粋なサクサチリンを１０７ｍｇ／Ｌの精製収率で得た。
【００３６】
実施例７：組換えサクサチリンによる血小板凝集阻害
実施例６で得た組換えサクサチリンを実施例１で述べた血小板凝集阻害法によりアッセイし、実施例１で得た野生型サクサチリン及びＧＲＧＤＳＰ（配列番号７）の結果とそれぞれ比較した（参照： 表１）。
【００３７】
下記の表１に示した通り、組換えサクサチリンは野生型サクサチリンの血小板凝集阻害活性に匹敵する活性を表した。
【００３８】
【表１】
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【００３９】
実施例８：サクサチリンによる抗血栓作用
マウスにコラーゲンとエピネフリンを静脈注射した場合、肺動脈内に血栓が形成され、これにより麻痺、瞳孔拡張、呼吸困難及び痙攣が引き起こされ、最終的に５分以内に７０％のマウスが死亡した。そこで、組換えサクサチリンの静脈注射により上記血栓症状を軽減させられるかどうかを調べた。
【００４０】
サクサチリン（０．１ｍｌ ＰＢＳ中にそれぞれ、０、０．１、０．２５及び０．５ｍｇ／ｋｇになるように溶解したもの）をＩＣＲマウスの尾に静脈注射した１０分後に、コラーゲンとエピネフリンの混合液（０．１ｍｌ ＰＢＳ中に１２０μｇコラーゲン及び１２μｇエピネフリン）を同様にＩＣＲマウスの尾に静脈注射し、生存率を測定した（参照：表２）。
【００４１】
【表２】
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【００４２】
表２に示すように、サクサチリン処理により生存率が上昇するという結果に基づき、コラーゲンとエピネフリンにより誘導される凝集をサクサチリンが抑制したと考えられ、後で処理した場合よりも予め処理した場合のほうが阻害作用は強かった。
【００４３】
実施例９：ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における組換えサクサチリンの効果
組換えサクサチリンの一部であるＲＧＤ配列（アミノ酸配列の４９ないし５１番目）を含むジスインテグリン類はｂＦＧＦにより刺激される内皮細胞の成長を抑制することが知られている。ＲＧＤ配列を含む組換えサクサチリンが内皮細胞の増殖を阻害するかどうかを調べるために、ＨＵＶＥＣを用いて増殖阻害アッセイを行った。サクサチリンの活性を、ｂＦＧＦにより刺激される内皮細胞の増殖を阻害することが知られているサルモシン（配列番号１０）の活性と比較した。
【００４４】
ゼラチンでコーティングした２４ウェルマイクロプレート上で、３７℃、５％ＣＯ２の環境下でＨＵＶＥＣを２４時間培養した。５％ウシ胎児血清を含む０．２５ｍｌ ＤＭＥＭに培地を交換し、実施例６で得られた組換えサクサチリン及びサルモシンをそれぞれ０、２０及び３０μｇ／ｍｌの濃度で加えた。その後、細胞をさらに２０分間インキュベートし、１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ溶液で処理した。７２時間インキュベートした後、細胞をトリプシン処理し細胞数をカウントして生存率を出した（参照：図３）。図３に示すように、サクサチリンはサルモシンと同様に用量依存型のＨＵＶＥＣ成育阻害を示した。
【００４５】
実施例１０：サクサチリンによるＨＵＶＥＣ癒着の阻害
サクサチリンによるＨＵＶＥＣの増殖阻害がサクサチリンとＨＵＶＥＣ表面に存在するビトロネクチン受容体であるαＶβ３インテグリンとの直接相互作用によるものであることを確認するために、ＨＵＶＥＣがビトロネクチンでコーティングされた９６ウェルプレートに結合するのをサクサチリンが妨げるかどうかを調べた。
【００４６】
９６ウェルプレートをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に溶解した実施例６で得られた組換えサクサチリン（１μｇ／ウェル）及びビトロネクチン（０．５μｇ／ウェル）で４℃で１６時間コーティングした。プレートを洗浄した後、未結合の蛋白結合部位を封鎖するために１０ｍｇ／ｍｌの熱処理ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を加えた。このプレートを１時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄した。ＨＵＶＥＣをトリプシン処理してＰＢＳで３回洗浄した後、無血清ＤＭＥＭに再懸濁した。５ｘ１０４細胞を抗αＶβ３モノクローナル抗体、合成ＲＧＤペプチドであるＧＲＧＤＳＰ（配列番号７）、合成ＲＧＥペプチドであるＧＲＧＥＴＰ（配列番号８）及びサクサチリンと混合して予め３７℃で２０分間インキュベートした。その後、混合液をサクサチリン及びビトロネクチンでコーティングされた両方の９６ウェルプレートのウェルに加えた。５％ＣＯ２の環境下３７℃で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳで洗浄して未結合細胞を除去し、結合細胞を固定してクマジーブルーで染色した。各ウェルの５４０ｎｍにおける吸光度を測定して相対細胞数をカウントした（参照： 図４ａ、図４ｂ）。
【００４７】
図４ａ及び図４ｂに示すように、ｂＦＧＦで刺激されたＨＵＶＥＣをＧＲＧＤＳＰ（配列番号７）、サクサチリン及び抗αＶβ３モノクローナル抗体と共に予めインキュベートすることによりＨＵＶＥＣのビトロネクチンへの付着が妨げられ（参照： 図４ａ）、サクサチリンへの付着も同様に妨げられた（参照： 図４ｂ）。このことは、サクサチリンはＨＵＶＥＣ表面のαＶβ３インテグリンに結合することによりインテグリンが媒介する細胞付着を阻害することを示唆している。
【００４８】
実施例１１：ニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイによるサクサチリンの脈管形成における効果
模擬インビトロモデルであるニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイを行って、ｂＦＧＦにより刺激される脈管形成におけるサクサチリンの効果を調べた。受精後３日齢のニワトリ卵の殻の一部を注意深く割り、透明テープで密封して、３７℃、６０％湿度の環境下で１０日間インキュベートした。その後、個々の胚のニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）にｂＦＧＦ（６ｎｇ／胚）を加え脈管形成を誘導した。さらに２４時間インキュベートした後、陰性対照としてＰＢＳを、及び実施例６で得られた組換えサクサチリン５μｇをそれぞれＣＡＭに加えた。処理の７２時間後に、胚の血管を観察した（参照： 図５ａ、図５ｂ）。図５ａ及び図５ｂに示すように、ＰＢＳは効果を示さなかった（参照： 図５ａ）が、サクサチリンは脈管形成に対して阻害効果を示した（参照： 図５ｂ）。
【００４９】
実施例１２：転移性腫瘍の成長に対するサクサチリンの阻害効果
ジスインテグリンは腫瘍細胞が内皮細胞に付着するのを妨げることにより肺腫瘍のコロニー形成を抑制する。しかしながら、ジスインテグリンが転移性腫瘍の発育を阻害するという報告はこれまでなかった。そこで、サクサチリンが転移性腫瘍の成長に影響を及ぼすかどうかを調べた。
【００５０】
ルイス肺癌細胞（アメリカン・タイプ・セル・カルチャー、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ、ＵＳＡ）から購入）１×１０６個を８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ ｒｉｖｅｒ、Ｊａｐａｎ）の尾に静脈注射した。注射の４日後、実施例６で得られた組換えサクサチリンを１．２５ｍｇ／ｋｇ／日の用量でマウスに定期的に（１日１回）静脈注射した。定期的処理の４週間後、腫瘍のできたマウスを屠殺し、立体顕微鏡を用いて腫瘍コロニーの数をカウントした。その結果、サクサチリンが転移性腫瘍の成長を強く阻害することが明白に証明された（参照： 表３）。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
サクサチリンによる転移性腫瘍の成長抑制は、脈管形成に必須のαＶβ３インテグリンの作用を封鎖することによりｂＦＧＦにより刺激されるＢＣＥ細胞の増殖を強力に阻害するサクサチリンの抗脈管形成作用によるものであった。また、被験マウスにおいてサクサチリンは毒性を示さなかった。
【００５３】
さらに、転移性肺癌に対するサクサチリンの直接的な作用を観察するために、組織化学検査を行った。腫瘍のできた肺組織を通常知られた方法によりパラフィン中に固定した後、４時間ブーイン溶液処理した。４μｍ厚さの組織切片にトリプシンを３７℃で１０分間浸透させ、ＰＢＳで洗浄した。この組織切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した後、マウントした（参照： 図６ａ、図６ｂ及び図６ｃ）。図６ａはルイス肺癌細胞のない肺組織を示す写真である；図６ｂはルイス肺癌細胞を移植した後、ＰＢＳで処理した肺組織の写真である；図６ｃはルイス肺癌細胞を移植した後、サクサチリンで処理した肺組織の写真である。図６ｂ及び図６ｃに見られるように、ＰＢＳで処理した対照群では転移性腫瘍の成長が明らかに観察されたが（参照： 図６ｂ）、サクサチリンを投与した群では観察されなかった（参照： 図６ｃ）。上記で説明したように、サクサチリン処理したマウスにおける転移性腫瘍の成長抑制は、二次腫瘍の成長に必須の脈管形成をサクサチリンが妨害するためと推測される。
【００５４】
投与法及び有効用量
活性成分としてのサクサチリン及び医薬上許容しうる担体を含む本発明の医薬用組成物は注射用形態で投与することができる。この注射用形態はさらに滅菌等張性水溶液又は懸濁液を含んでもよく、上記の医薬上許容しうる担体には防腐剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、滲透圧調節のための塩又は緩衝剤が含まれる。サクサチリンの有効用量は患者の年齢、体重及び疾患の進行度により異なるが、血栓治療には非経口で１日１回２０ないし５２ｍｇ／６０ｋｇ／日で投与することが好ましく、癌治療には１日１回３０ないし１２０ｍｇ／６０ｋｇ／日で投与することが好ましいが、当業者の経験により個別的に考慮されるであろう。
【００５５】
急性毒性
血小板凝集抑制剤及び抗腫瘍剤としてのサクサチリンの急性毒性を調べるために、サクサチリンをオスのＣ５７ＢＬ／６マウスに皮下注射し、投与後７日間の死亡数をカウントしてＬＤ５０を調べた。その結果、ＬＤ５０は約１１００ｍｇ／ｋｇであることが判明し、このことからサクサチリンを含む血小板凝集抑制剤及び抗腫瘍剤が有効用量の範囲において十分安全であることが示された。
【００５６】
上記で明確に説明及び証明されるように、本発明は韓国ヘビであるアグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブの毒液に由来する蛋白であるサクサチリン、その製造方法、並びにサクサチリンを活性成分として含む血小板凝集抑制剤及び抗腫瘍剤を提供する。本発明者らはサクサチリンをアグキストロドン・サクサチリス・エメリアノブの毒液から精製し、サクサチリンをコードするｃＤＮＡをクローニングし、当該ｃＤＮＡを含む組換え発現ベクター及びサクサチリンを発現する組換え発現ベクターで形質転換された組換え微生物を作製し、当該組換え微生物を培養することによりサクサチリンを製造した。
【００５７】
サクサチリンは血小板凝集及び腫瘍細胞の脈管形成を効果的に抑制するため、血小板凝集抑制剤及び抗腫瘍剤の活性成分としての実用が可能である。
【００５８】
説明を目的として本発明の好ましい態様を開示したが、添付の請求項に記載されるような本発明の範囲と意図から逸れることなく多様な変更、追加及び代用が可能であることは当業者に認知されるところであろう。
【００５９】
【配列表】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１はサクサチリンの阻害作用を公知の血小板凝集阻害剤と比較して示したグラフである。
【図２】図２は組換えサクサチリン発現ベクターであるｐＰＳＡＸの遺伝子地図である。
【図３】図３はＨＵＶＥＣの成長に対する組換えサクサチリンの効果をサルモシンの効果と比較して示したグラフである。
【図４】図４ａはビトロネクチンのＨＵＶＥＣへの結合に対する抗−αＶβ３モノクローナル抗体、ＧＲＧＤＳＰ、ＧＲＧＥＴＰ及び組換えサクサチリンの効果を示すグラフである。
【図５】図４ｂはサクサチリンのＨＵＶＥＣへの結合に対する抗−αＶβ３モノクローナル抗体、ＧＲＧＤＳＰ、ＧＲＧＥＴＰ及び組換えサクサチリンの効果を示すグラフである。
【図６】図５ａはＣＡＭ（ニワトリ絨毛尿膜）におけるｂＦＧＦに刺激された脈管形成を示す写真である。
【図７】図５ｂはＣＡＭ脈管形成に対する組換えサクサチリンの効果を示す写真である。
【図８】図６ａはルイス肺癌細胞のない正常な肺組織を示す写真である。
【図９】図６ｂはルイス肺癌細胞を注入しＰＢＳ対照で処理した肺組織を示す写真である。
【図１０】図６ｃはルイス肺癌細胞を注入し組換えサクサチリンで処理した肺組織を示す写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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