(57)【要約】この発明は、サンプル中の生物学的実体の検出に関するものである。より詳しくは、存在する可能性のある数百から数千の異なる生物種から、特定の病原体を検出することに関するものである。この発明は、数百から数千の異なる生物種のうちの１以上の生物学的実体の存在を、サンプル中から検出できる新たな分析を提供するものである。この発明によるサンプル中の生物学的実体の検出方法は、標識核酸を生成するために、サンプル中の核酸をランダムに増幅すること、標識核酸を予め定められた核酸の配列にハイブリダイズすること、および配列にハイブリダイズした標識核酸を検出することを備えている。
2004507207.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中の生物学的実体を検出する方法であって、標識核酸を生成するために、サンプル中の核酸をランダムに増幅し；予め定められた核酸のアレイに、前記標識核酸をハイブリダイズし；アレイにハイブリダイズされた標識核酸を検出することを備えたもの。
【請求項２】
請求項１の方法において、増幅ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応法を備えていること。
【請求項３】
請求項１の方法において、増幅ステップは、４から９の長さのヌクレオチドのランダムプライマーを用いること。
【請求項４】
請求項１の方法において、予め定められた核酸は、表面上に固定されること。
【請求項５】
請求項１の方法において、標識核酸は、酵素的に検出されること。
【請求項６】
請求項１の方法において、標識核酸は、ビオチン化されること。
【請求項７】
請求項１の方法において、標識核酸は、蛍光性標識であること。
【請求項８】
請求項１の方法において、標識核酸は、ジゴキシゲニンによって標識化されること。
【請求項９】
請求項１の方法において、標識核酸は、放射標識によって標識化されること。
【請求項１０】
請求項４の方法において、前記表面は、不透明膜であること。
【請求項１１】
請求項４の方法において、前記表面は、シリカベースであること。
【請求項１２】
請求項１の方法において、予め定められた核酸の配列は、アレイ上の予め定められた位置であること。
【請求項１３】
請求項１の方法において、前記サンプルは、多数の生物学的実体を備えていること。
【請求項１４】
請求項１の方法において、前記生物学的実体は、病原体であること。
【請求項１５】
請求項１の方法において、前記予め定められた核酸は、３０より長い核酸であること。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】
発明の分野
この発明は、サンプル中の生物学的実体の検出に関するものである。特に、１ないし数百、数千の病原体の存在が推定されるところから、特定の病原体を検出することに関するものである。
【０００２】
関連技術の概要
現代社会おける人口密集や不安は、細菌攻撃の形式によるテロリズムを通して、また、都市環境において密集して詰め込まれた人々の間での病気の伝染を通して、疾病を急速に拡散させるおそれをもたらした。ニューヨークタイムス、１９９７年１１月２１日号において、Ｗａｄｅは、２個の紙はさみ（ｐａｐｅｒ ｃｌｉｐｓ）の重さに相当する１グラムの炭疽菌が、１千万人を死亡させるに十分な成分を含有していることを開示している。同様に、その他多くの発病性生物が、テロリストによって使用されうる。また、発病や死亡の回避が手遅れとなってしまう前に、どの病原体が用いられたのかを知ることは困難である。加えて、都市環境においては、健康な人と病気の人が密集するため、広域に伝染する可能性が高い。このような例においては、どのような病原体が含まれていたかを、早い段階において決定することが、効果的な処置や予防を行うために、重大な問題となる。さらに、洪水や地震の発生による自然災害は、その発生直後に、疾病を広範囲に拡散させることが多い。 効果的な安全策のため、このような突発的災害をもたらす病原体を迅速に同定することが必要とされている。
【０００３】
残念ながら、現状の手法では、数百、数千の病原体の中から、瞬時に、特定の病原体を選別することはできない。現状の手法には、抗体ベース（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｂｓｅｄ）の測定、ＤＮＡチップ（ＤＮＡ Ｃｈｉｐ）測定、ポリメラーゼ連鎖反応法に基づく測定などがある。チーら（Ｃｈｅｅ ｅｔ ａｌ．）による米国特許５８６１２４２号（１９９９年）は、エイズウイルス（ＨＩＶ）の診断のためのバイオチップ上の核酸プローブのアレイを開示している。クロウルら（Ｃｒｏｗｌ ｅｔ ａｌ．）による米国特許５７３３２１０号（１９９８年）は、患者の血清中のウイルスに対する抗体を検出するため、当該ウイルスの外被タンパク（ｅｎｖｅｌｏｐｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いたＨＩＶのアッセイを開示している。グラッタードら（ｇｒａｔｔａｒｄ ｅｔ ａｌ．）は、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ３２（１９９４年）の５９６〜６０２頁において、院内感染のＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅを検出するために、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応法）を用いることを開示している。残念ながら、これら全ての手法は、１つの種類の病原体の検出に限定されている。したがって、数百、数千の異なる生物学的種の可能性中から、サンプルに含まれる１以上の生物学的実体を検出することのできる新しい分析が必要とされている。
【０００４】
【発明の概要】
この発明は、数百、数千の異なる生物学的種の可能性中から、サンプルに含まれる１以上の生物学的実体を検出可能な新たな分析を提供するものである。この発明による方法は、サンプル中の生物学的実体を検出するためのものである。この方法は、標識核酸を生成するために、サンプル中の核酸をランダムに増幅すること、標識核酸（ｌａｂｅｌｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）を所定核酸のアレイ（ａｎ ａｒｒａｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）にハイブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）すること、およびアレイにハイブリダイズした標識核酸を検出することを含んでいる。この発明による方法は、病院や医院、戦場や外傷状況、緊急応答者（ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ ｒｅｓｐｏｎｄｅｒｓ）、法医学的解析、食品および水の監視、特定病原体の遺伝的変質（ｇｅｎｅｔｉｃ ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ）の指標のための選別、および、環境解析や背景の特徴付けにおける、このような検出のために有用である。
【０００５】
この発明は、系統的解析として有用である。かかる実施形態においては、生成された２進数パターンに基づいて、単一のサンプルから生物学的実体の多重度を分類するために、高い保存性があり、高い特異性のある核酸の連続体が用いられる。よって、サンプルにおける特定の生物学的実体の存在または不存在を、結論づけることができ、併せて、生物界（ｏｒｇａｎｉｓｍ’ｓ ｋｉｎｇｄｏｍ）、門（ｐｈｙｌｕｍ）、綱（ｃｌａｓｓ）、目（ｏｒｄｅｒ）、属（ｇｅｎｕｓ）、種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を確証することができる。
【０００６】
好ましい実施形態において、増幅ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応法を備えている。増幅ステップは、４から９の長さ、より好ましくは４から６の長さのヌクレオチドのランダムプライマーを用いることが好ましい。好ましい実施形態のいくつかにおいては、予め定められた核酸の配列が、表面に固定化される。好ましい実施形態のいくつかにおいては、標識核酸が、酵素的に検出される。好ましい実施形態のいくつかにおいては、標識核酸はビオチン化される。好ましい実施形態のいくつかにおいては、標識核酸は蛍光標識または放射標識される。好ましい実施形態のいくつかにおいては、標識核酸はジゴキシゲニン（ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ）により標識化される。好ましい実施形態のいくつかにおいては、所定の核酸が固定化される表面は、不透明膜である。好ましい実施形態のいくつかにおいては、当該表面は、シリカベースである。予め定められた核酸の配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は、配列（ａｒｒａｙ）上の予め定められた位置であることが好ましい。好ましい実施形態のいくつかにおいては、サンプルは、多くの生物学的実体を含んでいる。概ね、検出される少なくとも一つの生物学的実体は、病原体である。好ましい実施形態のいくつかにおいては、予め定められた核酸は、３０より大きい長さのヌクレオチドである。
【０００７】
【好ましい実施形態の詳細な説明】
この発明は、サンプル中の生物学的実体の検出に関するものである。より詳しくは、この発明は、存在する可能性のある数百から数千の病原体から、特定の病原体を検出することに関するものである。この発明は、数百から数千の異なる生物種のうちの１以上の生物学的実体の存在を、サンプル中から検出できる新たな分析を提供するものである。
【０００８】
この明細書にて引用する特許文献および出版物は、この分野の知識レベルを表すものであり、その全体を参照してこの明細書に取り込む。これら特許文献・出版物と本明細書の開示との間に矛盾がある場合には、本明細書の開示が優先する。
【０００９】
この発明によるサンプル中の生物学的実体の検出方法は、標識核酸を生成するために、サンプル中の核酸をランダムに増幅すること、標識核酸を予め定められた核酸の配列にハイブリダイズすること、および配列にハイブリダイズした標識核酸を検出することを備えている。この発明による方法は、病院や医院、戦場や外傷状況、緊急応答者、法医学的解析、食品および水の監視、特定病原体の遺伝的変質の指標のための選別、および、環境解析や背景の特徴付けにおける、このような検出のために有用である。
【００１０】
この発明の目的上、用語「ランダムな増幅」は、４から９の長さ、より好ましくは４から６の長さのヌクレオチドのランダムプライマーを用いた、試験管内での、核酸のセグメントのコピー数の増加を意味する。「生物学的実体」は、ウイルス、ウイルス様体（ｖｉｒｏｉｄｓ）、バクテリア、菌類（ｆｕｎｇｉ）、原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａ）などを含む。「サンプル」は、何らかのソースであり、気体、液体、固体またはこれらの混合であってよい。「核酸」は、ＲＮＡまたはＤＮＡまたはその双方を意味し、非自然的塩基（ｕｎｎａｔｕｒａｌ ｂａｓｅｓ）を含んでもよい。「予め定められた核酸」は、配列が既知の核酸である。好ましい実施形態のいくつかにおいては、予め定められた核酸は、３０より大きい長さのヌクレオチドである。「標識核酸」は、検出可能な核酸である。「ハイブリダイズ」は、検出条件の下で、少なくとも部分的に二本鎖である核酸を形成するため、十分な数の塩基対を形成することを意味する。「予め定められた核酸のアレイ」は、互いの空間的配置あるいは関連が知られている、予め定められた核酸（検出される可能性のある生物学的実体に相補的な核酸を含む）の多重度である。
【００１１】
好ましい実施形態において、増幅ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応法を備えている。概ね、一般的なＰＣＲ方法（コインら（Ｃｏｙｎｅ ｅｔ ａｌ．）のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｍａｎｕａｌ、第３版（１９９４年）を参照のこと）は、たとえば摂氏５０〜６５度の低い温度にてアニーリングステップが好ましく実行される場合を除いて、増幅に用いることができる。増幅ステップ中で用いられるプライマーは、４から６の長さのヌクレオチドの多重ランダムプライマーである。既知の配列（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）の増幅のためには、長いプライマーが有用であるが、長いプライマーは必然的に増幅の重大な特異性をもたらすので、これらはサンプル中の核酸の不特定増幅のためには適切でない。短くランダムなプライマーの使用は、与えられたサンプル中の全ての核酸の増幅を可能にする。短いがために、プライマーは、実質的に全てのＤＮＡ配列と結合することができ、ランダムプライマー（すなわち、異なるＤＮＡ配列を有するプライマー）の使用により、全てのＤＮＡ配列が増幅される可能性をさらに増やすことができる。
【００１２】
好ましい実施形態のいくつかでは、増幅に用いられる１以上のヌクレオシド三リン酸（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が、標識化される。好ましい実施形態のいくつかでは、標識核酸は、酵素的に検出される。好ましい酵素としては、アルカリ・ホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ、その他の色のある生成物を生成する酵素が含まれる。ただし、これらに限定されるものではない。特定の好ましい実施の形態において、標識核酸はビオチン標識される。特定の好ましい実施の形態において、標識核酸は蛍光標識されるか、放射性同位元素で標識される。特定の好ましい実施の形態において、標識核酸はジゴキシゲニンによって標識される。ビオチン標識核酸配列は、アビジン結合比色酵素、例えばアルカリホスファターゼまたはホースラディッシュペルオキシダーゼとのインキュベーションにより、容易に識別される。ビオチンは、蛍光ベースシステムがない状態で可視化が必要な用途において、特に好ましい。ジゴキシゲニン標識核酸配列は、市販の免疫試薬を用いて容易に検出される。分子生物学における近年の進歩は、ヒトゲノム解析計画下の努力の結果、ある程度、ＤＮＡおよびＤＮＡ断片の標識化および検出に対する新規方法の発展を促進した。昔から、放射性同位元素は、ＤＮＡに対する高感度の標識として機能してきたが、最近では、蛍光性、化学発光および生理活性のレポーター基も利用されている。蛍光および化学発光の標識は、それぞれ、放射線吸収および化学反応結果の発光により機能する。プライマーおよび／または増幅された配列を標識するためのキットおよびプロトコルは、ＰＣＲ増幅に関して公表された文献から容易に入手できる。そのようなキットおよびプロトコルは、プライマーと増幅されたＤＮＡの両方を標識するための詳細な説明を提供しており、ここでのプロトコルは本発明の方法の目的に容易に適応できる。
【００１３】
特定の好ましい実施の形態において、所定の核酸配列は表面に固定される。特定の好ましい実施の形態において、所定の核酸が固定される表面は、不透明膜である。好ましい不透明膜材料には、制限しないが、ニトロセルロースとナイロンが含まれる。不透明膜は、戦場または他のフィールドでの適用等、厳しい状況において特に好ましい。特定の好ましい実施の形態において、表面はシリカベースである。「シリカベース」とは、シリカまたはシリカ誘導体を含むことを意味し、何れの市販シリケートチップも有用である。シリカベースチップは、病院または実験室のセッティングに特に有用であり、蛍光リーダーで使用されるのが好ましい。
【００１４】
所定の核酸配列は、配列上の所定位置にあるのが好ましい。好ましい実施の形態では、所定の核酸配列は、表面へ固定することにより配列される。チップ上の所定位置に所定の核酸配列を配列することにより、所定のサンプル内における生物種検出へのチップベースのアプローチが可能となる。所定の核酸配列は、コンピューター制御の高速ロボットを用いることにより、チップ上へプリントされるが、これら装置はしばしば「スポッタ」と呼ばれる。スポッタは、所定の核酸配列の同一の配列を何百ものチップ上に迅速に量産するために利用できる。チップ上の各所定核酸の位置は周知であるので、ハイブリダイゼーション、検出、およびローカリゼーションにより、サンプルに存在する生物学的実体（単数または複数）が識別される（図１参照）。特定の好ましい実施の形態では、サンプルは複数の生物学的実体を備える。一般に、検出される少なくともひとつの生物学的実体は病原体である。
【００１５】
本発明は、所定のサンプルにおけるひとつ以上の生物学的実体の識別に関する。本発明は、所定のサンプル内で複数の生物学的実体を迅速かつ同時に識別する方法を提供する。本発明により、科学者、技術者、および医療従事者らは、人体、陸生動物または水生動物を含むあらゆるソースから採取したサンプル、および水、植物または食料、埃、空気その他の環境的サンプルまたは法医学的サンプルにおいて、病原体を含む複数の生物学的実体の存在を迅速かつ同時に識別できる。
【００１６】
本発明の方法は特に、生物学的病原体に起因する戦況または病気の発生、ならびに法医学的分析、特定の生物に対する遺伝子操作の痕跡をスクリーニングするための食品および水のモニタリング、および環境分析や背景特性決定に適用される。本発明の方法を用いることにより、何れの周知の生物学的病原体もサンプル中に検出でき、かつ複数の生物種を同時に検出できる。さらに、前記方法は動植物に悪影響を及ぼす生物学的病原体の検出にも有用である。
【００１７】
テロリズムの潜在的脅威、そして戦場における生物兵器の潜在的使用が、世界中で高まりつつある。戦場では、複数の生物兵器が一度に投下されることがあるため、軍医は一回のテストで複数の生物種を同時に識別できなくてはならない。しかしながら、出願人の発明以前にはかかる方法が存在しなかった。都心では、投下の脅威や投下の行為に関する警告がほとんどなされないまま、また投下された生物種について何の特定もなされないまま、ひとつの生物学的病原体が広域にわたってもしくは人ごみに投下されることがある。
【００１８】
上述のかかる状況、または生物学的病原体の播種（例：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｉｌを有する食物汚染、または髄膜炎のような伝染病の蔓延）の自然的発生や偶発的発生の場合のいずれにしても、人体感染の最初の兆しは、それぞれが同様の症状を示す個体のクラスタであったかもしれない。しかしながら、多くの生物学的病原体の初期症状がそれぞれ非常に似通っているだけでなく、風邪（例：頭痛、発熱、疲労、筋肉痛、咳）の症状にも極めて類似しているため、実際に症状を引き起こす生物学的種を早急に特定することにより、医療専門家は迅速かつ適切に治療を実施することができ、非常に有益となろう。加えて、本発明による方法は、薬剤耐性に関する原因微生物の状態を見極めるために用いることができ、それによってより効果的な治療を施すことができる。
【００１９】
生物兵器の生産に使用される、またはテロ行為において係るテロ行為の目的が個体動物または植物を殺したり、衰弱させたりするようなことである場合に用いられる生物学的病原体の例としては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ（炭疽菌）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ（腺ペスト）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ ｓｕｉｓ（ブルセラ症）、Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（野兎病）、Ｃｏｘｉｅｌｌａ ｂｕｒｎｅｔｔｉ（キュー熱）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｉｇｉｎｏｓａ（肺炎、髄膜炎）、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａ （コレラ）、Ｖａｒｉｏｌａ ｖｉｒｕｓ（天然痘）、Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ ｔｏｘｉｎ（ボツリズム）、Ｓａｘｉｔｏｘｉｎ（呼吸麻痺）、Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ（リシン）、サルモネラ、黄色ブドウ球菌、アフラトキシンの他、真菌毒、Ｓｈｉｇｅｌｌａ（赤痢）および黄熱ウィルスが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００２０】
本発明は、系統的解析として有効である。かかる実施の形態においては、生成されたバイナリパターンに基づいて、単一サンプルの中から多数の生物学的実体を分類するために、非常に特異的な核酸に対して高度に保存された連続体が用いられる。このように、サンプル中の特異的な生物学的実体の有無を結論づけるだけでなく、生物の界、門、綱、目、属種を定めることができる。
【００２１】
その他の好ましい実施の形態において、サンプルは多数（２コ以上）の生物学的実体で構成される。選択する基質の種類および選択する基質の大きさに応じて、所定のパターンで、何百または何千もの所定の核酸とともにチップを配列することが可能である。
【００２２】
別の好ましい実施の形態において、１種類またはそれ以上の生物学的実在物（エンティティ）は病原体である。本発明の方法はサンプル内で全ＤＮＡを増幅するように設計されているので、生物種は、十分に増幅されるためには、多分、多重コピーの状態で存在する必要があろう。病理学的実在物が、危害を及ぼすのに十分な量でサンプル中に存在する場合、それら実在物は多分、多重コピーの状態で存在して、本発明の方法によって十分増幅されることになろう。
【００２３】
本発明の方法に従って検出される生物種の結果の信頼性高めるには、その配列が、ポジティブ・ネガティブコントロールおよび重複、例えば同じターゲット生物体からの、同一核酸または数種類の明確な核酸、を含むのが好ましい。また、この配列は、広範でしかも明確な識別を得るために用いることができる。例えば、１６ｓリボソームＲＮＡを使って微生物の存在を確証でき、バチルス保存配列を使ってバチルスの存在を識別でき、そして特定ＤＮＡにより、バチルス種および菌株を分類することができる。病原体種も含め所望する何れのターゲット生物種も、そのような生物体のＤＮＡ配列の特徴に関する公表文献に言及することにより、そのような公表配列が合成であっても、クローニングであっても、前記配列中へ含めることができる。
【００２４】
所定サンプル内での特定ターゲット生物体の存在は、増幅された標識核酸を周知の技法に従って所定サンプルからチップ上の配列へハイブリダイズすることによって決定される。ハイブリダイゼーションは極めて厳密な条件下で行われるのが好ましい。というのは、増幅された生成物の長さが少なくとも３０ヌクレオチドであって、さらに、それらがＰＣＲ法で増幅させた遺伝子配列にハイブリダイズされているように期待されるからである。ハイブリダイゼーションにおける、この好適な極めて厳密な温度条件は、５０℃と６５℃の間である。次に、予め定められたどの核酸配列がハイブリダイズされて増幅された核酸になったかを同定するために、適切な検知手段を利用して、増幅された核酸の標識付けに用いる特定標識を視覚化する。チップは、予め定められたパターンの予め定められた核酸の配列を保持しているので、ハイブリダイゼーションのパターンはサンプル内で生物種を識別することになる。
【００２５】
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施の形態を更に説明するためのものであって、何ら制限するものではない。
【００２６】
【実施例１】
診断アレイの調製
以下の方法は、本発明の方法を実行する目的で、固相表面に固定される所定の核酸のアレイを制作するために用いられうる。アレイ上に含まれる、所定の核酸の数は、ユーザの特別な必要性や要望にしたがってデザインされうる。様々な生物の相対量は、増幅／ラベルした核酸の連続希釈を用いた連続的なハイブリダイゼーションを行って確かめた。
【００２７】
所定の核酸の望ましいコレクションは、それらの各々が異なる生物または生物の変異体として特徴づけられるものであるが、様々な配列データベースまたは出版物から選択される。そのような所定の核酸配列は、次に、公開された核酸配列を基準にして合成されるか、あるいは、適当なソース（その核酸配列を含む生物、あるいは、ｃＤＮＡまたはその核酸配列を含むゲノムライブラリーなど）からクローニング（ｃｌｏｎｅｄ）される。固相基質（チップなど）上にデポジット（ｄｅｐｏｓｉｔ）するための配列な十分な量を生成するために、選択された所定の核酸を増幅した（例えば、ＰＣＲおよび所定の核酸配列に特異的なプライマーのペアを用いる）。次に、固相基質の各デポジットを、テストするサンプルに存在する所定の核酸配列の誤った指標を引き起こす可能性がある不純物のないものにするために、ＤＮＡの分離のための周知の技術にしたがって、それぞれの選択された所定の核酸を分離した。必要であれば、１以上の所定の核酸配列を固相表面上の単一のデポジットに結合させ、例えば、１以上の特定の生物の変異体を結合するのが望ましいかもしれない。
【００２８】
核酸の増幅および精製のための多数の方法は、公衆に利用可能である。以下のプロトコール（手順）は、単に例示するものである。
【００２９】
材料および装置（設備）
・　５’−アミノ−モディファイアー（５’−ａｍｉｎｏ−ｍｏｄｉｆｉｅｒ　Ｃ６　（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　＃１０−１９０６−　９０）によって修飾されたＰＣＲプライマー
・　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　＃６００１３９）
・　ＰＣＲ精製キット（Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）（ＴｅｌｅＣｈｅｍ　＃ＰＣＲ−１００）
・　平底面３８４ウェルプレート（Ｆｌａｔ−ｂｏｔｔｏｍ−３８４−ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅｓ）（Ｎｕｎｃ　＃２４２７６５）
・　マイクロ−スポッティングソリューション（Ｍｉｃｒｏ−Ｓｐｏｔｔｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＴｅｌｅＣｈｅｍ＃ＭＳＳ−ｌ）
方法
１．　要求される生物種からの、調製された所定の核酸配列のＤＮＡ（１０ｎｇ／マイクロリットル）の１．０マイクロリットルを、反応溶液に加える。要求される生物種の各ＤＮＡは、増幅される所定の核酸に特異的なプライマー（〜２１　ｍｅｒｓ）を用いた分離反応において増幅させる。
【００３０】
２．　１０マイクロリットルの１０×ＰＣＲバッファ（５００　ｍＭ　ＫＣｌ，１００　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｃｌ　ｐＨ　８．３，１５　ｍＭ　Ｍｇ２＋，　０．１％　ゼラチン（ｇｅｌａｔｉｎ））、１０マイクロリットルのｄＮＴＰ反応混液（ｃｏｃｋｔａｉｌ）（各２ｍＭ）、１．０マイクロリットルのプライマー１（１００ｐｍｏｌｅ／マイクロリットル）、１．０マイクロリットルのプライマー２（１００ｐｍｏｌｅ／マイクロリットル）、１．０マイクロリットルの生物サンプル、７６マイクロリットルのＨ２０、および１．０マイクロリットルのＴａｑポリメラーゼ（５ユニット（ｕｎｉｔｓ）／マイクロリットル）を含んだＰＣＲ混合液（ｍｉｘ）の９９．０マイクロリットルを加える。
【００３１】
３．　３０ラウンドのＰＣＲ（９４℃，３０秒；５５℃，３０秒；７２℃，６０秒）によってＤＮＡを増幅する。
【００３２】
４．　ＰＣＲ産物をＰＣＲ精製キットを用いて精製する。
【００３３】
５．　１００マイクロリットルの０．０１×ＴＥ（ｐＨ　８．０）によってＰＣＲ産物を溶出する。
【００３４】
６．　ｓｐｅｅｄｖａｃ．によってＰＣＲ産物を完全乾燥する。
【００３５】
７．　各ＰＣＲ産物を７．５マイクロリットルのマイクロ−スポッティング−ソリューション（Ｍｉｃｒｏ−Ｓｐｏｔｔｉｎｇ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）に再懸濁する。
【００３６】
８．　アレイ（ａｒｒａｙｉｎｇ）のために、平底面３８４ウェルプレート（Ｆｌａｔ−ｂｏｔｔｏｍ−３８４−ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ）（Ｎｕｎｃ）に移す。
ａ．　アミノ連鎖（Ａｍｉｎｏ−ｌｉｎｋｅｄ）のｃＤＮＡは、各プライマーの５’末端において、ＰＣＲ中にＣ６アミノモディファイアー（Ｃ６　ａｍｉｎｏ　ｍｏｄｉｆｉｅｒ）（Ｇｌｅｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて作成する。
【００３７】
ｂ．　プラスミドＤＮＡは、アルカリ溶解および精製によって調製されうる。９６−ウェル　ＲＥＡＬ　ｐｒｅｐ（９６−ｗｅｌｌ　ＲＥＡＬ　ｐｒｅｐ）（Ｑｉａｇｅｎ　＃ＳＱ８１１　ａｎｄ　＃１９５０４）によって、迅速な調製を行うことができる。
【００３８】
数百から数千のスポットの規則的なグリッド上に所定の核酸配列のアレイが形成されるように、所定の核酸のコレクションの各々は、シリカベースの基質または不透明膜（ナイロンまたはニトロセルロース）の上にアレイ装置を用いてスポットまたはプリントした。スポット中のＤＮＡは、ハイブリダイゼーションの間に洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ　ｏｆｆ）されないようにするために基質に結合しておく必要があるかもしれない。
【００３９】
表面上に核酸配列をスポットまたはプリントするための多数の方法は、公衆に利用可能である。以下のプロトコールは、単に例示するものである。
【００４０】
試薬および装置
・マイクロ−スポッティング　ロボット（Ｍｉｃｒｏ−ｓｐｏｔｔｉｎｇ　ｒｏｂｏｔ）（多数のモデルが利用可能である。）
・ステルスマイクロスポッティングデバイス（Ｓｔｅａｌｔｈ　Ｍｉｃｒｏ　Ｓｐｏｔｔｉｎｇ　Ｄｅｖｉｃｅ）（ＴｅｌｅＣｈｅｍ）
・スーパーアルデハイド基質（ＳｕｐｅｒＡｌｄｅｈｙｄｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ）（ＴｅｌｅＣｈｅｍ）
方法
１．　シリレイト（ｓｉｌｙｌａｔｅｄ）（活性化アルデハイド）マイクロスコープスライド（ＣＥＬ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を用意する。
【００４１】
２．　アミノ連鎖ｃＤＮＡを、マイクロスポッティングデバイスを用いて製造者インストラクションにしたがってプリントする。
【００４２】
３．　プリントしたマイクロアレイを、スライドボックス中でオーバーナイトで乾燥させる。
【００４３】
４．　室温にて２分間、激しい撹拌によってスライドを０．２％ＳＤＳに２回浸す。
【００４４】
５．　室温にて２分間、激しい撹拌によってスライドをｄｄＨ２Ｏに２回浸す。
【００４５】
６．　ＤＮＡ変成のために、２分間、９５−１００℃のｄｄＨ２Ｏにスライドを移す。
【００４６】
７．　室温にてスライドを完全に乾燥させる（−５分間）。
【００４７】
８．　遊離したアルデハイドを除くために、室温で５分間、水酸化ホウ素ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ　ｂｏｒｏｈｙｄｒｉｄｅ）溶液にスライドを移す。
【００４８】
９．　室温で各１分間、０．２％ＳＤＳで３回、スライドをリンスする。
【００４９】
１０．　室温で１分間、０．２％ＳＤＳで１回、スライドをリンスする。
【００５０】
１１．　９５−１００℃で２秒間、ｄｄＨ２Ｏにスライドを浸す。
【００５１】
１２．　スライドを空気乾燥し、２５℃で暗所に保存する（１年以上は安定（ｓｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　＞　１　ｙｅａｒ））。
【００５２】
ａ．　乾燥によって架橋効率（ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を増加する。数日以上の乾燥は許容される。
【００５３】
ｂ．　このステップは、塩および非結合のＤＮＡを取り除く。
【００５４】
ｃ．　水酸化ホウ素ナトリウム溶液は、次のように使用直前に調製する。１．０ｇのＮａＢＨ４を、３００ｍｌのリン酸緩衝食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）（ＰＢＳ）に溶解する。１００ｍｌの１００％エタノールを、通気（ｂｕｂｂｌｉｎｇ）を減らすために加える。
【００５５】
ｄ．　乾燥過程に大いに役立つように、スライドを加熱する。
【００５６】
【実施例２】
診断アレイの使用
実施例１にしたがって調製した例えば一つのアレイは、スクリーニングされるサンプルからの標識核酸の調製によって利用され、そのような標識核酸はアレイにハイブリダイズする。さらに、指定されたコントロール配列の標識核酸を、調製してもよい（または、アレイがキットの一部として販売されている場合には、ユーザに供給されうる）。
【００５７】
サンプルからの核酸配列の標識、および、コントロールのために、放射性、比色、化学発光、または、蛍光性のタグを用いることが可能である。アレイのスキャニング、蛍光、化学発光、または比色出力の検出、および、結果の分析のための多数の技術は、開発および商業化されている。例えば、ＧＳＩ　Ｌｕｍｏｎｉｃｓは、低コストな、ハイスループット２−、３−、４−カラーレーザースキャニングシステム（ＳｃａｎＡｒｒａｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を開発している。
【００５８】
標識核酸配列の調製のための多数のプロトコールは、公衆に利用可能である。以下のプロトコールは、説明の目的で提示するものである。（ｉ）アレイに対する、蛍光標識（ラベル）したサンプルのハイブリダイゼーションおよび、生物分析のための方法、（ｉｉ）サンプルから得られた、蛍光標識した核酸の調製の方法、（ｉｉｉ）蛍光標識したコントロール核酸の調製
１．　アレイに対する、蛍光標識したサンプルのハイブリダイゼーションおよび、生物分析のための方法
試薬および装置
・ハイブリダイゼーションカセット（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｃａｓｓｅｔｔｅｓ）（ＴｅｌｅＣｈｅｍ）
・アレイウォッシュステーション（Ａｒｒａｙ　ｗａｓｈ　ｓｔａｔｉｏｎ）（ＴｅｌｅＣｈｅｍ）
・テストするサンプルから得られた蛍光標識ＤＮＡ
・蛍光標識コントロール核酸配列
・スキャンアレイ（ＳｃａｎＡｒｒａｙ）３０００、４０００、または５０００（ＧＳＩ　Ｌｕｍｏｎｉｃｓ）
方法
１．前記アレイをハイブリダイゼーション・カセット（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）内に位置させる。本例におけるカセットは、そのサイズが２２ｍｍＸ２２ｍｍのマイクロアレイである。
【００５９】
２．加湿用に、５．０マイクロリットルの５ＸＳＳＣ＋０．２％のＳＤＳを添加する。
【００６０】
３．サンプルから得られた、適切な濃度の蛍光性コントロール核酸を含む、蛍光性の標識核酸を、２２ｍｍＸ２２ｍｍのカバー片の縁を介して５．０マイクロリットル滴下する。
【００６１】
４．サンプルが、カバー片とマイクロアレイとの間で薄い単層を形成するよう、ピンセットを用いてカバー片を前記マイクロアレイ上に置く。
【００６２】
５．マイクロアレイを含む前記ハイブリダイゼーション・カセットを密封する。
【００６３】
６．かかるハイブリダイゼーション・カセットを６２℃に設定された水槽内に沈める。
【００６４】
７．６２℃で６時間ハイブリダイズする。
【００６５】
８．ハイブリダイズに続き、前記マイクロアレイをハイブリダイゼーション・カセットから取り外すとともに、それを直ちに洗浄ステーション内に収納する。
【００６６】
９．マイクロアレイを、１ＸＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳにより室温で５分間洗浄する。
【００６７】
１０．洗浄ステーション及びマイクロアレイを、４００ｍｌの０．１ＸＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳを含んだ第２ビーカーに変更する。
【００６８】
１１．マイクロアレイを、０．１ＸＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳにより室温で５分間洗浄する。
【００６９】
１２．ＳＤＳを除去するため、０．１ＸＳＳＣを含む第３ビーカー内でマイクロアレイを簡単にすすぐ。
【００７０】
１３．かかるマイクロアレイを風乾させる。
【００７１】
１４．蛍光性の光を集めるため、スキャンアレイ３０００、４０００又は５０００を用いて当該マイクロアレイを走査する。
【００７２】
１５．マイクロアレイにおける各位置の蛍光性の光を定量化する。
【００７３】
１６．実験データと前記適切なコントロールとを比較することにより、検出した生化学的実態の遺伝子発現値（ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖａｌｕｅｓ）を割り当てる。
【００７４】
ａ．　カバー片は、油、ホコリ、その他の異物が付着していないことが必要である。サンプルがマイクロアレイの表面に対して単層を形成するつれ、それによって気泡が押し出されるよう、前記カバー片を左から右へとマイクロアレイ上に引き下げる。カバー片下に閉じこめられた細かい気泡は、６２℃において数分後に消える
ｂ．　６２℃という温度はｃＤＮＡ−ｃＤＮＡハイブリダイズ用に非常に効果がある。オリゴヌクレオチドのハイブリダイズ用には低い温度を用いるべきである。
【００７５】
ｃ． 洗浄ステーションは、４００ｍｌの１ＸＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳを含む６００ｍｌビーカー内に配置すべきである。前記マイクロアレイのカセットから洗浄ステーションへの移動は、迅速に行わなければならない。マイクロアレイを室温に放置することにより、背景の蛍光発光度が上昇する。
【００７６】
ｄ． カバー片は、洗浄ステップ中にマイクロアレイから外れるべきである。カバー片が３０秒以内に外れない場合、ピンセットを用いてカバー片を丁寧にマイクロアレイから除去する。カバー片の除去がうまくいかないと、マイクロアレイの洗浄を効率的に行うことができない。
【００７７】
２．サンプルから標識核酸を準備する
１．テストされるサンプルからすべての核酸（ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）を準備する。
【００７８】
２．ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により、短いランダムプライマーを用いて核酸を増幅する。
【００７９】
３．マイクロチューブに対し、７１マイクロリットルの水、１０マイクロリットルの１０ＸＰＣＲバッファ（５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＣｌであってｐＨが８．３のもの、１５ｍＭのＭＧＣｌ２、ゼラチン０．１％）、１０マイクロリットルのｄＮＴＰ（各２ｍＭ）、５マイクロリットルのＣｙ５−ｄＣＴＰ（１ｍＭ）ａ、２．０マイクロリットルの短いランダムのオリゴヌクレオチドプライマー（１００ｐモル／マイクロリットル）、サンプル（０．５マイクログラム／マイクロリットル）からの１マイクロリットルのすべての核酸、を加える。マイクロチューブをゆっくり叩くことにより混合する。
【００８０】
４．１．０マイクロリットルのＴａｑ　ＤＮＡポリマー（５ユニット／マイクロリットル）を加える。マイクロチューブをゆっくり叩くことにより混合する。
【００８１】
５．以下の条件：［９５℃で２分間変性させ、（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒）というサイクルを３０回行うことで増幅し、７２℃で３分延長し、精製可能になるまで４度で保持する］に基づき、全ての核酸を連続的に増幅することにより、蛍光性の、一本鎖ｃＤＮＡを生成する。
【００８２】
６．ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｃｏｌｕｍｎ上に蛍光性の、一本鎖生成物を精製する。
【００８３】
７．精製した生成物をＳｐｅｅｄＶａｃ上で乾燥状態になるよう蒸発させる。
【００８４】
８．５０マイクロリットルの１ＸＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ および１ｍＭのＥＤＴＡ）であってｐＨが８．０のもの、の中でペレットを再懸濁させる。
【００８５】
３．標識コントロール核酸を準備する
器具及び試薬
パーキンエルマー９６００、サーマルサイクラー（又は同等機）
ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＫｉｔＱｉａｇｅｎ ＃２８１０６）
方法
１．プラスミドベクター内にクローン化された異種ｃＤＮＡを得る。
【００８６】
２．ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により、ｃＤＮＡ専用プライマーを用いてかかるｃＤＮＡインサートを増幅する。
【００８７】
３．ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｃｏｌｕｍｎを用いて増幅されたｃＤＮＡインサートを精製する。
【００８８】
４．サンプルをＳｐｅｅｄＶａｃ内で乾燥状態になるよう蒸発させる。
【００８９】
５．精製したｃＤＮＡインサートを、１０マイクロリットルの１ＸＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ および１ｍＭのＥＤＴＡ）であってｐＨが８．０のもの、の中で再懸濁させる。
【００９０】
６．マイクロチューブに対し、７１マイクロリットルの水、１０マイクロリットルの１０ＸＰＣＲバッファ（５００ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＣｌであってｐＨが８．３のもの、１５ｍＭのＭＧＣｌ２、ゼラチン０．１％）、１０マイクロリットルのｄＮＴＰ（各２ｍＭ）、５マイクロリットルのＣｙ５−ｄＣＴＰ（１ｍＭ）ａ、２．０マイクロリットルの２０−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドプライマー（１００ｐモル／マイクロリットル）、１マイクロリットルのｃＤＮＡＰＣＲ生成物（０．５マイクログラム／マイクロリットル）を加える。マイクロチューブをゆっくり叩くことにより混合する。
【００９１】
７．１．０マイクロリットルのＴａｑ　ＤＮＡポリマー（５ユニット／マイクロリットル）を加える。マイクロチューブをゆっくり叩くことにより混合する。
【００９２】
８．以下の条件：［９５℃で２分間変性させ、（９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒）というサイクルを３０回行うことで増幅し、７２℃で３分延長し、精製可能になるまで４度で保持する］に基づき、テンプレートを連続的に増幅することにより、蛍光性の、一本鎖ｃＤＮＡを生成する。
【００９３】
９．ＱＩＡｑｕｉｃｋ ｃｏｌｕｍｎ上に蛍光性の、一本鎖生成物を精製する。
【００９４】
１０．精製した生成物をＳｐｅｅｄＶａｃ上で乾燥状態になるよう蒸発させる。
【００９５】
１１．５０マイクロリットルの１ＸＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ および１ｍＭのＥＤＴＡ）であってｐＨが８．０のもの、の中でペレットを再懸濁させる。蛍光性の、一本鎖ｃＤＮＡの濃度は、約４０ナノグラム／マイクロリットルであるべきである。
【００９６】
１２．約２ナノグラム／マイクロリットルにおいて、蛍光性の一本鎖ｃＤＮＡコントロールを提供するため、４０ナノグラム／マイクロリットル濃度の蛍光性コントロールを１．０マイクロリットル加える。
【００９７】
ａ． 蛍光物質（ｆｌｕｏｒｓ）に代えて、Ｆ１２−ｄＵＴＰ、 Ｌ５−ｄＣＴＰ ａｎｄ Ｃｙ５−ｄＣＴＰを用いることも出来る。
【００９８】
ｂ． このタイプのコントロールにより、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）のような酵素の標識ステップと独立して適度なハイブリダイズおよび走査を行うことができる。２ナノグラム／マイクロリットルの濃度の一本鎖生成物は、十分なセル転写（ａｂｕｎｄａｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ）と同様の強い蛍光信号を生成すべきである。複数の蛍光ｃＤＮＡは、一連の濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｓｅｒｉｅｓ）を生成するために用いることが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、この発明の好ましい一実施形態の概要を示す図である。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004507207.tif 000026
【国際調査報告】
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2004507207.tif 000028
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