(57)【要約】本発明は、病原性及び／又は寄生性微生物により引き起こされるヒト又は動物における感染の分析及び診断のための手段及び方法、変性した又は遺伝子工学的に操作されたヒト又は動物細胞の分析及び診断のための手段及び方法、抗感染薬及び抗腫瘍薬の研究及び試験のための手段及び方法、並びに特に感染しやすい組織（例えば腸、皮膚、角膜、気管及び粘膜）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元器官及び組織モデルに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
緩衝化した含血清細胞培地中少なくとも３ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを含む三次元ゲル状バイオマトリックスにヒト又は動物細胞を植込み、この培地中で単層のｉｎ　ｖｉｔｒｏ組織系が得られるように培養することを特徴とする、ヒト又は動物のｉｎ　ｖｉｔｒｏ単層組織試験系の調製方法。
【請求項２】
ヒト又は動物細胞の培養が少なくとも１〜２日の液内培養を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒト又は動物細胞が非変性細胞、変性細胞又はこれらの混合物である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ヒト又は動物細胞が遺伝子工学的に操作された細胞又は遺伝子工学的に操作されていない細胞と遺伝子工学的に操作された細胞の混合物である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
コラーゲンを含む組織を分離し、該コラーゲンを含む組織を酸性溶液に移し、酸性溶液に移したコラーゲン組織を２〜１０℃、特に４℃でインキュベートし、不溶のコラーゲン部分を遠心分離して除き、得られたコラーゲン溶液と、培養対象のヒト又は動物細胞、細胞培地、血清及び緩衝液を含む溶液とを２〜１０℃、好ましくは４℃で混合し、そして温度上昇により混合溶液をゲル化することを含む、請求項１〜４のいずれか１つに記載のヒト又は動物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層組織試験系の調製方法。
【請求項６】
ヒト又は動物細胞を三次元ゲル状バイオマトリックスで培養した後、該マトリックスから溶出し、高い細胞密度で引き続き培養することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層組織系を得るものである、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
緩衝化した含血清細胞培地中少なくとも３ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを含む三次元ゲル状バイオマトリックスに第１のヒト又は動物組織型の細胞を植込み、このバイオマトリックスで少なくとも１〜２日の培養を行い、次に第２のヒト又は動物組織型の細胞をバイオマトリックス上の細胞培地中に播種し、続いて引き続き培養し、次に場合によっては別のヒト又は動物組織型の細胞を細胞培地中に播種してもよく、続いて引き続き培養して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層器官又は組織試験系を得るものである、ヒト又は動物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層器官又は組織試験系の調製方法。
【請求項８】
第１のヒト又は動物組織型の細胞の培養が少なくとも１〜２日の液内培養を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第２のヒト又は動物組織型の細胞の培養が少なくとも２〜６日の液内培養と少なくとも１０〜１４日のエアリフト培養を含む請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
第２のヒト又は動物組織型の細胞及び場合によっては別のヒト又は動物組織型の細胞が高い割合の未分化幹細胞及び／又は免疫系細胞を有する請求項７〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
第１のヒト又は動物組織型の細胞、第２のヒト又は動物組織型の細胞及び場合によって使用される別のヒト又は動物組織型の細胞が、非変性細胞、変性細胞又はその混合物である請求項７〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
第１のヒト又は動物組織型の細胞、第２のヒト又は動物組織型の細胞及び場合によって使用される別のヒト又は動物組織型の細胞が、遺伝子工学的に操作された細胞又は遺伝子工学的に操作されていない細胞と遺伝子工学的に操作された細胞の混合物である請求項７〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
第１のヒト又は動物組織型の細胞が皮膚繊維芽細胞であり、第２のヒト又は動物組織型の細胞が角化細胞であり、培養後にｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元皮膚試験系が調製されるものである請求項７〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
第１のヒト又は動物組織型の細胞が腸の結合組織細胞であり、第２のヒト又は動物組織型の細胞が腸細胞又は腸上皮細胞であり、培養後にｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元腸試験系が調製されるものである請求項７〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
第１のヒト又は動物組織型の細胞が角膜内皮細胞であり、第２のヒト又は動物組織型の細胞が角膜角化細胞であり、別の第３のヒト又は動物組織型の細胞が角膜表皮細胞であり、培養後にｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元角膜試験系が調製されるものである請求項７〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
第１のヒト又は動物組織型の細胞が繊維芽細胞、特に気管繊維芽細胞であり、第２のヒト又は動物組織型の細胞が気管表皮細胞であり、培養後にｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元気管試験系が調製されるものである請求項７〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
第１のヒト又は動物組織型の細胞が繊維芽細胞、特に粘膜繊維芽細胞であり、第２のヒト又は動物組織型の細胞が粘膜表皮細胞であり、培養後にｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元粘膜試験系が調製されるものである請求項７〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
コラーゲン含有組織を分離し、該コラーゲン含有組織を酸性溶液に移し、酸性溶液に移したコラーゲン組織を２〜１０℃、特に４℃でインキュベートし、不溶のコラーゲン部分を遠心分離して除き、得られたコラーゲン溶液と、培養対象の第１のヒト又は動物組織型の細胞、細胞培地、血清及び緩衝液を含む溶液とを２〜１０℃、好ましくは４℃で混合し、温度上昇により混合溶液をゲル化し、ゲル化した混合物を３７℃でインキュベートし、インキュベートしたゲル化混合物に第２のヒト又は動物組織系の細胞を播種することを含み、場合によっては別のヒト又は動物組織型の細胞を播種してもよい、請求項７〜１７のいずれか１つに記載のヒト又は動物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層器官又は組織試験系の調製方法。
【請求項１９】
組織から分離したコラーゲン繊維を酸性溶液中で２〜１０℃、好ましくは４℃で３〜１４日間攪拌し、不溶のコラーゲン部分を遠心分離して除き、得られたコラーゲン含量３ｍｇ／ｍｌ〜８ｍｇ／ｍｌの完成コラーゲン溶液と、植込んだヒト又は動物細胞、細胞培地、血清及び緩衝液を含む溶液とを２〜１０℃、好ましくは４℃で混合し、続いて高い温度、好ましくは室温から３７℃でゲル化することによって、植込んだヒト又は動物細胞を含むバイオマトリックスを調製する請求項１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
酸性溶液が、酢酸溶液、特に０．１％酢酸溶液である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞、細胞培地、血清及び緩衝液を含む溶液を容積比１：１でコラーゲン含有溶液と混合する請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜６又は１９〜２１のいずれか１つに記載の方法により調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層組織試験系。
【請求項２３】
請求項７〜１３又は１８〜２１のいずれか１つに記載の方法により調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層皮膚試験系。
【請求項２４】
請求項７〜１２、１４又は１８〜２１のいずれか１つに記載の方法により調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層腸試験系。
【請求項２５】
請求項７〜１２、１５又は１８〜２１のいずれか１つに記載の方法により調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層角膜試験系。
【請求項２６】
請求項７〜１２、１６又は１８〜２１のいずれか１つに記載の方法により調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層気管試験系。
【請求項２７】
請求項７〜１２又は１７〜２１のいずれか１つに記載の方法により調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層粘膜試験系。
【請求項２８】
請求項２２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層組織試験系又は請求項２３〜２７のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層器官又は組織試験系と病原性又は寄生性微生物とを接触させ、感染過程の後続の又は同時的研究を行うことが可能な条件下で該微生物と該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層又は多層器官又は組織試験系とを共存培養することを含む、ヒト又は動物組織における病原性又は寄生性微生物の感染過程の試験方法。
【請求項２９】
共存培養を液内培養で行って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層又は多層器官又は組織試験系の細胞への微生物の接着を判定するものである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
共存培養をエアリフト培養で行って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層又は多層器官又は組織試験系の細胞への微生物の侵入を判定するものである請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層組織試験系又は請求項２３〜２７のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元器官又は組織試験系と病原性又は寄生性微生物とを接触させ、被検物質又は因子の存在下又は不在下で該微生物と該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層又は多層器官又は組織試験系とを共存培養し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層又は多層器官又は組織試験系、微生物及び被検物質又は被検因子の間の相互作用を判定することを含む、ヒト又は動物組織における病原性又は寄生性微生物の感染過程に対する化学物質又は因子の影響の決定方法。
【請求項３２】
微生物の接着に対する被検物質又は被検因子の影響を決定するものである請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
微生物の侵入に対する被検物質又は被検因子の影響を決定するものである請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
微生物の増殖率に対する被検物質又は被検因子の影響を決定するものである請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
化学物質又は因子と、変性及び／若しくは非変性のヒト若しくは動物の細胞で構成された請求項２２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層組織試験系、又は変性及び／若しくは非変性のヒト若しくは動物の細胞で構成された請求項２３〜２７のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元器官又は組織試験系とを接触させ、該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層又は多層器官又は組織試験系と該化学物質又は因子の間の相互作用を判定することを含む、非変性又は変性のヒト又は動物の細胞に対する化学物質又は因子の影響の決定方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、病原性又は寄生性微生物により引き起こされたヒト又は動物の身体の感染及び／又は疾患の分析及び診断のための手段及び方法、遺伝子工学的に操作されたヒト及び動物細胞の分析及び診断のための手段及び方法、抗感染薬及び抗腫瘍薬、特に細胞分裂阻害剤の開発及び試験のための手段及び方法、並びに特に感染しやすい組織（例えば腸、皮膚、角膜、気管及び粘膜）の動物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元器官及び組織モデルに関する。
【０００２】
大型生物（例えばヒト）は多数の微生物により罹病する。こうした微生物には、原核微生物（例えば細菌）及び真核微生物（例えば菌類及び原生動物）、さらには広い意味でウイルスも含まれる。当該の大型生物に対してこの微生物は多種多様な結果をもたらす。例えば微生物による感染は感染症を発生する。別の微生物は宿主生物の体内又は体外に寄生的生活様式を営む。即ち宿主生物の犠牲で生活するが、寄生生物は重大な病患を生じない。他方では、幾つかのウイルス、特に発癌性ウイルスが、ヒト又は動物細胞のｉｎ  ｖｉｖｏにおいて腫瘍性形質転換を生じることが知られており、それらの中には変性細胞の発生及び腫瘍の発病と関連づけられるものがある。
【０００３】
微生物によるヒト又は動物生体の感染は、幾つかの段階、例えば宿主生物への微生物の伝達、宿主生物の細胞又は組織への微生物の付着（接着）、宿主生物の特定の細胞又は組織への微生物の侵入（ｉｎｖａｓｉｏｎ又はｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）、及びそこでの微生物の増殖などからなる。感染は、微生物の感染性、例えば伝染性、伝染力、接着性、侵入能力及び増殖能力と、その病原性で決まる。感染症の発症と経過は罹患した宿主生物の感受性と免疫性にも左右される。特定の微生物に関連して例えばそれが原核又は真核生物であるかによって、また当該の宿主生物に関連して例えばどの器官又は組織が罹患しているかによって、感染機構が大きく相違する。
【０００４】
腫瘍疾患の発症と進行はまたウイルスの性質のほかに、当該の宿主生物の感受性と免疫性に関係する。例えばウイルスは好ましくは免疫力のない生物に腫瘍を形成することが知られている。
【０００５】
従って感染症又は腫瘍の治療のために使用される薬剤の効果も様々である。感染症に対して使用され、罹患生物の体内で微生物を損傷し又は殺傷する抗感染薬は、宿主生物自体を損傷せずに、微生物の細胞壁合成を阻止し、細胞質膜の透過性を妨害し、タンパク質合成を遮断し及び／又は核酸合成を抑制することを目標とする。これに対して発癌性ウイルスに原因する癌腫瘍の場合は、本来の原因因子、即ち発癌性ウイルスを的確に克服することは現在不可能であり、例えば細胞分裂阻害剤を使用して変性細胞を殺すか又はその成長を阻止する。
【０００６】
感染症を発症するヒト又は動物宿主と微生物との複雑な相互作用の研究及び変性動物細胞を発生する複雑な細胞及び／又はウイルス機構の分析のために、かつては動物実験が優先的に使用された。また抗感染薬又は細胞分裂阻害剤の開発と試験のために主として動物実験が、例えば臨床前試験の範囲で行われた。ところが動物で得た結果は条件付でしか人間に転用されないことが判明した。
【０００７】
細胞培養技術の発展により、動物実験を補完する又はそれと代替するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ二次元細胞系での試験も行われた。例えばヒトにおいてカンジダ真菌症を引き起こし、免疫が低下した患者に生命を脅かす感染症を生じるヒト病原性菌類のカンジダ・アルビカンスの研究も、このような細胞系で行なわれた（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１（１９９８年），６８７−６９２）。好ましくは１種類の細胞で構成され単細胞層からなる表皮モデルがカンジダの接着と侵入の研究のために開発された（Ｋｏｒｔｉｎｇら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．，３６（１９９８年），２５９−２６７；Ｚｉｎｋら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，６４（１９９６年），５０８５−５０９１）。
【０００８】
ところがこのような二次元のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞系の欠点は、進行中の感染機構又は腫瘍の発症の正確な経過を提示することができないことである。この系は構造の関係上、例えばｉｎ  ｖｉｖｏにおける完全器官の場合のような異種細胞間の相互作用を許容しない。またこの系は結合組織様（特異的）基質を含まず、合成膜の上に構成されている。これが原因で、例えば感染症の場合に、この系は病原体、器官又は組織を構成する細胞型、及び硬固な結合組織基質の間の複雑な相互作用を正確に分析することができない。それ故このような系は抗感染薬や細胞分裂阻害剤の開発及び試験のためにごく限定的にしか使用されない。
【０００９】
そこで本発明の根底にある技術問題は、病原性又は寄生性微生物によりヒト又は動物宿主生物に引き起こされる感染症の分析及び診断のための手段及び方法、ヒト又は動物の変性細胞又は遺伝子工学的に操作された細胞の分析及び診断のための手段及び方法、並びに診断薬及び治療薬、特に抗感染薬及び抗腫瘍薬、特に細胞分裂阻害剤の研究及び試験のための手段及び方法において、先行技術の上記の欠点を克服し、特に感染の発生を招く病原性又は寄生性微生物とその標的器官又は組織との間の相互作用及び腫瘍形成をもたらす細胞及び／又はウイルス機構を研究するのに適し、それに基づき特異的診断薬及び治療薬、例えば抗感染薬又は細胞分裂阻害剤の開発を可能にする手段及び方法を開発することである。
【００１０】
本発明は、分離された動物及びヒト細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける分化及び増殖を行い、その過程で動物又はヒトの器官又は組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける三次元モデルを調製する方法を提供することによって、発明の根底をなす技術問題を解決する。そのために本発明に基づき特に感染しやすい組織又は器官、例えば腸、皮膚、角膜、気管又は粘膜の一次細胞又はその他の細胞、特に上記の器官及び組織の被検変性細胞又は特に上記の器官及び組織の被検対象となる遺伝子工学的に操作された細胞を使用することができる。これに基づき本発明は上記の方法を利用して、分化及び／又は増殖した細胞と病原性又は寄生性微生物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ共存培養法、並びにｉｎ  ｖｉｔｒｏ共存培養した分化及び／又は増殖細胞並びに微生物と物質との相互作用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究法を提供する。これらの方法は、感染の経過を分析し、感染医療の分野で有用な診断薬及び治療薬を提供することができる。
【００１１】
本発明に係る器官試験系で得た結果は動物実験で確かめた結果よりも有意義であり、ヒトに良好に転用できることを保証する。
【００１２】
上記の細胞を本発明に基づき結合組織様の三次元ゲル状バイオマトリックスで培養し、そこで増殖させることができる。このバイオマトリックスは、培養対象の細胞のほかに、コラーゲン溶液で構成されたコラーゲン基質（ネットワーク）、即ち組織特異的な基質タンパク質を含む。所望の組織型によっては、他の細胞型、好ましくは他の一次細胞をこの細胞含有コラーゲンゲルに適用してもよい。特定の培養条件と特定の培地を使用すれば、バイオマトリックスに含まれる細胞及びバイオマトリックスに適用した他の細胞型は、分化を経て多層三次元動物組織又は器官試験モデルとなる。
【００１３】
こうして本発明に係る方法によって、複数の組織特異的な細胞層から構成され、組織学的にも機能的にも天然の器官又は組織にほぼ相当する動物又はヒトの組織又は器官の三次元試験モデルが得られる。従ってこの器官又は組織試験モデルは、動物及びヒトの感染過程の自然に忠実なモデル化のために、１種類の細胞型だけで構成された慣用のｉｎ  ｖｉｔｒｏ系よりもはるかに好適であり、細菌、菌類、ウイルス及び原生動物の感染及び耐性機構の的確な分析のために使用することができる。こうして本発明に係るｉｎ  ｖｉｔｒｏ器官又は組織試験モデルは、本発明に基づき寄生性又は病原性微生物を接種して、微生物とともに適当な条件で培養することができる。また動物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ器官又は組織試験系を構築するために、異なる器官から異なる一次細胞を使用することによって種々の組織系に対する原因因子の挙動を試験することが可能となる。
【００１４】
本発明に係る動物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ組織又は器官試験系と寄生性又は病原性微生物の本発明に基づく共存培養は、感染過程自体及び当該の類器官細胞系の防御反応を研究することを可能にする。例えば多量の感染細胞材料及び病原体自体を得ることができる。得た材料を、例えば感染細胞の形態変化、病原体による特異的物質（例えば毒素若しくは生じる耐性に関連するタンパク質）の分泌、又は罹患細胞による特異的物質（例えばインターロイキン）の分泌を防御反応として詳しく研究するため、あるいは転写及び／又は発現プロフィルを作成し、これに基づいて例えば抗感染薬の開発のための標的として毒性因子を同定するために、在来の組織学的、生化学的、分子生物学的又は免疫学的方法でさらに分析することができる。
【００１５】
本発明に係る上記の方法は好ましくは、例えば特定の感染症状の存在を検出することができる潜在的診断薬のスクリーニングと分析を行うことが可能である。そこで本発明は、診断薬の同定又はその特異性の分析のための方法にも関し、その場合、本発明に係るｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層又は多層組織又は器官試験系と感染因子との本発明に基づき行われる共存培養に関連して、感染又は感染過程を同定する潜在的又は被検診断薬の能力が試験される。この方法に関連して被検診断薬を本発明の系に加えることができ、その際、感染状態と診断薬によるマーキング又は検出との相関がどの程度存在するかを、形態学的、生理学的又はその他のパラメータに基づいて確かめることができる。
【００１６】
本発明に係る動物及びヒトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ組織又は器官試験系、並びに本発明に係る共存培養法によって、特に治療薬（例えば抗感染薬）の効力を作用機構及び／又は副作用に関して、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ器官又は組織試験系の細胞の遺伝子発現、物質代謝、増殖、分化及び再組織化に対する効果に基づいて、在来の試験系よりはるかに正確に分析することができる。作用物質、即ち治療薬及び診断薬、並びに感染因子と培養細胞の相互作用について、本発明に基づいて行われる動物又はヒトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ組織試験系における試験としては、在来の形態学的又は組織学的方法、並びに在来の生化学的、毒物学的、免疫学的及び／又は分子生物学的方法が含まれる。
【００１７】
本発明に係る方法及びこの方法に使用される手段、即ちｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層又は多層組織又は器官試験系は、本発明に基づき潜在的作用物質のスクリーニングのため、また性質（例えば特異性）及び作用物質と標的細胞の相互作用の研究のために使用することができる。本発明によれば「作用物質」という用語は、生物学的細胞又はその一部、特に細胞小器官に影響し又はこれを識別することができるあらゆる物質、その他の因子、例えば物理的影響因子、例えば電磁線、放射能、熱、音波等を意味する。このような作用物質は特に化学的性質のものであり、例えば診断薬又は治療薬である。本発明に関連して「診断薬」とは、状態、過程又は物質の存在又は不在を特異的に認識することができ、特に罹病状態を推定させることができるあらゆる物質を意味する。診断薬は識別及び標識（マーキング）機能を有することが多い。「治療薬」という用語は、特に罹病状態を回避し、緩和し、又は取り除くために予防的に又は疾病の進行と共に使用することができる物質を意味する。本発明に関連して「疾病」とは、不自然な情緒状態、妊娠、老化現象、発育障害等の状態も意味する。本発明に関連して「治療薬」とはもっぱら又は併せて美容効果を有する物質も意味する。
【００１８】
また本発明に係る方法は、腫瘍発病機構の研究及び／又は例えば特異的腫瘍に対する薬物としての物質の適性の研究にも適している。例えば特に上記の器官又は組織の変性細胞で構成されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ器官又は組織試験系は、多量の変性細胞材料を得るために使用される。次に例えば変性細胞の形態変化又は特異的物質の分泌を詳しく研究するため、あるいは転写及び／又は発現プロフィルを作成するために、得られた材料を在来の方法、例えば組織学的、生化学的、分子生物学的又は免疫学的方法でさらに分析することができる。また変性細胞で構成されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ器官又は組織試験系を用いて細胞分裂阻害能力について薬剤又はその他の因子の影響を研究することができる。他方では非変性一次細胞で構成されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ器官又は組織試験系と発癌性ウイルスを共存培養することができる。この方法によって、例えばウイルスの特異的機能を阻害することができる特異的物質の存在下又は不在下でｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験系の細胞における発癌性ウイルスの増殖及び／又は分布を研究することができる。
【００１９】
さらに本発明に係る方法は、特に上記の組織及び器官の遺伝子工学的に操作された細胞の試験のために使用される。例えば上記の器官の疾患で遺伝子に原因する異常機能の排除又は正常な遺伝子機能の回復のための遺伝子治療に関連して、遺伝子工学的に操作された細胞を試験することができる。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態は、動物又はヒトの細胞の増殖のため、及び動物又はヒトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元器官又は組織試験系の調製のための、三次元ゲル状バイオマトリックスでのこれらの細胞の培養を包含する。
【００２１】
本発明の特に好ましい実施形態は、真皮相当物と表皮相当物からなるヒトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元皮膚相当物の調製のための、バイオマトリックスでのヒト皮膚繊維芽細胞の培養を包含する。
【００２２】
本発明に関連して「細胞培養」という用語は、適当な環境で、例えば代謝生成物及び産物を供給及び排出しつつ、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる細胞（例えば繊維芽細胞）の生活機能の維持、特に細胞の増殖を意味する。本発明に関連して「皮膚繊維芽細胞」とは、天然の、特に皮膚に存在する繊維芽細胞、又は遺伝子工学的に操作された繊維芽細胞若しくはその前駆体を意味する。繊維芽細胞は、皮膚繊維細胞の前駆体である。繊維芽細胞は動物又はヒト起源のものである。
【００２３】
繊維芽細胞の培養のために用意されるバイオマトリックスは、培養される繊維芽細胞と、好ましくは新しいコラーゲン溶液で新たに構成された、バイオマトリックス１ｍｌにつき好ましくはコラーゲン３．５〜４．５ｍｇの濃度のコラーゲン基質を含む。コラーゲン基質はコラーゲンＩの好ましくは無細胞の酸性溶液から得られ、その場合コラーゲン溶液のタンパク質濃度は５〜７ｍｇ／ｍｌであることが好ましい。コラーゲン溶液のｐＨ値は３．８であることが好ましい。繊維芽細胞を含む本発明のバイオマトリックスの調製のために、好ましくは４℃で、コラーゲン溶液に対し、５倍に濃縮した細胞培地、緩衝液（好ましくはＨＥＰＥＳ緩衝液）、血清（好ましくはウシ胎仔血清（ＦＣＳ））及び硫酸−（４／６）−コンドロイチン並びに好ましくは１．５ｘ１０５／ｍｌの繊維芽細胞（特に予備培養した繊維芽細胞）を加えてよく混合する。室温又は３７℃に温度上昇してこの混合物をゲル化する。ゲル化の後にゲルの上にフィブロネクチンを加える。ｉｎ  ｖｉｖｏのフィブロネクチンの機能は、他の高分子（例えばコラーゲン）に結合すること及び細胞を隣接細胞に接着することである。コラーゲンゲルでの繊維芽細胞のその後の培養は液内培養で行うことが好ましい。本発明に関連して「液内培養」とは、細胞を栄養溶液で覆って行う細胞培養法を意味する。繊維芽細胞を含むバイオマトリックスはこのように細胞培地で覆われ、３７℃でインキュベートされる。
【００２４】
上記のゲルのインキュベーションの１〜３日後、好ましくは２日後に角化細胞をゲルに播種する。本発明に関連して「角化細胞」とは、動物又はヒト起源の、角化偏平上皮を形成する表皮細胞、又は遺伝子工学的に操作された角化細胞若しくはその前駆体を意味する。コラーゲンゲルに播種する角化細胞は、ヒト生検組織のなるべく予備培養した未分化角化細胞−幹細胞、即ちサイトケラチン１９−又はインテグリンβ１−陽性基底幹細胞であることが好ましい。バイオマトリックスへの角化細胞の播種は、細胞培地で、好ましくは５％のウシ胎仔血清を含むＫＭＢ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）で行う。続いてヒト表皮増殖因子（０．１μｇ／５００ｍｌ培地）（ｈＥＧＦ［上皮増殖因子］）、ＢＰＥ（ウシ下垂体抽出物）（１５ｍｇタンパク質／５００ｍｌ培地）及び０．８ｍＭのＣａＣｌ２を含むＫＢＭ培地でバイオマトリックスを覆い、１〜３日の液内培養を行う。１．８ｍＭのＣａＣｌ２を含み、ｈＥＧＦ及びＢＰＥを含まないＫＢＭ培地によるエアリフト培養で角化細胞層の完全な分化が得られる。本発明に関連して「エアリフト培養」とは、栄養培地の液面の高さがちょうどバイオマトリックスの高さに合わせて調整され、角化細胞又は角化細胞からなる細胞層が栄養培地の液面より上にあり、栄養培地で覆われていない培養を意味する。即ち空気−栄養培地境界層で培養が行われ、培養物には下から栄養物が補給されるのである。好ましくは１２〜１４日のエアリフト培養の後に真皮相当物及び表皮相当物からなる皮膚特有のｉｎ  ｖｉｔｒｏ全皮膚モデルが発生する。これを本発明に係る試験方法に使用することが好ましい。
【００２５】
そこで本発明はまた、皮膚特異的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ全皮膚試験モデルに関し、特に本発明の方法により調製され、少なくとも２〜４の増殖性細胞層、幾つかの分化細胞層及び少なくとも４〜５の角化細胞層を含み、表皮相当物が基底層、有刺層、顆粒層及び角質層を含み、真皮相当物と表皮相当物の間に基質タンパク質からなる機能性基底膜が含まれている、動物又はヒトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ全皮膚試験モデルに関する。このモデルは、潜在的な若しくは実際の作用物質、例えば治療薬、診断薬の研究、又は感染過程の進行の研究のために非常に好適である。
【００２６】
本発明の別の特に好ましい実施形態は、好ましくはＣａｃｏ２細胞若しくは腸表皮細胞又はその他のヒト細胞系からなるヒトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元腸試験系の調製のためにバイオマトリックスで腸繊維芽細胞を培養することを包含する。
【００２７】
本発明に関連して腸繊維芽細胞とは、天然の、特に腸組織に存在する繊維芽細胞、又は遺伝子工学的に操作された繊維芽細胞若しくはその前駆体を意味する。腸繊維芽細胞は、動物又はヒト起源のものである。
【００２８】
本発明に関連して腸表皮細胞とは、天然の、特に腸組織に存在する表皮細胞、又は遺伝子工学的に操作された表皮細胞若しくはその前駆体を意味する。腸表皮細胞は、動物又はヒト起源のものである。
【００２９】
腸繊維芽細胞を含む本発明のバイオマトリックスを調製するために、好ましくは４℃で、コラーゲン溶液に対し、好ましくは２倍に濃縮した細胞培地、緩衝液（好ましくはＨＥＰＥＳ緩衝液）、血清（好ましくは１０％血清）及び好ましくは１．５ｘ１０５／ｍｌの腸繊維芽細胞を含み、ゲル溶液とも呼ばれる溶液を１：１の容積比で加え、よく混合する。ゲル溶液がｘ倍に濃縮されているとすれば、コラーゲン溶液とゲル溶液とを（ｘ−１）：１の容積比で混合することが好ましい。ここでｘは濃縮率である。この混合物は室温又は３７℃への温度上昇によってゲル化される。コラーゲンゲル中の腸繊維芽細胞のその後の培養は液内培養で行うことが好ましい。繊維芽細胞を含むバイオマトリックスを３７℃でインキュベートする。
【００３０】
ゲルのインキュベーションの好ましくは１〜３日後に腸表皮細胞をゲルに播種する。
【００３１】
コラーゲンゲルに播種する腸表皮細胞は、なるべく予備培養した未分化の腸表皮細胞であることが好ましい。バイオマトリックスへの腸表皮細胞の播種は、細胞培地、好ましくは１０％のＦＣＳ及びグルタミン（２ｍＭ）並びに１％の非必須アミノ酸（ＭＥＭ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１１１４０）を含むＤＭＥＭ培地（ダルベッコの改変イーグル培地，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｎｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号４１９６６又は５２１００）で行う。続いて１０％ＦＣＳ、グルタミン（２ｍＭ）及び１％非必須アミノ酸を含むＤＭＥＭ培地でバイオマトリックスを覆い、単数又は複数の表皮層が完全に分化するまで１０〜２０日の液内培養を行う。このバイオマトリックスは本発明の試験法のために使用することが好ましい。
【００３２】
本発明の別の有利な実施形態は、本発明に基づいて調製されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元器官又は組織試験系と病原性又は寄生性微生物の共存培養を含む。本発明に関連して「病原性又は寄生性微生物」は、本明細書においては感染因子とも呼ばれ、大型生物、特にヒト又は動物生体を侵襲し、この生物の組織の中又は上で生活し、この生物の感染を引き起こす可能性はあるが、必然的に引き起こすとは限らない真核性及び原核性の微生物、例えば細菌、菌類、原生動物、ウイロイド、さらにはプリオン、又はウイルスを意味する。本発明に関連して「共存培養」という用語は、動物細胞及び微生物の双方に適した同じ環境で、例えば代謝生成物又は産物を供給及び排出する環境で、好ましくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる動物細胞と微生物の同時的維持、特に細胞と微生物の同時的増殖を意味する。
【００３３】
好ましい実施形態では、ヒト皮膚組織でのカンジダの感染過程を研究するために、ヒト病原性菌類カンジダ・アルビカンスと、本発明に基づいて調製したヒトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ皮膚試験系との共存培養、またヒト腸組織でのカンジダの感染過程を研究するために、本発明に基づいて調製したヒトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸試験系との共存培養が行われる。カンジダで得た結果、特に感染過程の詳細な説明は他の病原体にも転用することができる。
【００３４】
本発明の特に好ましい実施形態では、本発明は、感染過程の第１段階、即ち皮膚又は腸細胞への病原体の接着を研究するために、ヒト病原性微生物カンジダ・アルビカンスと、ヒトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ皮膚試験系又はヒトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸試験系との共存培養に関するものである。すでにマウス・マクロファージモデルで研究された毒性カンジダＳｃ５３１４株及び非毒性カンジダＣａｎ３４株（Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌら、Ｃｅｌｌ，９０（１９９７年），９３９−９４９）を使用して、病原体の接着を研究する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ皮膚試験系又はｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸試験系に液内培養でそれぞれ約１０３の病原性生物を接種し、振とうしつつ培養する。所定の期間、例えば３０分（最大４時間）おきにアリコートを採取し、適当な栄養培地（例えばＹＰＤ完全培地（Ｄｉｆｃｏ））を入れたペトリ皿で平板培養する。適当なインキュベーション時間の後にペトリ皿上のコロニーの数を確認する。確認したコロニー数と当初接種した病原体の数の比較に基づいて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ器官試験系への病原体の接着を決定する。この方法によって、毒性株は皮膚細胞にも腸細胞にも接着能力を有するが、非毒性株の場合は僅かな接着しか検出できないことを示すことができた。
【００３５】
本発明の別の特に好ましい実施形態は、感染過程のその後の段階、即ち細胞への病原体の侵入（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ／Ｉｎｖａｓｉｏｎ）を研究するための、ヒト病原性微生物カンジダ・アルビカンスと、本発明に基づいて調製されたヒトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ皮膚試験系又は本発明に基づいて調製されたヒトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸試験系との共存培養に関するものである。そのために類器官組織試験系をエアリフト法で上記の非毒性及び毒性病原体株と共に共存培養する。１０３／ｍｌの細胞数で病原体を１％寒天に固定し、直径４ｍｍの寒天片を類器官組織試験系の上に最大９８時間置くことが好ましい。１６時間、２４時間、７２時間、８６時間及び９８時間後に、薄片を用いた組織学的方法により類器官構造への病原体の侵入を調べる。その際組織学的方法においては染色法ＰＡＳ（Ｍｃ  Ｍａｎａｕｓ，Ｒｏｍｅｉｓ，１７版、３９３頁）を使用する。組織学的切片に基づき結合組織様基質の深層に至る毒性カンジダ株の侵入過程を記録することができる。
【００３６】
本発明の別の有利な実施形態では、本発明に基づいて調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ器官又は組織試験系と本発明に係る共存培養法を使用して、病原性微生物の感染過程又は増殖に対する化学物質（特に抗感染薬）又は因子の影響を研究する。本発明に関連して「因子」とは、生存する細胞に潜在的作用を働かせることができる特に化学的、生物学的又は物理的手段、例えば光又は熱を包含するものとする。抗感染薬の効果の研究もまたカンジダで行った。現在、全身感染に対する抗真菌剤として好んで使用される２種類の物質クラス、即ちアゾール系及びポリエン系が存在する。２つの種類の物質には欠点がある。ポリエン系には強い副作用があり、アゾール系に対しては次第に耐性が生じる（ＤｉＤｏｍｅｎｉｃｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２（１９９９年），５０９−５１５；Ｇｅｏｒｇｏｐａｐａｄａｋｏｕ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１（１９９９年），５４７−５５７）。この理由から新しい抗真菌剤の所期（ｓｐｅｃｉｆｉｃ）の開発が緊急に必要である。
【００３７】
好ましい実施形態では、本発明に係るｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸試験系及び本発明に係るｉｎ  ｖｉｔｒｏ皮膚試験系へのカンジダの接着の研究方法を、共存培養調合物が抗真菌剤、特にアンホテリシンＢ又はフルコナゾールを含むように改良する。この方法によって２つの抗真菌剤が病原体の接着にではなく、その増殖率に影響することを示すことができた。
【００３８】
別の好ましい実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸試験系及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ皮膚試験系へのカンジダの侵入の研究方法を、共存培養調合物がアンホテリシンＢ又はフルコナゾールを含むように改良する。この方法によって毒性病原体株の侵入を完全な増殖阻害によって初めて抑制できることを示すことができた。また本発明に基づき新しい作用物質が試験された。
【００３９】
本発明の特に好ましい実施形態は、変性細胞の分析を包含する。本発明に関連して「変性」という用語は、細胞の分化障害（異常）又は脱分化及び増殖調節喪失を招く可能性のある正常細胞のすべての変化、例えば細胞多形性、赤血球不同、核多形性、多染性、核−原形質関係の異常及び異倍数性などを包含し、特に悪性腫瘍細胞に関する。多量の変性細胞材料を得るために、特に上記の器官及び細胞の変性細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏ器官又は組織試験系を構成する。特異的物質の分泌を研究し、転写及び発現プロフィルを作成するために、得た材料を在来の方法、例えば組織学的、生化学的、分子生物学的又は免疫学的方法でさらに分析する。変性細胞で構成されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ器官又は組織試験系で、特に細胞分裂阻害能力に関して薬剤及び潜在的に薬剤として適した物質の効果を研究する。
【００４０】
本発明の特に好ましい実施形態では、患者の特定の腫瘍疾患の治療の可能性を研究するために、その患者に特異的な変性細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏ器官試験系の構築のために使用する。
【００４１】
本発明の別の好ましい実施形態では、特に上記の組織及び器官の遺伝子工学的に操作された細胞の試験が行われる。本発明に関連して「遺伝子工学的に操作された細胞」とは、外来ＤＮＡを細胞に導入するか又は固有のＤＮＡを例えば失欠、転位及び付加により改変して、遺伝子工学的方法により操作したすべての細胞を包含する。特に好ましい実施形態では、患者の特定の疾患の遺伝子治療に関連して、遺伝子工学的に操作された細胞を特にその機能性についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験し、その際このような遺伝子工学的に操作された細胞を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏ器官試験系を構築する。
【００４２】
また本発明は、上記の培養法を実施することができる好ましくはゲル状のバイオマトリックス、即ち１つの組織型の細胞を含むバイオマトリックスに関する。
【００４３】
本発明に基づいて設けられるバイオマトリックスとそこで培養される細胞との組合せは、前述のようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ器官又は組織試験系の調製のために使用することができる。
【００４４】
バイオマトリックスとは、コラーゲン、細胞培地、血清及び緩衝液（好ましくはＨＥＰＥＳ緩衝液）を含むゲル構造を意味する。バイオマトリックスの調製のために使用するコラーゲン溶液は、好ましくはｐＨ値３．８の酸性水性媒体、例えば酢酸中の高い割合の非変性天然コラーゲンを含む溶液、好ましくは０．１％酢酸溶液である。高い割合の非変性コラーゲンとは、溶液中のコラーゲンの総含量が５０％以上、特に６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上、好ましくは９９％以上であることを意味する。好ましい実施形態では、凍結乾燥したコラーゲンを使用しない。溶液のコラーゲン含量は、好ましくは溶液１ｍｌにつきコラーゲン３ｍｇから溶液１ｍｌにつきコラーゲン８ｍｇ、より好ましくは溶液１ｍｌにつきコラーゲン５ｍｇから溶液１ｍｌにつきコラーゲン７ｍｇ、最も好ましくは溶液１ｍｌにつきコラーゲン６ｍｇである。その場合、例えばネズミの尾から分離した後０．１％酢酸中４℃で３〜１４日攪拌しつつインキュベートし、不溶のコラーゲン部分を遠心分離して除いて得られるコラーゲンを使用することが好ましい。好ましい細胞培地は、ＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地）及びＭ１９９である。但し細胞培養が可能な他の任意のあらゆる細胞培地も使用することができる。血清としてウシ胎仔血清（ＦＣＳ）又はヒトの自己血清を、緩衝液として例えばＨＥＰＥＳ緩衝液を使用することが好ましい。細胞培地の溶液、緩衝液及び血清のｐＨ値は、好ましい実施形態では７．５〜８．５、例えば７．６〜８．２、特に７．８である。もちろんバイオマトリックスは、その他の因子（例えば成長因子、接着剤、抗生物質、選択剤等）を含むことができる。
【００４５】
そこで本発明は、細胞を含むバイオマトリックスの調製方法にも関する。その場合、第１段階では、コラーゲン含有組織から分離したコラーゲン繊維を緩衝溶液に集め、アルコールで表面消毒し、続いて緩衝溶液で洗浄し、続いてｐＨ値０．１〜６．９、好ましくは２．０〜５．０、特に好ましくは３．０〜４．０、特に３．３の酸性溶液（例えば０．１％酢酸溶液）に移すことによって、例えばネズミの尾から新鮮なコラーゲンを調製する。続いて後続の段階で、溶液中のコラーゲンを２〜１０℃（特に４℃）で数日（例えば３〜１４日）間攪拌し、不溶のコラーゲン部分を遠心分離して除き、コラーゲン含量３ｍｇ／ｍｌ〜８ｍｇ／ｍｌのコラーゲン溶液を２〜１０℃、例えば４℃で保管する。もちろん例えば−１０℃〜８０℃、特に−２０℃で凍結状態で、この溶液を一時的に貯蔵することも可能である。本発明に基づいて細胞を含むバイオマトリックスを調製するために、第３段階では、好ましくは多数倍（ｘ倍）に濃縮した細胞培地、血清及び緩衝液からなり、ゲル溶液とも呼ばれる溶液と、予備培養して遠心分離した細胞とを混合し、その際好ましくは溶液１ｍｌにつき１ｘ１０５〜２ｘ１０５の細胞、好ましくは１ｍｌにつき１．５ｘ１０５の細胞を使用する。続いてｐＨ値７．５〜８．５、好ましくは７．６〜８．２、特に７．８のこの溶液又は懸濁液と、上記のコラーゲン溶液を例えば１：２の比率で２〜１０℃、特に４℃で混合する。コラーゲン溶液とゲル溶液（緩衝液、血清、細胞、培地）の混合比（容積）は、１：１であることが好ましい。ゲル溶液をｘ倍に濃縮した場合は、コラーゲン溶液とゲル溶液の容積比が（ｘ−１）：１であることが好ましい。続いてゲル溶液を培養容器にピペットで移し、３７℃でゲル化した後、培地で覆う。次にバイオマトリックスを少なくとも２日間培養し、続いて別の組織型の細胞、例えば免疫系細胞をその上に適用することもできる。
【００４６】
本発明のその他の有利な実施形態は本明細書で明らかである。
【００４７】
下記の図と実施例に基づいて本発明を詳述する。
【００４８】
実施例１：ヒトのｉｎ　ｖｉｔｒｏ三次元皮膚試験系の調製
ゲル溶液の調製
５倍に濃縮したＭ１９９細胞培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１９９９年，カタログ番号４２９６６又は５２１００；ＤＭＥＭ）２０部、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＰＢＳ溶液１００ｍｌ中４．７６ｇ、ｐＨ値７．３）１０部及び硫酸−（４，６）−コンドロイチン（ＰＢＳ１ｍｌにつき５ｍｇ）１部を混合し、混合物のｐＨ値を７．８に調整する。混合物を滅菌ろ過し、続いてウシ胎仔血清１０部を加える。
【００４９】
コラーゲン溶液の調製
コラーゲン溶液の調製のために、コラーゲン含有組織、例えばネズミの尾の腱を使用する。すべての作業は無菌材料を使って無菌条件で行う。ネズミの尾を−２０℃で貯蔵の後、７０％アルコールで表面消毒する。ネズミの尾の皮膚を剥がして、個々のコラーゲン繊維を引き出す。別の出発組織を使用するときは、場合によって存在する細胞を機械的、酵素的又は化学的処理により入念に取り除くことができる。コラーゲン繊維をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）に集めて、７０％アルコールで１０分間表面消毒し、続いてＰＢＳでよく洗浄する。繊維の重量を測定し、繊維を０．１％酢酸溶液に移す（最終濃度は約８〜１２ｍｇ／ｍｌ）。この調製物を４℃で約３〜１４日攪拌し、続いて不溶のコラーゲン部分を遠心分離（１０００ｒｐｍ、１時間、８℃）によって取り除く。こうしてコラーゲンは繊維、基質（ネットワーク）又はマトリックスの形ではなく、溶解している。
【００５０】
真皮繊維芽細胞を含むコラーゲンゲル（２４個のインサートのための調製物）の調製
１６ｍｌのコラーゲン溶液を５０ｍｌの遠心分離管に入れ、氷上に置く。予備培養した真皮繊維芽細胞を回収して計数する。１．２ｘ１０６の繊維芽細胞を８ｍｌの氷冷ゲル溶液に入れて、よく懸濁させ、無気泡の状態でコラーゲン溶液に加える。ゲル溶液と繊維芽細胞をよく混合する。それぞれ６００μｌの混合物を２４ウエルマイクロタイタープレート（各ウエルの直径は１０ｍｍ）のウエルに入念に注入する。３７℃で２分間インキュベートすることにより混合物のゲル化が起こる。混合物のゲル化の後に５０μｌのフィブロネクチン（５μｇ／ｍｌ）を各インサートに加える。３７℃で１０分のインキュベーション又は室温で３０分のインキュベーションの後にウエル毎に１ｍｌのＭ１９９培地を加え、インサートをＭ１９９媒地で覆う。ゲルに含まれる繊維芽細胞を３７℃で約１〜２日液内培養し、その際１２時間おきに培地を新しい培地と交換する。
【００５１】
角化細胞の播種とｉｎ　ｖｉｔｒｏ皮膚試験系の培養
角化細胞の播種の前にまずマイクロタイタープレートのウエルの中のゲルから培地を入念に吸い出す。次に５％ＦＣＳを含む５００μｌのＫＢＭ培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を各ウエルに加える。ゲルをそれぞれ５０μｌのフィブロネクチン溶液で覆い、３７℃で１時間インキュベートする。次に５％ＦＣＳを含む５０〜１００μｌのＫＢＭ培地中の角化細胞を各ゲルに１００．０００個ずつ播種し、３７℃で１〜２時間インキュベートする。続いて５％ＦＣＳ、８ｍＭ　ＣａＣｌ２、ｈＥＧＦ（０．１μｇ／ｍｌ培地）及びＢＰＥ（１５ｍｇ／ｍｌ培地）を含む５００μｌのＫＢＭ培地を加え、ゲルを１〜３日間液内培養する。その際培地を毎日新しい培地と交換する。次に２％ＦＣＳ、８ｍｌ  ＣａＣｌ２、ｈＥＧＦ（０．１μｇ／５００ｍｌ培地）及びＢＰＥ（１５ｍｇ／５００ｍｌ培地）を含む１〜１．５ｍｌのＫＢＭ培地でゲルをさらに２〜３日液内培養する。皮膚相当物が発生しているゲルに、次にエアリフト培養を行う。そのためにゲルを６ウエルプレートに移し、ＣａＣｌ２含量１．８８ｍＭでｈＥＧＦ及びＢＰＥを含まないＫＢＭ培地を各ウエルに１．５〜２ｍｌずつ加え、培地の液面を正確にゲルの高さに合わせて調整し、一方、角化細胞又は角化細胞からなる層は培地で覆わない。エアリフト培養を少なくとも１２〜１４日続ける。
【００５２】
実施例２：ヒトのｉｎ　ｖｉｔｒｏ三次元腸試験系の調製
ゲル溶液の調製
２倍に濃縮したＤＭＥＭ−細胞培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号４１９６６又は５２１００、１９９９年）７７．５部、ＦＣＳ２０部、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＰＢＳ溶液１００ｍｌ中７１．４９ｇ、ｐＨ値７．８）２．５部を混合し、混合物のｐＨ値を７．４に調整する。混合物を滅菌ろ過する。
【００５３】
繊維芽細胞を含むコラーゲンゲル（２４個のインサートのための調製物）の調製
７．５ｍｌのコラーゲン溶液を５０ｍｌの遠心分離管に入れ、氷上に置く。予備培養した繊維芽細胞を回収して計数する。１．２ｘ１０６の繊維芽細胞を７．５ｍｌの氷冷ゲル溶液に入れ、よく懸濁させ、無気泡の状態でコラーゲン溶液に加える。コラーゲン溶液とゲル溶液と繊維芽細胞をよく混合する。それぞれ３００μｌの混合物をインサートのウエルに入念に注入する。インサートは２４ウエルのマイクロタイタープレートにある。３７℃で２分間のインキュベーションによって混合物のゲル化が起こる。混合物のゲル化の後に各インサートの上に接してそれぞれ１μｌの培地を加える。ゲルに含まれる繊維芽細胞を３７℃で約１〜３日間液内培養し、その際４８時間毎に培地を新しい培地と交換する。
【００５４】
腸表皮細胞の播種と腸相当物の培養
Ｃａｃｏ２細胞の播種の前にまずマイクロタイタープレートのウエルのゲルから培地を入念に吸い出す。次に１０％ＦＣＳを含む２００μｌのＤＭＥＭ培地（上記を参照）中の表皮細胞を各ゲルに２００．０００個ずつ播種し、インサートに接して約６００μｌの培地を加え、３７℃で１０〜２０日培養する。４８時間おきに培地の交換を行う。
【００５５】
こうして調製された腸相当物を図１に示す。
【００５６】
実施例３：細胞への病原体の接着を判定するためのカンジダ・アルビカンスとｉｎ　ｖｉｔｒｏ皮膚試験系又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ腸試験系の共存培養
細胞への病原体の接着を判定するために、ヒトのｉｎ　ｖｉｔｒｏ皮膚系の液内培養中のそれぞれ１２個のインサート又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ腸試験系の液内培養中のそれぞれ１２個のインサートに、毒性カンジダＳｃ５３１４株又は非毒性カンジダＣａｎ３４株の各々１０３株の病原性生物を感染させた（Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌら、Ｃｅｌｌ  ９０（１９９７年），９３７−９４９）。続いてインサートを３７℃で攪拌しつつ３０、６０、９０、１２０、１５０又は１８０分インキュベートした。
【００５７】
上記の時期に上清を採取し、ＹＰＤ栄養培地を入れたペトリ皿で平板培養した。２日のインキュベーション時間の後にペトリ皿上のコロニーを計数した。確かめたコロニー数と当初接種した病原体の数の比較に基づき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ皮膚モデルで２時間後に毒性株の約９５％及び非毒性株の１０％が接着していることが確かめられた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸モデルでは約９５％の毒性株（図２）と１０％の非毒性株が接着を示した。
【００５８】
実施例４：細胞への病原体の侵入を判定するためのカンジダ・アルビカンスとｉｎ　ｖｉｔｒｏ皮膚試験系又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ腸試験系の共存培養
病源体の侵入を判定するために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ皮膚系のエアリフト培養中のそれぞれ１２個のインサート及びｉｎ　ｖｉｔｒｏ腸試験系のエアリフト培養中のそれぞれ１２個のインサートに毒性カンジダ株ＡＳｃ５３１４及び非毒性カンジダＣａｎ３４株の各々１０３株の病原性生物を感染させた。続いてインサートを３７℃で最大３日間インキュベートした。
【００５９】
約１８〜２４時間後に薄片における組織学的方法により類器官構造への病原体の侵入を研究した。その際ｉｎ  ｖｉｔｒｏ皮膚系でもｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸系でもＰＡＳ染色法を使用した。組織学的切片に基づき結合組織様基質の深層への毒性カンジダ株の侵入経路を記録した（図３）。なお毒性カンジダ株は感染点から結合組織へ星形に広がるが、これに対して非毒性株は表皮細胞を貫通することができず、接着を示さないことが判明した。
【００６０】
実施例５：ｉｎ　ｖｉｔｒｏ皮膚及び腸細胞へのカンジダ・アルビカンスの接着に対する抗真菌剤の影響
皮膚及び腸細胞へのカンジダ・アルビカンスの接着に対する抗真菌剤の影響を判定するために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ皮膚試験系の液内培養中のそれぞれ１２個のインサート及びｉｎ　ｖｉｔｒｏ腸試験系のそれぞれ１２個のインサートに毒性カンジダＳｃ５３１４株又は非毒性カンジダＣａｎ３４株の１０３株の病原性生物を感染させた。５個のインサートに濃度０．１；０．５；１．０及び２．０μｇ／μｌのアンホテリシンＢ、５個のインサートに濃度０．１；０．５；１．０及び２．０μｇ／μｌのフルコナゾールを加えた。続いてインサートを３７℃で攪拌しつつ最大３日間インキュベートした。
【００６１】
１６、２４、７２、８６及び９８時間後にアリコートを採取し、ＹＰＤ栄養培地を入れたペトリ皿で平板培養した。２日のインキュベーション時間の後にペトリ皿上のコロニーを計数した。抗真菌剤を加えない試料で測定したコロニー数と抗真菌剤を加えた試料で測定したコロニー数の比較に基づき、アンホテリシンＢ及びフルコナゾールの添加と増殖の阻害によって初めて毒性カンジダ株の接着を抑制できることが確かめられた。
【００６２】
実施例６：病源体の侵入を判定するためのカンジダ・アルビカンスとｉｎ　ｖｉｔｒｏ皮膚試験系又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ腸試験系の共存培養
皮膚及び腸細胞へのカンジダ・アルビカンスの侵入に対する抗真菌剤の影響を判定するために、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ皮膚系のエアリフト培養中のそれぞれ１２個のインサート及びｉｎ　ｖｉｔｒｏ腸系のそれぞれ１２個のインサートに毒性カンジダＳｃ５３１４株又は非毒性カンジダＣａｎ３４株のそれぞれ１０３株の病原性生物を感染させた。５個のインサートに濃度０．１；０．５；１．０及び２．０μｇ／μｌのアンホテリシンＢ、５個のインサートに濃度０．１；０．５；１．０及び２．０μｇ／μｌのフルコナゾールを加えた。続いてインサートを３７℃で振とうしつつ最大３日間インキュベートした。
【００６３】
約１８〜２４時間後に、実施例４のように薄片における組織学的方法により類器官構造への病源体の侵入を研究した。アンホテリシンＢ及びフルコナゾールの添加は明らかに増殖の阻害によって毒性カンジダ株の侵入を抑制することが判明した。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明に基づいて調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸系の縦断面図である。
【図２】
菌類カンジダ・アルビカンスが接着した細胞を有する、本発明に基づいて調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸系の縦断面図である（毒性株の接着）。
【図３】
菌類カンジダ・アルビカンスが侵入した細胞を有する、本発明に基づいて調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ腸系の縦断面図である（毒性株の侵入）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年9月6日(2002.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマトリックスの調製のために使用されるコラーゲン溶液が酸性水性媒体中９０％以上の非変性天然コラーゲン部分を含んでおり、培養対象の細胞と、緩衝化した含血清細胞培地中少なくとも３ｍｇ／ｍｌのコラーゲンとを含む三次元ゲル状バイオマトリックスにおいて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ単層組織系が得られるようにヒト又は動物細胞を培養することを特徴とする、ヒト又は動物のｉｎ　ｖｉｔｒｏ単層組織試験系の調製方法。
【請求項２】
ヒト又は動物細胞の培養が少なくとも１〜２日の液内培養を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒト又は動物細胞が非変性細胞、変性細胞又はこれらの混合物である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ヒト又は動物細胞が遺伝子工学的に操作された細胞又は遺伝子工学的に操作されていない細胞と遺伝子工学的に操作された細胞の混合物である請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
コラーゲンを含む組織を分離し、該コラーゲンを含む組織を酸性溶液に移し、酸性溶液に移したコラーゲン組織を２〜１０℃、特に４℃でインキュベートし、不溶のコラーゲン部分を遠心分離して除き、得られたコラーゲン溶液と、培養対象のヒト又は動物細胞、細胞培地、血清及び緩衝液を含む溶液とを２〜１０℃、好ましくは４℃で混合し、そして温度上昇により混合溶液をゲル化することを含む、請求項１〜４のいずれか１つに記載のヒト又は動物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層組織試験系の調製方法。
【請求項６】
ヒト又は動物細胞を三次元ゲル状バイオマトリックスで培養した後、該マトリックスから溶出し、高い細胞密度で引き続き培養することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層組織系を得るものである、請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
バイオマトリックスの調製のために使用されるコラーゲン溶液が酸性水性媒体中９０％以上の非変性天然コラーゲン部分を含んでおり、培養対象の細胞と、緩衝化した含血清細胞培地中少なくとも３ｍｇ／ｍｌのコラーゲンとを含む三次元ゲル状バイオマトリックスにおいて第１のヒト又は動物組織型の細胞を少なくとも１〜２日培養し、次に第２のヒト又は動物組織型の細胞をバイオマトリックス上の細胞培地中に播種し、続いて引き続き培養し、次に場合によっては別のヒト又は動物組織型の細胞を細胞培地中に播種してもよく、続いて引き続き培養して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層器官又は組織試験系を得るものである、ヒト又は動物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層器官又は組織試験系の調製方法。
【請求項８】
第１のヒト又は動物組織型の細胞の培養が少なくとも１〜２日の液内培養を含む請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第２のヒト又は動物組織型の細胞の培養が少なくとも２〜６日の液内培養と少なくとも１０〜１４日のエアリフト培養を含む請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
第２のヒト又は動物組織型の細胞及び場合によっては別のヒト又は動物組織型の細胞が高い割合の未分化幹細胞及び／又は免疫系細胞を有する請求項７〜９のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
第１のヒト又は動物組織型の細胞、第２のヒト又は動物組織型の細胞及び場合によって使用される別のヒト又は動物組織型の細胞が、非変性細胞、変性細胞又はその混合物である請求項７〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
第１のヒト又は動物組織型の細胞、第２のヒト又は動物組織型の細胞及び場合によって使用される別のヒト又は動物組織型の細胞が、遺伝子工学的に操作された細胞又は遺伝子工学的に操作されていない細胞と遺伝子工学的に操作された細胞の混合物である請求項７〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
第１のヒト又は動物組織型の細胞が皮膚繊維芽細胞であり、第２のヒト又は動物組織型の細胞が角化細胞であり、培養後にｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元皮膚試験系が調製されるものである請求項７〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
第１のヒト又は動物組織型の細胞が腸の結合組織細胞であり、第２のヒト又は動物組織型の細胞が腸細胞又は腸上皮細胞であり、培養後にｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元腸試験系が調製されるものである請求項７〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
第１のヒト又は動物組織型の細胞が角膜内皮細胞であり、第２のヒト又は動物組織型の細胞が角膜角化細胞であり、別の第３のヒト又は動物組織型の細胞が角膜表皮細胞であり、培養後にｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元角膜試験系が調製されるものである請求項７〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
第１のヒト又は動物組織型の細胞が繊維芽細胞、特に気管繊維芽細胞であり、第２のヒト又は動物組織型の細胞が気管表皮細胞であり、培養後にｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元気管試験系が調製されるものである請求項７〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
第１のヒト又は動物組織型の細胞が繊維芽細胞、特に粘膜繊維芽細胞であり、第２のヒト又は動物組織型の細胞が粘膜表皮細胞であり、培養後にｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元粘膜試験系が調製されるものである請求項７〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
コラーゲン含有組織を分離し、該コラーゲン含有組織を酸性溶液に移し、酸性溶液に移したコラーゲン組織を２〜１０℃、特に４℃でインキュベートし、不溶のコラーゲン部分を遠心分離して除き、得られたコラーゲン溶液と、培養対象の第１のヒト又は動物組織型の細胞、細胞培地、血清及び緩衝液を含む溶液とを２〜１０℃、好ましくは４℃で混合し、温度上昇により混合溶液をゲル化し、ゲル化した混合物を３７℃でインキュベートし、インキュベートしたゲル化混合物に第２のヒト又は動物組織系の細胞を播種することを含み、場合によっては別のヒト又は動物組織型の細胞を播種してもよい、請求項７〜１７のいずれか１つに記載のヒト又は動物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層器官又は組織試験系の調製方法。
【請求項１９】
組織から分離したコラーゲン繊維を酸性溶液中で２〜１０℃、好ましくは４℃で３〜１４日間攪拌し、不溶のコラーゲン部分を遠心分離して除き、得られたコラーゲン含量３ｍｇ／ｍｌ〜８ｍｇ／ｍｌの完成コラーゲン溶液と、植込んだヒト又は動物細胞、細胞培地、血清及び緩衝液を含む溶液とを２〜１０℃、好ましくは４℃で混合し、続いて高い温度、好ましくは室温から３７℃でゲル化することによって、植込んだヒト又は動物細胞を含むバイオマトリックスを調製する請求項１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２０】
酸性溶液が、酢酸溶液、特に０．１％酢酸溶液である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
細胞、細胞培地、血清及び緩衝液を含む溶液を容積比１：１でコラーゲン含有溶液と混合する請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜６又は１９〜２１のいずれか１つに記載の方法により調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層組織試験系。
【請求項２３】
請求項７〜１３又は１８〜２１のいずれか１つに記載の方法により調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層皮膚試験系。
【請求項２４】
請求項７〜１２、１４又は１８〜２１のいずれか１つに記載の方法により調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層腸試験系。
【請求項２５】
請求項７〜１２、１５又は１８〜２１のいずれか１つに記載の方法により調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層角膜試験系。
【請求項２６】
請求項７〜１２、１６又は１８〜２１のいずれか１つに記載の方法により調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層気管試験系。
【請求項２７】
請求項７〜１２又は１７〜２１のいずれか１つに記載の方法により調製したｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層粘膜試験系。
【請求項２８】
請求項２２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層組織試験系又は請求項２３〜２７のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元多層器官又は組織試験系と病原性又は寄生性微生物とを接触させ、感染過程の後続の又は同時的研究を行うことが可能な条件下で該微生物と該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層又は多層器官又は組織試験系とを共存培養することを含む、ヒト又は動物組織における病原性又は寄生性微生物の感染過程の試験方法。
【請求項２９】
共存培養を液内培養で行って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層又は多層器官又は組織試験系の細胞への微生物の接着を判定するものである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
共存培養をエアリフト培養で行って、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層又は多層器官又は組織試験系の細胞への微生物の侵入を判定するものである請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層組織試験系又は請求項２３〜２７のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元器官又は組織試験系と病原性又は寄生性微生物とを接触させ、被検物質又は因子の存在下又は不在下で該微生物と該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層又は多層器官又は組織試験系とを共存培養し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層又は多層器官又は組織試験系、微生物及び被検物質又は被検因子の間の相互作用を判定することを含む、ヒト又は動物組織における病原性又は寄生性微生物の感染過程に対する化学物質又は因子の影響の決定方法。
【請求項３２】
微生物の接着に対する被検物質又は被検因子の影響を決定するものである請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
微生物の侵入に対する被検物質又は被検因子の影響を決定するものである請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
微生物の増殖率に対する被検物質又は被検因子の影響を決定するものである請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
化学物質又は因子と、変性及び／若しくは非変性のヒト若しくは動物の細胞で構成された請求項２２に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層組織試験系、又は変性及び／若しくは非変性のヒト若しくは動物の細胞で構成された請求項２３〜２７のいずれか１つに記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ三次元器官又は組織試験系とを接触させ、該ｉｎ  ｖｉｔｒｏ単層又は多層器官又は組織試験系と該化学物質又は因子の間の相互作用を判定することを含む、非変性又は変性のヒト又は動物の細胞に対する化学物質又は因子の影響の決定方法。
【国際調査報告】
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