(57)【要約】広範囲のマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（ＭＩＰＣ）の系および方法、ならびにそれに関連するコンピュータプログラムもしくはソフトウェアにおいて、該系は、広範なＭＩＰＣ分離方法のサンプル選択、移動相勾配の選択および制御、カラムおよび移動相の温度制御、ならびにフラグメント収集のための自動化されたオプションを提供する。ＭＩＰＣ分離方法は、ＤＮＡフラグメントの大きさに基づく分離、突然変異の検出、ＤＮＡフラグメントの精製、ＰＣＲ過程のモニタリング、および他の新規過程を遂げるために適用することができる。本発明は、これらの手順の多くを自動化する系およびソフトウェアに向けられ、複雑な分離方法を達成するための該系の使用を助長する。本発明の一態様において、使用者は混合物中の二本鎖ＤＮＡフラグメント（１種もしくは複数）の大きさ範囲を指定し、ソフトウェアが該フラグメント（１種もしくは複数）を溶出するための溶媒の勾配を計算し、そして、系が、計算された勾配を使用してクロマトグラフィー分離を実施する。ＤＮＡ突然変異の検出で有用な一態様においては、使用者が野性型ＤＮＡ分子の塩基配列を指定し、ソフトウェアが混合物中のＤＮＡのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖分子を部分的に変性させるための温度を計算し、ソフトウェアがフラグメントを溶出するための溶媒の勾配を計算し、そして、系が、計算された勾配および温度を使用してクロマトグラフィー分離を実施する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段（該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；ＭＩＰＣ分離カラム；移動相を移動相流量制御手段からＭＩＰＣ分離カラムに向かわせるための導管手段；ならびにその中に固有のソフトウェア移動相流量制御モジュールを有する移動相流量制御手段と通信するコンピュータ；
ａ）分離されるべきＤＮＡフラグメントの混合物中の塩基対長さの数値の範囲を受領すること；
ｂ）ＤＮＡフラグメントの混合物からの選択されたフラグメントの分離を遂げることができる溶媒濃度および対応する溶媒の勾配の範囲を計算すること；
ｃ）溶媒濃度および溶媒の勾配の前記範囲を移動相流量制御モジュールに提供すること；ならびに
ｄ）分離を実施すること（ここで、移動相流量制御モジュールが、選択されたフラグメントの分離を遂げるのに必要とされる勾配および溶媒濃度を果たすように、移動相流量制御手段の設定を制御する）
のコンピュータ化された段階、を含んで成る、高速液体クロマトグラフィー系を用いるＤＮＡフラグメントの混合物の塩基対長さに基づく分離を遂げるための方法において。
【請求項２】
移動相流量制御手段が、それぞれ流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
移動相流量制御手段が一組のポンプであり、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
フラグメントの選択された塩基対長さに基づく分離が、ＤＮＡフラグメントの混合物のフラグメントの全部の分離である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
フラグメントの選択された塩基対長さに基づく分離が、ＤＮＡフラグメントの混合物の１種もしくはそれ以上のフラグメントの選択である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
勾配がイソクラチック勾配を包含する、請求項１記載の方法。
【請求項７】
溶媒濃度が、最小のフラグメントについて計算された％Ｂの値より下で開始するよう計算され、かつ、最大のフラグメントについて計算された％Ｂの値より上で終了するよう計算され、ここで、％Ｂ、ここで、前記％Ｂは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、前記％Ｂは、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される、請求項１記載の方法。
【請求項８】
溶媒濃度が、最小のフラグメントについて計算された％Ｂの値より下で開始するよう計算され、かつ、最大のフラグメントについて計算された％Ｂの値より上で終了するよう計算され、ここで、％Ｂが、以下の式：
【数１】
2004506873.tif 000022
式中
％Ｂは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり
ｐ１、ｐ２およびｐ３は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
溶媒濃度が、最小のフラグメントについて計算された％Ｂの値より下で開始するよう計算され、かつ、最大のフラグメントについて計算された％Ｂの値より上で終了するよう計算され、ここで、％Ｂが、以下の式：
【数２】
2004506873.tif 000023
式中、
【数３】
2004506873.tif 000024
％Ｂは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり；
ｓは勾配の傾きであり；
ｄ、ｖｏｉｄ、ｐ４、ｐ５、ｐ６、ｐ７およびｐ８は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段（該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；ＭＩＰＣ分離カラム；移動相を移動相流量制御手段からＭＩＰＣ分離カラムに向かわせるための導管手段；ならびに移動相流量制御手段と通信するコンピュータ；該コンピュータおよび移動相流量制御手段と作業連合にあるソフトウェア移動相流量制御モジュール（ここで、該移動相流量制御手段は、それぞれが流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁であるか、もしくは、移動相制御手段は一組のポンプであって、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答し、前記コンピュータは溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを包含する）を含んで成る、コンピュータ化された制御手段を包含する高速液体クロマトグラフィー系。
【請求項１１】
溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアが、ＤＮＡフラグメントの混合物中の分離されるべきフラグメントの塩基対長さの範囲を受領しかつ最小のフラグメントについて計算された％Ｂの値より下で開始する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を含んで成り、かつ、最大のフラグメントについて計算された％Ｂの値より上で終了するよう計算され、ここで、前記％Ｂは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、前記％Ｂは、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される、請求項１０記載の高速液体クロマトグラフィー系。
【請求項１２】
溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアが、ＤＮＡフラグメントの混合物中の分離されるべきフラグメントの塩基対長さの範囲を受領し、かつ、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された％Ｂの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された％Ｂの値より上で終了する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を含んで成り、ここで、％Ｂが、以下の式：
【数４】
2004506873.tif 000025
式中
％Ｂは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり；
ｐ１、ｐ２およびｐ３は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される、請求項１０記載の高速液体クロマトグラフィー系。
【請求項１３】
溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアが、ＤＮＡフラグメントの混合物中の分離されるべきフラグメントの塩基対長さの範囲を受領し、かつ、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された％Ｂの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された％Ｂの値より上で終了する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を含んで成り、ここで、％Ｂが、以下の式：
【数５】
2004506873.tif 000026
式中
【数６】
2004506873.tif 000027
％Ｂは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり；
ｓは勾配の傾きであり；
ｄ、ｖｏｉｄ、ｐ４、ｐ５、ｐ６、ｐ７およびｐ８は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である、
により計算される、請求項１０記載の高速液体クロマトグラフィー系。
【請求項１４】
ＤＮＡフラグメントの混合物から分離されるべき塩基対長さの範囲を受領するための手段、ＭＩＰＣにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに必要とされる溶媒濃度を計算するための手段、ならびにＭＩＰＣにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに使用されるべき溶媒の勾配を選択するための手段（ここで、前記溶媒濃度を計算するための手段は、最小のフラグメントについて計算された％Ｂの値より下で開始する溶媒濃度を計算するための手段を包含しかつ最大のフラグメントについて計算された％Ｂの値より上で終了するよう計算され、ここで、前記％Ｂは、有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、前記％Ｂは、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される）を含んで成るソフトウェアプログラム。
【請求項１５】
％Ｂが、以下の式：
【数７】
2004506873.tif 000028
式中
ｐ１、ｐ２およびｐ３は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される、請求項１４記載のソフトウェアプログラム。
【請求項１６】
％Ｂが、以下の式：
【数８】
2004506873.tif 000029
式中
【数９】
2004506873.tif 000030
ｓは勾配の傾きであり；
ｄ、ｖｏｉｄ、ｐ４、ｐ５、ｐ６、ｐ７およびｐ８は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される、請求項１４記載のソフトウェアプログラム。
【請求項１７】
マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム；カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段（該オーブン温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；およびその中に固有のオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを有するオーブン温度制御手段と通信するコンピュータ、を含んで成る高速液体クロマトグラフィー系を用いる混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の分離を遂げる方法において：
約５０℃ないし約７５℃の温度範囲の一連の変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離において、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーにより混合物を分析すること（各連続する分離は、突然変異分離プロフィルが観察されるかもしくは突然変異分離温度範囲のいずれかの突然変異分離プロフィルの非存在が観察されるまで、先行する分離より高温を有し、ここで、突然変異分離プロフィルは突然変異の存在を同定し、かつ、突然変異分離プロフィルの非存在はサンプル中の突然変異の非存在を示し；また、ここで、オーブン温度制御モジュールは、連続する分離の間の温度を果たすオーブン温度制御手段の設定を制御する）
のコンピュータ化された段階を含んで成る方法。
【請求項１８】
マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム；カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段（該オーブン温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；およびその中に固有のオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを有するオーブン温度制御手段と通信するコンピュータ、を含んで成る高速液体クロマトグラフィー系を用いる混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の分離を遂げる方法において：
５０℃ないし約７５℃の温度範囲の一連の変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離において、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーにより混合物を分析すること（各連続する分離は、突然変異分離プロフィルが観察されるかもしくは突然変異分離温度範囲のいずれかの突然変異分離プロフィルの非存在が観察されるまで、先行する分離より低温を有し、ここで、突然変異分離プロフィルは突然変異の存在を同定し、かつ、突然変異分離プロフィルの非存在はサンプル中の突然変異の非存在を示し；また、ここで、オーブン温度制御モジュールは、連続する分離の間の温度を果たすオーブン温度制御手段の設定を制御する）
のコンピュータ化された段階を含んで成る方法。
【請求項１９】
前記マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラムが入口端を有し、かつ、オーブン温度制御手段が：循環空気温度制御系を有する空気浴オーブン；入口端および出口端を有するある長さの毛細管（該毛細管の出口端は分離カラムの入口端と連結され、また、毛細管の入口端は工程液を受領するための手段を含んで成り、該管は６から４００ｃｍまでの完全に伸長された長さを有し；そして、分離カラムおよび毛細管のコイルが空気浴オーブン中に囲まれかつその中の空気に曝露され、前記温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する）を含んで成る、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
オーブン温度制御手段が：第一の熱伝達表面、分離カラム差込口、およびキャピラリーコイル差込口を有する熱伝導ブロック；その内壁と熱伝導の関係で分離カラム差込口内に配置される分離カラム；ならびに、キャピラリーコイル差込口中に配置される毛細管のコイル（該コイルの外側先端はキャピラリーコイル差込口の内壁と熱伝導の関係にあり、前記温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する）を含んで成る、請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
オーブン温度制御手段が、ペルティエ型の加熱および冷却装置を含んで成り、該ペルティエ型の加熱および冷却装置が前記第一の熱伝達表面と熱伝導の関係にある、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム；分離カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段（該オーブン温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；およびその中に固有のオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを有するオーブン温度制御手段と通信するコンピュータ、を含んで成る高速液体クロマトグラフィー系を用いる混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の分離を遂げる方法において：
ａ）予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度を受領すること；
ｂ）ＤＮＡ分子の前記混合物を、前記予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度に加熱すること；および
ｃ）予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度で、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーを用いて段階（ｂ）の生成物を分析して、その中のいかなるヘテロ突然変異体部位の分離された成分の存在も同定すること
のコンピュータ化された段階を含んで成る方法。
【請求項２３】
予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度が：
ａ）計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を得るための計算段階；
ｂ）予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度を得るための予測段階
の段階により得られ；
ここで、計算段階は、第一の数学的モデルに従って、前記計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を計算することを含んで成り；ここで、予測段階は、第二の数学的モデルに従って、前記計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を補正することを含んで成り；ここで、第二の数学的モデルは、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度との経験的に決定されたヘテロ突然変異体部位分離温度の比較に基づく、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度が、以下の式：Ｔ（ｈｓｓｔ）＝Ｘ＋ｍ・Ｔ（ｗ）（ここで、Ｔ（ｈｓｓｔ）は予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度であり、Ｔ（ｗ）は、野性型二本鎖ＤＮＡの変性された状態と非変性状態との間に選択された平衡が存在する、ソフトウェアにより計算されたかもしくは実験的に決定された温度であり、Ｘは変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーの検出係数であり、そしてｍは０と２との間で選択される重み係数である）により計算される、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム；分離カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段（該温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；移動相ＭＩＰＣ分離カラムを指図するための導管手段；オーブン温度制御手段と通信するコンピュータ；コンピュータおよびオーブン温度制御手段と作業連合にあるオーブン温度制御ソフトウェアモジュール（前記コンピュータは、混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の分離のためのヘテロ突然変異体部位分離温度をコンピュータ計算するための温度コンピュータ計算ソフトウェアを包含する）を含んで成る、コンピュータ化された制御手段を包含する変性高速液体クロマトグラフィー系。
【請求項２６】
前記マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラムが入口端を有し、そして、オーブン温度制御手段が：循環空気温度制御系を有する空気浴オーブン；入口端および出口端を有するある長さの毛細管（該毛細管の出口端は分離カラムの入口端と連結され、また、毛細管の入口端は工程液を受領するための手段を含んで成り、該管は６から４００ｃｍまでの完全に伸長された長さを有し；そして、分離カラムおよび毛細管のコイルが空気浴オーブン中に囲まれかつその中の空気に曝露され、前記温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する）を含んで成る、請求項２５記載の系。
【請求項２７】
オーブン温度制御手段が：第一の熱伝達表面、分離カラム差込口、およびキャピラリーコイル差込口を有する熱伝導ブロック；その内壁と熱伝導の関係で分離カラム差込口内に配置される分離カラム；ならびに、キャピラリーコイル差込口中に配置される毛細管のコイル（該コイルの外側先端はキャピラリーコイル差込口の内壁と熱伝導の関係にあり、前記温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する）を含んで成る、請求項２５記載の系。
【請求項２８】
オーブン温度制御手段が、ペルティエ型の加熱および冷却装置を含んで成り、該ペルティエ型の加熱および冷却装置が前記第一の熱伝達表面と熱伝導の関係にある、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
分離されるべき混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の塩基対長さを受領するための手段、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーによる前記等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の分離に必要とされるヘテロ突然変異体部位分離温度を計算するための手段（ここで、前記ヘテロ突然変異体部位分離温度が、以下の式：Ｔ（ｈｓｓｔ）＝Ｘ＋ｍ・Ｔ（ｗ）（ここで、Ｔ（ｈｓｓｔ）はヘテロ突然変異体部位分離温度であり、Ｔ（ｗ）は、野性型二本鎖ＤＮＡの変性された状態と非変性状態との間に選択された平衡が存在する、ソフトウェアにより計算されたかもしくは実験的に決定された温度であり、Ｘは変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーの検出係数であり、そしてｍは０と２との間で選択される重み係数である）により計算される）、を含んで成るソフトウェアプログラム。
【請求項３０】
移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段（該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；ＭＩＰＣ分離カラム；移動相を移動相流量制御手段からＭＩＰＣ分離カラムに向かわせるための導管手段；ならびにその中に固有のソフトウェア移動相流量制御モジュールを有する移動相流量制御手段と通信するコンピュータ；
ａ）混合物中の変性されないホモ二重鎖もしくはヘテロ二重鎖分子の長さを有するＤＮＡ分子の塩基対長さの数値を受領すること；
ｂ）非変性条件下で前記カラムからの前記塩基対長さを有する分子の溶出を遂げることができる溶媒濃度を計算すること；
ｃ）前記ヘテロ二重鎖を部分的に変性させるのに有効な条件下で前記分離を遂げることができる溶媒濃度および対応する溶媒の勾配の範囲を計算すること；
ｄ）移動相流量制御モジュールに、溶媒濃度および溶媒の勾配の前記範囲を提供すること；ならびに
ｅ）分離を実施すること（ここで、移動相流量制御モジュールが、選択されたフラグメントの分離を遂げるのに必要とされる勾配および溶媒濃度を果たすように移動相流量制御手段の設定を制御する）
のコンピュータ化された段階、を含んで成る高速液体クロマトグラフィー系を用いて混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の分離を遂げる方法において。
【請求項３１】
移動相流量制御手段が、それぞれが流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
移動相流量制御手段が一組のポンプであり、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する、請求項３０記載の方法。
【請求項３３】
勾配がイソクラチック勾配を包含する、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
溶媒濃度が、前記塩基対長さを有するＤＮＡ分子について計算された％Ｂの値より下で開始するよう計算され、かつ、前記塩基対長さのＤＮＡ分子について計算された％Ｂの値より上で終了するよう計算され、ここで、前記％Ｂは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、前記％Ｂは、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段（該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；ＭＩＰＣ分離カラム；移動相を移動相流量制御手段からＭＩＰＣ分離カラムに向かわせるための導管手段；ならびに移動相流量制御手段と通信するコンピュータ；該コンピュータおよび移動相流量制御手段と作業連合にあるソフトウェア移動相流量制御モジュール（ここで、該移動相流量制御手段は、それぞれが流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁であるか、もしくは、移動相制御手段は一組のポンプであって、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答し、前記コンピュータは、混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の分離のための溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを包含する）を含んで成る、コンピュータ化された制御手段を包含する変性高速液体クロマトグラフィー系。
【請求項３６】
溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアが、前記混合物中のホモ二重鎖もしくはヘテロ二重鎖分子の塩基対長さを受領し、かつ、前記塩基対長さを有するＤＮＡ分子について計算された％Ｂの値より下で開始する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を含んで成り、かつ、前記塩基対長さのＤＮＡ分子について計算された％Ｂの値より上で終了するよう計算され、ここで、前記％Ｂは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、前記％Ｂは、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される、請求項３５記載の高速液体クロマトグラフィー系。
【請求項３７】
分離されるべき混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の塩基対長さを受領するための手段、ＭＩＰＣにより前記塩基対長さを有するＤＮＡ分子を溶出するのに必要とされる溶媒濃度を計算するための手段、ならびに部分的変性条件下で前記ヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子を分離するのに使用されるべき溶媒の勾配を選択するための手段（ここで、前記溶媒濃度を計算するための手段が、前記塩基対長さを有するＤＮＡ分子について計算された％Ｂの値より下で開始する溶媒濃度を計算するための手段を包含し、かつ、前記塩基対長さのＤＮＡ分子について計算された％Ｂの値より上で終了するよう計算され、ここで、前記％Ｂは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、前記％Ｂが、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される）を含んで成るソフトウェアプログラム。
【請求項３８】
％Ｂが、以下の式：
【数１０】
2004506873.tif 000031
式中
ｐ１、ｐ２およびｐ３は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される、請求項３７記載のソフトウェアプログラム。
【請求項３９】
％Ｂが、以下の式：
【数１１】
2004506873.tif 000032
式中
【数１２】
2004506873.tif 000033
ｓは勾配の傾きであり；
ｄ、ｖｏｉｄ、ｐ４、ｐ５、ｐ６、ｐ７およびｐ８は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される、請求項３７記載のソフトウェアプログラム。
【請求項４０】
マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム；移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段（該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；移動相を移動相流量制御手段からＭＩＰＣ分離カラムに向かわせるための導管手段；分離カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段（該オーブン温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；ならびにその中に固有のソフトウェア移動相流量制御モジュールを有する移動相流量制御手段と通信するコンピュータ（オーブン温度制御手段と通信する前記コンピュータは、その中に固有のオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを有し）を含んで成る高速液体クロマトグラフィー系を用いて混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の分離を遂げる方法において：
ａ）混合物中のホモ二重鎖もしくはヘテロ二重鎖分子の長さを有するＤＮＡ分子の塩基対長さの数値を受領すること；
ｂ）非変性条件下で前記カラムからの前記塩基対長さを有する分子の溶出を遂げることができる溶媒濃度を計算すること；
ｃ）前記塩基対長さを有するＤＮＡ分子について計算された％Ｂの値より下で開始する溶媒濃度を計算すること、かつ、前記塩基対長さのＤＮＡ分子について計算された％Ｂの値より上で終了するよう計算され、ここで、前記％Ｂは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり；
ｄ）移動相流量制御モジュールに、溶媒濃度および溶媒の勾配の前記範囲を提供すること；
ｅ）予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度を受領すること；ＤＮＡ分子の前記混合物を前記予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度に加熱すること；ならびに
ｆ）分離を実施すること（ここで、移動相流量制御モジュールは、予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度での変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーによるホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖フラグメントの分離を遂げるのに必要とされる勾配および溶媒濃度を果たすように移動相流量制御手段の設定を制御して、混合物中のいかなるヘテロ突然変異体部位の分離された成分の存在も同定する）
のコンピュータ化された段階を含んで成る方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＤＮＡの大きさに基づく（塩基対長さ）分離を遂げるのに適するＤＮＡ分離の系および方法に関する。とりわけ、本発明は、ＤＮＡの大きさに基づく分離を遂げる高度に自動化されたマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（ＭＩＰＣ）の系および方法、ならびに該系を作動させるための制御およびソフトウェアに関する。
【０００２】
（発明の背景）
ＤＮＡ分子はデオキシヌクレオチドと呼ばれるサブユニットを含んで成るポリマーである。ＤＮＡ中で見出される４種のデオキシヌクレオチドは、それぞれＡ、Ｇ、ＣおよびＴと本明細書で称される４種の塩基、アデニン（プリン）、グアニン（プリン）、シトシン（ピリミジン）およびチミン（ピリミジン）のいずれかに共有結合される共通の環状糖デオキシリボースを含んで成る。リン酸基が、１個のデオキシヌクレオチドの３’−ヒドロキシルを別のデオキシヌクレオチドの５’−ヒドロキシルと連結してポリマー鎖を形成する。二本鎖ＤＮＡ中の２本の鎖は、いわゆる相補塩基の間の水素結合によりらせん構造で一緒に保持される。塩基の相補性はそれらの化学構造により決定される。二本鎖ＤＮＡ中で、各ＡはＴと対をなし、また、各ＧはＣと対をなす。すなわち、プリンはピリミジンと対をなす。理想的には、ＤＮＡは、人体もしくは他の生存する生物体中で細胞分裂の間にＤＮＡポリメラーゼにより正確なコピーに複製される。ＤＮＡ鎖はまたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロで複製することもできる。ときに、正確な複製が失敗し、そして誤った塩基対形成が起こる。該新たな鎖のさらなる複製は、親のものとの塩基配列の遺伝する差異を含有する二本鎖ＤＮＡの子孫を生じさせる。塩基対配列のこうした遺伝する変化を突然変異と呼ぶ。
【０００３】
本明細書で使用されるところの二本鎖ＤＮＡは二重鎖と称される。一方の鎖の塩基配列が他方の鎖の塩基配列に完全に相補的である場合、該二重鎖をホモ二重鎖と呼ぶ。二重鎖が相補的でない最低１個の塩基対を含有する場合、該二重鎖をヘテロ二重鎖と呼ぶ。ヘテロ二重鎖は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素により誤りが生じられかつ複製されているポリヌクレオチド鎖に非相補的塩基が付加されるＤＮＡ複製の間に形成される。ヘテロ二重鎖のさらなる複製は、理想的には、ヘテロ接合性であるホモ二重鎖を生じさせることができる。すなわち、これらのホモ二重鎖は、元の親ＤＮＡ鎖と比較して変えられた配列を有することができる。親ＤＮＡが天然に存在する集団中で有意を占める配列を有する場合、該配列は一般に「野性型」と称される。
【０００４】
多くの異なる型のＤＮＡ突然変異が既知である。ＤＮＡ突然変異の例は、限定されるものでないが、「点突然変異」もしくは「単一塩基対突然変異」を挙げることができ、ここでは１個の誤った塩基対形成が起こる。最も普遍的な点突然変異は、１個のプリンもしくはピリミジン塩基が別のものに取って替わる「転位」、およびプリンがピリミジンの代わりに用いられる（そして逆もまた同じ）「トランスバージョン」を含んで成る。点突然変異は、その中で１個の塩基がＤＮＡ鎖に付加されもしくはそれから欠失される突然変異もまた含んで成る。こうした「挿入」もしくは「欠失」は「フレームシフト突然変異」としてもまた既知である。それらは点突然変異より少ない頻度で起こるとは言え、複数の塩基対に影響を及ぼすより大きな突然変異もまた起こる可能性があり、かつ、重要であるかもしれない。突然変異のより詳述された論考は、Ｍｏｄｒｉｃｈへの米国特許第５，４５９，０３９号明細書（１９９５）およびＣｏｔｔｏｎへの米国特許第５，６９８，４００号明細書（１９９７）に見出すことができる。
【０００５】
ＤＮＡ中の塩基対の配列はタンパク質の産生のための暗号である。とりわけ、ＤＮＡ鎖のエキソン部分のＤＮＡ配列は、タンパク質中の対応するアミノ酸配列をコードする。従って、ＤＮＡ配列中の突然変異は、タンパク質のアミノ酸配列中の変化をもたらすかもしれない。アミノ酸配列中のこうした変化は、完全に良性であるかもしれないか、あるいはタンパク質を不活性化するかまたは生命を脅かすかもしくは致死的であるようにその機能を変えるかもしれない。他方、ＤＮＡ鎖のイントロン部分中の突然変異は、生物学的影響を有することが期待されないとみられる。イントロン区分はタンパク質産生のための暗号を含有しないからである。にもかかわらず、イントロン区分中での突然変異の検出は、例えば法廷の検討において重要であるかもしれない。
【０００６】
従って、突然変異の検出は、疾患の診断、疾患の起源の理解、および潜在的な治療の開発で非常に重要である。ＤＮＡサンプル中の突然変異の検出および類似性もしくは差異の同定もまた、疾患に抵抗性のかつ／もしくはより多く産する作物系統を開発することによる世界の食糧供給の増大、法廷科学、進化および集団の研究、ならびに一般に学術研究において決定的に重要である（Ｇｕｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：１０８４１（１９９５）；Ｃｏｔｔｏｎ、ＴＩＧ　１３：４３（１９９７））。
【０００７】
良性である、もしくは負の結果を有しないＤＮＡ配列中の変化は、ときに「多形」と呼ばれる。本出願の目的上、ＤＮＡ配列中の全部の変化は、それらが負の結果を有するにしろしないにしろ、本明細書で「突然変異」と定義する。明快さのために、「突然変異」という用語を、参照鎖（一般に、しかし必ずしもでなく、野性型）に比較したＤＮＡ鎖の塩基配列中の変化を意味するのに本明細書で使用する。本明細書で使用されるところの「突然変異」という用語は、「多形」という用語、または当該技術のいずれかの他の類似のもしくは同等な用語を包含する。
【０００８】
従来技術において、ＤＮＡサンプルの大きさに基づく分析は標準的ゲル電気泳動（ＧＥＰ）により達成される。キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）もまた、多様な長さを有するＤＮＡフラグメントの混合物、例えばＤＮＡサンプルの制限酵素切断により生じられた消化物を分離かつ分析するのに使用されている。しかしながら、これらの方法は、同一の塩基対長さを有するがしかし異なる塩基配列を有するＤＮＡフラグメントを識別することができない。これはＧＥＰの重大な限界である。
【０００９】
「部分的に変性する」条件下のヘテロ二重鎖ＤＮＡ鎖中の突然変異は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）および変性勾配ゲルキャピラリー電気泳動（ＤＧＧＣ）のようなゲルに基づく分析方法により検出することができる。「部分的に変性する」という用語は、ＤＮＡ二本鎖の他の部分が無傷のままである、すなわち分離されない一方での、該二本鎖中の不適正にされた塩基対の分離（温度、ｐＨ、溶媒もしくは他の要因により引き起こされる）であると定義する。「部分的変性」の現象は、ヘテロ二重鎖が該鎖の残部を変性させるのに必要とされるよりもより低温で塩基対不適正の部位で変性することができるため発生する。
【００１０】
これらのゲルに基づく技術は困難であり、かつ、高度に熟練した実験室科学者を必要とする。加えて、各分析は冗長な準備および分離を必要とする。変性キャピラリーゲル電気泳動分析は、比較的小さいフラグメントのみを利用することができる。９０塩基対のフラグメントの分離は３０分以上かかる。勾配変性ゲルは一夜泳動し、そして約１日の準備時間を必要とする。勾配ゲルの付加的な欠陥は、分離されたＤＮＡフラグメントを単離するようにこれらの手順を適合させること（専門の技術および器具を必要とする）、ならびに単離に必要とされる条件を確立することという困難である。条件は各フラグメントについて実験的に開発しなければならない（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ、Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ編、ＣＲＣ　プレス（ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ）、１９９７）。ゲルの方法論の長い分析時間は、ゲル中でのＤＮＡフラグメントの動きが、ＤＮＡフラグメントの長さに幾何学的関係で逆比例するという事実によりさらに悪化される。従って、より長いＤＮＡフラグメントの分析時間は、しばしば擁護できない可能性がある。
【００１１】
上に挙げられた変性ゲルの方法の欠陥に加え、これらの技術は、ゲルの調製および分析の実施がひとりの操作者から別の者まで高度に変動性である可能性があるため、常に再現可能もしくは正確であるわけでない。
【００１２】
ＧＥＰもしくはＤＧＧＥによる二本鎖核酸フラグメント混合物の分離は直線状の一列のバンドを生じさせ、列中の各バンドはその混合物の分離された二本鎖核酸成分に相当する。多くの混合物が典型的に同一のゲルスラブ上の別個のレーンで同時に分離かつ分析されるため、平行な一連のこうした直線状のバンドの列が生じられる。バンドはしばしばまっすぐであるよりはむしろ湾曲し、それらの移動度および形状はゲルの幅にわたって変わる可能性があり、そしてレーンおよびバンドは相互に混じる可能性がある。こうした不正確さの起源は、ゲル床、電気浸透、熱勾配および拡散効果の均一性および均質性の欠如、ならびに多数の他の要因から起因する。この種の不正確さはＧＥＰ技術で公知であり、そして、分離結果の表示における重大な歪曲および不正確さにつながる可能性がある。加えて、ＧＥＰ分離から得られたバンド表示データは、バンドの形状および完全性に関係する不正確さのため、定量的もしくは正確でない。ＧＥＰ分離により生じられた直線状のバンドの列の表示の定量は、直線状のバンドの列を検出器で走査しそして生じるデータを積分する場合でさえ達成することができない。直線状のバンドの列はバンドの中央を横切ってのみ走査されるからである。検出器はいずれかの所定のバンドの小さい一部分のみ見、そしてバンドは均一でないため、走査法により生じられる結果は正確でなく、そして紛らわしくさえある可能性がある。
【００１３】
染色もしくはオートラジオグラフィーのようなＧＥＰおよびＤＧＧＥ分離の可視化方法もまた厄介でありかつ時間がかかる。加えて、分離データはハードコピーの形態であり、そして容易な検索および比較のため電子的に保存することができず、また、接近した分離の可視化を改良するためにそれを高めることもできない。
【００１４】
二本鎖デオキシリボ核酸（ｄｓＤＮＡ）フラグメントの分離、およびＤＮＡ突然変異の検出は、医学、物理および社会科学、ならびに法廷の検討で非常に重要である。ヒトゲノムプロジェクトは膨大な量の遺伝情報を提供しており、そして突然変異とヒトの障害との間の関連を評価するための新たな情報を生じている（Ｇｕｙｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：１０８４１（１９９５））。例えば、疾患の最終的な起源は野性型と異なる遺伝暗号により記述される（Ｃｏｔｔｏｎ、ＴＩＧ　１３：４３（１９９７））。疾患の遺伝的基礎の理解は治療法の出発点となる可能性がある。同様に、遺伝暗号中の差異の決定は、進化および集団の研究への強力かつおそらく決定的な洞察を提供する可能性がある（Ｃｏｏｐｅｒら、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｖｏｌ．６９：２０１（１９８５））。これらおよび遺伝暗号に関する他の論点の理解は、あるＤＮＡフラグメント中の野性型に関しての異常すなわち突然変異を同定する能力を必要とする。
【００１５】
伝統的なクロマトグラフィーは、「固定相」と「移動相」との間での混合物の成分の分配に基づく分離方法である。固定相は、セルロース、シリカゲル、被覆シリカゲル、ポリマービーズ、多糖などの粒子もしくは通路の表面の形態の多くの多様な物質を含むことができる固体素材の表面により提供される。これらの素材は、ガラス板上のような固体表面上で支持することができるか、もしくはカラム中に充填することができる。移動相は液体、もしくはガスクロマトグラフィーでは気体であることができる。本発明は液体の移動相に関する。
【００１６】
分離の原理は、一般に、使用される素材、素材の形態、もしくは使用される装置に関係なく同一である。混合物の多様な成分は、固定相および移動相中の異なるそれぞれの溶解度を有する。従って、移動相が固定相の上を流れる際に平衡が存在し、そこでサンプルの成分が固定相と移動相との間で分配される。移動相がカラムを通過する際に、該平衡は移動相の方を選んで絶えず移動される。これは、平衡混合物が、いずれの時点でも、新たな移動相に会いそして新たな移動相中に分配するために起こる。移動相がカラムを下に運搬される際に、移動相は新たな固定相に会いそして該固定相中に分配する。ついには、カラムの端ではもはや固定相が存在せず、そしてサンプルはただ移動相中でカラムを離れる。
【００１７】
混合物の成分が、わずかに異なる、固定相に対する親和性および／もしくは移動相中の溶解性を有し、そして従って異なる分配平衡値を有するために、混合物の成分の分離が起こる。従って、混合物の成分は異なる速度でカラムを下に進む。
【００１８】
クロマトグラフィー分離は固定相との相互作用に依存するため、固定相の表面積を増大させることにより分離を改良することができることが既知である。
【００１９】
伝統的な液体クロマトグラフィーにおいては、ガラスカラムを固定相粒子で充填し、そして移動相が重力によってのみ引かれてカラムを通過する。しかしながら、カラム中でより小さい固定相粒子を使用する場合、重力単独の引っ張りは移動相にカラムを貫流させるのに不十分である。代わりに、圧を適用しなければならない。しかしながら、ガラスカラムは約２００ｐｓｉに耐えることができるのみである。移動相に５ミクロンの粒子で充填されたカラムを通過させることは、約２０００ｐｓｉもしくはそれ以上の圧がカラムに適用されることを必要とする。５ないし１０ミクロンの粒子が今日、標準的である。５ミクロンより小さい粒子は、とりわけ困難な分離もしくはある特別な場合に使用する）。この方法は「高速液体クロマトグラフィー」もしくはＨＰＬＣという用語により示される。
【００２０】
ＨＰＬＣは、大きな粒子の重力カラムで可能であったよりも、より広範な化学構造を分離するのに使用されるはるかにより広範な型の粒子の使用を可能にした。しかしながら、分離の原理はそれでもなお同一である。
【００２１】
ＨＰＬＣに基づくイオン対形成クロマトグラフィー法は、一般に二本鎖ポリヌクレオチド、およびとりわけＤＮＡの混合物を効果的に分離するために最近導入され、ここでは分離は塩基対長さに基づく（Ｂｏｎｎへの米国特許第５，５８５，２３６号明細書（１９９６）；Ｈｕｂｅｒら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ　３７：６５３（１９９３）；Ｈｕｂｅｒら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１２：３５１（１９９３））。これらの参考文献およびその中に含有される参考文献は、そっくりそのまま本明細書に組み込まれる。「マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー」（ＭＩＰＣ）という用語を本明細書で定義し、そして本方法に適用する。分離の機構が、伝統的な分配よりもむしろ分離表面へのＤＮＡの結合およびそれからの放出に基づくことが見出されたためである。ＭＩＰＣは塩基対長さに基づいてＤＮＡフラグメントを分離し、そしてゲルに基づく分離方法に伴う欠陥により制限されない。
【００２２】
本明細書で使用されるところのマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーは、非極性の分離媒体を使用する一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドの分離方法と定義し、ここで、該方法は、対イオン剤、および分離媒体からポリヌクレオチドを放出させる有機溶媒を使用する。ＭＩＰＣ分離は１０分未満、および頻繁には５分未満で完了することができる。
【００２３】
ＭＩＰＣ分離方法は、液体がカラムを通過する際の移動相と固定相との間の一連の平衡分離により分離が達成されないため、伝統的なＨＰＬＣ分離方法と異なる。代わりに、サンプルｄｓＤＮＡを分離媒体表面に結合させる溶媒強度を使用して、サンプルをカラム中にフィードする。特定の塩基対長さの鎖を固定相表面から除去し、そして特定の溶媒濃度によりカラムを下に運搬する。溶媒の増大する勾配にサンプルを通過させることにより、連続的により大きな塩基対長さが連続して除去され、そしてカラムを通過する。該分離はカラム長さもしくは固定相の面積に依存しない。
【００２４】
本ＭＩＰＣ方法は温度感受性であり、そして正確な温度制御がＭＩＰＣ分離方法でとりわけ重要である。
【００２５】
ＭＩＰＣの使用および理解が進展した際に、部分的変性温度、すなわち塩基対不適正の部位でヘテロ二重鎖を変性させるのに十分な温度でＭＩＰＣ分析を実施した場合に、同一の塩基対長さを有するヘテロ二重鎖からホモ二重鎖を分離することができたことが発見された（米国特許第５，７９５，９７６号明細書；Ｈａｙｗａｒｄ−Ｌｅｓｔｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５：４９４（１９９５）；Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：１９３（１９９６）；Ｄｏｒｉｓら、ＤＨＰＬＣ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ、スタンフォード大学、（１９９７））。これらの参考文献およびその中に含有される参考文献はそっくりそのまま本明細書に組み込まれる。従って、変性ＨＰＬＣ（ＤＨＰＬＣ）の使用が、突然変位の検出に適用された（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌら、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　７：９９６（１９９７）；Ｌｉｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．、２６；１３９６（１９９８））。
【００２６】
ＤＨＰＬＣは、１塩基対程度だけ異なるヘテロ二重鎖を分離することができる。しかしながら、ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖の分離は乏しく分離される可能性がある。人工物および不純物もまた、人工物もしくは不純物と推定の突然変異との間を識別するのが難しいかもしれないという意味において、ＤＨＰＬＣ分離クロマトグラムの解釈を妨害する可能性がある（Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌら、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．７：９９６（１９９７））。突然変異の存在は完全に見逃されさえするかもしれない（Ｌｉｕら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．、２６：１３９６（１９９８））。
【００２７】
ＨＰＬＣおよびＤＨＰＬＣによるＤＮＡの分離および突然変異の検出の重要な局面は、クロマトグラフィー系の構成部品を含んで成る素材の処理；分離媒体を含んで成る素材の処理；方法の開発時間を最小限にするための溶媒の前選択；ＭＩＰＣの間のヘテロ二重鎖の部分的変性を遂げるための最適温度の前選択；および自動化高スループット突然変異検出スクリーニングアッセイのためのＤＨＰＬＣの最適化を包含する。これらの要因は、明白な、正確な、再現可能なかつ高スループットのＤＮＡ分離および突然変異の検出の結果を達成するために不可欠である。
【００２８】
突然変異の検出においてホモ二重鎖からヘテロ二重鎖を分離するために使用される部分的変性条件下でのマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（ＭＩＰＣ）の応用は、下でＤＭＰＩＣと称する。ＤＭＩＰＣにおいては、部分的変性温度、すなわち、ヘテロ二重鎖の突然変異部位に存在する不適正にされたＤＮＡが変性することができるがしかし適合されたＤＮＡが二本鎖に結合されたまま留まることができる温度で、移動相および固定相双方を維持するために、正確な温度制御が必要とされる。
【００２９】
ＨＰＬＣ分離系のある構成部品および作動は、伝統的な分配に基づく分離を助長するために部分的に自動化されている。一例は、それらのＨＰＬＣクロマトグラフィー装置とともに日立により提供されるＨＳＭ制御系である。これらの制御の使用において、クロマトグラフィーの専門家が、分離のための特定のサンプルを得るために詳細な命令をオートサンプラーに、所望の溶媒の勾配を遂げるために詳細な単純命令を比例弁に、および特定の温度の命令をカラムオーブンに人的に入力する。制御系がこれらの命令を自動的に実行してＨＰＬＣ分離を遂げる。
【００３０】
ＭＩＰＣ系は、現存する制御系で満足させることができない系の作動要件を導入している。増大された数のウェルをもつサンプルトレイが導入され、サンプルのそれぞれの分離アリコートを引き出すための対応する詳細なオートサンプラーの命令を必要とする。より複雑かつ多様な溶媒濃度および勾配の命令が必要とされる。より正確な温度制御が不可欠であり、また、若干の作動においては、同一のサンプルからのアリコートを、多様な予め設定された温度で分離することになる。ＭＩＰＣ系を使用して、それぞれが単一の塩基対の大きさを有する純粋な画分を単離することができ；これらはＰＣＲもしくはクローニング増幅技術に必要とされる。これは、ＭＩＰＣ分離過程と協調して作動するフラグメントコレクタの使用を必要とする。さらに、ＭＩＰＣ分離方法の拡大する応用は、該系がクロマトグラフィーの専門家よりはむしろ訓練された技術者により操作可能であることを必要とする。加えて、ＤＮＡフラグメントを大きさの差異に基づいて分離することができかつまた同一の長さを有するがしかし塩基対配列が異なる（野性型からの突然変異）ＤＮＡを正確な、再現可能な、信頼できる様式で分離することもできるＨＰＬＣ系に対する必要性が存在する。こうした系は自動化されかつ効率的であるべきであり、慣例の高スループットサンプルスクリーニングの応用に適合可能であるべきであり、そして最小限の操作者の注意で高スループットサンプルスクリーニングを提供すべきである。
【００３１】
これらの新たな要件は、現在入手可能な機器および関連する制御系により満足されない。
【００３２】
（発明の要約）
クロマトグラフィーの専門家よりはむしろ訓練された技術者により操作されることができるＭＩＰＣ分離系および方法を提供することが、本発明の一目的である。
【００３３】
広範な分離スキームについて、複数のサンプルを含有するトレイもしくはプレートからサンプルを選択し、各分離について溶媒の溶出勾配を設定し、各分離についてカラムの温度（１種もしくは複数）を設定し、そして継続される監視および人的制御なしで所望の画分を収集することができるＭＩＰＣ分離系およびソフトウェア制御を提供することが、本発明のさらなる一目的である。
【００３４】
一局面において、本発明は、移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段（該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；ＭＩＰＣ分離カラム；移動相を移動相流量制御手段からＭＩＰＣ分離カラムに向かわせるための導管手段；ならびにその中に固有のソフトウェア移動相流量制御モジュールを有する移動相流量制御手段と通信するコンピュータを含んで成る高速液体クロマトグラフィー系を用いるＤＮＡフラグメントの混合物の塩基対長さに基づく分離を遂げる方法に関する。該方法は、分離されるべきＤＮＡフラグメントの混合物中の塩基対長さの数値の範囲を受領すること；ＤＮＡフラグメントの混合物からの選択されたフラグメントの分離を遂げることができる溶媒濃度および対応する溶媒の勾配の範囲を計算すること；溶媒濃度および溶媒の勾配の前記範囲を移動相流量制御モジュールに提供すること；ならびに分離を実施すること、のコンピュータ化された段階を包含し、ここで、移動相流量制御モジュールが、選択されたフラグメントの分離を遂げるのに必要とされる勾配および溶媒濃度を果たすように移動相流量制御手段の設定を制御する。移動相流量制御手段は、それぞれ流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁を包含することができる。移動相流量制御手段は、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する一組のポンプを包含することができる。該方法において、塩基対長さに基づく分離は、ＤＮＡフラグメントの混合物のフラグメントの全部の分離であることができるか、または、ＤＮＡフラグメントの混合物の１種もしくはそれ以上のフラグメントの分離であることができる。該方法で使用される勾配はイソクラチック勾配を包含することができる。
【００３５】
該方法の一態様において、溶媒濃度は、最小のフラグメントについて計算された％Ｂの値より下で開始するよう計算され、かつ、最大のフラグメントについて計算された％Ｂの値より上で終了するよう計算され、ここで、％Ｂは、以下の式：
【００３６】
【数１３】
2004506873.tif 000002
【００３７】
％Ｂは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり
ｐ１、ｐ２およびｐ３は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【００３８】
該方法の別の態様において、溶媒濃度は、最小のフラグメントについて計算された％Ｂの値より下で開始するよう計算され、かつ、最大のフラグメントについて計算された％Ｂの値より上で終了するよう計算され、ここで、％Ｂは、以下の式：
【００３９】
【数１４】
2004506873.tif 000003
【００４０】
式中、
【００４１】
【数１５】
2004506873.tif 000004
【００４２】
％Ｂは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり；
ｓは勾配の傾きであり；
ｄ、ｖｏｉｄ、ｐ４、ｐ５、ｐ６、ｐ７およびｐ８は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【００４３】
別の局面において、本発明はコンピュータ化された制御手段を包含する高速液体クロマトグラフィー系に関し、該クロマトグラフィー系は、移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段（該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；ＭＩＰＣ分離カラム；移動相を移動相流量制御手段からＭＩＰＣ分離カラムに向かわせるための導管手段；ならびに移動相流量制御手段と通信するコンピュータ；該コンピュータおよび移動相流量制御手段と作業連合にあるソフトウェア移動相流量制御モジュールを含んで成り、ここで、該移動相流量制御手段は、それぞれが流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁であるか、もしくは、移動相制御手段は一組のポンプであって、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答し、前記コンピュータは溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを包含する。
【００４４】
該液体クロマトグラフィー系の一態様において、溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアは、ＤＮＡフラグメントの混合物中の分離されるべきフラグメントの塩基対長さの範囲を受領し、かつ、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された％Ｂの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された％Ｂの値より上で終了する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を包含し、ここで、％Ｂは、以下の式：
【００４５】
【数１６】
2004506873.tif 000005
【００４６】
％Ｂは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり；
ｐ１、ｐ２およびｐ３は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【００４７】
該高速液体クロマトグラフィー系の別の態様において、溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアが、ＤＮＡフラグメントの混合物中の分離されるべきフラグメントの塩基対長さの範囲を受領し、かつ、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された％Ｂの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された％Ｂの値より上で終了する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を包含し、ここで、％Ｂは、以下の式：
【００４８】
【数１７】
2004506873.tif 000006
【００４９】
式中
【００５０】
【数１８】
2004506873.tif 000007
【００５１】
％Ｂは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり；
ｓは勾配の傾きであり；
ｄ、ｖｏｉｄ、ｐ４、ｐ５、ｐ６、ｐ７およびｐ８は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【００５２】
なお別の局面において、本発明は、ＤＮＡフラグメントの混合物から分離されるべき塩基対長さの範囲を受領するための手段、ＭＩＰＣにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに必要とされる溶媒濃度を計算するための手段、およびＭＩＰＣにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに使用されるべき溶媒の勾配を選択するための手段を包含するソフトウェアプログラムに関し、ここで、前記溶媒濃度を計算するための手段は、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された％Ｂの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された％Ｂの値より上で終了するよう溶媒濃度を計算するための手段を包含し、ここで、％Ｂは、以下の式：
【００５３】
【数１９】
2004506873.tif 000008
【００５４】
％Ｂは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり
ｐ１、ｐ２およびｐ３は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【００５５】
別の局面において、本発明は、ＤＮＡフラグメントの混合物から分離されるべき塩基対長さの範囲を受領するための手段、ＭＩＰＣにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに必要とされる溶媒濃度を計算するための手段、およびＭＩＰＣにより分離されるべき塩基対長さの範囲を分離するのに使用されるべき溶媒の勾配を選択するための手段を包含するソフトウェアプログラムに関し、ここで、前記溶媒濃度を計算するための手段は、分離されるべき最小のフラグメントについて計算された％Ｂの値より下で開始しかつ分離されるべき最大のフラグメントについて計算された％Ｂの値より上で終了するよう溶媒濃度を計算するための手段を包含し、ここで、％Ｂは、以下の式：
【００５６】
【数２０】
2004506873.tif 000009
【００５７】
式中
【００５８】
【数２１】
2004506873.tif 000010
【００５９】
％Ｂは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり；
ｓは勾配の傾きであり；
ｄ、ｖｏｉｄ、ｐ４、ｐ５、ｐ６、ｐ７およびｐ８は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【００６０】
別の局面においては、本発明は、高速液体クロマトグラフィー系を用いる混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の分離を遂げる方法に関する。該系は、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム；カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段（該オーブン温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；およびその中に固有のオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを有するオーブン温度制御手段と通信するコンピュータを包含する。本方法は、約５０℃ないし約７５℃の温度範囲の一連の変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離において、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーにより混合物を分析することを包含する温度の最適化を実施することのコンピュータ化された段階を包含し、各連続する分離は、突然変異分離プロフィルが観察されるかもしくは突然変異分離温度範囲のいずれかの突然変異分離プロフィルの非存在が観察されるまで、先行する分離よりもより高温を有し、ここで、突然変異分離プロフィルは突然変異の存在を同定し、かつ、突然変異分離プロフィルの非存在はサンプル中の突然変異の非存在を示す。あるいは、５０℃ないし約７５℃の温度範囲の一連の変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離において、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーにより混合物を分析すること、各連続する分離は、突然変異分離プロフィルが観察されるかもしくは突然変異分離温度範囲のいずれかの突然変異分離プロフィルの非存在が観察されるまで、先行する分離よりもより低温を有し、ここで、突然変異分離プロフィルは突然変異の存在を同定し、かつ、突然変異分離プロフィルの非存在はサンプル中の突然変異の非存在を示す。本方法において、オーブン温度制御モジュールは、連続する分離の間の温度を果たすオーブン温度制御手段の設定を制御する。本発明の本局面のオーブン温度制御手段は以下の態様を包含することができる。第一に、循環空気温度制御系を有する空気浴オーブン；入口端および出口端を有するある長さの毛細管（該毛細管の出口端は分離カラムの入口端と連結され、また、毛細管の入口端は工程液を受領するための手段を含んで成り、該管は６から４００ｃｍまでの完全に伸長された長さを有し；そして、分離カラムおよび毛細管のコイルが空気浴オーブン中に囲まれかつその中の空気に曝露され、該温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する）。第二に、第一の熱伝達表面、分離カラム差込口、およびキャピラリーコイル差込口を有する熱伝導ブロック；その内壁と熱伝導の関係で分離カラム差込口内に配置される分離カラム；ならびに、キャピラリーコイル差込口中に配置される毛細管のコイル（該コイルの外側先端はキャピラリーコイル差込口の内壁と熱伝導の関係にあり、温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する）。ペルティエ型の加熱および冷却装置が該第一の熱伝達表面と熱伝導の関係で提供されることができる。
【００６１】
別の局面において、本発明は、高速液体クロマトグラフィー系を用いる混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の分離を遂げる方法に関する。該系は、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム；分離カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段（該オーブン温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；およびその中に固有のオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを有するオーブン温度制御手段と通信するコンピュータを包含する。該方法は、以下のコンピュータ化された段階、すなわちａ）予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度を受領すること；ｂ）ＤＮＡ分子の混合物を、予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度に加熱すること；ｃ）予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度で、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーを用いて段階（ｂ）の生成物を分析して、その中のいかなるヘテロ突然変異体部位の分離された成分の存在も同定することを包含する。該方法において、予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度は：ａ）計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を得るための計算段階；ｂ）予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度を得るための予測段階、の段階により得ることができ；ここで、計算段階は、第一の数学的モデルに従って、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を計算することを含んで成り；ここで、予測段階は、第二の数学的モデルに従って、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を補正することを含んで成り；ここで、第二の数学的モデルは、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度との、経験的に決定されたヘテロ突然変異体部位分離温度の比較に基づく。
【００６２】
本発明の本局面の一態様において、予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度は、以下の式：Ｔ（ｈｓｓｔ）＝Ｘ＋ｍ・Ｔ（ｗ）により計算され、ここで、Ｔ（ｈｓｓｔ）は予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度であり、Ｔ（ｗ）は、野性型二本鎖ＤＮＡの変性された状態と非変性状態との間に選択された平衡が存在する、ソフトウェアにより計算されたかもしくは実験的に決定された温度であり、Ｘは変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー検出係数であり、そしてｍは０と２との間で選択される重み係数である。
【００６３】
別の局面において、本発明はコンピュータ化された制御手段を包含する変性高速液体クロマトグラフィー系に関し、該クロマトグラフィー系は、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラム；分離カラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段（該温度制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；移動相ＭＩＰＣ分離カラムを指図するための導管手段；オーブン温度制御手段と通信するコンピュータ；コンピュータおよびオーブン温度制御手段と作業連合にあるオーブン温度制御ソフトウェアモジュールを含んで成り、該コンピュータは、混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の分離のためヘテロ突然変異体部位分離温度をコンピュータ計算するための温度コンピュータ計算ソフトウェアを包含する。該系において、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー分離カラムが入口端を包含し、そして、オーブン温度制御手段が：循環空気温度制御系を有する空気浴オーブン；入口端および出口端を有するある長さの毛細管を包含し、該毛細管の出口端は分離カラムの入口端と連結され、また、毛細管の入口端は工程液を受領するための手段を含んで成り、該管は６から４００ｃｍまでの完全に伸長された長さを有し；そして、分離カラムおよび毛細管のコイルが空気浴オーブン中に囲まれかつその中の空気に曝露され、該温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する。
【００６４】
あるいは、該オーブン温度制御手段は：第一の熱伝達表面、分離カラム差込口、およびキャピラリーコイル差込口を有する熱伝導ブロック；その内壁と熱伝導の関係で分離カラム差込口内に配置される分離カラム；ならびに、キャピラリーコイル差込口中に配置される毛細管のコイルを包含することができ、該コイルの外側先端はキャピラリーコイル差込口の内壁と熱伝導の関係にあり、該温度制御系はオーブン温度制御モジュールからの制御コマンドに応答する。ペルティエ型の加熱および冷却装置が、該第一の熱伝達表面と熱伝導の関係で提供されることができる。
【００６５】
なお別の局面において、本発明は、分離されるべき混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の塩基対長さを受領するための手段、変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィーによる該等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の分離に必要とされるヘテロ突然変異体部位分離温度を計算するための手段を包含するソフトウェアプログラムを提供し、ここで、該ヘテロ突然変異体部位分離温度が、以下の式：Ｔ（ｈｓｓｔ）＝Ｘ＋ｍ・Ｔ（ｗ）により計算され、ここで、Ｔ（ｈｓｓｔ）はヘテロ突然変異体部位分離温度であり、Ｔ（ｗ）は、野性型二本鎖ＤＮＡの変性された状態と非変性状態との間に選択された平衡が存在する、ソフトウェアにより計算されたかもしくは実験的に決定された温度であり、Ｘは変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー検出係数であり、そしてｍは０と２との間で選択される重み係数である。
【００６６】
別の局面において、本発明は、高速液体クロマトグラフィー系を用いて混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の分離を遂げる方法に関する。該系は、移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段（該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；ＭＩＰＣ分離カラム；移動相を移動相流量制御手段からＭＩＰＣ分離カラムに向かわせるための導管手段；およびその中に固有のソフトウェア移動相流量制御モジュールを有する移動相流量制御手段と通信するコンピュータを包含する。該方法は、（ａ）混合物中の変性されないホモ二重鎖もしくはヘテロ二重鎖分子の長さを有するＤＮＡ分子の塩基対長さの数値を受領すること；（ｂ）非変性条件下で該カラムからの該塩基対長さを有する分子の溶出を遂げることができる溶媒濃度を計算すること；（ｃ）該ヘテロ二重鎖を部分的に変性させるのに有効な条件下で該分離を遂げることができる溶媒濃度および対応する溶媒の勾配の範囲を計算すること；（ｄ）移動相流量制御モジュールに、溶媒濃度および溶媒の勾配の範囲を提供すること；ならびに（ｅ）分離を実施すること、のコンピュータ化された段階を包含し、ここで、移動相流量制御モジュールが、選択されたフラグメントの分離を遂げるのに必要とされる勾配および溶媒濃度を果たすように移動相流量制御手段の設定を制御する。該移動相流量制御手段は、それぞれが流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁であることができるか、もしくは、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する一組のポンプであることができる。該方法において、勾配はイソクラチック勾配であることができる。また、該方法において、溶媒濃度を、該塩基対長さを有するＤＮＡ分子について計算された％Ｂの値より下で開始するよう計算し、かつ、該塩基対長さのＤＮＡ分子について計算された％Ｂの値より上で終了するよう計算することができ、ここで、％Ｂは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、％Ｂは、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される。
【００６７】
なお別の局面において、本発明は、コンピュータ化された制御手段を包含する変性高速液体クロマトグラフィー系に関する。該クロマトグラフィー系は、移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御するための移動相流量制御手段（該流量制御手段はコンピュータ命令入力手段を包含し）；ＭＩＰＣ分離カラム；移動相を移動相流量制御手段からＭＩＰＣ分離カラムに向かわせるための導管手段；ならびに移動相流量制御手段と通信するコンピュータ；該コンピュータおよび移動相流量制御手段と作業連合にあるソフトウェア移動相流量制御モジュールを包含し、ここで、該移動相流量制御手段は、それぞれが流量制御モジュールからの制御コマンドに応答する自動開放制御を伴う一組の流量制御弁であるか、もしくは、移動相制御手段は一組のポンプであって、その流量設定が流量制御モジュールからの制御コマンドに応答し、コンピュータは、混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の分離のための溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを包含する。該系において、溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアは、該混合物中のホモ二重鎖もしくはヘテロ二重鎖分子の塩基対長さを受領しかつ該塩基対長さを有するＤＮＡ分子について計算された％Ｂの値より下で開始する溶媒濃度を計算するためのソフトウェア手段を包含することができ、かつ、該塩基対長さのＤＮＡ分子について計算された％Ｂの値より上で終了するよう計算され、ここで、％Ｂは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、％Ｂは、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される。
【００６８】
さらになお別の局面において、本発明は、分離されるべき混合物中の等しい長さのヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子の塩基対長さを受領するための手段、ＭＩＰＣにより該塩基対長さを有するＤＮＡ分子を溶出するのに必要とされる溶媒濃度を計算するための手段、ならびに部分的変性条件下で該ヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖ＤＮＡ分子を分離するのに使用されるべき溶媒の勾配を選択するための手段を包含するソフトウェアプログラムに関する。溶媒濃度を計算するための手段は、該塩基対長さを有するＤＮＡ分子について計算された％Ｂの値より下で開始する溶媒濃度を計算するための手段を包含し、かつ、該塩基対長さのＤＮＡ分子について計算された％Ｂの値より上で終了するよう計算され、ここで、％Ｂは有機溶媒を含有する水性溶液のパーセンテージであり、ここで、％Ｂは、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数を有する一次、双曲線、二次もしくは三次の式により計算される。該ソフトウェアの一態様において、％Ｂは、以下の式：
【００６９】
【数２２】
2004506873.tif 000011
【００７０】
式中
ｐ１、ｐ２およびｐ３は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。別の態様において、％Ｂは、以下の式：
【００７１】
【数２３】
2004506873.tif 000012
【００７２】
式中
【００７３】
【数２４】
2004506873.tif 000013
【００７４】
ｓは勾配の傾きであり；
ｄ、ｖｏｉｄ、ｐ４、ｐ５、ｐ６、ｐ７およびｐ８は、ＤＮＡフラグメントの標準混合物を用いる選択された溶媒についての該クロマトグラフィー系および分離カラムの較正により得られる定数である
により計算される。
【００７５】
（発明の詳細な記述）
本発明の目的は、広範囲のＭＩＰＣ系および方法、ならびにそれに関連するコンピュータプログラムもしくはソフトウェアで提供される。該系は、本発明の広範なＭＩＰＣ分離方法のためのサンプル選択、移動相の勾配の選択および制御、カラムおよび移動相の温度制御ならびにフラグメント収集の自動化されたオプションを提供する。より早期の同時係属中かつ共通に譲渡された米国特許もしくは特許出願（米国特許第５，７７２，８８９号；同第５，９９７，７４２号；同第５，９７２，２２２号明細書；１９９８年１０月３０日に出願された米国特許出願第０９／１８３，１２３号；１９９８年１０月３０日に出願された同第０９／１８３，４５０号；１９９９年７月９日に出願された同第０９／３５０，７３７号；１９９８年５月１８日の同第０９／０８０，５４７号明細書（それらのそれぞれは引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる））に記述されたとおり、ＭＩＰＣ分離方法は、ＤＮＡフラグメントの大きさに基づく分離、突然変異の検出、ＤＮＡフラグメントの精製、ＰＣＲ過程のモニタリングおよび他の新規方法を遂げるのに適用することができる。本発明は、複雑な分離方法を達成するための該系の使用を助長する、これらの手順の多くを自動化する系およびソフトウェアに向けられる。
【００７６】
図１は、本発明の一態様による該系の図解的配置である。複数の容器を、移動相を構成する溶液溜めとして使用することができる。例えば、容器２は、対イオン剤（例えば酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ））の水性溶液のような移動相の水性成分を含有することができ、そして、容器４は、有機（駆動）溶媒を含む対イオン剤の水性溶液（例えばアセトニトリルを含むＴＥＡＡ）を含有することができる。
【００７７】
本発明の記述を単純化する目的上、そして制限としてでなく、容器２中の水性溶液を溶液Ａと称することができ、また、容器４中の有機溶媒を含有する溶液を溶液Ｂと称することができる。補助液体（例えば補助溶媒）を容器６中に保持することができる。これらの溶液を混合して、分離の間に移動相中の有機溶媒の選択された濃度を達成する。これらの溶液の他の例は、本明細書の実施例、および上に示された共通に譲渡された特許に提供される。容器は、対イオン溶液輸送管８、溶媒溶液輸送管１０、およびそれと連絡しかつ脱気装置１４に至る補助液体輸送管１２のようなそれぞれの輸送管を有する。
【００７８】
ポリヌクレオチドという用語は、リン酸残基を介して１個のリボース（もしくはデオキシリボース）から別のものに連結される不定の数のヌクレオチドを含有する直鎖状ポリマーと定義する。本発明は、二本鎖もしくは一本鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡの分離で使用することができる。本発明の記述を単純化する目的上、そして制限としてでなく、二本鎖ＤＮＡの分離を本明細書の実施例で記述することができ、全部のポリヌクレオチドが本発明の範囲内に包含されることを意図していることが理解される。
【００７９】
脱気装置１４は、溶解された気体を液体から除去する。適する脱気装置の一例はデガスイット（Ｄｅｇａｓｓｉｔ）モデル６３２４である。溶解酸素の除去はとりわけ重要である。その存在は、系の構成部品中の鉄もしくは他の酸化可能な金属を酸化する危険を増大させ、そして従って移動相液体中に対応する陽イオンを導入するからである。
【００８０】
カラム浄化溶液が浄化溶液容器１６中に含有され、これは同様に、それと連絡して脱気装置１４に至る浄化溶液輸送導管１８を有する。本態様において、浄化溶液は容器１６が脱気装置および注入弁５４より上に上昇される場合に重力圧により流れることができる。あるいは、図２に示されるようなポンプ１１０を、浄化溶液の流れを達成するために提供することができる。
【００８１】
本発明の系は、移動相の溶媒溶液および水性成分の流量を制御する慣習的な移動相流量制御手段を組込む。一態様において、移動相流量制御手段は、それぞれが下述されるところのコンピュータ制御下に自動開放制御をもつ、一組の流量制御弁を含んで成る。別の態様において、移動相流量制御手段は一組のポンプを含んで成り、その流量設定は下述されるところのコンピュータ制御に応答する。
【００８２】
図１に具体的に説明される系は、一組の流量制御弁を包含する移動相流量制御手段の一態様を利用する。脱気装置１４から至る、脱気された対イオン溶液導管２０、脱気された溶媒溶液導管２２、および脱気された補助液体導管２４が、それぞれの水性成分比例弁２６、溶媒溶液比例弁２９、および補助液体比例弁３０と連絡する。これらの比例弁の設定は、それらに関連したステッピングモーターのような弁作動器により設定かつ変更され、また、これらの弁作動器は、下により詳細に記述される移動相流量制御ソフトウェアモジュールからのコマンドに応答して所望の一組の設定を確立するよう応答する。流量制御弁２６、２８および３０は、移動相の溶媒溶液および他の成分の流量を制御する移動相流量制御手段の一態様を含んで成る。これらの弁の設定は、インジェクタ弁および分離カラムを通る液体（補助溶媒、溶媒溶液、など）の比を制御する。導管３２、３４および３６は、それぞれの比例弁２６、２８および３０からポンプ３８の取込みまで至る。
【００８３】
浄化溶液輸送導管３１は浄化溶液弁４０に至る。任意の浄化溶液導管４２が弁４０から至りかつポンプ３８の入口と連絡する。弁３３は導管４２を通る流れを制御する。
【００８４】
弁２６、２８および３０の開口部が、移動相（ＭＩＰＣによる大きさに基づくＤＮＡ分離は溶媒濃度の関数であるため本系の最も重要な部分）内の有機溶媒および他の成分の相対比を正確に設定する。多様なＤＮＡフラグメント分離方法に関して記述されるであろうとおり、時間の関数としての有機溶媒の勾配の傾きが分離過程の間に変えられ、そして最も決定的な相は、非常に正確な勾配、もしくはいくつかの過程については、高度に正確なイソクラチック（一定の溶媒濃度）組成を必要とするかもしれない。弁２６、２８および３０の設定は、慣習的弁制御装置へのシグナルにより遠隔で設定することができる慣習的な弁作動器により確立される。下により詳細に記述されるであろうとおり、本発明の装置制御ソフトウェアはコンピュータに制御される命令を提供し、それらは系の作動の間の適切な時点で正確な流量値への弁２６、２８および３０の設定を確立する。
【００８５】
同様な様式で、本発明の装置制御ソフトウェアは、ポンプの切／入状態およびポンプの圧もしくは流速の設定のようなポンプ３８の作動上のパラメータを確立するためのコンピュータに制御される命令を提供する。
【００８６】
ポンプ流出導管４４はインラインミキサー４６と連絡し、成分の徹底的な混合のためミキサー４６を通る液体の流れを指図する。混合された液体の流出導管４８は、任意のガードカラム５０と連絡して、混合された液体を処理してＤＮＡフラグメントの分離を妨害するとみられる多価金属陽イオンおよび他の汚染物質を除去する。ガードカラム５０は、慣習的イオン交換による多価金属陽イオンの除去のためにナトリウムもしくは水素の形態の陽イオン交換樹脂を含有することができる。導管５２はガードカラムの出口および浄化溶液インジェクタ弁５４の入口と連絡する。浄化溶液供給導管５６は弁４０を浄化溶液インジェクタ弁５４と連結し、そして廃棄出口導管５８は廃液溜めに至る。導管６０は弁５４からサンプル注入弁６２に至る。
【００８７】
サンプルアリコートセレクター６４は、サンプル導管６６を通ってインジェクタ弁６２と連絡する。廃棄導管６８はインジェクタ弁から至りそして廃棄液体を除去する。サンプルアリコートセレクター６４についての詳細は図３に関して下により詳細に提供し、また、浄化溶液ならびにサンプルインジェクタ弁５４および６２、ならびにそれらの作動についての詳細は、図４−８に関して下により詳細に提示する。
【００８８】
インジェクタ弁６２において、サンプルが、導管６０から弁を通過する溶媒および担体液の流れに導入される。サンプル導管７０は、インジェクタ弁６２の出口および空気浴オーブン７２中のカラムプレフィルター７４と連絡する。毛細管コイル７６はプレフィルター７４および分離カラム７８の入口と連絡する。キャピラリーコイル７６の伸長された長さは、加熱されたオーブン空気からコイルを通過する液体に十分な熱を進ませて、液体を選択された温度の±０．０５℃以内にする。オーブン７２は、プレフィルター７４、コイル７６および分離カラム７８中のこの温度の均一性を確立する。
【００８９】
分離カラム７８は、ＭＩＣＰ過程により対イオンの存在下でのＤＮＡフラグメントの大きさに基づく分離を遂げる独特の分離表面を有するビーズで、慣習的なカラム構築物中に充填される。分離過程およびビーズについての詳細は下に詳細に記述する。塩基対長さの大きさで分離されたＤＮＡフラグメントを含有する移動相の流れが、導管８０を通り分離カラム７８から出る。
【００９０】
導管８０は検出器８４と連絡する。検出器は、液体の移動相中のＤＮＡフラグメント構造のＵＶ透過を測定する慣習的なＵＶ透過装置であることができる。吸光度は、試験されている液体中のＤＮＡフラグメントの濃度の関数である。
【００９１】
あるいは、ＤＮＡを蛍光マーカーで標識することができる場合、検出器は、該蛍光マーカーに最も適切な周波数で発射レベルを検出することにより液体中の該マーカーのレベルを継続的に測定することができる蛍光検出器であることができる。その中のＤＮＡフラグメントの濃度の関数である液体の一特徴を継続的に測定することが可能ないかなる検出系も適し、かつ、本発明の範囲内にあることを意図していることが容易に明らかであろう。導管８６は試験された液体を除去する。適する検出器の例は、日立から入手可能なＬ−７４２０　ＵＶ可視検出器およびＬ−７４８０蛍光検出器を包含する。検出器からの電気的出力は、好ましくは、Ａ／Ｄ変換器によりディジタルの形態に変換され、そしてコンピュータ５００中のディスクドライブのようなディジタル記憶装置に標準ディジタル形式で記録される。
【００９２】
その後、移動相が、図１４−２４に関して下により詳細に記述されるフラグメントコレクタ８８に進む。フラグメントコレクタ８８において、分離されたＤＮＡ画分を含有する移動相の選択された部分を、後の処理もしくは分析のためバイアルに収集する。収集されない画分は、廃棄導管９０を通って除去される。
【００９３】
該ＤＮＡ分離過程は多価陽イオンの存在により損なわれる。上の記述において、液体流系は一連の導管として記述される。該導管は、多価陽イオンの液体への導入を回避するよう選択された毛細管である。好ましい毛細管の素材はチタンおよびＰＥＥＫである。類似の理由から、系の他の構成部品は好ましくはチタンもしくはＰＥＥＫから作成されるか、またはそれらを酸化から保護しかつ液体への多価陽イオンの導入を予防するようにＰＥＥＫで被覆された、液体に露出される表面を有する。ステンレス鋼もまた使用することができるが、但し、それは全部の酸化された表面素材を除去するよう処理されており、また、ステンレス鋼表面を接触する溶液は溶解酸素を含まない。
【００９４】
移動相流量制御手段の別の態様を具体的に説明する図２は、移動相組成を確立するためのポンプ系の部分的図解である。本系は、下述される溶液ＡおよびＢのような水性成分および溶媒溶液の比を制御するのに比例ポンプに頼る。比例ポンプ９２、９４および９６の入口は、それらのそれぞれの供給導管９８、１００および１０２によって脱気装置１４と連絡し、また、それらのそれぞれの出口導管１０４、１０６および１０８によってインラインミキサー４６と連絡する。これらの比例ポンプの作動速度は、下により詳細に記述される流量制御ソフトウェアモジュールにより、それを通る流速に較正されかつ制御される。これらの比例弁の設定が、インジェクタ弁および分離カラムを通る液体（補助溶媒、駆動溶媒、など）の液体流速および比を制御する。
【００９５】
ポンプ１１０は、任意の導管１１２を通って系に浄化溶液を供給することができる。任意の導管１０７は導管１１２から至り、そしてインラインミキサー４６と連絡する。弁１１１は導管１０７を通る流れを制御する。
【００９６】
本発明での使用に適する移動相制御手段の例は、日立から入手可能なプログラム可能な二連ピストンポンプモデルＬ−７１００、およびウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）から入手可能なモデル２６９０分離モジュールを包含する。
【００９７】
図３は、ＭＩＰＣ系で使用されるオートランプラーサブシステムの図解である。本オートサンプラーは、マルチウェル１１３中の選択されたウェルもしくはその中で支持されるバイアル（例えば微小遠心管）から、予め決められた容量を有するアリコートを取り出す。マイクロウェルプレートは、標準的な９６穴マルチウェルプレートのような、各ウェルについて正確な寸法位置を有する、いずれかの予め決められた数のウェル１１４を有することができる。サンプリング針１１５はサンプリングキャリジ１１６上に支持される。サンプリングキャリジ１１６は、垂直支持体１１７上の垂直の動きのため据え付けられた針支持体１１８を有する。垂直支持体１１７はキャリジ１１６上の側方の動きのため据え付けられる。支持体１１７の側方の動きは、選択されたウェルもしくは注入弁１２０のインジェクタ口１１９の上に針を配置する。可撓性の管１２３は、一方の端で針１１５と、および他方の端でシリンジ針１２４と封止嵌合で据え付けられる。シリンジ針１２４はシリンジ筒１２５の内部体積と連絡する。ピストン１２６はシリンジ作動器ロッド１２８上に据え付けられ、そして筒１２５の内壁と封止嵌合を形成する。作動においては、シリンジ作動器ロッド１２８の垂直の上向きの動きが筒１２５中の液体を置き換え、また、シリンジ作動器ロッド１２８の垂直の下向きの動きがシリンジ中に液体を引く。ロッド１２８は、ガイド要素１３２に沿った動きのため支持されるクランプ１３０に取付られる。弁１２２が針１２４と管１２３との間の連絡を提供するように配置される場合、ピストン１２６の下向きの動きが、サンプルをウェル１１４から針１１５中に引く。針１１５がインジェクタ弁口１１９の上に配置される場合、ピストン１２６の上向きの動きが、サンプルを針１１５から口１１９中に放出する。
【００９８】
導管１３１は弁１２２から浄化溶液溜め１２１まで伸長する。弁１２２が針１２４と導管１３１との間の連絡を提供する位置にある場合、ピストン１２６の下向きの動きが浄化溶液を針中に引く。針１１５がインジェクタ口１１９の上に配置されかつ弁１２２が針１２４と導管１２３との間の連絡を提供するよう配置される場合、ピストン１２６の上向きの動きが浄化溶液をインジェクタ口１１９中に放出する。適するオートサンプラーの例は、日立モデルＬ−７２５０プログラム可能オートサンプラー、およびＨＴＳ　ＰＡＬ高スループットオートサンプラー（島津、メリーランド州コロンビア）を包含する。
【００９９】
オートサンプラーの動作は以下の制御の連続を包含する。すなわち
１．サンプリング針１１５を、選択されたウェル１１４の中央のプログラムされたＸ−Ｙ座標に動かす。
２．サンプリング針１１５をプログラムされた距離下げて、針を選択されたウェル１１４中の液体中に下げる。
３．シリンジロッド１２８の下向きの垂直の動き、予め決められた容量のサンプルを針１１５中に引くプログラムされた距離。
４．マイクロタイタープレート１１３の上部の上のある距離まで針１１５を上げること。
５．針１１５をインジェクタ口１１９の位置に動かすこと。
６．針１１５をインジェクタ口１１９まで下げること。
７．サンプルを針１１５からインジェクタ口１１９中に追い出す、シリンジロッド１２８の上向きの垂直の動き。
８．針１２４を浄化溶液１２１に連結する弁１２２の動き。
９．浄化溶液をシリンジ中に引くピストン１２６の下向きの動き。
１０．針１２４を導管１２３に連結する弁１２２の動き。
１１．浄化溶液を注入口１１９中に放出するピストン１２６の上向きの動き。
１２．次のＤＮＡ分離の開始で、段階１−１１を反復する。
【０１００】
図４は、ＭＩＰＣ系での使用のためのサンプル注入弁および浄化溶液注入弁の構造を示す図解である。同一の弁構造を、サンプル注入および浄化溶液注入の双方に使用することができる。注入弁１５０はステッピングモーター（示されない）のような慣習的な弁モーターにより作動される六口の回転弁である。例示的弁は、レオダイン（ＲＨＥＯＤＹＮＥ）（カリフォルニア州コタチ）から入手可能なラブプロ（ＬａｂＰＲＯ）弁を包含する。該弁は入口および出口導管に永続的に連結された６個の外口を有する。外口１５２は、分析されるべきサンプルを受領するための注入ライン１５４と連結される。外口１５６は分離カラム７８（図１）と連絡するカラム供給導管１５８と連結される。外口１６０はポンプ３８（図１）の出口と連絡する入口導管１６２と連結される。外口１６４は廃棄導管１６６と連結される。反対の出口１６８および１７０は、サンプルループ１７２の反対のサンプル入口および出口端と連絡する。浄化溶液の注入の間、弁が一区画の浄化溶液を溶媒の流れに注入して、分離カラムおよび注入の下流の他の構成部品を再生および浄化し、蓄積された残渣および分析前から残存するいかなる残余のＤＮＡも表面から除去する。
【０１０１】
外口と内的通路との間の連結、および図１中の浄化溶液インジェクタ弁５４およびサンプルインジェクタ弁６２でのそれらの作動を、図５−８に記述する。下の記述はサンプル注入弁６２について提示されるが、しかし、同一の関係および作動が、注入されている液体およびそれらの供給源を除いて、浄化溶液注入弁に当てはまる。
【０１０２】
図５および６は充填されたループ注入（より多量のサンプル（もしくは浄化溶液）が注入されるはずである場合に使用される様式）のための弁の使用を記述する。図５はサンプル負荷位置の注入弁の図解であり、また、図６は注入位置の注入弁の図解である。図５に示される負荷位置において、弁の第一の内的通路１７４が、ループ１７２の第一端１７６をサンプル注入ライン１５４と連結し、また、第二の内的通路１７８は、ループ１７２の第二端１８０を廃棄導管１６６と連結する。第三の内的通路１８２は、ポンプ出口導管１６２を分離カラム７８への導管１５８と連結する。注入口１５４からのサンプルが通路１７４を通ってサンプルループ１７２に導入される際に、ループ１７２中のいかなる剰余分もしくは液体も通路１７８を通って廃棄導管１６６に排出される。同時に、移動相溶液が、ポンプ導管１６２から分離カラム７８に、第三の導管１８２を通って流れる。
【０１０３】
図６に示される注入位置への矢印１５０の方向の弁の回転が、内的通路を動かして、入口および出口導管との異なる一組の連結を確立する。通路１７９は、ループ１７２の一端１８０を分離カラムに至る導管１５８と連結し、また、通路１７５は、ループ１７２の他端１７６をポンプに至る入口導管１６２と連結する。ポンプからの移動相溶液が通路１７５に進入しそしてループ１７２を通過して、サンプル溶液をカラムに至る導管１５８に排出し、そしてループをすすぎ続け、いかなる残渣もカラム導管１５８中に運搬する。そのうちに、通路１８３がサンプル注入導管１５４を廃棄に連結し、所望の場合は通路１８３を通る浄化溶液の通過を可能にする。この手順は、分離カラム７８（図１）に至る導管への測定された容量のサンプル溶液の信頼できる注入を提供し、該液体は、それが分離カラムに達する前に、プレフィルター７４および温度調節コイル７６を通過する。
【０１０４】
図１−８に関して上述されたところの多口弁を使用する改良されたカラム浄化系の特徴は、共通に所有される同時係属中の１９９９年４月２日に出願された米国特許出願第０９／２８５，３３１号明細書（その完全な内容はこれにより引用することにより組み込まれる）に、より詳細に記述される。
【０１０５】
図７および８は、図５および６に関して記述されたと同一の作動の連続を、しかしサンプル溶液もしくは廃棄液体の部分的ループ注入を伴い示す。
【０１０６】
本発明の系は、分離カラムおよびカラムに進入する移動相の温度を制御するためのオーブン温度制御手段を組込む。
【０１０７】
図９および１０は温度制御手段の一態様を具体的に説明する。図９はＨＰＬＣ　ＤＮＡ分析装置カラムオーブンの工程区画（ｐｒｏｃｅｓｓ　ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）の前面図であり、また、図１０は図９に示されるＨＰＬＣ　ＤＮＡ分析装置カラムオーブンの平面図である。図９および１０に示される態様の工程区画は、空気廃棄口２０２が配置される背壁２００により加熱区画から分割される。熱電対もしくはサーミスタのような温度センサーを囲む金属棒２０４が口２０２中に配置されて、該口を通過する空気の温度を測定する。毛細管２０６はサンプルインジェクタ（示されない）からプレフィルター２０８に至る。プレフィルター２０８は、入ってくる液体から汚染物質を除去する、米国特許第５，７７２，８８９号明細書に記述されるようなインラインフィルターもしくはガードカートリッジである。毛細管の長いコイル２１０は、それから移動相液体を受領するためのプレフィルター２０８と連絡する入口端を有する。長いコイル２１０は、分離カラム２１４の入口端２１２と連絡する出口端を有する。分離カラム２１４は、好ましくはＭＩＰＣ分離媒体を含有する。出口管２１６は分離カラム２１４の出口端２１８から検出器８４（図１）に至る。コイル２１０はチタンもしくはＰＥＥＫのようなＤＮＡに適合性の多価陽イオンを含まない管から作成される液体加熱コイルである。使用される管の長さおよび直径は、それを通過する液体移動相が処理区画（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）中の空気の平衡温度に達することを可能にするのに十分であるいずれかの長さである。６から４００ｃｍまでの管の長さ、および０．１５から０．４ｍｍまでの管の直径が通常十分である。管２１０の長さは該系により達成される成分の分離を低下しないため、該長さは工程液の効果的な加熱を達成するのに必要とされる長さに基づいて選択することができる。
【０１０８】
図１０を参照すれば、処理区画２２０からの空気は、温度調節のためのヒーター／ファン系２２２を通って壁２００中の開口部２０２を通過する。加熱区画２２４により受領される調節された空気は、側壁２２７とオーブン外壁２２８との間の空間により規定される通路２２６に沿って処理区画２２０に再循環する。図９および１０に示される態様中の加熱コイルは、±０．２℃の範囲内までの温度の正確さを提供し、そして５℃の温度変化について５分より下、および１℃までの温度変化について２分より下まで、温度設定の間の温度平衡時間を短縮する。
【０１０９】
図１１および１２は、温度制御手段の別の態様を具体的に説明する。図１１は小型のカラムヒーターの端部図であり、また、図１２は図１１の線Ａ−Ａに沿って採られた断面図である。本態様は、系の構成部品へのおよびそれからの熱の直接の金属から金属への伝導に頼り、そして、温度の変化および正確さを達成する空気浴に依存しない。本態様は２カラム系について示されるが、とは言え所望の場合は単一カラムに使用することができる。それは、系の構成部品を受領するよう大きさおよび形状を定められた差込口を有する熱伝導ブロック（２３０、２３２）を含んで成る。フィルター空隙もしくはプレフィルター差込口（２３４、２３６）は、プレフィルター（２３８、２４０）を受領するよう大きさを定められた内表面を有し、かつ、その外表面と熱伝達接触を確立する。分離カラム差込口（２４２、２４４）は、それぞれの分離カラム（２４６、２４８）、および毛細管をそれぞれの分離カラムに連結する分離カラム継手（２５０）（１個が図１２に示される）を受領するよう大きさを定められた内表面を有する。差込口（２４２、２４４）は、ブロック（２３０、２３２）の内熱伝達表面と、その中で受領される分離カラム構成部品の間の熱伝達接触を確立するよう大きさおよび形状を定められる。キャピラリーコイル差込口２５２（１個が図１２に示される）は、毛細管２５４（１個が図１２に示される）のコイルを受領しかつその外表面との熱伝達接触を確立するような形状にされる内表面を有する。これらの図に示される態様において、差込口（２３４、２３６）および（２４２、２４４）は、共通の面に存するおおよそ平行な中心軸を伴う筒状の穴であることができる。他の形状が等しく適しかつ全部の形状が本発明の範囲内にあると考えられることが、当業者に容易に明らかであろう。
【０１１０】
温度センサー差込口（２５６、２５８）が熱伝導ブロック（２３０、２３２）中に提供される。熱伝導の関係にある連結管２６２を受領するためのキャピラリー差込口通路２６０もまた加熱伝導ブロック（２３０、２３２）中に提供される。キャピラリーコイル差込口２５２が、本図で、それらの軸が差込口（２３４、２３６）および（２４２、２４４）の軸に垂直な筒状の空隙であることが示される。場合によっては、伝導金属筒（示されない）を、金属ブロック加熱アセンブリとコイル中の液体との間の熱交換面積を増大させるため、その内表面との熱伝導接触でキャピラリーコイル内に配置することができる。カプトン（ＫＡＰＴＯＮ）抵抗ヒーターもしくは他の型の加熱装置２６４は、熱伝導ブロックに熱を伝達するように、加熱ブロック（２３０、２３２）の表面２６６と２６８との間にかつそれらと熱伝導接触で配置される。冷却用放熱器（２７０、２７２）は、それから熱を除去するように、熱伝導ブロック（２３０、２３２）の反対の冷却表面（２７４、２７６）と熱伝導関係で配置される。冷却ファン２７８および２８０は冷却用放熱器２７０および２７２と熱除去関係にあり、そしてそれからの熱除去を加速するよう起動される。
【０１１１】
熱伝導ブロック２３０および２３２、ならびに冷却用放熱器２７０および２７２は、アルミニウムもしくは銅のような高い熱伝導性を有する素材から作成されるが、とは言え、それらは、鉄金属のような他の熱伝導性固体、もしくは必須の熱伝導性を有するいずれかの他の固体材料から作成することができる。ヒートパイプもまた冷却用放熱器として使用することができる。
【０１１２】
毛細管はＰＥＥＫもしくはチタンから作成することができるが、とは言え最大の熱伝達効率にはチタンが好ましい。本改良された熱伝達で、キャピラリーコイルは約５ｃｍの完全に伸長された長さを有することができるが、とは言え１０ｃｍの最小のコイル長さが好ましい。ＰＥＥＫ管のより長いコイルが、チタンの毛細管と同一の熱伝達を達成するのに必要とされるとみられる。
【０１１３】
図１１および１２に示される系は鏡像の２系を含んで成る。単一のカラムに系の半分が十分であるとみられ、かつ本発明の範囲内に包含されることを意図していることが容易に明らかであろう。差込口の位置、整列および間隔は本発明の決定的な特徴でない。小型かつ熱伝達効率の良い結果を提供するいかなる整列および形状も、本発明の範囲内に包含されることを意図している。
【０１１４】
図１１および１２に示される本発明の態様は、ヒーターの制御に対しより応答性であり、一温度基準から別のものへの迅速な変化を提供し、そして設定温度の±０．５℃以内の温度の正確さを維持する、小型のヒーターを提供する。加熱ブロックと加熱されている要素との間の、金属と金属の接触で得られる熱伝達速度は、空気浴系で得ることができるよりはるかにより大きく、変更された温度に対するより迅速な応答およびより大きな温度の正確さを提供する。それはまた、より短い毛細管コイルでの工程液温度の調節も可能にする。
【０１１５】
温度制御手段のなお別の具体的説明において、図１３は、本発明の好ましいペルティエ型のヒーター／冷却器の態様の図解を示す。加熱ブロック２８２は、所望の温度に達しかつ維持するのに必要とされる加熱もしくは冷却のためのペルティエ型加熱要素（示されない）と伝導接触にある。チャンネル２８４は、プレフィルター２８８と熱伝導関係にある内表面２８６を有するプレフィルター受容器である。チャンネル２９０は、分離カラム２９８の継手２９４および端ナット要素２９６と熱伝導関係にある内表面２９２を有するカラムおよびカラムガード受容器である。毛細管３００はプレフィルター２８８ならびにサンプルおよび溶液供給源（示されない）と連絡する。分離カラム２８８の出口からの毛細管３０２は分析装置８４（図１）と連絡する。毛細管３０４はプレフィルター２８８の出口端を継手２９４と連結し、それは順に分離カラム２９８と連絡する。毛細管３０４は、加熱ブロック２８２のチャンネルの迷路様の形状中で受領されて、増大されたキャピラリー長さ、および毛細管３０４と加熱ブロック２８２との間の表面接触を提供する。迷路および管の形状は、チャンネルあたり１個以上の列（ｐａｓｓ）の付加的なループおよびキャピラリーの配置を包含する、十分なキャピラリー長さおよび表面接触を提供するいかなる形状であることもできる。毛細管３０４はＰＥＥＫもしくはチタンであることができ、その高い熱伝導性のためチタンが好ましい。加熱ブロック２８２はいずれかの熱伝導性の金属であることができる。アルミニウムもしくは銅がそれらのより高い熱伝導性のため好ましいが、とは言え鋼のような鉄金属を使用することができる。ペルティエ型ヒーターは、ペルティエ型熱循環器（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）で使用される系のような、慣習的な温度および制御系（示されない）で制御される。図１１および１２で示される態様でのように、ペルティエ型の加熱されたブロックにより達成される温度の正確さは±０．５℃である。
【０１１６】
図９−１３に関して上述された、改良された空気浴オーブンおよび固体ブロック加熱系の特徴は、共通に所有される同時係属中の１９９９年４月１９日に出願された米国特許出願第０９／２９５，４７４号明細書（その完全な内容はこれにより引用することにより組み込まれる）に、より詳細に記述される。
【０１１７】
図１４は、本発明の好ましいフラグメントコレクタ３４８の透視図であり、図１５はその前面図であり、そして図１６はその端部図である。これらはＸ軸の動きの制御系の詳細を具体的に説明する。フラグメントコレクタ３５０は、制御部ハウジング３５２、サンプルトレイ支持体３５４および一吹き（ｐｕｆｆ）制御部ハウジング３５６を有する。ピンチ弁３５８が、液体の流れを終了させるために制御部ハウジング３５２の前に据え付けられる。マルチウェルプレート３６０はペルティエ型の冷却された冷却パッド３６２上に支持される。フラグメント分注器３６４が分注器支持キャリジ３６６上に支持される。分注器支持キャリジ３６６は、Ｙ軸の動きの制御部３６８上でＹ軸の動きについて支持される。Ｙ軸の動きの制御部３６８は、溝穴３７０を通って、図１７に示されるＸ軸の動きの制御系３７２まで伸長する。Ｘ軸およびＹ軸の動きの制御系は、その中に画分が分注されるはずであるプレート３６０中のウェルの中心軸に対応するＸ−Ｙ座標に分注器支持体３６６を動かし、画分が分注されるまで分注器をこの位置で維持し、そしてその後、画分が分注されるはずである次のウェルの中心軸に対応するＸ−Ｙ座標に分注器を動かす。
【０１１８】
図１７は、フラグメント分注器のＸ軸の動きについてウォーム歯車装置駆動アセンブリの詳細を示すために前面パネルが除去された、図１５のフラグメントコレクタの部分的前面図である。ガイドロッド３７４が、左および右支持パネル３７６および３７８によりその端部で支持される。支持パネル３７６および３７８は水平の支持プレート３８０上に据え付けられる。外にねじを切られたウォーム歯車装置３８２が、左および右支持パネル３７６および３７８上に支持された慣習的ベアリング（示されない）上のその中心軸の周りの回転のため据え付けられる。右支持パネル３７８上に据え付けられたステッピングモーター３８４は車軸３８６を有し、その上に第一の駆動プーリー３８８が据え付けられる。第二の駆動プーリー３９０は、ウォーム歯車装置３８２上で、第一の駆動プーリー３８８と整列された位置に据え付けられる。駆動ベルト３９２がプーリー３８８および３９０を嵌合して、モーター車軸３８６の回転運動をウォーム歯車装置３８２に移す。
【０１１９】
Ｙ軸の動きの制御部３６８はＸ軸の動きキャリジ３９４（図１７）上に支持される。Ｘ軸の動きキャリジ３９４は、ウォーム歯車装置３８２の外的ねじ山を嵌合する内側にねじを切られたボア３９６を有する。Ｘ軸の動きキャリジ３９４中のチャンネル３９８は、Ｘ軸方向の滑る動きのためのガイドロッド３７４と滑り嵌合のため配置される。ガイドロッド３７４は、ウォーム歯車装置３８２が回転する場合にウォーム歯車装置の軸の周りの回転に対してＸ軸の動きキャリジを安定化する。ステッピングモーター３８４の段階状の起動は、ウォーム歯車装置３８２の段階状の回転に移され、Ｘ軸の動きキャリジをＸ軸に沿って左もしくは右に、画分が分注されるはずであるウェルのＸ軸座標と整列して分注器を配置する位置まで動かす。
【０１２０】
図１８は、フラグメント分注器のＹ軸の動きのための駆動アセンブリのモーターおよびウォーム歯車装置アセンブリの部分図である。Ｙ軸ステッピングモーター４００はＸ軸の動きキャリジ３９４の支持表面４０２上に支持される。Ｙ軸ウォーム歯車装置４０４はステッピングモーター駆動装置４０６上に据え付けられる。Ｙ軸ウォーム歯車装置４０４は外鞘４０８中に部分的に囲まれる。外鞘４０８はステッピングモーター４００のハウジングの表面４１０上に据え付けることができるか、あるいは、それはキャリジ３９４に取付けることができる。溝穴３７０は前面パネル４１６の反対の縁４１２および４１４により規定される。ガイド４１８は、鞘４０８およびウォーム歯車装置４０４と軸方向に平行な整列で鞘４０８の下面上に据え付けられる。
【０１２１】
図１９は、図１７および１８に示される駆動アセンブリの端部図である。これはフラグメント分注器のＹ軸の動きのための駆動アセンブリのさらなる詳細を示す。鞘４０８は、ウォーム歯車装置４０４のねじを切られた嵌合表面４０９を露出させる側方開口部を有する。分注器支持体４１６は、ガイド４１８および適合された分注器支持溝４２０の相互嵌合により支持される。ガイド４１８の内側に勾配をつけられた縁は、支持溝４２０の対応して外側に勾配をつけられた反対の縁を嵌合する。分注器支持体３６６は、ウォーム歯車装置４０４の嵌合表面４０９を嵌合する、溝をつけられた表面４２２を有する。ウォーム歯車装置４０４の回転は分注器支持体３６６のＹ軸の動きを遂げる。ガイド４１８との溝４２０の嵌合は、分注器支持体３６６が回転する場合に、それをウォーム歯車装置４０４の軸の周りの回転する動きに対して安定化する。ステッピングモーター４００の段階状の起動は、ウォーム歯車装置４０４の段階状の回転に移され、分注器支持体３６６を、Ｙ軸に沿って後方にもしくは前方に、画分が分注されるはずであるウェルのＹ軸座座標と整列して分注器を配置する位置まで動かす。ガイド４１８および溝４２０の適合された嵌合表面が、ガイド、ならびにガイドおよび溝の嵌合の安定化機能を提供する他の配置であることができることが、当業者に容易に明らかであろう。適するフラグメントコレクタの例は、トランスゲノミック（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）から入手可能なモデルＡＳＷ１００、およびギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）（ウィスコンシン州ミドルトン）からのモデルＦＣ　２０３／２０４フラクションコレクタを包含する。
【０１２２】
図２０は標準的な９６穴マルチウェルプレートの平面図である。プレート４２４はサンプルウェル４２６を有し、各ウェルの中心軸は、次の隣接するウェルの中心軸から、ＸおよびＹ軸に沿った正確に反復される間隔を有する。ウェルの数およびウェルの間隔は所望のいずれかの値を有するよう選択することができる。ウェルの形状、大きさおよび分布は、例えば９６、３８４および１５３６穴マイクロタイタープレートについて標準化することができ、そしてこれらのそれぞれもしくは全部を本発明のフラグメントコレクタとともに使用することができる。ウェルは示されるとおり使用することができるか、または、それらは、個別のサンプルバイアルの内張り、もしくはマイクロタイタープレートのウェルの内側寸法に対応する外側寸法を有するサンプルバイアルを含有する慣習的な上置き板状内張りの使用により、サンプルの汚染から保護することができる。
【０１２３】
図２１は、本発明の空気一吹き（ａｉｒ−ｐｕｆｆ）分注器の一態様の図解である。該分注器の特徴は、同時係属中の共通に譲渡される１９９８年８月２８日に出願された米国特許出願第０９／１４３，４５６号明細書（その完全な内容はこれにより引用することにより組み込まれる）に記述される。加圧ガスが、加圧ガスの供給源（示されない）から導管４３０を通り一吹き弁４２８にフィードされる。導管４３２は一吹き弁４２８およびサンプル分注器４３４と連絡する。導管８０は図１に示される分離系および分注器４３４と連絡する。一吹き弁４２８は、制御部から作動する弁開放および弁閉鎖シグナルを受領するための連絡ライン４３８によりフラグメントコレクタ制御部４３６と連結される。サンプルがマルチウェルプレート４２４中のウェルもしくはバイアルに分注されるはずである場合に、弁開放シグナルが一吹き弁４２８に与えられ、また、弁閉鎖シグナルは、サンプル収集が完了した場合、もしくはバイアルが一杯になった場合のいずれかより早いほうで、一吹き弁４２８に与えられる。収集制御部４３６は、例えば連絡ライン４４０、４４２および４４４により受領されるデータおよび命令に応答して、弁開放および弁閉鎖シグナルを提供する。
【０１２４】
図２２は、一吹き弁４２８が閉鎖された位置にある場合のその要素を示す、図２１の空気一吹き分注器の態様の拡大断面図である。サンプル供給導管８０が分注器４３４の湾曲した通路４４６の入口端と連絡する。廃棄への導管９０は湾曲した通路４４６の出口端と連絡する。湾曲した通路４４６の中央４４８は、該通路中の開口部を通って空気一吹き導管４３２と連絡する。空気一吹き導管４３２は、湾曲した通路４４６との連絡にその出口を配置するよう位置を定められた、分注器４３４の筒状のくぼみ４５０中で受領される。湾曲した通路４４６の中央部分は、分注通路４５２と連絡するさらなる１個の開口部を有する。一吹き弁４２８が閉鎖される場合、サンプル液は導管８０、中央通路４４６を通り、そして廃棄導管９０に進む。分注通路はキャピラリーの大きさを有し、従ってこの通路中の液体は、一吹き弁４２８が閉鎖される場合に静的である。
【０１２５】
図２３は、一吹き弁４２８がサンプルの液滴をマルチウェルプレートの１個のウェル中に排出するよう開放される場合の、図２２に示される分注器先端の拡大断面部分図である。本図において、サンプルは入口導管８０を通って流れ続ける。一吹き弁４２８が開放される場合、一吹きの空気が導管４３２を通って湾曲したチャンバー４４６の中央部分４４８に進み、チャンバー４４８中の圧を増大させ、そして通路４５２の先端４５４から一滴４５１の液体をウェル４２６中に排出する。一吹き弁４２８は、迅速な一連のバーストを創製するよう開放および閉鎖することができ、サンプル収集が完了するかもしくはウェル４２６がいっぱいになるかのいずれかまで、ウェル４２６中に一連の液滴を排出する。
【０１２６】
図２４は、出口ライン中の流れの制限を伴う本発明の分注器先端の代替の一態様の断面図である。それを通ってサンプル画分を含有する移動相が突出先端４７４中の突出しチャンバー４７２に至る移動相入口導管４７０。突出しチャンバー４７２は出口廃棄導管４７６と、および液滴突出し口４７８はキャピラリーの大きさの液滴形成開口部４８０と連絡する。開口部４８０から下落する液滴４８２はサンプルバイアル（示されない）中に収集される。制限作動器４８６を有する流れ制限４８４が出口導管４７６中に配置される。制限作動器は慣習的ソレノイドであることができる。制限作動器４８６および制限４８４へのシグナル電圧は、導管４７６を通る流れ中に所望の程度の制限を提供するよう構築することができる。流れの制限はピンチ弁、ゲート弁などを包含するいずれかの調節可能な貫流弁により達成することができることが当業者に容易に明らかであろうし、また、本発明は、所望の程度の制限を提供する全部の調節可能な制限弁の使用を包含することを意図している。
【０１２７】
図２５は、本発明の慣習的検出器、中央制御部および液滴の大きさ制御系の組み合わせの図解である。ポリヌクレオチド画分を含有する移動相の流れが検出セル４９２まで導管４９０を通過する。光源４９４はセル４９２を通って光を向かわせる。セルから発射される光は検出器４９６により収集かつ測定され、出口電圧を生じさせ、これは選択された波長での透過の関数である。２６８ｎｍの波長を有するＵＶ光が、ポリヌクレオチドレベルの測定に慣習的に使用される。ポリヌクレオチドがそれに結合された蛍光部分を有する場合、検出器は、該蛍光部分の主たる発射波長に合致する波長で発射を測定する蛍光検出器であることができる。
【０１２８】
検出器４９６からの出力電圧シグナルは、ライン４９８により中央制御装置５００にフィードされ、ここでシグナルが増幅かつ分析される。測定セル４９２を出る移動相の流れは、導管５０４により液滴形成装置５０２に向けられる。本態様において、液滴形成装置５０２は例えば図２１、２２および２３においてより詳細に示される空気一吹き系であることができる。液滴形成装置５０２の突出しチャンバーは、導管５０８を通って圧縮ガスを受領した一吹き弁５０６からの空気一吹きを供給される。空気一吹きは、一吹き弁５０６および突出しチャンバー５０２と連絡する空気一吹き導管５１０を通って突出しチャンバーにフィードされて画分の液滴を形成し、これらがプレート５１２中のサンプル容器に収集される。一吹き弁５０６はライン５１４を通る制御部５００からの開放弁シグナルに応答して開放する。液滴形成後に残存する移動相は、制限弁５１８を包含する導管５１６を通って廃棄にフィードされる。
【０１２９】
図２６は検出器、中央制御部および流量制限制御系の組み合わせの図解である。図２６の図解は図２５の図解と同一の要素の多くを有し、そしてここで同一の数字を双方の図で同一の要素に使用する。液滴形成装置５２０は図２４に記述されると同一であることができる。制限手段５２２は制限起動装置を包含し、それは中央制御部５００からライン５２４を通って起動制限コマンドに応答し、それにより突出しチャンバー中の圧を増大させる。図２４を参照すれば、必要とされる増大された圧は、突出しチャンバー４７２中の液体の界面張力を克服しかつキャピラリーの大きさの開口部４８０を通って液体を流れさせるのに十分である。
【０１３０】
図２７は、時間間隔、閾値および傾きに基づく画分収集の基準を具体的に説明するクロマトグラムの表示である。画分は、図２１に示される一吹き弁４２８を開放すること、もしくは図２４に示されるところの流れ制限４８４を閉鎖すること、または双方が１つの系中に提供される場合は双方により収集される。開放一吹き弁もしくは閉鎖制限コマンドは、画分の存在を示すピークの存在の確認を伴いもしくは伴わずに、時間窓の間にそれぞれの収集起動装置に送ることができる。言い換えれば、収集は、標的ポリヌクレオチドが存在する場合に、該ポリヌクレオチドを含有することが既知である選択された時間窓（垂直線５２６および５２８により示される）で盲目にすることができる。これは、サンプルが、ポリヌクレオチドの痕跡量の所望の塩基対長さの画分のみを含有する場合にとりわけ有用である。この方法は最も広範な画分範囲を収集し、そして生成物は別の画分の部分を包含するかもしれない。盲目収集は、共通に譲渡される１９９９年５月１３日に出願された米国特許出願第０９／３１１，１１６号明細書（引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる）に記述される。
【０１３１】
あるいは、開放一吹き弁もしくは閉鎖制限コマンドは、検出器シグナルが破線５３０により示される絶対的閾値より上である場合に、ある間隔の間、それぞれの収集起動装置に送ることができる。この方法は、ピークが明瞭である場合に他の画分を排除してより狭い画分範囲を収集する。しかしながら、ピークが明瞭に規定されない場合、収集されたサンプル中に他の画分が包含されるかもしれない。
【０１３２】
第三の代替において、開放一吹き弁もしくは閉鎖制限コマンドは、前縁の傾きがある選択された値より上である場合、および後縁の負数が選択された値より上である場合に、ある間隔の間、それぞれの収集起動装置に送ることができる。傾きの値は、より小さな傾きの値（垂線５３２および５３４により示される）を選択することにより、画分の大部分を収集するよう選択することができる。あるいは、傾きの値は、画分の中心の最も純粋な部分のみを収集するために、より大きな値（垂線５３６および５３８により示される）であるよう選択することができる。
【０１３３】
図１および２に示されるところの各系の構成部品は、物理的装置と該装置を制御するソフトウェアとの間の通信インターフェースとして作用する慣習的なコンピュータ命令入力手段を好ましく包含することが認識されるであろう。例えば、上述されたところの好ましい注入弁は、ＲＳ−２３２口ならびにＴＴＬおよび接触閉鎖制御のための設備を包含する。
【０１３４】
好ましい一態様において、系の構成部品の全部は標準的通信インターフェースを共有する。一例として、モデルＬ−７１００ポンプ（日立）は、他の系の構成部品との双方向的交流および統合のためのＤ−Ｌｉｎｅネットワーク通信を包含する。好ましい系の構成部品はまた、中央制御部５００から送られかつ受領されたシグナルを処理するための集積回路も組み込む。
【０１３５】
図２８は、その各構成部品に関連した制御ソフトウェアモジュールと一緒の図１のＭＩＰＣ系の図解である。装置制御ソフトウェアの構成要素を図２８の右側に示す。装置制御ソフトウェアは、それぞれがクロマトグラフィー系の特定の一構成部品もしくは一群の構成部品を制御する原因であるいくつかのモジュールより成る。
【０１３６】
これらのモジュールの１つ、移動相流量制御モジュール５６０は、水性成分比例弁２６、溶媒溶液比例弁２８、補助液体比例弁３０および浄化溶液弁４０を制御する。モジュール５６０は、分離過程の間中、弁２６、２８および３０の１個もしくはそれ以上で弁の設定を変えることにより、分離過程の間に特定の溶媒濃度勾配を提供するよう、弁２６および２８（ならびにおそらく３０）のはたらきを制御する。比例弁２６、２８、３０および４０の設定は、対応するステッピングモーター（示されない）などの操作により変えることができる。溶媒の濃度を変えるために、モジュール５６０は命令を弁２６、２８および３０のステッピングモーターに送り、そして弁２６、２８および３０は増大の指示された数だけ閉鎖もしくは開放する。モジュール５６０は、好ましくはポンプ３８を通る一定の流速を提供するように同時に閉鎖および／もしくは開放することを弁に命令する。
【０１３７】
また、モジュール５６０は、弁４０を開放しかつそれにより浄化溶液容器１６からの浄化溶液で注入弁５４、毛細管７６、インラインの系の構成部品および分離カラム７８を洗い流すよう、浄化溶液弁４０に関連するステッピングモーターに命令することにより、分離の間にカラム浄化を提供することができる。弁３３は好ましくは浄化過程の間閉鎖される。
【０１３８】
あるいは、系が流量制御ポンプ９２、９４、９６（図２）を包含する場合、移動相流量制御モジュール５６０は、中央制御部５００から受領された体積流量命令を、所望の容量を送達するポンプの設定に変える。指定された勾配を確立するためモジュール５６０に送られた命令は、例えば溶液ＡおよびＢの所望の比に対応する流量命令を包含することができる。
【０１３９】
図２に示される系での任意の浄化溶媒の浄化相は、移動相流量制御ソフトウェアモジュール５６０に指定時刻に作動する命令を送って、ポンプ１１０を開放しかつ浄化溶液を注入弁５４、毛細管７６、インラインの系の構成部品および分離カラム７８を通過させることにより遂げられる。好ましくは、弁１１１は浄化過程の間閉鎖される。
【０１４０】
ポンプ制御モジュール５６２は、ポンプ３８の入／切状態および流速もしくは液圧レベルのようなポンプ３８の作動上のパラメータを制御する。ポンプ制御モジュール５６２は、分離過程の間、ポンプ３８を通る流速をモニターし、そして指示されたレベルで流速を維持するようポンプを調節する。
【０１４１】
インジェクタ制御モジュール５６４は、分離カラム７８に流れる溶液の流れ中への選択されたサンプルの注入を遂げるため、サンプルアリコートセレクター６４およびインジェクタ弁６２の作動を制御する。インジェクタ制御モジュール５６４は多様な命令コードに応答することができる。これらのコードは、それを用いてインジェクタ系６４およびインジェクタ弁６２を制御することができる有用なインジェクタモジュール機能を包含する。例は、サンプルの吸引、分注、管の同定、針の高さ、針の動く速度、弁位置の設定、タイマーの設定のためのコマンド、および他のコマンドを包含する。
【０１４２】
オーブン温度制御モジュール５６６は空気浴オーブン７２の作動を制御する。オーブン温度は図９−１３に示されるような熱制御系により決定される。オーブン温度制御モジュールは空気浴オーブン７２を起動し、そして分離過程の全分析時間の間中、オーブン７２中の温度レベルを継続的に制御する。オーブン温度制御モジュール５６６は、所望の工程温度とともに命令を加熱手段制御部に送る。加熱手段制御部は、順に、所望の温度変化を起動する加熱／冷却手段にコマンドを送る。オーブン温度制御モジュール５６６は、センサー２０４（図９）のような較正された温度センサーからフィードバックデータを受領する。それは空気浴オーブン７２中の空気温についての情報を提供する。所望の工程温度と空気温度との間の絶対的な差異が許容される限界より上である場合、オーブン温度制御モジュール５６６は、所望の工程温度と温度センサー２０４の示度との間の差異に従って加熱／冷却手段の設定を調節するよう、加熱手段制御部に命令する。場合によっては、オーブン温度制御モジュール５６６は、工程温度のより正確な読取りのためにコイル管７６上に直接配置された温度センサーから温度の示度を受領し、そして相応して加熱／冷却手段の設定を調節する。
【０１４３】
他のソフトウェアモジュールは、検出器８４の作動を制御する検出器制御およびデータ収集モジュール５６８；フラグメントコレクタ系を制御するフラグメントコレクタモジュール５７０を包含する。指定されたサンプルを分析するのに使用することができる利用可能な予め設定されたメソッドを列挙する利用可能なサンプルテーブルの一覧を使用者に提示するサンプル分析モジュール。あるいは、使用者は、サンプル分析モジュール５５０のプロンプトで必要とされる情報を入力することにより、彼自身のメソッドを規定することができる。こうした情報は、温度条件、勾配の条件、注入モードなどを包含することができる。
【０１４４】
図２９は、ＭＩＰＣ系のコンピュータ化された制御プロセス、および該プロセスの各部分に関連するモジュールの一態様の図解である。
【０１４５】
第一に、分析されるべきサンプルが使用者により同定される。サンプル分析モジュール５５０が、サンプルの正体を、分析されるべきサンプルを含有するバイアルの数字、もしくはこうしたバイアルのＸ−Ｙ座標の形態で受領する。
【０１４６】
サンプルテーブルの一覧がサンプル分析モジュール５５０により表示され、指定されたサンプルを分析するのに使用することができる利用可能な予め設定されたメソッドを列挙する。
【０１４７】
その後、果たされるべきメソッドを包含するサンプルテーブルが使用者により指定される。あるいは、使用者は、サンプル分析モジュール５５０のプロンプトで必要とされる情報を入力することにより、彼自身のメソッドを規定することができる。こうした情報は、温度条件、勾配の条件、注入モードなどを包含することができる。
【０１４８】
フラグメントの収集が望ましい場合、使用者はまたフラグメント収集パラメータも指定する。使用者は、予め規定されたフラグメント収集方法の１つを選択することができるか、もしくは彼自身の方法を指定することができる。盲目収集の場合、使用者は収集のための時間間隔を指定する。閾値収集の場合、使用者は収集が開始する閾値を指定する。傾き収集の場合、使用者は収集が開始する強度曲線の角度を指定する。この情報に基づき、フラグメントコレクタ制御モジュール５７０への命令を含有するフラグメント収集テーブルが創製される。
【０１４９】
分析過程が使用者により開始される。その後、サンプルテーブルのロードをサンプル分析モジュール５５０により実施する。サンプルテーブルは各サンプルの選択されたメソッドを包含する。サンプルテーブルの依存性はサンプルテーブルモジュール５５２により確かめる。
【０１５０】
ハードウェアおよびソフトウェアのチェックがサンプルテーブルモジュール５５２により開始される。サンプルテーブルモジュール５５２は、指定されたメソッドにより必要とされる全部のハードウェアおよびソフトウェアが利用可能かつ運転可能であるかどうかをチェックするように装置制御部５５４に命令する。流量制御モジュール５６０が、溶媒比例弁２６、担体液比例弁２８、補助液体比例弁３０および浄化溶液弁４０が存在しかつ適正に作動していることを確かめる。ポンプ制御モジュール５６２は、ポンプ３８が存在しかつ適正に作動しているかどうかをチェックする。インジェクタ制御モジュール５６４は、サンプルアリコートセレクター６４およびインジェクタ弁６２が存在しかつ適正に作動していることを確かめる。オーブン温度制御モジュール５６６が、空気浴オーブン７２、プレフィルター７４およびカラム７８が存在しかつ適正に作動していることを確かめる。フラグメント収集が選ばれたメソッドの一部である場合、フラグメントコレクタモジュール５７０が、フラグメントコレクタ８８が系中に存在しかつ適正に作動するかどうかを確かめる。
【０１５１】
装置制御部５５４がエラーを見出す、すなわち、この特定のメソッドに必要とされる装置もしくはソフトウェアが存在する系の環境設定で利用可能でない場合、サンプルテーブルモジュールは分析を中止し、そして使用者にエラーを報告する。
【０１５２】
そうでなければ、指定されたメソッドが系にロードされる。サンプルテーブルモジュール５５２が、メソッドテーブルへの選択されたメソッドの特定のパラメータの計算を開始する。こうしたパラメータは、分析されるべきサンプルを含有するバイアルの数字もしくは座標、分析されるべきサンプルの容量、サンプルの注入方法、注入の速度、溶媒の流速、注入溶媒の濃度、溶媒濃度の勾配の詳細、空気浴オーブンの温度、所望の工程温度と実際の工程温度との間の許容される不一致、分析装置の読取り頻度、などを包含する。移動相の勾配の詳細は、％Ｂが変えられるべきである時間および変化の大きさを指定するテーブルの形態であることができる。あるいは、該テーブルは、％Ｂが変化されるべきである特定の時間、およびこれらの時間で確立されるべき絶対的な％Ｂを含有することができる。あるいは、該テーブルは、移動相濃度の更新の頻度、および時間に基づく所望の％Ｂを計算するための式を含有することができる。この場合、流量制御モジュール５６０への命令は分離過程の間に実時間で計算される。
【０１５３】
その後、分析をメソッドモジュール５５６により開始する。メソッドモジュール５５６は、装置制御部５５４に分析を開始するよう命令する。装置制御部は、順に、装置制御ソフトウェアモジュールにより以下の分析前手順を果たす：
オーブン温度制御モジュール５６６は、加熱／冷却手段制御部に命令を送ることにより選択されたメソッドにより指示されたレベルにオーブン温度をするよう、温度制御手段に命令する。これらの命令は所望の工程温度を含有する。オーブン温度制御モジュール５６６は、温度センサー２０４からのデータを所望の工程温度と比較することにより、空気浴オーブン７２が所望の温度に達したことを確かめる。指示された温度と実際の温度との間の差異がメソッドテーブルで提供された誤差の許容される限界より大きい場合、オーブン温度制御モジュールは、加熱／冷却手段制御部にオーブン温度を相応して上げるもしくは下げるよう命令する。実際のオーブン温度が所望のパラメータ内になるまでこのプロセスが反復される。
【０１５４】
流量制御モジュール５６０は、メソッドテーブルにて設定されるところの注入溶媒濃度を達成するための対応するステッピングモーターの作動により、弁２６、２８および３０を設定する。この溶媒濃度は、溶媒、担体液および補助液体の流速の均衡をはかることにより達せられる。初期溶媒濃度は、好ましくは、非極性分離媒体へのサンプル中のＤＮＡフラグメントの結合を遂げる。
【０１５５】
ポンプ制御モジュール５６２は、ポンプ３８を所望のポンプ速度に設定して、メソッドテーブルで指示される流速を助長する。
【０１５６】
その後、メソッドモジュール５５６が、装置制御部５５４に分析を開始するよう命令する。
【０１５７】
装置制御部５５４は、順に、装置制御ソフトウェアモジュールにより以下の動きを果たす：
インジェクタ制御モジュール５６４は、メソッドテーブルにて指定されるところの１１４でのような選択されたウェルからのサンプルアリコートセレクター６４によるサンプルの注入を助長する。サンプルはメソッドテーブルにより指定される様式で注入される。注入されたサンプル中のＤＮＡフラグメントが非極性分離媒体に結合する。勾配分離の場合は、指示された時間間隔で、流量制御モジュール５６０が弁２６、２８、３０の設定を変えて、メソッドモジュールテーブルにより指示されたレベルまで溶媒濃度を増大させる。溶液ＡおよびＢの比は所望の勾配中の溶媒比を維持するように連続的に変えられる。イソクラチック流のためには、溶液ＡおよびＢの比は一定の値で維持される。
【０１５８】
塩基対の大きさによるＤＮＡフラグメントの混合物の分離においては、いくつかの異なる移動相勾配を使用してよい。増大する移動相勾配は溶液Ｂの濃度の段階的もしくは連続的増大であり、そして、勾配の１個もしくはそれ以上の部分が平坦もしくは一定の％Ｂの相（イソクラチック溶媒流）であってよい。ＤＮＡフラグメントは、低い％Ｂを含有する移動相流で、分離カラム７８中の分離媒体の非極性表面上に付着する。ＤＮＡフラグメントは、比較的狭い範囲の％Ｂでカラムから分離される。
【０１５９】
図３０は、ＭＩＰＣ過程での核酸フラグメントの基礎的分離の間の移動相中の溶媒濃度のグラフ表示である。図３０を参照すれば、カラム７８中の分離媒体にＤＮＡフラグメントが結合する平坦な溶媒濃度５７２は、ｔ（０）からｔ（１）までである。これの後に、ｔ（２）の分離相の開始までの急な溶媒の勾配の上昇５７４が続くことができる。この点で、溶媒勾配はＤＮＡ分離勾配５７６に変えられ、これはｔ（２）で開始し、かつ、目的の全部のＤＮＡフラグメントがｔ（３）でカラムから放出された溶媒濃度レベルまで継続する。その後、駆動する溶媒の勾配がより急な勾配５７８に変わり、これは、分離カラム７８から全部の残存する核酸を除去しかつ次の分離手順のためカラムを準備するｔ（４）のレベルまで継続する。
【０１６０】
これらの相の間に、弁２６および２８の設定は、分離カラム７８を通過する液体中で所望の移動相組成を遂げるよう継続的に調節される。弁の調節は漸増するため、それらはまた微小段階の調節として見ることもでき、そして勾配は微小段階の勾配として見ることができる。
【０１６１】
流量制御モジュール５６０は、特定の容量および容量比を対応する弁制御設定に変換するための転換式を包含する。指定された勾配を確立するための流量制御モジュール５６０への命令は、溶液ＡおよびＢの比のパラメータを包含する。
【０１６２】
分析の間中、オーブン温度制御モジュール５６６が、オーブン温度をモニターし、そして、オーブン温度が誤りの許容される限界よりも大きく指示されたレベルから逸脱する場合に、オーブン温度制御手段の設定を調節する。
【０１６３】
分析が開始する場合、検出器制御およびデータ収集モジュール５６８が装置制御部５５４により起動され、そして順に検出器８４を起動する。装置制御部５５４は、モジュール５６８に、検出器８４の作動モードでの特定の命令を提供する。こうした命令は、ＵＶ検出器の場合、検出されるべきＵＶ透過の基礎レベル、検出されるべき透過レベルの範囲、および検出器により得られるべき読取りの頻度を包含することができる。分析装置は進む液体を分析することを開始し、かつ、収集されたデータをモジュール５６８に渡す。検出器８４による各読取りについて、モジュール５６８は、検出された透過のレベルおよび読取りの時間を記録する。モジュール５６８は、得られた情報を解読かつ収集し、そしてまたこのデータを実時間表示のためサンプル分析モジュール５５０にアナログ形式で渡す。
【０１６４】
フラグメント収集が選ばれたメソッドの一部である場合、フラグメントコレクタモジュール５７０が装置制御部５５４により起動される。フラグメントコレクタモジュール５７０は、フラグメントコレクタパラメータテーブルに従ってフラグメントコレクタ８８にコマンドを与える。モジュール５６８により収集された情報もまた、フラグメントコレクタ８８に渡されかつ移動相の閾値もしくは傾き収集に使用されることができる。
【０１６５】
フラグメントコレクタモジュール５７０は、装置制御部５５４から収集の時間枠で命令を受領する。盲目収集の場合、命令は、特定の画分の収集を開始および終了するための特定の時間、もしくは開始時間および収集間隔の長さの形態であることができる。分析装置８４からの実際のピークの存在の確認は必要とされない。
【０１６６】
閾値収集については、フラグメントコレクタモジュール５７０が、収集が開始すべきである分析装置８４により生じられる強度のレベルを受領する。強度のレベルがこの閾値より下に下落するか、もしくはこのフラグメントの収集に指定されたバイアルがいっぱいである場合、フラグメントコレクタモジュール５７０はフラグメントコレクタに収集を終了するためのコマンドを与える。
【０１６７】
勾配収集については、フラグメントコレクタモジュール５７０が、傾きの閾値、すなわち収集が開始するべきであるＵＶ検出器３２６により生じられる強度の増加の速度のレベルを受領する。曲線の傾きが指定された閾値を越える場合、制御部３３０はフラグメントコレクタ８８に収集を開始するための命令を与える。収集は、該フラグメントの収集に指定されたバイアルがいっぱいである場合はいずれの点でも中断することができる。そうでなければ、収集は、傾きが負に転じる、すなわち強度のピーク値を過ぎるまで進行する。収集は、曲線の傾きの絶対値が指定されたレベルより下に下落する場合に中断される。
【０１６８】
これらのフラグメント収集方法はまた組み合わせでも使用することができる。例えば、盲目収集は、存在するフラグメントの確認が閾値もしくは傾き法により受領される場合にのみ起こることができる。
【０１６９】
サンプル分析モジュール５５０は、結果が検出器制御およびデータ収集モジュール５６８により獲得されている際に、分析の進行を表示する。
【０１７０】
分析が完了すれば、結果データモジュール５５８が創製され、そしてメソッドのパラメータがそこで保存される。結果データモジュール５５８は検出制御およびデータ収集モジュール５６８により収集された情報を受領し、そして結果を分析する。その後、結果データモジュール５５８が分析の結果を保存する。サンプルテーブルモジュール５５２が、結果データモジュール５５８による分析の品質管理（ｑｕａｌｉｔｙ　ｃｏｎｔｒｏｌ）チェックおよび後分析を開始する。その後、サンプル分析モジュール５５０が分析の後処理結果を表示し、そしてサンプルテーブルモジュール５５２がレポートを印刷する。
【０１７１】
図３１は、本発明の系を使用して実施されるところの分離過程の段階を具体的に説明する：
段階６００において、空気浴オーブン７２がメソッドテーブルにより指示された工程温度に加熱される。加熱手順はオーブン温度制御モジュールにより制御される。
【０１７２】
段階６０２において、ポンプのパラメータがメソッドテーブル中のパラメータに従って設定され、そして、ポンプ３８のスイッチが入れられる。ポンプを通る移動相の流速が達成される。ポンプを通る指示された移動相の流速を確立する過程は、ポンプ制御モジュール５６２により制御される。
【０１７３】
弁２６、２８および３０が、メソッドテーブルにより指示されたところの初期移動相組成を達成するよう設定される。６０４で示されるこの段階は、図３０でｔ（０）とｔ（１）との間の傾き５７２として示される。初期溶媒濃度を確立する過程は流量制御モジュール５６０により制御される。
【０１７４】
弁２６、２８および３０、ポンプ３８の速度、ならびに空気浴オーブン７２の温度の設定が確立された後に、インジェクタ６４が、段階６０６で示されるとおり、サンプルを溶媒の流れに注入する。サンプル注入の過程はインジェクタ制御モジュール５６４により制御される。サンプルが系に注入され、そしてサンプルのＤＮＡフラグメントがそれら自身をカラム７８の分離媒体に付着させた後に、迅速な溶媒の勾配を遂げるように弁２６、２８、３０の設定が変えられる。該過程のこの段階６０８は、図３０でｔ（１）とｔ（２）との間の勾配５７４として示される。この迅速な勾配は、その分離が所望されないより短いＤＮＡフラグメントを洗い流す。
【０１７５】
より短いＤＮＡフラグメントがカラムから溶出された後に、勾配の傾きがより遅い速度に変えられる。該過程のこの段階は６１０で示され、かつ、図３０でｔ（２）とｔ（３）との間の傾き５７６として示される。ｔ（２）とｔ（３）との間のこの期間の間に、分離過程が起こる（すなわち、ＤＮＡフラグメントが溶媒濃度に比例するそれらの塩基対長さに依存して系から溶出される）。溶媒の勾配ならびに弁２６、２８および３０の関連する作動は、流量制御モジュール５６０により制御される。
【０１７６】
分離過程が起こる際に、検出器８４は分離カラム７８の流出物中の溶出されたＤＮＡフラグメントの存在を絶えず検出し、そして、時間のいずれかの特定の瞬間に存在するＤＮＡ物質の量を記録する。検出器８４の作動は検出器制御モジュール５６８により制御される。検出器の出力は段階６１２で示されるとおり収集され、ディジタル形式に変換され、そしてデータ記憶装置に保存される。
【０１７７】
フラグメントの収集が望ましい場合は、フラグメントコレクタ８８が、任意の段階６１４で示されるとおり、検出器８４の流出物から分離された物質を収集する。盲目収集、閾値収集および傾き収集のようなフラグメント収集方法は上述する（図２７を参照されたい）。フラグメントコレクタ８８の作動はフラグメントコレクタ制御モジュール５７０により制御される。
【０１７８】
分離過程が完了しかつ目的の全部のＤＮＡフラグメントがカラムから溶出された後に、溶媒濃度を再度増大させる。有機溶媒の濃度を迅速に増大させて、分離カラム７８から全部の残存するＤＮＡフラグメントを溶出するのに十分高い濃度に達せさせる。該過程のこの段階６１８はｔ（３）とｔ（４）との間の傾き５７８として示される。移動相溶媒の勾配ならびに弁２６、２８および３０の関連する作動は、流量制御モジュール５６０により制御される。
【０１７９】
時々、過酷な洗浄が、系およびとりわけ分離媒体の状態を十分に維持するために必要とされる。これらの例では、分離過程の最後の部分は、好ましくは弁３３の同時の閉鎖を伴い浄化溶液弁４０を開放すること、および系全体に溶液をポンプで送っていかなる残渣も除去することにより、浄化溶液容器１６からの浄化溶液を用いて系を洗い流すことであることができる。
【０１８０】
同一サンプルの複数の注入を本発明の系により実施することができる。例えば、注入あたりの容量および注入の回数を、サンプルテーブルのロウに示されるとおり、特定のバイアルについて指定することができる。追加の注入を意思決定分岐５５１（図２９）の状態に基づき行うことができる。
【０１８１】
また、複数の異なるサンプルを分析することができる。図３２は、例えばソフトウェアに対ルーチン（ｃｏｕｎｔｅｒ　ｒｏｕｔｉｎｅ）を包含することにより、複数の異なるサンプルの分析を実施することができる、ＭＩＰＣ系の一態様の流れ図の表示である。この場合、各個別のサンプルは例えば異なる範囲の目的のフラグメント長さを含有することができる。特定の一サンプルの注入前に、後に溶出されるべきＤＮＡが、注入がなされる場合にカラムの頭部に集まるように、十分に低い有機溶媒濃度を有する移動相で、カラムを平衡化する（図３０で５７２に示されるような）。
【０１８２】
図３０に示されるとおり、分離サイクルは３つの主要な段階、すなわち付着相５７４、分離相５７６および浄化相５７８より成る。使用者が興味をもつ全部のＤＮＡフラグメントが、移動相勾配の分離相５７６の間に溶出されなければならない。高分離度の分離を達成するためには、分離相５７６の勾配の傾きは非常に低い増加速度を有しなければならない。他方、ＤＮＡ分離過程のサイクル時間を短縮するために、溶媒の勾配の分離相５７６は可能な限り短くすべきである。これらの目的を達成するために、本発明のコンピュータ化されたＨＰＬＣ系が、目的の最短のＤＮＡフラグメントが溶出されるであろう％Ｂ、および目的の最長のＤＮＡフラグメントが溶出されるであろう％Ｂを決定する。その後、該系は、目的の最短のＤＮＡフラグメントが溶出される％Ｂの直前に分離サイクルの分離相５７６を開始し、そして、目的の最長のＤＮＡフラグメントが溶出される％Ｂの直後に分離サイクルの浄化相５７８を開始する。
【０１８３】
該系は、ＤＮＡフラグメント分離過程のための移動相勾配を確立するためのいくつかのオプションを有する。使用者は、全部の勾配の情報を、時間点（もしくは間隔）および溶液Ｂの対応するレベルを含むテーブルの形態で提供することができる。あるいは、使用者が、勾配の分離相５７６が開始するレベル（％Ｂ２）、分離相５７６が終了するレベル（％Ｂ３）および勾配の増加の速度を提供することができる。直線、凹形、凸形もしくは他の形状のような勾配の形状もまた選択することができる。このデータは分離勾配を完全に規定することができる。
【０１８４】
あるいは、コンピュータ５００は、溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを包含する。
【０１８５】
好ましい一態様において、本発明は、分離で使用されるべき溶媒の勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアを提供する。一態様において、普遍的勾配が実施例１で記述されるとおり利用可能である。好ましい一態様において、該系は、目的のＤＮＡフラグメントの塩基対長さに基づく分離勾配に移動相中の％Ｂ２および％Ｂ３の好ましいレベルを提供するソフトウェアを包含する。ＤＮＡフラグメントの混合物を分析する場合、使用者が、目的のＤＮＡフラグメントの最短のものおよび最長のもののｂｐ値、もしくは混合物中の目的のフラグメント（１種もしくは複数）の塩基対長さを入力し、そしてこれらの値を好ましい移動相組成の計算で使用する。単一フラグメントを分析する場合、ただ１個のｂｐ長さを入力する必要があり、そして、ソフトウェアが、該フラグメントを溶出することができる％Ｂより下で開始しかつ該フラグメントを溶出することができる％Ｂの上で終了する勾配を計算する。一態様において、対応する溶媒濃度は、一定の傾きの分離勾配についての双曲線の式（ｉ）：
【０１８６】
【数２５】
2004506873.tif 000014
【０１８７】
式中、％Ｂは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり；ｂｐは目的のＤＮＡフラグメントの塩基対長さであり；
ｐ１、ｐ２、ｐ３は系に依存する係数である
に従って、ＤＮＡフラグメントの塩基対長さに基づいて計算される。
【０１８８】
既知の長さのＤＮＡフラグメントの標準混合物の分析から、発明者らは、有機溶媒としてアセトニトリルを使用して実施例２に記述される（かつ図３３に示されるような）条件下で、系に依存する係数について以下の値を決定した：
ｐ１＝１９．２４
ｐ２＝５３．６
ｐ３＝７８．５
式（ｉ）は溶媒濃度の直線状勾配を想定し、そして同一の勾配が較正および実際の分析に使用される場合に好ましい。いかなる傾きも使用することができる。しかしながら、系に依存する係数は、その場合に異なることができ、そして式（ｉ）の形態を有する等式への実験データの曲線のあてはめを包含する較正過程により決定しなければならない。
【０１８９】
等式（ｉ）を使用する場合、あるフラグメントの保持時間（Ｒｔ）は、以下の等式：
Ｒｔ＝死時間＋負荷時間＋（％Ｂ（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）−％Ｂ（ａｔ ｓｔａｒｔ ｏｆ ｇｒａｄｉｅｎｔ）／
傾き
式中、％Ｂ（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）は等式（ｉ）から計算された％Ｂであり；
死時間は実施例３で記述されるとおり決定され；
負荷時間は勾配５７４の時間に対応する
から計算することができる。
【０１９０】
本発明の他の態様において、他の等式を経験的データにあてはめ、そして本明細書に記述されるところの移動相組成の予測に使用した。例えば、形式％Ｂ＝ａ１（ｂｐ）＋ａ２を有する一次等式；形式％Ｂ＝ａ１（ｂｐ）２＋ａ２（ｂｐ）＋ａ３を有する二次等式；および形式％Ｂ＝ａ１（ｂｐ）３　ａ２（ｂｐ）２＋ａ３（ｂｐ）＋ａ４を有する三次等式（ａ１、ａ２、ａ３およびａ４は経験的に決定される定数である）を使用した。他の態様において、目的の範囲内の適切な形状を有するいかなる等式も使用することができる。
【０１９１】
本発明の不可欠のかつ従来認識されていない特徴は、非変性条件下で、ＤＮＡフラグメントが、各大きさについて特定の有機溶媒濃度で塩基対組成に独立に、かつ、有機溶媒の勾配の傾きの値に独立に、それらの大きさに基づいてＭＩＰＣカラムから溶出する、および、この溶出はＭＩＰＣを使用して高度に再現可能であるという、発明者らによる発見である。従って、各サンプル分析についてＭＩＰＣカラムを較正することは必要でない。１日１回の、もしくは週１回の較正さえ通常は必要でない。溶媒濃度が所定の塩基対長さについて決定されれば、その大きさのフラグメントを溶出するための％Ｂは、同一のカラムで日ごとにのみならず、しかしまた１本のカラムから別のものまで一定であることができる。溶媒濃度を塩基対長さに関係づける参照を創製すること、およびいずれかの付加的な方法の開発を伴わずに既知の塩基対長さのＤＮＡフラグメントを溶出するための溶媒濃度を予測することを可能にするのは、この驚くべき発見である。デフォルト値（標準的ＤＮＡ混合物を以前に分析することにより得られた）を用いかつ較正を伴わずに良好な結果を得ることができるとは言え、好ましい実務は、新たなカラムまたは溶離剤（緩衝液もしくは移動相）を装置に設置する場合に較正することである。高度に正確な結果を、内部標準の使用を伴わずに得ることができる。該方法は、既知の長さのフラグメントが特定の勾配でいつ溶出するであろうかを予測するのに使用することができ、また、特定の溶媒の勾配でのその保持時間から未知のフラグメントの分子量を確かめるのにもまた使用することができる。ＤＮＡフラグメントの溶出の予測可能性は、速度および分離度に関する勾配の最適化を助長する。
【０１９２】
分離勾配の式の別の態様において、等式（ｉｉ）が、特定の塩基対長さの特定のフラグメントが溶出するとみられる傾きｓの直線状勾配の経過中に達せられるとみられる％Ｂを表し：
【０１９３】
【数２６】
2004506873.tif 000015
【０１９４】
式中
【０１９５】
【数２７】
2004506873.tif 000016
【０１９６】
％Ｂは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり；
ｓは濃度増加の速度（すなわち傾き）であり；
ｄ、ｖｏｉｄ、ｐ４、ｐ５、ｐ６、ｐ７およびｐ８は系に依存する係数である。
【０１９７】
既知の長さのＤＮＡフラグメントの標準混合物の統計学的な曲線のあてはめの分析から、発明者らは、実施例２に示される溶出条件下でトランスゲノミック　インク（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州サンノゼ）から入手可能なＤＮＡＳＥＰカラム（５０ｍｍ×直径４．６ｍｍ）を装備されたＭＩＰＣ系で使用されるべき系のパラメータについて、以下の好ましい値を決定した：
ｄ＝２．０
空隙時間＝１．９５
ｐ４＝９．５９６×１０−４
ｐ５＝０．４１７
ｐ６＝２５．４
ｐ７＝４５．２
ｐ８＝８５．０
等式（ｉ）および（ｉｉ）において、異なる逆相分離カラム、異なる分離条件、もしくは異なる系の構成部品を使用するクロマトグラフィー系について、曲線のあてはめの後に、他の系のパラメータを得ることができる。例えば、多様な製造供給元からの系の構成部品が入手可能であり（例えば、ヒューレット　パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）、バリアン（Ｖａｒｉａｎ）、ベックマン　コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、島津）、そして本発明で使用することができる。しかしながら、等式の一般的形式は変えられないことができる。
【０１９８】
本発明の好ましいソフトウェアは、分離されるべきＤＮＡの塩基対でのフラグメント長さを入力するためのユーザーインターフェースを提供する。該ソフトウェアは、ｃｒｔもしくはフラットパネルモニタのようなディスプレイ装置上にグラフィカル・ユーザー・インターフェースを生成させる。ユーザーインターフェースの一例は、図３４に具体的に説明されるような勾配テンプレート６９９である。塩基対でのフラグメント長さに基づき、該ソフトウェアは、以下、すなわち直線状勾配の傾き、負荷段階の％Ｂの持続期間および変化、勾配の持続期間、洗浄の持続期間、洗浄後の平衡化の持続期間、ならびに勾配の開始および終了、を設定する。具体的に説明される例において、直線状勾配の傾きは７００に示され、また５０℃でのＤＮＡフラグメントの予測されるＲｔが垂直の棒７０２により示される。該インターフェースは、バイアル番号、注入容量、注入回数、アプリケーションの型、サンプル名、シーケンスファイル、オーブン温度、塩基対、メソッド名、分離勾配の開始での％Ｂ、および時間の移動のようなサンプルデータを入力するもしくは見るためのテーブル７０４を包含する。該インターフェースは、移動相勾配を計算するためのクリックボタン７０６を包含する。該インターフェースはまた、ポンプもしくは検出器のいずれかで表示されるべき勾配の位置を決定するためのパネル７０８；分析時間および急落流速（ｐｌｕｍｐ　ｆｌｏｗ　ｒａｔｅ）を見るもしくは入力するためのパネル７１０も包含する。検出器での勾配を表示する場合、２個の特徴が好ましく包含される。第一は、等式（例えば等式（ｉｉ））が当てはまる勾配の区分の開始および終了を表す２本の垂直の破線７０５および７０７である。第二は、規定された大きさのフラグメントが検出器を越して溶出するとみられる時間を示す、数字を付けられた刻み印（ｈａｓｈ　ｍａｒｋ）７０３である。
【０１９９】
パネル７１２は、多様な勾配のパラメータ、すなわち、１分あたりの％Ｂの勾配の傾きを示し；パネル７１２は、他のフィールドのそれぞれをエディットすることに対する一代替としてのこれらの設定名に一致する他のフィールド（傾きのフィールドを除外する）に予め規定された値を置く、注意（Ｃａｕｔｉｏｕｓ）、正常（Ｎｏｒｍａｌ）および速い（Ｆａｓｔ）のような設定を有する注意レベル（Ｃａｕｔｉｏｎ　Ｌｅｖｅｌ）を包含し；負荷に関する下落（Ｄｒｏｐ　ｆｏｒ　Ｌｏａｄｉｎｇ）は、保持されない成分（ＰＣＲ産物が注入される場合は典型的にはｄＮＴＰ、プライマー、緩衝剤など）が予測不可能な様式で分離に影響しないようにそれらを通過させるためのカラムへのＤＮＡの負荷に関する％Ｂの下落を示し；負荷に関する下落（Ｄｒｏｐ　ｆｏｒ　Ｌｏａｄｉｎｇ）が直線状勾配の開始まで上昇する持続期間を提供する負荷持続期間（Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｄｕｒａｔｉｏｎ）（典型的には０．１もしくは０．５分）；傾き（Ｓｌｏｐｅ）のオプションにより選択される１分あたりの％Ｂで％Ｂが直線的に上昇することができる時間の長さを規定する勾配持続期間（Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｄｕｒａｔｉｏｎ）；％Ｂがカラムから高分子量ＤＮＡを取り除くために１００％で留まることができる時間を示す除去持続期間（Ｃｌｅａｎ　Ｄｕｒａｔｉｏｎ）（例えば１００％への上昇および１００％からの下落は０．１分で起こる）；％Ｂが次の注入のために平衡化するよう一定のまま留まる時間を示す平衡持続期間（Ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ　Ｄｕｒａｔｉｏｎ）。勾配テンプレートはまた、勾配の洗浄部分を上述されたとおり任意の浄化溶液インジェクタ弁５４により実施することができる場合に使用される迅速浄化（Ｆａｓｔ　Ｃｌｅａｎ）の設定も包含することができる。迅速浄化のオプションを選択する場合、勾配の洗浄部分は排除される。この機能は代わりに弁５４により実施され、より高いサンプルのスループットを可能にするからである。フィールド７１４は使用者によりエディットすることができる勾配テーブルを表示する。フィールド７１３は、突然変異の検出（Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）、単一フラグメントの二本鎖の大きさ分類（Ｄｏｕｂｌｅ　Ｓｔｒａｎｄｅｄ　Ｓｉｚｉｎｇ　ｆｏｒ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）、複数のフラグメントの二本鎖の大きさ分類（Ｄｏｕｂｌｅ　Ｓｔｒａｎｄｅｄ　Ｓｉｚｉｎｇ　ｆｏｒ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）、および較正（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）のようなアプリケーションを選択するためのオプションを表示する。
【０２００】
目的のＤＮＡフラグメント（１種もしくは複数）の提供される長さに基づく、必要とされる最小および最大の溶媒濃度の計算後に、サンプル分析モジュール５５０が、勾配テーブル６９９のようなインターフェースにより、これらの勾配パラメータを使用者に表示し、使用者は、系の示唆を受容するかもしくは勾配パラメータを補正するかのいずれかができる。勾配パラメータが使用者により承認された後に、パラメータがメソッドファイル中のディジタルメモリに保存され、そしてサンプル分析モジュール５５０が、各サンプルをメソッドと関連させるサンプルテーブルを形成する。
【０２０１】
選択された塩基対長さのＤＮＡフラグメントのフラグメント収集が望ましい場合には、こうしたフラグメントの溶出の時間が、上に提示された式に従ってサンプル分析モジュール５５０により計算されることができる。サンプル分析モジュール５５０は、目的のＤＮＡフラグメントの溶出に対応する移動相組成を計算する。その後、対応する保持時間を勾配テンプレートで見ることができる。生じる保持時間は、カラムからの該ＤＮＡフラグメントの溶出と、フラグメントコレクタ８８へのその到着との間の系の遅延について補正される。その後、盲目収集についてのこれらの時間が使用者に提示されることができ、使用者はそれらを受容するかもしくは補正することができる。このデータに基づき、フラグメント収集テーブルが、サンプルテーブルモジュール５５２により計算される。
【０２０２】
突然変異の検出においては、異なる大きさの複数のフラグメントが存在する状況と対照的に、単一の塩基対長さのみが使用者により入力される。ホモ二重鎖からのヘテロ二重鎖の分離は、ＤＮＡをちょうど融解し始める温度での勾配溶出を必要とする。ヘテロ二重鎖は、不適正にされた塩基により不安定化され、そして従ってこの温度でホモ二重鎖よりわずかにより多く融解される。保持時間はＤＮＡが変性する際に減少し、そしてこれゆえにより多くの変性されたヘテロ二重鎖がホモ二重鎖より先に出現する。本明細書に記述されるところのサンプル分析モジュール５５０は、例えば等式（ｉ）を使用して、塩基対長さに基づき移動相勾配を計算する。好ましい一態様において、該計算はまた、例えばフラグメントが溶出する％Ｂよりすぐ下で勾配を開始しかつ目的のピークが検出器を通りすぎた直後に勾配を停止することにより、分離度の喪失を伴わずに分析の時間を減少させる勾配を決定することもできる。サンプル分析モジュール５５０は、単一の塩基対長さに関連する移動相組成を「一括する（ｂｒａｃｋｅｔ）」勾配を計算することができる。一態様において、サンプル分析モジュール５５０は、非変性条件下で直線状勾配のちょうど終点にＤＮＡフラグメントを置く最適化された勾配パラメータを計算する。これを行うのに必要とされる％ＢをＸと呼ぶ場合には、下の勾配を示されるとおり計算することができる：
【０２０３】
【表１】
2004506873.tif 000017
【０２０４】
複数のＤＮＡフラグメントを分析する場合、該ソフトウェアは、最大のＤＮＡフラグメントを直線状勾配のちょうど終点に置きかつ最小のＤＮＡフラグメントを直線状勾配のちょうど開始点に置くことにより、最適化された勾配パラメータを計算することができる。例えば、最小および最大のフラグメントを溶出するのに必要とされる％Ｂを決定することができる。％Ｂのこれらの値は、予備的な「フラグメントを一括する範囲」を決定する。フラグメントを一括する範囲は最初の％Ｂおよび最終の％Ｂを有する。最初の％Ｂは、混合物中の最初に溶出するＤＮＡ分子を溶出するのに必要とされる量までの有機溶媒濃度を含有する。最終の％Ｂは、混合物中の最後に溶出するＤＮＡフラグメントを溶出するのに十分な有機溶媒濃度を含有する。好ましい一態様において、最適化されたフラグメントを一括する範囲の最初の％Ｂは、最初の％Ｂの約１５パーセンテージ単位下より少ないかもしくはこれに等しい。最終の％Ｂは、最終の％Ｂより少なくとも約５パーセンテージ単位より高い。上述された手順は実務で広範に応用可能であるとは言え、最初および最終の溶媒濃度は特定の応用について補正することができることが認識されるであろう。
【０２０５】
ｄｓＤＮＡフラグメントの混合物、ならびにホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖ｄｓＤＮＡフラグメントの混合物の改良された分離は、イソクラチック移動相の条件下でＭＩＰＣを使用して達成することができる。以下の等式（ｉｉｉ）を使用して、ｄｓＤＮＡフラグメントの分離に好ましい移動相組成を決定することができる：
【０２０６】
【数２８】
2004506873.tif 000018
【０２０７】
式中
【０２０８】
【数２９】
2004506873.tif 000019
【０２０９】
Ｐは分配画分であり
％Ｂは移動相中で使用される水性有機溶媒溶液のパーセンテージであり；
また、式中、ｖｏｉｄ、ｐ４、ｐ５、ｐ６、ｐ７およびｐ８は、等式（ｉｉ）に関して記述されたような曲線のあてはめから得られる、系に依存する係数である。好ましい一態様において、これらのパラメータは等式（ｉｉ）に関して示されたと同一の値を有する。
【０２１０】
分配画分はカラムを通るＤＮＡフラグメントの速度に比例する。Ｐ＝０でＤＮＡは静的である一方、Ｐ＝１でＤＮＡは最大の速度（空隙ピークのものに等しい）で動いている。
【０２１１】
等式（ｉｉｉ）を論理的に導くために、ｐＢＲ３２２　ＨａｅＩＩＩ消化物からのフラグメントの混合物の一連のイソクラチック溶出を、５０から６５％までのすべての整数の％Ｂのイソクラチック移動相でカラムを溶出したことを除き、実施例１で記述される条件下で実施した。Ｒｔ対％Ｂのプロットを準備した（図３５）。空隙時間（１．９５）の観察された値を使用して図３５からのデータを再計算し、そして図３６にプロットした。等式（ｉｉｉ）を使用して計算された曲線を、図３７に示されるとおり生じさせた。
【０２１２】
等式（ｉｉｉ）の使用方法の一態様において、図３７の計算されたデータをディジタルメモリに保存することができる。ＤＮＡの１種もしくはそれ以上のフラグメントのイソクラチック溶出プロフィルを予測するために、ソフトウェアが、いかなる選択された％Ｂでも保存されたデータの「テーブルの調査」を実施し、そして所定のフラグメント長さについてＰ値を決定する。便宜性のため、グラフィカル・ユーザー・インターフェースが図３７のプロットを示し、そして使用者が、説明７１６に示されるようなフラグメントの長さに基づく検分により％Ｂを選択する。％Ｂが選択される場合、勾配テンプレートのようなユーザーインターフェースが、予測された保持時間（１種もしくは複数）のプレビュープロットを示す。
【０２１３】
等式（ｉｉｉ）の使用方法の別の態様において、使用者は、塩基対長さおよび所望の保持時間を入力するよう指示される。Ｐの値は、関係Ｐ＝（空隙体積）／（所望の保持時間）からソフトウェアにより計算され、そしてその後、等式（ｉｉｉ）を使用して％Ｂの値を決定する。勾配テンプレートのようなディスプレイが移動相プロフィルを示し、また、好ましくは、目的のフラグメントもしくは複数のフラグメントの予測される保持時間もまた表示する。本態様のソフトウェアの段階を具体的に説明する流れ図を図４３に示す。
【０２１４】
等式（ｉｉｉ）の使用において、装置の空隙体積が予め決定されかつコンピュータのメモリに入力されていなければならない。例えば、空隙体積について１．９５ｍＬという値が、実施例２で記述されるとおり決定された。
【０２１５】
分離勾配の開始および終了の点を変えることにより、選択された塩基対長さのフラグメントの分離が、ＤＮＡフラグメントの混合物内のフラグメントの全部の分離を包含することができるか、または、ＤＮＡフラグメントの混合物内の１種もしくはそれ以上のフラグメントの分離を包含することができることが認識されるであろう。
【０２１６】
本発明は、ＭＩＰＣカラムからＤＮＡフラグメントを溶出するのに必要とされる移動相中の有機溶媒の濃度と、ＤＮＡフラグメントの塩基対長さとの間の高度に再現可能な関係を利用する。溶媒濃度が所定の塩基対長さについて決定されれば、そのフラグメントの保持時間は、同一のカラムで日ごとにのみならず、しかしまた１本のカラムから別のものまでその溶媒濃度で一定であることができる。この再現可能な品質は、溶媒濃度を塩基対長さに関係づける参照を創製すること、およびいずれかの付加的な方法の開発を伴わずに既知の塩基対長さのＤＮＡフラグメントを溶出するための溶媒濃度を予測することを可能にする。良好な結果はデフォルト値を用いてかつ較正を伴わずに得ることができるとは言え、好ましい実務は、該装置で新たなカラムを使用する場合、またはフラグメントが一貫して期待されたより早くもしくは遅く溶出している場合に較正することである。分離カラムの較正は、既知の大きさの１種もしくはそれ以上のＤＮＡフラグメント（１種もしくは複数）を溶出するのに必要とされる％Ｂを決定することにより達成される。完全な較正手順の一例を実施例２に記述し、ここでは、ｐＵＣ１８　ＤＮＡ−ＨａｅＩＩＩ消化物から得られた標準フラグメントを使用した。標準は、好ましくは既知の大きさの３種もしくはそれ以上のフラグメントを有する。標準のピークは、好ましくは較正のために十分に分離し、また、ピーク高さが平均して５〜１０ｍＶの間となるように十分な標準を使用しなければならない。
【０２１７】
完全な較正に対する一代替としてゼロ点較正を選択することができ、ここでは、コンピュータメモリ内の（実施例２に記述されるとおり得られた％Ｂ対ｂｐの値のような）デフォルト値を使用し、そして、標準を分析しない。
【０２１８】
完全な較正に対する別の代替として、単一点較正手順を使用することができ、そして、サンプルの全部が同一長さのものである場合に十分である。この過程の第一段階で、使用者が勾配テンプレートのページを選択し、オプションの二本鎖の大きさ分類−単一フラグメント（Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ　Ｓｉｚｉｎｇ−ｓｉｎｇｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）を選択し、塩基対（Ｂａｓｅ−ｐａｉｒｓ）フィールドにフラグメントの大きさを入力し、そして更新（Ｕｐｄａｔｅ）ボタンを押す。使用者は、予測された勾配および予測された保持時間を検査し、オーブン温度フィールドが５０℃に設定されていることをチェックし、そしてサンプルを注入する。分析後に、結果を吟味し、そして予測された保持時間と比較する。予測された保持時間および観察された保持時間が０．５分以上だけ異なる場合、使用者は、較正ダイアログボックス（示されない）に観察された保持時間を入力し、そして観察された保持時間に基づく再較正を強制するよう選択を行う。
【０２１９】
例えば第一の標準に対して非常に異なる大きさ（例えば大きさが５０％以上異なる）のフラグメントについて第二の較正点が必要とされる場合、使用者は第二の点を使用することができる（第一の標準について予測される勾配を変えることなく第二の標準で較正する段階的較正）。使用者は、第一の点の較正後のいずれの時点でも第二の点の較正を実行することができる。この過程において、使用者は勾配テンプレートのページを選択し、オプションの二本鎖の大きさ分類−単一フラグメント（Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ　Ｓｉｚｉｎｇ−ｓｉｎｇｌｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）を選択し、そして使用するであろうフラグメントの大きさを入力する。これは、好ましくは、第一の標準と大きさが最低５０％異なる。その後、使用者は更新ボタンを押す。使用者は、予測された勾配および予測された保持時間を検査し、オーブン温度フィールドが５０℃に設定されていることをチェックし、そしてサンプルを注入する。分析後に、結果を吟味し、そして予測された保持時間と比較する。予測された保持時間および観察された保持時間が０．５分以上だけ異なる場合、使用者は、較正ダイアログボックス（示されない）に第二の標準の観察された保持時間を入力し、そして観察された第二の標準の保持時間に基づく再較正を強制するよう選択を行う。
【０２２０】
グラフィカル・ユーザー・インターフェースの別の態様において、図３８は注入テーブル７８０の一態様を示す。注入テーブルは、バイアル番号、注入の容量、注入の回数、メソッド名、サンプル名、コメントおよび温度のエントリーを提供するサンプルテーブル７８１を包含する。最も右の３個のカラムが、勾配を改変するためのオプションを提供する。「＋／−分」と名称をつけられたカラム７８２は、式、容量・傾きに従って、勾配テーブルのロウ７１４の全部の％Ｂを相殺する。従って、１分あたり２％の傾きで、−１のエントリーは洗浄を除き全部のロウで２％だけ％Ｂを減少させる。％Ｂのこの減少は、ピークに保持時間の１分の増大を与えることができる。「塩基対」と名称を付けられたカラム７８４は、述べられた長さのＤＮＡフラグメントに必要とされるパーセンテージだけ、勾配テンプレート（洗浄を除く）を相殺する。例えば、勾配テンプレートが２０７ｂｐのフラグメント長さを想定し、かつ、使用者が同一のテンプレートを使用して３９２ｂｐのフラグメントを分析したい場合、カラム７８４に３９２を入力することは、勾配を３％Ｂだけ相殺することができる。実際の％Ｂの変化は、カラムの較正に依存して変動するかもしれない。％Ｂと名称を付けられたカラム７８６は、勾配の開始の％Ｂが明確に設定されることを可能にする。勾配テンプレートで設定された傾きが維持される。カラム７８６で入力された値は、カラム７８２もしくは７８４のいずれか中のものを上書きする。好ましくは、カラム７８２、７８４および７８６中の設定は、既に得られた結果に基づいて来るべきサンプルパラメータに対する補正を使用者が行うことができるように、ソフトウェアが実行している際に「進行中に」補正することができる。
【０２２１】
一態様において、勾配テンプレートを使用して複数のフラグメントが分析されている場合、使用者は、ピーク間の分離を増大させるために、例えば多段階勾配を創製することにより勾配を改変することができる。
【０２２２】
注入テーブルは、好ましくは、以下のオプション、すなわちポンプを作動もしくは停止させるポンプオン（Ｐｕｍｐｓ　Ｏｎ）；サンプルテーブル中の全部のエントリーを削除するテーブルクリア（ｃｌｅａｒ　Ｔａｂｌｅ）；オーブンが温まる際に安全な低い流速（例えば０．２ｍＬ／分）を提供するウォームアップ（Ｗａｒｍ　Ｕｐ）；サンプルテーブル中に列挙されるサンプルを分析するサンプル分析（Ｒｕｎ　Ｓａｍｐｌｅｓ）；結果を保存することができるアプリケーションフォルダを示すアプリケーションフォルダ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｆｏｌｄｅｒ）；デフォルトとして使用されるべきオーブン温度を示すデフォルト温度（Ｄｅｆａｕｌｔ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）（この温度は、ＤＮＡシーケンス画面上の選択されたシーケンスについて決定された）；あるサンプルについて示された１回以上の注入が存在する場合に各注入についての温度の増大の値を示す温度増加（Ｔｅｍｐｅｔａｔｕｒｅ　Ｉｎｃｒｉｍｅｎｔ）（デフォルトは１に設定される）もまた包含する。注入テーブルはまた、１分析内の持続期間もしくは時間；印刷されたクロマトグラムを生じさせるための設定；および１回の分析を終了した後にポンプ、検出器ランプもしくはヒーターを停止させるためのオプションのような、カラムを平衡化するためのオプションも包含することができる。
【０２２３】
本発明のソフトウェアはまた、利用可能なサンプルについてのデータファイルのロケーションを包含する情報を列挙する結果テーブル（示されない）を表示するためのインターフェースも包含することができる。１種もしくはそれ以上のサンプルからのクロマトグラムを見るために選択することができる。
【０２２４】
本発明のためのソフトウェアの実行は当該技術分野の熟練内にあり、かつ、特定のコンピュータ、もしくは使用されるコンピュータ、およびオペレーティングシステムのような因子に依存する。同様に、コンピュータとＨＰＬＣとの間の連結は、ハードがワイヤードである必要はない。赤外線もしくは他の電磁放射線を使用して、普遍的設計の適切な変復調装置を用いて制御機能をＨＰＬＣにつなぐことが可能である。コンピュータ５００（図１）もしくは同等の論理実行ユニットがＭＩＰＣ系の論理およびオペレーションを命令する。好ましくは、ＯＳ／Ｗａｒｐ（ＩＢＭ　コーポレーション（ＩＢＭ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の製品）、Ｗｉｎｄｏｗｓ−９８もしくはＷｉｎｄｏｗｓ−ＮＴ（双方ともマイクロソフト　コーポレーション（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の製品）のようなマルチタスキングオペレーティングシステムを実行する単一のコンピュータ、例えばＩＢＭ−ＰＣもしくはＩＢＭ−ＰＣ互換機コンピュータを使用する。コンピュータ５００は、好ましくは、適切なメモリ、ハードおよびフロッピーディスクドライブ、ビデオモニタ、キーボード、ポインティング・デバイスおよび他の周辺装置を装備される。本明細書に記述されるところのユーザーインターフェースおよび勾配計算は、好ましくはＷｉｎｄｏｗｓに基づくオペレーティングシステムと統合するよう設計されているＶｉｓｕａｌ　Ｂａｓｉｃ（マイクロソフト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ））、Ｃ＋＋、ＪＡＶＡもしくはＤｅｌｐｈｉのようなソフトウェアパッケージを使用して実行される。しかしながら、システムが、アップル　コンピュータ　インク（Ａｐｐｌｅ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ，Ｉｎｃ．）から入手可能なＭａｃ　ＯＳを実行するマッキントッシュ（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）のコンピュータのような他のオペレーティングシステムをもつ他のコンピュータ、またはヒューレット　パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）もしくはディジタル　エキップメント　コーポレーション（Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手可能な他のコンピュータで実行することができない理由は存在しない。好ましくは、ソフトウェアは、必要とされる情報の入力で補助するため、ならびに結果を吟味および分析するためにユーザー・フレンドリーな画面を提供するよう実装されることができる。一態様において、本明細書に記述されるソフトウェアは、ＭＩＰＣを実施するためにカスタマイズすることができる、製造供給元に供給されるソフトウェアを包含することができる。例えば、日立は、ＨＳＭと統合するカスタマイズされたソフトウェアを使用者が開発することを可能にするアクセス可能な選択されたコンピュータの説明書を作成している。ＨＳＭは、記述されるＤ−７０００　ＨＰＬＣシステムマネージャユーザーマニュアル（部品番号８１０−９４４１−３）、第４版（１９９６年７月）（引用することにより本明細書に組み込まれる）である。
【０２２５】
図３９は、溶媒勾配の開始および終了溶媒濃度をコンピュータ計算するための溶媒濃度および勾配コンピュータ計算ソフトウェアの一態様を具体的に説明する図を示す。使用者は、５５０で目的のフラグメントの塩基対での長さを入力し、そしてソフトウェアが５５２で等式（ｉ）を使用して勾配パラメータを計算する。使用者は、７５４、７５６で分離を促進する最適化された勾配パラメータを使用することを選択することができる。移動相プロフィルが７５８で保持時間と一緒に表示される。使用者は、７６０、７６２でパラメータを人的に補正することができる。使用者がパラメータを受容する場合、ソフトウェアは、装置制御ソフトウェアによりアクセスされるべきディジタルメモリにそれらを（７６４で示されるとおり）保存する。
【０２２６】
図４０は、図３９に類似のしかし勾配パラメータ７７０の計算における等式（ｉｉ）の使用を具体的に説明する図を示す。使用者は、イソクラチック勾配を使用するというオプションもまた有し、この場合、（図３７に示されるような）プロットが７７２で表示され、そして使用者が等式（ｉｉｉ）に関して上述されたような％Ｂを選択する。
【０２２７】
図４１は、突然変異の検出について事実がそうであるとみられるような、単一のｂｐ長さのみが入力されることを除き、図３９に類似である。
【０２２８】
図４２は、図４０に類似であるが、しかし単一塩基対長さの１個のフラグメントについてである。
【０２２９】
図４３は、％Ｂを計算するための等式（ｉｉｉ）の使用を具体的に説明する。使用者は、塩基対長さを７７４で、および所望の保持時間を７７５で入力するよう指示される。
【０２３０】
本発明の別の局面は、ＤＮＡの突然変異の検出の実施での使用のための系および方法に関する。上で論考されたとおり、本発明は二本鎖ＤＮＡ中の突然変異を検出するのに使用することができる。以下の定義を本明細書で使用することができる：
「融解温度」は、ＤＮＡフラグメント中の塩基対の５０％が相補鎖から分離されている温度を意味すると本明細書で定義する。
【０２３１】
「ホモ二重鎖」は、各鎖中の塩基が他方の鎖中のそれらの対蹠物の塩基に関して相補的である二本鎖ＤＮＡフラグメントを意味すると本明細書で定義する。
【０２３２】
「ヘテロ二重鎖」は、各鎖中の最低１個の塩基が他方の鎖中の最低１個の対蹠物の塩基に相補的でない二本鎖ＤＮＡフラグメントを意味すると本明細書で定義する。これは、不適正にされた塩基もしくは欠失による可能性がある。ヘテロ二重鎖中の最低１個の塩基対が相補的でないため、それは、ホモ二重鎖中のその完全に相補的な塩基対類似物に比較して、その部位で塩基を分離させるのにより少ないエネルギーを利用する。これは、ホモ二重鎖に比較してヘテロ二重鎖の不適正にされた塩基の部位でのより低い融解温度をもたらす。
【０２３３】
「ハイブリダイゼーション」という用語は、ｄｓＤＮＡサンプルを加熱および冷却する、例えば９５℃に加熱し次いでゆっくりと冷却することの過程を指す。加熱過程はＤＮＡ鎖を変性させる。冷却に際して、鎖は主に統計学的様式で二重鎖に再結合する。サンプルが野性型および突然変異体のＤＮＡの混合物を含有する場合には、ハイブリダイゼーションはヘテロおよびホモ二重鎖の混合物を形成することができる。
【０２３４】
「ヘテロ突然変異体部位分離温度」Ｔ（ｈｓｓｔ）は、突然変異の部位でヘテロ二重鎖ＤＮＡを優先的に変性させかつヘテロ二重鎖とホモ二重鎖との間の変性の程度の最大の差異を生じる温度を意味すると本明細書で定義する。これは、ＤＭＩＰＣによるヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖のクロマトグラフィー分離を遂げ、そしてこれゆえに突然変異を検出するのに最適である温度である。
【０２３５】
「ヘテロ突然変異体」という用語は、多形もしくは非相補的塩基対を含有するＤＮＡフラグメントを意味すると本明細書で定義する。
【０２３６】
「突然変異分離温度範囲」という用語は、ＤＮＡセグメントが完全に変性されない最高温度と、ＤＮＡセグメントが完全に変性される最低温度との間の温度範囲を意味すると本明細書で定義する。
【０２３７】
「突然変異分離プロフィル」という用語は、ホモ二重鎖からのヘテロ二重鎖の分離を示すＤＭＩＰＣ分離クロマトグラムを意味すると本明細書で定義する。こうした分離プロフィルは、突然変異もしくは多形を含有しかつＤＭＩＰＣにより分離されている前にハイブリダイズされているサンプルに特徴的である。５１℃ないし６１℃で実施された図４５に示されるＤＭＩＰＣ分離クロマトグラムは、本明細書で定義されるところの突然変異分離プロフィルを例示する。
【０２３８】
本明細書で使用されるところのＤＮＡの「温度の最適化」という用語は、ＤＭＩＰＣからの保持時間が、横座標としてのカラム温度に対して縦座標としてプロットされる実験処置である。
【０２３９】
突然変異を検出するための信頼できる一方法は、野性型鎖とのサンプル中の推定の突然変異体鎖のハイブリダイゼーションによる（Ｌｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５５：４８２（１９８７））。突然変異体鎖が存在する場合には、図４４に示されるとおり、ハイブリダイゼーション過程の結果として２種のホモ二重鎖および２種のヘテロ二重鎖が形成されることができる。これゆえに、ホモ二重鎖からのヘテロ二重鎖の分離は、サンプル中の突然変異体のＤＮＡセグメントの存在もしくは非存在の直接の確認方法を提供する。
【０２４０】
本発明の一態様は、温度の最適化に基づくＴ（ｈｓｓｔ）の選択方法である。本態様において、突然変異を含有するサンプルを、帰納的な最適化のアプローチを使用して、一連の温度で検査する。本手順により得られた至適温度は、ピークのパターンの差異により突然変異体のＤＮＡフラグメントが野性型ＤＮＡと最も容易に識別される温度である。
【０２４１】
本発明において、好ましいソフトウェアは、使用者に最初の注入の温度を入力させるサンプルテーブルのようなユーザーインターフェースを提供する。デフォルトの温度は予測される温度である（下述されるような）。しかしながら、使用者はいかなる温度も入力するオプションを有する。使用者は、次に、所望の注入回数および注入ごとの温度の増加を入力する。増加のデフォルト値は１℃である。例えば、予測される温度が５５℃であり、そして使用者が５５＋／−２℃の範囲を包含するように５回の注入の温度の最適化を実施したい場合、使用者は最初にサンプルテーブル中で５３℃として温度を設定することができ、そしてその後注入回数を５に設定することができる。
【０２４２】
温度の最適化の一例において、ＤＭＩＰＣによる２０９塩基対のホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖を含有する標準品の温度依存性の分離を、一連の分離クロマトグラムとして図４５に示し、また、分離方法を実施例４に記述する。突然変異体のフラグメントが野性型からの単一塩基対の逸脱を含有した２０９塩基対のホモ二重鎖フラグメントのヘテロ接合性のサンプルを含有するサンプルを、加熱およびその後冷却することによりハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション過程は、図４４に図で示されるとおり２種のホモ二重鎖および２種のヘテロ二重鎖を創製した。図４５に示されるとおり、ＭＩＰＣを５１℃で実施した場合、全４種の混合物の成分を表す単一ピークがみられた。全４種の成分が同一の塩基対長さを有しかつ分離が非変性条件、すなわちなんらかの変性を引き起こすには低すぎる温度で実施されたため、この結果は期待された。５３℃で、ショルダーが主ピークの小さい保持時間側に出現した。これは、融解の開始、ならびにヘテロ二重鎖の潜在的な存在および部分的分離を示した。分離の温度を漸増的に増大させた際に、元の単一ピークは結局、４個のはっきりと明確なピークに分離した。２種のヘテロ二重鎖を表す２個のより小さい保持時間のピーク、および２種のホモ二重鎖を表す２個のより大きい保持時間のピークが図４５に示される。遺伝子座１６８のＡ−Ｔ塩基対はＣ−Ｇ塩基対より低温で変性するため、２種のホモ二重鎖は分離する。理論により束縛されることを願わないが、該結果は、一方の二重鎖中でのより大きい程度の変性、および／もしくは他方に比較して一方の部分的に変性されたヘテロ二重鎖の極性の差異と矛盾せず、ＭＩＰＣカラム上での保持時間の差異をもたらす。図４５の溶出プロフィルからのホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖種の温度の最適化を図４６に示す。
【０２４３】
図４５にみられるとおり、５７°ないし５８℃の温度範囲がこの分離に最適であった。図４４のハイブリダイゼーションの図解に基づき期待された結果に一致して、突然変異が元のサンプル中に存在した場合に、４個の識別可能なピークの出現が観察された。その温度より上では、突然変異を含有する領域が完全に変性されている。これは、分離が約５９°−６１℃で実施された場合に小さい保持時間でみられる、４個の同等に変性された種を表す単一ピークにより明示される。
【０２４４】
いくつかの突然変異分析においては、２個のピークもしくは部分的に分離されたピーク（１個もしくは複数）のみがＤＭＩＰＣ分析で観察される。２個のホモ二重鎖のピークは１個のピークもしくは部分的に分離されたピークとして出現するかもしれず、また、２個のヘテロ二重鎖のピークは１個のピークもしくは部分的に分離されたピークとして出現するかもしれない。いくつかの場合には、最初のピークの拡がりのみが、部分的変性条件下で観察される。
【０２４５】
あるサンプルが同一長さのホモ接合性のＤＮＡフラグメントを含有した場合には、ヘテロ二重鎖が形成される可能性がなかっため、ハイブリダイゼーションおよびＭＩＰＣによる分析は、いずれの温度でも単一ピークのみを生じることができた。本方法の実施において、突然変異の決定は、既知の野性型フラグメントとホモ接合性のサンプルをハイブリダイズさせること、および部分的変性温度でＤＭＩＰＣ分析を実施することにより行うことができる。サンプルが野性型フラグメントのみを含有した場合には、ヘテロ二重鎖が形成される可能性がなかったため、単一ピークがＤＭＩＰＣ分析で見られことができた。
【０２４６】
発明者らは、ヘテロ突然変異体部位分離温度Ｔ（ｈｓｓｔ）を予測するための式を開発した。一般に、この式は、等式：
Ｔ（ｈｓｓｔ）＝Ｘ＋ｍ・Ｔ（ｗ）　　　　　　　　（ｉｖ）
により表され、
ここで、Ｔ（ｈｓｓｔ）はヘテロ突然変異体部位分離温度であり、ここでＸはＤＭＩＰＣ検出係数であり、そしてｍは０と２との間で選択される重み係数であり；双方の係数はＴ（ｗ）をＴ（ｈｓｓｔ）に対し補正するのに使用する。
【０２４７】
本発明の特定の一態様において、Ｔ（ｗ）は正常な（すなわち野性型）ＤＮＡ二重鎖のＵＶ融解プロフィルから決定される融解温度である。別の特定の態様において、Ｔ（ｗ）は下述されるとおりソフトウェアにより計算される。ｍの値は好ましくは０と２との間である。
【０２４８】
既知のフラグメントの融解挙動の熱力学的数学的モデルを使用して、サンプルそれ自身に対するいかなる実験的作業も伴わずに新たなフラグメントの融解挙動を予測することができる。該モデルは、突然変異の検出のための最適温度を予測するため、およびまた該技術への該フラグメントの適合性を評価するためにも使用される。ＤＮＡの融解挙動の模型作成は文献中で十分に開発されている。しかしながら、公表された熱力学的融解手順は、それらを突然変異の検出のための温度予測に完全に使用することができる前に改変しなければならない。
【０２４９】
本発明の好ましい一態様において、突然変異の検出のためのサンプルのＤＭＩＰＣ分析で使用されるべき融解Ｔ（ｈｓｓｔ）は、数学的モデルにより予測される。一般的アプローチの一例として、予測されるＴ（ｈｓｓｔ）は、計算されたＴ（ｈｓｓｔ）を得るための計算段階、および予測されるヘテロ突然変異体部位分離温度を得るための予測段階を含んで成る方法により得ることができる。該計算段階は、第一の数学的モデルに従って、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を計算することを含んで成る。該予測段階は、第二の数学的モデルに従って、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度を補正することを含んで成る。好ましくは、第二の数学的モデルは、計算されたヘテロ突然変異体部位分離温度との、経験的に決定されたヘテロ突然変異体部位分離温度の比較に基づく。
【０２５０】
本アプローチの一例において、計算された融解温度は、ポーランド（Ｐｏｌａｎｄ）のモデルのフィクスマン−フリエル（Ｆｉｘｍａｎ−Ｆｒｉｅｒｅ）の実装のような第一の数学的モデルを使用して論理的に導かれる。その後、予測される融解温度が、第二の数学的モデルに従って計算された融解温度を補正することにより論理的に導かれる。第二の数学的モデルの好ましい一例は、第一のモデルに基づく計算された温度を、温度の最適化から観察される経験的に決定された温度と比較することにより開発される補正等式である。該補正等式を使用して、野性型もしくはホモ二重鎖のＤＮＡの配列情報のみを使用してＤＭＩＰＣの融解のＴ（ｈｓｓｔ）を予測するのことができる。フィクスマン−フリエル（Ｆｉｘｍａｎ−Ｆｒｉｅｒｅ）で計算された温度の補正は、熱力学的データを得ることにおいて使用される条件（Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ　ＵＳＡ　８３：３７４６（１９８６）（引用することにより本明細書に組み込まれる））と、ＤＭＩＰＣで使用される条件との間の差異を説明するために必要である。
【０２５１】
数学的モデルから論理的に導かれる等式の一具体的説明は以下であり、これは等式（ｉｖ）の特定の一態様である：
Ｔｍ０．７５’＝１９．６＋０．６８・Ｔｍ０．７５　　　　　　　　（ｖ）
式中、Ｔｍ’０．７５は７５％のらせん含有量に対応する予測される温度であり、また、Ｔｍ０．７５は、０．０００１というσ値を使用して、ポーランド（Ｐｏｌａｎｄ）のモデルのフィクスマン−フリエル（Ｆｉｘｍａｎ−Ｆｒｉｅｒｅ）の実装（Ｐｏｌａｎｄ、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　１３：１８５９（１９７４）およびＦｉｘｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　１６：２６９３（１９７７）（双方の参考文献は引用することにより本明細書に組み込まれる））から計算される温度である。図４７は、経験的に観察される融解温度に対する計算された融解温度のグラフである。等式（ｖ）は、図４７からの４０個の点の直線のあてはめを表す図４８中の実線から論理的に導かれる。Ｔｍ０．７５’を表す線の１℃上および下を表す破線もまた図４８のグラフ上にプロットされる。これらの破線は、予測されるＴｍ０．７５’の正確さが、経験的に決定された値の約１℃以内であると予測してよいことを示す。
【０２５２】
等式（ｖ）中のＴ（ｈｓｓｔ）は、これが実験的に観察された温度の最適化のデータとＴ（ｈｓｓｔ）の予測される値との間の最良の一致を与えたため、７５％のらせん含有量で選択された。当業者は、経験的な温度最適化曲線上の他の点を選択することができ（例えば５０％もしくは９０％のらせん含有量）、また、計算された温度を得かつ上述されたとおり補正することができることを認識するであろう。
【０２５３】
Ｔ（ｈｓｓｔ）を予測するための上の一般的アプローチを使用することの他の例において、マックメルト［ＭａｃＭｅｌｔ］（商標）（バイオラッド　ラボラトリーズ（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリフォルニア州ハーキュリーズ）、ＭＥＬＴ（Ｌｅｒｍａｎら　Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：４８２（１９８７））もしくはウィンメルト［ＷｉｎＭｅｌｔ］（商標）（バイオラッド　ラボラトリーズ（ＢｉｏＲａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））のようなソフトウェアを使用して、あるフラグメントの計算された融解プロフィルを得ることができる。
【０２５４】
Ｏｅｆｎｅｒら　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ワイリー　アンド　サンズ（Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク、Ｓｕｐｐｌ．１９：７．１０−７．１０．１２、およびＣｌｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍ．４５：１１３３−１１４０（１９９９）中のＪｏｎｅｓら（これらの参考文献は引用することにより本明細書に組み込まれる）により記述される等式のような、Ｔ（ｈｓｓｔ）の予測される値を与える他の等式を、本発明で使用することができる。
【０２５５】
Ｔ（ｈｓｓｔ）の予測される値は、特定のサンプルのサンプルテーブルのようなグラフィカル・ユーザー・インターフェースで人的に入力することができる。
【０２５６】
本発明の一態様において、使用者は、コンピュータのインターフェースで、ホモ二重鎖の野性型ＤＮＡの塩基の配列を入力するか、もしくはｂｐのフラグメント長さを入力し、また、予測されるＴ（ｈｓｓｔ）の値を入力し、これは、上述されたようなサンプルの分析でオーブン温度制御ソフトウェアモジュールにより使用されるようにディジタルメモリに保存される。
【０２５７】
本発明の好ましい一態様において、使用者が、コンピュータのインターフェースでホモ二重鎖の野性型ＤＮＡの塩基の配列を入力し、Ｔ（ｈｓｓｔ）を予測するためのコンピュータ内の（もしくはネットワークを通じてのようなコンピュータに連結された）ソフトウェアが、予測されるＴ（ｈｓｓｔ）を生じさせ、これは使用者により場合によっては吟味されることができ、また、これは、上述されたようなサンプルの分析でオーブン温度制御ソフトウェアモジュールにより使用されるようにディジタルメモリに保存されてる。
【０２５８】
別の好ましい態様において、使用者は、コンピュータのインターフェースでホモ二重鎖の野性型ＤＮＡの塩基の配列を入力し、そして、Ｔ（ｈｓｓｔ）を予測するためのソフトウェア、ならびに溶媒濃度および勾配をコンピュータ計算するためのソフトウェアの双方が一緒に、必要とされるメソッドのパラメータの全部を生じさせ、これは場合によっては吟味されることができ、そしてＤＭＩＰＣ分析が自動的に実施される。
【０２５９】
本発明の好ましいソフトウェアは、ＤＭＩＰＣによる突然変異の検出のためのデータ入力および評価を助長する新規のグラフィカル・ユーザー・インターフェース画面を提供する。こうしたインターフェースの一態様を具体的に説明する図４９は、クリックボタン８００によりアクセス可能であるＤＮＡ配列画面７９８を示す。フィールド８０２は、キーボード、クリップボードもしくはＡＳＣＩＩテキストファイルからＤＮＡ配列を入力するためのフィールドを提供する。フラグメント記述フィールド８０４が、フラグメントの記述を入力するためのフィールドを提供する。塩基対の数が自動的に計算され、フィールド８０６に表示され、そしてまたサンプルについての関連した勾配テンプレートでも入力される。好ましくは本明細書に記述される等式（ｖ）により予測されるＴ（ｈｓｓｔ）が８０８に表示される。現在のカーソル位置が８１０に示される。配列の％ＧＣが８１２に表示される。
【０２６０】
図５０は、クリックボタン８２０によりアクセス可能である融解プロフィル画面８１８を具体的に説明する。この画面は、ＤＮＡ配列フィールド８０２で入力された二重鎖フラグメントの、上述された等式（ｖ）のような等式により予測されるところの融解挙動を表示するフィールド８２２および８２４を包含する。
【０２６１】
フィールド８２２はらせん状画分対温度を示す。特定の一塩基でのらせん度パーセントは、フィールド８２６で塩基の位置を入力することにより表示することができる。該フィールドが空白のまま残される場合、らせん度の平均パーセントが表示される。いずれの場合も、プロットは計算ボタン８２８を押すことにより更新される。本明細書に記述されるユーザーインターフェースの全部が、他のコンピュータアプリケーションへの編集、ペーストおよびコピーのための通常のオプションを組込む。
【０２６２】
フィールド８２４は、フィールド８３０、８３２、８３４で入力された温度でのフラグメントに沿った変性のパターンを示す。複数の跡（例えば示されるような３個）を、異なる色により識別される異なる温度で表示されることができる。図５１は、フラグメントの異なる領域中の突然変異を検出するのに必要とされる温度を決定するためのフィールド８２４でのグラフの使用を具体的に説明する。破線の跡８３６は、およそ１２０ないし２０９ｂｐからの領域中に配置された突然変異が５７℃のオーブン温度で見出されるとみられることを示す一方、実線の跡８３８は、領域１−１２０ｂｐ中の突然変異が６２℃のオーブン温度を必要とするとみられることを示す。第一の温度は、等式（ｖ）のような等式を使用してソフトウェアにより自動的に決定される。第二の温度は、ボックスに試験温度を入力すること、および融解曲線を計算することにより決定することができる。好ましい温度は、約３０ないし８０パーセントの間のらせん状画分に目的の領域を表示することができる。
【０２６３】
図５２は、８４０に融解プロフィル画面の別の態様を具体的に説明する。７５％らせんに対応する温度を、フィールド８４２中でフラグメントの大きさ（塩基対）に対しプロットする。温度の目盛りがプロット８２２のものに合致するように、このプロットを９０℃だけ回転させることができる。
【０２６４】
その最も一般的な形態において、本発明のクロマトグラフィー系で使用される分離方法は、非極性表面を有する静的分離媒体を利用するポリヌクレオチド、例えばＤＮＡの分離に関する。好ましい表面は、ポリヌクレオチドを捕捉する可能性のある多価陽イオン汚染を本質的に含まない。該分離は静止表面上で実施される。該表面は多孔質であることができるが、しかし、好ましくは、いかなる表面の孔も、分析されている最小のポリヌクレオチドを排除する大きさのものである。
【０２６５】
一態様において、非極性表面はポリマービーズの表面を含んで成る。代替の一態様において、該表面は、成形されたポリマー性モノリス中の細隙空間の表面を含んで成る。本発明の記述を単純化する目的上、そして制限としてでなく、非多孔質ビーズを使用するポリヌクレオチドの分離、およびこうしたビーズの製造法を主として本明細書に記述することができ、ポリマー性モノリスの細隙空間のような他の分離表面が本発明の範囲内に包含されることを意図していることが理解される。棒材のようなモノリスは、溶出溶媒および被検体を通過させる通し孔もしくは細隙空間を有する単一構造としてカラムの内側に形成されておりかつ非極性分離表面を提供する、ポリマー性分離媒体を含有する。
【０２６６】
一般に、本発明の分離媒体に対する唯一の要件は、それらが、固有に非極性である表面を有しなくてはならないか、もしくは対イオン剤と相互作用するのに十分な非極性を有する表面を形成する素材と結合されなければならないかのいずれかであることである。
【０２６７】
非多孔質ポリマービーズは、約０．５〜１００ミクロン；好ましくは１〜１０ミクロン；より好ましくは１〜５ミクロンの平均直径を有することができる。１．０〜３．０ミクロンの平均直径を有するビーズが最も好ましい。
【０２６８】
米国特許第５，５８５，２３６号明細書において、Ｂｏｎｎらは、該核酸分離過程を逆相イオン対形成クロマトグラフィー（ＲＰＩＰＣ）として特徴づけた。しかしながら、ＲＰＩＰＣは本発明に記述されるある種の必須の特徴を組込んでいないため、別の用語、マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（ＭＩＰＣ）を選択した。本明細書で使用されるところのＭＩＰＣは、非極性ビーズを使用して一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドを分離するための方法と定義され、ここで、該方法は、対イオン剤、およびビーズから核酸を溶出させるための有機溶媒を使用し、また、ここで、該ビーズは最低０．０５のＤＮＡ分離係数を有することを特徴とする。好ましい一態様において、ビーズは最低０．５のＤＮＡ分離係数を有する。最適な一態様において、ビーズは最低０．９５のＤＮＡ分離係数を有する。
【０２６９】
本発明のビーズは、二本鎖および一本鎖ＤＮＡのＭＩＰＣによる高効率の分離を提供する。ビーズの性能を測定するための有用な一基準は、同時係属中の特許出願第０９／１８３，１２３号明細書に詳細に記述されるＤＮＡ分離係数である。これは、ｐＵＣ１８　ＤＮＡ−ＨａｅＩＩＩ制限消化物の２５７および２６７塩基対の二本鎖ＤＮＡフラグメントの分離として測定され、そして、ピークのベースラインから頂点までの距離に対しての、ピークの間の谷からピークの頂点までの距離の比と定義される。図５３の図解を参照すれば、ＤＮＡ分離係数は、ベースラインからピーク「ｂ」と「ｃ」との間の谷「ｅ」までの距離「ａ」、および谷「ｅ」からピーク「ｂ」もしくは「ｃ」の一方の頂点までの距離「ｄ」を測定することにより決定される。ピーク高さが等しくない場合は、最高のピークを使用して「ｄ」を得る。ＤＮＡ分離係数はｄ／（ａ＋ｄ）の比である。本図解中の２５７および２６７塩基対のピークは高さが同様である。本発明の使用できるビーズは最低０．０５のＤＮＡ分離係数を有する。好ましいビーズは最低０．５のＤＮＡ分離係数を有する。
【０２７０】
理論により束縛されることを願わないが、発明者らは、本明細書で指定されるところのＤＮＡ分離係数に従うビーズが、分離されているポリヌクレオチドがビーズに進入することを本質的に排除する孔径を有すると考える。本明細書で使用されるところの「非多孔質」という用語は、その中で使用される溶媒媒体中での分離で最小のＤＮＡフラグメントの大きさおよび形状より小さい直径を有する表面孔を有するビーズを示すと定義する。それらの本来の状態でこれらの指定された最大の大きさの制限を有するか、もしくは必要とされる最大有効孔径に合致するようにそれらの孔径を減少させるよう処理されているポリマービーズが、本定義に包含される。好ましくは、最低０．５のＤＮＡ分離係数を提供する全部のビーズが、「非多孔質」ビーズの定義内に包含されることを意図している。
【０２７１】
本発明の非多孔質ビーズの表面のコンホメーションは、分離過程を妨害しないくぼみ（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）および浅いくぼみ（ｐｉｔ）様構造を包含することができる。それを非多孔質にするための多孔質ビーズの前処理は、ビーズ構造中の孔を満たすことができかつＭＩＰＣ過程を大きく妨害しないいかなる素材を用いても遂げることができる。
【０２７２】
孔は、それを通って移動相および他の物質がビーズ構造に進入することができる開放構造である。孔は、しばしば、１個の孔に進入する液体が別の孔から出ることができるように相互に連結されている。発明者らは、相互に連結される孔構造およびビーズ中へのポリヌクレオチドの動きを可能にする寸法を有する孔は、分離の分離度を損なうか、もしくは非常に長い保持時間を有する分離をもたらすと考える。しかしながら、ＭＩＰＣにおいては、ビーズは「非多孔質」であり、そしてポリヌクレオチドはビーズ構造に進入しない。
【０２７３】
カラムビーズのクロマトグラフィー効率は、主として表面および近表面領域の特性により影響される。この理由から、以下の記述はとりわけポリマービーズの表面に近い領域に関する。こうしたビーズの本体および／もしくは中心は、本発明のポリマービーズの表面もしくは表面近くで観察されるものと全く異なった化学および物理特性の組を表す可能性がある。
【０２７４】
本発明の別の態様において、分離媒体は棒状様モノリスカラムのようなポリマー性モノリスの形態であることができる。モノリスカラムは、下の実施例に記述されるとおり、管の内側の単一の単位として重合もしくは形成される。通し孔もしくは細隙空間が溶出溶媒および被検体物質の通路を提供する。分離は静止表面上で実施される。表面は多孔質であることができるが、しかし好ましくは非多孔質である。分離の形態および機能は、ビーズで充填されたカラムに同一である。ビーズでのように、棒材中に含有される孔はＤＮＡと適合性でなくてはならず、かつ、該物質を捕捉してはならない。また、棒材は、ＤＮＡを捕捉することができる汚染を含有してはならない。
【０２７５】
本発明の成形されたポリマー性棒材は、クロマトグラフィーカラムの範囲内のバルクフリーラジカル重合により製造される。棒材のベースポリマーは多様な重合可能な単量体から製造することができる。例えば、モノリス棒材は、スチレン、置換スチレン、α−置換スチレンおよびジビニルベンゼンのようなモノおよびジビニル置換芳香族化合物；アクリレートおよびメタクリレート；ポリプロピレンおよびポリエチレンのようなポリオレフィン；ポリエステル；ポリウレタン；ポリアミド；ポリカーボネートを包含するポリマー；ならびに商標テフロン［ＴＥＦＬＯＮ］で公知のフルオロ置換エチレンを包含する置換ポリマーから作成することができる。ベースポリマーはまたポリマーの混合物であることもでき、その制限しない例は、ポリ（グリシジルメタクリレートコエチレンジメタクリレート）、ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）およびポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）を包含する。棒材は、置換されないことができるか、または炭化水素アルキルもしくはアリール基のような置換基で置換されることができる。アルキル基は、場合によっては、直鎖もしくは分枝状鎖中に１ないし１，０００，０００個の炭素を有し、そして、アルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アルキル基などを包含する多様な型の直鎖、分枝状鎖、環状、飽和、不飽和の非イオン性官能基を包含し、また、アリール基は、フェニル、ナフチルなどを包含する単環、二環および三環の芳香族炭化水素基を包含する。好ましい一態様において、アルキル基は１−２４個の炭素を有する。より好ましい一態様において、アルキル基は１−８個の炭素を有する。置換はまた、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ基、もしくは非極性の逆相官能基であると考えられる同様のものも含有することもできる。炭化水素の置換方法は当該技術分野で慣習的かつ公知であり、そして本発明の一局面でない。ポリマー性モノリスの製造法は、以下の参考文献、すなわちＷａｎｇら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．Ａ　６９９：２３０（１９９４））、Ｐｅｔｒｏら（Ａｎａ．Ｃｈｅｍ．６８：３１５（１９９６））、および以下の米国特許第５，３３４，３１０号；同第５，４５３，１８５号；同第５，５２２，９９４号明細書（Ｆｒｅｃｈｅｔへ）に記述されるところの当該技術分野で公知の慣習的方法による。モノリスもしくは棒材カラムは、メルク　アンド　カンパニー（Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ）（ドイツ・ダルムシュタット）から商業的に入手可能である。
【０２７６】
本発明の非多孔質ポリマービーズは二段階の工程により製造され、ここで、小さい種ビーズが適する重合可能な単量体の乳化重合により最初に製造される。本発明の乳化重合手順は、Ｇｏｏｄｗｉｎら（Ｃｏｌｌｏｉｄ　＆　Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｃｉ．、２５２：４６４−４７１（１９７４））の手順の変法である。種ビーズを製造するための乳化重合工程で使用することができる単量体は、スチレン、アルキル置換スチレン、α−メチルスチレンおよびアルキル置換α−メチルスチレンを包含する。その後、種ビーズを拡大させ、そして場合によっては多様な基での置換により修飾して、本発明の非多孔質ポリマービーズを製造する。
【０２７７】
乳化重合により製造される種ビーズは、ポリマービーズの大きさを増大させるためのいずれかの既知の方法により拡大することができる。例えば、ポリマービーズは、米国特許第４，５６３，５１０号明細書に開示される活性化膨潤工程により拡大することができる。拡大もしくは膨潤されたポリマービーズは、架橋する重合可能な単量体および重合開始剤を用いてさらに膨潤される。重合は、拡大されたポリマービーズの架橋密度を増大させ、かつ、ビーズの表面多孔性を減少させる。適する架橋単量体は、開始剤の存在下で重合が可能な最低２個の炭素−炭素二重結合を含有する。好ましい架橋単量体は、ジビニル単量体、好ましくはアルキルおよびアリール（フェニル、ナフチルなど）ジビニル単量体であり、そしてジビニルベンゼン、ブタジエンなどを包含する。ポリマーの種ビーズの活性化膨潤は、１から約１００ミクロンまでの範囲にわたる平均直径を有するポリマービーズを製造するのに有用である。
【０２７８】
あるいは、ポリマーの種ビーズは、乳化重合から生じる種ラテックスを単に加熱することにより拡大することができる。この代替は、活性化溶媒での種ビーズの活性化膨潤の必要性を排除する。代わりに、種ラテックスを、架橋単量体のための水と混合可能な溶媒と一緒にもしくはそれを伴わずに、上述された架橋単量体および重合開始剤と混合する。適する溶媒はアセトン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、メタノールおよびジオキサンを包含する。生じる混合物を、重合開始剤の開始温度より下の温度、一般に約１０℃−８０℃、好ましくは３０℃−６０℃で約１−１２時間、好ましくは約４−８時間加熱する。場合によっては、混合物の温度を１０−２０％だけ増大させることができ、そして混合物を追加の１ないし４時間加熱することができる。重合開始剤に対する単量体の比は、最低２００の重合度を確実にするために、最低１００：１、好ましくは約１００：１ないし約５００：１、より好ましくは約２００：１である。この重合度を有するビーズは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の応用で使用されるのに十分に圧に安定である。この熱的膨潤工程は、ビーズの大きさを約１１０−１６０％だけ増大させて約５ミクロン、好ましくは約２−３ミクロンまでの平均直径を有するポリマービーズを得ることを可能にする。従って、熱的膨潤手順は、活性化膨潤手順によってのみ以前に到達可能なより小さい粒子径を製造するのに使用することができる。
【０２７９】
熱的拡大の後に、過剰の架橋単量体を除去し、そして紫外光もしくは熱への曝露により粒子を重合させる。重合は、例えば、拡大された粒子の重合開始剤の活性化温度への加熱、および所望の重合度が達成されるまで重合を継続することにより実施することができる。継続された加熱および重合は、５００より大きい重合度を有するビーズを得ることを可能にする。
【０２８０】
本発明において、Ｂｏｎｎら、もしくは米国特許第４，５６３，５１０号明細書により開示された充填材料を、アルキル基でのポリマービーズの置換により修飾することができるか、もしくは、その修飾されない状態で使用することができる。例えば、ポリマービーズを、ヨウ化メチルもしくはヨウ化エチルのようなアルキル化剤とビーズを接触させることにより１もしくは２個の炭素原子でアルキル化することができる。アルキル化は、ポリマービーズをフリーデル−クラフツ触媒の存在下にアルキルハロゲン化物と混合して、ポリマーブレンドの表面の芳香環で親電子芳香族置換を遂げることにより達成する。適するフリーデル−クラフツ触媒は当該技術分野で公知であり、そして塩化アルミニウム、三フッ化ホウ素、四塩化スズなどのようなルイス酸を包含する。ビーズは、例えば上の手順でヨウ化メチルの代わりに対応する炭化水素ハロゲン化物を用いることにより炭化水素置換することができる。
【０２８１】
本発明のビーズに関して本明細書で使用されるところのアルキルという用語は、１から１，０００，０００個までの炭素を有するアルキルおよびアルキル置換アリール基を包含すると定義し、アルキル基は、アルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アルキル基などを包含する多様な型の直鎖、分枝状鎖、環状、飽和、不飽和の非イオン性官能基を包含し、また、アリール基はフェニル、ナフチルなどを包含する単環、二環および三環の芳香族炭化水素基として包含する。アルキル置換方法は当該技術分野で慣習的かつ公知であり、そして本発明の一局面でない。置換はまた、非極性の逆相官能基であると考えられるヒドロキシ、シアノ、ニトロ基なども含有することができる。
【０２８２】
Ｂｏｎｎの特許で報告されたクロマトグラフィー素材は、最低３個の炭素を有するアルキル基で置換された非多孔質ビーズに限定された。Ｂｏｎｎらはこの置換を欠くポリマービーズを使用して分離を得ることにおいて成功しなかったからである。加えて、該ポリマービーズは、小さな群のビニル芳香族単量体に限定され、また、Ｂｏｎｎらは、他の素材を用いて二本鎖ＤＮＡの分離を遂げることが不可能であった。
【０２８３】
本発明において、二本鎖ＤＮＡの成功裏の分離は、誘導体化されない非多孔質ビーズを使用して、ならびに、１ないし１，０００，０００個の炭素を有するアルキル基で誘導体化されたビーズを使用して、達成することができる。
【０２８４】
本発明のベースポリマーは他のポリマーでもあることもまたでき、その制限しない例は、スチレン、置換スチレン、α−置換スチレンおよびジビニルベンゼンのようなモノおよびジビニル置換芳香族；アクリレートおよびメタクリレート；ポリプロピレンおよびポリエチレンのようなポリオレフィン；ポリエステル；ポリウレタン；ポリアミド；ポリカーボネート；ならびに、商標テフロン［ＴＥＦＬＯＮ］で公知のフルオロ置換エチレンを包含する置換ポリマーを包含する。ベースポリマーはまたポリマーの混合物であることもでき、その制限しない例はポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）およびポリ（エチルビニルベンゼン−ジビニルベンゼン）を包含する。これらのポリマーからのビーズの作成方法は当該技術分野で慣習的かつ公知である（例えば、米国特許第４，９０６，３７８号明細書を参照されたい）。ビーズの表面および近表面領域の物理特性は、クロマトグラフィー効率に対する支配的な影響である。ポリマーは、誘導体化されるにしろされないにしろ、ＭＩＰＣ分離に非多孔質、非反応性、かつ非極性の表面を提供しなければならない。
【０２８５】
本発明の分離方法の記述は、制限としてでなくしかし提示を単純化するために、上述された非極性表面をもつポリマービーズに関して提示される。分離表面は上述されたモノリスのポリマー性素材によってもまた提供されることができるか、もしくは、それらは、下述される非極性表面をもつ無機ポリマーにより提供されることができ、そして、これらの素材の全部を包含する方法および系が本発明の範囲内に包含されることを意図していることが理解されるべきである。
【０２８６】
本発明のビーズは、同時係属中の特許出願第０９／１８３，４５０号明細書（その完全な内容はこれにより引用することにより組み込まれる）に記述される素材のような、その表面に結合されたもしくはその上に被覆された非極性分子もしくは非極性ポリマーを有する非多孔質粒子を含んで成る。一般に、該ビーズは、ポリマーで被覆されているか、または、実質的に全部の表面基質基が非極性炭化水素もしくは置換炭化水素基と反応されかついかなる残存する表面基質基も上述されるようにトリ（低級アルキル）クロロシランもしくはテトラ（低級アルキル）ジクロロジシラザンでエンドキャッピングされている、非多孔質粒子を含んで成る。
【０２８７】
非多孔質粒子は、好ましくは無機粒子であるが、しかし非多孔質有機粒子であることができる。非多孔質粒子は、例えば、シリカ、シリカカーバイド、亜硝酸シリカ、酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ジルコニウム、炭素、セルロースのような不溶性多糖、もしくはケイソウ土、または非多孔質であるように改変されたこれらの素材のいずれかであることができる。炭素粒子の例は、いかなる妨害する汚染物質も除去するように処理されているダイアモンドおよびグラファイトを包含する。好ましい粒子は本質的に非変形性でありかつ高圧に耐えることができる。非多孔質粒子は既知の手順により製造される。好ましい粒子径は約０．５−１００ミクロン；好ましくは１−１０ミクロン；より好ましくは１−５ミクロンである。１．０−３．０ミクロンの平均直径を有するビーズが最も好ましい。
【０２８８】
慣習的なシリカに基づく逆相ＨＰＬＣ素材の製造の化学は公知であるため、本明細書の本発明のビーズの記述の大部分はシリカに関して提示される。しかしながら、上に列挙されたもののような他の非多孔質粒子を同一の様式で修飾することができ、また、本発明の方法でシリカの代わりに用いることができることが理解されるべきである。シリカの一般的化学の記述については、Ｃｏｌｉｎ　Ｆ．ＰｏｏｌｅとＳａｌｗａ　Ｋ．Ｐｏｏｌｅ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　Ｔｏｄａｙ、エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）：ニューヨーク（１９９１）、ｐｐ．３１３−３４２、およびＳｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｌ．とＪ．Ｊ．Ｋｉｒｋｌａｎｄ、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｍｏｄｅｒｎ　Ｌｉｑｕｉｄ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、第２版、ジョン　ワイリー　アンド　サンズ　インク（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．）：ニューヨーク（１９７９）、ｐｐ．２７２−２７８（それらの開示はこれによりそっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０２８９】
本発明の非多孔質ビーズは、被覆もしくはケイ酸化（ｓｉｌａｔｉｎｇ）試薬との反応後に最小限の露出されたシラノール基を有することを特徴とする。最小限のシラノール基は、支持体とのＤＮＡの相互作用を減少させるため、ならびにまた高いｐＨおよび水性の環境中での素材の安定性を向上させるために必要とされる。シラノール基は、それらがＤＮＡ分子の負の電荷に反発してカラムの固定相とのＤＮＡの相互作用を予防もしくは制限する可能性があるために、有害である可能性がある。相互作用の別の可能な機構は、シラノールがイオン交換部位として作用して鉄（ＩＩＩ）もしくはクロム（ＩＩＩ）のような金属を取り込む可能性があることである。鉄（ＩＩＩ）もしくはカラム上に捕捉される他の金属は、ＤＮＡのピークを歪める可能性があるか、もしくはＤＮＡがカラムから溶出されることを予防さえする可能性がある。
【０２９０】
シラノール基は水に基づく移動相により加水分解される可能性がある。加水分解は、より多くのシラノール基を露出させることにより、もしくはシリカコア中に存在する可能性のある金属を露出させることにより、固定相の極性および反応性を増大させることができる。加水分解は、増大された誘導体化されないシラノール基でより優勢であることができる。ＤＮＡ分離に対するシラノール基の影響は、妨害のどの機構が最も優勢であるかに依存する。例えば、鉄（ＩＩＩ）は、鉄（ＩＩＩ）が移動相中に存在するか、機器中に存在するか、もしくはサンプル中に存在するかに依存して、露出されたシラノール部位に結合されたようになる可能性がある。
【０２９１】
金属の影響は、金属が系もしくは試薬内に既に存在する場合にのみ発生する可能性がある。系もしくは試薬内に存在する金属は、シリカ上のイオン交換部位により捕捉されたようになる可能性がある。しかしながら、系もしくは試薬内に金属が存在しない場合には、シラノール基それら自身がＤＮＡ分離の妨害を引き起こす可能性がある。水性環境による露出されたシラノール部位の加水分解は、シリカコア中に存在するかもしれない金属を露出させる可能性がある。
【０２９２】
完全に加水分解されたシリカは、表面１平方メートルあたり約８マイクロモルのシラノール基の濃度を含有する。せいぜい、立体構造の考慮により、最大で１平方メートルあたり約４．５マイクロモルのシラノール基が反応する可能性があり、シラノールの残部は反応された基により立体的に遮蔽される。最小限のシラノール基は、シラノール基が分離を妨害することを予防するのに十分な遮蔽の理論的限界に達するもしくはそれを有すると定義される。
【０２９３】
非多孔質のシリカコア粒子を形成するための多数の方法が存在する。例えば、メタノール中に注がれたケイ酸ナトリウム溶液は、ケイ酸ナトリウムの微細に分割された球形粒子の懸濁物を生じさせることができる。これらの粒子は酸との反応により中和される。こうして、約１−２ミクロンの直径を有するシリカゲルの球形粒子が得られる。シリカは、有機液体もしくは蒸気から沈殿させることができる。高温（約２０００℃）でシリカは蒸発され、そして該蒸気は、温度の低下もしくは酸化ガスを使用することのいずれかにより凝縮されて微細に分割されたシリカを形成することができる。シリカの合成および特性は、Ｒ．Ｋ．Ｉｌｅｒにより、Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｓｉｌｉｃａ，Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ，Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｌｏｉｄ　ａｎｄ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ジョン　ワイリー　アンド　サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ）：ニューヨーク（１９７９）に記述されている。
【０２９４】
Ｗ．Ｓｔｏｂｅｒらは、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　Ｓｃｉ．、２６：６２−６９（１９６８）に、ミクロンの大きさ範囲の単分散シリカ球体の制御された成長を記述した。Ｓｔｏｂｅｒらは、アルキルケイ酸塩の加水分解およびアルコール溶液中でのケイ酸のその後の凝縮によって、均一な大きさの球形のシリカ粒子の制御された成長を可能にする、化学反応の系を記述する。形態的触媒としてアンモニアを使用する。懸濁物中で得られる粒子径は、直径が０．０５μｍ未満から２μｍまでの範囲にわたる。
【０２９５】
非多孔質シリカコアビーズは、ミクラ　サイエンティフィック（Ｍｉｃｒａ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（イリノイ州ノースブルック）およびケミーエ　ユティコン（Ｃｈｅｍｉｅ　Ｕｅｔｉｋｋｏｎ）（スイス・ローザンヌ）から得ることができる。
【０２９６】
本発明の非多孔質ビーズを製造するためには、非多孔質粒子を、非多孔質粒子の実質的に全部の表面基質基が非極性炭化水素もしくは置換炭化水素基で封鎖されるように、ポリマーで被覆するかもしくは反応させかつエンドキャッピングする。これはいくつかの方法により達成することができる。
【０２９７】
有機結合された相のシロキサンコーティングは、単分子層もしくは重合された多層コーティングとして作成することができる。いわゆる単分子有機層をもつ充填剤は、通常、シリカ質基礎粒子の表面シラノール基を一、二もしくは三官能性のクロロ、ジメチル、アミノ、シロキシもしくはアルコキシシランと反応させることにより製造する。これらの反応で使用される典型的な一官能性反応体はＸ−Ｓｉ−Ｒを包含し、ここでＸ＝Ｃｌ、ＯＨ、ＯＣＨ３もしくはＯＣ２Ｈ５、また、Ｒは有機基である。図５４は、シリカコア９０２および単分子有機層を有するビーズ９００の図解である。（該図は、本発明のビーズの形態学もしくは孔構造を必ずしも反映せず、そして具体的説明の目的上のみ意味される。）
表面の修飾にＲ２ＳｉＸ２およびＲＳｉＸ３のような二および三官能性反応体を使用すれば、結合された官能基あたり２個までのＳｉ−Ｘ基が反応されないまま留まる。水での処理後に、これらの反応されない基の加水分解が起こり、そして付加的なシラノール基が、充填剤中に存在する結合された有機官能基とほぼ同一濃度で（ときにポリマーマトリックス中で）形成される。これらの酸性有機シラノール基は、溶質の保持挙動に有意に影響を及ぼす可能性があり、また、ｐＨ＞７の水性溶液中での充填剤の安定性に悪影響を及ぼす。
【０２９８】
従って、シラン試薬との表面の不完全な反応、または二もしくは三官能性の修飾剤を使用することからの新たなＳｉ−ＯＨ基の形成は、移動相もしくはサンプルの分子に容易に到達可能である残余の酸性のＳｉ−ＯＨ基の集団をもたらす可能性がある。従って、最近の傾向は、（ａ）部分的被覆の代わりに官能基の密な単層、および（ｂ）残余のＳｉ−ＯＨ基の最小限の可能性を伴う均質な有機コーティングを提供するための一官能性のジメチルシラン［Ｘ−Ｓｉ（ＣＨ３）２−Ｒ］の使用に向かっている。必要とされる有機官能性を調製することができる場合はモノクロロシラン試薬が好ましい。一官能性修飾剤中のＲ基の２個がメチルである場合、表面被覆は（炭素分析に基づき）１平方メートルの有機物あたり約４マイクロモル程度であることができる。後者の場合、シリカ表面上の残余のＳｉ−ＯＨ基は、立体遮蔽のため、大部分の溶質とのクロマトグラフィー相互作用に利用不可能である。
【０２９９】
有機シラノール（例えばＨＯ−Ｓｉ−Ｒ３）もしくは有機アルコキシ（例えばＲＯ−Ｓｉ−Ｒ３）シランのシリカ支持体との重合を伴わない反応もまた、良好な充填剤を生じさせることができる。これらの反応は比較的再現可能であるが、但し、痕跡の水もしくは他の反応性種が存在しない。反応されない到達可能なシラノールが最初の反応後に残る可能性があるが、しかし、これらはクロロトリメチルシランでの充填剤のキャッピングにより除去することができる（但し、Ｒ基が後者のシランと反応しない）。
【０３００】
一方法により、非多孔質粒子はポリマーコーティングで被覆される。該粒子の被覆での使用に適するポリマーは、連鎖反応ポリマーおよび段階反応ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリアミド、セルロースのような不溶性多糖、ポリジメチルシロキサン、ポリジアルキルシロキサンおよび関係する素材を包含する。ポリマーコーティングは、表面の完全な遮蔽が達成されるように、多被覆工程によって非多孔質粒子に結合することができる。
【０３０１】
最近数年に、ポリマーで被覆されたもしくはポリマーで被包化された充填剤として知られる新たな結合された相の充填剤が、開放管カラムガスクロマトグラフィーのための固定された固定相を製造するのに使用される技術に基づき導入されている。この場合、該相は、裸のシリカもしくは前シラン化された（ｐｒｅｓｉｌａｎｉｚｅｄ）シリカのいずれかの微粒子をポリ（シロキサン）もしくはポリ（ブタジエン）プレポリマーで機械的に被覆することにより製造され、それがその後、過酸化物、アゾ−ｔｅｒｔ−ブタンもしくはγ放射に誘導される化学的架橋反応により固定される。図５５は、シリカコア９０６およびポリマーコーティング９０８を有する被覆されたビーズ９０４の図解である。（該図は、本発明のビーズの形態学もしくは孔構造を必ずしも反映せず、かつ、具体的説明の目的上のみ意味される。）
代替の一方法は、ビニルを含有するシラン分子と共有結合すること、およびその後粒子の表面上のコーディングを重合することの組み合わせを含んで成る。残余のシラノール基もしくは金属基が存在する場合は、第二のコーティングを適用することができる。
【０３０２】
本方法の一変形物において、シリカ表面を最初にビニルトリクロロシランとの反応により修飾し、次いでアクリル酸誘導体を誘導体化されたシリカ表面にかつその上に重合する。多数の有用な単量体およびプレポリマーの利用可能性が、広範な逆相、極性およびイオン交換充填剤が同一の一般的反応を使用して製造されることを可能にした。また、一般的アプローチは下にある支持体の化学に依存しないため、シリカ以外の素材、例えばアルミナおよび酸化ジルコニウムを修飾しかつ例えばｐＨ範囲２−７．５の外側の移動相を用いるシリカが適しない条件下で使用することができる。シリカに戻れば、前シラン化は活性のシラノール基の数を減少させ、それらはその後表面上に固定されるポリマー性薄膜によりさらに遮蔽される。逆相液体クロマトグラフィーにおいて、これらの充填剤は、塩基性溶質の分離のための単量体の化学的に結合された相に比較して、改良されたクロマトグラフィー特性を示した。ポリマーで被包化された充填剤は、理にかなった物質移動の特徴を維持するための約１ｎｍの薄膜厚を有する。この手順の記述はＥｎｇｅｌｈａｒｔら（Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ、２７：５３５（１９８９））により発表された。
【０３０３】
上の方法のいずれかにより製造されたポリマー被覆されたビーズは、それらの修飾されない状態で使用することができるか、もしくは炭化水素基での置換により修飾することができる。いかなる炭化水素基も適する。本明細書で使用されるところの「炭化水素」という用語は、１から１，０００，０００個までの炭素を有するアルキルおよびアルキル置換アリール基を包含すると定義され、アルキル基は、アルデヒド、ケトン、エステル、エーテル、アルキル基などを包含する多様な型の直鎖、分枝状鎖、環状、飽和、不飽和の非イオン性官能基を包含し、また、アリール基は、フェニル、ナフチルなどを包含する単環、二環および三環の芳香族炭化水素として包含する。炭化水素の置換方法は当該技術分野で慣習的かつ公知であり、そして本発明の一局面でない。炭化水素はまた、ヒドロキシ、シアノ、ニトロ基、もしくは非極性の逆相官能基であると考えられる同様のものも含有することができる。好ましい炭化水素基はアルキル基であり、また、下の適する置換方法の記述は、単純化の目的上かつ制限としてでなく、アルキル化として提示され、慣習的手順によるアリール置換もまた本発明の範囲内に包含されることを意図していることが理解される。
【０３０４】
ポリマー被覆されたビーズは、ヨウ化アルキルのような対応するアルキルハロゲン化物との反応によりアルキル化することができる。アルキル化は、ポリマー被覆されたビーズをフリーデル−クラフツ触媒の存在下にアルキルハロゲン化物と混合して、ポリマーブレンドの表面の芳香環で親電子芳香族置換を遂げることにより達成する。適するフリーデル−クラフツ触媒は当該技術分野で公知であり、そして塩化アルミニウム、三フッ化ホウ素、四塩化スズなどのようなルイス酸を包含する。１から１，０００，０００個まで、および好ましくは１から２２個までの炭素を有する炭化水素基での置換を、これらの方法により遂げることができる。２３から１，０００，０００個までの炭素を有する炭化水素基は、本明細書で炭化水素ポリマーとして参考文献として引用される。
【０３０５】
アルキル化は多数の既知の合成手順により達成することができる。これらは、アルキルハロゲン化物を用いるフリーデル−クラフツアルキル化、エーテルを形成するためのクロロメチル化されたビーズへのアルキルアルコールの結合などを包含する。本発明のポリマー被覆されたビーズの好ましいアルキル化方法は、ポリマーコーティングが非多孔質粒子上で形成された後のアルキル化であるとは言え、アルキル化の代替の一方法は、アルキル化された単量体を重合して非多孔質粒子上にアルキル化されたポリマーのコーティングを形成することである。本態様において、単量体は、例えば分離変数の要件に依存して、いずれかの数の炭素原子、例えば１から１００まで、１ないし５０もしくは１ないし２４個を有するアルキル基で置換することができる。
【０３０６】
ポリマーコーティングに対する一代替として、非多孔質粒子を、アルキル基、もしくはシアノ、エステルおよび他の非イオン性基を包含する他の非極性官能基で官能性化することができ、次いで完全なエンドキャッピング過程でシラノールおよび金属の相互作用を減少させることができる。非多孔質粒子のエンドキャッピングは、例えば、トリメチルクロロシランもしくはジクロロテトライソプロピルジシラザンのようなトリアルキルクロロシランもしくはテトラアルキルジクロロジシラザンと粒子を反応させることにより達成することができる。
【０３０７】
多数の因子が、結合反応の成功および最終的な結合された相の生成物の質に影響する。結合反応の速度および程度は、シランの反応性、溶媒および触媒の選択、時間、温度、ならびに基質に対する試薬の比に依存する。脱離基としてのＣｌ、ＯＨ、ＯＲ、Ｎ（ＣＨ３）２、ＯＣＯＣＦ３およびエノレートをもつ反応性有機シランが広範に使用されている。ジメチルアミン、トリフルオロアセテート、およびペンタン−２，４−ジオンのエノールエーテルが最も反応性の脱離基であるとは言え、経済性、利用可能性および熟知が、とりわけ商業的製造元の間で最も広範に使用されているクロロシランおよびアルコキシシランをもたらす。当初、反応はほぼ化学量論的であることができるが、しかし、表面被覆が最大値に近づく際に、反応は非常に遅くなる。この理由から、反応時間は長くなる傾向にあり（１２〜７２時間）、反応温度は中程度に高くなる傾向があり（大部分の場合で約１００℃）、そして、クロロシランの場合には酸受容体触媒（例えばピリジン）が使用される。アルキルシリルエノレートおよびアルキルシリルジメチルアミンのようないくつかの試薬は、該反応を実施するための付加的な触媒、もしくは溶媒さえ必要としない。使用される最も普遍的な溶媒はトルエンおよびキシレンであるとは言え、四塩化炭素、トリクロロエタンおよびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）のような他の溶媒が優れているとして推奨されてきた。該結合反応は不活性雰囲気中で還流することにより実施するため、溶媒はしばしば有機シランに対する良好な溶媒である、および還流で所望の反応温度に到達するそれらの能力に基づき選択される。３−シアノプロピルシロキサン結合された相を除き、ある種の極性官能基（例えばＯＨなど）に対するクロロシランの高い反応性は、極性の逆相の結合された相の製造のためのこれらの基の使用を予め除外する。酸性もしくは塩基性の官能基を含有するアルコキシシランは自己触媒性であり、そして、結合された相は、通常、不活性溶媒中、表面のシラノール基との縮合反応により形成されるアルコールを蒸留分離するのに十分高温でシランを還流することにより製造する。中性の極性リガンドの結合は、一般に、シリカの単層被覆を生じさせるのに十分な水の存在下に、トルエン−４−スルホン酸もしくはトリエチルアミンのような触媒の添加を必要とする。水の存在は、溶液中で重合するよりはむしろ表面シラノール基と反応する傾向がある吸着された有機シランのアルコキシ基の加水分解を加速する。表面シラノール基が物理的に吸着された有機シランにより封鎖されて、理論的に予測される最大よりも低い結合された相の密度を操作後に生じさせることが、極性の結合された相の製造で一般的な問題であるようである。結合された相の密度は、反応を第二の回反復することにより増大させることができるか、もしくは、露出されたシラノール基はエンドキャッピングにより最小限にすることができる。
【０３０８】
大部分の結合された相は、ケイ素に結合された単一官能性化されたリガンドを含有する有機シランから製造され、残存する基は脱離基および／もしくはメチル基であるとは言え、より高度に置換された有機シランもまた使用することができる。１，３−ジクロロテトライソプロピルジシラザンのような二官能性有機シランは、鎖の両端の表面シラノール基と反応することが可能であり、慣習的有機シランから形成される結合された相よりもより加水分解的に安定である結合された相を形成する。二歯の（ｂｉｄｅｎｔａｔｅ）有機シランは、シリカ表面上のシラノール基の間隔により緊密に合致する反応性部位を有し、そして、双方の脱離基が同一のケイ素原子に結合されて、ジクロロシランで達成されるより大きい結合された相の被覆を提供する。アルキルジメチルシランについては、アルキル基の長さを増大させることは、トリメチルシリル結合されたリガンドのものに関して結合された相の加水分解の安定性を増大させる。メチル基の鎖長を増大させることは、結合された相の加水分解の安定性を増大させるが、しかし、立体効果により相の被覆を低下させる。シランのケイ素原子上に１もしくは２個の嵩高い基、例えばイソプロピルもしくはｔ−ブチルを含有する一官能性有機シランの使用が、低いｐＨでの使用のための結合された相の製造でより重要になる可能性がある。嵩高いアルキル基は、メチル基が提供するよりも、充填剤表面上の加水分解的に感受性のシロキサン基に対するより良好な立体保護を提供する。
【０３０９】
シリカ支持体の被覆およびエンドキャッピングの一般的方法は公知の技術である。しかしながら、これらの素材を使用したことのある者の一般的理解は、それらが高性能の二本鎖ＤＮＡ分離に適しないことである。しかしながら、本発明のビーズは、シリカコアの徹底的な遮蔽を遂げるような被覆およびエンドキャッピング手順のより慎重な適用により形成され、生じるビーズは、一本鎖および二本鎖双方のＤＮＡの迅速な分離を実施する能力を有し、それは例えば米国特許第５，５８５，２３６号明細書に開示されるアルキル化された非多孔質ポリマービーズを使用して達成されるものに等しいかもしくはそれより良好である。
【０３１０】
ビーズの表面が最小限のシラノールもしくは金属酸化物の露出を有すること、および、表面が非多孔質のままであることを確実にするために、ビーズの製造の間は注意が払われなければならない。
【０３１１】
本発明の重要な一局面において、本発明のビーズおよび他の媒体は、ＤＮＡを結合する可能性のある少量の金属汚染物質もしくは他の汚染物質を有することを特徴とする。本発明の好ましいビーズは、いかなる多価陽イオン汚染物質（例えば、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｃｒ（ＩＩＩ）もしくはコロイド状金属汚染物質）も実質的に排除するよう設計された酸洗浄処理のような除染処理を包含する、製造の間の予防措置にさらされていることを特徴とする。生じるビーズが最小限の金属含有量を有することができるために、非常に純粋な金属を含有しない素材のみをビーズの製造で使用すべきである。
【０３１２】
実質的に金属を含まないビーズそれら自身に加え、発明者らは、ＭＩＰＣの間に最適なピーク分離を達成するためには、分離カラム、およびカラム内に保持されるもしくはカラムを通って流れる全部の工程溶液が、好ましくは多価陽イオン汚染物質を実質的に含まないこともまた見出した。共通に所有される米国特許第５，７７２，８８９号；同第５，９９７，７４２号；および同第５，９７２，２２２号明細書、ならびに同時係属中の米国特許出願第０９／０８０，５４７号明細書（１９９８年５月１８日に出願された）に記述されるとおり、これは、分離カラムを多価陽イオン汚染から保護するために、カラム内に保持されるもしくはカラムを通って流れる工程溶液中に多価陽イオンを放出しない素材から作成された工程溶液接触表面を有する構成部品をカラムに進入する溶液に供給しかつそれをフィードすることことにより達成することができる。系の構成部品の工程溶液接触表面は、好ましくは、チタン、被覆ステンレス鋼、不動態化ステンレス鋼および有機ポリマーより成る群から選択される素材である。
【０３１３】
多価陽イオン結合剤、例えばキレート剤をＭＩＰＣ分離で使用する２つの場所が存在する。一態様において、これらの結合剤は、それを移動相が通過する固体に組込むことができる。汚染物質は、分離に害を与える可能性のある系内の場所にそれらが達する前に捕捉される。これらの場合、官能基が固体マトリックスもしくは樹脂（例えば貫流カートリッジ、通常は有機ポリマー、しかしときにシリカもしくは他の素材）に結合される。該マトリックスの容量は、好ましくは約２ｍ等量／ｇである。適するキレート樹脂の一例は、イミノジアセテート官能基を含有する、商標ケレックス［ＣＨＥＬＥＸ］１００（ダウ　ケミカル　カンパニー（Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．））で入手可能である。
【０３１４】
別の態様においては、多価陽イオン結合剤を移動相に添加することができる。結合する官能基が有機化学構造中に組み込まれる。好ましい多価陽イオン結合剤は３つの要件を満たす。第一に、それは移動相中で可溶性である。第二に、金属との錯体が移動相中で可溶性である。ＥＤＴＡのような多価陽イオン結合剤は、キレート剤および多価陽イオン結合剤−金属複合体の双方が、それら双方を水溶性にする電荷を含有するため、この要件を満たす。また、例えばアセトニトリルの場合、いずれの沈殿物も添加されない。水性移動相中での可溶性は、硫酸塩、カルボン酸塩もしくはヒドロキシのような共有結合されたイオン性の官能性を付加することにより高めることができる。好ましい多価陽イオン結合剤は、水、有機溶媒もしくは移動相で洗浄することによりカラムから容易に除去することができる。第三に、結合剤はクロマトグラフィー過程を妨害してはならない。
【０３１５】
多価陽イオン結合剤は配位化合物であることができる。好ましい配位化合物の例は、水溶性キレート剤およびクラウンエーテルを包含する。本発明で使用することができる多価陽イオン結合剤の制限しない例は、アセチルアセトン、アリザリン、アルミノン、クロラニル酸、コウジ酸、モリン、ロジゾン酸、チオナリド、チオ尿素、α−フリルジオキム、ニオキシム、サリチルアルドキシム、ジメチルグリオキシム、α−フリルジオキシム、クペロン、α−ニトロソ−β−ナフトール、ニトロソ−Ｒ−塩、ジフェニルチオカルバゾン、ジフェニルカルバゾン、エリオクロムブラックＴ、ＰＡＮ、ＳＰＡＤＮＳ、グリオキサルビス（２−ヒドロキシアニル）、ムレキシド、α−ベンゾインオキシム、マンデル酸、アントラニル酸、エチレンジアミン、グリシン、トリアミノトリエチルアミン、チオナリド、トリエチレンテトラミン、ＥＤＴＡ、金属フタレイン、アルソン酸、α，α’−ビピリジン、４−ヒドロキシベンゾチアゾール、８−ヒドロキシキナルジン、８−ヒドロキシキノリン、１，１０−フェナントロリン、ピコリン酸、キナルジン酸、α，α’，α’’−ターピリジル、９−メチル−２，３，７−トリヒドロキシ−６−フルオロン、ピロカテコール、サリチル酸、チロン、４−クロロ−１，２−ジメルカプトベンゼン、ジチオール、メルカプトベンゾチアゾール、ルベアン酸、シュウ酸、ジエチルジチオカルバルバメートナトリウムおよびジベンジルジチオカルバメート亜鉛を包含する。これらおよび他の例は、Ｐｅｒｒｉｎにより、Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｏｍｐｌｅｘｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｂｅｈａｖｉｏｒ，ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、ロバート　Ｅ．クリーガー　パブリッシング　カンパニー（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｅ．Ｋｒｉｅｇｅｒ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．）（１９６４）に記述される。本発明において好ましい多価陽イオン結合剤はＥＤＴＡである。
【０３１６】
ポリヌクレオチドの高分離度のクロマトグラフィー分離を達成するために、クロマトグラフィーカラムを固定相のポリマービーズできつく充填することが一般に必要である。十分な高分離度の分離を得るために、カラム充填剤でのカラムのいずれかの既知の充填方法を本発明で使用することができる。典型的には、ポリマービーズの密度に等しいかもしくはそれより小さい密度を有する溶媒を使用して、ポリマービーズのスラリーを調製する。その後、カラムをポリマービーズのスラリーで満たし、そして振動もしくは攪拌してカラム中でのポリマービーズの充填密度を向上させる。充填密度を向上させるのに、機械的振動もしくは超音波処理を典型的に使用する。
【０３１７】
例えば、５０×直径４．６ｍｍのカラムを充填するために、２．０グラムのビーズを、超音波処理の助けを借りて１０ｍＬのメタノールに懸濁することができる。その後、該懸濁物を、８，０００ｐｓｉの圧で５０ｍＬのメタノールを使用してカラムに充填する。これは充填された床の密度を向上させる。
【０３１８】
本発明の分離方法は、一般に、ＤＮＡおよびＲＮＡの一本鎖および二本鎖のポリヌクレオチドのクロマトグラフィー分離に応用可能である。ポリヌクレオチドの混合物を含有するサンプルは、ポリヌクレオチドの全合成、制限エンドヌクレレアーゼまたは他の酵素もしくは化学物質でのＤＮＡもしくはＲＮＡの切断、ならびにポリメラーゼ連鎖反応技術を使用して増殖および増幅された核酸サンプルから生じさせることができる。
【０３１９】
本発明の方法は、約１５００ないし２０００塩基対までを有する二本鎖ポリヌクレオチドを分離するのに使用することができる。多くの場合、該方法は、６００塩基もしくは塩基対までを有する、または５ないし８０塩基もしくは塩基対までを有するポリヌクレオチドを分離するのに使用する。
【０３２０】
好ましい一態様において、該分離はマッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（ＭＩＰＣ）による。本発明の非多孔質ビーズは、ＤＮＡ分離を遂げるための対イオン剤および溶媒の勾配とともに機能することができる逆相素材として使用する。ＭＩＰＣにおいて、ポリヌクレオチドが対イオンと対にされ、そしてその後、本発明の非多孔質ビーズを使用する逆相クロマトグラフィーにかけられる。
【０３２１】
ＭＩＰＣでの使用に適するいくつかの型の対イオンが存在する。これらは、プロトン供与されて正の対電荷（ｃｏｕｎｔｅｒ　ｃｈａｒｇｅ）を形成することができるモノ、ジもしくはトリアルキルアミン、または既に正の対電荷を含有する四級のアルキル置換アミンを包含する。アルキル置換は、均一（例えば、酢酸トリエチルアンモニウムもしくは酢酸テトラプロピルアンモニウム）または混合（例えば、酢酸プロピルジエチルアンモニウム）であってよい。アルキル基の大きさは、とりわけ１個の置換アルキル基のみが大きくかつ他者が小さい場合は、小さくても（メチル）もしくは大きくても（３０個までの炭素）よい。例えば、酢酸オクチルジメチルアンモニウムが適する対イオン剤である。好ましい対イオン剤は、エチル、プロピルもしくはブチルの大きさ範囲からのアルキル基を含有するものである。
【０３２２】
アルキル基の目的は、ポリ核酸が分離媒体の非極性表面と相互作用することができるようにマッチトイオン過程によりポリ核酸に非極性の特徴を与えることである。対イオン−ＤＮＡ対の非極性の程度に対する要件は、分離媒体の極性、分離に必要とされる溶媒条件、粒子径、および分離されているフラグメントの型に依存する。例えば、分離媒体の極性が増大される場合には、表面の極性に合致させかつ対イオン−ＤＮＡ対の相互作用を増大させるように対イオン剤の極性を変えなくてはならないかもしれない。酢酸トリエチルアンモニウムが好ましいとは言え、余分の非極性の特徴が必要とされるかもしくは望ましい場合は、テトラプロピルもしくはテトラブチルアンモニウム塩のような四級アンモニウム試薬を使用することができる。一般に、アルキル基の極性が増大される際に、大きさ特異的な分離、配列に依存しない分離がより可能になる。四級の対イオン試薬は揮発性でなく、フラグメントの収集をより困難にする。
【０３２３】
いくつかの場合には、分離を実施するのに使用される有機溶媒の濃度の範囲を増大させることが望ましいかもしれない。例えば、対イオン剤上のアルキルの長さを増大させることは、対イオン−ＤＮＡ対の非極性を増大させることができ、移動相有機溶媒の濃度を増大させるか、もしくは有機溶媒の型の強さを増大させる（例えば、アセトニトリルはポリ核酸を溶出するためにメタノールより約２倍より効果的である）かのいずれかの必要性をもたらす。カラムからフラグメントを溶出させるのに必要とされる有機溶媒の濃度と、フラグメントの長さとの間に、正の相関が存在する。しかしながら、高有機溶媒濃度ではポリヌクレオチドが沈殿する可能性がある。沈殿を回避するために、強い有機溶媒もしくはより小さい対イオンアルキル基を使用することができる。対イオン試薬のアルキル基はまた、ハロゲン化物、ニトロ基などで極性を和らげるように置換することもできる。
【０３２４】
移動相は、好ましくは対イオン剤を含有する。典型的な対イオン剤は、低級アルキル一級、二級および低級の三級アミンのような有機もしくは無機酸のトリアルキルアンモニウム塩、低級トリアルキアンモニウム塩、ならびに低級四級アルキアルモニウム塩を包含する。低級アルキルは、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、イソアミル、ｎ−ペンチルおよびイソペンチルにより例示されるような１ないし６個の炭素原子のアルキル基を指す。対イオン剤の例は、酢酸オクチルアンモニウム、酢酸オクタジメチルアンモニウム、酢酸デシルアンモニウム、酢酸オクタデシルアンモニウム、酢酸ピリジニウムアンモニウム、酢酸シクロヘキシルアンモニウム、酢酸ジエチルアンモニウム、酢酸プロピルエチルアンモニウム、酢酸プロピルジエチルアンモニウム、酢酸ブチルエチルアンモニウム、酢酸メチルヘキシルアンモニウム、酢酸テトラメチルアンモニウム、酢酸テトラエチルアンモニウム、酢酸テトラプロピルアンモニウム、酢酸テトラブチルアンモニウム、酢酸ジメチルジエチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウム、酢酸トリプロピルアンモニウム、酢酸トリブチルアンモニウム、酢酸テトラプロピルアンモニウムおよび酢酸テトラブチルアンモニウムを包含する。上の例中の陰イオンは酢酸であるとは言え、炭酸、リン酸、硫酸、硝酸、プロピオン酸、ギ酸、塩化物および臭化物を包含する他の陰イオン、もしくは陽イオンおよび陰イオンのいかなる組み合わせもまた使用してよい。これらおよび他の作用物質は、ＧｊｅｒｄｅらによりＩｏｎ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、第２版、ドクター　アルフレッド　ヒューティッヒ　フェアラーク　ハイデルベルク（Ｄｒ．Ａｌｆｒｅｄ　Ｈｕｔｈｉｇ　Ｖｅｒｌａｇ　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）（１９８７）に記述される。揮発性である対イオン剤が本発明の方法での使用に好ましく、酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）およびトリエチルアンモニウムヘキサフルオロイソプロピルアルコールが最も好ましい。
【０３２５】
ＭＩＰＣは、ホモ二重鎖からヘテロ二重鎖を分離することにより二本鎖ＤＮＡ中の突然変異の検出に成功裏に適用されてきた。こうした分離は、完全に相補的なホモ二重鎖ＤＮＡフラグメントに比較して、塩基対不適正の部位でヘテロ二重鎖を変性させるのに必要とされるより低い温度に依存する。ＭＩＰＣは、ヘテロ二重鎖を部分的に変性させるのに十分である温度で実施される場合に、本明細書で変性マッチトイオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー（ＤＭＩＰＣ）と称される。ＤＭＩＰＣは、典型的には５２℃と７０℃との間の温度で実施する。ＤＭＩＰＣを実施するための最適温度は５４℃ないし５９℃である。
実施例１
ＭＩＰＣを使用する突然変異の検出のための普遍的勾配
以下の普遍的勾配は、分析の速度について最適化されておらず、そして、ＭＩＰＣに敏感に反応する大きさ範囲内のいかなるサンプルの突然変異の検出にも使用することができる：
【０３２６】
【表２】
2004506873.tif 000020
【０３２７】
移動相溶液は、Ａ＝０．１Ｍ　ＴＥＡＡ、ｐＨ７、Ｂ＝０．１Ｍ　ＴＥＡＡおよび２５％アセトニトリルを生じるように、濃酢酸トリエチルアンモニウム（１００ｍＬ　トランスゲノミック（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）部品番号５５３３０１）から調製する。分離は、以下の条件、すなわち、カラム：アルキル化ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズ（ＤＮＡＳＥＰ（商標）、トランスゲノミック　インク（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．））を含有する５０×直径４．６ｍｍ；流速は０．９ｍＬ／分でありかつ２６０ｎｍでのＵＶによる検出下で、ＷＡＶＥ（商標）ＤＮＡフラグメント分析系（トランスゲノミック　インク（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｉｃ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サンノゼ）を使用して得られる。
実施例２
移動相対ヌクレオチド塩基対長さの参照グラフの準備
８０、１０２、１７４、２５７、２６７、２９８、４３４、４５８および５８７の塩基対長さを有するＤＮＡフラグメントを含有する、標準のｐＵＣ１８　ＨａｅＩＩＩ制限酵素消化物（トランスゲノミック　インク（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サンノゼから入手可能な部品番号４４０５８２）を、非変性温度（５０℃）でＭＩＰＣカラムに適用した。カラムは普遍的勾配を使用して溶出した。分離（示されない）は、以下の条件、すなわち、カラム：アルキル化ポリ（スチレン−ジビニルベンゼン）ビーズ（ＤＮＡＳＥＰ（商標）、トランスゲノミック　インク（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，Ｉｎｃ．））を含有する５０×直径４．６ｍｍ下で、ＷＡＶＥ（商標）ＤＮＡフラグメント分析系（トランスゲノミック　インク（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｉｃ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サンノゼ）を使用して得；ＵＶ検出は２６０ｎｍで実施した。各フラグメントのｂｐ長さおよび保持時間（Ｒｔ）をコンピュータインターフェース（示されない）で入力した。好ましいインターフェースは、Ｒｔ対ｂｐおよび／もしくは％Ｂ対ｂｐのグラフィック表示を包含するカラム較正ウインドウである。図３３に示される参照曲線５９０を、本発明のソフトウェア内の統計学的曲線あてはめルーチンを使用して、観察されたデータを等式（ｉ）にあてはめることにより得た。
実施例３
死時間の決定
実施例２に記述されたところのカラムおよび装置を使用して、示されるような勾配方形波であったメソッドを入力した：
【０３２８】
【表３】
2004506873.tif 000021
【０３２９】
次に、本勾配を使用して０μＬの注入を実施した。スペクトルのバックグラウンドの上昇が約４．８分に観察された（示されない）。死時間は、この観察された上昇時間から２を差し引くことにより得た。死時間についての約２．８分という値が、ディジタルメモリに保存された。
実施例４
温度依存性のＤＭＩＰＣ分離過程の記述
本実施例は図４５を指す（５１°ないし６１℃の温度範囲にわたるヘテロ二重鎖の分離）。
【０３３０】
位置１６８にＡからＧの突然変異をもつヒトＹ染色体の遺伝子座ＤＹＳ２７１からの２０９塩基対のフラグメントを含有する突然変異標準（トランスゲノミック（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ）からの部品番号４４０５８２、およびＳｅｉｅｌｓｔａｄら、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：２１５９（１９９４）により記述されるような）を、製造供給元により推奨されるとおりハイブリダイズし、そしてサンプルを５１℃でＭＩＰＣカラム（５０ｍｍ×直径４．６ｍｍ）に注入した。カラムは、７分にわたる０．１Ｍ　ＴＥＡＡ中アセトニトリルの勾配を用いて０．９ｍＬ／分で溶出した。クロマトグラフィーは、ＵＶ検出器を使用して２６０ｎｍをモニターした。混合物中に存在するヘテロ二重鎖は５１℃で変性されず；従って単一ピークが観察された。
【０３３１】
図４５にみられるとおり、該サンプルの注入およびクロマトグラフィーを、温度の１℃の増大する増加で反復した。ヘテロ二重鎖の潜在的存在を示すショルダーが、５３℃で主ピークの小さい保持時間側に観察された。５４℃で３本のピークがみられた。そして、５５°−５８°で４本のピークがみられ、突然変異の決定的な存在を示した。２本のより小さい保持時間のピークは２種のヘテロ二重鎖であり、また、より大きい保持時間のピークはホモ二重鎖であった。
【０３３２】
本発明は自動化された系および方法を提供し、これらは使用するのが簡単であり、そしてＭＩＰＣによるＤＮＡフラグメントの分離における最適な移動相濃度および温度を決定するための経験的方法の使用を最小限にする。
【０３３３】
前述は本発明の特定の態様を提示した一方、これらの態様は例としてのみ提示されたことが理解されるべきである。他者は、前述と異なるとは言え本明細書に記述かつ特許請求されるところの本発明の技術思想および範囲から離れない変形物を認めかつ実施することができることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
発明にかかる、溶出溶媒の勾配を確立するための弁および弁制御を使用する単一カラムのＭＩＰＣ系の図解である。
【図２】
発明にかかる、溶出溶媒の勾配を確立するためのポンプ系の部分図である。
【図３】
発明にかかる、ＭＩＰＣ系で使用されるオートサンプラーサブシステムの図解である。
【図４】
発明にかかる、ＭＩＰＣ系で使用される注入弁の図解である。
【図５】
発明にかかる、充填されたループの負荷位置の注入弁の図解である。
【図６】
発明にかかる、充填されたループの注入位置の注入弁の図解である。
【図７】
発明にかかる、部分的ループ負荷位置の注入弁の図解である。
【図８】
発明にかかる、部分的ループ注入位置の注入弁の図解である。
【図９】
発明にかかる、本発明の改良されたＨＰＬＣ　ＤＮＡ分析装置カラムオーブンの分離区画の前面図である。
【図１０】
発明にかかる、図９に示されるＨＰＬＣ　ＤＮＡ分析装置カラムオーブンの平面図である。
【図１１】
発明にかかる、本発明の小型のカラムヒーターの態様の端部図である。
【図１２】
発明にかかる、図１１の線Ａ―Ａに沿って採られた断面図である。
【図１３】
発明にかかる、本発明のペルティエ型のヒーター／冷却器の態様の図解である。
【図１４】
発明にかかる、フラグメントコレクタの透視図である。
【図１５】
発明にかかる、本発明のフラグメントコレクタの前面図である。
【図１６】
発明にかかる、図１５に示されるフラグメントコレクタの端部図である。
【図１７】
発明にかかる、フラグメント分注器のＸ軸の動きについてのウォーム歯車装置駆動アセンブリの詳細を示すために前面パネルが除去された、図１５のフラグメントコレクタの部分的前面図である。
【図１８】
発明にかかる、フラグメント分注器のＹ軸の動きについての該駆動アセンブリのモーターおよびウォーム歯車装置アセンブリの部分図である。
【図１９】
発明にかかる、フラグメント分注器のＹ軸の動きについての該駆動アセンブリの端部図である。
【図２０】
発明にかかる、標準的な９６穴マルチウェルプレートの平面図である。
【図２１】
発明にかかる、本発明の空気一吹き分注器の一態様の図解である。
【図２２】
発明にかかる、図２１の空気一吹き分注器の態様の拡大断面図である。
【図２３】
発明にかかる、分注器先端および図２２のマルチウェルプレートの提示のウェルの拡大断面部分図である。
【図２４】
発明にかかる、出口ライン中の流量制限を伴う、本発明の分注器先端の代替の一態様の断面図である。
【図２５】
発明にかかる、検出器、中央制御部および空気一吹き液滴大きさ制御系の組み合わせの図解である。
【図２６】
発明にかかる、検出器、中央制御部および流れ制限制御系の組み合わせの図解である。
【図２７】
発明にかかる、時間間隔、閾値および傾きに基づく画分収集の基準を具体的に説明するクロマトグラムの表示である。
【図２８】
発明にかかる、その各構成部品を伴う制御モジュールと一緒の図１のＭＩＰＣ系の図解である。
【図２９】
発明にかかる、ＭＩＰＣ系のコンピュータ化された制御プロセスおよび該プロセスの各部分に関連するモジュールの一態様の図解である。
【図３０】
発明にかかる、ＭＩＰＣ過程における核酸フラグメントの基礎的分離の間の溶媒濃度のグラフ表示である。
【図３１】
発明にかかる、本発明の分離方法の一態様を具体的に説明する流れ図である。
【図３２】
発明にかかる、ＭＩＰＣ系のコンピュータ化された制御プロセスおよび該プロセスの各部分に関連するモジュールの別の態様の図解である。
【図３３】
発明にかかる、既知の塩基対長さのＤＮＡフラグメントを含有する標準混合物についての溶液Ｂのパーセント対塩基対長さを示す参照図である。
【図３４】
発明にかかる、移動相の勾配プロフィルを見るためのグラフィカル・ユーザー・インターフェースの一態様を具体的に説明する。
【図３５】
発明にかかる、ｐＢＲ３２２　ＨａｅＩＩＩ消化物からのＤＮＡフラグメントについてのＲｔ対％Ｂのプロットを示す。
【図３６】
発明にかかる、ｐＢＲ３２２　ＨａｅＩＩＩ消化物からのＤＮＡフラグメントについてのＰ対％Ｂのプロットを示す。
【図３７】
発明にかかる、Ｐ対％Ｂの計算されたプロットを示す。
【図３８】
発明にかかる、サンプルテーブルを含んで成るグラフィカル・ユーザー・インターフェースの一態様を具体的に説明する。
【図３９】
発明にかかる、ＭＩＰＣによりある範囲の塩基対長さを有するＤＮＡフラグメントを分離するために使用されるべき移動相の勾配を計算するためのソフトウェアの一態様のオペレーションを示す流れ図である。
【図４０】
発明にかかる、ＭＩＰＣによりある範囲の塩基対長さを有するＤＮＡフラグメントを分離するために使用されるべき移動相の勾配を計算するためのソフトウェアの別の態様のオペレーションを示す流れ図である。
【図４１】
発明にかかる、ＤＭＩＰＣによる既知の塩基対長さを有するＤＮＡヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖フラグメントを分離するのに使用されるべき移動相の勾配を計算するためのソフトウェアの一態様のオペレーションを示す流れ図である。
【図４２】
発明にかかる、ＤＭＩＰＣによる既知の塩基対長さを有するＤＮＡヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖フラグメントを分離するのに使用されるべき移動相の勾配を計算するためのソフトウェアの一態様のオペレーションを示す流れ図である。
【図４３】
発明にかかる、ＤＭＩＰＣによる既知の塩基対長さを有するＤＮＡヘテロ二重鎖およびホモ二重鎖フラグメントを分離するのに使用されるべき移動相のイソクラチック勾配を計算するためのソフトウェアの一態様のオペレーションを示す流れ図である。
【図４４】
発明にかかる、ホモ二重鎖およびヘテロ二重鎖を形成するためのハイブリダイゼーションの図解を示す。
【図４５】
発明にかかる、ホモおよびヘテロ二重鎖の温度依存性の分離を具体的に説明する。
【図４６】
発明にかかる、図４５からのホモおよびヘテロ二重鎖のピークの温度での保持時間の変化を示す。
【図４７】
発明にかかる、計算された融解温度対経験的に決定される融解温度のグラフである。
【図４８】
発明にかかる、計算された融解温度対予測される融解温度のグラフである。
【図４９】
発明にかかる、突然変異の検出での使用のためのソフトウェアのインターフェース画面の一態様である。
【図５０】
発明にかかる、突然変異の検出での使用のためのソフトウェアのインターフェース画面の第二の態様である。
【図５１】
発明にかかる、図５０のインターフェース画面からのフィールドの一例である。
【図５２】
発明にかかる、突然変異の検出での使用のためのソフトウェアのインターフェース画面の第三の態様である。
【図５３】
発明にかかる、ＤＮＡ分離係数の決定の図解である。
【図５４】
発明にかかる、シリカコアおよびエンドキャッピング遮蔽物を伴う逆相ビーズの代表の断面図である。
【図５５】
発明にかかる、シリカコアおよびポリマー遮蔽物を伴う逆相ビーズの代表の断面図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【国際公開パンフレット】
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2004506873.tif 000223
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004506873.tif 000225
2004506873.tif 000226
2004506873.tif 000227
2004506873.tif 000228
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