(57)【要約】本発明は、(a) 細胞試料中の白血球を計数して、試料の白血球集団を得て；(b) 試料中の白血球集団中の細胞型の細胞の比率又はパーセントを測定して；そして(c) 試料中の細胞型の細胞数を算出することにより、細胞試料中の細胞型の細胞数を測定する方法を提供する。細胞型は、CD4+リンパ球、CD45細胞、CD19細胞、CD16及びCD56陽性細胞、CD8細胞、CD3細胞又はこれらの任意の組合せよりなる群から選択されるリンパ球サブセットでもよい。本方法は、CD4+リンパ球又はCD4+ Ｔ細胞が追跡または計数される状態又は疾患又は症状を追跡するのに特に有用である。
2004533855.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞試料中のある細胞型の細胞の数を計測する方法であって：
細胞試料中の白血球集団を計数して、当該試料の白血球集団を得る工程；
上記試料中の白血球集団中の当該細胞型の細胞の比率又はパーセントを測定する工程；及び
上記試料中の当該細胞型の細胞の数を算出する工程、
を含む前記方法。
【請求項２】
前記試料中の細胞型の細胞数は、前記細胞型の細胞の比率又はパーセントを、前記試料中の白血球集団に関連付けることにより算出され、こうして試料中の細胞型の細胞の集団が確立される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料中の細胞型の細胞の数は、前記試料中の白血球集団に、係数、すなわち、白血球集団の細胞型の比率が割合で表される時の白血球集団中の細胞型の細胞の比率を掛けることにより算出される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞型の細胞は、ヘマトロジー・アナライザーとフロー・サイトメーターの１つ又は両方を使用して算出される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記白血球は、サイズ区別法、インピーダンス測定法、又は精密容量計測法により計数される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞型はリンパ球サブセットである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記リンパ球サブセットは、CD4+リンパ球、CD45細胞、CD19細胞、CD16及びCD56陽性細胞、CD8細胞、CD3細胞、又はこれらの任意の組合せよりなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記リンパ球サブセットは、CD4+リンパ球である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記CD4+リンパ球は、CD4+ Ｔ細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
１つ以上の下記工程：
高密度CD45++bright細胞と低側方散乱細胞（その成分はCD4陽性リンパ球である）の比率またはパーセントを、試料中の白血球集団に関連付けて、こうして試料中のリンパ球集団を確立することにより、試料中のリンパ球数を算出する工程；
中密度CD45++細胞と中側方散乱細胞およびdim中密度CD4細胞の比率またはパーセントを、試料中の白血球集団に関連付けて、こうして試料中の単球集団を確立することにより、試料中の単球数を算出する工程；および
dim低密度CD45++細胞とCD4陰性細胞および高側方散乱細胞の比率またはパーセントを、試料中の白血球集団に関連付けて、こうして試料中の顆粒球集団を確立することにより、試料中の顆粒球数を算出する工程；
を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
細胞型の細胞の数を測定する時、CD45とCD4抗体は、少なくとも絶対リンパ球数、絶対単球数及び絶対顆粒球数を特定するのに使用される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
絶対好酸球数は、中密度CD45+細胞、CD4陰性細胞及び超高側方散乱細胞の比率又はパーセントを、試料中の白血球集団に関連付けて、こうして試料中の好酸球集団を確立することによっても特定される、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
絶対好塩基球数は、低密度dim CD45+細胞、CD4陰性細胞及び低側方散乱細胞の比率又はパーセントを、試料中の白血球集団に関連付けて、こうして試料中の好塩基球集団を確立することによっても特定される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
HIVに感染した患者又は他の免疫不全状態若しくは疾患若しくは症状の免疫状態を追跡する方法に使用される、請求項１〜１３のいずれか１項の方法であって、CD4+リンパ球又はCD4+ Ｔ細胞が追跡又は計数される方法。
【請求項１５】
前記試料は、全非溶解血液、非分画、分画、若しくは溶解全血である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料は、全非溶解骨髄、非分画、分画、若しくは溶解全骨髄である、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法に従って、試料中の細胞型の細胞数を測定するために使用されるキットであって、本方法で使用するための抗体、及び本方法を実施するための説明書を含むキット。
【請求項１８】
前記抗体はCD4および／またはCD45抗体である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の細胞計数法を少なくとも部分的に実施するための、機械で読むことができる説明書を含む、請求項１７又は８に記載のキット。
【請求項２０】
機械により実行された時に、請求項１〜１６のいずれか１項の方法を機械に実施させる命令を含む機械で読むことができる媒体。
【請求項２１】
フローサイトメーター及び／又はヘマトロジーアナライザーとともに使用されるように作成された、請求項２０に記載の機械で読むことができるプログラム。
【請求項２２】
フローサイトメトリーデータの解析のための命令を含む、請求項２０又は２１に記載の機械で読むことができる媒体。
【請求項２３】
HIV又は他の免疫不全症状若しくは疾患の患者の免疫状態を追跡する方法であって、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法により、患者の細胞試料中のCD4+リンパ球またはCD4+ Ｔ細胞の数を測定する工程を含む方法。
【請求項２４】
抗レトロウイルス療法に対する患者の応答を測定するために、患者の免疫状態が追跡又は測定される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
実質的に本明細書のいずれかの例を参照して記載された、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
実質的に本明細書のいずれかの例を参照して記載された、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本発明は、細胞試料、例えば骨髄細胞試料、体液試料、個別の組織試料、組織の細針吸引試料、または特に血液試料中の、細胞数の測定に関する。さらに詳しくは本発明は、特に限定されないが、血液試料中のCD4+リンパ球の計数に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、細胞数計測を行うために利用可能ないくつかの方法がある。最も一般的な方法は、フローサイトメトリーの細胞検査である。非フローサイトメトリー法も利用可能であるが、これらの方法はあまり使用されていない。
【０００３】
フローサイトメトリーCD4+ T細胞検査
フローサイトメトリーCD4+ 検査の方法は、CD4+ T細胞数の測定のために世界中で使用されている。最初の方法は、２つの機械を使用し、２重または２プラットフォーム法（dual or double platform method）（DP）と呼ばれる（1）。この方法は、CD3、CD4、CD8、CD19、CD16、CD56およびCD45を含む抗体の特異的パネルを使用する。種々の蛍光色素組合せを使用して、抗体の２つ、３つ、または４つの色の組合せを形成して、種々のパネルを構成することができる。再現性（例えば、CD3）を確保するために、典型的には少なくとも１つの測定の二重検査が行われる。ある場合には、「リンパ球」ゲートからCD14陽性の単球を排除し、検査するリンパ球集団の純度を確保するために、パネルでCD14発現を使用することも推奨される。
【０００４】
２重プラットフォーム法は、絶対リンパ球数（ALC）［２つの独立に測定したパラメータ（すなわち白血球数と総白血球数のリンパ球％）の掛け算により得られる、］を得るために、ヘマトロジーアナライザー（haematology analyser）を利用する。フローサイトメーターは、リンパ球の対応するCD4パーセント（CD4％）を得るために使用される。
【０００５】
Ｔ細胞と単球の表面で発現されるCD4抗原は、特異的Ｔリンパ球のMHCクラスII制限応答において重要な役割を果たす。これはまた、ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）の主要な受容体となる。
【０００６】
CD45は、すべての造血細胞上で発現される膜貫通タンパク質であるチロシンホスファターゼ（白血球共通抗原と呼ばれる）である。リンパ球上では発現は高密度であるが、他の白血球（例えば、顆粒球および単球）上では発現は低い。CD45は造血系統全体に見いだされるため、血液、骨髄およびリンパ系以外に、CD45は、そのような細胞が組織（例えば、脾臓、胸腺、および骨髄）の重要な部分を構成するすべての場所で見いだされる。
【０００７】
リンパ球は、フローサイトメトリーで２重光散乱パラメータにより、または（現在、新しいガイドラインで唯一の推奨されている方法）側方散乱性を有する２重bright CD45発現の使用により画定される。リンパ球集団は、総リンパ球のCD4 Ｔ細胞を計算するために、ヘマトロジー装置とフローサイトメトリー装置の共通分母または参照点として使用される。
【０００８】
絶対CD4数は、フローサイトメトリーにより画定される総リンパ球集団のCD4％（これは、CD3+/CD4+ Ｔ細胞としても画定される）にALCを掛けることにより算出され、これは次に、１μl当たりの細胞数、または細胞数×106/l、または細胞数×109/lとして表される。
【０００９】
しかし、広く使用されている２重プラットフォーム法について、15〜44％の実験室間の変動が記載されている（最近の英国 NEQAS Immunology shipmentでは60％を超えるリターンが報告されている）。理論的にすべての実験室が同様にリンパ球を測定するように、英国NEQAS、CDC、NCCLSなどは、「リンホサム（Lymphosum）」の使用について非常に具体的なガイドラインを考案した(1) 。「リンホサム（Lymphosum）」自体は、フローサイトメトリーにより、Ｔ細胞（CD3+）、すべてのＢ細胞（CD19+）、およびすべてナチュラルキラー細胞（CD16+/56+）を含む総リンパ球集団を特定して、個々の成分の合計がリンパ球のほぼ100％に等しくなるようにする方法である。
【００１０】
bright CD45陽性細胞（リンパ球）の特定を含む種々のゲート設定方策が、リンパ球集団の純度を確保するために(2)、および測定法の質を改良するために推奨されているが、これは、多くの国ではあまり広く使用されていない。省略パネル（CD3/CD4とCD8のみを含む）の使用は、あまり国際ガイドラインに基づいていない。これは主に、コスト削減のためであり、特に６〜24時間より古い試料の品質管理が限定されており、細胞の分解により細胞の画定が不明確になり、従ってリンパ球の正確な同定と以後のゲート設定で問題が起きる。従って、CD3、CD4およびCD8のみの省略パネルには、リンパ球ゲートの純度または完全性を評価するための手段が無いため、CD4 陽性Ｔ細胞のパーセントを求めるために単一のチューブでCD3、CD4およびCD8抗体を使用することは奨められない。
【００１１】
ヘマトロジーアナライザーの観点から、白血球計数と特に自動化百分率測定は理想的には静脈切開の６時間以内、好ましくは24時間以内に実施すべきである。現在、血液採取の36時間より後に、白血球計数および白血球百分率測定を容易に測定するヘマトロジーアナライザーは製造されていない。
【００１２】
さらに、異なるヘマトロジーアナライザーは、リンパ球の特定に異なる方法を使用し、６時間未満の新鮮な試料であっても、アナライザーの規格に従うALC報告では変動を示す。フローサイトメトリーによるリンパ球特定のガイドラインは比較的明確であるが、リンパ球についてCD45の非常に具体的な差があることがわかっているにもかかわらず、ヘマトロジーアナライザーについてリンパ球または他の型の白血球を特定するために推奨されるかまたは普遍的な方法は存在しない。従って、ALC白血球百分率測定は、実験室間で品質管理も標準化もされておらず、従って信頼できず、実験室間で直接比較ができない。CD4数は、２重プラットフォーム系でALCから計算されるため、ALCの不正確さはCD4数の不正確さとなる。すなわち２重プラットフォーム法の各別個の系の各独立した工程の誤差は、以後の各計算の工程で大きくなる。
【００１３】
CD4結果報告の比較的大きな実験室間の変動にもかかわらず、２重プラットフォームフローサイトメトリー系は、CD4検査の最も広く使用されている好適な系である。２重プラットフォーム法の大きな問題の１つは、２つのプラットフォームの間の共通分母または参照点としてのリンパ球の特定である。絶対リンパ球数（ALC）は、実験室間で非常に変動の大きいパラメータである。現在、白血球（WBC）数は、内部的には装置自体について、そして外部的には種々の品質評価計画により充分品質管理されているが、種々のヘマトロジーアナライザーについてのWBC百分率測定法と技術は、品質管理も標準化もされていない。ALCは現在、２重プラットフォーム系CD4数測定の共通分母および中心として使用されているため、記録されたALC報告の変動は、CD4+ Ｔ細胞結果の報告まで持ち越される。
【００１４】
単一プラットフォーム検査（Single platform testing）
CD4+ Ｔ細胞を測定するための単一プラットフォーム法（SP）は、フローサイトメトリーのみを使用し、CD4+ Ｔ細胞の細胞数測定と特定の両方を同じ装置（フローサイトメーター）で行う。実験室の結果の再現性を改良するために、実験室間変動が10〜18％で報告されることが推奨される。
【００１５】
単一プラットフォームCD4検査を行うのにいくつかの選択肢がある。１つの選択肢は、容量精密計測機能（volumetric precision counting facility）を有するフローサイトメーター、例えばオーソサイトロンアブソルート（Ortho CytronAbsolute）（オーソダイアグノスティックシステムズ（Ortho Diagnostic Systems）、米国）であるが、この装置はもう製造されていない。第２の選択肢は、細胞自体を計測する参照標準物質としてビーズを使用する。ビーズは、既知濃度で試料に加えられ、製造中または試料調製中に、特定の容量で、類似量の血液に加えられ、目的の細胞とともにフローサイトメーターで計測される。ビーズに基づく計測は、実験室間の変動が小さいが、より技術集約的であり、正確で精度の高いピペット操作に大きく依存し、また作業者の技術に依存する。ピペット操作の誤差と計測の正確性を確保するために、二重検査も推奨される。これは、ビーズに基づく検査のコストをさらに上昇させる。
【００１６】
CD4 計数専用の簡便なより小さい単一プラットフォームフローサイトメーター（FACSCount、BDS、サンホセ、カリホルニア州、米国）もまた広く使用されている。これらの装置は、フローサイトメーターよりかなり安価であるが、これらの装置の試薬コストは普通のフローサイトメトリーより高く、従って多くの実験室でのその使用が制限されている。
【００１７】
単一プラットフォーム系と２重プラットフォーム系の両方のさらなる問題は、「リンホサム（Lymphosum）」検査のコストが高いことである。残念ながら、明らかに安価な「CD4のみ」の代替物は、個々の試料の検査の正確性と精度を確保するための充分な組み込まれた品質管理は無い。
【００１８】
CD4+ Ｔ細胞測定のための代替法
CD4+ Ｔ細胞計測のために、いくつかの代替非フローサイトメトリー法が利用できる。これらには、ダイナビーズ（Dynabead）（登録商標）アッセイ、コールターサイトスフィアズアッセイ（Coulter Cytospheres Assay）TRAxアッセイ、およびマイクロボリューム蛍光測定（Microvolume Fluorimetry）がある。絶対リンパ球数（ALC）はまた、CD4 計数に対する代替法として使用され、ここで、1000細胞/μl未満のALCは、200/μlまたはそれ以下のCD4+ Ｔ細胞数の代替として使用される。しかしこれらのパラメータの相関は小さいことが証明されており、ALC代替値は個々の患者の管理のための有意な情報を与えないと言われている。
【００１９】
すなわち現在の２重CD4検査法は、非現実的および／または高価であり、充分に正確な結果を提供しない。従って、簡単に実施でき、既存の技術を受け入れ、かつ現在使用されている方法より正確な方法を提供する必要がある。
【発明の開示】
【００２０】
発明の要約
本発明の第１の実施態様において、細胞試料中のある細胞型の細胞の数を計測する方法であって：
細胞試料中の白血球集団を計数して、試料の白血球集団を得る工程；
試料中の白血球集団中のその細胞型の細胞の比率またはパーセントを測定する工程；および
試料中のその細胞型の細胞の数を算出する工程、
を含んでなる方法が提供される。
【００２１】
試料中の細胞型の細胞数は、細胞型の細胞の比率またはパーセントを、試料中の白血球集団に関連付けることにより算出される。
細胞型は、リンパ球サブセット、特にCD4+リンパ球、CD45細胞、CD19細胞、CD16およびCD56陽性細胞、CD8細胞、CD3細胞、またはこれらの任意の組合せよりなる群から選択されるリンパ球サブセットでもよい。さらに詳しくはリンパ球サブセットは、CD4+リンパ球でもよい。CD4+リンパ球はCD4+ Ｔ細胞でもよい。
【００２２】
試料は、全非溶解血液、非分画、分画、もしくは溶解全血でもよい。あるいは試料は、全非溶解骨髄、非分画、分画、もしくは溶解全骨髄でもよい。
試料中の白血球（CD45陽性リンパ球）を計数することは、当然、試料中の白血球の特定を含み、そのような計数（および特定）には、適当なヘマトロジーアナライザーまたはフローサイトメーターを使用して、任意の適当な公知の従来のまたは確立された方法が使用される。例えば、核の核酸（DNA）染色の特定は、試料中の白血球集団の計数（すなわち、白血球計数）方法として使用される。試料中の白血球集団は、フローサイトメーターにより免疫表現型でCD45+細胞として、または有核細胞のようにDNA染色に実質的に類似した方法を使用して画定される。白血球集団は、試料中の単一プラットフォーム参照標準物質としてビーズを取り込む時、総白血球数を得るために総CD45発現を使用するか、または容量精密カウンターを使用して、直接計数される。
【００２３】
試料中のCD4+ Ｔ細胞数の実際の計算は、試料中の白血球集団に、係数（これは、白血球集団のCD4+ Ｔ細胞の比率が割合で表される時の白血球集団中のCD4+ Ｔ細胞の比率である）を掛けて行われる。白血球集団中のCD4+ Ｔ細胞の比率がパーセントで表される時、白血球集団にパーセントの100分の１（％×10-2）である係数を掛ける。
【００２４】
すなわち本発明は、２つの別のパラメータを使用して、試料中の（特に限定されないが）CD4+ Ｔ細胞の数を確立する２重プラットフォーム法を提供する。
上記したように試料中の白血球の計数は、適当なヘマトロジーアナライザーを使用して行われる。任意の適当なヘマトロジーアナライザーが使用され、例えば、ベックマンコールター（Beckman Coulter, Inc.）（GenS（登録商標））、アボット（Abbott）（CELL-DYN（登録商標）4000）、およびシズメックス（Sysmex Corportion）（XE2100（登録商標））により製造されるそれぞれ商標名 GenS（登録商標）、CELL-DYN（登録商標）4000、およびXE2100（登録商標）が利用できる。また、試料の白血球中のCD4+ Ｔ細胞の比率の測定は、上記したように、適当なフローサイトメーターを使用して行われる。任意の適当なフローサイトメーターが使用され、例えばベックマンコールター（Beckman Coulter, Inc.）（EPICS（登録商標）XL）およびビーディーバイオサイエンシーズ（BD Biosciences）（FACSCalibur（登録商標））により製造されるそれぞれ商標名EPICS（登録商標）XLおよびFACSCalibur（登録商標）が利用できる。
【００２５】
試料中の白血球を計数するために任意の適当な方法が使用されるが、該白血球の計数は、例えば、サイズ区別法、インピーダンス測定法、または精密容量計測法により行われる。
【００２６】
同様に、試料中の白血球中のCD4+ Ｔ細胞の比率を測定するために任意の適当な方法が使用されるが、試料中の白血球中のCD4+ Ｔ細胞の比率の測定は、例えばCD4発現を用いるフローサイトメトリー90°／側方散乱により行われる。試料中の白血球の計数およびCD4+ Ｔ細胞の比率の測定は、別の装置で行ってもよい（すなわち、ヘマトロジーアナライザーとフローサイトメーター）が、そのような装置の機能を組合せて、白血球計数と白血球のCD4+ Ｔ細胞の比率またはパーセントの測定を、単一のまたは共通の装置で行うと便利である。
【００２７】
本発明の具体的な実施態様において、２重プラットフォーム（すなわち、２つまたは双子プラットフォーム）法が使用され、試料中のCD4+ Ｔ細胞集団（すなわち、絶対CD4+ Ｔ細胞数）を得るために２つの別の装置（すなわち、白血球数を得るためのヘマトロジーアナライザーとCD4+ Ｔ細胞の比率またはパーセントを得るためのフローサイトメーター）が使用される。ヘマトロジーアナライザーから得られる白血球数に、フローサイトメーターから得られる白血球集団の比率（CD45+（陽性）発現細胞として画定される）として測定されるCD4+ Ｔ細胞比率またはパーセント（上記したように）を掛ける。この計算は、絶対CD4+ Ｔ細胞数を求めることを容易にする。
【００２８】
すなわち例えば、ベックマンコールター（Beckman Coulter, Inc.）GenS（登録商標）ヘマトロジーアナライザーを使用して、血液試料の白血球数を得て、次に同じ血液試料について、ベックマンコールター（Beckman Coulter, Inc.）EPICS（登録商標）XLフローサイトメーターを使用して、白血球集団のCD4+ Ｔ細胞の比率またはパーセント（そのCD45+発現により画定される）を測定してもよい。
【００２９】
実際、単一の装置を含む単一プラットフォーム法が使用され、単一の装置で総白血球数と総白血球数のCD4+ Ｔ細胞比率またはパーセントが得てもよい。これは、総白血球数細胞集団のCD4+ Ｔ細胞の比率またはパーセントが測定できるように改変することができる蛍光測定機能を有するヘマトロジーアナライザーで、直接白血球を計数することにより行われる。あるいは、総白血球集団のCD4+ Ｔ細胞の比率またはパーセントは、血液試料についてフローサイトメーターで直接測定され、ここでこのフローサイトメーターは、付加された適当な（市販の）ビーズ計数調製物（例えば、ベックマンコールター（Beckman Coulter）フローカウント（登録商標）蛍光球（Flow-Count Fluorospheres））を有し、ビーズは同時に計数され、CD4+ Ｔ細胞の絶対数を計算できる標準物質として使用される。
【００３０】
本方法は、１つ以上の以下の工程を含む：
高密度CD45++bright細胞と低側方散乱細胞（その成分はCD4陽性リンパ球である）の比率またはパーセントを、試料中の白血球集団に関連付けて、こうして試料中のリンパ球集団を確立することにより、試料中のリンパ球数を算出する工程；
中密度CD45++細胞と中側方散乱細胞およびdim中密度CD4細胞の比率またはパーセントを、試料中の白血球集団に関連付けて、こうして試料中の単球集団を確立することにより、試料中の単球数を算出する工程；および
dim低密度CD45++細胞とCD4陰性細胞および高側方散乱細胞の比率またはパーセントを、試料中の白血球集団に関連付けて、こうして試料中の顆粒球集団を確立することにより、試料中の顆粒球数を算出する工程。
【００３１】
２重または単一プラットフォーム系とともに使用するためにCD45とCD4を組合せて、少なくとも３部または多くても５部の白血球鑑別（CD4+ リンパ球（Ｔ細胞）の特定以外に、顆粒球、単球、リンパ球、好塩基球および好酸球の特定を含む）を得てもよい。後者の個々の細胞成分のそれぞれのパーセントと絶対数が、上記したように得られる。これは、総白血球数細胞集団の関連する細胞（顆粒球などを含む）の比率またはパーセントが測定できるように改変することができる蛍光測定機能を有するヘマトロジーアナライザーで、直接白血球コンパートメントを計数することにより行われる。あるいは、総白血球集団の特定の細胞の比率またはパーセントは、血液試料についてフローサイトメーターで直接測定され、ここでこのフローサイトメーターは、付加された適当な（市販の）ビーズ計数調製物（例えば、ベックマンコールター（Beckman Coulter）フローカウント（登録商標）蛍光球（Flow-Count Fluorospheres））を有し、ビーズは同時に計数され、成分細胞（例えば、顆粒球などを含む）の絶対数を計算できる標準物質として使用される。
【００３２】
本発明の第２の実施態様において、上記の方法に従って試料中のCD4+ Ｔ細胞の計数に使用されるキットであって、この方法で使用される抗体と、この方法を実施するための説明書とを含むキットが提供される。キットは、フローサイトメトリーまたはヘマトロジーアナライザーデータの解析のためのソフトウェアを含んでもよい。
【００３３】
抗体はCD4および／またはCD45抗体でもよい。
キットはまた、上記の細胞計数法を少なくとも部分的に実施するためのコンピューターソフトウェアを含んでもよい。
【００３４】
本発明のさらなる実施態様において、機械により実行された時に、実質的に上記した方法の工程を、少なくとも部分的に機械に実施させる命令を含む機械で読むことができる媒体が提供される。機械で読むことができる媒体は、フローサイトメーターおよび／またはヘマトロジーアナライザーとともに使用できるように作成され、フローサイトメトリーデータの解析のための命令を含んでもよい。
【００３５】
本発明のさらなる実施態様において、HIVまたは他の免疫不全症状または疾患の患者の免疫状態を追跡する方法であって、実質的に上記した方法により、患者の細胞試料中のCD4+リンパ球またはCD4+ Ｔ細胞の数を測定する工程を含む方法が提供される。特にこの方法は、抗レトロウイルス治療に対する患者の応答を測定または追跡するのに使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明のいくつかの実施態様の詳細な説明
本発明を、非限定例により以下の説明例を参照して添付の図面を参照して説明する。
【実施例】
【００３７】
実施例１：２重プラットフォーム法
同意した成人からエチレンジアミン四酢酸（K3EDTA）中に全血試料を採取した。この試料を、静脈切開の６時間以内に実験室に送った。実験室で試料を受領後、ベックマンコールター（Beckman Coulter）GenS（登録商標）ヘマトロジーアナライザーで白血球数測定を行った。白血球数4.80×109/lが得られた。
【００３８】
装置について毎日、提供業者が推奨する適切な外部品質評価と内部品質管理を行い、白血球数が正確で高精度であることを確保する。
【００３９】
全血細胞数が得られた後、同じ試料から取った血液をフローサイトメトリー解析のために調製した。フローサイトメトリー調製は、充分混合した100μlアリコートの全血を12×75mmの試験管の底に入れた。提供業者の推奨に従って、抗CD4フィコエリトリン（PE）モノクローナル抗体とCD45フルオレセインイソチオシアネート（FITC）モノクローナル抗体を加え（両方とも、イムノテック（Immunotech）、ベックマンコールター（Beckman Coulter Inc.）、マイアミ、フロリダ州から得られた）、室温で暗所で10分間インキュベートした。
【００４０】
CD45とCD4抗体を加えた100μlの血液を含有する試験管を、次に提供業者の指示に従って、ベックマンコールター（Beckman Coulter）Q-Prep/ImmunoPrep（登録商標）試薬システムとワークステーションでフローサイトメトリー解析するために調製した。この調製工程では、赤血球溶解剤、安定剤および固定剤を加えた。次に試料を、ベックマンコールター（Beckman Coulter）EPICS（登録商標）XLフローサイトメーターで、後述するように解析した。提供業者が推奨するように、光散乱と蛍光強度の正しい調整と標準化ならびに色補償を含む適切な内部品質管理を毎日装置について行い、フローサイトメトリーの結果が正確で高精度であることを確保する。
【００４１】
すなわち、まず［CD45 FITC対側方散乱（SS）］ディスプレイ上で総白血球を特定した（図1aの領域A）。次に、［CD4 PE対SS］ディスプレイを使用して領域A中のすべてのCD45陽性のゲートしたイベント（白血球の総数／集団）を図1b（CD45陽性細胞のみを含む）で表示させ、ここでCD4++（高密度）低側方散乱リンパ系細胞を特定した（図1bの領域B）。CD4+ リンパ球（Ｔ細胞）パーセント16.5％が認められた。
【００４２】
ヘマトロジーアナライザーから得られた白血球数に、フローサイトメトリーにより得られたCD4+ Ｔ細胞率を掛けて、CD4+ リンパ球（Ｔ細胞）の絶対数が得られた、すなわち4.8×109/l×16.5％÷100。これにより0.792×109 CD4+ リンパ球（Ｔ細胞）/l（または、792 CD4+ リンパ球（Ｔ細胞）/μl）が得られた。
【００４３】
この方法では、共通分母または参照点としてリンパ系集団を使用する代わりに総白血球を２重プラットフォーム絶対CD4+ Ｔ細胞計数の共通分母または参照点とした（これは、２重プラットフォーム法の最新の水準である）。
【００４４】
使用したゲート設定方策はまた、総リンパ球のCD4+ Ｔ細胞パーセントの算出を可能にした（すなわちゲートBでのイベントの数（図1b）をゲートCのイベントの数（図1a）で割る）。すなわち、ゲートBで認められた752 CD4+イベントを、ゲートCで認められた1416 CD4+ brightイベントで割った（図1a）、すなわち752／1416（0.531または53.1％）。本発明とは無関係に、総リンパ球のCD4細胞パーセントは、臨床的に関連（例えば、小児例）した場合でも利用できた。
【００４５】
使用したゲート設定方策はまた、この試料の完全な白血球鑑別の個々の成分の算出を可能にした。この解析では、まず［CD45 FITC対側方散乱（SS）］ディスプレイ上で総白血球を特定した（図3aの領域A）。次に、［CD4 PE対SS］ディスプレイを使用して領域A中のすべてのCD45陽性のゲートした細胞（すなわち、ゲートしたイベント）を図3b（CD45陽性細胞のみを含む）で表示させた。これらのディスプレイは、リンパ球（図3aと3b、ゲートC）、単球（図3aと3b、ゲートE）、好塩基球（図3a、ゲートF）、顆粒球（図3aと3b、ゲートG）、および好酸球（図3b、ゲートH）を含有した。
【００４６】
これらの各ゲート中のイベントの数（すなわち、ゲートC（図3aと3b）、ゲートE（図3aと3b）、ゲートF（図3b）、およびゲートG（図3aと3b）とゲートH（図3b）中のイベントの数を、ゲートA（図3a）のイベントの数で割る）を使用して、個々の白血球鑑別成分のパーセントを得た。
【００４７】
すなわち、以下の算出が可能であった：
リンパ球パーセント：
ゲートC（図3a）で認められた、低側方散乱を有する1416の高密度CD45 bright陽性イベント（その成分はCD4陽性であろう）を、ゲートA（図3a）で認められた4750のCD45陽性イベントで割った、すなわち1416／4750（0.298または29.8％）。
【００４８】
単球パーセント：
ゲートE（図3aと3b）で認められた、中側方散乱と中密度CD4発現または陽性を有する380の中密度CD45中bright陽性イベントを、ゲートA（図3a）で認められた4750のCD45陽性イベントで割った、すなわち380／4750（0.080または8.0％）。
【００４９】
好塩基球パーセント：
ゲートF（図3a）で認められた、低側方散乱と陰性CD4を有する51の低密度CD45 dim陽性イベントを、ゲートA（図3a）で認められた4750のCD45陽性イベントで割った、すなわち51／4750（0.010または1.0％）。
【００５０】
顆粒球パーセント：
ゲートG（図3aと3b）で認められた、高側方散乱（および陰性CD4発現）を有する2758の低密度CD45 dim陽性イベントを、ゲートA（図3a）で認められた4750のCD45陽性イベントで割った、すなわち2759／4750（0.581または58.1％）。
【００５１】
好酸球パーセント：
ゲートHで認められた、超高側方散乱とやや弱い自己蛍光を有する145の中密度CD45中bright陽性イベントを、ゲートA（図3a）で認められた4750のCD45陽性イベントで割った、すなわち144／4750（0.031または3.1％）。
【００５２】
ゲートC、E、F、GおよびHを含む白血球鑑別の各成分の絶対数は、ヘマトロジーアナライザーから得られた白血球数に、フローサイトメトリーにより得られた各白血球百分率を掛けて得られた。
【００５３】
すなわち以下の算出が可能であった：
絶対リンパ球数
4.8×109/l 掛ける29.8％（図3a、ゲートC）割る100。これは1.430×109リンパ球/l（または1430リンパ球/μl）を与えた。
【００５４】
絶対単球数
4.8×109/l 掛ける8.0％（図3aと3b、ゲートE）割る100。これは0.384×109単球/l（または384単球/μl）を与えた。
【００５５】
絶対好塩基球数
4.8×109/l 掛ける1.0％（図3a、ゲートF）割る100。これは0.048×109好塩基球/l（または48好塩基球/μl）を与えた。
【００５６】
絶対好酸球数
4.8×109/l 掛ける3.1％（図3b、ゲートH）割る100。これは0.149×109好酸球/l（または149好酸球/μl）を与えた。
【００５７】
絶対顆粒球数
4.8×109/l 掛ける58.1％（図3aと3b、ゲートG）割る100。これは2.789×109顆粒球/l（または2789顆粒球/μl）を与えた。
【００５８】
実施例２：単一プラットフォーム法
同意した成人からK3EDTA中に全血試料を採取した。この試料を、静脈切開の６時間以内に実験室に送った。実験室で試料を受領後、フローサイトメトリー解析用に試料を調製した。フローサイトメトリー調製は、充分混合した100μlアリコートの試料（全血）を12×75mmの試験管の底に入れた。
【００５９】
提供業者の推奨に従って、抗CD4 PEモノクローナル抗体とCD45 FITCモノクローナル抗体を加え（両方とも、イムノテック（Immunotech）、ベックマンコールター（Beckman Coulter Inc.）、マイアミ、フロリダ州から得られた）、室温で暗所で10分間インキュベートした。CD45とCD4抗体を加えた100μlの血液を含有する試験管を、次に提供業者の指示に従って、上記のQ-Prep/ImmunoPrep（登録商標）試薬システムとワークステーションでフローサイトメトリー解析するために調製した。
【００６０】
赤血球溶解剤、安定剤および固定剤を加えるこの全血調製工程後、市販のビーズ試薬（ベックマンコールター（Beckman Coulter Inc.）、マイアミ、フロリダ州、から得られるフローカウント（登録商標）蛍光球（Flow-Count Fluorospheres））を、提供業者が指示するように、試料に加えた。蛍光球添加工程は、充分混合した100μlアリコートのフローチェック（登録商標）（Flow-Check）蛍光球を使用した。測定した濃度の蛍光球を1000μlとした。蛍光球は、気泡が入らないように注意して反転ピペット操作により加えた。これらの検査結果の正確性と精度のためには、上手な反転ピペット操作が決定的に重要である。試料は蛍光球の添加後２時間以内に測定し、フローサイトメトリー解析前に充分混合した。
【００６１】
次に試料を、ベックマンコールター（Beckman Coulter）EPICS（登録商標）XLフローサイトメーターで、1000 蛍光球が計測されるまで解析した。提供業者が推奨するように、装置について光散乱と蛍光強度の正しい調整と標準化ならびに色補償を含む適切な内部品質管理を毎日行い、フローサイトメトリーの結果が正確であることを確保した。この解析では、まず［CD45 FITC対側方散乱（SS）］ディスプレイ上で総白血球を特定した（図2aの領域A）。次に、［CD4 PE対SS］ディスプレイを使用して領域A（白血球の総数）中のすべてのCD45陽性のゲートした細胞（すなわち、ゲートしたイベント）を図2b（CD45陽性細胞のみを含む）で表示させ、ここでCD4++低側方散乱リンパ系細胞を特定した（図2b中の領域B）。蛍光球集団は、［前方散乱（FSと略す）対蛍光球］の別のヒストグラムに示し、後者はFL4（蛍光検出器番号4）の対数スケール上で検出された（領域D、図2c）。
【００６２】
絶対CD45陽性細胞数（総白血球数）は、蛍光球の製造業者（ベックマンコールター（Beckman Coulter）フローカウント（Flow-Count）（登録商標））の説明書に従って計算し、すなわち細胞の総数を、計数した蛍光球の総数で割り、次にフローカウント（登録商標）蛍光球（Flow-Count Fluorospheres）測定濃度を掛けて、絶対数/μlを得た。
【００６３】
すなわち、CD45陽性白血球数は以下のように算出した：
領域Aの計数4737（計数されたすべてのCD45陽性細胞）を領域Dの計数1000（計数されたすべての蛍光球）で割り、次に1000/μl（蛍光球測定濃度）を掛けて、白血球数4737/μlまたは4.737×109/l（絶対CD45陽性白血球数）を得た。絶対CD4+ Ｔ細胞数は、この算出されたCD45陽性白血球数に、CD45陽性白血球集団中で計数したCD4++低側方散乱リンパ球（Ｔ細胞）のパーセントを掛けて得られた（領域B、図2b、すなわち4737/μlに16.2％（すなわち、0.162）を掛けた）。これで、766 CD4リンパ球（Ｔ細胞）/μl（または0.766×109 CD4+ リンパ球（Ｔ細胞）/l）が得られた。
【００６４】
この方法では、ベースラインとして総リンパ球集団（光散乱またはCD45 brightまたはCD3陽性白血球数により画定される）を使用する代わりに、絶対CD4+ Ｔ細胞計数をベースラインとした（これは単一プラットフォーム法である）。
【００６５】
あるいは、CD4リンパ球（Ｔ細胞）数は直接計数することができる。これは、図2b、領域Bのイベント数（766）を取り、この数を図2c、領域Dの数（1000−計数した総蛍光球）で割り、次に1000/μl（蛍光球測定濃度）を掛けることにより行われ、766 CD4リンパ球（Ｔ細胞）/μlまたは0.766×109 CD4+リンパ球（Ｔ細胞）/lが得られ、これは絶対CD4+ Ｔ細胞数に等しい。
【００６６】
使用したゲート設定方策はまた、総リンパ球のCD4+ Ｔ細胞パーセントの算出を可能にした（すなわちゲートBでの細胞の数（図(IV)）をゲートCの細胞の数（図III）で割る）。すなわち、ゲートBで認められた766イベントをゲートCで認められた1421 CD4++ brightイベントで割り、766／1421（0.539または53.9％）。しかしこの値はCD4+計数の作成には使用せず、リンパ球のCD4パーセントは、臨床的に関連（例えば、小児例）した場合に、利用できる単なる追加の情報であった。
【００６７】
２重プラットフォーム法と同様に単一プラットフォーム法は、この試料について５部白血球鑑別について各パーセントと絶対数を算出するのに使用することができる。この方法は、２重プラットフォーム法と同一であるが、ただし、ビーズまたはオーソサイトロン（Ortho Cytron）（登録商標）計測を含む適切な単一プラットフォーム法は直接計測機序として使用され、全血または溶解血液試料に応用される。
【００６８】
本発明の利点（特に、上記例を参照したもの）は、細胞試料中のCD4+ Ｔ細胞の数を算出するための基礎としてCD45発現の使用を取り込む白血球集団の数の使用が、試料採取後数日までの遅れ後に、正確な測定を可能にすることである。CD45とCD4+ Ｔ細胞発現の両方とも、前方散乱性が喪失した後でも、蛍光強度のわずかな喪失で120時間以上保存される。実際、CD45+白血球と白血球の側方散乱性は、試料採取後７日まで保持されることを約束する。CD45+白血球と側方散乱パラメータの両方を含むために、技術的誤差が避けられ、例えば単球（絶対CD4リンパ球（Ｔ細胞）数に具体的に関連する）または赤血球から生じる無関係の細胞イベントが排除され、関係するリンパ系細胞（例えば、アポトーシス性散乱性を有するもの）を含めることができる。
【００６９】
白血球百分率の成分の特定とその計数に関して本発明のさらなる使用は、現在のヘマトロジーアナライザーの技術水準を有意に改変することができる。上記したように静脈切開時間の数日後にCD45とCD4分子の両方が充分に保持され、細胞測定の基礎はCD45とCD4によるため、総白血球数と絶対数を有する完全な百分率は、ほとんどのヘマトロジーアナライザー製造業者が示す24時間の制限に反して、静脈切開の数日後に得ることができる。この特徴は、数日の遅延検査という機能と、現在の技術水準のヘマトロジーアナライザーの特徴ではない新しい特徴を与える。従ってこの方法は、すでに数日間経っている試料について５部鑑別を有する白血球数と絶対百分率を生成するのに適している。
【００７０】
本発明のこのアプローチは、特に、血液が少量しか利用できない小児試料に適用される。CD45+白血球染色が無い場合、未溶解および有核赤血球は、CD4+ Ｔリンパ球絶対数とCD4+ Ｔリンパ球画分またはパーセント値の画定を顕著に妨害する。CD4+ Ｔ絶対数の年齢依存性変動のために、幼児や小児ではCD4+ Ｔリンパ球パーセント数は、臨床的に関連するパラメータとして使用される。CD45+白血球数を基礎として使用することは、bright CD45++白血球の関数としてCD4++ Ｔ細胞を特定することにより、正確なCD4+ Ｔリンパ球分画またはパーセント値の使用を容易にする。
【００７１】
CD45支援２重プラットフォームCD4計数系の大きな利点は、これが、単一の試験管中のCD4リンパ球計測の唯一の信頼できる品質管理された系であることである。ビーズベースのまたは容量高精密供給系を含む単一プラットフォーム系の計数は、良好な正確性を与えることが報告されているが、これらは、絶対数（特に、ビーズベースの計数は、ピペット操作の誤差による誤差が出やすい）を再現し品質を評価するのに、二重検査（すなわち、CD3二重検査）の少なくとも１つの成分の読み値の二重検査に依存する。DP CD45支援２重プラットフォーム「PanLeucogating」CD4 計数系は、ヘマトロジーアナライザー上の白血球数の品質管理による「組み込まれた」品質管理を有する白血球数測定を利用し、こうして、単一の試験管で良好な品質管理が行われる。この系では、モノクローナル抗体イソタイプの非特異結合を評価するための外部イソタイプ対照も必要ではない。
【００７２】
本発明は実施が比較的容易であり、本出願人は、上記したようにCD4+ Ｔ細胞計数または他の白血球鑑別の算出を用手的にする必要はなく、この計算のためにコンピュータープログラムが提供されることを期待する。コンピュータープログラムが、フローサイトメーターおよび／またはヘマトロジーアナライザーで使用するのに適したコンピューターで実施可能な命令を含んでよい。
【００７３】
ユーザーが本発明を実施するためのキットも提供され、このキットは、１つ以上の抗体および本発明を実施するための説明書を含む。抗体は典型的には、CD4および／またはCD45抗体である。キットはまた、コンピュータープログラムを含むか、またはプログラムとともに使用するための説明書を含む。
【００７４】
特にCD4リンパ球計測のための本発明の方法は、リンパ球参照の必要性を避け、比較的頑強であり、実験室間で再現性があり、正確であり、使用が容易であり、比較的安価で容易に実施できる。本方法はまた、すでに数日経った試料での使用にも適する。
【００７５】
参考文献：
1.  疾病管理と予防のためのCDCセンター（CDC-Centers for Disease Control and Prevention） 1997  ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）に感染したヒトのCD4+ Ｔ細胞測定を実施するためのガイドライン、MMWR 1997；46:1-29。
2.  Schniziein-Bick C, Mandy F, O'Gorman M, Paxton H, Nicholson JKA, Hultin LE, Gelman RS, Wilkening C およびLivnat D.  ３色および４色フローサイトメトリー免疫表現型判定におけるCD45ゲート設定の使用：NAID、AIDS部門からのガイドライン、Cytometry 2002, 50(2):46-52。
3.  Glencross DK, Scott L, Jani I.V., Barnett DおよびJanossy G. 正確な経済的な２重プラットフォーム系CD4+ Ｔ細胞計数のためのCD45支援PanLeucogating、Cytometry Clinical Cytometry, 2002 特別号−CD4：20年と計測：50(2):69-77.
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１ａ】図１は、２重プラットフォーム総白血球（CD45）支援CD4 Ｔ細胞計数のヒストグラムを示す：図1aは、総CD45陽性イベント（すべて白血球）の捕捉のヒストグラムを示す。
【図１ｂ】図1bは、CD4陽性リンパ球の特定を伴うゲートしたCD45陽性イベントのヒストグラムを示す。
【図２ａ】図２は、単一プラットフォーム総白血球（CD45）支援CD4 Ｔ細胞計数のヒストグラムを示す：図2aは、蛍光球を除く総CD45陽性イベント（すべて白血球）の捕捉のヒストグラムを示す。
【図２ｂ】図2bは、CD4陽性リンパ球の特定を伴うゲートしたCD45陽性イベントのヒストグラムを示す。
【図２ｃ】図2cは、総CD45陽性イベント（すべて白血球）の捕捉のヒストグラムを示す。
【図３ａ】図３は、CD45とCD4の使用に基づく５部白血球鑑別とCD4+ リンパ球のヒストグラムを示す：図3aは、総CD45陽性イベント（すべて白血球）（リンパ球、単球、顆粒球および好塩基球を含む）の捕捉のヒストグラムを示す。
【図３ｂ】図3bは、CD4陽性リンパ球、単球、顆粒球、および好酸球の特定を伴うゲートしたCD45陽性イベントのヒストグラムを示す。
【国際公開パンフレット】
2004533855.tif 000003
2004533855.tif 000004
2004533855.tif 000005
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2004533855.tif 000032
2004533855.tif 000033
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004533855.tif 000034
【手続補正書】
【提出日】平成15年10月17日(2003.10.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞サンプル中のCD4細胞の数の計数方法であって、以下のステップ：
ａ）CD4リンパ球を計測するための参照集団として全CD45発現集団を同定し；
ｂ）ステップ（ａ）において同定された全CD45参照集団の関数としてCD4リンパ球のパーセンテージを測定し；
ｃ）血液一定体積当りのCD45細胞数を測定し；そして
ｄ）ステップ（ｂ）において得たCD4細胞のパーセンテージに、ステップ（ｃ）において得たCD45カウント数を掛けることにより、上記サンプル中のCD4細胞数を計算する、
を含む前記方法。
【請求項２】
既知数のビーズがサンプルに添加され、そしてそのビーズと細胞が同時にカウントされて絶対細胞数が得られるところの単一プラットフォームによるか、又は血液学アナライザーから得られた白血球カウント数を用いるデュアル・プラットフォーム法によるかのいずれかにより、前記血液一定体積当りのCD45細胞数が、測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の方法であって、免疫学的方法により５部リンパ球サブ−セット分別を同定するために、CD45抗体とCD4抗体の組合せが使用され、以下のステップ：
ａ）まず、全CD45陽性イベントを同定し、そしてその後、CD4と側方散乱パラメーターであって、絶対リンパ球カウント数、絶対単球カウント数、絶対顆粒球カウント数、絶対好酸球カウント数、及びCD4カウント数を含むもののみを用いて、白血球細胞分別を定める
を含み、ここで、前記方法が、以下のステップ：
ｂ）高密度CD4++bright細胞と低側方散乱細胞、及びCD4-（陰性）低側方散乱細胞（その１成分はCD4陽性リンパ球である）のパーセンテージの全合計の全比率を、上記サンプル中の白血球細胞集団に、関連付けることにより、上記サンプル中のリンパ球数を計算して、これにより、上記サンプル中のリンパ球の集団を確立し；
ｃ）dim〜中密度CD4+細胞及び中側方散乱細胞のパーセンテージの比率を、上記サンプル中の白血球細胞集団に、関連付けることにより、上記サンプル中の単球の数を計算して、これにより、上記サンプル中の単球の集団を確立し；
ｄ）陰性〜dim低密度又は自己蛍光CD4陰性細胞、及び高側方散乱細胞のパーセンテージの比率を、上記サンプル中の白血球細胞集団に、関連付けることにより上記サンプル中の顆粒球の数を計算して、これにより、上記サンプル中の顆粒球の集団を確立し；そして
ｅ）dim低密度CD4+細胞、及び極高側方散乱細胞のパーセンテージの比率を、上記サンプル中の白血球細胞集団に関連付けることにより、上記サンプル中の好酸球の数を計算して、これにより、上記サンプル中の好酸球の集団を確立する、
の中の１以上をさらに含む、前記方法。
【請求項４】
dim低密度CD4+細胞、及び低側方散乱細胞のパーセンテージの比率を、前記サンプル中の白血球細胞集団に、関連付けることにより、前記サンプル中の好塩基球の数を計算するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが、全非溶解血液、分画されていない、分画された又は溶解された全血である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
サンプル中のCD4細胞の数を計数するために使用するCD4抗体とCD45抗体を含むキット。
【請求項７】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法を実施するための指示書をさらに含む、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
赤血球溶解剤、安定化剤、定着剤、対照細胞、媒質、及びビーズ試薬から成る群から選ばれる１以上の試薬をさらに含む、請求項６に記載のキット。
【請求項９】
機械により実行されるとき、当該機械に、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法のステップを実行させる指令を含む機械読み取り可能媒体。
【請求項１０】
フロー・サイトメトリー及び／又は血液学アナライザーと共に使用されるように設計された、請求項９に記載の機械読み取り可能媒体。
【請求項１１】
インピーダンス、光散乱、蛍光、及びプレシジョン体積カウンティングから成る群から選ばれる分析方法を実行するための指令を含む、請求項９又は１０に記載の機械読み取り可能媒体。
【請求項１２】
HIV又は他の免疫不全症状又は疾患をもつ患者の免疫状態をモニタリングする方法であって、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法により、上記患者からの細胞サンプル中の全白血球細胞に比較して、CD4+リンパ球又はCD4+T細胞の数を計数するステップを含む、前記方法。
【請求項１３】
抗レトロウィルス処置に対する前記患者の応答を測定するために、前記患者の免疫症状が、測定され又はモニタリングされる、請求項１２に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４５】
使用したゲート設定方策はまた、この試料の完全な白血球鑑別の個々の成分の算出を可能にした。この解析では、まず［CD45 FITC対側方散乱（SS）］ディスプレイ上で総白血球を特定した（図3aの領域A）。次に、［CD4 PE対SS］ディスプレイを使用して領域A（白血球の総数）中のすべてのCD45陽性のゲートした細胞（すなわち、ゲートしたイベント）を、CD45陽性細胞のみを含んで図3cに表示させた。これらのディスプレイは、リンパ球（図3bと3c、ゲートB+C-F）、単球（図3c、ゲートE）、顆粒球（図3c、ゲートG）、好酸球（図3c、ゲートH）、及び好塩球（図3b、ゲートF）を含有した。


【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
これらの各ゲート中のイベントの数（すなわち、ゲートB+C-F（図3bと3c）、ゲートE（図3c）、ゲートF（図3c）、ゲートG（図3c）とゲートH（図3c）中のイベントの数を、ゲートA（図3a）のイベントの数で割る）を使用して、個々の白血球鑑別成分のパーセントを得た。


【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４７】
すなわち、以下の算出が可能であった：
リンパ球パーセント：
ゲートC（図3c）で認められた、低側方散乱を有する1416の陽性イベント（＝ゲートB+C-F）を、ゲートA（図3a）で認められた4750のCD45陽性イベントで割った、すなわち1416／4750（0.298または29.8％）。


【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４８】
単球パーセント：
ゲートE（図3c）で認められた、中側方散乱と中密度CD4発現または陽性を有する380の中密度CD4中bright陽性イベントを、ゲートA（図3a）で認められた4750のCD45陽性イベントで割った、すなわち380／4750（0.080または8.0％）。


【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
好塩基球パーセント：
ゲートF（図3b）で認められた、低側方散乱と陰性CD4を有する51の低密度CD4 dim陽性イベントを、ゲートA（図3a）で認められた4750のCD45陽性イベントで割った、すなわち51／4750（0.010または1.0％）。


【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
顆粒球パーセント：
ゲートG（図3c）で認められた、2758の低密度CD4陰性〜dim陽性イベント（高側方散乱をもつ自己蛍光）を、ゲートA（図3a）で認められた4750のCD45陽性イベントで割った、すなわち2759／4750（0.581または58.1％）。


【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
好酸球パーセント：
ゲートHで認められた、超高側方散乱とやや弱い自己蛍光を有する145の中密度CD4中bright陽性イベントを、ゲートA（図3a）で認められた4750のCD45陽性イベントで割った、すなわち144／4750（0.031または3.1％）。


【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
ゲートB、C、E、F、GおよびHを含む白血球鑑別の各成分の絶対数は、ヘマトロジーアナライザーから得られた白血球数に、フローサイトメトリーにより得られた各白血球百分率を掛けて得られた。


【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
すなわち以下の算出が可能であった：
絶対リンパ球数
4.8×109/l 掛ける29.8％（図3bと3c、ゲートB+C-F）割る100。これは1.430×109リンパ球/l（または1430リンパ球/μl）を与えた。


【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５４】
絶対単球数
4.8×109/l 掛ける8.0％（図3c、ゲートE）割る100。これは0.384×109単球/l（または384単球/μl）を与えた。


【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
絶対好塩基球数
4.8×109/l 掛ける1.0％（図3b、ゲートF）割る100。これは0.048×109好塩基球/l（または48好塩基球/μl）を与えた。


【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
絶対好酸球数
4.8×109/l 掛ける3.1％（図3c、ゲートH）割る100。これは0.149×109好酸球/l（または149好酸球/μl）を与えた。


【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
絶対顆粒球数
4.8×109/l 掛ける58.1％（図3c、ゲートG）割る100。これは2.789×109顆粒球/l（または2789顆粒球/μl）を与えた。


【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
２重プラットフォーム法と同様に単一プラットフォーム法は、この試料について６部白血球鑑別について各パーセントと絶対数を算出するのに使用することができる。この方法は、２重プラットフォーム法と同一であるが、ただし、ビーズまたはオーソサイトロン（Ortho Cytron）（登録商標）計測を含む適切な単一プラットフォーム法は直接計測機序として使用され、全血または溶解血液試料に応用される。


【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
白血球百分率の成分の特定とその計数に関して本発明のさらなる使用は、現在のヘマトロジーアナライザーの技術水準を有意に改変することができる。上記したように静脈切開時間の数日後にCD45とCD4分子の両方が充分に保持され、細胞測定の基礎はCD45とCD4によるため、総白血球数と絶対数を有する完全な百分率は、ほとんどのヘマトロジーアナライザー製造業者が示す24時間の制限に反して、静脈切開の数日後に得ることができる。この特徴は、数日の遅延検査という機能と、現在の技術水準のヘマトロジーアナライザーの特徴ではない新しい特徴を与える。従ってこの方法は、すでに数日間経っている試料について全５−〜６−部鑑別を有する白血球数と絶対百分率を生成するのに適している。


【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７６】
【図１ａ】図１は、２重プラットフォーム総白血球（CD45）支援CD4 Ｔ細胞計数のヒストグラムを示す：図1aは、総CD45陽性イベント（すべて白血球）の捕捉のヒストグラム（A）を示す。
【図１ｂ】図1bは、CD4陽性リンパ球の特定を伴うゲートしたCD45陽性イベントのヒストグラム（B）を示す。
【図２ａ】図２は、単一プラットフォーム総白血球（CD45）支援CD4 Ｔ細胞計数のヒストグラムを示す：図2aは、蛍光球を除く総CD45陽性イベント（すべて白血球）の捕捉のヒストグラムを示す。
【図２ｂ】図2bは、CD4陽性リンパ球の特定を伴うゲートしたCD45陽性イベントのヒストグラムを示す。
【図２ｃ】図2cは、総CD45陽性イベント（すべて白血球）の捕捉のヒストグラムを示す。
【図３ａ】図３は、CD45とCD4の使用に基づく６部白血球鑑別とCD4+ リンパ球のヒストグラムを示す：図3aは、総CD45陽性イベント（すべて白血球）の捕捉のヒストグラム（A）を示す。
【図３ｂ】好酸球（F）を含む図3aのヒストグラムを示す。
【図３ｃ】図3cは、CD4陽性リンパ球（B）、総リンパ球（B+C-F、ヒストグラム3aから）、単球（E）、顆粒球（G）、好酸球（H）、及びCD4+ リンパ球（B）の同定によるゲートしたCD45陽性イベントのヒストグラムを示す。


【手続補正２０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１ａ】
2004533855.tif 000035
【手続補正２１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１ｂ】
2004533855.tif 000036
【手続補正２２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２ａ】
2004533855.tif 000037
【手続補正２３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２ｂ】
2004533855.tif 000038
【手続補正２４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２ｃ】
2004533855.tif 000039
【手続補正２５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３ａ】
2004533855.tif 000040
【手続補正２６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３ｂ】
2004533855.tif 000041
【手続補正２７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３ｃ】
2004533855.tif 000042
【国際調査報告】
2004533855.tif 000043
2004533855.tif 000044
2004533855.tif 000045
2004533855.tif 000046
2004533855.tif 000047
2004533855.tif 000048
2004533855.tif 000049
2004533855.tif 000050