(57)【要約】本発明は炎症過程に関与するレセプターを調節し、その調節された機能が炎症性疾病に影響を与える物質に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
物質がＩＬＭレセプターの活性化因子であるか阻害因子であるかを決定する方法であって、物質をＩＬＭレセプターまたはＩＬＭレセプター機能が調節された場合に測定可能な出力を生じさせるテスト系にかけることを含む前記方法。
【請求項２】
ＩＬＭレセプターが哺乳動物のレセプターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＩＬＭレセプターがヒトのレセプターである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
細胞系を用いた解析が行われる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＭｏｎｏＭａｃ６またはＴＨＰ−１細胞が使用され、前記細胞がホルボル１２−ミリステート １３−アセテートで刺激され、および、ＬＰＳおよび煙からなる群より選ばれる物質で刺激される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
無細胞系を用いた解析が行われる請求項１に記載の方法。
【請求項７】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプター（配列番号２）を含むＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、ＨＭ７４レセプター（配列番号２１）を含むＨＭ７４レセプタータイプレセプター、ＡＩＣＬレセプター（配列番号６）を含むＡＩＣＬレセプタータイプレセプター、ＩＬＴ１レセプター（配列番号１２）を含むＩＬＴ１レセプタータイプレセプター、ＳＨＰＳ−１レセプター（配列番号４）を含むＳＨＰＳレセプタータイプレセプター、ＫＤＥＬレセプター１（配列番号８）を含むＫＤＥＬレセプタータイプレセプター、およびＣＳＦ−１（配列番号１０）を含むＣＳＦ−１レセプタータイプレセプターからなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプターである請求項１に記載の方法。
【請求項９】
配列番号２に記載のＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、または同じ機能を有するその変種、変異体若しくは断片が使用される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＩＬＭレセプターの発現レベルを測定する方法であって、マクロファージにおいて発現しているＩＬＭレセプターのレベルを測定する前記方法。
【請求項１１】
マクロファージが哺乳動物細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
マクロファージがヒト細胞である請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
炎症部位から入手できるマクロファージまたはその一部を使用した解析が行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
哺乳動物の炎症部位から入手できるマクロファージまたはその一部を使用した解析が行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ヒトの炎症部位から入手できるマクロファージまたはその一部を使用した解析が行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプター（配列番号２）を含むＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、ＨＭ７４レセプター（配列番号２１）を含むＨＭ７４レセプタータイプレセプター、ＡＩＣＬレセプター（配列番号６）を含むＡＩＣＬレセプタータイプレセプター、ＩＬＴ１レセプター（配列番号１２）を含むＩＬＴ１レセプタータイプレセプター、ＳＨＰＳ−１レセプター（配列番号４）を含むＳＨＰＳレセプタータイプレセプター、ＫＤＥＬレセプター１（配列番号８）を含むＫＤＥＬレセプタータイプレセプター、およびＣＳＦ−１（配列番号１０）を含むＣＳＦ−１レセプタータイプレセプターからなる群より選ばれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプターである請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
配列番号２に記載のＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、または同じ機能を有するその変種、変異体若しくは断片が使用される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
慢性炎症性気道疾病の診断または監視のための請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
慢性炎症性気道疾病が慢性気管支炎およびＣＯＰＤからなる群より選ばれる請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
炎症部位から入手できるマクロファージまたはその一部を使用した解析が行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物の炎症部位から入手できるマクロファージまたはその一部を使用した解析が行われる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
ヒトの炎症部位から入手できるマクロファージまたはその一部を使用した解析が行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
物資がＩＬＭレセプター機能の活性化因子であるか阻害因子であるかを決定するテストシステムであって、前記レセプターが慢性炎症性気道疾病に関与し、かつ前記レセプターが炎症の媒介に役割を有するものであり、少なくとも、
ａ）ＩＬＭレセプター、または
ｂ）細胞中でＩＬＭレセプターを発現させることのできる発現ベクター、または
ｃ）ＩＬＭレセプターを発現させ得る発現ベクターで形質転換された宿主細胞、
を含む、前記方法。
【請求項２５】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプター（配列番号２）を含むＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、ＨＭ７４レセプター（配列番号２１）を含むＨＭ７４レセプタータイプレセプター、ＡＩＣＬレセプター（配列番号６）を含むＡＩＣＬレセプタータイプレセプター、ＩＬＴ１レセプター（配列番号１２）を含むＩＬＴ１レセプタータイプレセプター、ＳＨＰＳ−１レセプター（配列番号４）を含むＳＨＰＳレセプタータイプレセプター、ＫＤＥＬレセプター１（配列番号８）を含むＫＤＥＬレセプタータイプレセプター、およびＣＳＦ−１（配列番号１０）を含むＣＳＦ−１レセプタータイプレセプターからなる群より選ばれるレセプターである、請求項２４に記載のテストシステム。
【請求項２６】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプターである請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
配列番号２に記載のＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、または同じ機能を有するその変種、変異体若しくは断片が使用される、請求項２６に記載のテストシステム。
【請求項２８】
ＩＬＭレセプターを発現する細胞を含む、請求項２７に記載のテストシステム。
【請求項２９】
ＭｏｎｏＭａｃ６またはＴＨＰ−１細胞が使用され、前記細胞がホルボル１２−ミリステート １３−アセテートで刺激され、および、ＬＰＳおよび煙からなる群より選ばれる物質で刺激される、請求項２８に記載のテストシステム。
【請求項３０】
ＩＬＭレセプターの活性化因子または阻害因子として決定された物質。
【請求項３１】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプター（配列番号２）を含むＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、ＨＭ７４レセプター（配列番号２１）を含むＨＭ７４レセプタータイプレセプター、ＡＩＣＬレセプター（配列番号６）を含むＡＩＣＬレセプタータイプレセプター、ＩＬＴ１レセプター（配列番号１２）を含むＩＬＴ１レセプタータイプレセプター、ＳＨＰＳ−１レセプター（配列番号４）を含むＳＨＰＳレセプタータイプレセプター、ＫＤＥＬレセプター１（配列番号８）を含むＫＤＥＬレセプタータイプレセプター、およびＣＳＦ−１（配列番号１０）を含むＣＳＦ−１レセプタータイプレセプターからなる群より選ばれるレセプターである、請求項３０に記載の物質。
【請求項３２】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプターである請求項３０に記載の物質。
【請求項３３】
配列番号２に記載のＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、または同じ機能を有するその変種、変異体若しくは断片が使用される、請求項３２に記載の物質。
【請求項３４】
ＩＬＭレセプターの活性化因子または阻害因子である疾病治療のための物質。
【請求項３５】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプター（配列番号２）を含むＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、ＨＭ７４レセプター（配列番号２１）を含むＨＭ７４レセプタータイプレセプター、ＡＩＣＬレセプター（配列番号６）を含むＡＩＣＬレセプタータイプレセプター、ＩＬＴ１レセプター（配列番号１２）を含むＩＬＴ１レセプタータイプレセプター、ＳＨＰＳ−１レセプター（配列番号４）を含むＳＨＰＳレセプタータイプレセプター、ＫＤＥＬレセプター１（配列番号８）を含むＫＤＥＬレセプタータイプレセプター、およびＣＳＦ−１（配列番号１０）を含むＣＳＦ−１レセプタータイプレセプターからなる群より選ばれたレセプターである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプターである請求項３４に記載の物質。
【請求項３７】
配列番号２に記載のＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、または同じ機能を有するその変種、変異体若しくは断片が使用される、請求項３６に記載の物質。
【請求項３８】
疾病が慢性炎症性気道疾病である、請求項３４に記載の物質。
【請求項３９】
慢性炎症性気道疾病が慢性気管支炎およびＣＯＰＤからなる群より選ばれる請求項３８に記載の物質。
【請求項４０】
ＩＬＭレセプターの活性化因子および阻害因子として決定された物質を少なくとも一つ含む医薬組成物。
【請求項４１】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプター（配列番号２）を含むＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、ＨＭ７４レセプター（配列番号２１）を含むＨＭ７４レセプタータイプレセプター、ＡＩＣＬレセプター（配列番号６）を含むＡＩＣＬレセプタータイプレセプター、ＩＬＴ１レセプター（配列番号１２）を含むＩＬＴ１レセプタータイプレセプター、ＳＨＰＳ−１レセプター（配列番号４）を含むＳＨＰＳレセプタータイプレセプター、ＫＤＥＬレセプター１（配列番号８）を含むＫＤＥＬレセプタータイプレセプター、およびＣＳＦ−１（配列番号１０）を含むＣＳＦ−１レセプタータイプレセプターからなる群より選ばれるレセプターである、請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプターである請求項４０に記載の医薬組成物。
【請求項４３】
配列番号２に記載のＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、または同じ機能を有するその変種、変異体若しくは断片が使用される、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４４】
ＩＬＭレセプターの活性化因子または阻害因子であると決定された物質の、慢性炎症性気道疾病の治療用医薬組成物調製のための使用。
【請求項４５】
慢性炎症性気道疾病が慢性気管支炎およびＣＯＰＤからなる群より選ばれる請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプター（配列番号２）を含むＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、ＨＭ７４レセプター（配列番号２１）を含むＨＭ７４レセプタータイプレセプター、ＡＩＣＬレセプター（配列番号６）を含むＡＩＣＬレセプタータイプレセプター、ＩＬＴ１レセプター（配列番号１２）を含むＩＬＴ１レセプタータイプレセプター、ＳＨＰＳ−１レセプター（配列番号４）を含むＳＨＰＳレセプタータイプレセプター、ＫＤＥＬレセプター１（配列番号８）を含むＫＤＥＬレセプタータイプレセプター、およびＣＳＦ−１（配列番号１０）を含むＣＳＦ−１レセプタータイプレセプターからなる群より選ばれるレセプターである、請求項４４に記載の使用。
【請求項４７】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプターである請求項４４に記載の使用。
【請求項４８】
配列番号２に記載のＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、または同じ機能を有するその変種、変異体若しくは断片が使用される、請求項４７に記載の使用。
【請求項４９】
慢性炎症性気道疾病の治療を必要とする患者に、ＩＬＭレセプターの活性化因子または阻害因子であると決定された物質を少なくとも一つ含む医薬組成物を投与することを特徴とする、慢性炎症性気道疾病の治療方法。
【請求項５０】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプター（配列番号２）を含むＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、ＨＭ７４レセプター（配列番号２１）を含むＨＭ７４レセプタータイプレセプター、ＡＩＣＬレセプター（配列番号６）を含むＡＩＣＬレセプタータイプレセプター、ＩＬＴ１レセプター（配列番号１２）を含むＩＬＴ１レセプタータイプレセプター、ＳＨＰＳ−１レセプター（配列番号４）を含むＳＨＰＳレセプタータイプレセプター、ＫＤＥＬレセプター１（配列番号８）を含むＫＤＥＬレセプタータイプレセプター、およびＣＳＦ−１（配列番号１０）を含むＣＳＦ−１レセプタータイプレセプターからなる群より選ばれるレセプターである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプターである請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
配列番号２に記載のＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、または同じ機能を有するその変種、変異体若しくは断片が使用される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
哺乳動物を治療するための請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
ヒトを治療するための請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
慢性炎症性気道疾病が慢性気管支炎およびＣＯＰＤからなる群より選ばれる請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
マクロファージにおいてＩＬＭレセプターを選択的に調節する方法であって、ＩＬＭレセプターの活性化因子または阻害因子であると決定された物質を投与することを含む前記方法。
【請求項５７】
マクロファージが慢性炎症性気道疾病に関与するものである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
慢性炎症性気道疾病が慢性気管支炎およびＣＯＰＤからなる群より選ばれる請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプター（配列番号２）を含むＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、ＨＭ７４レセプター（配列番号２１）を含むＨＭ７４レセプタータイプレセプター、ＡＩＣＬレセプター（配列番号６）を含むＡＩＣＬレセプタータイプレセプター、ＩＬＴ１レセプター（配列番号１２）を含むＩＬＴ１レセプタータイプレセプター、ＳＨＰＳ−１レセプター（配列番号４）を含むＳＨＰＳレセプタータイプレセプター、ＫＤＥＬレセプター１（配列番号８）を含むＫＤＥＬレセプタータイプレセプター、およびＣＳＦ−１（配列番号１０）を含むＣＳＦ−１レセプタータイプレセプターからなる群より選ばれるレセプターである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
レセプターがＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプターである、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
配列番号２に記載のＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、または同じ機能を有するその変種、変異体若しくは断片が使用される、請求項６０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はマクロファージが重要な役割を果たす炎症過程、特に炎症性気道疾病の炎症過程の調節の分野に属する。本発明により、マクロファージ上の、炎症過程に関与することが明らかにされたレセプターの機能に影響を与えることにより炎症過程を調節することができる。
【０００２】
（発明の背景）
炎症過程は複数の反応のカスケードを含んでいる。炎症過程には多様な因子が関与しており、それらの因子を回避する単一治療を不成功に終わらせている。特に、慢性炎症性気道疾病（ｃｈｒｏｎｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｉｒｗａｙ ｄｉｓｅａｓｅ）のような気道の炎症過程について真である。
慢性炎症性気道疾病には、慢性気管支炎および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）が含まれる。例えば、ＣＯＰＤは以下の種々の異常を含む複雑な疾病である：咳と粘液分泌過多を特徴とする慢性気管支炎、炎症と気管支周辺の繊維化を含む末梢気道疾病、および肺気腫。ＣＯＰＤは肺機能の加速的かつ非可逆的な低下によって特徴づけられる。ＣＯＰＤ発症の主要危険因子は継続的なタバコ喫煙である。全喫煙者のわずかに約２０％しかＣＯＰＤにかからないので、遺伝的素因もこの疾病に寄与すると思われる。
【０００３】
ＣＯＰＤ発症の初期における最初の事象は炎症であり、小気道および大気道に影響を与える。喫煙によって引き起こされる刺激がマクロファージおよび好中球を引きつけ、喫煙者の痰中のそれらの数が増加する。絶え間ない喫煙は、損傷部位に炎症性細胞を集めるメディエーターをマクロファージ、好中球および上皮細胞から放出させることによって炎症性応答を引き起こす。これまでＣＯＰＤの経過を逆転させるために利用できる治療法は存在していない。禁煙は肺機能の衰えを減少させるかも知れない。わずかにいくつかの薬剤のみが患者の苦痛を和らげる。長期持続するβ２−アゴニストおよび抗コリン作動薬は一時的な気管支拡張を達成するために適用される。ＬＴＢ４−阻害剤、ＩＬ−８阻害剤、ＴＮＦα−阻害剤のような、炎症性事象に対する種々のアンタゴニストが研究されている。
慢性炎症性気道疾病は、活性化された炎症性免疫細胞、例えばマクロファージを特徴とすることができる。炎症過程の基礎を除去するためにマクロファージの機能を調節することが望まれる。
【０００４】
発明の記載
本発明において、マクロファージは炎症過程、好ましくは慢性炎症性気道疾病、より好ましくは慢性気管支炎またはＣＯＰＤに関与し、健康なドナーまたは刺激状態のドナー（活性化状態のマクロファージを実際に含む）のマクロファージ遺伝子発現のパターンとは異なる、示差的（ディファレンシャル）発現をする核酸配列およびタンパク質のパターンを示すことが見いだされた。したがって、マクロファージは異なる炎症状態下で異なる活性化レベルを示し、過活性化（ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ）状態が炎症過程、好ましくは慢性炎症性気道疾病、より好ましくは慢性気管支炎またはＣＯＰＤに関与していることが本発明において示される。本発明は、マクロファージの過活性化または過活性化状態の維持に関与するレセプターを調節する物質の同定を可能とすることにより、マクロファージの過活性化の阻害または過活性化状態の低下を提供する。
【０００５】
本発明は、炎症過程、好ましくは慢性炎症性気道疾病、より好ましくは気管支炎またはＣＯＰＤ、に関与するマクロファージの過活性化状態の誘導を生じさせるおよび／またはその維持に関与する、示差的に発現する核酸配列またはタンパク質の同定に基づいている。そのように示差的に発現する核酸配列またはタンパク質は以下ではそれぞれ、本発明のディファレンシャル発現核酸配列またはタンパク質と称する。特に、本発明はディファレンシャル発現核酸配列およびタンパク質の発現パターンによるマクロファージの表現型の変化と炎症過程におけるマクロファージの関与との関連を教示し、従って、種々の応用の基礎を提供する。例えば、本発明はマクロファージの本発明のディファレンシャル発現核酸配列またはタンパク質の発現レベルを決定するための方法およびテスト系を提供し、それにより、例えば、哺乳動物、好ましくはヒト、特に炎症性過程、好ましくは慢性炎症性気道疾病、より好ましくは慢性気管支炎またはＣＯＰＤにかかっている患者において、過活性化マクロファージが関与する炎症過程を診断又は監視する方法が提供される。
【０００６】
本発明はまた、本発明の方法のディファレンシャル発現核酸配列またはタンパク質によって、本発明のディファレンシャル発現核酸配列またはタンパク質を調節する、すなわちそれらに対して阻害因子または活性化因子として働く物質を同定する方法、それによって、マクロファージの過活性化を阻害するまたは過活性化状態を低減することによって慢性炎症性過程に積極的に影響を与える方法、および、それによってそのような疾病にかかった哺乳動物、好ましくはヒトを治療する方法に関する。本発明はまた、本発明のディファレンシャル発現核酸およびタンパク質をマクロファージにおいて選択的に調節する方法に関し、その方法は、前記タンパク質またはディファレンシャル発現核酸配列の調節因子であると決定された物質を投与することを含む。本発明は、炎症性過程、好ましくは慢性炎症性気道疾病、より好ましくは慢性気管支炎またはＣＯＰＤの治療を必要とする患者を治療するための前記物質の使用を含む。
【０００７】
本発明の最初の段階において、過活性化されていないマクロファージに比較して過活性化されたマクロファージにおいて異なる発現パターンを有するディファレンシャル発現核酸配列及びタンパク質が同定される。簡明化のため、本記載は特にＣＯＰＤに関与するマクロファージの研究を扱うが、他の慢性炎症性気道疾病、例えば慢性気管支炎にかかった患者の例でも同等の結果が観察されるであろう。種々の発現パターンを調べることは、以下の実施例に例示されるように、炎症性過程に関与するマクロファージの活性化状態に依存してマクロファージにおいて示差的に発現する、一連のディファレンシャル発現核酸配列の同定をもたらす。
【０００８】
簡単に言うと、そのようなディファレンシャル発現核酸配列は過活性化マクロファージまたはその細胞抽出物、例えば、ＣＯＰＤの炎症部位からのマクロファージ細胞またはその細胞抽出物、および、前記疾病にかかっていないが、タバコの煙に曝露されたような刺激状態にある対応する対照部位からのマクロファージ細胞またはその細胞抽出物を用いた比較発現プロファイリング実験（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）によって同定される。
ディファレンシャル発現するマクロファージ遺伝子の中で、過活性化していないマクロファージにおける対照レベルよりも低い、または高いレベルで発現することを特徴とするマクロファージ表面レセプタークラスをコードするディファレンシャル発現核酸配列クラスを同定することができるので、本発明のディファレンシャル発現核酸配列又はタンパク質は上述したような方法で容易に検出することができる。そのような、本発明のマクロファージ表面レセプターは以後ＩＬＭレセプターと呼ぶ。しかしながら、本発明は天然に現れるＩＬＭレセプターに関するだけでなく、ＩＬＭレセプターの意味する中にはＩＬＭレセプターと機能的に等価な、すなわち、ＩＬＭレセプターと結合能および細胞機能が共通するレセプターが含まれる。
【０００９】
本発明のＩＬＭレセプターの例は、ＦＰＲＬ−１レセプター（配列番号２）を含む、ＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプターである。本発明との関連で「レセプタータイプレセプター」、例えば、ＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプターとは、それぞれのレセプター、例えば配列番号２のＦＰＲＬ−１レセプターと「機能的に等価」な、すなわち、配列番号２のＦＰＲＬ−１レセプターと結合能及び細胞機能を共通にするレセプターである；この用語はまた天然に現れるレセプター、例えばＦＰＲＬ−１レセプター、あるいは天然に現れるレセプタータイプレセプター、例えばＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプター、の変種、変異体または断片を含み、ここで、前記変種、変異体または断片はレセプター、例えばＦＰＲＬ−１レセプターと機能的に等価なものである。
【００１０】
ＩＬＭレセプターの更なる例には、ＨＭ７４レセプター（配列番号２１）を含むＨＭ７４レセプタータイプレセプター；ＡＩＣＬレセプター（配列番号６）を含むＡＩＣＬレセプタータイプレセプター；ＩＬＴ１レセプター（配列番号１２）を含むＩＬＴ１レセプタータイプレセプター；ＳＨＰＳ−１レセプター（配列番号４）を含むＰＨＰＳ−１レセプタータイプレセプター；ＫＤＥＬレセプター１（配列番号８）を含むＫＤＥＬレセプター１タイプレセプター；およびＣＳＦ−１レセプター（配列番号１０）を含むＣＳＦ−１レセプタータイプレセプターが含まれる。配列表に示したそれぞれのレセプター、または同じ機能を有するその変種、変異体、若しくは断片が好ましく、配列表の配列番号２１、６、１２、４、８、１０に示したそれぞれのレセプターがより好ましい。更に好ましい実施態様において、レセプターは配列番号２０、５、１１、３、７または９の配列を有する核酸配列によってコードされる。
【００１１】
本発明との関連で好ましいＩＬＭレセプターの態様はＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプターである。用語ＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプターは天然に現れるＦＰＲＬ−１レセプターまたはＦＰＲＬ−１レセプタータイプレセプターの変種、変異体若しくは断片（これらの、変種、変異体若しくは断片はＦＰＲＬ−１レセプターと機能的に等価なもの）である。本発明の態様の記載において、より好ましい態様は配列番号２のＦＰＲ−１レセプター、またはそれと同じ機能を有するその変種、変異体または断片、さらに好ましい態様は配列番号２のＦＰＲＬ−１レセプターである。最も好ましい態様においてＦＰＲＬ−１レセプターは配列番号１に示した核酸配列によってコードされる。
【００１２】
本発明により、対照レベルよりも低いレベルで発現しているＩＬＭレセプターはマクロファージの過活性化を阻害またはマクロファージの過活性化状態を低下させるために活性化されることが好ましく、一方、、対照レベルよりも高いレベルで発現しているＩＬＭレセプターはマクロファージの過活性化を阻害またはマクロファージの過活性化状態を低下させるために阻害されることが好ましい。本発明との関連において、レセプターの機能とは炎症過程に影響を与えることのできる本発明のレセプターの一切の機能をいう。例えば、本発明のあるレセプターはリガンド（レセプターの細胞表面に露出した少なくとも一つのドメインに結合する能力を有するあらゆる物質）によって活性化され、炎症過程に関与する細胞内シグナルに至るという点で炎症を媒介するものである。
【００１３】
一つの実施態様において、本発明は、ある物質がＩＬＭレセプターの活性化因子であるかまたは阻害因子であるかを決定する方法に関し、前記レセプターが慢性炎症性起動疾病に関与するマクロファージにおいて好ましくは過剰発現またはダウンレギュレーションされて、調節解除されたものであり、前記レセプターが炎症媒介において重要な役割を果たすレセプターであることを特徴とする。本発明の方法は、注目している物質を、ＩＬＭレセプターの調節若しくはＩＬＭレセプター機能の調節があった場合に測定可能な読み取り情報を生成するテストシステムにかけることを含む。本発明の方法を行うために有用なテストシステムは細胞系または無細胞系を含む。例えば、本発明の一つの実施態様において、このシステムはディファレンシャル発現核酸配列の発現レベルに作用する物質のテストを可能にするために設計され、別の実施態様においてはこのシステムはレセプターと直接に相互作用する物質、または天然のリガンド若しくは人工的な、しかし適切なリガンドとの結合を阻害する物質のテストを可能にする。後のシステムは、テストされる物質が物理的に本発明のレセプターと接触することができ、その直接的相互作用が前記レセプター機能の変化の指標となる測定可能な読み取り情報を生じさせるような様式で、本発明のレセプターを含む。
【００１４】
細胞系を含む本発明の方法は、例えば、ＭｏｎｏＭａｃ６またはＴＨＰ−１細胞が使用される方法であって、前記細胞がホルボル１２−ミリステート１３−アセテートで刺激され、かつＬＰＳおよび煙から選ばれる物質で刺激される方法であってよい。
本発明は、ある物質が本発明に従って、本発明のＩＬＭレセプター機能の活性化因子であるかまたは阻害因子であるかを決定するテストシステムを提供し、このシステムは、レセプターが慢性炎症性気道疾病に関与し、炎症の媒介に役割を果たすものであることを特徴とし、少なくとも、ＩＬＭレセプター若しくは細胞中でＩＬＭレセプターを発現させることのできる発現ベクター、またはＩＬＭレセプターを発現させることのできる発現ベクターで形質転換された宿主細胞を含むシステムである。
【００１５】
ある物質が本発明のレセプター機能の活性化因子であるか阻害因子であるかを決定する方法を行うために、細胞系および無細胞系を使用することができる。この方法を実施するためのテストシステムは、例えば、この技術分野でよく知られた要素および方法を用いて設計し組み上げることができる。例えば、無細胞系は、例えば、本発明のレセプターを含む細胞区画または小胞を含んでよい。適切な細胞系には、例えば、適切な原核細胞または真核細胞、例えば本発明のそれぞれのレセプターを含む細胞が含まれる。本発明の前記方法を実施するために適切な細胞は、組換え技術によって、すなわち、所望の本発明のレセプターの発現させるために適切なベクターでトランスフォーメーション若しくはトランスフェクション後に得ることができ、または、本発明の所望のレセプターを発現している細胞株若しくは天然の供給源から単離されたものであっても良い。細胞系を含む本発明のテストシステムは、例えば、ＭｏｎｏＭａｃ６若しくはＴＨＰ−１細胞が使用され、これらの細胞がホルボル１２−ミリステート１３−アセテートで刺激され、かつＬＰＳおよび煙から選ばれる物質で刺激されるテストシステムであってもよい。本発明のテストシステムは、注目の物質が本発明のレセプターの阻害因子か活性化因子かをテストするために望ましいか必要である場合には、レセプターの天然のリガンドまたは人工リガンドを含んでも良い。
【００１６】
本発明のテスト方法は、読み取りデータの測定、すなわちテストシステムにおける表現型変化、例えば、細胞系が用いられる場合には、その細胞の表現型変化を測定することを含む。そのような変化は、例えば以下の実施例に詳細に記載したような、レセプターの活性化または阻害に対する細胞の天然に起こる応答でも人工的な応答であってもよい。
本発明のテスト方法は、一方である物質が本発明の阻害因子であるか活性化因子であるかを決定するために適切なハイスループットテストに有用であるが、例えば、ハイスループットテストにおいて同定されたヒットまたはリードの二次テストまたは評価のためにも有用である。
【００１７】
本発明はまた、本発明の方法により本発明のレセプターの阻害因子または活性化因子であると同定される物質に関する。本発明の物質は本発明のレセプターの機能を活性化、好ましくは阻害することのできる一切の化合物である。レセプターの機能を活性化または阻害する方法の例は、前記レセプターの発現レベルに影響を与えることによるものである。レセプターを活性化または阻害する方法の別の例は、レセプターに直接結合する物質を作用させ、それによって前記レセプターの機能ドメインを活性化または阻害することであり、これは作用させた物質の性質に依存して可逆的または不可逆的に行うことができる。
従って、レセプター機能を活性化または阻害するために有用な物質は、ディファレンシャル発現核酸配列の発現に作用する物質を含むが、また、レセプター自体に作用する物質も含む。従って、本発明に従って、「本発明の物質」の意味するところには、本発明のレセプターの遺伝子をコードする核酸配列、またはその断片若しくは変種であって、遺伝子発現レベルに影響を与えることのできるもの、例えば、アンチセンス核酸として適切な核酸分子、リボザイム、または３重らせん形成に適切なものが含まれるがこれらに限定されない。本発明の物質の別の例は、例えば、本発明のレセプターに直接結合する、または本発明のレセプターと適切なリガンドの結合を阻害し、それによってその機能に影響をあたえる抗体または有機若しくは無機化合物である。
【００１８】
更なる特徴において、本発明は、本発明によりディファレンシャル発現するＩＬＭレセプター核酸配列またはタンパク質の発現レベルを測定することを含み、マクロファージにおけるＩＬＭレセプターのレベルを測定するための方法に関する。そのような方法は、例えば、ある物質が活性化因子であるか阻害因子であるかを決定するための上述の方法において、ある物質がディファレンシャル発現核酸配列の発現レベルに影響を与え得るかどうかをテストするために利用できる。しかしながら、ディファレンシャル発現するＩＬＭレセプター核酸配列またはタンパク質の発現レベルを測定するための方法は、マクロファージの活性化状態をテストするために、例えば、診断目的または過活性化マクロファージによって生じる疾病の治療の成功性を調べるためにも利用できる。従って、本発明は、本発明に従ってマクロファージにおいて発現しているレセプターのレベルを測定することを含む、慢性炎症性疾病の診断またはそのような疾病のモニタリング方法、例えばそのような疾病の治療を必要とする患者における治療の成功性をモニタリングする方法に関する。前記マクロファージは好ましくは哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞である。従って、本発明のマクロファージは好ましくは哺乳動物の炎症部位から、より好ましくはヒトの炎症部位から得られる。
【００１９】
本発明によりレセプターの発現レベルを測定する方法は、発現レベルを測定する目的に応じて、それぞれのＲＮＡ転写物の濃度をハイブリダイゼーション技術またはルシフェラーゼアッセイのようなレポーター遺伝子駆動アッセイによって測定する、またはレセプタータンパク質を確認するためにそれぞれの抗体を用いてレセプターのタンパク質濃度を測定することのような既知の方法によって行うことができる。
本発明は、慢性炎症性気道疾病の治療のための、本発明の物質の使用に関する。本発明の別の実施態様は、ある物質が活性化因子であるか阻害因子であるかを決定するための本発明の方法を用いて活性化因子または阻害因子であるとして決定された少なくとも一つの本発明の物質を含む医薬組成物であって、本発明のそれぞれのレセプターが本発明の炎症性気道疾病に関与する本発明のマクロファージにおいて過剰発現しているものである、前記医薬組成物に関する。本組成物はそれ自体は既知の方法により、例えば、慣用的な混合製法、顆粒化製法、糖衣錠製法、微粒子製法、乳化製法、カプセル化法、エントラッピング法または凍結乾燥法により製造することができる。
【００２０】
慢性炎症性気道疾病の治療用薬剤として本発明の活性化物質または阻害物質を使用するために、これらの物質を動物モデル、例えば炎症性気道疾患にかかった動物、または本発明のレセプターを発現しているトランスジェニック動物でテストすることができる。本発明の物質の毒性および治療効能は標準的な製薬的手順によって決定することができ、これには、細胞培養および動物実験を行ってＩＣ５０、ＬＤ５０およびＥＤ５０を測定することが含まれる。得られたデータは動物の、より好ましくはヒトの用量を決定するために使用するが、これは投与形態（錠剤、カプセル、エアロゾル噴霧、アンプル等）および投与経路（例えば、経皮、経口、口内、経鼻、経腸、非経口、吸入、気管内、または経直腸）にも依存するであろう。
【００２１】
本発明の物質の少なくとも一つを活性成分として含む医薬組成物は慣用的な方法で製剤化することができる。そのような製剤を製造する方法は、いくつかのマニュアル、例えば”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ”に見ることができる。少なくとも一つの本発明の物質を製剤化するために有用な成分の例はＷＯ ９９／１８１９３にも見ることができ、これは引用により本明細書に取り込まれるものとする。
更なる特徴において、本発明は本発明による慢性炎症性疾病を治療する方法を教示し、その方法はそのような治療を必要とする患者、好ましくはヒトに、本発明に従って本発明のＩＬＭレセプターの活性化因子または阻害因子であることが決定された少なくとも一つの物質を含む医薬組成物の適切な量を投与することを含み、前記レセプターが本発明のマクロファージにおいて過剰発現しており本発明に従って慢性炎症性気道疾病に関与する炎症の媒介に役割を有するものであることを特徴とする。
別の態様において、本発明は、マクロファージにおけるＩＬＭレセプター濃度を選択的に調節する方法に関し、その方法は本発明のレセプターの活性化因子または阻害因子であると決定された物質を投与することを含む。
以下の実施例は本発明を例示するためのものであって、限定と解すべきではない。しかしながら、これらの実施例は本発明の最良の実施態様を記載したものである。
【００２２】
（実施例）
実施例１．比較発現プロファイリングおよびＦＰＬＲ−１クローニング
以下はどのように本発明のレセプターを同定するための比較発現プロファイリングを行えるかを例示したものである。
１．１．　患者の選抜
患者の３つのグループを調べる：健康な非喫煙者、健康な喫煙者およびＣＯＰＤの患者
肺機能を評価するために患者は肺活量測定を行う。年齢と身長に基づく簡単な計算を使用して結果を解析する。ＣＯＰＤの患者はその予測ＦＥＶ１％が７０％未満であれば含める。健康な喫煙者は年配者で喫煙履歴はＣＯＰＤ患者と同等であるが正常な肺機能をもっている。健康な非喫煙者は正常な肺機能を有しており喫煙経験はない。最後のグループは喘息を排除するためにメタコリン攻撃を受ける。この技術は患者に与えるメタコリンの用量を増加させることが必要であり、各投与の間に肺活量を測定する。ＦＥＶ１が２０％減少したときテストを止め、ＰＣ２０を計算する。これはＦＥＶ１の２０％減少を生じさせるメタコリンの用量であり、喘息がないことの証拠としては３２より大きな値が必要である。すべての患者は一般的なアレルゲンに対する皮刺テストを行い、陰性結果を得る必要がある。これによりアトピー性個体が排除される。付随する疾病を排除するため患者の臨床手履歴を監視し調べる。
【００２３】
１．２．　ＢＡＬ（気管支肺胞洗浄）手順
患者をミダゾラムで鎮静させてからＢＡＬを行う。喉の後ろを麻酔するために局所麻酔剤噴霧を行う。７ｍｍオリンパス気管支鏡を使用する。洗浄領域は右の中肺葉とする。２５０ｍｌの滅菌生理食塩水を注入し直ちに吸引する。得られた吸引物はマクロファージを含んでいる。
【００２４】
１．３．　ＢＡＬ処理
ＢＡＬを滅菌ガーゼを通してろ過し残渣を除去する。細胞をＨＢＳＳで２回洗浄し、１ｍｌのＨＢＳＳ（ハンクス平衡化塩溶液）に再懸濁して計測する。１５ｍｌのＦａｌｃｏｎ青キャップポリプロピレンを用いてマクロファージをスピンしてペレット化し、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に、１０７個の細胞あたり１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ試薬の濃度で再懸濁し、−７０℃で凍結する。
【００２５】
１．４．　ディファレンシャル遺伝子発現解析
総ＲＮＡを実施例１．３に従って得られたマクロファージサンプルから抽出する。Ｔｒｉｚｏｌ中の細胞懸濁液をピペッティングしてホモゲナイズし、室温にて５分間インキュベーションする。１ｍｌのＴｒｉｚｏｌあたり２００μｌのクロロホルムを添加し、混合物を注意深く１５秒間混合し、さらに３分間室温にてインキュベーションする。サンプルを４℃にて１００００ｇで１５分間遠心する。上層を新しい反応チューブに移し、１ｍｌのＴｒｉｚｏｌあたり０．５ｍｌのイソプロパノールを加えて室温にて１０分間ＲＮＡを沈殿させる。次に、沈殿物を微量遠心機を用いて１０分間、４℃にて１００００ｇでペレット化する。ペレットを７５％エタノールで２回洗浄し、風乾し、ＤＥＰＣ−Ｈ２Ｏに再懸濁する。
【００２６】
Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）でＲＮＡ生成を行いＲＮＡの純度を改善する。ＲＮＡの純度はアガロース電気泳動で決定し、濃度は２６０ｎｍにおけるＵＶ吸収により測定する。
５μｌの各ＲＮＡをｃＤＮＡ合成のために使用する。第１および第２鎖合成はＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＣｈｏｉｓｅシステム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で行う。総量１１μｌのＲＮＡと１μｌの１００μＭのＴ７−（ｄｔ）２４プライマー（配列は配列番号１３に記載）を７０℃まで１０分間加熱し、氷上で２分間冷却する。最終濃度１ｘの第１鎖バッファー、１０ｍＭの濃度のＤＴＴおよび最終濃度０．５ｍＭのｄＮＴＰ混合物を加えて最終体積を１８μｌとする。反応混合物を４２℃にて２分間インキュベーションし２μｌのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ）を加える。第２鎖合成のために１．１５ｘの第２鎖バッファー、２３０μＭのｄＮＴＰｓ、１０Ｕの大腸菌ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／μｌ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ（１０Ｕ／μｌ）、ＲＮａｓｅＨ（２Ｕ／μｌ）を含む１３０μｌの混合物を第１鎖合成反応液に加え、ピペットで注意深く混合する。第２鎖合成は１６℃にて２時間行い、次に２μｌのＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ）を添加し、１６度にて５分間インキュベーションし、１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加して反応を停止させる。
【００２７】
ｃＲＮＡ合成の前に二本鎖ｃＤＮＡを精製する。ｃＤＮＡを当量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）と混合し、微量遠心機にてフェーズロックゲル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）のゲルマトリックスを通してスピンしてｃＤＮＡを未結合ヌクレオチドから分離する。水性相を酢酸アンモニウムとエタノールで沈殿させる。続いて、このｃＤＮＡを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を行う。ｃＲＮＡ合成はＥＮＺＯ ＢｉｏＡｒａｙ　Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔラベリングキットを用い、製造業者のプロトコル（ＥＮＺＯ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ）に従って行う。簡単に言えば、ｃＤＮＡを１ｘＨＹ反応バッファー、１ｘビオチン標識リボヌクレオチド、１ｘＤＴＴ、１ｘＲＮａｓｅインヒビターミックス、および１ｘＴ７ ＲＮＡポリメラーゼと総量４０μｌで３７℃にて５時間インキュベーションする。次に、反応混合物をＲＮｅａｓｙカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ）により精製し、ｃＲＮＡを酢酸アンモニウムとエタノールで沈殿させ、最後にＤＥＰＣ−処理水に再懸濁する。濃度は２６０ｎｍにおけるＵＶ分光測定によって決定する。残りのｃＲＮＡは１ｘ断片化バッファー（５ｘ断片化バッファー：２００ｍＭのＴｒｉｓアセテート、ｐＨ８．１、５００ｍＭ ＫＯＡｃ、１５０ｍＭ ＭｇＯＡｃ）で９４℃にて３５分間インキュベーションする。
【００２８】
ＤＮＡチップのハイブリダイゼーションのためには、１５μｇのｃＲＮＡを使用し、５０ｐＭのビオチン標識対照Ｂ２オリゴヌクレオチド（配列は配列番号１４に記載）、１ｘｃＲＮＡカクテル、０．１ｍｇ／ｍｌニシン精子ＤＮＡ、０．５ｍｇ／ｍｌのアセチル化ＢＳＡ、１ｘＭＥＳ（２−［Ｎ−モルホリノ］−エタンスルホン酸）ハイブリダイゼーションバッファーと総体積３００μｌ中で混合する。このハイブリダイゼーション混合物を９９℃まで５分間加熱し、１０分間４５℃に冷却し、２００μｌの混合物をプローブアレイを満たすために使用する。ハイブリダイゼーションは４５℃にて６０ｒｐｍで１６時間行う。
ハイブリダイゼーション後、チップ上のハイブリダイゼーション混合物を３００μｌの非ストリンジェント洗浄バッファー（１００ｍＭ ＭＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｎ２０）で置換する。チップをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｆｌｕｉｄｉｃｓステーションに挿入し、洗浄と染色をＥｕｋＧＥ−ＷＳ２プロトコルに従って行う。チップあたりの染色溶液は６００μｌの１ｘ染色バッファー（１００ｍＭ ＭＥＳ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０）、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌのＳＡＰＥ（ストレプトアビジンフィコエリトリン）（Ｄｉａｎｏｖａ）からなり、抗体溶液は１ｘ染色バッファー、２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．１ｍｇ／ｍｌのヤギＩｇＧ、３μｇ／ｍｌビオチン化抗体からなる。洗浄および染色工程後、チップをＨＰ Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）でスキャンする。データ解析はＣＯＰＤ喫煙者から単離したＲＮＡとハイブリダイズさせたチップと健康な喫煙者から単離したＲＮＡからハイブリダイズさせたチップとの２つ組間の比較によって行う。
【００２９】
同定された、示差的に発現された核酸配列の一つはＦＰＲＬ−１（ホルミルペプチドレセプター様−１）レセプターである（ＬＸＡ４Ｒ、ＨＭ６３、ＦＰＲ２、ＦＰＲＨ２、ＦＭＬＰ−Ｒ−ＩＩ、Ｌｉｐｏｘｉｎ Ａ４レセプターともいう）；配列番号１および２を参照。これはｆＭＬＰ（Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニン）、ＩＬ−８またはＣ５ａを含む化学誘引物質ペプチドレセプターファミリーに属する。これらのレセプターは７つの膜貫通ヘリックスモチーフとヘテロトライマーＧ−プロテインを介したシグナルを示す。ＦＰＲＬ−１レセプターはリポキシンＡ４（ＬＸＡ４）に対する高親和性レセプターとして同定された（Ｍｕｒｐｈｙら、１９９２）。
肺胞マクロファージはリポキシンを産生することが示されており、このリポキシンは１５−リポキシゲナーゼによって合成される（Ｋｉｍ １９８８）。リポキシンＡ４（ＬＸＡ４）は単球において走化性、付着およびカルシウム放出を刺激する。好中球においては、ＬＸＡ４は走化性及び付着を阻害し上皮細胞からの遊走をダウンレギュレーションする（ＭａｄｄｏｘとＳｅｒｈａｎ １９９６）。ＬＸＡ４は喘息の患者からのＢＡＬで上昇していることが見いだされた（Ｌｅｅら、１９９０、Ｓｅｒｈａｎ １９９９）。特に、ＬＸＡ４はヒトの気管支の用量依存性萎縮を生じさせることが見いだされた（Ｃｈｒｉｓｔｉｅら、１９９２）。ＬＸＡ４は肺における炎症の包括的な調節因子であると考えられる。
【００３０】
１．５．　ＣＯＰＤマクロファージにおいて過剰発現するＦＰＲＬ−１レセプター
ＦＰＲＬ−１レセプターは健康な喫煙者に比べてＣＯＰＤ喫煙者において首尾一貫してアップレギュレーションされることが見いだされる（６６．７％）。これは４２組の比較による「変化倍数」（”ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ”）計算値、および平均差異（”ａｖｇ ｄｉｆｆ”）として示されている（表１、２）。非喫煙者および健康な喫煙者の相対的発現レベルは類似しており、発現レベルの上昇はＣＯＰＤの患者に限られている。従って、ＣＯＰＤ特異的な影響がアップレギュレーションを引き起こす。
【００３１】
表１：ＦＰＲＬ−１レセプターの発現パターン：ＣＯＰＤおよび健康な喫煙者間で比較した４２組について計算した変化倍数。２倍より高い値および−２倍より低い値のみを制御を脱調節されたものと考える。従って、ＦＰＲＬ−１レセプターは２８例でアップレギュレーションされ、１４例で調節されていない。
【００３２】
【表１】
2004507262.tif 000002
【００３３】
表２：ＦＰＲＬ−１レセプターの発現レベル：”ａｖｇ ｄｉｆｆ”値、チップ上のハイブリダイゼーションシグナルの強度の相対的指標、各患者について示してある；ＯＳは閉塞症喫煙者、ＨＳは健康な喫煙者、ＮＳは非喫煙者を表す。
【００３４】
【表２】
2004507262.tif 000003
ＣＯＰＤ喫煙者と健康な喫煙者との間の比較に関するＰ値：０．０２
【００３５】
ＦＰＲＬ−１レセプターに関するチップデータはＴａｑＭａｎ解析（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｌｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって確認する。ＴａｑＭａｎによって得られる変化倍数は遺伝子チップからのデータとよく似ている（表３）。
【００３６】
【表３】
表３：遺伝子チップ及びＴａｑＭａｎによって決定された、ＣＯＰＤ喫煙者におけるＦＰＲＬ−１レセプターのアップレギュレーション。ＣＯＰＤ喫煙者と健康喫煙者間の６つの比較におけるチップデータによるＦＰＲＬ−１の変化倍数測定は同じサンプルのＴａｑＭａｎによって確認され、相対アップレギュレーションはＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として計算する。
2004507262.tif 000004
【００３７】
同定された別のディファレンシャル発現核酸配列は、Ｇ−プロテイン共役レセプターのファミリーに属するＨＭ７４レセプター（配列番号２０およ２１参照）をコードする。ＨＭ７４レセプターはヒト単球ライブラリーからクローニングされた（Ｎｏｍｕｒａら、１９９３）。これまでにそのリガンドは同定されていない。ＨＭ７４レセプターはＣＯＰＤ喫煙者において健康喫煙者に比較して首尾一貫してアップレギュレーションされていることが見いだされる（５４．８％）。これは、４２組の比較による「変化倍数」値（表５）および”ａｖｇ ｄｉｆｆ”値によって示してある（表６）。
【００３８】
【表４】
表５．ＨＭ７４レセプターの発現パターン：ＣＯＰＤおよび健康な喫煙者間で比較した４２組について計算した変化倍数。２倍より高い値および−２倍より低い値のみを脱調節されたものと考える。従って、ＨＭ７４レセプターは２３例でアップレギュレーションされ、１７例で調節されていない。
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【００３９】
【表５】
表６：ＨＭ７４レセプターの発現レベル。”ａｖｇ ｄｉｆｆ”値、チップ上のハイブリダイゼーションシグナルの強度の相対的指標、各患者について示してある；ＯＳは閉塞症喫煙者、ＨＳは健康な喫煙者、ＮＳは非喫煙者を表す。
2004507262.tif 000006
【００４０】
ＨＭ７４レセプターに関するチップデータはＴａｑＭａｎ解析（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｌｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって確認する。ＴａｑＭａｎによって得られる変化倍数は遺伝子チップからのデータとよく似ている（表７）。
【００４１】
【表６】
表７．遺伝子チップ及びＴａｑＭａｎによって決定された、ＣＯＰＤ喫煙者におけるＨＭ７４レセプターのアップレギュレーション。ＣＯＰＤ喫煙者と健康喫煙者間の６つの比較におけるチップデータによるＨＭ７４の変化倍数測定は同じサンプルのＴａｑＭａｎによって確認され、相対アップレギュレーションはＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子として計算する。
2004507262.tif 000007
【００４２】
同定された別の別のディファレンシャル発現核酸配列は、Ｎ−アセチルガラクトサミンまたはＮ−アセチルグルコサミンを認識し結合するＩＩ型膜タンパク質である、ＡＩＣＬレセプター（活性化−誘導Ｃ−型レクチン）（Ｏｄａら、１９８８）をコードする（配列番号５および６参照）。これはリンパ組織および造血細胞およびＮＫおよびＴ細胞で発現している。この発現はリンパ細胞活性化の過程、およびＰＭＡ刺激後に誘導される（Ｈａｍａｎｎら、１９９７）。ＡＩＣＬレセプターのホモログはリンパ細胞のシグナル伝達およびリンパ細胞の増殖に関与しているので、ＡＩＣＬレセプターがこれらの過程にも関与していると仮定することはもっともらしい（Ｈａｍａｎｎら、１９９３）。
ＡＩＣＬレセプターは健康喫煙者に比較してＣＯＰＤ喫煙者では首尾一貫してアップレギュレーション（６６．７％）されることが見いだされる。これは、４２組の比較による「変化倍数」値（表８）および”ａｖｇ ｄｉｆｆ”値によって示してある（表９）。
【００４３】
【表７】
表８．ＡＩＣＬレセプターの発現パターン：ＣＯＰＤおよび健康な喫煙者間で比較した４２組について計算した変化倍数。２倍より高い値および−２倍より低い値のみを脱調節されたものと考える。従って、ＡＩＣＬレセプターは２８例でアップレギュレーションされ、１４例で調節されていない。
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【００４４】
【表８】
表９．ＡＩＣＬレセプターの発現レベル：”ａｖｇ ｄｉｆｆ”値、チップ上のハイブリダイゼーションシグナルの強度の相対的指標、各患者について示してある；ＯＳは閉塞症喫煙者、ＨＳは健康な喫煙者、ＮＳは非喫煙者を表す。
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【００４５】
同定された、別のディファレンシャル発現核酸配列はＩＬＴ１レセプター（イムノグロブリン様転写物１）をコードする（配列番号１１および１２参照）。ＩＬＴ１レセプターはＭＨＣクラスＩ分子に対するＮＫ細胞レセプターに類似した活性化レセプターのサブセットに関連するＩｇスーパーファミリーに属する。ＩＬＴ１レセプターは６９ｋＤａのグリコシル化膜貫通レセプターであり、肺及び肝臓および単球、顆粒球、マクロファージおよび樹状細胞で主として発現している（ＳａｍａｒｉｄｉｓとＣｏｌｏｎｎａ　１９９７）。抗体と架橋されるとＩＬＴ１レセプターはＦｃレセプターのγ−鎖と相互作用する（ＦｃεＲＩγ）（Ｎａｋａｊｉｍａら、１９９９）。ＩＬＴ１レセプターは、健康喫煙者に比較してＣＯＰＤ喫煙者では首尾一貫してアップレギュレーション（５９．５％）されていることが見いだされる。これは、４２組の比較による”ａｖｇ ｄｉｆｆ”値によって示してある（表１０）。ＣＯＰＤ喫煙者と健康喫煙者との間の比較に関するｐ値は０．０１であった。
【００４６】
【表９】
表１０．ＩＬＴ１レセプターの発現レベル：各患者についての”ａｖｇ ｄｉｆｆ”値は３つの患者グループについての平均値及びメジアン値と共に示してある。；ＯＳは閉塞症喫煙者、ＨＳは健康な喫煙者、ＮＳは非喫煙者を表す。
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【００４７】
同定された、ディファレンシャル発現核酸配列は、マクロファージで高度に発現することが知られているＳＨＰＳ−１レセプター（ＳＩＲＰ−α１、ＭＹＤ１、ＭＦＲ）（Ｆｕｊｉｏｋａら、１９９６、Ｋｈａｒｉｔｏｎｅｎｋｏｖら、１９９７、Ｂｒｏｏｋｅら１９９８）（配列番号３および４参照）をコードする。ＳＨＰＳ−１レセプターはイムノグロブリンスーパーファミリーに属する膜貫通糖タンパク質である。これは３つの細胞外Ｉｇ様ドメイン、予測されるチロシンリン酸化部位を有する細胞質尾部およびイムノレセプターチロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む。レセプターチロシンキナーゼが活性化されるとＳＨＰＳ−１レセプターのリン酸化が起こり、ＳＨＰ−１との会合（マクロファージにおいて）またはＳＨＰ−２との会合（非造血細胞において）が生じる（Ｖｅｉｌｌｅｔｔｅら、１９９８）。さらに、他のタンパク質がＳＨＰＳ−１レセプターの細胞質内ドメインと会合することが見いだされており、従って、ＳＨＰＳ−１レセプターが足場タンパク質として機能すると仮定することはもっともらしい。
ＳＨＰＳ−１レセプターは健康喫煙者に比較してＣＯＰＤ喫煙者においては首尾一貫してダウンレギュレーション（７３．８％）されていることが見いだされる。このことは、４２組の比較による「変化倍数」値（表１１）および”ａｖｇ ｄｉｆｆ”値（表１２）によって示される。ＣＯＰＤ喫煙者と健康喫煙者との間の比較に関するｐ値は０．００５である。
【００４８】
【表１０】
表１１．ＳＨＰＳ−１レセプターの発現パターン：ＣＯＰＤおよび健康な喫煙者間で比較した４２組について計算した変化倍数。２倍より高い値および−２倍より低い値のみを脱調節されたものと考える。従って、ＳＨＰＳ−１レセプターは２９例でダウンレギュレーションされ、１３例で制御されていない。
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【００４９】
【表１１】
表１２．ＳＨＰＳ−１レセプターの発現レベル：各患者についての”ａｖｇ ｄｉｆｆ”値は３つの患者グループについての平均値及びメジアン値と共に示してある。；ＯＳは閉塞症喫煙者、ＨＳは健康な喫煙者、ＮＳは非喫煙者を表す。
2004507262.tif 000012
【００５０】
同定された、別のディファレンシャル発現核酸配列は、エンドプラズミックレティキュラムにおけるタンパク質フォールディングおよびアッセンブルに重要な機能を有するレセプターであるＫＤＥＬレセプター１（配列番号７および８参照）をコードする。これは、アミノ酸配列Ｋ−Ｄ−Ｅ−Ｌを有する可溶性タンパク質を認識し、それらのタンパク質をエンドプラズミックレティキュラムに結合後回収する（Ｔｏｗｎｓｌｅｙら、１９９３）。ＫＤＥＬレセプター１はゴルジ複合体におけるタンパク質輸送の制御に関与しているかも知れない。リガンドが結合するとＫＤＥＬレセプターは二量体化しＡＲＦ ＧＡＰ（ＡＤＰリボシル化因子のＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質）と相互作用する（Ａｏｅら、１９９７）。これは健康喫煙者に比較してＣＯＰＤ喫煙者においては首尾一貫してダウンレギュレーション（７１．４％）されていることが見いだされる。このことは、”ａｖｇ ｄｉｆｆ”値（表１３）によって示される。ＣＯＰＤ喫煙者と健康喫煙者との間の比較に関するｐ値は０．００３である。
【００５１】
【表１２】
表１３．ＫＤＥＬレセプターの発現レベル：各患者についての”ａｖｇ ｄｉｆｆ”値は３つの患者グループについての平均値及びメジアン値と共に示してある。；ＯＳは閉塞症喫煙者、ＨＳは健康な喫煙者、ＮＳは非喫煙者を表す。
2004507262.tif 000013
【００５２】
同定された別のディファレンシャル発現核酸配列はマクロファージコロニー刺激因子−１レセプター前駆体（ＣＳＦ−１レセプター、ｃ−ｆｍｓ）をコードする；配列番号９および１０参照。ＣＳＦ−１レセプターはレセプターチロシンキナーゼのサブファミリーに属する。ＣＳＦ−１レセプターの活性化は複数のタンパク質、例えば、ＣＳＦ−１レセプター、Ｓｈｃ、ＰＩ３Ｋ、Ｇｒｂ２、Ｃｂｌ、ＳＨＰ−１、Ｓｒｃ、の複合体形成を生じさせる。更に、リガンドの結合は、Ｃｂｌ、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５ａ、ｐ８５ＰＩ３Ｋ、ＳＨＰ−１、Ｖａｖのような細胞質タンパク質および細胞骨格形成に関与するタンパク質過剰の迅速なチロシンリン酸化を引き起こす（Ｙｅｕｎｇら、１９９８）。ＣＳＦ−１レセプターは単核食細胞の生存、増殖、分化および形態を制御している（Ｈａｍｐｅら、１９８９）。ＣＳＦ−１レセプターは健康喫煙者に比較してＣＯＰＤ喫煙者においては首尾一貫してダウンレギュレーション（４５．２％）していることが見いだされる。このことは、”ａｖｇ ｄｉｆｆ”値（表１４）によって示される。ＣＯＰＤ喫煙者と健康喫煙者との間の比較に関するｐ値は０．００２である。
【００５３】
【表１３】
表１４．　ＣＳＦ−１レセプターの発現レベル：各患者についての”ａｖｇ ｄｉｆｆ”値は３つの患者グループについての平均値及びメジアン値と共に示してある。；ＯＳは閉塞症喫煙者、ＨＳは健康な喫煙者、ＮＳは非喫煙者を表す。
2004507262.tif 000014
【００５４】
１．６．　ＤＮＡチップデータの確認および診断のためのＴａｑＭａｎ解析の使用
ＤＮＡチップによって得られたｍＲＮＡ発現プロファイルは同じＲＮＡ調製物によりＴａｑＭａｎ解析によって確認される。さらに、この方法は培養細胞株およびヒトから単離した細胞中のＦＰＲＬ−１レセプターのｍＲＮＡレベルを測定して疾病の進行をモニターするためにも応用される。
１０ｎＭのレチノイン酸で３日間処理したＵ９３７細胞から単離したＲＮＡを用いてＦＰＲＬ−１レセプターのｍＲＮＡレベルを測定するための反応条件を最適化しＦＰＲＬ−１レセプターおよびハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）のための標準曲線を設定する。ＦＰＲＬ−１レセプターの定量は以下のプライマーを用いて行う：フォワードプライマー（ＦＰ）（配列番号１７参照、逆プライマー（ＲＰ）、配列番号１８参照、およびレポーター色素ＦＡＭで５’を、消光色素ＴＭＡＲＡで３’末端を標識されたＴａｑＭａｎプローブ（ＴＰ）、配列番号１９参照。
【００５５】
ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを測定するために、市販のキット”ＴａｑＭａｎ ＧＡＰＤＨ ＣＯｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ”（Ｐ／Ｎ ４０２８６９）（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する。ＧＰＰＤＨプローブはＪＯＥをレポーター色素として、ＴＭＡＲＡを消光色素として標識する。ＲＴ−ＰＣＲ反応は”ＴａｑＭａｎ ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔｓ”（Ｐ／Ｎ Ｎ８０８−０２３６） （Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）キットを使用して行う。ＦＰＲＬ−１およびＧＡＰＤＨのための標準曲線は１μＭのレチノイン酸で処理したＵ９３７細胞からのＲＮＡ濃度を、各アッセイについて０，５、１０、２５、５０、１００ｎｇの範囲で増加させて行う。反応混合物は１ｘＴａｑＭａｎ ＥＺ−バッファー、３ｍＭ Ｍｎ（Ｏａｃ）２、３００μＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、および６００μＭ ｄＵＴＰ、２．５Ｕ ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、０．２５Ｕ ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧを総体積２５μｌ中に含む。ＦＰＲＬ−１レセプタ−の解析のためには、反応混合物は３００ｎＭのＦＰおよびＲＰおよび１００ｎＭのＴＰを含む。ＧＡＤＰＨレベルを測定するためのプライマー濃度は各プライマーについて２００ｎＭでありＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブについては１００ｎＭである。
【００５６】
ＦＰＲＬ−１レセプターおよびＧＡＰＤＨのヒト患者および細胞株におけるｍＲＮＡレベルを測定するため、反応当たり１６〜５０ｎｇのＲＮＡを使用する。全てのサンプルは３つ組で走らせる。反応はＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ キャップでシールした”ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−穴反応プレート“（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ） により、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で行う。ＰＣＲ条件は、５０℃２分間、６０℃３０分間、９５℃５分間、続いて９４℃２０秒間および５９℃１分間を４０サイクルである。データ解析はＦＰＲＬ−１レセプターおよびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを標準曲線に従って決定するか、または、ＦＰＲＬ−１レセプターのＣＴ値をＧＡＰＤＨのＣＴ値に直接関連づけるかして行う。後者は、どちらの反応の効率も９５％付近なのでこれらの遺伝子について行うことができる。同じ方法を用いてＣＯＰＤ患者から単離したｍＲＮＡレベルを調べ疾病の診断または想定される活性薬剤で治療後にその治療の成功性をモニターする。
実施例１．５において述べた他のレセプターはそれぞれに適切なプライマーを用いてしかるべく調べられる。
【００５７】
１．７．　細胞系
ヒト単球／マクロファージ細胞株ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１およびＭｏｎｏＭａｃ６を細胞モデル系として使用する。１０％ＦＣＳを含み１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンおよび１ｘ非必須アミノ酸を添加したＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を増殖させる。ＭｏｎｏＭａｃ６細胞用の培地は５ｍｌ／ｌ ＯＰＩ培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ）も含む。ＭｏｎｏＭａｃ６はもっぱら２４穴プレートで培養する。全ての細胞は５％ＣＯ２を含む湿大気中で３７℃にて維持し、定期的にマイコプラズマによる汚染についてテストする。１０ｎＭ ＰＭＡ（ホルボル１２ミリステート−１３アセテート）を培地に添加して分化を行わせる。
【００５８】
１．８．　ＦＰＲＬ−１レセプターのクローニング
ＦＰＲＬ−１レセプターは１μＭのレチノイン酸で３日間処理したＵ９３７細胞から抽出した総ＲＮＡからクローン化する。５μｇのＲＮＡを５ｎｇのオリゴ（ｄｔ）１８プライマー、１ｘ第１鎖バッファー、１０ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ｄＮＴＰｓおよび２ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で４２℃にて５０分間逆転写してｃＤＮＡにする。次に、反応を７０℃、１５分間で停止させｃＤＮＡ濃度をＵＶ分光計で測定する。ＦＰＲＬ−１レセプターの増幅には１００ｎｇのｃＤＮＡおよび１０ｐｍｏｌのＦＰＲＬ−１レセプターについて配列特異的なプライマー（フォワードプライマーａｔｔＢ１；配列番号１５、および逆プライマーａｔｔＢ２；配列番号１６）をＰＣＲに使用する。反応条件は以下の通り：Ｔａｑポリメラーゼを用いて、９４℃２分間、続いて３０サイクルの（９４℃３０秒間、５３℃３０秒間、７２℃９０秒間）、続いて７２℃にて７分間。反応混合物を２％アガロースゲル上で分離し、約１０００ｂｐのバンドを切り出しＱＩＡＥＸ ＩＩ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製する。精製したバンドの濃度を測定し、約１２０ｎｇを３００ｎｇのｐＤＯＮＲ２０１（Ｇａｔｅｗａｙシステム用のドナーベクター）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１ｘＢＰクロナーゼ反応バッファー、ＢＰクロナーゼ酵素混合物と総体積２０μｌにて２５℃、６０分間インキュベーションする。次に反応混合物を２μｌのプロテイナーゼＫと３７℃にて１０分間インキュベーションする。反応混合物を次にコンピテントＤＢ３．１細胞にエレクトロポレーションし、カナマイシン含有プレートにプレーティングする。配列番号１に記載の核酸配列を保持するｐＤＯＮＲ−ＨＭ６３と命名したクローンを更なる実験に使用する。
実施例１．５で述べた他のレセプターも同様な方法を用いてクローニングする。
【００５９】
１．９．　ＦＰＲＬ−１レセプターのトランスフェクション
１．８に記載のＦＰＲＬ−１を含むベクターを使用してＦＰＲＬ−１レセプターのｃＤＮＡをＧａｔｅｗａｙクローニングシステム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｏｎｏｌｏｇｉｅｓ）のａｔｔＲ１およびａｔｔＲ２組換え部位を有する発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ａｔｔＲに移す。ここで、ＦＰＲＬ−１レセプターはＣＭＶプロモーターの制御下で発現される。１５０ｎｇの「エントリー」ベクターｐＤＯＮＲ−ＨＭ６３を１５０ｎｇの「デスティネーションベクター」ｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ａｔｔＲ、４μｌのＬＲクロナーゼ酵素ミックス、４μｌのＬＲクロナーゼ反応バッファー、と共にＴＥ（Ｔｒｉｓ／ＥＤＴＡ）によって２０μｌにして混合し、２５℃にて６０分間インキュベーションする。２μｌのプロテイナーゼＫ溶液を加え、３７℃にて１０分間インキュベーションする。１μｌの反応混合物を５０μｌのＤＨ５αへ形質転換する（氷上で３０分間ＤＮＡと共に細胞をインキュベーションした後４２℃にて３０秒間の熱ショックをかける）。細胞の熱ショック後４５０μｌのＳ．Ｏ．Ｃを添加し、細胞を３７℃にて６０分間インキュベーションする。細胞（１００μｌ）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢプレートにプレーティングし、一晩インキュベーションする。
ＦＰＲＬ−１レセプターをインサートとして有するｐｃＤＮＡ３．１（＋）／ａｔｔＲを含むコロニーをｐｃＤＮＡ／ＦＰＲＬ１と命名しトランスフェクション研究に使用する。
１．５に記載した他のレセプターをコードする核酸配列を保持する１．８で得られるベクターを含む細胞クローンは類似の方法で調製する。
【００６０】
実施例２：細胞系およびＦＰＬＲ−１レセプターの表現型効果
ＦＰＲＬ−１レセプターについて実施例２に記載したのと類似の方法を１．５に記載した他のレセプターを用いて行うことができる。
２．１．　細胞系
ヒト単球／マクロファージ細胞株ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１およびＭｏｎｏＭａｃ６を細胞モデル系として使用する。細胞を１０％ＦＣＳを含み１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２ｍＭグルタミンおよび１ｘ非必須アミノ酸を添加したＲＰＭＩ １６４０培地で細胞を増殖させる。ＭｏｎｏＭａｃ６細胞用の培地は５ｍｌ／ｌ ＯＰＩ培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ）も含む。ＭｏｎｏＭａｃ６はもっぱら２４穴プレートで培養する。全ての細胞は５％ＣＯ２を含む湿大気中で３７℃にて維持し、定期的にマイコプラズマによる汚染についてテストする。１０ｎＭ ＰＭＡ（ホルボル１２ミリステート−１３アセテート）を培地に添加して分化を行わせる。
ＦＰＲＬ−１レセプターの表現型効果（２．２−２．９）
２．２．　リガンド結合アッセイ
３００ｍｌの細胞培養物をＥＤＴＡ溶液で集め、懸濁液を用いて１１０〜１２０ｘｇにて細胞を遠心して落とし、１０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、４０μｇ／ｍｌバシトラシン、４μｇ／ｍｌロイペプチン、４μｇ／ｍｌキモスタチン、１０μｇ／ｍｌペファブロック、２μＭのホスホアミドンおよび０．１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ Ｆｒａｋｔｉｏｎ Ｖ， ＢＩ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）に再懸濁し、２ｘ１０６細胞／ｍｌに希釈する。
【００６１】
０．５ｍｌアリコートを０．３ｎＭ ３Ｈ−リポキシンＡ４（比活性〜１０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）と共にまたはトリチウムを含まないリポキシンＡ４の濃度を増加させて（３〜３００ｎＭ）、４℃にて３０分間インキュベーションする。ＧＦ／Ｂフィルターを備えたＣｅｌｌ−Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（Ｓｋａｔｒｏｎ）により細胞を集めてインキュベーションを終了させ、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４からなる３ｍｌの冷却したバッファーで３回洗浄し、フィルター片をバイアルに移す。２ｍｌのシンチレーションカクテルを加え、シンチレーション計測器（ＬＫＢ）で放射活性を測定する。非特異的結合は１００ｎＭの非標識リポキシンＡ４存在下で測定する。トリチウム化リポキシンＡ４を置き換えるため、ペプチドリガンドＭＭＫ−１（Ｋｌｅｉｎら、１９９８）を含む一連のペプチド及び低分子量化合物を濃度０．５〜３００ｎＭの範囲で同じ反応条件下で使用する。
結合した放射活性（フィルター片上）を計測器で評価し、値をオンラインで記録し、モデルにフィッティングする。３Ｈ−リポキシンＡ４の結合を阻害する物質は全てそのＩＣ５０値を計算する。
【００６２】
２．３．　ＦＬＩＰＲアッセイによって測定されるＣａ２＋−放出
ＦＰＲＬ−１レセプターを用いたＦＬＩＰＲアッセイ（蛍光イメージングプレートリーダー）をＧ−プロテインαサブユニットα１６またはキメラＧ−プロテインＧｑｉ５若しくはＧｑｏ５（これらはＧα（ｉ）またはＧα（ｏ）の最後の５残基を有する２つのＧα（ｑ）キメラである）およびＦＰＲＬ−１レセプターを構成的に発現する種々のＣＨＯ細胞株で行う。Ｇα１６、Ｇｑｉ５若しくはＧｑｏ５を構成的に発現する細胞株ＣＨＯ／Ｇａｌｐｈａ１６、ＣＨＯ／ＧａｌｐｈａＧｑｉ５およびＣＨＯ／ＧａｌｐｈａＧｑｏ５をＦＰＲＬ−１レセプター発現ベクターでトランスフェクションする。これらの細胞株を１０％ＦＣＳ（子牛胎仔血清）、２ｍＭグルタミン、２００ｎｇ／ｍｌハイグロマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＨａｍのＦ１２培地（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で、５％ＣＯ２を含む湿大気中で３７℃にて培養する。３〜７ｘ１０５細胞を６０ｍｍペトリ皿に播き一晩培養する。細胞を５０〜８０％コンフルエントまで増殖させ、トランスフェクションに使用する。６μｌのＦｕＧｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を血清を含まない１００μｌの培地に添加し、室温にて５分間平衡化させる。
【００６３】
次に、２μｇの精製ｐｃＤＮＡ／ＦＰＲＬ−１レセプターを予め希釈したＦｕＧｅｎｅ６溶液に加え、緩やかに混合し、更に室温にて１５分間インキュベーションする。培地を細胞から吸引し、４ｍｌの新しい培地を細胞に加える。ＦｕＧｅｎｅ６溶液を滴下して細胞に加え、培地を揺すって均等に配分する。４８時間後培地を吸引し、培地をＨａｍのＦ１２培地、１０％ＦＣＳ（子牛胎仔血清）、２ｍＭグルタミン、２００ｎｇ／ｍｌハイグロマイシン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８と置換する。その後５日間の間、死んだ細胞及び細胞破砕物が洗浄され細胞の単一コロニーが見えるまで培地を毎日交換する。単一コロニーをクローニングシリンダーで分離することによって単離し、１００μｌの１ｘトリプシン／ＥＤＴＡを加えて表面から遊離させる。
【００６４】
クローニングシリンダーから細胞を４ｍｌの培地に移し６穴プレートにプレーティングする。単一コロニーをエクスパンジョンし、いくつかのコロニーにおけるＦＰＲＬ−１レセプターの発現レベルをリガンド結合アッセイ（２．２）によってテストする。ＣＨＯ／Ｇａｌｐｈａ１６／ＦＰＲＬ−１レセプター、ＣＨＯ／ＧａｌｐｈａＧｑｉ５／ＦＰＲＬ−１レセプターまたは、ＦＰＲＬ−１レセプターを最も高発現するＣＨＯ／ＧａｌｐｈａＧｑｏ５／ＦＰＲＬ−１レセプターと命名される細胞クローンを用いてＦＬＩＰＲ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって細胞内Ｃａ２＋を測定する。細胞（ＣＨＯ／Ｇａｌｐｈａ１６／ＦＰＲＬ−１レセプター、ＣＨＯ／ＧａｌｐｈａＧｑｉ５／ＦＰＲＬ−１レセプターまたは、ＣＨＯ／ＧａｌｐｈａＧｑｏ５／ＦＰＲＬ−１レセプター）を３８４−ブラックウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にウェルあたり２５００〜５０００細胞にて４０μｌの体積で播き、５％ＣＯ２を含む湿大気中３７℃にて一晩増殖させる。
【００６５】
陰性対照として、ＣＨＯ／Ｇａｌｐｈａ１６、ＣＨＯ／ＧａｌｐｈａＧｑｉ５または、ＣＨＯ／ＧａｌｐｈａＧｑｏ５細胞を使用する。次に４０μｌのＦｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）染色溶液を各ウェルに最終濃度２μＭで加え、細胞をＦｌｕｏ−４で標識する。Ｆｌｕｏ−４染色溶液は、１０．５ｍｌの上述の細胞培地、４２０μｌのプロベニシド（Ｐｒｏｂｅｎｉｃｉｄ）溶液（１．４２ｇプロベニシド（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍｌ １Ｍ ＮａＯＨ、１０ｍｌ Ｈａｎｋｓバッファー）、４２μｌのＦｌｕｏ−４ストック溶液（５０μｇのＦｌｕｏ−４、２３μｌ ＤＭＳＯ、２３μｌ プルロニックＦ−１２７（２０％ＤＭＳＯ溶液）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）および４２０μｌ １Ｍ ＨＥＰＥＳからなっている。５％ＣＯ２を含む湿大気中３７℃、４５分間のインキュベーション後２０ｍｌのプロベニシド溶液を含む２０００ｍｌのハンクスバッファーを洗浄溶液として、ＥＭＢＬＡ−洗浄機（４洗浄工程、プログラム０３）で細胞を洗浄し、各ウェルに２５μｌの洗浄バッファーを残す。次に、染色ウェルについてＦＬＩＰＲを１００００計測、非染色細胞と染色細胞との差を１：５に設定する。次に、ハンクスバッファー／０．１％ＢＳＡで希釈した２５μｌのリポキシンＡ４およびペプチドリガンドＭＭＫ−１を含む一連のリガンド、ペプチドおよび低分子量化合物を濃度を増加させつつ（０．５〜３００ｎＭ）ウェルに加える。本発明の物質は濃度を増加させて（０．５〜３００ｎＭ）リポキシンＡ４（５０ｎＭ）と競合させてテストし、それらのアンタゴニスト能を測定する。リガンドの添加から開始して６０秒まで毎秒記録し、更にその後の６０秒間について５秒ごとに記録する。
【００６６】
２．４．　サイトカインまたはマトリックスメタロプロテアーゼの産生及び放出
単球／マクロファージ細胞株細胞を２．５〜５ｘ１０５細胞／ｍｌの細胞密度にてリポキシンＡ４で処理する。細胞を０、１、３、６、１２、２４、４８および７２時間後に集め、上清をさらなる調査のために凍結し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１４３ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む４００ｍｌのＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）に再懸濁し、ＤＮＡを２０ｇの針で少なくとも５回剪断力をかけ、−７０℃に保存する。
総ＲＮＡを製造業者のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で単離する。ＴａｑＭａｎ解析には精製ＲＮＡを用いる。サイトカインＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−６およびヒトマトリックスメタロプロテアーゼＭＭＰ−１、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２を適当なプライマー配列を用いて測定する。
【００６７】
２．４．１．　分泌されたサイトカインの検出
培養および刺激された細胞の上清中のタンパク質をＴＣＡ（トリクロロ酢酸）を最終濃度１０％になるように加えることにより沈殿させる。沈殿物を８０％エタノールで２回洗浄し、ペレットを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁する。タンパク質濃度はＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定し、各サンプルの５０μｇを１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上に乗せる。ゲルをＰＶＤＦ−膜にブロットし、ＴＢＳＴ中の５％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、商業的に入手可能なヒトＴＮＦα（腫瘍壊死因子α）、ＩＬ−１β（インターロイキン−１β）、ＩＬ−８（インターロイキン８）およびＩＬ−６（インターロイキン６）に対する抗体と１時間インキュベーションする。ＴＢＳＴで洗浄した後、ブロットをホースラディッシュペルオキシダーゼ結合抗−ヒトＩｇＧとインキュベーションし、再度洗浄し、ＥＣＬ化学発光キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で現像する。バンドの強度をＢｉｏＭａｘ　Ｘ−線フィルム（Ｋｏｄａｋ）で視覚化し、デンシトメーターで定量する。
【００６８】
２．４．２．　分泌されたマトリックスメタロプロテアーゼの検出及び解析
本方法は２．４．１に記載したのと同一である。ウェスタンブロッティングに使用する抗体はヒトＭＭＰ−１、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−１２に対するものである。
プロテアーゼ活性は、蛍光基質で測定する。刺激したおよび刺激しない細胞から単離した上清（上述）を、総体積５０μｌで、１μＭの基質（ＤＡＢ−Ｇａｂａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＥＤＡＮＳ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ））と室温にて５分間インキュベーションする。陽性対照は各反応あたり１２５ｎｇの精製ＭＭＰ−１２で行う。プロテアーゼ活性は３２０ｎｍの励起および４０５ｎｍの光放射により蛍光分光計で測定する。
【００６９】
タンパク質分解活性および細胞遊走を測定する別のアッセイでは走化チャンバーを使用する。チャンバーの上部部分のウェル中、８μｍのマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）層で被覆したフィルター上に細胞をプレーティングする（ウェルあたり１０５個の細胞）。下部区画においてはリポキシンＡ４（１００ｎＭ）、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）（１０ｎｇ／ｍｌ）のような化学誘引物質を培地に加える。５日後、フィルタを取り出し、マトリゲルを通過した下層表面上の細胞をメタノールで固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色キット（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）で染色し、光学顕微鏡により、３つの高出力フィールド中（４００ｘ）で計測する。
【００７０】
２．５．　走化性アッセイ
走化性を測定するために、４８穴走化（Ｂｏｙｄｅｎ）チャンバー（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ）を使用する。細胞をＦＣＳを含まないＲＰＭＩ培地中で２４時間飢餓させる。化学誘引物質（５０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ−８、１０ｎｇ／ｍｌ ＭＣＰ−１、１０ｎＭリポキシンＡ４、１０ｎＭ ＭＭＫ−１ペプチド（２．３．））をＦＣＳを含まないＲＰＭＩ培地で希釈し、３０μｌをウェルの下部区画に置く。上部区画は下部区画とポリカーボネートフィルター（孔細部８μｍ）によって隔てられている。５０μｌの細胞懸濁液（５ｘ１０４）を上部区画のウェルに置く。チャンバーを５％ＣＯ２を含む湿大気中で３７℃にて５時間インキュベーションする。次に、フィルターを取り出し、上側の細胞をこすり落とし、下側の細胞をメタノール中で５分間固定し、Ｄｉｆｆ−Ｑｕｉｋ染色セット（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）で染色する。遊走した細胞を光学顕微鏡により３つの高出力フィールドで計測する。
【００７１】
２．６．　付着性アッセイ
細胞を集め、ＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳおよび１μＭのＢＣＥＣＦ（（２’−７’−ビス−（カルボキシエチル）−５（６’）−カルボキシフルオレセインアセトキシメチル）エステル、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）中に再懸濁し（４ｘ１０６／ｍｌ）、３７℃にて２０分間インキュベーションする。細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁する（３．３ｘ１０６／ｍｌ）。３ｘ１０５細胞（９０μｌ）をラミニン（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で被覆した９６穴平底プレートの各ウェルに加える。１０μｌのアゴニスト（１００ｎＭリポキシンＡ４＋リポキシンＡ４アンタゴニスト）を加え、プレートを３７℃にて２０分間インキュベーションする。次に、細胞を０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳで洗浄し、付着細胞を１００μｌの０．０２５ＭのＮａＯＨと０．１％ＳＤＳで可溶化する。定量は蛍光測定によって行う。
【００７２】
２．７．　食細胞活動
細胞懸濁液（２．５ｘ１０４細胞／ｍｌ）を、５ｍｌのＵ９３７またはＴＨＰ−１として６穴プレートに、または２ｍｌのＭｏｎｏＭａｃ６として２４穴プレートに播き、アゴニスト（１００ｎＭリポキシンＡ４、５０ｎＭ ＭＭＫ−１ペプチド（２．３．））およびアゴニスト効果を打ち消すために本発明の低分子量化合物の存在下で、５％ＣＯ２を含む湿大気中で３７℃にて１時間インキュベーションする。熱不活性化サッカロミセス・ボウラルディィ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）（２０酵母／細胞）の分散懸濁液４０μｌを各ウェルに添加する。細胞を更に３時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗浄し、スピンする。細胞スピン調製物をＭａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａで染色し、食細胞作用を受けた粒子を光学顕微鏡で計測する。
【００７３】
実施例３：ＣＯＰＤ患者から単離されたマクロファージのための細胞培養モデル
ＦＰＲＬ−１について実施例３に記載したのと類似の方法を１．５に記載したレセプターを用いて行うことができる。
ＣＯＰＤ患者から単離されたマクロファージのための細胞培養モデルとして、我々は単球細胞細胞株ＭｏｎｏＭａｃ６およびＴＨＰ−１を選択する。これらの細胞株の過活性化状態を模倣するために、細胞をＰＭＡで処理する。ＣＯＰＤにおける状況と類似した条件を模倣する筈の刺激に更に細胞を曝露する。これらの刺激は喫煙またはＬＰＳに対する曝露である。
【００７４】
ＭｏｎｏＭａｃ６細胞のＰＭＡ、喫煙およびＬＰＳ刺激後のＦＰＲＬ−１の発現
ＭｏｎｏＭａｃ６細胞を１０％ＦＣＳ（低エンドトキシン）、２ｍＭグルタミン、１ｘ非必須アミノ酸、２００Ｕ／ｍｌペニシリン、２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび５ｍｌ ＯＰＩ培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地で２４穴プレート中で培養する。細胞をウェルあたり６０００００細胞の密度（２ｍｌ培地）まで増殖させ１０ｎＭ ＰＭＡ（ホルボル１２−ミリステート１３−アセテート）（Ｓｉｇｍａ）または２０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ（サルモネラミネソタＲｅ５９５からのリポポリサッカライド）（Ｓｉｇｍａ）で刺激する。煙曝露のため、細胞を煙を多く含ませた培地中で３７℃、５％ＣＯ２において１ｘ１０６細胞／ｍｌの密度でインキュベーションする。
【００７５】
ＲＰＭＩ １６４０培地に煙を多く含ませるのは２本のタバコで行った。タバコの煙を５０ｍｌシリンジに吸い込み（タバコ１本あたり５０ｍｌシリンジ約２０容）、次に補填物を含まない１００ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地に灌流する。その後、煙富裕化培地のｐＨを７．４に調整し、培地を０．２μｍフィルターで滅菌して使用する。煙曝露後、細胞をＲＰＭＩ １６４０で少なくとも２回洗浄し残存する煙粒子を除去する。次に、細胞を上記補充物を含む新しい２ｍｌのＲＰＭＩ １６４０培地を満たした２４穴プレートにウェルあたり４０００００〜６０００００細胞となるように播く。
【００７６】
ＴＨＰ−１細胞を１０％ＦＣＳ（低エンドトキシン）、２００Ｕ／ｍｌペニシリン、２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ １６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ中、７５ｃｍ２フラスコ内で増殖させる。細胞を１０ｎＭのＰＭＡで４８時間、３７℃、５％ＣＯ２にて処理し、細胞をマクロファージ様細胞に分化させる。次に、培地を２０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳを含む新しいＰＭＡフリーの培地に交換する。
両方の細胞型とも３７℃、５％ＣＯ２湿大気中で培養し、細胞をいろいろな時点で集め、経時的効果を監視する。細胞をスピンダウンし、ＰＢＳで洗浄し、１４３ｍＭのβ−メルカプトエタノールを含む４００μｌのＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅｗａｓｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ）に再懸濁し、ＤＮＡに２０ｇの針で少なくとも５回剪断力をかけ、−７０℃に保存する。
総ＲＮＡをＱｉａｇｅｎ Ｎｅｗａｓｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で製造業者のプロトコルに従って単離する。精製ＲＮＡをＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ）で消化し、ＴａｑＭａｎ解析に使用する。
【００７７】
ＴａｑＭａｎ解析
種々の時点で刺激した、および刺激しない細胞株におけるＦＰＲＬ−１のｍＲＮＡレベルを決定するためにＴａｑＭａｎ解析を使用する。１０ｎＭのレチノイン酸で３日間処理したＵ９３７細胞から単離した総ＲＮＡを用いてＦＰＲＬ−１のｍＲＮＡレベルを決定するための条件を最適化し、およびＦＰＲＬ−１およびハウスキーピング遺伝子としてのＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）のための標準曲線を設定する。ＦＰＲＬ−１の定量は以下のプライマーを用いて行う：フォワードプライマー（ｒｈＨＭ６３ ６６８（−）ＦＰ、配列番号２２）、リバースプライマー（ｈＨＭ６３ ５２５（＋）ＲＰ、配列番号２３）、および５’末端をレポーター色素ＦＡＭで、３’末端を消光色素ＴＡＭＲＡで標識したＴａｑＭａｎプローブ（ｒｈＨＭ６３ ６２９（−）ＴＰ、配列番号２４）。ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルは、市販のＧＡＰＤＨ用キット”ＴａｑＭａｎ ＧＡＰＤＨ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ”（Ｐ／Ｎ ４０２８６９）（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で測定する。ＧＡＰＤＨプローブはレポーター色素としてＪＯＥで、消光色素としてＴＡＭＲＡで標識する。
【００７８】
ＲＴ−ＰＣＲ反応はＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒの”ＴａｑＭａｎ ＥＺ ＲＴ−ＰＣＲ Ｃｏｒｅ Ｒｅａｇｅｎｔ”（Ｐ／Ｎ Ｎ８０８−０２３６）キットで行う。ＦＰＲＬ−１およびＧＡＰＤＨの標準曲線は１μＭのレチノイン酸で処理したＵ９３７細胞のＲＮＡを濃度を各アッセイについて０、５、１０、２５、５０から１００ｎｇまでの範囲で増加させて作成する。反応混合物は、１ｘＴａｑＭａｎ ＥＺ−バッファー、３ｍＭ Ｍｎ（Ｏａｃ）２、３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよび６００μＭのｄＵＴＰ、２．５Ｕ ｒＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、０．２５Ｕ ＡｍｐＥｒａｓｅ ＵＮＧを総体積２５μｌ中に含む。ＦＰＲＬ−１用には反応混合物は、３００ｎＭのｒｈＨＭ６３ ６６８（−）ＦＰおよびｈＨＭ６３ ５２５（＋）ＲＰ、および１００ｎＭのｒｈＨＭ６３ ６２９（−）ＴＰを含む。ＧＡＰＤＨレベルを測定するためのプライマーの濃度は各プライマーについて２００ｎＭであり、ＴａｑＭａｎプローブについて１００ｎＭである。ヒト患者および細胞株のＦＰＲＬ−１およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを測定するために、反応あたり１６〜５０ｎｇのＲＮＡを使用する。すべてのサンプルは３つ組で走らせる。反応はＭｉｃｒｏＡｍｐ ＯｐｔｉｃａｌキャップでシールしたＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６−穴プレート（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７７００ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて行う。ＰＣＲ条件は、５０℃２分間、６０℃３０秒間、９５℃５分間、続いて、４０サイクルの（９４℃２０秒間、５９℃１分間）である。データ解析はＦＰＲＬ−１およびＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルを標準曲線に従って決定するか、ＦＰＲＬ−１のＣＴ値を直接ＧＡＰＤＨのＣＴ値に関連づけるかによって行う。後者の方法は、どちらの反応の効率も互いによく一致するので（９５％程度）これらの遺伝子に適用することができる。
【００７９】
【表１４】
表１：１０ｎＭのＰＭＡで刺激したＭｏｎｏＭａｃ６細胞におけるＦＰＲＬ−１の発現
2004507262.tif 000015
【００８０】
【表１５】
表２：１０ｎＭ ＰＭＡによる分化および２０ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳによる刺激後のＭｏｎｏＭａｃ６細胞におけるＦＰＲＬ−１の発現
2004507262.tif 000016
【００８１】
【表１６】
表３：１０ｎＭ ＰＭＡによる分化および煙による刺激後のＭｏｎｏＭａｃ６細胞におけるＦＰＲＬ−１の発現
2004507262.tif 000017
【００８２】
【表１７】
表４：ＰＭＡによる分化およびＬＰＳによる刺激後のＴＨＰ−１細胞におけるＦＰＲＬ−１の発現
2004507262.tif 000018
【００８３】
ＦＰＲＬ−１のリガンドの効果を調べるため、ＭｏｎｏＭａｃ６細胞を２４穴プレートに２５００００細胞／ｍｌの密度で（ウェルあたり２ｍｌ）播き、２４時間、３７℃、５％ＣＯ２湿大気中で増殖させ、２００ｎＭリポキシンＡ４（Ｂｉｏｉｍｏｌ）、Ｗ−ペプチド（１μＭ）（Ｍｅｔａｂｉｏｎ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄによって合成）、および陽性対照としてＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ）で刺激する。細胞をいろいろな時点で集め、総ＲＮＡを上述したようにＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｅｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離する。
Ｗ−ペプチド（Ｂａｅｋら、１９９６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７１， ８１７０−８１７５）の配列は以下の通りである。
Ｗ−Ｋ−Ｙ−Ｍ−Ｖ−ｍ
このＲＮＡをＴａｑＭａｎ解析に用いてＴＮＦα、ＩＬ−８およびＭＭＰ−１２のような炎症マーカーの発現を調べる。
【００８４】
【表１８】
表５：リポキシンＡ４およびＷ−ペプチド刺激後のＭｏｎｏＭａｃ６細胞におけるＴＮＦαの発現
2004507262.tif 000019
【００８５】
【表１９】
表６：リポキシンＡ４およびＷ−ペプチド刺激後のＭｏｎｏＭａｃ６細胞におけるＩＬ−８の発現
2004507262.tif 000020
【００８６】
【表２０】
表７：リポキシンＡ４およびＷ−ペプチド刺激後のＭｏｎｏＭａｃ６細胞におけるＭＭＰ−１２の発現
2004507262.tif 000021
【００８７】
ＣＯＰＤ患者において末梢気道へのマクロファージの侵襲増加がみられるので、肺胞マクロファーの培養細胞モデルとして働くＭｏｎｏＭａｃ６の走化能をテストした。ＭｏｎｏＭａｃ６の走化性はＦＰＲＬ−１の種々のリガンドを投与することによって決定した。
ＭｏｎｏＭａｃ６細胞をＰＭＡで２４〜３０時間処理して細胞の活性化状態を誘導する。細胞を集め、補充物を含まないＲＰＭＩ １６４０で２回洗浄し、１０ｎＭ ＰＭＡ存在下で５０００００細胞／ウェル（２４穴プレート）の密度で播く。２４〜３０時間後、ピペットで繰り返しリンスすることにより細胞を基層から遊離させ、スピンダウンし、計測し、補充物を含まないが１０ｎＭのＰＭＡを含むＲＰＭＩ １６４０培地中に１ｘ１０６細胞／ｍｌの密度に調整する。走化性は４８穴走化チャンバー（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ Ｉｎｃ．）および８μｍの孔サイズを有するポリカーボネート膜で行う。チャンバーの下部ウェルを２８μｌの種々の濃度のリポキシンＡ４、Ｗ−ペプチド、陽性対照としてＭＣＰ−１、および陰性対照として補充物を含まないＲＰＭＩ １６４０培地（１０ｎＭのＰＭＡを含む）で満たす。下部ウェルはポリカーボネート膜で被覆し、チャンバーの上部区画は５０μｌの細胞懸濁液（５００００細胞／ウェル）で満たす。
【００８８】
３７℃、５％ＣＯ２にて４時間の遊走後、膜の上側部分にある細胞をこすり落とし、膜の下側部分に付着している細胞をＤｉｆｆ Ｑｕｉｋ染色キット（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）により製造業者のプロトコルに従って染色する。染色された細胞を光学顕微鏡で２５０倍の倍率で６〜８の高出力フィールドにて計測する。遊走指数は対照培地に対する、化学誘引物質に応答して遊走した細胞の数の増加倍数を表す。
【００８９】
【表２１】
表８：リポキシン Ａ４、Ｗ−ペプチド、およびＭＣＰ−１に応答したＭｏｎｏＭａｃ６の遊走
2004507262.tif 000022
【００９０】
上記実施例および上記各培養細胞モデルの細胞は、テストすべき物質を添加し、続いて上述の効果を測定することによって、ある物質がマクロファージにおいて本発明に従って脱調節された本発明のＩＬＭレセプターの阻害因子であるかどうかを決定するために使用される。
【００９１】
参考文献
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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