(57)【要約】本発明は、マイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）ワクチン、および動物に有効量の不活化マイコプラズマ・ボビス  ワクチンを投与することによって動物においてマイコプラズマ・ボビス感染により起きる疾患または障害を治療または予防する方法に関する。マイコプラズマ・ボビスワクチンは、細胞の全体もしくは一部分の不活化したまたは修飾した生菌調製物、サブユニットワクチン、あるいは核酸またはＤＮＡワクチンであってもよい。本発明により投与するマイコプラズマ・ボビス  ワクチンは、合成または組換え産生できる。本発明はまた、組み合わせワクチン、マイコプラズマ・ボビス  ワクチンの調製方法およびキットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫有効量の不活化マイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）細胞の全体または一部分および医薬的に許容できるキャリヤーを含む、動物を免疫化するためのワクチン処方物。
【請求項２】
さらにアジュバントを含む、請求項１に記載のワクチン処方物。
【請求項３】
有効量のマイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）ワクチンが、１用量当たり約１×１０６〜約５×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む、請求項１に記載のワクチン処方物。
【請求項４】
マイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）ワクチンが、さらにウイルス性または細菌性の、呼吸器、腸または生殖器病原体抗原を含む、請求項１に記載のワクチン処方物。
【請求項５】
動物においてマイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）感染により起きる疾患または障害を治療または予防する方法であって、動物に有効量のマイコプラズマ・ボビス  ワクチンを投与することを含む方法。
【請求項６】
有効量のマイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）ワクチンが、１用量当たり約１×１０６〜約５×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項７】
ワクチンの投与量が約０．５〜約５．０ｍｌである、請求項１３に記載の方法。
【請求項８】
ワクチンの投与量が約１．５〜約２．５ｍｌである、請求項１３に記載の方法。
【請求項９】
約２ｍｌのワクチンを仔ウシに２回投与する、請求項２７に記載の方法。
【請求項１０】
マイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）ワクチンの調製方法であって、マイコプラズマ・ボビスの単離体を適切な培地で培養して増殖させ；マイコプラズマ・ボビスをバイナリー  エチレンイミンで処理してマイコプラズマ・ボビスを不活化し；不活化マイコプラズマ・ボビスを医薬的に許容できる適切なキャリヤーと混合することを含む方法。
【請求項１１】
少なくとも１個の容器内にマイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）バクテリンおよびアジュバントを含むキット。
【請求項１２】
不活化マイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）単離体をバクテリン１用量当たり約５×１０８コロニー形成単位の量で医薬的に許容できるキャリヤー中に含むバクテリン。
【請求項１３】
さらにアジュバントまたはアジュバント類を含む、請求項１２に記載のバクテリン。
【請求項１４】
有効量のマイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）ワクチンを単一用量で投与する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
免疫有効量の不活化マイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）細胞の全体または一部分、ＱｕｉｌＡ、アンフィゲンおよびコレステロールを含む、動物を免疫化するためのワクチン処方物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、マイコプラズマ・ボビス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｂｏｖｉｓ）ワクチン配合物、および動物においてマイコプラズマ・ボビス感染により起きる疾患または障害を治療または予防する方法に関する。マイコプラズマ・ボビスワクチンは、細胞の全体もしくは一部分を不活化したまたは修飾した生菌調製物、サブユニットワクチン、あるいは核酸もしくはＤＮＡワクチンであることが可能である。本発明により投与するマイコプラズマ・ボビスワクチンは、合成または組換え産生することが可能である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
マイコプラズマ・ボビスは、屋内飼育または集約的に飼育した肉牛および乳牛に広くみられる重大なウシ病原体である。最も多く報告される症状は仔ウシの肺炎であり、これは肺炎性関節炎症候群としても知られる関節炎を随伴することがしばしばある。それは、雌ウシおよび雄ウシの乳腺炎、耳炎、および生殖器の疾患または障害の病因にも関連する。マイコプラズマ・ボビスはウシ呼吸器疾患（ｂｏｖｉｎｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，ＢＲＤ）による死亡率の３６％にも関連するので、マイコプラズマ・ボビス誘発性呼吸器疾患には著しい経済的損失が伴う。現在のところ完全に認可されたワクチンが無いので、死亡率を低下させるために抗生物質療法がしばしば用いられる。マイコプラズマ・ボビス疾患を予防すれば、他の呼吸器疾患に対する動物の疾病素因も低下する可能性がある。したがって、若い仔ウシに対する有効性が高く安全なマイコプラズマ・ボビス  バクテリン（細菌ワクチン、ｂａｃｔｅｒｉｎ）があれば、育牛産業にきわめて有用であろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
発明の概要
本発明は、マイコプラズマ・ボビス  ワクチン、ならびに動物に有効量のマイコプラズマ・ボビス  ワクチンおよび医薬的に許容できるキャリヤーを投与することによってマイコプラズマ・ボビス感染により起きる疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。本発明のワクチンは、マイコプラズマ・ボビスに特異的な細胞性または体液性の一次および二次免疫応答を誘発または増強するのに十分な量で提供される。１側面において、動物は仔ウシである。本発明のワクチン接種方法は、仔ウシをマイコプラズマ・ボビスの攻撃に対する防御を提供する。さらに、マイコプラズマ・ボビス  ワクチンを用いる本発明のワクチン接種方法は、仔ウシの免疫応答能を高め、これにより他のＢＲＤ病原体に対する抵抗性を高める；たとえば下記（限定ではない）により起きる感染症および疾患に対する疾病素因を低下させる：１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸器発疹ウイルス（ＢＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩ３）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ）、マイコプラズマ・ミコイデス（牛肺疫菌、Ｍ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、マイコプラズマ・アガラクチエ（Ｍ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・カリフォルニクム（Ｍ．ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・ボビリニス（Ｍ．  ｂｏｖｉｒｈｉｎｉｓ）、マイコプラズマ・ディスパル（Ｍ．ｄｉｓｐａｒ）、マイコプラズマ・カニス（Ｍ．ｃａｎｉｓ）、およびマンヘイミア・ヘモリティカ（Ｍａｎｈｅｉｍｉａ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）。本発明は、マイコプラズマ・ボビスワクチン、ならびに動物に有効量のマイコプラズマ・ボビス  ワクチンおよび医薬的に許容できるキャリヤーを投与することにより感染獣群からマイコプラズマ・ボビスを根絶する方法をも提供する。
【０００４】
本発明により投与するマイコプラズマ・ボビス  ワクチンは、追加成分、たとえばアジュバント、および所望により併用ワクチンに使用するための第２のまたはそれより多くの抗原が含まれていてもよい。第２の抗原はたとえば下記のものから選択されるが、これらに限定されない：１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸器発疹ウイルス（ＢＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩ３）、パスツレラ・ムルトシダ、ヘモフィルス・ソムナス、マイコプラズマ・ミコイデス、マイコプラズマ・アガラクチエ、マイコプラズマ・カリフォルニクム、マイコプラズマ・ボビリニス、マイコプラズマ・ディスパル、マイコプラズマ・カニス、およびマンヘイミア・ヘモリティカ。
【０００５】
本発明は、マイコプラズマ・ボビス  ワクチンの調製方法であって、マイコプラズマ・ボビス単離体を適切な培地で培養して増殖させ；マイコプラズマ・ボビスをバイナリー  エチレンイミンで処理してマイコプラズマ・ボビスを不活化し；不活化マイコプラズマ・ボビスを医薬的に許容できる適切なキャリヤーと混合してバクテリンを処方することを含む方法をも提供する。
【０００６】
本発明はさらに、マイコプラズマ・ボビスおよびアジュバント、ならびに所望により下記のものが非限定的に含まれるものから選択される抗原、を含むキットを提供する：１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸器発疹ウイルス（ＢＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩ３）、パスツレラ・ムルトシダ、ヘモフィルス・ソムナス、マイコプラズマ・ミコイデス、マイコプラズマ・アガラクチエ、マイコプラズマ・カリフォルニクム、マイコプラズマ・ボビリニス、マイコプラズマ・ディスパル、マイコプラズマ・カニス、およびマンヘイミア・ヘモリティカ。
【０００７】
発明の詳細な説明
本発明は、動物においてマイコプラズマ・ボビス感染により起きる疾患または障害を治療または予防するワクチン、およびその方法であって動物に有効量の不活化マイコプラズマ・ボビス  ワクチンおよび医薬的に許容できるキャリヤーを投与することを含む方法を包含する。本発明は、マイコプラズマ・ボビス  ワクチンの調製方法およびマイコプラズマ・ボビス  ワクチンキットを包含する。マイコプラズマ・ボビス菌株の例は、ＡＴＣＣ  ２５０２５（Ｒ．Ｇ．Ｗｉｔｔｌｅｒが１９６８年１０月８日に寄託）、２５５２３（Ｒ．Ｇ．Ｗｉｔｔｌｅｒが１９６９年１０月２２日に寄託）、および２７３６８（Ｒ．Ｇ．Ｗｉｔｔｌｅｒが１９７２年７月５日に寄託）である。これらの寄託はすべてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（1801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 - 2209）に行われたものである。好ましい態様において、バクテリンのマイコプラズマ・ボビス単離体は下記の菌株のうち１またはそれより多くを含む：２３００、３６２５、１６１５０、２０５１８または５０６３。
【０００８】
本発明は、いかなる不活化マイコプラズマ・ボビス単離体をも処方して有効なバクテリンとしてもよいことを企図する。好ましい態様においては、バイナリー  エチレンイミン（ｂｉｎａｒｙ  ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ、ＢＥＩ）により不活化したマイコプラズマ・ボビス単離体を処方して有効なバクテリンにしてもよい。特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従ってＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（1801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 - 2209）にマイコプラズマ・ボビス単離菌株２３００、３６２５、１６１５０、２０５１８または５０６３の寄託を行った；それぞれ菌株ＰＴＡ−３５５８、−３５５９、−３５６０、−３５６１および−３６８５と表示する。
【０００９】
ある態様において、本発明方法に使用するワクチンは、マイコプラズマ・ボビス細胞の全体もしくは一部分の不活化調製物（バクテリン）または修飾生ワクチンおよび医薬的に許容できるキャリヤー、あるいはマイコプラズマ・ボビス細胞の全体もしくは一部分の不活化調製物（バクテリン）または修飾生ワクチンおよびアジュバントを含む。
【００１０】
開示内容を明らかにするために、限定ではないが、本発明の詳細な説明を本発明の特色、具体的態様または利用を記載するまたは説明する下記のサブセクションに分ける。
定義と略号
種名の前にある略号Ｍ．はマイコプラズマ属を表わす。
【００１１】
マイコプラズマ・ボビス感染に関して本明細書中で用いる”治療または予防”という用語は、マイコプラズマ・ボビス細菌の複製を阻害すること、マイコプラズマ・ボビスの放出もしくは伝搬を阻害すること、またはマイコプラズマ・ボビスが宿主内において定着するのを妨げること、およびマイコプラズマ・ボビス感染により起きる疾患もしくは障害の症状を緩和すること、または動物からのマイコプラズマ・ボビスのクリアランスを促進することを意味する。細菌負荷の縮小、肺感染症の減少、肺病変の縮小、直腸温度の低下、ならびに／あるいは体重増加および／または成長の増大がみられた場合、その処置を治療的とみなす。本発明の方法は、動物、特にウシにおいて、たとえば肺炎、呼吸器感染症および肺病変の予防または縮小、肺におけるマイコプラズマ・ボビス  レベルの低下、体温低下、および体重増加に有効である。
【００１２】
本明細書中で用いる”マイコプラズマ・ボビス  ワクチン”という用語は、マイコプラズマ・ボビス感染により起きる障害または疾患を予防または治療するのに有用なワクチンを表わす。マイコプラズマ・ボビスワクチンには、ウシにおける毒性のマイコプラズマ・ボビスによる感染の治療または予防に有効ないかなるワクチンも含めることが可能である。本発明に使用してもよいマイコプラズマ・ボビス  ワクチンには、たとえばマイコプラズマ・ボビス細胞の全体もしくは一部分の不活化調製物、または修飾生ワクチン、サブユニットワクチン（マイコプラズマ・ボビス由来のポリペプチドもしくはタンパク質、またはそのようなタンパク質もしくはポリペプチドの免疫原性フラグメントの１つまたはそれより多くを有するもの）、あるいは１またはそれより多くのマイコプラズマ・ボビス遺伝子または核酸（マイコプラズマ・ボビス由来のポリペプチドもしくはタンパク質またはその免疫原性フラグメントの１つまたはそれより多くをコードし、かつウシにおいてインビボで発現することが可能な、遺伝子または核酸）を含めることも可能である。マイコプラズマ・ボビスのポリペプチド、タンパク質、そのようなポリペプチドおよびタンパク質の免疫原性フラグメント、またはマイコプラズマ・ボビスの遺伝子もしくは核酸は、当技術分野で既知の方法により合成または組換え産生することも可能である。好ましくは、本発明の方法に使用するマイコプラズマ・ボビス  ワクチンはバクテリンである。
【００１３】
本明細書中で用いる免疫原性フラグメントという用語は、マイコプラズマ・ボビス由来のタンパク質のフラグメントであって、宿主動物において免疫応答を誘発することが可能なものを表わす。限定ではないが、免疫応答には細胞性および／または体液性免疫の誘発を含んでもよい。
【００１４】
本明細書中で用いる”動物”という用語は、ヒト以外の哺乳動物を含めたすべての動物を表わす。
本明細書中で用いる”ウシ（ｃａｔｔｌｅ）”という用語は、ウシ亜科（ｂｏｖｉｎｅ）動物を表わし、これには去勢雄ウシ（ｓｔｅｅｒ）、雄ウシ（ｂｕｌｌｓ）、雌ウシ（ｃｏｗｓ）および仔ウシ（ｃａｌｖｅｓ）が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは本発明の方法は、動物であってヒト以外の哺乳動物、最も好ましくは仔ウシに適用される。
【００１５】
本明細書中で用いる”バクテリン”という用語は、ワクチンとして使用するのに適した不活化したマイコプラズマ・ボビス細胞の全体もしくは一部分の調製物を表わす。
本明細書中で用いる”免疫有効量”という用語は、投与される対象において免疫応答を誘発するのに十分なマイコプラズマ・ボビス  ワクチンの量を表わす。免疫応答は細胞性および／または体液性免疫の誘発を含んでもよいが、これらに限定されない。有効量のマイコプラズマ・ボビス  ワクチンとは、たとえばバクテリンがマイコプラズマ性肺炎を予防し、またはその程度を縮小することを意味する。
【００１６】
本明細書中で用いる”アジュバント”という用語は、免疫応答の増強物質である。
”医薬的に許容できるキャリヤー”という用語は、有効成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、化学的に不活性であり、かつ投与される対象に対して無毒性であるキャリヤー媒体を表わす。
【００１７】
不活化ワクチン（細胞の一部分または全体）および修飾生ワクチン
本発明は、マイコプラズマ・ボビス  ワクチン、およびマイコプラズマ・ボビス  ワクチンの調製方法であって、マイコプラズマ・ボビス単離体を適切な培地で培養して増殖させ；マイコプラズマ・ボビスをバイナリー  エチレンイミンで処理してマイコプラズマ・ボビスを不活化し；不活化マイコプラズマ・ボビスを医薬的に許容できる適切なキャリヤーと混合してバクテリンを処方することを含む方法を提供する。１態様において、マイコプラズマ・ボビスは肺組織から単離される。他の態様において、マイコプラズマ・ボビスはリンパ節組織から単離される。多様なそのようなキャリヤーが当技術分野で周知であり、蒸留水もしくは脱イオン水、塩類溶液または鉱油がこれに含まれる。バクテリン産物には、不活化した細菌単離体に加えて、１またはそれより多くの慣用されるアジュバントをも適量含めることも可能である。適切なアジュバントには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：無機ゲル、たとえば水酸化アルミニウム；界面活性物質、たとえばリゾレシチン；配糖体、たとえばサポニンおよびサポニン誘導体、たとえばＱｕｉｌ  ＡまたはＧＰＩ−０１００；カチオン界面活性剤、たとえばＤＤＡ（第四級炭化水素アンモニウムハロゲニド、プルロニックポリオール；ポリアニオンおよび多原子イオン；ポリアクリル酸、非イオン性ブロックポリマー、たとえばプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ−１２７（米国Ｂ．Ａ．Ｓ．Ｆ．）；アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）およびランチジン（Ｒａｎｔｉｄｉｎｅ）；ペプチド；組換え変異体不安定毒素、たとえばロイコトキシン（ＬＴ）またはコレラトキシン（ＣＴ）；化学結合または近接（ｃｌｏｓｅ  ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）分子輸送体（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）；鉱油、たとえばモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ−５０（Ｓｅｐｐｉｃ、フランス、パリ）、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）、アンフィゲン（Ａｍｐｈｉｇｅｎ）（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ、米国）、オマハ（Ｏｍａｈａ）、ＮＥ、米国、アルヒドロゲル（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）（Ｓｕｐｅｒｆｏｓ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、デンマーク、フレデリクスサンド）、油乳剤、たとえばＢａｙｏｌＦ／Ａｒｌａｃｅｌ  Ａなどの鉱油と水の乳剤、または植物油、水および乳化剤（たとえばレシチン）の乳剤、ミョウバン、コレステロール、サイトカイン、ならびに組合わせアジュバント。多原子イオンは、ワクチンを長期間の沈降後に単分散懸濁液として再懸濁させうる分散剤、増粘剤および粘結防止剤としても機能できる。組合わせアジュバントは、水性のカプセル封入（制御放出または遅延放出）またはマイクロカプセル封入形態であってもよい。免疫原をリポソームに取り込ませ、あるいはワクチン処方物での使用のための多糖類および／または他のポリマーに結合させることもできる。本発明に使用するバクテリン産物に含まれうる付加的な物質には、たとえば１またはそれより多くの保存剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）の二ナトリウム塩または四ナトリウム塩、マーシオレート（ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ）などが含まれる。ワクチンは液体剤形として処方されるか、あるいは可溶性成分または微粒子で作られた、使用前に医薬的に許��できる希釈剤に再懸濁される、固体剤形で提供される。可溶性成分または微粒子の調製方法にはビアセルベーション（ｂｉａｃｅｒｂａｔｉｏｎ）、コンゲルゲーション（ｃｏｎｇｅｌｇａｔｉｏｎ）、噴霧乾燥、バブルスライイング（ｂｕｂｂｌｅ  ｓｒｙｉｎｇ）、沈殿、超臨界溶媒和物／カプセル封入、および凍結乾燥が含まれるが、これらに限定されない。好ましい態様においては、２３００と表示されるマイコプラズマ・ボビス単離体をバクテリンの調製に用いる。さらに好ましい態様においては、ＱｕｉｌＡ、アンフィゲンおよびコレステロールの組み合わせアジュバントをバクテリンの処方に用いる。
【００１８】
単離体を増殖させる正確な条件は、培地の正確な組成および増殖させる具体的な単離体に応じて異なってもよい。しかし単離体は典型的には、インキュベーション時点から収穫時点まで測定して約２４〜約７２時間増殖させる。こうして増殖させた毒性のマイコプラズマ・ボビス単離体を、次いで米国特許第５，５６５，２０５号の記載に従ってバイナリー  エチレンイミン（ＢＥＩ）で処理してマイコプラズマ・ボビスを不活化し、あるいはホルマリン、グルタルアルデヒド、熱、照射、ＢＰＬその他、当技術分野で既知の不活化手段で不活化する。たとえば単離体をＢＥＩで処理する場合、単離体の培養物を約２〜約１０ｍＭ濃度のＢＥＩと接触させてもよい。次いで、マイコプラズマ・ボビスを不活化するのに有効な条件下で、たとえば約３７℃で少なくとも約２４時間、培養物をインキュベートする。次いで、中和有効濃度、たとえば２〜１０ｍＭ、のチオ硫酸ナトリウムの添加によりＢＥＩ培養物を中和する。
【００１９】
得られた不活化マイコプラズマ・ボビスを濃縮してもよい。そのような生物体を濃縮するための多様な方法が当技術分野で公知である。たとえば、遠心分離、たとえば超遠心分離、または濾過、たとえば限外濾過により生物体を濃縮してもよい。
【００２０】
得られた濃縮不活化マイコプラズマ・ボビスを、次いで当技術分野で周知の方法により回収する。最後に、こうして回収して得られた濃縮不活化マイコプラズマ・ボビスを医薬的に許容できる適切なキャリヤーと混合して、バクテリンを処方する。バクテリンは上記方法の幾つかの変法によっても産生でき、これらは当業者に自明である。
【００２１】
マイコプラズマ・ボビス単離体は、感染ウシの肺病変部から既知の方法で直接得ることもできる。マイコプラズマ・ボビス単離体は、感染ウシのリンパ節組織から既知の方法で直接得ることもできる。マイコプラズマ・ボビス単離体は、感染ウシのリンパ節組織から既知の方法で直接得ることもできる。本発明には、たとえば毒性の菌株の継代による弱毒化により修飾したマイコプラズマ・ボビス生ワクチンの調製も企図する。この方法は当技術分野で公知である。
【００２２】
本発明ワクチンの適切な製剤には、溶液または懸濁液としての注射剤が含まれる；注射前に液体に溶解または懸濁するのに適した固体剤形も調製してもよい。製剤は乳化していてもよい。
【００２３】
不活化マイコプラズマ・ボビス単離体を下記の細菌およびウイルス（これらに限定されない）と組み合わせることも可能である：１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸器発疹ウイルス（ＢＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩ３）、パスツレラ・ムルトシダ、ヘモフィルス・ソムナス、マイコプラズマ・ミコイデス、マイコプラズマ・アガラクチエ、マイコプラズマ・カリフォルニクム、マイコプラズマ・ボビリニス、マイコプラズマ・ディスパル、マイコプラズマ・カニス、およびマンヘイミア・ヘモリティカ。
【００２４】
サブユニットワクチン
本発明の方法は、精製したマイコプラズマ・ボビスの免疫原性タンパク質、ポリペプチド、ならびにそのようなタンパク質およびポリペプチドの免疫原性フラグメントを有する、サブユニットワクチンを用いて実施することも可能である。そのようなタンパク質およびポリペプチドは、当技術分野で既知の方法により、たとえば界面活性剤を用いて調製した抽出物、または熱的、化学的もしくは機械的抽出物を用いて調製できる。さらに、当業者に周知の方法を、たとえば試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、次いで染色ゲル上で単一ポリペプチドバンドを視覚化することにより、タンパク質の純度または均質性を判定するのに用いることが可能である。ＨＰＬＣ、または当技術分野で周知の他の同様な方法を用いて、より高い分解能で測定してもよい。
【００２５】
具体的な態様において、本発明に使用するワクチンは少なくとも１種類のマイコプラズマ・ボビスのタンパク質、たとえばＰ１３、Ｐ１８、Ｐ２１、Ｐ２５〜２６、Ｐ３３〜３４、Ｐ３９〜４０、Ｐ４５〜４６、Ｐ５０、Ｐ５４〜５８、Ｐ７７、Ｐ８２、Ｐ８７〜８９、Ｐ９７およびＰ１７５を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
他の態様において、本発明のサブユニットワクチンは、マイコプラズマ・ボビスのタンパク質、ポリペプチド、またはその免疫原性フラグメントではない、好ましくはウイルス性または細菌性抗原である、他の免疫原性または抗原性分子を少なくとも１種類含む。好ましい態様において、抗原は１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸器発疹ウイルス（ＢＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩ３）、パスツレラ・ムルトシダ、ヘモフィルス・ソムナス、マイコプラズマ・ミコイデス、マイコプラズマ・アガラクチエ、マイコプラズマ・カリフォルニクム、マイコプラズマ・ボビリニス、マイコプラズマ・ディスパル、マイコプラズマ・カニス、およびマンヘイミア・ヘモリティカである。そのような組成物は併用ワクチンとして有益である。本発明のサブユニットワクチンおよび併用ワクチンは、マイコプラズマ・ボビス感染により起きる疾患または障害を治療または予防するための本発明の方法に使用することも可能である。
【００２７】
さらなる具体的態様において、そのようなタンパク質またはポリペプチドの免疫原性フラグメントは、非限定的にＰ１３、Ｐ１８、Ｐ２１、Ｐ２５〜２６、Ｐ３３〜３４、Ｐ３９〜４０、Ｐ４５〜４６、Ｐ５０、Ｐ５４〜５８、Ｐ７７、Ｐ８２、Ｐ８７〜８９、Ｐ９７およびＰ１７５が含まれるような、本発明の方法に使用する免疫原性タンパク質およびポリペプチドの、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、または少なくとも１００個の連続アミノ酸を含む配列をもつ。
【００２８】
さらに、ワクチンに用いるマイコプラズマ・ボビスのタンパク質は実質的に純粋または均質である。本発明の方法は、典型的に、これらのタンパク質をコードする組換えヌクレオチド配列を発現する宿主細胞から精製したタンパク質またはポリペプチドを使用する。そのようなタンパク質の精製は、当技術分野で周知の多様な方法により達成することも可能である。たとえば下記に記載の技術を参照されたい：”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，サンディエゴ；”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ”，１９８２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク。
【００２９】
マイコプラズマ・ボビスの精製したポリペプチドおよびタンパク質ならびにその免疫原性フラグメントも、既知の合成方法で調製することも可能である。
マイコプラズマ・ボビスのポリペプチドおよびタンパク質ならびにその免疫原性フラグメントを、生きている組換えウイルスおよび細菌ベクター、たとえばアデノウイルスまたはサルモネラ属菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）により発現および送達させることも可能である。実際のベクターも公知であり、当技術分野で容易に入手でき、あるいは当業者が周知の方法で構築することも可能である。
【００３０】
遺伝子および核酸ワクチン
本発明の方法は、免疫原性タンパク質、ポリペプチド、およびそのようなタンパク質およびポリペプチドの免疫原性フラグメントをコードするマイコプラズマ・ボビス遺伝子または核酸を用いて実施することも可能である。そのような遺伝子および核酸を当技術分野で既知の方法によりインビボ発現させ、そして調製することも可能である。
【００３１】
具体的な態様において、本発明に使用するワクチンは、非限定的にＰ１３、Ｐ１８、Ｐ２１、Ｐ２５〜２６、Ｐ３３〜３４、Ｐ３９〜４０、Ｐ４５〜４６、Ｐ５０、Ｐ５４〜５８、Ｐ７７、Ｐ８２、Ｐ８７〜８９、Ｐ９７およびＰ１７５が含まれるような、マイコプラズマ・ボビスのンパク質をコードする、少なくとも１種類の遺伝子または核酸を含む。
【００３２】
さらなる具体的態様において、本発明方法に使用する遺伝子または核酸は、マイコプラズマ・ボビスのタンパク質またはポリペプチドの免疫原性フラグメントをコードし、そして、これらのフラグメントは、非限定的にＰ１３、Ｐ１８、Ｐ２１、Ｐ２５〜２６、Ｐ３３〜３４、Ｐ３９〜４０、Ｐ４５〜４６、Ｐ５０、Ｐ５４〜５８、Ｐ７７、Ｐ８２、Ｐ８７〜８９、Ｐ９７およびＰ１７５が含まれるような、本発明方法に使用する免疫原性タンパク質およびポリペプチドの、少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、または少なくとも１００個の連続アミノ酸を含む配列をもつ。
【００３３】
本発明の方法の他の態様において、使用する遺伝子または核酸は既知の方法で、たとえば遺伝子銃または他の無針送達器具を用いて投与する。
本発明の方法のさらに他の態様において、使用する遺伝子または核酸はＤＮＡワクチンである。さらに核酸または遺伝子は、リポソームまたは当技術分野で既知の他のトランスフェクション促進物質と会合して存在することも可能である。
【００３４】
ＤＮＡワクチンの調製および送達のための方法は当技術分野で公知である。たとえばＫｒｉｓｈｎａｎ，Ｂ．Ｒ．，”動物用医薬におけるＤＮＡワクチンの現状”，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）参照。
【００３５】
投与量、投与方式および処置方式
本発明によれば、有効量のマイコプラズマ・ボビスワクチンを少なくとも１用量、動物、好ましくは一から数十齢の仔ウシに投与すると、その後のマイコプラズマ・ボビス攻撃に対して有効な免疫が付与される。好ましくは、マイコプラズマ・ボビスワクチンを約７〜２８日齢目に投与し、約２８〜４８日齢目に再投与する。有効量のマイコプラズマ・ボビス  バクテリンワクチンは、１用量当たり約１×１０６〜約５×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含有する。好ましくは、有効免疫を付与するマイコプラズマ・ボビス  バクテリンワクチンは、１用量当たり約１×１０８〜約５×１０１０ＣＦＵ、より好ましくは１用量当たり約５×１０８〜約５×１０１０ＣＦＵを含有する。
【００３６】
本発明によれば、投与するためのマイコプラズマ・ボビス  バクテリンワクチンの有効量は約０．５〜約５．０ｍｌ、好ましくは約１．５〜約２．５ｍｌ、より好ましくは約２ｍｌである。
【００３７】
１またはそれより多くのタンパク質もしくはポリペプチドまたはそのようなタンパク質もしくはポリペプチドの免疫原性フラグメントを含むサブユニットワクチンであるマイコプラズマ・ボビスワクチンの、本発明の方法に有効な量は、約０．０１〜約２００μｇである。
【００３８】
免疫原性タンパク質もしくはポリペプチドまたはそのようなタンパク質もしくはポリペプチドの免疫原性フラグメントをコードする１またはそれより多くのマイコプラズマ・ボビス遺伝子または核酸（好ましくはＤＮＡ）を含むワクチンであるマイコプラズマ・ボビス  ワクチンの、本発明の方法に有効な量は、約０．１μｇ〜約２００ｍｇである。本発明によれば、投与は経口、鼻腔内、粘膜  局所、経皮および非経口（たとえば静脈内、腹腔内、皮内、皮下または筋肉内）が含まれる既知の経路で行うことも可能である。投与は無針送達器具を用いて行うことも可能である。投与は組み合わせ経路により、たとえばまず非経口経路による投与、次いで粘膜経路での投与により行うことも可能である。好ましい投与経路は皮下または筋肉内投与である。
【００３９】
本発明は単一用量ワクチン接種方法も企図し、これにより、マイコプラズマ・ボビスに対する免疫を形成および／または維持するために仔ウシに追加用量を投与する必要性が除かれる。
【００４０】
本発明によれば、約３〜６週齢の仔ウシに有効量のマイコプラズマ・ボビス  バクテリンを投与すると、肺炎を含む呼吸器感染症に対して有効な免疫が付与され、肺病変が縮小し、肺のマイコプラズマ・ボビスのレベルが低下し、体温が低下し、体重増加が増す。
【００４１】
本発明は、仔ウシをマイコプラズマ・ボビス感染に対して免疫化する方法であって、少なくとも１用量、好ましくは少なくとも２用量、バクテリンを仔ウシに投与することにより仔ウシをマイコプラズマ・ボビス感染に対して免疫化する方法を提供する。好ましい態様においては、バクテリンを皮下投与する。さらに、バクテリンの用量は約２ｍｌのバクテリンを含み、１ｍｌがそれぞれ約２．５×１０８コロニー形成単位のマイコプラズマ・ボビスを含有することが好ましい。バクテリンを仔ウシに２回投与することが望ましい；仔ウシの生後、約３週齢目に１回、そして約６週齢目に１回。
【００４２】
本発明は、有効量のマイコプラズマ・ボビス  バクテリンを動物、好ましくはウシに投与して、それらの動物における肺炎、関節炎、乳腺炎、耳炎、および生殖器障害を含めた障害を治療または予防することをも企図する。
【００４３】
ワクチンキット
本発明は、本発明のワクチン処方物の成分を１つまたはそれより多くを含む、１個またはそれより多くの容器を含む医薬キットをも提供する。したがって本発明は、動物を免疫化し、または動物における種々の疾患もしくは障害を治療もしくは予防する方法であって、動物に免疫化有効量の本発明のワクチンを投与することを含む方法を提供する。好ましい態様においてキットは、容器内に不活化マイコプラズマ・ボビス単離体および下記のものからから選択されるアジュバントを含む：ＱｕｉｌＡもしくはＧＰＩ−０１００、ＤＤＡ、サポニン、コレステロール、アルミニウムゲル、カルボポール、アンフィゲン、アルヒドロゲル、水中油、油中水、サイトカイン、または複数のアジュバントの組み合わせ。他の態様において本発明のキットは、所望により同一容器内または第２の容器内に、下記のものが非限定的に含まれるものから選択される抗原（これらに限定されない）を含む：１型ウシヘルペスウイルス（ＢＨＶ−１）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ呼吸器発疹ウイルス（ＢＲＳＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩ３）、パスツレラ・ムルトシダ、ヘモフィルス・ソムナス、マイコプラズマ・ミコイデス、マイコプラズマ・アガラクチエ、マイコプラズマ・カリフォルニクム、マイコプラズマ・ボビリニス、マイコプラズマ・ディスパル、マイコプラズマ・カニス、およびマンヘイミア・ヘモリティカ。
【００４４】
包装
ワクチン組成物は所望によりパックまたはディスペンサー器具内にあってもよく、これらは有効成分を含有する１またはそれより多くの単位用量剤形を含有してもよい。パックは、たとえばブリスターパックのような金属またはプラスチック箔を含むものである。パックまたはディスペンサー器具に投与説明書を添付してもよい。適合性の医薬的に許容できるキャリヤー中に処方された本発明の化合物を含む組成物もまた調製し、適切な容器に入れ、適応症の処置についてのラベルを貼付してもよい。
【００４５】
本発明を以下の実施例によりさらに説明する。
実施例１
材料と方法
動物
約１４日齢の健康な雑種乳牛の仔をワクチン接種用に入手した。試験開始前、仔ウシを７日間順化させた。すべての仔ウシに、既知の汚染物質または農薬を含まない薬物無添加濃縮飼料を毎日与え、水を自由に摂取させた。
【００４６】
ワクチン
バクテリンは、ＢＥＩ不活化したマイコプラズマ・ボビス菌全細胞を１用量当たり適切な濃度で含有していた。さらに、各ワクチン調製物はリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）および適切なアジュバントを含有していた。プラセボはＰＢＳを、またはＰＢＳと水中油型アジュバントを含有していた。
【００４７】
攻撃方法
それぞれの仔ウシに１０または１２ｍｌの新鮮なマイコプラズマ・ボビス培養物［約１×１０８〜１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）］を鼻腔内経路で３日間連続で与えた。攻撃接種物の生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）を各実験攻撃の終了直後に測定した。
【００４８】
実験方法
個別の耳タグ番号でそれぞれの仔ウシを識別した。動物はランダムに齢により囲いの中に割り当て、および処置群により割り当てた。
【００４９】
動物に２ｍｌの適切なワクチンまたはプラセボを皮下経路で０日目（左頸部）と２１日目（右頸部）に接種した。
すべての動物を攻撃前１日目、攻撃後７日目、攻撃後１４日目、および攻撃の約３週間後に体重測定した。
【００５０】
直腸温度を、攻撃前１日目、攻撃直前、および攻撃後２０日間、それぞれの朝、測定した。
それぞれの仔ウシの頚静脈から血液試料を採取した。おおまかに、１回目のワクチン接種前１日目、２回目のワクチン接種前１日目、攻撃前１日目（２回目のワクチン接種の約３週間後）、攻撃後７日目、攻撃後１４日目、および剖検時（攻撃の約３週間後）に、仔ウシから採血した。Ｂｏｍｍｅｌｉ  ＡＧ（Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｒｏｕｓｓｅｌ  Ｖｅｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、スイス、リーベンフェルド−ベルン）製マイコプラズマ・ボビスＥＬＩＳＡキット（Ｃｈｅｋｉｔ  Ｍ．ｂｏｖｉｓ  Ｓｅｒｏ）により評価するまで、それぞれの血液試料から得た血清を−２０℃に保存した。ＥＬＩＳＡプレートをＭｕｌｔｉｓｃａｎリーダーにより波長４０５ｎｍで読み取った。光学濃度（ＯＤ）値を次式に従って陽性対照血清のＯＤ値に対する％に換算した：％＝（試料ＯＤ−陰性血清ＯＤ）／（陽性血清ＯＤ−陰性血清ＯＤ）×１００。６０％未満の数値を陰性とみなした。６０〜８０％の値をもつ血清を疑いがあるとみなし、８０％より高いＯＤを示す血清を陽性とした。
【００５１】
実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃の約３週間後にすべての動物を剖検した。仔ウシを安楽死させ、中枢神経系以外のすべての主要臓器を肉眼で検査した。
肺を摘出し、マイコプラズマ・ボビス感染に起因する特徴的病変について肉眼で評価した。病変を標準肺図上に写生した。下記の全肺質量に対する各肺葉の比を用いて、各肺葉当たりの肉眼病変率％を加重した。
【００５２】
【表１】
2004536106.tif 000002
【００５３】
次いで、明らかな病変をもつ全肺％を判定するために、加重肺葉値を合計した（Ｐｏｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）。さらに、次式を用いて縮小率％を計算した：
【００５４】
【数１】
2004536106.tif 000003
【００５５】
さらに、各肺を５０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。この気管支洗浄液からマイコプラズマ・ボビスを単離して生菌数を測定する試験を試みた。気管支洗浄液の適当な系列希釈液を調製し、試料を適当な寒天培地にプレーティングすることにより、マイコプラズマ・ボビス生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）を測定した。
【００５６】
実施例２
この例では、若い仔ウシにおいてマイコプラズマ・ボビスバクテリンの有効性を評価した。２４頭の健康な雑種仔ウシを齢によりランダムに分けた。
【００５７】
動物に２ｍｌのワクチンまたはプラセボを皮下経路で０日目（左頸部）と２１日目（右頸部）に接種した。実験処置群と用いたワクチンを表１に示す。
【００５８】
【表２】
2004536106.tif 000004
【００５９】
仔ウシを、２回目のワクチン接種後３週目に前記に従って攻撃した。それぞれの仔ウシに１０ｍｌの新鮮なマイコプラズマ・ボビス培養物を鼻腔内経路で３日間連続投与した。
実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃終了後、１時間以内に、攻撃用接種物それぞれの生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）を測定した。結果を表２に示す。
【００６０】
【表３】
2004536106.tif 000005
【００６１】
すべての動物を実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃前１日目、攻撃後７日目、攻撃後１４日目、および攻撃の約３週間後に体重測定した。結果を表３にまとめる。被験マイコプラズマ・ボビス  バクテリンを投与した仔ウシ（処置群Ａ）は、プラセボワクチン接種群（処置群Ｂ）と比較して体重増加が大きかった。
【００６２】
【表４】
2004536106.tif 000006
【００６３】
直腸温度を、実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃前１日目、攻撃直前、および攻撃後２０日間、それぞれの朝、測定した。結果を図１にまとめる。マイコプラズマ・ボビス  バクテリンを接種した仔ウシ（処置群Ａ）は、プラセボワクチン接種した動物（処置群Ｂ）と比較して４〜８日目、１０〜１８日目および２０日目に平均体温が低かった。
【００６４】
マイコプラズマ・ボビスに特異的な血清抗体応答（ＩｇＧ）を表４にまとめる。平均光学濃度（ＯＤ）％値が陽性対照血清の＞８０％である血清試料を、マイコプラズマ・ボビス陽性とみなした。すべての仔ウシがワクチン接種前はマイコプラズマ・ボビス陰性であった。被験マイコプラズマ・ボビス  バクテリンを接種した仔ウシ（処置群Ａ）は、２回目の接種前にマイコプラズマ・ボビスに対して血清陽性となり、試験期間中、血清陽性を維持した。処置群Ｂの動物（プラセボワクチン接種動物）は、実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃後２週目まで血清陰性であった。
【００６５】
【表５】
2004536106.tif 000007
【００６６】
実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃の約３週間後にすべての動物を剖検した。肺を摘出し、マイコプラズマ・ボビス感染に起因する特徴的病変について肉眼で評価した。肺損傷スコア％および肺病変縮小率％を表５にまとめる。被験マイコプラズマ・ボビス  バクテリンを投与した仔ウシ（処置群Ａ）は、プラセボワクチン接種した動物（処置群Ｂ）と比較して肺損傷スコアが７１．２％低かった。これらの結果は、２回の被験マイコプラズマ・ボビス  バクテリン投与が実験的攻撃後の仔ウシに防御を誘導できたことを証明する。
【００６７】
【表６】
2004536106.tif 000008
【００６８】
各肺を５０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃の約２１日後に気管支洗浄試料からマイコプラズマ・ボビスを単離した結果を表６にまとめる。被験マイコプラズマ・ボビスバクテリンを投与した仔ウシ（処置群Ａ）は、プラセボワクチン接種した仔ウシ（処置群Ｂ）と比較して肺洗浄試料中の生存マイコプラズマ・ボビスの出現率およびレベルが低かった。
【００６９】
【表７】
2004536106.tif 000009
【００７０】
結論として、被験マイコプラズマ・ボビス バクテリンを投与した仔ウシ（処置群Ａ）は、プラセボ投与した動物（処置群Ｂ）と比較して肺病変の発生が低く、直腸温度が低く、体重増加が大きく、そして肺洗浄試料から単離した生存マイコプラズマ・ボビスのレベルが約４  ｌｏｇ低かった。これらの結果は、２用量のマイコプラズマ・ボビス  バクテリン投与が血清学的応答および実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃からの防御を誘導できたことを示す。
【００７１】
実施例３
この例では、種々のマイコプラズマ・ボビスバクテリンの有効性を若い仔ウシにおいて評価した。５８頭の健康な雑種仔ウシを齢によりランダムに分けた。
【００７２】
動物に２ｍｌの適当なワクチンまたはプラセボを皮下経路で０日目（左頸部）と２１日目（右頸部）に接種した。実験処置群と用いたワクチンを表１に示す。
【００７３】
【表８】
2004536106.tif 000010
【００７４】
仔ウシを、２回目のワクチン接種後３週目に前記に従って攻撃した。それぞれの仔ウシに１２ｍｌの新鮮なマイコプラズマ・ボビス培養物を鼻腔内経路で３日間連続投与した。
実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃終了後、１時間以内に、攻撃用接種物それぞれの生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）を測定した。結果を表２に示す。
【００７５】
【表９】
2004536106.tif 000011
【００７６】
すべての動物を実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃前１日目、攻撃後７日目、攻撃後１４日目、および攻撃の約３週間後に体重測定した。結果を表３にまとめる。被験マイコプラズマ・ボビス  バクテリンを投与した仔ウシ（処置群Ａ、ＢおよびＣ）は、プラセボワクチン接種群（処置群Ｄ）と比較して体重増加が大きかった。
【００７７】
【表１０】
2004536106.tif 000012
【００７８】
直腸温度を、実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃前１日目、攻撃直前、および攻撃後２０日間、それぞれの朝、測定した。結果を図２にまとめる。マイコプラズマ・ボビス  ワクチンを２回投与した仔ウシ（処置群Ａ、ＢおよびＣ）は、プラセボワクチン接種した動物（処置群Ｄ）と比較して７〜１７日目に平均体温が有意に低かった。
【００７９】
マイコプラズマ・ボビスに特異的な血清抗体応答（ＩｇＧ）を表４にまとめる。平均光学濃度（ＯＤ）％値が陽性対照血清の＞８０％である血清試料を、マイコプラズマ・ボビス陽性とみなした。すべての仔ウシがワクチン接種前はマイコプラズマ・ボビス陰性であった。被験マイコプラズマ・ボビス  バクテリンを接種した仔ウシ（処置群Ａ、ＢおよびＣ）は、２回目の接種前にマイコプラズマ・ボビスに対して血清陽性となり、試験期間中、血清陽性を維持した。処置群Ｄの動物（プラセボワクチン接種動物）は、実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃後３週目まで血清陰性であった。
【００８０】
【表１１】
2004536106.tif 000013
【００８１】
実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃の約３週間後にすべての動物を剖検した。肺を摘出し、マイコプラズマ・ボビス感染に起因する特徴的病変について肉眼で評価した。肺損傷スコア％および肺病変縮小率％を表５にまとめる。被験マイコプラズマ・ボビス  バクテリンを投与した仔ウシ（処置群Ａ、ＢおよびＣ）は、プラセボワクチン接種した動物（処置群Ｄ）と比較して肺損傷スコア％が低かった。これらの結果は、２用量の被験マイコプラズマ・ボビスバクテリン投与が実験的攻撃後の仔ウシに防御を誘導できたことを証明する。
【００８２】
【表１２】
2004536106.tif 000014
【００８３】
各肺を５０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃の約２１日後に気管支洗浄試料からマイコプラズマ・ボビスを単離した結果を表６にまとめる。被験マイコプラズマ・ボビス  バクテリンを投与した仔ウシ（処置群Ａ、ＢおよびＣ）は、プラセボワクチン接種した仔ウシ（処置群Ｄ）と比較して肺洗浄試料中の生存マイコプラズマ・ボビスの出現率およびレベルが低かった。
【００８４】
【表１３】
2004536106.tif 000015
【００８５】
結論として、被験マイコプラズマ・ボビスバクテリンを投与した仔ウシ（処置群Ａ、ＢおよびＣ）は、プラセボ投与した動物（処置群Ｄ）と比較して肺病変の発生が低く、直腸温度が低く、体重増加が大きく、肺洗浄試料から単離した生存マイコプラズマ・ボビスのレベルが低かった。これらの結果は、２用量のマイコプラズマ・ボビス  バクテリン投与が血清学的応答および実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃からの防御を誘導できたことを示す。
【００８６】
実施例４
この例では、種々のマイコプラズマ・ボビス  バクテリン処方物の有効性を若い仔ウシにおいて、同株または異株攻撃後に評価した。８３頭の健康な雑種仔ウシを齢によりランダムに分けた。
【００８７】
動物に２ｍｌの適当なワクチンまたはプラセボを皮下経路で０日目（左頸部）と２１日目（右頸部）に接種した。実験処置群と用いたワクチンを表１に示す。
【００８８】
【表１４】
2004536106.tif 000016
【００８９】
仔ウシを、２回目のワクチン接種の約４週間後に前記に従って攻撃した。それぞれの仔ウシに１２ｍｌ（各鼻孔当たり６ｍｌ）の新鮮なマイコプラズマ・ボビス菌株５０６３培養物を鼻腔内経路で３日間連続投与した。
【００９０】
実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃終了後、１時間以内に、攻撃用接種物それぞれの生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）を測定した。
すべての動物を実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃前１日目および攻撃の約３週間後に体重測定した。１日あたりの体重増加の平均の結果を表２にまとめる。被験マイコプラズマ・ボビス  バクテリンを投与した仔ウシ（処置群２、３、４および５）は、プラセボワクチン接種群（処置群１）と比較して１日あたりの体重増加の平均が大きかった。
【００９１】
【表１５】
2004536106.tif 000017
【００９２】
直腸温度を、実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃直前（４７日目）および攻撃後２０日間、それぞれの朝、測定した。結果を図３にまとめる。マイコプラズマ・ボビス  ワクチンを２用量投与した仔ウシ（処置群２、３、４および５）は、プラセボワクチン接種した動物（処置群１）と比較して５２〜６７日目に平均体温が低かった。
【００９３】
マイコプラズマ・ボビスに特異的な血清抗体応答（ＩｇＧ）を表３にまとめる。平均光学濃度（ＯＤ）％値が陽性対照血清の＞０．８０８０％である血清試料を、マイコプラズマ・ボビス陽性とみなした。すべての仔ウシがワクチン接種前はマイコプラズマ・ボビス陰性であった。被験マイコプラズマ・ボビス  バクテリンを接種した仔ウシ（処置群２、３、４および５）は、ワクチン接種後に抗体応答を示した。処置群１の動物（プラセボワクチン接種動物）は、実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃後３週目まで血清陰性であった。
【００９４】
【表１６】
2004536106.tif 000018
【００９５】
実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃の約３週間後にすべての動物を剖検した。肺を摘出し、マイコプラズマ・ボビス感染に起因する特徴的病変について肉眼で評価した。最小二乗平均（ＬＳＭ）肺損傷スコア％および肺病変縮小率％を表４にまとめる。被験マイコプラズマ・ボビス  バクテリンを投与した仔ウシ（処置群２、３、４および５）は、プラセボワクチン接種した動物（処置群１）と比較してＬＳＭ肺損傷スコア％が低かった。これらの結果は、２用量の被験マイコプラズマ・ボビス  バクテリン投与が実験的攻撃後の仔ウシに防御を誘導できたことを証明する。
【００９６】
【表１７】
2004536106.tif 000019
【００９７】
各肺を５０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃の約２１日後における気管支洗浄試料中のＰＣＲによるマイコプラズマ・ボビス存在の結果を表５にまとめる。被験マイコプラズマ・ボビス  バクテリンを投与した仔ウシ（処置群２、３、４および５）は、プラセボワクチン接種した仔ウシ（処置群１）と比較して肺洗浄試料中のＰＣＲによるマイコプラズマ・ボビス出現率が低かった。
【００９８】
【表１８】
2004536106.tif 000020
【００９９】
結論として、被験マイコプラズマ・ボビスバクテリンを投与した仔ウシ（処置群２、３、４および５）は、プラセボ投与した動物（処置群１）と比較して肺病変の発生が低く、直腸温度が低く、１日あたりの体重増加の平均が大きく、肺洗浄試料のマイコプラズマ・ボビス出現率が低かった。これらの結果は、２用量のマイコプラズマ・ボビス  バクテリン投与が血清学的応答および実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃からの防御を誘導できたことを示した。さらにこれらの結果は、単一のマイコプラズマ・ボビス菌株を含有するワクチンが全く異なる菌株による実験的攻撃後にも仔ウシを防御できることを明らかにした。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃直前と攻撃後のグループ平均体温を示すグラフである。マイコプラズマ・ボビス  バクテリンを２用量接種した仔ウシ（Ａ群）は、プラセボワクチン接種動物（Ｂ群）と比較して４〜８日目、１０〜１８日目および２０日目に平均体温が有意に低かった。
【図２】図２は、実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃直前と攻撃後のグループ平均体温を示すグラフである。マイコプラズマ・ボビス  バクテリンを２用量接種した仔ウシ（Ａ、ＢおよびＣ群）は、プラセボワクチン接種動物（Ｄ群）と比較して７〜１７日目に平均体温が有意に低かった。
【図３】図３は、実験的マイコプラズマ・ボビス攻撃直前と攻撃後のグループ平均体温を示すグラフである。マイコプラズマ・ボビス  バクテリンを２用量接種した仔ウシ（処置群２、３、４および５）は、プラセボワクチン接種動物（処置群１）と比較して５〜２０日目に平均体温が有意に低かった。
【図１】
2004536106.tif 000021
【図２】
2004536106.tif 000022
【図３】
2004536106.tif 000023
【国際公開パンフレット】
2004536106.tif 000024
2004536106.tif 000025
2004536106.tif 000026
2004536106.tif 000027
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【国際調査報告】
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