(57)【要約】本発明は、ＦＧＦレセプターファミリーと相同性を有するタンパク質であるＩＭＸＰ−８８８は前炎症性サイトカインであるという発見に関する。本発明は、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドおよびアンタゴニストの療法的組成物、その使用法、およびスクリーニング法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫系の活性化を必要としている哺乳動物において免疫系を活性化する方法であって、該個体に有効量のＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドを投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項２】
該哺乳動物が、ウイルス感染、細菌感染、真菌感染、癌、および移植片対宿主障害からなる群より選択される状態を有している、請求項１の方法。
【請求項３】
哺乳動物がヒトである、請求項１または２の方法。
【請求項４】
ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドが：
ａ）配列番号３の残基１８から３７５の配列を有するポリペプチド；
ｂ）配列番号１の残基１３から３７１の配列を有するポリペプチド；
ｃ）配列番号２の残基１３から２８０の配列を有するポリペプチド；
ｄ）配列番号３の残基１８から３７５をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同である配列によりコードされたポリペプチド；
ｅ）配列番号１の残基１３から３７１をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同である配列によりコードされたポリペプチド；および
ｆ）配列番号２の残基１３から２８０をコードするポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％相同である配列によりコードされたポリペプチド
から成る群より選択されるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１、２または３の方法。
【請求項５】
該アミノ酸配列が配列番号３の残基２３から３７０を含んでなる、請求項４の方法。
【請求項６】
該ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドがグリコシル化されている、請求項１、２、３、４または５の方法。
【請求項７】
該ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドが異種ポリペプチドへ融合されている、請求項１から６のいずれか１項の方法。
【請求項８】
該異種ポリペプチドが、抗体分子に由来する定常領域である、請求項７の方法。
【請求項９】
哺乳動物において炎症性障害を治療するための方法であって、該哺乳動物に有効量のＩＭＸＰ−８８８アンタゴニストを投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項１０】
該ＩＭＸＰ−８８８アンタゴニストが抗体である、請求項９の方法。
【請求項１１】
該ＩＭＸＰ−８８８アンタゴニストが、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドをコードするリボ核酸を特異的に切断するリボザイムである、請求項９の方法。
【請求項１２】
該ＩＭＸＰ−８８８アンタゴニストがＩＭＸＰ−８８８結合パートナーである、請求項９の方法。
【請求項１３】
ＩＭＸＰ−８８８レセプターを同定するためにＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドを使用する方法であって、ＩＭＸＰ−８８８へ結合するタンパク質をコードするクローンを求めて、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドへ応答する細胞型から調製された発現ライブラリーをスクリーニングすることを含んでなる、前記方法。
【請求項１４】
該細胞型が造血細胞である、請求項１３の方法。
【請求項１５】
該造血細胞がＴＨＰ−１細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、または末梢血リンパ球である、請求項１４の方法。
【請求項１６】
スクリーニング工程が、検出可能なように標識されたＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの結合を検出することを伴う、請求項１３、１４または１５の方法。
【請求項１７】
該検出可能なように標識されたＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドが、可溶性ＩＭＸＰ−８８８細胞外ドメインを含んでなる融合タンパク質である、請求項１６の方法。
【請求項１８】
ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの生物学的活性を促進または阻害可能な化合物を同定するための方法であって、
ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドへ応答する細胞と試験化合物を、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの存在下で接触させ、
該ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドに対する細胞の応答をアッセイし、そして
活性の基準レベルと細胞の応答を比較することを含んでなる、ここにおいて、基準は、試験化合物の不在下で、該細胞とＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの接触が行われた場合にアッセイされ、
ここにおいて、基準を超える応答の増加は、試験化合物がＩＭＸＰ−８８８活性のアゴニストであることを示しており、そして基準と比較された応答の減少は、試験化合物がＩＭＸＰ−８８８活性のアンタゴニストであることを示している、前記方法。
【請求項１９】
該応答を該細胞からのサイトカイン産生を測定することにより、または該細胞におけるカルシウム動員を測定することによりアッセイする、請求項１８の方法。
【請求項２０】
該細胞型が造血細胞である、請求項１９の方法。
【請求項２１】
該造血細胞がＴＨＰ−１細胞、ナチュラルキラー細胞、単球、または末梢血リンパ球である、請求項２０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０００年１１月２２日提出の米国仮出願第６０／２５２，７８５号の優先権を主張し、前記出願の開示全体が本明細書に援用される。
発明の分野
本発明はサイトカイン誘導物質（ｉｎｄｕｃｅｒ）、それらのアンタゴニスト、および疾患の治療および薬剤搬送におけるその使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
組織壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）およびインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）は多様な疾患および損傷に応答して、初期に誘導されるサイトカインであり、そして治癒過程に関与すると考えられている。しかし、これらのサイトカインの過剰発現は、多数の炎症性疾患に関係している。対照的に、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は抗炎症メディエイター（ｍｅｄｉａｔｏｒ）であると考えられている。
【０００３】
マウスＦＧＦレセプター同族体の二つのスプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｔ）のｃＤＮＡ配列、およびコードされたアミノ酸配列はＰＣＴ国際特許公開ＷＯ  ００／５８４６３（Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，オークランド，ニュージーランド）に開示されている。ｍｕＦＧＦＲ−βおよびｍｕＦＧＦＲ−γと名付けられたこれらのＦＧＦレセプター同族体は、リンパ節間質細胞で発現される。ｍｕＦＧＦＲ−βタンパク質の細胞外ドメインは、ＦＧＦ−２（塩基性線維芽細胞成長因子）を特異的に結合することが見いだされた。前記文献。さらに、ヒト同族体の部分クローンが報告されている。前記文献。
【０００４】
ＰＲＯ９４３は５０４アミノ酸の膜結合タンパク質であり、未同定のヒト発現ライブラリーから単離された（ＷＯ  ９９／６３０８８）。シグナルペプチドは、ほぼアミノ酸位１からほぼアミノ酸位１７に広がっていると暫定的に同定されている。膜貫通ドメインは、ほぼアミノ酸位３７６からほぼアミノ酸位３９６に広がっていると暫定的に同定されている。ＰＲＯ９４３タンパク質は、酸性および塩基性ＦＧＦの高親和性レセプターである線維芽細胞成長因子レセプター−４に対して配列相同性を有していると報告された。ＰＲＯ９４３は線維芽細胞成長因子レセプターファミリーに典型的な活性を持っているであろうことが推測された（ＷＯ  ９９／６３０８８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明の概要
本発明は、ＩＭＸＰ−８８８ファミリーポリペプチド、ＰＲＯ９４、ｍｕＦＧＦＲ−βおよびｍｕＦＧＦＲ−γを含むがそれらに限定されるわけではない、は免疫系の特定の細胞型に作用するサイトカイン誘導物質であるという発見に一部基づいている。実際、予想に反して、試験された細胞型のいずれにおいても、ＩＭＸＰ−８８８の直接的増殖効果は観察されなかった。さらに、ＩＭＸＰ−８８８はＴＨＰ−１細胞株、単球およびナチュラルキラー細胞でカルシウム動員を起こす。
【０００６】
よって、本発明は、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの有効量を哺乳動物に投与することにより、免疫系の活性化を必要としている哺乳動物において免疫系を活性化する方法に、一部関する。本発明の別の態様は、哺乳動物にＩＭＸＰ−８８８アンタゴニストの有効量を投与することにより、哺乳動物における炎症性障害を治療する方法を提供する。
【０００７】
本発明の別の側面において、ＩＭＸＰ−８８８レセプターを同定するためにＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドを使用する方法が提供され、前記方法はＩＭＸＰ−８８８へ結合するタンパク質をコードしているクローンを求めて、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドに応答する細胞型から調製された発現ライブラリーをスクリーニングすることを含んでなる。ＩＭＸＰ−８８８に応答する細胞型は、例えば、造血細胞である。特に好ましい造血細胞型はＴＨＰ−１、ナチュラルキラー細胞、単球および末梢血リンパ球である。
【０００８】
本発明のさらに別の側面は、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの生物学的活性を促進または阻害できる化合物を同定するための方法である。いくつかの態様において、前記方法はＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド存在下、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドに応答する細胞と試験化合物を接触させ、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドに対する細胞の応答をアッセイし、そして活性の基準レベルと細胞の応答を比較することを含んでなり、ここで前記基準は、試験化合物の不在下で細胞およびＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド間の接触が行われた場合にアッセイされている。基準よりも応答の増加を起こす試験化合物は、ＩＭＸＰ−８８８活性のアゴニストであり、一方、基準と比較して応答の減少を起こす試験化合物は、ＩＭＸＰ−８８８活性のアンタゴニストである。細胞の応答は、例えば、細胞からのサイトカイン産生を測定することにより、または細胞中のカルシウム動員を測定することによりアッセイできる。
【０００９】
さらに別の側面において、本発明はまた、ここに挙げた疾患のいずれかを治療するための医薬の製造における、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドおよびＩＭＸＰ−８８８アンタゴニストの使用も提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドが、実際に、サイトカイン誘導物質であるという発見に一部基づいている。特に、ＩＭＸＰ−８８８の可溶性細胞外型は、末梢血リンパ球、単球およびナチュラルキラー細胞を含む多様な細胞型でサイトカイン分泌を強く誘導した。試験されたいずれの細胞型においても増殖効果は観察されなかった。さらに、ＩＭＸＰ−８８８はＴＨＰ−１細胞株、単球およびナチュラルキラー細胞においてカルシウム動員を起こす。
【００１１】
本発明の一つの側面において、公共データベースの配列分析から、マウスＩＭＸＰ−８８８のヒト同族体が、ＰＲＯ９４３と呼ばれてきたタンパク質であることが明らかにされた。本発明の目的には、ＰＲＯ９４３はＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドであり、本明細書においては、特にヒトＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドと称される。
【００１２】
よって、本発明の一つの側面は、免疫系関連疾患を治療するように免疫応答を操作するための、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドおよびポリヌクレオチド、およびそれらのアンタゴニストの使用である。例えば、本発明は有効量のＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドを哺乳動物に投与することにより、免疫系の活性化を必要としている哺乳動物において、免疫系を活性化させることを含んでいる。あるいは、本発明は炎症性疾患を患った哺乳動物に有効量のＩＭＸＰ−８８８アンタゴニストを投与することを含んでいる。
【００１３】
さらに、本発明の別の側面はＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドに応答する、および、それ故にＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドに対するレセプターを発現する多数の異なった細胞型の発見である。よって、この発見はこうした細胞型から調製された発現ライブラリーをスクリーニングすることにより、ＩＭＸＰ−８８８レセプターを同定するためにＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドを使用する方法を可能にする。さらに、適切な細胞型、およびこうした細胞型において、ＩＭＸＰ−８８８により誘導される生物学的応答を知ることは、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドに対する細胞性応答を改変する（促進かまたは阻害）化合物をスクリーニングするための方法を可能ならしめる。こうした化合物、またはそれらの誘導体は、薬剤として有用である。
ＩＭＸＰ−８８８タンパク質およびポリペプチド
ＩＭＸＰ−８８８ファミリーポリペプチドは、（ａ）特定の構造ドメインを共有しているようであるポリペプチドとして当業者により同定される、および／または（ｂ）ポリペプチドのＩＭＸＰ−８８８ファミリーに共通した生物学的活性を有するおよび／または（ｃ）また、他のＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドへ特異的に結合する抗体へ結合する、図２に掲げたアミノ酸配列を含んでなるＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドのメンバーと十分な程度のアミノ酸同一性または類似性を共有するポリペプチドである。ＩＭＸＰ−８８８ファミリーポリペプチドは、天然に存在する源から単離されてもよいし、または天然に存在するＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドと同一の構造を有し、または天然に存在するＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドとは異なる構造を有するように製造されてもよい。いずれかの型の改変（例えば、限定されるわけではないが、アミノ酸の挿入、欠失または置換；ポリペプチドのグリコシル化状態の変化；その三次元構造または自己会合状態を変化させる再折り畳みまたは異性化；および他のポリペプチドまたは分子とのその会合の変化）によりいずれかのＩＭＸＰ−８８８ファミリーポリペプチドから誘導されたポリペプチドもまた、そのようなポリペプチドが単球、ナチュラルキラー細胞、末梢血リンパ球および／またはＴＨＰ−１細胞上のＩＭＸＰ−８８８レセプターへの結合において本明細書に記載したＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドと競合する限り、ＩＭＸＰ−８８８ファミリーポリペプチドである。いくつかの態様において、そのようなポリペプチドはまたＩＭＸＰ−８８８活性も有している。それ故、本発明で使用のためのポリペプチドには、本明細書に記載されたＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドのアミノ酸配列に類似したアミノ酸配列により特徴付けられるポリペプチドが含まれるが、その中への改変は天然に提供されるかまたは故意に工学により作製される。
【００１４】
ＩＭＸＰ−８８８はナチュラルキラー細胞、末梢血リンパ球および単球において、以下に記載するアッセイにおいて用量応答様式で、細胞内カルシウムを動員し、そしてサイトカイン産生を変調する。それ故、「ＩＭＸＰ−８８８活性を有するポリペプチド」には、以下に記載するアッセイにおいて用量応答様式で、同一のカルシウムおよび／またはサイトカイン調節活性のいずれかを示すポリペプチドが含まれる。用量応答性活性の程度はＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの活性と同じである必要はないが、好ましくは、「ＩＭＸＰ−８８８活性を有するポリペプチド」は、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドと比較して、与えられた活性において実質的に同様の用量応答性を示すであろう（即ち、候補ポリペプチドは基準ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドと比較して、より高い活性またはほぼ２５分の１より高い、好ましくはほぼ１０分の１より高い活性を示すであろう）。
【００１５】
ＩＭＸＰ−８８８ファミリーポリペプチドの完全長および成熟型の両方を本発明で使用することが可能である。完全長ポリペプチドとは、最初に翻訳されたものと同じポリペプチドの完全一次アミノ酸配列を有するポリペプチドである。完全長ポリペプチドのアミノ酸配列は、例えば、ｃＤＮＡ分子の完全オープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ）（「ＯＲＦ」）の翻訳により得ることが可能である。いくつかの完全長ポリペプチドは、選択的スプライシングによりまたは多翻訳開始部位の使用により、単一遺伝子座から多数のｍＲＮＡ型が産生されるならば、単一遺伝子座によりコードされていてもよい。ポリペプチドの“成熟型”とは、シグナル配列の切断、またはプロドメインを除去するための蛋白分解性切断のごとき、翻訳後プロセッシング工程を受けたポリペプチドを称している。特定の完全長ポリペプチドの多くの成熟型を、例えば、多数の部位でのシグナル配列の切断により、またはポリペプチドを切断するプロテアーゼの異なった調節により産生することができる。こうしたポリペプチドの成熟型（単数又は複数）は、適した哺乳動物細胞または他の宿主細胞中での、完全長ポリペプチドをコードする核酸分子の発現により得ることができる。本発明での使用のためのＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドにはまた、切断されているが（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）生物学的に活性なポリペプチド（例えば、ポリペプチドの天然に存在する可溶型）を得ることができる別のｍＲＮＡプロセッシングのような、転写後または翻訳後プロセッシングイベントから生じるものも含まれる。本発明での使用にまた包含されるものは、ポリペプチドからの一つまたはそれより多くの末端アミノ酸の蛋白分解性除去により（一般に、１から５の末端アミノ酸）、宿主細胞の異なった型での発現によるＮ−またはＣ−末端の相違のごとき、蛋白分解に帰する変異体である。
【００１６】
関連した天然型のグリコシル化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）を受けたまたは受けていないＩＭＸＰ−８８８ファミリーポリペプチドを本発明で使用することが可能である。酵母または哺乳動物発現系（例えば、ＣＯＳ−１またはＣＨＯ細胞）で発現されたポリペプチドは、発現系の選択に依存し、分子量およびグリコシル化パターンにおいて、天然のポリペプチドと同様でも、または著しく異なっていてもよい。細菌発現系（大腸菌のごとき）におけるポリペプチドの発現は、非グリコシル化分子を提供する。さらに、与えられた調製試料はポリペプチドの多数の異なったグリコシル化種を含むことが可能である。グリコシル基は慣用法により、特にグリコペプチダーゼを利用する方法により除去できる。一般に、グリコシル化ポリペプチドは過剰モルのグリコペプチダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）とインキュベートすることが可能である。
【００１７】
ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの種相同体（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）およびそれらをコードしている核酸もまた本発明で使用することが可能である。本明細書において、「種相同体」は、既定のポリペプチドまたは核酸の種とは異なった起源の種であるが、既定のポリペプチドまたは核酸に有意な配列類似性を有するポリペプチドまたは核酸である。一般に、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの種相同体は、本明細書に開示したＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの一つの細胞外ドメインのアミノ酸レベルで、少なくとも７０％同一であり、より好ましくは少なくとも８０％同一であり、さらにより好ましくは少なくとも８５％同一であり、いっそうより好ましくは少なくとも９０％同一である。種相同体は、本明細書に提供するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドから、適切なプローブまたはプライマーを作成し、そして望ましい種由来の適切な核酸供給源をスクリーニングすることによって、単離し、そして同定することができる。本発明はまた、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドのアリル変異体（ａｌｌｅｌｉｃ  ｖａｒｉａｎｔ）およびそれらをコードしている核酸の使用も包む；即ち、アミノ酸およびヌクレオチド配列の相違が遺伝的多型に起因するこうしたポリペプチドおよび核酸の天然存在代替型（集団内での個体間のアリル変異体）。
【００１８】
本発明のＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの断片は本発明で使用することが可能であり、そして該断片は直線型でも、例えば、Ｈ．  Ｕ．  Ｓａｒａｇｏｖｉら，  １９９２，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０，７７３−７７８およびＲ．  Ｓ．  ＭｃＤｏｗｅｌｌら，  １９９２，  Ｊ．  Ａｍｅｒ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１４  ９２４５−９２５３（どちらも本明細書に援用される）に記載されているごとき既知の方法を用いて環状化してもよい。本発明で使用するためのポリペプチドおよびポリペプチド断片、およびそれらをコードしている核酸には、ＩＭＸＰ−８８８ファミリーポリペプチドの長さの少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、そして最も好ましくは少なくとも８０％）であり、およびＩＭＸＰ−８８８ファミリーポリペプチドまたはコードしている核酸と少なくとも６０％（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくとも９％、および最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を有するアミノ酸またはヌクレオチド配列を持つポリペプチドおよび核酸が含まれ、ここで配列同一性は、配列ギャップを最小にしつつ、重複および同一性を最大になるように並列させた際、ポリペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定する。本発明での使用にやはり含まれるのは、少なくとも８、または少なくとも１０、または好ましくは少なくとも１５，またはより好ましくは少なくとも２０、またはさらにより好ましくは少なくとも３０、または最も好ましくは少なくとも４０の隣接するアミノ酸を含んでなるセグメントを含有するかまたはコードする、ポリペプチドおよびポリペプチド断片、およびそれらをコードする核酸である。こうしたポリペプチドおよびポリペプチド断片はまた、ＩＭＸＰ−８８８ファミリーポリペプチドのいずれかのこうしたセグメントのいずれかと、少なくとも７０％（より好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７．５％、または少なくともとも９９％、そして最も好ましくは少なくとも９９．５％）の配列同一性を共有するセグメントも含有することができ、ここで配列同一性は、配列ギャップを最小にしつつ、重複および同一性を最大になるように並列させた際、ポリペプチドのアミノ酸配列を比較することにより決定する。パーセント同一性は視覚的検査および数学的計算により決定可能である。あるいは、２つのアミノ酸または２つの核酸配列のパーセント同一性は、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら（Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：３８７，  １９８４）により記載され、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラム、バージョン６．０を用いて、配列情報を比較することによって、決定可能である。ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）ヌクレオチドに関する単一（ｕｎａｒｙ）比較マトリックス（同一に対し１および非同一に対し０の値を含む）、およびＳｃｈｗａｒｔｚおよびＤａｙｈｏｆｆ監修，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，  ｐｐ．３５３−３５８，  １９７９に記載されるような、ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＢｕｒｇｅｓｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：６７４５，の加重比較マトリックス；（２）各ギャップに対する３．０のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対しさらに０．１０のペナルティ；および（３）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅウェブサイトを通しての使用が利用可能なＢＬＡＳＴＮプログラムバージョン２．０．９、または標準デフォルトパラメーターを使用するＵＷ−ＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムのような、配列比較の当業者により使用される他のプログラムも使用可能である。
【００１９】
本発明はまた、これらのポリペプチドの特定の断片またはドメインを含んでなるＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの可溶型、特に、細胞外ドメインまたは一つまたはそれより多くの細胞外ドメインを含んでなるものの使用も提供する。可溶性ポリペプチドとは、それらが発現された細胞から分泌されることが可能なポリペプチドである。こうした型において、ポリペプチドはそれが発現された細胞から完全に分泌されるように、ポリペプチドの細胞内および膜貫通ドメインの一部またはすべてが切断されている。ポリペプチドの細胞内および膜貫通ドメインは、配列情報からこうしたドメインを決定するための既知の技術に従って同定することが可能である。例えば、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの可溶性細胞外型は、配列番号３の残基１８から３７５のアミノ酸配列または配列番号１の残基１３から３７１の配列、または前記ポリペプチドのアミノ終結末端かまたはカルボキシ終結末端のいずれかで最大５アミノ酸まで短くてもよく、そしてアミノ酸配列は少なくとも８０％同一であるそれらの変異体を有することができる。
【００２０】
可溶性ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドはまた、もし可溶性ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドが細胞から分泌されることが可能であり、および好ましくはＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド活性を保持しているとすれば、膜貫通領域の一部を含むポリペプチドも含んでいる。可溶性ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドはさらに、少なくとも一つのＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの細胞外部分、およびＩＭＸＰ−８８８活性を有するこれらのポリペプチドのいずれかの断片を含んでなる、オリゴマーまたは融合ポリペプチドを含んでいる。ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの可溶性型の使用は多くの応用で都合がよい。可溶性ポリペプチドは細胞から分泌されるので、組換え宿主細胞からのポリペプチドの精製が容易に行える。さらに、可溶性ポリペプチドは一般に、非経口投与および多くの酵素的方法のためには、膜結合型よりも適している。
【００２１】
別の側面において、本発明での使用に好ましいポリペプチドは、細胞外ドメインおよび細胞内ドメインのごとき、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドドメインの多様な組み合わせを含んでなる。従って、本発明で使用するためのポリペプチドおよびそれらをコードしている核酸は、細胞外ドメインのようなドメインの二つまたはそれより多くのコピー、細胞内ドメインのようなドメインの二つまたはそれより多くのコピー、または少なくとも一つの各ドメインを含んでなるまたはコードしているものを含み、そしてこれらのドメインはこのようなポリペプチド内で任意の順序で存在することができる。細胞内ドメインは、免疫細胞活性化に関与する細胞内因子のためのスクリーニングに使用することが可能である。
【００２２】
既知の技術を用いて、当業者はペプチドまたはＤＮＡ配列中のさらなる修飾を行うことが可能である。ポリペプチド配列中の目的の修飾には、コード配列中の選択したアミノ酸残基の改変、置換、交換、挿入、または欠失が含まれる可能性がある。例えば、一つまたはそれより多くのシステイン残基を欠失させるかまたは別のアミノ酸と交換して、分子のコンホメーションを改変することが可能であり、この改変は、フォールディングまたは再生に際して、正しくない分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐことを伴いうる。こうした改変、置換、交換、挿入、または欠失のための技術は、当業者に知られる（例えば米国特許第４，５１８，５８４号を参照されたい）。別の例として、ポリペプチド細胞外ドメイン中のＮ糖鎖形成部位を修飾して、グリコシル化を妨げてもよく、これにより哺乳動物および酵母発現系における炭水化物減少類似体（ａｎａｌｏｇ）の発現が可能になる。真核ポリペプチドのＮグリコシル化部位はアミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙにより特徴付けられ、ここでＸはＰｒｏ以外のいかなるアミノ酸でもよく、そしてＹはＳｅｒまたはＴｈｒである。これらのトリプレットをコードするヌクレオチド配列に対する適切な置換、付加または欠失の結果、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合が防止されるであろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸によって交換されるように選択される、単一のヌクレオチドの改変は、Ｎグリコシル化部位を不活性化するのに十分である。あるいは、ＳｅｒまたはＴｈｒを別のアミノ酸、例えばＡｌａで交換してもよい。ポリペプチドのＮグリコシル化部位を不活性化するための既知の方法には、本明細書に援用される、米国特許第５，０７１，９７２号およびＥＰ  ２７６，８４６に記載されるものが含まれる。本発明で使用することが可能なさらなる変異体には、グリコシル基、脂質、リン酸、アセチル基等の他の化学部分と共有または凝集結合体を形成することによって、修飾され、誘導体を生成する可能性があるポリペプチドが含まれる。例えば、ポリペプチドはペグ化でき、それはしばしば生じるポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させる。共有誘導体は、アミノ酸側鎖上の、あるいはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端の、官能基に、化学部分を連結することによって、調製可能である。付着している診断用（検出可能）剤または療法剤を含んでなるコンジュゲートが本明細書に意図される。好ましくは、こうした改変、置換、交換、挿入または欠失は、ポリペプチドまたはそれらの実質的均等物の望ましい活性を保持する。一つの例は、天然型が行う場合と本質的に同一の結合親和性で結合する変異体である。結合親和性は、例えば、米国特許第５，５１２，４５７号に記載されているような、および本明細書に示されているような慣用法により測定できる。
【００２３】
その他の誘導体は、Ｎ−末端またはＣ−末端融合のような組換え培養においての合成によるような、ポリペプチドの共有または凝集結合体を含んでいる。融合ポリペプチドの例はオリゴマーに関連して以下に議論されている。さらに、融合ポリペプチドは、精製および同定を容易にするため、付加されたペプチドを含んでなることが可能である。こうしたペプチドには、例えば、ポリ−Ｈｉｓあるいは米国特許第５，０１１，９１２号およびＨｏｐｐら，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４，  １９８８に記載される抗原性同定ペプチドが含まれる。こうしたペプチドの１つはＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドであり、該ペプチドは抗原性が高く、そして特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合するエピトープを提供し、発現した組換えポリペプチドの迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに結合するモノクローナル抗体は、Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ  Ｃｏ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、コネティカット州ニューヘブンより入手可能である。
【００２４】
本発明に含まれるのは、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド、一つまたはそれより多くのＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの断片、または本明細書に記載したようなＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの誘導体または変異体型のいずれかを含む、オリゴマーまたは融合ポリペプチドの使用である。特定の態様において、オリゴマーは可溶性ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドを含んでなる。オリゴマーは、二量体、三量体、またはより高次のオリゴマーを含む、共有結合または非共有結合多量体型であってもよい。本発明の一つの側面において、オリゴマーはポリペプチド構成要素の結合能を維持し、そしてしたがって、二価、三価等の結合部位を提供する。別の態様において、本発明は、ポリペプチドに融合しているペプチド部分間の共有または非共有相互作用を介して連結している多数のＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドを含んでなるオリゴマーの使用に関しており、こうしたペプチドは、オリゴマー化を促進する特性を有している。以下により詳細に記載するように、付着するポリペプチドのオリゴマー化を促進することが可能なペプチドの中に、ロイシンジッパーおよび抗体由来の特定のポリペプチドがある。
【００２５】
免疫グロブリンに基づくオリゴマー。
本発明で使用するためのポリペプチドまたはそれらの断片は、ポリペプチド結合部位の結合価を増加させることを含む多様な目的のため、免疫グロブリンのような分子に融合させてもよい。例えば、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの断片を、直接的にまたはリンカー配列を通じて、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合することが可能である。ポリペプチドを二価型にするため、こうした融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ部分に対してでもよい。他の免疫グロブリンアイソタイプもまた用いて、こうした融合体を生成することが可能である。例えば、ポリペプチド−ＩｇＭ融合は、本発明で使用するためのポリペプチドの十価型を生成するであろう。本明細書において、用語「Ｆｃポリペプチド」には、Ｆｃ領域のＣＨドメインのいずれかまたはすべてを含んでなる抗体のＦｃ領域で構成される、ポリペプチドの天然および突然変異タンパク質（ｍｕｔｅｉｎ）型が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有する、こうしたポリペプチドの一部切除型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍ）もまた含まれる。好ましいＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃポリペプチドを含んでなる。一つの代替物として、免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いて、オリゴマーを調製する。抗体由来ポリペプチドの多様な部分（Ｆｃドメインを含む）に融合している特定の異種ポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドの調製は、例えば、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら（ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８８：１０５３５，  １９９１）；Ｂｙｒｎら（Ｎａｔｕｒｅ，  ３４４：６７７，  １９９０）；並びにＨｏｌｌｅｎｂａｕｇｈおよびＡｒｕｆｆｏ（“免疫グロブリン融合ポリペプチドの構築”，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ中，  Ｓｕｐｐｌ．４，  １０．１９．１−１０．１９．１１ページ，  １９９２）に記載されている。免疫グロブリンに基づくオリゴマーの調製および使用法は、当該技術分野に知られる。本発明の一つの態様は、ポリペプチドを抗体由来のＦｃポリペプチドに融合することによって生成される二つの融合ポリペプチドを含んでなる二量体に関する。ポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドをコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクターに挿入する。組換え発現ベクターで形質転換した宿主細胞でポリペプチド／Ｆｃ融合タンパク質を発現し、そして抗体分子によく似た形で集合させ、その結果、Ｆｃ部分間に鎖間ジスルフィド結合が形成され、二価分子を生じるのを可能にする。ＰＣＴ出願ＷＯ  ９３／１０１５１（本明細書に援用される）に記載される一つの適切なＦｃポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域のＮ末端ヒンジ領域から天然Ｃ末端に渡る一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、本明細書に援用される米国特許第５，４５７，０３５号およびＢａｕｍら（ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：３９９２，  １９９４）に記載されるＦｃ突然変異タンパク質である。この突然変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化し、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化し、そしてアミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化していることを除けば、ＷＯ  ９３／１０１５１に示される天然Ｆｃ配列のものと同一である。該突然変異タンパク質は、Ｆｃ受容体に対し、減少した親和性を示す。Ｆｃ部分を含んでなる上述の融合ポリペプチド（およびそれから形成されるオリゴマー）は、ポリペプチドＡまたはポリペプチドＧカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによる容易な精製という利点を提供する。他の態様において、本発明のポリペプチドを、抗体重鎖または軽鎖の可変部に関して置換してもよい。融合ポリペプチドが抗体の重鎖および軽鎖両方で作成されている場合、最大４つものＩＭＸＰ−８８８細胞外領域を持つオリゴマーを形成することが可能である。
【００２６】
ペプチド−リンカーに基づくオリゴマー。
あるいは、前記オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を持つまたは持たない、多数のＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドを含んでなる融合ポリペプチドである。適切なペプチドリンカーの一つは、本明細書に援用される米国特許第４，７５１，１８０号および第４，９３５，２３３号に記載されるペプチドリンカーである。望ましいペプチドリンカーをコードするＤＮＡ配列は、いかなる適切な慣用的技術を用い、本発明のＤＮＡ配列の間に、そして該ＤＮＡ配列と同じ読み枠で挿入してもよい。例えば、リンカーをコードする、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを、配列間に連結してもよい。特定の態様において、融合ポリペプチドは、ペプチドリンカーによって分離された、２から４の可溶性ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドを含んでなる。適切なペプチドリンカー、他のポリペプチドとのそれらの組合せ、そしてそれらの使用は当業者にはよく知られている。
【００２７】
ロイシン−ジッパー。
本発明で使用するためのオリゴマーを調製するための別の方法は、ロイシンジッパーの使用を伴う。ロイシンジッパードメインは、該ドメインが見られるポリペプチドのオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、元々、いくつかのＤＮＡ結合ポリペプチドで同定され（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚら，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９）、そして以来、多様な異なるポリペプチドで見出されてきている。既知のロイシンジッパードメインの一つは、二量体化または三量体化した、天然に存在するペプチドおよびそれらの誘導体である。ジッパードメイン（本明細書ではまた、オリゴマー化またはオリゴマー形成ドメインとも称される）は、しばしば、他のアミノ酸と共に散らばる４または５のロイシン残基を持つ、７アミノ酸反復を含んでなる。ロイシンジッパーの使用、およびロイシンジッパーを使用するオリゴマーの調製は当該技術分野ではよく知られている。
【００２８】
ポリペプチド活性を全部または一部保持していると予想されるであろう、それ故スクリーニングまたは他の免疫学的方法論に有用であることができるポリペプチド配列の他の断片および誘導体もまた、本明細書の開示が与えられたら、当業者により作製することができる。
【００２９】
ＩＭＸＰ−８８８ファミリーポリペプチドをコードしている核酸
本発明は上で同定されたＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドのいずれかをコードしている、核酸およびそれらの断片の使用を意図している。マウスＩＭＸＰ−８８８タンパク質およびヒトＩＭＸＰ−８８８タンパク質の一部をコードしているポリヌクレオチド配列はＷＯ  ００／５８４６３に提供されている。ヒトＩＭＸＰ−８８８タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列はＷＯ  ９９／６３０８８の図６９に提供されている。よく知られているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドまたはＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド断片の望ましい組み合わせをコードするＤＮＡ配列を単離し、そして増幅するために用いることが可能である。ＤＮＡ断片の組み合わせの望ましい末端を定義するオリゴヌクレオチドを、５’および３’プライマーとして使用する。オリゴヌクレオチドは、発現ベクターに、ＤＮＡ断片の増幅された組み合わせの挿入を容易にするため、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を、さらに含有してもよい。ＰＣＲ技術は、Ｓａｉｋｉら，  １９８８，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７；Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，  Ｗｕら監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  （１９８９），  ｐｐ．１８９−１９６；およびＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｉｎｎｉｓら監修，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．（１９９０）に記載されている。
【００３０】
本発明で使用するための核酸分子には、一本鎖および二本鎖型両方のＤＮＡおよびＲＮＡと共に、対応する相補的配列が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成したＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅したＤＮＡ、およびそれらの組み合わせが含まれる。本発明で使用するための核酸分子には、完全長遺伝子およびｃＤＮＡ分子と共に、その断片の組み合わせが含まれる。本発明で使用するための核酸分子は、好ましくは、ヒト供給源に由来するが、本発明は、非ヒト種に由来するものもまた、含む。
【００３１】
「単離核酸」は、核酸が天然に存在する供給源から単離された場合、核酸が単離された生物体のゲノム中に存在する、すぐ隣接している遺伝子配列から分離された核酸である。例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、またはオリゴヌクレオチドのような、鋳型から酵素的にまたは化学的に合成された核酸の場合、こうした方法から生じた核酸は単離核酸であることが理解される。単離核酸分子は、分離断片の型の、またはより大きな核酸構築物の成分としての核酸分子を称している。一つの好ましい態様において、本発明は、混入する内因性物質を実質的に含んでいない、特定の単離核酸の使用に関する。該核酸分子は、好ましくは、少なくとも一度は、実質的に純粋な形で、および標準生化学的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ  （１９８９）に概説されているような方法）によりその成分ヌクレオチド配列の同定、操作および回収を可能にする量および濃度で単離されたＤＮＡまたはＲＮＡに由来している。こうした配列は、好ましくは、真核生物遺伝子中に典型的に存在する、内部非翻訳配列またはイントロンにより中断されていないオープンリーディングフレームの形で提供および／または構築される。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’または３’に存在でき、ここでそれらはコード領域の操作または発現を妨害しない。
【００３２】
ＩＭＸＰ−８８８ファミリーポリペプチドを作製および精製するための方法
ＩＭＸＰ−８８８ファミリーポリペプチドを作製する方法はよく知られている。組換えポリペプチドを発現する一般法も知られており、Ｒ．  Ｋａｕｆｍａｎ，  １９９０，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，５３７−５６６に例示されている。あるいは、遺伝子産物は、相同組換え、または「遺伝子ターゲティング」技術を介して、得ることが可能である。こうした技術は、ゲノム上の特にあらかじめ決定した部位において、外因性転写調節要素（ＣＭＶプロモーター等のような）の導入を使用して、目的の内因性核酸配列の発現を誘導する（例えば、米国特許第５，２７２，０７１号を参照されたい）。
【００３３】
多くの型の細胞が、ポリペプチドの発現に適した宿主細胞として務めることができる。哺乳動物宿主細胞には、例えば、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎら，  Ｃｅｌｌ  ２３：１７５，  １９８１）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞株、ＭｃＭａｈａｎら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：２８２１，  １９９１により記載されているようなアフリカミドリザル（Ａｆｒｉｃａｎ  ｇｒｅｅｎ  ｍｏｎｋｅｙ）腎臓細胞株ＣＶ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）由来であるＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞株、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、初代組織のｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養由来の細胞株、初代外植片、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）細胞が含まれる。あるいは、酵母または昆虫細胞などのより低次の真核生物において、または細菌などの原核生物において、ポリペプチドが産生可能である可能性がある。本発明で使用するためのポリペプチドはまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する体細胞または生殖細胞によって特徴付けられる、トランスジェニック動物の産物として、例えば、トランスジェニックウシ、ヤギ、ブタまたはヒツジのミルクの構成要素として、発現することも可能である。
【００３４】
本発明で使用するためのポリペプチドは、組換えポリペプチドを発現するのに適した培養条件下で、形質転換宿主細胞を培養することによって、調製可能である。生じた発現ポリペプチドをその後、ゲルろ過およびイオン交換クロマトグラフィーなどの、既知の精製法を用いて、こうした培養から（即ち、培養培地または細胞抽出物から）精製することが可能である。ポリペプチドの精製はまた、ポリペプチドに結合するであろう剤を含有するアフィニティーカラム；コンカナバリンＡ−アガロース、ヘパリン−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）またはＣｉｂａｃｒｏｍブルー３ＧＡセファロース（登録商標）のようなアフィニティー樹脂上の１またはそれより多くのカラム工程；フェニルエーテル、ブチルエーテル、またはプロピルエーテルのような樹脂を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーを伴う１またはそれより多くの工程；あるいは免疫親和性クロマトグラフィーも含むことが可能である。多様な組み合わせの、前述の精製工程のいくつかまたはすべてをまた使用して、実質的に均質な単離組換えポリペプチドを提供することが可能である。こうして精製したポリペプチドは、他の哺乳動物ポリペプチドを実質的に含まず、そして本発明にしたがって、「単離ポリペプチド」と定義される；本発明で使用するためのこうした単離ポリペプチドは、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド、断片、変異体、結合パートナー等へ結合する単離抗体を含んでいる。
【００３５】
ポリペプチドはまた、既知の慣用的な化学合成によっても産生可能である。合成手段によって、本発明のポリペプチドを構築する方法は、当業者に知られる。合成によって構築されたポリペプチド配列は、ポリペプチドと一次、二次または三次構造および／またはコンホメーション特性を共有するため、生物学的活性を含め、それと共通の生物学的特性を所持しうる。したがって、合成ポリペプチドは、療法化合物のスクリーニングにおいて、そして抗体発展のための免疫学的方法において、天然の精製ポリペプチドの生物学的に活性であるまたは免疫学的な置換体として、使用可能である。
【００３６】
望ましい純度は、ポリペプチドの意図される使用に依存する。例えば、ポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで投与しようとするとき、比較的高い純度が望ましい。こうした場合、ポリペプチドは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による解析に際し、他のポリペプチドに相当するポリペプチドバンドが検出不能であるように精製される。当業者は、異なる糖鎖形成、異なる翻訳後プロセシング等のため、該ポリペプチドに相当する多数のバンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより視覚化される可能性があることを認識するであろう。最も好ましくは、本発明で使用するためのポリペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる解析の際、単一のポリペプチドバンドにより示されるように、実質的に均一に精製される。ポリペプチドバンドは、銀染色、クーマシーブルー染色によって、または（ポリペプチドが放射標識されている場合は）オートラジオグラフィーによって、視覚化可能である。
【００３７】
炎症性障害を含む、ＩＭＸＰ−８８８による刺激に関係する障害の治療
本発明は、哺乳動物において、造血系列細胞活性化を修飾し、そして炎症性障害を含む造血系列細胞活性化障害を治療するための方法および組成物を含む。例えば、ＩＭＸＰ−８８８遺伝子発現、および／またはＩＭＸＰ−８８８遺伝子活性のレベルを減少させ、および／またはＩＭＸＰ−８８８経路の活性を下方制御（例えば、ＩＭＸＰ−８８８とＩＭＸＰ−８８８レセプターの相互作用を妨害することで）することにより、ＩＭＸＰ−８８８に対する造血細胞のサイトカイン応答を減少でき、そして慢性炎症性疾患徴候の緩解を必要としている哺乳動物においてその徴候を緩解する。逆に、ＩＭＸＰ−８８８レセプターの活性化に対する造血細胞の応答を、ＩＭＸＰ−８８８活性を増加させることにより増強することが可能である。例えば、こうした増強は感染に対する免疫系の応答を押し上げるために働くことが可能である。異なったアプローチが以下に議論されている。
【００３８】
ＩＭＸＰ−８８８活性を減少させるためのＩＭＸＰ−８８８のアンタゴニスト
ＩＭＸＰ−８８８を中和するかまたはＩＭＸＰ−８８８遺伝子の発現（転写または翻訳のいずれか）を阻害するいずれかの方法が、ＩＭＸＰ−８８８により起こされる炎症性応答を減少させるために使用可能である。こうしたアプローチは、炎症性障害のほんのいくつかのみを挙げると、慢性関節リューマチを含む関節炎、敗血症性ショック、多発性硬化症、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、肺炎、ＭＡ、狼瘡、喘息および他の肺状態、アレルギー、再潅流損傷、アテローム性動脈硬化症および他の血管疾患湿疹、乾癬、線維症および線維性障害の範囲、サルコイドーシス、アルツハイマー病、および癌のような炎症性応答障害を治療するために使用できる。
【００３９】
一つの態様において、免疫療法を設計して、内因性ＩＭＸＰ−８８８遺伝子発現のレベルを減少させることが可能であり、例えばＩＭＸＰ−８８８  ｍＲＮＡ転写物の翻訳を阻害するかまたは妨げる、既知のアンチセンスまたはリボザイムアプローチ；ＩＭＸＰ−８８８遺伝子の転写を阻害する三重らせんアプローチ；あるいは、ＩＭＸＰ−８８８遺伝子またはその内因性プロモーターを不活性化するかまたは「ノックアウト」する、標的化相同組換えを用いる。
【００４０】
アンチセンスアプローチは、ＩＭＸＰ−８８８  ｍＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡいずれか）の設計を伴う。アンチセンスオリゴヌクレオチドは相補的ＩＭＸＰ−８８８  ｍＲＮＡ転写対に結合し、そして翻訳を妨げるであろう。絶対の相補性は、好ましいが、必要ではない。ＲＮＡの一部に対して配列「相補的」とは、本明細書で称される場合、ＲＮＡとハイブリダイズ可能であり、安定な二重鎖を形成するための十分な相補性を有する配列を意味している。二本鎖アンチセンス核酸の場合、二重鎖ＤＮＡの一本鎖がこのように試験することが可能であり、または三重鎖形成をアッセイしてもよい。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度およびアンチセンス核酸の長さの両方に依存するであろう。
【００４１】
メッセージの５’端、例えばＡＵＧ開始コドンまでおよび該開始コドンを含む、５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドは、翻訳を阻害するのに最も効率的に働くはずである。しかしながら、ＩＭＸＰ−８８８遺伝子転写体の５’かまたは３’非翻訳、非コード領域に相補的であるオリゴヌクレオチドが、内因性ＩＭＸＰ−８８８  ｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスアプローチで使用できる。ｍＲＮＡの５’非翻訳領域に相補的なオリゴヌクレオチドはＡＵＧ開始コドンを含むはずである。アンチセンス核酸は少なくとも６ヌクレオチドの長さでなければならず、そして好ましくは、長さ６から約５０ヌクレオチドの範囲のオリゴヌクレオチドである。特定の側面において、オリゴヌクレオチドは少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
【００４２】
オリゴヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ、キメラ混合物、その誘導体または修飾型であってもよい。オリゴヌクレオチドは、塩基部分、糖部分、またはリン酸主鎖で修飾し、例えば分子の安定性、ハイブリダイゼーション等を改善することが可能である。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば宿主細胞受容体をｉｎ  ｖｉｖｏでターゲティングするため）、または細胞膜を横切る輸送を促進する剤（例えばＬｅｔｓｉｎｇｅｒら、１９８９，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：６５５３−６５５６；  Ｌｅｍａｉｔｒｅら，  １９８７，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８４：６４８−６５２；  ＰＣＴ公報第ＷＯ８８／０９８１０号、１９８８年１２月１５日公開、を参照されたい）、あるいはハイブリダイゼーション誘発切断剤または挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）（例えばＺｏｎ，  １９８８，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ５：５３９−５４９を参照されたい）などの他の付随する基を含んでもよい。
【００４３】
オリゴヌクレオチドは、当該分野では既知の標準法、例えば、自動化ＤＮＡ合成装置（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓなどから商業的に入手可能な装置）を使用して合成できる。例としては、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはＳｔｅｉｎら，  １９８８，  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：  ３２０９の方法によって、合成可能である。メチルホスホネートオリゴヌクレオチドは、制御孔ガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎら，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８５：７４４８−７４５１）の使用によって、調製可能である。
【００４４】
アンチセンス分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＭＸＰ−８８８転写体を発現する細胞へ搬送されなければならない。細胞へアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを搬送するために、多くの方法が開発されており、例えば、アンチセンス分子は、組織または細胞派生部位へ直接注入可能であり、あるいは望ましい細胞をターゲティングするよう設計した修飾アンチセンス分子（例えば、標的細胞表面上に発現される受容体または抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に連結したアンチセンス）を全身投与することが可能である。
【００４５】
しかしながら、内因性ｍＲＮＡの翻訳を抑制するのに十分な細胞内濃度を達成するのはしばしば困難である。それ故、好ましいアプローチは、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、強いｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの調節下に置かれる、組換えＤＮＡ構築物を利用する。患者の標的細胞をトランスフェクトためのこうした構築物の使用は、内因性ＩＭＸＰ−８８８遺伝子転写体と相補的塩基対を形成するであろう、十分な量の一本鎖ＲＮＡの転写を生じるであろうし、そしてそれによりＩＭＸＰ−８８８  ｍＲＮＡの翻訳を防止する。例えば、ベクターは、細胞により取り込まれ、そしてアンチセンスＲＮＡの転写を指示するように、ｉｎ  ｖｉｖｏで導入可能である。こうしたベクターは、転写できて望まれるアンチセンスＲＮＡを産生する限りは、エピソームにとどまるか、または染色体に組み込まれるようになる。こうしたベクターは、当該分野では標準の組換えＤＮＡ技法により構築できる。ベクターは、哺乳動物細胞での複製および発現に使用される、プラスミドでも、ウイルスでも、または当該分野では既知のその他のものでもよい。
【００４６】
ＩＭＸＰ−８８８  ｍＲＮＡ転写体を触媒的に切断するよう設計されたリボザイム分子は、ＩＭＸＰ−８８８  ｍＲＮＡの翻訳およびＩＭＸＰ−８８８タンパク質の発現を妨げるために使用可能である（例えば、ＰＣＴ国際公報ＷＯ９０／１１３６４；米国特許第５，８２４，５１９号を参照されたい）。本発明で使用可能なリボザイムには、ハンマーヘッドリボザイム（ＨａｓｅｌｈｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ，  １９８８，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４：５８５−５９１）、テトラヒメナ  テルモフィラ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）に天然に存在し（ＩＶＳ、またはＬ−１９  ＩＶＳ  ＲＮＡとして知られている）およびＴｈｏｍａｓ  Ｃｅｃｈおよび協同研究者により詳細に記載されている（国際特許出願ＷＯ  ８８／０４３００；ＢｅｅｎおよびＣｅｃｈ，  １９８６，  Ｃｅｌｌ  ４７：  ２０７−２１６）ような、ＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以後「Ｃｅｃｈ型リボザイム」）が含まれる。
【００４７】
アンチセンスアプローチにおけるように、リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチドで構成し（例えば、安定性、ターゲッティング等を改良するため）、ｉｎ  ｖｉｖｏでＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドを発現する細胞へ搬送しなければならない。搬送の好ましい方法には、トランスフェクトされた細胞が、内因性ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドメッセージを破壊し、そして翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するであろうように、強い恒常的ｐｏｌＩＩＩまたはｐｏｌＩＩプロモーターの調節下、リボザイムを「コードする」ＤＮＡ構築物を用いることが含まれる。アンチセンス分子と異なり、リボザイムは触媒的であるので、有効性に必要とされる細胞内濃度はより低い。
【００４８】
もしくは、タンパク質に基づく治療剤が、ＩＭＸＰ−８８８タンパク質の活性を阻害するために使用可能である。例えば、ＩＭＸＰ−８８８の一つまたはそれより多くのエピトープ、またはＩＭＸＰ−８８８の保存的変異体のエピトープ、またはＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドのペプチド断片を特異的に認識する抗体を、ＩＭＸＰ−８８８活性を阻害するために、本発明で使用することが可能である。こうした抗体には、限定されるわけではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化またはキメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生される抗体、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および前記のいずれかのエピトープ結合断片が含まれる。それ故、こうした抗体は、炎症性障害治療法の一部として利用することが可能である。
【００４９】
抗体産生のため、ＩＭＸＰ−８８８タンパク質、ＩＭＸＰ−８８８ペプチド、一部切断されたＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの機能的均等物、またはＩＭＸＰ−８８８の突然変異体を注射することによって、多様な宿主動物を免疫することが可能である。こうした宿主細胞には、限定されるわけではないが、いくつかのみを挙げると、ウサギ、マウス、およびラットが含まれることが可能である。宿主種に応じて、多様なアジュバントを用いて、免疫学的反応を増加させることが可能であり、こうしたアジュバントには、限定されるわけではないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性物質、ペプチド、油エマルジョン、スカシガイ（ｋｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン、ジニトロフェノール、並びにＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）および坐瘡プロピオンバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが含まれる。
【００５０】
特定の抗原に対する抗体の均質な集団であるモノクローナル抗体は、培養での連続的細胞株による抗体分子の産生を提供する、いずれの技術によっても得ることができる。これらには、限定されるわけではないが、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのハイブリドーマ技術（米国特許第４，３７６，１１０号）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら，  １９８３，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２；Ｃｏｌｅら，  １９８３，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：２０２６−２０３０）、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，  １９８５，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．，  ｐｐ．  ７７−９６）が含まれる。こうしたモノクローナル抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびそのいかなるサブクラスも含む、いかなる免疫グロブリンクラスのものであってもよい。ｍＡｂを産生するハイブリドーマはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養可能である。ｉｎ  ｖｉｖｏでのｍＡｂの高力価産生は、現在のところ、この方法を好ましい産生法にしている。
【００５１】
さらに、適切な生物学的活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と、適切な抗原特異性のマウス抗体分子由来の遺伝子を共にスプライシングすることによる、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術（Ｔａｋｅｄａら，  １９８５，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３１４：４５２−４５４）を用いることが可能である。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、ブタｍＡｂに由来する可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどである。
【００５２】
好ましくは、ヒトで使用するため、抗体はヒトであるかまたはヒト化されており；こうしたヒト抗体を生成する技術もまたよく知られており、例えばＭｅｄａｒｅｘ  Ｉｎｃ（ニュージャージー州プリンストン）およびＡｂｇｅｎｎｉｘ  Ｉｎｃ．（カリフォルニア州フレモント）から入手可能である。
【００５３】
一本鎖抗体の産生に関して記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号；Ｂｉｒｄ，  １９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；  Ｈｕｓｔｏｎら，  １９８８，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；  およびＷａｒｄら，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  ３３４：５４４−５４６）を、ＩＭＸＰ−８８８遺伝子産物に対する一本鎖抗体を産生するために適応させることもできる。一本鎖抗体は、アミノ酸架橋を経てＦｖ領域の重および軽鎖断片を連結させて形成され、一本鎖ポリペプチドが生じる。
【００５４】
特異的エピトープを認識する抗体断片は、既知の技術によって生成可能である。例えば、こうした断片には、限定されるわけではないが：抗体分子のペプシン消化によって産生可能なＦ（ａｂ’）2断片、および（ａｂ’）2断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成可能なＦａｂ断片が含まれる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築でき（Ｈｕｓｅら，  １９８９，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４６：１２７５−１２８１）、望ましい特異性を持つモノクローナルＦａｂ断片の迅速でそして容易な同定が可能である。
【００５５】
当業者に知られる技術を用いて、次いでＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドに対する抗体を利用して、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドを「模倣」し、そしてＩＭＸＰ−８８８レセプターに結合することが可能な抗イディオタイプ抗体を生成することが可能である（例えばＧｒｅｅｎｓｐａｎ  ＆  Ｂｏｎａ，  １９９３，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ７（５）：４３７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，  １９９１，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４７（８）：２４２９−２４３８を参照されたい）。
【００５６】
本発明のさらに別の側面において、ＩＭＸＰ−８８８結合パートナーの可溶型を、内因性ＩＭＸＰ−８８８レセプターへ結合し、そして内因性ＩＭＸＰ−８８８レセプターの活性化を競合的に阻害するために使用する。本明細書に記載したように、ＩＭＸＰ−８８８の結合パートナーはＴＨＰ−１細胞、ナチュラルキラー細胞、単球および末梢血リンパ球上で発現され、例えば、ＩＭＸＰ−８８８結合パートナーをコードするポリヌクレオチドは、以下に詳細に記載するごとく、こうした細胞型からの発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定することが可能である。
【００５７】
ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド自身もまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ法において、ＩＭＸＰ−８８８の生物学的活性を阻害するために用いることが可能である。本発明に含まれるのは、断片として、または融合ポリペプチドの成分として発現した際、天然のＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド機能の「ドミナントネガティブ（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ）」阻害剤として作用するＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの細胞外ドメインの一部である。例えば、本発明の精製ポリペプチドドメインは、内因性結合パートナーに対するＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの結合を阻害するために使用することが可能である。こうした使用は、効率的に、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド相互作用を遮断し、そしてＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド活性を阻害するであろう。本発明のさらに別の側面において、ＩＭＸＰ−８８８結合パートナーの可溶性型（それは、ほんのいくつかの例のみを挙げると、ＴＨＰ−１細胞、ＮＫ細胞、ＰＢＬおよび単球上に発現される）を用いて、内因性ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドに結合させ、そして該ポリペプチドの活性化を競合的に阻害する。
【００５８】
免疫系を活性化するためのＩＭＸＰ−８８８活性のアゴニスト
別の側面において、本発明はさらに、ＩＭＸＰ−８８８活性の増加が有益である疾患の症状を治療するかまたは寛解するための、ＩＭＸＰ−８８８活性のアゴニストの使用を含む。これらの疾患を患った患者は免疫系の活性化で利益を得るであろう。それ故、ＩＭＸＰ−８８８タンパク質およびそれらの可溶性誘導体および融合体は、免疫系の生来の応答を促進するように、ＮＫ細胞からＩ型サイトカイン（例えば、インターフェロン−ガンマおよびＴＮＦ−アルファ）の放出を刺激することが望まれる状態において、治療的に使用可能である。これらの状態には、感染（ウイルス、細菌および／または真菌）、癌／腫瘍学、移植片対宿主障害、および生来の免疫系応答を低下させる他の疾患が含まれる。この機能を実施する小分子の例はＲｉｂａｖｉｒｉｎ（商標）である。それ故、Ｒｉｂａｖｉｒｉｎ（商標）が指示される疾患のいずれも、ＩＭＸＰ−８８８アゴニストで治療できる。これらの疾患には、例えば、ＡＩＤＳ、呼吸系発疹ウイルスおよびＣ型肝炎が含まれる。
【００５９】
好ましい側面において、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞に、ｅｘ  ｖｉｖｏの細胞に、ｉｎ  ｖｉｖｏの細胞に、および／または多細胞生物に、ＩＭＸＰ−８８８ポリヌクレオチドまたはＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドを含んでなる組成物を投与することを必然的に伴う。ＩＭＸＰ−８８８の好ましい療法型は、前記のように可溶型である。本発明のさらに別の側面において、組成物は、疾患の治療のため、宿主生物においてＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドを発現させるＩＭＸＰ−８８８コード化核酸を投与することを含んでなる。これに関連して特に好ましいのは、ＩＭＸＰ−８８８ファミリーポリペプチドの異常な（例えば減少した）内因性活性に関連する機能障害を治療するためのヒト患者における発現である。さらに、本発明は、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの内因性活性を増加させることが見出された化合物の、細胞および／または生物への投与を含む。ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド活性を増加させる化合物の一例は、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドまたは結合パートナーに結合し、恒常的細胞内シグナル伝達（または「リガンド模倣」）を引き起こすことによって、またはＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド活性の天然阻害剤の結合を妨げることによって、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド活性を増加させることが可能なアゴニスト抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００６０】
上記の方法のすべてで治療できる哺乳動物は、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの生物学的活性の改変（促進かまたは阻害）が望まれる任意の哺乳動物である。治療することができる哺乳動物種には、限定されるわけではないが、ヒト、サル、ウシ、ブタ、ウマおよびマウス種が含まれる。タンパク質またはポリペプチドが哺乳動物に投与される際（例えば、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドまたは抗体）、タンパク質またはポリペプチドは、好ましくは、それらが投与されるべき哺乳動物と同一の種に由来するか、その種に内在するタンパク質またはポリペプチドにより密接に似るように突然変異されている（例えば、ヒト化抗体）。
【００６１】
ＩＭＸＰ−８８８活性に影響を及ぼす化合物のスクリーニングアッセイ
本発明は、多様なアッセイにおけるＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド（ポリペプチド、断片、変異体、オリゴマーおよび他の型を含む）の使用を含む。例えば、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドを用いて、ＩＭＸＰ−８８８に応答することが知られている細胞からＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの結合パートナーを同定することが可能であり、該結合パートナーは次に、細胞間コミュニケーション、共刺激、または免疫細胞活性を変調するのに使用可能である。あるいは、これらを用いて、細胞間コミュニケーション、共刺激経路、または免疫細胞活性を変調する非結合パートナー分子または物質を同定可能である。
【００６２】
結合パートナーを同定するためのアッセイ
ＩＭＸＰ−８８８ファミリーのポリペプチドおよびその断片を用いて、結合パートナーが同定可能である。例えば、これらは、慣用的結合アッセイなどの、いかなる適切なアッセイにおいても、候補結合パートナーに結合する能力に関して、試験可能である。例えば、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドを検出可能試薬（例えば放射性核種、発色団、および比色または蛍光定量反応を触媒する酵素等）で標識してもよい。標識ポリペプチドを、候補結合パートナーを発現する細胞と接触させる（例えば、この場合、ナチュラルキラー細胞、単球および末梢血リンパ球）。その後、細胞を洗浄し、未結合標識ポリペプチドを除去し、そして標識の性質にしたがって選択した適切な技術によって、細胞結合標識の存在を決定する。
【００６３】
結合アッセイ法の一例は以下のようである。候補結合パートナーｃＤＮＡを含有する組換え発現ベクター、またはＩＭＸＰ−８８８結合パートナーを発現する細胞（例えば、ＴＨＰ−１細胞）から調製された発現ライブラリーを構築する。１０ｃｍ2皿中のＣＶ１−ＥＢＮＡ−１細胞を、この組換え発現ベクターまたは発現ライブラリーでトランスフェクトする。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０４７８）は、ＣＭＶ最初期エンハンサー／プロモーター駆動のＥＢＶ核抗原−１を恒常的に発現する。ＣＶ−１−ＥＢＮＡ−１細胞は、ＭｃＭａｈａｎら，  １９９１，  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：  ２８２１により記載されているように、アフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶ−１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）由来であった。トランスフェクトした細胞を２４時間培養し、そして各皿の細胞を次に２４−ウェルプレート内へ分割する。さらに４８時間培養した後、トランスフェクトした細胞（約４ｘ１０4細胞／ウェル）を、５０ｍｇ／ｍｌの脱脂乾燥乳が加えられている結合培地（２５  ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２  ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０  ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含んでいるＲＰＭＩ  １６４０、ｐＨ  ７．２）であるＢＭ−ＮＦＤＭで洗浄する。次に、細胞を多様な濃度の、例えば、上に示されたような可溶性ポリペプチド／Ｆｃ融合ポリペプチドと、３７℃で１時間インキュベーションする。細胞を洗浄し、そして一定の飽和濃度の125Ｉマウス抗ヒトＩｇＧと、結合培地中、穏やかにかき混ぜながら３７℃で１時間インキュベーションする。よく洗浄後、トリプシン処理を介して細胞を遊離させる。上で使用するマウス抗ヒトＩｇＧは、ヒトＩｇＧのＦｃ領域に対して向けられ、そしてＪａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州ウェストグローブから得ることが可能である。該抗体は、標準クロラミン−Ｔ法を使用して放射性ヨウ素化する。該抗体は、細胞に結合しているいかなるＦｃポリペプチドのＦｃ部分にも結合するであろう。すべてのアッセイにおいて、125Ｉ抗体の非特異的結合は、Ｆｃ融合ポリペプチド／Ｆｃ不在下、並びにＦｃ融合ポリペプチドおよび２００倍モル過剰の非標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体存在下でアッセイする。細胞結合125Ｉ抗体は、Ｐａｃｋａｒｄ  Ａｕｔｏｇａｍｍａ計測装置上で定量化する。親和性計算（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，  １９４９，  Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ５１：  ６６０）は、Ｍｉｃｒｏｖａｘコンピューター上で走らせたＲＳ／１（ＢＢＮ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，マサチューセッツ州ボストン）で行う。結合はまた、シンチレーション近接アッセイ（Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ  Ｓ，  Ｇｅｒｂｅｒ  ＬＤ，  Ｂｒｉｎｋ  Ｌ，  Ｓｐｅｃｔｏｒ  Ｓ，  １９８５，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８２：  ８６７２−８６７６）、均質時間分解蛍光法（Ｐａｒｋ  ＹＷ，  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＲＴ，  Ｗｕ  Ｌ，  Ｚｈｅｎｇ  Ｓ，  Ｃａｍｅｒｏｎ  ＰＭ，  Ｗｏｏｄｓ  Ａ，  Ｚａｌｌｅｒ  ＤＭ，  Ｍａｒｃｙ  ＡＩ，  Ｈｅｒｍｅｓ  ＪＤ，  １９９９，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６９：  ９４−１０４）、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）法（Ｃｌｅｇｇ  ＲＭ．，  １９９５，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６：  １０３−１１０）、または結合ポリペプチドが潜在的結合パートナーへ暴露された場合に表面プラスモン共鳴のなんらの変化を測定する方法（こうした方法は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ（ウプサラ、スエーデン）から供給されるようなバイオセンサーを使用する）のような、ハイスループットスクリーニング法にうまく適している方法を用いて決定可能である。
【００６４】
競合結合アッセイ
別の種類の適切な結合アッセイは、競合的結合アッセイである。例えば、変異体の生物学的活性は、変異体が、ＩＭＸＰ−８８８結合パートナーへの結合に関して、天然ポリペプチドと競合する能力に関してアッセイすることによって、決定可能である。競合的結合アッセイは、慣用的方法論によって実行可能である。競合的結合アッセイに使用可能な試薬には、放射標識ＩＭＸＰ−８８８、および細胞表面上にＩＭＸＰ−８８８（内因性または組換え）を発現する、損なわれていない（ｉｎｔａｃｔ）細胞が含まれる。例えば、細胞表面レセプターへの結合に対し、可溶性ＩＭＸＰ−８８８変異体と競合させるために、放射標識可溶性ＩＭＸＰ−８８８断片が使用可能である。損なわれていない細胞の代わりに、Ｆｃ部分とのポリペプチドＡまたはポリペプチドＧ（固相上）の相互作用を通じて、固相に結合する可溶性結合パートナー／Ｆｃ融合ポリペプチドで代用可能である。ポリペプチドＡおよびポリペプチドＧを含有するクロマトグラフィーカラムには、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．、ニュージャージー州ピスカタウェイより入手可能なものが含まれる。
【００６５】
細胞間コミュニケーションまたは免疫細胞活性の変調剤（ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ）を同定するためのアッセイ
細胞間コミュニケーションおよび／または免疫細胞活性に対するＩＭＸＰ−８８８の影響は、標的細胞におけるこれらの活性を調節するように操作可能である。例えば、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドをコードしている核酸、またはこうしたポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストが、細胞間コミュニケーションまたは標的細胞における活性を誘導するか、増進するか、抑制するか、または抑止するために、細胞または細胞群へ投与可能である。ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド、アゴニストまたはアンタゴニストの同定は、当業者に知られる多様なアッセイを介して行うことが可能である。こうしたアッセイに含まれるのは、細胞間コミュニケーション、共刺激、または活性に影響を与えるＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの能力を評価するものである。こうしたアッセイは、例えば、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの存在下での、免疫細胞応答の解析を伴うであろう。こうしたアッセイにおいて、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの存在下で、コミュニケーションまたは刺激の率を決定し、そしてその後、こうしたコミュニケーションまたは刺激が、候補アゴニストまたはアンタゴニストまたは別のＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの存在下で、改変されるかどうかを決定するであろう。本発明のこの側面のアッセイ例には、サイトカイン分泌アッセイおよびカルシウム動員アッセイが含まれる。これらのアッセイは当業者にはよく知られており、そして両方とも一般的におよび例示的、非限定的具体例により以下に記載されている。
【００６６】
一つの側面において、本発明は、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの生物学的活性を促進または阻害できる化合物を同定するため方法であって、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの存在下で、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドに応答する細胞と試験化合物を接触させ、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドに対する細胞の応答をアッセイし、そして活性の基準レベルに対する細胞の応答を比較する、ことによる前記方法を提供する。活性の基準レベルは、候補化合物の不在下で、細胞およびＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド間の接触が行われた際にアッセイすることにより決定する。その存在が基準を超える応答を起こす試験化合物は、該試験化合物がＩＭＸＰ−８８８活性のアゴニストであることを示している。一方、基準と比較して応答の減少は、該試験化合物がＩＭＸＰ−８８８活性のアンタゴニストであることを示している。
【００６７】
一般に、試験化合物の存在下および不在下での、ＩＭＸＰ−８８８に対する細胞性応答（例えば、サイトカイン刺激および／またはカルシウム動員）における相違を比較すると、エフェクターが同定されるであろう。本発明に従ってスクリーニング可能な化合物には、限定するわけではないが、ペプチド（例えば、抗体を含むタンパク質のごときポリペプチドおよび小ペプチド）、非ペプチド性有機分子、および無機分子が含まれる。多数の化合物ライブラリーが、ほんのいくつかの供給源のみを挙げると、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ、Ａｒｑｕｌｅ、Ｅｎｚｙｍｅｄ、Ｓｉｇｍａ、Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ、ＴｒｅｇａおよびＰａｎＬａｂｓのような会社から商業的に入手可能である。天然産物または合成化学品を含む既知の化合物、およびエフェクターである化合物に対して生物学的に活性な物質のライブラリーもスクリーニング可能である。
【００６８】
サイトカイン産生および／または脾臓細胞、リンパ節細胞または胸腺細胞の増殖のためのアッセイには、非限定的に：ポリクローナルＴ細胞刺激、Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ａ．  Ｍ．およびＳｈｅｖａｃｈ，  Ｅ．  Ｍ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ監修，第１卷，  ｐｐ．  ３．１２．１−３．１２．１４，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  トロント．  １９９４；および、マウスおよびヒトインターフェロンガンマの測定，  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，  Ｒ．  Ｄ．  Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ監修，  第１卷，  ｐｐ．  ６．８．１−６．８．８，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  トロント．  （１９９４）に記載されているアッセイが含まれる。
【００６９】
レセプター−リガンド活性のためのアッセイには、非限定的に：  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊ．  Ｅ．  Ｃｏｌｉｇａｎ監修，  Ａ．  Ｍ．  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，  Ｄ．  Ｈ．  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，  Ｅ．  Ｍ．  Ｓｈｅｖａｃｈ，  Ｗ．  Ｓｔｒｏｂｅｒ，  Ｐｕｂ．  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  （７．２８章，静的条件下での細胞接着の測定  ７．２８．１−７．２８．２２），  Ｔａｋａｉら，  １９８７，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：  ６８６４−６８６８；  Ｂｉｅｒｅｒら，  １９８８，．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６８：  １１４５−１１５６；  Ｒｏｓｅｎｓｔｅｉｎら，  １９８９，  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １６９：  １４９−１６０；  Ｓｔｏｌｔｅｎｂｏｒｇら，  １９９４，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５：  ５９−６８；  およびＳｔｉｔｔら，  １９９５，  Ｃｅｌｌ  ８０：  ６６１−６７０に記載されているアッセイが含まれる。
【００７０】
処方および投与量
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」には、本明細書において、治癒的、防御的（例えば予防的）および対症的治療が含まれる。
【００７１】
こうした療法的使用のため、ＩＭＸＰ−８８８、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および／またはＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの同定されたアゴニストまたはアンタゴニストは、経口、非経口（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、皮内などの注射）、頬部、直腸、局所、または吸入および／または通気を含む、よく知られた手段を通じて、その必要がある哺乳動物に投与することが可能である。化合物は通常、適したキャリアーと処方する。投与に適した処方には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および処方をレシピエントの血液と等張にする溶質を含有してもよい水性および非水性無菌注射溶液、並びに懸濁剤または粘稠化剤を含んでもよい水性および非水性無菌懸濁物が含まれる。
【００７２】
同定された化合物は、療法的有効用量で患者に投与し、ＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの活性に関連した疾患を治療または緩解することが可能である。療法的有効用量とは疾患の徴候の緩解を生じるのに十分な化合物の量を意味している。投薬量は、化合物の比活性に応じるであろうし、そして日常的な実験によって、容易に決定可能である。例えば、療法的有効用量は、最初に、細胞培養アッセイから概算することが可能である。用量は、動物モデルにおいて、細胞培養で決定されるようなＩＣ50（すなわち症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含みつつ、毒性を最小限にする、循環血漿濃度範囲を達成するよう、処方することが可能である。こうした情報を用いて、ヒトにおいて、有用な用量を、より正確に決定することが可能である。投与する化合物の量および時期は、治療している患者、苦痛の程度、投与様式および主治医の判断に依存するであろう。
【実施例】
【００７３】
ここまで本発明を説明してきたが、以下の実施例は例示のために提供されており、限定のためではない。
実施例：サイトカイン分泌スクリーニング
サイトカイン分泌スクリーニングは、ＩＭＸＰ−８８８タンパク質細胞外ドメインの可溶性融合タンパク質の、多様な初代ヒト免疫細胞に対する生物学的活性を試験するために使用した。本スクリーニングにおいて、生物学的活性は、単独でのまたは共刺激分子と組み合わせてのサイトカイン分泌を誘導する能力として、共刺激分子により誘導されるサイトカイン分泌を阻害する能力として、または細胞増殖を誘導する能力として定義されている。
【００７４】
材料および方法
ヒト血液はドナーから集められ、望みの細胞型は最初に、フィコール勾配を通した遠心分離により他の細胞から分離した。界面の末梢血単球細胞を採取し、次にフィブロネクチン被覆（ウシ胎児血清）プレート上へ１から２時間置いた。単球はフィブロネクチン結合集団を構成し、フィブロネクチンを結合しない細胞を末梢血リンパ球（ＰＢＬ）と定義した。ＦＡＣＳ解析は、ＰＢＬ集団が典型的には６０−７５％のＴ細胞（ＣＤ３+）、１０−１５％のＢ細胞（Ｃ１９+）および１５−２０％のＮＫ（ＣＤ１６+）細胞を含んでいることを示した。ＲＰＭＩ−８８６６中で８日の、ＰＢＬ集団のさらなる培養、続いての抗ＣＤ３抗体によるＴ細胞の枯渇により、著しく濃縮されたＮＫ細胞が生じた（Ｐｅｒｕｓｓｉａら，  １９８７，  Ｎａｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｒｅｇｕｌ．  ６：  １７１−１８８）。これら３つの細胞型を９６ウェルプレートに小分割し（単球  ５ｘ１０4／ウェル；ＮＫ細胞  ２ｘ１０5／ウェル；ＰＢＬ  ２ｘ１０5／ウェル）、そして状態を変化させた。タンパク質は、細胞型に適した共刺激分子、並びに各細胞型に適した陽性、陰性および培地対照の存在下または不在下で、４重に試験した（表Ｉ）。ＩＭＸＰ−８８８タンパク質に対しては、マウスタンパク質の可溶型であるＦＧＦＲβＦｃ（Ｆｃドメインへ融合されたｍｕＦＧＦ−βの細胞外ドメインから成る）を使用した。この融合タンパク質の構築および発現は、本明細書に援用されるＷＯ  ００／５８４６３に記載されている。各アッセイプレートはまた、サイトカインイムノアッセイ標準物質の完全セットも含んでいた。
【００７５】
【表１】
2004520354.tif 000002
【００７６】
４８時間インキュベーション後、１０００ｘｇで１０分遠心分離して細胞上清液を採取した。上清液は次にサイトカインレベルを試験するか（表Ｉ）、またはＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ（商標）アッセイ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．，カリフォルニア州カマリロ；  Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  １９９３，  Ａｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｌａｂ．  １１：  ４８−５０）で細胞呼吸をモニターすることにより増殖を評価した。サイトカインレベル（ＩＬ−１２、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ）は、捕捉および検出のための商業的に入手可能な一致した抗体対（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ミネソタ州ミネアポリス）を利用する均質、時間分解蛍光イムノアッセイプロトコール（Ｄｅｌｆｉａ（登録商標）；  Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ，  トゥルク  フィンランド；  Ｒｏｂｅｒｔｓら，  １９９１）を使用して決定した。
【００７７】
結果
ＦＧＦＲβＦｃは５ｎＭで、３つの細胞型の各々について、４重に試験した。タンパク質は最初、各細胞型について一人のドナーに対して試験した。アッセイは１回の実験当たり１０プレートにグループ化し、個々の実験を各細胞型および検出された各サイトカインについて実行した。
【００７８】
ＦＧＦＲβＦｃは多様な細胞型においてサイトカイン分泌を強力に誘導した。非刺激ＰＢＬ細胞において、〜２０倍の増加がＴＮＦ−α分泌で観察され、そして抗ＣＤ３抗体で共刺激したＰＢＬ細胞において、対照の〜３倍の刺激が観察された。ＦＧＦＲβＦｃは、ＰＢＬにおいてのＩＦＮ−γ分泌には影響を与えなかった。
【００７９】
最も強いサイトカインの誘導がＮＫ細胞において観察され、そこでは、単独で投与した場合、ＴＮＦ−α分泌の〜２０倍の誘導、およびＩＦＮ−γ分泌の３倍の誘導を、ＦＧＦＲβＦｃが誘導した。共刺激分子としてＩＬ−１２を用いると、ＮＫ細胞において、ＴＮＦ−α分泌の〜４０倍の誘導、およびＩＦＮ−γ分泌の〜１０倍の誘導を、ＦＧＦＲβＦｃが誘導した。
【００８０】
単球において、ＦＧＦＲβＦｃ単独では、ＴＮＦ−α分泌が〜６倍増加したが、ＬＰＳ刺激ＴＮＦ−α分泌には影響を与えなかった。興味あることに、ＦＧＦＲβＦｃは単球におけるＬＰＳ刺激ＩＬ−１０分泌を減衰させた。
【００８１】
最後に、試験された３つの細胞型すべてにおいて、ＦＧＦＲβＦｃは細胞増殖には影響を与えなかった。
観察された活性は再現可能であり、およびタンパク質成分によるものであることを確認するため、異なったドナーからＮＫおよびＰＢＬ細胞を得、ＦＧＦＲβＦｃを再試験した。タンパク質は多様な濃度、および続いて熱不活性化して（７０℃で１０分）試験した。サイトカイン分泌のタンパク質誘導が、ＰＢＬおよびＮＫ細胞の両方で再び観察され、両方の場合とも、加熱後に活性が落ちた。高濃度のタンパク質（＞２０ｎＭ）では、等しいレベルのＩＦＮ−γ分泌が両方のタンパク質調製試料で最終的に得られ、このような不活性化条件下での不完全なタンパク質破壊を示唆している。
【００８２】
要約
ＮＫ細胞とインキュベートした場合、ＦＧＦＲβＦｃはＴＮＦ−αの強力な誘導を起こし、そしてＬＰＳ誘導ＩＬ−１０分泌を阻害した、これは、ＦＧＦＲβＦｃは前炎症性特性を有する可能性を示唆している。
【００８３】
ＦＧＦＲβＦｃのサイトカイン誘導活性は再現可能、細胞型特異性、熱感受性であり、力価測定可能である。共スクリーニングされた、いくつかの他のタンパク質は類似のＦｃタグを含んでいたが、それにもかかわらず同様の応答を誘導しなかったので、該活性はこのタンパク質に存在するＦｃタグに寄与するものではない。さらに、該活性が熱感受性であり、およびタンパク質調製試料中のエンドトキシンのレベルは、サイトカイン分泌を誘導するために必要なレベルよりかなり低いものであったので、該活性はエンドトキシンによるものではないことをデータが示している。
【００８４】
実施例：ＩＭＸＰ−８８８のカルシウム動員
細胞内カルシウムの変化は、広範囲の細胞過程に関連することが示されてきた。この実験においては、多様な異なった細胞型を、ＦＧＦＲβＦｃに応じたカルシウム動員についてスクリーニングした。
【００８５】
材料および方法
カルシウム動員は蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ（登録商標）３８４；  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，カリフォルニア州  サニーベイル）を使用してアッセイした。細胞に蛍光性カルシウム指示薬色素、Ｆｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，オレゴン州ユージーン，カタログ番号１４２０２）を負荷した。この色素は細胞内へ容易に負荷され、損なわれていない、生きている細胞における細胞内カルシウムレベルの測定を可能にする。Ｆｌｕｏ−４はＦＬＩＰＲ（登録商標）３８４装置内で、アルゴンレーザーの４８８ｎｍレーザー線により効率的に励起される。発光スペクトル蛍光強度の変化は、細胞内カルシウム濃度変化の直接的指標であり；こうした変化は励起または発光極大のいかなる変化も伴わずに起こる（ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＮｅａｇｌｅ，  １９９６，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｏｌ．  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １：  ７５−  ８０）。細胞内カルシウムのレベルは、ＦＧＦＲβＦｃタンパク質の添加に続いてモニターした。
【００８６】
初代細胞および細胞株の両方を含む、２５の細胞型の一団を、３１．２５ｎＭおよび３．１２５ｎＭでのＦＧＦＲβＦｃでスクリーニングした。初代細胞は上に記載したように調製した。アッセイした細胞型は以下のものであった：
１．初代免疫細胞：
Ｂ細胞（２ドナー）            Ｔ細胞（５日ＰＨＡ芽細胞、２ドナー）
ＮＫ細胞（２ドナー）          樹状細胞（１ドナー）
好中球（２ドナー）            単球（２ドナー）
２．初代細胞（クローン性）：
骨芽細胞（ＮＨＯｓｔ）          臍帯静脈内皮（ＨＵＶＥＣ）
大動脈内皮（ＨＡＥＣ）          包皮線維芽細胞（ＨＦＦ）
平滑筋（ＳＭＣ）                ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）
皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）
３．細胞株：
ヒーラ              ＫＧ−１          ＨＬ−６０
ＨｅｐＧ２          ＨＳＢ−２        ＴＨＰ−１
ラージ（Ｒａｊｉ）  ジャーカット      Ａ５４９
ＴＦ−１            Ｔ−８４
アッセイの１日前に、付着細胞を３８４ウェルプレートへ播種し、そしてプレート中でＦｌｕｏ−４色素を負荷した。非付着細胞は懸濁液中で負荷した。付着細胞に対しては、プレート当たり２百から１千万の間の細胞を使用し、および非付着細胞に対しては、プレート当たり４百から２千万の間の細胞を使用した。細胞を、細胞型に適した標準血清含有培地で増殖させた。
【００８７】
１ｍＭ  Ｆｌｕｏ−４および１０％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，オレゴン州ユージーン，カタログ番号Ｐ６８６７）保存液をＤＭＳＯで調製した。この保存液を、１ｘハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ，ＧＩＢＣＯ  ＃１４０６５−０５６）＋２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ＋１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ，ＨｙＣｌｏｎｅ  ＃ＳＨ３００７１）＋２．５ｍＭプロベネシド（Ｓｉｇｍａ，ミシガン州セントルイス，カタログ番号Ｐ８７６１）から成る負荷培地で、２μＭ  Ｆｌｕｏ−４まで希釈した。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７はＦｌｕｏ−４の安定性を促進させ、および細胞負荷を促進するために加える。プロベネシドは、細胞の外側へ色素を運び出すことができる、アニオン性交換タンパク質の活性を阻害するために加える。細胞に３０分負荷し、負荷培地で３回洗浄した。次に細胞を負荷培地中（３０μＬ／ウェル）、ＦＬＩＰＲ上に置いた。添加プレートは、最終試験濃度の４倍の試験ポリペプチドで作製した。次にデータをＦＬＩＰＲ上、１秒間隔で集め、そしてベースラインを確立するため、ＦＧＦＲβＦｃポリペプチドを１０時間点後に加えた。
【００８８】
すべての実験実施には、細胞が適切に負荷され、および機械が機能的に適切であることを示すために陽性対照としてイオノマイシン、並びにＵＰＴおよびヒスタミン（これらは多くの細胞型に対してより生理学的な陽性対照として働く）を加えた。各試験プレートは各細胞型に対して４重に（ｎ＝４）実験した。単一値データポイントは各試験ウェルにエクスポートした。最大−最小値がこの分析に選択された。
【００８９】
結果
試験された各細胞型に対し、カルシウムイオノホア  イオノマイシンに対する陽性応答が観察され、細胞はＦｌｕｏ−４で適切に負荷され、および装置は適切に働いていることを示していた。試験された細胞型の内、カルシウム動員応答は、ヒト単球（２人の独立したドナー）、ヒトＮＫ細胞（２人の独立したドナー）、並びにＴＨＰ−１（単球性）細胞株（ＡＴＣＣ番号ＴＩＢ−２０２）において、ＦＧＦＲβＦｃへの暴露により観察された。
【００９０】
要約
ＦＧＦＲβＦｃポリペプチドはまた、サイトカインアッセイの応答とは基本的に異なった生物学的応答を探るアッセイである、カルシウム動員スクリーニングにおいても活性を示した。
実施例：ＩＭＸＰ−８８８／Ｆｃ融合体の調製
この実施例は、ヒトＩＭＸＰ−８８８／Ｆｃ  ＤＮＡ構築物の調製、およびその後に、ヒトＩＭＸＰ−８８８／Ｆｃと称されるヒトＩＭＸＰ−８８８／免疫グロブリンＦｃ融合体タンパク質の発現を説明している。ヒトＩＭＸＰ−８８８／ＦｃをコードするＤＮＡは、マウスＩＬ−７リーダーペプチド、ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド（米国特許第５，０１１，９１２号に記載されている）、Ｆｃレセプターへの結合のため最小化するように突然変異された免疫グロブリンのＦｃ領域（Ｂａｕｍら，  １９９４，  Ｃｉｒ．  Ｓｈ．  ４４．  ３０に記載されている）、フレキシブルリンカー配列および配列番号３のアミノ酸１８から３７８をコードするＤＮＡを含んでいる。リーダー配列、ＦＬＡＧ、突然変異されたｈｕＩｇＧ  Ｆｃおよびフレキシブルリンカーを含んでいる発現ベクターは、慣用的酵素切断および連結技術を用いて調製する。得られたベクターは次に、ＳｐｅＩおよびＮｏｔＩで制限分解する。ヒトＩＭＸＰ−８８８の細胞外ドメインの一部をコードするＤＮＡを、フレキシブルリンカーの後に３’に対して５’で、以下に記載する２方向連結で挿入する。
【００９１】
ヒトＩＭＸＰ−８８８  ＤＮＡを調製するため、プライマー対を設計し、ヒト皮膚またはヒト皮膚疾患ライブラリーファージクローンからのＤＮＡ断片を増幅するために使用する。上流オリゴヌクレオチドプライマーは、ＩＭＸＰ−８８８ペプチドのアミノ酸１８に対応するコドンの上流にＳｐｅＩ部位を導入する。下流オリゴヌクレオチドプライマーは、アミノ酸３７８に対応するコドンのすぐ下流にＢｇｌＩＩ部位を導入する。
【００９２】
ＰＣＲ断片を、リーダー配列、Ｆｌａｇ（登録商標）配列、突然変異されたヒトＩｇＧ  Ｆｃおよびフレキシブルリンカー領域を含んでいる発現ベクター（ｐＤＣ４０９；ＰＣＴ／ＵＳ９９／２７０６９を参照されたい）内へ、２方向連結で連結する。得られたＤＮＡ構築物でサル腎臓細胞株ＣＶ−１／ＥＢＮＡをトランスフェクトする。０．５％低免疫グロブリンウシ血清を含んでいる培地中で７日培養した後、０．２％アジド溶液を上清に加え、そして上清は０．２２μｍフィルターを通して濾過する。次に、１Ｌの上清を、４．６ｘ１００ｍｍプロテインＡカラム（ＰＯＲＯＳ  ２０Ａ、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから）を使用し、１０ｍＬ／分にて、ＢｉｏＣａｄ  プロテインＡ  ＨＰＬＣタンパク質精製システムを通過させる。プロテインＡカラムは、上清中の融合タンパク質のＦｃ部分を結合し、融合タンパク質を固定化し、および上清の他の構成要素がカラムを通過することを可能にする。カラムを３０ｍＬのＰＢＳで洗浄し、結合された融合タンパク質を、ｐＨ３．０に調節したクエン酸でＨＰＬＣカラムから溶出する。溶出した精製融合タンパク質は、ｐＨ７．４の１Ｍ  ＨＥＰＥＳを使用して溶出するので、精製融合タンパク質を中和する。
実施例：ＩＭＸＰ−８８８に対するモノクローナル抗体
この実施例は、ＩＭＸＰ−８８８に対する抗体を調製する方法を例示している。精製ＩＭＸＰ−８８８／Ｆｃは上の実施例に記載したように調製する。精製タンパク質は、米国特許第４，４１１，９９３号に記載されているように、ＩＭＸＰ−８８８に対する抗体を発生させるために使用する。簡単には、マウスを１０μｇのＩＭＸＰ−８８８／Ｆｃで、０、２および６週目に免疫する。一次免疫感作は、Ｖａｘｃｅｌｌ，  Ｉｎｃ．からのＴＩＴＥＲＭＡＸアジュバントで調製し、および続いての免疫感作は不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）で調製する。１１週目、マウスを３−４μｇＩＭＸＰ−８８８／ＦｃのＰＢＳ溶液でＩＶ追加免疫する。ＩＶ追加免疫して３日後、脾臓細胞を採取し、５０％ＰＥＧ１５００水溶液を用いて、Ａｇ８．６５３骨髄腫融合パートナーと融合する。ハイブリドーマ上清を、ＩＭＸＰ−８８８／Ｆｃおよび不適切なＦｃタンパク質に対するドットブロットアッセイにより、ＩＭＸＰ−８８８抗体についてスクリーニングする。
【００９３】
ＩＭＸＰ−８８８に特異的なモノクローナル抗体は、応答性細胞（例えば、ＴＨＰ−１細胞株、単球、ＮＫ細胞および／またはＰＢＬ）において、ＩＭＸＰ−８８８によるサイトカイン産生および／またはカルシウム動員を阻止する能力を試験する。こうした抗体を阻止抗体として同定し、ＩＭＸＰ−８８８のアンタゴニストとして使用することが可能である。
【００９４】
本発明は、本発明の個々の側面のただ一つの例示として意図された、本明細書に記載の特別の態様による範囲に限定されるものではなく、そして機能的に均等な方法および構成要素は本発明の範囲内である。実際、本明細書に示され、および記載されたものに加え、本発明の多様な修飾が、前記の記述および付随する図から、当業者には明らかになるであろう。こうした修飾は付属する特許請求の範囲内に包含されることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ＮＫ細胞からのＩＦＮ−γ分泌の用量応答分析。ＮＫ細胞を、ＩＬ−１２および濃度を増加させた天然のＩＭＸＰ−８８８または熱不活性化ＩＭＸＰ−８８８（△Ｈ）で刺激した。生じたＩＦＮ−γ分泌のレベルは上に記載したようにイムノアッセイにより評価した。
【図２】２つのマウスＩＭＸＰ−８８８ポリペプチドの比較。ｍｕＦＧＦ−β（上の行；配列番号１）およびｍｕＦＧＦ−γ（下の行；配列番号２）のアミノ酸配列が示されている。２つの変異体は、成熟タンパク質のアミノ末端細胞外ドメインが異なっている。膜貫通ドメインには下線が引かれており、および細胞内ドメインはカルボキシ末端に存在している。
【図３】マウスおよびヒトＩＭＸＰ−８８８アミノ酸配列の比較。ＢＬＡＳＴプログラムを用い、マウスＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド配列の１つの変異体（上の行；配列番号１）をヒトＩＭＸＰ−８８８ポリペプチド配列（下の行；配列番号３）と比較した。マウス配列の最初の４７９アミノ酸、およびヒト配列の最初の４９０アミノ酸にわたり、ポリペプチドは８７％が同一であり、９１％が類似している（即ち、保存的置換）。相同性はアミノ末端細胞外ドメインで最も大きい。カルボキシ最末端で（細胞内ドメイン内）、２つのタンパク質は異なる。膜貫通ドメインには下線が引かれている。
【図１】
2004520354.tif 000003
【図２】
2004520354.tif 000004
【図３】
2004520354.tif 000005
【国際公開パンフレット】
2004520354.tif 000006
2004520354.tif 000007
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2004520354.tif 000046
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004520354.tif 000047
【国際調査報告】
2004520354.tif 000048
2004520354.tif 000049
2004520354.tif 000050