(57)【要約】本発明は、グリシル-Ｌ-プロリル-Ｌ-グルタミン酸（ＧＰＥ）の類縁体及びペプチドミメティックに関する。具体的には、本発明は、抗-アポトーシス性及び抗-ネクローシス性のＧＰＥ類縁体及びペプチドミメティック、それらの製造方法、それらを含有する医薬組成物及びそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式１又は一般式２の化合物又は医薬として許容され得るそれらの塩：
【化１】
2004536069.tif 000004
（式中、ｍは０又は１であり；
ｎは０又は１であり；
Ｘは、Ｈ又は−ＮＲ6Ｒ7を表し；
Ｙは、Ｈ、アルキル、−ＣＯ2Ｒ5又は−ＣＯＮＲ6Ｒ7を表し；
Ｚは、Ｈ、アルキル、−ＣＯ2Ｒ5又は−ＣＯＮＲ6Ｒ7を表し；
Ｒ1は、Ｈ、アルキル又はアラルキルを表し；
Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、独立してＨ又はアルキルを表し、
それぞれＲ5は、独立してＨ、アルキル、又は脂肪族アルコール残基を表し、
それぞれＲ6及びＲ7は、独立してＨ、アルキル又はアラルキルを表すか、又は-ＮＲ6Ｒ7はピロリジノ、ピペリジノ又はモルホリノを表すか；
又は、Ｙが−ＣＯ2（アルキル）を表しかつＺが−ＣＯ2Ｈを表すか、又はＹが−ＣＯ2Ｈを表しかつＺが−ＣＯ2（アルキル）を表す化合物がラクトン化される時に形成されるラクトンである。）、ここで該化合物は、ＧＰＥ、Ｎ-Ｍｅ-ＧＰＥ、ＧＰＥアミド、ＡＰＥ、ＧＰＱ又はそれらの塩ではないことを条件とする。
【請求項２】
一般式１の化合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｍが０である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
ｎが１である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｘ、Ｙ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5の少なくとも一つが水素ではない、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｘが、−ＮＲ6Ｒ7  である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｙが、−ＣＯ2Ｒ6又は−ＣＯ2ＮＲ6Ｒ7である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｚが、−ＣＯ2Ｒ6又は−ＣＯ2ＮＲ6Ｒ7である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
一般式１の化合物であって、式中、ｍが０、ｎが１であり、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3及びＲ4がすべて水素を表し、Ｙ及びＺの両方が-ＣＯＯＨであり、Ｘが−ＮＲ6Ｒ7であり、ここでＲ6及びＲ7の両方がメチルである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１０】
（ａ）請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物の治療的有効量；及び
（ｂ）医薬として許容され得る賦形剤
を含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項１１】
ＧＰＥ類縁体又はペプチドミメティックの投与により治療可能な疾患又は傷害を有する動物の治療方法であって、ここで請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物の治療的有効量の該動物への投与を含むことを特徴とする、上記方法。
【請求項１２】
疾患がアルツハイマー病である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
疾患が多発性硬化症である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
疾患がパーキンソン病である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
疾患が末梢神経障害である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
疾患がハンチントン病である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
疾患がＩ型糖尿病である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
疾患がII型糖尿病である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
傷害が、脳卒中である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
傷害が外傷性脳損傷である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
傷害が低酸素性脳損傷である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
傷害が虚血性脳損傷である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２３】
傷害が周産期仮死である、請求項１１に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも一つの他の抗-アポトーシス剤又は神経保護剤を投与する、請求項１１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも一つの抗アポトーシス剤又は神経保護剤が、成長因子及び関連した誘導体（インスリン様成長因子−Ｉ［ＩＧＦ−Ｉ］、インスリン様成長因子−II［ＩＧＦ−II］、トランスフォーミング成長因子−β１、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合タンパク、ＩＧＦ−結合タンパク［具体的にはＩＧＦＢＰ−３］、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、hst/Kfgk遺伝子プロダクト、ＦＧＦ−３，ＦＧＦ−４，ＦＧＦ−６、ケラチノサイト成長因子、アンドロゲン誘導成長因子、int-2、線維芽細胞成長因子相同因子−１（ＦＨＦ−１）、ＦＨＦ−２、ＦＨＦ−３及びＦＨＦ−４、ケラチノサイト成長因子２、グリア活性化因子、ＦＧＦ−１０およびＦＧＦ−１６、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４、骨形成タンパク２［ＢＭＰ−２］、グリア細胞系由来神経栄養因子、活性依存性神経栄養因子、サイトカイン白血病抑制因子、オンコスタチンＭ、インターロイキン）、α-、β-、γ-、又はコンセンサスインターフェロン、ＴＮＦ−α、クロメチアゾール；キヌレン酸、セマックス、タクロリムス、Ｌ-スレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノール、アドレノコルチコトロピン-(4-9)類縁体［ＯＲＧ２７６６］及びジゾルシピン[ＭＫ−８０１]、セレジリン、グルタミン酸拮抗薬、例えばＮＰＳ１５０６、ＧＶ１５０５２６０、ＭＫ−８０１、ＧＶ１５０５２６；ＡＭＰＡ拮抗薬、例えば2,3-ジヒドロキシ-6-ニトロ-7-スルファモイルベンゾ(f)キノキサリン（ＮＢＱＸ）、ＬＹ３０３０７０及びＬＹ３００１６４、及びアドレッシンMAdCAM-1及び／又はそのインテグリンα４レセプター（α４β１及びα４β７）に対して示された抗炎症剤、例えば抗-MAdCAM-１mAb ＭＥＣＡ-３６７(ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ-９４７８)から選ばれる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＧＰＥ類縁体又はペプチドミメティックの投与により治療可能な疾患又は傷害の治療に有用な薬剤の製造のための請求項１に記載の一般式１又は２の化合物の使用。
【請求項２７】
上記疾患又は傷害がアルツハイマー病、多発性硬化症、パーキンソン病、末梢神経障害、例えばハンチントン病、II型糖尿病、脳卒中、外傷性脳損傷、低酸素性脳損傷、虚血性脳損傷又は周産期仮死である、請求項２６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、グリシル-Ｌ-プロリル-Ｌ-グルタミン酸（ＧＰＥ）の類縁体及びペプチドミメティック(peptidomimetics)に関する。具体的には、本発明は、抗アポトーシス性及び抗ネクローシス性のＧＰＥ類縁体及びペプチドミメティック、それらの製造方法、それらを含有する医薬組成物及びそれらの使用に関する。
【０００２】
背景技術
EP 0 366 638は、ＧＰＥ（アミノ酸Ｇｌｙ-Ｐｒｏ-Ｇｌｕからなるトリペプチド）及びそのジペプチド誘導体Ｇｌｙ-Ｐｒｏ及びＰｒｏ-Ｇｌｕを開示している。EP 0 366 638は、ＧＰＥが神経調節物質として有効であり、ニューロンの電気的性質に影響を与え得ることを開示している。
WO95/172904は、ＧＰＥが神経保護性を有すること及び、ＧＰＥの投与が、ニューロン及びグリア細胞死の予防又は阻害により中枢神経系（ＣＮＳ）に対する損傷を減少し得ることを開示している。
WO 98/14202は、ＧＰＥの投与が、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）及び一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）の有効量を増加し得ることを開示している。
WO99/65509は、ＣＮＳにおけるＧＰＥの有効量の増加（例えば、ＧＰＥの投与による）は、ＣＮＳにおいてチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の有効量を増加し得ることを開示しており、それは、疾患、例えばパーキンソン病の治療において、ＴＨ介在ドーパミン産生を増加することに関する。
WO02/16408は、患者内のＧＰＥと同等の生理学的効果を生じ得るＧＰＥ類縁体を開示している。ＧＰＥ類縁体の適用としては、急性脳損傷及び神経変性疾患の治療があげられ、それはＣＮＳの傷害又は疾患を含むが、それらに限定されない。
本出願（図面を含む）において言及したこれらの開示及び他の文献は、参照文献としてここに含まれるものとする。
【０００３】
発明の概要
第一の態様において、本発明は、一般式１及び一般式２の化合物及び医薬として許容され得るそれらの塩を提供し、ここで該化合物は、ＧＰＥ、Ｎ-Ｍｅ-ＧＰＥ、ＧＰＥアミド、ＡＰＥ、ＧＰＱ又はそれらの塩ではないことを条件とする。
【０００４】
【化１】
2004536069.tif 000002
【０００５】
（式中、ｍは０又は１であり；
ｎは０又は１であり；
Ｘは、Ｈ又は−ＮＲ6Ｒ7を表し；
Ｙは、Ｈ、アルキル、−ＣＯ2Ｒ5又は−ＣＯＮＲ6Ｒ7を表し；
Ｚは、Ｈ、アルキル、−ＣＯ2Ｒ5又は−ＣＯＮＲ6Ｒ7を表し；
Ｒ1は、Ｈ、アルキル又はアラルキルを表し；
Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は、独立してＨ又はアルキルを表し、
それぞれＲ5は、独立してＨ、アルキル、又は脂肪族アルコール残基を表し、
それぞれＲ6及びＲ7は、独立してＨ、アルキル又はアラルキルを表すか、又は-ＮＲ6Ｒ7はピロリジノ、ピペリジノ又はモルホリノを表し；
また、Ｙが−ＣＯ2（アルキル）を表しかつＺが−ＣＯ2Ｈを表すか、又はＹが−ＣＯ2Ｈを表しかつＺが−ＣＯ2（アルキル）を表す化合物がラクトン化される時に形成されるラクトンである。）
【０００６】
第二の態様において、本発明は、医薬として許容され得る賦形剤及び治療上有効な量の本発明の化合物の少なくとも一つを含む医薬組成物を提供する。これらの組成物は、抗アポトーシス及び抗ネクローシス剤として、また、ＧＰＥ類縁体又はペプチドミメティックの投与が指示される状態への使用が見出されるものである。
第三の態様において、本発明は、ＧＰＥ類縁体又はペプチドミメティックの投与により治療可能な疾患又は傷害を有する動物を治療する方法であって、ここで、本発明の少なくとも一つの化合物を、所望により、治療される疾患のために少なくとも一つの他の慣用の治療薬と組み合わせて、その動物に投与することを含む、上記方法を提供する。
第四の態様において、本発明は、本発明の第一の態様の化合物の製造方法を提供する。
第五の態様において、本発明は、ＧＰＥ類縁体又はペプチドミメティックの投与により治療可能な疾患又は傷害の治療に有用な薬物の製造のための一般式１又は２の化合物の使用を提供する。
【０００７】
発明の詳細な記載
定義
「アルキル」は、炭素数１〜６の線状飽和ヒドロカルビル基、又は炭素数３〜６の分枝又は環状飽和ヒドロカルビル基を意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、イソプロピル、シクロプロピル、tert-ブチル、シクロプロピルメチル及びヘキシルが挙げられる。
「動物」としては、ヒト及び非-ヒト哺乳類、例えばペット（ネコ、イヌ等）及び家畜（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等）が挙げられる。
「アラルキル」は、以下の一般式、-(ＣＨ2)1-2Ａｒの基を意味し、式中Ａｒは、５員又は６員の炭素環式又は複素環式芳香環であり、所望により、Ｃｌ、Ｂｒ、-ＯＨ、-Ｏ-アルキル、-ＣＯ2Ｒ8(式中、Ｒ8はＨ又はアルキルを表す)又は-ＮＲ8Ｒ9(式中、Ｒ8は上記の通りであり、Ｒ9はＨ又はアルキルを表す)から選ばれる１つ〜３つの置換基により置換されている。アラルキル基の例としては、ベンジル、２-クロロベンジル、４-(ジメチルアミノ)ベンジル、フェネチル、１-ピロリルメチル、２-チエニルメチル及び３-ピリジルメチルが挙げられる。
「疾患」としては、動物の不健康な状態のいずれかであり、具体的にはパーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、糖尿病及び老化による認知機能障害が挙げられる。
【０００８】
「脂肪族アルコール残基」は、炭素数７〜１２の直鎖ヒドロカルビル基であり、所望により３つまでの炭素−炭素二重結合を含んでいる。脂肪族アルコール残基の例としては、デシル、ペンタデシル、ヘキサデシル（セチル）、オクタデシル（ステアリル）、オレイル、リノレイル及びエイコシルが挙げられる。
「増殖因子」は、細胞が成長又は増殖するように刺激する細胞外ポリペプチド−情報伝達分子を意味する。
「傷害」としては、動物の急性損傷のいずれかであって、具体的には、非出血性脳卒中(non-hemorrhagic stroke)、外傷性脳損傷、胎児仮死、例えば、剥離を伴う臍帯閉塞(cord occlusion)に関連した又は子宮内成長遅滞に関連した周産期仮死、適切な蘇生又は呼吸の失敗に関連した周産期仮死、溺死寸前、揺籃死寸前、一酸化炭素吸入、アンモニア又は他のガス中毒に関連した深刻なＣＮＳ傷害、心停止、昏睡、髄膜炎、低血糖及び癲癇重積状態、冠動脈バイパス手術、低血圧発症及び高血圧性クリーゼに関連した脳性仮死発作及び脳性外傷が挙げられる。
「医薬として許容され得る賦形剤」は、一般的に安全、非毒性かつ望ましい医薬組成物を製造するのに有用な賦形剤を意味し、また人間の医薬的使用と同様に獣医学的使用にも許容され得る賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体又は、エアロゾル組成物の場合においては気体であってもよい。
【０００９】
「医薬として許容され得る塩」とは、医薬として許容され得るものであり、また、望ましい薬理学的性質を有する塩を意味する。そのような塩は、化合物に存在する酸性プロトンが、無機又は有機塩基と反応可能な場合に形成されてもよい塩を含む。好適な無機塩としては、アルカリ金属、例えばナトリウム及びカリウム、マグネシウム、カルシウム及びアルミニウムで形成されるものが挙げられる。好適な有機塩としては、有機塩基、例えば、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン(tromethamine)及びＮ−メチルグルカミン等で形成されるものがあげられる。また、そのような塩としては、無機酸（例えば、塩化水素酸及び臭化水素酸）及び有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸及びアルカン−及びアレーン−スルホン酸、例えばメタンスルホン酸及びベンゼンスルホン酸）で形成された酸付加塩が挙げられる。二つの酸性基が存在する場合、医薬として許容され得る塩は、モノ-酸-モノ-塩又はジ-塩であってもよく；また、同様に、二つより多くの酸性基が存在する場合は、そのような基のいくつか又は全てが塩化され得る。
【００１０】
「保護基」とは、有機合成においてそれと通常関連した意味を有し、即ち、多機能性化合物の一つ又は二つ以上の反応部位を選択的に遮断する基であり、化学反応が、他の保護されていない反応部位で選択的に行われることを可能とし、また、選択的反応が完了した後に、その基が直ちに除去され得るようにするものである。
「治療的有効量」とは、疾患を治療するために動物に投与する時、その疾患の治療に影響を及ぼすのに十分な量を意味する。
疾患の「治療」としては、疾患の素因となる可能性があるが、その疾患の症候を未だ発現又は提示していない動物において疾患の発生を防ぐこと(予防的治療)、疾患を抑制すること（その進行を遅延又は抑止すること）、症候又は疾患の副作用軽減の提供（対症療法を含む）及び疾患の緩和（疾患の退行を生じる）を含む。
潜在的な水素原子（例えば、ピロリジン環等の水素）は、明瞭さを考慮して、一般式から省略されているが、存在するものと理解されるべきである。
【００１１】
好ましい化合物
本発明の最も広い定義を、発明の概要において示したが、本発明の一定の化合物が好ましい。
本発明の好ましい化合物は、以下の通りである：
（ａ）化合物が一般式１で表される化合物であり；
（ｂ）ｍが０であり；
（ｃ）ｎが１であり；
（ｄ）Ｘ、Ｙ、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4及びＲ5の少なくとも一つが水素ではなく；
（ｅ）Ｘが、−ＮＲ6Ｒ7  であり；及び
（ｆ）Ｙが、−ＣＯ2Ｒ5又は−ＣＯ2ＮＲ6Ｒ7であり；及び
（ｇ）Ｚが、−ＣＯ2Ｒ5又は−ＣＯ2ＮＲ6Ｒ7である。
本発明の特に好ましい化合物は、Ｘが−ＮＲ6Ｒ7であり、Ｒ6及びＲ7が独立してアルキル又はアラルキルを表す一般式Ｉの化合物である。より好ましい態様は、Ｘが−ＮＲ6Ｒ7であり、Ｒ6及びＲ7の両方がアルキルを表す一般式Ｉの化合物である。
いくつかの異なる好ましいものを上記した。これらの好適例のいずれか１つが続くことにより、その特定の好適例が続いて記載されていない化合物より好ましい本発明の化合物がもたらされる。しかしながら、これらの好適例は、一般には、独立しており付加的なものであり；これらの好適例が多段で続くことにより、好適例がより少段で続く場合より一層好ましい化合物がもたらされ得る。
【００１２】
薬理学及び有用性
本発明の化合物は、抗アポトーシス性及び抗ネクローシス性である。in vivoにおけるそれら抗アポトーシス及び抗ネクローシス活性は、細胞計数により、方法、例えば、Klempt ND ら:Hypoxia-ischemia induces transforming growth factor β1 mRNA in the infant rat brain. Molecular Brain Reserch:13:93-101において論じられたものにより測定することができる。それら活性は、in vitroで測定することもできる。また、本発明の化合物は、ＧＰＥと同様の薬理学的性質及び治療活性を持つことが予期される。そして、それらの活性は、当業者に公知でありここに記載した文書においてＧＰＥの活性の測定について論じられている方法により測定してもよい。
化合物の治療可能比(therapeutic ratio)は、例えば、好適なin vivoモデル、例えば低酸素性虚血性傷害において[Sirimanne ES, Guan J, Williams CE and Gluckman PD: Two models for determining the mechanisms of damage and repair after hypoxic-ischemic injury in the developing rat brain. Jornal of Neuroscience Methods:55:7-14,1994年] 、効果的な抗アポトーシス及び抗ネクローシス活性を与える量を、好適な動物種、例えばラットにおいて、試験動物において明らかに観察可能な副作用を与える量と比較することにより測定可能である。
【００１３】
医薬組成物及び投与
一般的に、本発明の化合物は、治療有効量において、当業者に公知な通常の方法のいずれかにより、単独で、又は、本発明の他の化合物の少なくとも一つ及び／又は治療される疾患用の他の従来の治療剤の少なくとも一つとの組み合わせにおいて投与されるであろう。治療有効量は、治療される動物の疾患又は傷害、その重症度、年齢及び関連健康状態(relative health)、化合物の効力及び他の因子に依存して、広く変化してもよい。抗アポトーシス及び抗ネクローシス剤として、本発明の化合物の治療有効量は、動物の質量キログラム当たりのミリグラムで０.００１〜１０００（ｍｇ/ｋｇ）の範囲であってもよく、例えば、０.１〜１０ｍｇ/ｋｇであり、低用量、例えば０.００１〜０.１ｍｇ/ｋｇ、例えば約０.０１ｍｇ/ｋｇにあっては、脳脊髄液を介する投与、例えば脳室内投与に対して好適であり、高用量、例えば１〜１００ｍｇ/ｋｇ、例えば約１０ｍｇ/ｋｇにあっては、経口、全身（例えば経皮的）、又は非経口（例えば、静脈内）投与のような方法に対して好適である。当業者は、過度の実験をすることなく、技術及びこの開示内容を考慮して、示された疾患又は傷害に関して本発明の化合物の治療有効量を決定することができるであろう。
【００１４】
一般的に、本発明の化合物は、以下の経路の一つにより医薬組成物として投与されるであろう：経口、局所的、全身的（例えば経皮的、鼻腔内又は坐剤により）、非経口（例えば、筋肉内、皮下又は静脈内注射）、ＣＮＳに対する投与（例えば、髄腔内又は大槽内注射）；移植、及び浸透圧ポンプ、経皮パッチ等のような装置による注入。組成物は、錠剤、ピル、カプセル、半固体、粉末、徐放性製剤、溶液、懸濁液、エリキシル、エアロゾル又は他の好適な組成物のいずれかの形態をとり；また、本発明の化合物の少なくとも一つを、医薬として許容され得る賦形剤の少なくとも一つとの組み合わせにおいて含んでいてもよい。好適な賦形剤は当業者に公知であり、それら及び組成物を組成する方法は、以下のような標準的な文献に見出してもよい：Gennaro AR:Remington:The Science and Practice of Pharmacy,20thed.,Lippincott, Williams&Wilkins,2000年。好適な液体キャリヤー、特に注射液用は、水、生理食塩水及びデキストロース水溶液等が挙げられ、等張液が、静脈内、髄腔内及び大槽内投与に好ましく、及び人工脳脊髄液のような溶媒が、ＣＮＳに対する化合物の投与に特に好適である。
【００１５】
また、本発明の化合物は、徐放性システムにより好適に投与される。徐放性組成物の好適な例としては、造形品の形態において半透性ポリマーマトリックス、例えばフィルム、又はマイクロカプセルを含む。徐放性マトリックスとしては、ポリ乳酸（米国特許第3,773,919号；EP 58,481）、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタミン酸コポリマー（Sidmanら、1983年）、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)（Langerら、1981年）、エチレンビニルアセテート(Langerら、上記のもの)、又はポリ-Ｄ-(-)-3-ヒドロキシ酪酸（EP 133,988）が挙げられる。また、徐放性組成物としては、リポソームエントラップ化合物（liposomally entrapped compound）があげられる。化合物を含有するリポソームは、それ自体公知の方法により製造される：DE 3,218,121；Epsteinら、1985年；Hwangら、1980年；EP52,322；EP36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本国特許出願83-118008；米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号及びEP102,324。通常、リポソームは、小さい（約２００〜８００オングストローム）単層タイプであり、その脂質含量は、約３０モル％コレステロールより高く、選ばれた比率は、最も効果的な治療方法に適合される。
【００１６】
また、本発明の化合物は、in vivoにおいてそれらの寿命を延ばすためにＰＥＧ化されてもよく、それらは、例えばWO 95/32003に記載された結合(conjugate)技術がベースにされている。
望ましくは、もし可能ならば、抗アポトーシス及び抗ネクローシス剤として投与される場合、本発明の化合物は経口的に投与されるであろう。組成物における本発明の化合物の量は、組成物のタイプ、単位投与量のサイズ、賦形剤の種類及び当業者に公知の他の因子に依存して広く変えられてもよい。一般的に、最終的な組成物は、本発明の化合物０.０００１質量％（％ｗ）〜１０％ｗ、好ましくは０.００１％ｗ〜１％ｗを、残部の賦形剤又は複数の賦形剤と含んでもよい。
【００１７】
抗アポトーシス及び抗ネクローシス組成物は、本発明の化合物の他に、所望により、少なくとも一つの抗アポトーシス剤、例えば成長因子及び関連した誘導体（インスリン様成長因子−Ｉ［ＩＧＦ−Ｉ］、インスリン様成長因子−II［ＩＧＦ−II］、トランスフォーミング成長因子−β１、アクチビン、成長ホルモン、神経成長因子、成長ホルモン結合タンパク、ＩＧＦ−結合タンパク［具体的にはＩＧＦＢＰ−３］、塩基性線維芽細胞成長因子、酸性線維芽細胞成長因子、hst/Kfgk遺伝子プロダクト、ＦＧＦ−３，ＦＧＦ−４，ＦＧＦ−６、ケラチノサイト成長因子、アンドロゲン誘導成長因子から選ばれるものを含んでいてもよい。ＦＧＦファミリーのさらなるメンバーとしては、例えば、int-2、線維芽細胞成長因子相同因子−１（ＦＨＦ−１）、ＦＨＦ−２、ＦＨＦ−３及びＦＨＦ−４、ケラチノサイト成長因子２、グリア活性化因子、ＦＧＦ−１０およびＦＧＦ−１６、毛様体神経栄養因子、脳由来成長因子(brain derived growth factor)、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４、骨形成タンパク２［ＢＭＰ−２］、グリア細胞系由来神経栄養因子、活性依存性神経栄養因子、サイトカイン白血病抑制因子、オンコスタチンＭ、インターロイキン）、α-、β-、γ-、又はコンセンサスインターフェロン、及びＴＮＦ−αが挙げられる。神経保護治療剤の他の形態としては、例えば、クロメチアゾール(clomethiazole)；キヌレン酸、セマックス(Semax)、タクロリムス、Ｌ-スレオ-1-フェニル-2-デカノイルアミノ-3-モルホリノ-1-プロパノール、アドレノコルチコトロピン-(4-9)類縁体［ＯＲＧ２７６６］及びジゾルシピン(dizolcipine)[ＭＫ−８０１]、セレジリン(selegiline)；グルタミン酸拮抗薬、例えばＮＰＳ１５０６、ＧＶ１５０５２６０、ＭＫ−８０１、ＧＶ１５０５２６；ＡＭＰＡ拮抗薬、例えば2,3-ジヒドロキシ-6-ニトロ-7-スルファモイルベンゾ(f)キノキサリン（ＮＢＱＸ）、ＬＹ３０３０７０及びＬＹ３００１６４；アドレッシン(addressin)MAdCAM-1及び／又はそのインテグリンα４レセプター（α４β１及びα４β７）に対して示された抗炎症剤、例えば抗-MAdCAM-１mAb ＭＥＣＡ-３６７(ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ-９４７８)が挙げられる。これらの薬剤の多く、具体的には成長因子等のようなペプチドは、経口で活性ではなく、注射又は注入による投与が要求されるであろう。
本発明は、また、ＧＰＥ類縁体又はペプチドミメティックの投与により治療可能な疾患又は傷害の治療に有用な薬剤を製造するために、一般式１又は２の化合物を使用することを示している。
【００１８】
本発明の化合物の製造
これら化合物の製造において使用される出発物質及び試薬は、商業的供給業者、例えばアルドリッチケミカルカンパニー（Aldrich Chemical Company）（ミルウォーキー、ウィスコンシン）、バッケム（Bachem）(トランス、カルフォルニア)、シグマ（Sigma）（セントルイス、ミズーリ）から入手可能であるか、又は以下の文献に記載される方法に従って当業者に公知の方法により製造可能される；Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, vols 1-17, Ｊohn Wiley and Sons, ニューヨーク、 N.Y., 1991年；Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, vols. 1-5 and supplements, Elsevier Science Publishers, 1989年； Organic Reactions, vols.1-40 John Wiley and Sons,ニューヨーク、N.Y.、1991年；March J;Advanced Organic Chemistry, 4THed. John Wiley and Sons, ニューヨーク、N.Y.、1992年；及びLarock:Comprehensive Organic Transfomations, VCH Publishers, 1989年。大抵の場合、アミノ酸及びそれらのエステル又はアミド、及び保護アミノ酸は、商業的に広く入手可能であり、修飾アミノ酸及びそれらのアミド又はエステルの製造は、化学及び生化学の文献に広範に記載されており、従って、当業者には公知である。例えば、N-ピロリジン酢酸は、Dega-Szafran Z and Pryzbylak R. Synthesis, IR, and NMR studies of zwitterionic α-(1-pyrrolidine)alkanocarboxylic acid and their N-methyl derivatives. J.Mol.Struct,: 436-7, 107-121,1997年に記載され；及びN-ピペリジン酢酸は、Matsuda O, Ito S, and Sekiya M. Reaction of N-(alkoxymethyl)dialkylamines and N,N'-methylenebisdialkylamines with isocyanides. Chem. Pharm. Bull.:23(1),219-221,1975年に記載されている。
【００１９】
出発物質、中間体及び本発明の化合物は、従来の技術、例えば、ろ過、蒸留、結晶化及びクロマトグラフィー等を使用して単離及び精製してもよい。それらは、従来の方法、例えば、物理定数及びスペクトルデータを使用して特徴付けしてもよい。
もし、明記されていないならば、ここに記載された反応は、大気圧で、温度範囲約０℃〜１２５℃で行われる。
本発明の化合物は、以下の記載及び実施例に示した方法により製造してもよい。
一般式１の化合物は、ＧＰＥの類縁体又はそれらの修飾物(modification)、例えばエステル又はアミドである。一般的に、それらは、当業者に既に公知の方法により、本明細書に添付の１１の図に示した反応図式に従って、あるいはペプチド及び類縁体の合成の当業者に公知の他の方法に従うことにより製造してもよい。
【００２０】
都合よく、本発明のポリペプチドの合成は、Merrifiedら、Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide: J.Amer. Chem. Soc.85, 2149-2156, 1963年、により記載された固相合成法に従ってもよい。この技術は、よく理解され、また、一般的なペプチドの製造方法である。固相合成法は、成長するペプチド鎖に保護アミノ酸を段階的に添加することを含み、ここでその鎖は、固体樹脂粒子に共有結合により結合される。この方法により、試薬及び副産物がろ過により除去され、そのようにして、中間体の生成の必要性が排除される。この方法の一般的な概念は、鎖の第一アミノ酸の共有結合による固体ポリマーへの付着に依存している。次の保護アミノ酸を、一つづつ（段階的方針）又は一括して（セグメント方針）、所望の配列が構築されるまで添加する。最終的に、保護ペプチドを固体樹脂支持体から除去し、保護基を切断する。
アミノ酸を、樹脂として好適なポリマーに付着してもよい。その樹脂は、官能基を含まなければならず、第一の保護アミノ酸はそれに共有結合でしっかりと結合し得る。様々なポリマーが、この目的に好適であり、例えばセルロース、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート及びポリスチレンが挙げられる。好適な樹脂は、商業上入手可能であり、当業者に公知である。そのような合成に有用な好適な保護基としては、tert-ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジル（Ｂzl）、t-アミルオキシカルボニル（Ａoc）、トシル(Ｔos)、o-ブロモ-フェニルメトキシカルボニル（ＢrＺ）、2,6-ジクロロベンジル（ＢzlCl2）、及びフェニルメトキシカルボニル（Ｚ又はＣＢＺ）が挙げられる。さらなる保護基は、上記のMerrifieldに、また、McOmie JFW: Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press、ニューヨーク、1973年、に確認される。
【００２１】
本発明のペプチドの一般的な製造方法は、樹脂に保護カルボキシル−末端アミノ酸を初めに付着することを含む。付着の後、樹脂をろ過し、洗い、カルボキシル末端アミノ酸のＩ−アミノ基上の保護基（望ましくはＢＯＣ）を除去する。この保護基の除去は、当然のことながら、そのアミノ酸及び樹脂の間の結合を壊すことなく行わなければならない。次のアミノ酸を、必要に応じて側鎖保護アミノ酸を、その後、樹脂上のアミノ酸の遊離Ｉ−アミノ基に結合させる。この結合を、第二のアミノ酸の遊離カルボキシル基と、樹脂に付着した第一アミノ酸のアミノ基との間のアミド結合の形成により行う。この順次現象を、すべてのアミノ酸が樹脂に付着するまで、首尾良いアミノ酸で繰り返した。最終的に、保護ペプチドを樹脂から切断し、保護基を除去し、所望のペプチドを現させる。樹脂からペプチドを分離するため及び保護基を除去するために使用する切断技術は、樹脂及び保護基の選択に依存しており、それらはペプチド合成の当業者に公知である。
ペプチド合成に関する代替技術は、Bodanszkyら、Peptide Synthesis, 2nd ed, John Wiley and Sons、ニューヨーク、1976年、に記載されている。例えば、本発明のペプチドを、標準溶液ペプチド合成方法論を用いて合成してもよい。それは、アミド結合形成の化学的又は酵素的方法を使用したアミノ酸又はペプチド断片の段階的又はブロック的結合のいずれかを含んでいる。（例えば、H.D.Jakubke in The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Academic Press, ニューヨーク、1987年、103〜165頁；J.D.Glass, ibid.、167〜184頁；及びEuropean Patent 0324659 A2、を参照されたい。それらには酵素的ペプチド合成方法が記載されている。）これら溶液合成方法は、当業者に公知である。
商業的ペプチド合成機、例えばApplied Biosystems Model 430Aは、これらの方法の実践のために利用可能である。
【００２２】
当業者は、本発明の化合物の好適な１又は２以上の合成方法を開発することにおいて、入手可能な当該技術及び知識及びこの開示を考慮に入れることは困難ではないであろう。
例えば、ＧＰＥのグリシン残基が代替アミノ酸又は非アミノ酸により置換された類縁体を、保護プロリン−グルタミン酸ジペプチド（例えば、ジベンジルエステル）を調製し、そのジペプチドを保護グリシン類縁体、例えばＢＯＣ-Ｎ-メチルグリシン、ＢＯＣ-Ｌ-バリン及びＮ-ピロリジン酢酸等と結合させること、さらにその後の脱保護により、都合よく製造してもよく、それらは図２及び図３に示すとおりである。ＧＰＥのグルタミン酸残基が代替アミノ酸又はアミノ酸アミド又はエステルにより置換された類縁体を、保護グリシン-Ｌ-プロリンジペプチド（例えばＢＯＣ-グリシル-Ｌ-プロリン）の調製及び、そのジペプチドを保護グルタミン酸又はそれらの類縁体、例えばtert-ブチルγ-アミノブチレート、tert-ブチル４-メチル-４-アミノペンタノエート、tert-ブチル４-アミノペンタノエート、メチル４-アミノ-4-ジメチルカルバモイルブチレート、Ｌ-グルタミンメチルエステル、ジメチルI-メチル-Ｌ-グルタメート等と結合することにより都合よく製造してもよい。ラクトンを、好適なモノ-酸-モノ-エステル誘導体の調製及び還元により製造してもよい。Ｒ2がアルキルである類縁体を、その合成において、好適な２-アルキルプロリンの使用により単純に都合よく製造してもよく、また、同様にＲ3がアルキルである類縁体を、その合成において、好適なＮ-アルキルグルタミン酸又は類縁体の使用により都合よく製造してもよい。二つ又はそれより多いアミノ酸に対して修飾がなされる場合、その結合技術は、依然として同じであり、一つより多くが修飾されたアミノ酸又は類縁体がその合成において用いられる。選択した方法（固相又は溶液相）に関する好適な保護基及び、もし固相合成が使用されるならば好適な基質を選択することは、当業者の技術範囲内であろう。
【００２３】
一般式２の化合物を、好適に保護された5-オキソ-Ｌ-プロリン又はそれらの類縁体又は誘導体から製造してもよく、それは、以下の方法、例えばプロリンカルボキシル基を保護グルタミン酸又は類縁体又は誘導体と結合し、図２の中間体Ａの類縁体を与え（図２に示す結合反応に匹敵するもの）、その後ピロリジン窒素を一般式Ａ-(ＣＨ2)m-ＣＨ(Ｒ1)-ＣＨ2Ｒで表され、必要に応じてＡが保護されている基（式中、Ｒはアルキル化条件下で脱離基である）でアルキル化するという方法である。そうでなければ、好適に保護された５-オキソ-Ｌ-プロリンを、ピロリジン窒素でまずアルキル化して図４の中間体Ｂの類縁体を与え、その後、これを、好適に保護されたグルタミン酸又は類縁体又は誘導体と、図４〜図９に示す方法において結合してもよい。
【００２４】
実施例
以下の非制限的な実施例は、本発明の化合物、N,N-ジメチルグリシル-Ｌ-プロリル-Ｌ-グルタミン酸の合成を示す。
【００２５】
【化２】
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【００２６】
すべての出発物質及び他の試薬を、Aldrich社から購入した。
ＢＯＣは、tert-ブトキシカルボニル；Ｂｎは、ベンジルを表す。
ＢＯＣ-(γ-ベンジル)-Ｌ-プロリル-Ｌ-グルタミン酸ベンジルエステル
ジクロロメタン（５０ｍｌ）中にＢＯＣ-プロリン[Anderson GW and McGregor AC:J.Amer.Chem.Soc.:79,6180,1957年](１０ｍｍｏｌ)を含む溶液を、０℃に冷却し、トリエチルアミン(１.３９ｍｌ、１０ｍｍｏｌ)及びエチルクロロホルメート（０.９６ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合物を０℃で、３０分間攪拌した。その後、ジベンジルＬ-グルタメート溶液（１０ｍｍｏｌ）を加え、その混合物を０℃で２時間攪拌し、その後室温まで暖め、一晩攪拌した。反応混合物を水性重炭酸ナトリウム及びクエン酸（２ｍｏｌ l-1）で洗い、その後、乾燥し（ＭｇＳＯ4）、減圧下で濃縮し、ＢＯＣ-(γ-ベンジル)-Ｌ-プロリル-Ｌ-グルタミン酸ジベンジルエステル(５.０ｇ、９５％)を得た。
【００２７】
(γ-ベンジル)-Ｌ-プロリル-Ｌ-グルタミン酸ジベンジルエステル
ＢＯＣ-(γ-ベンジル)-Ｌ-プロリル-Ｌ-グルタミン酸ジベンジルエステル（３.４ｇ、１０ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却し、トリフルオロ酢酸(２５ｍｌ)で２時間、室温で処理した。減圧下で揮発物を除去した後、残渣をエーテルでつき砕き、(γ-ベンジル)-Ｌ-プロリル-Ｌ-グルタミン酸ジベンジルエステル（Ｉ）を得た。
【００２８】
N,N-ジメチルグリシル-Ｌ-プロリル-Ｌ-グルタミン酸
ジクロロメタン(１０ｍｌ)中、ジシクロヘキシルカルボジイミド（１０.３ｍｍｏｌ）を含む溶液を、ジクロロメタン(３０ｍｌ)に(γ-ベンジル)-Ｌ-プロリル-Ｌ-グルタミン酸ジベンジルエステル（１０ｍｍｏｌ）、N,N-ジメチルグリシン(１０ｍｍｏｌ)及びトリエチルアミン(１０.３ｍｍｏｌ)を含み、攪拌し冷却した（０℃）溶液に加えた。その混合物を、０℃で一晩、その後室温で３時間攪拌した。ろ過の後、ろ液を減圧下で蒸発させた。得られた粗ジベンジルエステルを、木炭(０.５ｇ) に１０％パラジウムを含む酢酸エチル（３０ｍｌ）及びエタノール(３０ｍｌ)の混合物に溶解し、その後、水素の取り込みが終了するまで、室温及び室内圧力で水素化した。ろ過した溶液を蒸発させ、その後、酢酸エチルから再結晶化した残渣からトリペプチド誘導体を生成した。
実施例の方法に従い、また代替アミノ酸又はそれらのアミド又はエステルを使用することで一般式Ｉの代替化合物が生成されることは明らかであろう。
【００２９】
試験：材料及び方法
以下の実験プロトコールは、オークランド大学アニマル・エシックスコミッティにより認可されたガイドラインに従っている。
代謝細胞培養上澄液収集用の皮質星状細胞培養物の調製
出生後１日のラットの一つの皮質半球(cortical hemisphere)を使用し、ＤＭＥＭ ４ｍｌに集めた。５ｍｌガラスピペット及びその後１８ゲージニードルを介してすり潰しを行った。その後、細胞懸濁液を、１００μｍ細胞ろ過器を通して篩い、ＤＭＥＭ ５０ｍｌで洗った（５分間、２５０ｇで遠心分離）。沈降物を２０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎仔血清中に再懸濁した。懸濁液１０ミリリットルを二つの２５cm3フラスコそれぞれに加え、１０％ＣＯ2存在下、３７℃で培養し、週に２度培地を交換した。細胞が集密になった後、それらをＰＢＳで３回洗い、Neurobasal/Ｂ２７に調製し、さらに３日間インキュベートした。この上清を、一時的な貯蔵のため、使用するまで−８０℃で冷凍した。
【００３０】
ラットＥ１８／Ｅ１９胚からの線条体及び皮質組織の調製
母畜を、チャンバー中、４分までＣＯ2処理により犠牲にし、その後帝王切開の準備をした。手術の後、胚をそれらの羊膜嚢から取り出し、断頭し、頭を、線条体についてはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に、また皮質についてはＰＢＳ+0.65%D(+)-グルコースにおいて、氷上に置いた。
線条体組織抽出方法及び細胞の調整
脳全体を頭蓋骨から外し、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に腹側を上に向けて置いた。線条体を、実体顕微鏡の下、両半球から解体し、線条体組織を氷上のファルコンチューブ(Falcon tube)に置いた。
【００３１】
収集した線条体組織を、容量１ｍｌのP1000ピペットを使用してすり潰した。その組織を、溶液をピペットの先端に約１５回、吸い出しを静かにピペットで行い、行き来する流れにおける剪断力を使用することにより、すり潰した。組織片を３０秒以内、ファルコンチューブの下部に据え、続いて上清を、氷上の新規無菌ファルコンチューブに移した。上清は、分離した単細胞の懸濁液を含んでいた。その組織片に２度目のすり潰しを行い、それらを過剰にすり潰すことにより既に分離した細胞を過度に損傷することを避けた。氷冷したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地１ミリリットルを第一のチューブ中の組織片に加え、前のようにすり潰した。組織片を沈め、上清を氷上の新規無菌ファルコンチューブに移した。その細胞を、２５０ｇで、５分間、４℃で遠心分離した。再懸濁した細胞ペレットを、細胞計数のために用意した。
【００３２】
線条体細胞のプレーティング及び培養
線条体細胞を、９６穴プレート（内部６０穴のみ）をコートしたポリ-Ｌ-リジン（０.１ｍｇ/ｍｌ）に、密度２００,０００細胞/ｃｍ2、Neurobasal/Ｂ２７培地（インビトロゲン）に播いた。細胞を、５％ＣＯ2の存在下、３７℃で、１００％湿度下で培養した。完全培地を１、３及び６日目に交換した。
【００３３】
皮質組織抽出方法及び細胞の調整
二つの皮質半球を、脳全体からスパーテルにより注意深く取り出し、ＰＢＳ＋0.65%D(+）-グルコースを含むペトリ皿に、腹側を上にして置いた。ピンセットを、組織を固定するために皮質の吻側部分（嗅脳近く）に置き、二つの外側−矢状方向カッティング(two lateral-sagittal oriented cutting)を行い、パラホルム(paraform)及び嗅内皮質を取り除いた。次のカットは、後方末端において前面方向カットを含み、海馬体を取り除いた。最終的な前面カットを最後のカットから数ミリメートルのところで行い、視覚野の17/18域を手に入れた。
ＰＢＳ＋0.65%D(+）-グルコース中、氷上において、収集した皮質を３５０ｇで、５分間、遠心分離した。上清を取り除き、トリプシン／ＥＤＴＡ(０.０５％/０.５３ｍＭ)を８分間、３７℃で加えた。反応を、同量のＤＭＥＭ＋10％ウシ胎児血清を加えることにより止めた。上清を遠心分離により除き、Neurobasal/Ｂ２７培地において引き続き２回洗った。
【００３４】
細胞を、Neurobasal/Ｂ２７培地１ｍｌにおいて、ガラスパスツールピペットで１回、続いて、２２ゲージニードルで１ｍｌインシュリン用注射筒を使用して２回すり潰した。細胞懸濁液を、１００μｍ細胞ろ過器を通し、続いて、Neurobasal/Ｂ２７培地１ｍｌでリンスした。細胞を計数し、６０μl当たり５０,０００細胞に調節した。
皮質細胞のプレーティング及び培養
９６穴プレートを、０.２mg/ｍｌポリ-Ｌ-リジンでコートし、続いてＰＢＳにおいて２μg/ｍｌ ラミニンでコートし、その後、皮質星状細胞−条件培地６０μlをそれぞれの穴に加えた。次に、皮質細胞懸濁液６０μlを加えた。その細胞を、１０％ＣＯ2の存在下、３７℃、１００％湿度で培養した。１日目、１μＭシトシン-β-Ｄ-アラビノ-フラノシド（有糸分裂インヒビター）の添加と共に、完全培地交換（1:1- Neurobasal/Ｂ２７培地及び星状細胞条件培地）を行った。２日目、培地の２/３を交換した。５日目、再び、培地の２/３を交換した。
【００３５】
Ｐ８動物からの小脳マイクロエクスプラント(microexplant)：調製、培養及び固定化
二つの半球の積層した小脳皮質を、Ｐ８ラットから外移植し、ＰＢＳ＋0.65%D(+）-グルコース溶液において小片に切断し、２３ゲージニードルによりすり潰し、続いて１２５μｍ孔径篩を通してプレスした。得られたマイクロエクスプラントを、無血清ＢＳＡ補足ＳＴＡＲＴ  Ｖ−培地（Biochrom）において２度遠心分離した（６０ｇ）（培地交換）。最終的に、マイクロエクスプラントを、ＳＴＡＲＴ  Ｖ−培地（Biochrom）において再構築した。培養のため、細胞懸濁液４０μｌを、３５ｍＭサイズ６穴プレートに置かれたカバーガラスをコートしたポリ-Ｄ-リジン(０.１ｍｇ/ｍｌ)上において、５％ＣＯ2の存在下、１００％湿度、３４℃で接着した。次に、ＳＴＡＲＴ  Ｖ−培地１ｍｌを毒素及び薬剤と共に加えた。培養物を、培養の２〜３日後に、５％ＣＯ2の存在下、１００％湿度においてモニター（評価）した。細胞計数分析のために、培養物をリンス濃度でのパラホルムアルデヒド（０.４％、１.２％、３％及び４％、３分ごと）において固定し、続いてＰＢＳにおいて洗った。
【００３６】
小脳、皮質及び線条体細胞に関する毒素及び薬剤の投与：分析
すべての毒素及び薬剤投与実験を、１/１００部のオカダ酸（３０ｎＭ及び１００ｎＭ濃度及び小脳マイクロエクスプラントのみにおいては０.５ｍＭ ３-ニトロプロピオン酸）、ＧＰＥ(１ｎＭ〜１ｍＭ)及びＧ-２メチル-ＰＥ（１ｎＭ〜１ｍＭ）を、皮質培養物に関して８ＤＩＶ及び線条体培養物に関して９ＤＩＶで、それぞれ使用するように設計した。インキュベーション時間は、２４時間であった。生存率を比色指標ＭＴＴ−アッセイにより、５９５ｎｍで、多穴プレートリーダーにおいて測定した。小脳マイクロエクスプラントに関し、高い細胞密度の４つのウインド（０.６５ｍｍ2の領域）を選択し、神経突起増殖を示す細胞を計数した。
【００３７】
結果
ＧＰＥ類縁体Ｇ-２メチル-ＰＥは、in vitro系で試験した３つすべてにおいて比較可能な神経保護能力を示した（図１２〜１５）。
皮質培養物は、高濃度のＧＰＥ（図１２）／又はＧ-２メチル-ＰＥ（１０μＭ、図１３）に、６４％及び５９％神経保護をそれぞれ示した。
一方、他の２タイプの培養物は、低濃度のＧ-２メチル-ＰＥ（図１４及び１５）で神経保護を示した。線条体細胞は、１ｎＭ〜１ｍＭの範囲内のＧ-２メチル-ＰＥで神経保護を示すが（図１５）、出生後の小脳マイクロエクスプラントは、１ｎＭ〜１００ｎＭの容量範囲におけるＧ-２メチル-ＰＥで神経保護を示した（図１４）。
【００３８】
本発明は、特定の好ましい態様について記載してきたが、当該知識及び本開示内容に関する当業者には、本発明の化合物の等価物が、本出願に記載された状態のために製造され、また投与されてもよいということは明らかであり、またそのような等価物のすべてが本出願の請求の範囲に含まれるということを意図するものである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】本発明の化合物の製造に関する一般的な概略図である。
【図２】本発明化合物内のグリシン残基の修飾に関する概略図である。
【図３】本発明化合物内のグリシン残基の修飾に関する概略図である。
【図４】本発明化合物内のグルタミン酸残基の修飾に関する概略図である。
【図５】本発明化合物内のグルタミン酸残基の修飾に関する概略図である。
【図６】本発明化合物内のグルタミン酸残基の修飾に関する概略図である。
【図７】本発明化合物内のグルタミン酸残基の修飾に関する概略図である。
【図８】本発明化合物内のグルタミン酸残基の修飾に関する概略図である。
【図９】本発明化合物内のグルタミン酸残基の修飾に関する概略図である。
【図１０】本発明化合物内のペプチド結合の修飾に関する概略図である。
【図１１】本発明化合物内のペプチド結合の修飾に関する概略図である。
【図１２】試験結果の概要を示すものである。
【図１３】試験結果の概要を示すものである。
【図１４】試験結果の概要を示すものである。
【図１５】試験結果の概要を示すものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
2004536069.tif 000061
2004536069.tif 000062
2004536069.tif 000063