(57)【要約】本発明は、レーザ走査を使用して固有発色団を含む物質の多次元非線形イメージ化を行う装置に関する。この装置は、（ｉ）同期された光子の時間スタンプパルスの１以上のソース１１５と、（ｉｉ）固有発色団に２以上の同期された光子のグループを吸収させて応答光子を生成するためにパルスの焦点を物質上に局部的に結ばせる手段１２−１４と、（ｉｉｉ）その応答光子を１以上の収集ゾーンに導く手段２２，４０，５３と、（ｉｖ）その応答光子のエネルギがどれ程であろうと、それらの光子を収集ゾーンにおいて収集する手段３０−３４と、（ｖ）収集された光子を少なくともそれらの個数を表すデータに変換し、物質に応答光子を生成させる時間スタンプパルスに少なくとも対応してそれらデータを記憶する処理手段と、（ｖｉ）物質の選択されたエリアを通ってパルスを走査する手段１１，２０と、および（ｖｉｉ）前記記憶されたデータから、前記物質の選択されたエリアをミリメートル未満の分解能によりそれらの各時間スタンプパルスの関数として表すイメージを生じさせる手段とを含んでいる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の選択されたエネルギの光子によって励起されて応答光子が生成される、固有発色団を含む物質を多次元レーザ走査するための装置において、
同期された光子の時間スタンプパルスを生成する１以上のソース（１１５）と、
前記物質の前記固有発色団に２以上の同期された光子のグループを吸収させて非線形応答光子を生成するために前記パルスの焦点を物質上に局部的に結ばせる手段（１２−１４）と、
前記応答光子を１以上の収集ゾーンに導く手段（２２，４０，５３）と、
前記応答光子をそのエネルギがどれ程であろうと前記１以上の収集ゾーンにおいて収集する手段（３０−３４）と、
前記収集された光子を少なくともそれらの個数を表すデータに変換し、前記物質に前記応答光子を生成させる時間スタンプパルスに少なくとも対応してデータを記憶する処理手段と、
前記物質の選択されたエリアを通って前記パルスを走査する手段（１１）と、
前記記憶されたデータから、前記物質の選択されたエリアをミリメートル未満の分解能によりそれらの各時間スタンプパルスの関数として表すイメージを生じさせる手段とを具備している装置。
【請求項２】
前記収集する手段は、前記応答光子をそれらの各到達時間の関数として弁別する検出器手段（４１）を含み、前記処理手段は少なくとも時間スタンプパルスおよび到達時間に対応して前記データを記憶するように構成されている請求項１記載の装置。
【請求項３】
前記収集する手段は、前記応答光子をそれらの各エネルギの関数として弁別する検出器手段を含み、前記処理手段は少なくとも時間スタンプパルスおよびエネルギに対応して前記データを記憶するように構成されている請求項１または２記載の装置。
【請求項４】
前記収集する手段は、少なくとも蛍光、ルミネセンス、非線形ラマンおよび非線形レイリーを含むグループにおいて選択された放射チャンネルにしたがって前記物質によって放出された応答光子を収集することができる請求項１乃至３のいずれか１記載の装置。
【請求項５】
前記収集する手段は、ほぼ２５０ｎｍ乃至１μｍの波長を有する応答光子を収集することができる請求項１乃至４のいずれか１記載の装置。
【請求項６】
前記収集する手段は、ポイント検出器として構成された検出手段を含んでいる請求項１乃至５のいずれか１記載の装置。
【請求項７】
前記収集する手段は、並列の１組の個別のポイント検出器として構成された検出手段を含んでいる請求項１乃至６のいずれか１記載の装置。
【請求項８】
前記収集する手段は、２次元イメージ化検出器（４５）として構成された検出手段を含んでいる請求項１乃至７のいずれか１記載の装置。
【請求項９】
前記収集する手段はさらに前記検出手段（５０）の上流において、前記応答光子の焦点を前記検出手段上に結ばせるレンズ（５２）と、これに後続するシャッタおよびフィルタ構体（５１）と、および前記レンズ（５２）に関する前記検出手段（５０）の位置を調節する結合機構（４４）とを含んでいる請求項６乃至８のいずれか１記載の装置。
【請求項１０】
前記収集する手段は、ストリークカメラ（４１）として構成された検出手段を含んでいる請求項１乃至９のいずれか１記載の装置。
【請求項１１】
前記収集する手段はさらに前記検出手段（４１）の上流に、シャッタおよびフィルタ構体（４２）と、これに後続する色分散および前記検出手段（４１）の光電陰極ウインドウ上への焦点設定のための素子（４３）と、および前記素子（４３）に関する前記検出手段（４１）の位置を調節する結合機構（４４）とを含んでいる請求項１０記載の装置。
【請求項１２】
前記走査する手段は、前記物質を２つの直交する方向にポイント走査する結合された２つの検流計ミラー（１１Ｘ，１１Ｙ）のセットを前記ソースと前記物質との間に含んでいる請求項１乃至１１のいずれか１項記載の装置。
【請求項１３】
前記走査する手段はさらに前記結合された検流計ミラー（１１Ｘ，１１Ｙ）のセッの下流に、前記セット（１１Ｘ，１１Ｙ）の平面と共役させるように構成された２つの収斂レンズ（１２）および（１３）のセットを含んでおり、レンズ（１４）の後方開口が前記パルスを前記物質（１９）内の選択された焦点（１５）上に結ばせるように構成されている請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
前記パルスソース（１１５）は第１の波長の第１の非常に短い幅のパルス（１０３）を生成する発振器（１００）を含んでおり、前記発振器（１００）はレーザ（１０２）により生成される持続的なレーザビーム（１０１）によりポンプされる請求項１乃至１３のいずれか１項記載の装置。
【請求項１５】
前記パルスソース（１１５）はさらに第２の非常に短い幅のパルス（１１１）を生成する光学パラメトリック発振器（１０６）を含んでおり、前記第２の非常に短い幅のパルス（１１１）は前記第１の非常に短い幅のパルス（１１０）に類似した時間的特性を有し、そのパルスエネルギが前記第１の非常に短い幅のパルス（１１０）のものと比較してわずかに少なく、前記第１の波長とは異なった第２の波長を有している請求項１４記載の装置。
【請求項１６】
前記パルスソース（１１５）はさらに再生増幅器レーザ空洞（１０７）を含んでおり、前記再生増幅器レーザ空洞（１０７）は、前記第１の非常に短い幅のパルス（１０３）の一部分（２０４）を受取る第１の入力と、レーザ（１０２）によりポンプされる第２の入力と、第３の波長のパルス（１０８）を生じさせる出力とを含んでいる請求項１５記載の装置。
【請求項１７】
前記パルスソース（１１５）はさらに第４の波長のパルス（１１２）を第３の波長のパルス（１０８）から生じさせる光学パラメトリック増幅器（１０９）を含んでおり、前記第４の波長のパルス（１１２）の時間的特性が前記第２の非常に短い幅のパルス（１１１）のものに類似している請求項１６記載の装置。
【請求項１８】
前記パルスソース（１１５）はさらに、第１の非常に短い幅のパルス （１１０）、第２の非常に短い幅のパルス（１１１）、第３の非常に短い幅のパルス（１０８）および第４の非常に短い幅のパルス（１１２）を受取るための４つの入力と、これらの第１、第２、第３および第４の非常に短い幅のパルスの少なくとも１つを選択的に生じさせる出力とを備えたビームセレクタ手段（１１３）を含んでいる請求項１７記載の装置。
【請求項１９】
前記パルスソース（１１５）の下流には、ソースパワー制御手段（６）が含まれている請求項１乃至１８のいずれか１項記載の装置。
【請求項２０】
前記ソースパワー制御手段（６）は１以上の電気光学変調器を含んでいる請求項１９記載の装置。
【請求項２１】
前記パルスソース（１１５）の下流には、前記パルスの時間的分散を予め補償する手段（３−５）が含まれている請求項１乃至２０のいずれか１項記載の装置。
【請求項２２】
前記予め補償する手段（３−５）は、前記パルスを２つの逆平行のプリズムまたは格子セット（５）に伝送すると共に前記予め補償されたパルスを出力結合ミラー（３）に伝送するように構成された入力結合ミラー（４）を含んでいる請求項２１記載の装置。
【請求項２３】
前記パルスソース（１１５）の下流には、前記パルスの偏光を制御するように構成された偏光制御手段（８）が含まれている請求項１乃至２２のいずれか１項記載の装置。
【請求項２４】
前記偏光制御手段（８）はλ／２またはλ／４プレートを含んでいる請求項２３記載の装置。
【請求項２５】
前記パルスソース（１１５）の下流には、パルス成形手段（９）が含まれている請求項１乃至２４のいずれか１項記載の装置。
【請求項２６】
前記パルス成形手段（９）は、２素子望遠鏡を規定する発散レンズおよび収斂レンズを含んでいる請求項２５記載の装置。
【請求項２７】
前記焦点設定手段（１２−１４）および導く手段（２２，４０，５３）は、非侵入顕微鏡およびマクロスコープの一部である請求項１乃至２６のいずれか１項記載の装置。
【請求項２８】
物質を固定した位置に維持する支持手段（６０）が含まれている請求項２７記載の装置。
【請求項２９】
前記パルスの焦点が前記物質の選択されたエリアにおいて局部的に結ばれるように前記支持手段（６０）を前記焦点設定手段（１２−１４）に関して移動可能にする位置決定手段（２０）が含まれている請求項２８記載の装置。
【請求項３０】
前記位置決定手段（２０）はモータおよび、またはピエゾアクチュエータによって移動させられるＸＹＺ変換段（２０）を含んでおり、前記支持手段（６０）は前記変換段上に取付けられた物質ホルダである請求項２９記載の装置。
【請求項３１】
前記支持手段（６０）は、疾患のある人間または動物の少なくとも一部分を支持するように構成されたプレートである請求項２８または２９記載の装置。
【請求項３２】
前記支持手段（６０）は、前記パルスが前記物質（１９）の第１の面上に導かれる透過照明モードに適応し、前記応答光子は少なくとも前記物質の前記第１の面の反対側の第２の面の下流で収集される請求項２８乃至３１のいずれか１項記載の装置。
【請求項３３】
前記焦点設定手段および導く手段は、内視鏡の一部である請求項１乃至２６のいずれか１項記載の装置。
【請求項３４】
前記導く手段、前記収集する手段および前記焦点設定手段は、可動ヘッド構体（２１６；２１７；２１８）内に収容されている請求項３３記載の装置。
【請求項３５】
１以上の選択されたエネルギの光子によって励起されて応答光子が生成される、固有発色団を含む物質を多次元レーザ走査する方法において、
同期された光子の時間スタンプパルスを生成し、
前記物質の前記固有発色団に２以上の同期された光子のグループを吸収させて非線形応答光子を生成するために前記パルスの焦点を物質上に局部的に結ばせ、
前記応答光子を１以上の収集ゾーンに導き、
前記応答光子をそのエネルギにかかわりなく前記１以上の収集ゾーンにおいて収集し、
前記収集された光子を少なくともそれらの個数を表すデータに変換し、前記物質に前記応答光子を生成させる時間スタンプパルスに少なくとも対応して前記データを記憶し、
前記物質の選択されたエリアを通って前記パルスを走査し、
前記記憶されたデータから、前記物質の選択されたエリアをミリメートル未満の分解能によりそれらの各時間スタンプパルスの関数として表すイメージを生じさせるステップを含んでいる方法。
【請求項３６】
前記収集された光子はそれらの各到達時間を表すデータに変換され、少なくとも時間スタンプパルスおよび到達時間に対応して記憶される請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
前記収集された光子はそれらの各エネルギを表すデータに変換され、少なくとも時間スタンプパルスおよびエネルギに対応して記憶される請求項３５または３６記載の方法。
【請求項３８】
内視鏡検査、顕微鏡検査およびマクロスコープ検査に対する請求項１乃至３７のいずれか１項記載の装置および方法の使用法。
【請求項３９】
外科的処置をモニタするために組織または細胞の構造および代謝に関する情報を提供するための請求項３８記載の使用法。
【請求項４０】
レーザベースの処置においてレーザの位置を案内する請求項３９記載の使用法。
【請求項４１】
レーザ剥離において励起レーザソースを案内する請求項４０記載の使用法。
【請求項４２】
治療効果および回復の長期にわたる監視を追跡するための情報を提供する請求項３８乃至４１のいずれか１項記載の使用法。
【請求項４３】
人間、動物、植物または原核生物の生物学的物質、生合成組織またはキメラ組織、人工臓器、遺伝子操作された元素配列、移植された異種または自己の生体または固定された組織構造を元の場所で、あるいは別の場所でイメージ化する請求項３８乃至４２のいずれか１項記載の使用法。
【請求項４４】
癌、代謝または伝染性の病気、外部から入ってきた微生物、異質粒子、あるいは病理学的なものを光学的に検出する請求項４３記載の使用法。
【請求項４５】
人間の皮膚または人間の粘膜の生物学的物質をその本来の場所で、あるいは別の場所でイメージ化する請求項４３または４４記載の使用法。
【請求項４６】
膣鏡検査、皮膚病学または口腔検査に対する請求項４５記載の使用法。
【請求項４７】
オフサルモスコーピーに対する請求項４３乃至４６のいずれか１項記載の使用法。
【請求項４８】
法廷で用いられる証拠の検出または薬乱用の検出を行なうための請求項４３乃至４７のいずれか１項記載の使用法。
【請求項４９】
薬理学または薬力学において薬を局限するための請求項４３乃至４８のいずれか１項記載の使用法。
【請求項５０】
遺伝子治療において遺伝子生成物、細胞増殖部分および組織変異を局限するための請求項４３乃至４９のいずれか１項記載の使用法。
【請求項５１】
動物の病気、および人間の病気の動物モデルによる研究に対する請求項４３乃至５０のいずれか１項記載の使用法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、同期された光子の時間スタンプパルスの助けにより生物学的物質をイメージ化する分野に関する。
【０００２】
本発明は、とくに、同期された光子の時間スタンプパルスの助けによりたとえば、生物学的調査、医学的研究（たとえば、正常な組織を病的組織から守るための）、法廷用またはバイオテクノロジー用等のために生体内で、あるいは試験管内で生物学的サンプルの固有の非線形光学応答をイメージ化するための装置および方法に関する。
【０００３】
“非線形光学応答”という表現はここにおいて以降“応答光子”と呼ばれる光子を指すものであり、この光子は、サンプルに生来含まれている発色団がいくつかの（２以上の）同期された光子によって励起されたときに、それらの発色団から放出される。さらに正確には、“非線形”という表現は、分子の励起効率が電磁界の振幅と共に非線形的に変化することを意味する。実際に、単一の光子による励起（線形応答）の効率はその振幅に比例するだけであるが、ｎ個の同期された光子による励起効率はその振幅のｎ乗に比例する。
【０００４】
【従来の技術】
当業者によって知られているように、生物学的サンプルの光学イメージ化は、非常に多くの方法によって行われることが可能であり、これらの方法は簡明にするために光学的なコントラストが得られる物理的メカニズムにしたがって３つのクラスに分けることができる。
【０００５】
第１のクラスは、光トランスポート特性の空間的変化に基づく方法を示す。このクラスの方法は主として、吸収率、反射率、屈折率、複屈折率または偏光のコントラストに基づいている。光トランスポート特性は、それがどのようなものであっても、そのサンプルの生化学に関する直接的な情報は提供しない。
【０００６】
第２のクラスは、明確な非本質的発光分子を光学的に励起した結果生じた“非本質的”信号により生成され、サンプル内に導入され、強い光信号および特定の分子認識特性の両方を提供するために選択されるコントラストに基づく方法である。この非本質的発光コントラスト剤の使用法は時間を要するものであり、無理やりラベル付けする手順を必要とする。
【０００７】
第３のクラスは、サンプル中に自然に存在する明確な固有の分子を光学的に励起した結果生じた“固有の”信号により生成されたコントラストに基づく方法である。伝統的に、これらの方法により提供される横方向（ｌａｔｅｒａｌ）および深さ（ｄｅｐｔｈ）分解能は、詳細な組織構造を細胞以下のスケールで示すには不十分である。
【０００８】
第２および第３のクラスの方法は線形または非線形光学応答特性に基づくことができる。しかし、以降説明するように、非線形光学応答を使用することが好ましい。
【０００９】
実際に、焦点深度より厚いサンプル中の固有または非本質的な信号をイメージ化する場合、その光は焦点面に向かって導かれなければならず、コントラスト情報はその検出器の後方または前方に導かれなければならない。したがって、最適な光トランスポートには、そのサンプルが励起および放出光に対して透明であることが要求され、最適なコントラストには、サンプルが分子励起に対して透明でないことが必要とされる。
【００１０】
このパラドックスから、（ｉ）線形イメージ化顕微鏡技術は深い組織イメージ化をほとんど行うことができず、（ｉｉ）内視鏡蛍光イメージ化は表面からの信号を深い発色団によって生成された信号から分解することができないと結論づけられる。対照的に、非線形イメージ化は、生物学的サンプルの透明なスペクトルウインドウ内の長い波長の近赤外線レーザ光を使用する。したがって、励起光はその焦点に向かう途中で組織と最小限の相互作用を行い、これは、ここでは７００乃至１１００ｎｍの範囲内の励起波長でほぼ０．５ｍｍである有用な光透過境界の少なくともその範囲内で、線形イメージ化技術の透明度／励起パラドックスが解決されることを意味する。しかし、線形蛍光顕微鏡の場合のように、固有の信号は背景雑音と見なされ、適切な光フィルタにより濾波される。
【００１１】
生物学的サンプルの代謝状態に関する情報を生体内または生体外で抽出するか、あるいは固有の蛍光またはラマン放出スペクトルおよび寿命を使用して悪性腫瘍のような組織病理学的特徴を決定（ｒｅｓｏｌｖｅ）する方法もまた提案されている。しかし、これらのいわゆる“スペクトル病理学”方法は線形励起により行われており、したがって以下の３つの主要な欠点が生じる。
【００１２】
（ｉ）励起は焦点に制限されないので、線形分光法では空間的な分解が行われず、深いイメージ化だけでなく横断方向および深さ分解能に関して本質的に強い制限がある。
【００１３】
（ｉｉ）“単一光子”蛍光励起スペクトルはかなり頻繁に単一の狭いピークを表示し、１つのレーザ波長はごく少数の分子成分しか励起しない。これは励起波長の選択に対して厳しい条件を課し、病的状態を健康なものから区別するための分光学的基準をしばしば複雑なものにする。これは、たとえば、１つを区別するためにいくつかの波長が必要となる皮膚損傷の固有のイメージ化または結腸の単一地点の固有蛍光分光法の場合である。
【００１４】
（ｉｉｉ）スペクトル異常は、サンプルにおいて均一に分布されるのではなく、たいがい特定の細胞タイプまたは細胞未満の構造に集中された分子ソースによって引き起こされるため、それらの分光学的影響は、波長および寿命ドメインにおいて局部的に優勢である可能性がある。しかしながら、これらの局部的な影響は最終的なスペクトルでは優勢な特徴ではなく、したがってそれらは空間的に平均化されるために抽出し難い。
【００１５】
要約すると、線形励起により行われるあらゆるスペクトル診断方法では、結果的に、空間分解能は非常に低いものとなり、多くのソースが必要になることが多く、感度が制限され、細胞スケールで情報を獲得することが不可能となる。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上述した欠点の少なくとも一部分的に対する解決方法を提供することであり、とくに、（ｉ）ミクロン未満のスケール（細胞以下のスケール）から組織および器官構造スケールまでを範囲とする分解能で生物学的サンプルの幾何学構造を示すイメージを、非線形的な固有イメージ化（顕微鏡検査、マクロスコーピーおよび内視鏡検査）から獲得し、（ｉｉ）組織を詳細に診察して診断する（さらに一般的には、正常な組織と異常な組織との相違を検出する）ためにこのような非線形的な固有イメージ化を分光学と組合せることを可能にすることである。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
したがって、本発明は、２次元（２ＤまたはＸＹ）または３次元（３ＤまたはＸＹＺ）で空間的に分解されることができ、さらに寿命（τ）および、または波長（λ）でスペクトル的に解像されることのできる固有の非線形光学応答のイメージを獲得するのに適した手段を提供する。
【００１８】
さらに正確に述べると、本発明は、１以上の選択されたエネルギの光子による励起に応答して応答光子を生成する固有発色団を含む物質を多次元レーザ走査するための装置を提供する。この装置は、
・同期された光子の時間スタンプパルスを生成することのできる１以上のソースと、
・厳密に調査するために固有発色団に２以上の同期された光子のグループを吸収させて非線形応答光子を生成するためにパルスの焦点を物質上に局部的に結ばせる手段と、
・その応答光子を１以上の収集ゾーンに導く手段と、
・その応答光子をそのエネルギがどれ程であろうと収集ゾーンにおいて収集する手段と、
・収集された光子を少なくともそれらの個数を表すデータに変換し、物質に応答光子を生成させる時間スタンプパルスに少なくとも対応してデータを記憶する処理手段と、
・物質の選択されたエリアを通ってパルスを走査する手段と、
・物質の選択されたエリアをミリメートル未満の分解能によりデータの各時間スタンプパルスの関数として表すイメージを記憶されたデータから生じさせる手段とによって特徴付けられる。
【００１９】
この分光学的積分のおかげで、物質の種々の構成要素の固有発色団により放出された応答光子は、それらの放射性の下方遷移チャンネルがいずれのもの［蛍光、ルミネセンス、非線形ラマンおよび非線形レイリー（２次および３次の光学的高調波の発生）］であっても収集される。したがって、この装置は細胞スケールから細胞以下のスケールに及ぶ高い分解能を有するイメージを生じさせることができる。
【００２０】
厳密な意味で、レイリーおよびラマンプロセスは光子吸収を伴わないが、しかしながら、この明細書では簡明にするために吸収が使用される。
【００２１】
収集する手段は、応答光子をそれらの各到達時間および、またはそれらの各エネルギ（または波長）の関数として区別することができる検出器手段を含み、処理手段は少なくとも時間スタンプパルスおよび到達時間および、またはエネルギ（または波長）に対応してデータを記憶するように構成されていることが好ましい。したがって、（λ，τ）方式の選択された領域を表す部分だけを記憶されたデータから抽出して、それらが生じた分子成分を決定することができる。
【００２２】
好ましい実施形態において、収集する手段および導く手段は顕微鏡、マクロスコープおよび内視鏡の部分である。
【００２３】
装置は、請求項２乃至３５に規定されているように、別々にあるいは組合せられて採用される別の特徴が含まれていてもよい。
【００２４】
本発明はまた、応答光子を生成するために１以上の選択されたエネルギの光子による励起に応答して固有発色団を含む物質を多次元レーザ走査する方法を提供する。この方法は、
・同期された光子の時間スタンプパルスを生成し、
・固有発色団に２以上の同期された光子のグループを吸収させて非線形応答光子を生成するためにパルスの焦点を物質上に局部的に結ばせ、
・その応答光子を１以上の収集ゾーンに導き、
・応答光子をそのエネルギがどれ程であろうと収集ゾーンにおいて収集し、
・収集された光子を少なくともそれらの個数を表すデータに変換し、物質に応答光子を生成させる時間スタンプパルスに少なくとも対応するデータを記憶し、
・物質の選択されたエリアを通ってパルスを走査し、
・物質の選択されたエリアをミリメートル未満の分解能によりデータの各時間スタンプパルスの関数として表すイメージを記憶されたデータから生じさせるステップによって特徴付けられる。
【００２５】
この方法は、別々にまたは組合せられて採用される別の特徴を含んでいてもよく、とくに、収集された光子はそれらの各到達時間および、またはエネルギを表すデータに変換され、少なくとも時間スタンプパルスおよび到達時間および、またはエネルギに対応して記憶されてもよい。
【００２６】
【発明の実施の形態】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および添付図面を検討することにより明らかになるであろう。
図面はその性質が本質的に確実である。したがって、それらは本発明を補足するだけでなく、適切な場合にはそれを規定するのに貢献することができる。
【００２７】
以下の説明において、生物学的物質の多光子イメージ化のための装置および方法を参照とする。とくに、多光子イメージ化顕微鏡を単なる一例として参照とする。
【００２８】
上述したように、本発明は、レーザビームまたはサンプル保持段の一方あるいはその両者を移動することによって、生物学的サンプルの選択エリアをかなり連続的にあるいは選択された別個の地点において２次元（２Ｄ）または３次元（３Ｄ）でレーザ走査イメージ化することを可能にする装置（または計器）に関する。
【００２９】
各走査地点において、典型的に１００マイクロ秒から数秒を範囲とする２つの連続した地点間の滞留時間により、パルス化されたレーザソースにより放出される光は、サンプルの表面内のまたはその表面における“焦点ボリューム”において焦点を結ばれる。サンプル中に含まれている固有の発色団は、２以上の同期された光子のグループを吸収し、数種類の検出器上で収集されて積分されることのできる非線形応答光子を生成し、これら数種類の検出器とは：（１）光電子増倍管（ＰＭＴ）のようなポイント検出器または半導体ベースの検出器（または、さらに一般的には、２Ｄイメージ化検出器）、（２）分散素子に後続するものであり、ある方向の波長成分を垂直方向の空間分解能と共に分解するための２Ｄ半導体アレイ検出器、（３）オプショナルな色フィルタに後続し、寿命情報を提供するように構成された１組の並列な個別のポイント検出器、（４）分散素子に後続し、波長／寿命平面（λ、τ）二おける２Ｄ分光学的分解能のためのストリークカメラ等である。
【００３０】
図１に示されている実施形態には、上述した４つのタイプの検出器の種々の組合せを同時に使用するか、あるいはある単一検出モードから別のモードに迅速に切替えるいくつかの光ポートが含まれている。以下の説明において、“５Ｄイメージ化”とは、平面（λ、τ）におけるサンプル応答の２Ｄ分光学的分解能と３Ｄレーザ走査（ＸＹＺ）により与えられる空間分解能との組合せのことであり、“４Ｄイメージ化”とは平面（λ、τ）におけるサンプル応答の２Ｄ分光学的分解能と２Ｄレーザ走査（ＸＹ）により与えられる空間分解能との組合せ、またはλまたはτにおけるサンプル応答の１Ｄ分光学的分解能と３Ｄレーザ走査（ＸＹＺ）により与えられる空間分解能との組合せのことである。
【００３１】
生物学的サンプルは、巨大な組織のように一側からのみアクセス可能であるか、あるいは断面が十分に薄い場合には両側からアクセス可能であるため、好ましい実施形態は、（ｉ）レーザビームおよび関連した走査光学系が、たとえば垂直構造が使用される場合にはその上部から生じる等、巨大なサンプルの一側から生じる構成、および（ｉｉ）光学系を全く備えていないか、あるいは２つの排他的な光学機能すなわち徹照（ｔｒａｎｓ−ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ）または検出のために装備された巨大なサンプルをその反対側で受けるサンプルホルダに基づいている。そのセットアップには、接眼レンズによる視覚的検査または電荷結合素子（ＣＣＤ）のような簡単なイメージ化装置のいずれかを使用する徹照モードでの直接的な光学制御の可能性を含んでいる。
【００３２】
提案された構成の別の基本的な原理は、光損失と幾何学的分散の影響とを最小にするために検出器が光収集光学系に可能な限り近づくように検出ポートが形成されることである。
【００３３】
図１において、異なった波長、ピークエネルギ、パルス幅および繰返し率を有する非常に短い時間スタンプパルスをそれぞれ生成することが好ましいレーザソースセットアップ１１５のいくつかの可能なレーザの１つによって励起光１１４が生成される。レーザソースセットアップ１１５の一例は、図３に示されている。レーザパワーは、２つの異なった目的のために１または２つの電気光学変調器のセット６によって制御される：第１の変調器は手動として、あるいは走査タイミング制御に可能に結合される低周波コンピュータ制御される強度シャッタとして使用され、一方他方の変調器は同期検出、または減少された繰返し数に対するパルスの抑制のいずれかのための共振高周波数変調器として使用される。
【００３４】
ラマンイメージ化用のノッチフィルタ７ は、電気光学変調器６ の下流に設けることができる。さらに、時間的な分散を予め補償するためのシステム３ ４ ５ は、平坦な入力結合ミラー４ および平坦な出力結合ミラー３ と共に２つの逆平行プリズムまたは格子のセット５ から構成されることが好ましい。その後、レーザ出力偏光は、λ／２またはλ／４プレートであることができる随意的な素子８ によって制御される。ビーム成形は、必要ならば、ビームが焦点に集中することを回避するように１個の発散および１個の収斂レンズを有するように設計された簡単な２素子テレスコープ９ により随意に行われる。
【００３５】
その後、レーザビームはＸおよびＹ方向にポイント走査するために２つの結合された検流計ミラー１１Ｘおよび１１Ｙのセットに向かってオプションの二色性ミラー１０を横断し、この検流計ミラー１１Ｘおよび１１Ｙのセットはビームを２つの収斂レンズ１２および１３のセット上に操縦する。オプションの平坦なミラー１８を介して、２つのレンズ１２および１３は検流計ミラー１１Ｘまたは１１Ｙの平面を励起光の焦点をサンプル１９内の現在の焦点１５に結ばせるレンズ１４の後方開口と共役（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）させる。現在の焦点は、軸に沿った位置１６に、すなわちレンズ１２、１３および１４の光軸上にあるか、あるいは検流計ミラーの位置に応じて軸を外れているかのいずれかであることができる。
【００３６】
励起ビーム１７はレンズ１３と１４との間でコリメートされ、したがってサンプルの固有の発色団により放出された応答光子もまたほぼコリメートされ、それによって光学設計が簡単になる。さらに、レンズ１３と１４との間の自由空間の大きさは、検出効率をさらに良くする検出ポート３０、３１および３２の構成に対して十分である。レンズ１４は真の単体レンズであるか、色消しレンズであるか、あるいは顕微鏡の対物レンズのようなレンズの複合セットであることができる。レンズ１４はまた純反射性対物鏡により置換されることができる。これはとくに、スペクトルイメージ化がＵＶ放射を伴う場合、あるいは最適なＩＲ透過または最小の色分散が要求される場合、もしくはその代りにサンプルを励起する、またはそれによって放出された光の最小の時間的分散が要求される場合に重要である。
【００３７】
サンプル１９は、観察が一側だけに制限される厚いものであることができ、あるいは両側から光学的なアクセスが可能な薄いサンプルであることができる。前者の場合には、図１に示されているセットアップを切りつめたものとして扱われ、それによってサンプルホルダおよびその下方の全ての光学素子はサンプルホルダによって置換され、このサンプルホルダは同じタイプのものか、あるいは、おそらく重いサンプルまたは物質用の大型のものである。図１では、両側アクセスの場合で焦点が結ばれる。サンプル１９は、機械的なモータまたはピエゾアクチュエータにより、あるいはその組合せられた機構によって移動されるＸＹＺ変換段２０に固定されたプレート６０（またはサンプルホルダ）上に取付けられる。レンズ１４および２１はまたそれらの軸に沿って移動されることができる。現在のサンプル焦点１５によって放出された光は、両レンズ２１および１４によって収集される。
【００３８】
大型の平坦な、または湾曲した二色性レンズ２１を下方に挿入することにより、励起光がダンプに向かって伝送されているあいだに、応答光子（またはサンプル光）は二色性レンズ２１の後方におよび検出ポート３０、３１および３２に向かって反射されることができる。
【００３９】
レンズ１４はレンズ２１と焦点を共有し、前者と同様に、真の単体レンズ、色消しレンズ、顕微鏡の対物レンズのようなレンズの複合セット、または純反射性対物レンズの任意のもので置換されることができる。レンズ１４とは異なり、レンズ２１はまた純反射性コンデンサのような非分散性素子で置換されることができる。２つのレンズ１４および２１の光学共役は好ましいが必要ない。これは、検出器（または検出ポート）の下流においてＰ４およびＰ５がレンズ２１の後方開口に接近して設置されているためである。とくに、これら２つのレンズ１４および２１を最適位置に維持するために、サンプルホルダ６０によりＺ方向の運動が行われなければならない。
【００４０】
下方のレンズ２１によって収集された光は、二色性ミラー２２を通ってＰ４およびＰ５と名付けられた２つの検出ポート３３および３４に導かれることができる。この二色性ミラー２２は、サンプルによって放出された可視またはＵＶ範囲の光（応答光子）を近赤外線（ＮＩＲ）または赤外線（ＩＲ）範囲の励起光から分離するめために使用される。後者の励起ビーム光は、二色性ミラー２２を通ってビームダンプ２３に送られる。逆に言えば、サンプル光（または応答光子）は、平坦なまたは湾曲したミラーをレンズ２１とミラー２２との間に挿入することによりさらなる収集のためにサンプルに戻るように導かれることができる。その同じ二色性ミラー２２はまたハロゲンランプ２４から入ってきた可視光をサンプルに向かって適切な集光光学系２５およびホットフィルタ２６を通って導くために使用される。この可視光は、サンプルの透過照明のために使用される。対応したイメージは、直接視覚化するために接眼レンズ２７に向かって、あるいはチューブレンズ２９を通ってＣＣＤ２８に送られる。その場合には、当然ながら、ミラー１８は取除かれる。
【００４１】
ミラー１８を二色性ミラーで置換することにより、レーザビーム１７によって励起されたときにサンプルにより放出された光（応答光子またはサンプル信号）をＣＣＤ２８上で直接イメージ化することもできる。最後に、励起レーザビーム１７から結果的に得られたサンプル信号は検出ポート３０，３１および３２上で検出されることができる。これには、光路中に変換されてレンズ１４の光軸に沿って回転され、それによって光を３０および３１に向かって逆方向に導くことのできる１つの二色性ミラー４０が必要である。これら２つの対向した排他的な収集ポート３１および３２は、分光学的イメージ化のために装備されているが、しかしそれらの使用は排他的である。
【００４２】
第３の検出ポート３２はポート３０または３１のいずれかと同時に使用されることが可能であり、ＰＭＴまたは半導体ベースの検出器のような小型のポイント検出器５０であることが好ましい。このポイント検出器５０はシャッタ／フィルタ構体５１の前面においてポートコネクタに結合され、サンプル信号のフーリエイメージ化を行うために検出器の入力平面をレンズ１４の後方開口と共役させるレンズ５２により先行される。スライドする二色性フィルタ５３はサンプル信号をレンズ５２に導く。検出器５０はまた検出ポート３３（Ｐ４）または３４（Ｐ５）に配置されることができる。
【００４３】
２つの検出ポート３０および３１の一方、たとえば検出ポート３０はストリークカメラ４１を備えていることが好ましく、このストリークカメラ４１の前面にはシャッタおよびフィルタ構体４２と、色分散およびストリークカメラ４１の光電陰極ウインドウ上への焦点設定のための素子４３（分散素子）と、および素子４３に関するストリークカメラ４１の位置を調節する結合機構４４とが設けられている。以下、図２を参照としてストリークカメラ４１およびその結合に関する詳細を説明する。他方のポート３１は、以下説明するように４Ｄスペクトルイメージ化セクション内にスペクトルイメージ化検出器を備えていることができる。これら２つのタイプの検出手段を同時に使用する理由はない。２つの検出手段４１および４５のいずれもサンプルを越えて検出ポート３４の位置に配置することが可能なことは注目すべきことである。
【００４４】
最後に、ビーム操縦手段６０を備えた検出ポート６１（またはＰ６）は検流計ミラー１１の上流で利用可能であることが好ましく、この位置においてデスキャン（ｄｅｓｃａｎ）される（すなわち、応答光子のビームの位置がほぼ固定される）。その位置において、走査している最中に上述の任意の検出手段が使用されることができる。
【００４５】
ストリークカメラ４１の目的は（λ、τ）平面においてサンプル信号を解析することであり、これは励起ビーム１７が好ましくは軸方向に固定されていなければならないことを意味する。その後、モータおよび、またはピエゾアクチュエータによる２Ｄまたは３Ｄサンプルモーションによってイメージ化が行われる。このようなストリークカメラ４１は３つの出口ポート３０、３１または３５の任意のものに結合されることができる。
【００４６】
サンプルによって放出された応答光子（光）は二色性ミラー４０または２２によって反射され、最初に “シャッタ／モジュラフィルタ”構体４２を通って進行し、この“シャッタ／モジュラフィルタ”構体４２はストリークカメラ４１を保護し、サンプルの非線形的な光学応答特性を全体的に、あるいは部分的に解析するために必要とされる任意の種類の色またはニュートラルデンシティフィルタが取付けられる。その後、応答光子は、ストリークカメラの入力面４１ａ上に位置するその入力ウインドウ４１ｂ上にレンズまたは格子４３自身により焦点を結ばれる前に、プリズム構体または格子４３（あるいはＤＥ）によって分散され（図２に示されているように）、その後光子を時間的に垂直方向に分解する。ストリークカメラ４１はレーザ周波数と同位相で同期走査モードで動作するか、あるいはパルス選択装置を使用してその周波数の約数で動作する。ストリークカメラ上で解析されるべき中心波長および分散利得の選択は分散カップラ４３の変換により行われる。
【００４７】
別の構成では、ストリークカメラ４１の１つの方向が寿命（τ）イメージ化に対して使用され、ストリークカメラ４１のそれと垂直の方向がサンプルにおいてラインに沿って寿命をイメージ化するライン走査と同時に使用されるように、分散素子４３は除去されることができる。その場合、走査方法は４Ｄ（または５Ｄ）スペクトルイメージ化に関して以下に説明するものに非常に類似しており、その相違は、ストリークカメラ４１の時間偏向方向が４Ｄ（または５Ｄ）検出システムのスペクトル分散方向に対応していることである。
【００４８】
ここで、本発明による非線形イメージ化装置に適合されたレーザソースセットアップの一例を説明するために図３を参照とする。
【００４９】
非線形光学応答（たとえば、蛍光応答光子）を生じさせる多光子励起には、可視赤色または近赤外線領域で非常に短いパルスを供給する異なったタイプのレーザにより達成されることのできる高い瞬間パワーが必要とされる。７００−１０５０ｎｍの範囲の波長を有する６０−１００ｆｓ（フェムト秒）のパルスを供給するモードロックされたレーザは、多光子励起イメージ化のための典型的なソースである。ピコ秒ソースもまた使用可能である。本発明の目的は、蛍光だけでなくルミネセンスおよび非線形ラマンならびにレイリー応答も含む非常に一般的な方法で組織の固有の非線形応答を励起することであるため、広い範囲の短パルスソースが使用されなければならない。このようなレーザソースを選択するために、いくつかのパラメータ、すなわち、波長、パルス幅およびパルスエネルギならびに繰返し数が使用されてもよい。
【００５０】
伝統的に７００−１０５０ｎｍの範囲で選択された波長は、組織の線形励起が生じて、非線形励起の利点が失われるために、可視範囲にさらに深く選択されることができない。対照的に、水の透過率の限界の高い波長は、いくつかの理由：（ｉ）組織からの散乱を減少させることができること、（ｉｉ）低い吸収率と少ない散乱との間の妥協を改善することができること、および（ｉｉｉ）光学素子および光ファイバにおける時間的な分散を減少させることができることのために有効である。１乃至１．６μｍ（ミクロン）の範囲の波長は固有発色団の非線形のサブ共鳴励起を提供し、したがって非線形ラマンおよびレイリー励起に対して選別され、蛍光励起に関しては望ましくないことは注目すべきことである。本発明の方法では、ラマンはまた、好ましくはピコ秒モードでの７００−８００ｎｍの基本放射の非線形励起によってＵＶ共鳴モードで励起されることができる。したがって、３つの同期された光子の励起が、とくにＤＮＡ検出に対して好ましい。とくに、２次または３次の高調波（非線形レイリー）、あるいは固有の組織構成要素の３光子イメージ化が広い範囲の励起波長で容易である。
【００５１】
パルスエネルギは、深さの透過がサンプル焦点におけるパワーにより制限されるため、生物学的イメージ化に対して重要な問題である。当業者によって知られているように、所定のサンプルにおける透過の深さはレーザパワーの対数としておおよそスケーリングされる。たとえば、非線形蛍光励起に対して実際に使用されているレーザソースに対する伝統的なモードロックされた発振器は、１−１０ｎＪ（ナノジュール）の範囲のパルスを供給し、これは本来の場所および別の場所の組織における０．５ｍｍの近似的な実効顕微鏡イメージ化深度となる。高いエネルギのパルスは深い部位にアクセスすることができるが、しかしそれは組織の損傷を引き起こす可能性が高く、これはサンプル焦点には不要であり、そのサンプルの表面ではすでに発生している。しかしながら、マイクロジュール（μＪ）の範囲のパルスを提供する増幅された光学パラメータ発振器（ＯＰＡ）は、組織イメージ化に対して使用されることができ、以下説明するように、適切な光学系（たとえば、広い表面のレンズを備えた特別な光学設計または大型のカタディオプトリックデバイス）がレーザビームの焦点をサンプル上に結ばせる。
【００５２】
本発明の装置は、有効に、いくつかのパルス化されたレーザの１つを使用し、これらレーザは、それらが生成するビーム特性：パルス幅、エネルギ、波長に関してのみ選択されたものである。レーザソースにおいて使用される結晶の実際の性質はそれ程重要ではなく、別のレーザ設計はそれらが類似した放射線を生成する限り使用されることができる。非線形の固有光学応答を最もフレキシブルな方法でイメージ化するために、好ましい実施形態には図３に示されている１組のレーザソースが含まれている。もちろん、これらのレーザが全て同時に必要とされるわけではなく、これらのレーザ素子の任意のサブセットは、それが有用な放射線を生成する限り本発明に対して十分である。
【００５３】
以下に説明するレーザソースセットアップ全体は、一例として、図１の素子１１５に対応している。
Ｔｉ：サファイア発振器１００は、５／１０Ｗの固体レーザ１０２（別の発振器および、とくに、結晶発振器が使用されてもよい）によって生成された５３２ｎｍの連続的なレーザビーム１０１によりポンプされる。この第１の発振器１００は、７００−１０５０ｎｍの範囲におけるフェムト秒（たとえば、６０−１００ｆｓ）またはピコ秒（たとえば、１−４ｐｓ）のパルス化されたビーム１０３を生成し、１．８Ｗまでの平均パワーおよび７６−８０ＭＨｚの繰返し数を有する。このビーム１０３は、このビームの一部分２０４を再生増幅器レーザ空洞１０７に向かって導くオプションの平坦な部分的反射ミラー１０４を照射する。ビーム１０３の残りの部分２０３は、ビームセレクタ１１３に向かうビーム１１０として平坦なミラー１０５によって随意に全体的にまたは部分的に反射される。この残りの部分２０３は、フェムト秒またはピコ秒パルス１１１を生成する光学パラメータ発振器１０６中に部分的にまたは全体的に入ることができ、このパルス１１１はビーム１１０に類似した時間特性を有していることが好ましく、そのパルスエネルギはわずかに低下しているが、波長は１−２．４μｍの範囲のものである。再生増幅器レーザ空洞１０７は、レーザ１０２と同じ別のレーザによりポンプされてビーム２０４により注入されたときに、８００ｎｍの波長および２５０ｋＨｚの繰返し数でマイクロジュールからフェムト秒（典型的に、１３０ｆｓ）のパルス１０８を出力する。その後、このパルス１０８は光学パラメータ増幅器１０９内においてパルス１１２に変換され、このパルス１１２はパルス幅がパルス１１１に類似しているが、その波長は１．１−３．２μｍ領域のものである。（部分的）反射ミラーの助けによりビーム１０８を直接使用することも可能である。
【００５４】
最後に、ビーム（パルス）１１０、１１１および１１２（および最終的には１０８）は全て、ビームセレクタ１１３に到達し、このビームセレクタ１１３は入力ビームの１つまたはそれらの２以上のものの組合せを選択的に出力する。レーザ空洞１０７ではビーム１０３のごくわずかな部分が動作すればよく、また、光学パラメータ発振器１０６ではビーム１０３の２０−３０％が動作すればよいため、３つのビーム１１０、１１１および１１２の全てが同時に生成されて使用されることができる。再び、このセットアップの最大のフレキシビリティは本発明により満足できる結果を得るために必ずしも必要ではなく、大部分の適用にはいくつかの可能なサブセットで十分である。
【００５５】
フェムト秒およびピコ秒動作は原理的には共に固有イメージ化に対して使用可能であるが、励起効率に関して別個の利点を有する。とくに、ピコ秒モードはフェムト秒モードに比較して、ラマンラインを分解するために必要とされる、より狭いスペクトルを示し、それはまた、とくに内視鏡用途に対して非常に重要な光ファイバ中への伝播について優れている。ピコ秒モードにおいて、ノッチフィルタは必要ない。上述したように、励起ビームは、パルス選択のために共鳴方式で、あるいはシャッタとして機能するように低い周波で電気光学変調器６によって変調されることができる。
【００５６】
装置の全てのレンズは、適用により要求されるスペクトル範囲におけるそれらの透過率および反射防止コーティングを慎重に選択される。色収差の補正は、光学系の焦点設定を選択する際には重要な問題ではない。球面収差の補正のほうが重要である。さらに、組織のイメージ化には、一般に非常に低い次数の開口を有する低倍率の対物レンズが必要とされることが多い。これらの理由のために、大きい後方絞り開口および高次の開口を有すると共に非常に優れた球面収差補正を行う特定のレンズを使用することが好ましい。大きい絞り開口およびビーム拡張は、励起ビームがマイクロジュールパルスでＯＰＡレーザソース１０９から入ってきたときに、焦点設定素子を通って過度の光パワーを減少させるために、および組織面を横断するフラックスを最小にするためにも必要である。屈折光学素子の過度の時間的および空間的分散が分光学的解析の品質およびこの方法の全体的な効率を低下させることを考慮に入れながら、光学素子を選択することもまた重要である。したがって、可能である限り、とくにレンズ１４および２１に対して純粋に反射性の素子が好ましい。
【００５７】
上記の実施形態は本質的に、顕微鏡またはマクロスコープ段６０、２０上に位置されることのできるサンプルに適応され、この顕微鏡またはマクロスコープ段６０、２０は移動されることができるが、大型の装置に取付けられたままである。これには伝統的な隔離された顕微鏡検査またはマクロスコーピーのサンプルだけでなく、人間または動物の体の一部分（少なくとも）の解剖学的に完全なままのさらに大型のサンプルを含んでいる。しかし、本発明はまた、レーザソースにフレキシブルな方法で接続された遠隔イメージ化ヘッドに関する別の実施形態に適応される。
【００５８】
このような実施形態の１例は図４に示されている。入力カップラ２００はビーム成形光学系９のすぐ下流に配置され、図１の装置の検流計ミラー１１Ｘ，１１Ｙを置換している。この入力カップラ２００は、ソースセットアップ１１５から入ってきた励起レーザビームの焦点を結び、レーザ入力を最適化するためにフレキシブルな導波体２０１の適切な位置を設定する。導波体２０１は、たとえば光ファイバであることができる。このファイバ２０１の内部の時間的分散は、予め補償するための素子３、４および５を適切に調節することによって補償されることが好ましい。導波体２０１の出力は入力カップラ２００に類似している出力カップラ２０２に結合され、これは２つの検流計ミラー２０３Ｘおよび２０３Ｙを照射する平行なビームを生成する。これらのミラー２０３は、図１を参照として説明された方法と同様に、２つのレンズ２０６および２０７によって焦点設定レンズ２０８に向かって励起光ビーム２０５を操縦し、検流計ミラーをレンズ２０８の後方開口上にイメージ化する。レンズ２０８は励起光ビーム２０５の焦点をサンプル２０９中の、可調スリーブ２１０により調節されたレンズからの相対距離の位置に結ぶ。
【００５９】
その後、サンプルから戻ってきた応答光子は二色性ミラー２１１を通って検出装置２１５に向かって導かれ、この検出装置２１５は少なくともフィルタ２１２、光子を光検出器２１４（ＰＤ）に導く素子２１３を含んでいる。最も簡単な実施形態においては、素子２１３は平坦なミラーであり、一方光検出器２１４は小型の光電子増倍管（ＰＭＴ）である；その場合、レンズ２０８の後方開口を検出器入口と共役させるレンズが追加されることが好ましい。素子２１３はまた小型分散素子（ＤＥ）であることができ、したがって検出器２１４は（λ，ｘ）イメージ化向けに組立てられた２Ｄアレイ検出器（たとえば、ＣＣＤ）であり、それはある方向が信号の色解析のために使用され、それに垂直な方向がミラー上におけるサンプル走査のために使用される。そのモードでは、ラインはＣＣＤ検出器のフレーム周波数で走査され、解析されることが好ましい。Ｙ方向、すなわちλ方向における小さい振幅の走査は、スペクトル情報を損なわずに行われることができる。これは、連続したＹ位置が連続したイメージに対応し、そのＹ方向の関数としてスペクトルオフセットが補償されることができるからである。
【００６０】
ある変形において、素子２１３は、時間的に分解される解析のためのゲートを有する光電子増倍管であることができる。ファイバカップラの下流に接続されたこの構体の全ての部品は閉じた堅牢なマウント２０４中に封入されている。光検出器構体２１５は、所望される収集効率および、または便利さに応じてレンズ２０７と２０８との間に、あるいは図５に示されているように検流計ミラー２０３とレンズ２２０との間に位置された二色性ミラー２１１から応答光子を収集することができる。図５に示されている後者の場合、図４を参照として上述した検出器を使用することができる。さらに、物質の横方向の観察はまたミラー２１８に関して直角で可能である。
【００６１】
図６には、別の実施形態が示されている。この実施形態は、とくに内視鏡モードにおける非線形の固有イメージ化に適合する。その場合、ファイバ出力カップラ２２１は、ファイバの先端をカップラレンズ２２３の焦点面において２つの直交する方向に動かすことのできる遠隔制御装置２２２を含んでいる。ファイバの先端のコアから生じた励起光は、サンプル２０９中に焦点を結ばれて焦点面において対応的に走査されるようにカップラレンズ２２３によって焦点設定レンズ２２４に導かれる。したがって、レンズ２２４はレンズ２２３の焦点面に位置している。再び、スリーブ機構２２５はサンプルの内部の焦点面を位置させる。構体２１８の部品２２２−２２５は、小さい直径の堅牢な管２２８内に収容されている。サンプル２０９から生じた応答光子は、ファイバコアの周囲の大面積クラッディングによって収集され、その後ファイバ２０１から収集ファイバ２２６に分割されることが好ましく、収集ファイバ２２６がそれらを符号２１５により示されている構体に類似した光検出器構体２２７に向けて導く。
【００６２】
サンプル１９の非線形イメージ化は、少なくとも以下に説明するステップを含んでいた。
【００６３】
第１のステップにおいて、１以上の選択された波長の同期された光子の時間スタンプパルスをソース１１５で生成する。
【００６４】
第２のステップにおいて、パルスは物質（サンプル）の選択されたエリアの第１の部分に局部的に焦点を結ばれて、物質（サンプル）の固有の発色団に２以上の同期された光子のグループを吸収させ、それらの各構成（もっと正確には、それらの特定のエネルギトランジション）および多光子励起波長に関連したエネルギの光子を放出することによりそれら自身を下方遷移させる。
【００６５】
第３のステップにおいて、サンプルによって放出された光子（応答光子）は、位置５０または３３あるいは３４に配置された１以上の収集ゾーンに導かれる。
【００６６】
第４のステップにおいて、応答光子はそれらのエネルギがどれ程であろうと、たとえばポイント検出器等の検出器により検出され、このような検出器はＵＶ領域から、たとえば、ほぼ８００ｎｍ近赤外線（ＮＩＲ）領域までを範囲とする非常に広い可能なスペクトル領域にわたって高い感度を有している。技術的に知られている全ての非線形イメージ化装置とは対照的に、その装置のフィルタだけが励起光を排除するために使用される。そのため、たとえば、蛍光放射、ラマンおよびレイリー散乱のように、全ての可能なフォトフィジカル（ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃａｌ）メカニズム（放射性下方遷移チャンネル）により発生された固有の発色団放射の結果生じた（λ、τ）平面の全ての最も広いアクセス可能な領域の分光学的積分が行われる。
【００６７】
このステップの目的は、その固有の非線形光学応答を可能な限り完全に使用する２Ｄまたは３Ｄ空間サンプルイメージ化である。
【００６８】
第５のステップにおいて、検出器は収集された光子を最初に、たとえば電圧または電流等のアナログ物理信号に変換し、その後少なくともそれらの個数を表すデータに変換する。その後、データは固有の発色団に応答光子を生じさせる時間スタンプパルスに少なくとも対応して記憶される。当然ながら、検出器が異なった波長λおよび、または到達時間（または寿命時間）τを弁別できる場合、データはまた波長および、または到達時間に対応して記憶される。
【００６９】
その後、第６のステップにおいて、物質エリアの他のあらゆる部分に対して第２乃至第４のステップが再び行われる。これはそのエリアを通ってパルスを走査することにより行われる。それは２Ｄまたは３Ｄ空間走査であることができる。
【００７０】
最後に、第７のステップにおいて、記憶されたデータから物質の選択されたエリアをミリメートル未満の分解能によりそれらの各時間スタンプパルスの関数として表す完全なイメージを生じさせる。
【００７１】
以下、別のイメージ化方法の例を説明する。第１の方法によると、最初に、（λ、τ）平面における信号積分をさす全応答（または分光学的積分）を捕獲することにより上述されたサンプルの２Ｄまたは３Ｄイメージを記録する。この全応答イメージは、位置５０、３３または３４に配置された光電子増倍管またはＡＰＤのようなポイント検出器により非常に簡単に捕獲される。さらに完全な分光学的応答はおそらく、後続するステップを容易にするように１以上の別の励起波長を使用して生じさせることができる。
【００７２】
その後、一般に著しく鮮明な結果的に得られたイメージは、おそらく自動的なイメージセグメント化工程によってその主要な幾何学的構成要素を識別するように処理され、それによってその構成要素の寸法、体積、各強度が評価される。この簡単な解析は分光学的積分だけに基づき、分光学的解析が欠けているが、いくつかの場合において、組織、細胞または細胞未満のレベルで特徴、正常および異常を認識するにはこの解析で十分である。とくに、細胞配列の幾何学的無秩序および細胞外特徴だけでなく、増殖中心を見ることができる。
【００７３】
その代りに、分光学的積分イメージがセグメント化されると、物質の異なった領域の特定の分光学的シグナチャを抽出するための（λ，τ）平面における全分光学的解析が行われる。このシグナチャのセットは、その後、既知の物質領域情報との比較のために大型データベースを構成するのに役立ち、あるいはデータベース中に記憶されている既存のシグナチャとの比較による診断に関する解釈に役に立つことができる。
【００７４】
この方法の変形において、組織応答のλスペクトルだけが獲得される。これは、図１の光学ポート３１において高感度２Ｄ　ＣＣＤ検出器４５を保護または選択的なシャッタ／フィルタ構体４２および分散／焦点設定素子４３の後方に結合することにより簡単に行われる。再びストリークカメラ４１に関しては、重要な任意の所定の波長領域が容易に選択可能であるために、分散素子４３（またはＤＥ）が機械的に取付けられている。４Ｄスペクトルイメージ化は、波長分散素子４３に垂直なライン沿って検流計ミラーの１つ１１Ｘを駆動し、その方向の一方が波長分散の方向であり、他方がたとえばＸのような走査ミラーの移動方向であるように設置された２方向性（アレイ）ＣＣＤチップ４５を使用することにより行われる。サンプルに関するレーザビームの走査の垂直方向Ｙは、他方の検流計ミラー１１Ｙまたはサンプルホルダ２０，６０のいずれかによって実行されることができる。全２Ｄ走査パターンはＣＣＤ４５のラインフレーム周波数に等しいライン周波数において方向ＹまたはＺの遅い垂直運動により獲得されることができる。
【００７５】
第２の方法は、（λ，τ）平面において生成された、あるいは最も伝統的にλドメインにおいて生成され、第１の方法にしたがって獲得された分光学的シグナチャからスタートする。ここでは、シグナチャは一般的に、（λ，τ）平面におけるポイントの所定の分布を、たとえば重要な領域の重量または２つの重量の比率等のスカラーに変換するスカラー関数を示す。その後、選択されたシグナチャはサンプル全体またはそのサンプルの一部分をイメージ化し、選択されたシグナチャによりその強度が表わされるイメージを生成するために使用される。その後、選択されたシグナチャの関連性は、ターゲットにされた構造の局部化、形状および範囲を示し、量的に評価されることができる。
【００７６】
第３の方法は、任意の前の知識を仮定せず、セグメント化のために分光学的積分を使用できるという仮定も行わない。その場合、全５Ｄイメージ（３Ｄ空間および２Ｄスペクトル）が生成され、５Ｄ空間において情報が探索される。微分されたスペクトルおよびおそらく幾何学構造を示すために、たとえば、エントロピー最小化方法、主要な構成要素の解析または他の線形代数ツール等の種々の方法が使用される。
【００７７】
上述したように、技術導入により得られた非線形イメージとは対照的に、本発明の方法および装置は、全てのフォトフィジカルメカニズム、共鳴または非共鳴、弾性または非蛍光より生成されたサンプルの全体的な固有応答を可能な限り完全にイメージ化することである。これらのイメージは、ミリメートルスケールから細胞未満のスケールまでの組織構造の非常に完全な画像をミクロン解像度で示す。したがって、本発明はラベル付け工程を伴わずに組織、細胞および種々の細胞未満のオルガネラを瞬時に視覚化することを可能にする。
【００７８】
本発明の別の主な利点は、連続した地点で行われるこの非線形分光法が平均スペクトルで空間的に“希釈”されるスペクトルの局部特異性（ｓｉｎｇｕｌａｒｉｔｙ）を分解することである。対照的に、これらの局部特異性は局部的に優勢であり、したがってはるかに容易に検出される。その結果、本発明はバルク分光学的方法より感度が高く、固有の構造を他のイメージ化ツールよりはるかに良好に深く示す。さらに、本発明ははるかに豊富で効率的なスペクトルシグナチャセットを設定するのに有用である。これは、それらが真に２Ｄ（λ，τ）であることができるだけでなく、組織幾何学形状と相関されるためである。これらのフォトフィジカルシグナチャは、細胞内における、細胞間における、および組織領域のスケールで位置を突き止められることができるため、それらの元の分子に関してそれらを解釈することがさらに容易になる。したがって、これらの分光学的シグナチャを細胞の生化学に関して顕微鏡スケールで解釈することが可能となり、細胞増殖制御、組織内の細胞間の相互作用、細胞形状、細胞内分泌メカニズム、および虚血のような病理学的メカニズムに対する洞察は潜在的に非常に興味深いものとなる。
【００７９】
固有の蛍光レイリーおよびラマン励起、ならびに、細胞および組織内の種々の正常および病的プロセス（それらに限定されないが）、とくにこれらに対して設定されたものに基づく分光学的シグナチャは、本発明の非線形励起方法および装置によってアクセス可能である。したがって、本発明の簡単な適用は全て、１以上の空間ディメンションおよび１以上の分光学的ディメンションで分解されたイメージ、あるいは全２Ｄ分光学的積分（λ、τ）に基づくイメージのいずれかを設定するために細胞および組織の固有の応答を非線形励起により徹底的に調べる。
【００８０】
非常に多くの組織構成要素は、チロシン、ポルフィリン、フラビン、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ、セロトニン、ドーパミン、コラーゲン、メラニン、ヘモグロビン、ｆｕｓｃｉｎｓ、インドールアミンおよびエラスチンのような単一の光子励起のときに固有の蛍光応答を生じさせることが証明されている。たとえば、クロム親和性細胞で表されるセロトニンは、腫瘍検出に対して認められ、使用されることができる。
【００８１】
本発明にしたがって得られたラマンスペクトルは、コレステロール、コラーゲン、エラスチン、脂質（たとえば、コレステロール、ＤＮＡ、βカロチン）のような分子を識別するために使用されることができる。
【００８２】
さらに、本発明にしたがって得られたハイパーレイリースペクトル、すなわち２次および、または３次の高調波応答は、たとえばコラーゲンおよびＤＮＡを識別するために使用されることができる。高調波信号が顕微鏡的スケールでの局部オーダリングに敏感であり、したがって一般にコラーゲン組織および極性高分子構造を示すそのインジケータであることは注目すべきである。
【００８３】
本発明の固有のイメージ化は、植物物質、原核生物、動物および人間の生物学的サンプル、あるいは生合成組織またはキメラ組織のようなサンプル、および、とくに、木材、植物、動物または人間の細胞、組織または器官、再構成された皮膚、移植された異種または自己の生体または固定された組織構造のような人工臓器の元の場所および別の場所での観察に関連している。それ故、本発明は、生物学的リサーチ、バイオテクノロジー（再構成された組織のイメージ化のような）、法廷で用いる調査および法医学に適用される。少なくとも、皮膚、口腔粘膜および粘膜下組織、眼科学的研究に関与する目の内部および外部の組織、上方および下方呼吸管、食道、肺、イーソファーグ（ａｅｓｏｐｈａｇｕｓ）、乳房、冠状動脈、胃腸管、子宮頚部および子宮内膜を含む生殖路、膀胱、および肛門の組織はイメージ化されることができる。これらの組織のほとんどに対して、蛍光および、またはラマンスペクトルが成分識別のために使用可能である。したがって、本発明を使用してこれらのスペクトルを得ることができる。
【００８４】
これらのターゲットおよびその他の組織に対して、高い開口数の顕微鏡対物レンズのような対応した対物レンズ、レンズベースの対物レンズおよび純反射性対物レンズにより、非侵襲性の顕微鏡検査およびマクロスコーピーモードで図１、４および５を参照として説明し、あるいは内視鏡検査モードで図６を参照として説明した同じ原理と共にレーザ走査イメージ化が行われることができる。
【００８５】
本発明は、サンプルのフィルタ処理されていない非線形光学応答（分光学的積分）から結果的に得られた純粋に幾何学的にイメージ化したものに全て基づく４つの主要なイメージ化モードを提供し、この非線形光学応答は、
（ｉ）１以上のスペクトルディメンション（λおよび、またはτ）、または分光学的平面（λ，τ）から精巧に生成されたシグナチャ、
（ｉｉ）スペクトルイメージの構成を伴う、あるいは伴わない走査による特定の分光学的敵シグナチャのローカリゼーション、
（ｉｉｉ）１以上の特定の非本質的発色団の非線形光学応答と関連していることが好ましい。この最後のモードは、この技術の方法においていわゆるカウンターステイン（ｃｏｕｎｔｅｒ ｓｔａｉｎ）を必要とする特定の発色団の正確なローカリゼーションとの関連でとくに重要である。この方法を使用することで、細胞境界、細胞核または組織のような細胞または組織構造の主なエレメント（または成分）が固有の信号により視覚化されることができるため、カウンターステインは必要ない。組織および細胞解剖学的構造を直接視覚化できると同時に、非本質的発色団のイメージ化および分光学的解析を行うことができる。
【００８６】
このように固有応答により示された解剖学的関係と共に非本質的発色団を視覚化することが可能なことは、いくつかのタイプの用途に用いることができる。第１に、非本質的な外部からの信号は、バクテリア、ウィルスまたは寄生虫のような病理学関連の生体物質から、あるいは石綿のような不活性粒子から生じる可能性が高い。第２に、これらの種々の感染物質または不活性物質の存在に関連した組織応答方向（ｔｏｗａｒｄ）または組織変化もまた本発明により評価されることができる。第３に、信号はまた、薬の乱用に関連した、あるいは法的調査に重要な外生物質の存在からも発生することができる。
【００８７】
本発明はまた、肉体的な生検を必要とせずに固有の非線形イメージ化を行う元の場所でのターゲットの医学的診断に関する。したがって、本発明は、検査されて、ミクロン解像度で分光学的に解析され、それによって細胞の形態学的構造、組織障害および微小な血管新生を示すことのできるメラノーマまたは母斑を含むが、それに限定はされない、皮膚組織における病気の検出に関する。本発明はまた、非線形プロトポルフィリン光学応答を使用して腫瘍および癌の初期兆候を検出する符号２１７（図５の）で示されているような遠隔感知ヘッドによる口腔の診断に関する。この技術は、伝統的な組織生検および病理学的評価を補助し、あるいはこれに取って代わることさえ可能であり、また、いくつかの（１１個までの）異なった波長を必要とする既存の分光学的技術を補助し、あるいはこれに取って代わることさえできる。
【００８８】
膣鏡検査および子宮頚部検査はまた、符号２１６（図４の）で示されているような遠隔感知ヘッドを備えたデバイスを使用する本発明の別の用途である。事実上、形成異常ならびに前侵襲性および侵襲性の癌は、頚部上皮細胞、絨毛膜および深い層の少なくとも固有の蛍光を使用して検出されることができる。子宮頚部上皮細胞の場合には、とくにそのリコーゲン含有量のために、ピコ秒励起下でラマン信号シグナチャもまた検出されることができる。結腸上皮細胞の強い固有応答からは、単一細胞レベルの組織幾何学形状を示すイメージが生成される。本発明はまた、外科的処置をモニタするために組織および細胞構造ならびにメタボリズムに関する非常に重要な情報を外科医に提供するようにＧＩ管、筋肉および中枢神経系のような外科的に露出された組織の元の場所での直接的な巨視的または微視的イメージ化に適用される。
【００８９】
細胞または組織試料はまた、組織病理学的および細胞病理学的解析に加えて即座に診断（検出）するために１以上の空間ディメンションおよび１以上のスペクトルディメンションにより本発明による非線形固有スペクトルイメージ化によって視覚化され、解析されることができる。
【００９０】
診断目的に加えて、本発明による非線形固有スペクトルイメージ化はまた、フォトダイナミック・ローカル・トリートメント（ＰＤＴ）またはフォトアブレーションのようなレーザベース処置と並行して使用されることができる。事実、組織の構造およびそれらの異常を検出しているあいだに、固有のレーザ走査イメージ化を使用して同じ光路をたどる別のレーザアクションを誘導することができる。したがって、フォトアブレーションまたはフォトダイナミック・トリートメントに対して使用されるレーザビームは、単一細胞照準正確度により正確にターゲットされることができる。その代り、イメージ化ビーム（レーザ励起）自身が非線形フォト誘導破壊活動に対してローカルスケールで使用されることができる。さらに、非線形スペクトルイメージ化はまた、詳しい組織構造を細胞または細胞未満のスケールで示すことによってこれら２つのタイプのアクションの効果をモニタするために使用されることができる。最後に、上述した同じ診断（または検出）方法は、治療効果および回復を長期監視する追跡方法に容易に変形されることができる。
【００９１】
本発明はまた、薬理学的および薬力学的問題を解くための薬の局限化および新陳代謝にねらいを定めた研究に適応される。本発明により、重要な薬は、それらが非線形励起により視覚化されることが可能ならば、生体内で空間的および時間的に、組織の解剖学的関係において顕微鏡的解像度で局限されるであろう。これは、薬設計および薬物殻の解放問題の生体内評価に対して、あるいは遺伝子治療（遺伝子操作された元素配列の視覚化、遺伝子生成物の局限、細胞増殖および組織変異）において非常に有用である。
【００９２】
動物学的研究に対する本発明の医学的適用はまた、動物の疾病および人間の疾病の動物モデルの研究に対する１組の簡単に導出された方法を提供する。
【００９３】
本発明は単なる例示により上述された装置の実施形態および方法の実施に制限されるものではなく、添付された請求の範囲を逸脱することなく当業者により考慮されることのできる何れの変形をカバーするものである。
【００９４】
とくに、本発明は、完全なものに近い図１に示された装置を参照として説明されている。しかし、この装置は、それが光子エネルギがどれ程であろうと１以上の収集ゾーンにおいて応答光子を収集する１以上の収集手段を含んでいるならば、はるかに簡単なものであってもよい。換言すると、この装置は異なった収集ゾーンに配置された１、２、３、４、５または６つの、あるいは必要ならば、それより多くの異なった収集手段を設けられることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明の装置を示す概略図。
【図２】
図１の装置に対するストリークカメラの入力ウインドウを示す概略図。
【図３】
図１の装置に対するレーザソース機構を示す概略図。
【図４】
非侵襲性の顕微鏡検査またはマクロスコープ検査に適応された第１の可動光検出器構体を示す概略図。
【図５】
非侵襲性の顕微鏡検査またはマクロスコープ検査に適応された第２の可動光検出器構体を示す概略図。
【図６】
内視鏡検査に適応された光検出器構体を示す概略図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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