(57)【要約】AGPPaseはADPG（アデノシングルコース２リン酸）の加水分解を触媒する酵素である。細菌抽出物から得られた酵素は、AGPPaseによって触媒された反応によって放出されたG１P（グルコース１リン酸）に基づきADPGレベルを測定するアッセイ装置中で用いられる。本発明は、前記酵素のアミノ酸の部分配列、前記酵素をコードする遺伝子の配列及び推定のタンパク質にも関連する。本発明は更に、AGPPaseの遺伝子を過剰に発現し且つ糖質の含量が高く、デンプン又はグリコーゲン含量が低く、そして高い塩濃度及び高い温度に非常に耐性を示す、トランスジェニック植物及び細菌にも関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ADPGピロフォスファターゼ(AGPPase)活性を有する微生物起源の酵素産物の生産をする方法であって、大腸菌(E.coli)の懸濁は、バッファーによるタンパク質画分の抽出、抽出物の音波処理、しかる後に、逐次遠心及び沈殿をし、培地のpH及びイオン強度の両方の調整をし、好ましくは当該タンパク質を５８℃に加熱して氷中で冷却することを伴い、そしてゲルろ過、等電点電気泳動、イオン交換、又は細菌から抽出したタンパク質を精製する他の同等の方法による精製、による精製手順に委ねられることを特徴とする方法。
【請求項２】
以下の段階：
(１)大腸菌BL２１を５mMのグルコースを伴う３０LのＭ９最小培地中で培養し、(２)遠心によって細菌を沈降させ、(３)５０mM、 pH７．５のトリスHCl及び５mMのMgCl２中で再懸濁し、(４)音波処理をし、(５)１００，０００gでの超遠心をし、(６)５８℃の温度で１０分に渡り上清の加熱をし、しかる後に氷中で冷却し、(７) 遠心して上清の前記タンパク質の濃縮を硫酸アンモニウム中での沈殿によって行い、そして５０mM、pH７．５のトリスHCl中で再懸濁し、そして(８)ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は等電点電気泳動によって精製する
段階；
を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
用いた大腸菌の株が、配列番号：２及び配列番号：３でそれぞれ示されている、AGPPaseをコードする遺伝子の５´及び３´領域から順に得られた２つのプライマーによる大腸菌BL２１ゲノムDNA由来のPCRにより増幅された、配列番号：４で示されているDNA断片を発現することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記AGPPaseがCECT５３５７の株から得られ、そして精製されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
AGPPaseと命名された、請求項1〜４のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる、原核微生物起源の酵素産物。
【請求項６】
AGPPaseと命名された、原核微生物起源の酵素産物であって、それは、ADPGのG1P及びAMPへの等モルでの加水分解を触媒するが、リン酸モノエステル結合を有する分子、更にはモノ−、ジ−もしくはトリ−リン酸ヌクレオチド、例えば、とりわけて、ATP、UTP、ADP、UMPもしくはAMPを加水分解せず、MgCl２を必要とし、ビス−ｐ−ニトロフェニル−リン酸塩の加水分解をすることができず、モリブデン酸塩及びリン酸化された分子により阻害され、その活性は還元剤及びキレート剤によって悪影響を受け、約７．５〜８．５のpHで非常に安定であり、そしてADPGに加えて、ADPリボース及びADPマンノースを認識するが、他のヌクレオチド糖、例えば、とりわけて、UDPグルコース又はGDPマンノースは認識しない、ADPGピロフォスファターゼ(EC．３．６．１．２１)酵素活性を示すことを特徴とする、原核微生物起源の酵素産物。
【請求項７】
とりわけて、G1P、G6P、AMP、３−ホスホグリセリン酸塩、cAMP、更には長鎖核酸、例えば、DNA又はRNAをも加水分解しないことを特徴とする、請求項５及び６のいずれか１項に記載の酵素産物。
【請求項８】
無機ピロリン酸塩、及びリン酸エステル、例えば、とりわけて、AMP、ADP、ATP、又は３−ホスホグリセリン酸塩によって阻害されることを特徴とする、請求項５〜７のいずれか１項に記載の酵素産物。
【請求項９】
その活性が、とりわけて、β−メルカプトエタノール、EDTA、還元システイン又はアスコルビン酸塩によって悪影響を受けることを特徴とする、請求項５〜８のいずれか１項に記載の酵素産物。
【請求項１０】
とりわけて、UDPグルコース、GDPグルコース、アデノシン５´−ホスホ硫酸塩、又はビス−ｐ−ニトロフェニル−リン酸塩を基質として認識しないことを特徴とする、請求項５〜９のいずれか１項に記載の酵素産物。
【請求項１１】
ゲルろ過によって決定された約４０〜５０kDaの見掛けの分子量を有し、並びに０．１５mMのKmをADPG関して示すことを特徴とする、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の酵素産物。
【請求項１２】
配列番号：１に示されるポリペプチド断片を配列中に１つ以上含むことを特徴とする、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の酵素産物。
【請求項１３】
配列番号：５又は遺伝コードの縮重によりもたらされる相同配列からなることを特徴とする、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の酵素産物。
【請求項１４】
ADPGの測定において適用する為のアッセイ装置及び／又は組成物の製造における請求項５〜１３のいずれか１項に記載の酵素産物の使用。
【請求項１５】
測定が、AGPPaseによって触媒された反応中に放出されたG１Pに基づいて行われるように、請求項５〜１３のいずれか１項に記載の酵素産物を含むことを特徴とする、ADPGの測定をする為のアッセイ装置。
【請求項１６】
請求項１５に記載のアッセイ装置であって、測定が放出されたG１Pに基づいていることを特徴とし、ここで当該G１Pは酵素ホスホグルコムターゼに委ねられてG６Pを生産し、当該G６Pは次には、酵素G６Pデヒドロゲナーゼの作用によって共役態様においてNAD＋と反応し、常用の方法、即ち、分光光学的方法、蛍光測定又は他の性質を利用した方法によって測定可能な６−ホスホグルコネート及びNADHをもたらす、アッセイ装置。
【請求項１７】
DNA配列であって：
a)  配列番号：１又は配列番号：５で表されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列；
b)  配列番号：４で表されたポリヌクレオチド配列を含む配列；
c)  a)又はb)で規定された配列とハイブリダイズし且つAGPPase活性を有する酵素産物をコードする相補的配列；
d)  遺伝コードの縮重の為に、c)において規定されたものとは異なる配列；
から選択されたDNA配列。
【請求項１８】
酵素AGPPaseを過剰に発現するトランスジェニック植物の生産における、請求項１７に記載のDNA配列の使用。
【請求項１９】
請求項１７に記載のDNA配列をいくつか含むプラスミドを含む形質転換ベクターを使用することを特徴とする、AGPPaseを過剰に発現するトランスジェニック植物を生産する方法。
【請求項２０】
前記形質転換ベクターがアグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)であることを特徴とする、請求項１９に記載のトランスジェニック植物を生産する方法。
【請求項２１】
前記形質転換ベクターがアグロバクテリウム・チュメファシエンスの株CECT５９０１を含んで成ることを特徴とする、請求項２０に記載のトランスジェニック植物を生産する方法。
【請求項２２】
請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法により得ることができ、酵素AGPPaseを過剰に発現することを特徴とする、デンプン含量が減少し且つ高塩濃度及び高温に対する耐性を有するトランスジェニック植物。
【請求項２３】
AGPPaseを過剰に発現する形質転換された細菌の生産における、請求項１７に記載のDNA配列の使用。
【請求項２４】
形質転換ベクター、詳細には請求項１７に記載のDNA配列をいくつか含むプラスミドを使用することを特徴とする、AGPPaseを過剰に発現する形質転換された細菌を得る方法。
【請求項２５】
酵素AGPPaseを過剰に発現することを特徴とする、請求項２４に記載の方法により得ることができるグリコーゲン含量が減少した形質転換された細菌。
【請求項２６】
動物の飼養、特に魚類の飼養における、請求項２５に記載の形質転換された細菌の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明が関連する技術分野
本発明は、酵素ADPグルコースピロフォスファターゼ（AGPPase）の生産、精製及び特性決定をする分野、植物及び微生物抽出物の両方においてADPGを測定するための装置（キット）を作るためのその使用、並びにトランスジェニック植物及び細菌の生産（AGPPase, aspPをコードする遺伝子の過剰発現があり、デンプン又はグリコーゲンの含量がそれぞれ減少し、可溶性糖の含量が高く且つ塩分及び高温に対して耐性が高い植物及び細菌を生み出す）に関連する。
【背景技術】
【０００２】
従来技術の説明
グリコーゲン及びデンプンは、それぞれ細菌及び植物における炭水化物の貯蔵形態である。植物において、デンプンは例えば、種子（コムギ、オオムギ、ダイズ、エンドウなど）及び塊茎（特にポテト及びカム（カンショ））などの器官中に多量に蓄積し、そしてデンプンはヒトの食事の基本成分である。他方、デンプンは往々にして、紙、化粧品、医薬及び食品産業においても使用されており、そしてデンプンは生分解性プラスチック及び環境に優しい塗料を製造するための基本成分としても使用されている。これらの多糖類は、共有結合したグルコース分子で構成されているので、それらの合成に関わる過程を調査することが、様々な工業生産分野での緊急事項である。
【０００３】
ADPグルコース（ADPG）は、植物におけるデンプンの生合成及び細菌グリコーゲンの生合成における普遍的な前駆物質である。ADPGの細胞内レベルを支配する因子に関する研究は、主に、酵素、ADPGピロホスホリラーゼの合成の調節に注目して行われて来た。（Preiss (1988), “Biosynthesis of starch and its regulation”. The Biochemistry of Plants. Vol.14, Academic Press, New York, pp.182〜249; Pozueta-Romero, J., Perata, P., Akazawa, T. (1999) “Sucross-starch conversion in heterotrophic tissues”. Crit. Rev. Plant Sci., 18, pp.489〜525; Preiss, J. (1984) Bacterial glycogen synthesis and its regulation. Ann. Rev. Microbiol. 38, pp.419〜458; Preiss, J., Romeo, T. (1994) Molecular biology and regulatory aspects of glycogen biosynthesis in bacteria, Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 47, pp.301〜327）。しかし、細胞によって蓄積されたデンプン及びグリコーゲンのレベルの調節を促す、ADPGを分解する可能性のある機構の研究（Feingold, D.S., Avigad, G. (1980) “Sugar transformation in plants”. The Biochemistry of Plants. Vol.3, Stumpf, P.K. and Conn, E.E. Eds. Academic Press, New York, pp.101〜170）は殆んど行われておらず、植物及び細菌の両方が、ADPGの加水分解することができる酵素機構を有するという指摘は殆んどない（Melo, A., Glaser, L. (1966) “Nucleotide diphosphate hexose pyrophosphatases”. Biochem. Biophys. Res. Commun. 22, pp.524〜531; Rodriguez-Lopez, M., Baroja-Fernandez, E., Zandueta-Criado, A., Pozueta-Romero, J. (2000) “Adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase: a plastidial phosphodiesterase that prevents starch biosynthesis”. Proc. Natl. Acad. Sci., 97, pp.8705〜8710; Baroja-Fernandez, E., Zandueta-Criado, A., Rodriguez-Lopez, M., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2000) “Distinct isoforms of ADPglucose pyrophosphatase and ADPglucose pyrophosphorylase occur in the suspension-cultured cells of sycamore (Acer pseudoplatanus L.). FEBS Lett. 480, pp.277〜282; Rodriguez-Lopez, M., Baroja-Fernandez, E., Zandueta-Criado, A., Moreno-Bruna, B., Munoz, F.J., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2001) “Two isoforms of a nucleotide-sugar pyrophosphatase/phosphodiesterase from barley leaves (Hordeum vulgare L.) are distinct oligomers of HvGLP1, a germin-like protein”. FEBS Lett. 490, pp.44〜48; Moreno-Bruna, B., Baroja-Fernandez, E., Munoz, F.J., Bastarrica-Berasategui, A., Zandueta-Criado, A., Rodriguez-Lopez, M., Lasa, I., Akazawa, T., Pozueta-Romero, J. (2001) “Adenosine diphosphate sugar pyrophosphatase prevents glycogen biosynthesis in Escherichia coli” Proc. Natl. Acad. Sci. 98, pp.8128〜8132）。
【０００４】
植物中で生産されたデンプンの様々な用途は主に、アミロースとアミロペクチンのバランス（それによりデンプン粒の構造が決まる）、並びに水性懸濁におけるデンプンの粘度に基づいている。アミロースとアミロペクチンのこのような比率は、植物細胞中でのADPGの濃度に依存する（Clarke, B.R., Denyer, K., Jenner, C.F., Smith, A.M. (1999) The relationship between the rate of starch synthesis, the adenosine 5'-diphosphoglucose concentration and the amylose content of starch in developing pea embryos. Planta 209, pp.324〜329）。
【０００５】
デンプンは、植物のための貯蔵物質として作用するのみならず、植物が水ストレスの条件にさらされていない環境下で植物細胞中に蓄積する。植物が環境中で高温又は高濃度の塩にさらされる条件下では、植物はデンプンの蓄積をやめ、空胞中に蓄積する可溶性糖を多量に生産する（Keeling, P.L., Bacon, P.J., Holt, D.C. (1993) “Elevated temperature reduces starch deposition in wheat endosperm by reducing the activity of soluble starch synthase” Planta 191, pp 342〜348; Geigenberger, P., Geiger, M., Stitt, M. (1998) “High-temperature perturbation of starch synthesis is attributable to inhibition of ADP-glucose pyrophosphorylase by decreased levels of glycerate-3-phosphate in growing potato tubers” Plant Physiol. 117, pp.1307〜1316）。
【発明の開示】
【０００６】
本発明は、AGPPaseという、ADPGの加水分解を触媒する、微生物起源の酵素産物の精製及び用途を記載する。本発明において、我々は大腸菌（Escherichia coli）のAGPPaseを部分的に配列決定することに成功した。配列決定した断片とデータベースで入手可能な配列とを比較した後、AGPPaseは、orf２０９と命名された大腸菌のゲノムの配列（その産物は今迄、細胞中で同定されて来ておらず、それに細胞中のADPリボースの含量を調節する可能性のある機能が起因する）によってコードされた「ヌディックス（Nudix）ヒドロラーゼ」の群に属するタンパク質であることが結論づけられている（Bessman, M.J., Frick, D.N., O'Handley, S.F. (1996) “The MutT proteins or “Nudix” hydrolases, a family of versatile, widely distributed “housecleaning” enzymes” J. Biol. Chem. 271, pp.25059〜25062; Dunn, C.A., O'Handley, S.F., Frick, D.N., Bessman, M.J. (1999) “Studies on the ADP-ribose pyrophosphatase subfamily of the Nudix hydrolases and tentative identification of trgB, a gene associated with tellurite resistance” J. Biol. Chem. 274, pp.32318〜32334). The accession number of aspP (the gene that codes for AGPPase and was previously designated with the name orf209）EMLBデータベース中で利用可能なのは、AJ２９８１３６である。
【０００７】
クロマトグラフィー技術は、植物及び微生物抽出物中のADPGの含量の測定をするための強力な道具の構成要素となる（Sweetlove, L.J., Burrell, M.M., ap Rees, T. (1996) “Starch metabolism in tubers of transgenic potato (Solanum tuberosum) with increased ADPglucose pyrophosphorylase” Biochem. J. 320, pp.493〜498; Shannon, J.C., Pien, F-M., Liu, K-C. (1996) “Nucleotides and nucleotide sugars in developing maize endosperms” Plant Physiol. 110, pp.835〜843; Geigengerger, P., Reimboltz, R., Geiger, M., Merlo, L., Canale, V., Stitt, M. (1997) “Regulation of sucrose and starch metabolism in potato tubers in response to short-term water deficit” Plant 201, pp.520〜518; Geigenberger, P., Geiger, M., Stitt, M. (1998) High-temperature perturbation of starch synthesis is attributable to inhibition of ADPglucose pyrophosphorylase by decreased levels of glycerate-3-phosphate in growing potato tubers” Plant Physiol. 117, pp.1307〜1316）。それらは、非常に一般的に用いられるが、装置においてかなりの投資が要求される。残念ながら、単純且つ効率的な方法でADPGの検出及び定量を可能にする有力な代替方法が殆んど使用されていない。単純且つ安価な方法で試料中のADPGのレベルを分析することがクロマトグラフィーに代わり有利でありうることは明らかである。
【０００８】
本発明は第一に、大腸菌（E.coli）から出発して、AGPPaseを実質上純粋な形態で生産すること、その特性決定及びそれをコードする遺伝子を同定することに関連する。次いで本発明の他の対象は、AGPPase活性を有する酵素産物の使用に基づきADPGの測定をするための装置又はキットを作製するための手順である。AGPPase, aspPをコードする遺伝子が同定されたことで、コントロールの植物に比べてデンプン又はグリコーゲンの含量及び質でそれぞれ改変されている、高AGPPase活性を有するトランスジェニック植物及び細菌の生産を対象とした、同定された遺伝子から生成されたDNA構築体の設計を詳細に示す。単子葉植物又は双子葉植物の形質転換された植物は、高塩濃度及び高温に対する耐性を示す。形質転換された細菌は、特に水産養殖における手での餌やり（hand feeding）において用いられて良い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
大腸菌由来のAGPPaseの生産及び精製
AGPPaseは、様々な系統の大腸菌（とりわけてBL２１，ATCC１２７９３及びK１２）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）及びハエモフィルス・インフルザエ（Haemophilus influenzae）中に存在する。本発明中で記載したAGPPaseの生産及び精製をする一般的な方法は大腸菌 BL２１を用いて例示されており、そして以下の段階を伴う。ここで抽出及び精製の方法の全体的な考えを実質的に変えることはない小さな変更が行われて良い。
１．M９最小培地（９６mMのNa2HPO4、４４mMのKH2PO4、１５mMのNaCl、３５mMのNH4Cl、０．１mMのCaCl2、２mMのMgSO4）と５mMのグルコース中で定常状態迄増殖した細菌懸濁３０mlの１０，０００ｇでの遠心。
２．細菌は２００mlの５０mMトリスHCl、pH７．５中で再懸濁されて、音波処理後、１００，０００ｇで３０分に渡り超遠心される。
３．上清は５８℃で１０分に渡り加熱され、そして３０，０００ｇで３０分に渡り遠心される。
４．上清のタンパク質は３０〜５０％の硫酸アンモニウム中で沈澱され、そして５０mMのトリスHCl、pH７．５、２．７ml中で再懸濁される。
５．試料は、５０mMのトリスHCl、pH７．５／１５０mMのNaClで予め平衡化されたSuperdex２００型のゲルろ過カラム（Pharmacia LKB）に適用される。
６．AGPPase活性を示す画分は濃縮され、透析され、そして５０mMのトリスHCl、pH７．５で平衡化されたMono-Qカラム（HR５x５、Pharmacia）に適用される。酵素は、３０mMのトリスHCl、pH８．０中、KCl ４５mlの０〜１Ｍの勾配により溶出される。
７．活性画分はRotofor Cell (Bio-Rad) を用いる等電点泳動の段階に掛けられる。
【００１０】
AGPPase酵素活性を有する産物の同定
上記の手順、又は他の同等の手順によって得られた酵素産物は、以下の有用な標準的な方法によって同定されている。
●ADPGの、等モル量のG１PとAMPへの加水分解を触媒するのは「アデノシン二リン酸糖ピロフォスファターゼ（EC．３．６．１．２１）」である。
●ADPGに加えて、それはADPマンノース及びADPリボースを認識するが、例えば、UDPグルコース、GDPマンノース、UDPグルクロンなどの他のヌクレオチド糖を認識しない。更に、それは、例えば５′−ホスホスルフェート、ATP, ADP, UTP, GTPのみならず、ホスホジエステラーゼの特性決定のために用いた人工基質、ビス−パラニトロフェニル−リン酸塩も認識しない。
●それは、ホスホモノエステル結合を有する分子、例えば、G１P, G６P, AMP、３−ホスホグリセリン酸塩などを加水分解しない。更にそれは、サイクリックAMP、又はDNAもしくはRNAなどの長鎖核酸を加水分解しない。
●それは、リン酸化された分子、例えばAMP, ADP, ATP、３−ホスホグリセリン酸塩、無機ピロリン酸塩及び同様の特性を有する他の分子によって阻害される。
●それは、モリブデン酸塩によって非常によく阻害される。
●その活性は、β−メルカプトエタノール、EDTA、還元システイン、アスコルビン酸塩及び他の還元剤及びキレート剤によって影響を受ける。
●それは、７．５〜８．５のpH範囲で最大活性を示す。
【００１１】
AGPPaseをコードする大腸菌の遺伝子（aspP）の増幅
AGPPaseのアミノ酸配列が分かったらそれを、データベース中に存在する他の配列と比較した。こうすることで、AGPPaseをコードする遺伝子（それに対して名前aspPが与えられている）を同定することが可能になった。aspPのヌクレオチド配列を知ることで、２つの特異的プライマーを作製可能になった。これらのプライマーを用いることで、６４０bpのDNAが常用のPCR法によって、大腸菌BL２１のゲノムDNAから増幅され、それはXL１ブルー宿主細菌中で増幅される構築体pASPP（図１Ａ）を生じるために、プラスミドpSKブルースクリプト（Stratagene）のEcoRＶ／SmaＩ制限部の間に導入された。
【００１２】
aspPを過剰に発現する大腸菌からのAGPPaseの生産
pASPPは制限酵素HindIII及びNotＩで消化された。放出された断片（aspPを含む）は、エレクトロポレーションによって大腸菌BL２１（DE３）中に導入されるプラスミドpET-ASPP（図１Ｂ）を生じるために、pET-２８a(+)発現ベクター中にクローン化された。大腸菌の株は、寄託番号CECT５３５７で、Research Building of the University of Valencia, Campus de Burjassot, Burjassot 46100 (Valencia Spain) に位置するSpanish Collection of Standard Culturesに２０００年１０月５日に寄託された。aspPの過剰発現は、１００mlの培養細胞中に１mMのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加することによって行われた。培養により誘導された６時間後、細菌は回収されて４mlの結合ブァッファー（Novagen、His-結合精製キット）中で再懸濁された。そして細菌は音波処理されて４０，０００ｇで、２０分に渡り遠心された。AGPPaseをヒスチジンののりにより含む上清は、Novagenから入手した「His-結合」タンパク質精製キットのアフィニティーカラムを通過させられた。キットの説明書に従い、AGPPaseは６mlの推奨溶出ブァッファーで溶出された。
【００１３】
aspPを過剰に発現するトランスジェニック植物の生産
ａ．恒常的にaspPを過剰に発現してAGPPaseをサイトゾル中に蓄積する植物
pASPPは酵素NcoＩ及びXbaＩで消化された。放出された断片（aspPを含む）は、プラスミドpVT′BSP中にNcoＩ／XbaＩ部位でクローン化された（図２Ａ）。このようにして、pVT′ASPPというプラスミドが得られ、それは構成３５Sプロモーター、aspP及びターミネーターNosを有する（図２Ｂ）。
【００１４】
この構築体を植物のゲノムへとアグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）を介して移入できるようにするために、最初にそれはバイナリープラスミド中にクローン化されなければならない。こうするために、pVT′ASPPは、酵素EcoRＩ, T４DNAポリメラーゼ及びHindIIIで逐次消化されて、予め酵素XbaＩ, T４DNAポリメラーゼ及びHindIIIで逐次消化されていたバイナリープラスミドpCGN１５４８（McBride, K.E., Summerfelt, K.R. (1990) “Improved binary vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation”. Plant Mol. Biol. 14, pp.269〜276）中にクローン化された。このようにして得られたプラスミドはpCGN１５４８３５SASPPと命名された（図２Ｃ）。大腸菌（XL１、ブルー）中で増幅された後、pCGN１５４８３５SASPPは、トマト、タバコ、ポテトなどの種を形質転換するために用いられるアグロバクテリウム・チュメファシエンス（CECT５９０１)(Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffmann, N.L., Eichholtz, D., Rogers, S.G., Fraley, R,T, (1985) “A simple and general method for transferring genes into plants” Science 277, pp.1229〜1231）中に導入された。アグロバクテリウム・チュメファシエンスの株は寄託番号CECT５９０１でResearch Building of the University of Valencia, Campus de Burjassot, Burjassot (Valencia Spain) 46100に位置する、Spanish Collection of Standard Culturesに、２００１年２月１６日に寄託された。
【００１５】
ｂ．塊茎中で専らaspPを過剰に発現してAGPPaseをサイトゾル中に蓄積する植物
パタチン遺伝子をコードする遺伝子のプロモーター（Rocha-Sosa, M., Sonnewald, U., Frommer, W., Stratmann, M., Schell, J., Willmitzer, L. (1989) “Both developmental and metabolic signals activate the promoter of a class I patatin gene” EMBO J. 8, pp.23〜29）を含むプラスミドpSK-B３３は、酵素HindIII及びSmaＩで消化された。放出された断片は、プラスミドpVT-B３３-ASPP（図３Ｂ）を生じさせるために、NcoＩ, T４DNAポリメラーゼ及びHindIIIでpVT′-ASPP（図３Ａ）が逐次消化された後pVT′-ASPP中にクローン化された。この構築体をバイナリープラスミド中にクローニングするために、pVT-B３３-ASPPは、EcoRＩ及びT４DNAポリメラーゼで逐次消化された。放出された断片は、pCGN１５４８（図３Ｃ）がHindIII及びT４ポリメラーゼで逐次消化された後にpCGN１５４８中にクローン化された。このようにして得られたプラスミドは、pCGN１５４８-B３３-ASPP（図３Ｄ）の名称が与えられた。
【００１６】
ｃ．恒常的にaspPを過剰に発現してAGPPaseを色素体中に蓄積する植物
P５４１タンパク質をクロロプラストへ輸送するための輸送ペプチドをコードする遺伝子の領域（Houlne, G., Schantz, M-L., Meyer, B., Pozueta-Romero, J., Schantz, R. (1994) “A chromoplast-specific protein in Capsicum annuum: characterization and expression of the corresponding gene” Curr. Genet. 26, pp.524〜527）を含むプラスミドpGEM-ChlTP（図４Ａ）は、SalＩ及びNcoＩで消化された。放出された断片は、プラスミドpChl-TP-ASPP（図４Ｂ）を生じるために、pASPPがSalＩ及びNcoＩで消化された後に、pASPP中にクローン化された。pChlTP-ASPPはSalＩ, T４DNAポリメラーゼ及びXbaＩで逐次消化された。放出された断片は、プラスミドpVT-３５S-ChlTP-ASPP（図４Ｄ）を生じるために、予めNcoＩ, T４DNAポリメラーゼ及びXbaＩで消化されていたpVT′-ASPP（図４Ｃ）中にクローン化された。この構築体をバイナリープラスミド中にクローニングするために、pVT-３５S-ChlTP-ASPPはHindIII, EcoRＩ及びT４-DNAポリメラーゼで逐次消化された。放出された断片は、pCGN１５４８（図４Ｅ）がHindIII及びT４DNAポリメラーゼで逐次消化された後に、pCGN１５４８中にクローン化された（図４Ｅ）。このようにして得られたプラスミドはpCGN１５４８-３５S-ChlTP-ASPP（図４Ｆ）の名称が与えられた。
【００１７】
可溶性糖及びデンプンの含量の測定
可溶性糖は、科学刊行物（Heim, U., Weber, H., Baumlein, H., Wobus, U. (1993) “A sucrose-synthase gene of V. Faba L. Expression pattern in developing seeds in relation to starch synthesis and metabolic regulation” Planta 191, pp.394〜401）に記載された技術を用いて抽出された。スクロース、フルクトース及びグルコースは、CarboPac PA１０カラム、ED５０電気化学検出器、GP５０ E１勾配ポンプ及びE０１溶出物オーガナイザーが連結されたDIONEX自動化イオンクロマトグラフを用いて測定された。ADPGは、Partisil-１０-SAXカラムが連結されたHPLCシステム（Rodriguez-Lopez, M., Baroja-Fernandez, E., Zandueta-Criado, A., Pozueta-Romero, J. (2000) “Adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase: a plastidial phosphodiesterase that prevents starch biosynthesis”. Proc. Natl. Acad. Sci., 97, pp.8705〜8710）を用いて測定された。デンプンは、刊行物（Rodriguez-Lopez, M., Baroja-Fernandez, E., Zandueta-Criado, A., Pozueta-Romero, J. (2000) “Adenosine diphosphate glucose pyrophosphatase: a plastidial phosphodiesterase that prevents starch biosynthesis”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, pp.8705〜8710）に記載されたキットであって、本質的にデンプンのグルコースユニットに対するグルコースオキシダーゼの作用、しかる後に、共役的な酵素反応後に生産されたNADHの分光学的検出に基づくキットを用いて測定された。
【００１８】
植物又は細菌起源の抽出物中のADPGを測定するためのアッセイ装置（キット）の開発
ADPGを測定するために設計されたキットは、ADPG分子に対しAGPPase活性を有する産物の活性（分光学的方法によって容易に検出される等モル量のAMPとグルコース−１−リン酸（G１P）を放出する）に基づいている。G１Pは酵素ホスホグルコムターゼの活性に委ねられ、グルコース−６−リン酸（G６P）を生じ、それは次には酵素G６Pデヒドロゲナーゼの作用によってNAD+との共役的な反応を起こして良く、６−ホスホグルコン酸及びNADHが得られ、それは３４０nmでの分光分析によって容易に測定されうる。
【００１９】
大腸菌のAGPPaseの特異的ポリクローナル抗体の生産
精製された２mgのAGPPaseはSDS-PAGEでの電気泳動により分離された。それは溶出された後、完全Freundアジュバントと混合（５０％／５０％比で）され、次いで３つの等しいアリコートに分けられた。それらは各々、２週間に渡りウサギに注射された。最初の注射の約２月後、AGPPaseの特異的ポリクローナル抗体を含むウサギの血清が抽出された。
【００２０】
ウェスタンブロッティングを用いての産物の同定
野生植物及び遺伝子aspPを過剰に発現するトランスジェニック植物に由来するタンパク質の試料は１０％ SDS-PAGEにおいて分離された。次いで、論文（Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. (1979) “Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedures and some applications”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, pp.4350〜4354）に記載された方法によりそれらはニトロセルロース膜へ移され、そしてAGPPaseが特異的抗AGPPase抗体を用いて検出された。
【実施例】
【００２１】
本発明の用途の例
AGPPaseの生産及び精製をする方法が詳細に示されている例を以下に記載している。他の例では、植物組織中のADPGを測定するためのキット（アッセイ装置）を生産するためのAGPPaseの使用を例示している。その他の例では、aspPの生産を示す。最後に、他の例では、aspPを過剰に発現するトランスジェニック植物及び細菌の生産を記載する。
【００２２】
実施例１：AGPPaseの抽出及び精製
特に示していない限り、全ての段階を４℃で行った。３０Ｌの大腸菌BL２１を１０，０００ｇで遠心して、細菌のペレットを２００mlのトリスHCl（５０mM、pH７．５）中で再懸濁した。音波処理後、粗製の細菌抽出物を１０，０００ｇで３０分に渡り遠心して上清を５８℃で１０分に渡り加熱した。３０，０００ｇでの遠心後、上清中に存在するAGPPaseを３０〜５０％の硫酸アンモニウムで沈澱させた。３０，０００ｇ（２０℃）で３０分の遠心後得た沈澱を、２．７mlのトリスHCl（５０mM、pH７．５）中で再懸濁した。次いで、試料を、トリスHCl（５０mM、pH７．５）及びNaCl（１５０mM）で予め平衡化されたSuperdex２００のカラム（Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala Sweden）においてゲルろ過に委ねた。同じバッファーで溶出を行った。AGPPase活性がある画分を組み合わせて、濃縮してMono-Q型のイオン交換カラム（XR ５x５、Pharmacia）へ適用した。KClでの勾配溶出後、活性画分を組み合わせて、透析して、濃縮し、そしてRotofor Cell (Bio-Rad) を用いる等電点電気泳動に委ねた。活性画分は約５．２のpIを有し、そして組み合わされ、濃縮され、そしてSDS-PAGEでの電気泳動による分離をするために用いた。
【００２３】
実施例２：酵素アッセイ
特に示していない限り、全ての酵素反応を３７℃で行った。AGPPase活性の測定を、Sowokinosにより記載されたような、段階が２つのG１Pの分光光学的な測定（Sowokinos, 1981, Plant Physiol. 68, pp 924〜929）を用いて行った。反応混合物にはトリスHCl（５０mM、pH７．５）、５mMのMgCl2、特定量のADPG及びタンパク質抽出物を総量５０μlで含んだ。全てのアッセイを標的のADPGに対して行った。２０分のインキュベーション後、その反応を乾浴（dry bath）中、２分に渡り沸とうすることによって停止した。混合物を２０，０００ｇで５分に渡り遠心し、そして上清を回収した。次の段階では、G１Pを分光光度法によって、ヘペス（５０mM、pH７）、EDTA（１mM）、MgCl2（２mM）、KCl（１５mM）、NAD+（０．６mM）、ルコノストク・メスエンテロイド（Leuconostoc mesenteroides）由来の１Ｕのホスホグルコムターゼ及び他のG６Pデヒドロゲナーゼ、並びに段階１に由来する３０μｌの上清を含む３００μｌ混合物中で測定した。２０分のインキュベーション後、NADHの生産をMultiskan EX分光光度計（Labsystems）を用いて３４０nmで観測した。段階１において、ADPG不在下で、任意のタンパク質抽出物によって生産されたNADHの量は無視できた。
【００２４】
AGPPaseの天然の分子量を、ゲルろ過により、以下の参照タンパク質の分子量の対数に対して分配係数（Kav）をプロットすることによって決定した。参照タンパク質は：ウシチログロブリン（６７０kDa）、ウシγグロブリン（１５８kDa）、オボアルブミン（４５kDa）、ミオグロビン（１７kDa）及びビタミンB１２（１．３kDa）である。タンパク質の含量は、Bio-Radにより試薬が調製されたBradfad法及び標準物質としてγ−グロブリンを用いることによって測定した。
【００２５】
以下の表１には、細菌AGPPaseの精製を示している。ユニット（Ｕ）とは、１分あたりに１μmolの産物の生産を触媒する酵素の量として定義されている。
【表１】
2004525642.tif 000002
【００２６】
実施例３：獲得した、酵素活性を有する産物の同定
このようにして得られた、AGPPase活性を有する産物は、以下の特性を満たす。
●細菌のAGPPaseは、等モル量のG１P及びAMPを生産するADPGの加水分解を触媒するピロフォスファターゼである。
●ADPGに加えて、それはADPリボース及びADPマンノースも加水分解する。
●それは、リン酸モノエステル結合を有する分子、例えばG１P, G６P, AMP、３−ホスホグリセリン酸塩などを加水分解しない。更に、それはサイクリックAMP、又は長鎖核酸、例えばDNA及びRNAをも加水分解しない。
●それは、至適に機能するためにマグネシウムが必要である。
●それは、ホスホジエステラーゼによって加水分解されうる物質であるビス−パラ−ニトロフェニル−リン酸塩を加水分解しない。
●リン酸化された分子、例えばAMP, ADP, ATP、３−ホスホグリセリン酸塩、無機ピロリン酸塩、及び他の類似の特性を有する分子（しかし、オルトリン酸塩は除く）によって阻害された。
●モリブデン酸塩によって非常によく阻害された。
●その活性は、β−メルカプトエタノール、EDTA、還元システイン、還元グルタチオン、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩、アスコルビン酸塩、並びに他の還元剤及びキレート剤によって有害な影響を受ける。
●ADPGに関するミカエリス−メンテン定数（Km）は０．１５mMである。
●変性ゲル中で精製されたタンパク質の見掛けの分子量は、約２６kDaである。
●ゲルろ過によって測定された見掛けの分子量は、約４０〜５０kDaであり、これがホモ二量体でありうることを示唆する。
●本発明において、アミノ酸配列の特定決定をすることにより、他の種類の特性が我々にもたらされた。例えば、
●エドマン分解によって得られたアミノ酸配列は、Ｎ末端：配列番号：１である。
【００２７】
実施例４：AGPPaseをコードする遺伝子の獲得
大腸菌のAGPPaseをコードする遺伝子aspPのヌクレオチド配列を知っていることで、２つの特異的プライマーを作ることが可能であり、それらの配列は、５′→３′方向において、配列番号：２及び配列番号：３である。これらのプライマーを用いることで、大腸菌BL２１の染色体DNAからDNA断片を常用のPCR法によって増幅し、それをプラスミドpSKブルースクリプト（Stratagene）中に挿入し、宿主細菌XL１ブルー中で増幅させた。そのDNAのヌクレオチド配列は、配列番号：４であり、そして誘導アミノ酸配列は配列番号：５である。
【００２８】
実施例５：aspPを過剰に発現する大腸菌BL２１（DE３）からのAGPPaseの獲得
pET-ASPPで形質転換されたBL２１（DE３）細菌中でのaspPの誘導を、１mMのIPTGを添加することで行った。６時間以上培養した後、pET-ASPPで形質転換された細菌は、pET-２８a(+)で形質転換されたコントロールの細菌よりも有意により高いAGPPase活性を有したことが観察された（図５を参照のこと）。pET-ASPPで形質転換した細菌を回収して、「His-結合」タンパク質精製キット（Novagen）によって指定されたバッファー中で再懸濁して、そして超音波処理によって溶菌させた。溶出物の遠心後に得られた上清をNovagenの「His結合」タンパク質精製キットのアフィニティーカラムに通した。得られたタンパク質は、変性ゲル中で３０kDaのサイズであり、それは、細菌自身によって生産された２６kDaのタンパク質よりもわずかに大きいサイズであり、その理由はヒスチジングルーが付加されているためである。精製されたタンパク質は、形質転換されていない細菌によって生産されたAGPPaseに関して記載されたのと同一の動力学的特性及び基質特異性を持っていた。一方で、pET-ASPPで形質転換された細菌のグリコーゲンレベルは、事実上検出不可能であり、そしてコントロールの細菌よりも有意に低かった（図６）。
【００２９】
実施例６：AGPPaseを過剰に発現するタバコ、ポテト及びトマトのトランスジェニック植物の生産
アグロバクテリウム・チュメファシエンスCECT５８３７の株を用いることで、aspPを過剰に発現するタバコ（ニコチアナ・タバカム)(Nicotiana tabacum）、ポテト（ソラナム・チュベロサム)(Solanum tuberosum）及びトマト（リコペルシコン・スクレンタム)(Lycopersicon sculentum）の植物を得た。これらの植物に由来するタンパク質抽出物は、大腸菌のAGPPaseに特異的な抗体を用いるウェスタンブロット型の検出によって証明されている（図７）ように、大腸菌のAGPPaseを有する。aspPを過剰に発現する植物は、分析した全ての器官（根、葉、果実、塊茎及び茎）において、形質転換されなかった植物中に存在する内生のAGPPaseよりも、AGPPase活性を２０〜３０倍高いオーダーで有する特徴がある（図８）。aspPを過剰に発現する植物は以下の特徴を有した。
１．デンプン含量が低い。
２．スクロース、グルコース及びフルクトースなど可溶性糖の含量が高く且つADPGの含量は低い。
３．aspPを過剰に発現する植物の外見の形態は、形質転換されなかった植物と比べた場合に変わりはない。
４．aspPを過剰に発現する植物は、高温及び培養培地中の高塩濃度に対して、大いに耐性を示した。
【００３０】
実施例７：ADPGを測定するための酵素キットの開発
下記の要素を含むキットをADPGの測定をするために開発した。
ａ．pET-ASPPで形質転換されたBL２１（DE３）細菌から獲得し、そして「His-結合」キット（Novagen）を用いて精製したAGPPase。
ｂ．NAD
ｃ．ホスホグルコムターゼ（PGM）
ｄ．G６Pデヒドロゲナーゼ（G６PDH）
ｅ．バッファー
【００３１】
試験試料中に存在するADPG量の測定は、下記の共役反応により生産されたNADHの分光学的測定に基づく。
【化１】
2004525642.tif 000003
【００３２】
試験試料中のADPGの量は、下記の組成物によるカクテル（１mlにする）を調製することによって測定されて良い。
●試験試料
●１ＵのAGPPase
●１ＵのPGM
●１ＵのG６PDH
●０．６mMのNAD
●ブァッファー；トリスHCl（50mM、pH７．５）、MgCl2（５mM）
●水（１mlにする）
【００３３】
それを３７℃で２０分に渡りインキュベートし、そして３４０nmでの試料の吸光度の変化を観察した。AGPPaseを含まないカクテルをネガティブコントロールとして用いることができうる。
【００３４】
図９には、様々な分化の段階にあるオオムギの内胚乳におけるADPG含量を測定するためのキットの用途を例示しており、導入部に記載したクロマトグラフィーによって測定したものと（結果が）有意に同じことが証明された。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】プラスミドpET-ASPPを構築する段階である。
【図２】プラスミドpCGN１５４８３５SAPPを構築する段階である。
【図３】プラスミドpCGN１５４８-B３３-ASPPを構築する段階である。
【図４】プラスミドpCGN１５４８-３５S-ChlTP-ASPPを構築する段階である。
【図５】AGPPase活性である。  横軸：インキュベーション時間（時間）  縦軸：mU／培養細胞（ml）
【図６】形質転換された細菌（pET-ASPP）に対するコントロールの細菌（pET-２８a(+)）のグリコーゲンレベルである。  横軸：インキュベーション時間（時間）  縦軸：グリコーゲン（μg）／培養細胞（ml）
【図７】野生型ポテト植物の葉及び塊茎（レーン２及び４）並びにaspPを過剰に発現するポテト植物の葉及び塊茎（レーン３及び５）からのタンパク質抽出物におけるAGPPaseの免疫検出である。レーン１：大腸菌中で過剰に発現された後に精製されたAGPPase；レーン２及び３：葉からの抽出物；レーン４及び５：塊茎からの抽出物である。
【図８】野生型のポテト植物の塊茎（柱１及び２）並びにaspPを過剰に発現する植物の様々なクローン（柱３〜１３）から粗製の抽出物におけるADPGの加水分解活性である。
【図９】様々な分化の段階でのオオムギ内胚乳のADPG含量の測定である。  横軸：開花後の日数  縦軸：ADPG含量
【図１Ａ】
2004525642.tif 000004
【図１Ｂ】
2004525642.tif 000005
【図２Ａ】
2004525642.tif 000006
【図２Ｂ】
2004525642.tif 000007
【図２Ｃ】
2004525642.tif 000008
【図３Ａ】
2004525642.tif 000009
【図３Ｂ】
2004525642.tif 000010
【図３Ｃ】
2004525642.tif 000011
【図３Ｄ】
2004525642.tif 000012
【図４Ａ】
2004525642.tif 000013
【図４Ｂ】
2004525642.tif 000014
【図４Ｃ】
2004525642.tif 000015
【図４Ｄ】
2004525642.tif 000016
【図４Ｅ】
2004525642.tif 000017
【図４Ｆ】
2004525642.tif 000018
【図５】
2004525642.tif 000019
【図６】
2004525642.tif 000020
【図９】
2004525642.tif 000021
【国際公開パンフレット】
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2004525642.tif 000070
2004525642.tif 000071
【手続補正書】
【提出日】平成15年6月20日(2003.6.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ADPGピロフォスファターゼ(AGPPase)活性を有する微生物起源の活性酵素産物の生産をする方法であって、大腸菌(E.coli)の懸濁は、バッファーによるタンパク質画分の抽出、抽出物の音波処理、しかる後に逐次遠心及び沈殿をし、培地のpH及びイオン強度の両方の調整をし、当該タンパク質を５８℃に加熱して氷中で冷却することを伴い、そしてゲルろ過、等電点電気泳動、イオン交換、又は細菌から抽出したタンパク質を精製する他の同等の方法による精製、による精製手順に委ねられることを特徴とする方法。
【請求項２】
以下の段階：
(１)大腸菌BL２１を５mMのグルコースを伴う３０LのＭ９最小培地中で培養し、(２)遠心によって細菌を沈降させ、(３)５０mM、 pH７．５のトリスHCl及び５mMのMgCl２中で再懸濁し、(４)音波処理をし、(５)１００，０００gでの超遠心をし、(６)５８℃の温度で１０分に渡り上清の加熱をし、しかる後に氷中で冷却し、(７) 遠心して上清の前記タンパク質の濃縮を硫酸アンモニウム中での沈殿によって行い、そして５０mM、pH７．５のトリスHCl中で再懸濁し、そして(８)ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー又は等電点電気泳動によって精製する
段階；
を含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
用いた大腸菌の株が、配列番号：２及び配列番号：３でそれぞれ示されている、AGPPaseをコードする遺伝子の５´及び３´領域から順に得られた２つのプライマーによる大腸菌BL２１ゲノムDNA由来のPCRにより増幅された、配列番号：４で示されているDNA断片を発現することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記AGPPaseがCECT５３５７の株から得られ、そして精製されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項1〜４のいずれか１項に記載の方法により得ることができる、AGPPaseと命名された、原核生微物起源の酵素産物であって、それは、ADPGのG1P及びAMPへの等モルでの加水分解を触媒するが、リン酸モノエステル結合を有する分子、更にはモノ−、ジ−もしくはトリ−リン酸ヌクレオチド、例えば、とりわけて、ATP、UTP、ADP、UMPもしくはAMPを加水分解せず、MgCl２を必要とし、ビス−ｐ−ニトロフェニル−リン酸塩の加水分解をすることができず、モリブデン酸塩及びリン酸化された分子により阻害され、その活性は還元剤及びキレート剤によって悪影響を受け、約７．５〜８．５のpHで非常に安定であり、そしてADPGに加えて、ADPリボース及びADPマンノースを認識するが、他のヌクレオチド糖、例えば、とりわけて、UDPグルコース又はGDPマンノースは認識しない、ADPGピロフォスファターゼ(EC．３．６．１．２１)酵素活性を示すことを特徴とする、原核微生物起源の酵素産物。
【請求項６】
とりわけて、G1P、G6P、AMP、３−ホスホグリセリン酸塩、cAMP、更には、長鎖核酸、例えば、DNA又はRNAをも加水分解しないことを特徴とする、請求項５に記載の酵素産物。
【請求項７】
無機ピロリン酸塩、及びリン酸エステル、例えば、とりわけて、AMP、ADP、ATP、又は３−ホスホグリセリン酸塩によって阻害されることを特徴とする、請求項５及び６のいずれか１項に記載の酵素産物。
【請求項８】
その活性が、とりわけて、β−メルカプトエタノール、EDTA、還元システイン又はアスコルビン酸塩によって悪影響を受けることを特徴とする、請求項５〜７のいずれか１項に記載の酵素産物。
【請求項９】
とりわけて、UDPグルコース、GDPグルコース、アデノシン５´−ホスホ硫酸塩、又はビス−ｐ−ニトロフェニル−リン酸塩を基質として認識しないことを特徴とする、請求項５〜８のいずれか１項に記載の酵素産物。
【請求項１０】
ゲルろ過によって決定された約４０〜５０kDaの見掛けの分子量を有し、並びに０．１５mMのKmをADPG関して示すことを特徴とする、請求項５〜９のいずれか１項に記載の酵素産物。
【請求項１１】
配列番号：１に示されるポリペプチド断片を配列中に１つ以上含むことを特徴とする、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の酵素産物。
【請求項１２】
配列番号：５又は遺伝コードの縮重によりもたらされる相同配列からなることを特徴とする、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の酵素産物。
【請求項１３】
ADPGの測定において適用する為のアッセイ装置及び／又は組成物の製造における請求項５〜１２のいずれか１項に記載の酵素産物の使用。
【請求項１４】
測定が、AGPPaseによって触媒された反応中に放出されたG１Pに基づいて行われるように、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の酵素産物を含むことを特徴とする、ADPGの測定をする為のアッセイ装置。
【請求項１５】
請求項１４に記載のアッセイ装置であって、測定が放出されたG１Pに基づいていることを特徴とし、ここで当該G１Pは酵素ホスホグルコムターゼに委ねられてG６Pを生産し、当該G６Pは次には、酵素G６Pデヒドロゲナーゼの作用によって共役態様においてNAD＋と反応し、常用の方法、即ち、分光光学的方法、蛍光測定又は他の性質を利用した方法によって測定可能な６−ホスホグルコネート及びNADHをもたらす、アッセイ装置。
【請求項１６】
DNA配列の使用であって：
a)  配列番号：１又は配列番号：５で表されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列；
b)  配列番号：４で表されたポリヌクレオチド配列を含む配列；
c)  a)又はb)で規定された配列とハイブリダイズし且つAGPPase活性を有する酵素産物をコードする相補的配列；
d)  遺伝コードの縮重の為に、c)において規定されたものとは異なる配列；
から選択されたDNA配列の、酵素AGPPaseを過剰に発現するトランスジェニック植物の生産における使用。
【請求項１７】
AGPPaseを過剰に発現するトランスジェニック植物を生産する方法であって：
a)  配列番号：１又は配列番号：５で表されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列；
b)  配列番号：４で表されたポリヌクレオチド配列を含む配列；
c)  a)又はb)に規定された配列とハイブリダイズし且つAGPPase活性を有する酵素産物をコードする相補的配列；
d)  遺伝コードの縮重の為に、c)において規定されたものとは異なる配列；
から選択されたDNA配列をいくつか伴うプラスミドを含む形質転換ベクターを使用することを特徴とする方法。
【請求項１８】
前記形質転換ベクターがアグロバクテリウム・チュメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)であることを特徴とする、請求項１７に記載のトランスジェニック植物を生産する方法。
【請求項１９】
前記形質転換ベクターが、アグロバクテリウム・チュメファシエンスの株CECT５９０１を含んで成ることを特徴とする、請求項１８に記載のトランスジェニック植物を生産する方法。
【請求項２０】
請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法により得ることができ、酵素AGPPaseを過剰に発現することを特徴とする、デンプン含量が減少し且つ高塩濃度及び高温に対する耐性を有する、トランスジェニック植物。
【請求項２１】
DNA配列の使用であって：
a)  配列番号：１又は配列番号：５で表されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列；
b)  配列番号：４で表されたポリヌクレオチド配列を含む配列；
c)  a)又はb)で規定された配列とハイブリダイズし且つAGPPase活性を有する酵素産物をコードする相補的配列；
d)  遺伝コードの縮重の為に、c)において規定されたものとは異なる配列；
から選択されたDNA配列の、AGPPaseを過剰に発現する形質転換された細菌の生産における使用。
【請求項２２】
AGPPaseを過剰に発現する形質転換された細菌を得る方法であって、その方法は形質転換ベクター、詳細には：
a)  配列番号：１又は配列番号：５で表されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする配列；
b)  配列番号：４で表されたポリヌクレオチド配列を含む配列；
c)  a)又はb)で規定された配列とハイブリダイズし且つAGPPase活性を有する酵素産物をコードする相補的配列；
d)  遺伝コードの縮重の為に、c)において規定されたものとは異なる配列；
から選択されたDNA配列をいくつか含むプラスミドを用いることを特徴とする方法。
【請求項２３】
酵素AGPPaseを過剰に発現することを特徴とする、請求項２２に記載の方法により得ることができるグリコーゲン含量が減少した形質転換された細菌。
【請求項２４】
動物の飼養、特に魚類の飼養における、請求項２３に記載の形質転換された細菌の使用。
【国際調査報告】
2004525642.tif 000072
2004525642.tif 000073
2004525642.tif 000074
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