(57)【要約】４つのアルギニン反復部分のうちの１つ以上が欠失しているＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を含む蛋白質において、ＨＢｃＡｇのＣ末端システインを含む蛋白質が提供される。欠失された領域はＨＢｃＡｇ以外の蛋白質由来のエピトープで置換されていてもよく、その場合、ＨＢｃＡｇはそのエピトープを免疫系に提示するためのキャリアーとして機能する。このキメラ蛋白質は、例えばＢ型肝炎ウイルスに対する宿主の予防及び治療用ワクチン接種に役立つ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃＡｇ）を含む蛋白質において、その４つのアルギニン反復部分のうちの１つ以上が存在しておらず、Ｃ末端システイン残基が存在している、上記蛋白質。
【請求項２】
ＨＢｃＡｇ以外の蛋白質の第１のエピトープが不在のアルギニン反復部分の代わりに存在している、請求項１記載の蛋白質。
【請求項３】
上記第１のアルギニン反復部分が存在しており、第２から第４までのアルギニン反復部分が存在していない、請求項１又は２記載の蛋白質。
【請求項４】
ＨＢｃＡｇの残基１４５と残基１８２の間の配列が存在していない、請求項１−３のいずれか１項記載の蛋白質。
【請求項５】
ＨＢｃＡｇの残基１５０と残基１７７の間の配列が存在していない、請求項１−４のいずれか１項記載の蛋白質。
【請求項６】
ＨＢｃＡｇ以外の蛋白質由来の第２のエピトープを含んでおり、上記第２のエピトープがｅｌループ中にある、請求項１−５のいずれか１項記載の蛋白質。
【請求項７】
上記第２のエピトープがＢ細胞エピトープである、請求項６記載の蛋白質。
【請求項８】
上記第１のエピトープがＴ細胞エピトープである、請求項２−７のいずれか１項記載の蛋白質。
【請求項９】
上記第１のエピトープがＴヘルパー細胞エピトープであり、上記第２のエピトープがＢ細胞エピトープである、請求項８記載の蛋白質。
【請求項１０】
前記第１及び第２のエピトープを含んでおり、それらエピトープが同じである、請求項６記載の蛋白質。
【請求項１１】
上記第１及び／又は第２のエピトープがＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）由来である、請求項２−１０のいずれか１項記載の蛋白質。
【請求項１２】
上記第１及び／又は第２のエピトープがＨＢＶのプレ−Ｓ１、プレ−Ｓ２、又はＳ領域由来である、請求項１１記載の蛋白質。
【請求項１３】
Ｎ末端からＣ末端の方向で結合された以下の要素：
（ｉ） 粒子の形成を媒介するＨＢｃＡｇのＮ末端部分、及び
（ｉｉ）　末端システインを含むＨＢｃＡｇのＣ末端部分；
を含み、１つ以上のアルギニン反復部分を含んでいる前記Ｎ末端部分と前記Ｃ末端部分の間のＨＢｃＡｇ配列の少なくとも一部が存在しない請求項１記載の蛋白質。
【請求項１４】
Ｎ末端からＣ末端の方向で結合された以下の要素：
（ｉ） 粒子の形成を媒介するＨＢｃＡｇのＮ末端部分；
（ｉｉ）　ＨＢｃＡｇ以外の蛋白質由来のエピトープ；及び
（ｉｉｉ） Ｃ末端システインを含むＨＢｃＡｇのＣ末端部分；
を含み、１つ以上のアルギニン反復部分を含んでいる前記Ｎ末端部分と前記Ｃ末端部分の間のＨＢｃＡｇ配列の少なくとも一部が存在せず、前記エピトープで置換されていることを特徴とする請求項１記載の蛋白質。
【請求項１５】
Ｎ末端からＣ末端の方向で結合された以下の要素：
（ｉ） 残基１−６７を含むＨＢｃＡｇ配列のＮ末端部分；
（ｉｉ）　ＨＢｃＡｇ以外の蛋白質由来のエピトープ；
（ｉｉｉ） 残基９１−１４４を含むＨＢｃＡｇ配列の第２の部分；及び
（ｉｖ）　Ｃ末端システインを含むＨＢｃＡｇ配列の第３の部分
を含み、１つ以上のアルギニン反復部分を含んでいる残基１４５とＣ末端システインとの間のＨＢｃＡｇの配列の少なくとも一部が存在しない、請求項１記載の蛋白質。
【請求項１６】
Ｎ末端からＣ末端の方向で結合された以下の要素：
（ｉ） 残基１−６７を含むＨＢｃＡｇ配列のＮ末端部分；
（ｉｉ）　ＨＢｃＡｇ以外の蛋白質由来のエピトープ；
（ｉｉｉ） 残基９１−１４４を含むＨＢｃＡｇ配列の第２の部分；
（ｉｖ）　ＨＢｃＡｇ以外の蛋白質由来のさらなるエピトープ；
（ｖ） Ｃ末端システインを含むＨＢｃＡｇ配列の第３の部分
を含み、１つ以上のアルギニン反復部分を含む残基１４５と上記Ｃ末端システインとの間のＨＢｃＡｇの配列の少なくとも一部が存在しない、請求項１記載の蛋白質。
【請求項１７】
請求項１−１６のいずれか１項記載の１つの蛋白質の複数のコピーを含んでいる粒子。
【請求項１８】
請求項１−１６のいずれか１項記載の蛋白質をコードする核酸分子。
【請求項１９】
発現ベクターである請求項１８記載の核酸分子。
【請求項２０】
請求項１８又は１９記載の核酸分子で形質転換あるいはトランスフェクトされた宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１−１６のいずれか１項記載の蛋白質を製造する方法であって、上記蛋白質が発現される条件下で上記蛋白質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養すること、及び上記蛋白質を回収することを含む、上記方法。
【請求項２２】
請求項１記載の蛋白質をコードする核酸分子であって、ＨＢｃＡｇの４つのアルギニン反復部分の１つ以上をコードする配列が欠失されており、上記核酸分子に固有の制限酵素部位で置換されている、上記核酸分子。
【請求項２３】
請求項１−１６のいずれか１項記載の蛋白質、請求項１７記載の粒子、又は請求項１８又は１９記載の核酸分子、及び薬学的に許容される担体又は希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項２４】
ヒト又は動物の体を予防的または治療的目的でワクチン接種する方法で使用するための、請求項１−１６のいずれか１項記載の蛋白質、請求項１７記載の粒子、又は請求項１８若しくは１９記載の核酸分子。
【請求項２５】
ヒト又は動物の体を予防的または治療的目的でワクチン接種する方法で使用するための、請求項２４記載の蛋白質、粒子、あるいは核酸分子。
【請求項２６】
ヒト又は動物の体をＨＶＢに対して予防的又は治療的目的でワクチン接種するための薬剤製造のための請求項１−１６のいずれか１項記載の蛋白質、請求項１７記載の粒子、又は請求項１８若しくは１９記載の核酸分子の使用。
【請求項２７】
対象に対するワクチン接種又は治療方法において、上記対象に対して請求項１−１６のいずれか１項記載の蛋白質、請求項１７記載の粒子、又は請求項１８若しくは１９記載の核酸を投与することを含む上記方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明はＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のコア抗原の修飾された形態及び上記修飾された抗原を含む予防用及び治療用ワクチンに関するものである。
【０００２】
（発明の背景）
ＨＢＶは先進国と開発途上国の両方で依然として主要な健康管理上の問題となっている。このウイルスに感染すると、症例によっては肝細胞癌や死につながることもある急性及び慢性疾患になる場合もある。このウイルスは二重の殻を有しており、そのＤＮＡはコア抗原（ＨＢｃＡｇ）と呼ばれる蛋白質構造内に護られている。このコア（核）は表面又はＳ抗原（ＨＢｓＡｇ）として知られているエンベロープ蛋白質によって取り囲まれている。
【０００３】
ＨＢｃＡｇは免疫系への特定のペプチド類の送達ビヒクルとして用いることができる特殊な抗原である。この抗原はＨＢＶの表面抗原からのエピトープ、Ａ型肝炎からのエンベロープ蛋白質、そしてＣ型肝炎ウイルスからの抗原を含む種々のウイルス性及びバクテリア性病原由来のＴヘルパー、Ｂ及び細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）エピトープを提示するのに用いられている。詳しくは、Ｕｌｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ （１９９８） Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５０ １４１〜１８２参照。
【０００４】
ＨＢｃＡｇは、粒子へ自己凝集するという、その蛋白質の分子構造のためエピトープを提示するための優れたビヒクルである。各粒子は単量体ポリペプチドの１８０か２４０コピーから発生される。このポリペプチドはＨＢＶサブタイプによるが１８３個か１８５個のアミノ酸（ａａ）を有している。この単量体は宿主細胞内で適切な濃度に達すると、直径が約２７ｎｍの粒子を形成する。構造的研究により、残基６８−９０の領域内のアミノ酸がｅｌループとして知られているその粒子の表面上のスパイク構造を形成することが示されている。ジスルフィド結合で結合されている２つの単量体は二量体スパイクを形成し、最も露出されたアミノ酸は位置８０（ｅｌループの中心）に存在している。
【０００５】
ＥＰ−Ａ−４２１６３５（Ｔｈｅ Ｗｅｌｃｏｍｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ）は蛋白質が粒子を形成する能力を変えずに、ｅｌループ内に外来エピトープを挿入できるようにするためのＨＢＶコア遺伝子の修飾について述べている。このサイトへの挿入は、その蛋白質の二量体でつくられる各スパイクの頂上における、挿入されたエピトープの最大の露出を可能にする。粒子１個あたり約１８０（あるいは２４０）個の各モノマーのコピーが存在しているので、各粒子は関心のあるエピトープの１８０（または２４０）個のコピーを示すことができる。
【０００６】
従って、ＨＢｃＡｇは感染性疾患に対する予防用及び治療用ワクチンとして用いることができるハイブリッド粒子を発生するために用いることができる。しかしながら、初期の研究ではコア蛋白質の核酸に結合する本来的な性質の故に核酸の不純物が高いという特徴が認められている。核酸の結合はその蛋白質のＣ末端に見出される４つのアルギニン反復部分に関係していることが知られている。遺伝子ツールを用いてこれらの反復部分を取り除くことは実行可能であり、核酸をカプシドに含まない粒子が生成できることが示されている。しかしながら、この領域を除去すると、粒子構造の本来的な安定性が低下するようである。
【０００７】
（発明の概要）
粒子の安定性を保持するために、核酸不純物の問題を克服しつつ、発明者らは別の新しい方式に想到した。この方式はＨＢｃＡｇの１つ以上のアルギニン反復部分が取り除かれているが、Ｃ末端システインが保持されているクローンを発生させることを含んでいる。アルギニン反復部分の除去は核酸の結合を低下させるが、Ｃ末端システインの保持は、天然の構造では、安定した粒子の形成にとって重要なジスルフィド結合の形成を可能にしている。欠失された反復部分はバクテリア性またはウイルス性病原体、寄生虫、アレルゲン、あるいは癌関連抗原からのＴヘルパー、ＢあるいはＣＴＬエピトープをコードする配列で置換することができる。これは欠失された領域の代わりに適切なクローニング・サイトを挿入することで可能になる。
【０００８】
従って、本発明は上記４つのアルギニン反復部分の１つ以上が存在しておらず、Ｃ末端システイン残基が存在しているＨＢｃＡｇを含む蛋白質を提供する。ＨＢｃＡｇ以外の蛋白質からのエピトープが不在のアルギニン反復部分の代わりに存在していてもよい。その蛋白質は例えばＨＢＶに対する予防目的あるいは治療目的のワクチン接種用の医薬品組成物に組み込むことができる。
【０００９】
本発明の蛋白質はＨＢｃＡｇ以外の蛋白質からの第２のエピトープを含んでいてもよく、そしてその第２のエピトープはＨＢｃＡｇのｅｌループ中に存在していてもよい。Ｔヘルパー・エピトープをＣ末端に、そしてＢ細胞エピトープをｅｌループ中に配置することで、構造内Ｔ細胞の助けをかりてＢ細胞エピトープへの応答性を増大させることができる。さらに、この方式は同じ配列をｅｌ及びＣ末端領域の両方にクローニングすることで、各粒子上の特定のエピトープの数を二倍にするために用いることもできる。
【００１０】
（発明の詳細な説明）
ＨＢｃＡｇ配列の修飾
上に述べたように、ＨＢｃＡｇはＨＢＶのサブタイプによって１８３個あるいは１８５個のアミノ酸で構成される蛋白質である。１８５個形態の蛋白質での追加的な２個のアミノ酸は第１と第２のアルギニン反復部分の間に配置されている。蛋白質の１８５個アミノ酸形態の配列をプレ配列と共に図１に示す。図１で、成熟したＨＢｃＡｇ配列は位置２５のＭｅｔ残基から最端のＣ末端のＣｙｓ残基までの範囲にわたっており、残基１−２４の範囲の配列は先行配列である。４つのアルギニン反復部分は以下の位置に配置されている。
2004500868.tif 000002
【００１１】
本発明の蛋白質においては１つ以上のアルギニン反復部分が欠失している。従って、それら反復部分の１つ、２つ、３つ、あるいは４つ全部を欠失させることも、あるいは第１の反復部分、第２の反復部分、第３の反復部分及び／又は第４の反復部分を欠失させることもできる。４つの反復部分をいずれの組み合わせで欠失させることも可能である。第１の反復部分は主にＲＮＡ結合を担っており、第２、第３、及び第４の反復部分は主にＤＮＡ結合を担っており、好ましい実施の形態においては、第１の反復部分は保持され、第２−第４までの反復部分は特にＤＮＡ結合を減少させるために欠失される。
【００１２】
ＨＢｃＡｇの残基１４５と残基１８２との間の配列は通常は本発明の蛋白質には存在しておらず、好ましくは残基１５０と残基１７７のあいだの配列が存在していない。欠失される配列は残基１４５から残基１８２（あるいは残基１５０から残基１７７）の範囲の配列全体を含んでいてもよいし、あるいはそれらの残基間の配列の一部だけを含んでいてもよい。同様に、欠失される配列はそれら残基のいずれの側に続いているものでもよい。本明細書中で用いられる場合、『残基ｘとｙとの間の配列が存在しない』等の表現は、不在の配列が残基ｘとｙを含んでいてもよいことを意味している。残基１４５から上流の配列を除去すると蛋白質の粒子形成能力に影響が生じる場合があり、従って一般的には推奨できない。１８５ａａの形態のＨＢｃＡｇにおいては、欠失される配列は残基１８４で終了してもよく、１８３ａａ形態では、残基１８２で終端してもよい。
【００１３】
本発明の蛋白質におけるＣ末端システイン残基は通常ＨＢｃＡｇのＣ末端由来の天然の残基であり、通常はＨＢｃＡｇ内の上記残基のすぐ上流の配列がその直前に配置している。この先行するＨＢｃＡｇ配列は１−７個の残基、つまり、１個、２個、３個、４個、５個、６個又は７個の残基を含んでいてよい。従って、本発明の蛋白質のＣ末端は、Ｇｌｎ Ｃｙｓ、Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ、Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ、Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｇｌｎ Ｃｙｓ、Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ、Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓ あるいはＳｅｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｃｙｓの配列を含んでいてよい。しかしながら、Ｃｙｓ残基はＨＢｃＡｇ由来のものでなくてもよく、この場合、本発明による蛋白質はそのＨＢｃＡｇ配列の先頭を切り取って、切り取られた配列をＣｙｓ残基及び任意によりＨＢｃＡｇ以外の蛋白質由来のエピトープを含む他の配列で置換することによって構成することができる。Ｃｙｓ残基は通常、本発明の蛋白質の最端のＣ末端に配置されているが、最端Ｃ末端からの多数のアミノ酸残基であってもよい。例えば、それはＣ末端からの１−２０個の残基、１−１０個の残基、あるいは１−５個の残基で構成あってもよい。いずれの場合も、Ｃｙｓ残基はジスルフィド結合を形成できなければならない。
【００１４】
本発明の蛋白質は通常Ｎ末端からＣ末端方向に結合された以下の要素を含む：
（ｉ） 粒子の形成を媒介するＨＢｃＡｇのＮ末端部分、例えば残基１−１４４（あるいは１−１４６又は１−１５４）、及び
（ｉｉ）　Ｃ末端システインを含むＨＢｃＡｇのＣ末端部分；
ここで、１つ以上のアルギニン反復部分を含んでいる前記Ｎ末端部分とＣ末端部分の間からのＨＢｃＡｇ配列の少なくとも一部は存在しない。
【００１５】
上記蛋白質が不在のアルギニン反復部分の代わりにＨＢｃＡｇ以外の蛋白質由来のエピトープも含んでいる場合、その蛋白質は通常ＮからＣ末端方向に結合された以下の要素を含む：
（ｉ） 粒子の形成を媒介するＨＢｃＡｇのＮ末端部分、例えば残基１−１４４（あるいは１−１４６又は１−１５４）；
（ｉｉ）　ＨＢｃＡｇ以外の蛋白質由来のエピトープ；及び
（ｉｉｉ） Ｃ末端システインを含むＨＢｃＡｇのＣ末端部分；
ここで、１つ以上のアルギニン反復部分を含んでいる前記Ｎ末端部分と前記Ｃ末端部分の間のＨＢｃＡｇ配列の少なくとも一部が存在せず、前記エピトープで置換されている。
【００１６】
上記蛋白質がｅｌループ中にＨＢｃＡｇ以外の蛋白質由来のエピトープを含んでいる場合、上記蛋白質は通常ＮからＣ末端方向に結合された以下の要素を含む：
（ｉ） 例えば、残基１−６７（あるいは１−７４又は１−７９）を含むＨＢｃＡｇのＮ末端部分；
（ｉｉ）　ＨＢｃＡｇ以外の蛋白質由来のエピトープ；
（ｉｉｉ） 例えば、残基９１−１４４（あるいは９１−１４６、９１−１５４、８５−１４４、８６−１４６、８６−１５４、８０−１４６、あるいは８０−１５４）を含むＨＢｃＡｇ配列の第２の部分；及び
（ｉｖ）　Ｃ末端システインを含むＨＢｃＡｇ配列の第３の部分；
ここで、１つ以上のアルギニン反復部分を含んでいる残基１４５（あるいは１４７又は１５５）とＣ末端システインとの間のＨＢｃＡｇの配列の少なくとも一部が存在しない。
【００１７】
本発明の蛋白質が、不在のアルギニン反復部分の代わりにＨＢｃＡｇ以外の蛋白質由来の第１のエピトープとＨＢｃＡｇ以外の蛋白質由来の第２のエピトープとの両方をｅｌループに含んでいる場合、その蛋白質は通常ＮからＣ末端方向に結合された以下の要素を含む：
（ｉ） 例えば残基１−６７（あるいは１−７４又は１−７８）を含むＨＢｃＡｇ配列のＮ末端部分；
（ｉｉ）　ＨＢｃＡｇ以外の蛋白質由来のエピトープ；
（ｉｉｉ） 例えば、残基９１−１４４（あるいは９１−１４６、９１−１５４、８６−１４４、８６−１４６、８６−１５４、８０−１４４、８０−１４６、あるいは８０−１５４）を含むＨＢｃＡｇ配列の第２の部分；
（ｉｖ）　ＨＢｃＡｇ以外の蛋白質由来のさらなるエピトープ；及び
（ｖ） Ｃ末端システインを含むＨＢｃＡｇ配列の第３の部分
ここで、１つ以上のアルギニン反復部分を含む残基１４５（あるいは１４７又は１５５）と上記Ｃ末端システインとの間のＨＢｃＡｇの少なくとも一部が存在しない。
【００１８】
上の説明から明らかなように、発明者らは特異的に、１つ以上のアルギニン反復部分の欠失、欠失された反復部分に代わる異種エピトープの挿入、及びｅｌループへの第２の異種エピトープの挿入などを包含する多数の方法でのＨＢｃＡｇの装飾を想定している。しかしながら、ＨＢｃＡｇ配列のさらに別の修飾も可能である。そうしたさらに別の修飾は、置換、挿入、欠失、あるいは延長によって行うことができる。挿入、欠失あるいは延長のサイズは、例えば、ＨＢｃＡｇ配列において１−２００ａａ、１−１００ａａ、１−５０ａａ、１−２０ａａ、１−６ａａである。置換の場合は、ＨＢｃＡｇ配列の全長にわたって、例えば、１、２、５、１０、２０又は５０個のアミノ酸など多数のアミノ酸を含むことができる。修飾された蛋白質は通常粒子を形成する能力を保持している。置換は通常は保存的に行われ、例えば、以下の表に従って行うことができ、この場合、二番目の欄中の同一ブロック中のアミノ酸を互いに置換することができ、そして好ましくは第３の欄の同じ行の同一ブロック中のアミノ酸を互いに置換することができる。
2004500868.tif 000003
【００１９】
本発明の蛋白質中のＨＢｃＡｇ配列の各部分は、好ましくは配列番号：２に示されている配列を有する蛋白質など、天然のＨＢｃＡｇ蛋白質の対応する配列に対して少なくとも７０％の配列同一性を有している。より好ましくは、上記同一性は少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、あるいは少なくとも９９％である。蛋白質配列（及び核酸配列）同一性を測定するための方法は技術分野で周知である。例えば、ＵＷＧＣＧパッケージはＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供している（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ （１９８４）　Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２， ｐ． ３８７−３９５）。同様に、ＰＩＬＥＵＰ 及びＢＬＡＳＴアルゴリズムは配列を（例えば、Ａｌｓｃｈｕｌ Ｓ． Ｆ． （１９８３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｅｖｏｌ． ３６：２９０−３００及びＡｌｔｓｃｈｕｌ， Ｓ． Ｆ． ｅｔ ａｌ （１９９０） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５：４０３−１０に述べられているように）並べるために用いることができる。
【００２０】
本発明の蛋白質は天然のＨＢｃＡｇによって形成される粒子と非常によく似た粒子へと自己凝集することができる。これらの粒子は直径が２０−４０ｎｍの範囲であるが、好ましくは直径は（天然のＨＢｃＡｇ粒子のサイズである）約２７ｎｍである。それらの粒子は、検出できないか、あるいは天然のＨＢｃＡｇの粒子と比較してずっと少ない量の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）しか含まない。それらの粒子は１６０−２６０個の本発明の蛋白質の単量体を含んでいてもよいが、好ましくは（天然のＨＢｃＡｇ粒子中の単量体の数である）約１８０−約２４０個の単量体を含んでいる。
【００２１】
本発明による蛋白質の粒子性状の判定はサイズ排除クロマトグラフィ及び／又は電気顕微鏡で行うことができる。それら粒子のＤＮＡ含量の判定はアガロースゲル電気泳動あるいは分光分析によって行うことができる。Ｂｉｒｎｂａｕｍ及びＮａｓａｌ（１９９０， Ｊ． Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６４ ３３１９−３３３０）から適用される方法を用いることができる。上記蛋白質はプロテナーゼＫ及び市販のＤＮＡ回収キット（例えばＱｉａｇｅｎ，
ＱＩＡｑｕｉｃｋＴＭ ＰＣＲ 精製キット）を用いて抽出された核酸を用いて消化することができる。精製されたＤＮＡは、電気泳動の後１．５％アガロースゲル中で高感度ＤＮＡ染色（例えば、Ｎｏｖｅｘ， ＳＹＢＥＲ Ｇｒｅｅｎ ＩＴＭ）を用いることにより可視化することがができる。抽出に続いて得られるＤＮＡ生成物は、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｕｌｔｒａｓｃｐｅｃ ２０００ＴＭを用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓによって１９８９年に出版されたＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ参照）に従って光学密度（ＯＤ）２６０ｎｍ：２８０ｎｍで定量することができる。
【００２２】
（エピトープ）
一般的なルールとして、本発明の蛋白質に挿入されるエピトープはＨＢｃＡｇのフォールディングあるいは粒子への自己凝集を阻害してはならない。さらに、免疫原性を向上させるために、Ｂ細胞エピトープはその粒子の表面に表示されるべきである。Ｔ細胞エピトープは最良の提示のために粒子の表面上に表示されねばならないという必要はない。
【００２３】
エピトープの挿入のためには３つの好ましい領域、つまり、欠失されたアルギニン反復部分の代わりのＣ末端、ｅｌループ、そしてＮ末端がある。これら３つの領域はすべて外来配列の挿入に十分に耐えることができる。１つのエピトープがＨＢｃＡｇのｅｌループ中に置かれる場合、それはアミノ酸残基６８−９０、６９−９０、７１−９０、７５−８５、あるいは７８−８３の配列に挿入され得る。最も好ましいのはエピトープを残基７９と８０、あるいは８０と８１の間に挿入することである。ｅｌループ由来のＨＢｃＡｇ残基は本発明の蛋白質では欠失していてもよく、従って挿入されたエピトープがそのループの配列の一部、あるいは全部と置換していてもよい。
【００２４】
本発明の蛋白質中に存在している異種エピトープはＢ細胞エピトープ、あるいはＴ細胞エピトープであってもよい。そのエピトープがＴ細胞エピトープである場合、それはＴヘルパー（Ｔｈ）細胞エピトープ（Ｔｈ１あるいはＴｈ２エピトープ）、あるいは細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）エピトープであってよい。
【００２５】
本発明の蛋白質は一より多くの異種エピトープ、例えば最大２、３、５又は８つの異種エピトープを含んでいてよく、その場合、各エピトープがＨＢｃＡｇ内の同じ部位に存在していても、別の部位に存在していても構わない。本発明の好ましい実施の形態においては、それらのエピトープの１つはＴヘルパー細胞エピトープで、もうひとつはＢ細胞又はＣＴＬエピトープである。Ｔヘルパー細胞エピトープが存在していると、Ｂ細胞又はＣＴＬエピトープに対する免疫応答が強まる。本発明の蛋白質に２つ以上の異種エピトープが存在している場合、それらは同じ生物、あるいは同じ蛋白質由来のものであってもよい。実際、それらのエピトープが同じものであってもよく、これは粒子上に提示されているエピトープの数を倍化したり、さらに数倍化することを可能にする。
【００２６】
本発明の蛋白質に挿入されたエピトープを含む配列のサイズは幅広い範囲で変わるが、一般的には６−１２０ａａ、例えば６−８０ａａ、あるいは６−４０ａａである。そのエピトープは立体構造的でも、直線的なものであってもよい。
【００２７】
エピトープの選択はワクチン接種の対象としたい疾患に依存する。通常、そのエピトープはウイルス、バクテリア、又は原生動物などの病原体由来であるが、癌関連抗原又はアレルゲン由来のものであってもよい。そのエピトープを挿入することができる病原体の例としては、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ＨＢＶ、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、インフルエンザ・ウイルス、口蹄病ウイルス、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス・タイプ１（ＨＩＶ１）、ヒト免疫不全ウイルス・タイプ２（ＨＩＶ２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト・ライノウイルス、デング・ウイルス、黄熱病ウイルス、ヒトパピローマウイルス、プラスモディウム・ファルシパルム（マラリアの病原）、及びマイコバクテリア、ボルデテラ、サルモネラ、エシェリキア、ビブリオ、ヘモフィルス、ナイセリア、エルシニア、そしてブルセラなどのバクテリアなどである。特に、そのバクテリアはマイコバクテリウム・ツベルクローシス−結核の原因；ボルデテラ・ペルツッシス又はボルデテラ・パラペルツッシス−百日咳の原因；サルモネラ・ティフィムリウム−いくつかの動物種でのサルモネラ症の原因；サルモネラ・ティフィ−ヒト腸チフスの原因；サルモネラ・エンテリティディス−ヒトにおける食品中毒の原因；サルモネラ・コレレスイス−ブタにおけるサルモネラ症の原因；サルモネラ・ダブリン−ウシ、特に生まれたばかりの仔ウシの全身性及び下痢性疾患の両方の原因；大腸菌−ヒトの食品中毒の病原体；ヘモフィリス・インフルエンゼ−髄膜炎の原因；ナイセリア・ゴノレエ−淋病の原因；エルシニア・エンテロコリチカ−ヒトにおける胃腸炎から致死性の敗血症性病に至る幅広い病気の原因；ブルセラ・アボルタス−ウシの流産及び不妊症とヒトにおける波状熱として知られる症状の原因；あるいはクロストリジウム・ディフィシレ−偽膜性大腸炎の原因である。
【００２８】
抗原であって、そのエピトープを挿入してよい抗原の例はＨＢＶのプレＳ１、プレＳ２、及びＳ抗原；ＨＡＶ表面抗原；ＨＣＶ表面抗原；コア蛋白質及びＮＳ３蛋白質；ＨＩＶ抗原 ｇｐ１２０、 ｇｐ１６０、ｇａｇ、 ｐｏｌ、 Ｎｅｆ、 Ｔａｔ及びＲｅｆ； サーカムプソロゾイト（ｃｉｒｃｕｍｐｓｏｒｏｚｏｉｔｅ）蛋白質等のマラリア抗原；インフルエンザ抗原ＨＡ、ＮＰ及びＮＡ；ヘルペス・ウイルス抗原ＥＢＶ ｇｐ３４０、ＥＢＶｇｐ８５、ＨＳＶ ｇＢ、ＨＳＶ ｇＤ、ＨＳＶ ｇＨ及びＨＳＶ初期蛋白質；ヒト乳頭腫抗原 Ｅ４、Ｅ６及びＥ７； 癌抗原癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、Ｐ５３、ｒａｓ及びｍｙｃ；百日咳菌からのペルタクチン抗原；及びウマ・チリダニ・アルレゲンである。
【００２９】
本発明はキャリアー蛋白質ＨＢｃＡｇがＨＢＶ由来であるのでＨＢＶに対する予防あるいは治療目的のワクチン接種に特に適しており、ＨＢＶのプレＳ１、プレＳ２、及びＳ領域からのエピトープが特に好ましい。プレＳ１、プレＳ２、あるいはＳ挿入物は通常は長さが少なくとも６個のアミノ酸、例えば、６−１２０ａａ、８−８０ａａ、あるいは１０−４０ａａなどである。この挿入物は、例えば、プレＳ１位置　１−９、１０−１９、２０−２９、３０−３９、４０−４９，５０−５９、６０−６９、７０−７９、８０−８９、９０−９９、１００−１０９又は１１０−１１９の残基、あるいはプレＳ２位置　１２０−１２９、１３０−１３９、１４０−１４９、１５０−１５９、１６０−１６９、あるいは１７０−１７４の残基を含んでいてよい。特に好ましいフラグメントはプレＳ１残基２０−４７及びプレＳ２残基１３９−１７４に対応するものである。プレＳ１残基２１−２８はヒトＴ細胞エピトープに対応する。（Ｓ配列の最初の残基を残基１と数えた場合）Ｓ残基１１０−１４７及び１１０−１５７に対応するフラグメントも好ましい。
【００３０】
（本発明の蛋白質の作成）
本発明の蛋白質は一般的には遺伝子組み換えＤＮＡ技術によって行うことができる。本発明は発現ベクターなど本発明の蛋白質をコードする核酸分子（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）を含んでいる。
【００３１】
上記核酸分子は１つ以上のアルギニン反復部分が欠失されており、そしてＸｂａＩサイトなど、核酸分子に固有の制限酵素部位で置換されている蛋白質をコードすることができる。この核酸分子はｅｌループをコードする配列及び／又はＮ末端内に固有の制限酵素サイトを含んでいる場合もある。この固有の制限酵素サイトはエピトープをコードする配列を例えば欠失されたアルギニン反復部分の代わりに核酸分子中に、あるいはｅｌループ内に挿入できるようにする。
【００３２】
本発明の蛋白質はその蛋白質が発現される条件の下でその蛋白質をコードする核酸分子を含む宿主細胞を培養し、その蛋白質を回収することによってつくることができる。適切な宿主細胞としては大腸菌、イースト菌などのバクテリア、哺乳動物細胞株、そして例えば昆虫Ｓｆ９細胞などのその他の真核細胞株などである。
【００３３】
本発明による核酸分子を構成するベクターは、例えば、プラスミドあるいはウイルス・ベクターなどである。それらは複製起点、その蛋白質をコードする配列の発現のためのプロモータ、エンハンサなどそのプロモータに対するレギュレーター、転写停止信号、翻訳開始信号及び／又は翻訳停止信号などを含んでいる。これらのベクターは１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えばバクテリア・プラスミドの場合アンピシリン耐性遺伝子、あるいは哺乳動物ベクターに関してはネオマイシン抵抗遺伝子を含んでいてもよい。ベクターは例えば、ＲＮＡ生成のために、あるいは宿主細胞を形質転換あるいはトランスフェクトするためにｉｎ　ｖｉｔｒｏで用いることができる。これらのベクターは、例えば遺伝子治療やＤＮＡワクチン接種の方法でｉｎ　ｖｉｖｏで用いることにも適合させることができる。
【００３４】
プロモータ、エンハンサ、及びその他の発現調節信号は発現ベクター設計の対象となる宿主細胞と適合できるように選択することができる。例えば、原核性プロモータ、特に（Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１など）大腸菌株での使用に適しているｔｒｃプロモータなどを使用することができる。その活性が嫌気性条件など周辺環境の変化に応じて誘発されるプロモータを用いることができる。好ましくは、ｈｔｒＡあるいはｎｉｒＢプロモータを使用することができる。これらのプロモータを特に例えばワクチンとして使用するために弱毒化バクテリウムでその蛋白質を発現させるために用いることができる。本発明の蛋白質の発現が哺乳動物細胞内で実施される場合、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ又はｉｎ　ｖｉｖｏのいずれかで、哺乳動物のプロモータを用いることができる。組織特異プロモータ、例えば、肝細胞特異プロモータも使用することができる。例えば、マロニー・マウス白血病ウイルス長端反復部分（ＭＭＬＶ ＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥプロモータ、ヘルペスウイルス・プロモータ及びアデノウイルス・プロモータなどのウイルス性プロモータを用いることも可能である。これらのプロモータのすべては先行技術で容易に利用できる。
【００３５】
本発明による蛋白質は蛋白質を精製するための慣用の技術を用いて精製することができる。上記蛋白質は、例えば、精製された、純粋な、又は単離された形態で提供することができる。ワクチンで使用するためには、上記蛋白質は通常高い純度、例えば調製物中の蛋白質の８０％以上、９０％以上、９５％以上、あるいは９８％以上のレベルの純度で提供されなければならない。しかしながら、最終的なワクチン配合物中ではその蛋白質を他の蛋白質、例えば、ＨＢＶのプレＳ１、プレＳ２、あるいはＳ配列を含む他の蛋白質と混合することが望ましい。上記蛋白質は核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）を実質的に含んでいないことが好ましい。
【００３６】
（ワクチン）
本発明の蛋白質の主な使用形態は治療あるいは予防的ワクチンである。本発明は本発明の蛋白質（例えば、ワクチン組成物）、本発明の粒子、あるいは本発明の核酸分子、そして薬学的に許容される担体あるいは希釈剤を含む医薬品組成物（例えばワクチン組成物）を包含する。
【００３７】
予防的ワクチン接種の背景にある原理は宿主内で免疫学的記憶を発生させるためにその宿主内に免疫応答を誘発させることである。このことは、その宿主が悪性の病原に暴露された場合に、それが有効な（防御的）免疫応答、つまり、その病原を非活性化及び／又は殺す免疫応答を起こすことを意味している。本発明はＨＢＶ、ＨＡＶ、ＨＣＶ、インフルエンザ、口蹄病、ポリオ、疱疹、狂犬病、ＡＩＤＳ、デング熱、黄熱病、マラリア、結核、百日咳、サルモネラ症、腸チフス、食品中毒、下痢、髄膜炎及び淋病などの広範な疾病に対する予防的ワクチンの基礎を提供することができるであろう。本発明の蛋白質中のエピトープはそのワクチンが防御しようとする疾病に対して適切になるように選択される。
【００３８】
治療的ワクチン接種の背景となる原理は疾患あるいは症状を緩和あるいは根治するために宿主の免疫系を刺激することである。慢性ＨＢＶ及び慢性ＨＣＶ、癌、並びに喘息、アトピー、湿疹、鼻炎、及び食品アレルギーなどのアレルギー症状など、治療的ワクチン接種が効果を発揮する疾病及び症状は多数ある。
【００３９】
慢性的ウイルス性疾患は、感染された宿主の免疫系がそのウイルスを絶滅することができず、そのウイルスがその宿主内に長期間存在することを可能にしてしまった場合に発生する。本発明は慢性的に感染された個体の免疫系を誘発させ、そのウイルスを根絶するために用いることができる。例えば、慢性肝炎に罹っている患者ではＴ細胞応答が不十分であり、そして、適切なＴ細胞応答を刺激することでそのウイルスを根絶することができると考えられる。従って、本発明を用いてウイルス性肝炎を治療するために、ＨＢＶのプレＳ１及びプレＳ２領域由来のＴ細胞エピトープなどのＴ細胞エピトープを本発明の蛋白質に挿入することができる。
【００４０】
同様に、癌の場合は、腫瘍抗原に対するＴ細胞応答を増強することにより、免疫系がその腫瘍を破壊するのに役立つと考えられる。アレルギー性疾患は少なくとも部分的には炎症性Ｔｈ２応答が拮抗薬的Ｔｈ１応答より優勢になってしまうＴ細胞応答のアンバランスによって引き起こされ、従って、アレルギーはＴｈ１応答を増強させることで治療できると考えられる。このことは本発明によってＴｈ１応答を刺激する蛋白質を使用することで達成することができる。
【００４１】
本発明による複数の蛋白質をひとりの患者に投与してもよい。さらに、本発明による蛋白質は１つ以上の他の組成物と組み合わせて用いることができる。例えば、慢性ＨＢＶの治療においては、本発明による蛋白質をインターフェロン・ガンマ、ＬａｍｉｖｕｄｉｎｅＴＭ、あるいはＨｅｐａｃａｒｅＴＭ（従来ＨａｐａｇｅｎｅＴＭとして知られていたもの）などその他の免疫治療剤と組み合わせて用いることができる。本発明による蛋白質及びその他の組成物を同時に投与してもよいし、連続的に投与してもよい。
【００４２】
本発明の医薬組成物に含めるのに適した担体及び希釈剤は、例えば燐酸緩衝食塩水など、等張食塩水である。本組成物は通常水酸化アルミニウムなどのアジュバントも含んでいる。この組成物は経口、筋肉内、静脈内、鼻腔、皮下あるいは経皮的投与用に製剤化することができる。この組成物は予防的、あるいは治療的に有効な量で上記蛋白質、粒子あるいは核酸を含んでいる。通常、上記蛋白質又は粒子は体重１ｋｇあたり０．０１−３０μｇの用量で投与されるが、０．１−１０μｇ／ｋｇの用量で投与されるのが好ましく、体重１ｋｇあたり０．１−１μｇの用量で投与されるのがさらに好ましい。本発明の核酸は先行技術で周知の技術を用いて裸（ｎａｋｅｄ）の核酸構成物として直接投与したり、あるいは先行技術で周知のベクターを用いて投与することができる。投与される核酸の量は通常１μｇから１０ｍｇの範囲、好ましくは１００μｇから１ｍｇの範囲である。ワクチンは単一の用量スケジュールに従って投与してもよいし、複数の用量スケジュールによって投与してもよい。上に示した投与のルートと用量は１つの指標として示しているだけであり、ルートや用量は最終的には医師の判断に基づいて決められてよい。
【００４３】
（実験）
実験１
１．材料及び方法
Ｂ及びＴ細胞エピトープをコードする代替配列が挿入できるようにするために、３つ又は４つのＣ末端アルギニン反復部分領域が欠失され、ＳｐｅＩ制限部位を導入するように逆ＰＣＲによって新しいプラスミド構成物を発生させた（図１参照）。
【００４４】
逆ＰＣＲのためのプラスミド・テンプレートは非ハイブリッドＢ型肝炎コアと免疫優勢ｅｌループのアミノ酸７０及び８０の間に挿入されたＢ型肝炎表面抗原のプレＳ１配列のアミノ酸２０−４７を含むハイブリッドＢ型肝炎コアをそれぞれコードするｐｔｒｃ／コア及びｐｔｒｃ／コア−Ｓ１であった。ＰＣＲ反応のために３つのオリゴヌクレオチド・プライマを用いた（表１及び図２）。これらのプライマはＰＣＲフラグメント内に固有のＳｐｅＩ制限サイトを導入する。これらのプライマは残基１４６又は１５４で先端が切り取られているがジスルフィド結合の形成によって粒子の安定性を維持する上で重要と考えられる位置１８５の末端システインを含むＣ末端の７つの残基を保持している新しいフラグメントを発生するようにも設計されていた（図１）。
【００４５】
１．１　親の先端切除プラスミドの構成
プライマＭＧＲ３７１／３７０又はＭＧＲ３６９／３７０（表１及び図２）を用いて、逆ＰＣＲフラグメントをｐｔｒｃ／コア又はｐｔｒｃ／コア−Ｓ１から発生させる。この手順によって［２３個のアミノ酸（ａａ１５５−１７７）をコードする］６９個のヌクレオチド及び［３１個のアミノ酸（１４６−１７７）をコードする］９３個のヌクレオチドがそれぞれ除去される。ＰＣＲフラグメント・サイズをアガロースゲル上で分析することによって確認し、その後、ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、さらにアガロースゲル上で精製し、自己ライゲーションさせてプラスミドｐＴＣＲ１４６、ｐＴＣＲ１５４及びｐＴＣＳＲ１４６とｐＴＣＳＲ１５４とを発生させた。ｐＴＣＲプラスミドはｐｔｒｃ／コア・テンプレートから誘導され、ｐＴＣＳＲプラスミドはｐｔｒｃ／コア−Ｓ１テンプレートから誘導される。１４６及び１５４という数字は切断された箇所でのアミノ酸の数を示している。大腸菌ＨＢ１０１細胞を形質転換させるために４つの親先端切断プラスミドを用い、そしてオリゴヌクレオチド・プライマＭＧＲ６１／ＭＧＲ１６８を用いた診断ＰＣＲによって陽性コロニーをテストした。コア蛋白質の発現はマウス抗コア抗体を用いたバクテリア細胞溶解物の免疫ブロッティングによって確認された。
【００４６】
１．２　先端切断親プラスミドへの代替配列のサブクローニング
セクション１．１で述べた先端切断親プラスミドの３’末端に３つの配列をサブクローンした。これらは小さなＢ型肝炎表面蛋白質のアミノ酸１１０−１４７及び１１０−１５７、及び中型のＢ型肝炎表面蛋白質のＳ２領域のａａ２０−５５をコードする配列を含んでいる（図３）。
【００４７】
１１０−１５７配列（＋ＮｈｅＩ制限部位由来の２つのアミノ酸）を挿入するために、オリゴヌクレオチド・プライマＭＲ２４５−２４７（表１Ｂ）を用い、ｐＭＢｄＳＲＥ／１７をテンプレートとして用いて１４７個のヌクレオチドのＰＣＲフラグメントを発生させた（図３）。このプラスミドはマウス・メタロチオニンプロモーターを用いて哺乳動物細胞内で発現されるための小さなＢ型肝炎表面蛋白質（ａｄｗサブタイプ）をコードする。
【００４８】
１１０−１４７配列（＋ＮｈｅＩ部位由来の２つのアミノ酸）を挿入するために、オリゴヌクレオチド・プライマＭＧＲ２４７／２６４（表１Ｂ）を用い、ｐＭＢｄＳＲＥ／１７をテンプレートとして用いてＰＣＲフラグメントを発生させた（表３）。
【００４９】
プレ−Ｓ２の２０−５５配列（＋ＮｈｅＩ部位由来の２つの残基）を挿入するために、オリゴヌクレオチド・プライマＭＧＲ２４３／２４９（表１Ｂ）を用い、ｐＭＢｙＳ２Ｒ／８をテンプレートとして用いて１１４個のヌクレオチドのＰＣＲフラグメントを発生させた（図３）。このプラスミドは哺乳動物細胞発現のためのメタロチオニン・プロモータの制御下で中型のＢ型肝炎表面蛋白質（ａｙｗサブタイプ）をコードする。
【００５０】
ＰＣＲフラグメントをＮｈｅＩ制限エンドヌクレアーゼで消化して、アガロース・ゲル上で精製した。精製されたフラグメントを次にＳｐｅＩ消化、燐酸処理した親プラスミドとライゲートさせた（セクション１．１）。そして次に大腸菌ＨＢ１０１細胞を上記の得られたプラスミドで形質転換させ、陽性のコロニーをオリゴヌクレオチド・プライマＭＧＲ６１／１６８を用いた診断的ＰＣＲ、挿入物に対する固有の抗体を用いた免疫ブロッティング、そして上記挿入物の部分的ＤＮＡ配列決定によってテストした。
【００５１】
２　結果
２．１　逆ＰＣＲフラグメント発生の確認
ｐＴＣＲ１４６、ｐＴＣＲ１５４、ｐＴＣＳＲ１４６、ｐＴＣＳＲ１５４に対する逆ＰＣＲフラグメントを１％アガロースゲル上で分離して分析した（図４）。ＰＣＲフラグメントは適切なサイズであること（約５．２Ｋｂ）が分かり、さらに診断的ＰＣＲ（図示せず）によって正しいことが確認された。免疫ブロット分析により親の構成物と挿入された配列を含む構成物は抗コア抗体に対して反応性を示すコア蛋白質を発現したことが示された（図５）。さらに、挿入された配列の蛋白質発現の確認は抗Ｓ（図６）及び抗プレ−Ｓ２抗体（図７）を用いた免疫ブロッティングにより示された。
【００５２】
表１：　逆及び診断的ＰＣＲのために用いられたオリゴヌクレオチド
2004500868.tif 000004
【００５３】
実験２
概要
位置１４４に長い外来アミノ酸挿入物を含んだ全長のＣ末端で先端を切断されたＢ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）誘導体を構成した。長さで５０−１００アミノ酸のＨＢＶプレＳ１、プレＳ２、そしてＨＩＶ−１　Ｇａｇフラグメントをそのような挿入物として用い、適切な組み換え遺伝子を大腸菌細胞内に発現させた。適切なキメラＨＢｃ及びＨＢｃΔ誘導体を精製して、抗原及び免疫原的に調べた。マウス内で誘発された抗ＨＢｃ免疫応答のサブクラス分析により、長さが５０−１００アミノ酸の長いＣ末端付加物を含んだＣ末端で先端切断したＨＢｃΔ誘導体による免疫化後に、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂ抗体のＩｇ比率が、Ｃ末端で先端切断したＨＢｃΔ誘導体に典型的なＩｇＧ１＞ＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ２ｂパターンから全長ＨＢｃ誘導体に典型的なＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ２ｂ＞ＩｇＧ１パターンへと復元されたことが示された。
【００５４】
材料と方法
バクテリア株
キメラ遺伝子の選択及び発現のために、大腸菌株ＲＲ１（Ｆ、ｈｓｄＳ２０（ｒ−ｂ、ｍ−ｂ）、ｒｅｃＡ＋、ａｒａ−１４、ｐｒｏＡ２、ｌａｃＹ１、ｇａｌＫ２、ｒｐｓＬ２０（Ｓｍｒ）、ｘｙｌ−１、ｍｔｌ−１、ｓｕｐＥ４４、λ−）及びＫ８０２（ｈｓｄＲ、ｇａｌ、ｍｅｔ、ｓｕｐＥ、ｍｃｒＡ、ｍｃｒＢ）をそれぞれ用いた。
【００５５】
動物
生後約７−１０週間目、体重２０ｍｇのＢＡＬＢ／Ｃ（Ｈ−２ｄ）雌マウスを用いた。ニュージーランド白系雌ウサギを用いてポリクローナル抗体を得た。
【００５６】
ＨＢｃ誘導体の構成
プラスミド ｐＨＢｃ３及びｐＨＢｃ１６−１５に基づくベクター。大腸菌ｔｒｐプロモータのタンデム反復部分の制御下にＨＢｃ遺伝子を置くことによってベクター ｐＨＢｃを構成した。ベクターｐＨＢｃ１６−１５はＣｌａＩ／Ｅｃｏ ＲＶ制限部位を有するオリゴヌクレオチド・リンカーをＨＢｃ遺伝子の位置１４４に挿入することによって構成した。
【００５７】
キメラＨＢｃ誘導体の構成。ＨＢｃ及びＨＢｃΔ誘導体の構造を表２に示す。ＨＢｃ遺伝子のＣ末端部分にイン−フレーム結合を伴う場合と伴わない場合の両方で、適切なＨＢＶ プレＳ１、プレＳ２、及びＨＩＶ−１　ｇａｇフラグメントをｐＨＢｃ１６−１５ベクターのＣｌａＩ部位に入れることによって組み換え遺伝子を構成した。
【００５８】
キメラＨＢｃ誘導体の精製
１％カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｓｐａｒｋｓ， ＵＳＡ）及び０．２％グルコースを補足したＭ９最少培地３００ｍｌを含んでいる７５０ｍｌフラスコ内で回転シェーカーを用いて大腸菌細胞を３７℃で一昼夜成長させた。通常２−５の光学密度ＯＤ５４０が達成された。一般に、細胞はペレット化され、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ　８．０）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌ　ＰＭＳＦ、２ｍｇ／ｍｌリゾチームを含む溶解緩衝液中で３０分間氷上培養して溶解させ、その後、２２ｋＨｚで１５秒間づつ３回超音波処理を行った。溶解物を１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２ 及び２０μｇ／ｍｌ　ＤＮＡａｓｅで調節した。低速遠心分離を行った後、３３％の飽和度の硫酸アンモニウムを用いて４℃で１−２時間処理することで蛋白質を上澄み液から析出させた。ペレットを０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ＴＭを含む標準ＰＢＳ緩衝液中に再懸濁させ、そして、その溶液５ｍｌをＳｅｐｈａｒｏｓｅ ＣＬ４ＢＴＭカラム（２．５ｘ８５ｃｍ）上に置いて、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含まないＰＢＳ緩衝液を用いて溶出させた。画分中のＨＢｃポリペプチドの存在をＰＡＧＥでテストした。陽性のフラクションをプールし、４℃の温度下、３３％飽和度で硫酸アンモニウム析出を２０時間行うことで濃縮させた。ペレットをＰＢＳ、又はＴｒｉｓ食塩水緩衝液、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ　７．５）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ中に約５−２０ｍｇ／ｍｌの最終濃度に再懸濁させて、同じ緩衝液２０００体積で一昼夜透析して、５０％グリセロル中で−７０℃又は−２０℃の温度下で保存した。
【００５９】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動及びウエスタンブロッティング
ＰＡＧＥ分析を行うために、バクテリアをペレット化して、２％ＳＤＳ及び２％の２−メルカプトエタノールを含んだＳＤＳゲル電気泳動サンプル緩衝液中に懸濁させ、１００℃の温度で５分間加熱することで細胞溶解させた。蛋白質を傾斜１２−１８％流動ゲル及び４％スタッキング・ゲルを用いてスラブ（ｓｌａｂ）・ゲル（１５０ｘ１５０ｘ０．７５ｍｍ）装置内でＬａｅｍｍｌｉのポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行って分離された。ウエスタン・ブロッティングは一般的にはＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６ ４３５０−４３５４でＴｏｗｂｉｎ等が述べている方法に従って実施した。ニトロセルロース・シート（０．２μ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＵＳＡ）を１：１００から１：１０００の割合で希釈した抗ＨＢｃ抗体及び抗プレＳ１抗体と共に一夜培養して、その後抗マウスＩｇＧペロキシダーゼ接合体（１：１０００）を用いて室温で１−２時間培養した。この反応を３，３’−ジアミノベンジンで促進させた。同時に、Ｏｈｓａｗａ ａｎｄ Ｅｂａｔａ （１９８３） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３５ ４０９−４１５に従ってゲルを銀染色した。
【００６０】
免疫化
０日目にマウス（１グループあたり５匹）を完全Ｆｒｅｕｎｄアジュバント（ＣＦＡ、Ｄｉｆｃｏ）中の０．０２ｍｇのキメラ粒子を腹膜内注射することで免疫化させ、その後、１０日目（０．０１ｍｇ、腹膜内）及び２４日目（０．０１ｍｇ、腹膜内及び０．０１ｍｇ、皮下注射）にＦｒｅｕｎｄ不完全アジュバント（ＩＦＡ、Ｄｉｆｃｏ）を用いてブースタ免疫化を２回行った。３２日目に採取した血清をＨＢｃ粒子との反応性についてＥＬＩＳＡにより分析した。
【００６１】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡを実施するために、組み換えＨＢｃ粒子をケミカル・フード内で一昼夜空気乾燥を行うことで９６ウェル・マイクロタイタ・プレート上に被覆させた。ウェルをＰＢＳ中の０．５％ＢＳＡで１時間ブロックして、種々の抗体の希釈液を連続的に用いて３７℃の温度下で１時間処理して培養し、西洋ワサビ・ペロキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）に接合された適切な第２の抗体を用いて、製造者の定めた手順に従って処理した。それぞれの培養間にプレートをＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０ＴＭ　で５回洗浄し、さらに蒸留水で５回洗浄してＴｗｅｅｎ−２０を除去した。光吸収については自動Ｉｍｍｕｎｏｓｃａｎ ＭＳＴＭリーダーを用いて４９２ｎｍで測定した。力価はＳ字型用量応答曲線に基づいて　ＥＣ５０（有効濃度、５０％）血清希釈の負対数として計算した。平均力価計算ではＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｍｓ（商標）バージョン３．０２ソフトウエアを用いた。
【００６２】
（結果）
組み換え蛋白質の免疫原性：ＨＢｃ担体と挿入されたプレＳ１、プレＳ２、及びＧａｇ配列の免疫原性を測定するために、個々のマウス血清を固体支持体上で組み換えＨＢｃＡｇ及び合成プレＳ１、プレＳ２及びＨＩＶ−１ ｐ２４ペプチドを用いた直接ＥＬＩＳＡで繰り返しテストした。キメラ粒子で免疫化を行ったところ、高レベルの抗ＨＢｃと比較的低レベルの抗挿入物抗体が誘発された（図示せず）。
【００６３】
キメラＨＢｃΔ−プレＳ１（２０−４７）粒子による種々の免疫グロブリン・サブクラスの誘発：得られた免疫化データを平均化し、それらが誘発された免疫グロブリンの比較サブクラス分析のためにより多くの情報を提供してくれるようにするために、Ｓ字型用量応答曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標），バージョン３．０２）に基づいてＥＣ５０（有効濃度、５０％）血清希釈の負対数として免疫化された動物グループ毎の平均力価を計算した。平均化された力価の直接的比較を可能にしてくれる免疫化されたマウスの抗ＨＢｃ応答に関するこれらのデータを図８に示す。
【００６４】
図８に示されているデータは、野生型ＨＢｃＡｇが抗ＨＢｃ応答を誘発し、免疫グロブリン・サブクラス分布がＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ２ｂ＞ＩｇＧ１であるのに対して、Ｃ末端で先端切断されたＨＢｃΔ構造Ｔ３１に対する免疫応答はＩｇＧ１＞Ｉｇ２ｂ＞ＩｇＧａサブクラス分布パターンを示すことを表わしている。５０ａａ長のプレＳ１挿入物を含む全長ＨＢｃ誘導体１０−６２は、全長ＨＢｃベクターの場合と類似したサブクラス分布を示す。さらに、ＨＢｃ誘導体１０−１４０中での長い外来挿入物（プレＳ１配列の５０個のアミノ酸）によるＨＢｃ分子のＣ末端端末を置換すると、むしろ全長ＨＢｃ構造によって誘発されるものと類似した抗ＨＢｃ抗体のサブクラス分布が得られる（図８）。ＨＩＶ−１ Ｇａｇの１００ａａ長の挿入物を有するＨＢｃΔ誘導体４８−２は、この意味で野生型ＨＢｃＡｇとＣ末端先端切断ＨＢｃΔＴ３１構造の中間の位置を占める。
表２　Ｃ末端挿入物を有するＨＢｃ誘導体の構造。ＨＢｃ及び挿入配列結合に現れるアミノ酸を小文字で示してある。
2004500868.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【図１】
一文字コードを用いたＢ型肝炎コアのアミノ酸配列。欠失方式を詳しく示すためにＣ末端配列（ａａ１３５−１８５）が強調して示されている。４つのアルギニン（Ｒ）反復部分を太字で示し、さらに強調するために下線を付してある。ａａ１５４−１７８又はａａ１４６−１７８からぞれぞれ３つ又は４つのアルギニン反復部分領域に下線を付してある。ＳｐｅＩ制限部位を挿入し、下線を付した領域を欠失させると、それぞれｐＴＣＲ１５４及びｐＴＣＲ１４６によってコードされる構造が発生される。ｐＴＣＲ１５４はＮ末端アルギニン反復部分を保持しており、ｐＴＣＲ１４６の方はすべてのアルギニン反復部分が欠失されている。
【図２】
ＨＢｃＡｇをコードするＤＮＡ配列とＰＣＲのために用いられるオリゴヌクレオチド・プライマの位置及び方向。ＳｐｅＩ制限部位の位置はオリゴＭＧＲ３７１、ＭＧ３６９、及びＭＧＲ３７０に関して示してある（表１参照）。
【図３】
コアに挿入されたプレＳ２及びＳエピトープのＤＮＡ及びアミノ酸配列。図３ＡはＨＢＶａｙｗサブタイプのプレＳ２領域のａａ２０−５５の配列を示す。図３ＢはａｄｗサブタイプのＳ抗原のａａ１１０−１４７の配列を示している。図３ＣはａｄｗサブタイプのＳ抗原のａａ１１０−１５７の配列を示している。
【図４】
逆ＰＣＲフラグメントのアガロース・ゲル電気泳動。レーン１、２、３及び４はそれぞれｐＴＣＲ１４６、ｐＴＣＲ１５４、ｐＴＣＳＲ１４６、及びｐＴＣＳＲ１５４のフラグメントを示している。レーン５はサイズ・マーカー。すべてのフラグメントは約５ｋｂと予想される。
【図５】
３’置換プラスミド構造物によって形質転換された大腸菌の細胞溶解物のコア蛋白質の発現の免疫ブロット分析。すべてのサンプルは置換配列が存在しているかどうか、及び置換サイズによって変わる種々の相対的分子量の抗コア抗体反応性蛋白質を発現する。サンプル・オーダー：
レーン１＝ｐＴＣＲ１４６　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン２＝ｐＴＣＲ１４６／Ｓ１１０−１５７ Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン３＝ｐＴＣＲ１４６／Ｓ２−２Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン４＝ｐＴＣＲ１５４　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン５＝ｐＴＣＲ１５４／Ｓ１１０−１４７　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン６＝ｐＴＣＲ１５４／Ｓ１１０−１５７　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン７＝ｐＴＣＲ１５４／Ｓ２−２　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン８＝ｐＴＣＳＲ１４６　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン９＝ｐＴＣＳＲ１４６／Ｓ１１０−１５７Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン１０＝ｐＴＣＳＲ１４６／Ｓ２−２Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
【図６】
３’置換プラスミド構成物で形質転換されたバクテリアの細胞溶解物中のＳ配列発現の免疫ブロット分析。Ｓ配列を組み込んだ構成物（レーン２、４、５及び７）は抗Ｓ抗体反応性である。サンプル・オーダー：
レーン１＝ｐＴＣＲ１４６　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン２＝ｐＴＣＲ１４６／Ｓ１１０−１５７　　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン３＝ｐＴＣＲ１５４　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン４＝ｐＴＣＲ１５４／Ｓ１１０−１４７Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン５＝ｐＴＣＲ１５４／Ｓ１１−１５７Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン６＝ｐＴＣＳＲ１４６　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン７＝ｐＴＣＳＲ１４６／Ｓ１１０−１５７Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン８＝予備染色マーカー（Ｎｏｖｅｘ）
【図７】
３’置換プラスミド構造物で形質転換されたバクテリアの細胞溶解物中のプレＳ２配列の発現の免疫ブロット分析。プレＳ２配列（レーン４及び６）を組み込んだ構造物はプレＳ２抗体反応性である。サンプル・オーダー。
レーン１＝ｐＴＣＲ１４６　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン２＝ｐＴＣＲ１４６／Ｓ２−２　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン３＝ｐＴＣＲ１５４　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン４＝ｐＴＣＲ１５４／Ｓ２−２　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン５＝ｐＴＣＳＲ１４６　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン６＝ｐＴＣＳＲ１４６／Ｓ２−２　Ｅ．Ｃｏｌｉ ＨＢ１０１
レーン７＝予備染色マーカー（Ｎｏｖｅｘ）
【図８】
例で述べられる種々の構造物で免疫化されたマウスにおける平均的な抗ＨＢｃ応答を示している。力価はＳ字状用量応答曲線に基づいて、ＥＣ５０（有効濃度、５０％）血清希釈度の負対数として計算された。
【図１】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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