(57)【要約】【課題】抗炎症活性および抗動脈硬化活性を示すカワミドリ（Agastache rugosa）および分離−精製によって得られたチリアニンを含む組成物の提供。【解決手段】炎症反応因子である補体系の活性、細胞付着物質−１（ＩＣＡＭ−１）と血管細胞付着物質（ＶＣＡＭ−１）の発現および酸化窒素（ＮＯ）の生成を抑制することに優れた活性を示すことにより、炎症関連疾患だけでなく、炎症反応に関わる動脈硬化およびそれによる循環器疾患を予防および治療することに効果的であるカワミドリ抽出物およびそれから分離−精製によって得られたチリアニンを提供する。本発明によれば、炎症反応による動脈硬化の発生を顕著に減少できる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分としてカワミドリ（Agastache rugosa）抽出物を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記抽出物が、ｎ−ヘキサン、クロロホルムまたはｎ−ブタノールによって分画された溶媒分画物を含有する請求項１記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抽出物が有効成分としてチリアニン（tilianin）を含有する請求項１記載の医薬組成物。
【請求項４】
炎症反応因子である補体系に対して抑制活性を有する請求項１または３記載の医薬組成物。
【請求項５】
細胞付着物質−１（intercellular adhesion molecular-1）の発現を抑制できる請求項１または３記載の医薬組成物。
【請求項６】
酸化窒素の生成を抑制できる請求項１または３記載の医薬組成物。
【請求項７】
抗炎症活性と抗アテローム性動脈硬化活性を有する請求項１または３記載の医薬組成物。
【請求項８】
有効成分としてカワミドリ抽出物または分離−精製によって得られたチリアニンを含み、抗炎症活性と抗アテローム性動脈硬化活性を有する食品添加剤組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗炎症活性および抗アテローム性動脈硬化活性を示すカワミドリ（Agastache rugosa）およびそれから分離−精製によって得られたチリアニン（tilianin）を含む組成物に関し、さらに詳細には、炎症反応因子である補体系（complement system）の活性、細胞付着物質−１（ＩＣＡＭ−１）と血管細胞付着物質−１（ＶＣＡＭ−１）の発現および酸化窒素（ＮＯ）の生成を抑制するのに優れた活性を示すことにより、炎症関連疾患だけでなく、炎症反応に関わるアテローム性動脈硬化およびそれによる循環器疾患を予防および治療するのに効果的であるカワミドリ抽出物およびそれから分離−精製によって得られたチリアニンに関する。これらはまた、炎症反応によるアテローム性動脈硬化の発生を顕著に減少させることができる。
【背景技術】
【０００２】
人体において組織または細胞が損傷するか、外部感染源（バクテリア、カビ、ウイルス、様々な種類のアレルギー誘発物質）に感染した場合は、局所血管と体液中の各種炎症媒介因子および免疫細胞が関係して酵素活性化、炎症媒介物質の分泌、体液浸潤、細胞の移動、組織破壊などの一連の複合的な生理的反応と紅斑、浮腫、発熱痛みなど外的症状が現われる。通常、炎症反応は外部感染源を除去し、損傷した組織を再生して生命体機能の回復作用を果すが、抗原が除去されないか、内部物質が原因となって炎症反応が過度に、または持続的に起こると、かえって疾患の主要病理現象（過敏性疾患、慢性炎症）になり、輸血、薬物投与、臓器移植など治療過程においても障害要因となる。
【０００３】
本発明と関連して炎症反応に関与する因子の作用を述べると次の通りである。
補体系は、免疫反応の初期に炎症を活性化させ、増幅させる体液性主要因子である。補体系の活性化過程で生成される活性タンパク質（アナフィラトキシン類；Ｃ３ａ、Ｃ４ａ、Ｃ５ａ）と複合タンパク質（細胞膜障害複合体（membrane attack complex）、ＭＡＣ）は様々な炎症疾患（関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、成人呼吸窮迫症候群、アルツハイマー病）と関わりがあり、臓器移植時、激烈な拒絶反応の直接的な原因となっている。
【０００４】
ＩＣＡＭ−１は、内皮細胞の表面で発現される細胞付着物質群の代表的なタンパク質である。通常、これは非常に低い水準に発現されているが、ＴＮＦ−α、インターフェロン−γ、インターロイキン−１βのようなサイトカイン類の炎症媒介物質によって刺激を受けると、発現量が急速に増加して血流中を移動する単球やリンパ球などの炎症細胞を付着させ、炎症細胞を炎症発生組織に移動させる役割をする。したがって、ＩＣＡＭ−１の発現は炎症細胞が炎症発生部位に移動および収束する初期に作用して炎症反応を増幅させるに重要な役割をする。
【０００５】
ＶＣＡＭ−１は、内皮細胞の表面上で発現される細胞付着物質群の一つである。前記発現は、アテローム性動脈硬化性病変がヒトアテローム性動脈硬化の過程と類似に動物モデル（アポリポプロテインＥ−欠乏性マウス、ＡｐｏＥ−／−）で生成するとき、血管内皮細胞で急速に増加する。また、ＶＣＡＭ−１発現の増加は血中コレステロール−低密度リポタンパク質（コレステロール−ＬＤＬ）の濃度と直接的な関わりがある。したがって、アテローム性動脈硬化性病変が誘発された場合、血管内皮細胞で発現されたＶＣＡＭ−１は血中単球およびリンパ球と癒着し、炎症細胞は血管内皮細胞の下に集まってアテローム性動脈硬化性病変の発生に重要な役割を果す。
【０００６】
ＮＯはＮＯ合成酵素（nitric oxide synthase、以下ＮＯＳ）によってＬ−アルギニンが酸化した後、Ｌ−シトルリンとともに生成される。ＮＯは血管系に作用して血管拡張、血小板付着および凝集、神経伝達、消化器官運動、陰茎勃起などに関与する媒介物質である。また、ＮＯは炎症細胞だけでなく、非免疫細胞でも生成され、微生物感染に対する防御作用を果す。一方、ＮＯの生成に関与するＮＯＳ中の一つである誘導型−ＮＯＳ（inducible-NOS、以下ｉＮＯＳ）は、カルシウムやカルモジュリンに非依存性であって、リポ多糖類（以下ＬＰＳ）、サイトカイン類（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦなど）の刺激によって発現されるが、このような刺激によってシクロオキシゲナーゼ−２（以下ＣＯＸ−２）も共に活性化されて炎症媒介物質であるプロスタグランジン類（以下ＰＧｓ）が生成されるので、ｉＮＯＳ発現とＣＯＸ−２の発現は非常に密接な関わりがあり、したがって、生成されたＮＯはＣＯＸ−２の発現に影響を与える。マクロファージにおいてＮＯの生成は選択的にｉＮＯＳの発現によって誘発され、その結果もまた他の炎症反応の活性化を誘発するためＮＯは炎症疾患の重要な因子であるといえる。
【０００７】
アテローム性動脈硬化は脂質代謝に関わる遺伝的要因と食習慣、吸煙、運動不足などの環境的要因によって動脈が硬化される疾患であって、これによって心臓疾患、脳血管疾患などの循環系疾患が発生する。アテローム性動脈硬化の初期発生に関する仮説は、「損傷に対する反応（responce-to-injury hypothesis）」であって、遺伝的変異、過酸化物、高血圧、糖尿、血漿ホモシステイン濃度の増加、微生物感染などの原因によって血管内皮細胞が正常の恒常性を維持できない機能不全状態となるものである。血管内皮細胞が機能不全状態となると、細胞付着物質が大きく発現され、細胞透過性が増加して血中免疫細胞、血小板、脂肪質などの付着および組織への透過性が増加し、これらの免疫細胞の炎症媒介因子および成長因子の分泌のような炎症反応のためアテローム性動脈硬化性病変が発生するということである。この際、血中低密度リポタンパク質（以下、ＬＤＬ）が酸化、糖結合、集積化、糖タンパク質結合などの原因で変形−ＬＤＬ（modified-LDL、以下、ＭＬＤＬ）となり、これらは血管内皮細胞および平滑筋の刺激および損傷を誘発する。これにより、内皮細胞のＶＣＡＭ−１の発現、および炎症細胞の炎症媒介因子の放出が促進されると、ＬＤＬは内皮細胞の下に流入されて蓄積され、蓄積されたＬＤＬおよび酸化されたＭＬＤＬは再びマクロファージ、Ｔリンパ球などのような免疫細胞の流入および活性化を誘発する過程を繰り返して病変の炎症反応を促進することになる。その後、病変に流入されたマクロファージやリンパ球から放出された加水分解酵素、炎症媒介因子、成長因子などの作用により病斑は壊死し、壊死した病巣部位への単球の流入、平滑筋の移動および分化、繊維性組織の形成などの反復的な過程を通じて病変組織はＭＬＤＬを核とする壊死組織に繊維質が覆われた複雑な構造の繊維質病変に発達することになる。前記発達された病変組織から血栓が生成され、動脈が硬化されて血流障害のような循環器疾患が現われる。したがって、アテローム性動脈硬化は血中コレステロールおよびＬＤＬなどの脂肪質の含量が高い場合発生するが、単に脂肪質の蓄積によってのみ発生するのではなく、動脈内皮細胞の下に脂肪質が流入および蓄積される過程とその後起こる病変の発達および最終的に細胞壊死に至る一連の過程に内皮細胞、マクロファージおよびリンパ球などが関与する典型的な炎症反応である。
【０００８】
カワミドリ（Agastache rugosa O. Kuntze（生薬名：排草香））はシソ科（Labiatae）に属する多年生草本であって、韓国、中国、日本など東北アジアに分布しており、韓国では主に南部地方に野生し、一部は栽培されている。漢方では前記植物の地上部をカッコウ（Patcholi）（カワミドリの別名）と称し、中国の書籍である名医別録では「風水毒腫を治し、悪気を去り、霍乱、すなわち、胃が痛む症状を治療」する薬材として使用されており、民間では葉をどじょう汁などの各種のナベものに風味材料として用い、その花は蜜源として利用している。
【０００９】
カワミドリの成分に関する研究としては、精油成分、セスキテルペン類、ジテルペン類、トリテルペン類、フラボノイド、フェニルプロパノイド、カロチノイド類が報告されている。カワミドリの生理活性に関する研究としては、抽出物の抗菌活性［Phytother. Res. 14(3), 210-212, 2000; J. Food Sci. Nutr. 4(2), 97-102, 1999］、抗ウイルス活性［Arch. Pharm. Res. 22(5), 520-523, 1999；米国特許第５７７６４６２号］、モノアミンオキシダーゼ抑制活性［韓国薬学会誌42(6), 634-638, 1998］が報告されており、また、カワミドリの成分のうち、精油成分の抗菌活性［Zhongguo Yaozue Zazhi 35(1), 9-11, 2000; Weishengwuxue Zazhi 18(4), 1-4, 16, 1998］および蚊忌避活性［中国特許第１０４４２０５号］、カロチノイド成分の抗癌活性［韓国生薬学会誌30(4), 404-408, 1999］、ジテルペン類の抗癌活性［J. Nat. Prod. 58(11) 1718-1821, 1995］および抗ウイルス活性［Arch. Pharm. Res. 22(1), 75-77, 1999］、フェニルプロパノイド類の抗ウイルス活性［Arch. Pharm. Res. 22(5), 520-523, 1999］、抗酸化活性［韓国農化学会誌42(3), 262-266, 1999］および抗補体活性［韓国生薬学会誌27(1), 20-25, 1996；韓国農化学会誌39(2), 147-152, 1996］が報告されている。しかし、カワミドリ抽出物の抗炎症活性と抗アテローム性動脈硬化活性に関する研究は国内外的に報告されていない。
他方では、フラボノイド中の一つであるアカセチンのグルコース−グリコシド化合物として各種の植物に存在するチリアニンが報告されている。
【００１０】
2004521933.tif 000003
【００１１】
チリアニンの生理活性に関する研究は抗酸化活性[J. Food Sci. Nutr. 4(1999), 221-225; Indian J. Chem., Sect. B: Org. Chem. Incl. Med. Chem 36B(1997), 1201-1203]およびキサンチンオキシダーゼの抑制活性の不在[J. Nat. Prod. 51(1988), 345-348]を報告している。しかし、国内外的にチリアニンの抗炎症活性と抗アテローム性動脈硬化活性の研究に関する報告はまだされていない。
【００１２】
そこで、本発明者らは、正常の脂質代謝を阻害せず、抗炎症活性に基づく動脈硬化性病変の発達を抑制できる生薬材を選択する目的で、昔から食用および薬用として用いられてきた生薬材を対象に抗炎症活性および抗アテローム性動脈硬化活性を調査した結果、そのうち様々な炎症因子に対する抑制活性および炎症反応に関わる動脈硬化性病変を顕著に減少させる、優れた抗アテローム性動脈硬化活性を示すカワミドリ抽出物を得ることにより、本発明を完成した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、抗炎症活性と抗アテローム性動脈硬化活性を有することにより、炎症疾患、炎症反応に関わるアテローム性動脈硬化およびそれによる循環器疾患の予防および治療用途の薬物および食品添加剤として効果的なカワミドリ抽出物およびそれから分離−精製によって得られたチリアニンを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は有効成分としてカワミドリ抽出物およびそれから分離−精製によって得られたチリアニンを含む、抗炎症および抗アテローム性動脈硬化活性を有する組成物に関する。
【発明の効果】
【００１５】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明に係るカワミドリ抽出物または分離−精製によって得られたチリアニンは、炎症因子の抑制活性、すなわち、抗補体活性、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１発現抑制活性、およびＮＯ生成抑制活性を有し、したがって、これらは炎症疾患の予防および治療に効果的であるだけでなく、炎症反応に関わる動脈硬化性病変に対するその優れた抑制活性によってアテローム性動脈硬化の予防および治療にも効果的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
したがって、本発明は、有効成分としてカワミドリ抽出物および分離−精製によって得られたチリアニンを含む薬物または食品添加剤を含む。
本発明に係るカワミドリ抽出物およびチリアニンの分離−精製方法を詳しく説明すると次の通りである。
【００１７】
本発明に係るカワミドリ抽出物は、カワミドリの全草を日陰で乾燥した後、低級アルコールで抽出して濃縮することにより得られる。抽出物の分画収率はカワミドリ乾燥重量の１０〜２０％程度である。前記のようにして得られたカワミドリ抽出物を水に懸濁した後、ｎ−ヘキサンを同じ体積で加えて十分振盪した後、ヘキサン層を分画し、次いで、クロロホルムと低級アルコールを順次加えて各々の溶媒分画物を得る。この際、低級アルコールは、炭素数１または６のアルキル−アルコール、好ましくはｎ−ブタノールである。前記溶媒による分画方法は通常の方法、たとえば、シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーおよび高速液体クロマトグラフィーを必要とするか、或は再結晶のような一般的な分離−精製方法を使用してもよい。
【００１８】
前述の方法で得られたカワミドリ抽出物および分離−精製によって得られたチリアニンのそれぞれに対して、補体系に対する抗補体活性、ＩＣＡＭ−１発現抑制活性、ＶＣＡＭ−１発現抑制活性およびＮＯ生成抑制活性、およびカラギーナン誘導−急性炎症マウスに対する抗炎症活性とアテローム性動脈硬化性病変の抑制活性を調査した。
【００１９】
前記カワミドリ抽出物は、免疫複合体に対するヒト血清の補体活性化作用を強く抑制する抗補体活性を示す。また、前記は腫瘍壊死因子−α（以下ＴＮＦ−α）でＩＣＡＭ−１の発現を誘導した単球ＴＨＰ−１細胞（THP-1 monocytic leukemic cells、以下、ＴＨＰ−１細胞）に対するＩＣＡＭ−１の発現を強く抑制する。また、リポ多糖類（以下ＬＰＳ）で活性化を誘導したマウス単球／マクロファージＲＡＷ２６４．７細胞のＮＯ生成作用に対する強い抑制活性を示す。また、カラギーナン誘導−急性炎症マウスにおいて強い抗炎症活性を示し、低密度リポタンパク質受容体欠乏マウス（ＬＤＬＲ−／−マウス）をカワミドリ抽出物を飼料に１％添加して飼育した場合、無処理群大動脈洞（aortic sinus）においてアテローム性動脈硬化性病変が顕著に減少することが分かる。
【００２０】
また、カワミドリ抽出物のヘキサン分画物は前述の抗補体活性とＩＣＡＭ−１発現抑制活性を強く示し、クロロホルム分画物はＩＣＡＭ−１発現抑制活性とＮＯ生成抑制活性が強く、ブタノール分画物はＩＣＡＭ−１発現抑制活性を強く示すことを確認できた。
一方、本発明は、有効成分としてカワミドリ抽出物および分離−精製によって得られたチリアニンを含む薬物および食品添加剤を含むので、広く公知の方法に従って薬物および食品添加剤を製造する。
【００２１】
前記カワミドリ抽出物およびチリアニンはこれらが天然形態であり、また、薬剤学的に許容可能な担体、賦形剤（forming agent）、稀釈剤などと混合して粉末、顆粒、カプセルまたは注射剤などの剤形に製造できるため、その自体で使用してもよい。また、前記カワミドリ抽出物は昔から食品および薬物に使用されており、その容量は非制限的であり、体内吸収度、体重、患者の年齢、性別、健康状態、投与時間、投与方法、分泌速度、疾患の重症度などによって異にしてもよい。一般的に、有効成分として前記カワミドリ抽出物（濃縮状態）およびチリアニンの好ましい量は体重１ｋｇ当り０．１〜１００ｍｇである。したがって、本発明の有効成分を含む組成物は有効量の範囲を考慮して製造し、必要に応じて薬剤の投与を監視するか、観察する専門家の判断と個人の要求に応じて専門化された投薬法を使用するか、一定時間の間隔で数回投与できる。
【００２２】
また、前記カワミドリ抽出物およびチリアニンを食品添加剤として製造する場合、これらを飲料、ガム、お菓子類などの食品素材に含ませることができる。
上述のように、カワミドリ抽出物およびチリアニンを有効成分として含む薬物および食品添加剤は炎症疾患、アテローム性動脈硬化、およびアテローム性動脈硬化による循環器疾患の予防および治療に優れた効果がある。
【実施例】
【００２３】
以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、これらは本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
【００２４】
[製造例１]  カワミドリから抽出物を製造および溶媒によって分画
農家で栽培したカワミドリの地上部を採取して日陰で乾燥し、細かく切った３０ｋｇの試料にメタノール１２０ｌを加えて３日間静置した後抽出した。前記抽出物３０ｋｇを３回濃縮して抽出物３．５ｋｇを得た。抽出物２．５ｋｇを水１０ｌに懸濁した後ｎ−ヘキサン１０ｌで２回分画してｎ−ヘキサン分画物３８０ｇを得た。次いで、前記をクロロホルムとｎ−ブタノールによって前記のように分画した後濃縮してクロロホルム分画物５９０ｇ、ｎ−ブタノール分画物４５０ｇおよび水分画物９８０ｇをそれぞれ得た。
【００２５】
[製造例２]  カワミドリからチリアニンの分離−精製
農家で栽培したカワミドリの地上部を採取して日陰で乾燥し、細かく切った３０ｋｇの物質を得た。これにメタノール１２０ｌを加えて３日間静置した後抽出し、前記抽出物３０ｋｇを３回繰り返し抽出して抽出物３．５ｋｇを得た。
抽出物２．５ｋｇを水１０ｌに懸濁し、クロロホルム１０ｌで分画した後、これを２回繰り返してクロロホルム分画を除去した。次いで、前記を前述の方法によってｎ−ブタノールで分画してｎ−ブタノール分画４５０ｇを得た。シリカゲル１ｋｇに吸着されたｎ−ブタノール分画１５０ｇに対してシリカゲル４ｋｇが充填されたカラムクロマトグラフィー（２５×７５ｃｍ）を行い、次いで、クロロホルム−メタノール混合物（メタノール比率：５％〜１０％）を用いてチリアニンを含む分画を溶離させた。残りの分画３００ｇにメタノール１０ｌを加えて静置し、これから得られた沈澱物をメタノールで数回洗浄して９０％以上のチリアニンを含有する沈澱物を得た。前述の２つの方法によって得られた純粋なチリアニンを高速液体クロマトグラフィーによってチリアニン含有化合物から分離した。
【００２６】
[実施例１]  抗補体活性
補体系に対する抗補体活性の測定はマイヤー（Meyer）らの方法［Kabat, E. A. and Mayer M. M.(1961) in “Experimental Immunochemistry” 2nd ed. Charles and Thomas, USA］を修正して行い、その実験過程は次の通りである。
新鮮なヒツジの赤血球をゼラチン−ベロナール緩衝溶液（１．８ｍＭバルビタールナトリウム、３．１ｍＭバルビタール酸、０．１％ゼラチン、０．１４１Ｍ塩、０．３％アジ化ナトリウム、０．５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１５ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ７．３）で３回洗浄した後５×１０8細胞数／ｍｌの濃度に調整した。抗体（anti-sheep red blood cell stroma rabbit antisera, S-1389, Sigma）を１／１００に前記緩衝溶液で稀釈した後、ヒツジ赤血球稀釈液と同じ体積で混合し、３７℃培養器で１時間徐々に攪拌して免疫複合体（sensitized erhthrocytes, EA）を製造し、冷たい同一緩衝溶液で２回洗浄し、免疫複合体の濃度を５×１０8細胞数／ｍｌに調整した。ヒトの血液を２５００×ｇで遠心分離して得た補体（血清）を前記緩衝溶液で１／９０に稀釈し、免疫複合体溶液４０μｌ、補体稀釈液８０μｌおよび緩衝溶液８０μｌと混合した後、３７℃培養器で反応させた後、直ちに遠心分離して上澄液１００μｌに対して５０４ｎｍ波長で吸光度を測定し、各抗体および補体（血清）濃度別に吸光度を計算して５０％溶血（標準溶血）を起こすに必要な抗体および補体（血清）の稀釈濃度を決定した。その後、試料をＤＭＳＯに溶かし、標準溶血に添加する緩衝溶液８０μｌで２．５％に稀釈した後、前記方法で吸光度の測定を３回繰り返して試料による吸光度の低下を計算し、これを用いて検定用試料の溶血抑制活性を抗補体活性に換算した。
【００２７】
【数１】
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【００２８】
【数２】
2004521933.tif 000005
【００２９】
その結果、下記表１のようにカワミドリ抽出物のｎ−ヘキサン分画物およびクロロホルム分画物において強い抗補体活性が示された。
【００３０】
[表１]
カワミドリ抽出物および溶媒分画物の抗補体活性度
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【００３１】
[実施例２]  ＩＣＡＭ−１発現抑制活性
ＴＨＰ−１細胞に対するＩＣＡＭ−１発現抑制活性に対する実験過程は次の通りである。
ＴＨＰ−１細胞をＲＰＭＩ−１６４０培地［ＲＰＭＩ−１６４０（GibcoBRL 23400-021）１．６２％、炭酸水素ナトリウム０．２％、ペニシリンおよびストレプトマイシン混合抗生剤１％］にウシ胎児血清（fetal bovine serum, GibcoBRL 26140-079、以下、ＦＢＳ）を１０％添加した培養液を用いてＣＯ2培養器（５％二酸化炭素、９５％相対湿度、３７℃）内で培養した。検定用試料をＤＭＳＯに溶かし、リン酸緩衝溶液（phosphate buffered saline solution、以下ＰＢＳ）で５％以下に稀釈し、反応液に５％で加え、試料を溶かしたＤＭＳＯの濃度が最終反応液において０．２５％を超えないようにした。ＴＨＰ１細胞（２．５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を９６−ウェルに各ウェル当り２００μｌずつ分株し、一定の濃度で製造された試料溶液１０μｌを加えて３７℃のＣＯ2培養器内で１時間培養した後、ＩＣＡＭ−１の発現を誘導するためにＴＮＦ−α（最終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）を加え、さらにＣＯ2培養器内で１６時間培養した。反応液をグルタルアルデヒド緩衝液（glutaraldehyde 2.08% in PBS）２５μｌを加えて細胞をウェルに固定した後、これをＰＢＳＴ（0.005%tween-20 in PBS）で洗浄し、３％脱脂油（skim milk）を加えて非特異的結合部位が遮断されるようにし、さらに洗浄した後１次抗体（抗ヒトICAM-1）および２次抗体（抗マウスIgGパーオキシダーゼ複合物（peroxidase conjugate））を順次加えた後、発色用基質溶液［OPDパーオキシダーゼ基質（OPD Peroxidase substrate）, (Sigma P-9187), 0.05Mリン酸−クエン酸バッファー中］２００μｌを加え、５〜１０分後３Ｍ  ＨＣｌ５０μｌを加えて反応を中止した。その後、分光光度計を用いて４９０ｎｍで反応液の吸光度を測定してＴＮＦ−αによるＴＨＰ−１細胞のＩＣＡＭ−１発現率を測定し、試料による発現阻害率を計算した。
【００３２】
【数３】
2004521933.tif 000007
【００３３】
【数４】
2004521933.tif 000008
【００３４】
[表２]
カワミドリ抽出物および溶媒分画物のＩＣＡＭ−１発現抑制活性
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（註）* 陽性無処理群
【００３５】
前記表２に示したように、カワミドリ抽出物、その溶媒分画物およびチリアニンによるＩＣＡＭ−１発現抑制活性は消炎剤としてよく知られているデキサメタゾンよりも低かったが、特に、ｎ−ヘキサン分画物およびクロロホルム分画物は優れた抑制活性を示す。デキサメタゾンはステロイド剤として優れた効果を有する反面、長期使用時、任意の他のステロイド剤と同様に副作用（腎臓機能障害、炎症の増加、糖尿、筋収縮、成長抑制、骨粗鬆症など）が現われる。しかし、カワミドリ抽出物およびチリアニンはこのような副作用がない。
【００３６】
[実施例３]  ＶＣＡＭ−１発現抑制活性
ヒトのヘソ静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＶＣＡＭ−１発現に対する抑制活性に対する実験過程は次の通りである。
ＨＵＶＥＣをペニシリン１００Ｕ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌが添加されたＥＧＭ−２ブレットキット（Bulletkit）ブロス［５０ｍｌの内皮細胞基本培地−２（EBM-2, Clonetics CC-3156, MD, USA）容器を含有するキット］を用いてＣＯ2培養器（５％ＣＯ2、９５％相対湿度、３７℃）で培養した。検定用試料をＤＭＳＯに溶かし、その濃度を最終反応溶液に対して０．１％以下に保持した。ＨＵＶＥＣを各群に対して２つの培養皿（Ψ１０ｃｍ、２×１０6細胞）程度に使用し、前記ブロスを試料処理前に交換した。まず、チリアニンを２時間１００μＭおよび１０μＭの最終濃度で予備処理した。次いで、ＴＮＦ−αを各群に対して１０ｎｇ／ｍｌになるように処理し、ＶＣＡＭ−１発現を１６時間誘導した。ＰＢＳで２回洗浄し、５分間トリプシン処理（０．０２５％）した後、細胞を回収した。回収された細胞を１５ｍｌ管で遠心分離した後、上澄液を除去し、細胞沈澱物をＰＢＳで懸濁し、細胞をさらに遠心分離し、洗浄した。細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を０．５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含むＰＢＳ１００μｌに懸濁し、マウス抗−ヒトモノクローナル抗体（Ｒｂ  １／９；１μｇ／ｍｌ）を加えた。モノクローナル抗体を氷上で３０分間細胞と結合するように誘導した後、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄し、ＦＩＴＣ（フルオロセインイソチオシアネート、前記は４０分間ＰＢＳで１：２５（Ｗ／Ｗ）稀釈時、ヤギＦ（ａｂ’）２抗−マウスＩｇＧと結合する）とともに氷中で培養した。次いで、細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳｃａｎ（Bio-Rad, USA）で分析して検定用試料によるＶＣＡＭ−１発現抑制活性を測定した。
【００３７】
【数５】
2004521933.tif 000010
【００３８】
チリアニンで処理されたＨＵＶＥＣ群のＶＣＡＭ−１発現に対する抑制活性を表３および図１に示し、強いＶＣＡＭ−１発現抑制活性を確認した。
【００３９】
[表３]
2004521933.tif 000011
【００４０】
[実施例４]  ＮＯ生成抑制活性
リポ多糖類（lipopolysaccharide、以下ＬＰＳ）で活性化を誘導したマウス単球／マクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７（以下、ＲＡＷ２６４．７細胞）によるＮＯ生成抑制活性に対する実験過程は次の通りである。
実験はシャーマン（Sherman）らの方法［Sherman et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 191, 1301-1308, 1993］を修正して使用し、ＲＡＷ２６４．７細胞を対象にＮＯの安定な酸化生成物である硝酸イオン（ＮＯ3-）の生成を測定し、試料による生成抑制率を測定した。ダルベッコ修飾イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle's medium, Gibco BRL, USA、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０％ＦＢＳ、６ｇ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、３．７ｇ／Ｌ炭酸水素ナトリウム）で培養したＲＡＷ２６４．７細胞にＬＰＳ（１０μｇ／ｍｌ）を添加して活性化を誘導した後、前記細胞をＣＯ2培養器（５％二酸化炭素、９５％相対湿度、３７℃）で４８時間培養した。その後、培地を遠心分離（１０００ｒｐｍ、１０分）して得た上澄液１００μｌにグリース試薬［Griess reagent：３７．５ｍＭスルファニル酸（sulphanilic acid）、１２．５ｍＭ  Ｎ−（１−ナフチル）エチレンジアミンジヒドロクロリド、６．５ｍＭ塩酸］１００μｌを添加して常温で１０分間反応させた後、分光光度計を用いて５４０ｎｍで吸光度を測定した。この際、０〜５０μＭの濃度別に製造した硝酸塩を用いてＮＯ3-濃度−吸光度相関係数を作成した後、ＲＡＷ２６４．７細胞で生成されたＮＯ3-濃度を計算した。検定用試料をＤＭＳＯに溶かした後、これをＲＡＷ２６４．７細胞にＬＰＳを処理する２時間前に０．１％で添加して反応させた後、ＮＯ3-濃度を測定して試料によるＮＯ3-生成抑制率を計算した。
【００４１】
【数６】
2004521933.tif 000012
【００４２】
【数７】
2004521933.tif 000013
【００４３】
その結果、下記表４のように、カワミドリ抽出物、クロロホルム分画物およびn-ブタノール分画物において強いNO生成抑制活性を示したことを確認した。
【００４４】
[表４]  カワミドリ抽出物および溶媒分画物のＮＯ生成阻害活性
2004521933.tif 000014
（註）** : P＜0.01,  * : P＜0.05
【００４５】
[実施例５]  カラギーナン−誘導急性炎症動物モデルの抗炎症活性
実験動物としてスプラグダウリー雄ラット（male Sprague-Dawley rats, 210〜220g）を用い、起炎剤としてカラギーナンを用いて浮腫が誘導されたモデルに対して検定用試料の浮腫抑制率を調査した。実験の詳しい過程は次の通りである。
検定用試料として水に懸濁したカワミドリ抽出物２００ｍｇ／ｋｇを各々のマウスに供給し、１時間後に０．８５％塩水中の１％カラギーナン懸濁液０．１ｍｌを実験動物の後肢足蹠に皮下投与した。実験動物は７匹を１群とし、投与直後から５時間まで毎時間ごとに足蹠の厚さを測定し、この際、無処理（塩水処理）群の足蹠の厚さを共に測定して時間別無処理群の浮腫増加に対する試料処理群の浮腫抑制率を調査した。
【００４６】
【数８】
2004521933.tif 000015
【００４７】
表５はカラギーナン−誘導急性炎症動物モデルにおいて、カワミドリ抽出物の抗炎症活性を示す。前記カワミドリ抽出物は溶媒投与２時間後から強い抗炎症活性を示し、測定した５時間の間浮腫抑制効果が持続された。
【００４８】
[表５]
カラギーナン−誘導急性炎症動物モデルにおけるカワミドリ抽出物の抗炎症活性度
2004521933.tif 000016
註）** : P＜0.01,  * : P＜0.05
【００４９】
[実施例６]  動脈硬化性病変抑制活性
動脈硬化性病変の抑制活性に対する実験の詳しい過程は次の通りでる。
（段階１）マウスの飼育とカワミドリ抽出物の前記マウスに対する投与実験
使用モデルとして雌ＬＤＬＲ−／−マウス（６〜８週齢、平均体重１６．８ｇ）を任意に１０匹ずつ２群に分けた。１群は高コレステロール規定食（１５％脂肪、１．２５％コレステロール、０．５％Ｎａ−コール酸含有）を摂取させ、もう１群は前記規定食にカワミドリ抽出物が０．１％および１％になるように混合して摂取させた。実験期間中には固形飼料と水を自由に供給した。
【００５０】
（段階２）動物モデルの動脈硬化性病変の測定
実験を開始してから８週間後にすべてのマウスから眼球を通じて血液を採取した。次いで、このマウスの心臓と動脈をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で１０分間潅流し、さらに５分間パラホルムアルデヒドで潅流した。このような過程が終った心臓と動脈を切取り、１０％中性ホルマリンに２４時間浸漬した後ＯＣＴ培地（１０．２４％ポリビニルアルコール、４．２６％ポリエチレングリコール、８０．５％非反応性成分、w/w, Life Science International, England, UK）で包埋し、−７０℃で冷凍保管した。冷凍された組織切片を−２０℃に保たれるミクロトームを用いて心臓弁膜が見える動脈部分を起始点として９μｍずつ６枚の切片に製造した後、染色薬オイルレッドＯ（Oil red O）で染色し、ハリスヘマトキシリンカウンター染色を行った。染色された切片をコンピュータ支援された形態計測術によって定量分析し、各動物群の平均病変の面積を測定し、無処理群の病変発生に対する試料処理群の病変抑制活性を計算した。
【００５１】
【数９】
2004521933.tif 000017
【００５２】
（１）カワミドリ処理群における動脈硬化性病変抑制活性に対する実験結果
表６に示すように、カワミドリ抽出物を添加した処理群は８週の実験期間の間無処理群に比べて摂取量および体重の変化を全く示さなかった。
【００５３】
[表６]
カワミドリ抽出物処理群および無処理群の実験期間中体重の比較
2004521933.tif 000018
【００５４】
また、表７に示すように、カワミドリ抽出物の動脈硬化性病変に対する抑制効果では、０．１％および１％のカワミドリ抽出物を含有する規定食を摂取した実験群が無処理群に比べて病変のサイズが各々２３．％および４６．６％減少した結果を示した。
【００５５】
[表７]
カワミドリ抽出物の動脈硬化性病変抑制活性
2004521933.tif 000019
註）* : P＜0.01
【００５６】
そして、心臓動脈の断面組織を染色した結果、炎症反応による病変（壊死組織）のサイズが無処理群に比べて１％カワミドり抽出物処理群において顕著に減少したことが観察され（図２）、病変組織のマクロファージのみを染色した場合、１％カワミドリ抽出物処理群は無処理群よりもマクロファージの蓄積が顕著に減少したことを確認した（図３）。
したがって、動脈硬化性病変が動脈内皮細胞の下でマクロファージのような免疫細胞の蓄積と炎症反応に発達する過程で、カワミドリ抽出物は炎症による病変の発達を顕著に減少させることを確認した。
【００５７】
（２）チリアニン群における動脈硬化性病変抑制活性に対する実験結果
表８に示すように、チリアニンの動脈硬化性病変抑制に対する影響の結果は１％チリアニンを含む規定食を供給した群の病変面積が無処理群に比べて４１．９％まで減少したことを示す。
【００５８】
[表８]
2004521933.tif 000020
註）*：陽性無処理群、**：Ｐ＜０．００３、***：Ｐ＜０．０００２
【００５９】
表８に示したように、１％ロバスタチン群において動脈硬化性病変抑制活性は１％チリアニン群よりも高かったが、本発明に係るチリアニンは副作用なしに安全である反面、ロバスタチンは肝で毒性効果を有する。また、本発明に係るチリアニン群は無処理群よりも顕著に効果的であることを確認した。
また、心臓動脈断面の染色結果は炎症反応によって引起こされた病変（壊死組織）の大きさが無処理群に比べて１％チリアニン群において顕著に減少したことを示した（図４）。したがって、動脈硬化性病変が内皮細胞の下でマクロファージのような免疫細胞の蓄積と炎症反応に発達する過程で、チリアニンは動脈硬化性病変の発達を顕著に減少させることを確認した。
【００６０】
[実施例７]  錠剤の製造
カワミドリ抽出物１０ｇ（チリアニン１ｇを含む）、ラクトース７０ｇ、結晶性セルロース１５ｇおよびステアリン酸マグネシウム５ｇを粉砕し、混合した後、直接打錠法によって錠剤を製造した。各錠剤の総量は１００ｍｇであり、有効成分としてカワミドリ抽出物の量は１０ｍｇ（チリアニン１ｍｇ）であった。
【００６１】
[実施例８]  粉末の製造
カワミドリ抽出物１０ｇ（チリアニン１ｇを含む）、トウモロコシ澱粉５０ｇおよびカルボキシセルロース４０ｇを粉砕し、混合して粉末を製造した。また、前記粉末１００ｍｇを硬度ＩＶのカプセルに作ってカプセルを製造した。
【００６２】
[実施例９]  毒性試験
昔から、カワミドリ抽出物と分離−精製によって得られたチリアニンは無毒性物質であり、食品および薬剤として用いられてきた天然薬剤であった。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、水で稀釈した成分１ｇ／ｋｇを各々のマウス（群当りマウス１０匹）に投与し、７日後に死んだマウスは発見されなかった。
【００６３】
[実施例１０]  カワミドリ抽出物を含む飲料成分
プラム抽出物（プラム固形抽出物（固形分量６９°Ｂｘ）、製造元：Hadong National Agricultural Cooperative Federation, KR）、中国産カリン、オニノタケ（韓当帰）（Angelica gigas Nakai)、乾しょうが、五味子（Maximowiczia chinensis)、桂皮（Kyongdong Market, Seoul)、ブドウ汁（固形分量６５°Ｂｘ、製造元：Comax international Corp.)および梨汁（製造元：Hanmi aromatics chemistry)をカワミドリ抽出物を含む飲料成分に製造した。
【００６４】
まず、中国産カリン、オニノタケ、乾しょうが、五味子、桂皮のような天然薬剤を各天然薬剤重量の１０倍の水を加えた後３０分間１００℃で熱水作用によって抽出した。これらを４℃で２４時間保管し、これを１０分間遠心分離した後、上澄液からの天然薬剤抽出物を用いた。
【００６５】
また、プラム固形分抽出物（６９°Ｂｘ）を有するプラム抽出物を１０°Ｂｘに稀釈して用い、ブドウ汁（６５Ｂｘ°）と梨汁（６９Ｂｘ°）は稀釈せずに用いた。
カワミドリ抽出物を含む飲料成分に対して、０．１％カワミドリ抽出物、０．２％プラム抽出物、０．３％乾しょうが抽出物、０．３％中国産カリン抽出物、０．０１％桂皮抽出物、５．０％梨汁および１７％スーパーフルクトースを水で稀釈して１００ｍｌを作り、照射し（irradiate）、９５℃で１５秒間処理して飲料型商品を製造した。
前記でカワミドリ抽出物を含む飲料型商品の製造方法について述べたが、同様な目的でカワミドリ抽出物の代わりにチリアニンを含む健康飲料商品を製造できる。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】内皮分子誘導に対するチリアニンの容量依存効果を示す。ＨＵＶＥＣを１０または１００μＭのチリアニンと２時間予備培養させ、ＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍｌ）で１６時間刺激し、ＶＣＡＭ−１またはアイソタイプ無処理群を染色し、フローサイトメトリー法によって分析した。
【図２】８週間コレステロール規定食を供給したＬｄｌｒ−／−マウスのオイルレッドＯ−染色された大動脈弁病変領域中の動脈硬化性病変に対するカワミドリ抽出物の効果を示す。（Ａ）無処理群および（Ｂ）１％カワミドリ抽出物−規定食処理群からの心臓大動脈弁の典型的な断面（ｘ１００）を示す。
【図３】マウスマクロファージモノクローナル抗体−２（monoclonal antibody to mouse macrophages-2, MOMA-2, Serotec Inc. NC. USA）を用いた、８週間コレステロール規定食を供給したＬｄｌｒ−／−マウスにおいて、（Ａ）無処理群および（Ｂ）１％カワミドリ抽出物−規定食処理群からの大動脈弁病変のマクロファージ蓄積に対する免疫化学的染色を示す。
【図４】８週間コレステロール規定食を供給したＬｄｌｒ−／−マウスの大動脈弁病変領域において動脈硬化性病変に対するチリアニンの効果を示す。（Ａ）無処理群および（Ｂ）１％カワミドリ抽出物−規定食処理群からの心臓大動脈弁の典型的な断面（ｘ４０）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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