(57)【要約】本発明は，試料のｍＲＮＡを増幅する方法に関し，該方法は，ｉ．）ポリアデニル化ＲＮＡにハイブリダイズし，かつ５’ポリ（Ｃ）または５’ポリ（Ｇ）フランクを含む少なくとも１つのプライマーを用いてポリアデニル化ＲＮＡからｃＤＮＡを生成し；ｉｉ．）（ａａ）ハイブリダイズしていない余剰のプライマーおよび／または余剰のｄＮＴＰが存在する場合にはこれを除去し；ｉｉ．）（ａｂ）前記生成したｃＤＮＡを，工程ｉにおいて５’ポリ（Ｃ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｇ）テイルを用いて，または工程ｉにおいて５’ポリ（Ｇ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｃ）テイルを用いて３’テイリングを行い；またはｉｉ．）（ｂ）余剰のプライマーおよび／または余剰のｄＮＴＰの存在または非存在にかかわらず，前記生成したｃＤＮＡを，工程ｉにおいて５’ポリ（Ｃ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｇ）テイルを用いて，または工程ｉにおいて５’ポリ（Ｇ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｃ）テイルを用いて，ＲＮＡ−リガーゼを用いて３’テイリングを行い；ｉｉｉ．）テイリングしたｃＤＮＡを，工程ｉｉ（ａｂ）またはｉｉ（ｂ）において生成したテイルにハイブリダイズしたプライマーを用いて増幅する，の各工程を含む。本発明はさらに，ｍＲＮＡの増幅の前記方法を用いて，試験試料において発現されている遺伝子を同定するために，病理学的状態の治療のための薬剤候補物を同定するために，および病理学的状態をインビトロで検出するために，インビトロ代用物を製造する方法に関する。本発明はさらに，本発明の方法により得られた増幅されたｃＤＮＡを，ハイブリダイゼーション，相互作用および／または酵素アレイにおいて用いることに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料のｍＲＮＡを増幅する方法であって，
ｉ．ポリアデニル化ＲＮＡにハイブリダイズし，５’ポリ（Ｃ）または５’ポリ（Ｇ）フランクを含む少なくとも１つのプライマーを用いてポリアデニル化ＲＮＡからｃＤＮＡを生成し；
ｉｉ．（ａａ）ハイブリダイズしていない余剰のプライマーおよび／または余剰のｄＮＴＰが存在する場合にはこれを除去し；
（ａｂ）前記生成したｃＤＮＡを，工程ｉにおいて５’ポリ（Ｃ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｇ）テイルを用いて，または工程ｉにおいて５’ポリ（Ｇ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｃ）テイルを用いて，３’テイリングを行い；または
（ｂ）余剰のプライマーおよび／または余剰のｄＮＴＰの存在または非存在にかかわらず，前記生成したｃＤＮＡを，工程ｉにおいて５’ポリ（Ｃ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｇ）テイルを用いて，または工程ｉにおいて５’ポリ（Ｇ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｃ）テイルを用いて，ＲＮＡ−リガーゼを用いて３’テイリングを行い；そして
ｉｉｉ．テイリングしたｃＤＮＡを，工程ｉｉ（ａｂ）またはｉｉ（ｂ）において生成したテイルにハイブリダイズするプライマーを用いて増幅する
の各工程を含む方法。
【請求項２】
工程”ｉ”における前記少なくとも１つのプライマーがランダムプライマー，オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはこれらの組み合わせである，請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記ランダムプライマーが，ランダムヘキサマーまたはランダムオクタマーオリゴヌクレオチドを含む，請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ランダムプライマーが配列番号１−９に示される配列を有する，請求項２または３記載の方法。
【請求項５】
前記オリゴ（ｄＴ）プライマーが配列番号１０に示される配列を有する，請求項２記載の方法。
【請求項６】
工程”ｉ”において，前記少なくとも１つのプライマーの濃度が，０．０１μＭから５００μＭの範囲，好ましくは０．１μＭから２００μＭの範囲，より好ましくは１μＭから１００μＭの範囲，さらにより好ましくは１０μＭから６０μＭの範囲である，請求項１−５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程”ｉｉｉ”における前記プライマーが，工程”ｉｉ（ａｂ）”または”ｉｉ（ｂ）”において生成したテイルにハイブリダイズしうる，少なくとも１０，好ましくは少なくとも１２，最も好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドのストレッチを含む，請求項１−６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記プライマーが，配列番号１１，１２，１３，１４または１５に記載される配列を有する，請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ポリアデニル化ＲＮＡが固体支持体に結合されている，請求項１−８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記固体支持体が，ビーズ，膜，フィルター，ウエル，チップまたはチューブである，請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記ビーズが，磁気ビーズ，ラテックスビーズまたはコロイド金属ビーズである，請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記ビーズがオリゴ（ｄＴ）ストレッチを含む，請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ｍＲＮＡが，組織，少数の細胞または単一の細胞に由来する，請求項１−１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記少数の細胞が１０６−２個の範囲の細胞である，請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記組織，細胞または単一の細胞が植物または動物起源のものである，請求項１３または１４記載の方法。
【請求項１６】
前記動物がヒトである，請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記組織，少数の細胞または単一の細胞が化学的に固定された組織，化学的に固定された少数の細胞または化学的に固定された細胞である，請求項１３−１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記組織，少数の細胞または単一の細胞が体液または固体組織に由来する，請求項１３−１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
生成した増幅されたｃＤＮＡをさらに修飾する工程”ｉｖ”をさらに含む，請求項１−１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記修飾が，検出手段の導入を含む，請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記検出手段が，発色団，蛍光染料，放射性ヌクレオチド，ビオチンまたはＤＩＧにカップリングされたヌクレオチド類似体の導入を含む，請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
得られた増幅されたｃＤＮＡが固体支持体に結合されている，請求項１−２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
すべてのまたは個々の工程が非カコジル酸緩衝液中で行われる，請求項１−２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記非カコジル酸緩衝液がリン酸緩衝液である，請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記リン酸緩衝液がＫＨ２ＰＯ４緩衝液である，請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記試料が細胞および／または組織に由来し，その遺伝的同一性が比較ゲノムハイブリダイゼーションにより明確にされている，請求項１−２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
病理学的に変更されている細胞または組織のインビトロ代用物を製造する方法であって，
（ａ）前記病理学的に変更されている細胞または組織のｍＲＮＡを請求項１−２６のいずれかに記載の方法の工程にしたがって増幅し；
（ｂ）増幅されたｃＤＮＡおよび／またはその転写産物の量，および任意に生物物理学的特性を評価し，このことにより前記病理学的に変更されている細胞または組織の遺伝子発現パターンを決定し；
（ｃ）その遺伝子発現パターンが前記病理学的に変更されている細胞または組織の遺伝子発現パターンと似ているインビトロ細胞を選択し；そして
（ｄ）前記インビトロ細胞の遺伝子発現パターンを病理学的に変更されている細胞または組織の遺伝子発現パターンに適合させる
の各工程を含む方法。
【請求項２８】
ｂ（１）対照細胞または対照組織の遺伝子発現パターンを決定し；そして
ｂ（２）前記病理学的に変更されている細胞または組織および前記対照細胞または組織において異なるように発現されている遺伝子を決定する
の工程をさらに含む，請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
対照細胞または対照組織の前記遺伝子発現パターンが，請求項１−２６のいずれかに記載の方法を用いて決定される，請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記病理学的に変更されている細胞または組織が再狭窄細胞または再狭窄組織である，請求項２７−２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記対照細胞または組織が，健康な冠状動脈の平滑筋細胞，中膜／内膜からなる群より選択される，請求項２８−３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記インビトロ細胞が，初代培養細胞，二次培養細胞，組織培養または細胞株に由来する，請求項２７−３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記インビトロ細胞が，培養冠状動脈平滑筋細胞，ＨｅｐＧ２細胞，Ｊｕｒｋａｔ細胞，ＴＨＰ−Ｉ細胞，Ｍｏｎｏｍａｃ−６−細胞，Ｕ９３７細胞，ＡＴＣＣ４５５０５細胞，培養心筋細胞，ＥＣＶ３０４細胞およびＮＩＨ３Ｔ３細胞からなる群より選択される，請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
工程ｃにおける前記適合が，前記インビトロ細胞を物理学的および／または化学的変化に暴露することを含む，請求項２７−３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
前記物理学的変化が，温度シフト，光変化，ｐＨ変化，イオン強度の変化または気相の変化を含む，請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記化学的変化が，培地交換，培地置換，培地涸渇および／または培地添加を含む，請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記化学的変化が，成長因子，ホルモン，ビタミン，抗体またはこれらのフラグメントおよび／または誘導体，サイトカイン，転写因子，キナーゼ，抗生物質，天然のおよび／または非天然のレセプターリガンドおよびシグナル伝達経路の成分等の化合物に暴露することを含む，請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
前記サイトカインがＩＦＮ−γ（またはその機能的誘導体）であり，前記天然のおよび／または非天然のレセプターリガンドがＩＦＮ−γレセプター（ａおよび／またはｂ鎖）のリガンドであり，前記転写因子がＩＲＦ−１またはＩＳＧＦ３−γ−（ｐ４８）であり，前記キナーゼがチロシンキナーゼＰｙｋ２であり，シグナル伝達経路の前記成分がＤａｐ−１，ＢＡＧ−１，Ｐｉｍ−１またはＩＦＮ−γ−誘導性蛋白質９−２７であり，前記成長因子が血小板成長因子ＡＡ，アンジオテンシンまたは線維芽細胞成長因子であり，または前記抗生物質がラパマイシンである，請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
請求項２７−３８のいずれかに記載の方法により得ることができるインビトロ代用物の薬剤スクリーニング方法における使用。
【請求項４０】
試験試料において異なるように発現されている遺伝子を同定する方法であって，
（ａ）それぞれがポリアデニル化ＲＮＡを含む試験試料および対照試料を用意し；
（ｂ）前記試料および対照試料について請求項１−２６のいずれかに記載の方法の工程を用い；そして
（ｃ）前記試験試料の得られた増幅されたｃＤＮＡを前記対照試料の得られた増幅されたｃＤＮＡと比較する
の各工程を含む方法。
【請求項４１】
病理学的状態または病理学的疾患を予防または治療するための薬剤候補物を同定する方法であって，
（ａ）ポリアデニル化ＲＮＡを含む試料を前記薬剤候補物と接触させ；
（ｂ）前記試料に，請求項１−２６のいずれかに記載の方法の工程を用い；そして
（ｃ）前記試料における特定の発現された遺伝子の存在，非存在，増加または減少を検出する，
の各工程を含み，ここで，前記存在，非存在，増加または減少と前記薬剤候補物の存在との相関により，前記薬剤候補物を薬剤として適したものであると認めることを特徴とする方法。
【請求項４２】
被験者における病理学的状態または病理学的状態の疑いをインビトロで検出する方法であって，
（ａ）前記被験者からのポリアデニル化ＲＮＡを含む試料を用意し；
（ｂ）前記試料に，請求項１−２６のいずれかに記載の方法の工程を用い；そして
（ｃ）前記試料における発現された遺伝子の存在，非存在，増加，減少または量に基づいて，病理学的状態または病理学的状態の疑いを検出する，
の各工程を含む方法。
【請求項４３】
請求項１−２６のいずれかに記載の方法により得られる増幅されたｃＤＮＡの，インビトロおよび／またはインビボ発現のための使用。
【請求項４４】
請求項１−２６のいずれかに記載の方法により得られる増幅されたｃＤＮＡの，ｍＲＮＡ転写産物のインビトロおよび／またはインビボ製造のための使用。
【請求項４５】
請求項１−２６のいずれかに記載の方法により得られる増幅されたｃＤＮＡ，または請求項４２記載のｍＲＮＡ転写産物の，ハイブリダイゼーションアッセイまたは相互作用アッセイにおける使用。
【請求項４６】
前記ハイブリダイゼーションアッセイが，オリゴヌクレオチドアレイ，ｃＤＮＡアレイ，および／またはＰＮＡアレイへのハイブリダイゼーションを含む，請求項４４記載の使用。
【請求項４７】
前記相互作用アッセイが，炭水化物，レクチン，リボザイム，蛋白質，ペプチド，抗体またはそれらのフラグメント，および／またはアプタマーとの相互作用を含む，請求項４４記載の使用。
【請求項４８】
請求項１−２６のいずれかに記載の方法により得られる増幅されたｃＤＮＡの，配列特異的ＰＣＲ，ｃＤＮＡクローニング，サブトラクティブハイブリダイゼーションクローニング，および／または発現クローニングのための使用。
【請求項４９】
請求項１−５および７−８のいずれかに記載の少なくとも１つのプライマーを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は試料のｍＲＮＡを増幅する方法に関し，該方法は，ｉ．）ポリアデニル化ＲＮＡにハイブリダイズし，５’ポリ（Ｃ）または５’ポリ（Ｇ）フランクを含む少なくとも１つのプライマーを用いてポリアデニル化ＲＮＡからｃＤＮＡを生成し；ｉｉ．）（ａａ）ハイブリダイズしていない余剰のプライマーおよび／または余剰のｄＮＴＰが存在する場合にはこれを除去し；ｉｉ．）（ａｂ）前記生成したｃＤＮＡを，工程ｉにおいて５’ポリ（Ｃ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｇ）テイルを用いて，または工程ｉにおいて５’ポリ（Ｇ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｃ）テイルを用いて３’テイリングを行い；またはｉｉ．）（ｂ）余剰のプライマーおよび／または余剰のｄＮＴＰの存在または非存在にかかわらず，前記生成したｃＤＮＡを，工程ｉにおいて５’ポリ（Ｃ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｇ）テイルを用いて，または工程ｉにおいて５’ポリ（Ｇ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｃ）テイルを用いて，ＲＮＡ−リガーゼを用いて３’テイリングを行い；ｉｉｉ．）テイリングしたｃＤＮＡを，工程ｉｉ（ａｂ）またはｉｉ（ｂ）において生成したテイルにハイブリダイズするプライマーを用いて増幅する，の各工程を含む。本発明はさらに，ｍＲＮＡの増幅の前記方法を用いて，試験試料において発現されている遺伝子を同定するために，病理学的状態の治療のための薬剤候補物を同定するために，および病理学的状態をインビトロで検出するために，インビトロ代用物を製造する方法に関する。本発明はさらに，本発明の方法により得られた増幅されたｃＤＮＡを，ハイブリダイゼーション，相互作用および／または酵素アレイにおいて用いることに関する。
【０００２】
本明細書のテキストの全体においていくつかの文献が引用される。これらの文献のそれぞれの開示内容（製造元の仕様書，指示等を含む）を本明細書の一部としてここに引用する。
【０００３】
遺伝子発現および遺伝子発現パターンの研究は，最近，ｃＤＮＡフィルターアッセイまたはｃＤＮＡマイクロアレイによるｍＲＮＡ発現の広範な分析により大きく変革してきた（特に，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｇｅｎｅｔ．１２（１９９６），１１０−１１５；Ｄｅｂｏｕｃｋ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：４８−５０（１９９９）；Ｈａｃｉａ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２１，４２−７（１９９９）；Ｃｏｌｅ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１，３８４１（１９９９）；ＢｏｗｔｅｌｌＤＤ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２１，２５−３２（１９９９）；Ｃｈｅｕｎｇ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２１，１５−１９（１９９９）；Ｄｕｇｇａｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２１，１０−１４（１９９９）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２１，５−９（１９９９）を参照）。例えば，Ｌｏｃｋｈａｒｔ（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１４（１９９６），１６７５−１６８０）は，多数のｍＲＮＡを数万種類の合成オリゴヌクレオチドを含む小さな高密度アレイにハイブリダイズさせて，数万種類の（発現された）遺伝子を同時にモニタリングすることに基づく方法を記載する。遺伝子発現用の別のマイクロアレイは，Ｓｈａｌｏｎ（Ｐａｔｈｏｌ．Ｂｉｏｌ．４６（１９９８），１０７−１０９），Ｌｏｃｋｈａｒｄｔ（Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＳｙｍｐ．Ｓｅｒ．３８（１９９８），１１−１２）またはＳｃｈｅｎａ（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６（１９９８），３０１−３０６）に記載されている。しかし，上述のｃＤＮＡ−アレイ技術の主な欠点の１つは，これらの技術が，ｍＲＮＡ，逆転写されたＲＮＡまたは増幅されたｃＤＮＡのいずれの形においても，２．５−１０μｇの量の核酸プローブを試験することが必要であることである（特に，Ｓｃｈｅｎａ（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０（１９９５），４６７−４７０およびＰＮＡＳ　Ｕ．Ｓ．Ａ．９３（１９９６），１０６１４−１０６１９）またはＬｏｃｋｈａｒｄｔ（１９９６）上掲を参照）。この量の材料は，通常は多数の，例えば１０９個の細胞から得る。Ｂｒｙａｎｔ（ＰＮＡＳ　Ｕ．Ｓ．Ａ．９６（１９９９），５５５９−５５６４）またはＭａｈａｄｅｖａｐｐａ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７（１９９９），１１３４−１１３６）は，少なくとも５００００個の細胞を用いるそのような方法を報告した。これまでにエクスビボ組織分析および対応する遺伝子発現に用いられた細胞の最小数は１，０００個であった（Ｌｕｏ，Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　５（１９９９），１１７−１２２）。しかし，多くの生理学的および／または病理学的状態は，より少ない数の細胞の，あるいは単一の細胞の遺伝子発現パターンもしくは”トランスクリプトーム”（所与の生物学的試料におけるｍＲＮＡ分子全体として定義される（Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕ，Ｃｅｌｌ，８８，２４３−２５１（１９９７））を調べることを必要とするであろう。例えば，胚形成において空間的かつ過渡的に制御される遺伝子発現の研究は，少数の細胞，特に単一の細胞を演繹することができる方法から明らかに利益を得るであろう。同様に，成人組織，とりわけ血液または神経（幹）細胞に由来する個々の細胞または少数の細胞の遺伝子発現パターン���トランスクリプトームを研究することは非常に興味が持たれるであろう。さらに，多数の病理学的状態を明らかにすることができ，例えば，異型性増殖，化生，新生物発生前病巣および／またはインシトゥー癌腫における制御解除された遺伝子発現を記述することができる。研究することができる，局所的に限定された病理学的プロセスの別の例には，限定されないが，再狭窄，アルツハイマー病，パーキンソン病，対宿主性移植片病または自己免疫における炎症が含まれる。さらに，小さい癌に由来する不顕性微小転移巣は，散在性腫瘍細胞が遠位臓器で生存し，増殖して転移として現れる場合，悲惨な結果となる。原発性腫瘍の切除後に残存する腫瘍細胞は，現在，骨髄吸引物においてサイトケラチンに対する抗体を用いる免疫細胞化学的染色により検出されている（概説として，Ｐａｎｔｅｌ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．９１，１１１３−１１２４（１９９９））。いくつかの研究により，骨髄におけるサイトケラチン−ポジティブ微小転移性細胞の予後的意義が確立されているが（Ｂｒａｕｎ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２，５２５−５３３（２０００）；Ｐａｎｔｅｌ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．９１，１１１３−１１２４（１９９９）），これらの細胞の生物学は，１０−５−１０−６の範囲の非常に低い頻度のために，不可解なままである。
【０００４】
癌細胞が全身に広がるためには，細胞が固体腫瘍から外に出て，血管またはリンパ管を通じて分布し，内皮および組織バリアを横切り，そして異所的に単一細胞として生存する必要がある。これらの段階に伴う表現型の変化は，発生的プロセス，すなわちいわゆる上皮−間葉変換（ＥＭＴ）であると考えられる（Ｈａｙ，Ａｃｔａ　Ａｎａｔｏｍｉｃａ，１５４，８−２０，（１９９５）；Ｂｉｒｃｈｍｅｉｅｒ，Ａｃｔａ　Ａｎａｔｏｍｉｃａ，１５６，２１７−２２６（１９９６））。腫瘍から散在する細胞のわずかに少ない割合のみがＥＭＴに関連する特徴を獲得することができる（Ｂｏｙｅｒ，Ａｃｔａ　Ａｎａｔｏｍｉｃａ，１５６，２２７−２３９（１９９６））。ＥＭＴにつながる後成性変化はこれまでに知られていないが，将来の治療法の開発に重要な意味を有するかもしれない。
【０００５】
例えば，散在性腫瘍細胞または病理学的に変更した組織の後成的変化の研究における主な技術的ハードルは，単一細胞レベルまたは少数の細胞でのアクセス可能性，低頻度，明白な識別，および続くトランスクリプトーム分析が限定されていることである。”単一細胞ｃＤＮＡライブラリ”の生成および個々の細胞からのｍＲＮＡの包括的増幅のために種々のプロトコルが開発されている（Ｂｅｌｙａｖｓｋｙ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１７，２９１９−２９３２（１９８９）；Ｂｒａｄｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２２５，６１１−６２３（１９９３）；およびＫａｒｒｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２，３８１４３８１８（１９９５）を参照）。しかし，これらの方法は，明らかな欠点，例えば，３’末端に限定されることおよびＰＣＲ増幅産物をｃＤＮＡアレイにハイブリダイズさせたときの感度が不十分である等の欠点を有する。
【０００６】
これらの方法においては，逆転写の間にｃＤＮＡの長さを制限することにより，ｃＤＮＡフラグメントの増幅の間に導入される変動を減少させていた。これはリバーストランスクリプターゼに対して低い基質条件を用いる，すなわち，低濃度のオリゴｄ（Ｔ）プライマーおよび低いｄＮＴＰ濃度を用いることにより行われた。しかし，逆転写および続くＰＣＲの効率を低くさせるリスクがあり，これは細胞／単一細胞のトランスクリプトーム／遺伝子発現パターンを調べるべき場合に，恣意的な結果につながるかもしれない。さらに，ＰＣＲ増幅にオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いると，高いアニーリング温度が制限され，したがってストリンジェントなアニーリング条件が制限される。典型的には，アニーリングは４２℃で行う（Ｂｒａｉｌ，Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４０６（１９９９），４５−５４）。本明細書において指摘するように，そのような方法は，３’限定ｃＤＮＡ合成に適しているであろう。しかし，より高いアニーリング温度は，増幅物をｃＤＮＡ分子と比較して短くさせるであろうｃＤＮＡにおける二次構造の存在およびｃＤＮＡの内部配列に対する非特異的アニーリングの可能性を低下させる。本発明の方法のアニーリング温度は，好ましくは４５℃より高く，より好ましくは５５℃より高く，さらにより好ましくは６５℃より高い。
【０００７】
上述したように，少数の細胞または単一の細胞中のｍＲＮＡの量は，直接包括的分析において用いるのには不十分である。したがって，少数の細胞または個別の単一の細胞から発現されたｍＲＮＡの（”トランスクリプトーム”の）包括的分析には，抽出されたおよび／または逆転写されたポリアデニル化ｍＲＮＡの増幅が必要である。これまで，少量のｍＲＮＡのＰＣＲ増幅によっては，特定の時点，特定の発達段階および／または特定の生理学的状態においてある種の細胞／少数の細胞に存在するｍＲＮＡの相対的発現を信頼性をもって表すことはできなかった（Ｂｒａｉｌ，Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅｓ　４０６（１９９９），４５−５４）。Ｂｒａｉｌ（１９９９），（上掲）は，Ｂｒａｄｙ（Ｂｒａｄｙ（１９９３）（上掲）により記載されるような方法は，テイリング反応またはＰＣＲ増幅工程において変動を導入するようであると結論づけている。特に，Ｂｒａｉｌの分析（Ｂｒａｉｌ（１９９９），上掲）は，非常に多量のハウスキーピング遺伝子についてさえも５倍の変動があることを示している（ＧＡＰＤＨとリボソーム遺伝子Ｌ３２との直接比較）。
【０００８】
本発明の技術的課題は，少数の細胞または単一の細胞のｍＲＮＡ，特にトランスクリプトームの包括的かつ均一な増幅の必要性を満たす手段および方法を提供することである。この技術的課題は，特許請求の範囲に記載される態様を提供することにより解決される。
【０００９】
したがって，本発明は，試料のｍＲＮＡを増幅する方法に関し，該方法は，以下の工程を含む：（ｉ）ポリアデニル化ＲＮＡにハイブリダイズしかつ５’ポリ（Ｃ）または５’ポリ（Ｇ）フランクを含む少なくとも１つのプライマーを用いてポリアデニル化ＲＮＡからｃＤＮＡを生成し；（ｉｉ）（ａａ）ハイブリダイズしていない余剰のプライマーおよび／または余剰のｄＮＴＰが存在する場合には，これを除去し；（ａｂ）前記生成したｃＤＮＡを，工程ｉにおいて５’ポリ（Ｃ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｇ）テイルにより，工程ｉにおいて５’ポリ（Ｇ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｃ）テイルにより，３’テイリングを行い；または（ｂ）余剰のプライマーおよび／または余剰のｄＮＴＰの存在または非存在にかかわらず，前記生成したｃＤＮＡを，工程ｉにおいて５’ポリ（Ｃ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｇ）テイルを用いて，または工程ｉにおいて５’ポリ（Ｇ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｃ）テイルを用いて，ＲＮＡリガーゼを用いて３’テイリングを行い；そして（ｉｉｉ）テイリングしたｃＤＮＡを，工程（ｉｉ）（ａｂ）または（ｉｉ）（ｂ）で生成したテイルにハイブリダイズするプライマーを用いて増幅する。
【００１０】
ポリアデニル化ＲＮＡは，当該技術分野において知られる方法により試料から得ることができる。これらの方法には，オリゴ（ｄＴ）選択工程が含まれる。試料は動物または植物起源のものであることができ，組織または細胞試料であることができる。前記試料はまた，培養した組織または培養した細胞を含んでいてもよい。特に好ましいものはヒト起源の試料である。試料は当該技術分野において知られる方法により得ることができ，これには，限定されないが，アテレクトミー，減量手術，生検，レーザー切開または肉眼外科手術法が含まれる。
【００１１】
本明細書に記載される，前記試料からｍＲＮＡを増幅する技術および方法は，試料から得られた前記ポリアデニル化ＲＮＡを用いて，５’−オリゴ（ｄＣ）／ポリ（Ｃ）（または５’−オリゴ（ｄＧ）／ポリ（Ｇ））フランキング領域を含むプライマーを用いて第１のｃＤＮＡ産物を生成する工程を含む。前記５’−オリゴ（ｄＣ）または５’−オリゴ（ｄＧ）プライマーは，好ましくは８−２０個のシトシン（またはグアニン）ヌクレオチド，より好ましくは１０個のシトシン（またはグアニン）ヌクレオチドを含み，より好ましくは前記プライマーは１１個の，さらにより好ましくは前記プライマーは１３個の，最も好ましくは前記プライマーは１５個のシトシン（またはグアニン）ヌクレオチドを含む。第１のｃＤＮＡ合成は，潜在的に夾雑しているｔＲＮＡまたはｒＲＮＡを除去した後に行うことが好ましい。このような除去は，当業者に知られる方法により行うことができ，例えば，ポリアデニル化ｍＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）／ポリ（Ｔ）−被覆固体支持体（本明細書において定義される）に結合させ，次に洗浄する工程により行うことができる。
【００１２】
さらに，この第１のｃＤＮＡ合成工程は，好ましくは，先の研究において用いられるプライマー濃度（例えば，Ｔｒｕｍｐｅｒ，Ｂｌｏｏｄ　８１（１９９３），３０９７−３１１５において用いられた１０ｎＭ）より２，０００−８，０００倍高い濃度で存在するランダムプライマーを含む。さらに，前記第１のｃＤＮＡ合成，すなわち，ポリアデニル化ＲＮＡからｃＤＮＡの生成は，対応して高い濃度のｄＮＴＰ，好ましくは０．５ｍＭの濃度のｄＮＴＰ中で行うことが好ましい。この第１のｃＤＮＡ調製工程（工程”ｉ”）はまた，得られるｃＤＮＡを標識する手段を含んでいてもよい。標識は，当業者に知られる方法により導入することができ（特に，”Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＵＳＡ（１９８８）を参照），標識ｄＮＴＰ（例えばビオチン標識，放射性標識またはフルオレセイン標識ｄＮＴＰ）を用いることを含んでいてもよい。好ましくはランダムプライマーを用いるこの第１のｃＤＮＡ合成工程（逆転写）は，標準的な酵素，好ましくはＲＮＡｓｅＨ欠陥リバーストランスクリプターゼ，例えばＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩリバーストランスクリプターゼ（ＧＩＢＣＯ）を用いることを含んでいてもよい。
【００１３】
高いｄＮＴＰ濃度は前記第１のｃＤＮＡ合成を改良するが，続く反応のいずれか（例えばテイリング反応）を妨害するかもしれないため，（本発明の方法の次の反応および／または工程を行う前に）余剰の遊離のｄＮＴＰを除去することが好ましい。好ましくは，過剰の，ハイブリダイズしていないプライマーもまた，次の工程を行う前に除去する。前記除去は，とりわけ，洗浄工程，例えば緩衝液交換（後述の実施例に示されるように）により，または濾過法（すなわち，オーバーサイズ選択膜）により，行うことができる。しかし，前記除去工程は，余剰のｄＮＴＰおよび／またはプライマーが存在しない場合には省略することもできる。さらに，続く”テイリング−工程”をＲＮＡ−リガーゼ工程により行う場合には，除去工程を行わなくてもよい。
【００１４】
本発明の方法の３’−テイリング反応（本発明の方法の工程（ｉｉ）（ａｂ）または（ｉｉ）（ｂ）を参照）は，工程”ｉ”において５’ポリ（Ｃ）フランクを含むプライマーを用いる場合にはポリ（Ｇ）により，工程”ｉ”において５’ポリ（Ｇ）フランクを含むプライマーを用いる場合にはポリ（Ｃ）により，テイリングすることを含む。後述の実施例に示されるように，驚くべきことに，とりわけポリ（Ｇ）−テイルに結合するポリ（Ｃ）プライマーは，従来技術において提案されているポリ（Ａ）テイルに結合するポリ（Ｔ）プライマー（Ｂｒａｄｙ（１９９３），上掲；Ｔｒｕｍｐｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，８１，３０９７−３１１５（１９９３））より少なくとも１００倍感度が高いことが見いだされた。
【００１５】
テイリング反応は，３’末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ活性を有する酵素を用いて，好ましくは非カコジル酸含有保存緩衝液中で，例えば末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＭＢＩ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて行うことができる。しかし，前記”テイリング”工程はまた，ＲＮＡ−リガーゼにより行うこともできることに注意すべきである（Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，１９，５２２７−５２３２（１９９１）を参照）。この場合には，前記ＲＮＡリガーゼにより，オリゴ（ｄＣ）またはオリゴ（ｄＧ）フランキング領域を一本鎖ｃＤＮＡ分子の３’末端にライゲーションすることができる。フランキング領域の配列は，ｃＤＮＡ合成プライマーのフランキング領域にハイブリダイズすることができる（Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９（１９９１），５２２７−５２３２）。
【００１６】
最後に，ポリＧ／ポリＣ−テイル付加ｃＤＮＡをさらに増幅することができる。これらのｃＤＮＡは５’プライマーにより導入されたオリゴ（Ｃ）（またはＧ）ストレッチ，および例えばターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼにより導入された３’オリゴ（Ｇ）（またはＣ）ストレッチを含むためである。この第２のＰＣＲ反応は，標識ヌクレオチドの存在下で行うことができる。好ましいものはビオチン標識，フルオレセイン標識，ジオキシゲニン標識または放射性標識ヌクレオチドであり，これらは当該技術分野において知られている。さらに，１つのｃＤＮＡ種あたり１つのタグ／標識を得るために，”タグ付き”オリゴヌクレオチドプライマー（例えば，ビオチン−，フルオレセイン−，ジオキシゲニン−，または放射性−標識オリゴヌクレオチドプライマー）を用いることも，本発明の範囲内である。
【００１７】
本発明の方法の好ましい態様においては，工程”ｉ”における前記少なくとも１つのプライマーは，ランダムプライマー，オリゴ（ｄＴ）プライマーまたはこれらの組み合わせである。前記ランダムプライマーは，４−１０個のランダムヌクレオチドのストレッチ，好ましくは５−９個のランダムヌクレオチドのストレッチを含んでいてもよい。最も好ましくは，前記ランダムプライマーは，ランダムヘキサマーまたはランダムオクタマーオリゴヌクレオチドを含む。前記ランダムプライマーが配列番号１−８に示される配列を有することが特に好ましい。さらにより特に好ましいものは，後述の実施例において用いられる，ヌクレオチド５’−（ＣＣＣ）５ＧＴＣＴＡＧ−Ａ（Ｎ）６（配列番号８）を含むランダムプライマーである。
【００１８】
後述の実施例に示されるように，前記ランダムプライマーはまた，他のランダムプライマーまたはオリゴ（ｄＴ）プライマーと組み合わせて用いることもできる。例えば，本発明の工程”ｉ”においては，プライマー対（ＣＦＩ５ｃ８，配列番号９に対応）および（ＣＦＩ５ｃＴ，配列番号１０に対応）を用いることができ，これは配列５’−（ＣＣＣ）５ＧＴＣＴＡＧＡ（Ｎ）８および５’−（ＣＣＣ）５ＧＴＣＴＡＧＡＴＴ（ＴＴＴ）４ＴＶＮ（式中，”Ｖ”はＧ，ＣまたはＡを表し，ＮはＧ，Ｔ，ＣまたはＡを表す）を含む。したがって，オクタマー（例えば配列番号９を参照）を含むポリｄ（Ｃ）／（Ｇ）プライマーの組み合わせをオリゴ（ｄＴ）プライマー（配列番号１０を参照）と組み合わせて用いることが特に好ましい。
【００１９】
したがって，本発明の方法のさらに別の好ましい態様においては，工程”ｉ”において用いるべきオリゴ（ｄＴ）プライマーは，配列番号１０に示される配列を有し，配列５’−（ＣＣＣ）５ＧＴＣＴＡＧＡＴＴ（ＴＴＴ）４ＴＶＮを含む。上述したように，本発明の方法の工程”ｉ”において用いるべき前記オリゴ（ｄＴ）プライマーは，単独で用いてもよく，上述したようにランダムプライマーと組み合わせて用いてもよい。前記オリゴ（ｄＴ）プライマーは，好ましくはオリゴ（ｄＴ）ストレッチを含むプライマーである。
【００２０】
本発明の方法の別の好ましい態様においては，工程”ｉ”における前記少なくとも１つのプライマーの濃度は，０．０１μＭから５００μＭの範囲内，好ましくは０．１μＭから２００μＭの範囲内，より好ましくは１μＭから１００μＭの範囲内，さらにより好ましくは１０μＭから６０μＭの範囲内である。下記の実施例に示されるように，最も好ましい濃度は約５０μＭである。
【００２１】
本発明の方法のさらに別の好ましい態様においては，工程”ｉｉｉ”における前記プライマーは，工程”ｉｉ（ａｂ）”または”ｉｉ（ｂ）”において生成したテイルにハイブリダイズすることができる，少なくとも１０，好ましくは少なくとも１２，最も好ましくは少なくとも１５ヌクレオチドのストレッチを含む。前記プライマーが本発明の方法の工程”ｉｉ（ａｂ）”または”ｉｉ（ｂ）”において生成したテイルとハイブリダイズしうる２０より長いヌクレオチドを含まないことが好ましい。好ましい態様においては，工程”ｉｉｉ”における前記プライマーは，配列番号１１，１２，１３，１４または１５に示される配列を有する。後述の実施例に示されるように，工程”ｉｉｉ”における特に好ましいプライマーは，ヌクレオチド配列５’ＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧ（ＣＣＣ）５（配列番号１４を参照）を含むプライマー”ＣＰ２”であり，この”包括的増幅”工程においてこれを用いて特に良好な結果が得られた。したがって，この工程において単一のプライマーを用いる場合，工程”ｉｉ（ａｂ）”または”ｉｉ（ｂ）”においてポリ（Ｇ）−テイリングを行うならば，上述の”ＣＰ２”プライマーが特に好ましい。本発明の工程”ｉｖ”において単一のプライマーのみを用いることの利点は，潜在的な”プライマー−プライマー”相互作用を回避することができ，比較的高いプライマー濃度，好ましくは０．２μＭより高い，より好ましくは０．８μＭより高い，さらにより好ましくは１．０μＭより高い濃度を用いることができる点である。１．０μＭまたは１．２μＭより高い，より高いプライマー濃度を用いることもできる。
【００２２】
本発明の方法の別の好ましい態様においては，前記ポリアデニル化ＲＮＡ（および／または増幅すべきｍＲＮＡ）は固体支持体に結合させる。前記固体支持体は，とりわけ，ビーズ，膜，フィルター，ウエル，チップまたはチューブであることができる。特に好ましいものは，磁気ビーズ，ラテックスビーズまたはコロイド金属ビーズである。しかし，前記ポリアデニル化ＲＮＡは，固体支持体，例えばポリスチレンビーズに結合させてもよい。当該技術分野において知られる固相にはまた，ガラスおよび／またはシリコン表面，ニトロセルロースのストリップまたは膜，およびプラスチック（試験）管が含まれる。核酸を固定化する，特にポリアデニル化ＲＮＡを固相に固定化する適当な方法には，限定されないが，イオン的，疎水的，共有結合的相互作用などが含まれる。固相は１またはそれ以上の追加のレセプター，例えば，ポリ（Ｔ）ストレッチを保持していてもよく，これは，ポリアデニル化ＲＮＡを誘因し固定化する能力を有する。このレセプターはまた，核酸とは逆に荷電した荷電物質を含むことができる。したがって，本発明の方法の最も好ましい態様においては，固体支持体（前記の磁気ビーズなど）はオリゴ（ｄＴ）ストレッチを含む。
【００２３】
後述の実施例において示されるように，本発明の方法により増幅すべきｍＲＮＡ／ポリアデニル化ＲＮＡは，オリゴ（ｄＴ）被覆固体支持体，例えばオリゴ（ｄＴ）被覆磁気ビーズで容易に単離することができる。
【００２４】
本発明のさらに別の態様においては，増幅すべきｍＲＮＡは，組織，少数の細胞または単一の細胞に由来する。前記少数の細胞は，１０６−２個の範囲の細胞であることができる。前記組織，細胞または単一の細胞は，植物または動物起源のものであることができる。前記組織，細胞または単一の細胞はヒト起源のものであることが特に好ましい。前記組織，細胞または単一の細胞は，さらに，病理学的試料および／または病理学的であることが疑われる試料であってもよい。病理学的であるか，病理学的であると疑われるか，または正常／健康のいずれであっても，前記組織，（少数の）細胞または単一の細胞は，体液に，または固体組織に由来するものであってもよい。体液には，血液，リンパ液，腹膜液，脊髄／脳脊髄液，羊膜液，尿または糞便が含まれる。前記固体組織は，すべての動物／ヒト臓器または腺に由来するものであることができる。さらに，前記組織には，腫瘍などの悪性形質転換または再狭窄組織が含まれる。したがって，前記組織，（少数の）細胞，または単一の細胞はまた，癌腫，肉腫，リンパ腫，白血病または神経膠腫に由来するものであってもよい。しかし，本発明の方法は，良性組織，正常組織ならびに培養試料，たとえば培養組織および／または培養細胞に由来する試料についても適用しうることに注意すべきである。組織，少数の細胞および／または単一の細胞は，当該技術分野において知られる方法により得ることができ，これには，限定されないが，生検，吸引物または希釈物が含まれる。試料はまた，ＦＡＣＳソーティングまたは免疫学的方法または”レセプター／リガンド”結合方法により分離し入手することができる。後述の実施例に示されるように，試料はまた，動脈切除，例えば動脈切除用のらせん装置（Ｘ−サイザー，Ｅｎｄｉｃｏｒ）により得ることができる。
【００２５】
本発明の方法の別の好ましい態様においては，前記組織，少数の細胞または単一の細胞は，化学的に固定した組織，化学的に固定した少数の細胞または化学的に固定した細胞である。前記固定は，（パラ）ホルムアルデヒド中で行うことができる。好ましい濃度は０．１−１％の範囲であるが，最も好ましくは０．１％の濃度である。前記固定は，好ましくは，３０分間未満で行う（１％より低い濃度を用いる場合）。最も好ましくは，前記固定は０．１％の濃度の（パラ）ホルムアルデヒド中で５分間行う。
【００２６】
別の好ましい態様においては，本発明の方法はさらに，生成した増幅されたｃＤＮＡをさらに修飾する工程”ｉｖ”を含む。前記修飾は，検出手段の導入，例えば，単数または複数の発色団，蛍光染料，放射性ヌクレオチド，ビオチンまたはＤＩＧとカップリングさせたヌクレオチド類似体を導入することを含む。増幅されたｃＤＮＡの標識は，後述の実施例に記載されるように，または，とりわけ，Ｓｐｉｒｉｎ（１９９９），Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４０，３１０８−３１１５に記載されるように行うことができる。
【００２７】
さらに，得られた増幅されたｃＤＮＡを固体支持体（上で定義したとおりである）に結合させることが好ましい。
【００２８】
標準的なカコジル酸含有緩衝液（ある種のｃＤＮＡ合成緩衝液など）は本発明の方法の個々の工程（”テイリング反応”など）を妨害するかもしれないため，すべてのまたは個々の工程を非カコジル酸緩衝液中で行うことが好ましい。特に好ましいものはリン酸緩衝液であり，最も好ましいものは後述の実施例において用いられているようなＫＨ２ＰＯ４緩衝液である。好ましくは，前記緩衝液は，低イオン強度の緩衝液である（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，４１−５０（１９７９）を参照）。さらに，”テイリング”反応においてｄＧＴＰまたはｄＣＴＰを用いると１５−３０ヌクレオチドの短い伸長が得られるが，ｄＡＴＰまたはｄＴＴＰを用いると７０から数百ヌクレオチドの範囲の長い伸長が得られる（Ｎｅｌｓｏｎ（１９７９），上掲；ＭＢＩ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ　１９９８／１９９９カタログ，ｐ．１２５）；Ｄｅｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１００，９６−１１６，（１９８３））。しかし，長いポリ（ｄＡ）／（ｄＴ）テイルを用いると，種々のハイブリダイゼーション／アニーリング部位が存在するため，増幅の間に非均一的なｃＤＮＡの集団が生ずる。これに対し，短い（１０−３０塩基）５’プライマーおよび３’テイリングにより導入されたオリゴ（ｄＣ）またはオリゴ（ｄＧ）フランキング領域を用いる本発明の方法は，増幅されたｃＤＮＡの均一な集団を生成し，元のｃＤＮＡ分子のコーディング領域を優先的に増幅する。
【００２９】
本発明の方法のさらに別のより好ましい態様においては，増幅すべきｍＲＮＡ／ポリアデニル化ＲＮＡを含む試料は，細胞および／または組織に由来するものであり（または細胞および／または組織であり），その遺伝的同一性は，比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）により明確にされている。実施例に示されるように，最近，単一の細胞のＣＧＨを含む方法（ＳＣＯＭＰ；Ｋｌｅｉｎ（１９９９），ＰＮＡＳ　ＵＳＡ９６，４４９４−４４９９）を参照）が記載されており，これは，単一の細胞の明白な同定を可能とする。この方法を用いて，とりわけ，腫瘍細胞および／または腫瘍起源の細胞を染色体異常により同定することが可能である。したがって，本明細書に記載されるｍＲＮＡ増幅の方法を用いて，前記方法をＳＣＯＭＰと組み合わせることにより，同じ単一の細胞からゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを単離することが可能である。
【００３０】
本発明はまた，病理学的に変更されている細胞または組織のインビトロ代用物を製造する方法に関する。該方法は，以下の工程を含む：
（ａ）前記病理学的に変更されている細胞または組織のをｍＲＮＡを，上述の方法の工程にしたがって増幅し；
（ｂ）得られたｃＤＮＡおよび／またはその転写産物の量，および任意に生物物理学的特性を評価し，このことにより前記病理学的に変更されている細胞または組織の遺伝子発現パターンを決定し；
（ｃ）その遺伝子発現パターンが前記病理学的に変更されている細胞または組織の遺伝子発現パターンと似ているインビトロ細胞を選択し；そして
（ｄ）前記インビトロ細胞の遺伝子発現パターンを病理学的に変更されている細胞または組織の遺伝子発現パターンに適合させる。
【００３１】
本明細書において用いる場合，”インビトロ代用物”との用語は，病理学的状況または病理学的状態を模倣しうる細胞または細胞株を意味する。前記代用物は，とりわけ，医学，薬理学または化学的実験において有用であり，薬剤スクリーニングの目的に用いることができる。特に，このような代用細胞／細胞株は，潜在的薬剤および／または医薬品を同定するために用いることができる。そのような同定は，化学物質および／または生物学的製剤のライブラリをスクリーニングすることにより行うことができ，好ましくは，前記代用物はハイスループットスクリーニングにおいて用いられる。
【００３２】
得られたｃＤＮＡおよび／またはその転写産物の量，および任意に生物物理学的特性の評価は，当業者に知られる方法および／または本明細書に記載される方法により行うことができる。
【００３３】
本発明にしたがって用いる場合，”インビトロ細胞”との用語は，好ましくは，培養中で維持することができる細胞に関する。前記細胞は，好ましくは，少なくとも１時間，より好ましくは少なくとも６時間，より好ましくは少なくとも１２時間，より好ましくは少なくとも１日間，より好ましくは少なくとも２日間，より好ましくは少なくとも３日間，より好ましくは少なくとも１週間，最も好ましくは数週間の間培養中で維持される。
【００３４】
前記代用物／インビトロ代用物が，病理学的に変更されている細胞または組織のトランスクリプトーム／遺伝子発現パターンを忠実に反映することが特に好ましい。前記代用物は，病理学的に変更されている組織または病理学的に変更されている細胞と非常に似ているべきである。したがって，上述の工程ｃに記載される”インビトロ細胞”が病理学的に変更されている組織／細胞と類似していることが好ましい。例えば，”インビトロ細胞”は，病理学的に変更されている／患部組織と類似する組織または臓器に由来するものであることができる。とりわけ，冠状動脈平滑筋細胞を”インビトロ細胞”として用いることができ，この遺伝子発現パターンは再狭窄組織の遺伝子発現パターンと似ている。同様に，肝臓細胞（例えばＨｅｐＧ２）は，病理学的に変更されている肝臓組織の，培養腎臓細胞（例えば，ＡＴＣＣ４５５０５）は腎臓患部組織の，心臓筋芽細胞（例えばラット心筋細胞）は心筋患部組織の，またはＲｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２４（２０００），２２７−２３５に記載されるＮＣＩ細胞株は腫瘍性疾病，新生物疾病または癌の，それぞれ代用物を得るために用いることができる。
【００３５】
上述の工程（ｄ）の前記”適合”は，選択された”インビトロ細胞”の遺伝子発現パターンを，病理学的に変更されている組織／細胞の遺伝子発現パターンをより密接に反映する遺伝子発現パターンに適合させるために行う。特に，（上述の方法の工程（ａ）および（ｂ）において），特定の転写産物／発現遺伝子（または特定の転写産物／発現遺伝子の群）が前記”インビトロ細胞”（または対照細胞）と比較してダウンレギュレートされていることが見いだされた場合，前記”インビトロ細胞”における前記転写産物／発現遺伝子（または前記転写産物／発現遺伝子の群）の発現をアップレギュレートすることを試み留べきである。したがって，特定の転写産物／発現遺伝子（または特定の転写産物／発現遺伝子の群）が前記”インビトロ細胞”（または対照細胞）と比較してアップレギュレートされている場合，前記”インビトロ細胞”における前記転写産物／発現遺伝子（またはこれらの群）をダウンレギュレートさせることを試みるべきである。前記インビトロ細胞の遺伝子発現パターンを適合させるのに有用であろう特定の方法，因子，化合物および／または物質は，以下に記載される。
【００３６】
１つの態様においては，前記適合工程は，前記インビトロ細胞を少なくとも１つの化合物，因子，物質，複数の化合物，因子，物質またはこれらの組み合わせと接触させ，前記接触により前記インビトロ細胞における遺伝子発現パターン／トランスクリプトームが変更されるか否かを評価することを含むことが好ましい。遺伝子発現パターンの評価は本発明の方法により行うことができるが，当該技術分野において知られる他の分析方法，例えば生化学的または生物物理学的方法を含んでいてもよい。本発明において特に好ましい方法は，一次元または二次元（ゲル）電気泳動，高速液体クロマトグラフィー，質量分析または抗体に基づく検出方法（ブロッティングまたはアレイシステム）を含むプロテオーム分析の方法である。
【００３７】
上述の病理学的に変更されている細胞または組織および／またはインビトロ細胞は，好ましくは動物起源のものである。特に好ましいものは，霊長類，齧歯類または偶蹄目類に由来するか，および／またはこれらから得られた細胞または組織である。さらにより好ましいものは，ヒト，サル，ブタ，ウシ，ラットまたはマウスからの細胞および／または組織である。
【００３８】
さらに別の態様においては，病理学的に変更されている細胞または組織用のインビトロ代用物を製造する方法は，以下の工程を含む：
ｂ（１）．対照細胞または対照組織の遺伝子発現パターンを決定し；そして
ｂ（２）．病理学的に変更されている細胞または組織と前記対照細胞または組織とにおいて異なるように発現されている遺伝子を決定する。
【００３９】
ここで述べる対照細胞または対照組織は，当業者が容易に決定することができる。例えば，健康なドナーから得た類似する組織を用いることができる。例えば，後述の実施例に示されるように，再狭窄組織の対照組織は，健康な冠状動脈の中膜または中膜／内膜であることができる。さらに，対照細胞または対照組織は，肝臓組織，腎臓組織，前立腺，子宮頚部組織等の生検の間に得ることができる。
【００４０】
前記対照細胞または対照組織の遺伝子発現パターン，すなわち”トランスクリプトーム”はまた，本明細書に記載される試料のｍＲＮＡの増幅方法を用いて決定することが特に好ましい。好ましくは，試料，例えば病理学的に変更されている細胞または組織，対照細胞または対照組織の前記トランスクリプトーム分析は，以下の工程を含む：
ｉ．ポリアデニル化ＲＮＡにハイブリダイズし，かつ５’ポリ（Ｃ）または５’ポリ（Ｇ）フランクを含む少なくとも１つのプライマーを用いて，前記病理学的に変更されている細胞または組織，前記対照細胞または組織および／または前記インビトロ細胞のポリアデニル化ＲＮＡからｃＤＮＡを生成し；
ｉｉ．（ａａ）ハイブリダイズしていない余剰のプライマーおよび／または余剰のｄＮＴＰが存在する場合にはこれを除去し；
（ａｂ）前記生成したｃＤＮＡを，工程ｉにおいて５’ポリ（Ｃ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｇ）テイルを用いて，工程ｉにおいて５’ポリ（Ｇ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはまたはポリ（Ｃ）テイルを用いて，３’テイリングを行い；または
（ｂ）余剰のプライマーおよび／または余剰のｄＮＴＰの存在または非存在にかかわらず，前記生成したｃＤＮＡを，工程ｉにおいて５’ポリ（Ｃ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｇ）テイルを用いて，または工程ｉにおいて５’ポリ（Ｇ）フランクを含むプライマーを用いた場合にはポリ（Ｃ）テイルを用いて，ＲＮＡリガーゼを用いて３’テイリングを行い；
ｉｉｉ．テイリングしたｃＤＮＡを工程ｉｉ（ａｂ）またはｉｉ（ｂ）において生成したテイルにハイブリダイズするプライマーにより増幅し；
ｉｖ．増幅されたｃＤＮＡをハイブリダイゼーションアッセイにおいて用い；そして
ｖ．前記病理学的に変更されている細胞または組織，前記対照細胞または組織および／または前記インビトロ細胞の遺伝子発現パターンの相違性および／または類似性を検出する。
【００４１】
本発明の方法の上述の態様は，前記病理学的に変更されている細胞または組織，対照細胞または対照組織および／または前記インビトロ細胞の前記トランスクリプトーム分析に適用することができる。
【００４２】
インビトロ代用物を製造する上述の方法は，とりわけ，再狭窄組織または再狭窄細胞に用いることができる。前記対照細胞または前記対照組織は，（健康な）冠状動脈の平滑筋細胞，中膜／内膜および（健康な）末梢動脈の中膜／内膜からなる群より選択することができる。
【００４３】
病理学的に変更されている細胞または組織の遺伝子発現パターンに適合させるるべき”インビトロ細胞”は，初代培養細胞，二次培養細胞，組織培養または細胞株に由来するものでありうる。好ましくは，これらの細胞および／または培養細胞は，限定されないが，培養筋肉細胞，培養平滑筋細胞，培養冠状動脈平滑筋細胞，ＨｅｐＧ２細胞，Ｊｕｒｋａｔ細胞，ＴＨＰ−１細胞，Ｍｏｎｏｍａｃ−６細胞またはＵ９３７−細胞でありうる。そのような細胞は，当該技術分野において知られる起源，例えばＤＳＭＺ（ＡＴＣＣ，ＵＳＡの支社）から容易に入手することができる。さらに，心臓筋芽細胞を”インビトロ細胞”として”代用物”に適合させるために用いることができる。
【００４４】
前記適合工程（インビトロ代用物を製造するための上述の方法の工程ｄ）は，前記インビトロ細胞を物理学的および／または化学的変化に暴露することを含んでいてもよい。ここで，前記物理学的変化は，温度シフト，光変化，圧力，ｐＨ変化，イオン強度の変化または気相の組成の変化（例えばＯ２，Ｎ２，ＣＯ，ＣＯ２）を含むことができ，前記化学的変化は，培地交換，培地置換，培地涸渇および／または培地添加を含むことができる。前記化学的変化が，化合物，例えば成長因子，ホルモン，ビタミン，抗体またはこれらのフラグメントおよび／または誘導体，小分子リガンド，サイトカイン，転写因子，キナーゼ，抗生物質，天然のおよび／または非天然のレセプターリガンド，またはシグナル伝達経路の構成成分に暴露することを含むことが特に好ましい。前記適合工程はまた，他の細胞／細胞株との共培養，例えば血液細胞，グリア細胞，樹状細胞または破骨細胞との共培養を含んでいてもよい。前記血液細胞は，単球およびＴ−リンパ球を含んでいてもよい。
【００４５】
インビトロ代用物を製造するための方法のさらに好ましい態様においては，前記サイトカインはＩＦＮ−γ（またはその機能的誘導体）であり，前記天然のおよび／または非天然のレセプターリガンドはＩＦＮ−γレセプター（ａおよび／またはｂ鎖）のリガンドであり，前記転写因子はＩＲＦ−１またはＩＳＧＦ３−γ−（ｐ４８）であり，前記キナーゼはチロシンキナーゼＰｙｋ２であり，前記シグナル伝達経路の構成成分はＤａｐ−１，ＢＡＧ−１，Ｐｉｍ−１またはＩＦＮ−γ−誘導性蛋白質９−２７であり，前記成長因子は血小板成長因子ＡＡ，アンジオテンシンまたは線維芽細胞成長因子であり，または前記抗生物質はラパマイシンである。
【００４６】
この文脈において，ＩＦＮ−γの”機能的誘導体”との用語は，天然のＩＦＮ−γの生物学的特性を保持するか本質的に保持する誘導体に関連する。そのような誘導体の例はムテインである。同じことは，本明細書において言及される他の成分についても，必要な変更を加えて適用される。
【００４７】
上述の方法により得られるインビトロ代用物は，薬剤スクリーニング方法および／または毒物学的分析において特に有用である。そのような方法は，限定されないが，前記インビトロ代用物を試験物質および／または潜在的薬剤候補物と接触させた後に，変更された遺伝子発現パターンを検出することを含む。そのようなスクリーニング方法は当該技術分野においてよく知られており，とりわけ，Ｓｃｈｅｒｆ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２４（２０００），２３６−２４４；Ｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２４（２０００），２２７−２３５に記載されている。ハイスループットスクリーニングは，Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１（２０００），４７−５３；Ｈｏｐｆｉｎｇｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１（２０００），９７−１０３；Ｖｉｄａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９），３７４−３８１；Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（１９８９），６２４−６３１；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２（１９９８），５９７−６０３に記載および／または概説されている。
【００４８】
さらに，本発明は，試験試料において異なるように発現されている遺伝子を同定する方法に関する。該方法は，以下の工程を含む：（ａ）それぞれポリアデニル化ＲＮＡを含む試験試料および対照試料を用意し；（ｂ）本発明のｍＲＮＡの増幅の方法の工程を前記試験試料および対照試料に対して用い；そして（ｃ）前記試験試料の得られた増幅されたｃＤＮＡを，前記対照試料の得られた増幅されたｃＤＮＡと比較する。試験試料および対照試料は，同じ生物に由来するものであってもよく，異なる生物／個体に由来するものであってもよい。さらに，前記試験試料は，組織培養または培養細胞を含んでいてもよい。さらに，前記試験および／または対照試料は，好ましくは，同じ種類の細胞および／または組織を含む。工程（ｃ）の比較は，例えば，後述の実施例に記載されるように実施することができ，得られた増幅されたｃＤＮＡをｃＤＮＡアレイにハイブリダイズさせることを含むことができる。したがって，異なるように発現されている遺伝子を同定する方法は，異なる起源の組織，（少数の）細胞または単一の細胞の比較を含むことができる。例えば，病理学的および非病理学的組織，（少数の）細胞または単一の細胞をトランスクリプトームレベルで比較することができる。
【００４９】
本発明はまた，病理学的状態または病理学的疾患を予防または治療するための薬剤候補物を同定する方法に関する。該方法は，以下の工程を含む：（ａ）ポリアデニル化ＲＮＡを含む試料を前記薬剤候補物と接触させ；（ｂ）本発明のｍＲＮＡの増幅の方法の工程を前記試料に対して用い；そして（ｃ）前記試料において発現されている特定の遺伝子の存在，非存在，増加または減少を検出する。前記薬剤候補物と接触させるべき試料は，単離された臓器，組織，（少数の）細胞または単一の細胞でありうる。前記試料はまた，組織または培養細胞試料であってもよい。さらに，実験動物および／または被検者を前記薬剤候補物と接触させ，前記接触の後（またはその間）に，対応する試料を生検等により得ることも考えられる。
【００５０】
さらに，本発明は，被検者において病理学的状態または病理学的状態の疑いをインビトロで検出する方法を提供する。該方法は以下の工程を含む：（ａ）前記被験者からのポリアデニル化ＲＮＡを含む試料を用意し；（ｂ）本発明のｍＲＮＡの増幅の方法を前記試料に対して用い；そして（ｃ）前記試料において発現されている遺伝子の存在，非存在，増加，減少または量に基づいて，病理学的状態または病理学的状態の疑いを検出する。存在，非存在，増加または減少または量は，とりわけ，得られたｃＤＮＡを健康な対照試料から得られたｃＤＮＡと比較することにより検出することができる。試料はヒト起源のものであってもよい。
【００５１】
さらに，本発明は，本発明の方法により得られた増幅されたｃＤＮＡを，インビトロおよび／またはインビボ発現に使用することに関する。インビトロおよび／またはインビボ発現の方法は当該技術分野においてよく知られており，とりわけ”Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ．，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＵＳＡ（１９８８）；Ｓｃｈｏｅｌｋｅ，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１８，２３３−２３４（２０００））または”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”；Ｒｅｈｎ　ａｎｄ　Ｒｅｅｄ，ＶＣＭ　Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ　ｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，ＦＲＧ，（１９９３）に記載されている。さらに，植物細胞におけるインビトロ発現は，Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）に記載されている。インビトロ発現の特に好ましい系は，当該技術分野において知られる翻訳系，例えば，転写／翻訳の組み合わせのためのＥ．ｃｏｌｉ溶解物（Ｂａｓｓｅｔ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，（１９８３）１５６，１３５９−１３６２），小麦胚芽翻訳系または網状赤血球溶解物（Ｗａｌｔｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９３，６８２−６９１（１９８３）；Ｄａｓｎａｈａｐａｔｒａ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２１７，１４３−１５１（１９９３）；Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ，２５５，６０−６５（１９９５）；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２５０，７９−９１（１９９５））である。前記増幅されたｃＤＮＡの前記インビトロおよび／またはインビボ発現は，転写ならびに翻訳事象を含み，したがって，ｍＲＮＡならびに，所望の場合には蛋白質および／またはペプチドの生成を含む。したがって，本発明はまた，本発明の方法により得られた増幅されたｃＤＮＡを，ｍＲＮＡ転写産物のインビトロおよび／またはインビボ調製に使用することに関する。
【００５２】
本発明はまた，本発明の方法により得られた増幅されたｃＤＮＡ，または上で定義され，本発明の方法により得られたｃＤＮＡのインビトロおよび／またはインビボ発現により得られたｍＲＮＡ転写産物を，ハイブリダイゼーションアッセイ，および／または相互作用アッセイにおいて使用することに関する。
【００５３】
好ましくは，前記ハイブリダイゼーションアッセイは，規定された条件下で行う。最も好ましくは，前記ハイブリダイゼーション条件はストリンジェントな条件である。しかし，本発明にしたがって用いる場合，”ハイブリダイズする”との用語は，ストリンジェントなまたは非ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に関連する。前記ハイブリダイゼーション条件は，例えば，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．，Ａｕｓｕｂｅｌ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），またはＨｉｇｇｉｎｓ　ａｎｄ　Ｈａｍｅｓ（ｅｄｓ）”Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ”ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ　Ｏｘｆｏｒｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ，（１９８５）に記載される慣用のプロトコルにしたがって確立することができる。
【００５４】
好ましい態様においては，前記ハイブリダイゼーションアッセイは，オリゴヌクレオチドアレイ，ｃＤＮＡアレイ，および／またはＰＮＡアレイにハイブリダイズさせることを含み，前記相互作用アッセイは，炭水化物，レクチン，リボザイム，蛋白質，ペプチド，抗体またはそれらのフラグメント，および／またはアプタマーとの相互作用を含む。上述のアレイは当該技術分野においてよく知られている（とりわけ，Ｄｅｂｏｕｃｋ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１：４８−５０（１９９９）；Ｈａｃｉａ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２１，４２−７（１９９９）；Ｃｏｌｅ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１，３８４１（１９９９）；ＢｏｗｔｅｌｌＤＤ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２１，２５−３２（１９９９）；Ｃｈｅｕｎｇ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２１，１５−１９（１９９９）；Ｄｕｇｇａｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２１，１０−１４（１９９９）；Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２１，５−９（１９９９）を参照）。特に，ｃＤＮＡアレイは，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅから入手することができ，ｃＤＮＡマイクロアレイを含み，およびオリゴヌクレオチドアレイはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａから入手することができる。とりわけ，ｃＤＮＡアレイは，ＤｅＲｉｓｉ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．（１９９６），１４，４５７−４６０；Ｌａｓｈｋａｒｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４，１３０５７−１３０６２（１９９７）；Ｗｉｎｚｅｌｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０６，３−１８（１９９９）；またはＳｃｈｅｎａ（１９９５）（上掲）に記載される方法にしたがって，オリゴヌクレオチドアレイは，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９９９）（上掲）；Ｃｈｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，６１０−６１４（１９９６）にしたがって，調製することができる。上述のアレイは，マクロアレイならびにマイクロアレイを含むことができる。
【００５５】
実施例に示されるように，本発明の方法により得られたｃＤＮＡ（または前記ｃＤＮＡのｍＲＮＡ転写産物）は，ポリアデニル化ＲＮＡを含む（試験）試料の遺伝子発現パターン／トランスクリプトームを推定するために，ｃＤＮＡアレイ／ｃＤＮＡマイクロアレイで用いることができる。
【００５６】
上述のハイブリダイゼーションアッセイは，とりわけ，医療，診断，薬学ならびに科学的設定において有用である。後述の実施例において示されるように，病理学的に変更されている細胞および／または組織，例えば腫瘍性（細胞）組織，再狭窄組織の（遺伝子）発現パターンを推定するために，本発明の方法により得られたＤＮＡを用いることが可能である。
【００５７】
後述の実施例は，とりわけ，本発明の方法を用いて再狭窄組織において異なるように発現されている遺伝子を推定することができることを示す。このようにして，再狭窄において異なるように発現されている２２４種類の遺伝子が同定され，このうち，１６７種類の遺伝子は対照と比較して過剰発現しており，５６種類の遺伝子は過小発現していた。したがって，特定の，異なるように発現されている遺伝子または遺伝子発現パターンの検出は，とりわけ再狭窄組織を明らかにするために，診断方法においても用いることができる。さらに，後述の実施例に記載されるように，本発明の方法は，新生物疾病，癌の診断においても有用である。
【００５８】
したがって，本発明の方法により得られた増幅されたｃＤＮＡは，組織および／または細胞の遺伝子発現プロファイルを確立するのに特に有用である。そのような遺伝子発現プロファイル／遺伝子発現パターンは，薬剤発見スクリーニングにおいて特に有用でありかつ重要であろう。そのような遺伝子発現プロファイリングにより得られるデータを，薬剤活性パターンと組み合わせて用いることが特に好ましい（とりわけ，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７５（１９９７），３４３−３４９；Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５８（１９９２），４４７４５１，ｖａｎＯｓｄｏｌ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８６（１９９４），１８５３−１８５９またはＰａｕｌｉ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８１（１９８９），１０８８−１０９２）を参照）。さらに，本発明の方法により得られたｃＤＮＡおよび／またはそのｍＲＮＡ転写産物を，Ｓｃｈｅｒｆ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２４（２０００），２３６−２４４およびＲｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　２４（２０００），２２７−２３５に記載されるように，遺伝子発現パターンと薬剤活性プロファイルとが相関しているアッセイにおいて用いることが考えられる。さらに，上述するように本発明の方法により得られた”トランスクリプトーム”のデータはまた，後述の実施例に示されるように，蛋白質レベルとも相関しているであろう。
【００５９】
本発明はまた，本発明の方法により得られた増幅されたｃＤＮＡを，配列特異的ＰＣＲ，ｃＤＮＡクローニング，サブトラクティブハイブリダイゼーションクローニング，および／または発現クローニングに使用することに関する。特異的ＰＣＲを用いて，例えば，所与の試料中のおよび試料間の転写産物の相対的量を決定することができる。本発明により生成したｃＤＮＡはまた，サブトラクティブハイブリダイゼーションクローニングに適用して，試料に特異的なまたは存在しないｃＤＮＡを選択することができ，これは後述の実施例に示される（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．２２５，５８７−６１０（１９９３）；Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３０３，３４９−３８０（１９９９））。
【００６０】
好ましい態様においては，アダプター−プライマーＥｃｏ４４Ｉ：５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧ−３’（配列番号３１），Ｅｃｏ１２Ｉ：５’−ＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＣＧ−３’（配列番号３２），Ｅｃｏ４３ｉｌ：５’−ＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＴＧＧＴＧＣＧＧＡＧＧＧＣＧ−３’（配列番号３３）またはＥｃｏ１２ｉｌ：５’−ＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番号３４）を，上述の方法，すなわちサブトラクティブハイブリダイゼーション分析とともに用いることができる。さらに別の好ましい態様においては，上述のサブトラクティブハイブリダイゼーション分析により得られたｃＤＮＡ集団を増幅するときに，プライマーＰ１−３０：５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧ−３’（配列番号３５），Ｐ２−３０：５’−ＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＴ−３’（配列番号３６），Ｐ１−３３：５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＴＣ−３’（配列番号３７），Ｐ２−３３：５’−ＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＴＧＧＴ−３’（配列番号３８），ＰＮ１−３０：５’−ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＣＣ−３’（配列番号３９）またはＰＮ２−３０：５’−ＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＴＧＧＴＧＣＧ−３’（配列番号４０）を用いることができる。より好ましい態様においては，実施例において示されるように，プライマーＰ１−３０：５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧ−３’（配列番号３５），Ｐ２−３０：５’−ＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＴ−３’（配列番号３６）を上述の方法において用いることができる。
【００６１】
本発明はまた，上で規定される少なくとも１つのプライマーを含むキットを提供する。好都合には，本発明のキットは，前記プライマー／プライマーに加えて，任意に固体支持体（例えば磁気ビーズ），酵素，例えばリバーストランスクリプターゼ，ＲＮＡ−リガーゼまたは末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ，ならびに反応緩衝液（例えばｃＤＮＡ”洗浄緩衝液”または”テイリング緩衝液”）および／または保存溶液を含むことができる。さらに，本発明のキットの部品は，バイアル中に個々に包装してもよく，または容器または多容器ユニット中に組み合わせて包装してもよい。本発明のキットは，本発明の方法を実施するために都合よく使用することができ，とりわけ，上述した種々の応用において，例えば診断キット中でまたは研究ツールとして用いることができる。さらに，本発明のキットは科学的および／または診断目的に適した検出手段を含んでいてもよい。キットの製造業者は，好ましくは当業者に知られる標準的方法にしたがうであろう。
【００６２】
図面の簡単な説明
図１は，増幅の成功を判定するパラメータを示す。
ａ）２０種類のＨＴ２９結腸癌腫細胞（（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−３８）レーン１−２０）は個々に単離し，異なる濃度のランダムヘキサマープライマーの存在下でｍＲＮＡを逆転写した（レーン１−５，８０μＭ；レーン６−１０，８μＭ；レーン１１−１５，０．８μＭ；レーン１６−２０，０．０８μＭ）。次に，ｃＤＮＡの１／１０を遺伝子特異的ＰＣＲによりｋｉ−ｒａｓ転写産物の検出について試験した。
ｂ）感度に及ぼすホモポリマーテイルの影響
３５０ｂｐのＴＧＦ−αフラグメントを単離し，希釈し，ｄＡまたはｄＧテイルを付加した。それぞれポリ−ｄＴまたはポリ−ｄＣ含有プライマーおよびＴＧＦ−α配列中のプライマーを用いるＰＣＲにより一連の希釈物を試験した。有益な希釈物は二重に示されている（レーン１＋２，陰性対照；レーン３＋４，１０−３希釈；レーン５＋６，１０−５希釈）。
ｃ）ＦＬ４−Ｎ６でプライミングし逆転写したｍＲＮＡにｄＧ−テイルを付加し，ＣＰ３＋ＦＬ４プライマー（レーン１−３）またはＣＰ２＋ＦＬ４プライマーを，異なるアニーリング温度（レーン１＋４，６８℃，レーン２＋５，６５℃，レーン３＋６，陰性対照）で用いて増幅した。
ｄ）ｃ）と同量のｍＲＮＡをＣＦＬ５ｃＮ６プライマーを用いて逆転写し，ＣＰ２プライマーを用いて増幅した。ｃ）と同量のｃＤＮＡ（レーン３＋４）により，広範な範囲のｃＤＮＡフラグメントが増幅され，１：２００希釈（レーン１＋２）で異なるアニーリング温度（レーン１＋３，６８℃；レーン２＋４，６５℃；レーン５，陰性対照）を用いた場合にも同様であった。
【００６３】
図２は，Ａ４３１細胞の増幅していないプールｃＤＮＡを陽性対照（＋）として，包括的ＰＣＲの前に半分ずつ（ａ＋ｂ）に分けたβ−アクチンおよび種々のＭＡＧＥ転写産物および単一のＡ４３１細胞の増幅物（レーン２−４および６−８）についての遺伝子特異的ＰＣＲを示す。２回の独立した実験を行い（レーン１−４および５−８），レーン１およびレーン５は包括的ＰＣＲの陰性対照である。
【００６４】
図３は，２個の正常白血球（赤）および２個のＭＣＦ−７乳癌細胞（青）のＣＧＨプロファイルを示す。このゲノムＤＮＡはｍＲＮＡを単離した後に上清から単離した。正常細胞の染色体比は点線の範囲内にあって有意の閾値を与え，癌細胞のプロファイルはその染色体欠失および増幅に関して類似していた。
【００６５】
図４は，非常に小さい原発性腫瘍（ステージＴ１ａ）を有する乳癌患者に由来する細胞ＢのＣＧＨプロファイルを示す。染色体欠失は染色体記号の左に赤棒で，染色体獲得は右に緑棒で示される。
【００６６】
図５は，細胞Ｂ，ＣおよびＬにおいて，共通におよび異なるように発現されている遺伝子を示す図である。
【００６７】
図６は，細胞Ｌ（左）のハイブリダイゼーションおよび固定化されたｃＤＮＡの位置および名前のマトリクスを示す。遺伝子は斜め方向に２重にスポットした。青い遺伝子記号は左上から右下の方向であり，赤い遺伝子記号は右上から左下の方向である。
【００６８】
図７は，ヒト冠状動脈インステント再狭窄からの新脈管内膜の免疫組織化学的染色：フォンゲッソン（左パネル）および平滑筋アルファ−アクチン（右パネル）を示す。示される実験は，３回の独立した標本の代表例である。棒は１００μｍを示す。
【００６９】
図８は，微小組織標本から生成した第１鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅の成功の対照としての，β−アクチン（レーン１），ＥＦ−１α（レーン２）およびα−アクチン（レーン３）の遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲを示す。図に示されるものは，各実験群からの１つの代表例である（右パネル：患者Ｂ；左パネル：対照ドナーｂ）。３つのサイズマーカー（Ｍ）の位置が示される。
【００７０】
図９はｃＤＮＡアレイ分析を示す。同じアレイで新脈管内膜（パネルＡ）または対照血管（パネルＢ）から単離したｍＲＮＡ，および生物学的試料なし（パネルＣ）を比較した３つの独立したハイブリダイゼーション実験が示される。ｃＤＮＡアレイは９種類のハウスキーピング遺伝子および３種類の陰性対照を含む５８８種類の遺伝子を含んでいた［Ｍ１３ｍｐ１８（＋）鎖ＤＮＡ；ラムダＤＮＡ；ｐＵＣ１８ＤＮＡ］。ここに示される実験は，１０個の新脈管内膜および１０個の対照標本を用いたハイブリダイゼーション実験の代表例である。丸は再狭窄と対照との間で異なるように発現されている４つのハイブリダイゼーションシグナル（Ａ−Ｄ）を示す。
【００７１】
図１０は，ヒトインステント新脈管内膜および対照血管からの微小試料の転写プロファイルを示す。各カラムは，単一標本の５３種類の選択された遺伝子についての遺伝子発現分析を示す。矢印は新脈管内膜において対照に対して有意なアップまたはダウンレギュレーションを示す遺伝子を表す。８種類の高度に発現されているハウスキーピング遺伝子が最後に示されている。図の下に示されるように，１つの灰色の値はシグナル強度に対応する。
【００７２】
図１１は，ｃＤＮＡアレイからの異なるように発現されているｍＲＮＡの遺伝子特異的ＰＣＲによる確認を示す。予測されるＰＣＲフラグメントのサイズが右に示される。
【００７３】
図１２は，頸動脈再狭窄からの新脈管内膜の，ＦＫＢＰ１２蛋白質についての免疫組織化学的染色を示す。示される実験は，３回の独立した実験の代表例である。棒は１００μｍの距離を示す。パネルＡは，ヘマトキシリンエオシン染色を示し，パネルＢ−Ｄは，健康な中膜と新脈管内膜との境界領域（パネルＢ），健康な対照中膜（パネルＣ）および新脈管内膜組織（パネルＤ）のＦＫＢＰ１２の染色を示す。
【００７４】
図１３は，遺伝子発現のｃＤＮＡアレイ分析を示す。合計で２４３５種類のヒトｃＤＮＡを含む４つのＣｌｏｎｔｅｃｈ　Ａｔｌａｓマイクロアレイを，材料および方法に記載されるようにして，インステント新脈管内膜（ｎ＝１０）および対照中膜／内膜（ｎ＝１１）からのＲＮＡから調製したＤｉｇ−ｄＵＰＴ標識ｃＤＮＡとハイブリダイズさせた。スポットは２つの試験群の相対的発現の平均を示す。パネルＡは，この実験で試験したすべての遺伝子の発現を示す。パネルＢは，新脈管内膜において２．５倍以上誘導されているか減少しており，ウイルコキソン試験においてｐ＜０．０３の統計学的有意性を示した，２２４種類の異なるように発現されている遺伝子の発現を示す。ゼロ値は対数目盛で表せないため，この表示のために，ゼロ値を０．０００１の値で置き換えた。
【００７５】
図１４は，そのｍＲＮＡレベルが新脈管内膜と対照との間で異なる２２４種類の遺伝子の異なるクラスの遺伝子発現プロファイルを示すクラスター画像を示す。この遺伝子のサブセットを，異なる細胞タイプにおけるその発現に基づいて４つの群にクラスター化した。ここでは，このセットの各遺伝子の発現パターンは，水平なストリップとして表されている。各カラムは，試験した群の平均ｍＲＮＡ発現レベルを表す。各遺伝子について，ハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに対して標準化した，新脈管内膜（ｎ＝１０），対照（ｎ＝１１），増殖しているＣＡＳＭＣ（ｎ＝２）および血液試料（ｎ＝１０）のｍＲＮＡレベルの平均が下に示される色等級で表されている。群Ｉは，新脈管内膜標本においてのみ発現されている遺伝子を含む（図１４Ａ）。群ＩＩは，新脈管内膜と増殖しているＣＡＳＭＣにおいて同時に発現されている遺伝子を含む（図１４Ｂ）。群ＩＩＩは，そのｍＲＮＡが新脈管内膜ならびに血液において発現されている遺伝子からなる（図１４Ｃ）。群ＩＶは，そのｍＲＮＡが対照標本において過剰発現されている遺伝子を含む（図１４Ｄ）。
【００７６】
図１５は，新脈管内膜において対照に対してアップレギュレートされていた１４個の遺伝子および新脈管内膜においてダウンレギュレートされていた３個の転写因子を含む転写因子クラスターの拡大図である。この場合には，各列は単一の標本を表し，各行は単一の遺伝子を表す。
【００７７】
図１６は，新脈管内膜において対照に対してアップレギュレートされていた３２個の遺伝子を含むＩＦＮ−γ−関連クラスターの拡大図である。この場合には，各列は単一の標本を表し，各行は単一の遺伝子を表す。
【００７８】
図１７は，頸動脈再狭窄からの新脈管内膜および健康な対照の中膜の，ＩＲＦ−１蛋白質についての免疫組織化学的染色を示す（左パネル：対照中膜；右パネル：新脈管内膜）。示される実験は，６回の独立した実験の代表例である。
【００７９】
図１８は，冠状動脈インステントからの新脈管内膜のＩＲＦ−１蛋白質についての免疫組織化学的染色を示す。パネルＡは，インステント再狭窄からの新脈管内膜の標本のヘマトキシリンエオシン染色を示し，パネルＢは，平滑筋細胞マーカーであるβ−アクチンの染色を示し，パネルＣは，インステント再狭窄からの新脈管内膜における転写因子ＩＲＦ−１の免疫組織化学的染色を示し，パネルＤは，ＣＤ３の免疫組織化学的染色を示す。ここに示される実験は，３回の独立した実験の代表例である。
【００８０】
図１９は，新脈管内膜において対照に対してアップレギュレートされていた３２個の遺伝子を含むＩＦＮ−γ−関連クラスターを，培養ＣＡＳＭＣ，および１０００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ−γで１６時間刺激した培養ＣＡＳＭＣにおける発現と比較した図を示す。この場合には，各列は単一の標本を表し，各行は単一の遺伝子を表す。下部に示されるように１つの灰色の値は図のシグナル強度に対応する。
【００８１】
図２０は，骨髄中の散在性腫瘍細胞の二重染色を示す。上パネルの小さい凝集物中の細胞（７個の細胞および２個の細胞）および２人の異なる患者の骨髄において検出された１つの単一細胞をサイトケラチン（赤蛍光）およびエムプリン（青）について染色した。
【００８２】
図２１は，腫瘍細胞におけるトランスフェリンレセプター（ＣＤ７１）のディファレンシャル発現を示す。細胞核のＤＡＰＩ染色（左パネル）。アップレギュレートされたＣＤ７１発現が腫瘍組織において見られる（右パネル）。
【００８３】
図２２は，培養ＳＭＣの生存に及ぼすＩＦＮ−γの影響を示す。自発的（パネルＡおよびＣ）およびＨ２Ｏ２誘導性アポトーシス（パネルＢおよびＤ）のフローサイトメトリ分析。細胞は，１００μｍｏｌ／ｌのＨ２Ｏ２で処理した６時間後にＦｌＴＣ−標識アネキシンＶおよびＰＩで二重染色した。５回の独立した実験の代表的分析が示されている。
【００８４】
図２３は，再狭窄のマウスモデルにおける新脈管内膜の発達に及ぼす無ＩＦＮ−γレセプター変異の影響を示す。（Ａ−Ｄ）結紮の４週間後の未処理動脈（対照）および反対側の結紮動脈（結紮）について，野生型（ｗｔ）およびＩＦＮ−γＲ−／−ノックアウト（ｋｏ）マウスからのマウス頸動脈動脈の切片の代表的顕微鏡写真が示される。ファンゲッソン染色の方法を用いた。バーは１００μｍの長さを表す。（Ｅ）１６個の野生型および１１個のＩＦＮ−γＲ−／−マウスからのデータが，非対試料についてのｔ−テストにより分析した平均±ＳＥＭ（バー）として示される。目盛りは中膜および新脈管内膜の厚さをμｍで示す。白カラム：頸動脈結紮の前および後の対照動物；黒カラム：頸動脈結紮の前および後のノックアウト動物。影をつけた面積は新脈管内膜の厚さを表す。
【００８５】
図２４は，単一の細胞または少量の細胞試料で行ったＳＳＨ分析のフローチャートを示す。
【００８６】
図２５は，標識したドライバーおよびテスターをプローブとして用いるサザンブロットによるコロニーのスクリーニングを示す。レーン１−９；サブトラクション後に得られたコロニー。コロニー＃４はＥＳＥ１（上皮特異的転写因子）であると同定された。Ｍ＝分子量マーカー。
【００８７】
図２６は，ＰＣＲおよびゲル電気泳動により分析した，腫瘍細胞におけるＥＳＥ１の差異的発現を示す。レーン１−４：単一乳癌細胞，５−７：健康なドナーの骨髄。Ｍ＝分子量マーカー。
【００８８】
以下に生物学的実施例を参照して本発明を説明するが，これは例示にすぎず，本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【００８９】
実施例Ｉ：単一細胞ｃＤＮＡの生成および包括的増幅
単一の細胞からのｍＲＮＡの量は，アレイに基づくトランスクリプトーム分析に直接用いるには少なすぎる。直接標識法では５０，０００個の細胞からの全ＲＮＡ（１０μｇ）が検出限界であると報告されている（Ｍａｈａｄｅｖａｐｐａ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７，１１３４−１１３６（１９９９））。直線的増幅工程を用いると，この数は１０００個の細胞まで低下させることができるが（Ｌｕｏ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，５，１１７−１２２（１９９９）），これでもなお，微小転移性細胞の研究に適用するにははるかに少なすぎる。すなわち，ｍＲＮＡの逆転写およびｃＤＮＡの増幅が必要である。鍵となるものは，偏りのない包括的増幅方法の開発である。簡単に記載すると，この方法は以下の４つの基本的工程からなる：（１）オリゴ−ｄＴ−で被覆した固体支持体でのｍＲＮＡの単離，（２）５’−オリゴ−ｄＣ（またはｄＧ）フランキング領域を含むランダムプライマーを用いるｃＤＮＡ合成，（３）ｄＧＴＰ（またはｄＣＴＰ）を用いる３’テイリング反応による３’−オリゴ−ｄＧフランキング領域の生成，次に（４）ｃＤＮＡ分子のオリゴ−ｄＧ（または−ｄＣ）フランキング領域にハイブリダイズするプライマーを用いる単一プライマーに基づく増幅。これらの４つの基本的工程を実現し，感度および信頼性の高いｃＤＮＡ合成，３’−テイリングおよびｐＣＲ増幅を得るためには，ｔＲＮＡおよびｒＲＮＡを除いておかなければならない。
【００９０】
さらに，ｃＤＮＡ合成についてのランダムプライマーの濃度は，先に記載されているオリゴ−ｄＴ−に基づく方法（Ｂｒａｄｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５，６１１−６２３（１９９３）；Ｔｒｕｍｐｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，８１，３０９７−３１１５（１９９３），１０ｎＭのｃＤＮＡ合成プライマーを用いる）より２０００−８０００倍高かった。２０個のＨＴ２９結腸癌腫細胞（ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−３８）を個別に単離し，処理した。界面活性剤Ｉｇｅｐａｌを含むｃＤＮＡ合成緩衝液中で細胞を溶解した後，５個の細胞の群を作成し，４つの異なる濃度のランダムｃＤＮＡ合成プライマーを用いて逆転写した。各濃度について遺伝子特異的ＲＴ−ＰＣＲによりｃＤＮＡ合成を試験した。図１ａは，ｃＤＮＡ合成においてより高い濃度のランダムプライマーを用いると特異的転写産物（例えばｋｉ−ｒａｓ）の検出比率が増加することを示す。余剰のプライマーは続くテイリングおよび増幅反応における有効な競合剤であり，したがって，これらの工程の前に除去することが好ましい。同様に，高いｄＮＴＰ濃度はｃＤＮＡ合成を改良するが，続くテイリング反応を妨害し，除去する必要がある。標準的カコジル酸含有テイリング緩衝液は後のＰＣＲを妨害するため，低イオン強度のＫＨ２ＰＯ４緩衝液で置き換えた（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，６８，４１−５０（１９７９）。オリゴ−ｄＴ被覆磁気ビーズでのｍＲＮＡの捕捉は，ｍＲＮＡ単離および緩衝液交換工程の間の操作を簡単にした。以下において，単一の細胞の単離，ｍＲＮＡ単離，ｃＤＮＡ合成および３’−テイリングを簡単に説明し，例示する。
【００９１】
腫瘍細胞は記載されるようにして骨髄から単離した（Ｋｌｅｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，４４９４−４４９９（１９９９））。簡単には，生存能力のある骨髄試料を，５％ＡＢ血清の存在下で１０μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体３Ｂ１０−Ｃ９で１０分間染色して，非特異的結合を防止した。３Ｂ１０−ポジティブ細胞をマウスＩｇＧに対するＢ−フィコエリスリンコンジュゲート化ヤギ抗体（Ｔｈｅ　Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）で検出し，氷上のＰＣＲチューブに移した。オリゴ−ｄＴビーズを加え，細胞を１０μｌの溶解緩衝液（Ｄｙｎａｌ）で溶解し，チューブを３０分間回転させた。ｍＲＮＡの捕捉のためには，０．５％Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ）を含む１０μｌのｃＤＮＡ洗浄緩衝液−１（Ｄｙｎａｌ）を加え，ビーズに結合したｍＲＮＡをｃＤＮＡ洗浄緩衝液−２（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ８，３，７５ｍＭＫＣＩ，３ｍＭＭｇＣｌ２，１０ｍＭＤＴＴ，０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ）を補充）で洗浄し，新たなチューブに移し，ｃＤＮＡ洗浄緩衝液−１中で再び洗浄して痕跡ＬｉＤＳおよびゲノムＤＮＡを除去した。ｍＲＮＡは，ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩリバーストランスクリプターゼ（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）で，製造元から供給される緩衝液に５００μＭｄＮＴＰ，０．２５％Ｉｇｅｐａｌ，３０μＭのＣｆｆ５ｃ８プライマー（５’−（ＣＣＣ）５ＧＴＣＴＡＧＡＮＮ（Ｎ）６−３’）および１５μＭのＣＦＬ５ｃＴ（５’−（ＣＣＣ）５ＧＴＣＴＡＧＡＴＴ（ＴＴＴ）４ＴＶＮを補充して用いて，４４℃で４５分間逆転写させた。試料は反応の間回転させてビーズの沈殿を回避した。ｃＤＮＡはｍＲＮＡを介して常磁性ビーズに結合したままであり，テイリング洗浄緩衝液（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０，１ｍＭＤＴＴ，０．２５％Ｉｇｅｐａｌ）中で１回洗浄した。ビーズをテイリング緩衝液（１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０，４ｍＭＭｇＣｌ２，０．１ｍＭＤＴＴ，２００μＭＧＴＰ）中に再懸濁し，ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドを９４℃で４分間変性させ，氷上で冷却し，１０ＵのＴｄＴ（ＭＢＩ−Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を加え，３７℃で６０分間または３７℃で６０分間および２２℃で一夜インキュベートした。テイリング酵素を不活性化した後（７０℃，５分間），４μｌの緩衝液１（Ｒｏｃｈｅ，Ｔａｑロングテンプレート），３％脱イオン化ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）を３５μｌの容量中に含むＰＣＲ−ＭｉｘＩを加えた。プローブをＰＣＲサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　２４００）中で７８℃に加熱し，ホットスタート法用に容量５μｌ中で最終濃度３５０μＭのｄＮＴＰ，ＣＰ２プライマー（５’−ＴＣＡ−ＧＡＡ−ＴＴＣ−ＡＴＧ−ＣＣＣ−ＣＣＣ−ＣＣＣ−ＣＣＣ−ＣＣＣ−３’，最終濃度１．２μＭ）および５ユニットのＤＮＡＰｏｌｙ−Ｍｉｘを含むＰＣＲＭｉｘＩＩ（Ｒｏｃｈｅ，Ｔａｑロングテンプレート）を加えた。４０サイクルを走らせ，最初の２０サイクルについては９４℃，１５秒間，６５℃，３０℃，６８℃，２分間で，残りの２０サイクルについては，各サイクルの伸長時間を１０秒間長くし，最終伸長工程は６８℃で７分間行った。これらのＰＣＲ増幅条件は実質的にＢｒａｉｌ，Ｍｕｔ．Ｒｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅｓ，４０６，４５−５４（１９９９）とは異なる。Ｂｒａｉｌにおけるアニーリング温度はわずか４２℃で２分間であり，これに対して本発明の方法のこの例においては６５℃が適用される。
【００９２】
続くポリ−ｄＡ−およびポリＧ−テイル付加配列のＰＣＲのテイリング効率ならびに感度を，ポリ−ｄＡまたはポリ−ｄＴのいずれかのホモポリマーテイルを有する規定のｃＤＮＡフラグメントを用いて評価した。ポリ−（ｄＡ）およびポリ−（ｄＧ）−テイル付加フラグメントを希釈し，次にそれぞれ等量のポリ（ｄＴ）およびポリ（ｄＣ）プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した。これらの実験においては，ポリ−Ｃプライマーのポリ−Ｇテイルへの結合は，ポリＴプライマーのポリ−ｄＡテイルへの結合より少なくとも１００倍感度が高いことが見いだされた（図１ｂ，レーン１，２を３，４と比較されたい）。
【００９３】
同じポリ−ｄＣフランキング領域を共有する種々のｃＤＮＡ合成プライマーと，ランダムヘキサマー（Ｎ６），オクタマー（Ｎ８），オリゴ−ｄＴ（ｄＴ）１５単独または組み合わせとの組み合わせを比較した。すべて良好かつ信頼性をもって作動した。ポリ−ｄＣ−Ｎ８およびポリ−ｄＣ−（ｄＴ）１５プライマーの組み合わせを用いたときに最もよい結果が得られた（データ示さず）。
【００９４】
最も劇的な改良は，包括的ＰＣＲのために２つのプライマー（図１ｄ）ではなく１つのプライマー（図１ｃ）のみを用いたときに得られた。ｃＤＮＡ合成プライマーは，３’ランダムヘキサマーおよび，ポリ−ｄＣストレッチ（ＣＦＩ５ｃ）または４つすべての塩基のフランキング配列（Ｆｌ４Ｎ６）のいずれかのフランキング領域から構成された。２つのポリ−ｄＣ結合プライマーを，ＦＩ４相補配列に結合する追加のプライマーとの組み合わせで試験した（図１ｃ）。ポリ−ｄＣ結合プライマー（ＣＰ２，ＣＰ３）の他に追加のプライマー（ＦＬ４）を用いると増幅が妨害された（図１ｃ，レーン１，２および４，５）。これは，最適な感度には高いプライマー濃度が必要であるためであろう。ＣＰ２プライマー単独を用いた場合は，広範な範囲のｃＤＮＡ分子（０．２−３ｋＢ）が増幅された。さらに高度に希釈したｃＤＮＡ（１：２００）であっても包括的増幅には十分であった（図１ｄ）。
【００９５】
実施例ＩＩ：単一の細胞のトランスクリプトーム分析：ｃＤＮＡアレイ分析の特異性，再現性，感度，および適合性
培養細胞株から単離された単一の細胞を，ｃＤＮＡ合成，テイリングおよび増幅について最適化されたプロトコルにより分析した。これまでに合計で１００個の単一の細胞について，遺伝子特異的ＰＣＲによるβ−アクチンおよびＥＦ−１ｃｃ発現の試験に成功している（データ示さず）。ハウスキーピング遺伝子のｃＤＮＡは，二次ＰＣＲにおいて特異的増幅に用いた領域にはあまり関係なく，細胞あたり十分なコピー数で見いだされた。より少ない量の転写産物については，選択されたコーディング配列のサイズが検出比率を決定することが見いだされた。最も高い感度は，２００ｂｐより短い距離の２つのプライマーを用いたときに得られた（データ示さず）。
【００９６】
単一細胞からのＰＣＲ増幅物をｃＤＮＡアレイ分析の適合性について試験した。この目的のために，得られたｃＤＮＡをＤｉｇ（ジゴキシゲニン）標識した。Ｄｉｇ−ＵＴＰはＰＣＲにより取り込ませた。発現プロファイリングのため，ＰＣＲにより増幅した元のｃＤＮＡフラグメントの０．１−１μｌを，ジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ），５０μＭｄｉｇ−ｄＵＴＰ，３００μＭｄＴＴＰ，および最終濃度３５０μＭの他のｄＮＴＰの存在下で再増幅に用いた。再増幅条件は，本質的には上述のとおりであるが，２．５ユニットのＤＮＡ　ＰｏｌｙＭｉｘを用いるよう改変した。最初に９４℃で２分間変性させ，次に１２サイクルの９４℃，１５秒間，６８℃，３分間を行い，最終伸長時間は７分間であった。特異的転写産物は，元のＰＣＲを最終容量１０μｌで１／１０に希釈し，その１μｌを用いて検出した。
【００９７】
表１は，異なる組織発生学的起源の単一細胞からの遺伝子の発現パターンを示す，ジゴキシゲニン標識プローブのハイブリダイゼーションの特異性を示す。細胞は，ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ番号ＨＴＢ−２２），Ａ４３１（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５５５），Ｋ−５６２（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−２４３），ＪＹ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ：ＩＨＷ９２８７）であった。ＭＣＦ−７およびＡ４３１細胞のみがサイトケラチン遺伝子（これらが上皮起源であることのマーカー）を発現しており，一方，赤白血病Ｋ５６２細胞およびＥＢＶ形質転換Ｂ細胞ＪＹは造血起源の遺伝子，例えば，ＣＤ３３，ＣＤ３７，ＣＤ３８，およびＢ細胞中のカッパ軽鎖を発現していた。さらに，精巣および腫瘍特異的ＭＡＧＥ遺伝子はすべての癌細胞で高度に発現していたが，ウイルス形質転換Ｂ細胞ではそうではなかった。これらのデータは，単一細胞ＰＣＲ増幅物がｃＤＮＡアレイ分析に有用であり，単一細胞の細胞タイプ特異的遺伝子発現パターンを生ずることを示す。
【００９８】
表１：種々の組織に由来する単一細胞による，組織発生学的情報を与える遺伝子の発現
【表１】
2004508010.tif 000002
【００９９】
培養により成長させた個々の細胞を単離し，ｃＤＮＡを合成し，増幅し，組織発生学的情報を与える遺伝子のアレイにハイブリダイズさせた。細胞は以下の細胞株から得た：ＭＣＦ−７（乳癌）；Ａ４３１（類表皮癌腫）；Ｋ５６２（慢性骨髄性白血病）；ＪＹ（エプスタインバーウイルス形質転換Ｂ細胞株）。
【０１００】
再現性を評価するために，１１０種類の異なる遺伝子を有する第４世代のｃＤＮＡアレイを用いて４つのＭＣＦ−７細胞の発現パターンを比較した（表２）。特別注文のｃＤＮＡアレイは以下のようにして製造した。ｃＤＮＡを遺伝子特異的プライマーでヒトｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し，ＰＣＲ増幅物をゲル精製し，増幅物１種類あたり１５ｎｇのＤＮＡを，ＢｉｏＧｒｉｄスポッティングロボット装置（Ｂｉｏｒｏｂｏｔｉｃｓ）を用いてナイロン膜（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）上にスポットした。ＤＮＡマクロアレイ第４世代および第５世代と名付けた（下記を参照）。
【０１０１】
第４世代フィルター：スポットした遺伝子は以下のとおりであった：
【表２】
2004508010.tif 000003
【０１０２】
【表３】
2004508010.tif 000004
【０１０３】
【表４】
2004508010.tif 000005
【０１０４】
表２：４個の単一ＭＣＦ−７細胞において共通におよび異なるように発現されている遺伝子
【表５】
2004508010.tif 000006
【０１０５】
同じ細胞クローンに由来する個別の細胞の遺伝子発現の不均一性
培養細胞から単離された４個のＭＣＦ−７細胞を，遺伝子発現の単一細胞分析により分析した。４つの単一細胞すべてにおいて（４／４），４つのうち３つ（３／４），４つのうち２つ（２／４），および４つのうち１つ（１／４）で検出された転写産物が示される。発現されている遺伝子の１８／４６（３９％）がすべての細胞で検出された。６１％の遺伝子は，４つの細胞の一部においてのみ認められた。６３種の遺伝子は試験したすべての細胞についてネガティブであった。
【０１０６】
４６種の遺伝子（４２％）が少なくとも１つの細胞で発現され，６３種（５８％）は４個すべての細胞においてネガティブであった。４６（３９％）種の発現された遺伝子のうちの１８種は４すべての細胞において検出されたが，残りの２９種（６１％）は不均一に発現されていることが見いだされた。この不均一性が細胞間変動によるものかまたは技術上のアルチファクトであるかを評価するために，２つの別々のＰＣＲ増幅用に分割した単一のＡ４３１細胞のｃＤＮＡについても，不均一が観察されるか否かを試験した。最初の実験においては，単一細胞ｃＤＮＡの５０％から得られた包括的増幅されたＰＣＲ産物を用いて遺伝子特異的ＰＣＲを行った（図２）。比較のために，５００，０００個のＡ４３１細胞のプールから単離されたｃＤＮＡを，β−アクチンバンドの強度が単一の細胞のｃＤＮＡの５０％から得られる強度と同様になるように希釈した。３２サイクル後，ｃＤＮＡ量は約１０，０００個の細胞に対応し，プール対照のβ−アクチンシグナルおよび単一細胞ｃＤＮＡの５０％は増幅のプラトー段階に達した。図２に示されるように，同じ細胞の２つの半分のｃＤＮＡの変動は非常に低かった。２つの独立した実験において，６個のＡ４３１細胞からの各半分（ａ＋ｂ）から同様の強度のβ−アクチンバンドが得られた。
【０１０７】
ｃＤＮＡの包括的増幅の信頼性を試験するために，第２の遺伝子配列特異的ＰＣＲ増幅を行った。遺伝子特異的ＰＣＲ増幅の効率はプライマー配列に依存することが知られているため，プライマー設計についての要求が非常に厳しいＭＡＧＥ転写産物の増幅を試験した（Ｋｕｆｅｒ，ＷＯ９８／４６７８８（１９９８）；Ｓｅｒｒａｎｏ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　８３，６６４−６６９（１９９９））。配列特異的ＰＣＲにより決定されたＭＡＧＥ発現のレベルは，一貫してベータ−アクチンの発現より低かった。ｃＤＮＡの包括的ＰＣＲ増幅後の分割された単一細胞試料におけるＭＡＧＥ転写産物の相対量（図２，レーン２−４および６−８）は，プールされた細胞からの増幅されていないｃＤＮＡに由来する対照試料（図２，＋）の量と匹敵するものであった。６個のうち４個の場合において，結果はｃＤＮＡの両方の半分について同一であった。半分の細胞７ａおよび８ｂにおいてＭＡＧＥ転写産物が存在しなかったことは，おそらく，２つの半分の間でｃＤＮＡの分布が偏っていたことを示す。
【０１０８】
観察される配列非依存的増幅は，１５個のシトシン残基を含みしたがって同等に高いＣＧ含量を有するプライマー結合部位を導入するポリ−ｄＣプライマーの特徴的な点である。そのようなプライマーに適合した実験条件，すなわち３％変性ホルムアミドの存在下での高いアニーリング温度（６５℃）は顕著な再現性につながり，単一細胞トランスクリプトームに対して大きな量的変化をもたらさなかった。
【０１０９】
分割した単一細胞ｃＤＮＡからの増幅産物，および対照として５，０００個のプールした細胞からのｃＤＮＡを標識し，１９３種の異なる遺伝子を表すｃＤＮＡアレイにハイブリダイズさせた。単一細胞増幅産物の両方の半分からほとんどの転写産物を検出することができた（表３）。
【０１１０】
表３：５０００個の細胞のプールされたｃＤＮＡと比較した，包括的ＰＣＲの前にｃＤＮＡの２つのプールに分割された単一細胞の遺伝子発現パターン
【表６】
2004508010.tif 000007
【０１１１】
【表７】
2004508010.tif 000008
【０１１２】
【表８】
2004508010.tif 000009
【０１１３】
ＰＣＲ増幅の前に２つの単一細胞のｃＤＮＡを分割し，５０００個の細胞から得たｃＤＮＡプールと比較した。すべてのｃＤＮＡを包括的ＰＣＲにより増幅し，ｃＤＮＡアレイに対するハイブリダイゼーションにより分析した。対応する半分ずつ（１．１および１．２；２．１および２．２）の遺伝子発現プロファイルを細胞プール（＋）と並置させた。遺伝子はシグナル強度（濃いほど強い）および同じ細胞の両方の半分ずつにおける検出にしたがって一覧に記載される。用いたフィルターは第５世代であり，遺伝子および蛋白質の名前は以下に示される（前記第５世代フィルターの調製については上述を参照（第４世代フィルター））。
【０１１４】
第５世代フィルター：
【表９】
2004508010.tif 000010
【０１１５】
【表１０】
2004508010.tif 000011
【０１１６】
【表１１】
2004508010.tif 000012
【０１１７】
【表１２】
2004508010.tif 000013
【０１１８】
【表１３】
2004508010.tif 000014
【０１１９】
半分ずつのｃＤＮＡ４個について合計で１４８個のシグナルが得られた。これらのうち，９５個（６４％）は対応する半分ずつにおいて認められたが，５３個（３６％）は一方の半分にのみ認められた。５３個の単一ポジティブシグナルのうち，プールした細胞の対照においては，４６個（８７％）は非常に低量の転写産物であり，２６個（４９％）は検出できず，２０個（３７％）は弱くしか発現していなかった。７種類の遺伝子（ＡＸＬ，ＢＡＧ１，ＢＣＬ２Ｌ１，ＳＨＧＣ−７４２９２，Ｂ６１，ＴＧＦＢＲ２およびＡＢＣＣ１）はプールされた試料においてのみ検出されたが，シグナルはいくぶん弱かった。これに対し，３３種類の遺伝子は，半分の細胞の実験においてのみ認められたが，対照においては認められなかった。両方の半分ずつのシグナル強度は非常に類似しており，シグナルの５５％および７６％が対応する半分ずつにおいて同じ強度であった。２つの対応する半分ずつにおいて同一ではなかったシグナルは，ＰＣＲの前にｃＤＮＡフラグメントの分布がランダムでないことから生じたのかもしれない。特に，低い（＜１０）コピー数で存在する転写産物はそのような分布効果を受けるためであろうが，試料を分割しない場合には得られないであろう。
【０１２０】
実施例ＩＩＩ：単一細胞からのトランスクリプトームおよびゲノム分析の組み合わせ
最近，単一細胞（ＳＣＯＭＰ）のＣＧＨ（比較ゲノムハイブリダイゼーション）分析の方法が記載された（Ｋｌｅｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６，４４９４−４４９９（１９９９））。この方法を用いて，腫瘍細胞をその染色体異常により明白に識別することができる。したがって，同じ細胞からのゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡの両方を単離することを試みた。単離された単一細胞を１０μｌの溶解緩衝液（Ｄｙｎａｌ）中で溶解させ，チューブを３０分間回転させてｍＲＮＡを捕捉した。１０μｌのｃＤＮＡ洗浄緩衝液−１（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ８，３．７５ｍＭＫＣｌ，３ｍＭＭｇＣｌ２，１０ｍＭＤＴＴ，０．５％Ｉｇｅｐａｌ（Ｓｉｇｍａ）を含む）を加え，ビーズに結合したｍＲＮＡをｃＤＮＡ洗浄緩衝液−２（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８，３．７５ｍＭＫＣｌ，３ｍＭＭｇＣｌ２，１０ｍＭＤＴＴ，０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ）を補充）中で洗浄し，新たなチューブに移し，ｃＤＮＡ洗浄緩衝液−１中で再び洗浄して残留ＬｉＤＳおよびゲノムＤＮＡを除去した。ｍＲＮＡは，ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩリバーストランスクリプターゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で，製造元により供給される緩衝液中で５００μＭｄＮＴＰ，０．２５％Ｉｇｅｐａｌ，３０μＭのＣｆｌ５ｃ８プライマー（５’−（ＣＣＣ）５ＧＴＣＴＡＧＡＮＮ（Ｎ）８−３’）および１５μＭのＣＦＬ５ｃＴ（５’−（ＣＣＣ）５ＧＴＣＴＡＧＡＴＴ（ＴＴＴ）４ＴＶＮを補充して，４４℃で４５分間逆転写した。試料は反応の間回転させて，ビーズの沈殿を回避した。図１ｃおよびｄに示される用いたプライマーは，Ｃｆｌ５ｃＮ６（５’−（ＣＣＣ）５ＧＴＣＴＡＧＡＮＮ（Ｎ）６−３’）およびＦＬ４Ｎ６（５’−ＴＴＴＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣ（Ｎ）６−３’）であった。ｃＤＮＡは常磁性ビーズにｍＲＮＡを介して結合したままであり，テイリング洗浄緩衝液（５０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０，１ｍＭＤＴＴ，０．２５％Ｉｇｅｐａｌ）中で１回洗浄した。ビーズをテイリング緩衝液（１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４，ｐＨ７．０，４ｍＭＭｇＣｌ２，０．１ｍＭＤＴＴ，２００μＭＧＴＰ）に懸濁し，ｃＤＮＡ−ｍＲＮＡハイブリッドを９４℃で４分間変性し，氷上で冷却し，１０ＵのＴｄＴ（ＭＢＩ−Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を加え，３７℃で６０分間，または３７℃で６０分間および２２℃で一夜インキュベートした。テイリング酵素を不活性化した後（７０℃，５分間），４μｌの緩衝液１（Ｒｏｃｈｅ，Ｔａｑロングテンプレート），３５μｌの容量中の３％脱イオン化ホルムアミド（Ｓｉｇｍａ）からなるＰＣＲ−ＭｉｘＩを加えた。プローブをＰＣＲサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　２４００）中で７８℃に加熱し，ホットスタート法用に５μｌの容量中ｄＮＴＰを最終濃度３５０μＭで含むＰＣＲ−ＭｉｘＩＩ，ＣＰ２プライマー（５’−ＴＣＡ−ＧＡＡ−ＴＴＣ−ＡＴＧ−ＣＣＣ−ＣＣＣ−ＣＣＣ−ＣＣＣ−ＣＣＣ−３’，最終濃度１．２μＭ）および５ユニットのＤＮＡＰｏｌｙ−Ｍｉｘを加えた（Ｒｏｃｈｅ，Ｔａｑロングテンプレート）。最初の２０サイクルについては９４℃，１５秒間，６５℃，３０℃，６８��，２分間で，残りの２０サイクルについては各サイクルの伸長時間を１０秒間延長して，４０サイクルを行い，最後の伸長工程を６８℃で７分間行った。図１ｃにおいて用いたＰＣＲプライマーは次のとおりであった：ＣＰ３（５’−ＧＣＴＧＡＡＧＴＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＴＧＣＣ（Ｃ）１２−３’）およびＦＬ４（５’−ＣＴＣＣＴＴＡＡＴＧＴＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣ−３’）。
【０１２１】
細胞溶解物からの上清およびｍＲＮＡ単離のすべての洗浄工程（ｃＤＮＡ洗浄緩衝液１および２）を回収した（総容量６０μｌ）。ゲノムＤＮＡはシラン化チューブに写した後，２０μｇのグリコゲン（Ｒｏｃｈｅ）の存在下で−２０℃で一夜エタノール沈澱した。続くすべての工程は公表されているようにして行った（Ｋｌｅｉｎ，（１９９９），上掲）。
【０１２２】
主な懸念は，ゲノムＤＮＡの不完全な沈澱が最終的に癌性細胞における染色体欠失において見られるようなＤＮＡの欠失につながるかもしれないことである。しかし，明確な核型の細胞を用いる実験は，細胞性ＤＮＡは完全に失われるか（３０％の場合）または完全に沈澱する（７０％）（データ示さず）のいずれかであることを明確に示した。ゲノムＤＮＡが完全に回収されるのは，間期の染色体は非常に絡み合っており，全てが沈澱するかまたは何も沈澱しないという事実のためであろう。全ＤＮＡの喪失はおそらく，ゲノムＤＮＡとｍＲＮＡとの分離の間に反応チューブを交換することによりもたらされたものである。ＤＮＡを沈殿させた２種類の正常細胞および２種類のＭＣＦ−７乳癌細胞の核型が図３に示されている。２種類の正常細胞のプロファイルは中線から有意な偏差を示さなかったが，２種類のＭＣＦ−Ｆ７細胞の多数のゲノム異常はほぼ同一であった。したがって，悪性のＥｐＣＡＭ−ポジティブ細胞は，そのゲノム表現型により，骨髄中の正常ＥｐＣＡＭ−ポジティブ細胞から明白に区別することができる。ＥｐＣＡＭ−発現は骨髄試料における腫瘍細胞の（悪性の）識別の証拠としては不十分なであるため，このことは特に重要である。免疫蛍光法により判定したとき，健康なドナーも０．５−５％の”３　３Ｂ１０−Ｃ９−ポジティブ細胞（３Ｂ１０−Ｃ９，Ｐｒｏｆ．Ｊｕｄｙ　Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍｕｎｉｃｈ）ＥｐＣＡＭに対する高親和性ｍＡｂである）を示すことに注意しなければならない。
【０１２３】
実施例ＩＶ：３種類の微小転移性細胞における活性関連遺伝子発現
異なる腫瘍および疾病段階の３名の患者から単一の腫瘍細胞を単離した。第１の患者（Ｃ）は子宮頚部癌腫の１０年間の歴史を有し，胸部ｘ腺で疑わしい知見を有していた。第２の患者（Ｌ）においては，最近肺の腺癌が診断され，これは手術後にｐＴ２，Ｎ３，Ｍ０の段階であると判定された。骨髄試料は手術前の麻酔の間に採取した。第３の試料は，疾病がｐＴ１ａ，ｐＮ１ａ（１／１８），Ｍ０の段階である３１歳の乳癌患者（Ｂ）から吸引した。局所的再発，組織学的なＧ３の等級付け，および骨髄における１つのサイトケラチン−ポジティブ細胞の知見のため，この患者は高容量の化学療法（ＨＤ）を受けた。骨髄試料はＨＤ完了の１ヶ月後に採取した。３つすべての細胞についてＳＣＯＭＰを実施し，細胞が癌性起源であることが確認される多数の染色体異常を示した（表４）。
【０１２４】
表４：子宮頚部癌腫（Ｃ），肺癌（Ｌ）および乳癌（Ｂ）を有する３人の患者の骨髄から単離された３Ｂ１０−Ｃ９−ポジティブ細胞のゲノム異常
【表１４】
2004508010.tif 000015
【０１２５】
３種類の微小転移性細胞から得られたＣＧＨデータのまとめ。各細胞について，各染色体の短腕（ｐ）および長腕（ｑ）の喪失（Ｌ）および獲得（Ｇ）が示されている。
【０１２６】
最も進行の程度の低い疾病を有していた患者Ｂからの細胞は，最も低い程度の染色体変化を示した（図４）。
【０１２７】
３つすべての細胞からｍＲＮＡを単離し，上述したようにＳＣＡＧＥ用の試料を調製した。対照として，細胞を加えずに同じ方法を実施した。ｃＤＮＡ増幅物を合計で１，３００種類の遺伝子を含む，ＣｌｏｎｔｅｃｈのＣａｎｃｅｒ１．２フィルターおよび新たに作成したアレイ（ＡｘｘｉｍａＡ６，Ｍａｒｔｉｎｓｒｅｉｄ）にハイブリダイズさせた。
【０１２８】
ナイロンフィルターへの非放射性ハイブリダイゼーションは以下のように行った：１５ｎｇのＰＣＲ増幅しサブクローンした種々のｃＤＮＡフラグメントをＡｘｘｉｍａ　ＡＧ（Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ）により正に荷電したナイロンフィルターにスポットした。フィルターを６ｍｌのＤｉｇ−ｅａｓｙＨｙｂ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）中で，５０μｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉおよび５０μｇ／ｍｌのｐＢＳＤＮＡの存在下で一夜プレハイブリダイズさせた。単一の細胞からの９μｇの標識ＰＣＲ産物を１００μｇのニシン精子，３００μｇのＥ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡおよび３００μｇと混合し，９４℃で５分間変性させ，６ｍｌのＤｉｇ−ｅａｓｙハイブリダイゼーション緩衝液に加え，３６時間ハイブリダイズさせた。Ｒｏｃｈｅジゴキシゲニンハイブリダイゼーションプロトコルにしたがって２回ストリンジェント洗浄を行い，さらに０．１ｘＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で６８℃で１５分間追加の２回のストリンジェント洗浄を行った。フィルターに結合したプローブの検出は，キットとともに提供されるジゴキシゲニン検出システムプロトコル（Ｒｏｃｈｅ）にしたがって行った。
【０１２９】
３種類の遺伝子のみが，陰性対照の少なくとも１つからシグナルが得られたために分析から除く必要があった。これらの遺伝子は，ＶＨＬ−結合蛋白質，カスパーゼ１０，ＴＧＦ−βおよびヘモグロビンαであった。陽性シグナルの数は，それぞれ患者Ｂ，Ｃ，およびＬからの細胞について，５．３％（７０／１３１３），７．０％（９２／１３１３）から１１．８％（１５５／１３１３）の範囲であった。これらの数は，単一のインビトロで成長した癌腫細胞からの数（シグナルは１０−２０％の遺伝子（データ示さず）から得られた）より有意に低かった。３つの腫瘍細胞はすべて，増殖，複製または成長休止の制御において役割を果たすことが知られている遺伝子を発現していた（図５；表５）。
【０１３０】
表５：細胞Ｃ，ＬおよびＢにおいて細胞サイクル状態に関与することが示唆されるアップレギュレートされた遺伝子
【表１５】
2004508010.tif 000016
【０１３１】
細胞ＣおよびＢは細胞サイクルのいくつかのポジティブレギュレータを発現していたが，ＢおよびＬのみが細胞サイクル阻害剤を発現していた。
【０１３２】
細胞Ｃは，細胞サイクル進行に重要な遺伝子，例えば，サイクリンＡ（ＣＣＮＡ），ＥＢ１，ＲＣ２，Ｐ２Ｇ４，ＰＩＮ１，ＲＢＢＰ４およびＣＥＮＰＦを最も多数発現していた。これらの遺伝子のほとんどは厳密に転写的に制御されており，そのｍＲＮＡは細胞分裂が進行するにつれて急速に分解されるため，その発現は，細胞Ｃがサイクル進行に関わることのみならず，ＳＣＡＧＥによりこの活性に正確に捕獲されうることを示す。
【０１３３】
細胞Ｂは複製ならびに細胞サイクル阻害に重要な多数の遺伝子を発現していた。転写産物のパターンは，細胞がＤＮＡ修復の段階にあったことを示唆する。ＧＡＤＤ４５（ＤＤＩＴ１）およびｐ２１（ＣＤＫＮ１Ａ）の共発現は，成長休止を示す（Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６，１３７６−１３８０（１９９４））。同様に，正の細胞サイクルレギュレータ，例えば，ＤＮＡ−ＰＫ，ＲＦＣ２，ＬＩＧ１，ＡＤＰＲＴおよびＰＲＩＭ１の発現がＤＮＡ修復に関与することが示唆されている（Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，１８９７−１９０５（１９９９）；Ｂａｒｎｅｓ，Ｃｅｌｌ，６９，４９５−５０３（１９９２），Ｍｏｓｓｉ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５４，２０９−２１６（１９９８）；Ｌｅｅ，Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．１７，１４２５−１４３３（１９９７））。この細胞はアルキル化剤による遺伝子毒性高用量化学療法から生存したため，その発現プロファイルは，細胞サイクルへに再び入ることが回避されたように解釈することができる。この解釈は，プロ−アポトーシス遺伝子，例えば，カスパーゼ−６およびＢＡＤの発現がこの細胞においてのみ見いだされることにより支持される。しかし，この細胞におけるアポトーシスの完成は，サービビン（ＡＰ１４）の発現により妨げられるであろう（図５；表５）。
【０１３４】
細胞Ｌから得られたトランスクリプトームは，これが散在およびＥＭＴに関与していることと一致する特徴を示した。細胞Ｌの遺伝子発現はサイクリングまたはＤＮＡ修復細胞の発現と似ていなかったが（上述を参照），その８４種類の異なるように発現されている遺伝子は主として細胞骨格再編成，細胞接着および細胞外蛋白質分解活性に関与する（表６；図６）。
【０１３５】
表６：侵襲性表現型を示す細胞Ｌにおいてアップレギュレートされている遺伝子
【表１６】
2004508010.tif 000017
【０１３６】
本研究は，癌患者の骨髄に由来する個々の腫瘍細胞の細胞活性を始めて分析したものである。細胞Ｃは，１０年間の潜伏期間の後に肺転移を示した子宮頚部癌腫患者に由来するものであった。この細胞は増殖していることが見いだされた。細胞Ｂは，いくぶん小さい原発性癌を有し，その腫瘍が見かけ上攻撃的であったために高用量の化学療法を受けた乳癌患者の骨髄に由来する。この細胞は，比較的少なくかつ別々のゲノム変化を示し，この知見は，散在に必要なゲノム変化に関して特に興味深い。さらに，この細胞は，アルキル化剤を含む高用量化学療法投与計画にエピルビシンおよびタキソールを加えた通常の化学療法の４サイクルから生き残ったはずである。得られた発現プロファイルは成長休止および進行しつつあるＤＮＡ修復に特徴的である。
【０１３７】
散在のプロセスに関連する情報を最も与えるものは細胞Ｌのトランスクリプトームであった。この細胞は，臨床的に明白な転移を有しない気管支癌患者において検出され，活発な遊走および侵襲に関与する蛋白質をコードする多くの遺伝子を発現していた。ｕＰＡシステムのほとんどの活性化カスケード，すなわちカテプシンＢ，Ｄ，Ｌ，ｕＰＡレセプターおよびｕＰＡ自身が発現していることが見いだされた。同様に，糸状足，ラメリポディウムおよび張線維の組織化に関与する遺伝子，ＲｈｏファミリーメンバーであるＲｈｏＡおよびＢ，Ｒａｃ１，Ｃｄｃ４２およびｐ１６０ｒｏｃｋ，およびいくつかの接着分子をコードする遺伝子がこの細胞中でアップレギュレートされていた。多くのサイトケラチンおよびＥＭＴのマーカーであるビメンチンの発現により示されるように，その細胞骨格はリモデリングが進行していたようである。
【０１３８】
培養細胞株から単離された単一の細胞における転写産物の数は，患者由来腫瘍細胞のものより著しく低かったことに注目すべきである。この相違は，転写のインビボ制御がより密集しており，これは，細胞が培養細胞中で成長すると，ＤＮＡ脱メチル化等のためにより緩和されることを示すのかもしれない。したがって，エクスビボ標本の発現分析は，細胞株を用いる研究よりはるかに多くの情報を与えるであろう。これまでにｃＤＮＡアレイ分析に用いられてきた最少数の細胞は，１，０００細胞（Ｌｕｏ（１９９９），上掲）の範囲であった。アレイハイブリダイゼーションの感度は，より長い固定化ｃＤＮＡフラグメント（Ｃｌｏｎｔｅｃｈアレイのフラグメント長さは約２００ｂｐである），およびより密度が高く複雑なガラスチップを用いて得られた情報の量により，さらに高くなるであろう。本実験は１，３００種類の遺伝子のみを分析したが，微小転移性細胞については，これまでにわずか９種類の蛋白質の発現しか報告されていなかったことを考慮しなければならない。
これらの蛋白質は，ＥｒｂＢ２，トランスフェリンレセプター，ＭＨＣクラス１，ＥｐＣＡＭ，ＩＣＡＭ−１，プラコグロビン，Ｋｉ−６７，ｐ１２０およびｕＰＡレセプター／ＣＤ８７である（Ｐａｎｔｅｌ，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．９１，１１１３−１１２４（１９９９））。
【０１３９】
本明細書に記載される方法は，多くの他の分野において少数の細胞による遺伝子発現の研究の可能性を有する（以下の例えばヒト再狭窄組織の実験に示される）。例えば，胚発生において空間的にかつ過渡的に制御されている遺伝子発現の研究および成人組織における幹細胞および分化した細胞の分析を行うことができる。単一細胞分析は，異型性増殖，化生，プレ新生物性病巣およびインシトゥー癌腫の理解を大きく進歩させるであろう。
【０１４０】
同じ細胞のゲノム異常と発現プロファイルとの一覧は，腫瘍細胞集団中の異なる遺伝子型および表現型の偶発性を明らかにする。
【０１４１】
高用量化学療法，外科手術，および抗新脈管形成療法は，急速に分裂している細胞および大きな腫瘍塊を標的とすることができるが，レムナント細胞の排除には効果的ではなく，最小残留疾病につながる。アジュバント療法，例えば抗体に基づく方法（Ｒｉｅｔｈｍｕｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１６，１７８８−１７９４（１９９８））は，やはり原発性腫瘍において同定される蛋白質標的に基づいている。本明細書に示される方法は，微小転移性細胞を直接分析することにより，最小残留疾病に対する標的を発見する機会を提供する。
【０１４２】
実施例Ｖ：ヒト再狭窄組織における異常な遺伝子発現
さらに，上述の方法を用いて，ヒト再狭窄組織において異なるように発現されている遺伝子を検出した。
【０１４３】
再狭窄の割合が高いため，冠状動脈アテローム性動脈硬化症の疾病に頻繁に用いられる治療としての経皮，経管腔冠状動脈血管形成術および続くステント移植の成功が著しく制限されている．インステント再狭窄の発達においていくつかの細胞および分子メカニズムが同定されているが，再狭窄の有効な治療的予防の特異的標的はまだ不足している。この実験においては，ヒトインステント再狭窄からの微小アテレクトミー標本において，異なるように発現されている遺伝子を同定した。免疫組織化学は，再狭窄材料が主として平滑筋細胞（ＳＭＣ）から構成されており，単核細胞の浸潤はほとんどないことを示した。再狭窄標本から調製したｃＤＮＡ試料（ｎ＝１０），および対照として健康な筋性動脈の内膜および中膜からのｃＤＮＡ試料（ｎ＝１０）を，新規ポリメラーゼ連鎖反応プロトコルを用いて増幅し，異なるように発現されている遺伝子を同定するためにｃＤＮＡアレイにハイブリダイズさせた。デスミンおよび乳由来成長阻害剤の発現はダウンレギュレートされていたが，ＦＫ５０６結合蛋白質１２（ＦＫＢＰ１２），トロンボスポンジン−１，プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ−１，および７０−ｋＤａ熱ショック蛋白質Ｂの発現は，ヒト新脈管内膜において高い統計学的有意性をもってアップレギュレートされていることが認められた。免疫組織化学を用いて，ＴＧＦ−シグナリングの負のレギュレータであるＦＫＢＰ１２もまた，新脈管内膜において蛋白質レベルでアップレギュレートされており，これはブタ再狭窄モデルの治療におけるＦＫＢＰ１２リガンドであるラパマイシンの治療効果の理論的根拠を与える。
【０１４４】
平滑筋細胞遊走，増殖および細胞外マトリクスの合成を支配する転写およびシグナリング事象についてさらなる洞察を得るために，ヒト再狭窄組織の顕微鏡標本から生成したプローブを用いるｃＤＮＡアレイ技術を用いてディファレンシャル遺伝子発現スクリーニングを行った。この技術の力は，１つの試料に対して数千種類の遺伝子の発現を同時に調べることができることである（Ｋｕｒｉａｎ，（１９９９）ＪＰａｔｈｏｌ１８７：２６７−２７１）。この方法を用いることの以前のハードルは，通常は１０６−１０７個の細胞からなる試料からの数マイクログラムのｍＲＮＡまたはｃＲＮＡが必要であることであった。ここでは，上述した本発明の新規な技術を用いた。このことにより，単一の細胞または少数の細胞から包括的ｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーションに十分な量の代表的ｃＤＮＡ増幅物を生成することが可能となった。
【０１４５】
各新脈管内膜および静止性中膜の１０標本を，機能が知られている２，４３５種類の遺伝子の発現について調べた。ハウスキーピング遺伝子の発現は正常組織と再狭窄組織との間でほぼ同等であったが，実験した遺伝子の１０パーセント近くは，増加したかまたは減少したレベルの発現を示した。この研究においては，これまでに再狭窄と関連づけられている選択された遺伝子に注目した。ヒト新脈管内膜過形成において，デスミンおよび乳由来成長因子阻害剤（ＭＤＧＩ）の発現は選択的にダウンレギュレートされたが，プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ−１（ＣＯＸ−１），トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１），熱ショック蛋白質−７０Ｂ（ｈｓｐ７０Ｂ）およびＦＫ５０６−結合蛋白質１２（ＦＫＢＰ１２）の発現はアップレギュレートされていることが認められた。これらの知見はすべて，遺伝子特異的ＰＣＲにより確認した。新脈管内膜における遺伝子発現の増加の有意性を調べるために，ｍＲＮＡレベルの増加が蛋白質レベルの増加に反映されているか否かを調べた。免疫組織化学を用いるＦＫＢＰ１２に例示されるように，再狭窄組織においてＴＧＦ−シグナリングのこのレギュレータの大きな過剰発現が実際に認められた。この研究は，非常に少ない量の材料しか入手可能でない場合であっても，ｃＤＮＡアレイ技術を用いて健康なおよび疾病を有するヒト組織において異なるように発現されている遺伝子を信頼性をもって同定しうることを示す。
【０１４６】
インステント再狭窄実験群は，一次ステント移植の４−２３か月後に再び狭窄したステント中におけるらせんカッター装置動脈切除（Ｘ−サイザー，Ｅｎｄｉｃｏｒ）による別々のアテレクトミー法を受けた１３人の患者から構成されるものであった。すべての患者はこの方法についてのインフォームドコンセントを受け，術前に１５，０００単位のヘパリンを投与し，次に標準的な療法としてシートを除去した後の最初の１２時間１，０００単位／時間の静脈内ヘパリンを注入した。すべての患者に焼灼（ｃａｔｈｅｒｉｓａｔｉｏｎ）前にアスピリン５００ｍｇを静脈内投与し，術後の抗トロンビン療法は実験の全体を通してチクロピジン（２５０ｍｇｂｄｓ）およびアスピリン（１００ｍｇｂｄｓ）からなるものであった。
【０１４７】
試料の調製は以下のように行った：
アテレクトミー標本は，病巣の減量手術後直ちに液体窒素中で凍結し，記載されるようにしてｍＲＮＡ調製を行うまで液体窒素中に保存した。冠状動脈からのインステント再狭窄組織（ｎ＝３）の組織学および免疫組織化学のためには，試料を記載されるように４％パラホルムアルデヒド中で固定し，パラフィン中に包埋した。
【０１４８】
対照群は，５人の異なる患者からの胃腸管の筋性動脈の５標本および心臓移植を受けた３人の異なる患者からの冠状動脈の５標本からなるものであった。対照標本は直ちに液体窒素中で凍結した。ｍＲＮＡ調製の前に，対照動脈の中膜および内膜を調製し，免疫組織化学によりアテローム性動脈硬化症の変化について調べた。血管形態にアテローム性動脈硬化症の変化がなければ，標本（約１ｘ１ｍｍ）を健康な対照試料として用い，ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡの調製は記載されるようにして行った。
【０１４９】
ＦＫＢＰ１２の免疫組織化学のためには，頸動脈再狭窄動脈の新脈管内膜標本（ｎ＝２）をアテレクトミーにより採取し，除去後直ちに液体窒素中で凍結した。試料の３つの３μｍの連続凍結切片をＤＡＫＯ　Ｃｈｅｍ　Ｍａｔｅ　キャピラリーギャップ顕微鏡スライド（１００μｍ）上にマウントした。
【０１５０】
ｍＲＮＡ調製およびｃＤＮＡ増幅は以下のようにして行った：静止性血管またはインステント再狭窄組織の標本を急速に冷凍し，ｍＲＮＡ調製およびｃＤＮＡ合成を行うまで液体窒素中で保存した。凍結組織を液体窒素中ですりつぶし，凍結粉末を溶解／結合緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ７．５，５００ｍＭＬｉＣｌ，１０ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０，１％ＬｉＤＳ，５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））に溶解し，完全に溶解するまでホモジナイズした。溶解物を４℃で１０，０００ｇで５分間遠心分離して，細胞破片を除去した。ｍＲＮＡは，Ｄｙｎｂｅａｄｓ（登録商標）ｍＲＮＡ　ＤｉｒｅｃｔＫｉｔ（登録商標）（Ｄｙｎａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて製造元の推奨にしたがって調製した。簡単には，溶解物を１試料につき５０μＬのあらかじめ洗浄したＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５に加え，ミキサー上で４℃で３０分間回転させることによりｍＲＮＡをアニーリングさせた。上清を除去し，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５／ｍＲＮＡ複合体をＩｇｅｐａｌを含む洗浄緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，７５ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＤＴＴ，０２５％Ｉｇｅｐａｌ）で２回，Ｔｗｅｅｎ−２０を含む洗浄緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓＨＣＩ，ｐＨ８．０，７５ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＤＴＴ，０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄した。ｃＤＮＡは上述した方法を用いてＰＣＲにより増幅した。第１鎖ｃＤＮＡ合成は，固相ｃＤＮＡ合成として行った。ヘキサヌクレオチドプライマーによるランダムプライミングを用いて逆転写反応を行った。ｍＲＮＡはそれぞれ，１ｘ第１鎖緩衝液（Ｇｉｂｃｏ），０．０１ＭＤＴＴ（Ｇｉｂｃｏ），０．２５％Ｉｇｅｐａｌ，５０μＭのＣＦＬ５ｃ−プライマー５（ＣＣＣ）５ＧＴＣＴＡＧＡ（ＮＮＮ）２−３’］，各０．５ｍＭのｄＮＴＰ（ＭＢＩ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｇｉｂｃｏ）を含む２０μＬの反応容量中で逆転写し，４４℃で４５分間インキュベートした。続くテイリング反応は，４ｍＭＭｇＣｌ２，０．１ｍＭＤＴＴ，０．２ｍＭｄＧＴＰ，１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４および１０Ｕのターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＭＢＩ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含む１０μＬの反応容量中で行った。混合物は３７℃で２４分間インキュベートした。
【０１５１】
ｃＤＮＡは，１ｘ緩衝液１（Ｅｘｐａｎｄ（登録商標）ロングテンプレートＰＣＲキット，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ），３％脱イオン化ホルムアミド，１，２μＭＣＰ２−プライマー［５’−ＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧ（ＣＣＣ）５−３’］，３５０μＭｄＮＴＰおよび４．５ＵＤＮＡポリメラーゼミックス（エクスパンドロングテンプレートＰＣＲキット，Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｎ）を含む５０μＬの反応容量中でＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ反応は以下のサイクルパラメータで２０サイクル行った：９４℃で１５秒間，６５℃で０：３０分間，６８℃で２分間。次の２０サイクルは，９４℃で１５秒間，６５℃で３０秒間，６８℃で２：３０＋０：１０／サイクル分間；６８℃で７分間；その後４℃。２５ｎｇの各ｃＤＮＡをＰＣＲの間にジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Ｄｉｇ−ｄＵＴＰ）（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で標識した。ＰＣＲは，５０μＬの反応容量で，１ｘＰｕｆｆｅｒ１，１２０μＭＣＰ２プライマー，３％脱イオン化ホルムアミド，３００μＭｄＴＴＰ，３５０μＭｄＡＴＰ，３５０μＭｄＧＴＰ，３５０μＭｄＣＴＰ，５０μＭＤｉｇ−ｄＵＴＰ，４．５ＵＤＮＡ−ポリメラーゼミックスを用いて行った。サイクルパラメータは以下のとおりであった：１サイクル：９４℃で２分間；１５サイクル：９４℃で１５秒間，６３℃で１５秒間，６８℃で２分間；１０サイクル：９４℃で１５秒間，６８℃で３分間＋５秒間／サイクル；１サイクル：６８℃で７分間，その後４℃。
【０１５２】
ｄＵＴＰ標識ｃＤＮＡプローブを用いるＣｌｏｎｔｅｃｈｃ　ＤＮＡアレイのハイブリダイゼーションは以下のように行った：ｃＤＮＡアレイを，５０ｍｇ／ＬのＤＮＡｓｅｌ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）消化ゲノムＥ．ｃｏｌｉＤＮＡ，５０ｍｇ／ＬのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドＤＮＡおよび１５ｍｇ／Ｌのニシン精子ＤＮＡ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤｉｇＥＡＳＹＨｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中で４４℃で１２時間プレハイブリダイズさせて，膜上の非特異的核酸結合部位をブロックすることにより，バックグラウンドを低下させた。ハイブリダイゼーション溶液を，癌，心臓血管およびストレス応答に関連する（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）選択された遺伝子を有する市販のｃＤＮＡアレイにハイブリダイズさせた。各ｃＤＮＡテンプレートを変性させ，５μｇ／ｍｌＤｉｇ−ｄＵＴＰ−標識ｃＤＮＡの濃度でプレハイブリダイゼーション溶液に加えた。ハイブリダイゼーションは４４℃で４８時間行った。
【０１５３】
次に，ブロットを２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回，１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６８℃で１回すすぎ，次に０．５ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回１５分間および０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで１回３０分間６８℃で洗浄した。アレイにハイブリダイズしたＤｉｇ標識ｃＤＮＡの検出のためには，Ｄｉｇ発光検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）をユーザマニュアルに記載のように用いた。化学発光シグナルの検出のためには，アレイを化学発光フィルムに室温で３０分間露光させた。アレイデータの定量は，フィルムをスキャニングし，Ａｒｒａｙｖｉｓｉｏｎソフトウエア（Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｃａｔｈａｒｉｎｅｓ，Ｃａｎａｄａ）で分析することにより行った。バックグラウンドを差し引き，シグナルを各フィルター上に存在する９種類のハウスキーピング遺伝子に対して標準化し，このことによりハウスキーピング遺伝子発現シグナルの平均を１に設定し，バックグラウンドを０に設定した。パイロット実験においては，２つのプローブの１つが豊富である６個のクローンをＲＴ−ＰＣＲによりさらに分析した。
【０１５４】
実験の結果は，実験群または対照群の１０個の実験標本の平均発現値として表す。２つの患者群の間の相違はウイルコキソンテストにより分析した（ＳＰＳＳバージョン８．０）。０．０３より低いＰ値を有意であると見なした。
【０１５５】
ディファレンシャルハイブリダイゼーションシグナルの選択は，遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲにより確認した。ＰＣＲ反応は，２．５ｎｇの各ｃＤＮＡを用いて，１ｘＰＣＲ緩衝液（Ｓｉｇｍａ），２００μＭｄＮＴＰ，０．１μＭの各プライマーおよび０．７５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｓｉｇｍａ）を含む２５μｌの反応液中で行った。以下のプライマーを用いた：デスミン，５’−ＡＣＧＡＴＴＣＣＣＴＧＡＴＧＡＧＧＣＡＧ−３’および５’−ＣＣＡＴＣＴＴＣＡＣＧＴＴＧＡＧＣＡＧＧ−３’；トロンボスポンジン−１，５’−ＣＴＧＡＧＡＣＧＣＣＡＴＣＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧ−３’および５’−ＧＴＣＴＴＴＧＧＣＴＡＣＣＡＧＴＣＣＡＧＣＡＧＣ−５’；乳房由来成長阻害剤，５’−ＡＡＧＡＧＡＣＣＡＣＡＣＴＴＧＴＧＣＧＧ−３’および５’−ＡＡＴＧＴＧＧＴＧＣＴＧＡＧＴＣＧＡＧＧ−５’；プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ−１，５’−ＣＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＴＣＣＡＡＴＡＣＣ−３’および５’−ＣＣＣＣＡＴＡＧＴＣＣＡＣＣＡＡＣＡＴＧ−３’；ＦＫＢＰ１２，５’−ＡＴＧＣＣＡＣＴＣＴＣＧＴＣＴＴＣＧＡＴ−３’および５’−ＧＧＡＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＡＡＧＣＴＣＣ−３’；熱ショック蛋白質７０Ｂ，５’−ＴＡＣＡＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣ−３’および５’−ＣＴＴＣＣＣＧＡＣＡＣＴＴＧＴＣＴＴＧＣ−３’，およびβ−アクチン，５’−ＣＴＡＣＧＴＣＧＣＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＡＧＣ−３’および５’−ＧＡＴＧＧＡＧＣＣＧＣＣＧＡＴＣＣＡＣＡＣＧＧ−３’。ＰＣＲ産物は，ＴＡＥ緩衝液（２０ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣＩ，１０ｍＭ酢酸，１ｍＭＥＤＴＡ）中に臭化エチジウム（０．５μｇ／ｍｌアガロース溶液）を含む２％アガロースゲルで電気泳動を行った。
【０１５６】
免疫組織化学は以下のように実施した：
細胞のタイピングのための免疫組織化学は，冠状動脈インステント再狭窄からの３つの新脈管内膜標本のパラフィン包埋切片について行い，ＦＫＢＰ１２の検出のためには頸動脈再狭窄からの４つの新脈管内膜標本の凍結切片を用いた。３μｍの連続切片をＤＡＫＯ　Ｃｈｅｍ　Ｍａｔｅ（登録商標）キャピラリーギャップ顕微鏡スライド（１００μｍ）上にマウントし，６５℃で一夜焼結し，脱パラフィン化して，標準的プロトコルにしたがって脱水した。抗原の回収のためには，標本を圧力釜中でクエン酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ６．０）中で４分間煮沸した。内因性ペルオキシダーゼは１％Ｈ２Ｏ２／メタノールで１５分間ブロッキングした。一次抗体の非特異的結合は，スライドを抗体希釈液（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中の４％乾燥スキムミルクでプレインキュベートすることにより低下させた。免疫染色は，ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ手法によりＣｈｅｍ　Ｍａｔｅ検出キットＨＲＰ／Ｒｅｄウサギ／マウス（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて製造元の記載にしたがって行った。この方法はＤＡＫＯ　Ｔｅｃｈ　Ｍａｔｅ（登録商標）５００Ｐｌｕｓ自動化染色システム中で行った。平滑筋アクチン（Ｍ０６３５，ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ；１：３００），ＣＤ３（Ａ０４５２，ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ；１：８０），ＭＡＣ３８７（Ｅ０２６，Ｃａｍｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；１：２０）およびＦＫＢＰ１２（ＳＡ−２１８，Ｂｉｏｍｏｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１：２０）に対する一次抗体を抗体希釈液中で希釈し，室温で１時間インキュベートした。核をヘマトキシリンで対比染色した後，スライドを脱水し，Ｐｅｒｔｅｘ（Ｍｅｄｉｔｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でカバーした。
【０１５７】
ＦＫＢＰ１２免疫組織化学のためには，頸動脈再狭窄からの新脈管内膜標本の３μｍの凍結連続切片をＤＡＫＯ　Ｃｈｅｍ　Ｍａｔｅ（登録商標）キャピラリーギャップ顕微鏡スライド（１００μｍ）上にマウントした。
【０１５８】
以下の結果が得られた：
（ａ）減量したインステント再狭窄材料の細胞組成
新脈管内膜過形成のｘ−サイザー処置から得られた代表的試料を，その細胞組成を決定するために免疫組織化学により分析した。分析した再狭窄組織は，ＰＴＣＡおよびステント移植の２ヶ月以上後に冠状動脈からｘ−サイザー減量手術により除去した。この方法により生成した組織の量は非常に少なく，およそ３００−１００００個の細胞が含まれていた。図７Ａは，減量再狭窄材料からの小さい試料からの切片のファンゲッソン（Ｅ．−ｖａｎ−Ｇｉｅｓｓｏｎ）染色を示す。この染色法を用いると，コラーゲン繊維は赤色に染色され，フィブリンは黄色に染色され，平滑筋細胞の細胞質は暗黄茶色に染色される。減量手術した材料の体積の大部分はゆるい細胞外マトリクス様コラーゲンファイバーから構成され，明るい赤色に染色された。黄色のフィブリン染色はほとんど検出されなかった。紡錘形状の核および黄色／茶色に染色された細胞質を有する細胞の頻度が高かった。これらが平滑筋細胞であること，およびこれらが再狭窄材料において大量に存在することは，平滑筋α−アクチン（図７Ｂ）に対する抗体を用いる免疫染色により裏付けられた。ここでは，遺伝子発現分析に用いた全標本からの切片の染色パターンが示される。以下に記載されるように，そのような試料はまた，強い平滑筋特異的α−アクチンｍＲＮＡシグナルを生じた（図８を参照）。これらの結果は，先の実験からの知見を裏付け（Ｋｏｍａｔｓｕ，（１９９８），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９８：２２４−２３３；Ｓｔｒａｕｓｓ（１９９２），Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２０：１４６５−１４７３；Ｋｅａｒｎｅｙ（１９９７），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９５：１９９８−２００２），新脈管内膜において見いだされる主な細胞タイプが平滑筋細胞に由来するものであることを示す。文献に記載されるように，減量手術した再狭窄組織標本のある領域における単核浸潤も識別することができた（データ示さず）。これらの浸潤は，主としてマクロファージから，およびより少ない程度でｔリンパ球から構成されていた。再狭窄組織においては，ＣＤ２０に対する抗体を用いる免疫組織学的染色ではｂ−リンパ球は検出できなかった（データ示さず）。
【０１５９】
（ｂ）微小ヒト組織試料における特異的遺伝子の発現
インシトゥーのｍＲＮＡレベルを最適に保存するために，再狭窄および対照標本を採取した後液体窒素中で急速に冷凍し，上述するように注意深く溶解した。合成されたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅後，ドットブロットアッセイにより増幅されたｃＤＮＡの量を測定し，２００−３００ｎｇ／μｌであることがわかった。すべての増幅されたｃＤＮＡ試料の量は，β−アクチン，平滑筋細胞α−アクチンおよび偏在性伸長因子ＥＦ−ｌαのｃＤＮＡを検出するプライマーを用いる遺伝子特異的ＰＣＲにより試験した。図８は，患者Ｂからの材料およびドナーｂからの対照中膜を用いた代表的結果を示す。いずれの標本においても，ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンおよびＥＦ−１αからの正しいサイズのＰＣＲシグナルが同等の量で検出可能であった（レーン１と２をレーン４と５と比較されたい）。さらに，各標本から平滑筋細胞のマーカーとしてのα−アクチンシグナルが得られた（レーン３および６）。これらの結果は，微小ヒト再狭窄試料を用いてｍＲＮＡ調製，ｃＤＮＡ合成およびｃＤＮＡのＰＣＲ増幅が実行可能であることを示す。
【０１６０】
（ｃ）微小ヒト組織試料を用いる比較遺伝子発現プロファイリング
再狭窄と健康な標本とにおいて異なるように発現されているｍＲＮＡを同定するために，上述したようにＰＣＲ増幅の間にジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰでｃＤＮＡを標識した。この標識により，写真フィルム上でｃＤＮＡアレイのハイブリダイゼーションシグナルを高い感度で化学発光に基づいて検出することが可能となる。ｃＤＮＡアレイを有するナイロンフィルターをＤＮＡｓｅｌ−消化ゲノムＥ．ｃｏｌｉＤＮＡと，およびＤＮＡｓｅｌ−消化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドＤＮＡとプレハイブリダイズさせた。この方法は，アレイに対する非特異的ＤＮＡ結合を最大限に低下させるために用いた。各標識プローブを３つの異なる市販のｃＤＮＡアレイにハイブリダイズさせ，このことにより合計で２，４３５種類の既知遺伝子の発現分析が可能であった。図９は，患者Ｂの再狭窄組織から（パネルＡ），およびドナーｂの中膜から（パネルＢ）調製したプローブを用いて，１つのアレイで得られた代表的ハイブリダイゼーションパターンを示す。図８に示される遺伝子特異的分析と一致して，アレイの右および下レーンにスポットしたヒトゲノムｃＤＮＡの陽性対照および種々のハウスキーピング遺伝子のｃＤＮＡスポットを用いて，匹敵するハイブリダイゼーションシグナルが得られた（例えば，スポットＤを参照）。ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅反応から生物学的標本を除くと，ハイブリダイゼーションシグナルはほとんど得られなかった（図９，パネルＣ）。このことは，ハイブリダイゼーションシグナルがもっぱら加えた試料に由来し，用いた試薬または材料中のＤＮＡ夾雑物に由来するものではないことを示す。
【０１６１】
ハイブリダイゼーションパターンを肉眼で調べることにより，健康な組織と患部組織とで異なっている多数のシグナルを容易に同定することができる（例えば，シグナルＡ，ＢおよびＣ，図９ＡおよびＢ）。再狭窄組織からの試料は一貫して対照組織より大きいシグナルを与えた。３つの異なるｃＤＮＡアレイを用いて１０個の再狭窄患者試料および１０個の正常中膜試料から得られたハイブリダイゼーションシグナルは，写真フィルムの密度分析により定量化し，データを電子的にコンパイルして，統計学的にさらに分析した。２，４３５種類の遺伝子のうち５３の発現レベルが図１０に示されており，図の凡例に示されるように，１つの灰色の値がシグナル強度に対応する。遺伝子発現の顕著な変動が，ここに示される患者とドナーとの遺伝的および生理学的相違を反映するかもしれないほとんどの遺伝子について明らかである。遺伝子特異的ＰＣＲによるさらなる分析および確認のためには，ウイルコキソンテストにより少なくともｐ＝０．０３の統計学的な相違で異なる発現を示す遺伝子のみを考慮した。６種類のそのような遺伝子は一覧において強調されている（図１０）。２４３５種類の既知の遺伝子のうち合計で２２４種類の遺伝子が，新脈管内膜において高い統計学的有意性をもって異なるように制御されていることが見いだされた。これらの包括的な徹底的な分析は別途公表されるであろう。匹敵する試料の質を示すように，２０個すべての試料において８種類のハウスキーピング遺伝子は非常に類似したハイブリダイゼーションシグナル強度を示した（図１０，下）。
【０１６２】
（ｄ）遺伝子特異的ＰＣＲによるｃＤＮＡアレイデータの確認
図１０に挙げられるものの中から，６種類の異なるように制御されている遺伝子および１種類のハウスキーピング遺伝子を選択して，遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲによりハイブリダイゼーションシグナルを確認した。得られたすべてのＰＣＲシグナルは，予測されたサイズを有していた。試料の質が同等であることの裏付けとして，２０個すべての試料についてβ−アクチンシグナル（下）は非常に類似する強度を示した。遺伝子特異的ＰＣＲシグナル（図１１）とｃＤＮＡアレイから得られたハイブリダイゼーションシグナル（図１１）とを比較することにより，１４０シグナルのうち１３５が強度に関してマッチすることがわかった。これは，ｃＤＮＡアレイからのハイブリダイゼーションシグナルの９６％の忠実度に対応し，ここで用いた遺伝子発現プロファイリング法が，質および感度に関して遺伝子特異的ＰＣＲに匹敵することを示す。
【０１６３】
（ｅ）ヒト再狭窄組織における異常な遺伝子発現
間葉のマーカーであるデスミンは，対照中膜において強く発現されていることが見いだされたが，再狭窄標本においては弱いシグナルのみが見られた（図１０および１１）。デスミンは，静止期の分化したＳＭＣにおいて高度に発現されているＳＭＣのマーカーである。その発現は，脱分化した増殖しているＳＭＣ，例えばアテローム性動脈硬化症のプラークのＳＭＣ（Ｕｅｄａ（１９９１），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８３：１３２７−１３３２）において減少している。再狭窄組織におけるデスミンのダウンレギュレーションは，再狭窄材料中の紡錘形状の細胞が脱分化した増殖ＳＭＣであることを示唆する。反対に，ＴＧＦＲ活性化およびＳＭＣ遊走および増殖において重要な細胞外マトリクス蛋白質であるＴＳＰ−１（Ｙｅｈｕａｌａｅｓｈｅｔ（１９９９），Ａｍ　Ｊ　Ｐａｔｈｏｌ　１５５：８４１−８５１；Ｓｃｏｔｔ（１９８８），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５０：２７８２８６）は，新脈管内膜標本の大部分において対照試料と比較して顕著にアップレギュレートされていた。ＣＯＸ−１，ストレス誘導性ｈｓｐ７０Ｂおよび偏在的に発現されているＦＫＢＰ１２遺伝子は，ほぼすべての新脈管内膜過形成において顕著にアップレギュレートされており，対照標本ではほとんどまたは全く発現されていなかった（図１０および１１）。腫瘍サプレッサーであるＭＤＧＩは，静止期の平滑筋において強く発現されていたが，いくつかの新脈管内膜過形成試料においてはほとんど発現が見られなかった。デスミンは，いずれの再狭窄病巣でも発現されていないが（０／０），対照では１００％（１０／１０）であり，ＭＤＧＩは新脈管内膜標本のわずか３０％（３／１０）で非常にわずかに発現されていたのに対し，対照の８／１０（８０％）で発現されていた。他の点では，ＴＳＰ−１（７／１０），ＣＯＸ−１（９／１０），ｈｓｐ７０Ｂ（８／１０）およびＦＫＢＰ１２（１０／１０）は，新脈管内膜においては対照標本（ＴＳＰ−１［０／１０］，ｈｓｐ７０Ｂ［０／１０］，ＣＯＸ−１［０／１０］，ＦＫＢＰ１２［１／１０］）に対して著しくアップレギュレートされていた。
【０１６４】
（ｆ）ＦＫＢＰ１２蛋白質の発現はヒト再狭窄組織においてアップレギュレートされている
ｍＲＮＡレベルのアップレギュレーションは，厳密には蛋白質のレベルの増加を示さない。ヒト新脈管内膜においてアップレギュレートされている遺伝子のうち，ＦＫＢＰ１２は，ＴＧＦ−ｆ３シグナリングのレギュレータであり，ＦＫ５０６およびラパマイシン薬剤の標的であるため，特に興味深い。再狭窄の齧歯類モデルにおけるラパマイシンの治療効果（Ｇａｌｌｏ（１９９９），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９９：２１６４−２１７０）はほとんど理解されていないが，ＦＫＢＰ１２の発現レベルの変化と関連しているであろう。ＦＫＢＰ１２に特異的な抗体を用いて，頸動脈再狭窄からのヒト再狭窄組織（ｎ＝３）および対照組織（ｎ＝３）を蛋白質の発現について分析した。図１２に示されるように，再狭窄病巣からのＳＭＣの細胞質において，紡錘形状の核により示されるようにＦＫＢＰ１２蛋白質の増加が検出された（図１２ＢおよびＤ）。一方，健康な中膜の対照ＳＭＣではＦＫＢＰ１２は検出できず（図１２Ｃ），新脈管内膜のＳＭＣでは独特の染色が見られた（図１２Ｄ）。興味深いことに，特に再狭窄血管の新脈管内膜と健康な中膜との境界領域に存在する平滑筋細胞は高レベルのＦＫＢＰ１２蛋白質を発現していた（図１１Ｂ）。
【０１６５】
実施例ＶＩ：ヒト再狭窄組織のトランスクリプトームの特徴づけ
インステント再狭窄を有する１０人の患者のアテレクトミー標本，１０人の患者の血液細胞，１１人のドナーの正常冠状動脈標本，および培養ヒト冠状動脈平滑筋細胞において，機能の知られている２，４３５種類の遺伝子の発現（実施例Ｖを参照）を調べた。２２４種類の遺伝子が，新脈管内膜と対照組織との間で高い統計学的有意性（ｐ＜０．０３）をもって異なるように発現されていた。これらの遺伝子は以下のように分類することができる：（１）新脈管内膜においてのみ発現されている遺伝子；（２）新脈管内膜および増殖平滑筋細胞の両方で発現されている遺伝子；（３）新脈管内膜および血液試料の両方で発現されている遺伝子；および（４）対照組織において発現されているが新脈管内膜においてはほとんど発現されていない遺伝子。ヒト新脈管内膜のトランスクリプトームは，増殖，アポトーシス，炎症，細胞骨格再編成および組織リモデリングに関連する顕著な変化を示した。さらに，新脈管内膜においてインターフェロン−γシグナリングに関与する３２種類のアップレギュレートされている遺伝子が同定された。
【０１６６】
この実験においては，新脈管内膜の１０個の標本および静止性内膜／中膜の１１個の標本について，機能の知られている２，４３５種類のヒト遺伝子の発現を分析した。ハウスキーピング遺伝子の発現は，正常組織と再狭窄組織との間でほぼ同等であったが，印象的な数の遺伝子（ｎ＝２２４）は発現レベルの増加または減少を示した。新脈管内膜における遺伝子発現パターンは予期された増殖的応答を示し，主としてＧ１／Ｓ期において発現されている遺伝子が誘導され，平滑筋表現型が収縮から合成ＳＭＣに変化し，細胞外マトリクス蛋白質の合成が変化していた。さらに，マクロファージおよびＴリンパ球のマーカーの存在により，およびＩＦＮに対する細胞応答における機能が知られている多数の遺伝子の発現により特徴づけられるプロ炎症発現パターンが観察された。ＩＦＮ−γシグナリングにおける中枢的な転写因子であるＩＲＦ−１蛋白質は，ヒト新脈管内膜のＳＭＣにおいて過剰発現していることが見いだされた。
【０１６７】
この実施例の実験群の患者の臨床的特性は表７に示される。
【０１６８】
表７．１３人の患者の臨床データ
【表１７】
2004508010.tif 000018
【０１６９】
すべてのアテレクトミー標本は，病巣の減量手術後液体窒素中で急速に冷凍し，上述するようにｍＲＮＡ調製を実施するまで液体窒素中に保存した。
【０１７０】
対照群は，５人の患者からの腸の筋性動脈の５個の標本および心臓移植を受けた３人の患者からの冠状動脈の６個の標本から構成された。対照標本は液体窒素中で急速に冷凍した。ｍＲＮＡ調製の前に，動脈の中膜および内膜を調製した。標本の小さい断片（約１ｍｍ３）を急速に溶解し，残りをアテローム性動脈硬化症的な変化について組織学的に調べた。アテローム性動脈硬化症的な血管形態学の変化が存在しない場合，標本を”健康な”対照試料として用い，上述のようにｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ調製を行った。
【０１７１】
頸動脈（ｎ＝３）および大腿（ｆｅｍｏｒａｌｉｓ）動脈（ｎ＝３）の新脈管内膜組織は，再狭窄中のアテレクトミーにより調製し，切除した後液体窒素中で急速に冷凍した。冠状動脈（ｎ＝３）および再狭窄末梢動脈の新脈管内膜（ｎ＝６）からのインステント再狭窄組織の組織学的評価および免疫組織化学のためには，記載されるように，試料を４％パラホルムアルデヒド中で固定し，パラフィン中に包埋した。
【０１７２】
血液試料は，再狭窄血管の血管再生の直後に得た。８ｍｌの血液試料を回収して３５ｍｌのＴｒｉ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｂｌｏｏｄ（ＭＢＩ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に加え，次に，製造元のプロトコルに記載されるようにＲＮＡ調製を実施するまで−８０℃で凍結した。血液細胞の１μｇの全ＲＮＡを１０００μｌの溶解／結合緩衝液に溶解し，ｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ合成は上述するように行った。
【０１７３】
細胞培養は以下のように行った：
初代ヒト冠状動脈平滑筋細胞（ＣＡＳＭＣ）は，Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓｔ．Ｋａｔｈｒｉｎｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し，５％ウシ胎児血清（Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔ．Ｋａｔｈｒｉｎｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む平滑筋細胞成長培地（Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓｔ．Ｋａｔｈｒｉｎｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中で３７℃で５％ＣＯ２の湿潤雰囲気下で成長させた。実験には２−４継代のＣＡＳＭＣを用いた。増殖しているＣＡＳＭＣのｃＤＮＡ合成のためには，細胞を氷冷リン酸緩衝化食塩水中で３回洗浄し，次に１ｘ１０４個の細胞を１０００μｌの溶解／結合緩衝液中で溶解させた後に，上述するようにｍＲＮＡを調製した。
【０１７４】
遺伝子発現パターンの判定は以下のように行った：
試料ｍＲＮＡの調製，ｃＤＮＡ合成，ＰＣＲ増幅およびプローブ標識，ｃＤＮＡアレイハイブリダイゼーションおよびデータ分析は，上述したように，特に実施例Ｖに記載されるようにして実施した。得られたｃＤＮＡプローブを，機能が知られている合計２，４３５種類の遺伝子を有するＨｕｍａｎ１．２，Ｃａｎｃｅｒ１．２，心臓血管およびストレスｃＤＮＡアレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にハイブリダイズさせた。ｃＤＮＡアレイ間では約２０％の遺伝子の重複があった。単一の細胞レベル程度の微小ヒト組織試料の分析のためには，本明細書に記載されるｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅の新規方法を用いた（実施例Ｉ−Ｖを参照）。
【０１７５】
アレイデータの定量化は，フィルムをスキャンし，Ａｒｒａｙ　ｖｉｓｉｏｎソフトウエア（Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｃａｔｈａｒｉｎｅｓ，Ｃａｎａｄａ）で分析することにより行った。バックグラウンドを差し引き，シグナルを各フィルターに存在する９種類のハウスキーピング遺伝子について標準化した。このことにより，ハウスキーピング遺伝子発現シグナルの平均を１に設定し，バックグラウンドを０に設定した。図１に示される対数表示のためには，値を１０００倍した。１つの群のすべての試料の平均で平均値＞０．０５をポジティブシグナルとみなした。実験群と対照群との間の平均発現レベルが２．５倍以上相違するものについてさらに統計学的に分析した。
【０１７６】
実験的分析の結果は，実験群の実験した１０個の標本または対照群の実験した１１の標本の平均発現値として示される。患者群とドナー群との間の相違は，ウイルコキソンテスト（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ−ｔｅｓｔ：ＳＰＳＳバージョン８．０）により分析した。遺伝子は，２つの群の間でウイルコキソンテストにおいてｐ値が＜０．０３であり，かつ，１つの実験群で１０個の試料中少なくとも５個で異なる発現が観察されるが他の群中では１０個のうち０である場合，または１つの群中で１０個の試料のうち少なくとも７個で観察されるが，他の群中で１０個のうち最大３個である場合にのみ，異なるように発現されているとみなした。
【０１７７】
免疫組織化学は以下のように実施した：免疫組織化学は，冠状動脈インステント再狭窄からの３つの新脈管内膜標本，大腿動脈からの３つの新脈管内膜標本および頸動脈新脈管内膜標本からの３つの新脈管内膜標本からのパラフィン包埋切片について行った。３μｍの連続切片をＤＡＫＯ　Ｃｈｅｍ　Ｍａｔｅ（登録商標）キャピラリーギャップ顕微鏡スライド（１００μｍ）上にマウントし，日常的なプロトコルにしたがって，６５℃で一夜焼結し，脱パラフィン化し，脱水した。抗原の回収のために，標本をクエン酸緩衝液（１０ｍＭｏｌ，ｐＨ６．０）中で圧力容器中で４分間煮沸した。１％Ｈ２Ｏ２／メタノールで１５分間，内因性ペルオキシダーゼをブロックした。スライドを抗体希釈液（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中４％ドライスキムミルク中でインキュベートすることにより一次抗体の非特異的結合を低下させた。免疫染色は，Ｄａｋｏ　Ｃｈｅｍ　Ｍａｔｅ検出キットＨＲＰ／Ｒｅｄウサギ／マウス（ＤＡＫＯ　Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて，製造元の説明書にしたがって，ストレプトアビジンペルオキシダーゼ手法により行った。この方法は，ＤＡＫＯ　Ｔｅｃｈ　Ｍａｔｅ（登録商標）５００　Ｐｌｕｓ自動化染色システム中で行った。平滑筋アクチン（Ｍ０６３５，ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ；１：３００），ＣＤ３（Ａ０４５２，ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ；１：８０），ＭＡＣ３８７（Ｅ０２６，Ｃａｍｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；１：２０）およびＩＲＦ−１（ｓｃ−４９７，ＳａｎｔａＣｒｕｚ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に対する一次抗体は，抗体希釈液で希釈し，室温で１時間インキュベートした。核をヘマトキシリンで対比染色した後，スライドを脱水し，Ｐｅｒｔｅｘ（Ｍｅｄｉｔｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてカバーグラスをかぶせた。
【０１７８】
以下の結果が得られた：
（ａ）ヒト新脈管内膜における遺伝子発現の差異
２，４３５種のうち合計で１，１８６種の遺伝子（４８．７％）が，新脈管内膜および対照試料を用いたｃＤＮＡアレイで２０倍の発現レベルの範囲で検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを生じた（図１３Ａ）。これらのうち，３５２種の遺伝子（１４．５％）は，再狭窄と対照試料との間で２．５倍以上の差で発現しているようであった。しかし，発現レベルは個々の試料によりかなり変動していた（例えば図１５を参照）。したがって，統計学的な分析を用いて，実験群と対照群との間で高い有意性をもって異なるように発現されている遺伝子を同定した（方法の節を参照）。このようにして，再狭窄実験群と対照群との間でウイルコキソンテストのｐ＜０．０３の有意性で少なくとも２．５倍の差異で発現されている２２４種の遺伝子（９．６％）を単離した。このうち１６７種（７５％）の遺伝子は再狭窄実験群で対照群と比較して過剰発現しており，５６種の遺伝子（２５％）は過小発現していた（図１３Ｂ）。
【０１７９】
統計学的有意性に加え，発現データの妥当性は，用いた４種類のアレイ上のｃＤＮＡ要素の２０％重複によっても支持された。このようにして，独立したハイブリダイゼーション実験において，実質的な数のハイブリダイゼーションシグナルを二重または三重に決定した。二重の決定の４つの例が図１６（上）に示されており，これはすべて高い再現性を示した。ハイブリダイゼーションシグナルをさらに確認するために，異なるように発現されている遺伝子のうち３８種を，遺伝子特異的プライマーを用いるｃＤＮＡ試料のＰＣＲ分析用に選択した。３８種の遺伝子のうち３５種（９２％）のハイブリダイゼーションシグナルを遺伝子特異的ＰＣＲにより確認することができ，予測されたサイズおよび相対的量のシグナルが得られた（データ示さず）。これらのデータは，用いたｃＤＮＡアレイによる方法が，質および感度に関して遺伝子特異的ＰＣＲに匹敵することを示す。最後に，新脈管内膜において異常に発現している２２４種の遺伝子のうち１１２種類はこれまでに，新脈管内膜，ＳＭＣ，線維芽細胞，内皮細胞または間葉において発現されていることが文献に記載されている（図１４で＃で示す）。
【０１８０】
新脈管内膜発現に関しては，２２４種の異常に制御されている遺伝子は４個のサブグループに分類された（図１４）。グループＩは，新脈管内膜で過剰発現され，対照血管，ＣＡＳＭＣまたは血液細胞においては高度にもしくは検出可能なように発現されていない６２種の遺伝子を含む（図１４Ａ）。グループＩＩは，新脈管内膜とＣＡＳＭＣとで同様に発現されている４３遺伝子を含み，これは，新脈管内膜のこの遺伝子クラスターはＳＭＣの増殖に起因するものであることを示唆する（図１４Ｂ）。グループＩＩＩは，新脈管内膜と血液細胞とで同様に発現されている６２種の遺伝子を含み，これは，この遺伝子クラスターが浸潤した血液細胞による新脈管内膜のものに起因するものであることを示唆する（図１４Ｃ）。この概念は，４つすべての群のうち，群ＩＩＩににおいて最も数の多い炎症関連遺伝子が発現されていることにより裏付けられる。最後に，群ＩＶにおいては，５６種類の遺伝子が新脈管内膜において対照群と比較してダウンレギュレートされている（図１４Ｄ）。以下に，新脈管内膜における選択された遺伝子の異常な発現について，その遺伝子機能の文脈で議論する。
【０１８１】
まとめると，ヒト新脈管内膜において異なるように発現されている以下の遺伝子が検出された：
【表１８】
2004508010.tif 000019
【０１８２】
【表１９】
2004508010.tif 000020
【０１８３】
【表２０】
2004508010.tif 000021
【０１８４】
【表２１】
2004508010.tif 000022
【０１８５】
【表２２】
2004508010.tif 000023
【０１８６】
【表２３】
2004508010.tif 000024
【０１８７】
【表２４】
2004508010.tif 000025
【０１８８】
【表２５】
2004508010.tif 000026
【０１８９】
【表２６】
2004508010.tif 000027
【０１９０】
【表２７】
2004508010.tif 000028
【０１９１】
【表２８】
2004508010.tif 000029
【０１９２】
【表２９】
2004508010.tif 000030
【０１９３】
【表３０】
2004508010.tif 000031
【０１９４】
【表３１】
2004508010.tif 000032
【０１９５】
例えば，ヒト新脈管内膜において異なるように発現されている遺伝子のうち１７種類が，転写的レギュレータをコードすることが見いだされた。１４種類の転写因子のｍＲＮＡレベルが新脈管内膜において誘導されており，３種類は発現の低下を示した（図１５）。前者の群のいくつかの転写因子は，これまでにＳＭＣの増殖およびアポトーシスと（例えば，ＨＭＧ−１，Ｅ２Ｆ１，（ＲＦ−１，Ｆｌｉ−１），およびヒト新脈管内膜におけるプロ炎症シグナリングと（例えば，ＩＲＦ−１，ＩＲＦ−７およびＲｅｌＢ）と関連づけられている。以下の転写因子がアップレギュレートされていた：Ｅ２Ｆ１，エストロゲン関連レセプターアルファ，ｅｔｓドメイン蛋白質ｅｌｋ−３，ｆｌｉ−１オンコジン，ＨＭＧ−１，インターフェロンレギュレータ因子１，インターフェロンレギュレータ因子７，ＩＳＧＦ３−ガンマ，核レセプター関連１，ＲＥＬＢ，転写因子Ｓｐｉ−Ｂ，ｖａｖオンコジン，ｖ−ｅｒｂＡ関連蛋白質，ビタミンＤ３レセプター。一方，以下の遺伝子がダウンレギュレートされていた：ホメオボックス蛋白質ＨＯＸＢ７，初期成長応答蛋白質１，血清応答因子。
【０１９６】
Ｅｔｓファミリーの転写因子の発現に顕著な変化が生じているようである。一方，Ｓｐｉ−Ｂ，ｆｌｉ−オンコジン，およびＥｔｓ−リプレッサーＥｌｋ−３は，新脈管内膜において誘導され，Ｅｔｓ転写因子Ｅｇｒ−１は抑制されていた（図１４および１５）。
【０１９７】
さらに，増殖的応答の制御または媒介に関与する多数の遺伝子が，新脈管内膜と対照群とで異なるように発現されていた。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）−Ａおよびアンジオテンシノーゲン遺伝子（その産物は有糸分裂促進物質としてＳＭＣに作用する）は新脈管内膜においてのみ発現されていた（図１４）。アンジオテンシンは，インスリンによりアップレギュレートされ，ＳＭＣにおいてＰＤＧＦ−Ａの発現を誘導することが知られている。進行中の増殖のサインとして，細胞サイクルのＧ１／Ｓ移行に伴って発現されることが知られているいくつかの遺伝子が，新脈管内膜においてアップレギュレートされていることが見いだされた。これらには，転写因子Ｅ２Ｆ１，７０−ｋＤａ複製蛋白質Ａ，オンコジン産物Ｐｉｍ−１およびゲラニルゲラニルトランスフェラーゼが含まれる。さらに，細胞サイクルのＧ／Ｓ１期およびＳ期において発現され，ヒト新脈管内膜における進行中の増殖を示す細胞−サイクル制御性ヒストンＨ４のアップレギュレーションが観察された。
【０１９８】
新脈管内膜における細胞成長の再プログラミングは，明らかに，新脈管内膜において種々のシグナル伝達経路において機能を有する蛋白質をコードするいくつかの遺伝子，例えば，細胞表面レセプターＥＤＧ−１，ＥＤＧ−４，インスリンレセプターおよびＰ２Ｘプリノセプター５，および他のシグナリング蛋白質，例えば，リボソーム蛋白質Ｓ６キナーゼ１１アルファ１，ファルネシルトランスフェラーゼ，ホスホリパーゼＣベータ２，成長因子レセプター結合蛋白質２，および小さいＧ蛋白質ＣＤＣ４２，ＲｈｏＧ，ｐ２１−Ｒａｃ２およびＲａｌＢを誘導する。酵素ファルネシルトランスフェラーゼは，Ｒａｓおよびいくつかの他のシグナル伝達Ｇ蛋白質の必須の翻訳後脂質化を触媒する。Ｇ蛋白質，例えば，ｐ２１−Ｒａｃ２，ＣＤＣ４２およびＲｈｏＧは，シグナル伝達経路において中枢的役割を果たし，細胞遊走および細胞増殖につながる。同様に，平滑筋におけるホスホリパーゼＣベータ２によるアゴニスト刺激性１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）産生には，Ｇ蛋白質活性化，および活性化Ｒａｃ，およびｐ７０Ｓ６キナーゼの活性化において重要な役割を果たすＰｉ３キナーゼと結合したＣｄｃ４２が必要である。ｐ７０Ｓ６キナーゼ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）は，成長因子および有糸分裂促進物質に応答して細胞サイクルがＧ１期に入りＳ期に進むための重要なレギュレータである。これは，新脈管内膜形成において中枢的役割を果たすことが知られている多数の成長因子関連シグナル伝達経路，例えばアンジオテンシン，エンドセリンおよびＰＤＧＦに関与する。ｐ７０Ｓ６キナーゼのアップレギュレーションと調和して，新脈管内膜におけるＦＫ５０６結合蛋白質（ＦＫＢＰ）１２のｍＲＮＡレベル（図１４）および蛋白質レベルでの有意なアップレギュレーションが認められた。
【０１９９】
細胞サイクル進行の阻害剤をコードする多数の遺伝子が休止期の中膜において発現されるが，新脈管内膜においては有意にダウンレギュレートされる（図１４）ことが観察された。これらには，ＣＩＰ１，ｐ１６−ＩＮＫ４，メタロチオネイン，ＴＧＦ−ベータ３，乳房由来成長阻害剤，ＦｒｚＢおよびＧａｄｄ４５ベータおよびガンマサブユニットが含まれる。
【０２００】
さらに，ヒト新脈管内膜においてプロアポトーシス機能を有する蛋白質をコードする遺伝子のアップレギュレーション，例えば，カスパーゼ−１，ＤＡＰ−１およびＡＰＯ−２リガンド，ならびに抗アポソーシス機能を有する蛋白質をコードする遺伝子のアップレギュレーション，例えば，ＢＡＧ−１，ＢＣＬ−２−関連蛋白質Ａ１およびトレイルレセプター３（図１４）が認められた。
【０２０１】
最後に，ヒト新脈管内膜トランスクリプトームは，ＩＦＮ−γシグナリングに関連する３２種類の遺伝子のアップレギュレーションを示した（図１６）。ＩＦＮ−γレセプターアルファは新脈管内膜，増殖しているＣＡＳＭＣおよび，より低い程度で血液細胞中で発現していた。一方，ＩＦＮ−γレセプターベータは主として新脈管内膜標本で発現していた。同様に，Ｐｙｋ２のアップレギュレーションが観察された。
【０２０２】
ＩＦＮ−γにより制御されるカスパーゼ−１，カスパーゼ−８およびＤＡＰ−１の遺伝子のアップレギュレーションがヒト新脈管内膜において認められた。しかし，抗アポトーシス蛋白質ＢＡＧ−１，Ｐｉｍ−１（いずれもＩＦＮ−γにより制御される）およびＢＣＬ−２−関連蛋白質Ａ１のｍＲＮＡもまた対照と比較して新脈管内膜においてアップレギュレートされていた（図１４）。
【０２０３】
炎症応答において機能を有する多数の遺伝子がヒト新脈管内膜において活性化されていることが見いだされた。浸潤性炎症性細胞，例えばマクロファージおよびＴリンパ球（例えば，ＣＤ１１ｂ，ＣＤ３）（図１４Ｃ）または新脈管内膜ＳＭＣ（例えば，プロスタグランジンＧ／Ｈシンターゼ１，ホスホリパーゼＡ２，熱ショック蛋白質７０，Ｃ５ａアナフィラトキシンレセプター，ＩＦＮ−レセプター）（図１４ＡおよびＢ）からは，炎症前遺伝子パターンが得られた。新脈管内膜におけるＣＤ４０の選択的発現は注目に値する（図１４Ａ）。ＣＤ４０は最初はＢ細胞の表面にあると記述されたＴＮＦレセプターファミリーのメンバーである。
【０２０４】
新脈管内膜において，細胞骨格，細胞外マトリクスおよび細胞接着の以下の変化が認められた：
増殖しているＣＡＳＭＣにおいて新脈管内膜におけるコネキシン４３およびサイトケラチン−１８のアップレギュレーションが見られたが（図１４Ｂ，上パネル），デスミンの発現は新脈管内膜において非常に減少していた（図１４Ｄ，上パネル）。
【０２０５】
新脈管内膜において異なるコラーゲンサブタイプおよびテナシンの転写が減少していたが（図１４Ｄ，上パネル），トロンボスポンジン−１およびベルシカンの発現はアップレギュレートされていた（図１４Ｂ，上パネル）。
【０２０６】
接着分子，例えばＰ−セレクチン，ＩＣＡＭ２およびカドヘリン１６をコードする多数の遺伝子は，新脈管内膜において高度に発現していることが認められたが，ＳＭＣ，血液細胞または対照血管では認められなかった（図１４Ａ，上パネル）。他の多くの接着分子は，新脈管内膜，培養ＳＭＣ（図１４Ｂ）および血液細胞（図１４Ｃ）において同様に発現されていた。新脈管内膜は，動脈の中膜／内膜で通常発現されているある種の接着分子，例えばインテグリンａ７Ｂ，ａ３またはＭＵＣ１８の発現をダウンレギュレートするようである。
【０２０７】
実施例Ｖｌｌ：ＩＦＮ−γシグナリング経路においてアップレギュレートされている遺伝子
上述したように，インステント再狭窄を有する１０人の患者のアテレクトミー標本，１０人の患者の血液細胞，１１人のドナーからの正常冠状動脈標本および培養ヒト冠状動脈平滑筋細胞における機能既知の２，４３５種類の遺伝子の発現を調べ，新脈管内膜と対照組織との間で高い統計学的有意差（ｐ＜０．０３）をもって異なるように発現されていた２２４種類の遺伝子を同定した。特に，インターフェロン−γシグナリングに関連する３２種のアップレギュレートされた遺伝子が新脈管内膜において同定された。
【０２０８】
ＩＦＮ−γレセプターアルファは，新脈管内膜，増殖ＣＡＳＭＣ，およびより程度は低いが血液細胞において発現されていた。これに対し，ＩＦＮ−γレセプターベータは主として新脈管内膜の標本において発現されていた。
【０２０９】
ＩＦＮ−γは，αおよびβレセプター鎖を含有する高親和性レセプターを介してシグナルを伝える。興味深いことに，ＴＨ１細胞は，レセプターの修飾を用いてＩＦＮ−γ−耐性状態を達成する（Ｐｅｒｎｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６９（１９９５），２４５−２４７）。タイプ１およびタイプ２Ｔヘルパー細胞のＩＦＮ−γシグナリング経路の活性化におけるサブタイプ特異的相違は，タイプ１Ｔ細胞におけるＩＦＮγレセプターβの欠失のためである。したがって，ここに提供されるデータは，両方の鎖を含有する高親和性ＩＦＮ−γレセプターが主として新脈管内膜の平滑筋細胞において発現されることを主張するであろう。
【０２１０】
ＩＦＮ−シグナリングの活性化と一致して，新脈管内膜においてＩＦＮシグナリングに必須の２つの転写因子：ＩＲＦ−１およびＩＳＧＦ３γ（ｐ４８）のアップレギュレーションが見いだされた。これらの転写因子は，ＩＦＮ−γにより転写的にアップレギュレートされることが知られており（Ｄｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９５（１９９８），１５６２３−１５６２８），いずれもＩＦＮ−γシグナリングにおいて鍵となる役割を果たす（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０（１９９９），６９９−７０３；Ｋｉｍｕａｒ，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ１（１９９６），１１５−１２４；Ｋｉｒｃｈｈｏｆｆ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１（１９９３），２８８１−２８８９；Ｋａｎｏ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２５７（１９９９），６７２−６７７）。同様に，チロシンキナーゼＰｙｋ２のアップレギュレーションが認められた。これはＳＭＣにおいてアンジオテンシンによるシグナル伝達に役割を果たすことが知られている（Ｓａｂｒｉ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８３（１９９８），８４１−８５１）。Ｐｙｋ２はＩＦＮ−γにより選択的に活性化され，ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてＰｙｋ２を阻害すると，ＭＡＰＫおよびＳＴＡＴ１のＩＦＮ−γ誘導性活性化が強く阻害される（Ｔａｋａｏｋａ，ＥＭＢＯ　Ｊ．１８（１９９９），２４８０−２４８８）。
【０２１１】
ＩＦＮ−γ誘導性成長阻害およびアポトーシスにおいて鍵となる事象はカスパーゼの誘導である（Ｄａｉ，Ｂｌｏｏｄ　９３（１９９９），３３０９−３３１６）。ＩＲＦ−１が血管ＳＭＣにおいてカスパーゼ−１の発現を誘導し，アポトーシスにつながること（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ　３３（１９９９），１６２−１６６），およびアテローム性動脈硬化症においてアポトーシス性ＳＭＣおよびマクロファージがカスパーゼ−１とともに局在すること（Ｇｅｎｇ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７（１９９５），２５１−２６６）が示されている。この実験においては，ヒト新脈管内膜において，カスパーゼ−１のＩＦＮ−γ制御性遺伝子であるカスパーゼ−８およびＤＡＰ１のアップレギュレーションが見いだされた。しかし，抗アポトーシス蛋白質であるＢＡＧ−１，Ｐｉｍ−１（いずれもＩＦＮ−γにより制御される）およびＢＣＬ−２−関連蛋白質Ａ１のｍＲＮＡもまた，新脈管内膜において対照と比較してアップレギュレートされた（図１６）。このことは，ヒト新脈管内膜においては増殖およびアポトーシスが同時に生じ，増殖が優勢であるという概念を支持する。
【０２１２】
その産物が新脈管内膜プロセスの異なる工程において作用する遺伝子の協調的制御は，我々の遺伝子発現分析の繰り返しのテーマであった。ＩＦＮ−γ経路に関しては，完全なレセプター，主な転写因子，シグナル伝達経路の構成成分（Ｄａｐ−１，ＢＡＧ−１，Ｐｉｍ−１，ＩＦＮ−γ−誘導性蛋白質，ＩＦＮ−誘導性蛋白質９−２７）の遺伝子のみならず，ＩＦＮ−γ経路のいくつかの標的遺伝子，例えばＣＤ４０，ＣＤ１３およびトロンボスポンジン−１も誘導される（図１６）。
【０２１３】
ＩＦＮ−γ制御性遺伝子のクラスターは新脈管内膜標本において発現されていたが，関連性のある遺伝子のいくつか，例えばＩＲＦ−１は血液試料においても発現されていた。ＩＦＮ−γにより制御されるパターンに主として起因する細胞タイプを識別するために，冠状インステント再狭窄（ｎ＝３）および末梢動脈の再狭窄（ｎ＝６）からの新脈管内膜標本の凍結切片をＩＲＦ−１に特異的な抗体で染色した。この蛋白質は，ＩＦＮ−γシグナル伝達経路に必須であり（Ｋｉｍｕｒａ，上掲），クラスター中の他の遺伝子と協調的に発現されるために選択した（図１６）。免疫組織化学分析は，頸動脈再狭窄（図１７）および冠状インステント再狭窄（図１８）の新脈管内膜ＳＭＣにおいて，紡錘形状の核および平滑筋細胞マーカーであるアルファ−アクチンによる染色により示されるように（図１８），ＩＲＦ−１の強い核および細胞質染色を示した。インステント再狭窄におけるＩＲＦ−１の核染色（図１８）は，ＩＲＦ−１転写因子もまた活性化されていることを示した。頸動脈動脈の対照中膜のＳＭＣはＩＲＦ−１染色を示さなかった（図１７）。ＣＤ３−ポジティブ細胞の量は，標本（図１８）においてＳＭＣ（図１８）よりはるかに少なく，このことは，ＳＭＣがヒト新脈管内膜において主としてＩＲＦ−１発現の増加に寄与していることを示す。
【０２１４】
ヒトアテローム性動脈硬化症の病巣におけるＩＦＮ−γの存在はよく確立されている（Ｒｏｓｓ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０（１９９９），１１５−１２６）が，その役割はまだ不明である。ＩＦＮ−γはインビトロでＳＭＣにおいて増殖を阻害しアポトーシスを誘導するが（Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，上掲；Ｗａｒｎｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ８３（１９８９），１１７４−１１８２），ＩＦＮ−γが存在しないと，アテローム性および移植性動脈硬化症のマウスモデルにおいて内膜過形成が減少する（Ｇｕｐｔａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ９９（１９９７），２７５２−２７６１；Ｒａｉｓａｎｅｎ−Ｓｏｋｏｌｏｗｓｋｉ，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５２（１９９８），３５９−３６５）。この知見と一致して，ブタおよびヒト動脈組織においてＩＦＮ−γが白血球の非存在下で免疫不全マウスの大動脈内への白血球の挿入により動脈硬化症を誘導することが示された（Ｔｅｌｌｉｄｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ４０３（２０００），２０７−２１１）。
【０２１５】
インステント再狭窄の新脈管内膜における浸潤Ｔリンパ球の役割はまだ調べられていない。本研究においては，４個の新脈管内膜試料のうち３個において免疫生化学者によりＣＤ３−ポジティブ細胞が検出されることが示され（図１８を参照），１０個の新脈管内膜標本のうち７個においてｃＤＮＡアレイ上でＣＤ３特異的ハイブリダイゼーションシグナルが得られた（図１８）。いずれの方法により調べた場合でも，ＣＤ３についてネガティブの試料においても，ＩＦＮ−γ−関連発現パターンが認められ，このことは，サイトカインが広範囲のＴ細胞浸潤を必要とせずにある距離を越えてパラクライン様式で新脈管内膜に作用しうることを示唆する。Ｔ細胞およびプロ炎症サイトカインＩＦＮ−γはアテローム性動脈硬化症において重要な役割を果たすことが知られているが（Ｒｏｓｓ，上掲），新脈管内膜の発達におけるこれらの役割はほとんど研究されていない。本発明により提供されるデータは，新脈管内膜過形成の病態生理学におけるＩＦＮ−γの重要な役割を示唆する。
【０２１６】
実施例ＶＩＩＩ：代用細胞株の調製
病理学的に変更されている細胞および／または組織用の代用細胞株は，以下の工程により調製することができる：
ａ）患部組織のトランスクリプトーム／遺伝子発現パターンの明確化：
患部組織の顕微鏡標本は，アテレクトミー，減量手術，生検，患部組織のレーザー切除または患部組織の肉眼手術による切開のいずれかにより得ることができる。顕微鏡標本は，試料のトランスクリプトームのインビボの状態を保存するために，入手後速やかに液体窒素中で凍結し，ｍＲＮＡ調製を行うまで液体窒素中に保存する。
【０２１７】
そのような試料の細胞は特定の組の遺伝子を発現し，これは種々の濃度で生ずる特定のｍＲＮＡ分子の存在により反映される。所与の臨床試料におけるｍＲＮＡ分子全体およびその相対的量はトランスクリプトームと称される。患部組織のトランスクリプトームは健康な組織とは異なることが予測される。この相違は，組織の疾病状態を引き起こし，これを維持しまたはこれを示すことに関与する遺伝子のアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた発現と関連する。トランスクリプトームの分析は，典型的には特定のアレイがもつｃＤＮＡ要素の数により制限される。
【０２１８】
ｍＲＮＡ調製および増幅は，本発明の方法にしたがって実施し，上述されている。
【０２１９】
特に，患部組織の顕微鏡標本は，急速に冷凍し，上述するようにｍＲＮＡ調製およびｃＤＮＡ合成を行うまで液体窒素中に保存する。ＲＮＡ調製の方法にしたがって，凍結組織を液体窒素中ですりつぶし，凍結粉体を溶解緩衝液中に溶解する。溶解物を１０，０００ｇで４℃で５分間遠心分離して，細胞破片を除去する。ＲＮＡは，以下に記載されるように，全ＲＮＡとしてまたはｍＲＮＡとして調製することができる：（Ｓｃｈｅｎａ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０（１９９５），４６７−４７０），Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＣｌｏｎｔｅｃｈのＡｔｌａｓ　ｃＤＮＡ発現アレイのマニュアル，（Ｓｐｉｒｉｎ，ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４０（１９９９），３１０８−３１１５），（Ｃｈｅｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４（１９９６），６１０−６１４；Ａｌｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６（１９９９），６７４５−６７５０；Ｆｉｄａｎｚａ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　１８（１９９９），１２９３−１２９５；Ｍａｈａｄｅｖａｐｐａ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１９９９），１１３４−１１３６；ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘアレイについてのＬｉｐｓｈｕｔｚ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２１（１９９９），２０−２４），またはＱｉａｇｅｎ。
【０２２０】
ｃＤＮＡの調製および標識は，ＣｌｏｎｔｅｃｈまたはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのアレイハイブリダイゼーションキット用のユーザーマニュアルに記載されるように，または文献（Ｓｐｉｒｉｎ，上掲；Ｃｈｅｅ，上掲；Ａｌｏｎ，上掲；Ｆｉｄａｎｚａ，上掲；Ｍａｈａｄｅｖａｐｐａ，上掲；Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，上掲）に記載されるように行うことができる。さらに，増幅したｃＤＮＡを用いることができる。ｃＤＮＡ増幅物の調製および増幅したｃＤＮＡの標識は，上述したように，またはＳｐｉｒｉｎ（上掲）に記載されるように行うことができる。
【０２２１】
入手し標識したｃＤＮＡは，ハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いることができる。標識ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションおよびデータ分析は，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ　Ａｔｌａｓ（登録商標）ｃＤＮＡ発現アレイからのユーザーマニュアル，またはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘの製造元のマニュアルに記載されるような，または（Ｓｐｉｒｉｎ，上掲；Ｃｈｅｅ，上掲；Ａｌｏｎ，上掲；Ｆｉｄａｎｚａ，上掲；Ｍａｈａｄｅｖａｐｐａ，上掲；Ｌｉｐｓｈｕｔｚ，上掲）に記載されるような条件下で行うことができる。
【０２２２】
ｂ）対照組織のトランスクリプトーム／遺伝子発現パターンの明確化
疾病特異的遺伝子発現パターンを同定するために，患部組織の遺伝子発現パターンを健康なドナーからの対照材料と比較することができる。アテレクトミー材料の場合には，これは健康な媒体および弾力のない，例えば筋の動脈の内膜でありうる。心筋生検または腎臓生検の場合には，手術の間に回収された健康な対照組織を用いることができる。さらに，隣接する影響を受けていない組織の細胞または浸潤細胞，例えば血液細胞の遺伝子発現パターンを分析することができる。細胞マーカー蛋白質に対する抗体を用いる免疫組織化学的分析による組織の細胞の特性決定に基づいて，同じタイプの培養ヒト細胞株からトランスクリプトームを判定することができる。（例：動脈は平滑筋細胞および内皮細胞についてポジティブに染色される；したがって，培養ヒト平滑筋細胞および内皮細胞からトランスクリプトームを得る）。
【０２２３】
ｍＲＮＡの調製および増幅は，上述するように，および本発明の方法にしたがって実施することができる。得られた（標識された）ｃＤＮＡは，上述するようにハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用することができる。
【０２２４】
ｃ）疾病特異的遺伝子の関連性のある組の決定
疾病特異的遺伝子発現パターンを決定するために，最初に患部組織の遺伝子発現パターンを健康な対照組織の遺伝子発現パターンと比較しなければならない。比較のためには，十分な数の疾病標本（例えば１０個）と同じ数の対照標本の平均発現値を比較すべきである。２つの群の発現比が２．５倍より高い遺伝子について，１つの群におけるその相対的発現について分析すべきである：すなわち，１つの群において５／１０より高いポジティブがあり，他の群において０／１０である場合，または１つの群において少なくとも７／１０であり，他の群において最大で３／１０ポジティブである場合。さらに，これらのデータを統計学的に分析して，ＳＰＳＳ８．０のマニュアルに記載されるようなウイルコキソンテストでｐ＜０．０５である遺伝子を明らかにすべきである。
【０２２５】
２．５倍の顕著な過剰または過小発現に基づいて選択された遺伝子は，患部組織において異常に制御されているか，または疾病関連遺伝子であるとみなされる。次に，疾病関連遺伝子をコードする蛋白質の機能にしたがって分類する。例えば，シグナリング経路の蛋白質，サイトカイン，ケモカイン，ホルモン，それらのレセプター，浸潤細胞に特異的な蛋白質，または細胞外マトリクス，細胞接着，遊走，細胞分裂，細胞サイクル休止に関与する蛋白質をコードする遺伝子等である。同様に，公表されているＥＳＴデータベースから入手可能な遺伝子のような，機能が知られていない遺伝子は，疾病に関連するとして識別することができる。
【０２２６】
ｄ）患部組織に最も似たトランスクリプトームを有する細胞株のスクリーニング　疾病遺伝子の発現を制御しうる可能性のある薬剤は，化学物質または生物学的物質の大きなライブラリをスクリーニングすることにより発見することができる。そのような薬剤を同定するために，患部組織のトランスクリプトームを忠実に反映するスクリーニング細胞株が入手可能でなければならず，これは包括的薬剤スクリーニングを行うために大量に入手可能である。さらに，薬剤候補物がどのようにして患部組織のトランスクリプトームの特徴を有する細胞株のトランスクリプトームを変化させるかについての情報が必要である。この情報は健康な対照組織のトランスクリプトームから得られる。薬剤は，”健康な”トランスクリプトームの特徴を再び確立することができるはずである。
【０２２７】
患部組織の細胞起源と最も類似するヒト細胞株，例えば，アテレクトミーに対しては冠状動脈平滑筋細胞，肝臓疾病に対してはＨｅｐＧ２細胞，腎臓疾病に対しては腎臓細胞，または心筋疾病に対しては心臓筋芽細胞を用いるべきである。細胞は，製造元のマニュアル，例えばＡＴＣＣからのマニュアルに記載されているように，標準的な条件下で成長させるべきである。
【０２２８】
トランスクリプトーム分析／遺伝子発現パターン分析は，疾病組織および対照組織について記載されるように実施することができ，遺伝子発現パターンを疾病組織および健康な組織の遺伝子発現パターンと比較すべきである。代用物スクリーニング細胞株を生成するためには，疾病状態のトランスクリプトームに最も類似するトランスクリプトームを示す細胞株を選択すべきである。
【０２２９】
ｅ）疾病状態トランスクリプトーム／遺伝子発現パターンを模倣するための細胞株の適合化
患部組織のための代用物スクリーニング細胞株を作成するために，選択された細胞株のトランスクリプトームを患部組織のトランスクリプトームに適合させることが必要であろう。これは，１つには，細胞株を患部組織の遺伝子発現パターンに重要な役割を果たすことが示されている化合物，例えば，サイトカインまたはホルモンとともにインキュベートすることにより行うことができる。同様に，そのような化合物は，インターフェロン−ガンマの役割の証拠が得られた新脈管内膜の例に見られるように，患部組織のトランスクリプトーム分析により同定することができる。スクリーニング細胞株は，疾病に関連性を有する化合物を加える代わりに，疾病の病態生理学に関連する他の種類の細胞と共培養することにより条件づけてもよい。そのような細胞は，例えば，炎症細胞，例えば患部組織中に移動し，放出因子または細胞−細胞接触により疾病特異的遺伝子発現パターンに寄与するマクロファージまたはＴ細胞であってもよい。いずれの場合も，代用細胞株のトランスクリプトーム分析疾病特異的発現パターンを生ずるための最適な添加を識別しなければならない。
【０２３０】
代用細胞株のトランスクリプトームを疾病状態に適合させるために用いることができる化合物には，サイトカイン，成長因子，小分子化合物（薬剤），またはペプチドおよびペプチド模倣体が含まれる。そのような適合に用いることができる細胞株には，ヒト単球細胞株，例えばＵ９３７，ＴＨＰ−１またはＭｏｎｏｍａｃ−６，またはヒトＴ−細胞株，例えばＪｕｒｋａｔが含まれる。
【０２３１】
薬剤スクリーニングのために，代用細胞株を疾病トランスクリプトームにきわめて近い状態にする共培養／処置条件を選択する。
【０２３２】
以下の特定の実施例は代用物の製造を記述する。特に，再狭窄組織の代用細胞（株）は，以下の工程により調製する：
【０２３３】
ａ）インステント再狭窄組織の入手
患者
インステント再狭窄実験群は，一次ステント移植の４−２３か月後に再び狭窄したステント中でＸ−サイザーによる別々のアテレクトミー法を受けた１３人の患者から構成されるものであった。すべての患者はこの方法についてのインフォームドコンセントを受け，術前に１５，０００単位のヘパリンを投与し，次に標準的な療法としてシートを除去した後の最初の１２時間１，０００単位／時間の静脈内ヘパリンを注入した。すべての患者に焼灼（ｃａｔｈｅｒｉｓａｔｉｏｎ）前にアスピリン５００ｍｇを静脈内投与し，術後の抗トロンビン療法は実験の全体を通してチクロピジン（２５０ｍｇｂｄｓ）およびアスピリン（１００ｍｇｂｄｓ）からなるものであった。
【０２３４】
試料調製
アテレクトミー標本は，病巣の減量手術後に液体窒素中で急速に凍結し，記載されるようにｍＲＮＡ調製を行うまで液体窒素中に保存した。冠状動脈からのインステント再狭窄組織（ｎ＝３）の組織学および免疫組織化学のためには，試料を４％パラホルムアルデヒド中で固定し，記載されるようにパラフィン中に包埋した。
【０２３５】
再狭窄組織の形態学的特徴付け
免疫組織化学は，細胞タイピングのためには冠状動脈インステント再狭窄からの３つの新脈管内膜標本のパラフィン包埋切片について，ＦＫＢＰ１２の検出のためには頸動脈再狭窄からの４つの新脈管内膜標本の凍結切片について行った。３μｍの連続切片をＤＡＫＯ　Ｃｈｅｍ　Ｍａｔｅ（登録商標）キャピラリーギャップ顕微鏡スライド（１００μｍ）上にマウントし，標準的プロトコルにしたがって，６５℃で一夜焼結し，脱パラフィン化し，脱水した。抗原の回収のためには，標本をクエン酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ６．０）中で圧力釜中で４分間煮沸した。内在性ペルオキシダーゼは，１％Ｈ２Ｏ２／メタノールで１５分間でブロッキングした。一次抗体の非特異的結合は，スライドを抗体希釈液中４％乾燥スキムミルク（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）とともにプレインキュベートすることにより低下させた。免疫染色は，ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ手法により，Ｃｈｅｍ　Ｍａｔｅ検出キットＨＲＰ／Ｒｅｄラビット／マウス（ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて，製造元の記載にしたがって行った。この方法は，ＤＡＫＯ　Ｔｅｃｈ　Ｍａｔｅ（登録商標）５００Ｐｌｕｓ自動化染色システム中で行った。
【０２３６】
平滑筋アクチン（Ｍ０６３５，ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ；１：３００），ＣＤ３（Ａ０４５２，ＤＡＫＯ，Ｄｅｎｍａｒｋ；１：８０），ＭＡＣ３８７（Ｅ０２６，Ｃａｍｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ；１：２０）およびＦＫＢＰ１２（ＳＡ−２１８，Ｂｉｏｍｏｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ，１：２０）に対する一次抗体を抗体希釈液中で希釈し，室温で１時間インキュベートした。核をヘマトキシリンで対比染色した後，スライドを脱水し，Ｐｅｒｔｅｘ（Ｍｅｄｉｔｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でカバースリップを行った。
【０２３７】
減量手術インステント再狭窄材料の細胞組成
新脈管内膜の過形成のｘ−サイザー処理から得られる代表的試料を，その細胞組成を決定するために免疫組織化学により分析した。図７Ａは，減量手術再狭窄材料の小さい試料から切り出された切除された切片のファンゲッソン染色を示す。この染色法を用いると，コラーゲン繊維は赤色に染色され，フィブリンは黄色に染色され，平滑筋細胞の細胞質は暗黄茶色に染色される。減量手術材料の体積の大部分はゆるい細胞外マトリクス様コラーゲン繊維から構成され，明るい赤色に染色された。黄色いフィブリン染色はほとんど検出できなかった。紡錘形状の核および黄色／茶色に染色された細胞質を有する細胞の割合が多かった。これらが平滑筋細胞であるということ，および再狭窄材料に大量に存在することは，平滑筋α−アクチンに対する抗体を用いる免疫染色により裏付けられた（図７Ｂ）。ここでは，遺伝子発現分析に用いた全標本からの切片の染色パターンが示されている。以下に記載されるように，そのような試料はまた，強い平滑筋特異的α−アクチンｍＲＮＡシグナルを生じた（図８を参照）。これらの結果は，新脈管内膜において見いだされる主な細胞タイプは平滑筋細胞に由来するものであることを示す先の実験からの知見を裏付ける（Ｋｅａｒｎｅｙ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９５（１９９７），１９９８−２００２；Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９８（１９９８），２２４−２３３；Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏ．２０（１９９２），１４６５−１４７３）。文献（Ｋｅａｒｎｅｙ，上掲；Ｋｏｍａｔｓｕ，上掲；Ｓｔｒａｕｓｓ，上掲）に記載されるように，減量した再狭窄組織標本のある領域では単核浸潤物も同定することができた。これらの浸潤物は主としてマクロファージから構成されており，より低い程度でｔ−リンパ球が存在した。再狭窄組織においては，ＣＤ２０に対する抗体を用いる免疫組織化学染色ではｂ−リンパ球は検出できなかった。
【０２３８】
ｂ）再狭窄材料のトランスクリプトーム分析
新脈管内膜のトランスクリプトーム分析は，上述のｍＲＮＡ増幅の方法を用いて行った。
【０２３９】
ｍＲＮＡ調製
顕微鏡標本患部組織は急速冷凍し，ｍＲＮＡ調製およびｃＤＮＡ合成を行うまで液体窒素中に保存した。凍結組織を液体窒素中ですりつぶし，凍結粉体を溶解／結合緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ７．５，５００ｍＭＬｉＣｌ，１０ｍＭＥＤＴＡ，ｐＨ８．０，１％ＬｉＤＳ，５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ））に溶解し，完全に溶解するまでホモジナイズした。溶解物を４℃で１０，０００ｇで５分間遠心分離して細胞破片を除去した。ｍＲＮＡはＤｙｎｂｅａｄｓ（登録商標）；ｍＲＮＡ　Ｄｉｒｅｃｔ　Ｋｉｔ（登録商標）（Ｄｙｎａｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて，製造元の指針にしたがって調製した。簡単には，溶解物を１試料あたり５０μＬの予め洗浄したＤｙｎａｂｅａｄｓ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５に加え，混合器上で４℃で３０分間回転させることによりｍＲＮＡをアニーリングさせた。上清を除去し，Ｄｙｎａｂｅａｄｓ　Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５／ｍＲＮＡ複合体をＩｇｅｐａｌ（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ８．０，７５ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＤＴＴ，０２５％Ｉｇｅｐａｌ）を含有する洗浄緩衝液で２回，Ｔｗｅｅｎ−２０（５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ，ｐＨ８．０，７５ｍＭＫＣｌ，１０ｍＭＤＴＴ，０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０）を含有する洗浄緩衝液で１回洗浄した。
【０２４０】
増幅したｃＤＮＡの調製
ｃＤＮＡは，Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ．（Ｃ．Ｋｌｅｉｎｅｔａｌ．）の方法を用いてＰＣＲにより増幅する。第１鎖ｃＤＮＡ合成は固相ｃＤＮＡ合成として行う。逆転写反応にはヘキサヌクレオチドプライマーによりランダムプライミングを用いる。ｍＲＮＡはそれぞれ，１ｘ第１鎖緩衝液（Ｇｉｂｃｏ），０．０１ＭＤＴＴ（Ｇｉｂｃｏ），０．２５％ｌｇｅｐａｌ，５０μＭのＣＦＬ５ｃ−プライマー［５’−（ＣＣＣ）５ＧＴＣＴＡＧＡ（ＮＮＮ）２−３’］，０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ（ＭＢＩ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）および２００ＵのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｇｉｂｃｏ）を含む２０μＬの反応容量中で逆転写し，４４℃で４５分間インキュベートする。続くテイリング反応は，４ｍＭＭｇＣｌ２，０．１ｍＭＤＴＴ，０．２ｍＭｄＧＴＰ，１０ｍＭＫＨ２ＰＯ４および１０Ｕのターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＭＢＩ　Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を含む１０μＬの反応容量中で行う。混合物は３７℃で２４分間インキュベートする。
【０２４１】
ｃＤＮＡは，１ｘ緩衝液１（Ｅｘｐａｎｄ（登録商標）ロングテンプレートＰＣＲキット，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ），３％脱イオン化ホルムアミド，１２０μＭのＣＰ２−プライマー［５’−ＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧ（ＣＣＣ）５−３’］，３５０μＭｄＮＴＰおよび４．５ＵＤＮＡ−ポリメラーゼミックス（Ｅｘｐａｎｄ（登録商標）ロングテンプレートＰＣＲキット，Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｎ）を含む５０μＬの反応容量中でＰＣＲにより増幅する。ＰＣＲ反応は，以下のサイクルパラメータで２０サイクル行う：９４℃，１５秒間，６５℃，０：３０分間，６８℃，２分間；さらに，以下の２０サイクル：１サイクルにつき，９４℃，１５秒間，６５℃，３０秒間，６８℃，２：３０＋０：１０分間；６８℃，７分間；その後４℃。
【０２４２】
微小ヒト組織試料における特定の遺伝子の発現
インシトゥーのｍＲＮＡレベルを最適に保存するため，再狭窄および対照標本は，採取した後液体窒素中で速やかに凍結し，材料および方法において記載したように注意深く溶解した。合成したｃＤＮＡをＰＣＲ増幅した後，増幅したｃＤＮＡの量をドットブロットアッセイにより測定したところ，２００−３００ｎｇ／μｌであった。それぞれの増幅したｃＤＮＡ試料の質を，β−アクチン，平滑筋細胞α−アクチンおよび偏在的な伸長因子ＥＦ１αのｃＤＮＡを検出するプライマーを用いる遺伝子特異的ＰＣＲにより試験した。図８は，患者Ｂからの材料およびドナーｂからの対照中膜を用いた代表的な結果を示す。いずれの標本においても，ハウスキーピング遺伝子であるβ−アクチンおよびＥＦ−１αからの正しいサイズのＰＣＲシグナルが同じ量で検出可能であった（レーン１および２とレーン４および５を比較）。さらに，各標本から平滑筋細胞のマーカーとしてのα−アクチンシグナルが得られた（レーン３および６）。これらの結果は，微小なヒト再狭窄試料を用いてｍＲＮＡ調製，ｃＤＮＡ合成およびｃＤＮＡのＰＣＲ増幅が実行可能であることを示す。
【０２４３】
ｃＤＮＡプローブのＤｉｇ−ｄＵＴＰ標識
約２５ｎｇの各ｃＤＮＡを，ＰＣＲの間にジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Ｄｉｇ−ｄＵＴＰ）（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で標識する。ＰＣＲは，１ｘＰｕｆｆｅｒ１，１２０ｐＭＣＰ２プライマー，３％脱イオン化ホルムアミド，３００μＭｄＴＴＰ，３５０μＭｄＡＴＰ，３５０μＭｄＧＴＰ，３５０μＭｄＣＴＰ，５０μＭＤｉｇ−ｄＵＴＰ，４．５Ｕ　ＤＮＡ−ポリメラーゼミックスを含む５０ｕＬ反応中で行う。サイクルパラメータは以下のとおりである：１サイクル：９４℃で２分間；１５サイクル：９４℃で１５秒間，６３℃で１５秒間，６８℃で２分間；１０サイクル：９４℃で１５秒間，６８℃で３分間＋５秒間／サイクル；１サイクル：６８℃で７分間，その後４℃。
【０２４４】
ｄＵＴＰ−標識ｃＤＮＡプローブを用いるＣｌｏｎｔｅｃｈｃ　ＤＮＡアレイのハイブリダイゼーション
ｃＤＮＡアレイは，５０ｍｇ／ＬのＤＮＡｓｅｌ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）消化ゲノムＥ．ｃｏｌｉ　ＤＮＡ，５０ｍｇ／Ｌ　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドＤＮＡおよび１５ｍｇ／Ｌニシン精子ＤＮＡ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含むＤｉｇ　ＥＡＳＹ　Ｈｙｂ溶液（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中で４４℃で１２時間プレハイブリダイズさせて，膜上の非特異的核酸結合部位をブロッキングすることによりバックグラウンドを低下させる。ハイブリダイゼーション溶液を，癌，心臓血管およびストレス応答に関連する選択された遺伝子を有する市販のｃＤＮＡアレイ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にハイブリダイズさせる。各ｃＤＮＡテンプレートを変性させ，５μｇ／ｍｌのＤｉｇ−ｄＵＴＰ−標識ｃＤＮＡの濃度でプレハイブリダイゼーション溶液に加える。ハイブリダイゼーションは４４℃で４８時間行った。
【０２４５】
次にブロットを６８℃で２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で１回，１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で１回すすぎ，次に６８℃で０．５ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で１５分間で１回，０．１ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で３０分間で２回洗浄する。アレイにハイブリダイズしたＤｉｇ標識ｃＤＮＡを検出するためには，Ｄｉｇ化学発光検出キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ）をユーザーマニュアルに記載されるように用いた。化学発光シグナルを検出するためには，アレイを化学発光フィルムに室温で３０分間暴露する。アレイデータの定量化は，フィルムをスキャンし，ａｒｒａｙ　ｖｉｓｉｏｎソフトウエア（Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｃａｔｈａｒｉｎｅｓ，Ｃａｎａｄａ）を用いて分析することにより行った。バックグラウンドを差し引き，シグナルを各フィルター上に存在する９種類のハウスキーピング遺伝子に対して標準化して，ハウスキーピング遺伝子発現シグナルの平均を１と設定し，バックグラウンドを０と設定した。
【０２４６】
それぞれの標識したプローブを３種類の異なる市販のｃＤＮＡアレイにハイブリダイズさせることにより，合計２，４３５種類の既知の遺伝子の発現を分析した。図９は，患者Ｂの再狭窄組織（パネルＡ）およびドナーｂの中膜（パネルＢ）から調製したプローブを用いて１つのアレイで得られた代表的ハイブリダイゼーションパターンを示す。図８に示される遺伝子特異的分析と一致して，アレイの右および下のレーンにスポットしたヒトゲノムｃＤＮＡの陽性対照および種々のハウスキーピング遺伝子のｃＤＮＡスポットで，匹敵するハイブリダイゼーションシグナルが得られた（例えばスポットＤを参照）。ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅反応において生物学的標本を加えないと，ハイブリダイゼーションシグナルはほとんど得られなかった（図９，パネルＣ）。このことは，ハイブリダイゼーションシグナルが，ほぼ加えた試料にのみ由来するものであり，用いた試薬または材料におけるＤＮＡ夾雑物からのものではないことを示す。
【０２４７】
データ分析
アレイデータは，フィルムをスキャンし，ａｒｒａｙ　ｖｉｓｉｏｎソフトウエアを用いて分析することにより定量化した（Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｃａｔｈａｒｉｎｅｓ，Ｃａｎａｄａ）。バックグラウンドを差し引き，シグナルを各フィルター上に存在する９種類のハウスキーピング遺伝子に対して標準化して，ハウスキーピング遺伝子発現シグナルの平均を１と設定し，バックグラウンドを０と設定した。図１３Ａおよび１３Ｂに示される対数表示のためには，値を１０００倍した。１つの群のすべての試料の平均で平均値＞０，０５をポジティブシグナルとみなした。被検群と対照群との間の平均発現レベルの＞２．５倍の相違を有するものをさらに統計学的に分析した。
【０２４８】
ｃ）対照組織の選択
新脈管内膜の主な細胞成分は平滑筋細胞からなるため，健康な冠状動脈の中膜および中膜／内膜を採取するか，または冠状動脈は非弾性であるが筋性動脈に属するため，筋性動脈を対照組織とした。対照群は，心臓移植を行った３人の異なる患者からの冠状動脈からの６個の標本から構成された。さらに，冠状動脈は組織学的に筋性動脈に属するため，５人の異なる患者からの胃腸管の筋性動脈の５個の標本を対照とした。対照標本は液体窒素中で急速に凍結した。ｍＲＮＡ調製の前に，対照動脈の中膜および内膜を調製し，免疫組織化学によりアテローム性動脈硬化症的変化を調べた。血管形態のアテローム性動脈硬化症的変化がない場合，標本（約１ｘ１ｍｍ）を健康な対照試料として用いて，新脈管内膜組織について上述したようにｍＲＮＡおよびｃＤＮＡ調製およびトランスクリプトーム分析を行った。
【０２４９】
ｄ）新脈管内膜特異的遺伝子発現プロファイルの明確化
新脈管内膜および対照試料を用いるｃＤＮＡアレイで２０倍の範囲の発現レベルで，２，４３５種類のうち合計で１，１８６種類の遺伝子（４８．７％）から検出可能なハイブリダイゼーションシグナルが得られた（図１３Ａ）。このうち３５２種類の遺伝子（１４．５％）は，再狭窄試料と対照試料との間で＞２．５倍異なるように発現されているようであった。しかし，発現レベルは個々の試料により著しく変動していた（例えば図９を参照）。したがって，被検群と対照群とで高い有意性（上述を参照）をもって異なるように発現されている遺伝子を同定するために，統計学的な分析を用いた。このようにして，再狭窄被検群と対照群との間で，ウイルコキソン試験でｐ＜０．０３の有意性で少なくとも２．５倍異なるように発現されていた２２４種類の遺伝子（９．６％）が同定された。このうち，１６７種類（７５％）の遺伝子は再狭窄被検群において対照群と比較して過剰発現されていることが認められ，５６種類の遺伝子（２５％）は過小発現していた（図１３Ｂ）。
【０２５０】
ｅ）代用細胞株の選択
ヒト新脈管内膜は異種の細胞集団から構成される。したがって，新脈管内膜で見いだされる特異な統計学的に意味のある遺伝子発現パターンを，患者の末梢血液細胞および培養ヒトＣＡＳＭＣ，すなわち，再狭窄組織において最もしばしば見いだされる細胞に最終的に起因するパターンと関連づけることを試みた（Ｋｏｍａｔｓｕ，上掲）。新脈管内膜発現に関して，２２４種類の異常に制御されている遺伝子は４個のサブグループに分類された（図１４）。
【０２５１】
群Ｉには，新脈管内膜において過剰発現され，対照組織，ＣＡＳＭＣまたは血液細胞においては高くもしくは検出しうるように発現されていなかった６２の遺伝子が含まれる（図１４Ａ）。群ＩＩには，新脈管内膜およびＣＡＳＭＣにおいて同様に発現されており，新脈管内膜におけるこの遺伝子クラスターが増殖しているＳＭＣに起因するものであることが示唆される４３の遺伝子が含まれる（図５Ｂ）。群ＩＩＩには，新脈管内膜および血液細胞において同様に発現されており，この遺伝子クラスターが浸潤血液細胞に起因する新脈管内膜のものに起因することが示唆される６２の遺伝子が含まれる（図１４Ｃ）。この概念は，４つすべての群のうち炎症に関連する最大数の遺伝子が群ＩＩＩで発現していることにより裏付けられる。最後に，群ＩＶには，新脈管内膜において対照群と比較してダウンレギュレートされている５６の遺伝子が含まれる（図１４Ｄ）。
【０２５２】
新脈管内膜におけるγ−ＩＦＮ関連遺伝子のアップレギュレーション
ヒト新脈管内膜トランスクリプトームの驚くべき特徴は，ＩＦＮ−γシグナリングに関連する３２種の遺伝子が見かけ上調和してアップレギュレートされていることであった（図１６）。ＩＦＮ−γレセプターアルファは，新脈管内膜，増殖しているＣＡＳＭＣ，およびより低い程度で血液細胞において発現されていた。一方，ＩＦＮ−γレセプターベータは主として新脈管内膜標本で発現されていた。ＩＦＮ−シグナリングの活性化と一致して，新脈管内膜における２つの転写因子のアップレギュレーションが見いだされた。これらは，ＩＦＮシグナリングに必須のＩＲＦ−１およびＩＳＧＦ３γ（ｐ４８）である（図１４，１５，１６）。これらの転写因子は，ＩＦＮ−γにより転写的にアップレギュレートされることが知られており，いずれもＩＦＮ−シグナリングにおけるキープレイヤーである。同様に，チロシンキナーゼＰｙｋ２のアップレギュレーションが観察された（図１６）。これは，ＳＭＣにおいてアンジオテンシンによるシグナル伝達に役割を果たすことが知られている（Ｓａｂｒｉ，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８３（１９９８），８４１−８５１）。Ｐｙｋ２は，ＩＦＮ−γにより選択的に活性化され，ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてはＰｙｋ２を阻害するとＭＡＰＫおよびＳＴＡＴ１のＩＦＮ−γ誘導性活性化が強く阻害される。ＩＦＮ−γ誘導性成長阻害およびアポトーシスにおける鍵となる事象は，カスパーゼの誘導である（Ｄａｉ，Ｂｌｏｏｄ　９３（１９９９），３３０９−３３１６）。本明細書においては，ヒト新脈管内膜における，カスパーゼ−１，カスパーゼ−８およびＤＡＰ−１についてＩＦＮ−γ制御遺伝子のアップレギュレーションの分析が示される。しかし，抗アポトーシス蛋白質ＢＡＧ−１，Ｐｉｍ−１（いずれもＩＦＮ−γにより制御される）およびＢＣＬ−２関連蛋白質Ａ１のｍＲＮＡもまた，新脈管内膜において対照と比較してアップレギュレートされていた（図１６）。このことは，ヒト新脈管内膜においては増殖およびアポトーシスが同時に生じ，増殖が優位であるという概念を支持する。
【０２５３】
その産物が新脈管内膜プロセスにおいて異なる工程で作用する遺伝子の調和した制御は，我々の遺伝子発現分析の繰り返し発生するテーマであった。ＩＦＮ−γ経路に関しては，完全なレセプター，主要な転写因子，シグナル伝達経路の成分（Ｄａｐ１，ＢＡＧ−１，Ｐｉｍ−１，ＩＦＮ−γ誘導可能蛋白質，ＩＦＮ−誘導可能蛋白質９−２７）の遺伝子のみならず，ＩＦＮ−γ経路のいくつかの標的遺伝子，例えば，ＣＤ４０，ＣＤ１３およびトロンボスポンジン−１が誘導された（図１６）。
【０２５４】
ＩＦＮ−γにより制御される遺伝子クラスターは，新脈管内膜標本において発現されていたが，関連する遺伝子のいくつか，例えばＩＲＦ−１は血液試料においても発現されていた。ＩＦＮ−により制御されるパターンに主として寄与している細胞タイプを識別するために，結腸インステント再狭窄（ｎ＝３）および末梢動脈の再狭窄（ｎ＝６）からの新脈管内膜標本の凍結切片をＩＲＦ−１に特異的な抗体で染色した。この蛋白質を選択したのは，これがＩＦＮ−γシグナル伝達経路の必須の成分であり（Ｋｉｍｕｒａ，Ｇｅｎｅｓ　Ｃｅｌｌｓ　１（１９９６），１１５−１２４），クラスターの他の遺伝子と調和して発現されているためである（図１７）。免疫組織化学的分析は，そのスピンドル形状の核および平滑筋細胞マーカーであるアルファ−アクチンによる染色から識別して（図１８Ｂ），頸動脈再狭窄の新脈管内膜のＳＭＣ（図１７Ｂ）および結腸インステント再狭窄（図１８Ｃ）におけるＩＲＦ−１の強い核および細胞質の染色を示した。インステント再狭窄におけるＩＲＦ−１の核染色（図１８Ｃ）は，ＩＲＦ−１転写因子も活性化されていることを示した。頸動脈動脈の対照媒体中のＳＭＣはＩＲＦ−１染色を示さなかった（図１７Ｂ）。ＣＤ３−ポジティブ細胞は，標本（図１８Ｃ）においてＳＭＣ（図１８Ｄ）と比較してはるかに少なく，このことは，ＳＭＣが主としてヒト新脈管内膜におけるＩＲＦ−１発現の増加に寄与していることを示す。
【０２５５】
トランスクリプトームプロファイルを再狭窄組織に適合させるための培養条件の明確化：ＩＦＮ−γ
培養ヒト冠状動脈平滑筋細胞（ＣＡＳＭＣ）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）の転写プロファイルを新脈管内膜のものと適合させるために，ＣＡＳＭＣをＩＦＮ−γで刺激し，上述のようにトランスクリプトーム分析を行った。ＣＡＳＭＣは，製造元のマニュアルに記載されるように，成長培地で５０％コンフルエントに達するまで培養した。その後，細胞を１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で３７℃で１６時間刺激した。細胞をＰＢＳで２回洗浄し，上述のようにＲＮＡ調製，ｃＤＮＡ合成および増幅およびトランスクリプトーム分析を行った。
【０２５６】
図１９に示されるように，ＣＡＳＭＣを１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γとともにインキュベートすることにより，新脈管内膜特異的ＩＦＮ−γ遺伝子発現パターンを得ることができた。
【０２５７】
ＩＦＮ−γアンタゴニストとともにインキュベートした後の新脈管内膜のトランスクリプトーム／遺伝子発現パターンの明確化
インステント再狭窄組織の顕微鏡標本をＩＦＮのアンタゴニストとともに種々の時間インキュベートし，上述するようにトランスクリプトーム分析を行った。処理した新脈管内膜のトランスクリプトームを処理していない新脈管内膜および健康な対照組織のトランスクリプトームと比較して，ＩＦＮ−γアンタゴニストの治療効果を測定した。
【０２５８】
ラパマイシンとともにインキュベートした後の新脈管内膜のトランスクリプトーム／遺伝子発現パターンの明確化
再狭窄のブタモデルにおいて，細胞内蛋白質ＦＫＢＰ１２のリガンドであるラパマイシンが平滑筋細胞の遊走および増殖を阻害し，新脈管内膜過形成を減少させることができることが文献から示されている。ラパマイシンの治療効果を評価するために，新脈管内膜特異的トランスクリプトームにおいてＦＫＢＰ１２の有意なアップレギュレーションが認められた。増殖しているＣＡＳＭＣは新脈管内膜と同様にＦＫＢＰ１２を過剰発現するため，ラパマイシンの治療効果に関してこの細胞株を新脈管内膜の代用細胞株の候補として用いることができる。したがって，第１の工程においては，ＣＡＳＭＣを１００ｎｇ／ｍｌのラパマイシン（Ｓｉｇｍａ）とともに２４時間インキュベートし，治療効果をモニターするために，トランスクリプトーム分析を行った。その後，インステント再狭窄組織の顕微鏡標本をラパマイシンとともにインキュベートし，上述したようにトランスクリプトーム分析を行った。ラパマイシンで処理したＣＡＳＭＣのトランスクリプトーム／遺伝子発現パターンをラパマイシンで処理した新脈管内膜のトランスクリプトームと比較して，新脈管内膜の代用細胞株としてのＣＡＳＭＣの有効性を測定した。腫瘍サプレッサー遺伝子および増殖阻害遺伝子はこのＣＡＳＭＣ中でアップレギュレートされており，したがって，このＣＡＳＭＣは新脈管内膜の真の代用物であると考えることができる。
【０２５９】
実施例１Ｘ：腫瘍細胞におけるエムプリンおよびトランスフェリンレセプターのアップレギュレートされた蛋白質発現
種々の腫瘍および疾病段階の患者に由来する単一の微小転移性細胞のトランスクリプトーム分析により，細胞サイクル制御，細胞骨格構成，接着および蛋白質分解活性に関与する遺伝子の発現がアップレギュレートされていることが明らかになった。アレイハイブリダイゼーションにおいて，乳癌および前立腺癌患者の骨髄からの２６個の微小転移性細胞のうち１０個においてエムプリンのｍＲＮＡ発現の増強が認められ，これらの細胞の侵襲的表現型を示す。エムプリン（細胞外マトリクスメタロプロテイナーゼ誘導物質，ＣＤ１４７）は，腫瘍細胞の表面上に存在するイムノグロブリンスーパーファミリーのメンバーであり，隣接する線維芽細胞を刺激してマトリクスメタロプロテイナーゼを産生させる（ＭＭＰｓ，Ｇｕｏ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１９９７），２４−２７およびＳａｍｅｓｈｉｍａ，Ｃａｎｃｅｒ　Ｌｅｔｔ．１５７（２０００），１７７−１８４およびＬｉ，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．１８６（２００１），３７１−３７９）。結果を遺伝子特異的ＰＣＲと照らし合わせて，アレイハイブリダイゼーションと同様の感度であることが明らかとなった。アレイハイブリダイゼーション用に異なるエムプリン特異的プローブを用いると，エムプリンメッセージは１６／２６（６１％）の試料において見られた。これらの結果は，ランダムプライミングした単一細胞のｃＤＮＡの転写産物を検出するためのアレイ設計の感度を強調する。
【０２６０】
腫瘍細胞におけるエムプリン発現のアップレギュレーションをｍＲＮＡレベルのみならず蛋白質レベルにおいても関連づけるために，癌患者の骨髄細胞から先に記載されるようにスライドを作製した（Ｐａｎｔｅｌ，Ｌａｎｃｅｔ　３４７（１９９６），６４９−６５３）。スライドをＰＢＳ中１０％ヒトＡＢ血清を用いて２０分間ブロッキングした。各試料から１００万個の骨髄細胞を上皮細胞のマーカーであるサイトケラチン陽性細胞についてスクリーニングした。エムプリン特異的抗体ＭＥＭ６／２（Ｋｏｃｈ，Ｉｎｔ．ｌｍｍｕｎｏｌ．１１（１９９９），７７７−８６）およびいくつかのサイトケラチンファミリーメンバーと反応するビオチンコンジュゲート化Ａ４５Ｂ／Ｂ３抗体を用いる二重染色法を行った。抗体インキュベーションは以下のとおりであった：ＭＥＭ６／２，４５分間，５μｇ／ｍｌ；Ｚ２５９およびＡＰＡＡＰ複合体，製造元の指針にしたがう（ＤＡＫＯ）。すべての抗体インキュベーションの間にスライドをＰＢＳ中で３ｘ３分間洗浄した。Ａ４５Ｂ／Ｂ３−ビオチンＦ（ａｂ）２−フラグメントを加える前に，ＰＢＳ中１０％マウス血清を用いる追加のブロッキング工程を２０分間行った。Ａ４５Ｂ／Ｂ３−ビオチンコンジュゲート（２μｇ／ｍｌ；４５分間）はストレプトアビジン−Ｃｙ３（１．２μｇ／ｍｌ；１５分間；Ｊａｃｋｓｏｎ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により検出した。洗浄した後，ＦＡＳＴ−ＢＬＵＥ（Ｓｉｇｍａ）をアルカリホスファターゼの基質として用いた（１０−３０分間）。すべてのスライドについて，アイソタイプ対照を用いて同じ方法を行った。
【０２６１】
エムプリンは，乳，前立腺および肺癌を有する６８名の患者に由来する１４０種のサイトケラチン陽性腫瘍細胞の８２％で検出された（表８および図２０）。２つの吸引物においてのみ，検出されたサイトケラチン−ポジティブ細胞（ｎ＝４）はすべてエムプリンネガティブであった。
【０２６２】
表８．骨髄の散在性サイトケラチン陽性（ＣＫ＋）腫瘍細胞におけるエムプリン（ＥＭＭ）蛋白質発現
【表３２】
2004508010.tif 000033
【０２６３】
エムプリンの他，腫瘍細胞上のトランスフェリンレセプター（ＣＤ７１）の発現を蛋白質レベルで調べた。非小細胞肺癌に由来する６個の小さい生検および慢性閉塞性肺を有する患者の対照粘膜の５個の生検のトランスクリプトーム分析は，正常組織と腫瘍組織との間でＣＤ７１のシグナル強度が大きく相違することを示した（表９）。
【０２６４】
表９．アレイハイブリダイゼーション上のトランスフェリンレセプターｃＤＮＡのシグナル強度
【表３３】
2004508010.tif 000034
【０２６５】
腫瘍生検の低温切片Ｂｉｏ１０および正常粘膜からの生検（Ｂｉｏ６Ｇ）についてディファレンシャル発現を試験した。ＰＢＳ中１０％ＡＢ血清で２０分間非特異的結合をブロッキングし，ＣＤ７１−ＰＥ（フィコエリスリン）コンジュゲート化抗体（Ｃａｌｔａｇ）とともに４５分間インキュベートした。対照としては，抗ＣＤ４−ＰＥ抗体を用いた。いずれの組織試料においてもＣＤ４抗体の染色は認められなかった。ＣＤ７１−ＰＥ抗体は腫瘍生検の上皮領域を選択的に染色したが，正常粘膜ではトランスフェリンレセプター発現は認められなかった（図２１）。
【０２６６】
実施例Ｘ：ＩＦＮ−γの平滑筋細胞に及ぼす抗アポトーシス効果
培養増殖ＳＭＣの生存に及ぼすＩＦＮ−γの影響をフローサイトメトリにより分析した。この理由のため，初代ヒト結腸平滑筋細胞をＣｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手し，５％ウシ胎児血清（Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む平滑筋細胞成長培地（Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で，５％ＣＯ２の湿潤雰囲気中で３７℃で成長させた。ＳＭＣは継代２と４との間で用いた。１０００Ｕ／ｍｌのｒｈ−ＩＦＮ−γ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）による処理は１６時間行った。細胞死の誘導のためには，ＳＭＣを１００μｍｏｌ／ｌのＨ２Ｏ２および１００μｍｏｌ／Ｉの硫酸第一鉄を含むＨＢＳＳ中で３７℃で１時間インキュベートした。その後，細胞を新たに調製した培養培地中でさらに８時間培養した。細胞をＦＩＴＣ標識アネキシンＶ（Ｒｏｃｈｅ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で製造元の指針にしたがって標識した。１０４回の事象をフローサイトメータ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。フローサイトメトリ分析によりＩＦＮ−γのＳＭＣに及ぼす抗アポトーシス効果が明らかとなった（図２２）。ＰＩおよびＦＩＴＣ標識アネキシンＶによる二重染色の後のＦＡＣＳ分析は，ＩＦＮで処理した後に自発性アポトーシスが１０％から６％に減少したことを示した。Ｈ２Ｏ２を用いてＳＭＣにおいてアポトーシスを誘導した後，この効果はより顕著になった。ＩＦＮ−γで処理すると，アポトーシス細胞の数が５４％から２７％に減少した。これらの結果は，ＩＦＮ−γがＳＭＣに対して抗アポトーシス効果を及ぼすことを明らかに示す。
【０２６７】
実施例ＸＩ：再狭窄のマウスモデルにおける新脈管内膜形成に及ぼすＩＦＮ−γの阻害的効果
頸動脈結紮後の血管増殖リモデリングを調べるために，マウス血流停止モデル（Ｋｕｍａｒ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　９６（１９９７），４３３３−４３４２）を用いた。このモデルは，分岐近傍の総頸動脈の結紮に応答してＳＭＣの血管が増殖することを特徴とする。再狭窄のマウスモデルにおいて無ＩＦＮ−レセプター変異が新脈管内膜の発生に及ぼす影響を調べるために，ＩＦＮ−γＲ−／−ノックアウトマウスを用いた。成人雄１２９／ｓｖＪマウス（Ｎ＝１６）およびＩＦＮ−γＲ−／−マウス（ｎ＝１１）をキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ体重）およびケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ体重）の溶液の腹膜内注射により麻酔し，左総頸動脈を分岐近くで結紮した。４週間後動物を再び麻酔し，犠牲死させ，０．１ｍｏｌ／ｌリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）中４％パラホルムアルデヒドで３分間潅流することにより固定した。左頸動脈を切り出した後，血管を７０％エタノール中に浸漬することにより固定した。頸動脈をパラフィン中に包埋し，連続切片を作製した（％μｍ厚さ）。
【０２６８】
ライゲーション部位から６００μｍの距離でファンゲッソン染色切片の形態学的分析を行った。画像分析ソフトウエアＳＣＩＯＮイメージ４．０．２を用いて血管のデジタル化した画像を分析した。中膜の厚さは，外弾性板と内弾性板との間の直径の相違として，新脈管内膜の厚さは内弾性板と内腔直径との相違として求めた。形態学的分析からのデータは，２つの群のマウスの平均±ＳＥＭで表し，非対試料のｔ−テストにより検定した。ｐ値＜０．０５を有意とみなした。すべての分析はＳＰＳＳ統計学パッケージを用いて行った（バージョン８．０）。
【０２６９】
中膜増殖および新脈管内膜形成による実質的な壁の肥厚は，結紮の４週間後に１６匹の野生型マウスで観察された（図２３）。１１匹のＩＦＮ−γＲ−／−マウスの内膜および新脈管内膜肥厚は，平均±ＳＥＭで示されるように有意に減少し，非対試料についてのｔ−テストにより分析した。増殖的応答の減少と対応して，１１匹のＩＦＮ−γＲ−／−マウスは処置した頸動脈セグメントの内腔直径が野生型マウスより有意に大きかった（１０８±１５μｍ対９１±２４μｍ，ｐ＝０．０３３）。
【０２７０】
実施例ＸＩＩ：抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（ＳＳＨ）分析
ＳＳＨはサブトラクトされたｃＤＮＡライブラリを生成する新規かつ非常に有効な方法である。サブトラクティブｃＤＮＡハイブリダイゼーションは，異なるように発現されている遺伝子のｃＤＮＡを同定および単離するための強力な方法である（Ｄｕｇｕｉｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８（１９９０），２７８９−２７９２およびＨａｒａ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９（１９９１），７０９７−７１０４およびＨｅｎｄｒｉｃｋ，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３０８（１９８４），１４９−１５３）。一般に，１つの集団（テスター）からのｃＤＮＡを別の集団（ドライバー）からの過剰のｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）にハイブリダイズさせ，次に，ハイブリダイズしていない画分（標的）をハイブリダイズした共通配列から分離する。ＳＳＨを用いて，標的ｃＤＮＡフラグメント（異なるように発現されている）を選択的に増幅し，同時に非標的ＤＮＡの増幅を抑制する。この方法は，ＰＣＲの抑制に基づいている。すなわち，長い反転末端反復は，ＰＣＲ法においてＤＮＡフラグメントに結合したときに望ましくない配列の増幅を選択的に抑制することができる。ｍＲＮＡの量の相違の問題は，サブトラクションの間に配列の量を等しくするハイブリダイゼーション工程により解決される。異なるように発現されているｃＤＮＡを１０００倍濃縮するのに１ラウンドのサブトラクティブハイブリダイゼーションが必要である（概説として，Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３（１９９６），６０２５−３０およびＤｉａｔｃｈｅｎｋｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．３０３（１９９９），３４９−８０を参照）。
【０２７１】
非常に少ない数の細胞のディファレンシャル遺伝子発現分析のために，標準的ＳＳＨプロトコルにいくつかの改変を加えた（図２４）。１）本明細書に記載される方法にしたがって生成されたｍＲＮＡ増幅物を逆転写し，ＣＰ２プライマーを用いて増幅した；２）本明細書に記載される方法にしたがって生成されたｍＲＮＡ増幅物それ自体がｐａｎ様構造を形成する；３）制限酵素認識部位（例えばＥｃｏＲＩ）をＣＰ２プライマー中に導入する。
【０２７２】
ａ）材料および方法
オリゴヌクレオチド
ｃＤＮＡ合成プライマー：
ＣＰ２：５’−ＴＣＡＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−３’（配列番号１４）
アダプター
アダプター１（Ａ１）
Ｅｃｏ４４Ｉ：５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＧＧ−３’（配列番号３１）
Ｅｃｏ１２Ｉ：５’−ＡＡＴＴＣＣＴＧＣＣＣＧ−３’（配列番号３２）
アダプター２（Ａ２）
Ｅｃｏ４３ＩＩ：５’−ＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＴＧＧＴＧＣＧＧＡＧＧＧＣＧ−３’（配列番号３３）
Ｅｃｏ１２ＩＩ：５’−ＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番号３４）
ＰＣＲプライマー：
Ｐ１−３０：５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧ−３’（配列番号３５）
Ｐ２−３０：５’−ＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＴ−３’（配列番号３６）
Ｐ１−３３：５’−ＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＴＣ−３’（配列番号３７）
Ｐ２−３３：５’−ＴＧＴＡＧＣＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＴＧＧＴ−３’（配列番号３８）
ＰＮ１−３００：５’−ＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＧＧＣＴＣＧＣＣ−３’（配列番号３９）
ＰＮ２−３０：５’−ＧＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＧＴＣＧＣＧＴＧＧＴＧＣＧ−３’（配列番号４０）
【０２７３】
ドライバーの調製
微小な転移性腫瘍細胞において正常骨髄細胞と比較して異なるように発現されている転写産物を検出するために，健康なドナーに由来する骨髄試料からドライバーを調製した。３名の骨髄ドナーから，標準的プロトコルを用いて全ＲＮＡを単離した。次に，３００，０００個の骨髄細胞に対応するＲＮＡを３０μｌのＤｙｎａｌビーズに加え，ｍＲＮＡ増幅のプロトコルを実施した。
【０２７４】
ハイブリダイゼーションの速度論は，５μｇのドライバーを５０ユニットの制限酵素ＲｓａＩで，０．７５ｘ緩衝液ＮＥＢ１（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を含有する５０μｌの反応液中で９０分間消化することにより改良した。試料はＭｉｃｒｏｃｏｎ　１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で脱塩した。
【０２７５】
テスターの調製
５０μｌ中で５０ＵのＥｃｏＲｌを用いて，ＥｃｏＲＩで消化したテスターを調製した。テスターとしては，４つの異なる乳癌患者から単離した４つの単一の細胞の混合物を選択した。ＥｃｏＲＩで消化した後，テスターを水中で１００ｎｇ／μｌの濃度に希釈した。次に，１つのプローブを５μｌのアダプターＡ１（配列番号３１，配列番号３２）に，別のプローブをアダプターＡ２（配列番号３３，配列番号３４）（５０μＭ）に，２つの独立した１０μｌのライゲーション反応液中で５ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて１５℃で一夜ライゲーションした。ライゲーション反応は，２μｌの０．１ＭＥＤＴＡを加え，７０℃で５分間加熱することにより不活性化した。
【０２７６】
サブトラクティブハイブリダイゼーション
１μｌのドライバー（５００ｎｇ）を，アダプターＡ１（配列番号３１，配列番号３２）にライゲーションした２μｌのテスターｃＤＮＡ（約１８ｎｇ）を含む２つのチューブのそれぞれに加え，ハイブリダイゼーション緩衝液（１ＭＮａＣＩ，５０ｍＭＨｅｐｅｓ，１ｍＭＣＴＡＢ）中でアダプターＡ２（配列番号３３，配列番号３４）にライゲーションした。溶液にミネラルオイルを重層し，９８℃で１分間変性させ，次に６８℃で１０−１４時間アニーリングさせた。
【０２７７】
最初のハイブリダイゼーション後，両方の試料を一緒に混合し，１．５μｌのハイブリダイゼーション緩衝液中の約１５０ｎｇの熱変性ドライバーを加えた。試料を１０−１４時間ハイブリダイズさせた。２００μｌの希釈緩衝液（２０ｍＭＨｅｐｅｓ，ｐＨ８．３，５０ｍＭＮａＣｌ，０．２ｍＭＥＤＴＡ）を加え，６８℃で７分間加熱することによりハイブリダイゼーションを停止した。
【０２７８】
ＰＣＲ増幅
各サブトラクションについて，容量２５μｌ中で２回のＰＣＲ増幅反応を行った。第１のＰＣＲは，１μｌの希釈したサブトラクトしたｃＤＮＡ，１μｌのＰＣＲプライマーＰ１−３０（配列番号３５）（８ｐＭ）および１μｌのプライマーＰ２３０（配列番号３６）（８ｐＭ）および０．４ｍＭｄＮＴＰを含むＴａｑロングテンプレート緩衝液１（Ｒｏｃｈｅ）中で行った。ホットスタート法でＴａｑポリメラーゼを加えた。ＰＣＲ−サイクラーを７５℃で７分間（末端のフィルイン）に設定し，２７サイクルを行い（９４℃，３０秒間；６６℃，３０秒間；７２℃，１．５分間），最後に７２℃で７分間伸長した。ＰＣＲ産物を水で１０倍に希釈し，１μｌを用いて上述のプロトコルにしたがって２回目のＰＣＲを行った。ただし，ＰＣＲプライマーＰＮ１−３０（配列番号３９）およびＰＮ２−３０（配列番号４０）を用い，１２サイクル（９４℃，３０秒間；６８℃，３０秒間；７２℃，１．５分間）で行った。ＰＣＲ産物は１．５％アガロースゲルでゲル電気泳動により分析した。
【０２７９】
サブトラクトしたｃＤＮＡのクローニングおよび分析
二次ＰＣＲからの産物をＴ／Ａクローニングシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）のｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙ，にライゲーションした。Ｘ−Ｇａｌ／ＩＰＴＧ／アンピシリンでクローンを選択した後，ＰＮ１−３０（配列番号３９）およびＰＮ２−３０（配列番号４０）プライマーを用いて，ＰＣＲにより挿入物をスクリーニングした。ディファレンシャル発現は，増幅した挿入物を標識テスターおよびドライバーをプローブとして用いてサザンブロット分析することにより確認した。ドライバーおよびテスター試料の標識は，アレイ分析のための標識と同一であった。
【０２８０】
異なるようにハイブリダイズしたクローンからＱｌＡ　ｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドを調製し，配列決定した。核酸ホモロジー検索はＢＬＡＳＴプログラム（ＮＣＢＩ）を用いて行った。
【０２８１】
結果
ＰＣＲ増幅は，異なる長さ（３０ヌクレオチド：Ｐ１−３０（配列番号３５），Ｐ２−３０（配列番号３６）および３３ヌクレオチド：Ｐ１−３３（配列番号３７）およびＰ２−３３（配列番号３８））のプライマーセットを用いて行い，いずれも匹敵する結果が得られた。最も好ましいものは，３０ヌクレオチド（Ｐ１−３０（配列番号３５）およびＰ２３０（配列番号３６））からなるプライマーであった。Ｄｉａｔｃｈｅｎｋｏ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３（１９９６））により記載される２２ヌクレオチドのより短いプライマー（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）はＰＣＲ反応において作用しなかった。サブトラクション後，コロニーをＰＣＲによりスクリーニングし，生成物をゲル電気泳動しブロッティングした。標識したテスターおよびドライバーをブロットにハイブリダイズさせた。その１例を図２５に示す。コロニー＃４を上皮特異的遺伝子（Ｏｅｔｔｇｅｎ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４４５，（１９９７）４５６−４５７およびＯｅｔｔｇｅｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７（１９９７），４４１９−４４３３）およびＯｅｔｔｇｅｎ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ５５（１９９９），３５８６２）と記述される転写因子として同定した。この結果は，ドライバーとテスターを調製した元の試料を用いるＰＣＲにより確認した（図２６）。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は，増幅の成功を判定するパラメータを示す。
【図２】図２は，増幅物についての遺伝子特異的ＰＣＲを示す。
【図３】図３は，正常白血球（赤）およびＭＣＦ−７乳癌細胞（青）のＣＧＨプロファイルを示す。
【図４】図４は，細胞ＢのＣＧＨプロファイルを示す。
【図５】図５は，細胞Ｂ，ＣおよびＬにおいて，共通におよび異なるように発現されている遺伝子を示す。
【図６】図６は，細胞Ｌのハイブリダイゼーションおよび固定化されたｃＤＮＡの位置および名前のマトリクスを示す。
【図７】図７は，ヒト冠状動脈インステント再狭窄からの新脈管内膜の免疫組織化学的染色を示す。
【図８】図８は，遺伝子特異的プライマーを用いるＰＣＲを示す。
【図９】図９はｃＤＮＡアレイ分析を示す。
【図１０】図１０は，ヒトインステント新脈管内膜および対照血管からの微小試料の転写プロファイルを示す。
【図１１】図１１は，ｃＤＮＡアレイからの異なるように発現されているｍＲＮＡの遺伝子特異的ＰＣＲによる確認を示す。
【図１２】図１２は，頸動脈再狭窄からの新脈管内膜の，ＦＫＢＰ１２蛋白質についての免疫組織化学的染色を示す。
【図１３】図１３は，遺伝子発現のｃＤＮＡアレイ分析を示す。
【図１４】図１４は，２２４種類の遺伝子の遺伝子発現プロファイルを示すクラスター画像を示す。
【図１５】図１５は，転写因子クラスターの拡大図を示す。
【図１６】図１６は，ＩＦＮ−γ−関連クラスターの拡大図を示す。
【図１７】図１７は，頸動脈再狭窄からの新脈管内膜および健康な対照の中膜の，ＩＲＦ−１蛋白質についての免疫組織化学的染色を示す。
【図１８】図１８は，冠状動脈インステントからの新脈管内膜のＩＲＦ−１蛋白質についての免疫組織化学的染色を示す。
【図１９】図１９は，ＩＦＮ−γ−関連クラスターの発現を示す。
【図２０】図２０は，骨髄中の散在性腫瘍細胞の二重染色を示す。
【図２１】図２１は，腫瘍細胞におけるトランスフェリンレセプター（ＣＤ７１）のディファレンシャル発現を示す。
【図２２】図２２は，培養ＳＭＣの生存に及ぼすＩＦＮ−γの影響を示す。
【図２３】図２３は，再狭窄のマウスモデルにおける新脈管内膜の発達に及ぼす無ＩＦＮ−γレセプター変異の影響を示す。
【図２４】図２４は，単一の細胞または少量の細胞試料で行ったＳＳＨ分析のフローチャートを示す。
【図２５】図２５は，標識したドライバーおよびテスターをプローブとして用いるサザンブロットによるコロニーのスクリーニングを示す。
【図２６】図２６は，ＰＣＲおよびゲル電気泳動により分析した，腫瘍細胞におけるＥＳＥ１の差異的発現を示す。
【図１】
2004508010.tif 000035
【図２】
2004508010.tif 000036
【図３】
2004508010.tif 000037
【図４】
2004508010.tif 000038
【図５】
2004508010.tif 000039
【図６−１】
2004508010.tif 000040
【図６−２】
2004508010.tif 000041
【図７】
2004508010.tif 000042
【図８】
2004508010.tif 000043
【図９】
2004508010.tif 000044
【図１０−１】
2004508010.tif 000045
【図１０−２】
2004508010.tif 000046
【図１０−３】
2004508010.tif 000047
【図１１】
2004508010.tif 000048
【図１２】
2004508010.tif 000049
【図１３−１】
2004508010.tif 000050
【図１３−２】
2004508010.tif 000051
【図１４−１】
2004508010.tif 000052
【図１４−２】
2004508010.tif 000053
【図１４−３】
2004508010.tif 000054
【図１４−４】
2004508010.tif 000055
【図１４−５】
2004508010.tif 000056
【図１４−６】
2004508010.tif 000057
【図１４−７】
2004508010.tif 000058
【図１４−８】
2004508010.tif 000059
【図１５】
2004508010.tif 000060
【図１６−１】
2004508010.tif 000061
【図１６−２】
2004508010.tif 000062
【図１６−３】
2004508010.tif 000063
【図１７】
2004508010.tif 000064
【図１８】
2004508010.tif 000065
【図１９】
2004508010.tif 000066
【図２０】
2004508010.tif 000067
【図２１】
2004508010.tif 000068
【図２２】
2004508010.tif 000069
【図２３】
2004508010.tif 000070
【図２４】
2004508010.tif 000071
【図２５】
2004508010.tif 000072
【図２６】
2004508010.tif 000073
【国際公開パンフレット】
2004508010.tif 000074
2004508010.tif 000075
2004508010.tif 000076
2004508010.tif 000077
2004508010.tif 000078
2004508010.tif 000079
2004508010.tif 000080
2004508010.tif 000081
2004508010.tif 000082
2004508010.tif 000083
2004508010.tif 000084
2004508010.tif 000085
2004508010.tif 000086
2004508010.tif 000087
2004508010.tif 000088
2004508010.tif 000089
2004508010.tif 000090
2004508010.tif 000091
2004508010.tif 000092
2004508010.tif 000093
2004508010.tif 000094
2004508010.tif 000095
2004508010.tif 000096
2004508010.tif 000097
2004508010.tif 000098
2004508010.tif 000099
2004508010.tif 000100
2004508010.tif 000101
2004508010.tif 000102
2004508010.tif 000103
2004508010.tif 000104
2004508010.tif 000105
2004508010.tif 000106
2004508010.tif 000107
2004508010.tif 000108
2004508010.tif 000109
2004508010.tif 000110
2004508010.tif 000111
2004508010.tif 000112
2004508010.tif 000113
2004508010.tif 000114
2004508010.tif 000115
2004508010.tif 000116
2004508010.tif 000117
2004508010.tif 000118
2004508010.tif 000119
2004508010.tif 000120
2004508010.tif 000121
2004508010.tif 000122
2004508010.tif 000123
2004508010.tif 000124
2004508010.tif 000125
2004508010.tif 000126
2004508010.tif 000127
2004508010.tif 000128
2004508010.tif 000129
2004508010.tif 000130
2004508010.tif 000131
2004508010.tif 000132
2004508010.tif 000133
2004508010.tif 000134
2004508010.tif 000135
2004508010.tif 000136
2004508010.tif 000137
2004508010.tif 000138
2004508010.tif 000139
2004508010.tif 000140
2004508010.tif 000141
2004508010.tif 000142
2004508010.tif 000143
2004508010.tif 000144
2004508010.tif 000145
2004508010.tif 000146
2004508010.tif 000147
2004508010.tif 000148
2004508010.tif 000149
2004508010.tif 000150
2004508010.tif 000151
2004508010.tif 000152
2004508010.tif 000153
2004508010.tif 000154
2004508010.tif 000155
2004508010.tif 000156
2004508010.tif 000157
2004508010.tif 000158
2004508010.tif 000159
2004508010.tif 000160
2004508010.tif 000161
2004508010.tif 000162
2004508010.tif 000163
2004508010.tif 000164
2004508010.tif 000165
2004508010.tif 000166
2004508010.tif 000167
2004508010.tif 000168
2004508010.tif 000169
2004508010.tif 000170
2004508010.tif 000171
2004508010.tif 000172
2004508010.tif 000173
2004508010.tif 000174
2004508010.tif 000175
2004508010.tif 000176
2004508010.tif 000177
2004508010.tif 000178
2004508010.tif 000179
2004508010.tif 000180
2004508010.tif 000181
2004508010.tif 000182
2004508010.tif 000183
2004508010.tif 000184
2004508010.tif 000185
2004508010.tif 000186
2004508010.tif 000187
2004508010.tif 000188
2004508010.tif 000189
2004508010.tif 000190
2004508010.tif 000191
2004508010.tif 000192
2004508010.tif 000193
2004508010.tif 000194
2004508010.tif 000195
2004508010.tif 000196
2004508010.tif 000197
2004508010.tif 000198
2004508010.tif 000199
2004508010.tif 000200
2004508010.tif 000201
2004508010.tif 000202
2004508010.tif 000203
2004508010.tif 000204
2004508010.tif 000205
2004508010.tif 000206
2004508010.tif 000207
2004508010.tif 000208
2004508010.tif 000209
2004508010.tif 000210
2004508010.tif 000211
2004508010.tif 000212
2004508010.tif 000213
2004508010.tif 000214
2004508010.tif 000215
2004508010.tif 000216
2004508010.tif 000217
2004508010.tif 000218
2004508010.tif 000219
2004508010.tif 000220
2004508010.tif 000221
2004508010.tif 000222
2004508010.tif 000223
2004508010.tif 000224
2004508010.tif 000225
2004508010.tif 000226
2004508010.tif 000227
2004508010.tif 000228
2004508010.tif 000229
2004508010.tif 000230
2004508010.tif 000231
2004508010.tif 000232
2004508010.tif 000233
2004508010.tif 000234
2004508010.tif 000235
2004508010.tif 000236
2004508010.tif 000237
2004508010.tif 000238
2004508010.tif 000239
2004508010.tif 000240
2004508010.tif 000241
2004508010.tif 000242
2004508010.tif 000243
2004508010.tif 000244
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508010.tif 000245
【国際調査報告】
2004508010.tif 000246
2004508010.tif 000247
2004508010.tif 000248
2004508010.tif 000249
2004508010.tif 000250
2004508010.tif 000251
2004508010.tif 000252