(57)【要約】本発明は、新しく単離したＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ、テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）ポリメラーゼＪＤＦ−３、およびその変異組換え形を特徴とする。本発明の変異ポリメラーゼは、３’から５’エキソヌクレアーゼ活性が欠損している、および／または、野生型形ポリメラーゼに比べ、非慣用的ヌクレオチドに対する識別の低下を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
残基１から７７６までの配列番号２に提示したアミノ酸配列を有する、精製された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項２】
テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３から単離される請求項１に記載のポリメラーゼ。
【請求項３】
テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼの発現をコードするベクターで形質転換された組換え生物から単離される、請求項１に記載のポリメラーゼ。
【請求項４】
配列番号１に提示したヌクレオチド配列を含む組換えベクター。
【請求項５】
配列番号２のアミノ酸配列を含む単離組換えポリペプチド。
【請求項６】
３’から５’エキソヌクレアーゼ欠損であるテルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３由来の単離組換えＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項７】
前記ポリメラーゼは、配列番号２のＳ３４５に対応する部位にセリンからプロリンへの変異、および、配列番号２のＰ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を含む、二重変異を有する、請求項６に記載の単離組換えＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項８】
配列番号２のＤ１４１に対応するアミノ酸にアスパラギン酸からトレオニンまたはアラニンへの変異、または、配列番号２のＥ１４３に対応するアミノ酸にグルタミン酸からアラニンへの変異を有する、請求項６に記載の単離組換えＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項９】
配列番号２のＤ１４１に対応するアミノ酸にアスパラギン酸からトレオニンまたはアラニンへの変異、および、配列番号２のＥ１４３に対応するアミノ酸にグルタミン酸からアラニンへの変異を有する、請求項６に記載の単離組換えＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１０】
非慣用的なヌクレオチドに対する識別の低下した、単離組換えＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１１】
ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼである、請求項６または１０に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１２】
前記ＤＮＡポリメラーゼはさらに、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからフェニルアラニンへの変異、配列番号２のＰ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異、および、配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異からなる群から選択される変異を含む、請求項６または１０に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１３】
配列番号２のＡ４８５に対応する前記部位に前記のアラニンからトレオニンへの変異を有する前記ポリメラーゼはさらに、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからフェニルアラニンへの変異、配列番号２のＳ３４５に対応する部位にセリンからプロリンへの変異、および、配列番号２のＰ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異からなる群から選択される変異を含む、請求項１２に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１４】
ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび複合ヌクレオチドからなる群から選択される非慣用的なヌクレオチドに対する識別の低下した、請求項６または１０に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１５】
前記複合ヌクレオチドは、放射標識ヌクレオチド、蛍光標識ヌクレオチド、ビオチン標識ヌクレオチド、化学発光標識ヌクレオチドおよび量子ドット標識ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１４に記載のＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１６】
配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異、または配列番号２のＬ４０８、Ｓ３４５またはＰ４１０に対応する部位に変異を含む、単離組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼであって、前記ＤＮＡポリメラーゼは、野生型形のそのポリメラーゼと比べて、非慣用的なヌクレオチドに対して、識別が低下している、前記ポリメラーゼ。
【請求項１７】
３’から５’エキソヌクレアーゼ欠損である、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項１８】
配列番号２のＤ１４１またはＥ１４３に対応するアミノ酸に変異を有する、請求項１７に記載のポリメラーゼ。
【請求項１９】
配列番号２のＤ１４１に対応する部位にアスパラギン酸からトレオニンまたはアラニンへの変異を有する、請求項１７に記載のポリメラーゼ。
【請求項２０】
配列番号２のＥ１４３に対応する部位にグルタミン酸からアラニンへの変異を有する、請求項１７に記載のポリメラーゼ。
【請求項２１】
配列番号２のＤ１４１に対応する部位にアスパラギン酸からトレオニンまたはアラニンへの変異を有する、請求項２０に記載のポリメラーゼ。
【請求項２２】
熱安定性である、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項２３】
古細菌である、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項２４】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異を含む、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項２５】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからフェニルアラニンへの変異を含む、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項２６】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＰ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を含む、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項２７】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＳ３４５に対応する部位にセリンからプロリンへの変異を含み、前記ポリメラーゼはさらに、配列番号２のＴ６０４に対応する部位に変異を含み得る、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項２８】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＹ４９７に対応する部位にチロシンからシステインへの変異を含み、前記ポリメラーゼはさらに、配列番号２のＩ６３０に対応する部位にイソロイシンからバリンへの変異を含み得る、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項２９】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＥ６４５に対応する部位にグルタミン酸からリジンへの変異を含む、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項３０】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＥ５７８に対応する部位にグルタミン酸からリジンへの変異を含み、前記ポリメラーゼはさらに、配列番号２のＲ４６５に対応する部位にアルギニンからメチオニンへの変異を含み得る、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項３１】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＬ３９６に対応する部位にロイシンからグルタミンへの変異を含み、前記ポリメラーゼはさらに、配列番号２のＶ４０１、Ｎ４２４、Ｐ５６９、Ｅ６１７、またはＶ６４０に対応する部位に変異を含む、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項３２】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＳ６５１に対応する部位にセリンからアスパラギンへの変異を含む、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項３３】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＬ３９６に対応する部位にロイシンからプロリンへの変異を含み、前記ポリメラーゼはさらに、配列番号２のＥ４５９に対応する部位に変異を含み得る、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項３４】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＬ４５６に対応する部位にロイシンからプロリンへの変異を含み、前記ポリメラーゼはさらに、配列番号２のＥ６５８に対応する部位に変異を含み得る、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項３５】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異を含み、前記ポリメラーゼはさらに、配列番号２のＶ４３７またはＬ４７８に対応する部位に変異を含み得る、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項３６】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＹ４９６に対応する部位にチロシンからアスパラギンへの変異を含む、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項３７】
前記ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を含む、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項３８】
配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異を含む、請求項３７に記載のポリメラーゼ。
【請求項３９】
配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからフェニルアラニンへの変異を含む、請求項３７に記載のポリメラーゼ。
【請求項４０】
配列番号２のＰ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を含む、請求項３７に記載のポリメラーゼ。
【請求項４１】
ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび複合ヌクレオチドからなる群から選択される非慣用的なヌクレオチドに対する識別の低下した、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項４２】
前記複合ヌクレオチドは、放射標識ヌクレオチド、蛍光標識ヌクレオチド、ビオチン標識ヌクレオチド、化学発光標識ヌクレオチドおよび量子ドット標識ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項４１に記載のポリメラーゼ。
【請求項４３】
配列番号２のアミノ酸４０９におけるＹからＶへの変異；配列番号２のアミノ酸４８５におけるＡからＣ、Ｓ、Ｌ、Ｉ、ＦまたはＶへの変異；配列番号２のアミノ酸４９４におけるＹからＳへの変異；配列番号２のアミノ酸４９６におけるＹからＬへの変異；および、配列番号２のアミノ酸４９０におけるＡからＹへの変異からなる群から選択される変異に対応する、ポリメラーゼにおけるアミノ酸残基の変異をさらに含む、請求項１０または１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項４４】
配列番号２のアミノ酸４８３から４９６（これを含む）の１つに対応するポリメラーゼのアミノ酸に変異をさらに含む、請求項１０または１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項４５】
前記変異は、配列番号２のアミノ酸４８５、４９０、４９４、または４９６の１つに対応するポリメラーゼのアミノ酸においてである、請求項４４に記載のポリメラーゼ。
【請求項４６】
配列番号２のＡ４８５Ｔに対応するアミノ酸におけるアラニンからトレオニンへの変異、および、ポリメラーゼにおける配列番号２のそれぞれＬ４０８、Ｙ４０９、Ｓ３４５またはＰ４１０に対応するアミノ酸の少なくとも１つの置換を含む、単離組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４７】
配列番号２のＡ４８５に対応するポリメラーゼのアミノ酸におけるＡ以外のアミノ酸、および、ポリメラーゼにおける配列番号２のそれぞれＬ４０８、Ｙ４０９、Ｓ３４５またはＰ４１０に対応するアミノ酸の少なくとも１つの置換を含む、単離組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項４８】
請求項１、５、６、１０、１６、４６または４７のいずれか一項のＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含む組換えベクター。
【請求項４９】
ＤＮＡの相補鎖の標識法であって、前記方法は：
鋳型ＤＮＡ分子を：
請求項１０に記載の組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ；および
非慣用的なヌクレオチドと、前記ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡ鎖を合成し、前記の非慣用的なヌクレオチドを前記の相補的ＤＮＡ鎖に取込むことの可能な条件下および十分な時間、接触させる段階を含む、前記標識法。
【請求項５０】
ＤＮＡの相補鎖の標識法であって、前記方法は、鋳型ＤＮＡ分子を：配列番号２のＡ４８５に対応する部位におけるアラニンからトレオニンへの変異、または配列番号２のＬ４０８またはＰ４１０またはＳ３４５に対応する部位における変異を含む、組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ、ここでの前記ＤＮＡポリメラーゼは、非慣用的なヌクレオチドに対する識別が低下している；および、非慣用的なヌクレオチドと、前記ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡ鎖を合成し、前記の非慣用的なヌクレオチドを前記の相補的ＤＮＡ鎖に取込むことの可能な条件および十分な時間、接触させる段階を含む、前記標識法。
【請求項５１】
前記組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ欠損である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸Ｌ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異を含む、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸Ｌ４０８に対応する部位にロイシンからフェニルアラニンへの変異を含む、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸Ｐ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を含む、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸Ａ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を含む、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のＬ４０８に対応するアミノ酸にロイシンからヒスチジンへの変異を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のＬ４０８に対応するアミノ酸にロイシンからフェニルアラニンへの変異を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のＰ４１０に対応するアミノ酸にプロリンからロイシンへの変異を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のＳ３４５に対応するアミノ酸にセリンからプロリンへの変異を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記ポリメラーゼは、配列番号２のＳ３４５に対応する部位にセリンからプロリンへの変異、および、配列番号２のＰ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を含む、請求項５５に記載の単離組換えＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項６１】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、および複合ヌクレオチドからなる群から選択される非慣用的なヌクレオチドに対して識別が低下している、請求項４９から６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記複合ヌクレオチドは、放射標識ヌクレオチド、蛍光標識ヌクレオチド、ビオチン標識ヌクレオチド、化学発光標識ヌクレオチドおよび量子ドット標識ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
鋳型ＤＮＡ鎖を：シークエンスプライマー；請求項９に記載の組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ；および、鎖終結ヌクレオチド類似体と、前記ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡ鎖を合成し、ヌクレオチドを合成した相補的ＤＮＡ鎖に取込むことの可能な条件下で接触させる段階を含み、前記鎖終結ヌクレオチド類似体の取込みにより、鎖伸長が終結し、よって前記ＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列が決定される、ＤＮＡをシークエンスする方法。
【請求項６４】
ＤＮＡ鎖を、シークエンスプライマー；配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異、または、配列番号２のＬ４０８またはＰ４１０またはＳ３４５に対応する部位に変異を含む、組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ；および、鎖終結ヌクレオチド類似体と、前記ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡ鎖を合成し、ヌクレオチドを合成された相補的ＤＮＡ鎖に取込むことの可能な条件下で接触させる段階を含み、鎖終結ヌクレオチド類似体の取込みにより、鎖伸長は終結し、よって前記ＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列が決定される、ＤＮＡをシークエンスする方法。
【請求項６５】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、３’から５’エキソヌクレアーゼ活性が欠損している、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸Ｌ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異を有する、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸Ｌ４０８に対応する部位にロイシンからフェニルアラニンへの変異を有する、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸Ｐ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を有する、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を有する、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異を有する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからフェニルアラニンへの変異を有する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のＰ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を有する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のＳ３４５に対応する部位にセリンからプロリンへの変異を有する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
前記の鎖終結ヌクレオチド類似体はジデオキシヌクレオチドである、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ジデオキシヌクレオチドは検出可能なように標識されている、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ジデオキシヌクレオチドは、蛍光標識されている、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記ジデオキシヌクレオチドは、フルオレセインおよびローダミンからなる群から選択された部分で標識されている、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
請求項４９、５０、５１、６３または６４に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項７９】
残基１から７７６までの配列番号２に提示したアミノ酸配列を有する、精製された熱安定性のＤＮＡポリメラーゼの製造法であって、配列番号１に提示した核酸配列を含む宿主細胞を、前記ＤＮＡポリメラーゼの産生の可能な条件下で培養することを含む、前記製造法。
【請求項８０】
３’から５’エキソヌクレアーゼ欠損であるテルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３の組換えＤＮＡポリメラーゼの製造法であって、前記ポリメラーゼをコードする核酸配列を含む宿主細胞を、前記ＤＮＡポリメラーゼの産生の可能な条件下で培養することを含む、前記製造法。
【請求項８１】
非慣用的なヌクレオチドに対する識別の低下した組換えＤＮＡポリメラーゼの製造法であって、前記ポリメラーゼをコードする核酸配列を含む宿主細胞を、前記ＤＮＡポリメラーゼの産生の可能な条件下で培養することを含む、前記製造法。
【請求項８２】
配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異、または、配列番号２のＬ４０８またはＰ４１０またはＳ３４５に対応する部位に変異を含む、組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼの製造法であって、前記ＤＮＡポリメラーゼは、野生型形のそのポリメラーゼに比べて、非慣用的なヌクレオチドに対する識別が低下しており、前記ポリメラーゼをコードする核酸配列を含む宿主細胞を、前記ＤＮＡポリメラーゼの産生の可能な条件下で培養することを含む、前記製造法。
【請求項８３】
前記宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項７９、８０、８１または８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記宿主細胞はテルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）である、請求項７９、８０、８１または８２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、非慣用的ヌクレオチドに対する識別の低下したＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用する、組成物および方法に関する。本発明の酵素は、検出可能な核酸の標識に必要な多くの適用に有用であり、ＤＮＡシークエンス適用に特に有用である。
【０００２】
（発明の背景）
検出可能な核酸の標識は、研究ならびに臨床診断技術への適用を含む、分子生物学における多くの適用に必要である。一般に使用される核酸標識法は、１つ以上の非慣用的なヌクレオチド、および、非慣用的なヌクレオチド（群）の新規合成相補鎖への鋳型依存的な取込みを触媒するポリメラーゼ酵素を使用する。
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼが正しいデオキシヌクレオチドを取込む能力は、インビボでの高忠実度のＤＮＡ複製の基礎である。ポリメラーゼの活性部位内のアミノ酸は、鋳型ヌクレオチドとは逆の正しい相補ヌクレオチドの配置を好む特異的結合ポケットを形成する。ミスマッチのヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体がその位置を占める場合、来るヌクレオチドと接触するアミノ酸の正確なアラインメントは、ＤＮＡ重合に好ましくない位置へと歪み得る。このために、ＤＮＡの標識に使用される非慣用的なヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、標準的なデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ；いわゆる「標準的な」ｄＮＴＰは、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシトシン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）およびチミジン三リン酸（ＴＴＰ））よりも低い効率で伸長鎖に取り込まれる傾向がある。
【０００４】
非慣用的なヌクレオチドがポリメラーゼにより取り込まれる効率の低下は、ＤＮＡ標識に必要な非慣用的なヌクレオチドの量を増加させる。特定のヌクレオチドの取込み効率の低下はまた、均質なシグナル強度のために非慣用的なヌクレオチドの偏った取込みに依存した、ＤＮＡシークエンスなどの技術またはアッセイの性能に有害な影響を及ぼし得る。
【０００５】
来るヌクレオチド三リン酸と接触するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸の実体および正にその整列によって、そのポリメラーゼ酵素により取り込まれ得る、慣用的および非慣用的の両方のヌクレオチドの性質は決まる。結合または鎖伸長の任意の段階で来るヌクレオチド三リン酸と接触するアミノ酸の正にその配置の変化により、異常または非慣用的なヌクレオチドを利用するポリメラーゼの能力は劇的に変化し得る。時に、遠位のアミノ酸の変化が、間接的な全体的または構造的効果に因りヌクレオチド類似体の取込みに影響を及ぼし得る。ヌクレオチド類似体の取込み能の向上したポリメラーゼは、ダイ、反応性基または不安定同位体などのシグナル部分で修飾したヌクレオチドを用いたＤＮＡまたはＲＮＡ鎖の標識に有用である。
【０００６】
標識ヌクレオチドに加えて、極めて重要なクラスの修飾ヌクレオチドはジデオキシヌクレオチドである。いわゆる「サンガー」または「ジデオキシ」ＤＮＡシークエンス法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７４：５４６３、これは本明細書に参考として取込む）は、デオキシ−およびジデオキシヌクレオチドを含む混合物からの、ＤＮＡポリメラーゼによる、アニーリングしたプライマー上への鋳型により指示されるヌクレオチドの取込みに依拠する。ジデオキシヌクレオチドの取込みにより、酵素がその鎖のさらなる伸長を触媒できなくなる鎖終結が生じる。反応産物の電気泳動による分離により、伸長産物の「ラダー」が生じ、ここでの各伸長産物は、鋳型中のヌクレオチドとは逆のヌクレオチドに相補的な特定のジデオキシヌクレオチドで終結する。プライマーからのジデオキシヌクレオチド類似体の距離は、伸長産物の長さにより示される。各々が４つのジデオキシヌクレオチド類似体ｄｄＡ、ｄｄＣ、ｄｄＧ、またはｄｄＴ（ｄｄＮＴＰ）の１つを含む４つの反応を同じゲルで分離すると、鋳型の配列をラダーパターンから直接解読し得る。伸長産物は、例えば、同位体または蛍光標識プライマー、デオキシヌクレオチド三リン酸またはジデオキシヌクレオチド三リン酸を反応に包含することを含む、数個の方法で検出し得る。
【０００７】
蛍光標識は、より迅速なデータ収集（ゲルを流している間に検出を実施し得るため）、並びに、１つの反応およびゲルからのより長い配列データの解読という利点を有する。さらに、蛍光配列検出により、シークエンスを、４つの異なって標識した蛍光ダイ終結因子を含む１つの反応管で実施できる（いわゆるダイ終結因子法、Ｌｅｅら、１９９２、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２０：２４７１、本明細書に参考として取込む）。
【０００８】
ＤＮＡシークエンスに有用な所望の品質のポリメラーゼは、向上したジデオキシヌクレオチドの取込みである。ジデオキシヌクレオチドの取込み向上により、ＤＮＡシークエンスなどのプロセスは、高価な放射能または蛍光ダイ標識ジデオキシヌクレオチドの必要性を減少することにより、よりコスト効率的となる。さらに、偏っていないジデオキシヌクレオチド取込みは、シグナル均一の向上を提供し、塩基決定の正確性の向上をもたらす。均一なシグナル出力によりさらに、対立遺伝子変異のような因子により引き起こされる僅かな配列差異の検出が可能となる。関連位置において２つの異なる半強度シグナルを産生する、対立遺伝子変異は、非均一なｄｄＮＴＰを利用してポリメラーゼにより引き起こされる可変シグナル強度により容易に隠すことができる。
【０００９】
天然形のＤＮＡポリメラーゼによるリボヌクレオチドの取込みは、稀な事象である。より高いレベルのリボヌクレオチドを取り込んだ変異体を、部分的なリボ置換によるシークエンスなどの適用に使用できる。この系では、同じ塩基に対応するリボヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドの混合物を、変異ポリメラーゼにより取込む（Ｂａｒｎｅｓ、１９７８、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１９：８３〜９９）。リボシークエンス反応をアルカリ条件および熱に曝露すると、伸長鎖の断片化が生じる。全４つの塩基の反応を変性アクリルアミドゲル上で分離すると、シークエンスラダーが生じる。この代替のシークエンス法において、より多くのリボヌクレオチドの利用を伴うポリメラーゼ変異体が当分野で必要である。
【００１０】
別法として、リボヌクレオチドの取込み、次いでアルカリ加水分解を、ＤＮＡシャッフリング（（Ｓｔｅｍｍｅｒ、１９９４、Ｎａｔｕｒｅ、３７０：３８９〜３９１）これはまた分子交配、セクシャルＰＣＲおよび指向性進化とも呼ばれる）などのＤＮＡ分子の無作為な切断を必要とする系において使用できる。
【００１１】
ＤＮＡ標識酵素の別の望ましい品質は、熱安定性である。熱安定性を示すＤＮＡポリメラーゼは、熱変性、プライマーアニーリング、および酵素的プライマー伸長のサイクルを使用してＤＮＡ鋳型を増幅する、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の開発以来、分子生物学および臨床診断学の多くの態様を革新してきた。原型熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、好熱性真正細菌サーマス　アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から初めて単離された、Ｔａｑポリメラーゼである。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用したいわゆる「サイクルシークエンス」反応は、慣用的な（すなわち非サイクル）シークエンス反応に比べて、より少量の開始鋳型が必要であるという利点を有する
Ａ、ＢおよびＣファミリーと称される３つの主要なＤＮＡポリメラーゼファミリーがある。ポリメラーゼをこれらの３つのファミリーの１つに分類することは、特定のポリメラーゼの、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（ファミリーＡ）、ＩＩ（ファミリーＢ）またはＩＩＩ（ファミリーＣ）に対する構造的類似性に基づく。例として、ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼは、クレノウＤＮＡポリメラーゼ、サーマス　アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｔａｑポリメラーゼ）およびバクテリオファージＴ７ＤＮＡポリメラーゼを含むがこれに限定されず；−ファミリープロテアーゼ（ＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ、１９９１、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：４０４５）として以前には知られていたＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、ヒト、およびＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４、ＲＢ６９および２９バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ、およびパイロコッカス　フリオース（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕポリメラーゼ）を含むがこれに限定されず；そして、ＣファミリーＤＮＡポリメラーゼは、バチラス・スブチリスＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩおよびサブユニット（ＢｒａｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ、１９９３、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２１：７８７により、それぞれｄｎａＥおよびｄｎａＱ遺伝子産物として列挙）を含むがこれに限定されない。広域の古細菌、細菌、ウイルスおよび真核生物におよぶ各ファミリーのＤＮＡポリメラーゼタンパク質配列のアラインメントを、ＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ（１９９３、上記）に提示し、これは本明細書に参考として取込む。
【００１２】
ＤＮＡポリメラーゼが非天然ヌクレオチドの新生ＤＮＡポリマーへの取込みを実施しない傾向を記載するのに使用した用語は「識別」である。ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼにおいて、ジデオキシヌクレオチド類似体の取込みに対する効果的な識別は、１つのアミノ酸残基に大きく関連している。ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼ由来の大半の酵素は、ＤＮＡポリメラーゼの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）クレノウ断片のＦ７６２に等価な位置にフェニルアラニン（ｐｈｅまたはＦ）残基を有し、ジデオキシヌクレオチドに対する強い識別を実証する。ほとんどのポリメラーゼ（例えばＴ７ＤＮＡポリメラーゼ）は、対応する位置にチロシン（ｔｙｒまたはＹ）を有さず、ジデオキシヌクレオチドに対する比較的弱い識別を示す。この位置にチロシンを有するＡファミリーポリメラーゼは、それらがデオキシヌクレオチドを取込むレベルと等しいか、またはほんの僅かに異なるレベルでジデオキシヌクレオチドを容易に取込む。識別に関与する部位におけるチロシンまたはフェニルアラニン残基の変換は、Ａファミリー酵素のジデオキシヌクレオチド識別プロファイルを逆転する（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：６４４９）。
【００１３】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの中で、ＡｍｐｌｉＴａｑＦＳ（登録商標）（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）として知られる、サーマス　アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑａｔｉｃｕｓ）由来の変異形のＡファミリーＤＮＡポリメラーゼは、クレノウＤＮＡポリメラーゼのＦ７６２に等価な位置にＦ６６７Ｙ変異を含み、野生型酵素に比べてジデオキシヌクレオチド取込みの増加を示す（すなわち、ｄｄＮＴＰに対する識別の低下）。ジデオキシヌクレオチド取込みの識別低下により、それは野生型酵素よりも、蛍光および標識ジデオキシヌクレオチドシークエンスにおいてより有用となる。
【００１４】
しかし、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのＦ６６７Ｙ変異体は、ローダミンダイ終結因子の使用を必要とする、フルオレセイン標識ジデオキシヌクレオチドを用いた使用に適していない。しかし、Ｔａｑシークエンス反応で現在利用される、ローダミンダイ終結因子は、ＤＮＡ二次構造を安定化し、シグナルの圧縮を引き起こす。圧縮問題を排除する努力により、デオキシグアノシン三リン酸の代わりに、大量のヌクレオチド類似体デオキシイノシン三リン酸（ｄＩＴＰ）を使用する系が得られた。（ｄＩＴＰ）の取込みがシグナルの圧縮を減少する場合、反応におけるｄＩＴＰの存在により、反応温度の低下および反応時間の増加を含む追加の複雑化の要因が生じる。さらに、シークエンスにおけるローダミンダイの使用は、望ましくない反応後精製を必要とする（Ｂｒａｎｄｉｓ、１９９９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．２８：１９１２）。
【００１５】
ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、いわゆるｐａｌｍドメインにおいて触媒に関与する酸性残基の位置を除き、ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼに比べて実質的に異なる構造を示す（Ｗａｎｇら、１９９７、Ｃｅｌｌ　８９：１０８７；Ｈｏｐｆｎｅｒら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６：３６００）。ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼの独特な構造により、構造的束縛に因り、ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼでの使用に不適切な、類似体の利用をおそらく可能とする、ヌクレオチド類似体との完全に異なるスペクトルの相互作用を可能とし得る。熱安定性Ｂファミリーポリメラーゼは、超好熱性古細菌で同定された。これらの生物は、９０１Ｃよりも高い温度で増殖し、その酵素は、好熱性真正細菌ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼよりも高い熱安定性を実証する（Ｍａｔｈｕｒら、１９９２、Ｓｔｒａｔａｇｉｅｓ　５：１１）。超好熱性古細菌由来のＢファミリーポリメラーゼは、非慣用的なヌクレオチドに対する識別を低下する修飾（群）の出発基質としてよく適し得る。
【００１６】
３つのＢファミリーＤＮＡポリメラーゼの結晶構造が解像されたが（Ｗａｎｇら、１９９７、上記；Ｈｏｐｆｎｅｒ，Ｋ．−Ｐ．ら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６：３６００；Ｚｈａｏ、１９９９、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｆｏｌｄ　Ｄｅｓ．７：１１８９）、ＤＮＡポリメラーゼまたはｄＮＴＰ−ポリメラーゼ共複合体の構造は依然として報告されていない。現在では、ヌクレオチド類似体識別に寄与するアミノ酸残基の同定は、Ａファミリー−ｄＮＴＰ構造への外挿から、または、関連ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼを用いて実施した変異誘発試験からのみ推定できる（例えばヒトｐｏｌ、ファージＴ４、ファージ２９、Ｔ．リトラリス（Ｔ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ）。
【００１７】
ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼの配列比較により、Ｉ〜ＶＩとナンバリングした６つの保存領域が示される（ＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ、１９９３、上記）。Ｗａｎｇら（Ｗａｎｇら、１９９７、上記）により提唱されたバクテリオファージＲＢ６９ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂファミリー）の結晶構造により、領域ＩＩのＹ４１６（これはテルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３のＢファミリーＤＮＡポリメラーゼのＹ４０９に対応する）は、ＨＩＶ逆転写酵素（ＲＴ）のＹ１１５およびクレノウ断片（Ａファミリーポリメラーゼ）のＥ７１０と同じ位置を有する。ＲＢ６９におけるｄＮＴＰおよびプライマー鋳型複合体のモデリングは、逆転写酵素−ＤＮＡ共結晶の原子座標を使用して実施した。このモデルは、ｄＮＴＰのデオキシリボース部分下のＲＢ６９Ｙ４１６パックを予測する。この位置のチロシンは、哺乳動物逆転写酵素（Ｙ１１５）のリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの間のポリメラーゼ識別に寄与する、リボース選択性（Ｇａｏら、１９９７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：４０７；Ｊｏｙｃｅ、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：１６１９）、および、対応する不変グルタメート残基（Ｅ７１０）の修飾がリボヌクレオチドに対する識別を低下させるＡファミリーＤＮＡポリメラーゼに関与している（Ｇｅｌｆａｎｄら、１９９８、特許番号ＥＰＯ８２３４７９号；Ａｓｔａｔｋｅら、１９９８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６：３４０２）。
【００１８】
ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼで実施した変異誘発試験も、ｄＮＴＰ取込みおよびリボース選択性において、領域ＩＩ中の類似Ｙを含む領域が示される。ヒトＤＮＡポリメラーゼ中の対応するＹ８６５での変異は、３’−ＯＨ基の代わりにかさ高い３’−アジド基を有するＡＺＴ−ＴＰ、ｄＧＴＰのグアニン塩基のＣ−２位のアミノ基に付着したブチルフェニル基を含むＢｕＰｄＧＴＰ（よりかさ高くより疎水性のプリン塩基ヌクレオチドが生じる）、および、ピリミジンデオキシヌクレオチド三リン酸の競合的阻害剤であるアフィディコリンなどの、ｄＮＴＰヌクレオチド阻害剤に対するポリメラーゼ忠実度および感度に影響を及ぼす。興味深いことに、変異体は、それによるｄｄＣＴＰの取込みに差異を全く示さなかった（Ｄｏｎｇら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２６１４３）。さらに、類似Ｙ（４１１）のちょうど１アミノ酸前のＬ４１２をメチオニン（Ｍ）またはイソロイシン（Ｉ）に変換した、バクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、無機ピロリン酸類似体ホスホノ酢酸（ＰＡＡ）に対してそれぞれ極度および温和な感度を示す。ＰＡＡ感度の変化は、ポリメラーゼとヌクレオチド類似体との相互作用を予測することが示された。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのＬ４１２は、テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼのＬ４１０に対応する。Ｌ４１２ＭＴ４ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、野生型ポリメラーゼよりも５０倍少ないｄｄＧＴＰで阻害され、一方、ｄＧＴＰのＫｍは維持していた。研究で著者の記載したように、「Ｌ４１２Ｍ　ＤＮＡポリメラーゼのｄｄＧＴＰに対する感度にも関わらず、野生型およびＬ４１２ＭＤＮＡポリメラーゼによるｄｄＮＴＰの取込みには差異は全く見られなかった」（Ｒｅｈａ−Ｋｒａｎｔｚら、１９９３、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６０）。バクテリオファージ２９において、領域ＩＩの変異（Ｙはテルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ３ＤＮＡポリメラーゼＹ４０９に類似しているＬＹＰ）は、ＰＡＡで攻撃すると混合した結果を出し；Ｐ２５５Ｓは、ＰＡＡに対して過感度であったが、Ｌ２５３Ｖは、野生型酵素よりも感度の低いことが示された（Ｂｌａｓｃｏら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２４１０６）。これらのデータは、ポリメラーゼ−ヌクレオチド相互作用におけるＬＹＰ（領域ＩＩ）の役割を支持するが、ｄｄＮＴＰの取込み向上は、これらの文献では達成されなかった。
【００１９】
別の研究では、テルモコックス　リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）ＤＮＡポリメラーゼ由来の古細菌ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ（ＶＥＮＴ（商標）ポリメラーゼ、ニューイングランドバイオラブズ）における領域ＩＩの広範な変異を実施した。その研究では、２６個の異なる部位特異的変異体を、単にヌクレオチド類似体識別の調査の目的で作成した（ＧａｒｄｎｅｒおよびＪａｃｋ、１９９９、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７：２５４５）。ＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼの部位特異的変異誘発は、Ｙ４１２での３つの変異（ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼＹ４０９に対応する）がヌクレオチド結合を変化し得ることを実証した（ＧａｒｄｎｅｒおよびＪａｃｋ、１９９９、上記）。Ｙ４１２Ｖは、ジデオキシヌクレオチド取込みにおいて２倍の増加、リボヌクレオチドＡＴＰの取込みにおいて２００倍の増加で最も有意であった。変異Ｙ４１２Ｆは、類似体取込みの変化は全く示さなかった。
【００２０】
Ｂファミリーポリメラーゼの領域ＩＩＩ（モチーフＢとも称する）も、ヌクレオチド認識に役割を果たすことが実証された。ＪＤＦ−３ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼのＡＡ４８７から４９５に対応する、この領域は、共通配列ＫＸ３ＮＳＸＹＧを有し（Ｊｕｎｇら、１９９０、上記；Ｂｌａｓｃｏら、１９９２、上記；Ｄｏｎｇら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１１６３；Ｚｈｕら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１２１９：２６０；ＤｏｎｇおよびＷａｎｇ、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１５６３）、構造的ではないが（Ｗａｎｇら、１９９７、上記）機能的に、ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼのヘリックスＯのＫＸ３（Ｆ／Ｙ）ＧＸ２ＹＧに類似している。クレノウ断片およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどのＡファミリーＤＮＡポリメラーゼにおいて、Ｏヘリックスは、ｄＮＴＰ結合に主要な役割を果たすアミノ酸を含む（Ａｓｔａｔｋｅら、１９９８、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：１４７；Ａｓｔａｔｋｅら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９４５；Ｐｏｌｅｓｋｙら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：８４１７；Ｐｏｌｅｓｋｙら、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４５７９；Ｐａｎｄｅｙら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３２５９；Ｋａｕｓｈｉｋら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：７２５６）。特に、ヘリックスＯは、ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼ（ＫＸ３（Ｆ／Ｙ）ＧＸ２ＹＧ）（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９５、上記）にｄｄＮＴＰ識別を付与する、Ｆ（クレノウ断片のＦ７６３；ＴａｑのＦ６６７）を含む。
【００２１】
ＶＥＮＴ（商標）ＤＮＡポリメラーゼの領域ＩＩＩの特異的変異誘発試験はまた、テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼのＡ４８５に類似したアラニンに標的化した（Ｊｕｎｇら、１９９０、上記）。これらの変異体（Ａ→Ｃ、Ａ→Ｓ、Ａ→Ｌ、Ａ→Ｉ、Ａ→ＦおよびＡ→Ｖ）は、前駆酵素のポリメラーゼ活性の０．１２から１．２倍の範囲の比活性を示した（ＧａｒｄｎｅｒおよびＪａｃｋ、１９９９、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７：２５４５）。ジデオキシヌクレオチド取込みは、非変異酵素の４から１５倍の範囲であった。興味深いことに、ジデオキシヌクレオチド取込みの最も高い（１５倍）変異体は、最初の酵素の僅か０．１２倍の比活性を示した。
【００２２】
テルモコックス　バロッシー（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｂａｒｏｓｓｉｉ）由来のＢファミリーＤＮＡポリメラーゼに関する部位特異的変異誘発試験は、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼのＡＡ残基４８８〜４９３に対応する配列ＩＬＡＮＳＦの各々の残基を独立的に、チロシンに修飾した（Ｒｅｉｄｌら、米国特許第５，８８２，９０４号）。その研究により、Ｌ４８９Ｙ変異体は、この部位に野生型ロイシン残基を有する酵素に比べて、約３倍高いジデオキシヌクレオチドの取込みを示すことが示された。
【００２３】
活発な研究の１領域は、複数の異なる核酸配列の同時解析における、核酸またはＤＮＡ「チップ」も称されることの多い、核酸アレイの使用を含む。米国特許第５，８８２，９０４号に記載のようなこれらの適用の多くが（Ｒｅｉｄｌら、１９９９年３月１６日に発行）、非慣用的なヌクレオチド、特に蛍光標識した非慣用的なヌクレオチドに対して識別の低下を示すＤＮＡポリメラーゼから利点が得られる。チップ型式で取り組む適用は、とりわけ、ＤＮＡシークエンスおよび変異検出を含む。例えば、「ミニシークエンス」法（例えばＰａｓｔｉｎｅｎら、１９９７、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓ．７：６０６；Ｓｙｖａｎｅｎ、１９９９、Ｈｕｍａｎ　Ｍｕｔａｔｉｏｎ　１３：１〜１０）および整列プライマー伸長（ＡＰＥＸ）変異検出法（Ｓｈｕｍａｋｅｒら、１９９６、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．７：３４６）およびそれに類似した方法は、蛍光標識または他の非慣用的なヌクレオチドに対する識別の低下したＤＮＡポリメラーゼから利点が得られ得る。チップまたはゲルをベースとしたミニシークエンス系に使用する非識別ＤＮＡポリメラーゼが当分野では必要である。かかる系により、有利には、複合した１ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）の検出が可能となり、適量的遺伝子型分類が可能となる。配列変異の同定により、遺伝子疾患の診断および処置、多要素疾病の素因、および新しいまたは既存の医薬製品に対する感度が可能となる。
【００２４】
非慣用的なヌクレオチドに対する識別の低下したＤＮＡポリメラーゼが当分野で必要である。ジデオキシヌクレオチドに対する識別の低下を示す熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、およびさらに、蛍光標識ジデオキシヌクレオチドに対する識別の低下を示すＤＮＡポリメラーゼが当分野で必要である。
【００２５】
（発明の要約）
本発明は、非慣用的ヌクレオチドに対する識別の低下を示すＤＮＡポリメラーゼ酵素を使用した組成物および方法に関する。この品質をもつ酵素は、検出可能な核酸の標識を必要とする多くの適用に有用であり、特にＤＮＡシークエンス適用に有用である。
【００２６】
本発明はさらに、配列番号２のＬ４０８、Ｐ４１０、Ｓ３４５および／またはＡ４８５に対応する部位または部位群に１つ以上の変異を有するＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ、または、核酸の鋳型依存的な重合を指示する能力を保持したその断片に関する。本発明はまた、配列番号２のＬ４０８、Ｐ４１０およびまたはＡ４８５に対応する部位で変異したＢファミリーポリメラーゼの変異体および修飾形（例えば化学修飾または抗体複合体形成により調製された、例えば可逆的に不活性化された形のＢファミリーポリメラーゼ）を包含する。
【００２７】
１つの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＳ３４５に対応する部位にセリンからプロリンへの変異、および、配列番号２のＰ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を含む、二重変異を有する。
【００２８】
本発明は、残基１から７７６までの配列番号２に提示したアミノ酸配列を有する、精製された熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを包含する
１つの実施形態において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３から単離する。
【００２９】
別の実施形態において、熱安定性ポリメラーゼは、テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼの発現をコードするベクターで形質転換した組換え生物から単離される。
【００３０】
本発明はさらに、配列番号１に提示したヌクレオチド配列を含む組換えベクターを包含する。
【００３１】
本発明はさらに、配列番号２のアミノ酸配列またはその機能的断片を含む、単離組換えポリペプチドを包含する。
【００３２】
本発明はさらに、３’から５’エキソヌクレアーゼ欠損である、テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３由来の単離組換えＤＮＡポリメラーゼを包含する。
【００３３】
１つの実施形態において、単離組換えＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＤ１４１に対応するアミノ酸にアスパラギン酸からトレオニンまたはアラニンへの変異、または配列番号２のＥ１４３に対応するアミノ酸にグルタミン酸からアラニンへの変異を有する。
【００３４】
別の実施形態において、単離組換えＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＤ１４１に対応するアミノ酸にアスパラギン酸からトレオニンまたはアラニンへの変異、または配列番号２のＥ１４３に対応するアミノ酸にグルタミン酸からアラニンへの変異を有する。
【００３５】
本発明はさらに、非慣用的ヌクレオチドに対する識別の低下した、単離組換えＤＮＡポリメラーゼを包含する。
【００３６】
１つの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼはＢファミリーＤＮＡポリメラーゼである。
【００３７】
別の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼはさらに、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからフェニルアラニンへの変異、配列番号２のＰ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異、および配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を含む。
【００３８】
本発明はさらに、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異；配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからフェニルアラニンへの変異；および配列番号２のＰ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異からなる群から選択される変異をさらに含む、配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を有する、単離組換えＤＮＡポリメラーゼを包含する。
【００３９】
本発明はさらに、配列番号２のＳ３４５に対応する部位にセリンからプロリンへの変異をさらに含む、配列番号２のＰ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を有する、単離組換えＤＮＡポリメラーゼを包含する。
【００４０】
別の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび複合ヌクレオチドからなる群から選択される非慣用的なヌクレオチドに対して識別が低下している。
【００４１】
別の実施形態において、複合ヌクレオチドは、放射標識ヌクレオチド、蛍光標識ヌクレオチド、ビオチン標識ヌクレオチド、化学発光標識ヌクレオチドおよび量子ドット標識ヌクレオチドからなる群から選択される。
【００４２】
本発明はさらに、配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異、または、配列番号２のＬ４０８またはＰ４１０に対応する部位に変異を含む、単離組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼを包含し、ここでのＤＮＡポリメラーゼは、野生型形のそのポリメラーゼに比べて、非慣用的なヌクレオチドに対する識別が低下している。
【００４３】
１つの実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、３’から５’エキソヌクレアーゼ欠損である。
【００４４】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＤ１４１またはＥ１４３に対応するアミノ酸に変異を有する。
【００４５】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＤ１４１に対応する部位にアスパラギン酸からトレオニンまたはアラニンへの変異を有する。
【００４６】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＥ１４３に対応する部位にグルタミン酸からアラニンへの変異を有する。
【００４７】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＥ１４３に対応する部位にグルタミン酸からアラニンへの変異を有し、配列番号２のＤ１４１に対応するアミノ酸にアスパラギン酸からトレオニンまたはアラニンへの変異を有する。
【００４８】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは熱安定性である。
【００４９】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは古細菌である。
【００５０】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは。配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異を含む。
【００５１】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからフェニルアラニンへの変異を含む。
【００５２】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＰ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を含む。
【００５３】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を含む。
【００５４】
別の実施形態において、配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を含むＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異を含む。
【００５５】
別の実施形態において、配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を含むＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからフェニルアラニンへの変異を含む。
【００５６】
別の実施形態において、配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を含む、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＤ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を含む。
【００５７】
別の実施形態において、配列番号２のＰ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を含むＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＳ３４５に対応する部位にセリンからプロリンへの変異をさらに有する。
【００５８】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＳ３４５に対応する部位にセリンからプロリンへの変異を含み、配列番号２のＴ６０４に対応する部位に変異をさらに含み得る。
【００５９】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＹ４９７に対応する部位にチロシンからシステインへの変異を含み、そして配列番号２のＩ６３０に対応する部位にイソロイシンからバリンへの変異をさらに含み得る。
【００６０】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＥ６４５に対応する部位にグルタミン酸からリジンへの変異を含む。
【００６１】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＥ５７８に対応する部位にグルタミン酸からリジンへの変異を含み、そして配列番号２のＲ４６５に対応する部位にアルギニンからメチオニンへの変異をさらに含み得る。
【００６２】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＬ３９６に対応する部位にロイシンからグルタミンへの変異を含み、そして配列番号２のＶ４０１、Ｎ４２４、Ｐ５６９、Ｅ６１７またはＶ６４０に対応する部位に変異をさらに含み得る。
【００６３】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＳ６５１に対応する部位にセリンからアスパラギンへの変異を含む。
【００６４】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＬ３９６に対応する部位にロイシンからプロリンへの変異を含み、そして配列番号２のＥ４５９に対応する部位に変異をさらに含み得る。
【００６５】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＬ４５６に対応する部位にロイシンからプロリンへの変異を含み、そして配列番号２のＥ６５８に対応する部位に変異をさらに含み得る。
【００６６】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異を含み、そして配列番号２のＶ４３７またはＬ４７８に対応する部位に変異をさらに含み得る。Ｌ４０８Ｈ変異は、本明細書に記載したジデオキシヌクレオチドおよびダイ−ジデオキシヌクレオチドスクリーンの両方で単離された。
【００６７】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、配列番号２のＹ４９６に対応する部位にチロシンからアスパラギンへの変異を含む。
【００６８】
別の実施形態において、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチドおよび複合ヌクレオチドからなる群から選択される非慣用的なヌクレオチドに対して識別が低下している。
【００６９】
別の実施形態において、複合ヌクレオチドは、放射標識ヌクレオチド、蛍光標識ヌクレオチド、ビオチン標識ヌクレオチド、化学発光標識ヌクレオチドおよび量子ドット標識ヌクレオチドからなる群から選択される。
【００７０】
別の実施形態において、非慣用的ヌクレオチドに対する識別の低下した単離組換えＤＮＡポリメラーゼ、或いは、配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異もしくは配列番号２のＬ４０８またはＰ４１０に対応する部位に変異を含む単離組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ（ここでのＤＮＡポリメラーゼは、野生型形のそのポリメラーゼに比べて、非慣用的ヌクレオチドに対する識別が低下している）は、さらに、配列番号２のアミノ酸４０９におけるＹからＶへの変異；配列番号２のアミノ酸４８５におけるＡからＣ、Ｓ、Ｌ、Ｉ、ＦまたはＶへの変異；配列番号２のアミノ酸４９４におけるＹからＳへの変異；配列番号２のアミノ酸４９６におけるＹからＬへの変異；および、配列番号２のアミノ酸４９０におけるＡからＹへの変異からなる群から選択される変異に対応する、ポリメラーゼ中のアミノ酸残基における変異を含む。
【００７１】
別の実施形態において、非慣用的ヌクレオチドに対して識別の低下した単離組換えＤＮＡポリメラーゼ、または、配列番号２のＡ４８５に対応する部位でのアラニンからトレオニンへの変異もしくは配列番号２のＬ４０８またはＰ４１０に対応する部位での変異を含む単離組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ（ここでのＤＮＡポリメラーゼは、野生型形のそのポリメラーゼに比べて、非慣用的ヌクレオチドに対する識別が低下している）は、さらに、配列番号のアミノ酸４８３から４９６（これを含む）の１つに対応するポリメラーゼのアミノ酸における変異を含む。
【００７２】
１つの実施形態において、変異は、配列番号２のアミノ酸４８５、４９０、４９４、または４９６の１つに対応するポリメラーゼのアミノ酸においてである。
【００７３】
本発明はさらに、配列番号２のＡ４８５Ｔに対応するアミノ酸におけるアラニンからトレオニンへの変異、および、ポリメラーゼ中の配列番号２のＬ４０８、Ｙ４０９またはＰ４１０にそれぞれ対応するアミノ酸の少なくとも１つの置換を含む、単離組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼを包含する。
【００７４】
本発明はさらに、配列番号２のＡ４８５に対応するポリメラーゼのアミノ酸においてＡ以外のアミノ酸、および、ポリメラーゼ中の配列番号２のＬ４０８、Ｙ４０９またはＰ４１０にそれぞれ対応するアミノ酸の少なくとも１つの置換を含む、単離組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼを包含する。
【００７５】
本発明はさらに、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含む、組換えベクターを包含する。
【００７６】
本発明はさらに、ＤＮＡの相補鎖を標識する方法を包含し、前記方法は、鋳型ＤＮＡ分子を、テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３由来の組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ（ここでのＤＮＡポリメラーゼは、非慣用的ヌクレオチドに対する識別が低下している）および非慣用的ヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡ鎖を合成し、非慣用的ヌクレオチドを合成された相補的ＤＮＡ鎖に取込むことの可能な条件下および十分な時間、接触させる段階を含む。
【００７７】
本発明はさらに、ＤＮＡの相補鎖を標識する方法を包含し、前記方法は、鋳型ＤＮＡ分子を、配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異、または、配列番号２のＬ４０８またはＰ４１０に対応する部位に変異を含む組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ（ここでのＤＮＡポリメラーゼは、非慣用的ヌクレオチドに対する識別が低下している）および非慣用的ヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡ鎖を合成し、非慣用的ヌクレオチドを合成された相補的ＤＮＡ鎖に取込むことの可能な条件下および十分な時間、接触させる段階を含む。
【００７８】
１つの実施形態において、組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、３’から５’エキソヌクレアーゼ欠損である。
【００７９】
別の実施形態において、組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸Ｌ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異を含む。
【００８０】
別の実施形態において、組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸Ｌ４０８に対応する部位にロイシンからフェニルアラニンへの変異を含む。
【００８１】
別の実施形態において、組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸Ｐ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を含む。
【００８２】
別の実施形態において、組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸Ａ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を含む。
【００８３】
別の実施形態において、配列番号２のアミノ酸Ａ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を含む組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のＬ４０８に対応するアミノ酸にロイシンからヒスチジンへの変異を含む。
【００８４】
別の実施形態において、配列番号２のアミノ酸Ａ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を含む組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のＬ４０８に対応するアミノ酸にロイシンからフェニルアラニンへの変異を含む。
【００８５】
別の実施形態において、配列番号２のアミノ酸Ａ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を含む組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号１のＰ４１０に対応するアミノ酸にプロリンからロイシンへの変異を含む。
【００８６】
別の実施形態において、組換えＢファミリーポリメラーゼは、ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、および複合ヌクレオチドからなる群から選択される非慣用的ヌクレオチドに対する識別が低下している。
【００８７】
別の実施形態において、複合ヌクレオチドは、放射標識ヌクレオチド、蛍光標識ヌクレオチド、ビオチン標識ヌクレオチド、化学発光標識ヌクレオチドおよび量子ドット標識ヌクレオチドからなる群から選択される。
【００８８】
本発明はさらに、シークエンスするＤＮＡ鎖を、シークエンスプライマー、テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３由来の組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ（ここでのＤＮＡポリメラーゼは、非慣用的ヌクレオチドに対する識別が低下している）および鎖終結ヌクレオチド類似体と、ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡ鎖を合成し、ヌクレオチドを合成された相補的ＤＮＡ鎖に取込むことの可能な条件下で接触させる段階を含み、ここでの鎖終結ヌクレオチドの取込みにより鎖伸長は終結し、よって鋳型ＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列が決定される、ＤＮＡをシークエンスする方法を包含する。
【００８９】
本発明はさらに、シークエンスするＤＮＡ鎖を、シークエンスプライマー、配列番号２のＡ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異、または、配列番号２のＬ４０８、Ｓ３４５またはＰ４１０に対応する部位に変異を含む組換えＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ（ここでのＤＮＡポリメラーゼは、非慣用的ヌクレオチドに対する識別が低下している）、および鎖終結ヌクレオチド類似体と、ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡ鎖を合成し、ヌクレオチドを合成された相補的ＤＮＡ鎖に取込むことの可能な条件下で接触させる段階を含み、ここでの鎖終結ヌクレオチド類似体の取込みにより、鎖伸長は終結し、よって鋳型ＤＮＡ鎖のヌクレオチド配列が決定される、ＤＮＡをシークエンスする方法を包含する。
【００９０】
１つの実施形態において、組換えＤＮＡポリメラーゼは、３’から５’エキソヌクレアーゼ欠損である。
【００９１】
別の実施形態において、組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸Ｌ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異を有する。
【００９２】
別の実施形態において、組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸Ｌ４０８に対応する部位にロイシンからフェニルアラニンへの変異を有する。
【００９３】
別の実施形態において、組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸Ｐ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を有する。
【００９４】
別の実施形態において、配列番号２のＰ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を含むＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、さらに、配列番号２のＳ３４５に対応する部位にセリンからプロリンへの変異を有する。
【００９５】
別の実施形態において、組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のアミノ酸Ａ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を有する。
【００９６】
別の実施形態において、配列番号２のアミノ酸Ａ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を有する組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからヒスチジンへの変異を有する。
【００９７】
別の実施形態において、配列番号２のアミノ酸Ａ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を有する組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のＬ４０８に対応する部位にロイシンからフェニルアラニンへの変異を有する。
【００９８】
別の実施形態において、配列番号２のアミノ酸Ａ４８５に対応する部位にアラニンからトレオニンへの変異を有する組換えＢファミリーポリメラーゼは、配列番号２のＰ４１０に対応する部位にプロリンからロイシンへの変異を有する。
【００９９】
別の実施形態において、鎖終結ヌクレオチド類似体はジデオキシヌクレオチドである。
【０１００】
別の実施形態において、ジデオキシヌクレオチドは、検出可能なように標識されている。
【０１０１】
別の実施形態において、ジデオキシヌクレオチドは蛍光標識されている。
【０１０２】
別の実施形態において、ジデオキシヌクレオチドは、フルオレセインおよびローダミンからなる群から選択される部分で標識されている。
【０１０３】
本発明は、本明細書に開示した方法を実施するためのキットも包含する。
【０１０４】
本発明は、前記ポリメラーゼをコードする核酸配列を含む宿主細胞を、前記ＤＮＡポリメラーゼの産生を可能とする条件下で培養することを含む、ここで開示したような組換えＤＮＡポリメラーゼの製造法も包含する。
【０１０５】
本発明は、本明細書に記載した変異ＤＮＡポリメラーゼとＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（好ましくは変異形、Ｆ６６７Ｙ）などの別のＤＮＡポリメラーゼの混合物を包含する。前記混合物は、標識ヌクレオチドの合成ヌクレオチドへの重合から生じるシグナル均一性を向上し得る点で有用である。
【０１０６】
本明細書に使用したような「識別」は、ＤＮＡポリメラーゼが、非慣用的ヌクレオチドを新生ＤＮＡポリマーに取込まない傾向を意味する。ＤＮＡポリメラーゼは、ヌクレオチド塩基相補性および糖およびヘテロ環塩基の構造的特徴を含むがこれに限定されない、ヌクレオチド構造を感知する能力を有し、これにより、ＤＮＡポリメラーゼは、新生ポリマーに取込む上で非慣用的ヌクレオチドではなく慣用的なデオキシヌクレオチドを優先的に利用することが可能となる。ＤＮＡポリメラーゼは、慣用的なデオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰをＤＮＡポリマーに取込むことを強力に好み；ポリメラーゼは、その結合ポケット内の非慣用的ヌクレオチドでは進行しないようである。
【０１０７】
本明細書に使用したような「識別の低下」は、識別の低下を示さない親すなわち野生型ＤＮＡポリメラーゼに比べて、新生ＤＮＡポリマーから、非慣用的ヌクレオチドを排除する（すなわち非慣用的ヌクレオチドを新生ＤＮＡポリマーに取り込まない）傾向の少なくとも５０％の低下を意味する。ＤＮＡポリメラーゼが、非慣用的ヌクレオチドではなく慣用的デオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰを取込む優先性は、これにより、天然レベルの優先性に比べて低下し、よって、非慣用的ヌクレオチドは、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡポリマーにより迅速に取り込まれる。本発明により、識別の低下を示すポリメラーゼは、少なくとも１つの非慣用的ヌクレオチドに対する識別の低下を示すが、全ての非慣用的ヌクレオチドに対する識別の低下を示さないだろう。
【０１０８】
本発明により、識別は、対応する慣用的なヌクレオチドの取込みを５０％阻害するのに必要な非慣用的ヌクレオチドの濃度を測定することにより定量する。この濃度は、本明細書では非慣用的ヌクレオチドについて「Ｉ５０％」として言及する。特定の非慣用的ヌクレオチドに対する識別は、その非慣用的ヌクレオチドについてのＩ５０％が、変異ＤＮＡポリメラーゼの代わりに、親ＤＮＡポリメラーゼを含む、同一のアッセイに比べて、少なくとも２分の１（５０％）低下する場合に「低下」する。
【０１０９】
別法として、識別低下は、野生型または親酵素を使用して産生したシークエンスラダーに同一なシークエンスラダーを作成するために、識別の低下した変異ポリメラーゼを用いて、反応に必要な非慣用的ヌクレオチド（例えば、ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはコルジセピン）の量を決定することにより定量し得る。シークエンスラダーは、例えば、プライマー末端から１から４００塩基の範囲であり得、ラダーは、作成された伸長産物の数、並びに、シークエンス反応で作成される伸長産物の長さにおいて同一である。この型のアッセイでは、一定量のｄＮＴＰおよび可変量の非慣用的ヌクレオチドを使用して、野生型（または親）酵素および変異ポリメラーゼ（リボヌクレオチドでは、シークエンスラダーは、重合産物のアルカリ切断により生じる）の両方を用いてシークエンスラダーを作成する。Ｇａｒｄｎｅｒ＆Ｊａｃｋ、１９９９、上記参照。変異体は、野生型または親酵素により生じるものと同一（生じる伸長産物の数および長さに関して）のシークエンスラダーを生じる、野生型または親ポリメラーゼにより使用される非慣用的ヌクレオチドの量の少なくとも２分の１（５０％）少ない、５分の１（８０％）少ない、１０分の１（１００％）少ない等を必要とする場合、識別の低下を示す。
【０１１０】
本明細書に使用したような「親」または「前駆体」なる語は、識別の低下した変異ポリメラーゼを作成する上で、出発物質として使用するポリメラーゼを意味する。「親」なる語は、天然に存在するようないわゆる「野生型」酵素だけではなく、中間体形、例えば、非慣用的ヌクレオチドに対する識別の低下した酵素の作成において出発物質として使用するエキソヌクレアーゼ欠損酵素も包含することを意味する。
【０１１１】
本明細書に使用したような「非慣用的ヌクレオチド」は、ａ）ＤＮＡポリメラーゼにより認識され取り込まれる４つの慣用的なデオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびＴＴＰの１つではないヌクレオチド構造、ｂ）（ａ）の４つの慣用的デオキシヌクレオチドの１つではない合成ヌクレオチド、ｃ）修飾された慣用的ヌクレオチド、またはｄ）リボヌクレオチド（ＤＮＡポリメラーゼにより通常認識または取り込まれないので）および修飾形のリボヌクレオチドを意味する。非慣用的ヌクレオチドは、例えばＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒから市販されている、表ＩＩＩに列挙したものを含むがこれに限定されない。上記の非慣用的ヌクレオチドのいずれか１つは、「複合ヌクレオチド」であり得、これは本明細書に使用したように、蛍光標識、同位体、化学発光標識、量子ドット標識、抗原、または親和性部分を含むがこれに限定されない検出標識を有するヌクレオチドを意味する。
【０１１２】
本明細書に使用したような「細胞」、「細胞系」および「細胞培養液」なる語は同義語として使用でき、全てのかかる呼称は前駆体を含む。従って、「形質転換体」または「形質転換細胞」なる語は、一次対象細胞、および、移行の数に関係なくそれから得られる培養液を含む。また、全ての前駆体は、慎重または不注意な変異に因り、ＤＮＡ内容物が正確に同一でない場合があることを理解する。最初の形質転換細胞についてスクリーニングしたのと同じ機能を有する変異前駆体を含める。
【０１１３】
本明細書に使用したような「ベクターで形質転換した生物」なる語は、組換え遺伝子産物を有する生物を意味する。
【０１１４】
本明細書に使用したような「熱安定性」は、酵素は高温で活性であり、約９３℃から約９７℃の範囲のＤＮＡ二本鎖変性温度に抵抗性であるというような、ＤＮＡポリメラーゼの特性を意味する。「活性」は、酵素が、二本鎖核酸の変性を奏効するのに必要な時間、高温または変性温度にかける場合に、プライマー伸長反応を奏効できる能力を保持していることを意味する。本明細書に使用したような高温は、約７０℃から約７５℃の範囲を意味し、一方、本明細書に使用したような非高温は、約３５℃から約５０℃までの範囲を意味する。
【０１１５】
本明細書に使用したような「アーキア」は、古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）界の生物またはその生物由来のＤＮＡポリメラーゼを意味する。
【０１１６】
本明細書に使用したような「シークエンスプライマー」は、ポリメラーゼによる核酸合成の開始点、次いで、シークエンスするＤＮＡ鎖のアニーリング点として作用する、天然または合成のオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、典型的には、一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。適切なプライマーの長さは、目的のプライマーの用途に依存するが、ＤＮＡシークエンス適用では、典型的には約１５から約４０ヌクレオチド長の範囲である。
【０１１７】
本明細書に使用したような「ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ」は、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼの一員として分類される任意のＤＮＡポリメラーゼを意味し、ここでのＢファミリー分類は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩＩに対する構造類似性に基づく。以前には−ファミリープロテアーゼとして知られていた、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼは、表Ｉなどに列挙したものを含むがこれに限定されない。
【０１１８】
本明細書に使用したような「ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼ」は、ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼの一員として分類される任意のＤＮＡポリメラーゼを意味し、ここでのＡファミリー分類は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩに対する構造類似性に基づく。ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼは、表Ｉなどに列挙したものを含むがこれに限定されない。
【０１１９】
本明細書に使用したような「３’から５’エキソヌクレアーゼ欠損」または「３’から５’エキソ−」は、取込んだヌクレオチドを、ＤＮＡポリマーの３’末端から除去する能力を実質的に欠失した酵素を意味する。Ｂファミリーポリメラーゼのメンバーにより例示される３’から５’エキソヌクレアーゼ活性などの、ＤＮＡポリメラーゼエキソヌクレアーゼ活性は、変異により欠失し得、エキソヌクレアーゼ欠損ポリメラーゼが生じる。本明細書に使用したような、３’から５’エキソヌクレアーゼ活性の欠損したＤＮＡポリメラーゼは、実質的に、３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失している。「実質的に欠失」は、完全な活性の欠失、または「実質的な」活性の欠失を包含する。「実質的な」活性の欠失は、変異ポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性が、親ポリメラーゼに比べて、０．０３％であり、そしてまた、０．０５％、０．１％、１％、５％、１０％または２０％であり得るが、親または野生型ポリメラーゼの３’エキソヌクレアーゼ活性の５０％よりも高くない。
【０１２０】
本明細書に使用したような「変異」は、ＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を変化させる、出発親ＤＮＡ配列に導入された変化を意味する。変異の結果は、新しい特徴、機能、または親ＤＮＡによりコードされるタンパク質に見出されない特質の創造を含むがこれに限定されない。
【０１２１】
本明細書に使用したような「野生型」は、天然に存在するような、生物、株、遺伝子、タンパク質または特徴の典型的な状態を意味する。それ故、野生型は、野生型への変化（群）の導入による野生型から得られた、変異体から識別される天然状態である。
【０１２２】
本明細書に使用したような「対応する」は、２つ以上の核酸またはポリペプチドの比較における配列類似性を意味し、ここで機能的に等価なドメインまたはサブ配列が同定される；前記の機能的に等価なドメインまたはサブ配列、または、かかるドメインまたはサブ配列内のアミノ酸は「対応する」と言われる。すなわち、２つ以上の配列を、比較アラインメント解析により比較し、ここで全配列を、類似または同一の配列領域について調べ、よって、他の配列（群）由来の領域に機能的に等価でありそうな領域を同定する。
【０１２３】
アミノ酸、アミノ酸配列またはタンパク質ドメインの比較に関して本明細書に使用したような、「類似」なる語は、同一ではないが、「保存的」差異を示す、アミノ酸またはドメインを意味する。「保存的」により、異なるアミノ酸配列が、対応または基準配列中のアミノ酸と類似の特徴を有することを意味する。典型的な保存的置換は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ間；ＳｅｒとＴｈｒ間；酸性残基ＡｓｐとＧｌｕ間；ＡｓｎとＧｌｎ間；および、塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ間；または、芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒ間である。２つのポリペプチド配列間の類似度（最も多いのは％）の計算において、比較する２つの分子の全長に関して、２つのポリペプチド配列中の対応するアミノ酸残基間に同一性または類似性が観察される位置の数を考える。
【０１２４】
本明細書に使用したような「機能的等価」なる語は、特定のモチーフ、領域、またはモチーフまたは領域内のアミノ酸が、酵素の全体的な機能に関して、モチーフ、領域、または、モチーフまたは領域内のアミノ酸が別の酵素で実施するのと同じ機能を実施することを意味する。
【０１２５】
本明細書に使用したような「鎖終結ヌクレオチド類似体」は、一旦取り込まれると、ＤＮＡポリメラーゼによるその後の伸長の基質として作用できず、よってＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡポリマーの伸長は終結する、ヌクレオチド類似体を意味する。かかるヌクレオチド類似体は、典型的には、ＤＮＡポリメラーゼが、来るヌクレオチドとホスホジエステル結合を合成できる、その糖部分上のヒドロキシル基を欠失している。鎖終結ヌクレオチド類似体は、非慣用的ヌクレオチドのサブセットであり、ジデオキシヌクレオチドを含むがこれに限定されない。
【０１２６】
本明細書に使用したような「検出可能なように標識」は、種々の手段により容易に検出できる、官能基（標識）を取り込んだ構造的修飾を意味する。検出可能なように標識できる化合物は、ヌクレオチド類似体を含むがこれに限定されない。検出可能なヌクレオチド類似体標識は、蛍光化合物、同位体化合物、化学発光化合物、量子ドット標識、ビオチン、酵素、高電子密度試薬、および抗血清またはモノクローナル抗体の入手できるハプテンまたはタンパク質を含むがこれに限定されない。種々の検出手段は、分光、光化学、生化学、免疫化学、または化学手段を含むがこれに限定されない。
【０１２７】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して本明細書に使用したような「単離」なる語は、天然配列が、その通常の細胞環境から取り出されたか、または、非天然環境で合成（例えば人工的に合成）することを意味する。従って、配列は、細胞非含有溶液にあり得るか、異なる細胞環境に置かれ得る。この語は、該配列が、存在する唯一のヌクレオチドまたはポリペプチド鎖であるが、それに天然に会合した、非ヌクレオチドまたは非ポリペプチド物質を実質的に含まない（少なくとも約９０〜９５％純粋）ことを意味するものではない。
【０１２８】
本明細書に使用したような「組換え」なる語は、遺伝子工学（すなわち、そのポリヌクレオチドまたはポリペプチドをコードする遺伝子材料の修飾または操作により）により変化したポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。
【０１２９】
本発明は、本明細書に記載したような全長の変異ＤＮＡポリメラーゼ、並びに、変異ポリメラーゼの機能的断片、すなわち、変異ポリメラーゼの全アミノ酸配列未満であり、少なくとも１セットの条件下で、ポリヌクレオチドの重合を触媒する能力を保持した、ＤＮＡポリメラーゼ断片を包含する。前記機能的断片は、別々の実体として存在しても、融合タンパク質などの、より大きなポリペプチドの構成成分であってもよい。
【０１３０】
本明細書に使用したような「相補的ＤＮＡ鎖」なる語は、プライマー伸長反応においてＤＮＡポリメラーゼにより鋳型ＤＮＡ分子から合成されたＤＮＡ分子を意味する。
【０１３１】
本明細書に使用したような「鋳型ＤＮＡ分子」なる語は、相補的核酸鎖が、例えば、プライマー伸長反応において、ＤＮＡポリメラーゼにより合成される、核酸鎖を意味する。
【０１３２】
本発明のさらなる特徴および利点は、以下のその実施形態および図面の説明に、および特許請求の範囲から、より完全に明らかとなろう。
【０１３３】
説明
本発明は、その非修飾野生型形に比べて、非慣用的ヌクレオチドに対する識別の低下をもたらす、１つ以上の遺伝子変化を有する、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼの発見に基づく。本明細書に記載の全参考文献を、参考として本明細書にその全体を取込む。
【０１３４】
非慣用的ヌクレオチドに対する識別の低下を示すＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ：
Ａ．本発明により有用なＤＮＡポリメラーゼ
本発明により、ＢファミリーのＤＮＡポリメラーゼを変異して、非慣用的ヌクレオチドに対する識別の低下を示す酵素を作成し得る。表Ｉは、ファミリーにより分類される既知のＤＮＡポリメラーゼの非制限的なリストを含む。
【０１３５】
【表１】
2004500052.tif 000002
2004500052.tif 000003
【０１３６】
Ｂ．プラスミド
本発明に記載のＢファミリーＤＮＡポリメラーゼの作成用の出発配列は、プラスミドベクターに含み得る。クローン化したＢファミリーＤＮＡポリメラーゼの非制限的なリストおよびジェンバンクアクセッション番号を表ＩＩに示す。
【０１３７】
【表２】
2004500052.tif 000004
2004500052.tif 000005
2004500052.tif 000006
【０１３８】
修飾形のＢファミリーＤＮＡポリメラーゼの発現に許容されるプラスミドは、当業者によって、当分野で既知の多数から選択し得る。本発明に記載の修飾ＤＮＡポリメラーゼの発現用のプラスミドベクターは、好ましくは、高レベルのＤＮＡポリメラーゼの発現を指令する配列を含み、より好ましくは、誘導性の高レベルのＤＮＡポリメラーゼの発現を指令する配列を含む。誘導性の高レベルの発現系の一例として、本発明に記載の修飾ＤＮＡポリメラーゼコード配列を、バクテリオファージＴ７プロモーターの制御下に置いたプラスミドを、その染色体内に誘導性Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む細菌に導入し得る。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の誘導は、その後、高レベルのＴ７プロモーター駆動ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現を誘導する（例えば、Ｇａｒｄｎｅｒ＆Ｊａｃｋ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２７：２５４５参照）。
【０１３９】
Ｃ．変異誘発
クローン化した野生型形のＢファミリーＤＮＡポリメラーゼを変異して、多くの方法により非慣用的ヌクレオチドに対する識別の低下を示す形を作成し得る。
【０１４０】
第一に、１つ以上の無作為な状況の変異を有する変異体のパネルをもたらす、無作為変異誘発法が当分野に存在する。次いで、かかる変異体のパネルを、野生型ポリメラーゼと比較して識別の低下を示すものについてスクリーニングし得る（以下の「識別の低下について変異体を評価する方法」参照）。無作為変異誘発法の例は、いわゆる「エラーしがちなＰＣＲ法」である。名前が示すように、この方法は、特定の配列を、ＤＮＡポリメラーゼが高忠実度の取込みを支持しない条件下で増幅する。異なるＤＮＡポリメラーゼにおけるエラーしがちな取込みを促す条件は変化するが、当業者は、特定の酵素についてのかかる条件を決定し得る。増幅忠実度における多くのＤＮＡポリメラーゼの可変の鍵は、例えば、緩衝液中の二価金属イオンの種類および濃度である。それ故、マンガンイオンの使用および／またはマグネシウムまたはマンガンイオン濃度の変化を適用して、ポリメラーゼの誤速度に影響を及ぼし得る。
【０１４１】
第二に、真っ直ぐな方法で特定の部位または領域を変化することの可能な、当分野で既知の多くの部位特異的変異誘発法が存在する。慣用的およびＰＣＲをベースとした方法の両方を含む、部位特異的変異誘発の実施のために市販で入手可能な多くのキットがある。例は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できるＥＸＳＩＴＥ（商標）ＰＣＲをベースとした部位特異的変異誘発キット（カタログ番号２００５０２；ＰＣＲをベース）およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（商標）部位特異的変異誘発キット（カタログ番号２００５１８；ＰＣＲをベースとしていない）、および、これもＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＣＨＡＭＥＬＥＯＮ（登録商標）二本鎖部位特異的変異誘発キット（カタログ番号２００５０９）を含む。
【０１４２】
当分野で既知の古い部位特異的変異誘発法は、一本鎖ＤＮＡ鋳型の単離を可能とする、Ｍ１３バクテリオファージベクターなどの、ベクターへの変異すべき配列のサブクローニングに依拠する。これらの方法では、変異原性プライマー（すなわち、変異すべき部位にアニーリングできるが、変異すべき部位に１つまたはミスマッチのヌクレオチドを有するプライマー）を、一本鎖鋳型にアニーリングし、次いで変異原性プライマーの３’末端から開始して鋳型の相補体を重合した。次いで、得られた二本鎖を宿主細菌に形質転換し、プラークを所望の変異についてスクリーニングした。
【０１４３】
より近年では、部位特異的変異誘発は、一本鎖鋳型を必要としないという利点を有する、ＰＣＲ方法論を使用した。さらに、サブクローニングを必要としない方法を開発した。ＰＣＲをベースとした部位特異的変異誘発を実施する場合には数個の組織を考えなければならない。第一に、これらの方法では、ポリメラーゼにより導入される望ましくない変異の拡大を防ぐために、ＰＣＲサイクルの数を減少することが望ましい。第二に、反応に存続する非変異親分子の数を減少するために、選択を使用しなければならない。第三に、伸長された長さのＰＣＲ法が、単一のＰＣＲプライマーセットの使用を可能とするために好ましい。そして第四に、いくつかの熱安定性ポリメラーゼの非鋳型依存的末端伸長活性のために、ＰＣＲにより作成した変異産物の平滑末端ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）前に、最終研磨段階を手順に取込む必要がしばしばある。
【０１４４】
下記のプロトコルは、以下の段階を通じてこれらの考察を適応させる。第一に、使用する鋳型濃度は、慣用的なＰＣＲ反応に使用するものの約１０００倍であり、産物の収率を劇的に低下することなく、サイクル数を２５〜３０から５〜１０まで減少することが可能となる。第二に、制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ（認識標的配列：５−Ｇｍ６ＡＴＣ−３、ここでのＡ残基はメチル化されている）を使用して、親ＤＮＡに対して選択する。なぜなら、大半の一般的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｄａｍ株は、そのＤＮＡを配列５−ＧＡＴＣ−３でメチル化するからである。第三に、Ｔａｑエクステンダーを、ＰＣＲ混液に使用して、長い（すなわち完全なプラスミド長さの）ＰＣＲ産物の比率を増加する。最後に、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを使用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを使用した分子内ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）前に、ＰＣＲ産物の末端を研磨する。
【０１４５】
この方法は、以下のように詳述する：
３’−５’エキソヌクレアーゼドメインのＰＣＲをベースとした部位特異的変異誘発
プラスミド鋳型ＤＮＡ（約０．５ｐｍｏｌ）を、１×変異誘発緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５；８ｍＭ　ＭｇＣｌ２；４０μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）を含むＰＣＲカクテルに加え；１２〜２０ｐｍｏｌの各プライマー（当業者は、オリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング特徴に影響を及ぼす、塩基組成、プライマー長および目的の緩衝液塩濃度などの因子を考慮して、必要であれば変異原性プライマーを設計し得る；１つのプライマーは、所望の変異を含まなければならず、１つ（同じまたはその他）は、後のライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を容易にするために５’リン酸を含まなければならない）、２５０μＭの各ｄＮＴＰ、２．５Ｕ　ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、および２．５ＵのＴａｑエクステンダー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能；Ｎｉｅｌｓｏｎら（１９９４）Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　７：２７、および米国特許第５，５５６，７７２号参照）を含むＰＣＲカクテルに加える。ＰＣＲサイクリングは、以下のように実施する：９４℃で４分間、５０℃で２分間、７２℃で２分間の１サイクル；次いで、９４℃で１分間、５４℃で２分間および７２℃で１分間の５〜１０サイクル。親鋳型ＤＮＡ、および、変異原性プライマーを取り込んだ線形でＰＣＲにより作成されたＤＮＡを、ＤｐｎＩ（１０Ｕ）およびＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）で処理する。これにより、インビボでのメチル化親鋳型およびハイブリッドＤＮＡのＤｐｎＩによる消化、および、線形ＰＣＲ産物に対する鋳型の指令しないＴａｑＤＮＡポリメラーゼ伸長塩基（群）のＰｆｕＤＮＡポリメラーゼによる除去が生じる。反応液を３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、さらに３０分間７２℃まで移行した。０．５ｍＭ　ＡＴＰを含む変異誘発緩衝液（１１５μｌの１×）を、ＤｐｎＩ消化ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ研磨ＰＣＲ産物に加える。溶液を混合し、１０μｌを新しい微量遠心管に取り出し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２〜４Ｕ）を加える。ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）液を３７℃で６０分以上インキュベートする。最後に、処理した溶液を、標準的な方法に従ってコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換する。
【０１４６】
Ｄ．本発明により有用な非慣用的ヌクレオチド
当分野には利用可能な多種多様の非慣用的ヌクレオチドが存在する。それらのいずれかまたは全部を、本発明のＤＮＡポリメラーゼとの使用に考える。前記非慣用的ヌクレオチドの非制限的なリストを表ＩＩＩに提示する。
【０１４７】
【表３】
2004500052.tif 000007
2004500052.tif 000008
【０１４８】
本発明に有用な追加の非慣用的ヌクレオチドは、７−デアザ−ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、５’−メチル−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸を含むがこれに限定されない。上記に列挙したもののさらなる非慣用的ヌクレオチドまたは変形は、Ｗｒｉｇｈｔ＆Ｂｒｏｗｎ、１９９０、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．４７：４４７により考察されている。リボヌクレオチドは、非慣用的ヌクレオチドとして適正であると特に注記する。なぜなら、リボヌクレオチドは、一般にＤＮＡポリメラーゼにより取り込まれないからである。ポリメラーゼが、標識または非標識リボヌクレオチドを取込む能力または能力の増強をもたらす、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼの修飾を特に本明細書に考える。
【０１４９】
Ｅ．識別の低下について変異体を評価する方法
当分野で既知のように、または本明細書に記載のように作成し、細菌で発現した、無作為または部位特異的変異体を、数個の異なるアッセイにより、非慣用的ヌクレオチドに対する識別の低下についてスクリーニングし得る。１つの方法では、宿主細菌を、例えばλＺａｐＩＩ（登録商標）に基づいた発現ベクターで感染することより作成した、溶解性λファージプラークに発現されたＢファミリーＤＮＡポリメラーゼタンパク質を、膜支持体に移す。次いで、固体したタンパク質を、ＤＮＡ鋳型、および、取込みについてモニタリングすべき非慣用的ヌクレオチドを含む緩衝液に膜を浸漬することにより、膜上のポリメラーゼ活性についてアッセイする。
【０１５０】
変異体ポリメラーゼライブラリーは、Ｓａｇｎｅｒら（Ｓａｇｎｅｒ，Ｇ、Ｒｕｇｅｒ，Ｒ．およびＫｅｓｓｌｅｒ，Ｃ（１９９１）Ｇｅｎｅ　９７：１１９〜１２３）の使用した技術の変形を使用してスクリーニングし得る。このアプローチでは、λファージクローンは、平方ｃｍあたり１０〜２０個のプラークの密度で塗布する。プラークに存在するタンパク質をろ紙に移し、ポリメラーゼスクリーニング緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、７ｍＭ　ＭｇＣｌ２、３ｍＭ　β−ＭＥ）で湿らせる。ろ紙を、プラスチックラップ層とガラスの間に保ち、一方、宿主細胞タンパク質を、６５℃で３０分間インキュベートすることにより熱で失活させる。次いで、熱処理したろ紙を、新しいプラスチックラップに移し、約３５μｌのポリメラーゼアッセイカクテルを、ろ紙の各平方ｃｍごとに加える。アッセイカクテルは、１×クローン化Ｐｆｕ（ｃＰｆｕ）マグネシウム非含有緩衝液（１×緩衝液は２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、および０．１％トリトンＸ−１００からなり；Ｐｆｕマグネシウム非含有緩衝液は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号２００５３４）、１２５μｇ／ｍｌの活性化仔牛胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、１．２９μＣｉ／ｍｌ−３３ＰｄｄＮＴＰまたはジデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ：ダイ−ｄｄＮＴＰ比は１：１５で）から得られ得る。初期スクリーニングは、ＭｎＣｌ２の存在下で実施したが、好ましい方法は１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）中でスクリーニングすることであった。ろ紙を、プラスチックラップとガラスプレートの間に置き、次いで６５℃で１時間、次いで７０℃で１時間と１５分間インキュベートする。次いで、ろ紙を３回、１回の洗浄あたり５分間、２×ＳＳＣ中で洗浄し、その後、２回１００％エタノール中で濯ぎ、真空乾燥する。次いで、ろ紙をＸ線フィルム（約１６時間）に感光し、標識を取り込んだプラークを、ろ紙を、ファージクローンを有する最初のプレートとアラインすることにより同定する。このように同定したプラークをより希釈した濃度で再塗布し、精製プラークの単離の可能な類似した条件下でアッセイする。
【０１５１】
上記したアッセイなどのアッセイにおいて、標識により生じるシグナルは、アッセイに使用した特定の非慣用的ヌクレオチドまたは非慣用的ヌクレオチドの組合せに関して、ポリメラーゼの活性の直接の指標である。全４つの慣用的ヌクレオチドに対応する非慣用的ヌクレオチドを反応に含め得るか、または、別法として、唯１つの非慣用的ヌクレオチドを含めて、特定の非慣用的ヌクレオチドの利用に対する変異（群）の効果を評価し得る。１つのアプローチは、最初のスクリーンにおいて全４つのヌクレオチドに対応する非慣用的ヌクレオチドを使用して、基準野生型クローンより多く取込んだクローンを同定し、次いで、その後のスクリーンで個々の非慣用的ヌクレオチドの取込みをモニタリングする。好ましいスクリーニング形態において、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰおよびｄｄＴＴＰのジデオキシヌクレオチドおよびジデオキシヌクレオチド類似体のみを使用する。なぜなら、ｄｄＧＴＰは、いくつかのＤＮＡポリメラーゼにより識別されず、任意のスクリーンのバックグラウンドシグナルを増加させるからである。
【０１５２】
ジデオキシヌクレオチドの取込み能の増加したクローンについてスクリーニングするために、次いで、ジデオキシヌクレオチドのみを利用した最初のスクリーンで同定したクローンを、全４つのｄＮＴＰ、ａ；Ｈ−ＴＴＰトレーサー、および低レベルの各ｄｄＮＴＰを使用して、ＤＮＡポリメラーゼヌクレオチド取込みアッセイにおいて、低レベルの各４つのジデオキシヌクレオチドに対するその感度により特徴づけられ得る。ジデオキシヌクレオチドの取込みは、ＤＮＡ鎖伸長を停止するので、ジデオキシヌクレオチドを取込む優れた能力は、野生型ＤＮＡポリメラーゼに比べて、トリチウム標識デオキシヌクレオチドの取込みを減少させる。ヌクレオチド取込みの約５０％阻害（Ｉ５０％）をもたらすｄｄＮＴＰ濃度の比較を使用して、異なるポリメラーゼまたはポリメラーゼ変異体のｄｄＮＴＰ取込み効率を比較できる。ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＴＴＰのＩ５０％値の比較を使用して、特定の塩基の選択性の低下した変異体を同定できる。かかる変異体は、より均一なＤＮＡシークエンスラダーを生じることが期待される。
【０１５３】
個々のｄｄＮＴＰの取込みを測定するために、種々の濃度の目的のｄｄＮＴＰ、および計２００μＭの各ヌクレオチド三リン酸からなるカクテルを調製する。例えば、ｄｄＡＴＰの野生型ＪＤＦ−３ポリメラーゼによる取込みは、０、４０、８０、１２０および１６０μＭ　ｄｄＡＴＰで測定し得る。これらの反応において、ｄＡＴＰ濃度は、２００、１６０、１２０、８０および４０μＭにそれぞれ調整し、よって、アデニンヌクレオチド三リン酸の全量は２００μＭである。比較では、変異体を、０、５、１０および２０μＭのｄｄＡＴＰのｄｄＡＴＰ濃度、および、２００、１９５、１９０、および１８０μＭの調整ｄＡＴＰ濃度をそれぞれ使用してアッセイし得る（ｄＡＴＰ＋ｄｄＡＴＰ＝２００μＭ）。追加のカクテルを、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰ取込みを同じように測定するために調製する。
【０１５４】
上記の濃度パラメータ下でのヌクレオチドの取込みを、例えば、１μｌの適切に希釈した細菌抽出物（すなわち、クローン化ポリメラーゼまたは変異クローン化ポリメラーゼを発現している細菌細胞の熱処理および清澄化抽出物（実施例１、Ｍ部参照））を、１０μｌの各ヌクレオチドカクテルに添加し、次いで７２℃で３０分間インキュベートすることにより、伸長反応において測定し得る。伸長反応は氷上でクエンチし、次いで５μｌのアリコートをＤＥ８１イオン交換ろ紙（２．３ｃｍ；Ｗｈａｔｍａｎ３６５８３２３番）上に直ちにスポットする。非取込み標識を、２×ＳＳＣ（０．３Ｍ　ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で６回洗浄し、次いで１００％エタノールで簡潔に洗浄することにより除去する。次いで、取込まれた放射能を、シンチレーション計測により測定する。酵素を欠く反応も、試料インキュベート液と共に設定し、「全ｃｐｍ」（ろ紙洗浄段階を省く）および「最小ｃｐｍ」（上記のようにろ紙を洗浄）を決定する。
【０１５５】
Ｃｐｍ結合は、細菌抽出物の容量あたりに存在するポリメラーゼ活性の量に比例する。約１０，０００ｃｐｍの取込みをもたらす、細菌抽出物（一般に約０．２５〜１μｌ）の容量を、その後のヌクレオチド類似体取込み試験に使用するために決定する。
【０１５６】
無作為変異により生じた変異ＤＮＡポリメラーゼの遺伝子をシークエンスして、変異の部位および数を同定し得る。２つ以上の変異を含む変異体については、特定の変異の効果を、特定の変異体により生じる他の変異からの単離において、部位特異的変異誘発により、同定した変異をエキソ−前駆遺伝子に導入することにより評価し得る。次いで、かくして産生した単一変異体のスクリーニングアッセイにより、その変異のみの効果を決定できる。
【０１５７】
Ｆ．本発明に記載の変異ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼの発現
当分野で既知の方法を適用して、本発明に記載のＢファミリーＤＮＡポリメラーゼの変異形を発現および単離し得る。多くの細菌発現ベクターは、外来配列によりコードされるタンパク質の高レベルの誘導性発現を可能とする、配列エレメントまたは配列エレメントの組合せを含む。例えば、上記したように、組込まれた誘導形のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現している細菌を、Ｔ７プロモーターに連結した変異ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する発現ベクターで形質転換し得る。ｌａｃ誘導性プロモーターのための、適切な誘導物質、例えば、イソプロピル−β−Ｄ−チオがラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの誘導は、Ｔ７プロモーターからの高レベルの変異遺伝子の発現を誘導する（Ｇａｒｄｎｅｒ＆Ｊａｃｋ、１９９９、上記参照）。
【０１５８】
適切な細菌宿主株を、当業者により入手可能なものから選択し得る。非制限的例として、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ−２１株を、外来性タンパク質の発現のために一般的に使用する。なぜなら、他の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株と比べて、プロテアーゼが欠損しているからである。誘導性Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を有するＢＬ−２１株は、ＷＪ５６およびＥＲ２５６６（Ｇａｒｄｎｅｒ＆Ｊａｃｋ、１９９９、上記）を含む。特定のポリメラーゼ遺伝子のコドン使用が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子に通常見られるものとは異なる状況では、より稀なアンチコドンをもつｔＲＮＡをコードするｔＲＮＡを有するように修飾され、クローン化タンパク質遺伝子、例えばクローン化始原酵素遺伝子の高効率な発現を可能とする、ＢＬ−２１株が存在する（例えば、稀なコドンｔＲＮＡを有するＢＬ２１−ＣＯＤＯＮ　ＰＬＵＳ（商標）細胞は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手できる）。
【０１５９】
本発明の修飾ＤＮＡポリメラーゼの精製に適した当業者に公知の多くの方法が存在する。例えば、Ｌａｗｙｅｒら（１９９３、ＰＣＲ　Ｍｅｔｈ．＆Ａｐｐ．２：２７５）の方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現される熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの開始によく適している。なぜなら、それは元々、Ｔａｑポリメラーゼの単離用に設計されたからである。別法として、宿主タンパク質を破壊するための熱変性段階、および、高度に活性で約８０％純粋な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを単離するための２つのカラム精製段階を使用した、Ｋｏｎｇら（１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５、本明細書に参考として取込む）の方法を使用し得る。さらに、以下の実施例１のＮ部に詳述したように、ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、硫酸アンモニウム分画、次いでＱセファロースおよびＤＮＡセルロースカラムにより、またはＨｉＴｒａｐＱカラムでの混入物質の吸着により、次いでＨｉＴｒａｐヘパリンカラムからの勾配溶出により単離し得る。
【０１６０】
Ｇ．識別の低下したテルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの調製
ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）の識別低下を示す熱安定性Ｂファミリーポリメラーゼを調製するために、超好熱性古細菌テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３由来の３’から５’エキソヌクレアーゼ欠損（Ｄ１４１Ａ）ＢファミリーポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列を、本明細書に記載したような「エラーしがちなＰＣＲ」を使用して無作為変異誘発にかけ、バクテリオファージλＺａｐ（登録商標）ＩＩにクローニングした。パイロコッカス　フリオース（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（Ｐｆｕ）由来のＢファミリーＤＮＡポリメラーゼに比べて、優れた加工性、重合速度およびｄｄＮＴＰ取込みに因り、ＪＤＦ−３由来のポリメラーゼを選択した（以下の表ＩＶ参照）。変異体ライブラリーを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主に蒔き、溶菌プラークに存在するタンパク質を、ＤＮＡ鋳型および全４つの−３３Ｐ標識ジデオキシヌクレオチドを含む緩衝液中に浸漬した固相支持体に移した。標識ジデオキシヌクレオチドを取込んだ変異体は、３３ＰｄｄＮＴＰの取込み能に対応したシグナルを生じた。次いで、単離クローンを、全４つのｄＮＴＰおよびａ；Ｈ−ＴＴＰトレーサーを使用したＤＮＡポリメラーゼヌクレオチド取込みアッセイにおいて、低レベルの各４つのジデオキシヌクレオチドに対するその感度により特徴づけた。ジデオキシヌクレオチドの取込みは、ＤＮＡ鎖伸長を停止するので、ジデオキシヌクレオチドを取込む優れた能力は、トリチウム標識デオキシヌクレオチドの取込みを消失させる。非変異前駆ＤＮＡポリメラーゼは、ジデオキシヌクレオチドをほとんど取込まず、高ｄｄＮＴＰレベルで僅か５０％阻害される（１００〜１６０μｍｏｌの各ｄｄＮＴＰ）。変異酵素は、５から４０μｍｏｌの濃度のｄｄＮＴＰで５０％阻害を示し、取込み向上が、全４つのｄｄＮＴＰについて観察された（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＴＴＰおよびｄｄＧＴＰ；以下の実施例１の表ＶおよびＶＩ参照）。
【０１６１】
非慣用的ヌクレオチドの取込みはまた、各々０．０２１μＭで存在する−３３Ｐ標識ｄｄＮＴＰおよび２．１μＭで存在するｄＮＴＰを用いて、サイクルシークエンスにおける精製変異ポリメラーゼの使用により評価した。変異体は容易に全４つのジデオキシヌクレオチドを利用し、シークエンスラダーを生じ、これをＦ６６７ＹＴａｑＤＮＡポリメラーゼ変異体を使用するＴｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）に好適に比較した（ＶａｎｄｅｒＨｏｒｎら、１９９７、Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　２２：７５８）。
【０１６２】
４０中１７個の精製変異体の関連ドメインをシークエンスした。大半の無作為に変異したクローンは、シークエンスした領域には２つ以上の変異を含んだが、全変異体が３つの部位の１つでの変異を含んだ。増強されたｄｄＮＴＰ取込み表現型を付与すると予測された変異を、部位特異的変異誘発により前駆エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼ配列に導入し、ジデオキシヌクレオチド取込み表現型の向上に寄与すると期待されなかった付属的変異を排除した。
【０１６３】
１７中１６個のＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ変異が、共通配列４０４ＤｘｘＳＬＹＰＳＩＩ４１３のチロシンのいずれかの側上の領域ＩＩ（モチーフＡ）に見出された。これらの変異は、ＤＦＲＳＬＹＬＳＩＩ（Ｐ４１０Ｌ）、ＤＦＲＳＨＹＰＳＩＩ（Ｌ４０８Ｈ）およびＤＦＲＳＦＹＰＳＩＩ（Ｌ４０８Ｆ）から構成された。それ故、領域ＩＩのＬＹＰモチーフは、ＪＤＦ−３ＢファミリーポリメラーゼのｄｄＮＴＰ識別に重要であるようである。
【０１６４】
ＪＤＦ３ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼのＹ４０９に対応するチロシンの従来技術の修飾は、ヌクレオチド結合ポケットのその位置を認識する。しかし、本明細書に示したように、Ｙ４０９に隣接する残基の修飾（Ｌ４０８ＨまたはＬ４０８ＦまたはＰ４１０Ｌ）は、特にｄｄＮＴＰ取込みに関して、ヌクレオチド結合を顕著に変化させるという意外な効果を示した。
【０１６５】
領域ＩＩの外で生じる非慣用的ヌクレオチドの取込みの増強をもたらす唯一のＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ変異は、領域ＩＩＩの４８５位におけるアラニン（ａｌａまたはＡ）からトレオニン（ｔｈｒまたはＴ）変換（Ａ４８５Ｔ）である。この部位は、ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼのヘリックスＯのＫＸ３（Ｆ／Ｙ）ＧＸ２ＹＧに機能的に類似しているが、構造的（Ｗａｎｇら、１９９７、上記）には類似していない、ＫＸ３ＮＳＸＹＧの２残基上流である（Ｊｕｎｇら、１９９０、上記；Ｂｌａｓｃｏら、１９９２、上記；Ｄｏｎｇら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１１６３；Ｚｈｕら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１２１９：２６０；ＤｏｎｇおよびＷａｎｇ、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１５６３）（領域ＩＩＩまたはモチーフＢと称される）。クレノウ断片およびＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどのＡファミリーＤＮＡポリメラーゼにおいて、Ｏヘリックスは、ｄＮＴＰ結合に主要な役割を果たすアミノ酸を含む（Ａｓｔａｔｋｅら、１９９８、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７８：１４７；Ａｓｔａｔｋｅら、１９９５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１９４５；Ｐｏｌｅｓｋｙら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：８４１７；Ｐｏｌｅｓｋｙら、１９９０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１４５７９；Ｐａｎｄｅｙら、１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１３２５９；Ｋａｕｓｈｉｋら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：７２５６）。特に、ヘリックスＯは、ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼのｄｄＮＴＰ識別を付与する、Ｆ（クレノウ断片のＦ７６２；ＴａｑのＦ６６７）を含む（ＫＸ３（Ｆ／Ｙ）ＧＸ２ＹＧ）（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９５、上記）。
【０１６６】
ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼのｄｄＮＴＰ取込みに対するＡ４８５Ｔ変異の効果は驚くべきである。なぜなら、ＲＢ６９およびテルモコックス　ゴルゴナリウス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｏｒｇｏｎａｒｉｕｓ）結晶構造（Ｈｏｐｆｎｅｒら、１９９９、上記）は、ヌクレオチド結合表面の推定活性部位にそむくことを示す。さらに、古細菌ファミリーＤＮＡポリメラーゼにおいてリボース選択性を付与する側鎖の種類（Ａ：小さく非極性）は、ＡファミリーＤＮＡポリメラーゼにおけるｄｄＮＴＰ識別を指示するかさ高い芳香族ＹおよびＦ残基のそれとは異なる（ＴａｂｏｒおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ、１９９５、上記）。さらに、この位置（Ａ４８５）は、ＤＮＡポリメラーゼファミリー間でよく保存されておらず、このドメインの共通配列に含まれず（ＢｒａｉｔｈｗａｉｔｅおよびＩｔｏ、１９９３、上記）、これは、ｄＮＴＰ認識における決定的な重要性の欠如を意味する。
【０１６７】
変異Ｐ４１０ＬおよびＡ４８５Ｔを含む、ＪＤＦ−３二重変異体を作成した。ジデオキシヌクレオチドサイクルシークエンスにおいて、二重変異体により実証されるバンドパターン強度は極めて均一であり、これは、その対応するｄｄＮＴＰよりも、任意のｄＮＴＰに対する選択性があるとしてもほとんどないことを示唆する（図８および実施例１Ｑ参照）。このポリメラーゼ特徴は、自動化シークエンスに要求される塩基の正確度を向上する。我々は、Ｐ４１０ＬとＡ４８５変異、Ｌ４０８ＨとＡ４８５変異、およびＬ４０８ＦとＡ４８５変異の組合せにより、ｄｄＮＴＰ取込みの向上を示す酵素が得られると仮定する。かかる二重変異体酵素によるジデオキシヌクレオチド取込み効率はまた、取込みの相対的向上度を決定するための、本明細書に記載したようなＩ５０％の測定により特徴づけられ得るか、または定量され得る。
【０１６８】
（実施例）
以下の実施例は、単に説明のために提供され、特許請求した本発明の範囲を限定するものではない。
【０１６９】
（実施例１）
Ａ．テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼからのＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種は、Ｊｕａｎ　ｄｅ　Ｆｕｃａ　ｒｉｄｇｅから採取した海洋試料から培養した。ゲノムＤＮＡを単離し使用して、標準的な手順を使用してＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のゲノムＤＮＡファミリーを調製した。λファミリーを、ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲＦ’大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に蒔き、Ｓａｇｎｅｒら（Ｓａｇｎｅｒ，Ｇ、Ｒｕｇｅｒ，Ｒ、およびＫｅｓｓｌｅｒ，Ｃ（１９９１）Ｇｅｎｅ　９７：１１９〜１２３）により記載の方法の変形を使用してＤＮＡポリメラーゼ活性をもつクローンについてスクリーニングした。活性ポリメラーゼを含むプラークの芯を抜き、ＳＭ緩衝液に保存した。陽性一次クローンを再度蒔き、再度アッセイして、単離クローンの精製を可能とした。二次クローンを、ＺＡＰＩＩシステム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に具備された説明書に従って切断し、挿入断片のＤＮＡ配列を決定した（図１）。
【０１７０】
ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼの翻訳アミノ酸配列を図２に示す。アミノ酸配列アラインメントにより、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼは、Ｂファミリーと称されるクラスのＤＮＡポリメラーゼに相同性を示す。
【０１７１】
組換えＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼは下記のように精製した（「ＪＤＦ−３の精製」（方法１）参照）。ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼの生化学的特性を、他の市販で入手可能な古細菌ＤＮＡポリメラーゼと比較した。表ＩＶおよびＶに示した結果により、他の酵素に比べて、ＪＤＦ−３は、より早い加工性、より早い重合速度（Ｋｃａｔ）、およびより高いｄｄＮＴＰ利用傾向を示す。それ故、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼを、ＤＮＡシークエンス酵素の開発に選択した。
【０１７２】
【表４】
2004500052.tif 000009
【０１７３】
Ｂ．ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子からのインテインの除去　ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼに対するアラインメントにより、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼクローンは、インテイン配列を含むことが判明した（図３および４）。組換えＪＤＦ−３ポリメラーゼの発現を向上するために、インテインを逆ＰＣＲにより除去した。ＰＣＲプライマーは、インテイン末端をコードする配列のすぐ上流および下流をプライムするように設計され、プライマーの３’末端はインテインにそむくように配向した。プライマーはまた、５’リン酸基で修飾して、ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）を容易にした。プラスミド／挿入断片配列をＰＣＲ増幅し、標準的な方法により環状化した。
【０１７４】
Ｃ．３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の消失したＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ変異体の作成
３’−５’エキソヌクレアーゼ（校正）活性の欠失したＤＮＡポリメラーゼが、取込み後のヌクレオチド類似体の除去を防ぐために、ヌクレオチド類似体取込みを必要とする適用（例えばＤＮＡシークエンス）に好ましい。校正ＤＮＡポリメラーゼに関連した３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を、変異誘発により減少または消失できる。配列比較により、ＤＮＡポリメラーゼの３’−５’エキソヌクレアーゼドメインに３つの保存モチーフ（エキソＩ、ＩＩ、ＩＩＩ）が同定された（Ｖ．Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ、Ｊ．Ｋ．Ｐｉｎｓｏｎｎｅａｕｌｔ、およびＣ．Ｍ．Ｊｏｙｃｅ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、２６２、３６３（１９９５）で総説）。保存アスパラギン酸またはグルタミン酸残基のいずれかのアラニンとの交換は、Ｖｅｎｔ（Ｈ．Ｋｏｎｇ、Ｒ．Ｂ．Ｋｕｃｅｒａ、およびＷ．Ｅ．Ｊａｃｋ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８、１９６５（１９９３））およびＰｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、未発表）などの古細菌ＤＮＡポリメラーゼを含む、多くのＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を消失することが示された。保存的置換により、古細菌９°Ｎ−７ＤＮＡポリメラーゼの変異体について示されたように、エキソヌクレアーゼ活性は減少した（Ｍ．Ｗ．Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈ、Ｈ．Ｋｏｎｇ、Ｒ．Ｂ．Ｋｕｃｅｒａ、Ｊ．Ｗａｒｅ、Ｈ．Ｊａｎｎａｓｃｈ、およびＦ．Ｂ．Ｐｅｒｌｅｒ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３、５２８１（１９９６））。
【０１７５】
実質的に減少した３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を示すＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、エキソＩドメインの保存１４１Ｄまたは１４３Ｅ残基にアミノ酸置換を導入することにより調製した。ＣＨＡＭＥＬＥＯＮ（登録商標）二本鎖部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して、以下のＪＤＦ−３変異体を作成した：Ｄ１４１Ａ、Ｄ１４１Ｎ、Ｄ１４１Ｓ、Ｄ１４１Ｔ、Ｄ１４１ＥおよびＥ１４３Ａ。
【０１７６】
ＪＤＦ−３変異体タンパク質を解析するために、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列を、プライマー、
【化１】
2004500052.tif 000010
（ＮｄｅＩ部位は太字で、開始コドンには下線を付す）、および、
【化２】
2004500052.tif 000011
（ＢａｍＨＩ部位は太字で示す）を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ産物を消化し、精製し、標準的な方法を使用して高発現レベルベクターにライゲートした（ｌｉｇａｔｅｄ）。プラスミドクローンを、ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。組換え細菌クローンを、標準的な手順を使用して増殖し、ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体を、誘導の非存在下で発現した。組換えクローンのエキソヌクレアーゼおよびポリメラーゼ活性を、細菌溶解液を使用してアッセイした。典型的には、粗抽出物を７０℃で１５〜３０分間加熱し、次いで遠心分離して透明な溶解液を得た。
【０１７７】
Ｋｏｎｇら（Ｋｏｎｇら、１９９３、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１９６５）の方法およびＳｏｕｔｈｗｏｒｔｈら（Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：５２８１）の方法を含む、当分野で既知の３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を測定する数個の方法が存在し、その両方の全内容をこれにより参考として取込む。Ｋｏｎｇらの方法により測定したような、野生型および活性変異体ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性は、以下の通りであった：
エキソ活性（Ｕ／ｍｇ）
野生型　　９１５
Ｄ１４１Ａ７
Ｄ１４１Ｎ９５３
Ｄ１４１Ｓ９５４
Ｄ１４１Ｔ０．５
Ｄ１４１Ｅ９４０
Ｅ１４３Ａ０．３
組合せエキソヌクレアーゼ変異体Ｄ１４１Ａ＋Ｅ１４３は、Ｌ章に記載のように作成した。
【０１７８】
Ｅ１４３Ａ　ＪＤＦ−３変異体（クローン５５０番）は、有意に減少した３’−５’エキソ活性を示し、ｄｄＮＴＰおよび他のヌクレオチド類似体の取込みを向上するために、さらなる変異誘発について選択した。ＪＤＦ−３Ｄ１４１Ｔ変異体などの、実質的に減少したエキソヌクレアーゼ活性を有する他のＪＤＦ−３変異体を、この目的のために、３’から５’エキソヌクレアーゼ活性の完全な消失を必要とする実験または適用のために使用でき、二重変異体Ｄ１４１Ａ＋Ｅ１４３Ａが好ましかった。
【０１７９】
Ｄ．ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のエラーしがちなＰＣＲ増幅
無作為変異を、全遺伝子（クローン５５０番）を、高忠実度の複製を支持しない条件下で増殖することにより、エキソ−ＪＤＦ−３に導入した。可能性ある変異のスペクトルを広げるために、３つの異なるＰＣＲ酵素を、エラーしがちな条件下で使用した。
【０１８０】
好ましい形態において、各１００μｌの１０個の反応を、各ＰＣＲ酵素を用いて増幅した。
【０１８１】
ｉ．ＴａｑＤＮＡポリメラーゼで増幅
反応混合物
１×　マグネシウム非含有Ｔａｑ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００５３０）
１ｍＭ　各ＴＴＰおよびｄＣＴＰ
０．２ｍＭ　各ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰ
２ｎｇ／μｌ　プライマー９２３（４９０とも称される）
２ｎｇ／μｌ　プライマー７２１
０．０５μ／μｌ　Ｔａｑ２０００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００１９５）
１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２
０．５ｍＭ　ＭｎＣｌ２
０．１ｐＭ　プラスミドＤＮＡ
サイクリングパラメータ
ＰＣＲは、Ｈｏｔ　Ｔｏｐアセンブリを有するＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ（商標）４０温度サイクラーを使用して実施した。以下のサイクル条件を使用した：
１）９５℃で１分間
２）９５℃で１分間
３）５４℃で１分間
４）７２℃で２．５分間
５）２から４の段階を３０回繰返す
ｉｉ．エキソ−ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅
反応混合物
１×　マグネシウム非含有Ｔａｑ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００５３０）
４５０μＭの各デオキシヌクレオチド（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰ、およびｄＣＴＰ）
２ｎｇ／μｌ　プライマー９２３（４９０とも称される）
２ｎｇ／μｌ　プライマー７２１
０．１μ／μｌ　エキソ−ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼ
０．５ｍＭ　ＭｎＣｌ２
０．１ｐＭ　プラスミドＤＮＡ（クローン番号５５０）
サイクリングパラメータ
ＰＣＲは、Ｈｏｔ　Ｔｏｐアセンブリを有するＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ（商標）４０温度サイクラーを使用して実施した。以下のサイクリング条件を使用した：
１）９５℃で１分間
２）９５℃で１分間
３）５４℃で１分間
４）７２℃で５分間
５）２から４の段階を３０回繰返す
ｉｉｉ．エキソ−ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを用いた増幅
反応混合物
１×ＴＡＱＰＬＵＳ（登録商標）プレシジョン緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００２１０）
２００μＭの各デオキシヌクレオチド（ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ＴＴＰ、ｄＣＴＰ）
２ｎｇ／μｌ　プライマー９２３（４９０とも称される）
２ｎｇ／μｌ　プライマー７２１
０．０５μ／μｌ　エキソ−ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６００１６３）
０．１ｐＭ　プラスミドＤＮＡ（クローン番号５５０）
サイクリングパラメータ
ＰＣＲは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ’ｓ９６００温度サイクラーを使用して実施した。以下のサイクリング条件を使用した：
１）９５℃で１分間
２）９５℃で１分間
３）５３℃で１分間
４）７２℃で２．５分間
５）２から４の段階を３０回繰返す
正プライマー
変異ライブラリーのより以前の形は、ＥｃｏＲＩ部位を含む正プライマー４６１を用いて作成した。プライマー４６１および９２３で増幅した産物を制限消化し、以下の章に記載のようにλベクターにクローニングすると、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼが、ベクターのコードするβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）タンパク質の最初の３９アミノ酸との融合タンパク質として合成された。
【０１８２】
【化３】
2004500052.tif 000012
【０１８３】
プライマー４６１を使用して単離したクローンはｐ番号として設計した。
【０１８４】
好ましい増幅およびクローニングの形態は、ＥｃｏＲＩ部位、次いで３つの連続的なインフレーム終止コドンおよびリボソーム結合部位を含む、正プライマー７２１を利用する。この配置により、ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ末端にベクター由来残基が全くなくても、翻訳が可能となる。正プライマー７２１を用いて作成したライブラリーから単離したクローンは、それらをｐ番号シリーズのクローンから区別するために１−番と称した。
【０１８５】
【化４】
2004500052.tif 000013
【０１８６】
Ｅ．クローニング用のＰＣＲ産物の調製
ＰＣＲ産物を精製し、ＳＴＲＡＴＡＰＲＥＰ（商標）ＰＣＲ精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号４００７７１）を用いて濃縮した。次いで、ＰＣＲ産物を、１．５×ユニバーサル緩衝液（１０×ユニバーサル緩衝液：１Ｍ　ＫＯＡｃ、２５０ｍＭ　トリス−アセテート（ｐＨ７．６）、１００ｍＭ　ＭｇＯＡｃ、５ｍＭ　β−メルカプトエタノールおよび１００μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）中、５０単位のＸｈｏＩおよび５０単位のＥｃｏＲＩを用いて１時間３７℃で消化した。消化した試料を１％アガロース、１×ＴＢＥゲル上に流し、臭化エチジウム染色により可視化した。２．３ｋｂの増幅産物をゲル単離し、ＳＴＲＡＴＡＰＲＥＰ（登録商標）ＤＮＡゲル抽出キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号４００７６６）で精製した。
【０１８７】
Ｆ．Ｕｎｉ−Ｚａｐ（登録商標）ＸＲλベクターへのＰＣＲ挿入断片のクローニング
２００ｎｇの精製増幅産物を、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで予め消化しておいた、１μｇのＵＮＩ−ＺＡＰ（登録商標）ＸＲλベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２３９２１３）とライゲート（ｌｉｇａｔｅｄ）し、次いでアルカリホスファターゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２３７２１１）で脱リン酸化した。ＤＮＡを、反応容量１０から１５μｌ中、１×リガーゼ緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣＬ（ｐＨ７．５）、７ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ）中、２単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号６０００１１）および０．５ｍＭ　ＡＴＰを使用してライゲートした（ｌｉｇａｔｅｄ）。ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）は１６℃で最小１６時間実施した。
【０１８８】
Ｇ．λパッケージングおよび細菌感染
２μｌの各ライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応液を、ＧＩＧＡＰＡＣＫ（登録商標）ＩＩＩゴールドパッケージング抽出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００２０１）で９０分間室温でパッケージングし、その後、５００μｌのＳＭ緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ７．５、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、８ｍＭ　ＭｇＳＯ４、および０．０１％ゼラチン）および２０μｌクロロホルムで停止した。パッケージングしたλベクターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲＦ’宿主細胞に蒔いた。
【０１８９】
Ｈ．ジデオキシヌクレオチドスクリーニング
変異ポリメラーゼライブラリーを、Ｓａｇｎｅｒら（Ｓａｇｎｅｒ，Ｇ、Ｒｕｇｅｒ，Ｒ、およびＫｅｓｓｌｅｒ，Ｃ（１９９１）Ｇｅｎｅ　９７：１１９〜１２３）の使用した技法の変形を使用してスクリーニングした。λファージクローンを、平方ｃｍあたり１０〜２０個のプラークの密度で蒔いた。プラークに存在するタンパク質をろ紙に移し、ポリメラーゼスクリーニング緩衝液（５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）、７ｍＭ　ＭｇＣｌ２、３ｍＭ　β−ＭＥ）を用いて湿らせた。ろ紙を、プラスチックラップ層とガラスの間に保ち、一方、宿主細胞タンパク質は、６５℃で３０分間のインキュベートにより熱失活させた。熱処理ろ紙を、新しいプラスチックラップに移し、平方ｃｍ当たり約３５μｌのポリメラーゼアッセイカクテルを、ろ紙に加えた。ポリメラーゼアッセイカクテルは、１×クローン化Ｐｆｕマグネシウム非含有緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００５３４）、１２５ｎｇ／ｍｌの活性化ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、１．２９μＣｉ／ｍｌ−３３Ｐ　ｄｄＮＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、および０．５ｍＭ　ＭｎＣｌ２から構成された。初期スクリーニングは、ＭｎＣｌ２の存在下で実施したが、好ましい方法は、１×Ｔａｑポリメラーゼ緩衝液（１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）中でスクリーニングすることであった。ろ紙を、再度プラスチックラップとガラスの間に挟み、６５℃で１時間、次いで７０℃で１時間と１５分間インキュベートした。ろ紙を３回、２×ＳＳＣ中、各回５分間洗浄し、その後、２回１００％エタノール中で濯ぎ、真空乾燥機で乾燥した。ろ紙を約１６時間Ｘ線フィルムに感光した。強いシグナルに対応するプラークの芯を抜き、ＳＭ緩衝液に入れた。陽性一次プラークを、より希釈した濃度で再度蒔き、単離プラークの精製の可能な実質的に類似した条件下でアッセイした。
【０１９０】
ダイ−ジデオキシヌクレオチドスクリーニング
ダイ−デオキシヌクレオチドおよびダイ−デオキシヌクレオチド利用能の向上した変異ポリメラーゼを検出するために、ＪＤＦ−３変異ＤＮＡポリメラーゼライブラリーを、以下を除いて、前記した通りにスクリーニングした。
【０１９１】
Ｆｌｕ−１２−ｄＵＴＰスクリーニング用のポリメラーゼアッセイカクテル
０．９×Ｔａｑ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００４３５）、６５μＭ　ｄＡＴＰ、６５μＭ　ｄＣＴＰ、６５μＭ　ｄＧＴＰ、６５μＭｄＴＴＰ、０．３μＭ　フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ研究室内製造）、０．７５μｇ／μｌ活性化仔牛胸腺ＤＮＡ。
【０１９２】
ＲＯＸｄｄＮＴＰ用のポリメラーゼアッセイカクテル
１×Ｔａｑ緩衝液、０．９μＭ　ｄＡＴＰ、０．９μＭ　ｄＣＴＰ、０．９μＭ　ｄＧＴＰ、０．９μＭ　ＴＴＰ、０．６μＭ　ＲＯＸｄｄＡＴＰ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ（ＮＥＮ）ＮＥＮ４７８）、０．０６μＭ　ＲＯＸｄｄＧＴＰ（ＮＥＮ　ＮＥＬ４７９）、０．０６μＭ　ＲＯＸｄｄＣＴＰ（ＮＥＮ　ＮＥＬ４７７）、０．０６μＭ　ＲＯＸｄｄＵＴＰ（ＮＥＮ　ＮＥＬ４７６）、０．８４μｇ／μｌ活性化仔牛胸腺ＤＮＡ。（注意：ＲＯＸｄｄＧＴＰを含まないスクリーニング系が好ましい方法である。なぜなら、ＤＮＡポリメラーゼはｄｄＧＴＰに対して識別しないからである）。
【０１９３】
フルオレセインｄｄＵＴＰ用のポリメラーゼアッセイカクテル
１×Ｔａｑ緩衝液、７０μＭ　ｄＡＴＰ、７０μＭ　ｄＴＴＰ、７０μＭｄＣＴＰ、１５μＭ　ｄＴＴＰ、１μＭフルオレセイン−１２−ｄｄＵＴＰ（ＮＥＮ　ＮＥＬ４０１）、０．８４μｇ／μｌ活性化仔牛胸腺ＤＮＡ。
【０１９４】
フルオレセインへの抗体結合
ろ紙を、ＴＢＳＴ（５０ｍＭトリスｐＨ８．０、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）に溶かした１％無脂肪ドライミルクを用いて遮断した。ろ紙を、簡潔にＴＢＳＴ中で洗浄し、その後、イルミネーターキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号３００３６０）からのアルカリホスファターゼコンジュゲート抗フルオレセイン抗体を、５０ｍｌ　ＴＢＳＴ中１／１０，０００希釈度で加えた。抗体を、１００ｍＭトリスｐＨ９．５、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、および５ｍＭ　ＭｇＣｌ２から構成される緩衝液中、それぞれ０．３ｍｇ／ｍｌおよび０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度のＮＢＴ／ＢＣＩＰで検出した。
【０１９５】
ローダミンへの抗体結合
抗ＲＯＸ抗体（Ｚｙｍｅｄカタログ番号７１−３６００ウサギローダミン（５−ＲＯＸポリクローナル、１ｍｇ／ｍｌ））を、ＴＢＳＴ中１：１０００まで希釈した。遮断したろ紙を、簡潔にブロットし、過剰の湿気を除去し、次いでプラスチックラップ上にのせ、２．５ｍｌの希釈した抗体溶液で覆った。追加のシートのプラスチックラップを、ろ紙上にのせ、その後、室温で１時間インキュベートした。ろ紙を簡潔に３回ＴＢＳＴで洗浄し、次いで３回穏やかに撹拌しながら各回１５分間洗浄した。洗浄したろ紙を、ＴＢＳＴ中１：５０００に希釈したアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体と共にインキュベートした。ろ紙を、抗体と共に１時間インキュベートし、前記したようにＮＢＴ／ＢＣＩＰで検出した。
【０１９６】
Ｉ．ジデオキシヌクレオチド定性
一次ライブラリークローンスクリーンで３３Ｐ標識ｄｄＮＴＰを取り込んだλファージクローンを、再度スクリーニングし、ポリメラーゼ活性を確認し、３３Ｐ−ｄｄＮＴＰ取込みへの二価金属イオンの寄与を評価した。この回のスクリーニング中に選択したクローンをｐ番号と称した。これらのクローンは全て、「正プライマー」と題した章に議論したようにアミノ末端タグを含んだ。図５により、クローンｐ１、ｐ２、ｐ３、ｐ６、ｐ７、ｐ８、ｐ９、ｐ１０、ｐ１１、ｐ１２、ｐ１４、ｐ１５、およびｐ１６は、親５５０番クローンに対するシグナル強度の類似性に基づいて、野生型レベルのＤＮＡポリメラーゼ活性を示すことが示された（図５、パネル３）。初期のスクリーニングは０．５ｍＭ　ＭｎＣｌ２の存在下で実施したが、ｐ９およびｐ１０を除く全クローンが、３３Ｐ−標識ｄｄＮＴＰを、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２の存在下で少なくともある程度まで取込むことができ、クローンｐ２、ｐ４、ｐ８、ｐ１１、ｐ１２、ｐ１３、ｐ１４、ｐ１５、ｐ１７、およびｐ１８は最も高いシグナルを生じる。
【０１９７】
１８個の変異体を評価のために選択した。各精製プラークから単離した１μｌのファージを、各３つの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−ＢｌｕｅＭＲＦ’ローンに蒔いた。親コピーのエキソ−ＪＤＦ３ＤＮＡ（５５０番クローン）を含むファージも格子上にスポットした。ファージにより形成されたプラークをろ紙に移し、最終緩衝液組成物を除き、前のスクリーニング章に記載のように処理した。各ろ紙（ろ紙１〜３）に使用した緩衝液は以下の通りである：
ろ紙１：塩化マンガンを用いたジデオキシヌクレオチドスクリーン
１×ＴａｑＤＮＡポリメラーゼマグネシウム非含有緩衝液
１．２８μＣｉ／ｍｌ　３３ＰｄｄＮＴＰ
０．５μｇ／μｌ　活性化仔牛胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）
０．５ｍＭ　ＭｎＣｌ２
ろ紙２：塩化マグネシウムを用いたジデオキシヌクレオチドスクリーン
１×ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２含有、カタログ番号２００４３５）
１．２８μＣｉ／ｍｌ　３３ＰｄｄＮＴＰ
０．５μｇ／μｌ　活性化仔牛胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）
ろ紙３：塩化マグネシウムを用いたジデオキシヌクレオチドスクリーン
１×ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ緩衝液
０．０７２ｍＭ　ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびＴＴＰ
４０μＭ　ｄＡＴＰ
０．５μｇ／ｍｌ活性化仔牛胸腺ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ）
０．０１μＣｉ−３３ＰｄＡＴＰ
結果を図５に示す。
【０１９８】
ダイ−ジデオキシヌクレオチド定性
以前のセグメントに記載したように、一次λクローンを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ローン上にスポットし、適切な抗体または抗体群で再度スクリーニングした。
【０１９９】
Ｊ．λクローンの切断
適切な条件下でヘルパーファージと共にインキュベートすると、λＺａｐ（商標）ベクターを設計し、ｐブルースクリプト（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）（ＳＫ−）および挿入断片を含むベクターの一部のファージミドコピーを生成した。このプロセスにより、λクローンに含まれる同じ挿入断片を有するプラスミド（ｐブルースクリプトＳＫ−（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ−））ベクターが得られる。所望の表現型をもつクローンの切断を、ＥＸＡＳＳＩＳＴ（登録商標）システム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００２５３）で説明書に従って実施した。
【０２００】
Ｋ．変異体の配列解析
変異体は、Ｓｅｑｕｅｔｅｃｈ社（カリフォルニア州マウンテンビュー）により以下のプライマーを使用してシークエンスした：
プライマー３（またはプライマーＧ）５‘ＣＣＡＧＣＴＴＴＣＣＡＧＡＣＴＡＧＴＣＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣ３’
プライマー５（またはＪＤＦ３−１１２８）５‘ＡＡＣＴＣＴＣＧＡＣＣＣＧＣＴＧ３’
Ｌ．ジデオキシヌクレオチド変異誘発
ｄｄＮＴＰ識別の低下に寄与するアミノ酸を最終的に同定するために、個々の点変異を、エキソ−ＪＤＦ−３　５５０番クローンに、ＱＵＩＫＣＨＡＮＧＥ（商標）部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００５１８）を使用して導入した。以下の変異体を調製した：Ｌ４０８Ｈ、Ｌ４０８Ｆ、Ｐ４１０Ｌ、Ａ４８５Ｔ、Ｓ３４５Ｐ、Ｄ３７３Ｙ、Ａ６１９Ｖ、およびＬ６３１Ｖ。さらに、二重変異体（Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ）を、Ａ４８５Ｔ変異を、エキソ−ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ変異クローンに導入することにより作成した。全ての３’から５’エキソヌクレアーゼ活性を完全に消失するために、変異Ｄ１４１Ａを全クローンに加えた。既存の５’から３’エキソヌクレアーゼ変異（Ｅ１４３Ａ）は、親鋳型ＪＤＦ−３　５５０に存在していた。
【０２０１】
ダイ−ジデオキシヌクレオチド変異誘発
ダイヌクレオチドの識別の低下の寄与に関与するアミノ酸を最終的に同定するために、変異Ｓ３４５Ｐを、単独でおよびＰ４１０ＬおよびＰ４１０Ｌ＋Ａ４８５Ｔと組合せて作成した。
【０２０２】
Ｍ．熱処理した細菌抽出物の調製
切断したプラスミドを含む大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＯＬＲ細胞を、一晩３７℃で増殖した。５００μｌの培養液に含まれる細胞を、微量遠心分離により集めた。細胞ペレットを、５０μｌの５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）に再懸濁した。リゾチームを加えて最終濃度を１μｇ／μｌとし、細胞を、３７℃で１０分間、次いで６５℃で１０分間のインキュベート中に溶解した。熱不活性化細胞物質を、微量遠心分離により集め、上清を、下記したようにｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰ取込みについてアッセイした。
【０２０３】
Ｎ．ＪＤＦ−３およびＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体の精製
エキソ−ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼを精製する１つの方法は、硫酸アンモニウム分画、次いでＱセファロースおよびＤＮＡセルロースカラムを含む。ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体の迅速な精製を可能とする第二の方法が開発され、ＨｉＴｒａｐＱカラムでの混入物質の吸着、次いでＨｉＴｒａｐヘパリンカラムからの勾配溶出を含む（ｉｉｉ章）。
【０２０４】
ｉ．細菌溶解液の調製
凍結細胞ペースト（３〜１４ｇ）を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、および１０ｍＭ　β−メルカプトエタノールからなる、３×容量の溶解緩衝液に再懸濁した。リゾチームを加えて、０．２ｍｇ／ｍｌとし、ＰＭＳＦを加えて１ｍＭの最終濃度とした。細胞を氷上で１時間の期間かけて溶解した。次いで、溶解液を２分間超音波処理した（９０％能率、２×２．５、１×３．０のレベル）。超音波処理後、溶解液を６５℃で１５分間加熱し、細菌タンパク質を変性した。次いで、加熱した溶解液を３０分間１４．５ＫｒｐｍでＳｏｒｖａｌｌＲＣ−２Ｂ遠心機でＳｏｒｖａｌｌＳＳ−３４ローターを使用して遠心分離し、上清を回収した。
【０２０５】
ｉｉ．硫酸アンモニウム分画およびＱセファロース／ＤＮＡセルロースクロマトグラフィー（方法１）
硫酸アンモニウムを細菌溶解液に加えて、最終濃度を４５％とした。硫酸アンモニウムを１５分間の期間かけて加え、混合物をさらに３０分間撹拌した。混合物を上記のように遠心分離し、上清を回収した。次いで、追加の硫酸アンモニウムを加えて、最終濃度を６５％とした。混合物を上記のように遠心分離し、上清を取り出した。ペレットを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノール、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、および１０％（ｖ／ｖ）グリセロールからなる１０ｍｌの緩衝液Ａに再懸濁した。上清を一晩２回交換した緩衝液Ａ（各３リットル）に対して透析した。
【０２０６】
透析液を、緩衝液Ａで予め平衡化した、２．６×９．４ｃｍＱ−セファロースファーストフローカラム（５０ｍｌ）にのせた。カラムを、吸光度（ＯＤ２８０）が基線に到達するまで緩衝液Ａで洗浄した。次いで、カラムを０から１Ｍ　ＮａＣｌ／緩衝液Ａの勾配で溶出した。画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイ（下記参照）により解析した。活性タンパク質は、典型的には１３０ないし２４０ｍＭのＮａＣｌで溶出した。活性画分をプールし、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　β−メルカプトエタノール、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、および５０ｍＭ　ＮａＣｌからなる、一晩２回交換した緩衝液Ｂ（各３リットル）に対して透析した。
【０２０７】
次いで、Ｑ−セファロース溶出液を、緩衝液Ｂ中で平衡化した、１．６×４．９ｃｍ（１０ｍｌ）ＤＮＡセルロースカラムにのせた。カラムを、吸光度（ＯＤ２８０）が基線に到達するまで緩衝液Ｂで洗浄した。次いで、カラムを、５０から１０００ｍＭ　ＮａＣｌ／緩衝液Ａの勾配で溶出した。画分を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイにより解析した。活性タンパク質は、典型的には２８０ないし３６０ｍＭ　ＮａＣｌで溶出した。活性画分をプールし、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％（ｖ／ｖ）、Ｉｇｅｌａｌ６３０、１０μｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、および５０％（ｖ／ｖ）グリセロールからなる、ＪＤＦ−３最終透析緩衝液に対して一晩透析した。
【０２０８】
ｉｉｉ．ＨｉＴｒａｐＱ／ＨｉＴｒａｐヘパリンクロマトグラフィー（方法２）
複数の変異体を迅速に精製する好ましい方法は、以下の通りである。細菌細胞溶解液を、熱変性段階の直前にＴｗｅｅｎ２０およびＩｇｅｐａｌＣＡ６３０を加えて最終濃度を０．０１％（ｖ／ｖ）にし、７２℃の熱変性温度を使用する以外は、方法１で記載したように調製した。
【０２０９】
溶解液を、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　β−メルカプトエタノール、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、および０．１％（ｖ／ｖ）ＩｇｅｐａｌＣＡ６３０からなる、緩衝液Ｃ中で予め平衡化した、１．６×２．５ｃｍ（５ｍｌ）ＨｉＴｒａｐＱカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａの予め充填したカラム）にのせた。カラムを、吸光度（ＯＤ２８０）が基線に到達するまで緩衝液Ｃで洗浄した。分画による流出液（バックグラウンドより高いＯＤ２８０吸光度）を集め、次いで、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％（ｖ／ｖ）Ｉｇｅｌａｌ　ＣＡ６３０、および１０％グリセロール（ｖ／ｖ）からなる緩衝液Ｄで予め平衡化した、１．６×２．５ｃｍ（５ｍｌ）ＨｉＴｒａｐヘパリンカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａの予め充填したカラム）にのせた。カラムを、吸光度（ＯＤ２８０）が基線に到達するまで緩衝液Ｄで洗浄した。次いで、カラムを、０から１Ｍ　ＫＣｌ／緩衝液Ｄの勾配で溶出した。画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイにより解析した。活性タンパク質は、典型的には、３９０ないし５６０ｍＭ　ＮａＣｌで溶出した。活性画分をプールし、ＪＤＦ−３最終透析緩衝液（上記参照）に対して一晩透析した。精製したポリメラーゼを−２０℃で保存した。
【０２１０】
ｉｖ．精製タンパク質の解析
ＪＤＦ−３および変異ＤＮＡポリメラーゼの濃度を、ピアスクーマシーブルータンパク質アッセイ試薬を使用して、ＢＳＡ標準物質（Ｐｉｅｒｃｅ）と比較して決定した。さらに、異なるポリメラーゼ調製物の純度および相対的なタンパク質濃度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。ポリメラーゼ試料を、４〜２０％トリス−グリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で電気泳動し、ゲルを、標準的な手順を使用して銀染色した。
【０２１１】
Ｏ．ヌクレオチド取込みアッセイ
ＤＮＡポリメラーゼ活性を、種々の変異体クローンから調製した、精製ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体または熱処理した細菌抽出物を使用して測定した。ＤＮＡポリメラーゼ活性は、３Ｈ−ＴＴＰの、活性化仔牛胸腺ＤＮＡへの取込みをモニタリングすることにより測定した。含まれる典型的なＤＮＡポリメラーゼ反応カクテル：
１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８
１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ　ＫＣｌ
０．００１％　ゼラチン
２００μＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ
１９５μＭ　ＴＴＰ
５μＭ［３Ｈ］ＴＴＰ（ＮＥＮ　番号ＮＥＴ−２２１Ｈ、２０．５Ｃｉ／ｍｍｏｌ；部分的に蒸発してＥｔＯＨを除去する）
２５０μｇ／ｍｌの活性化仔牛胸腺ＤＮＡ（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ２７−４５７５−０１番）
取込みは、１μｌのポリメラーゼ試料の、１０μｌのアリコートのポリメラーゼカクテルへの添加により測定した。ＤＮＡポリメラーゼ試料を、適切な保存緩衝液（例えば、２５ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ　ＫＣｌ、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％（ｖ／ｖ）Ｉｇｅｐａｌ６３０、１０μｇ／ｍｌＢＳＡ、および５０％（ｖ／ｖ）グリセロール）中に希釈した。重合反応を、７２℃で３０分間実施した。伸長反応を氷上でクエンチし、次いで５μｌアリコートを、ＤＥ８１イオン交換ろ紙（２．３ｃｍ；Ｗｈａｔｍａｎ３６５８３２３番）上に即座にスポットした。非取り込み［３Ｈ］ＴＴＰを、２×ＳＳＣ（０．３Ｍ　ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で６回洗浄し、次いで１００％エタノールで簡潔に洗浄することにより除去した。取込まれた放射活性は、シンチレーション計測により測定した。酵素を欠いた反応も、試料インキュベート液と共に設定し、「全ｃｐｍ」（フィルター洗浄段階を省く）および「最小ｃｐｍ」（上記のようにフィルターを洗浄）を決定した。
【０２１２】
Ｃｐｍ結合は、細菌抽出物の容量あたりに存在するポリメラーゼ活性の量に比例する。約１０，０００ｃｐｍの取込みをもたらす、細菌抽出物の容量（０．２５〜１μｌ）を、その後のヌクレオチド類似体取込み試験で使用するために決定した。
【０２１３】
Ｐ．ｄｄＮＴＰ取込み効率の定量
ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体を評定して、相対的ｄｄＮＴＰ取込み効率を評価した。ヌクレオチド取込みは、種々の濃度の各ｄｄＮＴＰ終結因子（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ｄｄＴＴＰ）の存在下で測定した。ｄｄＮＴＰ取込みは、伸長不可能な末端を生じるので、重合は、ｄｄＮＴＰを効率的に取込むポリメラーゼでは強く阻害される。ヌクレオチド取込みの約５０％阻害（Ｉ５０％）をもたらすｄｄＮＴＰ濃度の比較を使用して、異なるポリメラーゼまたはポリメラーゼ変異体のｄｄＮＴＰ取込み効率を比較できる。ｄｄＡＴＰ、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰ、およびｄｄＴＴＰのＩ５０％値の比較を使用して、特定の塩基についての選択性の低下した変異体を同定できる。前記変異体は、より均一なＤＮＡシークエンスラダーを生じると期待される。
【０２１４】
個々のｄｄＮＴＰの取込みを測定するために、種々の濃度の目的のｄｄＮＴＰおよび計２００μＭの各ヌクレオチド三リン酸からなる、カクテルを調製した。例えば、野生型ＪＤＦ−３ポリメラーゼによるｄｄＡＴＰの取込みは、０、４０、８０、１２０、および１６０μＭ　ｄｄＡＴＰで測定した。これらの反応では、ｄＡＴＰ濃度は、それぞれ２００、１６０、１２０、８０および４０μＭに調整し、よって、アデニンヌクレオチド三リン酸の全量は２００μＭであった。比較において、変異体を、０、５、１０および２０μＭ　ｄｄＡＴＰのｄｄＡＴＰ濃度を使用してアッセイし、それぞれ２００、１９５、１９０および１８０μＭのｄＡＴＰ濃度（ｄＡＴＰ＋ｄｄＡＴＰ＝２００μＭ）を調整した。追加のカクテルを調製し、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰおよびｄｄＴＴＰ取込みを測定した。３つの異なるｄｄＮＴＰ濃度のＪＤＦ−３変異体によるｄｄＮＴＰ取込みを評価するために、以下からなる１２個の反応カクテルを調製した：
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８
１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２
５０ｍＭ　ＫＣｌ
０．００１％　ゼラチン
５μＭ［３Ｈ］ＴＴＰ（ＮＥＮ　番号ＮＥＴ−２２１Ｈ、２０．５Ｃｉ／ｍｍｏｌ；部分的に蒸発してＥｔＯＨを除去する）
２５０μｇ／ｍｌの活性化仔牛胸腺ＤＮＡ（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ２７−４５７５−０１番）
各１２個の反応カクテルに、以下に要約したように、適切な量のｄＮＴＰおよびｄｄＮＴＰを加えた。
【０２１５】
【表５】
2004500052.tif 000014
2004500052.tif 000015
2004500052.tif 000016
【０２１６】
取込みは、１μｌの適切に希釈した細菌抽出物（１０，０００ｃｐｍ）の、１０μｌの各ポリメラーゼカクテルへの添加により測定した。重合反応を３０分間７２℃で実施した。伸長反応を上記のように計測した。
【０２１７】
酵素を欠いた反応も、試料インキュベート液と共に設定し、「最小ｃｐｍ」（上記のようにろ紙を洗浄）を決定した。ｄｄＮＴＰ濃度の関数としての活性％を決定するために、バックグラウンド（「最小ｃｐｍ」値）を最初に、各試料ｃｐｍから差し引いた。１００％活性（０ｄｄＮＴＰ）に等価な「全ｃｐｍ」を、ｄｄＮＴＰを欠いた４つの反応についての修正ｃｐｍを平均化することにより決定する（Ａ−０、Ｇ−０、Ｃ−０、およびＴ−０）。次いで、残留活性率を、修正した試料ｃｐｍ（ｄｄＮＴＰを用いて）を、修正全ｃｐｍ（平均０ｄｄＮＴＰ）で割ることにより計算した。
【０２１８】
活性率を、ｄｄＮＴＰ濃度の関数としてプロットした。各ｄｄＮＴＰのＩ５０％値（ヌクレオチド取込みを５０％阻害するｄｄＮＴＰ濃度）を、各変異体について決定した。比較により、野生型ＪＤＦ−３に比較して、ｄｄＮＴＰ取込みの向上した変異体の同定が可能となる。
【０２１９】
初期の研究は精製酵素を使用し、Ｉ５０％値は、４０〜１６０μＭ　ｄｄＮＴＰを使用して阻害プロットから決定した。表Ｖの結果により、変異体ｐ８（Ｐ４１ＯＬ）、ｐ１１（Ｐ４１ＯＬ）、およびｐ１２（Ａ４８５Ｔ）は、親エキソ−ＪＤＦ−３ポリメラーゼよりも、低い濃度のｄｄＮＴＰにより阻害されることが示される。より高い感度により、変異体は、元のＪＤＦ−３ポリメラーゼよりも効率的に全４つのｄｄＮＴＰを取込むことが示される。
【０２２０】
ｄｄＴＴＰ（エキソ−ＪＤＦ−３、エキソ−Ｐｆｕ）よりもＴＴＰを優先的に取込む酵素では、一定量の［３Ｈ］ＴＴＰ（５μＭ）を組合わせた、漸増濃度のｄｄＴＴＰ（８０〜１６０μＭ）および対応するより低い濃度のＴＴＰ（１１５〜３５μＭ）の使用により、ｄｄＮＴＰ濃度の増加と共に、取り込まれるｃｐｍは増加する。それ故、これらの初期の実験において（ｄｄＴＴＰ＞１２０μＭ）、ＴＴＰのＩ５０％値は人工的に高い。それらは、異なるポリメラーゼ変異体間のｄｄＴＴＰ取込みを比較するために使用できるが、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＧＴＰまたはｄｄＡＴＰに比較した、ｄｄＴＴＰへの選択性の低下／増強の評価には使用できない。
【０２２１】
【表６】
2004500052.tif 000017
【０２２２】
より多数の変異クローンのスクリーニングを可能とするために、その後の実験は、ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体を含む細菌抽出物を使用した。さらに、より低濃度の各ｄｄＮＴＰ阻害剤（５〜２０μＭ）の使用により感度が向上した。表ＶＩの結果により、一次ろ紙スクリーンから選択した全変異体が、ｄｄＮＴＰの取込みの向上を示したことが実証される。ｄｄＮＴＰ取込みの向上は２０倍を超えていた。アミノ酸４０８（Ｌ４０８Ｈ／Ｆ）、４１０（Ｐ４１０Ｌ）、または４８５（Ａ４８５Ｔ）での変異（「一次変異」と称する）を含む全変異体が、全４つのｄｄＮＴＰに対する識別の低下を示した。Ｌ４０８Ｈ／Ｆ一次変異を有する全部ではないが、大半の変異体が、全４つのｄｄＮＴＰに対して類似のＩ５０％値（２倍未満の差異）を生じ、これは、塩基選択性が消失または存在しないことを示す。
【０２２３】
【表７】
2004500052.tif 000018
【０２２４】
Ｑ．精製ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体を用いたスクリーニング
ｉ．放射標識ジデオキシヌクレオチドを用いたシークエンス
１から２μｌの精製酵素を、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ放射標識ターミネーターシークエンスキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ−ＰｈｅｒｍａｃｉａＵＳ７９７５０号）に置換した。試料を、キットに具備された対照プライマーおよび鋳型を使用して、製造業者の説明書に従って処理した。３μｌの各シークエンス反応を、６％アクリルアミド−７Ｍ尿素、１×ＴＢＥ　ＣＡＳＴＡＷＡＹ（商標）プレキャストゲル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号４０１０９０および４０１０９４）にのせた。ブロモフェノールブルー指示ダイがゲルの端に到達すると、ゲルを固定し、乾燥させ、２４〜７２時間フィルムに感光した（図６）。
【０２２５】
図６の結果により、クローンｐ１１（パネルＤ）およびｐ８（パネルＥ）は、親５５０番クローン（パネルＢ）に比べて、全４つのｄｄＮＴＰの取込みの劇的な向上を示すことがが示される。変異体ｐ１１およびｐ８は両方共、一次Ｐ４１０Ｌ変異およびアミノタグを含むが、付属的変異の数および種類に関して異なる。変異体ｐ１２（パネルＣ）は、かすかなシークエンスラダーを生じ、これはおそらく、不十分量の酵素の使用または熱的安定性を低下する付属的変異の存在に起因するのだろう。全レーンで終結産物の証拠があり、これは、親クローンに比べて、全４つのｄｄＮＴＰの取込みの向上を示唆する。変異体ｐ１２は、付属的変異に加えて、一次変異Ａ４８５Ｔを含む。ここに同定したＪＤＦ−３変異体とは対照的に、パネルクローンは、ｄｄＧＴＰを取込む強い選択性を示し、これは一次伸長（図６）およびｄｄＮＴＰ阻害アッセイの両方で証明される（表ＶおよびＶＩ）。
【０２２６】
ｉｉ．放射標識プライマーおよび蛍光ジデオキシヌクレオチドを用いたシークエンス
異なるＤＮＡポリメラーゼおよびポリメラーゼ変異体は、ジデオキシヌクレオチド類似体上のダイ部分に対する種々の程度の識別を示す。ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体によるダイ標識ジデオキシヌクレオチド類似体の利用の評価を実施した。使用した手順は以下の通りであった：
ａ．プライマー標識
シークエンスプライマーＳＫを、ＫＩＮＡＣＥ−ＩＴ（商標）キネーシングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００３９０）で放射標識した。インキュベート反応液（４０μｌ）は以下の成分を含んだ：
１×キナーゼ緩衝液１番
０．７５μＣｉ／μｌ　γ−３３Ｐ　ＡＴＰ
０．３７５μ／μｌ　Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ
２．５ｐｍｏｌ／μｌ　ＳＫプライマー
反応液は３７℃で４５分間インキュベートした。プライマーを、サイズ排除マトリックス（ＮＵＣ　ＴＲＡＰ（登録商標）Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号４００７０１）を用いてヌクレオチドから除去して精製した。
【０２２７】
ｂ．ダイ標識ジデオキシヌクレオチド：ｄＮＴＰ比
蛍光ジデオキシヌクレオチドは、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ（ＮＥＮ）から購入した：
Ｒ６Ｇ−ｄｄＡＴＰ　ＮＥＮカタログ番号ＮＥＬ−４９０
Ｒ１１０−ｄｄＴＰ　ＮＥＮカタログ番号ＮＥＬ−４９５
ＴＡＭＲＡ−ｄｄＵＴＰ　ＮＥＮカタログ番号ＮＥＬ−４７２
ＲＯＸ−ｄｄＣＴＰ　ＮＥＮカタログ番号ＮＥＬ−４７７
取込みは、３つの異なる濃度のダイ標識ジデオキシヌクレオチド（ｄｄＮＴＰ）および一定量のデオキシヌクレオチド（ｄＮＴＰ；２．１４μＭ）を使用して測定した：
条件３）１：１　（２〜１４μＭの各ｄＮＴＰ：２．１４μＭのダイ標識ｄｄＮＴＰ）
条件２）１：０．１　（２．１４μＭの各ｄＮＴＰ：０．２１４μＭのダイ標識ｄｄＮＴＰ）
条件１）１：０．０１　（２．１４μＭの各ｄＮＴＰ：０．０２１４μＭのダイ標識ｄｄＮＴＰ）
ｃ．ＤＮＡシークエンス反応混合物の調製
４つのポリメラーゼを、ダイ標識ｄｄＮＴＰ、エキソ−ＪＤＦ−３（５５０番クローン）、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（４μ／μｌ）、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ（付属的変異およびアミノ末端タグをもつクローンｐ８）、およびＪＤＦ−３Ｌ４０８Ｈ（クローン１−１）の使用について試験した。以下の試薬を含む混合物を合わせた：
１３．７μｌ　Ｈ２Ｏ
１μｌ　標識ＳＫプライマー（２ｐｍｏｌ／μｌ）
１μｌ　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（０．２μｇ／μｌ）
１μｌ　ポリメラーゼ（約１．５μ／μｌ）
２μｌ　１０×緩衝液（１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２緩衝液を使用するＬ４０８Ｈを除く全部について反応緩衝液１）（下記参照）
１０×反応緩衝液１
２６０ｍＭトリスｐＨ９．５
６５ｍＭ　ＭｇＣｌ２
１０×１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２緩衝液
２４ｍＭ　ＭｇＣｌ２
２６０ｍＭ　トリス　ｐＨ９．５
２．５μｌの各ダイ標識ｄｄＮＴＰ終結因子（ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、およびｄｄＧＴＰ）を、別々に、４つの管の１つに分注した。４．５μｌの各ポリメラーゼ反応液を、各４つの管に加え、７μｌの最終反応容量を得た。
【０２２８】
ｄ．サイクルシークエンス反応
試料を、以下の条件を使用して、Ｈｏｔ　Ｔｏｐアセンブリを有するＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６温度サイクラー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号４００８７０および４００８９４）で循環した：
１）９５℃で１分間
２）９５℃で１分間
３）５０℃で１分間
４）７２℃で２分間
５）２〜４の段階を３０回繰返す
４μｌの停止溶液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノールＦＦ）を、それらを９９℃まで５分間加熱する前に、各増幅した反応液に加えた。試料を、上記したような６％ＣＡＳＴＡＷＡＹ（登録商標）ゲル上で電気泳動した。ゲルを乾燥し、次いで７２時間フィルムに感光した（図７）。
【０２２９】
異なるポリメラーゼクローンによる、ダイ標識ｄｄＮＴＰの利用を評価するために設計した研究の結果を、図７に示す。クローンｐ８（パネルＣ）および１−１（パネルＤ）は、親クローンに比べて、Ｒ６Ｇ−ｄｄＡＴＰおよびＲ１１０−ｄｄＧＴＰの取込みの有意な向上を示した（パネルＡ）。向上は、０．０１×（１）および０．１×（２）ダイ−ｄｄＮＴＰ／ｄＮＴＰ比でのシークエンスラダーの合成により証明した。反応条件および／またはダイ部分の最適化を実施して、ｄｄＴＴＰおよびｄｄＣＴＰの取込みの向上を実現し得る。
【０２３０】
ｉｉｉ．二重変異体エキソ−ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼを用いたシークエンス
４０８、４１０および４８５残基での変化は、ｄｄＮＴＰ取込みを向上するのに十分であることを確認するために、個々の変異体を、親５５０（ＪＤＦ−３エキソ−ＤＮＡポリメラーゼ）クローンに、部位特異的変異誘発により導入した。さらに、点変異を合わせて、１変異を有するポリメラーゼよりも、ジデオキシヌクレオチド取込みにおいてさらなる向上が生じるかどうかを調べた。
【０２３１】
１×反応緩衝液、０．１５ｐｍｏｌ／μｌの長い２０プライマー、および１０ｎｇ／μｇ　ｐブルースクリプトＫＳ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ）からなるＤＮＡシークエンス反応液を以下のように調製した：
８１μｌ　Ｈ２Ｏ
９μｌ　−２０長プライマー（２ｐｍｏｌ／μｌ）
６μｌ　ｐブルースクリプトＫＳ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ）（０．２μｇ／μｌ）
＊＊μｌ　ポリメラーゼ
１２μｌ　１０×緩衝液（２６０ｍＭトリスｐＨ９．５、６５ｍＭ　ＭｇＣｌ２）
上記に列挙した１８μｌのカクテルを、適切な数の管（１つのポリメラーゼあたり１つ）に分注した。各ポリメラーゼ（２μｌ）を、カクテルのアリコートに加え、管をよく混合した。次いで、得られた各ポリメラーゼ混合物（４．５μｌ）を、すでに２．５μｌの容量中に０．０６ｍＭの４つの３３Ｐ−ジデオキシヌクレオチドの１つ（ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰまたはｄｄＴＴＰ；１５００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；４５０μＣｉ／ｍｌ）および６ｍＭの各デオキシヌクレオチドを含む、各４つの管に加えた。
【０２３２】
シークエンス反応は、以下の条件を使用して、Ｈｏｔ　Ｔｏｐアセンブリを有するＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ（登録商標）温度サイクラーで循環した：
１）９５℃で１分間
２）９５℃で４５秒間
３）６０℃で４５秒間
４）７２℃で１．５分間
５）２〜４の段階を３０回繰返す
停止溶液（μｌ；９５％ホルムアミド、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノールＦＦ）を、各反応液に加え、その後、９９℃まで５分間加熱した。各試料（４μｌ）を、６％アクリルアミド変性ＣａｓｔＡｗａｙゲルにのせた。ゲルを流し、前記のように処理した。
【０２３３】
図８は、Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ二重変異体が、例外的に均一なシグナルを示すことを示す。バンド均一度は、変異体ｐ８（Ｐ４１０Ｌ変異と、Ａ４８５Ｔを含まない付属的変異）および変異体Ａ４８５Ｔ（データは示していない）に比較して向上した。変異体ｐ８は、配列依存的にｄｄＧＴＰおよびｄｄＣＴＰを優先的に取込む傾向を示した。最適量の酵素は、この実験で試験した量よりも高くあり得る。市販で入手可能なＡファミリーＤＮＡポリメラーゼ変異体のＴｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅにより産生される配列をパネルＥに示す。
【０２３４】
ｉｖ．ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体によるリボヌクレオチド取込み
一本鎖鋳型ＤＮＡにアニーリングしたプライマーを、全リボヌクレオチドまたは全デオキシヌクレオチドを、変異体および前駆ポリメラーゼと共に含む混合物中で伸長した。
【０２３５】
Ｍ１３ｍｐ１８＋一本鎖ＤＮＡを、混合物を９５℃まで加熱し、室温でゆっくりと冷却することにより、９５倍モル過剰の３８ｍｅｒプライマーにアニーリングした。
【０２３６】
３８ｍｅｒプライマー：５‘ＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ
予備アッセイを実施して、酵素のどの位の希釈が、非最大レベルでの取込み活性を調べるのに必要であるかを決定した。最終アッセイ溶液は、下記のように構成された：
リボヌクレオチド混合物
２０ｎｇ／μｌ　アニーリングしたプライマー／鋳型
１×クローン化したＰｆｕ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００５３２）
２００μＭ　各ＧＴＰ、ＵＴＰ、ＡＴＰ
５０μＭ　ＣＴＰ
１μＭ　５−３Ｈ　ＣＴＰ２０．２Ｃｉ／ｍｍｏｌ
０．０５〜０．３単位のＪＤＦ−３ポリメラーゼ＊
デオキシリボヌクレオチド混合物
２０ｎｇ／μｌ　アニーリングしたプライマー鋳型
１×クローン化したＰｆｕ緩衝液
２００μＭ　各ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ
５０μＭ　ＴＴＰ（デオキシリボヌクレオチド）
１μＭ　チミジン５’−三リン酸、［メチル−３Ｈ］２０．５Ｃｉ／ｍｍｏｌ　０．０５〜０．３単位のＪＤＦ−３ポリメラーゼ＊
＊別々に添加
９μｌのポリメラーゼ非含有混合物を、０．２ｍｌの管に入れ、その後ポリメラーゼを加えた。試料を、Ｈｏｔ　Ｔｏｐアセンブリ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号４００８７０および４００８９４）を有する７２℃のＲＯＢＯＣＹＣＬＥＲ（登録商標）９６鋳型サイクラー中でインキュベートした。デオキシリボヌクレオチド混合物を２分目に取り出し、約２℃に配置した。リボヌクレオチド混合物を３０分間インキュベートした。７μｌのアッセイ混合物をＤＥ８１ろ紙サークル（Ｗｈａｔｍａｎ）にスポットし、乾燥し、その後、３回２×ＳＳＣ（０．３Ｍ　ＮａＣｌ、０．０３Ｍ　クエン酸ナトリウム）中で各洗浄につき５分間洗浄した。ろ紙を２回エタノールで濯ぎ、乾燥させ、その後、シンチレーションカウンターで定量した。
【０２３７】
デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド反応の１分あたりのバックグラウンド計数（ＣＰＭ）を、各酵素の複製試料のそれぞれの平均化ＣＰＭ値から差し引いた。バックグラウンド修正リボヌクレオチドＣＰＭ値を、バックグラウンド修正デオキシリボヌクレオチドＣＰＭ値で割った（図９）。
【０２３８】
【表８】
2004500052.tif 000019
【０２３９】
ｖ．ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体を用いたリボヌクレオチドシークエンス
デオキシリボヌクレオチドポリマーに取り込んだリボヌクレオチドは、アルカリ加水分解を受け易く、ポリマー長の亜個体群を生じ得る。標識プライマーを、特定のリボヌクレオチド塩基（例えばＡＴＰ）および４つのデオキシリボヌクレオチド塩基の存在下で伸長すると、アルカリ加水分解から生じる断片により、ＡＴＰが取り込まれた全ての可能性ある位置に対応する、異なる長さの個体群が創造された。それらの断片をサイズ分離し、他のリボヌクレオチド塩基（ＣＴＰ、ＵＴＰ、およびＧＴＰ）加水分解産物に関するその移動パターンにより、鋳型配列を解読できる。前記したように、大半のＤＮＡポリメラーゼは、非慣用的デオキシヌクレオチドに対して識別する。非慣用的ジデオキシヌクレオチドの取込み向上を可能とするＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼのサブセットも、リボヌクレオチド取込みに対する抵抗性の向上を示す。
【０２４０】
１００ｎｇの３８ｍｅｒプライマーを、ＫＩＮＡＣＥ−ＩＴ（商標）キネーシングキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号３００３９０）の説明書に従って、γ−３３Ｐでキナーゼ化した。
【０２４１】
３８ｍｅｒプライマー：５‘ＧＧＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３’
標識オリゴヌクレオチドを、１０Ｔ．１Ｅ（１０ｍＭトリスｐＨ８．０、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中ＮＵＣ　ＴＲＡＰ（登録商標）プローブ精製カラム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号４００７０１）を用いて混入している遊離ヌクレオチドから精製した。標識オリゴヌクレオチド（約７ピコモル）を、９５℃まで加熱し、次いで０．３２ｍＭ　ＭｇＣｌ２の存在下で室温まで冷却することにより、０．０９ｐｍｏｌのＭ１３ｍｐｌ８＋にアニーリングした。
【０２４２】
伸長成分
０．０５４ｐＭ　アニーリングしたプライマー／鋳型
２００Ｍ　各ｄＮＴＰ
１×ｃＰｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号２００５３２）
４〜２００　ＡＴＰ＊
０．１〜５単位のＪＤＦ−３ポリメラーゼ＊
＊別々に添加
上記に列挙した最初の３つの成分を含む８μｌのカクテルを、０．２ｍｌ管に分注した。１μｌのポリメラーゼおよび１μｌの２ｍＭ、０．２ｍＭまたは０．４ｍＭ　ＡＴＰを加え、反応液を７２℃で１５分間インキュベートした。反応容量は、１×ｃＰｆｕポリメラーゼ緩衝液で１００μｌとし、１．５ｍｌの管に移した。反応液を７０ｍＭ　ＮａＯＨの存在下で１５分間１００℃で加熱した後、反応液を７０ｍＭ　ＨＣｌで中和し、１０μｌの３Ｍ酢酸ナトリウムおよび３２７．５μｌのエタノールの添加により沈降した。試料を、３０分間１４ｋｒｐｍで微量遠心分離し、その後、上清を取り出し、ペレットを８０％エタノールで洗浄した。真空乾燥した後、試料を５μｌのシークエンス停止溶液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシアノールＦＦ）に再懸濁し、２．５μｌを、６％アクリルアミド−７Ｍ尿素、１×ＴＢＥ　ＣＡＳＴＡＷＡＹ（商標）プレキャストゲル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅカタログ番号４０１０９０および４０１０９４）にのせた。ゲルを５０ワットでブロモフェノールブルーダイがゲルの下方に移動するまで流し、その後、ゲルを固定し、乾燥し、７２時間フィルムに感光した。
【０２４３】
試験したＪＤＦ−３　５５０（野生型ヌクレオチド取込み）および全変異体のシークエンスラダーは、２００μＭおよび２０μＭ　ＡＴＰレベルで可視であった。４μＭのレベルでは、Ｌ４０８ＨおよびＬ４０８Ｆ変異体のみが、ラダーを生じた（データは示していない）。
【０２４４】
ｖｉ．ダイ−ジデオキシヌクレオチド終結因子を用いたシークエンス
プライマーは、ＦＡＭｄｄＣＴＰ（ＮＥＮＮＥＬ４８１）の存在下で伸長した。配列反応液を精製し、ＡＢＩ３７０上に流した。
【０２４５】
サイクルシークエンスの反応条件は下記の通りであった：
１×ｃＰＦＵ緩衝液、２００ｎｇ　ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳプラスミド、３ｐｍｏｌ　Ｔ７プライマー、０．２３ｍＭ　ｄＣＴＰ、０．２３ｍＭ　ｄＡＴＰ、０．２３ｍＭ　ｄＴＴＰ、０．０４６ｍＭ　ＦＡＭ　ｄｄＣＴＰを有する０．２３ｍＭ　ｄＧＴＰ。
【０２４６】
試料を、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒサイクラー中で、１０μｌの容量中、下記した温度および時間を２５サイクル循環した。
【０２４７】
９５℃　３０秒
５５℃　３０秒
７２℃　２分間
試料を、製造業者の説明書に従って、ＣｅｎｔｒｉＳｅｐカラムを使用して精製した。乾燥後、試料を、６６．７％の脱イオン化ホルムアミド、１６．７ｍｇ／ｍｌブルーデキストラン、および８．３ｍＭ　ＥＤＴＡからなる３μｌのローディングダイに再懸濁した。試料を９５℃で３分間加熱し、ＡＢＩ　ＰＲＩＳＭ３７７ＤＮＡシークエンサー中の５％ＬｏｎｇＲａｎｇｅｎゲルにのせた。
【０２４８】
データをＧｅｎｅ　Ｓｃａｎ２．１で処理した。
【０２４９】
（実施例２）
ＤＮＡの標識
本発明の修飾ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡの標識に適用できる。放射標識ヌクレオチドの取込みを含む、ＤＮＡを標識する数個の手段が存在することは当業者には公知である。１つのかかる共通の手段は、ランダムプライミングであり、これにより当業者は、典型的には約５０から約１０００塩基長の標識ＤＮＡ断片を作成できる。本明細書に記載の手順は、Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌら、分子生物学の短いプロトコル、第３版、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ社、１９９５から適応する。
【０２５０】
ＤＮＡのランダムプライミングへの第一段階として、２．５μｌの０．５ｍＭ　３ｄＮＴＰ（各０．５ｍＭのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ）、５０μＣｉ［−３２Ｐ］ｄＡＴＰ、１μｌの３〜８単位／μｌのＤＮＡポリメラーゼを、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオトレイトール、０．０５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン中に含む反応混液を、全容量１１μｌ中で調製し、氷上でインキュベートする。次に、約３０から約１００ｎｇのＤＮＡを、１４μｌ中、約１から５μｇのランダムヘキサヌクレオチドと混合し、２から３分間煮沸し、次いで氷上に置く。次いで、１１μｌの反応混液をＤＮＡ／ランダムヘキサマー混液に加え、ランダムプライミング反応を、１０分間かけて、室温で４時間という長い時間インキュベートする。反応を停止するために、１μｌの０．５Ｍ　ＥＤＴＡ、３μｌの１０ｍｇ／ｍｌ　ｔＲＮＡ、および１００μｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を加え、混合物をフェノールで抽出する。次いで、標識したＤＮＡを、クロマトグラフィーにより取り込まれていない放射性前駆体から分離する。
【０２５１】
Ｒ．ダイ−ジデオキシヌクレオチド取込みのゲルアッセイ
標識オリゴヌクレオチド二本鎖を、ジデオキシヌクレオチドとダイ−ジデオキシヌクレオチドの混合物を用いて伸長した。二本鎖を変性２０％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲル上で分離すると、ジデオキシヌクレオチドで終結した標識オリゴヌクレオチドは、ダイ−デオキシヌクレオチドで終結したオリゴヌクレオチドから解像できる。
【０２５２】
オリゴヌクレオチド：
２５９Ｃ　３２Ｐ−ＴＡＡＣＧＴＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＣＡ→
２４８Ｃ　　　　　　ＴＧＣＡＡＣＣＣＣＣＣＣＣＣＧＴＡＴ
２５９Ｃの５’末端を、３２Ｐγ−ＡＴＰを使用する以外は、Ｑ．ｉｉ．ａ章に記載のように標識し、精製した。標識オリゴヌクレオチド２５９Ｃは、約０．７ｎｇ／μｌの濃度であった。相補的オリゴヌクレオチド（２５８Ｃ）は等しい濃度として加え、９５℃まで３分間、５０℃で５分間、室温で２０分間加熱した。関連変異体の加熱で死滅した溶解液を、実施例Ｃ章に記載のように調製した。反応液を、計０．１ｍＭのヌクレオチド混合物を有する３０ｍＭトリスｐＨ８．０および３ｍＭ　ＭｇＣｌ２からなる５μｌの容量中でインキュベートした。ｄｄＴＴＰとＦＬＵｄｄＵＴＰまたはＲＯＸｄｄＵＴＰの比は１０：１であった。ダイマーは、１．２ピコモルの濃度で存在し、０．５μｌの酵素または粗溶解液または精製酵素を反応液に加え、その後、Ｈｏｔ　Ｔｏｐを有するＲｏｂｅＣｙｃｌｅｒ（登録商標）勾配９６温度サイクラー中で５０℃でインキュベートした。試料を２０秒間インキュベートし、その後、３μｌのホルムアミドをベースとした添加ダイを加え、試料を９５℃で３分間加熱変性し、次いで２０％アクリルアミド／７Ｍ尿素ゲルにのせ、一定６０ワットで電気泳動にかけた。ゲルをＸ線フィルムに感光し、フィルムを、ＥａｇｌｅＥｙｅ（登録商標）Ｅａｇｌｅ　Ｓｉｇｈｔソフトウェアパッケージ中で解析した。
【０２５３】
表Ｉのリファレンス
１．　Ｊｏｙｃｅ，　Ｃ．Ｍ．，　Ｋｅｌｌｅｙ，　Ｗ．Ｓ．　および　Ｇｒｉｎｄｌｅｙ　Ｎ．Ｄ．Ｆ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．　２５７，　１９５８−１９６４．
２．　Ｌｏｐｅｓ，　Ｐ．　Ｍａｒｔｉｎｅｚ，　Ｓ．，　Ｄｉａｚ，　Ａ．　Ｅｓｐｉｎｏｓａ，　Ｍ．　および　Ｌａｃｋｓ，　Ｓ．Ａ．　（１９８９）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６４，　４２５５−４２６３．
３．　Ｌａｗｙｅｒ，　Ｆ．Ｃ．，　Ｓｔｏｆｆｅｌ．　Ｓ．，　Ｓａｉｋｉ，　Ｒ．Ｋ．，　Ｍｙａｍｂｏ，　Ｋ．　Ｄｒｕｍｍｏｎｄ，　Ｒ．　および　Ｇｅｌｆａｎｄ，　Ｄ．Ｈ．　（１９８９）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６４，　６４２７−６４３７．４．　Ａｋｈｍｅｔｚｊａｎｏｖ，　Ａ．Ａ．　および　Ｖａｋｈｉｔｏｖ，　Ｖ．Ａ．　（１９９２）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２０，　５８３９．
５．　Ｌｅａｖｉｔｔ，　Ｍ．Ｃ．　および　Ｉｔｏ，　Ｊ．　（１９８９）　Ｐｒｏｃ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８６，　４４６５−４４６９．
６．　Ｄｕｎｎ，　Ｊ．Ｊ，　および　Ｓｔｕｄｉｅｒ，　Ｆ．Ｗ．　（１９８３）　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　１６６，　４７７−５３５．
７．　Ｓｃａｒｌａｔｏ，　Ｖ．　および　Ｇａｒｇａｎｏ，　Ｓ．　（１９９２）　Ｇｅｎｅ　１１８，　１０９−１１３．
８．　Ｒａｄｅｎ，　Ｂ．　および　Ｒｕｔｂｅｒｇ，　Ｌ．　（１９８４）　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　５２，　９−１５．
９．　Ｆｏｕｒｙ，　Ｆ，　（１９８９）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６４，　２０５５２−２０５６０．
１０．　Ｉｔｏ，　Ｊ．　および　Ｂｒａｉｔｈｗａｉｔｅ，　Ｄ．Ｋ．　（１９９０）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１８，　６７１６．
１１．　Ｂｌａｎｃｏ，　Ｌ．　Ｂｅｒｎａｄ，　Ａ．　および　Ｓａｌａｓ，　Ｍ．　（１９９１）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　ｒｅｓ．　１９，　９５５．
１２．　Ｈａｈｎ，　Ｓ．　および　Ｒｕｇｅｒ，　Ｗ，　（１９８９）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１７，　６７２９．
１３．　Ｈｏｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ，　Ｈ．Ｃ．　および　Ｎｏｓｓａｌ，　Ｎ．Ｇ．　（１９９１）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６６，　１８８８−１８９７．
１４．　Ｋａｌｉｍａｎ，　Ａ．Ｖ．，　Ｋｒｕｔｉｌｉｎａ．　Ａ．Ｉ．，　Ｋｒｙｕｋｏｖ，　Ｖ，Ｍ．　および　Ｂａｙｅｖ，　Ａ．Ａ．　（１９８６）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．　１９５，　６１−６４．
１５．　Ｉｗａｓａｋｉ，　Ｈ．　Ｉｓｈｉｎｏ，　Ｙ．，　Ｔｏｈ，　Ｈ．　Ｎａｋａｔａ，　Ａ．　および　Ｓｈｉｎａｇａｗａ，　Ｈ．　（１９９１）　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ．　２２６，　２４−３３．
１６．　Ｊｕｎｇ，　Ｇ．，　Ｌｅａｖｉｔｔ．　Ｍ．Ｃ．，　Ｈｓｉｅｈ，　Ｊ．−Ｃ．　および　Ｉｔｏ，　Ｊ．　（１９８７）　Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８４，　８２８７−８２９１．
１７．　Ｓａｖｉｌａｈｔｉ，　Ｈ．　および　Ｂａｍｆｏｒｄ　Ｄ．Ｈ．　（１９８７）　Ｇｅｎｅ　５７，　１２１−１３０．１８．　Ｙｏｓｈｉｋａｗａ，　Ｈ．　および　Ｉｔｏ，　Ｊ．　（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１７，　３２３−３３５．
１９．　Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，　Ｋ．，　Ｔａｋａｎｏ，　Ｈ．，　Ｋｉｍ，　Ｃ．Ｉ．　および　Ｈｉｒｏｋａｗａ，　Ｈ．　（１９８９）　Ｇｅｎｅ　８４，　２４７−２５５．
２０．　Ｓｐｉｃｅｒ，　Ｅ．Ｋ．，　Ｒｕｓｈ，　Ｊ．　Ｆｕｎｇ，　Ｃ．，　Ｒｅｈａ−Ｋｒａｎｔｚ，　Ｌ．Ｊ．，　Ｋａｒａｍ，　Ｊ．Ｄ．　および　Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ，　Ｗ．Ｈ．　（１９８８）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．　２６３，　７４７８−７４８６．
２１　．　Ｐｅｒｌｅｒ，　Ｆ．Ｂ．，　Ｃｏｍｂ，　Ｄ．Ｇ．，　Ｊａｃｋ，　Ｗ．Ｅ．，　Ｍｏｒａｎ，　Ｌ．Ｓ．，　Ｑｉａｎｇ，　Ｂ．，　Ｋｕｃｅｒａ，　Ｒ．Ｂ．，　Ｂｅｎｎｅｒ，　Ｊ．，　Ｓｌａｔｋｏ，　Ｂ．Ｅ．，　Ｎｗａｎｋｗｏ，　Ｄ．Ｏ．，　Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ，　Ｓ．Ｋ．，　Ｃａｒｌｏｗ，　Ｃ．Ｋ．Ｓ．　および　Ｊａｎｎａｓｃｈ，　Ｈ．　（１９９２）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８９，　５５７７−５５８１．
２２．　Ｍａｔｈｕｒ，　Ｅ．Ｊ．，　Ａｄａｍｓ．　Ｍ．Ｗ．，　Ｃａｌｌｅｎ，　Ｗ．Ｎ．　および　Ｃｌｉｎｅ，　Ｊ．Ｍ．　（１９９１）　Ｎｕｃｌｅｉｃ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９，　６９５２．
２３．　Ｐｉｓａｎｉ，　Ｆ．Ｗ．，　Ｄｅ　Ｍａｒｔｉｎｏ，　Ｃ．　および　Ｒｏｓｓｉ，　Ｍ．　（１９９２）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２０，　２７１１−２７１６．
２４．　Ｗｏｎｇ　Ｓ．，　Ｗ．　Ｗａｈｌ．　Ａ．Ｆ．，　Ｙｕａｎ，　Ｐ．−Ｍ．，　Ａｒａｉ，　Ｎ．，　Ｐｅａｒｓｏｎ，　Ｂ．Ｅ．，　Ａｒａｉ，　Ｋ，　−ｉ．，　Ｋｏｒｎ，　Ｄ．，　Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，　Ｍ．　Ｗ．　および　Ｗａｎｇ，　Ｔ．Ｓ．−Ｆ．　（１９８８）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　７，　３７−４７．
２５．　Ｐｉｚｚａｇａｌｌｉ，　Ａ．，　Ｖａｌｓａｓｎｉｎｉ，　Ｐ．，　Ｐｌｅｖａｎｉ，　Ｐ．　および　Ｌｕｃｃｈｉｎｉ，　Ｇ．　（１９８８）　Ｐｏｒｃ．　Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８５，　３７７２−３７７６．
２６．　Ｄａｍａｇｎｅｚ，　Ｖ．，　Ｔｉｌｌｉｔ，　Ｊ．，　ｄｅＲｅｃｏｎｄｏ，　Ａ．−Ｍ．　および　Ｂａｌｄａｃｃｉ，　Ｇ．　（１９９１）　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２２６，　１８２−１８９．
２７．　Ｈｉｒｏｓｅ，　Ｆ．，　Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，　Ｍ．Ｎｉｓｈｉｄａ，　Ｙ．，　Ｍａｓｕｔａｎｉ．　Ｍ．，　Ｍｉｙａｚａｗａ．　Ｈ．，　Ｈａｎａｏｋａ．　Ｆ．　および　Ｍａｔｓｕｋａｇｅ，　Ａ．　（１９９１）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９，　４９９１−４９９８．　２８．　Ｌｅｅｇｗａｔｅｒ，　Ｐ．Ａ．Ｊ．，　Ｓｔｒａｔｉｎｇ，　Ｍ．，　Ｍｕｒｐｈｙ，　Ｎ．　Ｂ．，　Ｋｏｏｙ，　Ｒ．Ｆ．　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｖｌｉｅｔ，　Ｐ．Ｃ．　および　Ｏｖｅｒｄｕｌｖｅ，　Ｊ．Ｐ．　（１９９ｌ）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９，　６４４１−６４４７．
２９．　Ｃｈｕｎｇ，　Ｄ．Ｗ．，　Ｚｈａｎｇ，　Ｊ．，　Ｔａｎ　Ｃ．−Ｋ．，　Ｄａｖｉｅ，　Ｅ．Ｗ．，　Ｓｏ，　Ａ．Ｇ．　および　Ｄｏｗｎｅｙ，　Ｋ．Ｍ．　（１９９１）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　８８，　１１１９７−１１２０１．
３０．　Ｙａｎｇ，　Ｃ．−Ｌ．，　Ｃｈａｎｇ，　Ｌ．Ｓ．，　Ｚｈａｎｇ，　Ｐ．，　Ｈａｏ，　Ｈ．，　Ｚｈｕ，　Ｌ．，　Ｔｏｍｍｅｙ，　Ｎ．Ｌ．　および　Ｌｅｅ，　Ｍ．Ｙ．Ｗ．Ｔ．　（　（１９９２）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２０，　７３５−７４５．
３１．　Ｚｈａｎｇ，　Ｊ．　Ｃｈｕｎｇ，　Ｄ．Ｗ．，　Ｔａｎ，　Ｃ．−Ｋ．，　Ｄｏｗｎｅｙ，　Ｋ．Ｍ．，　Ｄａｖｉｅ，　Ｅ．Ｗ．　および　Ｓｏ，　Ａ．Ｇ．　（１９９１）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　３０，　１１７４２−１１７５０．
３２．　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，　Ａ．　および　Ｓｕｇｉｎｏ，　Ａ．　（１９９２）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２０，　３７５．
３３．　Ｐｉｇｎｅｄｅ，　Ｇ．，　Ｂｏｕｖｉｅｒ，　Ｄ．，　ｄｅＲｅｃｏｎｄｏ，　Ａ．−Ｍ．　および　Ｂａｌｄａｃｃｉ，　Ｇ．　（１９９１）　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　２２２，　２０９−２１８．
３４．　Ｒｉｄｌｅｙ，　Ｒ．Ｇ．，　Ｗｈｉｔｅ，　Ｊ．Ｈ．，　ＭｃＡｌｅｅｓｅ，　Ｓ．Ｍ．，　Ｇｏｒｍａｎ，　Ｍ．，　Ａｌａｎｏ，　Ｐ．，　ｄｅＶｉｅｓ，　Ｅ．　および　Ｋｉｌｂｅｙ，　Ｂ．Ｊ．　（１９９１）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１９，　６７３１−６７３６．
３５．　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，　Ａ．，　Ａｒａｋｉ，　Ｈ．，　Ｃｌａｒｋ，　Ａ．Ｂ．，　Ｈａｍａｔａｋｅ，　Ｒ．Ｋ．　および　Ｓｕｇｉｎｏ，　Ａ．　（１９９０）　Ｃｅｌｌ　６２，　１１４３−１１５１．
３６．　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，　Ａ．，　Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，　Ｒ．Ｂ．，　Ａｌｌｅｙ，　Ｊ．，　Ｂｅｃｋ，　Ａ．Ｋ．，　Ｂｅｒｎｓｔｉｎｅ，　Ｅ．Ｇ．，　Ｌｅｍｏｎｔｔ，　Ｊ．Ｆ．　および　Ｌａｗｒｅｎｃｅ，　Ｃ．Ｗ．　（１９８９）　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７１，　５６５９−５６６７．
３７．　Ｇｉｂｂｓ，　Ｊ．Ｓ．，　Ｃｈｉｏｕ，　Ｈ．Ｃ．，　Ｈａｌｌ，　Ｊ．Ｄ．，　Ｍｏｕｎｔ，　Ｄ．Ｗ．，　Ｒｅｔｏｎｄｏ，　Ｍ．Ｊ．，　Ｗｅｌｌｅｒ．　Ｓ．Ｋ．　および　Ｃｏｅｎ，　Ｄ．Ｍ．　（１９８５）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８２，　７９６９−７９７３．
３８．　Ｔｅｌｆｏｒｄ，　Ｅ．Ａ．，　Ｗａｔｓｏｎ，　Ｍ．Ｓ．，　ＭｃＢｒｉｄｅ，　Ｋ．　および　Ｄａｖｉｓｏｎ，　Ａ．Ｊ．　（１９９２）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８９，　３０４−３１６．
３９．　Ｄａｖｉｓｏｎ，　Ａ．Ｊ．　および　Ｓｃｏｔｔ，　Ｊ．Ｅ．　（１９８６）　Ｊ．Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ．　６７，　１７５９−１８１６．
４０．　Ｂａｅｒ，　Ｒ．，　Ｂａｎｋｉｅｒ，　Ａ．Ｔ．　Ｂｉｇｇｉｎ，　Ｍ．Ｄ．，　Ｄｅｉｎｉｎｇｅｒ．　Ｐ．Ｌ．，　Ｆａｒｒｅｌｌ，　Ｐ．Ｊ．，　Ｇｉｂｓｏｎ，　Ｔ．Ｊ．，　Ｈａｔｆｕｌｌ，　Ｇ．，　Ｈｕｄｓｏｎ，　Ｇ．Ｓ．，　Ｓａｔｃｈｗｅｌｌ，　Ｓ．Ｃ．，　Ｓｅｇｕｉｎ，　Ｃ．，　Ｔｕｆｆｎｅｌｌ，　Ｐ．Ｓ．　および　Ｂａｒｒｅｌｌ，　Ｂ．Ｇ．　（１９８４）　Ｎａｔｕｒｅ　３ｌ０，　２０７−２１１．
４１　．　Ａｌｂｒｅｃｈｔ，　Ｊ．−Ｃ．　および　Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，　Ｂ．　（１９９０）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１７４，　５３３−５４２．
４２．　Ｋｏｕｚａｒｉｄｅｓ，　Ｔ．　Ｂａｎｋｉｅｒ，　Ａ．Ｔ．，　Ｓａｔｃｈｗｅｌｌ，　Ｓ．Ｃ．，　Ｗｅｓｔｏｎ，　Ｋ．，　Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，　Ｐ．　ａｎｄ　Ｂａｒｒｅｌｌ，　Ｂ．Ｇ．　（１９８７）　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ，　６１，　１２５−１３３．　４３．　Ｅｌｌｉｏｔｔ，　Ｒ．，　Ｃｌａｒｋ，　Ｃ．　Ｊａｑｕｉｓｈ，　Ｄ．　および　Ｓｐｅｃｔｏｒ，　Ｄ．Ｈ．　（１９９１）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　ｎｌ８５，　ｌ６９−１８６．
４４．　Ｔｅｏ，　Ｉ．Ａ．，　Ｇｒｉｆｆｉｎ，　Ｂ．Ｅ．　および　Ｊｏｎｅｓ，　Ｍ．Ｄ．　（１９９１）　Ｊ．　Ｖｉｒｏｌ．　６５，　４６７０−４６８０．
４５．　Ｄａｖｉｓｏｎ，　Ａ．Ｊ．　（１９９２）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８６，　９−１４．
４６．　Ｇｒａｂｈｅｒｒ，　Ｒ．，　Ｓｔｒａｓｓｅｒ，　Ｐ．　および　Ｖａｎ　Ｅｔｔｅｎ，　Ｊ．Ｌ．　（１９９２）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８８，　７２１−７３１．
４７．　Ｂｉｎｎｓ，　Ｍ．　Ｍ．，　Ｓｔｅｎｚｌｅｒ，　Ｌ．　Ｔｏｍｌｅｙ，　Ｆ．Ｍ．，　Ｃａｍｐｂｅｌｌ，　Ｊ．　および　Ｂｒｏｕｒｓｎｅｌｌ，　Ｍ．Ｅ．Ｇ．　（１９８７）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１５，　６５６３−６５７３．
４８．　Ｅａｒｌ　Ｐ．Ｌ．，　Ｊｏｎｅｓ，　Ｅ．Ｖ．　および　Ｍｏｓｓ，　Ｂ．　（１９８６）　Ｐｒｏｖ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　８３，　３６５９−３６６３．
４９．　Ｍｕｓｔａｆａ，　Ａ．　および　Ｙｕｅｎ，　Ｌ．　（１９９１）　ＤＮＡ　Ｓｅｑ．　２，　３９−４５．
５０．　Ｔｏｍａｌｓｋｉ，　Ｍ．Ｄ．，　Ｗｕ，　Ｊ．　および　Ｍｉｌｌｅｒ，　Ｌ．Ｋ．　（１９８８）　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１６７，　５９１−６００．
５１．　Ｂｊｏｒｎｓｏｎ，　Ｒ．Ｍ．　および　Ｒｏｈｒｍａｎｎ，　Ｇ．Ｆ．　（１９９２）　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｖｉｒｏｌ　７３，　１４９９−１５０４．
５２．　Ｇｉｎｇｅｒａｓ，　Ｔ．Ｒ．，　Ｓｃｉａｋｙ，　Ｄ．，　Ｇｅｌｉｎａｓ，　Ｒ．Ｅ．，　Ｂｉｎｇ−Ｄｏｎｇ，　Ｊ．，　Ｙｅｎ，　Ｃ．Ｅ．，　Ｋｅｌｌｙ，　Ｍ．Ｍ．，　Ｂｕｌｌｏｃｋ，　Ｐ．Ａ．　Ｐａｒｓｏｎｓ，　Ｂ．Ｌ．，　Ｏ’Ｎｅｉｌｌ．　Ｋ．Ｅ．　および　Ｒｏｂｅｒｔｓ，　Ｒ．Ｊ．　（１９８２）　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ，　２５７，　１３４７５−１３４９１．５３．　Ｅｎｇｌｅｒ，　Ｊ．Ａ．，　Ｈｏｐｐｅ，　Ｍ．Ｓ．　および　ｖａｎ　Ｂｒｅｅ，　Ｍ．Ｐ．　（１９８３）　Ｇｅｎｅ　２１，　１４５−１５９．
５４．　Ｓｈｕ，　Ｌ．，　Ｈｉｎｇ，　Ｊ．Ｓ．，　Ｗｅｉ，　Ｙ．−ｆ．　および　Ｅｎｇｌｅｒ，　Ｊ．Ａ．，　（１９８６）　Ｇｅｎｅ　４６，　１８７−１９５．
５５．　Ｐａｉｌｌａｒｄ，　Ｍ．，　Ｓｅｄｅｒｏｆｆ，　Ｒ．Ｒ．　および　Ｌｅｖｉｎｇｓ，　Ｃ．Ｓ．　ＩＩＩ　（１９８５）　ＥＭＢＲＯ　Ｊ．　４，　１１２５−ｌ１２８．
５６．　Ｃｈａｎ，　Ｂ．Ｓ．−Ｓ．，　Ｃｏｕｒｔ，　Ｄ．Ａ．，　Ｖｉｅｒｕｌａ，　Ｐ．Ｊ．　および　Ｂｅｒｔｒａｎｄ，　Ｈ．　（１９９１）　Ｃｕｒｒ．　Ｇｅｎｅｔ．　２０，　２２５−２３７．
５７　Ｋｅｍｐｋｅｎ，　Ｆ．，　Ｍｅｉｎｈａｒｄｔ，　Ｆ．　および　Ｅｓｓｅｒ，　Ｋ．　（１９８９）　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ，　２１８，　６２３−５３０．
５８．　Ｏｅｓｔｅｒ，　Ｂ．　および　Ｔｕｄｚｙｎｓｋｉ，　Ｐ．　（１９８９）　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２１７，　１３２−１４０．
５９．　Ｃｏｕｒｔ　Ｄ．Ａ．　および　Ｂｅｒｔｒａｎｄ，　Ｈ．　（１９９２）　Ｃｕｒｒ．　Ｇｅｎｅｔ．　２２，　３８５−３９７．
６０．　Ｒｏｂｉｓｏｎ，　Ｍ．Ｍ．，　Ｒｏｙｅｒ，　Ｊ．Ｃ．　ａｎｄ　Ｈｏｒｇｅｎ，　Ｐ．Ａ．　（１９９１）　Ｃｕｒｒ．　Ｇｅｎｅｔ．　１９，　４９５−５０２．
６１．　Ｓｔａｒｋ，　Ｍ．Ｊ．Ｒ．，　Ｍｉｌｅｈａｍ，　Ａ．Ｊ．，　Ｒｏｍａｎｏｓ，　Ｍ．Ａ．　および　Ｂｏｙｄ，　Ａ．　（１９９４）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１２，　６０１１−６０３０．
６２．　Ｔｏｍｍａｓｉｎｏ，　Ｍ．　Ｒｉｃｃｉ，　Ｓ．　および　Ｇａｌｅｏｔｔｉ，　Ｃ．Ｌ．　（１９８８）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　１６，　５８６３−５８７８．
６３．　Ｈｉｓｈｉｎｕｍａ，　Ｆ．　および　Ｈｉｒａｉ，　Ｋ．　（１９９１）　Ｊ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２２６，　９７−１０６．
６４．　Ｈｏｐｆｎｅｒ，　Ｋ．Ｐ，　ら　（１９９９）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　９６，　３６００−３６０５．
６５．　Ｎｉｅｈａｕｓ，　Ｆ．　ら　（１９９７）　Ｇｅｎｅ　２０４，　１５３−１５８．
６６．　Ｔａｇａｋｉ　ｅｔ　ら　（１９９７）　Ａｐｐｌ．　Ｅｎｖｉｒｏｎ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　６３，　４５０４−４５１０．
６７．　Ｄａｔｕｋｉｓｈｖｉｌｉ，　Ｎ．　ら　（１９９６）　Ｇｅｎｅ　１７７，　２７１−２７３．
６８．　Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈ，　Ｍ．Ｗ．　ら　（１９９６）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．　９３，　５２８１−５２８５．
６９．　Ｕｅｍｏｒｉ，　Ｔ．　ら　（１９９５）　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．　１７７，　２１６４−２１７７．
７０．　Ｋｏｎｉｓｋｙ，　Ｊ．　ら　（１９９４）　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，　１７６，　６４０２−６４０３．
７ｌ．　Ｚｈａｏ　（１９９９）　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｆｏｌｄ　Ｄｅｓ．　７，　１１８９．
【０２５４】
他の実施形態
他の実施形態も、当業者には明らかである。前記の詳細な説明は、単に明瞭化のために提供され、単なる例示であることを理解すべきである。本発明の精神および範囲は、上記の実施例に限定されないが、以下の特許請求の範囲により包含される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列を示す（インテイン除去）（配列番号１）。
【図２】
図２は、テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼのアミノ配列を示す（インテイン除去）（配列番号２）。
【図３】
図３は、テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼをコードするゲノムクローンのアミノ酸配列を示す（配列番号３）。翻訳後プロセシングにより除去されたインテインの位置を示す。
【図４】
図４は、テルモコックス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）種ＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼをコードするゲノムクローンのＤＮＡ配列を示す（配列番号４）。５’および３’非翻訳領域、ポリメラーゼコード領域（エクステイン）、およびインテインコード領域に対応するＤＮＡ配列を示す。
【図５】
図５は、ＪＤＦ−３変異体によるヌクレオチド取込みを示す。一次ライブラリースクリーンで３３Ｐ標識ｄｄＮＴＰを取り込んだλファージクローンを再スクリーニングして、（パネル１）０．５ｍＭ　ＭｎＣｌ２または（パネル２）１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２の存在下で、３３Ｐ−ｄｄＮＴＰ取込みを評価した。ポリメラーゼ活性を、３３Ｐ−ｄＮＴＰを使用して、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２の存在下で測定した（パネル３）。ヌクレオチド利用を、クローン１〜１８について、および親５５０番クローンについて示す。
【図６】
図６は、ＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体を使用して実施した３３Ｐ−ｄＮＴＰサイクルシークエンス反応を示す。精製ＪＤＦ−３変異体を、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ放射能標識ターミネーターサイクルシークエンスキットに置換した。ＤＮＡシークエンスラダーを、以下のポリメラーゼを使用してキットの説明書の通りに作成した：（Ａ）Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｂ）ＪＤＦ−３　５５０番クローン（親）（Ｃ）ＪＤＦ−３　Ａ４８５Ｔ変異体（クローンｐ１２）（Ｄ）ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ変異体（クローンｐ１１）（Ｅ）ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ変異体（クローンｐ８）。最初のシークエンスゲルの上側を側に示す。レーンは（下）ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ（上）。クローンｐ８、ｐ１１、およびｐ１２は、付属的な変異およびアミノ末端タグを含む。
【図７】
図７は、ダイ標識ｄｄＮＴＰおよびＪＤＦ−３ポリメラーゼ変異体を使用して実施したサイクルシークエンス反応を示す。ＤＮＡシークエンスラダーを、（１）２．１４μＭ　ｄＮＴＰ：０．０２１４μＭ　ｄｄＮＴＰ；（２）２．１４μＭ　ｄＮＴＰ：０．２１４μＭ　ｄｄＮＴＰ；または（３）２．１４μＭ　ｄＮＴＰ：２．１４μＭ　ｄｄＮＴＰ。以下の精製ＤＮＡポリメラーゼを使用した：（Ａ）ＪＤＦ−３　５５０番クローン（親）（Ｂ）Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｃ）ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ変異体（クローンｐ８、付属的な変異およびアミノタグを含む）（Ｅ）ＪＤＦ−３Ｌ４０８Ｈ（クローン１−１）。最初のシークエンスゲルの上を、右手側に示す。
【図８】
図８は、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ二重変異体および３３Ｐジデオキシヌクレオチドを使用して実施した、サイクルシークエンス反応を示す。ＤＮＡシークエンスラダーは、（Ａ）２μｌ（Ｂ）１μｌ（Ｃ）０．５μｌのＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ／Ａ４８５Ｔ二重変異体、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌ変異体（クローンｐ８、付属的変異およおびアミノ末端タグを含む）、またはＴｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｅ）を使用して作成した。最初のシークエンスゲルの上を、左側に示す。レーンは：（下）ｄｄＧＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＣＴＰ（上）である。
【図９】
図９は、エキソＪＤＦ−３（５５０）およびこの前駆クローンの変異体を使用した、リボヌクレオチド取込みアッセイの結果を示す。リボヌクレオチド対デオキシヌクレオチド取込みの比を、ＪＤＦ−３　５５０、ＪＤＦ−３Ｌ４０８Ｈ、ＪＤＦ−３Ｌ４０８ＦおよびＪＤＦ−３Ａ４８５Ｔについてプロットする。
【図１０】
図１０は、４つの形のＪＤＦ−３ＤＮＡポリメラーゼおよびＦＡＭｄｄＣＴＰにより作成した配列軌跡を示す。パネルＡは、前駆ポリメラーゼＪＤＦ−３　５５０により生じた最小の軌跡を示し、パネルＢは、ＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌにより作成した僅かに向上した軌跡を実証し、パネルＣは、二重変異体Ｓ３４５ＰおよびＰ４１０Ｌにより作成した配列を示し、パネルＤは、ＪＤＦ−３Ｓ３４５Ｐにより創造した軌跡を示す。
【図１１】
図１１は、パネルＡでＴｈｅｒｍｏ　Ｓｅｑｕｅｎａｓｅにより実証されたピーク均一性の差異、および、パネルＢで二重変異体ＪＤＦ−３Ｓ３４５Ｐ＋Ｐ４１０Ｌを示す。
【図１２】
図１２は、ＲＯＸ−ｄｄＵＴＰ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ（ＮＥＮ）ＮＥＬ４７６）またはフルオレセイン−１２−ｄｄＵＴＰ（ＮＥＮ　ＮＥＬ４０１）のジデオキシヌクレオチドチミジン三リン酸を用いた、分離した標識オリゴヌクレオチドの３’伸長産物を示す。変異体４はＪＤＦ−３Ｓ３４５Ｐであり、変異体２はＪＤＦ−３Ｐ４１０Ｌであり、変異体３はＪＤＦ−３Ａ４８５Ｔであり、変異体５はＹ４９６Ｎである。ＦはＦＬＵｄｄＵＴＰを示し、ＲはＲＯＸｄｄＵＴＰを示す。
【図１３】
図１３は、図１２からの相対的バンド強度の図解を示す。数値は、ｄｄＴＴＰバンドの強度値を、フルオレセイン−１２−ｄｄＵＴＰバンドの強度値に分けることにより作成する。
【図１４】
図１４は、ダイ−ジデオキシヌクレオチド選択ＪＤＦ−３変異体（アミノ酸３０１〜４８０）の配列アラインメントを示す。白いボックスにより強調した核酸残基は、変異の位置を示す。変異Ｓ３４５Ｐは、変異体２８に存在する２つの変異の１つである。
【図１５】
図１５は、ダイ−ジデオキシヌクレオチド選択ＪＤＦ−３（アミノ酸４８１〜６６０）の配列アラインメントを示す。白いボックスにより強調した核酸残基は変異の位置を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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