(57)【要約】プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡの断片、染色体ＤＮＡ、またはＲＮＡなどの標的核酸を、たんぱく質、脂質、細胞破片、あるいは非標的核酸を含む夾雑物から単離するためにシラン処理シリカ基質を用いる方法が提供される。シラン処理シリカ基質は、シリカベース固相および前記固相の表面に共有結合した複数のシランリガンドを含む。非標的物質は、十分な濃度のカオトロピック塩の存在においてシラン処理シリカ基質に吸着する一方で、標的核酸は、他の溶液条件下で前記基質に吸着する。本発明のシラン処理シリカ基質を用いる方法は、破壊された生体物質を溶液から除去するため、およびそこから、あるいは核酸や少なくとも１の夾雑物を含む他の溶液から核酸を単離するために使用されうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）共有結合した複数のシランリガンドを伴うシリカ固相を含む第一シラン処理シリカ基質を提供するステップであって、前記複数のリガンドの各々が、第一溶液中に中性電荷を有するステップと；および
（ｂ）破壊された生体物質、標的核酸物質、および前記基質への前記破壊された生体物質の選択的吸着を促進し、それによって第一複合体を形成するのに十分な濃度のカオトロピック塩を含む、前記第一溶液と、前記第一シラン処理シリカ基質とを混合するステップと
を含む、破壊された生体物質を溶液から除去する方法。
【請求項２】
前記破壊された生体物質が、バクテリア細胞溶解物であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記破壊された生体物質が、破壊された植物であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）における前記カオトロピック塩濃度が、少なくとも約０．５Ｍであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のシランリガンドにおける各リガンドが、下記一般式で表され：
【化１】
2004513634.tif 000010
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、１乃至５の炭素原子を有する炭化水素鎖、１乃至５の炭素原子を有するアルコキシル基、ハロゲン原子、水素原子、ヒドロキシル基、酸素残基により中断された４乃至１０の炭素原子を有するアルキル鎖（５までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、ヒドロキシル基ならびに別のシランリガンドへの結合からなる群から選択された基により置換される）からなる群から選択されたサブユニットであり；および
Ｒ３は、少なくともの１のヒドロキシル基により置換される１乃至２０の炭素原子を有する炭化水素鎖、少なくとも１の酸素基により中断された４乃至２０の炭素原子を有するアルキル鎖（１０までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、ヒドロキシル基、およびエポキシ基からなる群から選択された基により置換される）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記複数のシランリガンドにおける各リガンドが下記一般式で表され：
【化２】
2004513634.tif 000011
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して−ＯＨ，−ＣＨ３，−ＯＣＨ３，または−ＯＣＨ２ＣＨ３であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記シリカ固相が、第一シリカ磁気粒子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第一溶液から前記第一複合体を分離し、それによって除去された溶液を作るステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記除去された溶液を第二溶液の中で第二シリカ基質と混合させるステップであって、前記標的核酸が特異的に前記第二シリカ基質に吸着し、それによって第二複合体を形成するステップをさらに含むことを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第二シリカ基質が、複数の第二のシリカ磁気粒子を含むことを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二シリカ基質が、複数の第二シラン処理シリカ磁気粒子であり、かつ前記第二溶液が、約８．０までのｐＨを有することを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記第一シリカ基質および前記第二シリカ基質が同じであることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）共有結合した複数のシランリガンドを伴うシリカ磁気粒子を含む第一シラン処理シリカ磁気粒子を提供するステップと；
（ｂ）破壊された生体物質、標的核酸、および前記破壊された生体物質の前記シラン処理シリカ磁気粒子への選択的吸着を促進し、それによって第一複合体を形成するのに十分に高いカオトロピック塩濃度を含む第一溶液と、前記第一シラン処理シリカ磁気粒子とを混合させるステップと；
（ｃ）前記第一溶液から前記第一複合体を分離し、それによって除去された溶液を形成するステップ
を含む、破壊された生体物質を溶液から除去する方法。
【請求項１４】
前記破壊された生体物質が、バクテリア細胞溶解物であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記破壊された生体物質が、破壊された植物であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記第一溶液が、約３．５Ｍまでの濃度でカオトロピック塩をさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数のシランリガンドの各々が下記一般式で表され：
【化３】
2004513634.tif 000012
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、１乃至５の炭素原子を有する炭化水素鎖、１乃至５の炭素原子を有するアルコキシル基、ハロゲン原子、水素原子、ヒドロキシル基、酸素残基により中断された４乃至１０の炭素原子を有するアルキル鎖（５までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、およびヒドロキシル基からなる群から選択された基により置換される）からなる群から選択されたサブユニットであり；Ｒ３は、少なくともの１のヒドロキシル基により置換される１乃至２０の炭素原子を有する炭化水素鎖、少なくとも１の酸素基により中断された４乃至２０の炭素原子を有するアルキル鎖（１０までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、ヒドロキシル基、エポキシ基および別のシランリガンドへの結合からなる群から選択された基により置換される）であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
前記第一複合体が、磁場の存在において前記第一溶液から分離されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記第一複合体が、遠心分離法によって前記第一溶液から分離されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記除去された溶液を第二シリカ基質と第二溶液の中で混合させるステップであって、前記標的核酸が特異的に前記第二シリカ基質に吸着し、それによって第二複合体を形成するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項２１】
前記第二シリカ基質が、共有結合した複数のシランリガンドを伴うシリカ磁気粒子固相を含む第二シラン処理シリカ磁気粒子であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第一シラン処理シリカ磁気粒子および前記第二シラン処理シリカ磁気粒子が同じであることを特徴とする請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第二シリカ基質が、シリカ磁気粒子であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）共有結合した複数のシランリガンドを伴うシリカ固相を含むシラン処理シリカ基質を提供するステップであって、前記複数のシランリガンドの各々が下記一般式で表され：
【化４】
2004513634.tif 000013
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、１乃至５の炭素原子を有する炭化水素鎖、１乃至５の炭素原子を有するアルコキシル基、ハロゲン原子、水素原子、ヒドロキシル基、酸素残基により中断された４乃至１０の炭素原子を有するアルキル鎖（５までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、およびヒドロキシル基からなる群から選択された基により置換される）からなる群から選択されたサブユニットであり；Ｒ３は、少なくともの１のヒドロキシル基により置換される１乃至２０の炭素原子を有する炭化水素鎖、少なくとも１の酸素基により中断された４乃至２０の炭素原子を有するアルキル鎖（１０までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、ヒドロキシル基、エポキシ基および別のシランリガンドへの結合からなる群から選択された基により置換される）であることを特徴したステップと；
（ｂ）前記シラン処理シリカ基質を、約ｐＨ８．０までのｐＨを有する核酸吸着溶液と混合させるステップであって、前記核酸吸着溶液が前記標的核酸および少なくとも１の非標的物質を含み、前記標的核酸が選択的に、前記シラン処理シリカ基質に吸着し、それによって複合体を形成するステップと；および
（ｃ）前記複合体を、前記核酸吸着溶液から分離するステップと
を含む、核酸吸着溶液から標的核酸を単離する方法。
【請求項２５】
前記核酸吸着溶液が、植物油を含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸吸着溶液が、前記標的核酸の、前記第二シラン処理シリカ基質への吸着を促進するのに十分な低分子量アルコールの濃度をさらに含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記吸着溶液が、０．２Ｍ乃至１．２Ｍのカオトロピック塩をさらに含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記カオトロピック塩が、塩酸グアニジンおよびグアニジンチオシアネートからなる群から選択されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記シリカ基質の前記シリカ固相が、シリカ磁気粒子であることを特徴とする、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記複合体が、磁場の存在において前記核酸吸着溶液から分離されることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
約８．０までのｐＨを有する洗浄溶液で前記複合体を洗浄するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
前記洗浄溶液が、少なくとも約３０％の低分子量アルコールの濃度を含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３３】
少なくとも約８．０のｐＨを有する溶出溶液と前記複合体を混合させ、それによって前記標的核酸を前記複合体から脱着するステップをさらに含むことを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３４】
前記溶出溶液が、少なくとも約９．０のｐＨを有するバッファであることを特徴とする請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的核酸が、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびトータルＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３６】
前記標的核酸が、少なくとも約２５塩基対かつ約６０キロ塩基対までの分子量を有する二本鎖線状ＤＮＡであることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
【請求項３７】
（ａ）共有結合した複数のシランリガンドを伴うシリカ磁気粒子を含む、シラン処理シリカ磁気粒子を提供するステップであって、前記複数のシランリガンドの各々が下記一般式で表され：
【化５】
2004513634.tif 000014
各式において、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立した−ＯＨ，−ＣＨ３，−ＯＣＨ３，または−ＯＣＨ２ＣＨ３であるステップと；
（ｂ）前記シラン処理シリカ磁気粒子を約ｐＨ８．０までのｐＨを有する核酸吸着溶液と混合させるステップであって、前記核酸吸着溶液が前記標的核酸および少なくとも１の非標的物質を含み、前記標的核酸が、前記シラン処理シリカ磁気粒子に選択的に吸着し、それによって複合体を形成するステップと；および
（ｃ）前記複合体を前記吸着溶液から分離するステップと
を含むことを特徴とする、シラン処理シリカ磁気粒子を用いて核酸吸着溶液から標的核酸を単離する方法。
【請求項３８】
前記吸着溶液が、約８．０までのｐＨを有することを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記吸着溶液が、植物油を含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記吸着溶液が、アガロースゲルスライスからの前記標的核酸と、前記アガロースゲルとを含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記吸着溶液が、前記シラン処理シリカ磁気粒子への前記標的核酸の吸着を促進するのに十分な低分子量アルコールの濃度をさらに含むことを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記吸着溶液がカオトロピック塩をさらに含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記カオトロピック塩が、塩酸グアニジンおよびグアニジンチオシアネートからなる群から選択されることを特徴とする請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
約８．０までのｐＨを有する洗浄溶液で前記複合体を洗浄するステップをさらに含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４５】
前記洗浄溶液が、少なくとも約３０％の低分子量アルコールの濃度を含むことを特徴とする請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
少なくとも約８．０のｐＨを有する溶出溶液と前記複合体を混合させ、それによって前記複合体から前記標的核酸を溶出するステップをさらに含むことを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記標的核酸が、プラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびトータルＲＮＡからなる群から選択されることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４８】
前記標的核酸が、少なくとも２５塩基対および約６０キロ塩基対までの分子量を有するＤＮＡであることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
単一の容器に：
各粒子の表面に共有結合した少なくとも１のシランリガンドを伴うシリカ固相を含む複数のシラン処理シリカ磁気粒子であって、前記シランリガンドが次の式の構造を有し：
【化６】
2004513634.tif 000015
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、１乃至５の炭素原子を有する炭化水素鎖、１乃至５の炭素原子を有するアルコキシル基、ハロゲン原子、水素原子、ヒドロキシル基、酸素残基により中断された４乃至１０の炭素原子を有するアルキル鎖（５までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、およびヒドロキシル基からなる群から選択された基により置換される）からなる群から選択されたサブユニットであり；およびＲ３は、少なくともの１のヒドロキシル基により置換される１乃至２０の炭素原子を有する炭化水素鎖、少なくとも１の酸素基により中断された４乃至２０の炭素原子を有するアルキル鎖（１０までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、ヒドロキシル基、エポキシ基および別のシランリガンドへの結合からなる群から選択された基により置換される）であることを特徴する複数のシラン処理シリカ磁気粒子を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、１９９９年１２月３０日出願、アメリカ合衆国特許出願第０９／４７５，９５８号の一部継続出願であり、それは１９９９年５月１４日出願、アメリカ合衆国特許仮出願番号第６０／１３４，１５６号の利益を主張する。
（連邦政府主催の調査または開発に関する申告）
なし
【０００２】
（技術分野）
本発明は、一般的に、植物や動物の組織の細胞溶解物またはホモジェネートのような破壊された生体物質を溶液から除去するために、修飾シリカ基質を利用する方法に関する。本発明は、プラスミドＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、ＤＮＡ断片、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのような標的核酸を、たんぱく質、脂質、細胞破片、および非標的核酸のような非標的物質から単離するための、そのような基質の使用にも関する。本発明は、特に、溶解物クリアランスおよび標的核酸単離におけるシラン処理シリカ基質の使用に関する。
【０００３】
（背景技術）
生体物質または核酸を含む他の種類の物質から、標的核酸を単離するための様々な方法が開発されてきた。標的核酸が細胞の内部に含まれる場合、細胞膜は破壊されなければならず、標的核酸が他の細胞質から単離される前に、細胞を取り囲む溶液に細胞の内容物が放出されなければならない。そのような破壊は、機械的手段によって（例えば、超音波破壊によって、あるいはミキサーでの混合によって）、酵素消化によって（例えば、プロテアーゼでの消化によって）、または化学的手段によって（例えば、後で中和溶液を追加するアルカリ溶解によって）達成されうる。細胞を破壊するためにどのような手段が使用されようと、ここでは溶解物溶液と称される最終生成物は標的物質、および細胞破片を含む多くの夾雑物を含む。
標的核酸物質がそれから単離される前に、大きな夾雑物をできるだけ多く溶解物溶液から除去するためには、一般的に遠心分離法およびろ過が使用される。残念ながら、ろ過も遠心分離法も、容易に自動化できない。特に、いずれも通常は、ＢｉｏｍｅｋＴＭ−２０００（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ　ＣＡ）のような基本ピペッタ‐ダイリュータ・ロボット・ステーションでは実行されない。
【０００４】
除去された溶解物溶液からの核酸の単離における使用のために、多くの物質および方法が開発されてきた。そのような方法の１は、ゲル電気泳動法による核酸の分画後の、アガロースゲルからの核酸の抽出である。ゲルスライスから核酸を抽出する公知の手段は、透析、溶媒抽出法、およびアガロースの酵素消化を含む。アガロースゲルスライスからのそのような核酸抽出システムは、大変に労働集約的になりがちであり、また自動化にしにくい傾向にある。さらに、ＤＮＡまたはＲＮＡのより小さいサイズの断片（すなわち、１００塩基対未満）は、抽出処理の中で見失いやすい。
【０００５】
核酸抽出の他のシステムは、多孔質ガラス、シリカ粒子を包埋したフィルタ、シリカゲル粒子、珪藻土の状態でのシリカを含む樹脂、グラスファイバまたは上述のものの混合物を採用しているようなシリカベースのものである。そのようなシリカベース固相分離システムの各々は、カオトロピック剤存在下に、そのような物質を含む媒体と接触するように配置されると、核酸物質を可逆的に結合させるように構成されている。シリカベース固相は、核酸物質に結合されたままでいるように設計されている一方で、前記固相は、残りの培地成分から、そこに結合された基質ならびに核酸物質を分離するために、遠心分離法や真空ろ過などの外力にさらされる。それから核酸物質は、水または溶出バッファのような溶出水溶液に固相をさらすことによって、固相から溶出される。多くの商業ソースが、遠心分離および／またはろ過単離システム、例えばＰｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＷｉｚａｒｄＴＭ　ＤＮＡ精製システム製品や、Ｑｉａｇｅｎ　Ｃｏｒｐ．（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＱｉａＰｒｅｐＴＭ　ＤＮＡ単離システムでの使用のために設計されたシリカベース樹脂を提供する。残念ながら、上述された種類のシリカベース固相はすべて、各方法における様々な単離ステップを実行するために遠心分離法またはろ過を用いる必要があり、自動化システムにおけるそのような固相の有用性を制約している。
【０００６】
常磁性または超常磁性粒子のような、磁気的に反応する固相は、上述されたシリカベース固相のいずれによっても提供されない効果を提供する。そのような粒子は、磁力場をつけたり消したりすることによって、容器を磁気分離装置に近づけたり磁気分離装置から離したりすることによって、または磁気分離装置を容器に近づけたり容器から離したりすることによって、溶液から分離されうる。そのような行動は、容易に自動化に適応するだろう。
磁気反応粒子は、粒子への、核酸の直接可逆的吸着による核酸の単離における使用のために開発されてきた。例えば、ＭｇｎｅＳｉｌＴＭ　常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）や、ＢｉｏＭａｇＴＭ　常磁性ビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のような、ＤＮＡに直接可逆的に結合するよう設計されたシリカゲルベース多孔質粒子を参照。また、アメリカ合衆国特許第６，０２７，９４５号も参照。管理された細孔サイズを有する磁気反応ガラスビーズも、核酸の単離のために開発されてきた。例えば、ＣＰＧ，Ｉｎｃ．（Ｌｉｎｃｏｌｎ　Ｐａｒｋ，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）の磁気多孔質ガラス（ＭＰＧ）粒子；またはアメリカ合衆国特許第４，３９５，２７１号；４，２３３，１６９号；あるいは４，２９７，３３７号に説明された多孔質磁気ガラス粒子を参照。しかしながら、核酸物質は、ガラスに大変しっかりと結合する傾向にあるので、一度そこに結合すると、そのような磁気ガラス粒子から核酸を取り除くことは困難になりうる。その結果、磁気ガラス粒子からの溶出効率は、低量の、シリカのような核酸結合物質を含む粒子からの溶出効率と比較して、低くなりがちである。
【０００７】
イオン交換または核酸との逆相相互作用に関わるように設計された、リガンドが共有結合しているシリカ固相を含む様々なシリカ基質も開発されてきた。しかしながら、そのようなシステムは、一般的には、液体クロマトグラフィシステムの固相としての使用のため、ろ過システムでの使用のため、または様々な溶液から固相を分離するための遠心分離法での使用のために設計されている。そのようなシステムはそれぞれ、複雑に、ＤＥＡＥ修飾フィルタ（例えば、ＣＯＮＣＥＲＴＴＭ分離システム、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ．，　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）でのような、フィルタの表面に共有結合した一種類のリガンドから、多孔質ディバイダによって分離される２の異なる固相を含むカラム（例えば、アメリカ合衆国特許第５，６６０，９８４号）まで、そこにｐＨ依存イオン性リガンドが共有結合したクロマトグラフィ樹脂（例えば、アメリカ合衆国特許第５，６５２，３４８号）まで、前記樹脂の同じ、あるいは異なる固相成分上にイオン交換リガンドおよび逆相リガンドを伴う混合モードあるいは混床樹脂まで（例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｌ．Ｍ．，Ｃｈｅｍ　Ｒｅｖ（１９８９）８９：３０９−３１９）及ぶ。
【０００８】
親和性相互作用を介して特定の標的物質に可逆的に結合するように設計されている基質も開発されてきた。そのような基質のいくつかは、オリゴ（ｄＴ）を直接固相の表面に結合することによって（例えば、アメリカ合衆国特許第５，６１０，２７４号）、またはストレプトアビジンでコートされた固相ならびに溶液中のストレプトアビジンとｍＲＮＡの両方に自然に結合するビオチン標識オリゴ（ｄＴ）（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＰｏｌｙＡＴｒａｃｔＴＭ　シリーズ　９６００ＴＭ　ｍＲＮＡ　単離システム；およびＢａｎｇｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｒｍｅｌ，Ｉｎｄｉａｎａ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）のＰｒｏＡｃｔｉｖｅＴＭストレプトアビジン・コート・ミクロスフェア粒子）を提供することによって、オリゴ（ｄＴ）がｍＲＮＡを分離するために、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部の親和性を利用する。
【０００９】
シラン処理は、核酸のような溶質の分離のためのクロマトグラフィ基質を作るために、様々なリガンドの、シリカ固相への共有結合を容易にするためのカップリング剤として使用されてきた。例えば、アメリカ合衆国特許第４，６７２，０４０号（コラム１３、３−２２行目）；アメリカ合衆国特許第５，７３４，０２０号；４，６９５，３９２号；および５，６１０，２７４号を参照。そのような反応においては、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランのようなシラン化合物が、シリカベース物質のような固相表面と、またはシランがそこに結合するような酸化鉄と反応する。その結果の基質は、固相表面との反応後も利用可能なままである、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランのアルコキシ鎖の末端にエポキシド基のような高い反応性の残留物を含む。そのような反応性基を伴う基質は、イオン交換、逆相、混床、混合モード、および親和性樹脂を作る際の媒介として使用されてきた。
【００１０】
上述されたシステムの各々は、核酸の単離に必要とされる溶液条件に関して、およびそこから核酸を最も良く単離できる基質のクラスに関して、制約がある。現在まで、植物油やアガロースゲルスライスなどの基質から、高分子量核酸と同じくらい効率的に、低分子量核酸（例えば、１００塩基対未満）を単離するために使用されうる物質も方法も開発されていない。ウイルス、およびそのような油が精製される植物の遺伝子組み換えの証拠を検出する現在の必要性があるので、そのような基質から少量の核酸を単離することができる大きな必要性がある。細胞または哺乳動物組織から標的核酸を迅速に、かつ効率的に単離するため、できるだけ多くのステップを自動化できるようにする物質および方法も必要とされる。特に、破壊された生体物質の、溶液からの除去のための、およびそのような除去された溶液からの標的核酸の単離のための方法および物質が必要とされており、その場合、ろ過や遠心分離法のような労働集約的なステップは必要とされない。本発明は、これらの必要性の各々に取り組む。
【００１１】
（発明の開示）
本発明の方法は、共有結合した複数の第一シランリガンドを伴う第一シリカ固相を用いて、破壊された生体物質を溶液から除去するための手段を提供し、前記手段において前記第一シランリガンドは、破壊された生体物質における非標的核酸に吸着されるように設計されている。本発明の方法は、共有結合した複数の第二シランリガンドを伴う第二シリカ固相を用いて、標的核酸および少なくとも１の非標的物質を含む、除去された溶解物溶液などの溶液から標的核酸を単離する手段も提供し、その場合、前記第二シランリガンドは、核酸吸着溶液において、標的核酸に選択的に吸着されるように設計されている。本発明の方法の好ましい実施態様において、破壊された生体物質の溶液は、第一溶液における第一シリカ固相で除去され、および結果としての除去された溶解物から、核酸吸着溶液における第二シリカ固相への吸着によって標的核酸物質が取り除かれる。
【００１２】
上述の本方法の第一の実施態様において、細胞溶解物または哺乳動物組織のホモジェネートなどの、破壊された生体物質の溶液は、以下のものを含むステップに従って除去される：（ａ）共有結合された複数のシランリガンドを伴うシリカ固相を含む、第一シラン処理シリカ基質を提供するステップと、および（ｂ）破壊された生体物質、標的核酸ならびに基質への、破壊された生体物質の選択的吸着を促進するのに十分に高いカオトロピック塩濃度を含む第一溶液と、前記第一シラン処理シリカ基質とを混合させ、それによって第一複合体を形成するステップである。前記破壊された生体物質は、好ましくは基質への、破壊された非標的生体物質の選択的吸着を促進するのに十分に効率的なカオトロピック塩濃度の存在下に、基質へと導入され、溶液中に標的核酸を残す。
【００１３】
上述された本発明の方法の第二の実施態様において、標的核酸は、第二溶液から単離され、核酸吸着溶液は、標的核酸および少なくとも１の非標的物質を含む。第二溶液は、除去された溶解物、植物油、哺乳動物組織の除去されたホモジェネート、植物質を除去された溶解物、またはアガロースゲルにおけるゲル電気泳動によって分画された標的核酸を含む溶液を含むが、それらに限定されない多くの様々なソースのどれか１つに由来しうる。前記方法のこの実施態様は、以下のステップを含む：（ａ）共有結合した、以下に示されている一般式（Ｉ）の複数のシランリガンドを伴うシリカ固相を含む第二シラン処理シリカ基質を提供するステップ；（ｂ）第二シラン処理シリカ基質を核酸吸着溶液と混合させるステップであって、その場合、前記核酸吸着溶液のｐＨは、約ｐＨ８．０より小さく、および溶液中のカオトロピック塩濃度は、標的核酸が第二シラン処理シリカ基質に選択的に吸着され、それによって第二の複合体を形成するのに十分低い前記ステップである。
【００１４】
前記第一ならびに第二シラン処理シリカ基質の複数のシランリガンドの各々は、好ましくは一般式（Ｉ）である：
【００１５】
【化７】
2004513634.tif 000002
【００１６】
式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ、１乃至５の炭素原子を有する炭化水素鎖、１乃至５の炭素原子を有するアルコキシル基、ヒドロキシル基、酸素残基により中断された４乃至１０の炭素原子を有するアルキル鎖（５までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、ならびにヒドロキシル基からなる群から選択された基により置換される）からなる群から選択されたサブユニットであり；Ｒ３は、少なくとも１のヒドロキシル基により置換される１乃至２０までの炭素原子を有する炭化水素鎖、少なくとも１の酸素基により中断された４乃至２０の炭素原子を有するアルキル鎖（１０までの炭素原子が、ハロゲン、１乃至３の炭素原子を有するシアノ基、１乃至３の炭素原子を有するアルコキシル基、ヒドロキシル基、およびエポキシ基からなる群から選択された基により置換される）である。Ｒ１およびＲ２は、より高いオーダーのポリマーを生み出すために、独立して、他のシランリガンドへの結合ともなりうる。
【００１７】
さらに別の実施態様においては、本発明は、単一の容器に、各リガンドが上述の式（Ｉ）の構造を有する、各粒子の表面に共有結合した複数のシランリガンドを伴うシリカ固相を含む複数のシラン処理シリカ磁気粒子を含むキットを含む。
本発明の方法および物質は、アガロースゲルからのアガロース、非標的核酸、ならびにバクテリア、動物組織、血液細胞、ならびに植物油あるいは他の植物質の非標的成分を含むがそれらに限定されない様々な夾雑物からの、プラスミドＤＮＡ、ＤＮＡ断片、トータルＲＮＡ，ｍＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、増幅核酸、およびゲノムＤＮＡを含むがそれらに限定されない標的核酸を単離するために使用されうる。本発明の方法および物質は、低分子量ＤＮＡ分子（すなわち、１５０塩基対未満）と高分子量ＤＮＡの両方を単離するのに効率的である。様々な媒体から核酸を単離するための、本発明の方法と組成の応用は、後述の本発明の詳細な説明から明らかになるだろう。当業者は、本発明の詳細な説明が例示的なものにすぎないものであり、本発明の範囲を限定するものとして考えるべきではないことを理解するだろう。
【００１８】
（発明を実施するための最良の形態）
Ａ．定義
ここで使用される“アルキル鎖”という用語は、少なくとも１の酸素、窒素、または硫黄原子と任意で置換される直鎖アルカンを意味する。
ここで使用される“カオトロピック剤”という用語は、水溶液中に十分な高濃度で存在すると、そこに存在するたんぱく質を変性させ、核酸に二次構造を失わせる特定のイオンの塩を意味する。カオトロピックイオンがこれらの効果を有するのは、それらが液体水に存在する水素結合ネットワークを破壊し、それによって、変性たんぱく質および核酸を、それらの正しく折りたたまれた、あるいは配列された同等物よりも熱力学的に安定させるからであると考えられる。カオトロピックイオンは、グアニジニウム、ヨウ化物、過塩素酸塩、およびトリクロロ酢酸を含む。カオトロピック剤は、塩酸グアニジン、グアニジンチオシアネート（グアニジンイソチオシアネートと称されることもある）、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウム、トリクロロ酢酸ナトリウムを含む。
【００１９】
ここで使用される“破壊された生体物質”という用語は、バクテリア、細胞、哺乳動物組織、血液細胞、または植物質のような生体物質が破壊されると放出される、標的核酸以外の物質を意味する。破壊された生体物質は、たんぱく質、脂質、細胞破片、および非標的核酸を含むが、それらに限定されない。
ここで使用される“ガラス粒子”という用語は、クリスタリンシリカが、不定形ではなく、主にシリカで作られているガラスの粒子でもないので、正式には“ガラス”ではないが、クリスタリンまたは石英ガラスの粒子を意味する。前記用語は、石英、石英シリカ、多孔質ガラス粒子およびグラスファイバを含む。
【００２０】
ここで使用される“磁気”という用語は、常磁性または超常磁性物質である物質を含むシリカ磁気粒子を意味する。ここで使用される“磁気”という用語は、強磁性、または強磁性物質などの一時的な磁性物質も含む。以下において、そうではないことを示された場合を除いて、本発明において使用されるシリカ磁気粒子は、好ましくは含水酸化ケイ素吸着表面（すなわち、シラノール基の存在を特徴とする表面）を有する酸化ケイ素で覆われた超常磁性コアを含む。
ここで使用される“核酸”という用語は、あらゆるＤＮＡあるいはＲＮＡ分子またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子を意味する。前記用語は、プラスミドＤＮＡ、増幅ＤＮＡあるいはＲＮＡ断片、トータルＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および染色体ＤＮＡを含む。
【００２１】
ここで使用される“ｐＨ依存イオン交換シリカ磁気粒子”という用語は、あるｐＨでは陽イオン交換体として、および別のｐＨでは陰イオン交換体として作用しうる、共有結合した複数のイオン交換リガンドを伴うシリカ磁気粒子を意味する。そのような磁気粒子が、特に本発明の方法およびキットにおける使用に適しているのは、基質が、疎水性相互作用を介して前記粒子の含水酸化ケイ素吸着表面に、イオン交換を介してイオン交換リガンドに、または表面ならびにイオン交換リガンドの両方へ、溶液条件によって選択的に吸着されうるからである。
“固相”という用語は、ここでは、標準的なクロマトグラフィ的な意味で、溶質と相互作用する不溶性、通常は固い基質または固定相、この場合は、溶質混合物における標的核酸を意味する。ここで使用される固相という用語は特に、液体クロマトグラフィ（ＬＣ）、高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）での固定相、フィルタに包埋された、あるいは結合した粒子基質、および溶質混合物に直接加えられると、溶質と相互作用する磁気あるいは非磁気多孔質基質粒子を含む。
【００２２】
ここで使用される“シリカゲル”という用語は、クロマトグラフィ・グレード・シリカゲルという、多くの様々なソースから市販されている物質を意味する。シリカゲルは、ケイ酸塩を含む溶液を酸性化させることによって、例えば、ケイ酸ナトリウムを１１未満のｐＨに酸性化し、それから酸性化された溶液をゲル化させることによって最も一般的に調製される。例えばＫｕｒｔ−Ｏｔｈｍｅｒ，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２１，４ｔｈ　ｅｄ．，Ｍａｒｙ　Ｈｏｗｅ−Ｇｒａｎｔ，ｅｄ．，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ｐｕｂ．，１９９７，ｐ．１０２１で説明されたシリカの調整を参照。
【００２３】
ここで使用される“シリカ磁気粒子”という用語は、磁場を持たないが、磁場にさらされると磁気ダイポールを形成する物質、すなわち磁場があると磁気化することができるが、それ自身ではそのような場がないと磁気を帯びない物質をさらに含むシリカベース固相を意味する。
ここで使用される“表面”という用語は、固相を溶液と混合したとき、溶液に直接接触するようになる固相の支持物質の部分を意味する。
ここで使用される“標的核酸”という用語は、本発明の方法の特定の応用で単離されるべき特定の種の核酸を意味する。標的核酸は、好ましくはＤＮＡ、好ましくは約６０キロ塩基対未満の、好ましくは少なくとも約１０００塩基対、より好ましくは少なくとも約５００塩基対、より好ましくは少なくとも約２５０塩基対、さらにより好ましくは少なくとも約１５０塩基対、より好ましくは少なくとも約１００塩基対、さらにより好ましくは少なくとも約５０塩基対のＤＮＡである。標的核酸は、好ましくは少なくとも２５塩基対のＤＮＡである。
【００２４】
本発明の方法およびキットは、破壊された生体物質を溶液から除去するため、および／または溶液から、好ましくは破壊された生体物質が除去された溶液から標的核酸を単離するために使用されうる。前記方法の少なくとも１のステップにおいて、基質と固相との間、好ましくは磁気粒子基質との間の溶液において複合体が形成される。その結果の複合体はそれから前記溶液から単離され、または取り除かれる。基質が磁気粒子である場合、それは好ましくは磁場の存在下に取り除かれる。本発明の方法およびキットのあらゆる一定のステップにおいての使用に適した磁気粒子または他の固相は、前記方法の特定のステップにおいて目的の溶質との複合体を形成する能力を有する。
【００２５】
本発明の方法によれば、前記溶質は、基質を用いて、溶液から単離されるべき、または取り除かれるべき物質の種類である。破壊された生体物質は、本発明の溶解物またはホモジェネート除去方法における溶質である。標的核酸は、基質が、標的核酸や、除去された溶解物、植物油、あるいは哺乳動物組織の除去されたホモジェネートのような他の物質を含むあらゆる溶液から標的核酸を単離するために使用される。
基質／溶質複合体の形成を促進する条件は、溶質の特質および基質の特性によって変わる。例えば、基質がイオン交換磁気粒子か、またはｐＨ依存イオン交換粒子である場合、前記複合体は好ましくは、粒子の表面で、溶質とイオン交換リガンドとの間のイオン交換の結果として形成される。そのようなイオン交換相互作用を促進するために、溶質とのイオン交換を促進するため、溶液に少なくともある程度の塩がなければならず、および溶液のｐＨは、イオン交換リガンドが、溶質との交換に適した電荷を有する範囲内でなければならない。基質がシリカ、またはシリカ磁気粒子である場合、前記複合体は好ましくは、溶質と粒子との間の疎水性相互作用の結果として形成される。基質がｐＨ依存イオン交換シリカ磁気粒子である場合、前記複合体は、溶質と、粒子の酸化ケイ素表面との間の疎水性相互作用の結果として、溶質とイオン交換リガンドとの間のイオン交換の結果として、または２種類の相互作用と組み合わせの結果として形成されうる。基質がシラン処理シリカまたはシラン処理シリカ磁気粒子である場合、前記複合体は好ましくは、溶質と基質との間の水素結合を促進する条件の下で形成される。
【００２６】
前記溶質が、細胞溶解物または組織ホモジェネートに見られるような、破壊された生体物質である場合、および前記基質がシリカ磁気粒子またはｐＨ依存性イオン交換シリカ磁気粒子である場合、基質／溶質複合体は好ましくは、微量より多いアルコールまたはカオトロピック塩を含まない溶液において形成される。アルコールと、グアニジンチオシアネートまたはグアニジンイソチオシアネートのようなカオトロピック塩の両方は、そのような粒子への核酸物質の吸着を促進する。しかしながら、ホモジェネートまたは溶解物溶液における、そのようなシリカ磁気またはｐＨ依存性イオン交換粒子の濃度が、溶液を除去するには十分低いが、溶液中の多量の標的核酸に接着するほどには十分高くない場合、アルコールまたはカオトロピック塩の存在により、細胞溶解物クリアランスの本方法を実行することができるであろうと考えられる。
【００２７】
溶質が破壊された生体物質であり、かつ基質が、第一シラン処理シリカ磁気粒子のような第一シラン処理シリカ固相である場合、第一複合体である基質／溶質複合体は、好ましくは基質への、破壊された生体物質の選択的吸着を促進するのに十分高い濃度のカオトロピック塩を含む第一溶液で形成される。基質への吸着を促進するのに必要とされるカオトロピック塩の濃度は、シラン処理シリカ基質の固相の表面に結合したシランリガンドの組成ならびに濃度に、およびそこに吸着されるべき破壊された生体物質の特質に依存するだろう。あらゆる一定のシラン処理シリカ基質への、あらゆる一定の破壊された生体物質の選択的吸着を促進するのに十分なあらゆるカオトロピック塩の濃度は、単純な滴定実験を通して決定されうる。カオトロピック塩が存在する場合、カオトロピック塩濃度は、好ましくは３．５Ｍより高くなく、より好ましくは約３．０Ｍより高くない。酢酸カリウムや塩化ナトリウムなどの他の塩が第一溶液に存在する場合、基質への、破壊された生体物質の吸着を促進するのに必要なカオトロピック塩の濃度は変化しうる。
【００２８】
溶質が、標的核酸である場合、複合体の形成は好ましくは、磁気粒子への、標的核酸の可逆的吸着を促進するとして公知である少なくとも１の薬剤の存在下に実行される。可逆的吸着反応は好ましくは、標的核酸と磁気粒子との間の特異的な吸着を通して実行され、溶液中に非標的物質を残す。例えば、標的核酸が、除去された溶解物溶液から単離されているプラスミドＤＮＡである場合、前記プラスミドＤＮＡが基質と複合体を形成する一方で、たんぱく質、脂質ならびに染色体ＤＮＡのような非標的物質が溶液にとどまる条件下で、前記プラスミドＤＮＡを基質と混合する。基質がイオン交換基質である場合、前記複合体は、対イオンの存在下に、およびイオン交換リガンドが、標的核酸と交換する能力を有するｐＨの溶液中で形成される。前記基質がシリカまたはシリカ磁気粒子である場合、前記複合体の形成は好ましくは、低分子量アルコール、高濃度の非カオトロピック塩、およびカオトロピック塩、または上述のいずれかからの組み合わせからなる群から選択された薬剤の存在下に実行される。本発明での使用に適している、そのようなシリカ磁気粒子への、標的核酸の吸着および脱着方法に関しては、ＷＯ９８／３１８４０として公告され、参照によりここに組み込まれている、国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９８／０１１４９号、ＭＥＴＨＯＤＳ　ＯＦ　ＩＳＯＬＡＴＩＮＧ　ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ　ＴＡＲＧＥＴ　ＭＡＴＥＲＩＡＬＳ　ＵＳＩＮＧ　ＳＩＬＩＣＡ　ＭＡＧＮＥＴＩＣ　ＰＡＲＴＩＣＬＥＳを参照。
【００２９】
基質が、第二シラン処理シリカ磁気粒子のような第二シラン処理シリカ基質である場合、基質／核酸溶出複合体は、水素結合形成を通して、基質への核酸の吸着を促進するように構成された核酸吸着溶液中で形成される。第二シラン処理基質との水素結合形成の促進に関する好ましい条件を、以下に述べる。
一つの側面において、本発明は、破壊された生体物質、標的核酸、およびカオトロピック塩を含む第一溶液から、破壊された生体物質を除去するために第一シラン処理シリカ基質を用いる方法である。第一複合体が形成されると、前記第一溶液は、前記溶液から前記第一複合体を分離することによって除去されうる。
【００３０】
シラン処理シリカ基質の特質によって、数多くの様々な手段のいずれか一つが溶液から第一複合体を分離するために使用されうる。シラン処理シリカ基質の固相がシリカ磁気粒子（以後“シラン処理シリカ磁気粒子”）である場合、前記基質は、遠心分離法によって、ろ過によって、または磁場を用いることによって、第一複合体から分離されうる。前記基質は、好ましくは、シラン処理シリカ磁気粒子であり、および前記第一複合体は、好ましくは、磁場の存在下に第一溶液から分離される。磁場および磁気粒子の利用が好ましいのは、それらが、単離処理を自動化させることができるからである。シラン処理シリカ基質の固相がグラスファイバ、珪藻土、または他の類似した、シリカ物質の固化体である場合、前記複合体は好ましくは、遠心分離法またはろ過を用いて、第一溶液から分離される。
【００３１】
上述のように作られた、除去された溶液は、第一溶液中の第一シラン処理シリカ基質に吸着されなかった、破壊された生体物質のような少なくともいくつかの非標的物質を含むだろう。後述のような、核酸吸着溶液における第二シラン処理シリカ基質への標的核酸の吸着、核酸のアルコール沈降、およびシリカ磁気粒子（例えばＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ　常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）または多孔質ガラス粒子（ＣＰＧ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ））への標的核酸の吸着、溶液を基礎とした核酸単離手順（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　２ｎｄ　ｅｄ，Ｓａｍｂｒｏｏｋら編集、１．２１−１．５２（１９８９））の利用、アガロースゲル精製、毛細管ゲル電気泳動、または多くの他の固相に基づいた手順のうちの１の利用（例えば、ＷｉｚａｒｄＴＭ　Ｐｌｕｓ　ＳＶ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を含むがそれらに限定されない、除去された溶液から標的核酸を単離するための様々な方法が適切に使用されることができ、そのすべてはここに参照によって組み込まれている。ｐＨ依存イオン交換シリカ磁気粒子も使用されうる。（Ｂｉｔｎｅｒら、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｎａｌｙｓｅｓ，　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，　ａｎｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ＳＰＩＥ　Ｖｏｌ．３９２６（２０００）ｐｐ．１２６−１３３、および１９９９年５月１４日に出願された、アメリカ合衆国特許出願第０９／３１２，１７２号であり、その両方が参照によってここに組み込まれている）。標的核酸がｍＲＮＡである場合、それは好ましくはｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部（例えば、ＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ　ｍＲＮＡ　単離システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）；アメリカ合衆国特許第５，７３４，０２０号または５，６１０，２７４号）に特異的に吸着するためにオリゴ（ｄＴ）を利用するシステムを用いて、除去された溶液から単離される。標的核酸が、非標的核酸によって共有されない特定の、固有のシーケンスを含む場合、それも、支持表面上に固定化されたシーケンスに相補的なオリゴヌクレオチドを用いて単離されうる（例えば、アメリカ合衆国特許第５，６８３，８７５号）。
【００３２】
本方法のこの特定的な実施態様は、破壊された生体物質の、溶液からの効率的な除去のための優れた手段を提供し、それによりその結果の除去された溶液から標的核酸をさらに単離するために使用される技術の効率性を向上させる。破壊された生体物質を除去するために使用される同じ種類の基質、すなわちシラン処理シリカ基質も、後述のように、除去された溶液から、または他の溶液から標的核酸を単離するために使用されうる。
本方法の別の実施態様において、第二シラン処理シリカ基質は、水素結合形成を介して、第二シラン処理基質への標的核酸の吸着を促進するよう設計された条件下で、標的核酸および少なくとも１の非標的物質を含む核酸吸着溶液と混合する。核酸吸着溶液は、例えば、除去されたバクテリア溶解物溶液、哺乳動物組織を除去されたホモジェネート、植物組織を除去された溶解物溶液、植物油、またはアガロースゲルスライスならびにアガロースゲルからの核酸の溶液であることができる。前記核酸吸着溶液は、好ましくは、ｐＨ８．０までのｐＨを有し、好ましくは、約７．０未満のｐＨであり、より好ましくは、約６．０未満のｐＨの溶液である。前記核酸吸着溶液のｐＨは、少なくとも約ｐＨ３．５であり、より好ましくは少なくとも約ｐＨ４．０である。核酸溶液がカオトロピック塩を含む場合、カオトロピック塩濃度は、基質への、標的核酸の選択的吸着を可能にするのに十分に低く、溶液中に非標的物質を残す。カオトロピック塩がグアニジンチオシアネートである場合、好ましくは、グアニジンチオシアネートは約０．２乃至約１．０Ｍの濃度、より好ましくは約０．３乃至約０．５Ｍ、最も好ましくは約０．４Ｍの濃度で、第一溶液中に存在する。カオトロピック塩が塩酸グアニジンである場合、好ましくは、塩酸グアニジンは、約０．４乃至約１．２Ｍ、より好ましくは約０．５乃至約０．７Ｍ、最も好ましくは約０．６Ｍの濃度で、第一溶液中に存在する。酢酸カリウムまたは塩化ナトリウムのような、カオトロピック剤ではない他の塩が第一溶液に存在する場合、第二基質への核酸の吸着を可能にする核酸吸着溶液におけるカオトロピック塩の濃度は変化しうる。
【００３３】
前記核酸吸着溶液は、好ましくは、エタノールやイソプロパノールのような低分子量アルコールをさらに含む。アルコールがイソプロパノールである場合、それは好ましくは、少なくとも２５％で約５０％（体積）まで、より好ましくは少なくとも３０％で約４５％（体積）までの量の濃度で存在する。アルコールがエタノールである場合、それは好ましくは、少なくとも５０％で約９０％（体積）まで、より好ましくは少なくとも６０％で約８０％（体積）までの量の濃度で存在する。
第二複合体が形成されると、それは、上述の第一溶液から前記第一複合体を分離する際に使用するのに適しているとして説明された分離手段のいずれかを使用して、前記溶液から分離されうる。
【００３４】
第二複合体は好ましくは、前記複合体に非特異的に伴う塩または他の夾雑物を取り除くために、洗浄液で少なくとも１回洗浄される。前記洗浄液は好ましくは、約ｐＨ８．０より高くなく、より好ましくは約ｐＨ６．０より高くないｐＨを有する。前記洗浄液は好ましくは、水、より好ましくは“ＮａｎｏｐｕｒｅＴＭ”水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，　Ｂｅｄｆｏｒｄ，　ＭＡ，　Ｕ．Ｓ．Ａ．）蒸留脱イオン水、またはヌクレアーゼ・フリー水（Ｎｕｃｌｅａｓｅ−Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む。第二シラン処理磁気粒子の表面上のシランリガンドの密度が十分に低い場合、標的核酸は、水洗で第二複合体から放出されるだろう。そのような状況において、前記洗浄液は、好ましくはエタノールやイソプロパノールのような低分子重アルコールをさらに含む。前記標的核酸は、溶液のｐＨが十分に低いままであれば、可変的な非カオトロピック塩濃度（例えば、３００ｍＭ乃至約５Ｍ　ＮａＣｌ）の洗浄液があれば、第二シラン処理シリカ基質へ吸着されるままである。洗浄ステップにおいて使用される洗浄液の少なくとも１は、好ましくは、少なくとも１Ｍの塩濃度を有する。第二複合体は、最も好ましくは、後述のように、溶出の前に少なくとも３回洗浄される。
【００３５】
標的核酸は、いかなる洗浄ステップもなく、第二複合体から溶出されうる。しかしながら、前記洗浄ステップは、非標的物質からの、標的核酸のより完全な単離を確実にするので、よって好ましい。標的核酸は、好ましくは、少なくとも約ｐＨ８．０、より好ましくは少なくとも約ｐＨ９．０、そして最も好ましくは少なくとも約ｐＨ９．５のｐＨを有する溶出溶液と前記複合体とを混合させることによって、前記第二複合体から溶出される。
標的核酸がプラスミドＤＮＡである場合、本発明のシラン処理シリカ基質は、溶液条件が、基質へのプラスミドＤＮＡの吸着を促進するのに必要な通りに調整されると、プラスミドＤＮＡで形質転換され、アルカリ溶解溶液で溶解され、および “中和溶液”で処理されたバクテリアを除去された溶解物に直接加えられうる。本発明での使用に適したアルカリ溶解手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．１，２ｎｄ　ｅｄ．（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓにより１９８９年発行）、ｐｐ．１．２５−１．２８、およびＴｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏｓ２０２，２２５，ならびに２５９（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ．）に見られる。実際に、そのような手順で使用される中和溶液は、溶解物溶液のｐＨを、前記溶液におけるあらゆるカオトロピック塩の濃度が、基質へのＤＮＡの選択的吸着を可能にするのに十分に低い場合には、プラスミドＤＮＡがシラン処理シリカ基質に容易に吸着されるｐＨ５．０よりも低くする。低分子量アルコールは、好ましくは、あらゆるカオトロピック塩を希釈するため、およびそのような吸着を促進するために除去された溶解物に加えられる。第二複合体を形成するために基質に吸着されると、前記複合体は、そこからプラスミドＤＮＡを溶出するために、上述のように洗浄され、処理されうる。
【００３６】
標的核酸がＲＮＡまたはプラスミドＤＮＡ以外のＤＮＡの一種である場合、基質への標的核酸の吸着は、好ましくは基質への標的の選択的吸着を促進するように設計された条件下で実行される。ＲＮＡとＤＮＡの両方が溶液に存在する場合、非標的核酸物質は、ＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅを用いて、それぞれ基質への標的物質の吸着の前に、非標的物質を排除するために消化されうる。ある状況では、溶液条件も、基質への特異的な標的核酸の選択的吸着を促進するように設計されうる。基質へのＤＮＡまたはＲＮＡの吸着および脱着を選択的に促進するために必要とされる特定の溶液条件は、基質そのものの特性に依存するので、よって、一定の応用で使用される基質の各実施態様に関して定められなければならない。
【００３７】
本発明の方法で使用され、および本発明のキットに含まれるシラン処理シリカ基質は、シリカ固相を含んでおり、複数のシラン処理リガンドがそこに共有結合している。シラン処理シリカ基質のシリカ固相は、好ましくはシリカゲルの状態でのシリカ、酸化ケイ素、グラスファイバ、ガラスビーズあるいは珪藻土のような固体シリカ、または上述のうちの２またはそれ以上の混合物を含む。本発明の基質での使用に適しているシリカ固相の組成は、アメリカ合衆国特許第５，６５８，５４８号に説明されたシリカゲルとガラスの混合物、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／３１８４０に説明されたシリカ磁気粒子、およびプラスミドＤＮＡ単離における使用のためのＰｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって販売されている固相、すなわちＷｉｚａｒｄＴＭ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ　ＤＮＡ精製樹脂を含む。シリカゲル粒子は特に、本発明において使用されるシリカ基質でのシリカ固相として好まれる。シリカゲル粒子は、ソフトゲル支持物質から作られる固相よりもずっと高い圧力で安定しており、シリカゲル固相を、ＬＣやバッチ分離応用と同様に、ＨＰＬＣにも適するようにする。
【００３８】
本発明の方法およびキットで使用される基質は、好ましくは標的核酸、および外力を加えることによって溶質混合物を混合した後に、少なくとも１の夾雑物を含む溶質混合物から分離されることができる状態である。当業者は、溶質混合物から基質を分離する際の使用に適している外力の種類は、基質が溶質混合物に与えられる状態、および基質の固相成分の物理的属性に依存することを理解するだろう。例えば、基質が、ＬＣカラムに充填されたクロマトグラフィ樹脂の状態である場合、基質の固相が溶質混合物にバッチ式で加えられ、そこからデカントあるいはろ過によって分離されるシリカ粒子（例えば、多孔質ガラス、シリカゲル粒子、あるいはシリカ磁気粒子）の状態である場合、または基質が、またはそこに包埋された、あるいは付着した粒子あるいはクロマトグラフィ樹脂の状態であるシリカ固相を伴うシリカファイバーまたはフィルタの状態である場合、溶質混合物からシラン処理シリカ基質を分離するために重力が使用されうる。
【００３９】
前記単離方法で使用される外力は、基質が高圧液体クロマトグラフィカラム（ＨＰＬＣ）の固定相である場合、高圧液体である。本発明の方法での使用に適した他の状態の外力は、真空ろ過（例えば、基質の固相成分が多孔質ガラスの粒子、シリカゲルの粒子またはシリカ磁気粒子、またはフィルタに包埋された、あるいは付着した上述の種類の粒子のうち、１またはそれ以上の混合物である場合）、遠心分離法（例えば、基質が磁気粒子を含む粒子である場合）、または磁石（基質が磁気または常磁性粒子を含む場合）を含む。
【００４０】
基質の固相成分がシリカゲル粒子である場合、最も好ましくはシリカ磁気粒子である。シリカ磁気粒子は、上述のような別の種類の固相との使用に関して、上述された外力のいずれかを用いて溶液から分離されうる。しかしながら、他の固相とは異なり、シリカ磁気粒子は、溶液から基質を分離する迅速で効率的な手段である磁力によって、溶液から分離されうる。
基質の固相支持成分がシリカ磁気粒子である場合、好ましくは、粒子の大きさは以下のように選択される。より小さいシリカ磁気粒子は、後述されるように修飾のためのより大きな表面領域（重量単位当たり）を提供する。しかしながら小粒子は、大粒子と比較してそのような粒子へと組み込まれうる磁気物質の量において制約される。本発明の特定的に好まれる実施態様において使用される中粒子サイズのシリカ磁気粒子は、約１乃至１５μｍであり、より好ましくは約３乃至１０μｍであり、最も好ましくは約４乃至７μｍである。粒子サイズ分布も変化しうる。しかしながら、相対的に狭いモノダル粒子サイズ分布が好まれる。モノダル粒子サイズ分布は、好ましくは、粒子の重量で約８０％が、１０μｍ範囲内、より好ましくは８μｍ範囲内、最も好ましくは６μｍ範囲内の中粒子サイズであるようなものである。
【００４１】
本発明の基質の固相支持成分は、多孔質または非多孔質でありうる。固相支持体が多孔質である場合、細孔は好ましくは、標的核酸物質を、固相粒子の内部へ入れるのに十分大きく、および細孔の内側表面上の官能基あるいはシリカに結合するのに十分に大きな管理されたサイズ範囲である。しかしながら、固相支持体は、上述の溶質、すなわち破壊された生体物質か、または標的核酸のいずれかとの複合体を形成するのに十分なリガンド密度を確保するために、好ましくは多孔質である。窒素ＢＥＴ法で測定されるような、シリカ磁気粒子の合計細孔容積は、好ましくは粒子質量の少なくとも約０．２ｍ２／ｇである。窒素ＢＥＴで測定される、本発明で使用されるシラン処理シリカ基質の成分としての使用に特に好まれる多孔質シリカ磁気粒子の合計細孔容積は、好ましくは、細孔容積の少なくとも約５０％であり、６００Åかそれより大きい直径を有する細孔に含まれる。
【００４２】
シリカ磁気粒子固相は、遷移金属や揮発性有機物など、そのような物質で実質的に汚染された標的核酸の有用性に悪影響を与えうる物質を含みうる。特に、そのような夾雑物は、例えば、酵素活性を阻害し、またはそれで単離された標的核酸を切断し、あるいは劣化させることによって、そのような物質の下流プロセス、分析、および／または使用に影響を与えうる。本発明において使用される基質のシリカ磁気粒子成分に存在するあらゆるそのような物質は、好ましくは、粒子から、および本発明の方法に従って作られた、単離された生体物質へと容易にろ過されない状態で存在する。鉄は、特に生体標的物質が標的核酸である場合に、そのような望ましくない、少なくとも１の夾雑物である。
【００４３】
磁鉄鉱の状態での鉄は、本発明の基質の固相成分として使用されるシリカ磁気粒子の特に好ましい状態のコアに存在する。鉄は、２６０から２７０ナノメーター（“ｎｍ”）の間の幅広い吸収ピークを有する。標的核酸は、約２６０ｎｍにピーク吸収を持つので、標的核酸サンプルにおける鉄夾雑物は、そのようなサンプルの分光光度定量分析の結果の正確さに悪影響を与えうる。本発明を用いて標的核酸を単離するために使用されるあらゆる鉄含有シリカ磁気粒子は、好ましくは、鉄が、２６０ｎｍまたは２６０ｎｍ付近において物質の分光光度分析に干渉する程度に、鉄で十分に汚染された、単離された標的核酸物質を生成しない。
【００４４】
本発明の方法およびキットにおけるシラン処理（ｓｉｌａｎａｔｅ）したシリカ磁気粒子での固相として使用される、最も好ましいシリカ磁気粒子は、国際特許出願公開番号ＷＯ９８／３１４６１で説明されているアレシリセウスオキシド（ａｒｅｓｉｌｉｃｅｏｕｓ ｏｘｉｄｅ）でコートした粒子である。前記国際出願に含まれるシリカ磁気粒子の説明は、参照によってここに組み込まれている。好ましいシリカ磁気粒子は、次のように分析されるときに、５０ｐｐｍより多くなく、より好ましくは１０ｐｐｍより多くなく、最も好ましくは５ｐｐｍより多くない遷移金属を浸出（ｌｅａｃｈ）させる。特に、前記粒子は次のように分析される：０．３３ｇの粒子（摂氏１１０度でオーブン乾燥される）は、２０ｍｌの１Ｎ　ＨＣＬ水溶液（脱イオン水を用いる）と混合される。得られた混合物は次に、粒子を分散させるためだけに攪拌される。約１５分の合計接触時間の後、前記混合物からの液体の一部は、金属含有量を分析される。従来の元素分析技術は、得られた液体における遷移金属の量を定量化するために利用されうるが、誘導結合プラズマ分光法（ＩＣＰ）が好ましい。特に好ましい粒子に関して上で引用された仕様を満たすシリカ磁気粒子は、ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ　常磁性粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）とうブランド名で販売されている。
【００４５】
溶液からシリカ磁気粒子を分離するのに十分に強いあらゆる磁力源は、本発明の核酸単離方法における使用に適しているだろう。しかしながら、磁力は、好ましくはＰｒｏｍｅｇａ　ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅＴＭ技術磁気分離スタンド（カタログ番号Ａ５３３１乃至３、またはＺ５３４１乃至３）の１つのような、磁気分離スタンドの状態で提供される。
本発明において使用されるシラン処理シリカ基質は、好ましくは一般式のシラン試薬を用いて作られる
【００４６】
Ｒ０Ｒ１Ｒ２ＳｉＲ３　　　　　　　　（ＩＩ）
式中、Ｒ０は１乃至１０の炭素原子を有する１のアルコキシ基、好ましくは−ＯＣＨ３，−ＯＣ２Ｈ５，あるいは−ＯＣ３Ｈ７、または１のハロゲン原子、好ましくは−Ｃｌ、または１乃至６の炭素原子を有する同一の、あるいは異なるアルキル基を伴う１のジアルキルアミノ基に相当し、Ｒ１およびＲ２は、１乃至１０の炭素原子を有する炭化水素基、−ＣＨ３，−Ｃ２Ｈ５あるいはＣ３Ｈ７、または１乃至１０の炭素原子を有するアルコキシ基、好ましくは‐ＯＣＨ３，−ＯＣ２Ｈ５，あるいは−Ｃ３Ｈ７、または少なくとも１の酸素あるいはアミノ基によって中断される４乃至２０の炭素原子を有する１のハロゲン原子あるいは１のアルキル基に相当し、前記基は、１回かそれ以上、ハロゲン、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、ヒドロキシ基またはアリル基とも置換されることができ、およびＲ３は、１乃至２０の炭素原子を有する炭化水素鎖または少なくとも１の酸素あるいはアミノ基によって中断されるまたはアルキル基に相当し、前記基は、１回またはそれ以上、ハロゲン、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、モノアルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アルコキシル基、ヒドロキシ基、アリル基および／またはエポキシ基、好ましくは一般式（ＩＩＩ）のエポキシ基とも置き換えられうる：
【００４７】
【化８】
2004513634.tif 000003
【００４８】
シラン化試薬は、好ましくは３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランである。シランとシリカ固相との比は、固相表面に接着した、異なる密度のシランリガンドを伴う基質を作るように調整されうる。
シラン化試薬を、シリカ固相に直接加えて反応させてもよい。しかしながら、シラン化試薬は好ましくは、シリカ固相への追加、ならびにシリカ固相との反応の前に、トルエンなどの有機溶媒に溶解される。シラン化反応は、シラン化試薬が安定しおよびシリカ固相と反応するいずれの温度でも行うことができる。前記反応は、好ましくは少なくとも４時間、より好ましくは少なくとも６時間、室温において試薬／固相混合物のインキュベーションによって実施される。
【００４９】
上述のように作られた、本発明の方法およびキットにおいて使用されるシラン処理シリカ基質でのシリカ固相に接着する複数のシランリガンドの各々は、上述の一般式（Ｉ）によって包括される構造を有する。シラン処理シリカ基質のシリカ固相に接着した、最も好ましい状態のリガンドは、一般式（ＩＶ）の構造有する：
【００５０】
【化９】
2004513634.tif 000004
【００５１】
式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立に‐ＯＨ，−ＣＨ３，−ＯＣＨ３，−ＯＣＨ２ＣＨ３である。
本発明の固相基質は、標的核酸の単離において使用されるように設計されている。上述のリガンド構成およびリガンド密度の両方が、一定の標的核酸の最適な吸着および脱着を確保するよう調整されうる。例えば、短いＤＮＡ断片（すなわち、長さが１５０塩基対未満）を単離するための適切なリガンド密度を伴う固相を識別するための可変的な長さを有するＤＮＡ断片を単離するために、可変的なリガンド密度を伴うシラン処理（ｓｉｌａｎａｔｅ）されたシリカ磁気粒子が使用された例である、後述の実施例８を参照。
【００５２】
以下の、非限定的な実施例は、本発明の様々な実施態様を教示する。実施例において、および本明細書ならびに特許請求の範囲の他の部分において、別に特定されていない限り、容積ならびに濃度は室温におけるものである。後述の実施例において使用される磁気シリカ粒子はすべて、一般的に好ましい大きさおよびここに説明された酸化ケイ素コーティングを有し、かつ後述の実施例３において説明されるように修飾された多孔質ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子であった。後述の実施例において使用される多孔質ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子は、以下の特性を有する２バッチの粒子のいずれかから用いた：（１）５５ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積、＜６００Åの直径を有する粒子に関して、０．１８１ｍｌ／ｇの細孔容積、＞６００Åの直径を有する粒子に関して、０．１６３ｍｌ／ｇの細孔容積、５．３μｍの中粒子サイズ、およびＩＣＰを用いて上述されたように検査される時、２．８ｐｐｍの鉄ろ過；または（２）４９ｍ２／ｇのＢＥＴ表面積、０．１６０ｍｌ／ｇの細孔容積（＜６００Å直径）、０．１６３ｍｌ／ｇの細孔容積（＞６００Å直径）５．５μｍの中粒子サイズ、および２．０ｐｐｍの鉄ろ過である。
【００５３】
本発明の当業者は、後述の実施例３で説明されたように作られ、および以下の実施例で使用されるシラン処理シリカ磁気粒子の特定の実施態様を除く、本発明の方法ならびにキットでの使用に適した基質を選択するために、本開示の教示を用いることができる。特に、前記実施例は、本発明の範囲を制約するように解釈するべきではない。他の修飾シリカ磁気粒子、およびそれを用いて本発明に従って標的物質を単離する方法は、クロマトグラフィ分離および分子生物学の当業者に明らかになるだろう。
【００５４】
実施例
以下の実施例は、本発明の範囲を制約することなく、その様々な特徴を説明するために与えられる。
実施例１−ゲル電気泳動
後述の実施例で説明された手順に従って単離される標的核酸のサンプルは、非標的核酸による汚染に関し、および以下のようなサイズに関し分析された。サンプルは、適切な密度のアガロースゲルで分画された（例えば、１．０％アガロースゲルが、プラスミドＤＮＡを分析するために使用された一方で、４．０％のアガロースゲルが、ＲＮＡを分析するために使用された。）分画された核酸は、臭化エチジウムのような核酸反応性染色でゲルを染色することによって検出された。その結果分画され染色されたゲルが写真に撮られた。
ある場合には、サイズ標準が標的核酸と同じゲル上で分画され、および適切なサイズの標的核酸を決定するために使用された。ゲル検査が実行されたすべての場合において、分画された核酸の写真は、非標的核酸による汚染に関して調べられた。例えば、プラスミドＤＮＡの分画されたサンプルの画像は、同じゲル上でＤＮＡよりもずっと迅速に動くＲＮＡがないか調べられ、および同じゲル上でプラスミドＤＮＡよりもずっと遅く動く染色体ＤＮＡに関して調べられた。単離されたプラスミドＤＮＡの画像も、画像に示されたプラスミドＤＮＡのほとんどが完全な、超らせんプラスミドＤＮＡであるかどうか決定するために調べられた。
【００５５】
実施例２−吸収分光測光法
後述のように、様々な媒体から単離された標的核酸のサンプルは、吸収分光測光法を用いても分析された。吸収測定は、２６０，２８０および２３０ナノメートル（ｎｍ）の波長で行われた。Ａ２６０／Ａ２８０吸収比は、測定値から算出された。１．７０よりも大きいか、またはそれに等しいＡ２６０／Ａ２８０は、そこで分析されたサンプルが、相対的にたんぱく質汚染がないことを示すと解釈される。各サンプルにおける核酸の濃度は、２６０ｎｍ（Ａ２６０）での吸収読み取り値から決定された。１．０のＡ２６０は、５０μｇ／ｍｌの二本鎖ＤＮＡを示す。たんぱく質やフェノールなどのペプチド結合または芳香族基を含む夾雑物は、２３０ｎｍで吸収する。
【００５６】
実施例３　−　グリシジル修飾ＭＡＧＮＥＳＩＬＴＭ粒子の調製
ＭａｇｎｅｓｉｌＴＭ粒子（Ｐｒｏｍｅｇａ）は、ろ過し、アセトンですすぎをし、それから一晩室温で換気フード内で乾燥させ、その後少なくとも２時間、真空状態下で、摂氏６０−７０度で乾燥させることによって、水懸濁液から乾燥された。前記粒子は、シラン化反応で使用されるまで、デシケータで保存された。
【００５７】
１．　５ｇのＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子が、モーター駆動攪拌装置を備えたフラスコの中で、２００ｍｌのトルエンに懸濁された。
２．　１５ｍｌの３−グリシドキシプロピルトリメトキシシランは、１００ｍｌのトルエンの中に溶解され、反応フラスコに加えられた。
３．　前記反応は、以下の実施例で示されることを除いて、還流せずにおよそ６時間、室温で攪拌された。
４．　粒子は、上述のステップ２で使用されたトルエンにおいて少なくとも３回洗浄され、毎回磁場で溶媒から粒子を分離する。同じ粒子が、同じ方法で、アセトンにおいても少なくとも２回洗浄された。
５．　最終洗浄ステップの後、前記粒子懸濁液はろ過され、室温で換気フード内で乾燥され、それからさらに摂氏６０−７０度の真空下で乾燥された。
元素分析のために提出された、乾燥した粒子のサンプルは、以下の一般式（ＶＩ）の構造を有するシラン処理シリカ磁気粒子と一致していた。以下の式の波線は、ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子の表面を表している。
【００５８】
【化１０】
2004513634.tif 000005
式中、Ｒ１およびＲ２は各々独立して‐ＯＨ，−ＣＨ３，−ＯＣＨ３または−ＯＣＨ２ＣＨ３である。上述のように作られたシラン処理ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子は、以後“グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子”と称される。グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子は以下の実施例で使用された。
【００５９】
実施例４−プラスミドＤＮＡの溶解物の調製
Ｅ．ｃｏｌｉバクテリア細胞、ＤＨ５α菌株は、ｐＧＥＭＴＭ−３ｚｆ＋プラスミドＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で形質転換され、摂氏３７度で、Ｌｕｒｉａ−Ｂｒｏｔｈ（“ＬＢ”）培地で一晩増やし、それから遠心分離法で採取された。
以下の溶液は、後述のように採取された細胞の溶解物を調製するために使用された：
【００６０】
細胞再懸濁溶液
５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ７．５
１０ｍＭ　ＥＤＴＡ
１００μｇ／ｍｌ　ＤＮａｓｅフリー・リボヌクレアーゼＡ
（ＲＮａｓｅ　Ａ）
中和溶液、ｐＨ４．２
０．５Ｋ＋
４．２Ｍ　ＧＴＣ（グアニジンチオシアネート）
１．９Ｍ　ＯＡｃ−
細胞溶解溶液：
０．２Ｍ　ＮａＯＨ
１％　ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）
【００６１】
形質転換した細胞の溶解物は、以下のように作られた：
１．　１乃至１０ｍｌのバクテリア培養組織からの細胞は、マイクロ遠心分離器の最高速度で、１−２分間、培養組織を遠心分離することによって採取された。採取された細胞は、２５０μｌの細胞再懸濁溶液に再懸濁され、およびマイクロ遠心分離管へと移された。その結果の、再懸濁細胞の溶液は濁っていた。
２．　２５０μｌの細胞溶解溶液が再懸濁細胞の溶液に加えられ、および前記溶液が相対的に、再懸濁細胞が溶解されたことを示す透明になるまで反転によって混ぜられた。
３．　３５０μｌの中和溶液が結果としての溶解物に加えられ、混ぜられた。前記溶解物は、中和溶液が加えられた後、濁った。
上述のように調製された溶解物の各サンプルは、後述のように、遠心分離法によって、またはＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子あるいはグリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子を用いることによって除去された。
【００６２】
実施例５−グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子での溶解物除去ならびにプラスミドＤＮＡ単離と、イソプロパノールを伴うならびに伴わないＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子との比較
Ａ．溶解物クリアランスおよびＤＮＡの単離
ｐＧＥＭＴＭ−３ｚｆ＋（Ｐｒｏｍｅｇａ）で形質転換された１００ｍｌの一晩培養したＤＨ５α細胞は、３６の異なる管の各々に分取され、遠心分離法で採取され、およびその溶解物を作るために、上述の実施例４で説明されたように処理された。得られた溶解物は、以下の３の方法のうちの１を用いて除去された。１２管の１組からの溶解物は、１６，０００ｘｇで１０分間の遠心分離により、および別個の清潔な試験管への移動により除去された。別の１２管の一組からの溶解物は、５ｍｇのＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子（１００ｍｇ／ｍｌの５０μｌ）を用いて除去された。最後の１２管の組からの溶解物溶液は、５ｍｇのグリシジルＭａｇｎｅＳｉｌを用いて除去された。磁気粒子が使用されたそれぞれの場合において、前記粒子は、各管における脂質、たんぱく質、および細胞破片のような物質に吸着するようにされ、磁力によって前記管の片側に引っ張られ、そして残りの除去された溶解物は清潔な試験管へと移された。
【００６３】
１２サンプルの各組は、それぞれ４サンプルの３のサブセットに分割された。以下の種類の常磁性粒子および溶液は、それに含まれるプラスミドＤＮＡに吸着するために、第一のサンプルの組に加えられた：（ａ）ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子（１００ｍｇ／ｍｌの１００μｌ）が、イソプロパノールを加えずに４のサンプルの各組の第一へと加えられ、（ｂ）ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子（１００ｍｇ／ｍｌの１００μｌ）が、各サンプルごとに６００μｌのイソプロパノールとともに、４のサンプルの第二の組に加えられ、および（ｃ）グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子が、各サンプルごとに６００μｌのイソプロパノールとともに、４のサンプルの第三の組に加えられた。すべてのサンプルは周期的に混ぜられ、および１０分間摂氏２０度でインキュベートされた。
【００６４】
前記粒子は、磁力を用いて各溶液から分離され、および上清は取り除かれ、廃棄された。
各組の粒子は、１．０ｍｌの洗浄溶液（８０％エタノール、２０％純水、容積／容積）で、３回洗浄された。三回目の洗浄の後、前記粒子は２０分間、摂氏２０度で空気乾燥された。
最後に、１００μｌの溶出溶液（２００ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ　ｐＨ９．５）が、各サンプルに加えられた。前記粒子に溶出溶液を足したものは、摂氏６５度で、ふたを外して５分間インキュベートされた。インキュベーション期間の終了時に、１００μｌになるまで、各管に合計容積の溶液を戻すために、１０μｌの純水が各管に加えられた。すべての管は１６，０００ｘｇで５分間遠心分離され、および後述のように、上清は分析のため清潔な管に移された。
【００６５】
Ｂ．結果の検査
上述のように作られた溶出液の各々のサンプルは、上述の実施例１で説明されたように、ゲル電気泳動によって検査された。ＤＮＡラダーは、溶出液ＤＮＡのバンドのサイズが、対象となるプラスミドＤＮＡに期待されるサイズに相当するか確認するため、２レーンのゲルで移動した。ゲル電気泳動検査結果は、図１に示されている。期待されるサイズが確認された。サンプルのいずれにおいても劣化またはＲＮＡ汚染の証拠がなく、各サンプルにおける完全なプラスミドＤＮＡが検出された。サンプルの各々がゲルに載せられる順番は、下の表Ｉに示されている：
【００６６】
【表１】
（表Ｉ）
2004513634.tif 000006
【００６７】
溶解物をＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子で除去することによって作られたすべてのサンプルにおけるＤＮＡの量は、テストされた３のプロトコルのどれが、それによって作られた除去された溶解物からプラスミドＤＮＡを単離するために使用されたとしても、グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子で除去することによって作られたＤＮＡの量よりもずっと少なかった。ＤＮＡの量および質は、そこからＤＮＡを単離するために使用される方法にかかわらず、テストされた、１２の除去された溶解物サンプルの各組内で比較することができるようであった。特に、ゲル検査結果は、すべてのプラスミドＤＮＡが完全であり、汚染されていないようであることを示していた。
すぐ上の、セクションＡに説明されたように作られたすべての溶出サンプルでも、実施例２において説明されたように、分光測光法検査が実施された。各分光測光走査は、４００μｌのキュベットで、３８０μｌの２００ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＬ、ｐＨ９．５で希釈された、２０μｌの各溶出液で実行された。上述の４のサンプルの各組からの読み取り値の平均は、以下の表ＩＩに示されている：
【００６８】
【表２】
（表ＩＩ）
2004513634.tif 000007
【００６９】
グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子を用いて除去された溶解物から単離されたＤＮＡの収量は、表ＩＩのＡ２６０の読み取り値によって示されているように、遠心分離法で除去された溶解物のＤＮＡの収量に類似した。ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子で除去された溶解物から単離されたＤＮＡの収量は、テストされた他の溶解物クリアランス法のいずれかを用いて得られたものよりもずっと低かった。
【００７０】
上の表ＩＩに記載された分光測光法検査の結果は、同じ方法が、溶解物のサンプルの３組と、および上述の３の異なる単離方法を用いてそこから単離されたＤＮＡを除去するために使用された場合、前記組における各サンプルから単離されたＤＮＡの量は、どの単離方法が使用されたかにかかわらず、類似していたことも示している。上述の単離されたすべてのＤＮＡサンプルの純度は、イソプロパノールを含まないＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子（サンプル１３−１６）で除去され、かつ単離されたサンプルのそれを除いては、高いようだった。そのような特定の粒子を除いては、すべてのものは、高い純度を示し、少なくとも１．７５のＡ２６０／Ａ２８０比を有していた。しかしながら、同じ溶解物クリアランス法を用いて処理されたすべてのサンプルの組において、グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子（イソプロパノール添加）を用いて単離されたＤＮＡが、最高の純度を有しており、同じイソプロパノール添加のＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子を用いて単離されたＤＮＡは次に高い純度を有し、およびイソプロパノールを添加していないＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子で単離されたＤＮＡは、Ａ２６０／Ａ２８０比によって決められるとおり、前記３の方法の最低純度を有する。
分光測光法の結果は、上述のゲル検査で得られた結果と一致していた。
【００７１】
実施例−６　ひまわりの種子の溶解物の調製、ならびにそこから純化されたＤＮＡ
新鮮なひまわりの種子の外皮が取り除かれ、そして前記種子は、（サンプルごとに）以下のものを含む約１Ｍのカオトロピック塩を含む溶液において別個に溶解された：２５０μｌのＷｉｚａｒｄＴＭ　ゲノム核溶解溶液（ＰｒｏｍｅｇａカタログＮｏ．Ａ７９４３）＋５００μｌ（４Ｍ　ＧＴＣ，０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ７．５）＋Ｒｅｔｓｃｈ（Ｈａｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）ミキサーで２回、各混合サイクルは２分間、スチールビーズと混合された５μｌのＲＮａｓｅ　Ａである。
４の種子はこの方法で処理され、そのうちの２は、Ｒｅｔｓｃｈミキサーでのそれらの混合の前に、１００ｍｇのポリビニルポリポロリドン（以後ＰＶＰＰ）（Ｓｉｇｍａ　Ｐ−６７５５，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）も加えられた。それ以外の２はＰＶＰＰを含んでいなかった。
【００７２】
ＰＶＰＰを伴う１のサンプルと、ＰＶＰＰを伴わない１のサンプルは、溶解物を除去するために、１６，０００Ｘｇで１０分、遠心分離された。ＰＶＰＰを伴う他方のサンプルおよびＰＶＰを伴わない他方のサンプルはそれぞれ、２０μｌ（２ｍｇ）のグリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子と混ぜられ、および破片と粒子は、磁力を用いて管の片側に引き寄せられた。
４のサンプルからの上清は、２５μｌ（２．５ｍｌ）のＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子を含む１．５ｍｌの管を清潔にするために取り除かれ、およびＤＮＡをＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子と結合させるために１０分培養された。上清はそれから取り除かれ、および粒子は、２５％イソプロパノール、２５％エタノール、０．２Ｍ　ＮａＣｌおよび１０ｍＭ　ＥＤＴＡの１ｍｌを含む洗浄溶液で３回洗浄され、上清は各洗浄後に取り除かれた。前記粒子は、２０分間摂氏２０度で乾燥され、１００μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．０で溶出された。
【００７３】
１０μｌの各溶出液サンプルは、アガロースゲルに載せられ、およびゲル電気泳動によって分離された。臭化エチジウムで染色された、その結果のゲルの写真が図２に示されている。ゲル検査結果は、同様のＤＮＡ収量が、遠心分離法によって、およびグリシジルＭａｇｎｅＳｉｌ粒子を用いた磁気除去により得られた。ＰＶＰＰを含むサンプルは収量の減少を示したが、除去のためにグリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子を用いた収量は、遠心分離法を用いて除去されたサンプルからの収量よりも高かった。
４つすべてのサンプルは、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）およびＲＡＰＤ（ランダム増幅多型ＤＮＡ、アメリカ合衆国特許第５，１２６，２３９号参照）で優れた増幅を示した。
【００７４】
実施例７−コーン油からのＤＮＡの単離
地元のスーパーマーケットからのコーン油のサンプルが、ＤＮＡ含有量に関して評価され、および視認できるＤＮＡを含むボトルが、この実施例に関して使用された（臭化エチジウムで染色した４％アガロースゲルで視覚化するのに十分なＤＮＡをすべてのボトルが含んでいたわけではない。）後述の方法がこれら他の油サンプルからＤＮＡを純化するが、その結果は、それほど容易には視覚化されない。
それぞれ２０ｍｌのコーン油を含む４の管は、各管に以下の溶液を加えられた：２００μｌのＷｉｚａｒｄＴＭ　ゲノム核溶解溶液＋１００μｌ　ＳＶトータルＲＮＡ溶解溶液＋２００μｌのＳＶトータルＲＮＡ希釈溶液（溶解溶液組成に関する実施例６を参照）である。前記管は室温での２０分の培養中、数回勢い良く混ぜられた。前記管は、それから３０００Ｘｇで５分間遠心分離にかけられ、それからより低い、水相は管をきれいにするために取り除かれた。これらの管のうちの２は、抽出された物質のサンプルを得るためにプールされた。残りの２の管のうち、１のサンプルは、１００μｌのＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子を加えられ、他方は、１００μｌのグリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子を加えられた。
【００７５】
これらの管の各々は、５０μｌの、１．３２Ｍ　酢酸カリウム、ｐＨ４．８が加えられた。それから４００μｌのイソプロパノールが各管に加えられた；および前記管は、室温での２０分間の培養中、周期的ボルテックスによって混ぜられた。
前記管はそれから５分間マグネチックラックに載せられ、そして上清は取り除かれた。粒子は、１．０ｍｌの純水で再懸濁され、上清は取り除かれた。この水洗浄は２回繰り返され、合計で３回洗浄した。ＤＮＡはそれから５０μｌの２００ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＬ　ｐＨ９．５に溶出された。
溶出液がゲル電気泳動によって分析されると、実施例１で説明されたように、ＤＮＡはグリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子を用いてコーン油から単離されたことがわかった。しかしながら、ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子を用いて処理されたサンプルでは、ＤＮＡがまったく検出されなかった。
【００７６】
実施例８−グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子を用いたＤＮＡの純化
様々な長さのＤＮＡが、グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子に結合し、およびグリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子から溶出された。５０μｌ（５ｍｇ）の、可変的なリガンド密度を伴うグリシジル修飾ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子が、３０μｌのＰｒｏｍｅｇａの１００ｂｐＤＮＡラダー（カタログ＃Ｇ６９５１）に加えられた。３０μｌの６６ｍＭ　ＫＯＡｃ　ｐＨ４．８が、ボルテックスで混ぜられた、結果としての混合物に加えられ、そして室温で２０分間培養された。培養の後、実施例１で説明されたように、粒子は磁場で溶液から分離され、およびそこから溶液のアリコートが取り除かれ、１１μｌの各アリコートは、１００ｂｐラダーの３μｌのサンプルの次に電気泳動された。図３Ａは、溶液に残ったＤＮＡが、より低いリガンド密度を伴うグリシジル修飾ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子（レーン３乃至６）に結合してないことを示している。しかしながら、上述の実施例３で説明されたように調製された、高リガンド密度グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子において、非結合ＤＮＡはまったく見られなかった。
【００７７】
前記溶液は各管から取り除かれ、および前記粒子は２．０ｍｌの純水で２回洗浄された。ＤＮＡは室温で５分間、５０μｌの１０ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣＬ　ｐＨ８．０で溶出され、磁気分離の後、短時間のボルテックスによりグリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子を溶液に混ぜることによって得られた１０μｌの溶出溶液のサンプルの次に、１０μｌの溶出溶液が電気泳動された。これは、Ｐｒｏｍｅｇａ１００ｂｐＤＮＡラダー溶液の３μｌのサンプルと比較された。図３Ｂは、水洗浄中、高リガンド密度グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子にＤＮＡが残っていたこと（レーン３）、および低分子量バンド（例えば１００ｂｐ）が、より大きな（例えば６００ｂｐ）ＤＮＡ断片と同様の効率性で純化されたことを示す、ゲル電気泳動の結果の写真である。ゲルのレーン４は、溶出の後に電気泳動されたグリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子のアリコートである。ゲルのレーン１はＤＮＡラダーである。残りのグリシジル修飾ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子へ結合した、および残りのグリシジル修飾ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子から溶出されたＤＮＡの量は、減少するリガンド密度とともに顕著に減少する。
【００７８】
実施例１０−グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子およびＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子を用いた、アガロースゲルスライスからのＤＮＡの純化
Ｐｒｏｍｅｇａの２５ｂｐＤＮＡラダー（カタログ＃Ｇ４５１１）は、２００Ｖで２０分間、１％アガロースゲル（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）で移動し、およびＤＮＡを含むアガロースゲルスライスはゲルから切除された。ゲルスライスの重量は３．７ｇｍであり、および５０ｍｌ管で、３．７ｍｌの４．２Ｍグアニジンチオシアネート、０．５Ｍカリウム、１．９Ｍ酢酸、ｐＨ４．２と混合された。前記管は、すべてのゲル断片が溶解されるまで、摂氏６０度で３０分間培養された。
【００７９】
その結果の融解したゲルスライス溶液の５００μｌサンプルが、５０μｌ（５ｍｇ）のグリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌあるいは５０μｌ（５ｍｇ）のＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子のいずれかを含む１．５ｍｌ管に加えられた。各粒子の２のサンプルは、イソプロパノール（ＩＰＡ）を追加されておらず、および各種類の粒子の４のサンプルは、５００μｌのＩＰＡが追加されていた（合計１２サンプル）。これらの管は、ＤＮＡに粒子と結合させるように摂氏２０度で２０分間培養され、および前記管は５分間、磁気分離ラックに載せられた。
前記溶液はそれから管から取り除かれた。前記管はそれから、後述のように、水（１洗浄ステップにつき１．０ｍｌで２回）または８０％エタノール（１洗浄ステップにつき１．０ｍｌで３回）のいずれかで洗浄された。洗浄後、エタノール洗浄された粒子は、室温で２０分間乾燥された。
【００８０】
乾燥した粒子は、そこに吸着したＤＮＡを溶出するために、３０μｌの２００ｍＭ　ＴｒｉｓＨＣｌ　ｐＨ９．５と混合した。１０μｌの各溶出液サンプルが、実施例１で説明されたとおり、４％アガロースゲルに載せられ、ゲル電気泳動によって分画された。
図４は、上述のとおりに作られた電気泳動ゲルの写真である。表ＩＩＩは、図４におけるゲルの最上レーンにどのサンプルが載せられたかを示す。表ＩＶは、図４に記載のゲルの下半分のレーンの各々に載せられたサンプルを示す。
【００８１】
【表３】
（表ＩＩＩ）（トップウェル）
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【００８２】
【表４】
（表ＩＶ）（ボトムウェル）
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【００８３】
図４に見られるように、グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌ粒子は、２５ｂｐＤＮＡラダーの低分子量断片（２５ｂｐ断片はそれほど容易には見えない）を結合したが、ＭａｇｎｅＳｉｌＴＭ粒子は、試験された条件下で、グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌと同様に、それらを結合しなかった。５０ｂｐ、７５ｂｐ、１００ｂｐおよび１２５ｂｐ断片の相対的復元は、レーン５，６，８および９の中で見られるように、グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌを用いて互いに類似していた。グリシジル‐ＭａｇｎｅＳｉｌの使用は、アルコール洗浄を用いるときに必要となる乾燥ステップを排除する、これらの条件下（酸性ｐＨ）で、水での洗浄後のＤＮＡの復元も可能にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ゲル電気泳動によるアガロールゲルでの分画の後、前述の実施例５で説明された様々な手段を用いてＥ．ｃｏｌｉバクテリア細胞の溶解物から単離されたプラスミドＤＮＡの写真である。
【図２】
ゲル電気泳動によるアガロースゲルでの分画の後、前述の実施例６で説明された様々な手段を用いてひまわりの種から単離されたＤＮＡの写真である。
【図３Ａ】
グリシジル修飾したシリカ磁気粒子へのＤＮＡの吸着の後、および実施例８で説明されたように、ゲル電気泳動によるアガロースゲルでの分画の後の、ＤＮＡラダーを含む核酸吸着溶液の写真である。
【図３Ｂ】
実施例８で説明されたように、様々なグリシジル修飾シリカ磁気粒子からの溶出の後、ゲル電気泳動によって分画されたＤＮＡの写真である。
【図４】
ゲル電気泳動による分画の後、実施例９で説明されたように、アガロースゲルシリカから単離されたＤＮＡの写真である。
【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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