(57)【要約】組換えＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞を使用して、発酵ブロスから精製され、かつ結晶化され得るエポシロンおよびエポシロンアナログを含むポリキチドを生成し得る。本発明は、組み換え発現ベクターであって、異種ＰＫＳ遺伝子をコードし、そしてこれらのベクター上でこの遺伝子によってコードされるＰＫＳ酵素によって合成されるポリケチドを生成する組み換え発現ベクター、を含むＣｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ亜目の組み換え宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、宿主細胞は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属またはＳｔｉｇｍａｔｅｌｌａ属由来である。特に好ましい実施形態において、宿主細胞は、Ｍ．ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ、Ｍ．ｆｕｌｖｕｓ、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ、Ｍ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ｅｒｅｃｔａ、およびＳ．ａｕｒａｎｔｉａｃａからなる群より選択される。
2004508810.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え発現ベクターを含む、Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ亜目の組換え宿主細胞であって、該ベクターは、異種ポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）遺伝子をコードし、かつ該ベクター上にコードされるＰＫＳ酵素によって合成されるポリケチドを生成する、組換え宿主細胞。
【請求項２】
Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科から選択される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項３】
Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科から選択される、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項４】
Ａｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ、ＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓおよびＣｏｒａｌｌｏｃｏｃｃｕｓからなる群より選択される属から選択される、請求項２に記載の宿主細胞。
【請求項５】
Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｌｉｔｔａｎｇｉｕｍ、ＳｔｉｇｍａｔｅｌｌａおよびＡｒｃｈａｎｇｉｕｍからなる群より選択される属から選択される、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項６】
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属から選択される、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項７】
Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ属から選択される、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項８】
Ｍ．ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ、Ｍ．ｆｕｌｖｕｓ、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓおよびＭ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓからなる群より選択される、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項９】
Ｓ．ｅｒｅｃｔａおよびＳ．ａｕｒａｎｔｉａｃａからなる群より選択される、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓである、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
前記Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ亜目の宿主細胞中でポリケチドを生成するための方法であって、該ポリケチドは、該宿主細胞中に天然に生成されず、該方法は、該ベクター上でコードされるＰＫＳ遺伝子が発現され、そして該ポリケチドが生成されるような条件下で、請求項１に記載の宿主細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項１２】
エポシロンまたはエポシロン誘導体を生成する、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１３】
エポシロンまたはエポシロン誘導体を生成する、請求項１０に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
エポシロンＡ、エポシロンＢ、エポシロンＣおよびエポシロンＤを生成する、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　Ｋ１１１−３２．２５である、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
主要生成物としてエポシロンＡおよびエポシロンＢを生成し、副生成物としてエポシロンＣおよびエポシロンＤを生成する、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
主要生成物としてエポシロンＣおよびエポシロンＤを生成する、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
ｅｐｏＫ遺伝子を含まないか、または完全に機能的なｅｐｏＫ遺伝子産物を発現しないかのいずれかである、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　Ｋ１１１−４０．１である、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　Ｋ１１１−７２．４．４である、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
エポシロンＰＫＳ遺伝子を含み、ここで、該ＰＫＳのモジュールに対するコード配列が、変異、欠失または置換によって変更されている、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記モジュールが伸長モジュール６である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記モジュールが機能的ケトレダクターゼドメインを欠失し、かつ９−ケトエポシロンを生成する、請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記モジュールが伸長モジュール５である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記モジュール５が機能的デヒドラターゼドメインを欠失し、かつ１３−ヒドロキシエポシロンを生成する、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記モジュールが伸長モジュール４である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記モジュールが機能的ケトレダクターゼドメインを欠失し、かつ１３−ケトエポシロンを生成する、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
請求項２１に記載の宿主細胞であって、ここで、前記モジュールが伸長モジュール２であり、前記ケトレダクターゼドメインに対するコード配列が変異によって変更されて、活性部位システインを別のアミノ酸に変更し、そして該宿主細胞は、エポシロンまたはエポシロン誘導体を生成するために、ジケトン等価化合物を提供されなければならない、宿主細胞。
【請求項２９】
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ９０−１３２．１．１．２である、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記モジュールが伸長モジュール１である、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記モジュールが変更され、その結果、該モジュールがシステイン以外のアミノ酸に結合する、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
前記モジュールが荷重モジュールである、請求項２１に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
前記モジュールがアミノ酸に結合するモジュールで置換されている、請求項３２に記載の宿主細胞。
【請求項３４】
以下の式：
【化１】
2004508810.tif 000093
のエポシロン誘導体であって、該誘導体は、以下の式：
【化２】
2004508810.tif 000094
のジケトン等価化合物を用いて請求項２８に記載の宿主細胞を培養することによって生成され、
ここで、Ｒ７は、水素またはメチルであり、そしてＡｒは、以下：
【化３】
2004508810.tif 000095
からなる群より選択されるアリールであり、
ここで、Ｒは、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、Ｃ１ｃＣ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５ヒドロキシアルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、およびＣ１〜Ｃ５アミノアルキルである、エポシロン誘導体。
【請求項３５】
請求項１に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞は、前記ポリケチドの生合成において利用される該細胞中に化合物を輸送する酵素、該ポリケチドの生合成において利用される化合物を合成する酵素、およびＰＫＳをホスホパンテテニル化する酵素、からなる群より選択される酵素をコードする異種遺伝子をさらに含む、宿主細胞。
【請求項３６】
前記酵素がＭａｔＢである、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
前記酵素がＭａｔＣである、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３８】
前記酵素がＭｔａＡである、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
請求項１３に記載の宿主細胞であって、ここで、前記エポシロンまたはエポシロン誘導体が、Ｓ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍエポシロンＰＫＳ遺伝子由来のプロモーター、ミクソチアゾール生合成遺伝子由来のプロモーター、ＴＡ生合成遺伝子由来のプロモーター、ｐｉｌＡプロモーター、カナマイシン耐性付与遺伝子由来のプロモーター、およびＳｏ　ｃｅ９０プロモーターからなる群より選択されるプロモーターの制御下で、ＰＳＫ遺伝子によって生成される、宿主細胞。
【請求項４０】
エポシロンを生成する細胞からエポシロンを精製するための方法であって、該方法が、ＸＡＤ樹脂の存在下で該細胞を培養する工程、該樹脂からエポシロンを溶離する工程、該樹脂から溶離されたエポシロンの固相抽出を行う工程、および該固相樹脂抽出から得られたエポシロンでクロマトグラフィーを行う工程、を包含する、方法。
【請求項４１】
結晶化段階をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
結晶エポシロンＤ。
【請求項４３】
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞の発酵のための方法であって、該方法が、炭素供給源として脂肪酸または油を含む液体培地中において該細胞を培養する工程を包含する、方法。
【請求項４４】
前記発酵がフェッドバッチ発酵である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞がエポシロンまたはエポシロン誘導体を生成する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記宿主細胞が、チアゾールの代わりにオキサゾールを含むエポシロン誘導体を生成し、かつ前記液体培地がＬ−セリンを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
以下の式：
【化４】
2004508810.tif 000096
の単離された化合物であって、
ここで、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ１１およびＲ１２が、それぞれ独立して、水素、メチルまたはエチルであるか；
Ｒ４、Ｒ６およびＲ９が、それぞれ独立して、水素、ヒドロキシルまたはオキソであるか；あるいは、
Ｒ５およびＲ６が、共に炭素間二重結合を形成し；
Ｒ７が、水素、メチルまたはエチルであり；
Ｒ８およびＲ１０が、両方水素であるか、または共に炭素間二重鎖結合もしくはエポキシドを形成し；
Ａｒがアリールであり；そして、
Ｗが、ＯまたはＮＲ１３であり、ここでＲ１３が、水素、Ｃ１〜Ｃ１０脂肪族、アリールまたはアルキルアリールである、単離された化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、組み換え宿主細胞においてポリケチドを生成するための組み換え方法および組み換え材料；ポリケチドを生成する組み換え宿主細胞；エポシロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）に対して構造的に関連する新規なポリケチド；エポシロンを精製するための方法；およびエポシロンＤの結晶性形態を提供する。好ましい実施形態において、本発明の組み換え宿主細胞は、モジュール型、または反復性のポリケチドシンターゼ（ＰＫＳ）遺伝子をコードする、本発明の組み換えＤＮＡ発現ベクターで形質転換された、Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ亜目、好ましくはＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属およびＳｔｉｇｍａｔｅｌｌａ属に由来する。この組み換え宿主細胞は、エポシロンおよびエポシロン誘導体が挙げられるがこれらに限定されない、公知のポリケチドおよび新規のポリケチドを生成する。本発明は、農学、化学、医化学、医薬、分子生物学、および薬理学の分野に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ポリケチドは、少なくとも部分的には、一連のクライゼン型縮合および引き続く修飾によって、ブロック化合物を構築する２つの炭素ユニットから合成された、構造的に多様な化合物のクラスを構成する。ポリケチドは、テトラサイクリンおよびエリスロマイシンのような抗生物質、エポシロンおよびダウノマイシンのような抗癌剤、ならびにＦＫ５０６、ＦＫ５２０、およびラパマイシンのような免疫抑制剤を含む。ポリケチドは、多くのタイプの生物体（真菌および菌糸体菌を含む）において天然に存在する。ポリケチドは、一般にＰＫＳ酵素と呼ばれるポリケチドシンターゼ酵素によってインビボで合成される。２つの主要なタイプのＰＫＳは、その構造およびポリケチド合成の様式における差異が公知である。これらの２つのタイプは一般に、Ｉ型すなわちモジュラー型ＰＫＳ酵素、およびＩＩ型すなわち反復式（芳香族）ＰＫＳ酵素と呼ばれる。
【０００３】
本発明は、モジュール型および反復性のＰＫＳ酵素の生成のための方法および組み換え発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにこれらの酵素によって生成されたポリケチドを提供する。モジュール型ＰＫＳ酵素は代表的に複数タンパク質の複合体であり、ここでは各タンパク質が、複数の活性部位を含み、その各々が、炭素鎖会合および修飾の間、１回だけ用いられる。反復性のＰＫＳ酵素は代表的には複数タンパク質の複合体であり、ここでは各タンパク質が、単一または多くとも２つの活性部位しか含まず、その活性部位の各々が、炭素鎖会合および修飾の間、複数回用いられる。以下にさらに詳細に記載するように、モジュール型ＰＫＳ酵素および芳香族ＰＫＳ酵素の両方について多数の遺伝子がクローニングされている。
【０００４】
モジュール型ＰＫＳ遺伝子は、ローディングモジュール、多数の伸長モジュール、および遊離するドメインをコードするように組織化されたコード配列から構成される。以下にさらに完全に記載するように、これらのドメインおよびモジュールの各々は、１つ以上の特定の機能を有するポリペプチドに相当する。一般に、ローディングモジュールは、ポリケチドを合成するために用いた第一構築ブロックの結合、およびこのブロックを第一の伸長モジュールに移すことを担う。複合ポリケチドを形成するために用いた構築ブロックは、代表的にはアシルチオエステル、最も一般的には、アセチル、プロピオニル、マロニル、メチルマロニル、ヒドロキシマロニル、メトキシマロニル、およびエチルマロニルＣｏＡである。他の構築ブロックは、アミノ酸およびアミノ酸様アシルチオエステルを含む。ＰＫＳは、アシルチオエステル結合ブロックの間の、反復された、脱炭酸的なクライゼン縮合を通じてポリケチドの生合成を触媒する。各モジュールは、構築ブロックを結合すること、その構築ブロック上で１つ以上の機能を実施すること、および得られた化合物を次のモジュールに移すこと、を担う。次に、次のモジュールは、次の構築ブロックを接着すること、および合成が完了するまで、成長する化合物を次のモジュールに移すこと、を担う。その時点で、遊離ドメイン（しばしば酵素的チオエステラーゼ（ＴＥ）活性）は、ＰＫＳからポリケチドを切断する。
【０００５】
６−デオキシエリスロノリド　Ｂ（６−ｄＥＢ）として公知のポリケチドは、原型のモジュール型ＰＫＳ酵素によって合成される。この遺伝子（ｅｒｙＡＩ、ｅｒｙＡＩＩ、およびｅｒｙＡＩＩＩとして公知）（６−ｄＥＢを合成するデオキシエリスロノリドＢシンターゼすなわちＤＥＢＳとして公知の複数サブユニットタンパク質（各サブユニットはＤＥＢＳ１、ＤＥＢＳ２、またはＤＥＢＳ３として公知）をコードする）は、米国特許第５，６７２，４９１号、同第５，７１２，１４６号および同第５，８２４，５１３号（その各々は、本明細書において参考として援用されている）に記載されている。
【０００６】
ＤＥＢＳ　ＰＫＳのローディングモジュールは、アシルトランスフェラーゼ（ＡＴ）およびアシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）からなる。ＤＥＢＳローディングモジュールのＡＴは、プロピオニルＣｏＡを認識し（他のローディングモジュールＡＴは、他のアシルＣｏＡ（例えば、アセチル、マロニル、メチルマロニル、またはブチリルＣｏＡ）を認識し得る）、そしてこれをチオエステルとしてローディングモジュールのＡＣＰに移す。同時に、ＤＥＢＳの各々の６つの伸長モジュール上のＡＴは、メチルマロニルＣｏＡを認識し（他のローディングモジュールＡＴは、他のアシルＣｏＡ（例えば、マロニル、またはアルファ置換マロニルＣｏＡ、すなわち、マロニル、エチルマロニル、および２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ）を認識し得る）、そしてこれをそのモジュールのＡＣＰに移してチオエステルを形成する。一旦ＤＥＢＳを、プロピオニルＡＣＰおよびメチルマロニルＡＣＰでプライムすれば、このローディングモジュールのアシル基は、移動して第一の伸長モジュールのＫＳでチオエステルを形成する（トランス−エステル化）；この段階で、モジュール１は、メチルマロニルＡＣＰに隣接してアシル−ＫＳを保有する。次いで、ＤＥＢＳローディングモジュールに由来するアシル基は、伸長基のα炭素に共有結合され、付随する脱炭酸によって誘導された炭素間結合を形成し、そしてローディングユニットよりも長い骨格の２つの炭素を有する新しいアシルＡＣＰを生成する（延長または伸長）。成長するポリケチド鎖を、ＡＣＰからＤＥＢＳの次のモジュールのＫＳに移し、そしてこのプロセスを続ける。
【０００７】
ＤＥＢＳの各モジュールについて２つの炭素によって成長するこのポリケチド鎖は、引き続いて、アセンブリライン様プロセスで、モジュールからモジュールへの共有結合したチオエステルとして受け渡される。このプロセス単独によって生成される炭素鎖は、あらゆる他の炭素原子でケトンを保有し、ポリケトンを生成し、ポリケチドという名称はこれに由来する。しかし、共通して、さらなる酵素活性が、ポリケチド鎖のβケト基を改変する。このポリケチド鎖のβケト基に対して２炭素ユニットが付加され、その後この鎖が次のモジュールに移される。従って、炭素間結合を形成するのに必要なＫＳ、ＡＴ、およびＡＣＰを含む最低限のモジュールに加えて、モジュールは、βケト基をアルコールに還元するケトリダクターゼ（ＫＲ）を含み得る。モジュールはまた、ＫＲおよびデヒドラターゼ（ＤＨ）（アルコールを二重結合に脱水する）を含み得る。モジュールはまた、ＫＲ、ＤＨ、およびエノイルリダクターゼ（ＥＲ）（メチレン官能基としてβ炭素を用いて、二重結合を飽和単結合に変換する）を含み得る。ＤＥＢＳモジュールとしては、ＫＲドメインのみを有するモジュール、不活性ＫＲドメインのみを有するモジュール、ならびにＫＲドメイン、ＤＨドメインおよびＥＲドメインの３つ全てを有するモジュールが挙げられる。
【０００８】
一旦、ポリケチド鎖がＰＫＳの最終モジュールを横切れば、ポリケチド鎖は、大部分のモジュール型ＰＫＳ酵素のカルボキシル末端で見出された、遊離ドメイン（代表的にはチオエステラーゼ）に遭遇する。ここで、このポリケチドは、酵素から切断され、そして多くの（ただし全てではない）ポリケチドについて環状化される。このポリケチドは、仕立てた酵素または修飾酵素によってさらに修飾され得る：これらの酵素は、ポリケチドコア分子および／またはその置換基の上に、炭水化物基またはメチル基を付加するか、または他の修飾（すなわち、酸化または還元）を作製する。例えば、６−ｄＥＢを、ヒドロキシル化およびグリコシル化（グリコシド化）し、そしてグリコシル置換基の１つをメチル化して、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ細胞（ここで、エリスロマイシンＡが天然に生成される）において周知の抗生物質エリスロマイシンＡを得る。
【０００９】
上記は、一般にモジュール型ＰＫＳ酵素、および具体的にはＤＥＢＳに適用するが、現実には多数のバリエーションが存在する。例えば、多くのＰＫＳ酵素が、ローディングモジュールを含む。このローディングモジュールは、ＤＥＢＳのローディングモジュールとは異なり、デカルボキシラーゼとして機能する「不活性な」ＫＳドメインを含む。この不活性なＫＳは、多くの場合、ＫＳＱと呼ばれ、ここでこの上付き文字は、ケトシンターゼ活性に必要な活性部位システインの代わりに存在するアミノ酸（グルタミン）の１文字略語である。エポシロンＰＫＳローディングモジュールは、ＫＳＹドメインを含み、ここでチロシンが活性部位システインの代わりに存在する。さらに、他のポリケチドの合成は、ＤＥＢＳまたはエポシロンローディングモジュールによって結合されたユニットとは異なる開始ユニットで始まる。このような開始ユニットに結合する酵素としては、以下が挙げられる：例えば、ＦＫ５２０、ＦＫ５０６、およびラパマイシンの生合成に使用されるようなＡＭＰリガーゼ、レイナマイシンの生合成に使用されるような非リボソームペプチドシンターゼ（ＮＲＰＳ）、または可溶性ＣｏＡリガーゼ。
【００１０】
ＰＫＳ酵素における他の重要なバリエーションは、伸長ユニットとして組み込まれた構築ブロックのタイプに関する。開始ユニットについて言えば、いくつかのＰＫＳ酵素は、伸長モジュールとして１つ以上のＮＲＰＳモジュールを用いて、アミノ酸様アシルチオエステル構築ブロックを組み込む。例えば、エポシロンＰＫＳは、ＮＲＰＳモジュールを含む。別のこのようなバリエーションが、ＦＫ５０６、ＦＫ５２０、およびラパマイシンＰＫＳ酵素（これは、ピペコレート残基を組み込むＮＲＰＳを含み、そしてまたＰＫＳの遊離ドメインとして働く）において見出される。なお別のバリエーションは、伸長モジュールにおけるさらなる活性に関連する。例えば、エポシロンＰＫＳの１つのモジュールは、メチル基をポリケチドに組み込む、メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ）ドメインを含む。
【００１１】
モジュール型ＰＫＳ遺伝子および反復性ＰＫＳ遺伝子を操作するための組み換え方法は、米国特許第５，９６２，２９０号；同第５，６７２，４９１号；同第５，７１２，１４６号；同第５，８３０，７５０号；および同第５，８４３，７１８号；ならびにＰＣＴ特許公開番号第９８／４９３１５号および同第９７／０２３５８号（本明細書において参考として援用されている）に記載されている。これらの特許および他の特許は、ポリケチドの異種生成のための組み換え発現ベクター、および新規なポリケチドを生成する２つ以上の異なるＰＫＳ遺伝子または遺伝子クラスターの組み合わせ部分によって組み立てられた組み換えＰＫＳ遺伝子を記載している。今日まで、このような方法を用いて、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ（ポリケチドを天然に生成する）、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび酵母（ポリケチドを天然には生成しない）のような生物体において、公知のポリケチドまたは新規のポリケチドを生成してきた（本明細書において参考として援用されている米国特許第６，０３３，８８３号を参照のこと）。後者の宿主において、ポリケチド生成は、ＰＫＳのＡＣＰドメインを活性化するホスホパンテテニル（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ）トランスフェラーゼの異種発現に依存する（本明細書において参考として援用されているＰＣＴ公開番号９７／１３８４５を参照のこと）。
【００１２】
このような方法は価値があり、かつ非常に有用であるが、特定のポリケチドは、使用される異種宿主細胞において、非常に低いレベルでしか発現されないか、または毒性である。例えば、抗癌剤エポシロンＡ，Ｂ，ＣおよびＤを、エポシロンＰＫＳ遺伝子の異種発現によってＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ中で生成した（それぞれが、本明細書において参考として援用されている、Ｔａｎｇら、２０００年１月２８日、Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８７：６４０〜６４２、およびＰＣＴ、公開番号００／０３１２４７）。エポシロンＡおよびＢは、約５０〜１００μｇ／Ｌ未満で生成され、そしてプロデューサー細胞上で有害な効果を有する様であった。
【００１３】
エポシロンＡおよびＢは、最初は、粘液細菌Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍから抽出した抗真菌活性として同定され（Ｇｅｒｔｈら、１９９６、Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ　４９：５６０〜５６３およびドイツ特許番号ＤＥ４１３８０４２（本明細書において参考として援用されている））、そして後に、チューブリン重合化アッセイにおいて活性を有することが見出された（本明細書において参考として援用されている、Ｂｏｌｌａｇら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５５：２３２５〜２３３３、を参照のこと）。エポシロンＡおよびＢならびに特定の天然に存在する誘導体および合成の誘導体は、癌の処置のために、可能性のある抗腫瘍薬剤としてずっと広範に研究されてきた。Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍの株Ｓｏ　ｃｅ９０によって生成されるエポシロンの化学構造は、Ｈｏｆｌｅら、１９９６、ＥｐｏｓｉｌｏｎｅＡ　ａｎｄ　Ｂ−ｎｏｖｅｌ　１６−ｍｅｍｂｅｒｅｄ　ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ　ｗｉｔｈ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ：ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｃｒｙｓｔａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ　ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５（１３／１４）：１５６７〜１５６９（本明細書において参考として援用されている）に記載された。エポシロンＡ（Ｒ＝Ｈ）およびＢ（Ｒ＝ＣＨ３）は、以下に示す構造を有し、そして真核生物細胞に対する広範な細胞傷害性活性、ならびに乳房および結腸の腫瘍細胞株に対して顕著な活性および選択性を示す。
【００１４】
【化５】
2004508810.tif 000003
エポシロンＡおよびＢのデゾキシ対応物（エポシロンＣ（Ｒ＝Ｈ）およびＤ（Ｒ＝ＣＨ３）としても公知）は、新たに化学合成されたが、またＳ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍの発酵における微量生成物としても存在する。エポシロンＣおよびＤは、エポシロンＡおよびＢよりも細胞傷害性が低く；その構造は以下に示される。
【００１５】
【化６】
2004508810.tif 000004
他の天然に存在するエポシロンが記載されている。これらとしては、エポシロンＥおよびＦが挙げられる。ここでは、エポシロンＡおよびＢのチアゾール部分のメチル側鎖を、ヒドロキシル化し、それぞれエポシロンＥおよびＦ、ならびに多くの他のエポシロン化合物を得た（本明細書において参考として援用されている、ＰＣＴ公開番号９９／６５９１３を参照のこと）。
【００１６】
抗癌剤としてのエポシロンの使用に関する可能性の理由から、そしてネイティブのＳｏ　ｃｅ　９０株によって生成された低レベルのエポシロンの理由から、多数の研究チームは、エポシロンを合成する労力を払った。上記で注記されるように、この労力は成功した（以下を参照のこと：Ｂａｌｏｇら、１９９６、Ｔｏｔａｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　（−）−ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ　Ａ，Ａｎｇｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５（２３／２４）：２８０１−２８０３；Ｓｕら、１９９７、Ｔｏｔａｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ（−）−ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ　Ｂ：ａｎ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｕｚｕｋｉ　ｃｏｕｐｌｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｉｎｓｉｇｈｔｓ　ｉｎｔｏ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３６（７）：７５７〜７５９；Ｍｅｎｇら．，１９９７、Ｔｏｔａｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ　ｏｆ　ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ　Ａ　ａｎｄ　Ｂ，ＪＡＣＳ　１１９（４２）：１００７３〜１００９２；およびＢａｌｏｇら、１９９８，Ａ　ｎｏｖｅｌ　ａｌｄｏｌ　ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ　ｗｉｔｈ　２−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｅｎｔｅｎａｌ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ｔｏｔａｌ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ　Ｂ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３７（１９）：２６７５〜２６７８（各々が、本明細書において参考として援用されている））。これらの労力の成功にもかかわらず、エポシロンの化学合成は、退屈であり、時間を浪費し、そして費用がかさむ。実際、この方法は、抗癌剤としてのなんらかのエポシロンのフルスケールの薬学的開発については現実的ではないとして特徴付けられた。
【００１７】
多数のエポシロン誘導体、およびエポシロンＡ〜Ｄは、インビトロおよびインビボで研究されてきた（以下を参照のこと：Ｓｕら、１９９７，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３６（１９）：２０９３−２０９６；およびＣｈｏｕら、Ａｕｇ．１９９８，Ｄｅｓｏｘｙｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ　Ｂ：ａｎ　ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ　ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ａｇｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ａ　ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｔｏ　ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ　Ｂ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：９６４２−９６４７（それぞれが、本明細書において参考として援用されている））。さらなるエポシロン誘導体ならびにエポシロンおよびエポシロン誘導体を合成する方法は、以下のＰＣＴ公開番号００／２３４５２、００／００４８５、９９／６７２５３、９９／６７２５２、９９／６５９１３、９９／５４３３０、９９／５４３１９、９９／５４３１８、９９／４３６５３、９９／４３３２０、９９／４２６０２、９９／４００４７、９９／２７８９０、９９／０７６９２、９９／０２５１４、９９／０１１２４、９８／２５９２９、９８／２２４６１、９８／０８８４９、および９７／１９０８６；米国特許第号５，９６９，１４５；およびドイツ特許公開番号ＤＥ４１３８０４２（それぞれが、本明細書において参考として援用されている）に記載されている。
【００１８】
天然に存在するエポシロンだけでなく、その誘導体または前駆体、ならびに特性が改善されている新しいエポシロン誘導体を生成するという経済的な手段の必要性が残っている。天然のプロデューサーＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍよりも取り扱いおよび発酵が容易である、そして所望のポリケチド生成物をさらに生成する、エポシロンまたはエポシロン誘導体を生成する宿主細胞の必要性が残っている。本発明は、高レベルでポリケチドを生成し、そしてエポシロン（本明細書に記載される新しいエポシロン誘導体を含む）だけでなく、他のポリケチドもまた生成することにおいて有用である宿主細胞を提供することによってこれらの必要性を満たしている。
【００１９】
（発明の要旨）
１つの実施形態において、本発明は、組み換え発現ベクターであって、異種ＰＫＳ遺伝子をコードし、そしてこれらのベクター上でこの遺伝子によってコードされるＰＫＳ酵素によって合成されるポリケチドを生成する組み換え発現ベクター、を含むＣｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ亜目の組み換え宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、宿主細胞は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属またはＳｔｉｇｍａｔｅｌｌａ属由来である。特に好ましい実施形態において、宿主細胞は、Ｍ．ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ、Ｍ．ｆｕｌｖｕｓ、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ、Ｍ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ｅｒｅｃｔａ、およびＳ．ａｕｒａｎｔｉａｃａからなる群より選択される。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、本発明の宿主細胞において、染色体組み込みまたは染色体外複製をし得る組み換えＤＮＡベクターを提供する。本発明のベクターは、ＰＫＳコード配列の少なくとも一部を含み、そして本発明の宿主細胞内で機能的なＰＫＳ酵素の発現を指向し得る。関連の実施形態において、本発明は、ポリケチド生合成についての基質（本発明の宿主細胞において、生成されないか、または低量でしか生成されないかのいずれかである）を生成するのに必要な遺伝子および遺伝子産物を含む、ベクターおよび宿主細胞を提供する。１つの実施形態において、この遺伝子および遺伝子産物は、エチルマロニルＣｏＡの合成を触媒する。別の実施形態において、この遺伝子および遺伝子産物は、ブチリルＣｏＡの合成を触媒する。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ亜目の宿主細胞（この宿主細胞ではポリケチドは天然には生成されない）においてポリケチドを生成するための方法を提供する。この方法は、ベクター上でコードされるＰＫＳ遺伝子が発現され、そしてポリケチドが生成されるような条件下で、本発明の組み換えＤＮＡベクターを用いて形質転換した宿主細胞を培養する工程を包含する。関連の実施形態において、本発明は、高収率のポリケチドの生成を生じる、本発明の宿主細胞の発酵のための方法を提供する。
【００２２】
好ましい実施形態において、本発明の組み換え宿主細胞は、エポシロンまたはエポシロン誘導体を生成する。従って、本発明は、所望のエポシロンまたはエポシロン誘導体を生成する組み換え宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、この宿主細胞は、１０ｍｇ／Ｌ以上の１つ以上のエポシロンを生成する。１つの実施形態において、本発明は、エポシロンを生成する天然に存在する生物体において生成されるレベルよりも高いレベルで１つ以上のエポシロンを生成する宿主細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、エポシロンを生成する天然に存在する生物体によって生成される混合物よりも複雑度が低いエポシロンの混合物を生成する宿主細胞を提供する。本発明の組み換え宿主細胞はまた、主要な産物として１つだけの所望のエポシロンまたはエポシロン誘導体を生成する宿主細胞を含む。
【００２３】
関連の好ましい実施形態において、本発明は、エポシロンＰＫＳの全てまたは一部をコードする組み換えＤＮＡ発現ベクターを提供する。従って、本発明は、本発明の宿主細胞において、エポシロンＡ，Ｂ、Ｃ、およびＤを生成するのに必要なタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ発現ベクターを提供する。本発明はまた、これらのタンパク質の一部をコードする組み換えＤＮＡ発現ベクターを提供する。本発明はまた、ハイブリッドタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ化合物を提供する。このハイブリッドタンパク質は、エポシロン生合成に関与するタンパク質の全てまたは一部、および別のポリケチドまたは非リボソーム由来ペプチドの生合成に関与するタンパク質の全てまたは一部を含む。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、農業、獣医学診療、および医学において有用な実質的に純粋な形態の、新規なエポシロン誘導化合物を提供する。これらの化合物としては、エポシロンＡ，Ｂ、Ｃ、およびＤの以下：１６−デスメチル；１４−メチル；１３−オキソ；１３−オキソ−１１，１２−デヒドロ；１２−エチル；１３−ヒドロキシ−１０，１１−デヒドロ；１１−オキソ；１１−ヒドロキシ；１０−メチル；１０，１１−デヒドロ；９−オキソ；９−ヒドロキシ；８−デスメチル；６−デスメチル；および２−メチルのアナログ、ならびに天然に存在するエポシロンのメチルチアゾール部分が別の部分で置換されている種々のアナログが挙げられる。１つの実施形態において、この化合物は、殺真菌剤として有用である。別の実施形態において、この化合物は、抗がん剤として癌の化学療法において有用である。好ましい実施形態において、この化合物は、エポシロンＢまたはＤと少なくとも同程度に腫瘍細胞に対して強力であるエポシロン誘導体である。別の実施形態において、この化合物は、免疫抑制剤として有用である。別の実施形態において、この化合物は、別の化合物の製造に有用である。好ましい実施形態において、この化合物は、ヒトまたは動物に対する投与のための混合物または溶液に処方される。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、エポシロンを精製する方法を提供する。好ましい実施形態において、エポシロンは発酵ブロスから精製される。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、高度に精製された形態でエポシロン化合物を提供する。好ましい実施形態において、エポシロンは、９５％よりも純粋である。さらに好ましい実施形態において、エポシロンは、９９％よりも純粋である。特に好ましい実施形態において、本発明は、結晶形態でエポシロンを提供する。１つの特に好ましい実施形態において、本発明は結晶エポシロンＤを提供する。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、癌を処置する方法を提供し、この方法は、治療的有効量の本発明の新規エポシロン化合物を投与する工程を包含する。本発明の化合物および組成物はまた、他の過剰増殖性疾患および状態（乾癬および炎症を含むが、これらに限定されない）の処置に有用である。
【００２８】
本発明のこれらまたは他の実施形態は、以下の説明、実施例、および上記の特許請求の範囲において、より詳細に記載する。
【００２９】
（発明の詳細な説明）
本発明の範囲および本明細書中に使用される用語の定義に関する陳述は、以下に列挙される。他に特定の例において限定されない限り、個々に、またはより大きな群の一部としてのいずれかで、本明細書全体を通じて使用される場合、この定義をこの用語に適用する。
【００３０】
本発明の化合物の全ての立体異性体は、純粋な化合物ならびにその混合物として、本発明の範囲内に含まれる。個々のエナンチオマー（鏡像異性体）、ジアステレオマー、幾何異性体、ならびにそれらの組み合わせおよび混合物が全て本発明に含まれる。さらに、これらの化合物の結晶形態のいくつかが、多形として存在し得、そしてそれ自体本発明に含まれる。さらに、これらの化合物のいくつかは、水との溶媒和物（すなわち、水和物）または通常の有機溶媒との溶媒和物を形成し得、このような溶媒和物もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００３１】
本発明の化合物の保護形態が本発明の範囲内に含まれる。種々の保護基が、例えば、Ｔ．Ｈ．Ｇｒｅｅｎｅ　ａｎｄ　Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９９）（本明細書中においてその全体が参考として援用される）に開示される。例えば、本発明の化合物のヒドロキシ保護形態は、ヒドロキシル基の少なくとも１つがヒドロキシ保護基によって保護される形態である。例示的なヒドロキシ保護基としては、限定しないが、テトラヒドロピラニル；ベンジル；メチルチオメチル；エチルチオメチル；ピバロイル；フェニルスルホニル；トリフェニルメチル；三置換シリル（例えば、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリブチルシリル、トリイソプロピルシリル、ｔ−ブチルジメチルシリル、トリ−ｔ−ブチルシリル、メチルジフェニルシリル、エチルジフェニルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリルなど）；アシルおよびアロイル（例えば、アセチル、ピバロイルベンゾイル、４−メトキシベンゾイル、４−ニトロベンゾイルおよび脂肪族アシルアリールなど）が挙げられる。本発明の化合物のケト基は、同様に保護され得る。
【００３２】
本発明は、本発明の化合物のプロドラッグをその範囲内に含む。一般的に、このようなプロドラッグは、必要な化合物にインビボで容易に転換可能な化合物の機能的誘導体である。従って、本発明の処置方法において、用語「投与」は、具体的に開示される化合物を用いるか、または具体的には開示されないかもしれないがこれを必要とする被験体に投与された後にインビボで特定の化合物に転換される化合物を用いる、記載される種々の障害の処置を包含するべきである。適切なプロドラッグ誘導体の選択および調製のための慣用的な手順は、例えば、「Ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」，Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８５に記載される。
【００３３】
本明細書中において使用される場合、用語「脂肪族」とは、飽和および不飽和の直鎖、分枝鎖、環式、または多環式炭化水素（これらは、必要に応じて、１つ以上の位置で置換され得る）をいう。脂肪族基の例示的な例としては、アルキル部分、アルケニル部分、アルキニル部分、シクロアルキル部分、シクロアルケニル部分、およびシクロアルキニル部分が挙げられる。用語「アルキル」とは、直鎖または分枝鎖の飽和炭化水素置換基をいう。「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分枝鎖炭化水素置換基をいう。「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分枝鎖炭化水素置換基をいう。
【００３４】
用語「アリール」とは、必要に応じて１つ以上のヘテロ原子を含み、そして好ましくは、３〜１４個の炭素原子を含む、少なくとも１つの芳香族環構造を有する単環式基または多環式基をいう。アリール置換基は、必要に応じて、１つ以上の位置において置換され得る。アリール基の例示的な例としては、限定しないが以下が挙げられる：フラニル、イミダゾリル、インダニル、インデニル、イノドリル、イソオキサゾリル、イソキノリニル、ナフチル、オキサゾリル、オキサジアゾリル、フェニル、ピラジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、ピラゾリル、キノリル、キノキサリル、テトラヒドロナフチル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈｔｈｌ）、テトラゾイル、チアゾイル、チエニル、チオフェニルなど。
【００３５】
脂肪族部分（すなわち、アルキル、アルケニルなど）およびアリール部分は、必要に応じて、１つ以上の置換基、好ましくは１〜５個の置換基、より好ましくは１〜３個の置換基、そして最も好ましくは１〜２個の置換基で置換され得る。分子内の特定の位置における任意の置換基または変数の定義は、その分子の他の定義と独立する。化学的に安定であり、そして当該分野で公知の技術ならびに本明細書中に示される方法によって容易に合成され得る化合物を提供するために、本発明の化合物上の置換基および置換のパターンが当業者によって選択され得ることが理解される。適切な置換基の例としては、限定しないが以下が挙げられる：アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ハロ；トリフルオロメチル；トリフルオロメトキシ；ヒドロキシ；アルコキシ；シクロアルコキシ；ヘテロシクロオキシ；オキソ；アルカノイル（−Ｃ（＝Ｏ）−アルキル、「アシル」とも呼ばれる）；アリールオキシ；アルカノイルオキシ；アミノ；アルキルアミノ；アリールアミノ；アラルキルアミノ；シクロアルキルアミノ；ヘテロシクロアミノ；二置換アミン（ここで、２つのアミノ置換基がアルキル、アリール、またはアラルキルから選択される）；アルカノイルアミノ；アロイルアミノ；アラルカノイルアミノ；置換アルカノイルアミノ；置換アリールアミノ；置換アラルカノイルアミノ；チオール；アルキルチオ；アリールチオ；アラルキルチオ；シクロアルキルチオ；ヘテロシクロチオ；アルキルチオノ；アリールチオノ；アラルキルチオノ；アルキルスルホニル；アリールスルホニル；アラルキルスルホニル；スルホンアミド（例えば、ＳＯ２ＮＨ２）；置換スルホンアミド；ニトロ；シアノ；カルボキシ；カルバミル（例えば、ＣＯＮＨ２）；置換カルバミル（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＲ’（ここで、ＲおよびＲ’は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アリール、アラルキルなどである））；アルコキシカルボニル、アリール、置換アリール；グアニジノ、ならびにヘテロシクロ（例えば、インドイル、イミダゾリル、フリル、チエニル、チオアゾリル、ピロリジル、ピリジル、ピリミジルなど）。適用可能な場合、置換基は、さらに、例えば、アルキル、アルコキシ、アリール、アラルキル、ハロゲン、ヒドロキシなどで置換され得る。
【００３６】
用語「アルキルアリール」または「アリールアルキル」とは、脂肪族基を介して化合物に結合される脂肪族置換基を有するアリール基をいう。アルキルアリール基またはアリールアルキル基の例示的な例は、ベンジル、メチル基を介して化合物に結合されるメチル基を有するフェニル（−ＣＨ２Ｐｈ（ここで、Ｐｈはフェニルである））である。
【００３７】
用語「アシル」とは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ（ここで、Ｒは、脂肪族基、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ６部分である）をいう。
【００３８】
用語「アルコキシ」とは、−ＯＲ（ここで、Ｏは酸素であり、そしてＲは、脂肪族基である）をいう。
【００３９】
用語「アミノアルキル」とは、−ＲＮＨ２（Ｒは、脂肪族部分である）をいう。
【００４０】
用語「ハロゲン」、「ハロ」、または「ハライド」とは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素をいう。
【００４１】
用語「ハロアルキル」とは、−ＲＸ（ここで、Ｒは、脂肪族部分であり、そしてＸは、１つ以上のハロゲンである）をいう。
【００４２】
用語「ヒドロキシアルキル」とは、−ＲＯＨ（ここで、Ｒは、脂肪族部分である）をいう、
用語「オキソ」とは、カルボニル酸素（＝Ｏ）をいう。
【００４３】
上記の基における明示した置換基に加えて、本発明の化合物は、適用可能な場合、他の置換基を含み得る。例えば、ラクトンまたはラクタム骨格または骨格置換基は、さらに、１つ以上の置換基（例えば、Ｃ１〜Ｃ５脂肪族、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、アリール、または官能基）で置換され得る（例えば、水素の１つを置換することによるかまたは非水素基を誘導体化することによる）。適切な官能基の例示的な例としては、限定しないが以下が挙げられる：アセタール、アルコール、アルデヒド、アミド、アミン、ボロネート、カルバメート、カルボアルコキシ、カルボネート、カルボジイミド、カルボン酸、シアノヒドリン、ジスルフィド、エナミン、エステル、エーテル、ハロゲン、ヒドラジド、ヒドラゾン、イミド（ｉｍｉｄｅ）、イミド（ｉｍｉｄｏ）、イミン、イソシアネート、ケタール、ケトン、ニトロ、オキシム、ホスフィン、ホスホネート、ホスホン酸、第４級アンモニウム、スルフェニル、スルフィド、スルホン、スルホン酸、チオールなど。
【００４４】
用語「単離された」とは、本発明の化合物をいうために本明細書中で使用される場合、その天然状態から人の介入によって変化したことを意味する。例えば、この化合物が天然に存在する場合、それは、そのもとの環境から変化したかまたは取り出されたかあるいはその両方である。言いかえると、この用語が本明細書中で使用される場合、生きた生物に天然に存在する化合物は、「単離」されていないが、その天然の状態の共存する物質から分離された同じ化合物は、「単離」されている。用語「単離された」はまた、夾雑物または望ましくない物質を実質的に含まない調製物中の化合物を意味し得る。天然に見出される化合物に関して、その化合物または組成物がその天然状態において関連する物質を実質的に含まない。
【００４５】
用語「精製された」は、化合物をいう場合、この化合物が調製物の主用成分を形成する（例えば、調製物の成分の約５０重量％、約６０重量％、約７０重量％、約８０重量％、約９０重量％、約９５重量％以上を構成する）調製物中にこの化合物があることを意味する。
【００４６】
用語「被験体」とは、本明細書中で使用される場合、動物、好ましくは、哺乳動物（処置、観察または実験の対象であった）、そして最も好ましくはヒト（処置および／または観察の対象であった）をいう。
【００４７】
用語「治療的有効量」は、本明細書中で使用される場合、研究者、獣医師、医師、または他の臨床家医によって探求される、組織系、動物またはヒトにおける生物学的応答または医薬的応答（処置される疾患または障害の症状の軽減を含む）を誘発する活性な化合物または薬学的因子の量を意味する。
【００４８】
用語「組成物」は、特定の量で特定の成分を含む生成物、ならびに特定の量での特定の成分の組み合わせから直接的または間接的に生じる任意の生成物を包含することを意図する。
【００４９】
用語「薬学的に受容可能な塩」は、本発明の化合物の１つ以上の塩である。化合物の適切な薬学的に受容可能な塩とは、酸付加塩が挙げられ、これは、例えば、化合物の溶液を薬学的に受容可能な酸（例えば、塩酸、硫酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、クエン酸、酒石酸、炭酸またはリン酸）の溶液と混合することによって形成され得る。さらに、本発明の化合物が酸性部分を有する場合、その薬学的に受容可能な塩としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩またはカリウム塩）；アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩またはマグネシウム塩）；および適切な有機リガンドを用いて形成された塩（例えば、ハライド、ヒドロキシド、カルボキシレート、スルフェート、ホスフェート、ニトレート、アルキルスルホネートおよびアリールスルホネートのような対アニオンを使用して形成されるアンモニウム、第４級アンモニウムおよびアミンカチオン）が挙げられ得る。薬学的に受容可能な塩の例示的な例としては、限定しないが、以下が挙げられ得る：アセテート、アジペート、アルギネート、アスコルベート、アスパルテート、ベンゼンスルホネート、ベンゾエート、ビカルボネート、ビスルフェート、ビタータレート、ボレート、ブロミド、ブチレート、カルシウムエデテート、カンファレート、樟脳スルホネート、カンシレート、カルボネート、クロリド、シトレート、クラブラネート、シクロペンタンプロピオネート、ジグルコネート、ジヒドロクロリド、ドデシルスルフェート、エデテート、エジシレート（ｅｄｉｓｙｌａｔｅ）、エストレート、エシレート、エタンスルホネート、ホルメート、フマレート、グルセプテート、グルコヘプトネート、グルコネート、グルタメート、グリセロホスフェート、グリコリルアルサニレート、ヘミスルフェート、ヘプタノエート、ヘキサノエート、ヘキシルレゾルシネート、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホネート、ヒドロキシナフトエート、ヨージド、イソチオネート、ラクテート、ラクトビオネート、ラウレート、ラウリルスルフェート、マレート、マレアート、マロネート、マンデレート、メシレート、メタンスルホネート、メチルスルフェート、ムケート（ｍｕｃａｔｅ）、２−ナフタレンスルホネート、ナプシレート、ニコチネート、ニトレート、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレエート、オキサレート、パモエート（エンボネート）、パルミテート、パントテネート、ペクチネート、ペルスルフェート、３−フェニルプロピオネート、ホスフェート／ジホスフェート、ピクレート、ピバレート、ポリガラクツロネート、プロピオネート、サリチレート、ステアレート、スルフェート、塩基性酢酸塩、スクシネート、タンネート、タータレート、テオクレート（ｔｅｏｃｌａｔｅ）、トシレート、トリエチオダイド、ウンデカノエート、バレレートなど。
【００５０】
用語「薬学的に受容可能なキャリア」は、本発明の化合物の所望の投薬形態を調製するために使用される媒体である。薬学的に受容可能なキャリアとしては、溶媒、希釈剤、または他の液体ビヒクル；分散または懸濁補助剤；表面活性剤；等張性剤；濃化剤または乳化剤、保存剤；固体結合剤；潤滑剤などが挙げられる。
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｉｆｔｅｅｎｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９７５）およびＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｔｈｉｒｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ，ｅｄ．（Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃ．２０００）（両方が本明細書中においてそれらの全体が参考として援用される）は、薬学的組成物を処方する際に使用される種々のキャリアおよびその調製のための公知の技術を開示する。
【００５１】
用語「薬学的に受容可能なエステル」は、インビボで本発明の化合物またはその塩に加水分解するエステルである。適切なエステル基の例示的な例として、例えば、薬学的に受容可能な脂肪族カルボン酸から誘導されるエステル（例えば、ホルメート、アセテート、プロピオネート、ブチレート、アクリレート、およびエチルスクシネート）が挙げられる。
【００５２】
本発明は、組換え宿主細胞においてポリケチドを産生するための組換え方法および材料；ポリケチドを産生する組換え宿主細胞；エポシロンに対して構造において関連する新規なポリケチド；エポシロンを精製するための方法；ならびにエポシロンＤの結晶形態を提供する。
【００５３】
１つの実施形態において、本発明は、異種ＰＫＳ遺伝子をコードする組換え発現ベクターを含むＣｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ亜目の組換え宿主細胞を提供し、それらのベクターにコードされるＰＫＳ酵素によって合成されるポリケチドを産生する。本明細書中で使用される場合、用語組換えとは、人の介入（代表的には、遺伝子またはその一部の特定の指示された操作）によって産生される細胞、化合物、または組成物をいう。Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ亜目は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｌｅｓ目における２つのうちの１つ（他方は、Ｓｏｒａｎｇｉｎｅａｅであり、これは、エポシロンプロデューサーＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍを含む）である。Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅ亜目は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科およびＣｙｓｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科を含む。Ｍｙｘｏｃｏｃｃａｃｅａｅ科は、Ａｎｇｉｏｃｏｃｃｕｓ属（すなわち、Ａ．ｄｉｓｃｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属、およびＣｏｒａｌｌｏｃｏｃｃｕｓ属（すなわち、Ｃ．ｍａｃｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｃ．ｃｏｒｒａｌｌｏｉｄｅｓ、およびＣ．ｅｘｉｇｕｕｓ）を含む。Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒａｃｅａｅ科は、Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒ属（すなわち、Ｃ．ｆｕｓｃｕｓ、Ｃ．ｆｅｒｒｕｇｉｎｅｕｓ、Ｃ．ｍｉｎｏｒ、Ｃ．ｖｅｌａｔｕｓ、およびＣ．ｖｉｏｌａｃｅｕｓ）、Ｍｅｌｉｔｔａｎｇｉｕｍ属（すなわち、Ｍ．ｂｏｌｅｔｕｓおよびＭ．ｌｉｃｌｚｅｎｉｃｏｌａ）、Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ属（すなわち、Ｓ．ｅｒｅｃｔａおよびＳ．ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、ならびにＡｒｃｈａｎｇｉｕｍ属（すなわち、Ａ．ｇｅｐｈｙｒａ）を含む。本発明の特に好ましい宿主細胞は、１０〜２０ｍｇ／Ｌ以上、より好ましくは１００〜２００ｍｇ／Ｌ以上、そして最も好ましくは１〜２ｇ／Ｌ以上のポリケチドを産生する宿主細胞である。
【００５４】
好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞はＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ属またはＳｔｉｇｍａｔｅｌｌａ属由来である。特に好ましい実施形態において、宿主細胞はＭ．ｓｔｉｐｉｔａｔｕｓ、Ｍ．ｆｕｌｖｕｓ、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ、Ｍ．ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ、Ｓ．ｅｒｅｃｔａ、およびＳ．ａｕｒａｎｔｉａｃａからなる群から選択される。本発明の特に好ましいＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞は、１０〜２０ｍｇ／Ｌ以上のポリケチドを産生し、より好ましくは１００〜２００ｍｇ／Ｌ以上、そして最も好ましくは１〜２ｇ／Ｌ以上産生する。これらのレベルで産生するＭ．ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞が特に好ましい。本発明の目的のために使用され得るＭ．ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞として、ＤＺ１細胞株（本明細書中で参考として援用される、Ｃａｍｐｏｓら，１９７８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１９：１６７−１７８）、ＴＡ−産生細胞株ＡＴＣＣ　３１０４６、ＤＫ１２１９細胞株（本明細書中に参考として援用される、ＨｏｄｇｋｉｎおよびＫａｉｓｅｒ，１９７９，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１７１：１７７−１９１，）およびＤＫ１６２２細胞株（本明細書中で参考として援用される、Ｋａｉｓｅｒ，１９７９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７６：５９５２−５９５６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明の宿主細胞は、組換えＤＮＡ発現ベクターを含み、そして別の実施形態では、本発明は、これらの宿主細胞内での染色体組込みまたは染色体外の複製が可能な組換えＤＮＡベクターを提供する。本発明のベクターは、ＰＫＳをコードする配列の少なくとも一部を含み、そして本発明の宿主細胞中で機能性ＰＫＳ酵素の発現を支持し得る。明細書中で使用される場合、用語「発現ベクター」は、宿主細胞内に導入され得る任意の核酸をあらわす。発現ベクターは、細胞内もしくは任意の細胞区画内の染色体もしくは他のＤＮＡ（例えば、細胞質内の複製ベクター）の一部であるか否かにかかわらず、細胞内で安定にまたは一過的に維持され得る。また、発現ベクターは細胞内または細胞抽出物内でポリケチドに翻訳されるＲＮＡの合成を支持する遺伝子を含む。従って、ベクターは、遺伝子発現を増強するためのプロモーターを含むか、遺伝子発現が得られるように染色体内の部位に組込まれるかのいずれかである。さらに、発現ベクターは、さらなる機能的成分（例えば、選択マーカーとして作用する耐性付与遺伝子およびプロモーター活性を増強するための調節遺伝子）を代表的に含む。
【００５６】
代表的に、発現ベクターは、ベクターを含む宿主細胞を同定および／または選択し得る、１以上のマーカー遺伝子を含む。本発明のベクター内で使用するための例示的な抗生物質耐性付与遺伝子として、ｅｒｍＥ耐性付与遺伝子（エリスロマイシンおよびリンコマイシンに対する耐性を与える）、ｔｓｒ耐性付与遺伝子（チオストレプトンに対する耐性を与える）、ａａｄＡ耐性付与遺伝子（スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する耐性を与える）、ａａｃＣ４耐性付与遺伝子（アプラマイシン、カナマイシン、ゲンタミシン、ジェネテシン（Ｇ４１８）およびネオマイシンに対する耐性を与える），ｈｙｇ耐性付与遺伝子（ハイグロマイシンに対する耐性を与える）、およびｖｐｈ耐性付与遺伝子（バイオマイシンに対する耐性を与える）が挙げられる。Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ内で使用するための選択マーカーとして、カナマイシン耐性付与遺伝子、テトラサイクリン耐性付与遺伝子、クロラムフェニコール耐性付与遺伝子、ゼオシン（ｚｅｏｃｉｎ）耐性付与遺伝子、スペクチノマイシン耐性付与遺伝子、およびストレプトマイシン耐性付与遺伝子を含む。
【００５７】
発現ベクターの種々の成分は意図されるベクターの用途に依存して広範囲に変化し得る。特に、成分は、ベクターが使用される宿主細胞および機能するために意図される様式に依存する。例えば、本発明のある好ましいベクターは組込みベクターである：宿主細胞の染色体ＤＮＡ内にベクターを組込む。このようなベクターは、ファージ結合部位または組込みを指示する宿主細胞染色体ＤＮＡのセグメントに対して相補的なＤＮＡセグメントを含み得る。さらに、本明細書中で例示されるように、このような一連のベクターは、完全なＰＫＳ遺伝子クラスターの一部分のみを含む各ベクターを用いて、宿主細胞中にＰＫＳ遺伝子クラスターを構築するために使用され得る。従って、本発明の組換えＤＮＡ発現ベクターはＰＫＳ遺伝子または遺伝子クラスターの一部分のみを含み得る。また、同種組換えは、宿主細胞内に前もって導入された異種ＰＫＳ遺伝子を含む遺伝子を欠失、破壊、または改変するために使用され得る。
【００５８】
好ましい実施形態では、本発明は発現ベクターおよび組換えＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、好ましくはＭ．ｘａｎｔｈｕｓ（ポリケチドを産生するこれらの発現ベクターを含む宿主細胞）を提供する。現在、Ｍｘ４ファージレプリコンに基づく人工プラスミドの未公開報告はあるが、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ内で染色体外で複製するベクターは公開されていない。しかし、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ染色体ＤＮＡ内に組込まれる公知の多くのファージ（Ｍｘ８，Ｍｘ９，Ｍｘ８１，およびＭｘ８２を含む）が存在する。これらのファージの組込み機能および結合機能は、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ染色体ＤＮＡ内でに組込まれるファージベースの発現ベクターを作製するためにプラスミド上に配置され得る。これらのうち、ファージＭｘ９およびＭｘ８は本発明の目的において好ましい。プラスミドｐＰＬＨ３４３（Ｓａｌｍｉら，１９９８年２月，Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｅｍｐｅｒａｔｅ　Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　ｐｈａｇｅ　Ｍｘ８，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８０（３）：６１４−６２１に記載）は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で複製し、結合機能および組込み機能をコードするファージＭｘ８遺伝子を含むプラスミドである。
【００５９】
本発明の好ましいＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ発現ベクターにおいて使用するための広範囲のプロモーターが入手可能である。以下の実施例８を参照のこと。例えば、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍエポシロンＰＫＳ遺伝子のプロモーター（本明細書中で参考として援用される、ＰＣＴ公開番号００／０３１２４７を参照のこと）はＭ．ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞中で機能する。エポシロンＰＫＳ遺伝子プロモーターは、組換え宿主細胞内での１以上のエポシロンＰＫＳ遺伝子または別のＰＫＳ遺伝子産生物の発現を推進するために使用され得る。本発明の組換えＰＫＳを発現する目的で、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞内で使用するための別の好ましいプロモーターは、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓのｐｉｌＡ遺伝子のプロモーターである。このプロモーターおよびｐｉｌＡプロモーター、ｐｉｌＡ欠損株およびｐｉｌＳ欠損株によって制御された遺伝子由来の遺伝子産物を高レベルで発現するＭ．ｘａｎｔｈｕｓ株は、本明細書中で参考として援用される、ＷｕおよびＫａｉｓｅｒ，１９９７年１２月，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｉｌＡ　ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７９（２４）：７７４８−７７５８に記載される。本発明はまた、ｐｉｌＡおよびｐｉｌＳ欠損の両方を含む組換えＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞を提供する。別の好ましいプロモーターは飢餓性依存ｓｄｅＫ遺伝子のプロモーターである。
【００６０】
本発明は、本発明の組換えＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ発現ベクターおよび宿主細胞の調製において使用するための好ましい発現ベクターを提供する。プラスミドｐＫＯＳ３５−８２．１およびｐＫＯＳ３５−８２．２と命名されたこれらのベクター（図２）は、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞において複製可能で、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓの染色体ＤＮＡ内への組み込みが可能である。ベクターは、Ｍｘ８結合遺伝子および組み込み遺伝子ならびに下流に都合よく配置された制限酵素認識部位を有するｐｉｌＡプロモーターを含む。２種のベクターは単にベクター上のｐｉｌＡプロモーターの方向においてお互いに異なっており、エポシロンＰＫＳおよび本発明の修飾酵素遺伝子あるいは他のＰＫＳおよび修飾酵素遺伝子を含むために容易に修飾され得る。ベクターの構築は実施例１に記載する。
【００６１】
別の実施形態において、本発明は、この宿主細胞中ではポリケチドが天然には産生しない亜目Ｃｙｓｔｏｂａｃｔｅｒｉｎｅａｅの宿主細胞中でポリケチドを産生する方法を提供し、この方法は本発明の組換えＤＮＡベクターを用いて形質転換された宿主細胞を、ベクター上でコードされたＰＫＳ遺伝子が発現し、前述のポリケチドを産生するような条件下で培養工程を包含する。この方法を用いて、モジュラーまたは反復ＰＫＳ酵素によって産生される任意の多様なポリケチドが調製され得る。さらにまた、ハイブリッドまたは他の組換えＰＫＳ遺伝子由来の新規ポリケチドがこの方法を用いて調製され得る。好ましい実施形態において、ＰＫＳ遺伝子はハイブリッドモジュラーＰＫＳをコードする。
【００６２】
多数のモジュラーＰＫＳ遺伝子は、クローン化され、そしてベクターおよび本発明の方法を用いて即時に入手可能である。ＰＫＳ酵素によって産生されるポリケチドは、ポリケチド修飾酵素（テイラーリング酵素とも呼ばれる）によって、ヒドロキシル化されたＰＫＳのポリケチド産生物、エポキシ化されたＰＫＳのポリケチド産生物、メチル化されたＰＫＳのポリケチド産生物、および／またはグリコシル化されたＰＫＳのポリケチド産生物へとしばしばさらに修飾される。また、本発明の方法に基づいて、目的の修飾されたポリケチドを調製するために、これらの遺伝子は宿主細胞に導入され得る。以下の表は例示的なＰＫＳ遺伝子および対応するＰＫＳ酵素を記載する参考文献を一覧にしたものであって、組換えＰＫＳおよび本発明のＰＫＳをコードする対応するＤＮＡ化合物の構築において利用し得る。また、本発明の組換えＤＮＡ化合物を作製するために使用し得るポリケチドテーラーリング酵素および修飾酵素ならびに対応する遺伝子を記載する種々の参考文献を示す。
（ＰＫＳおよびポリケチドテーラーリング酵素遺伝子）
（アベルメクチン）
米国特許第５，２５２，４７４号；米国特許第４，７０３，００９号；および欧州公報第１１８，３６７号（Ｍｅｒｃｋ）。
【００６３】
ＭａｃＮｅｉｌら，１９９３，Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ：Ｂａｓｉｃ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｂａｌｔｚ，Ｈｅｇｅｍａｎ，＆Ｓｋａｔｒｕｄ，ｅｄｓ．（ＡＳＭ），２４５−２５６頁，Ａ　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｎｅｓ　Ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈａｓｅｓ　ｆｏｒ　Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ，Ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ，ａｎｄ　Ｎｅｍａｄｅｃｔｉｎ。
【００６４】
ＭａｃＮｅｉｌら，１９９２，Ｇｅｎｅ　１１５：１１９−１２５，Ｃｏｍｐｌｅｘ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ　ｇｅｎｅｓ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｔｈｅ　ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ。
【００６５】
ＩｋｅｄａおよびＯｍｕｒａ，１９９７，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．９７：２５９９−２６０９，Ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ。
（カンジシジン（ＦＲ００８））
Ｈｕら，１９９４，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４：１６３−１７２。
（エポシロン）
ＰＣＴ公報第９９／６６０２８号（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）。
【００６６】
ＰＣＴ公報第００／０３１２４７号（Ｋｏｓａｎ）。
（エリスロマイシン）
ＰＣＴ公報第９３／１３６６３号；米国特許第６，００４，７８７号；および米国特許第５，８２４，５１３号（Ａｂｂｏｔｔ）。
【００６７】
Ｄｏｎａｄｉｏら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：６７５−９。
【００６８】
Ｃｏｒｔｅｓら，１９９０年１１月８日，Ｎａｔｕｒｅ　３４８：１７６−８，Ａｎ　ｕｎｕｓｕａｌｌｙ　ｌａｒｇｅ　ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｏｆ　Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ。
（グリコシル化酵素）
ＰＣＴ公報第９７／２３６３０号および米国特許第５，９９８，１９４号（Ａｂｂｏｔｔ）。
（ＦＫ−５０６）
Ｍｏｔａｍｅｄｉら，１９９８，Ｔｈｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍａｃｒｏｌａｃｔｏｎｅ　ｒｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ　ＦＫ−５０６，Ｅｕｒ．Ｊ．ｂｉｏｃｈｅｍ．２５６：５２８−５３４。
【００６９】
Ｍｏｔａｍｅｄｉら，１９９７，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｃｒｏｌｉｄｅ　ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔ　ＦＫ−５０６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４４：７４−８０。
（メチルトランスフェラーゼ）
米国特許第５，２６４，３５５号および米国特許第５，６２２，８６６号（Ｍｅｒｃｋ）。
【００７０】
Ｍｏｔａｍｅｄｉら，１９９６，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓａｎｔｓ　ＦＫ−５０６　ａｎｄ　ＦＫ−５２０，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：５２４３−５２４８。
（ＦＫ−５２０）
ＰＣＴ公報第００／２０６０１号（Ｋｏｓａｎ）。
【００７１】
Ｎｉｅｌｓｅｎら，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０：５７８９−９６。
（ロバスタチン）
米国特許第５，７４４，３５０号（Ｍｅｒｃｋ）。
（ネマデクチン（Ｎｅｍａｄｅｃｔｉｎ））
ＭａｃＮｅｉｌら，１９９３，前出。
（ニダマイシン（Ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）
ＰＣＴ公報第９８／５１６９５号（Ａｂｂｏｔｔ）。
【００７２】
Ｋａｋａｖａｓら，１９９７，Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃａｅｌｅｓｔｉｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：７５１５−７５２２。
（オレアンドマイシン）
Ｓｗａｎら，１９９４，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａ　ｔｙｐｅ　Ｉ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｗｈｉｃｈ　ｈａｓ　ａｎ　ｕｎｕｓｕａｌ　ｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２４２：３５８−３６２。
【００７３】
ＰＣＴ公報第００／０２６３４９号（Ｋｏｓａｎ）。
【００７４】
Ｏｌａｎｏら，１９９８，Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ　ｒｅｇｉｏｎ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｏｌｅａｎｄｏｍｙｃｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，　ｗｈｉｃｈ　ｅｎｃｏｄｅｓ　ｔｗｏ　ｇｌｙｃｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ　ｆｏｒ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｍａｃｒｏｌａｃｔｏｎｅ　ｒｉｎｇ，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５９（３）：２９９−３０８。
【００７５】
ＰＣＴ公報第９９／０５２８３号（Ｈｏｅｃｈｓｔ）。
（ピクロマイシン）
ＰＣＴ公報第９９／６１５９９号（Ｋｏｓａｎ）。
【００７６】
ＰＣＴ公報第００／００６２０（ｔｈｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）。
【００７７】
Ｘｕｅら，１９９８，Ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｃｒｏｌａｃｔｏｎｅｓ　ＹＣ−１７　ａｎｄ　ｎａｒｂｏｍｙｃｉｎ　ｉｓ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｐｉｋＣ−ｅｎｃｏｄｅｄ　ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０　ｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｙ　５（１１）：６６１−６６７。
【００７８】
Ｘｕｅら，１９９８年１０月，Ａ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｆｏｒ　ｍａｃｒｏｌｉｄｅ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ　：　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｍｅｔａｂｏｌｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９５：１２１１１　１２１１６。
（プラテノリド（Ｐｌａｔｅｎｏｌｉｄｅ））
欧州公報第７９１，６５６号；および米国特許第５，９４５，３２０号（Ｌｉｌｌｙ）。
（ラパマイシン）
Ｓｃｈｗｅｃｋｅら，１９９５年８月，Ｔｈｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：７８３９−７８４３。
【００７９】
Ａｐａｒｉｃｉｏら，１９９６，Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｆｏｒ　ｒａｐａｍｙｃｉｎ　ｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ　：　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏｄｕｌａｒ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，Ｇｅｎｅ　１６９：９−１６。
（リファマイシン）
ＰＣＴ公報第９８／０７８６８号（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）。
【００８０】
Ａｕｇｕｓｔら，１９９８年２月１３日，Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｓａｍｙｃｉｎ　ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｒｉｆａｍｙｃｉｎ：ｄｅｄｕｃｔｉｏｎｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｉｆ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅ　ｃｌｕｓｔｅｒ　ｏｆ　Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ　ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ　Ｓ６６９，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　＆　Ｂｉｏｌｏｇｙ，５（２）：６９−７９。
（ソランジウム（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ）ＰＫＳ）
米国特許第６，０９０，６０１号（Ｋｏｓａｎ）。
（ソラフェン（Ｓｏｒａｐｈｅｎ））
米国特許第５，７１６，８４９号（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）。
【００８１】
Ｓｃｈｕｐｐら，１９９５，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　１７７：３６７３−３６７９．Ａ　Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ　（Ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　Ｇｅｎｅ　Ｃｌｕｓｔｅｒ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍａｃｒｏｌｉｄｅ　Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ
Ｓｏｒａｐｈｅｎ　Ａ：Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ　Ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｔｏ　Ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　Ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ。
（スピノシン（Ｓｐｉｎｏｃｙｎ））
ＰＣＴ公報第９９／４６３８７号（ＤｏｗＥｌａｎｃｏ）。
（スピラマイシン）
米国特許第５，０９８，８３７号（Ｌｉｌｌｙ）。
（アクチベータ遺伝子）
米国特許第５，５１４，５４４号（Ｌｉｌｌｙ）。
（チロシン）
米国特許第５，８７６，９９１号；米国特許第５，６７２，４９７号；米国特許第５，１４９，６３８号；欧州公報第７９１，６５５号；および欧州公報第２３８，３２３号（Ｌｉｌｌｙ）。
【００８２】
Ｋｕｈｓｔｏｓｓら，１９９６，Ｇｅｎｅ　１８３：２３１−６．，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｎｏｖｅｌ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｈｙｂｒｉｄ　ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ。
（テーラーリング（Ｔａｉｌｏｒｉｎｇ）酵素）
Ｍｅｒｓｏｎ−ＤａｖｉｅｓおよびＣｕｎｄｌｉｆｆｅ，１９９４，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３：３４９−３５５．Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｆｉｖｅ　ｔｙｌｏｓｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｔｙｌＢＡ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｄｉａｅ　ｇｅｎｏｍｅ。
【００８３】
ポリケチド修飾のための遺伝子を含んでも含まなくてもよい上述の任意の遺伝子は、もしあれば、本発明の組換えＤＮＡ発現ベクター内で使用し得る。さらに、本発明の宿主細胞は、所望のＰＫＳおよび修飾酵素遺伝子クラスターの一部を各々含む複数のベクターを用いる形質転換によって構築し得る（本明細書中で参考として援用される、米国特許第６，０３３，８８３号を参照のこと）。
【００８４】
また、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞を含む本発明の宿主細胞における改良されたポリケチド産生のために、異種ホスホパンテテニル化（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ）トランスフェラーゼを発現する細胞を形質転換し得る。ＰＫＳタンパク質は、ローディングモジュールおよび伸長モジュールのＡＣＰドメインならびに任意のＮＲＰＳのＰＣＰドメインのホスホパンテテニル化（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌａｔｉｏｎ）を必要とする。ホスホパンテテニル化は、ホスホパンテテニル化トランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）と呼ばれる酵素によって媒介される。所望のＰＫＳ酵素上に作用し得るか、またはＰＰＴａｓｅが阻害されている宿主細胞中で機能的ＰＫＳ酵素の量を増加させ得るＰＰＴａｓｅを天然では発現しない宿主細胞において機能的ＰＫＳ酵素を産生するために、異種ＰＰＴａｓｅ（Ｓｆｐが挙げられるが、これに限定されない）を導入し得る（各々本明細書中で参考として援用される、ＰＣＴ公報第９７／１３８４５および同９８／２７２０３号、および米国特許第６，０３３，８８３に記載されている）。この目的のために使用され得る別の適切なＰＰＴａｓｅはＳｔｉｇｍａｔｅｌｌａ　ａｕｒａｎｔｉａｃａ由来のＭｔａＡである。
【００８５】
任意の生物（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳｏｒａｎｇｉｕｍ宿主細胞が挙げられるが、これらに限定されない）中でポリケチド産生を向上させる、本発明により提供される別の方法は、ストレプトマイシン、リファマイシンおよび／またはゲンタマイシンに対して耐性である細胞を選択することである。好ましい実施形態において、ポリケチド産生宿主細胞はこれらの各々の化合物（または、構造上これらに類似する化合物）を用いて連続的にチャレンジし、そしてポリケチド産生能力を高めた耐性細胞が単離され、次の選択段階で使用される。この様式において、例えば制限なしで、エポシロンまたはエポシロン誘導体を高レベルで産生し、かつストレプトマイシン、リファマイシン、およびゲンタマイシンに耐性のＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞が獲得され得る。
【００８６】
本発明の宿主細胞は天然に見出されるポリケチドを産生するだけでなく、組換えＰＫＳ遺伝子および修飾酵素の産物によって産生されるポリケチドを産生するためにも使用され得る。１つの重要な実施形態において、本発明はハイブリッドＰＫＳを有する組換えＤＮＡ発現ベクターを提供する。本発明の目的のために、ハイブリッドＰＫＳは、第１ＰＫＳの１以上の伸長モジュール、ローディングモジュール、およびチオエステラーゼ／シクラーゼドメインの全部または一部ならびに第２ＰＫＳの１以上の伸長モジュール、ローディングモジュール、およびチオエステラーゼ／シクラーゼドメインの全部または一部を含む組換えＰＫＳである。
【００８７】
本発明のハイブリッドＰＫＳにおける第１もしくは第２ＰＫＳのいずれかの全部または一部は、天然に発生する供給源から単離する必要がないことを当業者は理解する。例えば、少量のＡＴドメインのみが、その特異性を決定する。本明細書中で参考として援用される、ＰＣＴ公報第００／００１８３８号を参照のこと。ＤＮＡ合成における当該分野の状況では、当業者はＰＫＳモジュールまたはドメインの有用部分を構築するために十分なサイズのデノボＤＮＡ化合物を構築し得る。本発明の目的のために、このような合成ＤＮＡ化合物がＰＫＳの一部であるとみなす。
【００８８】
上の表で説明するように、本発明のハイブリッドＰＫＳコードＤＮＡ化合物を構築するために使用する、容易に入手可能なＤＮＡおよび配列情報の供給源として役立つ、広範囲のＰＫＳ遺伝子が存在する。ハイブリッドＰＫＳコードＤＮＡ化合物を構築する方法は、米国特許第６，０２２，７３１号；同第５，９６２，２９０号；同第５，６７２，４９１号；ならびに同第５，７１２，１４６号およびＰＣＴ公報第９８／４９３１５号；同第９９／６１５９９号；ならびに同第００／０４７７２４号（各々本明細書中に参考として援用される）に記載されている。本発明のハイブリッドＰＫＳコードＤＮＡ化合物は、２以上のＰＫＳ遺伝子のハイブリッドであり得る。２つの遺伝子のみが使用されている場合でさえ、モジュールの全部または一部が第２ＰＫＳ遺伝子由来であるハイブリッド遺伝子中にしばしば２以上のモジュールが存在する。本発明のハイブリッドＰＫＳは、以下の型の任意のＰＫＳを含むが、これに限定されないことを当業者は理解する：（ｉ）異種モジュール由来の少なくとも１以上のドメインを有するモジュールを含むＰＫＳ；（ｉｉ）異種ＰＫＳ由来のモジュールを含むＰＫＳ；（ｉｉｉ）異種ＰＫＳ由来のタンパク質を含むＰＫＳ；および（ｉｖ）これらの組み合わせ。
【００８９】
本発明のハイブリッドＰＫＳ酵素は、第１ＰＫＳ由来のモジュールの１以上のドメインのコード配列と第２ＰＫＳ由来のモジュールの１以上のドメインのコード配列とを置換して、組換えコード配列を構築することによってしばしば構築される。一般的に、ＫＲ、ＤＨ、および／またはＥＲドメインの挿入および置換に関する本明細書中の任意の参考文献は、モジュール内の関連のＫＲ、ＤＨ、またはＥＲドメインと、そのモジュール由来の対応するドメインとの置換（そのモジュールから挿入または置換されたドメインが獲得される）を含む。任意のモジュールのＫＳおよび／またはＡＣＰはまた、所望であるかまたは有益である場合、別のＫＳおよび／またはＡＣＰと交換され得る。例えば、エポシロン誘導体化合物の産生物がモジュールの改変に起因して低い場合、後続のモジュールのＫＳおよび／またはＡＣＰドメインの改変によって、産生は改良され得る。これらの交換または挿入の各々において、異種ＫＳ、ＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、ＥＲまたはＡＣＰコード配列は、同一のＰＫＳもしくは異なるＰＫＳの別のモジュール由来、またはハイブリッドＰＫＳコード配列が得られる化学合成由来のコード配列からに由来し得る。
【００９０】
本発明の重要な実施形態は、ハイブリッドＰＫＳ遺伝子に関するが、本発明はまた、第２のＰＫＳ遺伝子配列は存在しないが、天然に存在するＰＫＳ遺伝子と１つ以上の変異および／または欠失だけ異なる組換えＰＫＳ遺伝子を提供する。この欠失は、１つ以上のモジュールまたはドメインを包含し得、そして／または１つ以上のモジュールまたはドメイン内の欠失に限定され得る。欠失が伸張モジュール全体（ＮＲＰＳモジュール以外）を包含する場合、得られるポリケチド誘導体は、欠失バージョンが由来するＰＫＳから生成する化合物より短い少なくとも２つの炭素に存在する。この欠失はまた、ＮＲＰＳモジュールおよび／またはローディングモジュールを包含し得る。欠失がモジュール内にある場合、この欠失は、単一のドメイン（代表的には、ＫＲドメイン、ＤＨドメインまたはＥＲドメイン）、または１つより多いドメイン（例えば、ＤＨドメインとＥＲドメインの両方、またはＫＲドメインとＤＨドメインの両方、あるいは３つ全てのＫＲドメイン、ＤＨドメインおよびＥＲドメイン）を包含し得る。ＰＫＳのドメインはまた、変異（例えば、ランダム変異誘発または部位特異的変異誘発）によって機能的に「欠失」され得る。従って、本明細書中で例示される場合、ＫＲドメインは、変異によって非機能的にされ得るかまたは機能性を決して完全でなくし得る。さらに、ＡＴドメインの特異性はまた、変異（例えば、ランダム変異誘発または部位特異的変異誘発）によって変更され得る。
【００９１】
本発明の任意のＰＫＳを構築するために、ＰＣＴ公開番号９８／２７２０３および米国特許第６，０３３，８８３号（これらの各々は本明細書中で参考として援用される）に記載される技術を使用し得、ここで、ＰＫＳの様々な遺伝子および１つ以上のポリケチド改変酵素のための任意の遺伝子は、２つ以上、しばしば３つのセグメントに分割され、このセグメントの各々は、別個の発現ベクター上に配置される（ＰＣＴ公開番号００／０６３３６１（これは本明細書中で参考として援用される）もまた参照のこと）。このように、遺伝子の完全相補体が構築され得、そして異種発現についてより容易に操作され得、そしてこの遺伝子のセグメントの各々は変更され得、そして様々な変更されたセグメントは、単一の宿主細胞に組み込まれて本発明の組換えＰＫＳ遺伝子を提供し得る。この技術により、組換えＰＫＳ遺伝子の大きなライブラリ、これらの遺伝子を発現するためのベクター、およびこれらのベクターを含む宿主細胞の構築が、より効率的になる。このおよび他の状況において、所望のＰＫＳをコードする遺伝子は、２つ以上のベクターで提示され得るだけでなく、この遺伝子が由来するネイティブのプロデューサー生物に存在する場合とは異なって整列または配置され得る。
【００９２】
好ましい例示的な実施形態において、本発明の組換え宿主細胞は、エポシロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）またはエポシロン誘導体を産生する。天然に存在するエポシロン（エポシロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、ＥおよびＦを含む）、および構造的にこのエポシロンに関連した天然に存在しない化合物（エポシロン誘導体またはエポシロンアナログ）は、真核生物細胞に対して特異的な強力な細胞障害性因子である。これらの化合物は、抗真菌剤、癌化学治療剤、および免疫抑制剤としての用途、および一般的に、炎症または任意の過剰増殖疾患（例えば、乾癬、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、およびステントの妨害）の処置のための用途を有する。エポシロンは、このエポシロンが同定された天然に存在するＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ細胞において非常に低レベルで産生される。さらに、Ｓ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍは、非常にゆっくりと増殖し、そしてＳ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ株の発酵は、困難であり時間がかかる。本発明によって提供される１つの重要な利点は、非Ｓ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ宿主細胞においてエポシロンまたはエポシロン誘導体を簡単に産生する能力である。本発明の別の利点は、天然に存在するエポシロンプロデューサー細胞において可能なレベルおよび量よりも、本発明により提供される組換え宿主細胞において、より高いレベルおよびより多くの量で、エポシロンを産生する能力である。さらに別の利点は、組換え宿主細胞においてエポシロン誘導体を産生する能力である。従って、本発明は、所望のエポシロンまたはエポシロン誘導体を産生する組換え宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、宿主細胞は、１０ｍｇ／Ｌ以上のエポシロンまたはエポシロン誘導体を産生する。一実施形態において、本発明は、エポシロンを産生する天然に存在する生物において産生されるよりも高いレベルで、１つ以上のエポシロンまたはエポシロン誘導体を産生する宿主細胞を提供する。別の実施形態において、本発明は、エポシロンを産生する天然に存在する宿主細胞によって産生される混合物よりも複雑ではないエポシロンの混合物を産生する宿主細胞を提供する。
【００９３】
特に好ましい実施形態において、本発明の宿主細胞は、エポシロンを産生する天然に存在する宿主細胞が産生するよりも複雑ではないエポシロンの混合物を産生する。一例として、本発明の特定の宿主細胞は、天然に存在するＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍにより産生される混合物よりも複雑ではない混合物で、エポシロンＤを産生し得る。なぜなら、エポシロンＤは、本発明の宿主細胞においては主生成物であり、天然に存在する宿主細胞においては少量の生成物であるからである。エポシロンを産生する天然に存在するＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ細胞は、代表的には、エポシロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆおよび他の非常に少量の生成物の混合物を賛成し、エポシロンＡおよびＢのみが、主生成物として存在する。以下の表１は、本発明の異なる例示的な宿主細胞において産生されるエポシロンをまとめる。
【００９４】
【表１】
2004508810.tif 000005
従って、本発明の組換え宿主細胞はまた、ただ１つの所望のエポシロンまたはエポシロン誘導体を、主生成物として産生する宿主細胞を含む。
【００９５】
単にエポシロンＰＫＳのドメインの分析に基づいて、ＰＫＳ酵素は、「Ｇ」および「Ｈ」と任意に命名されたエポシロン（これらの構造は以下に示される）の産生を触媒すると予想し得る：
【００９６】
【化７】
2004508810.tif 000006
エポシロンＧ（Ｒ＝Ｈ）およびエポシロンＨ（Ｒ＝ＣＨ３）。
【００９７】
エポシロンＧがＣ１２において水素を有し、エポシロンＨがこの位置においてメチル基を有する点で、これらの化合物は互いに異なる。Ｃ１２位における不一致は、ＰＫＳの対応するＡＴドメイン（伸長モジュール４）がマロニルＣｏＡに結合して水素を誘導する能力、またはメチルマロニルＣｏＡに結合してメチルを誘導する能力のいずれかから生じると予測される。しかし、エポシロンＧおよびエポシロンＨは、天然でも本発明の組換え宿主細胞においても観察されていない。その代わり、ＰＫＳの産物は、エポシロンＣおよびエポシロンＤと考えられ、このエポシロンＣおよびエポシロンＤは、それぞれ、Ｃ−１２〜Ｃ−１３の二重結合を有しＣ−１３のヒドロキシル置換基を欠くことだけ、エポシロンＧおよびエポシロンＨとは異なる。異種宿主細胞におけるエポシロンＰＫＳ遺伝子の発現およびこの遺伝子の遺伝子改変により産生される産物に基づいて、以下により十分に記載されるように、エポシロンＣおよびエポシロンＤにおいてＣ１２−Ｃ１３二重結合を形成する脱水反応は、エポシロンＰＫＳ自体によって行われると考えられる。エポシロンＡおよびエポシロンＢは、それぞれ、エポシロンＣおよびエポシロンＤから、ｅｐｏＫ遺伝子産物によるＣ１２−Ｃ１３二重結合のエポキシ化によって形成される。エポシロンＥおよびエポシロンＦは、以下でさらに議論されるように、それぞれ、エポシロンＡおよびエポシロンＢから、Ｃ２１のメチル基のヒドロキシル化によって、またはエポシロンＰＫＳのローディングモジュールにより、マロニルＣｏＡの代わりにヒドロキシマロニルＣｏＡを組み込むことによって形成され得る。
【００９８】
従って、エポシロンＰＫＳ遺伝子およびｅｐｏＫ遺伝子の、本発明の宿主細胞における発現は、エポシロンＡ、Ｂ、ＣおよびＤの産生を導く。ｅｐｏＫ遺伝子が存在しないか、または変異によって不活性にされるかもしくは部分的に不活性にされる場合、エポシロンＣおよびエポシロンＤは、主生成物として産生される。伸長ドメイン４のＡＴドメインが、マロニルＣｏＡに対して特異的なＡＴドメインで置換される場合、エポシロンＡおよびエポシロンＣが産生され、そして機能的ｅｐｏＫ遺伝子が存在しない場合、エポシロンＣが、主生成物として産生される。伸長モジュール４のＡＴドメインが、メチルマロニルＣｏＡに対して特異的なＡＴドメインで置換される場合、エポシロンＢおよびエポシロンＤが主生成物として産生され、そして機能的ｅｐｏＫ遺伝子が存在しない場合、エポシロンＤが主生成物として産生される。
【００９９】
エポシロンＰＫＳおよび改変酵素遺伝子は、エポシロン産生株のＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ　ＳＭＰ４４からクローン化した。総ＤＮＡを、Ｊａｏｕａら、１９９２，Ｐｌａｓｍｉｄ　２８：１５７−１６５（これは本明細書中で参考として援用される）により記載される手順を使用して、この株から調製した。コスミドライブラリーを、ｐＳｕｐｅｒｃｏｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）において、Ｓ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍゲノムＤＮＡから調製した。ＰＫＳおよび改変酵素遺伝子クラスター全体を、４つの重複コスミドクローン（１９９９年２月１７日にブダペスト条約に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，２０１１０−２２０９　ＵＳＡ）に寄託し、以下のようなＡＴＣＣ受託番号を割り当てられた：ｐＫＯＳ３５−７０．１Ａ２（ＡＴＣＣ　２０３７８２）、ｐＫＯＳ３５−７０．４（ＡＴＣＣ　２０３７８１）、ｐＫＯＳ３５−７０．８Ａ３（ＡＴＣＣ　２０３７８３）、およびｐＫＯＳ３５−７９．８５（ＡＴＣＣ　２０３７８０））から単離し、そしてＤＮＡ配列を、ＰＣＴ公開番号００／０３１２３７（これは本明細書中で参考として援用される）に記載されるようにして決定した。ＤＮＡ配列分析は、ローディング分子および９個の伸長モジュールを有するＰＫＳ遺伝子クラスターを明らかにした。ＰＫＳ配列の下流は、ｅｐｏＫと称されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であり、これはシトクロムＰ４５０オキシダーゼ遺伝子に対して強い相同性を示し、そしてエポシロンエポキシダーゼ改変酵素をコードする。
【０１００】
ＰＫＳ遺伝子は、６個のＯＲＦから構成される。ポリペプチドレベルにおいて、ローディングモジュールおよび伸長モジュール１（ＮＲＰＳ）、２および９は、個々のポリペプチド上に現れ；これらの対応する遺伝子は、それぞれ、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣおよびｅｐｏＦと命名される。モジュール３、４、５および６は、単一のポリペプチド（この遺伝子は、ｅｐｏＤと命名される）に含まれ、そしてモジュール７および８は、別のポリペプチド（この遺伝子は、ｅｐｏＥと命名される）に存在する。ＯＲＦ間の間隔は、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、ｅｐｏＥおよびｅｐｏＦが、オペロンを構築することを示唆する。ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢおよびｅｐｏＫ遺伝子はまた、この大きなオペロンの一部であり得るが、ｅｐｏＢとｅｐｏＣとの間に約１００ｂｐの空間が存在し、そしてｅｐｏＦとプロモーターを含み得るｅｐｏＫとの間に１１５ｂｐの空間が存在する。エポシロンＰＫＳ遺伝子クラスターは、以下のスキーム１に概略的に示される。
【０１０１】
【化８】
2004508810.tif 000007
ｅｐｏＫのすぐ下流のＰ４５０エポキシダーゼ遺伝子は、ＯＲＦ１であり、これは膜貫通ドメインを含むようでありかつエポシロン輸送に関与し得るポリペプチドをコードする。このＯＲＦは、輸送および調節に関与するタンパク質をコードし得る遺伝子を含む多数のＯＲＦに続く。このモジュールの詳細な試験は、エポシロンの生合成と一致した構成および組成を示す。以下の記載は、ポリペプチドレベルにある。ローディングモジュールおよび伸長モジュール３、４、５および９におけるＡＴドメインの配列は、マロニルローディングモジュールについてのコンセンサス配列に対する類似性を示し、それぞれ、Ｃ−１４、Ｃ−１２（エポシロンＡおよびＣ）、Ｃ−１０およびＣ−２におけるＨ側鎖の存在、ならびにローディングモジュールの存在と一致する。モジュール２、６、７および８におけるＡＴドメインは、ＡＴドメインを特定するメチルマロニルについて、コンセンサス配列を構築し、またそれぞれ、Ｃ−１６、Ｃ−８、Ｃ−６およびＣ−４におけるメチル側鎖の存在と一致する。
【０１０２】
ローディングモジュールは、通常活性部位に存在するシステイン残基がチロシンに変わったＳＫドメインを含む。このドメインは、ＫＳｙと称され、そしてデカルボキシラーゼとして働き、これは、その正常な機能の一部であるが、縮合酵素として機能し得ない。従って、このローディングモジュールは、マロニルＣｏＡを負荷し、これをＡＣＰに移動し、そしてこれを脱カルボキシル化して、システインとの縮合に必要なアセチル残基を生成することが予測される。伸長モジュール１は、システインを活性化し、そしてローディングモジュール上のアセテートとの縮合を触媒する非リボソームペプチドシンセターゼである。この配列は、アミノ酸の活性化に必要なＡＴＰ結合ドメインおよびＡＴＰａｓｅドメインと非常に類似したセグメント、ホスホパンテイニル化部位、酸化ドメイン、環化ドメイン、ならびに伸長ドメインを含む。伸長ドメイン２は、Ｃ−１５〜Ｃ−１７におけるエポシロンの構造を決定する。モジュール２におけるＤＨドメインの存在は、このモジュール内のＣ−１６〜１７デヒドロ部分を生じる。モジュール３におけるドメインは、Ｃ−１４およびＣ−１５におけるエポシロンの構造と一致し；ＫＲの作用から生じるＯＨは、分子のラクトン化において用いられる。伸長モジュール４は、エポシロンＣおよびＤ内の、二重結合が見出されるＣ−１２およびＣ−１３における構造を制御する。ＡＴドメインの配列は、マロネートローディングを特定する配列と類似しているようであるが、これはまた、メチルマロネートを負荷し、それによりある程度、天然に存在する生物の発酵ブロスにおいて見出されるエポシロンの混合物の原因となる。
【０１０３】
機能の予測されるアレイからの有意な逸脱は、伸長モジュール４において見出された。このモジュールは、ＤＨドメインを含み、それによりエポシロンＣおよびＤの合成を、ＰＫＳの産物として検出すると予測された。分析は、モジュール４のＡＴドメインとＫＲドメインとの間の空間は、機能的ＤＨドメインを収容するのに十分には大きくないと評価した。従って、モジュール４における還元の程度は、伸長モジュール４によって指向される縮合後に形成されるβ−ケトのケト還元を越えて進行しないようである。本明細書中に示されるように、エポシロンＰＫＳ遺伝子単独は、本発明の宿主細胞に、エポシロンＣおよびＤを産生する能力を与えるのに十分である。エポシロンＣおよびＤの異種産生は、二重結合を導入するデヒドラターゼの機能が存在することを示す。エポシロンＰＫＳ遺伝子の異種発現および改変されたエポシロンＰＫＳ遺伝子により産生される産物に基づいて、この二重結合を形成する脱水反応は、エポシロンＰＫＳの伸長モジュール５のＤＨドメイン、およびモジュール５のＥＲドメインによる還元の前の、共役したジエン前駆体の生成により媒介されると考えられる。
【０１０４】
伸長モジュール５および６の各々は、還元ドメイン（ＫＲ、ＤＨおよびＥＲ）のフルセットを有し、Ｃ−１１およびＣ−９においてメチレン官能基を生成する。伸長モジュール７および９は、ＫＲドメインを有し、Ｃ−７およびＣ−３においてヒドロキシルを生成し、そして伸長ドメイン８は、機能的ＫＲドメインを有さず、Ｃ−５におけるケト基の存在と一致する。伸長モジュール８はまた、メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ）ドメインを含み、これはＣ−４におけるジェミナルなジメチル官能基の存在を生じる。伸長モジュール９はまた、ポリケチド合成を終結し、閉環反応を触媒するチオエステラーゼドメインを有する。
【０１０５】
エポシロンＰＫＳの遺伝子、タンパク質、モジュールおよびドメインを、以下の表２にまとめる。
（表２）
【０１０６】
【表２】
2004508810.tif 000008
ＮＲＰＳ−非リボソームペプチドシンセターゼ；ＫＳ−ケトシンターゼ；ｍＡＴ−マロニルＣｏＡ特定化アシルトランスフェラーゼ；ｍｍＡＴ−メチルマロニルＣｏＡ特定化アシルトランスフェラーゼ；ＤＨ−デヒドラターゼ；ＥＲ−エノイルレダクターゼ；ＫＲ−ケトレダクターゼ；ＭＴ−メチルトランスフェラーゼ；ＴＥ−チオエステラーゼ；＊−不活性ドメイン。
【０１０７】
配列検査により、ｅｐｏＡとｅｐｏＢとの間（ローディングモジュールと伸長モジュール１　ＮＲＰＳとの間）、およびｅｐｏＣとｅｐｏＤとの間の翻訳カップリングが評価された。非常に小さなギャップは、ｅｐｏＤとｅｐｏＥとの間、およびｅｐｏＥとｅｐｏＦとの間に見出されるが、１００ｂｐを越えるギャップは、ｅｐｏＢとｅｐｏＣとの間、およびｅｐｏＦとｅｐｏＫとの間に見出される。これらの遺伝子間領域は、プロモーターを含み得る。
【０１０８】
従って、エポシロンＰＫＳは、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、ｅｐｏＥ、およびｅｐｏＦ遺伝子の遺伝子産物からなる多タンパク質複合体である。エポシロンを産生する能力を宿主細胞に与えるために、この宿主細胞に、この宿主細胞において発現し得る本発明の組換えｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、ｅｐｏＥ、およびｅｐｏＦ遺伝子、ならびに必要に応じて他の遺伝子（例えば、ｅｐｏＫ）を提供する。当業者は、エポシロンおよび他のＰＫＳ酵素は、本明細書中で単一の実体として言及され得るが、これらの酵素は代表的に、マルチサブユニットタンパク質であることを理解する。従って、ＰＫＳを構築する複数のタンパク質のうち１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子を改変することによって、誘導体ＰＫＳ（天然に存在するＰＫＳとは欠失または変異だけ異なるＰＫＳ）またはハイブリッドＰＫＳ（２つの異なるＰＫＳ酵素の部分から構成されるＰＫＳ）を作製し得る。
【０１０９】
エポシロンのＰＫＳ後改変または変更は、複数の酵素により媒介される複数の工程を包含する。これらの酵素は、本明細書中で変更または改変酵素と称される。エポシロンＰＫＳ遺伝子のｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、ｅｐｏＥ、およびｅｐｏＦ遺伝子の、ｅｐｏＫを発現しない本発明の宿主細胞における発現は、主生成物としてのエポシロンＣおよびＤの産生を生じ、これらのエポシロンＣおよびＤは、エポシロンＡおよびＢのＣ−１２−Ｃ−１３エポキシドを欠くが、その代わりＣ−１２−Ｃ−１３二重結合を有する。従って、エポシロンＣおよびＤは、ｅｐｏＫ遺伝子によってコードされるエポキシダーゼにより、エポシロンＡおよびＢに変換される。エポシロンＡおよびＢは、ヒドロキシラーゼ遺伝子によって、エポシロンＥおよびＦに変換され得、これは、エポシロンＰＫＳ遺伝子クラスターと関連した遺伝子によってコードされ得るか、またはＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍに対して内在性の別の遺伝子によってコードされ得る。あるいは、これらの化合物は、マロニルＣｏＡ以外のスターター単位（例えば、ヒドロキシマロニルＣｏＡ）を結合するローディングモジュールによって形成され得る。従って、本発明によって提供される１つ以上の組換え改変酵素遺伝子を有する宿主細胞を提供することによって、または改変酵素を自然に発現する（または発現しない）宿主細胞を使用することによって、および／あるいはマロニルＣｏＡ以外のスターター単位を提供することによって、この宿主細胞において、必要に応じて改変されたエポシロンまたはエポシロン誘導体を産生し得る。
【０１１０】
従って、本発明は、多種多様な組換えＤＮＡ化合物、ならびに天然に存在するエポシロンＡ、Ｂ、ＣおよびＤ、およびそれらの誘導体を発現するための宿主細胞を提供する。本発明はまた、エポシロンＥおよびＦと類似の様式で改変されたエポシロン誘導体を産生する組換え宿主細胞を提供する。さらに、本発明の任意のエポシロンまたはエポシロン誘導体は、ＰＣＴ公開番号００／０３９２７６（本明細書中で参考として援用される）に記載される方法に従って、対応するエポシロンＥまたはＦ誘導体に変換され得る。
【０１１１】
本発明はまた、多種多様な組換えＤＮＡ化合物、およびエポシロン誘導体を作製する宿主細胞を提供する。本明細書中で使用する場合、成句、エポシロン誘導体とは、少なくとも１つのドメインが挿入されたか、またはドメインが欠失もしくは変異によって不活性にされたか、その触媒機能を変更するように変異されたか、もしくは異なる機能を有するドメインによって置換されたかのいずれかの組換えエポシロンＰＫＳによって産生される化合物をいう。任意の場合において、このように産生されたエポシロン誘導体ＰＫＳは、エポシロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦからなる群から選択される天然に存在するエポシロンの構造とは異なる化合物を産生するように機能する。本発明によって提供される組換えＤＮＡ化合物および宿主細胞のさらなる理解を容易にするために、エポシロンＰＫＳのローディングモジュールおよびモジュールの各々、ならびにそれらの新規の組換え誘導体の詳細な考察を、以下に示す。
【０１１２】
エポシロンＰＫＳのローディングモジュールは、「不活性な」ＫＳドメイン（ＫＳＹと称される）を含み、これは、「活性な」ＫＳドメイン中に見出されるシステイン残基の変わりのチロシン（Ｙ）残基の存在に起因して、活性なＫＳドメインによって媒介される縮合反応を行い得ない。このＫＳＹドメインは、ＫＳドメインによって媒介される脱カルボキシル化反応を行う。このような「不活性な」ＫＳドメインは、通常は、活性部位のシステインの代わりのグルタミン（Ｑ）残基と共に、他のＰＫＳ酵素中で見出され、そしてＫＳＱドメインと呼ばれる。ラット脂肪酸シンターゼ中のＫＳＱドメインは、縮合を行い得ないことが示されたが、脱カルボキシル化における２オーダーの大きさの増加を示す。Ｗｉｔｋｏｗｓｋｉら、７　Ｓｅｐ．１９９９，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３８（３６）：１１６４３−１１６５０（本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。ＫＳＱドメインは、脱カルボキシル化において、ＫＳＹドメインよりも効率的であり得、その結果、エポシロンＰＫＳ中のＫＳＹドメインのＫＳＱでの置換により、いくつかの宿主細胞における、または特定の培養条件下のエポシロン生合成の効率が増加し得る。これは、以下の実施例６に記載されるように、単にコドンをチロシンコドンからグルタミンコドンに変えることによって達成され得る。これはまた、ＫＳＹドメインを、別のＰＫＳ（例えば、オレアンドリド（ｏｌｅａｎｄｏｌｉｄｅ）ＰＫＳまたはナルボノリド（ｎａｒｂｏｎｏｌｉｄｅ）ＰＫＳ）のＫＳＱドメインで置換することによって達成され得る（上記の表で引用される参考文献を、オレアンドロマイシン、ナルボマイシンおよびピクロマイシンＰＫＳ、ならびに改変酵素と共に参照のこと）。
【０１１３】
エポシロンローディングモジュールはまた、マロニルＣｏＡに特異的なＡＴドメイン（これは、ＫＳＹによって脱カルボキシル化されて、アセチル基を生成すると考えられている）、およびＡＣＰドメインを含む。本発明は、組換えエポシロン誘導体ローディングモジュールまたはそれらのコードＤＮＡ配列を提供し、ここで、マロニル特異的ＡＴドメインまたはそのコード配列は、別の特異性（例えば、メチルマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、および２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ）に変更されている。エポシロンＰＫＳの他のタンパク質と共に発現される場合、このようなローディングモジュールは、エポシロンのチアゾール間のメチル置換基が、それぞれ、エチル、プロピルおよびヒドロキシメチルで置換されたエポシロンの生成を生じる。本発明は、このようなローディングモジュールを含む組換えＰＫＳ酵素、およびこのような酵素を産生するための宿主細胞、ならびにこれによって産生されるポリケチドを提供する。ＡＴドメインが、２−ヒドロキシマロニルＣｏＡを特定化するように変更される場合、対応するエポシロンＰＫＳ誘導体は、エポシロンＥおよびエポシロンＦ誘導体を産生する。２−ヒドロキシマロニルＣｏＡに対して特異的なＡＴドメインは、産生されるポリケチドの対応する位置にヒドロキシル基を有するポリケチドを生じ、このヒドロキシル基は、メチル化されて、ポリケチド改変酵素によってメトキシ基を生成する。例えば、上記の表のＦＫ−５２０　ＰＫＳと共に引用される参考文献を参照のこと。従って、本明細書中の２−ヒドロキシマロニル特異的ＡＴドメインを有するＰＫＳとの言及は、ポリケチド中の対応する位置にヒドロキシル基またはメトキシ基のいずれかを有するＰＫＳにより産生されるポリケチドをいう。
【０１１４】
エポシロンＰＫＳのローディングモジュールはまた、ＥＲドメインを含む。このＥＲドメインは、エポシロンのチアゾール部分の二重結合のうちの１つの形成に関与し得る（その通常の反応とは逆に）が、これは非官能性であり得る。いずれの場合においても、本発明は、ＥＲ領域を有するかまたは有さないエポシロンＰＫＳローディングモジュールをコードする組換えＤＮＡ化合物、ならびにエポシロンローディングモジュールのＥＲドメインの代わりに別のＰＫＳ由来のＥＲドメイン（活性または不活性のいずれかであり、付随的なＫＲドメインおよびＤＨドメインを有するかまたは有さない）を含むハイブリッドローディングモジュールを提供する。本発明はまた、このようなローディングモジュールを含む組換えＰＫＳ酵素、ならびにこのような酵素を産生するための宿主細胞、およびこれにより産生されるポリケチドを提供する。
【０１１５】
エポシロンＰＫＳのローディングモジュールはまた、異種ＰＫＳ由来のローディングモジュールと置換されて、エポシロン誘導体を作製するハイブリッドＰＫＳを形成する。１つの実施形態において、エポシロンＰＫＳのローディングモジュールは、以下の実施例に記載されるように、ＮＲＰＳで置換される。
【０１１６】
エポシロンＰＫＳのローディングモジュールは、ＰＫＳの第一の伸長モジュールに続き、これは、システインに特異的な伸長ＮＲＰＳモジュールである。このＮＲＰＳモジュールは、別個のタンパク質（ｅｐｏＢ遺伝子の産物）として天然に発現される。１つの実施形態において、ＮＲＰＳモジュールコード配列の一部分は、異種コード配列とともに利用される。この実施形態において、本発明は、例えば、システインから別のアミノ酸にエポシロンＰＫＳのＮＲＰＳモジュールの特異性を変化することを提供する。この変化は、コード配列を構築することによって達成され、ここで、このエポシロンＰＫＳ　ＮＲＰＳモジュールコード配列の全てまたは一部分が、異なる特異性のＮＲＰＳモジュールのコードする配列によって置換されている。
【０１１７】
１つの例示的な実施形態において、エポシロンＮＲＰＳモジュールの特異性が、システインからセリンまたはスレオニンに変化される。このような改変ＮＲＰＳモジュールがエポシロンＰＫＳの他のタンパク質と共に発現される場合、組換えＰＫＳは、エポシロン誘導体を生成し、ここで、エポシロン（エポシロン誘導体）のチアゾール部分が、各々、オキサゾールまたは５−メチルオキサゾール部分に変換される。従って、例示的な実施形態において、本発明は、宿主細胞、ベクター、および組換えエポシロンＰＫＳ酵素を提供し、ここで、ＮＲＰＳドメインは、エポシロンＮＲＰＳのアデニル化ドメインとｅｎｔＦ遺伝子によってコードされるＮＲＰＳのアデニル化ドメインとの置換によって変更されている（セリンについて）。別の例示的な実施形態において、本発明は、宿主細胞、ベクター、および組換えエポシロンＰＫＳ酵素を提供し、ここで、ＮＲＰＳドメインは、エポシロンＮＲＰＳのアデニル化ドメインとｖｉｂＦ遺伝子によってコードされるＮＲＰＳのアデニル化ドメインとの置換によって変更されている（スレオニンについて）。１つの実施形態において、これらのＮＲＰＳ置換は、エポシロンＰＫＳにおいてなされ、このエポシロンＰＫＳはまた、オキサゾールおよびメチルオキサゾールエポシロン誘導体の１６−デスメチル誘導体を生成するために、メチルマロニルＣｏＡの代わりに、マロニルＣｏＡに結合する伸長モジュール２を含む。
【０１１８】
あるいは、本発明は、ＮＲＰＳモジュールを伴わないかまたは異種ＰＫＳ由来のＮＲＰＳモジュールを伴う、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、ｅｐｏＥ、およびｅｐｏＦ遺伝子（またはそれらの改変されたバージョン）の産物からなる組換えＰＫＳ酵素を提供する。この異種ＮＲＰＳモジュールは、別個のタンパク質としてか、あるいはｅｐｏＡまたはｅｐｏＣ遺伝子を有する融合タンパク質として発現され得る。ＰＫＳの１つのモジュールを別のモジュールと置換する場合に、適合性のモジュール間リンカー配列を維持するかまたはそうでなければ利用することを確実にすることが重要であり得る。ＰＣＴ公開番号００／０４７７２４を参照のこと（参考として援用される）。
【０１１９】
別の実施形態において、本発明は、組換えエポシロンＰＫＳ酵素および対応する組換えＤＮＡ化合物ならびにベクターを提供し、ここで、ＮＲＰＳモジュールは、不活性化されているかまたは欠失されている。従って、本発明によって提供される不活性なＮＲＰＳモジュールタンパク質およびコード配列は、ＰＣＰドメインが、完全にまたは部分的に欠失されているか、またはそうでなければ活性部位セリン（ホスホパンテテイニル化のための部位）を別のアミノ酸（例えば、アラニン）に置換することによって不活性化されているか、もしくは、アデニル化ドメインが、欠失されているかまたはそうでなければ不活性化されているものを含む。１つの実施形態において、ローディングモジュールおよびＮＲＰＳの両方が、欠失されているかまたは不活性化されている。任意の事象において、得られたエポシロンＰＫＳは、次いで、エポシロンＰＫＳまたはエポシロン誘導体のためにＰＫＳの伸長モジュール２（または引き続くモジュール）のＫＳドメインに結合する基質が提供される場合にのみ、機能し得る。本発明によって提供される方法において、このように改変された細胞は、次いで、活性化アシルチオエステルを供給され、この活性化アシルチオエステルは、好ましくは、第二の、しかし潜在的に任意に引き続く、伸長モジュールによって結合され、そして新規なエポシロン誘導体に処理される。この宿主細胞は、活性化アシルチオエステルを供給されて、本発明の新規なエポシロン誘導体を生成する。ＰＫＳを発現する宿主細胞またはこれを含む抽出物を含まない細胞は、新規な前駆体分子のＮ−アシルシステアミンチオエステル（ＮＡＣＳ）を供給されるかまたはこれを補充されて、エポシロン誘導体を調製し得る。ＰＣＴ公開番号ＵＳ９９／０３９８６および００／０４４７１７（この両方は、本明細書中で参考として援用される）、および以下の実施例９および実施例１０を参照のこと。
【０１２０】
エポシロンＰＫＳの第二の（最初の非ＮＲＰＳ）伸長モジュールは、ＫＳ、メチルマロニルＣｏＡに特異的なＡＴ、ＤＨ、ＫＲ、およびＡＣＰを含む。エポシロンＰＫＳの第二の伸長モジュールは、ｅｐｏＣ遺伝子によって個別のタンパク質として生成される。第二の伸長モジュールコード配列の全てまたは一部分のみが、ハイブリッドモジュールを作製するために、他のＰＫＳコード配列と共に使用される。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴをマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴと置換すること；ＤＨまたはＫＲもしくは両方を欠失すること；ＤＨまたはＫＲもしくは両方を、異なる立体化学に特異的なＤＨまたはＫＲもしくは両方と置換すること；ならびに／またはＥＲを挿入することのいずれかを提供する。得られた第二の異種伸長モジュールコード配列は、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳを構成する他のタンパク質とともに同時発現される。あるいは、エポシロンＰＫＳの第二の伸長モジュールが欠失され得るか、またはこれが異種ＰＫＳ由来のモジュールと置換され得、これは、別個のタンパク質として、またはｅｐｏＢまたはｅｐｏＤ遺伝子産物のいずれかに融合され得る融合タンパク質として、発現され得る。
【０１２１】
本発明の例示的な組換えＰＫＳ遺伝子は、エポシロンＰＫＳの第二の伸長モジュールについてのＡＴドメインをコードする配列が、メチルマロニル特異的ＡＴからマロニル特異的ＡＴをコードするＡＴドメインを変化させるために、変更または改変されているものを含む。このようなマロニル特異的ＡＴドメインをコードする核酸が、例えば、限定されないが、ナルボノライド（ｎａｒｂｏｎｏｌｉｄｅ）ＰＫＳ、ソラフェン（ｓｏｒａｐｈｅｎ）ＰＫＳ、ラパマイシンＰＫＳ（すなわち、伸長モジュール２および１２）、ならびにＦＫ５２０　ＰＫＳ（すなわち、伸長モジュール３、７、および８）をコードするＰＫＳ遺伝子から単離され得る。このような第二のハイブリッド伸長モジュールが、エポシロンＰＫＳを構成する他のタンパク質とともに同時発現される場合、生成された得られたエポシロン誘導体は、１６−デスメチルエポシロンである。１つの実施形態において、このハイブリッドＰＫＳはまた、伸長モジュール４にメチルマロニルＣｏＡ特定的ＡＴドメインを含み、そして機能的ｅｐｏＫ遺伝子を欠く宿主細胞において発現され（ｅｐｒｅｓｓｅｄ）、その結果、生成される化合物は、１６−デスメチルエポシロンＤである。別の実施形態において、このハイブリッドＰＫＳはまた、スレオニンに特異的な変更されたＮＲＰＳを含み、これは、５−メチルオキサゾール−１６−デスメチルエポシロンの生成に導く。さらに、本発明は、組換えエポシロンＰＫＳ酵素および対応する組換えタンパク質をコードするＤＮＡ化合物およびベクターを提供し、ここで、ＫＳドメインは、第二の（または引き続く）伸長モジュールのＫＳドメインが、以下の実施例９に記載されるように、不活性化されているかまたは欠失されている。好ましい実施形態において、この不活性化は、活性部位のシステインについてのコドンをアラニンコドンに変化することによって達成される。ＮＲＰＳモジュールについて上記に記載される対応する改変体と同様に、得られた組換えエポシロンＰＫＳ酵素は、残りのドメインおよび組換えＰＫＳ酵素のモジュールによって結合および伸長され得る前駆体を供給しない限り、エポシロンまたはエポシロン誘導体を生成し得ない。例示的な前駆体化合物は、以下の実施例１０に記載される。あるいは、ｅｐｏＤ、ｅｐｏＥ、およびｅｐｏＦ遺伝子のみを発現する宿主細胞にこのような前駆体が単に提供され得る。
【０１２２】
エポシロンＰＫＳのこの第三の伸長モジュールは、ＫＳ、マロニルＣｏＡの特異的なＡＴ、ＫＲ、およびＡＣＰを含む。エポシロンＰＫＳのこの第三の伸長モジュールは、タンパク質（ｅｐｏＤ遺伝子の産物）として発現され、これはまた、モジュール４、５および６を含む。伸長モジュール３〜６のいずれかの改変に起因して、エポシロン誘導体を生成する組換えエポシロンＰＫＳを作製するために、代表的に、全ての４つの伸長モジュールを含むタンパク質が発現される。１つの実施形態において、第三の伸長モジュールコード配列の全てまたは一部分が、ハイブリッドモジュールを作製するために、他のＰＫＳコード配列と共に使用される。この実施形態において、本発明は、例えば、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、メチルマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴと置換すること；ＫＲを欠失すること；ＫＲを、異なる立体化学に特異的なＫＲと置換すること；ならびに／あるいはＤＨ、またはＤＨおよびＥＲを挿入することのいずれかを提供する。得られた第三の異種伸長モジュールコード配列は、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳについてのコード配列とともに利用され得る。
【０１２３】
本発明の例示的な組換えＰＫＳ遺伝子は、エポシロンＰＫＳの第三の伸長モジュールについての配列をコードするＡＴドメインが、マロニル特異的ＡＴからメチルマロニル特異的ＡＴをコードするＡＴドメインを変化させるために、変更または改変されているものを含む。このようなメチルマロニル特異的ＡＴドメインをコードする核酸が、例えば、限定されないが、ＤＥＢＳをコードするＰＫＳ遺伝子、ナルボノライド（ｎａｒｂｏｎｏｌｉｄｅ）ＰＫＳ、ラパマイシンＰＫＳ、ならびにＦＫ−５２０　ＰＫＳから単離され得る。残りのモジュールおよびエポシロンＰＫＳのタンパク質またはエポシロンＰＫＳ誘導体とともに同時発現される場合、組換えＰＫＳは、本発明の１４−メチルエポシロン誘導体を生成する。
【０１２４】
当業者は、ＰＫＳの第三の伸長モジュールのＫＲドメインが、エポシロンの環化に関連するヒドロキシル基を形成する原因であることを認識する。結果的に、第三の伸長モジュールのＫＲドメインを、破壊すること、あるいはＤＨまたはＤＨおよびＥＲドメインを付加することが、環化を妨害し、このことは、直鎖状分子、あるいはエポシロンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、およびＦとは異なる位置で環化される分子に導く。
【０１２５】
エポシロンＰＫＳの第四の伸長モジュールは、ＫＳ、マロニルＣｏＡまたはメチルマロニルＣｏＡのいずれかに結合し得るＡＴ、ＫＲ、およびＡＣＰを含む。１つの実施形態において、第四の伸長モジュールコード配列の全てまたは一部分のみが、ハイブリッドモジュールを作製するために、他のＰＫＳコード配列と共に使用される。この実施形態において、本発明は、例えば、マロニルＣｏＡおよびメチルマロニル特異的ＡＴを、マロニルＣｏＡ、メチルマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴと置換すること；ＫＲを欠失すること；ならびに／あるいは、ＫＲを置換すること（必要に応じて、異なる立体化学に特定することを含む）；ならびに／またはＤＨもしくはＤＨおよびＥＲを挿入することのいずれかを提供する。得られた第四の異種伸長モジュールコード配列は、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを合成する組換えＰＫＳのタンパク質サブユニットに組み込まれる。あるいは、本発明は、エポシロンおよびエポシロン誘導体のための組換えＰＫＳ酵素を提供し、ここで、第四の伸長モジュール全体が、欠失され得るか、またはこれが異種ＰＫＳ由来のモジュールと置換され得る。
【０１２６】
好ましい実施形態において、本発明は、メチルマロニルＣｏＡに結合するがマロニルＣｏＡに結合しない（またはマロニルＣｏＡに結合するかメチルマロニルＣｏＡに結合しない）ＡＴをコードするように改変されたエポシロンＰＫＳの第四の伸長モジュールについてのコード配列を含む組み換えＤＮＡ化合物を提供する。１つの実施形態において、特異性のこの変化は、伸長モジュール４ＡＴドメインについてのコード配列の変異によって達成される。このような変異は、変異誘発剤（例えば、ＵＶ光）を使用してか、または特異的変異誘発によって、ランダムに達成され得る。別の実施形態において、特異性のこの変化は、伸長モジュール４ＡＴドメインコード配列の全てまたは一部分を、異種ＡＴドメインについてのコード配列と置換することによって、達成される。従って、本発明は、組換えＤＮＡ化合物および発現ベクター、ならびに対応する組換えＰＫＳを提供し、ここで、第四のハイブリッド伸長モジュール（メチルマロニル特異的ＡＴを有する）が組み込まれている。このメチルマロニル特異的ＡＴコード配列は、例えば、限定されないが、オレアンドライドＰＫＳ、ＤＥＢＳ、ナルボノライドＰＫＳ、ラパマイシンＰＫＳ、またはメチルマロニル特異的ＡＴドメインを含む任意の他のＰＫＳについてのコード配列から開始し得る。
【０１２７】
本発明に従って、このコード配列から発現された第四のハイブリッド伸長モジュールは、エポシロンＰＫＳ（または、エポシロン誘導体についてのＰＫＳ）に、代表的には、エポシロンＰＫＳの誘導体ｅｐｏＤ遺伝子産物（これは、改変された第四の伸長モジュール、および伸長モジュール３、５、および６を有する）として、組み込まれ得、これらのモジュールの１つ以上は、必要に応じてエポシロンＰＫＳの誘導体の形態であり得る。従って、本発明によって提供される組換えメチルマロニル特異的エポシロン第四伸長モジュールコード配列は、宿主細胞中に所望のエポシロン化合物を生成するための代替の方法を提供する。特に、このような化合物は、エポシロンＤ、Ｂ、およびＦであり、エポシロンＢまたはその誘導体の生成は、機能的ｅｐｏＫ遺伝子が存在する否かに依存する。
【０１２８】
本発明はまた、マロニルＣｏＡに結合するがメチルマロニルＣｏＡには結合しないＡＴをコードするように改変されたエポシロンＰＫＳの第四の伸長モジュールについてのコード配列を含む組換えＤＮＡ化合物を提供する。本発明は、組換えＤＮＡ化合物およびベクター、ならびに対応する組換えＰＫＳを提供し、ここで、この第四のハイブリッド伸長モジュールは、誘導体ｅｐｏＤ遺伝子産物に組み込まれ得る。エポシロンＰＫＳ（またはエポシロン誘導体についてのＰＫＳ）に組込まれる場合、得られた組換えエポシロンＰＫＳは、エポシロンＣ、Ａ、およびＥを生成し、エポシロンＡの生成は、機能的ｅｐｏＫ遺伝子が存在するか否かに依存する。
【０１２９】
別の実施形態において、本発明は、１２−デスメチル−１２−エチル−エポシロンＤを生成するための組換え宿主細胞を提供する。この実施形態において、本発明は、宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、組換えエポシロンＰＫＳ誘導体を発現し、ここで、伸長モジュール４のＡＴドメインは、例えば、ＦＫ　５２０またはニッダマイシン（ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）ＰＫＳ酵素由来の、エチルマロニルＣｏＡ特異的伸長モジュールによって置換されている。１つの実施形態において、宿主細胞は、組換え宿主細胞であり、この組換え宿主細胞は、異種宿主細胞由来の遺伝子（ｃｃｒ遺伝子）によってコードされるか、またはメチルマロニルＣｏＡの生成を増強するための異種プロモーターの制御下で、クロトニルＣｏＡレダクターゼを発現する。１つの実施形態において、宿主細胞は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞であり、このＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ宿主細胞から単離されたｃｃｒ遺伝子を発現する。別の実施形態において、宿主細胞は、ブチレートを輸送し、そしてこれをブチリルＣｏＡ（これは、エチルマロニルＣｏＡに変換される）に変換する、Ｅ．ｃｏｌｉ　ａｔｏＡ、Ｄ、およびＥ遺伝子を発現または過剰発現するように、改変されている。
【０１３０】
内因性ＡＴコード配列と、メチルマロニルＣｏＡに特異的なＡＴについてのコード配列との置換に加えて、ＫＲドメインコード配列はまた、別のＫＲ、ＤＨおよびＫＲ（例えば限定されないが、ラパマイシンＰＫＳのモジュール１０あるいはＦＫ−５２０　ＰＫＳのモジュール１または５由来）、またはＤＨ、ＫＲ、およびＥＲについてのコード配列と置換され得る。ＫＲが、別のＫＲ、もしくはＫＲおよびＤＨと置換され得、そして伸長モジュール５（またはＰＫＳの他の箇所）に変化がない場合、組換えエポシロンＰＫＳは、エポシロンＣおよびＤを生成する。なぜなら伸長モジュール５のＤＨドメインは、エポシロンＣおよびＤのＣ−１２−Ｃ−１３二重結合の形成を媒介するからである。ＫＲが、ＫＲ、ＤＨ、およびＥＲと置換され得、そして伸長モジュール５（またはＰＫＳの他の箇所）において、変化がない場合、組換えエポシロンＰＫＳは、１２，１３−デヒドロ−エポシロンＣおよびＤを生成する。ＫＲが、不活性ＫＲと置換され得るかまたはそうでなければＫＲを不活性化する場合、組換えエポシロンＰＫＳは、１３−オキソ−１１，１２−デヒドロ−エポシロンＣおよびＤを生成する。
【０１３１】
従って、本発明は、組換えエポシロンＰＫＳを提供し、伸長モジュール４のＫＲドメインが、変異、欠失、または別のＰＫＳからの非機能的ＫＲドメインによって不活性にされる。この組換えＰＫＳは、主に１３−オキソ−１１，１２−デヒドロエポシロンＢを生成し；この生物体によって生成される化合物において観測されるＣ−１１−Ｃ−１２二重結合は、伸長モジュール５のＥＲドメインによる還元の前に、伸長モジュール５のＤＨドメインによる新生ポリケチド鎖において形成される二重結合の移動に起因して、生じると考えられる。本発明はまた、宿主細胞を提供し、この宿主細胞は、この新規なポリケチドを生成する。例えば、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１２２−５６（この株は、ブタベスト条約に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．　Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ　２０１１０−２２０９　ＵＳＡに２０００年１１月２１日に寄託され、そして登録番号ＰＴＡ　２７１４で入手可能である）は、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含み、ここで、モジュール４のＫＲドメインは、欠失によって、不活性にされており、そして１３−オキソエポシロンＡおよびＢならびにそのデヒドロ誘導体（主に、１３−オキソ−１１，１２−デヒドロエポシロンＢ）を生成する。本発明はまた、この株によって生成される新規なエポシロン誘導体を提供する。
【０１３２】
エポシロンＰＫＳの第五の伸長モジュールは、ＫＳ、マロニルＣｏＡに結合するＡＴ、ＤＨ、ＥＲ、ＫＲ、およびＡＣＰドメインを含む。１つの実施形態において、エポシロンＰＫＳの第五の伸長モジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、エポシロン誘導体を生成するエポシロンＰＫＳまたは組換えエポシロンＰＫＳについてのコード配列を含むＤＮＡ化合物に挿入され得る。別の実施形態において、第五の伸長モジュールコード配列の一部は、他のＰＫＳコード配列とともに利用されて、ハイブリッドモジュールコード配列およびそれによってコードされるハイブリッドモジュールを作製する。この実施形態において、本発明は、例えば、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、メチルマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴと置換すること；ＥＲ、ＤＨ、およびＫＲのうちのいずれか１つ、２つ、または３つ全てを欠失すること；ならびに／またはＥＲ、ＤＨ、およびＫＲのうちのいずれか１つ、２つ、または３つ全てを、ＫＲ、ＤＨおよびＫＲ、またはＫＲ、ＤＨ、およびＥＲのいずれかと置換すること（必要に応じて、異なる立体化学を特定することを含む）を提供する。この得られた第五のハイブリッド伸長モジュールコード配列は、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳについてのコード配列とともに利用され得る。あるいは、エポシロンＰＫＳの第五の伸長モジュールは、異種ＰＫＳのモジュールによってその全体が欠失または置換されて、エポシロンＰＫＳまたはその誘導体の他のタンパク質と組み合せて、エポシロン誘導体を生成するＰＫＳを構成するタンパク質を生成する。
【０１３３】
本発明の例示的な組換えＰＫＳ遺伝子は、組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体を含み、ここで、エポシロンＰＫＳの第五の伸長モジュールについてのコード配列をコードするＡＴドメインが、マロニル特異的ＡＴからメチルマロニル特異的ＡＴをコードするＡＴドメインを変化させるように変更または置換され得る。このようなメチルマロニル特異的ＡＴドメインをコードする核酸は、例えば限定されないが、ＤＥＢＳをコードするＰＫＳ遺伝子、ナルボノライドＰＫＳ、ラパマイシンＰＫＳ、およびＦＫ−５２０　ＰＫＳから単離され得る。このような組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体は、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＥ、ｅｐｏＦ、および／またはｅｐｏＫ遺伝子（あるいは、その誘導体）と同時発現され、それらから構成されるＰＫＳは、１０−メチルエポシロンまたはその誘導体を生成する。本発明によって提供される別の組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体は、この改変モジュール５コード配列だけでなく、モジュール４コード配列（これは、メチルマロニルＣｏＡのみに結合するＡＴドメインをコードする）を含む。ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＥ、ｅｐｏＦ、および／またはｅｐｏＫ遺伝子と共にＰＫＳが組み込まれる場合、組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体産物は、１０−メチルエポシロンＢおよび／またはＤ誘導体の生成を導く。
【０１３４】
本発明の他の例示的な組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体は、エポシロンＰＫＳ第五の伸長モジュールについての配列をコードするＥＲ、ＤＨ、およびＫＲドメインの１つ以上が、以下を提供するように置換されたかまたは変異されたかのいずれかであるものを含む：（ｉ）非機能的なＥＲ、ＤＨ、またはＫＲドメイン；（ｉｉ）機能的ＫＲドメインのみ；（ｉｉｉ）機能的ＫＲおよびＤＨドメイン；または（ｉｖ）別のＰＫＳ由来の機能的ＥＲ、ＤＨ、またはＫＲドメイン。伸長モジュール５のＤＨドメインが、エポシロンＣおよびＤにおけるＣ−１２−Ｃ−１３二重結合の形成の原因であるという発見は、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含む任意の生物体（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍおよび組換え宿主細胞を含む）において、エポシロンおよびエポシロン誘導体を作製するための、本発明の新規な方法を提供する。さらに、現在、伸長モジュール６のＤＨドメインもまた、先のモジュールに結合した新生ポリケチド（これは、新規なエポシロン誘導体を作製するために、本発明の方法に従って開発され得る）のβ−カルボニル上で作用し得ることが発見されている。
【０１３５】
従って、３つの伸長モジュール５のＫＲ、ＤＨ、およびＥＲドメイン全てが欠失されるか、そうでなければ不活化される場合、組換えエポシロンＰＫＳは、エポシロンＡおよびＢの１３−ヒドロキシ−１１−オキソアナログを生成する。ＤＨおよびＥＲドメインが欠失されるか、さもなくば不活化される場合、組換えエポシロンＰＫＳは、１３−ヒドロキシ−１０，１１−デヒドロ−エポシロン、主に、１３−ヒドロキシ−１０，１１−デヒドロ−エポシロンＤを生成する。本発明はまた、この新規なポリケチドを生成する宿主細胞を提供する、例えば、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１２２−１４８（この株は、ブタペスト条約の条項に従って、アメリカンタイプカルチャーコレクション，１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９　ＵＳＡに、２０００年１１月２１日に寄託され、登録番号ＰＴＡ−２７１１の下で利用可能である）は、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含み、ここで伸長モジュールの５のＤＨ、ＫＲおよびＥＲドメインは、ＫＲドメインのみと置き換えられ、１３−ヒドロキシ−１０，１１−デヒドロ−エポシロンＤを生成する。本発明はまた、この株により生成される新規なエポシロン誘導体を提供する。ＥＲドメインのみが欠失されるか、そうでなければ不活化される場合、組換えエポシロンＰＫＳは、エポシロンＣおよびエポシロンＤの１０，１１−デヒドロアナログ、主に、１０，１１−デヒドロエポシロンを生成する。従って、１つの局面において、本発明は、組換えエポシロンＰＫＳを提供し、ここで伸長モジュール５のＥＲドメインは、欠失されるか、または変異により不活化され、そして１０，１１−デヒドロエポシロンＤを生成する。別の実施形態において、本発明は、エポシロンＰＫＳの伸長モジュール５のＥＲドメインについてのコード配列における変異に起因して、１０，１１−デヒドロ−エポシロンＤを生成するＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ宿主細胞を提供する。
【０１３６】
本発明のこれらの組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体は、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＥ、およびｅｐｏＦ遺伝子とともに、または他の改変を含む（およびそれ自体がさらなる改変を含み得る）組換えｅｐｏ遺伝子とともに発現されて、対応するエポシロン誘導体を作製するＰＫＳを生成する。例えば、本発明により提供される１つの組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体はまた、メチルマロニルＣｏＡのみを結合するＡＴドメインをコードするモジュール４のコード配列を含む。上記のように、エポシロンＣ−１１誘導体を生成するための機能的に類似のｅｐｏＤ遺伝子はまた、エポシロンの５つめの伸長モジュールのＥＲ、ＤＨ、およびＫＲドメインのうちの１つ、２つまたは３つ全ての不活化により作製され得る。任意のモジュールにおいてこのようなドメインを改変するための別の様式は、同じまたは異種のＰＫＳコード配列の別のモジュールから得た所望のドメインの完全なセットと置換することによる。この様式において、ＰＫＳの天然の構成が保存される。また、存在する場合、ネイティブのＰＫＳにおいてともに機能するＫＲおよびＤＨまたはＫＲ、ＤＨおよびＥＲドメインは、好ましくは、組換えＰＫＳにおいて用いられる。上記の置換についての例示的置換ドメインとしては、例えば、ラパマイシンＰＫＳ伸長モジュール３に由来する不活性ＫＲドメイン、ラパマイシンＰＫＳ伸長モジュール５に由来するＫＲドメイン、ならびにラパマイシンＰＫＳ伸長モジュール４に由来するＫＲドメインおよびＤＨドメインが挙げられるが、これらに限定されない。他のこのような不活性ＫＲ、活性ＫＲ、および活性ＫＲおよびＤＨドメインをコードする核酸は、例えば、ＤＥＢＳ、ナルボノリドＰＫＳ、およびＦＫ−５２０ＰＫＳをコードするＰＫＳ遺伝子から単離され得るが、限定されない。得られたＰＫＳ酵素の各々は、本発明の半合成エポシロン誘導体を得るために、標準的な化学的方法論によりインビトロでさらに誘導体化され得るポリケチド化合物を生成する。
【０１３７】
エポシロンＰＫＳの第６の伸長モジュールとしては、ＫＳ、メチルマロニルＣｏＡに結合するＡＴ、ＤＨ、ＥＲ、ＫＲおよびＡＣＰが挙げられる。１つの実施形態において、第６の伸長モジュールコード配列の一部分は、他のＰＫＳコード配列とともに利用されて、ハイブリッド分子を作成する。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴをマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴと置換するか；ＥＲ、ＤＨ、およびＫＲのうちのいずれか１つ、２つまたは３つ全てを欠失させるか；ならびに／あるいはＥＲ、ＤＨおよびＫＲのうちのいずれか１つ、２つまたは３つ全てを、ＫＲ、ＤＨおよびＫＲ、またはＫＲ、ＤＨおよびＥＲのいずれかと置換して、必要に応じて、異なる立体化学を特定することを提供する。得られた異種の第６の伸長モジュールコード配列は、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを作製するＰＫＳのタンパク質サブユニットのコード配列とともに利用され得る。あるいは、エポシロンＰＫＳの第６の伸長モジュールは、異種ＰＫＳからのモジュールによりその全体が欠失または置換されて、エポシロン誘導体についてのＰＫＳを生成し得る。
【０１３８】
本発明の例示的組換えＰＫＳ遺伝子としては、エポシロンＰＫＳの第６の伸長モジュールのＡＴドメインコード配列が、コードされるＡＴドメインを変更または置換させ、それにより、メチルマロニル特異的ＡＴからマロニル特異的ＡＴへ変化させた遺伝子が挙げられる。このようなマロニル特異的ＡＴドメインコード核酸は、例えば、ナルボノリドＰＫＳ、ラパマイシンＰＫＳ、およびＦＫ−５２０ＰＫＳをコードするＰＫＳ遺伝子から単離され得るが、限定されない。このようなハイブリッドモジュール６をコードする本発明の組換えｅｐｏＤ遺伝子が他のエポシロンＰＫＳ遺伝子とともに同時発現された場合、組換えＰＫＳは、８−デスメチルエポシロン誘導体を作製する。この組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体はまた、他の改変を含む組換えｅｐｏ遺伝子誘導体とともに同時発現され得るか、またはそれ自体、対応する８−デスメチルエポシロン誘導体を作製するＰＫＳを生成するようにさらに改変され得る。例えば、本発明により提供される１つの組換えｅｐｏＤ遺伝子はまた、メチルマロニルＣｏＡのみを結合するＡＴドメインをコードするモジュール４コード配列を含む。ＰＫＳにｅｐｏＡ，ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＥおよびｅｐｏＦ遺伝子とともに組み込まれる場合、組換えｅｐｏＤ遺伝子産物は、エポシロンＢ（機能的ｅｐｏＫ遺伝子が存在するならば）およびエポシロンＤの８−デスメチル誘導体の生成を導く。
【０１３９】
本発明の他の例示的な組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体としては、エポシロンＰＫＳの６つの伸長モジュールについてのＥＲ、ＤＨ、およびＫＲドメインコード配列が、（ｉ）ＫＲおよびＤＨドメイン；（ｉｉ）ＫＲドメイン；ならびに（ｉｉｉ）不活性のＫＲドメインをコードする配列で置換されたものが挙げられる。本発明のこれらの組換えｅｐｏＤ遺伝子は、他のエポシロンＰＫＳ遺伝子と同時発現される場合、対応する（ｉ）Ｃ−９アルケン、（ｉｉ）Ｃ−９ヒドロキシ（両方のエピマー、このうちの１つのみが、さらなるＫＳおよび／またはＡＣＰ置換が次のモジュールでなされない限り、下流モジュールによってプロセスされ得る）、ならびに（ｉｉｉ）Ｃ−９ケト（Ｃ−９−オキソ）エポシロン誘導体を作製する。機能的に等価な６つの伸長モジュールはまた、エポシロンの６つの伸長モジュールのＥＲ、ＤＨ、およびＫＲドメインのうち、１つ、２つまたは３つ全ての相互作用によって作製され得る。例えば、本発明は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ３９−１６４（この株は、ブタペスト条約の条項に従って、アメリカンタイプカルチャーコレクション，１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９　ＵＳＡに、２０００年１１月２１日に寄託され、登録番号ＰＴＡ−２７１１の下で利用可能である）を提供し、これは、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含み、ここで伸長モジュールの６のＫＲドメインは、変異によって不活性にされ、そしてこれは、９−ケトエポシロンＤを生成する。本発明はまた、この株により生成される新規なエポシロン誘導体を提供する。
【０１４０】
従って、この組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体はまた、他の変化を有する他の組換えｅｐｏ遺伝子誘導体と共に同時発現され得るか、またはそれ自体が、対応するＣ−９エポシロン誘導体を作製するＰＫＳを生成するようにさらに変更され得る。例えば、本発明によって提供される１つの組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体はまた、メチルマロニルＣｏＡにのみ結合するＡＴドメインをコードするモジュール４コード配列を含む。ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＥ、およびｅｐｏＦ遺伝子と共にＰＫＳに組み込まれる場合、組換えｅｐｏＤ遺伝子産物は、機能的ｅｐｏＫが存在するか否かに依存して、エポシロンＢおよびエポシロンＤのＣ−９誘導体の産生をもたらす。
【０１４１】
上記の置換のための例示的な置換ドメインとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：ケトンを形成する、ラパマイシンＰＫＳモジュール３から不活性のＫＲドメイン、アルコールを形成する、ラパマイシンＰＫＳモジュール５からＫＲドメイン、ならびにアルケンを形成する、ラパマイシンＰＫＳモジュール４からＫＲドメインおよびＤＨドメイン。他のこのような不活性ＫＲ、活性ＫＲドメイン、ならびに活性ＫＲおよびＤＨドメインコード核酸は、例えば（限定ではなく）、ＤＥＢＳ、ナルボノリド（ｎａｒｂｏｎｏｌｉｄｅ）ＰＫＳ、およびＦＫ−５２０　ＰＫＳをコードするＰＫＳ遺伝子から単離され得る。得られたＰＫＳの各々は、Ｃ−９位置に官能基を含むポリケチド化合物を生成し、これは、標準的な化学的方法によってインビトロでさらに誘導されて、本発明の半合成エポシロン誘導体を生じ得る。
【０１４２】
エポシロンＰＫＳの第７の伸長モジュールは、ＫＳ、メチルマロニルＣｏＡに特異的なＡＴ、ＫＲ、およびＡＣＰを含む。エポシロンＰＫＳのこの第７の伸長モジュールは、ｅｐｏＥ遺伝子の遺伝子産物中に含まれ、これはまた、第８の伸長モジュールを含む。１つの実施形態において、エポシロンＰＫＳの第７の伸長モジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は発現されてタンパク質を形成し、このタンパク質は、他のタンパク質と一緒に、エポシロンＰＫＳまたはエポシロン誘導体を生成するＰＫＳを構成する。これらおよび関連する実施形態において、エポシロンＰＫＳまたはその誘導体の第７および第８の伸長モジュールは、代表的に、単一のタンパク質として発現され、そしてｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、およびｅｐｏＦ遺伝子またはその誘導体と同時発現されて、ＰＫＳを構成する。別の実施形態において、第７の伸長モジュールコード配列の一部または全ては、他のＰＫＳコード配列と関連して利用されて、ハイブリッドモジュールを生成する。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、マロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴで置換すること；ＫＲを欠失すること；ＫＲを、異なる立体化学を特定するＫＲで置換すること；および／あるいはＤＨまたはＤＨおよびＥＲを挿入することのいずれかを提供する。得られた異種の第７伸長モジュールコード配列は、必要に応じて他のコード配列と関連して利用されて、タンパク質を発現し、これは、他のタンパク質と共に、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳを構築する。あるいは、ｅｐｏＥ遺伝子における第７伸長モジュールについてのコード配列は、欠失され得るか、または異種モジュールについてのコード配列で置換され得、組換えｅｐｏＥ遺伝子誘導体を調製し、これは、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、およびｅｐｏＦ遺伝子と一緒に発現されて、エポシロン誘導体についてのＰＫＳを作製し得る。
【０１４３】
本発明の例示的な組換えｅｐｏＥ遺伝子誘導体としては、エポシロンＰＫＳの第７伸長モジュールについてのＡＴドメインコード配列が、コードされるＡＴドメインが変化するように変更または置換され、これによってメチルマロニル特異的ＡＴがマロニル特異的ＡＴへと変化した誘導体が挙げられる。このようなマロニル特異的ＡＴドメインコード核酸は、例えば（そして限定ではなく）、ナルボノリドＰＫＳ、ラパマイシンＰＫＳ、およびＦＫ−５２０　ＰＫＳをコードするＰＫＳ遺伝子から単離され得る。他のエポシロンＰＫＳ遺伝子、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、およびｅｐｏＦ、またはそれらの誘導体と共に同時発現される場合、Ｃ−６メチルの代わりにＣ−６水素を有する、エポシロン誘導体についてのＰＫＳが生成される。従って、この遺伝子が他の変更を含まない場合、生成される化合物は、６−デスメチルエポシロンである。
【０１４４】
エポシロンＰＫＳの第８の伸長モジュールとしては、ＫＳ、メチルマロニルＣｏＡに特異的なＡＴ、不活性ＫＲおよびＤＨドメイン、メチルトランスフェラーゼ（ＭＴ）ドメイン、ならびにＡＣＰが挙げられる。１つの実施形態において、エポシロンＰＫＳの第８の伸長モジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、他のタンパク質と同時発現され、エポシロンＰＫＳまたはエポシロン誘導体を生成するＰＫＳを構成する。別の実施形態において、第８伸長モジュールコード配列の一部または全ては、他のＰＫＳコード配列と関連して利用されて、ハイブリッドモジュールを生成する。この実施形態において、本発明は、例えば、メチルマロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、マロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴで置換すること；不活性ＫＲおよび／または不活性ＤＨを欠失すること；不活性ＫＲおよび／またはＤＨを、活性なＫＲおよび／またはＤＨで置換すること；ならびに／あるいはＥＲを挿入することのいずれかを提供する。得られる異種の第８伸長モジュールコード配列は、１つのタンパク質として発現され、これは他のタンパク質と関連して利用されて、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳを構成する。あるいは、ｅｐｏＥ遺伝子における第８伸長モジュールについてのコード配列は、欠失され得るか、または異種モジュールについてのコード配列で置換され得、組換えｅｐｏＥ遺伝子を調製し、これは、ｅｐｏＡ、ｅｐｏＢ、ｅｐｏＣ、ｅｐｏＤ、およびｅｐｏＦ遺伝子と一緒に発現されて、エポシロン誘導体についてのＰＫＳを作製し得る。
【０１４５】
エポシロンＰＫＳの第８伸長モジュールはまた、エポシロン前駆体をメチル化する活性を有する、メチル化またはメチルトランスフェラーゼ（ＭＴ）ドメインを含む。この機能は、本発明の組換えｅｐｏＤ遺伝子誘導体を生成するように欠失され得、この誘導体は、第８伸長モジュールのＡＴドメインが、エポシロン分子の対応するＣ−４位置でマロニル特異的ＡＴドメインに変化されているか否かに依存して、１つまたは両方のメチル基を欠失したエポシロン誘導体を作製する、他のエポシロンＰＫＳ遺伝子またはその誘導体と共に同時発現され得る。
【０１４６】
エポシロンＰＫＳの第９の伸長モジュールは、ＫＳ、マロニルＣｏＡに特異的なＡＴ、ＫＲ、不活性ＤＨ、およびＡＣＰを含む。エポシロンＰＫＳのこの第９の伸長モジュールは、１つのタンパク質（このｅｐｏＦ遺伝子の産物）として発現され、これはまた、エポシロンＰＫＳのＴＥドメインを含む。１つの実施形態において、エポシロンＰＫＳの第９の伸長モジュールをコードする配列を含むＤＮＡ化合物は、１つのタンパク質として発現され、他のタンパク質と一緒に、エポシロンＰＫＳまたはエポシロン誘導体を生成するＰＫＳを構築する。これらの実施形態において、第９の伸長モジュールは、代表的に、１つのタンパク質として発現され、これはまた、エポシロンＰＫＳまたは異種ＰＫＳのいずれかのＴＥドメインを含む。別の実施形態において、第９伸長モジュールコード配列の一部または全ては、他のＰＫＳコード配列と関連して利用されて、ハイブリッドモジュールを生成する。この実施形態において、本発明は、例えば、マロニルＣｏＡ特異的ＡＴを、メチルマロニルＣｏＡ、エチルマロニルＣｏＡ、または２−ヒドロキシマロニルＣｏＡ特異的ＡＴで置換すること；ＫＲを欠失すること；ＫＲを、異なる立体化学を特定するＫＲで置換すること；ならびに／あるいはＤＨまたはＤＨおよびＥＲを挿入することのいずれかを提供する。例えば、伸長モジュール９のＡＴドメインの、メチルマロニルＣｏＡに特異的なＡＴドメインでの置換は、本発明の組換えＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞中で２−メチル−エポシロンＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤを生成する組換えエポシロンＰＫＳを生じる。得られる異種の第９伸長モジュールコード配列は、他のタンパク質と共に同時発現されて、エポシロン、エポシロン誘導体、または別のポリケチドを合成するＰＫＳを構成する。あるいは、本発明は、エポシロンまたはエポシロン誘導体についてのＰＫＳを提供し、ここで、この第９伸長モジュールは、異種ＰＫＳ由来のモジュールで置換されるか、またはその全体が欠失されている。後者の実施形態において、ＴＥドメインは、別個のタンパク質として発現されるか、または第８の伸長モジュールと融合される。
【０１４７】
別の実施形態において、本発明は、異種のＰＫＳ遺伝子クラスター（同じ型の、未改変の天然に存在する宿主細胞には存在しないＰＫＳ遺伝子クラスター）、ならびにチオエステラーゼＩＩ型タンパク質（「ＴＥ　ＩＩ」）をコードする遺伝子を含む、本発明の宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、このＴＥ　ＩＩ遺伝子は、このＰＫＳ遺伝子クラスターに対して異種である−−このＴＥ　ＩＩ遺伝子は、ＰＫＳと同じ遺伝子クラスター由来ではない。１つの例として、本発明の組換え宿主細胞は、１つの実施形態において、エポシロンＰＫＳまたはエポシロンＰＫＳ誘導体の発現をコードする遺伝子を含む。本発明のこの局面に従って、この宿主細胞は、エポシロンＰＫＳ遺伝子クラスター以外のＰＫＳ遺伝子クラスターから単離されたＴＥ　ＩＩ遺伝子を含むように改変される。例示的な実施形態としては、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅのピクロマイシン（ｐｉｃｒｏｍｙｃｉｎ）ＰＫＳ遺伝子クラスター由来のＴＥ　ＩＩ遺伝子、およびＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍのｔｍｂＡ　ＰＫＳ遺伝子クラスター由来のＴＥ　ＩＩ遺伝子が挙げられる（これらのＰＫＳ遺伝子クラスターは、米国特許第６，０９０，６０１号；米国特許出願番号１４４，０８５（１９９８年８月３１日出願）；および米国特許仮出願番号６０／２７１，２４５（２００１年２月１５日出願）（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）において記載される）。
【０１４８】
本発明の組換えエポシロン誘導体ＰＫＳ遺伝子の例示的な例（これらは、ハイブリッドモジュール（エポシロンＰＫＳと同じ特異性を有する他のモジュール）の変化した特異性を列挙することによって同定される）としては、以下が挙げられる：
（ａ）メチルマロニル得的ＡＴ（ｍｍＡＴ）およびＫＲを有するモジュール４ならびにマロニル特異的ＡＴ（ｍＡＴ）およびＫＲを有するモジュール２；
（ｂ）ｍｍＡＴを有するモジュール４およびｍｍＡＴを有するモジュール３；
（ｃ）ｍｍＡＴを有するモジュール４およびｍｍＡＴを有するモジュール５；
（ｄ）ｍｍＡＴを有するモジュール４ならびにｍｍＡＴおよびＤＨおよびＫＲのみを有するモジュール５；
（ｅ）ｍｍＡＴを有するモジュール４ならびにｍｍＡＴおよびＫＲのみを有するモジュール５；
（ｆ）ｍｍＡＴを有するモジュール４ならびにｍｍＡＴおよび不活性ＫＲのみを有するモジュール５；
（ｇ）ｍｍＡＴを有するモジュール４およびｍＡＴを有するモジュール６；
（ｈ）ｍｍＡＴを有するモジュール４ならびにｍＡＴおよびＤＨおよびＫＲのみを有するモジュール６；
（ｉ）ｍｍＡＴを有するモジュール４ならびにｍＡＴおよびＫＲのみを有するモジュール６；
（ｊ）ｍｍＡＴを有するモジュール４ならびにｍＡＴおよび不活性ＫＲのみを有するモジュール６；
（ｋ）ｍｍＡＴを有するモジュール４およびｍＡＴを有するモジュール７；
（ｌ）ハイブリッド（ｄ）〜（ｆ）、ｍＡＴを有するモジュール５を除く；
（ｍ）ハイブリッド（ｈ）〜（ｊ）、ｍｍＡＴを有するモジュール６を除く；ならびに
（ｎ）ハイブリッド（ａ）〜（ｍ）、ｍＡＴを有するモジュール４を除く。
上記の列挙は、例示のみであり、そして本発明を限定するように解釈されるべきではなく、これらは、示されるハイブリッドモジュール以外の２つのハイブリッドモジュールを有する他の組換えエポシロンＰＫＳ遺伝子および酵素だけでなく、３つ以上のハイブリッドモジュールを有する組換えエポシロンＰＫＳ遺伝子および酵素を含む。
【０１４９】
本発明の宿主細胞は、本発明の化合物を生成するための他の目的について当該分野で公知の条件下で、増殖および発酵され得る。本発明はまた、本発明の宿主細胞を発酵するための新規な方法を提供する。本発明の化合物は、これらの培養された細胞の発酵ブロスから単離され得、そして以下の実施例３に記載されるような方法によって精製され得る。
【０１５０】
本発明は、ポリケチドおよび他の生成物の生成のための、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株の発酵に関連する多くの方法を提供する。本発明より前では、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓの発酵は、ＴＡおよびサフラマイシン（ｓａｆｒａｍｙｃｉｎ）以外の任意のポリケチドについての生成の目的では行われておらず、このＴＡおよびサフラマイシンは、特定のＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株によって天然で産生される。従って、１つの局面において、本発明は、有用な生理活性化合物（ポリケチド、非リボソームペプチド、エポシロン、リパーゼ、プロテアーゼ、他のタンパク質、脂質、糖脂質、ラムノ脂質（ｒｈａｍｎｏｌｉｐｉｄ）、およびポリヒドロキシアルカノエートが挙げられるがこれらに限定されない）の発酵による産生のための産生宿主としての、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓの使用を可能にする。
【０１５１】
本発明によって提供される方法の１つは、細胞バンクを調製および貯蔵する方法、ならびにＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株を発酵培地に適応する方法である。これらの方法は重要である。なぜなら、本発明より前では、油ベースの発酵培地中での産生のために適応したＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株の凍結細胞バンクは作製されておらず、そして適応の非存在下では、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株は、特に油ベースの発酵培地において、頻繁に死滅するためである。
【０１５２】
本発明はまた、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓを増殖するための発酵方法、およびこの方法において有用な発酵培地を提供する。驚くべきことに、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓおよび他のＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株は、炭水化物、グリセロール、アルコール、またはＴＣＡサイクル中間体を、炭素源として利用し得ない。本発明の前では、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓの発酵は、タンパク質ベースの培地中で行われた。しかし、ＮＨ４が、タンパク質ベースの培地中で増殖に有毒なレベルまで増加し、そして発酵を制限する。本発明に従うと、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株は、油および／または脂肪酸を炭素源として含む培地中で発酵される。
【０１５３】
この方法において有用な例示的な油および脂肪酸としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：オレイン酸メチル；ココナツ、ラード、アブラナ、ゴマ、ダイズ、およびヒマワリ由来の油；サラダ油；Ａｇｒｉｍｕｌ　ＣｏＳ２、Ｒ５Ｏ５、およびＲ５Ｏ３のような自己乳化油；グリセロールオレエート（グリセロールモノオレエートおよびグリセロールトリオレエートを含む）；奇数鎖エステル（例えば、メチルヘプタデカノエート、メチルノナデカノエート、およびメチルペラルゴネート）；エステル鎖（例えば、プロピルオレエートおよびエチルオレエート）；植物オレイン酸メチル；メチルステアレート；メチルリノレエート；オレイン酸；ならびにホスファチジルコリン（純粋であるかあるいはダイズまたは卵黄由来であるかにかかわらず）。従って、任意の植物または穀物由来の油（例えば、ヒマワリ油またはダイズ油）、任意の動物由来の油（例えば、ラード油）、飽和および不飽和の両方の、任意の鎖長の遊離脂肪酸およびエステル化された脂肪酸、天然および合成の脂肪酸混合物（例えば、それぞれ、ホスファチジルコリンまたはメチルペラルゴネート）、ならびに工業発酵油（例えば、Ｃｏｇｎｉｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ’ｓ　Ａｇｒｉｍｕｌシリーズ）が、この方法において使用され得る。好ましい実施形態において、この発酵培地は、炭素源としてオレイン酸メチルを利用する。主に分散の容易さに起因して、一般に、室温で液体である油が、固体油よりも好ましい。この発酵培地の他の重要な成分としては、微量の金属（例えば、ＦｅおよびＣｕ）が挙げられ、この金属は、複合培地および規定培地、ならびにバッチプロセスおよび供給バッチプロセスにおける、増殖および産生を改善する。オレイン酸メチルおよび微量の金属を含む培地が、エポシロンの産生のために好ましい。
【０１５４】
１つの実施形態において、本発明は、減少した量の動物由来の材料を含むかまたは動物由来の材料を含まない本発明の宿主細胞のための発酵培地を提供する。感染因子（例えば、ウイルスおよびプリオン）による夾雑物の可能性、ヒトまたは動物に投与される化合物の生成のための発酵プロセスにおける動物副産物の使用に起因して、減少した量の動物由来の材料を含むかまたは動物由来の材料を含まない発酵培地の使用が、好まれ得る。このような培地は、本発明の方法における使用のために提供される。発酵培地に含まれるオイルまたは脂肪酸は、非動物供給源（例えば、植物）由来で有り得る。例えば、脊椎動物由来のオレイン酸メチルを、商業的に得ることができる。さらに、動物由来の材料を、等価であるが非動物供給源由来の非同一材料と置換し得る。例えば、乳タンパク質であるカゼインの膵臓消化物のカジトン（ｃａｓｉｔｏｎｅ）が、非動物供給源（例えば、植物が挙げられるが、これに限定されない）由来のタンパク質の加水分解物（例えば、野菜由来のタンパク質加水分解物）と置換され得る。
【０１５５】
一般的に、フェッドバッチプロセス（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ　ｐｒｏｃｅｓｓ）が、発酵に好ましい。給餌によって細胞は栄養分を効率的に使用する（例えば、細胞は、毒性有機酸を生成する代わりに炭素をＣＯ２およびＨ２Ｏに代謝する）。高い栄養分レベルは、二次代謝を抑制し得、そして発酵が阻害の閾値より下の速度で栄養分を給餌する場合、生成量はより高くなり得る。
【０１５６】
本発明の発酵方法はまた、これらの方法に有用なエポシロンおよび発酵培地の産生に特に関連する方法を含む。１つの例として、プロピオネートおよびアセテートが、エポシロンＤ：Ｃ（またはＢ：Ａ）比および得られるエポシロンの力価に影響を与えるために使用され得る。この効果は、好ましいオレイン酸メチル／微量金属の発酵培地において最小であるが、この効果は、他の培地（例えば、ＣＴＳ培地）において極めて有意に効果的であり得る。発酵培地中のアセテート量の増加は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ増殖およびエポシロン産生を増加し得る。アセテート単独は、エポシロンＣ（またはエポシロンＡ）力価を劇的に増加し、そしてエポシロンＤ（またはエポシロンＡ）力価を減少する。プロピオネート単独は、エポシロン力価を増加せず、そして高い濃度のプロピオネートは、力価を減少し得る。しかし、プロピオネートおよびアセテートの共同では、エポシロンＣ（またはエポシロンＡ）からエポシロンＤ（またはエポシロンＢ）へ産生を移動させ得る。エポシロンＤ産生のための１つの好ましい培地は、カジトン、１０ｍＭ　アセテート、および３０ｍＭ　プロピオネートを含む。奇数鎖の脂肪酸を含む培地は、エポシロンＣおよびエポシロンＤを産生するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ細胞の発酵においてエポシロンＣの産生を減少し得る。微量金属がまた、エポシロンＤ産生を増強し得、そして発酵培地中にアセテートが存在しかついずれのオイルも存在しない下でエポシロンＤ：Ｃ比を増加し得る。
【０１５７】
本発明はまた、発酵培地からエポシロンを精製するための方法およびエポシロンの結晶形態を調製するための方法を提供する。一般的に、この精製方法は、発酵の間のＸＡＤ樹脂上へのエポシロンの捕獲、この樹脂からの溶出、固相抽出、クロマトグラフィー、および結晶化を含む。この方法は、実施例３に詳細に記載される。そして、この方法は、エポシロンＤについて好ましく、かつ例示されるが、この方法は、一般的に結晶エポシロン（他の天然に存在するエポシロンおよび本発明の宿主細胞によって産生されるエポシロンアナログを含むがこれらに限定されない）を調製するために使用され得る。
【０１５８】
従って、別の実施形態において、本発明は、農業、獣医業務、および医薬において有用な、単離され、かつ精製された形態の新規エポシロン誘導体化合物を提供する。１つの実施形態において、この化合物は、殺菌剤として有用である。別の実施形態において、この化合物は、癌の化学療法において有用である。別の実施形態において、この化合物は、所望されない細胞増殖の予防（炎症、自己免疫疾患、および乾癬のような過剰増殖疾患の処置を含むが、これらに限定されない）、およびステント中の細胞増殖の予防のために有用である。好ましい実施形態において、この化合物は、エポシロンＢまたはエポシロンＤと同様に腫瘍細胞に対して少なくとも強力であるエポシロン誘導体である。別の実施形態において、この化合物は、免疫抑制剤として有用である。別の実施形態において、この化合物は、別の化合物の製造において有用である。好ましい実施形態において、この化合物は、ヒトまたは動物への投与のために混合物または溶液で処方される。
【０１５９】
本発明の新規エポシロンアナログならびに本発明の宿主細胞によって産生されるエポシロンは、以下に記載されるように誘導され、そして処方され得る：ＰＣＲ特許公開番号９３／１０１２１号、同第９７／１９０８６号、同第９８／０８８４９号、同第９８／２２４６１号、同第９８／２５９２９号、同第９９／０１１２４号、同第９９／０２５１４号、同第９９／０７６９２号、同第９９／２７８９０号、同第９９／３９６９４号、同第９９／４００４７号、同第９９／４２６０２号、同第９９／４３３２０号、同第９９／４３６５３号、同第９９／５４３１８号、同第９９／５４３１９号、同第９９／５４３３０号、同第９９／６５９１３号、同第９９／６７２５２号、同第９９／６７２５３号、および同第００／００４８５、ならびに米国特許第５，９６９，１４５号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。
【０１６０】
本発明の化合物としては、１４−メチルエポシロン誘導体（マロニルＣｏＡの代わりにメチルマロニルＣｏＡに結合するＡＴを有する本発明のハイブリッドモジュール３を利用することによって作製される）；８，９−デヒドロエポシロン誘導体（ＥＲ、ＤＨ、およびＫＲの代わりにＤＨおよびＫＲを有する本発明のハイブリッドモジュール６の利用によって作製される）；１０−メチルエポシロン誘導体（マロニルＣｏＡの代わりにメチルマロニルＣｏＡに結合するＡＴを有する本発明のハイブリッドモジュール５を利用することによって作製される）；９−ヒドロキシエポシロン誘導体（ＥＲ、ＤＨ、およびＫＲの代わりにＫＲを有する本発明のハイブリッドモジュール６の利用によって作製される）；８−デスメチル−１４−メチルエポシロン誘導体（マロニルＣｏＡの代わりにメチルマロニルＣｏＡに結合するＡＴを有する本発明のハイブリッドモジュール３およびメチルマロニルＣｏＡの代わりにマロニルＣｏＡに結合するハイブリッドモジュール６の利用によって作製される）；８−デスメチル−８，９−デヒドロエポシロン誘導体（ＥＲ、ＤＨ、およびＫＲの代わりにＤＨおよびＫＲを有し、かつメチルマロニルＣｏＡの代わりにマロニルＣｏＡを特定するＡＴを有する本発明のハイブリッドモジュール６の利用によって作製される）；ならびに９−オキソ−エポシロンＤが挙げられる。本発明の他の好ましい新規エポシロンとしては、実施例１１および以下に記載されるものが挙げられる。
【０１６１】
本発明の１つの局面において、以下の式の化合物：
【０１６２】
【化９】
2004508810.tif 000009
が、提供され、ここで、：
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ１１およびＲ１２は、各々独立して水素、メチルもしくはエチルであるか；
Ｒ４、Ｒ６およびＲ９は、各々独立して水素、ヒドロキシル、またはオキソであるか；あるいは
Ｒ５およびＲ６は、一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ｒ７は、水素、メチルもしくはエチルであり；
Ｒ８およびＲ１０は、共に水素であるか、または一緒になって炭素間二重結合もしくはエポキシドを形成し；
Ａｒは、アリールであり；そして、
Ｗは、ＯまたはＮＲ１３であり、ここで、Ｒ１３は、水素、Ｃ１〜Ｃ１０脂肪族アリールもしくはＣ１〜Ｃ１０脂肪族アルキルアリールである。別の実施形態において、式Ｉの化合物が提供され、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、ＡｒおよびＷは、以前に記載されたようなものである（ただし、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９、およびＲ１１のうちの少なくとも１つは、水素ではない）。
【０１６３】
別の実施形態において、式Ｉの化合物が提供され、ここで、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ１１は、各々独立して水素もしくはメチルであり；
Ｒ４およびＲ９は、各々独立して水素、ヒドロキシル、もしくはオキソであり；
Ｒ５およびＲ６は、共に水素であるかもしくは一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ｒ７およびＲ１２は、共にメチルであり；
Ｒ８およびＲ１０は、共に水素であるかもしくは一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ａｒは、ヘテロアリールであり；そして、
Ｗは、ＯまたはＮＲ１３であり、ここで、Ｒ１３は、水素またはＣ１〜Ｃ５アルキルであり、ただし、Ｒ１、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ９、およびＲ１１のうちの少なくとも１つは、水素ではない。
【０１６４】
本発明の別の局面において、式：
【０１６５】
【化１０】
2004508810.tif 000010
の化合物が提供され、ここで：
Ｒ４、Ｒ６およびＲ９は、各々独立して水素、ヒドロキシル、またはオキソであるか；
Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１２は、各々独立して水素、メチルもしくはエチルであるか；あるいは
Ｒ５およびＲ６は、一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ｒ７は、水素、メチルもしくはエチルであり；
Ｒ８およびＲ１０は、共に水素であるか、または一緒になって炭素間二重結合もしくはエポキシドを形成し；
Ａｒは、アリールであり；そして、
Ｗは、ＯまたはＮＲ１３であり、ここで、Ｒ１３は、水素またはＣ１〜Ｃ５アルキルである。別の実施形態において、式ＩＩの化合物が提供され、ここで、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１２、Ｒ１３、ＡｒおよびＷは、以前に記載されたようなものである（ただし、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ９のうちの少なくとも１つは、水素ではない）。
【０１６６】
別の実施形態において、式ＩＩの化合物が提供され、ここで：
Ｒ４およびＲ９は、各々独立して水素、ヒドロキシル、またはオキソであり；
Ｒ５およびＲ６は、各々水素であるかまたは一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ｒ７およびＲ１２は、共にメチルであり；
Ｒ８およびＲ１０は、共に水素であるかまたは一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ａｒは、２−メチル−１，３−チアゾリニル、２−メチル−１，３−オキサゾリニル、２−ヒドロキシメチル−１，３−チアゾリニル、または２−ヒドロキシメチル−１，３−オキサゾリニルであり；そして、
Ｗは、ＯまたはＮＨである（ただし、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ９のうちの少なくとも１つは、水素ではない）。
【０１６７】
本発明の別の局面において、式：
【０１６８】
【化１１】
2004508810.tif 000011
の化合物が提供され、ここで、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ１１、Ｒ１２は、各々独立して水素、メチルまたはエチルであるか；
Ｒ６は水素であるか；あるいは
Ｒ５およびＲ６は、一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ｒ７は、水素、メチルまたはエチルであり；
Ａｒは、アリールであり；そして、
Ｗは、ＯまたはＮＲ１３であり、ここで、Ｒ１３は、水素またはＣ１〜Ｃ５アルキルである。別の実施形態において、式ＩＩＩの化合物が提供され、ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、ＡｒおよびＷは、以前に記載されたようなものである（ただし、Ｒ１、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ１１のうちの少なくとも１つは、水素ではない）。
【０１６９】
別の実施形態において、式ＩＩＩの化合物が提供され、ここで、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ１１は、各々独立して水素、メチルまたはエチルであり；
Ｒ５およびＲ６は、共に水素であるかまたは一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ｒ７およびＲ１２は、共にメチルであり；
Ａｒは、２−メチル−１，３−チアゾリニル、２−メチル−１，３−オキサゾリニル、２−ヒドロキシメチル−１，３−チアゾリニル、または２−ヒドロキシメチル−１，３−オキサゾリニルであり；そして、
Ｗは、ＯまたはＮＨである（ただし、Ｒ１、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ１１のうちの少なくとも１つは、水素ではない）。
【０１７０】
本発明の別の局面において、式：
【０１７１】
【化１２】
2004508810.tif 000012
の化合物が提供され、ここで：
Ｒ４は、水素またはオキソであり；
Ｒ５およびＲ６は、共に水素であるかまたは一緒になって炭素間二重結合を形成し；
Ｒ７は、水素またはメチルであり；
Ｒ９は、水素またはヒドロキシルであり；
Ｒ８およびＲ１０は、共に水素であるかまたは一緒になって炭素間二重結合もしくはエポキシドを形成し；
Ｗは、ＯまたはＮＨであり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；そして、
Ｒ１４は、メチルまたはヒドロキシメチルである。
【０１７２】
本発明の別の局面において、化合物は以下の式の化合物である：
【０１７３】
【化１３】
2004508810.tif 000013
ここで：
Ｒ４は、水素またはオキソであり；
Ｒ５およびＲ７は、各々独立して水素またはメチルであり；
Ｒ６は、水素であるか；
Ｒ８およびＲ１０は、共に水素であるかまたは一緒になって炭素間二重結合もしくはエポキシドを形成するか；あるいは、
Ｒ６およびＲ８は、一緒になって二重結合を形成し；
Ｒ９は、水素、ヒドロキシルまたはオキソであり；
Ｗは、ＯまたはＮＨであり；
Ｘは、ＯまたはＳであり；そして、
Ｒ１４は、メチルまたはヒドロキシメチルである。
【０１７４】
本発明の別の局面において、以下：
【０１７５】
【化１４】
2004508810.tif 000014
の化合物が提供される。
【０１７６】
本発明の化合物は、細胞傷害性薬剤であり、そして任意の適切な様式（抗癌剤を含むが、これに限定されない）で使用され得る。細胞傷害性またはチューブリン重合化（ｐｏｌｙｅｒｍｉｚａｔｉｏｎ）の程度を評価するための例示的なアッセイは、実施例１２に記載される。
【０１７７】
本発明の化合物は、多数の方法を用いて作製され得る。本発明の１つの局面において、これらの化合物は、エポシロンＰＫＳを発現する組み換え宿主細胞によって産生される。１つの実施形態において、式：
【０１７８】
【化１５】
2004508810.tif 000015
の化合物（ここで、Ｒ１〜Ｒ１２は、式Ｉについて以前に記載されたようなものである）が、１つ以上のモジュールにおいてＡＴ特異性を変更することによって、および／または１つ以上のモジュールにおいて酵素学的ドメインを変更することによって作製される。実施例１１は、本方法を使用して作製され得る改変の型および特異的な化合物を記載する。
【０１７９】
本発明の別の実施形態において、式Ｖのオキサゾール対応物が、式Ｖの化合物を通常作製する宿主細胞の発酵条件を調節することによって作製され得る。式Ｖの化合物のチアゾール部分が、ＮＲＰＳにおけるシステイン結合に由来する。エポシロンＨ１およびＨ２（これは、エポシロンＣおよびエポシロンＤのオキサゾール対応物である）が、微量の宿主細胞によって作製され、そしてこれは、エポシロンＮＲＰＳにおけるシステインの代わりの、セリンの臨時的な結合から生じると考えられる。
【０１８０】
本方法は、エポシロンＰＫＳのＮＲＰＳ結合部位におけるセリンとシステインとの明確な競合を利用し、そしてエポシロンＮＲＰＳにおいてシステインの代わりに、セリンの結合を好む培養条件を使用する。セリンを補充した（例えば、基底レベルを超えて５０倍の増加）培地中で宿主細胞を増殖させることによって、通常産生されるチアゾール含有化合物の代わりに、ほとんどオキサゾール含有化合物の産生を生じることが見出された。従って、特定のエポシロン化合物または式Ｖの化合物を作製するように操作された組み換え宿主細胞は、セリンで補充された培地中で増殖され得、その結果、この細胞はここで、オキサゾール対応物である以下の式：
【０１８１】
【化１６】
2004508810.tif 000016
の化合物の産生を好む。
【０１８２】
言い換えると、本方法は、２つの化合物（１つは、式Ｖに対応するものおよびその一部分について式ＶＩに対応するその対応物）を獲得する単純かつ洗練された方法である。オキサゾール含有化合物を作製するためのセリン補充方法は、実施例１３により詳細に記載される。この実施例は、エポシロンＨ２およびエポシロンＨ１（それぞれ、エポシロンＤおよびエポシロンＣのオキサゾール対応物）の産物を好むように、Ｋ１１１−４０−１株によって通常産生されるエポシロンＤおよびエポシロンＣのレベルを減少するために使用された条件を記載する。本発明の式Ｖの他の化合物を作製する他の組み換え構築物が、式ＶＩの化合物を作製するための条件と類似の条件を使用して増殖され得る。
【０１８３】
本発明の別の局面において、化合物は、化学生合成（ｃｈｅｍｏｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）と称される方法を用いて産生される。この方法は、ＰＫＳが合成前駆体を指定された部位において受容し、そして結合するような様式で変更されたエポシロンＰＫＳを使用する。次いで、この合成前駆体は、このポイントから前へと通常の様式でＰＫＳによって進行される。
【０１８４】
化学生合成に必要な変更の型の例示的な実施例は、実施例９に記載され、この実施例９は、エポシロンＡ、エポシロンＢ、エポシロンＣ、およびエポシロンＤを主要産物として通常産生するＭ．ｘａｎｔｈｕｓ株のＫＳ２ノックアウト型の構築を記載する。ＫＳ２ノックアウトは、伸長モジュール２のＫＳドメインの不活性化といわれ、その結果、生じるＰＫＳは、以前のモジュール、ローディングドメインおよびＮＲＰＳの生成物（これは、伸長モジュール１を考慮に入れる）をロードできず、そして進行できない。従って、ＰＫＳ指向された合成は、伸長モジュール２のＡＣＰにおいて失速し、エポシロン産物は、合成前駆体の非存在下においてそのような株によって作製されない。しかし、この株に合成前駆体が提供される場合、これは、ローディングドメインおよび伸長モジュール１の産生を模倣し、その結果、伸長モジュール２のＡＣＰは、前駆体に結合し、そしてＰＫＳが、この前駆体をこのポイントから前へと進行させる。例えば、実施例９のノックアウト株を合成前駆体：
【０１８５】
【化１７】
2004508810.tif 000017
と共に提供すると、実施例１０により詳細に記載されるように、エポシロンＢおよびエポシロンＤの産生を引起す（エポシロンＡおよびエポシロンＢがまた、産生されるが微量である）。図１をまた参照のこと。別の例において、実施例９のノックアウト株を合成前駆体、例えば、：
【０１８６】
【化１８】
2004508810.tif 000018
（ここで、Ｒは、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５ヒドロキシアルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、およびＣ１〜Ｃ５アミノアルキル、より好ましくは、水素またはメチルである）と共に提供する場合、以下のエポシロン化合物：
【０１８７】
【化１９】
2004508810.tif 000019
ならびに、これらそれぞれの、１２，１３−エポキシド対応物を生じる。
【０１８８】
従って、合成先駆体を変更することによって、単一ＫＳ２ノックアウト株は、広範な種々の化合物を作製するために使用され得る。実際、実施例９に記載される株は、式：
【０１８９】
【化２０】
2004508810.tif 000020
（ここで、Ａｒは、アリールであり、そしてＲ７は、水素またはメチルである）の化合物を作製するために、式：
【０１９０】
【化２１】
2004508810.tif 000021
（適切なＡｒ基の例示的な例としては、以下：
【０１９１】
【化２２】
2004508810.tif 000022
（ここで、Ｒは、水素、ヒドロキシ、ハロゲン、アミノ、Ｃ１〜Ｃ５アルキル、Ｃ１〜Ｃ５ヒドロキシアルキル、Ｃ１〜Ｃ５アルコキシ、およびＣ１〜Ｃ５アミノアルキルである）が挙げられるが、これらに限定されない）の合成前駆体をこれに提供することによって、使用され得る。より好ましい実施形態において、Ｒは、水素またはメチルである。実施例１０は、種々の前駆体の合成ならびに化学生合成におけるそれらの使用およびそれぞれの１２，１３−エポキシド対応物を記載する。
【０１９２】
別の実施形態において、ローディングドメインノックアウトは、本発明の特定の化合物を作製するために使用される。例えば、実施例９に使用された開始物質のローディングドメインノックアウトはまた、式
【０１９３】
【化２３】
2004508810.tif 000023
の合成前駆体を提供することによって式ＶＩＩおよびＶＩＩＩの化合物を作製するために使用され得る。
【０１９４】
他の実施形態において、本発明の他の株のＫＳ２またはローディングドメインノックアウトは、実施例１１に記載されるこれらの株を含むように作製されるが、それに限定されず、そして２−メチルチアゾール以外のアリール部分を有する化合物を作製するために使用される。例えば、優先的に９−オキソ−エポシロンＤ（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ　Ｄ）を作製する構築物のＫＳ２ノックアウトへ式ＩＸの合成前駆体を供給することは、式
【０１９５】
【化２４】
2004508810.tif 000024
（ここで、Ａｒがアリールである）の化合物を生じる。
【０１９６】
本発明の別の局面において、エポシロンＰＫＳを発現する宿主細胞から作製される化合物は、さらに生物学的および／または合成的方法を使用して修飾され得る。１つの実施形態において、式Ｉの化合物（ここで、Ａｒが、
【０１９７】
【化２５】
2004508810.tif 000025
である）は、微生物的に誘導されるヒドロキシラーゼを使用してＣ−２１炭素でヒドロキシル化され得る。このような形質転換を実施するためのプロトコールは、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／３９２７６（本明細書中にその全体が参考として援用される）、および本明細書中の実施例１４に記載される。
【０１９８】
別の実施形態において、エポシロンＡ〜ＤのＣ−１２およびＣ−１３に対応する位置で炭素−炭素二重結合を有する本発明の化合物は、ＥｐｏＫまたは別のＰ４５０エポキシダーゼを使用してエポキシド化され得る。エポキシド化のためにＥｐｏＫを使用する一般的な方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／３１２４７（本明細書中にその全体が参考として援用される）の実施例５および本明細書中の実施例１５に記載される。あるいは、エポキシド化反応は、炭素−１２および炭素−１３との間の結合に対応する位置で二重結合を含むエポシロン化合物を機能的なＥｐｏＫを発現する細胞培養物と接触させることによって起こり得る。このような細胞としては、ミクソバクテリウム（ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍが挙げられる。特に好ましい実施形態において、このＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍは、ＥｐｏＫを発現するが、機能的エポシロンポリケチドシンターゼ（「ＰＫＳ」）遺伝子を含まない。このような株は、変異誘発によって作製され得、ここで、エポシロンＰＫＳ遺伝子における１つ以上の変異は、それを無効にする。このような変異は、天然に起こり得る（スクリーニングによって見出され得る）か、または突然変異原（例えば、化学薬品）または照射（ｉｒｒａｄａｔｉｏｎ）いずれかを使用してか、もしくは遺伝子操作によって指向され得る。無効なエポシロンＰＫＳを有する株を作製するための特に有効なストラテジーは、ＰＣＴ公開ＷＯ００／３１２４７に記載されるような相同組換えである。
【０１９９】
別の実施形態において、エポキシ化反応は、合成方法を使用して起こり得る。例えば、スキーム２に示されるように、本発明のデソキシ（ｄｅｓｏｘｙ）化合物は、デソキシ化合物をジメチルジオキシランと反応させることによってエポキシ相対物へ変換され得る。
【０２００】
【化２６】
2004508810.tif 000026
実施例１６は、より詳細にこの合成方法を記載する。
【０２０１】
別の実施形態において、本発明のマクロラクトンは、本発明のマクロラクタムに変換され得る。スキーム３に例示されるように、本発明のデソキシマクロラクトンは、スキーム２に前記されるようにジメチルジオキシランを使用してエポキシド化されて、オキシ相対物（ｏｘｙｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔ）を提供する。
【０２０２】
【化２７】
2004508810.tif 000027
オキシ−マクロラクトンは、アジドナトリウムおよびテトラキス（ｔｅｔｒａｋｉｓ）（トリフェニルフォスリン）パラジウムで処理されて、開環してアジド酸を形成する。次いで、このアジドはトリメチルフォスフィンで還元されて、アミノカルボキシ酸を形成する。
【０２０３】
本発明のエポキシ化合物（ここで、ＷがＮＨである）は、アミノカルボキシ酸のマクロラクタム化から作製され得る。
【０２０４】
【化２８】
2004508810.tif 000028
スキーム４に示されるように、アミノカルボキシ酸は、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミドおよび１−ヒドロキシベンゾトリアゾールで処理されて、エポキシマクロラクタムを形成する。このデソキシ−マクロラクタムは、六塩化タングステンおよびブチルリチウムでエポキシ−マクロラクタムを処理することによって作製され得る。
【０２０５】
本発明のエポキシ化合物（ここで、ＷはＮＲ１３であり、そしてＲ１３は水素ではない）は、マクロラクタム化の前にアミノカルボキシ酸をアルデヒドおよびシアノホウ化水素ナトリウムで処理することによって作製され得る。
【０２０６】
【化２９】
2004508810.tif 000029
スキーム５に示されるように、アミノカルボキシ酸は、アルデヒド、Ｒ１３ＨＯ、およびシアノホウ化水素ナトリウムで処理されて、次いでスキーム４に前記されるようにマクロラクタム化されて、必要に応じて脱酸素される置換アミノ酸を形成して、エポキシおよびデソキシマクロラクタム（ここで、Ｒ１３は水素ではない）を提供する。
【０２０７】
本発明のマクロラクタムを作製するための合成方法はまた、実施例１７〜１９によってより詳細に記載される。実施例１７は、例示的な開始物質として９−オキソ−エポシロンＤを使用するアミノ酸の形成を記載する。実施例１８および１９は、それぞれ９−オキソ−エポシロンＤのエポキシおよびデソキシマクロラクタムバージョンの形成を記載する。実施例２０および２１は、それぞれ９−オキソ−エポシロンＤのエポキシ置換およびデソキシ置換のマクロラクタムバージョンの形成を記載する。
【０２０８】
本発明の組成物は、一般的に本発明の化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本発明の化合物は、遊離形式であり得るか、または薬学的に受容可能な誘導体（例えば、プロドラッグ、および本発明の化合物の塩およびエステル）として適切なものであり得る。
【０２０９】
この組成物は、任意の適切な形態（例えば、固体、半固体、または液体の形態）であり得る。Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｄｏｓａｇｅ　Ｆｏｒｍｓ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖｅｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、第５版、Ｌｉｐｐｉｃｏｔｔ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９１）（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。一般的に、薬学的調製物は、外用、経腸、または非経口用途に適切な有機または無機キャリア賦形剤と混合して、活性成分として１つ以上の本発明の化合物を含む。この活性成分は、例えば、錠剤、ペレット、カプセル、坐剤、ペッサリー、溶液、エマルジョン、懸濁液、および使用に適切な任意の他の形態のために有用な非毒性、薬学的に受容可能なキャリアと合わせられ得る。使用され得るキャリアとしては、水、グルコース、ラクトース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、スターチペースト、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ、ポテトスターチ、尿素、および調製物製造での使用に適切な他のキャリア（固体、半固体、液体形態で）が挙げられる。さらに、補助的な、安定化剤、増粘剤、および着色剤ならびに香料が使用され得る。
【０２１０】
１つの実施形態において、本発明の化合物を含む組成物は、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）を含まない。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）（ＢＡＳＦ　Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）は、ポリエトキシル化ヒマシ油であり、これは、代表的に、溶解度の低い薬物を処方する際の界面活性剤として使用される。しかし、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）は、被験体においてアレルギー反応の原因となり得るので、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）を最小にするかまたは排除する組成物が、好ましい。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）を排除するエポシロンＡまたはＢの処方物は、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９９／３９６９４（本明細書中に参考として援用される）に記載され、本発明の化合物を用いる使用に適用され得る。
【０２１１】
適用可能な場合、本発明の化合物は、マイクロカプセルおよびナノパーティクルとして処方され得る。一般的なプロトコールは、たとえば、Ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ　ａｎｄ　Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ　ｉｎ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　ａｎｄ　Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｍａｘ　Ｄｏｎｂｒｏｗ編、ＣＲＣ　Ｐｒｅｓｓ（１９９２）ならびに米国特許第５，５１０，１１８号；同第５，５３４，２７０号；および同第５，６６２，８８３号（全て本明細書中に参考として援用される）に記載される。体積に対する表面積の比を増加することによって、これらの処方物は、表面積の比を増加しなければ、経口送達に従わない化合物の経口送達を可能にする。
【０２１２】
本発明の化合物はまた、溶解度の低い薬物に対して以前使用されていた他の方法を使用して処方され得る。例えば、この化合物は、ＷＯ９８／３０２０５および００／７１１６３（本明細書中に参考として援用される）に記載されるようなビタミンＥまたはそれらのＰＥＧ化誘導体を有するエマルジョンを形成し得る。代表的に、本発明の化合物は、エタノールを含む水溶液（好ましくは１％ｗ／ｖ未満）に溶解される。ビタミンＥまたはＰＥＧ化ビタミンＥが添加される。次いでエタノールは、除去されて、静脈内投与または経口経路投与のために処方され得るプレ−エマルジョンを形成する。別のストラテジーは、リポソーム中に本発明の化合物をカプセル化する工程を含む。薬物送達ビヒクルとしてリポソームを形成する方法は、当該分野で周知である。適切なプロトコールとしては、米国特許第５，６８３，７１５号；同第５，４１５，８６９号、および同第５，４２４，０７３号（相対的に溶解度の低い別の癌薬物タキソールに関する参考として本明細書中に援用される）ならびにＰＣＴ公開ＷＯ０１／１０４１２（エポシロンＢに関する参考として本明細書中に援用される）に記載されるプロトコールが挙げられる。使用され得る種々の脂質のうち、エポシロンカプセル化リポソームを作製するために特に好ましい脂質としては、ホスファチジルコリンおよびポリエチレングリコール誘導ジステアリルホスファチジルエタノールアミンが挙げられる。実施例２２は、９−オキソ−エポシロンＤを含むリポソームを作製するための例示的なプロトコール（本発明の他の化合物を含むリポソームを作製するために容易に適合され得る一般的な方法）を提供する。
【０２１３】
さらに別の方法は、ポリマー（バイオポリマーまたは生体適合性（合成または天然に存在する）ポリマーなど）を使用して本発明の化合物を処方する工程を包含する。生体適合性ポリマーは、生分解性および非生分解性として類別され得る。生分解性ポリマーは、インビボで化学的組成物の機能、製造方法、および移植片構造として分解する。合成ポリマーの例示的な例としては、ポリ無水物、ポリヒドロキシ酸（例えば、ポリ酢酸、ポリグリコール酸およびそれらのポリマー）、ポリエステルポリアミドポリオルトエステルおよびいくつかのポリホスファゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）が挙げられる。天然に存在するポリマーの例示的な例としては、タンパク質ならびに多糖類（例えば、コラーゲン、ヒアルロン酸、アルブミン、およびゼラチン）が挙げられる。
【０２１４】
別の方法は、水溶性を高めるポリマーに本発明の化合物を結合体化する工程を包含する。適切なポリマーの例としては、ポリエチレングリコール、ポリ−（ｄ−グルタミン酸）、ポリ−（ｌ−グルタミン酸）、ポリ−（ｌ−グルタミン酸）、ポリ−（ｄ−アスパラギン酸）、ポリ−（ｌ−アスパラギン酸）、ポリ−（ｌ−アスパラギン酸）およびそれらのコポリマーが挙げられる。約５，０００と約１００，０００との間の分子量を有するポリグルタミン酸が、好ましく、約２０，０００と約８０，０００との間の分子量がより好ましく、そして約３０，０００と約６０，０００との間の分子量が最も好ましい。このポリマーは、米国特許第５，９７７，１６３号（本明細書中に参考として援用される）および実施例２３に本質的に記載されるプロトコールを使用してエステル結合を介して本発明のエポシロンの１つ以上のヒドロキシルに結合体化される。本発明の２１−ヒドロキシ誘導体の場合、好ましい結合体部位は、ヒドロキシルのとれた（ｈｙｄｒｏｘｙｌ　ｏｆｆ）炭素２１を含む。他の結合体部位は、ヒドロキシルのとれた炭素３およびヒドロキシルのとれた炭素７を含む。
【０２１５】
別の方法において、本発明の化合物は、モノクローナル抗体に結合体化される。このストラテジーは、特異的標的への本発明の化合物の標的化を可能にする。結合体化抗体の設計および使用のための一般的プロトコールは、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｂａｓｅｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ、Ｍｉｃｈａｅｌ　Ｌ．Ｇｒｏｓｓｂａｒｄ編（１９９８）（本明細書中に参考として援用される）に記載される。
【０２１６】
単一の投与量形態を作製するようにキャリア物質と組み合わせられ得る活性成分の量は、処置される被験体および投与の特定のモードに依存して変化する。例えば、静脈内使用のための処方は、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬの範囲、好ましくは約５ｍｇ／ｍＬ〜１５ｍｇ／ｍＬの範囲、そしてより好ましくは約１０ｍｇ／ｍＬの本発明の化合物の量を含む。静脈内処方物は、使用の前に、代表的に約２倍と約３０倍との間で通常の生理食塩水または５％デキストロース溶液を用いて希釈される。
【０２１７】
本発明の１つの局面において、本発明の化合物は、癌を処置するために使用される。１つの実施形態において、本発明の化合物は、頭部および頚部の癌（頭部、頚部、鼻腔、副鼻腔、鼻咽頭、口腔、口腔咽頭部、喉頭、下咽頭、唾液腺、および傍神経節腫の腫瘍を含む）を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、肝臓および胆道の癌（特に肝細胞癌）を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、腸癌（特に結腸直腸癌）を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、卵巣癌を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、小細胞および非小細胞肺癌を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、乳癌を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、肉腫（線維肉腫、悪性線維性組織球腫、胎児性横紋筋肉腫、平滑筋肉腫（ｌｅｉｏｍｙｓｏｓａｒｃｏｍａ）、神経線維肉腫、骨肉腫、滑膜肉腫、脂肪肉腫、および胞状軟部肉腫を含む）を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、中枢神経系の新生物（特に、脳癌）を処置するために使用される。別の実施形態において、本発明の化合物は、リンパ腫（ホジキンリンパ腫、リンパ血漿細胞様リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、被膜細胞リンパ腫（ｍａｎｔｌｅ　ｃｅｌｌ　ｌｙｍｐｈｏｍａ）Ｂ−直系大細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、およびＴ細胞未分化大細胞リンパ腫を含む）を処置するために使用される。
【０２１８】
この方法は、治療的に有効な量の本発明の化合物を癌に罹患する被験体に投与する工程を包含する。この方法は、癌を抑える（すなわち、さらなる増殖を予防する）ためか、または癌を除去するためのいずれかに必要な場合、繰り返され得る。臨床的に、この方法の実施は、癌性増殖のサイズもしくは数の減少、および／または関連症状（ここで適切な）の減少を生じる。病理学的に、この方法の実施は、以下のうちの少なくとも１つを生じる、以下：癌細胞増殖の阻害、癌または腫瘍のサイズの減少、さらなる転移の予防、および腫瘍新脈管形成の阻害。
【０２１９】
本発明の化合物および組成物は、組合せ治療に使用され得る。いいかえれば、本発明の化合物および組成物は、１つ以上の他の所望される治療手順もしくは医学手段と同時に、前に、または後に投与され得る。組合せレジメンにおける治療および手順の特定の組合せは、この治療および／または手順の適合性ならびに達成されるべき所望の治療効果を考慮に入れる。
【０２２０】
１つの実施形態において、本発明の化合物および組成物は、別の抗癌剤または手順と組み合わせて使用される。他の抗癌剤の例示的な例としては、（ｉ）アルキル化薬物（例えば、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミド）；（ｉｉ）代謝拮抗物質薬（例えば、メトトレキサート）；（ｉｉｉ）微小管安定化剤（例えば、ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、およびジスコデルモライド（ｄｉｓｃｏｄｅｒｍｏｌｉｄｅ））；（ｉｖ）新脈管形成インヒビター；（ｖ）ならびに細胞障害性抗生物質（例えば、ドキソルビコン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｏｎ）（アドリアマイシン）、ブレオマイシン、およびマイトマイシン）が挙げられるが、それらに限定されない。他の抗癌手順の例示的な例としては、（ｉ）手術；（ｉｉ）放射線治療；および（ｉｉｉ）光力学治療が挙げられる。
【０２２１】
別の実施形態において、本発明の化合物および組成物は、本発明の化合物または組成物由来の潜在的な副作用（例えば、下痢、悪心および嘔吐）を緩和する薬剤または手順と組み合わせて使用される。下痢は、抗下痢剤（例えば、オピオイド（例えば、コデイン、ジフェノキシラート、ジフェノキシン、およびロエラミド（ｌｏｅｒａｍｉｄｅ））、次サリチル酸ビスマス、ならびにオクトレオチド（ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ））で処置され得る。悪心および嘔吐は、制吐作用剤（例えば、デキサメタゾン、メトクロプラミド、ジフェニルヒドラミン（ｄｉｐｈｅｎｙｈｙｄｒａｍｉｎｅ）、ロラゼパム、オンダンセトロン、プロクロルペラジン、チエチルペラジン、およびドロナビノール）で処置され得る。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）などのポリエトキシル化ヒマシ油を含むこれらの組成物について、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾンおよびメチルプレドニゾロン）ならびに／またはＨ１アンタゴニスト（例えば、ジフェニルヒドラミンＨＣｌ）ならびに／またはＨ２アンタゴニストでの前処置が、アナフィラキシーを緩和するために使用され得る。静脈用途のための例示的な処方および前処置レジメンは、それぞれ実施例２４および２５に記載される。
【０２２２】
本発明の別の局面において、本発明の化合物は、細胞性過剰増殖によって特徴付けられる非癌障害を処置するために使用される。１つの実施形態において、本発明の化合物は、乾癬（皮膚に蓄積して上昇した鱗片の病巣を形成するケラチノサイトの細胞性過剰増殖によって特徴付けられる状態）を処置するために使用される。この方法は、治療的に有効な量の本発明の化合物を乾癬に罹患している被験体に投与する工程を包含する。この方法は、病巣の数または重篤度を減少するためか、または病巣を除去するためのいずれかに必要な場合、繰り返され得る。臨床的に、この方法の実施は、皮膚病巣のサイズもしくは数の減少、皮膚の症状（冒された皮膚の疼痛、灼熱および出血）の減少および／または関連症状（例えば、関節赤熱状態、熱、腫脹、下痢、腹痛）の減少を生じる。病理学的に、この方法の実施は、以下のうちの少なくとも１つを生じる、以下：ケラチノサイト増殖の阻害、皮膚炎症の減少（例えば、誘引因子および成長因子、抗原提示、反応性酸素種の生成ならびにマトリクスメタロプロテイナーゼに影響を与えることによって）、ならびに皮膚の新脈管形成の阻害。
【０２２３】
別の実施形態において、本発明の化合物は、多発性硬化症（脳における進行性髄鞘脱落によって特徴付けられる状態）を処置するために使用される。ミエリンの損失に関する正確な機構は、理解されていないが、星状細胞増殖の増加およびミエリン破壊領域の累積が存在する。これらの部位では、マクロファージ様活性およびミエリン鞘の破壊に少なくとも部分的に起因する増加したプロテアーゼ活性が存在する。この方法は、治療的に有効な量の本発明の化合物を多発性硬化症に罹患している被験体に投与する工程を包含する。この方法は、星状細胞増殖を阻害するためか、および／または運動機能の損失の重篤度を少なくするおよび／または疾患の慢性進行を予防もしくは減衰するのに必要な場合、繰り返され得る。臨床的に、この方法の実施は、視覚症状（視覚損失、複視）、歩行障害（虚弱、軸不安定性、感覚の喪失、痙性、反射亢進、機敏さの損失）、上肢機能障害（虚弱、痙性、感覚の喪失）、膀胱機能不全（尿意促迫、失禁、躊躇、不完全な空）、低下、情緒不安定性、および認識障害における改善を生じる。病理学的に、この方法の実施は、以下のうちの少なくとも１つを生じる、以下：例えば、ミエリン損失、血管脳関門の破壊、単核細胞の脈管周囲浸潤、免疫学的異常、神経膠瘢痕（ｇｌｉｏｔｉｃ　ｓｃａｒ）形成および星状細胞増殖、メタロプロテイナーゼ生成、ならびに減損電導速度。
【０２２４】
別の実施形態において、本発明の化合物は、慢性関節リウマチ（作用関節の破壊および強直（ａｎｋｙｉｏｓｉｓ）をしばしばもたらす慢性多系統（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｙｓｔｅｍ　ｃｈｒｏｎｉｃ）、再発性の炎症性疾患）を処置するために使用される。慢性関節リウマチは、関節間隙に伸長する絨毛突出、滑膜細胞整列（ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ　ｌｉｎｉｎｇ）の多層化（ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒｉｎｇ）（滑膜細胞増殖）、白血球（マクロファージ、リンパ球、形質細胞、およびリンパ小節；「炎症性滑膜炎」と呼ばれる）の滑膜の浸潤、ならびに滑膜内の細胞性壊死によるフィブリンの堆積を形成する滑膜のマークされた肥厚によって特徴付けられる。このプロセスの結果形成される組織は、パンヌスと呼ばれ、そして最終的には、このパンヌスは関節空隙を満たすように増殖する。このパンヌスは、滑膜の進化に必須の新脈管形成のプロセスを通して新しい血管の広いネットワークを発達させる。消化酵素（マトリクスメタロプロテイナーゼ（例えば、コラーゲナーゼ、ストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ））およびパンヌス組織の細胞由来の炎症性プロセスの他の媒介物質（例えば、過酸化水素、スーパーオキシド、リソソーム酵素、およびアラキドン酸（ａｒａｃｈａｄｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）代謝の産物））の放出は、軟骨組織の進行性の破壊を導く。このパンヌスは、軟骨組織の侵食およびフラグメント化を導く関節軟骨を浸潤する。結局、関連する関節の線維性強直および最終的には骨性強直と共に肋軟骨下の骨組織の侵食が存在する。
【０２２５】
この方法は、治療的有効量の本発明の化合物を、リウマチ様動脈炎に罹患している被験体に投与する工程を包含する。この方法は、滑膜細胞増殖の阻害、および／または罹患した関節の運動の損失の重篤度の減少、および／またはこの疾患の慢性的進行の予防もしくは軽減を達成するまで、必要に応じて繰り返され得る。臨床的に、本発明の実施は、以下のうちの１つ以上を生じる：（ｉ）症状（疼痛、腫脹および罹患した関節の圧痛、衰弱、疲労、食欲不振、体重減少）の重篤度の減少；（ｉｉ）この疾患の臨床的徴候（関節包の肥厚、滑膜肥厚、関節滲出液、軟組織拘縮、運動範囲の減少、強直および関節突起間関節変形）の重篤度の減少；（ｉｉｉ）この疾患の関節外発現（リウマチ性結節、脈管炎、肺結節、間隙性線維症、心膜炎、上強膜炎、虹彩炎、フェルティ症候群、骨粗鬆症）の減少；（ｉｖ）疾患寛解／無症状期間の頻度および持続時間の増加；（ｖ）固定欠陥および障害の予防；および／または（ｖｉ）疾患の慢性的進行の予防／減少。病理学的に、本発明の実施は、以下のうちの少なくとも１つを生じる（ｉ）炎症応答の減少；（ｉｉ）炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−Ｉ、ＴＮＦａ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ）の活性の破壊；（ｉｉｉ）滑膜増殖の阻害；（ｉｖ）マトリクスメタロプロテイナーゼ活性の阻害、および／または（ｖ）新脈管形成の阻害。
【０２２６】
別の実施形態において、本発明の化合物は、アテローム性動脈硬化症および／または再狭窄を処置するため、特に、妨害物が血管内ステントで処置され得る患者において使用される。アテローム性動脈硬化症は、動脈壁の正常な血管平滑筋細胞（「ＶＳＭＣ」）（これは、通常は血流を調節する血管緊張を制御する）のいくらかが、それらの性質を変え、そして「癌様」挙動を発生している慢性血管障害である。このＶＳＭＣは、異常に増殖性になり、このＶＳＭＣに侵入して内側の血管内層に拡散し得る物質（増殖因子、組織分解酵素および他のタンパク質）を分泌し、血流をブロックし、そしてこの血管を異常に、局所的な血液凝固によって完全にブロックされやすくする。再狭窄（矯正手順後の狭窄または動脈狭窄の再発）は、アテローム性動脈硬化症の促進された形態である。
【０２２７】
この方法は、治療的有効量の本発明の化合物を、ステント上にコーティングする工程、およびこのステントを、アテローム性動脈硬化症に罹患している被験体の患部動脈に送達する工程を包含する。ステントを化合物でコーティングするための方法は、例えば、米国特許第６，１５６，３７３号および同第６，１２０，８４７号により記載される。臨床的に、本発明の実施は、以下のうちの１つ以上を生じる：（ｉ）動脈血流の増加；（ｉｉ）この疾患の臨床的徴候の重篤度の減少；（ｉｉｉ）再狭窄の速度の減少；（ｉｖ）アテローム性動脈硬化症の慢性的進行の予防／減少。病理学的に、本発明の実施は、ステント移植部位において以下のうちの少なくとも１つを生じる：（ｉ）炎症応答の減少；（ｉｉ）マトリクスメタロプロテイナーゼのＶＳＭＣ脱分泌の阻害；（ｉｉｉ）平滑筋細胞蓄積の阻害；および（ｉｖ）ＶＳＭＣ表現型分化の阻害。
【０２２８】
一実施形態において、癌および細胞増殖によって特徴付けられる非癌障害に罹患した被験体に投与される投薬量レベルは、約１ｍｇ／ｍ２〜約２００ｍｇ／ｍ２のオーダーであり、これはボーラスとして投与され得る（投与の任意の適切な経路において）か、または連続注入（例えば、１時間、３時間、６時間、２４時間、４８時間または７２時間）として、１週間毎、２週間毎、または３週間毎に必要に応じて投与される。しかし、任意の特定の患者に対する特定の用量レベルは、様々な因子に依存することが理解される。これらの因子としては、用いられる特定の化合物の活性；この被験体の年齢、体重、一般的な健康状態、性別および食餌；投与の時間および経路、および薬物の排泄速度；薬物の組み合わせがこの処置において用いられるか否か；ならびに処置される状態の重篤度が挙げられる。
【０２２９】
別の実施形態において、投薬量レベルは、３週間毎に１回、必要に応じてかつ許容されるように、約１０ｍｇ／ｍ２〜約１５０ｍｇ／ｍ２、好ましくは約１０ｍｇ／ｍ２〜約７５ｍｇ／ｍ２、より好ましくは約１５ｍｇ／ｍ２〜約５０ｍｇ／ｍ２である。別の実施形態において、投薬量レベルは、２週間毎に１回、必要に応じてかつ許容されるように、約１ｍｇ／ｍ２〜約１５０ｍｇ／ｍ２、好ましくは約１０ｍｇ／ｍ２〜約７５ｍｇ／ｍ２、より好ましくは約２５ｍｇ／ｍ２〜約５０ｍｇ／ｍ２である。別の実施形態において、投薬量レベルは、１週間毎に一回、必要に応じてかつ許容されるように、約１ｍｇ／ｍ２〜約１００ｍｇ／ｍ２、好ましくは約５ｍｇ／ｍ２〜約５０ｍｇ／ｍ２、より好ましくは約１０ｍｇ／ｍ２〜約２５ｍｇ／ｍ２である。別の実施形態において、投薬量レベルは、一日に一回、必要に応じておよび許容されるように、約０．１ｍｇ／ｍ２〜約２５ｍｇ／ｍ２、好ましくは約０．５ｍｇ／ｍ２〜約１５ｍｇ／ｍ２、より好ましくは約１ｍｇ／ｍ２〜約１０ｍｇ／ｍ２である。
【０２３０】
本発明の詳細な説明は上記に示されてきたが、以下の実施例は、本発明の例示の目的のために提供され、そして本発明の範囲および特許請求の範囲の制限であると解釈されるべきではない。
【０２３１】
（実施例１）
（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ発現ベクターの構築）
ファージＭｘ８の組込み機能および結合機能を提供するＤＮＡを、市販のｐＡＣＹＣ１８４（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）に挿入した。Ｓａｌｍｉら、Ｆｅｂ．１９９８，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８０（３）：６１４−６１２に記載される、ｐＰＬＨ３４３由来の約２３６０ｂｐのＭｆｅＩ−ＳｍａＩを単離し、そしてプラスミドｐＡＣＹＣ１８４の大きなＥｃｏＲＩ−ＸｍｎＩ制限フラグメントに連結した。このように形成した環状ＤＮＡのサイズは、約６ｋｂであり、ｐＫＯＳ３５−７７と命名した。
【０２３２】
プラスミドｐＫＯＳ３５−７７は、エポシロンＰＫＳ遺伝子プロモーターの制御下で、本発明の組換えＰＫＳ遺伝子を発現するための従来のプラスミドとして働く。１つの例示的な実施形態において、エポシロンＰＫＳ遺伝子（その相同なプロモーターを有する）全体は、１つ以上のフラグメントにおいて、プラスミドに挿入され、本発明の発現ベクターを生成する。
【０２３３】
本発明はまた、本発明の組換えＰＫＳ遺伝子が、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓプロモーターの制御下にある発現ベクターを提供する。例示的なベクターを構築するために、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓのｐｉｌＡ遺伝子のプロモーターを、ＰＣＲ増幅産物として単離した。プラスミドｐＳＷＵ５３７（これは、ｐｉｌＡ遺伝子プロモーターを含み、そしてＷｕおよびＫａｉｓｅｒ，Ｄｅｃ．１９９７，Ｊ．Ｂａｃｔ．１７９（２４）：７７４８−７７５８に記載される）を、以下のＰＣＲプライマーＳｅｑ１およびＭｘｐｉｌ１プライマー：
Ｓｅｑ１：５’−ＡＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣ−３’；および
Ｍｘｐｉｌ１：５’−ＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧＡＡＧＧＴＴＧＣＡＡＣＧＧＧＧＧＧＣ−３’、
と混合し、そして標準的なＰＣＲ条件を使用して増幅し、約８００ｂｐのフラグメントを得た。このフラグメントを、制限酵素ＫｐｎＩを使用して切断し、そして市販のプラスミドｐＬｉｔｍｕｓ２８（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）の大きなＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＶ制限フラグメントに連結した。得られた環状ＤＮＡは、設計されたプラスミドｐＫＯＳ３５−７１Ｂであった。
【０２３４】
プラスミドｐＫＯＳ３５−７１Ｂ由来のｐｉｌＡ遺伝子のプロモーターを、約８００ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＳｎａＢＩ制限フラグメントとして単離し、そしてプラスミドｐＫＯＳ３５−７７の大きなＭｓｃＩ制限フラグメントと連結して、サイズが約６．８ｋｂの環状ＤＮＡを得た。約８００ｂｐのフラグメントは、２つの配向のいずれか一方に挿入され得たため、このライゲーションにより同じサイズの２つのプラスミドが生成し、これらをそれぞれ、プラスミドｐＫＯＳ３５−８２．１およびプラスミドｐＫＯＳ３５−８２．２と命名した。これらのプラスミドの制限部位および機能マップを、図２に示す。
【０２３５】
プラスミドｐＫＯＳ３５−８２．１およびｐＫＯＳ３５−８２．２は、組換えＰＫＳ遺伝子がＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　ｐｉｌＡ遺伝子プロモーターの制御下にある本発明のベクターの簡便な出発物質として働く。これらのプラスミドは、プロモーターの転写開始部位のすぐ下流に配置した単一のＰａｃＩ制限酵素認識配列を含む。１つの例示的な実施形態において、エポシロンＰＫＳ遺伝子（その相同なプロモーターを有さない）全体は、１つ以上のフラグメントにおいて、ＰａｃＩ部位にあるプラスミドに挿入されて、本発明の発現ベクターを生成する。
【０２３６】
これらのプラスミドにおけるｐｉｌＡプロモーターの配列を以下に示す：
【０２３７】
【化３０】
2004508810.tif 000030
本発明の組換えＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞を作製するために、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ細胞を、ＣＹＥ培地（ＣａｍｐｏｓおよびＺｕｓｍａｎ、１９７５，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｉｎ　Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ：ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　３’：５’−Ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰ，ＡＤＰ　ａｎｄ　ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７２：５１８−５２２）中、３０℃、３００ｒｐｍで１００のＫｌｅｔｔまで増殖する。残りのプロトコールは、他に示されない限り、２５℃で行う。次いで、これらの細胞を、遠心分離（８０００ｒｐｍで１０分間、ＳＳ３４またはＳＡ６００ローター中で）によってペレットかし、そして脱イオン水に再懸濁する。これらの細胞を再びペレット化し、そしてもとの容量の１／１００倍に再懸濁する。
【０２３８】
ＤＮＡ（１〜２μＬ）を、室温、０．１ｃｍのキュベット中、４００ｏｈｍ、２５μＦＤ、０．６５Ｖ、８．８〜９．４の範囲の時定数でエレクトロポレーションする。このＤＮＡは、塩を含まず、蒸留した脱イオン水に再懸濁するか、または０．０２５μｍ型ＶＳ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で透析する。抵抗率のエレクトロポレーションについて、このＤＮＡをスポット透析し、そして増殖物はＣＹＥ中に存在する。エレクトロポレーションの直後に、１ｍＬのＣＹＥを添加し、そして５０ｍＬのエーレンマイヤーフラスコに事前に添加した追加の１．５ｍＬのＣＹＥ（全容量２．５ｍｌ）を用いて、キュベット中の細胞をプールする。これらの細胞を、３０〜３２℃、３００ｒｐｍで、４〜８時間（または一晩）増殖し、選択マーカーを発現させる。次いで、これらの細胞を、選択したプレート上のＣＹＥ軟寒天にプレートする。選択マーカーとしてカンナマイシンを用いる場合、代表的な収量は、ＤＮＡ１μｇあたり１０３〜１０５である。選択マーカーとしてストレプトマイシンを用いる場合、これは寒天に結合するために、上部の寒天に含まれる。
【０２３９】
この手順を用いて、本発明の組換えＤＮＡ発現ベクターを、本発明の組換えＰＫＳを発現するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞にエレクトロポレーションし、エポシロン、エポシロン誘導体およびこれらによりコードされる他の新規なポリケチドを生成する。
【０２４０】
（実施例２：Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓにおけるエポシロン（Ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）の発現についての染色体組み込みおよび細菌人工染色体（ＢＡＣ））
異種宿主においてエポシロンＰＫＳおよび改変酵素遺伝子を発現して発酵によってエポシロンを生成するために、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍに密接に関連し、多くのクローニングベクターが利用可能であるＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓを、本発明の方法に従って使用する。Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓおよびＳ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍは、粘液細菌であり、そのためＭ．ｘａｎｔｈｕｓおよびＳ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍは、遺伝子発現、翻訳調節、および翻訳後修飾の共通エレメントを共有し得る。Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓは、遺伝子クローニングおよび発現について開発されてきた：ＤＮＡは、エレクトロポレーションによって導入され得、そして多くのベクターおよび遺伝子マーカーは、染色体中への安定な挿入を可能にするものを含む外来ＤＮＡの導入に利用可能である。Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓは、発酵槽中で複合培地にて比較的容易に増殖され得、そして求められる場合、遺伝子発現を増加するための操作に供され得る。
【０２４１】
エポシロン遺伝子クラスターをＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓに導入するために、相同組換えを使用することによって染色体にエポシロンクラスターを構築して完全な遺伝子クラスターをアセンブリし得る。あるいは、完全なエポシロン遺伝子クラスターを、細菌人工染色体（ＢＡＣ）にクローニングし得、次いで、染色体への組み込みのためにＭ．ｘａｎｔｈｕｓに移動し得る。
【０２４２】
コスミドｐＫＯＳ３５−７０．１Ａ２、およびｐＫＯＳ３５−７９．８５から遺伝子クラスターをアセンブリするために、これらのコスミドからの相同な小領域（約２ｋｂまたはそれより大きい）を、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓに導入して遺伝子クラスターのより大きな小片のための組換え部位を提供する。図３に示されるように、プラスミドｐＫＯＳ３５−１５４およびｐＫＯＳ９０−２２を作製して、これらの組換え部位を導入する。Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ染色体中のエポシロン遺伝子クラスターをアセンブリするための戦略を、図４に示す。最初に、遺伝子および転写単位をいずれも破壊しない、細菌染色体中の中立部位を、選択する。このような領域の１つは、ｄｅｖＳ遺伝子の下流であり、これは、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓの増殖または発達に影響しないことが示されている。第１のプラスミドであるｐＫＯＳ３５−１５４を、ＤｒａＩで線状化し、そしてＭ．ｘａｎｔｈｕｓ中にエレクトロポレーションする。このプラスミドは、エポシロン遺伝子クラスターの２つのフラグメントに隣接するｄｅｖ遺伝子座の２つの領域を含む。カナマイシン耐性マーカーおよびＥ．ｃｏｌｉ　ｇａｌＫ遺伝子を、ｅｐｏ遺伝子領域の間に挿入する。Ｕｅｋｉら、１９９６、Ｇｅｎｅ　１８３：１５３−１５７（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。相同な領域としてｄｅｖ配列を使用する二重組換えによってＤＮＡがｄｅｖ領域に再結合する場合、カナマイシン耐性は、コロニー中に生じる。
【０２４３】
この菌株（Ｋ３５−１５９）は、ｐＫＯＳ３５−７９．８５の組換えを可能にする、エポシロン遺伝子クラスターの小領域（約２．５ｋｂ）を含む。ｐＫＯＳ３５−７９．８５上の耐性マーカーがＫ３５−１５９におけるものと同一であるので、テトラサイクリントランスポゾンを、コスミド中に転位し、そしてカナマイシンマーカー中に挿入されたトランスポゾンを含むコスミドを、選択した。このコスミド（ｐＫＯＳ９０−２３）を、Ｋ３５−１５９中にエレクトロポレーションし、そしてオキシテトラサイクリン耐性コロニーを選択して、菌株Ｋ３５−１７４を作製した。所望でない領域をコスミドから除去しかつエポシロン遺伝子のみを残すために、細胞を、１％ガラクトースを含むＣＹＥプレート上に播いた。ｇａｌＫ遺伝子の存在は、これらの細胞を１％ガラクトースに感受性にする。Ｋ３５−１７４のガラクトース耐性コロニーは、組換えによってかまたはｇａｌＫ遺伝子中の変異によって、ｇａｌＫマーカーを損失した細胞を示す。組換え事象が生じる場合、ガラクトース耐性菌株は、カナマイシンおよびオキシテトラサイクリンに感受性である。両方の抗生物質に感受性な菌株を、サザンブロット分析によって立証する。正しい菌株を同定しＫ３５−１７５と称し、そして正しい菌株は、モジュール７からｅｐｏＫの停止コドンの下流４６８０ｂｐまでのエポシロン遺伝子クラスターを含む。
【０２４４】
モジュール１からモジュール７までを導入するために、上記のプロセスを、１度以上反復する。プラスミドｐＫＯＳ９０−２２を、ＤｒａＩで線状化し、そしてＫ３５−１７５にエレクトロポレーションしてＫ１１１−１３．２を作製する。この菌株を、テトラサイクリン耐性バージョンのｐＫＯＳ３５−７０．１Ａ２およびｐＫＯＳ９０−３８でエレクトロポレーションし、オキシテトラサイクリンに対して耐性なコロニーを、選択する。これによって、菌株Ｋ１１１−１３．２３を作製する。現在、全エポシロン遺伝子クラスターを有する組換え体を、１％ガラクトースに対する耐性によって選択する。これによって、クローンＫ１１１−３２．２５、Ｋ１１１−３２．２６およびＫ１１１−１３．３５が生じる。菌株Ｋ１１１−３２．２５を、ブダペスト条約に従って、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９，ＵＳＡに２０００年４月１４日に寄託し、そして受託番号ＰＴＡ−１７００の下で利用可能である。この菌株は、全てのエポシロン遺伝子およびそのプロモーターを含む。
【０２４５】
５０ｍＬフラスコ中で５ｍＬのＣＹＥ（１リットル当たり１０ｇカシトン（ｃａｓｉｔｏｎｅ）、５ｇ　酵母抽出物および１ｇ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ）に菌株を播種し、そしてこの培養物が中間対数増殖期になるまで一晩増殖させることによって、発酵を実施した。１００μＬのアリコートを、ＣＴＳプレート上に広げ、そしてプレートを３２℃で４〜５日間インキュベートした。エポシロンを抽出するために、プレートからのアガーおよび細胞を、浸軟し、５０ｍＬの円錐チューブに入れ、そしてアセトンを添加してチューブを充たした。溶液を、４〜５時間振動してインキュベートし、アセトンを吸引し、そして残った液体を、等量の酢酸エチルで２度抽出した。硫酸マグネシウムを添加することによって、酢酸エチル抽出物から水を除去した。硫酸マグネシウムを濾過し、そして液体を吸引して乾燥した。エポシロンを、２００μＬのアセトニトリル中に再懸濁し、ＬＣ／ＭＳによって分析した。この分析は、この菌株がエポシロンＡおよびＢを生成したことを示した。エポシロンＢは培養物中に約０．１ｍｇ／Ｌ存在し、そしてエポシロンＡは５〜１０倍低いレベルで存在した。
【０２４６】
この菌株をまた使用して、液体培地中にエポシロンを生成し得る。ＣＹＥを含むフラスコを、エポシロン生成菌株で播種する。次の日、細胞が中間対数増殖期にある間に、１ｍｇ／ｍＬのセリン、アラニンおよびグリシン、ならびに０．１％　ピルビン酸ナトリウムとともに、０．５％ＣＭＭ（０．５％カシトン、０．２％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍＭ　ＭＯＰＳ（ｐＨ７．６））を含むフラスコに、５％の接種原を添加した。ピルビン酸ナトリウムを０．５％にまで添加して、エポシロンＢ生成を増加し得たが、エポシロンＢ対エポシロンＡの比が減少した。培養物を、３０℃で６０〜７２時間増殖させる。より長いインキュベーションは、エポシロンの力価の低下をもたらす。エポシロンを回収するために、培養物を、ＳＳ３４ローターにて１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。上清を、酢酸エチルで２度抽出し、そして旋回吸引（「ロータベーポ（ｒｏｔａｖａｐｅ）」）して乾燥する。液体培養物は、プレート培養物で観察したものと類似した比の、２〜３ｍｇ／ＬのエポシロンＡおよびＢを生成した。ＸＡＤ（０．５〜２％）を培養物に添加する場合、エポシロンＣおよびＤを観察した。エポシロンＤは、０．１ｍｇ／Ｌで存在し、そしてエポシロンＣは、５〜１０倍低いレベルで存在した。
【０２４７】
１つのフラグメントとして全遺伝子クラスターをクローンするために、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリを構築する。まず、ＳＭＰ４４細胞を、アガロースに包埋し、そしてＢＩＯ−ＲＡＤゲノムＤＮＡプラグキットに従って溶解する。ＤＮＡプラグを、制限酵素（例えば、Ｓａｕ３ＡＩまたはＨｉｎｄＩＩＩ）で部分的に消化し、そしてＦＩＧＥゲルまたはＣＨＥＦゲル上で電気泳動する。アガロースからＤＮＡの電気抽出によってかまたはアガロースを分解するためにゲラーゼ（ｇｅｌａｓｅ）を使用して、ＤＮＡフラグメントを、単離する。フラグメントの単離するための選択法は、Ｓｔｒｏｎｇら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９：３９５９−３９６１（参考として本明細書中に援用される））に記載されるような電気抽出である。ＤＮＡを、適切な酵素で切断されたＢＡＣ（ｐＢｅｌｏＢＡＣＩＩ）に連結する。ｐＢｅｌｏＢＡＣＩＩのマップを、図５に示す。
【０２４８】
Ｓｈｅｎｇら、１９９５、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２３：１９９０−１９９６（参考として本明細書中に援用される）の方法によって、ＤＮＡを、ＤＨ１０Ｂ細胞にエレクトロポレーションして、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍのゲノムライブラリーを作製する。コロニーを、エポシロンクラスターのＮＲＰＳ領域からのプローブを使用してスクリーニングする。ポジティブクローンを、拾い上げ、そしてＤＮＡを、制限分析のために単離し、完全な遺伝子クラスターの存在を確認する。このポジティブクローンを、ｐＫＯＳ３５−１７８と称する。
【０２４９】
ｐＫＯＳ３５−１７８を導入するために使用され得る菌株を作製するために、ｄｅｖ遺伝子座に隣接するエポシロン遺伝子クラスターの上流および下流である相同性領域を含み、ｐＫＯＳ９０−２２およびｐＫＯＳ３５−１５４に類似するカナマイシン耐性ｇａｌＫカセットを含む、プラスミドｐＫＯＳ３５−１６４を構築する。このプラスミドを、ＤｒａＩで線状化し、そしてＫａｆｅｓｈｉら、１９９５、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５：４８３−４９４の方法に従って、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓにエレクトロポレーションしてＫ３５−１８３を作製する。エレクトロポレーションによってかまたはバクテリオファージＰ１での形質導入によって、プラスミドｐＫＯＳ３５−１７８を、Ｋ３５−１８３中に導入し得、そしてクロラムフェニコール耐性コロニーを選択する。あるいは、ｐＲＰ４からの接合移入（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ　ｔｒａｎｓｆｅｒ）の起源を含むｐＫＯＳ３５−１７８のバージョンを、Ｅ．ｃｏｌｉからＫ３５−１８３へのＤＮＡの移入のために構築し得る。このプラスミドを、ＲＰ４からのｏｒｉＴ領域およびｐＡＣＹＣ１８４からのテトラサイクリン耐性マーカーを含むトランスポゾンをまず構築して、次いで、ｐＫＯＳ３５−１７８にインビトロでかまたはインビボで転位する。このプラスミドを、Ｓ１７−１中に形質導入し、そしてＭ．ｘａｎｔｈｕｓに接合する。この菌株Ｋ３５−１９０を、１％ガラクトースの存在下で増殖させて、第２の組換え事象について選択する。この菌株は、全てのエポシロン遺伝子および全ての強力なプロモーターを含む。この菌株を発酵し、そしてエポシロンＡおよびＢの生成について試験した。
【０２５０】
あるいは、温度感受性プラスミドｐＭＡＫ７０５またはｐＫＯ３のいずれかを使用してｐＭＡＫ７０５またはｐＫＯ３のいずれかにトランスポゾンを転位し、ｔｅｔＲプラスミドおよびｃａｍＳプラスミドについて選択することによって、トランスポゾンを、ＢＡＣに組換え得る；Ｈａｍｉｌｔｏｎら、１９８９年９月、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７１（９）：４６１７−４６２２およびＬｉｎｋら、１９９７年１０月、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７９（２０）：６２２８−６２３７（これらの各々が本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、組換えを達成する。
【０２５１】
ｐＫＯＳ３５−１７８をｄｅｖ遺伝子座への組み込みに加えて、これをまた、ミクソファージ（ｍｙｘｏｐｈａｇｅ）Ｍｘ８またはＭｘ９から組み込み機能を使用してファージ接着部位へ組み込み得る。組み込み遺伝子、およびＭｘ８またはＭｘ９のいずれかからのａｔｔ部位をｐＡＣＹＣ１８４からのテトラサイクリン遺伝子とともに含む、トランスポゾンを構築する。このトランスポゾンの代替のバージョンは、接着部位のみを有し得る。このバージョンにおいて、次いで、組み込み遺伝子は、インテグラーゼ遺伝子を含むプラスミドとの同時エレクトロポレーションによってトランスで供給されるか、またはエレクトロポレーションされた菌株にて任意の構成的プロモーター（例えば、ｍｇｌプロモーター（Ｍａｇｒｉｎｉら、１９９９年７月、Ｊ．Ｂａｃｔ．１８１（１３）：４０６２−４０７０（本明細書中に参考として援用される））を参照のこと）から発現したインテグラーゼタンパク質を有することによって供給される。一旦、トランスポゾンが構築されると、これを、ｐＫＯＳ３５−１７８に転位してｐＫＯＳ３５−１９１を作製する。このプラスミドを、上記のようにＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ中に導入する。この菌株は、全てのエポシロン遺伝子および全ての強力なプロモーターを含む。この菌株を発酵して、そしてエポシロンＡおよびＢの生成について試験する。あるいは、ａｔｔ部位およびｏｒｉＴ領域を含む菌株は、ＢＡＣに転位され得、そして生じたＢＡＣは、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ中に接合され得る。
【０２５２】
一旦、エポシロン遺伝子がＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓの菌株に確立されたら、遺伝子クラスターの任意の部分の操作（例えば、プロモーターまたは交換（ｓｗａｐｐｉｎｇ）モジュールの変化）を、以下に記載されるように、カナマイシン耐性およびｇａｌＫカセットを使用して実施し得る。ｅｐｏ遺伝子を含むＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓの培養物を、多量の培地中で増殖させ、そしてエポシロンの生成について試験する。エポシロンの生成のレベル（特に、ＢまたはＤ）が低い場合、次いで、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ産生クローンを、以下の実施例に記載されるように、培地発生および変異ベースの菌株改善に供する。
【０２５３】
（実施例３）
（エポシロンの産生および精製のためのプロセス）
（Ａ．Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓにおけるエポシロンＤの異種性産生の最適化）
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓにおけるエポシロンＤの異種性産生を、吸着樹脂の組み込み、適切な炭素源の同定、およびフェッドバッチプロセス（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ　ｐｒｏｃｅｓｓ）の実行により、最初の力価の０．１６ｍｇ／Ｌから１４０倍に改善した。
【０２５４】
基底培地におけるエポシロンＤの分解を減少させるために、ＸＡＤ−１６（２０ｇ／Ｌ）を添加し、細胞外生成物を安定化させた。これはその回収を大いに容易にし、そして収率を３倍に増強した。細胞増殖および生成物形成のための炭素源としての油の使用もまた、評価した。種々の油のスクリーニングから、オレイン酸メチルが、最も大きな影響を有することを示した。バッチプロセスにおける最適濃度の７ｍＬ／Ｌにおいて、最大細胞密度は、０．４ｇ乾燥細胞重量（ＤＣＷ）／Ｌから２ｇＤＣＷ／Ｌに増加した。生成物の収率は、生成物培地における痕跡元素の存在に依存した。基底培地への痕跡元素の外因的な補給により、最高エポシロンＤ力価を８倍増強した。このことは、細胞の代謝およびエポシロン生合成において金属イオンが重要な役割を果たしていることを実証した。生成物の収率をさらに増加させるために、連続的なフェッドバッチプロセスを実施し、より高い細胞密度を促進し、そして延長した生成期間を維持した。最適化されたフェッドバッチ培養は、一貫して、７ｇＤＣＷ／Ｌの細胞密度および２３ｍｇ／Ｌの平均生成物力価を生じた。
【０２５５】
エポシロンは、ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍの種々の株により天然に産生される二次代謝物である（Ｇｅｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６；Ｇｅｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，２００１；この実施例において引用される参考文献はこの節の最後に列挙され、そして本明細書中で参考として援用される）。それらは、微小管解重合の強力なインヒビターであり、作用機構は、抗癌薬Ｔａｘｏｌ（Ｂｏｌｌａｇ　ｅｔ　ａｌ．，１９９５）と類似する。Ｐ糖タンパク質を発現する多剤耐性腫瘍細胞株に対するそれらの細胞障害性効果は、それらを大きな商業的価値を有する強力な治療化合物にする（Ｓｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７；Ｋｏｗａｌｓｋｉ　ｅｔ　ａｌ．，１９９７）。それらの水中での比較的高い溶解性もまた、臨床的評価のためのそれらの処方を容易にする。
【０２５６】
エポシロンＡおよびＢは、天然の宿主の主要な発酵産物である（Ｇｅｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，１９９６）。これらのポリケチド分子の大環状コアは、アセテート単位とプロピオネート単位との連続的な脱炭酸縮合により形成される（Ｇｅｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）。エポシロンＡおよびＢは、それらの炭素骨格のＣ−１２位での単一のメチル基が異なる。この構造の相違は、エポシロンＡのアセンブリにおけるアセテートの組み込み、およびエポシロンＢのアセンブリにおけるプロピオネートの組み込みに起因する。エポシロンＣおよびＤは、それぞれ、エポシロンＡおよびＢの生合成経路における中間体である（Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，２０００；Ｍｏｌｎａｒ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）。それらは、組み合わせた収率が約０．４ｍｇ／Ｌである、発酵プロセスの間の少数派の生成物として分泌される。予備的なインビボ研究は、エポシロンＤが４つの化合物の中で抗腫瘍薬として最も見込みがあることを明らかにし（Ｃｈｏｕ　ｅｔ　ａｌ．，１９９８）、この分子を大量に生成することが重要な目的である。
【０２５７】
エポシロン生合成を担う遺伝子クラスターは、配列決定され（Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，２０００；Ｍｏｌｎａｒ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）、そしてＳ．ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍに緊密に関連するが遺伝子操作の影響をより受けやすい微生物宿主であるＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓにおいてこれらの化合物を生成するために用いられる。エポシロンＤの生成を助長するために、この組換え株の欠損変異体（以下の実施例４に記載される）を構築し、それぞれエポシロンＣおよびＤからエポシロンＡおよびＢへの変換を触媒するＰ４５０エポキシダーゼを不活化した（Ｔａｎｇ　ｅｔ　ａｌ．，２０００）。この遺伝的な変更は、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ発酵の単独の生成物としてのエポシロンＣおよびＤの分泌を効果的に促進した（エポシロンＤ：エポシロンＣは４：１である）。得られた変異体は、所望の生成物の回収および精製において、天然の宿主を超える顕著な利点を提供する。この実施例において、培地組成および発酵ストラテジーの改善は、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓでのエポシロンＤの産生における１４０倍の増加を生じることが記載される。
【０２５８】
吸着樹脂は、少量で生成される生物学的に活性な分子の連続的な補足のために、ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉａの発酵において用いられる（ＲｅｉｃｈｅｎｂａｃｈおよびＨｏｆｌｅ，１９９３）。エポシロンＤの単離を容易にするために、疎水性樹脂ＸＡＤ−１６を培養培地に添加した。結合した生成物は、適切な溶媒を用いて樹脂から容易に溶出され得るので、その回収は非常に簡単であった。さらに、ＸＡＤ−１６の使用は、生成物の安定化を通じてエポシロン分解を最小化した。
【０２５９】
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓは、伝統的に、主にカゼインの酵素的加水分解産物（例えば、ペプトンおよびカシトン）からなる培地中で培養され、単独の炭素源および窒素源としてのアミノ酸に依存する（ＲｅｉｃｈｅｎｂａｃｈおよびＤｗｏｒｋｉｎ，１９９１）。その結果、アンモニアが、アミノ酸分解の結果として発酵ブロス中に蓄積される。Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｅｓ培養における３５〜４２ｍＭの細胞外アンモニア濃度は、細胞内での８０〜１４０ｍＭの驚くほど高いアンモニア濃度に対応することが、Ｇｅｒｔｈら（１９８６）により実証された。より重要なことは、インサイチュメンブレンプロセスを用いた過剰なアンモニアの８ｍＭ以下までの連続的な除去により、細胞質量および二次代謝産物の両方が劇的に増加することが示された（Ｈａｃｈｔ　ｅｔ　ａｌ．，１９９０）。高レベルのアンモニアの生成は、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓの増殖およびエポシロンＤ産生に阻害的であると推測されるので、アミノ酸の消費を減少させるための代替の炭素源が望ましい。
【０２６０】
適応プロセスが必要とされたけれども、オレイン酸メチルをＭ．ｘａｎｔｈｕｓにより代謝され得る基質として異なる油の広範囲のスクリーニングから同定した。増殖培地に外因性痕跡元素溶液を添加し、エポシロンＤ産生を８倍に増加した（単一のバッチ発酵における収率は３．３ｍｇ／Ｌ）。このプロセスをさらに最適化するために、カシトンおよびオレイン酸メチルの断続的または連続的補給を用いるフェッドバッチアプローチを適合し、細胞の産生フェーズを延長させた。２つの異なる栄養補給ストラテジーを用いて獲得された結果の比較を、この実施例で報告する。
【０２６１】
（材料および方法）
（接種材料の調製）
オレイン酸メチルを含まない培養培地でのエポシロンＤの生成のために、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール中の１ｍＬのＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−４０．１の凍結細胞を５０ｍＬガラス培養チューブ中の１０ｇ／Ｌカシトン（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／Ｌ酵母エキス（Ｄｉｄｃｏ）、１ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）からなる３ｍＬのＣＹＥ培地に接種した。ＨＥＰＥＳ緩衝溶液を、水酸化カリウムを用いてｐＨ７．６に滴定した。この細胞を、ロータリーシェーカー上で３０℃および１７５ｒｐｍで３日間インキュベートした。次いでそれらを、５０ｍＬのＣＹＥ培地を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移し、そして同一の条件下で２日間増殖させた。得られた種培養を用いて、５％（ｖ／ｖ）の接種サイズで５０ｍＬ生成物フラスコに接種した。
【０２６２】
オレイン酸メイルを含む培地中でのＭ．ｘａｎｔｈｕｓの培養のために、細胞が油の存在下で増殖するように適合させる必要があった。１つの凍結細胞の種バイアルを、３μＬのオレイン酸メチル（Ｅｍｅｒｅｓｔ　２３０１）（Ｃｏｇｎｉｓ　Ｃｏｒｐ）を補充した３ｍＬのＣＹＥ培地に接種した。この細胞を３０℃および１７５ｒｐｍにて２〜６日間ガラス培養中で、培養物が顕微鏡下で十分な密度になるまで増殖させた。次いでそれらを、１０ｇ／Ｌカシトン（Ｄｉｆｃｏ）、５ｇ／Ｌ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ）、１ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｍＬ／Ｌオレイン酸メチル、および５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）からなる５０ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭ培地を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移した。増殖の２日後、細胞を、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール中の１ｍＬアリコートとして−８０℃で凍結および保存した。
【０２６３】
オレイン酸メチルを含む培地中でのエポシロンＤの生成のために、１ｍＬの凍結油適合細胞を、ガラス培養チューブ中の３ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭ培地に接種した。この細胞を３０℃および１７５ｒｐｍで２日間インキュベートし、そして５０ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭ培地を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移動した。得られた種培養を同一の条件下で２日間増殖させ、そして５０ｍＬ生成物フラスコに５％（ｖ／ｖ）の接種サイズで接種するために用いた。
【０２６４】
５Ｌ発酵のための接種材料を調製することにおいて、２５ｍＬの油適合種培養物を、４７５ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭ培地を含む２．８Ｌフェルバッハフラスコに移した。この細胞を３０℃および１７５ｒｐｍで２日間増殖させた。続いて、２５０ｍＬのこの二次種培養物を４．７５Ｌの生成物培地を含む５Ｌ発酵槽に接種し、５％（ｖ／ｖ）の最終接種濃度にした。
【０２６５】
（振とうフラスコ生成）
オレイン酸メチルの非存在下でのＭ．ｘａｎｔｈｕｓ　Ｋ１１１−４０−１のバッチ培養を、以下のように調製した。１ｇのＸＡＤ−１６樹脂（ＲｏｈｍおよびＨａａｓ）を、５ｍＬの脱イオン水を加えた２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中で１２１℃にて３０分間オートクレーブした。次いで、過剰な水をフラスコから除去し、そして５ｇ／Ｌカシトン、２ｇ／Ｌ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、および５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）からなる５０ｍＬのＣＴＳ培地を添加した。生成培地の存在下での吸着樹脂のオートクレーブは、細胞に必要とされる必須栄養素の結合を導くので、樹脂および培地成分を別々に滅菌した。生成物フラスコを２．５ｍＬの種培養を用いて接種し、そして３０℃および１７５ｒｐｍで６日間インキュベートした。
【０２６６】
オレイン酸メチルの存在下でのバッチ培養を上述のようにして調製した。さらに、生成物培地に７ｍＬ／Ｌのオレイン酸メチルおよび４ｍＬ／Ｌの濾過滅菌痕跡元素溶液（１０ｍＬ／Ｌ　濃縮Ｈ２ＳＯ４、１４．６ｇ／Ｌ　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２０ｇ／Ｌ　ＺｎＣｌ３、１．０ｇ／Ｌ　ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．４３ｇ／Ｌ　ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３１ｇ／Ｌ　Ｈ３ＢＯ３、０．２４ｇ／Ｌ　ＣａＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、および０．２４ｇ／Ｌ　Ｎａ２ＭＯ４・２Ｈ２Ｏから構成される）を補充した。次いで、生成物フラスコを２．５ｍＬの油適合種培養で接種し、そして３０℃および１７５ｒｐｍで５日間増殖させた。
【０２６７】
カシトンおよびオレイン酸メチルを断続的に供給するフェッドバッチ培養物を以下のように調製した。１ｇのＸＡＤ−１６樹脂を、５ｍＬの脱イオン水を含む２５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中で１２１℃にて３０分間オートクレーブした。滅菌後、過剰な水をフラスコから除去し、２ｍＬ／Ｌオレイン酸メチル、４ｍＬ／Ｌ痕跡元素溶液、および５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）を補充した５０ｍＬのＣＴＳ培地を加えた。生成物フラスコを２．５ｍＬの油適合種培養で接種し、そして３０℃および１７５ｒｐｍでインキュベートした。接種の２日後、２ｇ／Ｌのカシトンおよび３ｍＬ／Ｌのオレイン酸メチルを、２４時間間隔で培養培地に加えた。カシトン供給物を濃縮した１００ｇ／Ｌ溶液として調製した。この培養物を１０〜１２日間、実質的な細胞溶解物を獲得するまで培養させた。
【０２６８】
全ての生成物培養物は、同一の増殖条件下で２．８Ｌフェルンバッハフラスコ中で５００ｍＬスケールにて増殖され得る。
【０２６９】
（発酵槽生成）
断続的にかまたは連続的にカシトンおよびオレイン酸メチルを供給する５Ｌスケールのフェッドバッチ発酵を、以下のように調製した。２０ｇ／ＬのＸＡＤ−１６および２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを、４．７５Ｌの脱イオン水を含む５Ｌ発酵槽（Ｂ．Ｂｒａｕｎ）中で１２１℃にて３０分間オートクレーブした。滅菌後、濃縮カシトン溶液（１５０ｇ／Ｌ）、オレイン酸メチル、および痕跡元素をバイオリアクターに無菌的に加え、それぞれ５ｇ／Ｌ、２ｍＬ／Ｌ、および４ｍＬ／Ｌの最終カシトン、オレイン酸メチル、および痕跡元素濃度を得た。次いで、培地を２５０ｍＬの油適合種培養で接種した。０．４〜０．５ｖ／ｖ／ｍの給気速度および４００ｒｐｍの初期攪拌速度で３０℃にて発酵を行った。４００〜７００ｒｐｍの間の攪拌カスケードにより、溶解酸素を５０％飽和で制御した。２．５Ｎ　ＫＯＨおよび２．５Ｍ　Ｈ２ＳＯ４の自動添加により培養ｐＨを７．４に維持した。接種の２４時間後、カシトン（１５０ｇ／Ｌ）およびオレイン酸メチルを、２ｇ／Ｌ／日（カシトン）および３ｍＬ／Ｌ／日（オレイン酸メチル）の供給速度で生成物培地に添加した。この供給を、２４ｈ毎の単一のボーラスとしてか、または蠕動ポンプ（Ｗ．Ｍａｒｌｏｗ）で連続的にかのいずれかで送達した。細胞を１０〜１２日間、有意な細胞溶解物が見られるまで増殖させた。
【０２７０】
（エポシロン定量）
発酵におけるＸＡＤ−１６樹脂の使用前に、１ｍＬの培養ブロスを生成物フラスコまたはバイオリアクターからサンプル採取し、そして１３，０００ｇにて１０分間遠心分離した。上清中のエポシロン生成物の定量をＨｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　１０９０　ＨＰＬＣを用いて２５０ｎｍでのＵＶ検出で実施した。５００μＬの上清を４．６×１０ｍｍガードカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、ＯＤＳ−３、５μｍ）に対して注入した。次いで、１ｍＬ／分の流速でオンライン抽出を実施し、１００％水で０．５分間洗浄し、続いて１．５分間にわたり５０％アセトニトリルまでの勾配により洗浄した。溶出液を最初の２分間を廃棄液に流し、その後、より長い分離カラム（４．６×１５０ｍｍ、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、ＯＤＳ−３、５μｍ）を通過させた。エポシロンＣおよびＤの分離を、８分間にわたる５０％から１００％アセトニトリルの勾配、それに続く３分間の１００％アセトニトリルによる洗浄により実施した。これらの条件下で、エポシロンＣは、９．４分で溶出し、そしてエポシロンＤは９．８分で溶出した。
【０２７１】
ＸＡＤ−１６樹脂の使用により、５〜５０ｍＬの十分に混合された培養ブロスおよび樹脂を、生成物フラスコまたはバイオリアクターからサンプル採取した。樹脂を重力により定着させた後、培養ブロスをデカントした。５〜５０ｍＬの水を用いて樹脂を洗浄し、そして再度重力により定着させた。この水性混合物を完全に取り除き、そしてエポシロン生成物を１００％メタノールを用いて樹脂から抽出した。用いた溶媒の量は、５０％のサンプル容量と等量であった。エポシロンＣおよびＤの定量を、ＨＰＬＣ分析により２５０ｎｍでのＵＶ検出で実施した。５０μＬのメタノール抽出物を２つの４．６×１０ｍｍガードカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、ＯＤＳ−３、５μｍ）およびより長い４．６×１５０ｍｍカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、ＯＤＳ−３、５μｍ）に対して注入した。アッセイ方法は、平等にし（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）、６０％アセトニトリルおよび４０％水を用いて流速１ｍＬ／分にて１８分間溶出した。これらの条件下で、エポシロンＣを１０．３分にて検出し、そしてエポシロンＤを１３．０分にて検出した。標準を、精製エポシロンＤを用いて調製した。
【０２７２】
（細胞増殖決定）
オレイン酸メチルの非存在下での細胞増殖を、光学密度（ＯＤ）を６００ｎｍにて測定することによりモニターした。サンプルを、最終ＯＤ値が０．４未満になるまで水で希釈した。培養培地へのオレイン酸メチルの添加は、６００ｎｍでの強い吸収を有するエマルジョンの形成を生じるので、オレイン酸メチルの存在下での細胞増殖を、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）により決定した。４０ｍＬの培養ブロスを予め重量測定した試験管中で４２００ｇにて２０分間遠心分離した。次いで、ペレットを４０ｍＬの水を用いて洗浄し、重量測定前に８０℃にて２日間乾燥させた。
【０２７３】
（アンモニア決定）
１ｍＬの発酵ブロスを、１３，０００ｇでの５分間の遠心分離により明澄化した。次いで、上清を、アンモニアアッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を用いたアンモニア分析のために使用した。サンプルを、最終濃度が８８０μＭ未満になるまで２０〜１００倍希釈した。
【０２７４】
（オレイン酸メチル決定）
１ｍＬの発酵ブロス中に残存するオレイン酸メチルを、５ｍＬのアセトニトリルを用いて抽出した。この混合物をボルテックスし、そして４２００ｇでの２０分間の遠心分離により明澄化した。オレイン酸メチルの定量を、ＨＰＬＣ分析により２１０ｎｍでのＵＶ検出で実施した。５０μＬの上清を、２つの４．６×１０ｍｍガードカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、ＯＤＳ−３、５μｍ）およびより長い４．６×１５０ｍｍカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、ＯＤＳ−３、５μｍ）に対して注入した。このカラムをアセトニトリル−水（１：１）を用いて流速１ｍＬ／分にて２分間洗浄した。次いで、２４分間にわたる５０％〜１００％アセトニトリルの勾配、それに続く５分間の１００％アセトニトリル洗浄により溶出した。市販のオレイン酸メチルの炭素鎖長の異種性が理由で、この化合物を２５．３分と２７．１分にて検出された２つの主要ピークとして溶出した。ＸＡＤ−１６樹脂に結合したオレイン酸メチルを、同じＨＰＬＣ法を用いたメタノール抽出から定量した。オレイン酸メチルの標準を８３．３％アセトニトリル中で調製した。細胞によるオレイン酸メチルの消費を以下のようにして算出した：（添加した総オレイン酸メチル）−（培地中に残存するオレイン酸メチル）−（樹脂に結合したオレイン酸メチル）。
【０２７５】
（結果）
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−４０−１を、５ｇ／Ｌカシトン（膵臓カゼイン消化物）および２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウムのみからなる単純生成物培地を用いるバッチ発酵プロセスにおいて初期培養した。細胞の基準性能を図６に示す。
【０２７６】
最大細胞密度およびエポシロンＤ産生を１．６のＯＤ６００および０．１６ｍｇ／Ｌの対応する力価での接種の３日間後に得た。細胞密度および生成物収率の両方は、その後実質的に減少した。細胞によるカシトンの消費により、アンモニウムの漸増的な蓄積もまた、生成物培地において検出した。最終アンモニア濃度は、５日間の発酵の最後で２０ｍＭに達した。
【０２７７】
（生成物の安定性に対するＸＡＤ−１６の効果）
エポシロンＤの急激な分解を防止するために、疎水性吸着樹脂ＸＡＤ−１６を生成物培地に添加し、分泌された生成物を結合および安定化させた。ＸＡＤ−１６は、微生物プロデューサーＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ　Ｓｏ　ｃｅ９０の発酵からエポシロンＡおよびＢを単離することについて、Ｇｅｒｔｈら（１９９６）により以前に使用された多芳香族樹脂である。図７に示されるように、吸着樹脂の存在は、細胞の増殖に影響しなかった。しかし、それは、発酵ブロス中のエポシロンＤの損失を効果的に減少させ、この生成物の回収における３倍の増強を導いた。
【０２７８】
（培地開発）
より高い細胞密度およびエポシロン産生を支持し得る培地を開発する試みにおいて、増殖および生成物の収率に対するカシトンの影響を、生成物培地中でのその濃度を１ｇ／Ｌから４０ｇ／Ｌに変化させることにより評価した。細胞増殖は漸増濃度のカシトンにより刺激されたが、細胞の特異的な生産能は、図８に示されるように有意に減少した。エポシロンＤ生成のための最適なカシトン濃度は、５ｇ／Ｌに達し、より高い濃度が低い力価を生じた。
【０２７９】
培地の改善はカシトンの使用で限定されたので、代替の基質を基底生成物培地への補給物質として評価した。表３に要約されるように、異なる油の詳細なスクリーニングから、オレイン酸メチルを、エポシロンＤ産生において最も大きな増加を促進する炭素源として同定した。
【０２８０】
【表３】
2004508810.tif 000031
しかし、生成物培地へのオレイン酸メチルの直接添加は、成熟前の細胞溶解を引き起こした。従って、種培養を、生成物発酵の前にオレイン酸メチルの存在下で増殖させた。興味深いことに、この適合プロセスによって、細胞は、溶解に対して感受性をより小さくした。表４に示されるように（バッチ発酵におけるＣＴＳ培地の基礎性能と比較した増殖および生成における改善）、７ｍＬ／Ｌのオレイン酸メチル濃度および４ｍＬ／Ｌの痕跡元素濃度を用いて、２．１ｇ／Ｌのピークバイオマス濃度および３．３ｍｇ／ＬのエポシロンＤ力価を達成した。
【０２８１】
【表４】
2004508810.tif 000032
さらなる力価の改善は、図９に示されるようにオレイン酸メチルのより高い濃度では観察されなかった。
【０２８２】
細胞増殖および産生に対するオレイン酸メチルの重要性を実証することに加えて、上のグラフはまた、産生培地におけるトレースエレメントの重要性を強調する。カシトン（ｃａｓｉｔｏｎｅ）によって補充された栄養素は、活発な細胞増殖に十分ではあり得ず、微量金属の外部からの添加を、オレイン酸メチルを含む結合体中心に添加した。驚くべきことに、この補充は、増殖および産生の両方を増強するために必須であることが見出された。微量金属の添加がない場合には、最大バイオマス濃度およびエポシロンＤ力価は、それぞれ１．２ｇ／Ｌおよび０．１２ｍｇ／Ｌのみであった。この低い力価は、基礎培地を用いて得られた力価に匹敵した。
【０２８３】
（フェッドバッチの開発）
バッチ発酵プロセスに、最適な濃度のオレイン酸メチルおよびトレースエレメントが存在する場合、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ菌株の対数増殖は、接種後の最初の２日間で起こった。エポシロンＤの生成は、定常期の開始時に始まり、そして５日目のオレイン酸メチルの枯渇とともに細胞溶解が起こったときに停止した（図１０Ａおよび１０Ｂに示される）。オレイン酸メチルの消費およびアンモニア生成についての時間過程がまた示される。産生培地におけるアンモニアの濃度は、発酵の全過程にわたって４ｍＭより少なかった。
【０２８４】
フラスコ培養における細胞産生期間を延長するために、カシトンおよびオレイン酸メチルをそれぞれ２ｇ／Ｌ／日および３ｍＬ／Ｌ／日の割合で１日１回培地に添加した。基質フィードを接種４８時間後に開始し、その後３日間、細胞は対数的に増殖した。図１１Ａに示されるように、バイオマス濃度は、５日目にプラトーになり始め、１０日目に最大６．３ｇ／Ｌでプラトーに達した。また、エポシロンＤの産生は、定常増殖期と一致し、そして９．８ｍｇ／Ｌの最終収率は、１２日目の終わりに達成された。図１１Ｂに示されるように、オレイン酸メチルの消費およびアンモニアの生成の両方が、発酵の全過程にわたって一定の割合で増加した。
【０２８５】
オレイン酸メチルは、オレイン酸メチルがバイオリアクターにフィードされるのと同じ速度で消費され、そして３．２ｍＭ／日の速度でアンモニアが蓄積された。カシトンまたはオレイン酸メチルのより低速でのフィードは、エポチロンＤ力価を非常に減少させるが、より高速でのフィードは、有意な産生が達成される前に成熟前細胞溶解を引き起こした。
【０２８６】
大きなスケールでのフェッドバッチプロセスの効率を試験するために、カシトンおよびオレイン酸メチルを２４時間間隔で断続的に、５Ｌのバイオリアクター中の発酵物に添加した。図１２に示されるように、生じた生成物曲線は、フラスコ培養についての生成物曲線と密接に類似した。基質フィードを接種２４時間後に開始し、エポシロンの生成は、４日目に始まった。９．２ｍｇ／Ｌの最高エポシロンＤ力価は、接種後１０日目に得られた。
【０２８７】
より正確なフィーディングストラテジーの増殖および産生に対する影響を評価するために、二重のフィードをバイオリアクターに連続的に送達した。図１３Ａに示されるように、連続的なフィードの実行は、細胞増殖に影響しなかったが、その生産性がほぼ３倍まで増加した。最終エポシロンＤ力価である２７ｍｇ／Ｌは、接種後１０日目に達成された。図１３Ｂに示されるように、オレイン酸メチルは、産生培地に添加されるのと同じ速度で消費され、そしてアンモニアは、全発酵過程にわたって、一定の速度６．４ｍＭ／日で放出された。
【０２８８】
（議論）
エポシロンＤの化学的合成が、近年達せられたが（Ｈａｒｒｉｓら、１９９９；Ｍｅｎｇら、１９９８；Ｓｈｉｎｈａら、１９９８）、２０工程の複雑なプロセスは、化合物の大きなスケールでの製造のために経済的に実行可能な方法ではない。Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ菌株の初期エポシロンＤに対する生産収率は、０．１６ｍｇ／Ｌであったが、本発明の改善された発酵プロセスは、産生レベルを２３ｍｇ／Ｌまで実質的に増加した。
【０２８９】
より高いエポシロンＤ力価を達成することに対する主な障害の１つは、発酵ブロス中の産物の迅速な分解であった。この問題は、培養培地に吸着樹脂を組込むことで軽減された。ＸＡＤ−１６の添加は、細胞増殖には影響しなかったが、分泌された産物の損失を最小にし、そしてその回収率を３倍まで増加した。
【０２９０】
生産収率を高めることに対する別の障害は、カシトンを主な炭素源および窒素源として使用することで力価における改善が制限されていることである。Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ菌株の増殖は、カシトン濃度の増加にともなって刺激されたが、５ｇ／Ｌを超える濃度は、力価における劇的な減少を引き起こした。ペプトンまたはカシトンの高濃度での二次代謝産物のこの阻害効果は、いくつかの他のミコバクテリア発酵において以前に実証されており、そしてこのことは、培養培地中にアンモニアが蓄積することに起因している。
【０２９１】
Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓは、多糖および糖を代謝し得ない（ＲｅｉｃｈｅｎｂａｃｈおよびＤｗｏｒｋｉｎ、１９９１）ので、油を炭素源として利用するためにその能力を調査した。油は、魅力的な炭素基質である。なぜなら、脂肪酸の酸化は、細胞のためのエネルギー源として役立ち得るだけでなく、分解産物としてのアセチルＣｏ−Ａの発酵は、エポシロン生合成のための前駆体を提供し得る。Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ　ｅｒｙｔｈｒａｅａ発酵、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｄｉａｅ発酵、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ発酵への油の添加は、ポリケチド分子（例えば、それぞれ、エリスロマイシン、チロシン、および免疫調製物質（ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｎｔ）Ｌ−６８３５９０）の産生を高めることが示されている（Ｍｉｒｊａｌｉｌｉら、１９９９；Ｃｈｏｉら、１９９８；Ｊｕｎｋｅｒら、１９９８）。
【０２９２】
異なる油のスクリーニングから、オレイン酸メチルが、細胞増殖およびエポシロンＤ産生を促進する優れた候補物質として同定された。しかし、これらの改善は、産生培地へ微量金属を同時に添加した場合にのみ観察された。７ｍＬ／Ｌでのオレイン酸メチル単独での添加は、最大細胞濃度を０．４ｇ　ＤＣＷ／Ｌから１．２ｇ　ＤＣＷ／Ｌまで増加したが、産生物はベースラインレベルのままであった。４ｍＬ／Ｌのトレースエレメントを外部から補充すると、最高バイオマス濃度は、２．１ｇ　ＤＣＷ／Ｌまで増加し、そしてエポシロンＤ力価は、０．４５ｍｇ／Ｌから３．３ｍｇ／Ｌまで促進された。これらの知見は、カシトンにおける栄養成分の欠乏がＭ．ｘａｎｔｈｕｓの増殖およびエポシロンの形成に重要であり得ることを示す。
【０２９３】
バッチプロセスのための、オレイン酸メチルおよびトレースエレメントの最適濃度を確立する努力が、活発な細胞増殖を維持し、そして産生期を延長するためのフィーディングストラテジーを開発するためになされた。断続的なおよび連続的なカシトンおよびオレイン酸メチルの一定の速度でのフィードが評価され、そして両方法は、増殖プロフィールにおいて類似の改善を生じた。２つの基質の最適フィードを用いて、約６．８ｇ　ＤＣＷ／Ｌの最大細胞濃度が得られた。両方の場合において、オレイン酸メチルは、オレイン酸メチルが発酵培地に添加されるにつれて消費された。
【０２９４】
細胞増殖およびオレイン酸メチルの消費とは対照的に、エポシロン産生およびアンモニア生成は、フィーディングストラテジーの選択によって大きく影響された。連続フェッドバッチ培養において、最大エポシロンＤ力価である、２３ｍｇ／Ｌが得られた。これは、断続的なフェッドバッチ培養で得られた力価のほぼ２．５倍であった。連続的なフィードでは、細胞によって放出されたアンモニアの速度もまた、２倍高かった。このことは、より高いカシトン消費速度を示唆している。これらの結果は共に、低い力価が、断続的なフェッドバッチプロセスに関連し、アンモニアの蓄積ではなく、異化産物制御によって引き起こされ得ることを示す。さらに、これらは、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ菌株の生産性が、培養培地中に存在する基質の量に対して感受性であり、そして基質制限条件下で最大であり得ることを示唆する。このことはまた、産生培地中のカシトン濃度の増加が、高い細胞濃度を生じるが、低い力価であるという観察と一致する。
【０２９５】
基礎培地でのバッチ培養と比較して、連続フェッドバッチ培養は、細胞濃度において１７倍の増加、そして力価において１４０倍の増加を生じた。このプロセスは、５Ｌ〜１０００Ｌのスケールであり、そして同等に行われることが示された。製造スケールでエポシロンＤを生産するために示されたこの結果は、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓが、ｍｙｘｏｂａｃｔｅｒｉａ由来の他の生物学的に活性な分子の産生のための宿主として使用され得ることを実証した。
【０２９６】
（参考文献）
【０２９７】
【化３１】
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2004508810.tif 000034
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（Ｂ．エポシロンＢの産生）
（フラスコ）
１ｍＬのバイアルのＫ１１１−３２−２５菌株を解凍し、内容物をガラス試験管中のＣＹＥシード培地３ｍＬに移す。この培地を３０℃で７２±１２時間インキュベートし、続いて２５０ｍＬの回り止めされたエルレンマイアーフラスコ（ｂｕｆｆｌｅｄ　Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ　ｆｌａｓｋ）内のＣＹＥ培地５０ｍＬ中でこの試験管の培養物３ｍＬを継代培養する。このＣＹＥフラスコを３０℃で２４±８時間インキュベートし、このシードの２．５ｍＬ（５％　ｖ／ｖ）を使用してエポシロン産生フラスコ（２５０ｍＬの回り止めされたエルレンマイアーフラスコ中のＣＴＳ−ＴＡ培地５０ｍＬ）に接種した。次いでこれらのフラスコを、３０℃で４８±１２時間、開始時のｐＨ７．４の培地と共にインキュベートする。
【０２９８】
（発酵槽）
上記と同様のＫ１１１−３２−２５の接種物の拡大して、５０ｍＬのＣＹＥシードのうち２５ｍＬを５００ｍＬのＣＹＥへ継代培養するさらなる工程とともに使用する。この第二のシードを使用して、１０Ｌの発酵槽（９．５ＬのＣＴＳ−ＴＡ、および１ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウムを含む）に接種する。この発酵についてのプロセスパラメーター設定は以下である：ｐＨ−７．４；攪拌−４００ｒｐｍ；スパージ速度−０．１５ｖｖｍ。これらのパラメーターは、８０％飽和を超えるＤＯを維持するのに十分であった。ｐＨコントロールを、２．５Ｎの硫酸および２．５Ｎの水酸化ナトリウムを培養物に添加することによって提供した。最高エポシロン力価が４８±８時間で達成される。
【０２９９】
（Ｃ．エポシロンＤの産生）
（フラスコ）
Ｋ１１１−４０−１菌株（実施例４に記載される）の１ｍＬバイアルを解凍し、その内容物をガラス試験管中のＣＹＥシード倍地の３ｍＬに移す。この培養物を３０℃で７２±１２時間インキュベートし、続いてこの試験管の培養物の３ｍＬを２５０ｍＬの回り止めしたエルレンマイヤーフラスコ内の５０ｍＬのＣＹＥ培地に継代培養する。このＣＹＥフラスコを３０℃で２４±８時間インキュベートし、このシードの２．５ｍＬ（５％ｖ／ｖ）を使用してエポシロン産生フラスコに接種する（２５０ｍＬの回り止めしたエルレンマイヤーフラスコ中の５０ｍＬの１×小麦グルテン培地）。次いで、これらのフラスコを、開始時のｐＨ７．４の培地と共に３０℃で４８±１２時間インキュベートする。
【０３００】
（発酵槽）
上記と同様のＫ１１１−４０−１の接種物の拡大して、５０ｍＬのＣＹＥシードのうち２５ｍＬを５００ｍＬのＣＹＥへ継代培養するさらなる工程に使用する。この第二のシード２５０ｍＬを使用して、５Ｌの発酵槽（４．５ＬのＣＴＳ−ＴＡ、および１ｇ／Ｌのピルビン酸ナトリウム（毎日フィードする）を含む）に接種する。この発酵についてのプロセスパラメーター設定は以下である：ｐＨ−７．４；攪拌−４００ｒｐｍ；スパージ速度−０．１５ｖｖｍ。これらのパラメーターは、８０％飽和を超えるＤＯを維持するのに十分であった。ｐＨコントロールを、２．５Ｎの硫酸および２．５Ｎの水酸化ナトリウムを培養物に添加することによって提供した。最高エポシロン力価が３６±８時間で達成される。最高エポシロンＣ力価は、０．５ｍｇ／Ｌであり、そして最高エポシロンＤ力価は、１．６ｍｇ／Ｌである。
【０３０１】
表５は、使用された培地およびそれぞれの成分の要約である。
【０３０２】
【表５】
2004508810.tif 000036
ＣＹＥシード培地およびＣＴＳ−ＴＡ産生培地を、１２１℃で３０分間の自動滅菌オートクレーブ（ａｕｔｏＳｔｅｒｉｌｉｚｅｄ　ａｕｔｏｃｌａｖｉｎｇ）によって滅菌する。次いで、小麦グルテン産生培地を１２１℃で４５分間オートクレーブすることによって滅菌する。
【０３０３】
（Ｄ．Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓからのエポシロンＣおよびＤの産生）
１つの局面において、本発明は、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ菌株（Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ　Ｋ１１１−４０−１が挙げられるが、これらに限定されない）のための改善された発酵プロセスを提供する。このプロセスにおいて、発酵培地は、アンモニアの生成なしに利用され得る炭素源を提供する。１つの好ましい実施形態において、炭素源は油（例えば、オレイン酸メチル、または類似の油）である。種々のフィード速度での振盪フラスコ試験において、これらの方法は、以下に記載のように１５〜２５ｍｇ／Ｌの範囲のレベルで、エポシロンＣおよびＤ（主には、エポシロンＤ）の産生を生じた。
【０３０４】
（シード培養）
２ｍＬ／Ｌのオレイン酸メチルを含むＣＹＥ培地５０ｍＬ中で増殖させ、凍結した１ｍＬバイアル中のＭ．ｘａｎｔｈｕｓ　Ｋ１１１−４０−１細胞を使用して、滅菌ガラス試験管中の１ｍＬ／Ｌのオレイン酸メチルを含む新しいＣＹＥ培地の３ｍＬに接種した。この試験管を３０℃で２４時間、２５０ＲＰＭの振盪にて、インキュベートした。次いで、この試験管中の培養物を、２ｍＬ／Ｌのオレイン酸メチルを含む新しいＣＹＥ培地５０ｍＬを含む回り止めしていない２５０ｍＬのフラスコに移した。このフラスコを、３０℃で、４８時間、２５０ＲＰＭの振盪にて、インキュベートした。
【０３０５】
（産生フラスコ）
１ｇのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＸＡＤ−１６を、２５０ｍＬの回り止めしていないフラスコ中で、１２１℃、３０分間オートクレーブすることによって滅菌した。次いで、５０ｍＬの滅菌産生培地をフラスコに加えた。このフラスコをシード培養物の５％（ｖ／ｖ）で接種し、これを２５０ＲＰＭおよび３０℃で作動するインキュベーター振盪器に設置した。滅菌オレイン酸メチルの３ｍＬ／Ｌ／日のフィードを、接種後２日目に開始し、そしてカシトンの２ｇ／Ｌ／日のフィードを接種後１日目に開始した。
【０３０６】
（産物の抽出）
１４日後に、産生フラスコ中のＸＡＤ樹脂を５０ｍＬの遠心管に移した。この遠心管中の過剰の培地を、樹脂のいずれも除去されないようにデカントした。次いで、ＸＡＤ樹脂を、２５ｍＬの水で洗浄し、静置した。この遠心管中の水を、樹脂のいずれも除去されないようにデカントし、この遠心管に２０ｍＬのメタノールを加えた。遠心管を、１７５ＲＰＭ、２０〜３０分間の振盪器に設置し、樹脂からエポシロン産物を抽出した。メタノール抽出物を、貯蔵およびＬＣ／ＭＳ分析のために新しい遠心管に移した。
【０３０７】
表６は、使用された培地およびそのそれぞれの成分の要約である。
【０３０８】
【表６】
2004508810.tif 000037
ＣＹＥ培地および産生培地を自動滅菌オートクレーブによって、１２１℃、３０分間滅菌する。トレースエレメント溶液は、濾過滅菌し；オレイン酸メチルは、別にオートクレーブする。
【０３０９】
トレースエレメント溶液を、表７の成分全てと合わせることによって作製し、この溶液に１０ｍＬ／Ｌの濃硫酸を加え、最終容量１Ｌにする。
【０３１０】
【表７】
2004508810.tif 000038
生じた溶液を濾過滅菌する。
【０３１１】
（Ｅ．Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓからのエポシロンの発酵、産生、および精製）
（Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ菌株の詳細）
菌株Ｋ１１１−２５−１は、エポシロンＢ産生菌株であり、これはまた、エポシロンＡも産生する。菌株Ｋ１１１−４０−１はエポシロンＤ産生菌株であり、これはまた、エポシロンＣも産生する。
【０３１２】
（プレート上でのＭ．ｘａｎｔｈｕｓの維持）
Ｍ．ｘａｎｔｕｓ菌株をＣＹＥ寒天プレートで維持する（プレート組成物については表８を参照のこと）。コロニーは、プレートに画線接種した後、約３日で現れる。プレートを、３２℃で所望の増殖レベルまでインキュベートし、次いで、３週間まで室温で貯蔵する（プレート上４℃での保存は、細胞を死滅させる）。
【０３１３】
（表８）
【０３１４】
【表８】
2004508810.tif 000039
＊１Ｌ寒天培地バッチを４５分間オートクレーブし、次いで、ペトリ皿中に注いだ。
【０３１５】
（細胞バンクについてのＭ．ｘａｎｔｈｕｓの油順応）
３ｍＬのＣＹＥシード培地および１滴のオレイン酸メチルを入れた、５０ｍＬのガラス培養チューブ内に、ＣＹＥプレートまたは細胞の凍結バイアルから、油に順応しないコロニーを１００μＬピペットで移す。顕微鏡下で培養物が高密度に見えるまで細胞を２〜６日間増殖させる（３０℃、１７５ｒｐｍ）。これらの細胞は、常に油によく順応するわけでないため、並行していくつか（５〜７）の試験管ではじめる。
【０３１６】
（細胞バンク手順（マスター細胞バンク））
上記のように、油順応性試験管培養を開始する。試験管培養物が十分に高密度（ＯＤ＝５＋／−１）である場合、この試験管の内容物全体を、５０ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭシード培地の入った滅菌した２５０ｍＬ振盪フラスコに移す（培地の組成について以下の表を参照のこと）。振盪インキュベータ中（３０℃、１７５ｒｐｍ）において、４８±１２時間の増殖の後、このシード培養物の５ｍＬを１００ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭの入った５００ｍＬ振盪フラスコ中に移す。この培養物を振盪インキュベータ中（３０℃、１７５ｒｐｍ）において、丸１日増殖させる。適切な増殖および混入のないことについて、培養物を顕微鏡で確認する。
【０３１７】
８０ｍＬのこのシード培養培養物と２４ｍＬの９０％滅菌グリセロールを滅菌した２５０ｍＬ振盪フラスコ中で合わせる。よく混合するよう旋回させ、１００個の滅菌した予め標識したクリオバイアルに、１ｍＬのこの混合物を等分する。これらを−８０℃フリーザー中において、バイアルをゆっくり凍結する。
【０３１８】
（細胞バンク手順（実用的（ｗｏｒｋｉｎｇ）細胞バンク））
上記のように作製されたマスター細胞バンクバイアルの１つを室温で解凍することによって、試験管培養を開始し、次いで、この内容物全部を３ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭシード培地の入ったガラス試験管に入れる。この試験管培養物が十分に高密度（ＯＤ＝５＋／−１）である場合、この試験管の内容物全部を５０ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭシード培地の入った２５０ｍＬ滅菌振盪フラスコに移す。４８±１２時間の増殖（３０℃、１７５ｒｐｍ）の後、このシード培養物の５ｍＬを１００ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭの入った５００ｍＬ振盪フラスコ中に移す。この培養物を、丸１日増殖させる（３０℃、１７５ｒｐｍ）。増殖および混入について、顕微鏡で確認する。
【０３１９】
８０ｍＬのこのシード培養培養物と２４ｍＬの９０％滅菌グリセロールを滅菌した２５０ｍＬ振盪フラスコ中で合わせる。よく混合するよう旋回させ、１００個の滅菌した予め標識したクリオバイアルに、１ｍＬのこの混合物を等分する。これらを−８０℃フリーザー中において、バイアルをゆっくり凍結する。
【０３２０】
（シード培地の組成）
細胞バンクおよび細胞バンクバイアルの任意の所望の用量までの拡大のために、表９に記載されるものと同じシード培地を使用する。
【０３２１】
（表９）
【０３２２】
【表９】
2004508810.tif 000040
＊注：オレイン酸メチルは、Ｃａｓｉｔｏｎｅ中でエマルジョンを形成し、他の成分と完全に混合しないため、他の成分を添加した後に、オレイン酸メチルを添加する。
【０３２３】
（振盪フラスコ５Ｌおよび１０００Ｌの発酵の種菌スケールアップ）
オレイン酸メチル順応細胞の凍結された実用的な細胞バンクバイアルを解凍する。３ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭシード培地が入った５０ｍＬガラス培養試験管中にバイアルの内容物全部を移す。試験管を振盪器（３０℃、１７５ｒｐｍ）中に置き、４８±２４時間増殖させる。培養試験管の内容物全部を５０ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭシード培地の入った２５０ｍＬ振盪フラスコに移す。試験管を振盪器（３０℃、１７５ｒｐｍ）中に置き、４８±２４時間増殖させる。振盪フラスコを実験に用いるために、この培養物の１０ｍＬを、５つの新しいシードフラスコ中の４０ｍＬの新鮮なＣＹＥ−ＭＯＭに、継代培養することによって、このシードを増殖する。シードフラスコを振盪器（３０℃、１７５ｒｐｍ）中で、２４±１２時間インキュベートし、フラスコ容量（３０〜１００ｍＬ）の生成培養物の種菌として使用する。４．５％の合わされた（シードおよび生成培地）最初の容量で、生成フラスコに播種する。
【０３２４】
小規模（５〜１０Ｌ）の発酵のためのシードを調製するために、これらの５０ｍＬのシードフラスコの１つの内容物全部を、５００ｍＬのＣＹＥ−ＭＯＭの入った滅菌した２．８Ｌフェルンバッハフラスコに継代培養する。このフェルンバッハフラスコを振盪器（３０℃、１７５ｒｐｍ）中において、４８±２４時間インキュベートし、発酵槽種菌として使用する。約５％の合わされた最初の容量にて、生成発酵物を播種する。
【０３２５】
さらなるシードの増殖は、大規模（１０００Ｌ）発酵に必要である。ここで、１Ｌのフェルンバッハフラスコシードを用いて、９ＬのＣＹＥ−ＭＯＭを含む１０Ｌのシード発酵槽に播種する（５容量％）。２．５Ｎ水酸化カリウムおよび２．５Ｎ硫酸の添加によって発酵槽のｐＨを７．４に制御する。温度は、３０℃にセットする。４００〜７００ｒｐｍの撹拌速度カスケージングによって、溶存酸素を、５０％以上の飽和度に維持する。最初の撹拌速度を４００ｒｐｍにセットし、スパージング速度を０．１ｖ／ｖ／ｍに維持する。１０Ｌの発酵槽中で２４±１２時間の増殖の後に、培養物全部を、９０ＬのＣＹＥ−ＭＯＭの入った１５０Ｌの発酵槽に移す。２．５Ｎ水酸化カリウムおよび２．５Ｎ硫酸を用いてｐＨをもう一度、７．４に制御する。温度を３０℃にセットする。４００〜７００ｒｐｍの撹拌速度カスケージングによって、溶存酸素を、５０％以上の飽和度に維持する。最初の撹拌速度を４００ｒｐｍにセットし、スパージング速度を０．１ｖ／ｖ／ｍに維持する。
【０３２６】
（発酵のためのＸＡＤ−１６樹脂の調製）
所望される量のＸＡＤ−１６樹脂（Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ）を、ＸＡＤ−１６樹脂重量の最低３倍の容量を有するメタノール安全容器に移す（すなわち、１．２ｋｇの樹脂は、少なくとも３．６Ｌの容器を必要とする）。樹脂を１００％メタノールを用いてよく洗浄して、未使用の樹脂上に存在する任意のモノマーを除去する。樹脂重量（ｋｇ）の２倍量のメタノール（Ｌ）を添加する（すなわち、３ｋｇのＸＡＤ−１６に対して、６Ｌのメタノール）。メタノールとＸＡＤスラリーを５分間混合して、ＸＡＤ−１６上に存在する任意のモノマーを除去する。このスラリーを穏やかに撹拌し、樹脂のフラグメント化を最小化するよう混合する。混合を止め、樹脂を１５分間以上、重力沈降させる。容器からメタノールを流し出し、０．５〜１インチのメタノールの層をＸＡＤベッドの上に残す。ＸＡＤおよびメタノールを混合容器からＡｍｉｃｏｎ　ＶＡ２５０カラムに移す。上部のベッド支持体をカラムに接着し、シール調節ノブを時計回りにまわしてベッド支持体をシールする。カラム容量の５倍以上のメタノールを用いて、３００±５０ｃｍ／時間でカラム中のＸＡＤを洗浄する。溶媒廃棄容器中にメタノールの流れたものを回収する。１０カラム容量以上の脱イオン水で、ＸＡＤをカラム中において３００±５０ｃｍ／時間で洗浄する。
【０３２７】
エポシロン生成培地の組成物を、表１０に記載する。
【０３２８】
（表１０）
【０３２９】
【表１０】
2004508810.tif 000041
＊注：オレイン酸メチルは、Ｃａｓｉｔｏｎｅ中でエマルジョンを形成し、他の成分と完全に混合しないため、他の成分を添加した後に、オレイン酸メチルを添加する。微量元素溶液は、表７に記載される通りである。
【０３３０】
（調製およびフラスコ規模（５０ｍＬ）のエポシロン生成発酵物）
１ｇのＸＡＤ−１６を２５０ｍＬ振盪中で、この樹脂を覆うのに十分な量の脱イオン水（約３ｍＬ）と共に、オートクレーブする。フラスコを３０分間、１２１℃でオートクレーブで滅菌する。以下の培地成分をフラスコに無菌的に添加する：５０ｍＬのＣＴＳ−ＭＯＭ生成培地、および２．５ｍＬの１Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（水酸化カリウムを用いてｐＨ７．６に滴定する）。２．５ｍＬのＣＹＥシードフラスコ（４．５％容量／容量種菌）と共に、培養物を播種する。撹拌器上で、３０℃、１７５ｒｐｍで生成フラスコをインキュベートする。
【０３３１】
播種後２４±６時間でＣａｓｉｔｏｎｅおよびオレイン酸メチルを給餌し始める。この時点およびこの後２４±６時間毎に、１ｍＬの１００ｇ／Ｌ　Ｃａｓｉｔｏｎｅ溶液および１５０μＬのオレイン酸メチルを給餌する。この給餌レジメンを最初の給餌後の１３日目まで続けるか、細胞が溶解し始めているのが観察されるまで（１１〜１４日目）続ける。エポシロン生成反応速度を決定するため、よく混合された発酵ブロスおよびＸＡＤの例示的な５ｍＬサンプルを採取し得る。さらに、ＸＡＤを含まないブロスの小サンプル（０．２５〜０．５ｍＬ）を毎日採取して、培養物の増殖の状態を可視的に確認し得る。大量の細胞溶解が観察される場合、培養容積の残りを収集すべきである。
【０３３２】
（調製および５Ｌスケールのエポシロン生成発酵）
１００ｇのＸＡＤおよび８ｇのＭｇＳＯ４−７Ｈ２Ｏを３．９Ｌの脱イオン水と合わせ、５ＬのＢ−Ｂｒａｕｎバイオリアクター中で滅菌（９０分、１２１℃）する。事前に滅菌したＣａｓｉｔｏｎｅ／脱イオン水溶液（１５０ｇ／Ｌ）の十分な量（１３３ｍＬ）を、無菌的に汲み出し、発酵槽中で最終のＣａｓｉｔｏｎｅ濃度が５ｇ／Ｌに達するようにする。２ｍＬ／Ｌの最初のオレイン酸メチル濃度を、１０ｍＬのオレイン酸メチルを添加することにより達成する。最終的に、１６ｍＬの事前に滅菌したトレース要素溶液を滅菌的に、播種の前に添加する。次いで、発酵層２００ｍＬのＣＹＥシード培養物（４．８％容量／容量）で播種し、２４±６時間増殖させる。この時点で、Ｃａｓｉｔｏｎｅ（２ｇ／Ｌ／日、連続給餌）およびオレイン酸メチル（計３ｍＬ／Ｌ／日、９０分毎の半連続給餌）の給餌を開始する。バイオリアクター内において、気流を０．４〜０．５ｖｖｍで一定に保つ（給餌が進行する場合の発酵容量の増加は、この変化を引き起こす）。溶存酸素濃度は、撹拌カスケード（４００〜７００ｒｐｍ）ことによって、５０％の飽和に制御される。１００％飽和の溶存酸素の較正点は、最初の撹拌を４００ｒｐｍ、最初の気流を０．５ｖｖｍにセットすることよって、確立される。７．４のｐＨセットポイントは、２．５Ｎ　Ｈ２ＳＯ４および２．５Ｎ　ＫＯＨの自動化された添加によって維持される。エポシロン生成は、播種後１１〜１４日間続き、細胞溶解物がブロスサンプル中に現れ、そして酸素要求（撹拌速度によって示される）が、急に減少する場合、バイオリアクターは、回収される。この発酵プロセスにおいて、エポシロンＤの力価は、一般に１８〜２５ｍｇ／Ｌに達する。
【０３３３】
（調製および１０００Ｌスケールのエポシロン生成発酵物）
１０００Ｌ発酵槽をエポシロン生成のために以下のように調製した。６００Ｌの水および１８Ｌ（１１．５７４ｋｇ）のＸＡＤ−１６を、発酵槽中で滅菌した（４５分、１２１℃）。微量金属およびＭｇＳＯ４を、直接発酵容器中にフィルター濾過（事前に滅菌した０．２μｍポリエーテルスルホン膜カプセルフィルターを通して）した。２．９Ｌの微量元素溶液および十分な量の濃縮ＭｇＳＯ４溶液（発酵槽中、最終濃度２ｇ／Ｌまで）を同じカプセルフィルターを通して添加した。１１７ｇ／Ｌ　Ｃａｓｉｔｏｎｅおよび１７５ｍＬ／Ｌ　オレイン酸メチルの混合物約２００Ｌを２６０Ｌ給餌タンク中で滅菌した。この滅菌混合物の３２Ｌを１０００Ｌの発酵槽に添加した。水を容器中に濾過（同じカプセルフィルターを通して）して、最終容量を７１０Ｌにした。撹拌は、１００ｒｐｍであった。背圧を１００〜３００ｍｂａｒに維持した。播種後に溶存酸素（ＤＯ）が５０％に達した場合、撹拌を１５０ｒｐｍに増加した。ＤＯが再び５０％に達した場合、撹拌を２００ｒｐｍに増加した。気流をカスケード（０Ｌｐｍ〜２４０Ｌｐｍ）することによって、ＤＯを５０％飽和に制御した。２．５Ｎ　Ｈ２ＳＯ４および２．５Ｎ　ＫＯＨの自動化された添加によって、ｐＨのセットポイントを７．４に維持した。１５０Ｌ撹拌槽からの３８Ｌのシードを撹拌槽に播種した（５％容量／容量）。
【０３３４】
０．５７０Ｌ／時間のＣａｓｉｔｏｎｅ−オレイン酸メチル給餌溶液の添加を、ＤＯが５０％に達した後に始め（２度目については、播種後およそ１０±５時間）、撹拌槽を回収するまで続けた。バイオリアクターを播種後１０日目に回収した。最終的なエポシロンＤの力価は、約２０±５ｍｇ／Ｌであることが決定された。
【０３３５】
（発酵物の採取手順）
フラスコにおける反応速度実験について、５〜５０ｍＬのよく混合したブロスおよびＸＡＤ樹脂を２５ｍＬピペットを用いて採取し、１０または５０ｍＬのコニカルチューブ中に入れた。バイオリアクターサンプルについて、５０ｍＬのよく混合したブロスおよび樹脂のサンプルを５０ｍＬのコニカルチューブ中に入れる。次いでコニカルチューブを１０分間静置し、ＸＡＤをチューブの底に沈降させた。この時点でのブロスをＸＡＤ樹脂からデカントし得る。ＸＡＤが沈降しない場合、１０〜２５ｍＬピペットを用いてブロスを除去し得る。
【０３３６】
（エポシロン力価定量のためのＸＡＤ樹脂のメタノール抽出）
ＸＡＤ樹脂が試験管の底に重力沈降した後（採取手順により）、上清の全てを新しい５０ｍＬのコニカルチューブに移す。水をもとの５０ｍＬマークまで添加することによって、一度ＸＡＤ樹脂を洗浄し、転倒によってよく混合し、そしてＸＡＤ樹脂を再び重力沈降させる。ＸＡＤを注ぎ出さないよう、試験管から水性混合物をデカントする。最後の数ｍＬの水を、１ｍＬピペットマンを使用して、チップを試験管の底に押し下げることによって除去し得る。このチューブに２５ｍＬの点までメタノールを添加し、このチューブにフタをする。撹拌器上に３０分間（２０〜３０℃で）、水平にコニカルチューブを置いて、ＸＡＤ樹脂から全てのエポシロンを徹底的に抽出する。
【０３３７】
（エポシロン定量のためのＨＰＬＣ手順）
エポシロンＣおよびエポシロンＤの分析を、Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　１０９０　ＨＰＬＣを用いて、ＵＶ検出を２５０ｎｍにおいて使用して、実施する。ＸＡＤ樹脂からのメタノール抽出溶液（５０μＬ）を、４．６×１０ｍｍガードカラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、Ｃ１８　ＯＤ　５３、５μｍ）、およびクロマトグラフ分離用の同じ材料の長いカラム（４．６×１５０ｍｍ）の２つに注入した。この方法は、１８分間の実施を通して、６０％アセトニトリルおよび４０％水を用いて、アイソクラチック溶出した。この方法を用いて、エポシロンＤは、１３分で、溶出され、エポシロンＣは、１０．３分で溶出した。標準を発酵ブロスから精製したエポシロンＤを用いて調製した。
【０３３８】
（増殖曲線のための乾燥細胞重量測定手順）
Ｓｏｒｖａｌｌ　ＲＣ５Ｂ遠心機（ＳＨ−３０００バケットロータを備える）において温度を２０℃にセットする。少なくとも１日の間８０℃のオーブンに入れていた５０ｍＬコニカルチューブを重量測定する。自重重量および発酵サンプル同定物を試験管の側面に記録する。４０ｍＬのブロス（ＸＡＤを含まない）を自重を量ったチューブに注ぐか、ピペットで移す。コニカルチューブを４７００ＲＰＭ（４２００ｇ）で３０分間回転させる。沈降させた後、上清を流し出して、そして細胞ペレットを４０ｍＬの脱イオン水中に再懸濁して、このペレットを洗浄する。再び試験管を回転させる（４２００ｇ、３０分間）。上清をデカントし、試験管を８０℃の乾燥オーブン中に少なくとも２日間置く。試験管の重量を測定し、この試験管に最終的な重量を記録する。次いで、乾燥した細胞重量（ＤＣＷ）を以下の式によって計算する：
ＤＣＷ（ｇ／Ｌ）＝（最終的な試験管重量（ｇ）−試験管の自重重量（ｇ））／０．０４Ｌ。
【０３３９】
（アンモニウムイオン濃度の決定）
発酵ブロスのアンモニア濃度は、エポシロン発酵物中において、慣用的に評価される。１ｍＬの発酵ブロスは、微量遠心機での遠心分離（５分、１２０００ｒｐｍ）によって、浄化される。Ｓｉｇｍａから提供されるアンモニアアッセイキット（カタログ番号１７１−ＵＶ）は、定量に用いられ、浄化された発酵ブロスをキットプロトコールに記載される血漿の代りにする。この比色定量アッセイの直線的応答範囲は、わずか０．０１１７６〜０．８８２ｍｍｏｌ／Ｌであり、この範囲内のアンモニウム濃度をアッセイするため、浄化された発酵サンプルを、典型的には蒸留水中で２０〜１００倍に希釈する。
【０３４０】
（残渣のオレイン酸メチル濃度の決定）
発酵ブロス中に存在する残渣のオレイン酸メチル量は、メタノールを用いて発酵ブロスサンプルを抽出し、そしてこれらの抽出したブロスサンプルをＨＰＬＣにかけることによって推定され得る。オレイン酸メチル濃度の定量は、Ｈｅｗｌｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　１０９０　ＨＰＬＣを用いて、ＵＶ検出を２１０ｎｍにおいて使用して、実施する。全ブロスサンプル（１〜４ｍＬ）を、等容量のメタノールを用いて抽出し、１２，０００ｇで遠心分離して、任意の不溶性成分を沈降させた。浄化された上清（５０μＬ）を４．６×１０ｍｍ抽出カラム（Ｉｎｅｒｔｓｉｌ、Ｃ１８　ＯＤ　５３、５μｍ）に注入し、５０％アセトニトリルで２分間洗浄し、次いで、メインカラム（４．６×１５０ｍｍ、同じ固定相および流速）にて、５０％アセトニトリルで開始し、１００％アセトニトリルで終わる２４分間の勾配で分離する。１００％アセトニトリルカラムフローを５分間維持した。この不均一性質に起因して、オレイン酸メチルは、単一の純粋な化合物としてではなく、多くの別個のピークとして溶出する。しかし、抽出可能な総オレイン酸メチルの約６４〜６７％は、２つの主だったピークに現れ、これらは、それぞれ２５．３±０．２分および２７．１±０．２分で溶出する。メタノール抽出された発酵サンプル中のオレイン酸メチルは、これら２つのピークの合計した面積を定量し、次いで、これらを、５０％水／メタノール中で調製されたオレイン酸メチルの標準でのこれら２つのピークの合計した面積に対して、基準化する。
【０３４１】
（エポシロンＤの精製および結晶化）
本発明は、エポシロンおよびエポシロンＤについての精製プロセス、ならびに高度に精製されたエポシロンＤの調製物（結晶化形態のエポシロンＤを含む）を提供する。本発明のプロセスの利点としては、アルコール（例えば、メタノール）および水のみを必要とする最初の精製工程が挙げられ、これは、生成物のプールの効果的な使用を可能にし、時間および手間のかかる蒸発工程の必要性を最小にする。本発明の方法は、単一の蒸発工程のみを必要とし、これは、１０〜１５ｇのエポシロン毎に、１Ｌのエタノールの蒸発を必要とする。このプロセスにおいて、合成ポリスチレン−ジビニルベンゼン樹脂（例えば、ＨＰ２０ＳＳ）でパックされたカラムを用いて、極性不純物および脂溶性不純物の両方を除去する。このカラムは、１０％エポシロンを含む中間生成物を生成し、非常に引火性の溶媒または毒性溶媒のいずれかを用いる液体／液体抽出の必要を排除する。
【０３４２】
別の改良は、４０〜６０μｍ粒子分布を有するＣ１８樹脂（例えば、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　Ｃ１８）の使用に関し、これは、低圧のカラムおよびポンプ（５０ｐｓｉ未満）の使用を可能にし、費用を顕著に減少させる。Ｃ１８クロマトグラフィー工程のための出発物質は、希釈された負荷溶媒中で負荷される溶液である。溶媒は、カラムの上端にエポシロンが、高度に濃縮された密なバンドになって、とどまるのに、十分弱く、このことによりカラムは、高負荷下で（２〜５ｇエポシロン／Ｌ　樹脂）に、十分に機能し得る。典型的にカラム負荷は、１ｇ／ｌ以下であり、クロマトグラフィーは通常、精製において最も高価な工程であるため、この改善は、顕著な経費節約を生じる。さらに、本発明の方法は、クロマトグラフィー工程において、アセトニトリルの代りに、アルコール（例えば、メタノール）の使用を可能にする。エポシロンを含むプールは、二成分溶媒系から結晶化され、ここで水は、エポシロンを結晶化形態で提供するためのフォーシング（ｆｏｒｃｉｎｇ　ｓｏｌｖｅｎｔ）溶媒である。
【０３４３】
１つの実施形態において、精製プロセスは、以下の工程および材料からなる。発酵ブロス中のＸＡＤ樹脂は、（１）フィルターバケット中に集められ、（２）溶出されてＸＡＤ抽出物を提供し、これを（３）水で希釈し、そして（４）ＨＰ２０ＳＳカラムを通して、ＨＰ２０ＳＳプールを提供する。ＨＰ２０ＳＳプールを、（５）水で希釈し、（６）Ｃ１８クロマトグラフィーにかけて、エポシロンプールを提供し、これを（７）水で希釈し、そして（８）溶媒交換に供して、濃縮エポシロンプールを提供する。この濃縮エポシロンプールを、（９）木炭濾過に供し、（１０）蒸発させ、そして（１１）結晶化させて、高度に精製された材料を提供する。
【０３４４】
２回の１０００Ｌ　Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　発酵の実行により、合計１１ｇのエポシロンＤを（１０３１００１Ｋおよび１１１７００１Ｋ）から単離し、白色結晶粉末に精製した。最終産物の純度は、９５％を超え、エポシロンＤの回収率は、７１％であった。
【０３４５】
表１１に、精製の間に使用したＨＰＬＣの方法をまとめる。
【０３４６】
（表１１）
【０３４７】
【表１１】
2004508810.tif 000042
この節において使用される材料は、以下の通りである。ＨＰ２０ＳＳ樹脂は、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉから購入した。Ｃ１８樹脂は、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ　Ｃ１８から購入（４０ｇ）し、メタノールは、Ｆｉｓｈｅｒ　Ｂｕｌｋ（５５ｇａｌ）から購入した。脱イオン水を用いた。
【０３４８】
（発酵の実行１０３１００１Ｋ）
（工程１　ＸＡＤ溶出（Ｋ１２５−１７３）
１７ＬのＸＡＤ−１６樹脂を１３Ｌ　１５０μｍカプセルバケットを備えたＭａｉｎｓｔｒｅａｍフィルターユニットを用いて、発酵培養物から濾過する。捕捉されたＸＡＤ樹脂を、Ａｍｉｃｏｎ　ＶＡ２５０カラムにパックし、そして６５Ｌ（３．８カラム容量）の水で１．０Ｌ／分で洗浄した。次いで、２３０Ｌの８０％メタノール／水を用いてエポシロンＤ生成物を樹脂から溶出した。
【０３４９】
（工程２　固相抽出（Ｋ１２５−１７５））
７７Ｌの水を工程１の生成物プール（２３０Ｌ）に添加して、負荷溶媒を６０％メタノール／水に希釈した。得られた懸濁液（３０７Ｌ）を混合し、事前に５カラム容量の６０％メタノールで平衡化した５ＬのＨＰ２０ＳＳ樹脂でパックしたＡｍｉｃｏｎ　ＶＡ１８０カラム上に負荷した。負荷する流速は、１Ｌ／分である。負荷した後、カラムを１３Ｌの６０％メタノールで洗浄し、７７Ｌの７５％メタノールを用いて、３２５ｍＬ／分の流速で溶出した。３１個の２．５Ｌの画分を集めた。画分１０〜２６（４２．５Ｌ）は、エポシロンＤを含むことが見出され、これらの画分を一緒にプールした。
【０３５０】
（工程３　クロマトグラフィー（Ｋ１２５−１７９））
工程２の生成物プールを２つの２０−Ｌ　ｒｏｔｏｖａｐを用いて、油になるまで蒸発させた。蒸発の間、発泡を最小にするためにエタノールを添加することが必要であった。乾燥させた材料を、１．０Ｌのメタノールに再懸濁し、０．６７Ｌの水で希釈して、１．６７Ｌの６０％メタノール溶液を作製した。得られた溶液を、事前に３カラム容量の６０％メタノールで平衡化した１−Ｌ　Ｃ１８クロマトグラフィーカラム（５５×４．８ｃｍ）に負荷した。負荷する流速平均は、６４ｍＬ／分であった。負荷されたカラムを１Ｌの６０％メタノールで洗浄し、エポシロンＤ生成物の溶出を、７０％メタノールを用いて流速３３ｍＬ／分で、アイソクラチックに実施した。合計２７画分を集めた（最初の画分は、３．８Ｌ容量を含んでいた）。これに３つの５００ｍＬ画分および２３個の２５０ｍＬ画分が続いた。画分５〜２０を最良のプールとして採用し（Ｋ１２５−１７９−Ｄ）、これは、４．８ｇのエポシロンＤを含んでいた。画分３〜４（Ｋ１２５−１７９−Ｃ）は、１．４ｇのエポシロンＤを含んでいた。このプールはまた、高濃度のエポシロンＣを含むため、再使用のため取っておいた（工程３ｂ）。
【０３５１】
（工程４　クロマトグラフィー（Ｋ１１９−１５３）
高濃度のＣアナログをまた含む、エポシロンＤ画分を以下のように、Ｃ１８樹脂上で、以下のように再びクロマトグラフィーにかけた。２．５×５０ｃｍカラムにＣ１８樹脂をパックし、１Ｌの１００％メタノールで洗浄し、１Ｌの５５％メタノール／水で２０ｍＬ／分の流速で平衡化した。圧力低下は、１２５ｐｓｉであった。出発物質（Ｋ１２５−１７９−Ｃ、１０４０ｍＬ）を、２６０ｍＬの水で希釈して、その結果、負荷溶液は、５５％メタノール／水を含んだ。得られた溶液（１３００ｍＬ）を樹脂に負荷し、さらに２５０ｍＬの５５％メタノールをカラムに通した。カラムをはじめに５Ｌの６５％メタノールで溶出し、続いて、３Ｌの７０％メタノール／水で溶出した。６５％メタノール溶出の間に、全体で４８個の１００ｍＬ画分を回収した。７０％メタノールに切り替えた後、全体で１０個の２５０ｍＬ画分を回収した。最良のエポシロンＤプール（Ｋ１１９−１５３−Ｄ）（画分５０〜５８を含む）は、１．０ｇの所望の生成物を含んだ。
【０３５２】
（工程５ａ　結晶化（Ｋ１１９−１５８））
この工程のための開始物質を、工程３および工程４からのクロマトグラフィー生成物の組み合わせであった。最初、１２０ｍｌのエタノールを、５．５ｇのエポシロンＤを含む７．９ｇの固体に添加した。穏やかに攪拌しながら、この固体を、完全に溶解させ、そしてこの溶液を、ヒューム・フード内の攪拌プレート上に置いた４００ｍＬのビーカーに移した。Ａ１’’攪拌バーを添加し、その溶液を迅速に攪拌した。その間に、１００ｍＬの水を、約５分間かけてゆっくりと添加した。小さな白色結晶の形成を観察した場合、この溶液を、この溶液が白い固体を有して厚くなるまで、１５分以上攪拌した。次いで、このビーカーを、攪拌プレートから取り除き、アルミホイルで覆い、そして冷蔵庫（２℃）に１２時間置いた。この白色固体をＷｈａｔｍａｎ＃５０ろ紙を使用して濾過し、第１のクロップに対してさらなる洗浄を実施しなかった。この固体を、結晶皿に置き、そして真空オーブン（１５ミリバーで４０℃）内で１時間乾燥した。次いで、この物質を、オーブンから取り出し、より微細な粒子にし、そして真空オーブン内でさらに４時間乾燥した。この結晶化プロセスにより、３．４１ｇの灰色の固体を得た。Ｅｐｏ１　ＨＰＬＣ方法を、使用して、最終生成物のクロマトグラフィー純度を決定した。対応するする１Ｈ　ＮＭＲデータおよび１３Ｃ　ＮＭＲデータと共に、ＨＰＬＣの結果は、すべて乾燥した物質が、９５％以上のエポシロンＤを含むことを確認した。第１のクロップの回収率は、５８％であった。
【０３５３】
（工程５ｂ　結晶化（Ｋ１１９−１６７））
この工程の開始物質は、工程５ａからのエバポレートされた母液であった。最初、７０ｍｌのエタノールおよび３０ｍｌの水を、２．１ｇのエポシロンＤを含む３．４ｇの固体に添加した。この透明な溶液を、ビーカーに移し、１ｇの脱色した木炭をこれに添加した。この混合物を、中程度の設定で１０分間攪拌し、次いで、Ｗｈａｔｍａｎ＃５０ろ紙を使用して濾過した。木炭を、１０ｍｌのエタノールのアリコートで２回洗浄し、そして再び濾過した。この合わせたろ液を、ｒｏｔｏｖａｐを使用して乾燥し、そして固体を、５０ｍｌのエタノールに再懸濁した。この得られた溶液を、２５０ｍｌのビーカー内に置き、そしてよく攪拌しながら、５０ｍｌの水をゆっくり添加した。結晶形成を促進するために、少量の種結晶（１ｍｇ）を、混合物に添加した。数分間の攪拌後、さらなる白色固体の形成を観察した。攪拌を続けている間、窒素流を、混合物に穏やかに吹き付けるように設置した。１５分後、このビーカーを、２℃の冷蔵庫に３６時間置いた。この混合物を、Ｗｈａｔｍａｎ＃５０ろ紙を使用して、結晶を捕獲し、そしてさらなる７ｍｌの５０：５０　エタノール：水を、使用して、固体を洗浄した。次いで、この結晶を、真空オーブン内で４時間乾燥した。この結晶化工程により、９５％以上のエポシロンＤを含む、１、４６ｇの白色結晶を得た。
【０３５４】
（発酵の実行　１１１７００１Ｋ）
（工程１　ＸＡＤ溶出（Ｋ１２５−１８２））
１７リットル（１７Ｌ）のＸＡＤ−１６樹脂を、１３リットルの１５０μｍの捕獲バスケットを備えるメインストリーム濾過を使用して発酵培養物から濾過した。捕獲したＸＡＤ樹脂を、Ａｍｉｃｏｎ　ＶＡ２５０カラムに充填し、そして１．０Ｌ／分で５８Ｌの（３．４カラム容積）の水を用いて洗浄した。次いで、エポシロンＤ生成物を、１７０Ｌの水中の８０％エタノールを使用して樹脂から溶出した。水での洗浄および第１のカラム容積の溶出の間、カラム背圧は、３００ｍＬ／分に最終流速で、３バールより大きく着実に増大した。従って、ＸＡＤ樹脂を、カラムから取り除き、代替のＡｍｉｃｏｎ　ＶＡ２５０カラムに再充填した。交換後、背圧は、１バー未満に減少し、そして流速は、１．０Ｌ／分を維持した。単一１７０−Ｌ分画を、６００−Ｌステンレス鋼タンクに回収した。ＨＰＬＣ分析に基づいて、工程１の生成物プールは、８．４ｇのエポシロンＤを含むことを見出した。
【０３５５】
（工程２　固相抽出（Ｋ１４５−１５０））
５７リットル（５７Ｌ）の水を、工程１の生成物プール（１７０Ｌ）に添加して、ロード溶媒を水中の６０％メタノールに希釈した。得られた懸濁液（２２７Ｌ）を、オーバーヘッドライトニングミキサーを使用して攪拌し、そして以前にカラム容積の５倍の６０％のメタノールで平衡化した６．５ＬのＨＰ２０ＳＳ樹脂を充填したＶＡ１８０カラムにロードした。ロード流速は、１Ｌ／分であった。ロード後、このカラムを、１６Ｌの６０％メタノールで洗浄し、そして３００ｍＬ／分の流速で８４Ｌの７５％メタノールで溶出した。７つの画分を、それぞれ、１８Ｌ、６Ｌ、６Ｌ、６Ｌ、３６Ｌおよび６Ｌを回収した。全量８．８ｇのエポシロンＤを含む、画分を、一緒にプールした。
【０３５６】
（工程３　クロマトグラフィー（Ｋ１４５−１６０））
工程２の生成物プールを、２つの２０Ｌ　ｒｏｔｏｖａｐを使用して油状物になるまでエバポレートした。エバポレーションプロセスの間の起泡を最小にするために、１０Ｌのメタノールを物質に添加した。乾燥した混合物を、２．８Ｌのメタノールに再懸濁し、そして３．４Ｌの水で希釈して、６．２Ｌの４５％　メタノールを作製した。この得られた溶液を、以前に、カラム容積の５倍量の４５％　メタノールで平衡化した１−Ｌ　Ｃ１８クロマトグラフィーカラム（５５×４．８ｃｍ）にポンピングした。ロード流速は、１００ｍＬ／分に平均した。ロードしたカラムを、１リットルの６０％　メタノールで洗浄し、そしてエポシロンＤ生成物を、１００ｍＬ／分の流速で段階勾配を使用して樹脂から溶出した。このカラムを、５Ｌの５５％　メタノール、１１．５Ｌの６０％　メタノールおよび１３．５Ｌの６５％　メタノールを使用して溶出した。５５％　メタノール溶出の間、全部で５００ｍＬの画分を回収した。６０％　メタノールに変更後、全部で２３個の５００ｍＬの画分を回収した。最終の６５％　メタノール溶出の間、１１個の５００ｍＬの画分を回収し、その後、８個の１Ｌの画分を回収した。画分２８〜５０からなる、この最良のエポシロンＤプール（Ｋ１４５−１６０−Ｄ）は、８．３ｇの所望の生成物を含む。０．４ｇのエポシロンＣを混入した画分２６〜２７（Ｋ１４５−１６０−Ｃ）は、０．２ｇのエポシロンＤを含む。これらの２５画分のすべてを合わせた。
【０３５７】
生成物プールを、水中の４０％のメタノールに希釈するために、９．５Ｌの水を１５．８Ｌのロード溶液に添加した。次いで、この得られた溶液（２５．３Ｌ）を、以前に、カラム容積の４倍量の４０％　メタノールで平衡化した７００ｍＬのＣ１８　クロマトグラフィーカラム（９×１０ｃｍ）にポンピングした。ロード流速は、平均して３６０ｍＬ／分であった。このロードされたカラムを１リットルの４０％　メタノールで洗浄し、そしてエポシロンＤ生成物を、３．７５Ｌの１００％　メタノールを用いて樹脂から溶出した。この溶出物を、ｒｏｔｏｖａｐを使用して乾燥するまでエバポレートした。この固体を、１００ｍＬのアセトンに再懸濁し、そして溶解しなかった物質を、Ｗｈａｔｍａｎ＃２ろ紙を使用して溶液から濾過した。この濾過された粒子を、さらなる１１５ｍＬのアセトンで洗浄し、そしてもう１度、濾過した。アセトン抽出後、２ｇの脱色木炭を合わせたろ液に添加した。この混合物を、中程度の設定で１時間攪拌し、そしてＷｈａｔｍａｎ＃５０ろ紙を使用して濾過した。この木炭を、１８０ｍＬのエタノールで洗浄し、そして再び濾過した。このろ液を、一緒にプールし、そして乾燥までエバポレート（ｒｏｔｏｖａｐｅ）した。
【０３５８】
（工程４　クロマトグラフィー（Ｋ１１９−１７４））
工程３からの乾燥した物質を、５．０Ｌの水中の５０％　メタノールに再懸濁し、そして以前に、カラム容積の３倍の５０％　メタノールで平衡化した１−Ｌ　Ｃ１８クロマトグラフィーカラム（５５×４．８ｃｍ）にロードした。ロード流速は、平均して８０ｍＬ／分であった。次いで、カラムを、１リットルの５０％　メタノールで洗浄し、エポシロンＤ生成物を、同じ流速で７０％　メタノールを使用して樹脂から一様に（ｉｓｏｃｒａｔｉｃａｌｌｙ）に溶出した。全部で４８の画分を、回収した（２４０ｍＬを含む最初の４７画分および１Ｌを含む最後の画分を含む）。画分２５〜４８を、７．４ｇのエポシロンＤを含む、最良のプール（Ｋ１１９−１７４−Ｄ）として得た。画分２１〜２４（Ｋ１１９−１７４−Ｄ）は、１．１ｇのエポシロンＤを含むので、このプールはまた、高濃度のエポシロンＤを含む、これは、再作業を無視した。
【０３５９】
（工程５　結晶化（Ｋ１１９−１７７））
結晶化工程の前に溶媒の交換を実施するために、３．９Ｌの水を、工程５からの６．４Ｌの最良のエポシロンＤ（Ｋ１１９−１７４−Ｄ）に添加して、水中の４０％　メタノールにロード溶液を希釈した。次いで、この得られた溶液を、以前にカラム容積の３倍の４０％　メタノールで平衡化した２００−ｍＬ　Ｃ１８　クロマトグラフィーカラム（２．５×１０ｃｍ）にロードした。このコードしたカラムを、２００ｍＬの４０％　メタノールで洗浄し、そしてエポシロンＤ生成物を、１Ｌの１００％　エタノールで樹脂から溶出した。この溶出液を、ｒｏｔｏｖａｐを使用して乾燥するまでエバポレートし、そしてこの固体を、１５０ｍＬの１００％　エタノールに再懸濁した。この透明な溶液を、ビーカーに移し、そしてよく攪拌しながら、１７５ｍＬの水を、ゆっくり添加した。少しの種結晶（１ｍｇ）をまた、この溶液に添加して、結晶の形成を促進した。小さな白色結晶の形成を観察した場合、この溶液を、この溶液が白い固体を含んで厚くなるまで、１５分間以上攪拌した。次いで、ビーカーを、攪拌プレートから取り除き、アルミホイルで覆い、そして冷蔵庫（２℃）内で１２時間置いた。白色固体を、Ｗｈａｔｍａｎ＃５０ろ紙を使用して濾過し、そして第１のクロップにおいてさらなる洗浄は、実施しなかった。この固体を、結晶皿に移し、真空オーブン（１５ミリバーで４０℃）で６時間乾燥した。この結晶化プロセスにより、９５％以上のエポシロンＤを含む、６．２ｇの白色固体を得た。この第１のクロップの回収は、７４％であった。
【０３６０】
（結果）
ラン１０３１００１Ｋに関するエポシロンＤの回収は、約９７．５〜９８．８％の純度において４．８ｇの結晶物質であった。ラン１１７００１Ｋに関するエポシロンＤの回収は、約９７．７％の純度において６．２ｇの結晶物質であった。これらのランに関する不純度プロフィールを、表１２に示す。
【０３６１】
【表１２】
2004508810.tif 000043
「Ｅｐｏ４９０」は、本発明の新規のエポシロン化合物（１０，１１−デヒドロエポシロンＤ）であり、これは、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞によって産生された。
【０３６２】
この精製方法論は、エポシロンＤ精製プロセスに対してなされる改変をスケールアップして、醗酵培地中のオレイン酸メチルの使用を適合させる努力から生じた。ＸＡＤ樹脂からのエポシロンＤ生成物の溶出を、直接的な様式で実行した。１００％のメタノールを使用する代わりに、カラム容量の１０倍の８０％　メタノールを使用して、カラムのビーズから生成物を溶出した。ＸＡＤ溶出工程の間、醗酵ブロス中の溶解した細胞の存在は、精製カラムの詰まりの原因になり得ることに留意した。１０３１００−１Ｋ醗酵ランの回収は、有意な細胞溶解が起こる前に実施したが、１１１７００−１Ｋ醗酵ランを、かなり細胞溶解が起こった後にのみ回収した。しかし、高背圧および低流速を、溶出工程後のより後のランにのみ観察した。従って、このランにおける溶解した細胞は、凝集し、次いでカラムフィルターを汚し得るようである。
【０３６３】
これらの精製ランは、エポシロンＤが、少なくとも１日間、８０％　メタノール中で室温で安定であることを示す。ＨＰＬＣ分析に基づいて、これらの条件下での生成物の分解は、検出されなかった。これらの知見は、冷蔵なしに、一晩ステンレス鋼タンクにおいてＸＡＤ溶出工程からの１７０Ｌ生成物プールの保存を可能にした。このプロセスをさらに改善するために、溶媒交換カラムを使用し、これは、消費する時間を少なくし、そしてある容積の生成物プールの濃縮におけるｒｏｔｏｖａｐの使用よりも過度の労働を少なくする。従って、当業者は、大規模なエバポレーションと溶媒交換工程とを交換し得る。
【０３６４】
有意な量の油が、ＸＡＤ溶出工程の間樹脂に結合したままであったが、相当な量がまだ、溶出物中に残っていた。ＨＰ２０ＳＳ固相抽出の後でさえ、オイル小滴は、生成物プールにおいて明らかに可視であり、そしてＣ１８　クロマトグラフィーの間、問題であることを証明した。最適なクロマトグラフィーの能力に関して、ロード溶液中のエポシロンＤの濃度は、２ｇ／Ｌ未満に維持すべきである。より高い濃度において、開始物質は、カラムにオイルオウト（ｏｉｌ　ｏｕｔ）する傾向を有する。
【０３６５】
結晶化は、供給物質が、３％より多いエポシロンＣかまたｅｐｏ４９０かのいずれかを含む場合、不可能である。これは、１１１７００１Ｋの精製の間の場合であった。第１のクロマトグラフィー工程は、５％のエポシロンＣの生成物を与えた。多数の試みの後、この物質の結晶化を達成しなかった。しかし、この物質を第２のクロマトグラフィー工程に供することは、エポシロンＣを１％に減少し、そして簡単に結晶化される供給物質を生成した。
【０３６６】
（実施例４）
（非機能的ｅｐｏＫ遺伝子を有するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株の構築）
Ｋ１１１−４０−１株を、ｅｐｏＫ遺伝子の挿入不活化によってＫ１１１−３２．２５株から構築した。このｅｐｏＫ変異体を構築するために、カナマイシン耐性カセットを、ｅｐｏＫ遺伝子に挿入した。これを、ｐＫＯＳ３５−７９．８５から４８７９ｂｐフラグメントを単離することによって行った。このｐＫＯＳ３５−７９．８５は、ｅｐｏＫを含み、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫＩＩ＋のＮｏｔＩにこれを連結した。このプラスミド（ｐＫＯＳ３５−８３．５）を、ＳｃａＩで部分的に切断し、そして７．４ｋｂフラグメントを、ｐＢＪ１８０−２（これは、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑化したＤＮＡ末端を有する）からカナマイシン耐性遺伝子を含む１．５ｋｂ　ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを連結して、プラスミドｐＫＯ９０−５５を得た。最後に、ｐＢＪ１８３から約４００ｂｐのＲＰ４　ｏｒｉＴ　フラグメントを、ＸｂａＩ部位およびＥｃｏＲＩ部位に連結して、ｐＫＯＳ９０−６３を作製した。このプラスミドを、ＤｒａＩを直線化し、そしてＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−３２．２５にエレクトロポレーションし、そして形質転換体を、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−４０．１を提供するために選択した。Ｋ１１１−４０．１株を、ブダペスト条約に従って、２０００年１１月２１日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９．ＵＳＡに寄託し、そして登録番号ＰＴＡ−２７１２において入手可能である。
【０３６７】
マーカーのないｅｐｏＫ変異体を作製するために、ｐＫＯＳ３５−８３．５を、ＳａｃＩで切断し、そして２．９ｋｂフラグメントおよび４．３ｋｂフラグメントを、一緒に連結した。このプラスミド（ｐＫＯＳ９０−１０１）は、ｅｐｏＫにおいてインフレーム欠失を有する。次いで、ＫＧ２から３ｋｂのＢａｍＨＩフラグメントおよびＮｄｅＩフラグメント（これは、ポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑化したＤＮＡ末端を有し、そしてカナマイシン耐性遺伝子およびｇａｌＫ遺伝子を含む）を、ｐＫＯＳ９０−１０１のＤｒａＩ部位に連結して、ｐＫＯＳ９０−１０５を作製した。このプラスミドを、Ｋ１１１−３２．２５にエレクトロポレーションし、カナマイシン耐性エレクトロポレーション物を、選択した。ｅｐｏＫの野生型コピーと欠失とを置換するために、第２の組換え現象を、ガラクトースプレート上に増殖によって選択した。これらのガラクトース耐性コロニーを、エポシロンＣおよびエポシロンＤの生成に関して試験し、そして生成した株を、Ｋ１１１−７２．４．４と命名し、そしてブダペスト条約に従って、２０００年１１月２１日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９．ＵＳＡに寄託し、そして登録番号ＰＴＡ−２７１３において入手可能である。
【０３６８】
（実施例５）
（ｍａｔＢＣの添加）
ｍａｔＢＣ遺伝子は、それぞれ、マロニル−ＣｏＡシンターゼおよびジカルボキシレートキャリアタンパク質をコードする。ＡｎおよびＫｉｍ．１９９８，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５７：３９５−４０２（これは、本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。これらの２つのタンパク質は、細胞内の内在性のマレイン酸を、マロニル−ＣｏＡに変換する原因である。２つの遺伝子の生成物は、ジカルボン酸を移し、そしてこれらを、ＣｏＡ誘導体に変換し得る（ＰＣＴ特許出願番号ＵＳ００／２８５７３、本明細書において参考として援用される）。これら２つの遺伝子を、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓの染色体に挿入して、マロニル−ＣｏＡおよびメチルマロニル−ＣｏＡの細胞内濃度を増大させ、ポリケチド生成を増大し得る。これは、ＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩでｐＭＡＴＯＰ−２を切断し、そしてｐＫＯＳ３５−８２．１（テトラサイクリン耐性付与遺伝子、Ｍｘ８　ａｔｔ部位、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓプロモーターを含む）のＢｇｌＩＩ部位およびＳｐｅＩにこれを連結し、そして、ｍａｔＢＣの発現を駆動することによって達成される。このプラスミドを、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓにエレクトロポレーションし得る。ｐｉｌＡプロモーターは、高度に翻訳されるので、ＭａｔＢおよびＭａｔＣは、細胞増殖に影響を与え過ぎる現象においてより弱いプロモーターを挿入する必要があり得る。代替のプロモーターは、カナマイシン耐性付与遺伝子のプロモーターを含む。
【０３６９】
（実施例６）
（ロードモジュールにおけるＫＳＹの変異）
エポシロン生合成の開始の提案された機構は、ロードドメインのＡＣＰへのマロイン酸の結合、次いで、ロードＫＳドメインによるデカルボキシル化である。このロードＫＳドメインは、縮合反応を実施し得ない活性部位シトシン（ＫＳＹ）においてチロシンを含む。しかし、まだ、デカルボキシル化反応を起こすと考えられる。ラット脂肪酸シンゼターゼを用いる実験は、活性シトシン（ＫＳＱ）におけるグルタミンを含むＫＳドメインは、２オーダーの大きさのデカルボキシル化を増大し、それによって、セリン、アラニン、アスパラギン、グリシンまたはスレオニンへのこのアミノ酸の変更は、野生型と比較して増加を生じなかったことを示した。従って、ＫＳＹをＫＳＱに変更することは、エポシロン生成の増加を生じるエポシロンのプライミングを増加し得る。Ｋ１１１−３２．２５株における変更を作製するために、約８５０ｂｐのエポシロンＫＳロードモジュールコード配列プラスミドを有するｐＫＯＳ３９−１４８を構築した。ＫＳＱ変異を、部位特異的突然変異誘発によってこのプラスミドにおいて生成した。Ｋ１１１−３２．２５における遺伝子置換を実施するために、ＫＧ２由来のカナマイシン耐性遺伝子およびｇａｌＫ遺伝子を、ｐＫＯＳ３９−１４８のＤｒａＩ部位に挿入して、プラスミドｐＫＯＳ１１１−５６．２ＡおよびプラスミドｐＫＯＳ１１１−５６．２Ｂを作製した。プラスミドは、カナマイシン―ｇａｌＫカセットの方向とは異なる。これらのプラスミドを、Ｋ１１１−３２．２５にエレクトロポレートし、そしてカナマイシン耐性コロニーを、選択して、Ｋ１１１−６３株を作製した。野生型ロードモジュールＫＳに置換するために、Ｋ１１１−６３を、ＣＹＥガラクトースプレートにプレートし、そしてコロニーを、ＰＣＲおよび配列決定によってＫＳＱ変異体の存在についてスクリーニングした。
【０３７０】
（実施例７）
（ｍｔａＡの添加）
ホスホパンテテニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴａｓｅ）タンパク質のレベルを増加するために、Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ　ａｕｒａｎｔｉａｃａ株ＤＷ４由来のＰＰＴａｓｅを、Ｋ１１１−３２．２５に添加し得る。これを、プライマー１１１−４４．１（ＡＡＡＡＧＣＴＴＣＧＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＧＴＣＧＧＣ）およびプライマー１１１−４４．４（ＧＧＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＡＣＣＣＣＧＧＧＣＡＴ）を使用するＤＷ４染色体ＤＮＡからのｍｔａＡのＰＣＲ増幅によって行った。Ｓｉｌａｋｏｗｓｋｉら，１９９９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（５２）：３７３９１−３７３９９（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。約８００ｂｐのフラグメントを、ＮｃｏＩで切断し、そしてＰｓｔＩで切断したｐＵＨＥ２４−２Ｂに連結し、ＤＮＡ末端は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで平滑化し、そしてＮｃｏＩで切断した。このプラスミドを、ｐＫＯＳ１１１−５４と命名した。ｍｔａＡ遺伝子を、プラスミドｐＫＯＳ３５−８２．１（テトラサイクリン耐性付与遺伝子Ｍｘ８　ａｔｔ部位、およびＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　ｐｉｌＡプロモーターを含む）に移動させて、ｍｔａＡの発現を駆動した。このプラスミドを、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓに導入し、そしてＭｘ８ファージ結合部位に組み込んだ。
【０３７１】
（実施例８）
（プロモーター置換プラスミドの構築）
エポシロン生成レベルを改善するために、そして本発明の宿主細胞におけるＰＫＳ遺伝子を発現するために使用され得る広範の種々のプロモーターを例示するために、ベクターおよび宿主細胞のシリーズを構築して、この実施例に記載されるように、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍエポシロンＰＫＳ遺伝子を他の適切なプロモーターと置換し得る。
【０３７２】
（Ａ．下流の結合領域を有するプラスミドの構築）
コスミドｐＫＯＳ３５−７０．８Ａ３をＮｓｉＩおよびＡｖｒＩで切断した。９．５ｋｂのフラグメントを、ＰｓｔＩおよびＡｖｒＩＩで切断したｐＳＬ１１９０で連結して、ｐＫＯＳ９０−１３を得た。プラスミドｐＫＯＳ９０−１３は、約１２．９ｋｂである。プラスミドｐＫＯＳ９０−１３を、ＥｃｏＲＩ／ＡｖｒＩＩを切断した。５．１ｋｂのフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＳｐｅＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに連結して、ｐＫＯＳ９０−６４（約８．１ｋｂ）を作製した。このプラスミドは、プロモーターに関する下流隣接領域（開始コドンのｅｐｏＡおよびいくつかの配列上流）を含む。ＥｃｏＲＩ部位は、ｅｐｏＡ遺伝子に関する開始コドンから約２２０ｋｂ上流である。ＡｖｒＩＩ部位は、ＥｃｏＲＩ部位から５１００ｂｐ下流である。
【０３７３】
（Ｂ．上流隣接領域のクローニング）
プライマー９０−６６．１およびプライマー９０−６７（以下に示す）を，使用して、上流隣接領域にクローニングした。プライマー９０−６７は、ＰＣＲフラグメントの５‘末端にあり、そして９０−６６．１は、ＰＣＲフラグメントの３’末端にある。フラグメントは、ｅｐｏＡ遺伝子に関する開始コドンの前に２４８１ｂｐで終わる。約２．２ｂｐフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩで切断した。クレノウポリメラーゼを添加して、ＨｉｎｄＩＩＩ部位で平滑化した。このフラグメントを、ｐＮＥＢ１９３のＨｉｎｃＩＩ部位に連結した。適切な方向でのクローン（挿入物に下流末端にＥｃｏＲＩおよび挿入物の上流末端にＨｉｎｄＩＩＩを有する）を、選択し、そしてｐＫＯＳ９０−９０と命名した。
【０３７４】
【化３２】
2004508810.tif 000044
（Ｃ．最終プラスミドの構築）
プラスミドｐＫＯＳ９０−９０を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断した。２．２ｋｂのフラグメントを、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＫＯＳ９０−６４と連結して、ｐＫＯＳ９０−９１（１０．３ｋｂ）を作製した。プラスミドｐＫＯＳ９０−９１は、プロモーターの上流隣接領域、続いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に下流隣接領域を含む。目的のプロモーターをクローニングするためのＰａｃＩ部位が、２つの隣接領域の間に存在する。次いで、ｇａｌＫ／ｋａｎｒカセットを、組換えを可能にするようにＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓに挿入した。プラスミドｐＫＯＳ９０−９１を、ＤｒａＩで切断した。ＤｒａＩは、ａｍｐ遺伝子中で一回、ベクター中で２回（ａｍｐ遺伝子のそば）切断する。プラスミドＫＧ−２を、ＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩで切断し、そしてＫｌｅｎｏｗポリメラーゼを添加してフラグメントを平滑末端化した。３ｋｂのフラグメント（ｇａｌＫ／ｋａｎｒ遺伝子を含む）を、ｐＫＯＳ９０−９１の約９．８ｋｂのＤｒａＩフラグメントと連結して、ｐＫＯＳ９０−１０２（１２．８ｋｂ）を作製した。
【０３７５】
（Ｄ．代替のリーダーを有するプラスミドの構築）
エポシロンＰＫＳ遺伝子のネイティブなリーダー領域を、異なるリボソーム結合部位を有するリーダーと置換し得る。プラスミドｐＫＯＳ３９−１３６（１９９９年１１月１９日に出願された、米国特許出願番号０９／４４３，５０１中に記載される）を、ＰａｃＩ／ＡｓｃＩで切断した。リーダー配列およびｅｐｏＡの一部を含む３ｋｂのフラグメントを単離し、そしてｐＫＯＳ９０−１０２の９．６ｋｂ　ＰａｃＩ／ＡｓｃＩフラグメントと連結してｐＫＯＳ９０−１０６（約１２．７ｋｂ）を作製した。
【０３７６】
（Ｅ．プロモーター置換プラスミドの構築）
（Ｉ．ＭＴＡ（ミクソチアゾール（ｍｙｘｏｔｈｉａｚｏｌ）プロモーター）　ミクソチアゾールプロモーターを、プライマー１１１−４４．３および１１１−４４．５（以下に記載される）を使用して、Ｓｔｉｇｍａｔｅｌｌａ　ａｕｒａｎｔｉａｃａ染色体ＤＮＡ（菌株ＤＷ４）からＰＣＲ増幅した。約５５４ｂｐのバンドを、ｐＮＥＢ１９３のＨｉｎｃＩＩ部位にクローニングして、ｐＫＯＳ９０−１０７を作製した。プラスミドｐＫＯＳ９０−１０７を、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩで切断し、そしてＫｌｅｎｏｗを充填した。５６０ｂｐのバンドを、ｐＫＯＳ９０−１０２にクローニングし、そしてｐＫＯＳ９０−１０６を、ＰａｃＩで切断し、そしてＫｌｅｎｏｗを充填した（ＰａｃＩはｐＫＯＳ９０−１０２およびｐＫＯＳ９０−１０６中で一度のみ切断する）。プラスミドを、正確な方向についてスクリーニングした。ＭＴＡプロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０２プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１１４（１３．３６ｋｂ）と名付け、そしてＭＴＡプロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０６プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１１３（１３．２６ｋｂ）と名付けた。
【０３７７】
【化３３】
2004508810.tif 000045
これらのプラスミドを、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含有するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞にエレクトロポレーションして、カナマイシン耐性形質転換体が、単一の交差組換え体を同定するために選択された。これらの形質転換体を、ガラクトース耐性について選択して、二重交差組換え体を同定する。これは、所望の組換え事象を含むものを同定するために、サザン分析およびＰＣＲによってスクリーニングされる。所望の組換え体を増殖させ、そしてエポシロン生成について試験する。
【０３７８】
（ＩＩ．ＴＡプロモーター）
推定の転写アンチターミネーターをコードするｔａＡと共にＴＡについての推定のプロモーターを、以下のプライマーを使用するＴＡ菌株からＰＣＲ増幅した：
【０３７９】
【化３４】
2004508810.tif 000046
約１．１ｋｂのフラグメントを、ＢａｍＨＩおよびＢｇｌＩＩで切断し、そしてＢａｍＨＩで切断したｐＮＥＢ１９３に連結した。このプラスミドを、ｐＫＯＳ１１１−５６．１と名付けた。プラスミドｐＫＯＳ１１１−５６．１を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、そしてＫｌｅｎｏｗを充填した。約１．１ｋｂのバンドを、ＰａｃＩで切断したｐＫＯＳ９０−１０２およびｐＫＯＳ９０−１０６中にクローニングして、そしてＫｌｅｎｏｗを充填した（ＰａｃＩは、ｐＫＯＳ９０−１０２およびｐＫＯＳ９０−１０６中で一度のみ切断する）。プラスミドを、正確な方向についてスクリーニングした。ＴＡプロモーター／９０−１０２プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１１５（１３．９ｋｂ）と名付け、ＴＡプロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０６プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１１１（１３．８ｋｂ）と名付けた。
【０３８０】
これらのプラスミドを、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含有するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞にエレクトロポレーションして、カナマイシン耐性形質転換体が、単一の交差組換え体を同定するために選択された。これらの形質転換体を、ガラクトース耐性について選択して、二重交差組換え体を同定する。これは、所望の組換え事象を含むものを同定するために、サザン分析およびＰＣＲによってスクリーニングされる。所望の組換え体を増殖させ、そしてエポシロン生成について試験する。
【０３８１】
（ＩＩＩ．ｐｉｌＡプロモーター）
プラスミドｐＫＯＳ３５−７１Ｂを、ＥｃｏＲＩで切断し、そしてＫｌｅｎｏｗを充填した。８００ｂｐのフラグメントを、ＰａｃＩで切断したｐＫＯＳ９０−１０２およびｐＫＯＳ９０−１０６にクローニングし、Ｋｌｅｎｏｗを充填した。プラスミドを、正確な方向についてスクリーニングした。ｐｉｌＡプロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０２プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１２０（１３．６ｋｂ）と名付け、ｐｉｌＡプロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０６プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１２１（１３．５ｋｂ）と名付けた。
【０３８２】
これらのプラスミドを、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含有するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞にエレクトロポレーションして、カナマイシン耐性形質転換体が、単一の交差組換え体を同定するために選択された。これらの形質転換体を、ガラクトース耐性について選択して、二重交差組換え体を同定する。これは、所望の組換え事象を含むものを同定するために、サザン分析およびＰＣＲによってスクリーニングされる。所望の組換え体を増殖させ、そしてエポシロン生成について試験する。
【０３８３】
（ＩＶ．ｋａｎプロモーター）
プラスミドｐＢＪ１８０−２を、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩで切断し、そしてＫｌｅｎｏｗを充填した。３５０ｂｐのフラグメントを、ＰａｃＩで切断したｐＫＯＳ９０−１０２およびｐＫＯＳ９０−１０６にクローニングし、Ｋｌｅｎｏｗを充填した。プラスミドを、正確な方向についてスクリーニングした。ｋａｎプロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０２プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１２６（１３．１５ｋｂ）と名付け、ｋａｎプロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０６プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１２２（１３．０５ｋｂ）と名付けた。
【０３８４】
これらのプラスミドを、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含有するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞にエレクトロポレーションして、カナマイシン耐性形質転換体が、単一の交差組換え体を同定するために選択された。これらの形質転換体を、ガラクトース耐性について選択して、二重交差組換え体を同定する。これは、所望の組換え事象を含むものを同定するために、サザン分析およびＰＣＲによってスクリーニングされる。所望の組換え体を増殖させ、そしてエポシロン生成について試験する。
【０３８５】
（Ｖ．Ｓｏ　ｃｅ９０プロモーター）
Ｓｏ　ｃｅ９０プロモーターを、プライマー１１１−４４．６および１１１−４４．７（以下に示す）を使用してＳｏ　ｃｅ９０染色体ＤＮＡから増幅した。約９００ｂｐのバンドを、ＰａｃＩで切断し、そしてＰａｃＩで切断したｐＮＥＢ１９３にクローニングしてｐＫＯＳ９０−１２５を作製した。プラスミドｐＫＯＳ９０−１２５を、ＰａｃＩで切断した。９２４ｂｐのバンドを、ＰａｃＩで切断したｐＫＯＳ９０−１０２およびｐＫＯＳ９０−１０６にクローニングした。プラスミドを、正確な方向についてスクリーニングした。Ｓｏｃｅ９０プロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０２プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１２７（１３．６ｋｂ）と名付け、Ｓｏｃｅ９０プロモーター／ｐＫＯＳ９０−１０６プラスミドを、ｐＫＯＳ９０−１２８（１３．７ｋｂ）と名付けた。
【０３８６】
これらのプラスミドを、エポシロンＰＫＳ遺伝子を含有するＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主細胞にエレクトロポレーションして、カナマイシン耐性形質転換体が、単一の交差組換え体を同定するために選択された。これらの形質転換体を、ガラクトース耐性について選択して、二重交差組換え体を同定する。これは、所望の組換え事象を含むものを同定するために、サザン分析およびＰＣＲによってスクリーニングされる。所望の組換え体を増殖させ、そしてエポシロン生成について試験する。
【０３８７】
【化３５】
2004508810.tif 000047
（実施例９：ＫＳ２ノックアウト菌株の構築）
本実施例は、エポシロンＰＫＳ誘導体の構築を記載する。ここで、拡張モジュール２のＫＳドメインを、活性部位のシステインコドンをアラニンコドンに変化する変異によって不活化する。得られた誘導体ＰＫＳを（以下の実施例に記載されるような）合成前駆体に提供して、本発明のエポシロン誘導体を作製する。
【０３８８】
エポシロンＰＫＳ遺伝子の下流隣接領域を、以下のプライマー：
【０３８９】
【化３６】
2004508810.tif 000048
を使用してプラスミドｐＫＯＳ３５−７８．２からＰＣＲ増幅した。約２ｋｂのＰＣＲ産物を、ＮｓｉＩ／ＸｂａＩで切断し、そしてＮｓｉＩおよびＳｐｅＩで消化したｐＳＬ１１９０と連結してｐＫＯＳ９０−１２３（約５．４ｋｂ）を作製した。以下のプライマー：
【０３９０】
【化３７】
2004508810.tif 000049
でｐＫＯＳ３５−７８．２ＤＮＡから増幅した約２ｋｂのＰＣＲフラグメントを、ＮｓｉＩで切断し、そしてＮｓｉＩ／ＥｃｏＲＶで消化したｐＫＯＳ９０−１２３と連結してｐＫＯＳ９０−１３０（約７．５ｋｂ）を作製した。このプラスミドをＮｓｉＩで切断して、そしてＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントでＤＮＡ末端を平滑末端化して再連結する場合に、プラスミドｐＫＯＳ９０−１３１を作製する。ｇａｌＫ／ｋａｎｒカセットをこのプラスミドにクローニングするために、プラスミドＫＧ−２を、ＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩで切断し、そしてＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントで平滑末端化する。３ｋｂのフラグメントを、ｐＫＯＳ９０−１３１のＤｒａＩ部位（ＤｒａＩは、このベクター中で３回切断する）にクローニングして、プラスミドｐＫＯＳ９０−１３２（１０．５ｋｂ）を作製する。ＫＳ２ノックアウトをもたらすシステインからアラニンへの所望の変化を作製する目的で、ＮｓｉＩ部位を使用する。ｐＫＯＳ９０−１３０をＮｓｉＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩからのＫｌｅｎｏｗフラグメントで平滑末端化して再連結する場合に、システインについてのコドンを、アラニンについてのコドンに置換する。所望の菌株を作製するために上記のプロトコールに従って、得られたプラスミドを、本発明のＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ菌株に導入し得る。
【０３９１】
Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ９０−１３２．１．１．２を、この手順（エポシロンＡ、Ｂ、ＣおよびＤプロデューサーＫ１１１−３２．２５を使用する）によって構築し、そしてブダペスト条約の規約の下、２０００年１１月２１日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ　２０１１０−２２０９、ＵＳＡに寄託し、ここから受託番号ＰＴＡ−２７１５の下に得ることができる。この株によって生成される得られたＰＫＳ産物が、適切な「ジケチド」開始単位が提供される場合にエポシロンを合成し得ることを実証するために、株Ｋ９０−１３２．１．１．２を３０℃で３日間５０ｍｌのＣＴＳおよび２０％のＸＡＤ中で増殖させ、次いで以下に示すチアゾールジケチドの２００ｍｇ／ｍＬを提供した：
【０３９２】
【化３８】
2004508810.tif 000050
この株を、さらに５日間培養し、そしてＸＡＤを収集し、そしてエポシロンを１０％メタノールで抽出した。この抽出物を乾燥させ、そして０．２ｍＬのアセトニトリルに再懸濁し、そして０．０５ｍＬのサンプルを、ＬＣ／ＭＳによって分析し、これは予測されたようにエポシロンＢおよびＤの存在を示した。以下の実施例に議論されるように、この系を使用して種々のエポシロンアナログを生成し得る。
【０３９３】
（実施例１０）
（化学的生合成からの改変エポシロン）
本実施例は、化学的生合成を介したエポシロン誘導体の生成のための一連のチオエステルを記載する。Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ由来のエポシロンのための生合成遺伝子クラスターのＤＮＡ配列は、ＰＫＳのプライミングがポリケチドおよびアミノ酸成分の混合物を含むことを示す。プライミングは、マロニルＣｏＡを有するローディングモジュールのＰＫＳ様部分のローディング、その後の脱カルボキシル化および伸長モジュール１ＮＲＰＳ（システインを有する）のローディングを含み、次いで、酵素結合Ｎ−アセチルシステインを形成するための縮合を含む。チアゾリンを形成するための環化の後に、酵素結合２−メチルチアゾル−４−カルボキシレート（ローディングモジュールおよびＮＲＰＳの生成物）を形成するための酸化を行う。続くモジュール２のケトシンターゼによるメチルマロニルＣｏＡでの縮合は、スキーム６に示すようなジケチドの等価物を提供する。
【０３９４】
【化３９】
2004508810.tif 000051
本発明は、ＰＣＴ公開番号９９／０３９８６および同９７／０２３５８において６−ｄＥＢおよびエリスロマイシンアナログを作製するために記載された様式と同様の様式でエポシロン誘導体を生成するための化学的生合成のための方法および試薬を提供する。供給基質の２つの型を提供する：ＮＲＰＳ生成物のアナログ、およびジケチド等価物のアナログ。ＮＲＰＳ生成物アナログを、変異ＮＲＰＳ様ドメインを有するＰＫＳ酵素と共に使用し、そしてジケチド等価物を、モジュール２中に変異ＫＳドメインを有するＰＫＳ酵素と共に使用する（実施例９に記載のように）。以下のスキーム７および８中の構造において、Ｒ、Ｒ１およびＲ２は、メチル、エチル、低級アルキル（Ｃ１−Ｃ６）、および置換された低級アルキルからなる群より独立して選択され得る。
【０３９５】
スキーム７は、例示的なローディングモジュールアナログを示す。
【０３９６】
【化４０】
2004508810.tif 000052
ローディングモジュールアナログを、対応するカルボン酸の活性化およびＮ−アセチルシステアミンでの処理によって調製する。活性化方法は、酸塩化物の形成、混合無水物の形成、またはカルボジイミドのような縮合試薬との反応を含む。
【０３９７】
スキーム８は、例示的なジケチド等価物を示す。
【０３９８】
【化４１】
2004508810.tif 000053
ジケチド等価物を、三段階のプロセスで調製する。第一に、対応するアルデヒドを、置換されたアクリルエステルを形成するためにＷｉｔｔｉｇ試薬または等価物で処理する。このエステルを酸にケン化し、次いで、これを活性化してＮ−アセチルシステアミンで処理する。
【０３９９】
ローディングモジュール生成物アナログおよびジケチド等価物を作製するための例示的な反応スキームが続く。ジケチド等価物を作成するために適切なさらなる化合物を、本発明の宿主細胞に供給するためのＮ−アセチルシステアミドに変換されるカルボン酸（またはカルボン酸に変換され得るアルデヒド）として図１に示す。
【０４００】
（Ａ．チオフェン−３−カルボキシレート　Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル）
不活性雰囲気下で、２ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン中のチオフェン−３−カルボン酸（１２８ｍｇ）溶液を、トリエチルアミン（０．２５ｍＬ）およびジフェニルホスホリルアジド（０．５０ｍＬ）で処理した。１時間後、Ｎ−アセチルシステアミン（０．２５ｍＬ）を添加し、そして反応を１２時間進めた。この混合物を水中に注ぎ、そして等量の酢酸エチルで３回抽出した。この有機抽出物を合わせて、水、１Ｎ　ＨＣｌ、飽和ＣｕＳＯ４およびブラインで連続して洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。エーテルの次に酢酸エチルを使用するＳｉＯ２でのクロマトグラフィーによって純粋生成物（これは、静置すると結晶化する）を提供した。
【０４０１】
（Ｂ．フラン−３−カルボキシレート　Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル）
不活性雰囲気下で、２ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン中のフラン−３−カルボン酸（１１２ｍｇ）溶液を、トリエチルアミン（０．２５ｍＬ）およびジフェニルホスホリルアジド（０．５０ｍＬ）で処理した。１時間後、Ｎ−アセチルシステアミン（０．２５ｍＬ）を添加し、そして反応を１２時間進めた。この混合物を水中に注ぎ、そして等量の酢酸エチルで３回抽出した。この有機抽出物を合わせて、水、１Ｎ　ＨＣｌ、飽和ＣｕＳＯ４およびブラインで連続して洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。エーテルの次に酢酸エチルを使用するＳｉＯ２でのクロマトグラフィーによって純粋生成物（これは、静置すると結晶化する）を提供した。
【０４０２】
（Ｃ．ピロール−２−カルボキシレート　Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル）
不活性雰囲気下で、２ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン中のピロール−２−カルボン酸（１１２ｍｇ）溶液を、トリエチルアミン（０．２５ｍＬ）およびジフェニルホスホリルアジド（０．５０ｍＬ）で処理した。１時間後、Ｎ−アセチルシステアミン（０．２５ｍＬ）を添加し、そして反応を１２時間進めた。この混合物を水中に注ぎ、そして等量の酢酸エチルで３回抽出した。この有機抽出物を合わせて、水、１Ｎ　ＨＣｌ、飽和ＣｕＳＯ４およびブラインで連続して洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。エーテルの次に酢酸エチルを使用するＳｉＯ２でのクロマトグラフィーによって純粋生成物（これは、静置すると結晶化する）を提供した。
【０４０３】
（Ｄ．２−メチル−３−（３−チエニル）アクリレート　Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル）
（１）２−メチル−３−（３−チエニル）アクリル酸エチル：乾燥テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中のチオフェン−３−カルボキサルデヒド（ｃａｒｂｏｘａｌｄｅｈｙｄｅ）（１．１２ｇ）および（カルベトキシエチリデン（ｃａｒｂｅｔｈｏｘｙｅｔｈｌｉｄｅｎｅ））トリフェニルホスホラン（４．３ｇ）の混合物を、還流で１６時間加熱した。この混合物を周辺温度まで冷却し、そして減圧下で濃縮して乾燥した。この固体残渣を１：１のエーテル／ヘキサン中に再懸濁し、そして濾過して酸化トリフェニルホスフィンを除去した。この濾過物を、１：１のエーテル／ヘキサンを使用してＳｉＯ２のパッドを通して濾過して、淡黄色の油状物として生成物（１．７８ｇ、９１％）を提供した。
【０４０４】
（２）２−メチル−３−（３−チエニル）アクリル酸：（１）由来のエステルを、メタノール（５ｍＬ）および８Ｎ　ＫＯＨ（５ｍＬ）の混合物中に溶解し、そして還流で３０分間加熱した。この混合物を周辺温度まで冷却し、水で希釈し、そしてエーテルで２回洗浄した。この水相を、１Ｎ　ＨＣｌを使用して酸性化し、次いで等量のエーテルで３回抽出した。この有機抽出物を合わせ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮して乾燥した。２：１のヘキサン／エーテルからの結晶化は、無色の針状物として生成物を提供した。
【０４０５】
（３）２−メチル−３−（３−チエニル）アクリレート　Ｎ−アセチルシステアミンチオエステル：不活性雰囲気下で、２ｍＬの乾燥テトラヒドロフラン中の２−メチル−３−（３−チエニル）アクリル酸（１６８ｍｇ）溶液を、トリエチルアミン（０．５６ｍＬ）およびジフェニルホスホリルアジド（０．４５ｍＬ）で処理した。１５分後、Ｎ−アセチルシステアミン（０．１５ｍＬ）を添加し、そして反応を４時間進めた。この混合物を水中に注ぎ、そして等量の酢酸エチルで３回抽出した。この有機抽出物を合わせて、水、１Ｎ　ＨＣｌ、飽和ＣｕＳＯ４およびブラインで連続して洗浄し、次いで、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、そして減圧下で濃縮した。酢酸エチルを使用するＳｉＯ２でのクロマトグラフィーは、純粋生成物（これは、静置すると結晶化する）を提供した。
【０４０６】
上記の化合物を、本発明の組換えエポシロンＰＫＳを含む宿主細胞の培養物に補充し、ここで、伸長モジュール２のＮＲＰＳまたはＫＳドメインのいずれかが、本発明の対応するエポシロン誘導体を調製するために、変異によって不活化されている。
【０４０７】
（実施例１１）
（エポシロンアナログの生成）
（Ａ．１３−ケト−エポシロンアナログの生成）
エポシロンＰＫＳの伸長モジュール４におけるＫＲドメインの不活化は、１３−ケト−エポシロンの生成に有用な本発明のハイブリッドＰＫＳを生じる。伸長モジュール４ＫＲドメインを、野生型遺伝子を以下に記載の種々の欠失バージョンで置換することによって改変した。第一に、フラグメントを、テンプレートとしてプラスミドｐＫＯＳ３９−１１８Ｂ（コスミドｐＫＯＳ３５−７０．４由来のｅｐｏＤ遺伝子のサブクローン）を使用して増幅した。欠失の左側を形成するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、ＴＬ３およびＴＬ４であり、以下に示す：
【０４０８】
【化４２】
2004508810.tif 000054
欠失の右側を形成するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、ＴＬ５およびＴＬ６であり、以下に示す：
【０４０９】
【化４３】
2004508810.tif 000055
ＰＣＲフラグメントをベクターＬｉｔｍｕｓ　３９にクローニングし、そして配列決定して所望のフラグメントが得られたことを確認した。次いで、ＴＬ３／ＴＬ４フラグメントを含むクローンを、制限酵素ＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで消化し、そして約４．６ｋｂのフラグメントを単離した。プライマーＴＬ５／ＴＬ６を使用して得られた２．０ｋｂのＰＣＲフラグメントを、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで処理し、次いで、（ｉ）「短い」ＫＲリンカーＴＬ２３およびＴＬ２４（これらは、共にアニールされて一本鎖の突出し（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を有する二本鎖のリンカーを形成する）に連結してｐＫＯＳ１２２−２９を得るか；または（ｉｉ）「長い」（ｅｐｏＤＨ３＊）リンカー（プライマーＴＬ３３＋ＴＬ３４を使用するＰＣＲ、次いで制限酵素ＮｓｉＩおよびＳｐｅＩでの処理によって得られる）に連結し、プラスミドｐＫＯＳ１２２−３０を得るかのいずれかであった。これらのオリゴヌクレオチドリンカーおよびプライマーの配列を、以下に示す：
【０４１０】
【化４４】
2004508810.tif 000056
。
【０４１１】
所望の置換を含むプラスミドを、配列決定によって確認し、次いで、制限酵素ＤｒａＩで消化した。次いで、各クローンの大きいフラグメントを、カナマイシン耐性遺伝子およびｇａｌＫ遺伝子（ＫＧまたはｋａｎ−ｇａｌ）カセットに連結して送達プラスミドを提供した。この送達プラスミドを、エポシロンＢプロデューサーＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓであるＫ１１１−３２．２５にエレクトロポレーションによって形質転換した。これらの形質転換体をスクリーニングし、そしてカナマイシン感受性のガラクトース耐性生存体を選択して、ＫＧ遺伝子を除去したクローンを同定した。組換え株についてのＫＧの除去および所望の遺伝子置換の確認を、ＰＣＲによって実施した。これらの組換え株を、５０ｍＬのＣＴＳ培地および２％のＸＡＤ−１６と共にフラスコ中で５日間発酵させ、そしてエポシロンアナログを１０ｍＬのメタノールでＸＡＤから溶出した。構造決定は、ＬＣ／ＭＳスペクトルおよびＮＭＲに基づいた。１つのこのような株（Ｋ１２２−５６と名付けた）を、ブダペスト条約の規約の下に、２０００年１１月２１日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａ、ＶＡ　２０１１０−２２０９、ＵＳＡに寄託し、これは受託番号ＰＴＡ−２７１４の下に入手可能である。このＫ１２２−５６株（プラスミドｐＫＯＳ１２２−２９に由来する）は、１３−ケト−１１，１２−デヒドロ−エポシロンＤを主生成物として生成し、その構造は以下に示される：
【０４１２】
【化４５】
2004508810.tif 000057
。
【０４１３】
Ｋ１２２−５６株はまた、１３−ケト−エポシロンＣ（１３−ｋｅｔｏ−ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ　Ｃ）およびＤを微量産物として産生する。これらのそれぞれの構造を以下に示す：
【０４１４】
【化４６】
2004508810.tif 000058
同様の結果が、プラスミドｐＫＯＳ１２２−３０から誘導されたＫ１２２−３０株から得られた。これらの化合物ならびにこれらを産生する株およびＰＫＳ酵素は、本発明の新規な化合物、株およびＰＫＳ酵素である。
【０４１５】
１３−ケト−１１，１２−デヒドロエポシロンを産生する本発明の他の株としては、ＫＲドメインが１以上の点変異によって不活性にされている株が挙げられる。例えば、ＫＲドメイン中の構成的チロシン残基をフェニルアラニンへと変異させることは、ＫＲ活性における約１０％の減少をもたらし、そしていくらかの１３−ケト−エポシロンの産生をもたらす。ＫＲドメインにおけるさらなる変異は、ＫＲ活性をより多くまたは全て除去し得るが、エポシロン産生の減少もまたもたらし得る。
【０４１６】
（Ｂ．１３−ヒドロキシ−エポシロンアナログの産生）
エポシロンＰＫＳの伸長（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）モジュール５のＫＲドメイン、ＤＨドメインおよびＥＲドメインの、異種ＫＲドメイン（例えば、ラパマイシンＰＫＳの伸長モジュール２由来のＫＲドメインまたはＦＫ５２０　ＰＫＳの伸長モジュール３由来のＫＲドメイン）による置換は、１３−ヒドロキシエポシロンの産生において有用な本発明のハイブリッドＰＫＳをもたらす。この構築は、本実施例の第Ａ部に記載される様式と類似の様式で行われる。プラスミドｐＫＯＳ３９−１１８Ｂをテンプレートして用いて、ｅｐｏＤ遺伝子の所望の部分を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマーは以下の通りであった：
【０４１７】
【化４７】
2004508810.tif 000059
プライマーＴＬ７／ＴＬ８から生成されたＰＣＲフラグメントを、ベクターＬＩＴＭＵＳ　２８にクローニングし、得られたクローンを、制限酵素ＮｓｉＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、５．１ｋｂのフラグメントを単離し、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで処理した、ＴＬ９／ＴＬ１０から生成された２．２ｋｂのＰＣＲフラグメントに連結し、そしてＫＲカセットに連結した。ＦＫ５２０　ＰＫＳ由来のＫＲカセットを、プライマーＴＬ３１およびＴＬ３２を用いるＰＣＲによって生成し、次いで制限酵素ＸｂａＩおよびＰｓｔＩで消化した。これらのプライマーを以下に示す：
【０４１８】
【化４８】
2004508810.tif 000060
残りの株構築を、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　Ｋｌｌｌ−７２．４．４をレシピエントとして用いたこと以外は、本実施例の第Ａ部に記載したのと同様に進めた。ＦＫ５２０　ＰＫＳの伸長モジュール３のＫＲドメインが、エポシロンＰＫＳの伸長モジュール５のＫＲドメイン、ＤＨドメインおよびＥＲドメインで置換された株をＫ１２２−１４８と命名し、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９，ＵＳＡに２０００年１１月２１日にブダペスト条約の約定の下に寄託した。この株は、登録番号ＰＴＡ−２７１１の下で入手可能である。株Ｋ１２２−１４８は、１３−ヒドロキシ−１０，１１−デヒドロエポシロンＤを主な産物として産生し、そしてＣ誘導体を微量産物として産生する。これらの構造を以下に示す：
【０４１９】
【化４９】
2004508810.tif 000061
ラパマイシンＰＫＳの伸長モジュール２のＫＲドメインが置換のために用いられた、Ｋ１２２−５２と命名された同様の株は、同じ化合物を産生した。これらの化合物ならびにこれらを産生する株およびＰＫＳ酵素は、本発明の新規な化合物、株およびＰＫＳ酵素である。
【０４２０】
（Ｃ．９−ケト−エポシロンアナログの産生）
エポシロンＰＫＳの伸長モジュール６のＫＲドメインの不活化は、９−ケト−エポシロンを産生し得る本発明の新規なＰＫＳをもたらす。ＫＲドメインは、１以上の保存された残基を変更することによる部位特異的変異誘発によって不活化され得る。エポシロンＰＫＳの伸長モジュール６のＫＲドメインのＤＮＡおよびアミノ酸の配列を以下に示す：
【０４２１】
【化５０】
2004508810.tif 000062
本発明によって提供される新規な９−ケト−エポシロンＰＫＳの伸長モジュール６の、変異し、かつ不活性なＫＲドメインのＤＮＡおよびアミノ酸の配列を以下に示す：
【０４２２】
【化５１】
2004508810.tif 000063
この変異したＫＲドメインコード配列を含む株を、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ　Ｋ１１１−７２．４．４をレシピエントとして用いたこと以外は、本実施例の第Ａ部に記載したように一般的に構築した。伸長モジュール６のＫＲドメインが不活化された株をＫ３９−１６４と命名し、そしてＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９，ＵＳＡに２０００年１１月２１日にブダペスト条約の約定の下に寄託した。この株は、登録番号ＰＴＡ−２７１６の下で入手可能である。株Ｋ３９−１６４は、９−ケト−エポシロンＤを主な産物として産生し、そしてＣ誘導体を微量産物として産生する。これらの構造を以下に示す：
【０４２３】
【化５２】
2004508810.tif 000064
これらの化合物ならびにこれらを産生する株およびＰＫＳ酵素は、本発明の新規な化合物、株およびＰＫＳ酵素である。
【０４２４】
（Ｄ．２−メチル−エポシロンアナログの産生）
エポシロンＡ、エポシロンＢ、エポシロンＣおよびエポシロンＤの２−メチル−エポシロンアナログは、伸長モジュール９のＡＴドメイン（「ｅｐｏＡＴ９」）についてのコード配列を、メチルマロニルＣｏＡについて特異的なＡＴドメインについてのコード配列で置換することによって構築され得る。従って、適切な置換ＡＴドメインコード配列は、例えば、ＦＫ５２０　ＰＫＳの伸長モジュール２をコードする遺伝子（「ＦＫＡＴ２」；本明細書中に参考として援用されるＰＣＴ公開番号００／０２０６０１を参照のこと）；エポシロンＰＫＳの伸長モジュール２をコードする遺伝子（「ｅｐｏＡＴ２」）；およびｔｍｂＡ遺伝子によってコードされるＰＫＳの伸長モジュール３をコードする遺伝子（「ｔｍｂＡＴ３」；米国特許第６，０９０，６０１号および２００１年２月１５日に出願された米国特許出願第６０／２７１，２４５号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される））から入手され得る。置換は、一般的に上記の通りに行われ、そして産生される特定のエポシロンは、どのエポシロンが、置換が行われたＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主によって産生されるかにのみ依存する。
【０４２５】
従って、ｅｐｏＡＴ９コード配列（ヌクレオチド５０９７９〜ヌクレオチド５２０２６）は、連結部に、操作されたＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）およびＮｓｉＩ（ＡＴＧＣＡＴ）制限酵素認識配列を有する、ｅｐｏＡＴ２コード配列（ヌクレオチド１２２５１〜ヌクレオチド１３２８７）またはＦＫＡＴ２コード配列またはｔｍｂＡＴ３コード配列のいずれかによって置換される。
【０４２６】
第一のＰＣＲを用いて、テンプレートとして用いたｐＫＯＳ３９−１２５のＤＮＡから約１．６ｋｂのフラグメントを生成する。このＰＣＲフラグメントを、ベクターＬＩＴＭＵＳ２８にＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＢｇｌＩＩ部位でサブクローニングし、そして配列決定する；所望の配列を有するプラスミドをＰ１と命名する。このＰＣＲにおいて用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【０４２７】
【化５３】
2004508810.tif 000065
第二のＰＣＲを用いて、テンプレートとしてｐＫＯＳ３９−１２５　ＤＮＡを用いて約１．９ｋｂのフラグメントを生成する。このＰＣＲフラグメントを、ベクターＬＩＴＭＵＳ２８にＮｓｉＩ部位およびＳｐｅＩ部位でサブクローニングし、そして配列決定する；所望の配列を有するプラスミドをＰ２と命名する。このＰＣＲにおいて用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【０４２８】
【化５４】
2004508810.tif 000066
次いで、プラスミドＰ１を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩで消化し、そして４．５ｋｂのフラグメントを単離し、そしてプラスミドＰ２由来の約１．９ｋｂのＮｓｉＩ−ＳｐｅＩ制限フラグメントおよびＮｓｉＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグメントとして単離された３つの置換ＡＴフラグメント（ＦＫＡＴ２、ｅｐｏＡＴ２、ｔｍｂＡＴ３）のうちの１つと連結して、プラスミドＰ３．１、Ｐ３．２およびＰ３．３を得た。置換ＡＴフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって生成する：
【０４２９】
【化５５】
2004508810.tif 000067
次いで、プラスミドＰ３．１、Ｐ３．２およびＰ３．３を、ｋａｎ−ｇａｌカセットのＤｒａＩ部位での挿入によって改変する。得られるプラスミドを、本発明のエポシロン産生性Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞（すなわち、Ｋ１１１−７２．４．４）に形質転換し、そしてこの細胞を培養し、上記の通りに二重交叉組換え事象について選択する。選択されたコロニーをＰＣＲによってスクリーニングする。所望の組換え事象を示すコロニーを５０ｍＬ培養において培養し、そして所望の化合物の産生についてＬＣ／ＭＳによってスクリーニングする。予想される産物は、２−メチル−エポシロンＤおよび２−メチル−エポシロンＣである。これらの構造を以下に示す。
【０４３０】
【化５６】
2004508810.tif 000068
（Ｅ．６−デスメチル−エポシロンアナログの産生）
エポシロンＡ、エポシロンＢ、エポシロンＣおよびエポシロンＤの６−デスメチル−エポシロンアナログは、伸長モジュール７のＡＴドメイン（「ｅｐｏＡＴ７」）についてのコード配列を、マロニルＣｏＡに特異的なＡＴドメインについてのコード配列で置換することによって構築され得る。従って、適切な置換ＡＴドメインコード配列は、例えば、ＦＫ５２０　ＰＫＳの伸長モジュール３をコードする遺伝子；エポシロンＰＫＳの伸長モジュール５をコードする遺伝子（「ｅｐｏＡＴ５」）；およびｔｍｂＡ遺伝子によってコードされるＰＫＳの伸長モジュール４をコードする遺伝子（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）から入手され得る。置換は、一般的に上記の通りに行われ、そして産生される特定のエポシロンは、どのエポシロンが、置換が行われたＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主によって産生されるかにのみ依存する。
【０４３１】
従って、ｅｐｏＡＴ７コード配列（ヌクレオチド３９５８５〜ヌクレオチド４０６２６）は、連結部に、操作されたＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）およびＮｓｉＩ（ＡＴＧＣＡＴ）制限酵素認識配列を有する、ｅｐｏＡＴ５コード配列（ヌクレオチド２６７９３〜ヌクレオチド２７８３３）またはＦＫＡＴ３コード配列またはｔｍｂＡＴ４コード配列のいずれかによって置換される。
【０４３２】
第一のＰＣＲを用いて、テンプレートとして用いたｐＫＯＳ３９−１２５のＤＮＡから約１．８ｋｂのフラグメントを生成する。このＰＣＲフラグメントを、ベクターＬＩＴＭＵＳ２８にＮｓｉＩ部位およびＳｐｅＩ部位でサブクローニングし、そして配列決定する；所望の配列を有するプラスミドをＰ４と命名する。このＰＣＲにおいて用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【０４３３】
【化５７】
2004508810.tif 000069
第二のＰＣＲを用いて、テンプレートとしてｐＫＯＳ０３９−１１８Ｂ　ＤＮＡを用いて約２．１ｋｂのフラグメントを生成する。このＰＣＲにおいて用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【０４３４】
【化５８】
2004508810.tif 000070
このＰＣＲフラグメントを、ＬＩＴＭＵＳ２８にＥｃｏＲＶ制限部位でサブクローニングし、そして所望の配列を有するプラスミドを、配列決定によって同定し、そしてプラスミドｐＫＯＳ１２２−４と命名する。次いで、プラスミドｐＫＯＳ１２２−４を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩで消化し、そして４．８ｋｂのフラグメントを単離し、そしてプラスミドＰ４由来の約１．８ｋｂのＮｓｉＩ−Ｓｐｅｌ制限フラグメントおよびＮｓｉＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグメントとして単離された３つの置換ＡＴフラグメント（ＦＫＡＴ３、ｅｐｏＡＴ５、ｔｍｂＡＴ４）のうちの１つと連結して、プラスミドＰ５．１、Ｐ５．２およびＰ５．３を得る。置換ＡＴフラグメントを、以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いるＰＣＲによって生成する：
【０４３５】
【化５９】
2004508810.tif 000071
次いで、プラスミドＰ５．１、Ｐ５．２およびＰ５．３を、ｋａｎ−ｇａｌカセットのＤｒａＩ部位での挿入によって改変する。得られるプラスミドを、本発明のエポシロン産生性Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞（すなわち、Ｋ１１１−７２．４．４）に形質転換し、そしてこの細胞を培養し、上記の通りに二重交叉組換え事象について選択する。選択されたコロニーをＰＣＲによってスクリーニングする。所望の組換え事象を示すコロニーを５０ｍＬ培養において培養し、そして所望の化合物の産生についてＬＣ／ＭＳによってスクリーニングする。予想される化合物は、６−デスメチル−エポシロンＤおよび６−デスメチル−エポシロンＣである。これらの構造を以下に示す。
【０４３６】
【化６０】
2004508810.tif 000072
（Ｆ．１０−メチル−エポシロンアナログの産生）
エポシロンＡ、エポシロンＢ、エポシロンＣおよびエポシロンＤの１０−メチル−エポシロンアナログは、伸長モジュール５のＡＴドメイン（「ｅｐｏＡＴ５」）についてのコード配列を、メチルマロニルＣｏＡに特異的なＡＴドメインについてのコード配列で置換することによって構築され得る。従って、適切な置換ＡＴドメインコード配列は、例えば、ＦＫ５２０　ＰＫＳの伸長モジュール２をコードする遺伝子（本明細書中に参考として援用される）；エポシロンＰＫＳの伸長モジュール２をコードする遺伝子（「ｅｐｏＡＴ２」）；およびｔｍｂＡ遺伝子によってコードされるＰＫＳの伸長モジュール３をコードする遺伝子から入手され得る。置換は、一般的に上記の通りに行われ、そして産生される特定のエポシロンは、どのエポシロンが、置換が行われたＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主によって産生されるかにのみ依存する。
【０４３７】
従って、ｅｐｏＡＴ５コード配列（ヌクレオチド２６７９３〜ヌクレオチド２７８３３）は、連結部に、操作されたＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）およびＮｓｉＩ（ＡＴＧＣＡＴ）制限酵素認識配列を有する、ｅｐｏＡＴ２コード配列（ヌクレオチド１２２５１〜ヌクレオチド１３２８７）またはＦＫＡＴ２コード配列またはｔｍｂＡＴ３コード配列のいずれかによって置換される。
【０４３８】
プライマーＴＬ１１およびＴＬ１２からプラスミドｐＫＯＳ３９−１１８Ｂをテンプレートとして用いて生成されたＰＣＲフラグメントを、ベクターＬＩＴＭＵＳ　２８にクローニングする。用いたＰＣＲプライマーは以下の通りである：
【０４３９】
【化６１】
2004508810.tif 000073
所望の挿入物を含むプラスミドを、ＤＮＡ配列決定によって同定する。次いで、このプラスミドを制限酵素ＮｓｉＩおよびＸｂａＩで消化し、そして４．６ｋｂのフラグメントを単離する。このフラグメントを、プライマーＴＬ５およびＴＬ６（本実施例の第Ａ部に記載される）から得られ、制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＸｂａＩで消化された２．０ｋｂのＰＣＲフラグメントおよび、ＮｓｉＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグメントとして単離された３つの置換ＡＴフラグメント（ＦＫＡＴ２、ｅｐｏＡＴ２、ｔｍｂＡＴ３）のうちの１つと連結して、プラスミドＰ６．１、Ｐ６．２およびＰ６．３を得る。次いで、これらの後者の３つのプラスミドを、ｋａｎ−ｇａｌカセットのＤｒａＩ部位での挿入によって改変する。得られるプラスミドを、本発明のエポシロン産生性Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞（すなわち、Ｋ１１１−７２．４．４）に形質転換し、そしてこの細胞を培養し、上記の通りに二重交叉組換え事象について選択する。選択されたコロニーをＰＣＲによってスクリーニングする。所望の組換え事象を示すコロニーを５０ｍＬ培養において培養し、そして所望の化合物の産生についてＬＣ／ＭＳによってスクリーニングする。予想される化合物は、１０−メチル−エポシロンＤ（１０−ｍｅｔｈｙｌ−ｅｐｏｔｈｉｋｌｏｎｅ　Ｄ）および１０−メチル−エポシロンＣである。これらの構造を以下に示す：
【０４４０】
【化６２】
2004508810.tif 000074
（Ｇ．１４−メチル−エポシロンアナログの産生）
エポシロンＡ、エポシロンＢ、エポシロンＣおよびエポシロンＤの１４−メチル−エポシロンアナログは、伸長モジュール３のＡＴドメイン（「ｅｐｏＡＴ３」）についてのコード配列を、メチルマロニルＣｏＡに特異的なＡＴドメインについてのコード配列で置換することによって構築され得る。従って、適切な置換ＡＴドメインコード配列は、例えば、ＦＫ５２０　ＰＫＳの伸長モジュール２をコードする遺伝子；エポシロンＰＫＳの伸長モジュール２をコードする遺伝子（「ｅｐｏＡＴ２」）；およびｔｍｂＡ遺伝子によってコードされるＰＫＳの伸長モジュール３をコードする遺伝子から入手され得る。置換は、一般的に上記の通りに行われ、そして産生される特定のエポシロンは、どのエポシロンが、置換が行われたＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ宿主によって産生されるかにのみ依存する。
【０４４１】
従って、ｅｐｏＡＴ３コード配列（ヌクレオチド１７８１７〜ヌクレオチド１８８５８）は、連結部に、操作されたＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）およびＮｓｉＩ（ＡＴＧＣＡＴ）制限酵素認識配列を有する、ｅｐｏＡＴ２コード配列（ヌクレオチド１２２５１〜ヌクレオチド１３２８７）またはＦＫＡＴ２コード配列またはｔｍｂＡＴ３コード配列のいずれかによって置換される。
【０４４２】
第一のＰＣＲを用いて、テンプレートとして用いたｐＫＯＳ３９−１２４のＤＮＡから約１．８ｋｂのフラグメントを生成する。このＰＣＲフラグメントを、ベクターＬＩＴＭＵＳ２８にＸｂａＩ部位およびＢｇｌＩＩ部位でサブクローニングし、そして配列決定する；所望の配列を有するプラスミドをＰ９と命名する。このＰＣＲにおいて用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【０４４３】
【化６３】
2004508810.tif 000075
第二のＰＣＲを用いて、テンプレートとして使用したｐＫＯＳ３９−１２４　ＤＮＡを用いて約１．９ｋｂのフラグメントを生成する。このＰＣＲフラグメントを、ベクターＬＩＴＭＵＳ２８にＮｓｉＩ部位およびＳｐｅＩ部位でサブクローニングし、そして配列決定した；所望の配列を有するプラスミドをＰ１０と命名する。このＰＣＲにおいて用いたオリゴヌクレオチドは以下の通りである：
【０４４４】
【化６４】
2004508810.tif 000076
次いで、プラスミドＰ９を制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＳｐｅＩで消化し、そして４．５ｋｂのフラグメントを単離し、そしてプラスミドＰ１０由来の約１．９ｋｂのＮｓｉＩ−ＳｐｅＩ制限フラグメントおよびＮｓｉＩ−ＢｇｌＩＩ制限フラグメントとして単離された３つの置換ＡＴフラグメント（ＦＫＡＴ２、ｅｐｏＡＴ２、ｔｍｂＡＴ３）のうちの１つと連結して、プラスミドＰ１１．１、Ｐ１１．２およびＰ１１．３を得る。次いで、これらの後者の３つのプラスミドを、ｋａｎ−ｇａｌカセットのＤｒａＩ部位での挿入によって改変する。得られるプラスミドを、本発明のエポシロン産生性Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞（すなわち、Ｋ１１１−７２．４．４）に形質転換し、そしてこの細胞を培養し、上記の通りに二重交叉組換え事象について選択する。選択されたコロニーをＰＣＲによってスクリーニングする。所望の組換え事象を示すコロニーを５０ｍＬ培養において培養し、そして所望の化合物の産生についてＬＣ／ＭＳによってスクリーニングする。予想される化合物は、１４−メチル−エポシロンＤおよび１４−メチル−エポシロンＣである。これらの構造を以下に示す。
【０４４５】
【化６５】
2004508810.tif 000077
（Ｈ．１０，１１−デヒドロ−エポシロンアナログの生成）
１つの実施形態において、本発明は、新規なエポシロン（１０，１１−デヒドロエポシロンＤ）およびこの化合物を産生する組換え宿主細胞を提供する。１０，１１−デヒドロエポシロンＤの構造を以下に示す。
【０４４６】
【化６６】
2004508810.tif 000078
。
【０４４７】
別の実施形態において、本発明は、任意の１０，１１−デヒドロエポシロンアナログを、対応するエポシロンを産生するエポシロンＰＫＳの、伸長モジュール５のＥＲドメインの不活化によって作製する方法を提供する。
【０４４８】
１つの実施形態において、１０，１１−デヒドロエポシロンＤを生成する株を、伸長モジュール５のエノイルレダクターゼ（ＥＲ）ドメインを不活化することによって構築する。１つの実施形態において、このＥＲ不活化を、ＮＡＤＰＨ結合領域における２つのグリシン（−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−）を、アラニンおよびセリン（−Ａｌａ−Ｓｅｒ−）に変更することによって達成する。プラスミドｐＫＯＳ３９−１１８Ｂ（コスミドｐＫＯＳ３５−７０．４由来のｅｐｏＤ遺伝子のサブクローン）由来のこの２．５ｋｂ　ＢｂｖＣＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＴＬ７としてｐＬｉｔｍｕｓ２８にクローニングし、これを部位指向変異誘発（ｓｉｔｅ　ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）のためのテンプレートとして使用する。−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−をＮＡＤＰＨ結合ドメイン中の−Ａｌａ−Ｓｅｒ−変異に導入するためのオリゴヌクレオチドプライマーは、以下である：
【０４４９】
【化６７】
2004508810.tif 000079
。
【０４５０】
置換を含むＰＣＲクローンを、配列決定によって確認し、そして制限酵素ＤｒａＩで消化し、そしてエビアルカリホスファターゼで処理する。次いで、それぞれのクローンの大きいフラグメントを、カナマイシン耐性遺伝子およびｇａｌＫ遺伝子（ＫＧ、すなわちｋａｎ−ｇａｌ）カセットを用いて連結し、送達プラスミドを提供する。送達プラスミドは、エポシロンＤ産生株Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ　Ｋ１１１−７２−４．４またはＫ１１１−４０−１中に、エレクトロポレーションによって形質転換される。この形質転換体をスクリーニングし、そしてカナマイシン−感受性の生存性、ガラクトース−耐性の生存体を選択し、ＫＧ遺伝子が排除されたクローンを同定する。ＫＧ排除および組換え体株についての所望の遺伝子の置換の確認を、ＰＣＲによって行う。この組換え株を、５０ｍＬのＣＴＳ培地（カシトン（ｃａｓｉｔｏｎｅ）、５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４、２ｇ／Ｌ；Ｌ−アラニン、１ｍｇ／Ｌ；Ｌ−セリン、１ｍｇ／Ｌ；グリシン、１ｍｇ／Ｌ；およびＨＥＰＥＳ緩衝液、５０ｍＭ）および２％のＸＡＤ−１６を有するフラスコ中で７日間発酵させ、そして１０，１１−デヒドロエポシロンＤをＸＡＤ樹脂から１０ｍＬのメタノールを用いて溶出する。
【０４５１】
（Ｉ．発酵によるオキサゾール含有エポシロンの生成）
１つの実施形態において、本発明は、オキサゾール含有エポシロン（この対応するエポシロンのチアゾール部分が、オキサゾールと置換されている）を、本発明によって提供されるエポシロン産生株（例えば、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ株またはＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ株）を発酵させることによって、Ｌ−セリンで補充した培地中で得る方法を提供する。
【０４５２】
本発明のこの局面を例示するために、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−４０．１またはＫ１１１−７２．４．４培養物を、Ｌ−セリンがバッチ培地（２．３ｍＭ）において基底セリン濃度の１１×、５１×、１０１×および２０１×で存在する以外は、実施例３の方法に従って発酵させる。従って、このバッチ培地含有５０ｍＬ培養物は、２０ｇ／ＬのＸＡＤ−１６；５ｇ／Ｌのカシトン；２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４；７ｍＭ／Ｌのオレイン酸メチル；および４ｍＭ／Ｌの微量金属溶液を含み、適切な濃度の濾過滅菌したＬ−セリンの１．２５Ｍ溶液を添加する。基礎培地において観察されたこのバッチ力価は、Ｅｐｏ　Ｃ：０．４ｍｇ／Ｌ、Ｅｐｏ　Ｄ：２ｍｇ／Ｌ、ＥｐｏＨ１（オキサゾールのＣアナログ）：検出されず、およびＥｐｏ　Ｈ２（オキサゾールのＤアナログ）：０．０２ｍｇ／Ｌであった。セリン濃度の上昇は、ｅｐｏＣおよびｅｐｏＤ濃度を減少した（５１×の補充ではほとんど検出不可能なレベル）。従って、基礎培地における５１×補充したＬ−セリンのバッチ力価は、Ｅｐｏ　Ｃ：０．０３ｍｇ／Ｌ、Ｅｐｏ　Ｄ：０．０５ｍｇ／Ｌ、Ｅｐｏ　Ｈ１：０．１２ｍｇ／Ｌ；およびＥｐｏ　Ｈ２：０．１３ｍｇ／Ｌであった。流加培養プロトコールは、観察される力価をほぼ１０倍に上昇させ得た。
【０４５３】
（Ｊ．エポシロンアナログの構築）
１つの実施形態において、本発明は、エポシロンおよび本発明の組換えエポシロンＰＫＳ酵素によって産生されるエポシロン誘導体を提供し、このエポシロン誘導体は、（ｉ）伸長モジュール１　ＮＲＰＳの特異性が、システインから別のアミノ酸に変更され；（ｉｉ）ローディングドメインがＮＲＰＳまたはＣｏＡリガーゼに変更され；あるいは（ｉｉｉ）　（ｉ）および（ｉｉ）の両方である。この実施例は、このような本発明の組換えエポシロンＰＫＳ酵素がどのようにして構築されるかを記載する；この実施例において引用される文献は、本実施例の最後に列挙され、そしてこの文章中において引用番号によって参照され、そして参考として本明細書中で援用される。
【０４５４】
エポシロンは、環化されそして酸化されてチアゾールを形成するアミノ酸システインを含む。２つの他のアミノ酸（セリンおよびスレオニン）は、同様の環化および酸化を受けて、それぞれオキサゾールおよびメチルオキサゾールを生成し得る。例えば、エポシロンＤのオキサゾール誘導体およびメチルオキサゾール誘導体を以下に示す。
【０４５５】
【化６８】
2004508810.tif 000080
オキサゾールまたはメチルオキサゾールのいずれかを有するエポシロンのアナログを構築するために、伸長モジュール１（ＮＲＰＳモジュール）の操作を実行し得る。成長モジュールを拡張するＮＲＰＳモジュールは、最低限、アミノ酸、アデニル化ドメイン、ＰＣＰまたはペプチジルキャリアタンパク質ドメインを活性化するドメインから構成され、これはアミノ酸をＮＲＰＳおよび圧縮ドメインに連結し、この圧縮ドメインはアミノ酸を成長モジュールのカルボキシル基に圧縮してペプチド結合を形成する（５、７）。このアミノ酸の特異性を決定するための認識配列を、アデニル化ドメイン、特にＡ４コンセンサス配列とＡ５コンセンサス配列との間に見出す（４）。この領域の分析は、このタンパク質領域中の重要なアミノ酸が、どのアミノ酸がＮＲＰＳによって使用されるかを予測し得ることを示した（２、８）。完全なＮＲＰＳアデニル化領域を別のアデニル化領域と交換する実験を行い、新規なアデニル化ドメインのアミノ酸特異性を有するハイブリッドＮＲＰＳを得る（６、９）。アデニル化領域のより小さな領域（例えば、Ａ４コンセンサス配列とＡ５コンセンサス配列との間の領域）を使用する実験は、報告されていない。１つの実施形態において、本発明のハイブリッドＰＫＳは、ｖｉｂＦおよびｂｌｍＶＩＩ（これはスレオニンを利用する）由来のドメインを有し、ならびにブレオマイシン遺伝子クラスターのｂｌｍＶＩ由来のＮＲＰＳ−４領域（これはセリンを利用する）を有するｅｐｏＢ由来のアデニル化ドメインの、Ａ４コンセンサス領域とＡ５コンセンサス領域との間の領域を置換することによって構築される（３）。
【０４５６】
最近の実験は、圧縮ドメインが、不正確なアミノ酸がＰＣＰに接着しているか否かを検出し得ることを示唆する（１）。一旦、不正確なアミノ酸が検出されると、圧縮反応の効率が減少する。これを回避するために、アデニル化ドメインの交換に加えて、アデニル化ドメインの特異性を変更し、そして十分に活性なＮＲＰＳを操作するために、同族の圧縮ドメインまたを使用し得る。
【０４５７】
本発明はまた、エポシロンのオキサゾール形態およびメチルオキサゾール形態の１６個のデスメチル誘導体を産生する組換えエポシロンＰＫＳ酵素を提供する。このような酵素は、伸長モジュール２、ｅｐｏＣのＡＴドメインを、メチルマロニル特異性からマロニル特異性まで変更することによって構築される。この構築物を作製するために使用され得るＡＴドメインとしては、エポシロンクラスターの伸長モジュール５および９、ならびにソラフェン（ｓｏｒａｐｈｅｎ）遺伝子クラスター由来の伸長モジュール２および４由来のドメインが挙げられる。
【０４５８】
本発明はまた、ＥｐｏＡタンパク質がＮＲＰＳによって置換されている組換えＰＫＳ酵素を提供する。本発明はまた、このような酵素によって産生された新規なエポシロンを提供する。エポシロンの生合成は、ローディングモジュール（ＥｐｏＡ）のＡＣＰ上にマロネートをロードすることによって開始する。このマロネートは、ＫＳドメインによって実質的に脱カルボキシル化され、次いでＥｐｏＢに対するアセチル部分（ＮＲＰＳモジュール）として移入される。この分子がＥｐｏＢによって影響された後、得られた化合物は２−メチルチアゾルである。
【０４５９】
チアゾール上の２位で接着されるアミノ酸を有するアナログを作製するために、ｅｐｏＡの欠失およびＮＲＰＳモジュールの挿入が必要とされる。任意のＮＲＰＳモジュールが使用され得る；しかし、ほぼ保存的な変化を作製するために、下流のＮＲＰＳモジュールと自然に連絡するｅｐｏＡを置換するＮＲＰＳモジュールを使用し得る。さらに、ｅｐｏＡを置換するＮＲＰＳがローディングモジュールであるので、圧縮ドメインは必要ではない。これは、拡張ＮＲＰＳモジュールを取ること、および圧縮ドメインを除去することまたは天然のローディングモジュールであり従って圧縮ドメインを欠くＮＲＰＳを使用することによって行なわれ得る。例示的なＮＲＰＳローディングモジュールは、ｓａｆＢ由来のローディングモジュールであり、これはアラニンを使用しそしてＭ．ｘａｎｔｈｕｓ由来である。
【０４６０】
ｅｐｏＡの位置にｓａｆＢローディングモジュールを含むＭ．ｘａｎｔｈｕｓ株を構築することにおいて、新規なローディングモジュールおよびｅｐｏＢについての最適な境界を決定し得る。ＰＫＳタンパク質の間のリンカー領域は、しばしばこのＰＫＳタンパク質の間の「連絡」のために重要である。最適なリンカーを検査するための３つの異なる株を構築し得る。第１に、ＥｐｏＡのＡＣＰドメインは、ｓａｆＢのローディングドメインのアデニル化ドメインに融合される。この構築物は、ＥｐｏＡのＡＣＰがＰＣＰとして機能することを必要とする。ＰＣＰおよびＡＣＰドメイは機能的に同様ではあるが、これらは高い配列同一性を示さず、そして従って、これらが認識しそして結合し得るものに制限され得る。これらの第２の構築物は、ＳａｆＢローディングモジュールのＰＣＰドメインのＥｐｏＡ下流の最後のいくつかのアミノ酸を融合し、従ってＥｐｏＢと「連絡する」ハイブリッドローディングモジュールについてのリンカー領域の必要性を提供する。最後に、ＥｐｏＢとのＳａｆＢローディングモジュールの融合が構築される。ＳａｆＢは２つのモジュールから構成されるので、全てのＳａｆＢのローディングモジュールを取り、そして直接ＥｐｏＢと融合して融合タンパク質を得ることは可能であり、これはＳａｆＢローディングモジュールとＥｐｏＢとの間の連絡のために最適であるべきである。
【０４６１】
一旦ＳａｆＢまたは別の任意のローディングＮＲＰＳドメインが使用されて、エポシロンのチアゾール上の２−メチルがアミノ酸で置換されると、次いで新規なローディングＮＲＰＳモジュールにおいて変化が生じ得、それによって任意のアミノ酸分子が使用されてエポシロンアナログの合成を開始し得た。潜在的なアミノ酸、およびこれらの交換のために使用され得るこれらの対応するＮＲＰＳモジュールの包括的なリストは、Ｃｈａｌｌｉｓらによって提供される（２）。
【０４６２】
全ての置換は、Ｋ１１１−３２．２５（エポシロン遺伝子を含むＭ．ｘａｎｔｈｕｓ株）またはＫ１１１−４０−１（エポシロン遺伝子を含むＭ．ｘａｎｔｈｕｓ株であり、ｅｐｏＫ遺伝子が機能的産物を生成しない）、あるいは本発明の任意の他のエポシロン産生株またはＳｏｒａｎｇｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍにおいて行なわれ得る。Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓにおいて、適切な構築物は、プラスミド上で、ｇａｌＫおよびカナマイシン選択を使用して作製され得、そして使用されて、野生型遺伝子を操作された遺伝子で置換する。例えば、Ｋ１１１−４０−１におけるＮＲＰＳを、セリンについて特異的であるＮＲＰＳで置換することは、エポシロンＤの２−メチル−オキサゾール誘導体およびエポシロンＣの２−メチル−オキサゾール誘導体を、それぞれ主産物および少数の産物として作製することが予期される。これらの化合物の構造を、以下に示す：
【０４６３】
【化６９】
2004508810.tif 000081
。
【０４６４】
Ｋ１１１−４０−１におけるＮＲＰＳを、スレオニンについて特異的であるＮＲＰＳで置換することは、以下の化合物ならびにそれぞれの主産物および少数の産物が予期される：
【０４６５】
【化７０】
2004508810.tif 000082
。
【０４６６】
Ｋ１１１−４０−１におけるＮＲＰＳを、グリシン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、バリン、およびチロシンについて特異的であるＮＲＰＳで置換することは、それぞれの主産物および少数の産物として以下の化合物を作製することが、各々予期され：
【０４６７】
【化７１】
2004508810.tif 000083
ここで、Ｒ’は、アミノ酸における特異的な側鎖に対応する（例えば、Ｒ’は、グリシンについてのアミノ酸の一般式　ＮＨ２−ＣＨＲ’ＣＯＯＨにおいてＨであり、そしてアラニンについてはメチルであり、など）。
【０４６８】
Ｋ１１１−４０−１におけるＮＲＰＳを、プロリンについて特異的であるＮＲＰＳで置換することは、それぞれの主産物および少数の産物として以下の化合物を作製することが予期される：
【０４６９】
【化７２】
2004508810.tif 000084
。
【０４７０】
この節において引用された文献は、以下の通りである。
【０４７１】
【化７３】
2004508810.tif 000085
。
【０４７２】
（実施例１２）
（生物学的アッセイ）
１０，１１−デヒドロエポシロンＤを、４つの異なるヒト腫瘍細胞株中でスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイを使用して、抗癌活性についてスクリーニングした。１０，１１−デヒドロエポシロンＤは、ＩＣ５０（２８ｎＭから４０ｎＭの範囲）を有する４つの全てに対して成長阻害効果を示す。作用の機能は、化合物がチューブリン重合化を促進することを明らかにする細胞ベースのチューブリン重合化アッセイによって決定された。ヒト癌細胞株ＭＣＦ−７（乳房）、ＮＣＩ／ＡＤＲ−Ｒｅｓ（乳房、ＭＤＲ）、ＳＦ−２６８（神経膠腫）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅから入手した。この細胞を、５％のＣＯ２−加湿大気中３７℃で、１０％のウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および２ｍＭのＬ−グルタミンで補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）において維持した。
【０４７３】
１０，１１−デヒドロエポシロンＤの細胞毒性を、ＳＲＢアッセイ（Ｓｋｅｈａｎら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８２：１１０７〜１１１２（１９９０））（これは本明細書中で参考として援用される）によって決定した。培養細胞をトリプシン処理し、計数し、そして増殖培地で１００μｌ当たり以下の濃度まで希釈した：ＭＣＦ−７、５０００；ＮＣＩ／ＡＤＲ−Ｒｅｓ、７５００；ＮＣＩ−Ｈ４６０、５０００；およびＳＦ−２６８、７５００。この細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート中に１００μｌ／ウェルで播種した。２０時間後、１００μｌの１０，１１−デヒドロエポシロンＤ（増殖培地中１０００ｎＭから０．００１ｎＭまでの範囲の希釈）をそれぞれのウェルに添加した。３日間この化合物でインキュベーションした後、この細胞を１００μｌの１０％トリ塩素酸（「ＴＣＡ」）で、１時間４℃で固定化し、そして０．２％のＳＲＢ／１％の酢酸で、室温で２０分間染色した。非結合色素を、１％の酢酸でリンスして除去し、次いで結合ＳＲＢを、２００μｌの１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ塩基によって抽出した。結合した色素の量を、ＯＤ５１５ｎｍによって決定し、これは総細胞タンパク質成分と関連がある。次いでこのデータを、Ｋａｌｅｉｄａ　ＧｒａｐｈプログラムおよびＩＣ５０計算を使用して分析した。化学的に合成されるエポシロンＤを、比較として並行して試験した。
【０４７４】
チューブリン重合化アッセイにおいて、ＭＣＦ−７細胞を３５ｍｍ培養皿中でコンフルエントまで増殖させ、そして１μＭの１０，１１−デヒドロエポシロンＤまたは１μＭのエポシロンＤのいずれかで、０、１もしくは２時間、３７℃で処理した（Ｇｉａｎｎａｋａｋｏｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７１：１７１１８〜１７１２５（１９９７）；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　７５：５７〜６３（１９９８）（これらは参考として本明細書中に援用される）。細胞をカルシウムまたはマグネシウムを含まない２ｍｌのＰＢＳで２回洗浄した後、この細胞を、３００μｌの溶解緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ、ＰＨ６．８、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、２ｍＭ　ＥＧＴＡ、１％　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００およびプロテアーゼインヒビター）で、室温で５〜１０分間溶解した。この細胞を掬い取り、そしてこの溶解物を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。次いでこの溶解物を、室温で１２分間、１８０００ｇで遠心分離した。可溶性または重合化していない（細胞質ゾル）チューブリンを含む上清を、不溶性または重合化した（細胞骨格）チューブリンを含むペレットから分離し、そして新しいチューブに移した。次いでこのペレットを、３００μｌの溶解緩衝液中に再懸濁した。この細胞におけるチューブリン重合化の変化を、それぞれのサンプルのアリコートの同量をＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析し、続いて抗チューブリン抗体（Ｓｉｇｍａ）を使用する免疫ブロッティングによって決定した。
【０４７５】
いくつかの実験の結果は、１０，１１−デヒドロエポシロンＤ（「Ｅｐｏ４９０」と略される）は、２８ｎＭから４０ｎＭの範囲において４つの異なるヒト腫瘍細胞株に対するＩＣ５０を有することを示した。
【０４７６】
【表１３】
2004508810.tif 000086
チューブリン重合アッセイは、１０，１１−デヒドロエポシロンＤはエポシロンＤと同じ作用の機構を有することを明らかにする。ＭＣＦ−７細胞において、１０，１１−デヒドロエポシロンＤは、試験される条件でチューブリン重合化を強力に促進し、エポシロンＤと同様の反応速度論および効率を有する。本発明の他の化合物を、１０，１１−デヒドロエポシロンＤについて目的の化合物を置換することによって同様の様式で試験し得る。
【０４７７】
（実施例１３）
（オキサゾール誘導体）
本実施例は、発酵条件を使用して宿主細胞によって生成されるエポシロン化合物の型を調節することを記載する。過剰のセリンで補充した宿主細胞によって、通常は宿主細胞によって生成される化合物を、オキサゾール対応物の生成を支持するような方法で調節する。例えば、式Ｖの化合物を優先的に生成する細胞を、式ＶＩの化合物に対応するオキサゾール対応物の生成を指示するように作製する。
【０４７８】
１つの実施形態において、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−４０−１（優先的にエポシロンＣおよびエポシロンＤを作製する株）を、有意にエポシロンＨ１およびエポシロンＨ２、エポシロンＣおよびエポシロンＤに対するオキサゾール対応物の生成を増加するように作製する。株Ｋ１１１−４０−１（ＰＴＡ−２７１２）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）、１０８０１　Ｕｉｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０〜２２０９　ＵＳＡに、２０００年１１月２１日に寄託した。株Ｋ１１１−４０−１を、さらなるセリンを補充したかまたは補充していないいずれかの培地中で増殖させた。補充していない培地中のこの化合物の最終濃度は：加水分解されたカゼイン（膵臓消化、ＤｉｆｃｏからＣａｓｉｔｏｎのブランド名で購入した）、５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ；ＸＡＤ−１６、２０ｇ／Ｌ；微量因子溶液　４ｍｌ／Ｌ；オレイン酸メチル、７ｍｌ／Ｌ；およびＨｅｐｅｓ緩衝液、４０ｍＭ（ＫＯＨでｐＨ７．６まで滴定した）であった。微量因子溶液は：濃Ｈ２ＳＯ４、１０ｍＬ／Ｌ、ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１４．６ｇ／Ｌ；ＺｎＣｌ２、２．０ｇ／Ｌ；ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／Ｌ；ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．４２ｇ／Ｌ；Ｈ３ＢＯ３、０．３１ｇ／Ｌ；ＣａＣｌ２／６Ｈ２Ｏ、０．２４ｇ／Ｌ；およびＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．２４ｇ／Ｌを含む。セリンの基礎レベルを、４．８２％（重量／重量）として取り、この値は、Ｃａｓｉｔｏｎｅの特定のロットのＤｉｆｃｏのアミノ酸分析によって決定された。従って、基礎セリン濃度は２．３ｍＭであり、値は培地中のＣａｓｉｔｏｎｅの最終濃度５ｇ／Ｌから計算した。セリン補充培地は、５０倍高いセリン濃度（１１７ｍＭ）を含有した。
【０４７９】
細胞を、フラスコ中３０℃で、１２０時間、２５０ｒｐｍのコフィン振盪器上で増殖させた。発酵の間に菌株によって産生される化合物は、樹脂を捕獲し、一旦水中でこの樹脂を洗浄し、そしてこの樹脂中の化合物を３０分間２０ｍＬのメタノールに抽出することによって抽出した。試料をＨＰＬＣおよび質量分析法によって分析した。
【０４８０】
細胞によって産生された化合物の分析は、セリンレベルの５０倍増加が、セリンを補充されていない培地において増殖した細胞によって産生されたものに対して、エポシロン（ｅｐｏｔｈｉｌｏｎｅ）Ｈ１の産生の３０倍増加（０．１２ｍｇ／Ｌ）およびエポシロンＨ２の産生の５倍増加（０．１２ｍｇ／Ｌ）を生じることを示した。特に、この細胞は、検出可能な量のエポシロンＣおよびＤをほとんど産生しなかった（５０μｇ／Ｌ未満）。
【０４８１】
セリン供給由来の同時のオキサゾール含有化合物の増加およびチアゾール含有化合物の減少は、通常は、チアゾール含有対応物を形成する宿主細胞からオキサゾール化合物を得る方法を提供する。例えば、（実施例１１のサブ項目Ｃに記載されるような）９−オキソエポシロンＤを形成するための組換え構築物は、１７−デス（２−メチル−４−チアゾリル）−１７−（２−メチル−４−オキサゾリル−４−オキサゾリル）−９−オキソ−エポシロンＤ、９−オキソ−エポシロンＤに対するオキサゾール対応物を形成するために前述した条件と同様の条件で増殖され得る。同様に、実施例１１に記載される組換え構築物を含む本発明の他の組換え構築物は、対応するオキサゾール化合物を提供するために過剰のセリンを用いて増殖され得る。
【０４８２】
（実施例１４）
（Ｃ−２１メチルからＣ−２１ヒドロキシメチルへの微生物変換）
本実施例は、式Ｉの化合物のＣ−２１メチルからＣ−２１ヒドロキシメチルへの微生物変換を記載し、ここで、Ａｒは、以下：
【０４８３】
【化７４】
2004508810.tif 000087
である。ＰＣＴ公開公報ＷＯ００／３９２７６に記載されるようなＡｍｙｃｏｌａｔａ　ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ　ＡＴＣＣ３５２０３またはＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．株ＰＴＡ−ＸＸＸの凍結バイアル（約２ｍｌ）を使用して、１００ｍＬの培地を含む１５００ｍｌフラスコに播種する。栄養性培地は、１リットルの脱イオン水中の、１０ｇのデキストロース、１０ｇの麦芽エキス、１０ｇの酵母抽出物、および１ｇのペプトンからなる。この栄養性培養物を、３日間、２８℃で、２５０ｒｐｍで作動する回転振盪器上でインキュベートする。１ｍＬの得られた培養物を、栄養性培地と同じ組成の変換培地を含有する６２個の５００ｍＬフラスコの各々に加える。この培養物を、２８℃で、２５０ｒｐｍで２４時間、インキュベートする。本発明の適切な化合物を、１５５ｍｌのエタノールに溶解し、この溶液を６２個のフラスコに分配する。次いで、これらのフラスコを振盪器に戻し、さらに４３時間、２８℃および２５０ｒｐｍで、インキュベートする。次いで、この反応培養物を処置し、出発化合物の２１−ヒドロキシ対応物を回収する。
【０４８４】
（実施例１５）
（ＥｐｏＫを使用するエポキシ化）
本実施例は、式Ｉの化合物の酵素的エポキシ化を記載し、ここで、Ｒ８およびＲ１０は、一緒になって、炭素間二重結合（本発明のデスオキシ化合物）を形成する。このｅｐｏＫ遺伝子産物を、ＰＣＴ公開公報ＷＯ００／３１２４７（本明細書中で参考として援用される）に記載されるように、ポリヒスチジンタグ（ｈｉｓ　ｔａｇ）を含む融合タンパク質としてＥ．ｃｏｌｉ中で発現し、精製した。この反応系は、１００μＭ容量中に、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２１μＭホウレンソウフェレドキシン、０．１３２ユニットのホウレンソウフェレドキシン：ＮＡＤＰ＋オキシドレダクターゼ、０．８ユニットのグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、１．４ｍＭ　ＮＡＤＰ、および７．１ｍＭ　グルコース−６−リン酸、１００μＭまたは２００μＭの本発明のデスオキシ化合物、および１．７μＭアミノ末端ヒスチジンタグ化ＥｐｏＫまたは１．６μＭカルボキシ末端ヒスチジンタグ化ＥｐｏＫからなる。この反応系を、３０℃で、６７分間インキュベートし、９０℃で２分間加熱することによって停止する。不溶物質を遠心分離によって除去し、所望の産物を含有する上清５０μＬをＬＣ／ＭＳによって分析する。
【０４８５】
（実施例１６）
（化学的エポキシ化）
本実施例は、式Ｉの化合物の化学的エポキシ化を記載し、ここで、Ｒ８およびＲ１０は、一緒になって、炭素間二重結合（本発明のデスオキシ化合物）を形成する。ジメチルジオキシランの溶液（アセトン中０．１Ｍ、１７ｍＬ）を、−７８℃でＣＨ２Ｃｌ２１０ｍＬ中の本発明のデスオキシ化合物（５０５ｍｇ）の溶液に滴下する。この混合物を−５０℃まで加温し、１時間維持し、次いで、もう一部のジメチルジオキシラン溶液（５ｍＬ）を加え、この反応をさらに１．５時間、−５０℃で継続する。次いで、この反応系をＮ２流下で、−５０℃で乾燥する。この生成物を、ＳｉＯ２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４８６】
（実施例１７）
（（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−１５−アミノ−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１７−（２−メチルチアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸）
【０４８７】
【化７５】
2004508810.tif 000088
工程１。９−オキソエポシロンＢ。ジメチルジオキシランの溶液（アセトン中０．１Ｍ、１７ｍＬ）を、−７８℃で１０ｍＬのＣＨ２Ｃ１２中の９−オキソエポシロンＤ（５０５ｍｇ）の溶液に、滴下する。この混合物を、−５０℃に昇温させて１時間維持し、次いで、もう一部のジメチルジオキシラン溶液（５ｍＬ）を加え、この反応をさらに１．５時間、−５０℃で継続させる。次いで、この反応系をＮ２流下で、−５０℃で乾燥する。この生成物を、ＳｉＯ２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４８８】
工程２。（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−１５−アジド−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１７−（２−メチルチアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸。
【０４８９】
アルゴン雰囲気下で、５５ｍＬの脱気したテトラヒドロフラン／水（１０：１ｖ／ｖ）中の９−オキソエポシロンＢ（２．６２ｇ）およびナトリウムアジド（０．４９ｇ）の溶液をテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０．５８ｇ）で処理する。この混合物を、４５℃で１時間維持し、次いで、５０ｍＬの水で希釈し、そして酢酸エチルで抽出する。この抽出物を、ブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物をＳｉＯ２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４９０】
工程３。（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−１５−アミノ−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１７−（２−メチルチアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸。１５ｍＬのＴＨＦ／水（１０：１ｖ／ｖ）中の（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−１５−アジド−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１７−（２−メチルチアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸（５６５ｍｇ）の溶液を、周囲温度で、アルゴン下において、２時間、トルエン（３ｍＬ）中の１．０Ｍトリメチルホスフィン溶液で処理する。この混合物を濃縮し、生成物を、ＳｉＯ２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４９１】
（実施例１８）
（（４Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１６Ｓ）−１３，１４−エポキシ−４，８−ジヒドロキシ−２，６，１０−トリオキソ−５，５，７，９，１３−ペンタメチル−１６−（１−（２−メチルチアゾル−４−イル）プロペン−２−イル）−１−アザ−１１−シクロヘキサデセン）
【０４９２】
【化７６】
2004508810.tif 000089
アセトニトリル／ジメチルホルムアミド（２０：１ｖ／ｖ，１５０ｍＬ）中の（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−１５−アミノ−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１７−（２−メチルジアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸（５４０ｍｇ）の溶液を、０℃に冷却し、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．１３５ｇ）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．５ｇ）で順次処理する。この混合物を、周囲温度まで加温し、１２時間維持し、次いで、水で希釈し、そして酢酸エチルで抽出する。この抽出物を、水、飽和ＮａＨＣＯ３、およびブラインで順次洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、ＳｉＯ２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４９３】
（実施例１９）
（（４Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１３Ｚ，１６Ｓ）−４，８−ジヒドロキシ−２，６，１０−トリオキソ−５，５，７，９，１３−ペンタメチル−１６−（１−（２−メチルチアゾル−４−イル）プロペン−２−イル）−１−アザ−１１−シクロヘキサデセン）
【０４９４】
【化７７】
2004508810.tif 000090
−７８℃でテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中のタングステンヘキサクロリド（０．７６ｇ）の溶液を、ヘキサン中のｎ−ブチルリチウムの１．６Ｍ溶液（２．５ｍＬ）で処理する。この混合物を、周囲温度まで２０分にわたって、昇温させる。得られる緑色溶液の１３．８ｍＬを、周囲温度で、２ｍＬのテトラヒドロフラン中の（４Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１６Ｓ）−４，８−ジヒドロキシ−１３，１４−エポキシ−２，６，１０−トリオキソ−５，５，７，９，１３−ペンタメチル−１６−（１−（２−メチルチアゾル−４−イル）プロペン−２−イル）−１−アザ−１１−シクロヘキサデセン（３６０ｍｇ）の溶液に、加える。３０分後、この反応系を０℃まで冷却し、飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）で処理する。この混合物を、水で希釈し、ＣＨ２Ｃ１２で抽出する。この抽出物を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物をＳｉＯ２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４９５】
（実施例２０）
（（４Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１６Ｓ）−１３，１４−エポキシ−４，８−ジヒドロキシ−２，６，１０−トリオキソ−１，５，５，７，９，１３−ヘキサメチル−１６−（１−（２−メチルチアゾル−４−イル）プロペン−２−イル）−ｌ−アザ−１１−シクロヘキサデセン）
【０４９６】
【化７８】
2004508810.tif 000091
工程１。（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１５−（メチルアミノ）−１７−（２−メチルチアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸。１０ｍＬのメタノール中の（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−１５−アミノ−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１７−（２−メチルチアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸（５４０　ｍｇ）の溶液を、３７％水性ホルムアルデヒド（１ｍＬ）、酢酸（２５ｕＬ）、およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１００ｍｇ）で処理する。次いで、１時間後、この混合物を、１Ｎ　ＨＣｌで処理し、次いで、酢酸エチルおよび水で希釈する。この水相を、酢酸エチルで抽出し、そして有機相を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、ＳｉＯ２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４９７】
工程２。（４Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１６Ｓ）−１３，１４−エポキシ−４，８−ジヒドロキシ−２，６，１０−トリオキソ−１，５，５，７，９，１３−ヘキサメチル−１６−（１−（２−メチルチアゾル−４−イル）プロペン−２−イル）−１−アザ−１１−シクロヘキサデセン。アセトニトリル／ジメチルホルミアミド（２０：１ｖ／ｖ，１５０ｍＬ）中の（３Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１２Ｒ，１３Ｓ，１５Ｓ，１６Ｅ）−３，７−ジヒドロキシ−５，９−ジオキソ−１２，１３−エポキシ−４，４，６，８，１２，１６−ヘキサメチル−１５−（メチルアミノ）−１７−（２−メチルチアゾル−４−イル）−１６−ヘプタデセン酸（５５４ｍｇ）の溶液を、０℃まで冷却し、そして１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（０．１３５ｇ）および１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（０．５ｇ）で順次処理する。この混合物を、周囲温度まで加温し、１２時間維持し、次いで、水で希釈し、酢酸エチルで抽出する。この抽出物を、水、飽和ＮａＨＣＯ３、およびブラインで順次洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、ＳｉＯ２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０４９８】
（実施例２１）
（（４Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１３Ｚ，１６Ｓ）−４，８−ジヒドロキシ−２，６，１０−トリオキソ−１，５，５，７，９，１３−ヘキサメチル−１６−（ｌ−（２−メチルチアゾル−４−イル）プロペン−２−イル）−１−アザ−１１−シクロヘキサデセン）
【０４９９】
【化７９】
2004508810.tif 000092
−７８℃のテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）中の六塩化タングステン（０．７６ｇ）の溶液を、ヘキサン中のｎ−ブチルリチウムの１．６Ｍ溶液（２．５ｍＬ）で処理する。この混合物を、周囲温度まで、２０分にわたって加温する。得られる緑色溶液の１３．８ｍＬ部を、周囲温度で、２ｍＬのテトラヒドロフラン中の（４Ｓ，７Ｒ，８Ｓ，９Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１６Ｓ）−１３，１４−エポキシ−４，８−ジヒドロキシ−２，６，１０−トリオキソ−１，５，５，７，９，１３−ヘキサメチル−１６−（ｌ−（２−メチルチアゾル−４−イル）プロペン−２−イル）−ｌ−アザ−１１−シクロヘキサデセン（３７０ｍｇ）の溶液に加える。３０分後、この反応系を０℃まで冷却し、そして飽和ＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）で処理する。この混合物を、水で希釈し、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出する。この抽出物を、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濾過し、そしてエバポレートする。この生成物を、ＳｉＯ２上のフラッシュクロマトグラフィーによって精製する。
【０５００】
（実施例２２）
（リポソーム組成物）
本実施例は、９−オキソエポシロンを含有するリポソーム組成物を記載する。脂質および９−オキソエポシロンＤの混合物を、エタノールに溶解し、この溶液を、減圧下での回転によって薄いフィルムとして乾燥する。この得られた脂質フィルムを水相の添加によって水和し、そしてエポシロン誘導体含有リポソームの粒子サイズを、所望の範囲に調節する。好ましくは、平均粒子直径は、１０ミクロン未満であり、好ましくは、約０．５〜約４ミクロンである。この粒子サイズは、例えば、ミル（例えば、エアジェットミル、ボールミル、またはバイブレーターミル）、ミクロ沈殿（ｍｉｃｒｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、スプレイ乾燥、凍結乾燥、高圧均質化、超臨界媒体からの再結晶を使用することによって、または選択された均一な孔サイズを有する一連の膜（例えば、ポリカーボネート膜）を通してリポソームの水性懸濁液を押し出すことによって、所望のレベルまで減少され得る。１実施形態において、このリポソーム組成物は、以下：本発明の化合物（１．００ｍｇ）；ホスファチジルコリン（１６．２５ｍｇ）；コレステロール（３．７５ｍｇ）；ポリエチレングリコール誘導体化ジステアリルホスファチジルエタノールアミン（５．００ｍｇ）；ラクトース（８０．００ｍｇ）；クエン酸（４．２０ｍｇ）；酒石酸（６．００ｍｇ）；ＮａＯＨ（５．４４ｍｇ）；水（１ｍＬまで）を含む。別の実施形態において、このリポソーム組成物は、以下：本発明の化合物（１．００ｍｇ）；ホスファチジルコリン（１９．８０ｍｇ）；コレステロール（３．７５ｍｇ）；ジステアリルホスファチジルコリン（１．４５ｍｇ）；ラクトース（８０．００ｍｇ）；クエン酸（４．２０ｍｇ）；酒石酸（６．００ｍｇ）；ＮａＯＨ（５．４４ｍｇ）；水（１ｍＬまで）を含む。なお別の実施形態において、このリポソーム組成物は、以下：本発明の化合物（１．００ｍｇ）；１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（１７．５０ｍｇ）；１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、Ｎａ（７．５０ｍｇ）；ラクトース（８０ｍｇ）；クエン酸（４．２０ｍｇ）；酒石酸（６．００ｍｇ）；ＮａＯＨ（５．４４ｍｇ）；水（１ｍＬまで）を含む。本発明の他の化合物を含むリポソーム組成物を、上記の条件と同様の条件を使用して、調製する。
【０５０１】
（実施例２３）
（ポリグルタミン酸複合体）
本実施例は、ポリ−グルタミン酸−２１−ヒドロキシ−９−オキソ−エポシロンＤ複合体の調製を記載する。ポリ（１−グルタミン酸）（「ＰＧ」）ナトリウム塩（ＭＷ３４Ｋ，Ｓｉｇｍａ、０．３５ｇ）を水に溶解する。この水溶液のｐＨを、０．２Ｍ　ＨＣｌを使用して、２に調節する。この沈殿物を回収し、蒸留水に対して透析し、そして凍結乾燥して０．２９ｇのＰＧを得る（ｙｉｌｅ）。乾燥ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中のＰＧ（７５ｍｇ、繰り返し単位ＦＷ１７０、０．４４ｍｍｏｌ）の溶液に、２０ｍｇの２１−ヒドロキシ−９−オキソエポシロンＤ、１５ｍｇのジシクロヘキシルカルボジイミド（「ＤＣＣ」）および微量のジメチルアミノピリジンを加える。この反応を、４時間または薄層クロマトグラフィーによって完了が示されるまで、室温で進行させる。この反応混合物を、クロロホルムに注ぎ、そして得られる沈殿物を回収し、そして真空中で乾燥し、約６５ｍｇのＰＧ−２１−ヒドロキシ−９−オキソ−エポシロンＤ複合体を得る。出発物質中のＰＧに対する本発明の化合物の重量比の変化は、種々の濃度の２１−ヒドロキシ−１０，１１−デヒドロエポシロンＤのポリマー複合体を生じる。本発明の他の化合物の複合体を、上記の条件と同様の条件を使用して調製する。
【０５０２】
（実施例２４）
（静脈処方物）
本実施例は、９−オキソ−エポシロンＤの静脈処方物を記載する。この処方物は、以下：３０％プロピレングリコール、２０％Ｃｒｅｏｍｏｐｈｏｒ　ＥＬ、および５０％エタノールを含むビヒクル中に、１０ｍｇ／ｍＬの９−オキソ−エポシロンＤを含む。このビヒクルは、スターラーバーを含むビーカーにエタノール（５９１．８ｇ）を計り取り；Ｃｒｅｏｍｏｐｈｏｒ　ＥＬ（３１５．０ｇ）をこの溶液に加え、そして１０分間混合し；次いで、プロピレングリコール（４６６．２ｇ）をこの溶液に加え、そして別の１０分間混合することによって調製する。９−オキソ−エポシロンＤ（１ｇ）を、４００〜６００ｍＬのビヒクルを含む１Ｌ容量フラスコに加え、５分間混合する。１０，１１−デヒドロエポシロンＤを溶液に加えた後、容量を１Ｌにし；さらに１０分間混合し；そして０．２２μｍ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｍｉｌｌｉｐａｋ　ｆｉｌｔｅｒを通して濾過する。得られる溶液を使用して、メーター表示（ｍｅｔｅｒｅｄ）蠕動ポンプを使用して、滅菌５ｍＬバイアルを、目標の充填容量５．１５ｍＬ／バイアルまで、無菌的に充填する。この充填したバイアルに、すぐに栓をし、圧着する。
【０５０３】
１０ｍｇ／ｍＬの９−オキソ−エポシロンＤを含有するバイアルを、患者への投与のための標準生理食塩水または５％デキストロース溶液に希釈し、非−ＰＶＣ、非−ＤＥＨＰバッグおよび投与セットで投与する。この生成物を１〜６時間にわたって注入し、所望の用量を送達する。
【０５０４】
１実施形態において、この処方物を、静脈注入の前に、滅菌生理食塩水に２０倍希釈する。この最終注入濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬの本発明の化合物、１．５％プロピレングリコール、１％Ｃｈｒｅｍｏｐｈｏｒ　ＥＬ、および２．５％エタノールであり、これを１〜６時間にわたって注入し、所望の用量を送達する。
【０５０５】
本発明の他の化合物を含む静脈処方物は、同様の様式で調製および使用され得る。
【０５０６】
（実施例２５）
（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）毒性についての前処理）
本実施例は、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）毒性についての前処置レジメン（ｒｅｇｉｍｅｎｔ）を記載する。Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）を含む本発明の化合物の処方物は、患者において毒性を引き起こし得る。ステロイドを用いる前処置を使用して、アナフィラキシーを防止し得る。任意の適切なコルチコステロイドまたはコルチコステロイドとＨ１アンタゴニストおよび／またはＨ２アンタゴニストとの組み合わせが使用され得る。１実施形態において、被験体を、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）含有処方物中の本発明の化合物による処置の１時間前に、５０ｍｇのジフェニルヒドラミンおよび３００ｍｇのシメチジンの経口用量で前投薬する。別の実施形態において、被験体を、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）含有処方物中の本発明の化合物を用いる処置の少なくとも１．５時間前に、２０ｍｇのデキサメタゾンの静脈投与で前投薬する。別の実施形態において、被験体を、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）含有処方物中の本発明の化合物を用いる処置の少なくとも１．５時間前に、５０ｍｇのジフェニルヒドラミン、３００ｍｇのシメチジンおよび２０ｍｇのデキサメタゾンの静脈投与で前投薬する。なお別の実施形態において、被験体の体重を考慮し、この被験体を、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）含有処方物中の本発明の化合物を用いる処置の少なくとも１．５時間前に、ジフェニルヒドラミン（５ｍｇ／ｋｇ、静脈内）；シメチジン（５ｍｇ／ｋｇ、静脈内）；およびデキサメタゾン（１ｍｇ／ｋｇ、筋肉内）の投与で前処置する。
【０５０７】
本明細書中で参照される全ての科学文献および特許公報は、本明細書により、参考として援用される。これまで本発明を記述した説明および実施例として記載してきたが、当業者は、本発明が種々の実施形態で実施され得、前述の記載および実施例は、例示のためであり、前述の特許請求の範囲を限定するものではないことを理解する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、本発明のエポシロンＰＫＳに供給され得るＮ−アシルシステアミンチオエステル誘導体に対する、多数の前駆体化合物を示す。ここで、ＮＲＰＳ様モジュール１またはＮＲＰＳ様モジュール２のＫＳドメインが不活化されて、新規なエポシロン誘導体を生成した。このような化合物を作製するための一般的な合成手順もまた示される。
【図２】
図２は、プラスミドｐＫＯＳ３５−８２．１およびｐＫＯＳ３５−８２．２の制限部位および機能のマップを示す。
【図３】
図３は、プラスミドｐＫＯＳ３５−１５４およびｐＫＯＳ９０−２２の制限部位および機能のマップを示す。
【図４】
図４は、実施例２に記載される、Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ宿主細胞の染色体へエポシロンＰＫＳおよび改変酵素遺伝子を導入するためのプロトコールの概略を示す。
【図５】
図５は、実施例２に記載されるｐＢｅｌｏＢＡＣＩＩのマップを示す。
【図６】
図６は、５ｇ／Ｌカシトン（ｃａｓｉｔｏｎｅ）（膵臓カゼイン消化物）および２ｇ／Ｌ硫酸マグネシウムのみからなる単純な産生培地におけるＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−４０−１の基礎的な性能を示す。説明：バッチプロセスにおける基礎的なＣＴＳ培地についての増殖（黒丸）、産生（黒四角）、およびアンモニア産生（黒三角）のプロフィール；培養条件は、実施例３の材料および方法に記載されるとおりであった。
【図７】
図７は、ＣＴＳ産生培地におけるＭｙｘｏｃｏｃｃｕｓ　ｘａｎｔｈｕｓ株Ｋ１１１−４０−１の発酵性能に対するＸＡＤ−１６樹脂の効果を示す。説明：バッチプロセスにおけるＣＴＳ産生培地に対する２０ｇ／Ｌ　ＸＡＤ−１６樹脂の組み込みについての増殖（黒丸）および産生（黒四角）のプロフィール。
【図８】
図８は、増殖および産生収量に対するカシトンの影響を示す。説明：増殖（黒丸）、産生（黒四角）、および比産生性（黒三角）に対するカシトン濃度の効果。
【図９】
図９は、増殖および産生収量に対する微量元素およびより高次のオレイン酸メチルの濃度の影響を示す。説明：産生に対するオレイン酸メチル（黒丸）および微量元素（黒四角）の効果。
【図１０Ａ】
図１０Ａは、バッチ発酵プロセスにおけるオレイン酸メチルおよび微量元素の最適濃度の存在下でのＭ．ｘａｎｔｈｕｓ株の増殖および産生を示す。播種後、最初の２日間の間、指数関数的増殖が生じる。エポシロンＤの産生は、定常期の開始から始まり、そして５日目のオレイン酸メチルの枯渇とともに細胞溶解が生じるときに終わる。説明：Ａ．）バッチプロセスにおけるＣＴＳ産生培地への最適濃度のオレイン酸メチル（７ｍＬ／Ｌ）および微量元素（４ｍＬ／Ｌ）の添加についての増殖（黒丸）および産生（黒四角）のプロフィール。
【図１０Ｂ】
図１０Ｂは、バッチ発酵プロセスにおける最適濃度のオレイン酸メチルおよび微量元素の存在下でのＭ．ｘａｎｔｈｕｓ株の増殖および産生の間の、オレイン酸メチルの消費およびアンモニアの産生に対応する時間過程を示す。Ｂ．）オレイン酸メチル（黒丸）およびアンモニアの産生（黒四角）の消費に対応する時間経過。
【図１１Ａ】
図１１Ａは、Ｍ．ｘａｎｔｈｕｓ株の増殖および産生に対する断続的供給バッチプロセスの影響を示す。説明：振盪フラスコにおける断続的供給バッチプロセスについての増殖（黒丸）および産生（黒四角）のプロフィール。カシトンおよびオレイン酸メチル供給速度は、それぞれ、２ｇ／Ｌ／日および３ｍＬ／Ｌ／日であった。
【図１１Ｂ】
図１１Ｂは、発酵過程の間のオレイン酸メチルの消費およびアンモニアの産生の定常速度を示す。説明：培養物へのオレイン酸メチルの添加の合計（黒丸）、オレイン酸メチルの消費の合計（黒四角）、およびアンモニアの産生（黒三角）に対応する時間経過。
【図１２】
図１２は、５Ｌバイオリアクターにおける断続的供給バッチプロセスについての産生プロフィールを示す。カシトンおよびオレイン酸メチル供給速度は、それぞれ、２ｇ／Ｌ／日および３ｍＬ／Ｌ／日であった。
【図１３Ａ】
図１３Ａは、増殖および産生に対する連続的供給の影響を示す。説明：５Ｌバイオリアクターにおける連続的供給バッチプロセスについての増殖（黒丸）および産生（黒四角）プロフィール。カシトンおよびオレイン酸メチル供給速度は、それぞれ、２ｇ／Ｌ／日および３ｍＬ／Ｌ／日であった。
【図１３Ｂ】
図１３Ｂは、連続的供給バッチプロセスの間の、オレイン酸メチルの添加および消費ならびにアンモニアの生成の時間経過を示す。説明：培養物へのオレイン酸メチルの添加の合計（黒丸）、オレイン酸メチルの消費の合計（黒四角）、およびアンモニアの産生（黒三角）に対応する時間経過；培養条件は、材料および方法に記載される通りである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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