(57)【要約】本発明は組換え微生物、およびブドウ球菌株などの菌株、とくに黄色ブドウ球菌に関するものである。微生物は微生物の生長に必須の少なくとも一つの遺伝子の発現に要求されるＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化するための調節可能な遺伝子を有する。調節可能な遺伝子は外因性作動因子分子に応答するものであり、とくにｌａｃｌ暗号化抑制因子などの抑制因子が結合することのできるｌａｃオペレータなどのオペレータ部位を含む誘導因子応答遺伝子とすることができる。調節可能な遺伝子はとくにＩＰＴＧ応答ｐｌａＣ対立遺伝子とすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物の生長のために必須の少なくとも一つの遺伝子の発現に要求されるＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化する調節自在な遺伝子を有する組換え微生物。
【請求項２】
微生物の生長のために必須の少なくとも一つの遺伝子の発現に要求されるＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化する調節自在な遺伝子を有する組換え微生物において、前記微生物が菌株であり、前記調節可能な遺伝子が外因性作動因子分子に応答することを特徴とする組換え微生物。
【請求項３】
前記菌株が黄色ブドウ球菌株であることを特徴とする、請求項２に記載の組換え微生物。
【請求項４】
微生物の生長のために必須の少なくとも一つの遺伝子の発現に要求されるＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化する調節自在な遺伝子を有する組換え微生物において、前記調節可能な遺伝子が外因性作動因子分子に応答し、前記調節可能な遺伝子が抑制因子が結合することが可能なオペレータ部位を含む誘導因子応答遺伝子であることを特徴とする組換え微生物。
【請求項５】
前記ブドウ球菌株の生長に必須の少なくとも一つの遺伝子の発現に要求されるブドウ球菌ＲＮＡポリメラーゼσサブユニットを暗号化する調節自在な遺伝子を有する組換えブドウ球菌株において、前記調節可能な遺伝子が外因性作動因子分子に応答することを特徴とする組換えブドウ球菌株。
【請求項６】
前記調節可能な遺伝子が抑制因子が結合することが可能なオペレータ部位を含む誘導因子応答遺伝子であることを特徴とする、請求項５に記載の組換えブドウ球菌株。
【請求項７】
前記オペレータ部位に結合する前記抑制因子の機構に関して、また前記抑制因子が前記σサブユニットの発現を不活性化する完璧さに関して、前記抑制因子が不完全に前記オペレータ部位に結合できることを特徴とする、請求項６に記載の組換えブドウ球菌株。
【請求項８】
前記オペレータ部位がｌａｃオペレータであり、前記抑制因子がｌａｃｌ−暗号化抑制因子であることを特徴とする、請求項６に記載の組換えブドウ球菌株。
【請求項９】
前記調節可能な遺伝子がｐｌａＣ対立遺伝子であることを特徴とする、請求項５に記載の組換えブドウ球菌株。
【請求項１０】
前記調節可能な遺伝子がＩＰＴＧ応答ｐｌａＣ対立遺伝子であり、前記株がｌａｃオペレータ部位で前記ＩＰＴＧ応答ｐｌａＣ対立遺伝子に結合することができる抑制因子を暗号化するｌａｃｌ遺伝子を含むことを特徴とする、請求項９に記載の組換えブドウ球菌株。
【請求項１１】
ＩＰＴＧが前記抑制因子が前記ＩＰＴＧ応答ｐｌａＣ対立遺伝子の転写を抑制するのを阻止する働きをすることを特徴とする、請求項１０に記載の組換えブドウ球菌株。
【請求項１２】
前記抑制因子が前記ｌａｃオペレータ部位に不完全に結合することを特徴とする、請求項１０に記載の組換えブドウ球菌株。
【請求項１３】
前記菌株が組換え黄色ブドウ球菌株であることを特徴とする、請求項１０に記載の組換えブドウ球菌株。
【請求項１４】
前記菌株が組換え黄色ブドウ球菌株であることを特徴とする、請求項５に記載の組換えブドウ球菌株。
【請求項１５】
黄色ブドウ球菌株ＲＮ４２２０，ＳＰ１０１。
【請求項１６】
微生物の生長に必須の少なくとも一つの遺伝子の発現に必要なＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化するための調節可能な遺伝子を有する組換え微生物を産生する方法において、
（ａ）野生型微生物における前記ＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化する野生型遺伝子を識別する過程と、
（ｂ）固有転写制御配列が欠けている前記野生型遺伝子の標的遺伝子断片を作成する過程と、
（ｃ）誘導可能なプロモータの下流の場所で組み込みベクターに前記標的遺伝子断片を連結する過程と、
（ｄ）前記ベクターを前記組換え微生物を産生するために前記野生型微生物の染色体内に組み込む過程、
とから成る方法。
【請求項１７】
標的遺伝子断片を作成する過程が固有転写制御配列が欠けている前記野生型遺伝子の区間のＰＣＲ増幅によって達成されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
連結過程が前記標的遺伝子断片を抑制因子暗号化遺伝子、耐性決定因子、前記誘導可能プロモータの下流の前記標的遺伝子断片を挿入するためのマルチクローニング部位と、前記誘導可能プロモータの上流の双方向転写ターミネータを有する組み込みベクター内への連結を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ベクターの組み込み過程が前記耐性決定因子の選択によって相同的組み換えを介して達成されることを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ブドウ球菌株の生長に必須の少なくとも一つの遺伝子の発現に必要なブドウ球菌ＲＮＡポリメラーゼσサブユニットを暗号化するための調節可能な遺伝子を有する組換えブドウ球菌株を産生する方法において、
（ａ）前記野生型ブドウ球菌株内の前記ＲＮＡポリメラーゼσサブユニットを暗号化する野生型遺伝子を識別する過程と、
（ｂ）固有転写制御配列が欠けている前記野生型遺伝子の標的遺伝子断片を作成する過程と、
（ｃ）誘導可能なプロモータの下流の場所で組み込みベクターに前記標的遺伝子断片を連結する過程と、
（ｄ）前記組換えブドウ球菌株を産生するために前記ベクターを前記野生型ブドウ球菌株の染色体内に組み込む過程、
とから成る方法。
【請求項２１】
識別過程が野生型黄色ブドウ球菌ｐｌａＣ遺伝子を識別することを含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
標的遺伝子断片を作成する過程が固有転写制御配列が欠けている前記ｐｌａＣ遺伝子の区間のＰＣＲ増幅によって達成されることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
連結過程が前記標的遺伝子断片をプラスミド内に連結することを含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
連結過程が前記標的遺伝子断片を抑制因子を暗号化するためのｌａｃｌ遺伝子を有する組み込みベクター内に連結することを含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
連結過程が前記誘導可能なプロモータの下流の前記標的遺伝子断片を挿入するためのマルチクローニング部位を有する組み込みベクター内に前記標的遺伝子断片を連結することを含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
連結過程がＳｒｆｌ部位を含むマルチクローニング部位を有する組み込みベクター内に前記標的遺伝子断片を連結することを含むことを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
連結過程が前記誘導可能なプロモータの上流に双方向転写ターミネータを有する組み込みベクター内に前記標的遺伝子断片を連結することを含むことを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
連結過程がクロラムフェニコール耐性決定因子を有する組み込みベクター内に前記標的遺伝子断片を連結することを含み、前記ベクターを組み込む過程がプラスミド担持クロラムフェニコール耐性のための選択によって相同的組み換えを介して遂行されることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
請求項２０の方法において、前記ベクターを組み込む過程が前記野生型ブドウ球菌株の電気形質転換によって遂行されることを特徴とする方法。
【請求項３０】
選択された微生物の生長に必須の少なくとも一つの遺伝子の発現に必要なＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を標的とする候補医薬品化合物を識別する高効率選別方法において、
（ａ）複数個の第一のタイプの培養物と複数個の第二のタイプの培養物を調製する過程であって、前記第一のタイプの培養物のそれぞれが前記ＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化するための調節可能な遺伝子を有する前記微生物の組換え株を含み、第二のタイプの培養物のそれぞれが前記ＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化するための野生型遺伝子を有する前記微生物の野生型株を含み、前記調節可能な遺伝子が第一のタイプの培養物のいくつかにおいて基底レベルで発現し、外因性作動因子分子に第一のタイプの培養物のすべてより少ないものが曝露された結果として第一のタイプの培養物の他のものにおいては基底を越えるレベルで発現し、第二のタイプの培養物のすべてより少ないものが外因性作動因子分子に曝露される過程と、
（ｂ）前記培養物のそれぞれを試験化合物と接触させる過程と、
（ｃ）前記試験化合物がＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を標的とすることを示す結果を識別するために培養物を監視する過程、
とから成ることを特徴とする方法。
【請求項３１】
前記培養物のそれぞれを試験化合物に接触させる過程の後、前記培養物を前記培養物の生長を支援する条件下で培養する過程を含むことを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
監視する過程が前記培養物の生長を測定することによって実施され、試験化合物の選択された濃度が試験化合物の選択された濃度と接触させた他の培養物の生長に対して基底レベルで前記遺伝子が発現した第一のタイプの培養物の生長を阻害するとき前記試験化合物が候補医薬品化合物と識別されることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
調製する過程が外因性作動因子分子として遺伝子誘導作用物質を添加する過程を含むことを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記遺伝子誘導作用物質に曝露されなかった第一のタイプの培養物に準最高濃度で遺伝子誘導作用物質を添加する過程を含むことを特徴とする、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記培養物のそれぞれを試験化合物に接触させる過程に先だって、それぞれの培養物の生長を目標密度に近づけるためにそれぞれの培養物の成長に十分な条件の下で選択された時間の間それぞれの培養物を培養する過程を含むことを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
調製過程が前記複数個の培養物を第一のタイプの培養物を第一の組と第二の組に、第二のタイプの培養物を第三の組と第四の組に組織化する過程を含み、前記第一の組と、前記第三の組が前記外因性作動因子分子に曝露させられることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記複数個の培養物を複数個の群を含む配列にさらに組織化する過程を含み、それぞれの群が第一から第四の組のそれぞれから一つの培養物を含み、それぞれの群が異なる濃度の前記試験化合物と接触させられることを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記複数個の培養物を行と列の正規配列に組織する過程を含み、それぞれの組が前記配列の列に整列され、それぞれの群が前記配列の行に整列されることを特徴とする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
該方法が複数個の試験化合物について反復されることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
監視過程がそれぞれの培養物のＲＮＡ合成を測定することによって達成され、試験化合物の選択された濃度が試験化合物の選択された濃度と接触させた他の培養物のＲＮＡ合成に対して基底レベルで前記調節可能な遺伝子が発現した第一のタイプの培養物のＲＮＡ合成を阻害するとき前記試験化合物が候補医薬品化合物として識別されることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
ＲＮＡ合成測定過程が放射線標識付けＲＮＡ前駆体の組み込みを測定することによって達成されることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＲＮＡ合成測定過程がレポーター遺伝子の発現監視によって達成されることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
選択された微生物の生長に必須の少なくとも一つの遺伝子の発現に必要なＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を標的とする候補医薬品化合物を識別するための高効率選別方法において、
（ａ）前記組換え株が前記ＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化するために調節可能な遺伝子を有する、前記微生物の組換え株の培養物を調製する過程と、
（ｂ）前記調節可能な遺伝子が発現する条件で前記培養物を成長させる過程と、
（ｃ）前記培養物によって産生された前記ＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を単離し精製する過程と、
（ｄ）前記単離され精製されたＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を試験化合物と接触させる過程と、
（ｅ）前記試験化合物が前記ＲＮＡポリメラーゼ特異性因子に結合するかを検出する過程、
とから成る方法。
【請求項４４】
調製過程がブドウ球菌ＲＮＡポリメラーゼσサブユニットを暗号化するための調節可能なＩＰＴＧ応答ｐｌａＣ遺伝子を有する組換え黄色ブドウ球菌株の培養物を調製する過程を含むことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記培養物の成長過程が前記培養物に遺伝子誘導作用物質を添加する過程を含むことを特徴とする、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般的に抗菌作用を有する医薬品化合物の選別に有効な遺伝子操作した微生物に関するものであり、もっと具体的にはＲＮＡポリメラーゼ特異性因子の発現を調節できる組換え微生物に関するものである。本発明はもっと具体的には、ＲＮＡポリメラーゼσサブユニットの発現が外因性の作動分子の添加によって調節できる組換え細菌株に関するものである。とくに、本発明はＲＮＡポリメラーゼσサブユニットの発現の調節のための操作した誘導物質反応性遺伝子を有する新規な組換えブドウ球菌株とブドウ球菌に対して医薬品として使用できる抗菌化合物を検出するために高効率選別にそれを用いるための方法に関するものである。
【０００２】
背景技術
黄色ブドウ球菌などの、多数の病原性微生物は米国および世界中のヒトおよびその他の動物の感染性疾患と健康関連問題を引き起こしている。特定の微生物の既存の株を除去するのに有効な新規開発抗生物質および化学物質を含む治療などの、特定の微生物を撲滅するための治療が開発されるにつれて、かかる微生物の新しい株が出現して、既存の治療に対する耐性を示している。したがって、病原性微生物と医薬品で戦うための新しい道を開発し続ける必要がある。
【０００３】
微生物の生存と生長に不可欠な遺伝子プロセスに介入することによって微生物と戦う方法がますます関心を集めつつある。とくに、開発者たちは病原性微生物の生長または継続的存在に要求される遺伝子転写プロセスに介入する化合物に関心を向けている。
【０００４】
微生物における遺伝情報の発現は最終的にはタンパク質によって、とくに代謝反応の触媒の役割を果たす酵素タンパク質によって発生する。ＤＮＡからタンパク質への遺伝情報の流れは「転写」と「翻訳」と呼ばれる２段階で一般的に起きる。転写は遺伝情報の流れの中の第一段階で、それによってＤＮＡ暗号化遺伝情報がＲＮＡに複写される。翻訳過程でＲＮＡがさらにタンパク質に転換される。「遺伝子」とは広義には一つのタンパク質を暗号化するＤＮＡの領域であり、そのタンパク質を形成する転写−翻訳過程は遺伝子の「発現」と呼ばれる。
【０００５】
とくに、転写にはＤＮＡ二重螺旋の一本の鎖を表すＲＮＡ鎖の合成が関与する。重要なことに、ＲＮＡ合成はＲＮＡポリメラーゼとして周知の酵素の触媒作用を受ける。転写はＲＮＡポリメラーゼがプロモータ部位として周知のＤＮＡ遺伝子の始まりの特殊領域に結合したときに開始される。
【０００６】
ＲＮＡポリメラーゼは一般的に、コア酵素と特異性因子の２つの構成要因から成る。特異性因子は酵素の認識と、ＤＮＡ鋳型上の特定の遺伝子または遺伝子の組のプロモータ領域への結合に特に関連している。ＲＮＡポリメラーゼのコア酵素構成要素はＤＮＡ鋳型上にＲＮＡを合成する能力を有するが、組み合わされた特異性因子なしにプロモータ部位で転写を開始することはできない。特異性因子の役割は、したがって、適切なプロモータ部位でのみＲＮＡポリメラーゼが安定した仕方でＤＮＡに結合することを保証することである。結果的に、特異性因子はＲＮＡポリメラーゼの結合を同源プロモータ配列に導き、それによって同源プロモータ配列を含む選択された遺伝子だけの発現を開始させる。
【０００７】
したがって、特定の遺伝子または遺伝子の組の発現は対応する特異性因子の産生を調節することによって制御できる。とくに、特定の遺伝子または遺伝子の組の発現は関連する特異性因子を阻止することによって阻害でき、それによって遺伝子プロモータ配列へのＲＮＡポリメラーゼの結合を防止する。結果として、病原性微生物の治療のための好適な目標は微生物の継続的存在に不可欠な遺伝子または遺伝子の組の発現に必要なＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を阻止する化学的作用物質の発見であろう。
【０００８】
関心を持たれる一つの特定の病原性微生物が黄色ブドウ球菌であり、これは日和見ヒト病原体であり、米国における院内細菌感染の主たる原因である。黄色ブドウ球菌は数多くの生命を脅かす全身病、たとえば菌血症／敗血症、中毒性ショック症状、および中毒性表皮壊死、ならびに皮膚の一般的細菌感染症に関わっている。黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性およびバンコマイシン耐性株が最近出現したことにより、かかる細菌株と戦うために新しい種類の抗生物質の開発の必要性に再び関心が集まっている。黄色ブドウ球菌ならびにその他のブドウ球菌を含む、細菌株と医薬品によって戦うための有力な道は細菌の生長に関連する遺伝子転写プロセスに干渉することである。
【０００９】
他の真性細菌と同様、黄色ブドウ球菌のＲＮＡポリメラーゼはコア酵素と特異性因子の２つの構成要因から成る。コア酵素はα２ββ’のサブユニット組成物を有する。βおよびβ’サブユニットは一緒に酵素の触媒センターを構成し、αサブユニットはコア酵素の組み立て、ならびにプロモータ認識の他の機能に必要である。
【００１０】
黄色ブドウ球菌の特異性因子は複数のσサブユニットまたは因子の一つである。染色体遺伝子ｐｌａＣによって黄色ブドウ球菌内に暗号化および発現された主たるσ因子は細菌生長に要求される主たるハウスキーピング遺伝子の発現に必要である。結果として、このσ因子はσ因子機能と結合またはその機能を阻止することによって抗菌特性を有する化学的作用物質の発見のための好適な目標である、なぜならσ因子機能を阻止、または干渉することによってこれらのハウスキーピング遺伝子の発現を防止し、細菌の生長を遅延または防止することができるからである。
【００１１】
Ｂｏｗｉｅらに対する米国特許第５，５８５，２７７号と第５，６７９，５８２号は潜在薬理または抗菌効果について化合物を選別する方法を開示している。とくに、これらの特許は標的タンパク質に結合する可能的治療リガンドを識別する方法を教示している。これらの特許の方法はＲＮＡポリメラーゼの試験管内阻害剤などの化合物、またもっと具体的にはブドウ球菌内の一次σサブユニットなどのＲＮＡポリメラーゼ特異性因子の初期識別の親和性ベース評価分析に有益であろう。しかしながら、識別方法の技術、および標的微生物の生長および／または生存に対する化合物の生体内効果を監視する、それに有益な組換え微生物が必要なままである。特に、組換え微生物のための技術と、微生物の生長と継続的存在に不可欠な遺伝子を暗号化するＲＮＡポリメラーゼ特異性因子が選別過程で使用するために特異的に制御できる、そのための産生方法が必要なままである。とくに、ＲＮＡポリメラーゼσサブユニットの産生が選別方法で使用できるように特異的に制御できるブドウ球菌株の技術が必要なままである。くわえて、ＲＮＡポリメラーゼσサブユニットの機能と相互作用および／または修飾し、それによって細菌生長を阻害する抗菌作用物質の識別を可能にする特定の方法と組成物の技術が必要である。
【００１２】
発明の要約
したがって、本発明の目的は、ＲＮＡポリメラーゼ特異性因子の産生が制御できる微生物を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は微生物の生長または継続的存在のために必須の遺伝子または遺伝子の組の発現に要求されるＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化する調節自在な遺伝子を有する組換え微生物を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的はかかる組換え微生物の産生のための方法を提供することである。
【００１５】
本発明の別の目的はＲＮＡポリメラーゼσサブユニットの産生を制御することができるブドウ球菌株を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに別の目的はそのＲＮＡポリメラーゼσサブユニットの機能と相互作用する微生物作用物質の識別を可能にする操作したブドウ球菌株を提供することである。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は特定の微生物に対して、またとくにブドウ球菌株に対して有益な候補抗菌化合物を検出するために高い効率で選別する方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらに別の目的はＲＮＡポリメラーゼσ因子を発現するための誘導可能遺伝子を担持する黄色ブドウ球菌の医薬品感受性をプロファイリングする方法を提供することである。
【００１９】
つぎに、本発明によれば、微生物の生長のために必須の選択された遺伝子発現に要求されるＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化する調節自在な遺伝子を有する組換え微生物が提供される。とくに、組換え微生物は、調節可能な遺伝子が、抑制因子が完全にまたは不完全に結合することが可能でそれによってＲＮＡポリメラーゼ特異性因子の遺伝子転写を抑制することができる、オペレータ部位を含む誘導因子応答遺伝子である、組換え微生物株とすることができる。
【００２０】
もっと具体的には、本発明はブドウ球菌株の生長に関係する選択されたハウスキーピング遺伝子発現に要求されるブドウ球菌ＲＮＡポリメラーゼσサブユニットを暗号化する調節自在な遺伝子を有する組換えブドウ球菌株に向けられる。とくに、調節可能な遺伝子はｌａｃｌ−暗号化抑制因子が完全にまたは不完全に結合することが可能で、それによってＲＮＡポリメラーゼσサブユニットの遺伝子転写を抑制することができるｌａｃオペレータを含むことができる。調節可能な遺伝子は好適にはＩＰＴＧ応答ｐｌａＣ対立遺伝子であり、組換えブドウ球菌株は好適には黄色ブドウ球菌株である。
【００２１】
本発明はまた微生物の生長または継続的存在に必須の選択的遺伝子の発現に必要なＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化するための調節可能な遺伝子を有する組換え微生物を産生する方法に向けられる。該方法はＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化する野生型遺伝子を識別する過程と、固有転写制御配列が欠けているその標的遺伝子断片を発生する過程と、誘導可能なプロモータの下流の場所で適切な組み込みベクターに標的遺伝子断片を連結する過程とから成る。つぎに組み込みベクターは組換え微生物を産生するために野生型微生物の染色体内に組み込まれる。組み込みベクターは抑制因子暗号化遺伝子、耐性決定因子、標的遺伝子断片の挿入のためのマルチクローニング部位と転写ターミネータをとくに含むことができる。
【００２２】
とくに、該方法はＲＮＡポリメラーゼσサブユニットを暗号化するために調節可能な遺伝子を有する、黄色ブドウ球菌の株のような、組換えブドウ球菌株の産生に向けられる。野生型遺伝子は好適にはｐｌａＣであり、組み込みベクターは好適には抑制因子を暗号化するためのｌａｃｌ遺伝子と、好適には標的遺伝子断片の挿入のためのＳｒｆｌ部位を含むマルチクローニング部位と、転写ターミネータと、クロラムフェニコール耐性決定因子を含むプラスミドである。
【００２３】
本発明の別の実施態様は、とくにブドウ球菌株および黄色ブドウ球菌などの微生物に対して有効な候補医薬品化合物を識別するために高い効率で選別する方法に関するものである。とくに、該方法は微生物の生長および／または生存可能性などの、継続的存在に必須の少なくとも一つの遺伝子の発現に必要な黄色ブドウ球菌内のσ因子などの、ＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を標的とする候補医薬品化合物を識別する。該方法は複数個の培養物を調製する過程と、それぞれの培養物を試験化合物と接触させる過程と、試験化合物がＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を標的とすることを示す結果を識別するために培養物を監視する過程とから成る。複数個の培養物を調製する過程は第一のタイプの培養物と第二のタイプの培養物を調製する過程を含んでいる。第一のタイプの培養物はＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化するための調節可能な遺伝子を有する微生物の組換え株を含み、第二のタイプの培養物はＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化するための野生型遺伝子を有する微生物の野生型株を含んでいる。調節可能な遺伝子は周知の技術である抑制因子と誘導因子分子の使用などの、各種の方法で調節できるものとすることができる。調節可能な遺伝子は、第一のタイプの培養物のいくつかにおいて基底レベルで発現し、作用物質を含む遺伝子または調節可能な遺伝子の規制条件によって決定された抑制因子分子イニシエータを含む、外因性作動因子分子に第一のタイプの培養物のいくつかが曝露された結果として第一のタイプの培養物の他のものにおいては基底を越えるレベルで発現される。第二のタイプの培養物のいくつかも外因性作動因子分子に曝露される。
【００２４】
遺伝子誘導作用物質が外因性作動因子分子として添加されたとき、該方法はさらに、遺伝子誘導作用物質に曝露されなかった第一のタイプの培養物に必要であれば基底レベル発現を誘導するために、これらの培養物に準最高濃度で遺伝子誘導作用物質を添加する過程を含むことができる。培養物を試験化合物に接触させる過程に先だって、培養物は好適には標的密度に近づくためにそれぞれの培養物の成長に十分な条件の下で選択された時間の間培養される。くわえて、培養物を試験化合物に接触させる過程の後、培養物は好適には培養物の生長を支援する条件下で保温される。
【００２５】
培養物は組と群に組織化し、それを行と列の配列に組織化することができる。それぞれの群は好適には異なる濃度の試験化合物と接触させられる。該方法は複数個の試験化合物について反復することができる。
【００２６】
監視する過程は候補医薬品化合物である試験化合物が遺伝子が基底レベルで発現された第一のタイプの培養物の生長を阻害する培養物の生長を測定することによって実施できる。代案として、候補医薬品化合物は調節可能な遺伝子が基底レベルで発現している第一のタイプの培養物内でＲＮＡ合成を阻害するものとして識別できる。
【００２７】
本発明はまたＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を標的とする候補医薬品化合物を識別するための高効率選別方法において、ＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化する調節可能な遺伝子を有する組換え株を調製する過程と、株を成長させる過程と、ＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を単離し精製する過程と、ＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を試験化合物と接触させる過程と、試験化合物が前記ＲＮＡポリメラーゼ特異性因子に結合するかを検出する過程とから成る方法に関するものである。
【００２８】
本発明のこれらおよびその他の目的は、以下の本発明の非制限的実施態様の詳細な説明を、付属の図面を参照して、読むことによっていっそう明らかになるだろう。
【００２９】
図面の簡単な説明
明細書に含まれ、その一部をなす付属の図面は本発明の推奨実施態様を示すものであり、記載と共に、本発明の原理の説明に供される。図面には下記のものがある。
【００３０】
図１はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を表す、調節された遺伝子発現を操作するための本発明に用いられる組み込みベクターであるｐｌｎｄの概略図である。
【００３１】
図２はＩＰＴＧ−誘導可能プロモータを使用する調節可能なｐｌａＣ遺伝子を担持する黄色ブドウ球菌の構造を示す概略図である。
【００３２】
図３は誘導および非誘導条件下での本発明の黄色ブドウ球菌株の生長の写真説明図である。
【００３３】
図４は遺伝子誘導作用物質ＩＰＴＧの存在を含む、および排除する生長条件で、本発明に従って操作された修飾黄色ブドウ球菌株と野生型黄色ブドウ球菌株の成長を示すグラフである。
【００３４】
図５はＩＰＴＧによるｐｌａＣ発現の定量を示す細胞抽出物の免疫ブロット分析を示す写真である。
【００３５】
図６はＩＰＴＧ−誘導ｐｌａＣ遺伝子を担持する黄色ブドウ球菌の医薬品感受性のプロファイリングを示す概略図である。
【００３６】
実施態様の詳細な説明
本発明は組換え微生物、とくに黄色ブドウ球菌株などの組換えブドウ球菌株の産生、および組換え微生物が派生した野生型微生物に対して薬理的に有益な化合物を発見するために組換え微生物を使用する高効率選別法に関するものである。
【００３７】
Ａ．組換え微生物の産生
本発明は自生遺伝子が、誘導因子または抑制因子分子の添加などによって、発現が調節できる遺伝子操作された遺伝子によって置換された組換え微生物を生み出すことを包含する。自生、または野生型遺伝子は自生、または野生型微生物内で、ＲＮＡポリメラーゼ酵素の結合を微生物の生長または継続的存在に必須の特定の遺伝子または遺伝子の組のプロモータ配列に向けるＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化する。ＲＮＡポリメラーゼ特異性因子産生の調節を可能にすることによって、組換え微生物は微生物の生長および／または継続的存在に対する外部制御を提供する。かかる制御は化合物に対する抑圧された、または誘導されていない組換え微生物の過敏性によって示される、特異性因子機能の阻害または阻止を示す化合物のための効果的選別を可能にする。
【００３８】
本発明の組換え微生物に使用するための特異性因子を暗号化する遺伝子はバクテリアなどの、野生型微生物から誘導することができ、また配列はゲノムＤＮＡの制限酵素消化によって、または好適には、既知のポリメラーゼ連鎖反応を元にした方法を用いる増幅によって得ることができる。
【００３９】
とくに、組換え微生物の産生には、自生微生物内のＲＮＡポリメラーゼ特異性因子を暗号化する対象の野生型遺伝子を識別し、固有の転写制御配列が欠損したその標的遺伝子断片を生み出すことが関与する。好適には、標的遺伝子断片は野生型微生物ゲノムＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって産生される。つぎに標的遺伝子断片は、適切なマルチクローニング部位（ＭＣＳ）などの、誘導可能なプロモータの下流の場所で適切な組み込みベクター内に連結される。
【００４０】
誘導可能なプロモータは異種規制遺伝子からのオペレータを含む。適切な異種規制遺伝子には、ｌａｃ（ｌａｃｌなど）、ｔｅｔ、λ、ｌｅｘおよび当業者に周知の他のものから誘導されるものが含まれる。組み込みベクターは好適には選択した規制オペレータに対応する抑制因子暗号化遺伝子、ベクター組み込みの後に組換え株を選択するための耐性決定因子、誘導可能なプロモータの下流の標的遺伝子断片の挿入のためのマルチクローニング部位と、好適には読み過ごし転写を除去するための誘導可能なプロモータの上流の双方向転写ターミネータを含んでいる。
【００４１】
つぎに組み込みベクターは電気転換などによって、自生微生物のＤＮＡ内に組み込まれる。耐性決定因子の選択による相同組換えは調節可能な遺伝子を担持する組換え形質転換体を産生する。
【００４２】
１．組換えブドウ球菌株
とくに、本発明は野生型遺伝子と通常称される、自生σ因子暗号化遺伝子が、外因性作動因子分子の添加によって、またとくに選択した規制オペレータに適した誘導作用物質によって発現を誘導することができる遺伝子操作された遺伝子で置換されたブドウ球菌株を使用する。野生型黄色ブドウ球菌株において、バクテリアの生長および／または生存可能性に必要な上述のハウスキーピング遺伝子の発現のために要求されるＲＮＡポリメラーゼσサブユニットは自生転写制御配列に従って、細胞内でｐｌａＣによって産生される。しかしながら、本発明の組換えブドウ球菌株によって、調節可能なｐｌａＣ遺伝子はバクテリアの遺伝子組み立ての要因となる。この調節可能な遺伝子は抑制因子タンパク質が結合することのできるオペレータ部位を含んでおり、それによってＲＮＡポリメラーゼσサブユニットの転写とその後の発現が抑制される。抑制因子タンパク質は組換えＤＮＡ内の、ｌａｃｌなどの追加遺伝子によって産生される。
【００４３】
この抑制は抑制因子タンパク質と結合し、ｐｌａＣ遺伝子のその抑圧を防止する誘導作用物質の添加によって克服可能であり、それによってｐｌａＣ遺伝子の転写およびＲＮＡポリメラーゼσサブユニットの発現または産生が可能になる。このようにして、本発明の組換えブドウ球菌株内のＲＮＡポリメラーゼσサブユニットの産生は誘導作用物質の使用によって制御できる。
【００４４】
なお、本発明の組換え黄色ブドウ球菌バクテリアに使用されるσ因子暗号化遺伝子にはｐｌａＣ、ｓｉｇＢその他が含まれるがそれらに限定されず、また好適にはｐｌａＣが含まれる。本発明のσ因子暗号化遺伝子配列は任意のブドウ球菌株から誘導できるが、好適なバクテリアは黄色ブドウ球菌であり、配列はゲノムＤＮＡの制限酵素消化によって得られる、あるいは、好適には、既知のポリメラーゼ連鎖反応を元にした方法を用いる増幅によって得られる。先述のごとく、適切な異種規制遺伝子にはｌａｃ（ｌａｃｌなど）、ｔｅｔ、λ、ｌｅｘその他から誘導したものが含まれる。好適な形において、規制遺伝子は組み換えｐｌａＣ遺伝子内でｌａｃオペレータに結合し、それによってσ因子の発現を抑圧する抑制因子タンパク質を産生するｌａｃｌである。
【００４５】
本発明の組換えブドウ球菌株を構成するときに、異種プロモータσ因子暗号化ＤＮＡ断片は図１に示したような組み込みプラスミドベクター内に暗号化される。ここで、ｐｌａＣ遺伝子の転写は、黄色ブドウ球菌内に誘導可能なプロモータ（Ｐｉｎｄ）の制御の下に置かれ、そこではＰｉｎｄがｌａｃオペレータ部位を含んでいる。ｌａｃ規制因子の場合、プロモータの抑制を阻止するための好適な誘導因子または誘導作用物質はチオガラクトシドであり、好適にはイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）である。
【００４６】
図１はｐＡＧ５８の修飾版であるｐｌｎｄ組み込みベクターを示している（Ｊａａｃｋｓ　ｅｔ　ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１：４１２１−４１２９；Ｈｅｎｎｅｒ，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：２２３−２２８）。ｐｌｎｄ１０はｌａｃオペレータを有する組み換え遺伝子の負の規制のための抑制因子タンパク質を合成するｌａｃｌ規制遺伝子１２を担持する。ｐｌｎｄ１０はグラム陽性菌内で選択可能なプラスミドｐＣ１９４のクロラムフェニコール耐性決定因子１４（Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ　＆　Ｗｅｉｓｂｌｕｍ，１９８２，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５０：８１５−８２５）、Ｐｉｎｄ１８の下流の平滑ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）発生標的遺伝子断片の挿入のための適切なＳｒｆｌ部位を含むマルチクローニング部位（ＭＣＳ）１６，およびベクターＤＮＡに起因する読み過ごし転写物を除去するためにＰｉｎｄ１８の上流のバクテリオファージＯ２９（Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ　ｅｔ　ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１，Ｎｏ．５：１７５１−１７５５）からの双方向転写ターミネータ２０も担持している。
【００４７】
ｐｌａＣ遺伝子のＩＰＴＧ−誘導応答コピーは黄色ブドウ球菌染色体内で図２に示したごとくｐｌｎｄにクローン化されたｐｌａＣの５’断片を用いて操作される。自生（すなわち野生型）転写制御配列欠損ｐｌａＣ遺伝子の４９８ｂｐ間隔は公刊されたｐｌａＣ配列（Ｂａｓｈｅｅｒ　＆　Ｉｏｒｄａｎｅｓｃｕ，１９９１，ＮＡＲ　１９：４９２１−４９２４）に基づくプライマーのそれぞれの１μｇで黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０（Ｋｒｅｉｓｗｉｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ　３０５：７０９−７１２）ゲノムＤＮＡの０．１μｇからＰＣＲ増幅される：
５’−ＡＴＧＴＣＴＧＡＴＡＡＣＡＣＡＧＴＴＡＡＡＡＴＴ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）および
５’−ＣＡＴＡＴＴＡＣＣＴＴＣＴＴＧＧＡＴＴＡＡＡＴＣ−３’（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）。
【００４８】
ＰＣＲ生成物はＳｒｆｌ部位でｐｌｎｄのマルチクローニング部位に連結された。結果としてのプラスミドはＩＰＴＧ−誘導ｐｌａＣ対立遺伝子、Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣを担持する黄色ブドウ球菌転換物質を産生するためにプラスミドから生まれたクロラムフェニコール耐性を選択することによって相同組換えを介してｐｌａＣ部位で黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０（Ｋｒｅｉｓｗｉｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ　３０５：７０９−７１２）の染色体内に組み込まれた。黄色ブドウ球菌の電気転換は記載のごとく実施した（Ｓｃｈｅｎｋ　ａｎｄ　Ｌａｄｄａｇａ，１９９２，ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．９４：１３３−１３８）。操作したＰｉｎｄ−ｐｌａＣ遺伝子の転写は培養媒質へのＩＰＴＧの添加に応じて誘導される。ＩＰＴＧがないとき、ｐｌａＣ転写はｌａｃｌ−暗号化抑制因子をＰｉｎｄの−１０領域の近傍のオペレータ部位（ｌａｃＯ）に結合することによって抑制される（図１）。
【００４９】
図３はｐｌａＣ転写がＰｉｎｄの制御の下におかれた黄色ブドウ球菌クロラムフェニコール耐性形質転換体の表現型分析を示している。Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣを含む菌はＩＰＴＧのないとき生存可能性を示し、野生型ｐｌａＣ対立遺伝子を有するクロラムフェニコール耐性株と比較して有意の生長欠陥を含む、多面表現型を示した。ＩＰＴＧのないとき、Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣを担持する形質転換体はコロニーの大きさの縮小と、図３に示したごとく、通常固定相と組み合わされた黄色いカロテノイド色素の産生の目立った増強を示した。液体培養物をさらに検査すると、Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣ細胞の生長が図４に明らかに示すごとく非誘導条件の下で野生型細胞のそれに比べてはるかに後方に遅れたことを示した。ｐｌａＣ発現は黄色ブドウ球菌の生長に必須であるから、ＩＰＴＧのないときのＰｉｎｄ−ｐｌａＣ菌の生存はｌａｃｌによる伝達の不完全な抑制に起因するものと解釈され、それが「漏洩性」である。抗ｐａｌＣ抗血清による細胞抽出物の免疫ブロット分析によるｐｌａＣレベルの定量化は図５に明らかに示すごとく、ＩＰＴＧによるｐｌａＣ発現の誘導を実証した。しかしながら、ＩＰＴＧなしで生長した非誘導細胞（レーン４）内のｐｌａＣタンパク質のレベルは検出限度未満であった。
【００５０】
本発明の推奨実施態様において、組み込みベクターは誘導作用物質がないとき（すなわち−ＩＰＴＧ）のσ因子発現の抑制レベルを最適化するために、また誘導作用物質があるとき（すなわち＋ＩＰＴＧ）のσ因子発現の誘導を最適化するために修飾することができる。本発明の範囲内である、かかる修飾には、オペレータ部位および転写終結部位などの追加の制御配列の含有が含まれるが、それに限定されない。
【００５１】
なお、組み込みプラスミドを含むｐｌａＣによる、ブドウ球菌株、好適には黄色ブドウ球菌の形質転換はこの分野で周知の任意の方法、好適には電気泳動を用いて達成することができる。プラスミド誘導配列とゲノムＤＮＡの間の組換えの結果、自生σ因子暗号化遺伝子（すなわち野生型）がプラスミドの中に存在する形質転換体遺伝子に置き換えられた。本発明の形質転換株内のσサブユニットの発現は異種プロモータによって指定された誘導作用物質（または作用因子分子）を用いて誘導することができる。例えば、ｌａｃが用いられるとき、σ因子の発現はバクテリアの培養物を、先述のごとく、ｌａｃｌ抑制因子タンパク質に結合し、遺伝子抑制を逆転または阻止するＩＰＴＧに曝露することによって誘導できる。
【００５２】
本発明による例としての形質転換黄色ブドウ球菌株は特許寄託としてＡＴＣＣとともに寄託されている。培養物は１９９９年１２月１日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣ　Ｐａｔｅｎｔ　Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ　２０１１０−２２０９に寄託され、黄色ブドウ球菌ＲＮ４２２０，ＳＰ１０１と命名され、登録番号ＰＴＡ−１００７が付けられた（参照 １９３３．０２．０２．１）。
【００５３】
本発明の実施の際に、分子生物学、微生物学および形質転換ＤＮＡの数多くの従来技術が用いられた。かかる技術は周知であり、各種の入手可能なテキストや論文に完全に記載されているが、その内容は次のごとく、参照文献として本書にとくに含められる：Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｂｙ　Ｂｅｎｊａｍｉｎ　Ｌｅｗｉｎ，１９９７，Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，ｂｙ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　ｅｔ　ａｌ，１９８９，Ｓｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ；ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ　Ｉ　ａｎｄ　ＩＩ，１９８５，（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ　ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９８４，（Ｍ．Ｌ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．）；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，１９８５，（Ｈａｍｅｓ　＆　Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，１９８４，（Ｈａｍｅｓ　＆　Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．）；Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ，１９８６，（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｃｅｌｌｓ　ａｎｄ　Ｅｎｚｙｍｅｓ，１９８６（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）；Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，１９８４，ｂｙ　Ｐｅｒｂａｌ；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｔｈｅ　ｓｅｒｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌｓ，１９８７（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４，１５５（Ｗｕ　ａｎｄ　Ｇｒｏｓｓｍａｎ，ｅｄｓ．）；およびＧｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｙｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ．１９４（Ｇｕｔｈｒｉｅ　ａｎｄ　Ｆｉｎｋ，ｅｄｓ．）。
【００５４】
本発明は、本発明の黄色ブドウ球菌株でＲＮＡポリメラーゼσサブユニットの制御された産生を通じて抗菌化合物を識別する選別方法に使用するための単離されたブドウ球菌ＲＮＡポリメラーゼσ因子も提供する。本発明によれば、σ因子ポリペプチドは好適には長さが少なくとも５以上の残基である。好適には、ポリペプチドは少なくとも１２の、もっと好適には少なくとも約２０の、もっとも好適には少なくとも約３０のかかる残基からなり、最大限タンパク質の完全なアミノ酸配列を含んでいる。タンパク質生化学および免疫学の数多くの従来技術をこれらのポリペプチドを得るために本発明の中で用いることができる。
【００５５】
とくに、ブドウ球菌ＲＮＡポリメラーゼσサブユニットの機能保存変型を含む、本発明のポリペプチドは、野生型、突然変異または組換え細胞から、または異種細胞または微生物から単離することができる。くわえて、ポリペプチドは排他的固体相合成、部分固体相法、断片凝集、または古典的溶液合成などの商業的に入手可能な、既知の手順で化学的に合成することができる。最後に、ポリペプチド精製方法は当業者には周知であり、単離されたポリペプチドは、例えば、燐酸エステル化、硫酸化、アシル化、またはその他の既知のタンパク質修飾によって修飾することができる。それらはまた放射性同位元素、および蛍光化合物を含む検出可能な信号を提供することのできるゲル標識によっても修飾できる。
【００５６】
Ｂ．選別方法
本発明は、黄色ブドウ球菌内のＲＮＡポリメラーゼσサブユニットなどのＲＮＡポリメラーゼ特異性因子の機能を阻害することによって作用する薬理的に適切な抗菌化合物を識別する方法も提供する。なお、本発明の選別法は、微生物の生長および／または生存可能性に必須のハウスキーピング遺伝子の発現に要求されるＲＮＡポリメラーゼ特異性因子の機能を阻害する候補医薬品または抗菌化合物を識別するためにその他の対象の微生物にも実施できる。
【００５７】
本発明の代表的な方法は、誘導および非誘導組換えおよび野生型ブドウ球菌株、好適には黄色ブドウ球菌の平行培養物を調製し、培養することが含まれる。規制遺伝子のオペレータ部位への規制因子の不完全な結合の結果として、非誘導組換え株内のＲＮＡポリメラーゼσサブユニットの最小発現の結果、σサブユニットを標的とする試験化合物に対して非誘導組換え株が過敏になる。この過敏性は、すべてがσサブユニットを標的とする試験化合物が存在するとき、他の株に比べて非誘導組換え株の生長が制限されることである。後述の本発明の好適実施態様は黄色ブドウ球菌株を用いるが、本発明は種類を問わずブドウ球菌株に応用できることに注意しなければならない。さらに、本発明の一般的選別法はＲＮＡポリメラーゼ特異性因子の生成が調節可能な任意の組換え微生物で実施できることを理解しなければならない。くわえて、本発明の選別方法は、異なる規制機構の使用を受け入れるために、当業者が理解できる範囲で、変更できることに注意しなければならない。
【００５８】
本発明の代表的方法によれば、既知の技術を用いて複数個の培養物が調製され、好適には、配列、または格子、フォーマットに組織化される。かかる培養物の代表的な組織は図６に、化合物１または化合物２のために示された配列として図示した。第一のタイプの複数個の培養物および第二のタイプの複数個の培養物を調製した。第一のタイプの培養物はブドウ球菌ＲＮＡポリメラーゼσサブユニットを暗号化するための負に調節された、誘導因子応答ｐｌａＣ遺伝子を有する組換え黄色ブドウ球菌株を含んでいる。第一のタイプの培養物は図６に「Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣ」として示されている。第二のタイプの培養物はＲＮＡポリメラーゼσサブユニットを暗号化する野生型遺伝子を有する黄色ブドウ球菌株を含んでいる。図６において、第二のタイプの培養物は「野生型」として記載されている。図６において、複数個の培養物が、例えば、上の化合物１と下の化合物２について配列の形で示されている。しかしながら、培養物の組織はこの技術分野で理解されるように変更することができる。
【００５９】
第一のタイプの培養物のいくつかと第二のタイプの培養物のいくつかは組換え株内の選択した規制オペレータにふさわしく、誘導因子または抑制因子分子などの外因性作動因子分子に曝露される。好適には、外因性作動因子分子は第一のタイプの培養物のすべてより少ないものに、また第二のタイプの培養物のすべてより少ないものに添加される。もっと好適には、外因性作動因子分子は第一のタイプの培養物の半分に、また第二のタイプの培養物の半分に添加される。
【００６０】
図６に示したように、代表的な実施態様において、培養物は好適には第一のタイプの培養物の第一の組と第二の組と、第二のタイプの培養物の第三の組と第四の組に組織化される。作動因子分子は好適には、第一の組に、好適にはＰｉｎｄ−ｐｌａＣ培養物の半分に添加され、それによってＩＰＴＧが添加された培養物に調節可能な遺伝子の発現を誘導する遺伝子誘導作用物質、好適にはＩＰＴＧである。作動因子分子は第三の組にも、好適には第二のタイプの培養物の半分に添加される。ＩＰＴＧが添加された培養物は図６において、「＋ＩＰＴＧ」で表され、ＩＰＴＧが添加されなかった培養物は「−ＩＰＴＧ」で表されている。結果として、配列を構成する４組の平行培養物があり、具体的には野生型＋ＩＰＴＧ、野生型−ＩＰＴＧ、Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣ組換え＋ＩＰＴＧ、およびＰｉｎｄ−ｐｌａＣ組換え−ＩＰＴＧである。図６は水平な列に並んだこれらの培養物の組を図示している。
【００６１】
Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣ組換え−ＩＰＴＧ培養物において、調節可能な遺伝子は、上述の規制系の不完全な伝達抑制、または「漏洩性」の結果として、微生物の生長を支えるのにちょうど足りる、基底レベルで発現される。Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣ組換え＋ＩＰＴＧ培養物において、調節可能な遺伝子は、ＩＰＴＧによる発現の誘導の結果として、基底を越えるレベルで発現される。野生型培養物において、調節可能な遺伝子は自生転写可能制御配列に従って、好適には基底を越えるレベルで発現される。したがって、Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣ組換え−ＩＰＴＧ培養物は、Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣ組換え−ＩＰＴＧ培養物内に存在するＲＮＡポリメラーゼσサブユニットの量が制限される結果として、ＲＮＡポリメラーゼσサブユニットが標的とする試験化合物に対する過敏性を示すものと期待される。
【００６２】
なお、場合よっては、一般的に微生物のタイプと規制系のタイプに依存して、非誘導組換え組の「漏洩性」が微生物の最低生長を支えるのに不十分なことがあり、その場合、準最大レベルで非誘導組換え組に誘導作用物質を添加することが必要になるかもしれない。くわえて、本方法は抑制因子がないときに発現する調節可能な遺伝子を有する微生物に適合させることができる。このような場合、調節可能な遺伝子の発現を基底レベルまで抑制するのに十分な、微生物の制限された生長だけを支えるのに十分な量の抑制因子を一部の組換え培養物に加えることが必要になるかもしれない。抑制因子が添加されていない培養物はこれらの基底レベル以上で発現されるはずである。
【００６３】
好適には、このとき培養物は、図４に示すごとく、Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣ組換え−ＩＰＴＧ組の初期の遅く予想される生長が要因にならないように、培養物の密度が目標密度、例えば、すべての培養物内で類似の密度に近づくのに十分な、時間の間、好適には一晩、培養される。
【００６４】
培養物はつぎに、試験化合物と接触させられ、ついで好適には試験化合物がないときに培養されたすべての培養物の生長を通常支えるであろう条件の下で培養される。図６に示したごとく、σサブユニットを標的とする試験化合物に対する非誘導組換え培養物（Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣ組換え−ＩＰＴＧ）の過敏性が試験化合物の極めて高いか、きわめて低い濃度のいずれかで観察されることは意外である。したがって、複数個の培養物をさらに群に分割し、図６の培養物の縦の欄によって示されるように、それぞれの群が組のそれぞれからの一つの培養物を含むことが望ましい。さらに、それぞれの群が、図６の培養物内の左から右に逓減する試験化合物濃度によって示されるように、他の群からの異なる濃度の試験化合物と接触させられることが望ましい。したがって、培養物の各組はそれぞれ好適には、試験化合物の濃度範囲を受容し、それに対して培養物に対する化合物の影響を試験化合物が候補医薬品化合物であるかの兆候について監視することができる。ここで、関心のある所与の濃度が識別されたとき、それぞれの組は試験化合物が所与の濃度で添加された、複数個の培養物でなく、一つの培養物を含むだけでよい。
【００６５】
試験化合物と接触した培養物はつぎに試験化合物が微生物に対して有効な候補医薬品化合物であるかの兆候について監視される。例えば、培養物内の菌の生長が測定される。σ因子機能を阻害することによって抗菌能力を有する試験化合物は、試験化合物の選択された濃度において、培養物の残りの組に対して、Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣ組換え−ＩＰＴＧなどの非誘導組換え組内で菌の生長を阻害するものであると識別できる。くわえて、ＲＮＡ合成または産生の阻害も培養物内で判定され、培養物の残りの組に対して、Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣ組換え−ＩＰＴＧ組内で試験化合物がＲＮＡ合成を阻害するとき試験化合物は候補として識別される。培養物の生長とＲＮＡ合成の両者は任意の所望の従来技術を用いて測定できる。例えば、生長は、例えば、Ｋｌｅｔｔリーダーまたは分光測光計内の培養吸収を監視することによって測定できる。ＲＮＡ合成は、例えば、放射線標識を付けたＲＮＡ前駆体の取り込みを測定することによって、あるいは転写がσ依存プロモータによって制御されるレポーター遺伝子の発現を監視することによって測定できる。
【００６６】
残りの培養物に対して、非誘導組換え組の生長を阻害するおよび／またはＲＮＡ合成を阻害する化合物は候補抗菌作用物質である、なぜならこれらの化合物は非誘導組換え組内に表示されたＲＮＡポリメラーゼσ因子の低いレベルの転写を明らかに阻害するか、少なくとも干渉するからである。すなわち、例示した黄色ブドウ球菌株のｐｌａＣ遺伝子の場合、抑制因子はＩＰＴＧ−応答ｐｌａＣ遺伝子と不完全に結合するので、ＩＰＴＧ誘導作用物質がない場合（−ＩＰＴＧ）でも、ｐｌａＣ遺伝子はなおきわめて低い基底レベルで転写され、限られた量のＲＮＡポリメラーゼσサブユニットが形成される結果、生長が制限される。このように、誘導因子（Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣ組換え−ＩＰＴＧ）のない培養物は野生型菌株または誘導された組換え株に対して、σサブユニット発現を標的にする抗菌化合物に対して感受性が高いか、あるいは過敏である、なぜなら非誘導組換え組内で開始されるσサブユニット産生がほとんどないからである。他の対象となる遺伝子および微生物の場合、組換え組は誘導因子がないとき特異性因子の産生が不十分になり、生長がない結果になることがある。このような場合、当業者が理解した限りにおいて、準最大レベルの誘電因子を添加して、それによって限定された生長にいたる限定された特異性因子の産生を誘導する必要があるだろう、それによってかかる培養物は同様に特異性因子を標的とする化合物に対して過敏になるだろう。
【００６７】
本発明の方法は、医薬品の発見および医薬品プロファイリングに関わる用途分野に利点を提供する。この特定の例において、σの機能を阻害する化合物のためのセルを基礎にしたスクリーンを開発するためにＰｉｎｄ−ｐｌａＣを担持する黄色ブドウ球菌細胞が使用された。ＩＰＴＧなしで生長したブドウ球菌を担持するＰｉｎｄ−ｐｌａＣの表現型は準許容条件で生長した温度感受ｐｌａＣ突然変異によって産生したものと外見が類似している。かかる菌は減衰または低下したσ機能を保有するものと見ることができる。ＩＰＴＧがないとき、Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣ菌は図６に示すごとく野生型ｐｌａＣ遺伝子を有する菌と比較してσを標的とする分子に対して高められた感受性を示すものと予測される。
【００６８】
別の実施態様において、Ｐｉｎｄ−ｐｌａＣ黄色ブドウ球菌は、とくに化合物が当初黄色ブドウ球菌ＲＮＡポリメラーゼの試験管内阻害剤の機能評価を用いて識別された場合、抗菌活性によって主導化合物の細胞間標的を確立することを目的とする医薬品プロファイリング研究に有益であることが証明されるはずである。
【００６９】
本発明のさらに別の実施態様において、有益な候補医薬品化合物、およびとくに抗黄色ブドウ球菌化合物はＲＮＡポリメラーゼ特異性因子に特異的に結合するものと識別されるが、それは黄色ブドウ球菌の場合、ｐｌａＣ遺伝子産生物、すなわちＲＮＡポリメラーゼσサブユニットである。本発明の誘導可能な株、およびとくにＰｉｎｄ−ｐｌａＣ組換え＋ＩＰＴＧは、ＩＰＴＧ誘導作用物質の添加などによって、調節可能な遺伝子が発現した条件の下で培養物を調製し生長させることによって大量のＲＮＡポリメラーゼσサブユニットを提供するのに使用できる。これは精製可能で、ついで試験管内評価で使用できる。典型的には、これらの評価には複数個の試験化合物を精製されたブドウ球菌ＲＮＡポリメラーゼσサブユニットと接触させる過程と、ついで試験化合物のσ因子への結合を測定する過程が含まれる。かかる結合は前述のＢｏｗｉｅらに対する米国特許第５，５８５，２７７号と第５，６７９，５８２号に開示されたものなどの、この技術分野で既知の任意の手段を用いて測定できるだろう。なお、本発明は機能評価などの、他の評価技術でも有益であろう。
【００７０】
好適には、本発明の選別方法は単一の評価で多数の化合物が分析できる、高い処理量フォーマットなどで、複数個の試験化合物で使用するのに適している。かかる阻害化合物は、例えば、自然に発生するライブラリ、植物と微生物を含む発酵ライブラリ、化合物ファイル、および合成化合物ライブラリの中に見出される。かかる化合物ライブラリは数多くの既知の出所から商業的に入手可能である。上述の本発明の方法を使用する識別された化合物は効能、効率、摂取、安定性および医薬品配合などに使用するための適性を高めるために変更しても良い。これらの変更はこの技術の分野で既知の方法を用いて達成され、試験される。
【００７１】
上記から自明なごとく、本発明のシステムはブドウ球菌、および特に黄色ブドウ球菌内の調節可能な遺伝子の発現のために設計されている。本発明は必須遺伝子を分析することを目的とし、菌の生長と生存可能性において、標的遺伝子産生物の役割を評価するために工夫されたものである。本発明は自生σ因子暗号化遺伝子が、その発現が外因性作動因子分子、とくにＩＰＴＧの添加によって誘導される遺伝子操作された遺伝子によって置換された組換えブドウ球菌株を生み出すことを包含する。さらに、本発明の操作した黄色ブドウ球菌株を用いる薬理的に有効なブドウ球菌抗菌候補を決定するための方法が紹介されている。
【００７２】
したがって、本発明は例示された本発明の実施態様にある程度重点を置いて記載された。しかしながら、ここに含まれる発明の構想から逸脱することなしに、本発明の例示的実施態様に対して修正または変更を加えることができるように、先行技術に照らして解釈された請求の範囲によって本発明は定義されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を表す、調節された遺伝子発現を操作するための本発明に用いられる組み込みベクターであるｐｌｎｄの概略図
【図２】ＩＰＴＧ−誘導可能プロモータを使用する調節可能なｐｌａＣ遺伝子を担持する黄色ブドウ球菌の構造を示す概略図
【図３】誘導および非誘導条件下での本発明の黄色ブドウ球菌株の生長の写真説明図
【図４】遺伝子誘導作用物質ＩＰＴＧの存在を含む、および排除する生長条件で、本発明に従って操作された修飾黄色ブドウ球菌株と野生型黄色ブドウ球菌株の成長を示すグラフ
【図５】ＩＰＴＧによるｐｌａＣ発現の定量を示す細胞抽出物の免疫ブロット分析を示す写真
【図６】ＩＰＴＧ−誘導ｐｌａＣ遺伝子を担持する黄色ブドウ球菌の医薬品感受性のプロファイリングを示す概略図
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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