(57)【要約】本発明は、サイクリン依存性キナーゼ、ＧＳＫ−３βおよびカゼインキナーゼ１を阻害する際に用いる医薬品製造における、式（Ｉ）のヒメニアルディシンもしくはその誘導体（式中、Ｒ１およびＲ２は同じまたは異なっていて、ＨまたはＢｒを表す）、またはその医薬品として許容される塩の使用に関する。神経変性性疾患、糖尿病、炎症性病変、および癌を予防および治療するための適用。【化１】2004500356.tif 000014
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイクリン依存性キナーゼ、ＧＳＫ−３βおよびカゼインキナーゼ１を阻害する際に用いる医薬品の製造における、下記の式Ｉのヒメニアルディシンもしくはその誘導体
【化１】
2004500356.tif 000013
（式中、Ｒ１およびＲ２は同じまたは異なっていて、ＨまたはＢｒを表す）、またはその医薬品として許容される塩の使用。
【請求項２】
化合物が４−（２−アミノ−４−オキソ−２−イミダゾリン−５−イリデン）−４，５，６，７−テトラヒドロピロロ（２，３−ｃ）アゼピン−８−オン、またはその医薬品として許容される塩である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
化合物が４−（２−アミノ−４−オキソ−２−イミダゾリン−５−イリデン）−２−ブロモ−４，５，６，７−テトラヒドロピロロ（２，３−ｃ）アゼピン−８−オン、またはその医薬品として許容される塩である、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記医薬品が神経変性性疾患を治療または予防するためのものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記医薬品がアルツハイマー病を治療するためのものである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記医薬品が糖尿病を治療または予防するためのものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記医薬品が炎症性病変を治療または予防するためのものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記医薬品が癌を予防または治療するためのものである、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記医薬品が経口経路による投与のために調製されている、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記阻害剤が注射経路による投与のために調製されている、請求項１から８のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、細胞分裂または細胞内シグナル伝達を阻止可能な医薬品の製造におけるヒメニアルディシンまたはその誘導体の使用に関する。
【０００２】
本発明は特に、蛋白質キナーゼ阻害剤の製造におけるヒメニアルディシン（以下、ＨＤと呼ぶ）またはその誘導体の使用に関する。
【０００３】
蛋白質キナーゼは細胞調節、特に蛋白質リン酸化に関与している。
【０００４】
サイクリン依存性キナーゼ蛋白質（略してＣＤＫ）は、細胞周期制御（ＣＤＫ１、２、３、４、６および７）、胸腺細胞アポトーシス（ＣＤＫ２）、神経機能（ＣＤＫ５）、転写制御（ＣＤＫ７、８および９）に関与している（総説［１、２、３］、参考文献リストは本書の最後に示している）。神経組織において、ＣＤＫ５／ｐ３５は微小管付属蛋白質ｔａｕおよびＭＡＰ−１Ｂ、Ｐａｋ１キナーゼならびにニューロフィラメントサブユニットをリン酸化する。集中的スクリーニングにより、オロモウシン（ｏｌｏｍｏｕｃｉｎｅ）、ロスコビチン（ｒｏｓｃｏｖｉｔｉｎｅ）、プルバラノール（ｐｕｒｖａｌａｎｏｌ）、フラボピリドール（ｆｌａｖｏｐｉｒｉｄｏｌ）、インジルビンズ（ｉｎｄｉｒｕｂｉｎｓ）、パウロンズ（ｐａｕｌｌｏｎｅｓ）などの一連のＣＤＫ化学阻害剤が数年のうちに同定された。これらの化合物のいくつかは顕著な選択性および有効性を示す。多くはＣＤＫ２と共結晶化され、キナーゼのＡＴＰ結合ポケットとのそれらの相互作用が詳細に解析されている（総説［４］）。
【０００５】
ＨＤは蛋白質キナーゼＣを阻害するとの報告もなされている（ＷＯ　９３１６７０３およびＷＯ　９５３１４６２）。
【０００６】
前記化合物およびその誘導体はＣＤＫ１、２および５、ならびに蛋白質リン酸化に関与する他の２つの主要な蛋白質キナーゼ、すなわちグリコーゲン合成酵素キナーゼ３−β（略してＧＳＫ−３β）およびカゼインキナーゼ１の強力で選択的な阻害剤であることが明らかにされている。
【０００７】
本発明は、したがって、サイクリン依存性キナーゼ、ＧＳＫ−３βおよびカゼインキナーゼ１を阻害する際に用いる医薬品製造における、下記の式Ｉのヒメニアルディシンもしくはその誘導体
【０００８】
【化２】
2004500356.tif 000002
（式中、Ｒ１およびＲ２は同じまたは異なっていて、ＨまたはＢＲを表す）、またはその医薬品として許容される塩の使用に関する。
【０００９】
本明細書において用いられる場合、「誘導体」なる用語は前述の塩を含む。
【００１０】
好ましい使用において、化合物は４−（２−アミノ−４−オキソ−２−イミダゾリン−５−イリデン）−４，５，６，７−テトラヒドロピロロ（２，３−ｃ）アゼピン−８−オン、またはその医薬品として許容される塩である。
【００１１】
もう１つの好ましい使用において、化合物は４−（２−アミノ−４−オキソ−２−イミダゾリン−５−イリデン）−２−ブロモ−４，５，６，７−テトラヒドロピロロ（２，３−ｃ）アゼピン−８−オン、またはその医薬品として許容される塩である。
【００１２】
他のＣＤＫ阻害剤で観察されるとおり、ＨＤおよびその誘導体はＡＴＰとの競合によって作用する。これらはＣＤＫ２のＧｌｕ−８１およびＬｅｕ−８３残基との３つの水素結合を通じてＡＴＰ結合ポケットと相互作用する。
【００１３】
ＣＤＫ２のＧｌｕ−８１およびＬｅｕ−８３残基との水素結合を形成することができるヒメニアルディシン誘導体も、本発明の一部である。
【００１４】
前述のとおり、前記化合物はＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ５、ＧＳＫ−３βおよびカゼインキナーゼ１を強力に阻害する。
【００１５】
いくつかのモデルにおけるインビボ実験で、Ｅ１８ラット皮質ニューロンにおけるＰａｋ１キナーゼのリン酸化／ダウンレギュレーションの欠損により示されるとおり、ＨＤおよびその誘導体がＣＤＫ５／ｐ３５を阻害することが明らかにされている。
【００１６】
これらは、ＧＳＫ−３β特異的部位におけるＭＡＰ−１Ｂリン酸化の阻害によって示されるとおり、インビボでＧＳＫ−３βも阻害する。また、これらは微小管結合蛋白質ｔａｕの、アルツハイマー病においてＧＳＫ−３βおよびＣＤＫ５／ｐ３５により過リン酸化されている部位でのインビボでのリン酸化も阻止する。
【００１７】
神経変性性疾患に関与する基質の過リン酸化に関与する主なキナーゼを表す、前記キナーゼに作用することにより、前記化合物は対応する状態を治療および予防する医薬品の製造のために非常に興味が持たれる。
【００１８】
したがって、本発明は、神経変性性疾患を治療する際に有用な医薬品の製造のためのＨＤおよびその誘導体の使用に関する。
【００１９】
前記医薬品はアルツハイマー病、またはパーキンソン病、多系統萎縮症などの他の神経疾患を治療または予防するために用いることができる。これらは、遺伝性イヌ脊髄性筋萎縮症のイヌを治療するためにも有用である。
【００２０】
本発明は、糖尿病の予防および治療において有効な医薬品の製造のためのＨＤおよびその誘導体の使用にも関する。前記化合物はＧＳＫ−３β阻害剤であるため、これらはその点で非常に興味深いインスリン様作用薬を構成する。
【００２１】
ＨＤおよびその誘導体の抗炎症性も、そのような状態を治療および予防する際に有用な医薬品の製造のために用いられる。
【００２２】
前記キナーゼ、特にＣＤＫに作用することにより、前記化合物は抗増殖効果も有し、非常に興味深い抗腫瘍性を示すことになる。本発明はしたがって、癌を予防および治療する医薬品製造のためのＨＤおよびその誘導体の使用にも関する。
【００２３】
式Ｉの化合物は海洋無脊椎動物から単離することができる［５］。
【００２４】
ＨＤはアゲラシダ、アキシネリダおよび磯海綿目に属する海洋海綿の種において見いだされた。これらの動物は、明らかに代謝的にＨＤに関係する様々な物質を含む（図１）。
【００２５】
式Ｉの化合物の医薬品として許容される酸付加塩は、通常の方法に従って有機または無機酸と形成される。
【００２６】
適当な酸には酢酸、アスコルビン酸、マレイン酸、リン酸、サリチル酸および酒石酸が含まれる。
【００２７】
医薬品は、前述の化合物の有効な量を、医薬品として許容される担体と共に含む。
【００２８】
前記担体は投与形態に応じて固体であっても、液体であってもよい。
【００２９】
医薬品は、非経口、直腸内、局所、経皮または経口などの様々な形態で投与することができる。これらは特に経口または注射可能な経路で投与される。
【００３０】
経口経路による投与のために、トローチ、圧縮錠、丸剤、錠剤、カプセル剤、滴剤、シロップ、懸濁剤または乳剤を用いることができる。これらの組成物は用量単位あたり１００から１０００ｍｇの活性成分を含むと都合がよく、３００から６００ｍｇが好ましい。
【００３１】
他の投与形態には、無菌または滅菌可能な溶液から調合された、静脈内、皮下または筋肉内経路のための注射溶液が含まれる。これらは懸濁液または乳液であってもよい。
【００３２】
これらの注射可能な形態は、用量単位あたり１００から１０００ｍｇの式Ｉの化合物、またはその医薬品として許容される塩を含み、３００から６００ｍｇが好ましい。
【００３３】
例示のために、それを必要とする患者に用いることができる用量は下記の用量に対応する。例えば、神経変性性障害の治療のために１日に１から４回、１００から１０００ｍｇ／日を患者に投与する。
【００３４】
本発明は、その活性成分が前述の式Ｉの化合物からなる生物学的試薬にも関する。
【００３５】
これらの試薬は細胞分裂およびリン酸化メカニズムの試験における基準または標準として用いることができる。
【００３６】
本発明の他の特徴および利点は、図１から１３を参考に以下の実施例に記載する。
【００３７】
Ｉ／材料と方法
−化学物質および試薬
オルトバナジン酸ナトリウム、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、ＲＮアーゼＡ、Ｍｏｐｓ、β−グリセロホスフェート、フェニルホスフェート、フッ化ナトリウム、グルタチオン−アガロース、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニトロフェニルホスフェート、ロイペプチン、アプロチニン、ミクロシスチンペプスタチン、大豆トリプシン阻害剤、ベンズアミジン、ヒストンＨ１（ＩＩＩ−Ｓ型）、ミエリン塩基性蛋白質、カゼインはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから入手し、［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ（ＰＢ１６８）はＡｍｅｒｓｈａｍから入手した。
【００３８】
ＧＳ−１ペプチド（ＹＲＲＡＡＶＰＰＳＰＳＬＳＲＨＳＳＰＨＱＳｐＥＤＥＥＥ）は合成によって得た。
【００３９】
ヒメニアルディシンは以前の報告［６、７］のとおりに単離し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に１０〜５０ｍＭの保存溶液として溶解した。これを水性緩衝液中で使用直前にＭｅ２ＳＯ中５〜１０ｍＭに希釈した。反応混合物中の最終ＤＭＳＯ濃度は１体積％未満であった。
【００４０】
アキシノヒダントイン（Ａｘｉｎｏｈｙｄａｎｔｏｉｎ）［７］、ヒメニアルディシン−白金錯体、ジアセチルヒメニアルディシン、ジアセチル−デブロモヒメニアルディシン、ジブロモファケルスタチン（ｄｉｂｒｏｍｏｐｈａｋｅｌｌｓｔｓｔｉｎ）［６］、アゲラスタチンＡ（ａｇｅｌａｓｔａｔｉｎ　Ａ）［８］、ジブロモアゲリフェリン（ｄｉｂｒｏｍｏａｇｅｌｉｆｅｒｉｎ）、クラスロジン（ｃｌａｔｈｒｏｄｉｎ）、ヒメニジン（ｈｙｍｅｎｉｄｉｎ）、ジブロモカンタレリン（ｄｉｂｒｏｍｏｃａｎｔｈａｒｅｌｌｉｎｅ）［９］は研究室で調製した。アゲロンジン（ａｇｅｌｏｎｇｉｎｅ）［１０］、ジスパカミドＢ（ｄｉｓｐａｃａｍｉｄｅ　Ｂ）［１１］、セプトリン（ｓｃｅｐｔｒｉｎ）［１２］、オロイジン（ｏｒｏｉｄｉｎ）［１３］およびスティーヴンシン（ｓｔｅｖｅｎｓｉｎｅ）（オジリン（ｏｄｉｌｉｎｅ））［１４、９］はＡｇｅｌａｓ属から精製した。
【００４１】
ＧＳＴ−網膜芽細胞腫蛋白質は細菌内で発現させ、以前の報告［１５］のとおりグルタチオン−セファロースビーズで精製した。ｐ９ＣＫＳｈｓ１−セファロースビーズは以前の報告［１６］のとおりに調製した。
【００４２】
−緩衝液
ホモジナイゼーション緩衝液：６０ｍＭ　β−グリセロホスフェート、１５ｍＭ　ｐ−ニトロフェニルホスフェート、２５ｍＭ　Ｍｏｐｓ（ｐＨ７．２）、１５ｍＭ　ＥＧＴＡ、１５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　バナジン酸ナトリウム、１ｍＭ　ＮａＦ、１ｍＭフェニルホスフェート、１０μｇロイペプチン／ｍｌ、１０μｇアプロチニン／ｍｌ、１０μｇ大豆トリプシン阻害剤／ｍｌおよび１００μＭベンズアミジン。
【００４３】
緩衝液Ａ：１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＥＧＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴ、２５ｍＭ　トリスＨＣｌ　ｐＨ７．５、５０μｇヘパリン／ｍｌ。
【００４４】
緩衝液Ｃ：５ｍＭ　ＥＧＴＡ、ＮａＦ無添加、プロテアーゼ阻害剤無添加以外はホモジナイゼーション緩衝液。
【００４５】
低張溶解緩衝液（ＨＬＢ）：５０ｍＭトリスＨＣｌ　ｐＨ７．４、１２０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０％グリセロール、１％ノニデットＰ４０、５ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＥＧＴＡ、２０ｍＭ　ＮａＦ、１ｍＭオルトバナジン酸塩、５μＭミクロシスチン、各１００μｇ／ｍｌのロイペプチン、アプロチニンおよびペプスタチン。
【００４６】
トリス緩衝化食塩水−トゥイーン２０（ＴＢＳＴ）：５０ｍＭトリスｐＨ７．４、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％トゥイーン２０。
【００４７】
ＳＴＭ緩衝液：１０ｍＭトリスＨＣｌ　ｐＨ８．０、０．２５Ｍ　ショ糖、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤［１７］。
【００４８】
−キナーゼの調製およびアッセイ
キナーゼの活性を緩衝液ＡまたはＣ（別に記載のない限り）中、３０℃、最終ＡＴＰ濃度１５μＭでアッセイした。ブランク値を差し引き、活性を１０分間のインキュベーション中に取り込まれたホスフェートのｐｍｏｌで計算した（通常は最大活性、すなわち阻害剤なしの場合の％で表す）。Ｍｅ２Ｓ０を適当に希釈して対照試験を行った。いくつかの場合に、基質のリン酸化をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のオートラジオグラフィにより評価した。ＩＣ５０値を用量反応曲線から見積もった。
【００４９】
ＣＤＫ１／サイクリンＢをＭ期のヒトデ（Ｍａｒｔｈａｓｔｅｒｉａｓ　ｇｌａｃｉａｌｉｓ）卵母細胞からホモジナイゼーション緩衝液中で抽出し、ｐ９ＣＫＳｈｓ１−セファロースビーズのアフィニティクロマトグラフィで、以前の報告［１５、１６］のとおり、遊離ｐ９ＣＫＳｈｓ１により溶出して精製した。キナーゼ活性を緩衝液Ｃで最終容量３０μｌ中、１５μＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１ｍＣｉ／ｍｌ）存在下、１ｍｇのヒストンＨ１／ｍｌを用いてアッセイした。３０℃で１０分間のインキュベーション後、２５μｌアリコートの上清を２．５×３ｃｍのワットマンＰ８１ホスホセルロース紙片にスポットし、２０秒後、フィルタを水１リットルあたり１０ｍｌのリン酸溶液中で５回（各回少なくとも５分間）洗浄した。湿ったフィルタを１ｍｌのＡＣＳ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）シンチレーション液中で計数した。
【００５０】
ＧＳＫ−３βは、ウサギ筋肉から精製するか、または昆虫Ｓｆ９細胞中で発現させて精製する［１８］。１ｍｇ　ＢＳＡ／ｍｌ　１０ｍＭ　ＤＴＴ中で１／１００に希釈した後、緩衝液Ａで最終容量３０μｌ中、１５μＭ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１ｍＣｉ／ｍｌ）存在下、５μｌの４０μＭ　ＧＳ−１ペプチドを基質としてアッセイした。３０℃で３０分間のインキュベーション後、２５μｌアリコートの上清をＰ８１ホスホセルロース紙にスポットし、前述のとおり処理した。
【００５１】
ＣＤＫ５／ｐ２５を等量の組換えＣＤＫ５と大腸菌において発現させたｐ２５とを混合することによりＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）融合蛋白質として再構成し、グルタチオン−アガロースのアフィニティクロマトグラフィで精製した（ｐ２５はＣＤＫ５活性化因子の短縮版である）。その活性を緩衝液ＣでＣＤＫ１／サイクリンＢについて記載のとおりにアッセイした。
【００５２】
ＣＤＫ２／サイクリンＡ、ＣＤＫ２／サイクリンＥ、ＣＤＫ３／サイクリンＥ、ＣＤＫ４／サイクリンＤ１、ＣＤＫ６／サイクリンＤ２、Ｈｉｓ標識ｅｒｋ１およびｅｒｋ２、蛋白質キナーゼＣアイソフォーム、ｃＡＭＰ依存性蛋白質キナーゼの触媒サブユニット、ｃＧＭＰ依存性蛋白質キナーゼ、ミオシン軽鎖キナーゼ、カゼインキナーゼ１および２、ＡＳＫ−γ（ＧＳＫ−３の植物ホモログ）、インスリン受容体チロシンキナーゼドメイン（ＣＩＲＫ−４１）、ｃ−ｒａｆ、ＭＡＰＫＫ、ｃ−ｊｕｎ　Ｎ末端キナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手）、ｃ−ｓｒｃキナーゼならびにｖ−ａｂｌキナーゼを報告されているとおりにアッセイした［１５］。
【００５３】
−電気泳動およびウェスタンブロッティング
ｐ９ＣＫＳｈｓ１−セファロースビーズに結合した蛋白質（ヒトデＣＤＫ１／サイクリンＢ）を２Ｘ　Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液で変性した。サンプルを１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。Ｍｉｌｌｉｂｌｏｔ−ＳＤＥシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で、転写緩衝液中２．５ｍＡ／ｃｍ２で３０分間、蛋白質をゲルから０．１μｍニトロセルロースシートに転写した。続いて、フィルタをＴＢＳＴ中５％の低脂肪乳で１時間ブロックした。次いでフィルタをＴＢＳＴで洗浄し、１次抗体（抗ＰＳＴＡＩＲＥ、１：２０００；抗サイクリンＢ、１：１０００）と共に１時間インキュベートした。ＴＢＳＴで４回洗浄（１×２０分、３×５分）後、ニトロセルロースシートをＴＢＳＴ中で希釈（１：１０００）したセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合２次抗体で１時間処理した。次いでフィルタをＴＢＳＴで５回洗浄（１×２０分、４×５分）し、ＥＣＬ検出試薬およびＨｙｐｅｒｆｉｌｍ　ＭＰを用いて増強したｃｈｅｍｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅにより分析した。
【００５４】
−ＣＤＫ２／ＨＤ結晶の調製
ヒトＣＤＫ２を以前の報告［１９］のとおりに精製して結晶化した。結晶が割れるのを防止するために、化学的架橋を含む方法を用いた。結晶をまず、０．５ｍＭ　ＡＴＰ、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２を含む溶液に２時間浸漬し、次いで０．１％グルタルアルデヒドを用い、４℃で１時間架橋させた。十分な洗浄後、結晶を０．２Ｍ　ＨＥＰＥＳ、５％エチレングリコールおよび１％ＤＭＳＯ中の阻害剤溶液に移した。このプロトコルにより、いかなる損傷も示すことなく、結晶を０．５ｍＭまでの阻害剤濃度で数日間浸漬することができた。
【００５５】
−ＣＤＫ２／ＨＤ結晶構造の決定
Ｒｉｇａｋｕ回転陽極発生器に固定されたＲ−Ａｘｉｓ　ＩＩイメージプレート検出システムを用い、ＣＤＫ２／ＨＤ単結晶で、２．１Åの分解能までのＸ線回折データを収集した。データは結晶の照射による損傷を防ぐために１２０Ｋで収集した。凍結直前に、結晶を２５％エチレングリコールを含む凍結防御溶液に移した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ凍結装置を用いて乾燥窒素蒸気中でフラッシュ凍結を行った。凍結により単位格子の寸法がわずかに変わり、モザイク幅が０．２から０．６°に増大した。それ自体での架橋では回折上の特徴はあまり変化がなかった。強度データをＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫプログラムで処理した［２０］。ＣＣＰ４スートで実行されるプログラムＴＲＵＮＣＡＴＥ［２１］を用いて、最終的な構造因子振幅を得た。データ処理統計の概要を表３に示す。ＣＤＫ２／ＨＤ複合体の精密化を高度に精密化されたＣＤＫ２／ＡＴＰモデルの座標から開始した。すべての精密化段階はプログラムＸ−ＰＬＯＲ［２２］を用いて行った。凍結結晶中の単位格子内にＣＤＫ２分子をうまく再配向および再配置するために、分子置換とその後の剛体精密化が必要であった。次いで、共役勾配エネルギー最小化を数回用いて、モデルをさらに精密化した。この段階の後、２Ｆｏ−ＦｃおよびＦｏ−Ｆｃフーリエマップから計算した明確な電子密度により、ヒメニアルディシン阻害剤の結合様式が示された。ヒメニアルディシンの初期座標および幾何学的制限条件はＭａｔｔｉａ他［２３］の小分子構造からとった。次いで、Ｘ線制限エネルギー最小化および分子動力学の両方を、モデル構築と交互に数回行うことにより、ＣＤＫ２／ＨＤモデルの精密化を続行した。精密化の終わりに向けて、いくつかの水分子および２〜３のエチレングリコール分子をモデルに加えた。ＣＤＫ２／ＨＤモデルの立体化学を、ソフトウェアパッケージＰＲＯＣＨＥＣＫ［２４］を用いて立証した。
【００５６】
−プレセニリン−２のインビトロでのリン酸化
プレセニリン−２の膜貫通ドメイン６と７との間の大きい親水性ループを、プレセニリン−２ループ−マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）融合蛋白質として大腸菌で発現させた［２５］。アフィニティクロマトグラフィによる精製後、プレセニリン−２−ＭＢＰをＣＫ１の基質として用いた。様々な濃度のＨＤ存在下で３０分間インキュベートした後、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液を加えてキナーゼ反応を停止した。ＭＢＰ−プレセニリン−２をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そのリン酸化レベルをオートラジオグラフィで可視化した。
【００５７】
−インビトロおよびインビボでのＣＤＫ５／ｐ３５によるＰａｋ１リン酸化
インビトロでのＰａｋ１リン酸化
ＣＤＫ５／ｐ３５を、Ｃ末端Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ抗体（キナーゼアッセイ毎に全蛋白質４００μｇ）を用いてＰ０２ラット皮質から免疫沈降させた。免疫沈降物を等しいアリコートに分け、ＧＳＴ−Ｐａｋ１Ｋ２９９を基質として用いてキナーゼアッセイを行った。報告されているとおり［１７］、キナーゼアッセイの直前に、ロスコビチン、ＨＤまたはＤＭＳＯをビーズに加えた。リン酸化をオートラジオグラフィでモニターした。
【００５８】
インビボでのＰａｋ１リン酸化
培養４日の時点でＥ１８ラット胚皮質から得た培養ニューロンにＨＤを加えた。対照としてＤＭＳＯを、用いた薬物の最大容量（７．５μｌ）まで用いた。薬物を細胞上に１時間放置した。次いで細胞を氷上、ＳＴＭ緩衝液中で溶解し、膜画分を０．５％ＮＰ−４０を含むＳＴＭで単離した［１７］。
【００５９】
Ｐａｋ１免疫沈降を特異的ポリクローナル抗体を用いて実施した後、ヒストンＨ４を基質として用いてキナーゼアッセイを行った。Ｐａｋ１活性のレベルを反映するＨ４リン酸化の量を、オートラジオグラフィフィルム上のバンド強度を測定し、ＮＩＨイメージングプログラムで定量することにより求めた。
【００６０】
負荷対照としてＰａｋ１およびｐ３５ウェスタンブロットを行った。ｐ３５の量はＣＤＫ５／ｐ３５キナーゼ阻害のレベルと共に増加する。
【００６１】
−インビボでのＧＳＫ−３によるＭＡＰ−１Ｂリン酸化および免疫化学
小脳顆粒細胞をマウス新生仔から単離し、Ｈａｔｔｅｎの方法に従い［２６］Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配を用いて精製した。細胞をポリ−Ｄ−リシン（１００μｇ／ｍｌ）およびラミニン（５０μｇ／ｍｌ）でコーティングしたプレートに播種し、無血清培地中で１日増殖させ、次いで培養物をＨＤ（１〜１００μＭ）で２０時間処理した。培養物をＰＢＳ中４％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ中、４℃で保存した。細胞を１００％メタノールで透過可能とし、ＧＡＰ−４３およびＭＡＰ−１Ｂ−Ｐ（ＳＭＩ−３１、Ａｆｆｉｎｉｔｉ）に対する１次抗体と共に４℃で終夜インキュベートした。ＦＩＴＣおよびテキサスレッド結合２次抗体を用いた（Ｖｅｃｔｏｒ）。ウェスタンブロット分析のために、細胞をサンプル緩衝液中で溶解し、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。蛋白質をニトロセルロース膜に転写し、ブロック溶液（ＴＢＳ中０．１％トゥイーン２０、３％乾燥スキムミルク）中で希釈したＭＡＰ−１Ｂ−Ｐ（ＳＭＩ−３１）に対する抗体と共に室温で２時間インキュベートした。ＨＲＰ結合２次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用い、蛋白質をＥＣＬシステム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて可視化した。ブロットをフラットベッドスキャナー（ＵＭＡＸ　Ａｓｔｒａ　１２００Ｓ）を用いてスキャンした。
【００６２】
−インビトロおよびインビボでのＴａｕリン酸化
細胞およびウイルス。Ｓｆ９細胞（カリフォルニア州サンディエゴのＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を、１０％ウシ胎仔血清ならびに５０μｇゲンタマイシン／ｍｌおよび２．５μｇアムホテリシン／ｍｌを補足した単層培養Ｇｒａｃｅ培地（メリーランド州ゲイザースバーグのＧｉｂｃｏ　ＢＲＬ）中２７℃で増殖させた。ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄをＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）から、ｐＶＬ１３９２をＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎから入手した。
【００６３】
ｔａｕトランスフェクション。最短のヒトｔａｕアイソフォーム［２７］であるｈｔａｕ２３の遺伝子をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩにより細菌発現ベクターｐＮＧ２［２８］から切り出し、同じ制限エンドヌクレアーゼによって切断されたバキュロウイルストランスファーベクターｐＶＬ１３９２に挿入した。ｔａｕバキュロウイルス含有ベクターを構築するためにＢａｃｕｌｏＧｏｌｄシステムを用いた。ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ　ＤＮＡは致命的欠失を含むバキュロウイルスの改変型である。ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ　ＤＮＡと相補バキュロウイルストランスファーベクターとの共トランスフェクションにより、このウイルスＤＮＡの致命的欠失が救済され、ｈｔａｕ２３コーディング配列を有する生存ウイルス粒子が再構成された。トランスフェクションに用いたプラスミドＤＮＡはＱＩＡＧＥＮカートリッジ（ドイツのＨｉｌｄｅｎ）を用いて精製した。単層において増殖させたＳｆ９細胞（６０ｍｍ細胞培養皿に２×１０６細胞）をバキュロウイルスＤＮＡ（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ　ＤＮＡ　０．５μｇ）およびｐＶＬ１３９２のベクター誘導体（２μｇ）と、リン酸カルシウム共沈法を用いて共トランスフェクションした。組換え蛋白質の有無を感染から５日後の感染細胞においてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにより調べた。
【００６４】
Ｓｆ９細胞におけるＴａｕリン酸化
キナーゼ阻害剤のｔａｕリン酸化に対する影響を調べるために、バキュロウイルス発現ｈｔａｕ２３に感染させたＳｆ９細胞を感染から３６時間後に５０μＭのＨＤまたはフラボピリドールで５時間処理した後、回収した。リン酸化が促進された対照ｔａｕサンプルを得るために、ｈｔａｕ２３発現Ｓｆ９細胞を回収前に０．２μＭのオカダ酸で５時間処理した。
【００６５】
Ｔａｕウェスタンブロッティング
Ｓｆ９細胞をＭＯＩ　１〜５で組換えウイルスにより感染させた。細胞溶解産物をＨｙｐｏｔｏｎｉｃ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（ＨＬＢ）中で調製した。１６，０００ｇで１５分間遠心後、上清を回収し、そのＮａＣｌ濃度を５００ｍＭとした。これを次いで、１０分間煮沸し、１６，０００ｇで１５分間再遠心した。蛋白質（３μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写し、下記の抗体でウェスタンブロッティングした。ＡＴ−８（１：２０００）、ＡＴ−１８０（１：１０００）、ＡＴ−１００（１：５００）、ＰＨＦ−１（１：６００）、およびポリクローナル抗ｔａｕ抗体Ｋ９ＪＡ。
【００６６】
インビトロでのｔａｕリン酸化を精製ＧＳＫ−３βおよび基質として組換えｔａｕ−３２を用いて行った。前述のＧＳＫ−３βアッセイ条件で、様々な濃度のＨＤ存在下、３０分間インキュベートした後、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液を加えることによりキナーゼ反応を停止した。ｔａｕをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、そのリン酸化レベルをオートラジオグラフィで可視化した。
【００６７】
ＩＩ／結果
ヒメニアルディシンのキナーゼ阻害の選択性
酵素活性を、漸増濃度のＨＤ存在下、実験法の項に記載のとおりにアッセイした。ＩＣ５０を用量反応曲線から計算した。−は、試験した最高用量（括弧内）で効果なし。結果を表１に示す。
【００６８】
【表１】
2004500356.tif 000003
１５μＭのＡＴＰ存在下で、ＨＤはＣＤＫ１／サイクリンＢ、ＣＤＫ２／サイクリンＡ、ＣＤＫ２／サイクリンＥ、ＣＤＫ３／サイクリンＥおよびＣＤＫ５／ｐ３５をそれぞれ２２、７０、４０、１００および２８ｎＭのＩＣ５０で阻害することが明らかとなった（表１）。オロモウシン［２９］、ロスコビチン［１５］、インジルビン−３’−モノキシム［３０］、ケンパウロン［３１］で観察されたとおり、またフラボピリドール［３２］とは反対に、ＨＤはＣＤＫ４／サイクリンＤ１およびＣＤＫ６／サイクリンＤ２に対しては限られた効果しかなかった（ＩＣ５０はそれぞれ６００および７００ｎＭ）。
【００６９】
次にＨＤを様々な高度に精製されたキナーゼに対して試験した（表１）。キナーゼ活性を適当な基質（ヒストンＨ１、カゼイン、ミエリン塩基性蛋白質、ペプチドなど）を用い、１５μＭ　ＡＴＰ（濃度は、過去に報告されている文献との比較、ＡＴＰの高い特異性といった実際的な理由から選んだ）および漸増濃度のＨＤ存在下でアッセイした。ＩＣ５０値も表１に示している。試験したたいていのキナーゼはほとんど、またはまったく阻害されなかった（ＩＣ５０＞１μＭ）。しかし、２つのキナーゼ、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）およびカゼインキナーゼ１（ＣＫ１）はＨＤに対して非常に感受性が強かった（ＩＣ５０はそれぞれ１０および３５ｎＭ）。
【００７０】
ＣＤＫ１／サイクリンＢのＨＤ類縁体による阻害
ＣＤＫ１／サイクリンＢを、漸増濃度のＨＤおよび類縁体存在下、実験法の項に記載のとおりにアッセイした。活性は最大活性、すなわち阻害剤なしで測定した値の％で表した。結果を図２に示す。
【００７１】
適当な基質を用いたＨＤ感受性キナーゼのインビトロアッセイ
ＨＤ感受性キナーゼの、生理的に適当な基質を用いてのインビトロアッセイも行った。カゼインキナーゼ１に対してはプレセニリン−２の断片［２５］、ＣＤＫ５／ｐ３５に対してはＰａｋ１［１７］、ＧＳＫ−３βに対してはインスリン受容体基質ＩＲＳ−１［３３］またはｔａｕ。結果を図３〜５に示す。
【００７２】
図３は、インビトロでのカゼインキナーゼ１によるプレセニリン−２のリン酸化に対するＨＤの阻害効果を示している。プレセニリン−２とマルトース結合蛋白質との間の細菌により発現させた融合蛋白質（ＰＳ−２．ＭＢＰ）をインビトロで漸増濃度のＨＤ存在下、カゼインキナーゼ１でリン酸化してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、オートラジオグラフィを行った。
【００７３】
図４は、インビトロおよびインビボでのＣＤＫ５／ｐ３５によるＰａｋ１のリン酸化に対するＨＤの阻害効果を示している。ラット胚皮質ニューロンを様々な濃度のＨＤに１時間暴露した。Ｐａｋ１を次いで免疫沈降し、ヒストンＨ４に対するそのキナーゼ活性を測定した。上図は基質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＨ４リン酸化のレベルを示している。数字はオートラジオグラフィの定量に対応する。ウェスタンブロットはＰａｋ１（下図）およびｐ３５の量を示す。ＣＤＫ５阻害の結果としてのｐ３５レベルの増大。図５は、インビトロおよびインビボでのＧＳＫ−３βによるｔａｕリン酸化によるリン酸化阻害効果を示している。
【００７４】
図５Ａは、下記の実験の結果を示す。細菌により発現させた組換えヒトｔａｕをインビトロで漸増濃度のＨＤ存在下、ＧＳＫ−３βでリン酸化してＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、オートラジオグラフィを行った。
【００７５】
結果を図５Ｂに示している実験において、ｈｔａｕ２３を発現するＳｆ９細胞を無処理で放置する（−）か、またはオカダ酸（ＯＡ）、ヒメニアルディシン（ＨＤ）、もしくはフラボピリドール（ＦＬ）に５時間暴露した。細胞溶解産物（３μｇ　ｈｔａｕ２３）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、クーマシーブルーで染色するか、または以下の様々な抗体で免疫ブロットした。Ｋ９ＪＡ（汎ｔａｕ抗体）はｔａｕを含むすべての調製物を認識し、ＡＴ８、ＡＴ１８０およびＰＨＦ１は異なるリン酸化ＳＰまたはＴＰモチーフに特異的で、ＡＴ１００はＴ２１２およびＳ２１４でリン酸化されたｔａｕを認識し、これはアルツハイマーｔａｕに高度に特異的な反応である。
【００７６】
キナーゼのＨＤに対する感受性は、より人工的な基質でアッセイした同じキナーゼの感受性に完全に匹敵していた。
【００７７】
ヒメニアルディシン類縁体によるＣＤＫ１、ＣＤＫ５ならびにＧＳＫ−３βおよびＣＫ１の阻害
ＣＤＫ１／サイクリンＢ、ＣＤＫ５／ｐ３５、ＧＳＫ−３βおよびＣＫ１に対して海洋海綿から単離されたいくつかの天然のＨＤ関連化合物およびいくつかの合成的に改変したＨＤ類縁体を試験した。結果を図２および表２に示す。数字は図１に示す構造を表している。酵素活性を、漸増濃度のＨＤ存在下、実験法の項に記載のとおりにアッセイした。ＩＣ５０を用量反応曲線から計算した。阻害効果が観察されなかった場合（−）、試験した最高濃度を括弧内に示す。
【００７８】
【表２】
2004500356.tif 000004
ＨＤはなお最も活性の高い化合物であった。興味深いことに、ジブロモカンタレリン（１０）はＧＳＫ−３βに対して著しい阻害効果を示した（ＩＣ５０　３μＭ）。ヒメニジン（１３）はＣＤＫ５に特異的であった。
【００７９】
ヒメニアルディシンはＡＴＰ結合の競合的阻害剤である
ＨＤ作用のメカニズムを調べるために、ＡＴＰレベルとＨＤ濃度の両方を変動させて動力学的実験を行った（図６Ａ）。異なるヒメニアルディシン濃度でのＣＤＫ１／サイクリンＢ蛋白質キナーゼ活性のアッセイから得た動力学データの二重逆数プロット。酵素活性を実験法の項に記載のとおりにアッセイした。結果を図６Ａに、１／ＡＴＰに対する１／ｖの１次プロットで示している。反応混合物中のＡＴＰ濃度は０．０５から０．２５ｍＭまで変動し、ヒストンＨ１濃度は０．７ｍｇ／ｍｌの一定値に保たれていた。挿入図は１次プロットからの濃度に対する傾きの２次再プロットを示している。見かけの阻害定数（Ｋｉ）を矢印で示す。結果を図６Ｂに示す。ヒメニアルディシンはＣＤＫ１からサイクリンＢを放出しない。ｐ９ＣＫＳｈｓ１−セファロース−固定ＣＤＫ１／サイクリンＢをＨＤに３０分間曝露し、洗浄し、抗サイクリンＢおよび抗ＰＳＴＡＩＲＥ抗体を用いたウェスタンブロッティングにより分析した。
【００８０】
データにより、ＨＤはＡＴＰの競合阻害剤として作用することが示されている。ＨＤ濃度に対する傾き再プロットで直線性が認められることから、ＨＤは１次阻害剤であると見なされる（図６Ａ、挿入図）。見かけの阻害定数（Ｋｉ）は５０ｎＭであった。ＨＤはＣＤＫ１からサイクリンＢを移動させることによって作用するものではない（図６Ｂ）。ｐ９ＣＫＳｈｓ１−セファロースに固定したＣＤＫ１／サイクリンＢを高濃度のＨＤに曝露し、ビーズを次いで十分に洗浄した後、ウェスタンブロット分析を行った。両方のサブユニットはまだ一緒に検出可能であった。
【００８１】
ＣＤＫ２／ヒメニアルディシン複合体の結晶構造
ＨＤに浸漬したＣＤＫ２結晶の構造を、２．１Åの分解能で決定および精密化した。結晶の割れを防ぐために、浸漬前に架橋剤による処理が必要であった。構造決定の詳細を表３に示す。
【００８２】
【表３】
2004500356.tif 000005
最終モデルは結晶学上のＲ−ｆａｃｔｏｒ　１９．２％（Ｒｆｒｅｅ　２６．７％）、良好な形状で、２７４のアミノ酸残基、１つの結合ＨＤ、８５の溶媒分子および４つのエチレングリコール分子からなる。ＣＤＫ２の２つの高度に柔軟なループの一部である、３６〜４４および１４９〜１６３残基は、電子密度が弱いか、またはないため、最終モデルから除外された。ＣＤＫ２モデルにおけるすべての非グリシン残基は、φ−ψ空間の「ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　ａｌｌｏｗｅｄ」領域のすぐ外側の主鎖配座を有するＧｌｕ−７３およびＡｒｇ−１２６の２残基を除き、ラマチャンドランプロット［２６］のエネルギー的に好ましい領域内に十分に入る主鎖ねじれ角を有する。
【００８３】
ＨＤの電子密度の立体図を図７に示す。ＨＤはフーリエの差の分布図に明白に配置可能で、この阻害剤もＡＴＰ結合ポケット内で結合することが確認された（図７Ａ）。結合部位相互作用の概略図を図７Ｂおよび８に示す。
【００８４】
図７ＡはＣＤＫ２のＡＴＰ結合ポケット内のＨＤの精密化構造を示す立体図である。推論される水素結合を細い点線で示す。
【００８５】
図７ＢはＣＤＫ２とＨＤとの相互作用の概略図である。蛋白質側鎖の接触はそれぞれの残基ボックスに連結する線で示し、主鎖原子との相互作用は特定の主鎖原子への線で示す。ファンデルワールス接触は点線で示し、水素結合は破線で示す。
【００８６】
ＨＤのピロロアゼピン二重環構造はＩｌｅ−１０、Ｖａｌ−１８、Ａｌａ−３１、Ｖａｌ−６４、Ｐｈｅ−８０、およびＬｅｕ−１３４により形成される浅い疎水性ポケットを占め、これらの残基の側鎖原子とのいくつかのファンデルワールス接触を形成する。加えて、ピロール環のＮ１原子とＬｅｕ−８３のカルボニル酸素との間、アゼピン環のＯ１カルボニル酸素とＬｅｕ−８３の主鎖アミドとの間、およびアゼピン環のＮ２アミドとＧｌｕ−８１のカルボニル酸素との間の３つの水素結合が、ＣＤＫ２の主鎖と形成される。ＨＤのピロロ環に結合した臭素原子はＡＴＰ結合ポケットの外側を向いており、部分的に溶媒に曝露されるが、Ｉｌｅ−１０およびＨｉｓ−８４の主鎖カルボニル酸素、ならびにＩｌｅ−１０およびＬｅｕ−１３４の側鎖に対して充填されてもいる。ＨＤのグアニジン環構造の結合は、１つの直接的な水素結合と２つの水を介しての水素結合に加えて、少数のファンデルワールス接触、主にＶａｌ−１８の側鎖との接触を含む。直接的な水素結合はグアニジンのＮ５アミノ基とＡｓｐ−１４５の側鎖酸素の１つとの間で形成される。２つの水を介しての水素結合はＨＤのＯ２とＡｓｐ−１４５の主鎖ＮＨとの間、およびＨＤのＮ５とＧｌｎ−１３１の主鎖カルボニルとの間の結合である。アポ−ＣＤＫ２およびＣＤＫ２／ＡＴＰの構造比較により、ＨＤとの結合によるＡｓｐ−１４５の大きな移動が明らかになり、この移動はＣα原子の１Åのシフトと、側鎖のＨＤグアニジン環から離れる方へのＣα−Ｃβ結合の周りの約９０°の回転とからなる。阻害剤と接触する他のすべての残基は、アポ−ＣＤＫ２およびＣＤＫ２／ＡＴＰの構造で見られたものと非常に類似の配座を有する。
【００８７】
ＣＤＫ２／ヒメニアルディシンと他のＣＤＫ２／阻害剤複合体との比較
ＨＤの効力を理解するための構造的基礎を提供するために、ＣＤＫ２／ＨＤ複合体の構造をＣＤＫ２とＡＴＰ、スタウロスポリン、フラボピリドール、ならびにプリン類縁体であるオロモウシン、ロスコビチン、およびプルバラノールとの複合体の構造と比較し、またサイクリンＡ／ＣＤＫ２／ＡＴＰ複合体の構造とも比較した。比較を示す立体図を図９に示す。
【００８８】
図９Ａは、アポ−ＣＤＫ２におけるＡＴＰ（白い結合）およびサイクリンＡ−ＣＤＫ２におけるＡＴＰ（黄色い結合）上にＨＤ（黒い結合）を重ね合わせた図である。
【００８９】
図９Ｂは、オロモウシン（白）およびプルバラノール上にＨＤを重ね合わせた図である。
【００９０】
図９Ｃは、フラボピリドール上にＨＤを重ね合わせた図である。ＣＤＫ２の残基８１〜８４の主鎖原子、およびＣＤＫ２／ＨＤ複合体中のＡｓｐ−１４５の側鎖を黒い結合の球棒模型で示している。重ね合わせたＣＤＫ２−リガンド複合体からの同じ残基を結合で示している。Ａ）において、細い結合はアポ酵素を表し、太い結合はサイクリンＡ−ＣＤＫ２二量体を表している。
【００９１】
ＨＤの疎水性二重環構造はＣＤＫ２において、ＣＤＫ２／ＡＴＰ複合体におけるＡＴＰのプリン環とほぼ同じ位置で、他のＣＤＫ２／阻害剤複合体における二重環構造と類似の位置に結合する（図９）。異なる二重環構造の配向は異なる阻害剤の間で著しく異なるが、浅いＡＴＰ−プリン結合ポケットとの最適な形状相補性を提供する必要性があるために制約され、一方でＣＤＫ２の交叉連結において残基８１〜８３の主鎖といくつかの水素結合が形成される。ＣＤＫ２／ＨＤ複合体における水素結合相互作用は、これまでに試験したすべてのＣＤＫ２／阻害剤複合体の中で最も好ましいもののようである。Ｎ２とＧｌｕ−８１のペプチド酸素との間、およびＯ１とＬｅｕ−８３のペプチドアミドとの間の水素結合は、ＡＴＰのアデニン塩基とＣＤＫ２との間や、スタウロスポリンおよびフラボピリドールとのＣＤＫ２／阻害剤複合体における水素結合に非常に類似している。ＣＤＫ２／ＨＤ複合体におけるＬｅｕ−８３の主鎖カルボニルとの第３の水素結合がこれらの複合体では見られず、３つのプリン系阻害剤であるオロモウシン、ロスコビチン、およびプルバラノールとの複合体でのみ認められる。ＨＤと同様、これら後者３つの阻害剤も、交叉連結によって３つの水素結合を形成するが、これらのＧｌｕ−８１ペプチド酸素との相互作用ははるかに弱く、プリン環の酸性Ｃ８原子との珍しいＣ−Ｈ−−−Ｏ水素結合を含む。
【００９２】
ＨＤの臭素原子はＣＤＫ２において、他のＣＤＫ２／阻害剤複合体ではベンジル基によって占有される領域の近隣に結合する。この領域での疎水性基の結合は、Ｉｌｅ−１０、Ｐｈｅ−８２の側鎖および残基８２〜８４の主鎖に対して充填することができ、これは阻害剤のＣＤＫ２に対する特異性の増大にとって重要である。ＨＤの臭素はベンジル環と同じ数の相互作用を提供することはできないが、表２および図２における様々なＨＤ類縁体の阻害活性から認められるとおり、ＨＤにこの原子が存在することは、ＣＤＫ２に対する結合親和性および特異性に著しく寄与していると考えられる。
【００９３】
同様に興味深いのは、ＨＤのグアニジン環によって占有されているＣＤＫ２の領域である。他のＣＤＫ２／阻害剤複合体との重ね合わせにより、フラボピリドールおよびスタウロスポリン阻害剤だけが、ＡＴＰのαホスフェートが結合するポケットに部分的に重なる、ＣＤＫ２のこの領域に結合する基を有していることが示される。ＣＤＫ２／ＨＤ複合体の構造を、ＣＤＫ２／フラボピリドール複合体［３４］の構造と比較することにより、これらの構造が異なる阻害剤の結合様式におけるいくつかの著しい類似性が明らかとなる。ＨＤのＯ２カルボニル酸素は、フラボピリドールのＯ７ヒドロキシル基の位置の近くにあり、ＡＴＰ−プリン結合ポケットに結合したベンゾピラン環から出ている。いずれの阻害剤においても、酸素原子は、Ａｓｐ−１４５の主鎖アミドとの水を介しての水素結合を形成する。さらに、ＨＤのグアニジン環のＮ５アミノ基は、ＣＤＫ２／フラボピリドール複合体のピペリジン環の正に荷電したアミン基の近くに位置する。いずれの原子もＡｓｐ−１４５の側鎖カルボキシレートと水素結合の距離にある。フラボピリドールの正に荷電したアミン基と、Ａｓｐ−１４５の負に荷電したカルボキシレートとの間のエネルギー的に好ましい相互作用は、この阻害剤のＣＤＫ２への結合強度に重要な寄与をすると考えられる。生理的条件下では、グアニジン環は少なくとも部分的にＮ３でプロトン化されるようで、したがってＮ３、Ｃ１１、Ｎ４およびＮ５の間で非局在化した（部分的）正電荷を提供するため、同様の相互作用がＣＤＫ２／ＨＤ複合体でも可能であると思われる。Ａｓｐ−１４５の移動も両方のＣＤＫ２／阻害剤複合体で保存されている。これはインジルビン−５−スルホネート／ＣＤＫ２の構造においても認められる。Ａｓｐ−１４５はほとんどの蛋白質キナーゼで見られる保存されたＤＦＧモチーフの一部である。ＣＤＫ２／ＡＴＰ複合体のものとは著しく異なるが、両方のＣＤＫ２／阻害剤複合体におけるＡｓｐ−１４５の位置と配座は事実、機能的により関連するサイクリンＡ／ＣＤＫ２／ＡＴＰ複合体のものと非常に類似している（図９Ａ）。
【００９４】
インビトロでのプレセニリンリン酸化の阻害
アルツハイマー病に関連する様々な蛋白質基質のインビトロおよびインビボでのリン酸化に対するＨＤの効果も調べた。プレセニリン−２の膜貫通ドメイン６および７の間の大きな親水性ループは、カゼインキナーゼ１および２両方のインビトロでの基質である。このドメインはインビボでリン酸化される［２５］。プレセニリン−２−ＭＢＰ融合蛋白質をＣＫ１のインビトロ基質として用い、プレセニリン−２リン酸化のＨＤによる用量依存的阻害を観察した（図３）。ＭＢＰ単独ではＣＫ１によりリン酸化されなかった。
【００９５】
インビトロおよびインビボでの神経性ＣＤＫ５／ｐ３５によるＰａｋ１リン酸化阻害
ＣＤＫ５／ｐ３５の生理的基質の中には神経性キナーゼＰａｋ１［１７］がある。Ｐａｋ１およびｐ３５はいずれもＲｈｏファミリーの小さいＧＴＰアーゼであるＲａｃに関連する。ＣＤＫ５／ｐ３５によるＰａｋ１リン酸化は、Ｐａｋ１キナーゼ活性を阻害することになる。ロスコビチンはインビトロおよびインビボの両方でＣＤＫ５／ｐ３５を阻害し、その結果Ｐａｋ１のダウンレギュレーションも阻害する。これらの実験をＨＤで繰り返した（図４）。まず、ＣＤＫ５／ｐ３５をＰ０２ラット皮質から免疫沈降させ、ＧＳＴ−Ｐａｋ１Ｋ２９９（キナーゼ失活Ｐａｋ１変異体）に対するそのキナーゼ活性をＨＤ、ロスコビチン、またはＤＭＳＯ存在下で［１７］のとおりにアッセイした。ＨＤによるＣＤＫ５の用量依存的阻害が観察された（ＩＣ５０は１０から１００ｎＭの間）（図４Ａ）。次に、Ｅ１８ラット胚皮質から得た培養ニューロンを用いて、インビボ実験を実施した（図４Ｂ）。培養４日目の時点でＨＤを加え、細胞上に１時間放置した。対照としてＤＭＳＯを用いた。次いで、細胞を氷上のＳＴＭ緩衝液中で溶解し、膜画分を単離した［１７］。次いで、Ｐａｋ１を免疫沈降させ、ヒストンＨ４を用いてアッセイした。ＮＩＨイメージングプログラムを用いて、オートラジオグラフィフィルム上のバンドの強度により測定したＨ４リン酸化の量を定量した。負荷対照として抗Ｐａｋ１および抗ｐ３５ウェスタンブロットを行った。以前に報告されているとおり［３５］、ＣＤＫ５／ｐ３５キナーゼ阻害の程度に伴ってｐ３５の量が増加する。Ｐａｋ１活性の増大が認められ、内因性ＣＤＫ５活性の阻害と一致した（図４Ｂ）。
【００９６】
ＨＤは小脳顆粒細胞ニューロンにおけるＧＳＫ−３によるＭＡＰ−１Ｂリン酸化を阻害する
小脳顆粒細胞ニューロンにおいて、ＧＳＫ−３βはＷＮＴ−７ａおよびリチウムの両方によって阻害される［４９、５０］。ＷＮＴ−７ａおよびリチウムは軸索のリモデリングと、軸索の成長に関与する微小管付属蛋白質であるＭＡＰ−１Ｂのリン酸化型の欠損を引き起こす。ＧＳＫ−３βは抗体ＳＭＩ−３１によって認識される部位でＭＡＰ−１Ｂをリン酸化するため、ＷＮＴまたはリチウムによるＧＳＫ−３βの阻害はリン酸化されたＡＰ−１ＢであるＭＡＰ−１Ｂ−Ｐの欠損を招くことになる。ニューロンの形態およびＭＡＰ−１Ｂリン酸化に対するＨＤの効果を調べるために、小脳顆粒細胞を異なる濃度のＨＤ中で培養した。
【００９７】
結果を図１０に示す。ＧＡＰ−４３およびＭＡＰ−１Ｂ−Ｐに対する二重免疫蛍光染色により、ＭＡＰ−１Ｂ−Ｐが軸索にそって存在することが示されている（ＡおよびＢ）。１０μＭのＨＤで２０時間処理しても、細胞の形態（Ｃ）またはＭＡＰ−１Ｂ−Ｐ（Ｄ）に明白な効果は認められない。矢印は同じ細胞を示している。５０μＭのＨＤ処理により、軸索の広がり、軸索の短縮（Ｅ）および軸索突起からのＭＡＰ−１Ｂ−Ｐの欠損（Ｆ）が引き起こされる。矢印は同じ細胞を示している。１００μＭのＨＤ処理では、細胞の形態により劇的な変化が生じ、軸索にそった広がりと分枝、糸状足の数の増加、および軸索の短縮が認められる（Ｇ）。ＭＡＰ−１Ｂ−Ｐはほとんどの軸索突起から失われる（Ｈ）。矢印はＭＡＰ−１Ｂ−Ｐが失われた軸索を示す。バー＝２０μＭ。
【００９８】
細胞溶解産物のウェスタンブロッティング分析により、ＨＤ用量増加に応答してのＭＡＰ−１Ｂ−Ｐの漸減が示されている（Ｉ）。
【００９９】
突起が長く、糸状足の数が非常に少ない対照細胞において（図１０Ａ）、ＭＡＰ−１Ｂ−Ｐは軸索の全長にそって存在する（図１０Ｂ）。低濃度（１μＭ、１０μＭ、２５μＭ）では、ＨＤは細胞の形態（図１０Ｃ）またはＭＡＰ−１Ｂ−Ｐの分布（図１０Ｄ）に対して目に見える効果は示さなかった。しかし、５０μＭのＨＤ処理では軸索の広がりおよび分枝、ならびに軸索長の短縮（図１０Ｅ）が引き起こされ、同時にほとんどの軸索突起からのＭＡＰ−１Ｂ−Ｐの欠損が見られた（図１０Ｆ）。培養物を１００μＭのＨＤで処理すると、細胞の形態により劇的な変化が生じ、広範な分枝および広がり、軸索長の短縮、および糸状足の数の増加が認められ（図１０Ｇ）、それと共に突起からのＭＡＰ−１Ｂ−Ｐの欠損が認められた（図１０Ｈ）。観察された軸索のリモデリングは軸索の拡がった領域からの安定な微小管欠損を伴っていた。ＨＤはウェスタンブロッティングによって調べたところ、用量依存的にＭＡＰ−１Ｂ−Ｐの欠損を引き起こす（図１０Ｉ）。この効果はリチウムまたはＷＮＴ−７ａ処理によって観察された効果［３７］と同様である。ＨＤはＧＳＫ−３βを直接阻害することが明らかにされたため、前記の結果よりＨＤによるＭＡＰ−１Ｂ−Ｐの欠損および軸索リモデリングは培養ニューロンにおけるＧＳＫ−３β阻害の結果であることが示唆される。
【０１００】
インビボおよびインビトロでのＧＳＫ−３によるｔａｕリン酸化の阻害
微小管付属蛋白質ｔａｕは、ＧＳＫ−３βおよびＣＤＫ５／ｐ３５を含むいくつかのキナーゼの基質である。細菌により発現された組換えヒトｔａｕは事実、インビトロでＧＳＫ−３βによってリン酸化され、このリン酸化はＨＤによって用量依存的に阻害された。ＩＣ５０はおよそ３３ｎＭであった（図５Ａ）。次いで、Ｓｆ９細胞において発現されたヒトｔａｕ２３のインビボでのリン酸化に対するＨＤの効果を調べた（図５Ｂ）。細胞を無処理で放置する（−）か、または０．２μＭのオカダ酸（ＯＡ）、５０μＭのＨＤ、もしくは同様にＧＳＫ−３βを阻害するＣＤＫ阻害剤のフラボピリドール（ＦＬ）５０μＭに暴露した。ｈｔａｕ２３をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した後、様々な抗体で免疫ブロットした。Ｋ９ＪＡ（汎ｔａｕ抗体）はｔａｕを含むすべての調製物を認識する。ＡＴ８、ＡＴ１８０およびＰＨＦ１は、それぞれＳｅｒ２０２とＴｈｒ２０５、Ｔｈｒ２３１とＳｅｒ２３５、およびＳｅｒ３９６とＳｅｒ４０４（最も長いヒトｔａｕアイソフォームであるｈｔａｕ４０での番号付けによる）の異なるリン酸化ＳＰまたはＴＰモチーフに特異的である。ＡＴ１００はＴ２１２およびＳ２１４でリン酸化されたｔａｕを認識する。この反応はアルツハイマーｔａｕに高度に特異的であるが、両方の部位がリン酸化されていれば、Ｓｆ９細胞でも起こる。ＨＤまたはフラボピリドールによる処理後にＡＴ１００のシグナルが消失することから、いずれの化合物もＳｆ９細胞におけるＧＳＫ−３β様活性を阻害可能であることが示される。
【０１０１】
ＩＩＩ　ＣＤＫ１、２、５、ＧＳＫ−３βおよびカゼインキナーゼ１阻害剤の調製
−液体調合物
ＨＤの懸濁液または溶液を、１００から１０００ｍｇのＨＤをエタノール、グリセリン、ポリエチレングリコールなどの非水性溶媒、油、または水などの液体担体に、懸濁化剤、保存剤、着香剤または着色剤と共に加えることによって調製するが、液体担体の量は活性成分の所望の濃度が得られるよう調節する。
【０１０２】
−錠剤
２ブロモＨＤ誘導体を、ステアリン酸マグネシウム、デンプン、乳糖、ショ糖またはセルロースなどの担体中に組み込み、圧縮する。
それぞれの量は活性成分の所望の濃度に応じて選択する。
【０１０３】
ＩＶ　ＨＤの細胞効果の試験
方法
ＮＣＩ疾患指向性インビトロスクリーニング
９つの腫瘍型を含む６０のヒト腫瘍細胞系統（Ｂｏｙｄ　ａｎｄ　Ｐａｕｌｌ、１９９５）を２４時間培養後、０．０１〜１００μＭのロスコビチンに４８時間連続曝露した。スルホローダミニンＢ蛋白質アッセイを用いて細胞毒性を評価した。
【０１０４】
チミジン取り込み。ＨＴ２９−１８−Ｃ１細胞を２４穴プレート中、２．１０５細胞／５００μｌ培地／ウェルで培養した。サブコンフルエムトな細胞を洗い流し、飢餓−同期化のために無血清培地中に４８時間放置した。ＨＤ存在下、５％の血清を加えることにより、増殖停止から解放した。２４時間処理期間の最後の４時間に、２μＣｉのメチル−３Ｈチミジン（比活性５０Ｃｉ／ｍＭｏｌ）（ＩＣＮ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を各ウェルに加えた。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、５％の冷トリクロロ酢酸により４℃で４５分間処理した。細胞を水洗し、０．３Ｍ　ＮａＯＨにより３７℃で１時間可溶化した。Ｂｅｃｋｍａｎベータ計数器で放射能を測定した。
【０１０５】
細胞培養および処理。ヒト大腸腺癌細胞系統ＨＴ２９のサブクローンであるＨＴ２９−１８−Ｃ１を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン（Ｅｕｒｏｂｉｏ）および５０ｍｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）を補足したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）中、３７℃、１０％ＣＯ２で培養した。細胞を４８時間の血清除去により同期化した。次いで、細胞に５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を加えることにより増殖停止から解放した。ＤＭＳＯ中で調製したＨＤを最終濃度０から８０μＭの範囲でただちに培地に加え、２４時間置いた。いくつかの実験では、血清添加の２２時間後にＨＤを加え、さらに２４時間放置した。また、他の実験では非同期化細胞にＨＤを加えた。次いで細胞を洗浄し、５％ＦＣＳ培地中で培養し、異なる時点でＦＡＣＳにより計数または分析した。
【０１０６】
細胞計数およびフローサイトメトリーによる細胞周期分析。細胞を血球計数器で計数した。細胞周期の分布をフローサイトメトリーで解析した。接着細胞（１．１０６）をトリプシン化し、冷７０％エタノール中で４時間固定した。固定細胞をＰＢＳで洗浄し、１ｍｌあたり５μｇのＲＮアーゼＡ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）とインキュベートし、２５μｇ／ｍｌのプロピジウムヨウ素（Ａｌｄｒｉｃｈ）により３７℃で１時間染色した。染色細胞をＦＡＣＳｃａｎ細胞蛍光測定器でｃｅｌｌＦｉｔ　Ｓｏｆｔｗａｒｅプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解析した。
【０１０７】
結果
ヒメニアルディシンの細胞効果：増殖阻害
ＨＤ（０．０１〜１００μＭ；４８時間暴露）をＮＣＩ疾患指向性インビトロスクリーニング、すなわち９つの腫瘍型（白血病、非小細胞肺癌、大腸癌、中枢神経系癌、黒色腫、卵巣癌、腎臓癌、前立腺癌、乳癌）を含む６０のヒト腫瘍細胞系統で試験した。すべての細胞系統はＨＤに対して同様の感受性を示した。平均ＩＣ５０は１５．１μＭであった（ロスコビチン：１６μＭ（Ｍｅｉｊｅｒ他、１９９７）、オロモウシン：６０．３μＭ（Ａｂｒａｈａｍ他、１９９５））。細胞系統のロスコビチンに対する感受性と野生型または突然変異ｐ５３の存在との間に相関は認められなかった。
【０１０８】
細胞特性
細胞増殖の阻害剤
【０１０９】
【表４】
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【０１１０】
【表５】
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ヒメニアルディシンの細胞効果：Ｓ期およびＧ２／Ｍ移行
ヒメニアルディシンはＨＴ２９−１８−Ｃ１の増殖阻害を引き起こす。
【０１１１】
ＨＴ２９−１８−Ｃ１細胞を血清除去によりＧ１において同期化させた。０時間の時点で５％ＦＣＳを加え、細胞を１０μＭのＨＤで同時に処理（ｏ）、または曝露なし（ｏ）とした。２４時間とその後は、５％ＦＣＳを含む培地中で培養した。細胞数を１２時間毎に７２時間、血球計数器を用いて計数した。増殖阻害の動力学を図９Ａに示す。ＨＤ処理により、７２時間の間の細胞数増加が対照に比べて低下していることによってモニターされるとおり、強い増殖阻害が引き起こされた。血清処理細胞（０時間）を様々な濃度のＨＤに曝露し、２４時間後に計数した。結果を図９Ｂに示す。非血清刺激細胞（網掛け）の数を比較のために示す。阻害効果はＨＤの用量に依存的で、ＩＣ５０は５μＭであった（図９Ｂ）。トリパンブルー色素排除により、２４時間の時点で１０および８０μＭ　ＨＤにはほとんど毒性は伴わないことが示された（それぞれ生存率＞９５％と９０％）。このＨＤの抗増殖効果は可逆的のようである。事実、細胞は培養７２時間後には再度ゆっくりと増殖し始めた。
【０１１２】
ヒメニアルディシンはＳ期停止を引き起こす。
【０１１３】
ＨＤ処理細胞の細胞周期分布に関する結果を図１０Ａに示す。ＨＴ２９−１８−Ｃ１を４８時間血清飢餓させた。次いで、５％血清を加え（０時間）、細胞を同時に５または４０μＭのＨＤでその後２４時間処理、または無処理とした。次いで、細胞を固定し、その細胞周期状態を実験法の項に記載のとおりにＦＡＣｓｃａｎ分析によって調べた。数字は異なる細胞周期にある細胞の％を示している。図１０ＢにＨＤ処理細胞におけるＳ期蓄積の動力学を示す。血清飢餓ＨＴ２９−１８−Ｃ１細胞に０時間の時点で血清を加え、同時に１０μＭのＨＤでその後２４時間処理、または無処理とした。細胞周期分布を２４時間毎に７２時間分析した。
【０１１４】
蛍光活性化細胞分類機（ＦＡＣｓ）解析により、ＨＤ処理は無処理の細胞に比べてＳ期における細胞蓄積を引き起こすことが明らかとなった。ＨＤ非存在下では、血清刺激した細胞は容易にＧ２／Ｍに進行した（図１０Ａ）。これとは対照的に、ＨＤ処理細胞は血清刺激後にＧ２／Ｍに進行できず、Ｓ期で停止したままであった。ＨＴ２９−１８−Ｃ１培養物の細胞周期分布に対するＨＤの効果も経時的に調べた（図１０Ｂ）。同期化した細胞を１０μＭのＨＤ存在下、または非存在下で５％ＦＣＳ培地中に２４時間放置した。次いで、細胞を５％ＦＣＳ培地中でさらに４８時間培養した。細胞数と一致して、ＨＤは７２時間の細胞培養中に細胞増殖を阻害し、Ｓ期に細胞を蓄積させることが認められた（図１０Ｂ）。ヒメニアルディシンはＧ２／Ｍ停止を引き起こす。
【０１１５】
別の型の実験で、ＨＴ２９−１８−Ｃ１を４８時間血清飢餓させた。次いで、５％血清を０時間の時点で加え、２２時間後に１０μＭのＨＤを加えた。１４時間後、すなわち血清刺激の３６時間後に、実験法の項に記載のとおりにＦＡＣｓｃａｎ分析によって細胞周期分布を調べた。この場合、細胞はＳ期に入る機会があり、ＨＤ処理によってＧ２／Ｍにおける細胞蓄積が引き起こされる（図１１）。
【０１１６】
参考文献
【０１１７】
【表６】
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【０１１８】
【表７】
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【０１１９】
【表８】
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【０１２０】
【表９】
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【０１２１】
【表１０】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
海洋海綿から単離されたヒメニアルディシンおよび関連する代謝産物の構造を示す図である。
【図２】
ＨＤおよび類縁体の濃度を漸増させた場合のＣＤＫ１／サイクリンＢキナーゼの活性を示す図である。
【図３】
漸増濃度のＨＤ存在下、インビトロでカゼインキナーゼ１によりリン酸化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したプレセニリン−ＭＢＰ融合蛋白質のオートラジオグラフィを示す図である。
【図４】
図４ＡはインビトロおよびインビボでのＣＤＫ５／ｐ３５によるＰａｋ１リン酸化に対するＨＤによる阻害を示す図であり、基質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＨ４リン酸化レベルを示す。
図４ＢはインビトロおよびインビボでのＣＤＫ５／ｐ３５によるＰａｋ１リン酸化に対するＨＤによる阻害を示す図であり、Ｐａｋ１およびｐ３５の量を示すウェスタンブロットである。
【図５】
図５Ａは漸増濃度のＨＤ存在下、インビトロでＧＳＫ−３βによりリン酸化し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したｒ−ｈｔａｕのオートラジオグラフィを示す図である。
図５ＢはインビボでＣＤＫ阻害剤に曝露した、または曝露していないｈｔａｕ２３調製物を、様々な抗体と反応させて得た免疫ブロット法の結果を示す図である。
【図６】
図６ＡはＨＤの異なる濃度でのＣＤＫ１／サイクリンＢ蛋白質キナーゼ活性のアッセイから得た動力学的データを示す図である。
図６Ｂは固定化ＣＤＫ１／サイクリンＢをＨＤに曝露し、抗サイクリンＢおよび抗ＰＳＴＡＩＲＥ抗体でウェスタンブロッティングして得た結果を示す図である。
【図７】
ＣＤＫ２と複合したＨＤの電子密度マップを示す立体図である。
【図８Ａ】
ＣＤＫ２のＡＴＰ結合ポケット内におけるＨＤの精密化された構造を示す立体図である。
【図８Ｂ】
ＣＤＫ２とＨＤとの間の相互作用を示す概略図である。
【図９】
ＨＤ−ＣＤＫ２結合と他のＣＤＫ２リガンドの結合との比較を示す立体図である。
【図１０】
ＨＤ濃度（Ａ〜Ｈ）に応じてＧＡＰ−４３およびＭＡＰ−１Ｂ−Ｐの二重免疫蛍光染色により得た結果と、ＨＤの漸増用量に応答しての細胞溶解産物によるウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図１１】
ＨＴ２９−１８−Ｃ１細胞増殖に対するＨＤの効果を示す図である。
【図１２】
Ｓ期停止におけるＨＤの細胞効果を示す図である。
【図１３】
Ｇ２／Ｍ移行におけるＨＤの細胞効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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