(57)【要約】本発明は、ＦｃεＲＩと称される免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する高親和性レセプターに結合する新規な化合物、並びにそのような化合物を同定及び調製する方法を提供する。特定の態様では、本発明は、本発明の新規な化合物を用いたＩｇＥにより媒介される疾患の治療法を提供する。本発明はまた、新規な化合物を含む組成物、例えば製薬組成物、並びに研究的、診断的、治療的、及び予防的方法におけるそれらの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロアッセイでの高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）結合についてＩｇＥ１３４（配列番号：１７５）と競合するペプチドであって、次の式：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
を有し、Ｘａａがアミノ酸であり、ｘが０、１又は２；ｙが３〜１０の間及びｚが０、１又は３であるペプチド。
【請求項２】
ｙが３である請求項１のペプチド。
【請求項３】
ｙが４である請求項１のペプチド。
【請求項４】
ｙが５である請求項１のペプチド。
【請求項５】
ｘが０である請求項１ないし４の何れか１項のペプチド。
【請求項６】
ｙが０である請求項１ないし４の何れか１項のペプチド。
【請求項７】
次の一般式：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｚ
を有し、ｘが０、１又は２、ｙが３、４又は５、及びｚが０、１又は３である、請求項１のペプチド。
【請求項８】
次の一般式：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｚ
を有する請求項７のペプチド。
【請求項９】
Ｘａａ２及びＸａａ３が高疎水性アミノ酸である請求項８のペプチド。
【請求項１０】
Ｘａａ２がＰｈｅ及びＸａａ３がＬｅｕである請求項８のペプチド。
【請求項１１】
ＩＶＣＰＲＬＣＹＶＧＧＫＡＬＣＰＤＶＣＹＶ−ｎｈ２ （ＩＧＥ１２０、配列番号：１６３）の配列を有する請求項１のペプチド。
【請求項１２】
ＶＶＣＰＮＭＣＹＶＧＧＫＡＬＣＰＤＶＣＹＶ−ｎｈ２ （ＩＧＥ１２１、配列番号：１６４）の配列を有する請求項１のペプチド。
【請求項１３】
ＶＱＣＰＨＦＣＹＶＧＧＫＡＬＣＰＤＶＣＹＶ−ｎｈ２ （ＩＧＥ１２２、配列番号：１６５）の配列を有する請求項１のペプチド。
【請求項１４】
ＶＱＣＰＨＦＣＹＥＬＤＹＥＬＣＰＤＶＣＹＶ−ｎｈ２ （ＩＧＥ１３４、配列番号：１７５）の配列を有する請求項１のペプチド。
【請求項１５】
ＶＱＣＰＨＦＣＹＦＧＧＡＥＬＣＰＤＶＣＹＶ−ｎｈ２ （ＩＧＥ１３５、配列番号：１７６）の配列を有する請求項１のペプチド。
【請求項１６】
請求項１のペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項１７】
高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）に対するＩｇＥの結合を阻害する方法であって、次の工程：
ａ）ＦｃεＲＩへのペプチドの結合を生じさせることが可能な条件下で請求項１のペプチドを含む組成物とＦｃεＲＩを接触させる工程；及び
ｂ）本発明の化合物が存在する及び存在しない場合のＦｃεＲＩへのＩｇＥ結合の量を測定する工程を含み、化合物が存在しない場合に比較して存在している場合に低いレベルであるＩｇＥ結合が阻害を示す方法。
【請求項１８】
高親和性ＩｇＥレセプターへのＩｇＥの結合を阻害する方法であって、次のアミノ酸配列：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚを含み、Ｘａａがアミノ酸であり、ｘが０、１又は２；ｙが３〜１０の間及びｚが０、１又は３であるペプチドとＦｃεＲＩとの接触を含む方法。
【請求項１９】
高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）とＩｇＥの相互作用を阻害する分子を選択する方法であって、次の工程：
（１）ＦｃεＲＩへのＩｇＥ１３４（配列番号：１７５）の特異的な結合を生じさせることが可能な条件下で候補分子の存在する及び存在しない場合において、ＩｇＥ１３４（配列番号：１７５）と競合するペプチドと、ＦｃεＲＩとを接触させる工程；及び
（２）候補分子が存在する及び存在しない場合に生じるＦｃεＲＩへのＩｇＥ１３４（配列番号：１７５）の特異的な結合の量を測定する工程を含み、候補化合物が存在している場合のペプチド化合物の結合量が存在しない場合の結合量に比較して少ないことが、ＩｇＥのＩｇＥ媒介活性化を阻害する候補化合物の能力を示す方法。
【請求項２０】
高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）の活性化を阻害する方法であって、次のアミノ酸配列：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
を有するペプチドを含む組成物とＦｃεＲＩを接触させることを含み、Ｘａａがアミノ酸であり、ｘが０、１又は２；ｙが３〜１０の間及びｚが０、１又は３である方法。
【請求項２１】
接触がインビボである請求項２０の方法。
【請求項２２】
接触がインビトロである請求項２０の方法。
【請求項２３】
その必要のある宿主においてＩｇＥ媒介疾患又は障害を治療する方法であって、治療的有効量の請求項１のペプチドを宿主に投与することを含む方法。
【請求項２４】
請求項１のペプチドと製薬的に許容される担体を含む製薬組成物。
【請求項２５】
吸入に適する請求項２４の組成物。
【請求項２６】
乾燥粉末である請求項２４の組成物。
【請求項２７】
液体である請求項２５の組成物。
【請求項２８】
次の一般式Ｉ：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
を有する化合物の３次元表面構造を模倣する化合物を作成する方法であって、
（ａ）一般式Ｉのペプチドを調製する工程、
（ｂ）ペプチドの３次元構造を決定する工程、
（ｃ）ペプチドの３次元表面構造を模倣する化合物を作成する工程を含む方法。
【請求項２９】
配列番号：ＩｇＥ１３４（配列番号：１７５）の残基Ｐｒｏ４、Ｐｈｅ６、Ｐｒｏ１６、Ｃｙｓ３、Ｃｙｓ７、Ｃｙｓ１５及びＣｙｓ１９の側鎖によって決定される溶媒接触可能表面を模倣する溶媒接触可能表面を有する化合物。
【請求項３０】
表８の構造座標を有するペプチド。
【請求項３１】
ＦｃεＲＩに結合し、ＩｇＥの結合を阻害するペプチド模倣体を選択する方法であって、
（ａ）表８の構造パラメータで分子構造データベースを検索する工程；及び
（ｂ）表８の構造パラメータを模倣するデータベースから分子を選択する工程を含む方法。
【請求項３２】
配列番号：ＩｇＥ１３４（配列番号：１７５）残基Ｐｒｏ４、Ｐｈｅ６、Ｐｒｏ１６、Ｃｙｓ３、Ｃｙｓ７、Ｃｙｓ１５及びＣｙｓ１９の座標を模倣するペプチド模倣体。
【請求項３３】
インビトロアッセイでの高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）結合についてＩｇＥ１３４（配列番号：１７５）と競合するペプチドであって、次の式：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ７）ｗ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
を有し、Ｘａａ１−６が天然アミノ酸であり、Ｘａａ７が非天然アミノ酸であり、ｘが０、１又は２；ｗが１〜１０及びｚが０、１又は３であるペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＦｃεＲＩと称される免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する高親和性レセプターに結合する新規な化合物、並びにそのような化合物を同定及び調製する方法に関する。特定の態様では、本発明は、本発明の新規な化合物を用いたＩｇＥにより媒介される疾患の治療に関する。本発明はまた、新規な化合物を含む組成物、例えば製薬組成物、並びにＩｇＥ媒介疾患の治療のための研究的、診断的、治療的、及び予防的方法におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ＩｇＥはアレルギー疾患において主要な役割を担っている。ＩｇＥ高親和性レセプター（ＦｃεＲＩ）は、アレルギー疾患の多くの症状を作り出す炎症介在物質の更なる放出を促進する抗原性標的として働いている肥満細胞及び好塩基球上にある。
ＩｇＥの媒介する炎症は、肥満細胞上のＦｃＲＩレセプターに取り付くＩｇＥ抗体に抗原が結合したときに生じる。その直後、この結合は肥満細胞を脱顆粒させて、ある種の予備成形媒介物質を放出させる。続いて脱顆粒細胞は、新たに更なる媒介物質の合成及び放出を始める。その結果、２つの段階の反応：血管、平滑筋、及び腺分泌（即時型過敏症）での初期の直接的影響、次に数時間後までに関与部位の細胞浸潤がある。
ＩｇＥ抗体は、各細胞の表面上で多数の高親和性Ｆｃレセプターを介して肥満細胞に結合する。結合は、非共有結合的で可逆的であるため、結合した抗体は循環するＩｇＥのプールと一定の平衡状態にある。その結果、各肥満細胞は多くの異なる抗原と結合することができる。応答は、ＦｃεＲＩレセプターに取り付く２つ以上のＩｇＥ抗体と多価抗体が結合した時に開始される。架橋結合は肥満細胞を活性化するシグナルを伝達して、タンパク質チロシンキナーゼの活性化を生じ、細胞内の遊離カルシウムのレベルを増加させる。その後すぐに、細胞質顆粒は互いに表面膜で融合し、外部にその内容物を放出する。好塩基球もまた、ＦｃεＲＩレセプターを発現するが、即時型過敏反応でのそれらの影響は分かっていない。
【０００３】
炎症反応のこの即時的な段階は、主に肥満細胞の蓄積される媒介物質（特にヒスタミン）、並びにある種の敏速に合成されたアラキドン酸誘導体によって生じる。反応の強度が最大となるのは、最初の抗原の接触から約１５分後である。この段階の特徴は、紅斑、膨疹の形態の局在型浮腫及びそう痒（かゆみ）である。しかしながら、顆粒はまた、血管透過性を助ける血管アドレシンＶＣＡＭ−１（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の局所発現を誘発する。更なる肥満細胞顆粒内容物としては、ＲＡＮＴＥＳ及び他のケモカインを含み、それは白血球及び繊維芽細胞の化学誘因物質活性を有する分子であり、最終的にはその部位の炎症を引き起こす。
後の段階の症状は、部分的には先に合成されたＴＮＦ−αが原因であり、部分的には他の媒介物質（例えば、ＰＡＦ、ＩＬ−４及びアラキドン酸代謝物）が原因であって、その合成は肥満細胞の脱顆粒の後に開始される。これらの媒介物質の影響は、抗原接触の約６時間後に明らかとなり、好酸球及び好中球の浸潤により特徴づけられる。後の段階の症状の特徴は、影響のある部位での紅斑、硬結、熱、そう痒、及び灼熱感を含む。肥満細胞が誘導するＩＬ−４はＴＨ２細胞の生成を促進する。ＴＮＦ−αは、白血球の化学誘因物質として短期間において機能するのみならず、持続性過敏反応の間に血管形成、繊維芽細胞の増殖、及び傷跡の形成もまた促進する。
【０００４】
ＩｇＥ媒介炎症は、アトピー性アレルギー（例えば枯草熱、喘息及びアトピー性皮膚炎）、全身性アナフィラキシー反応及びアレルギー性じんま疹（皮疹）の根底にある機構である。敏速な血管拡張、抗原に接触した部位への循環可溶性因子及び細胞の侵入の促進を引き起こすので、通常は免疫防御の最前線としての役割を果たす。アレルギー疾患の最も破壊的な特性の多くは、肥満細胞自体に由来するものよりも、むしろ化学誘因性白血球の作用によるものである。
様々なペプチドライブラリーの提示（ファージディスプレイ）のためのバクテリオファージ粒子の使用が記載されている（Ｌｏｗｍａｎ， （１９９７） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ２６：４０１−４２４）。ファージディスプレイは、強制的及び非強制的なペプチドライブラリーを作成する方法を提供する（Ｄｅｖｌｉｎ等， （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６； Ｃｗｉｒｌａ等， （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２； Ｌｏｗｍａｎ （１９９７） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ２６：４０１−４２４）。これらのライブラリーは、予定標的分子に結合能力のあるペプチドリガンドを同定及び選択するのに使用することができる（上掲のＬｏｗｍａｎ （１９９７））；Ｃｌａｃｋｓｏｎ及びＷｅｌｌｓ （１９９４） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：１７３−１８４； 上掲のＤｅｖｌｉｎ等， （１９９０））。細胞標的に存在し（Ａｒａｐ等， （１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３７７−３８０）；ＩＬ−αの結合を阻害するヒトＩ型インターロイキン１（ＩＬ−１）レセプターに結合し（Ｙａｎｏｆｓｋｙ等， （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：７３８１−７３８６）；サイトカインエリスロポエチン（ＥＰＯ）に対するレセプターに結合及びそれを活性化し（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ等， （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：４５８−４６３）；ヒトトロンボポエチンレセプターに結合して、天然リガンドトロンボポエチン（ＴＰＯ）の結合と競合する（Ｃｗｉｒｌａ等， （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７６：１６９６−１６９９）、ペプチド修飾を同定するために、又は天然タンパク質結合リガンドから親和性向上又は成熟したペプチドリガンドを生成する（Ｌｏｗｍａ等， （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３８）ために、該技術が使用される。
【０００５】
一価のファージディスプレイにより作成された構造的に構築されたペプチドライブラリーを用いて、インシュリン様成長因子１結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に特異的に結合する１４アミノ酸ペプチドが単離された（Ｌｏｗｍａｎ等， （１９９８）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３７：８８７０−８８７８）。ペプチドはヘリックス構造を有し、インビボでＩＧＦＢＰに結合してインシュリン様成長因子−ａ（ＩＧＦ−１）活性を遊離する（上掲のＬｏｗｍａｎ等（１９９８））。インビボでのファージ選択を利用して、脳及び腎臓のような種々の器官に選択的局在化に媒介可能なペプチド（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ及びＲｕｏｓｌｏｈｔｉ （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８０：３６４−３６６）、並びにαＶβ３又はαＶβ５インテグリンを担持する特定の腫瘍タイプに帰着するペプチドが同定されている（Ａｒａｐら， （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３７７−３８０）。米国特許第５，６２７，２６３号には、α５β１インテグリンにより認識され、これと選択的に結合するペプチドが記載されている。親和性又は特異性が改善されたタンパク質の例には、ヒト成長ホルモン、亜鉛フィンガー、プロテアーゼインヒビター、心房性ナトリウム利尿因子、及び抗体が含まれる（Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． 及びＬｏｗｍａｎ Ｈ．（１９９２）， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２：５９７−６０４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ， Ｔ．及び  Ｗｅｌｌｓ， Ｊ．（１９９４）， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：１７３−１８４；Ｌｏｗｍａｎ等， （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０（１０）：８３２−８３８；Ｌｏｗｍａｎ及びＷｅｌｌｓ Ｊ．（１９９３）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３４：５６４−５７８；Ｄｅｎｎｉｓ Ｍ．及び Ｌａｚａｒｕｓ Ｒ．（１９９４）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９（２２）：１３７−１４４）。
Ｅ分類の免疫グロブリン（ＩｇＥ）により媒介される場合のアレルギー反応は、喘息及びアレルギー性鼻炎等の疾病状態に関連する。ＩｇＥとその高親和性レセプターの間の相互作用は、このアレルギー反応の重要な段階である。特定のアレルゲンに特異的なＩｇＥ免疫グロブリンは、それらのＦｃ領域を通じて肥満細胞、好塩基球、及び他の細胞上の特異的な高親和性レセプター、ＦｃεＲＩに結合する（Ｉｓｉｓａｋａ等， （１９７０） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７：６８７−７０２； Ｍｅｔｚｇｅｒ等， （１９８６） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４：４１９−４７０； Ｋｉｎｅｔ （１９９９） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７：９３１−３７２）。ＩｇＥ結合ＦｃεＲＩの抗原架橋結合は、ヒスタミン、白血球及びプロスタグランジン等のアレルギー反応の媒介物質の肥満細胞脱顆粒及び放出を生じるアレルギーカスケードを開始させる。次にこれらの媒介物質の放出は、血管浸透性及び周囲の細胞への血小板、好酸球及び好中球の浸潤の増大を引き起こす。
【０００６】
ＦｃεＲＩは、高親和性ＩｇＥ結合を与えるα鎖の細胞外ドメインを有する三量体αγ２又は四量体αβγ２構造の何れかとして細胞上に存在する。α鎖の結晶構造は、最近になって解明されている（Ｇｅｒｍａｎ Ｓ． Ｃ．，等 （１９９８） Ｃｅｌｌ ９５：９５１−９６１）。ＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩ複合体形成に寄与する残基を同定するために突然変異誘発の研究が行われている（Ｎｉｓｓｉｍ等， （１９９１） ＥＭＢＯ Ｊ． １０：１０１−１０７）。結合したＩｇＥ−Ｆｃを有するヒトＦｃεＲＩの複合体の結晶構造の報告は、ＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩ構造におけるＩｇＥ−Ｆｃのための２つの別々の結合部位を示唆している（Ｇｅｒｍａｎ等， （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０６：２５９−２６６）。
ＩＧＥのＦｃ部位への抗体の結合は、レセプターへのＩｇＥの結合を阻害することができ（Ｐｒｅｓｔａ等， （１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：２６２３−２６３２； Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ等， （１９９３） Ｐｒｏｔｅｉｍ Ｅｎｇｉｎｎｅｒｉｎｇ ６：９７１−９８０）、インビボで遊離ＩｇＥのレベルを低下させることができる（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ等， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ３：４１９−４２５； ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ等， （１９９７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ． ２５：３８７−３９２）。
Ｐｒｅｓｔａ等 （１９９３） Ｊ． Ｉｍｕｎｏｌ． １５１：２６２３−２６３２は、ＦｃεＲＩへの遊離ＩｇＥの結合を阻害するが、ＦｃεＲＩに結合したＩｇＥには結合しないヒト化抗ＩｇＥ抗体を記載している。抗ＩｇＥモノクローナル抗体を用いたアレルギー性個体の臨床研究が報告されている（Ｊａｒｄｉｅｕ及びＦｉｃｋ （１９９９） Ｉｎｔｌ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８８： １１２−１１５）。
その結果、ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合を阻止する分子、ＩｇＥ高親和性レセプターのまた、ＩｇＥ媒介疾患の治療に有効性を有することが期待される。
【０００７】
本発明の化合物は、ＩｇＥに対するＩｇＥ高親和性レセプター（ＦｃεＲＩ）への免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の会合を阻止又は阻害する化合物及び組成物を提供する。特定の態様では、本発明の化合物は、ＦｃεＲＩのＩｇＥ媒介性活性化を阻止、防止又は減弱する。従って、本発明の特定の態様では、肥満細胞及び好塩基球のＩｇＥ依存性活性化及び脱顆粒、並びにヒスタミンの等の炎症媒介物質の持続放出等のＩｇＥ媒介又は関連段階を抑制するための治療的及び予防的方法に利用できる。有利には、組成物は、ＦｃεＲＩのＩｇＥ媒介活性化を強力に抑制でき、好ましい実施態様では、低用量の製薬とすることができる。
本発明の化合物は、ＦｃεＲＩに結合してＩｇＥの結合を阻止又は阻害する。好ましい化合物は、約１００μＭ未満、あるいは１００ｎＭ未満、あるいは１ｎｍ未満の解離定数、Ｋｄを有するＦｃεＲＩに結合するペプチド模倣体等のペプチド又はペプチド誘導体である。このような化合物の特定の例は、直鎖状又は環状、特に環状のペプチド、好ましくは約１０〜１００の長さのアミノ酸残基、その組み合わせ、Ｎ末端又はＣ末端又は両方で修飾されていてもよいもの、並びにその塩、誘導体、及び機能類似体及びその製薬的に許容される組成物を含む。
【０００８】
特定の実施態様では、本発明に係る化合物は、一般式Ｉを有する又はそれに由来するペプチド又はその模倣体、あるいはＦｃεＲＩの結合において一般式Ｉの化合物と競合するものであり：
式Ｉは
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
ここでＸａａがアミノ酸であり、ｘ、ｙ及びｚが０以上の全ての数、一般的にはｘが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は２であり；一般的にはｙが３〜１０の間の任意の整数であり、一般的にはｚが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は３である。
もう一つの実施態様では、本発明に係る化合物は、一般式ＸＩを有する又はそれに由来するペプチド又はその模倣体、あるいはＦｃεＲＩの結合において一般式ＸＩの化合物と競合するものであり：
式ＸＩは
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ７）ｗ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
ここでＸａａ１−６が天然アミノ酸であり、Ｘａａ７が非天然アミノ酸であり、ｘ、ｙ及びｚが０以上の全ての数、一般的にはｘが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は２であり；一般的にはｗが１、１０、あるいはその間の任意の整数であり、一般的にはｚが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は３である。
本発明に係る化合物の更なる実施例としては、一般式ＩＸに基づいて単離され：
式ＩＸは
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｃｙｓ−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８である。
【０００９】
特定の態様では、本発明は、二量体化又は環化された本発明のペプチドを提供する。二量体又は多量体は、２つの同様の又は相違するペプチドの間であることができ、ペプチド構成成分は、平行又は逆平行の様態の何れかで結合させることができる。
本発明は、
ａ）ＦｃεＲＩへの化合物の結合を生じさせることが可能な条件下で、場合によってはＩｇＥの存在下で、本発明の化合物を含む組成物とＦｃεＲＩを接触させる工程；及び
ｂ）本発明の化合物が存在する及び存在しない場合のＦｃεＲＩへのＩｇＥ結合の量を測定する工程を含み、化合物の存在する場合のＩｇＥ結合が存在しない場合に比較して少ないことによって阻害が示される、高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）へのＩｇＥの結合を阻害する方法を提供する。
さらに本発明は、
ａ）ＦｃεＲＩへの本発明の化合物の特異的な結合を生じさせることが可能な条件下で本発明の化合物の存在する及び存在しない場合において、ＦｃεＲＩと候補化合物を接触させる工程；
ｂ）候補分子が存在する及び存在しない場合に生じるＦｃεＲＩへの本発明のペプチド化合物の特異的な結合の量を測定する工程を含み、候補化合物の存在しない場合の結合量に比較して候補化合物の存在する場合のペプチド化合物の結合量が少ないことによって、ＦｃεＲＩのＩｇＥ媒介活性化を阻止する候補化合物の能力が示される、ＦｃεＲＩのＩｇＥ媒介活性化の相互作用を阻害する化合物の同定ための方法を提供する。
【００１０】
更なる態様では、本発明は、本発明のペプチドの３次元溶液構造を提供する。好ましい３次元溶液構造は、ここで提供されるＮＭＲデータにより提供される。更なる態様は、タンパク質ペプチド複合体の３次元構造を表す回折像を作るためにｘ腺放射を回折する、ＦｃεＲＩに結合するＩＧＦ１３４の複合体により形成される結晶を提供する。本発明はまた、前記結晶を含む組成物を提供する。
本発明はまた、
ａ）ＦｃεＲＩと本発明のペプチドを含む水溶液を、沈殿剤を含む保存液と混合して、混合物を形成する工程；及び
ｂ）混合物を結晶化させる工程を含む、ＦｃεＲＩを結晶化させる方法を提供する。
本発明はまた、上記方法により作成される結晶性ＦｃεＲＩ／ペプチド複合体を提供する。
さらに、本発明は、
（ａ）ＦｃεＲＩ／ペプチド複合体を結晶化する工程；
（ｂ）結晶性ＦｃεＲＩペプチド複合体を照射してＦｃεＲＩ／ペプチド複合体に特異的な回折像を得る工程；及び
（ｃ）回折像をＦｃεＲＩ／ペプチド複合体の３次元構造に変換する工程
を含む本発明のペプチドとの複合体におけるＦｃεＲＩの３次元構造を決定するための方法を提供する。
【００１１】
さらに本発明は、適した機械により読み取られる場合に、本発明のペプチドとＦｃεＲＩを含む分子複合体の結晶の３次元表示を示す機械読み取り可能なデータを用いてコードされるデータ蓄積物を含む機械読み取り可能なデータ蓄積媒体を提供する。更なる態様では、本発明は、添付物１に示される構造座標を有するＦｃεＲＩ／ペプチド結晶を提供する。
さらに、本発明は、ＦｃεＲＩペプチドの３次元構造がＦｃεＲＩペプチド結合領域を含む場合の、ペプチド及び／又はペプチドとＦｃεＲＩの複合体の３次元構造の使用方法を提供し、外報府は、ＦｃεＲＩの３次元構造のペプチド結合領域と相互作用する構造を有する化合物、並びにＦｃεＲＩアゴニスト及びアンタゴニストとしての機能の同定を含む。このような方法において好ましいのは、ＦｃεＲＩの３次元構造は添付物１にある構造情報のものと実質的に同一のα炭素配位を含む。
他の態様では、本発明は、
（ａ）ＦｃεＲＩ／ペプチド複合体を結晶化してＦｃεＲＩ／ペプチド複合体結晶を形成する工程であって、ＦｃεＲＩがペプチド結合領域を決定するアミノ酸残基の群を含む工程；
（ｂ）工程（ａ）から得たＦｃεＲＩ／ペプチド複合体結晶を照射してＦｃεＲＩ／ペプチド複合体結晶の回折像を得る工程；
（ｃ）回折像からＦｃεＲＩ／ペプチド複合体の３次元構造を測定する工程であって、外交像がペプチド結合領域を含む工程；及び
（ｄ）ＦｃεＲＩと接触させるペプチド残基の３次元構造を示す重要なＦｃεＲＩ結合残基を機能的に複製する３次元構造を有するＦｃεＲＩアゴニスト又はアンタゴニスト化合物、あるいは化学物質を同定する工程を含むＦｃεＲＩアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法を提供する。
【００１２】
特定の更なる態様に従うと、本発明は、
（ａ）ＦｃεＲＩ／ペプチド複合体の３次元構造を決定する工程；
（ｂ）本発明のペプチドの３次元構造を決定する工程；
（ｃ）ＦｃεＲＩと接触させるペプチドの領域の３次元表面構造を模倣する化合物又は化学物質を作成する工程を含んでなる、ＩｇＥ１３４又は本発明の他のペプチドの３次元表面構造を模倣する化合物又は化学物質、例えばペプチド模倣体等を生成する方法を含む。
更なる実施態様に従うと、本発明は、
（ａ）添付物１に提供される構造パラメータ又は構造座標を有する分子構造データベースを検索する工程；及び
（ｂ）ペプチドの構造パラメータまたは構造座標を模倣するデータベースから分子を検索する工程を含む、Ｆｃεに結合してＩｇＥの結合を阻害するペプチド模倣体を同定する方法を提供する。
本発明はまた、分子複合体の３次元構造の少なくとも一部を決定する方法であって、前記複合体がＦｃεＲＩとペプチドを含み、次の：
（ａ）複合体を結晶化する工程
（ｂ）回折データを集める工程
（ｃ）任意の適した供給源からのフェーズを用いて電子密度地図を計算する工程（ｄ）前記電子密度に基づいて複合体の少なくとも一部を同定する工程を含む方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、ＩｇＥとそのレセプターの間のインビボ又はインビトロ会合を阻害することができ、ＦｃεＲＩ上の結合部位と会合することができる前記方法によって同定される化学物質を提供する。
特定の態様では、本発明は、化合物と、本発明の他の化合物との、あるいは他のタンパク質、特に血清タンパク質又はペプチドとの組み合わせに関する。組み合わせは、様々な目的、例えば；ＦｃεＲＩに対するペプチド化合物の親和性及び結合活性をここに記載されるような種々の多量体ドメインの使用によって増大させること；例えばＺタンパク質融合体等のペプチド化合物を発現させることによるペプチド化合物の安定性の増大又は回収及び精製の促進；ペプチド化合物のインビボ使用に関わる本発明の態様におけるペプチド化合物の治療的効果を、例えば血清半減期を増大又は減少させること、例えば組み換え宿主細胞で簡単に作成されるような血清アルブミン、免疫グロブリン、アポリポタンパク質又はトランスフェリン等の血漿タンパク質へのペプチド化合物の融合により、又は二機能性架橋剤の使用により改善すること；などを意図して調製される。
この発明には、キット及び製造品とともに、プロエイジェント、並びにＩｇＥ媒介疾患又は疾病の治療のためのペプチドのような化合物を含有する製薬的組成物を含んでなる組成物が含まれる。キット及び製造品は、好ましくは：
（ａ）容器；
（ｂ）前記容器上の標識；及び
（ｃ）前記容器に収容される本発明の化合物を含有する組成物；を含み、その組成物はＩｇＥ媒介疾患又は疾病を治療すること関して効果的である。好ましくは、前記容器上のラベルに組成物がＩｇＥ媒介疾患又は疾病を治療するために使用できることを示す。キットには、製薬的に許容される賦形剤と、疾患の治療での組成物の使用のための指示書を含んでなる第２の容器のような付随的構成が含まれてもよい。
【００１４】
また、開示された内容は、特にＩｇＥ又はＦｃεＲＩ複合体の関与によって特徴付けられるアレルギー反応又は応答の治療に有用な方法である。従って、本発明は、本発明の化合物の治療的有効量を宿主へ投与することを含む、それを必要とする宿主のＩｇＥ又はＦｃεＲＩ媒介による疾患又は障害の治療方法を提供する。方法は、ＩｇＥ又はＦｃεＲＩの関連する活性現象の予防、阻止又は阻害にとって有用である。好ましい実施態様では、アレルギー反応が関与する組織傷害の重症度又は程度を緩和あるいは予防するために、本発明の方法を用いる。
さらに本発明は、限定されるものではないが、化合物の非経口的、経口的、直腸及び肺投与に適した剤形を包含する本発明の化合物の種々の剤形を提供する。本発明の好ましい側面では、治療的剤形は吸入に適したものとして提供され、本発明は、本発明の化合物の肺投与を経由する、ＦｃεＲＩの活性化のようなＩｇＥ媒介又は関連プロセスあるいは現象が関与する障害や疾患の治療的処置を提供する。より特別には、本発明は、本発明の化合物、特に吸入によるペプチド化合物の肺投与に向けられている。従って、本発明は、本発明の化合物の量を含んでなるエアロゾル製剤、より特異的には、ＩｇＥ媒介又は関連プロセスあるいは現象を効果的に阻止又は防ぐ本発明のペプチド及び分散剤を提供する。一実施態様では、本発明の化合物、特に本発明のペプチド化合物は、液体エアロゾル製剤として提供することが可能である。あるいは、この化合物は、乾燥粉末エアロゾル製剤として提供することができる。従って、本発明によると、製剤は、ＩｇＥ媒介あるいは関連現象の治療のための本発明の化合物の他の非経口的なルートの投与に対する有効で非侵襲的な代替法を提供するものとして提供されている。
さらに他の態様では、本発明は、罹患している患者のＩｇＥ媒介疾患を治療する、本発明の化合物の治療的有効量を含有する組成物の患者への投与を含む方法を提供する。特定の態様では、ＩｇＥ媒介疾患はアレルギー性鼻炎、喘息（アレルギー喘息）、アトピー性皮膚炎、じんま疹−血管性浮腫、寄生虫感染、ＩｇＥ骨髄腫、ＩｇＥ媒介消化管炎症疾患及び移植片対宿主反応からなる群から選択される。他の特定の態様では、投与方法は皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内又は関節内経路によって注射又は注入することができる。
【００１５】
（好適な実施態様の詳細な説明）
（定義）
特許請求の範囲及び明細書で使用する用語は、当分野の通常の技術者によって理解されるような通常の定義を有する。他の用語は、特に断らない限り以下に記載するように定義される。
ここで使用されるように、「エアロゾル」という用語は、気体のサスペンションを意味する。特に、エアロゾルは、本発明の製品の粒子化及び気体へのそのサスペンションに関する。本発明によれば、エアロゾル製品は、エアロゾル化に適した本発明の化合物、例えば吸入又は肺投与のための粒子化及び気体へのサスペンションを含む製品である。
「薬剤」及び「化合物」という表現は本発明の範囲内では交換可能に使用され、ＦｃεＲＩと本発明のペプチド化合物の間の相互作用を阻止又は防ぐすべての分子又は物質を含むことを意味する。このような分子は、小型有機及び生物有機分子、例えば、ペプチド模倣体、ペプチド類似体、抗体、イムノアドヘシン、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、製薬剤及びそれらの代謝物、及び類似物を含む。
【００１６】
本発明の好ましい化合物は、本発明のペプチド化合物のペプチド類似体又は模倣物を含む。これらは、例えば、ここで記載されているように化合物が、結合してＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合を抑制または阻害する能力を保持するとすれば、非天然発生アミノ酸を含有するペプチドを含む。同じように、ペプチド模倣体及び類似体は、本発明のペプチド化合物の構造を模倣し、ここに記載されているような結合してＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合を抑制または阻害する能力を保持する非アミノ酸化学構造を含みうる。このような化合物は、同じような物理的特徴、例えば大きさ、ペプチド化合物の対応物に見出される適切な空間的配向に存在する電荷や疎水性を示すことで一般的に特徴付けられる。ペプチド模倣化合物の特異的な例は、例えば、１つ又は複数のアミノ酸の間のアミド結合が当該分野において良く知られている炭素−炭素結合又は他の結合によって置換されている化合物である（例えば、Ｓａｗｙｅｒ， ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ｐｐ． ３７８−４２２（ＡＣＳ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， １９９５）を参照のこと）。
用語「ＩｇＥ媒介」又は「関連」疾患又は障害は、ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合から生じる又はそれに関連する症状を意味する。ＩｇＥ媒介又は関連疾患又は障害は、例えば、これに限定する物ではないがアレルギー性鼻炎、アレルギー喘息、例えば季節性花粉（イネ科草本；ライ麦、チモシー、ブタクサ）及び木（カバノキ）等の特定のアレルギー因子に関連する喘息、通年性アレルギー、例えばホコリダニ、動物のフケ、羽毛及び菌類胞子及び職業性抗原、例えば洗浄剤及び金属並びに非抗原特異的因子、例えば感染、煙、蒸気ディーゼル排気微粒子及び二酸化硫黄等の刺激に関する喘息、気道冷却（運動、冷えた気温）及び情緒的なストレスに関する喘息；アトピー性皮膚炎及びアレルギー性胃腸症並びに全身性アナフィラキシー、及び食物、毒液、ワクチン、ホルモン、抗血清、酵素、ラテックス中のタンパク質に対する反応、抗菌物質、筋弛緩剤、ビタミン、細胞毒及びオピエートを含むハプテンに対する反応、及びデキストラン、鉄デキストラン及びポリゲリン（ｐｏｌｙｇｅｌｉｎｅ）等の多糖類に対する反応を含むアナフィラキシー性の疾患及びじんま疹血管性浮腫等の他のアナフィラキシー性の疾患又は障害を含むＩｇＥ抗体及び肥満細胞媒介物質により引き起こされるアレルギー疾患を含む。
【００１７】
「ＩｇＥ媒介消化管炎症疾患」は、例えばＩｇＥに影響される病理により特徴づけられる、又は病理から生じる傷害又は感染により引き起こされるもののような様々な障害に対するホストの広範な反応に対する難治性慢性的応答のように広く定義される。この用語の範囲内に含まれる特定の疾患としては、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、不定大腸炎及び感染性大腸炎）、胃腸症（ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ）、腸炎、粘膜炎（例えば、口内炎（ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）、消化管粘膜炎、鼻粘膜炎及び直腸炎）、壊死性全腸炎及び食道炎を含む。
本発明の特定の態様において使用されるところの「多量体化ドメイン」なる用語は、直接又は「リンカードメイン」を介して化合物、特にペプチド化合物が結合する分子の一部を指すことを意味する。多量体化ドメインは、好ましい実施態様では、２又はそれ以上の多量体化ドメインの相互作用を容易にするアミノ酸ドメインである。多量体化ドメインは２又はそれ以上の多量体化ドメインの間の相互作用を促進するが、本発明では、多量体化ドメインに結合するペプチドが多量体の一部として存在している必要性はない。
本発明の好ましい態様では、多量体化ドメインは、２又はそれ以上の多量体化ドメインの安定した相互作用を促進させるポリペプチドである。例えば、限定するものではないが、多量体化ドメインは免疫グロブリン配列、例えば免疫グロブリン定常領域、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、２又はそれ以上の多量体化ドメイン間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを含有するポリペプチド、又は例えば米国特許第５７３１１６８号に記載されている「キャビティ中突起（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ）」ドメインであってよい。前記特許では、突起は、第１ポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置換することにより形成される。突起に対して同一又はより小さなサイズの相補的キャビティは、大きなアミノ酸側鎖を小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することにより、第２ポリペプチドの界面に任意につくり出される。
【００１８】
よって、好ましい態様では、多量体化ドメインは、２又はそれ以上の多量体化ドメインの安定した相互作用を促進するか、これを可能にし、モノマー性多量体ドメインからのダイマーと他の多量体の形成を促進させるか、これを可能にする分子の一部を提供する。好ましくは、本発明のこの態様では、多量体化ドメインは免疫グロブリンの定常領域ドメインである。免疫グロブリンの定常ドメインは、本発明の化合物のインビボ循環半減期を改善し、場合によっては、当業者をして、以下に記載する「エフェクター機能」を本発明の所定の態様に導入することを可能にするという利点をもたらす。
本明細書と特許請求の範囲を通して、免疫グロブリン重鎖中の残基の番号付けは、ここにＫａｂａｔ等， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ （１９９１）（開示によりここに取り込まれたものとみなす）のＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」とはヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
ここでの使用において、用語「非経口」は、腸以外で、特に静脈内（ｉ．ｖ．）、動脈内（ｉ．ａ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、脳室内、及び皮下（ｓ．ｃ．）経路で体内に本発明の化合物を取り込むことを意味する。
【００１９】
ここで使用される用語「ペプチド」は、束縛された（即ち、例えば、βターン又はβプリーツシートを開始するアミノ酸の存在のような構造の要素を有する、又はジスルフィド結合されたＣｙｓ残基の存在により環化された）あるいは非束縛（例えば線状）アミノ酸配列を意味し、約５０アミノ酸残基、好ましくは約４０アミノ酸残基未満であり、それ又はその間の二量体などの多量体を含む。約４０アミノ酸残基未満のペプチドの中で、好ましくは約１０から約３０アミノ酸残基のペプチド、特に約２０のアミノ酸残基のペプチドである。しかしながら、この開示を読むに当たり、当業者は、ペプチドを識別するのは特定のペプチドの長さではなく、結合してＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合を抑制または阻害する能力及びここに記載のペプチド化合物との結合競合能力であることを理解するであろう。従って、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４及び２５アミノ酸残基は、本発明の内容において等しく化合物であり得る。
他のペプチド化合物は、免疫原ポリペプチド、例えば、ベータラクタマーゼ等の細菌性ポリペプチド又は大腸菌Ｔｒｐ位置にコードされる酵素又は酵母タンパク質、プロテインＡのＺドメイン等の他のポリペプチド、及び免疫グロブリン定常領域又は他の免疫グロブリン領域等の長半減期を持つタンパク質とのＣ−末端融合物、アルブミン、又は１９８９年４月６日に公開された国際公開第ＷＯ８９／０２９２２号公報に記載されたフェリチンの、ここに述べた化合物の−又はＣ−末端への融合物を含む。さらに、アミノ酸残基の側鎖上の遊離の官能基も、アミド化、アシル化又は、例えば、化合物の溶解性をその活性に影響を与えず変化させることのできる他の置換によって修飾することができる。「Ａｃ−」は、例えばＣＨ３ＣＯ−修飾Ｎ末端を示し、「−ｎｈ２」又は「−ＮＨ２」は −ＮＨ２修飾Ｃ末端を示す。
【００２０】
本発明の内容での特定のペプチドは、非天然発生アミノ酸配列である。非天然発生により、アミノ酸配列が自然に見られないことを意味する。好ましいのは、約１０から３０アミノ酸残基、好ましくは約２０アミノ酸残基の非天然発生アミノ酸配列である。これらは、ペプチド、ペプチド類似物及び模倣物を含み、天然又は非天然発生アミノ酸を含む。特定の態様では、本発明のペプチドは天然発生アミノ酸のみからなるアミノ酸残基を含む。
非天然アミノ酸の例は、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０シクロアルキル及び芳香族アミノ酸を含む。特定のアルキル非天然アミノ酸は、β−アラニン、４−アミノ酪酸、５−アミノ吉草酸、６−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノカプリル酸等、及びその異性体を含む。特定のシクロアルキル非天然非天然アミノ酸は、１−アミノ−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−シクロブタンカルボン酸、１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸、１−アミノ−シクロヘキサンカルボン酸、ｃｉｓ−４−アミノシクロヘキサンカルボン酸、ｔｒａｎｓ−４−アミノシクロヘキサンカルボン酸、ｃｉｓ−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸、ｔｒａｎｓ−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸等、及びその光学及び化学異性体を含む。特定の芳香族非天然アミノ酸は、２−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸及び４−アミノ安息香酸等を含む。
【００２１】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００２２】
ここで使用されるように、「肺投与」という用語は、吸入により肺を通しての本発明の製品の投与を意味する。ここで使用されるように、「吸入」という用語は、肺胞への気体の吸気を意味する。特定の実施態様では、取り込みは、本発明の製品の自己投与により、又は、例えばレスピレータを使用する患者に対してのレスピレータを介しての投与により生じうる。本発明の製品に関して使用される「吸入」という用語は、「肺投与」と同義である。
本発明の文脈内で使用される「治療」とは、治癒的処置並びに予防的、又は疾患又は障害の抑制的手段を含んで意味する。従って、例えば治療という用語は疾患又は障害の発症の前に又は後に薬剤を投与すること、よって疾患又は障害の全ての症状を予防又は取り除くことを含む。他の例として、疾患の症状に対処するための疾患の臨床症状後の薬剤投与は疾患の「治療」を含む。例えば、肥満細胞又は好塩基球、組織傷害、炎症からの炎症媒介物質（例えば、サイトカイン）放出の放出範囲又は白血球輸送の量。他の方法は、ＩｇＥ媒介性障害の「治療」の指標となる他の手段は、高親和性ＩｇＥレセプター（例えば、肥満細胞又は好塩基球に存在するもの）へのＩｇＥの結合が抑制される範囲を測定することである。「治療を必要とする」ものは、既に疾患又は障害を有している哺乳動物、例えばヒトを含み、疾患又は障害が予防されるべきものを含む。
【００２３】
「有効量」は高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）に結合するＩｇＥレセプターアンタゴニストペプチドの能力を抑制する、低下させる又は低下を引き起こす前記ペプチドの最少量以上である。「治療的有効量」は、ＩｇＥ媒介疾患に関する病理症状を減弱する又は排除する、あるいは病理状態を改善するＩｇＥレセプターアンタゴニストペプチドの最少濃度以上である。例えば、炎症媒介物質（例えば、ヒスタミン）、遊離ＩｇＥ、高親和性レセプターへのＩｇＥ結合、炎症、組織傷害の量的レベル又は白血球輸送の量。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
「活性」は、本発明の予定化合物がＦｃεＲＩに結合することを意味する。さらに、活性である化合物はまた、ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合を抑制又は減弱する。ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合の抑制は、肥満細胞又は好塩基球上のＩｇＥによるＦｃεＲＩの活性化の結果生じた細胞媒介物質の減少（例えばヒスタミンの放出）を試験することにより測定することができる。
【００２４】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。免疫接着分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
ここで使用される用語「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばウシ（例えば、乳牛）、ウマ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ネコなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
１つ又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商品名）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）及びヒアルロン酸（ＨＡ）を含む。
【００２５】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（例えば本発明のＩｇＥレセプターアンタゴニストポリペプチド）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
「高（ｌａｒｇｅ）疎水性アミノ酸」は、アミノ酸であり、疎水性である分子であるアミノ酸（天然又は非天然を含む）であり、これらの用語は当分野の通常の技術者に容易に理解される。さらに、特徴を示す「高（ｌａｒｇｅ）」は、小さな物理的サイズであるような他のアミノ酸の側鎖に比較してより大きな物理的サイズであるものとして側鎖を説明している。側鎖の物理的特（例えば、疎水性、極性、電荷、酸性又は塩基性の特徴など）に基づくアミノ酸残基の分類に共通である。この定義の分類に入るアミノ酸に共通する特徴は、疎水性である性質を共有し、大きな物理的サイズの側鎖を有するものである。この定義の分類にはいるアミノ酸の非限定的な例は、トリプトファン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、ロイシン、イソロイシン、オクタヒドロインドール、テトラヒドロイソキノリン等である。
【００２６】
ＩＩ．本発明の実施の形態
本発明は、一般式Ｉを有する又はＦｃεＲＩの結合において一般式Ｉの化合物と競合するペプチド又はペプチド模倣体等を含む化合物を提供する。
式Ｉ
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
Ｘａａがアミノ酸であり、ｘ、ｙ及びｚが０以上の全ての数、一般的にはｘが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は２であり；一般的にはｙが３〜１０の間の任意の整数、あるいは３、４又は５であり、一般的にはｚが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は３である一般式Ｉのペプチド化合物が好ましい。例えばｘ及びｚが０のとき、本発明は一般式ＩＩを有する化合物を提供する。
式ＩＩ
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６
【００２７】
式Ｉ及びＩＩのペプチド化合物は、（Ｘａａ）ｙを３〜１０のアミノ酸残基の式で示すアミノ酸ドメインを含む。特定のペプチド化合物は、ｙが３、４、５、８、又は１０、あるいは３、４又は５、あるいは５であるアミノ酸ドメイン（Ｘａａ）ｙを含む。一般式１のペプチド化合物において、本発明は次に示す一般式の何れか１つの有するペプチド化合物を提供する：
式ＩＩＩ
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｘａａａ−Ｘａａｂ−Ｘａａｃ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
式ＩＶ
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｘａａａ−Ｘａａｂ−Ｘａａｃ−Ｘａａｄ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
式Ｖ
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｘａａａ−Ｘａａｂ−Ｘａａｃ−Ｘａａｄ−Ｘａａｅ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
一般式ＩからＶの化合物について、Ｘａａ６がＴｈｒである一般式ＶＩの化合物が提供される：
式ＶＩ
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｚ
ここでｘは０、１又は２であり、ｙは３、４又は５、あるいは５であり、ｚは０、１又は３である。
【００２８】
ある実施態様によれば、Ｘａａ４がＡｓｐである一般式ＶＩＩの化合物を提供する：
式ＶＩＩ
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｚ
ここでｘは０、１又は２であり、ｙは３、４又は５、あるいは５であり、ｚは０、１又は２である。
ある実施態様によれば、Ｘａａ２及びＸａａ３が高疎水性アミノ酸である一般式ＶＩＩＩの化合物を提供する：
式ＶＩＩＩ
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−ＬＨＲ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−ＬＨＲ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｚ
ここでＬＨＲは高疎水性アミノ酸、例えばＰｈｅ又はＬｅｕであり、Ｘａａ４はＡｓｐであって、ｘは０、１又は２で有り、ｙは３、４又は５、あるいは５であり、ｚは０、１又は３である。
本発明のさらに好ましい化合物は一般式ＩＸの化合物を含む：
式ＩＸ
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｃｙｓ−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８
【００２９】
このグループの好ましい化合物は、例えば実施例１−６に詳細に説明される、特に表５の記載されるようなペプチド化合物である。実施例は、式ＩＸのＸａａ１０がＴｒｐであり、Ｘａａ１１がＧｌｙであり、Ｘａａ１２がＴｒｐであるペプチドを含む：
式Ｘ
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｘａａ１３−Ｃｙｓ−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８
本発明のこの態様によれば、Ｎ及びＣ末端の欠失を有する一般式ＩＸ及びＸＩのペプチドもまた好ましく、例えば、Ｘａａ１を欠いていてもよい一般式ＩＸ及びＸの化合物が本発明の文脈において好ましい化合物である。同様に、ペプチドのＣ末端における１〜３のアミノ酸の欠失は、本発明の好ましい化合物を生じる。
別の実施態様では、本発明に係る化合物は、一般式ＸＩを有する又はそれに由来するペプチド又はその模倣体、あるいはＦｃεＲＩの結合において一般式ＸＩの化合物と競合するものであり：
式ＸＩは
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ７）ｗ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
ここでＸａａ１−６が天然アミノ酸であり、Ｘａａ７が非天然アミノ酸であり、ｘ、ｙ及びｚが０以上の全ての数、一般的にはｘが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は２であり；一般的にはｗが１、１０、あるいはその間の任意の整数であり、一般的にはｚが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は３である。
【００３０】
一般式Ｉ〜ＸＩの全ての化合物は本発明のペプチド化合物の例示であり、本発明は、該化合物が大きい化合物又は組成物の一部を構成している組成物を含む。例えば、一般式Ｉのペプチド化合物は、他のペプチド化合物に、又は他のタンパク質又はポリペプチドと、Ｎ又はＣ末端あるいはその両方を介して、あるいは側鎖を通じて該化合物が結合又は融合された融合タンパク質の一部を構成しうる。
本発明のこの態様によれば、化合物は、様々な目的、例えば；ＦｃεＲＩに対するペプチド化合物の親和性及び結合活性をここに記載されるような種々の多量体ドメインの使用によって増大させることを意図して調製される。本発明のこの実施態様では、化合物は、好ましくはそのＮ又はＣ末端を介して他のタンパク質又はペプチド、例えば免疫グロブリンに融合又は結合される。従って、本発明は、免疫グロブリンドメイン、例えば免疫グロブリン定常領域に融合又は結合された一般式Ｉ〜ＸＩの化合物を含有するハイブリッド免疫グロブリンタンパク質を提供する。更なる態様によれば、一般式Ｉ〜ＸＩの化合物は、例えばＺタンパク質融合体等のペプチド化合物を発現させることによって、ペプチド化合物の安定性を増大させる又は回収及び精製を促進する目的で他のタンパク質に融合又は結合されうる。本発明の更なる態様には、ペプチド化合物のインビボ使用に関わる本発明の態様における化合物の治療的効果を改善する目的で、一般式Ｉ〜ＸＩの化合物が作成される化合物又は組成物を含む。例えば、化合物の血清半減期が、免疫グロブリン、アポリポタンパク質又はトランスフェリン等の血漿タンパク質へのペプチド化合物の融合又は結合により調節されうる。あるいは、一般式Ｉ〜Ｘの化合物は、同様にアルブミン又は免疫グロブリンのような血清タンパク質に結合するペプチド等の他の小有機分子又は生物有機分子に融合又は結合されうる。
【００３１】
通常、化合物は次の配列：
Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ（配列番号：ＩｇＥ１３４）を有するペプチドと、インビトロアッセイにおける高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）への結合について競合する。
本発明は、
ａ）ＦｃεＲＩへの化合物の結合を生じさせることが可能な条件下で、場合によってはＩｇＥの存在下で、本発明の化合物を含む組成物とＦｃεＲＩを接触させる工程；及び
ｂ）本発明の化合物が存在する及び存在しない場合のＦｃεＲＩへのＩｇＥ結合の量を測定する工程を含み、化合物の存在する場合のＩｇＥ結合レベルが存在しない場合に比較して低いことにより阻害が示される、高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）へのＩｇＥの結合を阻害する方法を提供する。
【００３２】
本発明はさらに、高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）へのＵｇＥの結合を阻害する方法であって、Ｘａａがアミノ酸である、次のアミノ酸配列を有するペプチドとＦｃεＲＩとの接触を含む方法を提供する：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
ここでｘは０（ゼロ）以上の全ての数字、一般に５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は２であり；ｙは３〜１０の間、あるいは３、４又は５であり、ｚは０（ゼロ）以上の全ての数字、一般に５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は３である。
本発明の更なる態様では、本発明は、高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）へのＩｇＥの相互作用を阻害する分子を選択する方法であって、
（１）ＦｃεＲＩへのＩｇＥ１３４の特異的な結合を生じさせる条件下で候補分子の存在する場合と存在しない場合においてＩｇＥ１３４（配列番号：１７５）とＦｃεＲＩを接触させる工程；
（２）候補分子の存在する場合と存在しない場合において生じるＦｃεＲＩへのＩｇＥ１３４（配列番号：１７５）の特異的な結合の量を測定する工程を含み、候補化合物の存在する場合での低い結合レベルによってＦｃεＲへのＩｇＥの結合を阻害する能力が示される方法を包含する。
【００３３】
Ａ．ペプチド及び類似体の構造分析
ペプチド化合物の３次元構造は、核磁気共鳴分析法（ＮＭＲ）又はＸ線結晶構造解析を用いて決定することができる。ＮＭＲから導かれる構造情報又はペプチド結晶構造は、小分子及び生物有機分子、例えばＦｃεＲＩに結合する、好ましくはＩｇＥ媒介又は関連結合又は現象を阻害又は抑制する合成有機分子及びペプチド模倣体等を同定するのに利用することができる。このような構造に基づく化合物構築へのアプローチの例は、（「構造に基づく薬剤作成（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）」Ｐａｎｄｉ Ｖｅｅｒａｐａｎｄｉａｎ， 等Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９７）に記載されている。
この態様によれば、本発明は、例えば一般式Ｉ及びＸＩの化合物によって提供される溶媒接触可能表面を模倣する３次元構造を示す化合物を提供する。一例としては、本発明のペプチドの３次元構造を決定すれば、熟練技術者はペプチドの模型、例えば図７及び８に示されるようなものを構築できる。ペプチドの全ての原子は適切なファンデルワールス半径の球状範囲として示すことができるので、折り畳まれたペプチドの詳細な表面地図を作ることができる。「溶媒接触可能表面」は、化学プローブ、ここでは水分子に接触可能な表面であり、ファンデルワールス表面との接触を維持してペプチドの外側で適切な半径の水分子を回転することによって構成される。水分子の表面に接触するファンデルワールス表面のこれらの部分は、「溶媒接触可能表面」として知られる連続面を決定する（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔｈｏｍａｓ Ｅ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， 第２版 Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９８４， ｐｐ２２７−２２９）。従って、本発明は、一般式Ｉ及びＸＩのペプチドにより説明される溶媒接触可能表面を模倣する溶媒接触可能表面、特に、例えばＩＧＥ１３４（配列番号：１７５）及びＩＧＥ０６３（配列番号：５２）の有するペプチドを示す溶媒接触可能表面を示す化合物を提供する。
【００３４】
ペプチド化合物の溶媒接触可能表面を模倣する溶媒接触可能表面を提供するこのような化合物を、当業者は構築することができる。一例として、熟練技術者であれば、化合物の３次元構造データベースを検索して同様の３次元構造配置で適切な官能基を位置づけるこれらの化合物を同定し、次いでこのような化合物の間でコンビナトリアル・ケミストリーライブラリーを構築して高親和性のあるものを同定及び最適化することができる。
一般式Ｉ及びＸＩの化合物の代表的な３次元構造は、図７（式Ｘ）及び８（式Ｘ）に示される。ＩＧＥ０６３（配列番号：５２）及びＩＧＥ１３４（配列番号：１７５）は非常に異なる２次構造であるにも関わらず、３次元構造（図９）のオーバーレイは２つの疎水性及び／又はプロリン含有隆起に隣接する疎水性の溝からなる表面特徴を保持する。一般式Ｉのペプチド、例えばＩＧＥ１３４の場合、Ｃｙｓ３／Ｃｙｓ１９及びＣｙｓ７／Ｃｙｓ１５のジスルフィド結合は、一方がＰｒｏ４及びＰｈｅ６により形成される隆起に他方がＰｒｏ１６の突起に隣接する溝の底にある。これらの特徴は、ＩＧＥ１３４（配列番号：１７５）による高親和性ＦｃεＲＩ結合について重要である（実施例１２参照）ことが知られ、これによりペプチドにより示される隆起／溝／隆起溶媒接触可能表面を模倣する小有機分子の作成に関する必須の情報を提供する。例えば、技術者は、ＩＧＥ１３４（配列番号：１７５）の溶媒接触可能表面を有する小分子が、プロリンが形成する突起により作られる疎水性の溝及び疎水性の隆起（図９）を模倣する表面を示しうることを認識するであろう。従って、本発明は、例えばペプチドＩＧＥ１３４（配列番号：１７５）のもの、特にＩＧＥ１３４（配列番号：１７５）の残基Ｃｙｓ３、Ｐｒｏ４、Ｐｈｅ６、Ｃｙｓ７、Ｃｙｓ１５、Ｐｒｏ１６及びＣｙｓ１９により表される溶媒接触可能表面を模倣する溶媒接触可能表面を有する化合物を提供する。
【００３５】
従って、ある態様によれば、本発明は本発明のペプチド化合物、例えば一般式Ｉ：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
のペプチド化合物を模倣する化合物、例えばペプチド模倣体を作成する方法であって、
（ａ）一般式Ｉのペプチドを調製する工程
（ｂ）ペプチドの３次元構造を決定する工程
（ｃ）ペプチドの３次元表面構造を模倣する化合物を作成する工程を含む方法を含む。
更なる実施態様によれば、本発明は、ＦｃεＲＩに結合してＩｇＥの結合を阻害するペプチド模倣体を同定する方法であって、
（ａ）本発明に従って調製されたペプチドの構造パラメータ、例えば表６及び８に提供される配列番号：ＩＧＥ０６３（配列番号：５２）又はＩＧＥ１３４（配列番号：１７）においてここで提供される構造座標を用いて分子構造データベースを検索する工程；及び
（ｂ）データベースからペプチドの構造パラメータを模倣する分子を選択する工程を含む方法を提供する。
本発明のペプチド化合物を用いて同定されるペプチド類似体は、ここで記載される治療方法に、及び医薬組成物として利用できる。
【００３６】
ｘ線回折研究の実施を可能にする大きさ及び質である本発明のペプチドとＦｃεＲＩの組み合わせの結晶は、ＦｃεＲＩの結合特性、並びにＦｃεＲＩに結合する分子の結合特性に関する研究の当業者による実施を可能にする。
本発明により可能となった方法の一つは、ＦｃεＲＩに結合する又はＦｃεＲＩと関連する化学物質を作成するための、及び異なる方法で化学物質の物理的特性を変えるためのＦｃεＲＩの構造座標の使用である。従って、例えば、溶解性、親和性、特異性、作用強度、結合解離率又は他の結合特性等の性質がすべて改変及び／又は最適化されうる。
同様に本発明のペプチドの３次元構造を用いて、候補化学物質とＦｃεＲＩの間の相互作用に最適な部位を決定するために異なる物質のライブラリーでＦｃεＲＩ結晶構造を調査することにより所望の化学物質を作成することができる。例えば、溶媒を飽和させた結晶から収集された高分解能ｘ線回折データは、各タイプの溶媒分子がどこに接着するかの決定を可能にする。次いでこれらの部位に強く結合する小分子を設計及び合成し、所望の活性について試験する。一旦所望の活性が得られると、分子は更に最適化される。
【００３７】
様々な実施態様において、特許請求の範囲の本発明は、まずＦｃεＲＩ及びペプチドを含む水溶液を提供することによって、本発明のペプチドと複合したＦｃεＲＩの結晶形態を調製する方法に関する。次いで沈殿剤を含む保存液をある量のＦｃεＲＩ溶液と混合し、できた混合物を結晶化させる。典型的には、他の試薬の希釈効果を最小化させるために少量のこの試薬に結晶を溶解し、再生させるためにある時間放置する。更なる工程では、結晶複合体を混合物から単離する。
水溶液中のＦｃεＲＩ及びペプチドの濃度は変化しうるが、好ましくは約１〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約５〜１５ｍｇ／ｍｌである。同様に、本発明で使用される沈殿剤は様々なものであってよく、当分野で公知のあらゆる沈殿剤から選択することがもできる。好ましくは、沈殿剤は、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、酢酸ナトリウム、又はその混合物からなる群から選択される。より好ましくは、沈殿剤は、クエン酸ナトリウム又は酢酸ナトリウムで緩衝したポリエチレングリコールである。保存液において沈殿剤はあらゆる濃度で使用することができる；しかしながら、ポリエチレングリコールならば約２０〜２５％、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム又は酢酸ナトリウムなら１０ｍＭ〜１Ｍの濃度が好ましい。また、保存液のｐＨは変化しうるが、一般的には４〜１０、より具体的には約４．５でありうる。
【００３８】
当業者は、これらの各パラメータを過度の実験なしに変化させ、さらに適切な結晶を得ることができることを理解するであろう。実際には、提供されるあらゆる形成方法について適した沈殿剤、バッファー、又は他の実験変化因子が一旦決定されれば、これらの任意の方法又はあらゆる他の方法が請求する結晶の形成に使用することができる。当業者は、特定の必要性によって変化因子を決定することができる。
請求する本発明において、蒸気拡散法、バッチ法、液架橋（ｌｉｑｕｉｄ ｂｒｉｄｅｇｅ）、結晶透析法を含む様々な結晶化方法が使用できる。蒸気拡散法での結晶化が好ましい。例えば、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ等， Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｓ， Ｇｌｉｃｋ，等 （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｃｏ．，１９８２）， ｐｐ．８２−１５９； Ｊａｎｃａｒｉｋ等， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｃｒｙｓｔ．， ２４： ４０９−４１１ （１９９１）参照。蒸気拡散法では、少量（例えば数ミリリットル）のタンパク質溶液を、沈殿剤を含有する溶液と混合する。この混合物を少量、例えば１ｍｌの沈殿剤の入ったウェルに懸濁させる。液滴からウェルへの蒸気拡散によって液滴における結晶形成を生じる。
結晶透析法は、タンパク質を保持するが、小分子（すなわち、バッファー及び沈殿剤）を内に又は外に拡散させる半透性のサイズ排除膜を利用する。蒸発によるタンパク質及び沈殿剤の濃縮よりもむしろ、透析では、膜を通してゆっくりと沈殿剤を拡散させ、固定されるタンパク質濃縮を維持しながらタンパク質の溶解度を減少させることが可能である。バッチ法は、一般的にタンパク質の水溶液に溶液がちょうど濁るところまで沈殿剤をゆっくりと添加し；この時点で容器を密閉して結晶化が生じるまで静かにおくことを含む。
【００３９】
従って、出願人は、請求される本発明が結晶化のあらゆる全ての方法を包含することを意図する。当業者はこのような方法の何れかを選択することができ、選択した方法が所望の結晶を生じるようにパラメータを変化させることができる。
また、本発明では、ＦｃεＲＩの全体又は一部に結合することのできる小分子データべースのコンピュータ検索又は化学物質の作成も考えられる。
従って、得られた情報はＦｃεＲＩの可能性のある阻害剤又はアゴニストを最適化するするために使用することができる。一般に、ＦｃεＲＩを阻害する又はそれに拮抗する化学物質の作成は少なくとも２つの因子の検討を必要とする。まず、化学物質はＦｃεＲＩに物理的に又は構造的に関連する可能性がなければならない。関連は、物理的、構造的、又は化学的関係、例えば共有的又は非共有的結合、ファンデルワールス力、相互作用、疎水性又は静電気的相互作用等の何れでもよい。
第２に、化学物質はＦｃεＲＩに関連させることができる構造であるとみなすことができなければならない。化学物質の全ての部位がＦｃεＲＩとの関連に関係する必要があるわけではないが、これらの関与していない部位が、分子の全体的な構造に影響があるかもしれない。言い換えると、これが化学物質の有望性に重大な影響を持つかもしれない。このような構造上の要求は、結合部位の全て又は部分に関係する化学物質の３次元構造又は配向に関する。
【００４０】
ＦｃεＲＩにおける化学物質の可能性のある阻害又は結合効果は、実際の合成及びコンピュータモデリング技術の使用による試験の前に分析されうる。得られた化学物質の論理的な構造がそれとＦｃεＲＩの間の不十分な相互作用及び関連を示唆する場合、化学物質の合成及び試験の必要性は除去される。
しかしながら、コンピュータモデリングが強い相互作用を示す場合、次に分子は合成され、ＦｃεＲＩに結合する能力について試験されうる。こうして、効力のない化合物の効果で時間のかかる合成が回避されうる。
ＦｃεＲＩの阻害又は他の結合化合物は、化学物質又は断片がＦｃεＲＩの個々の結合部位に関連する能力について選別又は選択される連続した工程によって計算的に評価され、作成されうる。
従って、当業者は、ＦｃεＲＩと関連する能力について化学物質又は断片を選別する幾つかの方法のうち１つを使用しうる。この方法は、例えば、付録１のＦｃεＲＩ座標に基づくコンピュータスクリーンの結合部位のような目視検査により開始されうる。次いで、選択した断片又は化学物質をＦｃεＲＩの個々の結合ポケット内で様々な配向に位置づけられ、あるいは「ドッキングされ（ｄｏｃｋｅｄ）」うる。ドッキングは、例えばＱｕａｎｔａ及びＳｙｂｙｌ等のソフトウェアを用いてなされ、続いてＣＨＡＲＭＭ及びＡＭＢＥＲ等の標準的な分子力学力場を用いた分子動力学及びエネルギー最小化がなされうる。
【００４１】
対象とする断片又は化学物質の選択に特殊化したコンピュータプログラムを使用してもよい。これらのプログラムは、例えば、オックスフォード大学、オックスフォード、英国から入手可能なＧＲＩＤ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社、バーリントン、マサチューセッツ州から入手可能なＭＣＳＳ又はＣＡＴＡＬＹＳＴ；カリフォルニア大学、サンフランシスコ、カリフォルニア州から入手可能なＤＯＣＫ；ロンドン大学ユニバーシティカレッジ、英国から入手可能なＸＳＩＴＥ等を含む。
適した化学物質又は断片が選択されれば、それらから阻害剤又はアゴニストを構築することができる。構築は、コンピュータスクリーンに示される３次元構造像上での、ここに開示される構造座標に関する断片どうしの関係の目視検査によってなされうる。
あるいは、所望の活性を有する分子の空の結合部位、あるいは任意にはその部分を含んでいるものの何れかを実験的に用いて、新規に化学物質を作成してもよい。従って、例えば、ＦｃεＲＩ又はその断片、あるいは評価されるべき候補化学物質の何れかを固相に付着させて更なる研究又は最適化のための能力を有する結合剤を同定する、固相スクリーニング技術を用いてもよい。
【００４２】
Ｆｃεアンタゴニストの作成において、分子モデリング技術を本発明に従って用いることができ；これらの技術は公知、あるいは当業者に既に利用可能となっている。ここに開示される方法、化合物及び組成物を、ＦｃεＲＩに関連又は結合しうる物質のみならず、あるいはレセプターに結合して天然ＦｃεＲＩ−ＩｇＥ相互作用を乱しうるこのような物質の同定、作成、又は特徴付けに使用することができることが理解されるであろう。
化合物が前記方法によって作成又は選択されれば、その化合物がＦｃεＲＩに結合する能力を、コンピュータ的又は実験的な評価を用いて試験し、最適化することができる。様々なパラメータを所望の結果に従って最適化することができる。これらは、限定するものではないが、特異性、親和性、結合／解離率、疎水性、溶解性、及び当業者により容易に同定可能な他の特性を含む。
さらに、本発明は可能性を持った小分子薬剤候補の最適化のために利用できる。従って、結晶構造は、ＦｃεＲＩと小分子阻害剤の複合体の結晶構造に関する情報を得るために使用することもできる。例えば、小分子阻害剤がＦｃεＲＩと共に結晶化されれば、複合体の結晶構造を、位相計算用のＦｃεＲＩの既知の座標を用いた分子置換によって解くことができる。このような情報は、例えば、ＦｃεＲＩと小分子阻害剤の間の相互作用の性質を決定するために利用でき、従って、結合特性、例えば親和性、特異性、及び動力学等を改善しうる修飾を示唆する。
【００４３】
Ｂ．ペプチドの組み合わせ
１．多量体化ドメイン
本発明の好適な実施態様では、ペプチド化合物は多量体化ドメインと組み合わされる。本発明のこの側面においては、少なくとも二つの別のドメインを有するハイブリッド分子が提供される。各分子はペプチドドメインと多量体化ドメインを有している。本発明では、ペプチドドメインは任意には柔軟なリンカードメインを介して免疫グロブリンＦｃ領域のような多量体化ドメインに結合されている。
本発明のハイブリッド分子は適切な多量体化ドメインにペプチドを組み合わせることにより構築される。通常は、本発明のハイブリッド分子を調製する場合、ペプチドをコードする核酸は多量体化ドメイン配列をコード化する核酸に作用可能に結合される。典型的には、作成物は、ペプチドのＣ末端が多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端、好ましくはＣ末端に結合されている融合タンパク質をコードしている。しかし、ペプチドのＮ末端が多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端に結合されている融合体もまた可能である。
好適な多量体化ドメインは免疫グロブリンの定常領域配列である。典型的には、そのような融合体では、コードされたハイブリッド分子は免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持しているであろう。融合体はまた例えば定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１の直ぐ近くのＮ末端又は軽鎖の対応する領域に対して生成される。
【００４４】
免疫グロブリン定常ドメインへのペプチドの融合がなされる正確なアミノ酸部位は重要ではない；特定の部位はよく知られており、生物学的活性、分泌又は結合特性を最適化するために選択することができる。この点に関して、当業者は文献（米国特許第５１１６９６４号、同第５７１４１４７号及び同第５３３６６０３号；Ｃａｐｏｎら、（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−５３１； Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら， （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６８−７０；及びＢｙｒｎら， （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６６７−６７０； Ｗａｔｓｏｎら， （１９９０） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１０：２２２１−２２２９； Ｗａｔｓｏｎら， （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：１６４−１６７； Ａｒｕｆｆｏら， （１９９０） Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３； Ｌｉｎｓｌｅｙら， （１９９１） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３：７２１−７３０； Ｌｉｓｌｅｙら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７４：５６１−５６９； Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら， Ｃｅｌｌ ６６：１１３３−１１４４； Ａｓｈｋｅｎａｚｉら， （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９； Ｌｅｓｓｌｕｅｒら， （１９９１） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７：２８８３−２８８６； 及びＰｅｐｐｅｌら， （１９９１） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７４：１４８３−１４８９； Ｍｏｈｌｅｒら， （１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：１５４８−１５６１； Ｂｅｎｎｅｔｔら， （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２３０６０−２３０６７； Ｋｕｒｓｃｈｎｅｒら， （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：９３５４−９３６０； Ｃｈａｌｕｐｎｙら， （１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：１０３６０−１０３６４； Ｒｉｄｇｗａｙ及びＧｏｒｍａｎ， （１９９１） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１５， Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ． １４４８）に記載された様々なイムノアドヘシンの構築を参考にすることができる。特定の側面では、免疫グロブリンタイプの多量体化ドメインは機能性Ｆｃドメインを有するダイマーのような多量体を提供するように選択される。好適な側面では、多量体化ドメインは天然の免疫グロブリンＦｃ領域に伴うエフェクター機能を有しているＦｃドメインを提供するように選択される。従って、ペプチドは、特定の側面では、特定のエフェクター機能又は機能群に対して選択された機能性Ｆｃドメインを有する多量体を提供する免疫グロブリン重鎖定常ドメインに結合される。この場合、免疫グロブリン鎖−ペプチド配列をコードするＤＮＡは典型的には第二のペプチド−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌の際、ハイブリッド重鎖は二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖を有する免疫グロブリン様構造を提供するように共有結合的に結合される。
【００４５】
特定の実施態様では、Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域、例えば天然配列ヒトＦｃ領域ヒトＩｇＧ１（Ａ及び非Ａアロタイプ）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域である。
好適な実施態様では、ペプチド配列は免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ領域のＮ末端に融合している。ペプチド配列に重鎖定常領域の全体を融合させることが可能である。しかし、より好ましくは、ＩｇＧのＦｃを化学的に定めるパパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４であるとして、残基２１６）、又は他の免疫グロブリンの類似部位の丁度上流のヒンジ領域で始まる配列が融合に使用される。特定の好適な実施態様では、ペプチドアミノ酸配列はＩｇＧ重鎖の（ａ）ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３又は（ｂ）ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合している。さらに好適な実施態様では、ペプチドリガンドアミノ酸配列はＩｇＧの（ａ）ヒンジ領域及び（ｂ）ＣＨ３ドメインに融合している。
【００４６】
この実施態様の特定の側面では、ペプチドと多量体化ドメインを含むハイブリッド分子が多量体、例えばホモダイマー、又はヘテロダイマーあるいはヘテロテトラマーとしてでさえ構築される。ホモダイマーはペプチドと多量体化ドメインを含む二つのモノマーの対合又は架橋から生じる。しかし、二つの同一のモノマー対は必須ではない。本発明の特定の側面では、免疫グロブリン定常ドメインのような多量体化ドメインとペプチドを含むここに記載したハイブリッド分子は免疫グロブリンの一つのアームを含む対の他方の免疫グロブリンと対合しうる。本発明の範囲に入る様々な例示的構築ハイブリッド分子は以下に概略的に模式化される：
（ａ）Ａ−ＣＨ
（ｂ）Ａ−ＣＨ−ＡＣＨ
（ｃ）Ａ−ＣＨ−ＶＨＣＨ−ＶＬＣＬ
（ｄ）Ａ−ＣＨ−ＶＨＣＨ
ここで、Ａはそれぞれ独立して本発明のペプチドを表し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、及び
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインである。
【００４７】
ここに記載されたハイブリッド分子は免疫グロブリンｃＤＮＡ配列に読み枠を一致させてペプチド部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合させることにより最も簡便に構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合体もまた使用できる（Ａｒｕｆｆｏら， （１９９０）， Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３；及びＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら， （１９９１）， Ｃｅｌｌ ６６：１１３３−１１４４）。後者のタイプの融合体は発現のためにＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって脾臓又は末梢血リンパ球から取り出されたｃＤＮＡライブラリーから発表された配列に基づいて単離できる。ハイブリッド分子のペプチドと免疫グロブリン部分をコードしているｃＤＮＡは、選択された宿主細胞において効果的な発現をさせるプラスミドベクターにタンデムに挿入される。
あるいは、特にペプチドが例えば標準的な固相合成法によって合成される実施態様では、ペプチドは当業者によく知られた様々な手段の任意のものによって多量体化ドメインに結合されうる。共有結合的接合が典型的には最も簡便であるが、他の形態の接合も用途に応じて用いることができる。共有結合的な接合の好適な形態の例には、多量体化ドメインのアミノ酸側鎖と活性化された化学基を持つ分子の反応により生じる結合が含まれ、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作成することができる。
【００４８】
２．ペプチド融合体
本発明では、ペプチドは、任意には、例えば他のペプチドに、以下に記載するように直接又はフレキシブルなペプチドリンカーを経由して結合される。本発明では、リンカードメインは以下にさらに詳細に記載するように二以上のペプチドドメインの間に空間的ブリッジを提供する任意の分子群である。本発明のこの側面では、ペプチドは例えば融合タンパク質におけるように互いに結合される。
【００４９】
３．リンカードメイン
本発明では、ペプチドドメインは、任意には、例えば他のペプチドドメインに又はフレキシブルなペプチドリンカーを経由して多量体化ドメインに結合される。本発明のハイブリッド分子のリンカー成分はハイブリッド分子の機能に必ずしも関与しないが寄与しうる。従って、本発明では、リンカードメインは、二以上のペプチドドメイン又はペプチドドメインと多量体化ドメインの間に空間的ブリッジを提供する任意の分子群である。
リンカードメインは可変な長さ及び構造にできる。一般には、重要であるのは、リンカードメインにより引き起こされる配向であり、その化学構造ではない。リンカードメインは、好ましくは、配位ＦｃεＲＩ分子に対する空間的／立体配置的制約を実質的に生じないで、ハイブリッド分子のペプチドドメインを結合させない。従って、リンカードメインの長さは、ハイブリッド分子の例えばペプチドと多量体化ドメインの二つの機能の性質に依存する。
当業者であれば、原子の様々な組み合わせが様々な結合間の既知の距離に基づいて可変長さの分子を提供することが分かるであろう（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＢｏｙｄ， Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３版， Ａｌｌｙｎ及びＢａｃｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ （１９７７））。例えば、リンカードメインは可変長さのポリペプチドでありうる。ポリペプチドのアミノ酸組成がリンカーの性質と長さを決定する。例示的なリンカードメインは一又は複数のＧｌｙ及び又はＳｅｒ／Ａｒｇ残基を有する。
【００５０】
Ｃ．変異体分子
ここに開示される様々なＩｇＥレセプターペプチドアンタゴニスト分子は、本発明の範囲内であると考えられる。形態の変化がペプチド活性の所望の変化に影響をもたらすので、用語「変異体」は、ペプチド配列に変化及び／又は修飾を包含することを明確に意図している。形態の修飾の検討は、「Ｇ．製薬組成物及び用量」の章で述べる。ペプチド配列及び／又は形態のこのような変化は、少なくとも理論上は、ＩｇＥシグナル伝達の細胞性プロセスを変化させ、ＦｃεＲＩへの結合を改善し、ペプチドの安定性を改善し、体内での半減期を延長することができる。従って、このような変化は、最終的にＩｇＥレセプターペプチドアンタゴニスト分子の治療的能力を改善することができる。
「アミノ酸」なる用語は最も広い意味に使用され、自然に生じるＬα−アミノ酸又は残基、並びに対応するＤ光学異性体を含むことを意味する。自然に生じるアミノ酸に対して一般的に使用されている１文字及び３文字略号がここでも使用される（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ａ．Ｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第２版， ｐｐ．７１−９２，（１９７５） Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。ここで使用される通則としては、Ｌ光学異性体については大文字、Ｄ形態については小文字である。この用語には、Ｄ−アミノ酸、並びに化学的に修飾されたアミノ酸、例えばアミノ酸類似物、ノルロイシン等のタンパク質に通常導入されない自然に生じるアミノ酸、及びアミノ酸に特徴的な当該分野において公知の特性を有する化学的に合成された化合物が含まれる。例えば、天然Ｐｈｅ又はＰｒｏと同じペプチド化合物の配座制限を許容するフェニルアラニン又はプロリンの類似物又は模倣物が、アミノ酸の定義に含まれる。このような類似物及び模倣物はここではアミノ酸の「機能的等価物」と称する。アミノ酸の他の例は、出典を明示してここに取り込まれるＲｏｂｅｒｔｓ及びＶｅｌｌａｃｃｉｏ（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｅｄｓ． Ｇｒｏｓｓ及びＭｅｉｅｈｏｆｅｒ， Ｖｏｌ．５ ｐ３４１， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ， Ｎ．Ｙ． １９８３に列挙されている。
【００５１】
ここで記載されるペプチドのアミノ酸配列における適した変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、修飾されていない形態と比較してペプチドのアミノ酸配列が変化することになるペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも一つのアミノ酸のペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ここで同定される変異体ペプチドの活性を比較することによって見出されうる。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては約１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体について全長又は成熟天然配列が示す活性を試験することにより決定される。
【００５２】
本発明で使用される「保存的」アミノ酸置換という用語は、機能的に等価なアミノ酸を置換するアミノ酸置換を意味する。保存的アミノ酸変化は、結果的なペプチドのアミノ酸配列に変化を生じない。例えば、類似の極性の一又は複数のアミノ酸は等価に作用し、ペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさない。一般に、グループ内での置換は、構造及び機能に関して保存的であるとみなす。しかしながら、特定の残基の役割はそれが存在している分子の３次元構造を背景に決定されることを当業者は認識しているであろう。例えば、Ｃｙｓ残基は、還元された（チオール）形態よりも極性の低い酸化された（ジスルフィド）形態に存在する。Ａｒｇ側鎖の長い脂肪性部位は、その構造的又は機能的役割の重大な特徴を構成し、これは他の塩基性残基よりも非極性の置換によって最も保存されうる。また、芳香族のグループ（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＰｈｅ）を含む側鎖は、イオン性−芳香族又は「カチオン−π」相互作用に関与しうることが認識されるであろう。これらの場合において、酸性又は荷電していない極性のグループのメンバーを有するこれら側鎖の１つの置換は、構造又は機能に関して保存的でありうる。Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓ（ジスルフィド形態）のような残基は、主鎖の高次構造に直接的な影響力を有し、構造上の変形なしに置換されないことがある。
【００５３】
関心ある保存的置換の例を、好ましい置換との表題で表１に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に置換例と命名され、又は以下にアミノ酸分類に関してさらに記載されるような、より実質的な変化が導入され、生成物がスクリーニングされる。
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【００５４】
本発明のペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン， ｍｅｔ， ａｌａ， ｖａｌ， ｌｅｕ， ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ， ｓｅｒ， ｔｈｒ；
（３）非極性：ａｌａ， ｖａｌ， ｌｅｕ， ｉｌｅ， ｐｒｏ， ｐｈｅ， ｔｒｐ， ｍｅｔ；
（４）非荷電極性：ｇｌｙ， ｓｅｒ， ｔｈｒ， ｃｙｓ， ｔｙｒ， ａｓｎ， ｇｌｎ；
（５）酸性：ａｓｐ， ｇｌｕ；
（６）塩基性：ａｓｎ， ｇｌｎ， ｈｉｓ， ｌｙｓ， ａｒｇ；
（７）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ， ｐｒｏ； 及び
（８）芳香族：ｔｒｐ， ｔｙｒ， ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
【００５５】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該分野において公知の技術を使用して作成することができる。部位特異的突然変異誘発、Ｃａｒｔｅｒ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３： ４３３１ （１９８６）； Ｚｏｌｌｅｒ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １０： ６４８７ （１９８７）、カセット突然変異誘発、Ｗｅｌｌｓ等， Ｇｅｎｅ， ３４： ３１５ （１９８５）、制限選択突然変異誘発、Ｗｅｌｌｓ等， Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ， ３１７： ４１５ （１９８６）又は他の周知の技術が、変異体ＤＮＡを製造するために、クローン化されたＤＮＡに実施できる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Ｃｕｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４： １０８１−１０８５ （１９８９）］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， （Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．）； Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５０： １ （１９７６）。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸を用いることができる。
【００５６】
アミノ酸置換は、遺伝子によりコードされるアミノ酸に限定されない。遺伝子コードによりコードされない一般的に遭遇するアミノ酸には、例えば国際公開番号ＷＯ９０／０１９４０に記載されているもの、例えばＧｌｕ及びＡｓｐについての２−アミノアジピン酸（Ａａｄ）；Ｇｌｕ及びＡｓｐについての２−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２−アミノブチル酸（Ａｂｕ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２−アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）；Ｇｌｙについての２−アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、及びＬｅｕ及びＩｌｅについてのシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；Ａｒｇ及びＬｙｓについてのホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについての２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ａｓｎ、及びＧｌｎについてのＮ−エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓについてのヒドロキシルリジン（Ｈｙｌ）；Ｌｙｓについてのアロヒドロキシルリジン（ＡＨｙｌ）；Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒについての３−（及び４）−ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びＶａｌについてのアロ−イソロイシン（ＡＩｌｅ）；Ａｌａについてのｐ−アミジノフェニルアラニン；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及びＡｌａについてのＮ−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；ＩｌｅについてのＮ−メチルイソロイシイン（ＭｅＩｌｅ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸についてのノルバリン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸についてのノルロイシン（Ｎｌｅ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについてのオルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎについてのシトルリン（Ｃｉｔ）及びメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；Ｐｈｅについてのメチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチルフェニルアラニン、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩ）フェニルアラニン、トリフルオリルフェニルアラニンが含まれる。
【００５７】
Ｄ．共有結合的修飾
本発明のペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、本発明のペプチドの標的とするアミノ酸残基を、分子の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることを含む。二官能性試薬での誘導体化が、例えば分子を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗−（本発明のペプチド）抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む［Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ｐｐ．７９−８６ （１９８３）］。
【００５８】
本発明の範囲内に含まれる発明ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ポリペプチド（Ｏ−結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。アミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
本発明のポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行されたＷＯ８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ及びＷｒｉｓｔｏｎ， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｐｐ． ２５９−３０６ （１９８１）に記載されている。
本発明のペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ等， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ２５９：５２ （１９８７）により、及びＥｄｇｅ等， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１８： １３１ （１９８１）により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ等， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １３８：３５０ （１９８７）に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
【００５９】
共有結合的修飾の他の型は、本発明ポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した本発明ポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと本発明ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には本発明のポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このような本発明のポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって本発明のポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄ等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ８：２１５９−２１６５ （１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体、Ｅｖａｎ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５：３６１０−３６１６（１９８５）；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体、Ｐａｂｏｒｓｋｙ等， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ３（６）：５４７−５５３ （１９９０）を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド、Ｈｏｐｐ等， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：１２０４−１２１０（１９８８）；ＫＴ３エピトープペプチド、Ｍａｒｔｉｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５：１９２−１９４ （１９９２）；α−チューブリンエピトープペプチド、Ｓｋｉｎｎｅｒ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：１５１６３−１５１６６ （１９９１）；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ、Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６３９３−６３９７（１９９０）を含む。
【００６０】
それに換わる実施態様では、キメラ分子は本発明のポリペプチドの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えて本発明のポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。
本発明のペプチド化合物は、各々アミノ保護基又はカルボキシ保護基を用いてＮ末端又はＣ末端において修飾することができる。そのような修飾の数は当業者に理解されるであろう。例えば、ペプチド又はペプチド類似物のＮ末端は、Ｎ末端アミノ基が、例えばアセチル、シクロペンチルカルボキシ、イソキノリルカルボキシ、フロイル、トシル、ピラジンカルボキシ、ｔｅｒｔ−ブチルアセチル、ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル、ベンジロキシカルボニル、例えば２−アリール−２−ｏ−ベンジルオキシム等のベンゾイル基並びにそれ自身がアミノ保護基で修飾されていてもよいアミノアシル残基を含む。他のアミノ保護基は、例えばＴｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｅｄｓ． Ｇｒｏｓｓ 及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ． １９８１）及びＧｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｄ ｅｄ．， ｐａｇｅｓ ３０９−４０５ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１））に記載され、これら各々はここに参考として取り入れる。
【００６１】
Ｎ末端アミノ基は、例えば逆アミド結合で置換することもできる。このようなアミノ基の修飾は、他の反応性アミノ基を、合成手法の間に又は最終化合物に対して起こりうる望ましくない側鎖反応から保護することができる。アミノ基は、ここで広く用いられ、ペプチドに存在する第１級、第２級、又は第３級アミノ基を含む遊離のアミノ基を意味すると解される。これに対して用語Ｎ末端は従来の方法で記載したペプチドに存在する最初のアミノ酸のα−アミノ基を指す。本発明のペプチド又はペプチド類似物のこのようなＮ末端アミノ基修飾は、ここで「Ｎ末端誘導体」と呼ぶ。
またアミノ基の修飾は、例えば化合物の溶解性又は活性の向上を含む付加的な利点も提供する。これらの修飾を有する化合物は、それらの構造が本開示を与える当業者の能力の範囲内であるので本発明の化合物の範囲内にあることを意味する。種々のアミノ保護基がこの分野で知られており、例えば、アセチル、ピコリル、ｔｅｒｔ−ブチルアセチル、ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル、ベンジロキシカルボニル、例えば２−アリール−２−ｏ−ベンジルオキシム等のベンゾイル基並びにそれ自身がアミノ保護基で修飾されていてもよいアミノアシル残基を含む。他のアミノ保護基は、例えばＴｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｅｄｓ． Ｇｒｏｓｓ 及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ． １９８１）及びＧｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｄ ｅｄ．， ｐａｇｅｓ ３０９−４０５ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１））に記載され、これら各々はここに参考として取り入れる。
【００６２】
同様に、ペプチドのＣ末端に存在するカルボキシ基などのカルボキシ基もカルボキシ保護基を用いて化学修飾できる。「カルボキシ基」及び「Ｃ末端」という用語は、上記のアミノ基及びＮ末端と同様の方法で使用される。ペプチドのＣ末端に存在するカルボキシ基などのカルボキシ基は、Ｃ末端カルボキシ基のアルコール又はアルデヒドでの還元又はオーラルエステルの形成又はチアゾリル、シクロヘキシル又は他の基などの置換基によるカルボキシ基の置換によって修飾できる。オーラルエステルはこの分野で良く知られ、例えば、メトキシメチル、エトキシメチル、プロポキシメチル、イソプロポキシメチルといったアルコキシメチル基などを含む。
【００６３】
Ｅ．ペプチドの合成
１．化学合成
本発明の化合物を生成する方法の１つに化学合成を含む。これは、当業者に知られた方法論を用いて実施される（Ｋｅｌｌｙ， Ｒ．Ｆ． ＆ Ｗｉｎｋｌｅｒ， Ｍ．Ｅ． ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｓｅｔｌｏｗ， Ｊ．Ｋ， ｅｄ．， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｖｏｌ． １２， ｐｐ １−１９（１９９０）； Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｊ．Ｍ． Ｙｏｕｎｇ， Ｊ．Ｄ．， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ （１９８４）参照；また米国特許第４，１０５，６０３号； 第３，９７２，８５９号； 第３，８４２，０６７号； 及び第３，８６２，９２５号も参照）。
本発明のペプチド類似物は固相ペプチド合成を用いて便利に作成される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， （１９６４）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５： ２１４９ ； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，（１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ５１３２ 。固相ペプチド合成はまた、活性ドメインがポリペプチドであるか、又はそれを含んでいると、本発明のハイブリッド分子組成物を調製するのに使用することができる。
固相合成は、保護されたアミノ酸を不活性個体支持体に結合させることにより推定ペプチドのカルボキシ末端において開始される。不活性な固体支持体は、開始アミノ酸のＣ末端のアンカーとして働くことのできる任意の高分子であり得る。典型的には、高分子支持体は、上掲のＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇの２及び４ページの図１−１及び１−２に示されるような架橋高分子樹脂（例えば、ポリアミド又はポリスチレン樹脂）である。一実施態様では、Ｃ末端アミノ酸はベンジルエステルを形成するポリスチレン樹脂と連結している。高分子支持体は、例えば、ペプチド合成の阻害アミノ酸のαアミノ基を解放するのに使用される条件下でペプチドアンカー結合が安定であるものが選択される。塩基不安定α保護基が使用され、次いでペプチドと固体支持体の間の酸不安定結合を使用するのが好ましい。例えば、酸不安定エーテル樹脂は、上掲のＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇの１６ページに記載されるような塩基不安定Ｆｍｏｃアミノ酸ペプチド合成に効果的である。あるいは、ペプチドアンカー結合及び差別的にアシドリシスに移行するα保護基が使用できる。例えば、フェニルアセトアミドメチル（Ｐａｍ）樹脂のようなアミノメチル樹脂は、上掲のＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇの１１−１２ページに記載されるようにＢｏｃ−アミノ酸ペプチド合成に関連してうまく働く。
【００６４】
開始アミノ酸が不活性固体支持体に連結した後、開始アミノ酸のαアミノ酸保護基を例えば塩化メチレンのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で除去し、例えばトリエチルアミン（ＴＥＡ）で中和する。開始アミノ酸のαアミノ基の脱保護に続いて、合成における次のα−アミノ−及び側鎖保護したアミノ酸を添加する。次に残りのα−アミノ酸、必要ならば側鎖保護されたアミノ酸を縮合により所定の順序で続けて結合させ、個体支持体に結合した中間体化合物を得る。あるいは、ペプチド断片を伸長している固相ペプチド鎖に付加する前に、幾つかのアミ酸を互いに結合させて所望のペプチド断片を形成してもよい。
２つのアミノ酸、又はアミノ酸とペプチド、又はペプチドとペプチドの間の縮合反応は、通常の縮合方法、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）又はＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）法、活性エステル法、ｐ−ニトロフェニルエステル法、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス［ジメチルアミノ］ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法など、及びウッドワード試薬Ｋ法等に従って実施される。
【００６５】
ペプチドの化学合成に共通なのは、アミノ酸の任意の反応性側鎖基を適切な保護基で保護することである。最終的には、これらの保護基は、所望のポリペプチド鎖が連続的に組み立てられた後に除去される。さらに共通なのは、アミノ酸又はペプチド断片上のαアミノ基を保護するが、それがアミノ酸又はペプチド断片のＣ末端カルボキシル基で成長固体支持体ポリペプチド鎖の遊離Ｎ末端のアミノ酸と反応し、続いてαアミノ酸基を選択的に除去し、次のアミノ酸又はペプチド断片を固体ペプチド鎖に付加させる。従って、ペプチド合成において一般的には、中間体化合物が生成され、それはペプチド鎖の所望の配列に局在化した各アミノ酸残基を含み、その個々の残基は側鎖保護基を有することである。これらの保護基は、実質的に同時に除去され、固相から取り外した後に所望のポリペプチド生成物が生成される。
α−及びε−アミノ酸側鎖基を、ベンジルオキシカルボニル（省略して、Ｚ）、イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル［Ｚ（２Ｃｌ）］、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＮＯ２）］、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＯＭｅ）］、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボロニルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピル−オキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスルホンエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチオイル（Ｐｐｔ）、及びジメチロホスフィノチオイル（Ｍｐｔ）基などで保護できる。
【００６６】
カルボキシ官能基の保護基としては、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４−ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、ｔ−ブチルエステル（ＯｔＢｕ）、４−ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）等が例示される。アミノ及びカルボキシル基以外の官能基を有するアルギニン、システイン、及びセリンなどの特定のアミノ酸は、適当な保護基で保護するのが望ましいことが多い。例えば、アルギニンのグアニジノ基は、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル、４−メトキシ−２，６−ジメチルベンゼンスルホニル（Ｎｄｓ）、１，３，５−トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｓ）等で保護される。システインのチオール基は、ｐ−メトキシベンジル、トリチルなどで保護されうる。
前記されるような多くの阻害アミノ酸は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（サンディエゴ，ＣＡ）、Ｂａｃｈｅｍ ＣＡ（Ｔｅｒｒｅｎｃｅ， ＣＡ）又はＰｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｓ（ベルモント，ＣＡ）のように商業的に入手できる。
上掲のＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇは、ペプチド調製のための方法に関して詳細な情報を提供する。αアミノ基の保護は１４−１８ページに記載され、側鎖ブロックは１８−２８ページに記載されている。アミン、ヒドロキシル及びスルフヒドリル官能基の保護基の表が１４９−１５１ページに提供されている。
所望のアミノ酸配列が完成した後、ペプチドは固体支持体から離され、回収され、精製されうる。ペプチドは、ペプチド固相結合を崩壊することのできる試薬により固体支持体から取り除かれ、場合によっては、ペプチドの阻害側鎖官能基を脱保護する。一実施態様では、ペプチドは、液体フッ化水素酸（ＨＦ）を有するアシドリシスにより固相から取り外すが、残っている側鎖保護基も取り除く。好ましくは、ポリペプチド中の残基のアルキル化（例えば、メチオニン、システイン、及びチロシン残基のアルキル化）を回避するために、アシドリシス反応混合物はチオ−クレゾール及びクレゾール捕捉剤を含む。ＦＨ離脱の後、樹脂はエーテルで洗浄され、遊離ペプチドは酢酸溶液の連続洗浄で固相から抽出される。混合した洗浄液は凍結乾燥され、ペプチドが精製される。
【００６７】
ａ．ジスルフィド結合ペプチド
前記したように、本発明のいくつかの実施態様では、システイン基の間のジスルフィド結合の形成により環化されうる。このようなペプチドは前記したような化学合成により作成され、次いでジスルフィド結合の形成に使用される任意の簡単な方法により環化される。例えば、ペプチドは、還元した形態のメルカプト基を有する固相合成物から回収され、薄い溶液に溶解されうるが、分子内システイン濃度は、分子内ジスルフィド結合形態を最適化するための分子内システイン濃度を上回り、例えば２５ｍＭから１μＭ、好ましくは５００μＭから１μＭ、より好ましくは２５μＭから１μＭのペプチド濃度であり、次いで分子内ジスルフィド結合を生成するのに十分な弱酸化剤、例えば金属陽イオン、フェリシアン化カリウム、テトラチオン酸ナトリウム等のような触媒を有する又は有しない分子酸素に遊離メルカプト基をさらすことにより酸化される。あるいは、ペプチドはＰｅｌｔｏｎら， （１９８６） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ２９：２３７０−２３７５に記載されるようにして環化することができる。
【００６８】
環化は、例えば第１のＣｙｓと第２のＣｙｓの間のジスルフィド結合又はラクタム結合の形成により行われる。ジスルフィド結合を形成することのできる残基は例えばＣｙｓ、Ｐｅｎ、Ｍｐｒ、及びＭｐｐ及びその２−アミノ基含有等価物を含む。ラクタムブリッジを形成することのできる残基は、例えばＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、αβ−ジアミノブチル酸、ジアミノ酢酸、アミノ安息香酸、及びメルカプト安息香酸を含む。ここでの化合物は、例えばＣｙｓのＮ末端アミノ基又は他のアミノ酸に対して共有結合を形成する隣接していない残基の側鎖基を利用しうるラクタム結合により環化することができる。あるいは、ブリッジ構築はまた、本発明の化合物を環化するのに使用することができ、例えばペプチド及びペプチド類似物を含み、Ｓ−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２、ラクタムエステル又は他の結合により環化できる。
ジスルフィド結合により連結された本発明のペプチドの特定の例は、ＩｇＥ０８８（配列番号：１３２）（平行な様態で連結したＩｇＥ０３７）及びＩｇＥ０８９（逆平行な様態で連結したＩｇＥ０３７）を含む。しかしながら、ジスルフィド結合はまた、単量体形態の形成の際に又は後に自然におこる。
【００６９】
２．組み換え合成
ａ．本発明のペプチドをコードする核酸の作成
更なる実施態様では、本発明は、単離された核酸、好ましくはここに記載のペプチドをコードする単離された核酸、好ましくはＤＮＡを含む物質の組成物を包含する。本発明のペプチドをコードするＤＮＡは、当該分野で知られている様々な方法によって調製することができる。これらの方法は、限定されるものではないが、出典明示により開示の全体がここに取り込まれるＥｎｇｅｌｓら．， （１９８９）， Ａｇｎｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．， ２８：７１６−７３４に記載された任意の方法、例えばトリエステル、亜リン酸、ホスホラミダイト及びＨ−ホスホネート法による化学合成を含む。一実施態様では、発現宿主細胞により好まれるコドンはコード化ＤＮＡの設計に使用される。あるいは、ペプチドをコードしているＤＮＡを、組換えＤＮＡ法、例えば部位特異的突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌら．， （１９９１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２０４：１２５−１３９； Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．ら．， （１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：４３３１； Ｚｏｌｌｅｒ Ｍ．Ｊ．ら．， （１９８２） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：６４８７）、カセット突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓら．， （１９８５） Ｇｅｎｅ ３４：３１５）、制限選択突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ， Ｊ．Ａ．， ら．， （１９８６） Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ， Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７， ４１５）等々を使用して一又は複数の変異体をコードするように変更させることができる。
【００７０】
ｂ．複製可能なベクターの選択及び使用
本発明のペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、１つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
本発明のペプチドをコードする核酸の組み換え体発現は、通常このような核酸に作用可能に結合する発現コントロール配列、並びに例えばＤＮＡ分子を含むプラスミド等の発現ベクター、を必要とし、コントロール配列はベクターを用いて形質転換された宿主細胞により認識される。一般に、プラスミドベクターは、宿主細胞と適合する種に由来する複製及びコントロール配列を含む。通常、ベクターは複製部位、並びに形質転換細胞の表現型選択を可能にするタンパク質をコードする配列を有する。
【００７１】
本発明のペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるペプチドをコードするＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダアルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日発行のＥＰ３６２１７９）、又は１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
場合によっては宿主細胞によって培地中への発現産物の分泌を生じさせるように作用可能に結合されていてもよい更なる分泌配列の例には、ｓｔＩＩ、エコチン（ｅｃｏｔｉｎ）、ｌａｍＢ、ヘルペスＧＤ、ｌｐｐ、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、及びアルファ因子が含まれる。また、ここでの使用に適しているのはプロテインＡの３６アミノ酸リーダー配列である（Ａｂｒａｈｍｓｅｎら．，   （１９８５） ＥＭＢＯ Ｊ．， ４：３９０１）。
【００７２】
発現及びクローニングベクターは共に１つ又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシリに対する遺伝子コードＤ−アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように本発明ペプチドをコードする核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂらにより Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６ （１９８０）に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である。Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ等， Ｇｅｎｅ， ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ等， Ｇｅｎｅ， １０：１５７（１９８０）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４−１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ８５：１２ （１９７７）。
【００７３】
発現及びクローニングベクターは、通常、本発明のペプチドをコードする核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系；Ｃｈａｎｇ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２７５：６１５ （１９７８）； Ｇｏｅｄｄｅｌ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：５４４ （１９７９）；アルカリフォスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ８：４０５７ （１９８０）； ＥＰ ３６，７７６、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター、ｄｅＢｏｅｒ 等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０：２１−２５ （１９８３）を含む。細菌系で使用するプロモータもまた本発明のペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ、Ｈｉｔｚｅｍａｎ 等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５５：２０７３ （１９８０）又は他の糖分解酵素、Ｈｅｓｓ 等， Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．， ７：１４９ （１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １７：４９００（１９７８）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【００７４】
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはＥＰ７３，６５７にさらに記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの発現は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ２，２１１，５０４）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による本発明で使用可能なポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、本発明のペプチドのコード配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【００７５】
また真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
原核生物宿主中での発現に関しては、好適なベクターにはｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ第３７，０１７）、ｐｈＧＨ１０７（ＡＴＣＣ第４０，０１１）、ｐＢＯ４７５、ｐＳ０１３２、ｐＲＩＴ５、ｐＲＩＴ２０又はｐＲＩＴ３０シリーズの任意のベクター（Ｎｉｌｓｓｏｎ及びＡｂｒａｈｍｓｅｎ （１９９０）， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８５：１４４−１６１）、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＫＫ２３３−２、ｐＤＲ５４０及びｐＰＬ−ラムダが含まれる。本発明の発現ベクターを含む原核生物宿主細胞には、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ第３１４４６）、大腸菌株ＪＭ１０１（Ｍｅｓｓｉｎｇら．，   （１９８１） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， ９：３０９）、大腸菌株Ｂ、大腸菌株１７７６（ＡＴＣＣ第３１５３７）、大腸菌ｃ６００（Ａｐｐｌｅｙａｒｄ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ３９：４４０（１９５４））、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−、ガンマ−、原栄養菌株、ＡＴＣＣ第２７３２５）、大腸菌株２７Ｃ７（Ｗ３１１０、ｔｏｎＡ、ｐｈｏＡ、Ｅ１５、（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９、ｐｔｒ３、ｄｅｇＰ４１、ｏｍｐＴ、ｋａｎｒ）（米国特許第５，２８８，９３１号、ＡＴＣＣ第５５，２４４）、バチルス・サブチルス、サルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセッセンス、及びシュードモナス種が含まれる。
酵母宿主細胞、例えば一般的なパン酵母又は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の発現について、適したベクターには２ミクロンのプラスミドを有するエピソーム的な複製ベクター、組み込みベクター、及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターを含む。また、発現に適した宿主は多細胞生物からも誘導される。
【００７６】
昆虫宿主細胞、例えばＳｆ９又はハイファイブ（ｈｉ−ｆｉｖｅ）細胞での発現について、適したベクターにはバキュロウィルスベクターを含む。植物宿主細胞、特に双子葉植物宿主、例えばタバコでの発現について、適した発現ベクターにはアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドに由来するベクターを含む。
他の好ましいベクターは、標準的な技術を用いて上記されるベクターの関連する形質を組み合わせることにより構築することができる。関連する形質には、プロモーター、リボソーム結合部位、関心のある又は遺伝子融合の遺伝子（タンパク質ＡのＺドメイン並びに関心のある及びリンカーの遺伝子）、抗生物質耐性マーカー、及び適切な複製開始点を含む。
組換え脊椎動物細胞培養での本発明のポリペプチドの合成に適応化するのに適切な更なる他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２９３：６２０−６２５ （１９８１）； Ｍａｎｔｅｉ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：４０−４６ （１９７９）；ＥＰ１１７，０６０；及びＥＰ１１７，０５８に記載されている。
【００７７】
ｃ．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、上記の発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編 （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９９１）及びＳａｍｂｒｏｏｋ等， 上掲に見出すことができる。
形質移入は、コーディング配列が実際に発現されようとされまいと、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。数多くの形質移入の方法が当業者に知られており、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションである。このベクターの作用の任意の兆しが宿主細胞内で生じた場合に一般に成功した形質移入が認められる。
形質転換は、染色体外のエレメントとしてであろうと染色体構成成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （２版）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ （１９８９）のセクション１．８２に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Ｓｈａｗら， （１９８３） Ｇｅｎｅ， ２３：３１５及び１９８９年６月２９日公開の国際公開第８９／０５８５９に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。そのような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋらのセクション１６．３０−１６．３７に記載されたリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物宿主系の形質転換の一般的な側面は１９８３年８月１６日に発行された米国特許第４３９９２１６号にＡｘｅｌによって記載されている。酵母菌への形質転換は典型的には、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎら， （１９７７） Ｊ． Ｂａｃｔ．，１３０：９４６及びＨｓｉａｏら， （１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）， ７６：３８２９の方法に従って実施される。しかし、核注入、エレクトロポレーション、あるいは原形質融合のような他の細胞にＤＮＡを導入する方法を使用することもできる。
【００７８】
用いられる宿主細胞のタイプに応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いてトランスフェクション又は形質転換の間の選択がなされる。前掲のＳａｍｂｒｏｏｋら，に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Ｓｈａｗ等， Ｇｅｎｅ， ２３：３１５（１９８３）及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６−４５７ （１９７８）のリン酸カルシウム沈降法が用いられうる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ等， Ｊ． Ｂａｃｔ．， １３０：９４６ （１９７７）及びＨｓｉａｏ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６：３８２９ （１９７９）の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８５：５２７−５３７ （１９９０）及び Ｍａｎｓｏｕｒ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３６：３４８−３５２ （１９８８）を参照のこと。
【００７９】
ＤＮＡを発現するのに適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、又は高等真核細胞が含まれる。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、エンテロバクター、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ） 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルススブチルス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルスリチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６，７１０に記載されたバチルスリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｒｔ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｌｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行  米国特許第４，９４６，８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００８０】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、本発明のペプチドをコードする核酸を含むベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・プロンブ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｒｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ及びＮｕｒｓｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ２９０： １４０ （１９８１）； １９８５年５月２日発行のＥＰ１３９，３８３）；クルベロミセス宿主（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｈｏｓｔｓ）（米国特許第４，９４３，５２９号； Ｆｌｅｅｒ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９： ９６８−９７５ （１９９１））、例えばクルベロミセスラクチス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ， ＣＢＳ６８３， ＣＢＳ４５７４； Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ等， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４（２）： ７３７ （１９８３））、クルベロミセス・フラギリス（Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、クルベロミセスブルガリクス（Ｋ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、クルベロミセスウィケラミイ（Ｋ． ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、クルベロミセスワルチイ（Ｋ． ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、クルベロミセスドロソフィラルム（Ｋ． ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６； Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８： １３５ （１９９０））、クルベロミセス・テモトレランス（Ｋ． ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びクルベロミセス・マルキシアナス（Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ  ４０２，２２６）；ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ  １８３，０７０； Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ等， Ｊ． Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２８： ２６５−２７８ （１９８８））；カンジダ；トリコデルマレーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ  ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｃａｓｅ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６： ５２５９−５２６３ （１９７９））；シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（１９９０年１０月３１日発行のＥＰ３９４，５３８）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（１９９１年１月１０日発行のＷＯ９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルスニダランス（Ｂａｌｌａｎｃｅ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １１２： ２８４−２８９ （１９８３）； Ｔｉｌｂｕｒｎ等， Ｇｅｎｅ， ２６： ２０５−２２１ （１９８３）； Ｙｅｌｔｏｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： １４７０−１４７４ （１９８４））及びアスペルギルスニガー（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ， ＥＭＢＯ Ｊ．， ４： ４７５−４７９ （１９８５））が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック（Ｃ１化合物資化性、Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、及びロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、Ｃ． Ａｎｔｈｏｎｙ， Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ， ２６９ （１９８２）に記載されている。
原核生物に加えて、糸状菌、酵母、多細胞生物に由来する細胞が宿主細胞として使用できる。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。
【００８１】
有用な哺乳動物宿主細胞の例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 （ＣＯＳ−７， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ等 （１９９７）， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．， ３６：５９）；ハムスター乳児腎細胞（ＢＨＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ， Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ （１９８０）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４， Ｍａｔｈｅｒ （１９８０）， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ２３：２４３−２５１）；サルの腎細胞 （ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ−７６， ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞 （ＨＥＬＡ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）； イヌ腎細胞 （ＭＤＣＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞 （ＢＲＬ ３Ａ， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞 （Ｗ１３８， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞 （Ｈｅｐ Ｇ２， ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２， ＡＴＴＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍｏｔｈｅｒ等 （１９８２）， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３：４４−６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）が含まれる。
哺乳動物宿主細胞における発現に関しては、適切なベクターには、ＳＶ４０由来のベクター、サイトメガロウイルス由来のベクター、例えばｐＲＫ５及びｐＲＫ７を含むｐＲＫベクター（Ｓｕｖａ等 （１９８７）， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３７：８９３−８９６； ＥＰ３０７，２４７（３／１５／８９）、ＥＰ２７８，７７６（８／１７／８８））、ワクシニアウイルス又は他のポックスウイルス由来のベクター、及びモロニーのマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）由来のベクターのようなレトロウイルスベクターが含まれる。
【００８２】
ｄ．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法、Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５ （１９８０）、ドットブロット法（ＤＮＡ又はＲＮＡ分析）、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、本発明のペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又は本発明のペプチドをコードするＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００８３】
ｅ．精製
本発明で使用可能なポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液（例えばトリトン（登録商標）−Ｘ１００）又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。本発明で使用可能なポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。組み換え生産された本発明のペプチドを精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及び本発明のペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８２）に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び生産される特定のペプチドの性質に依存する。
【００８４】
上記の発現及び生成方法の変形例は、ベクターにおいて、所望のペプチドをコードする遺伝子が他のタンパク質又は他のタンパク質の断片をコードする遺伝子に結合している遺伝子融合体の使用を考える。これは、所望のペプチドが他のタンパク質又はペプチドとの融合体として宿主細胞によって産生される結果となる。「他の」タンパク質又はペプチドはしばしば細胞によって分泌されうるタンパク質又はペプチドであり、培地から所望のペプチドを単離し精製することを可能にし、所望のペプチドが細胞内に残る場合に生じる宿主細胞を破壊する必要性を排除する。あるいは、融合タンパク質は細胞内に発現されうる。高度に発現される融合タンパク質を使用するのが有用である。
遺伝子融合体の使用は、必須ではないが、昆虫細胞における異種性ペプチドの発現並びにその遺伝子産物の続く精製を容易にしうる。プロテインＡの結合、又はより詳細にはプロテインＡのＩｇＧへの結合が融合タンパク質の精製のための「アフィニティーハンドル」を提供するので、ＺドメインプロテインＡ融合体がしばしば使用される。例えば、所望のペプチドリガンドをコードするＤＮＡ配列を、Ｚドメインとして知られているプロテインＡのコンセンサスドメインの遺伝子と部位特異的突然変異誘発によって融合させることができる（Ｎｉｌｓｓｏｎら， （１９８７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １：１０７−１１３）。発現及び分泌後に、融合タンパク質を酵素的に切断して、酵素混合物から精製できる遊離のペプチドを生じさせることができる（例えばＶａｒａｄａｒａｊａｎら， （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：５６８１−５６８４； Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｓｅｒｒａら， （１９９６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７８：１７１−１７６； Ｎｉｌｓｓｏｎら， （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４８：２４１−２５０を参照されたい）。
【００８５】
融合タンパク質は、薬品、例えばメチオニンで切断する臭化シアノゲン、又はＡｓｎ及びＧｌｙ残基の間で切断するヒドロキシルアミンを使用して切断できる。標準的な組換体ＤＮＡ法を使用して、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基対を所望のペプチドをコードする遺伝子の５’末端の直ぐ前に挿入してもよい。
あるいは、融合タンパク質のタンパク分解的切断を用いることができる。Ｃａｒｔｅｒ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ， Ｌａｄｉｓｃｈら編， （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．４２７， １９９０）， Ｃｈ １３， ｐ１８１−１９３。
プロテアーゼ、例えばＸａ因子、トロンビン、及びサブチリシン又はその変異体、及び多くの他のものが融合タンパク質を切断するために首尾良く使用された。約３０未満のアミノ酸のペプチドリガンドの生産に対して本発明において好適なものは、Ａｒｇ及びＬｙｓ残基に高度に特異的なプロテアーゼトリプシンである。トリプシン切断は一般にＮｉｌｓｓｏｎら， （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ４８：２４１及びＳｍｉｔｈら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３２：２８９にいて検討されている。典型的には、使用されるプロテアーゼによる切断に受け入れられるペプチドリンカーは「他の」タンパク質（例えば、プロテインＡのＺドメイン）と所望のペプチドの間に挿入される。組換体ＤＮＡ法を使用して、リンカーをコードするヌクレオチド塩基対を他のタンパク質をコードする遺伝子又は遺伝子断片の間に挿入する。ついで、正しいリンカーを含む部分的に精製された融合タンパク質のタンパク分解的切断は天然融合タンパク質又は還元されもしくは変性された融合タンパク質の何れかで実施できる。
【００８６】
ペプチドは融合タンパク質として発現されるときに正しく折り畳まれても折り畳まれなくてもよい。また、切断部位を含む特異的ペプチドリンカーはプロテアーゼに接近可能でも可能でなくてもよい。これらの因子は、融合タンパク質が変性され、再び折り畳まれなければならないかを、そして、しかりであれば、これらの手順が切断の前又は後の何れに使用されるかを決定する。
変性と再折り畳みが必要な場合、典型的にはペプチドはグアニジンＨＣｌのようなカオトロープで処理し、ついで、例えば還元され酸化されたジチオスレイトール又はグルタチオンを適切な比、ｐＨ、及び温度で含むレドックスバッファーで、ペプチドがその天然構造まで再折り畳みされるように処理する。
この明細書において言及される宿主細胞はインビトロ培養中の細胞並びに宿主動物内である細胞を包含する。
本発明の環化実施態様では、組換え的に産生されたペプチドは上述したような細胞内ジスルフィド結合の形成により環化できる。
【００８７】
Ｆ．研究及び診断用組成物
好ましい実施態様では、本発明のペプチドは、固体支持体などの高分子に非共有吸着するか又は共有結合する。一般に、固体支持体はポリマーゲルなどの不活性マトリクスであり、三次元構造と材料の格子又はネットワークを有する。合成又は天然の殆ど全ての高分子が、二官能性試薬で架橋されたとき、適切な液体中でゲルを形成する。好ましくは、選択される高分子は、アフィニティクロマトグラフィでの使用に便利なものである。アフィニティクロマトグラフィに使用される殆どのクロマトグラフマトリクスはキセロゲルである。このようなゲルは乾燥時に収縮してゲルマトリクスのみを含むコンパクトな固体となる。乾燥キセロゲルが液体に再懸濁されると、ゲルマトリクスは液体を吸収し、膨潤し、ゲル状態に戻る。ここで使用するのに適したキセロゲルは、セルロース、架橋デキストラン（例えばセファロース）、アガロース、架橋アガロース、ポリアクリルアミドゲル、及びポリアクリルアミド−アガロースゲルなどのポリマーゲルを含む。
あるいは、エアロゲルもアフィニティクロマトグラフィに使用できる。これらのゲルは乾燥時に収縮しないが、周囲の空気の透過のみを可能にする。乾燥ゲルが液体に曝露されると、後者はゲル中の空気を置換させる。個々での使用に適したエアロゲルは、多孔性ガラス及びセラミックゲルである。
またここに包含されるのは、誘導体部分がペプチドリガンドのゲルマトリクスへの結合を促進し、アフィニティクロマトグラフィにおけるペプチド−リガンド相互作用の立体的隠蔽を回避する誘導化ゲルに結合した本発明のペプチドである。あるいは、類似の利点のために、ゲルマトリクスとペプチドリガンドとの間にスぺーサーアームを挿入することもできる。
他の実施態様では、本発明は、選択された又は意図されたポリペプチドがそのＮ末端又はそのＣ末端、又は両末端において本発明のペプチドの１又は複数へ融合したタンパク質を提供する。
【００８８】
Ｇ．製薬組成物及び用量
本発明のペプチドを製薬組成物の形態で、ＩｇＥ媒介疾患の治療のために投与することができる。さらにリポフェクション又はリポソームを送達媒体として使用することができる。
治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ活性成分を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． ［１９８０］）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）又はトゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（商品名）、プルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００８９】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなくてはならない。製剤は、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により無菌にすることができる。ここでの治療的組成物は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバイアルに入れられる。
また、ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的仮性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
投与経路は周知の一般に認められた方法に従い、例えば、静脈内、腹膜内、皮下、筋肉内、動脈内、病巣内又は関節内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放性又は持続放出の手段による。
本発明の製薬組成物の用量及び所望の薬剤濃度は、想定される特定の使用によって変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の技術者の技量の範囲内であろう。動物実験は、ヒトの治療に有効な用量を決定するための信頼性のある指針を提供する。有効な用量の種間スケーリングは、例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ Ｊ．及びＣｈａｐｐｅｌｌ． Ｗ．「Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」，Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｙａｃｏｂｉら編， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９， ４２−４６に開示されているような原理に従い実施することができる。
【００９０】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． （１９８０）に開示されている。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメート、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商品名）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−（Ｄ）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。徐放のための組み換えタンパク質のマイクロカプセル化はヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−（ｒｈＩＦＮ−）、インターロイキン２、及びＭＮｒｐｇ１２０で成功裏に実施されている。Ｊｏｈｎｓｏｎ等， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２： ７９５−７９９ （１９９６）； Ｙａｓｕｄａ等， Ｂｉｏｍｅｄ． Ｔｈｅｒ． ２７： １２２１−１２２３ （１９９３）； Ｈｏｒａ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ７５５−７５８ （１９９０）； Ｃｌｅｌａｎｄ， 「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，」ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ： Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ， 編， （Ｐｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ： ニューヨーク， １９９５）， ｐｐ． ４３９−４６２； ＷＯ９７／０３６９２，ＷＯ９６／４００７２，ＷＯ９６／０７３９９；及び米国特許第５，６５４，０１０号。
【００９１】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ−乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Ｌｅｗｉｓ， 「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ ｐｏｌｙｍｅｒ」： Ｍ． Ｃｈａｓｉｎ及び Ｒ． Ｌａｎｇｅｒ （編）， Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９０）， ｐｐ． １−４１。
エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリックス組成物の開発によって達成されうる。
【００９２】
本発明のペプチドのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号参照。異なる処方が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、及び特定の器官又は組織を意図する投与は、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要でありうることは本発明の範囲内である。さらに、一又は複数の別々の投与によって、又は連続注入によって用量を投与しうる。何日にも渡る又はそれより長期に渡る繰り返し投与について、疾患の症状の所望される抑制があるまで治療が続けられる。この療法の進行は、常套的な技術及びアッセイで容易に監視される。
【００９３】
Ｈ．肺経由送達
本発明の投与の特定の態様はエアロゾル又は吸入形態である。本発明の化合物は、分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｏｒ ｄｉｓｐｅｒｓａｎｔ）と組み合わせて、乾燥粉末として又は希釈液を用いた溶液又は懸濁液としてエアロゾル形態で投与することができる。分散剤は製薬的に許容できることが好ましい。ここで使用される用語「分散剤」は、化合物のエアロゾル化又はタンパク質の肺組織での吸収、あるいは両方を促進する薬剤を意味する。ここで使用される用語「製薬的に許容される」は、一般に、連邦又は州政府の監督官庁に認められ、動物、特にヒトでの使用のために米国薬局方又は他の一般に認められた薬局方に記載されたことを意味する。好ましい分散剤はこの分野で良く知られ、限定されないが、界面活性剤などを含む。例えば、液体エアロゾルを形成する溶液の噴霧によって生ずる、化合物、特にペプチド化合物の表面誘発性の凝固を抑制するためにこの分野で一般に使用される界面活性剤を使用できる。このような界面活性剤の非限定的な例は、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含む。使用される界面活性剤の量は変化するが、一般には製剤の０．００１〜４重量％の範囲である。特定の態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート又はソルビタントリオレエートである。好ましい界面活性剤はこの分野で知られており、特定の製剤、化合物の濃度、希釈剤（液体製剤における）又は粉末の形態（乾燥粉末製剤における）等に応じて、意図する特性に基づいて選択される。
【００９４】
さらに、化合物の選択、意図する治療効果、肺組織の質（例えば疾患又は健常な肺）、及び多くの他の要因に応じて、液体又は乾燥製剤は以下にさらに述べるような付加的成分を含有してもよい。
液体エアロゾル製剤は、一般に、生理学的に許容される希釈剤中に、化合物及び分散剤を含有する。本発明の乾燥粉末エアロゾル製剤は、微細に分割した固体形態の化合物及び分散剤からなる。液体又は乾燥粉末エアロゾルのいずれかで、製剤はエアロゾル化される。即ち、エアロゾル化された投薬が実際に肺胞に到達することを確実にするために、液体又は固体粒子まで分解する必要がある。一般に、マス媒体の動力学的半径は、薬物粒子の肺胞への到達を確実にするために５マイクロメートル未満とされる（Ｗｅａｒｌｅｙ， Ｌ．Ｌ．， １９９１， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． ｉｎ Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ８： ３３３）。ここで用語「エアロゾル粒子」は、肺性投与、即ち肺胞に到達するのに適した、液体又は固体粒子を記載するのに使用される。輸送装置の構成といった他の考慮では、製剤中の付加的な成分及び粒子の特性が重要である。この態様の薬剤の肺性投与は当業者に良く知られており、製剤の操作、エアロゾル化手段及び輸送装置の構成は、当業者に日常的な実験を要求するだけである。
輸送装置の構成に関して、エアロゾル化のあらゆる形態がこの分野で知られており、限定されないが、液体製剤の噴霧、微粒化又はポンプエアロゾル化、及び乾燥粉末製剤のエアロゾル化を含み、本発明の実施に使用できる。固体製剤の投与に特に設計された輸送装置が考慮される。しばしば、液体又は乾燥粉末のエアロゾル化は推進剤を必要とする。推進剤はこの分野で一般に使用される任意の推進剤でよい。これらの有用な推進剤の特定の非限定的な例は、クロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、又はトリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン又はこれらの混合物を含む炭化水素である。
【００９５】
本発明の好ましい態様では、エアロゾル化のための装置は、計量用量吸入器である。計量用量吸入器は、投与したときに投与に応じて変化する用量ではなく特定の用量を与える。このような計量用量吸入器は、液体又は乾燥粉末エアロゾル製剤の何れにも使用できる。計量用量吸入器はこの分野で良く知られている。
化合物がひとたび肺に到達すると、多くの用量依存的因子が薬剤吸収に影響する。化合物の循環レベルを要求する疾患又は障害の治療において、エアロゾル粒子サイズ、エアロゾル粒子形状、感染、肺疾患又は塞栓の有無などの因子が化合物の吸収に影響しうることは理解されるであろう。ここに記載した各製剤について、ある種の滑剤、吸収促進剤、タンパク質安定化剤又は懸濁剤が適当であることもある。これらの付加的な薬剤の選択は、目的に応じて変化する。化合物の局部的輸送が望まれ意図されている場合、吸収促進などの変化はあまり重要ではなくなることは理解されるであろう。
【００９６】
１．液体エアロゾル製剤
本発明の液体エアロゾル製剤は、典型的には噴霧器で使用される。噴霧器は、圧縮空気又は超音波のいずれでもよい。この分野で知られた噴霧器が、本発明と組み合わせて使用でき、限定されないが：Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ， Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ， Ｉｎｃ． （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）； Ａｃｏｒｎ ＩＩ 噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ ＣＯ）である。本発明と組み合わせて有用な他の噴霧器は、１９８６年１１月２５日に発行された米国特許第４，６２４，２５１号、１９７２年１１月２１日に発行された米国特許第３，７０３，１７３号、１９７１年２月９日に発行された米国特許第３，５６１，４４４号及び１９７１年１月１３日に発行された米国特許第４，６３５，６２７号に記載されている。
製剤は担体を含んでもよい。担体は、循環系に可溶で生理学的に許容される高分子であり、生理学的な許容とは、当業者が前記担体を治療計画の一部として患者に注入することを許容することを意味する。担体は、好ましくは循環系において比較的安定であり、クリアランスのための許容される血漿半減期を持つ。このような高分子は、限定されないが、ダイズレシチン、オレイン酸及びソルビタントリオレエートを含み、ソルビタントリオレエートが好ましい。
この実施態様の製剤は、タンパク質安定化又は浸透圧の調製のための他の薬剤を含んでもよい。この薬剤の例は、限定されないが、塩化ナトリウム、又は塩化カリウムなどの塩、及びグルコース、ガラクトース又はマンノースなどの炭水化物等を含む。
【００９７】
２．エアロゾル乾燥粉末製剤
また、この製薬製剤は、微細に分割した形態の化合物及び分散剤を含む乾燥粉末吸入製剤として使用することも考慮する。化合物の形態は一般に、凍結乾燥された粉末である。ペプチド化合物の凍結乾燥された形態は、標準的な技術を通して得られる。
他の実施態様では、乾燥粉末製剤は、本発明の化合物の１又は複数を含む微細に分割された乾燥粉末、分散剤及びバルク剤も含有する。本発明の製剤と組み合わせて有用なバルク剤は、装置からの粉末の分散を促進する量のラクトース、ソルビトール、スクロース、又はマンニトールなどの薬剤を含む。
【００９８】
Ｉ．治療方法
１．ＩｇＥ媒介疾患
アレルギーは、環境抗原に対する免疫反応が組織炎症及び臓器機能障害を引き起こす、特定の疾患を意味する。アレルゲンはアレルギーを引き起こす抗原である。このように、その抗原分子又はその原因、例えば、花粉粒、動物のふけ、昆虫の毒、又は食品等でありうる。以下に説明されるのは、様々なＩｇＥ媒介疾患である。
アトピー性疾患：
アトピーとは、ＩｇＥ抗体の断続的生成によって、多くの一般的な天然に生じる吸入又は摂取された抗原に対して免疫学的に応答する遺伝的な傾向を意味する。アレルギー性鼻炎及びアレルギー喘息は、環境抗原への暴露に続いて起こる臨床疾患の最も一般的な症状である。アトピー性皮膚炎はそれほど一般的ではない。アレルギー性胃腸症は更にまれであるが、一過性であり得る。２以上のこれらの臨床疾患が、同じ患者で同時に又は病気の進行の間の異なった時点で一緒に現れうる。アトピーは無症候性でもあり得る。また、ＩｇＥ抗体は、以下に更に述べられる非アトピー性アレルギー疾患アナフィラキシー及びじんま疹血管性浮腫を引き起こすこともありうる。
ＩｇＥ媒介性と考えられる他の障害は、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、寄生虫性炎症、過剰ＩｇＥ症候群、血管拡張性失調症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、胸腺リンパ形成不全症、ＩｇＥ骨髄腫及び移植片対宿主反応を含む。
【００９９】
肥満細胞も好塩基球も、ＩｇＥ（ＦｃεＲＩ）に対する高親和性ＩｇＥ細胞膜レセプターを有する。肥満細胞は呼吸器及び胃腸管の粘膜並びに皮膚に多く、そこにアトピー性反応が局在する。これらの細胞によって免疫学的に活性化される媒介物質の物理的影響は、アトピー性疾患の即時相及び遅延相の機能的及び病理的特性によるものである。ＩｇＥアレルギーの重要な媒介物質はヒスタミン、走化因子、プロスタグランジン、ロイコトリエン、及び血小板活性化因子である。
抗原抗体接触の部位は様々である。例えば、アレルギー性鼻結膜炎では、局部的な組織レベルで反応が生じる。アレルゲン粒子、例えば、花粉粒、カビの胞子、ホコリ又はペットの皮膚の薄片との接触後、即座に粘膜表面で可溶性アレルゲンタンパク質が吸収される。この位置で、粘膜肥満細胞のアレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体がアレルゲンと反応し、即時性の媒介物質放出と臨床的な症状を引き起こす。喘息では、気管支の反応が下気道に達することが可能なほど小さい粒子の吸入により引き起こされるのか、あるいは喘息が循環器を通して気管支の粘膜に到達する可溶性アレルゲンによって起こるのかはっきりしていない。アトピー性皮膚炎では、アレルゲン食物の摂取が皮膚の病変を突発させ、このような場合、アレルゲンへの暴露は循環器を介してなされるはずである。また、皮膚炎は、ハウスダストダニアレルギーの例では直接的な局所暴露により活性化されうる。
【０１００】
通常、アトピー患者は複数のアレルギーを有し；多くの環境アレルゲンに対するＩｇＥ抗体とそのアレルゲンからの症状を有する。全ての血清ＩｇＥレベルは、非アトピー性集団と比較するとアトピー性集団において高い平均値となるが、２者の間にかなりの重なりがあり、正常なＩｇＥレベルがアトピーの診断で除外できない。一般に、全ての血清ＩｇＥは、アレルギー喘息を有する患者においてアレルギー性鼻炎を有する者よりも高く、アトピー性皮膚炎を有する者においてさらに高い。上昇したレベルのＩｇＥに関連する疾患には、アレルギー性鼻炎、アレルギー喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、寄生虫性疾患、過剰ＩｇＥ症候群、血管拡張性失調症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、胸腺リンパ形成不全症、ＩｇＥ骨髄腫、移植片対宿主反応を含む。
アトピー性疾患の原因となるアレルゲンは、主に自然の空気中有機粒子、特に植物の花粉、カビの胞子並びに動物及び虫の組織片、並びに摂取した食物から誘発される。様々な花粉、カビ又は食物のような幾つかの環境アレルゲンの、種々のＩｇＥを感作する能力は、本質的に他のものより感受性が高くなっている。
典型的なアレルゲンの花粉は、虫媒花（ｉｎｓｅｃｔ−ｐｏｌｌｉｎａｔｅｄ ／ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌｏｕｓ）植物よりも風媒花（ｗｉｎｄ−ｐｏｌｌｉｎａｔｅｄ ／ ａｎｅｍｏｐｈｉｌｏｕｓ）植物によるものである。アレルゲン花粉粒はほとんどが直径１５−５０μｍの球状である。代表的な例には、ヒカゲノカズラ、シダ類、針葉樹（ｃｏｎｉｆｅｒｓ）、顕花植物、イネ科草本、スゲ、ヤシ、ガマ、針葉類（ｎｅｅｄｌｅｓ）、ブナ、アカザ、スイバ、ヤナギ、ポプラ、カエデ、アシュ、ブタクサ及びセージを含む。
【０１０１】
カビの増殖は温度と湿度に比例する。カビは、有性生殖的に又は無性生殖的に繁殖することができ、風媒性の胞子を産生し、ある種のものはアレルゲンとなる。カビの胞子はアトピー患者のアレルギーの重大な原因であるが、それらの形態学、生殖性及び生態学的性質の面からのカビの生物学的な複雑さ及び混乱した分類方法のために認識が薄い。通常のカビの空気中アレルゲンは、次のものを含む：担子菌類（例えば、黒穂菌属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）、霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）、アルタナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、エピコッカム（Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フォーマ（Ｐｈｏｍａ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ステフィリウム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ））、藻菌（例えば、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ））及び子嚢菌類（例えば、ユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ））。
また、ホコリ及びイエダニもアトピーの重大なアレルゲンである。５０，０００種を超えるダニの種類があるが、チリダニのヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）及びコナヒョウヒダニ（Ｄ． ｆａｒｉｎａｅ）が最も一般的である。これらの極小クモ類は、ほとんど肉眼で見ることができず、世界中のハウスダストサンプルから見つかるが、暖かく湿潤な気候でより多くなっている。それらは特に寝具、落屑したヒトの皮膚細胞が最もよく見つかる布張りの家具及び毛布に多い。ＩｇＥのレベル及びこれらのアレルゲンへの環境暴露は、吸入及び皮膚接触のそれぞれによって暴露が生じるためにアトピー性喘息及び皮膚炎と高い相関がある。
【０１０２】
他のアレルゲンダニには、ユーログリファス・マイネイ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ ｍａｙｎｅｉ）、サヤアシニクダニ（Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、アシブトコナダニ（Ａｃａｒｕｓ ｓｉｒｏ）を含み、それらは全て穀物にはびこるストレージマイトであり、穀物を扱う人の職業アレルギーを引き起こしうる。更にアトピーは家庭やレストラン、特にこれらは過密で衛生状態の悪い所に繁殖しうるゴキブリによっても引き起こされうる。呼吸器アレルギーの更なる特有の原因には、虫の季節的な群衆、例えばカゲロウ、トビケラ及び鱗翅目から発せられるもの又は残骸を含む。動物又はペット（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウス）もまた、フケ、唾液、尿及び糞によってアレルギーの原因となりうる。
食物のアレルギー成分は、アトピー性又は非アトピー性反応の何れかのＩｇＥ抗体反応を誘発しうる。食物に対するＩｇＥ抗体は、多くは食物を食べたときにあらゆる反応を引き起こさずにアトピー患者に存在する。無症候性の活性から症候性の活性に変わるように働く因子は、現在のところ分かっていない。あらゆる食物がアレルギーを引き起こす可能性を有し、ある種の食物は他のものよりもアレルゲンとなる可能性が高い。例えば、魚、甲殻類及び軟体類はアナフィラキシー及びアナフィラキシー様反応の重大な原因である。特定の食物のアレルゲン性は加熱又は調理法によって変わりうる。
【０１０３】
アナフィラキシー及びじんま疹
アトピー性疾患は、環境アレルゲンに対して共通してＩｇＥ抗体を生成する遺伝子的素質により特徴づけられるが、ＩｇＥは非遺伝子的アレルギー疾患であるアナフィラキシー及びじんま疹もまた引き起こしうる。全てのＩｇＥ媒介疾患の免疫学的病因は同じだが、アトピー性疾患と非アトピー性疾患の違いは、アレルゲン暴露の形式、病因に影響する遺伝的因子、診断方法、予後及び治療に関係している。
【０１０４】
アナフィラキシー：
アナフィラキシーは、幾つかの器官系、通常は心血管、呼吸器、皮膚及び消化管の同時関与のある急性全身アレルギー反応である。反応は免疫学的に関与し、対象が前もって感作されているところにアレルゲンに対して暴露することで生じる。アナフィラキシーショックは、意識消失と共に又はなしに低血圧となるアナフィラキシーを意味する。アナフィラキシー様反応は、アレルゲン−抗体のメカニズムなしにアナフィラキシーの症状及び徴候が生じる状態である。この場合には、アナフィラキシーの内因性媒介因子が非免疫的な機構を介してインビボで放出される。
アナフィラキシーの免疫学的病因は、ＩｇＥ及びアレルゲンへの暴露の両方を必要とする。アナフィラキシーはアレルゲン−ＩｇＥ肥満細胞媒介物質放出に起因して突発的、全身的に生じるものであり、様々な生命維持に重要な器官の機能において生命に関わる突発性の深刻な変化を生じる。血管虚脱、急性気道閉塞、皮膚血管拡張、浮腫並びに消化管及び尿生殖器筋痙攣がほとんど同時に生じる。
【０１０５】
アナフィラキシーショックにおいて、低血圧及びショックは、細動脈の全身性血管拡張及び後毛細血管細静脈を血漿が急速に浸出する増大した血管浸透性から生じる。血管内から血管外領域へのこの液体の移動は、皮膚及び様々な内臓の浮腫（血管性浮腫）、（特に内臓底部（ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃ ｂｅｄ）での）静脈血の貯蔵、血管濃縮、及び血液の粘度上昇と共に血液量不足のショックを生じる。低心拍排出量は、心臓への帰還を減少させ、不十分な冠動脈灌流を生じさせる。低末梢血管抵抗は、心筋低酸素症、リズム障害、及び二次性心臓ショックを引き起こしうる。冠動脈におけるヒスタミンＨ１レセプターの促進は冠動脈攣縮を引き起こしうる。患者の中にはアナフィラキシーの間にさらに狭心痛、場合によっては心筋梗塞を経験するものもある。長時間のショックの後、他の場所、特に腎臓や中枢神経系で臓器不全を残しうる。
患者の中には、気管支筋痙攣、気管支粘膜の浮腫及び好酸球性炎症、及び粘液の気道管腔への過分泌をアナフィラキシーと共に生じるものもあり、急性の喘息の発作と見分けが付かない。主な気管支収縮剤は、大きい近位の（ｐｒｏｘｉｍａｌ）気道に優先的に有効なヒスタミン、及び末梢気道に有効なロイコトリエンである。気道の閉塞は低酸素とのガス交換障害を引き起こし、さらにアナフィラキシーの血管への影響と重なって程度が増す。処置を行わず放置すると、急性肺性心及び呼吸不全が生じうる。また、ヒスタミンは消化管及び子宮平滑筋にも作用し、痛みを伴う痙攣を引き起こす。
【０１０６】
アナフィラキシーに関わるアレルゲンは、アトピーに一般的に関連するものとは異なる。それらは通常、食物、薬剤又は虫の刺傷で遭遇する。食物及び虫の毒は多くの可能性のあるアレルゲンの複合混合物であるので、これらアレルゲンの少数のみが化学的に同定されている。さらに、アレルギー性エピトープの同じアレルゲンが複数の食物、薬剤又は毒に天然に存在することがあり、交差反応を生じうる。アナフィラキシーを引き起こすことが知られている食物には、イセエビ、エビ、カニ、貝類、魚、落花生、エンドウマメ、マメ、甘草、ゴマ、綿実、キャラウェイ、カラシナ、アマニ、ヒマワリ、ナッツ、ベリー類、卵白（アルブミン）、ソバ及び牛乳を含む。
アナフィラキシーに関連する薬剤には、ホルモン（例えば、インスリン、副甲状腺ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、バソプレッシン、リラキシン）、酵素（例えば、トリプシン、キモトリプシン、キモパパイン、ペニシリナーゼ、アスパラギナーゼ）、ワクチン、トキソイド、アレルギー抽出物、多糖類（例えば、デキストラン、デキストラン鉄及びアカシア）及び種々のハプテン薬剤、例えばある種の抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、セファロスポリン、テトラサイクリン、アンホテリシンＢ、ニトロフラントイン）、診断用薬剤（例えば、スルホブロモフタレイン、デヒドロコール酸ナトリウム）、ビタミン（例えば、チアミン、葉酸）、及びバルビーツ酸塩、ジアゼパム、フェニトイン、プロタミン、アミノピリン、及びアセチルシステインを含む。
アナフィラキシーに関連する虫の毒には、ミツバチ（ｈｏｎｅｙｂｅｅ）（アピスメリフェラ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ））、スズメバチ（ｙｅｌｌｏｗ ｊａｋｅｔ）（ヴェスプラ（Ｖｅｓｐｕｌａ））、スズメバチ（ｈｏｒｎｅｔ）（ホオナガスズメバチ（Ｄｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａ））、スズメバチ（ｗａｓｐ）（アシナガバチ（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ））及びヒアリ（ｆｉｒｅ ａｎｔ）（ソレノプシス（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ））を含む。更なるアレルゲンには精液及びラテックスを含む。
【０１０７】
じんま疹及び血管性浮腫：
じんま疹（Ｕｒｔｉｃａｒｉａ）（じんま疹（ｈｉｖｅｓ）としても知られる）及び血管性浮腫（血管神経性浮腫としても知られる）は、皮膚（じんま疹）又は皮下組織（血管性浮腫）の血管拡張及び増大した血管浸透性により特徴づけられる１つの病気と考えることができる。それは、アナフィラキシの局所的な皮膚で起こる形式であり、全身性アナフィラキシーの症状の１つである。ＩｇＥは、全身性アナフィラキシーと同じようにじんま疹の症状を引き起こし、原因となるアレルゲンも非常に似ている。特有の（非アレルギー性）じんま疹−血管性浮腫は、アナフィラキシー様反応に類似する。アナフィラキシーに比べてじんま疹は、穏和な症状であり、より一般的である。
じんま疹及び血管性浮腫は、血管、たいていは後毛細管の増大した浸透性による局所的な皮膚又は皮下の浮腫の目に見える症状である。急性じんま疹及び浮腫はアレルギー性の原因を有しているようである。これらの場合、局部の肥満細胞に固定されたアレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体は、アレルゲンに遭遇した時に媒介物質の放出又は活性化を引き起こす。特有のじんま疹−血管性浮腫及び種々の物理的なじんま疹は、アレルゲン−抗体の病因を欠いている。皮膚の肥満細胞がこれらの状況で刺激される正確な機構は分かっていない。
【０１０８】
じんま疹は、強烈な痒みのあるはっきりとした境目のある浮腫プラークの複数の領域として現れる。それらは、周囲に紅斑を伴う白色か、又は延びた時の白化を伴う赤色である。個々の病変は、２、３ミリから数センチの様々な直径を有し、円又は蛇行状である。血管性浮腫は、痒みがなく、顔、特に眼窩周囲及び口周囲の領域に偏向性がある非依存性、非陥凹性の腫れの散在した領域として現れる。腫れは、口及び咽頭でも同様に生じる。
摂取したアレルゲンは、吸入したものよりも、より頻繁にじんま疹の原因となる。あらゆる食物及び薬剤がじんま疹を引き起こしうる。専売医薬品を含む薬剤の潜在性の供給源、例えば下剤、頭痛薬及びビタミン剤がアレルゲンであり得る。また、じんま疹は寒気、熱、運動障害又は精神的苦痛も引き起こしうる。
【０１０９】
胃腸疾患
消化管は非常に免疫学的に活性な場所である。消化管腔は、無害で必要な微生物叢、潜在的な病原体、免疫反応を誘発する能力のある多量の複合高分子の複雑な混合物を含む。粘膜の免疫系は、病原体に対する防御的反応を誘発する間に、無害な叢及び食物に対する免疫反応を下方制御する機構を展開する。
グルテン過敏症腸疾患（腹腔疾患）は、コムギ、オオムギ及びライムギに見られる穀物貯蔵タンパク質（グルテン又はグリアジン）に対して過敏であることにより引き起こされる絨毛萎縮及び吸収不良によって特徴づけられる小腸の疾患である。炎症性障害は、主に、摂取したグルテンに最もよく接触した領域にある最も深刻な変化のある小腸の粘膜、近接する小腸に制限される。通常、疾患は、上皮の浮腫及び基底膜の肥厚から始まり、続いて炎症細胞の流入がある。これらの炎症細胞は、一般に多形核白血球であり、すぐにリンパ球及び血漿細胞と置換する。ＩｇＥ血漿細胞は数を増して優勢を確保するが、ＩｇＧ血漿細胞では不均衡な増加がある。これに対し、あらゆるＩｇＥ血漿細胞のうち少数が現れる。
【０１１０】
対照的に、非グルテン感受性食物過敏症はグルテン感受性の様々な症状と非常に類似した症状を有するＩｇＥ媒介性過敏症である。ＩｇＥ媒介性食物過敏症の１つのタイプでは、消化管の局所的なアレルギー反応が全身的なアレルギー症状に関わる。食物アレルゲンへの暴露は、粘膜ＩｇＥ血漿細胞及び肥満細胞の脱顆粒を増大させ、深刻なタンパク喪失性腸症を引き起こす。食事から攻撃的な食物を排除することが、疾患を改善させるのに有効である。
過敏症の第２のタイプでは、臨床的な症状がグルテン感受性食物過敏症で見られるもの：絨毛萎縮及び吸収不良と実質的には同一である。この症状は幼い子供に幾分限られ、牛乳によって最も頻繁に起こる。しかしながら、ダイズ、卵及びコムギのタンパク質も関与している。症状はしばしば胃腸感染症の後に生じ、３歳を過ぎると自然に解消する。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、一般的に炎症及び／又は潰瘍形成を引き起こす腸疾患を表す用語である。例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、不定大腸炎（ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）及び完成性大腸炎。
また、クローン病（限局性腸炎又は潰瘍性大腸炎としても知られる）は未知の病因の慢性炎症疾患であるが、潰瘍性大腸炎とは異なり、腸のあらゆる部分に影響を与えうる。この疾患の最も顕著な特徴は、腸壁の肥厚した、ザラザラした赤みがかった紫の浮腫である。炎症の進行と共に、これらの肉芽腫はしばしば限局性の境界がなく、周辺組織と一体化している。下痢及び腸の閉塞が顕著な臨床特徴である。潰瘍性大腸炎と同様に、疾患の進行は連続性又は再発性、軽症又は重篤でありうるが、潰瘍性大腸炎と異なり、腸の関連部分を切除することによって治癒させることができない。クローン疾患を有する多くの患者はある時期に手術が必要であるが、その後の再発が通例であり、継続的な医療処置が通常行われる。
【０１１１】
クローン病は、典型的には回結腸、小腸又は結腸−肛門直腸領域で現れるが、消化管の口から肛門までのあらゆる部分に関与しうる。組織病理学的には、疾患は、肉芽種性（ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｍａｓ）、腺窩膿瘍、亀裂及びアフター性潰瘍により明白である。炎症浸潤物が混ざり、リンパ球（Ｔ及びＢ細胞）、血漿細胞、マクロファージ、及び好中球から構成される。ＩｇＭ及びＩｇＧ分泌血漿細胞、マクロファージ及び好中球で不均衡な増加がある。
抗炎症薬、スルファサラジン及び５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）は、軽症の活性間代性クローン病の治療に利用され、一般に疾患の緩解を維持するために処方される。メトロニダゾール及びシプロフロキサシンは、スルファサラジンと同様の効果であり、肛門周辺の疾患の治療に特に有用なようである。より重篤な場合には、副腎皮質ステロイドが急性悪化の治療に効果的であり、さらに緩解を維持する。また、アザチオプリン及び６−メルカプトプリンは、副腎皮質ステロイドの慢性的な投与を必要とする患者での成功が示されている。また、これらの薬剤が長期間の予防に役立つ可能性もある。不運なことには、患者の中には作用が現れるまで非常に時間がかかる（最大６ヶ月）ものもいる。
【０１１２】
また、止瀉薬は、患者によっては症候性の苦痛を与えることがある。食事療法又は成分栄養は、患者の栄養状態を改善して急性疾患の全身的改善を促進することができ、持続した臨床的緩解をせずにすむ。抗生物質は二次的な小腸細菌の過剰増殖の治療、及び化膿性合併症の治療に使用される。潰瘍性大腸炎（ＵＣ）は、大腸を冒す未知の病因の慢性炎症疾患である。疾患の進行は、断続性又は再発性、軽症又は重篤であり得る。最も初期の障害は、リーベルキューンの陰窩の下部で膿瘍形成を伴う炎症浸潤である。これらの膨張及び破裂した陰窩の結合は、覆っている粘膜をその血液供給から引き離して潰瘍形成を引き起こす傾向がある。疾患の症状には、痙攣、下腹痛、結腸出血、及び不十分な糞便を伴った主に血液、膿及び粘液等の頻繁な漏出を含む。急性の、重篤又は慢性の、断続的な潰瘍性大腸炎には全結腸切除が必要とされうる。
ＵＣの臨床的な特徴は非常に様々で、潜行的に又は突然はじまり、下痢、しぶり及び再発性直腸出血を含みうる。大腸全体の劇症性関与、中毒性巨大結腸によって、生命に関わる緊急事態が生じうる。腸外での徴候には、関節炎、壊疽性膿皮症、ブドウ膜炎、及び結節性紅斑を含む。
ＵＣの治療には、軽症の場合にはスルファサラジン及び関連したサリチル酸塩を含む薬剤を、重篤な場合には副腎皮質ステロイドを含む。サリチル酸塩又は副腎皮質ステロイドの何れかの局所投与は、時に効果的であり、特に疾患が腸の末端部である場合や全身的な使用に比較して小さな面の効果に関係している場合に効果的である。時には、鉄及び止瀉薬の投与等の支持的な手段を必要とする。アザチオプリン、６−メルカプトプリン及びメトトレキサートもまた、難治性の副腎皮質ステロイドに依存した場合における使用に処方される。
【０１１３】
粘膜炎は粘膜上皮組織の潰瘍性破壊によって特徴づけられ、事実上粘膜の炎症と定義される。粘膜炎の病態生理は複雑で、細胞、サイトカイン及び菌叢どうしの相互作用のカスケードに関与する。化学療法又は放射線障害に対する中咽頭及び消化管の粘膜の感受性の根拠は素速い上皮幹細胞の代謝に関係する。粘膜炎は次の４つのフェーズを生じることで説明することができる：（１）細胞障害剤によって引き起こされる局所の組織損傷に対する応答における炎症性サイトカインの放出により特徴づけられる初期炎症性フェーズ；（２）上皮の再増殖を妨害する程度の基底細胞の死によって特徴づけられる上皮性フェーズ；（３）局所感染に対する炎症応答を生じる菌叢の局所侵入に特徴づけられる感染性フェーズ。この炎症が更なる局所組織損傷及び侵食性潰瘍形成の可能性を生じ；（４）上皮の感染の回復及び再生に特徴づけられる治癒フェーズ。
口腔粘膜炎は細胞性損傷から生じる次の臨床的な徴候と症状を生じる：（１）乾燥した感じ；（２）無症候性の赤み及び紅斑；（３）接触痛のある孤立性白色の高剥離性斑；（４）嚥下障害及び経口摂取減退に関係する広範で、痛みのある、隣接の偽膜性病変部。これらの自発痛のある病変部は組織病理学的に基底膜までの上皮細胞の喪失を示し、関連する神経支配を有する結合組織間質を露出させる。
【０１１４】
胃腸粘膜は、しぶり（痛みを伴う排便時の無効な緊張）、痛み、出血、下痢、末梢血管拡張（新血管新生）、及び潰瘍形成の進行の臨床的徴候及び症状を生じる。下痢の初期徴候は、排便回数の増加、柔らかい又は水様の便、食物嫌悪、腸音の増加、腹痛、及び乾燥を表す皮膚弾力性（ｔｕｒｇｏｒ）のある程度の低下を含む。下痢が途絶えたとき、潰瘍形成、出血、腸穿孔及び直腸炎に関連しうる。便検査は潜在成の血液及び便白血球を明らかにする。
壊死性腸炎は、集中治療室に入る全乳児の１−５％が罹患する未知の病因の炎症性疾患であり、そのほとんどが早産児である。徴候及び症状は、腹部膨満、消化管出血、及び不耐感を含む。疾患は最もよく回腸と大腸に関わっており、上皮の喪失及び粘膜下浮腫、潰瘍形成、重傷な場合には、経壁の壊死に特徴づけられる。
【０１１５】
２．更なる免疫関連疾患
本発明のペプチドは、様々な他の免疫関連疾患を治療するために使用できると考えられる。ここで考慮される他の免疫に関連する病状又は疾患の例には、限定するものではないが、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、骨関節症、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症ミオパシー（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎症症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少（特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少）、甲状腺炎（グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経障害又はギラン−バレー症候群、及び慢性炎症脱髄性多発神経障害、肝疾患、例えば伝染性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝炎性（ｎｏｎ−ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ）ウィルス）、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎；クローン病）、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。
【０１１６】
全身性紅斑性狼瘡において、疾患の中心的媒介は、自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の産出、及びその後の免疫媒介炎症の発生である。これらの抗体は直接的又は間接的に組織傷害を媒介する。腎臓、肺、筋骨格、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む複数の器官及び系が臨床的な影響を受ける。
リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、複数の関節の滑膜に関係する慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原は、リウマチ因子、内在タンパク質に対する自己抗体の産生に関係し、結果として滑液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。これらの複合体は、滑液区画へのリンパ球、単球及び好中球による浸潤を誘発しうる。影響を受けている組織は、多くの場合対照的なパターンで主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態では、典型的な障害は、肺線維症、血管炎、及び皮膚潰瘍である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、ＲＡ疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡで生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
【０１１７】
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６才以下で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子がポジティブである患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は主な３つのカテゴリー：小関節（ｐａｕｃｉａｒｔｉｃｕｌａｒ）、多関節（ｐｏｌｙａｒｔｉｃｕｌａｒ）及び全身性のものに亜分類される。関節炎は重度で局所的な破壊が生じ、関節強直症及び遅延成長に至るおそれもある。他の徴候には慢性前ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
脊椎関節症は、一般的にＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子生成物の発現に関連した、いくつかの共通した臨床的特徴を有する疾患のグループである。疾患には：強直症、脊椎炎（ｓｐｏｎｙｌｉｔｉｓ）、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；ＨＬＡ−Ｂ２７（血清学的には、クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ−Ｂ座位にある定義された対立遺伝子）を伴う炎症非対称性関節炎；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導における鍵として関わるほとんどの細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球であり、クラスＩ ＭＨＣ分子により付与される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現した外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ−Ｂ２７と反応する。ＨＬＡ−Ｂ２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋Ｔ細胞の反応が誘発されると仮定されている。
【０１１８】
全身性硬化症（強皮症）は病因がよく知られていない。疾患の特徴は皮膚の硬化であり、これは活性化炎症プロセスにより誘発される。強皮症は局部的又は全身的である。血管障害が一般的で、微小血管系における内皮細胞傷害は全身性硬化症の発達における初期の重要な事象である。免疫学的基準では、皮膚障害における単核細胞浸潤の存在、多くの患者において抗細胞核抗体の存在を意味する。多くの場合、ＩＣＡＭ−１は皮膚障害における線維芽細胞の細胞表面をアップレギュレーションし、これらの細胞と相互作用するＴ細胞が疾患の病因における役割を担っていることが示唆される。他の器官藻また関連する。胃腸管では、平滑筋萎縮症及び線維症が異常なぜん動／運動性を生じさせる。腎臓では、小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼす同心性内皮下内膜増殖が、腎皮質の血流の低下させ、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧を生じさせる。骨格筋及び心筋では、萎縮、間質性線維症／瘢痕、及び壊死が生じうる。最後に、肺は間質性肺炎及び間質性線維症を有しうる。
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対称的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与する成分の機能を阻害及び対抗する。
【０１１９】
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症、続く涙腺及び唾液腺の機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患を伴うか又は伴わない。この疾患は、双方ともが小ＲＮＡ−タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する抗体産出に関連している。障害により、結果として乾性角結膜炎、ｂｉｌａｒｙ硬変を含む他の徴候又は会合を伴う口内乾燥、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病に至る。
全身性血管炎症症は主な障害が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として影響を受けた脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、最終的な末端器官ではいくつかのケースで機能障害になるといった疾患である。また、第２の障害として血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｄｅｓ）、又は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の形成に関連した疾患等の続発症が生じるおそれがある。主な全身性血管炎症症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節（ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｎｏｄｏｓａ）、アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。種々の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群（ＭＬＮＳ又は川崎病）、単離したＣＮＳ血管炎、ベヘット（Ｂｅｈｅｔ’ｓ）病、閉塞性血栓性血管炎（バージャー病）及び皮膚壊死性細静脈炎（ｖｅｎｕｌｉｔｉｓ）が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の病原メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
【０１２０】
サルコイドーシスは、体内のほとんど任意の組織中に類上皮細胞肉芽腫が存在し、肺ではほとんど一般的に包含されることにより特徴付けられる、病因がよく知られていない病状である。病原には疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞種より放出される局部的又は全身的活性物質の放出の結果として慢性続発症が生じる。
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球細胞（いくつかのケースにおいは、血小板を含む他の血液細胞）表面で発現する抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ−レセプター−媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
他の臨床的セッティング（ｓｅｔｔｉｎｇ）における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ−レセプター−媒介メカニズムによる除去の結果として生じる。
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に多くの場合特異的に存在するタンパク質と反応する抗体の産出を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。実験用モデルには：内在的モデルラット（ＢＵＦ及びＢＢラット）及びチキン（肥満チキン種）；誘導性モデル：チログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原（甲状腺ペルオキシダーゼ）を用いた動物の免疫化が含まれる。
【０１２１】
糖尿病は、インスリン分泌の相対的又は絶対的な不足及び様々なインスリン抵抗度と関係がある。その完全に進行した臨床的発現では、それは空腹時低血糖により、大多数の長期疾患においてはアテローム硬化型及び微小血管障害性の血管疾患及び神経障害により特徴づけられる。種々の型の疾病間の違いは、原因及び病因、自然史、及び処置に対する反応の点において示される。従って、糖尿病は、単なる病気ではなく症候群である。
Ｉ型、又はインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は西洋における全ての糖尿病患者の約１０パーセントに発症する。Ｉ型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は、膵臓小島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インスリン又はインスリン様レセプターに対する抗体は、インスリン−非−反応性の表現型を産出することができる。
典型的に、この型の疾病が幼児期及び青年期に最も一般的に生じるが；あらゆる年齢に見られ、及び徴候がある。ＩＤＤＭの最も一般的な型（ＩＡ型）において、遺伝的な要因に加えて、環境的（後天的）要因、例えば特定のウィルス感染、あるいは化学物質がβ細胞の細胞媒介性自己免疫崩壊を引き起こしうることが必要条件とされうる。従って、細胞媒介性の体液性自己免疫により特徴づけられる一般的に測定される異常な免疫反応（ＨＬＡ会合に関連する）は、環境的因子による誘起後の病原的役割を果たすと考えられる。ＩＤＤＭの第２の型（ＩＢ型）は主に自己免疫によると考えられている。これらの患者は、ハシモト甲状腺炎、グレーブス疾患、アジソン病、一次性腺機能不全、及び関連した比内分泌性自己免疫疾患、例えば、悪性貧血、結合組織疾患、セリアック病及び重症筋無力症等の自己免疫内分泌疾患に関連している。インスリン依存は、インスリンの投与が突発性のケトン症、昏睡、死の予防に必須であることを意味する。しかしながら、インスリン治療をしていてもなお、糖尿病患者は糖尿病に関連した更なる多くの問題、即ち結合組織疾患、神経障害等を有しうる。
【０１２２】
糖尿病の第２の型、ＩＩ型又は非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は全糖尿病の約９０％を占め、遺伝的な原因を有する。ＩＩ型糖尿病を有する患者は、普通から過剰の範囲の体重を有しうる。肥満及び病理的インスリン抵抗性は、ＮＩＤＤＭの進行において決して必須ではない。ＮＩＤＤＭを有する患者の大部分が、中年で糖尿病になる。ＮＩＤＤＭを有する患者は、ケトン症予防のための非インスリン依存であるが、これらが食事又は経口薬の使用で達成されない場合には、彼らは症候性又は非症候性の持続的な空腹時性低血糖を正すためにインスリンを必要としうる。従って、インスリンの治療的投与は、ＩＤＤＭ及びＮＩＤＤＭの間に違いは無い。ＮＩＤＤＭのいくつかのファミリーでは、グルコースに対するインスリン分泌反応が非常に遅いので、あらゆる時に初期のＩ型糖尿病と共通点を有しうる。その自然史の初期、インスリン分泌不足及びインスリン抵抗性は、グルコース許容度の正常化での治療（即ち、体重減少）により可逆的でありうる。糖尿病の典型的な慢性の合併症、つまり大血管障害、微小血管障害、神経障害、及びＩＤＤＭに見られる白内障が、ＮＩＤＤＭによく見られる。
他の型の糖尿病は、特定の他の状態又は症候群の派生的な又はそれと関連したものを含む。糖尿病は、膵臓疾患又は膵臓組織の切除；内分泌疾患、例えば、末端巨大症、クッシング症候群、クロム親和細腫、グルカゴン産生腫瘍、ソマトスタチン産生腫瘍、又は原発性アルドステロン症；高血糖を引き起こすホルモンの投与；及びある種の薬剤（即ち、降圧剤、チアジド系利尿薬、エストロゲンを含む製剤、精神賦活剤、交感神経模倣薬）の投与から２次的に生じうる。糖尿病は、多数の遺伝的症候群に関連しうる。最後に、糖尿病は、インスリンレセプターの遺伝的欠陥に関連しているか、又は関連免疫疾患を伴う又は伴わないインスリンレセプターに対する抗体に依るものである。
【０１２３】
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫媒介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産出される結果により直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応する、腎臓における抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果により間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の形成の結果生じる他の免疫媒介疾患により、間接的続発症等の免疫媒介腎疾患が誘発される。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として腎組織における障害発達が産出／誘発されるといった炎症反応が生じ、器官機能が損なわれ、いくつかのケースでは腎臓機能不全が進行する。体液及び細胞免疫メカニズムに双方が障害の病原に関与している。
多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン−バレー症候群；及び慢性炎症脱髄性多発神経障害は、自己免疫基準であり、神経脱髄が生じて、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に起因するダメージの結果によるものと考えられている。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。障害はＴ細胞媒介小膠細胞の優先的湿潤、及びマイクロファージの浸潤を含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は障害において優先的な細胞型であった。
【０１２４】
好酸球肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎を含む炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連しうる。反応を阻害することは治療的に有益なことであり、本発明の範囲内である。
免疫及び／又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染（限定するものではないがＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及びヘルペス）、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染（ＭＬＲを刺激する分子（又は誘導体／アゴニスト）を治療に利用して感染要因に対する免疫反応性を増強することができる）を含む感染疾患であり、ＭＬＲを刺激する免疫不全疾患（分子／誘導体／アゴニスト）は、遺伝性の、後天性の、感染誘発された（例えばＨＩＶ感染）、又は医原性の（即ち、化学療法からのもの）免疫欠損、及び異常増殖の状態に対する免疫反応を増強するために治療上用いることができる。
さらに、炎症誘発性特性を有する分子を阻害することは、再灌流傷害；脳卒中；心筋梗塞；アテローム性動脈硬化；急性肺傷害；出血性ショック；火傷；敗血症／敗血症ショック；急性尿細管壊死；子宮内膜症；変性関節疾患及び膵炎（ｐａｎｃｒｅａｔｉｓ）の治療に有益である。
【０１２５】
本発明の化合物、例えばポリペプチド又は抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入（鼻孔内、肺内）経路などにより投与される。
また、他の免疫疾患に関連した、又は腫瘍に関連した抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４０、ＣＤ１８、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体を投与することも好ましい。別法として、又は付加的に、同一の抗原又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有益である。一実施態様では、本発明のポリペプチドは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて本発明のポリペプチドを投与する。しかしながら、同時投与、又は最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤と本発明のポリペプチドとの組み合わせ（相乗）効果により減少させ得る。
重篤な免疫関連疾患の治療又は低減のための、本発明の化合物の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び化合物に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。化合物は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
【０１２６】
Ｊ．製造品
本発明の他の実施態様では、前述した疾患の治療に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は容器及び説明書を含んでなる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は病状の治療に有効な組成物を収容しており、滅菌した出入口を有している（例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤は本発明のペプチドを含む。更に組成物はここで開示される何れかの又は複数の成分を含む。容器上の又は容器に付随する説明書には、組成物が、選択された病状の治療に使用されることが示されている。例えば、説明書には組成物がＩｇＥ媒介疾患の治療に有効であることが示されうる。さらに製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガル液及びブドウ糖液を収容する第２の容器をさらに具備しうる。さらに、他のバッファー、希釈剤、（例えばここに記載されるような）、フィルター、針、シリンジ、及び使用指示書を含むパッケージ挿入物を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
【０１２７】
（実施例）
実施例１
ファージ提示したペプチド−ｇ８ライブラリーでのＩｇＥレセプター結合選択
Ｍ１３繊維状ファージでの提示のために一連のペプチドライブラリーを構築した。各ペプチドライブラリーは、１８−２０残基の長さのランダムな配列からなり、Ｍ１３繊維状ファージの主要コートタンパク質、遺伝子８−タンパク質（ｇ８ｐ）のＮ末端に融合させた。ｇ８ｐポリペプチド融合体としてペプチドライブラリーを多価提示できるファージミド構築は、Ｌｏｗｍａｎ 等， （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７， ８８７０−８８７８ （１９９８） 及びＳｉｄｈｕ 等， （２０００） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３２８：３３３−３６３に記載されている。１０のライブラリーのうち９つが、変化するｉ、ｊ、及びｋを有するＸｉＣＸｊＣＸｋ （配列番号：９６）の形態を有するシステイン残基の一定の対を含む。また、これらのライブラリーの２つはシステインペア内に一定のＧｌｙ−Ｐｒｏ配列も含む。１つのライブラリーは２０のみのランダムな残基を含み、一定のシステインペアはなかった。ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ大腸菌での形質転換体の数に基づくライブラリーの多様性はおよそ１０８程度であった。
これらのライブラリーは、選択の前に４つのグループで貯蔵された。グループ１はライブラリー３００（ＳＧＴＡＣＸ２ＧＰＸ４ＣＳＬＡＧＳＰ） （配列番号：９７）からなり；グループ２はライブラリー３０１（Ｘ４ＣＸ２ＧＰＸ４ＣＸ４） （配列番号：２０）からなり；グループ３はライブラリー３０２（Ｘ２０）（配列番号：１０５）からなり；グループ４はライブラリー３０３−３０９（それぞれＸ７ＣＸ４ＣＸ７， Ｘ７ＣＸ５ＣＸ６， Ｘ６ＣＸ６ＣＸ６， Ｘ６ＣＸ７ＣＸ５， Ｘ５ＣＸ８ＣＸ５， Ｘ５ＣＸ９ＣＸ４， Ｘ４ＣＸ１０ＣＸ４）（配列番号：９８−１０４）からなる。ファージ粒子は、ＰＥＧ沈降により２回精製し、１．０ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。
【０１２８】
ＣＨＯ細胞から作成し、ＩｇＧのＦｃドメインに融合したＦｃεＲＩの細胞外ドメインからなる２価の融合タンパク質、ＦｃεＲＩ−ＩｇＧ（ジェネンテック社）で結合選択を実施した。ファージ結合選択のために、９６ウェル免疫吸着プレートをＦｃεＲＩ−ＩｇＧでコートし、０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳで遮断した。コーティングは２μｇ／ｍＬのＦｃεＲＩ−ＩｇＧのＰＢＳ溶液による受動吸着によって実施した。結合選択のために、ファージ濃度をＯＤ２６８（１ＯＤ＝１．１３ｘ１０１３ファージ／ｍｌ）で測定し、次いでファージ選択バッファー（ＰＢＴＴ）：０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び０．００５％のトリトンＸ−１００を含有するＰＢＳで１ｘ１０１１ファージ／ｍＬの濃度まで希釈した。１００ｕｌの希釈ファージを９６ウェルマイクロタイターＭａｘｉｓｏｒｐプレートの８ウェルに加え、上記のようにしてコートした。ＦｃεＲＩ−ＩｇＧのＩｇＧ−Ｆｃ領域に結合するファージペプチドの数を減少させるために、さらに２５ｕｇ／ｍＬのＩｇＧ１ヒト化モノクローナル抗体溶液をファージ選択バッファーに加えた。プレートを室温で２−３時間インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＴ）で各ウェルを１０回洗浄し、結合していないファージ粒子を取り除いた。ｐＨ２．０の０．２Ｍグリシンで７分間、結合したファージを溶出させ、１Ｍトリスベース（Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ）で中和した。選択のその後のラウンドのために、溶出したプールの半分をＸＬ−１大腸菌細胞への再感染に使用した。数ラウンドの結合選択と増殖を、コロニーを数えることによって選択のモニターをしながら実施し、各ラウンドでの濃縮係数を測定した。第３、第４及び第５ラウンドのパニングの次に、濃縮割合、つまり、非特異的遮断薬、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合するものに対比したレセプターに特異的に結合するクローンの割合についてプールを評価した（例えばＬｏｗｍａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８７， ２４９−２６４ （１９９８）参照）。プール２（＃３０１， Ｘ４ＣＸ２ＧＰＸ４ＣＸ４） （配列番号：２０）のみが、第３、第４及び第５ラウンドそれぞれで１５、６６６及び３２５の値を有する、ＢＳＡ結合率に対して高いＦｃεＲＩ−ＩｇＧレセプターの結合率を示した。他に、プール１（＃３００）、プール３（＃３０２）、及びプール４（＃３０３−３０９）は、ＢＳＡに結合するものに対比してＦｃεＲＩに結合するクローンの結合率において有意な増加を示さず、従って更なる分析の可能性のある候補の原料とはされなかった。
【０１２９】
ａ）選択したペプチドファージクローンの配列
選択したペプチド−ファージクローンの配列を決定するために、対数期のＸＬ−１ Ｂｌｕｅ大腸菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をファージに感染させ、５．０ｍＬの２ＹＴブロス、カルベニシリン及びＶＣＳＭヘルパーファージ中で一晩増殖した。ファージ含有上清をＰＥＧ沈降によって精製し、１００ｕＬのＰＢＳに再懸濁した。ファージを９５℃で５分間熱し、遠心分離した。一本鎖のＤＮＡ鋳型を上清から単離し、標準のＳｅｑｕｅｎａｓｅＪ（ＵＳＢ）製品を用いて配列決定に使用した。ペプチドのコード領域の〜８０ｂｐ上流をアニーリングしたオリゴヌクレオチド６８７を、配列決定プライマーとして使用した。
一本鎖ＤＮＡをポジティブに結合するクローンから単離し、配列決定して、ファージが提示したペプチド配列、更に各クローンの頻度を測定した。３ラウンドの選択後のクローンは、配列（表１参照）ＭＧＴＬＣＬＥＧＰＥＧＷＦＣＩＥＳＡ （配列番号：１）、ＱＥＷＴＣＶＥＧＰＲＧＷＥＣＩＡＶＬ （配列番号：２）、ＤＧＳＬＣＦＥＧＰＷＧＷＩＣＱＳＤＧ （配列番号：３） 及びＴＧＥＡＣＶＥＧＰＧＡＷＶＣＣＬＥＰ （配列番号：４）を有し、それぞれクローンの５５、２３、１８、及び４パーセントを示す（２２配列）。配列のうち高い保存性を示すものは、７位のＧｌｕ、１２位のＴｒｐ並びに６位の疎水性残基（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ）であった。全てのクローンは８位と９位にそれぞれＧｌｙ−Ｐｒｏ、４位と１１位にシステイン残基を含み、その全てが未処理のライブラリーで初期に作成されていた。１つのクローンは１７位に付加的な（対になっていない）システイン残基を含んでいた。第５ラウンドの選択からの１７のクローンも更に配列決定した。８のクローンが配列ＭＧＴＬＣＬＥＧＰＥＧＷＦＣＩＥＳＡ （配列番号：５）を有し、他の８つがＴＧＥＡＣＶＥＧＰＧＡＷＶＣＣＬＥＰ （配列番号：６）であり、１つがＱＥＷＴＣＶＥＧＰＲＧＷＥＣＩＡＶＬ （配列番号：７）であった。これらの第５ラウンドのクローンの全てが、配列決定したクローンの第３ラウンドグループでも存在していた。
【０１３０】
2004517816.tif 000003
【０１３１】
ｂ）遺伝子８ファージでの更なるペプチドの選択
Ｘ４ＣＸ２ＧＰＸ４ＣＸ４ （配列番号：２０）のライブラリーから更なるペプチドを選択するために、固定したＦｃεＲＩ−ＩｇＧで選択を繰り返したが、結合選択の間、先に選択したｇ８ａ．３７クローン（表１）と対応する５−１０ｕＭの濃度の合成ペプチドに維持された。この濃度はレセプター（下記参照）に結合するペプチドの解離定数未満がよいが、インキュベーションバッファーに競合物としてそれを含有させることは、より強く結合するペプチドの選択に役立ち得た。同様に、ペプチドが阻害剤として働き、これによってレセプターの他の部位への直接選択に役立ちうる。４回の連続したラウンドのパニングを実施し、各ラウンド後に結合濃縮のレベルを測定した。ラウンド１、２、３、及び４の後にそれぞれ６倍、１８倍、１４６６倍及び２５００倍の増加を観察した。クローンを単離し、配列決定した（表２）。
【０１３２】
2004517816.tif 000004
ラウンド３で、２０のクローンのうち１５が配列ＥＩＱＥＣＴＥＧＰＷＧＷＦＣＶＧＳＧ （配列番号：１１）を有し、２０のうち３がＡＥＡＴＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：１２）であり、２０のうち２がそれぞれＮＹＥＥＣＶＭＧＰＤＧＶＷＣＬＩＰＴ （配列番号：９）又はＧＲＰＳＣＩＥＧＰＳＧＬＷＣＬＩＥ （配列番号：１０）であった。更なるクローンは３３のクローン配列決定のラウンド４から配列決定され、２つ優勢な配列のみが維持され、３３クローンの１５がＡＥＡＴＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：１２）であり、３３のうち１８がＥＩＱＥＣＴＥＧＰＷＧＷＦＣＶＧＳＧ （配列番号：１１）であった。
【０１３３】
実施例２
ＦｃεＲＩ結合ペプチドのｇ８ｐ及びｇ３ｐファージディスプレイベースアッセイ
ＦｃεＲＩ−ＩｇＧでのパニングの幾つかのラウンドの後に、ファージクローンをレセプターに対する特異的結合及びＩｇＥによる阻害についてアッセイした。ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ大腸菌細胞をファージライブラリーのプールによって感染させ、ＬＢ／カルベニシリン寒天プレート上に蒔いた。個々のコロニーを採り、抗生物質（カルベニシリン及びテトラサイクリン）及び１０１０／ｍＬのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を含有する５ｍＬの２ＹＴブロス中で一晩増殖させた。培地を遠心分離し、２０％のＰＥＧと２．５ＭのＮａＣｌを含有する１．０ｍＬの溶液を上清に加えた。１０分後、混合物を１０分間１０ＫのＲＰＭで遠心分離した。上清を吸引し、残ったファージペレットを１００ｕＬのＰＢＳに可溶化した。ＦｃεＲＩ−ＩｇＧを固定したＭａｘｉｓｏｒｐ９６マイクロタイタープレート上でヒトＩｇＥ（２ｕｇ／ｍＬ）の存在及び不存在下において、１／１００希釈の可溶化ファージを１時間インキュベートした。プレートをＰＢＴで５回洗浄し、１／５０００希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗Ｍ１３ファージ抗体（ファルマシア社）を室温で３０分間添加した。プレートを再びＰＢＴで５回洗浄し、１００ｕＬのＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）基質を添加した。１５分後、５０ｕＬの２．５ＭのＨ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止した。各ウェルのＯＤをＳＬＴプレートリーダーを用いて４９２ｎｍの波長で測定した。
プール２からの９５％を超えるクローンがＦｃεＲＩ−ＩｇＧに特異的に結合し、ウシ血清アルブミンにも４Ｄ５、ヒトＩｇＧ１抗体にも結合しなかった。さらに、ＩｇＥによる結合阻害試験において、ＩｇＥがインキュベーションバッファーに存在する場合に９５％以上の陽性のクローンが結合を抑制された。
【０１３４】
実施例３
一価ファージディスプレイを用いたペプチドの最適化
ペプチドＥＩＱＥＣＴＥＧＰＷＧＷＦＣＶＧＳＧ （配列番号：１１）及びＡＥＡＴＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：１２）を最適化のためにファージの遺伝子３への融合として選択した。ここでこれらのペプチドに基づく更なるライブラリーを、ｇ３ファージディスプレイに基づいて構築し、より強く結合するペプチドを選択した。ｇ３ファージディスプレイフォーマットにおいて、ディスプレイのレベルは通常一価であり、従って、選択は個々の分子の結合相互作用の親和性に依存する。ｇ８ファージフォーマットにおいて、ペプチドの提示は多価であり、ペプチドの選択をより弱い結合相互作用で可能にする結合活性力による選択効果である。両方のペプチドのランダム化残基１−４、５−１５及び１７−２０に基づいてライブラリーを作成した。固定したＦｃεＲＩ−ＩｇＧに対する５ラウンドのパニングの後、１−４位にランダム化した残基を有するライブラリーに基づくＡＥＡＴＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：１２）のみが有意な強さを有していた。配列決定及びファージ結合ＥＬＩＳＡアッセイによるＩＣ５０値の測定のために７つのクローンを採った。７つ全てが、クローンの５０％で３位がＰｒｏである以外は全く一致のない異なるＮ末端配列を有していた（表３）。Ｎ末端配列は次の通りであった：それぞれＮＬＰＲ、ＮＬＰＴ、ＶＭＰＴ、ＡＭＡＱ、ＧＲＡＱ、ＤＬＰＡ及びＧＲＴＥ （配列番号：１３−１９）。
【０１３５】
2004517816.tif 000005
滴定量の可溶性ＦｃεＲＩ−ＩｇＧの存在下における固定したＦｃεＲＩ−ＩｇＧのファージベース競合結合ＥＬＩＳＡを各クローンで実施した。クローンのＩＣ５０値は７−１６ｎＭの範囲であり、ＮＬＰＲ （配列番号：１３）クローンは１３ｎＭの値を有していた。
【０１３６】
ＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：２１）ペプチドを合成し、セルベースＩ１２５−ＩｇＥ結合阻害アッセイでアッセイした（実施例４参照）。このペプチドの１ｕＭのＩＣ５０値を測定した。これは、最初のＭＧＴＬＣＬＥＧＰＥＧＷＦＣＩＥＳＡ （配列番号：１）ペプチドの１６０倍を超える改善、ＥＩＱＥＣＴＥＧＰＷＧＷＦＣＶＧＳＧ （配列番号：１１）ペプチドの４０倍の改善を示した。親ＡＥＡＴＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：１２）ペプチドに対する改善倍率は、ペプチドがアッセイバッファーに溶解しなかったために測定されなかった。ペプチドＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：２１）についての１ｕＭのこのＩＣ５０値は、ファージ結合ＥＬＩＳＡで決定された１３ｎＭの値とは有意に異なっていた。これらの結果はアッセイ形式及び試薬の違いのために僅かに異なることが予想されるが、この相違はこのペプチドのＦｃεＲＩ−ＩｇＧ又はｇ３ファージディスプレイでの一価性によるものである可能性が高いと考えている。遺伝子３ファージの５以上の複製の提示により、結合活性による結合を増加し、より低いＩＣ５０値を与えることができる（Ｌｏｗｍａｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ２６， ４０１−４２４ （１９９７））。
【０１３７】
ＦｃεＲＩ−ＩｇＧに特異的に結合するｇ８ｐ融合ファージクローンのペプチド配列は一価ファージディスプレイのｇ３ｐ−ディスプレイ形式に移された（Ｂａｓｓ等， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ８， ３０９−３１４ （１９９０）； Ｌｏｗｍａｎ 等， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０， １０８３２−１０８３８ （１９９１））。ｇ３と重複する更なる５’及び３’の塩基対を有する所望の各ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドが合成された。このオロゴヌクレオチドを、ｇ３の１本鎖標準ＤＮＡファージミド鋳型とアニーリングした。ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ大腸菌を突然変異反応で形質転換し、ＬＢ−ｃａｒｂ＋寒天培地に蒔いた。各コロニーを５ｍＬの２ＹＴブロス、テトラサイクリン、カルベニシリン、及びＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に増殖させた。１本鎖標準ＤＮＡを精製ファージ粒子から単離し、配列決定してファージペプチド配列の挿入を確認した。２５ｍＬのｇ３ファージクローン調製物を一晩増殖させ、ＰＥＧ沈降によって精製した。１．０ｍＬのＰＢＳ中のファージペレットを再懸濁した後、それを連続して１／３に希釈し、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートに固定したＦｃεＲＩ−ＩｇＧ ２ｕｇ／ｍＬと共に室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで１０回洗浄し、次いで上述のようにして１００ｕＬの抗Ｍ１３ファージＨＲＰとインキュベートした。５０％未満の結合に相当するＯＤ（４９２）値が選択され、精製ファージクローンを希釈して、この標準化したレベルのシグナルを作成した。関連する親和性（ＩＣ５０）測定のために、ＦｃεＲＩ−ＩｇＧをＰＢＴＴで連続して希釈し、希釈したファージと共に１５分間プレインキュベートした。次いで混合物を固定したＦｃεＲＩ−ＩｇＧを含む９６ウェルマイクロタイター皿に移した。１時間のインキュベーションの後、プレートを１０回洗浄し、抗Ｍ１３−ＨＲｐコンジュゲート抗体と共にインキュベートして上述のようにＯＰＤで展開した。データをプロットし、４−パラメータフィット（カレイダグラフ３．０）をＩＣ５０の計測に使用した。
【０１３８】
記述されるようにして（Ｋｕｎｋｅｌ 等， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０４， １２５−１３９ （１９９１））部位特異的突然変異誘発を用いて一価（ｇ３ｐ）ファージディスプレイのペプチド配列にわたって様々な位置にアラニン置換を作成した。さらに、段階的なＮ末端及びＣ末端切断をしたペプチド配列を構築した。更なる１８ｂｐのペプチド重複ＤＮＡ又はｇ３ファージＤＮＡ配列を用いた、所望の置換又は切断に相当するオリゴヌクレオチドの構築によって全ての構築物を作成した。ファージクローンをＸＬ−１ Ｂｌｕｅ大腸菌に感染させた後に一晩増殖させた。精製ファージ調製物を滴定し、固定したレセプターに対する結合についてアッセイした。ＦｃεＲＩ−ＩｇＧ競合アッセイを上述のようにして実施した。
【０１３９】
観察されたＩＣ５０値を表４に報告する：
2004517816.tif 000006
【０１４０】
実施例４
合成ペプチドの作成及び活性
ペプチド−ファージクローンに相当する多数のペプチド及び類似体が合成された。注記されない限り、全てのペプチドを環状ジスルフィド形態に酸化し、組成物をＨＰＬＣ及び質量分析で確認した。大腸菌でＩＧＥ１３３を融合タンパク質として発現させ、臭化シアン反応により切断した（実施例１２参照）。
初期のファージ選択物を有する幾つかのペプチドが合成された。さらに、最適化したペプチド（ＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ） （配列番号：２１）を合成して、ペプチドの大きさを最小化する可能性を評価し、残基がレセプター結合に寄与することを確認した。更なる類似体を作成してＦｃεＲＩ結合に対するペプチド残基側鎖の寄与を測定した（Ｈａｋｉｍｉ 等， （１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：２２０７９−８１）。主に置換はシステインループ内の残基（Ｔ６−Ｗ１２）に限定された。幾つかの非天然アミノ酸類似体は、ペプチドＰｒｏ残基による結合相互作用の性質をプローブに使用された。
【０１４１】
ＦｃεＲＩへのＩｇＥ結合を阻害するペプチドの能力を測定するために、放射標識ＩｇＥを用いた細胞ベース結合アッセイを利用した。ヒトＦｃεＲＩレセプターのαサブユニットを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞をファルコン９６ウェルマイクロタイタープレートでウェル当たり５ｘ１０４細胞の濃度にして一晩培養した。次の日、細胞をＰＢＳで３回、次にＦ１２／ＤＭＥＭで１回洗浄した。ペプチド保存液をｐＨ７．２、５ｍｇ／ｍＬの濃度で１００ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝水に再懸濁した。ペプチドの作用濃度をアッセイバッファー（下記参照）で希釈した。７５ｕＬの所望の濃度のペプチドをセパレート９６ウェルマイクロタイタープレートの最前列に添加し、５０ｕＬのアッセイバッファー（Ｆ１２／ＤＭＥＭ、１％のＢＳＡ、０．０５％のＮａＮ３及び０．０２５ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．２）で１：３に連続して希釈した。最初の濃度は５０−５００ｕＭの範囲であった。次に、５０ｕＬの希釈ペプチドを一価のＣＨＯ ＦｃεＲＩ＋細胞を含有する９６マイクロタイターウェルプレートに移した。室温で１時間インキュベーションした後、５０ｕＬの１２５Ｉ−ＩｇＥ（１．５ｎＭ）を各ウェルに添加して４℃でさらに４５−６０分間インキュベートし、続いて２００ｕＬのアッセイバッファーで５回洗浄した。細胞を２００ｕＬの１Ｎ ＮａＯＨで可溶化し、γカウンターで計測するために９６マイクロタイターチューブに移して結合した数を決定した。データをカレイダグラフ３．０を用いてプロットし、４パラメータフィットを用いてあてはめた。ＩＣ５０値を各ペプチドについて測定した。
【０１４２】
ペプチドＭＧＴＬＣＬＥＧＰＥＧＷＦＣＩＥＳＡ （配列番号：１）のＩＣ５０は＞１６０ｕＭであることが分かった。ペプチドＥＩＱＥＣＴＥＧＰＷＧＷＦＣＶＧＳＧ （配列番号：１１）のＩＣ５０は３７ｕＭと測定され、ＭＧＴＬＣＬＥＧＰＥＧＷＦＣＩＥＳＡ （配列番号：１）ペプチドに対し＞４倍改善された活性であった。ペプチドＡＥＡＴＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：１２）は結合バッファーに不溶性であり、従って確実なＩＣ５０値を測定することができなかった。
ペプチドＩＧＥ０６３（表５）は約１ｕＭのＩＣ５０を有し、更なる構造活性研究の基準として使用された。残基１（Ａｓｎ）の切断は３倍減少する最少の影響を有していたが、最初の２残基（Ａｓｎ、Ｌｅｕ）の切断は３４倍減少した阻害を生じた。残基５（Ｃｙｓ）までの切断は＞４００倍減少した阻害を生じた。従って、相互作用が側鎖又は主鎖の相互作用に関係しているか不明だが、Ｎ末端の残基２−４はレセプター結合に重要であった。Ｃ末端での残基１５（Ｍｅｔ）の切断は、結合にほとんど影響しなかったが、残基１４（Ｃｙｓ）までの切断は結合の＞４００倍減少を生じた。まとめると、Ｎ末端から１残基及びＣ末端から３残基の切断は、１２５Ｉ−ＩｇＥ細胞結合阻害アッセイにおける阻害で最少の影響を有していた。
【０１４３】
ＩＧＥ０６３のアラニン置換を側鎖構築の評価に使用した。Ｐ９Ａ（ＩＧＥ０７０）置換は、結合において＞５００倍の減少である最も大きい影響を有していた。また、あまり強力ではないが、２５６倍及び６５倍の減少をそれぞれ生じるＧ８Ａ（ＩＧＥ０７９）及びＷ１２Ａ（ＩＧＥ０７３）変異体が活性であった。Ｗ１０Ａ（ＩＧＥ０７４）の効果は３０倍の減少であり、Ｇ１１Ａは５３倍の減少であった。Ｅ７Ａ（ＩＧＥ０５９）類似体はより小さく、結合において６倍の減少であった。明らかに、Ｇ８、Ｐ９、Ｗ１０、Ｇ１１及びＷ１２全てでの置換は、ＦｃεＲＩ結合に重大な影響を有していた。
ペプチドを２Ｄ ＮＭＲ分光法を用いて展開し、ペプチド類似体の３次元構造での置換の影響を評価した。表５に示される構造スコアを有する全てのペプチドを２Ｄ ＮＭＲ分光法で分析し；バックボーン１Ｈ共鳴を与え、３ＪＨＮ−Ｈαカップリング定数を測定し、基準ペプチド（ＩＧＥ０６３；実施例５参照）と比較した。ペプチドについて、化学シフト、カップリング定数が提供される基準ペプチドと同様の構造であることが同定され、ＮＯＥはその構造と一致する。３ＪＨＮ−Ｈαカップリング定数が基準よりも低い極値（例えば、＞８．５又は＜６Ｈｚ〜６と８．５の間の値になる）である場合、及び／又はバックボーン共鳴の化学シフトが基準に比較してペプチドにおいてランダムコイル値に近い場合に、ペプチドが低い安定性であることが決定される。
【０１４４】
表５
ＣＨＯ ＦｃεＲＩ＋細胞への標識したＩｇＥ結合の阻害
ＩｇＥ結合を阻害する能力及びその３次元構造についてペプチドを評価した。＋＋＋は、ペプチドがＩＧＥ０６３と類似した構造をもつことを示す。＋は、ペプチドがＩＧＥ０６３と類似した構造をもつが、安定性が低いことを示す。−／＋は、ペプチドが安定した構造の幾つかの要素を有するが、構造が基準の構造とは異なることを示す（例えば、異なる回転型であることが明らかである）。−は、ペプチドが水溶液で大部分構造化されないことを示す。
【０１４５】
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（Ｂｔ＝ビオチン；ｈＳ＝ホモセリン；ｔＰ＝チオプロリン；Ａｃ＝アセチル；ｈＰ＝ヒドロキシプロリン；Ｏｉｃ＝オクタヒドロインドール；ｐｉｐ＝Ｌ−ピペコリン酸；ｎｐＡ＝２−ナフチル−２−アラニン；小文字＝「Ｄ」光学異性体；大文字＝「Ｌ」光学異性体；Ｍ−Ｍｅ−Ｇ＝Ｎ−メチルグリシン；Ｎ−Ｍｅ−Ａ＝Ｎ−メチルアラニン）
【０１４６】
実施例５
ＮＭＲによるペプチド構造の決定
ペプチドＩＧＥ０６３のＮＭＲ分析
３ｍｇのペプチドを５００ｍＬの９２％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ／８％Ｄ２Ｏに溶解し、次いで０．１ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを５．７に調節することによって、ＩＧＥ０６３のＮＭＲ試料を調製した。２次元二量子遷移相関分光法（２ＱＦ−ＣＯＳＹ）、全相関スペクトル（ＴＯＣＳＹ）、核オーバーハウザー効果スペクトル（ＮＯＥＳＹ）、及び回転フレームオーバーハウザー効果スペクトル（ＲＯＥＳＹ）を２８８Ｋで５−ｍｍ３軸パルスフィールド勾配プローブを備えるＢｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−５００分光計で収集した。Ｃａｖａｎａｇｈ等によって「Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， Ｐｒｉｎｃｐｌｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、サンディエゴ：ＩＳＢＮ ０−１２−１６４４９０−１， １９９５）に記載されるようにして実験を記録した。Ｄ２Ｏのペプチドの凍結乾燥及び溶解の後、３５℃混合パルスで獲得される２Ｄ ＮＯＥＳＹ及びＣＯＳＹ−３５スペクトルを得た。完全な１Ｈ共鳴配座は、標準的な方法によってこれらのデータから導かれる（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ， ｉｎ 「ＮＭＲ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ＩＳＢＮ ０−４７１−８２８９３−９， １９８６）。
【０１４７】
ＩＧＥ０６３の明確な３次元構造は、次のようなことから得られた：（１）１Ｈ共鳴位置は構造化されていないペプチドで予測されるものとは有意に異なる。（２）アミドとαプロトンの間のスカラーカップリング定数（２ＱＦ−ＣＯＳＹスペクトルから得られる）は構造化されていないペプチドで得られる平均値と識別される。値は、これらの残基の展開した骨格構造に示される残基Ｃｙｓ５、Ｔｈｒ６、Ｔｒｐ１０、Ｖａｌ１３、及びＣｙｓ１４について８．５Ｈｚを超える。また、ＣＯＳＹ−３５スペクトルのα及びβプロトンの間でスカラーカップリング定数を測定した。これらのデータは、残基Ｃｙｓ５、Ｔｈｒ６、Ｔｒｐ１０、及びＣｙｓ１４の側鎖が一定のｃｈｉ−１角度を有することを示す、つまりこれらの側鎖が構造化されていないペプチドにあるｃｈｉ−１回転異性体の範囲をとらない。（３）ＮＯＥＳＹ及びＲＯＥＳＹスペクトルのピークは、主な配列の隣接していない残基の間で多くのプロトン−プロトン接触（＜５Å）があることを示す。これらは、ペプチドが明確な構造に折り畳まれる場合にのみ生じうる。Ｃｙｓ５及びＣｙｓ１４及びＧｌｕ７及びＴｒｐ１２のαプロトンの間の強力な鎖交換ＮＯＥは、ＩＧＥ０６３が２本鎖βシート内の非水素結合位置で生じるジスルフィドを有するβヘアピン構造をとることを示す。さらに、残基Ｇｌｙ８、Ｐｒｏ９、Ｔｒｐ１０、及びＧｌｙ１１に関する局所ＮＯＥ及びカップリング定数は、これらの残基が正のｐｈｉ角度をとるＧｌｙ１１を有するＩ型βターンをとることを示す。
【０１４８】
ＮＭＲデータを用いて、ＩＧＥ０６３構造の３次元構造モデルを決定するために使用することができる拘束条件を導いた。二面角の拘束は、適したカープラス相関（Ｋａｒｐｌｕｓ， Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ．， ３０： １１−１５ （１９５９））によってアミド−α及びα−βスカラーカップリング定数から導いた。距離の拘束は、ＲＯＥＳＹ又はＮＯＥＳＹスペクトルの空間を通した（ｔｈｒｏｕｇｈ−ｓｐａｃｅ）相互作用を示すプロトンの間で展開され；大きさの上限、及びピークの重複又は共鳴縮退による上限の修正はＳｔａｒｏｖａｓｎｉｋ等， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３５：１５５５８−６９ （１９９６）に記載されるようにした。これらの拘束条件を利用して、ＡＭＢＥＲ全原子力場（Ｗｅｉｎｅｒ等， Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ．，７：２３０−２５２ （１９８６））を利用したプログラムＤｉｓｃｏｖｅｒ（ＭＳＩ、サンディエゴ）による拘束分子動力学によって続けて精錬されるプログラムＧＤＩＩ（Ｈａｖｅｌ， Ｐｒｏｇ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５６：４３−７８ （１９９１））を用いて構造のファミリーを作成した。得られた構造は単一の全体的な折り畳みに収束する（Ｎ、Ｃ−α、及び残基５−１４のカルボニル炭素についての０．２４±０．０６Åの平均構造からの実効偏差値）。最良の２０モデル（入力データの最小バイオレーション）は入力データと非常によく一致し（０．１Åを超える距離拘束バイオレーション無し、１°を超える二面角バイオレーション無し）、プログラムＰＲＯＣＨＥＣＫ（商品名）で判断されるように良い共有結合配置を有していた（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ等， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｃｒｙｓｔ．， ２６： ２８３−２９１ （１９９３））。
【０１４９】
集合の代表的なメンバー（平均座標に最も近いモデル）を図７に示す。ＩＮＳＩＧＨＴプログラム（ＭＳＩ、サンディエゴ）でのＫａｂｓｃｈ及びＳａｎｄｅｒ二次構造アルゴリズムに従うと、ＩＧＥ０６３は残基５−７及び１２−１４で構成される２つのβ鎖を含み、残基Ｐｒｏ９及びＴｒｐ１０を中心とする逆ターンによって連結し（Ｉ型）；Ａｓｎ４及びＭｅｔ１５は、幾つかのモデルで２つのβ鎖を延長する。Ｎ末端の３つの残基（Ａｓｎ１、Ｌｅｕ２、及びＰｒｏ３）はＮＭＲデータで明確ではなく、残基Ｃｙｓ５−Ｃｙｓ１４よりも溶液中でフレキシブルであるようである。構造は、Ｔｒｐ１２の側鎖がＣｙｓ５及びＣｙｓ１４によって形成されるジスルフィド結合に対して詰められ、Ｔｒｐ１２をＡｌａで置換したペプチドから得られるＮＭＲデータの比較（ＩＧＥ０７３；上記参照）でもわかるようにペプチドの安定性に寄与することを示す。ジスルフィド結合はヘアピン構造の安定化に重要であり；過剰な還元剤ＤＴＴ（ジチオスレイトール）をＮＭＲ試料に添加すると安定した構造は示されない。Ｇｌｙ１１（Ｉ型βターンの４位にある）は正のｐｈｉ角度をとる。この骨格構造は、単にグリシンによって簡単に得ることができ、Ｇｌｙ１１をアラニンに換えたペプチドの構造がなぜ有意に安定性が低いのかを説明する（ＩＧＥ０７４）。しかしながら、Ｇｌｙ１１をＤ−Ａｌａ（ＩＧＥ１０５）又はＤ−Ｇｌｕ（ＩＧＥ１１４）で置き換えたペプチドで分かるように、Ｄアミノ酸は、容易にこの構造をとるだろう。
【０１５０】
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【０１５１】
実施例６
細胞ベースヒスタミン放出アッセイでのペプチド活性
ペプチドをヒスタミン放出アッセイ（Ｌｏｗｅ等， （１９９５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １８４：１１３−１２２）でアッセイして：（１）ペプチドがヒスタミン放出を誘発することができるか、及び（２）ペプチドがブタクサ及びブタクサに特異的なＩｇＥの存在下でヒスタミン放出を抑制するかどうかを決定した。ヒトＦｃεＲＩαサブユニットを発現するラットの好塩基性細胞株ＲＢＬ−４８をＦａｌｃｏｎ９６ウェル平板マイクロタイター皿で一晩培養した。細胞を成長培地で３回洗浄し、次いで１０％のウシ胎児血清及びミリリットル当たり３ＵＳＰ単位のヘパリンを含有するＩｓｃｏｖｅ’ｓ ＭＥＭ培地（ヒスタミンアッセイバッファー）でインキュベートした。
ペプチドＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：２１）、ＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭ （配列番号：３０）、及びＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭ （配列番号：９４）（０．５ｍＭ）をＲＢＬ−４８細胞に加え、ヒスタミン放出についてアッセイした。ヒスタミン放出のレベルを、ヒトＦｃεＲＩラット好塩基細胞でのヒスタミン放出を誘発する能力がペプチド自体に無いことを意味するネガティブコントロールと同等であった。
【０１５２】
次にペプチドＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：２１）、ＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭ （配列番号：３０）及びＤＧＣＡＷＤＧＶＱＭＶＤＣＴＦ （配列番号：９５）をブタクサ誘発性ヒスタミン放出の阻害能力についてアッセイした。１００−０．５ｕＭの濃度範囲のアッセイヒスタミンアッセイバッファー９５ｕＬを含有する９６ウェルマイクロタイター皿で、ペプチドを１：２に連続希釈した。希釈したペプチドをＲＢＬ−４８細胞を含む９６ウェル平板プレートに移し、室温で１５分間インキュベートした後、ブタクサに特異的なＩｇＥ血清５ｕＬを各ウェルに添加した。血清は１０２７ｎｇ／ｍＬの全ＩｇＥ及び４２０ｎｇ／ｍＬのブタクサ特異的ＩｇＥを含んでいた。このプレートをＣＯ２制御インキュベーターで１時間３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、上清を採取してＰＢＳで１／２００に希釈した。放出ヒスタミンレベルを市販のヒスタミンＥＬＩＳＡキット（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社、マルセイユ、フランス）を用いて測定した。放出したヒスタミンのレベルをカレイダグラフ３．０を用いてペプチド濃度に対してプロットした。４パラメータフィットにより曲線をあてはめ、ＩＣ５０値を各ペプチドについて測定した。コントロールペプチドＤＧＣＡＷＤＧＶＱＭＶＤＣＴＦ （配列番号：９５）はヒスタミン放出を抑制する能力を有しなかったが、ペプチドＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：２１）、ＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭ （配列番号：３０）はそれぞれ１０と１３ｕＭのＩＣ５０値を有していた。
これらのデータは、選択されたペプチドがヒスタミン放出を誘発せず、関連する細胞ベースバイオアッセイにおけるブタクサ誘発性のＩｇＥ依存性ヒスタミン放出の抑制に効果があったことを示す。
【０１５３】
実施例７
ＦｃεＲＩ−ＩｇＧに対する更なるライブラリー及び選択
Ｍ１３繊維状ファージでの提示のために２２の未処置のペプチドライブラリーを構築した。各ペプチドライブラリーを、ペプチドの多価提示を可能にするＭ１３ファージの主要コートタンパク質ｐ８に融合させた（Ｓｉｄｈｕ 等， （２０００） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３２８：３３３−３６３）。提示したペプチドの長さは８−２７残基の範囲であった。１７のライブラリーは２−１０の残基間隔で離れているシステイン残基対を導入することによって形成される推定上のジスルフィド拘束ループを含んでいた。また、これらのライブラリーの１つはループ内のグリシン及びプロリンを含み、βターンの形成を順調にするように誘導した。４つの他のライブラリーは複数のシステイン対を含み、コノトキシンペプチドに共通して観察されるシステイン残基パターンに基づいて様々な間隔で導入された（Ｏｌｉｖｅｒａ等， （１９９５） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １３：４２２−４２６）。また、８残基の線状ペプチドライブラリーを構築した。形質転換の数に基づく各ライブラリーの多様性は１０９であると決定された。
【０１５４】
これらのライブラリーからのファージ粒子をＸＬ−１ Ｂｌｕｅ大腸菌で増殖させ、ポリエチレングリコール沈降により精製した。吸着（２ｕｇ／ｍＬ）させて９６マイクロウェルプレートに固定したＦｃεＲＩ−Ｆｃに対してファージ粒子をパニングした。ＦｃεＲＩ−Ｆｃは、ＩｇＧのＣＨ２定常ドメイン領域に融合されたＩｇＥ高親和性レセプターの可溶化形態である。ＦｃεＲＩをコートしたプレート上の非占有部位を０．５％のウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳで阻害した後、ウェルにつき１０１１ファージ粒子を添加した。パニング、溶出、増殖及び再パニングの繰り返しを４回行い、パニングのラウンド終了後すぐに、ウシ血清アルブミンを超えるＦｃεＲＩに対する結合について濃縮のレベルを測定した。濃縮したペプチドライブラリーからの個々のクローンを、ＦｃεＲＩへの特異的結合及びＩｇＥ結合の阻害能力について分析した。
【０１５５】
ＦｃεＲＩ選択の結果
２２のペプチドライブラリーを、固定したＦｃεＲＩ−Ｆｃに対して４ラウンドの間でパニングした。各ラウンドの終了後、ウシ血清アルブミンを超えるＦｃεＲＩ−ＩｇＧ結合について濃縮のレベルを測定した。結合の有意な濃縮はラウンド２まで観察されず、ライブラリー３０１、３０９、５１５、５１６、５１３及び５１４の全てが１０倍を超える増加を有していた。ラウンド３で、ライブラリー３１５、３１８、５１０、５１２、５５３及び５５６に見られるように更なるライブラリーが有意な濃縮を有していた。２つのライブラリー、３０９及び５１５は、ラウンド２で観察されたものよりもラウンド３において低い濃縮であった。
ラウンド１、２及び３でのライブラリーの濃縮倍率
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濃縮ライブラリーの個々のクローンをファージ増殖について選択し、ＦｃεＲＩ−ＩｇＧに対する特異的な結合及びＩｇＥ結合を阻害する能力について分析した。レセプター結合についてポジティブであり、ＩｇＥ結合阻害についてポジティブなクローンは、ライブラリー３０１（Ｘ４ＣＸ２ＧＰＸ４ＣＸ４） （配列番号：２０）、５１６（Ｘ２ＣＸ３ＣＸ２） （配列番号：１０８）、５１０（Ｘ２ＣＸ６ＣＸ２） （配列番号：１１１）、５１２ （Ｘ２ＣＸ８ＣＸ２） （配列番号：１１３）、及び５１３（Ｘ２ＣＸ９ＣＸ２） （配列番号：１１４）で見つかった。これらのクローンの何れも、ウシ血清アルブミンあるいはヒト抗体のＦｃ領域に対して結合を示さなかった。
【０１５６】
ライブラリー５１６ （Ｘ２ＣＸ３ＣＸ２） （配列番号：１０８）由来のクローンのＤＮＡ配列：
ＦｃεＲＩに結合し、ＩｇＥによって阻害される個々のクローン由来のＤＮＡを配列決定し、ペプチドアミノ酸配列を決定した。７つの独自の配列は、Ｘ２ＣＸ３ＣＸ２ （配列番号：１０８）ライブラリーを起源とする全クローンと同一とされた。７つの配列の６つに保存されていたのは、４位のＰｒｏ及び８位のＴｙｒ、（Ｘ２ＣＰＸ２ＣＹＸ） （配列番号：１２０）であった。１つのクローンは６つとは異なり、配列ＬＮＣＳＱＰＣＱＲ （配列番号：１２１）を有していた。残りのクローンの配列は次の通りであった：
ＶＥＣＰＡＶＣＹＶ （配列番号：１２２）
ＱＶＣＰＡＩＣＹＳ （配列番号：１２３）
ＡＩＣＰＡＬＣＹＥ （配列番号：１２４）
ＡＥＣＰＩＭＣＹＳ （配列番号：１２５）
ＳＶＣＰＳＬＣＹＶ （配列番号：１２６）
ＡＬＣＰＥＶＣＹＶ （配列番号：１２７）
ＬＮＣＳＱＰＣＱＲ （配列番号：１２１）
ＬＶＣＰＤＬＣＹＧ （配列番号：２１２）
ＡＥＣＰＬＧＣＹＡ （配列番号：２１３）
【０１５７】
ＣＨＯ細胞ベース阻害アッセイのペプチドＩＧＥ０３５−３８のＩＣ５０
ライブラリー＃５１６由来の選択クローンに基づく６のペプチドを合成し、ＩｇＥ高親和性レセプター、ＦｃεＲＩのアルファサブユニットを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞に対する１２５Ｉ−ＩｇＥ結合阻害の能力をアッセイした。ペプチドを９残基の単量体として合成し、酸化して、環状ペプチドを生じるジスルフィド結合を形成させた。各ペプチドの大きさを質量分析により確認した。
ペプチドＩＧＥ０３５（ＡＬＣＰＥＶＣＹＶ−ｎｈ２） （配列番号：１２８）及びＩＧＥ０３６（Ａｃ−ＡＬＣＰＥＶＣＹＶ−ｎｈ２） （配列番号：１２９）はファージ選択クローンに直接基づいており、ＩＧＥ０５３（ＬＮＣＳＱＰＣＱＲ−ｎｈ２） （配列番号：１３０）及びＩＧＥ０５４（Ａｃ−ＬＮＣＳＱＰＣＱＲ−ｎｈ２） （配列番号：１３１）も同様であったが、一方、他のセットのペプチドでは、ＩＧＥ０３７（ＡＬＣＰＡＶＣＹＶ−ｎｈ２） （配列番号：１３２）、及びＩＧＥ０３８（Ａｃ−ＡＬＣＰＡＶＣＹＶ−ｎｈ２） （配列番号：１３３）は幾つかのクローンのコンセンサス配列に基づいていた。ペプチドＩＧＥ０３５及びＩＧＥ０３６は細胞表面で発現したＦｃεＲＩへの１２５Ｉ−ＩｇＥの結合の阻害活性がない。ペプチドＩＧＥ０３８は、５００ｕＭ未満のＩＣ５０値と非常に弱い。初め、ペプチドＩＧＥ０３７は約３００ｕＭのＩＣ５０値を有する弱い阻害を示したが、この阻害は７−１０日後、時間と共に２５ｕＭ程度の低さになる増大を示した。時間経過に従うこの増大は、他のペプチドでは観察されなかった。
【０１５８】
単量体ペプチドＩＧＥ０３７をホモ二量体に変換するジスルフィド改造
ＩＧＥ０３７の活性の増大はジスルフィド結合の入れ替えと直接関連し、ＩＧＥ０３７のホモ二量体の形成を生じることがわかった。この変化は、中性のｐＨで水又はバッファーにペプチドを可溶化させた後３−１２日の期間でゆっくりと生じる。共有ジスルフィド結合したホモ二量体の形成は、一量体形態の分子よりもむしろ二量体が活性型であることを示す質量分析データにより確かめられた。変化発生の更なる裏付けは、一次元のＮＭＲスペクトルにおいて変化を検出するＮＭＲデータによってなされた。また、ＨＰＬＣ逆相データは、一量体から二量体への変化及び活性と関連する保持時間の変化を示した。活性二量体形成の最終的な高次構造は、平行（ＩＧＥ０８８）及び逆平行（ＩＧＥ０８９）ジスルフィド結合二量体ペプチドの両方の合成を伴う。両方のペプチド形態を、細胞表面発現ＦｃεＲＩに対するＩ１２５−ＩＧＥ結合の阻害能力についてアッセイした。有意な阻害活性は、逆平行（つまり、Ｃ３−Ｃ７’、Ｃ７−Ｃ３’ジスルフィド）形態でのみ見られる。
【０１５９】
ヒスタミン放出及び安全性アッセイ
ペプチドＩＧＥ０８９をＲＢＬ−４８細胞ベースヒスタミン放出アッセイでアッセイし、ペプチドがＦｃεＲＩ結合時にヒスタミン放出を誘発する能力があるか、また、ペプチドがブタクサ誘発性ヒスタミン放出を阻害することができるかを決定した（実施例６参照）。ペプチドＩＧＥ０８９をアッセイして高濃度のペプチドがＦｃεＲＩへの結合時にヒスタミン放出を誘起することができるかを決定した。０．５ｕＭのペプチドＩＧＥ０８９を摂氏３７度で２時間ＲＢＬ−４８細胞と共にインキュベートした。インキュベーションの後、培地をヒスタミンについてアッセイした。ＩＧＥ０８９ペプチド培地におけるヒスタミン放出の量は、コントロールペプチドの培地及びバッファーコントロールの培地で見られるレベルと同等であった。これは、ブタクサ及びブタクサ特異的ＩｇＥを含有するポジティブコントロール培地由来のヒスタミンレベルよりも有意に少なかった。このことは、ペプチドＩＧＥ０８９がＲＢＬ−４８細胞におけるヒスタミン放出を誘発しないことを示した。
ブタクサ誘発を阻害するペプチドＩＧＥ０８９の活性も決定した。ペプチドＩＧＥ０８９を、０．１ｎＭのブタクサ特異的ヒトＩｇＥの存在下で細胞に滴定した。１−２時間後、１０ｎｇのブタクサを添加し、更に３０分間インキュベートした。反応を氷上で停止させ、ヒスタミンのレベルを測定した。ペプチドＩＧＥ０８９は８ｕＭのＩＣ５０でブタクサ誘発性ヒスタミン放出を阻害したが、コントロールペプチドは全く阻害活性を有していなかった。
【０１６０】
実施例８
ペプチドｇ３ファージライブラリー
ファージでの活性形態ＩＧＥ０３７の効果的な生合成を確保するために、９残基「単量体」配列の２つの複製の間に短いＧｌｙＧｌｙＬｙｓリンカーを導入することによって「一本鎖二量体」形態を作成した。リンカー配列をＩＧＥ０３７二量体（ａｋａ ＩＧＥ０８９）のＮＭＲ３次元構造分析に基づいて選択した。１つの単量体のＣ末端が次のＮ末端に連結するのに十分な長さであり、二量体コアの構造が変形しないように十分にフレキシブルであることを目的とした。２次単量体のＮ末端のアミノ基のものを模倣するように正電荷を与えるために、リジンを選択した。ペプチドＩＧＥ０８３ＡＬＣＰＡＶＣＹＶＧＧＫＡＬＣＰＤＶＣＹＶ （配列番号：１３４）はＩＧＥ０８９のこのような一本鎖二量体を示すが、Ａｌａ１７Ａｓｐの単一突然変異を含む。ペプチドのより高い親和性の変異体について選択するために、一価の提示されたＩＧＥ０８３ペプチド−ファージライブラリーのセットをそれぞれランダム化した残基の小さなセットを用いて構築した。これらのライブラリーは、提示されたペプチドとｇ３ｐ断片の間の融合相手として挿入されたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を含むライブラリーもいくつかあることを除いて、前記のようにしてファージミドで構築された。この種のｈＧＨファージミド構築は、一価のディスプレイを作成することが記載されている（Ｂａｓｓ等， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ８， ３０９ （１９９０）； Ｌｏｗｍａｎ等， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０， １０８３２ （１９９１）； Ｌｏｗｍａｎ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３４， ５６４ （１９９３）； 米国特許第５，８２１，０４７号）。ランダム化は、ＮＮＳ変性コドンが組込まれた合成オリゴヌクレオチド（「ハードランダム化」）、又はランダム化される各コドンの中でのヌクレオチドの７０：１０：１０：１０（つまり７０％の野生型ヌクレオチドと１０％の残りの各ヌクレオチド）混合物（「ソフトランダム化」）を用いて実施される（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ等， 上掲）。
【０１６１】
ヒトＦｃεＲＩ（ａａ．１−１７６）のαサブユニットの細胞外ドメインをバキュロウィルス分泌発現系（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて発現させた。このドメインをコードするｃＤＮＡを、完全長クローンを含有するプラスミドのＰＣＲによって得た。ＤＮＡ断片をバキュロウィルス転移ベクターｐＡｃＧＰ６７に結合させ、バキュロウィルスＤＮＡを線状化したバキュロゴールド（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ）と共にバキュロウィルス産生のためのＳｆ９細胞Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ昆虫細胞（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）に形質移入した。可溶性ＦｃεＲＩはバキュロウィルス挿入Ｈｉ−５昆虫細胞の成長培地（発現系）から親和性精製された。
これらのライブラリーの選別条件は、一般的に、免疫吸着プレート上にコートされたＦｃεＲＩを用いた結合選択について（Ｌｏｗｍａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８７， ２４９ （１９９８）； Ｃｈｅｎ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９３， ８６５ （１９９９））に記載されているものに従った。非標的でコートしたプレートに対比した標的でコートしたものから回収されるファージの率によって測定されるので、様々なコーティング及び溶出条件は改善された濃縮を支持するように用いられる。簡略していうと、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを２ｕｇ／ｍＬのＦｃεＲＩ（ジェネンテック社、バキュロウィルス感染昆虫細胞で産生される）を含有するＰＢＳでコートした。コーティングの後、各プレートを適した遮断薬を用いて遮断した。大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）培地で一晩増殖させたファージライブラリーをＰＥＧ沈降で精製し、結合のためにＥＬＩＳＡバッファー（０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）でおよそ１０１０−１０１１ファージ／ｍＬまで希釈した。ファージ結合を典型的に室温で１時間実施した。次いでプレートを上記の０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄した。選別の間のストリンジェンシーを増大させるために、結合したファージを時々可溶性ＦｃεＲＩとインキュベートした。残った結合ファージを、溶出試薬と共にインキュベーションすることによって溶出した。標的コートウェルから溶出した結合ファージの、ＢＳＡコートウェルからの物に対する割合によって濃縮を計測した。幾つかのライブラリーについて、提示ペプチドへの融合タンパク質としてｈＧＨの無くなったファージをスクリーニングするために、ｈＧＨｂｐに対する選別を行った。場合によっては、代表的なクローンを競合ファージＥＬＩＳＡでアッセイした。またペプチドを、優性、コンセンサス、又は親和性の改善された（例えばファージＥＬＩＳＡで測定される）ペプチド−ファージ選択に基づく合成のために作成した（実施例１２参照）。
最初のＩＧＥ０８３ファージライブラリーの選別は、残基１、２、５及び６をランダム化したライブラリーを除いて、濃縮を示さなかった。このライブラリーから、２つの優性なクローン、ＩＶＣＰＲＬＣＹＶＧＧＫＡＬＣＰＤＶＣＹＶ （配列番号：１３５）， ａｎｄ ＶＱＣＰＨＦＣＹＶＧＧＫＡＬＣＰＤＶＣＹＶ （配列番号：１３６）（図１）が同定され、ＩＧＥ０８３ファージに比較して改善された結合親和性を有し；これらの配列は、それぞれペプチドＩＧＥ１２０、及びＩＧＥ１２２（共にアミド形態）に相当した（実施例１２参照）。
【０１６２】
ゼータペプチドＩＧＥ１２０のファージＡｌａスキャン
ファージベースアラニンスキャン研究法（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ等， ＥＭＢＯ Ｊ． １３： ２５０８−２５１５ （１９９４）； Ｌｏｗｍａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８７： ２４９−２６４ （１９９８）参照）を利用してＦｃεＲＩへの結合に重要な側鎖をマッピングした。ペプチドＩＧＥ１２０（ＩＶＣＰＲＬＣＹＶＧＧＫＡＬＣＰＤＶＣＹＶ） （配列番号：１３５）を、下線を付した残基成熟ｇ３ｐの残基２５０−２５７に相当するリンカー配列ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＧＤＹ （配列番号：１３７）によって、バクテリオファージＭ１３のｇ３ｐに融合させて提示した（ｖａｎ Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋ及びＳｃｈｏｅｎｍａｋｅｒｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ６： ２７９９ （１９７９））。
部位特異的突然変異をＫｕｎｋｅｌの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０４， １２５ （１９９１））を用いて実施し、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商品名）を用いたジデオキシＤＮＡ配列決定を利用してクローンを確認した。場合によっては、一本鎖のペプチド−ファージクローンで複数のアラニン置換を生じさせた。また、幾つかの欠失変異体も作成した。Ｃｙｓ側鎖は置換されなかった。
【０１６３】
ファージＥＬＩＳＡアッセイを、記載されるように（Ｌｏｗｍａｎ， １９９８， 上掲）、バキュロウィルス誘導ＦｃεＲＩの２μｇ／ｍＬ溶液でコートしたＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商品名）プレートを用いて実施した。ペプチド−ファージをレセプターの段階希釈と共に５−１０分間プレインキュベートし、次いでレセプターコートプレートに添加した。室温で１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄して抗ファージＨＲＰコンジュゲート抗体（ファルマシア社）を添加した。さらに２０分間インキュベートした後、プレートを再び洗浄し、基質ＯＰＤ（シグマ社）を用いて進行させた。４９２ｎｍの吸光度で読み取り、ＦｃεＲＩ濃度の関数としてプロットし、各ペプチド−ファージ変異体による阻害のＩＣ５０を測定した。
ＩＧＥ１２０のアラニンスキャンの結果を表７に示す。検出できない結合をＰ４、Ｙ８、Ｐ１６、又はＹ２０のＡｌａ置換について観察した。これは結合親和性の欠損に由来するか、これら変異体の構造及び発現又はその両方を欠いている可能性がある。この種のペプチドをのＮＭＲ構造（実施例１１）に基づき、Ｙ８Ａ及びＹ２０Ａ置換は全体的にペプチド構造を破壊することが明らかである。しかしながら、Ｐ４Ａ及びＰ１６Ａ変異体は全ての野生型構造を維持する。従って、これらの側鎖は、レセプターとの接点として関係する。Ｄ１７Ａ突然変異はＩＧＥ１２０に比較して２５倍減少した結合親和性を引き起こし、Ａｓｐ側鎖がレセプター結合に重要であることを示している。試験された全ての残りの側鎖置換は、レセプター結合親和性で２倍未満の効果を示した。特に、アミノ末端の２つの残基での置換又は欠失はほとんど影響はない。
【０１６４】
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【０１６５】
ペプチド−ファージライブラリーの第２の作成はＩＧＥ１２０又はＩＧＥ１２２に基づいて構築された。これらのライブラリーを上記されるようにしてＦｃεＲＩ結合について選択した。ＩＧＥ１２０ファージライブラリー（ＮＢＯ８９５−６１９Ｄ）は、配列ＩＶＣＰＲＬＣＹＥＬＤＹＥＬＣＰＤＶＣＹＶ （配列番号：１５７）を有し、ＩＧＥ１２０に対して約２倍の改善された親和性を有することが分かった（図２）。このライブラリーにおいてペプチドの「リンカー領域」（下線を付した）をランダム化した。
ＩＧＥ１２２ペプチド及びファージは、ＩＧＥ１２０を超える改善された親和性を有することが分かっているので、ＥＬＤＹＥ （配列番号：１５８）リンカー配列をＩＧＥ１２２バックグラウンドに導入させて合成ペプチドを構築した。ＩＧＥ１３４として知られるこのペプチドは、対応ファージ構築物のように、ＩＧＥ１２２を超える改善された親和性を有することを示した（図３）。
ペプチド−ファージライブラリーの第３の作成をＩＧＥ１３４に基づいて構築した。これらのライブラリからの様々なクローンは、ＩＧＥ１３４−ファージと同様の親和性でＦｃεＲＩと結合することが分かった；しかしながら、何れも推定上の結合親和性において約２倍の改善よりも優れていないことが分かった（図４）。
【０１６６】
実施例９
リンカー領域での挿入及び欠失を有するＩＧＥ１３４ライブラリー
一価性に提示されたＩＧＥ１３４ペプチド−ファージライブラリーのセットを様々な長さの「リンカー領域」残基ＥＬＤＹＥ （配列番号：１５８）で構築し、改善された親和性及び代わりの配列を供給することができるペプチドの能力を試験した。
２つのライブラリー、ＨＬ７１８及びＨＬ７１９において、３又は５のランダム残基の挿入をＥＬＤＹＥ （配列番号：１５８）配列に従って設計した。ライブラリーＨＬ７２０及びＨＬ７２１のＥＬＤＹＥ （配列番号：１５８）配列について３又は４ランダム残基を置換することにより短いリンカー領域を構築した。
ＩＧＥ１３４−ｈＧＨ−ｇ３ファージライブラリーは上記（実施例ＩＩ）のようにして構築され、３ラウンドのレセプター選択を施した。ＳｅｑｕｅｎａｓｅＪ又はキャピラリー（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣＥＱ２０００）配列決定を用いてクローンをラウンド３の溶出プールから配列決定し、幾つかをファージＥＬＩＳＡでアッセイした（図５）。
【０１６７】
実施例１０
ゼータペプチドＩＧＥ１３４のファージＡｌａスキャン
ＩＧＥ１２０について前記されるように、ファージベースアラニンスキャンニング法をＩＧＥ１３４のＦｃεＲＩ結合決定基のマッピングに用いた。ペプチドＩＧＥ１３４（ＶＱＣＰＨＦＣＹＥＬＤＹＥＬＣＰＤＶＣＹＶ） （配列番号：１５９）をヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）への融合として提示し、ファージミド構築においてバクテリオファージＭ１３のｇ３ｐのＣ末端ドメインに融合させた（例えばＬｏｗｍａｎ等， １９９３， 上掲参照）。さらに、Ａｌａ突然変異、欠失及び他の置換の組合せを試験した。
ＩＧＥ１３４のアラニンスキャンニングの結果を図６に示す。検出できない結合を２つのジスルフィド結合Ｃｙｓ対、Ｐ４、又はＰ１６のＡｌａ置換について観察した。Ｙ８Ａは、結合親和性において大きな低下（＞５０倍）を引き起こす。これは、結合親和性喪失又は構造及びこれらの変異体の発現又はその両方での欠陥を生じさせることができた。上記されるように、Ｙ８Ａ及びＹ２０Ａ置換はペプチド構造を全体的に破壊するようである。しかしながら、Ｐ４Ａ及びＰ１６Ａ変異体は正準ゼータ構造を維持する。従って、側鎖はレセプターとの接点として関わる。Ｄ１７Ａ突然変異はＩＧＥ１３４に比較される結合親和性の減少を生じず、Ａｓｐ側鎖はレセプター結合にもはや重要でないことを示した（ＩＧＥ１２０参照）。しかしながら、Ｅ１３Ａ／Ｄ１７Ａの二重置換は約１０倍減少した結合親和性を生じ、カルボキシル基はＦｃεＲＩに対する高親和性結合にも必要である。しかしながら、更なる２つの酸性残基（Ｌ１０Ｅ及びＹ１２Ｅ）の付加は親和性を大して変化させない。リンカー領域における酸性残基の多くの突然変異はまた、Ｄ１７Ａと相まって結合親和性の大きな損失を生じる。ＩＧＥ１３４の残基Ｅ１３（ＩＧＥ１２０のＡ１３参照）はＤ１７Ａ突然変異における欠損カルボン酸を補うようである。
これらのデータ、ランダムペプチドライブラリー、及び合成ペプチド結合アッセイの結果に基づき、ＣＰＸＺＣＹＸｎＺＣＰＤＸＣＹ （ここでｎ＝３， ４， 又は５； Ｚ＝高疎水性残基）形態のペプチドは高親和性を有するＦｃεＲＩに結合しうることが期待される。さらに、ＣＰＸＺＣＹＸｎＥＺＣＰＸＸＣＹ（ここでｎ＝２，３， 又は４； Ｚ＝ 高疎水性残基）形態のペプチドは高親和性を有するＦｃεＲＩに結合しうることが期待される。
【０１６８】
実施例１１
ペプチドＩＧＥ１３４のＮＭＲ分析
２−３ｍｇのペプチドを５００ｍＬの９２％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ／８％Ｄ２Ｏに溶解し、次いで０．１ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを６．０に調節することによって、ＩＧＥ１３４（実施例１２参照）のＮＭＲ試料を調製した。２９８Ｋでの１Ｄ ＮＭＲスペクトルのピークは多少広かったので、８％のアセトニトリル−ｄ３を試料に添加し、温度を３０８Ｋまで上昇させた。これらの条件下で、ＮＭＲのピークはかなりはっきりとし、完全な３次元構造の決定をすることができた。化学シフトの有意な変化は見られなかったが、ただ、アセトニトリルを有する試料と有しない試料の間で、コソルベントが構造を混乱させずに非特異的な凝結の範囲を最小化したようである。２次元二量子遷移相関分光法（２ＱＦ−ＣＯＳＹ）、全相関スペクトル（ＴＯＣＳＹ）、核オーバーハウザー効果スペクトル（ＮＯＥＳＹ）、及び回転フレームオーバーハウザー効果スペクトル（ＲＯＥＳＹ）を３０８Ｋで５−ｍｍ３軸パルスフィールド勾配プローブを備えるＢｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−５００分光計によって収集した。Ｃａｖａｎａｇｈ等によって「Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、サンディエゴ：ＩＳＢＮ ０−１２−１６４４９０−１， １９９５）に記載されるようにして実験を記録した。Ｄ２Ｏのペプチドの凍結乾燥及び溶解の後、３５℃混合パルスで獲得される２Ｄ ＮＯＥＳＹ及びＣＯＳＹ−３５スペクトルを得た。完全な１Ｈ共鳴配座は、標準的な方法によってこれらのデータから導かれる（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ， ｉｎ 「ＮＭＲ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ＩＳＢＮ ０−４７１−８２８９３−９， １９８６）。
【０１６９】
ＩＧＥ１３４の明確な３次元構造は、次のようなことから得られた：（１）１Ｈ共鳴位置は構造化されていないペプチドで予測されるものとは有意に異なる。（２）アミドとαプロトンの間のスカラーカップリング定数（２ＱＦ−ＣＯＳＹスペクトルから得られる）は構造化されていないペプチドで得られる平均値と区別される。値は、残基Ｃｙｓ３、Ｔｙｒ８、Ｇｌｕ９、Ｃｙｓ１５、及びＴｙｒ２０について８．５Ｈｚを超え、Ｈｉｓ５、Ｐｈｅ６、Ｃｙｓ７、Ａｓｐ１７、Ｖａｌ１８、及びＣｙｓ１９については６Ｈｚ未満であった。また、ＣＯＳＹ−３５スペクトルのα及びβプロトンの間でスカラーカップリング定数を測定した。これらのデータは、残基Ｐｈｅ６、Ｃｙｓ７、Ｔｙｒ８、Ｇｌｕ９、Ｌｅｕ１０、Ｇｌｕ１３、Ｃｙｓ１５、Ｖａｌ１８、Ｃｙｓ１９及びＴｙｒ２０の側鎖が一定のｃｈｉ−１角度を有することを示す、つまりこれらの側鎖が構造化されていないペプチドにあるｃｈｉ−１回転異性体の範囲をとらない。（３）ＮＯＥＳＹ及びＲＯＥＳＹスペクトルのピークは、主な配列の隣接していない残基の間で多くのプロトン−プロトン接触（＜５Å）があることを示す。これらは、ペプチドが明確な構造に折り畳まれる場合にのみ生じうる。
【０１７０】
ＮＭＲデータを用いて、ＩＧＥ１３４構造の３次元構造モデルを決定するために使用することができる拘束条件を導いた。二面角の拘束は、適したカープラス相関（Ｋａｒｐｌｕｓ， Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ．， ３０： １１−１５ （１９５９））によってアミド−α及びα−βスカラーカップリング定数から導いた。距離の拘束は、ＲＯＥＳＹ又はＮＯＥＳＹスペクトルの空間を通した（ｔｈｒｏｕｇｈ−ｓｐａｃｅ）相互作用を示すプロトンの間で展開され；大きさの上限、及びピークの重複又は共鳴縮退による上限の修正はＳｔａｒｏｖａｓｎｉｋ等， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３５：１５５５８−６９ （１９９６）に記載されるようにした。これらの拘束条件を利用して、ＡＭＢＥＲ全原子力場（Ｗｅｉｎｅｒ等， Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ．，７：２３０−２５２ （１９８６））を利用したプログラムＤｉｓｃｏｖｅｒ（ＭＳＩ、サンディエゴ）による拘束分子力学によって続けて精錬されるプログラムＧＤＩＩ（Ｈａｖｅｌ， Ｐｒｏｇ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５６：４３−７８ （１９９１））を用いて構造のファミリーを作成した。得られた構造は単一の全体的な折り畳みに収束する（Ｎ、Ｃ−α、及び残基３−８及び１５−２０のカルボニル炭素についての０．３５±０．１０Åの平均構造からの実効偏差値）。最良の２０モデル（入力データの最小バイオレーション）は入力データと非常によく一致し（０．１Åを超える距離拘束バイオレーション無し、２°を超える二面角バイオレーション無し）、プログラムＰＲＯＣＨＥＣＫ（商品名）で判断されるように良い共有結合配置を有していた（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ等， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｃｒｙｓｔ．， ２６： ２８３−２９１ （１９９３））。
【０１７１】
集合の代表的なメンバー（平均座標に最も近いモデル）を図８に示す。ＩＧＥ１３４はあまり規則的な二次構造を有していないが、残基４−８及び１６−２０で構成される２つの小さな３１０らせん状ターンが有り、分子の中心の２つのジスルフィド結合で接触している。骨格高次構造は、基本的には残基１５−２０と同じ構造をとる残基３−８とほぼ対称である。らせん状の骨格高次構造は、骨格カルボニル酸素への「二量体接点」を渡るシステインの水素結合を提供する各チロシンヒドロキシルプロトン［Ｔｙｒ８（ＨＨ）−Ｃｙｓ１９（ＣＯ）及びＴｙｒ２０−Ｃｙｓ７（ＣＯ）］と、ジスルフィド「の下にある」チロシンリング（Ｔｙｒ８及びＴｙｒ２０）の強固な集合によって安定化しているようである。Ｔｙｒ２０のＡｓｐでの置換を有するペプチド（ＩＧＥ１５０）は、チロシン側鎖の構造的な役割を示すペプチドのＣ末端の半分で安定構造の喪失を示す。Ｖａｌ１及びＧｌｕ２はＮＭＲデータで不明瞭であり、分子の中心よりフレキシブルなようである。また、残基１０−１３に関わるリンカー領域は、ＮＭＲデータで構造化中心の残基３−８及び１５−２０よりも不明瞭である。
【０１７２】
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【０１７３】
実施例１２
ペプチドの活性と構造分析
ペプチドを合成して、ＩＧＥ０８３、ＩＧＥ１２０、又はＩＧＥ１２２バックグラウンドのファージ誘導置換を試験し、置換の組合せを試験し、又はペプチド−レセプター結合相互作用のより具体的な特徴を試験した。
ペプチドＩＧＥ１３２、ＩＧＥ１４２、ＩＧＥ１４３、ＩＧＥ１４４、及びＩＧＥ１４５、及びＩＧＥ１５６を、タンパク質ＡのＺドメインとの融合（Ｓｍｉｔｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３２， ２８９−２９６（１９９４）； Ｎｉｌｓｓｏｎ等， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４８， ２４１−２５０（１９９６））として生合成的に作成した。大腸菌からの分泌の後、融合タンパク質を精製してＴＰＣＫ処理チロシン（Ｓｉｇｍａ社）で切断し、ペプチドを逆相ＨＰＬＣにより精製した。
構造スコアをあてはめて２Ｄ ＮＭＲ分光計で分析した。これらのペプチドのそれぞれについて、バックボーン１Ｈ共鳴を与え、３ＪＨＮ−Ｈαカップリング定数を測定し、基準ペプチド（つまり、ＩＧＥ１３４）と比較した。ペプチドは、化学シフト、カップリング定数が提供される基準ペプチドと同様の構造であることが同定され、ＮＯＥはその構造と一致する。３ＪＨＮ−Ｈαカップリング定数が基準よりも低い極値（つまり、３ＪＨＮ−Ｈα＞８．５又は３ＪＨＮ−Ｈα＜６Ｈｚ〜６＜３ＪＨＮ−Ｈα＜８．５の範囲までの値になる）である場合、及び／又はバックボーン共鳴の化学シフトが基準に比較してペプチドにおいてランダムコイル値に近い場合に、ペプチドが低い安定性であることが決定される。
【０１７４】
表９
合成ペプチドのＩＧＥ阻害活性及び構造データ（ペプチドＩＧＥ０８８及びＩＧＥ０８９はそれぞれ平行及び共有結合二量体を示す；＋＋＋、基準と構造的に同等；＋、基準と構造的に同等であるが、かなり安定性が低い；＋／−、ペプチドが安定した構造の要素を有するが、構造が基準構造とは異なる；−、ペプチドが大部分構造化されていない；＊ペプチドＩＧＥ０３７は初め構造化されていなかった｛単量体形態｝が、自発的な二量体形成の後に構造化された）
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＊ペプチドは二量体である。配列番号：二量体の各モノマーを説明する。「ａｖａ」＝アミノ吉草酸
【０１７５】
また、幾つかのペプチドを表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて直接結合アッセイで試験した（Ｌｏｆａｓ ＆ Ｊｏｈｎｓｓｏｎ， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２１， １５２６−１５２８ （１９９０））。バキュロウィルス感染昆虫細胞で産生されるＦｃεＲＩαを表面チオール法（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５ａ， ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）で固定した。簡単に説明すると、レセプターを２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミン塩酸塩（ＰＤＥＡ；Ｎａｔａｋｅ ＆ Ｓｗａｉｓｇｏｏｄ， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７４， ７７−８６ （１９７３））とともに反応させ、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で脱塩させ、一定分量を−８０℃で保存した。解凍したＰＤＥＡレセプターを、Ｎ−エチルＮ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、シスタミン、及びＤＴＴで活性化させたカルボキシメチル−デキストラン（Ｂ１又はＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ社）バイオセンサーチップ上に注入した。カップリングの後、チップ上の反応基をＰＤＥＡ及びエタノールアミンでクエンチした。ランニングバッファー（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、０．０１％のアジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝食塩水）中のペプチドの段階希釈物を固定したレセプター上に注入し、定常状態での正味のペプチド結合の量を、ランニングバッファーベースラインに比較したペプチド注入終了の直前の反応（ＲＵ）における正味の変化として測定した。結合親和性（表１０）はペプチド飽和曲線に当てはめた４パラメーターの中心点（ＥＣ５０）として報告する。ＩＧＥ０３４の場合において、示される値は、速度定数、ｋｏｎ及びｋｏｆｆから計算されるＫｄを示す。結合アッセイの結果（表８）は阻害アッセイの結果（表７）とよく相関する。
【０１７６】
表１０
バイオセンサーアッセイからのペプチドの結合親和性（ＥＣ５０値は、ＩＧＥ１３４以外、Ｋｄ（見かけ上）で示す）
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【０１７７】
これらの実験から同定された最も効力のあるペプチドはＩＧＥ１３４及びＩＧＥ１３５であり、阻害アッセイ（表９）においてそれぞれ３２ｎＭ及び４７ｎＭのＩＣ５０平均を有していた。短いペプチドＩＧＥ１５５はＩＧＥ１３４のＮ末端の２つの残基及びＣ末端の残基を欠いており、また、ＩＧＥ１３４の約２倍以内の活性を維持する。切断したペプチドＩＧＥ１７０及びＩＧＥ１７１はＩＧＥ１６７の約２倍以内の活性を維持していた。
ペプチドの「リンカー領域」は、ＩＧＥ０８３で残基ＶＧＧＫＡ （配列番号：２１４）、ＩＧＥ１３２でＶＧＧＨＡ （配列番号：２１５）、ＩＧＥ１３４でＥＬＤＹＥ （配列番号：１５８）ＩＧＥ１３５でＦＧＧＡＥ （配列番号：２１６）、ＩＧＥ１５２でＦＧＡＥ （配列番号：２１７）に相当し、ファージ及びペプチドアッセイによって様々な置換並びに欠失及び挿入を受け入れることが示された。しかしながら、ＩＧＥ１２０とＩＧＥ１４１（活性が２倍異なる）、あるいはＩＧＥ１２２とＩＧＥ１３４、ＩＧＥ１３５、又はＩＧＥ１５２の何れか（活性が約３〜５倍異なる）に比較して、この領域での置換はレセプターへのペプチド結合に影響を有しうることが明確である。
１７位のＡｓｐ残基は、初めＩＧＥ０８３に相当するファージクローンで同定された。この側鎖は、ペプチド−ファージデータ、並びにＤ１７Ｈ置換を有するＩＧＥ１３１のペプチドデータに基づき、レセプター結合に明らかに重要である。このペプチドはＩＧＥ１２２に比較して活性が＞１０倍減少する。しかしながら、興味深いことに、リンカー領域の酸性残基の導入でＤ１７の役割は変化する。例えば、ＩＧＥ１３５及びＩＧＥ１３６はＤ１７Ｇ置換によって異なっているが、活性が約２倍だけ異なる。ペプチド−ファージデータは、ＩＧＥ１３４バックグラウンドのＤ１７Ａについて同様の小さな影響を裏付ける。従って、Ｄ１７のカルボキシル化のためにリンカー領域のカルボキシル化を含む側鎖が置換しうるようである。
【０１７８】
幾つかのペプチドは、レセプター結合のためにゼータペプチドの２つのＰｒｏ残基が重要であることを示す。ペプチドＩＧＥ１２７及びＩＧＥ１４２は、２つの別々の配列においてＰ４Ａ置換を有し、それぞれのコントロールペプチドに比較して５０倍及び＞１００倍減少した活性を示す。これらの影響はペプチド構造を乱さない（表９）ので、レセプターとの接触における変化によるようである。一方、ペプチドＩＧＥ１５９及びＩＧＥ１６２−２におけるようなＰ４のＮ−メチルアラニン（ｎｍＡ）、又はＬ−ピペコリン酸（Ｐｉｐ）の置換は活性において小さな変化を引き起こす。従って、４位はもっぱらＰｒｏである必要はない。同様に、１６位のＰｒｏは、ＩＧＥ１４３の場合のようにＡｌａでの置換が＞１００倍の活性喪失を引き起こすので、レセプター結合にとって重大な残基である。かさねて、ペプチド構造は大して乱されない。しかしながら、ｎｍＡ又はＰｉｐは約３−４倍の活性喪失でＰ１６を置換することができる（ＩＧＥ１５８及びＩＧＥ１６１−２）。
ペプチド−ファージ実験からのデータは、２つのジスルフィド結合（Ｃ３−Ｃ１５及びＣ７−Ｃ１９）及びチロシンＹ８及びＹ２０がレセプターへの高親和性結合にも重要であることを示す。ジスルフィド又はＹ８の実行不可能な置換をファージディスプレイライブラリーから同定することができた。ＩＧＥ１６４、ＩＧＥ１６５、及びＩＧＥ１６６のようなＣｙｓ残基のホモシステイン（ｈＣ）置換（ジスルフィド結合残基のＣａ間の距離を延長する）はそれぞれ有意な活性喪失を引き起こす。Ａｓｐは時々Ｙ２０を置換することがわかった；しかしながら、ペプチドＩＧＥ１５０は、これが約５倍の活性喪失、並びに構造安定性の喪失を引き起こすことを示す。
【０１７９】
実施例１３
ＩｇＥ１３４とＦｃεＲＩの細胞外ドメインとの複合体をサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。複合体（１４ｍｇ／ｍｌ）と平均分子量２０００ダルトンを有する３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（すなわちＰＥＧ ＭＭＥ２０００）、０．２Ｍの硫酸アンモニウム、及び０．１Ｍのクエン酸ナトリウムｐＨ４．２からなる保存液の１：１混合物を用いて懸滴で結晶を成長させた。空間群は、細胞パラメータａ＝２００Å、ｂ＝１５０Å、及びｃ＝１０４ÅのＣ２２２１、非対称単位につき４つの複合体であり、それぞれが他の３つとほぼ等価である。表１２のＡに挙げる各ペプチドとそのレセプターの間に多くの疎水性及びＨ結合相互作用がある。これらの相互作用に加えて、各複合体は隣接ペプチドとそのレセプターに近接し、表１２のＢ、Ｃ、及びＤの部分に挙げられる接点を有する。非対称単位内の他の２つの複合体からなるペプチド接触領域から離れて他のレセプター／レセプター接点がある。これらの接点は表１２に挙げていない。
【０１８０】
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構造は、非対称単位で２つの２：２、ペプチド：レセプター複合体を示す。また、レセプター由来の構築化した糖部分はペプチドと相互作用して結合を促進することが分かった。
【０１８１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＧＥ０８３ファージのライブラリーからＦｃεＲＩ結合について選択されたクローン。下線を引いた残基はランダム化されていた。ラウンド数Ｒは、何回の結合選択サイクルが使用されたかを示す。クローンの数Ｎは、そのアミノ酸配列で同定されたクローンの数を示す。示される野生型（ｗｔ）コントロールに比較して、相対結合親和性（ＩＣ５０／ＩＣ５０（ｗｔ））を測定した。
【図２】ＩＧＥ１２０−及びＩＧＥ１２２−ファージのライブラリーからＦｃεＲＩ結合について選択されたクローン。下線を引いた残基はランダム化されていた。ラウンド数Ｒは、何回の結合選択サイクルが使用されたかを示す。クローンの数Ｎは、そのアミノ酸配列で同定されたクローンの数を示す。示される野生型（ｗｔ）コントロールに比較して、相対的な結合親和性（ＩＣ５０／ＩＣ５０（ｗｔ））を測定した。
【図３】ＩＧＥ１２０、ＩＧＥ１２２及びＩＧＥ１３４の親和性。相対親和性を競合ファージＥＬＩＳＡアッセイ（Ｌｏｗｍａｎ， （１９９８） 上掲）で測定した。
【図４】ＩＧＥ１３４ファージのライブラリーからＦｃεＲＩ結合について選択されたクローン。下線を引いた残基はランダム化されていた。ラウンド数Ｒは、何回の結合選択サイクルが使用されたかを示す。クローンの数Ｎは、そのアミノ酸配列で同定されたクローンの数を示す。示される野生型（ｗｔ）コントロールに比較して、相対結合親和性（ＩＣ５０／ＩＣ５０（ｗｔ））を測定した。
【図５】一価的に提示されたＩＧＥ１３４ペプチドファージライブラリーを様々な長さの「リンカー領域」（残基ＥＬＤＹＥ）で構築して、改善された親和性及び代わりの配列を受け入れるペプチドの能力を試験した。２つのライブラリーＨＬ７１８及びＨＬ１７９のＥＬＤＹＥ配列に続けて３又は５のランダム残基の挿入を作成した。短いリンカー領域をライブラリーＨＬ７２０及びＨＬ７２１のＥＬＤＹＥ配列の３又は４のランダム領域を置換することにより構築された。クローンはラウンド３の選択から示された。
【図６】ＩＧＥ１３４ファージのアラニンスキャン。相対親和性を競合ファージＥＬＩＳＡアッセイで測定した。
【図７】ＩＧＥ０６３の３次元構造。ＮＭＲで導かれた距離及び二面角拘束に基づいて計算された２０構造のアンサンブルの代償的なメンバーの１つが示される。Ａ．骨格の折り畳みを示すリボン状図。Ｂ．明確には示されていない残基１−４及び１５の側鎖のものを除いては、ＩＧＥ０６３の全ての重原子。ＩＧＥ０６３はＩ型ターンを有する安定したβヘアピン構造をもち；Ｎ末端の４つの残基は溶液中で無秩序となる。
【図８】ＩＧＥ１３４の３次元構造。ＮＭＲで導かれた距離及び二面角拘束に基づいて計算された２０構造のアンサンブルの代償的なメンバーの１つが示される。Ａ．骨格の折り畳みを示すリボン状図。Ｂ．ＩＧＥ１３４の全ての重元素。ＩＧＥ１３４は構造中心を形成する２つのジスルフィド結合及びチロシンリングを有するへリックス「ゼータ」高次構造をとる。Ｎ末端（Ｖａｌ１、Ｇｌｎ２）及びリンカー（Ｌｅｕ１０、Ａｓｐ１１、Ｔｙｒ１２）は、ＮＭＲデータで残りの分子よりも明確性が低く、おそらく溶液中においてよりフレキシブルである。
【図９】ＩＧＥ０６３（明るい灰色）及びＩＧＥ１３４（暗い）の構造のオーバーレイ。ヘアピン及びノット（ｋｎｏｔ）ペプチドクラスの非常に異なる２次構造にも関わらず、３次元表面構造のオーバーレイはＦｃεＲＩに結合する潜在的な共通の形態を示す。どちらの場合にも、２つの疎水性及び／又はプロリン含有隆起に隣接する疎水性の溝がある。ＩＧＥ１３４のＰｒｏ１６はＩＧＥ０６３のＰｒｏ９に適格に合わさり、ＩＧＥ１３４のＰｒｏ４及びＰｈｅ６により決定される疎水性隆起はそれぞれＩＧＥ０６３のＶａｌ１３及びＴｈｒ６上に大体重なり、共通の表面特徴を示すようであった。Ｂ．ＩＧＥ１３４の表面図。この図はノットペプチドのプロリン面を見下ろすようにして示されるものから９０°回転したものを示す。残基Ｃｙｓ３、Ｐｒｏ４、Ｐｈｒ６、Ｃｙｓ７、Ｃｙｓ１５、Ｐｒｏ１６及びＣｙｓ１９の側鎖の溶媒接触可能表面は濃い灰色で示され、高親和性ＦｃεＲＩ結合の重要な構造及び機能的要因を含む。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成14年9月27日(2002.9.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【書類名】明細書
【発明の名称】ＩＧＥレセプターアンタゴニスト
【特許請求の範囲】
【請求項１】インビトロアッセイでの高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）結合についてＩｇＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）と競合するペプチドであって、次の式：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
を有し、Ｘａａがアミノ酸であり、ｘが０、１又は２；ｙが３〜１０の間及びｚが０、１又は３であるペプチド。
【請求項２】ｙが３である請求項１のペプチド。
【請求項３】ｙが４である請求項１のペプチド。
【請求項４】ｙが５である請求項１のペプチド。
【請求項５】ｘが０である請求項１ないし４の何れか１項のペプチド。
【請求項６】ｙが０である請求項１ないし４の何れか１項のペプチド。
【請求項７】次の一般式：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｚ
を有し、ｘが０、１又は２、ｙが３、４又は５、及びｚが０、１又は３である、請求項１のペプチド。
【請求項８】次の一般式：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｚ
を有する請求項７のペプチド。
【請求項９】Ｘａａ２及びＸａａ３が高疎水性アミノ酸である請求項８のペプチド。
【請求項１０】Ｘａａ２がＰｈｅ及びＸａａ３がＬｅｕである請求項８のペプチド。
【請求項１１】ＩＶＣＰＲＬＣＹＶＧＧＫＡＬＣＰＤＶＣＹＶ−ｎｈ２ （ＩＧＥ１２０、配列番号：１５９）の配列を有する請求項１のペプチド。
【請求項１２】ＶＶＣＰＮＭＣＹＶＧＧＫＡＬＣＰＤＶＣＹＶ−ｎｈ２ （ＩＧＥ１２１、配列番号：１６０）の配列を有する請求項１のペプチド。
【請求項１３】ＶＱＣＰＨＦＣＹＶＧＧＫＡＬＣＰＤＶＣＹＶ−ｎｈ２ （ＩＧＥ１２２、配列番号：１６１）の配列を有する請求項１のペプチド。
【請求項１４】ＶＱＣＰＨＦＣＹＥＬＤＹＥＬＣＰＤＶＣＹＶ−ｎｈ２ （ＩＧＥ１３４、配列番号：１７１）の配列を有する請求項１のペプチド。
【請求項１５】ＶＱＣＰＨＦＣＹＦＧＧＡＥＬＣＰＤＶＣＹＶ−ｎｈ２ （ＩＧＥ１３５、配列番号：１７２）の配列を有する請求項１のペプチド。
【請求項１６】請求項１のペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項１７】高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）に対するＩｇＥの結合を阻害する方法であって、次の工程：
ａ）ＦｃεＲＩへのペプチドの結合を生じさせることが可能な条件下で請求項１のペプチドを含む組成物とＦｃεＲＩを接触させる工程；及び
ｂ）本発明の化合物が存在する及び存在しない場合のＦｃεＲＩへのＩｇＥ結合の量を測定する工程を含み、化合物が存在しない場合に比較して存在している場合に低いレベルであるＩｇＥ結合が阻害を示す方法。
【請求項１８】高親和性ＩｇＥレセプターへのＩｇＥの結合を阻害する方法であって、次のアミノ酸配列：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚを含み、Ｘａａがアミノ酸であり、ｘが０、１又は２；ｙが３〜１０の間及びｚが０、１又は３であるペプチドとＦｃεＲＩとの接触を含む方法。
【請求項１９】高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）とＩｇＥの相互作用を阻害する分子を選択する方法であって、次の工程：
（１）ＦｃεＲＩへのＩｇＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）の特異的な結合を生じさせることが可能な条件下で候補分子の存在する及び存在しない場合において、ＩｇＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）と競合するペプチドと、ＦｃεＲＩとを接触させる工程；及び
（２）候補分子が存在する及び存在しない場合に生じるＦｃεＲＩへのＩｇＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）の特異的な結合の量を測定する工程を含み、候補化合物が存在している場合のペプチド化合物の結合量が存在しない場合の結合量に比較して少ないことが、ＩｇＥのＩｇＥ媒介活性化を阻害する候補化合物の能力を示す方法。
【請求項２０】高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）の活性化を阻害する方法であって、次のアミノ酸配列：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
を有するペプチドを含む組成物とＦｃεＲＩを接触させることを含み、Ｘａａがアミノ酸であり、ｘが０、１又は２；ｙが３〜１０の間及びｚが０、１又は３である方法。
【請求項２１】接触がインビボである請求項２０の方法。
【請求項２２】接触がインビトロである請求項２０の方法。
【請求項２３】その必要のある宿主においてＩｇＥ媒介疾患又は障害を治療する方法であって、治療的有効量の請求項１のペプチドを宿主に投与することを含む方法。
【請求項２４】請求項１のペプチドと製薬的に許容される担体を含む製薬組成物。
【請求項２５】吸入に適する請求項２４の組成物。
【請求項２６】乾燥粉末である請求項２４の組成物。
【請求項２７】液体である請求項２５の組成物。
【請求項２８】次の一般式Ｉ：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
を有する化合物の３次元表面構造を模倣する化合物を作成する方法であって、
（ａ）一般式Ｉのペプチドを調製する工程、
（ｂ）ペプチドの３次元構造を決定する工程、
（ｃ）ペプチドの３次元表面構造を模倣する化合物を作成する工程を含む方法。
【請求項２９】ＩｇＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）の残基Ｐｒｏ４、Ｐｈｅ６、Ｐｒｏ１６、Ｃｙｓ３、Ｃｙｓ７、Ｃｙｓ１５及びＣｙｓ１９の側鎖によって決定される溶媒接触可能表面を模倣する溶媒接触可能表面を有する化合物。
【請求項３０】表８の構造座標を有するペプチド。
【請求項３１】ＦｃεＲＩに結合し、ＩｇＥの結合を阻害するペプチド模倣体を選択する方法であって、
（ａ）表８の構造パラメータで分子構造データベースを検索する工程；及び
（ｂ）表８の構造パラメータを模倣するデータベースから分子を選択する工程を含む方法。
【請求項３２】配列番号：ＩｇＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）残基Ｐｒｏ４、Ｐｈｅ６、Ｐｒｏ１６、Ｃｙｓ３、Ｃｙｓ７、Ｃｙｓ１５及びＣｙｓ１９の座標を模倣するペプチド模倣体。
【請求項３３】インビトロアッセイでの高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）結合についてＩｇＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）と競合するペプチドであって、次の式：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ７）ｗ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
を有し、Ｘａａ１−６が天然アミノ酸であり、Ｘａａ７が非天然アミノ酸であり、ｘが０、１又は２；ｗが１〜１０及びｚが０、１又は３であるペプチド。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、ＦｃεＲＩと称される免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）に対する高親和性レセプターに結合する新規な化合物、並びにそのような化合物を同定及び調製する方法に関する。特定の態様では、本発明は、本発明の新規な化合物を用いたＩｇＥにより媒介される疾患の治療に関する。本発明はまた、新規な化合物を含む組成物、例えば製薬組成物、並びにＩｇＥ媒介疾患の治療のための研究的、診断的、治療的、及び予防的方法におけるそれらの使用に関する。
【０００２】
（発明の背景）
ＩｇＥはアレルギー疾患において主要な役割を担っている。ＩｇＥ高親和性レセプター（ＦｃεＲＩ）は、アレルギー疾患の多くの症状を作り出す炎症介在物質の更なる放出を促進する抗原性標的として働いている肥満細胞及び好塩基球上にある。
ＩｇＥの媒介する炎症は、肥満細胞上のＦｃＲＩレセプターに取り付くＩｇＥ抗体に抗原が結合したときに生じる。その直後、この結合は肥満細胞を脱顆粒させて、ある種の予備成形媒介物質を放出させる。続いて脱顆粒細胞は、新たに更なる媒介物質の合成及び放出を始める。その結果、２つの段階の反応：血管、平滑筋、及び腺分泌（即時型過敏症）での初期の直接的影響、次に数時間後までに関与部位の細胞浸潤がある。
ＩｇＥ抗体は、各細胞の表面上で多数の高親和性Ｆｃレセプターを介して肥満細胞に結合する。結合は、非共有結合的で可逆的であるため、結合した抗体は循環するＩｇＥのプールと一定の平衡状態にある。その結果、各肥満細胞は多くの異なる抗原と結合することができる。応答は、ＦｃεＲＩレセプターに取り付く２つ以上のＩｇＥ抗体と多価抗体が結合した時に開始される。架橋結合は肥満細胞を活性化するシグナルを伝達して、タンパク質チロシンキナーゼの活性化を生じ、細胞内の遊離カルシウムのレベルを増加させる。その後すぐに、細胞質顆粒は互いに表面膜で融合し、外部にその内容物を放出する。好塩基球もまた、ＦｃεＲＩレセプターを発現するが、即時型過敏反応でのそれらの影響は分かっていない。
【０００３】
炎症反応のこの即時的な段階は、主に肥満細胞の蓄積される媒介物質（特にヒスタミン）、並びにある種の敏速に合成されたアラキドン酸誘導体によって生じる。反応の強度が最大となるのは、最初の抗原の接触から約１５分後である。この段階の特徴は、紅斑、膨疹の形態の局在型浮腫及びそう痒（かゆみ）である。しかしながら、顆粒はまた、血管透過性を助ける血管アドレシンＶＣＡＭ−１（Ｖａｓｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）の局所発現を誘発する。更なる肥満細胞顆粒内容物としては、ＲＡＮＴＥＳ及び他のケモカインを含み、それは白血球及び繊維芽細胞の化学誘因物質活性を有する分子であり、最終的にはその部位の炎症を引き起こす。
後の段階の症状は、部分的には先に合成されたＴＮＦ−αが原因であり、部分的には他の媒介物質（例えば、ＰＡＦ、ＩＬ−４及びアラキドン酸代謝物）が原因であって、その合成は肥満細胞の脱顆粒の後に開始される。これらの媒介物質の影響は、抗原接触の約６時間後に明らかとなり、好酸球及び好中球の浸潤により特徴づけられる。後の段階の症状の特徴は、影響のある部位での紅斑、硬結、熱、そう痒、及び灼熱感を含む。肥満細胞が誘導するＩＬ−４はＴＨ２細胞の生成を促進する。ＴＮＦ−αは、白血球の化学誘因物質として短期間において機能するのみならず、持続性過敏反応の間に血管形成、繊維芽細胞の増殖、及び傷跡の形成もまた促進する。
【０００４】
ＩｇＥ媒介炎症は、アトピー性アレルギー（例えば枯草熱、喘息及びアトピー性皮膚炎）、全身性アナフィラキシー反応及びアレルギー性じんま疹（皮疹）の根底にある機構である。敏速な血管拡張、抗原に接触した部位への循環可溶性因子及び細胞の侵入の促進を引き起こすので、通常は免疫防御の最前線としての役割を果たす。アレルギー疾患の最も破壊的な特性の多くは、肥満細胞自体に由来するものよりも、むしろ化学誘因性白血球の作用によるものである。
様々なペプチドライブラリーの提示（ファージディスプレイ）のためのバクテリオファージ粒子の使用が記載されている（Ｌｏｗｍａｎ， （１９９７） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ２６：４０１−４２４）。ファージディスプレイは、強制的及び非強制的なペプチドライブラリーを作成する方法を提供する（Ｄｅｖｌｉｎ等， （１９９０） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４−４０６； Ｃｗｉｒｌａ等， （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６３７８−６３８２； Ｌｏｗｍａｎ （１９９７） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ２６：４０１−４２４）。これらのライブラリーは、予定標的分子に結合能力のあるペプチドリガンドを同定及び選択するのに使用することができる（上掲のＬｏｗｍａｎ （１９９７））；Ｃｌａｃｋｓｏｎ及びＷｅｌｌｓ （１９９４） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：１７３−１８４； 上掲のＤｅｖｌｉｎ等， （１９９０））。細胞標的に存在し（Ａｒａｐ等， （１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３７７−３８０）；ＩＬ−αの結合を阻害するヒトＩ型インターロイキン１（ＩＬ−１）レセプターに結合し（Ｙａｎｏｆｓｋｙ等， （１９９６） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３：７３８１−７３８６）；サイトカインエリスロポエチン（ＥＰＯ）に対するレセプターに結合及びそれを活性化し（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ等， （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：４５８−４６３）；ヒトトロンボポエチンレセプターに結合して、天然リガンドトロンボポエチン（ＴＰＯ）の結合と競合する（Ｃｗｉｒｌａ等， （１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７６：１６９６−１６９９）、ペプチド修飾を同定するために、又は天然タンパク質結合リガンドから親和性向上又は成熟したペプチドリガンドを生成する（Ｌｏｗｍａ等， （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２−１０８３８）ために、該技術が使用される。
【０００５】
一価のファージディスプレイにより作成された構造的に構築されたペプチドライブラリーを用いて、インシュリン様成長因子１結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）に特異的に結合する１４アミノ酸ペプチドが単離された（Ｌｏｗｍａｎ等， （１９９８）， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３７：８８７０−８８７８）。ペプチドはヘリックス構造を有し、インビボでＩＧＦＢＰに結合してインシュリン様成長因子−ａ（ＩＧＦ−１）活性を遊離する（上掲のＬｏｗｍａｎ等（１９９８））。インビボでのファージ選択を利用して、脳及び腎臓のような種々の器官に選択的局在化に媒介可能なペプチド（Ｐａｓｑｕａｌｉｎｉ及びＲｕｏｓｌｏｈｔｉ （１９９６） Ｎａｔｕｒｅ ３８０：３６４−３６６）、並びにαＶβ３又はαＶβ５インテグリンを担持する特定の腫瘍タイプに帰着するペプチドが同定されている（Ａｒａｐら， （１９９８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７９：３７７−３８０）。米国特許第５，６２７，２６３号には、α５β１インテグリンにより認識され、これと選択的に結合するペプチドが記載されている。親和性又は特異性が改善されたタンパク質の例には、ヒト成長ホルモン、亜鉛フィンガー、プロテアーゼインヒビター、心房性ナトリウム利尿因子、及び抗体が含まれる（Ｗｅｌｌｓ， Ｊ． 及びＬｏｗｍａｎ Ｈ．（１９９２）， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ２：５９７−６０４；Ｃｌａｃｋｓｏｎ， Ｔ．及び  Ｗｅｌｌｓ， Ｊ．（１９９４）， Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １２：１７３−１８４；Ｌｏｗｍａｎ等， （１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０（１０）：８３２−８３８；Ｌｏｗｍａｎ及びＷｅｌｌｓ Ｊ．（１９９３）， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３４：５６４−５７８；Ｄｅｎｎｉｓ Ｍ．及び Ｌａｚａｒｕｓ Ｒ．（１９９４）， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９（２２）：１３７−１４４）。
Ｅ分類の免疫グロブリン（ＩｇＥ）により媒介される場合のアレルギー反応は、喘息及びアレルギー性鼻炎等の疾病状態に関連する。ＩｇＥとその高親和性レセプターの間の相互作用は、このアレルギー反応の重要な段階である。特定のアレルゲンに特異的なＩｇＥ免疫グロブリンは、それらのＦｃ領域を通じて肥満細胞、好塩基球、及び他の細胞上の特異的な高親和性レセプター、ＦｃεＲＩに結合する（Ｉｓｉｓａｋａ等， （１９７０） Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７：６８７−７０２； Ｍｅｔｚｇｅｒ等， （１９８６） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４：４１９−４７０； Ｋｉｎｅｔ （１９９９） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １７：９３１−３７２）。ＩｇＥ結合ＦｃεＲＩの抗原架橋結合は、ヒスタミン、白血球及びプロスタグランジン等のアレルギー反応の媒介物質の肥満細胞脱顆粒及び放出を生じるアレルギーカスケードを開始させる。次にこれらの媒介物質の放出は、血管浸透性及び周囲の細胞への血小板、好酸球及び好中球の浸潤の増大を引き起こす。
【０００６】
ＦｃεＲＩは、高親和性ＩｇＥ結合を与えるα鎖の細胞外ドメインを有する三量体αγ２又は四量体αβγ２構造の何れかとして細胞上に存在する。α鎖の結晶構造は、最近になって解明されている（Ｇｅｒｍａｎ Ｓ． Ｃ．，等 （１９９８） Ｃｅｌｌ ９５：９５１−９６１）。ＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩ複合体形成に寄与する残基を同定するために突然変異誘発の研究が行われている（Ｎｉｓｓｉｍ等， （１９９１） ＥＭＢＯ Ｊ． １０：１０１−１０７）。結合したＩｇＥ−Ｆｃを有するヒトＦｃεＲＩの複合体の結晶構造の報告は、ＩｇＥ−Ｆｃ／ＦｃεＲＩ構造におけるＩｇＥ−Ｆｃのための２つの別々の結合部位を示唆している（Ｇｅｒｍａｎ等， （２０００） Ｎａｔｕｒｅ ４０６：２５９−２６６）。
ＩＧＥのＦｃ部位への抗体の結合は、レセプターへのＩｇＥの結合を阻害することができ（Ｐｒｅｓｔａ等， （１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：２６２３−２６３２； Ｋｏｌｂｉｎｇｅｒ等， （１９９３） Ｐｒｏｔｅｉｍ Ｅｎｇｉｎｎｅｒｉｎｇ ６：９７１−９８０）、インビボで遊離ＩｇＥのレベルを低下させることができる（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ等， Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ． ３：４１９−４２５； ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ等， （１９９７） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｔｒａｎｓ． ２５：３８７−３９２）。
Ｐｒｅｓｔａ等 （１９９３） Ｊ． Ｉｍｕｎｏｌ． １５１：２６２３−２６３２は、ＦｃεＲＩへの遊離ＩｇＥの結合を阻害するが、ＦｃεＲＩに結合したＩｇＥには結合しないヒト化抗ＩｇＥ抗体を記載している。抗ＩｇＥモノクローナル抗体を用いたアレルギー性個体の臨床研究が報告されている（Ｊａｒｄｉｅｕ及びＦｉｃｋ （１９９９） Ｉｎｔｌ． Ａｒｃｈ． Ａｌｌｅｒｇｙ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８８： １１２−１１５）。
その結果、ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合を阻止する分子、ＩｇＥ高親和性レセプターのまた、ＩｇＥ媒介疾患の治療に有効性を有することが期待される。
【０００７】
本発明の化合物は、ＩｇＥに対するＩｇＥ高親和性レセプター（ＦｃεＲＩ）への免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）の会合を阻止又は阻害する化合物及び組成物を提供する。特定の態様では、本発明の化合物は、ＦｃεＲＩのＩｇＥ媒介性活性化を阻止、防止又は減弱する。従って、本発明の特定の態様では、肥満細胞及び好塩基球のＩｇＥ依存性活性化及び脱顆粒、並びにヒスタミンの等の炎症媒介物質の持続放出等のＩｇＥ媒介又は関連段階を抑制するための治療的及び予防的方法に利用できる。有利には、組成物は、ＦｃεＲＩのＩｇＥ媒介活性化を強力に抑制でき、好ましい実施態様では、低用量の製薬とすることができる。
本発明の化合物は、ＦｃεＲＩに結合してＩｇＥの結合を阻止又は阻害する。好ましい化合物は、約１００μＭ未満、あるいは１００ｎＭ未満、あるいは１ｎｍ未満の解離定数、Ｋｄを有するＦｃεＲＩに結合するペプチド模倣体等のペプチド又はペプチド誘導体である。このような化合物の特定の例は、直鎖状又は環状、特に環状のペプチド、好ましくは約１０〜１００の長さのアミノ酸残基、その組み合わせ、Ｎ末端又はＣ末端又は両方で修飾されていてもよいもの、並びにその塩、誘導体、及び機能類似体及びその製薬的に許容される組成物を含む。
【０００８】
特定の実施態様では、本発明に係る化合物は、一般式Ｉを有する又はそれに由来するペプチド又はその模倣体、あるいはＦｃεＲＩの結合において一般式Ｉの化合物と競合するものであり：
式Ｉは
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
ここでＸａａがアミノ酸であり、ｘ、ｙ及びｚが０以上の全ての数、一般的にはｘが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は２であり；一般的にはｙが３〜１０の間の任意の整数であり、一般的にはｚが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は３である。
もう一つの実施態様では、本発明に係る化合物は、一般式ＸＩを有する又はそれに由来するペプチド又はその模倣体、あるいはＦｃεＲＩの結合において一般式ＸＩの化合物と競合するものであり：
式ＸＩは
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ７）ｗ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
ここでＸａａ１−６が天然アミノ酸であり、Ｘａａ７が非天然アミノ酸であり、ｘ、ｙ及びｚが０以上の全ての数、一般的にはｘが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は２であり；一般的にはｗが１、１０、あるいはその間の任意の整数であり、一般的にはｚが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は３である。
本発明に係る化合物の更なる実施例としては、一般式ＩＸに基づいて単離され：
式ＩＸは
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｃｙｓ−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８である。
【０００９】
特定の態様では、本発明は、二量体化又は環化された本発明のペプチドを提供する。二量体又は多量体は、２つの同様の又は相違するペプチドの間であることができ、ペプチド構成成分は、平行又は逆平行の様態の何れかで結合させることができる。
本発明は、
ａ）ＦｃεＲＩへの化合物の結合を生じさせることが可能な条件下で、場合によってはＩｇＥの存在下で、本発明の化合物を含む組成物とＦｃεＲＩを接触させる工程；及び
ｂ）本発明の化合物が存在する及び存在しない場合のＦｃεＲＩへのＩｇＥ結合の量を測定する工程を含み、化合物の存在する場合のＩｇＥ結合が存在しない場合に比較して少ないことによって阻害が示される、高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）へのＩｇＥの結合を阻害する方法を提供する。
さらに本発明は、
ａ）ＦｃεＲＩへの本発明の化合物の特異的な結合を生じさせることが可能な条件下で本発明の化合物の存在する及び存在しない場合において、ＦｃεＲＩと候補化合物を接触させる工程；
ｂ）候補分子が存在する及び存在しない場合に生じるＦｃεＲＩへの本発明のペプチド化合物の特異的な結合の量を測定する工程を含み、候補化合物の存在しない場合の結合量に比較して候補化合物の存在する場合のペプチド化合物の結合量が少ないことによって、ＦｃεＲＩのＩｇＥ媒介活性化を阻止する候補化合物の能力が示される、ＦｃεＲＩのＩｇＥ媒介活性化の相互作用を阻害する化合物の同定ための方法を提供する。
【００１０】
更なる態様では、本発明は、本発明のペプチドの３次元溶液構造を提供する。好ましい３次元溶液構造は、ここで提供されるＮＭＲデータにより提供される。更なる態様は、タンパク質ペプチド複合体の３次元構造を表す回折像を作るためにｘ腺放射を回折する、ＦｃεＲＩに結合するＩＧＦ１３４（配列番号：１５５、１７１）の複合体により形成される結晶を提供する。本発明はまた、前記結晶を含む組成物を提供する。
本発明はまた、
ａ）ＦｃεＲＩと本発明のペプチドを含む水溶液を、沈殿剤を含む保存液と混合して、混合物を形成する工程；及び
ｂ）混合物を結晶化させる工程を含む、ＦｃεＲＩを結晶化させる方法を提供する。
本発明はまた、上記方法により作成される結晶性ＦｃεＲＩ／ペプチド複合体を提供する。
さらに、本発明は、
（ａ）ＦｃεＲＩ／ペプチド複合体を結晶化する工程；
（ｂ）結晶性ＦｃεＲＩペプチド複合体を照射してＦｃεＲＩ／ペプチド複合体に特異的な回折像を得る工程；及び
（ｃ）回折像をＦｃεＲＩ／ペプチド複合体の３次元構造に変換する工程
を含む本発明のペプチドとの複合体におけるＦｃεＲＩの３次元構造を決定するための方法を提供する。
【００１１】
さらに本発明は、適した機械により読み取られる場合に、本発明のペプチドとＦｃεＲＩを含む分子複合体の結晶の３次元表示を示す機械読み取り可能なデータを用いてコードされるデータ蓄積物を含む機械読み取り可能なデータ蓄積媒体を提供する。更なる態様では、本発明は、添付物１に示される構造座標を有するＦｃεＲＩ／ペプチド結晶を提供する。
さらに、本発明は、ＦｃεＲＩペプチドの３次元構造がＦｃεＲＩペプチド結合領域を含む場合の、ペプチド及び／又はペプチドとＦｃεＲＩの複合体の３次元構造の使用方法を提供し、外報府は、ＦｃεＲＩの３次元構造のペプチド結合領域と相互作用する構造を有する化合物、並びにＦｃεＲＩアゴニスト及びアンタゴニストとしての機能の同定を含む。このような方法において好ましいのは、ＦｃεＲＩの３次元構造は添付物１にある構造情報のものと実質的に同一のα炭素配位を含む。
他の態様では、本発明は、
（ａ）ＦｃεＲＩ／ペプチド複合体を結晶化してＦｃεＲＩ／ペプチド複合体結晶を形成する工程であって、ＦｃεＲＩがペプチド結合領域を決定するアミノ酸残基の群を含む工程；
（ｂ）工程（ａ）から得たＦｃεＲＩ／ペプチド複合体結晶を照射してＦｃεＲＩ／ペプチド複合体結晶の回折像を得る工程；
（ｃ）回折像からＦｃεＲＩ／ペプチド複合体の３次元構造を測定する工程であって、外交像がペプチド結合領域を含む工程；及び
（ｄ）ＦｃεＲＩと接触させるペプチド残基の３次元構造を示す重要なＦｃεＲＩ結合残基を機能的に複製する３次元構造を有するＦｃεＲＩアゴニスト又はアンタゴニスト化合物、あるいは化学物質を同定する工程を含むＦｃεＲＩアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法を提供する。
【００１２】
特定の更なる態様に従うと、本発明は、
（ａ）ＦｃεＲＩ／ペプチド複合体の３次元構造を決定する工程；
（ｂ）本発明のペプチドの３次元構造を決定する工程；
（ｃ）ＦｃεＲＩと接触させるペプチドの領域の３次元表面構造を模倣する化合物又は化学物質を作成する工程を含んでなる、ＩｇＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）又は本発明の他のペプチドの３次元表面構造を模倣する化合物又は化学物質、例えばペプチド模倣体等を生成する方法を含む。
更なる実施態様に従うと、本発明は、
（ａ）添付物１に提供される構造パラメータ又は構造座標を有する分子構造データベースを検索する工程；及び
（ｂ）ペプチドの構造パラメータまたは構造座標を模倣するデータベースから分子を検索する工程を含む、Ｆｃεに結合してＩｇＥの結合を阻害するペプチド模倣体を同定する方法を提供する。
本発明はまた、分子複合体の３次元構造の少なくとも一部を決定する方法であって、前記複合体がＦｃεＲＩとペプチドを含み、次の：
（ａ）複合体を結晶化する工程
（ｂ）回折データを集める工程
（ｃ）任意の適した供給源からのフェーズを用いて電子密度地図を計算する工程（ｄ）前記電子密度に基づいて複合体の少なくとも一部を同定する工程を含む方法を提供する。
【００１３】
本発明はまた、ＩｇＥとそのレセプターの間のインビボ又はインビトロ会合を阻害することができ、ＦｃεＲＩ上の結合部位と会合することができる前記方法によって同定される化学物質を提供する。
特定の態様では、本発明は、化合物と、本発明の他の化合物との、あるいは他のタンパク質、特に血清タンパク質又はペプチドとの組み合わせに関する。組み合わせは、様々な目的、例えば；ＦｃεＲＩに対するペプチド化合物の親和性及び結合活性をここに記載されるような種々の多量体ドメインの使用によって増大させること；例えばＺタンパク質融合体等のペプチド化合物を発現させることによるペプチド化合物の安定性の増大又は回収及び精製の促進；ペプチド化合物のインビボ使用に関わる本発明の態様におけるペプチド化合物の治療的効果を、例えば血清半減期を増大又は減少させること、例えば組み換え宿主細胞で簡単に作成されるような血清アルブミン、免疫グロブリン、アポリポタンパク質又はトランスフェリン等の血漿タンパク質へのペプチド化合物の融合により、又は二機能性架橋剤の使用により改善すること；などを意図して調製される。
この発明には、キット及び製造品とともに、プロエイジェント、並びにＩｇＥ媒介疾患又は疾病の治療のためのペプチドのような化合物を含有する製薬的組成物を含んでなる組成物が含まれる。キット及び製造品は、好ましくは：
（ａ）容器；
（ｂ）前記容器上の標識；及び
（ｃ）前記容器に収容される本発明の化合物を含有する組成物；を含み、その組成物はＩｇＥ媒介疾患又は疾病を治療すること関して効果的である。好ましくは、前記容器上のラベルに組成物がＩｇＥ媒介疾患又は疾病を治療するために使用できることを示す。キットには、製薬的に許容される賦形剤と、疾患の治療での組成物の使用のための指示書を含んでなる第２の容器のような付随的構成が含まれてもよい。
【００１４】
また、開示された内容は、特にＩｇＥ又はＦｃεＲＩ複合体の関与によって特徴付けられるアレルギー反応又は応答の治療に有用な方法である。従って、本発明は、本発明の化合物の治療的有効量を宿主へ投与することを含む、それを必要とする宿主のＩｇＥ又はＦｃεＲＩ媒介による疾患又は障害の治療方法を提供する。方法は、ＩｇＥ又はＦｃεＲＩの関連する活性現象の予防、阻止又は阻害にとって有用である。好ましい実施態様では、アレルギー反応が関与する組織傷害の重症度又は程度を緩和あるいは予防するために、本発明の方法を用いる。
さらに本発明は、限定されるものではないが、化合物の非経口的、経口的、直腸及び肺投与に適した剤形を包含する本発明の化合物の種々の剤形を提供する。本発明の好ましい側面では、治療的剤形は吸入に適したものとして提供され、本発明は、本発明の化合物の肺投与を経由する、ＦｃεＲＩの活性化のようなＩｇＥ媒介又は関連プロセスあるいは現象が関与する障害や疾患の治療的処置を提供する。より特別には、本発明は、本発明の化合物、特に吸入によるペプチド化合物の肺投与に向けられている。従って、本発明は、本発明の化合物の量を含んでなるエアロゾル製剤、より特異的には、ＩｇＥ媒介又は関連プロセスあるいは現象を効果的に阻止又は防ぐ本発明のペプチド及び分散剤を提供する。一実施態様では、本発明の化合物、特に本発明のペプチド化合物は、液体エアロゾル製剤として提供することが可能である。あるいは、この化合物は、乾燥粉末エアロゾル製剤として提供することができる。従って、本発明によると、製剤は、ＩｇＥ媒介あるいは関連現象の治療のための本発明の化合物の他の非経口的なルートの投与に対する有効で非侵襲的な代替法を提供するものとして提供されている。
さらに他の態様では、本発明は、罹患している患者のＩｇＥ媒介疾患を治療する、本発明の化合物の治療的有効量を含有する組成物の患者への投与を含む方法を提供する。特定の態様では、ＩｇＥ媒介疾患はアレルギー性鼻炎、喘息（アレルギー喘息）、アトピー性皮膚炎、じんま疹−血管性浮腫、寄生虫感染、ＩｇＥ骨髄腫、ＩｇＥ媒介消化管炎症疾患及び移植片対宿主反応からなる群から選択される。他の特定の態様では、投与方法は皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内又は関節内経路によって注射又は注入することができる。
【００１５】
（好適な実施態様の詳細な説明）
（定義）
特許請求の範囲及び明細書で使用する用語は、当分野の通常の技術者によって理解されるような通常の定義を有する。他の用語は、特に断らない限り以下に記載するように定義される。
ここで使用されるように、「エアロゾル」という用語は、気体のサスペンションを意味する。特に、エアロゾルは、本発明の製品の粒子化及び気体へのそのサスペンションに関する。本発明によれば、エアロゾル製品は、エアロゾル化に適した本発明の化合物、例えば吸入又は肺投与のための粒子化及び気体へのサスペンションを含む製品である。
「薬剤」及び「化合物」という表現は本発明の範囲内では交換可能に使用され、ＦｃεＲＩと本発明のペプチド化合物の間の相互作用を阻止又は防ぐすべての分子又は物質を含むことを意味する。このような分子は、小型有機及び生物有機分子、例えば、ペプチド模倣体、ペプチド類似体、抗体、イムノアドヘシン、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、製薬剤及びそれらの代謝物、及び類似物を含む。
【００１６】
本発明の好ましい化合物は、本発明のペプチド化合物のペプチド類似体又は模倣物を含む。これらは、例えば、ここで記載されているように化合物が、結合してＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合を抑制または阻害する能力を保持するとすれば、非天然発生アミノ酸を含有するペプチドを含む。同じように、ペプチド模倣体及び類似体は、本発明のペプチド化合物の構造を模倣し、ここに記載されているような結合してＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合を抑制または阻害する能力を保持する非アミノ酸化学構造を含みうる。このような化合物は、同じような物理的特徴、例えば大きさ、ペプチド化合物の対応物に見出される適切な空間的配向に存在する電荷や疎水性を示すことで一般的に特徴付けられる。ペプチド模倣化合物の特異的な例は、例えば、１つ又は複数のアミノ酸の間のアミド結合が当該分野において良く知られている炭素−炭素結合又は他の結合によって置換されている化合物である（例えば、Ｓａｗｙｅｒ， ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ｐｐ． ３７８−４２２（ＡＣＳ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， １９９５）を参照のこと）。
用語「ＩｇＥ媒介」又は「関連」疾患又は障害は、ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合から生じる又はそれに関連する症状を意味する。ＩｇＥ媒介又は関連疾患又は障害は、例えば、これに限定する物ではないがアレルギー性鼻炎、アレルギー喘息、例えば季節性花粉（イネ科草本；ライ麦、チモシー、ブタクサ）及び木（カバノキ）等の特定のアレルギー因子に関連する喘息、通年性アレルギー、例えばホコリダニ、動物のフケ、羽毛及び菌類胞子及び職業性抗原、例えば洗浄剤及び金属並びに非抗原特異的因子、例えば感染、煙、蒸気ディーゼル排気微粒子及び二酸化硫黄等の刺激に関する喘息、気道冷却（運動、冷えた気温）及び情緒的なストレスに関する喘息；アトピー性皮膚炎及びアレルギー性胃腸症並びに全身性アナフィラキシー、及び食物、毒液、ワクチン、ホルモン、抗血清、酵素、ラテックス中のタンパク質に対する反応、抗菌物質、筋弛緩剤、ビタミン、細胞毒及びオピエートを含むハプテンに対する反応、及びデキストラン、鉄デキストラン及びポリゲリン（ｐｏｌｙｇｅｌｉｎｅ）等の多糖類に対する反応を含むアナフィラキシー性の疾患及びじんま疹血管性浮腫等の他のアナフィラキシー性の疾患又は障害を含むＩｇＥ抗体及び肥満細胞媒介物質により引き起こされるアレルギー疾患を含む。
【００１７】
「ＩｇＥ媒介消化管炎症疾患」は、例えばＩｇＥに影響される病理により特徴づけられる、又は病理から生じる傷害又は感染により引き起こされるもののような様々な障害に対するホストの広範な反応に対する難治性慢性的応答のように広く定義される。この用語の範囲内に含まれる特定の疾患としては、炎症性腸疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、不定大腸炎及び感染性大腸炎）、胃腸症（ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ）、腸炎、粘膜炎（例えば、口内炎（ｏｒａｌ ｍｕｃｏｓｉｔｉｓ）、消化管粘膜炎、鼻粘膜炎及び直腸炎）、壊死性全腸炎及び食道炎を含む。
本発明の特定の態様において使用されるところの「多量体化ドメイン」なる用語は、直接又は「リンカードメイン」を介して化合物、特にペプチド化合物が結合する分子の一部を指すことを意味する。多量体化ドメインは、好ましい実施態様では、２又はそれ以上の多量体化ドメインの相互作用を容易にするアミノ酸ドメインである。多量体化ドメインは２又はそれ以上の多量体化ドメインの間の相互作用を促進するが、本発明では、多量体化ドメインに結合するペプチドが多量体の一部として存在している必要性はない。
本発明の好ましい態様では、多量体化ドメインは、２又はそれ以上の多量体化ドメインの安定した相互作用を促進させるポリペプチドである。例えば、限定するものではないが、多量体化ドメインは免疫グロブリン配列、例えば免疫グロブリン定常領域、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、２又はそれ以上の多量体化ドメイン間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを含有するポリペプチド、又は例えば米国特許第５７３１１６８号に記載されている「キャビティ中突起（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ）」ドメインであってよい。前記特許では、突起は、第１ポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）で置換することにより形成される。突起に対して同一又はより小さなサイズの相補的キャビティは、大きなアミノ酸側鎖を小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）で置換することにより、第２ポリペプチドの界面に任意につくり出される。
【００１８】
よって、好ましい態様では、多量体化ドメインは、２又はそれ以上の多量体化ドメインの安定した相互作用を促進するか、これを可能にし、モノマー性多量体ドメインからのダイマーと他の多量体の形成を促進させるか、これを可能にする分子の一部を提供する。好ましくは、本発明のこの態様では、多量体化ドメインは免疫グロブリンの定常領域ドメインである。免疫グロブリンの定常ドメインは、本発明の化合物のインビボ循環半減期を改善し、場合によっては、当業者をして、以下に記載する「エフェクター機能」を本発明の所定の態様に導入することを可能にするという利点をもたらす。
本明細書と特許請求の範囲を通して、免疫グロブリン重鎖中の残基の番号付けは、ここにＫａｂａｔ等， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ （１９９１）（開示によりここに取り込まれたものとみなす）のＥＵインデックスのものである。「ＫａｂａｔのＥＵインデックス」とはヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
ここでの使用において、用語「非経口」は、腸以外で、特に静脈内（ｉ．ｖ．）、動脈内（ｉ．ａ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、脳室内、及び皮下（ｓ．ｃ．）経路で体内に本発明の化合物を取り込むことを意味する。
【００１９】
ここで使用される用語「ペプチド」は、束縛された（即ち、例えば、βターン又はβプリーツシートを開始するアミノ酸の存在のような構造の要素を有する、又はジスルフィド結合されたＣｙｓ残基の存在により環化された）あるいは非束縛（例えば線状）アミノ酸配列を意味し、約５０アミノ酸残基、好ましくは約４０アミノ酸残基未満であり、それ又はその間の二量体などの多量体を含む。約４０アミノ酸残基未満のペプチドの中で、好ましくは約１０から約３０アミノ酸残基のペプチド、特に約２０のアミノ酸残基のペプチドである。しかしながら、この開示を読むに当たり、当業者は、ペプチドを識別するのは特定のペプチドの長さではなく、結合してＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合を抑制または阻害する能力及びここに記載のペプチド化合物との結合競合能力であることを理解するであろう。従って、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４及び２５アミノ酸残基は、本発明の内容において等しく化合物であり得る。
他のペプチド化合物は、免疫原ポリペプチド、例えば、ベータラクタマーゼ等の細菌性ポリペプチド又は大腸菌Ｔｒｐ位置にコードされる酵素又は酵母タンパク質、プロテインＡのＺドメイン等の他のポリペプチド、及び免疫グロブリン定常領域又は他の免疫グロブリン領域等の長半減期を持つタンパク質とのＣ−末端融合物、アルブミン、又は１９８９年４月６日に公開された国際公開第ＷＯ８９／０２９２２号公報に記載されたフェリチンの、ここに述べた化合物の−又はＣ−末端への融合物を含む。さらに、アミノ酸残基の側鎖上の遊離の官能基も、アミド化、アシル化又は、例えば、化合物の溶解性をその活性に影響を与えず変化させることのできる他の置換によって修飾することができる。「Ａｃ−」は、例えばＣＨ３ＣＯ−修飾Ｎ末端を示し、「−ｎｈ２」又は「−ＮＨ２」は −ＮＨ２修飾Ｃ末端を示す。
【００２０】
本発明の内容での特定のペプチドは、非天然発生アミノ酸配列である。非天然発生により、アミノ酸配列が自然に見られないことを意味する。好ましいのは、約１０から３０アミノ酸残基、好ましくは約２０アミノ酸残基の非天然発生アミノ酸配列である。これらは、ペプチド、ペプチド類似物及び模倣物を含み、天然又は非天然発生アミノ酸を含む。特定の態様では、本発明のペプチドは天然発生アミノ酸のみからなるアミノ酸残基を含む。
非天然アミノ酸の例は、Ｃ１−１０アルキル、Ｃ１−１０シクロアルキル及び芳香族アミノ酸を含む。特定のアルキル非天然アミノ酸は、β−アラニン、４−アミノ酪酸、５−アミノ吉草酸、６−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、８−アミノカプリル酸等、及びその異性体を含む。特定のシクロアルキル非天然非天然アミノ酸は、１−アミノ−シクロプロパンカルボン酸、１−アミノ−シクロブタンカルボン酸、１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸、１−アミノ−シクロヘキサンカルボン酸、ｃｉｓ−４−アミノシクロヘキサンカルボン酸、ｔｒａｎｓ−４−アミノシクロヘキサンカルボン酸、ｃｉｓ−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸、ｔｒａｎｓ−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸等、及びその光学及び化学異性体を含む。特定の芳香族非天然アミノ酸は、２−アミノ安息香酸、３−アミノ安息香酸及び４−アミノ安息香酸等を含む。
【００２１】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００２２】
ここで使用されるように、「肺投与」という用語は、吸入により肺を通しての本発明の製品の投与を意味する。ここで使用されるように、「吸入」という用語は、肺胞への気体の吸気を意味する。特定の実施態様では、取り込みは、本発明の製品の自己投与により、又は、例えばレスピレータを使用する患者に対してのレスピレータを介しての投与により生じうる。本発明の製品に関して使用される「吸入」という用語は、「肺投与」と同義である。
本発明の文脈内で使用される「治療」とは、治癒的処置並びに予防的、又は疾患又は障害の抑制的手段を含んで意味する。従って、例えば治療という用語は疾患又は障害の発症の前に又は後に薬剤を投与すること、よって疾患又は障害の全ての症状を予防又は取り除くことを含む。他の例として、疾患の症状に対処するための疾患の臨床症状後の薬剤投与は疾患の「治療」を含む。例えば、肥満細胞又は好塩基球、組織傷害、炎症からの炎症媒介物質（例えば、サイトカイン）放出の放出範囲又は白血球輸送の量。他の方法は、ＩｇＥ媒介性障害の「治療」の指標となる他の手段は、高親和性ＩｇＥレセプター（例えば、肥満細胞又は好塩基球に存在するもの）へのＩｇＥの結合が抑制される範囲を測定することである。「治療を必要とする」ものは、既に疾患又は障害を有している哺乳動物、例えばヒトを含み、疾患又は障害が予防されるべきものを含む。
【００２３】
「有効量」は高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）に結合するＩｇＥレセプターアンタゴニストペプチドの能力を抑制する、低下させる又は低下を引き起こす前記ペプチドの最少量以上である。「治療的有効量」は、ＩｇＥ媒介疾患に関する病理症状を減弱する又は排除する、あるいは病理状態を改善するＩｇＥレセプターアンタゴニストペプチドの最少濃度以上である。例えば、炎症媒介物質（例えば、ヒスタミン）、遊離ＩｇＥ、高親和性レセプターへのＩｇＥ結合、炎症、組織傷害の量的レベル又は白血球輸送の量。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
「活性」は、本発明の予定化合物がＦｃεＲＩに結合することを意味する。さらに、活性である化合物はまた、ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合を抑制又は減弱する。ＦｃεＲＩへのＩｇＥの結合の抑制は、肥満細胞又は好塩基球上のＩｇＥによるＦｃεＲＩの活性化の結果生じた細胞媒介物質の減少（例えばヒスタミンの放出）を試験することにより測定することができる。
【００２４】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。免疫接着分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３又はＩｇＧ−４サブタイプ、ＩｇＡ（ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２を含む）、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
ここで使用される用語「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばウシ（例えば、乳牛）、ウマ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ヤギ、ネコなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
１つ又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商品名）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商品名）及びヒアルロン酸（ＨＡ）を含む。
【００２５】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（例えば本発明のＩｇＥレセプターアンタゴニストポリペプチド）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
「高（ｌａｒｇｅ）疎水性アミノ酸」は、アミノ酸であり、疎水性である分子であるアミノ酸（天然又は非天然を含む）であり、これらの用語は当分野の通常の技術者に容易に理解される。さらに、特徴を示す「高（ｌａｒｇｅ）」は、小さな物理的サイズであるような他のアミノ酸の側鎖に比較してより大きな物理的サイズであるものとして側鎖を説明している。側鎖の物理的特（例えば、疎水性、極性、電荷、酸性又は塩基性の特徴など）に基づくアミノ酸残基の分類に共通である。この定義の分類に入るアミノ酸に共通する特徴は、疎水性である性質を共有し、大きな物理的サイズの側鎖を有するものである。この定義の分類にはいるアミノ酸の非限定的な例は、トリプトファン、フェニルアラニン、ナフチルアラニン、ロイシン、イソロイシン、オクタヒドロインドール、テトラヒドロイソキノリン等である。
【００２６】
ＩＩ．本発明の実施の形態
本発明は、一般式Ｉを有する又はＦｃεＲＩの結合において一般式Ｉの化合物と競合するペプチド又はペプチド模倣体等を含む化合物を提供する。
式Ｉ
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
Ｘａａがアミノ酸であり、ｘ、ｙ及びｚが０以上の全ての数、一般的にはｘが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は２であり；一般的にはｙが３〜１０の間の任意の整数、あるいは３、４又は５であり、一般的にはｚが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は３である一般式Ｉのペプチド化合物が好ましい。例えばｘ及びｚが０のとき、本発明は一般式ＩＩを有する化合物を提供する。
式ＩＩ
Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６
【００２７】
式Ｉ及びＩＩのペプチド化合物は、（Ｘａａ）ｙを３〜１０のアミノ酸残基の式で示すアミノ酸ドメインを含む。特定のペプチド化合物は、ｙが３、４、５、８、又は１０、あるいは３、４又は５、あるいは５であるアミノ酸ドメイン（Ｘａａ）ｙを含む。一般式１のペプチド化合物において、本発明は次に示す一般式の何れか１つの有するペプチド化合物を提供する：
式ＩＩＩ
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｘａａａ−Ｘａａｂ−Ｘａａｃ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
式ＩＶ
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｘａａａ−Ｘａａｂ−Ｘａａｃ−Ｘａａｄ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
式Ｖ
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｘａａａ−Ｘａａｂ−Ｘａａｃ−Ｘａａｄ−Ｘａａｅ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
一般式ＩからＶの化合物について、Ｘａａ６がＴｈｒである一般式ＶＩの化合物が提供される：
式ＶＩ
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｚ
ここでｘは０、１又は２であり、ｙは３、４又は５、あるいは５であり、ｚは０、１又は３である。
【００２８】
ある実施態様によれば、Ｘａａ４がＡｓｐである一般式ＶＩＩの化合物を提供する：
式ＶＩＩ
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｚ
ここでｘは０、１又は２であり、ｙは３、４又は５、あるいは５であり、ｚは０、１又は２である。
ある実施態様によれば、Ｘａａ２及びＸａａ３が高疎水性アミノ酸である一般式ＶＩＩＩの化合物を提供する：
式ＶＩＩＩ
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−ＬＨＲ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−ＬＨＲ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｚ
ここでＬＨＲは高疎水性アミノ酸、例えばＰｈｅ又はＬｅｕであり、Ｘａａ４はＡｓｐであって、ｘは０、１又は２で有り、ｙは３、４又は５、あるいは５であり、ｚは０、１又は３である。
本発明のさらに好ましい化合物は一般式ＩＸの化合物を含む：
式ＩＸ
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１０−Ｘａａ１１−Ｘａａ１２−Ｘａａ１３−Ｃｙｓ−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８
【００２９】
このグループの好ましい化合物は、例えば実施例１−６に詳細に説明される、特に表５の記載されるようなペプチド化合物である。実施例は、式ＩＸのＸａａ１０がＴｒｐであり、Ｘａａ１１がＧｌｙであり、Ｘａａ１２がＴｒｐであるペプチドを含む：
式Ｘ
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−Ｘａａ７−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｘａａ１３−Ｃｙｓ−Ｘａａ１５−Ｘａａ１６−Ｘａａ１７−Ｘａａ１８
本発明のこの態様によれば、Ｎ及びＣ末端の欠失を有する一般式ＩＸ及びＸＩのペプチドもまた好ましく、例えば、Ｘａａ１を欠いていてもよい一般式ＩＸ及びＸの化合物が本発明の文脈において好ましい化合物である。同様に、ペプチドのＣ末端における１〜３のアミノ酸の欠失は、本発明の好ましい化合物を生じる。
別の実施態様では、本発明に係る化合物は、一般式ＸＩを有する又はそれに由来するペプチド又はその模倣体、あるいはＦｃεＲＩの結合において一般式ＸＩの化合物と競合するものであり：
式ＸＩは
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ７）ｗ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
ここでＸａａ１−６が天然アミノ酸であり、Ｘａａ７が非天然アミノ酸であり、ｘ、ｙ及びｚが０以上の全ての数、一般的にはｘが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は２であり；一般的にはｗが１、１０、あるいはその間の任意の整数であり、一般的にはｚが５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は３である。
【００３０】
一般式Ｉ〜ＸＩの全ての化合物は本発明のペプチド化合物の例示であり、本発明は、該化合物が大きい化合物又は組成物の一部を構成している組成物を含む。例えば、一般式Ｉのペプチド化合物は、他のペプチド化合物に、又は他のタンパク質又はポリペプチドと、Ｎ又はＣ末端あるいはその両方を介して、あるいは側鎖を通じて該化合物が結合又は融合された融合タンパク質の一部を構成しうる。
本発明のこの態様によれば、化合物は、様々な目的、例えば；ＦｃεＲＩに対するペプチド化合物の親和性及び結合活性をここに記載されるような種々の多量体ドメインの使用によって増大させることを意図して調製される。本発明のこの実施態様では、化合物は、好ましくはそのＮ又はＣ末端を介して他のタンパク質又はペプチド、例えば免疫グロブリンに融合又は結合される。従って、本発明は、免疫グロブリンドメイン、例えば免疫グロブリン定常領域に融合又は結合された一般式Ｉ〜ＸＩの化合物を含有するハイブリッド免疫グロブリンタンパク質を提供する。更なる態様によれば、一般式Ｉ〜ＸＩの化合物は、例えばＺタンパク質融合体等のペプチド化合物を発現させることによって、ペプチド化合物の安定性を増大させる又は回収及び精製を促進する目的で他のタンパク質に融合又は結合されうる。本発明の更なる態様には、ペプチド化合物のインビボ使用に関わる本発明の態様における化合物の治療的効果を改善する目的で、一般式Ｉ〜ＸＩの化合物が作成される化合物又は組成物を含む。例えば、化合物の血清半減期が、免疫グロブリン、アポリポタンパク質又はトランスフェリン等の血漿タンパク質へのペプチド化合物の融合又は結合により調節されうる。あるいは、一般式Ｉ〜Ｘの化合物は、同様にアルブミン又は免疫グロブリンのような血清タンパク質に結合するペプチド等の他の小有機分子又は生物有機分子に融合又は結合されうる。
【００３１】
通常、化合物は次の配列：
Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ（配列番号：１５５、１７１；ＩｇＥ１３４）を有するペプチドと、インビトロアッセイにおける高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）への結合について競合する。
本発明は、
ａ）ＦｃεＲＩへの化合物の結合を生じさせることが可能な条件下で、場合によってはＩｇＥの存在下で、本発明の化合物を含む組成物とＦｃεＲＩを接触させる工程；及び
ｂ）本発明の化合物が存在する及び存在しない場合のＦｃεＲＩへのＩｇＥ結合の量を測定する工程を含み、化合物の存在する場合のＩｇＥ結合レベルが存在しない場合に比較して低いことにより阻害が示される、高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）へのＩｇＥの結合を阻害する方法を提供する。
【００３２】
本発明はさらに、高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）へのＵｇＥの結合を阻害する方法であって、Ｘａａがアミノ酸である、次のアミノ酸配列を有するペプチドとＦｃεＲＩとの接触を含む方法を提供する：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
ここでｘは０（ゼロ）以上の全ての数字、一般に５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は２であり；ｙは３〜１０の間、あるいは３、４又は５であり、ｚは０（ゼロ）以上の全ての数字、一般に５０未満、あるいは２０未満、あるいは１０未満、あるいは０、１又は３である。
本発明の更なる態様では、本発明は、高親和性ＩｇＥレセプター（ＦｃεＲＩ）へのＩｇＥの相互作用を阻害する分子を選択する方法であって、
（１）ＦｃεＲＩへのＩｇＥ１３４の特異的な結合を生じさせる条件下で候補分子の存在する場合と存在しない場合においてＩｇＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）とＦｃεＲＩを接触させる工程；
（２）候補分子の存在する場合と存在しない場合において生じるＦｃεＲＩへのＩｇＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）の特異的な結合の量を測定する工程を含み、候補化合物の存在する場合での低い結合レベルによってＦｃεＲへのＩｇＥの結合を阻害する能力が示される方法を包含する。
【００３３】
Ａ．ペプチド及び類似体の構造分析
ペプチド化合物の３次元構造は、核磁気共鳴分析法（ＮＭＲ）又はＸ線結晶構造解析を用いて決定することができる。ＮＭＲから導かれる構造情報又はペプチド結晶構造は、小分子及び生物有機分子、例えばＦｃεＲＩに結合する、好ましくはＩｇＥ媒介又は関連結合又は現象を阻害又は抑制する合成有機分子及びペプチド模倣体等を同定するのに利用することができる。このような構造に基づく化合物構築へのアプローチの例は、（「構造に基づく薬剤作成（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ）」Ｐａｎｄｉ Ｖｅｅｒａｐａｎｄｉａｎ， 等Ｍａｒｃｅｌｌ Ｄｅｋｋｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９７）に記載されている。
この態様によれば、本発明は、例えば一般式Ｉ及びＸＩの化合物によって提供される溶媒接触可能表面を模倣する３次元構造を示す化合物を提供する。一例としては、本発明のペプチドの３次元構造を決定すれば、熟練技術者はペプチドの模型、例えば図７及び８に示されるようなものを構築できる。ペプチドの全ての原子は適切なファンデルワールス半径の球状範囲として示すことができるので、折り畳まれたペプチドの詳細な表面地図を作ることができる。「溶媒接触可能表面」は、化学プローブ、ここでは水分子に接触可能な表面であり、ファンデルワールス表面との接触を維持してペプチドの外側で適切な半径の水分子を回転することによって構成される。水分子の表面に接触するファンデルワールス表面のこれらの部分は、「溶媒接触可能表面」として知られる連続面を決定する（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔｈｏｍａｓ Ｅ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， 第２版 Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９８４， ｐｐ２２７−２２９）。従って、本発明は、一般式Ｉ及びＸＩのペプチドにより説明される溶媒接触可能表面を模倣する溶媒接触可能表面、特に、例えばＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）及びＩＧＥ０６３（配列番号：４９）の有するペプチドを示す溶媒接触可能表面を示す化合物を提供する。
【００３４】
ペプチド化合物の溶媒接触可能表面を模倣する溶媒接触可能表面を提供するこのような化合物を、当業者は構築することができる。一例として、熟練技術者であれば、化合物の３次元構造データベースを検索して同様の３次元構造配置で適切な官能基を位置づけるこれらの化合物を同定し、次いでこのような化合物の間でコンビナトリアル・ケミストリーライブラリーを構築して高親和性のあるものを同定及び最適化することができる。
一般式Ｉ及びＸＩの化合物の代表的な３次元構造は、図７（式Ｘ）及び８（式Ｘ）に示される。ＩＧＥ０６３（配列番号：４９）及びＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）は非常に異なる２次構造であるにも関わらず、３次元構造（図９）のオーバーレイは２つの疎水性及び／又はプロリン含有隆起に隣接する疎水性の溝からなる表面特徴を保持する。一般式Ｉのペプチド、例えばＩＧＥ１３４の場合、Ｃｙｓ３／Ｃｙｓ１９及びＣｙｓ７／Ｃｙｓ１５のジスルフィド結合は、一方がＰｒｏ４及びＰｈｅ６により形成される隆起に他方がＰｒｏ１６の突起に隣接する溝の底にある。これらの特徴は、ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）による高親和性ＦｃεＲＩ結合について重要である（実施例１２参照）ことが知られ、これによりペプチドにより示される隆起／溝／隆起溶媒接触可能表面を模倣する小有機分子の作成に関する必須の情報を提供する。例えば、技術者は、ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）の溶媒接触可能表面を有する小分子が、プロリンが形成する突起により作られる疎水性の溝及び疎水性の隆起（図９）を模倣する表面を示しうることを認識するであろう。従って、本発明は、例えばペプチドＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）のもの、特にＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）の残基Ｃｙｓ３、Ｐｒｏ４、Ｐｈｅ６、Ｃｙｓ７、Ｃｙｓ１５、Ｐｒｏ１６及びＣｙｓ１９により表される溶媒接触可能表面を模倣する溶媒接触可能表面を有する化合物を提供する。
【００３５】
従って、ある態様によれば、本発明は本発明のペプチド化合物、例えば一般式Ｉ：
（Ｘａａ）ｘ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−（Ｘａａ）ｙ−Ｘａａ３−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｃｙｓ−Ｘａａ６−（Ｘａａ）ｚ
のペプチド化合物を模倣する化合物、例えばペプチド模倣体を作成する方法であって、
（ａ）一般式Ｉのペプチドを調製する工程
（ｂ）ペプチドの３次元構造を決定する工程
（ｃ）ペプチドの３次元表面構造を模倣する化合物を作成する工程を含む方法を含む。
更なる実施態様によれば、本発明は、ＦｃεＲＩに結合してＩｇＥの結合を阻害するペプチド模倣体を同定する方法であって、
（ａ）本発明に従って調製されたペプチドの構造パラメータ、例えば表６及び８に提供されるＩＧＥ０６３（配列番号：４９）又はＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）においてここで提供される構造座標を用いて分子構造データベースを検索する工程；及び
（ｂ）データベースからペプチドの構造パラメータを模倣する分子を選択する工程を含む方法を提供する。
本発明のペプチド化合物を用いて同定されるペプチド類似体は、ここで記載される治療方法に、及び医薬組成物として利用できる。
【００３６】
ｘ線回折研究の実施を可能にする大きさ及び質である本発明のペプチドとＦｃεＲＩの組み合わせの結晶は、ＦｃεＲＩの結合特性、並びにＦｃεＲＩに結合する分子の結合特性に関する研究の当業者による実施を可能にする。
本発明により可能となった方法の一つは、ＦｃεＲＩに結合する又はＦｃεＲＩと関連する化学物質を作成するための、及び異なる方法で化学物質の物理的特性を変えるためのＦｃεＲＩの構造座標の使用である。従って、例えば、溶解性、親和性、特異性、作用強度、結合解離率又は他の結合特性等の性質がすべて改変及び／又は最適化されうる。
同様に本発明のペプチドの３次元構造を用いて、候補化学物質とＦｃεＲＩの間の相互作用に最適な部位を決定するために異なる物質のライブラリーでＦｃεＲＩ結晶構造を調査することにより所望の化学物質を作成することができる。例えば、溶媒を飽和させた結晶から収集された高分解能ｘ線回折データは、各タイプの溶媒分子がどこに接着するかの決定を可能にする。次いでこれらの部位に強く結合する小分子を設計及び合成し、所望の活性について試験する。一旦所望の活性が得られると、分子は更に最適化される。
【００３７】
様々な実施態様において、特許請求の範囲の本発明は、まずＦｃεＲＩ及びペプチドを含む水溶液を提供することによって、本発明のペプチドと複合したＦｃεＲＩの結晶形態を調製する方法に関する。次いで沈殿剤を含む保存液をある量のＦｃεＲＩ溶液と混合し、できた混合物を結晶化させる。典型的には、他の試薬の希釈効果を最小化させるために少量のこの試薬に結晶を溶解し、再生させるためにある時間放置する。更なる工程では、結晶複合体を混合物から単離する。
水溶液中のＦｃεＲＩ及びペプチドの濃度は変化しうるが、好ましくは約１〜５０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは約５〜１５ｍｇ／ｍｌである。同様に、本発明で使用される沈殿剤は様々なものであってよく、当分野で公知のあらゆる沈殿剤から選択することがもできる。好ましくは、沈殿剤は、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール、酢酸ナトリウム、又はその混合物からなる群から選択される。より好ましくは、沈殿剤は、クエン酸ナトリウム又は酢酸ナトリウムで緩衝したポリエチレングリコールである。保存液において沈殿剤はあらゆる濃度で使用することができる；しかしながら、ポリエチレングリコールならば約２０〜２５％、クエン酸ナトリウム、硫酸アンモニウム又は酢酸ナトリウムなら１０ｍＭ〜１Ｍの濃度が好ましい。また、保存液のｐＨは変化しうるが、一般的には４〜１０、より具体的には約４．５でありうる。
【００３８】
当業者は、これらの各パラメータを過度の実験なしに変化させ、さらに適切な結晶を得ることができることを理解するであろう。実際には、提供されるあらゆる形成方法について適した沈殿剤、バッファー、又は他の実験変化因子が一旦決定されれば、これらの任意の方法又はあらゆる他の方法が請求する結晶の形成に使用することができる。当業者は、特定の必要性によって変化因子を決定することができる。
請求する本発明において、蒸気拡散法、バッチ法、液架橋（ｌｉｑｕｉｄ ｂｒｉｄｅｇｅ）、結晶透析法を含む様々な結晶化方法が使用できる。蒸気拡散法での結晶化が好ましい。例えば、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ等， Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｓ， Ｇｌｉｃｋ，等 （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｃｏ．，１９８２）， ｐｐ．８２−１５９； Ｊａｎｃａｒｉｋ等， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｃｒｙｓｔ．， ２４： ４０９−４１１ （１９９１）参照。蒸気拡散法では、少量（例えば数ミリリットル）のタンパク質溶液を、沈殿剤を含有する溶液と混合する。この混合物を少量、例えば１ｍｌの沈殿剤の入ったウェルに懸濁させる。液滴からウェルへの蒸気拡散によって液滴における結晶形成を生じる。
結晶透析法は、タンパク質を保持するが、小分子（すなわち、バッファー及び沈殿剤）を内に又は外に拡散させる半透性のサイズ排除膜を利用する。蒸発によるタンパク質及び沈殿剤の濃縮よりもむしろ、透析では、膜を通してゆっくりと沈殿剤を拡散させ、固定されるタンパク質濃縮を維持しながらタンパク質の溶解度を減少させることが可能である。バッチ法は、一般的にタンパク質の水溶液に溶液がちょうど濁るところまで沈殿剤をゆっくりと添加し；この時点で容器を密閉して結晶化が生じるまで静かにおくことを含む。
【００３９】
従って、出願人は、請求される本発明が結晶化のあらゆる全ての方法を包含することを意図する。当業者はこのような方法の何れかを選択することができ、選択した方法が所望の結晶を生じるようにパラメータを変化させることができる。
また、本発明では、ＦｃεＲＩの全体又は一部に結合することのできる小分子データべースのコンピュータ検索又は化学物質の作成も考えられる。
従って、得られた情報はＦｃεＲＩの可能性のある阻害剤又はアゴニストを最適化するするために使用することができる。一般に、ＦｃεＲＩを阻害する又はそれに拮抗する化学物質の作成は少なくとも２つの因子の検討を必要とする。まず、化学物質はＦｃεＲＩに物理的に又は構造的に関連する可能性がなければならない。関連は、物理的、構造的、又は化学的関係、例えば共有的又は非共有的結合、ファンデルワールス力、相互作用、疎水性又は静電気的相互作用等の何れでもよい。
第２に、化学物質はＦｃεＲＩに関連させることができる構造であるとみなすことができなければならない。化学物質の全ての部位がＦｃεＲＩとの関連に関係する必要があるわけではないが、これらの関与していない部位が、分子の全体的な構造に影響があるかもしれない。言い換えると、これが化学物質の有望性に重大な影響を持つかもしれない。このような構造上の要求は、結合部位の全て又は部分に関係する化学物質の３次元構造又は配向に関する。
【００４０】
ＦｃεＲＩにおける化学物質の可能性のある阻害又は結合効果は、実際の合成及びコンピュータモデリング技術の使用による試験の前に分析されうる。得られた化学物質の論理的な構造がそれとＦｃεＲＩの間の不十分な相互作用及び関連を示唆する場合、化学物質の合成及び試験の必要性は除去される。
しかしながら、コンピュータモデリングが強い相互作用を示す場合、次に分子は合成され、ＦｃεＲＩに結合する能力について試験されうる。こうして、効力のない化合物の効果で時間のかかる合成が回避されうる。
ＦｃεＲＩの阻害又は他の結合化合物は、化学物質又は断片がＦｃεＲＩの個々の結合部位に関連する能力について選別又は選択される連続した工程によって計算的に評価され、作成されうる。
従って、当業者は、ＦｃεＲＩと関連する能力について化学物質又は断片を選別する幾つかの方法のうち１つを使用しうる。この方法は、例えば、付録１のＦｃεＲＩ座標に基づくコンピュータスクリーンの結合部位のような目視検査により開始されうる。次いで、選択した断片又は化学物質をＦｃεＲＩの個々の結合ポケット内で様々な配向に位置づけられ、あるいは「ドッキングされ（ｄｏｃｋｅｄ）」うる。ドッキングは、例えばＱｕａｎｔａ及びＳｙｂｙｌ等のソフトウェアを用いてなされ、続いてＣＨＡＲＭＭ及びＡＭＢＥＲ等の標準的な分子力学力場を用いた分子動力学及びエネルギー最小化がなされうる。
【００４１】
対象とする断片又は化学物質の選択に特殊化したコンピュータプログラムを使用してもよい。これらのプログラムは、例えば、オックスフォード大学、オックスフォード、英国から入手可能なＧＲＩＤ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ社、バーリントン、マサチューセッツ州から入手可能なＭＣＳＳ又はＣＡＴＡＬＹＳＴ；カリフォルニア大学、サンフランシスコ、カリフォルニア州から入手可能なＤＯＣＫ；ロンドン大学ユニバーシティカレッジ、英国から入手可能なＸＳＩＴＥ等を含む。
適した化学物質又は断片が選択されれば、それらから阻害剤又はアゴニストを構築することができる。構築は、コンピュータスクリーンに示される３次元構造像上での、ここに開示される構造座標に関する断片どうしの関係の目視検査によってなされうる。
あるいは、所望の活性を有する分子の空の結合部位、あるいは任意にはその部分を含んでいるものの何れかを実験的に用いて、新規に化学物質を作成してもよい。従って、例えば、ＦｃεＲＩ又はその断片、あるいは評価されるべき候補化学物質の何れかを固相に付着させて更なる研究又は最適化のための能力を有する結合剤を同定する、固相スクリーニング技術を用いてもよい。
【００４２】
Ｆｃεアンタゴニストの作成において、分子モデリング技術を本発明に従って用いることができ；これらの技術は公知、あるいは当業者に既に利用可能となっている。ここに開示される方法、化合物及び組成物を、ＦｃεＲＩに関連又は結合しうる物質のみならず、あるいはレセプターに結合して天然ＦｃεＲＩ−ＩｇＥ相互作用を乱しうるこのような物質の同定、作成、又は特徴付けに使用することができることが理解されるであろう。
化合物が前記方法によって作成又は選択されれば、その化合物がＦｃεＲＩに結合する能力を、コンピュータ的又は実験的な評価を用いて試験し、最適化することができる。様々なパラメータを所望の結果に従って最適化することができる。これらは、限定するものではないが、特異性、親和性、結合／解離率、疎水性、溶解性、及び当業者により容易に同定可能な他の特性を含む。
さらに、本発明は可能性を持った小分子薬剤候補の最適化のために利用できる。従って、結晶構造は、ＦｃεＲＩと小分子阻害剤の複合体の結晶構造に関する情報を得るために使用することもできる。例えば、小分子阻害剤がＦｃεＲＩと共に結晶化されれば、複合体の結晶構造を、位相計算用のＦｃεＲＩの既知の座標を用いた分子置換によって解くことができる。このような情報は、例えば、ＦｃεＲＩと小分子阻害剤の間の相互作用の性質を決定するために利用でき、従って、結合特性、例えば親和性、特異性、及び動力学等を改善しうる修飾を示唆する。
【００４３】
Ｂ．ペプチドの組み合わせ
１．多量体化ドメイン
本発明の好適な実施態様では、ペプチド化合物は多量体化ドメインと組み合わされる。本発明のこの側面においては、少なくとも二つの別のドメインを有するハイブリッド分子が提供される。各分子はペプチドドメインと多量体化ドメインを有している。本発明では、ペプチドドメインは任意には柔軟なリンカードメインを介して免疫グロブリンＦｃ領域のような多量体化ドメインに結合されている。
本発明のハイブリッド分子は適切な多量体化ドメインにペプチドを組み合わせることにより構築される。通常は、本発明のハイブリッド分子を調製する場合、ペプチドをコードする核酸は多量体化ドメイン配列をコード化する核酸に作用可能に結合される。典型的には、作成物は、ペプチドのＣ末端が多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端、好ましくはＣ末端に結合されている融合タンパク質をコードしている。しかし、ペプチドのＮ末端が多量体化ドメインのＮ末端又はＣ末端に結合されている融合体もまた可能である。
好適な多量体化ドメインは免疫グロブリンの定常領域配列である。典型的には、そのような融合体では、コードされたハイブリッド分子は免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持しているであろう。融合体はまた例えば定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１の直ぐ近くのＮ末端又は軽鎖の対応する領域に対して生成される。
【００４４】
免疫グロブリン定常ドメインへのペプチドの融合がなされる正確なアミノ酸部位は重要ではない；特定の部位はよく知られており、生物学的活性、分泌又は結合特性を最適化するために選択することができる。この点に関して、当業者は文献（米国特許第５１１６９６４号、同第５７１４１４７号及び同第５３３６６０３号；Ｃａｐｏｎら、（１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３３７：５２５−５３１； Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら， （１９８９） Ｎａｔｕｒｅ ３３９：６８−７０；及びＢｙｒｎら， （１９９０） Ｎａｔｕｒｅ ３４４：６６７−６７０； Ｗａｔｓｏｎら， （１９９０） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１０：２２２１−２２２９； Ｗａｔｓｏｎら， （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ ３４９：１６４−１６７； Ａｒｕｆｆｏら， （１９９０） Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３； Ｌｉｎｓｌｅｙら， （１９９１） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３：７２１−７３０； Ｌｉｓｌｅｙら， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７４：５６１−５６９； Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら， Ｃｅｌｌ ６６：１１３３−１１４４； Ａｓｈｋｅｎａｚｉら， （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０５３５−１０５３９； Ｌｅｓｓｌｕｅｒら， （１９９１） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２７：２８８３−２８８６； 及びＰｅｐｐｅｌら， （１９９１） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７４：１４８３−１４８９； Ｍｏｈｌｅｒら， （１９９３） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：１５４８−１５６１； Ｂｅｎｎｅｔｔら， （１９９１） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６６：２３０６０−２３０６７； Ｋｕｒｓｃｈｎｅｒら， （１９９２） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：９３５４−９３６０； Ｃｈａｌｕｐｎｙら， （１９９２） ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：１０３６０−１０３６４； Ｒｉｄｇｗａｙ及びＧｏｒｍａｎ， （１９９１） Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １１５， Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｎｏ． １４４８）に記載された様々なイムノアドヘシンの構築を参考にすることができる。特定の側面では、免疫グロブリンタイプの多量体化ドメインは機能性Ｆｃドメインを有するダイマーのような多量体を提供するように選択される。好適な側面では、多量体化ドメインは天然の免疫グロブリンＦｃ領域に伴うエフェクター機能を有しているＦｃドメインを提供するように選択される。従って、ペプチドは、特定の側面では、特定のエフェクター機能又は機能群に対して選択された機能性Ｆｃドメインを有する多量体を提供する免疫グロブリン重鎖定常ドメインに結合される。この場合、免疫グロブリン鎖−ペプチド配列をコードするＤＮＡは典型的には第二のペプチド−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌の際、ハイブリッド重鎖は二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖を有する免疫グロブリン様構造を提供するように共有結合的に結合される。
【００４５】
特定の実施態様では、Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域、例えば天然配列ヒトＦｃ領域ヒトＩｇＧ１（Ａ及び非Ａアロタイプ）、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のＦｃ領域である。
好適な実施態様では、ペプチド配列は免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）のＦｃ領域のＮ末端に融合している。ペプチド配列に重鎖定常領域の全体を融合させることが可能である。しかし、より好ましくは、ＩｇＧのＦｃを化学的に定めるパパイン切断部位（すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４であるとして、残基２１６）、又は他の免疫グロブリンの類似部位の丁度上流のヒンジ領域で始まる配列が融合に使用される。特定の好適な実施態様では、ペプチドアミノ酸配列はＩｇＧ重鎖の（ａ）ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３又は（ｂ）ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合している。さらに好適な実施態様では、ペプチドリガンドアミノ酸配列はＩｇＧの（ａ）ヒンジ領域及び（ｂ）ＣＨ３ドメインに融合している。
【００４６】
この実施態様の特定の側面では、ペプチドと多量体化ドメインを含むハイブリッド分子が多量体、例えばホモダイマー、又はヘテロダイマーあるいはヘテロテトラマーとしてでさえ構築される。ホモダイマーはペプチドと多量体化ドメインを含む二つのモノマーの対合又は架橋から生じる。しかし、二つの同一のモノマー対は必須ではない。本発明の特定の側面では、免疫グロブリン定常ドメインのような多量体化ドメインとペプチドを含むここに記載したハイブリッド分子は免疫グロブリンの一つのアームを含む対の他方の免疫グロブリンと対合しうる。本発明の範囲に入る様々な例示的構築ハイブリッド分子は以下に概略的に模式化される：
（ａ）Ａ−ＣＨ
（ｂ）Ａ−ＣＨ−ＡＣＨ
（ｃ）Ａ−ＣＨ−ＶＨＣＨ−ＶＬＣＬ
（ｄ）Ａ−ＣＨ−ＶＨＣＨ
ここで、Ａはそれぞれ独立して本発明のペプチドを表し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり、及び
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインである。
【００４７】
ここに記載されたハイブリッド分子は免疫グロブリンｃＤＮＡ配列に読み枠を一致させてペプチド部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合させることにより最も簡便に構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合体もまた使用できる（Ａｒｕｆｆｏら， （１９９０）， Ｃｅｌｌ ６１：１３０３−１３１３；及びＳｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら， （１９９１）， Ｃｅｌｌ ６６：１１３３−１１４４）。後者のタイプの融合体は発現のためにＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって脾臓又は末梢血リンパ球から取り出されたｃＤＮＡライブラリーから発表された配列に基づいて単離できる。ハイブリッド分子のペプチドと免疫グロブリン部分をコードしているｃＤＮＡは、選択された宿主細胞において効果的な発現をさせるプラスミドベクターにタンデムに挿入される。
あるいは、特にペプチドが例えば標準的な固相合成法によって合成される実施態様では、ペプチドは当業者によく知られた様々な手段の任意のものによって多量体化ドメインに結合されうる。共有結合的接合が典型的には最も簡便であるが、他の形態の接合も用途に応じて用いることができる。共有結合的な接合の好適な形態の例には、多量体化ドメインのアミノ酸側鎖と活性化された化学基を持つ分子の反応により生じる結合が含まれ、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル類（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド類（例えば、グルタルアルデヒド）、ビスアジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン−２，６−ジイソシアネート）、及び二活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を使用して作成することができる。
【００４８】
２．ペプチド融合体
本発明では、ペプチドは、任意には、例えば他のペプチドに、以下に記載するように直接又はフレキシブルなペプチドリンカーを経由して結合される。本発明では、リンカードメインは以下にさらに詳細に記載するように二以上のペプチドドメインの間に空間的ブリッジを提供する任意の分子群である。本発明のこの側面では、ペプチドは例えば融合タンパク質におけるように互いに結合される。
【００４９】
３．リンカードメイン
本発明では、ペプチドドメインは、任意には、例えば他のペプチドドメインに又はフレキシブルなペプチドリンカーを経由して多量体化ドメインに結合される。本発明のハイブリッド分子のリンカー成分はハイブリッド分子の機能に必ずしも関与しないが寄与しうる。従って、本発明では、リンカードメインは、二以上のペプチドドメイン又はペプチドドメインと多量体化ドメインの間に空間的ブリッジを提供する任意の分子群である。
リンカードメインは可変な長さ及び構造にできる。一般には、重要であるのは、リンカードメインにより引き起こされる配向であり、その化学構造ではない。リンカードメインは、好ましくは、配位ＦｃεＲＩ分子に対する空間的／立体配置的制約を実質的に生じないで、ハイブリッド分子のペプチドドメインを結合させない。従って、リンカードメインの長さは、ハイブリッド分子の例えばペプチドと多量体化ドメインの二つの機能の性質に依存する。
当業者であれば、原子の様々な組み合わせが様々な結合間の既知の距離に基づいて可変長さの分子を提供することが分かるであろう（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ及びＢｏｙｄ， Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３版， Ａｌｌｙｎ及びＢａｃｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｂｏｓｔｏｎ， ＭＡ （１９７７））。例えば、リンカードメインは可変長さのポリペプチドでありうる。ポリペプチドのアミノ酸組成がリンカーの性質と長さを決定する。例示的なリンカードメインは一又は複数のＧｌｙ及び又はＳｅｒ／Ａｒｇ残基を有する。
【００５０】
Ｃ．変異体分子
ここに開示される様々なＩｇＥレセプターペプチドアンタゴニスト分子は、本発明の範囲内であると考えられる。形態の変化がペプチド活性の所望の変化に影響をもたらすので、用語「変異体」は、ペプチド配列に変化及び／又は修飾を包含することを明確に意図している。形態の修飾の検討は、「Ｇ．製薬組成物及び用量」の章で述べる。ペプチド配列及び／又は形態のこのような変化は、少なくとも理論上は、ＩｇＥシグナル伝達の細胞性プロセスを変化させ、ＦｃεＲＩへの結合を改善し、ペプチドの安定性を改善し、体内での半減期を延長することができる。従って、このような変化は、最終的にＩｇＥレセプターペプチドアンタゴニスト分子の治療的能力を改善することができる。
「アミノ酸」なる用語は最も広い意味に使用され、自然に生じるＬα−アミノ酸又は残基、並びに対応するＤ光学異性体を含むことを意味する。自然に生じるアミノ酸に対して一般的に使用されている１文字及び３文字略号がここでも使用される（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ａ．Ｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第２版， ｐｐ．７１−９２，（１９７５） Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。ここで使用される通則としては、Ｌ光学異性体については大文字、Ｄ形態については小文字である。この用語には、Ｄ−アミノ酸、並びに化学的に修飾されたアミノ酸、例えばアミノ酸類似物、ノルロイシン等のタンパク質に通常導入されない自然に生じるアミノ酸、及びアミノ酸に特徴的な当該分野において公知の特性を有する化学的に合成された化合物が含まれる。例えば、天然Ｐｈｅ又はＰｒｏと同じペプチド化合物の配座制限を許容するフェニルアラニン又はプロリンの類似物又は模倣物が、アミノ酸の定義に含まれる。このような類似物及び模倣物はここではアミノ酸の「機能的等価物」と称する。アミノ酸の他の例は、出典を明示してここに取り込まれるＲｏｂｅｒｔｓ及びＶｅｌｌａｃｃｉｏ（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｅｄｓ． Ｇｒｏｓｓ及びＭｅｉｅｈｏｆｅｒ， Ｖｏｌ．５ ｐ３４１， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ， Ｎ．Ｙ． １９８３に列挙されている。
【００５１】
ここで記載されるペプチドのアミノ酸配列における適した変異は、例えば、米国特許第５，３６４，９３４号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、修飾されていない形態と比較してペプチドのアミノ酸配列が変化することになるペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも一つのアミノ酸のペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。どのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ここで同定される変異体ペプチドの活性を比較することによって見出されうる。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては約１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体について全長又は成熟天然配列が示す活性を試験することにより決定される。
【００５２】
本発明で使用される「保存的」アミノ酸置換という用語は、機能的に等価なアミノ酸を置換するアミノ酸置換を意味する。保存的アミノ酸変化は、結果的なペプチドのアミノ酸配列に変化を生じない。例えば、類似の極性の一又は複数のアミノ酸は等価に作用し、ペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさない。一般に、グループ内での置換は、構造及び機能に関して保存的であるとみなす。しかしながら、特定の残基の役割はそれが存在している分子の３次元構造を背景に決定されることを当業者は認識しているであろう。例えば、Ｃｙｓ残基は、還元された（チオール）形態よりも極性の低い酸化された（ジスルフィド）形態に存在する。Ａｒｇ側鎖の長い脂肪性部位は、その構造的又は機能的役割の重大な特徴を構成し、これは他の塩基性残基よりも非極性の置換によって最も保存されうる。また、芳香族のグループ（Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＰｈｅ）を含む側鎖は、イオン性−芳香族又は「カチオン−π」相互作用に関与しうることが認識されるであろう。これらの場合において、酸性又は荷電していない極性のグループのメンバーを有するこれら側鎖の１つの置換は、構造又は機能に関して保存的でありうる。Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、及びＣｙｓ（ジスルフィド形態）のような残基は、主鎖の高次構造に直接的な影響力を有し、構造上の変形なしに置換されないことがある。
【００５３】
関心ある保存的置換の例を、好ましい置換との表題で表１に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表６に置換例と命名され、又は以下にアミノ酸分類に関してさらに記載されるような、より実質的な変化が導入され、生成物がスクリーニングされる。
2004517816.tif 000956
【００５４】
本発明のペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けすることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン， ｍｅｔ， ａｌａ， ｖａｌ， ｌｅｕ， ｉｌｅ；
（２）中性の親水性：ｃｙｓ， ｓｅｒ， ｔｈｒ；
（３）非極性：ａｌａ， ｖａｌ， ｌｅｕ， ｉｌｅ， ｐｒｏ， ｐｈｅ， ｔｒｐ， ｍｅｔ；
（４）非荷電極性：ｇｌｙ， ｓｅｒ， ｔｈｒ， ｃｙｓ， ｔｙｒ， ａｓｎ， ｇｌｎ；
（５）酸性：ａｓｐ， ｇｌｕ；
（６）塩基性：ａｓｎ， ｇｌｎ， ｈｉｓ， ｌｙｓ， ａｒｇ；
（７）鎖配向に影響する残基：ｇｌｙ， ｐｒｏ； 及び
（８）芳香族：ｔｒｐ， ｔｙｒ， ｐｈｅ。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
【００５５】
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該分野において公知の技術を使用して作成することができる。部位特異的突然変異誘発、Ｃａｒｔｅｒ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １３： ４３３１ （１９８６）； Ｚｏｌｌｅｒ等， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １０： ６４８７ （１９８７）、カセット突然変異誘発、Ｗｅｌｌｓ等， Ｇｅｎｅ， ３４： ３１５ （１９８５）、制限選択突然変異誘発、Ｗｅｌｌｓ等， Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ． Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ， ３１７： ４１５ （１９８６）又は他の周知の技術が、変異体ＤＮＡを製造するために、クローン化されたＤＮＡに実施できる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である［Ｃｕｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４４： １０８１−１０８５ （１９８９）］。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い。Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， （Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｎ．Ｙ．）； Ｃｈｏｔｈｉａ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， １５０： １ （１９７６）。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸を用いることができる。
【００５６】
アミノ酸置換は、遺伝子によりコードされるアミノ酸に限定されない。遺伝子コードによりコードされない一般的に遭遇するアミノ酸には、例えば国際公開番号ＷＯ９０／０１９４０に記載されているもの、例えばＧｌｕ及びＡｓｐについての２−アミノアジピン酸（Ａａｄ）；Ｇｌｕ及びＡｓｐについての２−アミノピメリン酸（Ａｐｍ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２−アミノブチル酸（Ａｂｕ）；Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、及び他の脂肪族アミノ酸についての２−アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）；Ｇｌｙについての２−アミノイソブチル酸（Ａｉｂ）；Ｖａｌ、及びＬｅｕ及びＩｌｅについてのシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；Ａｒｇ及びＬｙｓについてのホモアルギニン（Ｈａｒ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについての２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ及びＡｌａについてのＮ−エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）；Ａｓｎ、及びＧｌｎについてのＮ−エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）；Ｌｙｓについてのヒドロキシルリジン（Ｈｙｌ）；Ｌｙｓについてのアロヒドロキシルリジン（ＡＨｙｌ）；Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、及びＴｈｒについての３−（及び４）−ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ、４Ｈｙｐ）；Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、及びＶａｌについてのアロ−イソロイシン（ＡＩｌｅ）；Ａｌａについてのｐ−アミジノフェニルアラニン；Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及びＡｌａについてのＮ−メチルグリシン（ＭｅＧｌｙ、サルコシン）；ＩｌｅについてのＮ−メチルイソロイシイン（ＭｅＩｌｅ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸についてのノルバリン（Ｎｖａ）；Ｍｅｔ及び他の脂肪族アミノ酸についてのノルロイシン（Ｎｌｅ）；Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓについてのオルニチン（Ｏｒｎ）；Ｔｈｒ、Ａｓｎ及びＧｌｎについてのシトルリン（Ｃｉｔ）及びメチオニンスルホキシド（ＭＳＯ）；Ｐｈｅについてのメチルフェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、トリメチルフェニルアラニン、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩ）フェニルアラニン、トリフルオリルフェニルアラニンが含まれる。
【００５７】
Ｄ．共有結合的修飾
本発明のペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、本発明のペプチドの標的とするアミノ酸残基を、分子の選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることを含む。二官能性試薬での誘導体化が、例えば分子を水不溶性支持体マトリクスあるいは抗−（本発明のペプチド）抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）−ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む［Ｔ．Ｅ． Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ｐｐ．７９−８６ （１９８３）］。
【００５８】
本発明の範囲内に含まれる発明ポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。ポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ポリペプチド（Ｏ−結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。アミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
本発明のポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、１９８７年９月１１日に発行されたＷＯ８７／０５３３０、及びＡｐｌｉｎ及びＷｒｉｓｔｏｎ， ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ｐｐ． ２５９−３０６ （１９８１）に記載されている。
本発明のペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ等， Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ．， ２５９：５２ （１９８７）により、及びＥｄｇｅ等， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， １１８： １３１ （１９８１）により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ等， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． １３８：３５０ （１９８７）に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
【００５９】
共有結合的修飾の他の型は、本発明ポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第４，６４０，８３５号；第４，４９６，６８９号；第４，３０１，１４４号；第４，６７０，４１７号；第４，７９１，１９２号又は第４，１７９，３３７号に記載された方法での結合を含む。
また、本発明のペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した本発明ポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと本発明ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には本発明のポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このような本発明のポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によって本発明のポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；ｆｌｕ ＨＡタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Ｆｉｅｌｄ等， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， ８：２１５９−２１６５ （１９８８）］；ｃ−ｍｙｃタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体、Ｅｖａｎ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， ５：３６１０−３６１６（１９８５）；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグ及びその抗体、Ｐａｂｏｒｓｋｙ等， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ３（６）：５４７−５５３ （１９９０）を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド、Ｈｏｐｐ等， ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ６：１２０４−１２１０（１９８８）；ＫＴ３エピトープペプチド、Ｍａｒｔｉｎ等， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２５５：１９２−１９４ （１９９２）；α−チューブリンエピトープペプチド、Ｓｋｉｎｎｅｒ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２６６：１５１６３−１５１６６ （１９９１）；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ、Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８７：６３９３−６３９７（１９９０）を含む。
【００６０】
それに換わる実施態様では、キメラ分子は本発明のポリペプチドの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えて本発明のポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、１９９５年６月２７日発行の米国特許第５，４２８，１３０号を参照のこと。
本発明のペプチド化合物は、各々アミノ保護基又はカルボキシ保護基を用いてＮ末端又はＣ末端において修飾することができる。そのような修飾の数は当業者に理解されるであろう。例えば、ペプチド又はペプチド類似物のＮ末端は、Ｎ末端アミノ基が、例えばアセチル、シクロペンチルカルボキシ、イソキノリルカルボキシ、フロイル、トシル、ピラジンカルボキシ、ｔｅｒｔ−ブチルアセチル、ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル、ベンジロキシカルボニル、例えば２−アリール−２−ｏ−ベンジルオキシム等のベンゾイル基並びにそれ自身がアミノ保護基で修飾されていてもよいアミノアシル残基を含む。他のアミノ保護基は、例えばＴｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｅｄｓ． Ｇｒｏｓｓ 及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ． １９８１）及びＧｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｄ ｅｄ．， ｐａｇｅｓ ３０９−４０５ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１））に記載され、これら各々はここに参考として取り入れる。
【００６１】
Ｎ末端アミノ基は、例えば逆アミド結合で置換することもできる。このようなアミノ基の修飾は、他の反応性アミノ基を、合成手法の間に又は最終化合物に対して起こりうる望ましくない側鎖反応から保護することができる。アミノ基は、ここで広く用いられ、ペプチドに存在する第１級、第２級、又は第３級アミノ基を含む遊離のアミノ基を意味すると解される。これに対して用語Ｎ末端は従来の方法で記載したペプチドに存在する最初のアミノ酸のα−アミノ基を指す。本発明のペプチド又はペプチド類似物のこのようなＮ末端アミノ基修飾は、ここで「Ｎ末端誘導体」と呼ぶ。
またアミノ基の修飾は、例えば化合物の溶解性又は活性の向上を含む付加的な利点も提供する。これらの修飾を有する化合物は、それらの構造が本開示を与える当業者の能力の範囲内であるので本発明の化合物の範囲内にあることを意味する。種々のアミノ保護基がこの分野で知られており、例えば、アセチル、ピコリル、ｔｅｒｔ−ブチルアセチル、ｔｅｒｔ−ブチロキシカルボニル、ベンジロキシカルボニル、例えば２−アリール−２−ｏ−ベンジルオキシム等のベンゾイル基並びにそれ自身がアミノ保護基で修飾されていてもよいアミノアシル残基を含む。他のアミノ保護基は、例えばＴｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ， ｅｄｓ． Ｇｒｏｓｓ 及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ． １９８１）及びＧｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ， Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ２ｄ ｅｄ．， ｐａｇｅｓ ３０９−４０５ （Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９１））に記載され、これら各々はここに参考として取り入れる。
【００６２】
同様に、ペプチドのＣ末端に存在するカルボキシ基などのカルボキシ基もカルボキシ保護基を用いて化学修飾できる。「カルボキシ基」及び「Ｃ末端」という用語は、上記のアミノ基及びＮ末端と同様の方法で使用される。ペプチドのＣ末端に存在するカルボキシ基などのカルボキシ基は、Ｃ末端カルボキシ基のアルコール又はアルデヒドでの還元又はオーラルエステルの形成又はチアゾリル、シクロヘキシル又は他の基などの置換基によるカルボキシ基の置換によって修飾できる。オーラルエステルはこの分野で良く知られ、例えば、メトキシメチル、エトキシメチル、プロポキシメチル、イソプロポキシメチルといったアルコキシメチル基などを含む。
【００６３】
Ｅ．ペプチドの合成
１．化学合成
本発明の化合物を生成する方法の１つに化学合成を含む。これは、当業者に知られた方法論を用いて実施される（Ｋｅｌｌｙ， Ｒ．Ｆ． ＆ Ｗｉｎｋｌｅｒ， Ｍ．Ｅ． ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ， Ｓｅｔｌｏｗ， Ｊ．Ｋ， ｅｄ．， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．， Ｖｏｌ． １２， ｐｐ １−１９（１９９０）； Ｓｔｅｗａｒｔ， Ｊ．Ｍ． Ｙｏｕｎｇ， Ｊ．Ｄ．， Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ （１９８４）参照；また米国特許第４，１０５，６０３号； 第３，９７２，８５９号； 第３，８４２，０６７号； 及び第３，８６２，９２５号も参照）。
本発明のペプチド類似物は固相ペプチド合成を用いて便利に作成される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ， （１９６４）Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．， ８５： ２１４９ ； Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，（１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２： ５１３２ 。固相ペプチド合成はまた、活性ドメインがポリペプチドであるか、又はそれを含んでいると、本発明のハイブリッド分子組成物を調製するのに使用することができる。
固相合成は、保護されたアミノ酸を不活性個体支持体に結合させることにより推定ペプチドのカルボキシ末端において開始される。不活性な固体支持体は、開始アミノ酸のＣ末端のアンカーとして働くことのできる任意の高分子であり得る。典型的には、高分子支持体は、上掲のＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇの２及び４ページの図１−１及び１−２に示されるような架橋高分子樹脂（例えば、ポリアミド又はポリスチレン樹脂）である。一実施態様では、Ｃ末端アミノ酸はベンジルエステルを形成するポリスチレン樹脂と連結している。高分子支持体は、例えば、ペプチド合成の阻害アミノ酸のαアミノ基を解放するのに使用される条件下でペプチドアンカー結合が安定であるものが選択される。塩基不安定α保護基が使用され、次いでペプチドと固体支持体の間の酸不安定結合を使用するのが好ましい。例えば、酸不安定エーテル樹脂は、上掲のＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇの１６ページに記載されるような塩基不安定Ｆｍｏｃアミノ酸ペプチド合成に効果的である。あるいは、ペプチドアンカー結合及び差別的にアシドリシスに移行するα保護基が使用できる。例えば、フェニルアセトアミドメチル（Ｐａｍ）樹脂のようなアミノメチル樹脂は、上掲のＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇの１１−１２ページに記載されるようにＢｏｃ−アミノ酸ペプチド合成に関連してうまく働く。
【００６４】
開始アミノ酸が不活性固体支持体に連結した後、開始アミノ酸のαアミノ酸保護基を例えば塩化メチレンのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で除去し、例えばトリエチルアミン（ＴＥＡ）で中和する。開始アミノ酸のαアミノ基の脱保護に続いて、合成における次のα−アミノ−及び側鎖保護したアミノ酸を添加する。次に残りのα−アミノ酸、必要ならば側鎖保護されたアミノ酸を縮合により所定の順序で続けて結合させ、個体支持体に結合した中間体化合物を得る。あるいは、ペプチド断片を伸長している固相ペプチド鎖に付加する前に、幾つかのアミ酸を互いに結合させて所望のペプチド断片を形成してもよい。
２つのアミノ酸、又はアミノ酸とペプチド、又はペプチドとペプチドの間の縮合反応は、通常の縮合方法、例えばアジド法、混合酸無水物法、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）又はＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）法、活性エステル法、ｐ−ニトロフェニルエステル法、ＢＯＰ（ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス［ジメチルアミノ］ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート）法、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル法など、及びウッドワード試薬Ｋ法等に従って実施される。
【００６５】
ペプチドの化学合成に共通なのは、アミノ酸の任意の反応性側鎖基を適切な保護基で保護することである。最終的には、これらの保護基は、所望のポリペプチド鎖が連続的に組み立てられた後に除去される。さらに共通なのは、アミノ酸又はペプチド断片上のαアミノ基を保護するが、それがアミノ酸又はペプチド断片のＣ末端カルボキシル基で成長固体支持体ポリペプチド鎖の遊離Ｎ末端のアミノ酸と反応し、続いてαアミノ酸基を選択的に除去し、次のアミノ酸又はペプチド断片を固体ペプチド鎖に付加させる。従って、ペプチド合成において一般的には、中間体化合物が生成され、それはペプチド鎖の所望の配列に局在化した各アミノ酸残基を含み、その個々の残基は側鎖保護基を有することである。これらの保護基は、実質的に同時に除去され、固相から取り外した後に所望のポリペプチド生成物が生成される。
α−及びε−アミノ酸側鎖基を、ベンジルオキシカルボニル（省略して、Ｚ）、イソニコチニルオキシカルボニル（ｉＮＯＣ）、ｏ−クロロベンジルオキシカルボニル［Ｚ（２Ｃｌ）］、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＮＯ２）］、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル［Ｚ（ＯＭｅ）］、ｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔ−アミルオキシカルボニル（Ａｏｃ）、イソボロニルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、２−（４−ビフェニル）−２−プロピル−オキシカルボニル（Ｂｐｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、メチルスルホンエトキシカルボニル（Ｍｓｃ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル（ＮＰＳ）、ジフェニルホスフィノチオイル（Ｐｐｔ）、及びジメチロホスフィノチオイル（Ｍｐｔ）基などで保護できる。
【００６６】
カルボキシ官能基の保護基としては、ベンジルエステル（ＯＢｚｌ）、シクロヘキシルエステル（Ｃｈｘ）、４−ニトロベンジルエステル（ＯＮｂ）、ｔ−ブチルエステル（ＯｔＢｕ）、４−ピリジルメチルエステル（ＯＰｉｃ）等が例示される。アミノ及びカルボキシル基以外の官能基を有するアルギニン、システイン、及びセリンなどの特定のアミノ酸は、適当な保護基で保護するのが望ましいことが多い。例えば、アルギニンのグアニジノ基は、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、ベンジルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンゼンスルホニル、４−メトキシ−２，６−ジメチルベンゼンスルホニル（Ｎｄｓ）、１，３，５−トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｓ）等で保護される。システインのチオール基は、ｐ−メトキシベンジル、トリチルなどで保護されうる。
前記されるような多くの阻害アミノ酸は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（サンディエゴ，ＣＡ）、Ｂａｃｈｅｍ ＣＡ（Ｔｅｒｒｅｎｃｅ， ＣＡ）又はＰｅｎｉｎｓｕｌａ Ｌａｂｓ（ベルモント，ＣＡ）のように商業的に入手できる。
上掲のＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇは、ペプチド調製のための方法に関して詳細な情報を提供する。αアミノ基の保護は１４−１８ページに記載され、側鎖ブロックは１８−２８ページに記載されている。アミン、ヒドロキシル及びスルフヒドリル官能基の保護基の表が１４９−１５１ページに提供されている。
所望のアミノ酸配列が完成した後、ペプチドは固体支持体から離され、回収され、精製されうる。ペプチドは、ペプチド固相結合を崩壊することのできる試薬により固体支持体から取り除かれ、場合によっては、ペプチドの阻害側鎖官能基を脱保護する。一実施態様では、ペプチドは、液体フッ化水素酸（ＨＦ）を有するアシドリシスにより固相から取り外すが、残っている側鎖保護基も取り除く。好ましくは、ポリペプチド中の残基のアルキル化（例えば、メチオニン、システイン、及びチロシン残基のアルキル化）を回避するために、アシドリシス反応混合物はチオ−クレゾール及びクレゾール捕捉剤を含む。ＦＨ離脱の後、樹脂はエーテルで洗浄され、遊離ペプチドは酢酸溶液の連続洗浄で固相から抽出される。混合した洗浄液は凍結乾燥され、ペプチドが精製される。
【００６７】
ａ．ジスルフィド結合ペプチド
前記したように、本発明のいくつかの実施態様では、システイン基の間のジスルフィド結合の形成により環化されうる。このようなペプチドは前記したような化学合成により作成され、次いでジスルフィド結合の形成に使用される任意の簡単な方法により環化される。例えば、ペプチドは、還元した形態のメルカプト基を有する固相合成物から回収され、薄い溶液に溶解されうるが、分子内システイン濃度は、分子内ジスルフィド結合形態を最適化するための分子内システイン濃度を上回り、例えば２５ｍＭから１μＭ、好ましくは５００μＭから１μＭ、より好ましくは２５μＭから１μＭのペプチド濃度であり、次いで分子内ジスルフィド結合を生成するのに十分な弱酸化剤、例えば金属陽イオン、フェリシアン化カリウム、テトラチオン酸ナトリウム等のような触媒を有する又は有しない分子酸素に遊離メルカプト基をさらすことにより酸化される。あるいは、ペプチドはＰｅｌｔｏｎら， （１９８６） Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．， ２９：２３７０−２３７５に記載されるようにして環化することができる。
【００６８】
環化は、例えば第１のＣｙｓと第２のＣｙｓの間のジスルフィド結合又はラクタム結合の形成により行われる。ジスルフィド結合を形成することのできる残基は例えばＣｙｓ、Ｐｅｎ、Ｍｐｒ、及びＭｐｐ及びその２−アミノ基含有等価物を含む。ラクタムブリッジを形成することのできる残基は、例えばＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、αβ−ジアミノブチル酸、ジアミノ酢酸、アミノ安息香酸、及びメルカプト安息香酸を含む。ここでの化合物は、例えばＣｙｓのＮ末端アミノ基又は他のアミノ酸に対して共有結合を形成する隣接していない残基の側鎖基を利用しうるラクタム結合により環化することができる。あるいは、ブリッジ構築はまた、本発明の化合物を環化するのに使用することができ、例えばペプチド及びペプチド類似物を含み、Ｓ−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２、ラクタムエステル又は他の結合により環化できる。
ジスルフィド結合により連結された本発明のペプチドの特定の例は、ＩｇＥ０８８（配列番号：１２８、１２８）（平行な様態で連結したＩｇＥ０３７）及びＩｇＥ０８９（配列番号：１２８、１５７）（逆平行な様態で連結したＩｇＥ０３７）を含む。しかしながら、ジスルフィド結合はまた、単量体形態の形成の際に又は後に自然におこる。
【００６９】
２．組み換え合成
ａ．本発明のペプチドをコードする核酸の作成
更なる実施態様では、本発明は、単離された核酸、好ましくはここに記載のペプチドをコードする単離された核酸、好ましくはＤＮＡを含む物質の組成物を包含する。本発明のペプチドをコードするＤＮＡは、当該分野で知られている様々な方法によって調製することができる。これらの方法は、限定されるものではないが、出典明示により開示の全体がここに取り込まれるＥｎｇｅｌｓら．， （１９８９）， Ａｇｎｅｗ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． Ｅｎｇｌ．， ２８：７１６−７３４に記載された任意の方法、例えばトリエステル、亜リン酸、ホスホラミダイト及びＨ−ホスホネート法による化学合成を含む。一実施態様では、発現宿主細胞により好まれるコドンはコード化ＤＮＡの設計に使用される。あるいは、ペプチドをコードしているＤＮＡを、組換えＤＮＡ法、例えば部位特異的突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌら．， （１９９１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．， ２０４：１２５−１３９； Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．ら．， （１９８６） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３：４３３１； Ｚｏｌｌｅｒ Ｍ．Ｊ．ら．， （１９８２） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １０：６４８７）、カセット突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓら．， （１９８５） Ｇｅｎｅ ３４：３１５）、制限選択突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ， Ｊ．Ａ．， ら．， （１９８６） Ｐｈｉｌｏｓ． Ｔｒａｎｓ， Ｒ． Ｓｏｃ． Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ ３１７， ４１５）等々を使用して一又は複数の変異体をコードするように変更させることができる。
【００７０】
ｂ．複製可能なベクターの選択及び使用
本発明のペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、１つ又は複数のシグナル配列、複製開始点、１つ又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
本発明のペプチドをコードする核酸の組み換え体発現は、通常このような核酸に作用可能に結合する発現コントロール配列、並びに例えばＤＮＡ分子を含むプラスミド等の発現ベクター、を必要とし、コントロール配列はベクターを用いて形質転換された宿主細胞により認識される。一般に、プラスミドベクターは、宿主細胞と適合する種に由来する複製及びコントロール配列を含む。通常、ベクターは複製部位、並びに形質転換細胞の表現型選択を可能にするタンパク質をコードする配列を有する。
【００７１】
本発明のペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるペプチドをコードするＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択された原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びクルイベロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）α因子リーダーを含み、後者は米国特許第５，０１０，１８２号に記載されている）、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダアルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日発行のＥＰ３６２１７９）、又は１９９０年１１月１５日に公開されたＷＯ９０／１３６４６に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
場合によっては宿主細胞によって培地中への発現産物の分泌を生じさせるように作用可能に結合されていてもよい更なる分泌配列の例には、ｓｔＩＩ、エコチン（ｅｃｏｔｉｎ）、ｌａｍＢ、ヘルペスＧＤ、ｌｐｐ、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、及びアルファ因子が含まれる。また、ここでの使用に適しているのはプロテインＡの３６アミノ酸リーダー配列である（Ａｂｒａｈｍｓｅｎら．，   （１９８５） ＥＭＢＯ Ｊ．， ４：３９０１）。
【００７２】
発現及びクローニングベクターは共に１つ又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、（ａ）アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシリに対する遺伝子コードＤ−アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように本発明ペプチドをコードする核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Ｕｒｌａｕｂらにより Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６ （１９８０）に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である。Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ等， Ｇｅｎｅ， ７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ等， Ｇｅｎｅ， １０：１５７（１９８０）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４−１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Ｊｏｎｅｓ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ８５：１２ （１９７７）。
【００７３】
発現及びクローニングベクターは、通常、本発明のペプチドをコードする核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系；Ｃｈａｎｇ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２７５：６１５ （１９７８）； Ｇｏｅｄｄｅｌ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：５４４ （１９７９）；アルカリフォスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、Ｇｏｅｄｄｅｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ８：４０５７ （１９８０）； ＥＰ ３６，７７６、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター、ｄｅＢｏｅｒ 等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８０：２１−２５ （１９８３）を含む。細菌系で使用するプロモータもまた本発明のペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセラートキナーゼ、Ｈｉｔｚｅｍａｎ 等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２５５：２０７３ （１９８０）又は他の糖分解酵素、Ｈｅｓｓ 等， Ｊ． Ａｄｖ． Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．， ７：１４９ （１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １７：４９００（１９７８）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
【００７４】
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはＥＰ７３，６５７にさらに記載されている。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの発現は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ２，２１１，５０４）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による本発明で使用可能なポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン）。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００−２７０塩基対）、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、本発明のペプチドのコード配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
【００７５】
また真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞）に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
原核生物宿主中での発現に関しては、好適なベクターにはｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ第３７，０１７）、ｐｈＧＨ１０７（ＡＴＣＣ第４０，０１１）、ｐＢＯ４７５、ｐＳ０１３２、ｐＲＩＴ５、ｐＲＩＴ２０又はｐＲＩＴ３０シリーズの任意のベクター（Ｎｉｌｓｓｏｎ及びＡｂｒａｈｍｓｅｎ （１９９０）， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ．， １８５：１４４−１６１）、ｐＲＩＴ２Ｔ、ｐＫＫ２３３−２、ｐＤＲ５４０及びｐＰＬ−ラムダが含まれる。本発明の発現ベクターを含む原核生物宿主細胞には、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ第３１４４６）、大腸菌株ＪＭ１０１（Ｍｅｓｓｉｎｇら．，   （１９８１） Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．， ９：３０９）、大腸菌株Ｂ、大腸菌株１７７６（ＡＴＣＣ第３１５３７）、大腸菌ｃ６００（Ａｐｐｌｅｙａｒｄ， Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ３９：４４０（１９５４））、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ−、ガンマ−、原栄養菌株、ＡＴＣＣ第２７３２５）、大腸菌株２７Ｃ７（Ｗ３１１０、ｔｏｎＡ、ｐｈｏＡ、Ｅ１５、（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９、ｐｔｒ３、ｄｅｇＰ４１、ｏｍｐＴ、ｋａｎｒ）（米国特許第５，２８８，９３１号、ＡＴＣＣ第５５，２４４）、バチルス・サブチルス、サルモネラ・ティフィムリウム、セラチア・マルセッセンス、及びシュードモナス種が含まれる。
酵母宿主細胞、例えば一般的なパン酵母又は酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の発現について、適したベクターには２ミクロンのプラスミドを有するエピソーム的な複製ベクター、組み込みベクター、及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターを含む。また、発現に適した宿主は多細胞生物からも誘導される。
【００７６】
昆虫宿主細胞、例えばＳｆ９又はハイファイブ（ｈｉ−ｆｉｖｅ）細胞での発現について、適したベクターにはバキュロウィルスベクターを含む。植物宿主細胞、特に双子葉植物宿主、例えばタバコでの発現について、適した発現ベクターにはアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉプラスミドに由来するベクターを含む。
他の好ましいベクターは、標準的な技術を用いて上記されるベクターの関連する形質を組み合わせることにより構築することができる。関連する形質には、プロモーター、リボソーム結合部位、関心のある又は遺伝子融合の遺伝子（タンパク質ＡのＺドメイン並びに関心のある及びリンカーの遺伝子）、抗生物質耐性マーカー、及び適切な複製開始点を含む。
組換え脊椎動物細胞培養での本発明のポリペプチドの合成に適応化するのに適切な更なる他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Ｇｅｔｈｉｎｇ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２９３：６２０−６２５ （１９８１）； Ｍａｎｔｅｉ等， Ｎａｔｕｒｅ， ２８１：４０−４６ （１９７９）；ＥＰ１１７，０６０；及びＥＰ１１７，０５８に記載されている。
【００７７】
ｃ．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、上記の発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編 （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ， １９９１）及びＳａｍｂｒｏｏｋ等， 上掲に見出すことができる。
形質移入は、コーディング配列が実際に発現されようとされまいと、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。数多くの形質移入の方法が当業者に知られており、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションである。このベクターの作用の任意の兆しが宿主細胞内で生じた場合に一般に成功した形質移入が認められる。
形質転換は、染色体外のエレメントとしてであろうと染色体構成成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ （２版）， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， ＮＹ （１９８９）のセクション１．８２に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理が、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Ｓｈａｗら， （１９８３） Ｇｅｎｅ， ２３：３１５及び１９８９年６月２９日公開の国際公開第８９／０５８５９に記載されているように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。そのような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、上掲のＳａｍｂｒｏｏｋらのセクション１６．３０−１６．３７に記載されたリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物宿主系の形質転換の一般的な側面は１９８３年８月１６日に発行された米国特許第４３９９２１６号にＡｘｅｌによって記載されている。酵母菌への形質転換は典型的には、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎら， （１９７７） Ｊ． Ｂａｃｔ．，１３０：９４６及びＨｓｉａｏら， （１９７９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ）， ７６：３８２９の方法に従って実施される。しかし、核注入、エレクトロポレーション、あるいは原形質融合のような他の細胞にＤＮＡを導入する方法を使用することもできる。
【００７８】
用いられる宿主細胞のタイプに応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いてトランスフェクション又は形質転換の間の選択がなされる。前掲のＳａｍｂｒｏｏｋら，に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Ｓｈａｗ等， Ｇｅｎｅ， ２３：３１５（１９８３）及び１９８９年６月２９日公開のＷＯ８９／０５８５９に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Ｇｒａｈａｍ及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ５２：４５６−４５７ （１９７８）のリン酸カルシウム沈降法が用いられうる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎ等， Ｊ． Ｂａｃｔ．， １３０：９４６ （１９７７）及びＨｓｉａｏ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６：３８２９ （１９７９）の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Ｋｅｏｗｎ等， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８５：５２７−５３７ （１９９０）及び Ｍａｎｓｏｕｒ等， Ｎａｔｕｒｅ， ３３６：３４８−３５２ （１９８８）を参照のこと。
【００７９】
ＤＮＡを発現するのに適切な宿主細胞には、原核生物、酵母、又は高等真核細胞が含まれる。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）；大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）；大腸菌株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）及びＫ５７７２（ＡＴＣＣ５３，６３５）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、Ｅ． ｃｏｌｉ、エンテロバクター、エルビニア（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ） 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルススブチルス（Ｂ． ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチルスリチェニフォルミス（Ｂ． ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、１９８９年４月１２日発行のＤＤ２６６，７１０に記載されたバチルスリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、宿主に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｒｔ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ  ５５，２４４）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｌｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎｒを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び１９９０年８月７日発行  米国特許第４，９４６，８３号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
【００８０】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、本発明のペプチドをコードする核酸を含むベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・プロンブ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｒｏｍｂｅ）（Ｂｅａｃｈ及びＮｕｒｓｅ， Ｎａｔｕｒｅ， ２９０： １４０ （１９８１）； １９８５年５月２日発行のＥＰ１３９，３８３）；クルベロミセス宿主（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｈｏｓｔｓ）（米国特許第４，９４３，５２９号； Ｆｌｅｅｒ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ９： ９６８−９７５ （１９９１））、例えばクルベロミセスラクチス（Ｋ． ｌａｃｔｉｓ）（ＭＷ９８−８Ｃ， ＣＢＳ６８３， ＣＢＳ４５７４； Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ等， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４（２）： ７３７ （１９８３））、クルベロミセス・フラギリス（Ｋ． ｆｒａｇｉｌｉｓ）（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、クルベロミセスブルガリクス（Ｋ． ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、クルベロミセスウィケラミイ（Ｋ． ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ）（ＡＴＣＣ ２４，１７８）、クルベロミセスワルチイ（Ｋ． ｗａｌｔｉｉ）（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、クルベロミセスドロソフィラルム（Ｋ． ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ  ３６，９０６； Ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， ８： １３５ （１９９０））、クルベロミセス・テモトレランス（Ｋ． ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）及びクルベロミセス・マルキシアナス（Ｋ． ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ヤロウィア（ｙａｒｒｏｗｉａ）（ＥＰ  ４０２，２２６）；ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）（ＥＰ  １８３，０７０； Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ等， Ｊ． Ｂａｓｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ， ２８： ２６５−２７８ （１９８８））；カンジダ；トリコデルマレーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ  ２４４，２３４）；アカパンカビ（Ｃａｓｅ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７６： ５２５９−５２６３ （１９７９））；シュワニオマイセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）（１９９０年１０月３１日発行のＥＰ３９４，５３８）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（１９９１年１月１０日発行のＷＯ９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルスニダランス（Ｂａｌｌａｎｃｅ等， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．， １１２： ２８４−２８９ （１９８３）； Ｔｉｌｂｕｒｎ等， Ｇｅｎｅ， ２６： ２０５−２２１ （１９８３）； Ｙｅｌｔｏｎ等， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８１： １４７０−１４７４ （１９８４））及びアスペルギルスニガー（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ， ＥＭＢＯ Ｊ．， ４： ４７５−４７９ （１９８５））が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック（Ｃ１化合物資化性、Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、カンジダ、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、及びロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、Ｃ． Ａｎｔｈｏｎｙ， Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ， ２６９ （１９８２）に記載されている。
原核生物に加えて、糸状菌、酵母、多細胞生物に由来する細胞が宿主細胞として使用できる。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。
【００８１】
有用な哺乳動物宿主細胞の例には、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 （ＣＯＳ−７， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ等 （１９９７）， Ｊ． Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．， ３６：５９）；ハムスター乳児腎細胞（ＢＨＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ， Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ （１９８０）， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ７７：４２１６）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４， Ｍａｔｈｅｒ （１９８０）， Ｂｉｏｌ． Ｒｅｐｒｏｄ．， ２３：２４３−２５１）；サルの腎細胞 （ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）；アフリカミドリザルの腎細胞（ＶＥＲＯ−７６， ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞 （ＨＥＬＡ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）； イヌ腎細胞 （ＭＤＣＫ， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）；バッファローラット肝細胞 （ＢＲＬ ３Ａ， ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）；ヒト肺細胞 （Ｗ１３８， ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）；ヒト肝細胞 （Ｈｅｐ Ｇ２， ＨＢ ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ ０６０５６２， ＡＴＴＣ ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍｏｔｈｅｒ等 （１９８２）， Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ３８３：４４−６８）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌細胞株（ＨｅｐＧ２）が含まれる。
哺乳動物宿主細胞における発現に関しては、適切なベクターには、ＳＶ４０由来のベクター、サイトメガロウイルス由来のベクター、例えばｐＲＫ５及びｐＲＫ７を含むｐＲＫベクター（Ｓｕｖａ等 （１９８７）， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３７：８９３−８９６； ＥＰ３０７，２４７（３／１５／８９）、ＥＰ２７８，７７６（８／１７／８８））、ワクシニアウイルス又は他のポックスウイルス由来のベクター、及びモロニーのマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）由来のベクターのようなレトロウイルスベクターが含まれる。
【００８２】
ｄ．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法、Ｔｈｏｍａｓ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，７７：５２０１−５２０５ （１９８０）、ドットブロット法（ＤＮＡ又はＲＮＡ分析）、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、本発明のペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又は本発明のペプチドをコードするＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００８３】
ｅ．精製
本発明で使用可能なポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液（例えばトリトン（登録商標）−Ｘ１００）又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。本発明で使用可能なポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。組み換え生産された本発明のペプチドを精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過；ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及び本発明のペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄｅｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， １８２（１９９０）；Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８２）に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び生産される特定のペプチドの性質に依存する。
【００８４】
上記の発現及び生成方法の変形例は、ベクターにおいて、所望のペプチドをコードする遺伝子が他のタンパク質又は他のタンパク質の断片をコードする遺伝子に結合している遺伝子融合体の使用を考える。これは、所望のペプチドが他のタンパク質又はペプチドとの融合体として宿主細胞によって産生される結果となる。「他の」タンパク質又はペプチドはしばしば細胞によって分泌されうるタンパク質又はペプチドであり、培地から所望のペプチドを単離し精製することを可能にし、所望のペプチドが細胞内に残る場合に生じる宿主細胞を破壊する必要性を排除する。あるいは、融合タンパク質は細胞内に発現されうる。高度に発現される融合タンパク質を使用するのが有用である。
遺伝子融合体の使用は、必須ではないが、昆虫細胞における異種性ペプチドの発現並びにその遺伝子産物の続く精製を容易にしうる。プロテインＡの結合、又はより詳細にはプロテインＡのＩｇＧへの結合が融合タンパク質の精製のための「アフィニティーハンドル」を提供するので、ＺドメインプロテインＡ融合体がしばしば使用される。例えば、所望のペプチドリガンドをコードするＤＮＡ配列を、Ｚドメインとして知られているプロテインＡのコンセンサスドメインの遺伝子と部位特異的突然変異誘発によって融合させることができる（Ｎｉｌｓｓｏｎら， （１９８７） Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １：１０７−１１３）。発現及び分泌後に、融合タンパク質を酵素的に切断して、酵素混合物から精製できる遊離のペプチドを生じさせることができる（例えばＶａｒａｄａｒａｊａｎら， （１９８５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：５６８１−５６８４； Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ−Ｓｅｒｒａら， （１９９６） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３７８：１７１−１７６； Ｎｉｌｓｓｏｎら， （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４８：２４１−２５０を参照されたい）。
【００８５】
融合タンパク質は、薬品、例えばメチオニンで切断する臭化シアノゲン、又はＡｓｎ及びＧｌｙ残基の間で切断するヒドロキシルアミンを使用して切断できる。標準的な組換体ＤＮＡ法を使用して、これらのアミノ酸をコードするヌクレオチド塩基対を所望のペプチドをコードする遺伝子の５’末端の直ぐ前に挿入してもよい。
あるいは、融合タンパク質のタンパク分解的切断を用いることができる。Ｃａｒｔｅｒ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｆｒｏｍ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｔｏ Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ， Ｌａｄｉｓｃｈら編， （Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ Ｎｏ．４２７， １９９０）， Ｃｈ １３， ｐ１８１−１９３。
プロテアーゼ、例えばＸａ因子、トロンビン、及びサブチリシン又はその変異体、及び多くの他のものが融合タンパク質を切断するために首尾良く使用された。約３０未満のアミノ酸のペプチドリガンドの生産に対して本発明において好適なものは、Ａｒｇ及びＬｙｓ残基に高度に特異的なプロテアーゼトリプシンである。トリプシン切断は一般にＮｉｌｓｓｏｎら， （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ４８：２４１及びＳｍｉｔｈら， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３２：２８９にいて検討されている。典型的には、使用されるプロテアーゼによる切断に受け入れられるペプチドリンカーは「他の」タンパク質（例えば、プロテインＡのＺドメイン）と所望のペプチドの間に挿入される。組換体ＤＮＡ法を使用して、リンカーをコードするヌクレオチド塩基対を他のタンパク質をコードする遺伝子又は遺伝子断片の間に挿入する。ついで、正しいリンカーを含む部分的に精製された融合タンパク質のタンパク分解的切断は天然融合タンパク質又は還元されもしくは変性された融合タンパク質の何れかで実施できる。
【００８６】
ペプチドは融合タンパク質として発現されるときに正しく折り畳まれても折り畳まれなくてもよい。また、切断部位を含む特異的ペプチドリンカーはプロテアーゼに接近可能でも可能でなくてもよい。これらの因子は、融合タンパク質が変性され、再び折り畳まれなければならないかを、そして、しかりであれば、これらの手順が切断の前又は後の何れに使用されるかを決定する。
変性と再折り畳みが必要な場合、典型的にはペプチドはグアニジンＨＣｌのようなカオトロープで処理し、ついで、例えば還元され酸化されたジチオスレイトール又はグルタチオンを適切な比、ｐＨ、及び温度で含むレドックスバッファーで、ペプチドがその天然構造まで再折り畳みされるように処理する。
この明細書において言及される宿主細胞はインビトロ培養中の細胞並びに宿主動物内である細胞を包含する。
本発明の環化実施態様では、組換え的に産生されたペプチドは上述したような細胞内ジスルフィド結合の形成により環化できる。
【００８７】
Ｆ．研究及び診断用組成物
好ましい実施態様では、本発明のペプチドは、固体支持体などの高分子に非共有吸着するか又は共有結合する。一般に、固体支持体はポリマーゲルなどの不活性マトリクスであり、三次元構造と材料の格子又はネットワークを有する。合成又は天然の殆ど全ての高分子が、二官能性試薬で架橋されたとき、適切な液体中でゲルを形成する。好ましくは、選択される高分子は、アフィニティクロマトグラフィでの使用に便利なものである。アフィニティクロマトグラフィに使用される殆どのクロマトグラフマトリクスはキセロゲルである。このようなゲルは乾燥時に収縮してゲルマトリクスのみを含むコンパクトな固体となる。乾燥キセロゲルが液体に再懸濁されると、ゲルマトリクスは液体を吸収し、膨潤し、ゲル状態に戻る。ここで使用するのに適したキセロゲルは、セルロース、架橋デキストラン（例えばセファロース）、アガロース、架橋アガロース、ポリアクリルアミドゲル、及びポリアクリルアミド−アガロースゲルなどのポリマーゲルを含む。
あるいは、エアロゲルもアフィニティクロマトグラフィに使用できる。これらのゲルは乾燥時に収縮しないが、周囲の空気の透過のみを可能にする。乾燥ゲルが液体に曝露されると、後者はゲル中の空気を置換させる。個々での使用に適したエアロゲルは、多孔性ガラス及びセラミックゲルである。
またここに包含されるのは、誘導体部分がペプチドリガンドのゲルマトリクスへの結合を促進し、アフィニティクロマトグラフィにおけるペプチド−リガンド相互作用の立体的隠蔽を回避する誘導化ゲルに結合した本発明のペプチドである。あるいは、類似の利点のために、ゲルマトリクスとペプチドリガンドとの間にスぺーサーアームを挿入することもできる。
他の実施態様では、本発明は、選択された又は意図されたポリペプチドがそのＮ末端又はそのＣ末端、又は両末端において本発明のペプチドの１又は複数へ融合したタンパク質を提供する。
【００８８】
Ｇ．製薬組成物及び用量
本発明のペプチドを製薬組成物の形態で、ＩｇＥ媒介疾患の治療のために投与することができる。さらにリポフェクション又はリポソームを送達媒体として使用することができる。
治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ活性成分を、親油性製剤又は水性溶液の形態で、任意の製薬上許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製され保存される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． ［１９８０］）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）又はトゥイーン（ＴＷＥＥＮ）（商品名）、プルロニクス（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ）（商品名）、及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００８９】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなくてはならない。製剤は、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により無菌にすることができる。ここでの治療的組成物は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバイアルに入れられる。
また、ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的仮性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
投与経路は周知の一般に認められた方法に従い、例えば、静脈内、腹膜内、皮下、筋肉内、動脈内、病巣内又は関節内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放性又は持続放出の手段による。
本発明の製薬組成物の用量及び所望の薬剤濃度は、想定される特定の使用によって変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の技術者の技量の範囲内であろう。動物実験は、ヒトの治療に有効な用量を決定するための信頼性のある指針を提供する。有効な用量の種間スケーリングは、例えば、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ Ｊ．及びＣｈａｐｐｅｌｌ． Ｗ．「Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ Ｓｃａｌｉｎｇ ｉｎ Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」，Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ， Ｙａｃｏｂｉら編， Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９８９， ４２−４６に開示されているような原理に従い実施することができる。
【００９０】
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｏｓｏｌ， Ａ． Ｅｄ． （１９８０）に開示されている。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）又はポリ（ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγ−エチル−Ｌ−グルタメート、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商品名）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−（Ｄ）−３−ヒドロキシブチル酸を含む。徐放のための組み換えタンパク質のマイクロカプセル化はヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン−（ｒｈＩＦＮ−）、インターロイキン２、及びＭＮｒｐｇ１２０で成功裏に実施されている。Ｊｏｈｎｓｏｎ等， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２： ７９５−７９９ （１９９６）； Ｙａｓｕｄａ等， Ｂｉｏｍｅｄ． Ｔｈｅｒ． ２７： １２２１−１２２３ （１９９３）； Ｈｏｒａ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８： ７５５−７５８ （１９９０）； Ｃｌｅｌａｎｄ， 「Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｉｎｇｌｅ Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌｙｌａｃｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｇｌｙｃｏｌｉｄｅ Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，」ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ： Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｐｏｗｅｌｌ ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ， 編， （Ｐｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ： ニューヨーク， １９９５）， ｐｐ． ４３９−４６２； ＷＯ９７／０３６９２，ＷＯ９６／４００７２，ＷＯ９６／０７３９９；及び米国特許第５，６５４，０１０号。
【００９１】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ−乳酸−コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Ｌｅｗｉｓ， 「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ ｆｒｏｍ ｌａｃｔｉｄｅ／ｇｌｙｃｏｌｉｄｅ ｐｏｌｙｍｅｒ」： Ｍ． Ｃｈａｓｉｎ及び Ｒ． Ｌａｎｇｅｒ （編）， Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ （Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９９０）， ｐｐ． １−４１。
エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリックス組成物の開発によって達成されうる。
【００９２】
本発明のペプチドのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４，６５７，７６０号、第５，２０６，３４４号、又は第５，２２５，２１２号参照。異なる処方が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、及び特定の器官又は組織を意図する投与は、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要でありうることは本発明の範囲内である。さらに、一又は複数の別々の投与によって、又は連続注入によって用量を投与しうる。何日にも渡る又はそれより長期に渡る繰り返し投与について、疾患の症状の所望される抑制があるまで治療が続けられる。この療法の進行は、常套的な技術及びアッセイで容易に監視される。
【００９３】
Ｈ．肺経由送達
本発明の投与の特定の態様はエアロゾル又は吸入形態である。本発明の化合物は、分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｏｒ ｄｉｓｐｅｒｓａｎｔ）と組み合わせて、乾燥粉末として又は希釈液を用いた溶液又は懸濁液としてエアロゾル形態で投与することができる。ここで使用される用語「分散剤」は、化合物のエアロゾル化又はタンパク質の肺組織での吸収、あるいは両方を促進する薬剤を意味する。分散剤は製薬的に許容されるのが好ましい。ここで使用される用語「製薬的に許容される」は、一般に、連邦又は州政府の監督官庁に認められ、動物、特にヒトでの使用のために米国薬局方又は他の一般に認められた薬局方に記載されたことを意味する。好ましい分散剤はこの分野で良く知られ、限定されないが、界面活性剤などを含む。例えば、液体エアロゾルを形成する溶液の噴霧によって生ずる、化合物、特にペプチド化合物の表面誘発性の凝固を抑制するためにこの分野で一般に使用される界面活性剤を使用できる。このような界面活性剤の非限定的な例は、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル及びアルコール、及びポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルを含む。使用される界面活性剤の量は変化するが、一般には製剤の０．００１〜４重量％の範囲である。特定の態様では、界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート又はソルビタントリオレエートである。好ましい界面活性剤はこの分野で知られており、特定の製剤、化合物の濃度、希釈剤（液体製剤における）又は粉末の形態（乾燥粉末製剤における）等に応じて、意図する特性に基づいて選択される。
【００９４】
さらに、化合物の選択、意図する治療効果、肺組織の質（例えば疾患又は健常な肺）、及び多くの他の要因に応じて、液体又は乾燥製剤は以下にさらに述べるような付加的成分を含有してもよい。
液体エアロゾル製剤は、一般に、生理学的に許容される希釈剤中に、化合物及び分散剤を含有する。本発明の乾燥粉末エアロゾル製剤は、微細に分割した固体形態の化合物及び分散剤からなる。液体又は乾燥粉末エアロゾルのいずれかで、製剤はエアロゾル化される。即ち、エアロゾル化された投薬が実際に肺胞に到達することを確実にするために、液体又は固体粒子まで分解する必要がある。一般に、マス媒体の動力学的半径は、薬物粒子の肺胞への到達を確実にするために５マイクロメートル未満とされる（Ｗｅａｒｌｅｙ， Ｌ．Ｌ．， １９９１， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． ｉｎ Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ ８： ３３３）。ここで用語「エアロゾル粒子」は、肺性投与、即ち肺胞に到達するのに適した、液体又は固体粒子を記載するのに使用される。輸送装置の構成といった他の考慮では、製剤中の付加的な成分及び粒子の特性が重要である。この態様の薬剤の肺性投与は当業者に良く知られており、製剤の操作、エアロゾル化手段及び輸送装置の構成は、当業者に日常的な実験を要求するだけである。
輸送装置の構成に関して、エアロゾル化のあらゆる形態がこの分野で知られており、限定されないが、液体製剤の噴霧、微粒化又はポンプエアロゾル化、及び乾燥粉末製剤のエアロゾル化を含み、本発明の実施に使用できる。固体製剤の投与に特に設計された輸送装置が考慮される。しばしば、液体又は乾燥粉末のエアロゾル化は推進剤を必要とする。推進剤はこの分野で一般に使用される任意の推進剤でよい。これらの有用な推進剤の特定の非限定的な例は、クロロフルオロカーボン、ハイドロフルオロカーボン、ハイドロクロロフルオロカーボン、又はトリフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタノール及び１，１，１，２−テトラフルオロエタン又はこれらの混合物を含む炭化水素である。
【００９５】
本発明の好ましい態様では、エアロゾル化のための装置は、計量用量吸入器である。計量用量吸入器は、投与したときに投与に応じて変化する用量ではなく特定の用量を与える。このような計量用量吸入器は、液体又は乾燥粉末エアロゾル製剤の何れにも使用できる。計量用量吸入器はこの分野で良く知られている。
化合物がひとたび肺に到達すると、多くの用量依存的因子が薬剤吸収に影響する。化合物の循環レベルを要求する疾患又は障害の治療において、エアロゾル粒子サイズ、エアロゾル粒子形状、感染、肺疾患又は塞栓の有無などの因子が化合物の吸収に影響しうることは理解されるであろう。ここに記載した各製剤について、ある種の滑剤、吸収促進剤、タンパク質安定化剤又は懸濁剤が適当であることもある。これらの付加的な薬剤の選択は、目的に応じて変化する。化合物の局部的輸送が望まれ意図されている場合、吸収促進などの変化はあまり重要ではなくなることは理解されるであろう。
【００９６】
１．液体エアロゾル製剤
本発明の液体エアロゾル製剤は、典型的には噴霧器で使用される。噴霧器は、圧縮空気又は超音波のいずれでもよい。この分野で知られた噴霧器が、本発明と組み合わせて使用でき、限定されないが：Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ， Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ， Ｉｎｃ． （Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）； Ａｃｏｒｎ ＩＩ 噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ ＣＯ）である。本発明と組み合わせて有用な他の噴霧器は、１９８６年１１月２５日に発行された米国特許第４，６２４，２５１号、１９７２年１１月２１日に発行された米国特許第３，７０３，１７３号、１９７１年２月９日に発行された米国特許第３，５６１，４４４号及び１９７１年１月１３日に発行された米国特許第４，６３５，６２７号に記載されている。
製剤は担体を含んでもよい。担体は、循環系に可溶で生理学的に許容される高分子であり、生理学的な許容とは、当業者が前記担体を治療計画の一部として患者に注入することを許容することを意味する。担体は、好ましくは循環系において比較的安定であり、クリアランスのための許容される血漿半減期を持つ。このような高分子は、限定されないが、ダイズレシチン、オレイン酸及びソルビタントリオレエートを含み、ソルビタントリオレエートが好ましい。
この実施態様の製剤は、タンパク質安定化又は浸透圧の調製のための他の薬剤を含んでもよい。この薬剤の例は、限定されないが、塩化ナトリウム、又は塩化カリウムなどの塩、及びグルコース、ガラクトース又はマンノースなどの炭水化物等を含む。
【００９７】
２．エアロゾル乾燥粉末製剤
また、この製薬製剤は、微細に分割した形態の化合物及び分散剤を含む乾燥粉末吸入製剤として使用することも考慮する。化合物の形態は一般に、凍結乾燥された粉末である。ペプチド化合物の凍結乾燥された形態は、標準的な技術を通して得られる。
他の実施態様では、乾燥粉末製剤は、本発明の化合物の１又は複数を含む微細に分割された乾燥粉末、分散剤及びバルク剤も含有する。本発明の製剤と組み合わせて有用なバルク剤は、装置からの粉末の分散を促進する量のラクトース、ソルビトール、スクロース、又はマンニトールなどの薬剤を含む。
【００９８】
Ｉ．治療方法
１．ＩｇＥ媒介疾患
アレルギーは、環境抗原に対する免疫反応が組織炎症及び臓器機能障害を引き起こす、特定の疾患を意味する。アレルゲンはアレルギーを引き起こす抗原である。このように、その抗原分子又はその原因、例えば、花粉粒、動物のふけ、昆虫の毒、又は食品等でありうる。以下に説明されるのは、様々なＩｇＥ媒介疾患である。
アトピー性疾患：
アトピーとは、ＩｇＥ抗体の断続的生成によって、多くの一般的な天然に生じる吸入又は摂取された抗原に対して免疫学的に応答する遺伝的な傾向を意味する。アレルギー性鼻炎及びアレルギー喘息は、環境抗原への暴露に続いて起こる臨床疾患の最も一般的な症状である。アトピー性皮膚炎はそれほど一般的ではない。アレルギー性胃腸症は更にまれであるが、一過性であり得る。２以上のこれらの臨床疾患が、同じ患者で同時に又は病気の進行の間の異なった時点で一緒に現れうる。アトピーは無症候性でもあり得る。また、ＩｇＥ抗体は、以下に更に述べられる非アトピー性アレルギー疾患アナフィラキシー及びじんま疹血管性浮腫を引き起こすこともありうる。
ＩｇＥ媒介性と考えられる他の障害は、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、寄生虫性炎症、過剰ＩｇＥ症候群、血管拡張性失調症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、胸腺リンパ形成不全症、ＩｇＥ骨髄腫及び移植片対宿主反応を含む。
【００９９】
肥満細胞も好塩基球も、ＩｇＥ（ＦｃεＲＩ）に対する高親和性ＩｇＥ細胞膜レセプターを有する。肥満細胞は呼吸器及び胃腸管の粘膜並びに皮膚に多く、そこにアトピー性反応が局在する。これらの細胞によって免疫学的に活性化される媒介物質の物理的影響は、アトピー性疾患の即時相及び遅延相の機能的及び病理的特性によるものである。ＩｇＥアレルギーの重要な媒介物質はヒスタミン、走化因子、プロスタグランジン、ロイコトリエン、及び血小板活性化因子である。
抗原抗体接触の部位は様々である。例えば、アレルギー性鼻結膜炎では、局部的な組織レベルで反応が生じる。アレルゲン粒子、例えば、花粉粒、カビの胞子、ホコリ又はペットの皮膚の薄片との接触後、即座に粘膜表面で可溶性アレルゲンタンパク質が吸収される。この位置で、粘膜肥満細胞のアレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体がアレルゲンと反応し、即時性の媒介物質放出と臨床的な症状を引き起こす。喘息では、気管支の反応が下気道に達することが可能なほど小さい粒子の吸入により引き起こされるのか、あるいは喘息が循環器を通して気管支の粘膜に到達する可溶性アレルゲンによって起こるのかはっきりしていない。アトピー性皮膚炎では、アレルゲン食物の摂取が皮膚の病変を突発させ、このような場合、アレルゲンへの暴露は循環器を介してなされるはずである。また、皮膚炎は、ハウスダストダニアレルギーの例では直接的な局所暴露により活性化されうる。
【０１００】
通常、アトピー患者は複数のアレルギーを有し；多くの環境アレルゲンに対するＩｇＥ抗体とそのアレルゲンからの症状を有する。全ての血清ＩｇＥレベルは、非アトピー性集団と比較するとアトピー性集団において高い平均値となるが、２者の間にかなりの重なりがあり、正常なＩｇＥレベルがアトピーの診断で除外できない。一般に、全ての血清ＩｇＥは、アレルギー喘息を有する患者においてアレルギー性鼻炎を有する者よりも高く、アトピー性皮膚炎を有する者においてさらに高い。上昇したレベルのＩｇＥに関連する疾患には、アレルギー性鼻炎、アレルギー喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、寄生虫性疾患、過剰ＩｇＥ症候群、血管拡張性失調症、ウィスコット・アルドリッチ症候群、胸腺リンパ形成不全症、ＩｇＥ骨髄腫、移植片対宿主反応を含む。
アトピー性疾患の原因となるアレルゲンは、主に自然の空気中有機粒子、特に植物の花粉、カビの胞子並びに動物及び虫の組織片、並びに摂取した食物から誘発される。様々な花粉、カビ又は食物のような幾つかの環境アレルゲンの、種々のＩｇＥを感作する能力は、本質的に他のものより感受性が高くなっている。
典型的なアレルゲンの花粉は、虫媒花（ｉｎｓｅｃｔ−ｐｏｌｌｉｎａｔｅｄ ／ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌｏｕｓ）植物よりも風媒花（ｗｉｎｄ−ｐｏｌｌｉｎａｔｅｄ ／ ａｎｅｍｏｐｈｉｌｏｕｓ）植物によるものである。アレルゲン花粉粒はほとんどが直径１５−５０μｍの球状である。代表的な例には、ヒカゲノカズラ、シダ類、針葉樹（ｃｏｎｉｆｅｒｓ）、顕花植物、イネ科草本、スゲ、ヤシ、ガマ、針葉類（ｎｅｅｄｌｅｓ）、ブナ、アカザ、スイバ、ヤナギ、ポプラ、カエデ、アシュ、ブタクサ及びセージを含む。
【０１０１】
カビの増殖は温度と湿度に比例する。カビは、有性生殖的に又は無性生殖的に繁殖することができ、風媒性の胞子を産生し、ある種のものはアレルゲンとなる。カビの胞子はアトピー患者のアレルギーの重大な原因であるが、それらの形態学、生殖性及び生態学的性質の面からのカビの生物学的な複雑さ及び混乱した分類方法のために認識が薄い。通常のカビの空気中アレルゲンは、次のものを含む：担子菌類（例えば、黒穂菌属（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）、霊芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ）、アルタナリア（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、クラドスポリウム（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、スポロボロミセス（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、エピコッカム（Ｅｐｉｃｏｃｃｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フォーマ（Ｐｈｏｍａ）、ボトリチス（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ）、ヘルミントスポリウム（Ｈｅｌｍｉｎｔｈｏｓｐｏｒｉｕｍ）、ステフィリウム（Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ）、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ））、藻菌（例えば、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ））及び子嚢菌類（例えば、ユーロチウム（Ｅｕｒｏｔｉｕｍ）、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ））。
また、ホコリ及びイエダニもアトピーの重大なアレルゲンである。５０，０００種を超えるダニの種類があるが、チリダニのヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）及びコナヒョウヒダニ（Ｄ． ｆａｒｉｎａｅ）が最も一般的である。これらの極小クモ類は、ほとんど肉眼で見ることができず、世界中のハウスダストサンプルから見つかるが、暖かく湿潤な気候でより多くなっている。それらは特に寝具、落屑したヒトの皮膚細胞が最もよく見つかる布張りの家具及び毛布に多い。ＩｇＥのレベル及びこれらのアレルゲンへの環境暴露は、吸入及び皮膚接触のそれぞれによって暴露が生じるためにアトピー性喘息及び皮膚炎と高い相関がある。
【０１０２】
他のアレルゲンダニには、ユーログリファス・マイネイ（Ｅｕｒｏｇｌｙｐｈｕｓ ｍａｙｎｅｉ）、サヤアシニクダニ（Ｌｅｐｉｄｏｇｌｙｐｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ）、アシブトコナダニ（Ａｃａｒｕｓ ｓｉｒｏ）を含み、それらは全て穀物にはびこるストレージマイトであり、穀物を扱う人の職業アレルギーを引き起こしうる。更にアトピーは家庭やレストラン、特にこれらは過密で衛生状態の悪い所に繁殖しうるゴキブリによっても引き起こされうる。呼吸器アレルギーの更なる特有の原因には、虫の季節的な群衆、例えばカゲロウ、トビケラ及び鱗翅目から発せられるもの又は残骸を含む。動物又はペット（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ラット、マウス）もまた、フケ、唾液、尿及び糞によってアレルギーの原因となりうる。
食物のアレルギー成分は、アトピー性又は非アトピー性反応の何れかのＩｇＥ抗体反応を誘発しうる。食物に対するＩｇＥ抗体は、多くは食物を食べたときにあらゆる反応を引き起こさずにアトピー患者に存在する。無症候性の活性から症候性の活性に変わるように働く因子は、現在のところ分かっていない。あらゆる食物がアレルギーを引き起こす可能性を有し、ある種の食物は他のものよりもアレルゲンとなる可能性が高い。例えば、魚、甲殻類及び軟体類はアナフィラキシー及びアナフィラキシー様反応の重大な原因である。特定の食物のアレルゲン性は加熱又は調理法によって変わりうる。
【０１０３】
アナフィラキシー及びじんま疹
アトピー性疾患は、環境アレルゲンに対して共通してＩｇＥ抗体を生成する遺伝子的素質により特徴づけられるが、ＩｇＥは非遺伝子的アレルギー疾患であるアナフィラキシー及びじんま疹もまた引き起こしうる。全てのＩｇＥ媒介疾患の免疫学的病因は同じだが、アトピー性疾患と非アトピー性疾患の違いは、アレルゲン暴露の形式、病因に影響する遺伝的因子、診断方法、予後及び治療に関係している。
【０１０４】
アナフィラキシー：
アナフィラキシーは、幾つかの器官系、通常は心血管、呼吸器、皮膚及び消化管の同時関与のある急性全身アレルギー反応である。反応は免疫学的に関与し、対象が前もって感作されているところにアレルゲンに対して暴露することで生じる。アナフィラキシーショックは、意識消失と共に又はなしに低血圧となるアナフィラキシーを意味する。アナフィラキシー様反応は、アレルゲン−抗体のメカニズムなしにアナフィラキシーの症状及び徴候が生じる状態である。この場合には、アナフィラキシーの内因性媒介因子が非免疫的な機構を介してインビボで放出される。
アナフィラキシーの免疫学的病因は、ＩｇＥ及びアレルゲンへの暴露の両方を必要とする。アナフィラキシーはアレルゲン−ＩｇＥ肥満細胞媒介物質放出に起因して突発的、全身的に生じるものであり、様々な生命維持に重要な器官の機能において生命に関わる突発性の深刻な変化を生じる。血管虚脱、急性気道閉塞、皮膚血管拡張、浮腫並びに消化管及び尿生殖器筋痙攣がほとんど同時に生じる。
【０１０５】
アナフィラキシーショックにおいて、低血圧及びショックは、細動脈の全身性血管拡張及び後毛細血管細静脈を血漿が急速に浸出する増大した血管浸透性から生じる。血管内から血管外領域へのこの液体の移動は、皮膚及び様々な内臓の浮腫（血管性浮腫）、（特に内臓底部（ｓｐｌａｎｃｈｎｉｃ ｂｅｄ）での）静脈血の貯蔵、血管濃縮、及び血液の粘度上昇と共に血液量不足のショックを生じる。低心拍排出量は、心臓への帰還を減少させ、不十分な冠動脈灌流を生じさせる。低末梢血管抵抗は、心筋低酸素症、リズム障害、及び二次性心臓ショックを引き起こしうる。冠動脈におけるヒスタミンＨ１レセプターの促進は冠動脈攣縮を引き起こしうる。患者の中にはアナフィラキシーの間にさらに狭心痛、場合によっては心筋梗塞を経験するものもある。長時間のショックの後、他の場所、特に腎臓や中枢神経系で臓器不全を残しうる。
患者の中には、気管支筋痙攣、気管支粘膜の浮腫及び好酸球性炎症、及び粘液の気道管腔への過分泌をアナフィラキシーと共に生じるものもあり、急性の喘息の発作と見分けが付かない。主な気管支収縮剤は、大きい近位の（ｐｒｏｘｉｍａｌ）気道に優先的に有効なヒスタミン、及び末梢気道に有効なロイコトリエンである。気道の閉塞は低酸素とのガス交換障害を引き起こし、さらにアナフィラキシーの血管への影響と重なって程度が増す。処置を行わず放置すると、急性肺性心及び呼吸不全が生じうる。また、ヒスタミンは消化管及び子宮平滑筋にも作用し、痛みを伴う痙攣を引き起こす。
【０１０６】
アナフィラキシーに関わるアレルゲンは、アトピーに一般的に関連するものとは異なる。それらは通常、食物、薬剤又は虫の刺傷で遭遇する。食物及び虫の毒は多くの可能性のあるアレルゲンの複合混合物であるので、これらアレルゲンの少数のみが化学的に同定されている。さらに、アレルギー性エピトープの同じアレルゲンが複数の食物、薬剤又は毒に天然に存在することがあり、交差反応を生じうる。アナフィラキシーを引き起こすことが知られている食物には、イセエビ、エビ、カニ、貝類、魚、落花生、エンドウマメ、マメ、甘草、ゴマ、綿実、キャラウェイ、カラシナ、アマニ、ヒマワリ、ナッツ、ベリー類、卵白（アルブミン）、ソバ及び牛乳を含む。
アナフィラキシーに関連する薬剤には、ホルモン（例えば、インスリン、副甲状腺ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン、バソプレッシン、リラキシン）、酵素（例えば、トリプシン、キモトリプシン、キモパパイン、ペニシリナーゼ、アスパラギナーゼ）、ワクチン、トキソイド、アレルギー抽出物、多糖類（例えば、デキストラン、デキストラン鉄及びアカシア）及び種々のハプテン薬剤、例えばある種の抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、セファロスポリン、テトラサイクリン、アンホテリシンＢ、ニトロフラントイン）、診断用薬剤（例えば、スルホブロモフタレイン、デヒドロコール酸ナトリウム）、ビタミン（例えば、チアミン、葉酸）、及びバルビーツ酸塩、ジアゼパム、フェニトイン、プロタミン、アミノピリン、及びアセチルシステインを含む。
アナフィラキシーに関連する虫の毒には、ミツバチ（ｈｏｎｅｙｂｅｅ）（アピスメリフェラ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ））、スズメバチ（ｙｅｌｌｏｗ ｊａｋｅｔ）（ヴェスプラ（Ｖｅｓｐｕｌａ））、スズメバチ（ｈｏｒｎｅｔ）（ホオナガスズメバチ（Ｄｏｌｉｃｈｏｖｅｓｐｕｌａ））、スズメバチ（ｗａｓｐ）（アシナガバチ（Ｐｏｌｉｓｔｅｓ））及びヒアリ（ｆｉｒｅ ａｎｔ）（ソレノプシス（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ））を含む。更なるアレルゲンには精液及びラテックスを含む。
【０１０７】
じんま疹及び血管性浮腫：
じんま疹（Ｕｒｔｉｃａｒｉａ）（じんま疹（ｈｉｖｅｓ）としても知られる）及び血管性浮腫（血管神経性浮腫としても知られる）は、皮膚（じんま疹）又は皮下組織（血管性浮腫）の血管拡張及び増大した血管浸透性により特徴づけられる１つの病気と考えることができる。それは、アナフィラキシの局所的な皮膚で起こる形式であり、全身性アナフィラキシーの症状の１つである。ＩｇＥは、全身性アナフィラキシーと同じようにじんま疹の症状を引き起こし、原因となるアレルゲンも非常に似ている。特有の（非アレルギー性）じんま疹−血管性浮腫は、アナフィラキシー様反応に類似する。アナフィラキシーに比べてじんま疹は、穏和な症状であり、より一般的である。
じんま疹及び血管性浮腫は、血管、たいていは後毛細管の増大した浸透性による局所的な皮膚又は皮下の浮腫の目に見える症状である。急性じんま疹及び浮腫はアレルギー性の原因を有しているようである。これらの場合、局部の肥満細胞に固定されたアレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体は、アレルゲンに遭遇した時に媒介物質の放出又は活性化を引き起こす。特有のじんま疹−血管性浮腫及び種々の物理的なじんま疹は、アレルゲン−抗体の病因を欠いている。皮膚の肥満細胞がこれらの状況で刺激される正確な機構は分かっていない。
【０１０８】
じんま疹は、強烈な痒みのあるはっきりとした境目のある浮腫プラークの複数の領域として現れる。それらは、周囲に紅斑を伴う白色か、又は延びた時の白化を伴う赤色である。個々の病変は、２、３ミリから数センチの様々な直径を有し、円又は蛇行状である。血管性浮腫は、痒みがなく、顔、特に眼窩周囲及び口周囲の領域に偏向性がある非依存性、非陥凹性の腫れの散在した領域として現れる。腫れは、口及び咽頭でも同様に生じる。
摂取したアレルゲンは、吸入したものよりも、より頻繁にじんま疹の原因となる。あらゆる食物及び薬剤がじんま疹を引き起こしうる。専売医薬品を含む薬剤の潜在性の供給源、例えば下剤、頭痛薬及びビタミン剤がアレルゲンであり得る。また、じんま疹は寒気、熱、運動障害又は精神的苦痛も引き起こしうる。
【０１０９】
胃腸疾患
消化管は非常に免疫学的に活性な場所である。消化管腔は、無害で必要な微生物叢、潜在的な病原体、免疫反応を誘発する能力のある多量の複合高分子の複雑な混合物を含む。粘膜の免疫系は、病原体に対する防御的反応を誘発する間に、無害な叢及び食物に対する免疫反応を下方制御する機構を展開する。
グルテン過敏症腸疾患（腹腔疾患）は、コムギ、オオムギ及びライムギに見られる穀物貯蔵タンパク質（グルテン又はグリアジン）に対して過敏であることにより引き起こされる絨毛萎縮及び吸収不良によって特徴づけられる小腸の疾患である。炎症性障害は、主に、摂取したグルテンに最もよく接触した領域にある最も深刻な変化のある小腸の粘膜、近接する小腸に制限される。通常、疾患は、上皮の浮腫及び基底膜の肥厚から始まり、続いて炎症細胞の流入がある。これらの炎症細胞は、一般に多形核白血球であり、すぐにリンパ球及び血漿細胞と置換する。ＩｇＥ血漿細胞は数を増して優勢を確保するが、ＩｇＧ血漿細胞では不均衡な増加がある。これに対し、あらゆるＩｇＥ血漿細胞のうち少数が現れる。
【０１１０】
対照的に、非グルテン感受性食物過敏症はグルテン感受性の様々な症状と非常に類似した症状を有するＩｇＥ媒介性過敏症である。ＩｇＥ媒介性食物過敏症の１つのタイプでは、消化管の局所的なアレルギー反応が全身的なアレルギー症状に関わる。食物アレルゲンへの暴露は、粘膜ＩｇＥ血漿細胞及び肥満細胞の脱顆粒を増大させ、深刻なタンパク喪失性腸症を引き起こす。食事から攻撃的な食物を排除することが、疾患を改善させるのに有効である。
過敏症の第２のタイプでは、臨床的な症状がグルテン感受性食物過敏症で見られるもの：絨毛萎縮及び吸収不良と実質的には同一である。この症状は幼い子供に幾分限られ、牛乳によって最も頻繁に起こる。しかしながら、ダイズ、卵及びコムギのタンパク質も関与している。症状はしばしば胃腸感染症の後に生じ、３歳を過ぎると自然に解消する。
炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、一般的に炎症及び／又は潰瘍形成を引き起こす腸疾患を表す用語である。例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、不定大腸炎（ｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｅ ｃｏｌｉｔｉｓ）及び完成性大腸炎。
また、クローン病（限局性腸炎又は潰瘍性大腸炎としても知られる）は未知の病因の慢性炎症疾患であるが、潰瘍性大腸炎とは異なり、腸のあらゆる部分に影響を与えうる。この疾患の最も顕著な特徴は、腸壁の肥厚した、ザラザラした赤みがかった紫の浮腫である。炎症の進行と共に、これらの肉芽腫はしばしば限局性の境界がなく、周辺組織と一体化している。下痢及び腸の閉塞が顕著な臨床特徴である。潰瘍性大腸炎と同様に、疾患の進行は連続性又は再発性、軽症又は重篤でありうるが、潰瘍性大腸炎と異なり、腸の関連部分を切除することによって治癒させることができない。クローン疾患を有する多くの患者はある時期に手術が必要であるが、その後の再発が通例であり、継続的な医療処置が通常行われる。
【０１１１】
クローン病は、典型的には回結腸、小腸又は結腸−肛門直腸領域で現れるが、消化管の口から肛門までのあらゆる部分に関与しうる。組織病理学的には、疾患は、肉芽種性（ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｏｍａｓ）、腺窩膿瘍、亀裂及びアフター性潰瘍により明白である。炎症浸潤物が混ざり、リンパ球（Ｔ及びＢ細胞）、血漿細胞、マクロファージ、及び好中球から構成される。ＩｇＭ及びＩｇＧ分泌血漿細胞、マクロファージ及び好中球で不均衡な増加がある。
抗炎症薬、スルファサラジン及び５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）は、軽症の活性間代性クローン病の治療に利用され、一般に疾患の緩解を維持するために処方される。メトロニダゾール及びシプロフロキサシンは、スルファサラジンと同様の効果であり、肛門周辺の疾患の治療に特に有用なようである。より重篤な場合には、副腎皮質ステロイドが急性悪化の治療に効果的であり、さらに緩解を維持する。また、アザチオプリン及び６−メルカプトプリンは、副腎皮質ステロイドの慢性的な投与を必要とする患者での成功が示されている。また、これらの薬剤が長期間の予防に役立つ可能性もある。不運なことには、患者の中には作用が現れるまで非常に時間がかかる（最大６ヶ月）ものもいる。
【０１１２】
また、止瀉薬は、患者によっては症候性の苦痛を与えることがある。食事療法又は成分栄養は、患者の栄養状態を改善して急性疾患の全身的改善を促進することができ、持続した臨床的緩解をせずにすむ。抗生物質は二次的な小腸細菌の過剰増殖の治療、及び化膿性合併症の治療に使用される。潰瘍性大腸炎（ＵＣ）は、大腸を冒す未知の病因の慢性炎症疾患である。疾患の進行は、断続性又は再発性、軽症又は重篤であり得る。最も初期の障害は、リーベルキューンの陰窩の下部で膿瘍形成を伴う炎症浸潤である。これらの膨張及び破裂した陰窩の結合は、覆っている粘膜をその血液供給から引き離して潰瘍形成を引き起こす傾向がある。疾患の症状には、痙攣、下腹痛、結腸出血、及び不十分な糞便を伴った主に血液、膿及び粘液等の頻繁な漏出を含む。急性の、重篤又は慢性の、断続的な潰瘍性大腸炎には全結腸切除が必要とされうる。
ＵＣの臨床的な特徴は非常に様々で、潜行的に又は突然はじまり、下痢、しぶり及び再発性直腸出血を含みうる。大腸全体の劇症性関与、中毒性巨大結腸によって、生命に関わる緊急事態が生じうる。腸外での徴候には、関節炎、壊疽性膿皮症、ブドウ膜炎、及び結節性紅斑を含む。
ＵＣの治療には、軽症の場合にはスルファサラジン及び関連したサリチル酸塩を含む薬剤を、重篤な場合には副腎皮質ステロイドを含む。サリチル酸塩又は副腎皮質ステロイドの何れかの局所投与は、時に効果的であり、特に疾患が腸の末端部である場合や全身的な使用に比較して小さな面の効果に関係している場合に効果的である。時には、鉄及び止瀉薬の投与等の支持的な手段を必要とする。アザチオプリン、６−メルカプトプリン及びメトトレキサートもまた、難治性の副腎皮質ステロイドに依存した場合における使用に処方される。
【０１１３】
粘膜炎は粘膜上皮組織の潰瘍性破壊によって特徴づけられ、事実上粘膜の炎症と定義される。粘膜炎の病態生理は複雑で、細胞、サイトカイン及び菌叢どうしの相互作用のカスケードに関与する。化学療法又は放射線障害に対する中咽頭及び消化管の粘膜の感受性の根拠は素速い上皮幹細胞の代謝に関係する。粘膜炎は次の４つのフェーズを生じることで説明することができる：（１）細胞障害剤によって引き起こされる局所の組織損傷に対する応答における炎症性サイトカインの放出により特徴づけられる初期炎症性フェーズ；（２）上皮の再増殖を妨害する程度の基底細胞の死によって特徴づけられる上皮性フェーズ；（３）局所感染に対する炎症応答を生じる菌叢の局所侵入に特徴づけられる感染性フェーズ。この炎症が更なる局所組織損傷及び侵食性潰瘍形成の可能性を生じ；（４）上皮の感染の回復及び再生に特徴づけられる治癒フェーズ。
口腔粘膜炎は細胞性損傷から生じる次の臨床的な徴候と症状を生じる：（１）乾燥した感じ；（２）無症候性の赤み及び紅斑；（３）接触痛のある孤立性白色の高剥離性斑；（４）嚥下障害及び経口摂取減退に関係する広範で、痛みのある、隣接の偽膜性病変部。これらの自発痛のある病変部は組織病理学的に基底膜までの上皮細胞の喪失を示し、関連する神経支配を有する結合組織間質を露出させる。
【０１１４】
胃腸粘膜は、しぶり（痛みを伴う排便時の無効な緊張）、痛み、出血、下痢、末梢血管拡張（新血管新生）、及び潰瘍形成の進行の臨床的徴候及び症状を生じる。下痢の初期徴候は、排便回数の増加、柔らかい又は水様の便、食物嫌悪、腸音の増加、腹痛、及び乾燥を表す皮膚弾力性（ｔｕｒｇｏｒ）のある程度の低下を含む。下痢が途絶えたとき、潰瘍形成、出血、腸穿孔及び直腸炎に関連しうる。便検査は潜在成の血液及び便白血球を明らかにする。
壊死性腸炎は、集中治療室に入る全乳児の１−５％が罹患する未知の病因の炎症性疾患であり、そのほとんどが早産児である。徴候及び症状は、腹部膨満、消化管出血、及び不耐感を含む。疾患は最もよく回腸と大腸に関わっており、上皮の喪失及び粘膜下浮腫、潰瘍形成、重傷な場合には、経壁の壊死に特徴づけられる。
【０１１５】
２．更なる免疫関連疾患
本発明のペプチドは、様々な他の免疫関連疾患を治療するために使用できると考えられる。ここで考慮される他の免疫に関連する病状又は疾患の例には、限定するものではないが、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、若年性慢性関節炎、骨関節症、脊椎関節症、全身性硬化症（強皮症）、特発性炎症ミオパシー（皮膚筋炎、多発性筋炎）、シェーグレン症候群、全身性血管炎症症（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血（免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿）、自己免疫性血小板減少（特発性血小板減少性紫斑病、免疫仲介血小板減少）、甲状腺炎（グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎）、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患（糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎）、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄性多発神経障害又はギラン−バレー症候群、及び慢性炎症脱髄性多発神経障害、肝疾患、例えば伝染性肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及び他の非肝炎性（ｎｏｎ−ｈｅｐａｔｏｔｒｏｐｉｃ）ウィルス）、自己免疫性慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎；クローン病）、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑及び接触性皮膚炎を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、乾癬、好球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎のような肺の免疫疾患、拒絶反応及び移植片対宿主疾患を含む移植関連疾患が含まれる。
【０１１６】
全身性紅斑性狼瘡において、疾患の中心的媒介は、自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体の産出、及びその後の免疫媒介炎症の発生である。これらの抗体は直接的又は間接的に組織傷害を媒介する。腎臓、肺、筋骨格、皮膚粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を含む複数の器官及び系が臨床的な影響を受ける。
リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、複数の関節の滑膜に関係する慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はリウマチ因子、内在タンパク質に対する自己抗体の産生に関係し、結果として滑液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。これらの複合体は、滑液区画へのリンパ球、単球及び好中球による浸潤を誘発しうる。影響を受けている組織は、多くの場合対照的なパターンで主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態では、典型的な障害は、肺線維症、血管炎、及び皮膚潰瘍である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、ＲＡ疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾肥大の存在に関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。多くの場合、患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡで生じる可能性のある他の徴候には：心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
【０１１７】
若年性慢性関節炎は、多くの場合１６才以下で発症する慢性特発性炎症疾患である。その表現型はＲＡといくつかの類似点があり；リウマチ因子がポジティブである患者の中には若年性リウマチ様関節炎に分類されるものもいる。この疾患は主な３つのカテゴリー：小関節（ｐａｕｃｉａｒｔｉｃｕｌａｒ）、多関節（ｐｏｌｙａｒｔｉｃｕｌａｒ）及び全身性のものに亜分類される。関節炎は重度で局所的な破壊が生じ、関節強直症及び遅延成長に至るおそれもある。他の徴候には慢性前ブドウ膜炎及び全身性アミロイド症が含まれる。
脊椎関節症は、一般的にＨＬＡ−Ｂ２７遺伝子生成物の発現に関連した、いくつかの共通した臨床的特徴を有する疾患のグループである。疾患には：強直症、脊椎炎（ｓｐｏｎｙｌｉｔｉｓ）、ライター症候群（反応性関節炎）、炎症性大腸疾患に関連した関節炎、乾癬に関連した脊椎炎、若年発生脊椎関節症及び未分化脊椎関節症が含まれる。区別する特徴には、脊椎炎を伴うか伴わない仙腸関節炎；ＨＬＡ−Ｂ２７（血清学的には、クラスＩ ＭＨＣのＨＬＡ−Ｂ座位にある定義された対立遺伝子）を伴う炎症非対称性関節炎；眼の炎症、及び他のリウマチ疾患に関連した自己抗体の不在が含まれる。疾患の誘導における鍵として関わるほとんどの細胞はＣＤ８＋Ｔリンパ球であり、クラスＩ ＭＨＣ分子により付与される抗原を標的としている細胞である。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子により発現した外来ペプチドであるかのように、クラスＩ ＭＨＣ対立遺伝子ＨＬＡ−Ｂ２７と反応する。ＨＬＡ−Ｂ２７のエピトープが細菌性又は他の微生物の抗原エピトープを模倣し、よってＣＤ８＋Ｔ細胞の反応が誘発されると仮定されている。
【０１１８】
全身性硬化症（強皮症）は病因がよく知られていない。疾患の特徴は皮膚の硬化であり、これは活性化炎症プロセスにより誘発される。強皮症は局部的又は全身的である。血管障害が一般的で、微小血管系における内皮細胞傷害は全身性硬化症の発達における初期の重要な事象である。免疫学的基準では、皮膚障害における単核細胞浸潤の存在、多くの患者において抗細胞核抗体の存在を意味する。多くの場合、ＩＣＡＭ−１は皮膚障害における線維芽細胞の細胞表面をアップレギュレーションし、これらの細胞と相互作用するＴ細胞が疾患の病因における役割を担っていることが示唆される。他の器官藻また関連する。胃腸管では、平滑筋萎縮症及び線維症が異常なぜん動／運動性を生じさせる。腎臓では、小弓形及び小葉間動脈に影響を及ぼす同心性内皮下内膜増殖が、腎皮質の血流の低下させ、タンパク尿、高窒素血尿及び高血圧を生じさせる。骨格筋及び心筋では、萎縮、間質性線維症／瘢痕、及び壊死が生じうる。最後に、肺は間質性肺炎及び間質性線維症を有しうる。
皮膚筋炎、多発性筋炎及び他のものを含む特発性炎症ミオパシーは病因がよく知られていない慢性筋肉炎症疾患であり、筋肉の弱化に至る。筋肉損傷／炎症は多くの場合対称的で進行性である。自己抗体は多くの形態と関連している。これらの筋炎特異的自己抗体は、タンパク質合成に関与する成分の機能を阻害及び対抗する。
【０１１９】
シェーグレン症候群は、免疫媒介炎症、続く涙腺及び唾液腺の機能破壊によるものである。この疾患は炎症結合組織疾患を伴うか又は伴わない。この疾患は、双方ともが小ＲＮＡ−タンパク質複合体であるＲｏ及びＬａ抗原に対する抗体産出に関連している。障害により、結果として乾性角結膜炎、ｂｉｌａｒｙ硬変を含む他の徴候又は会合を伴う口内乾燥、末梢又は感覚ニューロパシー、及び明白な紫斑病に至る。
全身性血管炎症症は主な障害が炎症で、続いて血管にダメージを受け、結果として影響を受けた脈管により供給される組織に虚血／壊死／変性が生じ、最終的な末端器官ではいくつかのケースで機能障害になるといった疾患である。また、第２の障害として血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｄｅｓ）、又は他の免疫炎症媒介疾患、例えばリウマチ様関節炎、全身性硬化症等、特に免疫複合体の形成に関連した疾患等の続発症が生じるおそれがある。主な全身性血管炎症症グループの疾患には：全身壊死性血管炎：多動脈炎結節（ｐｏｌｙａｒｔｅｒｉｔｉｓ ｎｏｄｏｓａ）、アレルギー性脈管炎及び肉芽腫症、多脈管炎：ヴェゲナー肉芽腫症；リンパ腫様肉芽腫症：及び巨細胞動脈炎が含まれる。種々の血管炎には：粘膜皮膚リンパ節症候群（ＭＬＮＳ又は川崎病）、単離したＣＮＳ血管炎、ベヘット（Ｂｅｈｅｔ’ｓ）病、閉塞性血栓性血管炎（バージャー病）及び皮膚壊死性細静脈炎（ｖｅｎｕｌｉｔｉｓ）が含まれる。列挙した血管炎のほとんどの種類の病原メカニズムは、主に脈管壁に免疫グロブリン複合体が付着し、続いてＡＤＣＣ、補体活性又は双方を介して炎症反応が誘発されることによると考えられている。
【０１２０】
サルコイドーシスは、体内のほとんど任意の組織中に類上皮細胞肉芽腫が存在し、肺ではほとんど一般的に包含されることにより特徴付けられる、病因がよく知られていない病状である。病原には疾患部位に活性マクロファージ及びリンパ球が残留していることに関連しており、続いてこれらの細胞種より放出される局部的又は全身的活性物質の放出の結果として慢性続発症が生じる。
自己免疫性溶血性貧血、免疫再生不良性貧血、発作性夜間血色素尿を含む自己免疫性溶血性貧血は、赤血球細胞（いくつかのケースにおいは、血小板を含む他の血液細胞）表面で発現する抗原と反応する抗体が産出される結果によるものであり、補体媒介溶解及び／又はＡＤＣＣ／Ｆｃ−レセプター−媒介メカニズムを介して、その抗体被覆細胞の除去に反映される。
他の臨床的セッティング（ｓｅｔｔｉｎｇ）における血小板減少性紫斑病及び免疫仲介血小板減少を含む自己免疫性血小板減少では、抗体又は補体が血小板に接合し、続いて補体溶解、ＡＤＣＣ又はＦｃ−レセプター−媒介メカニズムによる除去の結果として生じる。
グレーブス疾患、ハシモト甲状腺炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎を含む甲状腺炎は、甲状腺内に多くの場合特異的に存在するタンパク質と反応する抗体の産出を伴う、甲状腺抗原に対する自己免疫反応の結果によるものである。実験用モデルには：内在的モデルラット（ＢＵＦ及びＢＢラット）及びチキン（肥満チキン種）；誘導性モデル：チログロブリン、甲状腺ミクロソーム抗原（甲状腺ペルオキシダーゼ）を用いた動物の免疫化が含まれる。
【０１２１】
糖尿病は、インスリン分泌の相対的又は絶対的な不足及び様々なインスリン抵抗度と関係がある。その完全に進行した臨床的発現では、それは空腹時低血糖により、大多数の長期疾患においてはアテローム硬化型及び微小血管障害性の血管疾患及び神経障害により特徴づけられる。種々の型の疾病間の違いは、原因及び病因、自然史、及び処置に対する反応の点において示される。従って、糖尿病は、単なる病気ではなく症候群である。
Ｉ型、又はインスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は西洋における全ての糖尿病患者の約１０パーセントに発症する。Ｉ型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病は、膵臓小島β細胞の自己免疫破壊であり；この破壊は自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞により媒介される。また、インスリン又はインスリン様レセプターに対する抗体は、インスリン−非−反応性の表現型を産出することができる。
典型的に、この型の疾病が幼児期及び青年期に最も一般的に生じるが；あらゆる年齢に見られ、及び徴候がある。ＩＤＤＭの最も一般的な型（ＩＡ型）において、遺伝的な要因に加えて、環境的（後天的）要因、例えば特定のウィルス感染、あるいは化学物質がβ細胞の細胞媒介性自己免疫崩壊を引き起こしうることが必要条件とされうる。従って、細胞媒介性の体液性自己免疫により特徴づけられる一般的に測定される異常な免疫反応（ＨＬＡ会合に関連する）は、環境的因子による誘起後の病原的役割を果たすと考えられる。ＩＤＤＭの第２の型（ＩＢ型）は主に自己免疫によると考えられている。これらの患者は、ハシモト甲状腺炎、グレーブス疾患、アジソン病、一次性腺機能不全、及び関連した比内分泌性自己免疫疾患、例えば、悪性貧血、結合組織疾患、セリアック病及び重症筋無力症等の自己免疫内分泌疾患に関連している。インスリン依存は、インスリンの投与が突発性のケトン症、昏睡、死の予防に必須であることを意味する。しかしながら、インスリン治療をしていてもなお、糖尿病患者は糖尿病に関連した更なる多くの問題、即ち結合組織疾患、神経障害等を有しうる。
【０１２２】
糖尿病の第２の型、ＩＩ型又は非インスリン依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）は全糖尿病の約９０％を占め、遺伝的な原因を有する。ＩＩ型糖尿病を有する患者は、普通から過剰の範囲の体重を有しうる。肥満及び病理的インスリン抵抗性は、ＮＩＤＤＭの進行において決して必須ではない。ＮＩＤＤＭを有する患者の大部分が、中年で糖尿病になる。ＮＩＤＤＭを有する患者は、ケトン症予防のための非インスリン依存であるが、これらが食事又は経口薬の使用で達成されない場合には、彼らは症候性又は非症候性の持続的な空腹時性低血糖を正すためにインスリンを必要としうる。従って、インスリンの治療的投与は、ＩＤＤＭ及びＮＩＤＤＭの間に違いは無い。ＮＩＤＤＭのいくつかのファミリーでは、グルコースに対するインスリン分泌反応が非常に遅いので、あらゆる時に初期のＩ型糖尿病と共通点を有しうる。その自然史の初期、インスリン分泌不足及びインスリン抵抗性は、グルコース許容度の正常化での治療（即ち、体重減少）により可逆的でありうる。糖尿病の典型的な慢性の合併症、つまり大血管障害、微小血管障害、神経障害、及びＩＤＤＭに見られる白内障が、ＮＩＤＤＭによく見られる。
他の型の糖尿病は、特定の他の状態又は症候群の派生的な又はそれと関連したものを含む。糖尿病は、膵臓疾患又は膵臓組織の切除；内分泌疾患、例えば、末端巨大症、クッシング症候群、クロム親和細腫、グルカゴン産生腫瘍、ソマトスタチン産生腫瘍、又は原発性アルドステロン症；高血糖を引き起こすホルモンの投与；及びある種の薬剤（即ち、降圧剤、チアジド系利尿薬、エストロゲンを含む製剤、精神賦活剤、交感神経模倣薬）の投与から２次的に生じうる。糖尿病は、多数の遺伝的症候群に関連しうる。最後に、糖尿病は、インスリンレセプターの遺伝的欠陥に関連しているか、又は関連免疫疾患を伴う又は伴わないインスリンレセプターに対する抗体に依るものである。
【０１２３】
糸球体腎炎及び尿細管間質性腎炎を含む免疫媒介腎疾患は、腎抗原に対する自己反応性抗体又はＴ細胞が産出される結果により直接的に、又は他の非腎抗原に対して反応する、腎臓における抗体及び／又は免疫複合体の沈着の結果により間接的に、腎組織に抗体又はＴ細胞媒介傷害が生じることによるものである。よって、免疫複合体の形成の結果生じる他の免疫媒介疾患により、間接的続発症等の免疫媒介腎疾患が誘発される。直接的及び間接的免疫メカニズムの双方により、結果として腎組織における障害発達が産出／誘発されるといった炎症反応が生じ、器官機能が損なわれ、いくつかのケースでは腎臓機能不全が進行する。体液及び細胞免疫メカニズムに双方が障害の病原に関与している。
多発性硬化症のような中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、又はギラン−バレー症候群；及び慢性炎症脱髄性多発神経障害は、自己免疫基準であり、神経脱髄が生じて、オリゴデンドロサイト又はミエリンに直接的に起因するダメージの結果によるものと考えられている。多発性硬化症は、Ｔリンパ球依存性であり、再発性弛緩経路又は慢性進行経路のいずれかを有する脱髄疾患である。病因はよく知られていないが、ウイルス感染、遺伝的素因、環境及び自己免疫性の全てが寄与している。障害はＴ細胞媒介小膠細胞の優先的浸潤、及びマイクロファージの浸潤を含み；ＣＤ４＋Ｔリンパ球は障害において優先的な細胞型である。
【０１２４】
好酸球肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎を含む炎症及び線維症の肺疾患には、調節されない免疫炎症反応が関連しうる。反応を阻害することは治療的に有益なことであり、本発明の範囲内である。
免疫及び／又は炎症反応への介在が有益である他の疾患には、限定するものではないがウイルス感染（限定するものではないがＡＩＤＳ、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型肝炎及びヘルペス）、細菌感染、真菌感染、原生動物感染及び寄生虫感染（ＭＬＲを刺激する分子（又は誘導体／アゴニスト）を治療に利用して感染要因に対する免疫反応性を増強することができる）を含む感染疾患であり、ＭＬＲを刺激する免疫不全疾患（分子／誘導体／アゴニスト）は、遺伝性の、後天性の、感染誘発された（例えばＨＩＶ感染）、又は医原性の（即ち、化学療法からのもの）免疫欠損、及び異常増殖の状態に対する免疫反応を増強するために治療上用いることができる。
さらに、炎症誘発性特性を有する分子を阻害することは、再灌流傷害；脳卒中；心筋梗塞；アテローム性動脈硬化；急性肺傷害；出血性ショック；火傷；敗血症／敗血症ショック；急性尿細管壊死；子宮内膜症；変性関節疾患及び膵炎（ｐａｎｃｒｅａｔｉｓ）の治療に有益である。
【０１２５】
本発明の化合物、例えばポリペプチド又は抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入（鼻孔内、肺内）経路などにより投与される。
また、他の免疫疾患に関連した、又は腫瘍に関連した抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ４０、ＣＤ１８、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又は血管内皮因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体を投与することも好ましい。別法として、又は付加的に、同一の抗原又はここに開示した二又はそれ以上の異なる抗原に結合する二又はそれ以上の抗体を患者に同時投与してもよい。しばしば、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有益である。一実施態様では、本発明のポリペプチドは、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて本発明のポリペプチドを投与する。しかしながら、同時投与、又は最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤と本発明のポリペプチドとの組み合わせ（相乗）効果により減少させ得る。
重篤な免疫関連疾患の治療又は低減のための、本発明の化合物の適切な用量は、上記で定義したような治療される疾患の型、疾患の重篤さ及び経過、防止又は治療目的で薬剤が投与されるか否か、従前の治療、患者の臨床履歴及び化合物に対する反応、及び主治医の裁量に依存する。化合物は、適切には患者に一回又は一連の治療に渡って適切に投与される。
【０１２６】
Ｊ．製造品
本発明の他の実施態様では、前述した疾患の治療に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は容器及び説明書を含んでなる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は病状の治療に有効な組成物を収容しており、滅菌した出入口を有している（例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい）。組成物中の活性剤は本発明のペプチドを含む。更に組成物はここで開示される何れかの又は複数の成分を含む。容器上の又は容器に付随する説明書には、組成物が、選択された病状の治療に使用されることが示されている。例えば、説明書には組成物がＩｇＥ媒介疾患の治療に有効であることが示されうる。さらに製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガル液及びブドウ糖液を収容する第２の容器をさらに具備しうる。さらに、他のバッファー、希釈剤、（例えばここに記載されるような）、フィルター、針、シリンジ、及び使用指示書を含むパッケージ挿入物を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
【０１２７】
（実施例）
実施例１
ファージ提示したペプチド−ｇ８ライブラリーでのＩｇＥレセプター結合選択
Ｍ１３繊維状ファージでの提示のために一連のペプチドライブラリーを構築した。各ペプチドライブラリーは、１８−２０残基の長さのランダムな配列からなり、Ｍ１３繊維状ファージの主要コートタンパク質、遺伝子８−タンパク質（ｇ８ｐ）のＮ末端に融合させた。ｇ８ｐポリペプチド融合体としてペプチドライブラリーを多価提示できるファージミド構築は、Ｌｏｗｍａｎ 等， （１９９８） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３７， ８８７０−８８７８ （１９９８） 及びＳｉｄｈｕ 等， （２０００） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３２８：３３３−３６３に記載されている。１０のライブラリーのうち９つが、変化するｉ、ｊ、及びｋを有するＸｉＣＸｊＣＸｋの形態を有するシステイン残基の一定の対を含む。また、これらのライブラリーの２つはシステインペア内に一定のＧｌｙ−Ｐｒｏ配列も含む。１つのライブラリーは２０のみのランダムな残基を含み、一定のシステインペアはなかった。ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ大腸菌での形質転換体の数に基づくライブラリーの多様性はおよそ１０８程度であった。
これらのライブラリーは、選択の前に４つのグループで貯蔵された。グループ１はライブラリー３００（ＳＧＴＡＣＸ２ＧＰＸ４ＣＳＬＡＧＳＰ） （配列番号：９３）からなり；グループ２はライブラリー３０１（Ｘ４ＣＸ２ＧＰＸ４ＣＸ４） （配列番号：１７）からなり；グループ３はライブラリー３０２（Ｘ２０）（配列番号：１０１）からなり；グループ４はライブラリー３０３−３０９（それぞれＸ７ＣＸ４ＣＸ７， Ｘ７ＣＸ５ＣＸ６， Ｘ６ＣＸ６ＣＸ６， Ｘ６ＣＸ７ＣＸ５， Ｘ５ＣＸ８ＣＸ５， Ｘ５ＣＸ９ＣＸ４， Ｘ４ＣＸ１０ＣＸ４）（配列番号：９４−１００）からなる。ファージ粒子は、ＰＥＧ沈降により２回精製し、１．０ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。
【０１２８】
ＣＨＯ細胞から作成し、ＩｇＧのＦｃドメインに融合したＦｃεＲＩの細胞外ドメインからなる２価の融合タンパク質、ＦｃεＲＩ−ＩｇＧ（ジェネンテック社）で結合選択を実施した。ファージ結合選択のために、９６ウェル免疫吸着プレートをＦｃεＲＩ−ＩｇＧでコートし、０．５％のＢＳＡを含有するＰＢＳで遮断した。コーティングは２μｇ／ｍＬのＦｃεＲＩ−ＩｇＧのＰＢＳ溶液による受動吸着によって実施した。結合選択のために、ファージ濃度をＯＤ２６８（１ＯＤ＝１．１３ｘ１０１３ファージ／ｍｌ）で測定し、次いでファージ選択バッファー（ＰＢＴＴ）：０．５％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０及び０．００５％のトリトンＸ−１００を含有するＰＢＳで１ｘ１０１１ファージ／ｍＬの濃度まで希釈した。１００ｕｌの希釈ファージを９６ウェルマイクロタイターＭａｘｉｓｏｒｐプレートの８ウェルに加え、上記のようにしてコートした。ＦｃεＲＩ−ＩｇＧのＩｇＧ−Ｆｃ領域に結合するファージペプチドの数を減少させるために、さらに２５ｕｇ／ｍＬのＩｇＧ１ヒト化モノクローナル抗体溶液をファージ選択バッファーに加えた。プレートを室温で２−３時間インキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ（ＰＢＴ）で各ウェルを１０回洗浄し、結合していないファージ粒子を取り除いた。ｐＨ２．０の０．２Ｍグリシンで７分間、結合したファージを溶出させ、１Ｍトリスベース（Ｔｒｉｓ Ｂａｓｅ）で中和した。選択のその後のラウンドのために、溶出したプールの半分をＸＬ−１大腸菌細胞への再感染に使用した。数ラウンドの結合選択と増殖を、コロニーを数えることによって選択のモニターをしながら実施し、各ラウンドでの濃縮係数を測定した。第３、第４及び第５ラウンドのパニングの次に、濃縮割合、つまり、非特異的遮断薬、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に結合するものに対比したレセプターに特異的に結合するクローンの割合についてプールを評価した（例えばＬｏｗｍａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８７， ２４９−２６４ （１９９８）参照）。プール２（＃３０１， Ｘ４ＣＸ２ＧＰＸ４ＣＸ４） （配列番号：１７）のみが、第３、第４及び第５ラウンドそれぞれで１５、６６６及び３２５の値を有する、ＢＳＡ結合率に対して高いＦｃεＲＩ−ＩｇＧレセプターの結合率を示した。他に、プール１（＃３００）、プール３（＃３０２）、及びプール４（＃３０３−３０９）は、ＢＳＡに結合するものに対比してＦｃεＲＩに結合するクローンの結合率において有意な増加を示さず、従って更なる分析の可能性のある候補の原料とはされなかった。
【０１２９】
ａ）選択したペプチドファージクローンの配列
選択したペプチド−ファージクローンの配列を決定するために、対数期のＸＬ−１ Ｂｌｕｅ大腸菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）をファージに感染させ、５．０ｍＬの２ＹＴブロス、カルベニシリン及びＶＣＳＭヘルパーファージ中で一晩増殖した。ファージ含有上清をＰＥＧ沈降によって精製し、１００ｕＬのＰＢＳに再懸濁した。ファージを９５℃で５分間熱し、遠心分離した。一本鎖のＤＮＡ鋳型を上清から単離し、標準のＳｅｑｕｅｎａｓｅＪ（ＵＳＢ）製品を用いて配列決定に使用した。ペプチドのコード領域の〜８０ｂｐ上流をアニーリングしたオリゴヌクレオチド６８７を、配列決定プライマーとして使用した。
一本鎖ＤＮＡをポジティブに結合するクローンから単離し、配列決定して、ファージが提示したペプチド配列、更に各クローンの頻度を測定した。３ラウンドの選択後のクローンは、配列（表１参照）ＭＧＴＬＣＬＥＧＰＥＧＷＦＣＩＥＳＡ （配列番号：１）、ＱＥＷＴＣＶＥＧＰＲＧＷＥＣＩＡＶＬ （配列番号：２）、ＤＧＳＬＣＦＥＧＰＷＧＷＩＣＱＳＤＧ （配列番号：３） 及びＴＧＥＡＣＶＥＧＰＧＡＷＶＣＣＬＥＰ （配列番号：４）を有し、それぞれクローンの５５、２３、１８、及び４パーセントを示す（２２配列）。配列のうち高い保存性を示すものは、７位のＧｌｕ、１２位のＴｒｐ並びに６位の疎水性残基（Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ）であった。全てのクローンは８位と９位にそれぞれＧｌｙ−Ｐｒｏ、４位と１１位にシステイン残基を含み、その全てが未処理のライブラリーで初期に作成されていた。１つのクローンは１７位に付加的な（対になっていない）システイン残基を含んでいた。第５ラウンドの選択からの１７のクローンも更に配列決定した。８のクローンが配列ＭＧＴＬＣＬＥＧＰＥＧＷＦＣＩＥＳＡ （配列番号：１）を有し、他の８つがＴＧＥＡＣＶＥＧＰＧＡＷＶＣＣＬＥＰ （配列番号：４）であり、１つがＱＥＷＴＣＶＥＧＰＲＧＷＥＣＩＡＶＬ （配列番号：２）であった。これらの第５ラウンドのクローンの全てが、配列決定したクローンの第３ラウンドグループでも存在していた。
【０１３０】
2004517816.tif 000957
【０１３１】
ｂ）遺伝子８ファージでの更なるペプチドの選択
Ｘ４ＣＸ２ＧＰＸ４ＣＸ４ （配列番号：１７）のライブラリーから更なるペプチドを選択するために、固定したＦｃεＲＩ−ＩｇＧで選択を繰り返したが、結合選択の間、先に選択したｇ８ａ．３７クローン（表１）と対応する５−１０ｕＭの濃度の合成ペプチドに維持された。この濃度はレセプター（下記参照）に結合するペプチドの解離定数未満がよいが、インキュベーションバッファーに競合物としてそれを含有させることは、より強く結合するペプチドの選択に役立ち得た。同様に、ペプチドが阻害剤として働き、これによってレセプターの他の部位への直接選択に役立ちうる。４回の連続したラウンドのパニングを実施し、各ラウンド後に結合濃縮のレベルを測定した。ラウンド１、２、３、及び４の後にそれぞれ６倍、１８倍、１４６６倍及び２５００倍の増加を観察した。クローンを単離し、配列決定した（表２）。
【０１３２】
2004517816.tif 000958
ラウンド３で、２０のクローンのうち１５が配列ＥＩＱＥＣＴＥＧＰＷＧＷＦＣＶＧＳＧ （配列番号：８）を有し、２０のうち３がＡＥＡＴＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：９）であり、２０のうち２がそれぞれＮＹＥＥＣＶＭＧＰＤＧＶＷＣＬＩＰＴ （配列番号：６）又はＧＲＰＳＣＩＥＧＰＳＧＬＷＣＬＩＥ （配列番号：７）であった。更なるクローンは３３のクローン配列決定のラウンド４から配列決定され、２つ優勢な配列のみが維持され、３３クローンの１５がＡＥＡＴＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：９）であり、３３のうち１８がＥＩＱＥＣＴＥＧＰＷＧＷＦＣＶＧＳＧ （配列番号：８）であった。
【０１３３】
実施例２
ＦｃεＲＩ結合ペプチドのｇ８ｐ及びｇ３ｐファージディスプレイベースアッセイ
ＦｃεＲＩ−ＩｇＧでのパニングの幾つかのラウンドの後に、ファージクローンをレセプターに対する特異的結合及びＩｇＥによる阻害についてアッセイした。ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ大腸菌細胞をファージライブラリーのプールによって感染させ、ＬＢ／カルベニシリン寒天プレート上に蒔いた。個々のコロニーを採り、抗生物質（カルベニシリン及びテトラサイクリン）及び１０１０／ｍＬのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を含有する５ｍＬの２ＹＴブロス中で一晩増殖させた。培地を遠心分離し、２０％のＰＥＧと２．５ＭのＮａＣｌを含有する１．０ｍＬの溶液を上清に加えた。１０分後、混合物を１０分間１０ＫのＲＰＭで遠心分離した。上清を吸引し、残ったファージペレットを１００ｕＬのＰＢＳに可溶化した。ＦｃεＲＩ−ＩｇＧを固定したＭａｘｉｓｏｒｐ９６マイクロタイタープレート上でヒトＩｇＥ（２ｕｇ／ｍＬ）の存在及び不存在下において、１／１００希釈の可溶化ファージを１時間インキュベートした。プレートをＰＢＴで５回洗浄し、１／５０００希釈のセイヨウワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートした抗Ｍ１３ファージ抗体（ファルマシア社）を室温で３０分間添加した。プレートを再びＰＢＴで５回洗浄し、１００ｕＬのＯＰＤ（ｏ−フェニレンジアミン）基質を添加した。１５分後、５０ｕＬの２．５ＭのＨ２ＳＯ４を添加することによって反応を停止した。各ウェルのＯＤをＳＬＴプレートリーダーを用いて４９２ｎｍの波長で測定した。
プール２からの９５％を超えるクローンがＦｃεＲＩ−ＩｇＧに特異的に結合し、ウシ血清アルブミンにも４Ｄ５、ヒトＩｇＧ１抗体にも結合しなかった。さらに、ＩｇＥによる結合阻害試験において、ＩｇＥがインキュベーションバッファーに存在する場合に９５％以上の陽性のクローンが結合を抑制された。
【０１３４】
実施例３
一価ファージディスプレイを用いたペプチドの最適化
ペプチドＥＩＱＥＣＴＥＧＰＷＧＷＦＣＶＧＳＧ （配列番号：８）及びＡＥＡＴＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：９）を最適化のためにファージの遺伝子３への融合として選択した。ここでこれらのペプチドに基づく更なるライブラリーを、ｇ３ファージディスプレイに基づいて構築し、より強く結合するペプチドを選択した。ｇ３ファージディスプレイフォーマットにおいて、ディスプレイのレベルは通常一価であり、従って、選択は個々の分子の結合相互作用の親和性に依存する。ｇ８ファージフォーマットにおいて、ペプチドの提示は多価であり、ペプチドの選択をより弱い結合相互作用で可能にする結合活性力による選択効果である。両方のペプチドのランダム化残基１−４、５−１５及び１７−２０に基づいてライブラリーを作成した。固定したＦｃεＲＩ−ＩｇＧに対する５ラウンドのパニングの後、１−４位にランダム化した残基を有するライブラリーに基づくＡＥＡＴＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：９）のみが有意な強さを有していた。配列決定及びファージ結合ＥＬＩＳＡアッセイによるＩＣ５０値の測定のために７つのクローンを採った。７つ全てが、クローンの５０％で３位がＰｒｏである以外は全く一致のない異なるＮ末端配列を有していた（表３）。Ｎ末端配列は次の通りであった：それぞれＮＬＰＲ、ＮＬＰＴ、ＶＭＰＴ、ＡＭＡＱ、ＧＲＡＱ、ＤＬＰＡ及びＧＲＴＥ （配列番号：１０−１６）。
【０１３５】
2004517816.tif 000959
滴定量の可溶性ＦｃεＲＩ−ＩｇＧの存在下における固定したＦｃεＲＩ−ＩｇＧのファージベース競合結合ＥＬＩＳＡを各クローンで実施した。クローンのＩＣ５０値は７−１６ｎＭの範囲であり、ＮＬＰＲ （配列番号：１０）クローンは１３ｎＭの値を有していた。
【０１３６】
ＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：１８）ペプチドを合成し、セルベースＩ１２５−ＩｇＥ結合阻害アッセイでアッセイした（実施例４参照）。このペプチドの１ｕＭのＩＣ５０値を測定した。これは、最初のＭＧＴＬＣＬＥＧＰＥＧＷＦＣＩＥＳＡ （配列番号：１）ペプチドの１６０倍を超える改善、ＥＩＱＥＣＴＥＧＰＷＧＷＦＣＶＧＳＧ （配列番号：８）ペプチドの４０倍の改善を示した。親ＡＥＡＴＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：９）ペプチドに対する改善倍率は、ペプチドがアッセイバッファーに溶解しなかったために測定されなかった。ペプチドＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：１８）についての１ｕＭのこのＩＣ５０値は、ファージ結合ＥＬＩＳＡで決定された１３ｎＭの値とは有意に異なっていた。これらの結果はアッセイ形式及び試薬の違いのために僅かに異なることが予想されるが、この相違はこのペプチドのＦｃεＲＩ−ＩｇＧ又はｇ３ファージディスプレイでの一価性によるものである可能性が高いと考えている。遺伝子３ファージの５以上の複製の提示により、結合活性による結合を増加し、より低いＩＣ５０値を与えることができる（Ｌｏｗｍａｎ， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｔｒｕｃｔ． ２６， ４０１−４２４ （１９９７））。
【０１３７】
ＦｃεＲＩ−ＩｇＧに特異的に結合するｇ８ｐ融合ファージクローンのペプチド配列は一価ファージディスプレイのｇ３ｐ−ディスプレイ形式に移された（Ｂａｓｓ等， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ８， ３０９−３１４ （１９９０）； Ｌｏｗｍａｎ 等， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０， １０８３２−１０８３８ （１９９１））。ｇ３と重複する更なる５’及び３’の塩基対を有する所望の各ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドが合成された。このオロゴヌクレオチドを、ｇ３の１本鎖標準ＤＮＡファージミド鋳型とアニーリングした。ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ大腸菌を突然変異反応で形質転換し、ＬＢ−ｃａｒｂ＋寒天培地に蒔いた。各コロニーを５ｍＬの２ＹＴブロス、テトラサイクリン、カルベニシリン、及びＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）に増殖させた。１本鎖標準ＤＮＡを精製ファージ粒子から単離し、配列決定してファージペプチド配列の挿入を確認した。２５ｍＬのｇ３ファージクローン調製物を一晩増殖させ、ＰＥＧ沈降によって精製した。１．０ｍＬのＰＢＳ中のファージペレットを再懸濁した後、それを連続して１／３に希釈し、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートに固定したＦｃεＲＩ−ＩｇＧ ２ｕｇ／ｍＬと共に室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳＴで１０回洗浄し、次いで上述のようにして１００ｕＬの抗Ｍ１３ファージＨＲＰとインキュベートした。５０％未満の結合に相当するＯＤ（４９２）値が選択され、精製ファージクローンを希釈して、この標準化したレベルのシグナルを作成した。関連する親和性（ＩＣ５０）測定のために、ＦｃεＲＩ−ＩｇＧをＰＢＴＴで連続して希釈し、希釈したファージと共に１５分間プレインキュベートした。次いで混合物を固定したＦｃεＲＩ−ＩｇＧを含む９６ウェルマイクロタイター皿に移した。１時間のインキュベーションの後、プレートを１０回洗浄し、抗Ｍ１３−ＨＲｐコンジュゲート抗体と共にインキュベートして上述のようにＯＰＤで展開した。データをプロットし、４−パラメータフィット（カレイダグラフ３．０）をＩＣ５０の計測に使用した。
【０１３８】
記述されるようにして（Ｋｕｎｋｅｌ 等， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０４， １２５−１３９ （１９９１））部位特異的突然変異誘発を用いて一価（ｇ３ｐ）ファージディスプレイのペプチド配列にわたって様々な位置にアラニン置換を作成した。さらに、段階的なＮ末端及びＣ末端切断をしたペプチド配列を構築した。更なる１８ｂｐのペプチド重複ＤＮＡ又はｇ３ファージＤＮＡ配列を用いた、所望の置換又は切断に相当するオリゴヌクレオチドの構築によって全ての構築物を作成した。ファージクローンをＸＬ−１ Ｂｌｕｅ大腸菌に感染させた後に一晩増殖させた。精製ファージ調製物を滴定し、固定したレセプターに対する結合についてアッセイした。ＦｃεＲＩ−ＩｇＧ競合アッセイを上述のようにして実施した。
【０１３９】
観察されたＩＣ５０値を表４に報告する：
2004517816.tif 000960
【０１４０】
実施例４
合成ペプチドの作成及び活性
ペプチド−ファージクローンに相当する多数のペプチド及び類似体が合成された。注記されない限り、全てのペプチドを環状ジスルフィド形態に酸化し、組成物をＨＰＬＣ及び質量分析で確認した。大腸菌でＩＧＥ１３３を融合タンパク質として発現させ、臭化シアン反応により切断した（実施例１２参照）。
初期のファージ選択物を有する幾つかのペプチドが合成された。さらに、最適化したペプチド（ＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ） （配列番号：２８）を合成して、ペプチドの大きさを最小化する可能性を評価し、残基がレセプター結合に寄与することを確認した。更なる類似体を作成してＦｃεＲＩ結合に対するペプチド残基側鎖の寄与を測定した（Ｈａｋｉｍｉ 等， （１９９０） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：２２０７９−８１）。主に置換はシステインループ内の残基（Ｔ６−Ｗ１２）に限定された。幾つかの非天然アミノ酸類似体は、ペプチドＰｒｏ残基による結合相互作用の性質をプローブに使用された。
【０１４１】
ＦｃεＲＩへのＩｇＥ結合を阻害するペプチドの能力を測定するために、放射標識ＩｇＥを用いた細胞ベース結合アッセイを利用した。ヒトＦｃεＲＩレセプターのαサブユニットを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞をファルコン９６ウェルマイクロタイタープレートでウェル当たり５ｘ１０４細胞の濃度にして一晩培養した。次の日、細胞をＰＢＳで３回、次にＦ１２／ＤＭＥＭで１回洗浄した。ペプチド保存液をｐＨ７．２、５ｍｇ／ｍＬの濃度で１００ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝水に再懸濁した。ペプチドの作用濃度をアッセイバッファー（下記参照）で希釈した。７５ｕＬの所望の濃度のペプチドをセパレート９６ウェルマイクロタイタープレートの最前列に添加し、５０ｕＬのアッセイバッファー（Ｆ１２／ＤＭＥＭ、１％のＢＳＡ、０．０５％のＮａＮ３及び０．０２５ｍＭのＨｅｐｅｓ ｐＨ７．２）で１：３に連続して希釈した。最初の濃度は５０−５００ｕＭの範囲であった。次に、５０ｕＬの希釈ペプチドを一価のＣＨＯ ＦｃεＲＩ＋細胞を含有する９６マイクロタイターウェルプレートに移した。室温で１時間インキュベーションした後、５０ｕＬの１２５Ｉ−ＩｇＥ（１．５ｎＭ）を各ウェルに添加して４℃でさらに４５−６０分間インキュベートし、続いて２００ｕＬのアッセイバッファーで５回洗浄した。細胞を２００ｕＬの１Ｎ ＮａＯＨで可溶化し、γカウンターで計測するために９６マイクロタイターチューブに移して結合した数を決定した。データをカレイダグラフ３．０を用いてプロットし、４パラメータフィットを用いてあてはめた。ＩＣ５０値を各ペプチドについて測定した。
【０１４２】
ペプチドＭＧＴＬＣＬＥＧＰＥＧＷＦＣＩＥＳＡ （配列番号：１）のＩＣ５０は＞１６０ｕＭであることが分かった。ペプチドＥＩＱＥＣＴＥＧＰＷＧＷＦＣＶＧＳＧ （配列番号：８）のＩＣ５０は３７ｕＭと測定され、ＭＧＴＬＣＬＥＧＰＥＧＷＦＣＩＥＳＡ （配列番号：１）ペプチドに対し＞４倍改善された活性であった。ペプチドＡＥＡＴＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：９）は結合バッファーに不溶性であり、従って確実なＩＣ５０値を測定することができなかった。
ペプチドＩＧＥ０６３（配列番号：４９）（表５）は約１ｕＭのＩＣ５０を有し、更なる構造活性研究の基準として使用された。残基１（Ａｓｎ）の切断は３倍減少する最少の影響を有していたが、最初の２残基（Ａｓｎ、Ｌｅｕ）の切断は３４倍減少した阻害を生じた。残基５（Ｃｙｓ）までの切断は＞４００倍減少した阻害を生じた。従って、相互作用が側鎖又は主鎖の相互作用に関係しているか不明だが、Ｎ末端の残基２−４はレセプター結合に重要であった。Ｃ末端での残基１５（Ｍｅｔ）の切断は、結合にほとんど影響しなかったが、残基１４（Ｃｙｓ）までの切断は結合の＞４００倍減少を生じた。まとめると、Ｎ末端から１残基及びＣ末端から３残基の切断は、１２５Ｉ−ＩｇＥ細胞結合阻害アッセイにおける阻害で最少の影響を有していた。
【０１４３】
ＩＧＥ０６３（配列番号：４９）のアラニン置換を側鎖構築の評価に使用した。Ｐ９Ａ（ＩＧＥ０７０、配列番号：５２）置換は、結合において＞５００倍の減少である最も大きい影響を有していた。また、あまり強力ではないが、２５６倍及び６５倍の減少をそれぞれ生じるＧ８Ａ（ＩＧＥ０７９、配列番号：６１）及びＷ１２Ａ（ＩＧＥ０７３、配列番号：５５）変異体が活性であった。Ｗ１０Ａ（ＩＧＥ０７４、配列番号：５６）の効果は３０倍の減少であり、Ｇ１１Ａは５３倍の減少であった。Ｅ７Ａ（ＩＧＥ０５９、配列番号：４６）類似体はより小さく、結合において６倍の減少であった。明らかに、Ｇ８、Ｐ９、Ｗ１０、Ｇ１１及びＷ１２全てでの置換は、ＦｃεＲＩ結合に重大な影響を有していた。
ペプチドを２Ｄ ＮＭＲ分光法を用いて展開し、ペプチド類似体の３次元構造での置換の影響を評価した。表５に示される構造スコアを有する全てのペプチドを２Ｄ ＮＭＲ分光法で分析し；バックボーン１Ｈ共鳴を与え、３ＪＨＮ−Ｈαカップリング定数を測定し、基準ペプチド（ＩＧＥ０６３、配列番号：４９；実施例５参照）と比較した。ペプチドは、化学シフト、カップリングが提供される定数基準ペプチドと同様の構造であることが同定され、ＮＯＥはその構造と一致する。３ＪＨＮ−Ｈαカップリング定数が基準よりも低い極値（例えば、＞８．５又は＜６Ｈｚ〜６と８．５の間の値になる）である場合、及び／又はバックボーン共鳴の化学シフトが基準に比較してペプチドにおいてランダムコイル値に近い場合に、ペプチドが低い安定性であることが決定される。
【０１４４】
表５
ＣＨＯ ＦｃεＲＩ＋細胞への標識したＩｇＥ結合の阻害
ＩｇＥ結合を阻害する能力及びその３次元構造についてペプチドを評価した。＋＋＋は、ペプチドがＩＧＥ０６３（配列番号：４９）と類似した構造をもつことを示す。＋は、ペプチドがＩＧＥ０６３（配列番号：４９）と類似した構造をもつが、安定性が低いことを示す。−／＋は、ペプチドが安定した構造の幾つかの要素を有するが、構造が基準の構造とは異なることを示す（例えば、異なる回転型であることが明らかである）。−は、ペプチドが水溶液で大部分構造化されないことを示す。
【０１４５】
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（Ｂｔ＝ビオチン；ｈＳ＝ホモセリン；ｔＰ＝チオプロリン；Ａｃ＝アセチル；ｈＰ＝ヒドロキシプロリン；Ｏｉｃ＝オクタヒドロインドール；ｐｉｐ＝Ｌ−ピペコリン酸；ｎｐＡ＝２−ナフチル−２−アラニン；小文字＝「Ｄ」光学異性体；大文字＝「Ｌ」光学異性体；Ｍ−Ｍｅ−Ｇ＝Ｎ−メチルグリシン；Ｎ−Ｍｅ−Ａ＝Ｎ−メチルアラニン）
【０１４６】
実施例５
ＮＭＲによるペプチド構造の決定
ペプチドＩＧＥ０６３（配列番号：４９）のＮＭＲ分析
３ｍｇのペプチドを５００ｍＬの９２％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ／８％Ｄ２Ｏに溶解し、次いで０．１ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを５．７に調節することによって、ＩＧＥ０６３（配列番号：４９）のＮＭＲ試料を調製した。２次元二量子遷移相関分光法（２ＱＦ−ＣＯＳＹ）、全相関スペクトル（ＴＯＣＳＹ）、核オーバーハウザー効果スペクトル（ＮＯＥＳＹ）、及び回転フレームオーバーハウザー効果スペクトル（ＲＯＥＳＹ）を２８８Ｋで５−ｍｍ３軸パルスフィールド勾配プローブを備えるＢｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−５００分光計で収集した。Ｃａｖａｎａｇｈ等によって「Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、サンディエゴ：ＩＳＢＮ ０−１２−１６４４９０−１， １９９５）に記載されるようにして実験を記録した。Ｄ２Ｏのペプチドの凍結乾燥及び溶解の後、３５℃混合パルスで獲得される２Ｄ ＮＯＥＳＹ及びＣＯＳＹ−３５スペクトルを得た。完全な１Ｈ共鳴配座は、標準的な方法によってこれらのデータから導かれる（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ， ｉｎ 「ＮＭＲ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ＩＳＢＮ ０−４７１−８２８９３−９， １９８６）。
【０１４７】
ＩＧＥ０６３（配列番号：４９）の明確な３次元構造は、次のようなことから得られた：（１）１Ｈ共鳴位置は構造化されていないペプチドで予測されるものとは有意に異なる。（２）アミドとαプロトンの間のスカラーカップリング定数（２ＱＦ−ＣＯＳＹスペクトルから得られる）は構造化されていないペプチドで得られる平均値と識別される。値は、これらの残基の展開した骨格構造に示される残基Ｃｙｓ５、Ｔｈｒ６、Ｔｒｐ１０、Ｖａｌ１３、及びＣｙｓ１４について８．５Ｈｚを超える。また、ＣＯＳＹ−３５スペクトルのα及びβプロトンの間でスカラーカップリング定数を測定した。これらのデータは、残基Ｃｙｓ５、Ｔｈｒ６、Ｔｒｐ１０、及びＣｙｓ１４の側鎖が一定のｃｈｉ−１角度を有することを示す、つまりこれらの側鎖が構造化されていないペプチドにあるｃｈｉ−１回転異性体の範囲をとらない。（３）ＮＯＥＳＹ及びＲＯＥＳＹスペクトルのピークは、主な配列の隣接していない残基の間で多くのプロトン−プロトン接触（＜５Å）があることを示す。これらは、ペプチドが明確な構造に折り畳まれる場合にのみ生じうる。Ｃｙｓ５及びＣｙｓ１４及びＧｌｕ７及びＴｒｐ１２のαプロトンの間の強力な鎖交換ＮＯＥは、ＩＧＥ０６３（配列番号：４９）が２本鎖βシート内の非水素結合位置で生じるジスルフィドを有するβヘアピン構造をとることを示す。さらに、残基Ｇｌｙ８、Ｐｒｏ９、Ｔｒｐ１０、及びＧｌｙ１１に関する局所ＮＯＥ及びカップリング定数は、これらの残基が正のｐｈｉ角度をとるＧｌｙ１１を有するＩ型βターンをとることを示す。
【０１４８】
ＮＭＲデータを用いて、ＩＧＥ０６３（配列番号：４９）構造の３次元構造モデルを決定するために使用することができる拘束条件を導いた。二面角の拘束は、適したカープラス相関（Ｋａｒｐｌｕｓ， Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ．， ３０： １１−１５ （１９５９））によってアミド−α及びα−βスカラーカップリング定数から導いた。距離の拘束は、ＲＯＥＳＹ又はＮＯＥＳＹスペクトルの空間を通した（ｔｈｒｏｕｇｈ−ｓｐａｃｅ）相互作用を示すプロトンの間で展開され；大きさの上限、及びピークの重複又は共鳴縮退による上限の修正はＳｔａｒｏｖａｓｎｉｋ等， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３５：１５５５８−６９ （１９９６）に記載されるようにした。これらの拘束条件を利用して、ＡＭＢＥＲ全原子力場（Ｗｅｉｎｅｒ等， Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ．，７：２３０−２５２ （１９８６））を利用したプログラムＤｉｓｃｏｖｅｒ（ＭＳＩ、サンディエゴ）による拘束分子動力学によって続けて精錬されるプログラムＧＤＩＩ（Ｈａｖｅｌ， Ｐｒｏｇ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５６：４３−７８ （１９９１））を用いて構造のファミリーを作成した。得られた構造は単一の全体的な折り畳みに収束する（Ｎ、Ｃ−α、及び残基５−１４のカルボニル炭素についての０．２４±０．０６Åの平均構造からの実効偏差値）。最良の２０モデル（入力データの最小バイオレーション）は入力データと非常によく一致し（０．１Åを超える距離拘束バイオレーション無し、１°を超える二面角バイオレーション無し）、プログラムＰＲＯＣＨＥＣＫ（商品名）で判断されるように良い共有結合配置を有していた（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ等， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｃｒｙｓｔ．， ２６： ２８３−２９１ （１９９３））。
【０１４９】
集合の代表的なメンバー（平均座標に最も近いモデル）を図７に示す。ＩＮＳＩＧＨＴプログラム（ＭＳＩ、サンディエゴ）でのＫａｂｓｃｈ及びＳａｎｄｅｒ二次構造アルゴリズムに従うと、ＩＧＥ０６３（配列番号：４９）は残基５−７及び１２−１４で構成される２つのβ鎖を含み、残基Ｐｒｏ９及びＴｒｐ１０を中心とする逆ターンによって連結し（Ｉ型）；Ａｓｎ４及びＭｅｔ１５は、幾つかのモデルで２つのβ鎖を延長する。Ｎ末端の３つの残基（Ａｓｎ１、Ｌｅｕ２、及びＰｒｏ３）はＮＭＲデータで明確ではなく、残基Ｃｙｓ５−Ｃｙｓ１４よりも溶液中でフレキシブルであるようである。構造は、Ｔｒｐ１２の側鎖がＣｙｓ５及びＣｙｓ１４によって形成されるジスルフィド結合に対して詰められ、Ｔｒｐ１２をＡｌａで置換したペプチドから得られるＮＭＲデータの比較（ＩＧＥ０７３配列番号：５５；上記参照）でもわかるようにペプチドの安定性に寄与することを示す。ジスルフィド結合はヘアピン構造の安定化に重要であり；過剰な還元剤ＤＴＴ（ジチオスレイトール）をＮＭＲ試料に添加すると安定した構造は示されない。Ｇｌｙ１１（Ｉ型βターンの４位にある）は正のｐｈｉ角度をとる。この骨格構造は、単にグリシンによって簡単に得ることができ、Ｇｌｙ１１をアラニンに換えたペプチドの構造がなぜ有意に安定性が低いのかを説明する（ＩＧＥ０７４、配列番号：５６）。しかしながら、Ｇｌｙ１１をＤ−Ａｌａ（ＩＧＥ１０５、配列番号：８０）又はＤ−Ｇｌｕ（ＩＧＥ１１４、配列番号：８５）で置き換えたペプチドで分かるように、Ｄアミノ酸は、容易にこの構造をとるだろう。
【０１５０】
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【０１５１】
実施例６
細胞ベースヒスタミン放出アッセイでのペプチド活性
ペプチドをヒスタミン放出アッセイ（Ｌｏｗｅ等， （１９９５） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ， １８４：１１３−１２２）でアッセイして：（１）ペプチドがヒスタミン放出を誘発することができるか、及び（２）ペプチドがブタクサ及びブタクサに特異的なＩｇＥの存在下でヒスタミン放出を抑制するかどうかを決定した。ヒトＦｃεＲＩαサブユニットを発現するラットの好塩基性細胞株ＲＢＬ−４８をＦａｌｃｏｎ９６ウェル平板マイクロタイター皿で一晩培養した。細胞を成長培地で３回洗浄し、次いで１０％のウシ胎児血清及びミリリットル当たり３ＵＳＰ単位のヘパリンを含有するＩｓｃｏｖｅ’ｓ ＭＥＭ培地（ヒスタミンアッセイバッファー）でインキュベートした。
ペプチドＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：２８）、ＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭ （配列番号：２７）、及びＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭ （配列番号：９１）（０．５ｍＭ）をＲＢＬ−４８細胞に加え、ヒスタミン放出についてアッセイした。ヒスタミン放出のレベルを、ヒトＦｃεＲＩラット好塩基細胞でのヒスタミン放出を誘発する能力がペプチド自体に無いことを意味するネガティブコントロールと同等であった。
【０１５２】
次にペプチドＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：２８）、ＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭ （配列番号：２７）及びＤＧＣＡＷＤＧＶＱＭＶＤＣＴＦ （配列番号：９２）をブタクサ誘発性ヒスタミン放出の阻害能力についてアッセイした。１００−０．５ｕＭの濃度範囲のアッセイヒスタミンアッセイバッファー９５ｕＬを含有する９６ウェルマイクロタイター皿で、ペプチドを１：２に連続希釈した。希釈したペプチドをＲＢＬ−４８細胞を含む９６ウェル平板プレートに移し、室温で１５分間インキュベートした後、ブタクサに特異的なＩｇＥ血清５ｕＬを各ウェルに添加した。血清は１０２７ｎｇ／ｍＬの全ＩｇＥ及び４２０ｎｇ／ｍＬのブタクサ特異的ＩｇＥを含んでいた。このプレートをＣＯ２制御インキュベーターで１時間３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、上清を採取してＰＢＳで１／２００に希釈した。放出ヒスタミンレベルを市販のヒスタミンＥＬＩＳＡキット（Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ社、マルセイユ、フランス）を用いて測定した。放出したヒスタミンのレベルをカレイダグラフ３．０を用いてペプチド濃度に対してプロットした。４パラメータフィットにより曲線をあてはめ、ＩＣ５０値を各ペプチドについて測定した。コントロールペプチドＤＧＣＡＷＤＧＶＱＭＶＤＣＴＦ （配列番号：９２）はヒスタミン放出を抑制する能力を有しなかったが、ペプチドＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭＡＡＤ （配列番号：２８）、ＮＬＰＲＣＴＥＧＰＷＧＷＶＣＭ （配列番号：２７）はそれぞれ１０と１３ｕＭのＩＣ５０値を有していた。
これらのデータは、選択されたペプチドがヒスタミン放出を誘発せず、関連細胞ベースバイオアッセイにおけるブタクサ誘発性のＩｇＥ依存性ヒスタミン放出の抑制に効果があったことを示す。
【０１５３】
実施例７
ＦｃεＲＩ−ＩｇＧに対する更なるライブラリー及び選択
Ｍ１３繊維状ファージでの提示のために２２の未処置のペプチドライブラリーを構築した。各ペプチドライブラリーを、ペプチドの多価提示を可能にするＭ１３ファージの主要コートタンパク質ｐ８に融合させた（Ｓｉｄｈｕ 等， （２０００） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ３２８：３３３−３６３）。提示したペプチドの長さは８−２７残基の範囲であった。１７のライブラリーは２−１０の残基間隔で離れているシステイン残基対を導入することによって形成される推定上のジスルフィド拘束ループを含んでいた。また、これらのライブラリーの１つはループ内のグリシン及びプロリンを含み、βターンの形成を順調にするように誘導した。４つの他のライブラリーは複数のシステイン対を含み、コノトキシンペプチドに共通して観察されるシステイン残基パターンに基づいて様々な間隔で導入された（Ｏｌｉｖｅｒａ等， （１９９５） Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １３：４２２−４２６）。また、８残基の線状ペプチドライブラリーを構築した。形質転換の数に基づく各ライブラリーの多様性は１０９であると決定された。
【０１５４】
これらのライブラリーからのファージ粒子をＸＬ−１ Ｂｌｕｅ大腸菌で増殖させ、ポリエチレングリコール沈降により精製した。吸着（２ｕｇ／ｍＬ）させて９６マイクロウェルプレートに固定したＦｃεＲＩ−Ｆｃに対してファージ粒子をパニングした。ＦｃεＲＩ−Ｆｃは、ＩｇＧのＣＨ２定常ドメイン領域に融合されたＩｇＥ高親和性レセプターの可溶化形態である。ＦｃεＲＩをコートしたプレート上の非占有部位を０．５％のウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳで阻害した後、ウェルにつき１０１１ファージ粒子を添加した。パニング、溶出、増殖及び再パニングの繰り返しを４回行い、パニングのラウンド終了後すぐに、ウシ血清アルブミンを超えるＦｃεＲＩに対する結合について濃縮のレベルを測定した。濃縮したペプチドライブラリーからの個々のクローンを、ＦｃεＲＩへの特異的結合及びＩｇＥ結合の阻害能力について分析した。
【０１５５】
ＦｃεＲＩ選択の結果
２２のペプチドライブラリーを、固定したＦｃεＲＩ−Ｆｃに対して４ラウンドの間でパニングした。各ラウンドの終了後、ウシ血清アルブミンを超えるＦｃεＲＩ−ＩｇＧ結合について濃縮のレベルを測定した。結合の有意な濃縮はラウンド２まで観察されず、ライブラリー３０１、３０９、５１５、５１６、５１３及び５１４の全てが１０倍を超える増加を有していた。ラウンド３で、ライブラリー３１５、３１８、５１０、５１２、５５３及び５５６に見られるように更なるライブラリーが有意な濃縮を有していた。更なるライブラリーが２つのライブラリー、３０９及び５１５は、ラウンド２で観察されたものよりもラウンド３において低い濃縮であった。
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濃縮ライブラリーの個々のクローンをファージ増殖について選択し、ＦｃεＲＩ−ＩｇＧに対する特異的な結合及びＩｇＥ結合を阻害する能力について分析した。レセプター結合についてポジティブであり、ＩｇＥ結合阻害についてポジティブなクローンは、ライブラリー３０１（Ｘ４ＣＸ２ＧＰＸ４ＣＸ４） （配列番号：１７）、５１６（Ｘ２ＣＸ３ＣＸ２） （配列番号：１０４）、５１０（Ｘ２ＣＸ６ＣＸ２） （配列番号：１０７）、５１２ （Ｘ２ＣＸ８ＣＸ２） （配列番号：１０９）、及び５１３（Ｘ２ＣＸ９ＣＸ２） （配列番号：１１０）で見つかった。これらのクローンの何れも、ウシ血清アルブミンあるいはヒト抗体のＦｃ領域に対して結合を示さなかった。
【０１５６】
ライブラリー５１６ （Ｘ２ＣＸ３ＣＸ２） （配列番号：１０４）由来のクローンのＤＮＡ配列：
ＦｃεＲＩに結合し、ＩｇＥによって阻害される個々のクローン由来のＤＮＡを配列決定し、ペプチドアミノ酸配列を決定した。７つの独自の配列は、Ｘ２ＣＸ３ＣＸ２ （配列番号：１０４）ライブラリーを起源とする全クローンと同一とされた。７つの配列の６つに保存されていたのは、４位のＰｒｏ及び８位のＴｙｒ、（Ｘ２ＣＰＸ２ＣＹＸ） （配列番号：１１６）であった。１つのクローンは６つとは異なり、配列ＬＮＣＳＱＰＣＱＲ （配列番号：１１７）を有していた。残りのクローンの配列は次の通りであった：
ＶＥＣＰＡＶＣＹＶ （配列番号：１１８）
ＱＶＣＰＡＩＣＹＳ （配列番号：１１９）
ＡＩＣＰＡＬＣＹＥ （配列番号：１２０）
ＡＥＣＰＩＭＣＹＳ （配列番号：１２１）
ＳＶＣＰＳＬＣＹＶ （配列番号：１２２）
ＡＬＣＰＥＶＣＹＶ （配列番号：１２３）
ＬＮＣＳＱＰＣＱＲ （配列番号：１２４）
ＬＶＣＰＤＬＣＹＧ （配列番号：２０８）
ＡＥＣＰＬＧＣＹＡ （配列番号：２０９）
【０１５７】
ＣＨＯ細胞ベース阻害アッセイのペプチドＩＧＥ０３５−３８（それぞれ配列番号：１２４−１２５、１２８−１２９）のＩＣ５０
ライブラリー＃５１６由来の選択クローンに基づく６のペプチドを合成し、ＩｇＥ高親和性レセプター、ＦｃεＲＩのアルファサブユニットを発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞に対する１２５Ｉ−ＩｇＥ結合阻害の能力をアッセイした。ペプチドを９残基の単量体として合成し、酸化して、環状ペプチドを生じるジスルフィド結合を形成させた。各ペプチドの大きさを質量分析により確認した。
ペプチドＩＧＥ０３５（ＡＬＣＰＥＶＣＹＶ−ｎｈ２） （配列番号：１２４）及びＩＧＥ０３６（Ａｃ−ＡＬＣＰＥＶＣＹＶ−ｎｈ２） （配列番号：１２５）はファージ選択クローンに直接基づいており、ＩＧＥ０５３（ＬＮＣＳＱＰＣＱＲ−ｎｈ２） （配列番号：１２６）及びＩＧＥ０５４（Ａｃ−ＬＮＣＳＱＰＣＱＲ−ｎｈ２） （配列番号：１２７）も同様であったが、一方、他のセットのペプチドでは、ＩＧＥ０３７（ＡＬＣＰＡＶＣＹＶ−ｎｈ２） （配列番号：１２８）、及びＩＧＥ０３８（Ａｃ−ＡＬＣＰＡＶＣＹＶ−ｎｈ２） （配列番号：１２９）は幾つかのクローンのコンセンサス配列に基づいていた。ペプチドＩＧＥ０３５（配列番号：１２４）及びＩＧＥ０３６（配列番号：１２５）は細胞表面で発現したＦｃεＲＩへの１２５Ｉ−ＩｇＥ結合の阻害活性がない。ペプチドＩＧＥ０３８（配列番号：１２９）は、５００ｕＭ未満のＩＣ５０値と非常に弱い。初め、ペプチドＩＧＥ０３７（配列番号：１２８）は約３００ｕＭのＩＣ５０値を有する弱い阻害を示したが、この阻害は７−１０日後、時間と共に２５ｕＭ程度の低さになる増大を示した。時間経過に従うこの増大は、他のペプチドでは観察されなかった。
【０１５８】
単量体ペプチドＩＧＥ０３７（配列番号：１２８）をホモ二量体に変換するジスルフィド改造
ＩＧＥ０３７（配列番号：１２８）の活性の増大はジスルフィド結合の入れ替えと直接関連し、ＩＧＥ０３７（配列番号：１２８）のホモ二量体の形成を生じることがわかった。この変化は、中性のｐＨで水又はバッファーにペプチドを可溶化させた後３−１２日の期間でゆっくりと生じる。共有ジスルフィド結合したホモ二量体の形成は、一量体形態の分子よりもむしろ二量体が活性型であることを示す質量分析データにより確かめられた。変化発生の更なる裏付けは、一次元のＮＭＲスペクトルにおいて変化を検出するＮＭＲデータによってなされた。また、ＨＰＬＣ逆相データは、一量体から二量体への変化及び活性と関連する保持時間の変化を示した。活性二量体の形成の最終的な高次構造は、平行（ＩＧＥ０８８、配列番号：１２８、１２８）及び逆平行（ＩＧＥ０８９、配列番号：１２８、１５７）ジスルフィド結合二量体ペプチドの両方の合成を伴う。両方のペプチド形態を、細胞表面発現ＦｃεＲＩに対するＩ１２５−ＩＧＥ結合の阻害能力についてアッセイした。有意な阻害活性は、逆平行（つまり、Ｃ３−Ｃ７’、Ｃ７−Ｃ３’ジスルフィド）形態でのみ見られる。
【０１５９】
ヒスタミン放出及び安全性アッセイ
ペプチドＩＧＥ０８９（配列番号：１２８、１５７）をＲＢＬ−４８細胞ベースヒスタミン放出アッセイでアッセイし、ペプチドがＦｃεＲＩ結合時にヒスタミン放出を誘発する能力があるか、また、ペプチドがブタクサ誘発性ヒスタミン放出を阻害することができるかを決定した（実施例６参照）。ペプチドＩＧＥ０８９（配列番号：１２８、１５７）をアッセイして高濃度のペプチドがＦｃεＲＩ結合時にヒスタミン放出を誘起することができるかを決定した。０．５ｕＭのペプチドＩＧＥ０８９（配列番号：１２８、１５７）を摂氏３７度で２時間ＲＢＬ−４８細胞と共にインキュベートした。インキュベーションの後、培地をヒスタミンについてアッセイした。ＩＧＥ０８９（配列番号：１２８、１５７）ペプチド培地におけるヒスタミン放出の量は、コントロールペプチドの培地及びバッファーコントロールの培地で見られるレベルと同等であった。これは、ブタクサ及びブタクサ特異的ＩｇＥを含有するポジティブコントロール培地由来のヒスタミンレベルよりも有意に少なかった。このことは、ペプチドＩＧＥ０８９（配列番号：１２８、１５７）がＲＢＬ−４８細胞におけるヒスタミン放出を誘発しないことを示した。
ブタクサ誘発を阻害するペプチドＩＧＥ０８９（配列番号：１２８、１５７）の活性も決定した。ペプチドＩＧＥ０８９（配列番号：１２８、１５７）を、０．１ｎＭのブタクサ特異的ヒトＩｇＥの存在下で細胞に滴定した。１−２時間後、１０ｎｇのブタクサを添加し、更に３０分間インキュベートした。反応を氷上で停止させ、ヒスタミンのレベルを測定した。ペプチドＩＧＥ０８９（配列番号：１２８、１５７）は８ｕＭのＩＣ５０でブタクサ誘発性ヒスタミン放出を阻害したが、コントロールペプチドは全く阻害活性を有していなかった。
【０１６０】
実施例８
ペプチドｇ３ファージライブラリー
ファージでの活性形態ＩＧＥ０３７（配列番号：１２８）の効果的な生合成を確保するために、９残基「単量体」配列の２つの複製の間に短いＧｌｙＧｌｙＬｙｓリンカーを導入することによって「一本鎖二量体」形態を作成した。リンカー配列をＩＧＥ０３７二量体（ａｋａ ＩＧＥ０８９、配列番号：１２８、１５７）のＮＭＲ３次元構造分析に基づいて選択した。１つの単量体のＣ末端が次のＮ末端に連結するのに十分な長さであり、二量体コアの構造が変形しないように十分にフレキシブルであることを目的とした。２次単量体のＮ末端のアミノ基のものを模倣するように正電荷を与えるために、リジンを選択した。ペプチドＩＧＥ０８３ＡＬＣＰＡＶＣＹＶＧＧＫＡＬＣＰＤＶＣＹＶ （配列番号：１３０）はＩＧＥ０８９（配列番号：１２８、１５７）のこのような一本鎖二量体を示すが、Ａｌａ１７Ａｓｐの単一突然変異を含む。ペプチドのより高い親和性の変異体について選択するために、一価の提示されたＩＧＥ０８３ペプチド−ファージライブラリーのセットをそれぞれランダム化した残基の小さなセットを用いて構築した。これらのライブラリーは、提示されたペプチドとｇ３ｐ断片の間の融合相手として挿入されたヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を含むライブラリーもいくつかあることを除いて、前記のようにしてファージミドで構築された。この種のｈＧＨファージミド構築は、一価のディスプレイを作成することが記載されている（Ｂａｓｓ等， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ８， ３０９ （１９９０）； Ｌｏｗｍａｎ等， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０， １０８３２ （１９９１）； Ｌｏｗｍａｎ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２３４， ５６４ （１９９３）； 米国特許第５，８２１，０４７号）。ランダム化は、ＮＮＳ変性コドンが組込まれた合成オリゴヌクレオチド（「ハードランダム化」）、又はランダム化される各コドンの中でのヌクレオチドの７０：１０：１０：１０（つまり７０％の野生型ヌクレオチドと１０％の残りの各ヌクレオチド）混合物（「ソフトランダム化」）を用いて実施される（Ｗｒｉｇｈｔｏｎ等， 上掲）。
【０１６１】
ヒトＦｃεＲＩ（ａａ１−１７６）のαサブユニットの細胞外ドメインをバキュロウィルス分泌発現系（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）を用いて発現させた。このドメインをコードするｃＤＮＡを、完全長クローンを含有するプラスミドのＰＣＲによって得た。ＤＮＡ断片をバキュロウィルス転移ベクターｐＡｃＧＰ６７に結合させ、バキュロウィルスＤＮＡを線状化したバキュロゴールド（ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ）と共にバキュロウィルス産生のためのＳｆ９細胞Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ昆虫細胞（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社）に形質移入した。可溶性ＦｃεＲＩはバキュロウィルス挿入Ｈｉ−５昆虫細胞の成長培地（発現系）から親和性精製された。
これらのライブラリーの選別条件は、一般的に、免疫吸着プレート上にコートされたＦｃεＲＩを用いた結合選択について（Ｌｏｗｍａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８７， ２４９ （１９９８）； Ｃｈｅｎ等， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２９３， ８６５ （１９９９））に記載されているものに従った。非標的でコートしたプレートに対比した標的でコートしたものから回収されるファージの率によって測定されるので、様々なコーティング及び溶出条件は改善された濃縮を支持するように用いられる。簡略していうと、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを２ｕｇ／ｍＬのＦｃεＲＩ（ジェネンテック社、バキュロウィルス感染昆虫細胞で産生される）を含有するＰＢＳでコートした。コーティングの後、各プレートを適した遮断薬を用いて遮断した。大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）培地で一晩増殖させたファージライブラリーをＰＥＧ沈降で精製し、結合のためにＥＬＩＳＡバッファー（０．５％のＢＳＡ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）でおよそ１０１０−１０１１ファージ／ｍＬまで希釈した。ファージ結合を典型的に室温で１時間実施した。次いでプレートを上記の０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳで洗浄した。選別の間のストリンジェンシーを増大させるために、結合したファージを時々可溶性ＦｃεＲＩとインキュベートした。残った結合ファージを、溶出試薬と共にインキュベーションすることによって溶出した。標的コートウェルから溶出した結合ファージの、ＢＳＡコートウェルからの物に対する割合によって濃縮を計測した。幾つかのライブラリーについて、提示ペプチドへの融合タンパク質としてｈＧＨの無くなったファージをスクリーニングするために、ｈＧＨｂｐに対する選別を行った。場合によっては、代表的なクローンを競合ファージＥＬＩＳＡでアッセイした。またペプチドを、優性、コンセンサス、又は親和性の改善された（例えばファージＥＬＩＳＡで測定される）ペプチド−ファージ選択に基づく合成のために作成した（実施例１２参照）。
最初のＩＧＥ０８３ファージライブラリーの選別は、残基１、２、５及び６をランダム化したライブラリーを除いて、濃縮を示さなかった。このライブラリーから、２つの優性なクローン、ＩＶＣＰＲＬＣＹＶＧＧＫＡＬＣＰＤＶＣＹＶ （配列番号：１３１）， ａｎｄ ＶＱＣＰＨＦＣＹＶＧＧＫＡＬＣＰＤＶＣＹＶ （配列番号：１３２）（図１）が同定され、ＩＧＥ０８３ファージに比較して改善された結合親和性を有し；これらの配列は、それぞれペプチドＩＧＥ１２０（配列番号：１５９）、及びＩＧＥ１２２（配列番号：１６１）（共にアミド形態）に相当した（実施例１２参照）。
【０１６２】
ゼータペプチドＩＧＥ１２０のファージＡｌａスキャン（配列番号：１３１、１５９）
ファージベースアラニンスキャン研究法（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ等， ＥＭＢＯ Ｊ． １３： ２５０８−２５１５ （１９９４）； Ｌｏｗｍａｎ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ８７： ２４９−２６４ （１９９８）参照）を利用してＦｃεＲＩへの結合に重要な側鎖をマッピングした。ペプチドＩＧＥ１２０（ＩＶＣＰＲＬＣＹＶＧＧＫＡＬＣＰＤＶＣＹＶ） （配列番号：１３１）を、下線を付した残基成熟ｇ３ｐの残基２５０−２５７に相当するリンカー配列ＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＳＧＤＹ （配列番号：１３３）によって、バクテリオファージＭ１３のｇ３ｐに融合させて提示した（ｖａｎ Ｗｅｚｅｎｂｅｅｋ及びＳｃｈｏｅｎｍａｋｅｒｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ６： ２７９９ （１９７９））。
部位特異的突然変異をＫｕｎｋｅｌの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０４， １２５ （１９９１））を用いて実施し、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商品名）を用いたジデオキシＤＮＡ配列決定を利用してクローンを確認した。場合によっては、一本鎖のペプチド−ファージクローンで複数のアラニン置換を生じさせた。また、幾つかの欠失変異体も作成した。Ｃｙｓ側鎖は置換されなかった。
【０１６３】
ファージＥＬＩＳＡアッセイを、記載されるように（Ｌｏｗｍａｎ， １９９８， 上掲）、バキュロウィルス誘導ＦｃεＲＩの２μｇ／ｍＬ溶液でコートしたＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商品名）プレートを用いて実施した。ペプチド−ファージをレセプターの段階希釈と共に５−１０分間プレインキュベートし、次いでレセプターコートプレートに添加した。室温で１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄して抗ファージＨＲＰコンジュゲート抗体（ファルマシア社）を添加した。さらに２０分間インキュベートした後、プレートを再び洗浄し、基質ＯＰＤ（シグマ社）を用いて進行させた。４９２ｎｍの吸光度で読み取り、ＦｃεＲＩ濃度の関数としてプロットし、各ペプチド−ファージ変異体による阻害のＩＣ５０を測定した。
ＩＧＥ１２０（配列番号：１３１、１５９）のアラニンスキャンの結果を表７に示す。検出できない結合をＰ４、Ｙ８、Ｐ１６、又はＹ２０のＡｌａ置換について観察した。これは結合親和性の欠損に由来するか、構造及びこれら変異体の発現又はその両方を欠いている可能性がある。この種のペプチドをのＮＭＲ構造（実施例１１）に基づき、Ｙ８Ａ及びＹ２０Ａ置換は全体的にペプチド構造を破壊することが明らかである。しかしながら、Ｐ４Ａ及びＰ１６Ａ変異体は全ての野生型構造を維持する。従って、これらの側鎖は、レセプターとの接点として関係する。Ｄ１７Ａ突然変異はＩＧＥ１２０（配列番号：１３１、１５９）に比較して２５倍減少した結合親和性を引き起こし、Ａｓｐ側鎖がレセプター結合に重要であることを示している。試験された全ての残りの側鎖置換は、レセプター結合親和性で２倍未満の効果を示した。特に、アミノ末端の２つの残基での置換又は欠失はほとんど影響はない。
【０１６４】
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【０１６５】
ペプチド−ファージライブラリーの第２の作成はＩＧＥ１２０（配列番号：１３１、１５９）又はＩＧＥ１２２（配列番号：１３２、１６１）に基づいて構築された。これらのライブラリーを上記されるようにしてＦｃεＲＩ結合について選択した。ＩＧＥ１２０ファージライブラリー（ＮＢＯ８９５−６１９Ｄ）は、配列ＩＶＣＰＲＬＣＹＥＬＤＹＥＬＣＰＤＶＣＹＶ （配列番号：１５３）を有し、ＩＧＥ１２０（配列番号：１３１、１５９）に対して約２倍の改善された親和性を有することが分かった（図２）。このライブラリーにおいてペプチドの「リンカー領域」（下線を付した）をランダム化した。
ＩＧＥ１２２（配列番号：１３２、１６１）ペプチド及びファージは、ＩＧＥ１２０（配列番号：１３１、１５９）を超える改善された親和性を有することが分かっているので、ＥＬＤＹＥ （配列番号：１５４）リンカー配列をＩＧＥ１２２バックグラウンドに導入させて合成ペプチドを構築した。ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）として知られるこのペプチドは、対応ファージ構築物のように、ＩＧＥ１２２（配列番号：１３２、１６１）を超える改善された親和性を有することを示した（図３）。
ペプチド−ファージライブラリーの第３の作成をＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）に基づいて構築した。これらのライブラリからの様々なクローンは、ＩＧＥ１３４−ファージと同様の親和性でＦｃεＲＩと結合することが分かった；しかしながら、何れも推定上の結合親和性において約２倍の改善よりも優れていないことが分かった（図４）。
【０１６６】
実施例９
リンカー領域での挿入及び欠失を有するＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）ライブラリー
一価性に提示されたＩＧＥ１３４ペプチド−ファージライブラリーのセットを様々な長さの「リンカー領域」残基ＥＬＤＹＥ （配列番号：１５４）で構築し、改善された親和性及び代わりの配列を供給することができるペプチドの能力を試験した。
２つのライブラリー、ＨＬ７１８及びＨＬ７１９において、３又は５のランダム残基の挿入をＥＬＤＹＥ （配列番号：１５４）配列に従って設計した。ライブラリーＨＬ７２０及びＨＬ７２１のＥＬＤＹＥ （配列番号：１５４）配列について３又は４ランダム残基を置換することにより短いリンカー領域を構築した。
ＩＧＥ１３４−ｈＧＨ−ｇ３ファージライブラリーは上記（実施例ＩＩ）のようにして構築され、３ラウンドのレセプター選択を施した。ＳｅｑｕｅｎａｓｅＪ又はキャピラリー（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣＥＱ２０００）配列決定を用いてクローンをラウンド３の溶出プールから配列決定し、幾つかをファージＥＬＩＳＡでアッセイした（図５）。
【０１６７】
実施例１０
ゼータペプチドＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）のファージＡｌａスキャン
ＩＧＥ１２０（配列番号：１３１、１５９）について前記されるように、ファージベースアラニンスキャンニング法をＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）のＦｃεＲＩ結合決定基のマッピングに用いた。ペプチドＩＧＥ１３４（ＶＱＣＰＨＦＣＹＥＬＤＹＥＬＣＰＤＶＣＹＶ） （配列番号：１５５）をヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）への融合として提示し、ファージミド構築においてバクテリオファージＭ１３のｇ３ｐのＣ末端ドメインに融合させた（例えばＬｏｗｍａｎ等， １９９３， 上掲参照）。さらに、Ａｌａ突然変異、欠失及び他の置換の組合せを試験した。
ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）のアラニンスキャンニングの結果を図６に示す。検出できない結合を２つのジスルフィド結合Ｃｙｓ対、Ｐ４、又はＰ１６のＡｌａ置換について観察した。Ｙ８Ａは、結合親和性において大きな低下（＞５０倍）を引き起こす。これは、結合親和性喪失又は構造及びこれらの変異体の発現又はその両方での欠陥を生じさせることができた。上記されるように、Ｙ８Ａ及びＹ２０Ａ置換はペプチド構造を全体的に破壊するようである。しかしながら、Ｐ４Ａ及びＰ１６Ａ変異体は正準ゼータ構造を維持する。従って、側鎖はレセプターとの接点として関わる。Ｄ１７Ａ突然変異はＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）に比較される結合親和性の減少を生じず、Ａｓｐ側鎖はレセプター結合にもはや重要でないことを示した［ＩＧＥ１２０参照（配列番号：１３１、１５９）］。しかしながら、Ｅ１３Ａ／Ｄ１７Ａの二重置換は約１０倍減少した結合親和性を生じ、カルボキシル基はＦｃεＲＩに対する高親和性結合にも必要である。しかしながら、更なる２つの酸性残基（Ｌ１０Ｅ及びＹ１２Ｅ）の付加は親和性を大して変化させない。リンカー領域における酸性残基の多くの突然変異はまた、Ｄ１７Ａと相まって結合親和性の大きな損失を生じる。ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）の残基Ｅ１３（ＩＧＥ１２０（配列番号：１３１、１５９）のＡ１３参照）はＤ１７Ａ突然変異における欠損カルボン酸を補うようである。
これらのデータ、ランダムペプチドライブラリー、及び合成ペプチド結合アッセイの結果に基づき、ＣＰＸＺＣＹＸｎＺＣＰＤＸＣＹ （ここでｎ＝３， ４， 又は５； Ｚ＝高疎水性残基）形態のペプチドは高親和性を有するＦｃεＲＩに結合しうることが期待される。さらに、ＣＰＸＺＣＹＸｎＥＺＣＰＸＸＣＹ（ここでｎ＝２，３， 又は４； Ｚ＝ 高疎水性残基）形態のペプチドは高親和性を有するＦｃεＲＩに結合しうることが期待される。
【０１６８】
実施例１１
ペプチドＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）のＮＭＲ分析
２−３ｍｇのペプチドを５００ｍＬの９２％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ／８％Ｄ２Ｏに溶解し、次いで０．１ＮのＮａＯＨを添加してｐＨを６．０に調節することによって、ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）（実施例１２参照）のＮＭＲ試料を調製した。２９８Ｋでの１Ｄ ＮＭＲスペクトルのピークは多少広かったので、８％のアセトニトリル−ｄ３を試料に添加し、温度を３０８Ｋまで上昇させた。これらの条件下で、ＮＭＲのピークはかなりはっきりとし、完全な３次元構造の決定をすることができた。化学シフトの有意な変化は見られなかったが、ただ、アセトニトリルを有する試料と有しない試料の間で、コソルベントが構造を混乱させずに非特異的な凝結の範囲を最小化したようである。２次元二量子遷移相関分光法（２ＱＦ−ＣＯＳＹ）、全相関スペクトル（ＴＯＣＳＹ）、核オーバーハウザー効果スペクトル（ＮＯＥＳＹ）、及び回転フレームオーバーハウザー効果スペクトル（ＲＯＥＳＹ）を３０８Ｋで５−ｍｍ３軸パルスフィールド勾配プローブを備えるＢｒｕｋｅｒ ＡＭＸ−５００分光計によって収集した。Ｃａｖａｎａｇｈ等によって「Ｐｒｏｔｅｉｎ ＮＭＲ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ社、サンディエゴ：ＩＳＢＮ ０−１２−１６４４９０−１， １９９５）に記載されるようにして実験を記録した。Ｄ２Ｏのペプチドの凍結乾燥及び溶解の後、３５℃混合パルスで獲得される２Ｄ ＮＯＥＳＹ及びＣＯＳＹ−３５スペクトルを得た。完全な１Ｈ共鳴配座は、標準的な方法によってこれらのデータから導かれる（Ｗｕｔｈｒｉｃｈ， ｉｎ 「ＮＭＲ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： ＩＳＢＮ ０−４７１−８２８９３−９， １９８６）。
【０１６９】
ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）の明確な３次元構造は、次のようなことから得られた：（１）１Ｈ共鳴位置は構造化されていないペプチドで予測されるものとは有意に異なる。（２）アミドとαプロトンの間のスカラーカップリング定数（２ＱＦ−ＣＯＳＹスペクトルから得られる）は構造化されていないペプチドで得られる平均値と区別される。値は、残基Ｃｙｓ３、Ｔｙｒ８、Ｇｌｕ９、Ｃｙｓ１５、及びＴｙｒ２０について８．５Ｈｚを超え、Ｈｉｓ５、Ｐｈｅ６、Ｃｙｓ７、Ａｓｐ１７、Ｖａｌ１８、及びＣｙｓ１９については６Ｈｚ未満であった。また、ＣＯＳＹ−３５スペクトルのα及びβプロトンの間でスカラーカップリング定数を測定した。これらのデータは、残基Ｐｈｅ６、Ｃｙｓ７、Ｔｙｒ８、Ｇｌｕ９、Ｌｅｕ１０、Ｇｌｕ１３、Ｃｙｓ１５、Ｖａｌ１８、Ｃｙｓ１９及びＴｙｒ２０の側鎖が一定のｃｈｉ−１角度を有することを示す、つまりこれらの側鎖が構造化されていないペプチドにあるｃｈｉ−１回転異性体の範囲をとらない。（３）ＮＯＥＳＹ及びＲＯＥＳＹスペクトルのピークは、主な配列の隣接していない残基の間で多くのプロトン−プロトン接触（＜５Å）があることを示す。これらは、ペプチドが明確な構造に折り畳まれる場合にのみ生じうる。
【０１７０】
ＮＭＲデータを用いて、ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）構造の３次元構造モデルを決定するために使用することができる拘束条件を導いた。二面角の拘束は、適したカープラス相関（Ｋａｒｐｌｕｓ， Ｊ Ｐｈｙｓ Ｃｈｅｍ．， ３０： １１−１５ （１９５９））によってアミド−α及びα−βスカラーカップリング定数から導いた。距離の拘束は、ＲＯＥＳＹ又はＮＯＥＳＹスペクトルの空間を通した（ｔｈｒｏｕｇｈ−ｓｐａｃｅ）相互作用を示すプロトンの間で展開され；大きさの上限、及びピークの重複又は共鳴縮退による上限の修正はＳｔａｒｏｖａｓｎｉｋ等， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ３５：１５５５８−６９ （１９９６）に記載されるようにした。これらの拘束条件を利用して、ＡＭＢＥＲ全原子力場（Ｗｅｉｎｅｒ等， Ｊ． Ｃｏｍｐｕｔ． Ｃｈｅｍ．，７：２３０−２５２ （１９８６））を利用したプログラムＤｉｓｃｏｖｅｒ（ＭＳＩ、サンディエゴ）による拘束分子力学によって続けて精錬されるプログラムＧＤＩＩ（Ｈａｖｅｌ， Ｐｒｏｇ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ５６：４３−７８ （１９９１））を用いて構造のファミリーを作成した。得られた構造は単一の全体的な折り畳みに収束する（Ｎ、Ｃ−α、及び残基３−８及び１５−２０のカルボニル炭素についての０．３５±０．１０Åの平均構造からの実効偏差値）。最良の２０モデル（入力データの最小バイオレーション）は入力データと非常によく一致し（０．１Åを超える距離拘束バイオレーション無し、２°を超える二面角バイオレーション無し）、プログラムＰＲＯＣＨＥＣＫ（商品名）で判断されるように良い共有結合配置を有していた（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉ等， Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｃｒｙｓｔ．， ２６： ２８３−２９１ （１９９３））。
【０１７１】
集合の代表的なメンバー（平均座標に最も近いモデル）を図８に示す。ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）はあまり規則的な二次構造を有していないが、残基４−８及び１６−２０で構成される２つの小さな３１０らせん状ターンが有り、分子の中心の２つのジスルフィド結合で接触している。骨格高次構造は、基本的には残基１５−２０と同じ構造をとる残基３−８とほぼ対称である。らせん状の骨格高次構造は、骨格カルボニル酸素への「二量体接点」を渡るシステインの水素結合を提供する各チロシンヒドロキシルプロトン［Ｔｙｒ８（ＨＨ）−Ｃｙｓ１９（ＣＯ）及びＴｙｒ２０−Ｃｙｓ７（ＣＯ）］と、ジスルフィド「の下にある」チロシンリング（Ｔｙｒ８及びＴｙｒ２０）の強固な集合によって安定化しているようである。Ｔｙｒ２０のＡｓｐでの置換を有するペプチド（ＩＧＥ１５０；配列番号：１８３）は、チロシン側鎖の構造的な役割を示すペプチドのＣ末端の半分で安定構造の喪失を示す。Ｖａｌ１及びＧｌｎ２はＮＭＲデータで不明瞭であり、分子の中心よりフレキシブルなようである。また、残基１０−１３に関わるリンカー領域は、ＮＭＲデータで構造化中心の残基３−８及び１５−２０よりも不明瞭である。
【０１７２】
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【０１７３】
実施例１２
ペプチドの活性と構造分析
ペプチドを合成して、ＩＧＥ０８３（配列番号：１３０、１５６）、ＩＧＥ１２０（配列番号：１３１、１５９）、又はＩＧＥ１２２（配列番号：１３２、１６１）バックグラウンドのファージ誘導置換を試験し、置換の組合せを試験し、又はペプチド−レセプター結合相互作用のより具体的な特徴を試験した。
ペプチドＩＧＥ１３２（配列番号：１７０）、ＩＧＥ１４２（配列番号：１７５）、ＩＧＥ１４３（配列番号：１７６）、ＩＧＥ１４４（配列番号：１７７）、及びＩＧＥ１４５（配列番号：１７８）、及びＩＧＥ１５６（配列番号：１８８）を、タンパク質ＡのＺドメインとの融合（Ｓｍｉｔｈ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ３２， ２８９−２９６（１９９４）； Ｎｉｌｓｓｏｎ等， Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４８， ２４１−２５０（１９９６））として生合成的に作成した。大腸菌からの分泌の後、融合タンパク質を精製してＴＰＣＫ処理チロシン（Ｓｉｇｍａ社）で切断し、ペプチドを逆相ＨＰＬＣにより精製した。
構造スコアをあてはめて２Ｄ ＮＭＲ分光計で分析した。これらのペプチドのそれぞれについて、バックボーン１Ｈ共鳴を与え、３ＪＨＮ−Ｈαカップリング定数を測定し、基準ペプチド（つまり、ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１））と比較した。ペプチドは、化学シフト、カップリング定数が提供される基準ペプチドと同様の構造であることが同定され、ＮＯＥはその構造と一致する。３ＪＨＮ−Ｈαカップリング定数が基準よりも低い極値（つまり、３ＪＨＮ−Ｈα＞８．５又は３ＪＨＮ−Ｈα＜６Ｈｚ〜６＜３ＪＨＮ−Ｈα＜８．５の範囲までの値になる）である場合、及び／又はバックボーン共鳴の化学シフトが基準に比較してペプチドにおいてランダムコイル値に近い場合に、ペプチドが低い安定性であることが決定される。
【０１７４】
表９
合成ペプチドのＩＧＥ阻害活性及び構造データ（ペプチドＩＧＥ０８８（配列番号：１２８、１２８）及びＩＧＥ０８９（配列番号：１２８、１５７）はそれぞれ平行及び共有結合二量体を示す；＋＋＋、基準と構造的に同等；＋、基準と構造的に同等であるが、かなり安定性が低い；＋／−、ペプチドが安定した構造の要素を有するが、構造が基準構造とは異なる；−、ペプチドが大部分構造化されていない；＊ペプチドＩＧＥ０３７（配列番号：１２８）は初め構造化されていなかった｛単量体形態｝が、自発的な二量体形成の後に構造化された）
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＊ペプチドは二量体である。配列番号：二量体の各モノマーを説明する。「ａｖａ」＝アミノ吉草酸
【０１７５】
また、幾つかのペプチドを表面プラズモン共鳴バイオセンサーを用いて直接結合アッセイで試験した（Ｌｏｆａｓ ＆ Ｊｏｈｎｓｓｏｎ， Ｊ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２１， １５２６−１５２８ （１９９０））。バキュロウィルス感染昆虫細胞で産生されるＦｃεＲＩαを表面チオール法（ＢＩＡｃｏｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ５ａ， ＢＩＡｃｏｒｅ， Ｉｎｃ．， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）で固定した。簡単に説明すると、レセプターを２−（２−ピリジニルジチオ）エタンアミン塩酸塩（ＰＤＥＡ；Ｎａｔａｋｅ ＆ Ｓｗａｉｓｇｏｏｄ， Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ７４， ７７−８６ （１９７３））とともに反応させ、１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．８）で脱塩させ、一定分量を−８０℃で保存した。解凍したＰＤＥＡレセプターを、Ｎ−エチルＮ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、シスタミン、及びＤＴＴで活性化させたカルボキシメチル−デキストラン（Ｂ１又はＣＭ５、ＢＩＡｃｏｒｅ社）バイオセンサーチップ上に注入した。カップリングの後、チップ上の反応基をＰＤＥＡ及びエタノールアミンでクエンチした。ランニングバッファー（０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、０．０１％のアジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝食塩水）中のペプチドの段階希釈物を固定したレセプター上に注入し、定常状態での正味のペプチド結合の量を、ランニングバッファーベースラインに比較したペプチド注入終了の直前の反応（ＲＵ）における正味の変化として測定した。結合親和性（表１０）はペプチド飽和曲線に当てはめた４パラメーターの中心点（ＥＣ５０）として報告する。ＩＧＥ１３４（配列番号：）の場合において、示される値は、速度定数、ｋｏｎ及びｋｏｆｆから計算されるＫｄを示す。結合アッセイの結果（表８）は阻害アッセイの結果（表７）とよく相関する。
【０１７６】
表１０
バイオセンサーアッセイからのペプチドの結合親和性［ＥＣ５０値は、ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）以外、Ｋｄ（見かけ上）で示す。］
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【０１７７】
これらの実験から同定された最も効力のあるペプチドはＩＧＥ１３４（アミド変異体、配列番号：１７１）及びＩＧＥ１３５（配列番号：１７２）であり、阻害アッセイ（表９）においてそれぞれ３２ｎＭ及び４７ｎＭのＩＣ５０平均を有していた。短いペプチドＩＧＥ１５５（配列番号：１８７）はＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）のＮ末端の２つの残基及びＣ末端の残基を欠いており、また、ＩＧＥ１３４の約２倍以内の活性を維持する。切断したペプチドＩＧＥ１７０（配列番号：２０３）及びＩＧＥ１７１（配列番号：２０４）はＩＧＥ１６７（配列番号：２００）の約２倍以内の活性を維持していた。
ペプチドの「リンカー領域」は、ＩＧＥ０８３で（配列番号：１３０、１５６）残基ＶＧＧＫＡ （配列番号：２１０）、ＩＧＥ１３２（配列番号：１７０）でＶＧＧＨＡ （配列番号：２１１）、ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）でＥＬＤＹＥ （配列番号：１５４）、ＩＧＥ１３５（配列番号：１７２）でＦＧＧＡＥ （配列番号：２１２）、ＩＧＥ１５２（配列番号：１８５）でＦＧＡＥ （配列番号：２１３）に相当し、ファージ及びペプチドアッセイによって様々な置換並びに欠失及び挿入を受け入れることが示された。しかしながら、ＩＧＥ１２０（配列番号：１３１、１５９）とＩＧＥ１４１（配列番号：１７４）（活性が２倍異なる）、あるいはＩＧＥ１２２（配列番号：１３２、１６１）とＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）、ＩＧＥ１３５（配列番号：１７２）、又はＩＧＥ１５２（配列番号：１８５）の何れか（活性が約３〜５倍異なる）に比較して、この領域での置換はレセプターへのペプチド結合に影響を有しうることが明確である。
１７位のＡｓｐ残基は、初めＩＧＥ０８３（配列番号：１３０、１５６）に相当するファージクローンで同定された。この側鎖は、ペプチド−ファージデータ、並びにＤ１７Ｈ置換を有するＩＧＥ１３１（配列番号：１６９）のペプチドデータに基づき、レセプター結合に明らかに重要である。このペプチドはＩＧＥ１２２（配列番号：１３２、１６１）に比較して活性が＞１０倍減少する。しかしながら、興味深いことに、リンカー領域の酸性残基の導入でＤ１７の役割は変化する。例えば、ＩＧＥ１３５（配列番号：１７２）及びＩＧＥ１３６（配列番号：１７３）はＤ１７Ｇ置換によって異なっているが、活性が約２倍だけ異なる。ペプチド−ファージデータは、ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）バックグラウンドのＤ１７Ａについて同様の小さな影響を裏付ける。従って、Ｄ１７のカルボキシル化のためにリンカー領域のカルボキシル化を含む側鎖が置換しうるようである。
【０１７８】
幾つかのペプチドは、レセプター結合のためにゼータペプチドの２つのＰｒｏ残基が重要であることを示す。ペプチドＩＧＥ１２７（配列番号：１６５）及びＩＧＥ１４２（配列番号：１７５）は、２つの別々の配列においてＰ４Ａ置換を有し、それぞれのコントロールペプチドに比較して５０倍及び＞１００倍減少した活性を示す。これらの影響はペプチド構造を乱さない（表９）ので、レセプターとの接触における変化によるようである。一方、ペプチドＩＧＥ１５９（配列番号：１９１）及びＩＧＥ１６２−２（配列番号：１９６）におけるようなＰ４のＮ−メチルアラニン（ｎｍＡ）、又はＬ−ピペコリン酸（Ｐｉｐ）の置換は活性において小さな変化を引き起こす。従って、４位はもっぱらＰｒｏである必要はない。同様に、１６位のＰｒｏは、ＩＧＥ１４３（配列番号：１７６）の場合のようにＡｌａでの置換が＞１００倍の活性喪失を引き起こすので、レセプター結合にとって重大な残基である。かさねて、ペプチド構造はたいして乱されない。しかしながら、ｎｍＡ又はＰｉｐは約３−４倍の活性喪失でＰ１６を置換することができる［ＩＧＥ１５８（配列番号：１９０）及びＩＧＥ１６１−２（配列番号：１９４）］。
ペプチド−ファージ実験からのデータは、２つのジスルフィド結合（Ｃ３−Ｃ１５及びＣ７−Ｃ１９）及びチロシンＹ８及びＹ２０がレセプターへの高親和性結合にも重要であることを示す。ジスルフィド又はＹ８の実行不可能な置換をファージディスプレイライブラリーから同定することができた。ＩＧＥ１６４（配列番号：１９７）、ＩＧＥ１６５（配列番号：１９８）、及びＩＧＥ１６６（配列番号：１９９）のようなＣｙｓ残基のホモシステイン（ｈＣ）置換（ジスルフィド結合残基のＣａ間の距離を延長する）はそれぞれ有意な活性喪失を引き起こす。Ａｓｐは時々Ｙ２０を置換することがわかった；しかしながら、ペプチドＩＧＥ１５０（配列番号：１８３）は、これが約５倍の活性喪失、並びに構造安定性の喪失を引き起こすことを示す。
【０１７９】
実施例１３
ＩｇＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）とＦｃεＲＩの細胞外ドメインとの複合体をサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。複合体（１４ｍｇ／ｍｌ）と平均分子量２０００ダルトンを有する３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコールモノメチルエーテル（すなわちＰＥＧ ＭＭＥ２０００）、０．２Ｍの硫酸アンモニウム、及び０．１Ｍのクエン酸ナトリウムｐＨ４．２からなる保存液の１：１混合物を用いて懸滴で結晶を成長させた。空間群は、細胞パラメータａ＝２００Å、ｂ＝１５０Å、及びｃ＝１０４ÅのＣ２２２１、非対称単位につき４つの複合体であり、それぞれが他の３つとほぼ等価である。表１２のＡに挙げる各ペプチドとそのレセプターの間に多くの疎水性及びＨ結合相互作用がある。これらの相互作用に加えて、各複合体は隣接ペプチドとそのレセプターに近接し、表１２のＢ、Ｃ、及びＤの部分に挙げられる接点を有する。非対称単位内の他の２つの複合体からなるペプチド接触領域から離れて他のレセプター／レセプター接点がある。これらの接点は表１２に挙げていない。
【０１８０】
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構造は、非対称単位で２つの２：２、ペプチド：レセプター複合体を示す。また、レセプター由来の構築化した糖部分はペプチドと相互作用して結合を促進することが分かった。
【０１８１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】ＩＧＥ０８３ファージのライブラリーからＦｃεＲＩ結合について選択されたクローン。下線を引いた残基はランダム化されていた。ラウンド数Ｒは、何回の結合選択サイクルが使用されたかを示す。クローンの数Ｎは、そのアミノ酸配列で同定されたクローンの数を示す。示される野生型（ｗｔ）コントロールに比較して、相対結合親和性（ＩＣ５０／ＩＣ５０（ｗｔ））を測定した。
【図２】ＩＧＥ１２０−及びＩＧＥ１２２−ファージのライブラリーからＦｃεＲＩ結合について選択されたクローン。下線を引いた残基はランダム化されていた。ラウンド数Ｒは、何回の結合選択サイクルが使用されたかを示す。クローンの数Ｎは、そのアミノ酸配列で同定されたクローンの数を示す。示される野生型（ｗｔ）コントロールに比較して、相対的な結合親和性（ＩＣ５０／ＩＣ５０（ｗｔ））を測定した。
【図３】ＩＧＥ１２０（配列番号：１３１、１５９）、ＩＧＥ１２２（配列番号：１３２）及びＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）の親和性。相対親和性を競合ファージＥＬＩＳＡアッセイ（Ｌｏｗｍａｎ， （１９９８） 上掲）で測定した。
【図４】ＩＧＥ１３４ファージのライブラリーからＦｃεＲＩ結合について選択されたクローン。下線を引いた残基はランダム化されていた。ラウンド数Ｒは、何回の結合選択サイクルが使用されたかを示す。クローンの数Ｎは、そのアミノ酸配列で同定されたクローンの数を示す。示される野生型（ｗｔ）コントロールに比較して、相対結合親和性（ＩＣ５０／ＩＣ５０（ｗｔ））を測定した。
【図５】一価的に提示されたＩＧＥ１３４ペプチドファージライブラリーを様々な長さの「リンカー領域」［残基ＥＬＤＹＥ（配列番号：１５４）］で構築して、改善された親和性及び代わりの配列を受け入れるペプチドの能力を試験した。２つのライブラリーＨＬ７１８及びＨＬ１７９のＥＬＤＹＥ（配列番号：１５４）配列に続けて３又は５のランダム残基の挿入を作成した。短いリンカー領域をライブラリーＨＬ７２０及びＨＬ７２１のＥＬＤＹＥ（配列番号：１５４）配列の３又は４のランダム領域を置換することにより構築された。クローンはラウンド３の選択から示された。
【図６】ＩＧＥ１３４−ファージのアラニンスキャン。相対親和性を競合ファージＥＬＩＳＡアッセイで測定した。
【図７】ＩＧＥ０６３（配列番号：４９）の３次元構造。ＮＭＲで導かれた距離及び二面角拘束に基づいて計算された２０構造のアンサンブルの代償的なメンバーの１つが示される。Ａ．骨格の折り畳みを示すリボン状図。Ｂ．明確には示されていない残基１−４及び１５の側鎖のものを除いては、ＩＧＥ０６３（配列番号：４９）の全ての重原子。ＩＧＥ０６３（配列番号：４９）はＩ型ターンを有する安定したβヘアピン構造をもち；Ｎ末端の４つの残基は溶液中で無秩序となる。
【図８】ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）の３次元構造。ＮＭＲで導かれた距離及び二面角拘束に基づいて計算された２０構造のアンサンブルの代償的なメンバーの１つが示される。Ａ．骨格の折り畳みを示すリボン状図。Ｂ．ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）の全ての重元素。ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）は構造中心を形成する２つのジスルフィド結合及びチロシンリングを有するへリックス「ゼータ」高次構造をとる。Ｎ末端（Ｖａｌ１、Ｇｌｎ２）及びリンカー（Ｌｅｕ１０、Ａｓｐ１１、Ｔｙｒ１２）は、ＮＭＲデータで残りの分子よりも明確性が低く、おそらく溶液中においてよりフレキシブルである。
【図９】ＩＧＥ０６３（配列番号：４９）（明るい灰色）及びＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）（暗い）の構造のオーバーレイ。ヘアピン及びノット（ｋｎｏｔ）ペプチドクラスの非常に異なる２次構造にも関わらず、３次元表面構造のオーバーレイはＦｃεＲＩに結合する潜在的な共通の形態を示す。どちらの場合にも、２つの疎水性及び／又はプロリン含有隆起に隣接する疎水性の溝がある。ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）のＰｒｏ１６はＩＧＥ０６３（配列番号：４９）のＰｒｏ９に適格に合わさり、ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）のＰｒｏ４及びＰｈｅ６により決定される疎水性隆起はそれぞれＩＧＥ０６３（配列番号：４９）のＶａｌ１３及びＴｈｒ６上に大体重なり、共通の表面特徴を示すようであった。Ｂ．ＩＧＥ１３４（配列番号：１５５、１７１）の表面図。この図はノットペプチドのプロリン面を見下ろすようにして示されるものから９０°回転したものを示す。残基Ｃｙｓ３、Ｐｒｏ４、Ｐｈｒ６、Ｃｙｓ７、Ｃｙｓ１５、Ｐｒｏ１６及びＣｙｓ１９の側鎖の溶媒接触可能表面は濃い灰色で示され、高親和性ＦｃεＲＩ結合の重要な構造及び機能的要因を含む。




【国際調査報告】
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