(57)【要約】本発明はプロドラッグ及びレクチン指向性糖接合体、その接合体はプロドラッグを切断して薬物を放出するように設計されている、を含むレクチン指向性プロドラッグ輸送のためのキットを提供する。糖接合体は一般的にレクチンに結合する糖分子に接合した酵素を含んでいる。また本発明は新規糖接合体及びプロドラッグ合成方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖接合体がプロドラッグを切断しそれにより薬物を放出するように設計されているところの、プロドラッグ及びレクチン指向性糖接合体を含むレクチン指向性プロドラッグ輸送用のキット。
【請求項２】
糖接合体がレクチンに結合する糖分子と接合した酵素を含む請求項1に記載のキット。
【請求項３】
糖がマンノース、ガラクトース、グルコーズ、フコース、N-アセチルグルコサミン及びラムノースから選択されている請求項1または2に記載のキット。
【請求項４】
糖接合体が1から400の糖残基を含む請求項1，2または3に記載のキット。
【請求項５】
糖接合体が1から20部位の部位当たり1から20の糖残基を含む前記請求項のいずれか一つに記載のキット。
【請求項６】
糖接合体がラムノピラノシダーゼのクラスの酵素を含む前記請求項のいずれか一つに記載のキット。
【請求項７】
ラムノピラノシダーゼがα-L-ラムノピラノシダーゼである請求項6に記載のキット。
【請求項８】
酵素がナリンギナーゼである前記請求項のいずれか一つに記載のキット。
【請求項９】
糖がリシンまたはシステイン残基を介して酵素に結合している請求項2から8のいずれか一つに記載のキット。
【請求項１０】
糖がリンカーを介して酵素に結合している請求項2から8のいずれか一つに記載のキット。
【請求項１１】
-(c)-は糖への結合を示し、-(e)-は酵素への結合を示し、そして各nは独立して1から10の中から選択されている下記基：
(a)式Iaのイミノアルキル基
Ia          -(c)-SCH2C(NH)-(e)-
または式Ia'のイミノアルキル基
Ia'  [-(c)-XCH2COX(CH2)n]2N(CH2)nNHCO(CH2)nSCH2C(NH)-(e)-
式中XはN；
(b)式Ibの直接結合
Ib      -(c)-(e)-;
(c)式Icの基
Ic      -(c)-(CH2)nC(O)-(e)-   または  -(c)-C(O)(CH2)n-(e)-；及び
(d)式Idの基
Id      -(c)-CONH(CH2)nNH-C(C(O))=C(C(O))-(e)-
式中-C(C(O))=C(C(O))-は4員環状スクアラート、
から選択された基を介して糖が酵素に結合している請求項2から8のいずれか一つに記載のキット。
【請求項１２】
糖（c）及び酵素（e）が一般式II
【化１】
2004525171.tif 000087
式中〜〜〜〜はヒドロカルビル基、XはO,S,CH2またはNHを、そしてnは1から10を示す、
の2価分枝系を含む請求項2から8のいずれか一つに記載のキット。
【請求項１３】
糖（c）及び酵素（e）が一般式II’
【化２】
2004525171.tif 000088
式中各Xは独立してO,S,CH2及びNHから選択され、各Yは独立してNH,S及びOから選択され、nは1から10、そしてvとv'の合計及びvとv''の合計は独立してNの原子価に等しく、vは０または1そしてv'及びv''は独立して1または2、の2価分枝系を含む請求項12に記載のキット。
【請求項１４】
糖接合体が式IIIb
IIIb    Rv'N(H)vCO(CH2)nY(CH2)nC(=NH)N-(e)
式中Rは糖を含み、（e）は酵素、v及びv'は各1、各nは1から10及びYはS、
を有する請求項2から8のいずれか一つに記載のキット。
【請求項１５】
糖接合体が、
IME-チオガラクトシド試薬により修飾された野生型ナリンギナーゼ；
IME-チオマンノシド試薬により修飾された野生型ナリンギナーゼ；
IME-分枝チオガラクトシド試薬により修飾された野生型ナリンギナーゼ；
IME-チオマンノシド試薬を使用して再グリコシル化された脱グリコシル化ナリンギナーゼ；
IME-チオグリコシド試薬により修飾された野生型ナリンギナーゼ；
IME-分枝チオグリコシド試薬により修飾された野生型ナリンギナーゼ；
IME-チオグリコシド試薬を使用して再グリコシル化された脱グリコシル化ナリンギナーゼ；
IME-分枝クリコシド試薬を使用して再グリコシル化された脱グリコシル化ナリンギナーゼ；
上記IMEは2-イミノ-2-メトキシエチル、
から選択される請求項8に記載のキット。
【請求項１６】
プロドラッグがアミン、アルコールまたはチオールのラムノシドである前記請求項のいずれか一つに記載のキット。
【請求項１７】
ヒトまたは動物の身体に施す治療方法に使用するための前記請求項のいずれか一つに記載のキット。
【請求項１８】
感染性疾患、心血管系疾患、消化器系疾患、悪性疾患、呼吸器疾患、筋肉骨格系疾患または関節疾患の治療法に使用するための請求項17に記載のキット。
【請求項１９】
ヒトまたは動物の身体に施す治療方法において同時にまたは続けて使用するための請求項1から15のいずれか一つに記載の糖接合体及びプロドラッグ。
【請求項２０】
感染性疾患、心血管系疾患、消化器系疾患、悪性疾患、呼吸器疾患、筋肉骨格系疾患または関節疾患の治療においてプロドラッグと続けてまたは同時に投与するための医薬品を製造するために請求項1から15のいずれか一つに記載の糖接合体の使用。
【請求項２１】
マンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、N-アセチルグルコサミン、ラムノースまたはそれらの組合せでグリコシル化されたラムノピラノシダーゼ酵素を含む接合体。
【請求項２２】
単糖グルコシル化接合体または二糖、多糖または分枝グリコシル化接合体である請求項21に記載の接合体。
【請求項２３】
天然に存在するかまたは合成のラムノピラノシダーゼ酵素を脱グリコシル化し、次いでレクチン結合基で酵素を再グリコシル化することによって得られた請求項21または22に記載の接合体。
【請求項２４】
請求項11に記載の式Ia，Ib，Ic，またはId；
請求項12に記載の式II；
請求項13に記載の式II'；または
請求項14に記載の式IIIb；
式中（e）はラムノピラノシダーゼ酵素、
である請求項21から23のいずれか一つに記載の接合体。
【請求項２５】
酵素がナリンギナーゼである請求項21から24のいずれか一つに記載の接合体。
【請求項２６】
IME-チオガラクトシド試薬により修飾された野生型ナリンギナーゼ；
IME-チオマンノシド試薬により修飾された野生型ナリンギナーゼ；
IME-分枝チオガラクトシド試薬により修飾された野生型ナリンギナーゼ；
IME-チオマンノシド試薬を使用して再グリコシル化された脱グリコシル化ナリンギナーゼ；
IME-チオグリコシド試薬により修飾された野生型ナリンギナーゼ；
IME-分枝チオグリコシド試薬により修飾された野生型ナリンギナーゼ；
IME-チオグリコシド試薬を使用して再グリコシル化された脱グリコシル化ナリンギナーゼ；
IME-分枝チオグリコシド試薬を使用して再グリコシル化された脱グリコシル化ナリンギナーゼ；
上記IMEは2-イミノ-2-メトキシエチル、
から選択された接合体。
【請求項２７】
請求項21から26のいずれか一つに記載の接合体及び医薬として受容し得る担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２８】
ヒトまたは動物の身体に施す治療の方法に使用するための請求項21から26のいずれか一つに記載の接合体。
【請求項２９】
その方法が天然に存在するかまたは合成のラムノピラノシダーゼ酵素を脱グリコシル化して次いで酵素をレクチン結合基で再グリコシル化することを含む請求項21から25のいずれか一つに記載の接合体を合成する方法。
【請求項３０】
酵素の存在下に糖キャップドナーと反応する形の薬物と接触することを含む薬物分子及び糖キャップを含むプロドラッグの合成方法。
【請求項３１】
糖がα-ラムノピラノシドでありそして酵素がラムノピラノシダーゼである請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
ラムノピラノシダーゼがナリンギナーゼである請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
プロドラッグがアミン、アルコールまたはチオールのラムノシドである請求項31または32に記載の方法。
【請求項３４】
薬物分子及びα-ラムノピラノシドキャップを含むプロドラッグを製造するためにラムノピラノシダーゼ酵素の使用。
【請求項３５】
ラムノピラノシダーゼ酵素がナリンギナーゼである請求項34に記載の使用。
【請求項３６】
その方法が請求項1から15及び21から26のいずれか一つに記載の糖接合体をプロドラッグと同時にまたは続けて投与することを含み、その表面にレクチンを有するヒトまたは動物の細胞へ薬物を指向させる方法。
【請求項３７】
純粋なラムノピラノシダーゼ酵素。
【請求項３８】
純粋なナリンギナーゼである請求項37に記載の純粋な酵素。
【請求項３９】
ラムノピラノシダーゼであるがグルコシダーゼ活性を持たない請求項37または38に記載の純粋な酵素。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はプロドラッグの細胞への指向性輸送に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
糖は認識過程、特に細胞‐細胞認識における重要な因子としてますます研究が行なわれているi。糖はしばしば他の生体分子と結合して見出され、糖脂質及び糖タンパクを形成している。この糖分子は特異的な機能をこれらの分子にもたらし、親水性または立体構造安定性を増加させるii。
【０００３】
天然に存在する糖接合体は、物理学的性質が若干異なる複数の糖構造型として存在しiii、一つの糖構造型からもう一つの構造型へと変換する。しかし、これが均一な糖結合体の製造を可能にし、この目的を指向する多くの方法が開発され、そして表1に示すように当業者に知られている。これらの技術の多くは、グリコシル化に必要な時間の長さと濃度、すなわち特別なアミノ酸残基の存在及び残基とグリコシル化試薬の反応速度に依存しているためにグリコシル化の特異性及び程度の調節ができない欠点がある。
【０００４】
改良方法は部位指向性突然変異誘起及びウシ血清アルブミン（BSA）の単一システイン残基をペプチド鎖内の特定部位に導入しそしてシステイン選択的試薬でグリコシル化することによる化学変換を提供する（表１、第6段）。
【表１】
2004525171.tif 000002
【表２】
2004525171.tif 000003
【表３】
2004525171.tif 000004
表1：合成的グリコシル化技術
【０００５】
どのような薬物であれ目的の作用部位へ100％輸送することは現在不可能である。体内における、天然または外来性の、化合物の生体に備わった代謝は、薬物化合物を生体が容易に排泄できるような形に変換するものである。たとえ生体内代謝に抵抗するように薬物を設計したとしても、やはり薬物が目的とする標的に達することは必須であり、したがってある指向性を薬物中に組込むことは必要である。
【０００６】
生体内における薬物の消失を補うために投与量を増加させた時に認められる古典的副作用を防ぐために投与量を減らす必要がある。血液は身体中に薬物を分布させる。血液から活性部位‐目的の作用部位及び除去部位‐への移動は一般的に拡散によって行われ、したがって血漿及び標的細胞の間の濃度勾配、作用部位への薬物の優先的輸送及び薬物を受け入れるか受け入れないかは受容体に与えられた選択性により調節されている。毛細血管内皮の大きな孔は間質液への容易な移動を可能にし、したがって細胞表面への移動も可能にする。脂質細胞膜を通しての移動は薬物の親水性または親油性の性質に依存する。
【０００７】
生体内においてある応答を生じるために必要な分子の特異的性質が、その分子を体内の目的部位へ特異的に輸送し、親油性膜を通過するのにも適していることは、稀である。
【０００８】
薬物の活性と毒性の比率を上昇させることにより薬物の選択性を増加させる技術はプロドラッグ、すなわち活性薬物生成を利用する。プロドラッグは一般的に二つの分子からなる、一つの部分は薬物の毒性を取り去るかまたはマスクするかまたは薬物を保護し、もう一つの部分は作用部位の近くで望ましくは定量的に切断されて作用を発現する。プロドラッグ治療のその他の利点は、消化管刺激及び注射部位の痛みの軽減、味及び匂いの改善、化学的安定性の増加などである。
【０００９】
生体内に元来見出される酵素はこの切断を行なうために使用することができる。この方法の一つは、二つの異なる部分を個別に投与する「二分割」薬物輸送である。最初に、通常酵素が特異的にある細胞型を指向し、そして二番目のプロドラッグを活性化する機構を通常は提供する。しかしこれは特別な治療に限定されてきた。
【００１０】
ADEPT（抗体誘導酵素プロドラッグ治療、抗体誘導触媒‐ADC‐としても知られている）は酵素‐抗体接合体を導入するものであり、これは標的細胞の表面抗原に相補的であり、次いでプロドラッグは予め導入された酵素により選択的に切断される。
図１
2004525171.tif 000005
【００１１】
抗原は細胞によって異なる物質的性質の一つであり、そのためその方法により癌細胞を標的にすることが可能である。この優れたADEPTはその複雑なシステムを調節するのに困難がある。使用する抗体‐酵素接合体の決定は勿論標的とされる抗原及び輸送されるプロドラッグによるが、さらに特に接合体の薬物動態を管理することが重要である。目的とする部位においてのみ親化合物から活性薬物が放出されるように、プロドラッグの投与以前に接合体が腫瘍細胞に局在していなければならない。選択した抗体の慎重な修飾及び接合体の総分子量が調節に関与する。抗体は腫瘍細胞抗原にのみ高い親和性をもたなければならず、そして酵素との共有結合は抗体または酵素機能に影響してはならないv。
【００１２】
哺乳動物または非哺乳動物の酵素が使用されるが、非哺乳動物酵素は、生体内に存在する酵素による親プロドラッグの切断のリスクを減らし、したがって標的細胞における薬物濃度の調節を可能にする。しかし外来抗体‐酵素接合体の免疫原性の問題があるvi。これは哺乳動物酵素を使用することにより解決することができるが、しかし標的部位における活性薬物の選択的生成はできそうも無いvii。多くの技術viiiが外来酵素および抗体の存在によって生じる免疫原性を防ぐために、ヒト化抗体及び問題の効体の完全な再設計を含めて、開発されてきた
【００１３】
プロドラッグの標的指向性のための現行方法は非常に複雑、高度に状況依存的でありそして高価である。それ故に新規な標的指向性プロドラッグシステムに対するニーズがある。
【００１４】
細胞表面にレクチンが存在することは広く認められておりそして解明されている。レクチンは特別な糖残基または糖残基の配列を認識する結合部位を持つ多価リガンドの形の糖結合タンパクである。オリゴ糖が細胞間シグナリング、生理的応答を生じることに関係している事実はよく知られているix。レクチンは1888年に最初に発見され、それ以降その研究は多量の論文と総説を生産したx。細胞（マクロファージ）表面上の特異的マンノース結合レクチンにおけるマンノースに誘導された有用な酵素の取り込みが知られている。
【発明の開示】
【００１５】
発明の要約
特別な糖タンパク及びプロドラッグ接合体を新規に使用し、そしてレクチン‐糖相互作用を利用することにより特別な標的、その膜に特異的レクチンを持つ目的の細胞型を指向するタンパクまたは酵素を提供できること、そして酵素親和性を利用することにより酵素へ誘導されそして薬物を放出するプロドラッグを提供できることを、驚くべきことに発見した。このシステムを酵素ナリンギナーゼに関する図により説明する。
図２
2004525171.tif 000006
【００１６】
本発明の広範囲の態様において、レクチン指向性糖接合体及び対応するプロドラッグを含むレクチン指向性プロドラッグ輸送のためのキットが提供され、その中の糖接合体はプロドラッグを切断して薬物を放出するように設計される。
【００１７】
発明の詳細な説明
ここにおいて糖接合体、特に糖タンパクまたは糖結合酵素に関係するのは炭水化物、望ましくは（オリゴ）糖類、ここでは糖とも言われるものであり、これが分子、特に特異的化学反応を生じることができるタンパクまたは酵素と接合している。グリコシル化により認識が可能となり、そしてタンパクまたは酵素の機能及び輸送が影響を受ける。
【００１８】
プロドラッグに関係するのは、不活化またはマスク基、以下キャップ、を含む薬物治療に有用な分子、以下薬物、であり、このキャップは分子の薬物作用を不活性にし、そしてキャップを取り除き、薬物作用活性のある薬物を放出する糖接合体との反応をすることができる。
【００１９】
したがって、本発明により、われわれは多数の独立した、しかも共同的な、機構を一つの優れたレクチン‐酵素プロドラッグ活性化システム（LEAP）を構成した、このシステムは細胞型に酵素を特異的指向性輸送するためのレクチン結合及び輸送過程全体を調節することができるその酵素によるプロドラッグの調節放出を含んでいる。
【００２０】
この「構成要素」システムは酵素、酵素グリコシル化及びプロドラッグの組み合せの種々の配列を構築することが可能であり、適当なレクチンを持ついずれの細胞型に対しても選択的指向性をいずれの薬物にも持たせ得る可能性がある。
【００２１】
一態様において本発明のキットは一つのレクチン‐指向性糖接合体及び一つ以上の対応するプロドラッグを含む。他の態様において本発明のキットは一つ以上のレクチン‐指向性糖接合体及び一つの対応するプロドラッグを含む。
【００２２】
これは薬物範囲での特別な病気の治療に適したキットに対して、または逆に複数の作用を持つ一つの薬物による種々の病気の治療に対して追加の選択及び混合型の方法を提供し、医師が一つの作用で異なる組織を標的とするかまたは異なる作用で一つの組織を標的とする方法またはキットを選択及び調製することを可能にする。これは特別な個人には有用であり得るが、また重要なのは複雑な病気及び感受性の高い患者における治療の促進、治療の矛盾の回避などに有用であり得る。
【００２３】
グリコシル化の部位と性質はタンパクまたは酵素に与えられた効果を決定し、酵素活性に影響するグリコシル化は活性部位に近いか離れているかでありそして天然型か合成型かであろう。グリコシル化は部位特異的でありそして天然存在型のN-グリカンまたはO-グリカンであり、セリンまたはトレオニン残基にアスパルチルグルコサミンとベータ結合を形成し、またはセリンまたはトレオニンとのN-アセチルまたはキシロース結合である。合成型グリコシル化は通常リシン残基に対して行われるが、より望ましいのはシステイン残基に対するものである。グリコシル化は所与のタンパクの一部位または複数部位に行うことができ、そして反応速度により調節される。
【００２４】
以上に述べたようなキットの選択方法が提供され、それにはレクチン型または細胞型の決定または所与目的のための標的の所在及び投与する薬物の型、選択したレクチン型または細胞型または所在により認識されそしてそれに結合する糖の選択、プロドラッグを形成するための適当なキャップの選択、それらと接合し、その対象となる反応基質のなかに上記のようなキャップとして適する基を含む医薬として受容される分子（タンパクまたは酵素）の選択が含まれる。したがって糖の選択は望ましい標的細胞型のレクチン認識に依存し、糖接合体用の分子の選択は輸送したい望ましい薬物のキャップ分子の反応と除去に依存する。便宜的にはキャップは選択した酵素により加水分解することが知られている糖を含むことができる。
【００２５】
上記のような糖接合体は選択的にグリコシル化されて特異的レクチンにより認識されるいずれかの望ましい糖を含み、そのレクチンを含む目的の細胞型を特異的に標的とする。
【００２６】
糖分子は上記のように種々のレクチンに特異的な、そのため種々の細胞型に特異的なオリゴ糖から選択される。
細胞‐オリゴ糖の組合せは以下の例から選択することができる：
幹細胞‐ガラクトース特異的レクチンxi
マクロファージ‐マンノース特異的レクチンxii
マクロファージ‐マンノース及びマンノース-6-リン酸特異的レクチンxiii
単球‐マンノース-6-リン酸レクチンxiv
【００２７】
グリコシル基は直接またはリンカー分子を介して結合することができ、あるいはグリコシル化前駆体は糖分子に加えてリンカー分子を含むこともできる。
【００２８】
リンカー分子はグリコシル化に有用ないずれかの適当な基であり、そして次の群から選択されることが望ましい、その中で-(c）は糖への結合を示し、（c）は糖分子を示し、-(e)は原子またはグリコシル化される分子中の求核基中の基X、例えば各Xは酵素中の求核基中のNH，SまたはOから独立に選択される、への結合を示し、そして(e)はグリコシル化される分子、例えば酵素を示す；各Yはリンカー中のNH，SまたはOから独立に選択されそしてZは糖の中のNH，S，CH2またはOから独立に選択される；そして各n, a, b, c, d, eは独立に1から10または例えば1から5または1から3のいずれかの範囲から選択される：
【００２９】
（a）一般式Iaのイミノアルキル基
Ia      -(c)-SCH2C(NH)-(e)-
望ましくは一般式Ia'
Ia'
[-(c)-XCH2COX(CH2)n]2N(CH2)nNHCO(CH2)nSCH2C(NH)-(e)-
式中XはNそしてZは前に定義した；
式IaまたはIa'のリンカーは前に記述したように適当に既知IME反応により得られる、例えば対応するイミノ2-メトキシエチルチオ前駆体はリシンの側鎖Nと反応してリンカー基  -SCH2C(NH)NH-(e)  を生じる；
式Iaまたは式Ia'のイミノ2-メトキシエチルチオ前駆体は、既知方法により得られるか（Ia）または新規反応様式により得られる（Ia'）対応するシアノチオアミドの既知メトキシド変換により適当に得られる：
[(c)-XCH2COX(CH2)n]v'N(H)v(CH2)nNH2  +
SC(O)(CH2)3  +  L(CH2)nCN  →
[(c)-XCH2COX(CH2)n]v'2N(H)v(CH2)nNHCO(CH2)nSCH2CN
式中  SC(O)(CH2)3  は環状ガンマ-チオブチロラクトンでありそしてLは脱離基である；
【００３０】
（b）式Ibの直接結合
Ib      -(c)-(e)-
式中X及びZはそれぞれS；
基Ibは5-ニトロピリジン-2-スルフェニル経路またはメタンチオスルフォネート経路を経由する前記既知方法により適当に得られる
【００３１】
（c）式Icの基
Ic      -(c)-(CH2)nC(O)-(e)-
または  -(c)-C(O)(CH2)n-(e)
式中ZはNそしてXはS；
基Icは前に記述したN-アセチルグルコサミン経路を経由する既知方法により適当に得られる
【００３２】
（d）式Idの群
Id      -(c)-CONH(CH2)nNH-C(C(O))=C(C(O))-(e)-
式中ZはCH2，XはNH及び  -C(C(O))=C(C(O))-  は4員環スクアラートであり；
Id群は前に記述したスクアラート経路を経由する既知方法により適当に得られる。
【００３３】
望ましくは糖分子は1から400糖の適当な量で存在する、例えば部位当たり1から20糖、そして糖接合体当たり1から20部位。グリコシル化は所与接合分子について該当部位の1から100％の程度存在し、例えば所与の酵素分子について該当部位の1から45％または1から60％存在し得る。
【００３４】
糖接合体の糖分子は単糖、二糖または直鎖または分枝した多糖のいずれかであり、その他の機能基を含みそして例えば、マンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、N-アセチルグルコサミン、ラムノース、L-ラムノース（1-OH, 2-OH, 3-OH, 4-OH, 5-Me）、L-デオキシラムノジュリマイシン（1--, 2-OH, 3-OH, 4-OH, 5-Me）のような糖類及びその糖接合体のクラス及びその他の既知糖類クラスから選択された既知糖サブユニットの一つまたは組合せを含むことができる。
【００３５】
望ましくはグリコシルユニット及びリンカーは組合わせて標的レクチンに対する一つのまたは複数の結合部位を提供する、すなわちモノ、ジ、ポリまたは分枝グリコシル基を含む。レクチン自身がリガンドであるので、鋸の歯状のリガンドの結合に適しており、望ましくはグリコシルユニット及びリンカーは一般式IIの二価分枝システムを含む。
【化１】
2004525171.tif 000007
式中〜〜〜〜はハイドロカルビル基を示し、望ましくは一般式
【化２】
2004525171.tif 000008
式中結合  (c)- 及び -(e) はそれぞれ基ZまたはXを介しそして前に記述したようにO, S, CH2またはNHから選択され、nは前記と同じであり、v及びv'の合計とv及びv''の合計は独立してNの原子価と同じであり、vが0または1そしてv'及びv''が独立して一価または多価を示す1または2であり、例えば反復する分枝サブユニットにより二価、三価または多価グリカンが構築され、同様に反復して分枝するサブユニットにより6価または8価グリカンを構築することができる。
【００３６】
酵素は検討する広範囲のプロドラッグに対応し得るグリコシダーゼ、加水分解酵素またはリアーゼのクラスの範囲から選択することができる。酵素は市販品（Sigma）から入手することができるし、また培養などの適当な既知手段により得ることができる。適しているのは酵素が哺乳動物の相当物質がないかまたは哺乳動物の相当物質の変異体でない非哺乳動物酵素のいずれかから選択されている。これにより酵素は生体に新規な触媒作用を導入し、プロドラッグからの薬物放出に必要な作用であるこの作用はシステムが目的以外の位置を指向しないことを保証する。
【００３７】
哺乳動物相当物質がある酵素または哺乳動物酵素については天然哺乳動物機能の適当な修飾または阻害が考慮される。
【００３８】
非哺乳動物酵素はラムノピラノシダーゼ、ベータ-ラクタマーゼ、ペニシリンVアミダーゼを含む；哺乳動物相当物質がある酵素はベータ-グルクロニダーゼを含む；哺乳動物酵素はアルファ-ガラクトシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼを含む。
【００３９】
望ましくは、それが天然の哺乳動物には見出されない故に酵素はラムノピラノシダーゼのクラスの酵素、より望ましくはα-L-ラムノピラノシダーゼを含み、最も望ましいのはナリンギナーゼ、α-L-ラムノシダーゼ、ヘスペリジナーゼまたは同族体またはそのアミノ末端配列を含む。
【００４０】
より望ましくは酵素はナリンギナーゼ、同族体またはそのアミノ末端配列、例えば野生型ナリンギナーゼ（N-WT）、脱糖化ナリンギナーゼ（N-DG）及び熱安定性、活性、選択性の性質を賦与し、溶解性、溶媒耐性、分散性により製剤化し易くした、そして味、匂いなどを強化したその他の機能性ナリンギナーゼ（N-F）を含む；またはラクタマーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、ニトリラーゼ、エステラーゼ、リパーゼ、アミダーゼ、アルドラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼなどのようなその他の酵素を含む。
【００４１】
酵素の異なる培養は異なるプロドラッグ放出選択性を示すことがある、例えば酵素は市販品（Sigma）を入手できるし、また例えばUS 5,468,625に開示されているようにPenicillum sp. (DSM 6825, DSM 6826としてDeutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbHに寄託)の醗酵、培養液からの生産物の分離及び培養上清の濃縮による既知方法により調製される。この酵素は単離されそして活性N-末端配列を含む配列を有している
ナリンギナーゼ：（96000D）A S V P X G E X I L A P S SI E L I P T
アルファ-L-ラムノシダーゼ6826、ペプチドI（96000D）
D-T-N-D-Q-T-S-A-K-V-D-R-G-T-F-D-D-P-A-
及びアルファ-L-ラムノシダーゼ6826、ペプチドII（93500D）
F-F-G-S-X1(システイン？)-Q-S-L-Y-L-K-L-V-L-K-F-G-T-L-B-D(X2 )A
アルファ-L-ラムノシダーゼ（EC番号3.2.1.40）はしばしば若干異なる活性を持って多数の生物に見出されており、アルファ-L-ラムノシドにおける末端非還元アルファ-L-ラムノース残基を加水分解する。
【００４２】
別の研究xvにおいてAspergillus aculeatusから、ペクチンのラムノガラクツロナンフラグメントの非還元末端からラムノースを加水分解するα-L-ラムノピラノシダーゼが単離された。しかし異なるメチルラムノピラノシドの研究ではアルファ-L-ラムノピラノシダーゼがメチルアルファ-L-ラムノピラノシドに対して特異的であることが示された。
【００４３】
望ましくは酵素は目的薬物のグリコシル結合の合成及び加水分解の両者の能力に従って選択される。例えばBacillus circulansのβ-ガラクトシダーゼは、グリコシル受容体として1-チオ-β-D-グリコピラノシドをそしてグリコシル供与体としてp-ニトロフェニルβ-D-ガラクトピラノシドを使用して（代表例1）、エチル1-チオ-(β-D-ガラクトピラノシル)-O-β-D-グリコピラノシル二糖xviの生成を触媒することが示されている（そしてしたがってその加水分解を触媒することが予想され得る）。収率はグルコシダーゼ転移では、この例に認められたように、通常10-60％である。同様にラムノシダーゼをラムノシド結合を作製及び切断するために使用することができる。
【化３】
2004525171.tif 000009
代表例1：酵素的二糖合成
【００４４】
プロドラッグの輸送分子は、他のいずれの酵素によってもプロドラッグが切断されて元の活性薬物を形成されずに、選択部位へ多くの適当な薬物分子を輸送するために目的酵素および目的薬物の組み合わせから選択される。
【００４５】
プロドラッグのために望ましい輸送分子（キャップ）は糖、例えばラムノピラノースまたはラムノピラノースを組込んだその変異体及び自然に、化学的にまたは酵素的に分解して薬物を放出するリンカー、及び選択した酵素により分解されるその他の非炭水化物型キャップから選択される。
【００４６】
その他の態様において、望ましくは一つまたは既知糖類サブユニットの組合せ、例えばマンノース、ガラクトース、グルコース、フコース、N-アセチルグルコサミン、ラムノース、糖類及び単純な単糖接合体または二価、多価又は分枝結合原子または基のような適当な二価、多価または分枝骨格分子を持つ複雑な二糖、多糖または分枝糖接合体としてこれまでに述べたようなそれらの糖接合体から選択された一つまたはそれ以上の群でグリコシル化されている天然または合成的ラムノピラノシダーゼ酵素の新規グリコシル化接合体のクラス、及びそれらの調製方法が提供される。
【００４７】
新規酵素接合体は以下を含む
N-WT⇒GalIME
IME-チオガラクトシド試薬により修飾された野生型ナリンギナーゼ
N-WT⇒ManIME
IME-チオマンノシド試薬により修飾された野生型ナリンギナーゼ
N-WT⇒分枝GalIME
IME-分枝チオガラクトシド試薬により修飾された野生型ナリンギナーゼ
N-DG⇒ManIME
IME-チオマンノシド試薬を使用して再グリコシル化した脱グリコシル化ナリンギナーゼ
N-WT⇒GlyIME
IME-チオグリコシド試薬により修飾された野生型ナリンギナーゼ
N-WT⇒分枝GlyIME
IME-分枝チオグリコシド試薬により修飾された野生型ナリンギナーゼ
N-DG⇒GlyIME
IME-チオグリコシド試薬を使用して再グリコシル化した脱グリコシル化ナリンギナーゼ
N-DG⇒ 分枝GlyIME
IME-分枝チオグリコシド試薬を使用して再グリコシル化した脱グリコシル化ナリンギナーゼ
【００４８】
接合体は既知の化学的または生物学的技術により調製することができる。望ましくは化学的グリコシル化は還元的アミノ化またはIME-チオグリコシド化によるものであり、酵素構造の表面にマンノース、ガラクトース及びその他の前記糖残基を既知手段により結合することができる。生物学的技術は酵素合成を含み、そして酵素突然変異誘起、特別な結合型を阻害するまたは促進する酵素の抑制または過剰発現を考慮することができる。
【００４９】
本発明のその他の態様において、天然に存在する（WT）酵素または合成酵素の第1段階における脱グリコシル化を含む、式に示すグリコシル化酵素接合体の新規合成法方法が提供される：
【００５０】
(i) E-WT + 試薬  →      E-DG
式中試薬はEndo-Hなどのように適当に競合酵素である
次いで第2段階においてタンパクの前記のような糖及び式I（Ia-Id）のリンカーで前記既知技術を使用してグリコシル化する。
(ii) E-DG + (c)I →      E-DG⇒(c)I
【００５１】
望ましくは、ナリンギナーゼは既にグリコシル化されていると考えられるので、この方法は脱グリコシル化及び再グリコシル化の過程を含んでおり、体内の問題の部位へ酵素を輸送する選択性を高める目的を持っている、例えばIME分枝チオガラクトシドのようなリンカーで再グルコシル化された脱グリコシル化ナリンギナーゼを製造する。
【００５２】
特に、目的とする標的における接近とレクチン結合親和性を改善するために、競合ユニットに特異的な異なるレクチンへ酵素を指向させる望ましくない効果を有する競合グリコシルユニットを除去することにより、または調節された結合親和性のためにグリコシルユニットの比率を調節するために存在する類似のグリコシルユニットを除去することにより、またはより立体障害のあるグリコシルユニットを除去することによる。
【００５３】
脱グリコシル化は既知方法により、例えばN-WT⇒N-DG（またはN-DG）野生型ナリンギナーゼは酵素Endo-Hを使用する脱グリコシル化により得られる。
【００５４】
グリコシル化は、前記のようなリンカーIa-Idを経由する化学的修飾（表Xに示されているように、還元的アミノ化vii、IME経路viii、N-アセチル経路、５−ニトロピリジン−2−スルフェニル経路xii、システイン特異的メタンチオスルフォナート経路xi、リシンのフェニルイソチオシアナート修飾ix、リシン特異的ジエチルスクアラート結合xなど）、グリコペプチド構成、生物学的技術のような既知方法により、遺伝子発現または酵素阻害または酵素合成により行なうことができる。
【００５５】
望ましくはグリコシル化は一段階操作としてシアノアルキルヘテロアミドIIIからIME経路により行われる
【化４】
2004525171.tif 000010
式中YはS;そしてRはアミノ基を有する糖及び任意にIaまたはIa'のために前に定義したようなリンカーから選択されたヘテロ原子を含むヒドロカルビル基；例えば前記の図式Ia'の式Ia'の修飾前駆体を使用する。
【００５６】
酵素が上記技術のいずれにも適さない場合には、既知方法により修飾して適当な出発基を導入することができる、例えば修飾ナリンギナーゼ酵素は合成的に導入したシステイン残基を含むことができ、これによりグリコシル化のためにメタンチオスルフォナート試薬を使用することができるであろう。
【００５７】
式IVの脱グリコシル化酵素のクラスが提供される
IV  E-DG
前記のように得られ、式中Eは望ましくはラムノピラノシダーゼ、ベータ-ラクタマーゼ、ペニシリンVアミダーゼから選択された哺乳動物相当物質が無い非哺乳動物酵素である；またはベータ-グルクロニダーゼ類から選択された哺乳動物相当物質がある酵素である；またはアルファ-ガラクトシダーゼ及びアルカリ性ホスファターゼから選択された哺乳動物酵素である。
【００５８】
前記の式IIIまたはIIIaの新規レクチン指向性グリコシルIME前駆体のクラスが提供される、望ましくは酵素と接合しそしてその新規合成のためにv'は2そしてv''は1または2それによってvは1または0である糖分枝体。
【００５９】
このキット及び方法は、酵素活性を阻害して特定の部位において好ましくない代謝物の生成を阻止するために；ホルモン及び神経伝達物質の存在に対する受容体応答に影響を与える、すなわち増強するか減弱するか、または膜の透過性‐すなわち特定の膜を通して輸送することができる化合物の範囲‐を調節するために、目的とする既知または新規プロドラッグのいずれの輸送にも使用することができる。
【００６０】
プロドラッグは構造的に特異的または非特異的薬物型のいずれでもあり、望ましくは電荷分布及び薬物の形が生体の特異的な形と電荷分布の3次元受容体構造に相補的であることにより特異的であり、そして受容体により容易に受容され、そうして天然の受容体/分子相互作用に類似する。EC50値は可能な最大効果に対する50％応答を発生するのに必要な濃度を示す。
【００６１】
薬物はいずれの器官及び組織、例えば薬物を代謝することが知られている肝臓、肝臓以外の組織または器官、肺、消化器官または皮膚にも指向させるために選択することができる。
【００６２】
本発明のシステムにより輸送することができる既知プロドラッグは、その基の修飾により効果が減弱するアミンまたはアルコールまたはチオールのラムノシドを含んでおり、例えば、抗癌化合物の例としてメトトレキサートのN-リンクラムノシド、プロ抗生物質の例としてバンコマイシンのラムノシド、パラヒドロキシフェノキシ酢酸と縮合するのに適した遊離アミノ基を持つドキソルビシンのラムノシド、これはグリコペニシリンVアミダーゼ接合体により加水分解される、抗ウイルス、抗菌及び抗腫瘍の性質を持つフェネチルグリコシドであり、さらにアルドース還元酵素およびプロテインキナーゼCの阻害物質であり、20段階の合成により市販されているベルバスコシド
【化５】
2004525171.tif 000011
代表例2：ベルバスコシド
；及びマダガスカルのRavensura anisata Danguy (Lauraceae)の樹皮メタノール抽出から得られたフェノール性グリコシドxvii  1-(α-L-ラムノシル(1-6)-β-D-グルコピラノシルオキシ)-3,4,5-トリメトキシベンゼン（代表例3）、これは部分的保護/脱保護及びα-ラムノピラノシダーゼを使用する簡単な酵素合成により本発明に従って合成することができる。
【化６】
2004525171.tif 000012
代表例3：ラムノース含有フェノール性グリコシド
及び1-O-ガロイル-α-L-ラムノース（代表例4）、東カナダのレッドメープルAcer rubrum L.の葉から単離された天然抗生物質xviii。
【化７】
2004525171.tif 000013
代表例4
【００６３】
薬物は、これに限定されないが、以下を治療するための化合物を含む：
【００６４】
感染症に対する薬物、例えば抗ウイルス薬、抗細菌薬、抗菌薬、抗原生動物薬、駆虫薬；
【００６５】
心血管系に対する薬物、例えば陽性変力薬、利尿薬、抗不整脈薬、ベータ-交感神経遮断薬、カルシウムチャネルブロッカー、交感神経刺激薬、抗凝固薬、抗血小板薬、フィブリン溶解薬、脂質低下薬；
【００６６】
消化器系に対する薬物、例えば制酸薬、鎮痙薬、潰瘍治療薬、止瀉薬、緩下薬、中枢神経系に対する薬物、例えば睡眠薬及び抗不安薬、抗精神薬、抗うつ薬、中枢神経刺激薬、食欲抑制薬、吐き気及び嘔吐の治療に使用する薬物、鎮痛薬、抗てんかん薬、パーキンソン病に使用する薬物、物質依存性に使用する薬物；
【００６７】
悪性疾患に対する薬物及び免疫抑制薬、例えば細胞傷害性薬物、免疫応答調節物質、性ホルモン及び悪性疾患のアンタゴニスト；
【００６８】
呼吸器系に対する薬物、例えば気管支拡張薬、コルチコステロイド、クロモグリケート及び関連治療薬、抗ヒスタミン薬、呼吸刺激薬、肺表面活性薬、全身投与の鼻充血除去薬；
【００６９】
筋肉骨格及び関節の病気に対する薬物、例えばリューマチに使用される薬物、神経筋の異常に使用される薬物；及び
【００７０】
免疫学的製品及びワクチン。
【００７１】
本発明によって輸送することができるプロドラッグは、望む薬物の接合体及び天然または合成糖またはその他の前記キャップを抑制する活性を含み、特にα-ラムノピラノシド基、ガラクトシド基、ペプチド基、グリコシド基及びその他の前記糖残基などから選択された天然または合成グリコシル基を組込んでいるプロドラッグ接合体のクラス；またはエステル基などから選択された天然または合成の非グリコシル基；及び本発明の糖接合体によって同様に処理されて薬物を放出するその他の非天然キャップ。
【００７２】
プロドラッグは市販品を入手できるし、また既知方法または酵素合成による、望ましくは糖接合体に対応する酵素を使用する新規方法により適当に調製される。キャップ‐薬物結合を創るために酵素を使用することは、同じ酵素が適当な条件下においてその切断も触媒する微少可逆性の原理によるものである。
【００７３】
ラムノース型「キャップ」はプロテアーゼ活性に対して安定であることが認められており、細菌とのインキュベーションの後にもそれらが維持されており、薬物を放出する活性化機構も維持されていることが認められていることは有利な点である。プロドラッグが天然の酵素により加水分解され得る場合には、プロドラッグ輸送の指向性を確実にするためにその酵素に特異的な適当な阻害薬を同時投与することができるであろう。
【００７４】
その他の態様において、本発明はα-ラムノピラノシド基、ガラクトシド基、ペプチド基、グリコシド基及び前記のその他の糖残基などから選択された天然または合成グリコシル基を組込んだプロドラッグ接合体から選択された前記の糖キャップを有するプロドラッグを含むクラスのプロドラッグを提供するが、そのプロドラッグは、ナリンギナーゼ、ガラクトシダーゼ、ペプチダーゼ、グリコシダーゼなどまたは前記のその他の酵素のようなラムノプラノシダーゼから選択された天然に存在するかまたは合成の対応する非哺乳動物酵素を使用する酵素合成により得られた；またはエステル基などから選択された天然または合成の非グリコシル基を組込んでいるが、そのプロドラッグはペプチダーゼのような天然に存在するかまたは合成の非哺乳動物酵素を使用する酵素合成により得られた。
【００７５】
プロドラッグの酵素合成は活性型の選択した薬物、すなわち選択したキャップの受容体、とキャップ供与体及びその他の試薬を適当な酵素の存在下に接触させる既知方法による。
【００７６】
望ましくは酵素合成は求核試薬としてのグリコシル受容体（薬物）及び水の間の競合を減少させるために、有効な水分子数を減少させることにより、有機混合溶媒中で行なう。
【００７７】
酵素反応速度研究は特別な変換を行なうための酵素の有効性を示す。望ましくはプロドラッグは発色団、放射活性基などのような追跡基を含み、その基の減少または生成により薬物中のグリコシル基の取り込み及び生体内における薬物の輸送を監視することができる。追跡基は例えばカーボネート、カルバメート、パラ-アルコキシベンジルのように適するpH、触媒の条件下において自然に分離するものまたは環境に特異的な放出が監視または解明できるような化学的または生物学的刺激応答を示すものから選択される。追跡基は完全な形または分裂した形で追跡することができる。発光団またはフラグメントはUV/可視分光測定によりまたI135のような放射活性基はシンチレーション計測により、当業者には既知であるように、追跡することができる。
【００７８】
さらに前記のようなアルファ-ラムノースプロドラッグの新規な酵素合成が提供される。
【００７９】
酵素合成グリコシル化においてペプチド配列は潜在的グリコシル受容体を利用できなくすることにより、ポケットの中に折りたたむことまたは側鎖障害によりグリコシル化に影響する。酵素の型と量もグリコシル化パターンに影響する。したがってプロドラッグ結合を作る及び切断することの両方に対応する技術を使用する利点がある。
【００８０】
α-L-ラムノシダーゼ酵素は多数の工業的応用及び研究により知られており、α-L-ラムノシドにおける末端非還元α-L-ラムノース残基を加水分解するxix。(α-L-ラムノピラノシダーゼ（E.C.No.3.2.1.40）は多数の生物に認められており、しばしば若干異なる活性を持つことに注意すべきであり)、それらはこれまでグリコシル化プロドラッグに使用されることはなかった。
【００８１】
さらにレクチン指向性糖接合体及び対応する前記プロドラッグを投与することを含む治療方法が提供される；この方法は副作用を減らすことができそして改良された特異性により投与量を減らすことができる。
【００８２】
適当に接合体及びプロドラッグは経口、非経口、吸入、外用、静脈内、直腸などの適当な方法のいずれかによる投与に適合される。接合体は投与及び予定した循環期間、例えば30分までの範囲の例えば10分に適合され、循環してそしてレクチン認識により目的の細胞を指向し、そしてその他の位置からシステムを除去する。プロドラッグは別個に投与され、循環して酵素が局在する場所に達する。この場所において薬物の放出を伴うプロドラッグの切断を生じる。望ましくは酵素接合体は複数回のプロドラッグの投与の間そこに止まっている。
【００８３】
さらに糖接合体投与の時期及びプロドラッグ投与の1またはそれ以上の時期を含む投与方法が提供される。「キャップ」と酵素の会合により薬物が放出されるか、または「キャップ」が遊離分子として放出されそして酵素とは無関係に系から除去される場合には、投与方法はレクチンに対する接合体の高親和性、及びプロドラッグ切断部位の数に依存する。
【００８４】
またグリコシル化ラムノピラノシダーゼと共に医薬品として許容し得る賦形剤、担体などを含む哺乳動物、望ましくはヒトに投与するのに適した新規組成物が提供される。
【００８５】
また酵素合成により得られ前記のキャップを導入したプロドラッグと共に医薬品として許容し得る賦形剤、担体などを含む哺乳動物、望ましくはヒトに投与するのに適した新規組成物が提供される。
【００８６】
また哺乳動物の治療、望ましくはヒトの治療にグリコシル化ラムノピラノシダーゼを新規に使用することが提供される。
【００８７】
発明者は純粋なラムノピラノシダーゼ酵素、特に純粋なナリンギナーゼ酵素を得るための新規の方法を発明した。その精製方法は酵素の粗製物を透析し、透析産物にサイズ排除クロマトグラフィーを行ない、そしてサイズ排除クロマトグラフィーの産物にイオン交換クロマトグラフィーを行なう。この方法により500 mgの粗製ナリンギナーゼから30 mgの純粋なラムノシダーゼ活性を得ることができる。
【００８８】
純粋なラムノピラノシダーゼ酵素はラムノシダーゼ活性を有し、そして一般的には検出し得るグルコシダーゼ活性は混入していない。純粋なラムノピラノシダーゼ酵素を含む組成物中では、この酵素は組成物中のタンパクの例えば80％以上、90％以上、95％以上、98％以上または99％以上を占めることができる。この酵素を含有する組成物は10％SDS-PAGEにおいて単一バンドを与えるであろう。純粋な酵素は本発明のレクチン指向性糖接合体を作るために野生型、脱グリコシル化または糖で修飾されていることがある。
【００８９】
例
本発明を限定しない方式により以下の例を参照して説明する。
融点はガレンカンプ融点測定装置で記録した。プロトン核磁気共鳴（NMR）スペクトルは特記しなければVarian Unity 200スペクトル記録装置で200 MHzにおいて記録した。全ての化学シフトは残留溶媒を標準として使用しδ単位で示した。マススペクトルは特記しなければDurham大学マススペクトル測定装置によりエレクトロスプレーを使用して記録した。微量分析はDurham大学微量分析施設により行われた。薄層クロマトグラフィーはシリカゲル60 F254をコートしたアルミニウム板上で行なった。プレートをモリブデン酸アンモニウム展開液、またはメタノール/硫酸展開液を使用して展開した。
【００９０】
A  グリコシル化前駆体の調製
例A1−ガラクトース分枝IMEのシアノ前駆体の新規合成
合成は最初にN-ベンジル-4-シアノメチルスルファニル-ブチルアミドの調製から行なわれた
【化８】
2004525171.tif 000014
【００９１】
ベンジルアミン（0.55 ml, 5.0 mmol）、γ-チオブチロラクトン（0.87 ml, 10.0 mmol）及びクロロアセトニトリル（1.58 ml, 25 mmol）を、還流コンデンサーを付け、マグネチックスタラーを入れ、不活性気体を充たした丸底フラスコに入れた炭酸水素ナトリウム水溶液（30 ml, 0.5 M）及びメタノール（25 ml）に加えた。混合物を終夜50℃に加熱した。
【００９２】
減圧下にメタノールを除去し、残留する水溶液をクロロホルム（3×60 ml）で抽出した。有機層を集め、塩酸（3×60 ml, 1 M）で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥した。この溶液を濾過し、減圧下に溶媒を除去した
【００９３】
生成した油状物質をフラッシュクロマトグラフィー（3：1 EtOAc:ヘキサン＋1％Et3N）により精製した。
分析１
2004525171.tif 000015
【００９４】
グリコ分枝-IME試薬シアノ前駆体の合成
【化９】
2004525171.tif 000016
ビス{N-[2-(1-チオ-β-D-ガラクトピラノシル)エタノイル]アミノエチル}アミン（98.9 mg, 0.16 mmol）、γ-チオブチロラクトン（0.14 ml, 1.6 mmol）及びクロロアセトニトリル（0.20 ml, 3.2 mmol）を、還流コンデンサーを付け、マグネチックスタラーを入れ、不活性気体を充たした丸底フラスコに入れた炭酸水素ナトリウム水溶液（1 ml, 0.5 M）及びメタノール（1 ml）に加えた。混合物を24時間50℃に加熱した。
【００９５】
混合物を2 M HClで中和し、減圧下に濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（CHCl3：MeOH：H2O:Et3N  60：35：7：1）により精製し、生成物を得、減圧下に濃縮乾固した。次いで生成物を水：メタノール  1：1でDowex 50W2-200 (H+)に充填し、10％NH3溶液で溶出した。生成物を凍結乾燥により乾燥した。
分析２
2004525171.tif 000017
分子量はES-MSにより確認した。
【００９６】
例A2  1,2,3,4,6-ペンタ-O-アセチルβ-D-マンノピラノシドの調製
【化１０】
2004525171.tif 000018
酢酸ナトリウム（10 g,121.9 mmol）を無水酢酸（70 ml）に懸濁し、穏やかに還流するまで加熱し、加熱を止めた。D-マンノース（全量10 g, 55.49 mmol）を少しずつ反応を維持する速度で加えた。必要があれば反応温度を維持するためにヒートガンを使用した。発泡がなくなることにより判明するように反応が終了した後、オレンジ色に着色した混合物を再び加熱し、1時間還流する。混合物を冷却し、氷水（200 ml）上に注ぎ、時々攪拌して、3時間放置する。これにより有機層と水層の間にわずかに分離した暗褐色混合物を生じる。酢酸エチル（5×150 ml）で抽出し、減圧下濃縮し、暗褐色シロップを得た。フラッシュクロマトグラフィー（3：1酢酸エチル：ヘキサン）により精製して橙色オイル(8)を得た。
分析３
2004525171.tif 000019
【００９７】
例A3  1,2,3,4,6-ペンタ-O-アセチルβ-D-ガラクトピラノシドの調製
【化１１】
2004525171.tif 000020
酢酸ナトリウム（10 g,121.9 mmol）を無水酢酸（70 ml）に懸濁し、穏やかに還流するまで加熱し、加熱を止める。D-ガラクトース（全量10 g, 55.49 mmol）を少しずつ反応を維持する速度で加えた。必要があれば反応温度を維持するためにヒートガンを使用した。発泡がなくなることにより判明するように反応が終了した後、オレンジ色に着色した混合物を再び加熱し、1時間還流する。混合物を冷却し、氷水（200 ml）上に注ぎ、時々攪拌して、3時間放置する。これにより有機層と水層の間にわずかに分離した暗褐色混合物を生じる。酢酸エチル（5×150 ml）で抽出し、減圧下濃縮し、暗褐色シロップを得た。フラッシュクロマトグラフィー（3：1酢酸エチル：ヘキサン）により精製して橙色オイル(6)を得た。
収量19.27 g, 89.0%。元素分析：理論値：
分析４
2004525171.tif 000021
【００９８】
例A4  2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-α-D-マンノピラノシルブロミドの調製
【化１２】
2004525171.tif 000022
1,2,3,4,6-O-ペンタアセチルD-マンノピラノース（3.69 g, 9.45 mmol）を乾燥ジクロロメタン（130 ml）に溶解し、250 ml丸底フラスコ中窒素雰囲気下0℃で攪拌した。臭化水素（20 ml, 酢酸中30%）を徐々に加え、混合物を0℃で15分間攪拌した後室温まで加温した。反応を、1：1酢酸エチル：ヘキサンを使用して薄層クロマトグラフィー （RF  出発物質＝0.3、生成物＝0.5）により追跡した。
【００９９】
4時間後緑色/褐色混合物を氷上に注ぎ、白色への変色が認められた。この溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液（3×120 ml）で、次いで水（2×120 ml）で洗った。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、濾過し、減圧下に乾固し、透明、粘調オイル（9）を得た。
収量2.38 g, 61.3% 。元素分析：理論値：
分析５
2004525171.tif 000023
ESMS理論ピーク433/435、実測ピーク433/435。[α]D23.3＝＋123.757（CHCl3，c＝1.81）。
【０１００】
2-イミノ-2-メトキシエチル1-チオグリコシドの合成
例A5  臭化水素酸2-S-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル-β-D-ガラクトピラノシル)-2-チオプソイド尿素（ガラクトースのTPU誘導体）の合成
【化１３】
2004525171.tif 000024
アセトブロモ-α-D-ガラクトース（16.448 g, 40 mmol）及びチオ尿素（3.958 g, 52 mmol）をマグネチックスタラー及び還流コンデンサーを装着した250 ml丸底フラスコ中窒素雰囲気下乾燥アセトン（15 ml）に懸濁した。混合物を2時間還流し、反応をtlcで追跡し、減圧下濃縮（30 ml）し、3時間冷却した。生成した白色結晶（11）を濾取し、冷却アセトンで洗浄し、乾燥した。
収量：14.24 g, 73.1% .元素分析：理論値：
分析６
2004525171.tif 000025
【０１０１】
例A6  シアノメチル  ペル-O-アセチル-1-チオガラクトピラノシドの合成
【化１４】
2004525171.tif 000026
11（3.7 g, 7.6 mmol）を乾燥アセトン（20 ml）と攪拌し、水（20 ml）を加える。重亜硫酸ナトリウム（2.0 g, 38 mmol）、炭酸カリウム（1.6 g, 11.5 mmol）及びクロロアセトニトリル（2.5 ml, 40 mmol）を順番に加え、そして混合物を室温で3時間攪拌した。この混合物を氷水（40 ml）に加え、4℃で2.5時間攪拌した。減圧下にアセトン（20 ml）を除去し、生成した混合物を冷蔵庫で終夜冷却した。赤色ゴム状生成物をクロロホルム（2×40 ml）で抽出し、脱色炭で処理し、そしてセライトカラムを通して濾過し、抽出液を食塩液（3×40 ml, 1M）で洗い、得られた有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。クロロフォルム溶液を減圧下に濃縮乾固し、生成したゴムを熱エタノールから再結晶して、白色結晶性固体を得た。
収量：1.545 g, 50.4%. 元素分析：理論値：
分析７
2004525171.tif 000027
【０１０２】
例A7  2-イミノ-2-メトキシエチル  1-チオガラクトシドの合成：
【化１５】
2004525171.tif 000028
シアノメチル  ペル-O-アセチル-1-チオガラクトピラノシド（0.4805 g, 1.19 mmol）の乾燥メタノール（20 ml）溶液をナトリウムメトキシドのメタノル溶液（0.01 M, 30 ml）に加え、窒素雰囲気下室温で48時間攪拌した。減圧下にメタノールを除去し、タンパク接合を直ちに試みた。
【０１０３】
例A8  臭化水素酸2-S-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル  α-D-マンノピラノシル)-2-チオプソイド尿素の調製：
【化１６】
2004525171.tif 000029
アセトブロモ-α-D-マンノピラノシド（2.36 g, 5.7 mmol）及びチオ尿素（0.574 g, 7.54 mmol）をマグネチックスタラー及び還流コンデンサーを装着した50 ml丸底フラスコ中乾燥アセトン（25 ml）に懸濁した。混合物を3時間還流し、溶媒の20％を減圧下に除去し、2時間氷浴中冷却した。沈殿を生じないので、溶液を終夜冷凍庫で冷却した。未だ沈殿を生じないので、減圧下に溶媒をすべて除去し、淡黄色半結晶性ゴムを得た。熱酢酸エチルから再結晶して、生成物の沈殿を生じた。濾過後真空乾燥し、白色粉末を得た（14）。
収量：0.393 g, 14.16%. 元素分析：理論値：
分析８
2004525171.tif 000030
【０１０４】
例A9  シアノメチル  ペル-O-アセチル-1-チオマンノピラノシドの調製：
【化１７】
2004525171.tif 000031
臭化水素酸2-S-(2,3,4,6-テトラ-O-アセチル  α-D-マンノピラノシル)-2-チオプソイド尿素（0.37 g, 0.76 mmol）をアセトン（2 ml）に懸濁し、これに水（2 ml）、重亜硫酸ナトリウム（0.2 g, 3.8 mmol）、炭酸カリウム（0.16 g, 1.15 mmol）及びクロロアセトニトリル（0.25 ml, 4 mmol）を順次加えた。この混合物を室温で3時間攪拌し、次いで氷水（15 ml）上に注ぎ、4℃で2時間攪拌した。白色沈殿を生じ、濾取し、氷水で洗い、次いで真空乾燥した。熱メタノールから再結晶して白色固体（15）を得た。
収量：84.4 mg, 27.5% . 元素分析：理論値：
分析９
2004525171.tif 000032
【０１０５】
B  グリコシル化反応：糖接合体の調製
例B1  IME-チオガラクトシドを使用するナリンギナーゼのグリコシル化
【化１８】
2004525171.tif 000033
13（1.19 mmol）を丸底フラスコに入れ、ナリンギナーゼの溶液（20 mlの0.25 Mホウ酸ナトリウム中0.1070 g‐pH 8.5）を加えた。混合物を窒素雰囲気下48時間攪拌した。この後、Biogel P-2（2×60 cm, 0.1M NaCl, pH 4.8）及び溶出液として、0.1 M食塩液、pH 4.8による精製を行なった。タンパクの存在を分光光度計（280 nmにおける吸収）により検出し、目的フラクションを集めて凍結乾燥した。
【０１０６】
例B2  WTナリンギナーゼのIME-チオマンノシド化
1.1
【化１９】
2004525171.tif 000034
この工程の主な目的の一つは、レクチン-糖相互作用を使用して特別な細胞型にナリンギナーゼを特異的に輸送できるようにする目的の特異的糖分子をナリンギナーゼ、α-ラムノピラノシダーゼ、の表面に導入することである。これには多数のグリコシル化技術、すなわち還元的アミノ化及びIME-チオグリコシドの使用の検討を要する。両技術ともにタンパク構造中の遊離アミノ基の存在を要する‐そしてこのアミノ基がタンパク構造中に大きな立体障害を生じる基により妨害されていないことが必要である。
【０１０７】
タンパク表面の反応可能ないずれのアミノ基も修飾することを意図して、ナリンギナーゼをIME-チオマンノシドで処理した。シアノメチル  ペル-O-アセチル-1-チオマンノシド（12）をナトリウムメトキシドのメタノール溶液で処理し、IME-チオマンノシド（13）を得た。IME-チオマンノシドを調製したフラスコから一度溶媒をすべて除去し、ナリンギナーゼのナトリウム四ホウ酸緩衝液（pH 8.5）溶液を加え、不活性雰囲気下2日間攪拌した。
【０１０８】
BioGel P2サイズ排除クロマトグラフィー（2×60 cm, 0.1 M NaCl, pH 4.8）を使用して、タンパクの存在を調べるために280 nmにおける吸収によって部分標本を調べつつ、ナリンギナーゼを精製した。目的フラクションを集め、凍結乾燥して酵素活性を調べた。12.5％SDS PAGEを使用してこの方法により生じた分子量の変化を調べた。
【０１０９】
例B3  酵素の脱グリコシル化
エンドグリコシダーゼ  Hの精製
エンドグリコシダーゼ  H（EndoH）（1 ml, 10 mg/ml）を脱イオン水で20 mlに希釈し、次いでViskingチューブ（12-14 kDa MWCO）を使用して脱イオン水に対して24時間透析を行ない、1，6及び18時間で水を交換した。残った溶液を凍結乾燥して白色粉末を得た。純度をゲル電気泳動（SDS  PAGE）により評価し、ゲル中約25-30 kDaの分子量の減少が明らかに認められた（バンド2及び5の間の相違）。
【０１１０】
N-WTの脱グリコシル化（すなわち、N-DGの調製）
反応成績に対するスケール効果を評価する目的で、2回同様な方法を行なった。
【０１１１】
N-WTの溶液（5 ml, 10 mg/ml 10 mM pH 6.0オルトリン酸緩衝液）及びEndoHの溶液（25μl，10 mg/ml溶液）を合わせてマグネチックスタラーを付けたサンプルバイアルに入れ、37℃に24時間加温した。溶液をSpectrum DispoDialyserTM（50 kDa MWCO）に移し、脱イオン水に対して24時間透析し、1,6及び18時間に水を交換した。残った溶液を凍結乾燥して、白色粉末を得た。純度はゲル電気泳動（SDS  PAGE）で評価した、後記参照。
【０１１２】
N-WTの溶液（20 ml, 10 mg/ml 10 mM pH 6.0オルトリン酸緩衝液）及びEndoHの溶液（100μl，10 mg/ml溶液）を合わせてマグネチックスタラーを付けた丸底フラスコに入れ、37℃に24時間加温した。溶液をSpectrum Cellulose Ester透析チューブ（50 kDa MWCO）に移し、脱イオン水に対して24時間透析し、1,6及び18時間に水を交換した。残った溶液を凍結乾燥して、白色粉末を得た。純度はゲル電気泳動（SDS  PAGE）で評価した、後記参照。
【０１１３】
例B4  N-DG→GalIMEの調製
【化２０】
2004525171.tif 000035
マグネチックスタラーを装着した100 ml丸底フラスコ中不活性雰囲気下GalIME試薬（45 mg, 0.11 mmol）を乾燥メタノール（20 ml）に溶解した。ナトリウムメトキシド（30 ml, 0.01 M）のメタノール溶液を加え、混合物を36時間室温で攪拌した。
【０１１４】
フラスコ内容物を減圧下に乾固し、N-DGの溶液（2 ml, 5 mg/ml 0.25 Mホウ酸ナトリウム、pH 8.5にcHClで調節）を加えた。この混合物を窒素雰囲気下36時間攪拌した。この後、溶液をBiogel  P-2カラム（2×60 cm, 0.1 M NaCl, pH 4.8）により、タンパクの存在を分光光度計（280 nmにおける吸収）により検出しつつ精製した。目的とするフラクションを集め、凍結乾燥し、白色粉末を得た。純度をゲル電気泳動（SDS  PAGE）により評価した。期待したグリコシル化が検出され、バンド5及び6間の相違は、タンパクへの10糖分子の付加に相当する、約1.5 kDaの分子量の増加を示している。
【０１１５】
タンパク精製
ナリンギナーゼ検体はすべてSephadex  PD10脱塩カラムを使用して脱塩した。最大25 mgのタンパクを脱イオン水で予め溶出した各カラムに加えた。SDS  PAGEをタンパク検体全ての分子量測定に使用することができた。適当なフラクションを集めて、凍結乾燥した。
【０１１６】
ゲル電気泳動
ナリンギナーゼの検体は全て水溶液を調製し（2 mg/ml）、常法により12％ゲルに乗せた。ゲルを150 Vで3時間展開し、取出し、終夜染色し、次いで背景染色を終夜除去し、全検体の分子量を測定することができた、1  BioRad  SDS  PAGEタンパク標準（先端から：97.4，66，45（弱い），31 kDa）
【化２１】
2004525171.tif 000036
【０１１７】
C  酵素合成：プロドラッグの調製
例C1  β-メチル  グルコピラノシド及びp-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシド間の酵素反応：
【化２２】
2004525171.tif 000037
p-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシド（3.5 mM, 0.0050 g, 1.75×10-5 mol）のオルトリン酸緩衝液（5 ml, pH 7.0）中溶液を37℃に温度調節したグラファイト浴に入れた50 ml丸底フラスコ中攪拌した。β-メチル  グルコピラノシド（0.0204 g, 1.05×10-4 mol）のオルトリン酸緩衝液（3 ml, pH 7.0）溶液を加え、ナリンギナーゼ（0.0147 g, 5単位）と共に不活性雰囲気を導入した。反応を薄層クロマトグラフィー（1：9  メタノール：酢酸エチル）で追跡し、グリコシル供与体がすべて消費されたら100℃の水浴上に5分間おいて反応を止めた。凍結乾燥により水を除去した。
【０１１８】
例C2  酵素反応生成物のアセチル化
乾燥ピリジン（20 ml）及び無水酢酸（10 ml）をMAR48の粗生成物に加え、50 ml丸底フラスコ中終夜攪拌した。混合物を氷冷しつつ、メタノール（20 ml）を加え反応を止め、次いで溶媒を減圧下に完全に除去した。残留物をジクロロメタン（15 ml）に溶解し、炭酸水素ナトリウム溶液（0.05 M, 3×40 ml）で洗った。有機層を硫酸マグネシウム上乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下に除去した。この混合物を1：1酢酸エチル：ヘキサン溶媒系を使用してフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【０１１９】
例C3  β-メチル  ガラクトピラノシド及びp-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシド間の酵素反応：
【化２３】
2004525171.tif 000038
p-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシド（3.5 mM, 0.0050 g, 1.75×10-5 mol）のオルトリン酸緩衝液（5 ml, pH 7.0）溶液を37℃に温度調節したグラファイト浴に入れた50 ml丸底フラスコ中で攪拌した。β-メチル  ガラクトピラノシド（0.0323 g, 1.663×10-4 mol）のオルトリン酸緩衝液（3 ml, pH 7.0）溶液を加え、ナリンギナーゼ（0.0147 g, 5単位）と共に不活性雰囲気を導入した。反応を薄層クロマトグラフィー（1：9  メタノール：酢酸エチル）で追跡し、グリコシル供与体がすべて消費されたら100℃の水浴上に5分間おいて反応を止めた。凍結乾燥により水を除去した。
【０１２０】
例C4  酵素反応生成物のアセチル化
乾燥ピリジン（20 ml）及び無水酢酸（10 ml）をMAR50の粗生成物に加え、50 ml丸底フラスコ中終夜攪拌した。混合物を氷冷しつつ、メタノール（20 ml）を加え反応を止め、次いで溶媒を減圧下に完全に除去した。残留物をジクロロメタン（15 ml）に溶解し、炭酸水素ナトリウム溶液（0.05 M, 3×40 ml）で洗った。有機層を硫酸マグネシウム上乾燥し、濾過し、溶媒を減圧下に除去した。この混合物を1：1酢酸エチル：ヘキサン溶媒系を使用してフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
【０１２１】
NMR試験
p-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシド（3 mM, 200μl）及びβ-メチル  ガラクトピラノシド（18 mM, 200 μl）の水溶液をD2Oを充たした毛細管を入れたNMRチューブ内で混合した。検体中の水シグナルの抑制は適当な水シグナル周波数で検体を予め照射することにより行なった。ナリンギナーゼ溶液の一部（20μl、1 mg/ml, pH 7.0オルトリン酸緩衝液）をNMRチューブに入れ、NMRスペクトルを2分毎に4時間に亘って測定した。
【０１２２】
D  プロドラッグの調製
ナリンギナーゼ基質の合成−p-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシド：
出発物質p-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシド（18）は既報xxの方法を使用してグラムスケールで合成した。
【化２４】
2004525171.tif 000039
【０１２３】
方法は標準的技術に従い、無水酢酸及び触媒量の酢酸ナトリウムを使用するアセチル化によりL-ラムノース（15）を保護して68％の収率で（16）を得、次いでルイス酸触媒による「熔融」反応により結合して5.54％で（17）を形成した。次いで標準的メタノールによる脱保護を行ない目的の生成物（18）を得た。保護及び脱保護は相当な収率で行なわれた。
【０１２４】
最終物質を水及びジエチルエーテルで洗って精製し、凍結乾燥で生成物を乾燥することができ、分析の結果その後さらに使用し得る純度であることが確認された。わずかな黄色の着色は遊離p-ニトロフェノールの存在のためであるが、NMRでは検出できなかった（＜2％）。
【０１２５】
例D1  1,2,3,4-テトラ-O-アセチル  ラムノピラノースの調製
【化２５】
2004525171.tif 000040
L-ラムノピラノース  一水和物（11.10 g, 60.9 mmol）、酢酸ナトリウム（5.5 g, 67.0 mmol）及び無水酢酸（90 ml）を還流コンデンサーを装着した250 ml丸底フラスコ中で攪拌し、不活性雰囲気を導入した。混合物を110℃に温度調節した油浴を使用して90分間加熱した。加熱を止め、冷却した後氷水（500 ml）上に注いだ。2時間放置した後、この混合物をクロロホルム（3×100 ml）で抽出し、塩化カルシウム上で終夜乾燥した。濾過後減圧下に溶媒を除去し、淡黄色オイルを得、精製すること無く次の段階の合成を行なった。
【０１２６】
例D2  トリ-2,3,4-O-アセチル-p-アミノフェニル  α-L-ラムノピラノシド：
【化２６】
2004525171.tif 000041
テトラ-1,2,3,4-O-アセチル-ラムノピラノース（13.76 g, 41.4 mmol, MAR56から）及びp-ニトロフェノール（19.264 g, 138.4 mmol）を250 ml丸底フラスコに入れ、水流ポンプの減圧下に発泡が納まるまで120℃に加熱した。次いで塩化亜鉛（6.88 g, 50.5 mmol）の乾燥微粉末を熔融混合物に加え、減圧を続けた。淡黄色から暗褐色に変化した混合物を120℃60分間加熱し、次いで50℃に冷却した。この混合物をクロロホルム（200 ml）で抽出し、水酸化ナトリウム溶液（1 M,3×200 ml）及び水（5×200 ml）で洗った。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下に溶媒を除去した。
【０１２７】
残留した褐色ゴムを還流メタノール（120 ml）に溶解し、予め洗浄した活性炭を通し、濾過し、終夜放置した。沈殿を生じなかったので、減圧下に溶媒を一部除去し、溶液を終夜冷蔵庫に置いた。淡褐色結晶が生成し、これを熱メタノールから再結晶した。一連の収量を最終的収量とした。
収量：0.944 g, 5.54%.
分析１０
2004525171.tif 000042
ESMS  理論ピーク434、実測ピーク434．
【０１２８】
例D3  p-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシドの調整：
【化２７】
2004525171.tif 000043
ペル-O-アセチル  p-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシド（0.944 g, 2.39 mmol）を100 ml丸底フラスコ中乾燥メタノール（25 ml）に溶解し、これにナトリウムメトキシド（1.5 ml, 0.1 M）を加えた。混合物を反応が完了するまで15分間還流し、次いで減圧下に乾固した。エタノールを減圧下に除去した。残留固体を水に溶解し、ジエチルエーテルで洗ってp-ニトロフェノールを除去した。凍結乾燥により水を除去して、オフホワイトの生成物を得た。
元素分析：理論値：
分析１１
2004525171.tif 000044
【０１２９】
E  プロドラッグ放出：酵素反応速度試験：
【化２８】
2004525171.tif 000045
p-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシド溶液（190μl、3.5, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.25 mM/0.2 Mオルトリン酸緩衝液‐pH 6.8, 7.0, 7.2）の濃度範囲におけるナリンギナーゼ水溶液（10μl，0.5 mgml-1）の触媒活性を試験した。
【０１３０】
基質溶液をマルチウエルプレート上のウエルにピペッティングし、37℃5分間インキュベートした。次いでナリンギナーゼ溶液を加え、測定開始前に5秒間、各測定の前に1秒間振とうして6秒間隔で10分間405 nmの吸光度を測定した。
【０１３１】
F  酵素安定性
熱安定性試験：
上記方法で試験を行なう前に、酵素溶液を水浴中所定の温度で所定時間インキュベートした。
【０１３２】
有機溶媒安定性試験：
一般的方法を使用する試験に加えて、酵素を所定の（予め定めた有機/水比の）有機溶媒に所定の時間導入した。
【０１３３】
ナリンギナーゼのタンパク分解安定性
ナリンギナーゼは二分割薬物機構の部分として使用されるものであり、したがってタンパク分解酵素の攻撃に耐える能力はこのシステムの成功に必須である。この目的でナリンギナーゼ溶液をSubtilisn Bacillus Lentisの5％相当溶液で処理するプロトコールが開発され、そして種々のインキュベーション時間の後ナリンギナーゼ溶液を標準的な反応速度検定に附した。脱グリコシル化ナリンギナーゼは再グリコシル化試験に使用されるので、この脱グリコシル化ナリンギナーゼについても同様に試験した。野生型ナリンギナーゼはプロテアーゼ活性に対してかなり安定であることを示し、48時間以上でわずかな活性の消失を示したのみであった。
【０１３４】
反応速度検定
検定によりグリコシル化はレクチン指向性活性には悪影響を及ぼさないことが示された。
【０１３５】
p-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシド溶液（190μl、3.5, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.25 mM/0.2 Mオルトリン酸緩衝液‐pH 6.8, 7.0, 7.2）の濃度範囲におけるナリンギナーゼ水溶液（10μl）の触媒活性を試験した。
【０１３６】
基質溶液をマルチウエルプレート上のウエルにピペッティングし、37℃5分間インキュベートした。次いでナリンギナーゼ溶液を加え、測定開始前に5秒間、各測定の前に1秒間振とうして6秒間隔で10分間405 nmの吸光度を測定した。
【０１３７】
さらに、熱安定性試験では、使用前に酵素溶液を水浴中所定の温度で所定時間インキュベートした。
【０１３８】
吸光度データはUV-可視分光光度計を使用して測定し、MS Excelで速度情報に変換し、Erithacus SoftwareのGraFit4を使用して反応速度パラメータを決定した。
【０１３９】
N-WT→N-DG及びN-DG→GalIME，N-WT，N-WT-GalIME及びN-WT-ManIMEの完全な反応速度パラメータを決定した。N-DGはN-WTよりも大きな速度を示し、そして基質との結合はより活性の高い酵素と同じであり、安定性または立体構造の変化によるものではなく、妨害するグリコシル基の除去によるものであった。
【０１４０】
N-WT，N-WT-GalIME及びN-WT-ManIMEは60℃（生理的温度よりも高い）及び生理的pHにおいて安定であることが判明した。
【０１４１】
G  インビボ生体分布評価
放射標識酵素検体の調製
Pierce IODO-GENTMを予めコートしたヨード化試験管を使用して125Iを結合することにより酵素検体（10 mg）を放射標識した。ボロシリケート試験管をヨード化試薬（1,3,4,6-テトラクロロ-3α-6α-ジフェニルグリコウリル）でコートし、すぐ使用できるようにして供給されている。125IはAmershamから購入し、Pierceにより説明されている直接法に従った。検体をSephadex  PD10脱塩カラムに通して過剰の試薬を除去した。
この段階で各サンプルの放射活性を測定し、最終用量を算出した。
雄ウイスターラットにおけるインビボ試験では肝臓において酵素活性が示された。
【０１４２】
例H
1  緒言
かなりの量の純粋なタンパク（ラムノシダーゼ活性）を製造することができる、我々のシステムに対する著しく改良されたタンパク精製方法の発見、検討及び構成が達成された。
【０１４３】
ある範囲の構築を作製するためにこの純粋なタンパクに修飾を施した。
これらの構築の分析にはゲル電気泳動及び酵素活性を使用した。溶液における安定性の分析に加えて、温度（高温及び低温）及びタンパク分解酵素に対する安定性も評価した。
【０１４４】
インビボ評価試験は生体内における薬物を可視化するためにガンマシンチグラフィーを使用した。細胞レベルのインビボ評価は共焦点顕微鏡を使用するミクロオートラジオグラフィー試験により行なった。両者により肝臓内の特別な細胞型へのタンパク構築の細胞特異的輸送の評価をすることができる。さらに、ラムノピラノシド蛍光発生団を使用する共焦点顕微鏡によりプロドラッグに似た活性化を評価することができた。
【０１４５】
安定性試験には肝臓リソソームにおけるタンパク構築及びプロドラッグ両者の安定性を評価するためにラットトリトソーム標品xxiを使用した。
【０１４６】
2  方法及び検討
2.1  酵素精製
2.1.1  N-WT（野生型ナリンギナーゼ）の精製
P. decumbensのナリンギナーゼ(200 mg)を脱イオン水（20 ml）に溶解し、セルロースエステル透析チューブ（50 kDa MWCO）に入れて脱イオン水に対して24時間（1,3,6,18時間に水を交換）透析した。凍結乾燥により水を除去し、白色固体を得た。収量＝50 mg.
【０１４７】
2.1.2  N-DG（脱グリコシル化ナリンギナーゼ）の調製
N-WTの溶液（10 ml, 10 mg/ml 10 mM pH 6.0オルトリン酸緩衝液）及びEndoHの溶液（50μl，10  mg/ml溶液）をマグネチックスタラーを入れたサンプルバイアル中に入れ、37℃に24時間加温した。溶液をSpectrum DispoDialyserTM(50 kDa MWCO)に移し、1,4,6及び18時間に水を交換して24時間脱イオン水に対して透析した。生じた溶液を凍結乾燥して白色粉末を得た。純度はゲル電気泳動（SDS  PAGE）により評価した。
【０１４８】
2.1.3   安定性試験
2.1.3.1  透析/凍結/解凍/乾燥の間のN-WT安定性の評価
N-WT（80 mg）を水（8 ml）に溶解し、SpectraPorDispoDialyser（50 kDa MWCO）を使用して水に対して24時間透析した。生成した溶液から500μlの分割液を3個取り、以下のように処理した：
1．それ以上の処置無し、10％SDS  PAGEにより組成分析
2．検体凍結、解凍、10％SDS  PAGEにより組成分析
3．検体凍結乾燥、10％SDS  PAGEにより組成分析
結果は図1参照。図の左側のレーンは分子量マーカーを示す。
【０１４９】
2.1.3.2室温におけるN-WTの溶液安定性
N-WT（10 ml, 5 mg/ml）のオルトリン酸緩衝液（pH 7.0, 0.1 M）溶液を50 ml丸底フラスコ中14日間室温でゆっくりと攪拌した。下記に示した時間に分割液を取り、0.5 mg/mlに希釈して、反応速度検定を行なった（pH 6.8, 7.0, 7.2,基質としてpNP-Rhaを使用）。
サンプリング時間：1,2,3,5,7,9,14日
【０１５０】
2.1.3.3  N-WTの37℃における溶液安定性
N-WT（10 ml, 5 mg/ml）のオルトリン酸緩衝液（pH 7.0, 0.1 M）溶液を50 ml丸底フラスコ中14日間37℃でゆっくりと攪拌した。下記に示した時間に分割液を取り、0.5 mg/mlに希釈して、反応速度検定を行なった（pH 6.8, 7.0, 7.2,基質としてpNP-Rhaを使用）。
サンプリング時間：1,2,3,5,7,9,14日
【０１５１】
2.1.3.4  SBLの存在下におけるN-WTの溶液安定性
N-WT（10 ml, 5 mg/ml）のオルトリン酸緩衝液（pH 7.0, 0.1 M）溶液を50 ml丸底フラスコ中でSBL溶液の分割液（1 mg,pH 7.0オルトリン酸緩衝液で予め調製、凍結乾燥）と共に14日間ゆっくりと攪拌した。下記に示した時間に分割液を取り、0.5 mg/mlに希釈して、反応速度検定を行なった（pH 6.8, 7.0, 7.2,基質としてpNP-Rhaを使用）。
サンプリング時間：1,2,3,5,7,9,14日
【０１５２】
2.1.4  サイズ排除クロマトグラフィー
2.1.4.1  N-WTのBioGelTMP-2カラム（4×70 cm）精製
N-WT（50 mg, 10 mg/ml塩酸でpH 4.8に調整した0.1 M塩化ナトリウム）をBioGelTMP-2カラム（4×70 cm）に注入し、塩酸でpH 4.8に調整した0.1 M塩化ナトリウムを使用して溶出した。フラクション（5 ml）をとり、280 nmの吸光度を測定し、pNP-Rha及びpNP-Glc基質を使用してラムノシダーゼ及びグルコシダーゼ活性を測定し（カラム溶出液100μl＋100μl  3.5 mM基質溶液、37℃でインキュベート）、評価した。結果を図2に示した。
フラクション21-27、28-37及び39-40を集め、凍結乾燥、再度溶解し、Sephadex PD10脱塩カラムを通して、10％SDS  PAGEに使用した。
【０１５３】
2.1.4.2  N-WTのBioGelTM P-100カラム精製
2.1.4.2.1  3.5×50 cmカラム
N-WT（50 mg, 8 mg/ml塩酸でpH 4.8に調整した0.1 M塩化ナトリウム）をBioGelTMP-100カラム（3.5×50 cm）に注入し、塩酸でpH 4.8に調整した0.1 M塩化ナトリウムを使用して溶出した。フラクション（5 ml）をとり、280 nmの吸光度を測定し、pNP-Rha及びpNP-Glc基質を使用してラムノシダーゼ及びグルコシダーゼ活性を測定し（カラム溶出液100μl＋100μl  3.5 mM基質溶液、37℃でインキュベート）、評価した。結果を図3に示した。
注意。2.1.4.2.1では、N-WTの検体をカラムに適用する前に水に対して透析（50 kDa MWCO）を行なった。
フラクション19,21,23,26及び27をSephadex PD10TM脱塩カラムに通して、10％SDS  PAGEで分析した（図4）。
【０１５４】
2.1.4.2.2  5.5×45 cmカラム
N-WT（150 mg, 10 mg/ml塩酸でpH 4.8に調整した0.1 M塩化ナトリウム）をBioGelTMP-100カラム（5.5×45 cm）に注入し、塩酸でpH 4.8に調整した0.1 M塩化ナトリウムを使用して溶出した。フラクション（10 ml）をとり、280 nmの吸光度を測定し、pNP-Rha及びpNP-Glc基質を使用してラムノシダーゼ及びグルコシダーゼ活性を測定し（カラム溶出液100μl＋100μl  3.5 mM基質溶液、37℃でインキュベート）、評価した。結果を図5に示した。
【０１５５】
2.1.4.2.3  5.5×50 cmカラム
予め透析した（セクション2.2参照）N-WT（150 mg, 10 mg/ml塩酸でpH 4.8に調整した0.1 M塩化ナトリウム）をBioGelP-100カラムTM（5.5×50 cm）に注入し、塩酸でpH 4.8に調整した0.1 M塩化ナトリウムを使用して溶出した。フラクション（15 ml）をとり、280 nmの吸光度を測定し、pNP-Rha及びpNP-Glc基質を使用してラムノシダーゼ及びグルコシダーゼ活性を測定し（カラム溶出液100μl＋100μl  3.5 mM基質溶液、37℃で2分間インキュベート）、評価した。適するフラクションを集め、凍結乾燥及びSephadex G25TM（PD10カラム）による脱塩を行なった。
【０１５６】
2.1.4.2.4  2.5×75 cmカラム
予め透析した（セクション2.2参照）N-WT（150 mg, 10 mg/ml塩酸でpH 4.8に調整した0.1 M塩化ナトリウム）をBioGelP-100カラムTM（2.5×75.0 cm）に注入し、塩酸でpH 4.8に調整した0.1 M塩化ナトリウムを使用して溶出した。フラクション（12 ml）をとり、280 nmの吸光度を測定し、pNP-Rha及びpNP-Glc基質を使用してラムノシダーゼ及びグルコシダーゼ活性を測定し（カラム溶出液100μl＋100μl  3.5 mM基質溶液、37℃で2分間インキュベート）、評価した。適するフラクションを集め、凍結乾燥及びSephadex G25（PD10カラム）による脱塩を行なった。
【０１５７】
2.1.4.2.5  3.2×50.0 cm - Millipore Vantage-L TMカラム
予め透析した（セクション2.2参照）N-WT（250 mg, 20 mg/ml塩酸でpH 4.8に調整した0.1 M塩化ナトリウム）をBioGelP-100カラムTM（3.2×50.0 cm− Millipore Vantage-L TMクロマトグラフィーカラム）に注入し、塩酸でpH 4.8に調整した0.1 M塩化ナトリウムを使用して溶出した（流速＝20 ml/hr、ペリスタポンプを使用して調節）。フラクション（15 ml）をとり、280 nmの吸光度を測定し、pNP-Rha及びpNP-Glc基質を使用してラムノシダーゼ及びグルコシダーゼ活性を測定し（カラム溶出液100μl＋100μl  3.5 mM基質溶液、評価した。適するフラクションを集め、凍結乾燥及びSephadex G25TM（PD10カラム）による脱塩を行なった。結果を図6に示した。
【０１５８】
2.1.5  イオン交換クロマトグラフィー
2.1.5.1  標準カラムを使用するイオン交換
サイズ排除精製の生成物（2.4 ml, 5 mg/ml 20 mM L-ヒスチジン緩衝液、pH 6.0に調整）をSepharoseTM DEAE（2.0×25.0 cm）のカラムに注入し、pH 6.0に調整した20 mM L-ヒスチジン緩衝液（100 ml, 15 mlフラクション）で溶出した。塩濃度上昇グラジエント（0.05−0.35 M NaCl,30 ml毎に0.05 M上昇）を適用し、フラクション（15 ml）をとり、280 nmの吸光度を測定し、pNP-Rha及びpNP-Glc基質を使用してラムノシダーゼ及びグルコシダーゼ活性を測定し（カラム溶出液100μl＋100μl  3.5 mM基質溶液）、評価した。適するフラクションを集め、凍結乾燥及びSephadex G25TM（PD10カラム）による脱塩を行なった。結果を図7に示した。
【０１５９】
2.1.5.2   MilliporeTMカラムを使用するイオン交換
サイズ排除精製の生成物（セクション2.3参照）（2.4 ml, 5 mg/ml 20 mM L-ヒスチジン緩衝液、pH 6.0に調整）をSepharoseTM DEAE（2.0×25.0 cm− Millipore Vantage-L TMクロマトグラフィーカラム）のカラムに注入し、pH 6.0に調整した20 mM L-ヒスチジン緩衝液（100 ml, 15 mlフラクション）で溶出した（流速＝100 ml/hr、ペリスタポンプを使用して調節）。塩濃度上昇グラジエント（0.05−0.35 M NaCl,30 ml毎に0.05 M上昇）を適用し、フラクション（15 ml）をとり、280 nmの吸光度を測定し、pNP-Rha及びpNP-Glc基質を使用してラムノシダーゼ及びグルコシダーゼ活性を測定し（カラム溶出液100μl＋100μl  3.5 mM基質溶液）、評価した。適するフラクションを集め、凍結乾燥及びSephadex TM G25（PD10カラム）による脱塩を行なった。結果を図8に示した。
【０１６０】
酵素精製研究の要約
最初に、粗製ナリンギナーゼから（グルコシダーゼ活性またはその他のタンパク混入の無い）ラムノシターゼ活性の純粋なバンドを得るのは困難であることが示されていたので、この精製はこのプロジェクトにとって最優先であった。
【０１６１】
（グリコシル化に先行する）これまでの精製は50 kDa MWCOのセルロースエステルチューブを使用する透析（2.1.1）を必要とした。これはナリンギナーゼをある程度精製するが、薬物輸送システムの要求には充分ではなかった。
【０１６２】
常に不純物が存在することの一つの説明は取り扱っているうちにナリンギナーゼが分解することであり、そこで多数の検定を行なった。セクション2.1.3.1に記述した検討は、検体に対して日常行なわれる標準的な透析/凍結/解凍/乾燥の操作の効果を評価するために計画された。分析は全てSDS  PAGE（図1）によって行われ、これらの種々の技術はタンパクに悪影響を及ぼさないことが示された。
【０１６３】
さらにナリンギナーゼの溶液安定性−室温、37℃及びプロテアーゼ（SBL）の存在下における評価が企画された。これらの検定は取り扱い（すなわち、溶液）中の安定性を評価しそして薬物輸送に使用した場合の潜在的な問題も検討できるように立案された−溶液中で不安定な物質を有することは薬物輸送には不適当である。結果は、若干の活性低下が認められたが、大きな問題ではないことを示した。
【０１６４】
精製の質を向上させるために、多数の異なる技術を検討した。BioGelTM媒体を使用するサイズ排除クロマトグラフィーを最初の段階で使用した。BioGel P-2TMは低い排除限界（2 kDa）の樹脂であり、初期の比較に使用した。見ることができるように（エラー！出典不明）ナリンギナーゼ混合物の成分のわずかな分離が認められた−そのような低い排除限界の樹脂で予想されたように。
【０１６５】
BioGel P-100TMは同類の樹脂であるが、より大きな排除限界（80−100 kDa）を持っている。これが精製のレベルの著しい改善をもたらす。2.1.4.2.1（図4）のフラクションのゲルは特別な分子量範囲のバンドを精製することができることを示している。特に野生型検体とは著しく異なる大きなラムノシダーゼ活性を示したフラクション23は高分子量バンドが目立ち、我々が粗製混合物から低分子量不純物の多くを除去したことを示している。
【０１６６】
次いで同じBioGel P-100TM樹脂を使用して種々のカラムを検討した。異なる径と長さを評価し（2.1.4.2.2, 2.1.4.2.3,& 2.1.4.2.4）、それぞれは分離の質に若干異なる効果を有した。Millipore Vantage-LTMカラムを使用することにより、カラムのなかに溶媒を圧送するためにペリスタポンプを使用できた（従来精製は重力によるか空気圧を使用して行われた）。分離の質には著しい改善は見られなかったが、この新しいカラムによりより再現性のよい精製が行なわれるようになった（3.1.4.2.5）。
【０１６７】
ラムノシダーゼ活性が最も濃縮されたサイズ排除クロマトグラフィーから得た検体を使用して、イオン交換クロマトグラフィーを検討した。最初の試みは標準的クロマトグラフィーカラムを使用し、ラムノシダーゼ活性の純粋な検体を得られた。Millipore Vantage-LTMカラムを使用することにより、かなりの量の純粋なラムノシダーゼ活性を得るためにこの樹脂を日常的に使用することができた（修飾のセクションのグルを参照、図9）。
【０１６８】
透析、サイズ排除クロマトグラフィー及びイオン交換クロマトグラフィーにより、現在では500 mgの粗製ナリンギナーゼから30 mgの純粋ラムノシダーゼ活性を得ることができる精製法を使用可能である。
【０１６９】
2.2  酵素修飾
2.2.1  修飾試薬の調製
2.2.1.1  Gal-TPU誘導体の合成
【化２９】
2004525171.tif 000046
アセトブロモ-α-D-ガラクトース（5.0 g, 12.16 mmol）及びチオ尿素（1.2 g, 15.81 mmol）をマグネチックスタラー及び還流コンデンサーを装着した250 ml丸底フラスコ中窒素雰囲気下で乾燥アセトン（50 ml）に懸濁した。この混合物を2時間還流し、反応をtlcで追跡し、減圧下に（30 mlに）濃縮し、3時間冷却した。生成した白色結晶（11）を濾取し、冷アセトンで洗い、乾燥した。収量＝4.06 g.  前記のように分析した。
【０１７０】
2.2.1.2  Gal-IME試薬の合成
【化３０】
2004525171.tif 000047
Gal-TPU（3.7 g, 7.6 mmol）を乾燥アセトン（20 ml）と攪拌し、水（20 ml）を加えた。次いで重亜硫酸ナトリウム（2.0 g, 38 mmol）、炭酸カリウム（1.6 g, 11.5 mmol）及びクロロアセトニトリル（2.5 ml, 40 mmol）を順次加え、この混合物を室温で3時間攪拌した。この混合物を氷水（50 ml）上に加え、4℃で3時間激しく攪拌した。クロロホルム（4×40 ml）で抽出を行ない、抽出液を食塩溶液（2×60 ml, 1 M）で洗い、有機層を無水硫酸マグネシウム上で乾燥した。有機層を濾過し、減圧下に溶媒を除去した。
生成したゴム/結晶物質をフラッシュカラムクロマトグラフィー（3：1  EtOAc:ヘキサン）により精製し、適したフラクションを集め、減圧下に溶媒を除去した。収量＝2.05 g, 67% . 前記のように分析した。
【０１７１】
2.2.1.3  ペル-O-アセトマンノースの合成
【化３１】
2004525171.tif 000048
マンノース（4.0 g, 22.2 mmol）、ピリジン（40 ml）及び無水酢酸（20 ml）を250 ml丸底フラスコ中室温不活性雰囲気下で24時間攪拌した。減圧下に溶媒を完全に除去し、HCl（15 ml, 2 M）を加え、次いで生成物を酢酸エチル（3×20 ml）で抽出した。有機層を集めて水（3×10 ml）で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下に全ての溶媒を除去した。前記のように分析した。
この粗生成物を直ちに次の段階（2.1.4.2）に使用した。
【０１７２】
2.2.1.4  アセトブロモマンノースの合成
【化３２】
2004525171.tif 000049
ペル-O-アセトマンノース（8 g, 20.49 mmol）、HBr酢酸溶液（20 ml, 30% ）及び無水酢酸（10 ml）を250 ml丸底フラスコ中窒素雰囲気下で24時間攪拌した。追加のHBr酢酸溶液（5 ml, 30% ）を加え、さらに24時間攪拌を継続した。トルエン（30 ml）及び無水酢酸（5 ml）を加え、溶媒を減圧下に完全に除去し、暗褐色のシロップを得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（2:1  EtOAc:ヘキサン）により純粋生成物（6.0g, 13.59 mmol,66.3%）を得た。前記のように分析した。
【０１７３】
2.2.1.5  Man-TPU誘導体の合成
【化３３】
2004525171.tif 000050
アセトブロモマンノース（2.677 g, 6.51 mmol）及びチオ尿素（0.655 g, 8.60 mmol）をアセトン（25 ml,乾燥）に懸濁し、不活性雰囲気下に3.5時間還流した。生成した溶液を濃縮し（〜30％）、生成物の結晶化を促進するために冷却した。36時間後に結晶化を生じ、固体を濾取し、乾燥冷アセトンで洗い、減圧下に乾燥した。収量＝1.3 g, 3.32 mmol(51.0%). 前記のように分析した。
【０１７４】
2.2.1.6  Man-IME誘導体の合成
【化３４】
2004525171.tif 000051
Man-TPU試薬（5.413 g, 13.83 mmol）を水（30 ml）に溶解し、アセトン（30 ml）,次いで重硫酸ナトリウム（2.4 g, 45.6 mmol）、炭酸カリウム（2.33 g, 16.92 mmol）及びクロロアセトニトリル（7.2 ml, 115.2 mmol）を順次加えた。この混合物を6時間攪拌した。この混合物を氷水（50 ml）中に注ぎ、1時間攪拌し、白色沈殿を生じた。クロロホルム（3×80 ml）で抽出し、食塩液（3×40 ml, 1 M）で洗い、フラッシュクロマトグラフィー（3：1  EtOAc：ヘキサン）により白色固体を得た。収量＝3.539、  8.81 mmol(63.7%). 前記のように分析した。
【０１７５】
2.2.1.7  N-ベンジル-4-シアノメチルスルファニル-ブチルアミドの合成
【化３５】
2004525171.tif 000052
ベンジルアミン（0.55 ml, 5.0 mmol）、γ-チオブチロラクトン（0.87 ml, 10.0 mmol）及びクロロアセトニトリル（1.58 ml, 25 mmol）を、還流コンデンサー及びマグネチックスタラーを装着し、不活性雰囲気下の丸底フラスコ中の炭酸水素ナトリウム水溶液（30 ml, 0.5 M）及びメタノール（25 ml）に加えた。この混合物を終夜50℃に加熱した。
【０１７６】
減圧下にメタノールを除去し、残留する水溶液をクロロホルム（3×60 ml）で抽出した。有機層を合せ、塩酸（3×60 ml, 1 M）で洗い、硫酸マグネシウム上乾燥した。この溶液を濾過し、減圧下に全ての溶液を除去した。得られた油状物質をフラッシュクロマトグラフィー（3：1  EtOAc：ヘキサン＋1％Et3N）で精製した。
分析１２
2004525171.tif 000053
【０１７７】
2.2.1.8  グリコ分枝-IME試薬の合成
【化３６】
2004525171.tif 000054
ビス{N-[2-(1-チオ-β-D-ガラクトピラノシル)エタノイル]アミノエチル}アミン（98.9 mg, 0.16 mmol）、γ-チオブチロラクトン（0.14 ml, 1.6 mmol）及びクロロアセトニトリル（0.20 ml, 3.2 mmol）を、還流コンデンサー及びマグネチックスタラーを装着し、不活性雰囲気下の丸底フラスコ中の炭酸水素ナトリウム水溶液（1 ml, 0.5 M）及びメタノール（1 ml）に加えた。この混合物を24時間50℃に加熱した。
【０１７８】
混合物を2  M塩酸で中和し、減圧下に濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（CHCl3：MeOH：H2O：Et3N  60：35：7：1）で精製し、減圧下に乾固して生成物を得た。生成物を次いでDowex  50W2-200（H+）に水：メタノール  1：1で導入し、10％  NH3溶液で溶出した。生成物を凍結乾燥した。
分析１３
2004525171.tif 000055
【０１７９】
2.2.1.9  2.2.1.8のスケールアップ
300 mgスケールで2.2.1.8を繰り返した。同じパーセントの収率であった。
【０１８０】
2.2.1.10  ペルアセト-O-ラクトピラノース
【化３７】
2004525171.tif 000056
ラクトース一水和物（16.0 g, 44.4 mmol）を無水酢酸（64 ml, 678.4 mmol）及びピリジン（128 ml, 1.56 mol）に懸濁した。混合物を不活性雰囲気下24時間室温で攪拌した。減圧下に溶媒を全て除去し、橙色油状物を得、これを塩酸（50 ml, 2 M）で洗い、酢酸エチル（4×70 ml）で抽出した。有機層を合せて、水（3×30 ml）で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥した。溶媒を減圧下に除去して淡黄色ゴムを得た。
収量＝35.5 g, 50.1 mmol＝113％
この生成物を次の段階、2.2.1.11に粗製のまま使用した。
【０１８１】
2.2.1.11  アセトブロモラクトピラノースの合成
【化３８】
2004525171.tif 000057
ペルアセト-O-ラクトピラノース（30.9 g, 44.4 mmol）を乾燥ジクロロメタン（200 ml）に溶解し、臭化水素の酢酸溶液（60 ml, 30％）を滴下した。3時間後溶液を氷水上に注ぎ、次いで有機層を分離した。有機層を炭酸水素ナトリウムの飽和溶液（3×50 ml）で洗い、無水硫酸マグネシウム上で乾燥し、減圧下に溶媒を除去して褐色油状物を得た。フラッシュカラムクロマトグラフィー（2：1  酢酸エチル：ヘキサン）には成功しなかった。
【０１８２】
2.2.2  修飾反応
2.2.2.1  N-WT→GalIMEの調製
【化３９】
2004525171.tif 000058
シアノメチル  ペル-O-アセチル-1-チオガラクトピラノシド（270 mg, 0.67 mmol）をマグネチックスタラーを装着し不活性雰囲気の50 ml丸底フラスコ中で乾燥メタノール（24 ml）に溶解した。ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（240μl，1 M）を加え、室温で36時間攪拌した。溶媒を除去して白色固体を得た。
【０１８３】
N-WT（50 mg）を四ホウ酸ナトリウムの水溶液（0.25 M, pH 8.5）に溶解し、白色固体に加え、室温で24時間攪拌した。
【０１８４】
ViskinTM透析チューブ（12-14 kDa）を使用して脱イオン水に対して12時間（1、4及び6時間に水を交換）この溶液の透析を行ない、次いでSephadex  G25  PD10TMカラムを通した。得られた溶液を凍結乾燥し、白色粉末を得た。
【０１８５】
2.2.2.2   N-WT→ManIMEの調製
【化４０】
2004525171.tif 000059
シアノメチル  ペル-O-アセチル-1-チオマンノピラノシド（225 ml, 0.56 mmol）をマグネチックスタラーを装着し不活性雰囲気の50 ml丸底フラスコ中で乾燥メタノール（20 ml）に溶解した。ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（200μl，1 M）を加え、室温で36時間攪拌した。溶媒を除去して白色固体を得た。
【０１８６】
N-WT（40 mg）を四ホウ酸ナトリウムの水溶液（0.25 M, pH 8.5）に溶解し、白色固体に加え、室温で24時間攪拌した。
【０１８７】
ViskinTM透析チューブ（12-14 kDa）を使用して脱イオン水に対して12時間（1、4及び6時間に水を交換）この溶液の透析を行ない、次いでSephadex  G25  PD10TMカラムを通した。得られた溶液を凍結乾燥し、白色粉末を得た。
【０１８８】
2.2.2.3   N-WT→dGalIMEの調製
【化４１】
2004525171.tif 000060
シアノメチル分枝Gal（510 mg, 0.67 mmol）をマグネチックスタラーを装着し、不活性雰囲気の100 ml丸底フラスコ中乾燥メタノール（37 ml）に溶解した。ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（375μl，1 M）を加え、室温で36時間攪拌した。減圧下に溶媒をすべて除去し白色固体を得た。
【０１８９】
N-WT（50 mg）を四ホウ酸ナトリウムの水溶液（0.25 M, pH 8.5）に溶解し、白色固体に加え、室温で24時間攪拌した。
【０１９０】
ViskinTM透析チューブ（12-14 kDa）を使用して脱イオン水に対して12時間（1、4及び6時間に水を交換）この溶液の透析を行ない、次いでSephadex  G25  PD10TMカラムを通した。得られた溶液を凍結乾燥し、白色粉末を得た。
【０１９１】
2.2.2.4   N-DG→GalIMEの調製
【化４２】
2004525171.tif 000061
GalIME試薬（155 mg, 0.38 mmol）をマグネチックスタラーを装着し、不活性雰囲気の100 ml丸底フラスコ中乾燥メタノール（14 ml）に溶解した。ナトリウムメトキシドのメタノール溶液（28 ml，0.01 M）を加え、室温で36時間攪拌した。
【０１９２】
フラスコ内容物を減圧下に乾固し、N-DG溶液（35 mg, 10 mg/ml 0.25 Mホウ酸ナトリウム、cHClでpH 8.5に調整）を加えた。この混合物を窒素雰囲気下24時間攪拌した。その後、溶液を分光光度計によりタンパクの存在を監視しつつBiogel  P-2TM（2×60 cm, 0.1 M NaCl, pH 4.8 ）により精製した。目的のフラクションを集め凍結乾燥して白色粉末を得た。純度をゲル電気泳動により測定した（図9）。
図３
2004525171.tif 000062
【０１９３】
例Hに記述した修飾の要約
修飾用試薬の合成は例A及びBに記述した研究から継続している。ManIME及びGalIMEの試薬の大量（＞2 g）が合成され、分枝GalIMEの充分な量が使用できる。
【０１９４】
修飾反応は前記と同様に継続されたが、以前は粗製品を使用したが今回は精製したラムノシダーゼ活性を有するものを使用した。修飾後の分析（図9）は分子量及び構造の純度の変化を示している。
【０１９５】
2.3  酵素検定
2.3.1  N-WTのpH曲線
p-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシド溶液の濃度範囲（190μl, 3.5, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.25 mM, 0.1 Mオルトリン酸塩緩衝液中−pH 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0）におけるN-WTの水溶液（10μl，0.5 mg/ml）の触媒活性を試験した。
【０１９６】
基質溶液をマルチウエルプレートのウエルにピペッティングし、37℃で5分間インキュベートした。次いでナリンギナーゼ溶液を加え、そして測定開始前に5秒間、各測定の前に1秒間振とうして405 nmにおける吸光度を5分間、6秒間隔で測定した。結果を図10に示す。
【０１９７】
2.3.2   N-DGのpH曲線
p-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシド溶液の濃度範囲（190μl, 3.5, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.25 mM, 0.1 Mオルトリン酸塩緩衝液中−pH 5.8, 6.0, 6.2, 6.4, 6.6, 6.8, 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0）におけるN-DGの水溶液（10μl，0.5 mg/ml）の触媒活性を試験した。
【０１９８】
基質溶液をマルチウエルプレートのウエルにピペッティングし、37℃、5分間インキュベートした。次いでナリンギナーゼ溶液を加え、そして測定開始前に5秒間、各測定の前に1秒間振とうして405 nmにおける吸光度を5分間、6秒間隔で測定した。結果を図11に示す。
【０１９９】
2.3.3酵素検定
p-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシド溶液の濃度範囲（190μl, 3.5, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.25 mM, 0.2 Mオルトリン酸塩緩衝液中−pH 6.8, 7.0, 7.2）及びp-ニトロフェニル  β-Ｄ-グルコピラノシド溶液の濃度範囲（190μl, 3.5, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.25 mM, 0.2 Mオルトリン酸塩緩衝液中−pH 6.8, 7.0, 7.2）における酵素検体（10μl，0.5 mgml‐1）の触媒活性を試験した。
【０２００】
基質溶液をマルチウエルプレートのウエルにピペッティングし、37℃で5分間インキュベートした。次いで酵素溶液を加え、そして測定開始前に5秒間、各測定の前に1秒間振とうして405 nmにおける吸光度を10分間、6秒間隔で測定した。
【表４】
2004525171.tif 000063
【表５】
2004525171.tif 000064
表２：ラムノシダーゼ活性
【０２０１】
酵素検定の要約
標準的な検定を行なった他に、精製及び安定性の評価、pHの影響の検討及び一部の新規な精製した構築の検定も実施した。pH曲線は予想した結果を示した−以前に示したように、最適pHは7.0の少し下であり、その最適値の両側で活性は減少した。
【０２０２】
表2は検体のラムノシダーゼ活性に及ぼす精製及び修飾の影響を示している。図12も参照。
【０２０３】
グルコシダーゼ活性（微量−データは示さず）が最初の2検体では検出された−Sigmaからの粗製品及び透析後−しかし、さらに精製した（すなわち、イオン交換クロマトグラフィー）後には認められなかった。
【０２０４】
2.4  ポリ-L-リシン（PLL）修飾
2.4.1  PLL検体のマススペクトル分析
a)PLL-HBr（〜24 kDa）を脱イオン水に溶解し（2 mg/ml）、そして1：1  水：アセトニトリル（＋0.5％ギ酸）で6分の1に希釈した。検体をシリンジポンプで導入してMicroMass  LCTTMで分析した。
【０２０５】
b）PLL-HBr（〜24 kDa）を脱イオン水に溶解し（2 mg/ml）、Sephadex  PD10TMカラムを使用して脱塩した。目的のフラクション（ニンヒドリン検出）を集め、1：1  水：アセトニトリル（＋0.5％ギ酸）で6分の1に希釈した。検体をシリンジポンプで導入してMicroMass  LCTTMで分析した。
【０２０６】
c）PLL-HBr（〜24 kDa）を脱イオン水に溶解し（50 mg, 10 mg/ml）、DispoDialyserTM（2 kDa MWCO）を使用して水に対して透析した。得られた溶液を凍結乾燥した。脱塩した検体を脱イオン水に溶解し（2 mg/ml）、1：1  水：アセトニトリル（＋0.5％ギ酸）で6分の1に希釈した。検体をシリンジポンプで導入してMicroMass  LCTTMで分析した。
【０２０７】
2.4.2  ポリ-L-リシンのマンノース修飾−500：1
【化４３】
2004525171.tif 000065
マンノース-IME試薬（266 mg, 0.66 mmol）の乾燥メタノール（60 ml）を窒素雰囲気下メタノール性ナトリウムメトキシド（4.5 ml, 0.1 M）と24時間攪拌した。減圧下溶媒を除去した。
【０２０８】
臭化水素酸  ポリ-L-リシン（50 mg, MW〜24 kDa）を四ホウ酸ナトリウム溶液（5 ml, 0.25 M, pH 8.5）に溶解し、前段階の残留物に加え、室温で36時間攪拌した。オフホワイト沈殿を生じるので、さらに四ホウ酸ナトリウム溶液（75 ml, 0.25 M, pH 8.5）を加えて溶解させ、透析を行なった。
【０２０９】
次いでSpectraPor  Cellulose  EsterTM透析チューブ（12-14 kDa MWCO）を使用して24時間水に対してこの溶液の透析を行ない、次いで凍結乾燥により白色粉末を得た。
【０２１０】
2.4.3  ポリ-L-リシンのマンノース修飾−100：1
【化４４】
2004525171.tif 000066
マンノース-IME試薬（53 mg, 0.13 mmol）の乾燥メタノール（60 ml）を窒素雰囲気下メタノール性ナトリウムメトキシド（4.5 ml, 0.1 M）と24時間攪拌した。減圧下溶媒を除去した。
【０２１１】
臭化水素酸  ポリ-L-リシン（50 mg, MW〜24 kDa）を四ホウ酸ナトリウム溶液（5 ml, 0.25 M, pH 8.5）に溶解し、前段階の残留物に加え、室温で24時間攪拌した。
【０２１２】
次いでSpectraPor  DispoDialyserTM（12-14 kDa MWCO）を使用して24時間水に対してこの溶液の透析を行ない、次いで凍結乾燥により白色粉末を得た。
【０２１３】
2.4.4  ポリ-L-リシンのマンノース修飾のNMR分析
2.4.1及び2.4.2の実験の生成物をプロトンNMRを使用して分析した。各検体20 mgを0.7 mlの重水に溶解し、250  MHzでスペクトルを記録した。比較として、非修飾ポリ-L-リシンを修飾検体と同様に調製して、スペクトルを記録した。
【０２１４】
2.4.5  ポリ-L-リシン検体のSDS  PAGE
ゲル電気泳動用に標準的方法で調製したポリ-L-リシン検体を10％SDS  PAGEシステムに適用した。
染色後ゲル上には検体は検出されなかった。
【０２１５】
2.5  インビボ試験−ガンマ写真画像
多数の放射標識構築（下記参照）をニュージーランド白色ウサギ（約1 kg）に投与し、ガンマシンチグラフィーを使用して生体内分布を検討した。
【表６】
2004525171.tif 000067
a‐アシアロフェツイン(100 mg/kg)
b‐マンノシル化ポリリシン（100 mg/kg)
表3：投与方法の要約
【０２１６】
1.動物はHypnormで麻酔した（筋肉内または皮下）。
2.必要があれば、ブロッカー（100 mg/kg）をタンパク投与の10分前に静脈内投与した。
3.123I-標識xxiiタンパク（2.5 mg/kgの1 mlかそれ以下のPBS溶液）を静脈内に投与した。静脈内投与合計最大液量は2.0 ml/kgであった。
4.ガンマカメラを時間（投与後0, 10, 30, 60, 90及び120分）の間薬物の分布を写すために使用した。
5.血液検体を耳静脈から採取した（投与後10，30，60及び120分）。検体量はLASAガイドラインに従った（最大4 ml/kg）。
6．試験の最後に、動物を殺処理し、全身薄切及び器官分析により薬物分布を調べた。
【０２１７】
タンパク構築（N-WT，N-WT→GalIME，N-WT→ManIME，N-WT→dGalIME）をIODO-GEN技術（チロシン環のオルトの位置に求電子的付加を行なうことができるIODO-GEN試薬によりNa123Iの溶液からヨードニウムイオンを発生させる）を使用して123Iで標識した。123Iはガンマシンチグラフィーを使用して検出するのに適したエネルギーレベルを有するガンマ線原である。この技術によりある時間（2時間）の間タンパク構築の生体内分布を評価することができる。さらに、標準的薄切/器官分布試験はガンマシンチグラフィーのデータを補うために使用された。
【０２１８】
3種の修飾構築を2試験にそれぞれ投与した−特殊な取り込み機構のブロッカーの存在下及び非存在下において。ガラクトシル化構築はアシアロフェツイン(AF)、アシアログリコタンパク受容体（ASGPR）の既知阻害薬、により阻害され、そしてマンノシル化構築はマンノシル化ポリリシンにより阻害され、両者ともに構築の用量の約40倍高い用量において阻害された。
【０２１９】
図13により、アシアロフェツインによるガラクトシル化検体の取り込み阻害の効果を目で見て確認することができる。この阻害薬を大過剰に使用することにより、この阻害薬が存在する時に肝細胞の受容体依存性エンドサイトーシス（RME）の欠如による肝臓内（及びしたがって肝細胞内）の活性の変化を見ることができる。
【０２２０】
各肝細胞はその表面に約500,000 ASGPRを有しており、したがって大過剰の阻害薬が動物に導入されたとしても、その阻害能力は結局は減弱する。（RMEは能動的過程であり、細胞はAFを取り込み、長時間に亘って特別な受容体を単純に阻害はしない）。AFの溶解度の限界及び動物に投与できる最大容量のために、この阻害作用の持続時間は限定されていることを理解する必要がある。これは肝臓における標準活性測定における経時曲線から導かれる。
【０２２１】
我々はまた2時間の試験期間の経時的推移を見ることができる（図14及び15）。最初は、前投与したAFが存在しそしてガラクトシル化検体のRMEを阻害しているので、AFの存在下と非存在下の間に著しい差が認められる。循環によりAFが除去されそしてその影響が明確で無くなる試験の経過（2時間）に従ってその差は減少する。
【０２２２】
活性は多くの因子により減少する：
1．最初は、認められる一部の活性は構築が血液中に入り循環することによる。
2．構築の一部は肝臓に達して、代謝される。
3．ガンマカメラ画像は2時間後に膀胱中に大量の構築の存在を示す。これは大過剰の用量が投与されたためである。RMEを介する構築の選択的取り込みの生体能力に影響し、そのため腎から排泄されて膀胱に存在する。また肝臓における−多分構築を排泄するクッパー細胞への非選択的取り込みにも影響している。
【０２２３】
しかし重要な知見は、阻害薬の存在/非存在による輸送の相違が観察されたことであり、さらに明らかな活性が2時間後に残存していることである。
【０２２４】
2.7  インビトロ試験−ミクロオートラジオグラフィー及び共焦点顕微鏡
A.  結果/考察
2.7.1  Tissue Tek OCTTMの蛍光評価
Tissue Tek OCTは固定凍結組織検体用に設計された特許製品である。液は後に操作することができる検体を迅速に固定することができる、例えばクリオッスタットミクロトームで薄切を作製し、その後の試験に使用する。Tissue Tek OCT固定化検体から調製した薄切を使用してプロドラッグ活性化を評価するための蛍光を使用するために、Tissue Tek OCTがこれらの試験を妨害しないことを確認しておくことが必須である。Tissue Tek OCTの薄層を二枚の顕微鏡スライドグラスの間にサンドイッチして、365 nmで励起して蛍光を測定した。蛍光は認められなかった。
さらに、共焦点顕微鏡（後記参照）で観察した時、ラムノピラノシド蛍光団を加える以前に検体中に残余蛍光が観察された。この段階で検出される蛍光は検体自体によるものであった−多くの組織は低レベルの内在性蛍光を有している。
【０２２５】
2.7.2  3H-標識
タンパクをトリチウム化するためにN-コハク酸イミジル-[2,3-3H]プロピオン酸を使用することは充分に確立された方法であるxxiii。トリチウムは他のアイソトープに比較して高解像度の画像を提供する放射エネルギーを持つために、このミクロオートラジオグラフィーのために選択したアイソトープである。標識はトルエン溶液として供給されるが、（トルエンを減圧下に除去して）pH 8.0の水溶液で使用される。リシン残基のプロピオン酸化はpH範囲3-8で行なうことができることが文献に記載されているxxiii。さらに、チロシン残基はpH 8でプロピオン酸化することができ、ナリンギナーゼ構築はリシン残基を介してグリコシル化されているので、チロシン残基の標識を促進するためにアルカリ性のpH 8.0を選んだ。pH値が高いとタンパクの標識化が生じる前にN-コハクサンイミジル-[2,3-3H]プロピオン酸の加水分解を生じてしまうことに留意すべきである。標識時間を24時間まで延長することは可能である、しかしタンパク安定性のために反応時間を2時間とした。
【０２２６】
2.7.3  インビトロ分布試験
ミクロオートラジオグラフィーは生体内の薬物の細胞局在を調べるためにしばしば使用される技術である。ここに記述した方法はこのプロジェクトの以前のインビボ試験に基づいている。タンパクを2 mg/kgの用量で雄ウイスターラットに、100 mg/kgで投与した阻害薬の存在下及び非存在下に投与した。ガラクトース修飾構築に対する阻害薬はアシアロフェツイン、アシアログリコタンパク受容体の既知リガンド、及びマンノース修飾構築に対する阻害薬はPLL-Manであった。投与20分後に動物を殺処理し、肝臓及び腎臓を摘出した。肝臓検体は2種類の処理を行なった。第一に、各葉から2枚の3 mm薄切を作り、コルクリング上にTissue Tek OCTTM中固定し、共焦点顕微鏡試験のために溶媒浴中‐40℃で凍結した。第二に、残りの肝臓及び腎臓をミクロオートラジオグラフィー試験用の処理のために緩衝ホルマリン中に別々に保存した。
【０２２７】
2.7.4  ミクロオートラジオグラフィー用の検体処理
緩衝ホルマリン中に保存した肝臓及び腎臓検体をミクロオオートラジオグラフィー用にワックスに包埋した。この処理はTissue Tek VIPTM装置を使用して行なった。セットするとワックスブロックは分析用に4μmの厚さの切片が切り出された。これらの薄切はミクロトームにより行われ、Vectabondをコートした顕微鏡スライドに乗せた。一度乾燥し、これらのスライドを更に操作するための材料とした。オートラジオグラフィーのためにワックスを除去する必要があり、これはスライドをキシレン浴に浸すことにより行い、そしてIMS→水グラジエントの浴により有機溶媒を水に置換した。このスライドをIlford核エマルジョンに浸し、暗所に保存後処理した。
【０２２８】
2.7.5  共焦点顕微鏡
蛍光プロドラッグ類似体を肝臓におけるナリンギナーゼによるプロドラッグの活性化を検出するために使用した。これにより肝臓に局在するナリンギナーゼ検体の活性及び構築局在の評価を行なうことができる。将来プロドラッグと共に使用される蛍光プローブはラムノピラノシドであるので、哺乳動物酵素はプローブまたはプロドラッグを切断することはできない。したがってこのシステムにおいてプロドラッグ類似体を加えた後に観察される蛍光はすべて輸送された構築（ナリンギナーゼ）により活性化されたためであるはずである。
【０２２９】
検体はクリオスタットミクロトームにおいてTissue Tek OCT-固定肝臓検体の7ミクロン薄切により調製した。この薄切を顕微鏡スライドに載せ、そして共焦点顕微鏡に適合させたチャンバーに入れた。生理的条件に近似するように調整した緩衝液を検体上に積層し、そして顕微鏡の焦点を検体表面に合わせた。表面の走査画像及び蛍光画像を記録した−この段階では明瞭な蛍光は認められなかった。4-メチルウンベリフェリル  α-L-ラムノピラノシド（50μl, 2.0 mM）をチャンバーに加え、蛍光検出を継続した。N-DG→dGalIME（今日までに評価した唯一の検体）の場合には、蛍光が検出され、肝臓検体の肝細胞中に局在する構築によりプロドラッグ類似体の活性化によるものであった。
【０２３０】
結果を図18に示す。図18aはN-DG→dGalIME投与動物の肝臓から得た切片の画像を示す。図18bは4-メチルウンベリフェリル  α-L-ラムノピラノシドを使用した蛍光画像条件における同じ位置の切片を示す。
【０２３１】
B: 方法
2.7.1  Tissue Tek OCTTMの蛍光の評価
Tissue Tek OCTを2枚の顕微鏡スライドの間に挟み、蛍光分光光度計に入れ、365 nmで励起し、375-700 nmでの発光を記録した。対照として、同じ条件でTissue Tek OCTのない2枚のスライドについても行なった。蛍光は検出されなかった。
【０２３２】
2.7.2  3H-標識
【化４５】
2004525171.tif 000068
3H-NSP（4.30 mCi, 94.0 Ci/mmol, APBiotech TRK556TM, Batch 97, 1 mCi=37 MBq）がトルエン溶液で供給され、トルエンを減圧下に除去し、残留する白色固体をナトリウム四ホウ酸溶液（6.3 ml, 0.1 M, pH 8.0）に溶解した。この溶液を下記表に記述するようにタンパクのナトリウム四ホウ酸溶液に加えた。2時間の反応の後、タンパクをSephadex G25 PD10TMを使用するサイズ排除クロマトグラフィーにより精製し、リン酸‐緩衝食塩液で溶出した。放射活性はシンチレーションカウンターを使用して測定した。
【表７】
2004525171.tif 000069
【０２３３】
2.7.3  インビボ分布試験
1.雄ウイスターラット（約250 g）の体重を測定し、識別のために尾にマークした（用量当たり2動物）。
2.尾静脈を拡張させるためにラットを使用前約15分間38℃の温室に入れた。
3.動物は尾静脈に入れた固定針を介して2 ml Hypnorm(フェンタニール/フルアニソン)＋2 ml Hypnovel(ミダゾラム)＋10 ml注射用水の溶液を使用して麻酔した。0.2 mlの麻酔薬を導入のために投与し、試験中麻酔を維持するために必要な補充用量として0.1 mlを投与した。ラットは腹側を上にした位置で加温テーブルまたはマット上で体温（36-40℃）を維持した。ラットの首の正中線に切開をいれ、次いで経時的に採血できるように頚動脈にカニュレーションをした。ヘパリンの0.9％食塩液溶液0.25 mg/mlを頚動脈カニューレに点滴してサンプリングの間の凝固形成を防いだ。
4.必要な時には、阻害薬（100 mg/kg、PBS溶液として）をタンパク投与の10分前に尾静脈を介して静脈内投与した。（下記表に投与の内容を示す）
5.3H-標識タンパク（2mg/kg,  1 mlまたはそれ以下のPBSに溶解して）を静脈内に投与した。合計最大静脈内容量（被検物質及び麻酔薬）は、LASAガイドラインに従い、5.0 ml/kgであった。
6.血液検体を表在静脈または既に入れたカニューレ（可能であれば）から採取し、血中薬物の濃度‐時間推移（投与後0，1，5，10，15及び20分）を作製した。合計最大採血容量は6.5 ml/kg(全血の10％に相当)であった。
7．試験の終了時に、動物に過量（Euthatal）投与により殺処理し、さらに分析するために肝臓及び腎臓を摘出した。各動物の肝臓から2個の2 mm切片を採取し、コルクディスク上でTissue Tek OCT中で凍結し、残部を緩衝ホルマリン中で保存した。
【表８】
2004525171.tif 000070
【表９】
2004525171.tif 000071
【０２３４】
2.7.4  ミクロオートラジオグラフィー用の検体操作
2個の3 mm切片を各動物の肝臓及び腎臓から採取し、処理カセットに入れた。標準的な洗浄/ワックス処理のためにこのカセットをTissue Tek VIPTM装置に付し、次いでワックスの中に懸垂し、冷却した。検体組織が出るまでミクロトームでワックスブロックの表面を10ミクロンの厚さに薄切し、次いで4ミクロンの厚さに薄切し、VectabondTMをコートした顕微鏡スライドの表面に置いた（組織検体当たり10枚のスライドを作成した）。37℃のオーブンで終夜乾燥した後、残余ワックスをキシレン及びIMS→水グラジエントタンクに浸すことにより除去した。このスライドをIlford核エマルジョン（粒子径の範囲）でコートし、乾燥して暗所に保存した。
【０２３５】
2.7.5  共焦点顕微鏡
Tissue Tek OCTTM中に保存した組織検体を共焦点顕微鏡用にクリオスタットで7ミクロンの厚さの薄切にし、顕微鏡カバークラスに載せた。このカバーグラスを共焦点顕微鏡セルに入れ、生理的緩衝液（500μl，145 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CcaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mMグルコース，pH 7.4）に浸した。一度切片上に顕微鏡の焦点を合わせ、8秒毎に画像を記録した（アルゴンレーザー−360 nm励起、405±40 nm発光）、そして4−メチルウンベリフェリル  α-L-ラムノピラノシド（50μl，2 mM）を加えた。更に2分間蛍光が検出された。基質検体及び緩衝液を対照反応として画像を記録した。
【０２３６】
2.8  安定性試験
A:結果及び考察
2.8.1  トリトソーム精製
ラット肝臓トリトソーム標品は既知方法に従って調製した。この標品は肝細胞に輸送された構築の安定性を評価するために有用である。ガラクトシル化構築はアシアログリコタンパク受容体のエンドサイトーシス作用により細胞中のエンドソームに能動的に取込まれる。このエンドソームは肝細胞中のリソソームと融合し、そこでリソソーム酵素と接触するであろう。これらの酵素は体内に存在して、外来性物質及び老廃物を分解しており、中でもプロテアーゼ及びグリコシダーゼを含有している。輸送されるプロドラッグに作用するためには肝細胞に輸送された構築はこれらの分解機構の中で生き残ることが必須である。構築の修飾に使用されたグリコシル化過程がこれらの酵素に対して構築を実際に安定化することが望まれる。
【０２３７】
2.8.2  トリトソーム標品のタンパク含量の評価
ビシンコニン酸法をトリトソーム標品のタンパク含量（したがって酵素含量）の測定のために使用した。既知濃度のBSAに対して補正し、標品は0.18 mg/mlの濃度でタンパクを含有することを示した。
【０２３８】
2.8.4  トリトソーム活性の評価
2.8.5  トリトソーム検定条件におけるpNPの吸光係数の測定
ｐ-ニトロフェノールの吸光係数は条件、特にそれが測定されるpHにより変化する。以前の検定ではpH 7.0においてp-ニトロフェノールを測定したので、トリトソーム安定性試験を行なう条件における吸光係数を測定する必要があった。p-ニトロフェノールのDMSO溶液を調製し、Triton X100, EDTA及びGSHを添加したpH 5.5クエン酸-リン酸緩衝液で希釈して濃度勾配を作った。この条件下におけるp-ニトロフェノールの吸光係数は511.2  M-1cm-1であった（図16）。
【０２３９】
2.8.6  pNP-α-L-Rhaのトリトソーム安定性の評価(a)
LEAPT考案の本質はラムノシドでキャップしたプロドラッグは選択的に輸送されたナリンギナーゼ構築によってのみ切断されるという点にある。これが可能であることを確認するために、リソソーム性トリトソーム標品を肝細胞における酵素によるα-L-ラムノピラノシドの切断可能性を評価した。p-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシドを発色性プロドラッグ類似体として使用した。α-L-ラムノピラノシド結合を切断できる酵素が肝細胞中に存在するならば、p-ニトロフェノールの生成により検出されるであろう。2.2.4において使用した条件に基く検定条件をプロテアーゼ基質の代わりにpNP-α-L-Rhaを使用して再構成された。混合物を37℃でインキュベートして、5分毎に410 nmにおける吸光度を記録した。30分後活性は検出されなかったので高濃度のpNP-α-L-Rhaを使用する新規試験（2.8.7）が計画された。
【０２４０】
2.8.7   pNP-α-L-Rhaのトリトソーム安定性の評価(b)
pNP-α-L-Rhaの濃度を10倍に増加して、ラムノピラノシドのトリトソーム安定性を再度評価した。30分後p-ニトロフェノールの生成はなかったので、37℃に20時間置いた。20時間後、410 nmにおける吸光度のレベルの上昇はなかったので、我々はα-L-ラムノピラシドは肝臓リソソーム中で安定であると結論した。
【０２４１】
2.8.8  pNP-β-D-Galのトリトソーム安定性の評価
トリトソーム標品中に存在するグリコシド酵素の評価がプロドラッグの設計のために必要であった。2.8.7と同じ検定をβ-D-ガラクトピラノシド活性を評価するために使用した。30分後410 nmにおける吸光度の若干の増加が検出されたので、混合物を20時間37℃に置いた。その後かなりの量のp-ニトロフェノールが放出され、β-D-ガラクトピラノシド活性を示した。
【０２４２】
2.8.9  pNP-β-D-Glcのトリトソーム安定性の評価
トリトソーム標品中に存在するグリコシド酵素の評価がプロドラッグの設計のために必要であった。2.3.7と同じ検定をβ-D-グルコピラノシド活性を評価するために使用した。30分後410 nmにおける吸光度の若干の増加が検出されたので、混合物を20時間37℃に置いた。その後かなりの量のp-ニトロフェノールが放出され、β-D-グルコピラノシド活性を示した。
【０２４３】
2.8.10  pH 5.5クエン酸‐リン酸緩衝液中のpNPの吸光係数の測定
ｐ-ニトロフェノールの吸光係数は条件、特にそれが測定されるpHにより変化する。以前の検定ではpH 7.0においてp-ニトロフェノールを測定したので、長時間の構築安定性試験を行なう条件における吸光係数を測定する必要があった。p-ニトロフェノールの保存溶液（0.2 M）をクエン酸-リン酸緩衝液（0.2 M, pH 5.5）で希釈して濃度段階を作り、マルチウエルプレート（200μl）中37℃でインキュベートした。405 nmにおける吸光度を測定し、吸光係数は521.1  M-1cm-1と計算された。
【０２４４】
2.8.11   pH 5.5クエン酸‐リン酸緩衝液中のN-WTの標準的酵素反応速度の測定
N-WTの標準的酵素検定を、緩衝液をpH 5.5  0.2 Mクエン酸‐リン酸緩衝液に変え、Triton X100（リソソーム脂質コンパートメントを破壊するための界面活性剤として）の存在下及び非存在下の条件において、行なった。
【表１０】
2004525171.tif 000072
これらの結果は、酸性条件によるkcatの若干の減少があったが、N-WTに関する以前の検定とほぼ同じであった。
【０２４５】
2.8.12  N-WTのトリトソーム安定性の評価
N-WTをトリトソーム標品とインキュベートして肝臓リソソームにおける安定性を評価した。所定の時間毎に（48時間）少量の液をとり、pH 5.5においてpNP-α-L-Rhaを使用して標準的検定を行なった。図17の下部は経時的に速度パラメーターの変化は殆どないことを示しており、これはナリンギナーゼがLEAPTに使用するために良い候補であることを示している。
【０２４６】
B:  方法
2.8.1  トリトソーム精製
ラットトリトソームを標準的方法xxivにより調製した。
【０２４７】
2.8.2  トリトソーム標品のタンパク含量の評価
トリトソーム標品のタンパク含量はビシンコニン酸検定xxvを使用して測定した。BSA補正によりトリトソーム標品のタンパク濃度は0.18 mg/mlと決定することができた。
【０２４８】
2.8.3  保存溶液中の結合Napの評価
保存溶液（1.5 ml, pH 5.5クエン酸リン酸緩衝液＋0.2％ Triton X100及び50 mM還元グルタチオン及び10 mM EDTA）及びDMSO（5μl）をキュベット中で混合し、315 nmにおける分光光度計のブランクに使用した。別のキュベットに入れた保存溶液（1.5 ml）にBzPheValArgNapのDMSO溶液（5μl、7.0 mg/ml, 1.09×10-5 mol/ml）を加え、そして315 nmにおける吸光度を測定した。
【０２４９】
2.8.4  トリトソーム活性の評価
保存溶液（pH 5.5クエン酸リン酸緩衝液＋0.2% Triton X100及び50 mM還元グルタチオン（GSH）及び10 mM EDTA）を調製し、EDTA（10 mM）及び還元グルタチオン（50 mM）溶液の原液として使用した。3本のキュベット（1本はブランク、2本は検定用、下記表に示すように）を使用して、37℃のインキュベーションチャンバー中410 nmの吸光度（基質溶液はBzPheValArgNapのDMSO溶液7.0 mg/ml, 1.09×10-5 mol/ml）を測定してトリトソーム活性を評価した。
a)キュベットの内容
【表１１】
2004525171.tif 000073
b)分光光度計の測定値
【表１２】
2004525171.tif 000074
【０２５０】
2.8.5  トリトソーム検定条件におけるpNPの吸光係数の測定
p-ニトロフェノールのDMSO保存溶液（120 mM, 16.69 mg/ml）を調製し、下記に示す濃度段階を作製した。37℃でインキュベートして410 nmにおける吸光度を測定した。
a)キュベットの内容
【表１３】
2004525171.tif 000075
b)
【表１４】
2004525171.tif 000076
【０２５１】
2.8.6  pNP-α-L-Rhaのトリトソーム安定性の評価(a)
p-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラシドのDMSO溶液（3.1 mg/ml, BzPheValArgNap溶液に相当）の保存溶液を2.8.4と同じ検定に使用した。
a)キュベットの内容
【表１５】
2004525171.tif 000077
b)吸光度計の測定値
【表１６】
2004525171.tif 000078
【０２５２】
2.8.7   pNP-α-L-Rhaのトリトソーム安定性の評価(b)
前の検定ではα-L-ラムノピラノシドに対する活性が検出できなかったので、その他は同じ検定条件において高濃度のpNPαL-RhaのDMSO溶液（31.0 mg/ml）を使用した。さらに、キュベットを37℃において20時間インキュベートして吸光度を繰り返し測定した。
a)キュベットの内容
【表１７】
2004525171.tif 000079
b)吸光度計の測定値
【表１８】
2004525171.tif 000080
【０２５３】
2.8.8  pNP-β-D-Galのトリトソーム安定性の評価
p-ニトロフェニル  β-D-ガラクトピラノシドのDMSO保存溶液（31.0 mg/ml）を2.8.7と同じ検定に使用した。さらに、キュベットを37℃で20時間インキュベートして吸光度を繰り返し測定した。
a)キュベットの内容
【表１９】
2004525171.tif 000081
b)吸光度計の測定値
【表２０】
2004525171.tif 000082
【０２５４】
2.8.9   pNP-β-D-Glcのトリトソーム安定性の評価
p-ニトロフェニル  β-D-グルコピラノシドのDMSO保存溶液（31.0 mg/ml）を2.8.7と同じ検定に使用した。さらに、キュベットを37℃で20時間インキュベートして吸光度を繰り返し測定した。
a)キュベットの内容
【表２１】
2004525171.tif 000083
b)吸光度計の測定値
【表２２】
2004525171.tif 000084
【０２５５】
2.8.10  pH 5.5クエン酸-リン酸緩衝液におけるpNPの吸光係数の測定
p-ニトロフェノールのクエン酸-リン酸緩衝液の保存溶液（0.2 M, pH 5.5）を系統希釈し（0.2, 0.1, 0.075, 0.05, 0.025, 0.01, 0.005, 0.0 mM）、そしてマルチウエルプレート上（200μl）37℃でインキュベートした。405 nmにおける吸光度をパスチェックありとなしで測定した。
【０２５６】
2.8.11  pH 5.5クエン酸-リン酸緩衝液中におけるN-WTの標準的酵素反応速度の測定
p-ニトロフェニル  α-L-ラムノピラノシド（3.5 mM）のクエン酸-リン酸緩衝液（0.2 M, pH 5.5,0.2％Triton X100の添加及び非添加）の溶液を調製し、系統希釈段階に希釈した（3.5, 3.0, 2.5, 2.0, 1.5, 1.0, 0.5, 0.25 mM）。N-WT（5mg/ml）のクエン酸-リン酸緩衝液（0.2 M, pH 5.5）の溶液を調製した。基質溶液190μl及び酵素溶液10μlを37℃で5＋1秒振とうしてキンキュベートし、6秒毎に5分間405 nmにおける吸光度を測定した。
【０２５７】
2.8.12  N-WTのトリトソーム安定性の評価
N-WT（5 mg）をクエン酸リン酸緩衝液（680μl, 0.2 M, pH 5.5 +1 mM EDTA及び5 mM GSH）に溶解し、Triton X100溶液（20μl，10％）と混合した。トリトソーム標品（300μl）を37℃で5分間インキュベートし、N-WT溶液に加えた。一部の液（50μl）を取り（0, 10, 20, 30, 45, 60, 90分，2, 3, 4, 6, 12, 24, 48時間）、そしてクエン酸リン酸緩衝液で500μlに希釈して、標準的速度検定を行なった。
〔引用文献〕
2004525171.tif 000085
2004525171.tif 000086
【図面の簡単な説明】
【０２５８】
【図１】凍結（レーン2）または凍結‐乾燥（レーン3）を行なった野生型ナリンギナーゼ（N-WT）の10％SDS-PAGE。左側のレーンは分子量マーカーを含有し、レーン1はいずれの処理もされていない（すなわち、凍結または凍結‐乾燥をされていない）N-WTの検体を含有する。
【図２】BioGelTMP-2精製カラムから得たN-WTのフラクション中のラムノシダーゼ活性及びグルコシダーゼ活性の280 nmにおける吸光度の比較。
【図３】BioGelTMP-100精製カラムから得たN-WTのフラクション中のラムノシダーゼ活性及びグルコシダーゼ活性の280 nmにおける吸光度の比較。
【図４】BioGelTMP-100精製カラムから得たN-WTのフラクションの10％SDS-PAGE。左側のレーンは分子量マーカーを含有する。
【図５】BioGelTMP-100精製カラムから得たN-WTのフラクション中のラムノシダーゼ活性及びグルコシダーゼ活性の280 nmにおける吸光度の比較。
【図６】Millipore Vantage-LTM精製カラムから得たN-WTのフラクション中のラムノシダーゼ活性及びグルコシダーゼ活性の280 nmにおける吸光度の比較。
【図７】DEAE SepharoseTM精製カラムから得たN-WTのフラクション中のラムノシダーゼ活性及びグルコシダーゼ活性の280 nmにおける吸光度の比較。
【図８】Sephadex  G25TM精製カラムから得たN-WTのフラクション中のラムノシダーゼ活性及びグルコシダーゼ活性の280 nmにおける吸光度の比較。
【図９】種々な型のN-WTの10％SDS-PAGE。レーン1‐分子量マーカーレーン2‐野生型ナリンギナーゼ（N-WT）レーン3‐N-WT-GalIMEレーン4‐N-WT-ManIMEレーン5‐脱グリコシル化ナリンギナーゼ（N-DG）レーン6‐N-DG-GalIMEレーン7‐空レーン8‐N-WTレーン9‐N-WT-dGalIME
【図１０】種々のpHにおけるN-WTの酵素活性。
【図１１】種々のpHにおけるN-DGの酵素活性。
【図１２】野生型及び種々の修飾型のナリンギナーゼの活性。
【図１３】GalIMEで修飾した放射標識野生型ナリンギナーゼ（N-WT□GalIME）を投与されたウサギの放射線画像、単独投与（上段）または阻害物質アシアロフェツイン (AF)を併用（下段）。
【図１４】N-WT□GalIMEの120分を超える肝臓残留、単独及び阻害物質アシアロフェツイン (AF)併用。
【図１５】N-WT□dGalIMEの120分を超える肝臓残留、単独及び阻害物質アシアロフェツイン (AF)併用。
【図１６】トリトソーム検定条件におけるp-ニトロフェノール（pNP）の吸光係数（ブランクは0）。
【図１７】N-WTトリトソーム安定性。
【図１８】パネル（a）はN-DG□dGalIMEを投与した動物の肝臓の位相差条件下の切片を示し、パネル（b）は蛍光を発生する物質による蛍光条件下における同じ切片の同じ位置を示す。
【図２】
2004525171.tif 000089
【図３】
2004525171.tif 000090
【図５】
2004525171.tif 000091
【図６】
2004525171.tif 000092
【図７】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
2004525171.tif 000096
【図１６】
2004525171.tif 000097
【図１７】
2004525171.tif 000098
【図１８ａ】
2004525171.tif 000099
【図１８ｂ】
2004525171.tif 000100
【国際公開パンフレット】
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2004525171.tif 000219
2004525171.tif 000220
2004525171.tif 000221
【国際調査報告】
2004525171.tif 000222
2004525171.tif 000223
2004525171.tif 000224
2004525171.tif 000225
2004525171.tif 000226