(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、集合性マングローブ植物から生物活性分子を抽出し、分画し、精製する方法、粗抽出物、その画分、及び精製化合物の薬理活性をスクリーニングする方法、並びに抗痙攣物質、抗不整脈物質、及び前記粗抽出物のクロロホルム画分の抗コリン剤としての使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物Salvadora persicaから生物学的に活性な抽出物を抽出し、精製する方法であって、
１）Salvadora persicaの植物部分を集めて、処理を施す工程と、
２）Salvadora persicaの前記植物部分から粗抽出物を調製する工程と、
３）薬理学の方法を用いて前記粗抽出物を検査する工程と、
４）前記粗抽出物を分画する工程と、
５）薬理学の方法を用いて前記画分を検査する工程と、
６）カラムクロマトグラフィーによって精製化合物を単離する工程と、
７）薬理学の方法を用いることによって前記精製化合物を検査する工程と、
８）分光法によって前記化合物を同定する工程と、
を備えた方法。
【請求項２】
前記Salvadora persicaの植物部分が、葉、幹、及び花から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
粗抽出物を調製する前記工程が、
（１）前記植物部分を風乾し、
（２）９０％のメタノール水の中に前記植物部分を室温（２８±２℃）で１週間浸漬し、
（３）慣用法により前記メタノール性抽出物を濾過し、
（４）室温（２８±２℃）にて、減圧下で、最少量になるまで前記メタノール性抽出物を蒸発させて粗抽出物を取得する、ことである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記粗抽出物が、石油エーテル、クロロホルム、ブタノール、及び水画分から選択される溶媒を用いて４つの分画に分割される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記クロロホルム画分が、抗コリン活性、抗痙攣活性、及び抗不整脈活性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記クロロホルム画分が、シリカゲルカラムを通された後、石油エーテル−酢酸エチル−クロロホルム−メタノールのグラジエント系を用いて溶出される請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）が、シリカゲル上で実行された請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＴＬＣが、ヨウ素の蒸気にプレートを曝露するか又は硫酸のメタノール液を噴霧することにより可視化された請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗コリン活性を示した前記画分をプールし、シリカゲルカラムを通して、同一の溶媒群で溶出される請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抽出物中のパルミチン酸メチルの方が高い抗コリン活性を示し、ベツリンが穏やかな抗コリン活性を示した請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
β−アミリン（非ステロイド性多環式トリテルペン）分子が、
分子式：Ｃ３０Ｈ５０Ｏ
分子量：４２６
融点  ：１６０℃
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ベツリン分子が、
分子式：Ｃ３０Ｈ５０Ｏ２
分子量：４４２
融点  ：２５５℃
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ウルソル酸（トリテルペン酸）分子が、
分子式：Ｃ３０Ｈ５０Ｏ３
分子量：４５６
融点  ：２９２℃
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
パルミチン酸メチル（脂肪族エステル）分子が、
分子式：Ｃ３０Ｈ５０Ｏ２
分子量：２５６
融点  ：３０℃
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ルペオール（非ステロイド性多環式トリテルペン）分子が、
分子式：Ｃ３０Ｈ５０Ｏ
分子量：４２６
融点  ：２１５℃
を特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
抗コリン活性、抗痙攣活性、及び抗不整脈活性を示す薬学的組成物であって、前記植物Salvadora persicaから得られた前記抽出物の前記クロロホルム画分を含み、必要に応じて慣用的な添加物を加えた組成物。
【請求項２１】
前記添加物が、治療的に許容される添加物から選択される請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記抽出物が、β−アミリン、ベツリン、ウルソル酸、パルミチン酸メチル、及びルペオールから選択される化合物を含有する請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物中の抽出物の量が、１０μｇｍである請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抽出物の用量が、３μｇ／ｍＬ乃至１０μｇ／ｍＬである請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
不整脈の治療法であって、必要に応じて慣用的な添加物とともに、植物Salvadora persicaから得られた治療的有効量の抽出物を不整脈の患者に投与する工程を備えた方法。
【請求項２６】
前記植物Salvadora persicaから得られた前記抽出物が、クロロホルム画分である請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
３乃至１０μｇ／ｍＬ量の前記抽出物が、前記患者に１０分間投与される請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記患者が、ヒト又は動物である請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
筋肉の痙攣等の痙攣症状を治療する方法であって、必要に応じて慣用的な添加物とともに、植物Salvadora persicaから得られた治療的有効量の抽出物を、これを必要とする患者に投与する工程を備えた方法。
【請求項３０】
前記植物Salvadora persicaから得られた前記抽出物が、植物Salvadora persicaの前記粗抽出物のクロロホルム画分である請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
３乃至１０μｇ／ｍＬ量の前記抽出物が、前記患者に１０分間投与される請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記患者が、ヒト又は動物である請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
気管支喘息等のコリン性症状を治療する方法であって、必要に応じて慣用的な添加物とともに、植物Salvadora persicaから得られた治療的有効量の抽出物を、これを必要とする患者に投与する工程を備えた方法。
【請求項３４】
前記植物Salvadora persicaから得られた前記抽出物が、前記粗抽出物のクロロホルム画分である請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
３乃至１０μｇ／ｍＬ量の前記抽出物が、前記患者に１０分間投与される請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記患者が、ヒト又は動物である請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Salvadora persica  Ｌｉｎｎｅａｕｓ  １７５３という植物から得られる抽出物の生物学的に活性なクロロホルム画分に関する。本発明は、粗抽出物を得る方法、及び前記クロロホルム画分を得る方法も提供する。さらに、本発明は、生物活性を示す薬学的組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
集合性マングローブ植物Salvadora persica  Ｌｉｎｎｅａｕｓ  １７５３は、Ｓａｌｖａｄｏｒａｃｅａ目に属し、インド西海岸全域の朽ちたマングローブの湿地や塩分を含む浅瀬に多く見られる白い花の潅木又は低木である。これまで、数多くの海生植物の生物活性物質が調査されてきた。Ｎａｚａｒｉｎｅ、Ｆ；Ａｎｉｔａ  Ｆ；Ｒａｔａｂｏｌｉ、Ｐ．Ｖ．；Ｄｉｎｉｚ  Ｄ’Ｓｏｕｚａ、Ｒ．Ｓ、及びＤｈｕｍｅ、Ｖ．Ｇ．、１９９８は、「Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍａｒｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２７：４９９−５０１」の中で、インドの海域で得た海洋生物中に有望な薬理活性を報告している。
【０００３】
様々な用途の天然化合物や方法に関連する特許が世界中で幾つか取得されている。Ｋｗａｋ、Ｗｉｅ−ｊｏｎｇ、Ｈａｎ、Ｃｈａｎｇ−ｋｙｕｎ、Ｋｕｍ、Ｈｗａｎ−ｓｕ、Ａｎ、Ｊａｅ−ｓｕｋ、Ｋｕｍ、Ｔａｅｋ−ｓｏｏは、薬用植物の混合物やそれらの抽出組成物から生物学的に有効な成分を抽出及び精製する方法に関して特許を付与された（米国特許第５，９１０，３０７号、１９９９年６月８日公開）。Ｄ’Ａｍｅｌｉｏ、Ｆｒａｎｋ  Ｓ、Ｍｉｒｈｏｍ、Ｙｏｕｓｓｅｆ  Ｗ．は、１９９８年９月８日に公開された、米国特許第５，８０４，２０６号の中で、Ｃｅｎｔｉｐｅｄａ  ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉという植物から得られる抽出物を用いて皮膚を治療する治療用組成物及び方法を開示した。Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｃ．、Ａｌｂｅｒ、Ｒａｎｄａｌｌ  Ｓ．、Ｔｏｄｄ、Ｊａｍｅｓ  Ｓ．、Ｃｒｅｗｓ、ｐｈｉｌｉｐは、Ｚｏｓｔｒｅａ  ｍａｒｉｎａというアマモのメタノール抽出物から、水中での顕著な付着防止特性を有する化合物を単離した（米国特許第５，６０７，７４１号、１９９７年３月４日公開）。
【０００４】
ベツリンという化合物から調製されるベツリン酸は、多くの薬学的な効能を有している。Ｐｅｚｚｕｔｏ  Ｊｏｈｎ  Ｍ、Ｋｉｍ、Ｄａｒｒｉｃｋ  Ｓ．Ｈ．Ｌ．は、ベツリンからベツリン酸を作製する方法を開示した（１９９８年９月８日に公開された米国特許第５，８０４，５７５号）。ベツリン酸は、様々な病気の治療剤の候補として熱心に研究されている。Ｐｅｚｚｕｔｏ、Ｊｏｈｎ  Ｍ、Ｄａｓ  Ｇｕｐｔａ、Ｔａｐａｓ  Ｋ、Ｓｃｈｍｉｄｔ、Ｍａｒｙ  Ｌｏｕ、Ｋｕｚｍａｎｏｆｆ、Ｋｏｎｒａｄ  Ｍａｒｃ、Ｌｉｎｇ  Ｉｎｄｅｃｋ、Ｌｙｄｉａ、及びＫｉｍ、Ｄａｒｒｉｃｋ、Ｓ．Ｈ．Ｌ．（１９９９年１０月５日付け米国特許第５，９６２，５２７号）。Ｐｉｓｈａ  Ｅ，Ｃｈａｉ  Ｈ、Ｌｅｅ  ＩＳ、Ｃｈａｇｗｅｄｅｒａ  ＴＥ、Ｆｒａｍｓｗｏｒｔｈ  ＮＲ、Ｃｏｒｄｅｌｌ  ＧＡ、Ｂｅｅｃｈｅｒ  ＣＷ、Ｆｏｎｇ  ＨＨ、Ｋｉｎｇｈｏｒｎ  ＡＤ、Ｂｒｏｗｎ  ＤＭは、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１、１０４６−１０５１頁（１９９５）の中で、ヒトの黒色腫（例えば、ＭＥＬ−１、ＭＥＬ−２、及びＭＥＬ−４）に対して、ベツリン酸が予期せぬ選択的な抗腫瘍活性を有することを開示している。さらに、Ｆｕｊｉｏｋａ、Ｔ、Ｋａｓｈｉｗａｄａ  Ｙ、Ｋｉｌｋｕｓｋｉｅ  ＲＥ、Ｃｏｓｅｎｔｉｎｏ  ＬＭ、Ｂａｌｌａｓ  ＬＭ、Ｊｉａｎｇ  ＪＢ，Ｊａｎｚｅｎ  ＷＰ、Ｃｈｅｎ  ＩＳ、Ｌｅｅ  ＫＩＬ、Ｊ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．，５７（２）２４３−２４７頁（１９９４）は、Ｈ９リンパ球細胞中でベツリン酸が抗ＨＩＶ活性を有することを開示している。これらの発明者らは、入手可能なベツリン酸の量が極めて限られており、しかも極めて高価なので、ｔ  ベツリン酸を治療剤として開発した研究者達にとって困難があったことを述べている。Ｒａｍａｄｏｓｓ、Ｓｕｎｄｅｒ、Ｊａｇｇｉ、Ｍａｎｕ、Ｓｉｄｄｉｑｕｉ、Ｍｏｈａｍｍａｄ  Ｊａｍｓｈｅｄ  Ａｈｍｅｄは、２０００年４月１１日に公開された米国特許第６，０４８，８４７号の中で、ベツリン酸とその誘導体を癌の増殖を阻害するために使用すること、及びこれをモニタリングする方法について記載している。Ｋａｎｇ、Ｒａｐｈａｅｌ  Ｋ．Ｌ．、Ｚｙｚａｋ、Ｌｉ  Ｌｉ、ｎａｋａｔｓｕ、Ｔｅｔｓｕｏは、１９９９年９月７日付けの米国特許第５，９４８，４６０号の中で、製品中の後味を弱め、製品の甘みを増強するために風味付製品（ダイエット飲料など）に加えられた三つの化合物群の一つがウルソル酸である風味付製品の添加物を公開した。これは、皮膚の腫瘍発生を阻害するための調製物の成分としても使用された。
【０００５】
Ｈｅｒｍａｎ，Ｓ（米国特許第５，１９０，９７９号、１９９３年３月２日に公開）は、医学的な価値を有する薬理学的に活性なテルペンオゾニド類を作製することができる化合物として、レペオールも開示した。
【発明の開示】
【発明の目的】
【０００６】
本発明の主たる目的は、Salvadora persica（マングローブの沼で広く入手できる潅木）の幹、葉、及び花から得た粗抽出物からクロロホルム画分を取得する方法、及びその生物活性を研究するためにスクリーニングする方法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、Salvadora persicaという植物から天然の化合物を単離し、それらの分子量、分子式、融点、及び構造式を明らかにすることであり、これらの化合物の化学合成に役立つものと思われる。
【０００８】
本発明のさらに別の目的は、粗抽出物のクロロホルム画分、その画分と精製化合物を薬理学的にスクリーニングし、粗抽出物及びクロロホルム画分によって示された画分が全体を通じて維持されていることをチェックすることに関する。
【０００９】
本発明の別の目的は、Salvadora persicaという植物から得た抽出物のクロロホルム画分を含有し、生物活性を示す薬学的組成物を提供することである。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、活性な粗抽出物の処理、その分画、活性な化合物を単離し、精製するための非常に効率的且つ選択的な手段を提供することによって、従来技術に存する欠点を克服することを目的とする。さらに、本発明は、Salvadora persicaという植物から得られる抽出物を含有する薬学的組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、インド西海岸のマングローブの沼地から広く入手可能な植物から得られる上述の産業的に重要なこれらの化合物全てを単離し、精製し、薬理学的にスクリーニングする方法を初めて開示する。Salvadora persicaという名称の前記植物は集合性のマングローブ植物である。Salvadora persicaは潅木と小枝であり、花の葉は手で摘み取ることができる。粗抽出物と画分でさえ、治療的な価値を有している。重要なことは、この抽出物によって示される生物活性は、パルミチン酸メチルやベツリン等の精製された化合物中でも維持されているということである。
【００１２】
本開示は、平滑筋弛緩薬、気管支喘息、腎疝痛、及び早産の予防等の疾病を治療するために、前記抽出物と画分をさらに臨床的に使用できる可能性を指し示している。さらに、本開示は、乗り物酔い、腹部の痙攣におけるパルミチン酸メチルとベツリンの使用に関する。
【００１３】
本発明は、Salvadora persica  Ｌｉｎｎｅａｕｓ  １７５３という名称の集合性マングローブ植物（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｎｇｒｏｖｅ  ｐｌａｎｔ）の生物学的に活性な粗抽出物を調製する方法を提供する。Salvadora persica  Ｌｉｎｎｅａｕｓ（Ｓａｌｖａｄｏｒａｃｅａｅ）は、インドの西海岸、西アジア全域の朽ちたマングローブの湿地や塩分を含む浅瀬に多く見られる白い花の潅木又は低木である。本発明において開示される方法は、さらに、前記植物の活性成分代謝物の抽出、分画、及び精製に関する。本発明は、β−アミリン（非ステロイド系の多環式トリテルペン）、ベツリン、ウルソル酸（トリテルペン酸）、パルミチン酸メチル（脂肪族エステル）、及びルペオール（非ステロイド系の多環式トリテルペン）等の化合物のスペクトルによる同定にも関する。本発明は、前記化合物の分子式、分子量、融点、及び構造式も取り扱う。本発明は、Salvadora persicaから得られる活性な粗抽出物の処理（ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）、その分画、活性な化合物を単離、精製するための非常に効率的且つ選択的な手段を提供する。本明細書において使用する分画（ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）という用語は、粗抽出物を分割することを意味する。単離と分画という用語は、画分を精製化合物に分割することを意味する。
【００１４】
本発明は、さらに、哺乳動物組織中での前記化合物の薬理活性をスクリーニングする方法に関する。本出願人は、Salvadora persicaという植物から取得した粗抽出物は、二つの画分、すなわち、クロロホルム画分と水画分に分けられることを発見した。クロロホルム画分は、抗痙攣活性、抗コリン活性、及び抗不整脈活性を示し、本発明は、これらについて詳述している。
【００１５】
本発明は、心房組織に対する抗不整脈活性の薬理学的スクリーニングに対して異なるアプローチを採っている。ペースメーカーを有する右心房ではなく、電気刺激を与えるために左心房を用いた。本方法には、実験の間、心房の生存が長くなるという利点が見出された。
【００１６】
従って、本発明は、集合性マングローブ植物から生物学的に有用な分子を抽出し、精製する方法であって、
１）Salvadora persicaの植物部分（ｐｌａｎｔ  ｐａｒｔ）を集め、処理を施す工程と、
２）Salvadora persicaの前記植物部分から粗抽出物を調製する工程と、
３）薬理学の方法を用いて前記粗抽出物を検査する工程と、
４）前記粗抽出物を分画する工程と、
５）薬理学の方法を用いて前記画分を検査する工程と、
６）カラムクロマトグラフィーによって精製化合物を単離する工程と、
７）薬理学の方法を用いることによって前記精製化合物を検査する工程と、
８）分光法によって前記化合物を同定する工程と、
を備えた方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の実施態様によれば、前記マングローブ植物Salvadora persicaのクロロホルム画分は、親粗抽出物として、不整脈、抗痙攣活性、抗コリン活性を示した。
【００１８】
本発明は、スペクトルのデータから分子を同定することも提供する。スペクトルのデータからは、五つの化合物の分子式が与えられる。本発明は、ＥＩＭＳから得た前記分子の分子量を提供する。スペクトルのデータから得られた、前記化合物の構造式も提供する。
【００１９】
このように、Salvadora persicaという植物から粗抽出物が得られた。粗抽出物の生物活性を検査し、薬理活性に関して有望であることが明らかとされ、石油エーテル、クロロホルム、ブタノール、水等の画分を得るために、徐々に極性が増加した溶媒を用いて分画を行った。これらの各々についても、薬理活性を検査した。
【００２０】
前記植物の抽出物から精製された五つの化合物は、β−アミリン（非ステロイド性多環式トリテルペン）、ベツリン、ウルソル酸（トリテルペン酸）、パルミチン酸メチル（脂肪族エステル）、及びルペオール（非ステロイド性多環式トリテルペン）であった。
【００２１】
β−アミリンは、以下に詳述されている非ステロイド性多環式トリテルペンであることが明らかとなった。
【００２２】
分子式：Ｃ３０Ｈ５０Ｏ
分子量：４２６
融点  ：１６０℃
発見された他の分子は、
分子式：Ｃ３０Ｈ５０Ｏ２
分子量：４４２
融点  ：２５５℃
のベツリンであった。
【００２３】
前記抽出物の中にはウルソル酸（トリテルペン酸）分子も見出された。ウルソル酸は、
分子式：Ｃ３０Ｈ４８Ｏ３
分子量：４５６
融点  ：２９２℃
を有していた。
【００２４】
前記抽出物中に見出されたパルミチン酸メチル（脂肪族エステル）は、
分子式：Ｃ１６Ｈ３２Ｏ２
分子量：２５６
融点  ：３０℃
を有していた。
【００２５】
前記抽出物中に見出されたルペオール（非ステロイド性多環式トリテルペン）は、
分子式：Ｃ３０Ｈ５０Ｏ
分子量：４２６
融点  ：２１５℃
を有していた。
【００２６】
化合物の一つベツリンは、ベツリン酸の製造に使用することができる（米国特許第５，８０４，５７５号、１９９８年９月８日に公開）。ベツリン酸は、様々な疾病の治療剤の候補として熱心に研究されている。
【００２７】
ウルソル酸は、製品中の後味を減らし、例えばダイエット飲料の甘みを増強させるために、風味付製品に添加される。ウルソル酸は、皮膚の腫瘍発生を阻害するための調製物の成分としても使用された。
【００２８】
植物の抽出物には、血管収縮及び鎮痛特性を示すものがあり、トリテルペノイドであるβ−アミリンも含有している。望ましくない皮膚色素沈着の形成を阻害するためのこれらの組成物は、化粧品中での安定性、顕著な細胞毒性効果の欠如、及び作用の相乗効果と、高いチロシナーゼ遮断能を併せ持つ（米国特許第５，７７３，０１４号、５，６７９，３９３号）。β−アミリンとルペオールは、医薬製剤中で、ジメチルステロールの成分として使用されている（米国特許第４，８０８，５７４号）。
【００２９】
パルミチン酸メチルは、２０００年４月に公開された米国特許第６，０４９，０１３号に記載されているアルコールの製造に使用される化合物である。ルペオールは、幾つかの治療用医薬、防虫剤、醸造所、抗腫瘍産業、化学産業の成分として使用することができる（米国特許第４，８０８，５７４号、５，９６２，５２７号、５，９０８，６２８号）。
【００３０】
このように、Salvadora persicaの抽出物は、上述した幾つかの化合物を含有していた。次いで、前記植物Salvadora persicaの抽出物のクロロホルム画分のモルモットに対する生物活性について検査した。本出願人らは、驚くべきことに、前記抽出物が、優れた抗コリン活性、抗不整脈活性、及び抗痙攣活性を示すことを見出した。従って、本発明は、喘息等の抗コリン症状の治療を阻害する組成物であって、Salvadora persicaから得られる抽出物のクロロホルム画分を含有し、必要に応じて慣用の添加物を加えた組成物を提供する。該組成物は、約１０μｇｍの前記抽出物を含有し得る。このように、前記植物、Salvadora persicaから得られる前記抽出物のクロロホルム画分は、抗コリン作用剤の候補である。前記組成物は、必要であれば、様々な物理的形状で処方することができる。前記抽出物は、そのまま使用してもよいし、必要であれば、慣用的な添加物、生理的に許容される担体、防腐剤、緩衝液等とともに使用してもよい。
【００３１】
さらに、本発明は、気管支喘息等の抗コリン症状を治療する方法であって、Salvadora persicaから得られる治療的有効量の抽出物を、これを必要とする患者に投与することを備えた方法を提供する。前記抽出物は、通常の成人の場合、５０μｇ／ｍＬ−２５０μｇ／ｍＬの範囲の投薬レベルで投与することができる。正確な投薬量は、治療すべき患者に応じて変動し、患者の要求、治療されている症状の重篤性、前記抽出物の活性等の要素に依存するであろう。ある患者に対する至適投薬量の決定は、当業者に周知である。
【００３２】
さらに、本出願人は、Salvadora persicaという植物から得られた抽出物のクロロホルム画分が抗痙攣活性を示すことを見出した。従って、本発明は、筋肉の痙攣等の痙攣症状の治療を阻害するための組成物Salvadora persicaから得られる前記抽出物のクロロホルムを含有し、必要に応じて慣用的な添加物を加えた組成物を提供する。該組成物は、約１０μｇｍの前記抽出物を含有し得る。このように、Salvadora persicaという植物から得られる抽出物のクロロホルム画分は、抗痙攣剤となる可能性がある。前記組成物は、必要であれば、様々な物理的形状で処方することができる。前記抽出物は、そのまま使用してもよいし、必要であれば、慣用的な添加物、生理的に許容される担体、防腐剤、緩衝液等とともに使用してもよい。
【００３３】
加えて、本発明は、気管支喘息等の痙攣性症状を治療する方法であって、Salvadora persicaから得られる治療的有効量の抽出物を、これを必要としている患者に投与することを備えた方法を提供する。前記抽出物は、通常の成人の場合、５０μｇ／ｍＬ−２５０μｇ／ｍＬの範囲の投薬レベルで投与することができる。正確な投薬量は、治療すべき患者に応じて変動し、患者の要求、治療されている症状の重篤性、前記抽出物の活性等の要素に依存するであろう。ある患者に対する至適投薬量の決定は、当業者に周知である。
【００３４】
さらに、本出願人は、Salvadora persicaという植物から得られた抽出物のクロロホルム画分が抗不整脈活性を示すことを見出した。従って、本発明は、心臓の不整脈の治療を阻害するための組成物であって、Salvadora persicaから得られる前記抽出物のクロロホルム画分を含有し、必要に応じて慣用的な添加物を加えた組成物を提供する。該組成物は、約１０μｇｍの前記抽出物を含有し得る。このように、Salvadora persicaという植物から得られる抽出物のクロロホルム画分は、抗不整脈剤の候補である。前記組成物は、必要であれば、様々な物理的形状で処方することができる。前記抽出物は、そのまま使用してもよいし、必要であれば、慣用的な添加物、生理的に許容される担体、防腐剤、緩衝液等とともに使用してもよい。
【００３５】
さらに、本発明は、心臓の不整脈を治療する方法であって、Salvadora persicaから得られる治療的有効量の抽出物を、これを必要とする患者に投与することを備えた方法を提供する。前記抽出物は、通常の成人の場合、３μｇ／ｍＬ−１０μｇ／ｍＬの範囲の投薬レベルで投与することができる。前記抽出物は、患者に１０分間投与される。正確な投薬量は、治療すべき患者に応じて変動し、患者の要求、治療されている症状の重篤性、前記抽出物の活性等の要素に依存するであろう。ある患者に対する至適投薬量の決定は、当業者に周知である。
【００３６】
以下の実施例によって、本発明を詳細に記載し、説明を加えるが、以下の実施例は、本明細書に具体化された発明の思想を限定するものと解釈してはならない。
【実施例】
【００３７】
実施例１：本実施例は、使用した化学物質、試薬、装置とそれらの入手先についての情報を提供する。
【００３８】
試薬／化学物質名                    会社
メタノール水                Sisco Research Laboratories Pvt Ltd.
石油エーテル                Ranbaxy Finc Chemicals Ltd.
クロロホルム                Sisco Research Laboratories Pvt Ltd.
ブタノール                  Sisco Research Laboratories Pvt Ltd.
酢酸エチル                  Sisco Research Laboratories Pvt Ltd.
ヒスタミン酸ホスフェート    Blenkinsop & Co. Ltd
塩化アセチルコリン          Hopkin & Williams Ltd.
硫酸５−ヒドロキシ          Sigma Chemicals
トリプタミンクレアチン
塩化バリウム                Apex Chemicals
ニコチンサルフェート        BDH chemicals
オキシトシン                Parke Davis India Ltd.
プロストジン−ＰＧＦ２α    Astra IDL Ltd.
装置：
１．フィジオグラフ
会社：Ｂｉｏｄｅｖｉｃｅｓ
アムバーラ、インド
２．力変換器（Ｆｏｒｃｅ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）
モデルＮｏ．Ｔ−３０５
会社：ＧＲＡＳＳ、ＵＳＡ
３．刺激装置
モデルＳＳ４４
会社Ｂｉｏｄｅｖｉｃｅｓ、アムバーラ、インド
４．ポリグラフ
モデル７
会社．ＧＲＡＳＳ、ＵＳＡ
５．力変換器
モデルＮｏ．ＦＴ−０３
会社：ＧＲＡＳＳ、ＵＳＡ
６．臓器槽
アムバーラ
インド。
【００３９】
実施例２
ゴア（インドの州）の海岸でのマングローブ植物Salvadora persica  Ｌの採集は、マンドービ（Ｍａｎｄｏｖｉ）河口に近い、リバンダール（Ｒｉｂａｎｄａｒ）上流沿いで行った。この種は、ゴア海岸に遍在しており、潮間帯の浅瀬から手で採集した。
【００４０】
実施例３
集めたマングローブの処理は、まず海水で洗浄し、続いて、水道水で洗浄した。塩を除去するために水道水で洗浄しながら、望ましくない物質を篩で分けた。集合性マングローブ植物の葉、幹、及び花を風乾した。乾燥後、植物素材を小片に切断し、抽出のため、９０％のメタノール水溶媒中に一週間浸漬させた。これらが適切に溶媒中に浸されているかを確認することに注意を払い、腐敗をチェックした。
【００４１】
実施例４
粗抽出物の抽出と調製は、室温での低温パーコレーション法と、水槽（温度５０℃）での減圧下の溶媒蒸発とによって実施した。これは、抽出物中に存在する熱分解性代謝物の保護に役立つ。真空下で抽出物が濃縮されて、粗抽出物が得られるまで、再抽出を二度行った。
【００４２】
実施例５
粗抽出物の分画
分液漏斗を用いて、粗抽出物を、石油エーテル、クロロホルム、ｎ−ブタノール、及び水画分に分割した。分液漏斗中の抽出物に石油エーテルを加え、分離させた。次に、残留物にクロロホルムを加え、よく混合し、下層を分離した。残留物にブタノールを加え、上層をブタノール画分、下層を水画分とした。各画分の抽出は三度行い、エマルジョンが存在するたびに、エマルジョンを破壊するために塩化ナトリウムを加えた。クロロホルム画分とブタノール画分に硫酸ナトリウムを加え、濃縮の前に微量の水を除去した。粗抽出物と同様に、全ての画分を濃縮した。これらの画分が、親粗抽出物と同じ薬理活性を有しているか検査した。溶出物のカラムクロマトグラフィーと薄層クロマトグラフィーを繰り返して、純粋な化合物を単離するためにカラムクロマトグラフィーを行った。ＴＬＣによって、β−アミリン、ベツリン、ウルソル酸、及びルペオール等の化合物が明らかとなった。
【００４３】
実施例６
化合物βアミリンとベツリンを得るために、０．２５ｍｍ厚のシリカゲルプレート（Ｑｕａｌｉｇｅｎ）上で、薄層クロマトグラフィーによる分離を行う。９０：１０（ｖ／ｖ）の石油エーテル／酢酸エチル混合物を溶出剤とし、５％のＨ２ＳＯ４溶液を噴霧してスポットを展開し、１１０℃で加熱して固定した。
【００４４】
化合物ウルソル酸とパルミチン酸メチルの場合、０．２５ｍｍ厚のシリカゲルプレート（Ｑｕａｌｉｇｅｎ）上で、薄層クロマトグラフィーによる分離を行った。８５：１５（ｖ／ｖ）の石油エーテル／酢酸エチル混合物を溶出剤とし、５％のＨ２ＳＯ４溶液を噴霧してスポットを展開し、１１０℃で加熱して固定した。
【００４５】
化合物ルペオールの場合、０．２５ｍｍ厚のシリカゲルプレート（Ｑｕａｌｉｇｅｎ）上で、薄層クロマトグラフィーによる分離を行う。７５：２５（ｖ／ｖ）の石油エーテル／酢酸エチル混合物を溶出剤とし、５％のＨ２ＳＯ４溶液を噴霧してスポットを展開し、１１０℃で加熱して固定した。
【００４６】
本発明では、活性成分を単離するために、マングローブ植物Ｓ．  ｐｅｒｓｉｃａの活性なクロロホルム画分をシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにかけた。同一のＴＬＣプロフィールを有するカラムからの溶出物を混合し、薬理学的な検査に供した。活性な純粋化合物が得られるまで、活性なサブフラクションを、さらにクロマトグラフィーにかけた（フローチャートＩ）。ヨウ素の蒸気を用い、硫酸のメタノール液を噴霧することにより、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）上のスポットを可視化させた。
【００４７】
使用前に１１０℃で１時間活性化させたＴＬＣ品質等級のシリカゲル（Ｑｕａｌｉｇｅｎｓ）の０．２５ｍｍ層で覆われたガラスプレート（２０×２０ｃｍ）上で、ＴＬＣを行った。活性な水画分をＸＡＤカラムに通し、活性成分代謝物を単離及び精製するために、上述のように、溶出剤を処理した。
【００４８】
以下のスペクトル：
１Ｈ  ＮＭＲ  Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＸ−２００ＭＨｚで、分子のプロトン環境を測定
装置：Ｂｒｕｋｅｒ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ
モデル：ＤＰＸ
会社：Ｂｒｕｋｅｒ
炭素原子の１３Ｃ  ＮＭＲ  Ｂｒｕｋｅｒ  ＤＰＶ  ３００ＭＨｚ
により、インドのＲＳＩＣ（Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｓｏｐｈｉｓｔｉｃａｔｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ）で得られたスペクトルのデータに基づいて、五つの化合物を同定した。
【００４９】
文献に報告された類似の化合物のスペクトルデータと比較して、化合物を同定した。
【００５０】
断片化パターンとともに分子量を測定するために、質量分析計（Ｅ１／ＣＩＭＳ）Ｍｏｄｅｌ  Ｄ．３００  ＪＥＯＬで、電子衝撃質量分析（ＥＩＭＳ）を行った。
【００５１】
装置：Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（ＥＩＭＳ）
モデル：Ｄ−３００
会社；ＪＥＯＬ、日本。
【００５２】
実施例７
＜純粋な化合物の薬理検査＞：
使用した標準的な薬物は以下のとおりであった。
【００５３】
回腸にヒスタミン酸リン酸（Ｂｌｅｎｋｉｎｓｏｐ  ＆  Ｃｏ．Ｌｔｄ）
回腸に塩化アセチルコリン（Ｈｏｐｋｉｎ  ＆  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｌｔｄ）
胃腸管に５−ヒドロキシトリプタミンクレアチン硫酸（ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．）
平滑筋収縮に塩化バリウム（Ａｐｅｘ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
神経節刺激剤として腸にニコチン硫酸（ＢＤＨ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）
使用した他の試薬は全て、分析用の品質等級であった。
【００５４】
モルモットの回腸にはタイロード液を使用し、モルモットの心房にはリンゲル−ロックの生理溶液を使用した。
【００５５】
使用した他の試薬は全て、分析用の品質等級であった。
【００５６】
用いた生理溶液と様々なパラメータ：
全ての生理溶液は、実験の時点で新たに調製した。
【００５７】
ｐＨ：様々な生理塩溶液のｐＨは７．３と７．４の間であった。ｐＨが低くなると、調製物の緊張が減少する傾向があり、薬物の効果を変化させやすくなる。
【００５８】
温度：温度が３７℃を下回ると、腸の緊張が増加し、収縮が小さくなり、収縮弛緩時間が増大するので、一貫した効果を得るためには、槽の溶液の温度を一定レベルに維持することが重要であった。
【００５９】
空気：組織が適切に機能するためには、空気又は酸素が必要である。加えて、組織に酸素を供給するために、気泡の流れで槽の溶液を攪拌することにより、槽に加えた薬物の拡散を促進させた。長期間の通気によってｐＨが変化する傾向があるので、槽中の溶液は頻繁に交換した。
【００６０】
＜インビトロでの実験＞
均一な管理条件（温度２５±１℃）下で飼育した体重約３００−３５０ｇのメスの処女モルモットを使用した。実験前２４時間は、動物を絶食させ、水だけを自由に与えた。
【００６１】
単離したモルモットの回腸を使用して、抗痙攣活性、抗コリン活性、及び抗不整脈活性を調べた。
【００６２】
Ａ．抗コリン活性
抗コリン活性を調べるために活性な画分を単離し、単離したモルモットの回腸のみに対して、単離された五つの化合物を検査した。タイロード溶液を満たし、空気を通気した１０ｍｌ容量の臓器槽の中に、屠殺直後のモルモットから得た回腸の縦走筋を懸濁した。タイロード溶液の構成は、
タイロード溶液
グルコース            １．０ｇ
塩化ナトリウム        ８．０ｇ
重炭酸ナトリウム      １．０ｇ
塩化カリウム          ０．２ｇ
塩化カルシウム        ０．２ｇ
塩化マグネシウム      ０．１ｇ
リン酸水素ナトリウム  ０．０５ｇ
であった。
【００６３】
全て、１０００ｍｌの蒸留水中に溶かした。
【００６４】
一様な振幅が得られるように、３０秒の接触時間で、標準薬アセチルコリンを槽に２〜４回加え、その収縮をポリグラフで記録した。単離された五つの化合物は、槽濃度１９６及び３９２×１０−６モル／ｍＬの用量で検査した。アセチルコリンによって誘発された収縮に対して前記化合物の効果が見られ、収縮の減少パーセントを測定した。
【００６５】
Ｂ．抗痙攣活性
抗痙攣活性を調べるために活性な画分を単離し、単離したモルモットの回腸のみに対して、単離された五つの化合物を検査した。タイロード溶液を満たし、空気を通気した１０ｍｌ容量の臓器槽の中に、屠殺直後のモルモットから得た回腸の縦走筋を懸濁した。
【００６６】
モルモットの回腸に対する薬理学的な検査のために、頭部を強打することによってモルモットを屠殺した。腹部を素早く開腹した。腹部の下端の方向に、緑がかった袋状の盲腸が存在した。小腸は、局所的な壁の厚み（リンパ組織のパイエル板）を目印とした。回盲接合部に最も近い回腸の最下部１０ｃｍは廃棄した。そこから、約１０ｃｍの回腸組織を切除し、腸間膜を取り除き、暖かいタイロード溶液を含有するペトリ皿の中に置いた。管腔に粘膜が蓄積するのを防ぐために、タイロード溶液を満たした皮下注射器を用いて、回腸の管腔を穏やかに洗浄した。完全に弛緩した状態の長さ約３−４ｃｍの小セグメントに、回腸を切断した。チューブと直接接触しないようにするために、まずループを作ることにより、下端を組織容器に縫合した。タイロード溶液を含有し、空気を通気した３７℃の１０ｍｌ容量の臓器槽中に、組織を入れた。筋肉の収縮を等尺的に測定する、Ｇｒａｓｓ  Ｐｏｌｙｇｒａｐｈ（Ｍｏｄｅｌ  ７）に接続された力変換器（ＦＴ０３）のレバーに、回腸の上端の糸を固定した。タイロード溶液中で、３０分間、回腸組織を安定化させ、臓器槽中の液体を１０分毎に新しくした（ｐＨが変化するため）。
【００６７】
一様な振幅が得られるように、６０秒の接触時間で、標準痙攣薬（アセチルコリン、ヒスタミン、５−ヒドロキシトリプタミン、塩化バリウム、及びニコチン）を槽に２〜４回加え、その収縮をポリグラフで記録した。痙攣薬を加える一分前に、クロロホルム抽出物を加えた。アセチルコリンによって誘発された収縮に対して前記化合物の効果が見られ、収縮の減少パーセントを測定した。
【表１】
2004525943.tif 000002
【００６８】
Ｃ．抗不整脈活性
インビトロでの実験は、モルモットの単離した心房に対して行った。
【００６９】
胸肋接合部を切断して、殴打したモルモットの胸郭を素早く開いた。心臓は胸骨の背後に見られ、心臓被膜中で拍動していた。心臓を取り出して、純粋な酸素を通気したリンゲル−ロック溶液を含有するペトリ皿の中に置いた。心房及び心室の腔から血液を除去し、血液が冠動脈内部で凝固しないようにするために、心臓を穏やかに圧迫した。急速に拍動する一対の青みがかった桃色の葉状構造のようにみえる心耳以外何も残存しないようになるまで、他の組織は全て切除した。各心耳の先端に糸を繋いだ。ペースメーカーを有する右心房をガラスの酸素チューブに繋ぎ、３４℃のリンゲル−ロック溶液を含有する４０ｍｌ容量の臓器槽の中に載せ、酸素を送り込んだ。左心耳の他端にある糸は、Ｂｉｏｄｅｖｉｃｅｓ  Ｐｈｙｓｉｏｇｒａｐｈに接続した変換器（Ｆｏｒｃｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  Ｔ−３０５）に固定した。リンゲル−ロック溶液の組成は、
グルコース                  ０．５ｇ
塩化ナトリウム              ９．０ｇ
重炭酸ナトリウム            ０．５ｇ
塩化カリウム                ０．４２ｇ
塩化カルシウム              ０．２４ｇ
であった。
【００７０】
Ｐｈｙｓｉｏｇｒａｐｈの感度は、心臓の拍動に合わせて調整した。一対の刺激電極中に心耳を固定し、槽の中に垂直に浸漬されるように保った。心耳は、３０分間平衡化させた。５×１ｍｉ秒の持続時間で、５×０．１ｍｉ秒の遅延を一定に保って、電極を刺激装置（Ｍｅｄｉｃａｒｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ＳＳ４４）に接続した。初めは、電圧と周波数を最小にした。ついで、振幅に変化が生じるまで、電圧を徐々に増加させた。ついで、周波数を増加／調節して、不整脈を発生させた。抽出物／画分の用量は、ｍｌ槽溶液当たりの塩濃度として表し、心耳と１０分間接触させた。心拍数に何らかの変化が存在するかどうかを見るために、一分おきに、フィジオグラフを作動させた。１０分後に、不整脈を起こすために、心耳を二度刺激した。各用量（すなわち、３及び１０μｇ／ｍＬ）の抗不整脈効果を算出した。Salvadora persicaの粗抽出物のモルモット心房に対する不整脈効果を評価するために使用した式は、
％阻害＝（Ｘ）−（Ｙ）×１００／（Ｘ）
ここで、Ｘ＝抽出物を与える前の最大拍動数
Ｙ＝抽出物を与えた後の最大拍動数
モルモットの心房に対するSalvadora persicaの相対的なインビトロでの効果を下表に示す。
【表２】
2004525943.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１ａ】図１（ａ）は、マングローブ植物を示している。
【図１ｂ】図１（ｂ）は、用いた集合性マングローブ植物の小枝を示している。
【図２】図２は、Salvadora persicaという植物の抽出物から得られた様々な画分を示している。
【図３】図３は、β−アミリン（非ステロイド性多環式トリテルペン）の構造式を示している。
【図４】図４は、ベツリンの構造式を示している。
【図５】図５は、ウルソル酸（トリテルペン酸）の構造式を示している。
【図６】図６は、パルミチン酸メチル（脂肪族エステル）の構造式を示している。
【図７】図７は、ルペオール（非ステロイド性多環式トリテルペン）の構造式を示している。
【図８】図８は、Salvadora persicaの抽出物の分画チャートを示している。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
2004525943.tif 000006
【図３】
2004525943.tif 000007
【図４】
2004525943.tif 000008
【図５】
2004525943.tif 000009
【図６】
2004525943.tif 000010
【図７】
2004525943.tif 000011
【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【手続補正書】
【提出日】平成15年3月17日(2003.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物Salvadora persicaの生物学的に活性な抽出物から、生物学的に活性な代謝物を抽出、分画、精製、及び同定する方法であって、
ａ．Salvadora persicaの植物部分を集める工程と、
ｂ．前記植物部分を風乾する工程と、
ｃ．約９０％のメタノール水中に、約２８±２℃の室温で、前記植物部分を約一週間浸漬させる工程と、
ｄ．メタノール抽出物を濾過する工程と、
ｅ．約５０℃の温度で、最少量になるまで、前記メタノール抽出物を減圧下で蒸発させて粗抽出物を得る工程と、
ｆ．極性が増加する溶媒を用いて、前記粗抽出物を分画する工程と、
ｇ．生物学的に活性な画分を同定する工程と、
ｈ．カラムクロマトグラフィーによって、工程（ｇ）の画分から、生物学的に活性な化合物を単離する工程と、
を備えた方法。
【請求項２】
前記Salvadora persicaの植物部分が、葉、幹、及び花から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
極性が増加する溶媒が、石油エーテル、クロロホルム、ブタノール、及び水画分である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記クロロホルム画分が、抗コリン活性、抗痙攣活性、及び抗不整脈活性を示す請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記クロロホルム画分が、シリカゲルカラムを通された後、石油エーテル−酢酸エチル−クロロホルム−メタノールのグラジエント系を用いて溶出される請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）が、シリカゲル上で実行された請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＬＣが、ヨウ素の蒸気にプレートを曝露するか又は硫酸のメタノール液を噴霧することにより可視化された請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗コリン活性を示した前記画分をプールし、シリカゲルカラムを通して、同一の溶媒群で溶出される請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗コリン活性、抗痙攣活性、及び抗不整脈活性を示す薬学的組成物であって、前記植物Salvadora persicaから得られた前記抽出物の前記クロロホルム画分を含み、必要に応じて慣用的な添加物を加えた組成物。
【請求項１０】
前記添加物が、治療的に許容される添加物から選択される請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抽出物が、β−アミリン、ベツリン、ウルソル酸、パルミチン酸メチル、及びルペオールから選択される化合物を含有する請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物中の抽出物の量が、１０μｇｍである請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抽出物の用量が、３μｇ／ｍｌ乃至１０μｇ／ｍｌである請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
不整脈の治療法であって、必要に応じて慣用的な添加物とともに、植物Salvadora persicaから得られた治療的有効量の抽出物を不整脈の患者に投与する工程を備えた方法。
【請求項１５】
前記植物Salvadora persicaから得られた前記抽出物が、クロロホルム画分である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
３乃至１０μｇ／ｍｌ量の前記抽出物が、前記患者に１０分間投与される請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者が、ヒト又は動物である請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
筋肉の痙攣等の痙攣症状を治療する方法であって、必要に応じて慣用的な添加物とともに、植物Salvadora persicaから得られた治療的有効量の抽出物を、これを必要とする患者に投与する工程を備えた方法。
【請求項１９】
前記植物Salvadora persicaから得られた前記抽出物が、植物Salvadora persicaの前記粗抽出物のクロロホルム画分である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
３乃至１０μｇ／ｍｌ量の前記抽出物が、前記患者に１０分間投与される請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記患者が、ヒト又は動物である請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
気管支喘息等のコリン性症状を治療する方法であって、必要に応じて慣用的な添加物とともに、植物Salvadora persicaから得られた治療的有効量の抽出物を、これを必要とする患者に投与する工程を備えた方法。
【請求項２３】
前記植物Salvadora persicaから得られた前記抽出物が、前記粗抽出物のクロロホルム画分である請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
３乃至１０μｇ／ｍｌ量の前記抽出物が、前記患者に１０分間投与される請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者が、ヒト又は動物である請求項２２に記載の方法。
【国際調査報告】
2004525943.tif 000041
2004525943.tif 000042
2004525943.tif 000043