(57)【要約】本発明は一種突然変異型のヒト組織型プラスミノゲン活性剤（ＴＮＫ−ＴＰＡ）が表現できる細胞株とその構築方法である。また、突然変異型のヒト組織型プラスミノゲン活性剤を調剤する方法を含んでいる。本発明の提供した細胞株の寄託番号はＣＣＴＣＣ　Ｃ２００００６である。その構築方法はヒトＤ、Ｇ組染色体の短腕上の肝心な生理機能のない相関遺伝子のＤＮＡ配列或いは該ＤＮＡ配列と相同性があるＤＮＡ配列を目的遺伝子のリーダー配列として、それによって特異性がある遺伝子ベクターＴＮＫ−ＴＰＡの組み換え体を構築する。その組み換え体を利用して、ＴＮＫ−ＴＰＡ目的遺伝子を宿主細胞ＨＴ１０８０のＤ、Ｇ組染色体の核小体の組織領域のものを握る遺伝子座に導入して細胞株を取得し、また該細胞株をＴＮＫ−ＴＰＡ蛋白質の調剤に用いる。
2004508066.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一種のヒトの突然変異型のヒト組織型プラスミノゲン活性剤を発現する細胞株であって、寄託番号がＣＣＴＣＣ　Ｃ２００００６である細胞株。
【請求項２】
請求項１記載の突然変異型のヒト組織型プラスミノゲン活性剤（ＴＮＫ−ＴＰＡ）が発現できるヒトの細胞株を構築する方法、その特徴は：
（１）ヒトのＤ、Ｇ組の染色体の短腕で重要な生理機能のない相関遺伝子ＤＮＡの配列、或いは該ＤＮＡ配列と相同性のあるＤＮＡ配列を目的遺伝子のリーディング配列として、一般の方法で特異性のある遺伝子ベクターを構築する。
（２）　一般の方法で目的遺伝子ＴＮＫ−ＴＰＡを上記のベクターに入れて、ベクターＴＮＫ−ＴＰＡの組み換え体を得た。
（３）上記のベクター−ＴＮＫ−ＴＰＡ組み換え体を利用し、ＴＮＫ−ＴＰＡの目的遺伝子を宿主細胞ＨＴ１０８０のＤ、Ｇ組染色体の核仁組織領域のかぎを握る遺伝子座に導入する。選別して細胞株を取得する。
【請求項３】
請求項２に述べた突然変異型のヒト組織型プラスミノゲン活性剤の細胞株を構築する方法の特徴は、用いられたベクターに配列表１に表されたＤＮＡ配列であることを特徴とする請求項２に記載の構築方法。
【請求項４】
突然変異型のヒト組織型プラスミノゲン活性剤を調剤する方法が請求項１に記載の細胞株を工程細胞株として発現し、ＴＮＫ−ＴＰＡを調剤することを特徴とする組織型プラスミノゲン活性剤を調剤する方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は一種のヒトの細胞株を及び、具体的には突然変異型のヒト組織型プラスミノゲン活性剤（ＴＮＫ−ＴＰＡ）が発現できるヒトの細胞株である。また、本発明は該細胞株の構築する方法、及び遺伝子薬――ヒト組織型プラスミノゲン活性剤が生産される過程の応用まで及んでいる。
【０００２】
【従来の技術】
ヒト組織型プラスミノゲン活性剤はプラスミノゲン活性剤を活性化させる方法を通じて、局部的に血管内の血栓を溶かし、塞ぎとまっている血管を再び通るようにさせることができる。現在、国際上には遺伝子技術を利用して、ヒトのｔ−ＰＡという遺伝子を大規模に組み換え開発し、それに成功してｒｔ−ＰＡという薬を開発したのはアメリカのＧｅｎｅｔｅｃｈという会社しかない。その会社で生産された第一代の製品――ｒｔ−ＰＡは欧米ではすでに血栓症を治療する薬の第一選択薬になっている。しかし、該製品にはまだ下記の点で満足するものではない。それは：
一、国際市場には１バイアル＄１３７５であり、値段が高い。
二、機能の面においては、まだ一定の欠陥があって、主に以下の三つである。
▲１▼　ｒｔ−ＰＡの半減期が短すぎて、３〜５分間しかない。▲２▼ｒｔ−ＰＡは血餅中フィブリンの特異性と結ぶ効力が高くない。▲３▼　ｒｔ−ＰＡの活性と効力をさらに向上されるべきである。半減期が短いため、薬の投与量が多くなり、また、特異性と活性が高くないため、１０〜２０％の患者の血栓が完全にｒｔ−ＰＡによって溶解させられない。
【０００３】
一方、全身性のプラスミド状態を起こし、正常的な凝血メカニズムが影響され、さらに出血、特に頭内と消化道出血という重大な併発症を誘発する原因となっている。
【０００４】
上記の原因にかんがみ、海外においてはｒｔ−ＰＡを使用すると同時に第二代のｒｔ−ＰＡを研究を開始している。即ち、ｔ−ＰＡ遺伝子を修飾して、上述の欠点を無くし、弱化するようにめざしている。もっとも研究されているのは突然変異体のＴＮＫ−ＴＰＡである。例えば、Ｋｅｙｔ ＢＡ、 Ｐａｏｎｉ ＮＦ、 Ｒｅｆｉｎｏ ＣＪ等はアメリカ科学院院刊（１９９４年４月）に「一種高速効果の上にさらに有効的なヒト型プラスミノゲン活性剤」を公開した。その中で、ＴＮＫ−ＴＰＡのＤＮＡ配列（ＡＦａｓｔｅｒ−ａｃｔｉｎｇ Ａｎｄ Ｍｏｒｅ Ｐｏｔｅｎｔ Ｆｏｒｍ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ Ａｃｔｉｖａｔｏｒ．＜Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ＞１９９４ Ａｐｒ ２６；９１（９）：３６７０−４）が公開された。これはｔＰＡ遺伝子の三つの遺伝子座に定点的に突然変異された後で構築されたものである。その中の二つはｋｒｉｎｇｌｅ１機能域にある（Ｔ１０３ＮとＱ１１７Ｎ）。もう一つはプロテアーゼ機能域にある（ＫｈＲＲ２９６−２９９ＡＡＡＡ）。Ｔ１０３Ｎは一つのグリコシルキ化遺伝子座を増し、またＴＮｋ―ｔＰＡとフィブリンの結合する特異性を増加し，さらに体内のクリアするスピードをさげた。Ｑ１１７ＮはＫ１区とマンノースの結合を破壊し，即ち肝臓クッパー細胞の識別遺伝子座を破壊し、半減期を延長したものである。ＫＨＲＲ２９６−２９９ＡＡＡＡはセリンプロテアーゼ反応抑制剤ファミリ（ＰＡＩ−１）の作用遺伝子座を破壊し、半減期を延長した。目下、ＴＮＫ−ＴＰＡの開発について、国内外は一般的に普通な真核遺伝子の発現できるベクターを採用し、ＣＨＯ細胞を宿主細胞として、ＴＮＫ−ＴＰＡを無作為に宿主細胞遺伝子組という発現システムに整合する。例えば、呉本伝などは（生物化学と生物物理進展；１９９７，２４　（１）：７１−７５）という本の中に、「組み換えされたヒト型プラスミノゲン活性剤の純化と同定」という文で上記の発現システムと発現蛋白の調剤方法を公開した。
【０００５】
【発明が解決する課題】
本発明者は特別な双付随体小染色体（ＢＭ）を携帯し、形が正常な二つのファミリを発見した。該小染色体は二つのファミリの二世代と三世代の間で安定に遺伝でき、且つ人体にどんな危害もない。世界中今までにこのような１７つのファミリが報告されているが、該染色体を材料として利用し、ヒト由来遺伝子ベクターを組み立てるという構想を提出する人はいない。本発明者は該小染色体のエレメントを分離して，ヒト由来遺伝子ベクターを組み立てるという方法を提出する。研究の中、ＦＩＳＨ技術で、該小染色体が人間のＤ、Ｇ組染色体、即ち１３、１４、１５、２１、２２番の染色体短腕から来たことは明らかになった。Ｄ、Ｇ組の染色体短腕は核仁組織領域であるから、リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）が豊富である。該領域は群衆の中に長さによる（即ちｒＤＮＡの含有量による）形態がいろいろあって、且つ細胞分裂期に該領域の遺伝子の転録が非常に活躍である。したがって、本発明者はＢＭから特異性のあるＤＮＡ断片をクローンしたものを目的遺伝子のリーディング配列にして、目的遺伝子をヒトＤ、Ｇ組染色体短腕の組織領域に定点導入すれば、比較的高く、安定的、無害的発現があるべきであると推測した。以下の実施例はこれらに対する力強い証明である。
【０００６】
【課題を解決する手段】
本発明者はまず第一に顕微分割方法を利用して、小染色体の特異性を持っているプールｐＵＣ１９を構築し、その中からシングルコピーの断片を選び出した。蛍光原位交雑（ＦＩＳＨ）を通じて、該断片が小染色体とＤ、Ｇ組染色短腕からきたことは明らかになった。また、このシングルコピーの断片をプローブ針として、ヒトのＰＡＣ遺伝子組のＤＮＡプールを選び出し、小染色体の特異性を持っているＤＮＡ断片（ＢＭＳＦ）約１２０ｋｂを取得した。それにＦＩＳＨで小染色体とＤ、Ｇ組染色体の短腕からきたことが証明された（図１）。配列を測定し、ＢＭＳＦの配列の特性を分析したところ、肝心な生理機能とかかわっている遺伝子を発見することはない。それゆえ、これをカギを握る遺伝子座としては安全である。本発明者は更に上述のように手に入れた約１２０Ｋｂ或いはもっと小さくて特異性のある断片を目的遺伝子のリーディング配列として、遺伝子ベクターを構築する。
【０００７】
したがって、本発明者は下記のように考えている：遺伝子のリーディング配列がヒトのＤ、Ｇ組染色体の短腕上に肝心な生理機能がない関係遺伝子のＤＮＡ 配列、あるいわ該ＤＮＡ 配列と相同性があるＤＮＡ 配列を目的遺伝子のリーディング配列とし、それで構築された遺伝子のベクターは特異性が有し、目的遺伝子をヒト細胞のＤ、Ｇ組の染色体の短腕に定点導入することができ、それに本発明がめざしている細胞株が取得できる。
【０００８】
目的遺伝子を取得したことに基づいて、目的遺伝子を、今の技術で構築できた各形のベクターの中に入れて、ベクターＴＮＫ−ＴＰＡの組み換え体を取得する。ベクターを構築するのも目的遺伝子をベクターの中に入れるのも一般的な方法である。以上述べたように得たベクターＴＮＫ−ＴＰＡの組み換え体を利用して、一般的な方法で目的遺伝子ＴＮＫ−ＴＰＡを宿主細胞に導入することができる。
【０００９】
【本発明の実施の態様】
本発明の実施例の中には、ヒトＤ、Ｇ組染色体の短腕にクローンで得た、特異性のあるＤＮＡ 配列を約１２０ｋｂあげ、その中もっと小さく、特異性のあるＤＮＡ断片を３．８ ｋｂ目的遺伝子のリーディング配列としてベクターを構築し、配列表１に示されているようなベクターを得た。また目的遺伝子をそのベクターの中に入れ、ベクターＴＮＫ−ＴＰＡの組み換え体を得た。その中、目的遺伝子ＴＮＫ−ＴＰＡの差し挟む位置は５９１０である。ベクターＴＮＫ−ＴＰＡの組み換え体が含まれている菌株は２０００年９月２９日に中国典型養成物センター（中国・武漢・武漢大学　郵便番号 ４３００７２）に保存された。（中国・武漢・武漢大学 郵便番号 ４３００７２）その寄託番号：ＣＣＴＣＣＭ２０００３２。指定された分類名：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ＪＨ−５／Ｐｎｓ−ＴＰＡ．
本発明は上述の方法によってＴＮＫ−ＴＰＡ目的遺伝子をＨＴ１０８０細胞中のＤ、Ｇ組染色体に導入し、新たな細胞株を得た。該細胞株は２０００年８月１８日に中国典型養成物センター（中国・武漢・武漢大学 郵便番号 ４３００７２）に保存することを提起した。その寄託番号は：ＣＣＴＣＣ　Ｃ２００００６。指定された分類名：類肉腫症細胞系／ＪＨ−２／ＴＰＡ。該保存養成物は純養成物である。養成条件：子牛の血清が１０％含んでいるＤＭＥＭ（高糖）、ＰＨ：７．０−７．４、３７℃。
【００１０】
上述のように得た細胞株は直接現有技術の中のＣＨＯ転化体の代わりを務め、ＴＮＫ−ＴＰＡの調剤に用いる。
【００１１】
本発明から得た細胞株の発現産物は純化された後、Ｗｅｓｔｅｒｎ交雑とアミノ酸配列を測定したところ、目的蛋白であることが明らかになった。
【００１２】
本発明はヒト由来遺伝子ベクターＴＮＫ−ＴＰＡ　ｃＤＮＡをヒトＨＴ１０８０細胞株の中のＤ、Ｇ組染色体に定点導入して、一種新たな細胞株を得た。それにその細胞株を応用して、ＴＮＫ−ＴＰＡを調剤する方法を一つ提供した。現有技術と比べて、その発現量が著しく高くなり、且つ安定な発現レベルが保て、ＴＮＫ−ＴＰＡのコストは非常に下がった。
【００１３】
実施例１：
本発明で使用された遺伝子リーディング配列の調剤：
１．　遺伝子リーディング配列ＰＡＣクローンの取得
１．１　顕微分割、ＰＣＲ、マイクロクローンでＢＭ特異性を持っているｐＵＣ１９プ　　ールを構築する（Ｄｅｎｇ　Ｈ−Ｘ、Ｙｏｓｈｉｕｒａ　Ｋ、Ｄｉｒｋｓ　ＲＷ、ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９２、８９：１３）
【００１４】
１．２　ＢＭ特異性を持っているシングルコピーＤＮＡの取得及び鑑定
（１）　　コロニーラチス膜の調剤：二枚のナイロン膜の上に１４×１４の格子模様を書き、それぞれＡ、Ｂと表記し、二つ固体ＬＢのある平皿に置く。そして、プール皿から無作為に白いクローン１４×１２を選び、二枚座標が同じ膜にさす。第１３行点の１００ｎｇシングルコピーＤＮＡは陽性対照し、第１４行点の１００ｎｇ ｇＤＮＡは陰性対照し、二つの皿はそれぞれ３７℃の状態で１０〜１９時間養成する。その中、Ｂ膜が４℃で保存され、Ａ膜を皿から取り出し、以下の溶液で浸した濾紙で処理する。１０％ＳＤＳで５分間、０．５Ｎ ＮａＯＨ／１．５Ｍ ＮａＣｌで３分間、１．５Ｍ　ＮａＣｌ／０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ．ＨＣｌで３分間、２×ＳＳＣ／０．２Ｍ Ｔｒｉｓ．ＨＣＩで１０分間、８０℃で２時間真空乾燥し、３７℃で保存する。
（２）　　ｇＤＮＡプローブ針の調剤
ｇＤＮＡ ５０〜７０ｎｇを取って、無菌の水を１１ｍｌまでに付け加え、１００℃で１０分間沸騰、変質させる。下記の体系で無作為表記反応する。
２ｍＭ ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ−）　　　　　　３ μｌ
プライマー混合液　　　　　 ２ μｌ
Ｋｌｅｎｏｗ 酵素　　　　　　　　１ μｌ
ａ−３２ ｐ−ｄＡＴＰ　　　　　　　　３ μｌ
均一に混ぜて、３７℃の状態で３０分浴びる。停止液 を８μｌ付け加え、Ｇ−５０柱の純化ブジーにパスし、１／１０取って、液内値を測定する。
（３）交雑：コロニーマトリックス膜を２×ＳＳＣの中に１０分間浸して、軽く表面のコロニー破片をふき取る。そして、６５℃の状態で５ｍｌの交雑液を３０分以上予め交雑する。液内値によって、交雑液１．２×１０６ ｃｐｍ／ｍｌと同じような量でプローブ針液を取って、１００℃の状態で１０分間沸騰、変性させる。それから、新鮮な交雑液５ｍｌを付け加え、６５℃の状態で、コロニーラチス膜と１２時間以上交雑する。以下の条件で膜を洗う：２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、室温１０分間、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃の状態で１０分間、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃の状態で１０分間、−７０℃放射で、自動現像させ、もし交雑の信号がない、或いは弱いとしたら、初歩的にシングルコピーだと思われる。
（４）配列の決定およびサザーンブロッティング：Ｂ膜の相応位置から交雑信号のないクローンを選び出し、少しずつ増やし、質粒ＤＮＡを抜粋して配列を測定する。それにＧｅｎＢａｎｋデータベースと比べて、類似性がないならシングルコピーだと思われる。最後に、ＥｃｏＲＩ酵素で挿入子ＤＮＡを切って分離し、また無作為なプライマー法で、α−３２ Ｐ−ｄＡＴＰと表記して、ＥｃｏＲＩが消化したｇＤＮＡとナイロン膜を移転して交雑する。方法は上記のと同じように、交雑帯が１本か２本あるなら、シングルコピーである。
【００１５】
１．３　ＢＭ及びＤ、Ｇ組染色体短腕の特異性ＰＡＣを持っているクローンの取得と同定：
（１）ヒトＰＡＣｇＤＮＡのプールを選別し、陽性クローンの番号を取得する。
α−３２ Ｐ−ｄＡＴＰ無作為プライマー法で表記されたシングルコピー２６０ｂｐ　Ｐ８−７→Ｇ−５０カラム（等級づけは中）純化させる→４℃で保つ→七枚のＰＡＣ膜を２×ＳＳＣの中に１０分間浸す→５５℃で、３時間で予めの交雑をする→プローブ針で１００℃で１０分間変性させる。４．６×１０５ｃｐｍ／ｍｌの終濃度の量で購入した５０ｍｌの交雑液に入れ、ＰＡＣ膜と６５℃で一時間交雑する→膜を洗うこと：２×ＳＳＣ、室温で１０分間は一回で、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ、６５℃で１０分間２回洗う→Ｘ線フィルムをいれ、−７０℃の状態で１２時間放射、自動現像させる→Ｘ線フィルムを現像する→取り扱い説明書によって陽性のクローンの番号を読み取る。
（２）五つの異なっている板から無作為に陽性のクローンの番号を選び出し、ＰＡＣクローンを買う。
【００１６】
１．４　ＰＡＣ　ＤＮＡ　が中期相細胞とＦＩＳＨ交雑させ、Ｄ、Ｇ組染色体短腕から得たことが証明できる。図１に参照。
上記の実験の方法は《分子クローン実験のガイドブック》（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ． Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．１９８９）に参考できる。
【００１７】
２．　遺伝子リーディング配列ＤＮＡの取得
主要材料：β−アガロース（Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ）　ＮｏｔＩ アガロース
（１）ＮｏｔＩ酵素でプラスミドＰＡＣ１６９の切断
（２）ＰＦＧＥを通じて約１２０Ｋｂの挿入ＤＮＡ（Ｉｎｓｅｒｔｅｄ　ＤＮＡ）を分離する。
バルス電気泳動の条件：電極の緩衝液：０．５×ＴＢＥ、高純度分析用アガロース： （Ｂｉｏ−Ｒａｄ， 低融点アガロースＬＭＰ）１％、Ｓｗｉｔｃｈ　Ｔｉｍｅ：２〜１５秒；電気泳動の時間：１８時間；電圧：６Ｖ／ｃｍ；角度：１２０°温度：１４℃
（３）電気泳動が終わった後、ＥＢで３０分間染色させる（０．２ μｇ／ｍｌ）。標識の指示に基づいて、無菌の安全かみそりで約１２０ｋｂの条帯を切り取る。
（４）切り取られたゲルをβ−アガロースで処理し、エチル・アルコールで沈殿する。
【００１８】
実施例２
本発明で使用された遺伝子ベクターの調整：
１．遺伝子ベクターの構築及び目的遺伝子の導入
１．１　遺伝子ベクターの構築
１．１．１　ＮｓｉＩとＳｔｕＩ（平端酵素）酵素でＰＡＣ　ＤＮＡを切断。普通のアガロースゲルで試料を泳動し、３．８ｋｂの ＤＮＡを回収し、電気溶出によってＤＮＡを精製する。
１．１．２　ＨｉｎｄＩＩＩ酵素でｐＧＥＭ−ＴＫのベクターＤＮＡを切断する。Ｋｌｅｎｏｗ酵素で切断し、切れない末端を生じる。
１．１．３　さらにｐＧＥＭ−ＴＫ／ＨｉｎｄＩＩＩの切れない末端をＮｓｉＩ酵素で切断する。
１．１．４　３．８ｋｂ／ＮｓｉＩ＋ＳｔｕＩの純化した産物をｐＧＥＭ−ＴＫ／ＨＫ＋ＮｓｉＩ酵素の切断された産物と１６℃で１７時間連接させる。
１．１．５　連接した産物はＪＭ１０９コンピテント細菌に転化され、安否シリンを含むプレート３７℃で、１８時間培養する。
１．１．６　無作為にシングルクローンを選び、ＮｓｉＩ及びＮｈｅＩの酵素に切断し、陽性のクローンを同定する。
１．１．７　ＸｂａＩとＮｈｅＩの酵素でｐＣＤＮ−ＧＰＲプラスミドを切断する。Ｎｅｏ／ＸｂａＩ＋ＮｈｅＩを取得する。
１．１．８　Ｎｅｏ／ＸｂａＩ＋ＮｈｅＩをｐＧＥＭ−ＴＫ−３．８ｋｂ／ＮｈｅＩと連接させ、ＰＮＳ２遺伝子のベクターを構築する。
【００１９】
２．１　ＴＮＫ−ＴＰＡの導入：
２．１．１　ＴＮＫ−ＴＰＡ（ＣＤＳ）をｐｃＤＮＡ３．１（−）までクローンする。
２．１．２　プライマーＴＰＣＦとＴＰＣＲを設計し、ＴＮＫ−ＴＰＡ遺伝子及び発現エレメント［ＣＭＶプロモーターとＢＧＨ ｐｏｌｙ Ａシグナル］ を広げ、ＡｒｖＩＩ性源一がプライマーの両端に加えられる。プライマーの配列は：
ＴＰＣＦ：ＡＴＧＣＡＴＣＣＴＡＧＧＧＧＡＧＧＴＣＧＣＴＧＡＧＴＡＧＴＧ
ＡｖｒＩＩ
ＴＰＣＲ：ＴＧＣＡＴＧＣＣＴＡＧＧＴＡＣＣＣＣＣＴＡＧＡＧＣＣＣＡＧ
ＡｖＩＩ
２．１．３　ＡｖｒＩＩ酵素でＴＮＫ−ＴＰＡ遺伝子及び発現エレメント（ＣＭＶプロモーターとＢＧＨ　ｐｏｌｙ Ａ シグナル）を切る。それにＮｈｅＩ酵素に切られたｐＮＳ２ベクターと連接する。２．１．４　連接した産物はＪＭ１０９大腸菌に転化し、ベクター−ＴＮＫ−ＴＰＡが含まれている組み換え体の菌株を得た．（寄託番号はＣＣＴＣＣ　Ｍ２０００３２）
上記の実験の方法は《分子クローン実験のガイドブック》（Ｊ．　Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ． Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ．１９８９）に参考できる。
【００２０】
３．　遺伝子ベクターのＤＮＡの抽出：
３．１　材料：
３．１．１　ＱＩＡＧＥ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍａｘｉ　Ｋｉｔ
３．１．２　培養基：液体ＬＢ
トリプトン　　　　 ５ｇ
酵母抽出物　　　　 ２．５ ｇ
食塩　　　　　　　 ２．５ｇ
水を５００ｍｌまで加える
オートクレーブで殺菌する
３．１．３　アンピシリン（ＡＭＰ）：１００ｍｇ／ｍｌ　（１０００×）
３．２　方法：
（１）　陽性シングルクローンを選び、３ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋）３７℃、２５０ｒｐｍで１時間培養する。
（２）　上記の初代培養物を１００μｌ取って１００ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋）の中に入れ、３７℃、２５０ｒｐｍで１６時間培養する。
（３）　４℃で、６０００ｇ１５分間遠心され、細菌を取得する。
（４）　バッファー　Ｐ１の１０ｍｌで細菌ペレットを再懸濁する。
（５）　バッファー Ｐ２の１０ｍｌを入れ、軽くて６回を反転し、均一に混合させる。室温で五分間反応させる。
（６）　氷上に前置冷却されたバッファー Ｐ３を１０ｍｌ加えて、軽く６回反転し、均一に混合させる。氷上で２０分間反応させる。
（７）　４℃の状態で、２００００ｇを３０ 分間遠心する。
（８）　速やかに上澄み液をもう一つの４０ｍｌの高速遠心管に移し、４℃で２００００ｘｇで１５分間遠心する。
（９）　１０ｍｌの　バッファー ＱＢＴ でＱＩＧＥＮ ｔｉｐ ５００を平均化する。
（１０）　上澄み液をＱＩＧＡＥ ｔｉｐ５００に移し、このカラムを通す。
（１１）　３０ｍｌのバッファー ＱＣでカラムを二回洗う。
（１２）　１５ｍｌのバッファー　ＱＦで溶出し、溶出液を集める。
（１３）溶出の液に（０．７倍の容積の）１０．７ｍｌのイソプロパノ−ルを添加して、均一に混合させる。
（１４）１５０００ｘｇを４℃で３０分間遠心する。
（１５）上澄み液を取り除いて、ＤＮＡ沈殿物に５ｍｌ　７０％のエチル・アルコールを加えて洗浄する。１５０００ｘｇで４℃、１０分間遠心する。
（１６）７０％のエチル・アルコールを取り除いて、１０分間空気乾燥した後、ＴＥ溶液でＤＮＡ沈殿を溶解する。
【００２１】
実施例３
実施例２で得たベクターＴＮＫ−ＴＰＡの組み替え体で、宿主細胞ＨＴ１０８０に目的遺伝子を導入し、選別してから目指している細胞株を取得する。それを体外発現し、その定点導入及び高効率発現を確認する。
１．　材料：
１．１　細胞：ＨＴ１０８０
培養基：高糖ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ（ＨＴ１０８０）ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ
１．２　電気穿孔機：Ｂｉｏ−Ｒａｄ会社
【００２２】
２．　方法：
１） 細胞を７５ｃｍ２の培養瓶の内に７０％〜８０％まで底を覆うように増殖させる。
２）細胞を取り出した後ＨｅＢｓの緩衝液で２回洗う。そして細胞の数を計算する。
３）　１５０００ ｒｐｍを４℃で１０分間遠心する。
４）　適量のＨｅＢＳを下げ、細胞の濃度は１０６〜１０７／ｍｌになること。
５）０．４ｍｌのキュベット杯に８ｍｌの細胞の下げた液を入れ、ベクターＤＮＡは約１０μｇである
６）電気穿孔機で電気ショックする。電圧２６０Ｖ、電気容量５５０μＦ、時間１１〜１３ｍｓという電撃条件を設定する。
７）　電撃された細胞を７５ ｃｍ２の培養瓶の内に転入し、双抗体を含んでいる培地を１４ｍｌ入れ、３７℃で、５％ＣＯ２の中に２４〜４８時間培養する。
８）　培地に終濃度３００μｌのＧ４１８を入れて選別する。２〜３日経ってから液を取り替える。そして再度Ｇ４１８を入れる。同時に正常の細胞と対照する。
９）　約７〜１０日を経って全部の正常の細胞はなくなった。トランスフェクトした生存クローンの数を計算する。そして維持量Ｇ４１８　１５０μｇ／ｍｌを使い直す。
１０）続いて終濃度５００ｎｇ／ｍｌのＧＣＶでトランスフェクトした細胞を選別する。
１１）７〜１０日を経って大部分のクローンはなくなり、生存している細胞はＧＣＶ　２５０μｇ／ｍｌの維持量を使い直す。或いは、選別されなかった細胞を底の７０〜８０％まで覆うように増殖させ、移転遺伝子の発現活性を測定する。
【００２３】
３．結果：
該ベクターを利用し、電気穿孔方法で、ＴＮＫ−ＴＰＡ遺伝子をそれぞれＨＴ１０８０細胞に導入する。プラス選別とマイナス選別し、陽性細胞株を取得した（寄託番号はＣＣＴＣＣ　Ｃ２００００６）。定点に差し挟んだことがＦＩＳＨで確認された（図３に参照）。ＴＮＫ−ＴＰＡ活性の測定された結果は表１に参照する。
【００２４】
ＨＴ１０８０細胞の陰性対照のＴＰＫ−ＴＰＡ活性は０Ｕ／１０６細胞／２４時間で、導入された後ＴＮＫ−ＴＰＡ活性は４０８Ｕ／１０６細胞／２４時間である。トランスファーされた後９５日に発現量は４０７で、発現は非常に安定である。表１を参照。発現産物はすべてウェスタンブロッティングとアミノ酸配列の測定によって証明された。（図４）
表１　ＴＮＫ−ＴＰＡの転化した陽性細胞とＴＮＫ−ＴＰＡ活性の測定
（ μｇ／１０６細胞／２４時間）
2004508066.tif 000003
（＊Ｔ１とＴ１５は二つのＴＮＫ−ＴＰＡの陽性細胞株である。）
【００２５】
４．ＴＮＫ−ＴＰＡ蛋白を調剤する技術：
１）ＴＮＫ−ＴＰＡ／ＨＴ１０８０細胞株をＤＭＥＭで８０％まで底を覆うように培養し、血清がない培養基に取り替え、２４時間後上澄み液（その中発現ＴＮＫ−ＴＰＡを含んでいる）を集める。
２） 取得した上澄み液を０．２２μｍ濾過隔膜で濾過する。
３） 限外濾過膜１０ＫＤで濾過した上澄み液を、７倍限外濾過、濃縮する。
４）ＰＲＯＳＥＰ−ＬＹＳＩＮＥ　ＩＩ　クロマトグラフィーカラムにパスする。
５）０．０５ＭＰＢ、ＰＨ７．０、５倍の柱の容積で特異性のない吸着蛋白を洗浄する。
６）０．２Ｍ　Ａｒｇｉｎｅ／０．０５Ｍ　ＰＢ、ＰＨ７．５の条件で柱に粘っているＴＮＫ−ＴＰＡを溶出する。
７）３ＫＤで限外濾過し、塩を除く。凍結乾燥して粉末にする。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１はＰＡＣでクローンした１２０ｋｂ断片のＦＩＳＨマッピングの図である。
【図２】図２は本発明が提供した一種の遺伝子の構築図である（遺伝子ベクター配列のサイズ：１１１６２ｂｐ）、その中ｐＧＥＭ−７（８２６７−１１１６２）：ベクターのコピーしたエレメント及び前核の選別システムである；ＴＫ（１−２８４０）：真核細胞のマイナスの選別遺伝子、該遺伝子はＴＫとＴｋｐｏｌｙＡ信号を用いる；Ｎｅｏ（４３４２−５９１０）：真核細胞のプラスの選別遺伝子であり、ｓｖ４０プロモーターとｓｖ４０　ｐｏｌｙＡ 信号を用いる；ＧＬＳ（２８４１−４３４１、５９１１−８２６７）：目的遺伝子のリーディング配列である；クローニングサイト （５９１０）：目的遺伝子の差し挟む位置である。
【図３】図３は外源性（ｅｓｏｔｉｃ）を持っているＴＮＫ−ＴＰＡ目的遺伝子が陽性細胞のクローンの中のＦＩＳＨで測定された位置であり、該ベクターを通じて、ＴＮＫ−ＴＰＡをＤ、Ｇ組染色体の短腕に定点導入したことを証明する。
【図４】図４はＴＮＫ−ＴＰＡの純化した産物ウェスタンの結果であり、１〜４がＴＮＫ−ＴＰＡの純化した産物で、“−”が陰性対照である。
【配列表】2004508066.tif 000004
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【図２】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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