(57)【要約】本発明は、血栓溶解の分野と原核細胞における組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）誘導体生産の分野に属する。本発明は、原核細胞において組換えＤＮＡ由来のｔＰＡ、その変異体又は （クリングル２セリン） Ｋ２Ｓ分子又はその変異体を生産する方法であって、前記ｔＰＡ又はＫ２Ｓ又は変異体が活性でかつ正しく折りたたまれたタンパク質として細胞外に分泌され、該原核細胞がシグナルぺプチドＯｍｐＡをコードするＤＮＡに作用可能に結合した前記ｔＰＡ又はＫ２Ｓ又は変異体をコードするＤＮＡを含むベクターを含有し発現させる、前記方法に関する。本発明は、更に、前記方法によって得られる特定のＫ２Ｓ誘導体に関する。本発明は、更に、前記ＤＮＡ分子及び前記方法における前記ＤＮＡ分子の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性でかつ正しく折りたたまれたタンパク質として細胞外に分泌される、原核細胞において組換えＤＮＡ由来の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ｔＰＡ変異体、クリングル２セリンプロテアーゼ分子（Ｋ２Ｓ）又はＫ２Ｓ変異体を生産する方法であって、該原核細胞がシグナルぺプチドＯｍｐＡ又はその機能誘導体をコードするＤＮＡに作用可能に結合した前記ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体をコードするＤＮＡを含むベクターを含有し発現させることを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
該原核細胞が配列ＴＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣ （配列番号１）によって特定された核酸分子又はその機能誘導体に作用可能に結合しているシグナルぺプチドＯｍｐＡをコードするＤＮＡに作用可能に結合した前記ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体をコードするＤＮＡを含むベクターを含有し発現させることを特徴とする、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該原核細胞がＥ． ｃｏｌｉであることを特徴とする、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
下記ステップ：
ａ） 該ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体をコードするＤＮＡをＰＣＲで増幅させるステップと、
ｂ） 該ＰＣＲ産物が精製されるステップと、
ｃ） 前記ＰＣＲ産物が、ＯｍｐＡシグナル配列をコードするＤＮＡの上流に作用可能に結合するとともに前記ベクターのｇｐＩＩＩをコードするＤＮＡの下流に結合するようにＯｍｐＡシグナルぺプチドをコードするＤＮＡとｇｐＩＩＩをコードするＤＮＡを含むベクターに挿入されるステップと、
ｄ） その停止コドンが前記ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体とｇｐＩＩＩとの間に挿入されるステップと、
ｅ） 前記ベクターが該原核細胞によって発現されるステップと、
ｆ） 該ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体が精製されるステップと
が行われることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
該ベクターがＯｍｐＡシグナルぺプチドをコードするＤＮＡと ｇｐＩＩＩをコードするＤＮＡを含むファージミドであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
該ベクターがｐＣｏｍｂ３ＨＳＳファージミドであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ｋ２Ｓの上流に結合したＯｍｐＡのＤＮＡ配列が下記配列又はその機能変異体又は縮重ヌクレオチドコードに基づく変異体を含むことを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
2004520018.tif 000014
【請求項８】
ＯｍｐＡのＤＮＡ配列が下記配列を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
2004520018.tif 000015
【請求項９】
ＯｍｐＡのＤＮＡ配列が下記配列からなることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
2004520018.tif 000016
【請求項１０】
該ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体の前にｌａｃプロモーター及び／又はリボソーム結合部位があることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
該ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体をコードするＤＮＡがヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のアミノ酸８７ − ５２７、１７４ − ５２７、１８０ − ５２７又は２２０ − ５２７の少なくとも９０％ をコードするＤＮＡ分子の群より選ばれることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｋ２ＳのＤＮＡ配列が下記配列又はその機能変異体又は縮重ヌクレオチドコードに基づく変異体を含むことを特徴とする、請求項５〜１１のいずれか１項に記載の方法。
2004520018.tif 000017
【請求項１３】
Ｋ２ＳのＤＮＡ配列が下記配列からなることを特徴とする、請求項５〜１２のいずれか１項に記載の方法。
2004520018.tif 000018
【請求項１４】
ａ） 下記ｂ）に作用可能に結合したＯｍｐＡタンパク質又はその機能誘導体、
ｂ） 組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のクリングル２ドメインとセリンプロテアーゼドメインを含むポリぺプチドをコードするＤＮＡ分子、
をコードしていることを特徴とする、ＤＮＡ分子。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ配列が下記配列又はその機能変異体又は縮重ヌクレオチドコードに基づく変異体を含むことを特徴とする、請求項１４記載のＤＮＡ分子。
2004520018.tif 000019
【請求項１６】
前記ＤＮＡ配列が下記配列からなることを特徴とする、請求項１４又は１５記載のＤＮＡ分子。
2004520018.tif 000020
【請求項１７】
前記ＤＮＡ配列ｂ）が該ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のアミノ酸８７ − ５２７の少なくとも９０％ をコードしていることを特徴とする、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１８】
前記ＤＮＡ配列ｂ）が該ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のアミノ酸１７４ − ５２７の少なくとも９０％ をコードしていることを特徴とする、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ配列ｂ）が該ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のアミノ酸１８０ − ５２７の少なくとも９０％ をコードしていることを特徴とする、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項２０】
前記ＤＮＡ配列ｂ）が該ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のアミノ酸２２０ − ５２７の少なくとも９０％ をコードしていることを特徴とする、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ配列ａ）が下記配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズしていることを特徴とする、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
2004520018.tif 000021
【請求項２２】
前記ＤＮＡ配列ａ）が下記配列からなることを特徴とする、請求項１４〜２１のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
2004520018.tif 000022
【請求項２３】
前記ＤＮＡ配列ｂ）が下記配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズしていることを特徴とする、請求項１４〜２２のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
2004520018.tif 000023
【請求項２４】
前記ＤＮＡ配列ｂ）が下記配列からなることを特徴とする、請求項１４〜２３のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
2004520018.tif 000024
【請求項２５】
下記アミノ酸配列又はその断片、機能変異体、対立遺伝子変異体、サブユニット、化学誘導体又はグリコシル化変異体を特徴とするタンパク質を含むことを特徴とする、ＯｍｐＡとＫ２Ｓの融合タンパク質。
2004520018.tif 000025
【請求項２６】
下記アミノ酸配列を特徴とするタンパク質からなることを特徴とする、請求項２５記載のＯｍｐＡとＫ２Ｓの融合タンパク質。
2004520018.tif 000026
【請求項２７】
配列ＳＥＧＮ （配列番号９）又はその変異体又は断片、機能変異体、対立遺伝子変異体、サブユニット、化学誘導体、融合タンパク質又はグリコシル化変異体によって特定されたタンパク質を含むことを特徴とするＫ２Ｓタンパク質。
【請求項２８】
配列ＳＥＧＮＳＤ （配列番号１０）又はその変異体又は断片、機能変異体、対立遺伝子変異体、サブユニット、化学誘導体、融合タンパク質又はグリコシル化変異体によって特定されたタンパク質を含むことを特徴とする、請求項２７記載のＫ２Ｓタンパク質。
【請求項２９】
下記アミノ酸配列又はその断片、機能変異体、対立遺伝子変異体、サブユニット、化学誘導体又はグリコシル化変異体を特徴とするタンパク質を含むことを特徴とする、請求項２８記載のＫ２Ｓタンパク質。
2004520018.tif 000027
【請求項３０】
下記アミノ酸配列を特徴とするタンパク質からなることを特徴とする、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のＫ２Ｓ。
2004520018.tif 000028
【請求項３１】
請求項１４〜２４のいずれか１項に記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
【請求項３２】
前記ＤＮＡ配列の前にｌａｃプロモーターとリボソーム結合部位がある、請求項３１記載のベクター。
【請求項３３】
ｇｐ ＩＩＩタンパク質の発現が、前記ｇｐ ＩＩＩタンパク質をコードするＤＮＡ分子の欠失又は組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のクリングル２ドメインとセリンプロテアーゼドメインを含むポリぺプチドをコードする遺伝子とタンパク質ＩＩＩ遺伝子との間の停止コドンによって抑制又は阻止される、請求項１４〜２４のいずれか１項に記載のＤＮＡを含むベクターｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ。
【請求項３４】
請求項１４〜２４のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子を含む原核ホスト細胞。
【請求項３５】
請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のベクターを含む原核ホスト細胞。
【請求項３６】
請求項１４〜２４のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子を含むＥ． ｃｏｌｉホスト細胞。
【請求項３７】
請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のベクターを含むＥ． ｃｏｌｉホスト細胞。
【請求項３８】
組織プラスミノーゲン活性化因子の活性を有するポリぺプチドの生産方法における請求項１４〜２４のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子又は請求項３１〜３３のいずれか１項に記載のベクター又は請求項３４〜３７のいずれか１項に記載のホスト細胞の使用。
【請求項３９】
前記方法が請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法である、請求項３８記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、血栓溶解の分野と原核細胞における組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）誘導体生産の分野に属する。
本発明は、原核細胞において組換えＤＮＡ由来のｔＰＡ、その変異体、又は（クリングル２セリン） Ｋ２Ｓ分子又はその変異体の生産方法であって、前記ｔＰＡ又はＫ２Ｓ又は変異体が活性でかつ正しく折りたたまれたタンパク質を細胞外に分泌され、該原核細胞がシグナルぺプチドＯｍｐＡをコードするＤＮＡに作用可能に結合した前記ｔＰＡ又はＫ２Ｓ又は変異体をコードするＤＮＡを含むベクターを含有し発現させる、前記方法に関する。本発明は、更に、前記方法によって得られる特定のＫ２Ｓ誘導体に関する。本発明は、更に、前記ＤＮＡ分子及び前記方法における前記 ＤＮＡ分子の使用に関する。
【０００２】
背景技術
組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）は、分子量が７２ ｋＤａの５２７アミノ酸残基（２７）を有するポリぺプチドである。その分子は５つの構造ドメインに分けられる。Ｎ末端領域の近くにループフィンガードメイン、続いて増殖因子ドメインがある。２つの似たドメイン、クリングル１とクリングル２が続いている。フィンガードメインとクリングル２ドメインは共にフィブリンクロットに特異的に結合し、よって結合プラスミノーゲンのｔＰＡタンパク質活性化を促進させる。クリングル２の下流はセリンプロテアーゼであり、その触媒部位はＣ末端に位置する。セリンプロテアーゼはフィブリン形成とクロット溶解のホメオスタシスに重要なプラスミノーゲンをプラスミンに変換する反応に関与する。ｔＰＡの正しい折りたたみには、分子の１７ジスルフィド橋の正しい対合が必要である（１）。
臨床的には、ｔＰＡは急性心筋梗塞、肺動脈塞栓症、卒中、末梢動脈塞栓症、又は他の血栓塞栓症の治療に選択する血栓溶解剤である。全身性の出血やフィブリノーゲン除去に対する副作用を引き起こさない利点がある（７）。ボーエス（Ｂｏｗｅｓ）メラノーマ細胞をまず治療用ｔＰＡ生産の供給源として用いた（１２）。臨床用には良好な収率で高度に精製したタンパク質の効率のよい生産による一貫した方法が必要であるので、全長組換えｔＰＡ （ｒ−ｔＰＡ）の構築が哺乳動物細胞に前進した。チャイニーズハムスター卵巣をｔＰＡ遺伝子でトランスフェクトしてｒ−ｔＰＡが合成された（８， ２２）。哺乳動物発酵系によって産生した組換えＤＮＡ由来産物が培養液から収集精製された。生産の簡便さと経済によって引きつけられて、微生物、特に細菌、更に特に大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）からｒ−ｔＰＡを生産するために多くの努力がなされた（１０， １３， ３０）。誤折りたたみや不活性酵素を生じる低収量や封入体の形成に関して、これらの問題を克服するために多くの戦略が提唱されてきた。
【０００３】
クリングル２とセリンプロテアーゼ（Ｋ２Ｓ）を含む数種の欠失突然変異体が考えられた。しかしながら、組換えＫ２Ｓ （ｒ−Ｋ２Ｓ）の酵素活性は細胞質区画からの精製封入体の再折りたたみ過程が達成されたときにのみ得られた（１６， ２９）。扱いにくい再折りたたみ過程、誤折りたたみタンパク質の不純物、ペリプラズムタンパク質送出を避けるために、特別な細菌発現系が利用された（６， ３１）。ｔＰＡのペリプラズム発現にもかかわらず、ペリプラズムにおける比較的高い酸化条件でさえ過剰発現により不活性凝集体になった。
従来技術には、Ｅ． ｃｏｌｉ中での組換えＫ２Ｓの調製方法の記載が少しある。しかしながら、生物学的に活性なＫ２Ｓを大量生産するコストの有効な方法をもたらす方法の開示はない。
Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚら（２５）によってペリプラズム間隙からｒ−Ｋ２Ｓが発現精製された。 この方法の明らかな欠点は、過剰ペリプラズム抽出ステップであったことであり、これは大量生産に適さない。
Ｓａｉｔｏら（２９）には、ｒ−Ｋ２Ｓの細胞質発現が開示されている。著者らは発現ｒ−Ｋ２Ｓの生体内復元方法を用い、封入体としてＥ． ｃｏｌｉの細胞質間隙から精製された。ベーリンガーマンハイムは、コストがかかり（２４）かつおそらく抗原の可能性によるアミノ酸配列の突然変異を必要とする、細胞消化、変性還元条件下での可溶化、酸化条件下での再活性化のステップを含む似た取り扱いにくい変性／再折りたたみ方法を用いている。
【０００４】
１９９１年に、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｅｍら（３４）はクリングル２とセリンプロテアーゼドメインをＥ． ｃｏｌｉ培養上清に分泌するベクター（ｐＥＺＺＫ２Ｐ）を構築した。ヒドロキシルアミンを用いてＩｇＧ−セファロース精製画分からＺＺ融合ぺプチドを取り出した。切断剤ヒドロキシルアミンは、クリングル２とセリンプロテアーゼの切断部位の修飾を必要とする（Ａｓｎ１７７ → ＳｅｒとＡｓｎ１８４ → Ｇｌｎ）のでヒドロキシルアミン消化から保護された。しかしながら、得られた適切に折りたたまれていない変性Ｋ２Ｓ分子は治療用には適していない。フィブリン結合／プロテアーゼ活性に関する酵素活性は開示されなかった。異常な配列がヒト免疫系さえも活性化することがある。
従って、本発明の基礎にある問題は、ｔＰＡ分子又はその誘導体、例えば、Ｋ２Ｓを大量生産する商業的に適用できる方法であって、該Ｋ２Ｓがその生物学的に活性な形で培養上清に分泌される前記方法を提供することであった。
【０００５】
発明の説明
問題は本発明の特許請求の範囲と明細書の範囲内で解決された。
特許請求の範囲又は明細書での単数形又は複数形の使用は決して限定するものではなく、他の形も含まれる。
本発明は、活性でかつ正しく折りたたまれたタンパク質として細胞外に分泌される、原核細胞における組換えＤＮＡ由来の組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、ｔＰＡ変異体、クリングル２セリンプロテアーゼ分子（Ｋ２Ｓ）又はＫ２Ｓ変異体の生産方法であって、該原核細胞がシグナルぺプチドＯｍｐＡ又はその機能誘導体をコードするＤＮＡに作用可能に結合した前記ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体をコードするＤＮＡを含むベクターを含有し発現させることを特徴とする、前記方法に関する。
驚くべきことに、シグナルぺプチドＯｍｐＡ単独及び／又はＮ末端アミノ酸ＳＥＧＮ （配列番号９） ／ ＳＥＧＮＳＤ （配列番号１０）と組合わせた使用により、組換えＤＮＡ由来のｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体が外面に転位し、従来技術の他の方法より多く機能分子や活性分子を培養液に遊離することが促進される。外膜を交差させる前に、組換えＤＮＡ由来のタンパク質は本発明の方法に従って正しく折りたたまれる。シグナルぺプチドが切断されて成熟分子が生成する。驚くべきことに、シグナルぺプチド除去の効率は非常に高く、組換えＤＮＡ由来のタンパク質の正しい折りたたみがもたらされる。
【０００６】
前記シグナルぺプチドＯｍｐＡはＳｅｃＥと相互作用し、ＳｅｃＡによって生成するエネルギーによって内膜を横切って送達され、Ｓｅｃ成分に結合する（ＳｅｃＥ−ＳｅｃＹ）。ＳｅｃＹは本発明の組換えＤＮＡ由来タンパク質を送るために分泌細孔を形成する。グラム陰性菌の外膜と内膜との間の間隙、ペリプラズムの酸化状態は細胞質間隙に比べて高い。これにより、活性分子を得るペリプラズムにおいてジスルフィド結合の形成と組換えＤＮＡ由来タンパク質（例えば、Ｋ２Ｓ）の適切な折りたたみが支持される。本発明によれば、シグナルぺプチドが切断されて成熟分子が生成する。外膜上のＧｓｐＤセクレチンとＧｓｐＳリポタンパク質の複合体は、本発明の組換えＤＮＡ由来タンパク質を細胞外培養液に分泌するゲートチャンネルとして役立つ。この分泌過程は、エネルギーを必要とし、ＧｓｐＥヌクレオチド結合タンパク質によって細胞質中に生成してから内膜タンパク質に移される（Ｇｓｐ Ｇ−Ｊ， Ｆ， Ｋ−Ｎ）。ＧｓｐＣによって、一組の内膜タンパク質（Ｇｓｐ Ｇ−Ｊ， Ｆ， Ｋ−Ｎ）とＧｓｐＤとの間にクロスリンカーを形成することによりエネルギーがＧｓｐＤに移される。外膜を巧みに架橋する前に、組換えＤＮＡ由来タンパク質が正しく折りたたまれる。
【０００７】
本発明の作用可能に結合とは、ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体をコードするＤＮＡ （好ましくはＮ末端部にＳＥＧＮ又はＳＥＧＮＳＤをコードする核酸を含む）がＯｍｐＡ−ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体−融合タンパク質の発現を達成させるとともに原核ホスト細胞の外に分泌を特定するためにベクターの中にＯｍｐＡ ＤＮＡに接近してクローン化されることを意味する。典型的には、ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体の大部分が分泌され、次に硫酸アンモニウム沈降ステップ及び／又はアフィニティクロマトグラフィーステップ及び精製ステップのような適切な方法で精製され得る。本発明は、また、ＩＰＴＧ又はＩＰＴＧのようなインデューサーをグリセロールと組合わせて用いることを含み、活性タンパク質の量を最大にするためにインキュベーション条件と収集時間が改善される。
好適実施態様においては、ＯｍｐＡシグナルぺプチドをコードする前記ＤＮＡは、 アミノ酸配列ＳＥＧＮ又はＳＥＧＮＳＤ又はコーディング核酸配列ＴＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣ （配列番号２０）又はＴＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣ （配列番号１）を特徴とし、また、ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体のＮ末端部分にある短いぺプチドに融合することができる。従って、好ましくは、前記融合タンパク質はＯｍｐＡ−ＳＥＧＮＳＤ−ｔＰＡ、−ｔＰＡ変異体、−Ｋ２Ｓ分子又は−Ｋ２Ｓ変異体を含んでいる。更に好ましくは、ＳＥＧＮ又はＳＥＧＮＳＤを特徴とする前記アミノ酸は点突然変異を保有してもよく、非天然アミノ酸で置換されてもよい。更に好ましくは、ＯｍｐＡとＳＥＧＮ又はＳＥＧＮＳＤとｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体との間にアミノ酸又は非アミノ酸スペーサーがあってもよい。
【０００８】
従って、本発明の好適実施態様においては、前記原核細胞は、配列ＴＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣ又はその機能誘導体によって特定された核酸分子に作用可能に結合しているシグナルぺプチドＯｍｐＡをコードするＤＮＡに作用可能に結合した前記ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体をコードするＤＮＡを含むベクターを含有し発現させる。
本発明の方法は、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ （Ｅ． ｃｏｌｉ））、バシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）又はスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、例えば、スタフィロコッカス・カルノーサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｒｎｏｓｕｓ）のような原核ホスト細胞を含むがこれらに限定されない。好ましくは、本発明の前記ホスト細胞はグラム陰性菌である。
好ましくは、本発明の方法は、原核細胞がＥ． ｃｏｌｉであることを特徴とする。適切な株としては、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ系、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０、Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１が挙げられるがこれらに限定されない。
【０００９】
好ましくは、本発明の方法は、下記ステップ：
ａ） 該ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体をコードするＤＮＡをＰＣＲで増幅させるステップと；
ｂ） 該ＰＣＲ産物を精製するステップと；
ｃ） 前記ＰＣＲ産物がＯｍｐＡシグナル配列をコードするＤＮＡの上流に作用可能に結合されるとともに前記ベクターのｇｐＩＩＩをコードするＤＮＡの下流に結合されるように前記ＰＣＲ産物をＯｍｐＡシグナルぺプチドをコードするＤＮＡとｇｐＩＩＩをコードするＤＮＡを含むベクターに挿入するステップと；
ｄ） 停止コドンを前記ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体とｇｐＩＩＩとの間に挿入するステップと；
ｅ） 前記ベクターを該原核細胞によって発現させるステップと；
ｆ） 該ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体を精製するステップと
を行うことを特徴とする。
【００１０】
本発明のステップａ）について、プライマーの選択／設計はＤＮＡを正しい位置と発現ベクターの方向でクローン化するのに重要である（実施例１を参照のこと）。従って、実施例１と図４に例示されるプライマーは、本発明の重要な態様を含んでいる。ステップｃ）のｇｐ ＩＩＩにおいては、遺伝子タンパク質ＩＩＩは主にファージミドベクターに存在する。停止コドンはｇｐ ＩＩＩの転写を避けるために挿入されるので、最終的には問題のｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体が分泌される。停止コドンを挿入するのに適切な方法は、例えば、部位特異的変異導入を用いることができる（例えば、Ｗｅｉｎｅｒ ＭＰ， Ｃｏｓｔａ ＧＬ （１９９４） ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ ４（３）：Ｓ１３１−１３６； Ｗｅｉｎｅｒ ＭＰ， Ｃｏｓｔａ ＧＬ， Ｓｃｈｏｅｔｔｌｉｎ Ｗ， Ｃｌｉｎｅ Ｊ， Ｍａｔｈｕｒ Ｅ， Ｂａｕｅｒ ＪＣ （１９９４） Ｇｅｎｅ １５１（１−２）：１１９−１２３； 実施例１も参照のこと）。
ベクターは本発明の方法で用いることができ、好ましくはファージミドベクターである（下記を参照されたい）。
【００１１】
好ましくは、本発明の方法は、ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体がヒト組織プロスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ、図１６）又は断片、機能変異体、対立遺伝子変異体、サブユニット、化学誘導体、融合タンパク質又はそのグリコシル化変異体より選ばれることを特徴とする。そのような断片、対立遺伝子変異体、機能変異体、縮重核酸コードに基づく変異体、本発明のｔＰＡタンパク質との融合タンパク質、化学誘導体又は本発明のｔＰＡタンパク質のグリコシル化変異体は、下記ドメイン又はそのサブユニット又は変異体の１種類、数種類又は全種類を含むことができる。
１． フィンガードメイン（４−５０）
２． 増殖因子ドメイン（５０−８７）
３． クリングル１ドメイン（８７−１７６）
４． クリングル２ドメイン（１７６−２６２）
５． プロテアーゼドメイン（２７６−５２７）
【００１２】
ドメインの番号／命名はＧｅｎｂａｎｋ受託Ｎｏ．ＧＩ １３７１１９又はＮａｔｕｒｅ ３０１ （５８９７）， ２１４−２２１ （１９８３）に準じる。
更に好ましくは、本発明の方法は、ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体がヒト組織プラスミノーゲン活性化因子のクリングル２ （４．）とセリンプロテアーゼ（５．）Ｋ２Ｓ変異体又はその断片、機能変異体、対立遺伝子変異体、サブユニット、化学誘導体、融合タンパク質又はグリコシル化変異体より選ばれることを特徴とする。
更に好ましくは、本発明の方法は、ベクターがＯｍｐＡシグナルぺプチドをコードするＤＮＡとｇｐＩＩＩをコードするＤＮＡを含むファージミドベクターであることを特徴とする。
更に好ましくは、本発明の方法はベクターがｐＣｏｍｂ３ＨＳＳファージミドであることを特徴とする（実施例１も参照のこと）。
【００１３】
更に好ましくは、本発明の方法はＤＮＡ配列がＯｍｐＡとＫ２Ｓをコードする下記ＤＮＡ配列又はその機能変異体又は縮重ヌクレオチドコードに基づく変異体を含む又はＯｍｐＡとＫ２Ｓをコードする下記ＤＮＡ配列又はその機能変異体又は縮重ヌクレオチドコードに基づく変異体からなることを特徴とする。
2004520018.tif 000002
【００１４】
更に好ましくは、本発明の方法はＯｍｐＡのＤＮＡ配列が下記配列又はその機能変異体又は縮重ヌクレオチドコードに基づく変異体を含む又は下記配列又はその機能変異体又は縮重ヌクレオチドコードに基づく変異体からなることを特徴とする。
2004520018.tif 000003
前記ＤＮＡはＯｍｐＡの下記アミノ酸をコードしている。従って、ＯｍｐＡは本発明の一部として下記アミノ酸配列又はその断片、機能変異体、対立遺伝子変異体、サブユニット、化学誘導体又はグリコシル化変異体を特徴とするタンパク質を含む又は下記アミノ酸配列又はその断片、機能変異体、対立遺伝子変異体、サブユニット、化学誘導体又はグリコシル化変異体を特徴とするタンパク質からなる。ＭＫＫＴＡＩＡＩＡＶＡＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡＡ （配列番号２１）
非翻訳領域は、調節要素、例えば、転写開始単位（プロモーター）又はエンハンサーを含むことができる。前記プロモーターは、例えば、構成プロモーター、誘導プロモーター又は発育制御プロモーターであってもよい。好ましくは、他の既知のプロモーターを除外することなく、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）やラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ） の構成プロモーター、シミアンウイルス４０ （ＳＶ４０）や単純ヘルペスプロモーターである。本発明の誘導プロモーターは、抗生物質耐性プロモーター、熱ショックプロモーター、ホルモン誘導“乳がん腫瘍ウイルスプロモーター”、メタロチオネインプロモーターを含んでいる。好ましいプロモーターとしては、Ｔ３プロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｌａｃ／ａｒａ１、Ｌｔｅｔ０−１が挙げられる。
【００１５】
更に好ましくは、本発明の方法は、ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体のＤＮＡの前にｌａｃプロモーター及び／又はリボソーム結合部位、例えば、シャイン・ダルガルノ配列があることを特徴とする（実施例を参照のこと）。
更に好ましくは、本発明の方法は、ｔＰＡ、ｔＰＡ変異体、Ｋ２Ｓ分子又はＫ２Ｓ変異体をコードするＤＮＡがヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のアミノ酸８７ − ５２７、１７４ − ５２７、１８０ − ５２７又は２２０ − ５２７の少なくとも９０％をコードするＤＮＡ分子の群より選ばれることを特徴とする。
更に好ましくは、本発明の方法は、Ｋ２ＳのＤＮＡ配列が下記配列を含む又は下記配列からなることを特徴とする。
2004520018.tif 000004
【００１６】
本発明は、また、縮重コードに基づく前述の核酸分子の変異体、その断片、ストリンジェントな条件下で前記核酸に対してハイブリダイズする核酸、対立遺伝子変異体又は機能変異体に関する。本発明は、また、他のタンパク質分子をコードする核酸に融合した前記Ｋ２Ｓ核酸を含む核酸に関する。
当業者に理解されるようにストリンジェントな条件は、８５ ％を超える、好ましくは９０ ％を超える相同を選択する条件である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． １９８９； Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。ハイブリダイゼーションは、例えば、６× ＳＳＣ／ ５×デンハート溶液／ ０．１ ％ ＳＤＳ （ＳＤＳ： ドデシル硫酸ナトリウム）中６５℃で行われる。ストリンジェンシーの程度は洗浄ステップで決まる。従って、例えば、相同が約８５ ％以上のＤＮＡ配列を選択する場合には０．２×ＳＳＣ／ ０．０１ ％ ＳＤＳ／ ６５℃の条件、相同が約９０ ％以上のＤＮＡ配列を選択する場合には０．１×ＳＳＣ／ ０．０１ ％ ＳＤＳ／ ６５℃の条件が適切である。前記試薬の組成はＳａｍｂｒｏｏｋら （１９８９、上記）に記載されている。
本発明の他の重要な部分は、クリングル２ （４．）とセリンプロテアーゼ（５．） （略号Ｋ２Ｓ）タンパク質、その変異体又は断片、機能変異体、対立遺伝子変異体、サブユニット、化学誘導体、融合タンパク質又はグリコシル化変異体を含む又はクリングル２ （４．）とセリンプロテアーゼ（５．） （略号Ｋ２Ｓ）タンパク質、その変異体又は断片、機能変異体、対立遺伝子変異体、サブユニット、化学誘導体、融合タンパク質又はグリコシル化変異体からなるヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の変異体である。
【００１７】
ドメインの番号／命名はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＧＩ １３７１１９又はＮａｔｕｒｅ ３０１ （５８９７）， ２１４−２２１ （１９８３）に準じ、クリングル２ドメインはアミノ酸１７６−２６２から伸び、プロテアーゼドメインは２７６−５２７から伸びている。従って、本発明によれば、 好ましいＫ２Ｓ分子はクリングル２とプロテアーゼとの間のアミノ酸を含むアミノ酸 １７６−５２７を含むことができる（アミノ酸２６３〜２７５； 図に例示されている（構造Ａ））。本発明のＫ２Ｓ分子は、プロテアーゼ活性とフィブリン結合活性（説明／実施例に例示されるように測定した）をなお保持しているクリングル２ドメインとプロテアーゼドメインの最小部分を含んでいる。本発明の前記Ｋ２Ｓ分子は、Ｎ末端部分にアミノ酸ＳＥＧＮ又はＳＥＧＮＳＤを含んでいる（下記参照のこと）。好ましいＫ２Ｓ分子は ｔＰＡ分子のアミノ酸１〜３又は１〜５を含んでいない。好ましくは、本発明のＫ２Ｓ分子は 位置１７７と１８４にアミノ酸Ａｓｎを有する。即ち、本発明の方法による生産性の改良にはＷａｌｄｅｎｓｔｒｏｅｍに開示された修飾は必要ない。従って、本発明の好ましいＫ２Ｓは、従来技術から既知の分子とは反対に未変性アミノ酸配列（突然変異のない）を有する。最も好ましくは、本発明の前記Ｋ２Ｓ分子は、未変性アミノ酸配列又はその一部を特徴とし、ｔＰＡのアミノ酸１〜３も１〜５もなく、分子の生産性の改良及び／又は正しい折りたたみのためにＮ末端にアミノ酸ＳＥＧＮ又はＳＥＧＮＳＤを含む分子である。
【００１８】
本発明のＫ２Ｓタンパク質はＮ末端部分に正しく折りたたまれた分泌Ｋ２Ｓタンパク質をもたらす上記の方法で商業的生産を有利に可能にするアミノ酸配列ＳＥＧＮを特徴とするぺプチドを含むことが不可欠である。ＳＥＧＮを特徴とする４つのアミノ酸は、Ｎ末端近くに１つ又は数個のアミノ酸を有してもよいが、前記アミノ酸はＣ末端と反対にＮ末端になければならない。最も好ましくは、前記アミノ酸はＮ末端部分にある。好ましくは、ＳＥＧＮを特徴とするアミノ酸は点突然変異を保有することができ、非天然アミノ酸で置換されてもよい。
従って、他の重要な実施態様においては、本発明は、配列ＳＥＧＮによって特定されたアミノ酸又はその変異体又は断片、機能変異体、対立遺伝子変異体、サブユニット、化学誘導体、融合タンパク質又はグリコシル化変異体を含むことを特徴とするＫ２Ｓタンパク質に関する。
そのような断片は、例えば、アミノ酸１９３−５２７から伸びている図１０ （構造Ｂ−１）と図１１ （構造Ｂ−２）に例示される。構造Ｂ−１は２６１位に未変性アミノ酸Ｃｙｓを有し、Ｂ−２では該アミノ酸がＳｅｒで置換されている。更に、アミノ酸２２０−５２７ （図１４、構造Ｃ）又はアミノ酸２６０−５２７ （図１５、構造Ｄ）を含む本発明の断片はアミノ酸ＳＥＧＮの付加及び／又はＣｙｓ−２６１のＳｅｒによる置換で本発明に従って修飾されてもよい。当業者は、Ｎ末端部分にアミノ酸ＳＥＧＮを付加することにより生物学的機能を保持するとともに生産性及び／又は正しい折りたたみが改善されたＫ２Ｓ分子を作成するために本発明のＫ２Ｓ分子の最小長を求めることができる。従って、他の好適実施態様はＮ末端にＳＥＧＮを有する前記最小Ｋ２Ｓ分子である。
【００１９】
他の重要な実施態様においては、本発明は、配列ＳＥＧＮＳＤで特定されたアミノ酸、その変異体又は断片、機能変異体、対立遺伝子変異体、サブユニット、化学誘導体、融合タンパク質又はグリコシル化変異体を含むことを特徴とするＫ２Ｓタンパク質に関する。そのような断片は、例えば、アミノ酸１９１−５２７から伸びている図１２ （構造Ｂ−３）と図１３ （構造Ｂ−４）に例示される。構造 Ｂ−３は２６１位に未変性アミノ酸Ｃｙｓを有し、Ｂ−４では該アミノ酸がＳｅｒで置換されている。更に、アミノ酸２２０−５２７ （図１４、構造Ｃ）又はアミノ酸２６０−５２７ （図１５、構造Ｄ）を含む本発明の断片は、アミノ酸ＳＥＧＮＳＤの付加及び／又はＣｙｓ−２６１のＳｅｒによる置換により本発明に従って修飾されてもよい。当業者は、Ｎ末端部分にアミノ酸ＳＥＧＮＳＤを付加することにより生物学的機能を保持するとともに生産性及び／又は正しい折りたたみが改善されたＫ２Ｓ分子を作成するために本発明のＫ２Ｓ分子の最小長を求めることができる。従って、他の好適実施態様は、Ｎ末端部分にＳＥＧＮＳＤを有する前記最小Ｋ２Ｓ分子である。
【００２０】
本発明の他の好適実施態様は、下記アミノ酸配列又はその変異体又は断片、機能変異体、対立遺伝子変異体、サブユニット、化学誘導体又はグリコシル化変異体を特徴とするタンパク質を含むＫ２Ｓタンパク質に関する。
ＳＥＧＮＳＤＣＹＦＧＮＧＳＡＹＲＧＴＨＳＬＴＥＳＧＡＳＣＬＰＷＮＳＭＩＬＩＧＫＶＹＴＡＱＮＰＳＡＱＡＬＧＬＧＫＨＮＹＣＲＮＰＤＧＤＡＫＰＷＣＨＶＬＫＮＲＲＬＴＷＥＹＣＤＶＰＳＣＳＴＣＧＬＲＱＹＳＱＰＱＦＲＩＫＧＧＬＦＡＤＩＡＳＨＰＷＱＡＡＩＦＡＫＨＲＲＳＰＧＥＲＦＬＣＧＧＩＬＩＳＳＣＷＩ
2004520018.tif 000005
本発明によれば、＊ はＳＴＯＰを意味する（即ち、停止コドンでコードされている）。このＫ２Ｓ分子は図８に例示されている。
本発明のＫ２Ｓ分子の変異体は、他のタンパク質分子に融合しているＫ２Ｓの融合タンパク質に関する。
本発明の他の好適実施態様は、下記アミノ酸配列を特徴とするタンパク質からなるＫ２Ｓタンパク質に関する。
2004520018.tif 000006
前記Ｋ２Ｓ分子は上記ＤＮＡ分子でコードされてもよい。
【００２１】
本発明の他の重要な態様は、
ａ） ｂ）に作用可能に結合したＯｍｐＡタンパク質又は機能誘導体、
ｂ） 組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のクリングル２ドメインとセリンプロテアーゼドメインを含むポリぺプチドをコードするＤＮＡ分子、
をコードしていることを特徴とする、ＤＮＡ分子に関する。
更に好ましくは、本発明のＤＮＡ分子はＤＮＡ配列がＯｍｐＡとＫ２Ｓをコードする下記ＤＮＡ配列又はその機能変異体又は縮重ヌクレオチドコードに基づく変異体を含む又はＯｍｐＡとＫ２Ｓをコードする下記ＤＮＡ配列又はその機能変異体又は縮重ヌクレオチドコードに基づく変異体からなることを特徴とする。
2004520018.tif 000007
【００２２】
前記ＤＮＡ分子はＯｍｐＡとＫ２Ｓの下記融合タンパク質をコードしている。下記アミノ酸配列又はその断片、機能変異体、対立遺伝子変異体、サブユニット、化学誘導体又はグリコシル化誘導体を特徴とするタンパク質を含む又は下記アミノ酸配列又はその断片、機能変異体、対立遺伝子変異体、サブユニット、化学誘導体又はグリコシル化誘導体を特徴とするタンパク質からなることを特徴とするＯｍｐＡとＫ２Ｓの前記融合タンパク質は、本発明の重要な部分をなしている。
2004520018.tif 000008
本発明の他の好ましい態様は、前記ＤＮＡ配列ｂ）がヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質（本明細書に用いられている番号ＧＩ １３７１１９又はＮａｔｕｒｅ ３０１ （５８９７）， ２１４−２２１ （１９８３）のアミノ酸８７ − ５２７の少なくとも９０％ をコードすることを特徴とする、本発明のＤＮＡ分子に関する。
【００２３】
本発明の他の好適態様は、前記ＤＮＡ配列ｂ）がヒト組織プラスミノーゲン活性化因子のアミノ酸１７４ − ５２７の少なくとも９０％ をコードすることを特徴とする、本発明のＤＮＡ分子に関する。
本発明の他の好ましい態様は、前記ＤＮＡ配列ｂ）がヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のアミノ酸１８０ − ５２７の少なくとも９０％ をコードすることを特徴とする、本発明のＤＮＡ分子に関する。
本発明の他の好適態様は、前記ＤＮＡ配列 ｂ）がヒト組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のアミノ酸２２０ − ５２７の少なくとも９０％ をコードしていることを特徴とする、本発明のＤＮＡ分子に関する。
本発明の他の好適態様は、前記ＤＮＡ配列 ａ）が下記配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズしていることを特徴とする、本発明のＤＮＡ分子に関する。
2004520018.tif 000009
本発明の他の好適態様は、前記ＤＮＡ配列 ａ）が下記配列からなることを特徴とする、本発明のＤＮＡ分子に関する。
2004520018.tif 000010
【００２４】
本発明の他の好適態様は、前記ＤＮＡ配列ｂ）が下記配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズしていることを特徴とする、本発明のＤＮＡ分子に関する。
2004520018.tif 000011
【００２５】
本発明の他の好適態様は、前記ＤＮＡ配列 ｂ）が下記配列からなることを特徴とする、本発明のＤＮＡ分子に関する。
2004520018.tif 000012
【００２６】
本発明の他の好適実施態様は、本発明のＤＮＡ配列を含むベクターに関する。
本発明の他の好適実施態様は、前記ＤＮＡ配列の前にｌａｃプロモーターとリボソーム結合部位がある、本発明のベクターに関する。本発明の適切なベクターとしては、例えば、ワクシニアウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルスベクター及びアデノウイルスベクター、ファージミドベクター等が含まれるがこれらに限定されない。Ｅ． ｃｏｌｉで有利に使用し得るが、ｐＰＲＯＴｅｔ．Ｅ、ｐＰＲＯＬａｒ．Ａ、ｐＢＡＤファミリーの一部、ｐＳＥファミリー、ｐＱＥファミリー及びｐＣＡＬのような他の原核ホストでも有利に使用し得るベクターが好ましい。
本発明の他の好適実施態様は、ｇｐ ＩＩＩタンパク質の発現が前記ｇｐ ＩＩＩタンパク質をコードするＤＮＡ分子の欠失又は組織プラスミノーゲン活性化因子タンパク質のクリングル２ドメインとセリンプロテアーゼドメインを含むポリぺプチドをコードする遺伝子とタンパク質ＩＩＩ遺伝子との間の停止コドンで抑制又は阻止される本発明のＤＮＡを含むベクター ｐＣｏｍｂ３ＨＳＳに関する。
本発明の他の重要な態様は、本発明のＤＮＡ分子を含む原核ホスト細胞に関する。
本発明の他の重要な態様は、本発明のベクターを含む原核ホスト細胞に関する。
本発明の他の重要な態様は、本発明のＤＮＡ分子を含むＥ． ｃｏｌｉホスト細胞に関する。
本発明の他の重要な態様は、本発明のベクターを含むＥ． ｃｏｌｉホスト細胞に関する。
【００２７】
本発明の更に他の重要な態様は、組織プラスミノーゲン活性化因子の活性を有するポリぺプチドの生産方法における本発明のＤＮＡ分子の使用又は本発明のベクター又は本発明のホスト細胞の使用である。
本発明の更に他の重要な態様は、前記方法が本発明の方法である上記の本発明の使用である。
他の非常に重要な態様は、本発明の方法によって得られる物質と薬学的に許容しうる賦形剤や担体を含む医薬組成物である。前記物質の例は、上記Ｋ２Ｓ分子である。本明細書に用いられる“薬学的に許容しうる担体”という用語は、医薬製造技術において用いられる慣用の医薬賦形剤又は添加剤を意味する。そのような生理的に許容しうる化合物としては、例えば、グルコース、スクロース又はデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸又はグルタチオンのような抗酸化剤、キレート化剤、低分子量タンパク質又は他の安定剤又は賦形剤が含まれる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （１９９０， １８ｔｈ ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌ．， Ｅａｓｔｏｎ．）を参照のこと）。本発明の前記医薬組成物は、ボーラスとして静脈内に、例えば、１回のボーラスとして５〜１０秒間静脈内に有利に投与し得る。
本発明は、更に、卒中、心筋梗塞、急性心筋梗塞、肺塞栓症、冠動脈閉塞症のような動脈閉塞症、頭蓋内動脈閉塞症（例えば、脳に供給する動脈）、末梢閉塞動脈、深部静脈血栓症又は好ましくない血液クロッティングに付随する関連疾患の治療のための薬剤の製造において本発明の方法により得られる物質の使用に関する。
次の実施例は、本発明を理解するためのものであり、本発明の範囲を制限するものとしてみなされるべきでない。
【００２８】
実施例１
材料と方法
プライマー設計。ｔＰＡ遺伝子の特定の部分を増幅させるために、一組のプライマーＳＫ２／１７４ ［５’ ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＴＣＴＧＡＧＧＧＡＡＡＣＡＧＴＧＡＣ ３’］ （配列番号２２）とＡＳＳＰ ［５’ ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴＴＧＴＣＡＣＧ ３’］ （配列番号２３）を合成した（ライフテクノロジーズ、グランドアイランド、ニューヨーク）。これらのプライマーは、ＮＣＢＩデータベース（ｇ１３７１１９）から検索したヒトｔＰＡ遺伝子に基づいて設計した。ファージミドベクターｐＣｏｍｂ３ＨＳＳ中のｇｐＩＩＩ遺伝子のＡＴＧからのリーディングフレームが挿入配列全体に維持されるようにＳｆｉ Ｉ末端クローニング部位（下線）と共に合成した。
部位特異的変異導入用の他のプライマーセットをｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓ中のＫ２Ｓ遺伝子と遺伝子ＩＩＩとの間に位置する配列でアニールするように設計した。新しい停止コドンを作成する変異塩基（下線）を有するプライマーの配列は、ＭＳＴＰＡ ［５’ ＡＣＡＴＧＣＧＡＣＣＧＴＧＡＣＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧ ３’］ （配列番号２４）と
ＭＡＳＴＰＡ ［５’ ＣＴＧＧＣＣＧＧＣＣＴＧＴＣＡＣＧＧＴＣＧＣＡＴＧＴ ３’］ （配列番号２５）とした。
【００２９】
ＰＣＲによるＫ２Ｓ遺伝子の増幅。１μｇのＳＫ２／１７４とＡＳＳＰプライマーを５０ ｎｇのｐ５１−３鋳型（Ｄｒ． Ｈｉｒｏｓｈｉ Ｓａｓａｋｉから入手、藤沢薬品、日本）と共に１００μｌのＰＣＲ混合液に懸濁した。その溶液に２．５ Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ、インディアナポリス、インディアナ）の量を最後に添加した。滴定した増幅条件を８５℃で４分間のジャンプスタート、次に９５℃で５０秒間の変性、４２℃で５０秒間のアニーリング、７２℃で１．５分間のエクステンションにより開始した。３５ラウンドを反復して行った。この混合液を７２℃で１０分間インキュベートした。１１１０ ｂｐの増幅産物を引き続きＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット （キアゲン、ヒルデン、ドイツ）で精製した。精製産物の正しさを制限酵素で確認した。
Ｋ２Ｓを発現するファージミドの構築。Ｋ２ＳとｐＣｏｍｂ３ＨＳＳファージミドの精製ＰＣＲ産物（Ｄｒ． Ｃａｒｌｏｓ Ｆ． Ｂａｒｂａｓから恵与された、スクリップスインスティチュート、ＵＳＡ）をＳｆｉ Ｉ （ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ、インディアナポリス、インディアナ）で消化して特定の粘着クローニング部位を調製した。４μｇの精製ＰＣＲ産物を６０ ＵのＳｆｉ Ｉで５０℃において１８時間消化した。ｐＣｏｍｂ３ＨＳＳについては２０μｇのファージミドベクターを１００ ＵのＳｆｉ Ｉで処理した。Ｋ２ＳとｐＣｏｍｂ３ＨＳＳの精製ＰＣＲ産物の消化産物（〜３３００ ｂｐ）を引き続きＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）でゲル精製した。５ ＵのＴ４リガーゼ（ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ、インディアナポリス、インディアナ）を０．７μｇの精製Ｓｆｉ Ｉ消化ｐＣｏｍｂ３ＨＳＳと０．９ μｇの精製Ｓｆｉ Ｉ消化ＰＣＲ産物の混合物に導入した。ライゲーション反応を３０℃で１８時間インキュベートした。新たに作製したファージミドをｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓと命名した。
【００３０】
Ｅ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅのトランスフォーメーション。２００μｌのＣａＣｌ２コンピテントＥ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、カリフォルニア）を７０ ｎｇのライゲートした又は突然変異した産物でトランスフォームした。トランスフォームした細胞を１００μｇ／ｍｌアンピシリンと１０μｇ／ｍｌテトラサイクリン（シグマ、セントルイス、ミズーリ）を含有するＬＢ寒天上に拡散させることにより増殖させた。 ３７℃で１８時間培養した後、いくつかの抗生物質耐性コロニーをアルカリ溶解法を用いることによりプラスミドミニプレップに選択した。各々の精製プラスミドをＳｆｉ Ｉ制限部位分析に供した。引き続き、正しいＳｆｉ Ｉ制限部位を有するトランスフォーマントを含んでいるプラスミドをアンピシリン１００μｇ／ｍｌとテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含む１００ ｍｌ ＬＢブイヨン中３７℃で１８時間増殖させた。プラスミドマキシプレップをキアゲンプラスミドマキシキット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いて行った。精製プラスミドについてＳｆｉ Ｉにより特定の制限部位を調べ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼターミネーターサイクルシークエンシングキット（ザパーキンエルマーコーポレーション、フォスターシティ、カリフォルニア）で配列を決定した。
【００３１】
ｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓの部位特異的変異導入。１０ ｎｇのｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓ鋳型と１２５ ｎｇのＭＳＴＰＡとＭＡＳＴＰＡプライマーとを混合した。その混合物に２．５ ＵのＰｆｕＴｕｒｂｏ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、カリフォルニア）をサイクル増殖のために添加した。反応を９５℃で３０秒間の１ラウンドから開始した。次に ９５℃で３０秒間 、５５℃で１分間、６８℃で９分間からなる１６ラウンドを続けた。次に反応チューブを２分間氷上に置いた。鋳型鎖を破壊するために、１０ ＵのＤｐｎ Ｉ制限酵素（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、カリフォルニア）を増殖反応液に添加し、 ３７℃で１時間インキュベートした。この合成産物（ＭｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓ）を用いてＥ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅをトランスフォームした。
ファージディスプレイ組換えＫ２Ｓの調製。ｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２ＳをＸＬ−１ Ｂｌｕｅにトランスフォームした後、ファージディスプレイ法を行った。ｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２ＳトランスフォームＥ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅのクローンをアンピシリン１００μｇ／ｍｌとテトラサイクリン１０μｇ／ｍｌを含有する１０ ｍｌのスーパーブイヨン中３７℃でＯ．Ｄ． ［６００ ｎｍ］が１．５に達するまで増殖させた。引き続き、細菌培養液を１００ ｍｌの同じ培養液中で２時間増殖させた。１０１２ ｐｆｕのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージ（ストラタジーン、ラ・ホーヤ、カリフォルニア）の量を用いてトランスフォームしたＥ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅを感染させた。３時間インキュベートした後、培養物に最終濃度７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを 添加した。その培養物を３７℃で１８時間振盪（２００ ＲＰＭ）した。次に ４％ ｗ／ｖ ＰＥＧ ＭＷ ８０００ （シグマ、セントルイス、ミズーリ）と３％ ｗ／ｖ ＮａＣｌを添加することによりｇｐ３ （Ｋ２Ｓ−φ）上にＫ２Ｓを含んでいるバクテリオファージを収集した。最後に、収集したファージを２ ｍｌ ＰＢＳ ｐＨ ７．４に再懸濁した。Ｅ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅに感染させることによりファージ数を求めた。コロニー形成単位／ミリリットル（ｃｆｕ／ｍｌ）を以前に記載されているように計算した（２１）。
【００３２】
振盪フラスコにおける組換えＫ２Ｓの発現。ＭｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２ＳトランスフォームしたＥ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅを１００ ｍｌのスーパーブイヨン（３％ ｗ／ｖトリプトン、２％ ｗ／ｖ酵母エキス、１％ ｗ／ｖ ＭＯＰＳ）、ｐＨ ７．０中アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）の存在下に３７℃でＯ．Ｄ． ［６００ ｎｍ］が０．８に達するまで培養した。次に、タンパク質合成を１ ｍＭのＩＰＴＧ （プロメガ、マディソン、ウィスコンシン）で誘導した。その細菌を３０℃で６時間更に振盪（２００ ＲＰＭ）培養した。培養上清を集め、５５％ 飽和硫酸アンモニウムで沈殿させた（３２）。その沈殿をＰＢＳ、ｐＨ ７．２で再構成し、同じ緩衝液で４℃において１８時間透析した。細菌細胞からのペリプラズムタンパク質をＡｍｅｓら（２）によって以前に記載されたようにクロロホルムショックを用いて抽出した。
組換えＫ２Ｓのアムノアッセイ定量化。ｒ−Ｋ２Ｓを検出するために、固相をモノクローナル抗クリングル２ドメイン（１６／Ｂ）で被覆した（Ｄｒ． Ｕｔｅ Ｚａｃｈａｒｉａｓから恵与された、分子生物学中央研究所、ベルリンブック、ドイツ）。標準ＥＬＩＳＡ洗浄と阻止の工程を行った。５０μｌの１０１１ ｃｆｕ／ｍｌのＫ２Ｓ−φ又は分泌ｒ−Ｋ２Ｓを各抗クリングル２被覆ウェルに添加した。抗原−抗体検出を次のように行った。洗浄ステップ後にヒツジ抗Ｍ１３結合ＨＲＰ （ファーマシアバイオテック、アップサラ、スウェーデン）か或いはヒツジ抗ｔＰＡ結合ＨＲＰ （シーダーレーン、オンタリオ、カナダ）を各反応ウェルに添加した。基質ＴＭＢをすべてのウェルに入れ、３０分間インキュベートした後に反応を最後にＨ２ＳＯ４溶液で止めた。標準メラノーマｔＰＡ ８６／６７０ （Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ、ハートフォードシャイン、英国）を正の対照として用いた。
【００３３】
アミド分解活性分析。ｔＰＡアミド分解活性の検出用試験キットをクロモゲニックス（モルンダール、スウェーデン）から購入した。プラスミノーゲンとＳ−２２５１を含有する基質混合物を用いてセリンプロテアーゼ酵素活性を求めた。１０−２の各アンモニウム沈降試料の希釈液を刺激物質、ヒトフィブリノーゲンフラグメントを含めて又は含めずに分析した。分析手順はＣＯＡＳＥＴ ｔ−ＰＡマニュアルに従った。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥと免疫ブロッティング。培養上清からの透析沈殿産物をセントリコン１０  （アミコン、ビバリー、マサチューセッツ）で１０倍に濃縮した。濃縮した試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、還元バッファー中１５％ 分解ゲルに続いてニトロセルロースのエレクトロブロッティングによるタンパク質分離に供した。次にニトロセルロースを４％ 脱脂乳で２時間阻止した。ｒ−Ｋ２Ｓを検出するために、ヒツジ抗ｔＰＡ結合ＨＲＰの適切な希釈液をニトロセルロースに加えた。免疫反応バンドを感受性検出システム、増幅Ｏｐｔｉ−４ＣＮキット（バイオラド、ハーキュレス、カリフォルニア）で可視化した。
共重合プラスミノーゲンポリアクリルアミドゲル電気泳動。１１％ 分解ポリアクリルアミドゲルをＨｅｕｓｓｅｎら（１４）によって以前に記載されたようにプラスミノーゲンとゼラチンで共重合した。濃縮用ゲルをプラスミノーゲンとゼラチンを含めずに４ ％ 濃度として調製した。電気泳動を４℃で８ ｍＡの一定電流で行った。２．５％ トライトンＸ−１００中室温で１時間弱く振盪した後にゲルスラブ中の残留ＳＤＳを除去した。次にゲルスラブを０．１ Ｍグリシン−ＮａＯＨ、ｐＨ ８．３中３７℃で５時間インキュベートした。最後に、ゲルスラブを標準クーマシーブリリアントブルー（Ｒ−２５０）色素システムによって染色し脱染した。酵素活性を含んでいるぺプチドの場所はブルーペイントバックグラウンドと対照的に色素で染色しなかった。
【００３４】
結果
Ｋ２Ｓ遺伝子をもつベクターの構築。ベクターｐ５１−３からプライマーＳＫ２／１７４とＡＳＳＰを用いてクリングル２とそのｔＰＡのセリンプロテアーゼ部分（クリングル２ドメインのＳｅｒ１７４からセリンプロテアーゼのＰｒｏ５２７まで）を増幅した。増幅した１１１０ ｂｐ産物をアガロースゲル電気泳動で証明し（図１、レーン２）、５’端と３’端の２重Ｓｆｉ Ｉ切断部位によってｐＣｏｍｂ３ＨＳＳファージミドに正しいリーディングフレームで挿入した。このように新しいベクター、Ｋ２Ｓを含んでいるｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓを作成した。このベクターにおいてＫ２Ｓは 上流にＯｍｐＡシグナル配列が隣接し、下流にｇｐ３が隣接する。Ｋ２Ｓの正しい挿入をＳｆｉ Ｉによる制限分析（図２、レーン３）、ＰＣＲ分析（１１１０ ｂｐでシグナルバンドを示す）、ＤＮＡシークエンシングのいずれでも証明した。ｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓ地図の概略図を図３に示す。
【００３５】
ファージディスプレイｒ−Ｋ２Ｓ。ＶＣＳＭ１３繊維状ファージを用いてｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２ＳトランスフォームＥ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ、Ｘ［Ｋ２Ｓ］に感染させた。ＶＣＳＭ１３を増殖させ、上清パッケージング工程でＫ２Ｓ−ｇｐ３融合タンパク質を組込んだ。収集した組換えファージ（Ｋ２Ｓ−φ）は、Ｅ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ ＢｌｕｅにＰＥＧ沈降ファージを再感染させることにより求めた５．４ × １０１１ ｃｆｕ／ｍｌの濃度を得た。これらの組換えファージ粒子についてサンドイッチＥＬＩＳＡでｒ−Ｋ２Ｓの発現を証明した。ファージ結合異種Ｋ２Ｓタンパク質をヒツジ抗ｔＰＡ結合ＨＲＰ抗体検出システムを用いてモノクローナル 抗クリングル２抗体（１６／Ｂ）により認識した。この分析の吸光度は１．１２ ± ０．０３であった（表１）。１０１２ファージ粒子に関して検出可能なＫ２Ｓの量は、標準メラノーマｔＰＡに関して３３６ ｎｇのタンパク質である。Ｋ２Ｓ−ｇｐ３融合タンパク質がファージ粒子と関連があることを確認するために、ヒツジ抗ｔＰＡ結合ＨＲＰ抗体をヒツジ抗Ｍ１３抗体結合ＨＲＰで置換した。この免疫反応の吸光度は１．８９ ± ０．０７であった（表１）。対照的に、捕捉抗体がヒツジ抗Ｍ１３抗体である場合には、ヒツジ抗ｔＰＡ抗体結合ＨＲＰによりＫ２Ｓが非常に少量認められた。吸光度はわずか０．１７ ± ０．０１であった（表１）。これにより少数の精製ファージ粒子がＫ２Ｓ−ｇｐ３融合タンパク質をもつことが示された。トランスフォームされないＥ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅから調製されたＶＣＳＭ１３を負の対照として用いた。
【００３６】
ＭｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓの構築。変異原プライマー（ＭＳＴＰＡとＭＡＳＴＰＡ）によってｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓ中のＫ２Ｓとｇｐ３との間に停止コドンを作成した（図４）。新たに合成され変異したＭｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓを強化するために、サイクル増幅混合物をＤｐｎ Ｉで十分に消化して旧ダムメチル化ｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓ鋳型を分解した（Ｄｐｎ Ｉはダムメチル化ＤＮＡを意味する）。Ｅ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ ＢｌｕｅをＭｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓでトランスフォームした後、トランスフォーマントＸＭ［Ｋ２Ｓ］を実験のために選択した。ｂｐ置換の結果として、部位特異的変異導入後にＫ２Ｓ遺伝子の３’端に近いＳｆｉ Ｉ切断部位が失われた。 Ｓｆｉ Ｉ切断ＭｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓの直鎖形が４３１９ ｂｐに見られ、挿入Ｋ２Ｓ遺伝子断片は見られなかった（図５、レーン３）。このようにＭｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２ＳでコードしているＫ２Ｓ遺伝子はＸＭ［Ｋ２Ｓ］において非ｇｐ３融合形で発現した。
Ｋ２Ｓの発現と精製。ＸＭ［Ｋ２Ｓ］におけるＫ２Ｓ発現をＩＰＴＧで誘導させた。ペリプラズム間隙と培養上清双方においてＥＬＩＳＡを用いることによりｒ−Ｋ２Ｓが検出可能であった。各標品中の異種タンパク質の量をサンドイッチＥＬＩＳＡで求め、標準ｔＰＡと関連した。Ｏ．Ｄ． ［６００ ｎｍ］が５０の振盪フラスコ中の１００ ｍｌ細菌培養液から、ペリズム画分中に１．３８μｇのｒ−Ｋ２Ｓ （約３２％）が得られ、アンモニウム沈降培養上清中に２．９６μｇのｒ−Ｋ２Ｓ （約６８％）を得た。サンドイッチＥＬＩＳＡを用いてＶＣＳＭ１３感染ＸＭ［Ｋ２Ｓ］からのＰＥＧ沈降ファージを証明した。モノクローナル抗クリングル２抗体で捕捉したｒ−Ｋ２Ｓは抗Ｍ１３結合ＨＲＰで検出されず、ｇｐ３が消失している場合にＫ２Ｓがファージ粒子上に存在しないことが示された。
【００３７】
アミド分解活性測定。セリンプロテアーゼドメインが試料中に存在する場合には、プラスミノーゲンはプラスミンに変換される。生成したプラスミンは、Ｓ−２２５１基質を吸光度が４０５ ｎｍで最大の発色産物、ｐ−ニトロアニリンに消化する。 組換え産物の比活性は吸光度と一致している。各試料、即ち、Ｋ２Ｓ−φ、ペリプラズムｒ−Ｋ２Ｓ又は培養上清ｒ−Ｋ２Ｓのフィブリノーゲン依存性酵素活性を評価し比較した。Ｋ２Ｓ−φとペリプラズムｒ−Ｋ２Ｓは共に特に酵素活性が低く、試験の感度より低かった（０．２５ ＩＵ／ｍｌ）。培養上清中のｒ−Ｋ２Ｓからは７ ＩＵ／ｍｌのフィブリノーゲン依存性酵素活性が得られた。このように、１００ ｍｌの培養物から合計７００ ＩＵ酵素活性が得られた。フィブリノーゲンを含まない培養上清から精製したｒ−Ｋ２Ｓの酵素活性は見られなかったが、標準メラノーマｔＰＡは活性が少し示された。
免疫ブロッティングによる組換えタンパク質の証明。ＸＭ［Ｋ２Ｓ］の培養上清から部分的に精製したＫ２Ｓは、ヒツジ抗ｔＰＡ抗体を用いることにより ３９ ｋＤａの分子量を示した（図６）。負の対照、トランスフォームされていないＸＬ１−Ｂｌｕｅの部分的に精製した培養上清はサイズが同じ反応性バンドを含まなかった。
ＰＡＧＥによる活性酵素の局在。プラスミノーゲンを共重合し、電気泳動の前にポリアクリルアミドゲル中のゼラチンで固定化した。Ｅ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ、ｐＣｏｍｂ３ＨＳＳでトランスフォームしたＥ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ及びＸＭ［Ｋ２Ｓ］の硫酸アンモニウム沈降培養上清を分析した（図７）。すべての試料をセリンプロテアーゼドメインの正しいコンホメーションと活性を保存するために非還元条件で処理した。セリンプロテアーゼ消化プラスミノーゲンの透明な領域は、３４ ｋＤａと３７ ｋＤａの位置にＸＭ［Ｋ２Ｓ］の硫酸アンモニウム沈降培養上清にのみ見られた。他の試料には透明ゾーンは生じなかった。標準メラノーマｔＰＡの正の対照レーンには６６ ｋＤａと７２ ｋＤａの位置に酵素活性が示された。
【００３８】
引用文献
１．            Ａｌｌｅｎ， Ｓ．， Ｈ． Ｙ． Ｎａｉｍ， ａｎｄ Ｎ． Ｊ． Ｂｕｌｌｅｉｄ． １９９５． Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ． Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ ｂｏｎｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｎ Ｎ−ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：４７９７−４８０４．
２．            Ａｍｅｓ， Ｇ． Ｆ．， Ｃ． Ｐｒｏｄｙ， ａｎｄ Ｓ． Ｋｕｓｔｕ． １９８４． Ｓｉｍｐｌｅ， ｒａｐｉｄ， ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ． Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １６０：１１８１−１１８３．
３．            Ｂａｒｂａｓ， Ｃ． Ｆ． ＩＩＩ， Ａ． Ｓ． Ｋａｎｇ， Ｒ． Ａ． Ｌｅｒｎｅｒ， ａｎｄ Ｓ． Ｊ． Ｂｅｎｋｏｖｉｃ． １９９１． Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｌｉｂｒａｒｉｅｓ ｏｎ ｐｈａｇｅ ｓｕｒｆａｃｅｓ： ｔｈｅ ｇｅｎｅ ＩＩＩ ｓｉｔｅ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． ８８：７９７８−７９８２．
４．            Ｂａｒｂａｓ， Ｃ． Ｆ． ＩＩＩ， ａｎｄ Ｊ． Ｗａｇｎｅｒ． １９９５． Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ａ Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ８： ９４−１０３．
５．            Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｗ． Ｆ．， Ｎ． Ｆ． Ｐａｏｎｉ， Ｂ． Ａ． Ｋｅｙｔ， Ｄ． Ｂｏｔｓｔｅｉｎ， Ａ． Ｊ． Ｊｏｎｅｓ， Ｌ． Ｐｒｅｓｔａ， Ｆ． Ｍ． Ｗｕｒｍ， ａｎｄ Ｍ． Ｊ． Ｚｏｌｌｅｒ． １９９１． Ｈｉｇｈ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｎ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ． Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ． ２６６：５１９１−５２０１．
６．            Ｂｅｔｔｏｎ， Ｊ． Ｍ．， Ｎ． Ｓａｓｓｏｏｎ， Ｍ． Ｈｏｆｎｕｎｇ， ａｎｄ Ｍ． Ｌａｕｒｅｎｔ． １９９８． Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｖｅｒｓｕｓ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｍａｌｔｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｒｉｐｌａｓｍ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７３：８８９７−８９０２．
７．            Ｃａｍｉｏｌｏ， Ｓ． Ｍ．， Ｓ． Ｔｈｏｒｓｅｎ， ａｎｄ Ｔ． Ａｓｔｒｕｐ． １９７１． Ｆｉｂｒｉｎｏｇｅｎｏｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ ｗｉｔｈ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ， ｕｒｏｋｉｎａｓｅ， ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｌｏｂｕｌｉｎ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｎ． Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ３８：２７７−２８０．
８．            Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ， Ｔ． １９９２． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔ−ＰＡ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ， ｐ． ２１７−２４５． Ｉｎ Ｒ． Ｅ． Ｓｐｉｅｒ， ａｎｄ Ｊ． Ｂ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ （ｅｄ．）， Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ５． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．
９．            Ｃｕｒｒｙ， Ｋ． Ａ．， Ａ． Ｗ． Ｙｅｍ， Ｍ． Ｒ． Ｄｅｉｂｅｌ， Ｊｒ．， Ｎ． Ｔ． Ｈａｔｚｅｎｂｕｈｌｅｒ， Ｊ． Ｇ． Ｈｏｏｇｅｒｈｅｉｄｅ， ａｎｄ Ｃ． Ｓ． Ｔｏｍｉｃｈ． １９９０．  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ ｂｅｔａ ｆｕｓｅｄ ｔｏ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ． ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９：１６７−１７５．
１０．           Ｄａｔａｒ， Ｒ． Ｖ．， Ｔ． Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ， ａｎ Ｃ．−Ｇ． Ｒｏｓｅｎ． １９９３． Ｐｒｏｃｅｓｓ ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ： ａ ｃａｓｅ ｓｔｕｄｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：３４９−３５７．
１１．           Ｄｅｎｅｆｌｅ， Ｐ．， Ｓ． Ｋｏｖａｒｉｋ， Ｔ． Ｃｉｏｒａ， Ｎ． Ｇｏｓｓｅｌｅｔ， Ｊ． Ｃ． Ｂｅｎｉｃｈｏｕ， Ｍ． Ｌａｔｔａ， Ｆ． Ｇｕｉｎｅｔ， Ａ． Ｒｙｔｅｒ， ａｎｄ Ｊ． Ｆ． Ｍａｙａｕｘ． １９８９． Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｏｒｔ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ： ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｐｏｒｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ １ ｂｅｔａ． Ｇｅｎｅ ８５：４９９−５１０．
１２．           Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｊ． Ｂ．， Ａ． Ｅｌｅｃｔｒｉｃｗａｌａ． １９８７． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｆｒｏｍ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ． Ａｄｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｅｎｇ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ３４：１４７−１６６．
１３．           Ｈａｒｒｉｓ， Ｔ． Ｊ．， Ｔ． Ｐａｔｅｌ， Ｆ． Ａ． Ｍａｒｓｔｏｎ， Ｓ． Ｌｉｔｔｌｅ， Ｊ． Ｓ． Ｅｍｔａｇｅ， Ｇ． Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ， Ｇ． Ｖｏｌｃｋａｅｒｔ ， Ｗ． Ｒｏｍｂａｕｔｓ ， Ａ． Ｂｉｌｌｉａｕ， ａｎｄ Ｐ． Ｄｅ Ｓｏｍｅｒ． １９８６． Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｃＤＮＡ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ． ３：２７９−２９２．
１４．           Ｈｅｕｓｓｅｎ， Ｃ．， ａｎｄ Ｅ． Ｂ． Ｄｏｗｄｌｅ． １９８０． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｉｎ ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ ａｎｄ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚｅｄ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ． Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １０２：１９６−２０２．
１５．           Ｈｅｕｓｓｅｎ， Ｃ．， Ｆ． Ｊｏｕｂｅｒｔ， ａｎｄ Ｅ． Ｂ． Ｄｏｗｄｌｅ． １９８４． Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｗｉｔｈ Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２５９：１１６３５−１１６３８．
１６．           Ｈｕ， Ｃ． Ｋ．， Ｕ． Ｋｏｈｎｅｒｔ， Ｏ． Ｗｉｌｈｅｌｍ， Ｓ． Ｆｉｓｃｈｅｒ， ａｎｄ Ｍ． Ｌｌｉｎａｓ． １９９４． Ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｄｏｍａｉｎ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ＢＭ ０６．０２２： ｍｏｄｕｌａｒ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ， ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ， ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｃｌｅａｖａｇｅ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３３：１１７６０−１１７６６．
１７．           Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ， Ｓ． Ｍ．， Ｇ． Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ， ａｎｄ Ｍ． Ｌｉｔｔｌｅ． １９９７． Ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｉｎ ｓｍａｌｌ−ｓｃａｌｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｃｕｌｔｕｒｅｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００：６９−７７．
１８．           Ｋｏ， Ｊ． Ｈ．， Ｄ． Ｋ． Ｐａｒｋ， Ｉ． Ｃ． Ｋｉｍ， Ｓ． Ｈ． Ｌｅｅ， ａｎｄ Ｓ． Ｍ． Ｂｙｕｎ． １９９５． Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ ｉｎ Ｅｘｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １７：１０１９−１０２４．
１９．           Ｋｏｕｚｕｍａ， Ｙ．， Ｎ． Ｙａｍａｓａｋｉ， ａｎｄ Ｍ． Ｋｉｍｕｒａ． １９９７． Ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ＥＴＩａ ｆｒｏｍ Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｖａｒｉｅｇａｔａ： ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ｃｌｏｎｉｎｇ， ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ， ａｎｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＥＴＩａ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． （Ｔｏｋｙｏ） １２１：４５６−４６３．
２０．           Ｌａｓｔｅｒｓ， Ｉ．， Ｎ ． Ｖａｎ Ｈｅｒｚｅｅｌｅ， Ｈ． Ｒ． Ｌｉｊｎｅｎ， Ｄ． Ｃｏｌｌｅｎ， ａｎｄ Ｌ． Ｊｅｓｐｅｒｓ． １９９７． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２４４：９４６−９５２．
２１．           Ｌｏｂｅｌ， Ｌ． Ｉ．， Ｐ． Ｒａｕｓｃｈ， Ｉ． Ｔｒａｋｈｔ， Ｓ． Ｐｏｌｌａｋ， ａｎｄ Ｊ． Ｗ． Ｌｕｓｔｂａｄｅｒ． １９９７． Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈＬＨ／ＣＧ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄ ｈＣＧ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ． Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ． １３８：１２３２−１２３９．
２２．           Ｌｕｂｉｎｉｅｃｋｉ， Ａ．， Ｒ． Ａｒａｔｈｏｏｎ， Ｇ． Ｐｏｌａｓｔｒｉ， Ｊ． Ｔｈｏｍａｓ， Ｍ． Ｗｉｅｂｅ， Ｒ． Ｇａｒｎｉｃｋ， Ａ． Ｊｏｎｅｓ， Ｒ． ｖａｎ Ｒｅｉｓ， ａｎｄ Ｓ． Ｂｕｉｌｄｅｒ． Ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ， ｐ． ４４２−４５１． Ｉｎ Ｒ． Ｅ． Ｓｐｉｅｒ， Ｊ． Ｂ． Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｊ． Ｓｔｅｐｈｅｎｎｅ， ａｎｄ Ｐ． Ｊ． Ｃｒｏｏｙ （ｅｄ．）， Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｅｓ． Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ， Ｌｏｎｄｏｎ．
２３．           Ｌｕｃｉｃ， Ｍ． Ｒ．， Ｂ． Ｅ． Ｆｏｒｂｅｓ， Ｓ． Ｅ． Ｇｒｏｓｖｅｎｏｒ， Ｊ． Ｍ． Ｃａｒｒ， Ｊ． Ｃ． Ｗａｌｌａｃｅ， ａｎｄ Ｇ． Ｆｏｒｓｂｅｒｇ． １９９８． Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｐｈａｇｅ−ｄｉｓｐｌａｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ−２． Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ６１：９５−１０８．
２４．           Ｍａｒｔｉｎ， Ｕ．， Ｓ． Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｕ． Ｋｏｈｎｅｒｔ， Ｈ． Ｌｉｌｌ， Ｒ． Ｒｕｄｏｌｐｈ， Ｇ． Ｓｐｏｎｅｒ， Ａ． Ｓｔｅｒｎ， ａｎｄ Ｋ． Ｓｔｒｅｉｎ． １９９０． Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ （ＢＭ ０６．０２２） ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｚ． Ｋａｒｄｉｏｌ． ７９：１６７−１７０．
２５．           Ｏｂｕｋｏｗｉｃｚ， Ｍ． Ｇ．， Ｍ． Ｅ． Ｇｕｓｔａｆｓｏｎ， Ｋ． Ｄ． Ｊｕｎｇｅｒ， Ｒ． Ｍ． Ｌｅｉｍｇｒｕｂｅｒ， Ａ． Ｊ． Ｗｉｔｔｗｅｒ， Ｔ． Ｃ． Ｗｕｎ， Ｔ． Ｇ． Ｗａｒｒｅｎ， Ｂ． Ｆ． Ｂｉｓｈｏｐ， Ｋ． Ｊ． Ｍａｔｈｉｓ， Ｄ． Ｔ． ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｎ． Ｒ． Ｓｉｅｇｅｌ， Ｍ． Ｇ． Ｊｅｎｎｉｎｇ， Ｂ． Ｂ． Ｂｒｉｇｈｔｗｅｌｌ， Ｊ． Ａ． Ｄｉａｚ−Ｃｌｌｉｅｒ， Ｌ． Ｄ． Ｂｅｌｌ， Ｃ． Ｓ． Ｃｒａｉｋ， ａｎｄ Ｗ． Ｃ． Ｔａｃｏｎ． １９９０． Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｋｒｉｎｇｌｅ−２−ｓｅｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９：９７３７−９７４５．
２６．           Ｐａｒｍｌｅｙ， Ｓ． Ｆ．， ａｎｄ Ｇ． Ｐ． Ｓｍｉｔｈ． １９８８． Ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｄ ｐｈａｇｅ ｖｅｃｔｏｒｓ： ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ． Ｇｅｎｅ ７３：３０５−３１８．
２７．           Ｐｅｎｎｉｃａ， Ｄ．， Ｗ． Ｅ． Ｈｏｌｍｅｓ， Ｗ． Ｊ． Ｋｏｈｒ， Ｒ． Ｎ． Ｈａｒｋｉｎｓ， Ｇ． Ａ． Ｖｅｈａｒ， Ｃ． Ａ． Ｗａｒｄ， Ｗ． Ｆ． Ｂｅｎｎｅｔｔ， Ｅ． Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ， Ｐ． Ｈ． Ｓｅｅｂｕｒｇ， Ｈ． Ｉ． Ｈｅｙｎｅｋｅｒ， Ｄ． Ｖ． Ｇｏｅｄｄｅｌ， ａｎｄ Ｄ． Ｃｏｌｌｅｎ． １９８３． Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃＤＮＡ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ． Ｎａｔｕｒｅ ３０１：２１４−２２１．
２８．           Ｒｉｐｐｍａｎｎ， Ｊ． Ｆ．， Ｍ． Ｋｌｅｉｎ， Ｃ． Ｈｏｉｓｃｈｅｎ， Ｂ． Ｂｒｏｃｋｓ， Ｗ． Ｊ． Ｒｅｔｔｉｇ， Ｊ． Ｇｕｍｐｅｒｔ， Ｋ． Ｐｆｉｚｅｎｍａｉｅｒ， Ｒ． Ｍａｔｔｅｓ， ａｎｄ Ｄ． Ｍｏｏｓｍａｙｅｒ． １９９８． Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ−ｆｒａｇｍｅｎｔ （ｓｃＦｖ） ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｌ−ｆｏｒｍ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ ｌｅａｄｓ ｔｏ ａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ ｏｖｅｒｃｏｍｅｓ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６４：４８６２−４８６９．
２９．           Ｓａｉｔｏ， Ｙ．， Ｙ． Ｉｓｈｉｉ， Ｈ． Ｓａｓａｋｉ， Ｍ． Ｈａｙａｓｈｉ， Ｔ． Ｆｕｊｉｍｕｒａ， Ｙ． Ｉｍａｉ， Ｓ． Ｎａｋａｍｕｒａ， Ｓ． Ｓｕｚｕｋｉ， Ｊ． Ｎｏｔａｎｉ， Ｔ． Ａｓａｄａ， Ｈ． Ｈｏｒｉａｉ， Ｋ． Ｍａｓａｋａｚｕ， ａｎｄ Ｎ． Ｍｉｎｅｏ． １９９４． Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ． １０：４７２−４７９．
３０．           Ｓａｒｍｉｅｎｔｏｓ， Ｐ．， Ｍ． Ｄｕｃｈｅｓｎｅ， Ｐ． Ｄｅｎｅｆｌｅ， Ｊ． Ｂｏｉｚｉａｕ， Ｎ． Ｆｒｏｍａｇｅ， Ｎ． Ｄｅｌｐｏｒｔｅ， Ｆ． Ｐａｒｋｅｒ， Ｙ． Ｌｅｌｉｅｖｒｅ， Ｊ．−Ｆ． Ｍａｙａｕｘ， ａｎｄ Ｔ． Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ． １９８９． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：４９５−５０１．
３１．           Ｓｃｈｅｒｒｅｒ， Ｓ．， Ｎ． Ｒｏｂａｓ， Ｈ． Ｚｏｕｈｅｉｒｙ， Ｇ． Ｂｒａｎｌａｎｔ， ａｎｄ Ｃ． Ｂｒａｎｌａｎｔ． １９９４． Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ Ｇ ａｍｉｄａｓｅ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４２：８５−８９．
３２．           Ｓｏｅｄａ， Ｓ．， Ｍ． Ｋａｋｉｋｉ， Ｈ． Ｓｈｉｍｅｎｏ， ａｎｄ Ａ． Ｎａｇａｍａｔｓｕ． １９８６． Ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈ−ｙｉｅｌｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｒｃｉｎｅ ｈｅａｒｔ ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｂｙ ｈｅｐａｒｉｎ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｃｈｏｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ． Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ． ３９：１３１７−１３２４．
３３．           Ｓｚａｒｋａ， Ｓ． Ｊ．， Ｅ． Ｇ． Ｓｉｈｏｔａ， Ｈ． Ｒ． Ｈａｂｉｂｉ．， ａｎｄ Ｓ．−Ｌ． Ｗｏｎｇ． １９９９． Ｓｔａｐｈｙｌｏｋｉｎａｓｅ ａｓ ａ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ． Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６５：５０６−５１３．
３４．           Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍ， Ｍ．， Ｅ． Ｈｏｌｍｇｒｅｎ， Ａ． Ａｔｔｅｒｓａｎｄ， Ｃ． Ｋａｌｄｅｒｅｎ， Ｂ． Ｌｏｗｅｎａｄｌｅｒ， Ｂ． Ｒａｄｅｎ， Ｌ． Ｈａｎｓｓｏｎ， ａｎｄ Ｇ． Ｐｏｈｌ． １９９１． Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｖａｒｉａｎｔ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｇｅｎｅ ９９：２４３−２４８．
３５．           Ｗａｎ， Ｅ． Ｗ．−Ｍ．， ａｎｄ Ｆ． Ｂａｎｅｙｘ． １９９８． ＴｏｌＡＩＩＩ Ｃｏ−ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｔｈｅ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ． Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ． Ｐｕｒｉｆ． １４：１３−２２．
３６．           Ｚａｃｈａｒｉａｓ， Ｕ．， Ｂ． Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｆ． Ｎｏｌｌ， ａｎｄ Ｈ． Ｗｉｌｌ． １９９２． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｗｉｔｈ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ａｎｄ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｆｏｒ ｆｉｂｒｉｎ ａｎｄ ｌｙｓｉｎｅ． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ６７：８８−９４．
【００３９】
表１． サンドイッチＥＬＩＳＡによるファージ標品中のｒ−Ｋ２Ｓ分子の検出
2004520018.tif 000013
ａ  ＶＣＳＭ１３はｐＣｏｍｂ３ＨＳＳでトランスフォームしたＸＬ−１ Ｂｌｕｅから収集した。
ｂ  マウスモノクローナル抗クリングル２ （１６／Ｂ）を用いた。他の抗体はヒツジ免疫グロブリンから調製した。
ｃ  数値は３回の実験で分析した各試料の吸光度の平均である。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＳＫ２／１７４とＡＳＳＰのプライマーを用いることによるｐ５１−３ベクターからのＫ２Ｓ遺伝子のＰＣＲ増幅産物を確認する図である。レーン１は１ ｋｂマーカー（ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ、インディアナポリス、インディアナ）を示している。レーン２は１μｌの増幅産物を充填した。１１１０ ｂｐにシングルバンドが示されている。電気泳動は１％ アガロースゲルで行った。
【図２】
Ｓｆｉ Ｉ消化ｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓをレーン３に示した後に１１１０ ｂｐ （＊）の挿入Ｋ２Ｓ遺伝子を確認する図である。レーン１は１ ｋｂマーカーを示している。レーン２は切断されていないｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓを充填した。電気泳動は１％ アガロースゲルで行った。
【図３】
Ｋ２Ｓ遺伝子が挿入された２つのＳｆｉ Ｉクローニング部位を示すｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓのスキームである。シグナル配列（ＯｍｐＡ）、リボソーム結合部位（ＲＩＢＳ）、ｌａｃプロモーター、ｇｐＩＩＩ遺伝子も示されている。
【図４】
ｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２ＳについてＫ２Ｓ遺伝子とｇｐＩＩＩ遺伝子との間の結合部における変異点の概略図である。ｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓのアニーリング部位は修飾オリゴヌクレオチド（下線）を含む一組の突然変異プライマー（ＭＳＴＰＡとＭＡＳＴＰＡ）と結合している。サイクル増幅を行った後、Ｓｆｉ Ｉ部位１ （太字）が修飾され、新たに合成された鎖では消失している。
【図５】
新たに合成されたＭｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２ＳのＳｆｉ Ｉ制限酵素で確認する図である。レーン３にはＭｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓの単一切断部位を示す４３１９ ｂｐにシングルバンドが見られる。１１１０ ｂｐの挿入Ｋ２Ｓバンドは可視化できない。レーン１は １ ｋｂマーカーを示している。レーン２は切断されていないＭｐＣｏｍｂ３Ｈ−Ｋ２Ｓで充填した。電気泳動は１％ アガロースゲルで行った。
【図６】
ヒツジ抗ｔＰＡ結合ＨＲＰを含むＥ． ｃｏｌｉ ＸＭ［Ｋ２Ｓ］培養上清から精製した組換えタンパク質の免疫学的に反応性のバンドを確認する図である。レーン１は４０ ｎｇの標準メラノーマｔＰＡ （８６／６７０）で充填し、７０ ｋＤａに反応性バンドが示された。トランスフォームされていないＥ． ｃｏｌｉ ＸＬ１− ＢｌｕｅとＥ． ｃｏｌｉ ＸＭ［Ｋ２Ｓ］からの部分的に精製され濃縮された培養上清をレーン２とレーン３にそれぞれ加えた。はっきりした反応性バンドがレーン３の３９ ｋＤａに特に示された。
【図７】
共重合したプラスミノーゲンポリアクリルアミドゲル電気泳動により活性セリンプロテアーゼドメインを含んでいる細胞外ｒ−Ｋ２Ｓの分子量分析の図である。 レーン１は示した分子量標準（×１０−３）、ＳＤＳ−６Ｈ （シグマ、セントルイス、ミズーリ）を有した。レーン２、３、４には、Ｅ． ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ、ｐＣｏｍｂ３ＨＳＳでトランスフォームしたＥ． ｃｏｌｉ Ｘｌ−１、及びＥ． ｃｏｌｉ ＸＭ［Ｋ２Ｓ］の５０μｇの５５％ 飽和硫酸アンモニウム沈降培養上清をそれぞれ充填した。レーン５は５０ ｍＩＵの標準メラノーマｔＰＡ （８６／６７０）を有した。ポリアクリルアミドゲル中の消化プラスミノーゲンの透明ゾーンはレーン４には３４ ｋＤａと３７ ｋＤａの分子量 （Ｂ）、レーン５には の６６ ｋＤａと７２ ｋＤａの分子量 （Ａ）でのみ見える。
【図８】
構造Ａ （配列番号１１）、修飾していないアミノ酸１７４−５２７の未変性Ｋ２Ｓ分子を示す図である。
【図９】
構造Ｂ−０ （配列番号１２）、修飾していないアミノ酸１９７−５２７の未変性Ｋ２Ｓ分子を示す図である。
【図１０】
構造Ｂ−１ （配列番号１３）、図９の構造Ｂ−０にアミノ酸ＳＥＧＮをＮ末端部分に加えたアミノ酸１９３−５２７のＫ２Ｓ分子を示す図である。
【図１１】
構造Ｂ−２ （配列番号１４）、ＳｅｒをＣｙｓ−２６１に交換した図１０のアミノ酸１９３−５２７のＫ２Ｓ分子を示す図である。
【図１２】
構造Ｂ−３ （配列番号１５）、図９の構造Ｂ−０にアミノ酸ＳＥＧＮＳＤをＮ末端部分に加えたアミノ酸１９１−５２７のＫ２Ｓ分子を示す図である。
【図１３】
構造Ｂ−４ （配列番号１６）、ＳｅｒをＣｙｓ−２６１に交換した図１２のアミノ酸１９１−５２７のＫ２Ｓ分子を示す図である。
【図１４】
構造Ｃ （配列番号１７）、修飾を含まないアミノ酸２２０−５２７の未変性Ｋ２Ｓ分子を示す図である。この分子は、図１０〜図１３の構造Ｂと同様の方法で修飾することができる。
【図１５】
構造Ｄ （配列番号１８）、修飾を含まないアミノ酸２６０−５２７の未変性Ｋ２Ｓ分子を示す図である。この分子は、図１０〜図１３の構造Ｂと同様の方法で修飾することができる。
【図１６】
ｔＰＡ分子を示す図である（配列番号１９）。
【図３】
2004520018.tif 000029
【図４】
2004520018.tif 000030
【図８】
2004520018.tif 000031
【図９】
2004520018.tif 000032
【図１０】
2004520018.tif 000033
【図１１】
2004520018.tif 000034
【図１２】
2004520018.tif 000035
【図１３】
2004520018.tif 000036
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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