(57)【要約】本発明は、少なくとも親水性置換基および酸感受性である環状オルトエステルを有する新規な酸感受性化合物、ならびにそれらの塩に関する。その化合物は、生物活性物質を取り込んだ粒子を安定化し、次にそれらを酸性媒体中で不安定化するノニオン系界面活性剤として、あるいは治療性分子に共有結合的に結合していることで、その治療性分子をｐＨが酸性である細胞組織または区画で放出するベクターとして、生物活性物質と結合体（リポソーム、複合体、ナノ粒子）を形成する上で、そしてそれらをｐＨが酸性である細胞組織または区画で放出する上で有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状オルトエステルならびにポリアルキレングリコール類、単糖類もしくは多糖類、親水性治療性分子またはポリアミン型の基から選択される少なくとも一つの親水性置換基を有することを特徴とする酸感受性化合物ならびに該化合物の塩。
【請求項２】
下記式の構造を有する請求項１に記載の酸感受性化合物ならびに該化合物の塩。
【化１】
2004508364.tif 000031
［式中、
・ｇは０、１、２、３または４の値を取り得る整数であり；
・Ｇは、水素原子、飽和もしくは不飽和で直鎖もしくは分岐の形の炭素原子数１〜６のアルキル基、またはアリール基を表し；
・Ｇ１およびＧ２は、
（ａ）一方がポリアミン型の基から選択される親水性置換基を表し；他方が単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体または疎水性デンドリマーから選択される疎水性置換基を表し；あるいは
（ｂ）一方が炭素原子数１０〜２４であって、１以上の不飽和を有していても良い疎水性直鎖アルキル基を表し；他方が下記一般式の基：
【化２】
2004508364.tif 000032
（式中、ｉは１〜４の範囲の整数であり；ｊは９〜２３の範囲の整数であり；親水性置換基は、ポリアミン型の基から選択される）を表し；あるいは
（ｃ）一方がポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される親水性置換基を表し；他方が、ポリアルキレンイミン類から選択される置換基を表し；あるいは
（ｄ）一方がポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される親水性置換基を表し；他方が、単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体、疎水性デンドリマー、あるいは単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体もしくは疎水性デンドリマーとモノマー単位１〜２０個を有するポリアルキレングリコール分子との間の共有結合結合体から選択される疎水性置換基を表し；あるいは
（ｅ）一方がポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される親水性置換基を表し；他方が治療性分子を表し；あるいは
（ｆ）一方が親水性の治療性分子を表し；他方が単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体または疎水性デンドリマーから選択される疎水性置換基を表す。］
【請求項３】
Ｇが、水素、メチル、エチルまたはフェニルから選択される請求項２に記載の酸感受性化合物。
【請求項４】
前記単鎖または二重鎖アルキルが、炭素原子数１０〜２４であって、１以上の不飽和を有していても良い１個または２個の直鎖アルキル鎖からなる請求項２に記載の酸感受性化合物。
【請求項５】
前記ステロイド誘導体が、ステロール類、ステロイド類およびステロイドホルモン類から選択される請求項２に記載の酸感受性化合物。
【請求項６】
前記疎水性デンドリマーがポリ（ベンジルエーテル）である請求項２に記載の酸感受性化合物。
【請求項７】
前記ポリアルキレングリコール類が、平均分子量１０２〜１０５ダルトンを有するポリアルキレングリコール類から選択される請求項２に記載の酸感受性化合物。
【請求項８】
前記ポリアルキレングリコール類が、平均分子量１０２〜１０５ダルトンを有するポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）から選択される請求項７に記載の酸感受性化合物。
【請求項９】
前記単糖類または多糖類が、ピラノース類、フラノース類、デキストラン類、α−アミロース、アミロペクチン、フルクタン類、マンナン類、キシラン類およびアラビナン類から選択される請求項２に記載の酸感受性化合物。
【請求項１０】
前記ポリアルキレングリコールまたは前記単糖類もしくは多糖類が、標的指向要素に共有結合的に連結されている請求項２に記載の酸感受性化合物。
【請求項１１】
前記標的指向要素が、糖類、ペプチド類、蛋白類、オリゴヌクレオチド類、脂質類、神経伝達物質、ホルモン類、ビタミン類またはそれらの誘導体から選択される請求項１０に記載の酸感受性化合物。
【請求項１２】
前記ポリアルキレンイミン類が、下記一般式のモノマー単位を有するポリマーから選択される請求項２に記載の酸感受性化合物。
【化３】
2004508364.tif 000033
［式中、
Ｒは水素原子または下記式の基であることができ；
【化４】
2004508364.tif 000034
ｎは２〜１０の整数であり；ｐおよびｑは、合計ｐ＋ｑがポリマーの平均分子量が１００〜１０７Ｄａとなるように選択される整数であり；
ｎの値は、異なる−ＮＲ−（ＣＨ２）ｎ−単位間で変動し得るものである。］
【請求項１３】
前記置換基Ｇ１およびＧ２のそれぞれが、「スペーサー」分子を介して前記環状オルトエステルに間接的に連結されている請求項２に記載の酸感受性化合物。
【請求項１４】
前記「スペーサー」分子が、アルキル類（炭素原子数１〜６）、カルボニル、エステル、エーテル、アミド、カーバメートもしくはチオカーバメート結合、グリセリン、尿素、チオ尿素またはそれらの基のいくつかの組み合わせから選択される請求項１３に記載の酸感受性化合物。
【請求項１５】
前記治療性分子が、ペプチド類、オリゴペプチド類、蛋白類、抗原類およびそれの抗体類、酵素類およびそれの阻害剤類、ホルモン類、抗生物質、鎮痛薬、気管支拡張薬、抗微生物薬、抗高血圧薬、心血管薬、中枢神経系に作用する薬剤、抗ヒスタミン薬、抗鬱薬、精神安定薬、抗痙攣薬、抗炎症物質、刺激薬、鎮吐薬、利尿薬、鎮痙薬、抗虚血薬、細胞死を制限する薬剤または抗癌剤から選択される請求項２に記載の酸感受性化合物。
【請求項１６】
請求項１ないし１５のいずれかに記載の酸感受性化合物を少なくとも１種類含む組成物。
【請求項１７】
少なくとも１種類の生物活性物質および請求項２に記載の酸感受性化合物を含み、Ｇ１およびＧ２が（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）で示される定義を有する組成物。
【請求項１８】
前記生物活性物質が、請求項１５に記載の治療性分子または核酸である請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
さらに１以上の補助剤を含む請求項１６および１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
前記補助剤が１以上の中性脂質である請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記補助剤が、天然または合成の両性イオン性脂質または生理条件下ではイオン電荷を持たない脂質から選択される請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記補助剤が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンならびに１〜３回Ｎ−メチル化されたそれらの誘導体、ホスファチジルグリセリン類、ジアシルグリセリン類、グリコシルジアシルグリセリン類、セレブロシド類（特に、ガラクトセレブロシド類など）、スフィンゴ脂質（特に、スフィンゴミエリン類など）あるいはアシアロガングリオシド類（特に、アシアロＧＭ１およびＧＭ２など）から選択される請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
さらに、注射製剤用の製薬上許容される媒体を含む請求項１６ないし２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
さらに、皮膚および／または粘膜への投与用の製薬上許容される媒体を含む請求項１６ないし２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
疾患治療用の医薬品製造における請求項１ないし１５のいずれかに記載の酸感受性化合物の使用。
【請求項２６】
核酸トランスフェクション用の医薬品製造における、請求項２に記載されており、Ｇ１およびＧ２が（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）で示される定義を有する酸感受性化合物の使用。
【請求項２７】
医薬品として使用される、請求項２に記載されており、Ｇ１およびＧ２が（ｅ）または（ｆ）で示される定義を有する酸感受性化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、酸感受性化合物およびその化合物の製造に関する。これらの化合物は、少なくとも１個の親水性置換基および酸感受性である環状オルトエステルを有する。これらの化合物は、生物活性物質と結合体（リポソーム、複合体、ナノ粒子など）を形成し、それらをｐＨが酸性である細胞組織または区画に放出するのに有用であるか、あるいは生物活性物質を包み込んだ粒子を安定化し、それを酸性媒体中で不安定化するためのノニオン系界面活性剤として有用であるか、あるいは治療性分子に共有結合的に結合して、それをｐＨが酸性である細胞組織または区画に放出するベクターとして有用である。
【０００２】
（背景技術）
生理的に正常のものと比較して酸性度の高い組織または細胞への生物活性物質の放出は、多くの研究が取り挙げている既知の問題であって、現在のところ、結果的に完全に満足な結果が得られていない。そこで、多くのｐＨ感受性リポソームを設計して、ある種の組織またはエンドソームの酸性化を利用することで生物活性物質を放出することが行われている。
【０００３】
例えばヤトビンら（Ｙａｔｖｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｖｏｌ． ２１０， １９８０， ｐｐ．１２５３−４）は、下記式の従来のリポソームの脂質二重層内に挿入され得るｐＨ感受性脂質を設計している。
【０００４】
【化５】
2004508364.tif 000002
この脂質に存在するホモシステインは、中性またはアルカリ性のｐＨでは開環型であり、その場合には、リポソームの二重層内に完全に挿入される脂肪酸に似ている。酸性のｐＨでは、それは閉環型で存在する。それは次に、環状チオラクトンを形成することで、リポソーム二重層を不安定化することで活性物質の放出を可能とする中性脂質に似ている。そのような分子は、ｐＨが生理的ｐＨより低い身体領域、例えば原発腫瘍、転移または炎症部位および感染部位における医薬分子の放出を可能とするものである。
【０００５】
米国特許第５９６５４３４号には、下記式のカチオン性ｐＨ感受性親水性部分を有する両親媒性脂質が提案されている。
【０００６】
【化６】
2004508364.tif 000003
式中、Ｒ１およびＲ２は互いに独立に、ＣＨ３（ＣＨ２）１４、ＣＨ３（ＣＨ２）１２、ＣＨ３（ＣＨ２）７ＣＨＣＨ（ＣＨ２）７を表し；Ｒ３は、置換基１−メチルイミダゾール、イミダゾール、４，９−ジオキソ−１，１２−ドデカンジアミン、システアミン、１−（３−アミノプロピル）イミダゾール、モルホリン、４−アミノピリジン、ピリジン、グアニジン、ヒドラジン、チオウロニウムまたはピペラジンを表す。
【０００７】
これらの化合物は、ｐＨが８．０から４．５に低下すると増加する全体的な正電荷（化合物Ｒ３のレベルで）を有するという特徴的特性を有する。この電荷調節はリポソームの立体配座的変形を誘発することで、リポソームにその内容物を放出させる。そこでこれらの脂質は、ｐＨが４．５以下で変動する酸性媒体中に医薬分子または核酸分子を放出させる。
【０００８】
さらに、特許出願ＷＯ　９７／３１６２４には、細胞質で分解し得るビニルエーテル官能基を有し、下記一般式の構造を有するｐＨ感受性リン脂質（「誘発性（ｔｒｉｇｇｅｒａｂｌｅ）脂質）が提案されている。
【０００９】
【化７】
2004508364.tif 000004
式中、ｐおよびｑは０または１であり；これら二つのうちの少なくとも一つは１であり；Ｒ１およびＲ２は互いに独立に、炭素原子数１２〜２４のアルキルまたはアルケンを表し；Ｒは２−アミノエチル、２−（トリメチルアミノ）エチル、２−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エチル、２−（トリメチル−アンモニウム）エチル、２−カルボキシ−２−アミノエチル、スクシンアミド−エチルまたはイノシチルから選択される基を表す。
【００１０】
これらのリン脂質を、それ自体が細胞受容体リガンドと複合体を形成する他のリン脂質と混合して、酸性ｐＨで立体配座変化を受けることができるリポソームを形成する。そのようなリポソームによって、多くの医薬物質の包み込み、そしてさらには遺伝子療法用の核酸の包み込みを行うことができる。
【００１１】
別の手法も報告されており（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．， Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ． １９９９， １６（３）， ｐｐ．２４５−８８）、そこでは、治療性分子を酸感受性結合を介してポリマーに共有結合的に結合させて、前記治療性分子を、弱酸性の腫瘍組織あるいは高分子結合体の細胞取り込み後のエンドソームおよびリソソームに放出させる。そうして、多くの可能な結合が報告されており、例えばアセタール、ジスルフィド、ヒドラゾン、シス−アコニトリル（ｃｉｓ−ａｃｏｎｉｔｒｉｌｅ）、トリチルまたはシリル化エーテル結合などがある。
【００１２】
しかしながら、今日までに開発されたいずれのｐＨ感受性化合物も、その感受性に関して調節できないという欠点を有する。従って、標的の組織もしくは細胞、放出される生物活性物質または想到される用途などに応じて感受性を調節可能な酸不安定性化合物を持つことができることは、非常に有利であるものと考えられる。より一般的には、製造が容易であって、特に核酸のトランスフェクションにおいて有効な新たなｐＨ感受性化合物を持つことも有利であると考えられる。
【００１３】
（発明の開示）
この問題を解決するため、本出願人は、環状オルトエステルならびにポリアルキレングリコール類、単糖類もしくは多糖類、親水性治療性分子またはポリアミン型の基から選択される少なくとも一つの親水性置換基を有することを特徴とする新規な種類の酸感受性化合物を開発した。
【００１４】
そのような化合物は、酸感受性である環状オルトエステル官能基によって、身体の酸性領域への生物活性物質の指向（ｖｅｃｔｏｒｉｚａｔｉｏｎ）および放出において有用である。それらは、中心の炭素上に存在する置換基およびオルトエステル環の大きさの選択に応じて化合物のｐＨ感受性を調節可能であることにより、特に有利である。従って、その化合物の加水分解の動力学を広い範囲で変動させることが可能であり、従って生物活性物質の放出に要する時間を調節することが可能である。さらに、本発明による酸感受性化合物は、自己触媒的に酸性媒体中で分解するようになるという別の長所を有する。実際に、本発明による酸感受性化合物の部分分解によって、ｐＨ低下を誘発する酸（例えば、原料化合物がオルトギ酸エステル由来の場合にはギ酸、あるいは原料化合物がオルト酢酸エステル由来である場合には酢酸、あるいは原料化合物がオルト安息香酸エステル由来である場合には安息香酸）が徐々に放出され、その分解がさらに促進される。
【００１５】
より詳細には、本発明による酸感受性化合物は、下記式の構造を有する。
【００１６】
【化８】
2004508364.tif 000005
式中、
・ｇは０、１、２、３または４の値を取り得る整数であり；
・Ｇは、水素原子、飽和もしくは不飽和で直鎖もしくは分岐の形の炭素原子数１〜６のアルキル基、またはアリール基を表し；
・Ｇ１およびＧ２は、
（ａ）一方がポリアミン型の基から選択される親水性置換基を表し；他方が単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体または疎水性デンドリマーから選択される疎水性置換基を表し；あるいは
（ｂ）一方が炭素原子数１０〜２４であって、１以上の不飽和を有していても良い疎水性直鎖アルキル基を表し；他方が下記一般式の基：
【００１７】
【化９】
2004508364.tif 000006
（式中、ｉは１〜４（両端を含む）から選択される整数であり；ｊは９〜２３（両端を含む）から選択される整数であり；親水性置換基は、ポリアミン型の基から選択される）を表し；あるいは
（ｃ）一方がポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される親水性置換基を表し；他方が、ポリアルキレンイミン類から選択される置換基を表し；あるいは
（ｄ）一方がポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される親水性置換基を表し；他方が、単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体、疎水性デンドリマー、あるいは単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体もしくは疎水性デンドリマーとモノマー単位１〜２０個を有するポリアルキレングリコール分子との間の共有結合結合体から選択される疎水性置換基を表し；あるいは
（ｅ）一方がポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される親水性置換基を表し；他方が治療性分子を表し；あるいは
（ｆ）一方が親水性の治療性分子を表し；他方が単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体または疎水性デンドリマーから選択される疎水性置換基を表す。
【００１８】
オルトエステルの中心炭素上にある置換基Ｇを選択して、本発明による酸感受性化合物の感受性を調節する。そこで、基Ｇの電子供与性が高いほど化合物の酸感受性が高く、基Ｇの電子吸引性が高いほど化合物の酸感受性は低い。従って、基Ｇの選択が一般式（Ｉ）の酸感受性化合物の特性を決定および調節する上で特に重要であるように思われる。本発明の好ましい態様によればＧは、水素原子、飽和もしくは不飽和で直鎖もしくは分岐の形での炭素原子数１〜６のアルキル基あるいはアリール基から選択される。さらに有利な形では、Ｇは水素、メチル、エチルまたはフェニルから選択される。
【００１９】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明に関して、「アリール基」という表現は、１価の芳香族炭化水素基を意味するものである。本発明におけるアリール基は、一般に６〜１４個の炭素原子を有する。好ましくは本発明におけるアリール基は、フェニル、ナフチル（例えば１−ナフチルもしくは２−ナフチル）、ビフェニリル（例えば２−ビフェニリル、３−ビフェニリルまたは４−ビフェニリル）、アントリルまたはフルオレニルから選択される。フェニルが特に好ましい。アリール基、特にフェニルは置換されていても良く、例えばモノ置換、ジ置換、トリ置換またはテトラ置換されており、それらの置換基は同一でも異なっていても良い。好ましくはその置換基は、ハロゲン原子、（Ｃ１〜Ｃ８）アルキル基または（Ｃ１〜Ｃ８）アルコキシ基から選択される。モノ置換フェニル基の場合、前記置換基は２位、３位または４位に置換されていても良い。ジ置換フェニル基の場合、前記置換基は２，３位、２，４位、２，５位、２，６位、３，４位または３，５位にあることができる。トリ置換フェニル基の場合、その置換基は、例えば２，３，４位、２，３，５位、２，４，５位、２，４，６位、２，３，６位または３，４，５位にあることができる。
【００２０】
場合に応じて、置換基Ｇ１およびＧ２のそれぞれは、環状オルトエステルに直接結合しているか、あるいは当業者には公知であるものから選択される「スペーサー」分子を介して間接的に連結されている。そのような「スペーサー」分子によって、結合を形成するだけでなく、対象の置換基を環状オルトエステルから離れさせて、酸感受性環状オルトエステルとそれの置換基との間の望ましくない相互作用を低減することもできる。好ましいスペーサー分子は、例えばアルキル類（炭素原子数１〜６）、カルボニル、エステル、エーテル、アミド、カーバメートもしくはチオカーバメート結合、グリセリン、尿素、チオ尿素またはそれらの基のいくつかの組み合わせから、置換基Ｇ１またはＧ２の性質に応じて選択することができる。例えば、疎水性置換基がステロイド誘導体の場合、スペーサー分子はカーバメート−Ｎ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−型の結合であることができるか、あるいは疎水性置換基が二重鎖アルキルの場合、スペーサー分子は式−アルキル−Ｃ（Ｏ）−Ｎの基から選択することができ、その場合２個のアルキル鎖が窒素原子に固定されている。
【００２１】
本発明の好ましい態様によれば、ポリアミン型の基とは、少なくとも３個の炭素原子を有し、少なくとも１個のメチレン基がアミノ基で置き換わっていても良く、そのアミノ基は置換されていても良く（例えばメチル基で）、末端メチルが（１級、２級、３級または４級）アミン類、グアニジン類または環状グアニジン類から選択される１以上の基で置換されている直鎖または分岐のアルキルであると定義することができる。これらのポリアミン型の基は好ましくは、すでに公知であって、核酸の指向について文献に、例えば公開ＷＯ９６／１７８２３、ＷＯ９７／１８１８５、ＷＯ９８／５４１３０またはＷＯ９９／５１５８１に記載のポリアミン基から選択される。詳細には、それには例えば、下記一般式のポリアミン類などがあり得る。
【００２２】
【化１０】
2004508364.tif 000007
式中、
−Ｒは、非存在であることから環状オルトエステルとの共有結合を表すただ１個のＲ基を除いて水素原子であり；
−ｎは１〜９（両端を含む）の整数であり；
−ｍは２〜６（両端を含む）の整数であり、ｍの値は異なる−（ＣＨ）ｍ−ＮＨ−基内で同一でも異なっていても良い。
【００２３】
別の態様によれば、それはまた、下記一般式のポリアミン型の基を含むことができる。
【００２４】
【化１１】
2004508364.tif 000008
式中、
−Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は互いに独立に、水素原子または基−（ＣＨ２）ｑ−ＮＲＲ＝を表し、ｑは１、２、３、４、５および６の間で変動することができ、それは、異なる基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３間で独立であり；ＲおよびＲ＝は互いに独立に、水素原子または−（ＣＨ２）ｑ＝−ＮＨ２を表し、ｑ＝は１、２、３、４、５および６の間で変動することができ、それは異なる基ＲおよびＲ＝の間で独立であり；
−ｍおよびｐは互いに独立に、１〜６の間で変動し得る整数を表し；
−ｎは、０〜６の間で変動し得る整数を表し；ｎが１より大きい場合、ｍは異なる値を取ることができ、Ｒ３は前記一般式において異なる意味を有し、ｎが０である場合、Ｒ１およびＲ２のうちの少なくとも一方は水素とは異なる。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、ポリアミン型の基は、前記のものと同一の一般式を有する置換基であって、ＲおよびＲ＝が互いに独立に、水素原子または下記式（１）の基を表すもので表すことができる。
【００２６】
【化１２】
2004508364.tif 000009
上記式中、ｒは０〜６（両端を含む）で変動し得る整数であり；基Ｒ５は互いに独立に、水素原子、アルキル、カーバメートまたは脂肪族もしくは芳香族アシル置換基を表し；その置換基はハロゲン化されていても良く；基Ｒ１、Ｒ２およびＲ３のうちの少なくとも一つが少なくとも１個の式（１）の基を有するものである。
【００２７】
そこで、１以上の末端グアニジン官能基を有するポリアミン型の基が得られる。
【００２８】
本発明の別の態様によれば、ポリアミン型の基はまた、上記したようなポリアミンであって、下記式（２）の環状グアニジン型の末端基（アミンやグアニジンに代えて）を有するものも表すことができる。
【００２９】
【化１３】
2004508364.tif 000010
式中、
・ｍおよびｎは互いに独立に、０〜３（両端を含む）の整数であって、ｍ＋ｎは１以上となるものであり；
・Ｒ１は、下記式（３）の基を表し
【００３０】
【化１４】
2004508364.tif 000011
上記式中、ｐおよびｑは互いに独立に、０〜１０（両端を含む）の整数であり；Ｙはカルボニル、アミノ、メチルアミノまたはメチレン基を表し；Ｙは異なる［（ＣＨ２）ｐ−Ｙ］基で異なる意味を有することができ；（＊）は、水素原子または共有結合を表し；Ｒ１はＺを含む一般式（２）のいずれの原子にも連結されていることができること、また式（２）には１個の基Ｒ１があること；
・Ｘは基ＮＲ２またはＣＨＲ２を表し；Ｒ２は水素原子または上記で定義の基Ｒ１との結合であり；
・基
【００３１】
【化１５】
2004508364.tif 000012
は、次のものを表す。
＊第１の場合
下記一般式（４）の基：
【００３２】
【化１６】
2004508364.tif 000013
［式中、Ｗ＝はＣＨＲ＝＝＝またはＮＲ＝＝＝を表し；Ｒ＝＝およびＲ＝＝＝は互いに独立に、水素原子、メチルまたは上記で定義の基Ｒ１との結合である］または
＊第２の場合
下記一般式（５）の基：
【００３３】
【化１７】
2004508364.tif 000014
［式中、Ｗ＝はＣＨＲ＝＝＝またはＮＲ＝＝＝を表し；Ｒ＝およびＲ＝＝＝は互いに独立に、水素原子、メチルまたは上記で定義の基Ｒ１との結合である］
を表す。
【００３４】
一般には、特に静電相互作用による核酸との結合について当業者には公知の任意のポリアミン型の他の基も好適であり得る。
【００３５】
本発明に関して、単鎖または二重鎖アルキルとは、炭素原子数１０〜２４であって、１以上の不飽和を有していても良い１個または２個の直鎖アルキル鎖からなる疎水性基を表す。二重鎖アルキルの場合、それは例えば、窒素原子に結合していることで、ジアルキルアミノ置換基を形成している２個のアルキル鎖を含むことができ、その２個のアルキル鎖は例えば、直鎖であって、炭素原子数１０〜２４であり、１以上の不飽和を有していても良い。それは例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸またはミリスチン酸などの飽和または不飽和脂肪酸などであり得る。好ましくは、単鎖または二重鎖アルキルは炭素原子１２〜１８個を有しており、さらに好ましくはそれは、炭素原子１２個、１４個、１６個または１８個（各アルキル鎖について）を有する基から選択される。
【００３６】
本発明に関して「ステロイド誘導体」とは、例えばステロール類、ステロイド類およびステロイドホルモン類から選択される置換基を意味する。より好ましくはステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、３−α−５−シクロ−５−α−コレスタン−６β−オール、コール酸、ギ酸コレステリル、ギ酸コレスタニル、ギ酸３α，５−シクロ−５α−コレスタン−６β−イル、コレステリルアミン、６−（１，５−ジメチルヘキシル）−３ａ，５ａ−ジメチルヘキサデカヒドロシクロペンタ−［ａ］シクロプロパ［２，３］シクロペンタ［１，２−ｆ］ナフタレン−１０−イル−アミン、コレスタニルアミンまたはデキサメタゾンから選択される。
【００３７】
本発明における疎水性デンドリマーは好ましくは、疎水性ポリ（アルキルエーテル）類または疎水性ポリ（アリールエーテル）類から選択される。特に有利な形態では、本発明における疎水性デンドリマーは、ポリ（ベンジルエーテル）類から選択される。
【００３８】
本発明に関して、ポリアルキレングリコール類は好ましくは、平均分子量１０２〜１０５ダルトン（Ｄａ）を有し、標的指向要素に共有結合的に連結していても良いポリアルキレングリコール類から選択される。特に有利な形態では、本発明におけるポリアルキレングリコール類は、平均分子量１０２〜１０５Ｄａ、より好ましくは５００〜１０５Ｄａを有するポリエチレングリコール類（ＰＥＧ）から選択される。
【００３９】
本発明に関して、「単糖類または多糖類」とは、標的指向要素に共有結合的に連結していても良い１以上の糖からなる分子を意味する。例として、ピラノース類およびフラノース類を挙げることができ、例えばグルコース、マンノース、ラムノース、ガラクトース、フルクトースまたはマルトース、乳糖、サッカロース、ショ糖、フコース、セロビオース、アロース、ラミナロビオース（ｌａｍｉｎａｒｏｂｉｏｓｅ）、ゲンチオビオース、ソホロース、メリビオースなどがある。さらにそれは、いわゆる「複合」糖を含むこともできる。すなわち互いに共有結合的に結合しているいくつかの糖であり、各糖は好ましくは上記で挙げたものから選択される。好適な多糖類としては、デキストラン類、α−アミロース、アミロペクチン、フルクタン類、マンナン類、キシラン類およびアラビナン類があり得る。好ましくは本発明における単糖類または多糖類は、天然糖類、シクロデキストリン類またはデキストラン類などの薬理用途に適合する天然または商業的誘導体から選択される。
【００４０】
本発明の別の形態によれば、ポリアルキレングリコールまたは単糖類もしくは多糖類は、標的指向要素に共有結合的に連結されていても良い。その場合それには、本発明による酸感受性化合物またはそれを含む組成物を、ある細胞種またはある所望の組織（腫瘍細胞、肝細胞、造血細胞など）に向かわせることができる細胞外標的指向要素を含むことができるか、あるいはある種の好ましい細胞区画（ミトコンドリア、核など）に指向させることができる細胞内標的指向要素を含むことができる。
【００４１】
本発明の文脈で使用することができる標的指向要素の中で言及できるものとしては、糖類、ペプチド類、蛋白類、オリゴヌクレオチド類、脂質類、神経伝達物質、ホルモン類、ビタミン類またはそれらの誘導体がある。好ましくはそれには、糖類、ペプチド類、ビタミン類または蛋白類があり、例えば抗体もしくは抗体断片、細胞受容体のリガンドもしくはそれの断片、受容体または受容体断片などがある。例えばそれには、成長因子受容体のリガンド、サイトカイン受容体、細胞レクチン型の受容体、葉酸受容体またはインテグリン類などの接着蛋白の受容体に対して親和性を有する配列ＲＧＤを持つリガンドなどがあり得る。トランスフェリン、ＨＤＬ類およびＬＤＬ類または葉酸輸送体の受容体も挙げることができる。標的指向要素はまた、アシアロ糖蛋白の受容体またはシアリルルイスＸのようなシアライド（ｓｙａｌｙｄｅｓ）の受容体のようなレシチン類、あるいは抗体Ｆａｂ断片、または単鎖抗体（ＳｃＦｖ）を指向させることが可能な糖であることもできる。
【００４２】
本発明に関して、「ポリアルキレンイミン類」とは、公開ＷＯ　９６／０２６５５に記載のポリマー、すなわち下記一般式のモノマー単位を有するポリマーを表す。
【００４３】
【化１８】
2004508364.tif 000015
式中、
Ｒは水素原子または下記式の基であることができ；
【００４４】
【化１９】
2004508364.tif 000016
ｎは２〜１０の整数であり；ｐおよびｑは、合計ｐ＋ｑがポリマーの平均分子量が１００〜１０７Ｄａとなるように選択される整数である。
【００４５】
この式では、ｎの値は異なる−ＮＲ−（ＣＨ２）ｎ−単位間で変動し得る。そこで、この式は単独重合体とヘテロ重合体の両方を包含するものである。市販のポリアルキレンイミン類が有利な選択肢である。ポリエチレンイミン類（ＰＥＩ）が最も好ましく、より具体的にはＰＥＩ２５Ｋ（平均分子量２５ＫＤａのＰＥＩ）、ＰＥＩ５０Ｋ、ＰＥＩ１００ＫまたはＰＥＩ２００Ｋである。
【００４６】
本発明において、「治療性分子」とは、生理的に正常なものと比較して酸性度の高い身体領域で発現する病気を予防または治療することを可能とする分子を意味する。そのような領域はより具体的には、
−腫瘍、詳細には生理的に正常なものより高い局所酸性度を示す腫瘍細胞およびその腫瘍細胞付近の正常細胞（例えば、腫瘍の内皮細胞）（Ｎ． Ｒａｇｈｕｎａｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｄｒｕｇ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｕｐｄａｔｅｓ， ２０００， ３， ｐｐ．３０−３８）；
−虚血の影響を受けた筋肉、例えば部分的に糖型の炭化水素または脂肪酸の嫌気性発酵によって産生される乳酸のために酸性症が生じている心筋；
−大食細胞による超酸化物イオンの産生が多量の酸素を消費する炎症領域；あるいは
−代謝、感染または炎症障害が局所酸性症を生じている組織
であるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
別の形態によれば、本発明における「治療性分子」は、酸性の細胞区画、例えば酸性である細胞のエンドソームへのそれの放出によって、病気を予防または治療することができる。
【００４８】
そこで治療性分子は、例えばペプチド類、オリゴペプチド類、蛋白類、抗原類およびそれの抗体類、酵素類およびそれの阻害剤類、ホルモン、抗生物質、鎮痛薬、気管支拡張薬、抗微生物薬、抗高血圧薬、心血管薬、中枢神経系に作用する薬剤、抗ヒスタミン薬、抗鬱薬、精神安定薬、抗痙攣薬、抗炎症物質、刺激薬、鎮吐薬、利尿薬、鎮痙薬、抗虚血薬、細胞死を制限する薬剤または抗癌剤から選択することができる。
【００４９】
さらに、「生物活性物質」とは、上記の治療性分子または核酸から選択される物質を意味する。
【００５０】
本発明に関して「核酸」とは、デオキシリボ核酸およびリボ核酸の両方を意味する。これは、天然または合成の配列を含むことができ、詳細にはゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ハイブリッド配列または合成もしくは半合成配列、修飾を受けたもしくは受けていないオリゴヌクレオチドがある。これらの核酸は、例えばヒト、動物、植物、細菌、ウィルスまたは合成由来のものであることができる。これらは当業者には公知の方法によって得ることができ、詳細にはライブラリーのスクリーニング、化学合成あるいはライブラリーのスクリーニングによって得られた配列の化学的もしくは酵素的修飾を含む組み合わせ方法によって得ることができる。それは化学的に修飾することができる。
【００５１】
より詳細にデオキシリボ核酸については、１本鎖または２本鎖、さらには短いオリゴヌクレオチドまたは相対的に長い配列であることができる。詳細には、核酸は有利には、例えばプラスミド、ベクター、エピソームまたは発現カセットからなる。これらのデオキシリボ核酸は詳細には、標的細胞、１以上のマーカー遺伝子、転写もしくは複製の調節に関する配列、治療対象の遺伝子、修飾を受けていてもよいアンチセンス配列あるいは他の細胞要素に結合する領域で機能性を発揮することもある複製起点を有することができる。
【００５２】
好ましくは核酸は、標的細胞で活性である１以上のプロモーターおよび転写ターミネーターの制御下にある治療対象の１以上の遺伝子からなる発現カセットを有する。
【００５３】
本発明に関して、「該当遺伝子の発現カセット」とは、特定の制限部位でベクターに挿入することができるＤＮＡ断片を意味する。そのＤＮＡ断片は、ＲＮＡまたは対象の核ペプチドをコードする核酸配列を有し、さらに、その配列の発現に必要な配列（活性化、プロモーター、ポリアデニル化配列など）を有する。このカセットおよび制限部位は、転写および翻訳の適切な読取枠への発現カセットの挿入を行うように設計されている。
【００５４】
それには、１以上の治療該当遺伝子を有するプラスミドまたはエピゾームが含まれる。例を挙げると、特許出願ＷＯ９６／２６２７０およびＷＯ９７／１０３４３（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載のプラスミドがある。
【００５５】
本発明に関して治療該当遺伝子とは、特に、治療効果を有する蛋白産生物をコードする遺伝子を意味する。そのようにコードされた蛋白産生物は特に、蛋白またはペプチドであることができる。この蛋白産生物は、標的細胞に対して外因性、相同性または内因性であることができる。すなわち、標的細胞が病気を示さない場合に標的細胞で正常に発現される産生物である。その場合、蛋白の発現によって、例えば細胞での不十分な発現または修飾のために不活性であるか活性の弱い蛋白の発現を補償したり、あるいはその蛋白を過剰発現することが可能となる。治療該当遺伝子は、例えば高い安定性または変化した活性を有する細胞蛋白の突然変異体をコードすることもできる。蛋白産生物は、標的細胞に関して異種であることもできる。その場合、発現蛋白は例えば、細胞において欠乏している活性を補給または提供することで、病気と戦うことができるようにしたり、あるいは免疫応答を刺激することができる。
【００５６】
本発明に関する治療性産生物の中では、より詳細には、酵素、血液誘導体、ホルモン類、リンフォカイン類、インターロイキン類、インターフェロン類またはＴＮＦ（例：ＦＲ９２／０３１２０）、成長因子、神経伝達物質またはそれらの前駆体もしくは合成酵素、栄養因子（例：ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５またはＨＡＲＰ／プレイオトロフィン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ））、アポリポ蛋白（例：ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶまたはＡｐｏＥ：ＦＲ９３／０５１２５）、ジストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）またはミニジストロフィン（ｍｉｎｉｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）（ＦＲ９１／１１９４７）、嚢胞性線維症関連蛋白ＣＦＴＲ、腫瘍抑制遺伝子（例：ｐ５３、Ｒｂ、Ｒａｐ１Ａ、ＤＣＣまたはｋ−ｒｅｖ：ＦＲ９３／０４７４５）、凝血に関与する因子をコードする遺伝子（因子ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ）、ＤＮＡ修復に関与する遺伝子、自殺遺伝子（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ）、ヘモグロビンその他の蛋白キャリアの遺伝子、代謝酵素、分解酵素などを挙げることができる。
【００５７】
治療該当核酸はまた、標的細胞での発現によって遺伝子の発現または細胞性ｍＲＮＡの転写を制御することが可能となる遺伝子またはアンチセンス配列であることもできる。そのような配列は例えば、特許ＥＰ１４０３０８に記載の方法に従って、細胞性ｍＲＮＡに対して相補的であることから、蛋白へのそれの翻訳を遮断するＲＮＡに標的細胞で転写することができる。その治療性遺伝子はまた、選択的に標的ＲＮＡを破壊することができるリボザイムをコードする配列を有する（ＥＰ３２１２０１）。
【００５８】
上記のようにその核酸は、ヒトまたは動物において免疫応答を生じることができる抗原ペプチドをコードする１以上の遺伝子を有することもできる。その特定の実施形態では、本発明によって、特に微生物、ウィルスまたは癌に対してヒトまたは動物に施されるワクチンまたは免疫療法治療薬の生産を行うことができる。それには特に、エプスタイン−バールウイルス、ＨＩＶウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス（ＥＰ１８５５７３）、仮性狂犬病ウイルス、シンシチア（ｓｙｎｃｉｔｉａ）形成ウィルス、他のウィルスに対して特異的な抗原ペプチドまたは腫瘍に対して特異的な抗原ペプチド（ＥＰ２５９２１２）などがあり得る。
【００５９】
好ましくは核酸は、所望の細胞または臓器で、治療該当遺伝子および／または抗原ペプチドをコードする遺伝子の発現を行うことができる配列も有する。それには、自然において感染細胞でその配列が機能することができる場合に考えられる遺伝子の発現に関与する配列などがあり得る。それにはまた、異なる起源の配列もあり得る（他の蛋白の発現に関与するもの、あるいは合成のもの）。詳細にはそれには、真核生物遺伝子またはウィルス遺伝子のプロモーター配列などがあり得る。例えばそれには、感染することが望ましい細胞のゲノム由来のプロモーター配列などがあり得る。同様にそれには、ウィルスのゲノム由来のプロモーター配列などがあり得る。その点に関しては例えば、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶおよびＲＳＶ遺伝子などのプロモーターを挙げることができる。さらに、これらの発現配列は、活性化配列または調節配列などの付加によって修飾することができる。それにはさらに、誘導性または抑制性のプロモーターなどもあり得る。
【００６０】
さらに前記核酸は、特に該当の治療遺伝子の上流で、標的細胞の分泌経路で合成される治療性産生物を指向するシグナル配列を有することもできる。このシグナル配列は、治療性産生物の天然シグナル配列であることができるが、他の機能性シグナル配列または合成シグナル配列であることもできる。前記核酸は、合成される治療性産生物を、細胞の特定の区画に指向させるシグナル配列を有することもできる。
【００６１】
本発明の好ましい態様によれば、酸感受性化合物はより具体的には、下記一般式の化合物から選択される。
【００６２】
【化２０】
2004508364.tif 000017
式中、
・ｇは０または１である整数であり；
・Ｇは、水素原子、飽和もしくは不飽和で直鎖もしくは分岐の形の炭素原子数１〜６のアルキル置換基、またはアリールを表し；
・Ｇ１およびＧ２は、
（ａ）一方がポリアミン型の基から選択される親水性置換基を表し；他方が単鎖もしくは二重鎖アルキルまたはステロイド誘導体から選択される疎水性置換基を表し；あるいは
（ｂ）一方が炭素原子数１０〜２４であって、１以上の不飽和を有していても良い疎水性直鎖アルキル基を表し；他方が下記一般式の基：
【００６３】
【化２１】
2004508364.tif 000018
（式中、ｉは１〜４の範囲の整数であり；ｊは９〜２３の範囲の整数であり；親水性置換基は、ポリアミン型の基から選択される）を表し；あるいは
（ｃ）一方がポリアルキレングリコール類から選択される親水性置換基を表し；他方が、ポリアルキレンイミン類から選択される置換基を表し；あるいは
（ｄ）一方がポリアルキレングリコール類から選択される親水性置換基を表し；他方が、単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体、あるいは単鎖もしくは二重鎖アルキル、ステロイド誘導体とモノマー単位１〜２０個を有するポリアルキレングリコール分子との間の共有結合結合体から選択される疎水性置換基を表し；あるいは
（ｅ）一方がポリアルキレングリコール類から選択される親水性置換基を表し；他方が治療性分子を表す。
【００６４】
さらに好ましくは本発明の酸感受性化合物は、下記一般式の化合物から選択される。
【００６５】
【化２２】
2004508364.tif 000019
式中、
・ｇは０または１である整数であり；
・Ｇは、水素原子、飽和もしくは不飽和で直鎖もしくは分岐の形の炭素原子数１〜６のアルキル置換基、またはフェニルを表し；
・Ｇ１およびＧ２は、
（ａ）一方がポリアミン型の基から選択される親水性置換基を表し；他方が単鎖もしくは二重鎖アルキルまたはステロイド誘導体から選択される疎水性置換基を表し；あるいは
（ｄ）一方がポリアルキレングリコール類から選択される親水性置換基を表し；他方が、単鎖もしくは二重鎖アルキルまたはステロイド誘導体から選択される疎水性置換基を表す。
【００６６】
一般式（Ｉ）の新規な酸感受性化合物は、無毒性かつ製薬上許容される塩の形で提供することができる。その無毒性塩には、無機酸（塩酸、硫酸、臭化水素酸、リン酸または硝酸）または有機酸（酢酸、プロピオン酸、コハク酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、フマル酸、メタンスルホン酸またはシュウ酸）との塩が含まれる。
【００６７】
本発明による酸感受性化合物は、環状オルトエステル基を有する分子の合成について文献に記載の方法から選択される多くの方法に従って製造することができる（例えば、総説Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｒｏｂｅｒｔ Ｈ． ＤｅＷｏｌｆｅ， １９７４， ｐｐ．１５３−１７２にある例を挙げることができる）。想到され得る別法によれば、一般式（Ｉ）の酸感受性化合物は例えば、式Ｇ１ＯＨのアルコールを下記一般式のオルトエステルと反応させることで得ることができる。
【００６８】
【化２３】
2004508364.tif 000020
式中、ｇ、Ｇ、Ｇ１およびＧ２は一般式（Ｉ）について定義した通りであり；Ｚは炭素原子数１〜４個の直鎖または分岐アルキル基を表す。
【００６９】
この置換は、酸触媒の存在下に行うことができ、および／または溶媒を使用しもしくはせずに５０〜１５０℃の温度で加熱して活性化することができる。溶媒存在下での操作を行うことを選択する場合、その溶媒は、例えば有機塩素系溶媒、芳香族溶媒またはエーテル類などの従来の有機化学溶媒から選択される。触媒を用いる場合、それは無機もしくは有機酸、ルイス酸もしくはブレンステッド酸であることができる。例えばその触媒は、塩酸、硫酸、パラトルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、パラトルエンスルホン酸ピリジニウムまたは塩化マグネシウムから選択することができる。この置換はまた、アルコールＺＯＨがアルコールＧ１ＯＨより揮発性が高い場合に、その反応中に生成するＺＯＨを蒸留することで促進することもできる。その連続蒸留は、常圧または減圧下で加熱することで行うことができる。
【００７０】
原料のアルコールＧ１ＯＨは市販されているか、あるいは当業者には公知の方法、例えば相当するアルケンの水和、相当するハロゲン化誘導体の加水分解、あるいは相当するカルボニル含有誘導体の還元によって合成することができる。
【００７１】
本発明の別の形態によれば、基Ｚはすでに基Ｇ１を表すことができ、その場合には、一般式（ＩＩＩ）のオルトエステルとアルコールＧ１ＯＨの間の反応段階は必要ない。
【００７２】
一般式（ＩＩＩ）の化合物は、下記一般式（ＩＶ）のトリアルキルオルトエステル：
【００７３】
【化２４】
2004508364.tif 000021
［式中、ＺおよびＧは上記で定義の通りであり；Ｚ１およびＺ２は同一でも異なっていても良く、炭素原子数１〜４個の直鎖または分岐のアルキル基を表す］の下記一般式（Ｖ）のジオール：
【００７４】
【化２５】
2004508364.tif 000022
［式中、ｇおよびＧ２は上記で定義の通りである］に対する作用によって得ることができる。
【００７５】
この反応は、例えばグリーンら（Ｔ． Ｗ． Ｇｒｅｅｎｅ ａｎｄ Ｐ． Ｇ． Ｍ． Ｗｕｔｓ， ″Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ″ （２ｎｄ Ｅｄ．， Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ， ｐｐ． １３５−１３６））によって示されている方法に従って、ジオールをオルトエステルとして保護する従来の方法に従って行うことができる。この方法は一般的には、酸触媒存在下に従来の有機溶媒（例えば、有機塩素系溶媒、芳香族溶媒、エーテル類など）中で行う。その触媒は、無機もしくは有機酸、ルイス酸もしくはブレンステッド酸であることができる。例えば、塩酸、硫酸、パラトルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、パラトルエンスルホン酸ピリジニウムまたは塩化マグネシウムを用いることができる。
【００７６】
一般式（ＩＶ）のトリアルキルオルトエステルは市販されているか、あるいは当業者には公知の従来法に従って、例えば相当するエステルから、あるいは別の市販のトリアルキルオルトエステルを原料とするアルコキシ基の置換によって合成することができる。
【００７７】
一般式（Ｖ）のジオールは市販されているか、あるいは市販のジオールとＧ２との間の反応によって得ることができるか、あるいはＧ２のジオールへの直接官能化によって得ることができる。この官能化は例えば、相当するアルケンの酸化、あるいは当業者には公知の方法による相当するエポキシドの開環であることができる。
【００７８】
Ｇ１およびＧ２のいずれかがポリアミン型の基を表す場合、それは市販されているか、あるいは当業者には公知の従来の方法に従って、例えば先行技術に記載の方法（例：公開ＷＯ９６／１７８２３、ＷＯ９７／１８１８５、ＷＯ９８／５４１３０またはＷＯ９９／５１５８１）に従って、あるいは類似の方法に従って得られる。
【００７９】
Ｇ１およびＧ２のいずれかが単鎖または二重鎖アルキルから選択される疎水性置換基を表す場合、後者は市販されているか、あるいは当業者には公知の従来の方法に従って得られる。例えば、それが長い炭素鎖を有するジアルキルアミノ置換基を有する場合、アルキル化（ハロゲン化アルキルのモノ置換）によって、アルキル化還元（アルデヒドから）によって、あるいは縮合／還元（酸からのアミド官能基の形成とそれに続く還元）によって相当する１級アミンから製造することができる。
【００８０】
Ｇ１およびＧ２のいずれかがステロイド誘導体または疎水性デンドリマーから選択される疎水性置換基を表す場合、それは好ましくは市販品から選択される。
【００８１】
Ｇ１およびＧ２のいずれかがポリアルキレングリコール類または単糖類もしくは多糖類から選択される置換基を表す場合、後者は市販されているか、あるいは当業者には公知の従来法によって、詳細には重合によって得られる。その置換基が標的指向要素に共有結合的に連結されている場合、上記の本発明による酸感受性化合物の合成は、当業者の従来法によって、前記標的指向要素のその置換基への結合の前または後に行うことができる。
【００８２】
Ｇ１およびＧ２のいずれかがポリアルキレンイミン類から選択される置換基を表す場合、後者は市販されているか、あるいは当業者には公知の従来法に従って、あるいは先行技術、例えば公開ＷＯ９６／０２６５５に記載の方法に従って得られる。
【００８３】
上記の製造方法は、単に例示方法を構成するものであって、他の均等な製造方法も使用可能であることは当然である。例えば、基Ｇ２を持たないが、代わりに保護されていても良い官能基（例えば、保護アミン）を有する一般式（Ｖ）のジオールを原料とする反応を、基Ｇ２の結合を行う追加の最終段階（例えば、アミンの脱保護とそれに続く式Ｇ２ＣＯＯＨの酸の縮合）を行うことで行うことが可能である。
【００８４】
本発明の別の主題は、上記で定義の一般式（Ｉ）の酸感受性化合物を少なくとも１個含む組成物に関する。本発明の別形態によれば、前記組成物は、少なくとも１種類の生物活性物質ならびにＧ１およびＧ２が（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）で示した定義を有する一般式（Ｉ）の酸感受性化合物を含む。
【００８５】
本発明による組成物はさらに、本発明による酸感受性化合物と生物活性物質との間で形成される複合体と結合することができる１以上の補助剤を含む。従って別の実施形態において本発明は、少なくとも１種類の生物活性物質、Ｇ１およびＧ２が（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）で示した定義を有する式（Ｉ）の酸感受性化合物、ならびに１以上の補助剤を含む組成物に関する。この種の補助剤（例えば、脂質、ペプチドまたは蛋白）が存在することで、生物活性物質がトランスフェクションされる核酸である場合に、化合物のトランスフェクション力を高めることができるという効果を得ることができる。
【００８６】
この点で、本発明による組成物は、補助剤として１以上の中性脂質を含むことができる。実際、中性脂質を加えることで、核脂質粒子（生物活性物質が核酸である場合）の形成を促進し、膜不安定化による細胞へのその粒子の侵入を促進することができることが明らかになっている。
【００８７】
より好ましくは、前記中性脂質は、２個の脂肪族鎖を有する脂質である。特に有利な形態では、天然または合成の両性イオン性脂質または生理条件下ではイオン電荷を持たない脂質を用いる。それらはより詳細には、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、オレオイルパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミンならびに１〜３回Ｎ−メチル化されたそれらの誘導体、ホスファチジルグリセリン類、ジアシルグリセリン類、グリコシルジアシルグリセリン類、セレブロシド類（特に、ガラクトセレブロシド類など）、スフィンゴ脂質（特に、スフィンゴミエリン類など）、あるいはアシアロガングリオシド類（特に、アシアロＧＭ１およびＧＭ２など）から選択することができる。
【００８８】
これらの各種脂質は、当業者には公知の従来の方法により、合成によって、あるいは臓器（例：脳）または卵からの抽出によって得ることができる。詳細には、天然脂質の抽出は、有機溶媒によって行うことができる（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙも参照）。
【００８９】
好ましくは、生物活性物質が核酸である場合、本発明の組成物は、モル／モル基準で１当量の核酸について０．０１〜２０当量の補助剤、より好ましくは０．５〜５当量の補助剤を含む。
【００９０】
本発明による酸感受性化合物は、環状オルトエステルのいずれかの側にある置換基Ｇ１およびＧ２に応じて各種用途を有することができる。
【００９１】
置換基Ｇ１およびＧ２が一般式（Ｉ）での（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に示した定義を有する場合、本発明による酸感受性化合物は、生物活性物質と直接結合体（例えば、リポソーム、複合体またはナノ粒子などの種類）を形成することができ、それを次に、生理的に正常なものより酸性が高い組織または細胞区画中に放出することができる。詳細にはその酸感受性化合物は、核酸のトランスフェクションにおいて特に有用である。
【００９２】
置換基Ｇ１およびＧ２が一般式（Ｉ）での（ｄ）に示した定義を有する場合、本発明による酸感受性化合物は、生物活性物質を包み込んだ粒子を安定化し、さらには身体において非常に弱酸性ないし酸性である領域、特にはｐＨが酸性であって約４〜約７である領域での分解によって前記生物活性物質を放出するという両方の作用を可能とするノニオン系界面活性剤を構成する。
【００９３】
さらに、多糖類またはポリアルキレングリコール置換基、より具体的にはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、血清蛋白の非特異的吸着、および結果的に大食細胞によるその粒子の認識を阻害することで、それらが関連する粒子上にある種の「被覆性」を与えることが知られている（例えば、Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ １９９４， １１９５， ｐｐ．１１−２０またはＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．， ＰＮＡＳ １９９１， ８８， ｐ．１１４６０−４参照）。そこで、本発明によるＰＥＧ分子を有する酸感受性化合物は、安全の観点から長所を有し、それらが他の蛋白と干渉する危険性を低下させるという意味での別の長所を有する。身体の酸性領域のレベルでは、本発明による化合物中に存在するオルトエステルの分解によって、粒子の残りの部分からＰＥＧ分子を分離することが可能となり、生物活性物質が再度「利用可能」となる（実際には、「被覆性の消失」がある。）。そこで、酸性組織に関して、選択的転移を期待することができる。
【００９４】
最後に、置換基Ｇ１およびＧ２が一般式（Ｉ）での（ｅ）または（ｆ）に示した定義を有する場合、本発明による酸感受性化合物は、治療性分子との共有結合的結合体を構成することで、それの指向化が可能となり、身体の酸性領域でのそれの放出が可能となる。その共有結合的結合体は、クラッツら（Ｋｒａｔｚ ｅｔ ａｌ．）が報告したものと同じ種類であるが、治療性分子と「ベクター」部分との間に現時点で用いられているｐＨ感受性結合と比較して調節可能な感受性があるという利点を有する新規な酸感受性結合を有する。
【００９５】
そこで本発明の主題は、疾患を治療するための医薬品製造における、上記で定義の一般式（Ｉ）の酸感受性化合物の使用でもある。その場合、標的となる疾患によって、生物活性物質の選択が決まる。
【００９６】
特に有利な形態によれば、生物活性物質が核酸である場合、Ｇ１およびＧ２が（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で示した定義を有する一般式（Ｉ）の酸感受性化合物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの核酸のトランスフェクション、特には一次細胞または定着した細胞系へのトランスフェクション用の医薬品の製造において用いることができる。それには例えば、分化型または多分化能型（前駆体）での線維芽細胞、筋細胞、神経細胞（ニューロン、星状細胞、神経膠細胞）、肝細胞、造血系の細胞（リンパ球、ＣＤ３４、樹状細胞など）または上皮細胞などがあり得る。
【００９７】
最後に、本発明の別の形態によれば、Ｇ１およびＧ２が（ｅ）または（ｆ）で示した定義を有する一般式（Ｉ）の酸感受性化合物を、医薬品として用いることができる。
【００９８】
以上の説明では、本発明による酸感受性化合物は、ｐＨが生理的に正常なものより酸性の組織または細胞区画で分解するようになる。しかしながら別の形態によれば、当業者には公知の全身または局所処置によって、身体の標的領域での酸性を誘発または上昇させることが可能である。例として、処置対象領域への酸性物質の注射または腫瘍組織の特異的酸性化を引き起こすグルコースの静脈注射などを挙げることができるが、これらに限定されるものではない（Ｔ． Ｖｏｌｋ ｅｔ ａｌ．； Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ； １９９３， ６８（３）， ４９２−５００）。そこで、本発明による酸感受性化合物を、元来は非酸性であるが、当業者に公知の処置によって酸性となった領域で用いることもできる。
【００９９】
上記の本発明による酸感受性化合物の全ての使用に関して、
−Ｇ１およびＧ２が（ｅ）または（ｆ）で示した定義を有する一般式（Ｉ）の酸感受性化合物；あるいは
−Ｇ１およびＧ２が（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）で示した定義を有する一般式（Ｉ）の酸感受性化合物および生物活性物質
を含む本発明による組成物を、例えば局所、皮膚、経口、直腸、膣、非経口、経鼻、静脈、筋肉、皮下、眼球、経皮、気管内または腹腔内の経路による投与用に製剤することができる。好ましくは本発明の組成物は、注射製剤用、特には所望の臓器への直接注射用、あるいは局所経路による投与用（皮膚および／または粘膜に対して）の製薬上許容される媒体を含む。それには特に、等張性で無菌の溶液、あるいは乾燥した、特に状況に応じて滅菌水もしくは生理食塩水を添加することで注射溶液を調製することができる凍結乾燥組成物などがあり得る。注射用に用いられる生物活性物質の用量ならびに投与回数は、各種パラメータに応じて調節可能であり、特には、使用される投与形態、関連する病気、生物活性物質が核酸である場合に発現される鎖または所望の投与期間に応じて調節可能である。より詳細な投与形態に関して、それには例えば腫瘍または循環経路のレベルでの組織への直接注射、あるいは培養細胞の処理とそれのｉｎ ｖｉｖｏでの再移植、注射もしくは移植などがあり得る。本発明の文脈での関連組織には、例えば筋肉、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、血液、骨、軟骨、膵臓、腎臓、膀胱、胃、腸、睾丸、卵巣、直腸、神経系、眼球、腺または結合組織などがある。
【０１００】
以上の構成以外に本発明は、添付の実施例および図面からわかる他の特徴および利点をも有するものであり、それら実施例および図面は本発明を説明するものと考えるべきであって、本発明の範囲を限定するものではない。特に本出願人らは、各種の操作記録や一般式（Ｉ）の化合物を製造するのに用いることができる反応中間体を提案するが、それに限定するものではない。当然のことながら、これらの操作記録および／または中間体生成物から類推して同様の手順を開発することで、本発明による他の式（Ｉ）の化合物に到達することは、当業者であれば可能である。
【０１０１】
図面の簡単な説明
図１は、カチオン性脂質または酸感受性化合物０．４または１．７または６．０ｎｍｏｌ／ＤＮＡμｇという３種類の異なる比率で、ＤＮＡと対照カチオン性脂質または酸感受性化合物Ａ　シンもしくはトランスとの間で形成される複合体のｐＨ５での時間の関数としての蛍光レベルの変動を示す図である。
【０１０２】
図２は、血清を含む場合または含まない場合での、各種使用比率でのＤＮＡと化合物Ａ　シンもしくはトランスまたは対照カチオン性脂質との間で形成された複合体のＨｅＬａ細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏでのトランスフェクションの効率を示す図である。ｙ軸はｐｇ／ウェル／蛋白μｇでのルシフェラーゼの発現を表す。ｘ軸は、化合物Ａ　シンもしくはトランスまたは対照カチオン性脂質／ＤＮＡ使用量比を示す。
【０１０３】
図３は、ＤＮＡ量に関して使用される化合物Ｃまたは化合物ＤまたはＢｒｉｊ７００または化合物Ｄの非酸感受性類縁体（類縁体Ｄ）の量（重量比）の関数としての対照カチオン性脂質／ＤＮＡ核脂質粒子の粒径（ｎｍ単位）の変動を示す図である。径が小さいということは、核脂質粒子が安定化されていることを示している。非常に大きい粒径は、それとは逆に、核脂質粒子の不安定化があって、それらが凝集する傾向を有することを示す。
【０１０４】
図４は、ｐＨが５の場合の各種比率（重量比）での、時間の関数としての対照カチオン性脂質／ＤＮＡ／化合物もしくは類縁体Ｄ核脂質粒子の粒径（ｎｍ単位）の変動を示す図である。小さい径の核脂質粒子は、それが安定化されていることを示している。非常に大きい粒径は、それとは逆に、核脂質粒子の不安定化があって、それらが凝集する傾向を有することを示す。
【０１０５】
図５は、各種ｐＨ（ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６およびｐＨ７．４）での時間の関数としての、対照カチオン性脂質／ＤＮＡ／化合物Ｃもしくは化合物Ｅ核脂質粒子の粒径（ｎｍ単位）の変動を示す図である。化合物Ｃもしくは化合物Ｅ／ＤＮＡ比は１に設定してある（ｎｍｏｌ／ＤＮＡμｇ）。
【０１０６】
図６は、プラスミドｐＸＬ３０３１の模式図である。
【０１０７】
図７は、カチオン性脂質／ＤＯＰＥ／ＤＮＡ（５／５／１）複合体が介在するｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子転移活性に対する化合物Ｄについての用量／応答曲線を示す図である。化合物「類縁体Ｄ」は、陰性対照として使用する。データは、皮下Ｍ１０９腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃマウスについての平均（線）および個々の値（点）である。
【０１０８】
実施例
トリエチルアミン、トリフルオロ酢酸、無水トリフルオロ酢酸、ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル、ブチロラクトン、３−アミノプロパン−１，２−ジオール、セリノール（２−アミノプロパン−１，３−ジオール）、オルトギ酸トリメチル、オルト酢酸トリメチル、パラトルエンスルホン酸、パラトルエンスルホン酸ピリジニウムまたはベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム（ＢＯＰ）ヘキサフルオロホスフェートなどの通常の試薬および触媒は市販のものである。
【０１０９】
洗浄は、飽和塩化ナトリウム水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および０．５ｍｏｌ／Ｌの濃硫酸水素カリウム溶液で行う。
【０１１０】
親水性ポリマー（各種大きさのポリエチレングリコール類）は市販品である。ポリアミン型の親水性置換基も市販されているか、あるいは詳細には下記の実施例で示されている当業者には公知の従来の方法によって合成することができる。疎水性置換基（単鎖または二重鎖ジアルキルアミン類、脂肪族アルコール類など）は市販されているか、あるいは当業者には公知の従来法に従って合成される。例えば、単鎖または二重鎖ジアルキルアミン類は、下記の実施例に示した方法に従って、１級アミンおよび相当するハロゲン化アルキル誘導体から合成することができる。
【０１１１】
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ　ＮＭＲ）スペクトラムは、ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）３００、４００および６００ＭＨｚスペクトル装置で記録した。化学（ｃｌｉｎｉｃａｌ）シフトはｐｐｍ（１／１００００００）単位で表してあり、多重度は通常の略称で表してある。
【０１１２】
使用したプラスミドは、刊行物（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ （１９９９） ６， ｐｐ， １４８２−１４８８）に記載のｐＸＬ３０３１であり、それはサイトメガロウィルスＣＭＶ　Ｅ／Ｐプロモーターの制御下にルシフェラーゼをコードするｌｕｃ遺伝子を有する。このプラスミドは図６に示してある。それの大きさは３６７１ｂｐである。使用のプラスミド溶液は、注射用水で１．２６２ｇ／Ｌに希釈する。
【０１１３】
実施例１：２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（２−メトキシ−［１，３］ジオキソラン−４−イルメチル）アセトアミド（「オルト１」）の合成
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（２−メトキシ−［１，３］ジオキソラン−４−イルメチル）アセトアミド（「オルト１」）は下記式の構造を有する。
【０１１４】
【化２６】
2004508364.tif 000023
それは、３−アミノプロパン−１，２−ジオールから２段階で得ることができる。
【０１１５】
１）Ｎ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミドの製造
３−アミノプロパン−１，２−ジオール１５ｇ（１６４．６ｍｍｏｌ）を、磁気撹拌子を入れた丸底フラスコ中で、テトラヒドロフラン１００ｍＬに溶かす。反応混合物を氷浴で冷却して０℃とし、トリフルオロ酢酸エチル２１．５ｍＬ（１８１．１ｍｍｏｌ）を徐々に加える。反応混合物を室温で２時間撹拌する。粗反応生成物を溶媒留去して乾固させる。そうして、純粋な無色油状物２９ｇが得られ（収率９５％）、その生成物をそれ以上精製せずに用いる。
【０１１６】
２）２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（２−メトキシ−［１，３］ジオキソラン−４−イルメチル）アセトアミド（オルト１）の製造
前段階で得られたＮ−（２，３−ジヒドロキシプロピル）−２，２，２−トリフルオロアセトアミド２９ｇ（１５５ｍｍｏｌ）を、オルトギ酸トリメチル７５ｍＬ（６８５ｍｍｏｌ）を加えた塩化メチレン７５ｍＬに溶かす。パラトルエンスルホン酸３００ｍｇ（１．７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で２時間撹拌する。
【０１１７】
その粗生成物を塩化メチレン５００ｍＬで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム２００ｍＬで３回洗浄し、次に飽和塩化ナトリウム２００ｍＬで３回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮して乾固させる。そうして、それ以上精製せずに、純粋な油状生成物３０ｇが得られる（収率：８５％）。
【０１１８】
１Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δｄ（ｐｐｍ単位））。５０／５０の割合での２種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【０１１９】
＊３．３３および３．３７（２ｓ：計３Ｈ）；３．３５〜３．８０（ｍｔ：３Ｈ）；４．１０〜４．２５（ｍｔ：１Ｈ）；４．５０（ｍｔ：１Ｈ）；５．７３および５．７８（２ｓ：計１Ｈ）；６．６６および７．５５（２つの未分離の複雑なピーク：計１Ｈ）。
【０１２０】
実施例２：２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（２−メトキシ−２−メチル−［１，３］ジオキサン−５−イル）アセトアミド（「オルト２」）の合成
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（２−メトキシ−２−メチル−［１，３］ジオキサン−５−イル）アセトアミド（「オルト２」）は、下記式の構造を有する。
【０１２１】
【化２７】
2004508364.tif 000024
それは、２−アミノプロパン−１，３−ジオール（セリノール）から２段階で得ることができる。
【０１２２】
１）２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチルエチル）アセトアミドの製造
２−アミノプロパン−１，３−ジオール４ｇ（４３．９ｍｍｏｌ）に、テトラヒドロフラン２０ｍＬを加える。反応混合物を氷浴で冷却して０℃とし、トリフルオロ酢酸エチル５．８ｍＬ（４８．３ｍｍｏｌ）を徐々に加える。その溶液を室温で２時間撹拌する。
【０１２３】
反応混合物を溶媒留去して乾固させ、塩化メチレンに３回取ってテトラヒドロフランを完全に留去する。白色粉末８．１ｇ（収率：９９％）が純粋な形で得られ、それをそれ以上精製せずに次の段階で用いる。
【０１２４】
２）２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（２−メトキシ−２−メチル−［１，３］ジオキサン−５−イル）アセトアミド（オルト２）の製造
前段階で得られた２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−１−ヒドロキシメチルエチル）アセトアミド７．９ｇ（４２．２ｍｍｏｌ）を、オルトギ酸トリメチル１６．１ｍＬ（１２６．７ｍｍｏｌ）を加えた塩化メチレン３０ｍＬに溶かす。パラトルエンスルホン酸７３ｍｇ（０．４２ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で３時間撹拌する。
【０１２５】
その粗生成物を塩化メチレン１５０ｍＬで希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液５０ｍＬで３回、次に飽和塩化ナトリウム溶液５０ｍＬで３回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮して乾固させる。そうして白色固体９．９ｇが、それ以上精製せずに純品として得られる（収率：９６％）。
【０１２６】
１Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δｄ（ｐｐｍ単位））。約７５／２５の割合での２種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【０１２７】
＊１．４９および１．５０（２ｓ：計３Ｈ）；３．３４および３．３５（２ｓ：計３Ｈ）；３．６６および３．８２（それぞれｄｍｔ、Ｊ＝１２Ｈｚおよびｄｄ、Ｊ＝１１および８Ｈｚ：計２Ｈ）；３．９０〜４．００および４．２０〜４．３５（２ｍｔ：計１Ｈ）；３．９７および４．３３（それぞれｄｄ、Ｊ＝１１および５Ｈｚならびにｄｍｔ、Ｊ＝１２Ｈｚ：計２Ｈ）；６．３８および７．０４（２つの広い未分離の複雑なピーク：計１Ｈ）。
【０１２８】
実施例３：シンおよびトランス化合物４−｛４−［（２−｛３−［４−（３−アミノ−プロピルアミノ）ブチルアミノ］プロピルアミノ｝アセチルアミノ）メチル］−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ｝−Ｎ，Ｎ−オクタデシルブチルアミド・テトラアセテートの合成
本実施例は、下記式の２種類の異なるジアステレオマー型シンおよびトランスの形での酸感受性化合物Ａの合成経路を説明するものである。
【０１２９】
【化２８】
2004508364.tif 000025
ａ−シンおよびトランス４−（４−アミノメチル−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルブチルアミド（脂質部分−Ｏ−オルト１−ＮＨ２）の合成
この合成は、３段階で行う。ジオクタデシルアミンのアルコールへの官能基化と基オルト１への付加と、それに続く保護基の開裂である。
【０１３０】
１）４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルブチルアミドの製造
塩化アルミニウム４．６ｇ（３４ｍｍｏｌ）にクロロホルム２５ｍＬを加え、全体をサーモスタット調節の浴で約１０℃まで冷却する。トリエチルアミン６．４ｍＬ（４６ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１５ｍＬ）溶液を滴下し、反応混合物を室温に戻す。ジオクタデシルアミン６ｇ（１１．５ｍｍｏｌ）をブチロラクトン１ｍＬ（１３．８ｍｍｏｌ）とクロロホルム１１０ｍＬ中で混合し、それを滴下漏斗を用いて前記の混合物に徐々に加える。
【０１３１】
室温で２時間磁気撹拌子撹拌した後、反応にそれ以上の変化がなくなる。水７５ｍＬを加え、反応混合物を３０分間撹拌する。粗生成物をセライト濾過し、クロロホルムで洗浄する。濾液を放置することで分離し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液５０ｍＬで３回洗浄する。クロロホルム溶液を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮する。シリカでのクロマトグラフィー後に、白色粉末４．９ｇが得られる（収率：７０％）。
【０１３２】
２）シンおよびトランスＮ，Ｎ−ジオクタデシル−４−｛４−［２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）メチル］−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ｝ブチルアミドの製造
前段階で得られた４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルブチルアミド２．８ｇ（４．６ｍｍｏｌ）を２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（２−メトキシ−［１，３］ジオキソラン−４−イルメチル）アセトアミド２．６ｇ（オルト１、１１．５ｍｍｏｌ）および塩化マグネシウム９０ｍｇ（０．９２ｍｍｏｌ）を混合する。全体を無溶媒で８０℃にて２時間加熱する。
【０１３３】
粗反応生成物をシクロヘキサン１５０ｍＬに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム溶液３０ｍＬで３回洗浄し、飽和塩化ナトリウム溶液３０ｍＬで３回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮する。精製をシリカでのクロマトグラフィーによって行う。２種類の予想されるジアステレオマーであるシンおよびトランス１．２ｇおよび１．１ｇが、白色粉末の形で単離される（収率：６２％）。
【０１３４】
化合物シンの１Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δ（ｐｐｍ））：０．８９（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ：６Ｈ）；１．１５〜１．４０（ｍｔ：６０Ｈ）；１．５２（ｍｔ：４Ｈ）；１．９４（ｍｔ：２Ｈ）；２．３９（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ：２Ｈ）；３．２０（広いｔ、Ｊ＝８Ｈｚ：２Ｈ）；３．２９（ｍｔ：２Ｈ）；３．６１（ｔ、Ｊ＝５Ｈｚ：２Ｈ）；３．６６（ｍｔ：２Ｈ）；３．７９（ｄｄ、Ｊ＝８および７Ｈｚ：１Ｈ）；４．１１（ｔ、Ｊ＝８Ｈｚ：１Ｈ）；４．５０（ｍｔ：１Ｈ）；５．８２（ｓ：１Ｈ）；８．１３（未分離の複雑なピーク：１Ｈ）。
【０１３５】
化合物トランスの１Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δ（ｐｐｍ））：０．８９（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ：６Ｈ）；１．１５〜１．４０（ｍｔ：６０Ｈ）；１．５２（ｍｔ：４Ｈ）；１．９４（ｍｔ：２Ｈ）；２．３８（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ：２Ｈ）；３．２１（広いｔ、Ｊ＝８Ｈｚ：２Ｈ）；３．２９（広いｔ、Ｊ＝８Ｈｚ：２Ｈ）；３．４４（ｍｔ：１Ｈ）；３．５５〜３．７５（ｍｔ：１Ｈ）；３．６０（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ：２Ｈ）；３．６９（ｄｄ、Ｊ＝８．５および５Ｈｚ：１Ｈ）；４．１９（ｄｄ、Ｊ＝８．５および７Ｈｚ：１Ｈ）；４．５０（ｍｔ：１Ｈ）；５．８７（ｓ：１Ｈ）；６．７０（未分離の複雑なピーク：１Ｈ）。
【０１３６】
３）シンおよびトランス４−（４−アミノメチル−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルブチルアミドの製造
前段階で得られたＮ，Ｎ−ジオクタデシル−４−｛４−［（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）メチル］−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ｝ブチルアミド１．１ｇ（１．３７ｍｍｏｌ、シンまたはトランス）をテトラヒドロフラン１０ｍＬに溶かし、４モル％水酸化ナトリウム１０ｍＬを高撹拌しながら加える。反応を室温で終夜放置する。
【０１３７】
テトラヒドロフランを濃縮し、生成物をジエチルエーテル１５０ｍＬで３回抽出する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濾過し、溶媒留去する。そうして予想される生成物８４０ｍｇが単離される（収率：８６％）。それをそのまま次の段階で用いる。
【０１３８】
ｂ−（トリフルオロアセチル−｛３−［トリフルオロアセチル−（４−｛トリフルオロアセチル−［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］アミノ｝ブチル）アミノ］プロピル｝アミノ）酢酸（親水性部分ポリアミン−ＣＯＯＨ）の合成
この合成は、スペルミンの４つのアミンの保護とそれに続く１級アミンのうちの一つの保護ブロモ酢酸による置換という２段階で行われる。
【０１３９】
１）２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］−Ｎ−（４−｛トリフルオロアセチル−［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］アミノ｝ブチル）アセトアミドの合成
スペルミン８ｇ（３９．５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン７５ｍＬに溶かす。トリエチルアミン３３ｍＬ（２３７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を氷浴で冷却して０℃とする。塩化メチレン１００ｍＬで希釈した無水トリフルオロ酢酸４１．５ｇを、滴下漏斗を用いて１時間かけて滴下する。反応混合物を室温に戻し、反応液を撹拌しながら終夜放置する。
【０１４０】
５％炭酸水素ナトリウム溶液７５ｍＬを反応混合物に加え、溶液を室温で１５分間撹拌する。水相を塩化メチレン１５０ｍＬで３回抽出する。有機相を合わせ、０．５Ｍの濃硫酸水素カリウム溶液１００ｍＬで３回、飽和塩化ナトリウム溶液１００ｍＬで３回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮乾固する。純粋な黄色粉末２２．５ｇが、それ以上の精製を行わずに単離される（収率：９７％）。
【０１４１】
２）（トリフルオロアセチル−｛３−［トリフルオロアセチル−（４−｛トリフルオロアセチル−［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］アミノ｝ブチル）アミノ］プロピル｝アミノ）酢酸の製造
水素化ナトリウム１ｇ（６０％オイル中分散品、すなわち２５．６ｍｍｏｌ）に脱水ジメチルホルムアミド６０ｍＬを加える。反応混合物をアルゴン気流下に水浴で冷却し、脱水ジメチルホルムアミド４０ｍＬに溶かした上記で得られた２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］−Ｎ−（４−｛トリフルオロアセチル−［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］アミノ｝ブチル）アセトアミド１０ｇ（１７ｍｍｏｌ）を滴下する。反応混合物を室温で１時間放置し、再度氷浴で冷却し、ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル３．６６ｇ（１８．７ｍｍｏｌ）を加える。反応混合物を室温で終夜撹拌する。
【０１４２】
酢酸エチル５００ｍＬを加え、混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液１００ｍＬで３回、飽和塩化ナトリウム溶液１００ｍＬで３回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮乾固する。そうして、予想される不純物を含む黄色油状物が、ｔｅｒｔ−ブチルエステルの形で単離される。
【０１４３】
この粗反応生成物を塩化メチレン５０ｍＬで希釈し、トリフルオロ酢酸５０ｍＬを加える。溶液を室温で３時間撹拌する。反応混合物を溶媒留去して乾固させ、塩化メチレン５０ｍＬで希釈する。生成物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液１５０ｍＬで３回抽出する。得られた水相を塩化メチレン３０ｍＬで３回洗浄してから、濃塩酸を加えることで酸性とする。次に、生成物を塩化メチレン３００ｍＬで３回抽出する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮乾固する。精製をシリカでのクロマトグラフィーによって続ける（溶離液：塩化メチレン／メタノール８／２）。そうして、黄色粉末３．５ｇを回収する（２段階の全体収率：３２％）。
【０１４４】
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、温度３７３Ｋの（ＣＤ３）２ＳＯ−ｄ６、δｄ（ｐｐｍ））：１．６２（ｍｔ：４Ｈ）；１．８０〜２．００（ｍｔ：４Ｈ）；３．２８（ｍｔ：２Ｈ）；３．３０〜３．６０（ｍｔ：１０Ｈ）；４．０１（ｓ：２Ｈ）；９．１５〜９．３５（未分離の複雑なピーク：１Ｈ）。
【０１４５】
ｃ−シンおよびトランス４−｛４−［（２−｛３−［４−（３−アミノプロピルアミノ）ブチルアミノ］プロピルアミノ｝アセチルアミノ）メチル］−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ｝−Ｎ，Ｎ−オクタデシルブチルアミド・テトラアセテート（酸感受性化合物Ａ）の合成
この合成は、直前のａおよびｂで合成を説明した２種類の分子の縮合、次にポリアミンの脱保護、最後の塩化という３段階で行う。生成物シンおよびトランスについて同じ操作記録を用いた。
【０１４６】
１）シンおよびトランスＮ，Ｎ−ジオクタデシル−４−（４−｛［２−（トリフルオロアセチル−｛３−［トリフルオロアセチル−（４−｛トリフルオロアセチル−［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］アミノ｝ブチル）アミノ］プロピル｝アミノ）アセチルアミノ］メチル｝−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ）ブチルアミドの合成
上記の段階（段階ａ）で得られた４−（４−アミノメチル−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルブチルアミド８００ｍｇ（１．１３ｍｍｏｌ、シンまたはトランス）を塩化メチレン１０ｍＬに溶かしたものに、トリエチルアミン３９０μＬ（２．８ｍｍｏｌ）、上記段階ｂにて得られた（トリフルオロアセチル−｛３−［トリフルオロアセチル−（４−｛トリフルオロアセチル−［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］アミノ｝ブチル）アミノ］プロピル｝アミノ）酢酸８００ｍｇ（１．２４ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ　６００ｍｇをその順序で加える。溶液を室温で２時間撹拌する。
【０１４７】
粗反応生成物を濃縮し、酢酸エチル１５０ｍＬ中に取り、飽和炭酸水素ナトリウム溶液４０ｍＬで３回、次に飽和塩化ナトリウム溶液４０ｍＬで３回洗浄する。硫酸マグネシウムでの脱水、濾過、溶媒留去後、生成物をシリカでのクロマトグラフィーによって精製する（溶離液：酢酸エチル）。そうして、白色粉末１．１ｇを単離する（収率：７３％）。
【０１４８】
２）シンおよびトランス４−｛４−［（２−｛３−［４−（３−アミノプロピルアミノ）ブチルアミノ］プロピルアミノ｝アセチルアミノ）メチル］−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ｝−Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルブチルアミドの製造
上記で得られたＮ，Ｎ−ジオクタデシル−４−（４−｛［２−（トリフルオロアセチル−｛３−［トリフルオロアセチル−（４−｛トリフルオロアセチル−［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］アミノ｝ブチル）アミノ］プロピル｝アミノ）アセチルアミノ］メチル｝−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ）ブチルアミド２９０ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ、シンまたはトランス）をテトラヒドロフラン３ｍＬに溶かし、４モル％水酸化ナトリウム３ｍＬを高撹拌しながら加える。反応を室温で終夜放置する。
【０１４９】
次に溶媒を濃縮し、粗生成物を塩化メチレン／メタノールの１／１混合液中に取る。その粗溶液をシリカでのクロマトグラフィー（塩化メチレン／メタノール／アンモニア、４５／４５／１０）によって精製する。生成物を濃縮し、水を加えた後に凍結乾燥する。そうして、白色の凍結乾燥生成物１８０ｍｇが得られる（収率：８７％）。
【０１５０】
３）４−｛４−［（２−｛３−［４−（３−アミノプロピルアミノ）ブチルアミノ］プロピルアミノ｝アセチルアミノ）メチル］−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ｝−Ｎ，Ｎ−ジオクタデシルブチルアミドのジアステレオマーシンおよびトランスの製造（化合物Ａ）
遊離塩基の形で前の段階で得られた生成物を、イオン交換樹脂によって定量的に塩化する。それを水／エタノール混合液に溶かし、大過剰のアセテート樹脂（ＢＩＯ−ＲＡＤ；ＡＧ１−Ｘ２樹脂）を充填したカラムで溶出する。
【０１５１】
化合物シンの１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δｄ（ｐｐｍ））：０．８９（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ：６Ｈ）；１．２０〜１．４０（ｍｔ：６０Ｈ）；１．５２（ｍｔ：４Ｈ）；１．６５〜１．９０（ｍｔ：８Ｈ）；１．９３（ｍｔ：２Ｈ）；１．９７（ｓ：３Ｈ）；２．３７（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ：２Ｈ）；２．７３（ｍｔ：４Ｈ）；２．８１（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ：２Ｈ）；２．８９（ｍｔ：４Ｈ）；２．９５（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ：２Ｈ）；３．１５〜３．３０（ｍｔ：４Ｈ）；３．３２（ＡＢ、Ｊ＝１７Ｈｚ：２Ｈ）；３．４５（ｄｔ、Ｊ＝１４および６．５Ｈｚ：１Ｈ）；３．５５〜３．６５（ｍｔ：１Ｈ）；３．６１（分裂ｔ、Ｊ＝７および２Ｈｚ：２Ｈ）；３．７４（ｔ、Ｊ＝８Ｈｚ：１Ｈ）；４．０６（ｔ、Ｊ＝８Ｈｚ：１Ｈ）；４．３１（ｍｔ：１Ｈ）；５．７９（ｓ：１Ｈ）；７．８１（ｔ、Ｊ＝５．５Ｈｚ：１Ｈ）。
【０１５２】
化合物トランスの１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δｄ（ｐｐｍ））：０．８８（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ：６Ｈ）；１．０５〜１．４５（ｍｔ：６０Ｈ）；１．５１（ｍｔ：４Ｈ）；１．６５〜１．９０（ｍｔ：８Ｈ）；１．９２（ｍｔ：２Ｈ）；１．９７（ｓ：３Ｈ）；２．３７（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ：２Ｈ）；２．７３（ｍｔ：４Ｈ）；２．８０（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ：２Ｈ）；２．８８（ｍｔ：４Ｈ）；２．９６（ｔ、Ｊ＝６Ｈｚ：２Ｈ）；３．１５〜３．５５（ｍｔ：８Ｈ）；３．５７（広いｔ、Ｊ＝６Ｈｚ：２Ｈ）；３．６９（ｄｄ、Ｊ＝７．５および５．５Ｈｚ：１Ｈ）；４．１１（ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ：１Ｈ）；４．４３（ｍｔ：１Ｈ）；５．８５（ｓ：１Ｈ）；７．７３（広いｔ、Ｊ＝５．５Ｈｚ：１Ｈ）。
【０１５３】
実施例４：４−｛４−［（２−｛３−［ビス（３−アミノプロピル）アミノ］プロピルアミノ｝アセチルアミノ）メチル］−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ｝−Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルブチルアミド・４塩酸塩の合成
この実施例は、下記式の２種類のジアステレオマーであるシンおよびトランスの等モル混合物の形での酸感受性化合物Ｂの合成経路を説明するものである。
【０１５４】
【化２９】
2004508364.tif 000026
ａ−４−（４−アミノメチル−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルブチルアミド（脂質部分−Ｏ−オルト１−ＮＨ２）の合成
この合成は、ジテトラデシルアミンの合成とそれに続くアルコールへの官能化、そして基オルト１への付加とその保護基の開裂という４段階で行う。
【０１５５】
１）ジテトラデシルアミン塩酸塩
ブロモテトラデカン７４ｇ（２６７．１ｍｍｏｌ）にエタノール４００ｍＬおよびテトラデシルアミン５７ｇ（２６７．１ｍｍｏｌ）を加える。炭酸ナトリウム７０．８ｇ（６６７ｍｍｏｌ）を懸濁状態で入れ、反応混合物を終夜加熱還流する。反応混合物を溶媒留去して乾固させ、塩化メチレン１．５リットル中に取り、水２００ｍＬで３回、次に飽和塩化ナトリウム溶液４００ｍＬで１回洗浄する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濃縮する。
【０１５６】
高い温度で粗生成物を５Ｎ塩酸のイソプロパノール溶液３００ｍＬを加えたイソプロパノール６００ｍＬに溶かすことで、塩化を行う。そうして得られた透明溶液を放冷することで、予想生成物の結晶化を誘発する。濾過およびイソプロパノールによる洗浄後に、凝集白色粉末４８．４ｇを得る（収率：４１％）。
【０１５７】
２）４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルブチルアミドの製造
塩化アルミニウム２２．４ｇ（１６８．１ｍｍｏｌ）にクロロホルム７５ｍＬを加え、全体を氷水浴で冷却して約１０℃とする。トリエチルアミン３９ｍＬ（２８０．１ｍｍｏｌ）のクロロホルム（１００ｍＬ）溶液を滴下し、反応混合物を室温に戻す。ジテトラデシルアミン塩酸塩２５ｇ（５６ｍｍｏｌ）をブチロラクトン（６７．２ｍｍｏｌ）のクロロホルム（３５０ｍＬ）溶液と混合したものを、機械撹拌しながら前記混合物に徐々に加える。室温で２時間後に、反応にそれ以上の変化が生じなくなる。
【０１５８】
水２００ｍＬを加え、反応混合物を３０分間撹拌する。粗生成物をセライト濾過し、クロロホルムで洗浄する。濾液を放置後に分離し、有機相を飽和塩化ナトリウム溶液１５０ｍＬで３回洗浄する。クロロホルム溶液を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮する。シリカでのクロマトグラフィー（酢酸エチル／シクロヘキサン１／１）でのクロマトグラフィー後に、白色粉末２１．２ｇを収率７６％で得る。
【０１５９】
３）Ｎ，Ｎ−ジテトラデシル−４−｛４−［（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）メチル］−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ｝ブチルアミドの製造
前段階で得られた４−ヒドロキシ−Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルブチルアミド３．５ｇ（７．１ｍｍｏｌ）を、２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（２−メトキシ−［１，３］ジオキソラン−４−イルメチル）アセトアミド１．８ｇ（オルト１、７．８ｍｍｏｌ）およびパラトルエンスルホン酸ピリジニウム１８ｍｇ（ＰＰＴＳ、０．０７１ｍｍｏｌ）と混合する。全体を無溶媒で８０℃にて３時間加熱する。
【０１６０】
粗反応生成物をヘプタン２００ｍＬに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム溶液５０ｍＬで３回、アセトニトリル５０ｍＬで３回洗浄し、濃縮して乾固させる。
【０１６１】
少量の粗生成物についてシリカでの精製を行って、この中間体の特性決定を行う、残りはそのまま次の段階で用いる。シリカでのクロマトグラフィー（シクロヘキサン／酢酸エチル７／３（体積比））によって、油状生成物数ｍｇを単離することができる。
【０１６２】
４）４−（４−アミノメチル−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルブチルアミドの製造
前段階で得られた粗生成物を、４％水酸化ナトリウム２０ｍＬを加えたテトラヒドロフラン２０ｍＬに溶かす。反応混合物を室温で高撹拌しながら終夜放置する。
【０１６３】
次に、テトラヒドロフランを濃縮し、生成物をジエチルエーテル２００ｍＬで３回抽出する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濾過し、溶媒留去する。シリカでのクロマトグラフィー（塩化メチレン／メタノール９／１（体積比））によって、無色油状物１．６ｇを単離することができる（２段階での収率：３８％）。
【０１６４】
１Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δｄ（ｐｐｍ））：５０／５０の割合での２種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【０１６５】
＊０．８９（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ：６Ｈ）；１．１５〜１．４５（ｍｔ：４４Ｈ）；１．５２（ｍｔ：４Ｈ）；１．５８（未分離の複雑なピーク：２Ｈ）；１．９５（５重線、Ｊ＝６．５Ｈｚ：２Ｈ）；２．３９（ｔ、Ｊ＝６．５Ｈｚ：２Ｈ）；２．７５〜３．００（ｍｔ：２Ｈ）；２．３１（ｍｔ：２Ｈ）；３．２９（ｍｔ：２Ｈ）；３．６０（ｍｔ：２Ｈ）；３．７１および３．８０（それぞれｄｄ、Ｊ＝７．５Ｈｚおよび６Ｈｚならびにｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ：計１Ｈ）；４．０６および４．１４（２ｔ、Ｊ＝７．５Ｈｚ：計１Ｈ）；４．２１および４．３３（２ｍｔ：計１Ｈ）；５．８２および５．８５（２ｓ：計１Ｈ）。
【０１６６】
ｂ−トリフルオロ酢酸塩の形での［（３−｛ビス［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］アミノ｝プロピル）トリフルオロアセチルアミノ］酢酸の合成（ポリアミン−ＣＯＯＨ型の親水性部分）
この合成は、３−アミノプロパノールおよび３，３′−イミノビスプロピルアミンを原料とする６段階で行う。
【０１６７】
１）２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−｛３−［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピルアミノ］プロピル｝アセトアミドの製造
３，３′−イミノビスプロピルアミン３５ｇ（２６６．７ｍｍｏｌ）を、アルゴン気流下に脱水テトラヒドロフラン１５０ｍＬに溶かす。反応混合物を氷浴で冷却して０℃とし、トリフルオロ酢酸エチル６５ｍＬ（５４６．８ｍｍｏｌ）を滴下漏斗を用いて（非常にゆっくりと）滴下する。滴下終了後（３時間後）、反応混合物を室温に戻し、撹拌をアルゴン下で数時間維持する。
【０１６８】
反応混合物を濾紙で濾過する。濾液を濃縮乾固させ、塩化メチレン中に数回取り、スライド羽根ロータリー真空ポンプによる真空下４０℃での乾燥機で１６時間にわたって最終の乾燥を行う。白色粉末８５．３ｇが、それ以上精製せずに単離される（収率：９９％）。
【０１６９】
２）（３−ヒドロキシプロピルアミノ）酢酸ｔｅｒｔ−ブチルの製造
３−アミノプロパノール１９６ｍＬ（２．５６ｍｏｌ）を塩化メチレン２５０ｍＬで希釈し、全体を氷浴で冷却して０℃とする。反応混合物を０℃に維持しながら、ブロモ酢酸ｔｅｒｔ−ブチル２０ｇ（１０２．５ｍｍｏｌ）を塩化メチレン２００ｍＬに溶かしたものを滴下する。滴下終了後（２時間後）、反応混合物を室温で３時間放置する。
【０１７０】
その粗生成物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液１５０ｍＬで３回、飽和塩化ナトリウム溶液１５０ｍＬで３回洗浄する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濾過し、濃縮する。そうして、無色油状物１７．８ｇが単離される（収率：９２％）。
【０１７１】
３）［（３−ヒドロキシプロピル）−トリフルオロアセチルアミノ］酢酸ｔｅｒｔ−ブチルの製造
（３−ヒドロキシプロピルアミノ）酢酸ｔｅｒｔ−ブチル１７．６５ｇ（９３．３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン１００ｍＬに溶かし、全体を氷浴で冷却して０℃とする。トリエチルアミン２６ｍＬ（１８６．６ｍｍｏｌ）を加え、次に滴下漏斗を用いて無水トリフルオロ酢酸２１．５ｇ（１０２．６ｍｍｏｌ）を滴下する。滴下終了後、反応混合物を、磁気撹拌子撹拌しながら室温で終夜放置する。
【０１７２】
その溶液を飽和炭酸水素ナトリウム溶液５０ｍＬで３回、０．５Ｍ硫酸水素カリウム溶液５０ｍＬで３回、飽和塩化ナトリウム溶液５０ｍＬで３回洗浄する。有機相を硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、濃縮する。そうして、淡黄色油状物２４．５ｇが単離される（収率：９２％）。
【０１７３】
４）［（３−ブロモプロピル）トリフルオロアセチルアミノ］酢酸ｔｅｒｔ−ブチルの製造
［（３−ヒドロキシプロピル）−トリフルオロアセチルアミノ］酢酸ｔｅｒｔ−ブチル１０ｇ（３５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１５０ｍＬに溶かす。トリフェニルホスフィン１２．４ｇ（４７．３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物をサーモスタットで１５〜２０℃とする。四臭化炭素１５．１ｇ（４５．６ｍｍｏｌ）をアセトニトリル６０ｍＬに溶かしたものを滴下漏斗を用いて滴下し、全体を室温で４時間撹拌する。
【０１７４】
反応混合物を濃縮して乾固させ、酢酸エチル中に取り、濾紙で濾過する。濾液を濃縮乾固させ、シクロヘキサン中に取り、焼結材Ｎｏ．３で濾過する。濾液を再度濃縮し、シリカでのクロマトグラフィー（シクロヘキサン／酢酸エチル８／２（体積比））によって精製する。そうして、淡黄色油状物１０．４ｇが単離される（収率：８５％）。
【０１７５】
５）［（３−｛ビス［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］アミノ｝プロピル）トリフルオロアセチルアミノ］酢酸ｔｅｒｔ−ブチルの製造
［（３−ブロモプロピル）トリフルオロアセチルアミノ］酢酸ｔｅｒｔ−ブチル２６ｇ（７４．７ｍｍｏｌ）および２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−｛３−［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピルアミノ］プロピル｝アセトアミド２４．１ｇ（７４．７ｍｍｏｌ）をアセトニトリル１３０ｍＬに溶かす。炭酸カリウム３０ｇ（２２４ｍｍｏｌ）を懸濁状態で入れ、全体を６時間加熱還流する。
【０１７６】
反応混合物を濾紙で濾過し、濃縮乾固する。粗生成物をシリカでのクロマトグラフィーによって精製する（シクロヘキサン／酢酸エチル２／８（体積比））。そうして、淡黄色油状物１６．６ｇ（収率：３８％）を単離する。
【０１７７】
６）［（３−｛ビス［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］アミノ｝プロピル）トリフルオロアセチルアミノ］酢酸のトリフルオロ酢酸塩の製造
［（３−｛ビス［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］アミノ｝プロピル）トリフルオロアセチルアミノ］酢酸ｔｅｒｔ−ブチル１５．８ｇ（２８．７６ｍｍｏｌ）に塩化メチレン５０ｍＬを加え、次にトリフルオロ酢酸５０ｍＬを加える。その混合物を室温で数時間撹拌する。反応混合物を濃縮乾固する。そうして、淡黄色粘稠物１８．７ｇを単離する（収率：１００％）。
【０１７８】
１Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δｄ（ｐｐｍ））：室温で、回転異性体の混合物が認められる。
【０１７９】
＊１．８０〜２．１０（ｍｔ：６Ｈ）；３．１２（ｍｔ：６Ｈ）；３．２９（ｍｔ：４Ｈ）；３．５０（ｍｔ：２Ｈ）；４．１３および４．２９（それぞれ広いｓおよびｍｔ：計２Ｈ）；９．５０〜９．７５（ｍｔ：２Ｈ）。
【０１８０】
ｃ−４−｛４−［（２−｛３−［ビス（３−アミノプロピル）アミノ］プロピルアミノ｝アセチルアミノ）メチル］−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ｝−Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルブチルアミド・４塩酸塩（化合物Ｂ）の合成
この合成は、上記の工程ａおよびｂで得られた２種類の分子の縮合、それに続くポリアミンの脱保護および塩化という３段階で行う。
【０１８１】
１）４−［４−（｛２−［（３−｛ビス［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］アミノ｝プロピル）トリフルオロアセチルアミノ］アセチルアミノ｝メチル）−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルブチルアミドの製造
トリエチルアミン１．９ｍＬ（１３．８ｍｍｏｌ）、［（３−｛ビス［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］アミノ｝プロピル）トリフルオロアセチルアミノ］酢酸２ｇ（トリフルオロ酢酸塩、３．０４ｍｍｏｌ）およびＢＯＰ１．８ｇ（４．１４ｍｍｏｌ）を順次、塩化メチレン３０ｍＬに溶かした４−（４−アミノメチル−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ）−Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルブチルアミド１．６５ｇ（２．７６ｍｍｏｌ）に加える。得られた溶液を室温で１時間撹拌する。
【０１８２】
粗反応生成物を濃縮して乾固させ、酢酸エチル２００ｍＬ中に取り、飽和塩化ナトリウム溶液４０ｍＬ、次に飽和炭酸水素ナトリウム溶液４０ｍＬで３回、飽和塩化ナトリウム溶液４０ｍＬで３回洗浄する。生成物をシリカでのクロマトグラフィーによって精製する（溶離液：酢酸エチル）。そうして、淡黄色粘稠物２．２ｇが単離される（収率：７２％）。
【０１８３】
２）４−｛４−［（２−｛３−［ビス（３−アミノプロピル）アミノ］プロピルアミノ｝アセチルアミノ）メチル］−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ｝−Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルブチルアミドの製造
４−［４−（｛２−［（３−｛ビス［３−（２，２，２−トリフルオロアセチルアミノ）プロピル］アミノ｝プロピル）トリフルオロアセチルアミノ］アセチルアミノ｝メチル）−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ］−Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルブチルアミド２．１ｇ（１．８８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン３０ｍＬに溶かし、４モル％水酸化ナトリウム３０ｍＬを高撹拌下に加える。反応液を室温で終夜放置する。
【０１８４】
溶媒を濃縮し、粗生成物を塩化メチレン／メタノール１／１混合液中に取る。その粗溶液をシリカでのクロマトグラフィーによって精製する（塩化メチレン／メタノール／アンモニア、４５／４５／１０（体積比））。生成物を濃縮し、水を加えた後に凍結乾燥する。そうして、白色の凍結乾燥生成物１．３ｇが得られる（収率：８４％）。
【０１８５】
３）４−｛４−［（２−｛３−［ビス（３−アミノプロピル）アミノ］プロピルアミノ｝アセチルアミノ）メチル］−［１，３］ジオキソラン−２−イルオキシ｝−Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルブチルアミド・４塩酸塩（化合物Ｂ）の合成
遊離塩基の形での前段階で得られた生成物を、イオン交換樹脂によって定量的に塩化する。それを水に溶かし、大過剰のクロライド樹脂（ＦＬＵＫＡ；ＤＯＷＥＸ２１Ｋ）を充填したカラムで溶出する。得られる白色の凍結乾燥生成物の構造を１Ｈ　ＮＭＲで確認する。
【０１８６】
１Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、（ＣＤ３）２ＳＯ−ｄ６、δｄ（ｐｐｍ））：５０／５０の割合での２種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【０１８７】
＊０．８９（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ：６Ｈ）；１．１５〜１．４０（ｍｔ：４４Ｈ）；１．４０〜１．６０（ｍｔ：４Ｈ）；１．７２（ｍｔ：８Ｈ）；２．３１（ｍｔ：２Ｈ）；２．４０〜２．５５（ｍｔ：６Ｈ）；２．７０〜２．９０（ｍｔ：６Ｈ）；３．１５〜３．７５−４．００〜４．４０（２つのｍｔ：計１３Ｈ）；５．８３および５．８６（２ｓ：計１Ｈ）。
【０１８８】
実施例５：ＰＥＧ化脂質ＣおよびＤの合成
本実施例は、互いに脂質部分のみが異なる、すなわち化合物Ｃではオクタデカノールであり、化合物ＤではコレステロールであるＰＥＧ化脂質オクタデカノール−オルト１−ＰＥＧ５０００−ＯＭｅおよびコレステロール−オルト１−ＰＥＧ５０００−ＯＭｅの合成経路を説明するものである。これら２種類の酸感受性化合物は下記一般式の構造を有する。
【０１８９】
【化３０】
2004508364.tif 000027
ａ−Ｃ−（２−オクタデシルオキシ−［１，３］ジオキソラン−４−イル）メチルアミンおよびＣ−｛２−［１７−（１，５−ジメチルヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシ］−［１，３］ジオキソラン−４−イル｝メチルアミン（脂質部分−Ｏ−オルト１−ＮＨ２）の合成
この合成は、化合物オルト１を原料とし、環外メトキシ基の脂肪族アルコール（コレステロールまたはオクタデカノール）による置換とそれに続くアミンの脱保護による２段階で行われる。
【０１９０】
１）２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（２−オクタデシルオキシ−［１，３］ジオキソラン−４−イルメチル）アセトアミドの製造
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（２−メトキシ−［１，３］ジオキソラン−４−イルメチル）アセトアミド３ｇ（オルト１、１３．０９ｍｍｏｌ）をオクタデカノール３．５４ｇ（１３．０９ｍｍｏｌ）と混合する。混合物を８０℃で溶融させ、パラトルエンスルホン酸ピリジニウム３２ｍｇ（０．１３ｍｍｏｌ）を加えた後に２時間放置する。粗反応生成物をシクロヘキサンに溶かし、飽和炭酸水素ナトリウム溶液、次に飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで脱水し、濃縮乾固させる。その粗生成物をそのまま次の段階で用いる。
【０１９１】
１′）Ｎ−｛２−［１７−（１，５−ジメチルヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシ］−［１，３］ジオキソラン−４−イルメチル｝−２，２，２−トリフルオロアセトアミドの製造
この操作記録は上記のものと同じであり、この反応は触媒を用いずに行うこともできる。
【０１９２】
２）Ｃ−（２−オクタデシルオキシ−［１，３］ジオキソラン−４−イル）メチルアミンの製造
前段階１の粗反応生成物６．１２ｇ（１３．０９ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン２０ｍＬに溶かす。反応混合物を氷浴で冷却し、４％水酸化ナトリウム３０ｍＬを加える。試薬が完全に消失するまで、混合物を室温で撹拌する（４時間かけて）。
【０１９３】
次に、溶媒をある程度濃縮し、ジエチルエーテル２００ｍＬで３回抽出する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濾過し、溶媒留去する。粗反応生成物をシリカでのクロマトグラフィーによって精製する（塩化メチレン／メタノール９／１（体積比））。そうして、白色粉末２．６ｇが回収される（収率：上記一連の２段階１および２で５３％）。
【０１９４】
１Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δｄ（ｐｐｍ））。ほぼ５０／５０の割合での２種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【０１９５】
＊０．８９（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ：３Ｈ）；１．２０〜１．４５および１．５８（２ｍｔ：計３２Ｈ）；２．７５〜３．００（ｍｔ：２Ｈ）；３．５３（ｍｔ：２Ｈ）；３．６５〜３．８５（ｍｔ：１Ｈ）；４．００〜４．４０（ｍｔ：２Ｈ）；５．８１および５．８４（２ｓ：計１Ｈ）。
【０１９６】
２′）Ｃ−｛２−［１７−（１，５−ジメチルヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシ］−［１，３］ジオキソラン−４−イル｝メチルアミンの製造
この操作記録は、段階２）のものと同じである。そうして、白色粉末１．４ｇが回収される（収率：２連続段階１′および２″で２２％）。
【０１９７】
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δｄ（ｐｐｍ））。ほぼ５０／５０の割合での２種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【０１９８】
＊０．６９（ｓ：３Ｈ）；０．８５〜１．７５および２．００（ｍｔ：計２６Ｈ）；０．８８（ｍｔ：６Ｈ）；０．９３（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ：３Ｈ）；１．０１（ｓ：３Ｈ）；２．３３（ｍｔ：２Ｈ）；２．７５〜３．００（ｍｔ：２Ｈ）；３．５０（ｍｔ：１Ｈ）；３．７１〜３．８５〜４．０５および４．１６（４ｍｔ：計２Ｈ）；４．２０および４．３５（２ｍｔ：計１Ｈ）；５．３６（ｍｔ：１Ｈ）；５．９３および５．９６（２ｓ：計１Ｈ）。
【０１９９】
ｂ−メトキシポリエチレングリコール５０００の酸の合成（親水性部分ＭｅＯ−ＰＥＧ５０００−ＣＯＯＨ）
市販のメトキシポリエチレングリコールの末端水酸基の酸化という１段階が必要である。
【０２００】
ＭｅＯ−ＰＥＧ５０００−ＯＨ２０ｇ（４ｍｍｏｌ）を等量の水／アセトニトリル混合液１００ｍＬに溶かす。２，２，６，６−テトラメチルピペリジニルオキシル３１２ｍｇ（２ｍｍｏｌ）および［ビス（アセトキシ）ヨード］ベンゼン６．４ｇ（２０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１６時間撹拌する。
【０２０１】
その粗反応生成物を溶媒留去して乾固させ、塩化メチレン／エタノール（１：１；体積比）混合液４０ｍＬ中に取り、ジエチルエーテル５００ｍＬを加えることで沈殿させる。そうして、濾過およびエーテル洗浄によって、白色粉末１９ｇが単離される（収率：９５％）。
【０２０２】
１Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δｄ（ｐｐｍ）：３．３９（ｓ：３Ｈ）；３．４０〜３．９５（ｍｔ：４０４Ｈ）；４．１５（ｓ：２Ｈ）。
【０２０３】
ｃ−メトキシ−（ポリエチレングリコール５０００）−（Ｎ−（２−オクタデシルオキシ−［１，３］ジオキソラン−４−イルメチル）アミド（化合物Ｃ）およびメトキシ−（ポリエチレングリコール５０００）−Ｎ−｛２−［１７−（１，５−ジメチルヘキシル）−１０，１３−ジメチル−２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７−テトラデカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−３−イルオキシ］−［１，３］ジオキソラン−４−イルメチル｝アミド（化合物Ｄ）の合成
化合物Ｃ
前段階で得られたＭｅＯ−ＰＥＧ５０００−ＣＯＯＨ１．２ｇ（０．２４ｍｍｏｌ）を塩化メチレン５ｍＬに溶かす。トリエチルアミン１８８μＬ（１．３４ｍｍｏｌ）を加え、次にＣ−（２−オクタデシルオキシ−［１，３］ジオキソラン−４−イル）メチルアミン１００ｍｇ（０．２７ｍｍｏｌ）を加える。ＢＯＰ１４３ｍｇ（０．３２ｍｍｏｌ、１．２当量）を加え、反応液を室温で１時間撹拌する。
【０２０４】
ジエチルエーテル（６０ｍＬ）を加えることで反応混合物を沈殿させ、遠心分離し、エーテルで洗浄し、分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に注入する。最も純粋な分画を単離することで、白色凍結乾燥生成物４１５ｍｇを得る（収率：３２％）。
【０２０５】
１Ｈ　ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δｄ（ｐｐｍ））：ほぼ５０／５０の割合の２種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【０２０６】
＊０．９０（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ：３Ｈ）；１．２０〜１．４０および１．５０〜１．７５（ｍｔ：３２Ｈ）；３．３９（ｓ：３Ｈ）；３．４０〜３．９５（ｍｔ：４４８Ｈ）；４．０２および４．０３（２ｓ：計２Ｈ）；４．００〜４．２５（ｍｔ：計３Ｈ）：５．８０および５．８４（２ｓ：計１Ｈ）。
【０２０７】
化合物Ｄ
この操作記録は、化合物Ｃの製造について示したものと同じである。最も純粋な分画を単離することで、白色の凍結乾燥生成物３９５ｍｇが得られる（収率：３０％）。
【０２０８】
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δｄ（ｐｐｍ））：ほぼ５０／５０の割合の２種類のジアステレオマーの混合物が認められる。
【０２０９】
＊０．６８（ｓ：３Ｈ）；０．８５〜１．７５−１．８５および２．００（ｍｔ：計２６Ｈ）；０．８７（ｍｔ：６Ｈ）；０．９２（ｄ、Ｊ＝７Ｈｚ：３Ｈ）；１．００（ｓ：３Ｈ）；２．３３（ｍｔ：２Ｈ）；３．３９（ｓ：３Ｈ）；３．４０〜３．９０（ｍｔ：４４８Ｈ）；４．００〜４．２０（ｍｔ：計１Ｈ）；４．０１および４．０４（２ｓ：計２Ｈ）；４．２８および４．４６（２ｍｔ：計１Ｈ）；５．３５（ｍｔ：１Ｈ）；５．９０および５．９５（２ｓ：計１Ｈ）。
【０２１０】
実施例６：ＰＥＧ化脂質Ｅの合成
本実施例は、下記一般式の構造を有するＰＥＧ化脂質オクタデカノール−オルト２−ＰＥＧ５０００−ＯＭｅの合成経路について説明するものである。
【０２１１】
【化３１】
2004508364.tif 000028
ａ−２−メチル−２−オクタデシルオキシ−［１，３］ジオキサン−５−イルアミンの合成（疎水性脂質部分−Ｏ−オルト２−ＮＨ２）
この合成は、上記で合成について説明した基質オルト２を原料とする、環外メトキシ基のオクタデカノールによる置換およびそれに続くアミンの脱保護により、２段階で行われる。
【０２１２】
１）２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（２−メチル−２−オクタデシルオキシ−［１，３］ジオキサン−５−イル）アセトアミドの製造
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（２−メトキシ−２−メチル−［１，３］ジオキサン−５−イル）アセトアミド３ｇ（１２．３４ｍｍｏｌ）をオクタデカノール３ｇ（１１．１ｍｍｏｌ）と混合する。混合物を８０℃で溶融させ、２時間放置して、アルコール交換中に生成する全てのメタノールを蒸発させる。
【０２１３】
溶融反応混合物をアセトニトリル５０ｍＬ中に投入することで沈殿を生じさせる。予想生成物を、アセトニトリルからの再結晶によって精製する。そうして、白色粉末２．８５ｇを単離する（収率：再結晶後で５３％）。
【０２１４】
２）２−メチル−２−オクタデシルオキシ−［１，３］ジオキサン−５−イルアミンの製造
前段階のトリフルオロアセトアミド誘導体１ｇ（２．０８ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン１０ｍＬに溶かし、それに４モル％水酸化ナトリウム１０ｍＬを加える。試薬が完全に消失するまで、混合物を室温で高撹拌する（４時間かけて）。
【０２１５】
次に、溶媒をある程度濃縮し、ジエチルエーテル１００ｍＬで３回抽出する。有機相を塩化カルシウムで脱水し、濾過し、溶媒留去して乾固させる。そうして、それ以上精製せずに、白色粉末８１０ｍｇが回収される（収率：１００％）。
【０２１６】
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δｄ（ｐｐｍ））：０．８９（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ：３Ｈ）；１．２０〜１．５０（ｍｔ：計３０Ｈ）；１．４９（ｓ：３Ｈ）；１．６２（ｍｔ：２Ｈ）；１．６７（広いｓ：２Ｈ）；２．７１（ｍｔ：１Ｈ）；３．４６（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ：２Ｈ）；３．５４（広いｄ、Ｊ＝１０Ｈｚ：２Ｈ）；４．３０（ｄｄ、Ｊ＝１０および１．５Ｈｚ：２Ｈ）。
【０２１７】
ｂ−メトキシ−（ポリエチレングリコール５０００）−Ｎ−（２−メチル−２−オクタデシルオキシ−［１，３］ジオキサン−５−イル）アミド（化合物Ｅ）の合成
この最後の段階では、脂質アミンとＰＥＧの酸（それの合成は実施例５に記載）との縮合を行う。
【０２１８】
ＭｅＯ−ＰＥＧ５０００−ＣＯＯＨ１．１５ｇ（０．２３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン５ｍＬに溶かす。トリエチルアミン１８１μＬ（１．３０ｍｍｏｌ）を加え、次に２−メチル−２−オクタデシルオキシ−［１，３］ジオキサン−５−イルアミン１００ｍｇ（０．２６ｍｍｏｌ）を加える。ＢＯＰ１７２ｍｇ（０．３９ｍｍｏｌ）を加え、反応液を室温で１時間撹拌する。
【０２１９】
ジエチルエーテル（６０ｍＬ）を加えることで反応混合物を沈殿させ、遠心分離し、エーテルで洗浄し、分取ＨＰＬＣに注入する。最も純粋な分画を単離することで、白色凍結乾燥生成物４２０ｍｇを得る（収率：３４％）。
【０２２０】
１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３、δｄ（ｐｐｍ））：０．８９（ｔ、Ｊ＝７Ｈｚ：３Ｈ）；１．２０〜１．５０（ｍｔ：３０Ｈ）；１．４８（ｓ：３Ｈ）；１．５５〜１．７５（ｍｔ：２Ｈ）；３．３９（ｓ：３Ｈ）；３．４０〜３．９０（ｍｔ：４４８Ｈ）；３．８９（広いｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ：１Ｈ）；４．０５（ｓ：２Ｈ）；４．３０（広いｄ、Ｊ＝１２Ｈｚ：２Ｈ）；７．５７（ｄ、Ｊ＝８．５Ｈｚ：１Ｈ）。
【０２２１】
実施例７：酸感受性化合物ＡシンおよびトランスによるＤＮＡ取り込みに関する試験
上記で製造される酸感受性化合物Ａのシン型およびトランス型は、ＤＮＡの非ウィルストランスフェクションに従来使用されているカチオン性脂質と類似の構造を有し、それらはそれ自体で構造中に、それらを酸感受性とする上で寄与する環状オルトエステル官能基を有する。
【０２２２】
従って本実施例の目的は、酸感受性化合物Ａシンおよびトランスが、カチオン性脂質に対して特異的なトランスフェクション対象のＤＮＡを取り込む能力を保持しながら、酸性媒体中で分解することから、取り込まれたＤＮＡを放出する能力を有することを示すことにある。それは、臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）を用いる蛍光試験によって容易に示すことができる。蛍光がなければ、遊離のＤＮＡが存在しないことを反映しており、それはＤＮＡが取り込まれていることを意味する。
【０２２３】
以下の説明においては、実施例３で製造した酸感受性化合物Ａの２種類の型であるシンおよびトランスを用い、公開ＷＯ９７／１８１８５に記載されていて、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｇｌｙ−Ｎ［（ＣＨ２）１７−ＣＨ３］２という式を有する非酸感受性類縁体を対照として用いた。この非酸感受性類縁体は、下記の説明において「対照カチオン性脂質」と称する。
【０２２４】
異なる力価を有する脂質溶液とＤＮＡ溶液を等量混合することで、対照カチオン性脂質または酸感受性化合物Ａシンもしくはトランスを増量させながら、それとＤＮＡを接触させる。そうして、濃度１０μｇ／ｍＬを有するＤＮＡ複合体８００μＬのサンプルを、対照カチオン性脂質または酸感受性化合物Ａシンもしくはトランスの量を増加させながら、１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中で調製する。
【０２２５】
時間ｔ＝０で、濃度０．１ｍｏｌ／Ｌを有しｐＨ５の緩衝液２００μＬをそれらのサンプルに加え、サンプルを３７℃の乾燥機に入れる。臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）による蛍光を、励起波長および発光波長をそれぞれ２６０ｎｍおよび５９０ｎｍとするフルオロマックス（ＦｌｕｏｒｏＭａｘ）−２（Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ−Ｓｐｅｘ）を用いて経時的に測定する（２０℃で測定）。励起および発光用のスリット幅は、５ｎｍに設定する。蛍光値は、ＤＮＡ／カチオン性脂質もしくはＤＮＡ／酸感受性化合物溶液１ｍＬ当たり１ｇ／Ｌ（ＤＮＡ０．０１ｍｇ／ｍＬ）の臭化エチジウム３μＬを加えた後に、蛍光値を記録する。
【０２２６】
結果を図１にまとめてある。ｐＨ５では、ＤＮＡを取り込むのに用いられる酸感受性化合物Ａシンもしくはトランスまたは対照カチオン性脂質の量が低すぎる場合（脂質０．４ｎｍｏｌ／ＤＮＡμｇ）、従ってＤＮＡが完全に取り込まれているわけではない場合、経時的に蛍光に有意な変動は測定されない。他方、それより多量（脂質１．７ｎｍｏｌ／ＤＮＡμｇおよび脂質６．０ｎｍｏｌ／ＤＮＡμｇ）の場合には、（非酸感受性）対照カチオン性脂質に関して、酸感受性化合物Ａシンおよびトランスの異なる挙動が認められ、ＤＮＡの完全な取り込みが可能である。実際、酸感受性化合物Ａシンおよびトランスは、蛍光の増加によって示されるように、経時的にＤＮＡを放出するが、酸感受性ではない対照カチオン性脂質の場合にはその放出はない。さらに、そのＤＮＡ放出は酸添加（ｐＨ５および３７℃）から数時間後に生じる。
【０２２７】
使用される酸感受性化合物の量に応じて、ＤＮＡ放出の動力学にも変化が認められる。使用される酸感受性化合物Ａの量が少なくなるほど、ＤＮＡ放出が急速になる。
【０２２８】
この試験は、酸感受性化合物Ａシンおよびトランスの顕著な特性を示すものである。これら化合物は、ＤＮＡを取り込むことでそれと複合体を形成することができ、それの酸性媒体中での分解によって、ＤＮＡと形成された複合体の分解が生じ、従ってＤＮＡが放出される。従ってこれらの酸感受性化合物は、細胞へのＤＮＡの非ウィルストランスフェクションの文脈で特に有用である。
【０２２９】
実施例８：ｉｎ ｖｉｔｒｏでの酸感受性化合物Ａシンおよびトランスのトランスフェクション力についての試験
本実施例は、前述の実施例に記載の非酸感受性類縁体（対照カチオン性脂質）と比較した、酸感受性化合物Ａシンおよびトランスのｉｎ ｖｉｔｒｏでのトランスフェクション力を示すものである。
【０２３０】
本試験は、脂質１．０または４．０または６．０または１０．０ｎｍｏｌ／ＤＮＡμｇという４種類の異なる使用比で行った。これら各条件について、ウシ胎仔血清を使用した場合および使用しない場合（「＋および−血清」）で試験を行った。
【０２３１】
細胞の培養
ヒト頸部上皮癌由来のＨｅＬａ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ （ＡＴＣＣ） Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ， ＵＳＡ）を、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、５０単位／ｍＬのペニシリンおよび５０単位／ｍＬのストレプトマイシンを加えたＭＥＭ（「最小必須培地」）型の培地存在下に培養する。培地および添加剤は、ギブコ／ＢＲＬライフテクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ， ＵＳＡ）から入手される。細胞を、インキュベータ中、３７℃および５％二酸化炭素でフラスコ中にて培養する。
【０２３２】
トランスフェクション
トランスフェクション前日にＨｅＬａ細胞を、細胞数３００００〜５００００／ウェルで２４ウェルプレートに移し入れる。これらの希釈液は、２４時間後に約８０％集密状態となる。
【０２３３】
トランスフェクションのため、細胞を２回洗浄し、血清を含む（１０％ＦＣＳ（体積比））または血清を含まない培地５００μＬとともに３７℃でインキュベートする。
【０２３４】
プラスミドＤＮＡ　０．５μｇを含む複合体５０μＬを各ウェルに加える（複合体は、ウェルへの添加の少なくとも３０分前に調製する）。３７℃で２時間後、血清を含まないプレートに１０％（体積比）のＦＣＳ（「ウシ胎仔血清」）を補給する。
【０２３５】
全てのプレートを３７℃および５％二酸化炭素に３６時間置く。
【０２３６】
ルシフェラーゼ活性の測定
短時間で、トランスフェクション細胞をＰＢＳ（リン酸緩衝液）５００μＬで２回洗浄し、試薬（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）細胞培養物溶解試薬、ルシフェラーゼアッセイシステムキットから）２５０μＬで溶解する。
【０２３７】
４℃で５分間遠心分離した（１２０００×ｇ）溶解物の上清１０μＬの小分けサンプルを、光度計（Ｗａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ２光度計（１４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ ｃｏｕｔｅｒ））で測定する。
【０２３８】
ルシフェラーゼ活性を、ルシフェリン、補酵素ＡおよびＡＴＰ存在下に１０秒間にわたり発光によって定量し、２０００個の処理細胞に関して表す。そこで、ルシフェラーゼ活性は、相対光単位（「ＲＬＵ」：「相対光単位」）として表し、ピアースＢＣＡキット（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ ｋｉｔ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ， ＵＳＡ）を用いて得られるサンプルでの蛋白濃度で正規化する。
【０２３９】
図２にまとめた結果は、調べた３種類の化合物（酸感受性化合物Ａシンおよびトランスならびに対照カチオン性脂質）について高いトランスフェクション活性を示している。それらの間で有意差は認められない。血清が存在しないと、トランスフェクションのレベルは全ての場合で高く（１０５〜１０７ＲＬＵ／蛋白μｇ）、トランスフェクション力は使用される酸感受性化合物または対照カチオン性脂質の量に応じて上昇する。血清の存在によって、全ての場合でトランスフェクションの阻害が誘発される。
【０２４０】
従って本実施例は、シン型およびトランス型での酸感受性化合物Ａのトランスフェクション力が、それの非酸感受性類縁体（対照カチオン性脂質）と比較して保存されることを示している。より一般的には、非ウィルストランスフェクションで有用であることが知られているカチオン性脂質型の分子への酸感受性環状オルトエステル官能基の導入は、その化合物が効率良くＤＮＡをトランスフェクションする能力を破壊しない。
【０２４１】
実施例９：ＤＮＡ／カチオン性脂質トランスフェクション性複合体のコロイド安定化のためのノニオン系界面活性剤としての酸感受性化合物ＣおよびＤの使用
本実施例は、本願において（ｄ）で定義の種類の酸感受性ＰＥＧ化脂質を、ＤＮＡ／カチオン性脂質トランスフェクション性粒子に関してコロイド安定化の役割を果たすノニオン系界面活性剤として使用することができることを示すものである。
【０２４２】
本実施例において使用するカチオン性脂質は、実施例７および８ですでに使用され、公開ＷＯ９７／１８１８５に式Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＯ−Ｇｌｙ−Ｎ［（ＣＨ２）１７−ＣＨ３］２（対照カチオン性脂質）で記載されているものである。
【０２４３】
実施例５で製造された化合物ＣおよびＤを、酸感受性ＰＥＧ化脂質として用いる。対照としては、ＢＲＩＪ７００（ＳＩＧＭＡ）および下記式のＰＥＧ化脂質：
【０２４４】
【化３２】
2004508364.tif 000029
を用い、それらはそれぞれ化合物ＣおよびＤの非酸感受性類縁体であり、ノニオン系界面活性剤として知られている（例えば、公開ＷＯ９８／３４６４８参照）。これら２種類の対照を水中１０ｇ／Ｌで用いる。
【０２４５】
核脂質複合体（ＤＮＡ／対照カチオン性脂質）のサンプル１ｍＬを、７５ｍＭの塩化ナトリウム溶液中１０μｇ／ｍＬのＤＮＡから、対照カチオン性脂質およびＰＥＧ化脂質（化合物Ｃまたは化合物ＤまたはＢｒｉｊ７００または類縁体Ｄ）の溶液とＤＮＡ溶液とを等量混合することで調製する。これらのサンプルはいずれも、１．５（ＤＮＡ１μｇ当たりの脂質ｎｍｏｌ単位）の対照カチオン性脂質／ＤＮＡ比を有し、含有ＰＥＧ化脂質量を増加させる（ポリマー／ＤＮＡの重量比として表す）。
【０２４６】
得られる粒子の径の測定は、混合後３０分に行い、特に対照カチオン性脂質／ＤＮＡ複合体の安定化に対する酸感受性ＰＥＧ化脂質（化合物ＣまたはＤ）または非酸感受性ＰＥＧ化脂質（Ｂｒｉｊ７００または類縁体Ｄ）の量の影響を調べることができる。流体力学的直径の測定は、ＤＮＡ　０．０１ｍｇ／ｍＬを含む異なる溶液８００μＬを充填したプラスチックキュベット（４つの透明な面）を用いるコールター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）Ｎ４Ｐｌｕｓ装置で行い、測定は単一モードで９０°にて行う。
【０２４７】
結果を図３に示してあるが、この図は使用される化合物ＣもしくはＤまたはＢｒｉｊ７００もしくは類縁体Ｄの量の関数としての対照カチオン性脂質／ＤＮＡ粒子の径における変動を示したものである。
【０２４８】
酸感受性ＰＥＧ化脂質とそれの安定な対照が、ある最小量に達した時に粒径の小さい（１００ｎｍ未満）対照カチオン性脂質／ＤＮＡ粒子を形成することができ、しかもその同じ対照カチオン性脂質／ＤＮＡ粒子が、酸感受性や非酸感受性ＰＥＧ脂質が存在しない場合、または後者の量が非常に低い場合には、自然に凝集する（１μｍより大きい粒径）ことが認められる。
【０２４９】
そこで本実施例では、化合物ＣおよびＤ、より一般的には本願の一般式（Ｉ）において（ｄ）で定義の種類の酸感受性ＰＥＧ化脂質をノニオン系界面活性剤として用いることができ、それのコロイド安定化力が、核脂質粒子のコロイド安定化に従来使用されている安定なノニオン系界面活性剤（すなわち、例えばＢｒｉｊ７００などの非酸感受性のもの）の力に匹敵することが示される。
【０２５０】
実施例１０：化合物ＣおよびＤによるＤＮＡ／カチオン性ベクター複合体のコロイド安定化に対するｐＨの影響
本実施例は、本願の一般式（Ｉ）における（ｄ）で定義される種類の酸感受性ＰＥＧ化脂質であって、ＤＮＡ／カチオン性脂質核脂質複合体を安定化するノニオン系界面活性剤として使用されるものを、酸性ｐＨで分解することができ、従って前記核脂質複合体を放出することができることを示すものである。
【０２５１】
ここで使用される顕著な特性は、ＰＥＧ化脂質を脂質部分を持たないＰＥＧに置き換えた場合に、コロイド安定化がないことである。実際、カチオン性ベクターおよび酸感受性ＰＥＧ化脂質の存在下でのＤＮＡの緩衝剤を含まない媒体中での製剤によって、小さい粒子が生じる（上記の実施例９参照）。他方、ＰＥＧのみ（すなわち、脂質部分に結合していない）を用いる同じ試験では安定化は得られない。
【０２５２】
本実施例で使用される酸感受性ＰＥＧ化脂質は、実施例５で製造の化合物Ｄ、ならびに前記実施例および後述の説明で「類縁体Ｄ」と称されるそれの非酸感受性類縁体である。
【０２５３】
核脂質複合体（ＤＮＡ／対照カチオン性脂質）のサンプル１ｍＬを、７５ｍＭの塩化ナトリウム溶液中１０μｇ／ｍＬのＤＮＡから、対照カチオン性脂質および化合物Ｄまたは非酸感受性類縁体Ｄを含む溶液とＤＮＡ溶液とを等量混合することで調製する。これらのサンプルはいずれも、対照カチオン性脂質／ＤＮＡ比が１．５（ＤＮＡ１μｇ当たりの脂質ｎｍｏｌ単位）であり、含有ＰＥＧ化脂質量を増加させる（ポリマー／ＤＮＡの重量比として表す）。
【０２５４】
ｐＨ５の酢酸／酢酸ナトリウム緩衝液（０．１ｍｏｌ／Ｌ）１００μＬを、換気式乾燥機中３７℃にサーモスタット調節したこれらサンプルに加える。粒子径を時間の関数として測定する。
【０２５５】
得られる結果を図４に示してあり、その図は時間の関数として、さらに酸感受性もしくは非酸感受性ＰＥＧ化脂質／ＤＮＡ比（３種類の重量比で試験：０．５または０．７５または１）に従っての核脂質粒子粒径を表す。
【０２５６】
類縁体Ｄ（非酸感受性ＰＥＧ化脂質）の場合、ｐＨは粒子のコロイド安定性に影響しない。形成される粒子は、使用される類縁体Ｄ／ＤＮＡ比とは無関係に、１００ｎｍ程度の小さい粒径を有する。時間ｔ＝０では、化合物Ｄ／ＤＮＡ比とは無関係に、化合物では同じ安定性が認められる。
【０２５７】
他方、化合物Ｄを酸性ｐＨ（ｐＨ５）でのノニオン系界面活性剤として用いる場合に、時間の関数としての核脂質粒子の粒径の上昇が認められる。化合物Ｄ／ＤＮＡ比が低いほど、核脂質粒子の粒径におけるその上昇が急速になる。そこで、４時間後に、比率が低い場合（０．５）には粒子は完全に凝集体になっており、大過剰の化合物Ｄを用いる場合（比率１）にはそれが全くないかごくわずかである。
【０２５８】
従ってその結果から、化合物ＤがｐＨ値に対して感受性であると推測することができる。実際、時間の関数としての核脂質粒子粒径の増加は、酸性媒体を用いた場合の酸感受性ＰＥＧ化脂質（化合物Ｄ）の分解を反映している（実際に、その化合物の酸感受性部分のレベルで脂質部分の「脱離」がある）。
【０２５９】
さらに、酸感受性ＰＥＧ化脂質／ＤＮＡ比を上昇させることで、凝集に要する時間も増加し、それは酸感受性ＰＥＧ化脂質の使用量が増えるに連れて、その中で核脂質粒子の凝集が起こる閾値を超える前に分解を起こすべきものが増えることを示す傾向を有している。そこで、酸感受性コロイド安定化剤の量を調節することで、所定のｐＨで有効成分を放出するのに要する時間をプログラムすることが可能である。
【０２６０】
実施例１１：カチオン性脂質／中性共脂質（ｃｏ−ｌｉｐｉｄ）／化合物Ｄ混合物で調整されるＤＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでのトランスフェクション
本実施例は、カチオン性脂質系のリポソームで調整されるＤＮＡ転移の効率に対する化合物Ｄなどのノニオン系界面活性剤の影響を示すものである。
【０２６１】
１）リポソームの製造
それぞれクロロホルムに溶かした下記式：
【０２６２】
【化３３】
2004508364.tif 000030
のカチオン性脂質および中性脂質ＤＯＰＥ（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ， Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ， ＡＬから入手）を等モル量ずつ混合する。
【０２６３】
適切な量の化合物Ｄをクロロホルムに溶かし、混合物に加える。使用する化合物Ｄの量は、総脂質量のモル％で示す。
【０２６４】
次に、有機溶媒をアルゴン気流下で留去することで、試験管の底に脂質薄膜を形成する。この薄膜を少なくとも１時間にわたり真空乾燥し、ｐＨ７．４の２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液および５％ブドウ糖で、４℃にて２時間にわたり再水和させる。そうして得られる脂質懸濁液を５０℃で３０分間加熱し、次に５分間超音波処理して、約１００ｎｍのリポソームの均一懸濁液を形成する。
【０２６５】
使用するＤＮＡは、ＣＭＶプロモーターの制御下でＣＡＴ遺伝子を含むプラスミドＤＮＡである。使用されるプラスミドＤＮＡは、エンドトキシンレベルが２０Ｕ／ｍｇ未満であり、超らせんＤＮＡの量が９０％より大きく、大腸菌ＤＮＡの混入が５％未満であり、ＲＮＡの混入が５％未満であり、蛋白の混入が１％未満であるという基準を有する。
【０２６６】
２）ＤＮＡ／脂質複合体の製造
急速かつ激しく撹拌しながら、ＤＮＡ溶液に等容量のリポソーム懸濁液（適切な濃度で）を急速に加える。全体として、ＤＮＡ　１μｇがカチオン性脂質５ｎｍｏｌと複合体を形成する。この形成された複合体は、約１００〜２４０ｎｍの直径を有する。
【０２６７】
３）ｉｎ ｖｉｖｏでの投与
全ての実験で、約６週齢の雌Ｂａｌｂ／Ｃマウスを用いる。各マウスには、右脇腹に１０６個のＭ１０９細胞を皮下注射する。腫瘍が約３００ｍｍ３の大きさに達した時に、マウスに対して静脈注射にて、ＤＮＡ５０μｇを含むＤＮＡ／脂質複合体２００μＬを投与する。注射から２４時間後に組織を摘出し、用時まで−７０℃で保存する。
【０２６８】
４）ＣＡＴアッセイ
「ファストプレプ細胞破壊装置ＦＰ１２０（ＦａｓｔＰｒｅｐ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ ＦＰ１２０）」（Ｂｉｏ １０１／Ｓａｖａｎｔ）を用いて組織を均質化する。次にサンプルを、５分間にわたり１００回転／分で遠心分離する。発現されるＣＡＴ導入遺伝子の量を、標準的なＣＡＴ　ＥＬＩＳＡ法（Ｒｏｃｈｅ， ＩＮ）を用いて求める。
【０２６９】
５）結果
ＤＮＡ／カチオン性脂質／ＤＯＰＥ複合体の遺伝子転移活性に関する化合物Ｄの用量−応答曲線を調べた。陰性対照としては、化合物「類縁体Ｄ」を用いた。予想通り、最も高い遺伝子転移は肺で起こる。化合物「類縁体Ｄ」を用いることで、用量依存的に肺および腫瘍でのトランスフェクション活性が阻害されることが認められた。化合物Ｄの量を増やすことでも、肺でのトランスフェクション活性が阻害される。他方、遺伝子転移は腫瘍では影響を受けないように思われる。これらの結果は、腫瘍の酸性環境により、管外溢出後に粒子の残りの部分からＰＥＧ部分が分離するという仮説と一致している。
【０２７０】
こうして得られ、図７に示した結果は、化合物Ｄにより、肺と比較して腫瘍に対して特異的な遺伝子転移活性を４０倍上昇させることができることを示している。
【０２７１】
実施例１２：ｐＨの関数としての酸感受性化合物の安定性についての試験
本実施例は、本発明による酸感受性化合物が、存在するオルトエステル環（５員環または６員環）の性質に応じて調節可能である酸感受性を有することを示すものである。
【０２７２】
この趣旨において、各種範囲の感受性を網羅することができる各種酸感受性ＰＥＧ化脂質について、ｐＨおよび時間の関数として核脂質複合体（実施例９および１０で用いたものと同じもの）の粒径の変動を測定する。これらの試験は、一定の対照カチオン性脂質／ＤＮＡ比および酸感受性ＰＥＧ化脂質／ＤＮＡ比で行う。
【０２７３】
ＤＮＡ／対照カチオン性脂質／酸感受性ＰＥＧ化脂質複合体のサンプル１ｍＬを、以下のようになるように調製する。
【０２７４】
−対照カチオン性脂質／ＤＮＡ比が１．５ｎｍｏｌ／μｇである。
【０２７５】
−酸感受性ＰＥＧ化脂質／ＤＮＡ比が０．５または１である。
【０２７６】
−ＤＮＡ濃度が、７５ｍＭの塩化ナトリウム溶液中２０μｇ／ｍＬである。
【０２７７】
３０分後、０．０５ｍｏｌ／Ｌの緩衝液５００μＬおよび１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液５００μＬを、換気式乾燥機中３７℃でサーモスタット調節された上記サンプルに加える。そうして酸性ｐＨとし、粒径を時間の関数として測定する。
【０２７８】
サンプルの最終濃度は、７５ｍＭの塩化ナトリウム溶液中ＤＮＡ１０μｇ／ｍＬである。使用する緩衝液は、ｐＨ４、ｐＨ５およびｐＨ６のクエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液、ならびにｐＨ７．４のＨｅｐｅｓ／水酸化ナトリウム緩衝液である。
【０２７９】
得られた結果を図５に示してあり、その図は、前記実施例で製造され、使用されるオルトエステル環（５員環もしくは６員環）の性質のみが異なる酸感受性化合物ＣおよびＥについての、ｐＨおよび時間の関数としての核脂質粒子の粒径における変動を示すものである。
【０２８０】
これら２種類の化合物について、ｐＨが酸性の場合には、時間の関数としての核脂質粒子の粒径に上昇が認められ、それは分解を反映している。他方、ｐＨが７．４の場合には、時間の関数としての核脂質粒子の粒径に上昇は認められない。さらに、ｐＨが低くなるにつれて、核脂質粒子の凝集が急速に増える。
【０２８１】
最後に、試験を行った２種類の化合物ＣおよびＥの間で、動力学に大きい相違が認められる。ｐＨ６では、化合物Ｅを用いた場合には酸性化から約１時間後に核脂質粒子の凝集が開始するが、化合物Ｃを用いた場合には少なくとも４時間にわたって安定化を行うことができる。
【０２８２】
これらの結果は、酸感受性化合物ＣおよびＥ、より一般的には本発明によるその種の酸感受性化合物に下記のようないくつかの顕著な特性があることを示している。
【０２８３】
−それらはいずれも、酸性ｐＨ値で高い感受性を示し、いずれの場合もｐＨが低いほど、それの不安定化が急速になる。
【０２８４】
−それらはいずれも、生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）では比較的安定である。
【０２８５】
−それらの分解の動力学は、使用されるオルトエステル基（５員環または６員環）に応じて非常に異なる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
カチオン性脂質または酸感受性化合物０．４または１．７または６．０ｎｍｏｌ／ＤＮＡμｇという３種類の異なる比率で、ＤＮＡと対照カチオン性脂質または酸感受性化合物Ａ　シンもしくはトランスとの間で形成される複合体のｐＨ５での時間の関数としての蛍光レベルの変動を示す図である。
【図２】
血清を含む場合または含まない場合での、各種使用比率でのＤＮＡと化合物Ａ　シンもしくはトランスまたは対照カチオン性脂質との間で形成された複合体のＨｅＬａ細胞へのｉｎ ｖｉｔｒｏでのトランスフェクションの効率を示す図である。
【図３】
ＤＮＡ量に関して使用される化合物Ｃまたは化合物ＤまたはＢｒｉｊ７００または化合物Ｄの非酸感受性類縁体（類縁体Ｄ）の量（重量比）の関数としての対照カチオン性脂質／ＤＮＡ核脂質粒子の粒径（ｎｍ単位）の変動を示す図である。
【図４】
ｐＨが５の場合の各種比率（重量比）での、時間の関数としての対照カチオン性脂質／ＤＮＡ／化合物もしくは類縁体Ｄ核脂質粒子の粒径（ｎｍ単位）の変動を示す図である。
【図５】
各種ｐＨ（ｐＨ４、ｐＨ５、ｐＨ６およびｐＨ７．４）での時間の関数としての、対照カチオン性脂質／ＤＮＡ／化合物Ｃもしくは化合物Ｅ核脂質粒子の粒径（ｎｍ単位）の変動を示す図である。
【図６】
プラスミドｐＸＬ３０３１の模式図である。
【図７】
カチオン性脂質／ＤＯＰＥ／ＤＮＡ（５／５／１）複合体が介在するｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子転移活性に対する化合物Ｄについての用量／応答曲線を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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