(57)【要約】本発明による可溶性内皮プロテインＣレセプター（ｓＥＰＣＲ）のアッセイは、有効なトロンビンレベルおよび凝固能亢進状態をモニタリングするために有用である。従って、ｓＥＰＣＲに対するアッセイは、抗凝固剤治療の進行中の効果をモニタリングするために有用である。ｓＥＰＣＲ  ＥＬＩＳＡアッセイは、この目的で特に有用である。患者または正常な個体における凝固能亢進の状態もまた、このようなアッセイによって同定され得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗凝固剤治療を受けている患者において、有効トロンビンレベルをモニタリングするための方法であって、該方法は、可溶性内皮プロテインＣレセプター（ｓＥＰＣＲ）の循環レベルを測定する工程を包含し、ここで、低下したｓＥＰＣＲレベルが、低下した有効トロンビン活性に関連する、方法。
【請求項２】
前記抗凝固剤治療が、ビタミンＫアンタゴニストを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗凝固剤治療が、ワルファリン、クマジン、プレビスカン、およびシントロームのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗凝固剤治療が、ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ヒルジン、ヒルジンアナログ、凝固因子インヒビター、プロテインＣ経路の成分、組織因子経路インヒビター、抗血小板化合物またはフィブリン溶解経路の成分の使用を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ｓＥＰＣＲが、イムノアッセイによって測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｓＥＰＣＲが、ＥＬＩＳＡによって測定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｓＥＰＣＲレベルが、血液産物、脳脊髄液または尿中のｓＥＰＣＲを測定することによって決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記血液産物が、血漿または血清である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
抗凝固剤治療の有効性をモニタリングするための方法であって、該方法は、循環ｓＥＰＣＲレベルを測定する工程を包含し、ここで、ｓＥＰＣＲの減少が、該抗凝固剤治療が有効であることを示す、方法。
【請求項１０】
前記抗凝固剤治療が、ビタミンＫアンタゴニストを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗凝固剤治療が、ワルファリン、クマジン、プレビスカン、およびシントロームのうちの少なくとも１つを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗凝固剤治療が、ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ヒルジン、ヒルジンアナログ、凝固因子インヒビター、プロテインＣ経路の成分、組織因子経路インヒビター、抗血小板化合物またはフィブリン溶解経路の成分の使用を包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記ｓＥＰＣＲが、イムノアッセイによって測定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記ｓＥＰＣＲが、ＥＬＩＳＡによって測定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｓＥＰＣＲレベルが、血液産物、脳脊髄液または尿中のｓＥＰＣＲを測定することによって決定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記血液産物が、血漿または血清である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
凝固能亢進状態にある個体を同定するための方法であって、該方法は、可溶性内皮プロテインＣレセプター（ｓＥＰＣＲ）の循環レベルを測定する工程を包含し、ここで、上昇したｓＥＰＣＲレベルが、凝固能亢進性に関連する、方法。
【請求項１８】
前記ｓＥＰＣＲが、イムノアッセイによって測定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ｓＥＰＣＲが、ＥＬＩＳＡによって測定される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｓＥＰＣＲレベルが、血液産物、脳脊髄液または尿中のｓＥＰＣＲを測定することによって決定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記血液産物が、血漿または血清である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
凝固能亢進状態を発達させる危険のある患者を同定するための方法であって、該方法は、可溶性内皮プロテインＣレセプター（ｓＥＰＣＲ）の循環レベルを測定する工程を包含し、ここで、上昇したｓＥＰＣＲレベルが、凝固能亢進状態の増加した危険に関連する、方法。
【請求項２３】
前記ｓＥＰＣＲが、イムノアッセイによって測定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｓＥＰＣＲが、ＥＬＩＳＡによって測定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記患者が、凝固能亢進性に頻繁に関連する状態を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記患者が、癌、敗血症、糖尿病、心臓病、アテローム性動脈硬化症または自己免疫疾患を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｓＥＰＣＲが、イムノアッセイによって測定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記ｓＥＰＣＲが、ＥＬＩＳＡによって測定される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｓＥＰＣＲレベルが、血液産物、脳脊髄液または尿中のｓＥＰＣＲを測定することによって決定される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記血液産物が、血漿または血清である、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（発明の背景）
本願は、米国出願６０／２７０，０６６（２００１年２月２０日出願）および米国通常出願１０／０２８，７４１（２００１年１２月２０日）に対する優先権の権利を主張し、これらの全内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（Ｉ．発明の分野）
本発明は、脈管生物学および炎症の分野に関する。より詳細には、本発明は、トロンビン生成の測定として可溶性内皮プロテインＣレセプターを検出するためのアッセイに関する。
【０００３】
（ＩＩ．関連技術）
米国において、５５００万人より多くの人が、現在、血栓症と関連する状態に罹患している。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎは、血栓症の処置のための米国ヘルスケアシステムに対する年間の直接的な費用は、２０００億ドルを超えると試算している。世界規模での年間ベースでは、ほぼ２００万人の患者が、このような状態を処置するために、心肺バイパス手術または冠状動脈血管形成術のいずれかを受けている。血栓症および関連する疾患は、数１００万人の患者を襲い、そして血栓症の発現は、有意な罹病率および死亡率の源である。
【０００４】
うっ血の心配は、過剰凝固状態の病因の中心にあり、そして複数の重複する作用によって誘発され得る。これらとしては、環境効果（手術、食事、喫煙、出産、外傷）、原発性疾患の発現（心臓疾患、糖尿病、敗血症、高血圧、自己免疫疾患、悪性腫瘍）またはうっ血因子の遺伝的欠損（例えば、プロテインＣ、プロテインＳ、Ｖ因子Ｌｅｉｄｅｎ、プロトロンビン、アンチトロンビンＩＩＩ）が挙げられるが、これらに限定されない（Ｋｅａｒｏｎら、２０００；Ｃａｒｅｙら、１９９８；Ｌａｎｅら、２０００）。臨床設定としては、汎発性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）、深静脈血栓症（ＤＶＴ）、または手術時のＤＶＴ回避ならびに急性心筋梗塞、機械式人工器官心臓弁、僧帽弁逸脱症、心房性細動、リウマチ性僧帽弁疾患、および拡張型心筋症のような心臓状態が挙げられる。米国単独で、心房性細動または機械式心臓弁を有する１５０万人より多くの患者が、現在、予防的経口抗凝固剤治療を受け、発作および血栓形成を予防するための一助としている。
【０００５】
血栓性疾患を有する患者に対する現在の治療アプローチは、代表的に、一連の静脈内未分画ヘパリンまたは静脈内低分子量ヘパリンで開始され、一連の経口抗凝固剤が続く。どちらの治療レジメンとも、トロンビンの活性、細胞の活性化を担う潜在的な酵素、凝血塊の基礎を形成するフィブリンの生成を低下させることを求める。北アメリカにおいて、ワルファリン（４−ヒドロキシクマリン）は、最も広範に使用される経口抗凝固剤であり、静脈血栓症または動脈血栓症および塞栓症を予防および処置するために処方される。
【０００６】
しかし、ワルファリンは、潜在的な危険薬物である。なぜなら、その治療ウインドウは相対的に狭く、そして用量応答が、患者間で有意に異なるからである。ワルファリン治療は、処置した人の約１〜８％に大きな出血を引き起こし、治療の各年の間に患者の約０．１〜０．５％に頭蓋内出血を引き起こす（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒら、１９９３；Ｃｏｎｎｅｇｉｅｔｅｒら、１９９５；Ｌｅｖｉｎｅら、ＮＥＥＤ  ＹＥＡＲ）。一過性虚血性発作または小さな発作を有する患者は、特に、ワルファリン治療からの出血に対して危険なようである（Ｌａｕｐａｃｉｓら、１９９４；Ａｎｎ．Ｎｕｅｒｏｌ．，１９９７；Ｎ．Ｅ．Ｊｏｕｒ．Ｍｅｄ．，１９９５）。小規模な患者集団（０．０１〜０．１％）は、皮下脂肪の静脈および毛細血管の血栓症に起因してワルファリン誘導性皮膚壊死を示し得る（Ｃｈａｎら、２０００）。これは、抗凝固剤タンパク質の欠損と関連し得るか、または前凝固剤（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）タンパク質プロトロンビン（日）と比較して、抗凝固剤プロテインＳおよび／またはプロテインＣの急速なワルファリン誘導性の損失（時間）に起因した、バランスのとれていないうっ血制御と関連し得る。従って、凝固状態の連続的なモニタリングが必要である。
【０００７】
トロンビンの直接的な測定は、循環中でのその３０秒の半減期に起因して実質的に不可能である。これは短い時間のようであるが、トロンビンは、特別に強力な酵素であり、そして３０秒は、トロンビンがそのタンパク質基質および細胞レセプターに作用するのに十分すぎるほどの時間である。従って、凝固試験の設計者に課される課題とは、他のタンパク質またはインビトロパラメーターから影響を受けることなくトロンビンレベルを反映させるアッセイ、再現性がありかつ標準化され得るアッセイ、そして理想的にはトロンビンレベルのヒストリを報告するアッセイを作製することである。この後者の課題は、糖尿病患者においてヘモグロビンＡ１ｃ（グリコヘモグロビン）レベルによって提供されるものと等価である。患者の遵守および治療効果は、これらの患者において、それらのヘモグロビンＡ１ｃのグリコシル化レベル（本質では、２〜４ヶ月の期間にわたるそれらの血漿グルコースレベルの反映）によって測定される（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９９４）。経口抗凝固剤治療を受ける患者について、これらの課題パラメーターはいずれも、現在利用可能な抗凝固剤試験によって満たされておらず、改善された方法が必要とされる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
従って、本発明に従って、抗凝固剤治療を受けている患者において有効なトロンビンレベルをモニタリングするための方法が提供され、この方法は、可溶性内皮プロテインＣレセプター（ｓＥＰＣＲ）の循環レベルを測定する工程を包含し、ここで、低下したｓＥＰＣＲレベルは、低下した有効トロンビン活性と関連する。抗凝固剤治療は、ビタミンＫアンタゴニストを含み得、ワルファリン、クマジン（Ｃｏｕｍａｄｉｎｅ）、プレビスカン（Ｐｒｅｖｉｓｃａｎ）、シントローム、ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ヒルジン、ヒルジンアナログ、凝固因子インヒビター、プロテインＣ経路の成分、組織因子経路のインヒビター、抗血小板化合物またはフィブリン溶解経路の成分のうちの少なくとも１つを含み得る。ｓＥＰＣＲは、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって測定され得る。循環ｓＥＰＣＲレベルは、サンプル（例えば、血液産物（血清、血漿）、髄液または尿）から決定され得る。
【０００９】
別の実施形態において、抗凝固剤治療の効果をモニタリングするための方法が提供され、この方法は、循環ｓＥＰＣＲレベルを測定する工程を包含し、ここで、ｓＥＰＣＲの低下は、その抗凝固剤治療が有効であることを示す。抗凝固剤治療は、ビタミンＫアンタゴニストを含み得、ワルファリン、クマジン、プレビスカン、シントローム、ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、ヒルジン、ヒルジンアナログ、凝固因子インヒビター、プロテインＣ経路の成分、組織因子経路のインヒビター、抗血小板化合物またはフィブリン溶解経路の成分のうちの少なくとも１つを含み得る。ｓＥＰＣＲは、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって測定され得る。循環ｓＥＰＣＲレベルは、サンプル（例えば、血液産物（血清、血漿）、髄液または尿）から決定され得る。
【００１０】
なお別の実施形態において、過剰凝固状態の個体を同定するための方法が提供され、この方法は、可溶性内皮プロテインＣレセプター（ｓＥＰＣＲ）の循環レベルを測定する工程を包含し、ここで、上昇したｓＥＰＣＲレベルは、過剰凝固と関連する。ｓＥＰＣＲは、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって測定され得る。循環ｓＥＰＣＲレベルは、サンプル（例えば、血液産物（血清、血漿）、髄液または尿）から決定され得る。
【００１１】
なおさらなる別の実施形態において、過剰凝固状態を発生する危険性のある患者を同定するための方法が提供され、この方法は、可溶性内皮プロテインＣレセプター（ｓＥＰＣＲ）の循環レベルを測定する工程を包含し、ここで、上昇したｓＥＰＣＲレベルは、過剰凝固の危険性の増加に関連する。ｓＥＰＣＲは、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって測定され得る。患者は、過剰凝固としばしば関連する状態、例えば、癌、敗血症、糖尿病、心臓病、アテローム性動脈硬化症、または自己免疫疾患を有し得る。ｓＥＰＣＲは、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって測定され得る。循環ｓＥＰＣＲレベルは、サンプル（例えば、血液産物（血清、血漿）、髄液または尿）から決定され得る。
【００１２】
以下の図面は、本明細書中の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書中に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することによってより良く理解され得る。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
米国において、５５００万人より多くの人が、現在、血栓症と関連する状態に罹患している。これらの患者の多くは、抗凝固剤の投与を必要とする。一様な慢性抗凝固剤治療を可能にする優れた薬物が存在するが、これらの薬物は有害効果（例えば、過剰な出血）を有する。これらの薬物に対する治療ウインドウは狭くかつ変動性の両方であり、抗凝固状態の一定の評価が必要とされる。
【００１４】
抗凝固剤経路における重要な成分は、トロンビンであり、トロンビンは、凝固カスケードの最終酵素産物であり、フィブリンの形成および血小板の活性化に必要であり、これらは両方とも、凝血塊の必須の成分である。トロンビン自体は、実質的に測定が不可能であるので、代理マーカーの使用が必要である。現在、トロンビン生成をモニターするために臨床的に使用される４種類の試験物が存在する：（ａ）プロトロンビン（ＰＴ）フラグメント１＋２（Ｆ１＋２）；（ｂ）フィブリノペプチドＡ（ＦｐＡ）；（ｃ）トロンビン／抗トロンビン複合体（ＴＡＴ）；および（ｄ）可溶性フィブリンモノマー（ＳＦＭ）。プロトロンビンフラグメント１＋２は、プロトロンビンがプロトロンビン複合体中の第Ｘａ因子によってトロンビンに変換されたときに、生成される。これは、約９０分の半減期で循環中に放出されるペプチドである。従って、Ｆ１＋２レベルは、急性のトロンビン生成のみを反映する。
【００１５】
フィブリノペプチドＡ（ＦｐＡ）は、直接的なトロンビンタンパク質分解によってフィブリノーゲンから放出される。このペプチドは血中を循環し、そして感応性ＥＬＩＳＡを用いて検出され得る。ＦｐＡレベルの主要な欠点は、これらが、静脈切開技術および血液操作慣用手順によるトロンビンのインビトロ生成に非常に感受性であるということである。数社の製造業者は、ＥＬＩＳＡキットの製造を停止し、そしてほとんどの血液学試験所および凝固参照試験所が、この試験を提供していない。
【００１６】
抗トロンビン（ＡＴ）は、トロンビンの主要なインヒビターであり、トロンビンと複合体化して（ＴＡＴ）、トロンビンを循環から除去する。ＴＡＴレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定され得る。ＴＡＴレベルはまた、トロンビンの急性の生成も反映する。なぜなら、この複合体は、肝臓中でレセプター媒介機構によって清澄されるからであり、このことは、長期のトロンビンレベルの評価を制限する。重要なことに、Ｆ１＋２レベルおよびＴＡＴレベルの両方が、インビボトロンビン生成および人工インビトロトロンビン生成の両方を反映する。トロンビンは、インビトロにおいて生成され得（最も一般的には、静脈切開手順によって）、人工的にＦ１＋２レベルおよびＴＡＴレベルを上昇させる。
【００１７】
可溶性フィブリンモノマー（ＳＦＭ）は、トロンビンがフィブリノペプチドＡおよびフィブリノペプチドＢをフィブリノーゲンから切断する場合に生成され、そしてこのフィブリンモノマーは、過剰なフィブリノーゲンと非共有結合的に相互作用する。次いで、トロンビンは、第ＸＩＩＩａ因子を生成し、このＳＦＭを血管壁上の局所的血塊または全身的沈積物に架橋させる。従って、ＳＦＭが増加するほど、トロンビンの正常な除去が飽和したかまたはもはや適切には作用しないということを示す。
【００１８】
プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイは、血塊を生じる能力を評価するための慣用的なスクリーニング方法である。その有用性は、全経路要素における欠陥を検出することである。しかし、ＰＴアッセイは、凝固時間の延長を生じる因子または現象に対してより感受性である。抗凝固治療を受けた患者における延長したＰＴ時間と出血エピソードとの間には良好な相関が存在する。しかしながら、ＰＴ値およびＩＮＲ値により判断されるように、抗凝固治療の投薬中であることを検出することは困難である。長期間の治療は、凝固能亢進状態を維持し、従って、患者は、血栓事象の危険性を知らずに保持する。ｓＥＰＣＲレベルは、トロンビン活性のより確実なマーカーを提供し、そして抗凝固治療の投与中であることを報告し、かつ特定の抗凝固薬に対して応答性である。
【００１９】
従って、現在利用可能な試験は、インビトロのトロンビン生成からの妨害を受ける。さらに、毎週または毎月のモニタリングを必要とする経口抗凝固治療中の比較的安定した患者について、このような試験は、静脈切開の場合のみに、凝固状態を報告する。これらの結果は、数日間にわたって生成されたトロンビンレベルを示さず、可能性のあるトロンビン現象の危険性も示さない。
【００２０】
（Ｉ．本発明）
本発明者らは、凝固状態を測定するための新規で改善された方法を同定した。本発明者らは、可溶性内皮プロテインＣレセプター（ｓＥＰＣＲ）の血漿レベルとトロンビン生成との間に直接的な関係があることを決定した。ｓＥＰＣＲを測定するためのアッセイは、米国特許第５，８０４，３９２号において以前に記載されており、そして以下で考察されるように、種々の異なる実施形態において用いられ得る。
【００２１】
第１に、本発明は、静脈内治療または経口抗凝固治療（例えば、ヘパリン、低分子量ヘパリン、ワルファリン、クマジン（ｃｏｕｍａｄｉｎｅ）、プレビスカン（ｐｒｅｖｉｓｃａｎ）、シントローム、凝固因子のインヒビターまたは抗血小板化合物を用いる処置）を受けている患者における、トロンビンレベル、すなわち凝固性を間接的にモニタリングするための方法に関する。この方法は一般に、患者の血漿サンプル中の可溶性内皮プロテインＣレセプター（ｓＥＰＣＲ）のレベルを測定する工程を包含する。ｓＥＰＣＲレベルは、ｓＥＰＣＲの放出を生じるプロテアーゼ活性のトロンビン誘導性上方制御に関する。この制御されたｓＥＰＣＲ放出は、トロンビン生成自体と比較して長い期間にわたって生じ、従って、患者および無症候個体において長期トロンビン活性および凝固能亢進状態についてのマーカーを提供する。ｓＥＰＣＲに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を用いる利用可能なＥＬＩＳＡアッセイは、血漿ｓＥＰＣＲレベルの測定を可能にする。従って、抗凝固治療の有効性は、投薬中であることおよび治療に対する応答を報告することに重点をおいて、患者においてモニタリングされ得る。
【００２２】
さらに、本明細書中で記載されるデータは、ｓＥＰＣＲレベルが病的な凝固能亢進性、またはその増大した危険性を示し得ることを、示唆する。従って、抗凝固治療をモニタリングするための実質的に同じアッセイを使用して、本発明者らは、ｓＥＰＣＲレベルを使用して、凝固能亢進状態（例えば、癌、敗血症、糖尿病、心臓疾患、アテローム性動脈硬化症または自己免疫疾患により引き起こされる凝固能亢進状態）の危険性を診断または評価することを提案する。これらおよび他の実施形態は、以下でより詳細に記載される。
【００２３】
（ＩＩ．抗凝固治療および凝固状態のモニタリング）
経口抗凝固治療の基本的な前提は、プロトロンビンの活性化に必要なビタミンＫ依存性凝固因子を妨害することによって、トロンビン形成を最終的に減少させることである。トロンビンは、凝固カスケードの最終酵素生成物であり、フィブリンを形成し血小板を活性化するために必要であり、これら両方は、血塊の必須成分である。しかし、トロンビンはまた、抗凝固制御系が適切に機能するために必要である。プロテインＣ抗凝固系は、凝固およびトロンビン形成の一次調節因子である（Ｅｓｍｏｎ，１９９９）。この経路によって生成される活性化プロテインＣは、トロンビン形成に必要な重要な凝固因子を不活性化する。
【００２４】
内皮プロテインＣレセプター（ＥＰＣＲ）は、最近同定され（Ｆｕｋｕｄｏｍｅら、１９９４）、トロンビン／トロンボモジュリン系によるこのプロテインＣの活性化を促進することが示された（Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａら、１９９６）。可溶性ＥＰＣＲ（ｓＥＰＣＲ）は、血漿中に見出され（Ｋｕｒｏｓａｗａら、１９９７）、レベルは、敗血症または全身性エリテマトーデスを有する患者において、上昇している（Ｋｕｒｏｓａｗａら、１９９８）。可溶性ＥＰＣＲレベルは、可溶性トロンボモジュリンのレベルと相関しなかった。可溶性トロンボモジュリンは、好中球エラスターゼタンパク質分解によって生成され、内皮損傷の容認されたマーカーである（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、１９９２；Ｔａｋａｎｏら、１９９０；Ｗａｄａら、２０００）。しかし、ｓＥＰＣＲは、異なる経路によって生成される。最近の研究によって、ｓＥＰＣＲがメタロプロテイナーゼ活性によって膜に結合した親から生成され、そしてこの活性はトロンビンおよび炎症性メディエータによって引き起こされ得ることが証明された（Ｘｕら、２０００）。従って、止血の観点から、トロンビン生成の制御が重要であるが、その全体的な除去は、同様に有害である。
【００２５】
血栓疾患を有する患者に対する現在の治療的アプローチは、代表的に、非分画ヘパリンまたは低分子量ヘパリンの静脈内コースで始まり、経口抗凝固薬のコースが続く。両方の治療レジメンは、トロンビンの活性、細胞の活性化を担う強力な酵素および血塊の基礎を形成するフィブリンの生成を減少することを試みる。北米において、ワルファリン（４−ヒドロキシクマリン）が、最も広く使用される経口抗凝固薬であり、これは、静脈または動脈の血栓症および塞栓症を予防および処置するために処方される。ワルファリンおよび類似のクマリン誘導体は、凝固タンパク質（プロトロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子）および抗凝固タンパク質（プロテインＣ、プロテインＳ）の形成および／または作用を弱めるビタミンＫアンタゴニストである（Ｈｒｉｓｈら、１９９８；Ｂｒｅｃｋｅｎｒｉｄｇｅ，１９７８；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，１９７６；Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら、１９８７）。２〜７日のワルファリンの開始および作用の持続時間は、予測可能であり、これは優れたバイオアベイラビリティを有する。ワルファリンは、ＧＩ管から迅速に吸収され、健康なボランティアにおいて９０分で最大血液レベルに達し、そして３６〜４２時間の半減期を有する。他の抗凝固薬としては、ヘパリン、低分子量ヘパリン、五糖類、プレビスカン、シントローム、凝固因子のインヒビター、または抗血小板化合物が挙げられる。
【００２６】
抗凝固治療の間、患者の凝固状態は、ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）アッセイおよび／またはＰＴ（プロトロンビン時間）凝固アッセイを使用してモニタリングされる。ＡＰＴＴアッセイは、凝固の内因的な最終的な共通の経路の完全性を試験し、従って、このアッセイは、凝固因子の減少または凝固因子インヒビターの存在に対して感受性である。ＰＴアッセイは、凝固の外因的または開始剤の経路の有用な指標であり、従って、第ＶＩＩ因子、ならびに共通経路の第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｘ因子およびフィブリノーゲンのレベルに依存する。ＰＴアッセイは、ワルファリンを用いる抗凝固治療をモニタリングするために、スクリーニング試験として使用される。患者の凝固状態のモニタリングは、非常に重要である。なぜなら、抗凝固治療レジメンは、出血エピソードを含む有意な合併症を有し得るからである。
【００２７】
経口抗凝固治療の患者の間隔の短いモニタリングが、必要とされ、そしてほとんどの患者は、治療範囲が達成されるまで毎日のＰＴ試験を受け、続いて示された安定性が毎月のモニタリングを許容するまで、７〜１４日間、３回／週のＰＴ試験を受ける。しかし、研究室間の臨床的ＰＴ結果の標準化は、非常に異なる。なぜなら、アッセイで使用されるトロンボプラスチン試薬は、組織源および調製方法に依存して、メーカー間で広範な可変性を示すからである。これらの可変性の源が、ＰＴ報告の標準化を困難にし、そして患者を異常な投薬に曝していた。
【００２８】
ＷＨＯの推奨に基づいて、国際規格化比率（ＩＮＲ）が、この標準化の問題を解決するために、１９８０年代初期に採用された。このＩＮＲは、患者の測定されたＰＴ時間および標準的な試薬と市販のトロンボプラスチンとを比較することによって決定された国際感受性指数（ＩＳＩ）に基づく計算値である。１９９０年代初期において、ＩＮＲの概念が、米国医学界に導入された。ほとんどの治療的抗凝固用途について、２．０〜３．０の範囲のＩＮＲ値が、推奨される。現在、ほとんどの研究所は、ＩＮＲ形式を世界的に使用する。しかし、ＩＮＲの使用が可変性の問題を排除しないという一般協定がある（Ｒｉｌｅｙら、２０００）。なぜなら、部分的に、各トロンボプラスチンのロットについてのメーカーの指定するＩＳＩ値は、使用される機器に従って異なるからである。約２７０の異なる試薬−機器の組み合わせが存在するので、これは、有意な問題を残す。
【００２９】
（ＩＩＩ．ｓＥＰＣＲ）
ＥＰＣＲは、ＣＤ１／ＭＨＣクラス１ファミリーに対して有意な相同性を有する内皮細胞レセプターである（ＦｕｋｕｄｏｍｅおよびＥｓｍｏｎ，１９９４；Ｆｕｋｕｄｏｍｅら、１９９６；Ｒｅｇａｎら、１９９６）。プロテインＣに対する内皮細胞レセプターのクローン化および生物学的役割は、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９６３６に記載された。このタンパク質は、２３８アミノ酸からなることが予測され、このタンパク質は、Ｎ末端に１５アミノ酸のシグナル配列を含み、そしてこのレセプターをタイプ１膜貫通タンパク質と特徴付ける２３アミノ酸膜貫通領域を含む。ＥＰＣＲは、カルシウムの存在下で、プロテインＣおよびＡＰＣの両方と、類似の親和性で結合し（Ｆｕｋｕｄｏｍｅら、１９９６）、そしてトロンビン−トロンボモジュリン活性化複合体に対するプロテインＣ基質を細胞表面上に提示することによって、プロテインＣの活性化を促進する（Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａら、１９９６）。組換え可溶性ＥＰＣＲ（ｒｓＥＰＣＲ）（膜貫通ドメインの直前で切断されている）は、プロテインＣおよびＡＰＣの両方に、インタクトな細胞表面で発現されるＥＰＣＲについて観察される親和性と類似の親和性で結合する（Ｆｕｋｕｄｏｍｅら、１９９６）。
【００３０】
（ＩＶ．イムノアッセイ）
ｓＥＰＣＲに対して特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、いくつかの用途において有用性を有することが理解される。これらには、診断キットの製造およびｓＥＰＣＲの検出方法における用途が挙げられる。従って、本発明は、ｓＥＰＣＲに免疫学的に結合する抗体を提供する。抗体を調製および特徴付けするための手段は、当該分野で周知である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８（本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。ｓＥＰＣＲに対する抗体は、このような標準的な技術を使用して作製されており、そして米国特許第５，８０４，３９２号に記載されている。
【００３１】
（Ａ．ポリクローナル抗血清）
ポリクローナル抗血清は、動物を本発明に従う免疫原性組成物で免役し、そしてこの免役された動物から抗血清を収集することによって、調製される。広範な動物種が、この抗血清の生成のために使用され得る。代表的には、抗血清の生成のために使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモットまたはヤギである。ウサギの比較的多い血液量に起因して、ウサギが、ポリクローナル抗体の生成のための好ましい選択肢である。
【００３２】
当該分野で周知のように、所定の組成物の免疫原性は異なる。従って、ペプチド免疫原またはポリペプチド免疫原をキャリアに結合することにより達成され得るように、宿主免疫系をブーストすることが、しばしば必要である。代表的な好ましいキャリアは、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。他のアルブミン（例えば、オボアルブミン、マウス血清アルブミンまたはウサギ血清アルブミン）もまた、キャリアとして使用され得る。ポリペプチドをキャリアタンパク質に結合するための手段は、当該分野で周知であり、そしてこれには、グルタルアルデヒド、ｍ−マレイミドベンコイル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｂｅｎｃｏｙｌ）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボジイミドおよびビス−ビアゾ化ベンジジンが挙げられる。
【００３３】
当該分野で周知でもあるように、特定の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントとして公知の、免疫応答の非特異的刺激因子の使用によって増大され得る。例示的な好ましいアジュバントとしては、完全フロイントアジュバント（殺傷されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有する免疫応答の非特異的刺激因子）、不完全フロイントアジュバントおよび水酸化アルミニウムアジュバントが挙げられる。
【００３４】
ポリクローナル抗体の生成に使用される免疫原組成物の量は、免疫原および免疫に使用される動物の性質に依存して変化する。免疫原を投与するために、種々の経路が使用され得る（皮下、筋肉内、皮内、静脈内および腹腔内）。ポリクローナル抗体の生成は、免疫後の種々の時点で免疫された動物の血液を採取することによって、モニタリングされ得る。
【００３５】
第２のブースター注射もまた、与えられ得る。ブーストプロセスおよび滴定プロセスは、適切な力価が達成されるまで、繰り返される。所望のレベルの免疫原性が得られた場合、この免疫された動物を出血させ、そして血清が単離され、そして保存されるか、またはこの動物を使用して、ｍＡｂｓを作製する（以下）。
【００３６】
ウサギポリクローナル抗体の生成について、動物は、耳静脈を介して出血され得るか、あるいは心臓穿刺によって出血され得る。得られた血液を凝固させ、次いで、遠心分離して、全細胞および血餅から血清成分を分離する。この血清を、種々の用途で使用されるのと同じように使用するか、または所望の抗体画分を、周知の方法（例えば、固体マトリクスまたはプロテインＡに結合した別の抗体またはペプチドを使用するアフィニティクロマトグラフィー、続く精製のための抗原（ペプチド）アフィニティカラム）によって、精製し得る。
【００３７】
（Ｂ．モノクローナル抗体）
ｍＡｂは、周知の技術（例えば、米国特許第４，１９６，２６５号（本明細書中に参照として援用される）に例示される技術）の使用を介して容易に調製され得る。代表的には、この技術は、適切な動物を選択された免疫原組成物（例えば、精製したか部分的に精製したｓＥＰＣＲタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド）で免疫化することを含む。この免疫組成物は、抗体産生細胞を刺激するに効果的な様式で投与される。
【００３８】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作製するための方法は、一般に、ポリクローナル抗体を調製するための方法と同一のラインに沿って始まる。げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）は、好ましい動物であるが、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、サルの細胞もまた可能である。ラットの使用は、特定の利点を提供し得る（Ｇｏｄｉｎｇ，１９８６，ｐｐ．６０−６１）が、マウスが好ましく，ＢＡＬＢ／ｃマウスが、最も慣用的に使用され、安定な融合物のより高いパーセントを一般に与えるものとして、最も好ましい。
【００３９】
動物は、（一般的には上記されるような）抗原を注射される。抗原は、必要ならば、キャリア分子（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン）に結合され得る。抗原は、代表的には、アジュバント（例えば、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント）と混合される。同一の抗原でのブースター注射は、約２週間の間隔で生じる。
【００４０】
免疫化に続いて、抗体産生について潜在性を有する体細胞（特に、Ｂリンパ球（Ｂ細胞））は、ＭＡｂ作製プロトコルにおける使用について選択される。これらの細胞は、生検の脾臓またはリンパ節から得られ得る。脾細胞およびリンパ節細胞が好ましい。なぜなら、脾細胞は、分裂段階の形質芽球における抗体産生細胞の豊富な供給源であるからである。
【００４１】
しばしば、動物のパネルは、免疫化されており、そして最大の抗体力価を有する動物の脾臓が、取り出され、そして脾臓リンパ球が、シリンジで脾臓をホモジナイズすることによって得られる。代表的には、免疫化したマウス由来の脾臓は、約５×１０７〜２×１０８個のリンパ球を含む。
【００４２】
次いで、免疫化した動物由来の抗体産生Ｂリンパ球は、不死化骨髄腫細胞の細胞（一般に、免疫化された動物と同一種の細胞）と融合される。ハイブリドーマ産生融合手順における使用に適切な骨髄腫細胞株は、好ましくは、非抗体産生であり、高い融合効率を有し、次いで、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地中で増殖し得なくする酵素欠損を有する。
【００４３】
多くの骨髄腫細胞のいずれか１つは、当業者に公知であるように使用され得る（Ｇｏｄｉｎｇ，ｐｐ．６５−６６，１９８６；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ｐｐ．７５−８３，１９８４（各々が、本明細書中に参考として援用される）。例えば、免疫動物がマウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７およびＳ１９４／５ＸＸ０  Ｂｕｌが使用され得；ラットについて、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ  １．２．３、ＩＲ９８３Ｆおよび４Ｂ２１０が使用され得；ならびにＵ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２およびＵＣ７２９−６は、ヒト細胞融合物との結合に全て有用である。
【００４４】
１つの好ましいマウス骨髄腫細胞は、ＮＳ−１骨髄腫細胞株（Ｐ３−ＮＳ−１−Ａｇ４−１とも称される）であり、これは、細胞株寄託番号ＧＭ３５７３を請求することによってｔｈｅ  ＮＩＧＭＳ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｕｔａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙより容易に入手可能である。使用され得る別のマウス骨髄腫細胞株は、８−アザグアニン耐性マウス骨髄腫ＳＰ２／０非プロデューサー細胞株である。
【００４５】
抗体産生脾臓細胞またはリンパ球細胞と骨髄腫細胞とのハイブリッドを作製するための方法は、通常、体細胞を骨髄腫細胞と２：１の割合で混合する工程を包含するが、その割合は、細胞膜の誘導を促進する因子（化学的または電気的）の存在下で、それぞれ約２０：１〜約１：１まで変動し得る。センダイウイルスを使用する融合法は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５；１９７６）によって記載されており、そしてＧｅｆｔｅｒら．（１９７７）によってポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、３７％  （ｖ／ｖ）  ＰＥＧ）を使用する方法が記載されている。電気的に誘導された融合法の使用はまた、適切である（Ｇｏｄｉｎｇ  ｐｐ．７１−７４，１９８６）。
【００４６】
融合手順は、通常、生存可能なハイブリッドを低周波数（約１×１０−６〜１×１０−８）で産生する。しかし、これは、選択培地中で培養されることによって生存可能な融合されたハイブリッドが親の注入された細胞（特に、正常には無期限に分裂し続ける、注入された骨髄腫細胞）から分化される場合に、問題を示さない。選択培地は、一般に、組織培養培地中にデノボでのヌクレオチドの合成をブロックする薬剤を含む培地である。例示的かつ好ましい薬剤は、アミノプテリン、メトトレキサートおよびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレキサートは、プリンおよびピリミジンの両方の合成をデノボでブロックするが、アザセリンは、プリン合成のみをブロックする。アミノプテリンまたはメトトレキサートが使用される場合、培地は、ヒポキサンチンおよびチミジンをヌクレオチドの供給源として補充される（ＨＡＴ培地）。アザセリンが使用される場合、培地は、ヒポキサンチンで補充される。
【００４７】
好ましい選択培地は、ＨＡＴである。ヌクレオチドサルベージ経路を操作し得る細胞のみが、ＨＡＴ培地中で生存し得る。骨髄腫細胞は、サルベージ経路の主要酵素（例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ））を欠失し、この細胞は生存し得ない。Ｂ細胞は、この経路を操作し得るが、培養物中での制限された寿命を有し、一般に、２週間以内に死ぬ。従って、選択培地中で生存し得る細胞のみが、骨髄腫細胞およびＢ細胞から形成されるハイブリッドである。
【００４８】
この培養は、特定のハイブリドーマが選択されるハイブリドーマの集団を提供する。代表的には、ハイブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートでの単一クローン希釈による細胞を培養すること、続いて個々のクローン上清を、（約２〜３週間後に）所望の活性について試験することによって実施される。アッセイは、感受性であり、単純であり、そして迅速であらねばならない（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、細胞傷害性アッセイ、プラークアッセイ、ドットイムノブロッティングアッセイなど）。次いで、選択されたハイブリドーマは、段階希釈され、そして個々の抗体産生細胞株にクローニングされる。次いで、このクローンは、ｍＡｂを提供するために無期限に培養され得る。細胞株は、２つの基本的方法においてｍＡｂ産生に活用され得る。
【００４９】
ハイブリドーマのサンプルは、体細胞および骨髄腫細胞をもともとの融合物（例えば、同系マウス）に提供するために使用される、組織適合性の型の動物に注入され得る。必要に応じて、動物は、炭化水素、特に、油（例えば、プリスタン（テトラメチルペンタデカン））で、注入前にプライムされる。注入された動物は、融合された細胞ハイブリッドによって産生される特定のモノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発達させる。次いで、動物の体液（例えば、血清または腹水）は、ｍＡｂを高濃度で提供するように穿刺される。
【００５０】
個々の細胞株はまた、インビトロで培養され得る。ここで、ｍＡｂは、高濃度で容易に得ることができる培養培地中に天然に分泌される。いずれかの手段によって産生されるｍＡｂは、所望ならば、濾過、遠心分離および種々のクロマトグラフィー法（例えば、ＨＰＬＣまたはアフィニティクロマトグラフィー）を使用してさらに精製され得る。本発明のモノクローナル抗体のフラグメントは、酵素（例えば、ペプシンまたはパパイン）での消化、および／または化学的還元によるジスルフィド結合の切断を含む方法によって精製されたモノクローナル抗体から精製され得る。あるいは、本発明によって含まれるモノクローナル抗体フラグメントは、自動化ペプチド合成機を使用して合成され得る。
【００５１】
分子クローニングアプローチがモノクローナル抗体を作製するために使用され得ることはまた、企図される。これについて、コンビナトリアル免疫グロブリンファージミドライブラリーが、免疫化された動物の脾臓から単離されたＲＮＡより調製され、そして適切な抗体を発現するファージミドが、抗原およびコントロール細胞（例えば、正常対腫瘍細胞）を発現する細胞を使用するパニングによって選択される。慣用的なハイブリドーマ技術を超えるこのアプローチの利点は、約１０４倍の多さの抗体が、単一周回で産生およびスクリーニングされ得、そして、新たな特異性が、適切な抗体を発見する機会をさらに増加させるＨ鎖とＬ鎖の組み合わせによって作製されるということである。
【００５２】
（Ｃ．イムノアッセイ）
なおさらなる実施形態において、従って、本発明は、ｓＥＰＣＲを結合、定量またはさもなくば一般的に検出するための免疫検出法に関する。種々の有用な免疫検出法の工程は、学術文献（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａら（１９８７；本明細書中に参考として援用される））に記載されている。イムノアッセイは、そのほとんどが単純かつ直接的に感知する、結合アッセイである。特定の好ましいイムノアッセイは、種々の型の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫ビーズ捕獲アッセイである。しかし、検出が、このような技術に限定されないことは、容易に明白であり、そしてウエスタンブロッティング、ドットブロッティング、ＦＡＣＳ分析などもまた、本発明と合わせて使用され得る。
【００５３】
一般に、免疫結合法は、タンパク質、ペプチドまたは抗体を含むことが予想されるサンプルを得る工程、およびこのサンプルを、本発明に従って抗体またはタンパク質またはペプチドと接触させる工程、を包含し、この場合は、免疫複合体の形成を可能にするに効果的な条件下であり得る。
【００５４】
本発明の免疫結合法は、サンプル中の反応性成分の量を検出または定量化するための方法を含み、この方法は、結合プロセスの間に形成される任意の免疫複合体の検出または定量を必要とする。ここで、本発明者らは、ｓＥＰＣＲを含むことが予想されるサンプルを得、そしてこのサンプルを抗体と接触させ、次いで、特定の条件下で形成される免疫複合体の量を検出または定量する。
【００５５】
選択された生物学的サンプルを、抗体または抗血清と、効果的な条件下で、そして免疫複合体の形成（一次免疫複合体）を可能にするに十分な期間にわたって接触させることは、一般に、組成物をサンプルに単に添加し、そしてｓＥＰＣＲとの免疫複合体を形成するためにこの混合物を抗体と十分な期間にわたってインキュベートする様式である。この期間の後、サンプル−抗体組成物は、一般に、洗浄して非特異的に結合した任意の抗体種を除去し、これらの抗体のみが、検出されるべき一次免疫複合体内に特異的に結合することを可能にする。
【００５６】
一般に、免疫複合体の検出は、当該分野において周知であり、多くのアプローチの適用を介して達成され得る。これらの方法は、一般に標識またはマーカーの検出に基づく（例えば、任意の放射活性、蛍光、生物学的タグまたは酵素的タグあるいは当該分野における標準法）。このような標識の使用に関する米国特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号（各々が、本明細書中に参考として援用される）が挙げられる。
【００５７】
特定の実施形態において、一次免疫複合体内に結合される最初に添加される成分は、コードされるタンパク質、ペプチドまたは対応する抗体に対して結合親和性を有する第２の結合リガンドによって検出され得る。これらの場合において、第２の結合リガンドは、検出可能な標識に連結され得る。第２の結合リガンドは、それ自体しばしば抗体であり、よってこれは、「二次」抗体と称され得る。一次免疫複合体は、二次免疫複合体の形成を可能にするに効果的な条件下で、二次免疫複合体の形成を可能にするに十分な期間にわたって、標識された第２の結合リガンドまたは抗体と接触される。次いで、第２の免疫複合体は、一般に、非特異的に結合した任意の標識二次抗体またはリガンドを洗浄して除去し、次いで、二次免疫複合体中に残存した標識は、検出される。
【００５８】
さらなる方法は、２工程アプローチによる一次免疫複合体の検出を含む。コードされたタンパク質、ペプチドまたは対応する抗体に対する結合親和性を有する第２の結合リガンド（例えば、抗体）を使用して、上記のような二次免疫複合体を形成する。洗浄後、二次免疫複合体は、免疫複合体（三次免疫複合体）の形成を可能にするに効果的な条件下で、免疫複合体の形成を可能にするに十分な時間にわたって、二次抗体に対する結合親和性を有する第３のリガンドまたは抗体と接触させられる。第３のリガンドまたは抗体は、よって形成される三次免疫複合体の検出を可能にする、検出可能な標識に連結される。この系は、（所望される場合）シグナル増幅を提供する。
【００５９】
ＥＬＩＳＡとして知られる酵素免疫測定法は、本発明における特定の目的である。１つの例示的ＥＬＩＳＡにおいて、本発明のコードされたタンパク質に結合する抗体は、タンパク質親和性を示す選択された表面（例えば、ポリスチレンマイクロタイタープレートのウェル）上に固定化される。次いで、ｓＥＰＣＲを含むことが予想される試験組成物が、このウェルに添加される。結合、および非特異的に結合した免疫複合体の洗浄の後、結合した抗原は、検出され得る。
【００６０】
検出は、一般に、検出可能な標識に連結されている、標的タンパク質に対して特異的な二次抗体の添加によって達成される。この型のＥＬＩＳＡは、単純な「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。検出はまた、二次抗体の添加、続く三次抗体の添加によって達成され得る。この三次抗体は、二次抗体に対する結合親和性を有し、この三次抗体は、検出可能な標識に連結されている。
【００６１】
別の例示的ＥＬＩＳＡにおいて、ｓＥＰＣＲを含むと疑われるサンプルは、ウェル表面に固定化され、次いで、本発明の抗体と接触される。結合させ、洗浄して非特異的に結合した免疫複合体を除去した後、結合した抗体を検出する。最初の抗体は、検出可能な標識に連結され、免疫複合体が直接検出され得る。繰り返して、免疫複合体は、第１の抗体に対する結合親和性を有する第２の抗体（この第２の抗体は、検出可能な標識に連結されている）を使用して、検出され得る。
【００６２】
ｓＥＰＣＲが固定化される別のＥＬＩＳＡは、検出において抗体競合の使用を包含する。このＥＬＩＳＡにおいて、標識された抗体は、ウェルに添加され、ｓＥＰＣＲを結合させ、それらの標識により検出される。次いで、未知サンプルにおけるマーカー抗原の量は、コーティングしたウェルとのインキュベーション前またはインキュベーションの間に、このサンプルと標識された抗体を混合することにより決定される。このサンプル中のマーカー抗原の存在は、そのウェルに結合させるために利用可能な抗体の量を減少させるように働き、よって最終的なシグナルを減少させる。これは、未知サンプル中の抗体を検出するに適切である。ここで非標識抗体は、抗原をコーティングしたウェルに結合し、また標識抗体を結合させるに利用可能な抗原の量を減少させる。
【００６３】
使用される形式に関係なく、ＥＬＩＳＡは、共通した、特定の特徴（例えば、コーティング、インキュベートまたは結合、洗浄して、非特異的に結合した種の除去、および結合した免疫複合体の検出）を有する。例えば、抗原または抗体のいずれかを用いたプレートのコーティングにおいて、一般に、抗原または抗体の溶液とともにプレートのウェルを、一晩または特定の時間のいずれかにわたりインキュベートする。次いで、プレートのウェルを、洗浄して、不完全に吸着した物質を除去する。次いで、ウェルの残りの利用可能な表面の全てを、試験血清に関する抗原に中立の非特異的タンパク質を使用して「コーティング」する。これらとしては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインおよび粉乳の溶液が挙げられる。このコーティングにより、固定化表面上の非特異的吸着部位のブロッキングが可能になり、従って、表面への抗血清の非特異的結合により引き起こされるバックグラウンドを減少させる。
【００６４】
ＥＬＩＳＡにおいて、直接的な手順より、二次検出手段または三次検出手段を使用することがより慣用的である。従って、ウェルにタンパク質または抗体を結合し、非反応性物質を使用してコーティングしてバックグラウンドを減少させ、洗浄して非結合物質を除去した後、固定化表面は、免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にするに有効な条件下で、試験されるコントロールおよびサンプルと接触される。次いで、免疫複合体の検出は、標識された二次結合リガンドまたは二次抗体、あるいは二次結合リガンドまたは二次抗体（標識された三次抗体または三次結合リガンドと共同して）を必要とする。
【００６５】
「免疫複合体（抗原／抗体）形成を可能にするに有効な条件下」とは、好ましくは、溶液（例えば、ＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧＧ）およびリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）／Ｔｗｅｅｎ）を使用して抗原および抗体を希釈することを包含する条件を意味する。これら添加された薬剤はまた、非特異的バックグラウンドの減少を補助する傾向がある。
【００６６】
「適切な」条件はまた、インキュベーションが、有効な結合を可能にするに十分な温度および時間にて行われることを意味する。インキュベーション工程は、代表的には、約１時間から２〜４時間、好ましくは、２５℃〜２７℃の次元の温度にて行われるか、または約４℃程度にて一晩行われ得る。
【００６７】
ＥＬＩＳＡにおける全てのインキュベーション工程の後に、非複合体化物質を除去するために、接触された表面を洗浄する。好ましい洗浄手順は、水溶液（例えば、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎまたはホウ酸緩衝液）を用いて洗浄することを含む。試験サンプルと通常結合した材料との間の特異的免疫複合体の形成、引き続く洗浄の後に、わずかな量の免疫複合体の存在すら決定され得る。
【００６８】
検出手段を提供するために、第２の抗体または第３の抗体は、検出を可能とする会合標識を有する。好ましくは、これは、適切な色素原生基質とともにインキュベートした際に発色を生じる。従って、例えば、第１の免疫複合体または第２の免疫複合体を、ウレアーゼ結合体化抗体、グルコースオキシダーゼ結合体化抗体、アルカリホスファターゼ結合体化抗体、ペルオキシダーゼ（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）結合体化抗体と一定時間かつさらなる免疫複合体形成の発生に都合のよい条件下で接触させ、これらをインキュベートする（例えば、ＰＢＳ−ＴｗｅｅｎのようなＰＢＳが含有溶液中で室温にて２時間インキュベートする）。
【００６９】
標識抗体とのインキュベーション、および引き続く洗浄、非結合物質の除去の後、酵素標識がペルオキシダーゼの場合、例えば、色素原生基質（例えば、尿素とブロモクレゾールパープル、または２，２’−アジド−ジ−３−エチル−ベンゾチアゾリン−６−スルホン酸（ＡＢＴＳ）とＨ２Ｏ２）とのインキュベーションにより、標識の量が定量される。次いで、定量は、例えば、可視スペクトル分光光度計を使用して、発色の程度を測定することにより達成される。
【実施例】
【００７０】
（Ｖ．実施例）
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例に開示される技術が、本発明の実施においてうまく機能することが本発明者により発見された技術を示し、従って、その実施のための好ましい態様を構成するとみなされ得ることが当業者により認識されるべきである。しかし、本開示に鑑みて、多くの変更が、開示された特定の実施形態において行われ得、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく同様または類似の結果を得ることがなおできることを、当業者は認識するべきである。
【００７１】
（実施例１：結果）
可溶性ＥＰＣＲを、トロンビンおよびいくつかの炎症性メディエータにより誘導されたメタロプロテイナーゼ活性によりインビトロで生成する（Ｘｕら，２０００）。従って、本発明者らは、可溶性ＥＰＣＲレベルが、インビボトロンビン生成を反映するか否かを決定することを選択した。このことを評価するために、可溶性ＥＰＣＲレベルを、経口抗凝固治療に対して患者において決定し、正常な、明らかに健康な成体集団中で見出された可溶性ＥＰＣＲレベルと比較した（図１Ａおよび１Ｂ）。これらのサンプルを、フランスの共同研究者から得た（Ｄｒ．Ｍ．Ｇｒｉｍｅａｕｘ，Ｓｅｒｂｉｏ／Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ）。可溶性ＥＰＣＲレベルを、モノクローナル抗体ベースの酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用してアッセイした（本明細書中に参考として援用される米国特許第５，８０４，３９２号）。正常な集団（図１Ａ）は、１６５．８＋／−１１５．８ｎｇ／ｍｌの可溶性ＥＰＣＲレベルを有した。経口抗凝固治療の患者（図１Ｂ）は、１０５．３＋／−７０．８ｎｇ／ｍｌのより顕著に低下した可溶性ＥＰＣＲレベルを有した（ｐ＜０．０００１；ｎ＝５５）。この患者集団内で、３種類の異なる抗凝固薬物を使用した：Ｃｏｕｍａｄｉｎｅ、Ｐｒｅｖｉｓｃａｎ、およびシントローム。３種類の機能全てが、ビタミンＫアンタゴニストであるという点で、これらはアルファリン（クマリン）と類似である。Ｐｒｅｖｉｓｃａｎは、フランスおよびドイツで使用されている主な経口抗凝固剤である。ＣｏｕｍａｄｉｎｅおよびＰｒｅｖｉｓｃａｎはともに半減期が長い（数日）のに対して、シントロームの半減期は、比較的短い（約８．５時間）。使用される薬物による個々のデータの分析は、可溶性ＥＰＣＲレベルが、Ｐｒｅｖｉｓｃａｎを摂取している患者において最も低いようであることが明らかになった（図２）。しかし、薬物クリアランス速度が異なり、患者がどの程度の期間その医薬品を摂取し続けていたかが分からなかったので、統計学的分析は困難である。このことは、循環からの機能的抗凝固因子のクリアランス速度が有意に異なるので、考慮すべき事項である。第ＶＩＩ因子の半減期は、わずか３〜５時間であるのに対し、プロトロンビンの半減期は、６０〜１００時間である。
【００７２】
血漿ｓＥＰＣＲレベルと抗凝固治療との間の関係をさらに評価するために、サンプルを、正常な成体集団および静脈内非分画ヘパリン治療の患者から得た（図３）。このデータを、図３、４Ａ、４Ｂおよび５に示し、このデータは、イタリアにいる共同研究者（Ｄｒ．Ａｒｍａｎｄｏ  Ｄ’Ａｎｇｅｌｏ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｈ．Ｓ．Ｒａｆｅａｌｅ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）により譲り受けたサンプルから得た。このイタリア集団からの正常サンプルは、１９５．１±１１４．０ｎｇ／ｍｌのｓＥＰＣＲレベルを有し（図３左；ｎ＝４９）、これは、フランスからのサンプルにおいて認められたｓＥＰＣＲレベルとは有意差がなかった（図１Ａ）。静脈内ヘパリン治療の患者は、より低いｓＰＥＣＲレベル（平均１４７．１±３９．３ｎｇ／ｍｌ）を有した（図３右；ｐ＜０．０９；ｎ＝１０）。ヘパリン処置患者サンプルの数は少ないが、血漿ｓＥＰＣＲレベルの減少は、経口抗凝固剤治療を受けている患者において上記で観察された傾向をたどっている。
【００７３】
正常成体被験体におけるワルファリン処置の血漿ｓＥＰＣＲに対する効果は、インフォームドコンセントを受けた６名の成体ボランティアにおいて研究した（図４Ａおよび４Ｂ）。これらの被験体は、ワルファリン（経口抗凝固剤）を７日間摂取し、さらに追跡期間は１５日までであった。ワルファリンを開始する前に、０日目に血液を採取し、次いで、ＩＮＲレベルの評価のために各日に血液を採取した。血漿を、ＥＬＩＳＡによるｓＥＰＣＲレベルの決定のために、−８０℃で保存した。各被験体の日々のＩＮＲ値に基づいて、彼らについて必要であれば、ワルファリン投薬量を調節した。図４Ａに示されるように、血漿ｓＥＰＣＲレベルは、ワルファリン処置期間の間に減少した。これは、ｓＥＰＣＲレベルが減少する前の２４〜４８時間という時間的ずれが存在し、減少の程度が被験体間で変動した。ワルファリンを中断して約２４〜４８時間後、ｓＥＰＣＲレベルは、全ての被験体において再び増大し始め、被験体の大部分は、１５日目までに処置前の値に達した。これらサンプルのＩＮＲ値は、本質的に、ｓＥＰＣＲレベルをそのまま映し出した（図４Ｂ）。
【００７４】
ワルファリンの投与が、健常人におけるトロンビン生成の減少を付随することを確認するために、Ｆ１＋２レベルをモニターした（図６）。Ｆ１＋２のレベルは、ワルファリン投与の結果として減少し、５日目に有意に減少した（最初の値の３９％へ；Ｐ＜０．０５）。
【００７５】
経時的なｓＥＰＣＲの類似の減少を、経口抗凝固剤治療を開始している患者において観察した（図５）。抗凝固剤の開始前に血液を採取し、ｓＥＰＣＲレベルを患者らの治療の過程にわたりＥＬＩＳＡにより決定した。心房細動を有する患者が３名、ならびに拡張型心筋症、僧帽弁疾患、心房細動＋発作、ならびに深部静脈血栓症（ＤＶＴ）を有する患者が１名ずつであった。研究した患者全てにおいて、ｓＥＰＣＲレベルは、経口抗凝固剤治療の開始後に、時間とともに減少した。正常被験体と同じように、ｓＥＰＣＲレベルの減少の程度は、変動した。予測されるように、Ｆ１＋２レベルは、ワルファリン治療の開始後に、患者の大部分において減少し、特に、より高いＦ１＋２レベルを有する患者において減少した（図７）。
【００７６】
これらの観察は、経口抗凝固剤治療がトロンビン生成を減少させるのみならず、可溶性ｓＥＰＣＲレベルもまた減少させることを示す。このデータは、高ＩＮＲ値（すなわち治療に役立つＩＮＲ値）および付随する高ｓＥＰＣＲ値を有する患者が、トロンビン生成および疾患病理に関して適切に制御されないかもしれないことをさらに示唆する。この概念は、経口抗凝固剤シントロームでの処置を受けている患者の、表１に示されるＩＮＲおよびｓＥＰＣＲデータにより例示される。２名の患者は、治療に役立つＩＮＲ値（２．０および２．６）を有するが、ｓＥＰＣＲレベルは非常に上昇していた（３６９および３５７ｎｇ／ｍｌ）。別の２名の患者は、ＩＮＲレベルが上昇しており（３．３および３．６）、このことは、シントローム投薬量が高いかまたは処置時間が長いとしても、彼らのｓＥＰＣＲレベルはなお上昇したままである（１９８および２９３ｎｇ／ｍｌ）ことを示唆する。臨床医は、ＩＮＲ値に依存して患者の凝固状態を評価する傾向があり、現在のデータは、ＩＮＲ値単独では十分ではないかもしれないことを示唆する。
【００７７】
（表１：シントロームを摂取している患者におけるＩＮＲ値およびｓＥＰＣＲ値）
【００７８】
【表１】
2004530114.tif 000002
このことに関連するのは、ｓＥＰＣＲレベルに関して、正常な、明らかに健常な集団内に少なくとも２つの亜集団が存在することである。研究したフランス人被験体およびイタリア人被験体両方において、大部分のｓＥＰＣＲレベルは、約７５〜１７５ｎｇ／ｍｌの範囲内にある（図１Ａ、１Ｂおよび３を参照のこと）。残りのｓＥＰＣＲレベルは、２００〜７００ｎｇ／ｍｌに分散している。本発明者らは、環境的要因（喫煙、食餌）も遺伝的要因（多型、性別）も排除できなかったが、ワルファリン処置の間の正常被験体におけるｓＥＰＣＲレベルの観察（図４Ａおよび図４Ｂ）は、異常に高いｓＥＰＣＲレベルを有するこれら無症候性の個体が血栓形成事象の危険性にあり得るということを示唆する。従って、ｓＥＰＣＲレベルはまた、過剰凝固状態についてのマーカーであり得る。
【００７９】
（実施例２：考察）
可溶性ＥＰＣＲ形成の現在の理解は、トロンビンがメタロプロテイナーゼ活性を誘導し、次いで、このメタロプロテイナーゼ活性が膜結合ＥＰＣＲそのもの（ｐａｒｅｎｔ）をタンパク質分解して可溶性レセプターを放出するようになることである。このプロセスのインビトロでの時間枠は、数時間である（Ｘｕら，２０００）。これを、ヘパリンの非存在下で、トロンビン−アンチトロンビン（ＴＡＴ）形成に関してはわずか数分である（ヘパリンの存在下では約２３００倍に促進される（Ｂｅｌｌｅｒら，１９７９））ことと比較する。従って、ｓＥＰＣＲ形成のモニターに伴う時間枠は、トロンビン自体のものよりはるかに長い。図４Ａおよび４Ｂに示すデータは、正常個体におけるｓＥＰＣＲレベルがワルファリン開始後の２４〜４８時間以内に低下し始め、逆に、ワルファリンを中止して２４〜４８時間後に上昇し始めることを示す。図５で３名の患者により示されるように、数名の患者においては、この時間はより長い可能性があり、彼らのｓＥＰＣＲレベルは、わずか処置の３〜４日目に低下した。静脈切開の間にインビトロで生成されたトロンビン（他の試験に伴う大きな問題である）が、可溶性ＥＰＣＲレベルに対してまったく効果がないということにもなる。ＥＰＣＲレベルの標準化も問題ではない。なぜなら、ＥＬＩＳＡアッセイは、ある製造業者の標準化試薬を使用するからである。
【００８０】
可溶性ＥＰＣＲアッセイに関する本発明の潜在的な用途は、経口抗凝固剤治療または他の抗凝固剤治療を受けるいずれの患者集団をもモニターすることを包含する。いくつかの現在の予測によれば、この群に、１年あたり少なくとも約２００〜３００万人の患者が加わる。米国において、心房細動または機械的心臓弁を有する１５０万人を超える患者が、発作および関連する心血管の問題の予防の補助とするために、現在ある種の経口抗凝固剤または抗血小板物質を摂取している。トロンビン生成またはトロンビン活性を標的とする多くの抗凝固剤治療が、種々の患者集団において、使用中（ヘパリン、低分子量ヘパリン）であるかまたは試験中である（抗血小板化合物、第Ｘａ因子インヒビター）。これらの患者全ての凝固状態をモニターして、過小投薬および凝固も、過剰投薬および出血も、防止しなければならない。新たなアッセイは、抗凝固剤治療の過小投薬を報告するために特に有用であり得る。なぜなら、最も一般的に使用される凝固スクリーニング法（プロトロンビン時間、ＰＴ）は、過小投薬に対しては比較的感度が低いからである。従って、多くの患者は、気付かないうちに血栓形成事象の危険性にあり得、この危険性は、彼らの抗凝固治療および抗凝固剤の選択のより良好なモニタリングにより予防され得る。逆に多くの患者（例えば、心筋梗塞）は、さらなる血栓形成の危険性はないかもしれないが、彼らは、自動的に予防目的で長期間の抗凝固治療を受け続けている。なぜなら、利用可能なマーカーがないからである。このｓＥＰＣＲアッセイは、臨床医が、血栓形成の危険性が低い患者を選択する助けとなり、それにより、患者への不要な投薬、問題および費用を防止し得る。
【００８１】
さらに、ｓＥＰＣＲアッセイを使用して、患者または正常な集団において、凝固能亢進状態を同定またはモニタリングし得る。凝固能亢進性は、原疾患がうっ血平衡を変化させる多くの患者集団において、重大な問題である。これらの集団としては、癌、敗血症、糖尿病、アテローム性動脈硬化症または自己免疫疾患を有する患者（Ｃａｒｅｙら，１９９８）、ならびに遺伝性および後天性の凝固障害を有する患者（Ｋｅａｒｏｎら，２０００；Ｃａｒｅｙら，１９９８；Ｌａｎｅら，２０００）が挙げられる。ｓＥＰＣＲアッセイはまた、アテローム性動脈硬化症状態に対するマーカーとしての血漿コレステロールおよび低−高密度リポタンパク質（ＬＤＬ、ＨＤＬ）レベルの一般的な使用に類似して、無症候性の個体における凝固能亢進状態に対するマーカーとして、価値があり得る。本発明者らは、過剰に高いｓＥＰＣＲレベルを有する正常な個体の亜集団を繰返し観察した。これらの個体は、約２０〜２５％の見かけ上健康な成体集団を含み、そしてこれらの個体は、血栓事象に対する危険が増加しているかもしれない。ｓＥＰＣＲレベルに寄与する、トロンビン以外の要因が存在し得るが、正常な被験体におけるｓＥＰＣＲレベルがワルファリン処置の間に低下するという観察は、トロンビン活性が、血漿ｓＥＰＣＲレベルに対して直接的な影響を有することを、強く示唆する。
【００８２】
本明細書中に開示され、そして特許請求される組成物および方法の全ては、本開示を参照して、過度に実験することなく作製および実施され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態の観点から記載されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載される組成物および方法、ならびにその方法の工程または工程の順序に対して、変化が適用され得ることが、当業者に明らかである。より具体的には、化学的にと生理学的にとの両方で関連する特定の薬剤は、同一または類似の結果を達成しながら、本明細書中に記載される薬剤と置換され得ることが明らかである。当業者に明らかな、このような類似の置換および改変の全ては、添付の特許請求の範囲によって規定されるような、本発明の精神、範囲および概念に入るとみなされる。
【００８３】
（ＶＩ．参考文献）
以下の参考文献は、本明細書中に記載されるものに対する例示的な手順の補充または他の詳細の補充を提供し、具体的に本明細書中に参考として援用される：
米国特許第３，８１７，８３７号
米国特許第３，８５０，７５２号
米国特許第３，９３９，３５０号
米国特許第３，９９６，３４５号
米国特許第４，１９６，２６５号
米国特許第４，２７５，１４９号
米国特許第４，２７７，４３７号
米国特許第４，３６６，２４１号
米国特許第５，８０４，３９２号
”Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｔｒｉａｌ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｔｒｉａｌ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｏｒａｌ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈｏｕｔ  Ｎｏｎｒｈｅｕｍａｔｉｃ  Ａｔｒｉａｌ  Ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｎｔ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ，”Ｎ．Ｅ．Ｊｏｕｒ．Ｍｅｄ．，３３３：５−１０，１９９５．
”Ｔｈｅ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ  Ｔｒｉａｌ（ＳＰＩＲＩＴ）Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ａ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ  Ｖｅｒｓｕｓ  Ａｓｐｉｒｉｎ  ａｆｔｅｒ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｏｆ  Ｐｒｅｓｕｍｅｄ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ，”Ａｎｎ．Ｎｕｅｒｏｌ．，４２：８５７−９６５，１９９７．
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Ｂｅｌｌｅｒら，”Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｏｗ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４：２９０２−２９１３，１９７９．
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ＦｕｋｕｄｏｍｅおよびＥｓｍｏｎ，”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｃｌｏｎｉｎｇ，ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ／ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２６４８６−２６４９１，１９９４．
Ｆｕｋｕｄｏｍｅら，”Ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”：Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７１（２９）：１７４９１−１７４９８，１９９６．
Ｇｅｆｔｅｒら，”Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ，”Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ，３（２）：２３１−６，１９７７．
Ｇｏｄｉｎｇ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，第２版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｒｌａｎｄｏ，Ｆｌａ．，ｐｐ．６０−６６，および７１−７４，１９８６．
Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，”Ｉｓ  Ｇｌｙｃｏｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｕｓｅｆｕｌ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｌｌｉｔｉｓ？  Ｌｅｓｓｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｔｒｉａｌ，”Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４０：１６３７−１６４０，１９９４．
Ｈｒｉｓｈら，”Ｏｒａｌ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｒａｎｇｅ，”Ｃｈｅｓｔ，１１４、補遺４４５Ｓ−４６９Ｓ，１９９８．
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ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，”Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，”Ｎａｔｕｒｅ，２５６（５５１７）：４９５−７，１９７５．
ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，”Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｌｉｎｅｓ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ，”Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，６（７）：５１１−９，１９７６．
Ｋｕｒｏｓａｗａら，”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  Ｐｌａｓｍａ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１００：４１１−４１８，１９９７．
Ｋｕｒｏｓａｗａら，”Ｐｌａｓｍａ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｒｅ  Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｅｐｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｌｕｐｕｓ  Ｅｒｙｔｈｍａｔｏｓｕｓ：Ｌａｃｋ  ｏｆ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ  Ｓｕｇｇｅｓｔｓ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ，”Ｂｌｏｏｄ，９１：７２５−７２７，１９９８．
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Ｌｅｖｉｎｅら，”Ｈｅｍｍｏｒｈａｇｉｃ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，”Ｃｈｅｓｔ，１１４、補遺：５１１Ｓ−５２３Ｓ．
Ｎａｋａｍｕｒａら：Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第４版），Ｗｅｉｒ，Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，（編）．第１巻，第２７章，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌ．，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７．
Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ，Ｒ．Ａ．，”Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｏｒａｌ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  Ｄｒｕｇｓ，”Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．，２７：２４５−２６１，１９７６．
ＰＣＴ／ＵＳ９５／０９６３６
Ｒｅｇａｎら，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１７４９９−１７５０３
Ｒｉｌｅｙら，”Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  Ｒａｔｉｏ（ＩＮＲ），”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．，１４：１０１−１１４，２０００．
Ｓｔｅａｒｎｓ−Ｋｕｒｏｓａｗａら，”Ｔｈｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌＡｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３：１０２１２−１０２１６，１９９６．
Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅら，”Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  Ａｃｔｉｏｎ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｗａｒｆａｒｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｇｅｎｅｒｓ，”Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌ．Ｄｒｕｇ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ，５：２２５−２７２，１９８７．
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Ｔａｋａｎｏら，”Ｐｌａｓｍａ  Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，”Ｂｌｏｏｄ，７６：２０２４−２０２９，１９９０．
ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｍｅｅｒら，”Ｂｌｅｅｄｉｎｇ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｏｒａｌ  Ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｉｓｋ  Ｆａｃｔｏｒｓ，”Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，１５３：１５５７−１５６２，１９９３．
Ｗａｄａら，”Ｐｌａｓｍａ  Ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ  ａｓ  ａ  Ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  Ｐｕｒｐｕｒａ  ａｎｄ  Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  Ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ，”Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，３９：２０−２４，２０００．
Ｘｕら，”Ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，”Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．，２７５：６０３８−６０４４，２０００。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１Ａは、正常な見かけ上健康な成体集団におけるｓＥＰＣＲレベルを示すグラフである（ｎ＝２００；左）。平均および標準偏差を含める。図１Ｂは、抗凝固剤治療を受けている成体患者集団におけるｓＥＰＣＲレベルを示すグラフである（ｎ＝５５）。平均および標準偏差を示す。
【図２】図２は、抗凝固剤（クマジン、プレビスカン、シントローム）の機能下での、患者のｓＥＰＣＲレベルを示すグラフである。平均および標準偏差を示す。
【図３】図３は、健康な成体集団（ｎ＝４９；左）および未分画ヘパリンを用いた静脈内抗凝固剤治療を受けている患者（ｎ＝１０；右）におけるｓＥＰＣＲレベルを示すグラフである。平均および標準偏差を示す。
【図４】図４Ａは、７日間ワルファリンを投与された６人の正常成体患者におけるｓＥＰＣＲレベル、およびワルファリン停止後のさらなる７〜８日の追跡期間におけるｓＥＰＣＲレベルを示すグラフである。図４Ｂは、７日間ワルファリンを投与された６人の正常成体患者におけるＩＮＲ値、およびワルファリン停止後のさらなる７〜８日の追跡期間におけるＩＮＲ値を示すグラフである。
【図５】図５は、経口抗凝固剤治療の開始前および治療の間の、７人の患者におけるｓＥＰＣＲレベルを示すグラフである。患者の診断を示す。ＤＶＴ、深静脈血栓症。
【図６】図６は、７日間ワルファリンを投与された６人の正常成体患者におけるＦ１＋２値、およびワルファリン停止後のさらなる７〜８日の追跡期間におけるＦ１＋２値を示すグラフである。レベルは、中央値、四分位数間領域、および平均の９５％信頼区間を用いて示す。
【図７】図７は、経口抗凝固剤治療の開始前および治療の間の、７人の患者におけるＦ１＋２レベルを示すグラフである。患者の診断を示す。記号は、図５に従う。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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