(57)【要約】本発明は新規なレチノール誘導体、その製造方法およびその用途に関する。本発明によれば、レチノール誘導体は、ＣＯＯＨ官能基をもつジ−、トリ−、ポリペプチドとレチノール間のカルボエステル結合を含む。本発明のレチノール誘導体は、ジ−ＣＯＯＨ官能基をもつアミノ酸とレチノール間のカルボエステル結合を含む。レチノール誘導体は、レチノールとＣＯＯＨ官能基および炭素鎖上に複数の２重結合をもつ化合物との間のカルボエステル結合を含む。本発明のレチノール誘導体は、レチノールとジ−ＣＯＯＨ官能基および１個の２重結合をもつ化合物との間のカルボエステル結合を含む。本発明のレチノール誘導体は、ＯＨ官能基をもつ化合物とレチノール間のエーテル結合を含む。
2004517876.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
レチノールと、官能基ＣＯＯＨをもつペプチドとの間にカルボエステル結合を含むレチノール誘導体。
【請求項２】
上記官能基ＣＯＯＨをもつペプチドが、α−アスパチル−Ｌ−フェニルアラニン  １−メチルエステル（ＡＰＭ；アスパタム）、Ｎ−保護−アスパタム、ネオタムなどを含む、ジ−、トリ−、ポリペプチドの群から選ばれる、請求項１記載のレチノール誘導体。
【請求項３】
レチノールと、官能基ジ−ＣＯＯＨをもつアミノ酸との間に、カルボエステル結合を含むレチノール誘導体。
【請求項４】
上記官能基ジ−ＣＯＯＨをもつアミノ酸が、アスパラギン酸、Ｎ−保護−アスパラギン酸、グルタミン酸、Ｎ−保護−グルタミン酸、α−アスパチル−Ｌ−フェニルアラニン（α−ＡＰ）、Ｎ−保護−α−アスパチル−Ｌ−フェニルアラニンからなる群から選ばれる、請求項３記載のレチノール誘導体。
【請求項５】
レチノールと、官能基ＣＯＯＨおよび炭素鎖に複数の２重結合をもつ化合物との間にカルボエステル結合を含むレチノール誘導体。
【請求項６】
上記官能基ＣＯＯＨおよび炭素鎖に複数の２重結合をもつ化合物が、共役リノール酸（ＣＬＡ）、オレイン酸、リノレン酸、プロドルア、ロイコトリエンなどを含む群から選ばれる、請求項５記載のレチノール誘導体。
【請求項７】
レチノールと、ジ−ＣＯＯＨ官能基および１個の２重結合をもつ化合物との間にカルボエステル結合を含むレチノール誘導体。
【請求項８】
上記ジ−ＣＯＯＨ官能基および１個の２重結合をもつ化合物が、マレイン酸、フマール酸、メサコニン酸などからなる群から選ばれる、請求項７記載のレチノール誘導体。
【請求項９】
レチノールと、ＯＨ官能基をもつ化合物との間にエーテル結合を含むレチノール誘導体。
【請求項１０】
上記ＯＨ官能基をもつ化合物が、レチノール、アルキルアルコール、アリールアルコール、ジエニルアルコール、トリエニルアルコールなどからなる群から選ばれる、請求項９記載のレチノール誘導体。
【請求項１１】
下記の工程：
１）酢酸レチニルと無機塩をメタノール性溶媒中で反応させ、エーテルでレチノールを抽出する、酢酸レチニルから純粋なレチノールへの変換工程、
２）ＣＯＯＨを含むペプチド、ジ−ＣＯＯＨを含むアミノ酸、官能基ＣＯＯＨおよび炭素鎖上に複数の２重結合を含有する化合物、官能基ジ−ＣＯＯＨおよび１個の２重結合を含む化合物からなる群から選ばれる化合物を、溶媒中縮合剤および触媒剤の存在下でレチノールと結合させる結合工程、および
３）レチノールカルボエステル誘導体の分離、精製および回収工程、
からなるレチノールカルボエステル誘導体の製造方法。
【請求項１２】
下記の工程：
１）酢酸レチニルから純粋なレチノールへの変換工程、
２）官能基ＯＨを含有する化合物とレチノールの結合工程、および
３）レチノールエーテル誘導体の分離、精製および回収工程、
からなるレチノールエーテル誘導体の製造方法。
【請求項１３】
上記変換工程の抽出溶媒が、ジエチルエーテルまたはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などのエーテルである、請求項１１または１２記載のレチノール誘導体の製造方法。
【請求項１４】
上記結合工程の縮合剤が、Ｎ，Ｎ’−ジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＤＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−スルフリルジイミダゾール（ＳＤＩ）およびＳＯ２Ｃｌからなる群から選ばれる、請求項１１記載のレチノール誘導体の製造方法。
【請求項１５】
請求項１−１０に記載のレチノール誘導体を含む皮膚疾患の治療および予防のための医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１−１０に記載のレチノール誘導体を含む皮膚の異常の予防のための化粧品組成物。
【請求項１７】
請求項１−１０に記載のレチノール誘導体を含む皮膚の異常の予防のための石鹸または毛髪用洗剤。
【請求項１８】
請求項１−１０に記載のレチノール誘導体を含む皮膚の異常の予防のための食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は新規レチノール誘導体およびその製造方法および用途に関する。
【０００２】
レチノール誘導体は動物の胎児の発育、ホメオスタチス、形態発生、皮膚の老化および細胞分化の制御に必須である。また、レチノール誘導体は、制御のきかない細胞増殖の抑制および、細胞分化の誘導またはアポトーシスの誘導による、ウイルスまたは他の要因によって起こる癌の抑制または治療に有効であると考えられている。
【０００３】
レチノール誘導体は、上皮組織の活性を維持し、紫外光線のシグナル透過を遮断することによって皮膚の老化を抑制する。幹細胞の筋肉神経細胞への分化は、レチノールの濃度に依存する。従って、レチノール自体およびその誘導体は医薬、化粧品などの多方面に広く用いられている。
【０００４】
［背景技術］
数工程を経るレチノールの製造方法が米国特許第４０３５４２４号、第４０６４１８３号、第４０９２３６６号に記載されている。しかし、上記方法にょって製造された純粋なレチノールは光に対して不安定であり、容易に光で異性化し分解し、その結果、活性が影響を受け、一般に安定剤がレチノールの市販品に添加されている。
【０００５】
上記の安定性の問題を克服するために、種々の炭水化物に結合したレチノール誘導体の製造方法が米国特許第４４７３５０３号および第５６３１２４４に記載されているが、その製造工程は複雑であり、不経済でありまた安定性に関して満足すべきものではない。
【０００６】
従って、光および水溶液中で安定で、その製造方法が単純かつ経済的なレチノール誘導体が必要とされていた。
【０００７】
本発明は上記の問題点を解決するもので、本発明の目的は新規なレチノール誘導体、高収率である製造方法およびその用途を用意するものである。
【０００８】
［発明の詳細な記載］
本発明は新規なレチノール誘導体、その製造方法およびその用途に関する。
【０００９】
本発明によれば、レチノール誘導体はレチノールのカルボエステル誘導体およびエーテル誘導体である。
【００１０】
本発明のレチノールのカルボエステル誘導体は、ＣＯＯＨ官能基をもつジ−、トリ−、ポリペプチドとレチノール間のカルボエステル結合を含む。
【００１１】
本発明のカルボエステル誘導体は、ジ−ＣＯＯＨ官能基をもつアミノ酸とレチノール間のカルボエステル結合を含む。
【００１２】
本発明によれば、レチノールの他のカルボエステル誘導体は、ＣＯＯＨ官能基および炭素鎖上に複数の２重結合をもつ化合物とレチノール間のカルボエステル結合を含む。
【００１３】
レチノールのカルボエステル誘導体は、ジ−ＣＯＯＨ官能基および１個の２重結合をもつ化合物とレチノール間のカルボエステル結合を含む。
【００１４】
レチノールのエーテル誘導体は、ＯＨ官能基をもつ化合物とレチノール間のエーテル結合を含む。
【００１５】
本発明を下記でより詳細に説明する。
本発明によるレチノールのカルボエステル誘導体の構造を下記に示す。本発明のレチノールのカルボエステル誘導体のうち、ＣＯＯＨ官能基をもつジ−、トリ−、ポリペプチドとレチノール間のカルボエステル結合をもつ代表的な例は下記の式１に相当する。
【００１６】
下記の式１において、ＣＯＯＨ官能基をもつペプチドは、Ｎ−Ｌ−α−アスパチル−Ｌ−フェニルアラニン  １−メチルエステル（ＡＰＭ；アスパタム（ａｓｐａｔａｍ））、Ｎ−保護−アスパタム、ネオタムなどから選ばれる。
【００１７】
式１：
【化１】
2004517876.tif 000003
（式中、Ｒ１は、Ｈ、ＣＨＯ、レチノイン酸（ＲＡ）、ＡｃまたはＢｏｃであり、Ｒ２は、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、レチノールまたはＣＬＡであり、ｎは、１〜６の整数である。）
【００１８】
本発明によれば、ジ−ＣＯＯＨ官能基をもつアミノ酸とレチノール間のカルボエステル結合をもつレチノールのカルボエステル誘導体の構造は、下記の式２に相当する。
【００１９】
下記の式２において、ジ−ＣＯＯＨ官能基をもつアミノ酸は、アスパラギン酸、Ｎ−保護−アスパラギン酸、グルタミン酸、Ｎ−保護−グルタミン酸、α−アスパチル−Ｌ−フェニルアラニン（α−ＡＰ）、Ｎ−保護−α−アスパチル−Ｌ−フェニルアラニンからなる群から選ばれる。
【００２０】
式２：
【化２】
2004517876.tif 000004
（式中、Ｒ１は、Ｈ、ＣＨＯ、レチノイン酸（ＲＡ）、ＡｃまたはＢｏｃであり、Ｒ２は、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣ２Ｈ５、レチノールまたはＣＬＡであり、ｎは、１〜６の整数である。）
【００２１】
本発明によれば、ＣＯＯＨ官能基および炭素鎖上に複数の２重結合をもつ化合物とレチノール間のカルボエステル結合をもつレチノールのカルボエステル誘導体の構造は、下記の式３に相当する。
【００２２】
下記の式３において、ＣＯＯＨ官能基および炭素鎖上に複数の２重結合をもつ化合物は、共役リノール酸（ＣＬＡ）の代わりに、オレイン酸、リノレン酸、プロドルア（ｐｒｏｄｌｕｒｅ）、ロイコトリエン、などからなる群から選ばれる。
【００２３】
式３：
【化３】
2004517876.tif 000005
【００２４】
本発明によれば、ジ−ＣＯＯＨ官能基および１個の２重結合をもつ化合物とレチノール間のカルボエステル結合をもつレチノールのカルボエステル誘導体の構造は、下記の式４に相当する。
【００２５】
下記の式４において、ジ−ＣＯＯＨ官能基および１個の２重結合をもつ化合物は、マレイン酸、フマール酸、メサコニン酸などからなる群から選ばれる。
【００２６】
【化４】
2004517876.tif 000006
（式中、Ｒは、Ｈ、ＣＨ３、またはＣ２Ｈ５である。）
【００２７】
本発明によれば、ＯＨ官能基をもつ化合物とレチノール間のエーテル結合をもつレチノールのエーテル誘導体の構造は、下記の式５に相当する。
【００２８】
下記の式５において、ＯＨ官能基をもつ化合物は、レチノールの代わりに、アルキルアルコール、アリールアルコール、ジエニルアルコール、トリエニルアルコールなどからなる群から選ばれる。
【００２９】
式５：
【化５】
2004517876.tif 000007
【００３０】
本発明のレチノールカルボエステル誘導体の製造方法は下記の工程からなる：１）酢酸レチニルと無機塩をメタノール性溶媒中で反応させ、エーテルでレチノール抽出する、酢酸レチニルから純粋なレチノールへの変換工程、２）ＣＯＯＨを含むペプチド、ジ−ＣＯＯＨを含むアミノ酸、官能基ＣＯＯＨおよび炭素鎖上に複数の２重結合を含有する化合物、官能基ジ−ＣＯＯＨおよび１個の２重結合を含む化合物からなる群から選ばれる化合物の、溶媒中縮合剤および触媒の存在下レチノールとの結合工程、および３）レチノールカルボエステル誘導体の分離、精製および回収工程。
【００３１】
本発明のレチノールカルボエステル誘導体の製造方法は下記の工程によって説明される。
【００３２】
第１の工程では、一般に市販されている酢酸レチニルをメタノール性溶媒中２５−４０℃にて、反応中の光異性化を避けるために暗室で無機塩と反応させ、反応混合物をエーテル溶媒で抽出する。このとき、用いる無機塩は１−３当量であり、抽出溶媒はジエチルエーテルまたはテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などのエーテルを含む。酢酸エチルなどの抽出溶媒では、メタノール性溶媒に溶解している残渣の無機塩が酢酸レチニルに変化するから、エーテルを溶媒として用いる。
【００３３】
第２工程で、ＣＯＯＨを含むペプチド、ジ−ＣＯＯＨを含むアミノ酸、官能基ＣＯＯＨおよび炭素鎖上に複数の２重結合を含有する化合物、官能基ジ−ＣＯＯＨおよび１個の２重結合を含む化合物からなる群から選ばれる化合物を、縮合剤およびメチレンクロリド（または有機溶媒）と反応させ、化合物の酸性度を活性化またはハロゲン化アシルに変換する。その後、反応混合物中に純粋なレチノールを添加することによって、レチノールカルボエステルを製造する。縮合剤は、Ｎ，Ｎ’−ジクロロヘキシルカルボジイミド（ＤＤＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ）、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−スルフリルジイミダゾール（ＳＤＩ）、ＳＯ２Ｃｌを含み、縮合反応を触媒する触媒剤は、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を含む。
【００３４】
第３工程は純粋なレチノールカルボエステル誘導体を分離する。反応混合物は特別のシリカゲル（逆相、メルクシリカゲル６０ＲＰ１８（４０−６３）μｍ）のカラムクロマトグラフィーにかける。
【００３５】
レチノールエーテル誘導体の製造方法は、１）酢酸レチニルから純粋なレチノールへの変換工程、２）官能基ＯＨを含有する化合物の結合工程および３）レチノールエーテル誘導体の分離、精製および回収工程からなる。
【００３６】
本発明のレチノールエーテル誘導体の製造方法は下記の工程によって説明される；
第１の工程では、一般に市販されている酢酸レチニルをメタノール性溶媒中２５−４０℃にて、光異性化を避けるために暗室で無機塩と反応させ、反応混合物をエーテルなどの溶媒で抽出する。
【００３７】
第２工程で、溶媒を除去後、官能基ＯＨを含む化合物、天然または分離かつ精製したレチノール、ジエチルアゾジカルボキシレート（ＤＥＡＤ）およびトリフェニルホスフェート（Ｐｈ３Ｐ）をメチレン溶媒中に添加し、反応混合物を室温で反応させ、レチノールエーテル誘導体を製造する。
【００３８】
第３工程は純粋なレチノールエーテル誘導体の分離工程である。反応混合物は特別のシリカゲル（逆相、メルクシリカゲル６０ＲＰ１８（４０−６３）ｍ）のカラムクロマトグラフィーにかける。
【００３９】
塩基、縮合剤および触媒は、上記のレチノール誘導体の製造方法に用いられるものに限定されず、本発明の分野で通常知られている標準的なものであればいずれでもよいが、反応に悪影響を与えないことが条件である。
【００４０】
本発明のレチノール誘導体は、しわ、肌あれ、乾燥肌、乾燥および異常な角質化をもたらす皮膚の老化を予防または改善するための医薬、化粧品、石鹸、毛髪用洗剤および機能性食品に用いることができる。
【００４１】
本発明のレチノール誘導体を含む医薬組成物は、皮膚癌、にきびおよび老化によるしわ、色素沈着、肌あれおよびたるんだ皮膚などの治療および予防剤として用いることができる。
【００４２】
本発明の目的のための投与方法には、経口、局所、経皮、経鼻、吸入、点眼、直腸、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、または皮下の経路を含む。ローション、軟膏、ジェル、クリーム、膏薬またはスプレーなどの経皮製剤が好ましい医薬製剤である。
【００４３】
患者の年齢、体重、疾患などにより１日あたりの勧告投与量は変化するが、提案投与量は０．０１〜８０ｍｇ／ｋｇ体重および１〜３回投与／日である。
【００４４】
また、本発明のレチノール誘導体を含有する化粧品組成物は、しみ、老人性色素斑（ｃｈｒｏｍｅｌａｓｍａ）などの皮膚の異常の予防および改善の目的のために化粧品に添加することができる。色調ローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、パック、ジェルまたは皮膚接着タイプが好ましい製剤であるが、いずれにしても限定する意図ではない。
【００４５】
また、本発明のレチノール誘導体を含有する食物組成物は、にきび、しみ、しわ、色素沈着、肌あれおよびたるんだ皮膚などの皮膚の異常を予防または改善する目的のための種々の食品、肉、チョコレート、スナック、クッキー、ピザ、インスタント麺、アイスクリーム、アルコール飲料、ビタミン、健康食品に添加することができる。
【００４６】
［実施例］
本発明の、実際かつ今現在好ましい実施態様を、以下の実施例において具体的に示す。しかし、本発明はこれらの実施例に限定されない。
【００４７】
実施例１ａ：（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセニル）−２，４，６，８−ノナテトラエニル（３Ｓ）−４−［（１−ベンジル−２−メトキシ−２−オキソエチル）アミノ］−３−ホルミルアミノ−４−オキソブタノエ−トの製造
Ｎ−ホルミルアスパルタム（ａｓｐａｒｔａｍ）（８４３．３ｍｇ）、塩化メチレン（１０ｍｌ）および最小量のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を窒素を充填した３ツ口丸底フラスコに添加し、溶解した。反応混合物を０℃に冷却した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩［ＥＤＣＩ］（６８３ｍｇ）をゆっくりと添加し、およそ３０分間攪拌した。レチノールを反応混合物に添加し、少量のＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を直ぐに添加し、およそ１〜３時間攪拌した。反応が終了した後、減圧下で溶出物を取り除き、残査を酢酸エチルで溶解し、水および食塩水を用いて数回洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ４を用いて乾燥させ、減圧下で濃縮させ、逆相カラムクロマトグラフィーを用いて分離した。
【００４８】
収率：８２％
【数１】
2004517876.tif 000008
【００４９】
実施例１ｂ：実施例１ａの別の例
カップリング試薬としてＮ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を用いる以外は、全ての操作を実施例１ａと同様に行った。
【００５０】
実施例１ｃ：実施例１ａの別の例
カップリング試薬としてＳＯ２Ｃｌを用いる以外は、全ての操作を実施例１ａと同様に行った。
【００５１】
実施例１ｄ：実施例１ａの別の例
カップリング試薬としてＮ，Ｎ’−スルフリルジイミダゾール（ＳＤＩ）を用いる以外は、全ての操作を実施例１ａと同様に行った。
【００５２】
実施例２：（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセニル）−２，４，６，８−ノナテトラエニル（３Ｓ）−４−［（１−ベンジル−２−メトキシ−２−オキソエチル）アミノ］−３−アミノ−４−オキソブタノエート，塩酸塩の製造
アスパルタム塩酸塩（１５０ｍｇ）、塩化メチレン（１０ｍｌ）および最小量のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を窒素を充填した３ツ口丸底フラスコに添加し、溶解した。反応混合物を０℃に冷却し、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩［ＥＤＣＩ］（１２８ｍｇ）をゆっくりと添加し、およそ３０分間攪拌した。レチノール（１３０ｍｇ）を反応混合物に添加し、少量のＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を直ぐに添加し、およそ１〜３時間攪拌した。反応が終了した後、減圧下で溶出物を取り除き、残査を酢酸エチルに溶解し、水および食塩水を用いて数回洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ４を用いて乾燥させ、減圧下で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーを用いて分離した。
【００５３】
収率：６２％
【数２】
2004517876.tif 000009
【００５４】
実施例３：ジ［（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセニル）−２，４，６，８−ノナテトラエニル］（２Ｓ）−２−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタンジオエートの製造
Ｎ−Ｂｏｃアスパラギン酸（１．２ｍｇ）、塩化メチレン（２０ｍｌ）および最小量のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を窒素を充填した３ツ口丸底フラスコに添加し、溶解した。反応混合物を０℃に冷却した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩［ＥＤＣＩ］（１．３６ｍｇ）をゆっくりと添加し、およそ３０分間攪拌した。レチノール（０．５１ｇ）を反応混合物に添加し、少量のＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を直ぐに添加し、およそ１〜３時間攪拌した。反応が終了した後、減圧下で溶出物を取り除き、残査を酢酸エチルに溶解し、水および食塩水を用いて数回洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ４を用いて乾燥させ、減圧下で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーを用いて分離した。
【００５５】
収率：５３％
【数３】
2004517876.tif 000010
【００５６】
実施例４：ジ［（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセニル）−２，４，６，８−ノナテトラエニル］（２Ｓ）−２−アミノブタンジオエートの製造
アスパラギン酸（１６０ｍｇ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（７２０ｍｇ）、塩化メチレン（１０ｍｌ）および最小量のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を窒素を充填した３ツ口丸底フラスコに添加し、溶解した。少量のＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を添加した。レチノール（３２４ｍｇ）を反応混合物に添加し、およそ１〜３時間攪拌した。反応が終了した後、減圧下で溶出物を取り除き、残査を酢酸エチルに溶解し、水および食塩水を用いて数回洗浄した。有機相を無水ＭｇＳＯ４を用いて乾燥させ、減圧下で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーを用いて分離した。
【００５７】
収率：５０％
【数４】
2004517876.tif 000011
【００５８】
実施例５：ジ［（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセニル）−２，４，６，８−ノナテトラエニル］２−（アセチルアミノ）スクシネートの製造
Ｎ−アセチルアスパラギン酸（６１０ｍｇ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（７２０ｍｇ）、塩化メチレン（１０ｍｌ）および最小量のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を窒素を充填した３ツ口丸底フラスコに添加し、溶解した。少量のＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を添加した。レチノール（３２４ｍｇ）を反応混合物に添加し、およそ１〜３時間攪拌した。反応が終了した後、減圧下で溶出物を取り除き、残査を酢酸エチルで溶解し、水および食塩水を用いて数回洗浄した（２０ｍｌ×２）。有機相を無水ＭｇＳＯ４を用いて乾燥させ、減圧下で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーを用いて分離した。
【００５９】
収率：５０％
【数５】
2004517876.tif 000012
【００６０】
実施例６：（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセニル）−２，４，６，８−ノナテトラエニル（９Ｚ，１１Ｅ）−９，１１−オクタデカジエノエートの製造
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩［ＥＤＣＩ］（０．７１ｇ、３．６７ｍｇ）および無水塩化メチレン１５ｍｌを窒素を充填した３ツ口丸底フラスコに添加し、溶解した。反応混合物を０℃まで冷却した。共役リノール酸を添加し、およそ３０分攪拌した。無水塩化メチレン（７ｍｌ）に溶解したレチノール（０．８７ｇ、３．０５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を反応混合物に添加し、４時間、室温で攪拌した。有機相を水（２０ｍｌ×２）および食塩水（２０ｍｌ×２）で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４を用いて乾燥させ、減圧下で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーを用いて分離した（溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝１／８）。
【００６１】
収率：８０％
【数６】
2004517876.tif 000013
【００６２】
実施例７：ジ［（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセニル）−２，４，６，８−ノナテトラエニル］マレエートの製造
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩［ＥＤＣＩ］（３３４．６ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）および無水塩化メチレン（５ｍｌ）を窒素を充填した３ツ口丸底フラスコに添加し、溶解した。反応混合物を０℃に冷却した。マレイン酸（７８ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）を添加し、およそ３０分間攪拌した。無水塩化メチレン（６ｍｌ）に溶解したレチノール（５００ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジンを反応混合物に添加し、室温で４時間攪拌した。有機相を水（２０ｍｌ×２）および食塩水（２０ｍｌ×２）を用いて洗浄し、無水ＭｇＳＯ４を用いて乾燥させ、減圧下で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーを用いて分離した（溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝１／３０）。
【００６３】
収率：４８％
【数７】
2004517876.tif 000014
【００６４】
実施例８：ジ［（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセニル）−２，４，６，８−ノナテトラエニル］（Ｅ）−２−ブテンジオエートの製造
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩［ＥＤＣＩ］（１．４ｇ、７．３２ｍｍｏｌ）および無水塩化メチレン（２０ｍｌ）を窒素を充填した３ツ口丸底フラスコに添加し、溶解した。反応混合物を０℃に冷却した。フマル酸（０．３９ｇ、３．０５ｍｍｏｌ）を添加し、およそ３０分間攪拌した。無水塩化メチレン（７ｍｌ）に溶解したレチノール（１．７５ｇ、６．１０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジンを反応混合物に添加し、室温で４時間攪拌した。有機相を水（２０ｍｌ×２）および食塩水（２０ｍｌ×２）を用いて洗浄し、無水ＭｇＳＯ４を用いて乾燥させ、減圧下で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーを用いて分離した（溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝１／３０）。
【００６５】
収率：５０％
【数８】
2004517876.tif 000015
【００６６】
実施例９：ジ［（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセニル）−２，４，６，８−ノナテトラエニル］（Ｅ）−２−ブテンジオエートの製造
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩［ＥＤＣＩ］（１．４ｇ、７．３２ｍｍｏｌ）および無水塩化メチレン（２０ｍｌ）を窒素を充填した３ツ口丸底フラスコに添加し、溶解した。反応混合物を０℃に冷却した。メサコニン酸（０．３９ｇ、３．０５ｍｍｏｌ）を添加し、およそ３０分間攪拌した。無水塩化メチレン（７ｍｌ）に溶解したレチノール（１．７５ｇ、６．１０ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジンを反応混合物に添加し、室温で４時間攪拌した。有機相を水（２０ｍｌ×２）および食塩水（２０ｍｌ×２）を用いて洗浄し、無水ＭｇＳＯ４を用いて乾燥させ、減圧下で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーを用いて分離した（溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝１／３０）。
【００６７】
収率：５３％
【数９】
2004517876.tif 000016
【００６８】
実施例１０：（１Ｅ，３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−９［（２Ｅ，４Ｅ，６Ｅ，８Ｅ）−３，７−ジメチル−９−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセニル）−２，４，６，８−ノナテトラエニル］オキシ−３，７−ジメチル−１−（２，６，６−トリメチル−１−シクロヘキセニル）−１，３，５，７−ノナテラエン（ｎｏｎａｔｅｒａｅｎｅ）の製造
レチノール（０．６ｇ、２．１０ｍｍｏｌ）、ＤＥＡＤ（ジエチルアゾジカルボキシレート）（０．３ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）、Ｐｈ３Ｐ（０．３３ｇ、１．１５ｍｍｏｌ）および無水塩化メチレン（２０ｍｌ）を窒素を充填した３ツ口丸底フラスコに添加し、溶解し、およそ２０分間激しく攪拌した。反応が終了した後に、水（５０ｍｌ）を反応混合物に添加し、酢酸エチル（３０ｍｌ×２）を抽出に使用した。有機相を水（５０ｍｌ）および食塩水（５０ｍｌ）を用いて洗浄し、ＭｇＳＯ４を用いて乾燥させ、減圧下で濃縮させ、カラムクロマトグラフィーを用いて分離した（溶媒：酢酸エチル／ヘキサン＝１／１）。
【００６９】
収率：８４％
【数１０】
2004517876.tif 000017
【００７０】
実験例１：レチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）の細胞毒性試験
レチナール誘導体の細胞毒性試験に利用した細胞系統は、ＳＫ−Ｈｅｐ−１（肝臓癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）、ＨａＣＡＴ（皮膚癌）およびＨＣＴ１１６（結腸癌）であった。これらの細胞ラインをＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）／１０％ＦＢＳ（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を含有する）中で維持し、培養した。３×１０３細胞（１ウェルあたり１００μｌの培地）を９６ウェルマイクロタイタープレートに分配し、２４時間培養した。培養した各細胞ラインを種々の濃度のレチナール誘導体（０、５００、１０００、５０００ｎＭ）で４日間処理し、生存細胞を血球計を用いて計測して細胞増殖阻害効果を測定した。
【００７１】
実験に利用したレチナール誘導体は、レチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）、レチノール、４−ＨＰＲ［Ｎ−（４−ヒドロキシフェニル）レチンアミド］（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）であった。これらの誘導体をジメチルスルホキシドに溶解し、培養培地に添加したジメチルスルホキシドの濃度が０．０１％を超えないように維持した。
図１に示すように、異なる濃度のレチナール誘導体を用いての処理の結果は以下の通りである。レチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）はＳＫ−Ｈｅｐ−１（肝臓癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳癌）およびＨａＣＡＴ（皮膚癌）細胞ラインに毒性を示さず、ＨＣＴ１１６（結腸癌）細胞ラインに対してはレチノールよりも低い毒性を示す。
【００７２】
実験例２：レチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）を用いてのレチノイン酸レセプター／レチノイドＸレセプター（ＲＡＲ／ＲＸＲ）の活性試験
レチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）の、レチノイン酸レセプターの活性に対する効果を分析するために、皮膚癌（ＨａＣＡＴ）細胞ラインを利用してレチノイン酸レセプター／レチノイドＸレセプターの活性を測定した。
【００７３】
組換えＤＮＡ（ＤＲ１またはＤＲ５からなるＤＲ５−ｔｋ−ＣＡＴまたはＤＲ１−ｔｋ−ＣＡＴ）、レチノイン酸レセプターのエフェクター／レチノイドＸレセプター、チミンキナーゼプロモーターおよびＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を、レチノイン酸レセプターα、β、γまたはレチノイドＸレセプターα、β、γを発現するプラスミドＤＮＡと混合し、リポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて皮膚癌（ＨａＣＡＴ）細胞ラインをコトランスフェクトした。共形質移入した細胞ラインをＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地で１日培養し、各レチノール誘導体（１μＭ）を添加し、さらに１日、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、各細胞からタンパク質を単離し、β−ガラクトシダーゼの活性およびタンパク質含量を測定してトランスフェクション効率を決定し、ＲＡＲまたはＲＸＲレセプターの転写レベルをＣＡＴ  ＥＬＩＳＡを用いて測定した（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００７４】
レチノイン酸レセプターに対するレチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）の効果を決定するために、各レチノイン酸レセプター（α、βまたはγ）発現ベクターおよび活性測定ＤＲ５−ｔｋ−ＣＡＴプラスミドをリポソームを用いて導入した。細胞をレチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）を用いて処理した後、細胞抽出物を単離した。ＣＡＴの発現レベルをＣＡＴ ＥＬＩＳＡを用いて測定してレチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）のレチノイン酸レセプターに対する効果を決定した。
【００７５】
図２に示すように、レチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）は、レチノールとして、レチノイン酸レセプターαの高い活性化を生じ、レチノイン酸レセプターβ、γの弱い活性化を示す（Ａ）。レチノールおよびレチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）誘導体はレチノイドＸレセプター（α、β、γ）の活性化を生じなかった（Ｂ）。
【００７６】
実験例３：レチノール−（メサコニン酸）を用いて処理したレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）の活性試験
レチノイン酸レセプターの活性に対するレチノール−（メサコニン酸）の効果を分析するために、Ｃｏｓ−１細胞ラインを用いてレチノイン酸レセプター／レチノイドＸレセプターの活性を測定した。
【００７７】
組換えＤＮＡ（ＤＲ５からなるＤＲ５−ｔｋ−ＣＡＴ）、レチノイン酸レセプター／レチノイドＸレセプターのエフェクター、チミンキナーゼプロモーターおよびＣＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を、レチノイン酸レセプターα、β、γを発現するプラスミドＤＮＡと混合し、リポフェクタミン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いて皮膚癌（ＨａＣＡＴ）細胞ラインを共形質移入するために用いた。共形質移入した細胞ラインをＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地で１日培養し、各レチノール誘導体（１μＭ）を添加し、さらに１日、５％ＣＯ２、３７℃で培養した。細胞をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、各細胞からタンパク質を単離し、β−ガラクトシダーゼの活性およびタンパク質含量を測定してトランスフェクション効率を決定し、ＲＡＲレセプターの転写レベルをＣＡＴ  ＥＬＩＳＡを用いて測定した。
【００７８】
図３に示すように、レチノール−（メサコニン酸）は、レチノールとして、レチノイン酸レセプターαの高い活性化を生じ、一般に、レチノイン酸レセプターβ、γの弱い活性化を示す。
【００７９】
実験例４：レチノール−（フマル酸）を用いるレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）の活性試験
レチノイン酸レセプターの活性に対するレチノール−（フマル酸）の効果を分析するために、Ｃｏｓ−１細胞ラインを利用してレチノイン酸レセプターの活性を測定した。全ての操作は実験例３と同様に行った。
【００８０】
図４に示すように、レチノール−（フマル酸）は、レチノールとして、レチノイン酸レセプターαの高い活性化を生じ、レチノイン酸レセプターβ、γの弱い活性化を示した。
【００８１】
実験例５：レチノール−（レチノール）を用いるレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）の活性試験
レチノイン酸レセプターの活性に対するレチノール−（レチノール）の効果を分析するために、Ｃｏｓ−１細胞ラインを利用してレチノイン酸レセプターの活性を測定した。全ての操作は実験例３と同様に行った。
【００８２】
図５に示すように、レチノール−（レチノール）は、レチノールとして、レチノイン酸レセプターαの高い活性化を生じ、レチノイン酸レセプターβ、γの弱い活性化を示した。
【００８３】
実験例６：レチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）を用いて処理した活性化プロテイン−１（ＡＰ−１）の活性阻害試験
活性化プロテイン−１（ｃ−ＪｕｎはＡＰ−１の構成要素である）はコラゲナーゼ酵素の発現を誘発する転写因子であり、これは皮膚のしわの主な原因であり、しわ予防の効果はＡＰ−１の活性阻害試験により測定される。
【００８４】
ＡＰ−１転写因子結合部位（ＴＲＥ）を含むコラーゲンプロモーターを含有するＣＡＴレポータ−（Ｃｏｌｌ−ＣＡＴ）を利用して皮膚癌（ＨａＣＡＴ）細胞ラインを共形質移入した。レチノール誘導体のＡＰ−１の活性に対する効果は、ＣＡＴ ＥＬＩＳＡにより測定した。ある場合では、ｃ−Ｊｕｎまたはレチノイン酸レセプターを発現するベクターを用いて共形質移入してｃ−Ｊｕｎの転写活性に対するレチノール誘導体のの効果を分析した。
【００８５】
皮膚のしわを引き起こすＡＰ−１の活性を阻害する、調製したレチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）誘導体が化粧品として有用であると仮定して、関連する研究を行った。レチノイン酸レセプターの実験と同様に、活性測定のためのＡＰ−１（ｃ−Ｊｕｎ）発現ベクターおよびＣｏｌｌ−ＣＡＴプラスミドを皮膚癌（ＨａＣＡＴ）細胞ラインにリポソームを用いて組込んだ。細胞をレチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）誘導体で処置した後、細胞抽出物を単離した。ＣＡＴの発現レベルをＣＡＴ ＥＬＩＳＡを用いて測定してレチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）のＡＰ−１の活性に対する効果を決定した。
【００８６】
図６に示すように、ｃ−Ｊｕｎの発現は皮膚のしわを引き起こすコラゲナーゼの発現をおよそ４．５倍上昇させ、レチノイン酸レセプターαの存在下でのレチノールを用いる処理によりコラゲナーゼの発現をおよそ４７％低下させた。従って、レチノイン酸またはレチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）での処理は、それらをおよそ６０％、４４％低下させた。他の場合では、類似の阻害比が得られた（図６、−ｃ−Ｊｕｎまたは＋ｃ−Ｊｕｎ）。それゆえ、これらの結果は、レチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）が、レチノイン酸よりは低いが、レチノールとしてＡＰ−１活性に対して類似の阻害結果を示すことを示す。
【００８７】
実験例７：活性化プロテイン−１（ＡＰ−１）のレチノール−（メサコニン酸）で処理した活性化プロテインの活性阻害試験
ＡＰ−１転写因子結合部位（ＴＲＥ）を含むコラーゲンプロモーターを含有するＣＡＴレポータ−（Ｃｏｌｌ−ＣＡＴ）を利用してＣｏｓ−１細胞ラインを形質移入した。実験例６と同様の活性化プロテイン−１（ＡＰ−１）の活性阻害試験を行った。
【００８８】
ｃ−Ｊｕｎ発現の存在下でコラゲナーゼの発現レベルを１００％と設定すると、レチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）、レチノイン酸、またはレチノール−（メサコニン酸）を用いての処理は、それぞれ、コラゲナーゼの発現をおよそ４２％、５０％または３０％低下させた。それゆえ、これらの結果は、レチノール−（メサコニン酸）がＡＰ−１活性阻害に対してレチノイン酸またはレチノールよりも低い効果を有することを示した。
【００８９】
実験例８：レチノール−（フマル酸）を用いる活性化プロテイン−１：ＡＰ−１の活性阻害試験
ＡＰ−１転写因子結合部位（ＴＲＥ）を含むコラーゲンプロモーターを含有するＣＡＴレポーター（Ｃｏｌｌ−ＣＡＴ）を利用してＣｏｓ−１細胞ラインをトランスフェクトした。実験例６と同様の活性化プロテイン−１（ＡＰ−１）の活性阻害試験を行った。
【００９０】
ｃ−Ｊｕｎ発現の存在下でコラゲナーゼの発現レベルを１００％と設定すると、レチノール−（フマル酸）またはレチノイン酸を用いての処理は、それぞれ、コラゲナーゼの発現をおよそ４２％、５０％低下させた。それゆえ、これらの結果は、レチノール−（フマル酸）がＡＰ−１活性阻害に対してレチノイン酸またはレチノールよりも顕著な効果を有さないことを示した。
【００９１】
実験例９：レチノール−（レチノール）を用いる活性化プロテイン−１：ＡＰ−１の活性阻害試験
ＡＰ−１転写因子結合部位（ＴＲＥ）を含むコラーゲンプロモーターを含有するＣＡＴレポータ−（Ｃｏｌｌ−ＣＡＴ）を利用してＣｏｓ−１細胞ラインをトランスフェクトした。実験例６と同様の活性化プロテイン−１（ＡＰ−１）の活性阻害試験を行った。
【００９２】
ｃ−Ｊｕｎ発現の存在下でコラゲナーゼの発現レベルを１００％と設定すると、レチノール、レチノイン酸またはレチノール−（レチノール）を用いての処理は、それぞれ、コラゲナーゼの発現をおよそ４３％、４７．５％、４１．５％低下させた。それゆえ、これらの結果は、レチノール−（レチノール）がＡＰ−１活性阻害に対してレチノイン酸またはレチノールと比較して類似の効果を有することを示した。
【００９３】
［産業上の有用性］
本発明のレチノール誘導体は光に対してこれまでのレチノールよりもより良好な安定性を示し、これは１０日後でさえも全く変化せずに維持されることがわかった。
【００９４】
本発明のレチノール誘導体はレチノールとして、レチノイン酸レセプターαの高い活性化を生じ、一般に、レチノイン酸レセプターβ、γの弱い活性化を示し、レチノイドＸレセプター（α、β、γ）の活性化を生じなかった。
【００９５】
また、活性化プロテイン−１の阻害の場合、本発明のレチノール誘導体は、レチノールとして、レチノイン酸レセプターαに対する効果と同様に、ｃ−Ｊｕｎ活性において類似する阻害を生じた。
【００９６】
それゆえ、本発明のレチノール誘導体は、しわ、肌荒れ、乾燥、異常な角質化により引き起こされる皮膚の老化の予防および改善のための医薬、化粧品、石鹸、毛髪用洗剤、機能性食品として有効に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のレチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）の細胞毒性分析を示す。
【図２】レチノイン酸レセプター／レチノールＸレセプター（ＲＡＲ／ＲＸＲ）に対する本発明のレチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）の活性制御分析を示す。
【図３】レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）に対する本発明のレチノール−メサコニン酸の活性制御分析を示す。
【図４】レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）に対する本発明のレチノール−フマール酸の活性制御分析を示す。
【図５】レチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）に対する本発明のレチノール−レチノールの活性制御分析を示す。
【図６】活性プロテイテン−１（ＡＰ−１）に対する本発明のレチノール−（Ｎ−ホルミルアスパルタム）の活性制御分析を示す。
【図１】
2004517876.tif 000018
【図２】
2004517876.tif 000019
【図３】
2004517876.tif 000020
【図４】
2004517876.tif 000021
【図５】
2004517876.tif 000022
【図６】
2004517876.tif 000023
【国際公開パンフレット】
2004517876.tif 000024
2004517876.tif 000025
2004517876.tif 000026
2004517876.tif 000027
2004517876.tif 000028
2004517876.tif 000029
2004517876.tif 000030
2004517876.tif 000031
2004517876.tif 000032
2004517876.tif 000033
2004517876.tif 000034
2004517876.tif 000035
2004517876.tif 000036
2004517876.tif 000037
2004517876.tif 000038
2004517876.tif 000039
2004517876.tif 000040
2004517876.tif 000041
2004517876.tif 000042
2004517876.tif 000043
2004517876.tif 000044
2004517876.tif 000045
2004517876.tif 000046
2004517876.tif 000047
2004517876.tif 000048
2004517876.tif 000049
2004517876.tif 000050
2004517876.tif 000051
2004517876.tif 000052
2004517876.tif 000053
2004517876.tif 000054
2004517876.tif 000055
2004517876.tif 000056
2004517876.tif 000057
2004517876.tif 000058
【国際調査報告】
2004517876.tif 000059
2004517876.tif 000060