(57)【要約】本発明はＭＡＧＥ−Ａ３腫瘍関連遺伝子によってコードされるＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド、ならびにかかるペプチドをコードしている核酸、およびそれらに関連する抗体を示す。このペプチドはＣＤ４＋Ｔリンパ球の活性および増殖を刺激する。またＭＡＧＥ−Ａ３遺伝子の発現により特徴づけられる症状を診断および処置するための方法ならびに製品が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、または１〜１０のアミノ酸の付加、置換または欠失を含むその機能的な変異体を含む、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドであって、該ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：２のアミノ酸配列を含む全長ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を含まない、前記単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項２】
単離されたペプチドが、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項１に記載の単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項３】
単離されたペプチドが、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項４】
単離されたペプチドが、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる、請求項３に記載の単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項５】
単離されたペプチドが、エンドソーム標的化シグナルを含む、請求項１に記載の単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項６】
エンドソーム標的化シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的化部分を含む、請求項５に記載の単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項７】
単離されたペプチドが非加水分解性である、請求項１に記載の単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項８】
単離されたペプチドが、Ｄ−アミノ酸を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ２ＮＨ］−還元アミドペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＯＣＨ２］−ケトメチレンペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−（シアノメチレン）アミノペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）］−ヒドロキシエチレンペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ２Ｏ］−ペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ２Ｓ］−チオメチレンペプチド結合を含むペプチドからなる群から選択される、請求項７に記載の単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド。
【請求項９】
単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドと、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとを含む組成物であって、該単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含み、該ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、全長ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を含まない、前記組成物。
【請求項１０】
ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドとＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとが、ポリトープポリペプチドとして組合わされている、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、エンドソーム標的化シグナルを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
エンドソーム標的化シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的化部分を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
１または２以上の単離されたＨＬＡクラスＩＩ分子と複合体化した、請求項１に記載の１または２以上の単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含む組成物。
【請求項１７】
単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの数と、単離されたＨＬＡクラスＩＩ分子の数とが等しい、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと、単離されたＨＬＡクラスＩＩ分子とが、個々の単離されたＨＬＡクラスＩＩ分子に結合した個々の単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの４量体分子として結合している、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ＨＬＡクラスＩＩ分子がＤＲ１分子である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載のペプチド、請求項２に記載のペプチド、請求項３に記載のペプチドおよび請求項５に記載のペプチドからなる群より選択されるペプチドをコードしている単離された核酸であって、該核酸分子が全長ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質をコードしない、前記核酸。
【請求項２１】
核酸が、配列番号：５、配列番号：６および配列番号：１５からなる群より選択される核酸配列を含む、請求項２０に記載の単離された核酸。
【請求項２２】
作動可能にプロモーターと連結した請求項２０に記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項２３】
核酸が、配列番号：５、配列番号：６および配列番号：１５からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２２に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
ＨＬＡ−ＤＲ１分子をコードしている核酸をさらに含む、請求項２２または２３に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２２に記載の発現ベクターおよび請求項２３に記載の発現ベクターからなる群より選択される発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換した宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２４に記載の発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換した宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２２に記載の発現ベクターおよび請求項２３に記載の発現ベクターの群より選択される発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換した宿主細胞であって、該宿主細胞がＨＬＡ−ＤＲ１分子を発現する、前記宿主細胞。
【請求項２８】
Ｔリンパ球の集団を、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドに対して特異的なＣＤ４＋Ｔリンパ球で選択的に富化する方法であって、
Ｔリンパ球の単離された集団を、Ｔリンパ球の単離された集団をＣＤ４＋Ｔリンパ球で選択的に富化するのに充分な量で、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を提示している剤と接触させることを含み、ここで、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む、前記方法。
【請求項２９】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＨＬＡクラスＩＩ分子がＨＬＡ−ＤＲ１分子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的化部分を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を診断するための方法であって、
対象から単離した生物学的試料を、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドに特異的な剤と接触させること、および
疾患の決定として、剤とＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド間の相互作用を測定すること
を含み、ここでＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む、前記方法。
【請求項３５】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
剤が、抗体またはその抗原結合断片である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
ＨＬＡクラスＩＩ分子と複合体を形成するＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの発現によって特徴づけられる疾患を診断するための方法であって、
対象から単離した生物学的試料を、複合体と結合する剤と接触させること、および
疾患の決定として、複合体と剤との間の結合を測定することを含み、ここでＨＬＡクラスＩＩ分子はＨＬＡ−ＤＲ１であり、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む、前記方法。
【請求項４０】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象を処置するための方法であって、
対象に、疾患を改善するのに充分な量のＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを投与することを含み、ここでＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む、前記方法。
【請求項４４】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、エンドソーム標的化シグナルを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
エンドソーム標的化シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的化部分を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象を処置するための方法であって、
対象に、疾患を改善するのに充分な量のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドおよびＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを投与することを含み、ここで、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む、前記方法。
【請求項５０】
ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドと、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとが、ポリトープポリペプチドとして組合わされている、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドが、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、エンドソーム標的化シグナルを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
エンドソーム標的化シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的化部分を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象を処置するための方法であって、
対象に、疾患を改善するのに充分な量の、ＨＬＡクラスＩＩ分子とＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとの複合体の存在を、対象内で選択的に富化する剤を投与することを含み、ここでＨＬＡクラスＩＩ分子はＨＬＡ−ＤＲ１分子であり、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む、前記方法。
【請求項５８】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
剤が、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項６２】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、エンドソーム標的化シグナルを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
エンドソーム標的化シグナルが、ヒト不変鎖Ｉｉのエンドソーム標的化部分を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象を処置するための方法であって、
対象に、疾患を改善するのに充分な量の自己ＣＤ４＋Ｔリンパ球を投与することを含み、ここでＣＤ４＋Ｔリンパ球がＨＬＡクラスＩＩ分子とＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとの複合体に特異的であり、
ＨＬＡクラスＩＩ分子はＨＬＡ−ＤＲ１分子であり、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む、前記方法。
【請求項６５】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの機能的変異体を同定するための方法であって、
配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと結合するＨＬＡクラスＩＩ結合分子、およびＨＬＡクラスＩＩ結合分子によって提示されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドによって活性化されるＴ細胞を選択すること、
変異体ペプチドを調製するために、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの第一アミノ酸残基を変異させること、および
ＨＬＡクラスＩＩ結合分子に対する変異体ペプチドの結合およびＴ細胞の活性化を測定することを含み、ＨＬＡクラスＩＩ結合分子に対する変異体ペプチドの結合およびＨＬＡクラスＩＩ結合分子によって提示された変異体ペプチドによるＴ細胞の活性化が、変異体ペプチドが機能的変異体であること示す、前記方法。
【請求項６９】
機能的変異体によるＴ細胞の活性化の効力の決定として、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドによるＴ細胞の活性化と、機能的変異体によるＴ細胞の活性化を比較する工程をさらに含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
請求項２に記載のポリペプチドに選択的に結合する単離されたポリペプチドであって、該単離されたポリペプチドがＨＬＡクラスＩＩ分子ではない、前記単離されたポリペプチド。
【請求項７１】
単離されたポリペプチドが抗体である、請求項７０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７２】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項７１に記載の抗体。
【請求項７３】
モノクローナル抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または一本鎖抗体である、請求項７２に記載の抗体。
【請求項７４】
単離されたポリペプチドがＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片またはＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドに選択的であるＣＤＲ３領域を含む断片からなる群より選択される抗体断片である、請求項７０に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７５】
ＨＬＡクラスＩＩ分子とＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとの複合体に選択的に結合する単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球であって、
ＨＬＡクラスＩＩ分子はＨＬＡ−ＤＲ１分子であり、そして、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む、前記単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球。
【請求項７６】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項７５に記載の単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球。
【請求項７７】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項７５に記載の単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球。
【請求項７８】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる、請求項７７に記載の単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球。
【請求項７９】
ＨＬＡクラスＩＩ分子とＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとの複合体を含む単離された抗原提示細胞であって、
ＨＬＡクラスＩＩ分子はＨＬＡ−ＤＲ１分子であり、そして、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む、前記単離された抗原提示細胞。
【請求項８０】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的になる、請求項７９に記載の単離された抗原提示細胞。
【請求項８１】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項７９に記載の単離された抗原提示細胞。
【請求項８２】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる、請求項８１に記載の単離された抗原提示細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は腫瘍関連遺伝子産物であるＭＡＧＥ−Ａ３の断片であって、ＨＬＡクラスＩＩ分子によりＴリンパ球に対して結合および提示される断片に関する。該ペプチド、かかるペプチドをコードする核酸分子、ならびに関連する抗体およびＣＤ４＋リンパ球は、特に診断および治療の面において有用である。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類の免疫系が外来性または異質の物質を認識し、かつ反応する過程は複雑である。この系の重要な一面はＴ細胞の応答であり、一部はＣＤ４またはＣＤ８細胞表面タンパク質のいずれかについて陽性である成熟したＴリンパ球を含む。Ｔ細胞は、他の細胞上のヒト白血球抗原（「ＨＬＡ」）または主要組織適合性遺伝子複合体（「ＭＨＣ」）と呼ばれるペプチドおよび分子からなる細胞表面複合体を介して他の細胞を認識し相互作用することができる。当該ペプチドはさらに大きな分子に由来するが、それらはＨＬＡ／ＭＨＣ分子の提示も行う細胞によってプロセシングされる。Male ら、Advanced Immunology（J. P. Lipincott Company, 1987）、特に第６〜１０章を参照のこと。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチドの複合体との相互作用は制限されており、ＨＬＡ分子とペプチドとの特異的な複合体には特異的なＴ細胞が必要である。もし特異的なＴ細胞が存在しなければ、たとえその相手の複合体が存在してもＴ細胞の応答はない。同様に、もし特異的な複合体がなければ、Ｔ細胞が存在しても反応はない。上記のメカニズムは外来タンパク質に対する免疫系の応答に、自己免疫の病理学に、また細胞異常に対する応答に関わっている。
【０００３】
外来抗原に対するＴ細胞の応答は、細胞溶解性Ｔリンパ球とヘルパーＴリンパ球の双方を含む。ＣＤ８＋細胞傷害性または細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、活性化された場合、ＨＬＡクラスI分子によって提示される適当な抗原を提示している細胞を溶解するＴ細胞である。ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞はサイトカインを分泌するＴ細胞であって、表面上のＨＬＡクラスＩＩ分子により適当な抗原を提示するマクロファージおよび抗原産生Ｂ細胞を活性化する。
【０００４】
Ｔ細胞が異質な物質を認識する機構もまた癌と関係づけられてきた。自己由来のメラノーマに向けられた細胞溶解性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の数多くのクローンが記述されてきた。いくつかの例では、このようなクローンによって認識される抗原が特徴づけされてきた。Plaenら、Immunogenetics 40 : 360 - 369（1994）には、腫瘍特異抗原をコードしている遺伝子ファミリー、「ＭＡＧＥ」が述べられている（１９９２年１１月２６日刊行のＰＣＴ出願、PCT/US92/04354も参照のこと）。これらの遺伝子の発現産物はプロセシングされてペプチドとなり、次いでそれは細胞表面上に発現される。これにより、特異的なＣＴＬによる腫瘍細胞の溶解を導くことが可能となる。これらの遺伝子は「腫瘍拒絶抗原前駆体」または「ＴＲＡＰ」分子をコードしているといわれ、それらに由来するペプチドは「腫瘍拒絶抗原」または「ＴＲＡ」と呼ばれる。この遺伝子ファミリーについてのさらなる情報は、Traversariら、Immunogenetics 35 : 145（1992）；van der Bruggenら、Science 254 : 1643 ( 1991 )を参照のこと。また米国特許第5,342,774号も参照のこと。
【０００５】
米国特許第5,405,940号には、ＨＬＡ−Ａ１分子によって提示されるＭＡＧＥノナペプチドが教示されている。特定のＨＬＡ分子についての特定のペプチドの既知の特異性があるとすれば、ある特定のペプチドは一つのＨＬＡ分子に結合し、他とは結合しないことが期待されるだろう。異なる個体は異なるＨＬＡ表現型をもっているため、このことは重要である。その結果として、ある特定のＨＬＡ分子の相手となるべき特定のペプチドの同定に診断上および治療上の効果があるとしても、それは当該特定のＨＬＡ表現型をもつ個体にしか関係がない。細胞の異常は一つの特定のＨＬＡ表現型に限定されず、また標的とされた治療法は問題となる異常細胞の表現型についてのある程度の知識を必要とするため、この領域においてはさらなる研究の必要性がある。
【０００６】
米国特許第5,591,430号においては、単離された付加的なＭＧＥ−Ａ３ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２分子によって提示されるものとして教示されている。したがって、所与のＴＲＡＰは複数のＴＲＡを生じることができる。
上述の参考文献は、ＨＬＡクラスI分子によって提示される腫瘍拒絶抗原の単離および／または特徴づけを記載する。このようなＴＲＡは、ＴＲＡをコードする腫瘍関連遺伝子（例えばＭＡＧＥ遺伝子）を発現する腫瘍細胞を認識するＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化および増殖を誘導することができる。
抗腫瘍免疫におけるＣＤ４＋Ｔリンパ球（ヘルパーＴ細胞）の重要性は動物モデルにおいて証明されており、その中ではこれらの細胞は協力的なエフェクター機能を務めるばかりでなく、免疫記憶の維持においても重要である（Topalianによる総説、Curr. Opin. Immunol. 6 : 741 -745, 1994）。さらに、いくつかの研究は、腫瘍に特異的な免疫性の乏しさがＴヘルパー細胞の不適切な活性化によるものであるという主張を支持している。
【０００７】
最近、チロシナーゼ遺伝子が、ＨＬＡクラスＩＩ分子によりＣＤ４＋Ｔリンパ球を刺激すべく提示されることが証明された（Topalianら、1994；Yeeら、J. Immunol. 157 : 4079 - 4086, 1996；Topalianら、 J. Exp. Med. 183 : 1965 - 1971, 1996）。多くの癌関連抗原と同様に、チロシナーゼは限られたパーセントの腫瘍および限られた型の腫瘍に発現される。さらに、二つの同定されたＭＨＣクラスＩＩ結合性チロシナーゼペプチドはＨＬＡ−ＤＲＢ１＊０４０１拘束性ペプチドであり、この特定のＨＬＡ分子を発現する細胞によってのみ認識される。
【０００８】
より最近になって、癌細胞に広く発現しているが、精巣を除く正常細胞には発現しない癌−精巣抗原であるＭＡＧＥ−Ａ３において、ＨＬＡクラスＩＩペプチドが同定された。米国特許第5,965,535号、およびPCT/US99/21230を参照。
癌抗原チロシナーゼおよびＭＡＧＥ−Ａ３がＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含むことは示されたが、患者の腫瘍がチロシナーゼを発現しないため、または患者が適当なＨＬＡ分子を発現しないために、上記のチロシナーゼおよびＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドによるヘルパーＴ細胞の活性化を含む治療から何ら利益を得ない多くの患者が存在する。したがって、ＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示されかつＣＤ４＋リンパ球によって認識されるエピトープを含む、さらなる腫瘍関連抗原を同定する必要がある。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
ＭＡＧＥ−Ａ３遺伝子が、ＨＬＡ―ＤＲ１によって提示されるエピトープである、さらなるＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードしていることが今回見出された。これらのペプチドは、適切なＨＬＡクラスＩＩ分子を有する抗原提示細胞により提示された場合、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の活性化および増殖を効果的に誘導する。
【００１０】
本発明はＨＬＡクラスＩＩ分子に結合する単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドおよび、かかるペプチドの機能的変異体であって、ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチド配列に対する１または２以上のアミノ酸の付加、置換、または欠失を含む変異体を提供する。本発明はまた、かかるペプチドをコードしている単離された核酸分子、それらの核酸分子を含む発現ベクター、それらの核酸分子を用いてトランスフェクトされた宿主細胞、およびそれらのペプチドおよびペプチドとＨＬＡクラスＩＩ抗原提示分子との複合体に対する抗体も提供する。ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ抗原提示分子との複合体を認識するＴリンパ球も提供される。前述の分子を付加的に含むキットおよびワクチン組成物が提供される。前述のものは、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる症状の診断または治療に使用することが可能である。ＭＡＧＥファミリーのポリペプチドおよび核酸のメンバーが、有意な配列の一致および機能上の相同関係を共有すること（例えば腫瘍抗原および前駆体）が知られているため、本発明はまたＭＡＧＥ−Ａ３以外のＭＡＧＥファミリーのメンバーに由来する類似のアミノ酸配列のＨＬＡ結合ペプチドも含む。したがって、本明細書に含まれているＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド、かかるペプチドを含む組成物、およびかかるペプチドを同定および使用する方法についての開示は、ＭＡＧＥ腫瘍関連抗原ファミリーの他のメンバーに対しても適用されるものと理解される。
【００１１】
本発明の一つの側面によれば、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが提供される。当該ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、または１〜１０アミノ酸の付加、置換または欠失を含むそれらの機能的変異体を含む。しかしながら、当該単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、全長ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質配列、例えば配列番号：２のアミノ酸配列は含まない。
【００１２】
ある態様においては、当該単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列から本質的になるか、または配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる。好ましい態様においては、当該単離されたＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる。
【００１３】
別の態様では、当該単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、エンドソーム標的化シグナル、好ましくはヒト不変鎖Iｉのエンドソーム標的化部分を含む。本発明のさらに別の態様においては、当該単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは非加水分解性である。好ましい非加水分解性のペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ２ＮＨ］−還元アミドペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＯＣＨ２］−ケトメチレンペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−(シアノメチレン）アミノペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）］−ヒドロキシエチレンペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ２Ｏ］−ペプチド結合を含むペプチド、−ｐｓｉ［ＣＨ２Ｓ］−チオメチレンペプチド結合を含むペプチドを包含する。
【００１４】
本発明のもう一つの側面によれば、１または２以上の単離されたＨＬＡクラスＩ結合ペプチドと、１または２以上の単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとを含む組成物が提供される。これらの組成物においては、少なくとも１つの単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはこれらの機能的変異体を含む。ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、全長ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を含まない。
【００１５】
いくつかの態様においては、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドとＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとは、ポリトープポリペプチド、例えば、任意にリンカー（非エピトープ）アミノ酸配列によって連結された、一連の連続したエピトープアミノ酸配列、として組合わされている。好ましくは、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になる。他の好ましい態様においては、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。最も好ましくは、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる。
ある態様においては、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドはエンドソーム標的化シグナルを含み、これは好ましくは、ヒト不変鎖Iｉのエンドソーム標的化部分を含む。
【００１６】
本発明のさらに別の側面によれば、１または２以上の単離されたＨＬＡクラスＩＩ分子と複合体化した、前述の１または２以上の単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含む組成物が提供される。ある態様では、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの数と、単離されたＨＬＡクラスＩＩ分子の数は等しい。好ましくは、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと、単離されたＨＬＡクラスＩＩ分子とは、個々の単離されたＨＬＡクラスＩＩ分子に結合した、個々の単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの４量体分子として結合している。上述の態様では、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、好ましくはＤＲ１分子である。
【００１７】
本発明のさらなる側面によれば、１または２以上の前述のＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードする単離された核酸が提供される。該核酸分子は、全長ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質をコードしない。好ましい態様において、該核酸は、配列番号：５、配列番号：６および配列番号：１５からなる群より選択される核酸配列を含む。
プロモーターに作動可能に連結された前述の単離核酸を含む発現ベクターもまた、本発明によって提供される。該発現ベクターにおいて、核酸配列は、好ましく配列番号：５、配列番号：６または配列番号：１５として示すヌクレオチド配列を含む。該発現ベクターは、任意に、ＨＬＡ−ＤＲ１分子をコードする核酸を含む。
本発明のさらなる側面によれば、１または２以上の前述の発現ベクターでトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞が提供される。 宿主細胞のいくつかは、ＨＬＡ−ＤＲ１分子を発現する。
【００１８】
本発明のさらに別の側面によれば、Ｔリンパ球の集団を、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔリンパ球で選択的に富化する方法が提供される。この方法は、単離されたＴリンパ球集団を、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を提示する剤と、当該単離されたＴリンパ球集団をＣＤ４＋Ｔリンパ球で選択的に富化するのに充分な量で接触させることを含む。該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。
【００１９】
ある態様においては、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になる。他の態様では、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。好ましくは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる。さらに他の態様では、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲ１分子である。ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、ヒト不変鎖Iｉのエンドソーム標的化部分を含むことができる。
【００２０】
本発明の別の側面では、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患の診断方法が提供される。この方法は、対象からの生物学的試料を、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドに特異的な剤と接触させることと、当該剤と、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとの間の相互作用を、疾患の決定として測定することを含む。これらの方法において、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。好ましい方法においては、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になるか、または、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。好ましくは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる。前述の方法において、剤は、好ましくは、抗体、または抗原に結合したその断片である。
【００２１】
本発明のもう一つの側面によれば、ＨＬＡクラスＩＩ分子と複合体を形成するＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの発現によって特徴づけられる疾患の診断方法が提供される。この方法は、対象から単離された生物学的試料を、当該複合体と結合する剤と接触させること、および、当該複合体と当該剤の間の結合を、当該疾患の決定として測定することを含む。かかる方法において、ＨＬＡクラスＩＩ分子は、ＨＬＡ−ＤＲ１分子であり、そして、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。
いくつかの態様においては、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になるか、または、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。好ましい態様においては、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる。
【００２２】
ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象の処置方法が、本発明のもう一つの側面において提供される。この方法は、この疾患を改善させるに充分な量のＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを対象に投与することを含み、ここで、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。
いくつかの態様においては、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、エンドソーム標的化シグナル、好ましくはヒト不変鎖Iｉのエンドソーム標的化部分を含む。他の態様においては、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になるか、または、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。好ましくは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる。
【００２３】
本発明の別の側面によれば、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象の処置方法が提供される。この方法は当該対象に、該疾患を改善させるに充分な量のＨＬＡクラスＩ結合ペプチドとＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとを投与することを含む。これらの方法においては、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。
【００２４】
いくつかの態様においては、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドと、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとは、ポリトープポリペプチドとして組合わされる。別の態様においては、ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドである。さらに別の態様では、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、エンドソーム標的化シグナル、好ましくはヒト不変鎖Iｉのエンドソーム標的化部分を含む。
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、ある態様においては、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になか、または、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。好ましくは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる。
【００２５】
本発明のさらに別の側面によれば、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象のさらなる処置方法が提供される。この方法は、当該疾患を改善させるに充分な、ＨＬＡクラスＩＩ分子とＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとの複合体の存在を、当該対象において選択的に富化する剤を、対象に投与することを含む。これらの方法において、ＨＬＡクラスＩＩ分子はＨＬＡ−ＤＲ１分子であり、そして、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。
【００２６】
ある態様において、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になるか、または、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。好ましくは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる。
別の態様においては、剤はＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含む。好ましくは、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドはエンドソーム標的化シグナルを含む。より好ましくは、エンドソーム標的化シグナルは、ヒト不変鎖Iｉのエンドソーム標的化部分を含む。
【００２７】
本発明の別の側面において、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる疾患を有する対象を処置するための他の方法が提供される。この方法は、対象に、当該疾患を改善させるに充分な量の自己由来のＣＤ４＋Ｔリンパ球を投与することを含み、ここで、当該ＣＤ４＋Ｔリンパ球はＨＬＡクラスＩＩ分子とＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとの複合体に特異的である。かかる方法において、ＨＬＡクラスＩＩ分子はＨＬＡ−ＤＲ１分子であり、そして、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。
これらの方法のある態様では、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になるか、または、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。好ましくは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる。
【００２８】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの機能的変異体の同定方法もまた、本発明の別の側面で提供される。この方法は、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと結合するＨＬＡクラスＩＩ結合分子、および当該ＨＬＡクラスＩＩ結合分子により提示されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドによって活性化されたＴ細胞を選択することを含む。該方法はまた、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの第一アミノ酸を変異させ、変異体ペプチドを調製すること、および、当該変異体ペプチドのＨＬＡクラスＩＩ結合分子に対する結合と、Ｔ細胞の活性化とを決定することを含む。該変異体ペプチドの当該ＨＬＡクラスＩＩ結合分子への結合と、当該ＨＬＡクラスＩＩ結合分子によって提示された当該変異体ペプチドによるＴ細胞の活性化とが、当該変異体が機能的変異体であることを示す。
いくつかの態様において、前述の方法はまた、該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドによるＴ細胞の活性化と、当該機能的変異体によるＴ細胞の活性化とを、当該機能的変異体によるＴ細胞の活性化の有効性を決定するものとして比較する工程を含む。
【００２９】
本発明の別の側面において、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になるＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと、選択的に結合する単離されたポリペプチドが提供される。ただし、該単離されたポリペプチドは、ＨＬＡクラスＩＩ分子ではない。
ある態様においては、当該単離されたペプチドは抗体であり、好ましくはモノクローナル抗体である。好ましいモノクローナル抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体および一本鎖抗体を含む。別の態様では、該単離ペプチドは、抗体断片である。好ましい抗体断片は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、Ｆｖ断片、およびＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドに選択的なＣＤＲ３領域を含む断片を含む。
【００３０】
本発明の別の側面において、ＨＬＡクラスＩＩ分子と、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとの複合体に選択的に結合する、単離されたＣＤ４＋Ｔリンパ球が提供される。ＨＬＡクラスＩＩ分子はＨＬＡ−ＤＲ１分子であり、そして、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列、またはその機能的変異体を含む。ある態様では、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になるか、または、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。好ましくは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる。
【００３１】
本発明のさらに別の側面によれば、ＨＬＡクラスＩＩ分子と、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとの複合体を含む、単離された抗原提示細胞が提供される。これらの細胞において、ＨＬＡクラスＩＩ分子はＨＬＡ−ＤＲ１分子であり、そして、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になるか、または、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：７および配列番号：１６からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。好ましくは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：４として示すアミノ酸配列からなる。
【００３２】
本発明はまた、前述の、または本明細書全体を通して述べられた１または２以上の医薬を含む医薬製剤を提供する。かかる医薬製剤は、薬学的に許容し得る希釈担体または賦形剤を含むことができる。
医薬、特に癌の処置のための医薬の調製における、前記の組成物、ペプチドおよび核酸の使用もまた提供される。
本発明のこれらの、また他の目的は、本発明についての詳細な説明でさらに説明されるだろう。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明はＨＬＡクラスＩＩ分子により提示される単離されたＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドであって、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の増殖および活性化を刺激するペプチドを提供する。かかるペプチドは本明細書において、「ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド」、「ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド」、および「ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチド」と呼ばれる。したがって、本発明の一つの側面は、配列番号：４のアミノ酸配列を含む単離されたペプチドである。本明細書中で「ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド」と呼ばれるペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質の断片を含むが、全長ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質は含まない。同様に、「ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド」をコードする核酸は、ＭＡＧＥ−Ａ３遺伝子のコード領域の断片を含むが、全長ＭＡＧＥ−Ａ３コード領域は含まない。
【００３４】
以下の例は、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドであるペプチドの単離を示している。これらの代表的なペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ３核酸（配列番号：１、これのポリペプチド配列は配列番号：２として示されている）のプロセシングされた翻訳産物である。したがって、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドがそこから提示用の最終的な形状にプロセシングされる翻訳産物は、それらが当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを包含する限り、いかなる長さまたは配列であってもよいことが当業者には理解されるであろう。以下の例において証明されるように、１３または１４アミノ酸程の小ささでも、またＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質（配列番号：２）のような大きさでも、ペプチドまたはタンパク質は適切にプロセシングされ、ＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示され、かつ有効にＣＤ４＋Ｔリンパ球を活性化する。
【００３５】
配列番号：３、配列番号：４または配列番号：７のペプチドといったＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、またはそれより多いアミノ酸が一端または両端に付加されてもよい。このようなペプチドの抗原性部分は、生理的な条件下ではＨＬＡクラスＩＩ分子による提示用に切断される。当該技術分野においては、ＨＬＡクラスＩＩペプチドの長さが約１０アミノ酸と約３０アミノ酸の間で可変であることも知られている（Engelhard, Ann. Rev. Immunol. 12 : 181 - 201, 1994）。当該ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドのほとんどは、１２〜１９アミノ酸長の範囲に入る。ペプチドがコア配列を共有しているが、アミノおよび／カルボキシ末端においては異なるアミノ酸を有するＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの入れ子のセット（nested sets）が同定されている（例えば、Chiczら、J. Exp. Med. 178 : 27 - 47, 1993を参照のこと）。このように、当業者は、付加的なＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド、ならびにＭＡＧＥ−Ａ３ファミリーＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを、本明細書に開示された手順に従って同定することが可能であろう。
【００３６】
例において記述された手順は、ＭＡＧＥファミリーＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを同定すべく使用することが可能である。したがって、例えば正常な血液ドナーの樹状細胞などの抗原提示細胞を、当該細胞をＭＡＧＥポリペプチドと接触させることにより、あるいは対象となるＭＡＧＥタンパク質の発現を指示する核酸分子を細胞内に導入することにより、組換えＭＡＧＥタンパク質（またはその断片）を用いてロードすることができる。当該抗原提示細胞は次いで、ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを認識する特異的なＣＤ４リンパ球のin vitroの活性化および増殖を誘導すべく用いることが可能である。次いで当該ペプチドの配列は、例において記述されているように、例えばＣＤ４リンパ球の活性化および増殖を刺激すべく用いたＭＡＧＥタンパク質のペプチド断片を用いて細胞を刺激することにより決定することが可能である。別法として、ＭＡＧＥタンパク質由来のペプチドを用いて抗原提示細胞をロードすることもできる。例えば、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するアミノ酸のコンセンサス配列に基づき、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの候補であるＭＡＧＥファミリータンパク質由来のペプチド配列を予測することが可能である。この点については、国際出願PCT/US96/03182およびPCT/US98/01373を参照のこと。かくして選ばれたペプチドは、特異的なＣＤ４リンパ球の誘導およびペプチドの同定のための本明細書に述べられたアッセイに使用することが可能である。ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの選択および試験のための付加的な方法は、当該技術分野において周知である。
【００３７】
上述したように、本発明はＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの機能的変異体を含む。本明細書に用いる場合、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの「機能的変異体」または「変異体」は、あるＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの一次アミノ酸配列の１または２以上の修飾を含み、かつ本明細書に開示されたＨＬＡクラスＩＩおよびＴ細胞受容体結合特性を保持しているペプチドである。ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの変異体を生じる修飾は、例えば、１）発現系におけるペプチドの安定性、またはＨＬＡ−ペプチド結合などのタンパク質−タンパク質結合の安定性といった、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの特性を強化するため；２）抗原性エピトープの付加、または検出可能な成分の付加といった、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドに対する新規な活性または特性を提供するため；または３）同一または同様のＴ細胞活性化特性を生じる異なるアミノ酸配列を提供するために行うことが可能である。
【００３８】
ＭＡＧＥ−Ａ３（ならびにＭＡＧＥファミリー）ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの修飾は、当該ペプチドをコードしている核酸に対して行なうことが可能であり、欠失、点突然変異、切断、アミノ酸置換、およびアミノ酸付加を含むことができる。別法として、例えば切断、リンカー分子の付加、ビオチンなどの検出可能な成分の付加、脂肪酸の付加、１アミノ酸の他のアミノ酸への置換などによる修飾が、当該ポリペプチドに対して直接に行なわれることが可能である。変異体はまたランダムペプチドか、または１または２以上の位置における置換を含むＭＡＧＥペプチドの配列に基づく、ペプチドのライブラリーから選ぶことが可能である。例えば、ペプチドライブラリーはＨＬＡクラスＩＩ分子に結合したＭＡＧＥペプチドの複合体（例えばＭＡＧＥタンパク質でロードされた樹状細胞）を用いた競合アッセイに使用することができる。ＨＬＡクラスＩＩ分子に対するＭＡＧＥペプチドの結合について競合するペプチドは、配列決定することが可能であり、ＭＡＧＥペプチドの機能的変異体を決定すべく、他のアッセイ（例えば、ＣＤ４リンパ球の増殖）に使用される。
【００３９】
修飾はまた、本明細書に述べられた不変鎖−ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質などの、ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含む融合タンパク質を包含する。したがって本発明は、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと、ヒト不変鎖（Iｉ）などのエンドソーム標的化部分とを含む融合タンパク質を含む。以下に開示されるように、ヒト不変鎖のエンドソーム標的化部分のＭＡＧＥ−Ａ３に対する融合の結果、ＨＬＡクラスＩＩペプチド提示経路に対するＭＡＧＥ−Ａ３の効果的な標的化が生じる。ヒト不変鎖または他の標的化ポリペプチドの「エンドソーム標的化部分」は、第２のポリペプチドに融合または結合された時、当該第２のポリペプチドのエンドソームへの局在化を亢進する分子部分である。したがって、エンドソーム標的化部分は、全配列かまたはヒト不変鎖Iｉなどの標的化ポリペプチドのごく小さな部分を含むことが可能である。当業者は、標的化分子のエンドソーム標的化部分を容易に決定することができる。
【００４０】
先行する研究（PCT/US99/21230）は、ＬＡＭＰ−１タンパク質のエンドソーム標的化部分の融合が、ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド提示経路へのＭＡＧＥ−Ａ３の標的化を有意に亢進しないことを指摘している。したがって、本発明の特定のＭＡＧＥ−Ａ３を、ＬＡＭＰ−１との融合体として試験し、かかる融合タンパク質がＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド提示経路に有効に標的化されているかを決定することができる。さらなるエンドソーム標的化シグナルを当業者が同定し、ＭＡＧＥ−Ａ３またはそのＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合部分に融合し、ＨＬＡクラスＩＩペプチド提示経路への標的化について、日常の実験の範囲内で試験することが可能である。
【００４１】
ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドのアミノ酸配列は、天然または非天然由来であってよく、すなわち、それらは天然のＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド分子を含むか、または提示された際に当該アミノ酸配列がヘルパーＴ細胞を刺激する能力を保持し、かつＨＬＡ−ＤＲ１分子に結合する特性を保持している限り、修飾された配列を含んでよい。例えば、このような状況において、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと、無関係なアミノ酸配列、合成ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド、標識されたペプチド、ＭＡＧＥ−Ａ３を発現している癌を有する患者から単離されたペプチド、ＭＡＧＥ−Ａ３を発現する培養細胞から単離されたペプチド、非ペプチド分子に結合されたペプチド（例えばある剤の送達システムにおいて）、および配列番号：３、配列番号：４または配列番号：７のアミノ酸配列を含む他の分子を含む融合タンパク質であってもよい。
【００４２】
好ましくは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは非加水分解性である。かかるペプチドを提供するため、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは１または２以上のＤ−アミノ酸を含むペプチド、または１または２以上の非加水分解性ペプチド結合で連結されたアミノ酸を含むペプチドなどの、非加水分解性ペプチドのライブラリーから選択されてもよい。別法として、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の誘導に最適なペプチドを選択し、次いでプロテアーゼによる加水分解の可能性を減じるために必要とされるように、当該ペプチドを修飾することもできる。例えば、タンパク質分解に対する感受性を測定すべくペプチドが標識され、さらに細胞抽出物または精製されたプロテアーゼと共にインキュベートされ、次いでどのペプチド結合がタンパク質分解に対して感受性であるのかを、例えばペプチドおよびタンパク質分解による断片の配列決定により決定すべく単離されてもよい。別法として、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドのアミノ酸配列を、一団のプロテアーゼの既知の切断特異性と比較することにより、可能性のある感受性ペプチド結合を同定することも可能である。このような分析結果に基づき、タンパク質分解に対して感受性である個々のペプチド結合が、in vitroのペプチド合成により非加水分解性ペプチド結合に置き換えられることが可能である。
【００４３】
当該技術分野においては、多くの非加水分解性ペプチド結合が、かかる結合を含むペプチドの合成法と共に周知である。非加水分解性結合は、限定されることなく、−ｐｓｉ［ＣＨ２ＮＨ］−還元アミドペプチド結合、−ｐｓｉ［ＣＯＣＨ２］−ケトメチレンペプチド結合、−ｐｓｉ［ＣＨ（ＣＮ）ＮＨ］−（シアノメチレン）アミノペプチド結合、−ｐｓｉ［ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）］−ヒドロキシエチレンペプチド結合、−ｐｓｉ［ＣＨ２Ｏ］−ペプチド結合、および−ｐｓｉ［ＣＨ２Ｓ］−チオメチレンペプチド結合を含む。
【００４４】
当該ペプチドの非ペプチド類似体、例えば安定化された構造または減じられた生物分解を提供するものもまた考えられる。ペプチド模倣性類似体(mimetic analogs)は、選ばれたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを主成分とし、非ペプチド成分による１または２以上の残基の置換により調製することができる。好ましくは、当該非ペプチド成分は、当該ペプチドがその天然の構造を保持するか、または好ましい、例えば生物活性のある構造を安定化させることを可能にする。かかるペプチドは、構造および／または活性についての置換の影響を査定するための、分子または細胞を基盤とする結合分析において検査することが可能である。ペプチドからの非ペプチド模倣性類似体の調製法は、Nachmanら、Regul. Pept. 57 : 359 - 370（1995）に記述されている。本明細書において使用されたようなペプチドは前述のすべてを含む。
【００４５】
変異体が、配列番号：３、配列番号：４または配列番号：７のアミノ酸についての変化を含む場合、保存的アミノ酸置換を有するＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの機能的変異体、すなわち、もとのアミノ酸の電荷、疎水性、構造、その他の特性を保持する置換が、典型的には好ましいであろう。アミノ酸の保存的置換の例は、以下のグループ内でのアミノ酸の間で行なわれる置換を含む：（ａ）Ｍ、I、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００４６】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの機能的変異体を同定するための他の方法は、Strominger ＆ Wucherpfenningの公開されたＰＣＴ出願（PCT/US96/03182）に提供されている。これらの方法は、可能性のあるエピトープがそれについて比較されてもよいアミノ酸配列モチーフの開発に依存している。各々のモチーフは、ある有限のアミノ酸配列のセットを記述しており、各々の（相対的な）位置は（ａ）一つの残基に限定されるか、（ｂ）限定された残基のセットの中で変化するようにされるか、または（ｃ）すべての可能な残基の中で変化するようにされてもよい。例えば、一つのモチーフは第１の位置の残基がバリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、またはフェニルアラニンの残基のうちのどの一つであってもよく；第２の位置の残基はヒスチジンでなけらばならず；第３の位置の残基はどのアミノ酸残基でもよく；第４の位置の残基はバリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの残基のいずれであってもよく；さらに第５の位置の残基はリジンでなければならないことを明示している。
【００４７】
アミノ酸置換を選択するための他のコンピュータ化された方法、例えば、反復コンピュータ構造モデリング（iterative computer structural modeling）を、当業者が変異体を調製するために行うこともできる。ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの機能的変異体についての配列モチーフは、本明細書において開示されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの、主要組織適合性複合体ＨＬＡ−ＤＲタンパク質および／またはＴ細胞受容体（「ＴＣＲ」）接触点の結合ドメインまたは結合ポケットの分析により開発することが可能である。ＨＬＡクラスＩＩ結合ポケットの形成に関わる残基についての詳細な構造分析を提供することにより、いかなるＨＬＡクラスＩＩタンパク質に対してもＭＡＧＥペプチドを結合するための配列モチーフを予測することが可能となる。
【００４８】
このような配列モチーフを研究、評価、または設計の基準として用いることにより、特定のＨＬＡ分子に対して結合すること、およびＴ細胞の応答を誘導すべくＴ細胞受容体と相互作用することについての正当な可能性をもつペプチド（例えばＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド、特に本明細書において開示されたＭＡＧＥ−Ａ３ペプチド、およびそれらの機能的変異体）の種類を同定することが可能となる。このようなペプチドは、本明細書に記述されたように合成し、活性について試験することが可能である。純粋な配列の相同性（抗原性としては同様であるが全く配列の異なる多くのペプチドを除外する）、または制限されない「保存的」置換のある配列の相同性（高度に保存された決定的な部位が異なる多くのペプチドを認める）に反してこれらのモチーフを用いることは、それによって当業者がペプチドを、疾患の治療における可能性のある適用について評価することができる方法を表している。
【００４９】
Strominger ＆ WucherpfenningのＰＣＴ出願および、そのすべてが参考文献として取込まれており、それに引用された参考文献は、ＨＬＡクラスＩＩと、ＨＬＡクラスＩＩペプチドの残基と接触するＴＣＲ結合ポケットについて記述している。ＨＬＡクラスＩＩおよび／またはＴＣＲ結合ポケットにおいて結合しやすい残基を一定に保持することにより、あるいはわずかに指定された置換のみを許すことにより、ＨＬＡクラスＩＩおよびＴ細胞受容体に対する結合性を保持しているＭＡＧＥ ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの機能的変異体を調製することができる。
【００５０】
このように、付加的なＭＡＧＥファミリーＨＬＡクラスＩＩペプチド、特にＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド、およびそれらの機能的変異体を同定するための方法が提供される。一般に、どのようなＭＡＧＥタンパク質も上記の分析に供することが可能であり、ペプチド配列は本明細書に記述されたように選択され、かつ試験される。例えばＭＡＧＥ−Ａ３については、当該方法は、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと結合するＨＬＡクラスＩＩ結合分子、およびＨＬＡクラスＩＩ結合分子によって提示された当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドによって活性化されるＴ細胞を選択することを含む。好ましい態様においては、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、配列番号：３、配列番号：４または配列番号：７を含む。より好ましくは、当該ペプチドは、本質的にこれらのアミノ酸配列からなる。当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの第１アミノ酸残基が、変異体ペプチドを調製すべく突然変異される。当該アミノ酸残基は、上記のStrominger ＆ WucherpfenningのＰＣＴ出願に述べられたＨＬＡとＴ細胞受容体の接触点についての原理に従って突然変異させることが可能である。変異体ペプチドの合成、突然変異した核酸分子を用いた変異体ペプチドの組換えによる産生などの、変異体ペプチドを調製するためのどのような方法を用いることも可能である。
【００５１】
次いで当該変異体ペプチドの、ＨＬＡクラスＩＩ結合分子に対する結合とＴ細胞の活性化とが、標準的な方法に従って測定される。例えば、以下において例証されるように、当該変異体ペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドと結合して当該変異体と抗原提示細胞との複合体を形成する当該ＨＬＡクラスＩＩ分子を含む、抗原提示細胞と接触させることができる。次いでこの複合体は、当該ＨＬＡクラスＩＩ結合分子によって提示された当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを認識するＴ細胞と接触させることが可能である。Ｔ細胞は、ＭＡＧＥ−Ａ３の発現によって特徴づけられる症状、例えば癌を有する患者から取得することが可能である。当該Ｔ細胞による変異体ペプチドの認識は、ＴＮＦまたはIＦＮγ産生といったＴ細胞活性化の指標を測定することにより決定することが可能である。他のＭＡＧＥファミリーＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの同定および特徴づけのため、同様の方法を行うことが可能である。
【００５２】
ＨＬＡクラスＩＩ結合分子に対する変異体ペプチドの結合と、当該ＨＬＡクラスＩＩ結合分子によって提示された当該変異体ペプチドによるＴ細胞の活性化とは、当該変異体ペプチドが機能的変異体であることを示唆している。この方法はまた、機能的変異体によるＴ細胞の活性化の有効性の測定として、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドによるＴ細胞の活性化と、当該機能的変異体によるＴ細胞の活性化とを比較することの工程を含むことができる。機能的変異体をＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと比較することにより、Ｔ細胞活性化特性の亢進されたペプチドの調製が可能となる。
【００５３】
前述の方法を、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９および第１０の置換について順次繰返し、開示されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドのさらなる機能的変異体を調製することができる。
前記のどの方法によって調製されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの変異体でも、もし必要であれば、アミノ酸配列を決定すべく、したがって、かかる変異体をコードしている核酸配列を演繹すべく、配列決定することが可能である。
【００５４】
本発明の一部はまた、ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドまたはその変異体をコードしている核酸配列、および、ストリンジェントな条件下に上記のヌクレオチド配列からなる核酸分子とハイブリダイズする他の核酸配列である。好ましい核酸分子は、配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７をコードするヌクレオチド配列であって、それぞれ配列番号：５、配列番号：６および配列番号：１５である配列を含むものを包含する。本明細書において用いられたような「ストリンジェントな条件」という用語は、当該技術分野において知られたパラメーターである。核酸のハイブリダイゼーションのパラメーターは、かかる方法を集めた参考文献、例えばMolecular Cloning：A Laboratory Manual, J. Sambrook ら編、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubelら編、John Wiley & Sons社、ニューヨーク、に見出されるであろう。
【００５５】
さらに具体的には、本明細書において用いられたようなストリンジェントな条件は、６５℃においての、ハイブリダイゼーション緩衝液（３．５xＳＳＣ、０．０２％フィコール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．０５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）におけるハイブリダイゼーションを指す。ＳＳＣは０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７であり；ＳＤＳはドデシル硫酸ナトリウムであり；またＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが移された膜は、２xＳＳＣにて室温において、次いで０．１〜０．５ｘＳＳＣ／０．１ｘＳＤＳにて６８℃までの温度において洗浄される。あるいは、ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、ExpressHyb（登録商標）緩衝液（Clontech）などの市販のハイブリダイゼーション緩衝液を用いて、製造者によって記載されたハイブリダイゼーションおよび洗浄条件で行ってもよい。
【００５６】
同程度のストリンジェンシーを生じる結果となる使用可能な他の条件、試薬、その他がある。熟練した技術者はかかる条件に通じていると思われるため、それらはここに記されていない。しかしながら熟練した技術者は、本発明のＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードしている核酸の相同物または対立遺伝子の明確な同定を可能にする方式で、条件を操作することが可能であることが理解されよう。また熟練した技術者は、かかる分子の発現のための細胞およびライブラリーのスクリーニングについての方法論にも通じており、それらの分子は次いで慣例的に単離され、続いて関連する核酸分子が単離され配列決定される。
【００５７】
一般的に相同物および対立遺伝子は、典型的には少なくとも９０％のアミノ酸の同一性、および／または少なくとも７５％のヌクレオチドの同一性を（配列番号：３、配列番号：４および配列番号：７などの）ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドのアミノ酸配列に対して、またはかかるペプチドをコードしている核酸に対して各々共有するであろう。いくつかの例においては、相同物および対立遺伝子は、少なくとも９０％のヌクレオチドの同一性および／または少なくとも９５％のアミノ酸の同一性を共有するであろうし、さらに別の例では、少なくとも９５％のヌクレオチドの同一性および／または少なくとも９９％のアミノ酸の同一性を共有するであろう。上記の核酸の相補体もまた本発明に含まれる。
ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードしている核酸についてのスクリーニングでは、サザンブロットまたはノーザンブロットなどの核酸のハイブリダイゼーションは、上記の条件を用いて、検出可能に標識されたプローブ（例えば、３２Pなどの放射性標識、化学発光標識、蛍光標識）と共に行なってもよい。ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードしているＤＮＡが最終的に移された膜の洗浄後、放射性シグナルを検出すべく、Ｘ線フィルム、フォスフォイメージャーまたは他の検出装置に当該膜を設置することができる。
【００５８】
本発明はまた、当該ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと同一のアミノ酸配列をコードする代替コドンを含む核酸配列の使用を含む。例えば、本明細書に開示されているように、ペプチドＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳ（配列番号：３）はＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドである。ロイシン残基（配列番号：４の６番および１２番アミノ酸）はコドンＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、ＵＵＡ、およびＵＵＧによりコードすることが可能である。６個のコドンの各々はロイシン残基をコードする目的については同等である。したがって、ロイシンをコードしているヌクレオチドトリプレットのいずれもが、ロイシン残基を取込むため、in vitroまたはin vivoのタンパク質合成装置を指示すべく用いられてもよいことが当業者には明らかであろう。同様に、配列番号：４のＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含む他のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列のトリプレットは：ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＴ、ＡＧＡ、およびＡＧＧ（アルギニンコドン）；ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、およびＧＵＵ（バリンコドン）；ＧＡＡおよびＧＡＧ（グルタミンコドン）；ＵＵＣおよびＵＵＵ（フェニルアラニンコドン）、およびＵＡＣおよびＵＡＵ（チロシンコドン）を含む。他のアミノ酸残基も、同様に複数のヌクレオチド配列によってコードされてもよい。したがって本発明は、遺伝子コードの縮重のため、コドンの配列において天然のＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードしている核酸とは異なる縮重された核酸を含む。
【００５９】
また本発明が、発現ベクターにおける、ならびに原核性（例えば大腸菌）または真核性（例えば樹状細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、酵母の発現系、および昆虫細胞における組換えバキュロウイルスの発現）である、宿主細胞または細胞系をトランスフェクトするための、当該配列の使用を含むことも理解されよう。発現ベクターは、関係する配列、すなわち前述のものが、プロモーターに対し作動可能に連結されていることを必要とする。ヒトＨＬＡ−ＤＲ１分子がＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを提示することが判っているため、当該発現ベクターもまたＨＬＡ−ＤＲ１分子をコードしている核酸配列を含んでもよい。ベクターが、両方のコード配列を含む状況においては、それを、いずれか一つを通常は発現しない細胞をトランスフェクトするのに用いることが可能である。ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドのコード配列は、例えば宿主細胞がすでにＨＬＡ−ＤＲ１分子を発現している場合には、単独で用いられてもよい。もちろん、当該二つのコード配列を含むベクターが、所望であればＨＬＡ−ＤＲ１分子を発現しない宿主細胞において用いられてよく、またＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドのコード核酸が、 ＨＬＡ−ＤＲ１分子を発現する抗原提示細胞において使用することが可能であることから、使用可能な宿主細胞については何ら制限はない。
【００６０】
本明細書に用いられているように、「ＨＬＡ−ＤＲ１分子」は、サブタイプＤＲＢ１*0101、ＤＲＢ１*01021、ＤＲＢ１*01022、ＤＲＢ１*0103、ＤＲＢ１*0104、ＤＲＢ１*0105、ＤＲＢ１*0106、ＤＲＢ１*0107、および当業者に周知の他のサブタイプを含む。他のサブタイプは、ＨＬＡ対立遺伝子リストをアップデートした種々の刊行物に見出すことができる。
【００６１】
本明細書に用いる場合、「ベクター」は、異なる遺伝的環境間の移送のため、または宿主細胞における発現のために、制限または連結によって所望の配列が挿入されてもよい多数の核酸のどれでもよい。ベクターは典型的にはＤＮＡから構成されるが、ＲＮＡベクターもまた利用できる。ベクターはプラスミド、ファージミド、およびウイルスゲノムを含むがこれに制限されない。クローニングベクターは、自律的に、あるいはゲノムへの組込みの後に、宿主細胞において複製することができるものであり、それはさらに１または２以上のエンドヌクレアーゼ制限部位によって特徴づけられ、その場所で当該ベクターは決定可能な様式で切断されてよく、そこに所望のＤＮＡ配列が連結されてよく、新規な組換えベクターが宿主におけるその複製能を保持するようにする。プラスミドの場合には、宿主細菌内のプラスミドのコピー数が増えるにつれて所望の配列の複製が何度も起きてよく、あるいは細胞分裂によって宿主が再生される前に宿主あたり１回だけでもよい。ファージの場合には、複製は溶菌相の間は積極的に、あるいは溶原相の間は受動的に起きてもよい。
【００６２】
発現ベクターは、その中に所望のＤＮＡ配列が制限および連結により挿入され、それが調節配列に対して作動可能に連結されて、ＲＮＡ転写物として発現されようにするものである。ベクターはさらに、当該ベクターによって形質転換またはトランスフェクトされたか、またはされない細胞を同定することにおける使用に適した１または２以上のマーカー配列を含んでもよい。マーカーは、例えば抗生物質または他の化合物に対する抵抗性または感受性のどちらかを亢進または低下させるタンパク質をコードしている遺伝子、その活性が当該技術分野における標準的な分析法によって検出可能な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、またはアルカリ性ホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換またはトランスフェクトされた細胞、宿主、コロニー、またはプラークの表現型に視覚的に影響する遺伝子を含む。好ましいベクターは自律的な複製と、それに対してベクターが作動可能に連結されているＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子産物の発現が可能なベクターである。
【００６３】
好ましくは、当該発現ベクターはＭＡＧＥファミリーポリペプチド、例えばＭＡＧＥ−Ａ３、またはそれに由来するＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを、当該タンパク質が発現される細胞のエンドソームに対して標的化する配列を含む。ＨＬＡクラスＩＩ分子は、当該ＨＬＡクラスＩＩ分子に対する他の分子の結合を妨げる不変鎖（Iｉ）を含む。この不変鎖はエンドソームにおいて切断され、それによりＨＬＡクラスＩＩ分子によるペプチドの結合が許される。したがって、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドおよびその前駆体（例えばＭＡＧＥ−Ａ３）はエンドソームに対して標的化され、それによりＨＬＡクラスＩＩ分子に結合するＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが増大する。エンドソームに向けて分子を指向させるための標的化シグナルは当該技術分野において周知であり、これらのシグナルは発現ベクターに都合よく取込まれ、エンドソーム標的化シグナルを含む融合タンパク質が産生されるようにする。Sandersonら（Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 92 ; 7217 - 7221, 1995）、Wuら（Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 92 ; 11671 - 11675, 1995）、およびThomsonら（J. Virol. 72 : 2246 - 2252, 1998）は、エンドソーム標的化シグナル（不変鎖（Iｉ）およびリソゾーム結合性膜タンパク質ＬＡＭＰ−１を含む）と、エンドソーム性および／またはリソゾーム性の細胞区画へ抗原を指向させることにおけるそれらの使用について述べている。例に示したように、不変鎖−ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質が好ましい。
【００６４】
不変鎖などのエンドソーム標的化シグナルもまた、特異的にＭＡＧＥ−Ａ３を標的化することができる結合体を調製すべく、非ペプチド結合により（すなわち非融合タンパク質）、ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質またはペプチドに結合することが可能である。共有結合の具体例は、二価性架橋分子が用いられているものを含む。この架橋分子は結合されるべき分子の性質に依存して、ホモの二価性（homobifunctional）か、またはヘテロの二価性（heterobifunctional）であってもよい。ホモの二価性架橋剤は二つの同等の反応基を有する。へテロの二価性架橋剤は、連続的な結合反応を可能にする二つの異なる反応基を有するものとして定義される。市販の種々の架橋剤は、以下の１または２以上の基と反応性である；第一級アミン、第二級アミン、スルフヒドリル、カルボキシル、カルボニル、および炭水化物。当業者は、結合されるべき分子の化学的特性と、１または２以上の結合についての好ましい性質とに基づき、エンドソーム標的化成分とＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドまたはタンパク質との連結のために好ましい分子を、過度の実験をすることなく確認することができるであろう。
【００６５】
本明細書に用いられたように、コード配列および調節配列は、当該コード配列の発現または転写が、当該調節配列の影響または支配下にあるように位置される様式において共有結合されている場合、「作動可能に」結合されているといわれる。もし当該コード配列を機能タンパク質に翻訳することが望まれる場合には、二つのＤＮＡ配列は、もし５’調節配列におけるプロモーターの誘導の結果当該コード配列の転写を生じ、またもし当該二つのＤＮＡ配列の間の連結の性質が、（１）フレームシフト突然変異を誘導する結果とならず、（２）当該コード配列の転写を指示するための当該プロモーターの能力を妨害せず、あるいは（３）タンパク質に翻訳されるべき対応するＲＮＡ転写物の能力を妨害しない場合には、「作動可能に」連結されているといわれる。したがってプロモーター領域は、もし当該プロモーター領域が、結果として得られる転写物が所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳されるように、そのＤＮＡ配列の転写を果たすことができれば、作動可能にコード配列に結合されていることになる。
【００６６】
遺伝子発現に必要な調節配列の詳細な性質は、種または細胞型の間で異なってもよいが、一般的には、必要なこととして、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの、各々転写および翻訳の開始に関与する５’非転写、および５’非翻訳配列を含むであろう。特に、かかる５’非転写調節配列は、作動可能に結合された遺伝子の転写調節のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含むであろう。調節配列はまたエンハンサー配列か、または所望の上流のアクチベーター配列を含んでもよい。本発明のベクターは、任意に５’リーダーまたはシグナル配列を含んでもよい。適当なベクターの選択および設計は、当業者の能力および自由裁量の範囲内にある。
【００６７】
発現に必要な要素のすべてを含む発現ベクターが市販されており、当業者には周知である。例えば、 Sambrookらの、Molecular Cloning : A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989参照のこと。細胞は、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードしている異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）を当該細胞に導入することにより遺伝子操作される。その異種ＤＮＡ（ＲＮＡ）は、宿主細胞における異種ＤＮＡの発現を可能にするための転写エレメントの作動可能な支配下に置かれる。本明細書に述べたように、かかる発現構築物はまた、任意にエンドソーム標的化シグナル、好ましくはヒト不変鎖またはその標的化断片をコードしているヌクレオチド配列を含む。
【００６８】
哺乳類細胞におけるｍＲＮＡ発現についての好ましいシステムは、ｐＲｃ／ＣＭＶおよびｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen, Carlsbad, CAより市販）などの、Ｇ４１８抵抗性を与える遺伝子（安定にトランスフェクトされた細胞系の選択を容易にする）などの選択可能なマーカーと、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー−プロモーター配列を含む。さらに、霊長類またはイヌの細胞系における発現に適したものはｐＣＥＰ４ベクター（Invitrogen）であり、これは多コピー染色体外エレメントとしてのプラスミドの維持を容易にするＥＢ−ウイルス（ＥＢＶ）の複製起点を含む。もう一つの発現ベクターはポリペプチド伸長因子１αのプロモーターを含むｐＥＦ−ＢＯＳプラスミドであって、それはin vitroの転写を効果的に刺激する。当該プラスミドはMishizuma & Nagata（Nuc. Acids Res. 18 : 5322, 1990）によって記述され、トランスフェクション実験におけるその使用は、例えばDemoulin（Mol. Cell. Biol. 16 : 4710 - 4716, 1996）によって開示されている。さらにもう一つの好ましい発現ベクターは、Stratford-Perricaudetにより記述されたアデノウイルスであり、それはＥ１およびＥ３タンパク質が欠失している（J. Clin. Invest. 90 : 626 - 630, 1992）。Ａｄｅｎｏ．Ｐ１Ａ組換え体などのアデノウイルスの使用は、WarnierらによりＰ１Ａに対する免疫のためのマウスへの皮内注射において開示されている（Int. J. Cancer, 67 : 303 - 310, 1996）。アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルスおよびＡＬＶＡＣ、ＮＹＶＡＣなどの弱毒化ポックスウイルスを含むポックスウイルス、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、レトロウイルス、シンドビスウイルスおよびＴｙウイルス様粒子、他のアルファウイルス、ＶＳＶ、プラスミド（例えば、「裸の」ＤＮＡ）、細菌（例えば、カルメット・ゲラン桿菌、弱毒化サルモネラ菌）などをかかる送達、例えば、ワクチンとしての使用に用いることができる。
【００６９】
本発明はまた、技術者に所望の発現ベクターまたは複数のベクターの調製を可能にするいわゆる発現キットも含む。かかる発現キットは、先に議論した物質の少なくとも二つについての、少なくとも別々の部分を含む。所望の、他の成分が加えられてもよい。
本明細書に記述された本発明には多くの用途があり、それらのいくつかは本明細書に述べられている。以下の用途はＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドについて述べられたものであるが、他のＭＡＧＥファミリーＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの使用に対しても同様に適用することができる。第１に、本発明は、技術者が、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの発現によって特徴づけられる疾患を診断することができるようにする。これらの方法は、生物学的試料におけるＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドか、またはＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体の発現を測定することを含む。ペプチドか、またはペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体の発現は、抗体などの、当該ペプチドまたは複合体に対する結合相手を用いたアッセイにより測定することが可能である。
【００７０】
本発明はさらに、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドまたはかかるポリペプチドをコードする核酸に結合する要素を有する、核酸またはタンパク質マイクロアレイを包含する。本発明のこの側面では、タンパク質マイクロアレイ技術の標準的な技法が、ＭＡＧＥ−Ａ３ポリペプチドの発現を調査すること、および／またはかかるポリペプチドに結合する生物学的構成成分を同定することに用いられる。生物学的試料の構成要素は、抗体、リンパ球（特にＴリンパ球）などを包含する。タンパク質マイクロアレイ技術、これはタンパク質チップ技術および固相タンパク質アレイ技術を含む他の名前でも知られているが、これは当業者によく知られており、次に限定されるものではないが、固定基材上に、同定したペプチドまたはタンパク質のアレイを得ること、該ペプチドと標的分子または生物学的構成成分を結合すること、およびそのような結合を評価することに基づく。例えば、G. MacBeath and S. L. Schreiber, ”Printing Proteins as Microarrays for High-Throughput Function Determination,” Science 289(5485):1760-1763, 2000参照。核酸アレイ、特にＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドを結合するアレイもまた、診断用途、例えば、ＭＡＧＥ−Ａ３ポリペプチドの発現を特徴とする症状を有する対象を同定するために用いることができる。
【００７１】
マイクロアレイの基材は、限定されないが、ガラス、シリカ、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、アルミナおよびニッケル酸化物などの金属酸化物、種々のクレイ、ニトロセルロースまたはナイロンを含む。マイクロアレイの基材は、基材上でのプローブ（ペプチドまたは核酸）の合成を促進する化合物で被覆されていてもよい。基材上のカップリング剤または基は、最初のヌクレオチドまたはアミノ酸を基材に共有結合させるために用いることができる。種々のカップリング剤または基が、当業者に知られている。ペプチドまたは核酸プローブを、こうして、基材上の所定のグリッドに直接合成することができる。あるいは、ペプチドまたは核酸プローブを基材上にスポットすることができ、かかる場合には、プローブの基材への結合を促進する化合物で基材を被覆してもよい。これらの態様においては、事前に合成したプローブを、所定の、正確な量およびグリッドパターンで基材に適用し、好ましくは、接触プリント法、または、インクジェットまたは圧電送達（piezo-electric delivery）などの非接触法でプローブを基材に適用するための、コンピュータ制御のロボットを用いる。プローブは、基材に共有結合させることもできる。
【００７２】
標的はペプチドまたはタンパク質であり、天然でも合成でもよい。組織は、対象から得てもよく、または、培養で増殖させてもよい（例えば細胞系から）。
本発明のいくつかの態様では、１または２以上の対照ペプチドまたはタンパク質分子が基材に付着している。好ましくは、対照ペプチドまたはタンパク質分子は、ペプチドまたはタンパク質の質および結合特性、試薬の質および効力、結合の成否、および分析の閾値および成否などの因子の決定を可能にする。
別の態様では、１または２以上の対照ペプチドまたは核酸分子が基材に付着している。好ましくは、対照核酸分子は、結合特性、試薬の質および効力、ハイブリダイゼーションの成否、および分析の閾値および成否などの因子の決定を可能にする。
【００７３】
核酸マイクロアレイ技術、これはＤＮＡチップ技術、遺伝子チップ技術、そして固相核酸アレイ技術を含む他の名前でも知られているが、これは当業者によく知られており、次に限定されるものではないが、固定基材上に、同定した核酸プローブのアレイを得ること、レポーター分子（例えば、放射性、化学発光性または蛍光性のタグ、例えば、フルオレセイン、Ｃｙｅ３−ｄＵＴＰまたはＣｙｅ５−ｄＵＴＰなど）で標的分子を標識すること、標的核酸とプローブとをハイブリダイズすること、および標的−プローブハイブリダイゼーションを評価することに基づく。標的配列に完全に合致する核酸配列を備えたプローブは、一般的に、あまり完全に合致しないプローブよりも強いレポーター分子シグナルの検出をもたらす。核酸マイクロアレイ技術に活用される多くの成分および技法は、”The Chipping Forecast”, Nature Genetics, Vol. 21, 1999年1月に示されており、その全内容を本明細書に参照によって組み込む。
【００７４】
本発明によれば、マイクロアレイの基材は、限定されないが、ガラス、シリカ、アルミノケイ酸塩、ホウケイ酸塩、アルミナおよびニッケル酸化物などの金属酸化物、種々のクレイ、ニトロセルロースまたはナイロンを含む。すべての態様において、ガラス基材が好ましい。本発明により、プローブは、限定されないが、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドを含む核酸の群から選択され、天然であっても合成であってもよい。オリゴヌクレオチドプローブは好ましくは、２０〜２５マーのオリゴヌクレオチドであり、ＤＮＡ／ｃＤＮＡプローブは、他の長さも用い得るが、好ましくは５００〜５０００塩基長である。好適なプローブの長さは、以下の技術的に知られた方法により当業者によって決定されてもよい。一態様において、好ましいプローブは、本明細書で述べるＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードする核酸分子を結合する分子の２または３以上のセットである。プローブは、ゲル濾過または沈降などの当業者に知られた標準的な方法を用いて混入物を除去するために精製してもよい。
【００７５】
一態様において、マイクロアレイの基材は、基材上でプローブの合成を促進するための化合物で被覆されていてもよい。このような化合物には、限定されないが、オリゴエチレングリコールを含む。他の態様において、基材上で、カップリング剤または基を、基材へ第一のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを共有結合するのに用いることができる。これらの剤または基は、例えば、アミノ、ヒドロキシ、ブロモおよびカルボキシ基が含まれてもよい。これらの反応基は、好ましくは、アルキレンまたはフェニレンの２価のラジカルなどのヒドロカルビル基を介して基材に付着し、一価の位置が鎖状結合（chain bonding）により占められ、残りが反応基に付着する。これらヒドロカルビル基は、約１０個までの炭素原子を含んでもよく、好ましくは、約６個までの炭素原子を含んでもよい。アルキレン基は、通常、主鎖に２〜４個の炭素原子を含むことが好ましい。該方法、およびそのさらなる詳細は、例えば、全体が参照文献により組み込まれる米国特許第4,458,066号に開示されている。
【００７６】
一態様において、プローブは、光誘導（light-directed）化学合成、光化学脱保護、またはヌクレオチド前駆体の基材への送達と、それに続くプローブの生成などの方法を用いて、予め決めたグリッドパターンで基材上に直接合成する。
他の態様において、基材はプローブの基材への結合を促進するために化合物で被覆してもよい。このような化合物は、限定されないが、ポリリシン、アミノシラン、アミノ反応性シラン（Chipping Forecast, 1999）またはクロムを含む。この態様において、予め合成されたプローブは、基材にプローブを接触プリント法またはインクジェットもしくは圧電送達などの非接触法で適用するためにコンピュータで制御されたロボットを利用し、正確に、予め決定された量とグリッドパターンで基材へ適用される。プローブは、限定されないが、ＵＶ照射を含む方法で、基材と共有結合され得る。他の態様において、プローブは熱で基材と結合される。
【００７７】
マイクロアレイのための標的は、限定されないが、ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡを含む群から選択される核酸であり、天然または合成であってもよい。すべての態様において、ヒト組織からの核酸標的分子が好ましい。該組織は、対象から得ることができ、または培養によって（例えば、細胞系から）増殖させ得る。
本発明の態様においては、１または２以上の対照核酸分子が基材に付着している。好ましくは、対照核酸分子により、核酸の質および結合特性、試薬の質および効力、ハイブリダイゼーションの成否、および分析の閾値および成否などの因子の決定が可能になる。対照核酸は、限定されないが、ハウスキーピング遺伝子などの遺伝子の発現産物またはその断片を含む。
いくつかの態様では、１または２以上の対照ペプチドまたは核酸分子が基材に付着している。好ましくは、対照核酸分子は、結合特性、試薬の質および効力、ハイブリダイゼーションの成否、および分析の閾値および成否などの因子の決定を可能にする。
【００７８】
本発明はまた、技術者がＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの発現によって特徴づけられる疾患を有する対象を治療できるようにする。治療は、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体を対象の中で富化させる剤を投与すること、およびかかる複合体に特異的なＣＤ４＋Ｔリンパ球を投与することを含む。上記の治療において有用な剤は、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドと、それらの機能的変異体、かかるＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドを含むエンドソーム標的化融合タンパク質、かかるタンパク質およびペプチドを発現する核酸（当該核酸を含むウイルスを含む）、かかるペプチドとＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド（例えばＨＬＡ  ＤＲ１）との複合体、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ結合分子との複合体を担持する抗原提示細胞などを含む。本発明はまた、技術者があるＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドに特異的なＣＤ４＋Ｔリンパ球でＴリンパ球集団を選択的に富化することができるようにする。
【００７９】
また、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの単離は、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードしている核酸の単離を可能にする。核酸は、in vitroか、または原核性または真核性の宿主細胞において、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを産生すべく用いることが可能である。熟練した技術者には周知の種々の方法を、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを取得するために利用できる。例えば、ある発現ベクターが当該ペプチドの産生を引起こすべく細胞内に導入されてもよい。もう一つの方法においては、ｍＲＮＡ転写物は、そのコードされたペプチドの産生を引起こすべく細胞内にマイクロインジェクションされるかまたは他の方法で注入されてもよい。網状赤血球溶解産物系などの無細胞抽出物におけるｍＲＮＡの翻訳もまたペプチドを産生すべく用いられてもよい。また本発明のＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを含むペプチドは、インビトロにおいて合成されてもよい。当業者らはまた、単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを取得するため、既知のペプチド単離法に容易に従うことができる。これらは免疫クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫アフィニティクロマトグラフィーを含むが、これに制限されない。
【００８０】
これらの単離されたＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド、かかるペプチドを含むタンパク質、または当該ペプチドと、ＨＬＡ−ＤＲ１分子などのＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体は、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの発現によって特徴づけられる疾患の治療に有用なワクチンを製造すべく、アジュバントなどの物質と組合わされてもよい。さらに、ワクチンは樹状細胞、Ｂ細胞、非増殖性のトランスフェクタントなどの、当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド／ＨＬＡ複合体を表面上に提示する細胞から調製することができる。細胞がワクチンとして用いられる場合にはすべて、それらの細胞はＣＤ４＋Ｔリンパ球を刺激するために必要な成分の一つまたは双方のコード配列を用いてトランスフェクトすることが可能であるか、またはトランスフェクションの必要なくしてすでに双方の分子を発現している細胞である。例えば、自己由来の抗原提示細胞を対象から単離し、ＨＬＡクラスIおよびＨＬＡクラスＩＩ分子と会合したＭＡＧＥ−Ａ３エピトープを提示する細胞を取得すべく処理することが可能である。これらの細胞は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞応答の双方を刺激し得る。かかる抗原提示細胞は、Iｉ．ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質をコードしている組換えウイルスを用いて樹状細胞を感染させることにより取得することができる。樹状細胞はまたＨＬＡクラスIおよびＨＬＡクラスＩＩエピトープを用いてロードすることが可能である。
【００８１】
ワクチンはまた、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドまたはその前駆体をコードしている裸のＤＮＡまたはＲＮＡ含んでおり、それらはin vitroにおいて製造されてよく、注射、粒子衝撃、鼻からの吸入、および他の方法により投与される。「裸の核酸」型のワクチンは、当該裸の核酸によってコードされるペプチドに特異的なＣＴＬの発生を誘導する免疫学的応答を引起こすことが証明されている（Science 259 : 1745 - 1748, 1993）。またワクチンは、ウイルス、リポソーム、または薬剤の送達に有用なポリマー粒子を含む他の粒子にパッケージされた核酸を含む。
【００８２】
本明細書に述べられた処理のいずれかによって発生または亢進された免疫応答は、当該技術分野において知られた種々の方法によって監視することが可能である。例えば、所与の抗原に特異的なＴ細胞の存在は、抗原性ペプチドを提示する可溶性の蛍光性ＭＨＣ分子４量体を用いたＴ細胞受容体の直接的な標識により検出することが可能である（Altmanら、Science 274 : 94 - 96, 1996；Dunbarら、Curr. Biol. 8 : 413 - 416, 1998）。要すれば、可溶性のＭＨＣクラスI分子が、β２−ミクログロブリンおよびクラスI分子と結合するペプチド抗原の存在下に、インビトロにおいて折りたたまれる。精製後、ＭＨＣ／ペプチド複合体が精製され、ビオチンを用いて標識される。４量体は、ビオチニル化されたペプチド−ＭＨＣ複合体を、標識されたアビジン（例えばフィコエリトリン）と共に４：１のモル比において混合することにより形成される。次いで４量体を、末梢血またはリンパ節などのＣＴＬの供給源と接触させる。当該４量体は、ペプチド抗原／ＭＨＣクラスI複合体を認識するＣＴＬと結合する。当該４量体に結合された細胞は、反応性のＣＴＬを単離すべく、蛍光活性化セルソーティングにより分類することができる。単離されたＣＴＬは次いで本明細書に記述された用途のためにin vitroにおいて拡大させことが可能である。４量体としてのＭＨＣクラスＩＩ分子の用途は、最近Crawfordら（Immunity 8 ; 675 - 682, 1998）により証明された。可溶性のＭＨＣクラスＩＩ分子の多量体が、共有結合により結合されたペプチドと複合体化された。クラスＩＩ４量体は、適当な特異性と親和性とをもって特異的なＴ細胞に結合することが示されている。したがって４量体は、ワクチン接種に対するＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞の双方を監視すべく使用することが可能である。
【００８３】
ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド、ならびにＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとＨＬＡ分子との複合体もまた、当該技術分野で周知の標準的な技術を用いて抗体を産生すべく用いてもよい。抗体産生についての一般原理を記述している参考となる標準的な研究は、Catty, D., Antibodies. A Practical approach, 第１巻、IRL 出版、ワシントン（1998）；Klein, J., Immunology: The Science of Cell-Non-Cell Discrimination, John Wiley and Sons、ニューヨーク（1982）；Kennett, R.,ら、Monoclonal Antibodies, Hybridoma. A New Dimension In Biological Analysis, Plenum出版、ニューヨーク（1980）；Campbell, A., Laboratory Techniques and Biochenistry and Molecular Biology、第１３巻のMonoclonal Antibody Technology, （Burdon, R.ら編）、Elsevierアムステルダム（1984）；およびEisen, H. N., Microbiology,第３版、Davis, B. D. ら編（Harper & Rowe、フィラデルフィア（1980））を含む。
【００８４】
有意には、当分野で周知のように、抗体分子の小部分のみ、即ちパラトープが、抗体のそのエピトープとの結合に関与する（概して、Clark, W.R.（1986）The Experimental Foundations of Modem Immunology Wiley & Sons, Inc., New York; Roitt, 1.（1991）Essential Immunology 7th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford参照）。例えばｐＦｃ’およびＦｃ領域は補体カスケードのエフェクターであるが、抗原結合に関与しない。ｐＦｃ’領域が酵素的に切断された、またはｐＦｃ’領域を伴わずに産生された、Ｆ（ａｂ’）２断片と呼ばれる抗体は、無傷の抗体の抗原結合部位の両方を保持する。同様に、Ｆｃ領域が酵素的に切断された、またはＦｃ領域を伴わずに産生された、Ｆａｂ断片と呼ばれる抗体は、無傷の抗体分子の抗原結合部位の一方を保持する。さらに続けると、Ｆａｂ断片は、共有結合した抗体軽鎖、およびＦｄと示される抗体重鎖の一部分からなる。Ｆｄ断片は、抗体特異性の主要決定因子であり（単一Ｆｄ断片は、抗体特異性の変化を伴わずに１０までの異なる軽鎖と会合することができる）、Ｆｄ断片は単離した状態でエピトープ結合能力を保持する。
【００８５】
当分野で周知であるように、抗体の抗原結合部分内には、相補性決定領域が（ＣＤＲ）が存在し、これが抗原のエピトープ、およびパラトープの三次構造を保持するフレームワーク領域（ＦＲ）と直接相互作用する（概して、Clark, 1986; Roitt, 1991参照）。ＩｇＧ免疫グロブリンの重鎖Ｆｄ断片および軽鎖の両方において、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）により別々に分けられる４つのフレームワーク領域（ＦＲ１〜ＦＲ４）が存在する。ＣＤＲ、特にＣＤＲ３領域、より詳細には重鎖ＣＤＲ３は、抗体特異性に大いに寄与する。
【００８６】
哺乳類抗体の非ＣＤＲ領域は、元の抗体のエピトープ特異性を保持しながら、同種異系抗体または異種抗体の同様領域と置換することができる、ということは、当分野で目下十分に確立されている。これは、非ヒトＣＤＲがヒトＦＲおよび／またはＦｃ／ｐＦｃ’領域と共有結合されて機能性抗体を産生する「ヒト化」抗体の開発および使用において最も明白に示される（例えば、米国特許第4,816,567号、第5,225,539号、第5,585,089号、第5,693,762号および第5,859,205号参照）。
【００８７】
完全にヒトのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンの重鎖および軽鎖遺伝子座の大部分についてトランスジェニックなマウスを免疫することによって作製することもできる。例えば、米国特許第5,545,806号、第6,150,584号およびそこに引用された参考文献を参照。これらのマウス（例えばXenoMouse（Abgenix）、HuMAbマウス（Medarex/GenPharm））を免疫後、モノクローナル抗体を、標準的なハイブリドーマ技術にしたがって作製することができる。これらのモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有しており、したがって、ヒトに投与した場合に、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応を惹起しないだろう。
【００８８】
したがって、当業者には明らかなように、本発明は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、ＦｖおよびＦｄ断片；Ｆｃおよび／またはＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられたキメラ抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられたキメラＦ（ａｂ’）２断片抗体；ＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２および／または軽鎖ＣＤＲ３領域が相同ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられたキメラＦａｂ断片抗体；ならびにＦＲおよび／またはＣＤＲ１および／またはＣＤＲ２領域が相同ヒトまたは非ヒト配列により置き換えられたキメラＦｄ断片抗体も提供する。本発明は、いわゆる一本鎖抗体も含む。
【００８９】
本発明の抗体は、したがって、タンパク質、タンパク質の断片、当該タンパク質またはその断片を発現している細胞、および適当なＨＬＡクラスＩＩ分子などを、ポリクローナル抗体を誘導すべく動物に投与することを含む。モノクローナル抗体の製造は、当該技術分野において周知の技術に従う。本明細書に詳述したように、かかる抗体は、例えば、タンパク質を発現している組織を同定するため、またはタンパク質を精製するために用いられてもよい。抗体もまた、画像化のための特異的な標識剤に対し、またはメトトレキセート、放射性ヨウ素標識化合物、リシンなどの毒素、他の細胞増殖抑制性または細胞溶解性剤などを含むがこれに制限されない抗腫瘍剤に対し、結合されてもよい。本発明により調製された抗体は、好ましくは本明細書に記したペプチド／ＨＬＡ複合体に特異的でもある。
【００９０】
本明細書において「疾患」または「症状」が用いられる場合、それはＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドが発現されているいかなる病的状態をも指す。かかる疾患は、メラノーマ、頭部、頚部、肺、または食道の扁平上皮癌、結腸直腸癌、骨肉腫、神経芽腫、頭部または頚部の非偏平上皮癌、卵巣腫瘍、リンパ球性白血病、膀胱癌、前立腺癌などの癌を含む。
【００９１】
この開示に基づくいくつかの治療用アプローチは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチド提示細胞に対しての、対象の免疫系による応答の誘導を前提としている。かかるアプローチの一つは、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドとＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体に特異的な自己由来のＣＤ４＋Ｔ細胞を、問題となる表現型をもつ異常細胞のある対象に投与することである。かかるＣＤ４＋Ｔ細胞をin vitroにおいて発生させることは、技術者の能力の範囲内にある。一般的に、対象から採取された血液細胞などの検体は、当該複合体を提示しており、かつＣＤ４＋Ｔリンパ球を増殖させるべく刺激することができる細胞と接触せられる。ターゲット細胞は、ＣＯＳ細胞か、または樹状細胞またはＢ細胞などのＨＬＡクラスＩＩ分子を担持している抗原提示細胞などの、トランスフェクタントであることが可能である。このようなトランスフェクタントは、その表面上に所望の複合体を提示しており、対象となるＣＤ４＋Ｔリンパ球と組合わせると、その増殖を刺激する。ＣＯＳ細胞は、他の適当な宿主細胞と同様に、広く入手可能である。ＣＤ４＋Ｔリンパ球の特異的な産生については、下文に記述されている。次いで、クローン性に拡大させた自己由来のＣＤ４＋Ｔリンパ球が対象へ投与される。 ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、次いで当該対象の免疫応答を刺激し、それにより所望の治療上の目的が達成される。
【００９２】
ＣＴＬの増殖は、Ｔ細胞の培養物におけるトリプトファンの濃度を、インドールアミン２,３-ジオキシゲナーゼ（IＤＯ）などの、トリプトファンを異化する酵素を阻害すること、または当該培養物にトリプトファンを添加することで増加させることにより、亢進させることが可能である（例えば、ＰＣＴ出願WO 99/29310を参照のこと）。Ｔ細胞の増殖は、増殖の速度を増すことおよび／または培養物中のＴ細胞の分裂数を増すことによって亢進される。
上記の治療は、対象の異常細胞の少なくともいくらかが、関連するＨＬＡ／ペプチド複合体を提示するものと仮定している。このことは、この技術が特定のＨＬＡ分子を発現している細胞を同定する方法について、ならびに関係する配列、この場合にはＭＡＧＥ−Ａ３配列、のＤＮＡを発現している細胞をいかにして同定するかについて熟知しているため、非常に容易に決定できる。
【００９３】
上記の治療は、本発明に従って取得できる唯一の治療形態ではない。 またＣＤ４＋Ｔリンパ球も、多くのアプローチを用いてin vivoにおいて刺激することが可能である。一つのアプローチは、当該複合体を発現している非増殖性の細胞の使用である。このアプローチに用いられる細胞は、樹状細胞などの当該複合体を正常に発現しているものか、あるいは当該複合体の提示に必要な遺伝子の一つまたは双方を用いてトランスフェクトされた細胞であってもよい。Chenら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 110 - 114, 1991）は、このアプローチを例示し、ＨＰＶ−Ｅ７ペプチドを発現しているトランスフェクタント細胞の治療用プログラムにおける使用について示している。種々の細胞型が用いられてもよい。同様に、対象となる遺伝子の一つまたは双方を運んでいるベクターが使用されてもよい。ウイルス性または細菌性のベクターが特に好ましい。例えば、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードしている核酸は、ある組織または細胞型において当該ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの発現を指示するプロモーターおよびエンハンサー配列に、作動可能に連結されてもよい。当該核酸は発現ベクターに取込まれてもよい。発現ベクターは、未修飾の染色体外核酸、プラスミド、または、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードしているような外来性の核酸の挿入を可能にすべく構築または修飾されたウイルスゲノムであってもよい。ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドをコードしている核酸はまた、レトロウイルスゲノムにも挿入されてよく、それにより当該核酸の、標的組織または細胞型のゲノムへの組込みが容易となる。このような系においては、対象となる遺伝子は、例えばワクシニアウイルス、ポックスウイルス全般、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルス、または細菌ＢＣＧなどの微生物によって担時され、この物質は宿主細胞に事実上「感染する」。結果として得られた細胞は対象となる複合体を提示し、自己由来のＣＤ４＋Ｔリンパ球により認識され、次にそれらは増殖する。
【００９４】
同様な効果は、ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを、ＨＬＡクラスＩＩ提示細胞への取込みをインビボにおいて促進するためのアジュバントと結合させることにより、成遂げることが可能である。もしＨＬＡクラスＩＩ結合部分より大きい場合には、ＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは必要であればＨＬＡ分子に対するペプチドのパートナーを生じるべくプロセシングされると共に、ＴＲＡはさらなるプロセシングを必要とせずに提示されるようにすることができる。一般的に対象は、有効量のＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの皮内注射を受けることができる。当該技術分野において標準的な免疫のプロトコールに従って、初回量にブースター投与量が続くことが可能である。
ＨＬＡクラスＩＩ提示細胞へのＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドの取込みを促進するための好ましい方法は、当該クラスＩＩ結合ペプチドを含むＭＡＧＥ−Ａ３ポリペプチドに融合させたエンドソーム標的化シグナルを含むポリペプチドを、当該提示細胞に発現させることによる。特に好ましいのはヒト不変鎖Iｉを含むＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質である。
【００９５】
上記のいかなる組成物またはプロトコールもまた、細胞溶解性Ｔリンパ球の応答の誘導のため、ＭＡＧＥ  ＨＬＡクラスＩ結合ペプチドを含むことができる。例えば、以下において論証されるように、ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質は細胞内においてプロセシングされ、ＨＬＡクラスIおよびＨＬＡクラスＩＩの双方の応答を生じることができる。かかるペプチドのいくつかは、米国特許第5,585,461号および5,591,430号と、公開されたＰＣＴ出願PCT/US96/03657、ならびにGauglerら（J. Exp. Med. 179 : 921 - 930, 1994）、van der Bruggenら（Eur. J. Immunol. 24 : 3038 - 3043, 1994）、およびHermanら（Immunogenetics 43 : 377 - 383, 1996）によって述べられている。ＨＬＡクラスＩおよびクラスＩＩ分子と結合するＭＡＧＥ−Ａ３ペプチド（またはかかるペプチドをコードしている核酸）を投与することで、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞の双方を誘導することにより、改善された免疫応答が提供されてもよい。
【００９６】
さらに、非ＭＡＧＥ−Ａ３腫瘍関連ペプチドもまた、ＨＬＡクラスIおよび／またはクラスＩＩによる免疫応答を亢進させるべく投与することが可能である。癌細胞が一つ以上の腫瘍関連遺伝子を発現することができることはよく確立されている。ある特定の対象が、付加的な腫瘍関連抗原を発現しているかどうか、したがってかかる遺伝子の発現産物に由来するＨＬＡクラスIおよび／またはＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドを上記のＭＡＧＥ−Ａ３組成物およびワクチンの中に含むかどうかを決定することは、当業者には日常の実験の範囲内にある。
特に好ましいのは、「ポリトープ」として知られる一連のエピトープをコードしている核酸である。エピトープは連続的に、あるいは重なりあう様式で、天然のフランキング配列を伴って、または伴わずに配列させることが可能であり（例えば、Thomsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 : 5854 - 5849, 1995；Gilbertら、Nature Biotechnol. 15 : 1280 - 1284, 1997参照）、所望であれば無関係なリンカー配列により分離することが可能である。ポリトープは生成された個々のエピトープにプロセシングされ、それらは免疫系によって、免疫応答の発生のために認識される。
【００９７】
したがって、例えばＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩＩ結合ペプチドは、他の腫瘍拒絶抗原からのペプチドと（例えば、ハイブリッド核酸またはポリペプチドの調製による）、またＭＡＧＥ−Ａ３  ＨＬＡクラスＩ結合ペプチド（これらのいくつかは以下にリストされている）と共に、「ポリトープ」を形成すべく結合される。免疫応答を誘導または亢進すべく投与することが可能な代表的な腫瘍関連ペプチドは、腫瘍関連遺伝子に由来し、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ａ１３、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＢＡＧＥ−１、ＲＡＧＥ−１、ＬＢ３３／ＭＵＭ−１、ＰＲＡＭＥ、ＮＡＧ、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、チロシナーゼ、脳グリコゲンホスホリラーゼ、Ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−１、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１、およびＣＴ−７を含むタンパク質をコードしていた。例えば、腫瘍に特徴的な抗原性ペプチドは公開されたＰＣＴ出願WO 00/20581（PCT/US99/21230）にリストされたものを含む。
【００９８】
他のＨＬＡクラスIおよびクラスＩＩ結合ペプチドの例は、当業者に周知であろうし（例えば、Coulie、Stem Cells 13 : 393 - 403, 1995参照）、また本明細書に開示されたものと同様の方法で本発明に使用することが可能である。当業者は、１または２以上のＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドと、１または２以上の上記の腫瘍拒絶抗原ペプチドを含むポリペプチドか、またはかかるポリペプチドをコードしている核酸を、分子生物学の標準的な方法に従って調製することができる。
このように、ポリトープは２または３以上の潜在的な免疫原性もしくは免疫応答刺激性ペプチドのグループであり、それらは種々の配置でつなぎあわせることが可能である（例えば連鎖状、重複）。ポリトープ（または当該ポリトープをコードしている核酸）は、免疫応答の刺激、亢進、および／または誘発における当該ポリトープの有効性を試験すべく、例えば動物に対し、標準的な免疫のプロトコルによって投与することが可能である。
【００９９】
ペプチドは直接か、またはフランキング配列の使用により、ポリトープを形成すべく結合することが可能であり、またポリトープのワクチンとしての使用は当該技術分野において周知である（Thomsonら、Proc. Acad. Natl. Acad. Sci. USA 92（13）: 5845 - 5849, 1995；Gilbertら、Nature Biotechnol. 15（12 ) : 1280 - 1284, 1997：Thomsonら、J. Immunol. 157 (2 ) : 822 - 826, 1996；Tamら、J. Exp. Med. 171（1）:299 - 306, 1990参照のこと ）。例えば、TamはＭＨＣクラスIおよびクラスＩＩ結合エピトープの双方からなるポリトープが、マウスモデルにおいて抗体および防御免疫を成功裏に生じたことを示した。Tamはまた、エピトープの「紐(strings)」がプロセシングされて個々のエピトープを生じ、それらがＭＨＣ分子により提示され、さらにＣＴＬにより認識されることを証明した。このように、様々な数および組合わせのエピトープを含むポリトープの調製が可能であり、ＣＴＬによる認識について、また免疫応答の亢進における有効性について試験することが可能である。
【０１００】
腫瘍が、あるセットの腫瘍抗原を発現しており、そのうちのあるサブセットのみが任意の所与の患者の腫瘍にも発現されるであろうことは周知である。ポリトープは、特定の患者において発現された腫瘍拒絶抗原のサブセットを表している、エピトープの異なる組み合わせに対応すべく調製することができる。またエピトープは、ある腫瘍型によって発現されることが知られている腫瘍拒絶抗原のより広い範囲を反映すべく調製することが可能である。ポリトープは、かかる治療を必要としている患者に対し、ポリペプチド構造物として、あるいは当該技術分野において周知の核酸送達システムを用いることにより、導入することが可能である（Allsoppら、Eur. J. Immunol. 26（8）: 1951 - 1959, 1996参照）。アデノウイルス、ポックスウイルス、Ｔｙ−ウイルス様粒子、アデノ随伴ウイルス、プラスミド、細菌、その他は、かかる送達において使用することが可能である。ポリトープの送達システムは、当該送達システムの有効性を測定すべく、マウスモデルにおいて試験することができる。またこのシステムは、ヒトの臨床試験においても試験することが可能である。
【０１０１】
免疫組成物の一部として、免疫応答を高める１または２以上の物質が本明細書に記載したペプチドとともに投与される。かかる物質は、アジュバントおよびサイトカインを包含する。アジュバントは、抗原に組み入れられるかまたは抗原とともに投与される物質であり、これが免疫応答を増強する。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外またはマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定の組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を高め得る。多数の種類のアジュバントが、当分野で周知である。アジュバントの特定の例としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ、SmithKline Beecham）、Salmonella minnesota Re 595リポ多糖の精製および酸加水分解後に得られる同属体；サポニン、例えばＱＳ２１（SmithKline Beecham）、Quillja saponaria 抽出物から精製される純ＱＡ−２１サポニン；ＰＣＴ出願WO 96/33739（SmithKline Beecham）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８およびＱＳ−Ｌ１（So et al., Mol. Cells 7:178-186, 1997）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；モンタニド；免疫刺激性オリゴヌクレオチド（例えば、Kreig et al., Nature 374:546-9, 1995に記載されたＣｐＧオリゴヌクレオチドを参照）；ビタミンＥならびにスクアレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルションが挙げられる。
【０１０２】
好ましくは、ペプチドは、ＤＱＳ２１／ＭＰＬの組合せと混合して投与される。ＤＱＳ２１対ＭＰＬの比は、典型的には約１：１０〜１０：１、好ましくは約１：５〜５：１、さらに好ましくは約１：１である。典型的には、ヒト投与に関しては、ＤＱＳ２１およびＭＰＬは、約１μｇ〜約１００μｇの範囲でワクチン処方物中に存在する。その他のアジュバントが当分野で既知であり、本発明に用いることできる（例えば、Goding, Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, 2nd Ed., 1986を参照）。ペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルションの製造方法は、予防接種の当業者には周知である。
【０１０３】
対象の免疫応答を刺激するその他の剤も、対象に投与することができる。例えばその他のサイトカインも、それらのリンパ球調節特性の結果として、予防接種プロトコルに有用である。このような目的のために有用な多数のその他のサイトカインは当業者に既知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されている（例えば、Science 268:1432-1434, 1995を参照）インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−１８が挙げられる。したがって、サイトカインは抗原およびアジュバントと一緒に投与されて、抗原に対する免疫応答を増大し得る。予防接種プロトコルに用いることできる多数のさらなる免疫応答助長化合物が存在する。これらは、タンパク質または核酸形態で提供される共刺激分子を含む。このような共刺激分子としては、樹状細胞（ＤＣ）で発現される分子であって、Ｔ細胞で発現されるＣＤ２８分子と相互作用するＢ７−１およびＢ７−２（それぞれＣＤ８０およびＣＤ８６）分子が挙げられる。この相互作用は、抗原／ＭＨＣ／ＴＣＲ刺激（シグナル１）Ｔ細胞に共刺激（シグナル２）を提供して、Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能を増大する。Ｂ７はＴ細胞でＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）とも相互作用し、ＣＴＬＡ４およびＢ７リガンドに関する研究は、Ｂ７−ＣＴＬＡ４相互作用が抗腫瘍免疫性およびＣＴＬ増殖を強化し得るということを示す（Zheng et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6284-6289（1998））。
【０１０４】
Ｂ７は典型的には腫瘍細胞上に発現されず、したがってそれらはＴ細胞のための効率的な抗原提示細胞（ＡＰＣ）ではない。Ｂ７発現の誘導は、腫瘍細胞がより効果的にＣＴＬの増殖およびエフェクター機能を刺激することができるようにする。Ｂ７／IＬ−６／IＬ−１２補助刺激の組合せは、Ｔ細胞におけるIＦＮ−γおよびＴｈ１サイトカインプロフィールを、Ｔ細胞活性のさらなる亢進に導くことが示されている（Gajewskiら、J. Immunol. 154 : 5637 - 5648, 1995）。Ｂ７を用いた腫瘍細胞のトランスフェクションは、Wangら、（J. Immunother. 19 : 1 - 8, 1996）により、養子移入免疫療法のためのin vitroでのＣＴＬの拡大に関連して議論されてきた。Ｂ７分子のための他の送達メカニズムは、核酸（裸のＤＮＡ）、免疫（Kimら、Nature Biotechnol. 15 : 7 : 641 - 646, 1997）、およびアデノおよびポックスなどの組換えウイルス（Wendtnerら、Gene Ther. 4: 726 - 735, 1997）を含むであろう。これらのシステムはすべて、Ｂ７と、本明細書において議論された抗原または抗原断片（ポリトープを含む）、あるいはサイトカインといった他の選択分子との同時発現のための発現カセットの構築および使用に従う。このような送達システムは、インビトロにおける適当な分子の誘導のため、およびin vivoにおけるワクチン接種状況のために使用することが可能である。in vitroおよびin vivoにおいてＴ細胞を直接刺激すべく抗ＣＤ２８抗体を用いることについても考慮することができた。同様に、外来性抗原に対してＴ細胞の応答を誘導する誘導可能な共刺激分子、IＣＯＳ分子が、例えば抗IＣＯＳ抗体の使用により調節できた（Hutloffら、Nature 397 : 263 - 266, 1999）。
【０１０５】
リンパ球機能関連抗原−３（ＬＦＡ−３）はＡＰＣおよびいくつかの腫瘍細胞上に発現され、Ｔ細胞上に発現されたＣＤ２と相互作用する。この相互作用はＴ細胞にIＬ−２およびIＦＮ−γの産生を誘導し、したがってＢ７／ＣＤ２８共刺激相互作用を補足することはできるが、代替することはできない（Parraら、J. Immunol., 158 : 637 - 642, 1997；Fentonら、J. Immunother. , 21 : 95 - 108, 1998）。
リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）は白血球上に発現され、ＡＰＣおよびいくつかの腫瘍細胞上に発現されたIＣＡＭ−１と相互作用する。この相互作用はＴ細胞にIＬ−２およびIＦＮ−γの産生を誘導し、したがってＢ７／ＣＤ２８共刺激相互作用を補足することはできるが、代替することはできない（Fentonら、1998）。したがってＬＦＡ−１は、Ｂ７について前文に議論された種々の方法における、ワクチン接種プロトコールにおいて提供することが可能な共刺激分子のさらなる例である。
【０１０６】
完全なＣＴＬの活性化およびエフェクター機能は、Ｔｈ細胞ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０リガンド）分子と、ＤＣによって発現されるＣＤ４０分子との間の相互作用を通したＴｈ細胞の助けを必要とする（Ridgeら、Nature 393 : 474, 1998；Bennettら、Nature 393 : 478, 1998；Schoenbergerら、Nature 393 : 480, 1998）。この共刺激シグナルの機構は、Ｂ７と、ＤＣ（ＡＰＣ）によって産生される、関連するIＬ−６／IＬ−１２とのアップレギュレーションを含むだろう。したがって、ＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用は、シグナル１（抗原／ＭＨＣ−ＴＣＲ）およびシグナル２（Ｂ７−ＣＤ２８）の相互作用を補足する。
【０１０７】
ＤＣ細胞を直接刺激すべく抗ＣＤ−４０抗体を使用することは、通常は炎症性の環境の外側で遭遇するか、または専門でないＡＰＣ（腫瘍細胞）によって提示される腫瘍関連抗原に対する応答を亢進するものと期待される。例えばＣＤ４０−ＣＤ４０Ｌ相互作用によるか、またはＤＣを、ＣｐＧを含むオリゴデオキシヌクレオチドかまたは細胞外マトリックスからの刺激性の糖成分と接触させることによる、樹状細胞の成熟を誘導するための他の方法は、当該技術分野において周知である。このような状況においては、Ｔｈの助けおよびＢ７共刺激シグナルは提供されない。このメカニズムは、抗原パルスされたＤＣを主体とする治療という状況において、あるいはＴｈエピトープが既知の腫瘍関連抗原前駆体の中では定義されていない状況において有用であろう。
【０１０８】
投与に際しては、本発明の治療用組成物は、薬学的に許容され得る製剤で投与される。かかる製剤は、薬学的に許容され得る濃度の塩、緩衝薬、保存料、適合性のキャリア、アジュバントおよびサイトカインなどの補足的な免疫強化剤、および任意に他の治療用剤を慣例的に含んでよい。
本発明の製剤は有効な量において投与される。有効量は、ある薬学的製剤が、単独で、あるいは付加的な用量と共に、所望の応答を刺激する量である。癌の治療の場合には、所望の応答は癌の進行を阻止することである。このことは、この疾患の進行を一時的に遅くすることを含んでよいが、さらに好ましくは当該疾患の進行を永久に止めることを含む。免疫応答を誘導する場合には、所望の応答は、用いられたＭＡＧＥ−Ａ３免疫原に特異的な抗体またはＴリンパ球の増加である。このような所望の応答は、慣例的な方法により監視されるか、または本明細書に議論した本発明の診断方法に従って監視することが可能である。
【０１０９】
本発明の治療用組成物を用いて免疫応答を刺激することが所望される場合には、血清中の抗体力価を増加させる結果となる液性抗体の応答、細胞傷害性リンパ球のクローン性拡大、または他の所望の免疫学的応答に対する活性化を含んでよい。免疫原の用量は、投与の様式に応じて、１ナノグラム／キログラムから１００ミリグラム／キログラムまでの範囲が効果的であると信じられている。好ましい範囲は、キログラムあたり５００ナノグラムと５００マイクログラムの間であると信じられている。絶対量は、投与のために選択された物質、単回での投与かまたは複数の用量か、および年齢、身体の状況、大きさ、体重、および病期を含む個々の対象のパラメーターを含めた種々の因子に依存するであろう。これらの因子は当業者には周知であり、慣例的な実験法を超えることなく扱われることが可能である。
【０１１０】
例
ＭＡＧＥ−Ａ３によってコードされ、Ｔ細胞に認識される抗原は、それが厳密に腫瘍特異的であり、および種々の組織学的タイプの多く腫瘍によって共有されているために、腫瘍免疫療法の興味ある標的である。ＨＬＡクラスＩ分子によって提示される多くのＭＡＧＥ−Ａ３抗原性ペプチドが、臨床試験で用いられ、メラノーマの転移の退縮が観察された。本発明者らは、ここで、ＣＤ４＋Ｔリンパ球にＨＬＡ−ＤＲ１分子によって提示され、コーカサス人の約１８％および東洋人の約６％に発現されている、ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳ（ＭＡＧＥ−Ａ３267-282、配列番号：４）およびＧＳＤＰＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬ（ＭＡＧＥ−Ａ３263-278、配列番号：３）を含む、さらなるＭＡＧＥ−Ａ３エピトープの同定を報告する。これらの新規なエピトープは、治療的なワクチン接種および癌患者における免疫応答の評価の両方に有用であり得る。該エピトープを同定するために、癌患者からの単球由来樹状細胞に組換えＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質をロードし、自己ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激するのに用いた。この患者はＭＡＧＥ−Ａ３を発現しているメラノーマの転移を有しており、組換えＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質が注射された。
【０１１１】
材料と方法
細胞系、培地および試薬
エプシュタイン・バー・ウイルス形質転換Ｂ（ＥＢＶ−Ｂ）細胞系および腫瘍細胞系ＭＺ２−ＭＥＬ４３、ＮＡ４１−ＭＥＬおよびＳＫ３７−ＭＥＬを、１０％のウシ胎児血清（Gibco BRL）、０．２４ｍＭのＬ−アスパラギン、０．５５ｍＭのＬ−アルギニン、１．５ｍＭのＬ−グルタミン（ＡＡＧ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むIＭＤＭ（Gibco BRL,Gaithersburg,MD）中で培養した。ヒト組換えＩＬ−２はEurocetus（Amsterdam, The Netherlands）から、ＩＬ−７はGenzyme（Cambridge, MA）から、ＧＭ−ＣＳＦはSchering Plough（Brinny, England）から、ＴＮＦ−αはR&D Systems（Abingdon, United Kingdom）から入手した。ヒト組換えIＬ−４、IＬ−６およびIＬ−１２は本発明者らの実験室で得た。
【０１１２】
ＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ細胞系（Nolan博士、Stanford University School of Medicine,CA,USAより親切にも提供された）はＲＳＶプロモーターおよびｐＰＧＫハイグロ選択可能マーカーをもつＭｏｌｏｎｅｙ  ＧａｇＰｏｌ−IＲＥＳ−Ｌｙｔ２構築物での２９３Ｔ細胞の安定トランスフェクションによって生成された高タイター両栄養性レトロウイルス産生細胞系である。次に、これらの細胞を、ＣＭＶプロモーターによって駆動するモロニー（Moloney）両栄養性エンベロープ遺伝子で安定にトランスフェクトし、ジフテリア毒素抵抗性遺伝子（ｐＨＥＤ−７）で共選択した。このプロデューサー細胞系はヘルパーウイルスを必要としない。
ＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ細胞を培養し、１０％熱不活性化ＦＣＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ（Life Technologies, Ghent, Belgium）中、１７５ｃｍ２フラスコ内で継代した。
【０１１３】
ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質
２種類の異なるＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質を用いた。１つは本発明者らの研究室でSpodoptera frugiperda（Ｓｆ９）昆虫細胞内で作製し、以後タンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３insectと呼ぶ。PharMingen（San Diego, CA）からのバキュロウイルス発現系を用いた。ＭＡＧＥ−Ａ３のコード配列をバキュロウイルス導入ベクターｐＡｃＧＰ６７−Ａ（PharMingen）中の、バキュロウイルスの一種であるAutographa californica核酸多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）のｇｐ６７表面タンパク質のシグナル配列の下流にクローン化した。精製をより簡単にするために、ヒスチジンテールをコードしている配列をＭＡＧＥ−Ａ３配列のＣ−末端に加えた。組換えプラスミドのＤＮＡをＳｆ９昆虫細胞内へ、致死的に変異させたＡｃＮＰＶのＤＮＡと共トランスフェクトした。共トランスフェクションにより、プラスミドおよびウイルスの相同性領域間の組換えが可能になり、ベクターからの外来遺伝子をＡｃＮＰＶ  ＤＮＡへ移入する。
【０１１４】
Ｓｆ９昆虫細胞培養液の上清に含まれるタンパク質の精製は、以下の工程を伴った：DEAE-sephadex A-50（Amersham-Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）での陰イオン交換、ＮｉＣｌ２で飽和したＨｉｇｈＴｒａｐキレーティングカラム（Amersham-Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden）での保持、固定化５７Ｂ抗体（G. Spagnoli博士、Department of Surgery, Basel, Switzerlandよりいただいた）でのアフィニティクロマトグラフィー、濃縮および透析。ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質の精製は、ラテックスビーズが、ＭＡＧＥ−Ａ３に対して免疫したヤギから得た精製Ｆ（ａｂ’）２で被覆されている、粒子計数イムノアッセイ（particle counting immunoassay）を用いてモニターした。
【０１１５】
以後タンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３bacteriaと呼ぶもう一方のＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質は、SmithKline-Beecham Biologicals（Rixensart, Belgium）により大腸菌中に産生させた。ＭＡＧＥ−Ａ３bacteria、は、組換えＨｉｓ−ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質（Ｈｉｓタグを有するＭＡＧＥ−Ａ３）または組換えＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ−Ａ３−Ｈｉｓタンパク質として産生された。ＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ−Ａ３−Ｈｉｓは、そのＮ末端残基に、Haemophilus influenzaeタンパク質の脂質形態（lipidic form）の３分の１を、そしてそのＣ末端に、ポリヒスチジンマーカーを含む。該タンパク質は、標準的なクロマトグラフィー手順によって精製した。
【０１１６】
Iｉ−ＭＡＧＥ−Ａ３をコードするレトロウイルスの構築
組換えレトロウイルス、ｐＭＦＧ−Iｉ８０−ＭＡＧＥ−Ａ３−（IＲＥＳ）−ΔＬＮＧＦｒを構築した（レトロ−Iｉ−ＭＡＧＥ）。ヒト低親和性神経増殖因子レセプターの切断形態をコードする配列（ΔＬＮＧＦｒ）を、親切にもC. Traversari博士（Instituto Scientifico H.S. Raffaele, Milan, Italy）より提供されたプラスミドｐＵＣ１９−ΔＬＮＧＦｒより増幅した。ＰＣＲ増幅を以下のプライマーを用いて行った。
センス：５’−ＣＣＣＴＣＡＴＧＡＧＧＧＣＡＧＧＴＧＣＣＡＣＣＧ−３’（配列番号：１７）
アンチセンス：５’−ＣＣＣＡＧＡＴＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＴＣＣＣＣＴＧＴＴＣＣＡＣ−３’（配列番号：１８）。
このＰＣＲにより開始コドン部位にＢｓｐＨ１部位が、そして、終止コドンの下流にＢｇｌ２部位が導入される。３’末端付近のＢａｍＨ１部位は削除された。このＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１内にクローン化し、配列決定した。ΔＬＮＧＦｒ遺伝子断片をＢｓｐＨ１−Ｎｏｔ１（ｐＣＲ２．１ポリリンカーより）断片として、このベクターより単離した。
【０１１７】
脳心筋炎ウイルス由来のIＲＥＳ配列をｐＧＥＭ−ＥＭＣ２（J.-C.Renauld博士、Catholic University of Louvain, Brussels, Belgiumより親切にもいただいた）よりｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内へ移入した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−IＲＥＳからのＥｃｏＲ１−Ｎｃｏ１断片をさらなる構築に使用した。
ΔＮＧＦｒおよびＩＲＥＳの両方のＤＮＡ断片を一緒にｐＣＲ２．１  ＥｃｏＲ１−Ｎｏｔ１内へライゲーションした。この３つの断片のライゲーションにより、結果としてｐＣＲ２．１−IＲＥＳ−ΔＬＮＧＦｒと命名したプラスミドができた。
【０１１８】
IＲＥＳ−ΔＬＮＧＦｒ配列を、次に、ヒト不変鎖の最初の８０アミノ酸（Ｉｉ８０）をコードするｐＭＦＧ−Iｉ８０に移入した。この後、完全なＭＡＧＥ−Ａ３  ｃＤＮＡをｐＭＦＧ−Iｉ８０−（IＲＥＳ）−ΔＬＮＧＦｒ内のＩｉ８０の下流にライゲーションし、ｐＭＦＧ−Iｉ８０−ＭＡＧＥ−Ａ３−（IＲＥＳ）−ΔＬＮＧＦｒを形成し、Iｉ−ＭＡＧＥ−Ａ３融合タンパク質とΔＬＮＧＦレセプターとの同時発現を可能にした。細胞系の形質導入の手順は前記した。
高タイターＭＡＧＥ  Ａ３コード組換えレトロウイルスストックを、上述のように、プラスミドｐＭＦＧ−Iｉ８０−ＭＡＧＥ−Ａ３−（IＲＥＳ）−ΔＬＮＧＦｒをＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯパッケージング細胞内へトランスフェクションによって導入することで生成した。レトロウイルスストックを回収し、下記のとおり形質導入に使用した。
【０１１９】
高タイターＭＡＧＥ−Ａ３コード組換えレトロウイルスの生成
ＭＡＧＥ−Ａ３コードレトロウイルスベクタープラスミドｐＭＦＧ−Iｉ８０−ＭＡＧＥ−Ａ３−（IＲＥＳ）−ΔＬＮＧＦｒをトランスフェクションによってＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯパッケージング細胞内に導入した。ＭＦＧレトロウイルスベクターはモロニーマウス白血病ウイルスより由来し、薬剤耐性マーカーを欠いており、挿入されたｃＤＮＡ以外他の潜在的な抗原性タンパク質を発現していない（Riviere, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6733-6737, 1995）。トランスフェクションの手順は、Grahamおよびvan der Eb（Virology 54:536-539）のリン酸カルシウム媒介トランスフェクションプロトコールの変法である。
【０１２０】
トランスフェクションの２４時間前、１０．８×１０６個のＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ細胞を７５ｃｍ２組織培養フラスコ（Falcon）内で１４ｍｌ細胞増殖培地中にプレートした。細胞を加えた後、このフラスコを穏やかに前後に揺すり、細胞を、フラスコの底に均等に分配した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２にてインキュベートした。トランスフェクション時、細胞は７０〜８０％のコンフルエントに達しているべきであるが、培地を取り除き、２５ｍＭのクロロキン（Sigma Chemical Co., St.Louis, MO, USA）を含む新鮮な１４ｍｌのＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ細胞増殖培地で置換した。トランスフェクションカクテルを、４０μｇレトロウイルスベクタープラスミドＤＮＡを水に加え、１５７５μｌの最終容量まで希釈することで５０ｍｌチューブ内に調製した。このＤＮＡ溶液に、２ＭのＣａＣｌ２（Sigma）を２２５μｌ加えた。次いで１８００μｌの２×ＨｅＢＳ（蒸留水中に５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＫＣｌ、１２ｍＭのデキストロース、２８０ｍＭのＮａＣｌおよび１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４を溶解し、０．２μフィルターで濾過し、−２０℃で保存した）を、自動ピペットで１５秒間勢いよくバブリングすることでＤＮＡ／ＣａＣｌ２溶液に滴下して加えた。
【０１２１】
ＤＮＡ／ＣａＣｌ２／ＨｅＢＳ混合液をすぐに細胞上に滴加し、フラスコを緩やかに攪拌し、ＤＮＡ／ＣａＰＯ４粒子を均一に混合させた。細胞を３７℃／５％ＣＯ２にて７〜９時間インキュベートし、クロロキン含有培地を新鮮なＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ細胞増殖培地に交換した。レトロウイルス上清の回収のおよそ２４時間前に、ＰｈｏｅｎｉｘＡＭＰＨＯ培地を取り除き、ゆっくりと２．５％ＦＣＳのみを含む９ｍｌのＥＢＶ細胞増殖培地（イスコブ）で置換した。培地を細胞から取り除き、０．４５μフィルターを通して濾過して細胞残骸を取り除くことで、トランスフェクションの４８時間後に、レトロウイルス上清を回収した。回収および濾過後、ウイルス含有培地を氷上におき、１５ｍｌのポリプロピレンチューブ内で望ましい容量に分液し、−８０℃で保存した。
【０１２２】
ＥＢＶ細胞系のレトロウイルスによる形質導入
ＥＢＶ形質転換細胞を、細胞を感染カクテル中で再懸濁させ、遠心することで感染させた。標的細胞を６０ｍｍ組織培養プレート（Falcon）内で４ｍｌの感染カクテル中１．０×１０６細胞の濃度で再懸濁した。プレートをIＥＣ遠心器、ローター型２２８内で２時間、３２℃、１２００ｒｃｆで遠心した。形質導入すべきプレートのそれぞれに対して、４ｍｌの感染カクテルを、ＥＢＶ細胞増殖培地中でウイルス上清１：２に希釈し、最終濃度６μｇ／ｍｌまで硫酸プロタミンを加えることで調製した。さらに２時間の加湿インキュベーター内で３７℃でのインキュベーション後に遠心をし、細胞を４ｍｌの標的細胞増殖培地へ移した。この形質導入サイクルを細胞をプレーティングした直後に行い、２４および４８時間の時点で繰り返した。
【０１２３】
樹状細胞およＣＤ４＋応答Ｔ細胞
血液細胞を、メラノーマ患者ＤＤＨＫ２からのバフィーコート調製物として採取し、実質的にPCT/US99/21230に既に記載されたとおりに処理した。簡潔に述べると、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Nycomed pharma, Oslo, Norway）での遠心にて単離した。血小板によるＰＢＭＣのコンタミネーションを最小化するために、調製物をまず２０分間／１０００ｒｐｍで室温にて遠心した。ほとんどの血小板を含む上部２０〜２５ｍｌを取り除いた後、チューブを室温で２０分間／１５００ｒｐｍにて遠心した。ＰＢＭＣを２−アミノエチルイソチオウロニウム（Sigma）処理ヒツジ赤血球にてロゼット形成することによってＴ細胞を枯渇させた。リンパ球枯渇ＰＢＭＣを、Ｌ−アスパラギン（０．２４ｍＭ）、Ｌ−アルギニン（０．５５ｍＭ）、Ｌ−グルタミン（１．５ｍＭ）および１％自己血清を含むＲＰＭI  １６４０培地（完全培地）中、２ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で、培養フラスコ（Falcon）内で３７℃にて２時間放置し、接着させた。接着しなかった細胞を捨てた。
【０１２４】
接着細胞（樹状細胞）は、単球を、ＡＡＧおよび１％の自己血漿を含むＲＰＭＩ１６４０培地中、IＬ−４（２００Ｕ／ｍｌ）およびＧＭ−ＣＳＦ（７０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養して得た。毎２日、培地の４分の１を新鮮な培地およびサイトカインと交換した。７日目に、非接着細胞集団を富化樹状細胞源として用いた。ロゼット形成したＴ細胞をＮＨ４Ｃｌ（１６０ｍＭ）で処理し、ヒツジ赤血球を溶解し、洗浄した。ＣＤ４＋Ｔリンパ球を、磁気マイクロビーズと結合した抗ＣＤ４モノクローナル抗体（Miltenyi Biotech, Germany）を使用して、製造業者によって推奨されたようにＭＡＣＳ磁石を通して分類することによるポジティブ選別により、ロゼット形成したＴ細胞から単離した。
【０１２５】
リンパ球／樹状細胞混合培養
樹状細胞（５×１０５）を、ＭＡＧＥ−Ａ３bacteria（２０μｇ／ｍｌ）の存在下、IＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−α（５ｎｇ／ｍｌ）を含む完全ＲＰＭI培地中で２０時間、３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした。細胞を洗浄し、IＬ−６（１,０００Ｕ／ｍｌ）およびIＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、ＡＡＧおよび１％の自己血漿を含む２００μｌのＩＭＤＭ中の１０５個のＣＤ４＋Ｔリンパ球に、丸底マイクロウェルあたり１０４個加えた。ＣＤ４＋リンパ球を、ＭＡＧＥ−Ａ３bacteriaで新たにロードした自己樹状細胞で７、１４、２１および２８日目に再刺激し、ＡＡＧおよび１％の自己血漿を含むＩＭＤＭ（以後、完全ＩＭＤＭと呼ぶ）に、IＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）およびIＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）を含むものの中で増殖させた。３５および４２日目に、各マイクロカルチャー（〜５，０００細胞）のアリコットを、２０μｇ／ｍｌのＭＡＧＥ−Ａ３bacteria、ＭＡＧＥ−Ａ３insect、またはオボアルブミンのいずれかで２０時間ロードした〜２０，０００個の自己ＥＢＶ−Ｂ細胞で刺激した場合にＩＦＮ−γを産生するそれらの能力について評価した。丸底マイクロウェル中、および、ＩＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）を含む１００μｌの完全ＩＭＤＭ中での２０時間の共培養後、上清中に放出されたＩＦＮ−γを、Medgenix Diagnostics-Biosource（FLeurus, Belgium）からの試薬を用いたＥＬＩＳＡで測定した。
【０１２６】
ＣＤ４＋Ｔ細胞クローン
陽性のマイクロカルチャーＦ４からの細胞を、限界希釈法により、レトロ−Ｉｉ．ＭＡＧＥ−Ａ３で形質導入した照射自己ＥＢＶ−Ｂ細胞（５ｘ１０３〜２ｘ１０４細胞）を刺激細胞として用いてクローニングした。照射同種ＬＧ２−ＥＢＶ細胞（５ｘ１０３〜１０４個）をフィーダー細胞として用いた。ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンに、週１回、IＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）、IＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５Ｕ/ｍｌ）を含む新鮮な培養培地を補充した。
【０１２７】
ペプチドでの認識アッセイ
一過性のＮＨ２末端保護のためにＦ−ｍｏｃを用いて、固相上にペプチドを合成し、質量分析で特徴付をした。全てのペプチドは、分析ＨＰＬＣが示すとおり純度が＞９０％であった。凍結乾燥したペプチドを、１０ｍＭの酢酸および１０％のＤＭＳＯ中に５ｍｇ／ｍｌで溶解し、−２０℃で保存した。ＥＢＶ−Ｂ細胞を丸底マイクロウェル１個あたり２０，０００個ずつ分配し、種々のペプチドの存在下、３７℃で２時間インキュベートした。示した濃度は、インキュベーション工程中のそれらの濃度を表す。ＣＤ４＋Ｔリンパ球（５，０００個）を、ＩＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）を含む１００μｌの完全ＩＭＤＭ（GIBCO）培地に加えた。２０時間の共培養後、上清を回収し、ＩＦＮ−γの産生をＥＬＩＳＡで測定した。
【０１２８】
腫瘍細胞の認識
腫瘍細胞を丸底マイクロウェル１個あたり２０，０００細胞ずつ、５，０００個のＣＤ４＋Ｔリンパ球とともに、ＩＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）の存在下、１００μｌの完全ＩＭＤＭ（GIBCO）培地中に分配した。２０時間の共培養後、上清を回収し、ＩＦＮ−γの産生をＥＬＩＳＡで測定した。
【０１２９】
結果
ＨＬＡクラスＩＩ分子によって提示される新規なＭＡＧＥ−Ａ３エピトープを同定するために、メラノーマ患者ＤＤＨＫ２からの単球由来樹状細胞（ＤＣ）を自己血漿中で培養し、その成熟を誘導するために組換えＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質およびＴＮＦ−αとともに１晩インキュベートした。これらの細胞を、その後、自己ＣＤ４＋Ｔリンパ球を刺激するのに用いた。これまでの実験では、同様の方法で得られたＣＤ４＋Ｔ細胞クローンの多くが、おそらくタンパク質バッチ中の細菌混入物に向けらていた。したがって、大腸菌中で産生されたＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質（ＭＡＧＥ−Ａ３bacteria）をリンパ球を刺激するのに用い、Spodoptera frugiperda 昆虫細胞中で産生されたＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質（ＭＡＧＥ−Ａ３insect）を、応答リンパ球の特異性を試験するのに用いた（データは示さない）。
【０１３０】
ＭＡＧＥ−Ａ３抗原に向けられたＣＤ４＋Ｔ細胞クローン
それぞれ１０５個のＣＤ４＋細胞、および、刺激細胞として、ＭＡＧＥ−Ａ３bacteriaタンパク質でロードした１０４個の自己由来の刺激ＤＣを含む、合計９６のマイクロカルチャーを準備した。応答細胞を、該タンパク質でロードしたＤＣによって、１週間間隔で３回再刺激した。２週間の休止期間後、３５および４２日目に、各マイクロカルチャーの応答細胞を、ＭＡＧＥ−Ａ３insect、ＭＡＧＥ−Ａ３bacteria、またはオボアルブミンのいずれかでロードした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞で刺激した後のＩＦＮ−γの産生について試験した。１２のマイクロカルチャーが、タンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３insectおよびタンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３bacteriaでの刺激後に、特異的に高レベルのＩＦＮ−γを産生した。このうちの１つであるＦ４を、限界希釈法により、レトロ−Ｉｉ．ＭＡＧＥ−Ａ３で形質導入した自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を刺激細胞に用いてクローニングした。数種の陽性のクローンが得られ、これはＣＤ４＋Ｔ細胞クローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３を包含した。このクローンは、タンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３insectまたはタンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３bacteriaのいずれかでロードした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞、またはレトロ−Ｉｉ．ＭＡＧＥ−Ａ３で形質導入したＥＢＶ−Ｂ細胞を認識した。
【０１３１】
自己ＤＤＨＫ２−ＥＢＶ−Ｂ細胞を、２０μｇ／ｍｌのタンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３insectまたはタンパク質ＭＡＧＥ−Ａ３bacteriaのいずれかで２０時間パルスした。タンパク質でパルスしたＥＢＶ−Ｂ細胞（２０，０００個）、またはＭＡＧＥ−Ａ３と切断されたヒト不変鎖（レトロ−Ｉｉ．ＭＡＧＥ−Ａ３）とで構成された融合タンパク質をコードするレトロウイルスで形質導入したＥＢＶ−Ｂ細胞を、ＣＤ４＋クローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３細胞（５，０００個）とともに、マイクロウェル中で２０時間インキュベートした。ＩＦＮ−γの産生をＥＬＩＳＡで測定した（図１）。示した結果は、トリプリケートした培養の平均を表している。
【０１３２】
クローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３はペプチドＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳ（配列番号：４）を認識した
１２アミノ酸分重複した、全ＭＡＧＥ−Ａ３タンパク質配列をカバーする、１６アミノ酸のペプチドの組をスクリーニングした。自己ＥＢＶ−Ｂ細胞を、これらのペプチドのそれぞれでパルスし、クローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３による認識について試験した。該クローンは、２個の重複ペプチド、すなわちＭＡＧＥ−Ａ３263-278（ＧＳＤＰＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬ；配列番号：３）およびＭＡＧＥ−Ａ３267-282（ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳ；配列番号：４）での刺激の後に、ＩＦＮ−γを産生した。
ＤＤＨＫ  ＥＢＶ−Ｂ細胞（２０，０００個）を、マイクロウェル中で2時間、種々の濃度のＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドとインキュベートした。ＣＤ４＋クローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３（５，０００個）との２０時間の共培養の後に、ＩＦＮ−γの産生をＥＬＩＳＡで測定した（図２）。実験は２回行った。
【０１３３】
図２Ａは、実験Ｉを示す。多数の異なる長さのＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドを試験し、クローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３によって認識させた。試験したペプチドは、ＧＳＤＰＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬ（ＭＡＧＥ−Ａ３263-278；配列番号：３）、ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳ（ＭＡＧＥ−Ａ３267-282；配列番号：４）、ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥ（配列番号：７）、ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（配列番号：８）、ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬ（配列番号：９）、ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡ（配列番号：１０）、ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲ（配列番号：１１）、ＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥ（配列番号：１２）、ＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥ（配列番号：１３）およびＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥ（配列番号：１４）であった。これらのうち、ＧＳＤＰＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬ（配列番号：３）、ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳ（配列番号：４）およびＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥ（配列番号：７）がよく認識された。配列番号：４および配列番号：７のアミノ酸配列の中間であるＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴ（配列番号：１６）も、よく認識されることが予想された。
【０１３４】
図２Ｂは、実験ＩＩを示す。この第２の実験では、ペプチド濃度を光学密度により測定した。試験したペプチドはＧＳＤＰＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬ（配列番号：３）、ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳ（配列番号：４）、ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥ（配列番号：７）およびＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（配列番号：８）であった。これらのうち、ＧＳＤＰＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬ（配列番号：３）、ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳ（配列番号：４）およびＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥ（配列番号：７）はよく認識されたが、ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶ（配列番号：８）は、より高いペプチド濃度でしか認識されなかった。
【０１３５】
ペプチドはＨＬＡ−ＤＲ１分子によって提示されている
レトロ−Ｉｉ．ＭＡＧＥ−Ａ３で形質導入したＤＤＨＫ２−ＥＢＶ（２０，０００個）を、モノクローナル抗体Ｂ７．２１（抗ＤＰ）、ＳＰＶ  Ｌ３（抗ＤＱ）、またはＡＨ８９（抗ＤＲ）のいずれかの存在下、ＣＤ４＋クローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３細胞（５，０００個）とともに２０時間共培養した。ＩＦＮ−γの産生をＥＬＩＳＡで測定した。ペプチドＭＡＧＥ−Ａ３267-282（ＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳ；配列番号：４）でロードした自己ＥＢＶ−Ｂ細胞のクローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３による認識は、抗ＨＬＡ−ＤＲ抗体で阻止されたが、ＨＬＡ−ＤＰまたはＨＬＡ−ＤＱに対する抗体では阻止されなかった（図３）。
メラノーマ患者ＤＤＨＫ２は、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＤＲ１５およびＤＲ５１とタイピングされた。ペプチドＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳ（配列番号：４）を、ＤＲ１、ＤＲ１５またはＤＲ５１を発現する数種のＥＢＶ−Ｂ細胞系にロードした。ＤＲ１を発現するものは全て、そしてＤＲ１を発現するもののみがクローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３に該ペプチドを提示することが可能だった（表１）。自己ＤＤＨＫ２−ＥＢＶおよび同種ＥＢＶ−Ｂ細胞（２０，０００個）を、５μｇ／ｍｌのペプチドＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳ（ＭＡＧＥ−Ａ３267-282；配列番号：４）と１時間インキュベートし、洗浄した。ペプチドでパルスしたＥＢＶ−Ｂ細胞（２０，０００個）を、次に、ＣＤ４＋クローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３細胞（５，０００個）とともにインキュベートした。ＩＦＮ−γの産生を、２０時間の共培養後にＥＬＩＳＡで測定した。
【０１３６】
【表１】
2004536590.tif 000002
【０１３７】
腫瘍細胞系の認識
ＭＡＧＥ−Ａ３を発現する３種のＤＲ１メラノーマ細胞系を、ＣＤ４＋Ｔ細胞クローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３を刺激し、ＩＦＮ−γを産生させるそれらの能力について試験した。腫瘍細胞を１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ−γで４８時間前処理し、そして、マイクロウェル中（２０，０００個）、１μｇ／ｍｌのペプチドＡＣＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＶＥＴＳ（ＭＡＧＥ−Ａ３267-282；配列番号：４）で１時間パルスした。ＩＦＮ−γの産生を、２０時間のＣＤ４＋クローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３（５，０００個）との共培養後に、ＥＬＩＳＡで測定した。Ｉｉ．ＭＡＧＥ−Ａ３をコードするレトロウイルスで形質導入した自己ＥＢＶ刺激細胞を陽性対照として用いた。
メラノーマ細胞系の１つであるＮＡ４１−ＭＥＬが、若干ＣＤ４＋クローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３を刺激し、ＩＦＮ−γを産生させた（図４）。この細胞をＩＦＮ−γで処理すると、その認識が改善した。
【０１３８】
本発明の他の観点は当業者に対して明らかになるであろうから、ここで繰り返す必要ない。本明細書で引用したそれぞれの参考文献はその全体が参照により組込まれる。
使用した用語および表現は説明の意味で用いており、限定の意味で用いたのではなく、かかる用語および表現の使用において、示され、記述された特徴の均等物またはその部分を除外することを意図するものではなく、さまざまな改変が本発明の範囲内で可能であることが認識される。
【図面の簡単な説明】
【０１３９】
【図１】ＭＡＧＥ−Ａ３に由来する抗原に向けられたＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを示した図である。
【図２Ａ】ＣＤ４＋クローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３によって認識されたＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドの力価測定を示したグラフである。
【図２Ｂ】ＣＤ４＋クローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３によって認識されたＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドの力価測定を示したグラフである。
【図３】ＭＡＧＥ−Ａ３ペプチドがＣＤ４＋クローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３に、ＨＬＡ−ＤＲ分子によって提示されることを示したグラフである。
【図４】ＭＡＧＥ−Ａ３を発現しているＤＲ１腫瘍細胞のＣＤ４＋クローンＭＡＧＪ５６９／Ｆ４．３による認識を表したグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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