(57)【要約】光線力学療法に用いられる新規な光増感剤およびその調製方法を提供すること。光線力学療法に用いられる光増感剤として、下記一般式（Ｉ）で表される、製薬学上許容可能な塩または酸付加塩である９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａ誘導体。【化１】2004513948.tif 000008（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素、炭素数１〜６個の直鎖状または分岐状アルキル基、あるいは炭素数３〜８個のアリール基である。）
2004513948.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光線力学療法に用いられ、下記一般式（Ｉ）で表される、製薬学上許容可能な塩または酸付加塩である９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａ誘導体。
【化１】
2004513948.tif 000007
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素、炭素数１〜６個の直鎖状または分岐状アルキル基、あるいは炭素数３〜８個のアリール基である。）
【請求項２】
好ましい化合物が、Ｒ１としてメチル基とＲ２として水素とを有する化合物であることを特徴とする、請求項１に記載の光線力学療法に用いられる製薬学上許容可能な塩または酸付加塩である９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａ誘導体。
【請求項３】
ｉ）藍藻のクロロフィルを酸処理してフェオフィチン−ａを調製する工程、
ｉｉ）有機溶媒を用いて抽出した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりフェオフィチン−ａを分離する工程、
ｉｉｉ）フェオフィチン−ａのＣ９位でカルボニル基からヒドロキシ基に還元する工程、
ｉｖ）フィチルエステル残基を加水分解して除去する工程、および
ｖ）シリカゲルカラムクロマトグラフィーおよび薄層クロマトグラフィーを用いて一般式（Ｉ）の化合物を分離して得る工程
から構成される、請求項１に記載の一般式（Ｉ）の化合物を調製する方法。
【請求項４】
ｉ）一般式（Ｉ）の化合物とリポソームとを結合し、
ｉｉ）前記結合された化合物を癌組織に直接挿入し、
ｉｉｉ）ダイオードレーザー（６６０ｎｍ）ファイバーを癌組織に挿入し、
ｉｖ）６５０〜６７０ｎｍ波長を持つ光の照射によって癌組織を治療すること
から構成される光増感剤として一般式（Ｉ）の化合物を用いる癌治療方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は、光線力学療法に用いられる９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａ誘導体の新規光増感剤およびその調製方法に関する。
【０００２】
【背景技術】
最近、光線力学療法（Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ ｔｈｅｒａｐｙ、ＰＤＴ）は有望な癌治療法の１つとみなされている。光線力学療法のメカニズムは、光（光量子）が光量子に感受性のある光増感剤とともに外部で供給されると、体内の酸素間の化学反応によって生成される一重項酸素またはフリーラジカルが癌細胞または悪性腫瘍組織を破壊するという事実に基づいている。
【０００３】
より具体的には、光線力学療法において、一重項酸素、酸素ラジカル、スーパーオキサイドあるいはパーオキサイドは、可視光（光量子）が光増感剤に照射されると、癌細胞または悪性腫瘍組織を破壊するためにその場での光増感作用によって化学的に生成され得る。
この技術は、非有害性の光増感させる照射との組み合わせにおいて非毒性薬物を利用しており、一般に用いられる化学療法または放射線療法と比較すると、より選択的ではあるけれども、それでもやはり害がある可能性を有し、したがって、治療されている患者の生活の質を向上させることが期待されている。
【０００４】
そのような光線力学療法は、１９８０年代から研究されている。１９９０年代から光線力学療法の臨床治療が、カナダ、ドイツ、日本、アメリカなどの多くの国で許可されている。特に、ＦＤＡは１９９６年１月に食道癌に対してこの療法を認可し、１９９７年９月に肺癌の第一段階に対してもこの療法を認可した。最近の統計は、この療法の３０００症例が１９９６年に処置されたことを示す。
【０００５】
しかし、光線力学療法は次のような基本的な問題がある。ｉ）大量の癌の場合には、この療法は、光が悪性腫瘍組織の全体に透過することができないため、利用できない。ｉｉ）光増感剤の費用が非常に高い。ｉｉｉ）光増感剤は、毒性が示される人体でゆっくりと代謝される。ｉｖ）悪性腫瘍中の光増感剤の濃度は、あまり高くすることができず、治療効果の低減をもたらす。
【０００６】
１９９６年ＦＤＡにより認可され、市販されている光増感剤「フォトフリン（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ）ＴＭ」は、良好な治療効果および安定性を示す。しかし、そのような光増感剤の投与後、５〜６週間はまだ光増感剤は残存し、副作用を引き起こす。さらに、光線力学療法に最適な光スペクトル（６５０〜８５０ｎｍ）と比較すれば６３０ｎｍ（フォトフリンの最大光吸収）はより低い光スペクトルであり、光の悪性腫瘍組織への透過の減少を引き起こす。他方、化学合成において純粋なフォトフリンを調製するためにはいくつかの困難がある。したがって、より効果的な光増感剤を開発することが要求されている（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ、７３９〜７４３頁、１９９８年９月；Ｃｈｅｍｉｃａｌ ＆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｎｅｗｓ、２２〜２７頁、１９９８年１１月）。
【０００７】
他方、次世代の光増感剤として、ポルフィリン（ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、クロリン（ｃｈｌｏｒｉｎ）、バクテリオクロリン（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｉｎ）およびポルフィシーン（ｐｏｒｐｈｙｃｅｎｅ）が開発されている（Ｊ． Ｏｒｇ． Ｃｈｅｍ．、第６３巻、１６４６〜１６５６頁、１９９８年）。
それらのうち、フェオフィチン（ｐｈｅｏｐｈｙｔｉｎ）は、植物のクロロフィルから金属イオンを除去した後に調製され、フォトフリンと比較して長波長の良好な吸収を示す。さらに、フェオフィチンを高純度の処方で調製することができる。
【０００８】
たとえ植物のクロロフィルから金属イオンを除去した後に調製されるフェオフィチンの本来の構造を光増感剤として利用することができても、分子構造を変形すれば、フェオフィチンを優れた光増感剤として発展させることができる。たとえば、１０−ヒドロキシフェオフィチン−ａ（１０−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｏｐｈｙｔｉｎ−ａ）は、フェオフィチン−ａの環構造の炭素１０位の酸化によって得られ、優れた光増感剤と考えられる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、第５５巻、１２４１〜１２５１頁、１９９２年）。
【０００９】
１０−ヒドロキシフェオフィチン−ａは、体内での短い存続の特性のみならず優れた光化学的特性を有する、蚕の排泄物から分離される化合物である。さらに、それはフェオフィチン−ａの酸化によって大規模かつ高純度で製造することができる。しかしながら、それがある量以上で使用されると、致命的な毒性に基づく不利な条件がある（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９３／１１２１１４）。
【００１０】
優れた光増感剤を開発するために、以下の条件を満足する必要がある。
ｉ）三重項酸素から一重項酸素への高い光反応収率、ｉｉ）波長６５０ｎｍ以上のスペクトルの高い吸収、ｉｉｉ）悪性腫瘍組織への高い選択性、ｉｖ）投与後の人体からの高い排泄性、ｖ）最小の副作用および毒性、およびｖｉ）高純度かつ低コストでの大量生産。
【００１１】
次世代の光増感剤として、クロロフィル（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ）およびバクテリオクロロフィル（ｂａｃｔｅｒｉｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ）の誘導体が米国特許Ｎｏ． ５，６５０，２９２に開示された。特にフェオフィチン−ａはクロロフィルから金属イオンを除去することにより調製され、フェオフォルビド−ａ（ｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ−ａ）はフェオフィチン−ａからのフィチルラジカルの加水分解することにより調製され、それらは、優れた光増感剤と考えられ、フォトフリンの欠陥を解決する。さらに、そのような化合物は分子構造の変形によって開発することができる。
【００１２】
しかし、フェオフォルビド−ａの場合には、室温でゆっくりと分解する欠点がある。したがって、この化合物は、低い安定性を示す（Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ、第６４巻、１９４〜２０４頁、１９９６年）。そのような低い安定性は光増感剤として致命的な欠点であり、新規のフェオフォルビド−ａ誘導体の開発が進められてきた（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第３８巻、３３３５〜３３３８頁、１９９７年）。
【００１３】
そのような欠点を克服するために、クロロフィルが新規の光増感剤とみなされている。クロロフィルは天然の産物、特に藍藻類から分離することができる。さらにフェオフィチンは、クロロフィルを有機溶媒による抽出を行い、ついで酸処理して得ることができる。
クロロフィル構造を有する光増感剤は低親水性質を示し、そのため長い排泄の期間を必要とする。したがって、新規の光増感剤は、親水性ラジカルの導入によりフェオフィチン構造を変形することによって、その長い排泄期間を解消することが要求されている。
【００１４】
本発明で、発明者らは、悪性腫瘍組織への高い選択性、体内からの容易な排泄性、低毒性、および１０−ヒドロキシフェオフィチン−ａと比較して長波長の吸収を有する、優れた光増感剤を開発し、それは現在では優れた光増感剤と考えられている。
【００１５】
【発明の概要】
本発明の目的は、光線力学療法に用いられ、下記一般式（Ｉ）で表される製薬学上許容可能な塩または酸付加塩である９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａ（９−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ−ａ）誘導体を提供することである。
【００１６】
【化２】
2004513948.tif 000003
【００１７】
（式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して水素、炭素数１〜６個の直鎖状または分岐状アルキル基、あるいは炭素数３〜８個のアリール基である。）
一般式（Ｉ）の化合物のうちの好ましい化合物は、Ｒ１としてメチル基とＲ２として水素とを有する化合物である。
一般式（Ｉ）の化合物は、以下の工程から構成される方法によって調製することができる。
【００１８】
ｉ）藍藻のクロロフィルを酸処理してフェオフィチン−ａを調製する工程、ｉｉ）有機溶媒を用いて抽出した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりフェオフィチン−ａを分離する工程、ｉｉｉ）フェオフィチン−ａのＣ９位で、カルボニル基からヒドロキシ基に還元する工程、ｉｖ）フィチルエステル残基を加水分解して除去する工程、およびｖ）シリカゲルカラムクロマトグラフィーおよび薄層クロマトグラフィーを用いて一般式（Ｉ）の化合物を分離して得る工程。
【００１９】
得られた化合物はＮＭＲスペクトルおよび高分解能ＦＡＢマススペクトルにより確認される。
さらに本発明の目的は、
ｉ）一般式（Ｉ）の化合物とリポソームとを結合し、ｉｉ）前記結合された化合物を癌組織に直接挿入し、ｉｉｉ）ダイオードレーザー（６６０ｎｍ）ファイバーを癌組織に挿入し、ｉｖ）６５０〜６７０ｎｍ波長を持つ光の照射によって癌組織を治療すること
から構成される、光増感剤として一般式（Ｉ）の化合物を用いる癌治療方法を提供することである。
【００２０】
【発明を実施するための最良の形態】
本明細書において、一般式（Ｉ）の化合物を９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａ（９−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｏｐｈｏｒｂｉｄｅ−ａ）と呼ぶ。
９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａを、ｉ）藍藻類のクロロフィルを酸処理してフェオフィチン−ａを調製する工程、ｉｉ）有機溶媒を用いて抽出した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによりフェオフィチン−ａを分離する工程、ｉｉｉ）フェオフィチン−ａのＣ９位でカルボニル基からヒドロキシ基に還元する工程、ｉｖ）フィチルエステル残基を加水分解して除去する工程、およびｖ）シリカゲルカラムクロマトグラフィーおよび薄層クロマトグラフィーを用いて、９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａを分離して得る工程から構成される方法によって調製することができる。
【００２１】
さらに、本発明は、ｉ）９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａとリポソームとを結合し、ｉｉ）前記結合された化合物を癌組織に直接挿入し、ｉｉｉ）ダイオードレーザー（６６０ｎｍ）ファイバーを癌組織に挿入し、ｉｖ）６５０〜６７０ｎｍ波長を持つ光の照射によって癌組織を治療することから構成される、光増感剤として９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａを用いる癌治療方法を提供する。
【００２２】
本発明の９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａは、ｉ）三重項酸素から一重項酸素への高い光反応収率、ｉｉ）波長６５０ｎｍ以上のスペクトルの高い吸収、ｉｉｉ）悪性腫瘍組織への高い選択性、ｉｖ）投与後の人体からの高い排泄作用、ｖ）最小の副作用および毒性、およびｖｉ）低コストかつ高純度で大量生産という特性を有する。
【００２３】
９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａを、製薬剤組成物として用いることができ、メラノーマ腫瘍、悪性脳腫瘍、卵巣癌、乳癌、皮膚癌、肺癌、食道癌および膀胱癌を含むいくつかの種類の癌に対して有効である。
【００２４】
【実施例】
本発明を以下の実施例によって、より具体的に説明する。しかし、実施例は、実例を挙げて説明しようとするものであり、本発明の範囲を何ら限定しようとする意図のものではない。
【００２５】
【実施例１】
９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａの抽出、半合成および単離
本製造方法は、赤色灯を備えた暗室内で実施した。ピリジン−メタノール混合溶液（１：１、ｖ／ｖ）２０ｍｌを、窒素供給装置、温度計および滴下漏斗を有する５０ｍｌの丸底反応器に入れた。次いで、クロロフィルの抽出に続き金属イオンを除去してから、フェオフィチン−ａ、５００ｍｇをこの溶液に溶解した。ＮａＢＨ４ ２５０ｍｇをピリジン−メタノール混合溶液２０ｍｌに溶解し、この混合物を１時間かけて滴下漏斗で前記反応器に加えた。
【００２６】
反応の終了点は、フェオフィチン−ａの消失時間を、ＨＰＬＣを用いて測定することによって決定した。反応時間は、１．５時間から２．５時間を要した。氷水を使って前記反応混合物を冷却した後、ＨＣｌ溶液（２Ｎ）１００ｍｌをゆっくり加えた。メチレンクロライド１００ｍｌを使用して、前記反応混合物を抽出した。その後、蒸留水を用いてメチレンクロライド相からＨＣｌを除去した。
【００２７】
前記メチレンクロライド相中の水を、硫酸ナトリウムを用いて除去した。次いで、ロータリーエバポレーターを使用して、メチレンクロライドを除去した。得られた９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａをシリカ−ゲルカラムクロマトグラフィー（２３０〜４００メッシュ；ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン＝１０／１）および薄層クロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／アセトン＝５／１）を用いて単離した。
９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａの同定
得られた化合物を１Ｈおよび１３ＣＮＭＲで分析した。そのＮＭＲスペクトルは、フィチルラジカルが加水分解されてカルボン酸に変化したこと、およびＣ９位のカルボニル基がヒドロキシ基に変化したことを示した。したがって、得られた化合物を９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａと同定した。得られた化合物の分子量は６１７．２７６４であった（理論値：Ｃ３５Ｈ３８Ｎ４Ｏ５＋Ｎａ＝６１７．２７４０）。
【００２８】
【実施例２】
癌細胞系
咽頭癌ＳＮＵ−１０４１の通常メラノーマ細胞系および肺癌Ａ５４９細胞系を組織培養した。有効性の比較のために、同量の既知光増感剤「１０−ヒドロキシフェオフィチン−ａ」および「フォトジェム（Ｐｈｏｔｏｇｅｍ）」を使用した。
インビトロ光線力学療法
フォトジェムを加えられた細胞系を処理し、蛍光灯からの赤色光（５７０〜６５０ｎｍ、０．３５ｍＷ／ｃｍ２、３１５Ｊ／ｍ２）を照射した。試験サンプルを処理し、同じ赤色光と、レーザー（６６０ｎｍ、０．３５ｍＷ／ｃｍ２、３１５Ｊ／ｍ２）を照射した。照射処置の後、前記細胞系に新しい培地と１０％ウシ胎児血清を添加して３７℃で培養した。８日後に細胞毒性を、クローン産生のアッセイ（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙ）により測定した。
【００２９】
線量反応曲線を下記の処理後に作成した。ｉ）各細胞系に対して、それぞれ２５ｇ／ｍｌのフォトジェム、１０−ヒドロキシフェオフィチン−ａおよび９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａ（９−ＨＰｂＤ−ａ）、で処理すること、ｉｉ）それらを２時間置くこと、ｉｉｉ）６６０ｎｍの光（３１５Ｊ／ｍ２）を照射し処置することである。フォトジェムサンプルに対しては、前記の光（６３０±１０ｎｍ）として、直径５ｍｍの流動光ガイド（２０００Ａ、Ｌｕｍｉｎｅｘ、ミュンヘン、ドイツ）を備えた１ＫＷのキセノン灯（モデルＡ５０００；Ｐｈｏｔｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．；電力密度７５ｍＷ／ｃｍ２）を用いた。
結果
表１に、９−ＨＰｂＤ−ａの細胞毒性と、肺癌Ａ５４９細胞系に対する総光線量２０ジュールにおける９−ＨＰｂＤ−ａの線量反応結果を示した。自然光および燈火による副次的な光反応を最小限にするため、細胞分配および培地交換は、実験サンプルを反応させない緑色光（５００ｎｍ）の下で実施した。暗い培養室で、７５μｇ／ｍｌの試薬処理を各１０皿について行った後、この実験サンプルを４８時間培養した。その後、細胞死の比率を測定した。５回実験した後、データの平均値を計算した。９−ＨＰｂＤ−ａが、１０−ヒドロキシフェオフィチン−ａと比較して、わずかに高い細胞毒性を示したとしても、極めて低濃度で、非常に高い線量反応が見られた。したがって、９−ＨＰｂＤ−ａの場合には、既知の光増感剤濃度のたった１／１００の濃度で顕著な細胞死効果を示した。さらに、９−ＨＰｂＤ−ａの細胞毒性は無視できるほどであった。
【００３０】
【表１】
2004513948.tif 000004
【００３１】
表１に示したように、濃度７５、７．５、０．７５μｇ／ｍｌである各光増感剤を同じ細胞系に添加し、６６５ｎｍの単色光を総光線量が２０ジュールとなるように照射した。９−ＨＰｂＤ−ａは、１０−ヒドロキシフェオフィチン−ａと比較して優れた細胞死効果を示した。さらに少量（０．７５μｇ／ｍｌ）でも、高い細胞死効果が見られた。他のバッチで合成された別の９−ＨＰｂＤ−ａ化合物を用いて、前記実験を同じ手順で再度行った。繰り返した実験においても、同じ結果が見られた。
【００３２】
表２に、同じ細胞系に対して、総光線量を１００ジュールに増やした以外は同じ光増感剤を用いた場合の効果を示した。０．０１８５μｇ／ｍｌという極めて少ない量の投与で、９−ＨＰｂＤ−ａで処理したものについては総光線量の増加に従い、細胞死が起こった。９−ＨＰｂＤ−ａは、２０ジュール照射と同様、１００ジュール照射でも優れた効果を示した。
【００３３】
【表２】
2004513948.tif 000005
【００３４】
【実施例３】
細胞分裂周期の変化は、癌治療の評価に関するキー要素である。たいていの抗癌剤は、癌細胞の成長を、細胞周期調節遺伝子の発現を調節することによって抑制する。本実施例では、９−ＨＰｂＤ−ａを用いる光線力学療法の際に、細胞周期の変化を測定した。さまざまな濃度の光増感剤（７５〜０．０１８５μｇ／ｍｌ）を使用して、総光線量２０ジュールの下、ウェスタンブロット分析を行い、細胞周期調節遺伝子の調節活性の変化に伴う細胞周期の変化を検出した。
【００３５】
図１は、細胞の有糸分裂に関係するサイクリンＢ１の量が急速に減少したことを示す。９−ＨＰｂＤ−ａが細胞周期の調節に影響を与えたことが明らかである。
図２は、９−ＨＰｂＤ−ａを使用した場合に、Ｇ２／Ｍ細胞周期において細胞周期の停止が生じたことを、ＦＡＣＳ分析で示したものである。
【００３６】
【実施例４】
実験動物と細胞系の移植
実験動物として、６週齢のオスのヌードマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ／ｎｕ／ｎｕ）を使用し、滅菌水と滅菌した餌を与えた。これらの動物をフィルタートップケージ（ｆｉｌｔｅｒ−ｔｏｐ ｃａｇｅ）の中で、適切な温度と湿度の下で飼育した。培養した癌細胞系をヌードマウスに移植するために、ＳＮＵ−１０４１細胞系サスペンション（１０７細胞／０．１ｍｌ）０．１ｍｌを皮下注射した。注射後、腫瘍が生じ、腫瘍の体積は８週間を超える観察の後には増加するようになった。
【００３７】
通常のメラノーマ細胞系ＳＮＵ−１０４１をヌードマウスに移植した。８週間経過後、腫瘍が全身に広がったことが観察された。光線力学療法を、腫瘍の体積が１００〜６００ｍｍ３になった後のみに実施した。
実験群を光線力学療法のために３グループに分けた。露出したファイバーチップを使用して、６６０ｎｍのダイオードレーザーを挿入し照射した。腫瘍の外側の温度をモニタリングすることにより、高熱に起因した治療効果を除いた。最適な照射強度および時間を測定した。
移植された腫瘍における治療効果
光線力学療法を、移植した腫瘍の体積が約１００〜６００ｍｍ３になったときに実施した。実験群を３グループに分けた。
【００３８】
ａ．グループ１（ｎ＝１０）
９−ＨＰｂＤ−ａ（０．７５ｍｇ／ｍｌ）０．１〜０．２ｍｌを、３０Ｇシリンジを使用して腫瘍に注射した。１〜４時間後、６６０ｎｍダイオードレーザーを６００ｍの光ファイバーチップを使用して照射した。２〜４箇所の直径５ｍｍの腫瘍に１ワットの連続波を１０分間照射した。
【００３９】
ｂ．グループ２（ｎ＝１０）
フォトジェム（１ｍｇ／ｍｌ）０．１〜０．２ｍｌを、３０Ｇシリンジを使用して腫瘍に注射した。１〜４時間後、照射をグループ１と同様の方法で行った。
ｃ．グループ３（ｎ＝５）
光増感剤を挿入しないで、レーザーをグループ１と同様の方法で照射した。
【００４０】
実験結果として、グループ１では、１０例中３例が腫瘍の完全な消失を示し、７例が腫瘍の部分的な消失を示した。グループ２では、１０例中２例が腫瘍の完全な消失を示し、８例が腫瘍の部分的な消失を示した。グループ３では、５例中２例が腫瘍の部分的な消失を示した。
９−ＨＰｂＤ−ａを用いる光線力学療法
実験群を、移植した腫瘍の体積が約１００〜６００ｍｍ３になったときに６グループに分けた。以下の処理を行い、腫瘍の変化を観察した。
【００４１】
ａ．グループ１（ｎ＝１０）
いかなる処置も行わず、腫瘍の変化を観察した。
ｂ．グループ２（ｎ＝２０）
光増感剤を投与せず、６６０ｎｍダイオードレーザーを、拡散器チップ（ｄｉｆｆｕｓｅｒ ｔｉｐ）を使用して照射した。その後、腫瘍の変化を観察した。
【００４２】
ｃ．グループ３（ｎ＝２０）
９−ＨＰｂＤ−ａとリポソームとの複合体を０．１〜０．１５ｍｌだけ腫瘍に投与し、照射をしないで腫瘍の変化を観察した。
ｄ．グループ４（ｎ＝２０）
フォトジェムを０．１〜０．１５ｍｌだけ腫瘍に投与し、照射をしないで腫瘍の変化を観察した。
【００４３】
ｅ．グループ５（ｎ＝１００）
フォトジェム ０．１〜０．１５ｍｌを腫瘍に投与した。フォトジェムの投与から１時間経過後、４時間経過後、２４時関経過後に、６６０ｎｍのダイオードレーザーを、拡散器チップ（ｄｉｆｆｕｓｅｒ ｔｉｐ）を使用して照射し、腫瘍の変化を観察した。
ｆ．グループ６（ｎ＝１００）
９−ＨＰｂＤ−ａとリポソームとの複合体０．１〜０．１５ｍｌを腫瘍に投与した。フォトジェムの投与から１時間経過後、４時間経過後、２４時関経過後に、６６０ｎｍのダイオードレーザーを、拡散器チップを使用して照射し、腫瘍の変化を観察した（図３）。
【００４４】
観察された治療効果は、すべての動物において細胞レベルを超えて有効であった。そうした事実は、ヌードマウス実験系を使用して確認された。実験系のために、６週齢のオスのヌードマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ／ｎｕ／ｎｕ）を使用し、飼育した。培養した細胞系をヌードマウスの皮下組織に移植した（図４）。
癌細胞系サスペンションの皮下注射から１週間後、腫瘍の成長が観察された。その後、腫瘍は全身の組織に広がり、実験動物の死を引き起こした（図５）。
【００４５】
光線力学療法を、癌細胞系の移植から２週間後に開始した。そのとき、腫瘍の体積は約１００〜６００ｍｍ３になっていた（図６）。
腫瘍の体積の測定は、試験物質の投与の直前、９−ＨＰｂＤ−ａの投与直後、投与後１週間、投与後２週間、投与後３週間、投与後４週間の時点で実施した。抗癌効果は、腫瘍の体積によって評価した。体積の計算は、下記の式を使用して行った。
【００４６】
【数１】
2004513948.tif 000006
【００４７】
フォトジェムまたは９−ＨＰｂＤ−ａを挿入しただけ（グループ３および４）では、腫瘍体積の減少は観察されなかった。光増感剤を投与せずに６６０ｎｍダイオードレーザーを照射した場合（グループ２）には、一時的な腫瘍の統制が観察された。しかしながら、前記腫瘍は１週間以内に再び成長した。したがって、レーザー照射だけでは、腫瘍を治療することはできなかった。
【００４８】
抗癌効果の評価を、４週間、腫瘍体積を観察した後に決定した。相対腫瘍成長（ＲＴＧ）を測定した後、９−ＨＰｂＤ−ａが、１０−ヒドロキシフェオフィチン−ａおよびフォトジェムと比較して、光線力学療法のための優れた光増感剤であることが証明された。図７は、９−ＨＰｂＤ−ａの投与と６６０ｎｍダイオードレーザー照射とによって腫瘍が治療されたことを示す写真である。
【００４９】
９−ＨＰｂＤ−ａの場合、処理から４週間後の腫瘍の体積は６４６ｍｍ３、ＲＴＧは３．５であった。フォトジェムの場合、処理から４週間後の腫瘍の体積は８３８ｍｍ３、ＲＴＧは６．９であった（図８）。したがって、実験群と対照群との間には統計学的に顕著な相違を観察することができた。
結論として、９−ＨＰｂＤ−ａは、悪性組織に対して高い選択性を有し、容易に体内から排泄され、低毒性であり、１０−ヒドロキシフェオフィチン−ａ（今日まで良い光増感剤であると考えられている）と比較して長波長の吸収を有する、優れた光増感剤であることが証明された。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、癌細胞系に対して一般式（Ｉ）の９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａを処理した後の細胞周期制御を示す写真である。写真は、細胞の有糸分裂を制御するサイクリンＢ１が迅速に減衰することを示す。
【図２】図２は、癌細胞系に対して一般式（Ｉ）の９−ヒドロキシフェオフォルビド−ａを処理した後のＦＡＣＳを示す図である。図は、細胞周期の停止が細胞周期のＧ２／Ｍで起こることを示す。
【図３】図３は、９−ＨＰｂＤ−ａとリポソームとの複合体が腫瘍に投与され、拡散器チップ（ｄｉｆｆｕｓｅｒ ｔｉｐ）を用いて、６６０ｎｍダイオードレーザーの照射とともに腫瘍の変化が観察されることを示す写真である。
【図４】図４は、癌細胞系ＳＮＵ−１０４１がヌードマウスの組織に移植されることを示す写真である。
【図５】図５は、癌細胞系ＳＮＵ−１０４１の移植後、腫瘍の成長がヌードマウスの死を引き起こすことを示す写真である。
【図６】図６は、光線力学療法の開始が癌細胞系ＳＮＵ−１０４１の移植から２週間後に実施されたことを示す写真である。
【図７】図７は、腫瘍が６６０ｎｍダイオードレーザーの照射とともに９−ＨＰｂＤ−ａの投与によって治療されることを示す写真である。
【図８】図８は、各実験群の相対腫瘍成長（ＲＴＧ）分析のための図である。
―◆―　：９−ＨＰｂＤ−ａ投与後、レーザー処置
―●―　：フォトジェム投与後、レーザー処置
―＝―　：９−ＨＰｂＤ−ａ投与のみ
―■―　：フォトジェム投与のみ
−−−▲−−−：レーザー処置のみ
−−−●−−−：対照
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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