(57)【要約】置換イミノキノンまたはオルトキノン環系を任意に包含する２種の低分子量化合物関連種に関する使用方法および医薬組成物を開示している。前記化合物はＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）拮抗作用を示し、しかもそれが有用であることが分かった。前記化合物は、例えば、自己免疫疾患（リウマチ性の関節炎、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、ループス症候群など）、喘息、関節炎、ＥＡＥ、ＡＲＤＳ、乾癬、インターロイキン−２毒性、増殖性血管疾患、および様々な形態の敗血症および敗血症性ショックなどの炎症作用または炎症誘発性のサイトカイン応答を伴う種々の疾病の治療や、腫瘍成長および新血管新生（血管形成）などのＭＩＦ応答の根底にある前記以外の状態を治療するのに有用である。
2004521068.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の下記式ＩまたはＩＩの化合物を投与することを含む、炎症性疾患、関節炎、増殖性の血管疾患、ＥＡＥ、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、サイトカイン媒介毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦ媒介条件、自己免疫疾患、腫瘍成長または血管形成、あるいは局所または全身性のＭＩＦ放出または合成を特徴とする状態の治療方法。
【化１】
2004521068.tif 000012
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３またはハロゲン（Ｂｒ、Ｃｌ、ＦまたはＩ）であり、Ｒ５は独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３またはＮＲ６Ｒ７であり、ここで、Ｒ６およびＲ７は独立して、ＨまたはＣ１〜４アルキルである。）
【化２】
2004521068.tif 000013
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、上記と同様の意味を表し、およびＲ８は、（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＯ−Ｒ５であり、ここでｎは０、１、２または３であり、およびＲ５は独立して、式Ｉと同様の意味を表す。）
【請求項２】
式Ｉにおいて、Ｒ５がＣＨ３であり、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である請求項１記載の方法。
【請求項３】
式Ｉにおいて、Ｒ５がＣＨ３であり、Ｒ１およびＲ４がＨであり、およびＲ２およびＲ３が独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である請求項２記載の方法。
【請求項４】
式Ｉにおいて、Ｒ５がＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４がＨであり、およびＲ３がＯＨである請求項３記載の方法。
【請求項５】
式ＩＩにおいて、ｎが１であり、Ｒ５がＯＨであり、およびＲ１、Ｒ２およびＲ３が独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である請求項１記載の方法。
【請求項６】
式ＩＩにおいて、ｎが１であり、Ｒ５がＯＨであり、Ｒ１がＨであり、およびＲ２およびＲ３が独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である請求項５記載の方法。
【請求項７】
式ＩＩにおいて、ｎが１であり、Ｒ５がＯＨであり、およびＲ１、Ｒ２およびＲ３がＨである請求項６記載の方法。
【請求項８】
キノン系化合物または製薬上容認できるその塩、および製薬上容認できるキャリアーまたは希釈剤を含有する医薬組成物であって、前記化合物が下記式ＩまたはＩＩの化合物を包含する医薬組成物。
【化３】
2004521068.tif 000014
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３またはハロゲン（Ｂｒ、Ｃｌ、ＦまたはＩ）であり、Ｒ５は独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３またはＮＲ６Ｒ７であり、ここで、Ｒ６およびＲ７は独立して、ＨまたはＣ１〜４アルキルである。）
【化４】
2004521068.tif 000015
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、上記と同様の意味を表し、およびＲ８は、（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＯ−Ｒ５であり、ここでｎは０、１、２または３であり、およびＲ５は独立して、式Ｉと同様の意味を表す。）
【請求項９】
式Ｉにおいて、Ｒ５がＣＨ３であり、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１０】
式Ｉにおいて、Ｒ５がＣＨ３であり、Ｒ１およびＲ４がＨであり、およびＲ２およびＲ３が独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
式Ｉにおいて、Ｒ５がＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４がＨであり、およびＲ３がＯＨである請求項１０記載の医薬組成物。
【請求項１２】
式ＩＩにおいて、ｎが１であり、Ｒ５がＯＨであり、およびＲ１、Ｒ２およびＲ３が独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１３】
式ＩＩにおいて、ｎが１であり、Ｒ５がＯＨであり、Ｒ１がＨであり、およびＲ２およびＲ３が独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である請求項１２記載の医薬組成物。
【請求項１４】
式ＩＩにおいて、ｎが１であり、Ｒ５がＯＨであり、およびＲ１、Ｒ２およびＲ３がＨである請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ステロイド、グルココルチコイド、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１抗体、抗ＩＦＮ−γ抗体、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１０またはこれらの組み合わせを更に含有する請求項８記載の医薬組成物。
【請求項１６】
キノン系化合物または製薬上容認できるその塩、および製薬上容認できるキャリアーまたは希釈剤を含有する医薬組成物であって、前記キノン系化合物が、ＭＩＦタンパク質のアミノ酸残基と安定な共有結合性の相互作用（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を形成する医薬組成物。
【請求項１７】
前記化合物が、置換イミノキノン化合物または置換オルトキノン化合物である請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ステロイド、グルココルチコイド、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１抗体、抗ＩＦＮ−γ抗体、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１０またはこれらの組み合わせを更に含有する請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１９】
炎症性疾患、関節炎、増殖性の血管疾患、ＥＡＥ、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、サイトカイン媒介毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦ媒介条件、自己免疫疾患、腫瘍成長または血管形成、あるいは局所または全身性のＭＩＦ放出または合成を特徴とする状態の治療方法であって、有効量のキノン系化合物の投与を含み、該キノン系化合物が、ＭＩＦタンパク質のアミノ酸残基と安定な共有結合性の相互作用を形成することを特徴とする治療方法。
【請求項２０】
前記化合物が、置換イミノキノン化合物または置換オルトキノン化合物である請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、置換されたイミノキノンおよびオルトキノン環系を任意に包含する低分子量化合物の関連種に関する使用方法および医薬組成物を提供する。前記化合物はＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）拮抗作用を示し、かつその有用性が見出されている。前記ＭＩＦ拮抗剤は、例えば自己免疫疾患、喘息、関節炎、ＥＡＥ、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）および様々な形態の敗血症および敗血症性ショックなどのような炎症作用または炎症誘発性のサイトカイン応答を伴う種々の疾病や、腫瘍成長および新血管新生を含むＭＩＦ応答の根底にある前記以外の状態を治療する方法において有用である。
【０００２】
発明の背景
マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）は、最も早期に開示されたサイトカインの一つであり、広範な細胞および生物学的活性を有する免疫調節性タンパク質である（例えば、スウォープおよびロリス著、Ｒｅｖ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第１３９巻；１〜３２頁、１９９９年、メッツおよびブカラ著、Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．第６６巻、１９７〜２２３頁、１９９７年、およびブカラ著、ＦＡＳＥＢジャーナル第１４巻、１６０７〜１６１３頁、１９９６年を参照のこと）。当初、ＭＩＦは、活性化されたリンパ球様の細胞によって分泌され、マクロファージのランダムな遊走を抑制し、しかも遅延型過敏症反応に付随するものと考えられていた（ジョージおよびヴォーン著、Ｐｒｏｃ． Ｓｏｃ． Ｅｘｐ． Ｂｉｏｌ． Ｍｅｄ．第１１１巻、５１４〜５２１頁、１９６２年、ヴァイザーら著、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１２６巻、１９５８〜１９６２頁、１９８１年、ブルームおよびベネット著、サイエンス第１５３巻、８０〜８２頁、１９６６年、デイヴィット著、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ第５６巻、７２〜７７頁、１９６６年）。ＭＩＦは、マクロファージの癒着、食作用および殺腫瘍性活性を高めることも分かった（ネイザンら著、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．第１３７巻、２７５〜２８８頁、１９７３年、ネイザンら著、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．第１３３巻、１３５６〜１３７６頁、１９７１年、チャーチルら著、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１１５巻、７８１〜７８５頁、１９７５年）。残念な事に、多くの初期の研究では、マクロファージ遊走阻止作用も示すＩＦＮ−γやＩＬ−４などの他のサイトカインを含有することが後に明らかになった混成培養の上澄みを使用していた（マッキーンおよびレニック著、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．第１６７巻、５９８〜６１１頁、１９８８年、ツールマンら著、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１３４巻、３０５〜３０９頁、１９８５年）。これは、ＭＩＦとして定義された単一のタンパク質に対する特異的な生物学的活性の歴史的な特質を幾分疑わしいものにした。組換え型ＭＩＦの有効性には、その生物学的活性の確認とそれ以外の活性の識別も斟酌されていた。
【０００３】
組換え型ヒトＭＩＦは、本来、ヒトＴ細胞ライブラリからクローン化されものであって（ヴァイザーら著、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ第８６巻、７５２２〜７５２６頁、１９８９年）、血液由来のマクロファージを活性化して細胞間の寄生虫や腫瘍細胞を試験管内（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で殺傷すること、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα発現をシミュレートすること、および一酸化窒素合成を誘導することが示された（ヴァイザーら著、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４７巻、２００６〜２０１１頁、１９９１年、ポッチら著、Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｌ．第１４５巻、３７２〜３７９頁、１９９２年、ヴァイザーら著、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ第８９巻、８０４９〜８０５２頁、１９９２年、クーナら著、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５０巻、１９０８〜１９１２頁、１９９３年）。これら初期の論文から得られる結論は、使用された組換え型ＭＩＦ標本中の生理活性な分裂促進的汚染の存在で混乱させられている一方で、ＭＩＦの有効な炎症誘発活性が、この複雑な因子の影響を受けない別の研究で再調査されている（ブカラ著、ＦＡＳＥＢジャーナル第１０巻、１６０７〜１６１３頁、１９９６年に記載）。
【０００４】
より最近のＭＩＦ研究は、様々の正常な恒常性設定および病態生理学的な設定においてＭＩＦの生物学的な役割を確立するために、精製された形態の組換え型ＭＩＦの産生や、ＭＩＦ特異性多クローン性抗体および単クローン性抗体の開発に乗じている（ライスら著、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３３巻、２４３〜２５２頁、１９９８年に記載）。同時に、これら最近の論文の最も重要な洞察は、ＭＩＦが、免疫系のサイトカイン生成物であるのみならず、内分泌系、特に下垂体のホルモン様生成物でもあるという認知である。この研究は、グルココルチコイド（内因的に放出されたものと治療上投与されたものの両者）の抗炎症性効果の対抗制御因子（ｃｏｕｎｔｅｒ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）としてのＭＩＦの有効な活性を、炎症性応答の重症度を制限および抑制するグルココルチノイドの正常な活性がＭＩＦによって抑制されるという効果と共に強調している。すなわち、内因性のＭＩＦ応答は、種々の炎症性の疾患および状態における原因または悪化因子と考えられる（ドネリーおよびブカラ著、モレキュラー・メディスン・トゥデイ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｔｏｄａｙ）第３巻、５０２〜５０７頁、１９９７年に記載）。
【０００５】
ＭＩＦは、遅延型過敏性反応との長年仮説として取り上げられている関係以外に、幾つかの生態学的機能を有していることが分かっている。例えば、上述のように、マクロファージやＴ細胞によって放出されたＭＩＦは、グルココルチコイドの生理的な濃度に応じて、下垂体媒介物として作用する（ブカラ著、ＦＡＳＥＢジャーナル第１４巻、１６０７〜１６１３頁、１９９６年）。このことは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−８レベルの変化によって、グルココルチコイド免疫抑制作用の最も重要な効果を導く。ＭＩＦの別の生物学的活性には、刺激されたＴ細胞の調節（バッチャーら著、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ第９３巻、７８４９〜７８５４頁、１９９６年）、ＩｇＥ合成の制御（ミカヤマら著、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ第９０巻、１００５６〜６０頁、１９９３年）、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質の機能の失活（ハドソンら著、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．第１９０巻、１３７５〜１３８２頁、１９９９年）、グルコースおよび炭化水素代謝の調節（サカウエら著、Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．第５巻、３６１〜３７１頁、１９９９年）、および腫瘍細胞成長および腫瘍血管形成の減弱（チェズニーら著、Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．第５巻、１８１〜１９１頁、１９９９年、シミズら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．第２６４巻、７５１〜７５８頁、１９９９年）が包含される。
【０００６】
ＭＩＦは、かなりの配列相同性（３６％同一性）をＤ−ドーパクロム・トートメラーゼと共有し、しかもＭＩＦは、非生理的物質であるＤ−ドーパクロムや（ローゼングレンら著、Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．第２巻、１４３〜１４９頁、１９９６年）Ｌ−ドーパクロムメチルエステル（ベンドラットら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３６巻、１５３５６〜１５３６２頁、１９９７年）の互変異性（ｔａｕｔｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を触媒作用する酵素活性を示す（図１Ａ）。加えて、フェニルピルビン酸およびｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸（ローゼングレンら著、ＦＥＢＳレター第４１７巻、８５〜８８頁、１９９７年）、そして３，４−ジヒドロキシフェニルアミンクロームおよびノルエピネフリンクローム（マツナガら著、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．第２７４巻、３２６８〜３２７１頁、１９９９年）もＭＩＦ基質であるが、これら試薬のうちどの互変異性がＭＩＦについての本来の機能を包含するのは分からない。
【０００７】
ヒトＭＩＦの３次元結晶構造は、そのタンパク質がホモトリマーとして存在し（ロリスら著、Ｐｒｏｃ． Ａｓｓ． Ａｍ． Ｐｈｙｓ．第１０８巻、４１５〜４１９頁、１９９６年）、そして４−オキサルオクトネート・トートメラーゼ、５−（カルボキシメチル）−２−ヒドロキシムコネート・イソメラーゼ、コリスメート・ムターゼや、Ｄ−ドーパクロム・トートメラーゼと実質上関連していることを示す（スヴォープら著、ＥＭＢＯジャーナル第１７巻、３５３４〜３５４１頁、１９９８年、スギモトら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３８巻、３２６８〜３２７９頁、１９９９年）。最近、前記結晶構造が、ヒトＭＩＦとｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸で形成された複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）であると報告された（ルベツスキーら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３８巻、７３４６〜５４頁、１９９９年）。基質は、アミノ終端で疎水性空洞と結合しており、サブユニットの一つではＰｒｏ−１、Ｌｙｓ−３２およびＩｌｅ−６４と、また隣接するサブユニット中ではＴｙｒ−９５およびＡｓｎ−９７とそれぞれ相互作用していると報告されている。マウスＭＩＦと（Ｅ）−２−フルオロ−ｐ−ヒドロキシシンナメートの間でも同様の相互作用が報告されている（タイラーら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３８巻、７４４４〜７４５２頁、１９９９年）。ＮＭＲを用いた解析研究は、アミノ末端の疎水性空洞内でのｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸とＰｒｏ−１の間の相互作用の更なる証拠を立証している（スヴォープら著、ＥＭＢＯジャーナル第１７巻、３５３４〜３５４１頁、１９９８年）。
【０００８】
突然変異の研究は、Ｐｒｏ−１がＭＩＦの触媒作用的な機能に必要であるという納得のいく証拠を与えている。Ｐｒｏ−１の欠失またはＰｒｏ−１とＳｅｒ（ベンドラットら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３６巻、１５３５６〜１５３６２頁、１９９７年）、Ｇｌｙ（スウォープら著、ＡＭＢＯジャーナル第１７巻、３５３４〜３５４１頁、１９９８年）またはＰｈｅ（ヘルマノウスキー−ウォサッカら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３８巻、１２８４１〜１２８４９頁、１９９９年）との置換、そしてＰｒｏ−１へのＮ−末端ペプチドタグの付加（ベンドラットら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３６巻、１５３５６〜１５３６２頁、１９９７年）は、Ｌ−ドーパクロムメチルエステルおよびｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸を用いたアッセイにおいてＭＩＦの触媒活性を抑制した。同様の活性低下は、Ｐｒｏ−１とＭｅｔ−２の間へのＡｌａの挿入や（ルベツスキーら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３８巻、７３４６〜５４頁、１９９９年）、Ｐｒｏ−１の３−ブロモピルビン酸エステルによる誘導体化（スタンプスら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３７巻、１０１９５〜１０２０２頁、１９９８年）によっても観察された。
【０００９】
しかし、酵素と生物学的な活性の関係には不明な点が残っている。ＰｒｏからＳｅｒへのＭＩＦ変異体は、ＰｒｏからＰｈｅへの変異体と同様に、グルココルチコイド対抗−制御活性を示し（ベンドラットら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３６巻、１５３５６〜１５３６２頁、１９９７年）、単球走化性を完全に抑制できた（ヘルマノウスキー−ウォサッカら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３８巻、１２８４１〜１２８４９頁、１９９９年）。対照して、ＰｒｏからＧｌｙへのＭＩＦ変異体は、その活性が大きく低下して、活性化された好中球の超酸化物の発現を刺激した（スウォープら著、ＥＭＢＯジャーナル第１７巻、３５３４〜３５４１頁、１９９８年）。これらの結果は、酵素不活性なＭＩＦ変異体の特異的な生物学活性が、特異的な突然変異には差別的に鋭敏であって、生物学的な機能を評価するのに用いられる特異性アッセイでは別の効果を表すかもしれないことを示唆している。
【００１０】
この分野では、ＭＩＦ拮抗剤として機能し、しかもより大きなオリゴマー性タンパク質（例えば、抗体）や核酸系（例えば、アンチセンス）治療薬に対する小さな有機分子治療学の利点も有する小さな有機分子を見出して開発する必要がある。治療上有望な低分子量ＭＩＦ抑制剤は、内毒系−および外毒系−誘発毒性ショック（ベルンハーゲンら著、Ｎａｔｕｒｅ第３６５巻、７５６〜７５９頁、１９９３年、コバヤシら著、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ第２９巻、１７５２〜１７５９頁、１９９９年、カレンドラら著、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ第９５巻、１１３８３〜１１３８８頁、１９９８年、およびマキタら著、Ａｍ． Ｊ． Ｒｅｓｐｉｒ． Ｃｒｉｔ． Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．第１５８巻、５７３〜５７９頁、１９９８年）、Ｔ−細胞活性（ベイカーら著、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ第９３巻、７８４９〜７８５４頁、１９９６年）、リウマチ性関節炎（キタイチら著、Ｃｕｒｒ． Ｅｙｅ Ｒｅｓ．第２０巻、１０９〜１１４頁、２０００年、リーチら著、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．第４２巻、１６０１〜１６０８頁、１９９９年）を含む自己免疫疾患（例えば、移植片体宿主病、インシュリン依存性糖尿病および種々の狼瘡形態）、創傷の治癒（アベら著、Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ第１５００巻、１〜９頁、２０００年）および血管形成（シミズら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．第２６４巻、７５１〜７５８頁、１９９９年）のモデルにおいて抗−ＭＩＦ抗体の活性を実質上示す。低分子量抗−ＭＩＦ拮抗剤（薬）は、治療薬が経口的に活性であるかまたは一般にはより容易に投与できることから、中和抗体や核酸系試薬と比較して臨床的な利点を提供し、より良好な生物学的利用能を示し、しかも高い体内分布を有し得るが、非常に安価に製造されなければならない。本発明以前は、有効な低分子量ＭＩＦ抑制剤を開示した唯一の論文が、マウスＭＩＦのドーパクロム・トートメラーゼ活性を可逆的に抑制する幾つかの一般に提供されている長鎖脂肪酸と関連していた（ベンドラットら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３６巻、１５３５６〜１５３６２頁、１９９７年）。これら脂肪酸は、ＭＩＦ活性の生物学的アッセイにおける効果について試験されていなかった。
【００１１】
発明の要旨
ＭＩＦの酵素活性（トートメラーゼ）およびそれを受け入れる基質は、ＭＩＦと結合してその生物学的活性を破壊する低分子量試薬の設計のための酵素活性アッセイを提供する。本発明は、イミノキノン系またはオルトキノイド型構造を有する前記化合物の２種の関連種に関する使用方法を提供する。イミノキノン由来の化合物は、アセトアミノフェンやその活性な代謝産物のうち幾つかと同族である。これら試薬は、ＭＩＦと共有結合的に反応し、その酵素活性を阻害して、ＭＩＦの生物学的活性に影響を及ぼす。
【００１２】
本発明は、関節炎、増殖性の血管疾患、ＥＡＥ、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、サイトカイン媒介毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦ媒介条件、自己免疫疾患（限定されないが、リウマチ性関節炎、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、ループス症候群を包含する）を非限定的に包含する炎症性疾患、腫瘍成長または血管形成、あるいは局所または全身性のＭＩＦ放出または合成を特徴とする状態の治療方法であって、有効量の下記式ＩまたはＩＩの化合物を投与することを含む治療方法を提供する。
【化５】
2004521068.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３またはハロゲン（Ｂｒ、Ｃｌ、ＦまたはＩ）であり、Ｒ５は独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３またはＮＲ６Ｒ７であり、ここで、Ｒ６およびＲ７は独立して、ＨまたはＣ１〜４アルキルである。）
【化６】
2004521068.tif 000004
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、上記と同様の意味を表し、およびＲ８は、（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＯ−Ｒ５であり、ここでｎは０、１、２または３であり、およびＲ５は独立して、式Ｉと同様の意味を表す。）
【００１３】
式Ｉにおいて、好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式Ｉにおいて、より好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１およびＲ４はＨであり、そしてＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式Ｉにおいて、更に好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４はＨであり、そしてＲ３はＯＨである。式ＩＩにおいて、好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式ＩＩにおいて、より好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、Ｒ１はＨであり、そしてＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式ＩＩにおいて、更に好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３はＨである。
【００１４】
更に、本発明は、キノン系化合物または製薬上容認できるその塩、および製薬上容認できるキャリアーまたは希釈剤を含有する医薬組成物であって、前記化合物が下記式ＩまたはＩＩの化合物を含有する医薬組成物を更に提供する。
【化７】
2004521068.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３またはハロゲン（Ｂｒ、Ｃｌ、ＦまたはＩ）であり、Ｒ５は独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３またはＮＲ６Ｒ７であり、ここで、Ｒ６およびＲ７は独立して、ＨまたはＣ１〜４アルキルである。）
【化８】
2004521068.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、上記と同様の意味を表し、およびＲ８は、（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＯ−Ｒ５であり、ここでｎは０、１、２または３であり、およびＲ５は独立して、式Ｉと同様の意味を表す。）
【００１５】
式Ｉにおいて、好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式Ｉにおいて、より好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１およびＲ４はＨであり、そしてＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式Ｉにおいて、更に好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４はＨであり、そしてＲ３はＯＨである。式ＩＩにおいて、好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式ＩＩにおいて、より好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、Ｒ１はＨであり、そしてＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式ＩＩにおいて、更に好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３はＨである。
【００１６】
好ましくは、本発明の医薬組成物は、ステロイド、グルココルチコイド、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１抗体、抗ＩＦＮ−γ抗体、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１０またはこれらの組み合わせを更に含有する。
【００１７】
本発明は、キノン系化合物および製薬上容認できるキャリアーを含有する医薬組成物であって、前記キノン系化合物が、ＭＩＦタンパク質のアミノ酸残基と安定な共有結合性の相互作用を形成する、医薬組成物も提供する。好ましくは、前記化合物は、置換イミノキノン化合物または置換オルトキノン化合物である。好ましくは、本発明の医薬組成物は、ステロイド、グルココルチコイド、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１抗体、抗ＩＦＮ−γ抗体、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１０またはこれらの組み合わせを更に含有する。
【００１８】
本発明は、関節炎、増殖性の血管疾患、ＥＡＥ、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、サイトカイン媒介毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦ媒介条件、自己免疫疾患（限定されないが、リウマチ性関節炎、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、ループス症候群を包含する）を非限定的に包含する炎症性疾患、腫瘍成長または血管形成、あるいは局所または全身性のＭＩＦ放出または合成を特徴とする状態の治療方法であって、有効量のキノン系化合物の投与を含み、前記キノン系化合物が、ＭＩＦタンパク質のアミノ酸残基と安定な共有結合性の相互作用を形成する、治療方法も提供する。好ましくは、前記化合物は、置換イミノキノン化合物または置換オルトキノン化合物である。
【００１９】
図面の簡単な説明
Ｆｉｇｕｒｅ１は、（Ａ）ドーパクロムメチルエステル（１、ＭＩＦの酵素アッセイで用いられる色素生産性基質）およびその互変異化された無色の生成物（２）の構造、および（Ｂ）アセトアミノフェン（３）およびその肝性酸化（ｈｅｐａｔｉｃ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）生成物（化合物４〜６）の構造を表す。
Ｆｉｇｕｒｅ２は、アセトアミノフェン（３）およびその代謝産物（４〜６）による組換え型ヒトＭＩＦの酵素活性の抑制を表す。ＭＩＦ（０．７２μｇ／ｍＬ）を、種々の濃度の抑制剤で５分間処理して、未処理の対象と比較したトートメラーゼ酵素活性への影響を、ドーパクロムメチルエステル（１）を基質として用いて求めた。ＮＡＰＱＩ（４）は有効な抑制剤である。
Ｆｉｇｕｒｅ３は、血清タンパク質の存在下での化合物４による組換え型ヒトＭＩＦの酵素活性の抑制を表す。ＭＩＦは、ウシ胎児血清を含有する溶液で希釈して（０．７２μｇ／ｍＬ最終濃度）、化合物４（ＤＭＳＯ中、５０ｍＭ）を最終濃度０．２ｍＭに添加した。酵素活性は、ＭＩＦを含有しない理想的な対照溶液と比較して、ドーパクロムメチルエステル（１）を基質として用いて２０分後に求めた。ＮＡＰＱＩによるＭＩＦの抑制は、ウシタンパク質の存在下でも生じた（特異性の表示）。
Ｆｉｇｕｒｅ４は、化合物４で処理したヒトＭＩＦの還元性（Ａ）および非還元性（Ｂ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１８％アクリルアミド）分析を用いた化学変性ＭＩＦの分析を表している。Ｆｉｇｕｒｅ４（Ａ）および４（Ｂ）において、ＭＩＦ（０．３６ｍｇ／ｍＬ）は、非処理（レーン１）、またはＤＭＳＯ（化合物４用の溶媒、レーン２、０％酵素抑制）、化合物４ ４９．５μＭ（レーン３、３７％酵素抑制）、化合物４ １９０μＭ（レーン４、９４％酵素抑制）および化合物４ ５００μＭ（レーン５、１００％酵素抑制）で１５分処理した。標準タンパク質の分子量（ｋＤａ）を（Ａ）に示す。Ｆｉｇｕｒｅ４（Ｃ）および４（Ｄ）は、未変性の組換え型ヒトＭＩＦ（予想される分子量１２．３４５ｋＤａ）および組換え型ヒトＭＩＦ（３６０μｇ／ｍＬを化合物４ ２００μＭでインキュベートしたもの）のＭＡＬＤＩ質量スペクトルをそれぞれ表している。１：１（１２．４９４ｋＤａ）および１：２（１２．６４３ｋＤａ）ＭＩＦの化合物４共有付加物に関して予想される質量は、１２．４９１ｋＤａおよび１２．６４５ｋＤａにおける測定値の３原子質量単位以内である。これらのデータは、化合物４がＭＩＦを化学変性して、安定な共有結合複合物を形成することを表している。
【００２０】
Ｆｉｇｕｒｅ５は、分化したＬ６筋肉細胞内でのフルクトース−２，６−二リン酸エステル（Ｆ２，６ＢＰ）生成における組換え型マウスＭＩＦ試料の影響を表している。Ｌ６細胞培養液を、１０ｎｇ／ｍＬマウスＭＩＦで処理するか、または化合物４（１６７μＭ、９６％酵素活性抑制）または化合物６（３３μＭ、１００％酵素活性抑制）およびＦ２，６ＢＰで前処理（複合化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ））した等量のＭＩＦで処理し、その培養液上澄みにおいて測定した。得られたデータは、ＭＩＦと化合物４または６との複合物（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）が、Ｌ６ラット筋芽細胞による高いＦ２，６ＢＰ産生を誘導できなかったことを示している。
Ｆｉｇｕｒｅ６は、細胞のアラキドン酸放出のＭＩＦ媒介誘発におけるＮＡＰＱＩ（４）の影響を表している。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を１μＭ［１４Ｃ］アラキドン酸でラベルした。一晩培養した後、細胞を大量のＰＢＳで洗浄し、次いでＭＩＦまたはＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）複合物の適当な試料を全く同様に添加した。その後、培養培地へのアラキドン酸の放出を測定した。得られたデータは、非変性のＭＩＦとは異なり、ＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）複合物がＮＩＨ／３Ｔ３細胞からのアラキドン酸放出を誘発しないことを示している。
Ｆｉｇｕｒｅ７は、ＭＩＦをＮＡＰＱＩ（４）と共にインキューベーションした後の、抗ＭＩＦ抗体との免疫交差反応性の低下を表している。ＭＩＦについての標準ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）で評価したところ、抗ＭＩＦ抗体は、非変性のＭＩＦよりも非常に少ないＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ複合物（約５μＭ〜５００μＭの濃度のＮＡＰＱＩ（４）を、約０．１〜１０μｇ／ｍＬの濃度のＭＩＦと共に、別のタンパク質を含むまたは含まないバッファー中、室温で約０．５〜５０分間インキュベートしたもの）を束縛した（ｂｏｕｎｄ）。
【００２１】
発明の詳細な説明
定義：抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１抗体および抗ＩＦＮ−γ抗体は、ＴＮＦα、ＩＬ−１またはＩＦＮ−γそれぞれの１以上のエピトープ、ＴＮＦα、ＩＬ−１またはＩＦＮ−γそれぞれの保存変異種、あるいはＴＮＦα、ＩＬ−１またはＩＦＮ−γそれぞれのペプチド断片を特異的に認識する抗体をいい、限定されないが、多クローン性抗体、単クローン性抗体（ｍＡｂｓ）、ヒト化またはキメラ抗体、単鎖の抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって産生される断片、抗イディオタイプの（抗Ｉｄ）抗体、および前記抗体の各エピトープ結合断片を包含する。
【００２２】
本発明は、前記式Ｉおよび式ＩＩで表される２種のＭＩＦ拮抗性化合物関連種を提供する。ここで、式Ｉは、
【化９】
2004521068.tif 000007
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３またはハロゲン（Ｂｒ、Ｃｌ、ＦまたはＩ）であり、Ｒ５は独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３またはＮＲ６Ｒ７であり、ここで、Ｒ６およびＲ７は独立して、ＨまたはＣ１〜４アルキルである。）
であり、および式ＩＩは
【化１０】
2004521068.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、上記と同様の意味を表し、およびＲ８は、（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＯ−Ｒ５であり、ここでｎは０、１、２または３であり、およびＲ５は独立して、式Ｉと同様の意味を表す。）
である。
【００２３】
式Ｉにおいて、好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式Ｉにおいて、より好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１およびＲ４はＨであり、そしてＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式Ｉにおいて、更に好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４はＨであり、そしてＲ３はＯＨである。式ＩＩにおいて、好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式ＩＩにおいて、より好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、Ｒ１はＨであり、そしてＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式ＩＩにおいて、更に好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３はＨである。
【００２４】
前記化合物種は、試験管内でのＭＩＦ酵素活性の抑制によりＭＩＦ拮抗剤として定義される。前記化合物は、ＭＩＦの共有結合性誘導体化（ｃｏｖａｌｅｎｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ）により作用すると考えられ、この仮説についての支持は、前記化合物を用いた処理により、および化合物への曝露後の、抗ＭＩＦ拮抗剤との免疫学的な交差反応性の低下により誘導体化されるＭＩＦの質量分析特性から生じる。ＭＩＦ拮抗作用の別の徴候は、ＭＩＦの生理活性が、前記式Ｉおよび式ＩＩで表される化合物で処理した後で低下することを示す細胞単位のバイオアッセイで証明された。
【００２５】
ＭＩＦは、ドーパクロム系ＭＩＦ基質の無色の生成物への互変異化を触媒作用する。以降の表１（化合物１〜１８を表す）では、ＭＩＦトートメラーゼアッセイにおいて１６個の化合物のＩＣ５０値を示した。特に断りのない限り、抑制濃度（例えば、ＩＣ５０または他の活性指数）への言及は、ＭＩＦトートメラーゼアッセイにおける試験化合物の抑制活性をいう（これは、以降に更に詳細に説明し、またベントラットら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３６巻、１５３５６〜１５３６２頁、１９９７年にも記載されている）。
【００２６】
ＭＩＦトートメラーゼ活性
ＭＩＦは、互変異化（すなわちケト−エノール異性化）反応を触媒作用する（ローゼングレンら著、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ第２巻、１４３〜１４９頁、１９９６年）。最も活性な基質は、ドーパクロムの非生理学的なＤ−異性体である。この反応は、治療上のＭＩＦ拮抗剤を予測する（１９９６年２月１６日出願の継続中の米国特許出願第０８／６０２，９２９号および１９９９年２月２９日出願の米国特許仮出願第６０／１６２，４６７号を参照し、これらの開示内容を全てここに参照として挿入する。）。ＭＩＦトートメラーゼ活性の抑制は、ＭＩＦ生物学的活性の抑制を予測する。
【００２７】
ＭＩＦドーパクロム・トートメラーゼ活性についてのアッセイを行う方法は、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンメチルエステルなどのＤＯＰＡ系基質前駆体の調製および酸化から開始する。この酸化は、例えば、過ヨウ素酸ナトリウムを用いて、対応するドーパクロム誘導体を生成する（例えば、Ｌ−３，５−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−５−オキソ−２−２Ｈ−インドール−２−カルボン酸メチルエステル（１）（「ドーパクロムメチルエステル」）、Ｆｉｇｕｒｅ１の化合物１参照）。これは橙色であり、トートメラーゼとして、ＭＩＦの酵素活性のための測光アッセイで使用される汎用の基質を含有する。ＭＩＦ（一般に、最終濃度５０〜１０００ｎｇ／ｍＬの組換え型ＭＩＦの精製製剤）を添加すると、着色したドーパクロム基質が無色の５，６−ジヒドロキシインドール−２−カルボン酸メチルエステル生成物（２）へと互変異化する（Ｆｉｇｕｒｅ１）。ＭＩＦの酵素活性は、好適なバッファー中のドーパクロム系基質の着色溶液の退色速度として測定される。吸光度を約４７５ｎｍ（または０．５ｎＭ過剰の基質濃度では、５５０ｎｍ）で測定する。試験化合物はアッセイ溶液に包含されていることがあり、それによって、ＭＩＦトートメラーゼ活性に対する試験化合物の（すなわち抑制剤としての）効果が、基質の酸化の動力学変化を、試験抑制剤化合物の不存在下で行われる対照アッセイと比較して記すことによって測定される。特に、ＭＩＦトートメラーゼアッセイは、本質的には以下のように行われる。
【００２８】
Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンメチルエステル（例えば、シグマ社製Ｄ−１５０７）はドーパクロム基質前駆体であり、重水（ｄｄ Ｈ２Ｏ）中で４ｍＭ溶液として調製する。過ヨウ素酸ナトリウムは重水中で８ｍＭ溶液として調製する。アッセイバッファー（Ａｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭリン酸カリウム／１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０）を調製する。精製した組換え型ＭＩＦは、ＭＩＦに最終濃度約７００ｎｇ／ｍＬで供給するのに便利な原液として、１５０ｍＭ ＮａＣｌ／２０ｍＭ トリスバッファー（Ｔｒｉｓ ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ７．４）中で調製する。アッセイを開始する直前に、ドーパクロム基質前駆体溶液３．６ｍＬ、過ヨウ素酸塩溶液２．４ｍＬおよびアッセイバッファー４．０ｍＬを合わせて均一な混合物にする（このドーパクロム基質の調製は、１分後およびそれから約３０分後までにアッセイに使用するのに適している）。次いで、試験化合物（一般に、ＤＭＳＯ中で濃縮原液として調製されるもの）とＭＩＦを、アッセイバッファー０．７ｍＬおよびドーパクロム基質溶液０．３ｍＬと混合し、所望の最終濃度の試験化合物を均質な混合物中に提供する。このアッセイ混合物の光学濃度（吸光度）を４７５ｎｍでモニターする。通常、ＯＤ４７５を５秒毎に０〜６０秒間記録し、特定の時間点におけるそのＯＤ４７５を、これと同時に行われる、ＭＩＦを添加していないかまたは試験化合物を省いたアッセイと比較する。試験化合物によるＭＩＦトートメラーゼ活性の抑制は、アッセイ混合物の退色の抑制により、好ましくは２０秒時点で求められる。ＭＩＦトートメラーゼ抑制活性を有する化合物のＩＣ５０値を、ＭＩＦトートメラーゼ活性を５０％まで抑制する抑制剤の濃度に相応じて、ＭＩＦトートメラーゼアッセイからの結果を幾つかの異なる抑制剤濃度で内挿することにより求める。得られたＩＣ５０値は、試験化合物のＭＩＦ酵素抑制活性とＭＩＦの生物学的活性の抑制との間に妥当な相互関係を提供する（以降参照）。
【００２９】
治療方法および医薬組成物
ＭＩＦトートメラーゼアッセイは実施例１および２で使用した。これらは、特定のキノン様の化合物（任意に置換イミノキノンおよび誘導体化オルトキノン）がＭＩＦ酵素活性を抑制することを示している。実施例３では、質量分析およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を更に用いて、前記キノン様の化合物が、ＭＩＦタンパク質分子の１個以上のアミノ酸残基と安定な共有結合性の相互作用を形成することを示した。言いかえると、キノン様のＭＩＦ拮抗剤化合物は、ＭＩＦと共有結合する。最後に、実施例４は、ＭＩＦ生物学的活性のアッセイで測定されるように、特定のキノン系化合物が、ＭＩＦ酵素活性（すなわちトートメラーゼ）を特異的に抑制するだけでなく、ＭＩＦ免疫調節性活性をも抑制することを示している。前記データは、ＭＩＦトートメラーゼ酵素活性アッセイと生物学的アッセイにおけるＭＩＦ拮抗作用の間に妥当な相互関係を提供する。集合的には、前記データは、ＭＩＦトートメラーゼアッセイでのある化合物による抑制が、ＭＩＦ生物学的活性を抑制する場合の治療法上の使用を予測することを表す。
【００３０】
すなわち、本発明の実施例に基づいて、理論に縛られるわけではないが、特定のキノン系化合物は、ＭＩＦを共有結合的に誘導体化してよい。このような誘導体化は、ＭＩＦトートメラーゼ活性を抑制し、単クローン性抗ＭＩＦ抗体による交差反応性の低下で表されるような、ＭＩＦタンパク質表面の臨界的な変化と、ＭＩＦ活性の生物活性のＭＩＦ生物活性の低下を誘発する。
【００３１】
従って、本発明は、ヒトＭＩＦを、ヒトＭＩＦのアミノ酸残基と安定な共有結合性相互作用を形成するキノン系化合物または当該化合物の組み合わせに接触させることを含む、ヒトＭＩＦの酵素活性および生物学的活性を不活性化する方法を提供する。好ましくは、安定な共有結合性相互作用は、ヒトＭＩＦのＮ−末端プロリン残基によるものである。好ましくは、前記化合物は、置換イミノキノン化合物または置換オルトキノン化合物である。好ましくは、前記化合物は、以下の式Ｉまたは式ＩＩで表されるものである。ここで、式Ｉは、
【化１１】
2004521068.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３またはハロゲン（Ｂｒ、Ｃｌ、ＦまたはＩ）であり、Ｒ５は独立して、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＯＨ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ３またはＮＲ６Ｒ７であり、ここで、Ｒ６およびＲ７は独立して、ＨまたはＣ１〜４アルキルである。）
であり、および式ＩＩは
【化１２】
2004521068.tif 000010
（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、上記と同様の意味を表し、およびＲ８は、（ＣＨ＝ＣＨ）ｎ−ＣＯ−Ｒ５であり、ここでｎは０、１、２または３であり、およびＲ５は独立して、式Ｉと同様の意味を表す。）
である。
【００３２】
式Ｉにおいて、好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式Ｉにおいて、より好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１およびＲ４はＨであり、そしてＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式Ｉにおいて、更に好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４はＨであり、そしてＲ３はＯＨである。式ＩＩにおいて、好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式ＩＩにおいて、より好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、Ｒ１はＨであり、そしてＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式ＩＩにおいて、更に好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３はＨである。
【００３３】
本発明は、限定されないが、関節炎、増殖性の血管疾患、ＥＡＥ、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、サイトカイン媒介毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦ媒介条件、自己免疫疾患（限定されないが、リウマチ性関節炎、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、ループス症候群を包含する）を含む炎症性疾患、腫瘍成長または血管形成、あるいは局所または全身性のＭＩＦ放出または合成を特徴とする状態の治療方法であって、有効量の式Ｉまたは式ＩＩで表される化合物またはこれらの組み合わせを投与することを含む方法も提供する。
【００３４】
式Ｉにおいて、好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式Ｉにおいて、より好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１およびＲ４はＨであり、そしてＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式Ｉにおいて、更に好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４はＨであり、そしてＲ３はＯＨである。式ＩＩにおいて、好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式ＩＩにおいて、より好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、Ｒ１はＨであり、そしてＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式ＩＩにおいて、更に好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３はＨである。
【００３５】
本発明は、さらに、キノン系化合物またはその製薬上許容される塩、および製薬上許容されるキャリアまたは希釈剤を含有する医薬組成物であって、前記化合物が、式Ｉまたは式ＩＩで表される化合物またはこれらの組み合わせである、医薬組成物を提供する。
【００３６】
式Ｉにおいて、好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式Ｉにおいて、より好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１およびＲ４はＨであり、そしてＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式Ｉにおいて、更に好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４はＨであり、そしてＲ３はＯＨである。式ＩＩにおいて、好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式ＩＩにおいて、より好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、Ｒ１はＨであり、そしてＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式ＩＩにおいて、更に好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３はＨである。
【００３７】
本発明は、キノン系化合物またはその製薬上許容される塩、および製薬上許容されるキャリアまたは希釈剤を含有する医薬組成物であって、キノン系化合物が、ＭＩＦタンパク質のアミノ酸残基と安定な共有結合性の相互作用を形成することを特徴とする医薬組成物も提供する。好ましくは、前記化合物は、置換イミノキノン化合物または置換オルトキノン化合物である。好ましくは、前記化合物は、置換イミノキノン化合物である。好ましくは、前記化合物は、前記式Ｉまたは式ＩＩで表される化合物を包含する。
【００３８】
更に、本発明は、非限定的に、関節炎、増殖性の血管疾患、ＥＡＥ、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、サイトカイン媒介毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦ媒介条件、自己免疫疾患（限定されないが、リウマチ性関節炎、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、ループス症候群を包含する）を包含する炎症性疾患、腫瘍成長または血管形成、あるいは局所または全身性のＭＩＦ放出または合成を特徴とする状態の治療方法であって、該方法が、有効量のキノン系化合物またはその製薬上許容される塩、および製薬上許容されるキャリアを投与することを含み、キノン系化合物が、ＭＩＦタンパク質のアミノ酸残基と安定な共有結合性の相互作用を形成するものである治療方法も提供する。好ましくは、前記化合物は、置換イミノキノン化合物または置換オルトキノン化合物である。好ましくは、前記化合物は、前記式Ｉまたは式ＩＩで表される化合物を包含する。
【００３９】
本発明の治療方法の一例として、本発明のキノン様の化合物はＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）患者の治療に使用されてよい。ＡＲＤＳは、多くの場合、免疫応答中の動的バランスが過剰の炎症や細胞破壊に転じる典型的な臨床反応とみなされる。ＭＩＦは、ＩＩ型肺胞細胞と浸潤型免疫細胞の両者で表される。ＡＲＤＳ患者の気管支肺胞洗浄におけるＭＩＦ濃度は、対照被験者に比べてかなり高いことが分かった（ドネリーら著、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．第３巻、３２０〜３２３頁、１９９７年）。ヒトＭＩＦは、対照細胞と比べると、ＡＲＤＳ肺胞マクロファージからの（生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）での）ＴＮＦαおよびＩＬ−８分泌を共に増加させる。抗ＭＩＦ抗体を用いた前記細胞の前処理は、ＡＲＤＳ肺胞細胞からのＴＮＦαおよびＩＬ−８産生をかなり低減する。さらに、前述の「発明の背景」において説明したように、ｒＭＩＦ（組換え型ＭＩＦ）は、濃度依存形態で、ＡＲＤＳマクロファージ内でのサイトカイン分泌のグルココルチコイド媒介抑制を無効にすることが分かった。これらは、ＭＩＦ／グルココルチコイド二分子が、ヒトの病気中に生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）で炎症誘発性作用を生じる細胞内で活性であることを示す最初のデータであった（ドネリーら著、Ｎａｔ． Ｍｅｄ．第３巻、３２０〜３２３頁、１９９７年）。ＡＳＲＤに罹っていないヒトよりもＡＳＲＤに進行した危険な状態の患者内でかなり高い濃度の肺胞ＭＩＦが見つかった。ＭＩＦは、おそらく、重要な媒介物として作用して、ＡＲＤＳ患者の肺の炎症応答を促進しかつ支援する。ＡＲＤＳ患者におけるその突出した発現は、この疾患の劇症過程や、あるいはグルココルチコイド治療が定着した場合に何故あっけなく検証されているのかを説明し得る。従って、本発明のキノン系化合物を含有する医薬組成物は、原型炎症の効能として、ＡＲＤＳ患者の治療に使用できる。
【００４０】
本発明の方法の更なる例として、本発明のキノン系化合物は、リウマチ性関節炎の患者を治療するのに使用できる。リウマチ性関節炎の患者の患部関節から得られた滑液は、骨関節炎の患者または通常の対照被験者のものよりもかなり大量のＭＩＦを含んでいる（メッツおよびブカラ著、Ａｄｖ． ｉｍｍｕｎｏｌ．第６６巻、１９７〜２２３頁、１９９７年、リーチら著、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．第４１巻、９１０〜９１７頁、１９９８年、オノデラら著、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ第１１巻、１６３〜１６７頁、１９９９年）。免疫組織化学的染色法で分かるように、ヒト関節炎の関節内の浸潤単核細胞は、ＭＩＦの一次原因である。２種類の動物の関節炎モデルにおいて、中和抗ＭＩＦ抗体ｍＡｂ’ｓは、疾患の進行と疾患の重症度をかなり抑制し（リーチら著、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．第４１巻、９１０〜９１７頁、１９９８年、ミクロウスカ（Ｍｉｋｕｌｏｗｓｋａ）ら著、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１５８巻、５５１４〜５５１７頁、１９９７年）、免疫疾患における潜在的な治療上の使用のための望ましい別のＭＩＦ抑制剤の開発への刺激を与えた。すなわち、本発明のキノン系化合物を含有する医薬組成物は、関節炎患者へ使用できる。
【００４１】
本発明の治療方法の別の例において、本発明のキノン化合物を、アトピー性皮膚炎の患者を治療するのに使用できる。アトピー性皮膚炎は、慢性の掻痒症の炎症性皮膚疾患である。この原因は、幾分、末梢的な単核細胞による調節不全サイトカイン産生に起因すると考えられる。アトピー性皮膚炎患者からの障害において、ＭＩＦタンパク質は、ケラチノサイトによって高く発現されて、全表皮層に亙って広く分布している（シミズら著、ＦＥＢＳレター第３８１巻、１９９〜２０２頁、１９９６年）。正常なヒトの皮膚では、ＭＩＦは、主に表皮性ケタリノサイトに位置している。アトピー性皮膚炎患者の血清ＭＩＦ濃度は、対照被験者の６倍であった。アトピー性皮膚炎患者の血清ＭＩＦ濃度は、臨床特徴が改善すると低下した。これは、ＭＩＦは、皮膚炎の皮膚において免疫応答の中心的な役割を果たすことを提案していた。すなわち、本発明のキノン系化合物を含有する医薬組成物は、アトピー性皮膚炎の患者を治療するのに使用されてよい。
【００４２】
同様に、本発明は、限定されないが、増殖性の血管疾患、サイトカイン媒介毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦ媒介条件、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、ループス症候群、ＥＡＥを包含する他の炎症性または自己免疫疾患、および局所的または全身性のＭＩＦ放出または合成を特徴とするこれら以外の状態を治療または予防する方法も提供する。
【００４３】
本発明の治療方法の別の例において、本発明のキノン化合物は、腫瘍成長を患っている患者を治療するのにも使用できる。中和抗ＭＩＦ抗体は、マウス３８Ｃ１３Ｂ細胞リンパ腫のｉｎ ｖｉｖｏでの成長や血管新生（血管形成）をかなり低下させることが分かった（チェズニーら著、Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．第５巻、１８１〜１９１頁、１９９９年）。ＭＩＦは、主に、腫瘍関連の新生血管内で発現された。３８Ｃ１３Ｂ細胞ではなく、培養された微小血管の内皮細胞は、ＭＩＦを産生しかつｉｎ ｖｉｔｒｏでの増殖にその活性を必要とすることが認められた（タカハシら著、Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．第４巻、７０７〜７１４頁、１９９８年）。更に、抗ＭＩＦ抗体のマウスへの投与が、Ｍａｔｒｉｇｅｌ移植（ｉｎ ｖｉｖｏでの新しい血管形成のモデル）によって誘発された新生血管の応答をかなり抑制することも分かった（ボッツァら著、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．第１８９巻、３４１〜３４６ページ、１９９９年）。このデータは、ＭＩＦが、腫瘍血管形成において重要が役割を果たすことを表しており、これは腫瘍新生血管を抑制する抗腫瘍剤の開発のための新しい目標である。
【００４４】
すなわち、本発明は、ＭＩＦタンパク質のアミノ酸残渣と安定な共有結合性の相互作用を形成するキノン系化合物またはキノン系化合物の組み合わせを有効量投与することを含む、腫瘍成長または血管形成を治療または予防する方法も提供する。好ましくは、前記化合物は、置換イミノキノン化合物または置換オルトキノン化合物である。好ましくは、前記化合物は、前記式Ｉまたは式ＩＩで表される化合物を包含する。
【００４５】
本発明は、式Ｉの化合物または製薬上許容できるその塩も提供する。これは、関節炎、増殖性の血管疾患、ＥＡＥ、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、サイトカイン媒介毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦ媒介条件、自己免疫疾患（限定されないが、リウマチ性関節炎、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、ループス症候群を包含する）を含む炎症性疾患、腫瘍成長または血管形成、あるいは局所または全身性のＭＩＦ放出または合成を特徴とする状態の治療または予防用の薬物の医薬における使用または製造のための、前記式Ｉの化合物または製薬上許容できるその塩のうちいずれかを含有する医薬組成物として提供される。
【００４６】
本発明は、式ＩＩの化合物または製薬上許容できるその塩も提供する。これは、関節炎、増殖性の血管疾患、ＡＲＤＳ（急性呼吸窮迫症候群）、サイトカイン媒介毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦ媒介条件、自己免疫疾患（限定されないが、リウマチ性関節炎、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、ループス症候群を包含する）を含む炎症性疾患、腫瘍成長または血管形成、あるいは局所または全身性のＭＩＦ放出または合成を特徴とする状態の治療または予防用の薬物の医薬における使用または製造のための、前記式ＩＩの化合物または製薬上許容できるその塩のうちいずれかを含有する医薬組成物として提供される。
【００４７】
併用治療法および組成物：もう一つの態様において、本発明のキノン系化合物は、ステロイド、グルココルチコイド、他の炎症性サイトカインの抑制剤（例えば、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１抗体、抗ＩＦＮ−γ抗体）などの前記以外の治療薬と組み合わせて、あるいはＩＬ−１ＲＡまたはＩＬ−１０などの別のサイトカインと組み合わせて使用してもよい（米国特許第６，０３０，６１５号明細書を参照し、この公報の内容を全てここに参照として挿入する；この公報には、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１抗体、抗ＩＦＮ−γ抗体、ＩＬ−１ＲＡ、ステロイド、グルココルチコイドまたはＩＬ−１０と組み合わせてサイトカイン媒介毒性を治療するための抗ＭＩＦ抗体の使用がクレームされている）。
【００４８】
例えば、種々の抗炎症性ステロイドは、マクロファージおよび下垂体細胞によるＭＩＦ（炎症の媒介）分泌／放出を誘発することが知られており、そしてそのために、対抗炎症性ステロイド治療法の利点を低下させることがある（米国特許第６，０３０，６１５号明細書、この内容を全てここに参照として挿入する）。更に、幾つかのステロイド誘導体（例えば、２０αジヒドロコルチゾル、グルココルチコイド）は、実際はステロイド誘発ＭＩＦ放出も抑制する（米国特許第６，０３０，６１５号明細書、ここでこの公報の内容をすべてここに参照として挿入する）。従って、本発明のキノン系化合物は、関節炎、増殖性の血管疾患、ＥＡＥ、ＡＲＤＳ、サイトカイン媒介毒性、敗血症、敗血症性ショック、乾癬、インターロイキン−２毒性、喘息、ＭＩＦ媒介条件、自己免疫疾患（限定されないが、リウマチ性関節炎、インシュリン依存性糖尿病、多発性硬化症、移植片対宿主病、ループス症候群を包含する）を含む炎症性疾患、腫瘍成長または血管形成、あるいは局所または全身性のＭＩＦ放出または合成を特徴とする状態の治療または予防のために、ステロイドなどと関連して使用してよい。このよな併用治療法は、局所および／または全身的なＭＩＦ放出および／または活性を抑制するように設計できる。
【００４９】
そのため、本発明は、（ａ）キノン系化合物または製薬上許容できるその塩であって、前記式Ｉまたは式ＩＩで表される化合物を含有するものを、（ｂ）ステロイド、グルココルチコイド、抗ＴＮＦα抗体、抗ＩＬ−１抗体、抗ＩＦＮ−γ抗体、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−１０またはこれらの組み合わせ、および製薬上許容できるキャリアまたは希釈剤と組み合わせて包含する医薬組成物も提供する。
【００５０】
式Ｉにおいて、好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、およびＲ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式Ｉにおいて、より好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１およびＲ４はＨであり、そしてＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式Ｉにおいて、更に好ましくは、Ｒ５はＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２およびＲ４はＨであり、そしてＲ３はＯＨである。式ＩＩにおいて、好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式ＩＩにおいて、より好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、Ｒ１はＨであり、そしてＲ２およびＲ３は独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＨ３、ＯＣＨ３またはＯＣＨ２ＣＨ３である。式ＩＩにおいて、更に好ましくは、ｎは１であり、Ｒ５はＯＨであり、そしてＲ１、Ｒ２およびＲ３はＨである。
【００５１】
医薬製剤
本発明の化合物は、細胞源からＭＩＦを放出してＭＩＦ産生を高めるＭＩＦ応答を特徴とする多数の疾病および疾患の治療および予防のための薬理学的な組成物内で有効性を示す。本発明の化合物は、単独で患者に投与されるか、投与時に好適なキャリアまたは賦形剤と混合した医薬組成物で患者に投与されて、ＭＩＦ放出を特徴とする種々の状態を治療または回復することが可能である。さらに、治療上の有効性は、ＭＩＦトートメラーゼ活性およびＭＩＦ生理活性を抑制するのに十分な化合物の量にも関し、これらの抑制が異なる濃度で生じ得ることから、結果として当業者が、標的であるＭＩＦ活性を抑制するのに必要な化合物投与量を決定できると考えられる。治療上の有効な投与量は、単独で、あるいは炎症、腫瘍成長または関連する疾患のための他の治療と組み合わせた補助的な治療として投与されてもよい。例示的な応用の化合物の処方および投与技術は、ペンシルバニア州イーストンのマック・パブリッシング・カンパニー発行の「レミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンシーズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」最新号に開示されている。
【００５２】
好適な投与経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜（ｔｒａｎｓｍｕｃｏｓａｌ）または腸管からの投与が挙げられる。非経口デリバリーは、筋肉注射、皮下注射、髄内注射、並びにくも膜下腔内注射、直接脳室内注射、静脈注射、腹腔注射、鼻腔注射または眼内注射、および場合によりデポー剤（ｄｅｐｏｔ）または徐放性処方も包含する。
【００５３】
本発明の化合物は、リポソームなどのドラッグデリバリーシステムで投与されてもよい。
【００５４】
本発明の医薬組成物および化合物は、自体公知の方法、例えば、常套の混合、溶解、糖衣錠（ｄｒａｇｅｅ）製造法、空中浮揚（ｌｅｖｉｔａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、包括または凍結乾燥法により製造されてよい。そのため、本発明で使用される医薬組成物は、製剤上許容され得る、調製中へ活性な化合物を加工するのを助ける賦形剤や補助剤を包含する、生理学上容認され得る１種以上のキャリアを用いて、通常用いられる形態に処方されてよい。適正な処方は、選択された投与経路に依存する。
【００５５】
注射用として、本発明の化合物は、水溶液、好ましくは生理的適合性を有するバッファー（例えば、ハンクス液、リンゲル液または生理食塩水バッファー）に処方され得る。経粘膜投与用には、浸透させるバリアーに好適な貫通刺胞（ｐｅｎｅｔｒａｎｔｓ）が処方に使用される。前記貫通刺胞は当該分野で公知である。
【００５６】
経口投与に関し、化合物は、活性な化合物を当業者に周知の製剤上許容できるキャリアと組み合わせて容易に処方され得る。このようなキャリアは、治療される患者が経口摂取するために、本発明の化合物を錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして調剤できる。経口用途のための医薬製剤は、前記化合物を固体賦形剤と組み合わせ、場合により得られる混合物を粉砕し、そして顆粒混合物を加工し、所望により好適な補助剤を添加した後、錠剤または糖衣錠コアを得ることにより得られる。好適な賦形剤は、特にフィラーであり、例えば、乳糖、蔗糖、マンニトールまたはソルビトールなどの糖類、セルロース製剤（トウモロコシ澱粉、小麦澱粉、米澱粉、芋澱粉、ゼラチン、トラガカントガム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル−セルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ））が挙げられる。所望により、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）などの崩壊剤を加えてよい。
【００５７】
糖衣錠コアには好適なコーティングが付与される。この目的のために、濃縮した糖溶液が使用される。前記糖溶液は、任意に、アラビアガム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有していてよい。活性な化合物用量の異なる組み合わせを確認するためまたは特徴付けるために、染料または顔料を錠剤または糖衣錠のコーティングに添加してもよい。
【００５８】
経口に使用できる医薬製剤としては、ゼラチンから製造されるプッシュ−フィットカプセル（ｐｕｓｈ−ｆｉｔ ｃａｐｓｕｌｅｓ）、およびゼラチンや可塑剤（グリセロールまたはソルビトール）から製造されるソフトカプセル、封入カプセルが挙げられる。プッシュ−フィットカプセルは、フィラー（例えば、乳糖）、バインダー（例えば、澱粉）および／または潤滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム）および任意に安定化剤を含有する混合物中の有効成分を含有し得る。ソフトカプセルにおいて、有効成分は、脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの好適な液体中に溶解または懸濁されてよい。加えて、安定化剤を添加してよい。経口投与のための処方は全て、投与に好適な１回分の投与量に含まれていなければならない。
【００５９】
頬側投与のために、前記組成物は、常套の方法で処方された錠剤またはトローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅｓ）の形態を取ってよい。
【００６０】
吸入による投与のために、本発明で使用される化合物は、圧縮パックまたは噴霧器からの噴霧スプレー調剤の形態で、好適な噴霧剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の好適なガス）を用いて都合良く届けられる。圧縮されたエアロゾルの場合、投与量単位は、計量された量を届けるバルブを付与することによって決定され得る。吸入器に使用されるゼラチンなどのカプセルやカートリッジは、前記化合物と好適な粉末ベース（乳糖または澱粉など）から成る粉末ミックスを含有させて処方され得る。
【００６１】
前記化合物は、注射により、例えば、大量瞬時投与または継続注入などによって非傾向的に処方されてもよい。注射用製剤は、例えば、アンプルでまたは多種投与容器で、添加された保存剤と共に単位投与量形態で含まれていてよい。前記組成物は、油性または水性媒介物中の懸濁液、溶液またはエマルションような形態をとってよく、しかも懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの処方剤を含有していてもよい。
【００６２】
非経口投与のための医薬製剤は、水溶性形態の活性な化合物の水溶液を包含する。更に、活性な化合物の懸濁液は、ＤＭＳＯ中、または適当な油性の注射懸濁液として調製され得る。好適な親油性溶媒または媒介物は、ごま油などの脂肪油、あるいはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドまたはリポソームなどの合成脂肪酸エステルを包含する。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を高める物質（例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストラン）を含有していてよい。場合により、懸濁液は、前記化合物の溶解性を高めて高濃度の溶液の調製を可能にする好適な安定化剤または試薬も含有していてよい。
【００６３】
別法として、有効成分は、使用前、好適な媒介物、例えば、非発熱性の滅菌水を含む構成のための粉末状であってもよい。
【００６４】
前記化合物は、ココアバターまたは別のグリセリドなどの汎用の座薬ベースを含有する、座薬または滞留浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｎｅｍａｓ）直腸組成物中に処方されてもよい。
【００６５】
前述の製剤に加えて、前記化合物は、デポー剤として処方されてもよい。このように長時間作用する製剤は、移植（例えば、皮下または筋肉内）により、あるいは筋肉注射により投与され得る。従って、例えば、前記化合物は、好適なポリマー性もしくは疎水性材料（例えば、許容できる油中のエマルションとして）またはイオン交換樹脂と共に、あるいは緩やかに溶解し得る誘導体（例えば、緩やかに溶解し得る塩）として処方され得る。
【００６６】
リポソームやエマルションは、疎水性薬剤用のデリバリー媒介物またはキャリアに関する周知の例である。ジメチルスルホキシドなどの特定の有機溶媒も使用され得るが、通常はより高い毒性を犠牲にする。更に、前記化合物は、治療薬を含有する固体疎水性ポリマーの半透明のマトリックスなどの、徐放性システムを用いて届けられてもよい。種々の形態の徐放性材料が確立されており、当業者にも周知である。徐放性カプセルは、その化学的な性質に依存して、前記化合物を数週間から１００日間までの間で放出し得る。治療薬の化学的な性質および生物学的な安定性に依存して、タンパク質安定化のための別の戦略を用いてもよい。
【００６７】
前記医薬組成物は、好適な固体相またはゲル相キャリアまたは賦形剤を含有してもよい。前記キャリアまたは賦形剤の例としては、限定されないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、澱粉、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられる。
【００６８】
ＭＩＦ活性の抑制剤として認識される本発明の多数の化合物は、製剤上相溶し得るカウンターイオンを含む塩として提供されてよい。製剤上相溶し得る塩は、限定されないが、塩化水素酸、硫酸、酢酸、酪酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸を包含する多数の酸、または塩基を用いて形成され得る。塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性または他のプロトン性溶媒に溶解し易い。製剤上相溶し得る塩、キャリアまたは賦形剤の例は、当業者に周知であり、かつ例えば、「レミングトンズ・ファーマシューティカル・サイエンシーズ」第１８版、エイ・アール・ジェナロ編、マック・パブリッシング・カンパニー、イーストン、ペンシルバニア、１９９０年にも記載されている。このような塩は、限定されないが、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、塩化水素、臭化水素、ヨウ化水素、酢酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩およびリンゴ酸塩などを包含する。
【００６９】
本発明での使用に好適な医薬組成物は、有効成分が、イトされる目的を達成するのに有効な量で含まれている組成物を包含する。特に、製剤上有効な量とは、治療される対象内でのＭＩＦ放出および製造を特徴とする疾患の展開または進行を予防または抑制するのに有効な量を表す。有効量の決定は、当業者の許容範囲内であり、特に前述の詳細な開示を考慮すると十分である。
【００７０】
本発明の方法で使用される化合物に関し、製剤上有効な投与量は、トートメラーゼ抑制アッセイおよび細胞培養アッセイから初期に確立され得る。このような情報は、ヒトに有用な投与量をより厳密に決定するのに使用され得る。
【００７１】
製剤上有効は投与量は、ＭＩＦ放出および産生を特徴とする疾患の展開または重症度を低下させる前記化合物の量をいう。前記化合物の毒性および治療上の有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％までの致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％での投与治療有効性）を求めるための細胞培養液または被験動物における標準的な製薬手順、薬理学的手順および毒物学的手順により求められる。毒性と治療効果の間の投与比は、治療係数であり、ＬＤ５０とＥＤ５０の比として表される。高い治療係数を示す化合物が好ましい。細胞倍溶液アッセイまたは動物実験から得られるデータは、ヒトに使用する投与量範囲を処方するのに用いられる。前記化合物の投与量は、好ましくは、ほとんどまたは全く毒性のないＥＤ５０（またはＥＤ９０）を包含する循環濃度の範囲内である。投与量は、用いられる投与形態や利用される投与経路に依存して、前記範囲内で変更してよい。正確な処方、投与経路および投与量は、各医師により、患者の状態を考慮して選択される（例えば、フィングルら著、１９７５年、「ザ・ファーマコロジカル・ベイシス・オブ・セラピューティクス（Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、第１章、１頁を参照のこと）。
【００７２】
投与量と間隔は、所望の調節効果を保持するのに十分な活性部位の血漿レベル、または最小有効濃度（ＭＥＣ）を付与するようにそれぞれ調整され得る。ＭＥＣは、化合物毎に変わるが、ＭＩＦ活性の５０〜９７％抑制を達成するのに必要な濃度のようなｉｎ ｖｉｔｒｏでのデータから確立され得る。ＭＥＣを達成するのに必要な投与量は、個々の特徴および投与経路に依存する。とはいえ、ＨＰＬＣアッセイ、バイオアッセイまたは免疫アッセイを使用して血漿濃度を求めることも可能である。
【００７３】
投与間隔も、ＭＥＣ値を用いて決定できる。化合物は、当面、ＭＥＣを超える血漿レベル１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、より好ましくは５０〜９０％を保持する投与計画を用いて投与されなければならない。
【００７４】
例えば、局部投与の場合、標的器官または細胞への直接導入、または選択的な取り込みは、血漿濃度と関係のない薬物の有効な局部濃度を生じさせ得る。
【００７５】
投与される組成物の量は、当然、治療される対象に依存し、かつ対象の重量、重症度、投与方法および医師の診断にも依存する。
【００７６】
前記組成物は、所望により、パックまたはディスペンサー装置に含まれていてよい。パックは、例えば、ブリスター包装のような、金属またはプラスチック箔を含んでいてよい。パックまたはディスペンサー装置は、投与のための指示に付随する。適合性の製剤キャリア中に処方された本発明の化合物を含有する組成物は、望まれた状態の治療のために調製され、好適な容器内に配置されてラベルされることもある。
【００７７】
材料および方法
合成：以下の合成例において、用いられる試薬と溶媒は、最も高い市販品質で入手した。使用する全ての溶媒は、フィッシャー製ＨＰＬＣ級であった。１Ｈ（２７０ＭＨｚ）および１３Ｃ（６７．５ＭＨｚ）ＮＭＲスペクトルは、ＪＯＥＬＥｃｌｉｐｓｅ２７０分光計で記録した。結合定数はヘルツ（Ｈｚ）で示し、ＣＤＣｌ３、ＤＭＳＯまたはＣＤ３ＯＤを溶媒として用い、テトラメチルシラン（ＴＭＳ、０．０ｐｐｍ）に対する化学シフトはｐｐｍで示した。薄層（ＴＬＣ）およびフラッシュカラムクロマトグラフィーはセェｃト・サイエンティフィック（Ｓｅｌｅｃｔ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製ＡｒｕｍｉｎａＢ、ｆ−２５４ＴＬＣプレートおよびフィッシャー・サイエンティフィック・ベイシック（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｂａｓｉｃ）社製アルミナ・ブロックマン活性Ｉをそれぞれ用いて行った。前記反応は、ＴＬＣと１ＨＮＭＲでモニターし、１ＨＮＭＲにより粗製品の収量が９０〜９５％となったところで停止した。
【００７８】
試薬：特に断りのない限り、化合物３、１２、１３、１５、１７および１８を包含する全ての化学薬品は、アルドリッチ社またはシグマ・ケミカル・カンパニーズ社から入手し、市販の最も高いグレードのものであった。化合物４（ダーリンおよびネルソン著、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．第２５巻、８８５〜８８６頁、１９８２年）、化合物５（ラッシュドおよびネルソン著、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．第４７４巻、２０９〜２２２頁、１９８８年）、化合物８、９（フェルナンドら著、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．第２３巻、１１５３〜１１５８頁、１９８０年）および化合物１０（ホウムら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第４２巻、１１３７〜１１４２頁、１９９１年）は、公知の方法で調製した。例えば、ＮＡＰＱＩ（４）は、新しく調製した酸化銀で処理した乾燥クロロホルム５０ｍＬのアセトアミノフェン（１ｇ）の溶液から合成的に調製した。この反応は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）でモニターした（移動相としてジエチルエーテル）。１時間後、反応物をＣｅｌｉｔｅで濾過してブチル化ヒドロキシトルエン５ｍｇを含むフラスコに移した。溶液の容量を減少させて、濃縮した溶液を乾燥シリカゲルカラムに加えた。生成物をフラッシュクロマトグラフィーによりジエチルエーテルを用いて溶出させた。黄色のバンドを回収して、氷冷したフラスコ内でアスピレータを用いて濃縮した。残りのエーテルは高真空で除去した。（生化学実験に必須の）純粋な材料を得るためには、コールドフィンガーと２０℃での高真空（０．０１ｍｍＨｇ）を用いた純粋なＮＡＰＱＩ（４）の昇華が究極の選択であった。全収率は非常に低かった（約０．５％）。ＮＡＰＱＩ（４）を乾燥ＤＭＳＯに５０ｍＭの濃度で溶解する。少量のアリコート（一般には２５μＬ）をＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに等分し、−７０℃で貯蔵した。必要時に、内容物を素早く解凍して、解凍塊から残った未使用の材料は廃棄した。−２０℃の霜無しフリーザー（ｆｒｏｓｔ−ｆｒｅｅ ｆｒｅｅｚｅｒ）での貯蔵は、溶液が数週間で淡黄色に変色するため推奨しない。
【００７９】
ドーパクロムメチルエステル（１）は、以前に公開された手順と同様にして調製した（ベンドラットら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３６巻、１５３５６〜１５３６２頁、１９９７年、スウォープら著、ＥＭＢＯジャーナル第１７巻、３５３４〜３５４１頁、１９９８年）。簡潔に言えば、Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンメチルエステルの４ｍＭ水溶液にＮａＩＯ４を添加して最終濃度６ｍＭにした。即座にこの溶液を氷上に置いた。アッセイは、制限試薬ＮａＩＯ４を使い尽したのを示す４７５ｎｍでの吸光度が最大値に達したときに開始した。組換え型ヒトおよびマウスＭＩＦを大腸菌中に発現させて、既に報告されている方法で精製した（バーンハーゲンら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３３巻、１４１４４〜１４１５５頁、１９９４年）。
【００８０】
化合物６、１１、１４および１６を、それらの対応するジヒドロキノン（ＤＭＳＯ中、２０ｍＭ）から、ＮａＩＯ４  １体積をＨ２Ｏ中、１８ｍＭ（０．９等量）で４℃において添加することにより調製した。５分後、試料を５０％水性ＤＭＳＯに４℃で希釈し、次いで組換え型マウスまたはヒトＭＩＦに前記濃度で添加した。
【００８１】
抑制剤によるＭＩＦの処理：ＭＩＦ試料（製法Ａ：ウシ血清アルブミン２０μｇ／ｍＬを含有するリン酸ナトリウム５０ｍＭ中０．７２μｇ／ｍＬ（ｐＨ６．６）、製法Ｂ：ウシ胎児血清を含有するリン酸ナトリウム５０ｍＭ中０．７２μｇ／ｍＬ（ｐＨ６．６）、製法Ｃ：リン酸ナトリウム５０ｍＭ中０．１〜０．６ｍｇ／ｍＬ（ｐＨ６．６））を、種々の濃度の抑制剤を用い、室温で５〜２０分間処理した（正確な時間は以下の実施例で特定する）。次いで、変性タンパク質の酵素活性について、ドーパクロム・トートメラーゼ・アッセイを用いて分析した。タンパク質濃度は、ミクロＢＣＡアッセイ（ピアース・ケミカル・カンパニー社製）を用いて求めた。
【００８２】
ドーパクロム・トートメラーゼ・アッセイ：化合物１（４ｍＭで０．３ｍＬ、生体内原位置で調製されたもの）を組換え型マウスまたはヒトＭＩＦ（前記製法Ａ、ＢおよびＣから、指定バッファー中０．７２μｇ／ｍＬ）の室温溶液（０．７ｍＬ）に添加した。即座に前記ＭＩＦ試料の４７５ｎｍでの吸光度低下を、未処理のＭＩＦ溶液およびＭＩＦを添加していない化合物１と比較してモニターした。
【００８３】
ＭＡＬＤＩ ＭＳ実験：試料を、Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＭＡＩＤＩ ＭＳ（ＤＨＢマトリックス）を用いてワシントン大学バイオケミストリー学部質量分析実験室で試験した。
【００８４】
フルクロース−２，６−二リン酸エステルアッセイ：Ｌ６ラット筋芽細胞はＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１４５８）から入手した。細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中で培養して、２０，０００細胞／ｍＬで蒔いた。１％ウマ血清を含むＤＭＥＭ中、ウシインシュリン（０．３μＭ、Ｇｉｂｓｏ社製）で処理することによって分化が高まった。３７℃でインキュベーションして３日後に、細胞を洗浄して、ＤＭＥＭ全量を加えた。その後、細胞をＭＩＦ試料（１０ｎｇ／ｍＬ）で刺激して、３７℃でのインキュベーションを２４時間続けた。血清を含まない媒体で洗浄した後、５０ｍＭ ＮａＯＨを０．８ｍＬ添加して細胞を分裂させた。フルクロース−２，６−二リン酸エステルを抽出し、公知の方法で測定した（ファン・シャフティンゲンら著、Ｅｕｒ．Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１２９巻、１９１〜１９５頁、１９８２年）。
【００８５】
実施例１
酵素抑制実験  この実施例は、イミノキノンによるヒトＭＩＦの酵素活性の抑制を表している。組換え型ヒトＭＩＦの酵素互変異性活性は、Ｌ−ドーパクロムメチルエステル（１）を用いて行った（ベンドラットら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３６巻、１５３５６〜１５３６２頁、１９９７年）。先に詳細に記載したように、ＭＩＦで触媒作用された互変異性反応は、無色のジヒドロキシインドール生成物（２）の形成を導く（Ｆｉｇｕｒｅ１Ａ参照）。Ｎ−アセチル−ｐ−ベンゾキノンイミン（ＮＡＰＱＩ；４）は、Ｌ−ドーパクロムメチルエステル（１）のイミノキノン官能性を有しており、有効な電解質として作用して、グルタチオン（アルバノら著、Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第２８巻、３０６〜３１１頁、１９８５年）や、パパインなどのタンパク質（チェンら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３８巻、８１５９〜８１６６頁、１９９９年）、ＢＳＡ（スティーラーら著、Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．第１９７巻、７２７〜７３７頁、１９８６年）およびグルタミン酸脱水素酵素（ホームズら著、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．第９巻、５４１〜５４６頁、１９９６年）をアルキル化することが分かっている。
【００８６】
化合物４は、ＭＩＦの酵素活性部位と結合するかどうか、そして共有結合性の付加物を潜在的に形成するかどうかを決定するために試験した。酵素抑制アッセイは、ＭＩＦを種々の濃度の化合物３〜６で５分間処理し、ドーパクロムメチルエステル１を添加して、化合物１から化合物２への転化速度を未処理のＭＩＦと比較して測定することにより行った。アセトアミノフェン（３）は、非常に弱い抑制性を有し、ＩＣ５０値１０ｍＭを示した（Ｆｉｇｕｒｅ２参照）。ＮＡＰＱＩ（４）は、アセトアミノフェンの周知の肝性酸化生成物（ダーリンおよびネルソン著、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．第２５巻、８８５〜８８６頁、１９８２年、チェンら著、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．第１１巻、２９５〜３０１頁、１９９８年）であり、より有効で、化合物３の２５０倍低く、ＩＣ５０値が４０ｍＭであった。この一連の中で最も有効な化合物は、誘導化ヒドロキシイミノキノン６であり、ＩＣ５０値が０．７μＭであった。これは、アセトアミノフェン代謝産物としても公知の関連するジヒドロキノン様の類似物５よりも７１５倍有効であった（チェンら著、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．第１１巻、２９５〜３０１頁、１９９８年）。
【００８７】
すなわち、本発明の置換イミノキノン４および６は、ＭＩＦトートメラーゼ酵素活性の有効な抑制剤である。
【００８８】
実施例２
キノン系酵素抑制剤  この実施例は、ＭＩＦ酵素活性に対するキノン系（およびイミノキノン系）化合物の抑制活性を示している（表１にまとめる）。関連する数種のキノン系化合物の抑制活性は、化合物４や関連するキノン様の試薬がチオールを包含する求核試薬と反応することが知られるため、ＭＩＦ酵素活性に対して試験した（ダーリンおよびネルソン著、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．第２５巻、８８５〜８８６頁、１９８２年、ラッシュドおよびネルソン著、Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．第４７４巻、２０９〜２２２頁、１９８８年、フェルナンドら著、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．第２３巻、１１５３〜１１５８頁、１９８０年、ホウムら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第４２巻、１１３７〜１１４２頁、１９９１年、チェンら著、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．第１１巻、２９５〜３０１頁、１９９８年、アルバノら著、Ｍｏｌ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．第２８巻、３０６〜３１１頁、１９８５年、チェンら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第３８巻、８１５９〜８１６６頁、１９９９年、スティーラーら著、Ａｄｖ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ．第１９７巻、７２７〜７３７頁、１９８６年およびホームズら著、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．第９巻、５４１〜５４６頁、１９９６年）。試験した約６０種の化合物のうち、最も活性なものは、色素生産性基質１に関連するオルト−およびパラ−キノイド構造を含むものであった（表１参照）。最も有効な試薬は、キノイド系化合物６および１６であり、これらはサブ−μモルオーダーの活性を示した。化合物５、１０、１２、１３および１５などのジヒドロキノン含有３，４−２置換ベンゼン誘導体は、ＭＩＦ酵素抑制活性をほとんど示さず、たとえあったとしても小さかった。チオール反応性試薬、ヨードアセトアミド（１７）およびＮ−エチルマレイミド（１８）には、抑制活性は観られなかった。これは、キノン系抑制剤が、ＭＩＦに含まれている遊離システイン以外の部位で反応し得ることを示唆している（３種の遊離システインがある；ブカラ著、ＦＡＳＥＢジャーナル、第１４巻、１６０７〜１６１３頁、１９９６年）。
【００８９】
特定の抑制剤を用いたＭＩＦ酵素抑制の有効性は、反応中のＭＩＦ濃度に従って変化した。反応をより高いＭＩＦ濃度で行うと（約０．１ｍｇ／ｍＬ以上）、化合物６および１６は、ＭＩＦモノマーと当モル量の投与量でＭＩＦ酵素活性を事実上消失させた。例えば、２．８μＭのＭＩＦ（０．１ｍｇ／ｍＬ、モノマーに関して８．４μＭ）を化合物６  ７μＭ（モノマーに対し０．８３当量）で処理すると、９３％の酵素活性が失われた。全酵素活性は、タンパク質を１．７当量／モノマーで処理すると消失した。この反応条件下では、化合物６の抑制活性が極めて有効であった。
【００９０】
さらに、ＭＩＦとキノン系化合物との相互作用は、特異的な認識プロセスと一致していた。化合物４による酵素抑制の特異性に関する洞察は、ＭＩＦの希薄溶液（０．７２μｇ／ｍＬ）を用いかつウシ胎児血清の存在下で抑制アッセイを行うことにより得られた。ウシ胎児血清の濃度が２５％に達したときにだけ、化合物４の抑制活性に検知可能な低下が観られた（Ｆｉｇｕｒｅ３参照）。前記血清濃度が５０％のときには、抑制活性を３１％残していた。すなわち、大過剰（約５６，０００倍）の非標的タンパク質の存在下でも、化合物４はかなりのＭＩＦ酵素抑制活性を発揮した。以上の結果は、キノン系ＭＩＦ抑制剤は、特異的な認識プロセスによってタンパク質と結合することを示している。
【００９１】
従って、本発明によれば、化合物１の構造に関連する求電子性キノン系化合物は、新しく総体的な類の、低分子量の、ＭＩＦ酵素活性の特異性抑制剤を包含する。
【００９２】
表１：ＭＩＦａ酵素活性抑制剤として試験した代表的な化合物
【表１】
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【００９３】
ＭＩＦａ（０．７μｇ／ｍＬ）を種々の濃度の化合物で５分間処理し、ドーパクロムメチルエステル（１）を基質として用いて残留酵素活性を求めた。未処理ＭＩＦの活性を基準として、ＩＣ５０値（５０％ＭＩＦ抑制）を求めた。
【００９４】
実施例３
共有結合性酵素変性  この実施例は、ＮＡＰＱＩ（４）がＭＩＦを化学変性して安定で共有結合性のＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ複合物を形成することを示している（Ｆｉｇｕｒｅ４参照）。化合物４がタンパク質求核試薬と反応してタンパク質−タンパク質架橋を誘導することは既に報告されている（ダーリンおよびネルソン著、Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ．第２５巻、８８５〜８８６頁、１９８２年、チェンら著、Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ．第１１巻、２９５〜３０１頁、１９９８年）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる反応生成物の分析は、９４％ＭＩＦ酵素抑制をもたらす化合物４の濃度（１９０μＭ）では、架橋したＭＩＦモノマーの存在と合致する、少量の２５ｋＤａ種があることを示していた（Ｆｉｇｕｒｅ４ａおよび４ｂ、レーン４参照）。以上の結果、および化合物４で不活性化されたジアリール化またはゲル篩い分けＭＩＦによる酵素活性の回復が不可能であったという事実（データは示さず）は、共有結合性の付加物の形成を示している。
【００９５】
化合物４によるＭＩＦの共有結合的な変性は、質量分析によって確認された。ＭＩＦを、化合物４により、６９％酵素活性抑制を導く条件下で化学変性した。次いで、得られたタンパク質をＭＡＬＤＩ質量分析計で分析した。ＭＩＦの測定値は、１２，３４３ダルトンであり（Ｆｉｇｕｒｅ４Ｃ）、理論的な分子量１２，３４５のの２質量単位以内である。分子量が１２，４９１ダルトンおよび１２，６４５ダルトンの新規な分子の存在は、化学変性ＭＩＦ試料内で形成され（Ｆｉｇｕｒｅ４Ｄ参照）、ＭＩＦサブユニット当たり化合物４を１分子および２分子有する付加物にそれぞれ相当した（理論値１２，４９４よび１２，６４３）。さらに、ＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）付加物の液体クロマトグラフィー−検電器イオン化質量分析計（ＬＣ−ＥＳＩＭＳ）による完全な評価は、付加物の分子イオンがｍ／ｚ１２４９１Ｄａであり、元来のＭＩＦ（１２，３４３Ｄａ）に比べて１４８Ｄａ増であることが分かった（データは示さず）。これは、ＭＩＦモノマーとＭＡＰＱＩ（ＭＷ＝１４９）の当量比を表す。
【００９６】
従って、共有結合的な変性は、ＭＩＦを化合物４で処したときに形成される共有結合性の付加物と同様に、ＭＩＦ酵素抑制アッセイおよび生物学的アッセイ（以下に示す）におけるキノン系化合物の活性を原因としていた。
【００９７】
実施例４
ＭＩＦ活性の生物学的アッセイ  この実施例は、イミノキノン系およびオルトキノン系化合物がＭＩＦ酵素活性を特異的に抑制するのみならず、ＭＩＦ免疫調節活性をも抑制することを示している。先に詳細に述べたように、ｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的なＭＩＦ抑制活性を予測するＭＩＦトートメラーゼ活性に関するアッセイを使用して試験化合物を評価した。簡潔に言えば、アッセイ手順は、ＭＩＦトートメラーゼ活性を試験化合物（潜在的な抑制剤）の存在下、Ｌ−ドーパクロムメチルエステルを基質として用いて測定することを含む。種々の濃度の抑制剤化合物を添加して、酵素（トートメラーゼ）抑制活性についてのＩＣ５０を求めた。このＩＣ５０値は、前記試験化合物の構造類似物と関連させて表１に示す。
【００９８】
前記化合物は、ＭＩＦ生物学的活性の抑制についても、ＭＩＦ生物学的活性についての多数のアッセイ（例えば、標的細胞とＭＩＦの結合の抑制、ＭＩＦ放出または合成の抑制、ＭＩＦ−特異性抗体とのＭＩＦ免疫反応の抑制、円偏光二色性分光法および熱安定性測定で評価されるようなＭＩＦ配置または構造完全性の変化、静止状態ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に対するＭＩＦの後増殖性効果の抑制およびそこでの関連する遷延性ＥＲＫ活性の抑制、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞からのＭＩＦ誘発アラカドン酸（ａｒａｃｈａｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）放出の抑制、Ｌ６筋細胞におけるＭＩＦ誘発フルクトース−２，６−二リン酸エステル形成の抑制、ＴＮＦまたはＬＰＳ−誘発試験動物におけるＭＩＦ毒性の抑制、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでのＭＩＦのグルココルチコイド対抗−制御活性の抑制、並びにＭＩＦの放出、産生および／または出現を特徴とするヒト疾患の多数の動物モデルにおける羅漢率または死亡率の抑制など）で評価した。
【００９９】
従って、ＮＡＰＱＩ（４）（すなわちＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）複合物）は、以下の項目関するアッセイで試験した：（ｉ）フルクトース−２，６−二リン酸エステル産生の誘導、（ｉｉ）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞からのアラキドン酸放出の誘導、および（ｉｉｉ）抗ＭＩＦ抗体との交差反応性。化合物６（すなわちＭＩＦ−Ｎ−アセチル−３−ヒドロキシ−ｐ−ベンゾキノンイミン（６）複合物）は、フルクトース−２，６−二リン酸エステル産生を誘導する活性についてのアッセイでも試験した。
【０１００】
（ｉ）フルクトース−２，６−二リン酸エステル産生の誘導：ＭＩＦと化合物４または６のいずれかとの複合物（すなわち、ＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）複合物またはＭＩＦ−Ｎ−アセチル−３−ヒドロキシ−ｐ−ベンゾキノンイミン（６）複合物）は、Ｌ６ラット筋芽細胞内でフルクトース−２，６−二リン酸エステル（Ｆ２，６ＢＰ）産生を誘導しなかった。Ｆ２，６ＢＰは、解糖の有効なアロステリック性刺激因子である（例えば、チェズニーら著、Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．第９巻、３０４７〜３０５２頁、１９９９年を参照のこと）。フルクトース６−リン酸エステルからのＦ２，６ＢＰの産生は、酵素ホスホフルクトキナーゼ−２（ＰＦＫ−２）によって触媒作用されるので、Ｆ２，６ＢＰの細胞内濃度は、解糖状態の細胞の優れたインジケータである（ファン・シャフティンゲンら著、Ｐｒｏ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ．第７８巻、３４８３〜３４８６頁、１９８１年）。ＴＮＦαなどの炎症性サイトカインは、Ｌ６ラット筋芽細胞における細胞内のＦ２，６ＢＰの産生を高めることによってｉｎ ｖｉｔｒｏでの炭化水素代謝を、刺激する（ヤマサキら著、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｒｅｓ． Ｃｌｉｎ． Ｐｒａｃｔ．第３２巻、１１〜１８頁、１９９６年）。
【０１０１】
興味深いことに、細胞倍溶液を組換え型ＭＩＦで処理すると、匹敵するＦ２，６ＢＰ濃度の増加が検出された（Ｆｉｇｕｒｅ５参照）。本発明の誘導アッセイは、マウスＭＩＦ １０ｎｇ／ｍＬで処理したＬ６ラット筋芽細胞で行った。アッセイ前に、ＭＩＦを化合物４（１６７μＭ、９８％酵素不活性化を導く）または化合物６（３３μＭ、１００％酵素不活性化を導く）で処理した。予想された通り、未反応のマウスＭＩＦは、Ｌ６ラット筋芽細胞によってＦ２，６ＢＰ産生を刺激した（対照の１３０％）。対照して、化合物４または６でのＭＩＦの処理時に形成されたマウスＭＩＦ複合物は、ほとんど活性化せず、それぞれ、未処理のマウスＭＩＦ（対照＝１００％）の活性の９４％および１０５％であった。
【０１０２】
すなわち、化合物４および６などのキノン様のＭＩＦ抑制剤は、ＭＩＦのトートメラーゼ酵素活性を抑制するのみならず、治療有効性をも予測するバイオアッセイでのＭＩＦ生物学的活性も抑制する。
【０１０３】
（ｉｉ）ＮＩＨ／３Ｔ３細胞からのアラキドン酸放出の誘導：ＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）複合物は、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞からのアラキドン酸放出を誘導しなかった（Ｆｉｇｕｒｅ６参照）。ＭＩＦは、ｐ４４／ｐ４２細胞外−信号−調節キナーゼ（ＥＲＫ）のホスホリル化および活性化と関連する情報伝達経路を明らかに介して、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の増殖を刺激する（ミッチェルら著、Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．第２７４巻、１８１００〜１８１０６頁、１９９９年）。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞におけるＥＲＫの前記ＭＩＦ活性化は、前記細胞内で媒介伝達される成長因子によって一般に観察されるキナーゼ活性の迅速な停止とは明らかに対照して、少なくとも２４時間維持される。さらに、ＭＡＰキナーゼ経路のＭＩＦ−誘発活性化は、Ｃａ２＋流動とは無関係に細胞質ホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２）のホスホリル化および活性化をもたらし、そして時間依存および濃度依存形態でアラキドン酸の産生を導く。この細胞増殖のプロフィールは、ＮＡＰＱＩや他の抑制剤によるＭＩＦ生理活性の抑制を評価するのみ用いた。
【０１０４】
アラキドン酸放出に対するＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）複合物の効果は、等量のＭＩＦまたはＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）複合物を、放射性アラキドン酸エステル（ａｒａｃｈｉｄｏｎａｔｅ）で前平衡化したＮＩＦ／３Ｔ３細胞培養液に添加した後、アラキドン酸放出をシンチレーション計数器で測定することにより試験した。簡潔に言えば、ＮＩＦ／３Ｔ３筋芽細胞を１μＭ［１４Ｃ］−アラキドン酸でラベルした。一晩培養した後、細胞を大量のＰＢＳで洗浄し、適当なＭＩＦまたはＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）複合物試料をそれぞれに同様に添加した。次いで、媒介物へのアラキドン酸の放出も以下の文献と同様に測定した（ミッチェルら著、Ｊ． Ｂｉｏ． Ｃｈｅｍ．第２７４巻、１８１００〜１８１０６頁、１９９９年）。
【０１０５】
安定なＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）複合物で処理した培養液は、ＭＩＦで処理した培養液の１／１０未満の量のアラキドン酸を培養上澄みへ産生した（ｅｌａｂｏｒａｔｅｄ）。これは、このＭＩＦの細胞活性が、共有結合性の付加で誘発された分子変化によって大いに抑制されることを示している（Ｆｉｇｕｒｅ６参照）。
【０１０６】
（ｉｉｉ）抗ＭＩＦ抗体との交差反応性：単クローン性抗ヒトＭＩＦ抗体（クローン＃１２３０２．２、アール・アンド・ディ、ミネアポリス、ミネソタ州）は、安定なＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）複合物を認識できない。機構に縛られるものではないが、前記アラキドン酸放出およびＦ２，６ＢＰ誘発アッセイにおけるＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）複合物の生理活性の欠如を考慮すると、ＮＡＰＱＩ（４）結合は、ＭＩＦペプチド立体配座の歪みを導くものと考えられる。この歪みは、ＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（ａ）（４）複合体も抗ＭＩＦ Ｍａｂと交差反応させない。
【０１０７】
前記構造変化の発現は、別のＭＩＦ特異性抗体（ピコワー・インスティチュート・クローンＸＩＶ．１４．３、ＩＩＩ．Ｄ．９およびＸＩＶ．１５．５；これらは、前記エピトープ認識や活性とは相違して生物学的に活性なＭＩＦを抑制する）の結合を、標準的なＥＬＩＳＡ法を用いて特性評価することによって調査された。ＭＩＦに特異的な標準的なサンドイッチＥＬＩＳＡ（マインハートら著、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ第１３７巻、５０９０〜５０９５頁、１９９６年）では、（タンパク質濃度で示される）等量のＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）複合物が、ＮＡＰＱＩ（４）に曝露しなかった精製組換え型ＭＩＦの７倍未満であることが分かった（Ｆｉｇｕｒｅ７）。また、反応機構に縛られるのではないが、このＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）の交差反応性の低下は、ＮＡＰＱＩ（４）の共有結合によって誘発されたＭＩＦの間接的な構造変化にもおそらく起因していた。そのため、この構造変化は、Ｆ２，６ＢＰ誘導アッセイ中でのＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）複合物およびＭＩＦ−Ｎ−アセチル−３−ヒドロキシ−ｐ−ベンゾキノンイミン（６）複合物の生理活性の欠如、並びにアラキドン酸放出アッセイにおけるＭＩＦ−ＮＡＰＱＩ（４）複合物の生理活性の欠如が原因かもしれない。
【０１０８】
すなわち、トートメラーゼ・アッセイにおける化合物による抑制は、この点に関してはその治療用途を包含するＭＩＦ生物学的活性を抑制するその有用性を予測する。というのも、化合物４および６などのキノン系試薬は、ＭＩＦのトートメラーゼ酵素活性を抑制するのみならず、治療有用性をさらに予測するバイオアッセイにおいてＭＩＦ生物学的活性も抑制したためである。
【０１０９】
本発明の実施例に基づけば、理論に縛られることなく、キノン系化合物（本明細書において、式ＩおよびＩＩで表されるもの）がＭＩＦを共有結合的に誘導体化し得る。前記誘導体化は、ＭＩＦトートメラーゼ活性を抑制し、しかも単クローン性抗ＭＩＦ抗体との交差反応性の低下や治療有用性をさらに予測するバイオアッセイにおけるＭＩＦ性理活性の低下で示されるように、天然のＭＩＦタンパク質表面の重大な変化を導く。
【０１１０】
結論として、イミノキノンまたはオルトキノン環系を包含する２種のＭＩＦ酵素抑制剤関連種は、ＭＩＦ酵素活性および生物学的活性の両者を、ＭＩＦアミノ酸残基と安定な共有結合性の相互作用を形成することにより、不可逆的に抑制する低分子量試薬である。従って、前記試薬は、臨床設定においてＭＩＦ活性を抑制する医薬組成物として有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】（Ａ）ドーパクロムメチルエステル（１）とその互変異化された無色の生成物（２）、および（Ｂ）アセトアミノフェン（３） およびその代謝産物（４〜６）の構造をそれぞれ表すスキームである。
【図２】組換え型ヒトＭＩＦの、アセトアミノフェン（３）およびその代謝産物（４〜６）による酵素活性の抑制を表すグラフである。
【図３】組換え型ヒトＭＩＦの酵素活性の、血清タンパク質の存在下における化合物４による抑制を表すグラフである。
【図４】アセトアミノフェンの代謝産物（４）で処理したヒトＭＩＦの化学変性ＭＩＦの分析結果である。
【図５】組換え型マウスＭＩＦ試料のフルクトース−２，６−二リン酸エステル（Ｆ２，６ＢＰ）生成への影響を表すグラフである。
【図６】細胞のアラキドン酸放出のＭＩＦ媒介誘発に対するＮＡＰＱＩ（４）の影響を表すグラフである。
【図７】ＭＩＦをＮＡＰＱＩ（４）と共にインキューベーションした後の、抗ＭＩＦ抗体との免疫交差反応性の損失を標準ＥＬＩＳＡによる測定結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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