(57)【要約】【課題】本発明は、患者のＢ細胞媒介性病態を改変する方法を提供する。【解決手段】この方法は、少なくとも１つおよび／または２つのキメラタンパク質を含有する組成物を投与する。キメラタンパク質はそれぞれ、Ｂ細胞媒介性病態の患者由来の特定のＢ細胞の免疫グロブリンのＶＨまたはＶＬ領域のいずれかの少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域を含有する。ＶＨおよび／またはＶＬ領域をコードする遺伝子および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を単離し発現ベクターに挿入する。キメラタンパク質はその発現ベクターを昆虫細胞系統に導入することにより調製される。キメラタンパク質は抗体アフィニティーカラムを使用して精製され、次いで免疫学的担体キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）と化学的に会合させる。会合体はＢ細胞媒介性病態の患者由来の特定のＢ細胞から特異的に調製されたキメラタンパク質を含有しているので、それを顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦなどのサイトカインまたはケモカインと、またはそれ無しで投与すると、このようなＢ細胞媒介性病態を改変するための免疫応答を誘導させることができる。【選択図】図１
2004506022.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者のＢ細胞媒介性病態を改変する方法であって、
Ｂ細胞媒介性病態を有する患者のＢ細胞クローンに関連するＶＨまたはＶＬ領域の少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含むキメラタンパク質を含有する組成物を投与し、
それにより患者におけるＢ細胞媒介性病態を改変させる、ことを特徴とする方法。
【請求項２】
該組成物がさらに、ＶＨまたはＶＬ領域の少なくとも一部、および第２の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む第２のキメラタンパク質を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
免疫グロブリン定常領域がヒトＩｇＧγ１定常領域を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＶＨまたはＶＬ領域がＶＨ領域である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
ＶＨまたはＶＬ領域がＶＬ領域である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
第１のキメラタンパク質のＶＨまたはＶＬ領域がＶＨ領域を含み、第２のキメラタンパク質がＶＬ領域を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
第２の免疫グロブリン定常領域がヒトκまたはλ定常領域を含む、請求項２記載の方法。
【請求項８】
ＶＨまたはＶＬ領域が全可変領域である、請求項１または２記載の方法。
【請求項９】
ＶＬ領域が全定常領域である、請求項１または２記載の方法。
【請求項１０】
第１または第２の免疫グロブリン定常領域が、ヒトＩｇＧγ１定常領域、ヒトＩｇＧγ２定常領域、ヒトＩｇＧγ３定常領域、ヒトＩｇＧγ４定常領域、ヒトＩｇＡ１定常領域、ヒトＩｇＡ２定常領域、ヒトＩｇＭ定常領域、ヒトＩｇＤ定常領域、ヒトＩｇＥ定常領域、ヒトκ鎖定常領域、およびヒトγ鎖定常領域のなかから選ばれる、請求項１または２記載の方法。
【請求項１１】
該キメラタンパク質が、
Ｂ細胞媒介性病態を有する患者のＢ細胞由来のＶＨまたはＶＬ領域の少なくとも一部をコードする遺伝子を単離し、
ＶＨまたはＶＬ領域をコードする該遺伝子および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部をコードする遺伝子を、該第１のキメラタンパク質を発現できる発現ベクターに挿入し、
得られた発現ベクターを昆虫細胞系統に挿入し、キメラタンパク質を産生させ、そして
得られたキメラタンパク質を単離する、ことにより調製される、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ＶＨまたはＶＬ領域の少なくとも一部をコードする遺伝子、および第２の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入し、第２のキメラタンパク質を発現させる工程をさらに含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
キメラタンパク質を担体タンパク質に会合させる工程をさらに含む、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
担体タンパク質がキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
組成物をさらに、サイトカインまたはケモカインと同時投与する、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
サイトカインが顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ケモカインが単球走化性タンパク質３（ＭＣＲ３）である、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
発現ベクターがバキュロウイルス発現ベクターである、請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
バキュロウイルス発現ベクターがミツバチメリチン分泌シグナル配列およびヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
バキュロウイルス発現ベクターが、ミツバチメリチン分泌シグナル配列を制御するバキュロウイルスＡｃＮＰＶ ｐ１０プロモーター、およびヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を制御するＡｃＮＰＶポリヘドリンプロモーターをさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ＶＨ領域および第１の免疫グロブリン定常領域を含むキメラタンパク質をコードする遺伝子がバキュロウイルス発現ベクターにおいてｐ１０プロモーターにより制御され、そしてＶＬ領域および第２の免疫グロブリン定常領域を含むキメラタンパク質をコードする遺伝子がバキュロウイルス発現ベクターにおいてポリヘドリンプロモーターにより制御されている、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
ＶＨまたはＶＬ領域をコードする遺伝子および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子がバキュロウイルス発現ベクターにおいて、ｐ１０プロモーターまたはポリヘドリンプロモーターのいずれかにより制御されている、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子がヒトＩｇＧγ１遺伝子である、請求項１１記載の方法。
【請求項２４】
第２の免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子がヒトκまたはλ定常領域をコードする遺伝子である、請求項１２記載の方法。
【請求項２５】
免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子が、ヒトＩｇＧγ１定常領域、ヒトＩｇＧγ２定常領域、ヒトＩｇＧγ３定常領域、ヒトＩｇＧγ４定常領域、ヒトＩｇＡ１定常領域、ヒトＩｇＡ２定常領域、ヒトＩｇＭ定常領域、ヒトＩｇＤ定常領域、ヒトＩｇＥ定常領域、ヒトκ鎖定常領域、およびヒトγ鎖定常領域のなかから選ばれる、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項２６】
キメラタンパク質が、ＶＨ領域およびヒトヒトＩｇＧγ１定常領域を含むタンパク質、ＶＬ領域およびヒトκ鎖定常領域を含むタンパク質、およびＶＬ領域およびヒトλ鎖定常領域を含むタンパク質のなかから選ばれる、請求項１１記載の方法。
【請求項２７】
第１および第２のキメラタンパク質が、ＶＨ領域およびヒトヒトＩｇＧγ１定常領域を含むタンパク質、およびＶＬ領域およびヒトκまたはλ鎖定常領域を含むタンパク質を含む、請求項１２記載の方法。
【請求項２８】
昆虫細胞系統がＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ （Ｈｉ−５）またはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （ｓｆ９）細胞系統である、請求項１１記載の方法。
【請求項２９】
キメラタンパク質の発現をＥＬＩＳＡにより分析する、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項３０】
キメラタンパク質を、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬおよび、免疫グロブリン結合ドメインと結合できる他のタンパク質のなかから選ばれるタンパク質を用いて単離する、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項３１】
免疫グロブリン結合ドメインと結合できる他のタンパク質が抗−免疫グロブリン抗体である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
Ｂ細胞媒介性病態がＢ細胞リンパ腫である、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
Ｂ細胞媒介性病態が、難治性低グレードリンパ腫、または濾胞性リンパ腫である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
患者のＢ細胞媒介性病態を改変するための組成物であって、Ｂ細胞媒介性病態を有する患者のＢ細胞クローンに関連するＶＨまたはＶＬ領域の少なくとも一部に連結する免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含むキメラタンパク質を含有する組成物。
【請求項３５】
ＢＶＨまたはＶＬ領域の可変領域（該可変領域は細胞媒介性病態を有する患者のＢ細胞クローンに関連する）の少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含む第２のキメラタンパク質をさらに含有する、請求項３４記載の組成物。
【請求項３６】
キメラタンパク質が請求項１３または１４の方法により調製される、請求項３４または３５記載の組成物。
【請求項３７】
免疫グロブリン定常領域が、ヒトＩｇＧγ１定常領域、ヒトＩｇＧγ２定常領域、ヒトＩｇＧγ３定常領域、ヒトＩｇＧγ４定常領域、ヒトＩｇＡ１定常領域、ヒトＩｇＡ２定常領域、ヒトＩｇＭ定常領域、ヒトＩｇＤ定常領域、ヒトＩｇＥ定常領域、ヒトκ鎖定常領域、およびヒトγ鎖定常領域のなかから選ばれる、請求項３４または３５記載の組成物。
【請求項３８】
免疫グロブリン定常領域が、ＶＨ領域と作動可能に連結されているヒトＩｇＧγ１定常領域である、請求項３４記載の組成物。
【請求項３９】
免疫グロブリン定常領域が、ＶＬ領域と作動可能に連結されているヒトκまたはλ定常領域である、請求項３４記載の組成物。
【請求項４０】
第１および第２のキメラタンパク質がヒトＩｇＧγ１定常領域に作動可能に連結されているＶＨ領域、およびヒトκまたはλ定常領域に作動可能に連結されているＶＬ領域である、請求項３５記載の組成物。
【請求項４１】
担体タンパク質をさらに含有する、請求項３４または３５記載の組成物。
【請求項４２】
担体タンパク質がキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）である、請求項４１記載の組成物。
【請求項４３】
サイトカインまたはケモカインとともに同時に投与される、請求項３４または３５記載の組成物。
【請求項４４】
サイトカインが顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦである、請求項４３記載の組成物。
【請求項４５】
ケモカインが単球走化性タンパク質３（ＭＣＲ３）である、請求項４３記載の組成物。
【請求項４６】
ワクチンである、請求項３４または３５記載の組成物。
【請求項４７】
Ｂ細胞媒介性病態がＢ細胞リンパ腫である、請求項３４記載の組成物。
【請求項４８】
Ｂ細胞リンパ腫が非ホジキンリンパ腫である、請求項４７記載の組成物。
【請求項４９】
Ｂ細胞媒介性病態が、Ｂ細胞媒介性病態が、難治性低グレードリンパ腫、または濾胞性リンパ腫である、請求項４７記載の組成物。
【請求項５０】
注射、吸入、経口または経皮的に投与される、請求項３４記載の組成物。
【請求項５１】
Ｂ細胞媒介性病態が、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、抗−Ｈｕ関連傍腫瘍性神経症候群、自己免疫肝炎、Ｉ型糖尿病、自己免疫甲状腺炎、および強皮症のなかから選ばれる自己免疫疾患である、請求項３４記載の組成物。
【請求項５２】
（ａ）　ＶＬ領域の一部およびκ軽鎖をコードする遺伝子の一部をコードするキメラ遺伝子であって、共にヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列およびポリヘドリンプロモーターと作動可能に連結されている該キメラ遺伝子、および（ｂ）　ＶＨ領域の一部およびＩｇＧ１重鎖の一部をコードするキメラ遺伝子であって、共にミツバチメリチン分泌シグナル配列およびＰ１０プロモーターが作動可能に連結されている該キメラ遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項５３】
（ａ）　ＶＬ領域の一部およびκ軽鎖をコードする遺伝子の一部をコードするキメラ遺伝子であって、共にヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列およびポリヘドリンプロモーターと作動可能に連結されている該キメラ遺伝子、および（ｂ）　ＶＨ領域の一部およびＩｇＧ１重鎖の一部をコードするキメラ遺伝子であって、共にミツバチメリチン分泌シグナル配列およびＰ１０プロモーターが作動可能に連結されている該キメラ遺伝子を含むバキュロウイルス発現ベクター。
【請求項５４】
（ａ）　ヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列およびポリヘドリンプロモーターと作動可能に連結されているκ軽鎖定常領域をコードする遺伝子の一部、および（ｂ）　ミツバチメリチン分泌シグナル配列およびＰ１０プロモーターが作動可能に連結されているＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする遺伝子の一部、を含む発現ベクター。
【請求項５５】
（ａ）　ヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列およびポリヘドリンプロモーターと作動可能に連結されているλ軽鎖定常領域をコードする遺伝子の一部、および（ｂ）　ミツバチメリチン分泌シグナル配列およびＰ１０プロモーターが作動可能に連結されているＩｇＧ１重鎖定常領域をコードする遺伝子の一部、を含む発現ベクター。
【請求項５６】
配列番号：６に示す核酸配列を含むベクター。
【請求項５７】
配列番号：７に示す核酸配列を含むベクター。
【請求項５８】
配列番号：８９に示す核酸配列を含むベクター。
【請求項５９】
配列番号：９０に示す核酸配列を含むベクター。
【請求項６０】
配列番号：９１に示す核酸配列を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願
本出願は、「イディオタイプワクチンの調製方法」と題する米国仮出願番号６０／２２４，７２３、「組換え免疫グロブリンを調製するための発現ベクター」と題する米国仮出願番号６０／２２４，７２２、および「Ｂ細胞媒介性病態を改変するための方法および組成物」と題する米国仮出願番号６０／２７９，０７９の優先権を主張する。
【０００２】
【技術分野】
本発明は一般に、免疫学および免疫療法の分野に関する。詳細には、本発明はＢ細胞媒介性病態、例えばＢ細胞悪性腫瘍および／または自己免疫疾患を改変するための方法および組成物に関する。
【０００３】
【発明の背景】
免疫系は抗体媒介性および細胞媒介性の応答を生じさせる。それぞれのタイプの免疫応答は、Ｂ細胞（抗体性応答）およびＴ細胞（細胞性応答）のリンパ球型によって調節されている。Ｂ細胞は最初に抗原を認識し、その際、Ｂ細胞表面上のＩｇＭおよびＩｇＤ分子と抗原が結合する。各Ｂ細胞クローンはそのクローンのユニークなイディオタイプによって特異的な抗原のみを認識する。抗原を認識するとＢ細胞は内部移行し、ＭＨＣクラスＩＩ分子を介する抗原提示のために抗原をプロセッシングする。Ｂ細胞はよって、Ｔ細胞のための抗原提示細胞（ＡＰＣ）として機能できる。Ｔ細胞は、特定の外来タンパク質（抗原）と、その一部が主要組織適合複合体分子（ＭＨＣ）と関連する場合に典型的にはＡＰＣを介して結合し、抗原提示細胞では抗原が断片にまで消化されてそのＭＨＣと結合するＡＰＣの表面に提示される。
【０００４】
幾つかの型の癌は循環系にその起源を持つ。主要な型には、骨髄および血液の新生物；骨髄腫、Ｂ細胞の癌；およびリンパ腫、リンパ系に起源を有する一群の癌がある。リンパ腫はさらに、幾つかの群に分類でき、そのひとつは非ホジキンリンパ腫であり、これは種々の癌を形成する。「癌分類の国際ワーキング策定」に従って、リンパ腫では３つの広いカテゴリー、低グレード、中間グレードおよび高グレードが定義されており、これらは治癒率および攻撃力の点で相違している（Ｃｈｅｓｏｎ， ｅｔ ａｌ．， ”Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ａｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｏｒｋｓｈｏｐ ｔｏ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，” Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ． １７（４）：１２４４， １９９９）。概して、これらリンパ腫は総合して、米国において癌発生率および死亡率の点で５位にランクされ、年におよそ５０，０００人の新たな患者が有病と診断されている。
【０００５】
高グレード非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の５１人の患者の単離物を調べた最近の試験では、４３人がＢ細胞から誘導されており、８人がＴ細胞由来であることが示された（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ １４：６２１−２７， １９８９）。従って、病原性Ｂ細胞に特異的に対応する処置は非ホジキンリンパ腫や骨髄腫の処置に有益であると思われる。
【０００６】
悪性Ｂ細胞から専ら（ユニークに）産生される抗原に指向した免疫学を基礎とする処置を開発する初期の試みは、病原性Ｂ細胞から直接、イディオタイプ（Ｉｄ）タンパク質を煩雑にも単離し精製するものであった。この精製タンパク質はまず、関連リンパ腫を処置するモデル体系に使用された。単離された患者のイディオタイプ決定基に対するこの能動はマウスモデル系では腫瘍成長に対して抵抗性を付与することが証明された（Ｄａｌｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １２０（５）：１６２０−２４， １９７８； Ｓａｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３（９）：９２７−３１， １９７９）。この腫瘍成長に対する抵抗性現象はその後、多くの実験腫瘍モデルにおいて再現されている（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３０（２）：９７０−０３， １９８３； Ｇｅｏｒｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１（６）：２１６８−７４， １９８８； Ｋｗａｋ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７６（１１）：２４１１−１７， １９９０）。
【０００７】
このアイデアと技術を最初に臨床に応用したものは非常に煩雑であり、そのなかには、患者個々のバイオプシーにより単離されたリンパ腫のタンパク質に対して惹起させたマウスモノクローナル抗体を利用するものがあった。Ｍｅｅｋｅｒとその共同研究者は、通常のリンパ腫治療を既に受けている１１人の患者の処置に当たり、マウスモノクローナル抗−イディオタイプ抗体を作成した（Ｍｅｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ６５：１３４９−６３， １９８５）。およそ半分の患者に陽性の結果が得られ、１名は明らかに緩解した。しかし、患者のなかには、細胞表面発現抗体のクラスがスイッチすることによりリンパ腫細胞が抗体に対する耐性を発達させたものがあった（Ｍｅｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ． ３１２：１６５８−６５， １９８５）。
【０００８】
Ｂ細胞リンパ腫クローンが抗−イディオタイプ抗体に対する耐性を発達させる別の経路はＣＤＲ２領域の体細胞性突然変異を介するものであり、それにより認識を巧みに回避する（Ｃｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ ４４：９７−１０６， １９８６）。この受動免疫処置アプローチは、マウスに免疫応答を惹起させるための、患者由来のイディオタイプタンパク質を比較的少量単離し精製するだけでよいという利点がある反面、イディオタイプに対するモノクローナル抗体によりリンパ腫を処置する有用性は制限されている。大量のイディオタイプタンパク質を生産できる確固とした簡便な手法が無ければ、Ｂ細胞リンパ腫のイディオタイプを直接攻撃する免疫系の能力を開発する実際の手法であることを示すに過ぎない。
【０００９】
Ｋｗａｋらは種々のアプローチを行い、理論的には大量のイディオタイプタンパク質が必要であるにもかかわらず、患者自身のユニークなリンパ腫から精製したタンパク質を用いて患者を能動免疫した（Ｋｗａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３２７：１２０９−１５， １９９２）。化学療法により疾患が最小あるいは消失した患者を自己（オートローガス）のイディオタイプタンパク質によるワクチンで処置した。ワクチンのための充分量のイディオタイプタンパク質を得るため、バイオプシーにより得たリンパ細胞を樹立細胞系統と融合し、組織培養にて発育させ、分泌イディオタイプタンパク質をクロマトグラフィーにより精製した。この免疫方法の大規模適用は、極めて煩雑な操作を要し、技術的な障壁もありまた経費が膨大であることもあり、不可能であった。さらに、哺乳動物におけるタンパク質生産にはウイルス混入という問題が最近、注目されている。
【００１０】
以後の報告によれば、Ｈｓｕらは、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）と会合させたイディオタイプを接種し、Ｂ細胞リンパ腫を処置する臨床試験の第２相を報告した（Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８９：３１２９−３５， １９９７）。標準的な化学療法の後、難治性非ホジキンＢ細胞リンパ腫の４１人の患者を腫瘍特異的イディオタイプで接種した。Ｋｗａｋら（１９９２）（前掲）によれば、腫瘍特異的イディオタイプ抗原は患者のハイブリドーマから産生されるタンパク質をクロマトグラフィーにより精製して入手している。このタンパク質は従って、患者のリンパ腫由来の患者自身の免疫グロブリンの可変領域と定常領域のすべてから構成される。この結果は、抗−イディオタイプ応答の生成が臨床結果の改善と相関していることを示した。疾患進行の免除の期間と、抗−イディオタイプ細胞性免疫応答が上昇した患者すべての全的的生存の期間とは、免疫応答が上昇しなかった患者と比較して有意に長期化した。この試験は、Ｂ細胞リンパ腫をもつ患者は腫瘍イディオタイプ（Ｉｄ）タンパク質に対する特異的免疫応答を惹起し得ることを確認するものである。さらに、抗−イディオタイプ免疫応答の生成能は臨床結果の良好性と相関している。しかし、個々の患者を処置するには、バイオプシーにより得たリンパ腫細胞を樹立細胞系統と融合させて、標準的な患者を接種するのに充分なタンパク質を生産しなければならない。
【００１１】
最近、Ｂｅｎｄａｎｄｉらは、濾胞性リンパ腫の患者において、イディオタイプ患者特異的なワクチンが寛解を誘導することを証明した（Ｂｅｎｄａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ５：１１７１−７７， １９９９）。標準的な化学療法に従い、完全な臨床的寛解を証明する２０人の患者に、顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ；前述）とともに患者特異的イディオタイプタンパク質を接種した。このリンパ腫の転移特性の分子解析を、化学療法前、臨床的寛解期およびワクチン接種後に行った。化学療法誘導化寛解後に転移が検出された１１人の患者の８人は、ワクチン接種後に完全な分子寛解を受けていることが見出された。腫瘍特異的細胞毒性ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞が２０名中１９名の患者に見出された。腫瘍特異的抗体も検出されたが、寛解には必要ないことが認められた。繰り返すが、この試験では、患者リンパ腫に関して見出され、ヘテロハイブリドーマ融合により産生された免疫グロブリンの可変領域および定常領域のすべてから構成されたイディオタイプタンパク質を用いている。
【００１２】
従って、細胞のイディオタイプに対する免疫応答を目的とするのは保証されたアプローチであるが、上記の手法は、個々の患者のリンパ細胞から充分量のイディオタイプタンパク質を生産しなければならないという制限がある。
【００１３】
Ｂ細胞腫瘍に対する抗−イディオタイプ免疫なる概念は多発性骨髄腫の場合にも用いられている。患者から単離した骨髄腫ＩｇＧでドナーを免疫し、同種間骨髄移植の特異的効能を高めるためにその免疫を利用し、その結果がＫｗａｋおよびその共同研究者により報告されている（Ｋｗａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｌａｎｃｅｔ ３４５ （８９５６）：１０１６−２０， １９９５）。また、Ｍａｓｓａｉａおよび共同研究者は、高用量化学療法の寛解に患者をワクチン接種し、末梢血幹細胞移植を行った（Ｍａｓｓａｉａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９４：６７３−８３， １９９９）。
【００１４】
Ｂｅｎｄａｎｄｉらの研究において上記に使用された顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、造血前駆細胞の増殖および分化をしべきする造血性成長因子である。このサイトカインはＴ細胞増殖を増大させ （Ｓａｎｔｏｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８８， １４１（２）：５１９−２６）、顆粒球および単球における接着分子の発現を増大させ（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９０， １４５（２）：６０７−１５； Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８６， ２３２（４７４９）：５０６−０８）、および抗原提示能を増大させ（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８７，１３９（４）：１１１３−９； Ｈｅｕｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １９８８， １６７（２）：７００−０５； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９０， １４４（５）：１７７７−８２）、細胞性免疫を形成する役割も果たす。
【００１５】
ＧＭ−ＣＳＦを産生するよう遺伝子的に操作した細胞基本ワクチンは、前臨床モデルにおいて全身リンパ腫を排除できる細胞性免疫応答を誘導することが示された。この効果は免疫系の細胞アームの活性化を介して専ら媒介される（Ｌｅｖｉｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏ． １５６（１０）： ３８５８−６５， １９９６）。同様に、低容量の遊離ＧＭ−ＣＳＦは、イディオタイプタンパク質−ＫＬＨ免疫により誘導される予防的抗−腫瘍免疫を、ＣＤ８細胞に対する効果を介したその免疫増大能により増大させることが示されている（Ｋｗａｋ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９３（２０）：１０９７２−７７， １９９６）。１つの研究では、ＧＭ−ＣＳＦはモデル系にて試験したなかで、抗−腫瘍免疫を惹起させる最も優れた免疫調整物質であることを示している （Ｄｒａｎｏｆｆ， Ｇ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（８）：３５３９−４３， １９９３）。
【００１６】
ＧＭ−ＣＳＦはまた、モデル系において免疫応答を惹起させるのに使用されるキメラタンパク質の一部としても用いられている。ＣｈｅｎおよびＬｅｖｙは、ＧＭ−ＣＳＦの一部および目的の抗原の一部、即ちネズミＢ細胞腫瘍３８Ｃ１３から入手されるイディオタイプ領域を含み、これらが共にヒト免疫グロブリン鎖の一部と融合しているキメラタンパク質を用いた、マウスモノクローナル抗体の生産を試験した（Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｌｅｖｙ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５４（７）：３１０５−１７， １９９５； Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６，０９９，８４６）。Ｃｈｅｎおよび共同研究者は、ＧＭ−ＣＳＦ部分がＩＬ−２またはＩＬ−４の一部と置き換わっている融合タンパク質についても試験した（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５３（１０）：４７７５−８７， １９９４）。ＧＭ−ＣＳＦ部分（またはインターロイキン部分）を誘導する必要があるその説明は、哺乳動物細胞発現系から産生される低レベルのキメラタンパク質の効果を増大させるためである。しかし、精製ＧＭ−ＣＳＦをキメラタンパク質と同時投与すると、ワクチン接種の免疫応答が増大されることが証明された。
【００１７】
組換えＤＮＡ技術の出現により、重鎖および軽鎖ｃＤＮＡ分子が現在は、ハイブリドーマまたは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用するコンビナトリアルライブラリーからクローニングできる。この組換えＤＮＡ技術により、選択したモノクローナル抗体のエフェクター機能または結合機能を操作できるようになった。さらに、大量のＶＨまたはＶＬ遺伝子をクローニングし、それらを無作為に分類して種々の結合特異性のライブラリーを作成し、それらを大腸菌にて発現させ、次いで、所望の結合親和性を有するクローンについて確率的ライブラリーをスクリーニングすることにより、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーが作成できる（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６（４９３５）：１２７５−８１， １９８９）。この組換えアプローチを使用し、大腸菌から発現させた無作為組立てライブラリーから、破傷風トキソイドに対する高い親和性と特異性を有するヒト抗体がクローニングされた（Ｍｕｌｌｉｎａｘ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７（２０）：８０９５−９９， １９９０）。特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行い、免疫グロブリン遺伝子を活性化Ｂ細胞からバクテリオファージベクターにクローニングした。Ｈ鎖およびＬ鎖を無作為に結合し、大腸菌において同時発現させ、１０７個を含むライブラリーが得られた。このコンビナトリアルライブラリーを１２５Ｉ−破傷風トキソイドおよび結合活性を示すクローンの０．２％を用いてスクリーニングした（Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｃａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８７（１６）：６４５０−５４， １９９０）。Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者は、細菌における発現のためにポリメラーゼ連鎖反応により免疫グロブリン鎖をクローニングするためプラスミドベクターを使用した（Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８６（１０）：３８３３−３７， １９８９）。
【００１８】
新たに開発された大腸菌抗体クローニング系は所望の結合特異性をコードする遺伝子の同定に非常に有用である。しかし、大腸菌から産生される抗体は一般に、治療応答には不向きである。典型的には、抗体の抗原結合断片であるＦａｂまたはＦｖしか、分泌型産物として細菌から産生できない。全鎖の４量体ＩｇＧを大腸菌から産生させる稀な場合、ＣＨ２ドメインはグリコシル化されない。非グリコシル化抗体は、抗体指向性細胞毒性（ＡＤＣＣ）の細胞融解活性や能動免疫療法を強力にする補体活性化を欠く。哺乳動物発現系はグリコシル化抗体を産生し、従って細菌系の上記制限を回避する。しかし、ＦＤＡの「考慮すべき点」のＣＢＥＲ部における最近の改変では、哺乳動物細胞の発現系において産生されるモノクローナル抗体に付随するウイルス混入への問題が明らかに警告されている。さらに、哺乳動物発現系にて産生された遺伝子操作抗体は極めて高価であると予想される （１回投与当たり＄１５００−＄５０００）。現在の哺乳動物および細菌系において出くわす困難を回避する代替の発現系の要求度は高い。
【００１９】
バキュロウイルス発現系は、大腸菌および哺乳動物細胞における抗体産生の魅力的な代替系である。バキュロウイルス系を使用する組換えタンパク質の発現が個々数年内に証明され、生物学的に活性なタンパク質を真核生物細胞において高収量（１−１００ ｍｇ／Ｌ）で生産するための優れた選択肢である。バキュロウイルス／昆虫細胞系では、組換えタンパク質が原核生物にて過剰発現する際にしばしば遭遇する可溶性の問題も回避できる。さらに、昆虫細胞は、原核生物細胞に存在しない、正しい折り畳みに関与する真核生物翻訳後修飾機構、ジスルフィド形成、グリコシル化、β−ヒドロキシル化、脂肪酸アシル化、プレニル化、リン酸化およびアミド化を含んでいる。ヒト結腸直腸癌腫細胞を認識する機能的なグリコシル化モノクローナル抗体のバキュロウイルス系からの産生が最近証明された（Ｎｅｓｂｉｔ， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ， １５１：２０１−２０８， １９９２）。さらに、組換えＩｇＡの発現もバキュロウイルス細胞において証明されており、このＩｇＡは重鎖／軽鎖へテロ二量体に正しく組立てられ、Ｎ−グリコシル化され、分泌された（Ｃａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ９１：８３４８−５２， １９９４， ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ． ＷＯ ９８／３０５７７， Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ６，０６３，９０５）。しかし、Ｂ細胞悪性新生物や自己免疫疾患などのＢ細胞病態を改変するための免疫療法剤として使用するキメライディオタイプタンパク質を発現するためにバキュロウイルスを使用することは、証明されていない。
【００２０】
【発明の概要】
本発明は、患者のＢ細胞媒介性病態を改変する方法を提供する。この方法は、免疫グロブリン可変領域のＶＨまたはＶＬ領域の少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を有する少なくとも１つのキメラタンパク質を含有する組成物を投与することを含む。この組成物に使用されるＶＨまたはＶＬ鎖はＢ細胞媒介性病態を有する患者のＢ細胞から産生される特定の免疫グロブリンと関連している。このような組成物を患者に投与した後、患者におけるＢ細胞媒介性病態は改変される。
【００２１】
本発明はさらに、２つの異なるキメラタンパク質を含む組成物を投与することによる、患者のＢ細胞媒介性病態を改変する方法をも提供する。それぞれのキメラタンパク質は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部と連結されている、免疫グロブリン鎖のＶＨおよび／またはＶＬ領域の少なくとも一部を有している。キメラタンパク質の一部であるＶＨおよび／またはＶＬ鎖はＢ細胞媒介性病態を有する患者のＢ細胞由来の特定の免疫グロブリン鎖と関連している。
【００２２】
患者由来のユニークなＶＨおよび／またはＶＬ鎖を含有する特異的免疫グロブリン鎖は治療用組成物として開発できる。これらは、Ｂ細胞悪性新生物や自己免疫疾患などに罹患した患者に治療上の価値を与える。処置できる主要な型の癌には白血病、骨髄腫およびリンパ腫があり、リンパ腫のなかには非ホジキンリンパ腫がある。本発明の治療価値の例として、Ｂ細胞リンパ腫由来の抗原を患者の処置に使用する。
【００２３】
多発性硬化症（ＭＳ） （Ｗａｒｒｅｎ ａｎｄ Ｃａｔｚ， Ｍｕｌｔ． Ｓｃｌｅｒ． ６（５）：３００−１１， ２０００）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ） （Ｚｈａｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６（１）：６−１０， ２００１； Ｏｄｅｎｄａｈｌ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５（１０）：５９７０−７９， ２０００）、抗−Ｈｕ関連傍腫瘍性神経症候群（Ｒａｕｅｒ， Ｓ． ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ， Ｒ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． １１１（１−２）：２４１−４４， ２０００）、および自己免疫肝炎（ＡＩＨ）（Ｏｇａｗａ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． Ｈｅｐａｔｏｌ （１）：６９−７５， ２０００）などの自己免疫疾患に関与するＢ細胞をアフィニティー精製するのに、疑われる自己抗原を使用できる。Ｂ細胞が関与し得る他の自己免疫疾患には、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、重症筋無力症（ＭＧ）、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、強皮症および特定の糖尿病などがある。少数の病原性Ｂ細胞を精製後、細胞から発現される免疫グロブリンの可変部分を本明細書に記載の方法によりＰＣＲを用いてクローニングすることができる。クローニングすると、Ｂ細胞病態に特異的に関連する免疫グロブリン鎖のＶＨおよび／またはＶＬ部分を使用し、本明細書に記載のバキュロウイルス系にて発現できるキメラタンパク質を作成できる。
【００２４】
上記の組成物およびキメラタンパク質に使用される免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ重鎖、およびκまたはλ軽鎖、またはそれらの一部のなかから選ぶことができる。ある態様では、キメラタンパク質は免疫グロブリン定常領域とともに免疫グロブリン領域のＶＨおよび／またはＶＬ領域のいずれかのみを含有する。キメラタンパク質の例としては、ＶＨ−ＩｇＧγ１、ＶＬ−κ、またはＶＬ−γが挙げられる。他の態様としては、本発明の組成物、免疫グロブリン定常領域とともにＶＨおよびＶＬ領域をそれぞれ含む２つのキメラタンパク質を含有する。この例としては、ＶＨ−ＩｇＧγ１およびＶＬ−κ、およびＶＨ−ＩｇＧγ１およびＶＬ−λが挙げられる。
【００２５】
本発明はまた、組換えＤＮＡ技法および発現系を用いてキメラタンパク質を調製する方法を提供する。この方法は次の工程を含む：（ａ）Ｂ細胞媒介性病態を有する患者のＢ細胞由来の特定の免疫グロブリン鎖のＶＨまたはＶＬ領域をコードする遺伝子を単離し、（ｂ）免疫グロブリン鎖のＶＨまたはＶＬ領域をコードする単離された遺伝子および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を、キメラタンパク質を発現できる発現ベクターに挿入し、（ｃ）得られた発現ベクターを昆虫細胞系統に挿入して発現させ、キメラタンパク質を産生させ、そして（ｄ）得られたキメラタンパク質を単離する。キメラタンパク質の調製方法はさらに、免疫グロブリン鎖のＶＨおよび／またはＶＬ鎖のいずれかをコードする遺伝子および第２の免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を発現ベクターに挿入し、第２のキメラタンパク質を発現させる工程をさらに含む。
【００２６】
本発明はさらに、患者のＢ細胞媒介性病態を改変するための組成物を提供する。この組成物は、免疫グロブリン鎖のＶＨまたはＶＬ領域の少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を有する少なくとも１つのキメラタンパク質を含有する。好ましい態様では、キメラタンパク質は、免疫グロブリン鎖のＶＨ領域の少なくとも一部、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。キメラタンパク質の一部であるＶＨまたはＶＬ領域はＢ細胞媒介性病態を有する患者のＢ細胞由来の特定の免疫グロブリン鎖と関連している。このような組成物はさらに、免疫グロブリン鎖のＶＨおよび／またはＶＬ領域の少なくとも一部、および第２の免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を有する第２のキメラタンパク質を含有する。他の好ましい態様では、第２のキメラタンパク質は、免疫グロブリン鎖のＶＨまたはＶＬ領域の少なくとも一部および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含むことができる。キメラタンパク質の一部であるＶＨまたはＶＬ領域はＢ細胞媒介性病態を有する患者のＢ細胞由来の特定の免疫グロブリンと関連している。
【００２７】
本発明の１つの態様では、組成物は２つのキメラタンパク質を含有する。第１のキメラタンパク質は、全ＶＨ領域および免疫グロブリンＩｇＧγ１のヒト定常領域を含み（ＶＨ−ＩｇＧγ１）、および第２のキメラタンパク質は全ＶＬおよびヒトκまたはλ定常領域を含む （ＶＬ−ＣκまたはＶＬ−Ｃλ）。他の好ましい態様では、キメラタンパク質のいずれかまたは両者は、免疫グロブリンのＶＨおよび／またはＶＬ領域の少なくとも一部、リンカー領域、および免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部を含有することができる。
【００２８】
本発明の別の態様では、組成物は、患者のＢ細胞由来の特定の免疫グロブリン鎖のＶＨおよび／またはＶＬ領域のいずれか、および免疫グロブリン定常領域を含有する単一のキメラタンパク質を含有する。この例としては、キメラタンパク質ＶＨ−ＩｇＧγ１、ＶＬ−κ、ＶＬ−λ、ＶＬ−ＩｇＧγ１、ＶＨ−κおよびＶＨ−λが挙げられる。
【００２９】
本発明は１つの態様として、キメラタンパク質を発現するために使用される発現ベクターはバキュロウイルスベクターである。このベクターは好ましくは、プロモーター、分泌シグナル配列およびキメラタンパク質をそれぞれ有する２つの発現カセットを含む。１つの発現カセットは、ミツバチメリチン分泌シグナル配列と連結しているバキュロウイルスＡｃＮＰＶｐ１０プロモーターを含む。他の発現カセットは、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列と連結しているポリヘドリンプロモーターを含む。ここに挙げたプロモーターおよびシグナル配列に加え、当業者に知られている他のプロモーターおよびシグナル配列も使用できる。好ましい態様では、シグナル配列は特定の患者から単離したＶＨまたはＶＬ遺伝子に関連する内生シグナル配列である。免疫グロブリン鎖のＶＨまたはＶＬ部分をコードする遺伝子、および免疫グロブリン定常領域をコードする遺伝子を別個におよび／または一緒にバキュロウイルスベクターの上記発現カセットに挿入し、１つまたは２つのキメラタンパク質を発現させる。好ましい態様では、免疫グロブリン重鎖の定常領域、例えばＩｇＧγ１をＶＨまたはＶＬ領域のいずれかとともにポリヘドリンプロモーターによって制御する。
【００３０】
産生されたキメラタンパク質は抗−免疫グロブリン抗体またはＩｇ結合タンパク質、例えば免疫グロブリン重鎖の定常領域に対するプロテインＡ、免疫グロブリンカッパ軽鎖に対するプロテインＬ、および／または免疫グロブリン結合ドメインと結合する他のタンパク質などのアフィニティーカラムを用いて精製する。
【００３１】
本発明はさらに、キメラタンパク質とキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）などの担体タンパク質との共有結合も包含する。本発明の組成物はまた、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦなどのサイトカイン、または単球走化性タンパク質３（ＭＣＲ３）などのケモカインとともに投与することができる。キメラタンパク質を含有する本発明の組成物は、Ｂ細胞媒介性病態を有する患者のＢ細胞由来の特定の免疫グロブリンに特異的に関連しているため、この組成物を投与すれば、特定のＶＨまたはＶＬセグメントが関与しているイディオタイプ特異的疾患に対する免疫応答を誘導する。同様に、ＶＨまたはＶＬセグメントなどの免疫グロブリンＶ領域セグメントの拘束レパートリーを使用するＢ細胞が関与している自己免疫疾患に関連するＢ細胞に対する応答が治療結果を誘導できる。従って、本発明の組成物を投与すれば、患者のＢ細胞媒介性病態および／または自己免疫疾患が改変される。本発明組成物の投与経路には経口、吸入、注射、経皮的供給があるが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書に引用するすべての米国特許および特許出願、外国特許および特許出願、科学雑誌、製本および刊行物は図面、数値および表を含みすべて、引用により本明細書に包含される。
【００３３】
【好ましい態様の詳しい説明】
正常組織は回避して悪性新生物細胞を認識し除去する免疫応答を惹起できることは、癌を処置する現存のアプローチである。ユニークな腫瘍抗原を同定すれば、このような免疫応答の誘導が促される。Ｂ細胞悪性新生物は、その表面にユニークな抗原である免疫グロブリンイディオタイプ（Ｉｄ）を発現する。この抗原は、可変領域の免疫グロブリン重鎖および軽鎖（ＶＨまたはＶＬ）の両者由来のタンパク質配列を含む。各Ｂ細胞は免疫グロブリンイディオタイプを産生する際に使用されるユニークな遺伝子配列を有している。よって、殆どのＢ細胞悪性新生物が単一のＢ細胞のクローン性増殖によって引き起こされるので、Ｂ細胞悪性新生物を含むすべての細胞はユニークなＩｄタンパク質を発現する。また、イディオタイプタンパク質はリンパ腫や白血病などのＢ細胞悪性新生物の免疫基本療法における理想的な標的として役立つはずである。
【００３４】
受動免疫療法
初期の免疫療法ストラテジーは腫瘍特異的イディオタイプ（抗−Ｉｄ ＭｏＡｂ）に対するモノクローナル抗体の使用に焦点を当てていた。このアプローチは、非ホジキンリンパ腫を有する幾人かの患者に腫瘍の退縮と長期の寛解をもたらした（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３０６（９）：５１７−２２， １９８２； Ｍａｌｏｎｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ８０（６）：１５０２−１０， １９９２； Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７３（３）：６５１−６１， １９８９； Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １６（３）：１９９−２１０， １９８９； Ｍｅｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ６５（６）：１３４９−６３， １９８５）。
【００３５】
この試験に付随する１つの困難性は、悪性Ｂ細胞またはＴ細胞リンパ球の細胞がイディオタイプ免疫グロブリンまたはＴ細胞レセプターの発現を改変できることである。この２つの例が上記の論文に記載されている（Ｃｌｅａｒｙ ｅｔ ａｌ．， １９８６， ａｎｄ Ｍｅｅｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８５）。また、Ｔ細胞白血病細胞は、Ｔ細胞レセプターの表面発現を減じて抗−イディオタイプ抗体を回避しかねないことが示され（Ｍａｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４１：２９９４−３００２， １９８５）、これは動物モデルでのＢ細胞白血病においても確認されている（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３０（２）：９７０−３， １９８３）。他の試験では、特定のヒトＢ細胞リンパ腫においてさえもイディオタイプ多様性があることを証明している（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４４（２）：７５２−８， １９９０； Ｌｅｖｙ Ｓ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６８（２）：４７５−８９， １９８８；）。このような突然変異は抗−Ｉｄ ＭｏＡｂの有効性を経時的に減少させることは明らかである（Ｂｅｒｉｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， ｓｕｐｒａ； Ｔａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３６２（６４２２）：７５５−８， １９９３； Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ １５３（１０）：４７７５−８７， １９９４）。
【００３６】
この問題を回避する１つの方法は、イディオタイプタンパク質に対するポリクローナル抗体を作成し使用することに依存する。Ｃａｓｐａｒおよび共同研究者はマウスモデル系においてポリクローナル抗体基本療法の可能性を試験した（Ｃａｓｐａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ９０：３６９９−７０６， １９９７）。ここでは、モノクローナル抗体療法が成功してその後再発した非ホジキン白血病患者由来のイディオタイプ抗体をマウスにワクチン接種した。得られたポリクローナル抗体は元の腫瘍とすべての変異体の両者由来のイディオタイプタンパク質を認識した。従って、Ｂ細胞リンパ腫または白血病のイディオタイプに特異的なポリクローナル抗体応答を惹起させると、モノクローナル抗体療法よりも改善が見られる。このアプローチでは、ワクチン接種を行うに充分な量のポリクローナル抗体を生産することが有意な障壁である。
【００３７】
能動免疫療法
受動免疫ストラテジーにて認められる突然変異回避の減少は能動免疫療法により克服できる。この療法は、より広範な免疫応答を惹起できる可能性があり、よって経時的に出現し得る異種（ヘテロローガス）腫瘍細胞の集団を認識できる。能動免疫療法の難点は、腫瘍が発現する認識「自己抗原」に対して患者の免疫系を反応させることが困難な点である。イディオタイプタンパク質に関し、腫瘍が発現する多くの抗原は弱い免疫原である。
【００３８】
本発明では、免疫系のユニークな特異性をＢ細胞悪性腫瘍および病態の処置に適用する。本発明では、イディオタイプ免疫グロブリンの可変領域をコードするはＤＮＡ配列を、ユニークなサブファミリーの軽鎖および重鎖免疫グロブリン鎖それぞれの５’末端由来のプライマー、および定常領域プライマーを用いてクローニングした。典型的には、この方法では、ＰＣＲなどの幾つかの適当なクローニング手法の１つを利用する。可変領域および定常領域を含有するキメラタンパク質を調製する第１段階として、定常領域プライマーをＶＨ領域のプライマーおよびＶＬ領域のプライマーともに使用し、可変領域にクローニングする。あるいは、５’ＲＡＣＥなどの手法を使用できる。上述の患者の場合、５’ＲＡＣＥを使用し、免疫グロブリン重鎖および軽鎖の可変領域をクローニングし、キメラタンパク質を調製する。キメラタンパク質の例としては、ＶＬ／Ｃκ、ＶＬ／Ｃλ、ＶＬ／ＩｇＧγ１、ＶＨ／ＩｇＧγ１、ＶＨ／ＣκおよびＶＨ／Ｃλが挙げられる。このキメラタンパク質はバキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞にて調製される。このようなキメラタンパク質は、患者由来の免疫グロブリン分子の可変領域の一部を含有し、さらにこの患者以外の供給源由来の定常領域の一部を含有する。好ましい態様では、重鎖および軽鎖定常領域は９Ｆ１２細胞から誘導する。しかし、免疫グロブリン定常領域遺伝子としては他の供給源も使用できる。これらキメラタンパク質はイディオタイプタンパク質を生産するための既存の系よりも効率的に生産され、ワクチン接種プロトコールの使用に優れた免疫原と期待される。
【００３９】
本発明は、Ｂ細胞媒介性病態および自己免疫疾患の有効な処置に対する大きな要求を満たすものである。本発明は、Ｂ細胞媒介性病態に関与するＢ細胞表面に存在する、患者特異的な方法により調製されるユニークな細胞表面抗原をうまく利用するものである。このようなワクチンは特定患者に見出される病原性Ｂ細胞にユニークなマーカーに対して加工されることにより、優れて選択的である。
【００４０】
新規なバキュロウイルス／昆虫細胞発現系は特定患者ｋらの免疫グロブリンに対する機能低交代を効率的に産生するのに有効であることが証明された。ヒトカッパ軽鎖またはＩｇＧγ１重鎖として簡便にサブクローニングし発現させるため、抗体可変領域の対を増幅するのに、２つの通常遺伝子特異的プライマーのみを必要とするようにバキュロウイルス発現ベクターを作製した。重鎖および軽鎖を分泌経路に置くための異種分泌シグナル配列を組込み、大量の活性免疫グロブリンを昆虫細胞から発現させた。このようなベクターは、ヒトカッパ定常領域とインフレームにありヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を介して分泌されるカッパ軽鎖可変領域（ＶＬ）、およびミツバチメリチン分泌シグナル配列に先行されるヒトＩｇＧγ１定常ドメインとインフレームにある重鎖可変領域（ＶＨ）を発現させるのに有用である。他の系では、ラムダ軽鎖定常領域をカッパ定常領域と置きかえる。次いで、キメラタンパク質を、ヒトラムダ定常領域とインフレームにありヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を介して分泌されるＶＬ領域およびヒトＩｇＧγ１定常領域とインフレームにありミツバチメリチン分泌シグナル配列に先行される重鎖可変領域（ＶＨ）を有するキメラタンパク質を発現させる。モノクローナル細胞系統からまたはファージディスプレークローニングにより同定されるマウスまたはヒトモノクローナル抗体は２つの単純なサブクローニング工程を経て、全ヒトＩｇＧγ１／κまたはＩｇＧγ１／λとして簡便に発現させることができる。さらに、ＩｇＧγ２、ＩｇＧγ３、ＩｇＧγ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ重鎖などの種々の免疫グロブリン型またはそのセグメントを、ＩｇＧγ１に代えて使用できる。さらに、上記シグナル配列に加え、本発明は、特定の患者から誘導される免疫グロブリン遺伝子に付随する内生分泌配列を使用できる。さらに、当業者は、簡便なサブクローニングのために抗体可変領域の対を増幅し同等の結果を得るためのこの系において同等に使用できる種々の異なるプライマーを選択できる。
【００４１】
幾つかの場合において、生物学的活性タンパク質の発現におけるバキュロウイルス系の利用性は、過剰なタンパク質分解的変性無しに組換えタンパク質を効率的に可溶化できないことから障害されている。昆虫細胞における組換えタンパク質の発現の際に遭遇する溶解性およびタンパク質分解の問題を回避するため、バキュロウイルス移入ベクターが生物学的活性タンパク質の効率的分泌のために開発された。この宿主昆虫細胞から組換えタンパク質を分泌させるベクターは、機能的分泌リーダー配列をポリヘドリンプロモーターの下流に挿入することにより構築される。ｃＤＮＡ配列のインフレーム挿入により、組換えタンパク質を分泌経路に置く異種シグナル配列を含むタンパク質が合成される。ヒトおよび昆虫リーダー配列はともに、昆虫細胞からの異種タンパク質の分泌を最大にするために試験された。ヒト胎盤アルカリホスファターゼシグナル配列（配列番号：１：　ＭＬＧＰＣＭＬＬＬＬＬＬＬＧＬＲＬＱＬＳＬＧ；ＤＮＡ配列は配列番号：２：　ＡＴＧ ＧＴＧ ＧＧＡ ＣＣＣ ＴＧＣ ＡＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＧ ＣＴＡ ＧＧＣ ＣＴＧ ＡＧＧ ＣＴＡ ＣＡＧ ＣＴＣ ＴＣＣ ＣＴＧ ＧＧＣ）、およびミツバチメリチンシグナル配列（配列番号：３：　ＭＫＦＬＶＮＶＡＬＶＦＭＶＶＹＩＳＹＩＹＡ；ＤＮＡ配列は配列番号：４：　ＡＴＧ ＡＡＡ ＴＴＣ ＴＴＡ ＧＴＣ ＡＡＣ ＧＴＴ ＧＣＡ ＣＴＡ ＧＴＴ ＴＴＴ ＡＴＧ ＧＴＣ ＧＴＧ ＴＡＣ ＡＴＴ ＴＣＴ ＴＡＣ ＡＴＣ ＴＡＴ ＧＣＧ）はともに、多くの細菌およびヒトタンパク質の分泌に有用であることが証明されている（Ｍｒｏｃｚｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１３５２２−２８， １９９４およびＴｅｓｓｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ ９８：１７７−８３， １９９１）。
【００４２】
本発明を特定の患者に対して加工するには、まず、ユニーク抗原コードする遺伝子を同定、単離し、次いでそのような抗原を調製する手段を探索する必要がある。これは、当業者に利用可能な種々の多くの手法により行うことができる。例えば、最近開発された本発明の要求にかなう方法は、新規なバキュロウイルス／昆虫細胞発現系を利用し、これは最近、免疫療法のための機能的抗体を効率的に調製するために開発されたものである（ｓｅｅ Ｕ．Ｓ． Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ． ６０／２４４，７２２， ｅｎｔｉｔｌｅｄ ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ”）。
【００４３】
バキュロウイルス系を使用する組換えタンパク質の発現により、細菌でのタンパク質作成に付随する多くの欠点を伴うことなく、さらに哺乳動物使用に伴う煩雑さを回避して、大規模な生物学的活性タンパク質が生産できる。例えば、破傷風トキソイドに特異的なヒトＩｇＧ１／κ抗体を産生する安定なヒト細胞系統９Ｆ１２（ＡＴＣＣ＃ＨＢ８１７７）由来の免疫グロブリン遺伝子をバキュロウイルス二次元プロモーター発現輸送ベクターにクローニングした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびウエスターンブロッティングにおいて哺乳動物抗体と同様に挙動する無傷のＩｇＧ１／κ免疫グロブリンを昆虫細胞から調製した。昆虫細胞から産生された抗体はグリコシル化されていた。精製ＭａｂｐＦ１２および精製バキュロウイルス発現抗体の結合親和性は同一であると測定され、その産生レベルは約５−１０μｇ／ｍｌと測定された。
【００４４】
特定の可変領域の特異的エピトープを含む可溶性ヒト免疫グロブリン断片は、昆虫宿主細胞において遺伝子操作により調製できる。患者由来の特定のＶＨおよび／またはＶＬ鎖を含むこのような可溶性組換え免疫グロブリンタンパク質は治療用組成物として使用できる。患者に投与すれば、Ｂ細胞媒介性病態を改変するための細胞性免疫応答がインビボにおいて特異的に誘発されよう。
【００４５】
この手法はさらに、Ｔ細胞リンパ腫から発現される患者特異的なＶαおよびＶβ遺伝子の迅速な同定とクローニングに適用されており、次いでこれらを組換えκ／ＶαまたはＩｇＧγ１／Ｖβ分子として昆虫細胞において発現された（ｓｅｅ Ｕ．Ｓ． 仮出願番号Ｎｏ． ６０／２２４，７２３ ｅｎｔｉｔｌｅｄ ”Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｉｄｉｏｔｙｐｅ−Ｖａｃｃｉｎｅ”）。この方法により調製された分子は製剤化され、患者特異的な態様におけるリンパ腫に対する抗−イディオタイプ細胞性免疫の誘発に使用された。
【００４６】
「改変」または「改変する」なる用語は、本発明化合物または組成物におけるＢ細胞媒介性病態の調整能力を意味する。Ｂ細胞媒介性病態を改変する化合物は、化合物に対する抗体応答を惹起させてＢ細胞病態の細胞を破壊する；
病態に関与するＢ細胞にアポトーシスを誘発する；
Ｂ細胞病態の細胞に対する細胞性免疫を誘発してＢ細胞病態の細胞の発育や分裂をさらに阻害する；あるいは病原性Ｂ細胞の活性を阻害する、などの多くの可能性ある機序によりそのように機能する。改変を起こす正確な機序は決定する必要はないが、Ｂ細胞媒介性病態の改変は本発明の分子または組成物を投与する結果として、何らかの機序により起こるのは確かである。
【００４７】
「Ｂ細胞媒介性病態」または「Ｂ細胞病態」なる用語は、Ｂ細胞の不適切な複製または活性により引き起こされる疾患および状態を意味する。好ましい態様では、Ｂ細胞媒介性病態は、Ｂ細胞の不適切な複製によって引き起こされるＢ細胞リンパ腫である。Ｂ細胞リンパ腫は現在利用可能な治療法では有効に処置するのが困難である。Ｂ細胞の不適切な複製が関与する他のタイプのＢ細胞病態には慢性および急性のＢ細胞白血病、多発性骨髄腫および幾つかの型の非ホジキンリンパ腫が挙げられる。他の好ましい態様では、多発性硬化症（ＭＳ） （Ｗａｒｒｅｎ ａｎｄ Ｃａｔｚ， Ｍｕｌｔ． Ｓｃｌｅｒ． ６（５）：３００−１１， ２０００）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ） （Ｚｈａｎｇ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６６（１）：６−１０， ２００１； Ｏｄｅｎｄａｈｌ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １６５（１０）：５９７０−７９， ２０００）、抗−Ｈｕ関連傍腫瘍性神経症候群（Ｒａｕｅｒ， Ｓ． ａｎｄ Ｋａｉｓｅｒ， Ｒ．， Ｊ． Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ． １１１（１−２）：２４１−４４， ２０００）、および自己免疫肝炎（ＡＩＨ）（Ｏｇａｗａ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． Ｈｅｐａｔｏｌ （１）：６９−７５， ２０００）などの、宿主自身の免疫系が宿主自身の組織を攻撃する自己免疫疾患として分類される、その数が増加途上のヒト疾患が挙げられる。本発明により処置される他の候補自己免疫疾患は、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、重症筋無力症（ＭＧ）、自己免疫性甲状腺炎（橋本病）、グレーブス病（Ｇｒａｖｅｓ’ ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性大腸疾患、自己免疫性ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、強皮症および特定の型の糖尿病などがある。これら自己免疫疾患を処置する現在の処置方法は疾患を治癒するのでなく、症状を改善するに過ぎない。
【００４８】
「Ｂ細胞」なる用語は、生物の正常機能における体液性免疫に関与する、生物の免疫系細胞（即ち、Ｂ細胞媒介性病態を経験していないもの）を意味する。Ｂ細胞は骨髄から誘導され、抗体を産生する白血球であり、Ｂリンパ細胞としても知られる。一般に、Ｂ細胞は生物において抗体産生を担う細胞である。
【００４９】
「病態」なる用語は、多くの医学領域により異常と認識されている生物（例えばヒト）の状態を意味する。本発明により処置される病態はＢ細胞の機能または複製の異常を特徴とする。
【００５０】
「患者」なる用語は、病態、より具体的にはＢ細胞病態の処置を必要とする生物を意味する。この用語は、臨床の場において治療物質による処置が必要であると示唆される特定の症状（群）を示す生体を意味する。処置は医学領域において一般に許容されている、または経験されるもののいずれであってもよい。好ましい態様では、患者は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラットおよびマウスなどの哺乳動物である。さらに好ましい態様では、患者はヒトである。患者の診断は疾患の進行により自発的に、または治療方法や処置の経過とともに変化することがある。
【００５１】
「生物」なる用語は単細胞または多細胞であり得る。この用語は、哺乳動物、最も好ましくはヒトを含む。好ましい生物はマウスであり、それは、マウスでの処置または診断の能力がヒトなどの他の生物における機能性を予測させることが多いからである。他の好ましい生物は霊長類であり、それは、霊長類での処置または診断の能力がヒトなどの他の生物における機能性を予測させることが多いからである。
【００５２】
「キメラタンパク質」なる用語は、異なる少なくとも２つのタンパク質由来のセグメントを含む単一のポリペプチド鎖を含むタンパク質を意味する。キメラタンパク質のセグメントは異種タンパク質から誘導されなければならず、即ち、キメラポリペプチドのすべてのセグメントは同じタンパク質由来ではない。本発明のキメラタンパク質は、免疫グロブリン鎖のＶＨまたはＶＬ領域の一部を含有するが、ＶＨまたはＶＬ領域が誘導されたＢ細胞クローンに見出されるそれら鎖のＣ領域のすべては含まない。さらに、ＶＨまたはＶＬ領域は前可変領域を含んではならないが、免疫応答を惹起するに充分な領域を含む。本発明のキメラタンパク質は、天然に存在するタンパク質のセグメントが天然に存在するまたは存在しない同等のセグメントと置き換わっているタンパク質をも包含する。これには、別の供給源由来のＩｇＧ１定常領域を有する患者から誘導されるＩｇＧ１定常領域の置換が包含され、タンパク質のセグメントが、部分的にまたは全体が人工のリンカー、セグメントまたはドメインと置き換わっている免疫グロブリン定常領域をも含んでいる。しかし、須らく、本発明のキメラタンパク質の遺伝子は患者に天然に存在する免疫グロブリンの遺伝子と同じではない。キメラタンパク質の遺伝子は以下の理由の１つから天然に存在するタンパク質と区別できる：　（１）患者由来の免疫グロブリン遺伝子またはｃＤＮＡの全長を有さない、（２）患者から単離されたサブタイプとは異なる、または（３）患者ＩｇＧ１定常領域をコードする核酸配列は発現ベクターに使用されるＩｇＧ１遺伝子と異なっている。
【００５３】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、「ペプチド」なる用語は本明細書では交換可能に使用している。
【００５４】
「天然に」または「天然」なる用語は、天然から単離されているタンパク質を意味する。従って、天然に存在するタンパク質とは、組換え手法により修飾されていない遺伝子によりコードされる、それが天然にて見出される形態のタンパク質を意味すると定義できる。天然タンパク質は天然に見出されまたは合成されていてもよいタンパク質と定義できる。また、この用語は、本発明のバキュロウイルス系または親試料の細胞培養によるなどの生物系により産生されるタンパク質にも適用できる。天然タンパク質は変性されていない単離されたタンパク質とも定義できる。「天然」なる用語はまた、ポリペプチドまたはタンパク質が単独でまたは他のポリペプチドとともに折り畳まれ、天然に見出される同様のタンパク質に類似する態様、あるいは翻訳後に修飾（翻訳後修飾）され、天然に見出される同様のタンパク質と類似する態様をも意味する。天然に存在するタンパク質は、単一の患者由来の病原性Ｂ細胞においてのみ見出されるが、いずれにせよ、これは天然に存在するタンパク質と考えられる。
【００５５】
「セグメント」または「一部」なる用語は、誘導元の全長ポリペプチドよりも長さが短いキメラタンパク質に使用されるタンパク質のアミノ酸配列から誘導されるポリペプチドを示す用語として使用している。このようなセグメントは天然ポリペプチドの１つまたはそれ以上の特性を保持できると考えられる。このような保持される特性の例としては、天然ポリペプチドまたはそのエピトープに特異的な抗体との結合性である。
【００５６】
「ＶＨ」および「ＶＬ」なる用語は、免疫グロブリンのポリペプチド鎖の可変領域またはそのポリペプチド鎖をコードする核酸を意味する。当業者であれば、これらの用語の意味を理解するものである。可変領域の正確な配列は予測できず、問題の配列を単離することにより決定しなければならない。特定の患者から単離されたＶＨおよびＶＬ領域を本発明にて使用できる。カッパ（κ）またはラムダ（λ）軽鎖の正確な配列は軽鎖座のＶ領域、Ｊ領域および定常領域のクローン的再構成により決定される。（カッパおよびラムダ座は分離し別個である）　重鎖の正確な配列は重鎖座のＶ領域、Ｄ領域、Ｊ領域および定常領域のクローン的再構成により決定される。可変領域における付加的な配列変異は組換え工程時の不正確さで起こり、また組換え工程の末期後の体細胞突然変異によっても引き起こされる。「ＶＨ」および「ＶＬ」なる用語はＶＨまたはＶＬ鎖の一部またはセグメントをも意味する。ＶＨおよびＶＬ領域のセグメントはＶ領域のすべてまたは実質的にすべてを含むこともできる。「実質的にすべて」なる用語は可変領域全体の約９０％または可変領域全体の約８０％を意味する。ＶＨおよびＶＬ領域における存在する一部は、本発明のキメラタンパク質が機能するに充分でなければならない。「ＶＨ」および「ＶＬ」なる用語はまた、上記のポリペプチド鎖の機能的誘導体をも意味する。
【００５７】
「免疫グロブリン定常領域」なる用語は、免疫グロブリンの可変領域によりコードされていない免疫グロブリン分子部分のすべてまたはその一部を意味する。「免疫グロブリン定常領域」なる用語はまた、免疫グロブリン定常領域をコードするＤＮＡ配列をも意味することができる。免疫グロブリン定常領域にはＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３セグメント、およびヒンジ領域が含まれる。免疫グロブリンタイプには、ＩｇＧγ１、ＩｇＧγ２、ＩｇＧγ３、ＩｇＧγ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ重鎖、およびκまたはλ軽鎖またはそのセグメントが含まれる。免疫グロブリン定常領域セグメントは、それが免疫グロブリン定常領域を本発明の目的に適うように機能させる限り、例えば、キメラ分子のアフィニティー精製をプロテインＧ、プロテインＡ、プロテインＬまたは適当な抗体を介して可能とする限り、あらゆるものを本発明に使用できる。上記の免疫グロブリン定常領域セグメントの機能的誘導体も使用できる。
【００５８】
「免疫グロブリン折り畳み」または「免疫グロブリンドメイン」なる用語は、免疫グロブリンスーパーファミリーの構造要素を意味する。免疫グロブリンドメインは各々が、約１１０個のアミノ酸の保存された反復構造ドメインである。
【００５９】
免疫グロブリンドメインは抗体、Ｔ細胞抗原レセプター、サイトカインレセプター（例えば５Ｉｇドメインを有する血小板誘導化成長因子レセプター）、細胞接着分子（例えばＩＣＡＭ−１／ＣＤ５４）などの多くのタンパク質分子に見出される。２つの免疫グロブリンドメインがＴＣＲの各鎖に見出され、１つは可変領域に、１つは定常領域内にである。２つの免疫グロブリンドメインが抗体軽鎖に見出され、４つがＩｇＧ重鎖に見出される。本発明は、定常領域の１つまたは２つのドメインを別の分子、例えば免疫グロブリン分子由来のドメインと置き換え、その分子に対する結合性などの異なる性質を有し得る改変（キメラ）定常領域を産生することも包含する。
【００６０】
「ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ」なる用語は、免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスを意味する。これらの用語は、タンパク質のＤＮＡ配列またはアミノ酸配列を意味できる。免疫グロブリン分子のクラスおよびサブクラスは重鎖によって決定される。例えば、ＩｇＧおよびＩｇＤは免疫グロブリンの異なるクラスであり、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２は免疫グロブリン分子の異なるサブクラスである。「ＩｇＡ」なる用語はＩｇＡ分子のあらゆるサブクラスを意味できる。好ましい態様では、これはＩｇＡ１分子を意味する。別の好ましい態様では、これはＩｇＡ２分子を意味する。ある態様では、使用される免疫グロブリン重鎖第２のタンパク質由来のアミノ酸を含むキメラタンパク質であってもよい。
【００６１】
「ＩｇＧγ１」なる用語は免疫グロブリンのＩｇＧ１クラスと関連する重鎖を意味する。ＩｇＧ１は、ヒトＩＧ免疫グロブリンの約６６％を代表する（Ｒｏｉｔｔ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｍｏｓｂｙ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， １９９３， ｐｇ．４．２， １９９３）。
【００６２】
「カッパ定常領域」、「ラムダ定常領域」、「κ定常領域」および「λ定常領域」なる用語は、免疫系の発達過程で保存されてきたカッパ（κ）およびラムダ（λ）軽鎖の定常領域を意味する。これらの用語は、タンパク質のアミノ酸配列またはＤＮＡ配列のいずれかを意味できる。ある場合には、免疫グロブリン軽鎖の部分は１つまたはそれ以上の他のタンパク質由来のアミノ酸を含むキメラタンパク質に含まれていても良い。
【００６３】
「投与」なる用語は、化合物を生物の細胞または組織とまたはその内部に接触させる方法に関連する。Ｂ細胞媒介性病態は、生物の細胞または組織が生物の内部または生物の外部に存在すると予防または処置できる。生物の外部に存在する細胞は細胞培養皿にて維持または生育できる。生物の内部に保持される細胞では、経口、腸管外、経皮、注射および吸入など（これらに限定されない）の化合物を投与するための多くの手法が当業者に知られている。
【００６４】
病態の特性を示すＢ細胞に対し、本発明の化合物または本発明化合物に対して惹起された抗体を投与することにより、Ｂ細胞媒介性病態は予防または処置できる。化合物投与の生物機能に対する効果を次いでモニターすればよい。生物は好ましくはマウス、ラット、ウサギ、モルモットまたはヤギであり、より好ましくはサルまたは霊長類、最も好ましくはヒトである。
【００６５】
「組成物」なる用語は、目的のタンパク質を含む混合物を意味する。好ましい態様では、組成物は添加剤、安定化剤、賦形剤などの付加的な成分を含むことができる。
【００６６】
Ｂ細胞クローンとの関連において可変領域に対して使用される「関連する」なる用語は、特定のＢ細胞クローンによって産生される免疫グロブリンに見出される可変領域を意味する。
【００６７】
「Ｂ細胞クローン」なる用語は単一のＢ細胞のクローン的子孫を意味する。Ｂ細胞のクローン的子孫は産生される抗体において親細胞と同じイディオタイプを発現する。当業者であれば、Ｂ細胞のクローン的子孫は免疫グロブリン遺伝子の可変領域内に体細胞性変異を受けることがあるが、Ｂ細胞クローンの部分は依然保持していることを理解できる。
【００６８】
「単離」なる用語は、天然に存在する核酸配列をその通常の細胞環境から取り出すことを意味する。従って、核酸配列は細胞不含溶液中に、または別の細胞環境に置かれているといえる。この用語は、配列がヌクレオチド鎖のみで存在することを意味せず、それに通常付随する非ヌクレオチド物質が実質的に含まれていない（少なくとも約９０−９５％純度）ことを意味しており、従ってこれは単離された染色体と区別される。さらに、核酸に関連して使用する「単離」なる用語は、目的の溶液に存在する全ＤＮＡまたはＲＮＡの画分における特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が、その配列が取り出された細胞内よりも有意に高く増大（２−５倍）していることを意味する。これは、他の存在するＤＮＡまたはＲＮＡの量を優先的に減少させること、または特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の量を優先的に増大させること、またはそれらを組合わせることにより行うことができる。しかし、増大させることは、他のＤＮＡまたはＲＮＡ配列が存在しないことを意味せず、目的の配列の量が相対的に有意に増大していることを意味する点に留意しなければならない。「有意」なる用語は、増大レベルが増大させる者にとって有用であることを示すために使用され、一般に他の核酸と比較して、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも５−１０倍またはそれ以上の増大を意味する。この用語はさらに、他の供給源由来のＤＮＡまたはＲＮＡが存在しないことを意味しない。他の供給源由来のＤＮＡとは例えば、酵母または細菌ゲノム由来のＤＮＡ、またはｐＵＣ１９などのクローニングベクターなどである。この用語は、１つのｍＲＮＡレベルが他の種のｍＲＮＡと比較して自然に増大し得るウイルス感染または腫瘍型増殖を区別する。即ち、この用語は、所望の核酸の比率を高める場合のみを網羅する意味である。
【００６９】
単離されたＤＮＡ配列は天然環境におけるよりも比較的純度が高い（天然レベルと比較し、そのレベルは例えばｍｇ／ｍｌ単位にて少なくとも２−５倍高い）。ＰＣＲによって得られる個々の配列は電気泳動的な均一にまで精製できる。ＰＣＲ反応によって得られるＤＮＡ分子は全ＤＮＡまたは全ＲＮＡから得ることができる。これらのＤＮＡ配列は天然に存在していないが、好ましくは部分的に精製された天然に存在する物質（例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））を操作することにより得られる。例えば、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを構築するには、合成物質（ｃＤＮＡ）を作成し、ｃＤＮＡライブラリーを含む細胞からのクローン選択により合成ライブラリーから個々の精製ｃＤＮＡを単離すればよい。ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ構築および別個のｃＤＮＡクローンの単離を含むこの方法は、天然メッセージの約１０６倍の純度を与える。従って、少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、さらに好ましくは４または５桁の純度が明示的に理解される。
【００７０】
「をコードする遺伝子」なる用語は、目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸の配列を意味する。核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡのいずれの分子であってもよい。好ましい態様では、この分子はＤＮＡ分子である。他の好ましい態様では、分子はＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子と存在する場合、翻訳を開始させるよう宿主細胞のリボゾームを駆動する配列（例えば開始コドンＡＴＧ）および翻訳を終止させるようリボゾームを駆動する配列（例えば終止コドン）を含む。開始コドンと終止コドンとの間には解読枠（ＯＲＥ）がある。当業者は、これらの意味に精通している。
【００７１】
「昆虫細胞系統」なる用語は、バキュロウイルスによって感染される昆虫由来の細胞系統を意味する。当業者はこのような細胞系統およびその利用に必要な技術に精通している。代表的な昆虫細胞系統の例は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （ｓｆ９） および Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｈｉ−５）細胞系統である。
【００７２】
「Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ（Ｈｉ−５）およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （ｓｆ９）細胞」なる用語は、バキュロウイルス発現ベクターとともに使用される昆虫細胞系統である。当業者はこのような細胞系統およびその入手方法に精通している。
【００７３】
「挿入」なる用語は、制限酵素またはリガーゼを使用してＤＮＡ配列を操作することを意味し、それにより、目的のＤＮＡ配列、通常は目的遺伝子をコードするＤＮＡ配列を別の核酸分子に組込むことができる、その際は両分子を、適合オーバーレイを作成するのに適当な制限酵素を用いて消化し、次いでリガーゼを用いて両分子を共に結合する。当業者はこのような操作に精通しており、その実例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ， ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８９）に見出される（これは図面、数値および表などすべてが引用により本明細書に包含される）。
【００７４】
「アジュバント」なる用語は、選択した抗原または免疫原に対する動物における免疫応答を惹起させる場合に、選択した抗原または免疫原、例えば免疫応答を望むタンパク質またはポリペプチドとともに供給される、免疫応答を増大させるための物質である。当業者は選択および使用に適したアジュバントに精通している。ヒト使用が許可されているアジュバントにはアルミニウム塩およびＭＦ５９ （Ｓｉｎｇｈ ａｎｄ Ｏ’Ｈａｇａｎ， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １７：１０７５−８１， １９９９）がある。他のアジュバントも開発されており（前掲）、それらも本発明に使用できる。
【００７５】
「キーホールリンペットヘモシニアン」または「ＫＬＨ」なる用語は、免疫反応において担体タンパク質として普通に使用されているカサガイ（Ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔｓ）から単離されたタンパク質を意味する。当業者はキーホールリンペットヘモシニアンなる用語の意味に精通している。
【００７６】
「サイトカイン」なる用語は、主としてリンパ球から分泌される、普通は可溶性の（糖）タンパク質、成長因子ファミリーを意味する。サイトカインは体液性および細胞性免疫応答、および貪食細胞の活性化の両者を刺激する。サイトカインは、免疫系内部の種々の細胞型（リンホカイン、インターロイキン、モノカイン、腫瘍壊死因子、インターフェロン）のみならず、血液学の分野（コロニー刺激因子）、腫瘍学（トランスホーミング成長因子）および細胞生物学（ペプチド成長因子、熱ショックおよび他のストレスタンパク質）で研究されている他の細胞から合成され、保存され輸送される。
【００７７】
リンパ球から分泌されるサイトカインはリンホカインと呼ばれ、単球またはマクロファージから分泌されるものはモノカインと呼ばれる。多くのリンホカインは白血球から分泌されるのみならず、白血球の細胞応答に影響を与え得るため、インターロイキン（ＩＬｓ）とも呼ばれる。具体的には、インターロイキンは造血器官の細胞を標的とする成長因子として機能する。
【００７８】
「成長因子」なる用語は、細胞表面のレセプターと結合した後、細胞増殖および／または分化を活性化するタンパク質を意味する。多くの成長因子は用途が極めて広く、種々の細胞型の細胞分化を刺激するように機能できるが、他のものは特定の細胞型に特異的である。
【００７９】
「ケモカイン」なる用語は、白血球の化学遊走物質および活性化物質として機能する炎症前の小さなサイトカインの一群であり、３０個以上の化学遊走性サイトカインのスーパーファミリーである。ケモカインは、血液または骨髄由来の免疫系細胞を活性化し、それらを感染および障害組織へと移動させることを調和させる。ケモカインはまた、骨髄に見出される原始的幹細胞を成長および増殖する本質的な役割を果たし、それは成熟免疫細胞へと成長させる。ケモカインは広範な急性および炎症性疾患に関与し、７回膜貫通へリックスクラスのレセプターと結合することによりその作用を主として発揮する。
【００８０】
ケモカインは分子量８ から １１ ｋＤａであることが多く、１ から １００ ｎｇ／ｍｌの濃度で活性であり、広範な細胞型から産生される。ケモカインの産生は通常、外因性の刺激物質および内生伝達物質、例えばＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＰＤＧＦによって誘導される。ケモカインは特異的細胞表面レセプターに結合し、他のサイトカインの強力な誘導物質でなく、炎症および修復において比較的特殊な機能を果たすのみであるので、一次炎症前サイトカインよりも多面性が明らかに低い二次サイトカインと考えられる。
【００８１】
「顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子」または「ＧＭ−ＣＳＦ」なる用語は、小さな（２０ ｋＤａより小さい）分泌型タンパク質を意味する。これは特異的細胞表面レセプターに結合し、骨髄細胞の種特異的刺激物質として機能する。これは、樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、好酸球および赤血球などの幾つかの造血細胞系譜の成長および分化を刺激する。具体的には、このサイトカインはＴ細胞増殖を増大させ （Ｓａｎｔｏｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８８， １４１（２）：５１９−２６）、顆粒球および単球における接着分子の発現を増大させ（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９０， １４５（２）：６０７−１５； Ｇｒａｂｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９８６， ２３２（４７４９）：５０６−０８）、および抗原提示能を増大させ（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８７，１３９（４）：１１１３−９； Ｈｅｕｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．， １９８８， １６７（２）：７００−０５； Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ， １９９０， １４４（５）：１７７７−８２）、細胞性免疫を形成する役割も果たす。
【００８２】
「単球走化性タンパク質３」または「ＭＣＲ３」なる用語は、単球から主として産生されるケモカインを意味する。ＭＣＲ−３は広範なスペクトラムの化学遊走活性を有し、単球、樹状細胞、リンパ球、ナチュラルキラー細胞、好酸球、好塩基球、および好中球を引き付ける。このｃＤＮＡは１９９３年にＭｉｎｔｙ ｅｔ ａｌ．， Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ ４（２）：９９−１１０， １９９３， ａｎｄ Ｏｐｄｅｎａｋｋｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．， １９１（２）：５３５−４２， １９９３によってクローニングされた。その性質は最近、Ｐｒｏｏｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｌｅｕｋｏｃ Ｂｉｏｌ． ５９（１）：６７−７４， １９９６によって綜説されている。
【００８３】
「発現ベクター」なる用語は、選択した目的遺伝子、通常はタンパク質が適切に挿入された場合、発現するよう作製されている組換えＤＮＡ構築物を意味する。当業者はこの用語を理解する。発現ベクターは普通、目的遺伝子を挿入する部位の５’末端にプロモーター、およびその部位の３’末端にターミネーター領域を含む。目的遺伝子は制限酵素切断部位を選択して適当な部位に挿入することが多い。「発現ベクター」なる用語は、目的産物をコードする目的遺伝子がすでに挿入されている上記のＤＮＡ構築物をも意味する。
【００８４】
「バキュロウイルス発現ベクター」なる用語は、選択した遺伝子がバキュロウイルス系に挿入された場合、発現するよう作製されているＤＮＡ構築物を意味する。本発明では、バキュロウイルス系で機能するよう作製された可能性あるバキュロウイルスまたは発現ベクターはあらゆるものを使用できる。同様に、「発現ベクター」なる用語は、バキュロウイルス発現ベクターの特定の態様を包含する用語であるが、「発現ベクター」は昆虫細胞系統だけではなく、それに加えて細胞および細胞系統において機能できる。
【００８５】
「発現できる（発現させる）」なる用語は、発現ベクターを、目的遺伝子が発現される環境に置くことを意味する。これは通常、プロモーターおよび他の遺伝子発現に必須の領域が宿主細胞成分によって認識され目的遺伝子を発現させる適当な細胞型に発現ベクターを挿入する意味である。発現は普通、転写および翻訳の２つの工程からなる。発現はまた、細胞由来の成分を用いてインビトロにて行うこともできる。当業者はそのような手法、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｆｒｉｔｓｃｈ， ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”， ２ｎｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８９）に記載されている技法に精通している。好ましい態様では、発現産物はタンパク質またはポリペプチドである。他の好ましい態様では、発現産物はＶＨ／ＩｇＧγ１、ＶＬ／Ｃκ、ＶＬ／Ｃλ、またはＶＬ／ＩｇＧγ１である。
【００８６】
「分泌シグナル配列」なる用語は、ペプチド配列を意味する。この配列が選択したポリペプチドのアミノ末端に結合したペプチドとしてインフレームにて翻訳されると、分泌シグナル配列は宿主細胞の機構と相互作用し選択ポリペプチドを分泌させる。分泌過程の部分では、この分泌シグナル配列は切断除去され、輸送後には目的のポリペプチドのみを残す。好ましい態様では、ミツバチメリチン分泌シグナル配列を使用する。別の好ましい態様では、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列を使用する。さらに好ましい態様では、特定の患者から誘導される免疫グロブリン遺伝子に付随する内生分泌配列を使用する。しかし、本発明はこれら分泌シグナル配列によって限定されず、当業者に周知の他の配列をこれらの代わりに、または付加的に使用できる。「分泌シグナル配列」なる用語はさらに、分泌ペプチドをコードする核酸配列をも意味する。
【００８７】
「ＥＬＩＳＡ」なる用語は、タンパク質の存在または濃度をＥＬＩＳＡ平板のプラスチックウエルとの結合性によって測定し、次いで定量または検出するタンパク質に特異的な抗体により検出を行う、「酵素結合免疫吸着アッセイ」を意味する。
【００８８】
「プロモーター制御」なる用語は、プロモーターが目的遺伝子の５’側に配置され、ＤＮＡ配列をｍＲＮＡ分子に転写させる、発現ベクターにおけるＤＮＡの配列を意味する。ｍＲＮＡ分子は次いで、宿主細胞の機構により翻訳される。当業者のこの用語に非常に精通している。
【００８９】
「プロテインＡ」、「プロテインＧ」、および「プロテインＬ」なる用語は、抗原結合部位と相互作用することなく、免疫グロブリン分子と特異的に結合できる特異的細菌タンパク質である。プロテインＡは免疫グロブリン分子のＦｃ領域と結合するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓから単離されるポリペプチドである。プロテインＧは免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対する親和性を有する細菌細胞壁タンパク質であり、ヒト連鎖球菌株Ｇ（Ｇ１４８）から単離された。プロテインＬは嫌気性細菌Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍａｇｎｕｓのある種の株から発現される免疫グロブリン軽鎖結合タンパク質である。
【００９０】
「Ｂ細胞リンパ腫」なる用語は、リンパ系の細胞に起こるＢ細胞由来の癌を意味する。Ｂ細胞は骨髄から発達し抗体を産生する白血球である。これはＢリンパ球としても知られている。
【００９１】
「難治性低グレードＢ細胞リンパ腫」は、処置に応答しない低グレードＢ細胞リンパ腫を意味する。「低グレードＢ細胞リンパ腫」なる用語は、濾胞性小決断細胞リンパ腫などの、発育と拡散が遅い傾向を示すリンパ腫を意味する。発育が遅いことから、無痛性リンパ腫とも呼ばれる。
【００９２】
「濾胞性Ｂ細胞リンパ腫」は、非ホジキンリンパ腫の型を意味する。これは無痛性（発育が遅い）型のリンパ腫である。
【００９３】
低グレードリンパ腫のさらなる定義および特徴はインターネットｈｔｔｐ：／／ｒｉｔｕｘａｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ／ｃｌｉｎｉｃａｌ＿ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ／ｃｌａｓｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌに見出すことができる。
【００９４】
タンパク質またはポリペプチドに関して「単離」なる用語は、天然に存在するポリペプチドまたはタンパク質をその正常な細胞環境から取り出すこと、または発現系（本明細書に記載のバキュロウイルス系）において合成されたポリペプチドまたはタンパク質を他の発現系成分から取り出すこと、を意味する。従って、このポリペプチド配列は細胞不含溶液中に、または別の細胞環境に置かれているといえる。この用語は、ポリペプチド配列がアミノ酸鎖のみで存在することを意味せず、それに天然にて付随する非アミノ酸基本物質が実質的に含まれていない（少なくとも約９０−９５％純度）ことを意味している。
【００９５】
ポリペプチドに関連して「増大」なる用語は、特定のアミノ酸配列が正常または疾患細胞またはその配列が取り出された細胞内よりも、目的の溶液または細胞に存在する全アミノ酸配列が有意に高い（２−５倍）画分を意味する。これは、他の存在するアミノ酸配列の量を優先的に減少させること、または特異的アミノ酸配列の量を優先的に増大させること、またはそれらを組合わせることにより行うことができる。しかし、増大させることは、他のアミノ酸配列が存在しないことを意味せず、目的の配列の量が相対的に有意に増大していることを意味する点に留意しなければならない。ここでの「有意」なる用語は、増大レベルが増大させる者にとって有用であることを示すために使用され、一般に他のアミノ酸と比較して、少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも５−１０倍またはそれ以上の増大を意味する。この用語はさらに、他の供給源由来のアミノ酸配列が存在しないことを意味しない。他の供給源のアミノ酸とは例えば、酵母または細菌ゲノムまたはｐＵＣ１９などのクローニングベクターによってコードされるアミノ酸などである。好ましい態様では、アミノ酸配列は上記のキメラタンパク質である。この用語は、所望のアミノ酸配列の比率を高める場合のみを網羅する意味である。
【００９６】
アミノ酸配列は精製形態であることがある種の目的にとって有益である。ポリペプチドに関連して「精製」なる用語は、絶対的純度（均一調製物のような）を要せず、配列が天然環境よりも純粋であることを示すものである。天然のレベルに比較し、このレベルは（例えばｍｇ／ｍｌ単位にて）少なくとも２−５倍高い。精製は、少なくとも１桁、好ましくは２または３桁、さらに好ましくは４または５桁であることが明示的に理解される。好ましくは、物質は、機能的に有意なレベル、例えば９０％、９０−９５ ％純度で混入が無いものである。
【００９７】
「作動可能に連結」なる用語は、プロモーターまたはエンハンサーなどの制御領域が目的の連結ＤＮＡに結合されてその転写、そしてその翻訳を起こす、ＤＮＡの配列操作を意味する。「作動可能に連結」なる用語はさらに、分泌シグナル配列などのプロセッシングシグナルをコードするＤＮＡ配列をポリペプチドをコードする遺伝子と連結させ、単一の解読枠を形成させることをも意味する。転写および翻訳の後、分泌シグナル配列は翻訳ポリペプチドを外部輸送させることができる。当業者はこの用語の意味に精通している。
【００９８】
有用なキメラタンパク質の機能的誘導体
本発明はさらに、本発明のポリペプチドまたは核酸の機能的誘導体をも提供する。「機能的誘導体」とは、本発明のポリペプチドまたは核酸の「化学的誘導体」、「断片」または「変異体」を意味し、これらの用語は以下に詳述する。機能的誘導体はタンパク質の機能の少なくとも一部、例えばタンパク質に特異的な抗体との反応性、非触媒ドメインを介する酵素活性または結合活性を保持しており、これらは本発明の機能的誘導体の有用性を保証する。当業者には、遺伝子コードの縮重により、多くの異なる核酸配列が同じアミノ酸配列をコードできることが周知である。同様に、アミノ酸の保存的変化により、元の機能が保持されているタンパク質またはポリペプチドが得られることも周知である。両者ともに、すべての順列が本明細書に包含されるものである。
【００９９】
本発明には、本明細書に記載の単離された核酸分子の機能的等価物が包含される。遺伝子コードの縮重により、特定のコドンは同一アミノ酸を特定し同じタンパク質を与える他のコドンに置換できる。メチオニンおよびトリプトファンを除き、既知のアミノ酸は１つ以上のコドンによってコードされ得るので、核酸配列は実質的に変動し得る。従って、本発明の遺伝子の一部またはすべては、天然に見出される配列と有意に異なる核酸配列として合成することができる。しかし、コードされるそのアミノ酸配列は保存されている。
【０１００】
複合体の「化学的誘導体」は、通常はタンパク質の部分ではない付加的な化学部分を含む。タンパク質またはペプチドの共有結合修飾が本発明の範囲に含まれる。以下に説明するように、このような修飾は、選択した側鎖または末端残基と反応できる有機誘導化試薬とペプチドの標的アミノ酸残基を反応させることにより、分子に導入できる。本発明のバキュロウイルス発現系によって通常結合される炭水化物に加え、タンパク質に別の炭水化物を結合させることもできる。
【０１０１】
最も普通には、システイン残基をクロロ酢酸またはクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させ、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システイン残基はさらに、ブロモトリフルオロアセトン、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル ２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールと反応させることにより誘導化される。
【０１０２】
ヒスチジル残基は、ｐＨ ５．５−７．０においてジエチルプロカルボネートと反応させることにより、その試薬は比較的ヒスチジン側鎖に特異的であるので、誘導化される。パラブロモフェナシルブロミドも有用である。この反応は好ましくは、ｐＨ ６．０において０．１Ｍ ナトリウム・カコヂレート中にて行う。
【０１０３】
リジンアミノ酸末端残基はクエン酸または他のカルボン酸無水物と反応させる。これらの試薬との誘導化により、リジン残基の効果またはその電荷が保存される。１級アミンを含有する残基を誘導化するための他の適当な試薬は、メチルピコリンイミデート、プリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロハイドライド（水素化クロロホウ素）、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシレートによるトランスアミナーゼ触媒反応などである。
【０１０４】
アルギニル残基は１つまたは幾つかの通常の試薬、例えばフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンの中から選ばれるものとの反応によって修飾される。アルギニン残基の誘導化には、グアニジン官能基の高いｐＫａ故に、アルカリ条件において反応を行う必要がある。さらに、これらの試薬はリジンの基およびアルギニンα−アミノ基と反応できる。
【０１０５】
チロシル残基は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応による分光学的標識を導入する修飾のための周知の標的である。最も普通には、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを使用し、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ調製する。
【０１０６】
カルボキシ側鎖基（アスパラギン酸またはグルタミン酸）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドなどのカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｒ’）との反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【０１０７】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は脱アミド化されて対応するグルタミルおよびアスパルチル残基になることが多い。あるいは、これらの基は温和な酸性条件下、脱アミド化される。これら残基のいずれの形態も本発明の範囲に包含される。
他の修飾には、ポリペプチドまたはタンパク質のインビトログリコシル化がある。
【０１０８】
二機能性試薬での誘導化は、例えば水不溶性支持マトリックスまたは他の高分子担体との複合体において、タンパク質のペプチド成分を互いに、または他のタンパク質と架橋させ際に有用である。通常使用される架橋剤は、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二機能性イミドエステル、例えば３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二機能性マレイミドなどである。メチル−３−［ｐ−アジドフェニル］ジチオールプロピオイミデートなどの誘導化剤は、光の存在下に架橋を形成できる光活性化中間体を与える。あるいは、シアノゲンブロミド活性化炭水化物および反応性基質などの反応性水不溶性材料はＵ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏｓ． ３，９６９，２８７； ３，６９１，０１６； ４，１９５，１２８； ４，２４７，６４２； ４，２２９，５３７；および４，３３０，４４０に記載され、これらはタンパク質固定化に使用される。
【０１０９】
他の修飾にはプロリンおよびリジンのヒドロキシ化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシ基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化 （Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ， Ｔ．Ｅ．， Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ， Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．， Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ， ｐｐ． ７９−８６ （１９８３））、Ｎ−末端アミノのアシル化などがあり、ある場合には、Ｃ−末端カルボキシ基のアミド化もある。
【０１１０】
このような誘導化部分は安定性、溶解性、吸収性、生物学的半減期などを改善できる。これらの部分はまた、タンパク質複合体の望ましくない副作用を排除しまたは減じることができる。このような効果を媒介できる部分は例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ （１９９０）に記載されている。
【０１１１】
アミノ酸残基が欠失、挿入および／または置換されたタンパク質の機能的誘導体は、当業者に周知の標準的手法により調製できる。例えば、機能的誘導体の修飾された成分は、部位特異的突然変異手法（Ａｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．， １９８３， ＤＮＡ ２：１８３に例示）によって調製でき、ここでは配列をコードするＤＮＡのヌクレオチドを修飾し、修飾コード配列を修飾し、次いで既述の手法により原核生物または真核生物宿主細胞において得られた組換えＤＮＡを発現させる。あるいは、アミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有するタンパク質は、当業者に周知の方法により直接化学合成によって常法により調製できる。タンパク質の機能的誘導体は通常、天然タンパク質と同じ質的生物活性を示す。
【０１１２】
本発明のキメラタンパク質の用途
本発明の他の態様は、本発明のキメラタンパク質の用途に関する。好ましい用途は、医薬および獣医薬適用であり、ここでは有効量の本発明キメラタンパク質（好ましくは本発明の組成物の形態で）を患者に投与する。このように、キメラタンパク質は患者の細胞と接触し、その接触は所望の生物学的応答を引き起こす。本発明のキメラタンパク質を使用する方法は、生物において免疫応答を引き起こす方法、生物において抗体を産生させる方法（Ｂ細胞免疫応答）、生物によりＴ細胞免疫応答を誘導する方法、およびＢ細胞病態を処置する方法を含む。本発明はさらに、本発明のキメラタンパク質を投与することにより、Ｂ細胞媒介性病態を改変できる免疫応答を増大させるため、被験者を処置する方法をも含む。
【０１１３】
通常、このような方法は、生物に有効量の本発明キメラタンパク質を供給することにより行われる。「有効量」とは、所望の生物応答を惹起させる量を意味する。このような量を構成するものは、具体的キメラタンパク質、惹起させる所望の生物応答、キメラタンパク質の製剤、処置する生物の年齢、体重、性別および健康度、投与方法、処置または予防する疾患の状態など種々の因子によって変動する。本発明のキメラタンパク質および組成物を投与できる生物は哺乳動物であり、好ましくは哺乳動物はウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、および霊長類動物から選ばれる哺乳動物である。特に好ましい生物はヒトである。
【０１１４】
本明細書に記載の化合物はそのまま、または他の活性成分と混合して混合療法として、または適当な賦形剤または担体とともに、ヒト患者自身に投与できる。本発明適用のための化合物の製剤および投与方法は、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，” Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ，に見出すことができる。
【０１１５】
１．投与経路
適当な投与経路は例えば、経口、直腸、経粘膜、腸管適用；腸管外供給、例えば筋肉内、皮下、静脈内、皮内注射；およびクモ膜下内、直接心室内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射などである。当業者は特定に投与経路に対して組成物を適合させる種々の方法を理解している。
【０１１６】
あるいは、化合物は全身投与でなく、固形癌に直接注入することにより局所的に投与することができ、その場合、デポット（貯蔵）としてまたは徐放製剤として局所投与することが多い。
【０１１７】
２．組成物／製剤
本発明の医薬組成物は、たとえば、慣例の混合、溶解、顆粒化、糖衣形成、すりつぶし、乳化、カプセル封入、封入または凍結乾燥工程などのそれ自体公知の方法で製造することができる。
したがって、本発明に用いるための医薬組成物は、医薬的に用いることができる調製品への活性化合物の加工を促進する賦形剤および補助剤を含む１種またはそれ以上の生理的に許容しる担体を用いる慣例の方法で製剤することができる。適当な製剤は、選ばれた投与経路に従属する。
【０１１８】
注射液のためには、本発明作用剤は、水性溶液、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液または生理的食塩緩衝液などの生体適合性緩衝液として製剤することができる。経粘膜投与のためには、製剤において、浸透されるべきバリヤーに適した浸透剤を用いる。このような浸透剤は一般に、当業界で公知である。
【０１１９】
経口投与のためには、活性化合物と当業界で公知の医薬的に許容しうる担体を合わせることによって、本発明化合物を容易に製剤することができる。このような担体によって、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤などとして製剤されるべき本発明化合物は、処置されるべき患者による経口摂取が可能になる。適当な担体として、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールなどの糖類；トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよび／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などのセルロース調製物といったような充填剤などの賦形剤が挙げられる。要すれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天またはアルギン酸もしくはアルギン酸ナトリウムなどのその塩などの崩壊剤を加えてもよい。
【０１２０】
糖衣錠のコアは、適当なコーティングをして提供される。この目的のために、必要に応じてアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カーボポールゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含む濃縮糖類溶液を用いる。識別のため、または活性成分用量の異なる組み合わせを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに染料または含量を加えてもよい。
【０１２１】
経口で用い得る医薬調製物として、ゼラチン製プッシュフィットカプセルならびにゼラチン、グリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤製軟密閉カプセルおよびが挙げられる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースなどの充填剤、デンプンなどの結合剤および／またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤ならびに必要に応じて安定剤と混合して有効成分を含むことができる。軟カプセルでは、脂肪油、液体パラフィンまたは液体ポリエチレングリコールなどの適当な液体に活性化合物を溶解または懸濁する。さらに、安定剤を加えてもよい。すべての経口投与用製剤は、このような投与に適した用量であるべきである。
【０１２２】
バッカル投与のためには、組成物を慣例の方法で製剤された錠剤またはロゼンジの剤形にする。
吸入による投与のためには、慣例的に、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体などの適当な噴霧剤を用いて、加圧パックまたは噴霧器からエアロゾルスプレーの剤形で本発明使用のための化合物をデリバリー（供給）する。加圧エアロゾルの場合、計量された量をデリバリーするバルブを提供することによって用量単位を決定する。吸入器（ｉｎｈａｌｅｒまたはｉｎｓｕｆｆｌａｔｏｒ）で用いるためのたとえばゼラチン製のカプセル剤およびカートリッジを、本発明化合物およびラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤の粉末混合物を含めて製剤することができる。
【０１２３】
ボーラス注射または継続的輸液などの注射による非経口投与用に本発明化合物を製剤することができる。注射用製剤は、たとえば、保存剤を添加したアンプルまたはマルチ投与容器などの単位投与剤形で提供される。該組成物は、懸濁液、溶液または油性または水性ビヒクルにおける乳液などの剤形をとることができ、懸濁剤、安定剤および／または分散剤などの製剤用剤を含んでもよい。
【０１２４】
非経口投与用医薬製剤は、水溶性形体の活性化合物の水溶液であってもよい。さらに、適当な油性注入用懸濁液として、活性化合物の懸濁液を製造してもよい。適当な親油性溶媒またはビヒクルとして、ゴマ油などの脂肪油、オレイン酸エチルもしくはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステルまたはリポソームが挙げられる。水性注射用懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなどの懸濁液の粘度を増す物質を含むことができる。必要に応じて、懸濁液は、適当な安定剤または高濃縮溶液が製造されるように化合物の溶解度を増加させる作用剤を含むこともできる。
あるいは、活性成分は適当なビヒクル、例えば滅菌発熱物質不含水により使用前に再構成される粉末形態であってもよい。
【０１２５】
これまでに記載した製剤に加えて、持効性製剤として、本発明化合物を製剤してもよい。このような長期作用製剤は、植込錠（たとえば、皮下または筋肉内）または筋肉内注射によって投与される。したがって、たとえば、適当なポリマーまたは疎水性材料（たとえば、許容しうる油中の乳剤）もしくはイオン交換樹脂とともに、またはたとえば可溶性の小さい塩などの可溶性の小さい誘導体として、本発明化合物を製剤してもよい。
【０１２６】
本発明の疎水性化合物のための医薬担体は、ベンジルアルコール、非極性界面活性剤、水混和性有機ポリマーおよび水性相を含む共溶媒系である。共溶媒系は、ＶＰＤ共溶媒系であってよい。ＶＰＤは、３％ ｗ／ｖのベンジルアルコール、８％ ｗ／ｖの非極性界面活性剤ポリソルベート８０および６５％ ｗ／ｖのポリエチレングリコール３００の無水エタノール溶液である。ＶＰＤ共溶媒系（ＶＰＤ：Ｄ５Ｗ）は、５％デキストラン水溶液で１：１に希釈したＶＰＤからなる。この共溶媒系は、疎水性化合物をよく溶解し、それ自体、全身投与において毒性が低い。共溶媒系の特性は、その溶解性および毒性特性を無効にすることなくかなり変えることができる。さらにそのうえ、共溶媒成分の個性は、変更することができる：たとえば、ポリソルベート８０の代りに、他の低毒性非極性界面活性剤を用いてもよい；ポリエチレングリコールのフラクションサイズを変えてもよい；ポリビニルピロリドンなどの他の生体適合性ポリマーをポリエチレングリコールと交換してもよい；および他の糖質または多糖類をデキストロースの代りに使ってもよい。
【０１２７】
別法として、疎水性医薬化合物のための他のデリバリーシステムを用いてもよい。リポソームおよびエマルションが、疎水性薬物のためのデリバリービヒクルまたは担体の公知の例である。毒性はより大きいが、ジメチルスルホキシドなどの有機溶媒もまた、用いることができる。さらに、治療薬を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスなどの徐放性系を用いて本発明化合物をデリバリーすることができる。種々の徐放性素材が確立されており、当業者には公知である。徐放性カプセル剤は、その化学的性質に応じて、２、３週間〜１００日間化合物を放出する。治療薬の化学的性質および生物学的安定性に応じて、タンパク質安定化のさらなる方策を採ってもよい。
【０１２８】
医薬組成物はまた、適当な固相もしくはゲル相担体または賦形剤をふくむことができる。このような担体または賦形剤の例として、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖質、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチンおよびポリエチレングリコールなどのポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１２９】
多くの本発明化合物が、医薬的に適合しうる対イオンとして提供される。医薬的に適合しうる塩は、多くの酸とともに形成され、該酸として、硫酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。塩は、水性または対応する遊離塩基体であるプロトン性溶媒により可溶性であることを企図されるものである。
【０１３０】
３．有効用量
本発明における使用に適した医薬組成物は、その企図する目的を達成するのに有効な量で有効成分が含まれる組成物である。さらに詳しくは、治療有効量とは、疾患の症状を予防、軽減または寛解するか、または治療されている患者の生存を延長するのに有効な化合物の量を意味する。治療有効量の決定は、特に本明細書に提供する詳細な記載を考慮して、当業者であれば成しうることである。
【０１３１】
本明細書に記載した本発明化合物の毒性および治療的有効性は、ＬＤ５０（集団の５０％が死に到る用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療が有効である用量）の決定などの細胞培養または実験動物における標準の薬学的方法によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比が、治療指数であり、ＬＤ５０およびＥＤ５０の比率として表わされる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物実験から得られるデータは、ヒトにおける使用のための用量範囲を設定するのに用いることができる。このような化合物の用量は、毒性が少ししかないか、または無毒性のＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあるのが好ましい。該用量は、採用する投与剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変化する。正確な製剤、投与経路および用量は、患者のコンディションを考慮して、個々の医師によって選択される（たとえば、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．， １９７５， ｉｎ ”Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”， Ｃｈ． １ ｐ．１， １９７５を参照）。
【０１３２】
投与量および間隔は、必要な効果を維持するのに十分である活性部分の血漿レベル、あるいは最小有効濃度（ＭＥＣ）が提供されるように個々に調節する。ＭＥＣは、各化合物によって変化する。ＭＥＣを達成するのに必要な用量は、個々の特性および投与経路に応じて変化する。しかし、ＨＰＬＣアッセイまたはバイオアッセイを用いて、血漿濃度を決定することができる。
【０１３３】
また、投薬間隔はＭＥＣ値を用いても決定され得る。化合物は、期間のうち１０−９０％、好ましくは３０−９０％、および最も好ましくは５０−９０％の間、ＭＥＣを超える血漿レベルを維持する処方を用いて投与されるべきである。
局所投与または選択的取り込みの場合、薬物の有効な局所濃度は血漿濃度とは関連しないかもしれない。
当然のことながら、投与される組成物の量は処置される被検体、被検体の体重、苦痛の重篤度、投与様式および指示する医師の判断に依存する。
【０１３４】
４．パッケージング
所望であれば、組成物は、活性成分を含有する単位投薬形態を１以上を含み得る容器またはディスペンサー装置中に提示され得る。例えば、容器はブリスターパックのような金属またはプラスチックのホイルを備え得る。容器またはディスペンサー装置は、投与に関する使用説明書を有しうる。また、容器またはディスペンサーは、医薬の製造、使用または販売を規定する政府機関により指示されている形態で、容器に付随した警告を備え得、この警告は、その機関によるヒトまたは動物投与用のポリヌクレオチドの形態の認可を反映している。例えば、このような警告は、処方薬剤または認可された製品添加物（ａｐｐｒｏｖｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｎｓｅｒｔ）に関して米国食品医薬品局により認可されているラベルであり得る。また、融和性の製薬キャリア中に処方されている本発明の化合物を含有する組成物も、製造し、適切な容器中に配置し、そして指定の状態の治療についてラベルすることができる。ラベル上に記載の適切な状態としては、腫瘍の治療、慢性関節リウマチの治療、糖尿病の治療などを挙げることができる。
【０１３５】
実施例
以下の記載において、免疫学、細胞生物学および分子生物学の分野の当業者にとって公知である種々の方法に対して参照がなされる。そのような公知の方法を記載する、参照の刊行物および他の材料は、そのすべてを本明細書中に参照して組み込む。
【０１３６】
１．非ホジキン性リンパ腫イディオタイプ（Ｉｄ）同定およびクローニングのための組織処理：
末梢リンパ節由来の腫瘍サンプルに、臨床的に指示されているように滅菌条件下で生検（バイオプシー）を実施し、患者イディオタイプ特異的組換えキメラ免疫グロブリンタンパク質を作製するために使用する。残りのリンパ節生検材料は今後の使用のために組織細胞バンクで液体窒素中で保存した。
【０１３７】
ａ．細胞単離：
生検を実施したリンパ腫組織を、滅菌ＰＢＳ中に沈めながら、使い捨ての０．３８ｍｍスチールメッシュスクリーンに押し付けて通すことにより、患者リンパ節生検の単一細胞懸濁物を得た。分散させた細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、ついで再懸濁してカウントする。１０％の細胞画分を全ＲＮＡ抽出のために処理し、残りの細胞は、３０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清および１０％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含有するＲＰＭＩ １６４０組織培養培地中での再懸濁の後、液体窒素中に保管（ａｒｃｈｉｖｅ）する。臨床サンプルの処理は全て、生物用安全キャビネットの中で行う。
【０１３８】
ｂ．全ＲＮＡ調製：
ホモジナイズしたリンパ節細胞由来の全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて業者の指示のとおりに単離した。全ＲＮＡは分光光度計により定量した。
【０１３９】
ｃ．ｃＤＮＡ合成：
業者の推奨に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ （ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ） を用いての第１鎖ｃＤＮＡ合成のために、鋳型としておよそ２．０μｇの全ＲＮＡを使用した。キットで得たオリゴ（ｄＴ）を用いてｃＤＮＡをプライムした。
【０１４０】
ｄ．リンパ腫重鎖および軽鎖をコードする遺伝子のＰＣＲ増幅：
リンパ腫特異的免疫グロブリン由来の重鎖および軽鎖の両方を以下のようにして同定した。一本鎖リンパ腫ｃＤＮＡのアリコートを、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡまたはＩｇκおよびＩｇλ定常域特異的アンチセンスプライマーと対合した、第１表に列挙の公知のＶＨ、ＶκおよびＶλスーパーファミリー全てを表す一連のＶＨおよびＶＬリーダー配列特異的オリゴヌクレオチドセンスプライマーと合わせた。次いで、これらのサンプルをＰＣＲにより増幅し、アガロースゲル電気泳動により分析した。
【０１４１】
患者の末梢血リンパ球から調製したｃＤＮＡを使用してパラレルな反応を行った。正常ＰＢＬまたはリンパ節生検ｃＤＮＡをふくむサンプル由来の各プライマー対により作製したＰＣＲ産物の比較により、リンパ腫中に過剰に提示されている腫瘍特異的ＶＨおよびＶκ またはＶλサブファミリーの候補の同定および重鎖および軽鎖のイソタイプを導くことができる。次いで、腫瘍Ｖ霊異記遺伝子産物の候補を切り出し、その核酸配列を決定してクローン性を評価した。各患者について、出発細胞画分から２回の独立分析を行った。
【０１４２】
ｃＤＮＡ反応物１μｌ（全ｃＤＮＡ反応体積の５％）を、ＨｏｔＳｔａｒＴａｑＭａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて５０μｌの体積で３５サイクルで増幅した。サイクル条件：９５℃１５分、６５℃４分、７２℃１分、続いて９４℃１分、６１℃３０秒、７２℃１分を３４サイクル、および最終伸長工程て７２℃で７分。各反応系のアリコート１０μｌを１％アガロースゲル上でのエチジウムブロミドを用いる電気泳動により分析する。
【表１】
2004506022.tif 000003
【表２】
2004506022.tif 000004
【表３】
2004506022.tif 000005
【０１４３】
ｅ．ＰＣＲ産物のクローニングおよび配列決定：
重鎖および軽鎖に関する腫瘍特異的可変配列を含有することが決定された反応物由来のＰＣＲ産物を、業者の推奨に従ってプラスミドｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯに直接クローニングし、Ｔｏｐ１０コンピテント大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に導入した。２４個のミニプレプＤＮＡプラスミドを、ＱＩＡＰｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ （Ｑｉａｇｅｎ）を用いてカーベニシリン耐性細菌コロニーから調製し、分光光度計により定量する。各プラスミド２００ｎｇを、Ｃｙ５／Ｃｙ５．５ Ｄｙｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ （Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いて配列決定した。配列決定反応の完了後、ＯｐｅｎＧｅｎｅ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍでサンプルを電気泳動し、ＧｅｎｅＯｂｊｅｃｔｓソフトウェアパッケージ （Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）を用いてデータを処理した。ＳＥＱＵＥＮＣＨＥＲ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．１．２ ＤＮＡ分析ソフトウェア （ＧＥＮＥ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐ．）を用いて、配列アラインメントを含む更なる分析を行った。Ｖ領域由来配列は、上記のデフォルトパラメータを用いるソフトウェアを用いて分析した場合にサンプルのうちの７５％にＶ存在する場合（例えば、２４個のうち１８個以上が同一のグループを形成する場合）に、腫瘍特異的であるとみなすことができる。入手可能な場合には２個の独立生検サンプルを比較する。
【０１４４】
ｆ．ｃＤＮＡ合成および５’ＲＡＣＥ産物の作製：
ＶＨおよびＶＬ配列中の変異の存在に起因して、腫瘍特異的免疫グロブリン再編成の同定は、しばしば、可能ではない。前記の配列特異的ＰＣＲストラテジーの代わりとして、腫瘍特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）再編成を同定するために５’ＲＡＣＥ ＰＣＲストラテジーを利用することができる。第１鎖ｃＤＮＡ合成〜Ｉｇ特異的ＰＣＲ産物の製造までの全工程は、わずかに改変した業者の指示（５’ＲＡＣＥ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ， ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０， Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）に従って行った。目的のＢ細胞集団により利用されている免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常域に相補的な特異的アンチセンスプライマーの存在下で、各第１鎖ｃＤＮＡ合成のために全ＲＮＡのうち約２．５μｇを鋳型として使用した（ＩｇＧに関しては配列番号６９、ＩｇＭに関しては配列番号７０、Ｃκに関しては配列番号７１およびＣλに関しては配列番号７２）。ｃＤＮＡ反応系をＧｌａｓｓＭＡＸスピンカートリッジで精製し、各々、最終体積５０μｌを得る。精製した各ｃＤＮＡのアリコート１０μｌを、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて２５μｌの体積でオリゴ（ｄＣ）テイル化し、続いてのＰＣＲ反応に用いる鋳型を作製した。ＰＣＲの設定は、業者から得た、ポリ（Ｇ）トラックを含有する上流プライマー、およびｃＤＮＡ第１鎖合成に用いたものより内部のＩｇ特異的アンチセンスプライマーを利用する（ＩｇＧに関しては配列番号７３、ＩｇＭに関しては配列番号７４、Ｃκに関しては配列番号７５およびＣλに関しては配列番号７６）。鋳型５μｌを５０μｌで以下の通りに増幅する。９５℃１５分、５５℃４分、７２℃１分、続いて９４℃１分、５５℃３０秒、７２℃１分を３４サイクル、および最終伸長工程て７２℃で７分。最終ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上でのエチジウムブロミドを用いる電気泳動により分離し、適切なサイズ（約５００〜６００ｂｐ）のバンドを単離し、上記の１ｅに記載のようにｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミドにクローニングする。
【０１４５】
２．　免疫グロブリン重鎖および軽鎖の定常域を含有するバキュロウィルス発現ベクターｐＴＲＡＢａｃＶαＨＣγ１およびｐＴＲＡＢａｃＶβＨＣγ１の構築
ａ．分泌シグナル配列のｐ２Ｂａｃへのクローニング：
ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１およびｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１構築物のためのベースベクターはｐ２Ｂａｃ （図２、配列番号：５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）であった。２個の分泌シグナル配列をこのベースベクター中にクローニングし、最初の中間生成物であるバキュロウィルス発現ベクターｐ２ＢａｃＭを作製した。たいていの場合、バキュロウィルスＡｃＮＰＶＰ１０プロモーターの転写制御下に配置したミツバチメリチン分泌シグナル配列のアミノ末端ドメインをコードする相補的オリゴヌクレオチドを利用して、ベクターｐ２Ｂａｃをまず修飾した。メリチン配列クローニングのため、ｐ２Ｂａｃ（２μｇ）を、３７℃で４時間、Ｎｏｔ ＩおよびＳｐｅ Ｉで消化した。１％アガロースゲルでの電気泳動の後、Ｑｉａｅｘ ＩＩ樹脂 （Ｑｉａｇｅｎ， Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）を用いて線状ベクターを精製した。ついで、精製したＤＮＡを水５０μｌを用いて溶離し、ＤＮＡ濃度を測定した。プライマーＭｅ１Ｓ／Ｎ（配列番号：１５）およびＭｅ１Ｎ／Ｓ（配列番号：１６）、各１μｇを、消化緩衝液Ｍ（１０ μｌ）（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）中で混合し、５分間、７０℃まで加熱し、ついで室温まで冷却して相補的プライマーとアニーリングさせた。アニーリングしたプライマーのうち１０％を、Ｎｏｔ ＩおよびＳｐｅ Ｉを用いて２０μｌの反応系中で、３７℃で４時間、消化し、消化したプライマーを１５％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動の後、Ｑｉａｅｘ Ｈ樹脂を用いて精製し、アニーリングしたプライマーに対するＤＮＡの濃度を決定した。ｐ２ＢａｃベクターおよびアニーリングしたメリチンフラグメントのＤＮＡを、１：１０のベクター対インサート比でライゲーションした。ライゲーション産物をコンピテントＸＬ １−Ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を用いて形質転換し、３７℃で一晩増殖させるためにＬＢ−カーベニシリン寒天プレートにプレーティングした。標準的なプロトコルによりミニプレプコロニーを調製し、プラスミドを配列決定して構築物をチェックした。得られたベクターｐ２ＢａｃＭはメリチン分泌シグナル配列を含有していた。
【０１４６】
同様に、ｐ２ＢａｃＭベクターを、ＡｃＮＰＶポリへドロンプロモーターの転写制御下にヒト胎盤アルカリホスファターゼ分泌シグナル配列のアミノ末端ドメインをコードするようにさらに修飾して、第二の中間生成物であるバキュロウィルス発現ベクターｐ２ＢａｃＭＡを作製した。アルカリホスファターゼ配列を導入するために用いた方法は、概して、以下のとおりであった。ｐ２ＢａｃＭプラスミド（２μｇ）をＢａｍ ＨＩおよびＥｃｏ ＲＩを用いて消化し、線状ベクターをＱｉａｅｘ ＩＩ樹脂を用いてアガロースゲルからゲル精製し、水５０μｌ中に溶出した。ベクターのＤＮＡ濃度を測定した。プライマーＡＰＢ／Ｅ（配列番号：１７）およびＡＰＥ／Ｂ（配列番号：１８）の各１μｇを消化緩衝液Ｍ１０μｌ中に混合し、７０℃で５分間加熱し、ついで室温まで冷却して相補的なプライマーをアニーリングさせた。アニーリングしたプライマーのうち１０％を、Ｂａｍ ＨＩおよびＥｃｏ ＲＩを用いて２０μｌの反応系中で、３７℃で４時間、消化した。ついで、消化したプライマーを１５％ポリアクリルアミドゲルから、Ｑｉａｅｘ ＩＩ樹脂を用いて精製した。また、消化したプライマーのＤＮＡ濃度を決定した。ついで、線状ｐ２ＢａｃＭベクターおよびアルカリホスファターゼフラグメントを、１：１０のベクター対インサート比でライゲーションし、ライゲーション産物をコンピテントＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｅ．ｃｏｌｉを用いて形質転換し、３７℃で一晩増殖させるためにＬＢ−カーベニシリン寒天プレートにプレーティングした。ミニプレプコロニーを調製し、プラスミドを配列決定して構築物をチェックした。得られた中間生成物ベクターｐ２ＢａｃＭＡは、ヒト胎盤アルカリホスファターゼに対する分泌シグナル配列を含有する。メチル感受性（ｍｅｔｈｙｌ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）Ｓｔｕ Ｉ部位へのκ定常域の続いてのクローニングのために、ｐ２ＢａｃＭＡプラスミドをさらに、ｄｃｍメチラーゼ活性を欠損したＳＣＳ−１１０ Ｅ． ｃｏｌｉ株（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換した。
【０１４７】
ｂ．ＩｇＧγ１および軽鎖の定常領域の増幅およびクローニング：
ヒトモノクローナル抗体９Ｆ１２のヒトカッパ（κ）定常およびヒトＩｇＧγ１定常ドメインを、ヒト細胞系統９Ｆ１２（ＡＴＣＣ＃ＨＢ８１７７）から抽出したＲＮＡからＰＣＲ増幅した。κ定常領域は、アルカリホスファターゼシグナル配列の後ろにクローニングした。ＩｇＧγ１定常領域はメリチン分泌シグナル配列の下流に挿入し、それによりベクター（ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１、図５ａ）を作製した。ヒトラムダ（λ）軽鎖定常領域を含むベクター（ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１、図５ｂ）を、κ軽鎖定常領域をλ軽鎖定常領域と置換することにより調製した。軽鎖は、クローン性リンパ球白血病細胞ＲＮＡ調製物からＲＴ−ＰＣＲにより単離した。クローニング操作の詳細は次の通りである。
【０１４８】
ｃ．９Ｆ１２κおよびＩｇＧγ１定常領域断片の増幅：
９Ｆ１２細胞（ＡＴＣＣ＃ＨＢ８１７７）由来の全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、その製造元の教示に従って抽出した。１本鎖ｃＤＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）をオリゴ（ｄＴ）プライマーとともに用いて合成した。合成した１本鎖ｃＤＮＡの１／１２を、９Ｆ１２κおよびＩｇＧγ１特異的オリゴヌクレオチド（それぞれ配列番号：２１ ｐｌｕｓ 配列番号：２２および配列番号：１９ｐｌｕｓ 配列番号：２０）を用い、Ｅｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ Ｔａｑ（ロッシュ）を含む１００μｌ ＰＣＲ反応中にて増幅した。増幅９Ｆ１２免疫グロブリン由来の断片をＱｉａｅｘ ＩＩ樹脂を含む１．５％ ＳｅａＫｅｍアガロースから精製し、水５０μｌで溶出させた。断片のＤＮＡ濃度を測定した。精製９Ｆ１２免疫グロブリン断片を別々に、ＴＡ−ＩＩ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） ＰＣＲクローニングベクターに連結した。連結産物をコンピテントＸＬＩ−Ｂｌｕｅ大腸菌に形質転換し、ＬＢ−カルベニシリン寒天平板上にて３７℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、プラスミドＤＮＡを配列決定した。
【０１４９】
ｄ．９Ｆ１２κ定常領域の発現ベクターへの挿入
κ定常ドメインに関し、κ定常ドメインを含有するプラスミドＤＮＡ５μｇおよびＳＣＳ１１０ Ｅ．ｃｏｌｉ（大腸菌）から精製したベクターｐ２ＢａｃＭＡ のＤＮＡ２μｇ をＳｔｕ ＩおよびＨｉｎｄ ＩＩＩで消化した。κ定常領域を含む３２０ｂｐ断片およびｐ２ＢａｃＭＡベクターを含む７．１ｋｂ断片をＱｕｉｅｘ ＩＩでゲル精製し、水５０μｌで溶出した。両断片のＤＮＡ濃度を測定した。次いで、精製した断片をＲａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（ロッシュ）で連結した。連結産物をコンピテントＸＬＩ−Ｂｌｕｅ大腸菌に形質転換し、ＬＢ−カルベニシリン寒天平板上にて３７℃にて一晩発育培養した。ミニプレップ細菌コロニーを調製し、組換えＤＮＡを配列決定し、それによりκ定常領域の挿入を確認した。得られたプラスミドベクターはｐＴＲＡＢａｃＬＣκであった。
【０１５０】
ｅ．ＩｇＧγ１定常ドメインのベクターへの付加：
ＩｇＧγ１定常領域を含むプラスミドＤＮＡ５μｇ およびベクターｐＴＲＡＢａｃＬＣκのプラスミドＤＮＡ２μｇ をまずＳｐｅ ＩおよびＸｂａ Ｉで消化し、ＩｇＧγ１定常ドメインをベクターに付加した。ＩｇＧγ１定常領域の１ｋｂ断片およびｐＴＲＡＢａｃＬＣκベクターの７．４ｋｂ断片をＱｕｉｅｘ ＩＩを含むアガロースプラグからゲル精製し、水５０μｌで溶出した。両断片のＤＮＡ濃度を測定した。次いで、精製した断片をＲａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（ロッシュ）で連結した。連結産物をコンピテントＸＬＩ−Ｂｌｕｅ大腸菌に形質転換し、ＬＢ−カルベニシリン寒天平板上にて３７℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、ＩｇＧγ１挿入の連結および方向性を制限部位の制限分析と配列決定により決定した。得られた組換えベクターはｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１であった。
【０１５１】
このプラスミドｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１におけるミツバチメリチン分泌配列とＣγ１領域配列、およびアルカリホスファターゼ分泌配列とＣκ領域配列との間にそれぞれ転写終止コドンを付加し、該プラスミドをさらに調整した。この修飾のため、ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１ベクターをＳｐｅ Ｉ ＋ Ａｐａ Ｉ消化により線状化した。次いで、線状化したベクターをアニール化相補プライマーγ１−ｓｔｕｆｆ（スタッフ）１（配列番号：８２）およびγ１−ｓｔｕｆｆ １’（配列番号：８３）に連結し、インフレイム終止コドンを導入した。この修飾により得られたベクターを次いで、Ｓｔｕ Ｉ （ＡＧＧＣＣＴ） ＋ Ｄｒａ ＩＩＩ （ＣＡＣｎｎｎＧＴＧ）で線状化した後、アニール化相補プライマーκ−ｓｔｕｆｆ １（配列番号：８４）およびκ−ｓｔｕｆｆ １’（配列番号：８１）に連結し、インフレイム終止コドンを導入した。これらの修飾の正味の効果をそれぞれ図６Ｃおよび６Ｄに示す配列に表す。（付加した配列は二重線と太字により示している）
【０１５２】
ｆ．γ定常領域のベクターへの付加：
γ軽鎖イディオタイプを示す慢性リンパ球白血病（ＣＬＬ）の患者から精製した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）から全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。
【０１５３】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ）を製造元の教示に従って使用し、約２．０μｇ の全ＲＮＡを第１ストランドｃＤＮＡ合成の鋳型として用いた。オリゴ（ｄＴ）をプライミングに使用した。Ｖγシグナル配列の部分と同一の上流プライマー（配列番号：５４）およびλ定常領域の最後の幾つかのコドンと相補的な下流プライマー（配列番号：７７）および３’非翻訳領域の部分を用い、ＰＣＲ反応により合成した１本鎖ｃＤＮＡの１／１２を増幅した。ＰＣＲ産物をｐＣＲＩＩベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列決定を行い、同一性を確認した。正しいλ定常領域配列を含むプラスミドを第２のＰＣＲの鋳型として選択した。この反応では、Ｊλの下流直後のλ定常領域の配列に相当する、操作したＤｒａ ＩＩＩ制限部位を含有するセンスオリゴヌクレオチドＣλ−５’（配列番号：７８）、およびλ定常領域の直後の終止コドンをまたぐ、Ｈｉｎｄ ＩＩＩを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドプライマーＣλ−３’（配列番号：７９）を使用した。得られたＰＣＲ産物をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、配列決定した。ＨｉｎｄＩＩＩ制限反応に際し、挿入物の方向性に応じて、λ定常領域配列を含む断片を幾つかのプラスミドから遊離させた。この制限断片をゲル単離し、ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１（図５Ａ）にクローニングした後、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ消化により線状化し、それによりλおよびκ定常領域をともに含む中間プラスミドを作製した。このプラスミドをＳｔｕ ＩおよびＤｒａ ＩＩＩで制限反応し、κ配列を除去した。得られた線状化プラスミドをアニール化相補プライマーγ−ｓｔｕｆｆ １（配列番号：８０）およびγ−ｓｔｕｆｆ １’に連結し、最終プラスミドであるｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１（図５Ｂ）を作製した。
【０１５４】
３．患者由来イディオタイプＶＨおよび／またはＶＬ領域に関する遺伝子の発現ベクターへの挿入
唯一のクローニング配列Ｓｔｕ ＩおよびＤｒａ ＩＩＩを含有するＶＬ領域はアルカリホスファターゼシグナル配列およびλ定常領域間に、および唯一のクローニング配列Ｓｐｅ ＩおよびＡｐａ Ｉを含有するＶＨ領域はメリチン分泌シグナル配列およびＩｇＧγ１定常領域間にそれぞれ、ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１またはｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１のいずれかを使用して遺伝子を挿入することができた（図５Ａおよび５Ｂを参照のこと）。次いで、得られた発現ベクターをＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （Ｓｆ−９）昆虫細胞に形質導入し、組換え出芽バキュロウイルスを調製した。次いで、組換えバキュロウイルスをＳｆ−９細胞にて連続的に増幅し、高力価の組換えバキュロウイルスストックを調製した。この高い力価の組換えバキュロウイルスストックをＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ （Ｈｉｇｈ−５）細胞に感染させ、以後のキメラＩｇＧタンパク質の産生に使用した。ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１またはｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１の構築に用いた全オリゴヌクレオチドプライマーのリストは第２表に見出すことができる。
【０１５５】
上記のようにして、腫瘍由来のＶＨおよび／またはＶＬ領域を単離した後、ミリチンリーダーペプチドの末端４０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマー（Ｉｇ重鎖クローニングのため）（配列番号：８−
【数１】
2004506022.tif 000006
）、アルカリホスファターゼリーダーペプチドの末端２８ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドプライマー（Ｉｇ軽鎖クローニングのため）（配列番号：９−
【数２】
2004506022.tif 000007
）、ならびにそれぞれＶＨまたはＶＬ領域タンパク質の最初の２１〜２４ヌクレオチドを調製した。αまたはβ鎖定常領域由来のＣＡ （ＣＡ／ＩｇＫ；配列番号：１５）の４−３６塩基対およびＣＢ （ＣＢ／ＩｇＧ１；配列番号：１４）の６−３５塩基対に相補的な逆オリゴヌクレオチドプライマー。クローナルＶαまたはＶβ配列を有すると同定された組換えプラスミドを２回目のＰＣＲの鋳型として使用する。サイクル条件は既述の通りである。重鎖または軽鎖定常領域由来のオリゴヌクレオチド逆方向プライマーを用いた。
【数３】
2004506022.tif 000008
クローナルＶαまたはＶβ配列を有すると同定された組換えプラスミドを２回目のＰＣＲの鋳型として使用する。サイクル条件は既述の通りである。
【０１５６】
プラスミド鋳型を、それぞれ、アミノ酸１４１〜１４９、１１５〜１２３、１０８〜１１９および１０９〜１１７、ならびに適切なリーダー／Ｖ領域融合プライマーをコードするコドンに相補的なＩｇＧγ１、ＩｇＭ、ＩｇλまたはＩｇκ定常領域プライマーと合わせた。例えば、ある患者に対して、用いたプライマーはＶＨ３に関しては配列番号６７であり、Ｖκ３に関しては配列番号６８である。
【数４】
2004506022.tif 000009
サイクル条件は既述の通りである。
【０１５７】
ａ．発現ベクターへの軽鎖可変領域挿入：
ＰＣＲ由来ＶＬ産物および対応するｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１またはｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１カセットベクター（２μｇ）をＳｔｕ ＩおよびＤｒａ ＩＩＩを用いて消化した。患者由来ＶＬ領域のＤＮＡフラグメント（３５０ ｂｐ）および線状ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１またはｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１ベクターのフラグメント（８．４ ｋｂ）をＱｕｉｅｘ ＩＩを含むアガロースゲルプラグから精製し、水５０μｌで溶出した。両断片のＤＮＡ濃度を測定し、次いで両断片をＲａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（ロッシュ）を用いて連結した。連結産物をコンピテントＸＬＩ−Ｂｌｕｅ大腸菌に形質転換し、ＬＢ−カルベニシリン寒天平板上にて３７℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、組換えＤＮＡプラスミドを制限分析と配列決定により確認した。得られたベクターをｐＴＲＡＢａｃ（ＮＨＬ−ＶＬ）ＬＣκＨＣγ１またはｐＴＲＡＢａｃ（ＮＨＬ−ＶＬ）ＬＣλＨＣγ１と命名した。
【０１５８】
ｂ．発現ベクターへの重鎖可変領域挿入：
ＰＣＲ由来ＶＨ産物およびｐＴＲＡＢａｃ（ＮＨＬ−ＶＬ）ＬＣκＨＣγ１またはｐＴＲＡＢａｃ（ＮＨＬ−ＶＬ）ＬＣλＨＣγ１カセットベクター（２μｇ）をＳｐｅ ＩおよびＡｐａ １を用いて消化した。患者由来ＶＨ領域のＤＮＡフラグメント（３５０ ｂｐ）および線状ｐＴＲＡＢａｃ（ＮＨＬ−ＶＬ）ＬＣκＨＣγ１またはｐＴＲＡＢａｃ（ＮＨＬ−ＶＬ）ＬＣλＨＣγ１ベクターのフラグメント（８．４ ｋｂ）をＱｕｉｅｘ ＩＩを含むアガロースゲルプラグから精製し、水５０μｌで溶出した。両断片のＤＮＡ濃度を測定し、次いで両断片をＲａｐｉｄ Ｌｉｇａｔｉｏｎキット（ロッシュ）を用いて連結した。連結産物をコンピテントＸＬＩ−Ｂｌｕｅ大腸菌に形質転換し、ＬＢ−カルベニシリン寒天平板上にて３７℃にて一晩発育培養した。ミニプレップコロニーを調製し、組換えＤＮＡプラスミドを制限分析と配列決定により確認した。得られたベクターをｐＴＲＡＢａｃ（ＮＨＬ−ＶＬ）ＬＣκ（ＮＨＬ−ＶＨ）ＨＣγ１、ｐＴＲＡＢａｃ（ＮＨＬ−ＶＬ）ＬＣλ（ＮＨＬ−ＶＨ）ＨＣγ１と命名し、患者に対する参照番号（例えば、ＦＶ８７８６−００１）を割り当てた。
【表４】
2004506022.tif 000010
【０１５９】
４．可変領域含有発現ベクターでの昆虫細胞株のトランスフェクションおよび組換えキメラタンパク質の産生：
ａ．昆虫細胞発育：
２つの樹立された昆虫細胞系統（Ｓｆ９およびＨｉｇｈ−５）を改変バキュロウイルスベクターにトランスフェクトし、組換えキメラＶＨ／免疫グロブリンおよび／またはＶＬ／免疫グロブリンタンパク質を調製した。すべての昆虫細胞は、使い捨て滅菌通気式振盪フラスコ（Ｃｏｍｉｎｇ）中、１４０−１５０ ｒｐｍにて、５０μｇ／Ｌゲンタマイシンを含むＥＳＦ−９２１血清不含昆虫培地 （Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＬＬＰ）にて２８℃において、液体容量の５０％を超えることがないように発育させた。細胞を２−３日ごとに継代した。凍結細胞を産物の各ロットごとに稼動しているセルバンクから、または６週ごとに解凍することにより（凍結保護培地： １０％ ＤＭＳＯ， ４０％ ＥＳＦ−９２１ 培地， ５０％ Ｈｉｇｈ−５ ならし培地）、バキュロウイルスによる感染に対して退縮性でない対数増殖期の細胞を連続して保存できるようにした。
【０１６０】
ｂ．Ｓｆ９細胞トランスフェクションおよび組換え検定：
ＶＨおよび／またはＶＬ領域の遺伝子および免疫グロブリン重鎖および／または軽鎖定常領域の遺伝子を含む改変バキュロウイルス発現ベクターを、ＢａｃＶｅｃｔｏｒ−３０００トランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＳｆ９細胞に同時トランスフェクトした。アガロースオーバーレイから１０個のプラークを個別に取り出した。単離したプラーク由来のウイルスを使用し、ＥＳＦ−９２１培地５ｍｌ中、５０％コンフルエントにＳｆ−９細胞を播種したＴ−２５フラスコに感染させた。Ｔ−２５フラスコにて増幅したクローナルウイルス単離物を、２つのプライマー（配列番号：３６−ＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴ ＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴ ＴＴＴＧ）および（配列番号：３７−ＧＧＴＣＧＴＴＡＡＣ ＡＡＴＧＧＧＧＡＡＧ ＣＴＧ）を使用するＰＣＲにより試験し、単離したプラークのクローン性を確かめ、野生型ウイルスの混入のないことを確かめた。概して言えば、組換え移入ベクタープラスミド２００ｎｇを、供給されているＥｕｆｅｃｔｉｎ ｌｉｐｉｄ試薬を用いたＢａｃ Ｖｅｃｔｏｒマニュアル（Ｎｏｖａｇｅｎ）に記載されているようにしてトリプレット−カットＢａｃ−Ｖｅｃｔｏｒ−３０００により同時トランスフェクトした。このトランスフェクション混合物を５倍に系列希釈した。１００μｌを、２．５ ｘ １０６接着Ｓｆ９細胞を含む６０ｍｍ組織培養皿にて培養した。１時間後、細胞に、ＥＳＦ−９２１培養培地の１％アガロース溶液４ｍｌを重層した。トランスフェクションの１４４時間目に、Ｎｅｕｔｒａｌ Ｒｅｄ （Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を用いて生細胞を染色し、次いでアガロースオーバーレイ中にて発育しているトランスフェクト細胞から１０個のクローンを個別に取り出した。ＥＳＦ−９２１培地１ ｍｌ中、一晩のプラーク・プラグからウイルスを溶出させた。Ｔ−２５フラスコに、ＥＳＦ−９２１培地５ｍｌ中、５０％全面成長のＳｆ−９細胞を播種し、溶出クローナルウイルス０．５ ｍｌを感染させた。感染の９５時間後、Ｔ−２５フラスコから培地０．５ｍｌを取り出し、遠心により細胞を除去し、得られた上清を、ニトロセルロースへのブロッティングにより免疫グロブリン活性について検定した。野生型ウイルスが存在しないことも以下のＰＣＲにより試験した。
【０１６１】
組換えバキュロウイルスを含む感染上清（１０ μｌ）を、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．３、５０ ｍＭ ＫＣｌ、０．１ ｍｇ／ｍｌ ゼラチン、０．４５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０および０．４５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含み、さらに６ μｇ プロテイナーゼ−Κを含む細胞溶解緩衝液９０ μｌに加えた。この混合物を６０℃にて１時間加熱し、９５℃で１０分間インキュベートすることによりプロテイナーゼ−Κを変性させた。加熱した混合物２５μｌが冷却した後、新しいＰＣＲチューブに移し、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．３， ５０ ｍＭ ＫＣｌ， ０．１ ｍｇ／ｍｌ ゼラチン， ０．４５％ ＮＰ−４０， ０．４５％ Ｔｗｅｅｎ−２０， ４００ μＭ 各ｄＮＴＰ， ５ ｍＭ ＭｇＣｌ２， ５０ ｐＭ 各 ＰＣＲ プライマー （最終）および２．５ Ｕ Ｔａｑ ポリメラーゼ （ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））を含む別の混合物２５μｌを加えた。ウイルスＤＮＡを、９２℃の１分、次いで５８℃の１分、および７２℃の１分の４０サイクルで増幅した。組換えバキュロウイルス正方向プライマーＰＨ（配列番号：３６）および逆方向ＰＨ（配列番号：３７）を使用し、軽鎖遺伝子を発現するポリヘドロン座を増幅した。アガロースゲルでの電気泳動によりＰＣＲ産物を分析した。組換えバキュロウイルスは１３００ ｂｐ断片が増幅され、野生型バキュロウイルスは上記のプライマーセットを用いて約８００ ｂｐ断片が増幅される。野生型ウイルスが混入した組換えウイルスはこれら両断片サイズが増幅される。
【０１６２】
ｃ．Ｓｆ−９細胞における高力価ウイルス保存液の調製：
Ｔ−２５初代培養物から得た２ｍｌを、ＥＳＦ−９２１培地１０ｍｌ中、５０％全面成長のＳｆ−９細胞を含有するＴ−７５フラスコに移し、２８℃にて１２０時間細胞を発育させた。二次Ｔ−７５培養物５ｍｌを、２ｘ１０６ 細胞／ｍｌのＳｆ−９細胞５０ｍｌを含有する１５０ｍｌ振盪フラスコに移し、細胞を２８℃にて１２０時間発育させた。１５０ｍｌ振盪フラスコから２５ｍｌを移し、それを１Ｌ振盪フラスコ中の２ｘ１０６ 細胞／ｍｌのＳｆ−９細胞５００ｍｌに移し、２８℃にて発育させた。培養物が２０％に達したら、トリパンブルー染色により生細胞をスコアー化し（感染の約１２０−１４４時間後）、３０００ｘＧの遠心によりウイルス培養物を収獲し、５０ｍｌ滅菌チューブに分配し、チューブの半分を４℃にて保存し、−８０℃にて休止させて保存した。これにより高力価のウイルス保存液５００ｍｌ（＞１ｘ１０８ ｐｆｕ／ｍｌ）が収獲され、これを免疫グロブリン生産のためのＨｉｇｈ−５昆虫細胞の感染に用いた。ウイルス力価（ｐｆｕ／ｍｌ）はＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｒａｐｉｄ Ｔｉｔｅｒ Ｋｉｔ （Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ）を用いて測定した。
【０１６３】
ｄ．Ｈｉｇｈ−５昆虫細胞におけるＩｄの生産：
Ｈｉｇｈ−５昆虫細胞（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４）はＳｆ−９細胞と比較して、より高いレベルの組換え免疫グロブリン（２〜２０×）を分泌するので、それをキメラタンパク質生産のために選択した。初期の対数期にあるＨｉｇｈ−５細胞（１．０−２．０ｘ１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）を、ＥＳＦ９２１培地（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＬＬＰ）中５ｘ１０５ 細胞／ｍｌの、通気閉口を有する１Ｌ使い捨て培養フラスコに播種した。フラスコを２８℃にて１４０−１５０ ｒｐｍで振盪させ、フラスコ内の培地容量を経時的に５００ｍｌを越えないようにした。細胞密度が５００ ｍｌ培地中、１．５−２．５ 細胞／ｍｌに達すると、感染多重度（ＭＯＩ）約０．５：１ （ｐｆｕ：細胞）で高力価組換えバキュロウイルス保存液でフラスコを感染させた。次いで、フラスコを２８℃にて１４０−１５０ ｒｐｍで振盪させた。感染９６時間後に培養物を回収した。
【０１６４】
５．ＶＨ免疫グロブリンおよびＶＬ免疫グロブリンを含むキメラタンパク質の精製：
約５，０００ ｘ ｇで６０分間遠心し、次いで０．２μ ＰＥＳ滅菌フィルターユニットで濾過し、細胞および細胞残骸を除去した。プロテインＡ Ｈｉｇｈ−Ｔｒａｐ カートリッジ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）によるアフィニティークロマトグラフィー、およびその後のＦＰＬＣ技術（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いるイオン交換クロマトグラフィーにより、清澄な組織培養培地からキメラタンパク質を精製した。精製したキメラタンパク質をサイズ分離し、ＦＰＬＣ クロマトグラフィーにより緩衝液をＰＢＳに交換した。タンパク質精製のために使用したすべての試薬はＵＳＰバイオテクノロジー級（ＧｅｎＡｒ， Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｔ Ｂａｋｅｒ， Ｐａｒｒｉｓ， ＫＹ）であり、製造元によりエンドトキシンは試験されている。滅菌ＵＳＰ級水を使用し、すべての緩衝液および他の溶液を調製した。緩衝液および他の溶液は生物学的安全キャビネット内で調製し、０．２ μｍ ＰＥＳフィルターユニットで滅菌濾過した。
【０１６５】
ａ．キメラタンパク質のプロテインＡセファロースアフィニティー精製：
増殖培養フラスコから組織培養培地を取り出し、５，０００ ｘ ｇで６０分回転させて細胞および細胞残骸を沈殿させた。得られた上清を０．２ μ ＰＥＳフィルターユニットで濾過滅菌した。ＶＨおよび／またはＶＬ−免疫グロブリンキメラタンパク質を含む濾過した培地にトリス緩衝液（１Ｍ， ｐＨ ７．４）を終濃度２０ｍＭまで加えた。Ｐ１蠕動ポンプ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により、緩衝化組織培養上清をＨｉｇｈＴｒａｐ組換えプロテインＡセファロースアフィニティーカートリッジ５ｍｌ上に流速５ｍｌ／分で加え、清澄なフラスコ内の流路に集めた。カラムを５ ｍｌ／分にてＰＢＳ （ｐＨ７．４） ２５ ｍｌで洗浄した。流れの方向を逆にし、カラムをＰＢＳ ２５ ｍｌでさらに洗浄した。０．０５Ｍクエン酸（ｐＨ ３．５）を１ｍｌ／分で逆にカラムに溶出し、画分１ｍｌを集めた。この同じ方法により、プロテインＧ、プロテインＬ（これらに限定されない）または免疫グロブリン結合ドメインを結合できる他のタンパク質を含む他のタンパク質カラムを使用できる。
【０１６６】
ｂ．イオン交換クロマトグラフィー：
Ｈｉｇｈ Ｔｒａｐ ＳＰセファロースカチオン交換カートリッジを、２５ ｍＭクエン酸（ｐＨ ３．５）および２０ ｍＭ ＮａＣｌ（５０ｍｌ）を用いて平衡化した。プロテインＡ溶出型ＶＨおよび／またはＶＬ−ＩｇＧキメラタンパク質を、蠕動ポンプを用いて直接、流速１ｍｌ／分で平衡化Ｈｉｇｈ Ｔｒａｐ ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにロードした。カラムを、５０ ｍＭクエン酸 （ｐＨ ３．５） および２０ ｍＭ ＮａＣｌ （緩衝液Ａ）を用いて２ ｍｌ／分で洗浄した。カラムを線状勾配（０％緩衝液Ｂ〜１００％緩衝液Ｂ）で溶出させて１ｍｌの画分を１ｍｌ／分で回収した（緩衝液Ｂ＝１００ ｍＭ 炭酸Ｎａ （ｐＨ １０．０） および１Ｍ ＮａＣｌ）。ＶＨおよび／またはＶＬ−ＩｇＧキメラタンパク質含有イオン交換溶出画分を、ＯＤ２８０により分光光度計で分析した。ピーク画分をプールした。
【０１６７】
ｃ．サイズ排除クロマトグラフィー：
次いで、ＳＰイオン交換からプールしたＩｇ画分を、５カラム容量のＰＢＳ（ｐＨ７．２）で平衡化し、続いて滅菌水（１００ｍｌ）で予備洗浄したＨｉ Ｐｒｅｐ Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ ２６／６０ Ｓ２００ Ｈｉ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にロードした。流速０．５ｍｌ／分のＰＢＳでキメラＩｇタンパク質を溶出させ、１ｍｌの画分で回収した。主なＩｇピークをプールし、０．２μフィルターで滅菌ろ過した（ａｐｏｏｌｅｄ ａ ｓｔｅｒｉｌｅ ｆｉｌｔｅｒｅｄ）。
【０１６８】
６．イディオタイプタンパク質のキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）との会合（コンジュゲート）
１回精製後、イディオタイプタンパク質をグルタルアルデヒド架橋を介してＧＭＰ 級 ＫＬＨ （ＶＡＣＭＵＮＥ， Ｂｉｏｓｙｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に会合させた。滅菌１５ｍｌ円錐チューブ中、前述の精製した滅菌イディオタイプタンパク質の少なくとも５ｍｇを同重量のＫＬＨと混合し、ＰＢＳで最終容量を９ｍｌに調節した。１％グルタルアルデヒド（２５％ １級 水溶液， Ｓｉｇｍａ）１ｍｌを終濃度０．１％まで滴加した。次いで、チューブを室温にて４時間ゆっくりと振動させた。滅菌ＰＢＳ ２Ｌに対して滅菌ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｚｅｒｓ （Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｌａｂｓ）にて会合体を透析し、その際、生物学的安全フードにて少なくとも２４時間緩衝液を３回交換した。最終的なＰＢＳ中のＩｇＧ／ＫＬＨ会合体を透析チャンバーから無菌的に取り出し、それを滅菌チューブに移し、混合し、次いでバイアルに分配した。最終産物の各バイアルにロット番号、患者情報、バイアル番号およびそれをバイアルに分配した日付を付した。最終バイアル化ロットの１０％を滅菌性について試験し、またバイアルを選択しエンドトキシンの存在に関して試験した。１つのバイアルを保管用に保持した。
【０１６９】
７．産物試験
ａ．生産ロット上清を含むバキュロウイルスのＤＮＡ配列：
昆虫細胞生産培養上清の試料１ｍｌを収穫し、卓上遠心機にて５分間３０００ｒｐｍにて回転させ、細胞残骸を除去した。バキュロウイルス粒子を含む、この清澄な上清の少なくとも０．１ｍｌを、細胞溶解緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．３， ５０ ｍＭ ＫＣｌ， ０．１ ｍｇ／ｍｌ ゼラチン， ０．４５％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０， および ０．４５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）と１：９の容量比で混合し、プロテイナーゼＫ（終濃度６０μｇ／ｍｌ）で１時間６０℃のタンパク質分解反応に付し、次いで９５℃で１５分間変性させた。この細胞溶解液２５μｌを、４００μＭの各ｄＮＴＰ、５ ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ ｐｍｏｌ のフォワードおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマー（第３表参照；それぞれ、ＶＨの同定には、配列番号：３４および配列番号：３５；およびＶＬの同定には、配列番号：３５および配列番号：３６）、および２．５ Ｕ Ｔａｑポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）を含む蒸気の細胞溶解緩衝液２５μｌとさらに混合し、ＰＣＲ反応を行った。ＶＬのＰＣＲのためのサイクリング条件は、９２℃での２分間の初期変性、その後の、９２℃、５８℃および７２℃でのそれぞれ１分間の４０サイクル、および７２℃での７分間の最終伸張。ＶＨのＰＣＲのためのサイクリング条件は、アニーリング温度が６４℃である以外は、同じである。ＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動により、予想サイズおよび量について評価した。次いで、２つまたはそれ以上の入れ子状態の（ｎｅｓｔｅｄ）プライマーを使用し、ＰＣＲ産物の配列決定を直接行った。（第３表参照；それぞれ、ＶＨの同定には、配列番号：３０および配列番号：３４；Ｖκの同定には、配列番号：２８および配列番号：３５；およびＶλの同定には、配列番号：８８および配列番号：３５。）完全なＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列を、ＯｐｅｎＧｅｎｅ Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ （Ｖｉｓｉｂｌｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）および上記の配列決定分析ソフトウエアを用いて決定し、その患者イディオタイプに対応するｐＴＲＡＢａｃ（ＮＨＬ−ＦＶ−８７８６−ＸＸＸ）ベクターのＶ−遺伝子配列と比較した。
【０１７０】
ｂ．スーパーロース６ゲル濾過クロマトグラフィー：
タンパク質の純度を評価するために精製Ｉｄのゲル濾過クロマトグラフィーを行った。スーパーロース６ＨＲ １０／３０ ＦＰＬＣカラム（Ａｍｅｒｃｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用い、液相としてＰＢＳを用いて、ゲル濾過クロマトグラフィーを行った。領域評価への参入からピークを排除するための以下の基準を用い、ＦＰＬＣソフトウェアによって、最大２０ピークにおいてピーク積分を行った：高さ０．０１Ａｕ以下；幅０．０５ｍｌ以下；領域０．０１Ａｕ／ｍｌ以下。各カラム流れのフラクションを集め、捕獲ＥＬＩＳＡによってヒト免疫グロブリン特異的活性について検定し、ＯＤ２８０クロマトグラムと比較した。
【０１７１】
ｃ．免疫グロブリン検；定抗ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ：
炭酸緩衝液中、ヤギ抗−ヒトＩｇＧ重鎖特異的抗体（Ｒｏｃｈｅ）の３ μｇ／ｍｌ希釈液１００ μｌでマイクロタイタープレートを被覆し、ＴＢＳ （５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ， １５０ ｍＭ ＮａＣｌ， ｐＨ ７．５） １００ μｌで２回洗浄した。次いで、２２℃にて１時間、ウエルをＴＢＳＢ （ＴＢＳ ＋ １％ ＢＳＡ） ２００μｌでブロックした。
ＴＢＳＢ中のヒトのピークに対応する各クロマトグラムフラクションを試験した。２倍連続希釈の希釈試料１００μｌ をウエルに加え（２回操作）、２２℃にて１時間インキュベートした。検定を、精製ヒトＩｇＧ１／κまたはＩｇＧ１／γ標準品（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）を用いて繰り返した。ウエルをＴＢＳＴ （ＴＢＳ ＋ ０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０） ２００μｌで４回洗浄した。検出抗体、ヤギ−抗−ヒト κ および λ−ＨＲＰ （Ｇｏａｔ−ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ κ ａｎｄ λ−ＨＲＰ、Ｆｉｓｃｈｅｒ， Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ， ＰＡ）をＴＢＳＢで１：２０００に希釈し、その１００μｌをウエルに加え、２２℃にて１時間インキュベートした。ウエルをＴＢＳＴ２００μｌで６回洗浄した。基質（ＴＭＢ １ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ， ＫＰＬ Ｉｎｃ．， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）１００μｌをウエルに加え、３０分間発色させ、試料をＯＤ６２０クロマトグラムで検定した。
【０１７２】
ｄ．イディオタイプタンパク質の放出基準：
（１）生産上清からのバキュロウイルス中のイディオタイプ可変遺伝子のＤＮＡ配列は、生産ベクター中のＤＮＡ配列と同一でなければならない。（２）イディオタイプタンパク質濃度は、ＯＤ２８０に基いて０．５ｍｇ／ｍｌ以上であった。（３）主要ピーク領域は、スーパーロース６分析クロマトグラフィーにおいて評価されたピークの領域の９０％以上であった。（４）主要クロマトグラフィーピークは、ヒトヒトＩｇＧκ（またはλ）に対応する。
動力学的濁度マイクロプレート検定またはＬｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ（ＬＡＬ）検定によって、エンドトキシンレベルについて最終ワクチン産物であるＩｄ−ＫＬＨを試験し、３５０以下のエンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍｌレベルを得た。第１４日試験において無菌性についてロットの１０％を試験し、試験ネガティブを捨てた。
【０１７３】
第３表は、最終産物の同一性を確立するのに用いたプライマー配列の概要である。
【表５】
2004506022.tif 000011
【０１７４】
８．非ホジキン病のＢ細胞リンパ腫の治療のための本発明キメラタンパク質の使用
非ホジキン病のＢ細胞リンパ腫から、ＶＨおよびＶＬ領域を得た。前述の５’ＲＡＣＥ法を用いて、これらの領域をコードする遺伝子をクローニングし、発現ベクターに挿入し、本発明方法によって発現させた。Ｔａｂｌｅ５は、発現ベクターに用いたＶＨおよびＶｌ領域のＤＮＡ配列を含む。
【０１７５】
第５表：患者から得られた可変領域配列
【表６】
2004506022.tif 000012
【０１７６】
先に詳述した遺伝情報からこの患者のために生産された単離した組換えキメラ免疫グロブリンタンパク質をＫＬＨと会合させ、前述のようにＧＭ−ＣＳＦとともに６ヶ月間にわたって５回投与した。治療を始める前および９ヶ月後に、患者の首および骨盤領域においてＣＴスキャンを行った。６個の腫瘍塊の直径の総和の比較から、治療開始から９ヶ月後において６０％縮小したことが明らかになった。これらの形状は、疾患の診断に先だって、リンパ節の大きさを調整するようには調節されないことに注意（Ｃｈｅｓｏｎら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．， １７（４）：１２４４，１９９９を参照）。
【０１７７】
第６表：処置後のリンパ節の大きさの縮小
【表７】
2004506022.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【図１】Ｂ細胞媒介性病態を有する患者のＢ細胞由来の特定の免疫グロブリンのＶＨまたはＶＬ領域に対するキメラタンパク質を含有する組成物を調製するための概略である。
【図２】多重クローニング部位を有するバキュロウイルス発現ベクターｐ２Ｂａｃのプラスミド地図である。
【図３】バキュロウイルス発現ベクターｐ２ＢａｃのＤＮＡ配列（配列番号：５）である。この配列は５’から３’方向へ描いている。ｐ２ＢａｃベクターはＡｃＮＰＶポリヘドリン遺伝子プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 Ｘ０６６３７ （配列番号：９２）のヌクレオチド１ から１２０）、およびＡｃＭＮＰＶ ｐ１０プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋ 受入番号 Ａ２８８８９ （配列番号：９３）のヌクレオチド８から２３７）を含んでいる。
【図４】プラスミドｐＴＲＡＢａｃ／９Ｆ１２のＤＮＡ配列である。このプラスミドは、安定なヒト細胞系統９Ｆ１２から発現される重鎖および軽鎖（κ）の遺伝子を含有する。９Ｆ１２細胞系統は破傷風トキソイド特異的なヒトＩｇＧ１／κ抗体を産生する（配列番号：８９）。下線一部は成熟９Ｆ１２ ＩｇＧγ１（ＴＴＴＡＣＣＣ．．．．）およびカッパ（ＡＴＣＧＡＣＡ．．．）鎖をそれぞれコードする配列である。配列は５’から３’方向へ描いている。
【図５Ａ】ＩｇＧγ１およびκ定常領域を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１のプラスミド地図である。
【図５Ｂ】ＩｇＧγ１およびλ定常領域を有する組換えバキュロウイルス発現ベクターｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１のプラスミド地図である。
【図６Ａ】ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１（配列番号：６）のＤＮＡ配列である。５’から３’方向へ描いている。
【図６Ｂ】ｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１（配列番号：７）のＤＮＡ配列である。５’から３’方向へ描いている。
【図６Ｃ】カッパスタッフプライマー（配列番号：９０）を利用する修飾後におけるｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣκＨＣγ１のＤＮＡ配列である。５’から３’方向へ描いている。
【図６Ｄ】ラムダスタッフプライマー（配列番号：９１）を利用する修飾後におけるｐＴＲＡＢａｃＨｕＬＣλＨＣγ１のＤＮＡ配列である。５’から３’方向へ描いている。
【図１】
2004506022.tif 000014
【図２】
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【図３Ａ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004506022.tif 000125
【国際調査報告】
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2004506022.tif 000127
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