(57)【要約】感染動物における伝染性海綿状脳症(TSE)の株を型別する方法であって、該動物から採取した特定のタイプの細胞内のペプチド配列の存在または濃度を検出することを含み、該細胞タイプ内の該ペプチド配列の存在または濃度は、TSEの特定株に特有である方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染動物における伝染性海綿状脳症(TSE)の株を型別する方法であって、該動物から採取した特定のタイプの細胞内のペプチド配列の存在または濃度を検出することを含み、該細胞タイプ内の該ペプチド配列の存在または濃度は、TSEの特定株に特有である方法。
【請求項２】
該特定の細胞タイプが、脳細胞、中枢神経系(CNS)細胞またはリンパ性組織の細胞である請求項１記載の方法。
【請求項３】
特定の細胞タイプ内の該ペプチド配列の存在が、TSEの特定株に特有である請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
動物が羊である請求項３記載の方法。
【請求項５】
ペプチド配列が、羊海綿状脳症のプリオンタンパク質のアミノ酸84〜105に対応するペプチドまたはそのエピトープ領域に対して産生された抗体に結合し、神経膠細胞におけるその存在が検出されて、スクラピーもしくはウシ海綿状脳症(BSE)に由来する株間を識別する請求項３または４記載の方法。
【請求項６】
特定の細胞タイプ内の該ペプチド配列の濃度が、TSEの特定株に特有であり、試験動物からの結果が、公知のTSE株に患っている少なくとも１種の比較動物の細胞から同様のやり方で得られた結果と比較される請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
該細胞が羊由来である請求項６記載の方法。
【請求項８】
該ペプチド配列が、羊海綿状脳症のプリオンタンパク質のアミノ酸84〜105に対応するペプチドまたはそのエピトープ領域に対して産生された抗体に結合し、ニューロン細胞におけるその濃度が検出され、該TSEの公知株が、スクラピーおよび／またはウシ海綿状脳症(BSE)に由来する株である請求項７記載の方法。
【請求項９】
検出されるペプチド配列が、羊海綿状脳症のアミノ酸89〜104に対応するペプチドまたはそのエピトープ領域に対して産生された抗体に結合する請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該ペプチド配列が、ウシ海綿状脳症のプリオンタンパク質のアミノ酸217〜231に対応するペプチドまたはそのエピトープ領域に対して産生された抗体に結合し、ニューロン細胞におけるその濃度が検出され、該TSEの公知株が、スクラピーおよび／またはウシ海綿状脳症(BSE)に由来する株である請求項７記載の方法。
【請求項１１】
ペプチド配列が、羊プリオンタンパク質のアミノ酸54〜60に対応するペプチドまたはそのエピトープ領域に対して産生された抗体に結合し、細胞外神経網におけるその濃度が検出され、該TSEの公知株が、スクラピーおよび／またはウシ海綿状脳症(BSE)に由来する株である請求項７記載の方法。
【請求項１２】
該ペプチド配列の存在または濃度が、該ペプチド配列に対して特異的な抗体もしくはその特異的結合断片を用いて決定される請求項１〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
検出がELIZAアッセイによって行なわれる請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
細胞アッセイとして行なわれる請求項１〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
該特定の細胞タイプの細胞が、ペプチド配列の検出前に分離される請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
細胞が、フローサイトメトリーによって分離される請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
該細胞が、ペプチド配列の存在または量の検出前に溶解される請求項１５または１６記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項記載の方法を用いて、伝染性海綿状脳症(TSE)の株を型別するためのキットであって、
感染動物の特定の細胞タイプの細胞内に見出されるTSEに由来するペプチド配列に特異的である抗体またはその結合断片であって、該細胞タイプ内の該ペプチド配列の存在または濃度がTSEの特定株に特有である、抗体またはその結合断片ならびに、
該抗体を検出するための手段
を含むキット。
【請求項１９】
実質的に請求項１〜１８のいずれか１項に記載したように、感染動物において伝染性海綿状脳症(TSE)の株を型別するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、感染動物において見出される伝染性海綿状脳症またはプリオン疾患の株または形態を型別する方法ならびに、この方法において使用される診断キットおよび試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝染性海綿状脳症(TSE)は、神経実質 (neuroparenchymal)空胞化および、プリオンタンパク質(PrP)と呼ばれる宿主コード化された細胞表面シアロ糖タンパク質(sialoglycoprotein)の疾患特異的イソ型の蓄積によって特徴づけられる一群の進行性神経障害を含む。スクラピー、ウシ海綿状脳症(BSE)および種々のクロイツフェルト-ヤーコプ病が、この群の疾患に属する。この疾患は、種々の形態または株で出現する。
【０００３】
すでに、多数のTSE分離物（通常、株と称される）が、ある範囲の伝染源のネズミへの伝染後に同定された。羊がBSE剤に感染し得る可能性は、ヒトおよび動物の健康にかかわりがある。
【０００４】
目下のところ、TSE剤株型別の唯一信頼性のある方法は、マウスにおける逐次伝染後の分離物の生物学的特性に基づく（ブルース(Bruce)ら、1994年、ウシ海綿状脳症およびスクラピーのマウスへの伝染：株変動および種の防壁(Transmission of bovine spongiform encephalopathy and scrapie to mice: strain variation and the species barrier)Philosophical Transactions- Royal Society of London. Series B. 343, 405-411）。しかしながら、そのような方法は非常に時間がかかり、すべてのスクラピー株がマウスに容易に伝染するわけではない。幾つかの研究は、スクラピーを有するマウスの脳におけるPrP堆積のパターンは株特異的であることを示した（ブルース(Bruce) M Eら、1989年、Neuroscience Letters 102, 1-6; ブルース(Bruce)、1996年、スクラピーおよびBSEの株の型別研究。プリオン疾患において。(Strain typing studies of scrapie and BSE. In Prion Diseases)、編者 ベーカー(Baker), H. F. およびリドレー(Ridley), R. M.  pp. Totowa/NJ 07512: ヒューマナ  プレス社(Humana Press Inc.)）。
【０００５】
幾つかの他の方法が、株の同定に対するより迅速な答えを提供するという希望をもって、研究された。これらの全てが、PrPの疾患特異的プロテアーゼ耐性断片（PrPres）の特性、例えば分子量（パーチ(Parchi)ら、1996年、Annals of Neurology 39, 767-778）、PrPres断片の糖形態(glycoform)の比（コリンジ(Collinge)ら、1996年、Nature 383, 685-690；クチウス(Kuczius)ら、1998年、Journal of Infectious diseases 178, 693-699；サマービル(Somerville)ら、1997a, Nature 386, 564-564）またはPrPresの相対的プロテアーゼ耐性（クチウス(Kuczius)およびグロシャップ(Groschup)、1999年、Molecular Medicine 5, 406-418）に基づく。しかしながら、PrPresのこれらの特性は、異なる株または分離物が比較されるときに重複し、よってそれらはなお、決定的な株の型別に使用することができない。PrPresの立体配座アッセイが記載されており、株の型別の手段を提供し得るが、この技術の有用性はなお確立されていない（セーファー(Safer)ら、1998年、Nature Medicine 4, 1157-1165）。
【０００６】
天然のスクラピーを有する羊の脳においては、免疫組織化学標識化の後に、多数の異なるパターンの疾患特異的PrP蓄積をみることができる（ライダー(Ryder)ら、2001年、Veterinary Record 148, 7-13；ファン  コイレン(van Keulen)ら、1995年、Veterinary Pathology 32, 299-308）。
【０００７】
出願人は、これらのパターンは、内皮細胞、星状細胞、ニューロンおよび上衣細胞を含む多数の異なる神経系細胞タイプによるPrPの蓄積および推測される放出と関連があり、主にスクラピー源における差異によって影響されると思われることを見出した（以下の実施例２および、ゴンザレツ(Gonzalez)L.ら、自然におよび実験的にスクラピーにかかった羊の脳におけるPrP蓄積への分離物および遺伝子型の影響(Isolate and genotype effects on PrP accumulation in the brain of sheep naturally and experimentally affected with scrapie), J. Comparative Pathology 2001年提出、参照）。マウスおよび羊の両方のリンパ性網様(lymphoreticular)系(LRS)において、疾患特異的PrPは、可染性の身体マクロファージ(TBM)内および、二次小胞の小胞樹状突起細胞(FDC)の周りに認識される（ジェフリー(Jeffrey)ら、2000年、Journal of Pathology, 191, 323-332；ジェフリー(Jeffrey)ら、2001b, Journal of Comparative Pathology 印刷中）。
【０００８】
出願人は、特性の細胞タイプに関連したPrPペプチド蓄積を同定することを目的とする免疫組織化学を、TSE、例えば羊における天然スクラピーおよびBSEの株を識別するために使用することができることを見出した。
【０００９】
さらには出願人は、疾患特異的PrPペプチド断片の細胞および神経解剖学的分布は、BSEに感染された羊および天然のスクラピー源が比較されるときには、異なることを見出した。これらの差異は、疾患特異的PrPの推測されるイン  サイツ(in situ)での立体配座依存性先端切断(truncation)パターンに関連すると思われる。とにかく、結果は、疾患特異的PrPエピトープの脳およびLRSにおける分布が、個々のTSE疾患、特に羊TSE疾患の株の型別を可能にし得ることを示唆する。
【００１０】
本発明に従えば、感染した動物における伝染性海綿状脳症(TSE)の株を型別するための方法が提供され、該方法は、該動物から採取した特定のタイプの細胞内のペプチド配列の存在または濃度を検出することを含み、該細胞タイプ内の該ペプチド配列の存在または濃度は、TSEの特定株に特有である。
【００１１】
本明細書において使用されるように、「ペプチド配列」という語は、分離において別個のペプチドの形態である配列であるかまたは、タンパク質もしくは先端切断タンパク質の一部としての配列をいう。
【００１２】
任意の特定の場合に使用される特定の細胞タイプは、特定の動物、感染しているTSEの特定の株および、動物の細胞によるプリオンタンパク質のプロセシングのような要因に依存して変化する。任意の特定の場合に、これは、以後記載するのと同様の方法を用いて決定することができる。しかしながら一般に、細胞タイプは、特定の脳細胞タイプ、中枢神経系(CNS)細胞タイプまたはLRS内に含まれる細胞タイプである。
【００１３】
本明細書において証明されるように、自然にスクラピー感染した、かつBSE剤感染したサフォーク(Suffolk)およびロムニー(Romney)羊のCNSおよびLRSの特定の細胞タイプにおける特定のプリオンタンパク質(PrP)ペプチド配列を同定するために、免疫組織化学が使用された。これらの結果は、羊のCNSおよびLRSにおける免疫組織化学的PrPプロファイル作成は、羊のスクラピー株の同定を可能にすることを示す。これらの方法はもしかすると、CNSおよびLRSの病因におけるTSE剤株依存性の差異の認識および、個々の脳内の多数の株の同定を可能にするかもしれない。
【００１４】
細胞タイプ間で注目される差異は、疾患特異的PrPの、分離物に関連する細胞特異的イン  サイツ(in situ)での立体配座依存性先端切断パターンによるものであり得る。
【００１５】
好ましくは、本発明の方法は、特定の細胞タイプ内のペプチド配列の存在を検出するために使用され、ここでは、単に存在が、TSEの特定株に特有である。これは、絶対的なやり方で株を同定するのを可能にする。
【００１６】
特に好ましい実施態様においては、本発明の方法は、TSEのBSE株からスクラピーを識別するために、羊に適用される。
【００１７】
本明細書において報告された結果は、ペプチド配列84-105から生じた抗体521.7は、BSE剤感染したCNSおよびLRSの食細胞の推定されるリソソーム内で容易には検出されないが、同じペプチド配列が、自然にスクラピーにかかった羊の同じ細胞に存在することを示す。臨床的に感染させた羊および、幾らかの臨床前BSE剤感染した羊は、LRSおよび脳の食細胞における羊の84-105アミノ酸ペプチド配列を含むPrPの少ない量の標識化によって、スクラピーから区別することができた。
【００１８】
このように、本発明の特に好ましい実施態様は、感染動物の神経膠細胞において、羊の海綿状脳症のプリオンタンパク質のアミノ酸84-105に対応するペプチドまたはそのエピトープ領域に対して産生される抗体に結合するペプチド配列の存在の検出を頼みにする。
羊およびウシのプリオンタンパク質の配列を、以下の図10および図11に示す。
【００１９】
「エピトープ領域」という表現は、抗原応答を生じさせる、基本的に規定された配列の任意の断片をいう。
代替の実施態様においては、本方法は、TSEの公知株に患っている少なくとも１種の比較動物の細胞から同様のやり方で得られた結果との、試験動物の特定の細胞タイプ内のペプチド配列の量の比較を含み、ここでは、濃度がTSEの特定株に特有である。好ましくは、プロセシングにおける動物の遺伝子型から生じるいかなる差異をも防止するために、比較動物は試験動物と同様の血統を有する。しかしながら以下で説明するように、幾つかの場合には、遺伝子型は、得られる結果にあまり影響を及ぼさない。
【００２０】
例えば、BSE-剤-感染した羊は、ある範囲のPrPペプチド配列についての標識化により検出される脳における高濃度のニューロン内PrP蓄積によって、天然の羊スクラピーから区別することができることが見出された。
【００２１】
例えば羊においては、プリオンタンパク質のアミノ酸84-105に対応するペプチドまたはそのエピトープ領域に対して産生される抗体に結合するペプチド配列（例えば、羊のアミノ酸89-104に対応するペプチド）は、スクラピーおよび／またはウシ海綿状脳症(BSE)由来株において異なって、ニューロン細胞において濃縮されること、およびこの差異は、株を型別するのに使用できることが見出された。
【００２２】
同様に、牛のプリオンタンパク質のアミノ酸217-231に対応するペプチドまたはそのエピトープ領域に対して産生される抗体に結合するペプチド配列は、ウシ海綿状脳症(BSE)由来株と比べて異なって、天然のスクラピーに感染した羊のニューロン細胞において分布される。
【００２３】
なお更なる代替の実施態様においては、羊プリオンタンパク質のアミノ酸54-60に対応する抗体に結合するペプチド配列またはそのエピトープ領域は、ウシ海綿状脳症(BSE)由来株と比べて異なって、スクラピーを有する羊においては細胞外神経網において濃縮されることが見出された。
【００２４】
本明細書において報告された結果は、羊のBSE剤と他のスクラピー株との感染を区別するために使用することができる、神経系およびLRS内の特定の細胞タイプにおける疾患特異的PrPの株依存性のプロセシングがあることを示唆する。
【００２５】
適当には、特定の細胞タイプ内のペプチド配列の存在または濃度は、慣用の免疫組織化学技術を用いて決定することができる。特に、本発明の方法は、該ペプチド配列に特異的な抗体またはその特異的結合断片を使用する。これらは、例えば慣用のELISAフォーマットにおいて適用することができる。
【００２６】
以下で報告する研究においては、抗体が産生される配列は、この研究で使用されるほとんどの抗体について公知である。しかしながら、各抗体によって認識される正確なエピトープは、免疫しているペプチドの配列に常に一致するわけではありえない。この研究（ガーセン(Garssen)ら、2000年、Microscopy Research and Technique, 50, 32-39）において使用される最も重要な抗体の１つ（521.7)の詳細な分析は、この抗体が、免疫源供給源から予想されるより広い免疫反応性を有する配列を有することを示唆する。この抗体は、PrPタンパク質のアミノ酸範囲33〜146にわたって、GG、GSおよびGQジペプチドと反応すると思われる。特に84〜105のエピトープは強く認識される。同様に、FH11およびBG4の免疫源供給源は54〜60であるが、（フォスター(Foster)ら、2001年、Journal of General Virology 82, 267-273）に引用された個人的な報道は、BG4およびFH11により認識されるエピトープは、47〜57および89〜99であることを示唆する。これらの結果は、羊の配列89〜99についてのこれらの抗体の親和性が、ホルマリン固定組織に保持されないことを示唆する。
【００２７】
本発明の方法は、以下に説明するように、細胞アッセイとして行なうことができる。しかしながら、生化学的環境で行なうことができるようにこの技術を変更することが好ましくあり得る。これは、種々の細胞タイプの細胞が、ペプチド配列の検出前に分離されることを必要とし得る。慣用の分離方法、例えばフローサイトメトリーを使用することができる。
【００２８】
分離したなら、細胞を公知のやり方で溶解することができ、例えばELISAを用いて、内容物を、目標ペプチド配列の存在または量について探索する。便利なら、結合の検出前に、抗体を支持媒体、例えばビーズまたはウェルに不動化することができる。
【００２９】
本発明はさらに、上記した方法を用いる伝染性海綿状脳症(TSE)の株を型別するためのキットを提供し、該キットは、感染動物の特定の細胞タイプの細胞内に見出されるTSEに由来するペプチド配列に特異的な抗体もしくはその結合断片であって、該細胞タイプ内の該ペプチド配列の存在または濃度がTSEの特定の株に特有である、抗体もしくはその結合断片ならびに、該抗体を検出するための手段を含む。
【００３０】
抗体を検出するための手段は、例えば蛍光標識で標識されることができる二次抗体であり得る。
添付の図面に関して、例として、本発明をここで特に記載する。
【発明の開示】
【００３１】
実施例１
羊における天然のスクラピーもしくはウシ海綿状脳症剤間の免疫組織化学的差異
PrPタンパク質の種々のペプチド配列に対して生じたある範囲の抗体（表１）を得、天然のスクラピーまたはウシ海綿状脳症(BSE)剤に感染した羊からの脳およびLRSにおける疾患特異的PrP標識化の組織および細胞のパターンを比較するために使用した。
【００３２】
研究のために８群の羊が入手可能であった（表２）。群１〜３においては、ロムニー-マーシュ(Romney-Marsh)またはサフォーク羊が、5gのBSE脳のプールを経口的に投与され、５つのPrPARQ/ARQ羊の群が逐次殺された。４または６ヶ月間隔で、５匹の羊の群から脳および内臓を得た。BSE攻撃されたロムニー羊における最も早い臨床的疾患の開始は、接種後20ヶ月であった。ロムニー羊、採集した組織およびPrPの分布のさらなる詳細は、（ジェフリー(Jeffrey)ら、2001a、羊の経口的BSE攻撃：1：ロムニー羊の脳および内臓における疾患特異的PrP蓄積の開始および分布(Oral BSE challenge of sheep:1: Onset and distribution of disease specific PrP accumulation in brains and viscera of Romney sheep.)、Journal of Comparative Pathology（印刷中））に記載されている。
【００３３】
群４〜8は、天然のスクラピーのケースから成っていた。群４の羊は、スコットランドの農場から得たサフォークスクラピーの４つの臨床的なケースから成っていた。群５の羊は、この同じひどく感染した供給源農場から得、さらに10匹の、4、10、14、20および26ヶ月に逐次扁桃生検した、PrPARQ/ARQ遺伝子型サフォーク羊から成っていた。さらに、12匹の臨床前のケースに、逐次剖検を行なった。これらの動物のすべてからの組織が、実験のために入手可能であった。この群れの詳細および、疾患特異的PrPについての臨床前試験の結果は、（ジェフリー(Jeffrey)ら、2001b, 逐次剖検および扁桃生検を用いたサフォーク羊におけるスクラピー周辺病因の予備的研究(A preliminary investigation of scrapie peripheral pathogenesis in Suffolk sheep using sequential necropsies and tonsil biopsies.), Journal of Comparative Pathology（印刷中））に記載されている。群６は、限られた地理的地域における３つの農場からの臨床的スクラピーのケースから成っており（遺伝子型PrPARQ/VRQ；PrPVRQ/VRQ；PrPARR/VRQの17匹のシェトランドクロス羊）、一方群７のケースは、ウェールズの１箇所の供給源からきた（PrPVRQ/VRQの遺伝子型を有する３匹のウェルシュ  マウンテン羊）。最後に、幾つかの広く分散したUK供給源場所から生じた２つの遺伝子型の12匹の臨床的ケースの寄せ集めが、群８の羊を構成していた。
【００３４】
組織および手順
脳およびある範囲のリンパ性組織（脾臓、扁桃、前肩甲骨(prescapular)リンパ節、腸間膜リンパ節、咽頭後方リンパ節、縦隔リンパ節、脾臓および、回腸および結腸から主として得られる腸関連のリンパ性組織）を、選択的剖検で得、10％中性リン酸塩緩衝ホルマリン中に固定し、トリミングし、後固定し、そして標準的手順に従って包埋した。この研究の目的のために、脳組織の試験は、閂のレベルに限られた。
【００３５】
５μ厚さの組織切片をミクロトームで切り出し、処理スライドグラス（スーパーフロストプラス(superfrost plus)、メンツェル-グレーザー(Menzel-Glaser)、ドイツ国 ）上に固定し、37℃にて１晩乾燥した。切片を脱蝋し、慣用のプロトコルに従って脱水した後、抗原回復処置に供した。切片を98％蟻酸に５分間浸漬し、流水で洗浄した後、0.2％クエン酸緩衝液中に浸漬し、121℃のオートクレーブで５分間処理した。内因性ペルオキシダーゼ活性を消すための工程（３％過酸化水素で20分間）、および非特異的組織抗原を除去するための工程（５％正常ウマ血清で60分間）の２つの最初のブロッキング工程を室温で行なった。一次抗体とのインキュベーションを４℃にて１晩行ない、トリス緩衝液ですすいだ後、結合抗体を市販のイムノペルオキシダーゼ法（ベクター-エライト(Vector-elite)ABC；ベクターラボラトリーズ(Vector Laboratories)、ピーターバラ(Peterborough)）によって標識した。さらにすすいだ後、切片を0.5％硫酸銅に浸漬して、イムノペルオキシダーゼ反応生成物の強度を高め、メイヤーのヘマトキシリン(Mayer’s haematoxylin)で２分間対比染色した。
【００３６】
一定範囲の一次抗体を、可動尾のN末端ドメインから、タンパク質の球形ドメインを通って（リーク(Riek)ら、1997年、全長組換えネズミプリオンタンパク質、mPrP(23-231)のNMR特性決定(NMR characterization of the full-length recombinant murine prion protein, mPrP(23-231))。FEBS Letters 413, 282-288）、カルボキシ末端までのPrPタンパク質に及ぶアミノ酸配列を標識するために選択した（リーク(Riek)ら、1997年、全長組換えネズミプリオンタンパク質、mPrP(23-231)のNMR特性決定(NMR characterization of the full-length recombinant murine prion protein, mPrP(23-231))。FEBS Letters 413, 282-288）。使用した抗体およびそれらが産生された配列（公知）を表１に示す。
PrP分子（約120のアミノ酸から）の球形ドメインおよびC末端に向けられた抗体はすべて本質的に同じ結果を与え、したがって１群と称する。使用された抗体のいずれもPrPの正常イソ型および異常イソ型の間を識別することができなかったが、研究に使用された動物はすべてTSEに感染していることが知られていたので、組織切片の正の標識は疾患特異的PrP蓄積の結果であると仮定された。
【００３７】
標識化の強度は、以下の基準に従って主観的に判定した；-  染色なし；+/-  時折薄茶色の標識化として、高倍率（x40の対物レンズ）でのみ見ることができる痕跡の染色；+  薄茶色の標識として、適度の（ｘ10の対物レンズ）倍率で見ることができる染色；++  ｘ2.5の対物レンズで見ることができるほとんどの目標領域で見ることができる茶色の標識；+++  ほとんどの目標部位にわたって濃茶色の標識；++++  すべての目標領域にわたって最低の倍率（ｘ2.5）で見ることができる強い均一な茶色／黒色の標識。
【００３８】
結果
臨床的に病気にかかった羊からのLRS組織
LRS組織においては、ほとんどの抗体（表３図１）が、群4/5サフォーク羊スクラピーおよびBSE剤感染群1〜3の羊においてFDCおよびTBMの両方を標識した。一般に、BSE剤群1〜3リンパ節感染羊におけるTBMの標識化は、スクラピーよりわずかに強かった。２つの抗体（FH11、BG4）のみが、スクラピーまたはBSE剤感染したTBMのPrPを標識しなかった。
【００３９】
別の２つの抗体（521.7、P4）は、BSE剤感染した動物からのTBMを同じ切片のFDCより少なく標識した。521.7抗体を用いると、標識化のTBM関連パターンの実質上の不在がBSE剤感染リンパ性組織について常に見出されたが、スクラピー感染した二次小胞羊については見出されず、ここでは、同じ抗体を用いると、TBM標識化が同じ切片のFDC標識化より強かった。
【００４０】
TBMの521.7標識化のほとんど完全な不在がBSE剤感染のみに限られるのかどうかを決定するために、異なる遺伝子型、血統およびUK内での地理的出所を有するスクラピー感染羊の選択を調べた。試験したBSE剤およびスクラピー源を表２に示す。免疫標識化の異なる細胞パターンが部位特異的であったかどうかを決定するために、表２に示す供給源からの一定範囲のLRS組織（脾臓、扁桃およびリンパ節を含む）を調べた。TBMおよびFDC標識化の同じ相対的強度が、試験したすべてのLRS部位について見出された。群１のそれぞれのLRS組織部位において、521.7抗体を用いたBSE剤感染羊のTBM標識化は、他の抗体と比較したときに減少したかまたは失われ、それに対して、スクラピー感染羊のすべての遺伝子型の全てのLRS組織において、521.7を含む試験した全ての抗体について良好なTBM標識化が見出された。
【００４１】
臨床前疾患からのリンパ性組織
上記したTBMの差別的な標識化がまた、臨床的疾患の開始前に存在したかどうかを決定するために、群２、３および５からの羊を、表２に示した時点で調べた。先に記載したように、BSE剤感染（ジェフリー(Jeffrey)ら、2001a、羊の経口的BSE攻撃：1：ロムニー羊の脳および内蔵における疾患特異的PrP蓄積の開始および分布(Oral BSE challenge of sheep:1: Onset and distribution of disease specific PrP accumulation in brains and viscera of Romney sheep). Journal of Comparative Pathology （印刷中））および天然のスクラピー（ジェフリー(Jeffrey)ら、2001b、逐次剖検および扁桃生検を用いた、サフォーク羊におけるスクラピー周辺病因の予備的研究(A preliminary investigation of scrapie peripheral pathogenesis in Suffolk sheep using sequential necropsies and tonsil biopsies). Journal of Comparative Pathology （印刷中））の両方の初期段階において、疾患特異的PrPは、TBM内にまばらな蓄積として初期に検出された。接種後16ヶ月までで、群２および３からのBSE感染羊においては、521.7抗体を用いてTBMもFDCも同定することができなかった（図２）が、PrP蓄積を含むTBMは、他の抗体（R486/R482/R145）を用いて検出された（図２）。それに対して、521.7は臨床前スクラピーのケースにおいてTBMを標識した。疾患特異的BSE剤およびスクラピーのPrP標識化パターン間のこれらの差異は、12、14、16および20月齢の臨床前スクラピー感染サフォーク羊と比べたときに、投与後４、10、16および22ヶ月で試験したBSE剤感染羊の全ての臨床前段階で見出された。
【００４２】
CNS
BSE剤感染した羊の髄質延髄への幾つかの抗体の適用後に得られたPrP免疫標識化のパターンを、表４に示したように種々の血統および遺伝子型のスクラピー感染羊のものと比較した。
【００４３】
２つの抗体FH11およびBG4は、群1〜8の羊の脳において細胞内疾患特異的PrPを標識しなかった。しかしながら、これらの抗体の両方が、細胞外神経網免疫標識化の強く粗い粒状および星状パターンを生じた。それに対して、抗体521.7は、細胞内ニューロンのPrP蓄積に対して親和性を示し、細胞外PrP蓄積は中くらいもしくは弱い標識化のみであった。C末端に近いアミノ酸に対する抗体、例えば抗体R145は、細胞内および細胞外堆積の両方に親和性を示したが、標識化のこれらの広いパターンにおいてBG4またはFH11ほどの高い標識化の強度を与えなかった。P4抗体は、ニューロン内標識化ならびに可変性のレベルの星状の細かい斑点および上衣下標識化を検出した。
【００４４】
BSEおよびスクラピーにおけるPrPの細胞パターンおよび神経解剖学的分布を比較したとき、ニューロン内PrPの強度および分布の両方に著しい差異が見出された。群１からの全てのBSE剤感染脳および群２の投与後16〜22ヶ月の脳において、PrPタンパク質の球形ドメインまたはC末端を認識する抗体を使用したときに、強く広範な粒子状ニューロン内PrP標識化が観察された。
【００４５】
スクラピー脳において、抗体R145、R486および521.7を用いて、疾患特異的ニューロン内PrPが、BSE感染脳より低い濃度で検出された（図３、表４）。スクラピー脳に適用されたときに、ただ１つの抗体(P4)が、BSE剤感染（拡散したニューロン内標識化）と比べたときに、特にオリーブにおいて（顆粒状堆積物）、より大きいニューロン内標識化を与えた。少数の、群６および８からのPrPVRQ/VRQおよびPrPVRQ/ARQ遺伝子型のスクラピー感染羊において、より広範なニューロン内PrP蓄積が見出されたが、全てのこれらの脳において、全般的な疾患特異的PrP標識化の量は弱かった。ニューロン内標識化の差異の他に、特にBG4およびFH11抗体を用いて、群４〜８からの羊スクラピーと比較したときに、粗い粒状神経網標識化の割合の増加が、群１および２におけるBSE剤感染脳において見出された（図４）。それに対して、後者の群における羊スクラピー脳は、同じ抗体を用いたBSE剤感染脳と比べて増加された割合の星状パターンを示した。
【００４６】
LRS系と同様の所見が、脳組織における神経膠内PrP蓄積に関して見出された（図５）。神経膠内免疫標識化は、全てのBSEのケースおよびある割合のスクラピー脳において見られた。BSE剤感染脳は、521.7抗体で処理したとき、神経膠内PrP蓄積を示さなかった。しかしながら、抗体、例えばR486、R482およびR145は、著しい神経膠内PrP蓄積の証明を可能にした。神経膠内PrP蓄積は、群５においてはまれにしか観察されず、群６〜７からのスクラピー感染脳と特徴が一致しなかった。存在する場合には、スクラピー関連の神経膠内PrPは、FH11およびBG4以外の試験した全ての抗体で良好な免疫標識化を示した。
【００４７】
上記したCNS組織の染色における主観的に査定した差異が、BSE剤感染脳と天然のスクラピーとの間の識別に使用できるかどうかを決定するために、12のスクラピーのケースの寄せ集めを選択し（群７〜８）、BSE剤感染した羊脳の３つの臨床的（群１）および２つの臨床前（群２）のケースと混合した。次に、髄質の切片を切り出し、盲コード化し(blind-coded)、８つの異なる抗体で標識化した。P4およびR145/R486/521.7での染色後のニューロン内標識化の相対的強度および分布を用いて、４つのBSEケースを同定し、最終的な臨床前BSEケースを、結果が解読されたときに、未知のタイプとして分類した。
【００４８】
したがって、要約すると、LRSでの所見を取ると、羊群１〜３におけるBSE剤感染は、２つの以下のペプチド特異的抗体：R145、521.7で組織を標識化したときに、FDCおよびTBM標識化のパターンおよび分布に基づいて、すべての天然のスクラピー供給源（群４〜８）から区別することができた。CNS組織においては、BSE剤感染羊の閂は、以下によって認識することができた。
1.   P4およびR145/R486/521.7を用いたニューロン内標識化の強度および分布
2.  BG4/FH11での免疫標識化の強度および、三叉神経の脊髄路における星状標識化対粗い粒状顆粒状神経網標識化の相対的割合、ならびに
3.  PrPの球形ドメイン／C-末端に対する抗体と比べた、521.7抗体を用いた神経膠標識化の不在。
【００４９】
マウスにおける神経膠PrPの細胞内蓄積は、星状細胞および小神経膠リソソームにおいて（ジェフリー(Jeffrey)ら、1994年、87VスクラピーにおけるPrP局在化の相関的な光学顕微鏡および電子顕微鏡による研究(Correlative light and electron microscopy studies of PrP localisation in 87V scrapie.), Brain Research 656, 329-343）、かつTBMリソソーム内のリンパ性組織において（ジェフリー(Jeffrey)ら、2000年、イムノ-ゴールド電子顕微鏡により示された、スクラピー感染マウス脾臓におけるプリオンタンパク質蓄積の部位(Sites of prion protein accumulation in scrapie infected mouse spleen revealed by immuno-gold electron microscopy.), Journal of Pathology. 191, 323-332）、非細胞レベルで見出される。スクラピー感染したマウスおよび羊の脳に堆積された細胞外PrPが全長タンパク質として存在することは、以前に示された（ジェフリー(Jeffrey)ら、1996年、Neurodegeneration 5, 101-109；ジェフリー(Jeffrey)ら、1998年、Veterinary Record, 142, 534-537）。しかしながら、リソソーム内PrPは、幾つかのタンパク質分解酵素によって作用を受け、PrPのリソソーム内蓄積が切り捨てられ得ることが可能である。BG4およびFH11抗体の両方が、PrPタンパク質の可動尾のN-末端セグメントにおけるドメインを認識し（レイク(Reik)ら、1997年）、これはPrPのスクラピーのイソ型のプロテアーゼκ処理にて除去される。
【００５０】
このように、スクラピーおよびBSE剤起源の両方のFH11またはBG4標識したTBMおよび神経膠細胞におけるPrPの不在は、リソソーム内のイン  ビボ(in vivo)N-末端切断の結果であり得る。
【００５１】
それに対して、ニューロン、星状細胞およびFDCの周囲に放出されるものを含む、疾患特異的PrPの細胞外形態は、全長タンパク質として存在し（ジェフリー(Jeffrey)ら、1996年、Neurodegeneration 5, 101-109）、したがって、疾患特異的PrPのプロテアーゼ耐性およびプロテアーゼ感受性ドメインの両方を認識する抗体で標識する。さらに、羊スクラピーの場合と比べた、幾つかのBSE剤感染細胞において蓄積されたPrPに対する特異的抗体の標識親和性の差異は、BSE剤特異的PrPの異なるプロセシングおよび先端切断があり得ることを示唆する。
【００５２】
機械論的な考察によって束縛されることなしに、立体配座の変化が、羊のBSE剤感染後に蓄積するPrPの疾患特異的形態の可変であるが長いN末端の欠失を生じるという仮説が立てられる。これは、周辺のリンパ性網様組織および脳のスクラピーとBSE剤感染との間の識別を可能にする。521.7抗体は84〜105のエピトープを認識するので、これらの残基間のPrPの先端切断が、BSE剤感染組織において免疫標識化の排除をもたらすが、タイプ１ヒトPrPresについて示唆されるように、先端切断がコドン82の近くであることが予想されるスクラピーにおける標識化の保持をもたらすことが可能である（パーチ(Parchi)ら、2000年、異常プリオンタンパク質の構造的変形への遺伝子の影響(Genetic influence on the structural variations of the abnormal prion protein.), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 97, 10168-10172）。
【００５３】
本発明の方法は、広く種々のTSEにおいて適用可能であり得る。脳の一定範囲の部位にわたる詳細な研究は、「PrPプロファイル作成(profiling)」が、他の自然に生じる株または個々の羊の脳に存在する分離物を決定するのに有効であり得ることを示した。PrPの内蔵の標識化におけるように、BSE剤感染動物の脳において見出されたPrPresのタイプがまた、天然の羊スクラピーの脳において形成されるものと異なり得るという幾らかの証拠がまたある。スクラピー脳の神経膠細胞におけるPrPの中位の免疫組織化学的標識化は、これが生じたある割合のスクラピーのケースにおいてのみ生じるが、神経膠におけるBSE剤関連のPrPと比べたときに神経膠における消化されたスクラピー関連のPrP蓄積の仮定された短いN末端断片の大きさの故に、スクラピー感染を認識することにあまり困難性はなかった。第２に、星状および粒状の標識化の全般的な大きさおよび割合が異なっていた。第３に、羊スクラピーにおけるP4抗体でのニューロン内標識化は常に、他の抗体、例えばR145/R482/R486/L42を用いたものより大きかった（特にオリーブにおいて）が、BSE剤感染脳においては逆が観察された（表４）。BSE感染脳と天然のスクラピー感染脳の神経膠内およびニューロン内標識化の間のこれらの相対的な差異は、BSEのPrPの疾患特異的形態が、疾患特異的スクラピーのPrPとは違って、合成され、および／または折り畳まれるという考え方と一致する。
【００５４】
さらに、少なくとも１つの抗体(P4)は、スクラピーおよびBSEの脳に存在するPrP間の差異を検出したが、LRSにおいては検出せず、PrPの株特異的プロセシングにおける正確な差異は、異なる細胞または細胞群について異なることを示唆する。PrPresおよび同じ動物の内蔵もしくは脳から抽出されたPrPsenの両方に差異がある（ルベンシュタイン(Rubenstein)ら、1991年、Journal of Infectious diseases 164, 29-35；サマービル(Somerville)ら、1997b, Journal of General Virology 78, 2389-2396；サマービル(Somerville)、1999年、Journal of General Virology 80, 1865-1872）ので、この概念は幾らかの生化学的な裏付けを有する。
【００５５】
【表１】
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【００５６】
【表２】
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【００５７】
【表３】
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【００５８】
【表４】
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【００５９】
【表５】
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【００６０】
試験した抗体の幾つかのみが示されている。影をつけた領域は、大多数とは異なるパターンの結果を生じる抗体を示す。全てのこれらの抗体は、PrPの可動尾を認識する。強く影を付けた部分は、羊のBSE剤感染とスクラピーとを識別するための鍵となる抗体である。
【００６１】
【表６】
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【００６２】
本研究においては記載されていないが、SSBP/1のPrP標識化パターンがまた、BSE剤感染羊のものと比較された。閂での差異の他に、BSE免疫標識化における変形は、より吻の脳部位において大きいようである。さらなる研究は、間脳における免疫標識化のBSE剤関連パターンにおけるよりはっきりした差異さえ提供すると思われる。影を付けた領域は、BSE剤感染と天然の羊スクラピーとを識別するために好都合な抗体パネルを示す。
【００６３】
実施例２
感染羊における天然スクラピーとSSBP1/1株との間の免疫組織化学的差異
スクラピーに一致する臨床的な兆候を示す全部で43匹の羊を、以下に記載したようにして、脳におけるPrPd蓄積について試験した。表５に示したようにその血統、PrP遺伝子型および感染源に従って群に分けた。表５はまた、年齢または、動物が臨床的兆候を生じた接種後の時間についての詳細を含む。PrPの遺伝子型別は、製造者（PEアプライド  バイオシステムズ(PE Applied Biosystems)、ウォリントン、英国）の指示に従ってABI  プリズム  377  DNAシーケンサー(ABI Prism 377 DNA sequencer)を用いた配列決定によって行なった。
【００６４】
実験的に感染させた羊（群１、２、３および４）は、公知のスクラピーでない供給源からの４匹のポールドーセットおよび13匹のチェビオット羊（３つの異なる遺伝子型を有する）を含んでおり、これらは、他で記載したように（ゴールドマン(Goldmann)ら、1994年）、皮下にスクラピーのSSBP/1源を接種された。自然感染した動物のうち、７匹のウェルシュマウンテン羊はウェールズの単一の群れから来ており、８匹のサフォーク羊はスコットランドの群れから来た。11匹のVRQ/ARQシェトランド羊は、シェトランドの５つの異なる群れから来た（１つの群れから５匹の羊、別の群れから３匹の羊、残りの3つの群れからそれぞれ１匹の羊）。
【００６５】
試料および免疫組織化学的手順
標準的な手順に従って、上記の羊の脳を固定し、トリミングし、後固定し、そして包埋した。全ての羊の脳の免疫組織化学的試験を、８つの異なる神経解剖学的位置、すなわち：大脳皮質（独立に評点を付けられた正面および後頭部の領域および注釈を付けられた平均値）、線条体、海馬、視床／視床下部、中脳、小脳（虫部での矢状方向）、吻の髄質延髄および閂での髄質延髄で行なった。これらのレベルで、５μm厚の切片をミクロトームで切り出し、処理したスライドグラス（スーパーフロストプラス(superfrost plus)、メンツェル-グレーザー(Menzel-Glaser)、ドイツ国）上に固定し、37℃にて１晩乾燥した。
【００６６】
組織切片を、慣用のプロトコルに従って脱蝋し、脱水した後、抗原回復処置に供した。切片を98％蟻酸に５分間浸漬し、流水で洗浄した後、0.2％クエン酸緩衝液中に浸漬し、121℃のオートクレーブで５分間処理した。内因性ペルオキシダーゼ活性を消すための工程（３％過酸化水素で20分間）、および非特異的組織抗原を除去するための工程（５％正常ウマ血清で60分間）の２つの最初のブロッキング工程を室温で行なった。一次抗体（R486-上記表１参照、1/10,000に希釈した）とのインキュベーションを４℃にて１晩行ない、免疫組織化学的プロトコルの残りを、市販のイムノペルオキシダーゼ法（ベクター-エライト(Vector-elite)ABC；ベクターラボラトリーズ(Vector Laboratories)、ピーターバラ(Peterborough)）によって行なった。切片を0.5％硫酸銅に浸漬して、イムノペルオキシダーゼ反応生成物の強度を高め、最後にメイヤーのヘマトキシリン(Mayer’s haematoxylin)で２分間対比染色した。
【００６７】
正の対照ブロック（スクラピー羊の脊髄）からの連続切片を、各免疫組織化学作業に含め、以下に記載する手順に従って評点を付けて、プロトコルの感度における一致を保証した。18匹の臨床的に健康な羊（３匹のシェトランド：１匹はARQ/ARR、１匹はARQ/ARQ、および１匹はARQ/AHQ、および15匹のサフォーク羊：9匹はARQ/ARQ、３匹はARQ/ARR、および３匹はARR/ARR）を同じ免疫組織化学試験に供して、負の対照を提供した。
【００６８】
命名、評点付け体系および統計的分析
スライドを、試験のために盲コード化した。観察された12の異なるタイプのPrPd堆積物のそれぞれ（説明のため結果参照）を、試験した８つの神経解剖学的部位の全てで定量的に評点付け（0から3の値）し、よって各羊から96個の数値を得た。各動物について、それぞれの「PrPdタイプ」は、８つの異なる部位で得られた値の平均であり、「全PrPd」は、12個のPrPdタイプの平均であった。12個のPrPdタイプはまた、４つの「PrPdパターン」へと分類され、その組み合わせが「PrPdプロファイル」を構成した。同じ群の動物間でのPrPdタイプ、PrPdパターンおよび全PrPdの平均値における変動は、標準偏差を提供した。
【００６９】
異なるPrPdタイプ、PrPdパターンおよび全PrPdの堆積の大きさを、統計コンピュータパッケージ（InStat（商標）、グラフパッド  ソフトウェア社(GraphPad Software Inc.)、サン  ディエゴ、カリフォルニア州）を用いた非対t試験(unpaired t test)によって、選ばれた羊群間で比較した。比較下にある群が同様の標準偏差を示し（バートレット試験(Bartlett test)）、データがガウス分布を有していた（コルモゴロフ(Kolmogorov)およびスミルノフ(Smirnov)試験）ときに、パラメーターt試験(parametric t test)を使用し；さもなければ、非パラメーターt試験(non-parametric t test)（マン-ウィトニー(Mann-Whitney)）を使用した。SSBP/1の実験的に感染させた羊群間の比較は、血統または遺伝子型が共通であるもの間でのみ行ない、それに対して、自然に感染した羊群間で、全ての３つの可能な比較を行なった。自然に感染した羊と実験的に感染させた羊との比較は、同じ遺伝子型のものの間でのみ行なった。
【００７０】
結果
異なるPrPdタイプの説明
12の異なるPrPdタイプを、研究した43匹の動物において同定し、異なる神経解剖学的部位にわたって評点付けした。18匹の負の対照のシェトランドおよびサフォーク羊においては、これらのタイプのいずれも検出されなかった。PrPdタイプは：
ニューロン内：核の周りのニューロンの細胞質中に散乱したPrPの、細かいから粗いまでの、時には融合性の顆粒状堆積物（図6a）。それらは、髄質、中脳および小脳の室頂核の大きい運動ニューロンにおいて最も普通であった。このタイプは、試験した全ての羊群において観察されたが、SSBP/1感染チェビオット羊において最も顕著であった（図8b）。
神経膠内：しばしば核に近い神経膠細胞の細胞体細胞質中に分散される、ニューロンで観察されるものよりわずかに大きい、強い顆粒状もしくは卵形のPrPdの堆積物（図6b）。このタイプは、ニューロン内と神経解剖学的に相関し、脳幹および小脳白質において最も顕著であった。このタイプはまた、全ての羊群において見出され、SSBP/1感染チェビオット羊において最も顕著であった（図8b）。
【００７１】
星状：星のような概観を与える、目に見える神経膠タイプの核に多数回集中した、放射状に広がる、分岐しているPrPd堆積物（図6c）。それらは、脳中いたるところで見出すことができたが、小脳皮質の分子層中で最も明らかであり、次いで大脳灰白質で明らかであり、その概観は、脳幹の灰白質においてより可変であった。自然感染したサフォーク羊は、最も強く広範な星状PrPdを示す群であった。
軟膜下：軟膜の下の、ゆるい網からより不定形への、多焦点もしくは連続したPrPd蓄積（図3d）。大脳および小脳の皮質において顕著であった。
【００７２】
脈管周囲：軟膜下に見出されるものと形態学的に同様であるが、白質における血管周囲に位置する。それらは、脳幹の視床／視床下部領域において最も顕著であった（図3e）。上記した他の２つの神経膠に関連するPrPd堆積物でのように、それらは、ARQ/ARQサフォーク羊において最も普通であり、最も顕著であるが、SSBP/1感染羊においては希にしか見出されなかった。
【００７３】
上衣下：形態学的に上記と同様であり、このPrPdタイプは、脳室系の上衣内層下の神経膠層に見出された（図3f）。これらの堆積物は一般に不連続であり、第３および第４の脳室よりむしろ、主として側脳室の周りに見られた。このタイプは、ポールドーセット羊では観察されず、他のSSBP/1接種羊群において非常に低い大きさおよび頻度を有した。12匹の羊において、細かい顆粒状のPrPd堆積物が、上衣細胞の細胞質またはそれらの先端表面で観察された。これらの堆積物は一般に微妙で随時のものであり、評点を付けられなかった。
【００７４】
線状：神経網に位置するPrPの糸状の堆積物。非常に薄く個別の線状形態が、任意の脳の部位に気まぐれに出現し、他のPrPdタイプと地域的に関連しなかった。より濃くより強い線状の染色はしばしば他のPrPdタイプと関連し、主として髄質および視床に局在化した（図6g）。このタイプは一般に、自然感染動物において最も顕著であった。
【００７５】
細かい斑点：しばしば他のPrPdタイプと関連する、神経網における多数の小さい顆粒（図6h）。SSBP/1感染ポールドーセット羊（事実上不在であった）を除く全ての群において同様の低い強度をもってそれが見出された、試験した全ての脳領域中いたるところに広く行き渡っていた。
【００７６】
粗い粒子：先に述べた細かいタイプと同様であり、多数回それと関連していたが、また神経網に位置する不規則な形のより粗い堆積物からできていた（図6i）。主として脳幹において見出され、まれに大脳および海馬において見られ、特にサフォーク羊において顕著であった。
【００７７】
融合：ほとんど不変的に先のタイプと関連しており、粗い粒子状PrPd堆積物の融合によって生じて、不定形または網状の免疫染色の塊を形成するように思われた（図6j）。その解剖学的分布ならびに、異なる群における頻度および大きさは、粗い粒子タイプと同じであったが、実験的に攻撃した羊においてはこの最後のものよりまれですらあった。
【００７８】
ニューロン周囲：個々の分散したニューロン細胞質および神経突起の周りのPrPdの薄い堆積物（図6k）。あまりニューロン内染色と関連しないが、むしろ粗い粒子および／または融合タイプと関連し、多くの異なる部位で見出されるけれども、小脳において最も普通であった。また、サフォーク羊において最も顕著であった。
【００７９】
プラーク：しばしば異なる内径の血管の周りに明確に分布する、小繊維の放射状の比較的大きいPrPdの蓄積（図6l）。感染した脈管の脈管内膜および中膜がまた、部分的または完全に、より不定形のPrPd堆積物を載せて出現した。管のPrPdプラークはほとんどもっぱら、VRQ/VRQウェルシュマウンテン羊において見出され（図9aおよび10b）、ここでは、それらは、任意の脳部位に集中的に出現したが、視床／視床下部ならびに大脳および小脳の皮質において最もしばしば見出された。壁内の堆積物がまた髄膜で観察されたが、脈管周囲のプラークは、この場所で見出されなかった。
【００８０】
異なる羊群におけるPrPdタイプの比較分析
研究下の幾つかの羊群における免疫標識化の全PrPd（全てのタイプを合わせて）の大きさを表６および図6Iに与え、差異の有意性を表７に示す。自然感染したARQ/ARQサフォーク羊の群は、最も大きく、最も一致する全PrPd評点を提供し、これはシェトランド（p＜0.01）およびウェルシュマウンテン（p＜0.05）羊（表２および３）とは有意に異なっており、SSBP/1感染羊の評点より大きくさえあった。他方では、SSBP/1感染ポールドーセットVRQ/ARQは、最も低い全PrPd評点を示し、同じ遺伝子型のチェビオット羊との統計上の比較のみが、有意な差異を与えた（p＜0.05）。
【００８１】
研究下の羊群間の比較を容易にするために、同定された12のPrPdタイプは分類されて、４つのPrPdパターンを形成した。ニューロン内および神経膠内PrPdは、「細胞内」パターンとして分類されたが、また別々に分析された（表３）。PrPd堆積物の「星状細胞-関連の」パターンは、星状、脈管周囲、上衣下および軟膜下タイプを含んでいた。というのは、それらの全てが、神経膠細胞プロセスに関連するからである（最後の３つは、いわゆる「神経膠境界(glia limitans)に対応する；ジェフリー(Jeffrey)ら、1990年、J. Comp. Pathology, 103, 23-35）。それらの位置および地域的な関連に基づいて、細かい粒子および融合の堆積物は、電子顕微鏡での研究はそれらの細胞外位置を示したので（ジェフリー(Jeffrey)ら、1994年、Neuroscience Letters, 174, 39-42）、線状およびニューロン周囲のPrPd堆積物と共に「神経網」PrPdパターンと分類された。最後に、脈管周囲または壁内のPrPdプラークは、「脈管」パターンとして一緒に考えられた。
【００８２】
異なる群の羊におけるこれらのPrPdパターンの蓄積の大きさは表６ならびに図8bおよび8cに見られ、なされた比較において見出された差異の有意性は、表７に示されている。各群の個々の羊間のPrPdプロファイルの一致は、図9a、9bおよび9cに与えられる。大いに一致するPrPdプロファイルは、血統または遺伝子型とは独立して、SSBP/1スクラピー源を実験的に投与された動物で観察された（図9a）。より個別の変動が、自然感染した羊の群内で、特にVRQ/VRQウェルシュマウンテン羊およびVRQ/ARQシェトランド羊の群において見出された（図9bおよび9c）。しかしながら、この最後においては、特定のPrPdプロファイルについての傾向が、５匹の羊が試験された群れで見出された。
【００８３】
同じ遺伝子型を有し、同じ経路および同じスクラピー源での投与によって接種された２つの羊群、すなわちSSBP/1感染VRQ/ARQのポールドーセット羊およびチェビオット羊を比較することによって、血統の効果を試験した。細胞内堆積物が著しく優勢である（図8a）、両群のPrPdプロファイルは同じであったが、大きさの差異が有意であった（p＜0.05）。これらの差異は、ニューロン内および神経膠内のPrPdについて維持され（図8b）、全PrPd形態において見出された有意の差異の原因であった。
【００８４】
同じスクラピー株に感染した同じ血統の動物、すなわち実験的に感染させたチェビオット羊の３つの群を比較することによって、遺伝子型の効果を評価した。３つの群は全て、細胞内堆積物が著しく優勢で、脈管PrPdプラークが全部不在である（図8a）、同じPrPdプロファイルを有していた。見出された唯一の差異は、PrPdの神経膠内蓄積にあり、これは、VRQ/ARQおよびVRQ/ARR羊におけるより、VRQ/VRQ羊において有意に低かった（p＜0.05）（表７、図8b）。
【００８５】
天然スクラピー源をSSBP/1源と比較したとき、大きな差が見出された。同じ遺伝子型のSSBP/1感染したVRQ/ARQチェビオット羊と自然感染したシェトランド羊との間には、細胞内（ニューロン内および神経膠内の両方）ならびに星状細胞関連のPrPdパターンについて差異が統計的に有意であり、神経網PrPdパターンについてはほとんど有意（p=0.06）であった（表７、図8a）。しかしながら、２つの群間ではPrPdプロファイルが著しく異なっていたので、全PrPd蓄積の大きさの差異は見出されなかった。別の比較では、VRQ/VRQウェルシュマウンテン羊は、同じ遺伝子型のSSBP/1攻撃されたチェビオット羊と、その神経網および星状細胞関連のPrPdパターンにおいて異なっていた（表７、図8a）。
【００８６】
３つの群の自然感染した羊を比較したときには、細胞内PrPd（ニューロン内または神経膠内）の量に差異は見出されなかった。脈管PrPdプラークの大きさは、ウェルシュマウンテン羊においては他の２つの群より有意に（p＜0.001）大きかったが、ARQ/ARQサフォーク羊は、他の２つの群より大きい量の神経網（p＜0.05）および星状細胞関連（p＜0.01）のPrPdパターンを示した。
【００８７】
【表７】
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【００８８】
表５：研究に使用した羊。遺伝子型は、２つの対立遺伝子についてコドン136、154および171での多型性を示す（V=バリン、R=アルギニン、A=アラニン、Q=グルタミン）。齢は月齢であり、平均値として表す（最小-最大）。Dpi：接種後の日数であり、平均として表す（最小-最大）。
【００８９】
【表８】
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【００９０】
表６：異なる羊群間に見出されるPrPdタイプ（４つの種類に分類し、および合計）の強度。結果は、平均±標準偏差として表した。羊群の同定については、表１に言及し、図3aに対する図形的な表示および統計上の分析については表３に言及せよ。
【００９１】
【表９】
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【００９２】
表７：スクラピー感染した羊の脳に蓄積した、異なるPrPdタイプ（ニューロン内および神経膠内）、パターン（細胞内、星状細胞関連、神経網および脈管）ならびに合計のPrPdの大きさにおける差異の統計上の分析 。羊群の同定については、表１に言及せよ。*：p＜0.05の差異；**：p＜0.01の差異；***：p＜0.001の差異；ns：有意の差異なし；ND：１つの群または両群の平均値がゼロであったので、t試験を行なわなかった。
【００９３】
ファン  コイレン(van Keulen)ら(1995)による報告においては、同一タイプでないなら非常に類似の、星状として本明明細書に記載した、同じ神経解剖学的局在化を有するものが記載されている。しかしながら、二重免疫染色切片における神経膠小繊維酸タンパク質についての標識化が負であったので、これらの著者は、感染した細胞を星状細胞として同定しなかった。それに対して、これらの結果から、このタイプは、形態学（分岐した星状突起）および局所解剖学（灰白質）に基づいて、原形質性星状細胞の突起の周囲のPrPd堆積物を反映することが明らかである。したがってこのタイプは、他の３つの神経膠限界(glia limitans)タイプ（脈管周囲、上衣下および軟膜下）と共に分類された。本発明者らの融合タイプは、ライダー(Ryder)ら(2001)により記載された「コケ様の」堆積物に関連しているかどうかがまた不明である。というのは、両者は少なくとも閂で神経解剖学的な位置を分かつようであるが、これらはニューロンに集中しているようであり、それに対して本発明者らのものは神経網に局在化しているからである。
【００９４】
PrPd蓄積および臨床疾患
幾つかの研究は、疾患の原因であるのはPrPdの蓄積であることを示した（デアーモンド(DeArmond)およびアイアンサイド(Ironside)、1999年）。本発明者らの結果は、すべてのPrPd蓄積がスクラピーの臨床的兆候と関連するわけではないことを示唆する。というのは、脈管プラーク、星状細胞関連堆積物および神経網のPrPd蓄積が、幾らかの感染動物において、または群においてさえ、特にSSBP/1感染した羊の群においてさえ、不在であるか、または非常に低かったからである。細胞内PrPd堆積物、特にニューロン内タイプは、研究された異なる群間で、より一致する大きさを示し（図8aおよび8b参照）、したがって、臨床疾患の発生に対して最も有意のPrPd蓄積タイプであり得た。
【００９５】
自然感染したシェトランド羊の群においては、７匹の動物が0.5より下の細胞内PrPd評点を有し（図9c）、そのうちの３匹は、0.45より下（データは示さず）のニューロン内PrPd評点を有し、全PrPd評点がまた0.45より下であるのに対応していた。また、ウェルシュマウンテン羊の2/7は、0.5より下の細胞内PrPd評点を有し（図4b）、ニューロン内および全PrPd評点の両方において0.45より下であった（データは示さず）。これは、低いニューロン内および全PrPd蓄積を有するこれらの動物が、異なる競合する疾患の兆候を示すスクラピーの無症状のケースであったという可能性を高める。自然条件下でのスクラピーの診断はしばしば困難であり、飼育者の観察に影響されるかまたは依存する場合には特にそうであり、したがって、PrPdプロファイルおよびPrPd蓄積の大きさにおける動物間の幾らかの変動は、診断基準における不一致をもたらし得る。この欠点は、１つ以上の保有地から来ているケースである、この研究のシェトランド羊において最も大きい影響があった。
【００９６】
血統、遺伝子型およびスクラピー源の比較
同じ実験的スクラピー源を用いて同じ経路で感染させたポールドーセットVRQ/ARQ（群１）および同じ遺伝子型のチェビオット（群２）を比較するとき、結果は、PrPdプロファイルにおいて羊の血統の効果を示さない。しかしながら、細胞内および全PrPd堆積物の強度に有意の差異があったが、他の３つのパターンにはなかった。脳におけるPrPd蓄積への羊遺伝子型の効果の評価は、３つの異なる遺伝子型（VRQ/ARQ、VRQ/ARRおよびVRQ/VRQ；それぞれ群２、３および４）のSSBP/1感染チェビオットを比較することによって達成された。有意であるが小さい差異が、神経膠内PrPd蓄積の量に見出された（VV136遺伝子型の動物においてより低かった）が、PrPdプロファイルまたは全PrPd蓄積における差異は見出されなかった。
【００９７】
脳におけるPrPd堆積物のプロファイルに影響を及ぼさないのなら、何が血統およびPrP遺伝子型の効果であり得るのか？ポールドーセット羊の脳に蓄積されたより低いPrPdの量は、同じか非常に類似の遺伝子型のチェビオット羊（群２および３、両方コドン136でVA、表１参照）よりも短いこの血統における潜伏期間に対応する。しかしながら、VRQ/VRQチェビオット羊における潜伏期間はすべてのSSBP/1接種羊のうちの最短であり、なおそれらは、ポールドーセット羊より大きい脳におけるPrPd蓄積を示した。臨床疾患進行中匹敵する時点で全ての羊を殺したと仮定するなら、PrP遺伝子型は（少なくともコドン136で）脳におけるPrPd蓄積の迅速性に影響を与え、故にVRQ/VRQチェビオット羊のより短い潜伏期間に影響を与えるという仮説が立てられる。それに対して、PrP遺伝子型以外の血統の要素は潜伏期間および臨床的兆候に影響を及ぼし得ることがまた可能であり、よって、他に対して、幾つかの血統における神経退化を引き起こすためにより低いPrPd量の堆積が必要とされ得る。このことは、同じ遺伝子型のより長い潜伏期間のチェビオット羊における同じ感染と比べたときに、より少ない量のPrPdが、短い潜伏期間のポールドーセット羊において見出されたことを説明することができた。
【００９８】
SSBP/1感染羊の実験からの主な結論は、同じ株による感染は、大きさにわずかの差異があるだけで、非常に一致したPrPd堆積プロファイルを生じることである。SSBP/1が羊スクラピー脳のプールであり、それから異なるネズミ分離物（最も典型的には22A、79Aおよび139A）が、羊における継代およびマウスにおけるクローニングによって同定された（ディッキンソン(Dickinson)、1976年）ので、これはおそらく驚くべきことである。SSBP/1羊脳において得られたPrPdパターンの一致は、1) SSBP/1プールにおいて安定な平衡として多数株が存在するため、または2)プール内の単一株が優勢な病因効果を発揮するためであり得る。あるいは、そしておそらく最ももっともらしくは、SSBP/1誘導ネズミ分離物は、変異または種間継代後に生じ得る。
【００９９】
スクラピー源のPrPdプロファイルへの効果は、自然感染した羊が比較されるときにより明らかになる。ウェルシュマウンテン羊における脳血管性PrPdプラークの一致した検出は明らかに、単にPrP遺伝子型の差異を反映しているだけではありえない。というのは、それらは、プラークが不在のSSBP/1感染VRQ/VRQチェビオット羊と同じ遺伝子型を有していたからである。これらのプラークはまた、血統の効果であるとは思われない。というのは、SSBP/1感染したポールドーセット羊がSSBP/1感染したチェビオット羊と比較されたときに、PrPdプロファイルへの血統の効果は見出されなかったからである。その上、天然の羊スクラピーについての先の研究は、血統と脳における脳血管性アミロイドプラークの存在との間にいかなる関係をも見出さなかった（ギルモア(Gilmour)ら、1985年）。したがって、このPrPdタイプ／パターンは、特定のスクラピー株の特性、ネズミスクラピーにおける発見と一致する概念を反映すると思われる（ブルース(Bruce)ら、1976年、1989年）。
【０１００】
星状細胞関連または神経網PrPdの一致する優勢および脈管プラークのほとんど完全な欠如を伴う、自然に感染したARQ/ARQサフォーク羊にみられるPrPdプロファイルは、自然感染したウェルシュマウンテン羊とは異なっていた。それだけでは、多くの要素を考慮することができるので、これらの差異を解釈するのは困難である。しかしながら、血統および遺伝子型の効果が、すでに記載した比較から除外されるなら、PrPdプロファイルにおける差異は主として、スクラピー株の特性によって誘導されそうに思われる。
【０１０１】
自然感染したVRQ/ARQシェトランド羊の群は、出自の群れの多様性によって説明することができる何かである、全てのうちで最も異種の個体を含んでいた。群として、そのPrPdプロファイルは、SSBP/1感染羊およびウェルシュマウンテン羊のものとは著しく異なっていた。上記した推論の後に、これらの差異はおそらく株の多様性に由来する。そのPrPdプロファイルはサフォーク羊に非常に類似であったけれど、PrPd堆積物（星状細胞関連、神経網および合計）の大きさはより低く、疾患の結果のより高い平均齢（47対24ヶ月、表１参照）と一致した。両群は感染時に類似の齢だと仮定すると、実験的に感染させた群について表された仮説に従って、遺伝子型（この場合はVRQ/ARQ対ARQ/ARQ）が脳におけるPrPdの蓄積の迅速性に影響を及ぼし、かくして、潜伏期間に影響を及ぼすと思われる。
【０１０２】
結論として、この実施例は、異なるPrPdパターンおよびタイプの組合せとして定義された、脳におけるPrPd堆積のプロファイルは、羊におけるスクラピー株に特有であることを確認する。それ自体、実施例１に報告した免疫組織化学的技術は、一定範囲のTSE株間での識別に有効であることを示唆する。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】図１は、３つの抗体で標識された、スクラピーまたはBSEに感染した羊からの咽頭後方リンパ節の比較を示す。群１のBSE剤感染したロムニー(Romney)羊(a-c)から採取した同じ二次小胞の連続切片および、同様に、抗体R486(d)、L42(e)および521.7(f)で標識したスクラピー感染したサフォーク(Suffolk)羊(d-f)の同じ二次小胞からの連続切片。後者の羊には、印を付けたFDCタイプの標識化での明帯域の標識化ならびにまた、明帯域、暗帯域および小胞被膜に位置する個々の細胞(TBM)に関連する強い顆粒状標識化がある。BSE剤感染した羊からの小胞には、R486(a)およびL42(b)での同様のパターンがあるが、521.7抗体では、TBM標識化(c)の証拠がないかほとんどない穏やかなFDCタイプのパターンがほとんど独占的にある。a〜f  x120；
【０１０４】
【図２】図２は、攻撃後10ヶ月で殺した群２の羊の咽頭後方リンパ節からの二次リンパ性小胞の連続切片を示す。抗体R486を用いると、TBM位置と一致した免疫標識化の広範な焦点的に強い顆粒状パターンがある。しかしながら、FDC (a)の有意の免疫標識化はない。521.7で処理した連続切片においては、不確定の細胞パターン(b)のまばらな標識化しかない。a〜ｂ  x250
【０１０５】
【図３】図３は、BSEもしくはスクラピー剤に感染させ、抗体R145で処理した羊からの脳の比較を示す。切片は、群１および群４からの臨床的に感染された羊の閂での舌下およびオリーブ状核による。BSE剤に感染させた羊の舌下(a)およびオリーブ状(b)核に、ニューロンの強い顆粒状細胞質内標識化があることに注意せよ。比較によって、スクラピーに感染した羊(c,d)からの同じ核には、弱い細胞質内ニューロン内標識化しか存在しないことに注意せよ。a  x220；  b  x280；  c  x230；  d  x190cおよび  x250
【０１０６】
【図４】図４は、BSE剤もしくはスクラピー剤に感染させ、抗体BG4で処理した羊からの脳の切片の比較を示す。BSEに感染した羊（群１）からの三叉神経(a)の脊髄路核による切片において、強い標識化の粗い粒子および星状のパターンがあることに注意せよ。それに対して、スクラピーの脳（群６）の同じ領域における標識化の量は、この抗体で標識化されるとき著しく少ない(b)。  a〜b  x100；および
【０１０７】
【図５】図５は、BSEもしくはスクラピーに感染させ、抗体R145および521.7で処理した羊からの脳の切片における神経膠細胞の標識化の比較を示す。  密集した顆粒状の標識化は、細胞核に隣接して見ることができ、スクラピーに感染した（群８の）羊における星状細胞および小神経膠細胞（矢印a,b）のものと形態学的に一致する。aおよびbは、それぞれR145および521.7抗体で処理したオリ−ブ状核による隣接切片である。同様の標識化は、R145抗体に感染させた羊において見られた。抗体521.7は（FH11およびBG4を用いたように）、神経膠内顆粒を標識しなかった(d)。a,b  x750；  c,d  x350
【０１０８】
【図６ａ】図6a：ニューロン内タイプ：赤核のニューロンの細胞質におけるPrPdの顆粒状堆積物の蓄積。VRQ/ARQシェトランド羊。R-486抗体でのABCイムノペルオキシダーゼおよびヘマトキシリン対比染色x2160。
【０１０９】
【図６ｂ】図6b：神経膠内タイプ：小脳白質中の神経膠細胞の細胞質におけるPrPdの粗い顆粒状堆積物の蓄積。SSBP/1-投与したVRQ/ARQチェビオット(Cheviot)羊。R-486抗体でのABCイムノペルオキシダーゼおよびヘマトキシリン対比染色x2160。
【０１１０】
【図６ｃ】図6c：星状タイプ：小脳皮質における星状細胞の突起でのPrPdの分岐堆積物。ARQ/ARQサフォーク羊。R-486抗体でのABCイムノペルオキシダーゼおよびヘマトキシリン対比染色x2160。
【０１１１】
【図６ｄ】図6d：軟膜下タイプ：大脳皮質における軟膜下のPrPdの連続したゆるい網状組織(loose mesh)。VRQ/ARQシェトランド羊。一致した星状タイプに注意。R-486抗体でのABCイムノペルオキシダーゼおよびヘマトキシリン対比染色x1080。
【０１１２】
【図６ｅ】図6e脈管周囲タイプ：大脳白質における血管の周りの濃く強く標識化されたPrPd蓄積。ARQ/ARQサフォーク羊。R-486抗体でのABCイムノペルオキシダーゼおよびヘマトキシリン対比染色x2160。
【０１１３】
【図６ｆ】図6f：上衣下タイプ：線条のレベルでの側脳室の上衣下のPrPdの連続的な強く標識された網状組織。ARQ /ARQサフォーク羊。R-486抗体でのABCイムノペルオキシダーゼおよびヘマトキシリン対比染色x2160。
【０１１４】
【図６ｇ】図6g：線状タイプ：閂のレベルでの神経網におけるPrPdの濃い糸状の堆積物。VRQ/ARQシェトランド羊。R-486抗体でのABCイムノペルオキシダーゼおよびヘマトキシリン対比染色x2160。
【０１１５】
【図６ｈ】図6h：細かい斑点タイプ：吻髄質延髄のレベルでの神経網における粉末状の拡散PrPd蓄積。VRQ/ARRチェビオット(Cheviot)羊。R-486抗体でのABCイムノペルオキシダーゼおよびヘマトキシリン対比染色x2160。
【０１１６】
【図６ｉ】図6i：粗い粒子タイプ：中脳のレベルでの神経網におけるPrPdの不規則な顕著な堆積物。ARQ /ARQサフォーク羊。R-486抗体でのABCイムノペルオキシダーゼおよびヘマトキシリン対比染色x2160。
【０１１７】
【図６ｊ】図6j：融合タイプ：閂のレベルでの神経網におけるPrPdの無定形の強く標識化された塊。粗い粒子状堆積物との一致に注意。VRQ/ARQシェトランド羊。R-486抗体でのABCイムノペルオキシダーゼおよびヘマトキシリン対比染色x2160。
【０１１８】
【図６ｋ】図6k：ニューロン周囲タイプ：小脳の室頂核におけるニューロンの細胞膜周囲のPrPdの薄い堆積物。ARQ /ARQサフォーク羊。R-486抗体でのABCイムノペルオキシダーゼおよびヘマトキシリン対比染色x2160。
【０１１９】
【図６ｌ】図6l：血管プラーク：小脳皮質における血管周囲のPrPdの放射状の小繊維状蓄積。壁内堆積物にまた注意。VRQ/VRQウェルシュマウンテン(Welsh Mountain)羊。R-486抗体でのABCイムノペルオキシダーゼおよびヘマトキシリン対比染色x2160。
【０１２０】
【図７】図７：研究下の異なる羊群における球形のPrPds蓄積の大きさ。1：SSBP1-感染したポール  ドーセット(Poll Dorset) VRQ/ARQ；2：SSBP1-感染したチェビオットVRQ/ARQ；3：SSBP1-感染したチェビオットVRQ/ARR；4：SSBP1-感染したチェビオットVRQ/VRQ；5：自然に感染したウェルシュマウンテンVRQ/VRQ；6：自然に感染したシェトランド-チェビオットVRQ/ARQ；7：自然に感染したサフォークARQ /ARQ。棒は平均値を意味し、線は標準偏差を意味する。
【０１２１】
【図８ａ】図8a：（表６に言及する群の同定のために）研究した異なる羊群のPrPdプロファイル。(a)：細胞内PrPd。(b)：星状細胞-関連のPrPd。(c)：神経網PrPd。(d)：脈管PrPd。
【０１２２】
【図８ｂ】図8b：（表６に言及する群の同定のために）研究した異なる羊群の細胞内PrPdプロファイル。(a)：ニューロン内PrPd。(b)：神経膠内PrPd。
【０１２３】
【図９ａ】図9a：スクラピーのSSBP1株を投与した個々の羊（群１〜群４）のPrPdプロファイル。(a)：細胞内PrPd。(b)：星状細胞-関連のPrPd。(c)：神経網PrPd。
【０１２４】
【図９ｂ】図9b：自然に感染した個々の羊（群５〜群７、それぞれ１つの群れ）のPrPdプロファイル。(a)：細胞内PrPd。(b)：星状細胞-関連のPrPd。(c)：神経網PrPd。(d)：脈管PrPd。
【０１２５】
【図９ｃ】図9c：自然に感染した個々の羊（群６、点線により分離された５つの異なる群れ）のPrPdプロファイル。(a)：細胞内PrPd。(b)：星状細胞-関連のPrPd。(c)：神経網PrPd。(d)：脈管PrPd。
【０１２６】
【図１０】図10は、羊およびウシのPrPタンパク質配列間の比較（最も共通の対立遺伝子）を示す。
【０１２７】
【図１１】図11は、羊の配列において見出された対立遺伝子変異体をまとめており、ここでは、最も共通の「野生型」が太線タイプで示される。
【図２】
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【図４】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004534945.tif 000071
【国際調査報告】
2004534945.tif 000072
2004534945.tif 000073
2004534945.tif 000074