(57)【要約】本発明は、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子、および、そのオリゴヌクレオチドを提供する。該単離核酸分子を適切な細菌細胞中で発現させて２−ＫＬＧの産生を向上することができ、２−ＫＬＧは続いてアスコルビン酸へ変換可能である。さらに、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有する単離ポリペプチド、その免疫原性ペプチド、および、これらに特異的な抗体も提供する。本発明はまた、新規な２，５−ＤＫＧパーミアーゼの同定方法も提供する。
2004514421.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子。
【請求項２】
配列番号１、３、５、７、９および１１からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項３】
配列番号１、３、５、７、９および１１からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項４】
配列番号１、３、５、７、９および１１からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項５】
配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項６】
配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項７】
配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項８】
配列番号２、４、６、８、１０および１２のいずれかの少なくとも１０個の連続したアミノ酸を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項９】
配列番号４、８および１２のいずれか少なくとも２つの少なくとも１０個の連続したアミノ酸を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項１０】
配列番号２、６および１０のいずれか少なくとも２つの少なくとも１０個の連続したアミノ酸を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項１１】
遺伝子発現プロモーターに機能し得る形で連結された、請求項１記載の単離核酸分子。
【請求項１２】
前記プロモーターがｌａｃプロモーターである、請求項１１記載の単離核酸分子。
【請求項１３】
請求項１１記載の単離核酸分子を含むベクター。
【請求項１４】
スペクチノマイシン耐性遺伝子を含む、請求項１３記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１３記載のベクターを含む細菌細胞。
【請求項１６】
前記単離核酸分子が、配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１５記載の細菌細胞。
【請求項１７】
前記アミノ酸配列が配列番号８に対して少なくとも９５％同一である、請求項１６記載の細菌細胞。
【請求項１８】
配列番号４に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子をさらに含む、請求項１７記載の細菌細胞。
【請求項１９】
配列番号１０に対して少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子をさらに含む、請求項１７記載の細菌細胞。
【請求項２０】
Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属菌である、請求項１５記載の細菌細胞。
【請求項２１】
内在性２，５−ＤＫＧ活性を欠損している、請求項１５記載の細菌細胞。
【請求項２２】
配列番号１４に対して少なくとも８０％の同一性と２−ケトレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を含む、請求項２１記載の細菌細胞。
【請求項２３】
配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性と５−ケトレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を含む、請求項２１記載の細菌細胞。
【請求項２４】
Ｐａｎｔｏｅａ属菌である、請求項１５記載の細菌細胞。
【請求項２５】
２，５−ＤＫＧの２−ＫＬＧへの変換を触媒する酵素を発現する、請求項１５記載の細菌細胞。
【請求項２６】
グルコースの２，５−ＤＫＧへの変換を触媒する酵素を発現する、請求項２５記載の細菌細胞。
【請求項２７】
内在性２−ケト−レダクターゼ活性を欠損している、請求項２６記載の細菌細胞。
【請求項２８】
配列番号１、３、５、７および９からなる群より選択されるヌクレオチド配列の少なくとも２０個の連続したヌクレオチドを含む、単離オリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
配列番号１、３、５、７および９からなる群より選択されるヌクレオチド配列の少なくとも５０個の連続したヌクレオチドを含む、請求項２８記載の単離オリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
配列番号２、４、６、８および１０からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも１０個の連続したアミノ酸を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離オリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
請求項１記載の単離核酸分子の作製方法であって、内在性２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を欠損した細菌細胞へ１以上の発現可能な核酸分子を導入し、導入後に２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有する細胞を同定し、導入した核酸分子を該細胞から単離する、ことを含む前記方法。
【請求項３２】
前記１以上の単離核酸分子がゲノムＤＮＡライブラリーである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記ゲノムＤＮＡライブラリーが環境サンプルから調製されたものである、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記細菌細胞が、ｙｉａＸ２を欠損したＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａである、請求項３１記載の方法。
【請求項３５】
前記細菌細胞が、配列番号１４に対して少なくとも８０％の同一性と２−ケトレダクターゼ活性を有するポリペプチドと、配列番号１６に対して少なくとも８０％の同一性と５−ケトレダクターゼ活性を有するポリペプチドとをコードする単離核酸分子を含む、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
２−ＫＬＧの産生を向上させるための請求項１記載の単離核酸分子の使用方法であって、該核酸分子によってコードされているポリペプチドを、２，５−ＤＫＧの２−ＫＬＧへの変換を触媒する酵素を発現する細菌細胞中で発現させる、ことを含む前記方法。
【請求項３７】
前記細菌細胞が、グルコースの２，５−ＤＫＧへの変換を触媒する酵素をさらに発現する、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
前記細菌細胞が、内在性２−ケトレダクターゼ活性を欠損している、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記細菌細胞がＰａｎｔｏｅａ属菌である、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
前記２−ＫＬＧをアスコルビン酸へ変換することをさらに含む、請求項３６記載の方法。
【請求項４１】
２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有する単離ポリペプチド。
【請求項４２】
配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４１記載の単離ポリペプチド。
【請求項４３】
配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４１記載の単離ポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４１記載の単離ポリペプチド。
【請求項４５】
配列番号２、４、６、８、１０および１２のいずれかの少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含む、請求項４１記載の単離ポリペプチド。
【請求項４６】
配列番号２、４、６、８および１０のいずれかの少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含む単離ペプチドであって、免疫原性である前記ペプチド。
【請求項４７】
請求項４４記載の単離ポリペプチドに特異的な抗体。
【請求項４８】
請求項４６記載の単離ペプチドに特異的な抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、協同契約７０ＮＡＮＢ５Ｈ１１３８およびＡＴＰ ＮＩＳＴプロジェクト識別番号１９９５−０５−０００７Ｅのもと、米国政府の一部支援によってなされたものである。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般には微生物輸送体タンパク質に関し、より詳細には新規な２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸（２，５−ＤＫＧ）パーミアーゼに関する。
背景情報
アスコルビン酸（即ち、ビタミンＣ）を適切に摂取することは、健康を維持する上で重要な要因であると認識されている。アスコルビン酸を確実に適切量摂取できるよう、現在、化学合成物が多くの食品、飲料および化粧品に添加されており、また、直接的なビタミンサプリメントとしても販売されている。アスコルビン酸に対する商業上の要求を満たすため、より効率的な製造方法の開発が求められている。
【０００２】
アスコルビン酸を製造する代替法はいくつか存在するものの、最も費用がかからず、かつ、最も環境にやさしいと思われる方法の１つは生物発酵である。安価な糖質源（例えば、Ｄ−グルコース）を安定なアスコルビン酸前駆体である２−ケト−Ｌ−グルコン酸（２−ＫＬＧ）へ段階的に変換するのに必要な酵素を全て発現するように細菌株を操作することは、現在既に行われている（米国特許第５，０３２，５１４号およびその引用文献を参照されたい）。２−ＫＬＧは、化学的または酵素的手法によってアスコルビン酸へ容易に変換することができる。
【０００３】
図２は、Ｄ−グルコースが２−ＫＬＧへ生物変換される際に生じる酵素反応の概略を示したものである。図２に示すように、Ｄ−グルコースからＤ−グルコン酸、２−ケト−Ｄ−グルコン酸（２−ＫＤＧ）、２，５−ジケト−Ｄ−グルコン酸（２，５−ＤＫＧ）を誘導する酵素反応は、細菌細胞の表面で生じる。その後２，５−ＤＫＧは、２−ＫＬＧへ酵素変換されるべく細胞内部へ移動しなければならない。
【０００４】
２−ＫＬＧの産生に関与する酵素反応の効率を上げるために多くの努力が展開されてきた。例えば、米国特許第５，０３２，５１４号には、２−ＫＬＧ以外の生成物への２，５−ＤＫＧの代謝変換を減らすことにより２−ＫＬＧの産生を向上させる方法が記載されている。
【０００５】
生物発酵に適した細菌株による２，５−ＤＫＧの取込みを増加させれば、２−ＫＬＧの産生を向上する上で有利であり得た。内在性２，５−ＤＫＧパーミアーゼのコピーをさらに発現させたり、優れた特性を有する外来性２，５−ＤＫＧパーミアーゼを発現させれば、２，５−ＤＫＧの取込みを増加させることができた。しかしながら、現在までのところ、このような方法に利用し得る２，５−ＤＫＧパーミアーゼは同定も特性決定もされていない。
【０００６】
従って、２，５−ＤＫＧパーミアーゼをコードする核酸分子を同定および特性決定し、有利な特性を有するパーミアーゼをアスコルビン酸の商業生産または他の重要な用途に使用できるようにすることが求められている。本発明は、この要望に応えるものであり、これに関連する利点を提供するものでもある。
発明の要旨
本発明は、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供する。実施形態の１つでは、単離核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９および１１からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含有するものである。別の実施形態では、単離核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するものである。
【０００７】
また、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を含有するベクターおよび細胞も提供する。実施形態の１つでは、該細胞はＰａｎｔｏｅａ属およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ属から選択される細菌細胞である。
【０００８】
本発明はまた、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子の同定および単離方法を提供する。また、本発明の核酸分子を適切な細菌細胞において発現させることにより２−ＫＬＧ産生を向上させる方法も提供する。
【０００９】
さらに、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有する単離ポリペプチドおよび該ポリペプチドから誘導される免疫原性ペプチドも提供する。本発明はまた、このようなポリペプチドおよびペプチドに特異的な抗体を提供する。
発明の詳細な説明
本発明は、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする新規な核酸分子、並びに、これに関連する生成物および方法を提供する。本発明の分子は有利には、２−ＫＬＧの生物産生効率を上げるのに用いることができ、従って、アスコルビン酸の商業生産のコストを削減できる。
【００１０】
天然の２，５−ＤＫＧパーミアーゼは、微生物の細胞質膜に局在するポリペプチドであり、市販のトポロジー予測プログラムによって約１０〜１２個の膜貫通ドメインを含有するものと予測されている。膜を貫通する部分の長さは各々約２０アミノ酸長であり、細胞内ループおよび細胞外ループの長さは約２〜約８３アミノ酸長である。通常、５番目および６番目の膜貫通ドメインの膜貫通部分間のループは、それ以外のループよりも大きい。
【００１１】
天然の２，５−ＤＫＧパーミアーゼは典型的には約３５０〜５５０アミノ酸長であり、例えば約４００〜４５０アミノ酸長、特に約４２５〜４４０アミノ酸長である。
６種類の代表的な２，５−ＤＫＧパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列を以下に示す（分子の名称および生物源をカッコ内に示す）：配列番号１（環境源由来のＰＥ１）、配列番号３（環境源由来のＰＥ６）、配列番号５（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＰＫ１）、配列番号７（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ由来のｐｒｍＡ）、配列番号９（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ由来のｐｒｍＢ）および配列番号１１（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＹｉａＸ２）。コードされている対応の２，５−ＤＫＧパーミアーゼのアミノ酸配列を配列番号２（ＰＥ１）、配列番号４（ＰＥ６）、配列番号６（ＰＫ１）、配列番号８（ｐｒｍＡ）、配列番号１０（ｐｒｍＢ）および配列番号１２（ＹｉａＸ２）に示す。
【００１２】
様々な微生物に由来する２，５−ＤＫＧパーミアーゼは、図１に示す６配列間の配列アラインメントから明らかなように、その全長にわたって広範なアミノ酸配列近縁度を示す。図１に示す６種類のパーミアーゼの総同一性は約１７％であり、総類似性は保存的置換を考慮に入れて約４３％である。
【００１３】
それらの予測されるトポロジー類似性および配列類似性に基づいて、本明細書に開示の２，５−ＤＫＧパーミアーゼをさらに２つの構造的ファミリーに分類することができる。ＹｉａＸ２、ＰＥ６およびＰｒｍＡと呼ばれる３種類の２，５−ＤＫＧパーミアーゼは、一方のパーミアーゼファミリーの代表例であり、３配列間のアミノ酸配列アラインメントにおいて約５０％の総同一性を共有する。ＰＫ１、ＰＥ１およびＰｒｍＢと呼ばれる３種類の２，５−ＤＫＧパーミアーゼは、関連する２つ目のパーミアーゼファミリーの代表例であり、３配列間のアミノ酸配列アラインメントにおいて約６０％の総同一性を共有する。
【００１４】
天然の２，５−ＤＫＧパーミアーゼも２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を示す。本明細書中、用語「２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性」とは、ポリペプチドがその本来の向きで細胞膜に発現した場合に、該ポリペプチドが細胞質膜を通して２，５−ＤＫＧを輸送する能力を、関連性のない対照ポリペプチドの場合と比較したものをいう。このような輸送は単方向または双方向のいずれであってもよい。
【００１５】
２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性は様々な方法で測定できる。例えば、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性は、実施例で詳述するように、代謝選択アッセイを利用して測定できる。簡単に言うと、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性をもともと欠損している細菌細胞、または、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を欠損させた細菌細胞のいずれかを、同定または作製する。実施例に記載するように、当該技術分野で公知の方法に従って、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて内在性２，５−ＤＫＧパーミアーゼ遺伝子を１以上欠失させた欠失突然変異体を調製することにより、細菌細胞から内在性２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を欠損させることができる。２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を欠損した細胞に関して使用する場合、用語「欠損」とは、増殖アッセイまたは２，５−ＤＫＧ取込みアッセイのいずれかで評価した際に、ｙｉａＸ２遺伝子を欠失したＫ．ｏｘｙｔｏｃａ株（例えば、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎＯ］）の内在性パーミアーゼ活性に匹敵するか、または、それ以下の内在性２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を意味するものとする。
【００１６】
発現したポリペプチドの２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を測定する代謝選択アッセイにおいて有用な細胞は、さらに、細胞内２，５−ＤＫＧを炭素とエネルギーにもともと変換し得るものであってもよく、また、適切な代謝酵素を組換え発現させることでこのような変換が可能になるものであってもよい。実施例に記載するように、任意の細菌種に由来する２−ケト−レダクターゼ（ｔｋｒ）と５−ケト−レダクターゼ（ｉｄｎＯ）をコードする核酸分子を組み合わせて細胞内で発現させることもでき、これらのレダクターゼによって、２，５−ＤＫＧのグルコン酸への還元を触媒する能力が細胞に付与される。これによりグルコン酸は、細胞増殖を支える炭素・エネルギー源として細胞に利用可能となる。
【００１７】
２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を測定する代謝アッセイに適した細菌細胞の代表例は、図３および後述の実施例に示すＫ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎＯ］株である。この株はｙｉａＸ２ ２，５−ＤＫＧパーミアーゼ遺伝子を欠失しており、同時に、高コピー数プラスミド上にある配列番号１３に記載のｔｋｒ／ｉｄｎＤ／ｉｄｎＯオペロンを組換え操作によって発現する。配列番号１３のうち、ヌクレオチド２９２〜１２３６は２−ケト−レダクダーゼ（ｔｋｒ）（配列番号１４）をコードしており、ヌクレオチド１２５２〜２２８０はイドン酸（ｉｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）デヒドロゲナーゼ（ｉｄｎＤ）（配列番号１５）をコードしており、ヌクレオチド２２９３〜３０４５は５−ケト−レダクターゼ（ｉｄｎＯ）（配列番号１６）をコードしている。あるいは、配列番号１４または１６に記載のアミノ酸配列に改変を含むが、それぞれ２−ケト−レダクターゼ活性または５−ケト−レダクターゼ活性を保持しているポリペプチドをコードする核酸分子を代謝アッセイに用いることもできる。代表的なアミノ酸配列は、配列番号１４または１６に対して、それぞれ少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、好ましくは８０％、９０％、９５％またはそれ以上の同一性を有するものである。
【００１８】
２，５−ＤＫＧパーミアーゼ候補の発現時にこのような細菌細胞が２，５−ＤＫＧを唯一の炭素源として含有する培地上で増殖する能力は、発現したパーミアーゼが２，５−ＤＫＧを細胞内へ輸送する能力を示す尺度となり、従って、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性の尺度となる。配列番号２、４、６、８、１０および１２はいずれも、各パーミアーゼを発現するＫ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎＯ］が２，５−ＤＫＧを唯一の炭素源として増殖し得ることから明らかなように、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有することが判明した。
【００１９】
同様に、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性は、標識または未標識２，５−ＤＫＧの取込みを測定することでも求めることができる。例えば、２，５−ＤＫＧは、蛍光タグまたは放射性タグ等によって検出し得るように標識できる。検出可能なように標識された２，５−ＤＫＧの添加時に２，５−ＤＫＧパーミアーゼ発現細胞または膜小胞が検出標識を取込む能力を、特定の標識に対して特異的な当該技術分野で周知の検出アッセイを用いて測定すればよい。同様に、ＨＰＬＣまたは当該技術分野で公知の他の高感度検出アッセイによって未標識２，５−ＤＫＧの取込みを測定することもできる。このように、２，５−ＤＫＧの取込みはパーミアーゼ活性の尺度となる。配列番号２、４、６、８、１０および１２はいずれも、組換えパーミアーゼを発現する細菌細胞による放射性標識２，５−ＤＫＧの取込みアッセイで測定したところ、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を示した。
【００２０】
さらに、２，５−ＤＫＧを何らかの生成物に変換し得る任意の細胞において、細胞外２，５−ＤＫＧの存在下で該生成物の産生量を測定することにより、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を求めることもできる。例えば、２，５−ＤＫＧレダクターゼをもともと発現する細胞または組換え操作によって発現する細胞において、細胞内２，５−ＤＫＧを２−ＫＬＧへ変換させる。２，５−ＤＫＧパーミアーゼの発現時に、細胞外２，５−ＤＫＧを添加した際の細菌細胞の２−ＫＬＧ産生能を測定すれば、発現したパーミアーゼが２，５−ＤＫＧを細胞内へ輸送する能力を示す尺度となり、従って、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性の尺度となる。細胞内２−ＫＬＧは、例えば、ＨＰＬＣまたは当該技術分野で公知の他の高感度検出法を用いて検出できる。２，５−ＤＫＧの他の代謝産物も、同様の方法によって検出できる。
【００２１】
２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性の測定に様々な代替アッセイが利用できることは明らかである。例えば、酸である２，５−ＤＫＧの膜通過に伴う細胞膜または小胞膜のｐＨ変化を検出してもよい。同様に、細胞外２，５−ＤＫＧの経時減少を測定してもよい。
【００２２】
従って、本明細書に記載の活性アッセイのいずれかを用いることにより、当業者であれば、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドとこのような活性を持たないポリペプチドとを識別することが可能である。
【００２３】
本発明の２，５−ＤＫＧパーミアーゼは、２，５−ＤＫＧを選択的に輸送し得るものである。本明細書中で輸送活性に関して使用する場合には、用語「選択的」とは、２−ＫＬＧよりも２，５−ＤＫＧが優先的に細胞内または細胞外へ輸送されることを意味する。２，５−ＤＫＧを選択的に輸送するパーミアーゼは、２−ＬＫＧを輸送する場合の少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、あるいは１０倍以上の効率で２，５−ＤＫＧを輸送する。２，５−ＤＫＧを選択的に輸送するパーミアーゼは、２−ＫＬＧの細胞内産生を増加させるのが望ましい用途、例えば、アスコルビン酸の商業生産において特に有利である。特に、２，５−ＤＫＧを選択的に輸送するパーミアーゼを用いることにより、パーミアーゼ介在型膜輸送に対する細胞内２−ＫＬＧと細胞外２，５−ＤＫＧとの競合が回避され、細胞内２−ＫＬＧ産生の総効率が上昇する。
【００２４】
２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を測定するための上述のアッセイを、２−ＫＬＧパーミアーゼ活性を同時にまたは別個に測定するよう改変できることは明らかである。例えば、細菌細胞によって細胞内２，５−ＤＫＧまたは２−ＫＬＧのいずれかを炭素とエネルギーに変換し得る代謝アッセイを設計すればよい。このような細胞では、該細胞が２，５−ＤＫＧを唯一の炭素源として増殖する場合の能力と、２−ＫＬＧを唯一の炭素源として増殖する場合の能力とを比較した相対的な能力を、発現したパーミアーゼが２，５−ＤＫＧを選択的に輸送する能力の尺度とする。このようなアッセイを用いたところ、ＹｉａＸ２、ＰＥ１、ＰＥ６、ｐｒｍＡおよびｐｒｍＢと呼ばれる２，５−ＤＫＧパーミアーゼは、２−ＫＬＧの輸送も同時に効率よく触媒したことから、２，５−ＤＫＧに対して非選択的であることが判明した。このことは、これらのパーミアーゼを発現するＫ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎＯ］細胞が２，５−ＤＫＧまたは２−ＫＬＧのいずれを用いても十分に増殖することからも明らかである。これに対し、ＰＫ１は選択的に２，５−ＤＫＧを輸送するものであり、ＰＫ１（配列番号６）を発現するＫ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎＯ］細胞は２，５−ＤＫＧを唯一の炭素源として増殖するものの、２−ＫＬＧでは増殖しない。
【００２５】
本発明は、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、様々な商業および研究用途に適している。例えば、２，５−ＤＫＧの細胞による取込み率を向上させる目的で、本発明の核酸分子の１以上を細菌細胞で発現させることができる。２，５−ＤＫＧの取込みを向上させることには、例えば、２，５−ＤＫＧ自体の商業生産または２，５−ＤＫＧの任意の代謝産物の商業生産において様々な用途がある。例えば、２，５−ＤＫＧの取込みは、アスコルビン酸合成の安定な中間体である２−ＫＬＧの生合成においては律速工程である。従って、２−ＫＬＧを２，５−ＤＫＧパーミアーゼを発現する細菌細胞から取得し、アスコルビン酸へ変換することができる。
【００２６】
さらに、当該技術分野で公知の方法および以下に詳述する方法を用いることにより、本発明の核酸分子を、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ相同体を別種から同定および単離するためのプローブもしくはプライマーとして、または、突然変異体パーミアーゼ産生用の鋳型として使用することもできる。このようなパーミアーゼは、配列番号２、４、６、８、１０および１２として本明細書に開示された２，５−ＤＫＧパーミアーゼに比べて有利な特性、例えば、優れた酵素活性または優れた２，５−ＤＫＧ選択性を有する可能性がある。
【００２７】
実施形態の１つでは、本発明の単離核酸分子は、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ ｙｉａオペロンであるＷＯ００／２２１７０の配列番号１９に記載のヌクレオチド配列内に完全に含まれていなくてもよい。別の実施態様では、本発明の単離核酸分子は、本明細書の配列番号１１に記載のヌクレオチド配列内に完全に含まれていなくてもよい。さらに別の実施形態では、コードされているポリペプチドは、本明細書の配列番号１２に記載のアミノ酸配列内に完全に含まれていなくてもよい。
【００２８】
本明細書中、用語「単離された」とは、自然環境で見られる状態から人為的に分子が改変されていることを意味するものとする。例えば、単離核酸分子は、外来核酸配列に機能し得る形で連結した分子であってよい。単離核酸分子はまた、通常隣接する核酸配列を一部または全て取り除いた分子、例えば、該核酸分子が通常存在するオペロン内にある１以上の他の遺伝子から切り離された分子であってもよい。
【００２９】
特に、配列番号１１に記載のヌクレオチド配列を含有する、または、配列番号１２に記載のｙｉａＸ２ポリペプチドをコードする単離核酸分子については、用語「単離（された）」とは、該核酸分子が、ＷＯ００／２２１７０に記載のＫ．ｏｘｙｔｏｃａ ｙｉａオペロン内に存在する隣接のオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）（例えば、ｌｙｘＫおよびｏｒｆ１と呼ばれるｏｒｆ）のいずれをも含有しないことを意味するものとする。
【００３０】
単離分子とは、あるいはまたはさらに、該分子と本来会合する細胞成分を少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％含まない点において、「実質的に純粋」な分子であるといえる。単離核酸分子は任意の形態をとることができ、例えば、緩衝化溶液、懸濁液、異種細胞、凍結乾燥粉末の形態であってよく、また、固相支持体へ結合させてもよい。
【００３１】
本明細書中、用語「核酸分子」とは、天然または合成起源のポリヌクレオチドのことをいう。核酸分子は、１本鎖または２本鎖ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、センスもしくはアンチセンス鎖のいずれかまたは両鎖を表す。核酸分子は従って、指定された配列、その相補鎖、または、両者に該当し得る。
【００３２】
用語「核酸分子」は、１以上の非天然ヌクレオチド（例えば、塩基、糖もしくはリン酸部分が修飾されたヌクレオチド、または、ホスホチオエート結合等の１以上の非天然結合を有するヌクレオチド）を含有する核酸分子を含むことを意図する。このような修飾は、特にハイブリダイゼーション用途に使用する際の核酸分子の安定性を向上させる上で有利であり得る。
【００３３】
さらに、用語「核酸分子」には、放射性標識、蛍光色素、強磁性物質、発光タグまたは検出可能な結合剤（例えば、ビオチン）等の検出可能な部分を含有するように改変された核酸分子も含まれるものとする。このような部分を含有する核酸分子は、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子の有無または発現を検出するためのプローブとして有用である。
【００３４】
実施形態の１つでは、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９または１１のいずれかのヌクレオチド１〜２０、１〜１００、１０１〜１２０、１０１〜２００、２０１〜２２０、２０１〜３００、３０１〜３２０、３０１〜４００、４０１〜４２０、４０１〜５００、５０１〜５２０、５０１〜６００、６０１〜６２０、６０１〜７００、７０１〜７２０、７０１〜８００、８０１〜８２０、８０１〜９００、９０１〜９２０、９０１〜１０００、１００１〜１０２０、１００１〜１１００、１１０１〜１１２０、１１００〜１２００、１２０１〜１２２０、１２０１〜１３００、１３０１〜１３２０、１３０１〜１４００、１４０１〜１４２０または１４０１〜１５００を含むヌクレオチド配列を含有する。
【００３５】
別の実施形態では、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０または１２のいずれかのアミノ酸１〜１０、１〜５０、５１〜６０、５１〜１００、１０１〜１１０、１０１〜１５０、１５１〜１６０、１５１〜２００、２０１〜２１０、２０１〜２５０、２５１〜２６０、２５１〜３００、３０１〜３１０、３０１〜３５０、３５１〜３６１、３５１〜４００、４０１〜４１０または４０１〜４３９を含むアミノ酸配列をコードする。
【００３６】
実施形態の１つでは、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子は、配列番号１、３、５、７、９または１１に記載の２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子のいずれかに対して少なくとも３５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含有するものである。このような分子は、これらの配列番号のいずれかに対して少なくとも４０％、例えば、少なくとも４５％、５０％、６０％、７０％または８０％の同一性を有するのが好ましく、配列番号１、３、５、７、９または１１に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有するものを含む。
【００３７】
別の実施形態では、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子は、配列番号２、４、６、８、１０または１２に記載の２，５−ＤＫＧパーミアーゼポリペプチドのいずれかに対して少なくとも３５％の同一性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する。コードされているポリペプチドは、これらの配列番号のいずれかに対して少なくとも４０％、例えば、少なくとも４５％、５０％、６０％、７０％、８０％の同一性を有するのが好ましく、配列番号２、４、６、８、１０または１２に対して少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有するものを含む。
【００３８】
本発明の核酸分子またはポリペプチドに対する用語「同一性（％）」とは、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖコンピュータアラインメントとデフォルトパラメータを用いて全配列を比較した場合に、２つの配列のアラインメントをとった部分間で同一なヌクレオチドまたはアミノ酸の残基数を、アラインメントをとった残基の総数に対するパーセントとして表したものとする。ＣＬＵＳＴＡＬ ＶアラインメントはＨｉｇｇｅｎｓ， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２５：３０７−３１８（１９９４）に記載されており、２，５−ＤＫＧパーミアーゼアミノ酸配列の代表的なＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアラインメントを図１に示す。
【００３９】
遺伝子コードの縮重ため、天然型核酸分子のヌクレオチド配列は改変されても依然として同一のまたは実質的に同等のポリペプチドをコードすることができる。従って、配列番号１、３、５、７、９または１１の縮重変異体は、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明の核酸分子の一例である。
【００４０】
さらに、他の微生物種に由来する２，５−ＤＫＧパーミアーゼをコードする核酸分子も、本発明の核酸分子の一例である。少なくとも３種類（おそらく４種類）の異なる微生物種から単離したＹｉａＸ２、ＰＥ１、ＰＥ６、ｐｒｍＡ、ｐｒｍＢおよびＰＫ１と呼ばれる６種類のパーミアーゼは、実質的なヌクレオチド配列同一性を共有している。例えば、開示された２，５−ＤＫＧパーミアーゼヌクレオチド配列のうち類似性の最も高い配列番号５（ＰＫ１）と配列番号１（ＰＥ１）の２配列は、その全長にわたって８６％の同一性を共有している。開示された２，５−ＤＫＧパーミアーゼヌクレオチド配列のうち類似性の最も低い配列番号７（ｐｒｍＡ）と配列番号９（ｐｒｍＢ）の２配列でも、その全長にわたって５１％の同一性を共有している。これに対し、ＧｅｎＢａｎｋの検索からは、開示の２，５−ＤＫＧパーミアーゼヌクレオチド配列のいずれかに対してその全長にわたって実質的な同一性または類似性を示す、輸送体タンパク質および他の膜貫通タンパク質をコードする配列といった他のヌクレオチド配列が存在しないことが分かっている。
【００４１】
本明細書に開示の６種類のパーミアーゼはまた、既述されているように、その全長にわたって実質的なアミノ酸配列同一性も共有している。例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のＰＫ１（配列番号６）と環境源由来のＰＥ１（配列番号２）は、アミノ酸レベルで９３％同一である。２，５−ＤＫＧパーミアーゼと最も密接に関係しているＧｅｎＢａｎｋデータベース中のアミノ酸配列はＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｔｉｓ由来の推定タートレート輸送体であり（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ３２３７５またはＵ２５６３４）、配列番号１２（ＹｉａＸ２）とは３３％同一であるものの、それ以外の開示２，５−ＤＫＧパーミアーゼに対してはさらに低い同一性しか有さない。開示の２，５−ＤＫＧパーミアーゼに対してある程度の同一性を有するＧｅｎＢａｎｋデータベース中の他の配列としては、様々な種に由来する膜輸送体タンパク質、例えば、Ｂ．ｃｅｐａｃｉａ（ＡＦ１５２０９４）およびＰ．ｐｕｔｉｄａ（Ｄ１３２２９）由来のフタレート輸送体タンパク質、Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ（ＡＦ１４４４２２）および大腸菌（Ｚ３７９８０）由来のヒドロキシフェニルアセテート輸送体、並びに、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（ＡＬ１３６５０３およびＡＬ１３２９９１）由来の推定輸送体タンパク質が挙げられる（いずれも、指定の配列番号に対してアミノ酸レベルで約２７％以下の同一性を有する）。
【００４２】
単一種内でも、異なる微生物種間でも、個々の２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子およびコードされているポリペプチドの間に高い同一性があることから、他種に由来する別の２，５−ＤＫＧパーミアーゼを容易に同定および試験することができる。従って、本発明の核酸分子には、任意の微生物種に由来する２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子も含まれる。２，５−ＤＫＧパーミアーゼを含有する微生物は、２，５−ＤＫＧを唯一の炭素源とする増殖を可能にする２，５−ＤＫＧの能動輸送能、または、取込みアッセイにおける２，５−ＤＫＧの摂取能によって識別し得る。このような微生物としては、例えば、古細菌、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌等の細菌、酵母並びに真菌が挙げられる。
【００４３】
２，５−ＤＫＧパーミアーゼを含有する代表的な細菌としてはＰｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａが挙げられ、より詳細には、実施例に記載するような腸内細菌およびシュードモナス菌（例えば、緑膿菌）が挙げられる。代表的な腸内細菌としては、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属由来の種（例えば、配列番号５および１１を取得したＫ．ｏｘｙｔｏｃａ）、並びに、Ｐａｎｔｏｅａ属由来の種（例えば、配列番号７および９を取得したＰ．ｃｉｔｒｅａ、およびＰ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）が挙げられる。このような微生物の供給元としては、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｏｉｎ （ＡＴＣＣ）等の公共の受託機関や販売業者が挙げられる。細菌属の分類および命名が、同一または類似の株が時として異なる名前で文献に報告される程度のものであることは明らかである。例えば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ（ＡＴＣＣ１３１８２等）は一方で、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ａｅｒｏｇｅｎｅｓおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅと記載されていたことがある。同様に、Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ（ＡＴＣＣ２１９９８等）は一方で、Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａおよびＡｃｅｔｏｍｏｎａｓ ａｌｂｏｓｅｓａｍａｅと記載されていたことがある。本明細書中、用語「Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ」および「Ｐａｎｔｏｅａ」は、それぞれＡＴＣＣ１３１８２および２１９９８として寄託された株の属名を表すものとする。
【００４４】
さらに、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子を取得可能な微生物は、環境サンプル中に存在する微生物である。例えば、配列番号１および３に記載の２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子は環境サンプルから取得したものである。本明細書中、用語「環境サンプル」とは、微生物の混合体を通常含有する天然または人工の環境から得られるサンプルをいう。
【００４５】
代表的な環境サンプルは、土壌、砂、淡水または淡水沈渣、海水または海水沈渣、工業廃水、温泉、排熱口等のサンプルである。環境サンプル内には、未同定微生物の他、未培養微生物も存在する可能性がある。本発明の２，５−ＤＫＧパーミアーゼ分子を環境サンプル中に存在する微生物から単離するには、微生物を同定する必要も培養する必要もない。
【００４６】
さらに、本発明の核酸分子には、配列番号２、４、６、８、１０または１２の天然型配列に対して１以上のアミノ酸付加、欠失または置換によって改変されたアミノ酸配列をコードする核酸分子が含まれる。このような改変は、例えば、パーミアーゼの安定性、発現レベル、酵素活性または２，５−ＤＫＧ選択性を向上させる上で有利である。必要であれば、当該技術分野で周知の方法を用い、天然型パーミアーゼ配列の化学的突然変異誘発または指向型（例えば、位置指定）突然変異誘発等によって、このような改変を無作為に行ってもよい。
【００４７】
天然型パーミアーゼアミノ酸配列から改変されたアミノ酸配列には、１以上の保存的アミノ酸置換が含まれていてもよく、例えば、無極性アミノ酸を別の無極性アミノ酸で置換（例えば、ロイシンをイソロイシン、バリン、アラニン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニンもしくはメチオニンで置換）したり、荷電アミノ酸を同様の荷電アミノ酸で置換（例えば、グルタミン酸をアスパラギン酸で置換、または、アルギニンをリシンもしくはヒスチジンで置換）したり、あるいは、非荷電極性アミノ酸を別の非荷電極性アミノ酸で置換（例えば、セリンをグリシン、トレオニン、チロシン、システイン、アスパラギンもしくはグルタミンで置換）してもよい。改変アミノ酸配列には、所望の生物活性に悪影響を及ぼさない限り、１以上の非保存的置換も含まれていてもよい。
【００４８】
当該技術分野で公知のコンピュータプログラムは、どのアミノ酸残基が２，５−ＤＫＧパーミアーゼの酵素活性を損なうことなく置換し得るかを決定する上での指標となり得る（例えば、Ｅｒｏｓｈｋｉｎら、Ｃｏｍｐｕｔ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｓｃｉ． ９：４９１−４９７（１９９３）を参照されたい）。
【００４９】
さらに、機能活性を保持または向上させつつアミノ酸配列を改変する際の指標は、様々な種に由来する相同な２，５−ＤＫＧパーミアーゼポリペプチドのアラインメントをとることにより得られる（図１参照）。進化の過程で保存されたアミノ酸残基およびドメインは、保存度の低い残基およびドメインよりも生物活性を維持する上で重要である可能性が高いことは、当該技術分野では周知である。従って、図１に示す６種類の２，５−ＤＫＧパーミアーゼ間（または、配列番号２、６および１０と配列番号４、８および１２とで規定されるような、パーミアーゼの２つの構造的ファミリーのメンバー間）で高度に保存されている残基を非保存残基で置換することは有害であるのに対し、異なるパーミアーゼ間で大幅に異なる残基について同様の置換を行うことは、生物活性に対して実質的な作用を及ぼさないと予想される。
【００５０】
２，５−ＤＫＧおよび２−ＫＬＧの両者を輸送するＰＥ１（配列番号２）と２，５−ＤＫＧを選択的に輸送するＰＫ１（配列番号６）とのアミノ酸配列の比較より、２，５−ＤＫＧ選択性を担う領域が、これら２つの配列間で異なる７％のアミノ酸内に存在しなければならないことは明らかである。従って、２，５−ＤＫＧパーミアーゼにおけるこれらの異なる残基の全てまたは一部をＰＫ１配列に見られる残基へ改変することで、パーミアーゼの２，５−ＤＫＧ選択性が向上すると期待される。
【００５１】
本明細書に記載の６種類の２，５−ＤＫＧパーミアーゼのアラインメントからは、付加および欠失が許容される可能性のある領域に関する指標も得られる。例えば、ＮおよびＣ末端、並びに、アミノ酸２２５〜２５０（配列番号１２（ｙｉａＸ２）の残基番号に基づく）付近の領域は、配列アラインメントのギャップから分かるように、アミノ酸の挿入および欠失に対して比較的寛容な領域であると思われる。従って、改変型２，５−ＤＫＧパーミアーゼはこのような部位に、エピトープ・タグ、ヒスチジン・タグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等の「タグ」配列、または、ソーティング配列を含むことができる。このような追加の配列を使用すれば、例えば、組換え２，５−ＤＫＧパーミアーゼの精製または特性決定の促進が可能である。
【００５２】
いずれかの特定の核酸分子が本発明の核酸分子であることの確認は、本明細書に記載の１以上の機能アッセイを用いて、コードされているポリペプチドの２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を測定することにより得られることは明らかである。
【００５３】
本発明はさらに、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を、遺伝子発現プロモーターに機能し得る形で連結させたものを提供する。本明細書中、用語「機能し得る形で連結（させた）」とは、核酸分子を内在性プロモーターまたは異種プロモーターのいずれかに対して配置する際に、プロモーターが核酸分子を鋳型としてＲＮＡの転写を指令し得るように配置を行うことを意味するものとする。
【００５４】
核酸を所望のプロモーターに機能し得る形で連結させる方法は当該技術分野では周知であり、例えば、核酸を所望のプロモーターを含有するベクターへクローニングしたり、ＰＣＲを利用してプロモーターを核酸配列へ付加することが挙げられる。ＲＮＡ転写のプロモーターに機能し得る形で連結された核酸分子を使用することにより、２，５−ＤＫＧ転写産物やポリペプチドを所望の宿主細胞またはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写−翻訳系において発現させることができる。
【００５５】
本発明の核酸分子へ機能し得る形で連結させるプロモーターの選択は目的とする用途に依存し、当業者であれば決定できる。例えば、特定の遺伝子産物が特定の宿主細胞にとって有害である可能性のある場合には、本発明の核酸分子を調節性プロモーターに連結して遺伝子発現をオン／オフできるようにするのが望ましい場合がある。当該技術分野で公知の代表的な誘導性プロモーターはｌａｃＰＯプロモーター／オペレーターであり、該プロモーターは、ある種の宿主細胞によってもたらされるｌａｃＩｑ遺伝子産物によって抑制され、０．０１〜１ｍＭのＩＰＴＧが存在すると誘導される（後述の実施例参照）。他の用途に対しては、作用の弱いまたは強い構成的プロモーターが好適な場合がある。
【００５６】
本発明はさらに、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を含有するベクターを提供する。本発明のベクターは一般に、細菌由来の複製起点、１以上の選択マーカー、および１以上の多重クローニング部位等のエレメントを含有するものである。ベクターに組込む特定のエレメントの選択は、目的とする宿主細胞、挿入配列の発現の必要性、ベクターの必要コピー数、必要とされる選択系等の要因に依存する。様々な用途に対して宿主とベクターとの適合性を確実にする要因は、当該技術分野では周知である。
【００５７】
ベクターを使用してコードされているポリペプチドの組換え発現を行う用途では、一般に、単離核酸分子を、ベクターまたは挿入核酸分子中に存在し得る上述のような遺伝子発現プロモーターに機能し得る形で連結させる。しかしながら、クローニングやサブクローニングの用途ではプロモーターエレメントを存在させる必要はない。
【００５８】
クローニング用途および２，５−ＤＫＧパーミアーゼを異なる細菌種にて発現させる用途の双方に適した代表的なベクターは、Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：４６２１（１９９４）に記載の低コピー数プラスミドｐＣＬ１９２０であり、該プラスミドはスペクチノマイシン耐性遺伝子を含有している（後述の実施例参照）。
【００５９】
また、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を含有する細胞も提供する。単離核酸分子は通常、特定の宿主細胞での複製に適合したベクター内に保有される。しかしながら、特定の用途の場合には、核酸分子を細菌ゲノムへ組込むのが好ましい。
【００６０】
本発明の細胞は、２，５−ＤＫＧパーミアーゼが発現されて活性形態へ折りたたまれるのであれば、いずれの細胞であってもよい。適切な宿主細胞を選ぶ際の指標は、他の機能的な１０〜１２回膜貫通輸送体タンパク質を発現する細胞型を同定することで得られる。例えば、１０〜１２回膜貫通輸送体タンパク質は、様々な細菌種の他、酵母（例えば、Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）にも見られる。従って、宿主細胞の特定の用途に応じて、本発明の宿主細胞は細菌細胞、酵母、シロイヌナズナまたはショウジョウバエ細胞であってよい。
【００６１】
好適な実施形態では、細胞は細菌細胞である。細菌細胞の選択は目的とする用途に依存する。例えば、慣用のサブクローニング用途の場合には、細胞は、当該技術分野で周知の方法によって本発明の単離核酸分子やベクターで形質転換可能な、大腸菌等の任意の簡便な細菌実験株であってよい。
【００６２】
コードされている２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を評価する場合には、細胞は代謝アッセイに適した細菌株であればよく、例えば、２，５−ＤＫＧの必須産物への変換を触媒する酵素を内在的に発現する株、または、該酵素を遺伝子操作によって発現する株などである。代謝アッセイに適した代表的な株は、後述の実施例で詳述するＭＧＫ００２［ｐＤＦ３３］と呼ばれるＫ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎＯ］株であり、細胞内２，５−ＤＫＧを、炭素・エネルギー源として利用可能なグルコン酸へ変換する株である。
【００６３】
２，５−ＤＫＧ代謝産物を商業的に生物生産する場合には、細胞は、２，５−ＤＫＧレダクターゼを内在的に発現する細菌株、または、該酵素を遺伝子操作によって発現する細菌株であればよい。米国特許第５，０３２，５１４号に記載されているように、２，５−ＤＫＧレダクターゼは、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、ＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒおよびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ等の属に見られる。従って本発明の細胞は、これらの属のいずれかの細菌細胞、または、これらの属のいずれかの２，５−ＤＫＧレダクターゼを発現するように遺伝子操作した細菌細胞であってよい。
【００６４】
２，５−ＤＫＧ代謝産物を産生可能な細胞は、好ましくは、安価な炭素源（例えば、グルコース）からの２，５−ＤＫＧの細胞外産生も触媒し得るものである。Ｄ−グルコースから２，５−ＤＫＧを生成する代表的な経路は、図２に示すように、Ｄ−グルコースのＤ−グルコン酸への酵素変換（Ｄ−グルコースデヒドロゲナーゼによって触媒）、Ｄ−グルコン酸から２−ケト−Ｄ−グルコン酸への酵素変換（Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼによって触媒）、および２−ケト−Ｄ−グルコン酸から２，５−ＤＫＧへの酵素変換（２−ケト−Ｄ−グルコン酸デヒドロゲナーゼによって触媒）を伴う。これらの工程は、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ、ＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒおよびＥｒｗｉｎｉａ（Ｐａｎｔｏｅａとも称する）といった複数の属の生物によって行うことができる。
【００６５】
Ｄ−グルコースからの２−ＫＬＧの産生に有用な細菌細胞は、ＡＴＣＣ２１９９８ ｐｔｒｐ １−３５ ｔｋｒＡΔ３と呼ばれる米国特許第５，０３２，５１４号に記載のＰａｎｔｏｅａ ａｇｇｏｌｍｅｒａｎｓ株（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａまたはＡｃｅｔｏｍｏｎａｓ ａｌｂｏｓｅｓａｍａｅともいう）、または、この株から得られる特性の向上した誘導株である。遺伝子操作によって付与し得る、この株に対する改良点としては、グルコースを２−ＫＬＧ以外の代謝産物へ転じる酵素を欠失させて２−ＫＬＧの収率を増加させることなどが考えられる。この株に対する他の改良点としては、２−ＫＬＧの回収と精製を向上させる突然変異などが考えられる。
【００６６】
米国特許第５，０３２，５１４号に記載のＰａｎｔｏｅａ株は、組換え操作によりＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来の２，５−ＤＫＧレダクターゼ（米国特許第４，７５７，０１２号に記載）を発現する。該株はさらに、ｔｋｒＡ遺伝子を機能不能にして２−ケトレダクターゼ活性を欠損させる突然変異を有する。ｔｋｒＡ遺伝子の突然変異は、２−ＫＬＧをＬ−イドン酸へ転じる代謝や、２，５−ＤＫＧを２−ＫＬＧから５−ケト−Ｄ−グルコン酸へ転じる代謝を抑える上で有利である。
【００６７】
本発明の２，５−ＤＫＧパーミアーゼの１種以上をこのような細胞中で発現させることにより、Ｄ−グルコースからの２−ＫＬＧの総生産量が顕著に増加し、アスコルビン酸の商業生産のコストが削減される。
【００６８】
本発明の細胞は、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明の単離核酸分子を１、２またはそれ以上含有することができる。例えば、本発明の細胞は、配列番号２、４、６、８、１０または１２のいずれかに対して少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドを少なくとも１つコードする単離核酸分子を含有することができ、場合によっては、このような核酸分子を２つ以上任意に組に合わせて含有することもある。好ましくは、コードされているこのようなポリペプチドの少なくとも１つが、２，５−ＤＫＧを選択的に輸送する。
【００６９】
好適な実施形態では、２−ＫＬＧの生物生産に適した本発明の細菌細胞は、配列番号８に記載の２，５−ＤＫＧ選択的パーミアーゼ（ｐｒｍＡ）に対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を含有し、場合によっては、配列番号４（ＰＥ６）、配列番号１０（ｐｒｍＢ）および配列番号６（ＰＫ１）からなる群より選択される２，５−ＤＫＧパーミアーゼに対して少なくとも９５％の同一性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を少なくとも１つさらに含有するものである。
【００７０】
本発明はまた、２−ＫＬＧの産生を向上させる方法を提供する。該方法は、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子を含有する細菌細胞を、コードされている２，５−ＤＫＧパーミアーゼが発現され、かつ、細胞内２，５−ＤＫＧが２−ＫＬＧに変換される条件下にて培養することからなる。この目的に適した細胞（例えば、米国特許第５，０３２，５１４号に記載のＰａｎｔｏｅａ株）は既に上述した通りである。場合によっては、このようにして産生された２−ＫＬＧを、当該技術分野で公知の方法に従って、化学的にまたは酵素によってアスコルビン酸等の所望の生成物へ変換してもよい。
【００７１】
本発明はさらに、配列番号１、３、５、７、９または１１として参照されるヌクレオチド配列のいずれかに由来する少なくとも１７個の連続したヌクレオチドを含有する単離オリゴヌクレオチド分子を提供する。本明細書中、用語「オリゴヌクレオチド」とは、参照配列に由来する少なくとも１７個の連続したヌクレオチドを含有する核酸分子をいい、必須というわけではないが、機能的なタンパク質をコードしていてもよい。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、参照ヌクレオチド配列に由来する少なくとも１８、１９、２０、２２または２５個の連続したヌクレオチド、例えば、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、４００、５００、７５０、１０００またはそれ以上の連続したヌクレオチドを含有することができ、最大で参照ヌクレオチド配列の完全長までを含有することができる。従って本発明のオリゴヌクレオチドは、配列決定プライマー、ＰＣＲプライマー、ハイブリダイゼーションプローブまたはアンチセンス試薬として有用な十分な長さを有し、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドまたは該ポリペプチドから誘導される免疫原性ペプチドをコードすることもできる。当業者であれば、特定の用途に対して、本発明のオリゴヌクレオチドの適切な長さと配列を決定することが可能である。
【００７２】
細胞またはライブラリーにおける２，５−ＤＫＧ発現の検出といった特定の用途に対しては、２，５−ＤＫＧパーミアーゼをコードする核酸分子に特異的にハイブリダイズする本発明の単離オリゴヌクレオチド分子を使用するのが望ましい。用語「特異的にハイブリダイズする」とは、後述するようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にて、ある核酸分子が、２，５−ＤＫＧパーミアーゼをコードする核酸分子にハイブリダイズするが、同一条件下にて、２，５−ＤＫＧパーミアーゼをコードしない核酸分子（例えば、パーミアーゼ配列に対して同一性を示す短い領域を偶然に含有する関連性のない分子）には実質的な程度までハイブリダイズしないことをいう。従って、「特異的にハイブリダイズする」核酸分子は、十分な長さを有し、かつ、２，５−ＤＫＧパーミアーゼに由来する十分な識別配列を含有するため、２，５−ＤＫＧパーミアーゼの特徴を示すものである。このような分子は、通常、ストリンジェントな条件下にてハイブリダイズし、単一種のｍＲＮＡから調製したノーザンブロットまたはサザンブロットでは１本のバンドとして現れる。
【００７３】
本明細書中、用語「ストリンジェントな条件」とは、５０％ホルムアルデヒド、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳを含有する溶液中、４２℃にて、フィルターに結合させた核酸分子を核酸とハイブリダイズさせ、次いで０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳ中、６５℃にて２回３０分間フィルターを洗浄した場合に相当する条件をいう。上述のストリンジェントな条件に相当する条件は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９２）に記載されている。
【００７４】
配列番号１、３、５、７または９の各々に特徴的なヌクレオチド配列、または、配列番号１、３、５，７、９または１１のうちの２、３またはそれ以上に共通するヌクレオチド配列は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖアラインメントプログラムを用いて配列のアラインメントをとることにより容易に決定できる。有利には、２以上の異なる２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子に共通する領域を含有するオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用し、他種由来の２，５−ＤＫＧパーミアーゼをコードする核酸分子を単離または検出することができる。
【００７５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、必須というわけではないが、２，５−ＤＫＧ活性を有するポリペプチドをコードすることができる。従って、本発明のオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９または１１に記載のヌクレオチド配列の５’もしくは３’非翻訳領域またはその両者に由来する配列、または、コード配列、あるいはその両者を含有することが可能である。用語「核酸分子」について上述したように、本発明のオリゴヌクレオチドは、指定された配列番号のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれから誘導したものであってよい。
【００７６】
有利には、本発明のオリゴヌクレオチドを使用して、アミノ酸付加、欠失または置換を組換え２，５−ＤＫＧパーミアーゼへ組込むこともできる。このような用途では、参照配列に由来する少なくとも１７個の連続した残基を含有する限り、本発明のオリゴヌクレオチドが配列番号２、４、６、８、１０または１２に対して所望のアミノ酸改変をコードするよう、配列番号１、３、５、７、９または１１に対してヌクレオチドを改変し得ることは明らかである。
【００７７】
本発明の代表的なオリゴヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９または１１のいずれかのヌクレオチド１〜２０、１〜１００、１０１〜１２０、１０１〜２００、２０１〜２２０、２０１〜３００、３０１〜３２０、３０１〜４００、４０１〜４２０、４０１〜５００、５０１〜５２０、５０１〜６００、６０１〜６２０、６０１〜７００、７０１〜７２０、７０１〜８００、８０１〜８２０、８０１〜９００、９０１〜９２０、９０１〜１０００、１００１〜１０２０、１００１〜１１００、１１０１〜１１２０、１１００〜１２００、１２０１〜１２２０、１２０１〜１３００、１３０１〜１３２０、１３０１〜１４００、１４０１〜１４２０または１４０１〜１５００より選択される配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【００７８】
本発明はさらに、２，５−ＤＫＧパーミアーゼオリゴヌクレオチドの対を１つの容器または別々の容器のいずれかに包装した状態で含有するキットを提供する。該オリゴヌクレオチドの対は、好ましくは、２，５−ＤＫＧパーミアーゼをコードする核酸分子を検出または増幅するＰＣＲ用途での使用に適したものである。該キットはさらに、ＰＣＲ用途におけるプライマー対の使用説明書、または、このような用途に適した溶液および緩衝液を含有していてもよい。
【００７９】
本発明はさらに、配列番号２、４、６、８、１０または１２からなる群より選択されるアミノ酸のうち少なくとも１０個の連続したアミノ酸を有するペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する単離オリゴヌクレオチドを提供する。このようなオリゴヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０または１２の少なくとも１０、１２、１５、２０、２５またはそれ以上の連続したアミノ酸、例えば、参照配列由来の少なくとも３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００またはそれ以上の連続したアミノ酸をコードし得る。以下に詳述するように、コードされているペプチドは、このようなオリゴヌクレオチドから慣用の方法によって発現可能であり、該ペプチドを使用して２，５−ＤＫＧ抗体を産生、精製または特性決定することもできる。このようなオリゴヌクレオチドによってコードされているペプチドは、必須というわけではないが、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ酵素活性をさらに有していてもよい。
【００８０】
実施形態の１つでは、単離オリゴヌクレオチドは、配列番号２、４、６、８、１０または１２のいずれかのアミノ酸１〜１０、１〜５０、５１〜６０、５１〜１００、１０１〜１１０、１０１〜１５０、１５１〜１６０、１５１〜２００、２０１〜２１０、２０１〜２５０、２５１〜２６０、２５１〜３００、３０１〜３１０、３０１〜３５０、３５１〜３６１、３５１〜４００、４０１〜４１０、４０１〜４３９から選択されるアミノ酸配列をコードするものである。
【００８１】
２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子、並びに、上述の単離オリゴヌクレオチドは、以下、「２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子」と呼ぶことにする。
【００８２】
本発明の単離２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子は、当該技術分野で公知の方法によって調製可能である。どの方法を選択するかは、単離しようとする核酸分子の種類と大きさ、生物学的に活性なポリペプチド（例えば、パーミアーゼ活性もしくは免疫原性を有するポリペプチド）のコードの有無、核酸分子の起源等の要因に依存する。当業者であれば、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子をゲノムＤＮＡもしくはその所望の断片として、完全長ｃＤＮＡもしくはその所望の断片として、または、完全長ｍＲＮＡもしくはその所望の断片として、目的の任意の微生物から単離または調製することができる。
【００８３】
２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子を調製する代表的な方法は、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードおよび発現する組換え構築物を単離することによるものである。実施例に記載するように、有用な方法の１つは、細菌細胞の増殖を２，５−ＤＫＧパーミアーゼの発現に依存させた代謝選択系を提供するものであり、発現可能なＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリー）をアッセイ細胞へ導入し、選択条件下で生存している細胞を選択し、導入したＤＮＡを単離することからなる。あるいは、機能的な２，５−ＤＫＧパーミアーゼを発現した場合にのみ細胞が検出可能なシグナルを発生するようにスクリーニング方法を設計することも可能である。検出可能なシグナルの代表的なものは、２，５−ＤＫＧ上に存在する検出可能な標識を細胞内に取込ませることである。さらに、代謝酵素をコードする核酸分子の同定に適したスクリーニングおよび選択方法は、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ００／２２１７０並びに米国特許第５，９５８，６７２号および同第５，７８３，４３１号に記載されている。
【００８４】
単離２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子を産生するためのさらなる方法は、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ特異的プライマーとポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いた核酸分子の増幅を伴うものである。ＰＣＲを用いることで、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ遺伝子を有する任意の細胞から、任意の所望の範囲を有する２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子を、わずか１コピー程度の遺伝子またはｍＲＮＡから指数関数的に増幅させることが可能である。
【００８５】
開示された６種類の２，５−ＤＫＧパーミアーゼ間で同一性の程度が高いとすれば、当業者であれば、別の２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子の単離に適したプライマーを設計することができる。このようなプライマーは好ましくは、本明細書に開示の２，５−ＤＫＧパーミアーゼの２種以上に存在する短い共通アミノ酸配列をコードする縮重オリゴヌクレオチド、または、該アミノ酸配列に相補的な縮重オリゴヌクレオチドであり、例えば、配列番号２、６および１０のうちの少なくとも２つに存在する１０個以上の連続したアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチド、または、配列番号４、８および１２のうちの少なくとも２つに存在する１０個以上の連続したアミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドである。このような配列は、図１に示すアミノ酸配列のアラインメントから決定できる。配列番号２、６および１０のうちの少なくとも２つに存在する代表的なアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸１９〜３１、１１５〜１２４、１４６〜１５６および３３９〜３４８である。配列番号４、８および１２のうちの少なくとも２つに存在する代表的なアミノ酸配列は、配列番号８のアミノ酸５５〜６４、６０〜６９、２５２〜２６１および３７０〜３７９である。
【００８６】
縮重プライマーを用いて所望の核酸分子を単離する場合のＰＣＲ反応条件を決定または変更する方法は当該技術分野で周知である。続いて、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （２０００）等に記載の当該術分野で周知の手順に従って、増幅産物を配列決定し、ハイブリダイゼーションプローブとして用いて、または、５’もしくは３’ＲＡＣＥに用いて隣接配列を単離することができる。
【００８７】
開示された６種類の２，５−ＤＫＧパーミアーゼ間で配列同一性と構造近縁度が高いとすれば、ハイブリダイゼーションまたは抗体スクリーニングのいずれかによって任意の他種に由来する相同体を容易に同定することができる。例えば、ゲノムライブラリー、ｃＤＮＡライブラリーまたは発現ライブラリー等のライブラリーを、検出可能な核酸分子または抗体を用いてスクリーニングすることにより、単離２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子を同定できる。このようなライブラリーは様々な微生物由来のものが市販されており、また、目的の任意の入手可能な微生物もしくは環境サンプルからＰＣＴ公開公報ＷＯ００／２２１７０等に記載の方法を用いても作製できる。２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子を含有していると同定されたライブラリークローンは、慣用の方法にて単離、サブクローニングおよび配列決定可能である。
【００８８】
さらに、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ核酸分子は直接合成法によって作製可能である。例えば、当該技術分野で公知の自動合成法によって、１本鎖核酸分子を一度にまたは複数の部分に分けて化学的に合成することができる。相補鎖も１つ以上の部分に分けて同様に合成でき、２本鎖分子は相補鎖どうしをアニーリングさせることで作製できる。直接合成は、オリゴヌクレオチドプローブやプライマーといった比較的短鎖の分子を作製する場合に特に有利であり、ヌクレオチドまたは結合に修飾を加えた核酸分子を作製する場合にも有利である。
【００８９】
本発明はまた、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有する単離ポリペプチドを提供する。このような単離ポリペプチドは、細胞膜において正常な形態で発現されれば、２，５−ＤＫＧの取込みの向上が望まれる用途（例えば、２−ＫＬＧの生物生産）において有用である。本発明の単離ポリペプチドは培養培地へ添加することもでき、好ましくは膜小胞中にて、２，５−ＤＫＧに対する膜結合パーミアーゼと競合させて２，５−ＤＫＧの取込みを止めることもできる。従って、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有する単離ポリペプチドを使用して２，５−ＤＫＧ代謝産物の産生を調節することが可能である。
【００９０】
実施形態の１つでは、本発明の単離ポリペプチドは、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ ｙｉａオペロンであるＷＯ００／２２１７０の配列番号１９に記載のヌクレオチド配列内に完全に含まれるヌクレオチド配列にコードされていなくてもよい。別の実施形態では、本発明の単離ポリペプチドは、本明細書の配列番号１２に記載のアミノ酸配列内に完全に含まれない。
【００９１】
本発明の「単離」ポリペプチドは、自然環境で見られる状態から人為的に改変されている。例えば、単離２，５−ＤＫＧパーミアーゼは、本来の宿主中よりも高レベルで存在するように、または、異なる宿主中に存在するように、組換え操作によって発現された分子であってよい。あるいは、本発明の「単離」２，５−ＤＫＧパーミアーゼは、実質的に精製された分子であってもよい。実質的に精製された２，５−ＤＫＧパーミアーゼは当該技術分野で公知の方法にて調製可能である。特に、配列番号１２に記載のｙｉａＸ２ポリペプチドをコードするポリペプチドについては、用語「単離（された）」とは、該ポリペプチドが、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ ｙｉａオペロンの他の遺伝子（例えば、ＷＯ００／２２１７０に記載のｌｙｘＫおよびｏｒｆ１と呼ばれる遺伝子）によって発現されたポリペプチドと会合した状態で存在しないことを意味するものとする。
【００９２】
実施形態の１つでは、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０または１２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも４０％の同一性を有するアミノ酸配列を含有するものである。コードされているポリペプチドは、指定された配列のいずれかに対して少なくとも４５％、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％の同一性を有するのが好ましく、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を有するものであってもよい。
【００９３】
別の実施形態では、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０または１２のいずれかの少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含有するものである。代表的な本発明のポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０または１２のいずれかのアミノ酸１〜１０、１〜５０、５１〜６０、５１〜１００、１０１〜１１０、１０１〜１５０、１５１〜１６０、１５１〜２００、２０１〜２１０、２０１〜２５０、２５１〜２６０、２５１〜３００、３０１〜３１０、３０１〜３５０、３５１〜３６１、３５１〜４００、４０１〜４１０、４０１〜４３９からなるアミノ酸配列を含有するものである。
【００９４】
また、２，５−ＤＫＧパーミアーゼから誘導されるアミノ酸配列を有する単離免疫原性ペプチドも提供する。このような単離免疫原性ペプチドは、例えば、２，５−ＤＫＧ抗体を調製および精製する上で有用である。本明細書中、用語「免疫原性」とは、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ特異的抗体を誘導可能なペプチド、または、２，５−ＤＫＧパーミアーゼへの結合時に２，５−ＤＫＧパーミアーゼ特異的抗体と競合可能なペプチドのいずれかをいう。免疫原性である可能性のあるペプチドは、Ｉｒｎａｔｅｎ ｅｔ ａｌ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １１：９４９−９５５（１９９８）およびＳａｖｏｉｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐａｃ． Ｓｙｍｐ． Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ． １９９９：１８２−１８９（１９９９）等に記載の当該技術分野で公知の方法およびアルゴリズムを用いることで予測できる。本発明のペプチドの免疫原性は当該技術分野で公知の方法により確認でき、例えば、２，５−ＤＫＧパーミアーゼに感作させた動物における遅延型過敏症応答アッセイ、または、直接もしくは競合ＥＬＩＳＡアッセイによって確認できる。
【００９５】
本発明の単離免疫原性ペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０または１２からなる群より選択されるポリペプチドの少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含有することができ、例えば、配列番号２、４、６、８、１０または１２のいずれかのアミノ酸１〜１０、１〜５０、５１〜６０、５１〜１００、１０１〜１１０、１０１〜１５０、１５１〜１６０、１５１〜２００、２０１〜２１０、２０１〜２５０、２５１〜２６０、２５１〜３００、３０１〜３１０、３０１〜３５０、３５１〜３６１、３５１〜４００、４０１〜４１０、４０１〜４３９を含有し得る。このようなペプチドは、参照配列の少なくとも１２、１５、２０、２５またはそれ以上の連続したアミノ酸、例えば、参照配列由来の少なくとも３０、４０、５０、７５、１００、２００、３００、４００またはそれ以上の連続したアミノ酸を有することができ、最大で完全長配列までを有することができる。
【００９６】
２，５−ＤＫＧパーミアーゼを認識する抗体を天然型形態で産生する場合には、このようなペプチドは好ましくは、パーミアーゼ由来の細胞外または細胞内ドメインの少なくとも一部を含有する。細胞外または細胞内ドメインは一般に、極性残基または正もしくは負に荷電した残基を少なくとも１つ含有することを特徴とするのに対し、膜貫通ドメインは一般に、約２０個の連続した疎水性残基からなる連続領域であることを特徴とする。市販のコンピュータトポロジープログラムを使用することで、ペプチドが細胞外もしくは細胞内ドメイン、または、膜貫通領域のいずれに相当する可能性があるのかを判定することができる。膜貫通領域から誘導した本発明の免疫原性ペプチドは、２，５−ＤＫＧポリペプチドが認識に際して天然型形態をとる必要のない免疫ブロッティング等の用途に使用する抗体を惹起するのに有用である。
【００９７】
本発明の２，５−ＤＫＧパーミアーゼポリペプチドの構造的および機能的な特徴および用途は、コード核酸分子について上述した通りであり、本発明の単離ポリペプチドの場合と同様である。２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有する単離ポリペプチド、並びに、本発明の単離免疫原性ペプチドは、以下、「２，５−ＤＫＧパーミアーゼ」と呼ぶことにする。
【００９８】
２，５−ＤＫＧパーミアーゼを組換え操作によって産生する方法は、本発明の核酸分子、ベクターおよび細胞について上述した通りである。２，５−ＤＫＧパーミアーゼは、あるいは、生化学的手法によって、２，５−ＤＫＧパーミアーゼをもともと発現する細菌または組換え操作によって発現する細菌から膜を単離することによっても調製可能である。サイズもしくはアフィニティークロマトグラフィー、電気泳動または免疫親和性手法によって膜をさらに分画し、所望の純度を達成してもよい。精製は、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ抗体との免疫反応性や機能性アッセイ等の様々な手法によってモニターが可能である。
【００９９】
免疫原性ペプチドは、精製または部分精製２，５−ＤＫＧパーミアーゼポリペプチドから、例えば、完全長ポリペプチドの酵素切断または化学的切断により産生できる。酵素切断および化学的切断の方法、並びに、得られたペプチド断片の精製方法は、当該術分野で周知である（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， ｖｏｌ．１８２， ”Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，” Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ： Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．（１９９０）を参照）。
【０１００】
あるいは、２，５−ＤＫＧパーミアーゼは化学合成によっても生成可能である。必要であれば、機能活性、安定性または生物学的利用能の最適化等の目的で、このような化学合成分子にＤ−立体異性体、非天然アミノ酸、および、アミノ酸類似体や模倣体を含有させることも可能である。Ｓａｗｙｅｒ， Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｓｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ， ＡＣＳ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（１９９５）およびＧｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ， Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａｎａｌｙｓｉｓ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８３）。ポリペプチドの検出といった特定の用途に対しては、１個以上の検出可能なように標識されたアミノ酸（例えば、放射性標識または蛍光標識されたアミノ酸）を化学合成パーミアーゼへ組込むことも有用である場合がある。
【０１０１】
本発明の単離２，５−ＤＫＧパーミアーゼはさらに、抗体産生の際に単離２，５−ＤＫＧパーミアーゼの免疫系による認識を向上させることのできる笠貝（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）のヘモシニアン等の担体分子へコンジュゲートすることもできる。分子の安定性もしくは生物活性の向上、または、同定の促進といった特定の用途の場合には、２，５−ＤＫＧパーミアーゼを化学的にまたは酵素によって、例えば、アシル化、リン酸化またはグリコシレーションによって誘導体化してもよい。
【０１０２】
本発明はまた、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドに特異的な抗体、例えば、配列番号２、４、６、８、１０または１２のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドに特異的な抗体を提供する。また、配列番号２、４、６、８、１０または１２のいずれかの少なくとも１０個の連続したアミノ酸を含有する単離免疫原性ペプチドに特異的な抗体も提供する。本発明の抗体を使用することで、例えば、２，５−ＤＫＧパーミアーゼを発現ライブラリーまたは細胞から検出または単離することができる。
【０１０３】
本明細書中、用語「抗体」には、少なくとも約１×１０５Ｍ−１、好ましくは少なくとも１×１０７Ｍ−１、より好ましくは少なくとも１×１０９Ｍ−１の２，５−ＤＫＧパーミアーゼに対して特異的結合活性を有する分子が含まれるものとする。用語「抗体」には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方、並びに、このような抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびＦｖ断片等）が含まれる。さらに、用語「抗体」は、１本鎖抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ＣＤＲ−グラフティング抗体およびヒト化抗体といった非天然抗体、並びに、これらの抗原結合断片を包含するものとする。
【０１０４】
ペプチドおよびポリペプチド免疫原を利用した、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体といった抗体の調製および単離方法は当業者には周知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）に記載されている。非天然抗体は、固相ペプチド合成を利用することで構築可能であり、組換え操作によっても産生可能であり、また、可変Ｈ鎖および可変Ｌ鎖からなるコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング等によっても取得可能である。このような方法は、例えば、Ｈｕｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５−１２８１（１９８９）； Ｗｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｈａｒｒｉｓ， Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｔｏｄａｙ １４：２４３−２４６（１９９３）； Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６（１９８９）； Ｈｉｌｙａｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ （ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ １９９２）；およびＢｏｒｒａｂｅｃｋ， Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２ｄ ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９９５）に記載されている。
【０１０５】
以下の実施例は本発明の例示であって、限定を意図したものではない。
実施例
本実施例では、２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を有する６種類の新規なポリペプチドをコードする核酸分子の単離と特性決定を示す。
ｙｉａＸ２を２，５−ＤＫＧパーミアーゼとして同定
ＷＯ００２１７０には、８個の推定オープンリーディングフレームを含有するＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ由来のオペロン（ｙｉａオペロンと称する）の同定および配列決定が記載されている。このオペロンを破壊するとＫ．ｏｘｙｔｏｃａがアスコルビン酸を唯一の炭素源として利用できなくなることから、ｙｉａオペロンはアスコルビン酸の異化代謝に関与していると予測された。ｙｉａオペロンの個々のオープンリーディングフレームによってコードされているポリペプチドの機能は、ＷＯ００２１７０には記載されていなかった。
【０１０６】
Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａが２，５−ＤＫＧを唯一の炭素源として増殖可能であることを確認した結果、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａが２，５−ＤＫＧパーミアーゼを発現するものと判断した。このようなパーミアーゼは既知の細菌輸送体タンパク質と構造特性（例えば、複数の膜貫通セグメント）を共有するものと予測した。ｙｉａオペロン中の特性決定されていないオープンリーディングフレームの１つ（ｙｉａＸ２と称する）には、既知のタートレート輸送体に対して約３３％の同一性を有する膜貫通ポリペプチドがコードされていたため、ｙｉａＸ２を２，５−ＤＫＧパーミアーゼ候補であると考えた。
【０１０７】
ｙｉａＸ２が２，５−ＤＫＧパーミアーゼをコードしているか否かを判定するために、本遺伝子をＭ５ａ１と呼ばれるＫ．ｏｘｙｔｏｃａ株の染色体から欠失させた。Ｍ５ａ１はＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａとしても文献に記載されている（例えば、Ｓｔｒｅｉｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ６８：１１７４−１１７７（１９７１）を参照）。ｙｉａＸ２欠失突然変異体は、ｙｉａＸ２遺伝子のすぐ上流およびすぐ下流にある配列を３通りのライゲーションにてｐＭＡＫ７０５組込みベクター（Ｈａｍｉｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １７１：４６１７−４６２２（１９８９）に記載）と連結することにより構築した。ｏｒｆ１遺伝子中の約１ｋｂの断片を、オリゴヌクレオチド５’−ＡＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＡＡＡＧＡＧＴＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号１７）および５’−ＣＧＴＡＴＣＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＴＴＣＴＧＧＴＧＡＴＧＡＡＧＧＴＧＡ−３（配列番号１８）を使用して増幅し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化した。ｌｙｘＫ遺伝子中の同様のサイズの断片をオリゴヌクレオチド５’−ＡＧＡＣＴＣＴＡＧＡＴＣＣＡＣＡＴＡＡＡＣＧＣＡＣＴＧＣＧＴＡＡＡＣ−３’（配列番号１９）および５’−ＧＡＧＧＧＧＡＴＣＣＴＧＧＣＴＴＣＧＴＧＡＡＣＧＡＴＡＴＡＣＴＧＧ−３’（配列番号２０）を用いて増幅し、ＸｂａＩおよびＢａｍＨＩで消化した。得られた２つの断片を共に、ベクターｐＭＡＫ７０５のＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ部位間にライゲートした。得られたプラスミドによりＫ．ｏｘｙｔｏｃａ株Ｍ５ａ１を形質転換し、二重交差（ｄｏｕｂｌｅ ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ）によって欠失構築物が組込まれた候補をＨａｍｉｌｔｏｎら（前掲、１９８９）の記載に従って取得した。得られたＫ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２株の名称はＭＧＫ００２である。ｙｉａＸ２欠損表現型をＰＣＲ分析で確認した。
【０１０８】
後述するように、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎＯ］株が、２，５−ＤＫＧを唯一の炭素源とした場合には極めて非効率的に増殖し、かつ２−ＬＫＧでは増殖しないことを確認した。ｙｉａＸ２が２，５−ＤＫＧおよび２−ＫＬＧパーミアーゼ活性を有するポリペプチドをコードしていることの確認は、該遺伝子を戻すことによりＫ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎＯ］が２，５−ＤＫＧまたは２−ＫＬＧのいずれにおいても再び十分に増殖可能となることを確認することで行った（下記参照）。
Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎＯ］の構築
別の２，５−ＤＫＧパーミアーゼ、好ましくは２，５−ＤＫＧに対して選択的なパーミアーゼを同定するために、代謝選択法を利用した。ＷＯ００／２２１７０に記載されているように、代謝選択は、事前に配列情報を何ら必要とすることなく、特性決定されていない培養不可能ですらある微生物に由来する機能性遺伝子を迅速に同定できる点で有利である。
【０１０９】
２，５−ＤＫＧパーミアーゼをコードする核酸分子を代謝選択するための試験株は、２，５−ＤＫＧのグルコン酸（炭素とエネルギーへ変換可能）への異化代謝に関与する酵素を発現するようにＫ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２を遺伝子操作することで調製した。２，５−ＤＫＧをグルコン酸へ異化代謝可能な酵素は、配列番号１３に記載のｔｋｒ ｉｄｎＤ ｉｄｎＯオペロンのｔｋｒおよびｉｄｎＯ遺伝子によってコードされている。
【０１１０】
ｔｋｒ ｉｄｎＤ ｉｄｎＯオペロン（配列番号１３）を高コピー数ベクターｐＵＣ１９へサブクローニングし、得られたクローン（ｐＤＦ３３と称する）をＫ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２へ形質転換した。得られた試験株（ＭＧＫ００２［ｐＤＦ３３］またはＫ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎＯ］と称する）は従って、２，５−ＤＫＧを唯一の炭素源として利用するのに必要なポリペプチドを全て発現するが、細胞外２，５−ＤＫＧを細胞内へ輸送する２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性を欠損している。従って、２，５−ＤＫＧパーミアーゼをコードする核酸分子が試験株中で発現すると、試験株は２，５−ＤＫＧでの増殖が可能となるはずである。代謝選択法の概略を図３に示す。
【０１１１】
提案された代謝選択法を確認するために、陽性対照としてｙｉａＸ２遺伝子を試験株へ再導入し、２，５−ＤＫＧおよび２−ＫＬＧでの増殖が可能になることを確認した。ｙｉａＸ２オープンリーディングフレーム（ＷＯ００／２２１７０の配列番号１９のヌクレオチド３７７７〜５２７８）を、オリゴヌクレオチド５’−ＡＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＴＣＡＣＣＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡ−３’（配列番号２１）および５’−ＣＡＴＡＧＧＴＡＣＣＧＧＣＴＴＴＣＡＧＡＴＡＧＧＴＧＣＣ−３’（配列番号２２）を用いてＰＣＲ増幅し、ＢａｍＨＩおよびＫｐｎ１で消化し、同一の制限酵素で予め消化しておいたｐＣＬ１９２０（Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ． Ｒｅｓ． １８：４６３１（１９９０）および下記参照）へライゲートした。得られた構築物で形質転換したＫ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎＯ］は、３０℃で一晩、２−ＫＬＧまたは２，５−ＤＫＧのいずれか（０．２５％）および０．１ｍＭ ＩＰＴＧを添加したＭ９最少寒天培地上で増殖可能であった。従って、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎＯ］が、別の新規な２，５−ＤＫＧパーミアーゼを同定し、かつ、その選択性を判定するための適切な試験株であることを確認した。
細菌ゲノムライブラリーの構築
上記陽性対照の構築と細菌ゲノムライブラリーの調製に使用するクローニングベクターは、スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性決定基を保有する低コピー数発現ベクターであるプラスミドｐＣＬ１９２０（Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、前掲、１９９０）である。ｌａｃＰＯプロモーター／オペレーター領域によって発現が駆動されるが、該領域は、宿主中でｌａｃＩｑ遺伝子産物が生成されると抑制され、０．０１〜１ｍＭのＩＰＴＧが存在すると誘導される領域である。
【０１１２】
下記の種および分離株（ｉｓｏｌａｔｅｓ）に由来するゲノムＤＮＡを以下に略述する方法に従って調製した：Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ（ＡＴＣＣ３９１４０）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ ＭＧＫ００２（ΔｙｉａＸ２）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、並びに、２５種類の環境分離株の混合物（１８種類の土壌および水サンプルより取得し、２，５−ＤＫＧを唯一の炭素源として増殖可能なもの）。Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ ＭＧＫ００２（ΔｙｉａＸ２）は、試験株中で２，５−ＤＫＧを唯一の炭素源としたバックグラウンド増殖がわずかに観察され、ある程度の２，５−ＤＫＧパーミアーゼ活性が取込みアッセイにおいて見られたことから、選択細菌の１つとした。しかしながら、試験株は２−ＫＬＧでは増殖せず、２−ＫＬＧの取込みも検出されなかったことより、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ中に２，５−ＤＫＧに対する選択性を有する第２の２，５−ＤＫＧパーミアーゼが存在することが示唆された。
【０１１３】
ＬＢ（３０℃）中で一晩培養した培養物５ｍｌを５分間６，０００ｒｐｍで遠心分離した。ペレットを１．５ｍｌのＴｒｉｓ １０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ ｐＨ ８．０（ＴＥ）で洗浄し、再度遠心分離して０．４ｍｌのＴＥ中に再懸濁した。リゾチーム（５ｍｇ／ｍｌ）およびＲＮａｓｅ（１００ｐｇ／ｍｌ）を添加し、細胞を１０分間３７℃にてインキュベートした。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度１％まで添加し、溶解が完了するまで試験管を穏やかに振盪した。５Ｎ ＮａＣｌＯ４原液１００μｌを溶解産物へ添加した。混合物を１倍容量のフェノール：クロロホルム（１：１）で１回抽出し、１倍容量のクロロホルムで１回抽出した。２ｍｌの冷エタノール（−２０℃）を添加し、沈殿物をパスツールピペットの曲面へ静かに巻き取ることにより、染色体ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを３０分間室温で乾燥させ、５０〜１００μｌのＴｒｉｓ １０ｍＭ、ＥＤＴＡ １ｍＭ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ ｐＨ ８．０に再懸濁し、ＤＮＡ濃度を０．５〜１μｇ／μｌとした。各環境分離株に由来するゲノムＤＮＡ調製物を等量ずつ混合して１つの混合ライブラリーを調製した。
【０１１４】
各調製物について、サイズが３〜２０ｋｂの範囲の断片を取得するため、ゲノムＤＮＡの一定量（１０〜１５μｌ）を、Ｓａｕ３Ａの制御された消化に付した。その半量を、予めＢａｍＨＩで消化し、脱リン酸化しておいた低コピー数発現ベクターｐＣＬ１９２０とライゲートした。得られたゲノムライブラリーにより大腸菌ＤＨ１０Ｂエレクトロコンピテント細胞（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を形質転換し、簡便には、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを添加したＬＢ寒天上で３０℃にて一晩増幅させた。各ライブラリーについて、３０，０００〜１２０，０００クローンをプレートアウトし、常法を用いてプラスミドＤＮＡを大量に抽出した。インサートのサイズを無作為に確認し、増幅させたライブラリーをプラスミドＤＮＡの状態で−２０℃にて保存して、試験株での使用に備えた。
パーミアーゼ遺伝子の選択、同定および配列決定
各ゲノムライブラリーの一定量をエレクトロポレーションによってＫ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎＯ］（ＭＧＫ００２［ｐＤＦ３３］）株へ導入した。形質転換におけるＤＮＡの使用量は、選択培地上でライブラリー当たり５×１０５〜１×１０６クローンを培養後採取できるよう調節した。各選択ラウンドを、１００μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含有するＬＢ寒天上で平板培養し、次いで２．５％の２，５−ＤＫＧおよび０．１ｍＭ ＩＰＴＧを含有するＭ９寒天プレート（ｐＨ４．５に調整）へレプリカプレート法で転写した。２，５−ＤＫＧ上で増殖したクローンを、プラスミドｐＤＦ３３を欠損したＫ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２（ＭＧＫ００２）へ移入し、このようなクローンが２，５−ＤＫＧ上で増殖する際にｔｋｒ ｉｄｎＤ０経路が実際に必要であることを確認した。簡単な遺伝子特性決定を行って同一クローンを排除した。予備的な２，５−ＤＫＧ／２−ＫＬＧ取込みアッセイを行った後、５種類のクローンをさらに分析にかけるため維持した（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａライブラリー起源のものが２つ、Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ起源のものが１つ、混合環境ライブラリー起源のものが２つ）。
【０１１５】
全ての場合において、ベクターインサートのＤＮＡ配列決定から、既報の輸送体およびｙｉａＸ２（配列番号１１およびそれにコードされているポリペプチド（配列番号１２））と相同性を示すポリペプチド（配列番号２、４、６、８および１０）をコードするヌクレオチド配列（配列番号１、３、５、７および９）の存在が判明した。また、これらのインサート上には他のｏｒｆも存在し、ほとんどの場合内在性プロモーターであった。
【０１１６】
ｐｒｍＡ ｏｒｆ（配列番号７）およびｐｒｍＢ ｏｒｆ（配列番号９）の双方を含有するインサートは約９ｋｂであり、該インサートには他にも、細菌ｉｄｎＯに相同なｏｒｆ、転写リプレッサーをコードするｏｒｆ（２つ）、機能が未知のｏｒｆ、および、硝酸塩利用に関与する大腸菌ポリペプチドの相同体をコードするｏｒｆ（３つ）が含まれていた。
【０１１７】
ＰＥ１ ｏｒｆ（配列番号１）を含有するインサートは約３ｋｂであり、該インサートには他にも、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ｋｄｇＫ遺伝子に密接に関係する推定デヒドロ−デオキシグルコノキナーゼ遺伝子、および大腸菌ｙｄｃＧ遺伝子の相同体が含まれていた。
【０１１８】
ＰＥ６ ｏｒｆ（配列番号３）を含有するインサートは約６．７ｋｂであった。配列番号４がｙｉａＬ相同体よりも下流にあり、かつ、ｙｉａＫ相同体もインサート上に存在するため、ＰＥ６のゲノム環境は大腸菌およびＫ．ｏｘｙｔｏｃａのｙｉａオペロンに近いと考えられた。
【０１１９】
ＰＫ１ ｏｒｆ（配列番号５）を含有するインサートは約５．５ｋｂであった。他のインサートとは対照的に、本インサートは内在性プロモーターを含有していないと考えられることから、ＰＫ１ ｏｒｆは明らかにベクターのプロモーターから転写されていることが判明した。ＰＫ１ ｏｒｆにはｔｋｒ相同体が直接続いていた。
【０１２０】
各２，５−ＤＫＧパーミアーゼをコードする核酸分子をＫ．ｏｘｙｔｏｃａ ΔｙｉａＸ２［ｔｋｒ ｉｄｎＯ］へ再導入し、得られた株を２，５−ＤＫＧおよび２−ＬＫＧでの増殖についてアッセイし、また、放射標識２，５−ＤＫＧおよび２−ＫＬＧの取り込みについてもアッセイした。
【０１２１】
取込みアッセイは、放射性２−ＫＬＧまたは２，５−ＤＫＧをＩＰＴＧで誘導した細胞と混合し、一定間隔で一定量を採取し、上清中の放射能の低下と細胞内における放射能の出現の双方を経時的に測定することにより行った。増殖アッセイと２，５−ＤＫＧ取込みアッセイの結果を下記の表１に示す。
【０１２２】
【表１】
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【０１２３】
異なるパーミアーゼをコードする核酸分子も、高コピー数ベクターｐＳＥ３８０（ｔａｃプロモーターを含有）、中コピー数ベクターｐＡＣＹＣ１８４（プロモーターなし）または低コピー数ベクターｐＣＬ１９２０等の様々なベクターへサブクローニングし、グルコースから２−ＫＬＧを生物生産するのに適したＰａｎｔｏｅａ株（米国特許第５，０３２，５１４号参照）へ導入した。得られた株を生物発酵条件下で評価し、核酸分子、プロモーターおよびベクターのいずれの組み合わせが、２−ＫＬＧ産生の向上に最適であるのかを判定した。
【０１２４】
括弧内その他で引用してきた投稿論文、参考文献および特許は全て、内容に言及したか否かにかかわらず、その全内容が引用により本明細書中に含まれるものとする。
【０１２５】
以上、実施例を参照して本発明を説明してきたが、本発明の趣旨を逸脱することなく各種の改変がなし得ることは理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１Ａおよび１Ｂは、ＹｉａＸ２（配列番号１２）、ＰＥ１（配列番号２）、ＰＥ６（配列番号４）、ｐｒｍＡ（配列番号８）、ｐｒｍＢ（配列番号１０）およびＰＫ１（配列番号６）と呼ばれる２，５−ＤＫＧパーミアーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す。
【図２】
図２は、生物発酵に適した細菌株におけるグルコースから２−ＫＬＧへの生合成経路を示す。
【図３】
図３は、新規な２，５−ＤＫＧパーミアーゼの同定に使用する代謝選択法を示す。
【図２】
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【図３】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004514421.tif 000097
【国際調査報告】
2004514421.tif 000098
2004514421.tif 000099
2004514421.tif 000100
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