(57)【要約】血管形成増殖因子および血管形成成熟因子を発現する核酸発現構築物、およびそれにより形質転換され血管の形成を誘発するために利用可能である細胞集団が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）血管形成増殖因子をコードする第１のポリヌクレオチドセグメント；および
（ｂ）血管形成成熟因子をコードする第２のポリヌクレオチドセグメント
を含む核酸発現構築物。
【請求項２】
前記第１および前記第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つの発現を意図するためのプロモーター配列少なくとも１つを更に含む請求項１に記載の核酸発現構築物。
【請求項３】
前記第１のポリヌクレオチドセグメントは前記第２のポリヌクレオチドセグメントに転写可能に連結されており、前記第１および前記第２のポリヌクレオチドセグメントは前記プロモーター配列少なくとも１つの単一のプロモーター配列の転写制御下にある請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記第１および前記第２のポリヌクレオチドセグメントの間に介在したリンカー配列を更に含む請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記リンカー配列はＩＲＥＳおよびプロテアーゼ切断認識部位よりなる群から選択される請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記プロモーター少なくとも１つは真核細胞において機能する請求項１に記載の核酸発現構築物。
【請求項７】
前記プロモーター少なくとも１つは構成的プロモーター、誘導プロモーターおよび組織特異的プロモーターよりなる群から選択される請求項１に記載の核酸発現構築物。
【請求項８】
（ｃ）前記第１のポリヌクレオチドセグメントの発現を意図した第１のプロモーター配列；および
（ｄ）前記第２のポリヌクレオチドセグメントの発現を意図した第２のプロモーター配列
を更に含む請求項１に記載の核酸発現構築物。
【請求項９】
前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターは各々構成的プロモーター、誘導プロモーターおよび組織特異的プロモーターよりなる群から選択される請求項８に記載の核酸発現構築物。
【請求項１０】
前記第１のプロモーターおよび前記第２のプロモーターからの発現が１つのエフェクターにより調節可能である請求項９に記載の核酸発現構築物。
【請求項１１】
マーカーポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１つを更に含む請求項１に記載の核酸発現構築物。
【請求項１２】
前記マーカーポリペプチドは選択ポリペプチドおよびレポーターポリペプチドよりなる群から選択される請求項１１に記載の核酸発現構築物。
【請求項１３】
前記別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１つは前記第１および前記第２のポリヌクレオチドセグメントの前記少なくとも１つに転写可能に連結されている請求項１１に記載の核酸発現構築物。
【請求項１４】
前記別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１つはリンカー配列を介して前記第１および前記第２のポリヌクレオチドセグメントの前記少なくとも１つに転写可能に連結されている請求項１３に記載の核酸構築物。
【請求項１５】
前記リンカー配列はＩＲＥＳおよびプロテアーゼ切断認識部位よりなる群から選択される請求項１４に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
前記別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１つは前記第１および前記第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つに翻訳可能に融合している請求項１１に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
前記血管形成増殖因子はＶＥＧＦ、酸性または塩基性のＦＧＦ、ＰｌＧＦ、レプチンおよびＨＧＦよりなる群から選択される請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１８】
前記血管形成成熟因子はアンジオポエチン−１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β受容体−２、エンドグリン、Ｓｍａｄ５、ＶＥ‐Ｃアドヘリン、エフリンＢ２、ＰＤＧＦ、ＢｍｘチロシンキナーゼおよびＭＣＰ−１よりなる群から選択される請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
活性成分として請求項１に記載の核酸発現構築物および製薬上許容しうる担体を含有する医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１に記載の核酸発現構築物を含有する遺伝子的に形質転換された細胞。
【請求項２１】
前記形質転換された細胞は内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、筋細胞、単球および線維芽細胞よりなる群から選択される請求項２０に記載の形質転換された細胞。
【請求項２２】
前記形質転換された細胞は静脈のセグメント、骨髄原種細胞、末梢血液原種細胞、循環内皮細胞および胚性幹細胞よりなる群から選択される原材料に由来するものである請求項２０に記載の形質転換された細胞。
【請求項２３】
前記形質転換された細胞はヒトドナーおよび動物原材料よりなる群から選択される原材料に由来するものである請求項２０に記載の形質転換された細胞。
【請求項２４】
（ａ）血管形成増殖因子をコードする第１のポリヌクレオチドセグメントを含む第１の核酸発現構築物；および
（ｂ）血管形成成熟因子をコードする第２のポリヌクレオチドセグメントを含む第２の核酸発現構築物
を包含する核酸発現構築物系。
【請求項２５】
前記第１および前記第２の核酸発現構築物の少なくとも１つは選択マーカーポリペプチドまたはレポーターポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１つを更に含む請求項２４に記載の核酸発現構築物系。
【請求項２６】
前記第１および前記第２の核酸発現構築物は各々前記第１および前記第２のポリヌクレオチドセグメントの発現を意図したプロモーター配列を更に含む請求項２４に記載の核酸発現構築物系。
【請求項２７】
前記プロモーター配列は真核細胞において機能する請求項２６に記載の核酸発現構築物系。
【請求項２８】
前記プロモーター配列は構成的プロモーター、誘導プロモーターおよび組織特異的プロモーターよりなる群から選択される請求項２６に記載の核酸発現構築物系。
【請求項２９】
前記別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１つは前記第１のポリヌクレオチドセグメントまたは前記第２のポリヌクレオチドセグメントに転写可能に連結されている請求項２４に記載の核酸発現構築物系。
【請求項３０】
前記別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１つは、ＩＲＥＳおよびプロテアーゼ切断認識部位よりなる群から選択されるリンカー配列を介して前記第１のポリヌクレオチドセグメントまたは前記第２のポリヌクレオチドセグメントに転写可能に連結されている請求項２９に記載の核酸構築物系。
【請求項３１】
活性成分として請求項２４に記載の核酸発現構築物系および製薬上許容しうる担体を含有する医薬組成物。
【請求項３２】
血管形成増殖因子少なくとも１つおよび血管形成成熟因子少なくとも１つを発現するように遺伝子的に形質転換された細胞集団。
【請求項３３】
前記細胞集団は内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、筋細胞、単球および線維芽細胞よりなる群から選択される細胞型少なくとも２つを含む請求項３２に記載の細胞集団。
【請求項３４】
前記細胞型少なくとも２つのうちの第１の細胞型は前記血管形成増殖生育因子少なくとも１つを発現するように遺伝子的に形質転換され、前記細胞型少なくとも２つのうちの第２の細胞型は前記血管形成成熟因子少なくとも１つを発現するように遺伝子的に形質転換される請求項３２に記載の細胞集団。
【請求項３５】
前記第１の細胞型は内皮細胞であり、更に前記第２の細胞型は平滑筋細胞である請求項３３に記載の細胞集団。
【請求項３６】
前記内皮細胞は静脈組織、動脈組織、脂肪組織、原種細胞、循環内皮細胞および骨髄幹細胞よりなる群から選択される原材料に由来するものであり、更に前記平滑筋細胞は動脈組織および静脈組織よりなる群から選択される原材料に由来するものである請求項３５に記載の細胞集団。
【請求項３７】
前記血管形成増殖因子少なくとも１つおよび前記血管形成成熟因子少なくとも１つの各々の発現は独立して調節可能である請求項３２に記載の細胞集団。
【請求項３８】
前記血管形成増殖因子少なくとも１つはＶＥＧＦ、酸性または塩基性のＦＧＦ、ＰｌＧＦ、レプチンおよびＨＧＦよりなる群から選択される請求項３２に記載の細胞集団。
【請求項３９】
前記血管形成成熟因子少なくとも１つはアンジオポエチン−１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β受容体−２、エンドグリン、Ｓｍａｄ５、ＶＥ‐Ｃアドヘリン、エフリンＢ２、ＰＤＧＦ、ＢｍｘチロシンキナーゼおよびＭＣＰ−１よりなる群から選択される請求項３２に記載の細胞集団。
【請求項４０】
個体の組織領域における新しい血管の形成を誘発する方法であって、
（ａ）個体の組織領域内に血管形成増殖因子少なくとも１つを発現するように遺伝子的に形質転換された第１の細胞型を投与する工程；および
（ｂ）個体の組織領域内に血管形成成熟因子少なくとも１つを発現するように遺伝子的に形質転換された第２の細胞型を投与する工程、
を含む方法。
【請求項４１】
前記組織領域は虚血組織、閉塞したまたは狭窄した血管組織または傷害血管組織を含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記閉塞したまたは狭窄した血管組織は閉塞したまたは狭窄した動脈である請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１および前記第２の細胞型が個体に由来するものである請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１および前記第２の細胞型は各々、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、筋細胞、単球、骨髄幹細胞、線維芽細胞および胚性幹細胞よりなる群から選択される請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
方法は閉塞したまたは狭窄した血管をバイパスするか貫通させるために利用される請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１および前記第２の細胞型を個体の組織領域に同時投与する請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１の細胞型からの前記血管形成増殖因子少なくとも１つの発現は第１の因子により調節可能であり、更に前記第２の細胞型からの前記血管形成成熟因子少なくとも１つの発現は第２の因子により調節可能である請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１および前記第２の因子は前記血管形成増殖因子少なくとも１つの発現をダウンレギュレートすることができ、そして、前記血管形成成熟因子少なくとも１つの発現をアップレギュレートすることができる単一の因子である請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
工程（ｂ）は工程（ａ）の後、少なくとも１２時間経過後に行なわれる請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
個体の組織領域における新しい血管の形成を誘発する方法であって、前記方法は個体の組織領域内に細胞を投与する工程を含み、前記細胞は、
（ａ）個体の組織領域内に血管形成増殖因子少なくとも１つ；および
（ｂ）個体の組織領域内に血管形成成熟因子少なくとも１つ
を発現するように遺伝子的に形質転換され、それにより個体の組織領域内に新しい血管の形成を誘発する方法。
【請求項５１】
前記細胞は内皮細胞である請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
活性成分として血管形成増殖因子および血管形成成熟因子を含む調製品および製薬上許容しうる担体を含有する医薬組成物。
【請求項５３】
前記血管形成増殖因子はＶＥＧＦ、酸性または塩基性のＦＧＦ、ＰｌＧＦ、レプチンおよびＨＧＦよりなる群から選択される請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
前記血管形成成熟因子はアンジオポエチン−１、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β受容体−２、エンドグリン、Ｓｍａｄ５、ＶＥ‐Ｃアドヘリン、エフリンＢ２、ＰＤＧＦ、ＢｍｘチロシンキナーゼおよびＭＣＰ−１よりなる群から選択される請求項５２に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記製薬上許容しうる担体はリポソーム、ミセル、ウィルスよりなる群から選択される請求項５２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は核酸構築物、それにより形質転換された血管細胞、および、血管形成を誘発するためのこのような形質転換された血管細胞を利用する方法に関する。より詳しくは、本発明は血管形成増殖因子少なくとも１種および血管形成成熟因子少なくとも１種を発現する遺伝子的に形質転換された血管細胞および哺乳類組織中の新しい血管の形成を誘発するための遺伝子的に形質転換された細胞の利用方法に関する。
【０００２】
アテローム性動脈硬化閉塞性心臓血管病：
冠動脈、脳血管および末梢血管の疾患のようなアテローム性動脈硬化症により生じる疾患は西半球における罹患および死亡の最も一般的なものである［２０］。
【０００３】
公的および私的な研究がかなり行なわれているにもかかわらず、アテローム性動脈硬化症関連疾患はそれに起因する経済的負担の観点において他の如何なる知られた疾患よりも重大問題である。世界保健機構（ＷＨＯ）は、アテローム性動脈硬化症関連疾患は２０２０年までに世界において罹患および死亡の第１の原因となると予測している。
【０００４】
バイパス手術および血管形成術のような種々の侵襲的な治療方法がアテローム性動脈硬化症関連疾患の治療のために通常用いられている。これらの治療方法はアテローム性動脈硬化症患者の寿命を延長するが、このような方法は複雑さと高度に侵襲的な性質のため限定されている。
【０００５】
更にまた、これらの方法は、動脈枝の遮断または合成、静脈または動脈の何れかのバイパス移植片の遮断から生じる虚血性症状を有する患者全てにおいて効果的に利用できるわけではない。現時点で、公的および私的基金による心臓血管研究施設は、アテローム性動脈硬化症の患者の治療において有効な新しい治療方法を発見するための研究においてかなりの時間と資源を投入している。
【０００６】
血管形成
成人においては、正常および罹患した組織における新しい血管の形成は、２つの過程、即ち、反復される動脈形成（存在前の細動脈から小型の筋性動脈への変換）および血管形成、既存の血管の新芽形成（胚および成人の両方で起こる）により調節されている［１−５］。成人においては、生理学的血管形成は女性ホルモン周期において、そして多くの病理学的条件下、例えば成長中の腫瘍の内部および周囲における新しい血管の形成および虚血の心臓または四肢における副行血管の形成において起こる［４，５］。
【０００７】
血管形成の過程は生物力学的および生化学的な刺激により調節される。血管形成過程は３つの逐次的な段階よりなる。開始時と称される第１段階では、内皮細胞と周囲組織との間の結合はより堅固である。第２段階では、ＥＣが増殖して虚血性組織を侵襲し、これによりＥＣ新芽形成が起こる。血管形成過程の最終段階では、新しく形成されたＥＣ新芽が成熟して機能的血管となる。成熟過程の特徴は内皮細胞を包囲する細胞の漸増である。周囲内皮細胞、例えば毛細血管の周皮細胞、大血管の平滑筋細胞および心臓の心筋細胞が漸増することにより形成中の血管を維持し、モジュレーション機能を与える。
【０００８】
血管の完成とリモデリングはパラクリンシグナルにより制御されており、その大部分は膜貫通チロシンキナーゼ受容体の活性をモジュレートする蛋白リガンドにより媒介されている［１，３，６］。これらの分子に属するものは、血管内皮細胞生育因子（ＶＥＧＦ）およびその受容体ファミリー（ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２）、アンジオポエチン１および２（Ａｎｇ−１およびＡｎｇ−２）およびその受容体（Ｔｉｅ２）、塩基性腺維芽細胞生育因子（ｂＦＧＦ）、血小板由来生育因子（ＰＤＧＦ）、およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ‐β）である。
【０００９】
血管形成および管腔形成の予備的段階におけるＶＥＧＦおよびその受容体の主な役割はＶＥＧＦ受容体ヌルヘテロ接合動物において明らかにされている［７−９］。胚の発生の早期の段階に生存し続けることができないこのような動物は、ＶＥＧＦＲ１受容体に対してヘテロ接合の場合は内皮細胞を生産しないか、またはＶＥＧＦＲ２受容体に対してヘテロ接合である場合は血管を形成することができない。Ｔｉｅ２受容体またはそのリガンドアンジオポエチン１および２を破壊した実験によれば、内皮細胞は管を形成したが周囲内皮細胞は漸増しなかった［１０−１４］。興味深いことに、同様の表現型がＰＤＧＦ−Ｂ、ＴＧＦ‐βおよび組織因子を欠損した動物でも観察されており［１５−１８］、アンジオポエチンのその受容体への結合が内皮細胞からの上記因子の分泌をもたらしていることを示唆している。最近の研究によれば、ＶＥＧＦは内皮細胞の崩壊と血漿成分の漏出を特徴とする血管形成の早期の段階に関与している［１９，２０］。この研究によればＡｎｇ−１は新しく形成された血管の成熟を調節するが、別の研究によればＡｎｇ−２とＴｉｅ２との結合が既存の血管の後退に関与しているとされている［６，１３］。
【００１０】
血管形成の速度には微小血管の生育に影響する陽性および陰性の血管形成因子の間の局所的平衡の変化が関わっている。血管形成因子とその受容体の役割の部分的解明により幾つかの提案されている遺伝子治療方法がもたらされた。遺伝子治療は血管の治療において好都合であると考えられているが、その理由はトランスジーンは全身副作用を伴うことなく発現することができ、その治療効果は長期間にわたり顕著であり、その作用は血管組織の正常な生化学的調節を緊密に摸倣することができるからである［２１−２４］。
【００１１】
遺伝子治療は血管形成術およびバイパス手術の後の平滑筋細胞の増殖の抑制について、そして、内皮細胞増殖の増強による血管形成の誘発について、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび動物実験の両方で調べられている［２３］。更にまた、それぞれＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ１２１をコードする裸のＤＮＡおよび組み換えアデノウィルスベクターを用いて虚血性の末梢血管の疾患を有する患者の遺伝子的に修飾された血管細胞へのｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子転移を行なった［２５，２６］。しかしながら、このような治療法の安全性および有効性は、上記試験に参加した患者６人が死亡した後には疑問視されている。
【００１２】
動物モデルにおいてＶＥＧＦおよびＡｎｇ−１コードベクターの同時投与は副行血管の形成を促進したが［３９］、このような直接のベクターの投与は、虚血性組織および損傷を受けた臓器においては、このような組織は健康な細胞を欠いているため発現濃度に限界があることから、治療効果には限界がある。
【００１３】
即ち、上記した限界のために、現在提案されている、または利用されている治療方法は、末梢、冠動脈および脳血管の血管の閉塞により生じる症状に罹患した広範囲の患者を治療するために効果的で安全に使用することができない。
【００１４】
即ち、上記限界のない患者の組織領域における血管形成を誘発するための効果的で安全で侵襲性の低い方法が必要であること、および、それを保有することが極めて好都合であることは広く認められている事である。
【００１５】
発明の要約
本発明の１つの特徴によれば、（ａ）血管形成増殖因子をコードする第１のポリヌクレオチドセグメント；および（ｂ）血管形成成熟因子をコードする第２のポリヌクレオチドセグメントを含む核酸発現構築物が提供される。
【００１６】
本発明の別の特徴によれば、（ａ）血管形成増殖因子をコードする第１のポリヌクレオチドセグメントを含む第１の核酸発現構築物；および（ｂ）血管形成成熟因子をコードする第２のポリヌクレオチドセグメントを含む第２の核酸発現構築物を包含する核酸発現構築物系が提供される。
【００１７】
後に記載する本発明の好ましい実施態様における別の特徴によれば、第１および第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも一方の発現を意図するためのプロモーター配列少なくとも１つを更に含む核酸発現構築物である。
【００１８】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第１のポリヌクレオチドセグメントは第２のポリヌクレオチドセグメントに転写可能に連結されており、第１および第２のポリヌクレオチドセグメントはプロモーター配列少なくとも１つの単一のプロモーター配列の転写制御下にある。
【００１９】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第１および第２のポリヌクレオチドセグメントの間に介在したリンカー配列を更に含む核酸構築物である。
【００２０】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、リンカー配列はＩＲＥＳおよびプロテアーゼ切断認識部位よりなる群から選択される。
【００２１】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、プロモーター少なくとも１つは真核細胞において機能する。
【００２２】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、プロモーター少なくとも１つは構成的プロモーター、誘導プロモーターおよび組織特異的プロモーターよりなる群から選択される。
【００２３】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、（ｃ）第１のポリヌクレオチドセグメントの発現を意図した第１のプロモーター配列；および（ｄ）第２のポリヌクレオチドセグメントの発現を意図した第２のプロモーター配列を更に含む核酸発現構築物である。
【００２４】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターは各々構成的プロモーター、誘導プロモーターおよび組織特異的プロモーターよりなる群から選択される。
【００２５】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第１のプロモーターおよび第２のプロモーターからの発現が１つのエフェクターにより調節可能である。
【００２６】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、マーカーポリペプチドをコードする別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１つを更に含む核酸発現構築物である。
【００２７】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、マーカーポリペプチドは選択ポリペプチドおよびレポーターポリペプチドよりなる群から選択される。
【００２８】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１つは第１および第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つに転写可能に連結されている。
【００２９】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１つはリンカーセグメントを介して第１および第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つに転写可能に連結されている。
【００３０】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、リンカー配列はＩＲＥＳおよびプロテアーゼ切断認識部位よりなる群から選択される。
【００３１】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、別のポリヌクレオチドセグメント少なくとも１つは第１および第２のポリヌクレオチドセグメントの少なくとも１つに翻訳可能に融合している。
【００３２】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、血管形成増殖因子はＶＥＧＦ、酸性または塩基性のＦＧＦ、ＰｌＧＦ、レプチンおよびＨＧＦよりなる群から選択される。
【００３３】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、血管形成成熟因子はアンジオポエチン−１、Ｔｉｅ−２、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β受容体−２、エンドグリン、Ｓｍａｄ５、ＶＥ‐Ｃアドヘリン、エフリンＢ２、ＰＤＧＦ、ＢｍｘチロシンキナーゼおよびＭＣＰ−１よりなる群から選択される。
【００３４】
本発明の更に別の特徴によれば、（ａ）血管形成増殖因子をコードする第１のポリヌクレオチドセグメント；および（ｂ）血管形成成熟因子をコードする第２のポリヌクレオチドセグメントを含む核酸発現構築物を包含する遺伝子的に形質転換された細胞が提供される。
【００３５】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、形質転換された細胞は内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、筋細胞、単球および線維芽細胞よりなる群から選択される。
【００３６】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、形質転換された細胞は静脈または動脈のセグメント、骨髄細胞、末梢血液原種細胞、前駆細胞、循環内皮細胞および胚性幹細胞よりなる群から選択される原材料に由来するものである。
【００３７】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、形質転換された細胞はヒトドナーおよび動物原材料よりなる群から選択される原材料に由来するものである。
【００３８】
本発明の更に別の特徴によれば、血管形成増殖因子少なくとも１つおよび血管形成成熟因子少なくとも１つを発現するように遺伝子的に形質転換された細胞集団が提供される。
【００３９】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、細胞集団は内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、筋細胞、単球、線維芽細胞および骨髄由来細胞よりなる群から選択される細胞型少なくとも２つを含む。
【００４０】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、細胞型少なくとも２つのうちの第１の細胞型は血管形成増殖生育因子少なくとも１つを発現するように遺伝子的に形質転換され、細胞型少なくとも２つのうちの第２の細胞型は血管形成成熟因子少なくとも１つを発現するように遺伝子的に形質転換される。
【００４１】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第１の細胞型は内皮細胞であり、第２の細胞型は平滑筋細胞である。
【００４２】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、内皮細胞および平滑筋細胞は各々血管セグメントに由来のものである。
【００４３】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、血管形成増殖因子少なくとも１つおよび血管形成成熟因子少なくとも１つの各々の発現は独立して調節可能である。
【００４４】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、血管形成増殖因子少なくとも１つはＶＥＧＦ、酸性または塩基性のＦＧＦ、ＰｌＧＦ、レプチンおよびＨＧＦよりなる群から選択される。
【００４５】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、血管形成成熟因子少なくとも１つはアンジオポエチン−１、Ｔｉｅ−２、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β受容体−２、エンドグリン、Ｓｍａｄ５、ＶＥ‐Ｃアドヘリン、エフリンＢ２、ＰＤＧＦ、ＢｍｘチロシンキナーゼおよびＭＣＰ−１よりなる群から選択される。
【００４６】
本発明の更に別の特徴によれば、個体の組織領域における新しい血管の形成を誘発する方法が提供され、該方法は、（ａ）哺乳類の組織領域内に血管形成増殖因子少なくとも１つを発現するように遺伝子的に形質転換された第１の細胞型を投与すること；および（ｂ）哺乳類の組織領域内に血管形成成熟因子少なくとも１つを発現するように遺伝子的に形質転換された第２の細胞型を投与すること、の工程を含む。
【００４７】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、組織領域は血管、虚血筋肉組織またはバイパス移植片の閉塞または狭窄したセグメントを含む。
【００４８】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、バイパス移植片は合成移植片または動脈または静脈の組織に由来するものである。
【００４９】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第１および第２の細胞型は個体に由来するものである。
【００５０】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第１および第２の細胞型は各々、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、筋細胞、単球、線維芽細胞および骨髄幹細胞よりなる群から選択される。
【００５１】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、方法は閉塞した血管セグメントをバイパスするか貫通させるため、または、虚血領域への副行血流を確立するために利用する。
【００５２】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第１および第２の細胞型を個体の組織領域に同時投与する。
【００５３】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第１の細胞型からの血管形成増殖因子少なくとも１つの発現は第１の因子により調節可能であり、第２の細胞型からの血管形成成熟因子少なくとも１つの発現は第２の因子により調節可能である。
【００５４】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第１および第２の因子は血管形成増殖因子少なくとも１つの発現をダウンレギュレートすることができ、そして、血管形成成熟因子少なくとも１つの発現をアップレギュレートすることができる単一の因子である。
【００５５】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、工程（ｂ）は工程（ａ）の後、少なくとも１２時間経過後に行なう。
【００５６】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、第１の細胞型および第２の細胞型は単一の細胞型である。
【００５７】
記載した好ましい実施態様における更に別の特徴によれば、活性成分として上記した核酸構築物、またはこれにより発現された蛋白および製薬上許容しうる担体を含有する医薬組成物が提供される。
【００５８】
本発明は、核酸構築物、これにより形質転換された細胞、および、哺乳類組織中の血管形成を誘発するためにこのような形質転換細胞を利用する方法を提供することにより、現時点で知られている構成の難点に良好に対処する。
【００５９】
図面の簡単な説明
本発明は本明細書においては例示のみを目的として添付図面を参照しながら説明している。特定の参照例をここでは図面にて詳述するが、記載した特定のものは例示のため、そして、本発明の好ましい実施態様を説明的に論じるためのものであり、本発明の原理と概念的特徴の最も有用で容易に理解できる説明であると考えられるものを与えるために示している。この点に関し、本発明の基礎的理解のために必要である以上に詳細には本発明の構造的詳細を示すことは試みてはおらず、図面と組合せた説明は、本発明の幾つかの形態をどのようにして実際に実施するかを当業者に対して明らかにするものである。
図１は本発明によるＶＥＧＦ発現ベクター構築物を示す。
図２は本発明によるＡｎｇ−１発現ベクターを示す。
図３ａ−ｂはＶＥＧＦ−ＬａｃＺ（３ａ）またはＶＥＧＦ−ＧＦＰ（３ｂ）発現構築物で形質転換された培養ＥＣを示す。
図４ａ−ｃは閉塞した血管（図４ａ）、このような閉塞を治療するための従来技術のバイパス法（図４ｂ）および本発明による閉塞血管を貫通またはバイパスする方法（図４ｃ）を示す。
図５ａは人工的に遮蔽しＶＥＧＦ１６５を発現する組み換えアデノウィルスベクターを注入することにより再開通させたラット後肢動脈枝における閉塞部位と流動の測定を示す。
図５ｂはＶＥＧＦ１６５アデノウィルスベクターまたは生理食塩水（対照）の注射後３、７および１４日のラット大腿動脈中の血流を示すグラフである。数値は平均±Ｓ．Ｄ．，であり、各時点においてｎ＝５である。
図６ａ−ｄはｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰを感染させたＥＣまたはＳＭＣ（それぞれ図６ａ−ｂおよび６ｃ−ｄ）を示す光学顕微鏡または蛍光顕微鏡（それぞれ図６ａ−ｃおよび６ｂ−ｄ）写真である。
図７ａ−ｄはレトロＡｎｇ１−ＧＦＰを感染させたＥＣまたはＳＭＣ（それぞれ図７ａ−ｂおよび７ｃ−ｄ）を示す光学顕微鏡または蛍光顕微鏡（それぞれ図７ａ−ｃおよび７ｂ−ｄ）写真である。
図８ａ−ｂはアデノウィルス感染後４８時間のＥＣおよびＳＭＣ（それぞれ図８ａおよび８ｂ）におけるＡｎｇ−１  ｍＲＮＡの発現を示す写真である。図８ａのレーン：１−対照非感染ＥＣ、２−ｒＡｄＡｎｇ１感染ＥＣ、３−ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ、４−逆転写反応の陰性対照、５−プラスミドＡｎｇ−１ＤＮＡの陽性対照。図８ｂのレーン：１−Ａｎｇ−１コードプラスミドＤＮＡ、２−ＰＣＲ反応の陰性対照、３−ＲＴ反応の陰性対照、４−ｒＡｄＧＦＰ感染ＳＭＣ、５−ｒＡｄＡｎｇ１感染ＳＭＣ、６−対照非感染ＳＭＣ。総ＲＮＡはアデノウィルスベクター注入後のＥＣおよびＳＭＣから抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ分析は以下に示す実施例の項において記載する通り実施した。試料はβ−アクチンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅により規格化した。
図９ａ−ｂはレトロウィルス形質導入後４８時間のＥＣおよびＳＭＣ（それぞれ図９ａおよび９ｂ）におけるＡｎｇ−１  ｍＲＮＡの発現を示す写真である。図９ａのレーン：１−対照非形質導入ＥＣ、２−レトロＧＦＰ形質導入ＥＣ、３−レトロＡｎｇ１形質導入ＥＣ、４−ＲＴ反応の陰性対照、５−陽性対照Ａｎｇ‐１ＤＮＡコードプラスミド。図９ｂのレーン：１−陽性対照Ａｎｇ−１ＤＮＡコードプラスミド、２−ＰＣＲ反応の陰性対照、３−逆転写反応の陰性対照、４−レトロＧＦＰ形質導入ＳＭＣ、５−レトロＡｎｇ１形質導入ＳＭＣ、６−対照非感染ＳＭＣ。総ＲＮＡはレトロウィルスベクターによる形質導入後のＥＣおよびＳＭＣから抽出し、ＲＴ−ＰＣＲ分析は以下に示す実施例の項において記載する通り実施した。試料はβ−アクチンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅により規格化した。
図１０はアデノウィルス感染ＥＣおよびＳＭＣにおけるＡｎｇ‐１蛋白の発現を示す写真である。レーン：１−対照非感染細胞、２−ｒＡｄＧＦＰ感染細胞、３−ｒＡｄＵＰ５０幹線細胞、４−ｒＡｄＡｎｇ１感染細胞、Ｃ−陽性対照Ａｎｇ−１組み換え蛋白。
図１１はレトロウィルス形質導入ＥＣおよびＳＭＣにおけるＡｎｇ‐１蛋白の発現を示す写真である。レーン：１−非形質導入ＥＣ、２−レトロＧＦＰ形質導入ＥＣ、３−レトロＡｎｇ１形質導入ＥＣ、４−非形質導入ＳＭＣ、５−レトロＧＦＰ形質導入ＳＭＣ、６−レトロＡｎｇ１形質導入ＳＭＣ、７−Ａｎｇ１陽性対照。
図１２ａ−ｂはＡｎｇ−１を過剰発現するアデノウィルス感染ＥＣとＶＥＧＦ１６５を過剰発現するＥＣとの同時培養物におけるＡｎｇ−１およびＶＥＧＦ１６５蛋白の発現（それぞれ図１２ａおよび１２ｂ）のウエスタンブロットによる分析を示す写真である。レーン：１−ｒＡｄＶＥＧＦ感染ＥＣ＋ｒＡｄＡｎｇ１感染ＥＣ、２−ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ＋ｒＡｄＡｎｇ１感染ＥＣ、３−ｒＡｄＶＥＧＦ感染ＥＣ＋ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ、４−Ａｎｇ−１を安定して過剰発現する陽性対照２９３ＦＬＹＡ細胞。
図１３ａ−ｂはＡｎｇ−１を過剰発現するアデノウィルス感染ＥＣとＶＥＧＦ１６５を過剰発現するＳＭＣとの同時培養物におけるＶＥＧＦ１６５およびＡｎｇ−１蛋白の発現（それぞれ図１３ａおよび１３ｂ）のウエスタンブロットによる分析を示す写真である。レーン：１−ｒＡｄＶＥＧＦ感染ＥＣ＋ｒＡｄＡｎｇ１感染ＳＭＣ、２−ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ＋ｒＡｄＧＦＰ感染ＳＭＣ、３−Ａｎｇ−１を安定して過剰発現する陽性対照２９３ＦＬＹＡ細胞。
図１４はＡｎｇ‐１過剰発現ｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰ感染ＥＣの正常な増殖を示すヒストグラムである。細胞はｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰ（ＡｄＡｎｇ１）、ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ（ＡｄＶＥＧＦ）、ｒＡｄＧＦＰ（ＡｄＧＦＰ）で感染させたか、または非感染（対照）である。結果は感染後第７日における増殖を示す。
図１５ａ−ｂはｒＡｄＡｎｇ１感染ＥＣにおけるＴｉｅ２受容体の増強されたリン酸化を示す写真である。ｒＡｄＡｎｇ１‐ＧＦＰ、ｒＡｄＧＦＰまたはｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰに感染させたＥＣの蛋白分解物をＴｉｅ２のリン酸化を抗ホスホチロシン抗体による予備免疫沈降を行わない場合、および行った場合についてウエスタンブロットにより分析した（それぞれ図１５ａおよび１５ｂ）。レーン：１−非感染ＥＣ、２−ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ、３−ｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰ感染ＥＣ、４−ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ、５−陰性対照２９３細胞（図１５ａのみ）。
図１６ａ−ｈはアデノウィルス感染ＥＣを含有するコラーゲンゲル包埋同時培養スフェロイドの３次元ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管形成新芽形成を示す顕微鏡写真である。パネルはｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ（図１６ａ−ｂ）、同時培養ｒＡｄＧＦＰ＋ｒＡｄＶＥＧＦ感染ＥＣ（図１６ｃ−ｄ）、同時培養ｒＡｄＡｎｇ１‐ＧＦＰ＋ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ（図１６ｅ−ｆ）および同時培養ｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰ＋ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ（図１６ｇ‐ｈ）を示す。２つの代表的な９６時間試験の結果を示す。
図１７ａ−ｄはアデノウィルス感染ＥＣおよびレトロウィルス形質導入ＳＭＣを含有するコラーゲンゲル包埋同時培養スフェロイドの３次元ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管形成新芽形成を示す蛍光顕微鏡写真である。パネルは同時培養ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ＋レトロＧＦＰ形質導入ＳＭＣ（図１７ａ）、ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ＋レトロＶＥＧＦ−ＧＦＰ形質導入ＳＭＣ（図１７ｂ）、ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ＋レトロＡｎｇ１−ＧＦＰ形質導入ＳＭＣ（図１７ｃ）、ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ＋レトロＡｎｇ１−ＧＦＰ形質導入ＳＭＣ（図１７ｄ）。内皮細胞およびＳＭＣはそれぞれ赤および緑の蛍光で示す。各実験群の代表的な４８時間試験を示す。
図１８ａ−ｈは血清枯渇条件下における血管形成分化増殖因子を過剰発現するウィルスで形質転換された血管細胞の同時培養物の生存性を示す蛍光顕微鏡写真である。パネルは以下の通り：ｒＡｄＧＦＰ感染ＳＭＣ（図１８ａ）、ｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰ感染ＳＭＣ（図１８ｂ）、ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｃ）、ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｄ）、同時培養ｒＡｄＧＦＰ感染ＳＭＣ＋ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｅ）、同時培養ｒＡｄＧＦＰ感染ＳＭＣ＋ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｆ）、同時培養ｒＡｄＡｎｇ１‐ＧＦＰ感染ＳＭＣ＋ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｇ）および同時培養ｒＡｄＡｎｇ１‐ＧＦＰ感染ＳＭＣ＋ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｈ）。
図１９ａ−ｈは血清枯渇２４時間後のＡｎｇ−１を過剰発現するようにレトロウィルスで形質導入されたＴＵＮＥＬ−染色ＥＣの増強された生存性を示す光学顕微鏡写真（図１９ａ、１９ｃ、１９ｅおよび１９ｇ）および蛍光顕微鏡写真（図１９ｂ、１９ｄ、１９ｆおよび１９ｈ）である。添加血清の存在下および非存在下（それぞれ図１９ａ−ｂおよび１９ｃ−ｄ）で培養した非形質導入ＥＣおよび添加血清の存在下および非存在下（それぞれ図１９ｅ−ｆおよび１９ｇ−ｈ）で培養したレトロＡｎｇ１−ＧＦＰ形質導入ＥＣを示す無作為の視野を示した。アポトーシス細胞は緑色の蛍光で示す。
図２０はＡｎｇ−１を過剰発現するようにレトロウィルスで形質導入されたＥＣにおけるアポトーシス率を示すヒストグラムである。結果は前の図に示したＴＵＮＥＬ試験のデータの定量値を示す。実験群は以下の通り：添加血清の存在下または非存在下［それぞれ血清（＋）または血清（−）］で培養した非形質導入ＥＣ、レトロＡｎｇ１‐ＧＦＰ形質導入ＥＣ。結果は６つの無作為に選んだ顕微鏡視野において計数した総細胞集団中のアポトーシス細胞の比率を示す。
【００６０】
好ましい実施例の態様
本発明は核酸構築物、それにより形質転換された血管細胞であり、これらは血管形成を誘発するために利用することができる。特に本発明は閉塞、傷害または虚血の状態の哺乳類組織をバイパスする、または、貫通することの可能な新しい血管の形成を誘発するために利用することができる。
【００６１】
本発明の原理および作用は図面および附属の説明を参照することによりより良好に理解される。
【００６２】
本発明の少なくとも１つの実施態様を詳細に説明する前に理解しておくべきことは、本発明は、以下の説明に記載した、または図面に示した要素の構築および配置の詳細への適用に限定されないことである。本発明は他の実施態様も可能であり、種々の方法で実施することができる。更にまた、本明細書において使用する表現や用語は説明を目的としたものであり、限定的な意味を有さない。
【００６３】
血管形成を誘発および調節するための従来技術の非外科的方法は血管の閉鎖、障害または虚血の治療において既に一般的な慣行になっている。
【００６４】
このような方法には使用する血管形成因子の種類および／または慣行されている投与方法に固有の制約がある。
【００６５】
従来技術の方法に固有の制約を克服するために、本発明は血管組織の生成を促進するための新しい方法を提案するものであり、その方法は個体の治療すべき部位にＶＥＧＦおよびＡｎｇ−１を含む血管形成因子２種以上を提供することにより行うことができる。好ましくは、提供される血管形成因子は治療部位に投与されたｅｘ−ｖｉｖｏ形質転換内皮細胞および平滑筋細胞により発現され、分泌される。
【００６６】
即ち、本発明の１つの特徴によれば、ＶＥＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２１２２１）、ＨＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ１４０１２）、ＰｌＧＦ［２８］（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ５４９３６）、ＶＥＧＦ−Ｃ［３０］（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ００５４２９）、ｂＦＧＦ［３１］（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ０４５１３）、ａＦＧＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｓ６７２９１）、レプチン［３２］（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＸＭ０４５４２６）または内皮細胞の増殖および移行をもたらす他の因子のような、ただしこれらに限定されない、血管形成増殖因子をコードする第１のポリヌクレオチドセグメント；および、アンジオポエチン−１、ＴＧＦ−βファミリー（ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β受容体−２、エンドグリン、Ｓｍａｄ５）［３３］、ＶＥ‐Ｃアドヘリン［３４］、エフリンＢ２［３５］、ＰＤＧＦ［３６］、Ｂｍｘチロシンキナーゼ［３７］、ＭＣＰ−１［３８］または血管の成熟および安定化をもたらす他の因子のような、ただしこれらに限定されない、血管形成成熟因子をコードする第２のポリヌクレオチドセグメントを含む核酸発現構築物が提供される。
【００６７】
本発明のこの特徴の１つの好ましい実施態様によれば、血管形成増殖因子および血管形成成熟因子は核酸構築物に含まれる単一のプロモーター配列から発現される。
【００６８】
種々の構築物スキームを利用することにより単一のプロモーター配列からの第１および第２のポリヌクレオチドセグメントの同時発現を行なうことができる。
【００６９】
例えば、第１および第２のポリヌクレオチドセグメントをＩＲＥＳ配列の下流のポリヌクレオチドセグメントの翻訳を可能とする内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）配列を含むリンカー配列を介して転写可能に融合することができる。この場合、血管形成増殖因子および血管形成成熟因子の双方のコード配列を含む転写されたポリシストロニックＲＮＡ分子を５’キャップ末端およびポリシストロニックＲＮＡ分子の内部ＩＲＥＳ配列の両方から翻訳することにより血管形成増殖因子および血管形成成熟因子の両方を生成することができる。
【００７０】
或いは、第１および第２のポリヌクレオチドセグメントは核酸構築物で形質転換すべき細胞により発現されるプロテアーゼにより切断することができるプロテアーゼ認識部位を介して翻訳可能に融合することができる。この場合、翻訳されたキメラポリペプチドは細胞が発現したプロテアーゼにより分解され、これにより血管形成増殖因子と血管形成成熟因子の両方が生成される。
【００７１】
本発明のこの特徴の別の好ましい実施態様によれば、血管形成増殖因子と血管形成成熟因子がおのおの個別に専用のプロモーター配列から転写されるように、核酸構築物は２つの同じか異なるプロモーター配列を含む。
【００７２】
血管形成増殖因子および血管形成成熟因子の発現には２つの個別の核酸構築物が関与すると考えなければならない。
【００７３】
即ち、本発明の別の特徴によれば、核酸構築物系が提供される。この場合、血管形成増殖因子をコードする第１のポリヌクレオチドセグメントは第１のプロモーター配列を介して第１の核酸構築物から発現され、血管形成成熟因子をコードする第２のポリヌクレオチドセグメントは第１のプロモーター配列と異なるか同じであることができる第２のプロモーター配列を介して第２の核酸構築物から発現される。
【００７４】
以下に更に説明する通り、本発明の核酸構築物は、例えば内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、筋細胞、単球、線維芽細胞、胚性幹細胞または骨髄幹細胞のような哺乳類細胞を形質転換するために利用される。この点において、本発明の核酸構築物により利用されるプロモーター配列は好ましくは上記哺乳類細胞型において機能可能な構成的、組織特異的または調節可能な（例えば誘導可能な）プロモーターである。
【００７５】
本発明の核酸構築物を生成するためには、血管形成増殖生育因子および／または血管形成成熟因子をコードするポリヌクレオチドセグメントを哺乳類細胞の形質転換に適し、形質転換細胞内部での上記因子の発現を意図した市販の発現ベクター系に連結することができる。このような市販のベクター系は一般的に用いられている組み換え技術により容易に修飾することができ、これにより、既存のプロモーターまたはエンハンサーの配列を置き換え、複製または突然変異させることができ、そして／または、例えば別の選択マーカーをコードする配列またはレポーターポリペプチドをコードする配列のような更に別のポリヌクレオチド配列を導入することができる。
【００７６】
本発明の使用に適する哺乳類の発現ベクターは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎより入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、Ｐｒｏｍｅｇａより入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能なｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈより入手可能なｐＴＲＥＳおよびこれらの誘導体であるが、これらに限定されない。
【００７７】
本発明によれば、血管形成増殖因子および血管形成成熟因子を虚血組織領域に提供することによりその内部に血管形成を誘発する。
【００７８】
ｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子転移に関わる安全性の問題を回避するため、そして、新しい血管の形成を増強するために、血管形成因子は好ましくは採取され、ｅｘ−ｖｉｖｏで形質転換された血管細胞から得る。
【００７９】
このような形質転換細胞は例えばＢｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  （ＵＳＡ）により製造された灌流カテーテルと原理的に同様の特別に設計されたデリバリーカテーテルを用いて治療すべき組織領域の内部または周囲に細胞を直接注入することにより、新しい血管の形成の誘発のために利用することができる。
【００８０】
即ち、本発明の別の特徴によれば、血管形成増殖因子少なくとも１つおよび血管形成成熟因子少なくとも１つを発現するように遺伝子的に形質転換された細胞の集団が提供される。
【００８１】
細胞の採取後の異種の組織のｉｎ  ｖｉｖｏの形質転換も本発明で用いることができるが、好ましくは細胞はｅｘ−ｖｉｖｏで形質転換する。
【００８２】
本明細書においては、「遺伝子的に形質転換された」とう表現は外来のポリヌクレオチド配列で一過性に、または、安定して形質転換された細胞を指す。安定な形質転換においては、外来のポリヌクレオチド配列は細胞のゲノムに組み込まれ、そのまま娘細胞に遺伝子的に受け継がれるが、一過性の形質転換の場合は、外来のポリヌクレオチド配列は核または原形質の分子として一過性に存在し、そのまま娘細胞に遺伝子的に受け継がれるわけではない。
【００８３】
本発明の核酸構築物は如何なる標準的な哺乳類形質転換方法により細胞集団に導入することもできる。このような方法としては、限定はされないが、例えば直接ＤＮＡ取りこみ法およびウィルスまたはリポソーム媒介形質転換が挙げられる（詳細は例えばＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．１−３１７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ参照）。
【００８４】
本発明のこの特徴によれば、細胞集団は１種以上の細胞型を含む。血管の生成と成熟は数種の血管形成因子を発現する幾つかの細胞型が関与する段階的な過程であるため、本発明の細胞集団は好ましくは２種の異なる血管細胞型を含むものであり；第１の細胞型は例えば内皮細胞であり、そして第２の細胞型は例えば平滑筋細胞、周皮細胞または筋細胞である。
【００８５】
好ましくは、細胞集団の各々の細胞型は特定の血管形成因子を発現する。例えば、第１の細胞型は血管形成増殖因子を発現するための核酸で形質転換され、第２の細胞型は血管形成成熟因子を発現するための核酸で形質転換される。
【００８６】
しかしながら、血管形成増殖因子および血管形成成熟因子が両方の細胞型から発現される細胞集団、または、一方の細胞型が両方の因子を発現し、他方の細胞型が１つのみの因子を発現する細胞集団もまた本発明に包含される。
【００８７】
以下に更に詳述する通り、本発明の細胞集団は例えば組織領域への供給路である血管内の閉塞部をバイパスするかまたは貫通するために個体の組織領域に投与する。後の実施例の項で更に詳述する通り、このような投与は閉塞血管内部に直接行なうか、または、閉塞血管周囲の組織内に行なうことができる。
【００８８】
この点に関し、細胞集団の細胞型は好ましくは治療すべき個体の静脈または動脈組織または骨髄組織、または、同系の個体の組織に由来するものである。異種の細胞も細胞集団の調製のために利用することができるが、ただし、治療された個体によるその細胞の拒絶を回避するために投与の前、または投与中に手段を講じなければならない。
【００８９】
本発明の別の特徴によれば、個体の組織領域内の新しい血管の形成を誘発するための方法が提供される。
【００９０】
新しい血管の発生は各細胞型およびより重要なものとして各血管形成因子のタイムリーな提供に依存しているため、本発明の方法は好ましくは治療すべき組織領域においてそのような条件を発生させるために最も適する態様で行なう。
【００９１】
即ち、本発明の１つの好ましい実施態様によれば、血管形成は、個体の組織領域内部に血管形成増殖因子少なくとも１つを発現するように遺伝子的に形質転換された第１の細胞型を投与すること、次いで、個体の組織領域に血管形成成熟因子少なくとも１つを発現するように遺伝子的に形質転換された第２の細胞型を投与することにより行う。
【００９２】
第１の細胞型は好ましくは第２の細胞型の投与より１２時間〜２週間前に投与する。これにより、治療すべき組織への血管形成増殖因子および血管形成成熟因子のタイムリーな提供が確実になり、これにより血管形成のための最適条件が確保される。
【００９３】
血管形成因子のタイムリーな提供はまたエフェクターにより調節可能なプロモーター配列から血管形成因子を発現する細胞型１種以上を投与することによっても行なうことができる。
【００９４】
本明細書においては、「エフェクター」という用語または「調節因子」という表現は、このようなエフェクターにより調節されるプロモーター配列からのポリヌクレオチド配列の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートすることのできる分子または物理的条件（例えば光、生物力学的ストレスなど）を互換的に指すものとする。本発明で使用できる調節可能なプロモーターの例は、化学的に調節されるプロモーター、例えばＡｇｈａ−Ｍｏｈａｍｍａｄｉ  Ｓ，  Ｌｏｔｚｅ  ＭＴ．  調節可能な系：遺伝子治療およびウィルス複製への応用（Ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ：  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓｅｓ）．  Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ２０００；  １０５：１１７７−１１８３に記載のテトラサイクリン調節性プロモーター系および生物力学的に調節されるプロモーター、例えばＲｅｓｎｉｃｋ等、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ９０：４５９１−４５９５，１９９３に記載の剪断応力応答性エレメントを包含する。
【００９５】
後の実施例の項で更に詳述する通り、１種以上の細胞型は調節可能なプロモーター配列から血管形成因子を発現する核酸構築物を用いて形質転換することができる。このようなプロモーターは、治療すべき組織領域への細胞型の投与の後に血管形成因子の発現をアップレギュレートまたはダウンレギュレートして新しい血管の形成を誘発するのに適する所望の一時的発現パターンが得られるように選択する。
【００９６】
即ち、例えば、血管形成増殖因子の発現は第１の調節因子により調節することができ、そして、血管形成成熟因子の発現は第２の調節因子により調節することができる。
【００９７】
このような調節因子は細胞の投与後の種々の時点で利用することができ、これにより血管形成因子の各々に対し異なる発現パターンを得ることができる。
【００９８】
或いは、プロモーター配列は、血管形成成熟因子の発現がある因子によりアップレギュレートされ、血管形成増殖因子の発現が同じ因子によりダウンレギュレートされるように選択することもできる。即ち、この場合、単一の調節因子を用いて血管形成因子の各々に対し異なる発現パターンを得ることができる。
【００９９】
調節可能なプロモーターはその調節が治療すべき組織領域への細胞の投与の後に起こることができるように選択しなければならない。即ち、血管形成の最中に発生する条件、例えば細胞対細胞の相互作用に関わる力により調節可能なプロモーター、または、治療すべき個体の組織領域または血流の何れかに安全に提供できる外部から投与された因子により調節されることのできるプロモーターが好ましい。
【０１００】
即ち、本発明は虚血組織を治療するための新しい方法を提供する。血管の形成を促進しながら細胞の生存性を改善する因子を過剰発現するように遺伝子的に形質転換された血管細胞による虚血臓器への栄養供給を行なうことは従来技術が意図した遺伝子転移方法よりも合理的で安全な方法である。内皮細胞と平滑筋細胞の組み合わせ、および、それによる２種の異なる遺伝子の発現により、投与された細胞と漸増した細胞との間の協力が確保され、これにより血管の形成と維持が確保される。
【０１０１】
上記した血管形成増殖および成熟因子は投与された細胞から発現されるのが好ましいが、このような因子はまた、化学的に合成されるか、またはこのような因子を発現するトランスジェニックな原核細胞または真核細胞の宿主から抽出したポリペプチド調製品として投与することもできる。
【０１０２】
好ましくは、ポリペプチド調製品は医薬組成物の部分を構成する。このような医薬組成物はポリペプチド因子のターゲティングを安定化し増強する作用を有する製薬上許容しうる担体を含む。
【０１０３】
適当な担体の例としては生理食塩水、リポソーム、ミセル体、ウィルス粒子等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０４】
本発明の医薬組成物は当該分野で知られる如何なる方法で投与することもできる。好ましくは、組成物は前述した通り投与すべき組織領域の内部または周囲に注入する。
【０１０５】
即ち、本発明は、新しい血管の形成または閉塞または狭窄した血管組織領域の再疎通を促進するために使用することができる方法を提供する。
【０１０６】
本発明はバイパス手術や血管形成術よりもかなり侵襲性が低いため、このような外科的処置に伴う危険性を回避することができる。
【０１０７】
本発明の更に別の目的、利点および新しい特徴は限定する意図のない後述する実施例を検討することにより当該技術者には自明のものである。更にまた、上記した、および、請求項に記載した、本発明の種々の実施態様および特徴の各々は後述する実施例において実験的に裏付けられる。
【０１０８】
実施例
以下の実施例と上記した説明を参照することにより、非限定的な態様で本発明を説明する。
【０１０９】
一般的に、本明細書において使用した名称および本発明において用いた実験手法は分子学、生物化学、微生物学および組み換えＤＮＡ技術を含む。このような技術は文献に十分記載されている。例えば“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、（１９８９）；  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＩＩ  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．，  ｅｄ．  （１９９４）；  Ａｕｓｂｅｌ等、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｍａｒｙｌａｎｄ  （１９８９）；  Ｐｅｒｂａｌ，  “Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）；  Ｗａｔｓｏｎ等、“Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ”、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｂｉｒｒｅｎ等、（ｅｄｓ）、“Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ”，  Ｖｏｌｓ．  １−４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９８）；  米国特許４６６６８２８号；４６８３２０２号；４８０１５３１号；５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載の方法；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”，  Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．，  ｅｄ  （１９９４）；  “Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌ．Ｉ−ＩＩＩ  Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．，  ｅｄ  （１９９４）；  Ｓｔｉｔｅｓ等、（ｅｄｓ），  “Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  （第８版），  Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，  Ｎｏｒｗａｌｋ，  ＣＴ（１９９４）；  Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓｈｉｉｇｉ  （ｅｄｓ），  “Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，  Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  ＣＯ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８０）を参照することができ、そして；使用できる免疫検査は特許および学術文献に詳述されており、例えば米国特許３７９１９３２号；３８３９１５３号；３８５０７５２号；３８５０５７８号；３８５３９８７号；３８６７５１７号；３８７９２６２号；３９０１６５４号；３９３５０７４号；３９８４５３３号；３９９６３４５号；４０３４０７４号；４０９８８７６号；４８７９２１９号；５０１１７７１号および５２８１５２１号を参照でき；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，  Ｇａｉｔ，  Ｍ．Ｊ．，  ｅｄ．  （１９８４）；  “Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，  ｅｄｓ．  （１９８５）；  “Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”  Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．，  ｅｄｓ．  （１９８４）；    “Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｌｕｔｕｒｅ”  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．，  ｅｄ．  （１９８６）；  “Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  （１９８６）；  “Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”  Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．，  （１９８４）および“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌ．１−３１７，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；  “ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｈｔｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  （１９９０）；  Ｍａｒｓｈａｋ等、“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ”  ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ  （１９９６）が参照され；これらは全て、その内容全体が参考により本明細書に組み込まれる。その他の一般的な参考文献は本明細書を通じて示したものである。そこに記載される手法は当該技術者のよく知るものであるが、読者の便宜のために示されている。そこにふくまれる情報の全ては参考により本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
実施例１
発現ベクターおよびウィルス粒子
前述した通り、本発明の実施態様は虚血、傷害または閉塞組織中の血管形成を誘発するためのＶＥＧＦおよびＡｎｇ−１を発現する形質転換血管細胞を利用する。以下に示す実施例は血管細胞を採取し、コンディショニングし、そして、形質転換するための方法、および、血管形成を促進する際にそのような細胞を利用する方法を概説するものである。
【０１１１】
材料および方法
ＶＥＧＦ１６５−ＧＦＰ遺伝子を発現するレトロウィルスベクターの調製：
図１は本発明のＶＥＧＦ−ＧＦＰ発現ベクター構築物を示す。ヒトＶＥＧＦ１６５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＢ０２１２２１）および／またはＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｃａ，  ＵＳＡ）遺伝子を発現する組み換えレトロウィルスをＬＸＳＮプラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）に２つの異なるベクターを個別にクローニングすることにより構築した。ＧＦＰのみを発現するＬＸＳＮ系レトロウィルスベクターの構築のために、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）およびＧＦＰ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ１４００ｂｐのフラグメントをＬＸＳＮプラスミドマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）の特異的制限部位に挿入した。ＶＥＧＦ１６５およびＧＦＰ遺伝子を同時発現するＬＸＳＮ−ＶＥＧＦ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰビシストロニックプラスミド（図１）の構築のために、ＶＥＧＦ１６５（６００ｂｐ）をコードする２．０ｋＢのＥｃｏＲＩ−ＭｕｎＩフラグメントおよびＩＲＥＳおよびＥＧＦＰ配列をＬＸＳＮＭＣＳのＥｃｏＲＩ部位に連結した。これらのＬＸＳＮベクターによるトランスジーンの発現はＭｏＭＵＬＶ長末端リピート（ＬＴＲ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，  Ｃａ，  ＵＳＡ）により調節される。レトロウィルスベクター生成のために、ＬＸＳＮ−ＧＦＰまたはＬＸＳＮ−ＶＥＧＦーＧＦＰプラスミドＤＮＡ１０μｇを２９３Ｅ３エコトロピックパッケージング細胞にトランスフェクトし、４８時間インキュベートし、その後、Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＵＳＡ）耐性産生細胞の全面培養物の上澄みを採取し、濾過（０．４５μｍ）し、ＰＡ３１７両栄養性パッケージング細胞に添加した。形質導入された細胞をＧ４１８選択に付し、培養上澄みを更に４８時間培養後に採取し、ＥＣの高い形質導入効率でＧＡＬＶエンベロープを特徴的に発現し、そして、ヒト血清不活性化に対して耐性のＴＥＦＬＹＧＡ両栄養性パッケージング細胞を感染させるために用いた。形質導入されたＴＥＦＬＹＧＡ細胞のＧ４１８選択の後、個々のコロニーを採取し、ＧＦＰおよびＶＥＧＦ１６５の発現があるかどうかスクリーニングした。各コロニーのウィルス価をＴＥ６７１細胞形質導入により測定し、１０５〜１０６ｐｆｕ／ｍＬのウィルス価を得た。最も高いウィルス価を示したコロニーの上澄みを採取し、−８０℃で保存した。
【０１１２】
上記した段階は実施例６に記載する通り、Ａｎｇ−１発現ベクター構築物ＬＸＳＮ−Ａｎｇ１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（図２）の構築に適用する。
【０１１３】
パッケージング細胞系統の調製：パッケージング細胞系統は知られた方法で調製した。パッケージング細胞系統の詳細な説明は以下の文献：「アヒルプラークウィルスヘマグルチニンのネズミ白血病ウィルス粒子への組込みおよび偽形レトロウィルスの感染性の分析」、Ｔ．Ｈａｔｚｉｉｏａｎｎｏｕ，  Ｓ．Ｖａｌｓｅｓｉａ−Ｗｉｔｔｍａｎｎ，  Ｓ．Ｊ．，  ＲｕｓｓｅｌｌおよびＦ．−Ｌ．Ｃｏｓｓｅｔ，  １９９８，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ７２：５３１３−５３１７、「レトロウィルスベクターの逆ターゲティング：造血細胞および非造血細胞の混合集団における選択的遺伝子転移」、Ａ．Ｋ．Ｆｉｅｌｄｉｎｇ，  Ｍ．ｍａｕｒｉｃｅ，  Ｆ．Ｊ．Ｍｏｒｌｉｎｇ，  Ｆ．−Ｌ．ＣｏｓｓｅｔおよびＳ．Ｊ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，  １９９８，  Ｂｌｏｏｄ，  ９１：１８０２−１８０９、「融合誘発性テナガザル白血病ウィルスエンベロープ糖蛋白：リガンドディスプレーによる細胞毒性遺伝子のターゲティング」、Ｆｉｅｌｄｉｎｇ  ＡＫ，  Ｃｈａｐｅｌ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ  Ｓ．，  Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ＭＰ，  Ｂｕｌｌｏｕｇｈ  ＦＪ，  Ｃｏｓｓｅｔ  Ｆ−ＬおよびＲｕｓｓｅｌｌ  ＳＪ，  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ２０００；１１；８１７−８２６に記載されている。
【０１１４】
形質転換された細胞の調製：
自己内皮細胞の採取：ＥＣは５ｃｍの長さのヒト伏在静脈セグメントから採取する。細胞は以前に報告された通り［２７］コラゲナーゼ消化により採取する。３〜９回継代培養した細胞を収集することにより細胞の特性の安定性を確保する。細胞の同定はｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の免疫組織化学的試験により行なう。
【０１１５】
自己平滑筋細胞の採取：平滑筋細胞はヒト伏在静脈（ＨＳＶＳＭＣ）および内乳動脈（ＨＬＳＭＣ）からの外植体発芽後成長により培養した。細胞は１０％プールヒト血清（Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，  Ｉｓｒａｅｌ）を添加したダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｓｒａｅｌ）中で培養した。平滑筋細胞は抗筋アクチン抗体（Ｚｙｍｅｄ，  ＵＳＡ）を用いて同定した。
【０１１６】
ＶＥＧＦコードベクターによる骨髄前駆細胞感染：骨髄前駆細胞をＶＥＧＦ−ＧＦＰをコードする組み換えアデノウィルスベクターに感染させる。分化は感染細胞においてｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子の形態学的および免疫組織化学的試験により行なう。細胞の採取および新血管形成に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏの分化に関しては、Ａｓａｈａｒａ  Ｔ．等のＥＭＢＯ  Ｊ  １９９９；１８：３９６４−７２およびＨｕａｎｇ  ＸＬ，  Ｔａｋａｋｕｒａ  Ｎ，  Ｓｕｄａ  Ｔ．のＢｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  １９９９，  ２６４：１３３を参照できる。
【０１１７】
レトロウィルスベクターによるヒトおよびヒツジの伏在静脈ＥＣの形質導入：ＥＣをフィブロネクチンコーティングプレート（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）に播種（１０５個／３５ｍｍ皿）し、２０％胎児血清を含有するＭ１９９（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，ＵＳＡ）中で生育させた。２４時間後、形質導入の１時間前に細胞をカチオン性重合体ＤＥＡＲ‐デキストラン（０．１μＧ／ｍＬ）に曝露し、ＰＢＳで３回洗浄し、次にＶＥＧＦ−ＬａｃＺまたはＶＥＧＦ−ＧＦＰ遺伝子の何れかをコードする高ウィルス価の組み換えウィルスベクターで形質導入した。４時間３７℃ででインキュベートした後、ウィルス含有培地を２０％プールヒト血清を含有する新しい培地と交換した。図３ａ−ｂはそれぞれＬａｃＺ活性またはＧＦＰ蛍光により示されたＶＥＧＦ−ＬａｃＺまたはＶＥＧＦ−ＧＦＰ構築物からのトランスジーンの発現を示している。
【０１１８】
投与後の遺伝子発現の調節：エフェクター調節可能な発現系を用いてＥＣおよび／またはＳＭＣにおけるＶＥＧＦとＡｎｇ−１の遺伝子発現を調節する。例えば、ＶＥＧＦの発現はテトラサイクリンを介してダウンレギュレートされるのに対し、Ａｎｇ−１の発現はこれによりアップレギュレートされる。このような系を用いて、投与された細胞を細胞増殖を必要とする第１週においてＶＥＧＦを発現させ、細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ移植後１２時間〜２週間にテトラサイクリンをｉｎ  ｖｉｖｏ投与するとＶＥＧＦの発現がダウンレギュレートされ、Ａｎｇ‐１の発現がアップレギュレートされて細胞の成熟が促進される（Ａｇｈａ−Ｍｏｈａｍｍａｄｉ  Ｓ，  Ｌｏｔｚｅ  ＭＴ．  「調節可能な系：遺伝子治療の応用とウイルスの複製（Ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ  ｓｙｓｔｅｍｓ：  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｖｉｒｕｓｅｓ）」，  Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ  ２０００，  １０５：１１７７）。
【０１１９】
実施例２
形質転換された細胞の分析
組み換え蛋白発現の分析：遺伝子的に修飾された細胞の培養物から採取した上澄み中のＶＥＧＦおよびＡｎｇ−１の量を測定する。ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析を用いて２４時間の期間にわたるＶＥＧＦまたはＡｎｇ−１の生産を測定した。ドナーへの形質転換細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ再注入の後、採血してＶＥＧＦとＡｎｇ‐１の濃度をＥＬＩＳＡ分析する。
【０１２０】
実施例３
動物実験
ｉｎ  ｖｉｖｏ動物実験：実験動物の短静脈セグメント（ウサギまたはヒツジの後肢由来）を用いて内皮細胞を採取する。ＥＣの代替の原材料は吸引により抽出した骨髄または循環している内皮細胞前駆体である。採取された細胞をＶＥＧＦ存在下に生育させ、細胞の分化および／または増殖を増強させる。細胞を実験室内で増殖させ、ＶＥＧＦおよびＡｎｇ−１をコードする偽形のレトロウィルスベクターを用いて遺伝子的に修飾する。
【０１２１】
実験動物の各後肢の浅大腿動脈を深大腿動脈の分岐部直後で結紮する。血流をドップラーフローメーター（Ｔｒａｎｓｏｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｌｏｗｍｅｔｅｒ，  ＮＹ，  ＵＳＡ）を用いて結紮の両側で測定する。流量測定後、種々の相対的発現量でＶＥＧＦとＡｎｇ−１を発現する同種または異種の血管細胞の集団を投与四肢の１つ目に注入し、マーカーポリペプチドを発現する対照細胞集団またはＰＢＳを２つ目の四肢に注入する。注入は深大腿動脈の近位に行なう。細胞の投与後３、７、１４および３０日に両方の四肢において流量を測定する。総大腿動脈における流量増大は血管形成が起こっていることを示す。
【０１２２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ形態学的変化の評価：ｉｎ  ｖｉｖｏの実験の後、造影剤を用いて得たデジタル化された血管造影図のコンピューター分析を用いて新しい血管の形成を評価する。対象となる組織の顕微鏡切片にマーカーポリペプチドの発現（例えばＧＦＰ）により同定される移植細胞が存在するかどうか調べる。新しく形成された血管の種類および成熟段階をその血管の形態（細胞型の存在、弾性膜の数など）に基づいて評価する。
【０１２３】
実施例４
治療方法
材料および方法：
３種類の方法を用いて閉塞血管の治療を行なうことができる（図４ａ）。図４ｂは単一の閉塞血管を治療するための従来技術のバイパス手術を示している。図４ｃは本発明の方法を用いて閉塞血管をバイパスするか、貫通させるための代替治療法を示している。
【０１２４】
図４ｃは閉塞血管内またはその周囲に血管形成増殖因子少なくとも１つおよび血管形成成熟因子少なくとも１つを発現する血管細胞を投与した結果としての閉塞組織中の血管形成を示している。このような投与により、１０に示すとおり血管の再疎通が可能となるか、または、２０に示すとおり閉塞部周囲のバイパスの形成が可能となる。
【０１２５】
３０に特に示されるとおり、本発明の血管形成はまた閉塞血管から非閉塞血管を相互連絡する血管架橋の形成をもたらすことができ、これにより効果的に閉塞を回避でき、閉塞血管が供給路となっていた標的組織への血流を再樹立することができるのである。
【０１２６】
上記した代替法の何れの場合も、閉塞または傷害血管が供給路となっていた組織領域に血流の供給を再開するために利用することができる。更にまた、本発明の方法は以前にバイパス手術または血管形成術により治療されていた血管の場合にも血流の再開のために利用することができる。
【０１２７】
実施例５
ＶＥＧＦを過剰発現するように遺伝子的に修飾されたＥＣにより誘発されたｉｎ  ｖｉｖｏの血管形成
本発明の方法は最適な新血管形成を誘発するように遺伝子的に修飾されたＥＣの投与により閉塞血管疾患を治療するように考案されている。従って、本発明の方法を適用する事により閉塞血管への血流の再開を以下の通り行なった。
【０１２８】
体重４００〜４５０ｇの雄性または雌性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄｏｌｌｙラット（Ｈａｒｌａｎ，  Ｉｓｒａｅｌ）をケタミンまたはキシラジンを用いて麻酔した。これらのラットの大腿動脈を大貫通動脈の遠位に外科的に結紮した。次にラットにＶＥＧＦ１６５をコードする組み換えアデノウィルスベクター（１０９ｐｆｕ）、ＧＦＰをコードする組み換えアデノウィルスベクター（１０９ｐｆｕ）または通常の生理食塩水を注入した。注入は結紮したセグメントの近位の大腿動脈の側枝に直接行なった（図５ａ）。大腿動脈中の血流はドプラーフローメーターを用いて注入後３、７および１４日に測定した。ＶＥＧＦを発現する組み換えアデノウィルスベクターを投与したラットにおいて測定した血流はＧＦＰをコードする組み換えアデノウィルスベクターまたは生理食塩水を注入したラットで測定したものよりも有意に高値であった（図５ｂ参照）。注入後のＶＥＧＦの局所的発現は筋肉組織抽出液のＲＴ−ＰＣＲにより、そして、ＥＬＩＳＡによる血漿中のＶＥＧＦの量を測定することにより確認した（データは示さず）。
【０１２９】
従って、これらの結果は、前血管形成因子を過剰発現するように遺伝子的に修飾されたＥＣを用いて閉塞血管の新血管形成を誘発することによる閉塞血管疾患の治療における本発明の方法の有効性を示している。本発明の遺伝子的に修飾された細胞はまた虚血臓器内に投与することもでき、これにより有害である可能性のあるウィルスベクターの血流中への注入の必要性を回避でき、かつ、生存性の高い活性化された血管細胞を虚血臓器に供給することができるのである［４０］。
【０１３０】
実施例６
ウィルスベクターで遺伝子的に修飾されたＥＣおよびＳＭＣにおける血管形成分化因子Ａｎｇ‐１の発現
理想的には、閉塞血管疾患のような血管疾患の治療は血管の不全をバイパスするかまたは軽減するような新しい血管の形成により行なうことができる。しかしながら、従来技術の方法を用いたｉｎ  ｖｉｖｏの新血管形成過程の誘発は解決されていない問題点をなお有している。本発明の方法は血管の生来の生育の間の血管細胞により使用される複数の前血管形成刺激の利用を介してこのような新血管形成を誘発するように考案されている。このような前血管形成刺激は前血管形成分化因子Ａｎｇ−１およびＥＣ生育因子ＶＥＧＦにより与えられる。即ちこのような因子を発現する血管細胞は、これらが前駆細胞からの血管組織の分化およびその後の生育の双方を誘発し、これにより必要な治療用の血管の形成を可能にすることから、理想的な治療様式である。
【０１３１】
従って、閉塞性の血管疾患の治療のための血管細胞における前血管形成因子の発現を起こすために、以下に記載の通りＡｎｇ‐１およびＶＥＧＦの発現のためのウィルスベクターを構築し、ＥＣおよびＳＭＣ中での発現を行なった。
【０１３２】
材料および方法：
ヒトＳＭＣからのＡｎｇ‐１ｃＤＮＡのクローニング：ヒトＡｎｇ‐１ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８３５０８のヌクレオチド座標３１０〜１８０６）をヒト伏在静脈ＳＭＣから抽出した総ＲＮＡからＡＭＶ逆転写酵素（ＲＴ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，  ＵＳＡ）を用いて逆転写した。簡単に説明すると、ＲＮＡ２μｇをランダムヘキサマー５００ｎｇと混合し、混合物を１０分間７０℃で加熱し、氷冷した。この予備加熱したＲＮＡに０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、ＡＭＶ−ＲＴ５単位、５ｍＭ  ＤＴＴ、ＲＮＡａｓｅ  ｏｕｔ  （Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，  ＵＳＡ）３２単位および１  ｘ  Ｐｒｏｍｅｇａ  ＲＴ緩衝液を含有する反応混合物を添加した。得られた混合物を２時間３８℃で、次いで１５分間９５℃でインキュベートした。
【０１３３】
前段階のｃＤＮＡ産物をＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ，  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いてＰＣＲ増幅した。増幅には以下のプライマー：５’−ＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＧＧＴＣＧＡＡＴ−３’（配列番号１）および５’−ＡＧＡＴＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＡＧＴＴ−３’（配列番号２）を用いた（下線部の配列はクローニングに用いたＢｇｌＩＩ切断部位を示す）。ＰＣＲはＲＴ反応混合物ｃＤＮＡ産物テンプレート７μＬ、各プライマー２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  ５ｎｍｏｌｅ、１Ｕ  Ｅｘ−Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）および製造元の提供したＰＣＲ反応緩衝液を含有する容量２０μＬ中で行なった。ＰＣＲ反応は以下の通り、即ち：９４℃／２’→１０ｘ：［９４℃／３０”→５０℃／３０”→７２℃／１’］→２４ｘ：［９４℃／３０”→５６℃／３０→７２℃／（６０”＋５”／サイクル）］→７２℃／１０’で行なった。１５００ｂｐのヒトＡｎｇ−１ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ８３５０８のヌクレオチド座標３１０〜１８０６）をｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）内にサブクローニングした。ＰＣＲ産物の鎖２本とも配列決定したところ、報告されている配列と１００％同一であった。
【０１３４】
組み換えベクターの作成
Ａｎｇ‐１遺伝子をコードする組み換えアデノウィルスベクターの作成：ヒトＡｎｇ−１遺伝子の発現のための組み換えアデノウィルスベクターを、通常の原核細胞クローニングおよび２９３細胞系統における相同組み換え法よりなる数段階で構築した。ヒトＡｎｇ−１ｃＤＮＡを含む１５００ｂｐのフラグメントを構成的ＣＭＶ即時型プロモーターの制御下にｐＣＡ３プラスミド内に挿入した。得られたプラスミドをアデノウィルスＥ１遺伝子を構成的に発現する２９３細胞内にプラスミドｐＪＭ１７を用いてコトランスフェクトした。プラスミドｐＪＭ１７は、Ｅ３領域を除いた、そして、ウィルスのＥ１領域のインサート（ｐＢＲＸ）を含む、アデノウィルスゲノムを含んでいる。トランスフェクト後のＡｎｇ‐１をコードするｐＣＡ３とｐＪＭ１７との間の相同組み換えによりｐＪＭ１７のＥ１領域とｐＣＡ３由来のＣＭＶ−Ａｎｇ−１発現カセットとが入れ替わる。コトランスフェクションの２〜４週間後にプラークの形成が起こり、その後、各プラークを単離し、ウィルス抽出液をそこから２９３細胞感染により増幅させた。各ウィルス保存溶液のウィルス価は２９３細胞におけるプラーク試験により測定し、ウィルス価〜１０１１ｐｆｕ／ｍＬが得られた。
【０１３５】
形質転換細胞の生育培地中のＡｎｇ−１蛋白の発現は、ウエスタンブロット分析により確認した。
【０１３６】
Ａｎｇ‐１およびＧＦＰ遺伝子の両方をコードする組み換えアデノウィルスベクターの作成：ヒトＡｎｇ‐１およびＧＦＰ遺伝子をコードする組み換えアデノウィルスベクターｒＡｄＡｎｇ１‐ＧＦＰをＡｄＥａｓｙプロトコールの変法を用いて構築した（Ｈｅ  ＴＣ．等、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  １９９８，  ９５：２５０９）。簡単に説明すると、ＣＭＶプロモーターの制御下に発現するためにｐＡｄＴｒａｃｋ−ＣＭＶシャトルベクターのＢｇｌＩＩ部位にヒトＡｎｇ−１ｃＤＮＡの１５００ｂｐＢｇｌＩＩフラグメントを挿入した。このシャトルベクターは第２のＣＭＶプロモーターの制御下のトランスジーンの下流にＧＦＰ遺伝子をコードしている。Ａｎｇ−１‐ＧＦＰコードシャトルベクターをＰｍｅＩ消化により線状化し、Ｑｉａｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｉｔｏｎ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）で精製した。コンピテントなＢＪ５１８３細胞をエレクトロポレーションにより、線状化したＡｎｇ−１−およびＧＦＰ−コードシャトルベクターおよびアデノウィルスベクターｐＡｄＥａｓｙ−１で共形質転換した。Ａｎｇ‐１およびＧＦＰ遺伝子をコードする組み換えアデノウィルスベクターを発現する形質転換体をＰＣＲ分析および制限酵素マッピングにより同定した。組み換えアデノウィルスベクターをＰａｃＩ消化により線状化し、精製し、リポフェクタミン２０００（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＵＳＡ）を用いて２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後７日に、細胞障害作用が起こり、この時点で細胞の１００％がＧＦＰを発現した。細胞を採取し、ウィルス抽出液を調製し、ウィルス抽出液で２９３細胞を感染させる事によりウィルス生産を更に増幅した。ウィルス保存溶液のウィルス価を２９３細胞の連続希釈試験により測定し、〜１０１１ｐｆｕ／ｍＬのウイルス価を得た。トランスジーンの発現は感染細胞コンディショニング培地のウエスタンブロット分析により確認した。
【０１３７】
レトロウィルス発現ベクターにおけるＡｎｇ−１遺伝子のクローニング：レトロウィルスプラスミドベクターｐＬＸＳＮ（＃Ｋ１０６０−Ｂ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＵＳＡ）のＢａｍＨＩ部位に１５００ｂｐのヒトＡｎｇ−１ＢｇｌＩＩｃＤＮＡフラグメントをクローニングすることによりＭｏ−ＭＵＬＶ５’長末端リピート（ＬＴＲ）の調節制御下にヒトＡｎｇ−１遺伝子を発現する組み換えレトロウィルスベクターｐＬＸＳＮ−Ａｎｇ−１を構築した。
【０１３８】
Ｍｏ−ＭＵＬＶ５’長末端リピート（ＬＴＲ）の調節制御下にヒトＡｎｇ−１およびＥＧＦＰ遺伝子の両方をコードする組み換えビシストロニック性のレトロウィルスベクターを、以下に記載の通り、２段階の工程においてｐＬＸＳＮレトロウィルスプラスミドに上記遺伝子をクローニングすることにより構築した。第１に、ｐＩＲＥＳ２−ＥＧＦＰ（＃６０２９−１，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から切り出した内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）−ＥＧＦＰ  ＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩフラグメント（１４００ｂｐ）を、対照プラスミドｐＬＸＳＮ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰの構築のためにｐＬＸＳＮのＥｃｏＲＩ−ＨｐａＩ内に挿入した。第２段階において、ｐＬＸＳＮ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰのＥｃｏＲＩ部位にヒトＡｎｇ−１の１３６１ｐｂのＥｃｏＲＩフラグメントをクローニングすることによりｐＬＸＳＮ−Ａｎｇ−１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰを構築した。
【０１３９】
ヒトＡｎｇ−１遺伝子の発現のための偽形レトロウィルスの作成：レトロウィルスベクターの生成のために、ｐＬＸＳＮ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ、ｐＬＸＳＮ−Ａｎｇ−１−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰまたはｐＬＸＳＮ−Ａｎｇ−１レトロウィルスベクタープラスミド１０μｇをリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＵＳＡ）を用いて２９３ＦＬＹＡパッケージング細胞内にトランスフェクトした。４８時間後、ウィルス産生細胞の全面培養物の上澄みを採取し、０．４５μｍで濾過し、２９３ＦＬＹ１０Ａまたは２９３ＦＬＹＧＡＬＶ両栄養性パッケージング細胞に添加した。形質導入された細胞をＧ４１８選択に付し、個々のコロニーを採取し、蛍光顕微鏡観察によりＥＧＦＰ発現があるものをスクリーニングし、そして、形質導入細胞コンディショニング培地試料のウエスタンブロット分析によりＡｎｇ−１発現を確認した。ＴＥ６７１細胞の形質導入により測定したウィルス価は１０５〜１０６ｐｆｕ／ｍＬの範囲であることがわかった。最も高いウィルス価を有するコロニーの上澄みを採取し、−８０℃で凍結した。
【０１４０】
遺伝子移転後のトランスジーン発現の確認：
細胞培養：ヒト伏在静脈ＥＣ（ＨＳＶＥＣ）を単離し、２０％プールヒト血清、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｓｒａｅｌ）、１００単位／ｍＬのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｓｒａｅｌ）、１００μｇ／ｍＬヘパリン（Ｓｉｇｍａ，  ＵＳＡ）および２ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦ（Ｈａｉｆａ，  ＩｓｒａｅｌのＴｅｃｈｎｉｏｎ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＮｅｕｆｅｌｄ博士より寄贈）を添加したＭ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＵＳＡ）を含有する完全培地中、ゼラチンコーティングデイッシュ上で培養した。ヒトＥＣはｖｏｎ  Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子抗体（Ｚｙｍｅｄ，  ＵＳＡ）の免疫組織化学的分析により同定した。平滑筋細胞はヒト伏在静脈ＳＭＣ（ＨＳＶＳＭＣ）およびヒト左内乳動脈ＳＭＣ（ＨＬＳＭＣ）からの外植体発芽後成長により培養した。細胞は１０％ヒト血清、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンおよび２ｎｇ／ｍＬｂＦＧＦを添加したダルベッコの変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＵＳＡ）中で培養した。平滑筋細胞は抗平滑筋α−アクチン抗体（Ｚｙｍｅｄ，  ＵＳＡ）を用いた免疫組織化学的分析により同定した。
【０１４１】
パッケージング細胞系統２９３−ＦＬＹＡ、２９３−ＦＬＹ１０Ａ、２９３−ＦＬＹＧＡＬＶおよびＴＥＦＬＹＧＡ（Ｄｒ．Ｆ．Ｌ．Ｃｏｓｓｅｔ−Ｌｉｏｎ，  Ｆｒａｎｃｅより入手）を１０％ＦＣＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｉｓｒａｅｌ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、６μｇ／ｍＬブラスチシジン（Ｓｉｇｍａ，  ＵＳＡ）および６μｇ／ｍＬフレオマイシン（Ｓｉｇｍａ，  ＵＳＡ）を添加したＤＭＥＭ中で生育させた。
【０１４２】
パッケージング細胞系統ＰＡ３１７、２９３Ｅ３（ＪｅｒｕｓａｌｅｍのＤｒ．Ｊ．Ｅｘｅｌｒｏｄより入手）を１０％ＦＣＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび０．１ｍｇ／ｍＬストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中で生育させた。
【０１４３】
組み換えアデノウィルスベクターによるＥＣおよびＳＭＣの感染：内皮細胞およびＳＭＣに以下に記載の通り組み換えアデノウィルスベクターを感染させた。簡単に説明すると、インフェクションの２０時間前、フィブロネクチン（４．５μｇ／ｍＬ）を予備コーティングしたプレート上に〜７０％全面培養の密度で細胞を播種し、完全培地（Ｍ２０）中で生育させた。インフェクション日に培地を新しいＭ１９９培地（血清非含有）と交換し、細胞を３０００のウィルス粒子／細胞、の密度で組み換えウィルスに感染させた。２０分おきに穏やかに傾斜させながら９０分間細胞を培養し、その後、ウィルス含有培地を完全培地（Ｍ２０）と交換した。感染はＧＦＰ蛍光フィルター（ＧＦＰ−ＬＰ、Ｎｉｋｏｎ）を装着した倒立蛍光顕微鏡（ＴＥ２００、Ｎｉｋｏｎ、Ｊａｐａｎ）を用いてＧＦＰ発現を可視化することによりモニタリングした。
【０１４４】
組み換えレトロウィルスによるＥＣおよびＳＭＣの形質導入：  レトロウィルスベクターによるＥＣおよびＳＭＣの形質導入は以下の通り行なった。簡単に説明すると、内皮細胞（４〜９回継代）をフィブロネクチン（４．５μｇ／ｍＬ）をコーティングしたプレート中、１０５個／３５ｍｍウェルの密度で播種し、２４時間完全培地中で生育させた。形質導入の１時間前に、培地を０．１ｍｇ／ｍＬ  ＤＥＡＥ−デキストランを含有する血清非含有のＭ１９９培地と交換した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ウイルス産生パッケージング細胞の培養物から新たに採取して濾過（０．４５μｍ）した上澄みと共に細胞を４時間インキュベートすることにより形質導入を行なった。インキュベーション終了時に培地を新しいＭ２０培地と交換した。
【０１４５】
感染ＥＣおよびＳＭＣによるＡｎｇ−１の過剰発現：
Ａｎｇ−１ｍＲＮＡ転写のＲＴ−ＰＣＲ分析：Ａｎｇ−１遺伝子転写を検出するために、ＰＵＲＥＳＣＲＩＰＴ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔｒａ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を用いて形質導入されたＨＳＶＥＣおよびＨＳＶＳＭＣから総ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡ合成のために、ＲＮＡ１μｇをランダムヘキサマー５００ｎｇと混合し、１０分間７０℃に加熱し、その後混合物を氷冷した。０．４ｍＭ  ｄＮＴＰ、５単位のＡＭＶ−ＲＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、５ｍＭ  ＤＴＴ、３２単位のＲＮＡｓｅ−ｏｕｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，ＵＳＡ）および１ｘＲＴ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）を含有する反応混合物を予備加熱したＲＮＡヘキサマー混合物に添加した。逆転写は、反応混合物を２時間３８℃でインキュベートし、その後１５分間９５℃でインキュベートすることにより行なった。ＨＳＶＥＣのＡｎｇ−１ｍＲＮＡ発現の分析のために、ｃＤＮＡのＰＣＲ分析を、２０μＬの容量中、逆転写ｃＤＮＡ産物７μＬ、センスプライマー（５’−ＧＣＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＡＧＴＴ−３’、配列番号３）、２０ｐｍｏｌ、アンチセンスプライマー（５’−ＴＣＡＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＧＧＴＣＧＡＡＴ−３’、配列番号４）、２０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  ５ｎｍｏｌ、１Ｕ  Ｅｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）および製造元の提供するＰＣＲ緩衝液を用いて実施した。ＰＣＲは以下の一連のインキュベート、即ち：９４℃／２’→１０ｘ：［９４℃／３０”→５０℃／３０”→７２℃／１’］→２４ｘ：［９４℃／３０”→５６℃／３０”→７２℃／（６０”＋５”／サイクル）］→７２℃／１０’で行なった。ＨＳＶＳＭＣのＡｎｇ−１ｍＲＮＡ発現の分析のために、ｃＤＮＡのＰＣＲ分析を、逆転写ｃＤＮＡ産物７μＬ、センスプライマーおよびアンチセンスプライマー（それぞれ、５’−ＧＣＴＧＧＣＡＧＴＡＣＡＡＴＧＡＣＡＧＴＴ−３’、配列番号５、および、５’−ＴＣＡＡＡＡＡＴＣＴＡＡＡＧＧＴＣＧＡＡＴ−３’、配列番号６）、１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ  ５ｎｍｏｌ、１Ｕ  Ｅｘ−ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ，Ｊａｐａｎ）および製造元の提供するＰＣＲ緩衝液を含有する２０μＬの容量で実施した。ＰＣＲは以下の一連のインキュベート、即ち：９４℃／２’→１０ｘ：［９４℃／３０”→５０℃／３０”→７２℃／１’］→２１ｘ：［９４℃／３０”→６０℃／３０”→７２℃／（６０”＋５”／サイクル）］→７２℃／１０’で行なった。ＰＣＲ産物は０．８％アガロース中の電気泳動で分離し、ＥｔＢｒで標識し、ＵＶ蛍光により可視化した。
【０１４６】
ウエスタンブロット分析：アデノウィルスまたはレトロウィルスにより感染されたＥＣおよびＳＭＣによるＡｎｇ−１またはＶＥＧＦ１６５蛋白の発現の検出は、以下に記載する通り、感染２４時間後、細胞コンディショニング培地のウエスタンブロット分析により行った。簡単に説明すると、ウィルス含有培地を血清非含有培地と交換し、細胞を更に２４時間生育させる。細胞コンディショニング培地中の試料３０μｌ中の分泌蛋白を還元条件下の１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上のＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）上にエレクトロブロッティングした。穏やかに振とうしながら１時間室温で０．１％スキムミルクおよび０．３％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ中でインキュベートすることによりブロットをブロッキングした後、ブロットをブロッキング溶液中１：５００希釈度のポリクローナルヤギ抗Ａｎｇ−１抗体（＃ｓｃ−６３１９  Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ，  ＵＳＡ）または１：７００希釈度のポリクローナルウサギ抗ＶＥＧＦ１６５抗体（＃ｓｃ  １５２  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＵＳＡ）とともに２時間室温でインキュベートした。予備抗体標識ブロットをＴＢＳＴで３回洗浄し、製造元の仕様に従ってＴＢＳＴ中希釈したパーオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギまたは抗ヤギ二次抗体（Ｓｉｇｍａ，  ＵＳＡ）とともに１時間室温でインキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬ試薬（Ｓｉｇｍａ，  ＵＳＡ）にブロットを反応させることにより標識された蛋白を可視化し、これらをＸ線フィルムに露光した。
【０１４７】
結果：
ウィルス構築物：ＥＣおよびＳＭＣをＡｎｇ−１に感染させるために構築して用いたアデノウィルスおよびレトロウィルスのベクターを表１に示す。
【表１】
2004520009.tif 000002
【０１４８】
アデノウィルス感染またはレトロウィルス形質導入ＥＣおよびＳＭＣのＡｎｇ−１−ＧＦＰトランスジーンの発現：ｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰに感染した内皮細胞およびＳＭＣは高濃度のＧＦＰを発現することがわかった（それぞれ図６ｂおよび６ｄ）。同様に、レトロＡｎｇ−１−ＧＦＰで形質導入したＥＣおよびＳＭＣもまた高濃度のＧＦＰを発現することがわかった（それぞれ図７ｂおよび７ｄ）。ＧＦＰの発現は蛍光顕微鏡により可視化した。
【０１４９】
内皮細胞およびＳＭＣはｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰによりアデノウィルス感染後４８時間にＡｎｇ−１ｍＲＮＡを転写することがわかった（それぞれ図８ａおよび図８ｂ）。同様にレトロＡｎｇ１−ＧＦＰをレトロウィルス形質導入されたＥＣおよびＳＭＣもまた形質導入後４８時間にＡｎｇ−１ｍＲＮＡを発現することがわかった（それぞれ図９ａおよび図９ｂ）。
【０１５０】
内皮細胞およびＳＭＣはｒＡｄＡｎｇ１のアデノウィルス感染後、または、レトロＡｎｇ１のレトロウィルス形質導入後、２４時間にＡｎｇ−１蛋白を過剰発現していることがわかった（それぞれ図１０および１１）。
【０１５１】
従ってこれらの結果によれば、本発明のアデノウィルスおよびレトロウィルスベクターは一次ヒトＥＣおよびＳＭＣを遺伝子的に修飾する能力を有し、そこにＡｎｇ−１およびＧＦＰトランスジーンを発現させることができることがわかる。従って、これらの構築物は血管成熟因子Ａｎｇ−１を過剰発現するようにヒト血管細胞を遺伝子的に修飾するために使用することができ、このため、閉塞、傷害または虚血の哺乳類組織をバイパスする、または、貫通する新しい血管の形成を誘発することを目的とした血管疾患の治療に対し、有効に応用できる。
【０１５２】
実施例７
血管細胞におけるＡｎｇ−１およびＶＥＧＦの機能的同時過剰発現
血管疾患を治療するために、本発明の方法は血管形成因子Ａｎｇ−１およびＶＥＧＦを同時過剰発現する血管細胞の投与を用いる。しかしながら、このような治療様式が有効であるためには、これらの蛋白の何れか一方の過剰発現がもう一方の発現や機能の何れかを妨害してはならない。
【０１５３】
即ち、これらの蛋白が機能的に同時過剰発現される能力を以下の通り明らかにした。
【０１５４】
結果：
Ａｎｇ−１を過剰発現するアデノウィルス感染ＥＣおよびＶＥＧＦを過剰発現するアデノウィルス感染ＥＣまたはＳＭＣの同時培養におけるＡｎｇ−１およびＶＥＧＦ蛋白の過剰発現の保持：本発明の方法はＥＣおよびＳＭＣのような遺伝子的に修飾された血管細胞において血管成熟因子Ａｎｇ−１および血管形成因子ＶＥＧＦの両方の過剰発現を用いることにより、このような細胞を血管疾患の治療に利用した場合に最適治療効果を媒介するようにこれらの細胞の分化と生育を最適化する。しかしながら、このような治療手段が最も有効であるためには、Ａｎｇ−１を過剰発現するＥＣ、またはＶＥＧＦを過剰発現するＥＣまたはＳＭＣが、その対応するトランスジーンの過剰発現をもう一方のトランスジーンの過剰発現状態において各々保持できる能力を有することが必要とされる。従って、ｒＡｄＶＥＧＦ感染ＥＣとｒＡｄＡｎｇ１感染ＥＣの同時培養物中のＡｎｇ−１とＶＥＧＦの蛋白の両方の過剰発現が維持されることをウエスタンブロット分析により明らかにした（それぞれ図１２ａおよび１２ｂ）。同様に、ｒＡｄＶＥＧＦ感染ＳＭＣおよびｒＡｄＡｎｇ１感染ＥＣの同時培養物中のＶＥＧＦおよびＡｎｇ−１の両方の同時過剰発現もウエスタンブロット分析により明らかにした（それぞれ図１３ａおよび１３ｂ）。
【０１５５】
Ａｎｇ−１の過剰発現により抑制されないＥＣ増殖：
材料および方法：
増殖試験：アデノウィルス感染の２４時間前、ＥＣ（５〜１１継代）をフィブロネクチン（４．５ｍｇ／ｍＬ）で予備コーティングされた２４ウェルプレート中１０４個／ウェル（〜３０％全面培養）の密度で播種した。細胞にｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰまたはｒＡｄＧＦＰを感染させ、９０分間３７℃でインキュベートした後、血清添加培地を添加した。１６〜１８時間の後、培地を２％ヒト血清および２ｎｇ／ｍＬ、ｂＦＧＦ添加Ｍ１９９培地と交換した。増殖試験は３連で行ない、感染後第３、５および７日にＸＴＴ比色試験により増殖を調べた。
【０１５６】
本発明の方法は同じ環境においてＥＣのような血管細胞によりＡｎｇ−１とＶＥＧＦが同時過剰発現される血管疾患の治療のための治療様式を包含する。しかしながら、最適作用のためには好ましくはＥＣに対するＶＥＧＦの増殖作用が望まれるため、ｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰ感染ＥＣの増殖に対するＡｎｇ−１過剰発現の抑制作用が無いことを調べた。ＥＣにおけるこのようなＡｎｇ−１の過剰発現はｒＡｄＧＦＰに感染した細胞の増殖速度と比較した場合に細胞増殖に対して抑制または促進作用の何れも有さないことが解かった（図１４）。予測した通り、ＶＥＧＦを過剰発現する陽性対照感染体の増殖は増強された。
【０１５７】
従ってこれらの結果によれば、本発明によるＶＥＧＦおよびＡｎｇ−１の同時発現がこれらの蛋白両方の機能的発現をもたらすことがわかる。従って遺伝子的に修飾された血管細胞におけるこれらの蛋白両方の同時過剰発現が関与する本発明の方法は、新血管形成の必要な血管疾患の治療において効果的に使用できる。
【０１５８】
実施例８
血管細胞におけるＡｎｇ−１過剰発現の生物学的活性
本発明の方法はＥＣにおけるＡｎｇ−１の過剰発現のためのウィルス構築物を用いており、血管疾患の治療において新血管形成を誘発するためにＡｎｇ−１とＶＥＧＦを同時過剰発現させる様式を包含する。
【０１５９】
即ち、生物学的に活性ナＡｎｇ−１蛋白の発現を引き起こす本発明のＡｎｇ−１発現アデノウィルスベクターの機能、および、ＥＣおよびＳＭＣのような血管細胞においてＡｎｇ−１とＶＥＧＦの同時過剰発現を介して新血管形成を最適に誘発する本発明の方法の能力を、以下の通り明らかにした。
【０１６０】
材料および方法：
Ａｎｇ−１を過剰発現するＥＣにおけるＴｉｅ２リン酸化の免疫沈降免疫ブロッティング分析：フィブロネクチン（４．５μｇ／ｍＬ）を予備コーティングした６０ｍｍのプレートに内皮細胞を播種し、ｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰ、ｒＡｄＧＦＰまたはｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰに感染させた。感染後２４時間に、ウィルス含有培地を血清非含有培地と交換し、細胞を更に２４時間培養した後に細胞蛋白の免疫沈降を行なった。細胞を１００μＭ  Ｎａ３ＶＯ４添加冷ＰＢＳ中で洗浄し、２０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、１０％グリセロール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、２μｇ／ｍＬロイペプチン、２μｇ／ｍＬアプロチニンおよび１００μＭ  Ｎａ３ＶＯ４を含有する細胞溶解緩衝液中で溶解させた。溶解液上澄みの蛋白含量を測定し、等しい量の蛋白を含有する溶解液上澄みを小分けした試料を一夜４℃でインキュベートすることにより抗ホスホチロシン抗体ＰＹ２０（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  ＵＳＡ）で標識した。プロテインＡセファロースビーズを抗体標識試料に添加し、２時間４℃で試料をインキュベートすることにより免疫沈降を行なった。次にビーズを冷ＰＢＳで４回洗浄し、３分間ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液中で煮沸し、遠心分離によりペレット化した。上澄みの蛋白を６％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル中で電気泳動することにより分離した。分離した蛋白をニトロセルロース膜（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｅｌｌ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）上にエレクトロブロッティングし、抗Ｔｉｅ２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，  ＵＳＡ）を用いたウエスタン免疫ブロッティング分析によりプローブした。
【０１６１】
結果：
Ａｎｇ−１の生物学的活性：ＥＣにおけるＡｎｇ−１の過剰発現は増強されたＴｉｅ２リン酸化をもたらす：Ａｎｇ−１を過剰発現するようにアデノウィルス感染されたＥＣにおけるＴｉｅ２リン酸化の免疫沈降および免疫ブロッティング分析によれば、増強されたＴｉｅ２リン酸化が観察された（図１５ｂ）。
【０１６２】
従って、これらの結果によれば、本発明の構築物から分泌されたＡｎｇ−１蛋白は同属体受容体、Ｔｉｅ２、への結合において有効であり、このため、そのような構築物は、本発明の方法によるＥＣのような遺伝子的に修飾された血管細胞を用いて血管疾患を治療する際に血管成熟因子Ａｎｇ−１を発現するために効果的に用いることができる。
【０１６３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管形成試験−Ａｎｇ−１およびＶＥＧＦを過剰発現する同時培養血管細胞において誘発された最適３次元血管形成性新芽形成：
本発明の方法は血管疾患の治療のための最適な血管形成を促進するために、血管成熟および血管形成の因子であるそれぞれＡｎｇ−１およびＶＥＧＦの両方を使用する。従ってこれらの因子の両方を過剰発現するＥＣおよびＳＭＣのような血管細胞による最適血管形成を、以下に記載する通り、ウィルス形質転換された血管細胞を含むコラーゲンゲル包埋同時培養スフェロイドの３次元新芽形成の分析により明らかにした。
【０１６４】
材料および方法：
ＥＣのアデノウィルス感染スフェロイドによる、或いは、アデノウィルス感染ＥＣおよびＳＭＣの同時培養スフェロイドによる新芽形成（血管形成と等価なｉｎ  ｖｉｔｒｏの状態）を前に報告された通り（Ｋｏｒｆｆ  Ｔ．等、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８，  １４３：１３４１）コラーゲンゲルにおけるこのようなスフェロイドの新芽形成を分析することによりｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。簡単に説明すると、ＥＣおよびＳＭＣを、同時培養スフェロイドの発生のために適する場合はプールして、０．２５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロース（Ｓｉｇｍａ，  ＵＳＡ）を含有する培地中に懸濁した。ＥＣ‐ＳＭＣ同時培養物を発生させるために、ＥＣをＤｉＩ−２９１赤色蛍光マーカーで標識した後に混合することにより、その後のスフェロイドの蛍光顕微鏡分析のためにＳＭＣからのＥＣの分化を可能とした。２４時間培養後にウェル当たりスフェロイドあたり〜７５０個の細胞の単一のスフェロイドが形成されるように細胞懸濁液を非付着性丸底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ，  Ｄｅｎｍａｒｋ）中に播種した。このようにして得られたスフェロイドを次に以下の通り、コラーゲンゲルに包埋した。コラーゲン保存溶液は１０  ｘ  Ｍ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ，  ＵＳＡ）１容量およびｐＨ７．４とするための０．３４  Ｎ  ＮａＯＨ１容量にラット尾部コラーゲンの酸性抽出液（４℃で２ｍｇ／ｍＬに平衡化）８容量を混合することにより用時に新しく調製した。コラーゲンの保存溶液はゲルの重合よりも前にスフェロイドが沈降するのを防止するために０．２５％（ｗ／ｖ）カルボキシメチルセルロースを含有する４０％ヒト血清を添加したＭ１９９培地等容量と室温で混合した。２０〜３０スフェロイドを含有するゲル試料を迅速に予備加温した２４ウェルのプレートに移し、重合させた。ゲルを３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、各試料群から少なくとも２０個のスフェロイドの新芽形成をデジタルビデオカメラ（ＤＸＭ１２００  Ｎｉｋｏｎ，  Ｊａｐａｎ）に記録した。
【０１６５】
Ａｎｇ−１およびＶＥＧＦを過剰発現する血管細胞の同時培養物による最適血管形成の誘発：ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣのスフェロイド（図１６ａ−ｂ）を蛍光顕微鏡分析により観察したところ、低いベースライン新芽形成活性が認められたが、これはｒＡｄＧＦＰ感染およびｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ（図１６ｃ−ｄ）並びにｒＡｄＡｎｇ１‐ＧＦＰ感染およびｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ（図１６ｅ−ｆ）を含む同時培養スフェロイドにおいてアップレギュレートされることが観察された。しかしながらこの最も高い新芽形成活性は、ｒＡｄＡｎｇ１‐ＧＦＰおよびｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ（図１６ｇ−ｈ）を含む同時培養スフェロイドにおいて記録された。
【０１６６】
同様の結果はアデノウィルス感染ＥＣおよびレトロウィルス感染ＳＭＣを同時培養した場合にも得られた。ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣおよびレトロＧＦＰ感染ＳＭＣを含有する同時培養スフェロイドは、ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣおよびレトロＧＦＰ感染ＳＭＣを含有する同時培養スフェロイドと比較した場合、血管形成性新芽形成活性がやや上昇していることがわかった（それぞれ図１７ｂおよび１７ａ）。ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣおよびレトロＡｎｇ１−ＧＦＰ感染ＳＭＣを含有する同時培養スフェロイドは高度にアップレギュレートされた血管形成性新芽形成活性を示したが（図１７ｃ）、ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣおよびレトロＡｎｇ１−ＧＦＰ感染ＳＭＣを含有する同時培養スフェロイドは相乗効果的に上昇した水準の血管形成性新芽形成活性を示した（図１７ｄ）。これらの結果は、ｒＡｄＧＦＰ感染ＳＭＣ（図１８ａ）、ｒＡｄＡｎｇ１‐ＧＦＰ感染ＳＭＣ（図１８ｂ）、ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｃ）、ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｄ）、同時培養ｒＡｄＧＦＰ感染ＳＭＣ＋ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｅ）、同時培養ｒＡｄＧＦＰ感染ＳＭＣ＋ｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｆ）、および同時培養ｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰ感染ＳＭＣ＋ｒＡｄＧＦＰ感染ＥＣ（図１８ｇ）と比較した場合、血清枯渇条件下（図１８ｈ）、２４時間スライドガラス上で培養したｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰ感染ＳＭＣと混合したｒＡｄＶＥＧＦ−ＧＦＰ感染ＥＣの同時培養物中で観察された劇的な生存率の上昇により裏付けられる。
【０１６７】
従ってこれらの結果はＥＣおよびＳＭＣのような血管細胞において血管成熟および血管形成因子であるそれぞれＡｎｇ−１およびＶＥＧＦの同時発現を用いることにより、本発明の方法が最適な血管形成および細胞生存を誘発することができることを示している。即ち、本発明の方法は血管疾患を治療するための新血管形成誘発のために血管形成因子僅か１種のみを使用していた従来の方法よりも優れている。
【０１６８】
実施例９
Ａｎｇ−１過剰発現による遺伝子的に修飾されたＥＣのアポトーシスからの保護
本発明の方法はＥＣのような血管細胞の遺伝子的修飾を用いてＥＣ分化因子Ａｎｇ−１の過剰発現とＥＣ生育因子ＶＥＧＦの過剰発現を組み合わせることにより血管疾患の治療のための最適な新血管形成を誘発している。しかしながら、このような最適治療効果を達成するためには、Ａｎｇ−１を過剰発現するこのような遺伝子的に修飾された細胞は、一次細胞の採取、その遺伝子的修飾、そのｅｘ  ｖｉｖｏの培養、および、とりわけ、低酸素圧と全般的に望ましくない条件が細胞の生存率を低下させる虚血組織へのｉｎ  ｖｉｖｏの再移植の際など、全ての処理段階に渡って遭遇すると考えられる前アポトーシス条件を克服して生存することが可能であることが高度に望まれる。
【０１６９】
即ち、前アポトーシス条件に対してこのような耐性を示すＡｎｇ−１を過剰発現するようにレトロウィルス形質導入されたＥＣの能力を以下に記載する通り明らかにした。
【０１７０】
材料および方法：
アポトーシス細胞の末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）試験：簡単に説明すると、非感染ＥＣまたはレトロＡｎｇ１−ＧＦＰ形質導入ＥＣを２４ウェルの培養プレート中４ｘ１０５個／ウェルの密度で播種した。培養２４時間の後、細胞を２０％ヒト血清添加Ｍ１９９培地中で更に２４時間培養するか、または、血清非含有Ｍ１９９培地中で培養してアポトーシスを誘発した。前アポトーシス条件に曝露した後、浮遊および付着している全ての細胞をトリプシン処理により回収し、新たに調製したＰＢＳ−４％ホルムアルデヒド中で固定し、メタノール−３％Ｈ２Ｏ２でブロッキングし、そして更に０．１％トリトンＸ−１００−０．１％クエン酸ナトリウム中で浸透性付与した。最後にフラグメント化したＤＮＡの末端をＴｄＴを用いてフルオレセインコンジュゲートヌクレオチドで標識し、細胞を蛍光顕微鏡により、励起波長４５０〜５００ｎｍ、検出波長５１５〜５６５ｎｍ（緑色）で検査した。ＴＵＮＥＬ法試験はＩｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ｃａｔ＃１６８４８１７，  Ｒｏｃｈｅ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて製造元による取扱説明書に従って行なった。
【０１７１】
結果：
遺伝子的に修飾されたＥＣにおけるアポトーシスからのＡｎｇ−１過剰発現媒介による保護：Ａｎｇ−１を過剰発現するようにレトロウィルス形質導入された内皮細胞はＴＵＮＥＬ染色細胞の顕微鏡蛍光分析による可視化によれば、非形質導入細胞と比較して前アポトーシス条件下でアポトーシスに対する顕著な耐性を示した（図１９ｈおよび１９ｄ）。上記のとおり顕微鏡的に明らかにされたデータに対して行なった数的定量によれば、非形質導入ＥＣの５５％が血清枯渇２４時間後にアポトーシス状態となったのに対し、Ａｎｇ−１（図２０）を過剰発現するようにレトロウィルス形質導入されたＥＣでは僅か１２％であった。同様のアポトーシス率低下と生存率向上はＶＥＧＦおよびＡｎｇ−１を過剰発現する混合内皮細胞集団においても観察されている（データは示さず）。
【０１７２】
これらの実験から、好ましくはＶＥＧＦの過剰発現と組み合わせられた血管細胞によるＡｎｇ−１の過剰発現は例えば虚血臓器において遭遇することが予測される生理学的ストレス下におけるこのような細胞の生存性を最適化すると結論することができる。即ち、本発明は一般的には血管疾患の治療のため、そして、とりわけ虚血組織が関わる病態において、従来技術の新血管形成を超えた進歩をもたらす。
【０１７３】
本発明は特定の実施態様との関連において記載したが、多くの変法は当業者の知る通りである。従ってこれらの変法は全て本発明とその請求項の精神および範囲に包含されるものである。全ての公報、特許、出願およびそこに開示される、そして／または明細書に記載したＧｅｎＢａｎｋ受託番号で認識される配列は、個々の公報、特許、出願または配列が、参考により本明細書に組み込まれるべく特定して個々に示される場合と同様の程度にまで、その全体が参考により本明細書に組み込まれる。更にまた本出願中の参考文献の引用および確認のいずれも、その参考文献が本発明の先行技術として使用できることを受け入れたものと解釈してはならない。
【参考文献】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明によるＶＥＧＦ発現ベクター構築物を示す。
【図２】
本発明によるＡｎｇ−１発現ベクターを示す。
【図３】
ＶＥＧＦ−ＬａｃＺ（３ａ）またはＶＥＧＦ−ＧＦＰ（３ｂ）発現構築物で形質転換された培養ＥＣを示す。
【図４】
閉塞した血管（図４ａ）、このような閉塞を治療するための従来技術のバイパス法（図４ｂ）および本発明による閉塞血管を貫通またはバイパスする方法（図４ｃ）を示す。
【図５】
図５ａは人工的に遮蔽しＶＥＧＦ１６５を発現する組み換えアデノウィルスベクターを注入することにより再開通させたラット後肢動脈枝における閉塞部位と流動の測定を示す。図５ｂはＶＥＧＦ１６５アデノウィルスベクターまたは生理食塩水（対照）の注射後３、７および１４日のラット大腿動脈中の血流を示すグラフである。
【図６】
図６ａ−ｄはｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰを感染させたＥＣまたはＳＭＣ（それぞれ図６ａ−ｂおよび６ｃ−ｄ）を示す光学顕微鏡または蛍光顕微鏡（それぞれ図６ａ−ｃおよび６ｂ−ｄ）写真である。
【図７】
図７ａ−ｄはレトロＡｎｇ１−ＧＦＰを感染させたＥＣまたはＳＭＣ（それぞれ図７ａ−ｂおよび７ｃ−ｄ）を示す光学顕微鏡または蛍光顕微鏡（それぞれ図７ａ−ｃおよび７ｂ−ｄ）写真である。
【図８】
図８ａ−ｂはアデノウィルス感染後４８時間のＥＣおよびＳＭＣ（それぞれ図８ａおよび８ｂ）におけるＡｎｇ−１  ｍＲＮＡの発現を示す写真である。
【図９】
図９ａ−ｂはレトロウィルス形質導入後４８時間のＥＣおよびＳＭＣ（それぞれ図９ａおよび９ｂ）におけるＡｎｇ−１  ｍＲＮＡの発現を示す写真である。
【図１０】
アデノウィルス感染ＥＣおよびＳＭＣにおけるＡｎｇ‐１蛋白の発現を示す写真である。
【図１１】
レトロウィルス形質導入ＥＣおよびＳＭＣにおけるＡｎｇ‐１蛋白の発現を示す写真である。
【図１２】
図１２ａ−ｂはＡｎｇ−１を過剰発現するアデノウィルス感染ＥＣとＶＥＧＦ１６５を過剰発現するＥＣとの同時培養物におけるＡｎｇ−１およびＶＥＧＦ１６５蛋白の発現（それぞれ図１２ａおよび１２ｂ）のウエスタンブロットによる分析を示す写真である。
【図１３】
図１３ａ−ｂはＡｎｇ−１を過剰発現するアデノウィルス感染ＥＣとＶＥＧＦ１６５を過剰発現するＳＭＣとの同時培養物におけるＶＥＧＦ１６５およびＡｎｇ−１蛋白の発現（それぞれ図１３ａおよび１３ｂ）のウエスタンブロットによる分析を示す写真である。
【図１４】
Ａｎｇ‐１過剰発現ｒＡｄＡｎｇ１−ＧＦＰ感染ＥＣの正常な増殖を示すヒストグラムである。
【図１５】
図１５ａ−ｂはｒＡｄＡｎｇ１感染ＥＣにおけるＴｉｅ２受容体の増強されたリン酸化を示す写真である。
【図１６】
図１６ａ−ｈはアデノウィルス感染ＥＣを含有するコラーゲンゲル包埋同時培養スフェロイドの３次元ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管形成新芽形成を示す顕微鏡写真である。
【図１７】
図１７ａ−ｄはアデノウィルス感染ＥＣおよびレトロウィルス形質導入ＳＭＣを含有するコラーゲンゲル包埋同時培養スフェロイドの３次元ｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管形成新芽形成を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１８】
図１８ａ−ｈは血清枯渇条件下における血管形成分化増殖因子を過剰発現するウィルスで形質転換された血管細胞の同時培養物の生存性を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図１９】
図１９ａ−ｈは血清枯渇２４時間後のＡｎｇ−１を過剰発現するようにレトロウィルスで形質導入されたＴＵＮＥＬ−染色ＥＣの増強された生存性を示す工学顕微鏡写真（図１９ａ、１９ｃ、１９ｅおよび１９ｇ）および蛍光顕微鏡写真（図１９ｂ、１９ｄ、１９ｆおよび１９ｈ）である。
【図２０】
Ａｎｇ−１を過剰発現するようにレトロウィルスで形質導入されたＥＣにおけるアポトーシス率を示すヒストグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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