(57)【要約】治療用遺伝子を含むリポソームは、封入された遺伝子の血液脳関門および脳細胞膜を横切る輸送を提供するために、複数の血液脳関門および脳細胞膜ターゲッティング物質に結合させる。いったん血液脳関門および脳細胞膜を横切ると、封入された遺伝子はコードされた治療薬を脳内に発現し、疾患の治療および診断を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子を脳血液脳関門および脳細胞膜を横切って送達するための受容体特異的リポソームであり：
外表面および内部コンパートメントを有するリポソーム；
物質をコードするための十分な量の遺伝情報を含み、前記リポソームの内部コンパートメント内にある遺伝子；
複数の血液脳関門および脳細胞膜ターゲッティング物質；および
おのおののターゲッティング物質が少なくとも結合物質の一つにより前記リポソームの外表面に連結されている複数の前記結合物質を含む前記リポソーム。
【請求項２】
リポソームの外表面が２００ナノメーターより小さい直径を有する球を定義する、請求項１に記載の受容体特異的リポソーム。
【請求項３】
遺伝子が脳由来神経栄養因子、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ、β−グルクロニダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、チミジンキナーゼをコードする遺伝子、およびアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される治療薬をコードする、請求項１に記載の受容体特異的リポソーム。
【請求項４】
遺伝子がプラスミド中にある、請求項１に記載の受容体特異的リポソーム。
【請求項５】
遺伝子の分子量が３０，０００ダルトンより大きいか、または該遺伝子が少なくとも１００ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の受容体特異的リポソーム。
【請求項６】
５から１０００の間の血液脳関門または脳細胞膜ターゲッティング物質がリポソームの表面に結合している、請求項１に記載の受容体特異的リポソーム。
【請求項７】
２５から４０の間の血液脳関門または脳細胞膜ターゲッティング物質が前記リポソームの表面に結合している、請求項１に記載の受容体特異的リポソーム。
【請求項８】
結合物質がポリエチレングリコール、スフィンゴミエリンおよび有機ポリマーからなる群から選択される、請求項１に記載の受容体特異的リポソーム。
【請求項９】
結合物質の分子量が１０００から５０，０００ダルトンの間にある、請求項１に記載の受容体特異的リポソーム。
【請求項１０】
血液脳関門または脳細胞膜ターゲッティング物質がインスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、レプチン、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、およびこれらの内因性ペプチドを模倣し、そして血液脳関門および脳細胞膜上のインスリン、トランスフェリン、ＩＧＦ、レプチン、またはＬＤＬ受容体に結合する、対応するペプチド類似モノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の受容体特異的リポソーム。
【請求項１１】
脳における発現のために遺伝子を血液脳関門を横切って送達するための方法であって：
ａ）外表面および内部コンパートメントを有するリポソーム；
薬剤的物質をコードするための十分な量の遺伝情報を含み、前記リポソームの内部コンパートメント内にある遺伝子；
複数の血液脳関門または脳細胞膜ターゲッティング物質；
おのおののターゲッティング物質が少なくとも結合物質の一つにより前記リポソームの外表面に連結される、複数の前記結合物質；を含む受容体特異的リポソーム；および
ｂ）前記受容体特異的リポソームが前記血液脳関門を横切って、前記脳の前記遺伝子の発現を提供する、前記受容体特異的リポソームのための薬剤的に受容できるキャリアを含む、製剤の効果的な量を動物に投与する段階を含む前記方法。
【請求項１２】
医薬製剤が静脈内に投与される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
リポソームの外表面が２００ナノメーターより小さい直径を有する球を定義する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
遺伝子が脳由来神経栄養因子、チロシンヒドロキシラーゼ、芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ、グルクロニダーゼ、ヘキソサミニダーゼＡ、チミジンキナーゼをコードする遺伝子、およびアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子からなる群から選択される治療薬をコードする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
遺伝子がプラスミド中にある請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子が少なくとも１００ヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
５から１０００の間の血液脳関門および脳細胞膜ターゲッティング物質がリポソームの表面に結合している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
２５から４０の間の血液脳関門および脳細胞膜ターゲッティング物質がリポソームの表面に結合している、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
結合物質がポリエチレングリコール、スフィンゴミエリンおよび他の有機ポリマー性物質からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
結合物質の分子量が１０００から５０，０００ダルトンの間にある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
血液脳関門または脳細胞膜ターゲッティング物質がインスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、レプチン、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）、およびこれらの内因性ペプチドを模倣し、そして血液脳関門および脳細胞膜上のインスリン、トランスフェリン、ＩＧＦ、レプチン、またはＬＤＬ受容体に結合する、対応するペプチド類似モノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項１１に記載の非侵襲性方法。
【請求項２２】
ａ）外表面および内部コンパートメントを有するリポソーム；
物質をコードするための十分な量の遺伝情報を含み、前記リポソームの内部コンパートメント内にある遺伝子；
複数の血液脳関門ターゲッティング物質；
おのおののターゲッティング物質が少なくとも結合物質の一つにより前記リポソームの外表面に連結されている、複数の前記結合物質；を含む受容体特異的リポソーム；および
ｂ）前記受容体特異的リポソームのための薬剤的に受容できるキャリアを含む医薬製剤。
【請求項２３】
特異的受容体を有する細胞に治療用遺伝子を送達するためのナノコンテナーであって：
外表面および内部コンパートメントを有するナノコンテナー；
薬剤物質をコードするための十分な量の遺伝情報を含み、前記ナノコンテナーの内部コンパートメント内にある遺伝子；
前記細胞上にある受容体を標的にすることができる、複数の受容体特異的ターゲッティング物質；および
おのおののターゲッティング物質が少なくとも結合物質の一つにより前記ナノコンテナーの外表面に連結されている、複数の前記受容体特異的ターゲッティング物質を含む前記受容体特異的ナノコンテナー。
【請求項２４】
特異的受容体を有する前記細胞が脳、肝臓、肺および脾臓からなる細胞の群から選択される、請求項２３に記載の受容体特異的ナノコンテナー。
【請求項２５】
特異的受容体を有する細胞に遺伝子を送達するための方法であって：
ａ）外表面および内部コンパートメントを有するナノコンテナー；
前記ナノコンテナーの内部コンパートメント内にある、薬剤的物質をコードするための十分な量の遺伝情報を含む遺伝子；
前記細胞上にある受容体を標的にすることができる複数の受容体特異的ターゲッティング物質；および
おのおののターゲッティング物質が少なくとも結合物質の一つにより前記ナノコンテナーの外表面に連結されている、複数の受容体特異的ターゲッティング物質；を含む受容体特異的ナノコンテナー；ならびに
ｂ）前記受容体特異的ナノコンテナーのための薬剤的に受容できるキャリアを含む、効果的な量の製剤を動物に投与することを含む前記方法。
【請求項２６】
ナノコンテナーが標的にする細胞が、脳、肝臓、肺および脾臓細胞からなる細胞の群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の背景
１．発明の属する技術分野
本発明は一般に脳への遺伝子治療薬の送達に関する。より具体的には、本発明は脳への遺伝子の非侵襲性送達に有用な製剤を提供するためのリポソーム技術、血液脳関門（ＢＢＢ）受容体技術、ペギレーション（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）技術、および治療用遺伝子技術の組み合わせに関する。
【０００２】
２．関連技術の説明
本発明の背景を説明するため、およびその実施に関する付加的な詳細を提供するために本明細書で引用される出版物および他の参考文献は本明細書に参照として引用する。便宜上、参考文献に番号を付けて表し、末尾の参考文献一覧に分類した。
【０００３】
脳に外因性に投与された遺伝子の発現は、以前はウイルスベクターまたはカチオンリポソームのいずれかによりｉｎ  ｖｉｖｏで達成されてきた（１〜４）。しかし、いずれの場合も侵襲性の高い投与経路が要求される。ウイルスまたはカチオンリポソームのいずれもｉｎ  ｖｉｖｏで血液脳関門（ＢＢＢ）を形成する脳毛細血管壁を横切ることができないため、そのような侵襲性の技術が必要とされる。ＢＢＢの存在が、開頭術による脳内投与（１）か、またはＢＢＢ破壊および一過性ＢＢＢの開口を起こす有害物質の頸動脈内注入（４）のいずれかによる外因性遺伝子の投与を余儀なくさせている。
【０００４】
脳のヒト遺伝子治療はおそらく遺伝子治療薬の反復した投与を必要とするであろう。したがって、単純な静脈内投与と同じ程度に侵襲性でない経路により遺伝子を投与することは好都合であろう。この方法により、遺伝子治療薬は内因性ＢＢＢ輸送系を通して当該遺伝子治療薬を脳に向かわせることで、ＢＢＢを横切って送達される（５）。キャリア媒介輸送（ＣＭＴ）系がＢＢＢを横切る栄養素の輸送のために存在する（５）。同様に、受容体媒介トランスサイトーシス（ＲＭＴ）系が、インスリン、トランスフェリン、またはインスリン様成長因子のような循環ペプチドをＢＢＢを横切って輸送するために作動する（５）。これらの内因性ペプチドはＢＢＢを横切って薬物を輸送するための“輸送ペプチド”または“分子のトロイの木馬” として作用することができる。キメラペプチド技術と呼ばれるこの方法では、ふつうはＢＢＢを横切って輸送されない薬物が“輸送可能なペプチド”に結合し、そして薬物／輸送可能なペプチドの結合物がＢＢＢを通ってＲＭＴを受ける（米国特許第４，８０１，５７５号）。
【０００５】
以前の研究では、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）またはインスリン受容体のようなＢＢＢ内の内因性輸送系に結合するペプチドミメティックモノクローナル抗体（ＭＡｂ）が、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢＢＢを通って神経ペプチドまたはアンチセンス物質を標的へ向かわせるために使用された（５）。同じ受容体に結合する内因性ペプチドの作用を模倣する、ある種受容体結合ＭＡｂｓの能力は文献（３５〜３７）で既知である。さらに、これらの受容体媒介エンドサイトーシスにより細胞に薬物を輸送する抗ＴｆＲ  ＭＡｂｓのような、ペプチドミメティックＭＡｂｓの能力もよく知られている（３８）。
【０００６】
治療用遺伝子の脳における発現は、血液中に注射される遺伝子製剤がＲＭＴによりＢＢＢを横切るだけでなく、受容体媒介エンドサイトーシス（ＲＭＥ）により脳細胞膜（ＢＣＭ）を横切って脳の標的細胞中に入ることを必要とする。さらに、非侵襲的に脳に遺伝子治療薬を向かわせるための内因性ＢＢＢ輸送系の使用には、血流中で安定な遺伝子治療薬の適切な製剤の開発も必要である。カチオンリポソーム／ＤＮＡ複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子発現に使用されてきたが、これらの製剤は生理食塩水中で甚だしく凝集する（６〜１１）。カチオン性リポソーム／ＤＮＡ複合体の静脈内投与後のこの凝集は、肺において選択的に遺伝子が発現され、末梢組織ではほとんど発現が見られず（１２〜１４）、そして脳では全く発現が見られないという結果に終わる（１２）。ＤＮＡプラスミドはカチオンポリリシンブリッジによりペプチドミメティックＭＡｂに結合することが可能である（１５〜１７）。しかし、ＤＮＡとポリカチオン間の静電相互作用は血液中で安定ではないかもしれず、ヒストンまたはポリリシンのような高度にポリカチオン性の蛋白質はＢＢＢに毒作用を及ぼし、ｉｎ  ｖｉｖｏでの広範なＢＢＢの透過性変化を引き起こすおそれがある（１８）。
【０００７】
発明の概要
本発明によれば、治療用遺伝子は血液脳関門を横切って、脳に非侵襲的に導入される。いったん脳の内部にはいると、治療用遺伝子は脳疾患の診断および治療に有用な治療薬を発現する。本発明は血液脳関門を横切って治療用遺伝子を送達することができるリポソームの使用に基づく。
【０００８】
本発明のリポソームは、外表面と治療用遺伝子が含まれる内部コンパートメントを有する中性リポソームを含む。リポソームの表面は数千のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖により修飾され、この工程は“ペギレーション（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）”と呼ばれる。ＰＥＧ鎖はリポソームの表面を“有毛”にし、これが非保護状態ではリポソームの血液からの迅速な除去を加速する、リポソーム表面への血液蛋白質の速やかな吸収を妨げる。対照的に、ペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｅｄ）リポソームは保護され、ずっと遅い速度で血液から除去される。ＰＥＧ鎖はまた、ペギル化リポソームの表面への“輸送可能なペプチド”の連結のための“結合物質”として作用し、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢＢＢを通る複合体のＲＭＴ、およびＢＣＭを通過するＲＭＥを引き起こすものである。治療用遺伝子には、治療薬をコードするために十分な量の遺伝子が含まれる。複数の血液脳関門ターゲッティング物質は結合物質を介してリポソーム表面に連結する。イムノリポソームターゲッティングベヒクル内にある治療用遺伝子は血液脳関門を横切って輸送され、脳の間質腔に放出される。いったんそこに到達すると、“ペギル化リポソーム”は受容体媒介エンドサイトーシスをうけ、脳の標的細胞中に送達される、なぜなら、リポソーム表面は脳細胞膜（ＢＣＭ）上にある受容体を認識する“輸送可能なペプチド”により修飾されているからである。ＢＢＢおよびＢＣＭ上には共にインスリンまたはトランスフェリン受容体が存在するため、“輸送可能なペプチド”は脳の２つの障壁、ＢＢＢおよびＢＣＭの両方を横切る輸送を触媒する。いったん標的脳細胞の内部にはいると、リポソーム複合体は脳細胞エンドソーム内に捕捉され、次いで脳細胞の細胞質中に遺伝子治療薬を放出することで、それが核内に入ることができ、治療薬が発現することになる。
【０００９】
本発明によれば、ポリエチレングリコールがリポソームの表面に結合したリポソームの使用が、イムノリポソームの内部に取り込まれたＤＮＡの血漿バイオアベイラビリティーの増加になることが見出された。イムノリポソームの内部にあるＤＮＡの安定性がｉｎ  ｖｉｖｏでの使用中増大することも見出された。さらに、脳において外因性遺伝子が発現されることに加え、同時に、血液脳関門ターゲッティング物質により標的にされる受容体を高レベルで含む、または発現する他の器官において遺伝子を発現させることも可能である。
【００１０】
本発明の先に記載された、そして多くの他の態様および付随する利点は、添付された図面と一緒に以下の詳細な説明を参照することにより、よりよく理解されるであろう。
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明のイムノリポソームは、血液脳関門を横切って治療用遺伝子を送達し、続いてその遺伝子によりコードされる治療薬が脳で発現されるように設計される。リポソームはナノコンテナーの形状であり、ナノ粒子またはリポソームのようなナノコンテナーは一般に薬物の封入のために使用される。リポソームは好ましくは２００ナノメーター以下の直径を有する。５０から１５０ナノメーター間の直径を有するリポソームが好ましい。約８０ナノメーターの外部直径を有するリポソームまたは他のナノコンテナーがとりわけ好ましい。適切なリポソームの型は、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、ジホスファチジルホスホコリン、ジステアロイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、またはコレステロールのような中性リン脂質、およびリポソーム内のアニオンＤＮＡを安定させるための少量（１％）のジドデシルジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）のようなカチオン脂質から作られる。
【００１２】
リポソーム内に封入される治療用遺伝子は、治療および診断薬を発現するために使用される一般の治療用遺伝子のいずれであってもよい。代表的な治療用遺伝子には、神経変性疾患、脳卒中、または脳外傷の治療のための脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）；パーキンソン病のためのチロシンヒドロキシラーゼおよび／または芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ；β−グルクロニダーゼ；ヘキソサミニダーゼＡ；脳腫瘍の治療のための単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼまたは上皮成長因子受容体に対するアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子；黒内障性白痴および他のリソソーム貯蔵障害のためのリソソーム貯蔵障害置換酵素；後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の脳成分治療のためのアンチセンスＲＮＡをコードする遺伝子が挙げられる。治療用遺伝子に加えて、プラスミドＤＮＡはまた治療配列の前または後どちらにでもＤＮＡ配列を含んでもよく、プラスミドのこれらの付加的な部分は脳の特定の細胞においてプラスミドの組織特異的転写を促進してもよく、治療用遺伝子のｍＲＮＡの増大された翻訳および／または安定化を促進してもよく、そして脳細胞においてトランスジーンのエピゾーム複製を可能にしてもよい。一般に、治療用遺伝子は少なくとも１００ヌクレオチドを含むか、または３０，０００ダルトンより大きい分子量を有する。治療用遺伝子は、リポソームまたはナノコンテナーの内部コンパートメント内に封入するための、プラスミドまたは他の適切なキャリア内に含まれることが好ましい。
【００１３】
治療用遺伝子は既知の薬物封入工程のいずれかに従ってリポソーム内に封入されてもよい。たとえば、超音波処理、凍結／解凍、およびメンブランフィルタによるエクストルージョン。
【００１４】
リポソーム内に封入される治療用遺伝子の数は、治療される疾患に依存して１から多数まで変化してもよい。その数を制限する要因はリポソーム内に封入される治療用遺伝子の直径であろう。ヒストン、プロタミン、またはポリリシンのようなポリカチオン蛋白質を使用して、数千ヌクレオチドを含むプラスミドＤＮＡのサイズを１０〜３０ｎｍの直径を有する構造に圧縮することが可能である。直径１００ｎｍのリポソームの容積は、１０ｎｍおよび３０ｎｍのＤＮＡ圧縮球体の容積よりそれぞれ１０００倍および３５倍大きい。したがって、リポソーム内に同じ遺伝子の多くのコピー、または複数遺伝子の複数コピーを封入することが可能である。
【００１５】
封入された治療用遺伝子の血液脳関門を横切る輸送を提供するために、種々の血液脳関門ターゲッティング物質がリポソーム表面に結合される。適切なターゲッティング物質としては、インスリン、トランスフェリン、インスリン様成長因子、またはレプチンが含まれる、なぜなら、これらのペプチドはすべてＢＢＢ内、およびＢＣＭ上にも存在する内因性ＲＭＴ系を有し、そしてこれらの内因性ペプチドは“輸送可能なペプチド”として使用できるからである。あるいは、リポソーム表面は内因性ＢＢＢ受容体を標的にする１ペプチド、および内因性ＢＣＭペプチドを標的にする他のペプチドの、２種の異なる“輸送可能なペプチド”と結合することができる。後者はニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞、平滑筋細胞、またはミクログリアのような脳内の特定の細胞に特異的であってもよい。ターゲッティングペプチドは受容体の内因性ペプチドリガンド、内因性リガンドの類似体、または内因性リガンドと同じ受容体に結合するペプチドミメティックＭＡｂｓであってもよい。ＢＢＢ“輸送可能なペプチド”としてのトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）−特異的ペプチドミメティックモノクローナル抗体の使用は、米国特許第５，１５４，９２４号；第５，１８２，１０７号；第５，５２７，５２７号；第５，６７２，６８３号；第５，８３３，９８８号；および第５，９７７，３０７号に詳細に記載される。ＢＢＢ“輸送可能なペプチド”としてのヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）に対するＭＡｂの使用が記載されている（３３）。
【００１６】
リポソーム表面に血液脳関門ターゲッティング物質を結合するために使用される結合物質はスフィンゴミエリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または他の有機ポリマーのような既知のポリマー性結合物質のいずれであってもよい。ＰＥＧはとりわけ好ましい結合物質である。結合物質の分子量は好ましくは１０００から５０，０００ＤＡの間にある。とりわけ好ましい結合物質は一端に脂質そして、他の端にマレイミド基を有する二官能性２０００ＤＡのＰＥＧである。ＰＥＧの脂質末端はリポソーム表面に結合し、マレイミド基は受容体特異的モノクローナル抗体または他の血液脳関門ターゲッティングベヒクルに結合する。５から１０００までのターゲッティングベヒクルがおのおののリポソームに結合することが好ましい。約２５〜４０のターゲッティングベヒクルが結合したリポソームがとりわけ好ましい。
【００１７】
リポソーム、結合物質およびターゲッティング物質の代表的な組み合わせは以下のとおりである：
輸送可能なペプチド、たとえばインスリンまたはＨＩＲＭＡｂがチオール化され、ＰＥＧ鎖の小画分先端上のマレイミド基に結合するか；または、たとえばトランスフェリンもしくはＴｆＲＭＡｂのような輸送可能なペプチド上の表面カルボキシル基がＰＥＧ鎖の先端上のヒドラジド（Ｈｚ）部分に、Ｎ−メチル−Ｎ′−３（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）のようなカルボキシル活性化基により結合する；輸送可能なペプチドがチオール化され、ジスルフィドリンカーにより、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）と反応させたリポソームに結合するか；または輸送可能なペプチドがアビジン−ビオチン技術によりリポソーム表面に結合する、たとえば輸送可能なペプチドがモノビオチン化され、ＰＥＧ鎖の表面に連結したアビジンまたはストレプトアビジン（ＳＡ）に結合する。
【００１８】
本発明は好ましいナノコンテナーとしてリポソームを使用することを記載してきたが、当業者は他のナノコンテナーを使用してもよいことを認識するであろう。たとえばリポソームは、ＤＮＡを封入し、製剤がまだ血中にあるか、または血液から標的細胞の細胞内コンパートメントへの輸送中に核酸をヌクレアーゼから保護することができる直径＜２００ｎｍのナノ粒子または任意の他の分子ナノコンテナーと交換することができる。またＰＥＧ鎖は、リポソームまたはナノコンテナーの表面に連結して、“輸送可能なペプチド”結合用の、および血液から製剤の除去を遅延させ、血漿薬物動力学を最適化するための足場を提供するという二重の役割を果たす、スフィンゴミエリンのような多くの他のポリマーと交換してもよい。さらに、本発明は特異的な標的受容体を有する任意の細胞群または器官に遺伝子を送達することを意図する。図４に示すように、本特許出願は肝臓、肺および脾臓のような器官に遺伝子を送達するために使用してもよい。
【００１９】
本発明のイムノリポソームは静脈内投与のための任意の適切な薬剤的キャリアと併用してもよい。イムノリポソームの静脈内投与は、侵襲性が最も少ないため、好ましい経路である。所望するならば、他の投与経路も可能である。適切な薬剤的に受容できるキャリアには、生理食塩水、Ｔｒｉｓバッファー、リン酸バッファー、または他の任意の水溶液が挙げられる。
【００２０】
イムノリポソームの治療的有効量は、治療される個体および投与される特定の遺伝子に依存して、広く変化するであろう。適切な量は当業者に既知の方法により証明されるであろう。
【００２１】
実施例
本発明の以下の実施例は外因性プラスミドＤＮＡについて記載し、ここでＳＶ４０プロモータにより駆動されるβ−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ発現プラスミドは、ＰＥＧ２０００と呼ばれる分子量２０００ダルトンのＰＥＧによりペギル化された中性リポソームの内部に組み込んだ。リポソーム当たり約４０のＰＥＧ鎖が、ラットトランスフェリン受容体に対するＯＸ２６マウスＭＡｂと結合する。ＯＸ２６ＭＡｂ、またはトランスフェリンはｉｎ  ｖｉｖｏで受容体媒介トランスサイトーシスを受けて、ＢＢＢを通過する。ＯＸ２６のようなペプチドミメティックＭＡｂの性質は、ＢＢＢＴｆＲを介した脳への輸送を引き起こすことにより、ペギル化イムノリポソームの脳ターゲッティングを可能にする。
【００２２】
材料。ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロール−３−ホスホコリン）およびＤＤＡＢ（ジドデシルジメチルアンモニウムブロミド）はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から購入した。ＤＳＰＥ（ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン）−ＰＥＧ２０００−マレイミドはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓに特注した。〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰ（８００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）はＮＥＮ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。１２５ＮａＩおよびＮ−スクシンイミジル−〔２，３−３〕プロピオネート（３Ｈ−ＮＳＰ）はＡｍｅｒｓｈａｍ  ＬＩＦＥ  ＳＣＩＥＮＣＥ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔ、ＩＬ）から購入した。ニックトランスレーションシステムはＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ（Ｆｒｅｄｒｉｃｋ、ＭＤ）から購入した。比活性２０００Ｋｕｎｉｔｚ  ｕｎｉｔｓ／ｍｇの膵臓ＤｎアーゼＩ（ウシ膵臓由来）はＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ルシフェラーゼ試薬、組換えルシフェラーゼ、６．８ｋｂ  ｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼプラスミド、およびエキソヌクレアーゼＩＩＩはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から得た。プロテインＧセファロースＣＬ−４ＢはＰｈａｒｍａｃｉａ  ＢｉｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入した。マウス骨髄腫腹水ＩｇＧ２ａ（κ）はＣａｐｐｅｌ（Ｗｅｓｔｃｈｅｓｔｅｒ、ＣＡ）から購入した。Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−３０（分子量カットオフ：３０，０００）濃縮装置はＡｍｉｃｏｎ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から得た。雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（体重２００〜２５０ｇ）はＨａｒｌａｎ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から得た。
【００２３】
プラスミド産生。  共にＳＶ４０プロモータの影響下にある、ホタル、ホチヌス  ピラリス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子をコードする５．８ｋｂプラスミドのｐＧＬ２、または６．８ｋｂ  ｐＳＶ−β−ガラクトシダーゼプラスミドはＰｒｏｍｅｇａから得た。プラスミドは大腸菌ＪＭ１０９株で増幅した。ＤＮＡはアルカリ分解法を使用して抽出し、ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ  Ｐｌａｓｍｉｄ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、イソプロパノールによる沈殿により精製した。ＤＮＡは２６０ｎｍでのＵＶ吸収により測定し、ＴＥバッファーに溶解した。ＢａｍＨＩによる消化により、線状ＤＮＡが得られた。そのサイズは０．８％アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロミド染色により確認した。
【００２４】
ＤＮＡ放射標識。  超らせんＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびＤｎａｓｅ  Ｉを使用して、ニックトランスレーション法（Ｎｉｃｋ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）により〔α−３２Ｐ〕ｄＣＴＰで標識した。取り込まれなかったヌクレオチドはＧ２５  Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ＩＮ）により除去した。標識されたプローブの比活性は５ｘ１０６ｃｐｍ／μｇである。
【００２５】
線状プラスミドはＴ４ポリメラーゼにより５′および３′末端を共に３２Ｐで放射標識し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５スピンカラムにより９８％トリクロロ酢酸沈降能に精製した。この物質は０．８％アガロースゲル電気泳動およびフィルムオートラジオグラフィーにより分析し、５．８ｋｂの単一バンドとして移動し、放射標識された低分子量の不純物は見られなかった。
【００２６】
３２Ｐ−線状プラスミドは薬物動力学実験に使用された。３２Ｐ−超らせんプラスミドはリポソームへの非標識超らせんプラスミドの取り込みを測定するためにトレーサとして使用された。
【００２７】
ペギル化リポソーム合成およびプラスミドＤＮＡ封入。
ＰＯＰＣ（１９．２μｍｏｌ）、ＤＤＡＢ（０．２μｍｏｌ）、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（０．６μｍｏｌ）、およびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−マレイミド（３０ｎｍｏｌ）はクロロホルム／メタノール（２：１，ｖｏｌ：ｖｏｌ）に溶解し、つづいて留去した。脂質は１ｍｌ  ０．０５ＭＴｒｉｓ−Ｃｌバッファー（ｐＨ＝８）に分散し、１０分間超音波処理した（２０）。超らせんＤＮＡ（１００μｇ）および１μＣｉ  ３２Ｐ−ＤＮＡを脂質に添加した。リポソーム／ＤＮＡ分散液は留去して、容積１００μｌ、最終濃度２００ｍＭにした。分散液はエタノール／ドライアイスで４〜５分間凍結して４０℃で１〜２分間解凍し、そしてこの凍結−解凍サイクルを１０回繰り返した。リポソーム分散液は脂質濃度４０ｍＭに希釈し、続いて先に記載（１９）の、手動のエクストルーダ（Ａｖｅｓｔｉｎ、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、それぞれ２枚重ねの４００ｎｍ、２００ｎｍ、１００ｎｍ、および５０ｎｍポアサイズポリカーボネート膜をとおして１０回エクストルージョンした。平均粒子径は、先に記載（１９）のＭｉｃｒｏｔｒａｃ  Ｕｌｔｒａｆｉｎｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｌｅｅｄｓ−Ｎｏｒｔｈｒｕｐ、Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ、ＦＬ）を使用して、準弾性光散乱（ｑｕａｓｉｅｌａｓｔｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）により測定した。
【００２８】
リポソームの外側に吸着したプラスミドはヌクレアーゼ消化により除去された（２０）。非封入ＤＮＡを消化するために、エクストルージョン後、５Ｕの膵臓エンドヌクレアーゼＩおよび５ＵのエキソヌクレアーゼＩＩＩを５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および０．１ｍＭ  ＤＴＴ中のリポソーム／ＤＮＡ混合物に添加した。３７℃で１時間インキュベーション後、反応は７ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することにより停止した。ヌクレアーゼ消化が外側のプラスミドＤＮＡを除去した程度は、ヌクレアーゼ処理前後に採取したアリコートのアガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色により測定した。
【００２９】
ペギル化リポソーム／ＤＮＡへのＯＸ２６  ＭＡｂまたはマウスＩｇＧ２ａの結合。  抗−ラットトランスフェリン受容体ＯＸ２６ＭＡｂは記載（２１）のように無血清ＯＸ２６ハイブリドーマならし培地から得た。ＯＸ２６およびアイソタイプ対照のマウスＩｇＧ２ａはプロテインＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅアフィニティークロマトグラフィーにより精製した（２１）。ＯＸ２６は先に記載のように、３Ｈ−ＮＳＰにより放射標識した（２２）。３Ｈ−ＯＸ２６は比活性  ０．１３μＣｉおよびＴＣＡ沈降能  ９５％であった。
【００３０】
ＯＸ２６またはマウスＩｇＧ２ａ（１．５ｍｇ、１０ｎｍｏｌ）は先に記載（１９）のように４０：１モル過剰の２−イミノチオラン〔トラウト（Ｔｒａｕｔ）の試薬〕を使用してチオール化した。リポソーム当たりの結合したＯＸ２６分子の数は、先に記載（１９）のように、リポソーム当たり１００，０００の脂質分子が存在すると仮定して、リポソームプール中の総ＯＸ２６ｃｐｍおよび標識されたＯＸ２６ＭＡｂの比活性から計算した。リポソーム製剤中の１００μｇ  ｐＧＬ２の最終捕捉％は３２Ｐ放射活性から計算し、典型的には３０％または３０μｇ  プラスミドＤＮＡであった。次にこれをルシフェラーゼ遺伝子発現測定のために、３匹のラットに１匹あたりプラスミドＤＮＡ１０μｇづつを投与した。
【００３１】
薬物動力学。  薬物動力学的研究は先に記載（１９）のように、ケタミン／キシラジンで麻酔した雄Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットで行った。以下の製剤３種のうち１種とした３２Ｐ−ｐＧＬ２（１μＣｉ）をラットに注入した：（ａ）裸のＤＮＡ、（ｂ）抗体が連結していない、ペギル化リポソームに封入されたＤＮＡ、または（ｃ）ＰＥＧ鎖に結合したＯＸ２６ＭＡｂを持つペギル化リポソームに封入されたＤＮＡ。
【００３２】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのルシフェラーゼ遺伝子発現。  ＯＸ２６ＭＡｂまたはマウスＩｇＧ２ａのいずれかと結合したペギル化リポソーム／ルシフェラーゼＤＮＡを、麻酔したラットに、ラット毎にｐＧＬ２  ＤＮＡ１０μｇの投与量で静脈内注射した。ラットは注射後２４，４８または７２時間で屠殺した。脳、心臓、腎臓、脾臓、肝臓および肺組織は、０．１Ｍ  リン酸カリウムバッファー、ｐＨ７．８，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００，１ｍＭ  ジチオスレイトールおよび２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む４倍容積の溶解バッファー中で、Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーを使用してホモジナイズした。ホモジネートは１４，０００ｒｐｍ、１０分間、４℃で遠心分離した。上清はＬｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｉｏｌｕｍａｔ  ＬＢ  ９５０７，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、Ｎａｓｈｕａ、ＮＨ）による組織ルシフェラーゼ活性の測定に使用した；１００μｌの再構成ルシフェラーゼ基質を組織抽出物２０μｌに添加した。先に記載（２３）のように、ピーク発光は２０℃で１０秒間測定し、相対光単位（ＲＬＵ）として記録した。バックグラウンドレベルは溶解バッファーのみを含む試料を測定することにより決定した。組織抽出物の蛋白質濃度は、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）蛋白質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）により決定した。
【００３３】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのβ−ガラクトシド遺伝子発現。  ペギル化イムノリポソーム／β−ガラクトシダーゼＤＮＡは、ＯＸ２６ＭＡｂに関して先に記載した方法と同様に製造し、先に記載のように０．２５ｋｇの成体ラットにつき５０μｇ  プラスミドＤＮＡの投与量をラットに静脈内注射した。４８時間後，脳および肝臓を取り出し、粉状ドライアイス中で速やかに凍結し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  ＯＣＴ包埋剤に浸し、１５ミクロン凍結切片をＢｒｉｇｈｔ  ｃｒｙｏｓｔａｔ上で作製した。製造業者の説明書に従い、切片を室温で５分間０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４中の０．５％  グルタルアルデヒドで固定し、５−ブロモ４−クロロ−３−インドイル−β−ガラクトース（Ｘ−ｇａｌ、Ｐｒｏｍｅｇａ）によるβ−ガラクトシダーゼ組織化学分析を行うまで−７０℃で保存した。スライドを３７℃で一晩染色し、いくつかのスライドはＭａｙｅｒのヘマトキシリンで対比染色した。スライドは写真を撮るか、またはトランスイルミネータの付いた、１２００ｄｐｉ  ＵＭＡＸ平面スキャナーでスキャニングし、Ｇ４  Ｐｏｗｅｒ  Ｍａｃｉｎｔｏｓｈを用いて、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ５．５により処理した。
【００３４】
結果
リポソーム内にｐＧＬ２ルシフェラーゼプラスミドを持つペギル化イムノリポソームの構造を図１Ａに示す。内部にｐＧＬ２プラスミドを持つペギル化イムノリポソームの平均直径は７３ｎｍ（図１ｂ）であるため、リポソームは水溶液中で形成される。プラスミドＤＮＡを持つペギル化イムノリポソーム形成中に、複合体はヌクレアーゼ混合物で処理される（方法）。このヌクレアーゼ処理はペギル化リポソームの外側に結合したプラスミドＤＮＡを除去し；アガロースゲル電気泳動後のエチジウムブロミド染色は外側に結合したプラスミドがいずれも製剤から完全に除去されたことを示す（図１Ｃ、レーン１）。ｐＧＬ２プラスミドＤＮＡをリポソーム内への取り込みの前に３２Ｐで放射標識すると、５．８ｋｂ  ｐＧＬ２プラスミドのみが検出され、ＤＮＡの低分子量型は観察されなかった（図１Ｃ、フィルムオートラジオグラフィー）。ペギル化イムノリポソーム上のＰＥＧ鎖末端へのＯＸ２６ＭＡｂの共有結合はＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−４Ｂゲルろ過クロマトグラフィーによりモニターした（図１Ｄ）。これらの研究はリポソームの内部に取り込まれた３２Ｐ−ｐＧＬ２とＰＥＧ鎖に付着した３Ｈ−標識ＯＸ２６ＭＡｂの共移動を示す。ＯＸ２６の比活性に基づき、このペギル化イムノリポソームの製剤は個々のリポソームに結合したＯＸ２６ＭＡｂを３９分子含むことが計算された。
【００３５】
薬物動力学的研究を、末端が３２Ｐで標識された線状ｐＧＬ２プラスミドＤＮＡに関して行った。つまり、これを以下の３種の形状の１種として麻酔したラットに注射した：（ａ）裸のＤＮＡ、（ｂ）ＭＡｂと結合していないペギル化リポソームの内部に取り込まれた３２Ｐ−ｐＧＬ２プラスミド、または（ｃ）ＯＸ２６と結合したペギル化イムノリポソームの内部に取り込まれた３２Ｐ−ｐＧＬ２プラスミドＤＮＡ。これら３種の異なる製剤を異なる群のラットに注射し、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）で沈殿した血漿放射活性を静脈内投与後２時間までの各種時点で測定した（図２、右パネル）。裸のＤＮＡは４．１±０．５ｍＬ／分／ｋｇのクリアランス（Ｃｌ）、５１４±２４３ｍＬ／ｋｇの全身分布容積（Ｖｓｓ）で、速やかに血漿から除去された。ＯＸ２６ＭＡｂを持たないペギル化リポソームの内部にＤＮＡが取り込まれたときは、ＤＮＡのクリアランスは、０．９５±０．０５ｍＬ／分／ｋｇまで４倍以上減少した（図２、左パネル）。ＯＸ２６ＭＡｂがリポソームのＰＥＧ尾の先端に結合しているとき、全身クリアランスは２．３±０．２ｍＬ／分／ｋｇに増加した。脳、肝臓、腎臓、および心臓における組織取り込みも測定した。これらのデータは、ＤＮＡを収容するペギル化リポソームの先端へのＯＸ２６ＭＡｂの連結が、ペギル化イムノリポソームの腎臓または心臓における組織取り込みのわずかな増加、肝臓における中等度の増加、そして脳取り込みの著しい増加を引き起こすことを示す（図３）。ＰＥＧ鎖に結合したＯＸ２６を持たないプラスミドＤＮＡを収容するペギル化リポソームは有意に脳に取り込まれなかった（図３）。しかし、プラスミドＤＮＡを収容するＯＸ２６ペギル化リポソームは、静脈内注射後１２０分で、０．０６６±０．００２％ＩＤ／ｇ脳のレベルで脳に取り込まれた（図３）。この脳取り込みのレベルはモルヒネのような神経活性小分子のそれに匹敵し、麻酔したラットに注射後６０分で、モルヒネは０．０８１±０．００１％ＩＤ／ｇ脳、脳に取り込まれた（２４）。
【００３６】
脳および末梢組織におけるルシフェラーゼ遺伝子発現は、ＯＸ２６ペギル化イムノリポソームの内部に取り込まれたプラスミドＤＮＡをラット毎に１０μｇ投与したラットの群において試験した。ｍｇ組織蛋白質毎の相対光単位（ＲＬＵ）として表された器官ルシフェラーゼ酵素活性は、静脈内注射後２４，４８および７２時間後に測定した（図４）。心臓または腎臓におけるルシフェラーゼ遺伝子のターゲッティングは最小であったが、脳におけるルシフェラーゼ遺伝子発現は肺および脾臓のそれに類似し、静脈内投与後４８時間で最高になった（図４）。肝細胞膜上でトランスフェリン受容体は大量発現されるために、肝臓におけるピークルシフェラーゼ遺伝子発現は脳に比較して約６倍高かった。対照実験のために、ＯＸ２６と同じアイソタイプであるマウスＩｇＧ２ａをＯＸ２６ＭＡｂの代わりにペギル化リポソームに結合することを除いて、同様にペギル化イムノリポソームを製造した。マウスＩｇＧ２ａペギル化イムノリポソーム／ｐＧＬ２ＤＮＡ複合体は麻酔したラットに静脈内注射した；ｐＧＬ２プラスミドＤＮＡの投与量はラット毎に１０μｇ、または４０μｇであった。しかし、静脈内注射後４８時間では、脳または他のいずれの器官においても測定可能なルシフェラーゼ発現は見られなかった。この対照実験は３回繰り返し、すべての試料でルシフェラーゼ活性は検出限界以下であった。
【００３７】
β−ガラクトシダーゼ組織化学は図５に示す。低倍率（図５Ａ）で見られるように、脳はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を広く発現するが、対照脳ではβ−ガラクトシダーゼ活性は全く見られなかった（図５Ｂ）。両側脳室の脈絡叢と同様に、海馬のＣＡ１−ＣＡ３セクターの錐体ニューロンは明確に視覚化され；第３脳室の後角および乳頭陥凹の両方においても脈絡叢は遺伝子発現に陽性である（図５Ａ）。脳基底部にある海馬の対視索上核は低倍率で見られる（図５Ａ）。高倍率では、微小血管（図５Ｃ）、脈絡叢上皮（図５Ｄ）、および視床核（図５Ｅ）は豊富なβ−ガラクトシダーゼ発現を示した。脳全体のニューロンにおける低レベルの遺伝子発現も視覚化された。門脈周囲パターンにおいて肝臓全体の遺伝子発現が組織化学的に検出され、図５Ｆに示すように遺伝子発現は肝細胞に局在した。高倍率像は肝細胞全体の酵素生成物の点状（ｐｕｎｃｔａｔｅ）沈着を示し、このことは酵素が小胞体の管状小胞（ｔｕｂｕｌｏｖｅｓｉｃｕｌａｒ）ネットワークに局在することを示唆する。
【００３８】
先の実施例は、本発明に従って、外因性遺伝子が非侵襲的投与後に脳における広範な発現が可能であることを証明する。ＳＶ４０プロモータおよびプラスミドの３−非翻訳領域（ＵＴＲ）部分を組織−および遺伝子−特異的プロモータおよび３−ＵＴＲ要素と交換すると、脳における領域特異的および細胞特異的遺伝子発現でさえも可能なはずである。この遺伝子治療の方法は、単に製剤（図１Ａ）のＭＡｂ部分を、霊長動物では抗−ＴｆＲＭＡｂより１０倍近く活性が高いヒトインスリン受容体（ＨＩＲ）ＭＡｂ（３３）に変換することにより、ヒトでの使用に適切になる。ＨＩＲＭＡｂのキメラ型は最近記載され、遺伝子組換えキメラＨＩＲＭＡｂは、元のマウス抗体のように霊長動物またはヒトＢＢＢにおいて、同一の輸送の性質を有する（３４）。
【００３９】
さらに別の実施例において、６．８ｋｂ  ｐＳＶ−β−ガラクトシドプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、２種のターゲッティングリガンド：ラットトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）に対するＯＸ２６モノクローナル抗体（ＭＡｂ）またはマウスＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体のうちのいずれか１種と結合したペギル化イムノリポソームの内部に取り込んだ。器官は投与後２、４、または６日にβ−ガラクトシド組織化学またはサザンブロット法のために取り出した。マウスＩｇＧ２ａペギル化イムノリポソーム投与後に、肝臓、脾臓、脳または心臓で測定可能なβ−ガラクトシド遺伝子発現は見られなかった。マウスＩｇＧ２ａペギル化イムノリポソームの静脈内投与後４８時間では、サザンブロット法により肝臓にプラスミドを検出できなかった。しかし、ＯＸ２６ＭＡｂとともに製剤されたペギル化イムノリポソームの内部にβ−ガラクトシド発現プラスミドが取り込まれると、製剤の単回静脈内注射後４８時間で肝臓または脾臓に豊富なβ−ガラクトシド遺伝子発現が見られた。外因性プラスミドＤＮＡはまた、静脈内注射後２、４、および６日に肝臓でサザンブロット法により検出された。対照的に、心筋の連続毛細血管を含む内皮上でのＴｆＲのわずかな発現のために、心臓では測定可能なβ−ガラクトシド遺伝子発現は見られなかった。肝臓のβ−ガラクトシド組織化学は、正常ラット肝臓の肝ＴｆＲの同じ発現パターンと一致して、遺伝子発現がほとんど肝小葉全体で一様であることを示す。脾臓における高倍率のβ−ガラクトシド組織化学は、赤脾髄での著しい遺伝子発現および白脾髄でのより少ない遺伝子発現を示す。
【００４０】
これらの付加的な実施例は、本発明が脳における広範な外因性遺伝子発現を提供することを示す。脳におけるβ−ガラクトシド導入遺伝子の発現は、ペギル化イムノリポソームの単回静脈内注射後少なくとも６日間持続する。肝臓または脾臓においても、単回静脈内注射後少なくとも６日間持続するβ−ガラクトシド導入遺伝子の発現が見られ、注射後６日の肝臓または脾臓の組織化学パターンは注射後２日のこれらの器官で見られたものと類似した。測定は静脈内注射後４日でも行われ、これらの組織化学的研究は、肝臓、脾臓、または脳におけるβ−ガラクトシド遺伝子発現のレベルが２日または６日の活性の中間であることを示した。外因性遺伝子は、肝臓、脾臓、および脳のような抗−ＴｆＲＭＡｂに標的にされる器官の実質内に深く発現される。遺伝子発現は、ペギル化イムノリポソームの単回静脈内注射後少なくとも６日間持続する。β−ガラクトシド組織化学はサザンブロット法により確認され、組織でのβ−ガラクトシド酵素活性の持続がｉｎ  ｖｉｖｏでの導入遺伝子の持続性と平行することを示した。
【００４１】
本発明は第２の種、マウスにおいても証明された。ラットＴｆＲに対するＯＸ２６ＭＡｂはマウスでは生物学的に活性ではない（３４）。したがって、ペギル化イムノリポソームにマウスＴｆＲに対するラット８Ｄ３ＭＡｂを結合し、マウスに静脈内注射した。２日後に脳を取り出し、器官におけるβ−ガラクトシド遺伝子発現レベルを標準組織化学により測定した。脳および脾臓における外因性遺伝子の広範な発現が見出された。
【００４２】
本発明の典型的な態様を記載したので、当業者は開示内容は単なる例示であり、本発明の範囲内で各種の他の可能な変法、応用、および修正が行われてもよいことを理解するであろう。したがって、本発明は本明細書で説明される具体的な態様に限定されず、以下の請求項のみによって限定される。
【００４３】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａは、ｐＧＬ２ルシフェラーゼ発現プラスミドが中性脂質から構築されたＯＸ２６（ＢＢＢターゲッティング物質）ペギル化イムノリポソームに封入される、好ましい典型的な態様の図である。リポソーム表面に連結した、ＰＥＧ２０００と呼ばれる分子量２０００ダルトンのポリエチレングリコールが約３０００鎖あり、ＰＥＧ鎖の約１％がラットトランスフェリン受容体に対するＯＸ２６モノクローナル抗体と結合している。ＯＸ２６ＭＡｂはペプチドミメティックＭＡｂであり、トランスフェリンのＢＢＢ輸送を媒介する内因性経路でＢＢＢを通るＲＭＴを受ける（５）。
図１ＢはｐＧＬ２プラスミドＤＮＡを封入するペギル化リポソームの平均直径が７３ｎｍであることを示すグラフである。
図１ＣはＤＮＡｓｅ  １／エキソヌクレアーゼＩＩＩ処理の前（レーン２）および後（レーン１）のリポソームの電気泳動を示す。電気泳動は０．８％アガロースゲル電気泳動で行われ、エチジウムブロミド（ＥｔＢｒ）で染色された。ＤＮＡ分子量サイズ標準は左側に示される。ペギル化リポソームに結合したＤＮＡの約５０％はリポソームの外側に結合し（レーン２）、これはヌクレアーゼ処理により定量的に除去された（レーン１）。極微量のｐＧＬ２プラスミドが３２Ｐで放射標識され、ゲルのフィルムオートラジオグラフィーは単一の５．８ｋｂバンドを示し、低分子量の放射標識されたＤＮＡは見られなかった。これらの結果は、ＤＮＡのすべてはペギル化イムノリポソームの内側に封入されていることを示す。
図１Ｄでは、封入されたｐＧＬ２プラスミドを有するペギル化リポソームへのＯＸ２６ＭＡｂの結合に続いてヌクレアーゼ消化したものについてセファロースＣＬ−４Ｂゲルろ過クロマトグラフィーを行った。極微量の封入されたｐＧＬ２プラスミドＤＮＡが３２Ｐで標識され、極微量のＯＸ２６ＭＡｂが３Ｈで放射標識された。これは結合したＯＸ２６ＭＡｂと封入されたｐＧＬ２プラスミドＤＮＡの共移動を示す。
【図２】図２Ａは、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）により沈殿した、血漿ｍＬあたりの注入量（ＩＤ）の割合を、麻酔したラットに３２Ｐ  ＤＮＡを静脈内注射した後１２０分間までの時間に対してプロットしたグラフを示す。ＤＮＡは３種の製剤のうち１種として注射した：（ａ）“裸”のＤＮＡ（ＤＮＡ）、（ｂ）ヌクレアーゼ処理されたＯＸ２６ペギル化イムノリポソームの内部に封入されたｐＧＬ２プラスミドＤＮＡ（ＯＸ２６−リポ／ＤＮＡ）、および（ｃ）連結したＯＸ２６ＭＡｂを持たない、ヌクレアーゼで処理されたペギル化リポソームの内部に封入されたｐＧＬ２プラスミドＤＮＡ（Ｐｅｇ−リポ／ＤＮＡ）。
図２Ｂは、ＴＣＡにより沈殿した血漿放射活性の割合を示すグラフである。データは平均±ＳＥである（ｎ＝３ラット／群）。
【図３】図３は、連結した抗体を持たないペギル化リポソーム（ＰＥＧ／ＤＮＡ）、またはＯＸ２６ペギル化イムノリポソーム（ＯＸ２６−リポ／ＤＮＡ）内のいずれかに封入された３２ＰＧＬ２プラスミドＤＮＡの静脈内注射後１２０分間での肝臓、脳、腎臓、または心臓の組織１グラム毎の注入量（ＩＤ）％として表された組織取り込みを示すグラフである。データは平均±ＳＥである（ｎ＝３ラット／群）。
【図４】図４は、本発明に従ってＯＸ２６ＭＡｂと結合したペギル化イムノリポソームに封入されたｐＧＬ２プラスミドＤＮＡ注射後２４、４８，７２時間の脳、心臓、腎臓、肝臓、肺および脾臓の組織蛋白質１ｍｇあたりの相対的光単位（ＲＬＵ）として表した、器官ルシフェラーゼ活性を示すグラフである。データは平均±ＳＥである（ｎ＝３ラット／群）。
【図５】図５Ａ−Ｆは、本発明に従ってＯＸ２６ペギル化イムノリポソームの内部に封入されたβ−ガラクトシド遺伝子の静脈内注射後４８時間での脳（図５Ａ−Ｅ）および肝臓（図５Ｆ）におけるβ−ガラクトシドの組織化学を示す写真である（図５Ｂ−Ｆ）。遺伝子投与を受けていないラット由来の対照脳は図５Ｂに示される。倍率＝１．５ｍｍ（図５Ａ）、２．２ｍｍ（図５Ｂ）、５７μｍ（図５Ｃ）、２３μｍ（図５Ｄ）、２３０μｍ（図５Ｅ）、および１５μｍ（図５Ｆ）。図ＡおよびＢは対比染色されていない。図５Ａで、側脳室（ＬＶ）、第３脳室（ＩＩＩ）、左または右海馬（ｈｉｐｐｏ）、および視床下部視索上核（ｓｏｎ）は標識される。図５Ｄは脈絡叢の毛細血管の管腔（Ｌ）を示し、そして図５Ｅは、図５Ａでも見ることができる、第３脳室の脈絡叢下の視床（ｔｈａｌ）核を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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