(57)【要約】本発明は、アミノ酸配列：【化１】2004514449.tif 000019を有するパピローマウイルスＴ細胞エピトープ及び／又はその機能的に活性な変異体、並びに診断及び療法へのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
【化１】
2004514449.tif 000016
を有するＴ細胞エピトープ及び／又はその機能的に活性な変異体。
【請求項２】
前記変異体が、
【化２】
2004514449.tif 000017
と、アミノ酸レベルにおいて少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７５％、特に少なくとも約８５％の配列相同性を有することを特徴とする、請求項１記載のＴ細胞エピトープ。
【請求項３】
前記変異体が、
【化３】
2004514449.tif 000018
との構造相同性を有することを特徴とする、請求項１記載のＴ細胞エピトープ。
【請求項４】
Ｔ細胞エピトープが細胞傷害性応答を誘発するか、Ｔヘルパー細胞機能を仲介することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載のＴ細胞エピトープ。
【請求項５】
化合物がパピローマウイルス由来の天然生成Ｌ１タンパク質ではなく、ＨＰＶ−１６Ｔ細胞エピトープの場合には、パピローマウイルス由来の天然生成Ｌ１タンパク質の排他的にＮ末端欠失又は排他的にＣ末端欠失突然変異体ではない、請求項１〜４のいずれかに記載のＴ細胞エピトープを含有する化合物。
【請求項６】
化合物がポリペプチド、特に融合タンパク質であることを特徴とする、請求項５記載の化合物。
【請求項７】
化合物が、長さにおいて、少なくとも約５０アミノ酸、好ましくは、少なくとも約３５アミノ酸、特に、少なくとも約２０アミノ酸、そして、特に好ましくは、少なくとも約９〜１３アミノ酸のポリペプチドであることを特徴とする、請求項５又は６に記載の化合物。
【請求項８】
化合物がＴ細胞エピトープ及び／若しくは前記融合タンパク質並びに／又は該Ｔ細胞エピトープ及び／若しくは融合タンパク質の化学的修飾の化学的標識、放射性標識、非放射性標識、同位体標識及び／又は蛍光標識を含有することを特徴とする、請求項５〜７のいずれかに記載の化合物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載のＴ細胞エピトープをコードする又は、請求項５〜８のいずれかに記載のＴ細胞エピトープを含有する化合物をコードすることを特徴とする核酸。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸を含有することを特徴とするベクター、特に発現ベクター。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれかに記載の少なくとも１つのＴ細胞エピトープを、又は請求項５〜８のいずれかに記載の化合物を含有する、好ましくは提示することを特徴とする細胞。
【請求項１２】
請求項９記載の核酸及び／又は請求項１０記載のベクターによって、細胞がトランスフェクトされる、形質転換される及び／又は感染されることを特徴とする、請求項１１記載の細胞。
【請求項１３】
細胞が、請求項１〜４のいずれかに記載の少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、請求項５〜８のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物及び／又は、請求項５〜８のいずれかに記載のＴ細胞エピトープを含有する請求項１５〜１７のいずれかに記載の少なくとも１つの複合体と共に、インキュベートされたことを特徴とする、請求項１１記載の細胞。
【請求項１４】
細胞がＢ細胞、マクロファージ、樹枝状細胞又は線維芽細胞、特にＪＹ細胞、Ｔ２細胞、ＣａＳｋｉ細胞又はＥＢＶ形質転換細胞であることを特徴とする、請求項１１又は１２記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれかに記載のＴ細胞エピトープ又は請求項５〜８のいずれかに記載の化合物及び少なくとも１つの更なる化合物を含む複合体。
【請求項１６】
複合体が少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ分子を、好ましくはＨＬＡ　Ａ２．０１、Ａ１又はＡ２４テトラマーとして含有することを特徴とする、請求項１５記載の複合体。
【請求項１７】
前記ＭＨＣクラスＩ分子がヒトＭＨＣクラスＩ分子、特に、ＨＬＡ　Ａ２．０１、Ａ１又はＡ２４分子であることを特徴とする、請求項１６記載の複合体。
【請求項１８】
請求項１〜４のいずれかに記載の少なくとも１つのＴ細胞エピトープによる、又は請求項１〜４のいずれかに記載のＴ細胞エピトープを含有する少なくとも１つの化合物による、Ｔ細胞活性化のｉｎ−ｖｉｔｒｏ検出方法であって、下記工程：
（ａ）少なくとも１つの前記化合物によって細胞を刺激する工程；
（ｂ）請求項１〜４のいずれかに記載のＴ細胞エピトープ又は請求項１５〜１７のいずれかに記載の複合体を提示する、少なくとも１つの標的細胞を加える工程；及び
（ｃ）Ｔ細胞の活性化を測定する工程
を含有する上記方法。
【請求項１９】
工程（ａ）後に、工程（ｂ）が次に続く前に、下記追加工程（ａ’）：
（ａ’）細胞を（ｉ）請求項１〜４のいずれかに記載のＴ細胞エピトープ、請求項５〜８のいずれかに記載の化合物、請求項１５〜１７のいずれかに記載の少なくとも１つの複合体、少なくとも１つのキャプソメア、少なくとも１つの安定なキャプソメア、少なくとも１つのＶＬＰ、少なくとも１つのＣＶＬＰ及び／又は少なくとも１つのウイルスを負荷されている、少なくとも１つの標的細胞、（ｉｉ）請求項１５〜１７のいずれかに記載の少なくとも１つの複合体、並びに／あるいは（ｉｉｉ）請求項１〜４のいずれかに記載のＴ細胞エピトープを提示する少なくとも１つの標的細胞と共に、少なくとも約１週間、特に少なくとも約８週間、同時培養する工程
を含有することを特徴とする、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
標的細胞を請求項１〜４のいずれかに記載の少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、請求項５〜８のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物及び／又は、請求項５〜８のいずれかに記載のＴ細胞エピトープを含有する請求項１５〜１７のいずれかに記載の少なくとも１つの複合体と共に、インキュベートすることを特徴とする、請求項１１、１３、１４、１８又は１９のいずれかに記載の標的細胞の調製方法。
【請求項２１】
標的細胞が請求項９記載の核酸及び／又は請求項１０記載のベクターによって、トランスフェクトされる、形質転換される及び／又は感染されることを特徴とする、請求項１１、１２、１４、１８又は１９のいずれかに記載の標的細胞の調製方法。
【請求項２２】
標的細胞がＢ細胞、マクロファージ、樹枝状細胞又は線維芽細胞、特にＪＹ細胞、Ｔ２細胞、ＣａＳｋｉ細胞又はＥＢＶ形質転換細胞であることを特徴とする、請求項２０又は２１に記載の標的細胞の調製方法。
【請求項２３】
工程（ａ）の代わりに下記工程（ａ”）：
（ａ”）Ｔ細胞を含有するサンプルを単離及び調製して、次にそれらを培養する工程が行なわれることを特徴とする、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）請求項１〜４のいずれかに記載の少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、請求項５〜８のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物、請求項１０記載の少なくとも１つのベクター、請求項１１〜１４のいずれかに記載の少なくとも１つの細胞及び／又は請求項１５〜１７のいずれかに記載の少なくとも１つの複合体、並びに（ｂ）免疫系エフェクター細胞、好ましくはＴ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞又はＴヘルパー細胞を含む、Ｔ細胞活性化をｉｎ−ｖｉｔｒｏ検出するための試験系。
【請求項２５】
免疫応答を誘発するため又は検出するための、請求項１〜４のいずれかに記載の少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、請求項５〜８のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物、請求項１０記載の少なくとも１つのベクター、請求項１１〜１４のいずれかに記載の少なくとも１つの細胞及び／又は請求項１５〜１７のいずれかに記載の少なくとも１つの複合体の使用。
【請求項２６】
請求項１〜４のいずれかに記載の少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、請求項５〜８のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物、請求項１０記載の少なくとも１つのベクター、請求項１１〜１４のいずれかに記載の少なくとも１つの細胞及び／又は請求項１５〜１７のいずれかに記載の少なくとも１つの複合体、及び適当な場合には、製薬的に受容されるキャリヤーを含む薬剤又は診断剤。
【請求項２７】
請求項１〜４のいずれかに記載の少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、請求項５〜８のいずれかに記載の少なくとも１つの化合物、請求項１０記載の少なくとも１つのベクター、請求項１１〜１４のいずれかに記載の少なくとも１つの細胞及び／又は請求項１５〜１７のいずれかに記載の少なくとも１つの複合体が溶解状態で存在する、固体マトリックスに結合している、及び／又はアジュバントで処理されていることを特徴とする、請求項２６記載の薬剤又は診断剤。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、アミノ酸配列：
【０００２】
【化４】
2004514449.tif 000002
【０００３】
及び／又はその機能的に活性な変異体を有するパピローマウイルスＴ細胞エピトープ、並びに診断及び治療へのその使用に関する。
【０００４】
いぼウイルスとも呼ばれる、パピローマウイルスは、約８０００塩基対のゲノムサイズ及び約５５ｎｍの直径を有する正二十面体キャプシドを有する二本鎖ＤＮＡウイルスである。今までに、ヒトに対して病原性である１００種類を越えるパピローマウイルス（ＨＰＶ）が知られており、そのうちの幾つか、例えば、ＨＰＶ−１６， ＨＰＶ−１８， ＨＰＶ−３１， ＨＰＶ−３３， ＨＰＶ−３９， ＨＰＶ−４５， ＨＰＶ−５２及び ＨＰＶ−５８は悪性腫瘍を誘発する可能性があり、他のもの、例えば、ＨＰＶ−６， ＨＰＶ−１１及び ＨＰＶ−４２，は良性腫瘍を誘発する可能性がある。
【０００５】
パピローマウイルス・ゲノムは３領域に細分されることができる：第１領域は、ウイルスの転写及び複製を制御する要素を含有する非コーディング領域に関する。Ｅ（初期）領域とも呼ばれる第２領域は異なるタンパク質コーディングセグメントＥ１−Ｅ７を含有し、これらのうちの例えば、Ｅ６及びＥ７タンパク質は上皮細胞の形質転換を担い、Ｅ１タンパク質はＤＮＡコピー数を制御する。Ｅ６及びＥ７領域は腫瘍遺伝子と呼ばれるものであり、悪性に変性した細胞においても発現される。Ｌ（後期）領域とも呼ばれる第３領域は２つのタンパク質コーディングセグメントＬ１及びＬ２を含有し、これらはウイルスキャプシドの構造成分をコードする。ウイルスキャプシドの９０％より多くがＬ１タンパク質から成り、Ｌ１：Ｌ２ 比率は一般に３０：１である。本発明の意味において、Ｌ１タンパク質なる用語は主要なパピローマウイルスキャプシドタンパク質を意味するとして理解される（ＢａｋｅｒＴ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ６０， １４４５）。
【０００６】
症例の５０％より多くにおいて、ＨＰＶ−１６が子宮頚部癌（子宮頚癌）に関係する。ＨＰＶ−１６は頚部新生物の形成の腫瘍危険因子である。この疾患の進行には免疫系が重要な役割を果たしている。したがって、防御機構には細胞免疫応答、特に抗原特異性Ｔリンパ球が恐らく重要であると思われる。それ故、極端に悪性な頚部上皮内新生物（ＣＩＮ ＩＩ／ＩＩＩ）及び頚部腫瘍では、感染した上皮の全ての層においてＥ７遺伝子が構成的に発現されることが見出されている。Ｅ７タンパク質が特に、可能な腫瘍抗原及び活性化Ｔ細胞の標的分子であると見なされるのはこの理由からである（例えばＷＯ ９３／２０８４４参照）。しかし、患者においてＥ７が誘発する細胞免疫応答は、疾患の経過に影響を及ぼすほど充分に強いとは思われない。この免疫応答は恐らく適当なワクチンによって増強されると考えられる。
【０００７】
Ｌ１遺伝子の発現又はＬ１遺伝子とＬ２遺伝子との同時発現がキャプソメア、安定なキャプソメア、キャプシド又はウイルス様粒子（ＶＬＰｓ）の形成をもたらしうることが見出されている（例えばＷＯ ９３／０２１８４，ＷＯ ９４／２０１３７又はＷＯ ９４／０５７９２参照）。キャプソメアは５つのＬ１タンパク質から成るオリゴマー立体配置を意味するとして理解される。キャプソメアは基本的ビルディング・ブロックであり、これからウイルスキャプシドが構築される。安定なキャプソメアは、キャプシドにアセンブルされることができないキャプソメアを意味するとして理解される。キャプシドは、例えば７２キャプソメアから構成されるパピローマウイルス皮殻を意味すると理解される（ＢａｋｅｒＴ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ． ６０， １４４５）。ＶＬＰは、形態的に及びその抗原性において完全なウイルスに類似するキャプシドを意味するとして理解される。ＶＬＰｓは、種々な動物系において中和抗体の形成を特徴とする体液性免疫応答を誘発させるために用いられている。しかし、Ｌ１タンパク質及び／又はＬ２タンパク質に対するウイルス−中和抗体の形成は、ウイルス感染が既に発生している場合には、臨床的に殆ど重要ではない、この理由は、ウイルス感染細胞を除去するために必要であると思われるのは抗体ではなくて、むしろウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答であるからである。その上、ＶＬＰｓは細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発することができるとしても、排他的にキャプシドタンパク質Ｌ１及び／又はＬ２に対する免疫応答は、パピローマウイルス関連腫瘍を治療するために適するとは思われない。
【０００８】
それゆえ、キメラパピローマウイルス様粒子（ＣＶＬＰｓ）と呼ばれるものが開発されており、これらの粒子はキャプシドタンパク質Ｌ１と可能な腫瘍抗原Ｅ７との間に形成されるＨＰＶ−１６融合タンパク質から成る（ＷＯ ９６／１１２７２及びＭｕｌｌｅｒ，Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ， ２３４， ９３）。ＣＶＬＰｓのみがＥ７タンパク質に対する弱い体液性免疫応答を誘発した（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９７），上記参照）。しかし、試験したＣＶＬＰｓの幾つかは実際にはマウスにおいて所望のＥ７特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発しなかった（ＰｅｎｇＳ． ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２４０， １４７−５７も参照のこと）。それゆえ、ＣＶＬＰｓはワクチンの開発のためにも及び既存の感染とそれに由来する腫瘍の治療のためにも興味深い、この理由は、クラスＩ　ＭＨＣ分子を介して腫瘍細胞によって提示されるＥ７ペプチドが細胞傷害性Ｔ細胞の標的分子を構成すると考えられるからである。
【０００９】
ＣＶＬＰｓから構成されるワクチンは、ＣＶＬＰｓによる細胞の偽感染（ｐｓｅｕｄｏｉｎｆｅｃｔｉｎｇ）の原理に基づく。これは、ＣＶＬＰｓがウイルスと同様に細胞にアクセスして、そこでペプチドに加工され、次に該ペプチドがＭＨＣクラスＩ及びクラスＩＩ分子に負荷されて、最後に、それぞれＣＤ８陽性細胞及びＣＤ４陽性細胞に提示されることを意味する。この刺激の結果として、ＣＤ８細胞は分化して、細胞傷害性Ｔ細胞になって、次に細胞免疫応答を招来することができ；一方、ＣＤ４細胞はＴヘルパー細胞に進化して、Ｂ細胞を刺激して、体液性免疫応答を生じさせる、又はＣＤ８陽性Ｔ細胞に細胞傷害性免疫応答を生じさせ、それら自身で感染細胞の溶解を誘発することができる。
【００１０】
小ペプチドは細胞表面上でＭＨＣクラスＩ分子に既に結合して、次に、更なる加工なしに、ＣＤ８陽性又はＣＤ４陽性細胞を刺激して、細胞免疫応答を生じさせることができる。しかし、特定のペプチドは特定のＭＨＣ分子によってのみ結合されることができる。したがって、天然集団におけるＭＨＣ分子の広範囲な多型現象（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の結果として、特定のペプチドは集団の小割合によってのみ結合され、提示されることができる。本発明の意味の範囲内で、提示は、ペプチド又はタンパク質フラグメントがＭＨＣ分子に結合し、この結合が例えば小胞体内、細胞外スペース内、エンドソーム、エンドソーム前駆体、リソソーム又はリソソーム前駆体において行なわれうる時、及びこのＭＨＣ分子／ペプチド複合体が次に、免疫細胞によって特異的に認識されうるように、細胞膜の細胞外側に結合する時を意味するとして理解される。
【００１１】
ＣＶＬＰｓは細胞免疫応答及び体液性免疫応答の両方を誘発し、ＭＨＣ制限されないので、これらの粒子は一般にワクチンの発生に適しており、Ｌ１部分は粒子を形成するための能力を与え、付加的な抗原部分がこのＬ１部分に融合する。
【００１２】
このようなＣＶＬＰｓを発生させようとするときには、ＣＶＬＰ抗原性を直接研究するために用いることができる機能的試験系を用意することが絶対的に必要である。このような試験系は、異なる抗原部分を含有するＣＶＬＰｓを同じ試験系を用いて研究することができるという性質を有するべきである。腫瘍又はウイルス性疾患を治療するための免疫学的方法にとって細胞免疫応答は極めて重要であるので、１６型又は１８型ＣＶＬＰｓによって誘発される細胞免疫応答を測定可能にするという目的が生じた。
【００１３】
この目的は、ＭＨＣ分子と一緒になって、例えばｉｎ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞傷害性Ｔ細胞応答を誘発するＨＰＶ−１６又はＨＰＶ−１８Ｔ細胞エピトープを同定することによって、達成された。それゆえ、本発明によるペプチドは配列：
【００１４】
【化５】
2004514449.tif 000003
【００１５】
を有する。
可能なエピトープはＫａｓｔ ｅｔ ａｌ．， （１９９４） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５２， ３９０４−３９１２に既に発表されている。しかし、この刊行物は、これらのペプチドがＨＬＡ Ａ１分子に結合することができることを示すに過ぎず、細胞傷害性Ｔ細胞応答が実際に誘発されることができることを示していない。その上、この刊行物は、Ｔ細胞が該ペプチドをタンパク質成分として認識することができることを実証するデータを記載していない。ＨＬＡ分子にそれ自体結合するペプチドがＴ細胞によって必ずしも認識されないことが、しばしば見出されている。その上、ペプチドがＴ細胞にＴ細胞応答を生じさせることができるという事実によって測定されることができる、ペプチドを認識するＴ細胞が、それにも拘わらず、対応ペプチドを含有する総タンパク質を負荷されている細胞を必ずしも認識しないことが知られている。このことは、ペプチドがしばしばプロテアーゼ切断部位を含有し、総タンパク質が細胞中でプロセスされている間に、該部位の範囲内で該ペプチドが切断され、そのため破壊されて；その結果として、該ペプチドがＴ細胞によってもはや認識されないという事実によって説明することができる。この問題は例えばＦｅｌｔｋａｍｐ ｅｔ ａｌ． （１９９３）， Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２３： ２２４２−２２４９において確認されている。
【００１６】
それゆえ、本発明は、アミノ酸配列：
【００１７】
【化６】
2004514449.tif 000004
【００１８】
を有するＴ細胞エピトープ及び／又はその機能的に活性な変異体に関する。
本発明によるＴ細胞エピトープの機能的に活性な変異体は、Ｔ細胞の細胞傷害性試験系（例えば、本発明の実施例２〜５を参照のこと）において、少なくとも、陰性対照の平均値と標準偏差の３倍との合計に相当する、本発明によるＴ細胞エピトープの細胞傷害性に比較して測定して、好ましくは少なくとも約３０％、特に少なくとも約５０％、そして特に好ましくは少なくとも約８０％の細胞傷害性を有するＴ細胞エピトープであるとして理解される。
【００１９】
好ましい変異体の例は、アミノ酸レベルで、本発明によるＴ細胞エピトープとの少なくとも約６５％、好ましくは少なくとも約７５％、そして特に少なくとも約８５％の配列相同性を有するＴ細胞エピトープである。他の好ましい変異体は、本発明によるＴ細胞エピトープとの構造相同性を有するＴ細胞エピトープでもある。このようなエピトープは、本発明によるＴ細胞エピトープに対する特異的Ｔ細胞を作製して（ＤｅＢｒｕｉｊｎ Ｍ．Ｌ． ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２１， ２９６３−７０； ａｎｄ ＤｅＢｒｕｉｊｎ Ｍ．Ｌ． （１９９２） Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２２， ３０１３−２０）、例えば、合成的に調製されたペプチドを、選択後に、ペプチド特異性Ｔ細胞（実施例参照）による認識に関して試験することによって見出すことができる。特に、Ｔ細胞エピトープは細胞傷害性Ｔ細胞エピトープ又はＴヘルパー細胞エピトープ（ＴＨ，ＴＨ１又はＴＨ２）を意味するとして理解される。しかし、同様にＭＨＣ Ｉ分子を認識することができる非細胞傷害性Ｔ細胞はまた、非細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが本発明の変異体としても包含されるといったように知られる。
【００２０】
本発明の他の実施態様は、化合物の一部であるＴ細胞エピトープであり、該化合物はパピローマウイルス由来の天然生成Ｌ１タンパク質ではなく、ＨＰＶ−１６ Ｔ細胞エピトープの場合には、パピローマウイルス由来の天然生成Ｌ１タンパク質の排他的Ｎ末端欠失及び排他的Ｃ末端欠失突然変異体ではない。例えば、該化合物は、本発明による同じ又は異なるＴ細胞エピトープの融合であることができる。
【００２１】
特定の１実施態様では、本発明によるＴ細胞エピトープ及び／又は機能的に活性な変異体は、異なるパピローマウイルス由来のＬ１タンパク質中に又はキメラＬ１タンパク質、例えばＨＰＶ１８ Ｌ１Ｅ７融合タンパク質又はＨＰＶ１６ Ｌ１Ｅ７融合タンパク質中に存在しうる。本発明による、このような化合物は、ＣＶＬＰｓを形成する能力を有することができる。
【００２２】
前記Ｔ細胞エピトープは好ましくは、化合物の一部として、好ましくは他のアミノ酸配列、特に融合タンパク質を含有するポリペプチドでありうる。特に、該化合物は長さにおいて少なくとも約５０アミノ酸、好ましくは、少なくとも約３５アミノ酸、特に少なくとも約２０アミノ酸、そして特に好ましくは、少なくとも約９〜１２アミノ酸のポリペプチドであることができる。
【００２３】
該化合物を検出する、又はＴ細胞への結合におけるその活性を修飾するために、該化合物はＴ細胞エピトープ及び／又は前記融合タンパク質の化学的、放射性同位体、非放射性同位体及び／又は蛍光標識を含有することができる。
【００２４】
当業者（ｔｈｅ ｓｋｉｌｌｅｄ ｐｅｒｓｏｎ）に知られた、そして本発明による化学的標識に適した化学物質の例は、ビオチン、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）及びストレプトアビジンである。
【００２５】
可能な１実施態様は、ペプチドが少なくとも１つのリシンを含有するように修飾されることである。次に、ビオチン又はＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）がこのリシンに、当業者に知られた方法でカップリングする。この方法で修飾されたペプチドを適当なＭＨＣ分子に又は、適当なＭＨＣ分子を含有する細胞に結合させる。次に、該ペプチドを標識されたアビジン若しくはストレプトアビジンによって、又はＦＩＴＣの蛍光を直接用いて検出することができる。
【００２６】
当業者に知られた、そして本発明による放射性同位体標識に適した同位体の例は、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ及び１４Ｃである。
【００２７】
当業者に知られた、そして本発明による非放射性同位体標識に適した同位体の例は、２Ｈ及び１３Ｃである。
【００２８】
当業者に知られた、そして本発明による蛍光標識に適した蛍光物質の例は、１５２Ｅｕ、フルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド（ｏ−ｐｈｔｈａｌｄｅｈｙｄｅ）及びフルオレスカミンである。
【００２９】
本明細書に記載されないが、本発明の意味の範囲内での標識にやはり用いることができる他の標識を、当業者は熟知している。
【００３０】
当業者に知られる、本発明による化学的修飾の例は、アセチル、ホスフェート及び／又は単糖基の転移（ｔｒａｎｓｆｅｒ）である。
【００３１】
約５０のアミノ酸長さを有する本発明によるポリペプチドは、例えば、化学的ペプチド合成を用いて調製することができる。長いポリペプチドは好ましくは組換えによって製造される。
【００３２】
それゆえ、本発明は、例えば下記成分：（ａ）少なくとも１つの調節要素、及び（ｂ）本発明による化合物のアミノ酸配列をコードする少なくとも１つの核酸を含有する、例えば、前記Ｔ細胞エピトープ又は化合物を発現するための核酸にも関する。前記核酸構築体は好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡから構成される。適当な調節要素は、例えば、真核細胞における構成的、調節可能な、組織特異的、細胞サイクル特異的若しくは代謝特異的発現、又は原核細胞における構成的、代謝特異的若しくは調節可能な発現を可能にする。本発明によると、調節可能な要素はプロモーター、アクチベーター配列、エンハンサー、サイレンサー（ｓｉｌｅｎｃｅｒｓ）及び／又はリプレッサー配列である。
【００３３】
真核細胞における構成的発現を可能にする、適当な調節可能な要素の例は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって認識されるプロモーター、又は例えばＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターとウイルスプロモーターのようなウイルスプロモーター及び、例えばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＶＢ ＨＴＬＶ及びＨＩＶに由来するアクチベーター配列である。
【００３４】
真核細胞における調節可能な発現を可能にする調節可能な要素の例は、適当なリプレッサーと結合したテトラサイクリンオペレーターである（Ｇｏｓｓｅｎ Ｍ． ｅｔ ａｌ （１９９４） Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５， ５１６−２０）。
【００３５】
真核細胞における組織特異的発現を可能にする調節可能な要素の例は、ある一定の細胞種類においてのみ発現されるタンパク質をコードするような遺伝子に由来する、プロモーター又はエンハンサーから構成されるアクチベーター配列のプロモーターである。
【００３６】
真核細胞における細胞サイクル特異的発現を可能にする調節可能な要素の例は、下記遺伝子：ｃｄｃ２５Ｃ、ｃｙｃｌｉｎ Ａ、ｃｙｃｌｉｎ Ｅ、ｃｄｃ２、Ｅ２Ｆ、Ｂ−ｍｙｂ及びＤＨＦＲのプロモーターである（Ｚｗｉｃｋｅｒ Ｊ． ａｎｄ Ｍｕｌｌｅｒ Ｒ． （１９９７） Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １３， ３−６）。
【００３７】
真核細胞における代謝特異的発現を可能にする調節可能な要素の例は、酸素不足によって、グルコース欠乏によって、ホスフェート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）濃度によって又は熱ショックによって制御されるプロモーターである。
【００３８】
本発明による核酸は、例えば、ＤＮＡワクチンの製造に用いることもできる。このために、これらのエピトープと他の既知のパピローマウイルスエピトープとをコードする配列を任意の配列において直接一緒に、又はオープンリーディングフレームにおいて中間に幾つかのヌクレオチドを挟んで結合させることができる。さらに、例えば、得られたポリペプチド鎖を細胞内で特に小胞体中に、エンドソーム中に又はリソソーム中に向ける（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）ために用いられる非パピローマウイルスＤＮＡ配列を加えることができる。
【００３９】
前記核酸を真核細胞又は原核細胞中にトランスフェクション、形質転換又は感染によって導入させることを可能にするために、該核酸はプラスミドとして、又はウイルスベクター若しくは非ウイルスベクターの一部として存在することができる。
【００４０】
それゆえ、本発明は、本発明による核酸を含有するベクター、特に発現ベクターにも関する。これに関連して、特に適当なウイルスベクターは：バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びヘルペスウイルスである。これに関連して、特に適当な非ウイルスベクターは：ヴィロソーム、リポソーム、カチオン脂質及びポリリシン複合ＤＮＡ（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ＤＮＡ）である。
【００４１】
その上、本発明はさらに、少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含有する、好ましくは提示する細胞にも関する。特定の１実施態様では、本発明によるベクターの１つで、細胞をトランスフェクト、形質転換又は感染させる。例えば、この細胞は、当業者に知られた、そしてその時点で用いられている調節可能な要素の活性化をもたらす条件下で、本発明によるポリペプチドを発現する。次に、例えば上記標識のいずれかを用いて、該ポリペプチドをこの細胞から単離して、精製することができる。原核細胞及び真核細胞、特に、例えば大腸菌のような細菌細胞、例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（Ｓｆ−９）若しくはトリコプルシア・ナイ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）細胞のような昆虫細胞、又は例えばＣＯＳ細胞若しくはＨｅＬａ細胞のような哺乳動物細胞が、組換え調製を行なうために適している。発現されている本発明による化合物を次に標準方法を用いて精製することができる。
【００４２】
好ましい実施態様は、本発明によるポリペプチド自体を発現している細胞を用いることであり、特に好ましい実施態様では、細胞表面上に、ＭＨＣ−１分子によって、本発明によるポリペプチドの一部を提示している細胞を用いることである。例えばＢ細胞、マクロファージ、樹枝状細胞、線維芽細胞又は他のＨＬＡ Ａ２．０１陽性細胞のような抗原提示細胞、好ましい実施態様では、ＪＹ、Ｔ２若しくはＣａＳｋｉ細胞又はＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系（ＢＬＣＬｓ）が本発明による細胞の作製のために適している。Ｔ細胞エピトープを含有するポリペプチドを提示する、本発明による細胞を、免疫細胞、特にＴ細胞を再刺激するため及び／又はＴ細胞の活性化を測定するための標的細胞として用いることができる。本発明の意味の範囲内で、標的細胞とは、ＭＨＣ分子によってＴ細胞エピトープを提示し、それによって、Ｔ細胞活性化、特に該細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞反応を特異的に誘出する細胞であると理解すべきである。
【００４３】
その上、Ｔ細胞エピトープを含有する化合物は、この化合物が共有結合によって、又は疎水性相互作用、イオン結合若しくは水素結合によって、例えばペプチド、タンパク質、ペプトイド、直鎖若しくは分枝鎖オリゴ糖又は多糖類及び核酸のような、少なくとも１つの他の種に結合しているという事実を特徴とする複合体の一部であることができる。
【００４４】
それゆえ、本発明は、Ｔ細胞エピトープ又は化合物及び少なくとも１つの他の化合物を含有する複合体に関する。好ましい実施態様は、ポリペプチドがＭＨＣクラスＩ分子と結合して、例えばＨＬＡ Ａ２．０１ （又は他にＨＬＡ Ａ１， ＨＬＡ Ａ２４等）テトラマーとして存在することである。ヒトＭＨＣクラスＩ分子が特に好ましい。例えば、Ａｌｔｍａｎ Ｊ．Ｄ．等の手法（１９９６， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４， ９４−６）を、例えば、ペプチド特異的細胞傷害性Ｔ細胞のＴ細胞受容体に結合することができる、適当に結合したペプチドを含有するＨＬＡ Ａ２．０１テトラマーを調製するために用いることができる。
【００４５】
他の実施態様は、本発明による化合物又は前記複合体を担体物質上に固定する実施態様である。適当な担体物質の例は、セラミック、金属、特に貴金属、ガラス、プラスチック、結晶質物質、又は担体、特に前記物質の薄層、又は例えばセルロース若しくは構造タンパク質のような（バイオ）分子フィラメントである。
【００４６】
本発明による複合体を精製するために、複合体の１成分は付加的にタンパク質タグを含有することができる。本発明によるタンパク質タグは、例えば、マトリックスへの高アフィニティ吸収、該複合体を有意な程度に溶出させない、適当なバッファーによるストリンジェント（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）洗浄、及び吸収された該複合体のその後の選択的溶出を可能にする。当業者に知られたタンパク質タグの例は、（ＨＩＳ）６タグ、Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ヘマグルテニン・タグ、グルタチオン・トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、インテイン含有アフィニティキチン結合タグ又はマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグである。本発明によるタンパク質タグはＮ末端に、Ｃ末端に及び／又は内部に配置されることができる。
【００４７】
本発明は、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも１つの化合物を用いて、Ｔ細胞の活性化をｉｎ ｖｉｔｒｏ検出するための方法に関する。このような方法は好ましくは３工程から成る：
（ａ）第１工程では、本発明による少なくとも１つのＴ細胞エピトープで、好ましくは、本発明によるＴ細胞エピトープを含有する少なくとも１つの化合物で細胞を刺激する。この化合物は、Ｔ細胞エピトープを含有する、本発明による少なくとも１つの化合物、Ｔ細胞エピトープを含有する、少なくとも１つの複合体、少なくとも１つのキャプソメア、少なくとも１つの安定なキャプソメア、少なくとも１つのＶＬＰ、少なくとも１つのＣＶＬＰ及び／又は少なくとも１つのウイルスを意味することができる。好ましい実施態様では、免疫細胞をＣＶＬＰｓと共にインキュベートすることによって刺激する。この刺激は、例えば、ワクチン接種（ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ）として又は免疫細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＶＬＰｓと共にインキュベートすることによって行なうことができる。この方法で刺激された免疫細胞を例えばワクチン接種後に又は腫瘍患者の場合には、血液から、腫瘍から又はリンパ節から単離し、及び／又は培養する。
【００４８】
（ｂ）第２工程では、細胞を、本発明による少なくとも１つのＴ細胞エピトープと共に、Ｔ細胞エピトープを含有する、本発明による少なくとも１つの化合物と共に、Ｔ細胞エピトープを提示する少なくとも１つの標的細胞と共に及び／又は本発明による少なくとも１つの複合体と共にインキュベートする。
【００４９】
（ｃ）第３工程では、Ｔ細胞の活性化を検出する。このために適した方法は、例えば、Ｔ細胞によるサイトカインの産生若しくは分泌を検出する、Ｔ細胞の表面分子の発現を検出する、標的細胞の溶解（ｌｙｓｉｓ）を検出する又は細胞の増殖を検出する方法である。このために適当である手段の例は、サイトカイン・アッセイ（ｃｈａｐｔｅｒ ６．２ ｔｏ ６．２４ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９９９）， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．， Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ Ａ．Ｍ．， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ Ｄ．Ｈ．， Ｓｈｅｖａｃｈ Ｅ．Ｍ． ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ Ｗ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ＥＬＩＳＰＯＴ （ｃｈａｐｔｅｒ ６．１９ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， 上記参照）、５１Ｃｒ放出試験（ｃｈａｐｔｅｒ ３．１１ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記参照）、又は増殖の検出（ｃｈａｐｔｅｒ ３．１２ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記参照）。これに関連して、用いる手段に依存して、例えば細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞のような免疫細胞と他の細胞とを識別することも可能である。本発明による標識を含有する、本発明による化合物、複合体及び／又は細胞の使用は、標識された化合物、複合体及び／又は細胞の、Ｔ細胞への結合を検出することによって、Ｔ細胞エピトープを認識するＴ細胞を検出することを可能にする。好ましい実施態様では、本発明によるＭＨＣ／ポリペプチド複合体のＴ細胞表面への結合を検出する。これは、ＭＨＣ複合体自体を標識する、例えば蛍光標識することによって、又は適切な（ｉｎ ｏｒｄｅｒ）、他の工程で、再度、ＭＨＣ複合体を検出するためにＭＨＣ特異的標識された、例えば蛍光標識された抗体を用いることによって行なうことができる。次に、蛍光活性化セルソーター（ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）（ＦＡＣＳ）において、Ｔ細胞の蛍光標識を測定して、分析することができる。Ｔ細胞への該複合体の結合を検出するための他の可能性は、この場合も、Ｔ細胞活性化を測定する可能性である（サイトカイン・アッセイ、Ｅｌｉｓｐｏｔ、５１Ｃｒ放出試験又は増殖、上記参照）。しかし、これをするためには、例えば補受容体（ｃｏｒｅｃｅｐｔｏｒ）特異的抗体（ａｎｔｉ−ＣＤ２８）及び／又は他の非特異的アクチベーター（ＩＬ−２）による補受容体（例えば、ＣＤ２８）の同時刺激が必要である。
【００５０】
本発明はまた、工程（ａ）の後に挿入される追加工程（ａ’）を含有する方法に関する。
【００５１】
（ａ’）工程（ａ）に続く、この追加工程（ａ’）では、単離された又は培養された細胞を、本発明による少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープを含有する本発明による少なくとも１つの化合物、Ｔ細胞エピトープを含有する本発明による少なくとも１つの複合体、少なくとも１つのキャプソメア、少なくとも１つの安定なキャプソメア、少なくとも１つのＶＬＰ、少なくとも１つのＣＶＬＰ及び／若しくは少なくとも１つのウイルスを負荷された少なくとも１つの標的細胞と共に、並びに／又はＴ細胞エピトープを提示する少なくとも１つの標的細胞と共に、工程（ｂ）が次に行なわれる前に、少なくとも約８週間、特に少なくとも約１週間共存培養する。
【００５２】
共存培養は、同じ増殖培地中及び同じ組織培養容器における、
（ｉ）本発明による少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープを含有する本発明による化合物、Ｔ細胞エピトープを含有する本発明による少なくとも１つの複合体、少なくとも１つのキャプソメア、少なくとも１つの安定なキャプソメア、少なくとも１つのＶＬＰ、少なくとも１つのＣＶＬＰ及び／又は少なくとも１つのウイルスを負荷された少なくとも１つの標的細胞の存在下で、
（ｉｉ）Ｔ細胞エピトープを含有する本発明による少なくとも１つの複合体の存在下で、
（ｉｉｉ）本発明によるＴ細胞エピトープを提示する少なくとも１つの標的細胞の存在下での細胞の増殖を意味すると理解すべきである。
【００５３】
本発明はまた、Ｔ細胞エピトープを提示する標的細胞の調製方法にも関する。これに関連して、該標的細胞に異なるＴ細胞エピトープの組み合わせを負荷させることができる。好ましい実施態様では、標的細胞を、本発明による少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープを含有する少なくとも１つの化合物及び／又はＴ細胞エピトープを含有する少なくとも１つの複合体と共にインキュベートする。特に好ましい実施態様では、標的細胞を、本発明によるポリペプチドを含有する増殖培地中で、又は本発明による結合ポリペプチドを含有するＭＨＣクラスＩ複合体と共にインキュベートする。ＭＨＣクラスＩ複合体は例えばＨＬＡ Ａ２．０１テトラマーとして存在することができる。原則として、テトラマーはこれに関連して４ペプチドを結合する。これらのペプチドは同じであることも、ペプチドの異なる種を表すこともできる。他の好ましい実施態様では、標的細胞を本発明による核酸によって及び／又は本発明によるベクターによってトランスフェクトさせる、形質転換させる及び／又は感染させる。特に好ましい実施態様では、標的細胞をワクシニアウイルスベクターで感染させる。本発明による方法は、抗原を提示する細胞を用いて、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、樹枝状細胞、胚芽細胞又は線維芽細胞又は他のＨＬＡ陽性細胞を用いて、１実施態様では、ＪＹ、Ｔ２若しくはＣａＳｋｉ細胞又はＥＢＶ形質転換Ｂ細胞系を用いて、行なわれる。
【００５４】
用いられるＣＶＬＰｓは、パピローマウイルスＬ１タンパク質又はその変異体、特にＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質、及び必然的ではないとしても、Ｌ１に対して異種（ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）であるタンパク質又はその変異体を含有する。該２タンパク質は、それらが直接又は間接的に結合している形態で存在することができる。本発明の意味の範囲内で、直接結合したとは、２つのタンパク質の間に共有結合、例えばペプチド結合又はジスルフィド結合が存在することを意味する。間接的に結合したとは、これらのタンパク質が非共有結合によって、例えば疎水性相互作用、イオン結合又は水素結合によって結合することを意味する。他の実施態様では、ＣＶＬＰｓは、Ｌ１タンパク質又はその変異体の他に、パピローマウイルスＬ２タンパク質を含有する。
【００５５】
本発明のＬ１タンパク質の好ましい実施態様の例は、１つ以上の欠失、特にＣ末端欠失を含有するＬ１タンパク質によって代表される。Ｃ末端欠失は、ウイルス様粒子の形成効率が、Ｃ末端に位置付けられる核局在化シグナルが欠失するので、増加しうるという利点を有する。それゆえ、Ｃ末端欠失は、好ましくは、総計で約３５アミノ酸にまで、特に約２５〜約３５アミノ酸、とりわけ約３２〜約３４アミノ酸になる。例えば、３２アミノ酸長さのＨＰＶ１６ Ｌ１タンパク質のＣ末端欠失は、ウイルス様粒子の形成を少なくとも約１０倍増加させうるために充分である。その上、Ｌ１タンパク質は１つ以上の突然変異を有することができる、又はＬ１部分は、異なるパピローマウイルスからのＬ１タンパク質から構成することができる。本発明によるＬ１タンパク質が共通に有する特徴は、それらがＶＬＰｓ又はＣＶＬＰｓ の形成を可能にすること、及びそれらが本発明による少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含有することである。
【００５６】
好ましい実施態様では、Ｌ１タンパク質又はその変異体と、Ｌ１に対して異種であるタンパク質とは融合タンパク質を形成する。これはまた、幾つかの異なるタンパク質又はそれらの部分から構成される異種タンパク質を包含する。これらはまた、例えば、タンパク質のエピトープ、特に細胞傷害性Ｔ細胞エピトープでもありうる。これに関連して、本発明の意味の範囲内でのエピトープは、約５０アミノ酸、好ましくは少なくとも約３５アミノ酸、特に少なくとも約２０アミノ酸、そして特に好ましくは、少なくとも約９アミノ酸の長さを有する合成ポリペプチドの一部でもあることができる。
【００５７】
ウイルスタンパク質に由来する、例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ又はＨＣＶに由来する、好ましくはパピローマウイルス、特にヒトパピローマウイルスに由来するＬ１異種タンパク質が好ましい。
【００５８】
好ましい実施態様では、このＬ１異種タンパク質はパピローマウイルスＥタンパク質、好ましくはＥ６タンパク質及び／又はＥ７タンパク質である。欠失Ｅタンパク質、好ましくはＣ末端欠失Ｅタンパク質、特にＣ末端欠失Ｅ７タンパク質であるＥタンパク質が特に好ましい、この理由は、これらの構築体が欠失Ｌ１タンパク質と結合して、ウイルス様粒子を優先的に形成することができるからである。５５アミノ酸まで、好ましくは約５〜約５５アミノ酸、特に約３８〜約５５アミノ酸の欠失が特に好ましい。
【００５９】
他の実施態様では、Ｌ１異種タンパク質は、非ウイルス病原体に由来する抗原から得ることができる。これらはまた、例えばチログロブリン、ミエリン塩基性タンパク質又は透明帯糖タンパク質３（ＺＰ３）のような自己免疫抗原から得ることもでき、これらの自己免疫抗原は特定の自己免疫疾患、例えば、甲状腺炎、多発性硬化症、卵巣炎又はリウマチ性関節炎に随伴する。好ましい実施態様では、Ｌ１異種タンパク質を腫瘍抗原から、好ましくは黒色腫抗原、例えばＭＡＲＴから、卵巣癌抗原、例えばＨｅｒ２ ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ２）、ＢＣＲＡ−１若しくはＣＡ１２５、結腸癌抗原、例えばＣＡ１２５、又は乳癌抗原、例えばＨｅｒ２ ｎｅｕ （ｃ−ｅｒｂＢ２）、ＢＣＲＡ−１若しくはＢＣＲＡ−２から得る。
【００６０】
本発明はまた、サンプルからＴ細胞を調製することによって得られるＴ細胞の活性化のｉｎ ｖｉｔｒｏ検出方法にも関する。この方法は、サンプル中、例えば、患者からの血液サンプル中、又は腫瘍患者からの腫瘍若しくはリンパ節中にパピローマウイルスＬ１タンパク質特異的細胞傷害性Ｔ細胞が存在するか否かを判定することを可能にする。この検出方法は下記工程を含有する：
（ａ”）第１工程では、例えば、患者から血液を採取することによって、又は例えば腫瘍若しくはリンパ節を切開することによって細胞を得る。これらの細胞を次に増殖培地中に入れて、培養する。
【００６１】
（ｂ）第２工程では、Ｔ細胞エピトープを提示する、少なくとも１つの標的細胞と共に、又は成分としてＴ細胞エピトープ含有化合物を包含する、少なくとも１つの複合体と共に細胞をインキュベートする。
【００６２】
（ｃ）第３工程では、Ｔ細胞の活性化を測定する。このために適した方法は、例えば、Ｔ細胞によるサイトカインの産生若しくは分泌を検出し、Ｔ細胞上の表面分子の発現を検出する、標的細胞の溶解を検出する、又は細胞の増殖を検出する方法である。このために適した手段の例は、サイトカイン・アッセイ（ｃｈａｐｔｅｒ ６．２ ｔｏ ６．２４ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９９９）， ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｃｏｌｉｇａｎ Ｊ．Ｅ．， Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ Ａ．Ｍ．， Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ Ｄ．Ｈ．， Ｓｈｅｖａｃｈ Ｅ．Ｍ． ａｎｄ Ｓｔｒｏｂｅｒ Ｗ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ＥＬＩＳＰＯＴ （ｃｈａｐｔｅｒ ６．１９ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記参照）、５１Ｃｒ放出試験（ｃｈａｐｔｅｒ ３．１１ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記参照）又は増殖の検出（ｃｈａｐｔｅｒ ３．１２ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、上記参照）である。これに関連して、用いる手段に依存して、例えば細胞傷害性Ｔ細胞、Ｔヘルパー細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞のような免疫細胞と他の細胞とを識別することも可能である。標識を含有する、本発明による化合物、複合体及び／又は細胞の使用は、標識された化合物、複合体及び／又は細胞の、Ｔ細胞への結合を検出することによって、Ｔ細胞エピトープを認識するＴ細胞を検出することを可能にする。好ましい実施態様では、本発明によるＭＨＣ／ポリペプチド複合体のＴ細胞表面への結合を検出する。これは、ＭＨＣ複合体自体を標識する、例えば蛍光標識することによって、又は適切な、他の工程で、再度、ＭＨＣ複合体を検出するためにＭＨＣ特異的標識された、例えば蛍光標識された抗体を用いることによって行なうことができる。次に、蛍光活性化セルソーター（ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｅｒ）（ＦＡＣＳ）において、Ｔ細胞の蛍光標識を測定して、分析することができる。Ｔ細胞への該複合体の結合を検出するための他の可能性は、この場合も、Ｔ細胞活性化を測定する可能性である（サイトカイン・アッセイ、Ｅｌｉｓｐｏｔ、５１Ｃｒ放出試験又は増殖、上記参照）。しかし、これをするためには、例えば補受容体特異的抗体（ａｎｔｉ−ＣＤ２８）及び／又は他の非特異的アクチベーター（ＩＬ−２）による補受容体（例えば、ＣＤ２８）の同時刺激が必要である。
【００６３】
本発明はまた、工程（ａ”）の後に挿入される追加工程（ａ’）を含有する方法に関する。
【００６４】
（ａ’）工程（ａ”）に続く、この追加工程（ａ’）では、単離された又は培養された細胞を、本発明による少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープを含有する本発明による１つの化合物、Ｔ細胞エピトープを含有する本発明による少なくとも１つの複合体、少なくとも１つのキャプソメア、少なくとも１つの安定なキャプソメア、少なくとも１つのＶＬＰ、少なくとも１つのＣＶＬＰ及び／若しくは少なくとも１つのウイルスを負荷された少なくとも１つの標的細胞と共に、Ｔ細胞エピトープを含有する本発明による少なくとも１つの複合体と共に、並びに／又はＴ細胞エピトープを提示する少なくとも１つの標的細胞と共に、工程（ｂ）が次に行なわれる前に、少なくとも約８週間、特に少なくとも約１週間共存培養する。
【００６５】
共存培養は、同じ増殖培地中及び同じ組織培養容器における、
（ｉ）本発明による少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープを含有する本発明による化合物、Ｔ細胞エピトープを含有する本発明による少なくとも１つの複合体、少なくとも１つのキャプソメア、少なくとも１つの安定なキャプソメア、少なくとも１つのＶＬＰ、少なくとも１つのＣＶＬＰ及び／又は少なくとも１つのウイルスを負荷された少なくとも１つの標的細胞の存在下で、
（ｉｉ）Ｔ細胞エピトープを含有する本発明による少なくとも１つの複合体の存在下で、
（ｉｉｉ）Ｔ細胞エピトープを提示する少なくとも１つの標的細胞の存在下での細胞の増殖を意味すると理解すべきである。
【００６６】
本発明はまた、Ｔ細胞の活性化をｉｎ ｖｉｔｒｏ検出するための試験系（キット）であって、（ａ）本発明による少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、本発明による少なくとも１つの化合物、本発明による少なくとも１つのベクター、本発明による少なくとも１つの細胞、及び／又は本発明による少なくとも１つの複合体、及び（ｂ）免疫系のエフェクター細胞、好ましくはＴ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞又はＴヘルパー細胞を含む前記試験系に関する。
【００６７】
特定の１実施態様では、該試験系は、例えば、患者からの血液サンプル中に又は腫瘍患者の腫瘍若しくはリンパ節中に存在するＬ１タンパク質特異的細胞傷害性Ｔ細胞を検出するために用いられる。この場合に、（ｂ）に記載した細胞は、試験系中に存在する対照細胞であり、第１キット成分、即ち，（ａ）に記載した物質によるその活性化は標準として役立つ。この反応において観察される活性化を、患者から単離された細胞のキット成分（ａ）によるＴ細胞活性化と比較する。
【００６８】
他の好ましい実施態様では、この該試験系は、例えば、Ｔ細胞エピトープを含有する化合物、Ｔ細胞エピトープを含有する複合体、キャプソメア、安定なキャプソメア、ＶＬＰ、ＣＶＬＰ及び／又はウイルスのＬ１タンパク質特異的抗原性を評価するために用いられる。この場合に、（ａ）に記載した物質は、第２キット成分、即ち、（ｂ）に挙げた細胞に対するその活性化効果が基準として役立つような対照物質である。この反応において観察される活性化を、キット成分（ｂ）に対する、Ｔ細胞エピトープを含有する化合物、Ｔ細胞エピトープを含有する複合体、キャプソメア、安定なキャプソメア、ＶＬＰ、ＣＶＬＰ及び／又はウイルスの活性化効果と比較する。
【００６９】
その上、本発明は、免疫応答を誘発するため又は検出するための、本発明による少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープを含有する本発明による少なくとも１つの化合物、Ｔ細胞エピトープを含有する化合物をコードする核酸を含有する、本発明による少なくとも１つのベクター、Ｔ細胞エピトープを含有する本発明による少なくとも１つの細胞及び／又はＴ細胞エピトープを含有する本発明による少なくとも１つの複合体の使用に関する。
【００７０】
それらのＭＨＣクラス１分子によって本発明による少なくとも１つの分子を提示する細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方において免疫細胞を刺激するために特に適する。抗原提示のために適した細胞の例は、免疫細胞と共に培養されることによって特異的Ｔ細胞の刺激を達成することができる、Ｂ細胞、樹枝状細胞、マクロファージ、線維芽細胞又は他のＨＬＡ陽性細胞である。
【００７１】
特定の１実施態様では、本発明による化合物、例えば、本発明によるＴ細胞エピトープを付加的に含有するＨＰＶ１８ Ｌ１Ｅ７融合タンパク質を免疫応答の検出に用いることができる。本発明によるこのような化合物は、ＣＶＬＰｓを形成する能力を有することができる。
【００７２】
本発明はまた、本発明による少なくとも１つのＴ細胞エピトープ、Ｔ細胞エピトープを含有する本発明による少なくとも１つの化合物、Ｔ細胞エピトープを含有する化合物をコードする核酸を含有する少なくとも１つのベクター、Ｔ細胞エピトープを含有する本発明による少なくとも１つの細胞及び／又はＴ細胞エピトープを含有する本発明による少なくとも１つの複合体と、必要な場合には、製薬的に受容されるキャリヤーを含む薬剤又は診断剤に関する。
【００７３】
当業者に知られたキャリヤーの例は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然若しくは修飾セルロース（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ポリアクリルアミド、アガロース、水酸化アルミニウム及びマグニタイド（ｍａｇｎｉｔｉｄｅ）である。
【００７４】
本発明による薬剤又は診断剤は溶解状態で、固体マトリックスに結合して、及び／又はアジュバントと混合して存在することができる。
【００７５】
該薬剤又は診断剤は多様な方法で投与することができる。当業者に知られた投与形の例は、例えば、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内及び／又は局所投与による、非経口、局部及び／又は全身投与である。好ましい投与形は、例えば、一定のパピローマウイルス感染の自然感染経路によって影響される。投与される量は患者の年齢、体重及び全身健康状態、並びにパピローマウイルス感染のタイプに依存する。該薬剤又は診断剤はカプセル、溶液、懸濁液、エリキシル剤（経口投与用）又は無菌溶液若しくは懸濁液（非経口若しくは鼻腔内投与用）の形態で投与することができる。リン酸塩緩衝化された塩溶液である塩溶液を例えば不活性な、免疫学的に受容されるキャリヤーとして用いることができる。該薬剤は治療的に有効な量で投与される。これは、保護的免疫応答を導出するために充分である量を意味する。
【００７６】
特定の１実施態様では、本発明による化合物、例えば、付加的に本発明によるＴ細胞エピトープを含有するＨＰＶ１８ Ｌ１Ｅ７融合タンパク質を薬剤又は診断剤として用いることができる。本発明によるこのような化合物は、ＣＶＬＰｓを形成する能力を有することができる。
【００７７】
図面及び下記実施例は、本発明を限定することなく、本発明を明確にするように意図される。
【００７８】
実施例
１．出発物質の説明
ＨＰＶ１６Ｌ１Δｃ＊Ｅ７１−５５ ＣＶＬＰｓはドイツ特許出願ＤＥ １９８１２９４１に記載されているように調製した。Ｍｕｌｌｅｒ Ｍ． ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２３４， ９３−１１１も参照のこと。
【００７９】
ＰＢＭＣは末梢血単核細胞を意味し、これの単離は例えばＲｕｄｏｌｆ Ｍ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．（１９９９）， Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ３８０， ３３５−４０に記載されている。
【００８０】
ＢＬＣＬは、各場合にＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスで形質転換され、各血液ドナーの場合に個別に調製されたＢ細胞系を意味する（Ｄｒ Ａｎｄｒｅａｓ Ｋａｕｆｍａｎｎ， Ｊｅｎａ， Ｇｅｒｍａｎｙから入手）。
【００８１】
ＣＶＬＰ刺激されたネズミＴ細胞は、次のようにして得た：
３５４数の（３５４ ｓｅｖｅｒａｌ）Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はＣ３Ｈマウスを各場合にＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ＊Ｅ７１−５５ ＣＶＬＰｓ又はＨＰＶ１８ Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−５３ＤＩ ＣＶＬＰｓとＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−６０ＤＩ ＣＶＬＰｓとから成る１：１混合物によって、又は対照の場合にはバッファーによって２回免疫化した（ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ）。２週間後に、脾臓細胞を標準方法を用いて単離した。
【００８２】
脾臓細胞は次のようにして得た：
非接種マウスから脾臓を摘出して、脾臓細胞を標準方法を用いて再懸濁させた。
【００８３】
細胞に関連して、ＡＰＣは抗原提示細胞を意味する。
ＪＡＷＳ細胞はＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１１９０４）から入手した。
【００８４】
ＬＫＫはＡＴＣＣ（ＣＣＬ−１）から入手した。
ＲＭＡ細胞はＣ５７ＢＬ／６マウスの胸腺腫から得た（Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ Ｈ．Ｇ． ａｎｄ Ｋａｒｒｅ Ｋ． （１９８５） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １６２， １７４５−５９）。
【００８５】
α−マウスＣＤ８／ＰＥは、ネズミＣＤ８の細胞外部分に対して向けられ、蛍光標識フィコエリトリンを含有するラットモノクローナル抗体を意味する（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００８６】
α−マウスＣＤ４／シクロム（ｃｙｃｈｒｏｍｅ）は、ネズミＣＤ４の細胞外部分に対して向けられ、蛍光標識シクロムを含有するラットモノクローナル抗体を意味する（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００８７】
α−マウスＩＦＮγ／ＦＩＴＣは、ネズミインターフェロンγに対して向けられ、蛍光標識ＦＩＴＣを含有するラットモノクローナル抗体を意味する（Ｃａｌｔａｇ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００８８】
α−ヒトＣＤ８／ＡＰＣは、ヒトＣＤ８の細胞外部分に対して向けられ、蛍光標識ＡＰＣを含有するマウスモノクローナル抗体を意味する（Ｃａｌｔａｇ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００８９】
α−ヒトＣＤ４／ＰｅｒＣＰは、ヒトＣＤ４の細胞外部分に対して向けられ、蛍光標識ＰｅｒＣＰを含有するマウスモノクローナル抗体を意味する（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００９０】
α−ヒトＩＦＮγ／ＦＩＴＣは、ヒトインターフェロンγに対して向けられ、蛍光標識ＦＩＴＣを含有するマウスモノクローナル抗体を意味する（Ｃａｌｔａｇ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００９１】
α−ヒトＩＬ４／ＰＥは、ヒトインターロイキン４に対して向けられ、蛍光標識フィコエリトリンを含有するマウスモノクローナル抗体を意味する（Ｃａｌｔａｇ， Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）。
【００９２】
ヒトＧＭ−ＣＳＦ （Ｌｅｕｋｏｍａｘ）は、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ ＧｍｂＨ （Ｎｕｒｎｂｅｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【００９３】
ヒトＩＬ４は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ （Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
ヒトＩＬ２は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ （Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【００９４】
Ｍｏｎｅｎｓｉｎは、Ｓｉｇｍａ （Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００は、Ｓｉｇｍａ （Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【００９５】
細胞は、各場合に、１０％ウシ胎仔血清、カナマイシン及びアンピシリンを含有するＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ， Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）中、３７℃及び５％ＣＯ２において培養した。
【００９６】
Ｌｕｍａプレート及びＣａｎｂｅｒｒａ−Ｐａｃｋｅｒｄ Ｂ−Ｐｌａｔｅ ＣｏｕｎｔｅｒはＣａｎｂｅｒｒａ−Ｐａｃｋｅｒｄ， Ｄｒｅｉｅｉｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙから入手した。
【００９７】
ＦＡＣＳｃａｎ Ｃａｌｉｂｕｒは、“蛍光活性化セルソーター”を意味する；この装置は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ （Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【００９８】
Ｃｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアは、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ （Ｈａｍｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手した。
【００９９】
各場合に９アミノ酸だけオーバーラップし、ＨＰＶ１６ Ｌ１及びＥ７タンパク質の配列をカバーする２０マー・ペプチドを合成した。これらのペプチドに１から５２まで連続的に番号を付けた。これらの名称及びこれらの配列を下記表にまとめる。
【０１００】
表１：ＨＰＶ１６ Ｌ１及びＥ７の合成オーバーラップ２０マーペプチド
【０１０１】
【化７】
2004514449.tif 000005
【０１０２】
【化８】
2004514449.tif 000006
【０１０３】
”ＨＰＶ１６ Ｌ１ペプチドプール”は、ペプチドＰ１〜Ｐ４３の混合物を意味するとして理解され、”ＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドプール”は、ペプチドＰ４４〜Ｐ５１の混合物を意味するとして理解される。
【０１０４】
ＨＰＶ１８ Ｌ１及びＥ７タンパク質の配列をカバーし、各場合に９アミノ酸だけオーバーラップする２０マーペプチドも合成した。これらのペプチドに１から５２まで連続的に番号を付けた。これらの名称及び配列を下記表にまとめる。
【０１０５】
表２：ＨＰＶ１８ Ｌ１及びＥ７の合成オーバーラップ２０マーペプチド
【０１０６】
【化９】
2004514449.tif 000007
【０１０７】
【化１０】
2004514449.tif 000008
【０１０８】
”ＨＰＶ１８ Ｌ１ペプチドプール”は、ペプチドＱ１〜Ｑ４３の混合物を意味するとして理解され、”ＨＰＶ１８ Ｅ７ペプチドプール”は、ペプチドＱ４４〜Ｑ５２の混合物を意味するとして理解される。
【０１０９】
２．ＨＰＶ１８ Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−５３ＤＩ ＣＶＬＰｓ及びＨＰＶ１８ Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−６０ＤＩ ＣＶＬＰｓの調製
（ａ）構築体の調製
個々のパピローマウイルス特異的タンパク質をコードする核酸を、例えばＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅によって、遺伝子ライブラリーから単離して、クローン化した。ＨＰＶ１８ゲノムは、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ． Ｘ０５０１５で広く入手することができ、Ｃｏｌｅ及びＤａｎｏｓ （Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９８７， １９３ （４）， ５９９−６０８）によって発表されている。
【０１１０】
この他に、本発明による融合タンパク質を構築するための基礎として用いた配列は、Ｌ１遺伝子における下記変化を示した：ＤＮＡレベルで、Ｌ１遺伝子中の位置８９、８４８、１０１３及び１２３０においてＣがＧと交換された。タンパク質レベルでは、最初の３変化はＡｒｇによるＰｒｏの交換を生じるが、最後の突然変異はタンパク質レベルでの如何なる変化も生じない。Ｅ７遺伝子は発表された配列に対応する。
【０１１１】
所望の核酸を得る他の方法は、いぼ又は腫瘍から直接パピローマウイルス特異的遺伝子を単離するためにＰＣＲを用いることである。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８ Ｅ６とＥ７遺伝子のための適当なプライマーは、例えばＷＯ９３／２１９５８に開示されている。所望の核酸を扱った他の参考文献（ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）の例は、Ｋｉｒｎｂａｕｍ， Ｒ．等（１９９４）のＪ． Ｖｉｒｏｌ．， ６７， ６９２９−６９３６又は既に上述した、ＥＭＢＬデータベースに寄託されたクローンである。
【０１１２】
ＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩを調製するために、ＨＰＶ１８Ｌ１オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に相補的である２つのプライマーを構築した。第１プライマーは配列：
【０１１３】
【化１１】
2004514449.tif 000009
【０１１４】
を有し、第２プライマーは配列：
【０１１５】
【化１２】
2004514449.tif 000010
【０１１６】
を有する。
第１プライマーは、ＸｈｏＩ制限酵素切断部位５’をコードする。第２プライマーはＥｃｏＲＶ制限酵素切断部位５’をコードする。ＨＰＶ１８Ｌ１ ＯＲＦの最後の３５アミノ酸を欠失させるために、ＥｃｏＲＶ部位の後にＴＡＡ翻訳終止コドンを続ける。ＰＣＲ生成物をＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶによって切断して、やはりＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＶによって既に切断されているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクターにライゲートする。得られた構築体、即ち、ＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩ ｐＫＳを、ＨＰＶ１８Ｅ７１−５３ＤＩ及びＨＰＶ１８Ｅ７１−６０ＤＩ ＯＲＦ’ｓをＥｃｏＲＶ部位にクローン化するために用いた。
【０１１７】
５’ ＥｃｏＲＶ制限酵素切断部位を有するプライマーを、ＨＰＶ１８ Ｅ７フラグメントをクローン化するために用いた。下記プライマー対を用いた：
【０１１８】
【化１３】
2004514449.tif 000011
【０１１９】
ＰＣＲ生成物をＥｃｏＲＶによって切断して、修飾されたＬ１遺伝子のＥｃｏＲＶ部位に挿入した。
【０１２０】
該クローンをＤＮＡ配列決定によって分析した。それぞれ、ＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−５３ＤＩ及びＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−６０ＤＩ融合遺伝子を次に、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ベクターからＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ制限消化（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）を用いて切り取って、組換えバキュロウイルスを調製するために、ＢｇｌＩＩ／ＥｃｏＲＩ切断バキュロウイルス転移ベクターｐＶＬ１３９２にライゲートした。
【０１２１】
（ｂ）組換えバキュロウイルスの調製
Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ （Ｓｆ９）細胞を、１０％ウシ胎仔血清を含有するＴＮＭ−ＦＨ 昆虫培地（ｉｎｓｅｃｔ ｍｅｄｉｕｍ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）中の単層として又は懸濁培養で増殖させた。組換えプラスミド５μｇと線状化Ｂａｃｕｌｏ−Ｇｏｌｄ（登録商標）ＤＮＡ （Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）１μｇとをＳｆ９細胞中に同時トランスフェクトする（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｎｇ）ことによって、組換えバキュロウイルスを調製した。組換えウイルスを、終点希釈（ｅｎｄ ｐｏｉｎｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）及び／又はプラーク単離によって精製した。発現を試験するために、１０６ Ｓｆ９ 細胞を組換えバキュロウイルスによって０．５及び１のｍ．ｏ．ｉ．’ｓ（感染多重度）で４８時間感染させた。インキュベーション後に、培地を除去して、細胞をＰＢＳ（１４０ｍＭ ＮａＣｌ， ２．７ｍＭ ＫＣｌ， ８．１ｍＭ Ｎａ２ＰＯ４， １．５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４， ｐＨ ７．２）で洗浄した。次に、細胞をＦＡＣＳ測定によって分析したか、又はＳＤＳサンプルバッファー中で溶菌させて、ＳＤＳゲルクロマトグラフィー及びイムノブロット・アッセイ（ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ ａｓｓａｙ）によって試験した。
【０１２２】
（ｃ）キメラウイルス様粒子の精製
ＣＶＬＰｓを調製するために、Ｓｆ９又はＳＦ＋細胞を無血清培地ＩｎｓｅｃｔＸＰｒｅｓｓ （Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ， Ｖｅｒｖｉｅｒｓ， Ｂｅｌｇｉｕｍ）又はＳｆ ９００ＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）中、２７℃において、１．５〜２ｘ１０６細胞／ｍｌの密度になるまで培養した。培養物２００ｍｌを組換えバキュロウイルスによって１〜２のｍ．ｏ．ｉ．で４８時間感染させた。次に、細胞をペレット化して、−８０℃において凍結した。次に、４倍量の抽出バッファー（２００ｍＭ ＮａＣｌ， ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．５）を加えて、凍結融解溶菌（ｆｒｅｅｚｅ−ｔｈａｗ ｌｙｓｉｓ）を行なった。該ホモジネートを、Ｓｏｒｖａｌｌ ＳＳ３４ローターにおいて１０，０００ｒｐｍで遠心分離することによって、清澄化した。免疫学的アッセイのために、Ｌ１Ｅ７タンパク質を、清澄化粗抽出物から３５〜４０％飽和の硫酸アンモニウムによって沈降させ、次にＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥ （Ｍｅｒｃｋ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）上でのアニオン交換クロマトグラフィーを行なって、精製した、ＣＶＬＰｓは線状塩勾配で３００〜４００ｍＭ ＮａＣｌにおいて溶出した。精製した画分の該タンパク質含量を、基準としてウシ血清アルブミンを用いるＢｒａｄｆｏｒｄ法によって測定した。
【０１２３】
３．ＨＰＶ１６ Ｌ１ペプチド刺激ネズミＴ細胞の、異なる抗原提示細胞による再刺激　ＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ＊Ｅ７１−５５ ＣＶＬＰ接種Ｃ５７ＢＬ／６マウスから得たネズミＴ細胞（４ｘ１０５）を、ＨＰＶ１６ Ｌ１ペプチドプールによって３７℃において５週間、各個々のペプチド１μｇ／ｍｌ及び１０５抗原提示細胞（照射済み脾臓細胞）を毎週添加しながら刺激して、回収した。該細胞を次に、培地１００μｌ中で、３７℃において、図１のＸ軸に示したペプチド１μｇ／ｍｌ及び１０５抗原提示細胞（ＪＡＷＳ）によってＩＬ２ １０ＩＵ／ｍｌの存在下で再刺激した。バッファーのみと共にインキュベートした細胞を陰性対照として用いる。
【０１２４】
１時間後に、モネンシン（３００μＭ）１μｌを加えた。該細胞を３７℃においてさらに５時間インキュベートした。次に、細胞を固定し、α−マウスＣＤ８／ＰＥ、α−マウスＣＤ４／シクロム及びα−マウスインターフェロンγ／ＦＩＴＣによって透過させ、染色した。細胞の標識をＦＡＣＳｃａｎキャリバー（ｃａｌｉｂｅｒ）によって分析して、測定結果をＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【０１２５】
結果：図１の上部に示すようなペプチドＰ１８， Ｐ１９若しくはＰ４３と共に、又は図１の下部に示すようなペプチドＰ３５若しくはＰ３と共にインキュベートした場合に、ＪＡＷＳ細胞は、ペプチド刺激されたＣＤ８陽性ネズミＴ細胞の再刺激をもたらした。その結果、ペプチドＰ３， Ｐ１８， Ｐ１９， Ｐ３５及びＰ４３は、Ｈ２ｂ制限された細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含有する。
【０１２６】
４．Ｐ３３負荷ＲＭＡ細胞の溶菌
ＲＭＡ細胞を５１Ｃｒと共に３７℃において１時間インキュベートし、培地によって３回洗浄し、２つのアリコートに分割した。該細胞の一方のアリコートにＰ３３ペプチド１０μｇ／ｍｌを加え、他方のアリコートはペプチドの不存在下の陰性対照として用いた。各場合に、次に２０００細胞（＝標的細胞）を４０，０００Ｔ細胞（＝エフェクター細胞）に１５０μｌの総量で加えた。該Ｔ細胞は既に、４３ペプチド（ペプチド１〜４３、各場合に１μｇ／ｍｌ）から成る混合物によって５週間刺激されたものである。
【０１２７】
該細胞の自然溶菌及び最大溶菌のためのアッセイ混合物を並行して設定した。培養培地と共にインキュベートした標的細胞を自然溶菌のために用いた。最大溶菌のためには、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００を加えて、標的細胞を溶菌した。
【０１２８】
該アッセイ混合物を３７℃において５時間インキュベートした。該アッセイ混合物からの５０μｌ量の上清をＬｕｍａプレートに加えて、室温において一晩乾燥させた。翌朝に、放射性５１Ｃｒの量（カウント）をＣａｎｂｅｒｒａ−Ｐａｃｋｅｒｄ Ｂプレート・カウンターを用いて測定し、Ｔｒｉｔｏｎアッセイ混合物中の最大溶菌細胞に関連づけた。次に、式：
Ｘ＝１００・（カウント−自然カウント）／（最大カウント−自然カウント）を用いて、比溶菌％を算出した。
【０１２９】
図２は、Ｔ細胞がＰ３３ペプチドを負荷されたＲＭＡ細胞を効果的に溶菌することができるのに対して、これらのＴ細胞が非負荷ＲＭＡ細胞を溶菌することができなかったことを示す。したがって、Ｐ３３ペプチドはＨ２ｂ制限された細胞傷害性Ｔ細胞エピトープである。
【０１３０】
５．異なる抗原提示細胞による、ＨＰＶ１８ペプチド刺激されたネズミＴ細胞の再刺激
ＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−５３ＤＩ ＣＶＬＰｓ及びＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−６０ＤＩ ＣＶＬＰｓを接種されたＣ３Ｈマウスから得たネズミＴ細胞（４ｘ１０５）を、ＨＰＶ１８ Ｌ１又はＥ７ペプチドプールによって３７℃で５週間、各個々のペプチド１μｇ／ｍｌ及び１０５抗原提示細胞（照射済み脾臓細胞）を毎週添加しながら、刺激して、回収した。次に、該細胞を３７℃において及び培地１００μｌ中で、図３のＸ軸に示したペプチド１μｇ／ｍｌ及び１０５抗原提示細胞（ＬＫＫ）によってＩＬ２ １０ＩＵ／ｍｌの存在下で再刺激した。バッファーのみと共にインキュベートした細胞を陰性対照として用いた。
【０１３１】
１時間後に、モネンシン（３００μＭ）１μｌを加えた。該細胞を３７℃においてさらに５時間インキュベートした。次に、細胞を固定し、α−マウスＣＤ８／ＰＥ、α−マウスＣＤ４／シクロム及びα−マウスインターフェロンγ／ＦＩＴＣによって透過させ、染色した。細胞の標識をＦＡＣＳｃａｎキャリバーによって分析して、測定結果をＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【０１３２】
結果：図３に示すようなペプチドＱ２２， Ｑ２３， Ｑ５１， Ｑ４３及びＱ４４と共に、又は図４に示すようなペプチドＱ４１及びＱ５と共にインキュベートした場合に、ＬＫＫ細胞は、ペプチド刺激されたネズミＣＤ８陽性Ｔ細胞の再刺激をもたらした。その結果、ペプチドＱ５， Ｑ２２， Ｑ２３， Ｑ４１， Ｑ４３， Ｑ４４及びＱ５１は、Ｈ２ｋ制限された細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含有する。
【０１３３】
６．異なる抗原提示細胞による、ＨＰＶ１８ ＣＶＬＰ刺激されたＴ細胞の再刺激
非ＨＬＡ型血液ドナーからのヒトＴ細胞（４ｘ１０５）をＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−５３ＤＩ ＣＶＬＰｓ及びＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−６０ＤＩ ＣＶＬＰｓ、ヒトＧＭ−ＣＳＦ　８００Ｕ／ｍｌ並びにヒトＩＬ４　５００Ｕ／ｍｌによって１週間刺激し、さらに、ＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−５３ＤＩ ＣＶＬＰｓ及びＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−６０ＤＩ ＣＶＬＰｓによって３７℃においてさらに５週間、ＣＶＬＰｓ混合物（該２構築体の比率１：１）１μｇ／ｍｌ及び１０５抗原提示細胞（照射済みＰＭＢＣ）を毎週添加しながら、刺激して、回収した。
【０１３４】
２０マーペプチドＱ１〜５２を、それぞれ、マトリックスに従って、ペプチドプールＡ〜Ｈ及び１〜７にアセンブルした。
【０１３５】
【化１４】
2004514449.tif 000012
【０１３６】
次に、該Ｔ細胞を３７℃において及び培地１００μｌ中で該ペプチドプール及び１０５抗原提示細胞（ドナー同一のＢＬＣＬ）によってＩＬ２　１０ＩＵ／ｍｌの存在下で再刺激した。これに関連して用いたペプチドプール量は、各個々のペプチドの場合に１μｇ／ｍｌが加えられるような量であった。
【０１３７】
バッファーのみと共にインキュベートした細胞を陰性対照として用い、それぞれ、ＨＰＶ１８ Ｌ１ペプチドプール及びＨＰＶ１８ Ｅ７ペプチドプールと共にインキュベートした細胞は陽性対照として用いた。
【０１３８】
１時間後に、モネンシン１μｌを加えた。次に、該細胞を３７℃においてさらに５時間インキュベートした。この後に、細胞を固定し、α−ヒトＣＤ８／ＡＰＣ、α−ヒトＣＤ４／ＰｅｒＣＰ及びα−ヒトＩＦＮγ／ＦＩＴＣによって透過させ、染色した。細胞の標識をＦＡＣＳｃａｎキャリバーによって分析して、測定結果をＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【０１３９】
結果：図５は、ペプチドプールＦ及び１と共にインキュベートされたＢＬＣＬが特に、ＣＶＬＰ刺激されたヒトＣＤ４陽性Ｔ細胞の再刺激をもたらしたことを示す。その上、ペプチドプールＡ及び６は、陰性対照の再刺激よりも明らかに高度である再刺激を示した。対照的に、他のペプチドプールと共にインキュベートされたＢＬＣＬ、及び陰性対照又はＥ７ペプチドプールと共にインキュベートされたＢＬＣＬは、反応性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の小さい割合を示したに過ぎなかった。ペプチドプールＦ及び１は共通にペプチドＱ６を含有し、その結果として、ＣＶＬＰ刺激されたＴ細胞の再刺激を惹起する。したがって、ペプチドＱ６はＴヘルパーエピトープを含有する。ペプチドプールＡ及び１は、共通に有されるペプチドとしてペプチドＱ１を含有し、これに対して、Ａ及び６の場合には、このペプチドはＱ４１であり、Ｆ及び６の場合には、Ｑ４６である。その結果、ペプチドＱ１、Ｑ４１及びＱ４６もＴヘルパーエピトープを含有する。
【０１４０】
７．異なる抗原提示細胞による、ＨＰＶ１６ ＣＶＬＰ刺激されたＴ細胞の再刺激
実施例６と同様に、非ＨＬＡ型血液ドナーから得たヒトＴ細胞をＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ＊Ｅ７１−５５ ＣＶＬＰｓによって刺激して、回収した。
【０１４１】
２０マーペプチドＰ１〜５１を、それぞれ、次のマトリックスに従って、ペプチドプールＡ〜Ｈ及び１〜７にアセンブルした。
【０１４２】
【化１５】
2004514449.tif 000013
【０１４３】
次に、該Ｔ細胞を実施例６に記載したように再刺激し、固定し、透過させ、染色した。分析も実施例６に記載したように行なった。
【０１４４】
結果：図６は、ペプチドプールＧ及び３と共にインキュベートされたＢＬＣＬが、ＣＶＬＰ刺激されたＴ細胞の再刺激をもたらしたことを示す。さらに、ペプチドプールＢ及びＣ、並びに２及び４も、陰性対照の再刺激よりも明らかに高度である再刺激を示した。対照的に、他のペプチドプールと共にインキュベートされたＰＢＭＣ、及び陰性対照としてインキュベートされたＰＢＭＣは、反応性ＣＤ４陽性Ｔ細胞の小さい割合を示したに過ぎなかった；しかし、他のペプチドプールと共にインキュベートされたＢＬＣＬ、並びに陰性対照及び、Ｅ７ペプチドプールと共にインキュベートされたＰＢＭＣはこのようにしなかった。ペプチドプールＧ及び３は共通にＰ２３を含有し；これに対して、Ｂ及び２は共通にＰ１０を含有し、Ｂ及び３は共通にＰ１８を含有し、Ｂ及び４は共通にＰ２６を含有し、Ｃ及び２は共通にＰ１１を含有し、Ｃ及び３は共通にＰ１９を含有し、Ｃ及び４は共通にＰ２７を含有し、Ｇ及び２は共通にＰ１５を含有し、Ｇ及び４は共通にＰ３１を含有する。したがって、これらのペプチドは各場合にＣＶＬＰ刺激されたＴ細胞の再刺激を惹起する。この結果、ペプチドＰ１０、Ｐ１１、Ｐ１５、Ｐ１８、Ｐ１９、Ｐ２３、Ｐ２６、Ｐ２７及びＰ３１は、各場合に、Ｔヘルパーエピトープを含有する。
【０１４５】
８．異なる抗原提示細胞による、ＨＰＶ１８ Ｌ１ペプチド刺激されたＴ細胞の再刺激
実施例３と同様に、ＨＬＡ Ａ２４陽性ドナーから得たヒトＴ細胞（４ｘ１０５）を
ＨＰＶ１８ Ｌ１ペプチドプールによって３７℃において３週間、各個々のペプチド１μｇ／ｍｌ及び１０５抗原提示細胞（照射済みＰＭＢＣ）を毎週添加しながら、刺激して、回収した。
【０１４６】
次に、該細胞を培地１００μｌ中、３７℃においてＨＰＶ１８ Ｌ１ペプチドＱ９　１０μｇ／ｍｌ及び１０５抗原提示細胞（ドナー同一ＢＬＣＬ）によって、ＩＬ２　１０ＩＵ／ｍｌの存在下で再刺激した。バッファーのみと共にインキュベートされた細胞を陰性対照として用いた。
【０１４７】
１時間後に、モネンシン（３００μＭ）１μｌを加えた。該細胞を３７℃においてさらに５時間インキュベートした。この後に、次に、細胞を固定し、α−ヒトＣＤ８／ＡＰＣ、α−ヒトＣＤ４／ＰｅｒＣＰ及びα−ヒトＩＦＮγ／ＦＩＴＣによって透過させ、染色した。細胞の標識をＦＡＣＳｃａｎキャリバーによって検査して、測定結果をＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【０１４８】
結果：図７は、ペプチドＱ９と共にインキュベートされたＢＬＣＬ細胞が、ＨＰＶ１８ Ｌ１ペプチドプールで刺激されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の再刺激をもたらしたことを示す。したがって、ペプチドＱ９は、ＨＬＡ Ａ２４制限細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含有する。
【０１４９】
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／下でＰａｒｋｅｒ’ｓペプチド予測プログラムと呼ばれるもので実施された、可能なＨＬＡ Ａ２４結合ペプチドに関するアルゴリズム（Ｐａｋｅｒ， ＫＣ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：１６３）を用いて、該ペプチドＩＹＮＰＥＴＱＲＬがＨＬＡ Ａ２４ハプロタイプ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）のＭＨＣ クラスＩ分子に結合することを確証した。したがって、ペプチドＩＹＮＰＥＴＱＲＬは、Ｑ９ペプチドと共にインキュベートされたＢＬＣＬ細胞によるＴ細胞の再刺激を惹起する。
【０１５０】
したがって、オーバーラップ２０マーのペプチドＱ９中に含有されるペプチドＩＹＮＰＥＴＱＲＬは、ＨＬＡ Ａ２４制限細胞傷害性Ｔ細胞エピトープである。
【０１５１】
９．異なる抗原提示細胞による、ＨＰＶ１６ ＣＶＬＰ刺激されたＴ細胞の再刺激
実施例６と同様に、非ＨＬＡ型血液ドナーから得たヒトＴ細胞をＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ＊Ｅ７１−５５ ＣＶＬＰｓによって刺激して、回収した。
【０１５２】
次に、該Ｔ細胞を３７℃において及び培地１００μｌ中で、実施例７からのペプチドプール及び１０５抗原提示細胞（ドナー同一ＢＬＣＬ）によってＩＬ２　１０ＩＵ／ｍｌの存在下で再刺激した。これに関連して、各個々のペプチドの場合に１μｇ／ｍｌが加えられるような量であるペプチドプール量を用いた。バッファーのみと共にインキュベートされた細胞を陰性対照として用い、これに対して、ＨＰＶ１６ Ｌ１ペプチドプールと共にインキュベートされた細胞を陽性対照として用いた。
【０１５３】
１時間後に、モネンシン１μｌを加えた。次に、該細胞を３７℃においてさらに５時間インキュベートした。この後に、次に、細胞を固定し、α−ヒトＣＤ８／ＡＰＣ、α−ヒトＣＤ４／ＰｅｒＣＰ及びα−ヒトＩＦＮγ／ＦＩＴＣによって透過させ、染色した。細胞の標識をＦＡＣＳｃａｎキャリバーによって検査して、測定結果をＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【０１５４】
結果：図８（上部）は、ペプチドプールＧ及び５と共にインキュベートされたＢＬＣＬの場合に並びにＰ３９と共にインキュベートされたＢＬＣＬの場合にはＣＤ４陽性及びＩＦＮγ陽性細胞の割合が非常に高いことを示す。ペプチドＰ３９は、ペプチドプールＧ及び５に共通に含有され、そのままで同様にＣＶＬＰ刺激されたＴ細胞の再刺激をもたらしたペプチドであるので、ペプチドＰ３９はＴヘルパーエピトープを含有する。ＣＤ４陽性及びＩＦＮγ陽性細胞は一般にＴＨ１であるので、その結果、該エピトープはＴＨ１エピトープである。
【０１５５】
さらに、ＣＤ４陽性及びＩＬ４陽性細胞の割合（図８の下部）は、ペプチドプールＦ、Ｇ及び５と共にインキュベートされたＢＬＣＬの場合には、他のペプチドプールと共にインキュベートされたＢＬＣＬの場合又は陰性対照の場合の反応性細胞の割合よりも顕著に高い。一般に、ＣＤ４陽性及びＩＬ４陽性細胞はＴＨ２細胞である。このことは次には、Ｇ及び５中に含有されるペプチドＰ３９もさらにＴＨ２エピトープを含有するか、又はＴＨ１エピトープに同じであること、並びにＦ及び５中に含有されるペプチド３８もまたＴＨ２エピトープを含有することを意味する。
【０１５６】
１０．異なる抗原提示細胞による、ＨＰＶ１６ ＣＶＬＰ刺激されたＴ細胞の再刺激
実施例６と同様に、非ＨＬＡ型血液ドナーから得たヒトＴ細胞をＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ＊Ｅ７１−５５ ＣＶＬＰｓによって刺激して、回収した。
【０１５７】
次に、該Ｔ細胞を３７℃において及び培地１００μｌ中で、実施例７からのペプチドプール及び１０５抗原提示細胞（ドナー同一ＢＬＣＬ）によってＩＬ２　１０ＩＵ／ｍｌの存在下で再刺激した。これに関連して、各個々のペプチドの場合に１μｇ／ｍｌが加えられるような量であるペプチドプール量を用いた。バッファーのみと共にインキュベートされた細胞を陰性対照として用い、これに対して、ＨＰＶ１６ Ｌ１ペプチドプールと共にインキュベートされた細胞を陽性対照として用いた。
【０１５８】
１時間後に、モネンシン１μｌを加えた。次に、該細胞を３７℃においてさらに５時間インキュベートした。この後に、細胞を固定し、α−ヒトＣＤ８／ＡＰＣ、α−ヒトＣＤ４／ＰｅｒＣＰ及びα−ヒトＩＦＮγ／ＦＩＴＣによって透過させ、染色した。細胞の標識をＦＡＣＳｃａｎキャリバーにおいて検査して、測定結果をＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【０１５９】
結果：図９は、ペプチドプールＢ、Ｅ、Ｇ及び１と共にインキュベートされたＢＬＣＬの場合にＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合が高いことを示す。ペプチドプールＢ及び１はペプチドＰ２を共通に含有し、これに対してペプチドプールＥ及び１はＰ５を共通に含有し、ペプチドプールＧ及び１はＰ７を共通に含有するので、ペプチドＰ２、Ｐ５及びＰ７はそれぞれ細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含有する。
【０１６０】
１１．Ｐ３３刺激された抗原提示細胞による、ＨＰＶ１６ ＣＶＬＰ刺激されたＴ細胞の再刺激
実施例６と同様に、非ＨＬＡ型血液ドナーから得たヒトＴ細胞をＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ＊Ｅ７１−５５ ＣＶＬＰｓによって刺激して、回収した。
【０１６１】
次に、該Ｔ細胞を３７℃において及び培地１００μｌ中で、ペプチドＰ３３　１μｇ／ｍｌ及び１０５抗原提示細胞（ドナー同一ＢＬＣＬ）によってＩＬ２　１０ＩＵ／ｍｌの存在下で再刺激した。バッファーのみと共にインキュベートされた細胞を陰性対照として用い、これに対して、ＨＰＶ１６ Ｌ１ペプチドプールと共にインキュベートされた細胞を陽性対照として用いた。
【０１６２】
１時間後に、モネンシン１μｌを加えた。次に、該細胞を３７℃においてさらに５時間インキュベートした。この後に、細胞を固定し、α−ヒトＣＤ８／ＡＰＣ、α−ヒトＣＤ４／ＰｅｒＣＰ及びα−ヒトＩＦＮγ／ＦＩＴＣによって透過させ、染色した。細胞の標識をＦＡＣＳｃａｎキャリバーにおいて検査して、測定結果をＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【０１６３】
結果：図１０は、ペプチドＰ３３と共にインキュベートされたＢＬＣＬの場合にはＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合が、陰性対照の場合よりも顕著に高いことを示す。したがって、ペプチドＰ３３は細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含有する。
【０１６４】
１２．異なる抗原提示細胞による、ＨＰＶ１８ ＣＶＬＰ刺激されたＴ細胞の再刺激
実施例６と同様に、非ＨＬＡ型血液ドナーから得たヒトＴ細胞を３７℃においてＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−５３ＤＩ ＣＶＬＰｓ及びＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−６０ＤＩ ＣＶＬＰｓによって刺激して、回収した。
【０１６５】
次に、該Ｔ細胞を３７℃において及び培地１００μｌ中で、実施例６からのＨＰＶ１８ペプチドプール及び１０５抗原提示細胞（ドナー同一ＢＬＣＬ）によってＩＬ２　１０ＩＵ／ｍｌの存在下で再刺激した。これに関連して、各個々のペプチドの場合に１μｇ／ｍｌが加えられるような量であるペプチドプール量を用いた。バッファーのみと共にインキュベートされた細胞を陰性対照として用い、これに対して、ＨＰＶ１８ Ｌ１ペプチドプールと共にインキュベートされた細胞を陽性対照として用いた。
【０１６６】
１時間後に、モネンシン１μｌを加えた。次に、該細胞を３７℃においてさらに５時間インキュベートした。この後に、細胞を固定し、α−ヒトＣＤ８／ＡＰＣ、α−ヒトＣＤ４／ＰｅｒＣＰ及びα−ヒトＩＦＮγ／ＦＩＴＣによって透過させ、染色した。細胞の標識をＦＡＣＳｃａｎキャリバーにおいて検査して、測定結果をＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【０１６７】
結果：図１１（上部）は、ペプチドプールＦ、Ｇ、５及び６と共にインキュベートされたＢＬＣＬの場合にはＣＤ４陽性及びＩＦＮγ陽性細胞の割合が高いことを示す。したがって、ペプチドプールＦ及び５は共通にペプチドＱ３８を有し、ペプチドプールＦ及び６は共通にペプチドＱ４６を有し、ペプチドプールＧ及び５は共通にペプチドＱ３９を有し、ペプチドプールＧ及び６は共通にペプチドＱ４７を有する。したがって、ペプチドＱ３８、Ｑ３９、Ｑ４６及びＱ４７はそれぞれＴＨ１エピトープを含有する。
【０１６８】
図１１（下部）は、ＣＤ４陽性及びＩＬ４陽性細胞の割合がペプチドプールＧの場合に特に高い；しかし、反応性細胞の割合はプール３、４、５及び６の場合にほぼ等しい高さであることを示し、このことは、この実験からＴＨ２エピトープに関する明白な結論を引き出すことが不可能であったことを意味する。しかし、ペプチドＱ３８、Ｑ３９、Ｑ４６及びＱ４７を下記実験では個別に試験した。
【０１６９】
１３．Ｑ３８ペプチド、Ｑ３９ペプチド、Ｑ４６ペプチド又はＱ４７ペプチドによって刺激された抗原提示細胞による、ＨＰＶ１８ ＣＶＬＰ刺激Ｔ細胞の再刺激
実施例６と同様に、非ＨＬＡ型血液ドナーから得たヒトＴ細胞（４ｘ１０５）をＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−５３ＤＩ ＣＶＬＰｓ及びＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−６０ＤＩ ＣＶＬＰｓによって刺激して、回収した。
【０１７０】
次に、該Ｔ細胞を３７℃において及び培地１００μｌ中で、各場合に、ペプチドＱ３８、Ｑ３９、Ｑ４６又はＱ４７　１μｇ／ｍｌ及び１０５抗原提示細胞（ドナー同一ＢＬＣＬ）によってＩＬ２　１０ＩＵ／ｍｌの存在下で再刺激した。バッファーのみと共にインキュベートされた細胞を陰性対照として用い、これに対して、ＨＰＶ１８ Ｌ１ペプチドプール又はＥ７ペプチドプールと共にインキュベートされた細胞を陽性対照として用いた。
【０１７１】
１時間後に、モネンシン１μｌを加えた。次に、該細胞を３７℃においてさらに５時間インキュベートした。この後に、細胞を固定し、α−ヒトＣＤ８／ＡＰＣ、α−ヒトＣＤ４／ＰｅｒＣＰ及びα−ヒトＩＦＮγ／ＦＩＴＣによって透過させ、染色した。細胞の標識をＦＡＣＳｃａｎキャリバーにおいて検査して、測定結果をＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【０１７２】
結果：図１２（上部左）は、ペプチドＱ３８及びＱ３９と共にインキュベートされたＢＬＣＬの場合には反応性ＣＤ４陽性及びＩＦＮγ陽性Ｔ細胞の割合が特に高く、この割合がペプチドＱ４６及びＱ４７の場合にも陰性対照の場合よりもまだ顕著に高いことを示す。したがって、Ｑ３８、Ｑ３９、Ｑ４６及びＱ４７はそれぞれＴＨ１エピトープを含有する。
【０１７３】
図１２（下部左）は、ペプチドＱ３８及びＱ３９の場合には反応性ＣＤ４陽性及びＩＬ４陽性Ｔ細胞の割合が特に高いことを示し、このことは、Ｑ３８及びＱ３９が、ＴＨ１エピトープの他に、さらにＴＨ２エピトープをも含有するか、又はＴＨ１エピトープが同時にＴＨ２エピトープでもあることを意味する。
【０１７４】
図１２（上部右）は、ペプチドＱ３８、Ｑ３９及びＱ４７の場合には反応性ＣＤ８陽性及びＩＮＦγ陽性Ｔ細胞の割合が特に高いことを示し、このことは、ペプチドＱ３８、Ｑ３９及びＱ４７が付加的に細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含有することを意味する。ＣＤ８陽性及びＩＬ４陽性細胞の割合は低く、ペプチドＱ３８、Ｑ３９、Ｑ４６及びＱ４７の場合には陰性対照に匹敵する、これは、ＣＤ８陽性細胞が一般にＩＬ４を全く発現しないという事実によって説明することができる発見である。
【０１７５】
１４．異なる抗原提示細胞による、ＨＰＶ１６ ＣＶＬＰ刺激されたＴ細胞の再刺激
実施例６と同様に、非ＨＬＡ型血液ドナーから得たヒトＴ細胞をＨＰＶ１６Ｌ１ΔＣ＊Ｅ７１−５５ ＣＶＬＰｓによって刺激して、回収した。
【０１７６】
次に、該Ｔ細胞を３７℃において及び培地１００μｌ中で、実施例７からのペプチドプール及び１０５抗原提示細胞（ドナー同一ＢＬＣＬ）によってＩＬ２　１０ＩＵ／ｍｌの存在下で再刺激した。これに関連して、各個々のペプチドの場合に１μｇ／ｍｌが加えられるような量であるペプチドプール量を用いた。バッファーのみと共にインキュベートされた細胞を陰性対照として用い、これに対して、ＨＰＶ１６ Ｌ１又はＥ７ペプチドプールと共にインキュベートされた細胞を陽性対照として用いた。
【０１７７】
１時間後に、モネンシン１μｌを加えた。次に、該細胞を３７℃においてさらに５時間インキュベートした。この後に、細胞を固定し、α−ヒトＣＤ８／ＡＰＣ、α−ヒトＣＤ４／ＰｅｒＣＰ及びα−ヒトＩＦＮγ／ＦＩＴＣによって透過させ、染色した。細胞の標識をＦＡＣＳｃａｎキャリバーにおいて検査して、測定結果をＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【０１７８】
結果：図１３は、ＣＤ８陽性及びＩＮＦγ陽性Ｔ細胞の割合が、ペプチドプールＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、１及び６と共にインキュベートされたＢＬＣＬの場合に高いことを示す。ペプチドプールＡ及び１はペプチドＰ１を共通に含有し、これに対して、ペプチドプールＣ及び１はペプチドＰ３を共通に含有し、ペプチドプールＥ及び１はペプチドＰ５を共通に含有し、ペプチドプールＦ及び１はペプチドＰ６を共通に含有し、ペプチドプールＡ及び６はペプチドＰ４１を共通に含有し、ペプチドプールＣ及び６はペプチドＰ４３を共通に含有し、ペプチドプールＥ及び６はペプチドＰ４５を共通に含有し、そしてペプチドプールＦ及び６はペプチドＰ４６を共通に含有する。したがって、ペプチドＰ１、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ４１、Ｐ４３、Ｐ４５及びＰ４６は、それぞれ、細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含有する。
【０１７９】
１５．異なる抗原提示細胞による、ＨＰＶ１８ ＣＶＬＰ刺激されたＴ細胞の再刺激
実施例６と同様に、非ＨＬＡ型血液ドナーから得たヒトＴ細胞を３７℃においてＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−５３ＤＩ ＣＶＬＰｓ及びＨＰＶ１８Ｌ１ΔＣＤＩＥ７１−６０ＤＩ ＣＶＬＰｓによって刺激して、回収した。
【０１８０】
次に、該Ｔ細胞を３７℃において及び培地１００μｌ中で、実施例６からのペプチドプール及び１０５抗原提示細胞（ドナー同一ＢＬＣＬ）によってＩＬ２　１０ＩＵ／ｍｌの存在下で再刺激した。これに関連して、各個々のペプチドの場合に１μｇ／ｍｌが加えられるような量であるペプチドプール量を用いた。バッファーのみと共にインキュベートされた細胞を陰性対照として用い、これに対して、ＨＰＶ１８ Ｌ１又はＥ７ペプチドプールと共にインキュベートされた細胞を陽性対照として用いた（図１４の上部）。図１４の下部の場合には、Ｔ細胞を３７℃において及び培地１００μｌ中で、ペプチドプールＦ及び４によって並びにペプチドＱ３０　１μｇ／ｍｌ及び１０５抗原提示細胞（ドナー同一ＢＬＣＬ）によってＩＬ２　１０ＩＵ／ｍｌの存在下で再刺激した。
【０１８１】
１時間後に、モネンシン１μｌを加えた。次に、該細胞を３７℃においてさらに５時間インキュベートした。この後に、細胞を固定し、α−ヒトＣＤ８／ＡＰＣ、α−ヒトＣＤ４／ＰｅｒＣＰ及びα−ヒトＩＦＮγ／ＦＩＴＣによって透過させ、染色した。細胞の標識をＦＡＣＳｃａｎキャリバーにおいて検査して、測定結果をＣｅｌｌｑｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析した。
【０１８２】
結果：図１４（上部）は、ＣＤ４陽性及びＩＦＮγ陽性Ｔ細胞の割合が、ペプチドプールＦ及び４と共にインキュベートされたＢＬＣＬの場合には高いことを示す。ペプチドプールＦ及び４はペプチドＱ３０を共通に含有する。したがって、ペプチドＱ３０はＴＨ１エピトープを含有する。
【０１８３】
この結果は、図１４に示す実験によって実証された。Ｔ細胞がペプチドプールＦ若しくは４と共にインキュベートされたＢＬＣＬ、又はペプチドＱ３０と共にインキュベートされたＢＬＣＬのいずれによって再刺激されたかに拘わらず、反応性ＣＤ４陽性及びＩＦＮγ陽性Ｔ細胞の割合は、各場合に、類似する。
【０１８４】
１６．ＨＰＶ１８ペプチド刺激されたネズミＴ細胞の再刺激
実施例５と同様に、ＣＶＬＰ接種されたマウスから得たネズミＴ細胞をＬ１又はＥ７ ペプチドプールによって、添加した抗原提示細胞の存在下で刺激した。次に、該細胞を図１５におけるＸ軸上に示したペプチド（図１５の上部ではＱ３及びＱ４、図１５の下部ではＬ１４７４Ｅ７１−８、Ｅ７２−１１及びＥ７１−８）及びさらに抗原提示細胞（ＲＭＡ）によって再刺激した。バッファーのみと共にインキュベートされた細胞を陰性対照として用いた。
【０１８５】
実験をさらに実施例５と同様に分析し、反応性ＣＤ８陽性細胞を抗体染色及びＦＡＣＳｃａｎによって測定した。
【０１８６】
結果：図１５は、ペプチドＱ３及びＱ４（図の上部）並びにペプチドＬ１４７４Ｅ７１−８、Ｅ７２−１１及びＥ７１−８（図の下部）と共にインキュベートされたときに、ＲＭＡ細胞がペプチド刺激されたネズミＣＤ８Ｔ細胞の再刺激をもたらしたことを示す。したがって、ペプチドＱ３、Ｑ４、Ｌ１４７４Ｅ７１−８、Ｅ７２−１１及びＥ７１−８はそれぞれＨ２ｂ制限細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含有する。
【０１８７】
１７．ＨＰＶ１８ペプチド負荷ＲＭＡ細胞／ＬＫＫ細胞の溶菌
実施例４と同様に、ＲＭＡ細胞又はＬＫＫ細胞を５１Ｃｒによって放射能標識して、Ｘ軸上にプロットしたペプチド（図１６の上部ではＱ４３及びＱ４４、図１６の下部ではＱ４９）と共にインキュベートした。ペプチドなしの細胞は陰性対照として用いた。次に、予めペプチドプールで刺激されているＴ細胞を加えた。
【０１８８】
Ｔ細胞によるＲＭＡ細胞又はＬＫＫ細胞の溶菌を５１Ｃｒの放出によって測定し、実施例４に記載したように算出する。
【０１８９】
結果：図１６は、Ｔ細胞が、Ｑ４３又はＱ４４を負荷されたＲＭＡ細胞（図１６の上部）又はＱ４９を負荷されたＬＫＫ細胞（図１６の下部）を効果的に溶菌することができたが、負荷されないＲＭＡ細胞又はＬＫＫ細胞を溶菌することはできなかったことを示す。したがって、Ｑ４３ペプチド及びＱ４４ペプチドはＨ２ｂ制限された細胞傷害性Ｔ細胞エピトープであるが、この結果、Ｑ４９はＨ２ｋ制限された細胞傷害性Ｔ細胞エピトープである。
【０１９０】
１８．細胞傷害性Ｔ細胞エピトープＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４の同定
Ａ．ＨＬＡ結合予測
ＨＬＡ Ａ＊０２０１に高い強度で結合すると考えられるＨＰＶ型１８ Ｅ７タンパク質中の９マー配列を予測するために、ＮＩＨ　ＨＬＡ結合予測プログラム（アドレス：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ／＿ｂｉｎｄ／）を用いた。該９マーはＨＬＡクラスＩ分子のための最適リガンドであるので、これらを試験した。この予測のために、ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質の完全なアミノ酸配列を該プログラムに供給して、ＨＬＡ Ａ＊０２０１対立遺伝子に対する９マーが予測されることを決定した。該プログラムは、見出された９マーが結合強度に従って配列されるリストを提供する。結合強度の値は、対応アミノ酸配列を有するペプチドの解離の半変化値（ｈａｌｆ−ｃｈａｎｇｅ ｖａｌｕｅ）（Ｔ１／２）（分）として記載する。
【０１９１】
Ｂ．ＰＢＭＣのｉｎ ｖｉｔｒｏワクチン接種
予測ペプチドを、標準方法（Ｆ ｍｏｃ方法）を用いて合成した。ＨＬＡ−Ａ２に対して高い予測結合強度を有するペプチドに対して、ペプチド特異的Ｔ細胞系を確立した。このために、健康なＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーから得た１ｘ１０５ＰＢＭＣを９６穴プレートの各穴中の培地（ＲＰＭＩ １６４０、１０％ 熱不活化ＡＢプラズマ）１００μｌ中に撒き散らした。ペプチド２０μｇ／ｍｌを該培養培地に加えた。細胞を３７℃においてインキュベートして、照射済みペプチド負荷された自己ＰＢＭＣ（ａｕｔｏｌｏｇｕｓ ＰＢＭＣ）で１回／週再刺激した。刺激剤ＰＢＭＣを、ペプチド２０μｇ／ｍｌを含有する培地中で４時間インキュベートした。照射後に、これらを培地で１ｘ１０４／１００μｌまでに希釈して、ペプチド刺激されたＰＢＭＣに加えた。このために、該培地の半分を各穴から吸引して、刺激剤ＰＢＭＣ懸濁液１００μｌを加えた。ＩＬ−２　１０Ｕ／ｍｌ及びＩＬ−７　１０Ｕ／ｍｌを第３刺激以降加えた。第５刺激以降、再刺激をペプチド負荷自己Ｂリンパ芽球細胞系（ＢＬＣＬ）を用いて同じ方法で行なった。
【０１９２】
同種腫瘍細胞を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏワクチン接種のために、ＨｅＬａ細胞をＣＤ８０及びＨＬＡ−Ａ２によってトランスフェクトした（Ｈ７．１−Ａ２）。これらの細胞を照射して、１ｘ１０４／穴の濃度でＰＢＭＣを刺激するために用いた。再刺激はペプチド刺激と同様な方法で３回行なった。
【０１９３】
Ｃ．ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
１ｘ１０４刺激剤細胞（Ｋ−５６２細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４３）であるＫ−Ａ２細胞をＨＬＡ Ａ２ 発現ベクター、ＰＢＭＣ又は樹枝状細胞によってトランスフェクトした）を、９６穴丸底細胞培養プレートの１つの穴中の培地（ＲＰＭＩ １６４０、０．４％ヒトアルブミン）６０μｌ中に撒き散らし、ペプチド５０μｇ／ｍｌを一晩負荷させた。次の日、培地（ＩＬ−２及びＩＬ−７各１０Ｕ／ｍｌ含有）６０μｌ中の５ｘ１０４Ｔ細胞を各穴に加えて、プレートを４時間インキュベートした。ＭｉｌｌｉｐｏｒｅニトロセルロースＨＡプレートを４℃において抗ヒトＩＦＮ−γモノクローナル抗体１−Ｄ１ｋ（１０μｇ／ｍｌＰＢＳ中、６０μｌ／穴、Ｈｏｌｚｅｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ， Ｃｏｌｏｇｎｅ）で一晩被覆した。次の日、該プレートを滅菌ＰＢＳ１５０μｌ／穴で３回各場合に５分間洗浄し、次に、３７℃において培地で１時間ブロッキングした。このブロッキング培地を除去して、細胞を該丸底細胞培養プレートからフィルター・プレートに移して、次にさらに２０〜２２時間インキュベートした。この後に、細胞及び培地を取り出し、フィルター・プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で２分間６回洗浄した。次に、抗体 Ａｂ−７−Ｂ６−１−ビオチン（２μｇ／ｍｌＰＢＳ／ＢＳＡ中、６０μｌ／穴、Ｈｏｌｚｅｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋａ）を加えて、このプレートを４℃において一晩インキュベートした。次の日、該フィルター・プレートを再度ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０（０．０５％）で２分間６回洗浄して、ストレプトアビジン−ＡＰ（５０ｎｇ／ｍｌＰＢＳ中、Ｓｉｇｍａ （Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）、１００μｌ／穴）を加えた。室温において２時間インキュベートした後に、該フィルター・プレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ ２０（０．０５％）で２分間３回及びＰＢＳで２分間３回洗浄した。次に、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質（Ｓｉｇｍａ， Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）６０μｌを加えて、該プレートを、青みを帯びた黒色スポットが出現するまで、さらに１〜２時間、室温においてインキュベートした。該反応を水で停止させ、該プレートを乾燥させた。スポットを、ＺＥＩＳＳ−ＶＩＳＩＯＮ （Ｈａｌｂｅｒｇｍｏｏｓ） ＥＬＩＳｐｏｔ読み出し系を用いて、計数した。
【０１９４】
Ｄ．細胞傷害性試験
ＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４特異的Ｔ細胞の細胞傷害性をクロム放出アッセイにおいて評価した。標的細胞として、自己ＢＬＣＬを用いた。各場合に、５ｘ１０５細胞を培地（ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＣＳ）１００μｌ中に入れ、５１クロム（ＮＥＮ）２０μｌで処理した。ＢＬＣＬにペプチドを負荷させるために、対応ペプチド５０μｇ／ｍｌを加えた。この後に、２０〜３０分間毎に細心に再懸濁させながら、細胞を室温において２時間インキュベートした。次に、細胞を培地５ｍｌで３回洗浄した。沈降させるために、細胞を各場合に１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次に細心に再懸濁させた。標的（ｔａｒｇｅｔｓ）を培地中に入れ、１ｘ１０５細胞／ｍｌの密度に調節した。各場合に、この細胞懸濁液４０μｌを、９６穴先端の尖った底（ｐｏｉｎｔｅｄ−ｂｏｔｔｏｍ）細胞培養プレートの穴中に既に撒き散らされた、エフェクター及びＣＣＬ−２４３ Ｋ−５６２細胞に加えた。
【０１９５】
エフェクター（エピトープ特異的Ｔ細胞）を回収して、培地（ＲＰＭＩ １６４０、１０％ ＦＣＳ、ＩＬ−２及びＩＬ−７　１０Ｕ／ｍｌ）中に入れた。各場合に、この細胞懸濁液８０μｌを９６穴先端の尖った底細胞培養プレートの穴中にピペットで入れた（２とおり）。同時に、細胞数／ｍｌを、所望のエフェクター／標的比率が得られることを保証するように調節した。該細胞系中に存在する可能性があるＮＫ細胞活性を完全に阻止するために、非標識Ｋ−５６２細胞（４０μｌ、標的細胞を基準にして２０倍過剰）をエフェクターに加えた。該エフェクターをＫ−５６２細胞と共に少なくとも３０分間インキュベートしてから、標識した標的細胞を加えた。
【０１９６】
対照（６倍のアッセイサンプル）として、標的細胞を、一方では、Ｋ−５６２及び培地と共にインキュベートし（低放出対照）、他方では、Ｋ５６２、培地及びＴｗｅｅｎ２０と共にインキュベートした（高放出対照）。ＮＫ活性が完全に阻止されたかどうかチェックするために、エフェクターをさらに非標識Ｋ−５６２及び標識Ｋ−５６２と共にインキュベートした。
【０１９７】
アッセイサンプルを３７℃、９８％大気湿度及び５％ＣＯ２において、４時間インキュベートした。この後に、細胞を沈降させるために、培養プレートを７００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離した。次に、細胞ペレットを旋回させることなく、各穴からの上清１００μｌをピペットでＯｐｔｉ−Ｐｌａｔｅシンチレーション製錠プレート（ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ ｔａｂｌｅｔｔｉｎｇ ｐｌａｔｅ）上に載せ、室温において一晩放置した。次の日に、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ４０シンチレーション液（Ｃａｎｂｅｒｒａ−Ｐａｃｋａｒｄ， Ｄｅｉｅｉｃｈ）１５０μｌを加えて、個々のアッセイサンプル中の崩壊数／分をシンチレーション計数器（Ｔｏｐｃｏｕｎｔ， Ｃａｎｂｅｒｒａ−Ｐａｃｋａｒｄ， Ｄｒｅｉｅｉｃｈ）において測定した。結論として、多重アッセイサンプルの平均値及び標準偏差を算定した。
【０１９８】
下記式を用いて、比溶菌を算出した：
比溶菌（％）＝１００ｘ（結果−低放出）ｘ（高放出−低放出）−１
Ｅ．腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の培養
ＨＰＶ１８及びＨＬＡ−Ａ２陽性を示す女性患者に存在する腫瘍のバイオプシーからのＴＩＬを、ＩＬ−２及びＩＬ−７各場合に１００Ｕ／ｍｌ並びにＤｙｎａｌビーズＴ細胞エキスパンダー（ｅｘｐａｎｄｅｒ）（Ｄｙｎａｌ， Ｈａｍｂｕｒｇ）０．１２５μｌ／穴を含有するＡＩＭ Ｖ培地（Ｇｉｂｃｏ−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）中でＴＩＬを培養することによって、増殖させた。これらのＴＩＬのＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４ペプチド エピトープの特異性をＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて直接試験した。
【０１９９】
Ｆ．結果
ＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質のいずれのＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドが腫瘍細胞によってプロセスされ、提示されるかを判定するために、ＨｅＬａ ＣＤ８０／ＨＬＡ−Ａ２ トランスフェクタント（ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔｓ）（Ｈ７．１−Ａ２）を用いるｉｎ ｖｉｔｒｏワクチン接種によってＴ細胞系を作製した。ＩＦＮ−γ ＥＬＩＳｐｏｔ分析（図１７の上部参照）において予測合成ペプチドＦＱＱＬＦＬＮＴＬに対する特異的反応が見られた。他の予測ペプチドと比較して、このペプチドはＨＬＡ−Ａ２に対する相対的に低い結合アフィニティを有する。これにも拘わらず、特異的Ｔ細胞が検出された。ＩＦＮ−γ 分泌を誘発しなかったＨＰＶ１６ Ｅ７２８−３６を対照ペプチドとして用いた。このことは、このペプチドがＨ７．１−Ａ２細胞によって提示されることを示唆する。
【０２００】
ＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４特異的Ｔ細胞が溶菌活性（ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有するかどうかを試験するために、合成ペプチドに対してＴ細胞系を調製した。このＴ細胞をクロム放出アッセイにおいて試験した。標的細胞として、自己ペプチド負荷ＢＬＣＬを用いた。エフェクター対標的比率３０：１において約２０％の比溶菌が観察された（図１７の下部参照）。対照ペプチドＨＰＶ１８ Ｅ７７−１５及びＨＰＶ１６ Ｅ６２８−３６に対しては、比溶菌が測定されなかった。
【０２０１】
ＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４ペプチドもイムノプロテアソーム（ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ）によって自然にプロセスされるかどうかをチェックするために、抗原負荷自己樹枝状細胞（ＤＣ）で刺激することによって、Ｔ細胞系を調製した。このＤＣに組換えＨＰＶ１８ Ｅ７タンパク質又は、総ＨＰＶ１８ Ｅ７を表すオーバーラップ２０マーペプチドから成るプール（図１８の上部：それぞれ、”Ｅ７タンパク質誘導”及び”Ｅ７ペプチドプール誘導”参照）を負荷させた。ＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４エピトープに対する誘導Ｔ細胞の特異性をＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて試験した。ＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４特異的Ｔ細胞が両Ｔ細胞系で検出された（図１８の上部参照）。このことは、該イムノプロテアソームが該エピトープをプロセスすることを意味する。
【０２０２】
ＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４エピトープの生物学的関連をＴＩＬ集団を用いて研究した。ＨＰＶ１８−及びＨＬＡ−Ａ２−陽性女性患者から得た腫瘍バイオプシーからＴＩＬを単離して、如何なる抗原特異的再刺激もなしに、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで直線的に増殖させた。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで、これらをＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４負荷Ｋ−Ａ２（刺激剤としての、ＨＬＡ−Ａ２でトランスフェクトされたＫ−５６２細胞）と対決させた。
【０２０３】
ＴＩＬ集団にはＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４に対する顕著な反応が存在するが、Ｒｕｄｏｌｆ ＭＰ等（２００１， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ７ （３ Ｓｕｐｐｌ）：ｐｐ７８８−７９５）が記載するＨＰＶ１８ Ｅ７７−１５エピトープに対するこのような反応は存在しない（図１８の下部参照）。該ペプチドＨＰＶ１８ Ｅ７７−１５はＨＬＡ−Ａ２に対して、２．５倍大きい結合アフィニティを有する。これらの結果は、ＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４特異的Ｔ細胞が腫瘍中に自然に存在することを暗示し、今までに見出されているペプチドプールの関連を強調する重要なことである。
【０２０４】
１９．実施例３〜１８の概要
実施例３〜１８で得られたデータを表３及び４に要約する。
【０２０５】
【化１６】
2004514449.tif 000014
【０２０６】
【化１７】
2004514449.tif 000015
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、異なるペプチドを提示するＪＡＷＳ細胞による、特異的ネズミＴ細胞の再刺激後の２つのＦＡＣＳｃａｎ実験の分析図を示す。それぞれのペプチドの名称はＸ軸に示す；ペプチドなしのＪＡＷＳ細胞はバッファーのみとインキュベートして、陰性対照として用いた。ＦＡＣＳｃａｎ実験におけるＩＦＮγ発現に基づいて反応性であると分類されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合をＹ軸にプロットする。
【図２】
図２は、ペプチドＰ３３をＲＭＡ細胞（標的細胞）に負荷した後の５１Ｃｒ放出実験の分析図を示す。該標的細胞を、ペプチドＰ１〜Ｐ４３によって刺激されたＴ細胞（エフェクター細胞）によって溶菌させた、用いた標的細胞に対して用いたエフェクター細胞の比率は２０である。バッファーのみとインキュベートされたＲＭＡ細胞（陰性対照）と、Ｐ３３ペプチドと共にインキュベートされたＲＭＡ細胞とをそれぞれＸ軸上に示す。標的細胞からの５１Ｃｒの放出によって判定して、特異的に溶菌された標的細胞の％をＹ軸にプロットする。これらの％値は、実施例４に記載した式を用いて算出した。
【図３】
図３は、異なるペプチドを提示するＬＫＫ細胞による、特異的ネズミＴ細胞の再刺激後の２つのＦＡＣＳｃａｎ実験の分析図を示す。それぞれのペプチドの名称はＸ軸に示す；ペプチドなしのＬＫＫ細胞はバッファーのみとインキュベートして、陰性対照として用いた。ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＦＮγ発現に基づいて反応性であると分類されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合をＹ軸にプロットする。
【図４】
図４は、異なるペプチドを提示するＬＫＫ細胞による、特異的ネズミＴ細胞の再刺激後の２つのＦＡＣＳｃａｎ実験の分析図を示す。それぞれのペプチドの名称はＸ軸に示す；ペプチドなしのＬＫＫ細胞はバッファーのみとインキュベートして、陰性対照として用いた。ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＦＮγ発現に基づいて反応性であると分類されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合をＹ軸にプロットする。
【図５】
図５は、異なるＨＰＶ１８ペプチドプールを提示するドナー同一ＢＬＣＬによる、特異的ヒトＴ細胞の再刺激後のＦＡＣＳｃａｎ実験の分析図を示す。それぞれのペプチドプールの名称はＸ軸に示す；“なし（ｗｉｔｈｏｕｔ）”は、バッファーのみとインキュベートされるＢＬＣＬ（陰性対照）を意味し、これに対して、Ｌ１及びＥ７は、それぞれ、ＨＰＶ１８ Ｌ１ペプチドプール及びＨＰＶ１８ Ｅ７ペプチドプールと共にインキュベートされるＢＬＣＬ（陽性対照）をそれぞれ意味する。ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＦＮγ発現に基づいて反応性であると分類されたＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合をＹ軸にプロットする。
【図６】
図６は、異なるＨＰＶ１８ペプチドプールを提示するドナー同一ＢＬＣＬによる、特異的ヒトＴ細胞の再刺激後のＦＡＣＳｃａｎ実験の分析図を示す。それぞれのペプチドプールの名称はＸ軸に示す；“なし”は、バッファーのみとインキュベートされるＢＬＣＬ（陰性対照）を意味し、これに対して、Ｌ１及びＥ７は、それぞれＨＰＶ１８ Ｌ１ペプチドプール及びＨＰＶ１８ Ｅ７ペプチドプールと共にインキュベートされるＢＬＣＬ（陽性対照）をそれぞれ意味する。ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＦＮγ発現に基づいて反応性であると分類されたＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合をＹ軸にプロットする。
【図７】
図７は、Ｑ９ペプチドを提示するドナー同一ＢＬＣＬによる、特異的ヒトＴ細胞の再刺激後のＦＡＣＳｃａｎ実験の分析図を示す。それぞれのペプチドの名称はＸ軸に示す；ＢＬＣＬは、バッファーのみとインキュベートされるＢＬＣＬ（陰性対照）を意味する。ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＦＮγ発現に基づいて反応性であると分類されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合をＹ軸にプロットする。
【図８】
図８は、異なるＨＰＶ１６ペプチドプール又はＰ３９ペプチドを提示するドナー同一ＢＬＣＬによる、特異的ヒトＴ細胞の再刺激後の２つのＦＡＣＳｃａｎ実験の分析図を示す。それぞれのペプチドプール（Ａ〜Ｈ、１〜７）又はそれぞれのペプチド（Ｐ３９）の名称はＸ軸に示す；“なし”は、バッファーのみとインキュベートされるＢＬＣＬ（陰性対照）を意味し、これに対して、Ｌ１は、ＨＰＶ１６ Ｌ１ペプチドプールと共にインキュベートされるＢＬＣＬ（陽性対照）を意味する。ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＦＮγ発現に基づいて反応性であるとして、したがってＴヘルパー１細胞（ＴＨ１）であるとして分類されたＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合を、図８の上部において、Ｙ軸にプロットする。ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＬ−４発現に基づいてＴヘルパー２細胞（ＴＨ２）であるとして分類されたＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合を、図８の下部において、Ｙ軸にプロットする。
【図９】
図９は、異なるＨＰＶ１６ペプチドプールを提示するドナー同一ＢＬＣＬによる、特異的ヒトＴ細胞の再刺激後のＦＡＣＳｃａｎ実験の分析図を示す。それぞれのペプチドプールの名称はＸ軸に示す；“なし”は、バッファーのみとインキュベートされるＢＬＣＬ（陰性対照）を意味し、これに対して、Ｌ１は、ＨＰＶ１６ Ｌ１ペプチドプールと共にインキュベートされるＢＬＣＬ（陽性対照）を意味する。ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＦＮγ発現に基づいて反応性であると分類されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合をＹ軸にプロットする。
【図１０】
図１０は、Ｐ３３ペプチドを提示するドナー同一ＢＬＣＬによる、特異的ヒトＴ細胞の再刺激後のＦＡＣＳｃａｎ実験の分析図を示す。ペプチドの名称はＸ軸に示す；“なし”は、バッファーのみとインキュベートされたＢＬＣＬ（陰性対照）を意味し、これに対して、Ｌ１は、ＨＰＶ１６ Ｌ１ペプチドプールと共にインキュベートされたＢＬＣＬ（陽性対照）を意味する。ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＦＮγ発現に基づいて反応性であると分類されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合をＹ軸にプロットする。
【図１１】
図１１は、異なるＨＰＶ１８ペプチドプールを提示するドナー同一ＢＬＣＬによる、特異的ヒトＴ細胞の再刺激後の２つのＦＡＣＳｃａｎ実験の分析図を示す。それぞれのペプチドプール（Ａ〜Ｈ、１〜７）の名称はＸ軸に示す；“なし”は、バッファーのみとインキュベートされたＢＬＣＬ（陰性対照）を意味し、これに対して、Ｌ１及びＥ７は、それぞれＨＰＶ１８ Ｌ１ペプチドプール及びＨＰＶ１８ Ｅ７ペプチドプールと共にインキュベートされたＢＬＣＬ（陽性対照）をそれぞれ意味する。ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＦＮγ発現に基づいて反応性であるとして、したがってＴヘルパー１細胞（ＴＨ１）であるとして分類されたＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合を、図１１の上部において、Ｙ軸にプロットする。Ｌ１及びＥ７の値を、異なるＹ軸目盛りを用いた別のグラフ（上部右）に、陰性対照と共に示す。ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＬ−４発現に基づいてＴヘルパー２細胞（ＴＨ２）であるとして分類されたＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合を、図１１の下部において、Ｙ軸にプロットする。
【図１２】
図１２は、異なるＨＰＶ１８ペプチド又はペプチドプールを提示するドナー同一ＢＬＣＬによる、特異的ヒトＴ細胞の再刺激後の４つのＦＡＣＳｃａｎ実験の分析図を示す。それぞれのペプチド（Ｑ３８、Ｑ３９、Ｑ４６及びＱ４７）の名称はＸ軸に示す；“なし”は、バッファーのみとインキュベートされたＢＬＣＬ（陰性対照）を意味し、これに対して、Ｌ１及びＥ７は、それぞれＨＰＶ１８ Ｌ１ペプチドプール及びＨＰＶ１８ Ｅ７ペプチドプールと共にインキュベートされたＢＬＣＬ（陽性対照）をそれぞれ意味する。各場合に、反応性Ｔ細胞の割合をＹ軸にプロットする。
図１２（上部左）は、ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＦＮγ発現に基づいて反応性であるとして、したがってＴヘルパー１細胞（ＴＨ１）であるとして分類されたＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合をプロットする。
図１２（上部右）は、ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＦＮγ発現に基づいて反応性細胞傷害性Ｔ細胞であるとして分類されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合をプロットする。
図１２（下部左）は、ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＬ−４発現に基づいてＴヘルパー２細胞（ＴＨ２）であるとして分類されたＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合をプロットする。
図１２（下部右）は、ＩＬ−４を発現するＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合をプロットする。
【図１３】
図１３は、異なるＨＰＶ１６ペプチドプールを提示するドナー同一ＢＬＣＬによる、特異的ヒトＴ細胞の再刺激後のＦＡＣＳｃａｎ実験の分析図を示す。それぞれのペプチドプール（Ａ〜Ｈ、１〜７）の名称はＸ軸に示す；“なし”は、バッファーのみとインキュベートされたＢＬＣＬ（陰性対照）を意味し、これに対して、Ｌ１及びＥ７は、それぞれＨＰＶ１６ Ｌ１ペプチドプール及びＨＰＶ１６ Ｅ７ペプチドプールと共にインキュベートされたＢＬＣＬ（陽性対照）をそれぞれ意味する。ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＦＮγ発現に基づいて反応性であるとして、したがって細胞傷害性Ｔ細胞であるとして分類されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合をＹ軸にプロットする。
【図１４】
図１４は、異なるＨＰＶ１８ペプチドプール又はペプチドを提示するドナー同一ＢＬＣＬによる、特異的ヒトＴ細胞の再刺激後の２つのＦＡＣＳｃａｎ実験の分析図を示す。それぞれのペプチドプール（Ａ〜Ｈ、１〜７）又はペプチドＱ３０の名称はＸ軸に示す；“なし”は、バッファーのみとインキュベートされたＢＬＣＬ（陰性対照）を意味し、これに対して、Ｌ１及びＥ７は、それぞれＨＰＶ１８ Ｌ１ペプチドプール及びＨＰＶ１８ Ｅ７ペプチドプールと共にインキュベートされたＢＬＣＬ（陽性対照）をそれぞれ意味する。ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＦＮγ発現に基づいて反応性であるとして、したがってＴヘルパー１細胞（ＴＨ１）であるとして分類されたＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合を、図１４の上部において、Ｙ軸にプロットする。ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＬ−４発現に基づいてＴヘルパー２細胞（ＴＨ２）であるとして分類されたＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合を、図１４の下部において、Ｙ軸にプロットする。
【図１５】
図１５は、異なるペプチドを提示するＲＭＡ細胞による、特異的ネズミＴ細胞の再刺激後の２つのＦＡＣＳｃａｎ実験の分析図を示す。それぞれのペプチドの名称はＸ軸に示す；ペプチドなしのＲＭＡ細胞はバッファーのみとインキュベートして、陰性対照として用いた。ＦＡＣＳｃａｎ実験においてＩＦＮγ発現に基づいて反応性であると分類されたＣＤ８陽性Ｔ細胞の割合をＹ軸にプロットする。
【図１６】
図１６は、それぞれペプチドＱ４３及びＱ４４を並びにそれぞれＱ４９をＲＭＡ細胞（上部）及びＬＫＫ細胞（下部）（標的細胞）に負荷した後の５１Ｃｒ放出実験の分析図を示す。該標的細胞を、ＨＰＶ１８ Ｌ１及びＨＰＶ１８ Ｅ７ペプチドプールによって刺激されたＴ細胞（エフェクター細胞）によって溶菌させた、用いた標的細胞に対して用いたエフェクター細胞の比率は２０である。細胞種類及びペプチドをＸ軸に示し、ペプチドなしの細胞は陰性対照として機能した。標的細胞からの５１Ｃｒの放出によって判定して、特異的に溶菌された標的細胞の％をＹ軸にプロットする。これらの％値は、実施例４に記載した式を用いて算出した。
【図１７】
図１７上部は、Ｈ７．１−Ａ２特異的Ｔ細胞系におけるＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４エピトープ反応性Ｔ細胞を示す。Ｈ７．１−Ａ２細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏワクチン接種によって、Ｔ細胞系を作製した。このＴ細胞系をＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、ペプチドＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４を負荷された自己ＰＢＭＣに対して試験した。Ｔｃｏは、非特異的Ｔ細胞を用いる陰性対照を意味し、これに対して、ＰＢＭＣ ｃｏは、ペプチドを負荷されなかったＰＢＭＣを用いる陰性対照を意味する。
図１７下部は、ＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４特異的Ｔ細胞の溶菌活性を示す。エピトープＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４に対するＴ細胞系を２人の健康な血液ドナーから調製して、細胞傷害性試験（５１クロム放出アッセイ）（エフェクター：標的細胞比率３０：１）においてペプチド−パルス処理（ｐｅｐｔｉｄｅ−ｐｕｌｓｅｄ）自己ＢＬＣＬの溶菌に関して試験した。ＢＬＣＬ ｃｏは、ペプチドでパルス処理されなかったＢＬＣＬの陰性対照を意味する。
【図１８】
図１８上部は、樹枝状細胞によるエピトープＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４の自然プロセシングを示す。ＨＰＶ１８ Ｅ７に対するＴ細胞系を、タンパク質負荷又はペプチドプール負荷自己樹枝状細胞によるｉｎ ｖｉｔｒｏワクチン接種によって作製した。エピトープ負荷樹枝状細胞（ＤＣ）によるＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４特異的Ｔ細胞の刺激をＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて測定した。Ｔ ｃｏは、非特異的Ｔ細胞を用いる陰性対照を意味し、これに対して、ＤＣ ｃｏは、ペプチドを負荷されなかったＤＣｓの陰性対照を意味する。
図１８下部は、腫瘍浸潤リンパ球の集団におけるＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４特異的Ｔ細胞の存在を示す。ＨＰＶ１８陽性及びＨＬＡ−Ａ２陽性の女性患者から得たＴＩＬをｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させて、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにおいて、ＨＰＶ１８ Ｅ７８６−９４エピトープとの反応性に関して試験した。Ｔ ｃｏは、非特異的Ｔ細胞を用いる陰性対照を意味し、これに対して、Ｋ−Ａ２は、ペプチドを負荷されなかったＫ−Ａ２細胞の陰性対照を意味する。
【図１】
2004514449.tif 000020
【図２】
2004514449.tif 000021
【図３】
2004514449.tif 000022
【図４】
2004514449.tif 000023
【図５】
2004514449.tif 000024
【図６】
2004514449.tif 000025
【図７】
2004514449.tif 000026
【図８】
2004514449.tif 000027
【図９】
2004514449.tif 000028
【図１０】
2004514449.tif 000029
【図１１】
2004514449.tif 000030
【図１２】
2004514449.tif 000031
【図１３】
2004514449.tif 000032
【図１４】
2004514449.tif 000033
【図１５】
2004514449.tif 000034
【図１６】
2004514449.tif 000035
【図１７】
2004514449.tif 000036
【図１８】
2004514449.tif 000037
【国際公開パンフレット】
2004514449.tif 000038
2004514449.tif 000039
2004514449.tif 000040
2004514449.tif 000041
2004514449.tif 000042
2004514449.tif 000043
2004514449.tif 000044
2004514449.tif 000045
2004514449.tif 000046
2004514449.tif 000047
2004514449.tif 000048
2004514449.tif 000049
2004514449.tif 000050
2004514449.tif 000051
2004514449.tif 000052
2004514449.tif 000053
2004514449.tif 000054
2004514449.tif 000055
2004514449.tif 000056
2004514449.tif 000057
2004514449.tif 000058
2004514449.tif 000059
2004514449.tif 000060
2004514449.tif 000061
2004514449.tif 000062
2004514449.tif 000063
2004514449.tif 000064
2004514449.tif 000065
2004514449.tif 000066
2004514449.tif 000067
2004514449.tif 000068
2004514449.tif 000069
2004514449.tif 000070
2004514449.tif 000071
2004514449.tif 000072
2004514449.tif 000073
2004514449.tif 000074
2004514449.tif 000075
2004514449.tif 000076
2004514449.tif 000077
2004514449.tif 000078
2004514449.tif 000079
2004514449.tif 000080
2004514449.tif 000081
2004514449.tif 000082
2004514449.tif 000083
2004514449.tif 000084
2004514449.tif 000085
2004514449.tif 000086
2004514449.tif 000087
2004514449.tif 000088
2004514449.tif 000089
2004514449.tif 000090
2004514449.tif 000091
2004514449.tif 000092
2004514449.tif 000093
2004514449.tif 000094
2004514449.tif 000095
2004514449.tif 000096
2004514449.tif 000097
2004514449.tif 000098
2004514449.tif 000099
2004514449.tif 000100
2004514449.tif 000101
2004514449.tif 000102
2004514449.tif 000103
2004514449.tif 000104
2004514449.tif 000105
2004514449.tif 000106
2004514449.tif 000107
2004514449.tif 000108
2004514449.tif 000109
2004514449.tif 000110
2004514449.tif 000111
2004514449.tif 000112
2004514449.tif 000113
2004514449.tif 000114
2004514449.tif 000115
2004514449.tif 000116
2004514449.tif 000117
2004514449.tif 000118
2004514449.tif 000119
2004514449.tif 000120
2004514449.tif 000121
2004514449.tif 000122
2004514449.tif 000123
2004514449.tif 000124
2004514449.tif 000125
2004514449.tif 000126
2004514449.tif 000127
2004514449.tif 000128
2004514449.tif 000129
2004514449.tif 000130
2004514449.tif 000131
2004514449.tif 000132
2004514449.tif 000133
2004514449.tif 000134
2004514449.tif 000135
2004514449.tif 000136
2004514449.tif 000137
2004514449.tif 000138
2004514449.tif 000139
2004514449.tif 000140
2004514449.tif 000141
2004514449.tif 000142
2004514449.tif 000143
2004514449.tif 000144
2004514449.tif 000145
2004514449.tif 000146
2004514449.tif 000147
2004514449.tif 000148
2004514449.tif 000149
2004514449.tif 000150
2004514449.tif 000151
2004514449.tif 000152
2004514449.tif 000153
2004514449.tif 000154
2004514449.tif 000155
2004514449.tif 000156
2004514449.tif 000157
2004514449.tif 000158
2004514449.tif 000159
2004514449.tif 000160
2004514449.tif 000161
2004514449.tif 000162
2004514449.tif 000163
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004514449.tif 000164
【国際調査報告】
2004514449.tif 000165
2004514449.tif 000166
2004514449.tif 000167
2004514449.tif 000168
2004514449.tif 000169
2004514449.tif 000170
2004514449.tif 000171
2004514449.tif 000172
2004514449.tif 000173
2004514449.tif 000174
2004514449.tif 000175