(57)【要約】所望の標的物質との不可逆共有結合のような強力な結合をこれらの物質が形成することを可能にする化学基で修飾することによって、所望の予め選択された標的物質（低分子；タンパク質、炭水化物、核酸等のような巨大分子；細胞；ウイルス粒子等）に対する増強された親和性を有する新規な化合物が提供される。これらの緊密な特異的結合の特質は抗体様の親和性によるものであり、従って新しい物質はＣＯＢＡＬＴ（共有結合抗体様トラップの頭字語化したもの）と呼ばれる。本発明は、標的種が選択され、次いで、合成化学的手法及び修飾によって、予め選択された標的種との選択的な共有結合を示す新規の物質（ＣＯＢＡＬＴ）が入手される。ＣＯＢＡＬＴの適用には、診断的、分析的、治療的、及び産業的な適用が含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子構造を特異的に結合させるための化合物であって、標的に対する選択性を有する化学的に修飾された反応性化合物を含み、化学的に修飾されていない出発化合物の親和定数の少なくとも２倍の増強された見かけの親和定数を有する化合物。
【請求項２】
前記化合物は、標的構造に対して選択的な親和性を有する抗体模倣体であり、標的分子構造と化学的に反応するよう化学的活性化によって修飾された請求項１の化合物。
【請求項３】
前記化合物は、標的分子構造と反応するよう化学的活性化によって修飾された、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）である請求項１又は２の化合物。
【請求項４】
前記化合物は、活性化された標的物質と反応する機能性モノマーを含むよう修飾された、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）である請求項１又は２の化合物。
【請求項５】
前記ＭＩＰは、標的物質と反応して共有結合をつくるために化学的に修飾され、前記化学的修飾は少なくとも一つの反応性官能基を含む請求項１〜４のいずれか一つの化合物。
【請求項６】
前記官能基は、イソシアネート及びイソチオシアネートのうちの少なくとも一つを含む請求項５の化合物。
【請求項７】
前記官能基は、ハロゲン部分がフルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨードであり得るアルファ−ハロメチルエーテル；ハロゲン部分がクロロ、ブロモ、もしくはヨードであり得るベータ−ハロエチルエーテル；及びハロゲン部分がフルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨードであり得るハロメチルアリールのうちの少なくとも一つを含む請求項５又は６の化合物。
【請求項８】
前記官能基は、２，５−ジケト−Ｎ−フェニルトリアゾリン、カルボン酸塩化物及び活性化されたカルボン酸のうちの少なくとも一つを含む請求項５〜７のいずれか一つの化合物。
【請求項９】
標的分子構造はステロイドである請求項３〜８のいずれか一つの化合物。
【請求項１０】
前記ステロイドはコレステロール又は胆汁酸である請求項９の化合物。
【請求項１１】
前記化合物はシクロデキストリンである請求項１又は２の化合物。
【請求項１２】
前記化合物はトリアジンである請求項１又は２の化合物。
【請求項１３】
前記化合物はペプチドである請求項１又は２の化合物。
【請求項１４】
前記ペプチドは環状ペプチド、直鎖状ペプチド、及び修飾型ペプチド、並びにそれらの誘導体のうちの少なくとも一つを含む請求項１３の化合物。
【請求項１５】
標的構造は有機リン化合物である請求項１〜５のいずれか一つの化合物。
【請求項１６】
前記化合物は前記有機リン化合物と反応する少なくとも一つの機能性モノマーを含む請求項１５の化合物。
【請求項１７】
前記化合物は前記有機リン化合物に特異的に結合する求核基を含む請求項１５又は１６の化合物。
【請求項１８】
前記求核基は、オキシム、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、フェノール、及び２−ヨードソ安息香酸のうちの少なくとも一つの誘導体である請求項１７の化合物。
【請求項１９】
前記化合物は、複数のボロン酸官能基を含む請求項１〜５のいずれか一つの化合物。
【請求項２０】
前記化合物は、複数のアルデヒド官能基を含む請求項１〜５のいずれか一つの化合物。
【請求項２１】
前記官能基は、炭水化物との特異的かつ緊密な結合を達成する請求項１９又は２０の化合物。
【請求項２２】
前記化合物は、標的分子構造と共有結合的に反応するよう化学的に修飾された抗体もしくはその誘導体である請求項１の化合物。
【請求項２３】
標的分子構造の活性部位とは別に、標的分子構造上の部位に結合しかつ特異的に反応する請求項１〜２２のいずれか一つの化合物。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一つの化合物の作製のため、標的としての分子構造との選択性及び化学反応に関してスクリーニングされる、化学反応性基を各々含有している化合物のコンビナトリアルライブラリー。
【請求項２５】
診断的適用、ゲノミック、プロテオミック、及びグリコミックのコンビナトリアルスクリーニングの適用のうちの少なくとも一つに使用する請求項１〜２３のいずれか一つの化合物。
【請求項２６】
前記コンビナトリアルスクリーニングは、薬物発見のためのコンビナトリアルスクリーニングを含む請求項２５の化合物。
【請求項２７】
化学兵器又は環境的な危険の環境的な検出、環境的な除去、及び化学兵器又は環境的な危険からの保護のうちの少なくとも一つに使用する請求項１〜２３のいずれか一つの化合物。
【請求項２８】
治療的化合物としての請求項１〜２３のいずれか一つの化合物の使用。
【請求項２９】
薬物又は生体外治療のための請求項１〜２３のいずれか一つの化合物の使用。
【請求項３０】
標的分子構造を特異的に結合させるための化合物であって、増強された見かけの親和定数を有する選択的な化学反応性化合物を含む化合物を作製する方法であって、
化学反応性基を含有している化合物のコンビナトリアルライブラリーを提供すること、
標的分子構造との選択的化学反応を有する化合物に関して前記コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすること、
前記コンビナトリアルライブラリーの少なくとも一つの前記化合物から標的分子構造を特異的に結合させるための化合物を作製すること、
を含む方法。
【請求項３１】
前記コンビナトリアルライブラリーの前記化合物は複数のモノマーを含み、標的分子構造を特異的に結合させるための化合物はポリマーである請求項３０の方法。
【請求項３２】
標的分子構造を特異的に結合させるための化合物はＭＩＰ（分子インプリントポリマー）である請求項３０又は３１の方法。
【請求項３３】
前記化合物はシクロデキストリンである請求項３０の方法。
【請求項３４】
前記化合物はトリアジンである請求項３０の方法。
【請求項３５】
前記化合物はペプチドである請求項３０の方法。
【請求項３６】
前記ペプチドは環状ペプチド、直鎖状ペプチド、及び修飾型ペプチド、並びにそれらの誘導体のうちの少なくとも一つを含む請求項３５の方法。
【請求項３７】
化合物は、標的分子構造と反応する少なくとも一つの官能基を特徴とする請求項３０〜３６のいずれか一つの方法。
【請求項３８】
標的分子構造を特異的に結合させるための化合物を作製する方法であって、
標的分子構造に結合するためのＭＩＰを調製すること、
標的分子構造への前記ＭＩＰの結合時に標的分子構造と共有結合を形成するために前記ＭＩＰの少なくとも一部を活性官能基に変換して、それによって標的分子構造を結合させるための化合物を形成すること
を含む方法。
【請求項３９】
前記ＭＩＰの調製は、
標的分子構造の少なくとも一つの官能基を選択すること、
前記ＭＩＰが前記少なくとも一つの官能基に結合するために相補的な官能基を調製すること、
前記相補的な官能基を含む複数のモノマーを重合して前記ＭＩＰであるポリマーを製造すること
をさらに含む請求項３８の方法。
【請求項４０】
前記ＭＩＰの調製は、
標的分子構造の少なくとも一つの官能基を選択すること、
前記標的分子構造の誘導体を機能性モノマーとして調製すること、
前記機能性モノマーを含む複数のモノマーを重合して前記ＭＩＰであるポリマーを製造すること、
をさらに含む請求項３８の方法。
【請求項４１】
前記ＭＩＰの調製は、
前記ポリマーの少なくとも一つの結合を加水分解して前記標的分子構造を放出すること、
をさらに含む請求項３９の方法。
【請求項４２】
標的分子構造は、ステロイド又は胆汁酸であり、標的分子構造の前記官能基はＲ−ＯＨであり、前記機能性モノマーは前記標的アルコールＲＯＨのエステル誘導体Ｒ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’又はカルバメート誘導体Ｒ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ’［Ｒ’基は、重合可能な官能基であるビニルを有する］のうちの少なくとも一つを含む請求項４０又は４１の方法。
【請求項４３】
前記ステロイドはコレステロールである請求項４２の方法。
【請求項４４】
前記胆汁酸は、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、又はリトコール酸のうちの少なくとも一つを含む請求項４２の方法。
【請求項４５】
前記活性官能基は、ヒドロキシル基又はアミノ基を含む標的分子構造と反応する酸塩化物Ｃｌ−Ｃ（＝Ｏ）−ポリマー官能基である請求項４２の方法。
【請求項４６】
前記活性官能基は、ヒドロキシル基又はアミノ基を含む標的分子構造と反応するイソシアネートＯ＝Ｃ＝Ｎ−ポリマー又はイソチオシアネートＳ＝Ｃ＝Ｎ−ポリマーである請求項４２の方法。
【請求項４７】
化学的に活性化された標的分子構造物質を特異的に結合させるための化合物を作製する方法であって、
標的分子構造に結合するためのＭＩＰを調製すること；及び活性化された標的分子構造への前記ＭＩＰの結合時に標的分子構造と共有結合を形成するために前記ＭＩＰの少なくとも一部を官能基に変換することを含む方法。
【請求項４８】
前記ＭＩＰの調製は、
活性化された標的分子構造の少なくとも一つの反応性官能基を選択すること、
重合されることのできる前記標的分子構造の誘導体（機能性モノマー）を調製すること、
前記機能性モノマーを含む複数のモノマーを重合して前記ＭＩＰであるポリマーを製造すること
をさらに含む請求項４７の方法。
【請求項４９】
前記ＭＩＰの調製は、
前記ポリマーの少なくとも一つの結合を加水分解して前記標的分子構造を放出し、前記活性化された標的分子構造と反応するためにＭＩＰ腔に少なくとも一つの官能基を残すこと
をさらに含む請求項４８の方法。
【請求項５０】
活性化された標的分子構造は有機リン化合物であり、前記機能性モノマーは４−ビニルベンズアルデヒドオキシムエステルのホスフェート又はホスホネートのうちの少なくとも一つを含む請求項４８又は４９の方法。
【請求項５１】
前記ＭＩＰの調製は、
前記ポリマーの少なくとも一つの結合を加水分解して標的分子構造の前記官能基を放出すること
をさらに含む請求項５０の方法。
【請求項５２】
標的分子構造は、コレステロール及び胆汁酸のうちの少なくとも一つを含み、標的分子構造の前記官能基はＲ−ＯＨであり、前記相補的な官能基は前記標的アルコールＲＯＨのエステル誘導体Ｒ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’又はカルバメート誘導体Ｒ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ’［Ｒ’基は、重合可能な官能基であるビニルを有する］のうちの少なくとも一つを含む請求項５０又は５１の方法。
【請求項５３】
前記活性官能基は、カルバメートポリマーのための酸塩化物Ｃｌ−Ｃ（＝Ｏ）−ポリマー官能基である請求項５２の方法。
【請求項５４】
前記胆汁酸は、デオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、又はリトコール酸のうちの少なくとも一つを含む請求項５２の方法。
【請求項５５】
前記シクロデキストリンはアルファ−、ベータ−、又はガンマ−シクロデキストリンである請求項１１の化合物。
【請求項５６】
前記シクロデキストリンは１個以上のヒドロキシル基を置換するための１個以上のアミノ基を含む請求項５５の化合物。
【請求項５７】
１個以上のヒドロキシル基又はアミノ基は、アミド結合又はエステル結合を介して、アリールカルボン酸基、アリールアルキルカルボン酸基のうちの少なくとも一つと直接連結されている請求項５５又は５６の化合物。
【請求項５８】
１個以上のヒドロキシル基又はアミノ基は、アリール基又はアリールメチル基の少なくとも一つと直接連結されており、アリール基は、フェニル基及び置換されたフェニル基、ピリジル基及び置換されたピリジル基、ナフチル基及び置換されたナフチル基を含む請求項５５〜５７のいずれか一つの化合物。
【請求項５９】
前記シクロデキストリンはアルファ−、ベータ−、又はガンマ−シクロデキストリンである請求項３３の化合物。
【請求項６０】
前記シクロデキストリンは１個以上のヒドロキシル基を置換するための１個以上のアミノ基を含む請求項５９の化合物。
【請求項６１】
１個以上のヒドロキシル基又はアミノ基は、アミド結合又はエステル結合を介して、アリールカルボン酸基、アリールアルキルカルボン酸基のうちの少なくとも一つと直接連結されている請求項５９又は６０の化合物。
【請求項６２】
１個以上のヒドロキシル基又はアミノ基は、アリール基又はアリールメチル基の少なくとも一つと直接連結されており、アリール基は、フェニル基及び置換されたフェニル基、ピリジル基及び置換されたピリジル基、ナフチル基及び置換されたナフチル基を含む請求項５９〜６１のいずれか一つの化合物。
【請求項６３】
前記トリアジンは、クロロ基のうちの１個以上がアルコール基、フェノール基、またはアミン基によって置換されている２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジン（塩化シアヌル）の誘導体である請求項１２の化合物。
【請求項６４】
前記トリアジンは、クロロ基のうちの１個以上がアルコール基、フェノール基、またはアミン基によって置換されている２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジン（塩化シアヌル）の誘導体である請求項３４の化合物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、所望の予め選択された標的物質（低分子；タンパク質、炭水化物、核酸等のような巨大分子；細胞；ウイルス粒子等）に対する抗体又は抗体様の親和性による標的との特異的結合を特徴とし、そしてＣＯＢＡＬＴが特異的に設計された標的物質との不可逆共有結合のような強力な特異的結合をこれらのＣＯＢＡＬＴが形成することを可能にする化学基を含有している、本発明においてＣＯＢＡＬＴ、又は共有結合抗体様トラッピングもしくはトラップと命名された化合物に関する。
【０００２】
発明の背景
抗体、特にモノクローナル抗体は、優れた選択性のため、イムノアッセイ診断薬及び治療薬のような多くの生物医学的及びその他の適用において、広範に使用されている。しかしながら、抗体は、合成化合物と比較すると、化学的修飾による最適化又は修飾の困難さ；低温で維持する必要；短い貯蔵寿命（熱及び微生物による分解を受けやすい）；生物学的汚染；高い製造コストを含む、多数の短所を有している。さらに、抗体は一般に免疫系を使用して作製されるため、使用される動物の遺伝学的制限が、結合部位可変性を制限する場合がある。この最後の制限は、ファージディスプレイ及びその他の抗体作製のための遺伝子工学的方法を使用することにより克服されうるが、この場合にも、あらゆる所望の標的材料に対する効果的な抗体を産生させることは必ずしも可能でない。極めて高い親和定数を有している抗体も存在するが、特定の所望の適用にとって必要な結合の程度を有していないものも存在する。これら及びその他の考慮の結果として、抗体模倣体（ｍｉｍｉｃｓ）を開発すべく相当の努力がなされた。しかしながら、現在までに作製された抗体模倣体は、限定された実用性を有している。特に、これらの抗体模倣体は、普遍的な適用可能性の欠如；不十分な選択性；低い親和定数のうちの一つ以上を欠点として有している。従って、改良された抗体模倣体の必要性が明白に存在しており、本発明は、生物医学的及びその他の分野への広い適用を有する、前記のように本明細書においてＣＯＢＡＬＴと呼ばれる抗体模倣体を提供することにより、それらの必要性を満たす。
【０００３】
生物学的認識、即ち選択的な相互作用を含んでおり、生命にとって不可欠である、自然界の無数の物質間の特異的な誘引的な相互作用は、総じて、可逆的な非共有結合性の相互作用に基づいている。ビオチンとアビジンとの間の「本質的に不可逆性」の非常に緊密な結合相互作用（Ｋａ〜１０１５）ですら、共有結合を含んでいない。しかしながら、多くの診断的、治療的、及びその他の適用にとって、所定の生物学的物質に対する抗体様の特異的認識を示し、正常な状況において共有結合的に、即ち本質的に不可逆的にその選択された物質と結合するであろう合成物質は、有利であろう。
【０００４】
背景技術は、（活性部位において共有結合を形成する限定された狭義の酵素阻害剤、又は抗体もしくは受容体の結合部位において共有結合を形成する活性化されたリガンドを超えた）特定の生物学的物質のための共有結合型の「トラップ」、「タグ」、又は「標識」の設計を可能にする一般的なアプローチを教示又は示唆していない。
【０００５】
発明の要約
本発明は、所望の予め選択された標的物質（低分子；タンパク質、炭水化物、核酸等のような巨大分子；細胞；ウイルス粒子等）に対する親和性を有し、所望の標的物質と不可逆共有結合のような強力な結合をこれらの物質が形成することを可能にする化学基を含有している多様な物質を提供することにより、背景技術の欠陥を解決する。これらの物質は、抗体又は抗体様の親和性による標的との緊密な特異的結合を特徴としているため、ＣＯＢＡＬＴ、又は共有結合抗体様トラッピングもしくはトラップと呼ばれる。本発明に係るこれらの物質は、好ましくは、所望の標的とＣＯＢＡＬＴ物質との間に特異的に共有結合が形成されるメカニズムを特色とすることから、共有結合が、所望の標的とＣＯＢＡＬＴ物質との間の結合を不可逆なものにし得るため、ＣＯＢＡＬＴの文字「Ｔ」は、「タギング」又は「タグ」を表すこともできる。
【０００６】
本発明は、場合により、そしてより好ましくは、（前記のような）標的種が選択され、次いで、合成化学的手法及び修飾によって、予め選択された標的種との選択的な共有結合を示す新規の物質（ＣＯＢＡＬＴ）がコンビナトリアルライブラリーより入手又は選択される方法を含む。ＣＯＢＡＬＴ物質自体は、場合により、標的物質と共有結合的に反応することができる化学反応性の物質のこれらのコンビナトリアルライブラリーより選択され得る、分子インプリントポリマー、シクロデキストリン、トリアジン、及びペプチド（これらに限定はされない）を含む、種々の構造の型によって分類され得る。分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）は、より詳細に後述されるように、典型的には標的分子の存在下で合成され、従ってその標的分子と特異的に結合するよう設計される。ペプチド誘導体は、環状ペプチド、直鎖状ペプチド、及び修飾型ペプチド、並びにそれらの誘導体のうちの少なくとも一つを含み得る。
【０００７】
本発明のＣＯＢＡＬＴ物質は、好ましくは、使用されるＣＯＢＡＬＴ物質のカテゴリー又は型に関わらず、高度に特異的であるよう、そして高度の特異性を持って標的物質と結合するよう設計される。ＣＯＢＡＬＴの使用には、診断的、分析的、治療的、及び産業的な適用が含まれる。
【０００８】
単一の仮説に限定されることは望まないが、ＣＯＢＡＬＴと標的物質との間の結合メカニズムは、以下のように起こり得る。初期の非共有結合性の複合体が、ＣＯＢＡＬＴと標的との間に迅速に形成されることが想像され；標的物質と異なる他の物質は、そのような複合体を形成しないか、又はＣＯＢＡＬＴ−標的物質複合体よりはるかに短い寿命を有する複合体（換言すると、それらの安定性ははるかに低いであろう）を形成すると予想され得る。複合体内の二成分、ＣＯＢＡＬＴ及び標的物質の配向は、二つの初期成分間の強力な（１個以上の）共有結合を有する新たな物質を生成させる化学反応が、迅速に起こり得るようなものである。ＣＯＢＡＬＴと標的物質以外の物質とによって形成された複合体は、たとえ幾らかの安定性を示したとしても、共有結合形成にとって必要な配向もしくは寿命を有していないか、又は反応速度が、ＣＯＢＡＬＴと所望の標的物質との間のものよりもはるかに低いと予想されよう。複合体という用語の使用は、ＣＯＢＡＬＴと所望の標的物質との間の複数個の複合体の可能性を排除するものではない。実際、本明細書に記載された適用のうちのいくつかの場合、多くの異なる複合体が形成され得るが、全体的な結果として、ＣＯＢＡＬＴは、その他の材料に比べて優先的な親和性を所望の標的物質に対して示し、所望の標的物質と優先的に化学反応すると予想される。
【０００９】
化学反応性ＣＯＢＡＬＴアプローチが、重要な治療的及びその他の適用を有し得る状況の例には、従来の非共有結合性結合剤と比較して増加した標的分子の結合が含まれる。不可逆化学反応は、最終的に、初期に結合した標的を本質的に全て選択的にタギング又はトラッピングすることができるが、従来の非共有結合では、平衡定数に到達した後は、さらなる標的分子がトラッピングされ得ない。例示的な可能性のある適用には、低濃度の標的分析物のアッセイ検出、又はより低用量のより効果的な薬物を可能にするＣＯＢＡＬＴのより効果的な治療的作用が含まれる。
【００１０】
本発明によると、増強された見かけの親和定数を有する選択的な化学反応性化合物を含む、ある分子構造を特異的に結合させるための化合物が提供される。好ましくは、化合物は、抗体模倣体である。場合により、そしてより好ましくは、化合物は、ある分子構造と共有結合的に反応するよう化学的活性化によって修飾された、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）である。
【００１１】
別法として、標的物質は化学反応性の物質であり、ＣＯＢＡＬＴは標的と選択的に反応するよう設計又は選択される。本発明の重要な実施態様は、ＤＦＰ、ソマン、サリン、ＶＸ等のような反応性有機リン化合物毒（ＯＰ剤）と共有結合的に反応するよう設計されたＭＩＰを含む。
【００１２】
本発明の一つの実施態様によると、好ましくはＭＩＰであるこのＣＯＢＡＬＴは、イソシアネート官能基又はイソチオシアネート官能基を含めることにより化学的に修飾される。別法として、そして好ましくは、ＭＩＰは、イソシアネート官能基又はイソチオシアネート官能基を含めることにより化学的に修飾され、かつ分子構造はステロイドである。より好ましくは、ステロイドは、コレステロール又は胆汁酸である。別法として、そして好ましくは、ＭＩＰは、有機リン化合物との特異的かつ緊密な結合のため、オキシム、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、フェノール、及び２−ヨードソ安息香酸等のうちの少なくとも一つのような求核基を含有している。別法として、そして好ましくは、ＭＩＰは、炭水化物との特異的かつ緊密な結合のため、２個以上のボロン酸又は２個以上のアルデヒド官能基を含有している。
【００１３】
ＣＯＢＡＬＴが含有し得るその他の任意の官能基には、好ましくはＭＩＰ実施態様の一部として、クロロメチルフェニル及び２，５−ジケト−Ｎ−フェニルトリアゾリン又はその他の任意のトリアジン関連官能基（これらに制限はされない）が含まれ；官能基には、ハロゲン部分がフルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨードであり得るアルファ−ハロメチルエーテル；ハロゲン部分がクロロ、ブロモ、もしくはヨードであり得るベータ−ハロエチルエーテル；及びハロゲン部分がフルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨードであり得るハロメチルアリール；又はカルボン酸塩化物もしくは活性化されたカルボン酸（例えば、４−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル等）のうちの少なくとも一つが含まれる。この官能基のリストは、包括的ではなく、適当な官能基の範囲を例示するためのものである。
【００１４】
本発明のもう一つの態様によると、ＣＯＢＡＬＴ化合物は、標的分子構造と共有結合的に反応するよう化学的に修飾されたシクロデキストリン誘導体である。本発明の一つの実施態様によると、好ましくはシクロデキストリンであり、より好ましくはアルファ−、ベータ−、又はガンマ−シクロデキストリンであるこのＣＯＢＡＬＴは、（ヒドロキシル基のうちの１個以上と置換された）１個以上のアミノ基を少なくとも含んでいる。より好ましくは、ヒドロキシル基及びアミノ基のうちの１個以上は、アミド結合又はエステル結合を介して、アリールカルボン酸基、アリールメチルカルボン酸（又はその他のアリールアルキルカルボン酸）基と直接連結されている。また、より好ましくは、ヒドロキシル基及びアミノ基のうちの１個以上は、アリール基又はアリールメチル基と直接連結されている。ここで、アリール基とは、フェニル基及び置換されたフェニル基、ピリジル基及び置換されたピリジル基、ナフチル基及び置換されたナフチル基をさすが、これらに制限はされない。
【００１５】
本発明のさらにもう一つの態様によると、ＣＯＢＡＬＴ化合物は、標的分子構造と共有結合的に反応するよう化学的に修飾されたトリアジン誘導体である。本発明の一つの実施態様によると、このＣＯＢＡＬＴは、好ましくはトリアジンであり、より好ましくはクロロ基のうちの１個以上がアルコール、フェノール、又は好ましくは例えばＲ−Ｘ  Ｌｉ，Ｖ．Ｄｏｗｄ，Ｄ．Ｊ．Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｓ．Ｊ．Ｂｕｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｒ．Ｌｏｗｅ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６，１９０−１９５及びその中の参照により記載されたようなアミン含有誘導体に置換されている２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジン（塩化シアヌル）の誘導体である。
【００１６】
本発明のさらにもう一つの態様によると、ＣＯＢＡＬＴ化合物は、標的分子構造と共有結合的に反応するよう化学的に修飾されたペプチド又はそれらの誘導体である。好ましくは、ペプチド誘導体は、環状ペプチド、直鎖状ペプチド、及び修飾型ペプチド、並びにそれらの誘導体のうちの少なくとも１つである。
【００１７】
本発明のさらにもう一つの態様によると、ＣＯＢＡＬＴ化合物は、標的分子構造と共有結合的に反応するよう化学的に修飾された抗体もしくは抗体断片又はそれらの誘導体である。
【００１８】
好ましくは、シクロデキストリン、トリアジン、ペプチド、又は抗体に対する化学的修飾は、１個以上のイソチオシアネート基の導入を含む。シクロデキストリン、トリアジン、ペプチド、又は抗体に対するその他の任意の化学的修飾には、クロロメチルフェニル及び２，５−ジケト−Ｎ−フェニルトリアゾリン又はその他のトリアジン関連官能基（これらに制限はされない）が含まれ；官能基には、ハロゲン部分がフルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨードであり得るアルファ−ハロメチルエーテル；ハロゲン部分がクロロ、ブロモ、もしくはヨードであり得るベータ−ハロエチルエーテル；及びハロゲン部分がフルオロ、クロロ、ブロモ、もしくはヨードであり得るハロメチルアリール；又はカルボン酸塩化物もしくは活性化されたカルボン酸（例えば、４−ニトロフェニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニルエステル等）のうちの少なくとも一つが含まれる。この修飾のリストは、包括的ではなく、適当な官能基の範囲を例示するためのものである。
【００１９】
別法として、そして好ましくは、シクロデキストリンに対する化学的修飾は、炭水化物との特異的かつ緊密な結合のための２個以上のボロン酸又は２個以上のアルデヒド官能基を含む。
【００２０】
本発明のもう一つの態様によると、本発明の化合物の作製のため、標的としての分子構造との選択性及び化学反応に関してスクリーニングされる、化学反応性基を含有している化合物のコンビナトリアルライブラリーが提供される。
【００２１】
本発明のさらにもう一つの態様によると、標的の従来の活性部位又はリガンド結合部位に制限されない標的分子上の任意の部位において特異的に反応する化合物が提供される。
【００２２】
以後、「抗体模倣体」という用語には、所定の標的構造に対する選択的な親和性を示すよう設計又は選択された、ＭＩＰもしくはトリアジン誘導体のような任意の合成物質、又はシクロデキストリンもしくはペプチドのような天然生成物の誘導体が含まれるが、これらに制限はされない。
【００２３】
図面の簡単な説明
以下、添付の図面を参照しつつ、例としてのみ、本発明を説明する。
図１は、ヒドロキシル含有標的物質、ＲＯＨの選択的な共有結合のための「化学反応性」分子インプリントポリマー（ＭＩＰに基づくＣＯＢＡＬＴ）の例示的な調製を示す概略的なフローチャートである。
図２は、従来のコレステロール結合アミノ含有ＭＩＰ（ＭＳ５０）の調製の概略図を示す。
図３は、２個のＭＩＰ、即ち非共有結合的に結合するＭＩＰ、及び共有結合的に結合するＭＩＰ（ＣＯＢＡＬＴ）の概略図を示す。
図４は、コレステロールに関する較正曲線を示す。
図５は、実施例３に関するスキャッチャードプロットを示す。
図６は、実施例３に関する結合等温プロットを示す。
図７は、ｃｒＭＩＰ−ＭＳ７１の調製に関する。
図８は、ＭＳ７１のＩＲスペクトル（最大のＮＣＯへの変換が達成された時点）を示す。
図９は、機能性モノマーＡを、大過剰の架橋剤、ポロジェン等により重合させてＭＩＰ、Ｂ（ＭＩＰ−Ｂ）を作製し、それを加水分解してホスホネートを除去し、ＤＦＰと選択的に共有結合的に反応してＤ（ＭＩＰ−Ｄ）を形成する求核基（Ｘ）を含有している相補的な腔をＭＩＰ−Ｃに残す、有毒有機リン化合物の結合のためのＭＩＰに基づくＣＯＢＡＬＴを開発するための全体的なアプローチを記載する。ＭＩＰ−Ｃの中の求核基Ｘは、モノマーの中の官能基Ｚとも、ＤＦＰとの反応後のＹとも異なることに注意されたい。放出されたＨＦを結合させるための塩基性基を含有しているもののようなその他の機能性モノマーの包含も実施された。ＭＩＰ−ＣのＤＦＰとの反応は、最初は、所定のＫａを有する平衡結合反応であり、その後、不可逆性の共有結合反応となり、ＭＩＰ−Ｄを与えることにも注意されたい。また、ＭＩＰ−Ｄの性質は、ホスホネートが、ジアルキルリン酸及びＭＩＰ−Ｃへと容易に加水分解され、触媒サイクルを表すようなものである。
図１０は、調製されたＤＦＰ結合ＭＩＰのために使用された合成された機能性モノマーの代表的な構造を示す。
図１１は、４−ビニルベンズアルデヒドオキシムホスフェート及びホスホネート機能性モノマー３、９、及び１０の調製に使用された合成スキームを示す。
図１２は、ＢＣｈｅ阻害率（％）をＤＰＦＰ濃度へと変換するための較正曲線を示す。
図１３は、ＤＣＰ濃度に関する較正曲線を示す。
図１４は、標的物質との共有結合反応のためのイソチオシアネートを有するシクロデキストリンに基づくコンビナトリアルライブラリーを使用した、極めて多様なＣＯＢＡＬＴを調製するために採られたアプローチを例示する。図中、Ｒ１、Ｒ２＝フェニル、置換されたフェニル、ナフチル、置換されたナフチル等；異なるシクロデキストリン誘導体（例えばジアミン等）を使用した付加的なＲ基の追加等により、このスキームを使用することにより調製されうる構造の可変性にはほとんど限界がない。
【００２４】
好ましい実施態様の説明
本発明は、所望の予め選択された標的物質（低分子；タンパク質、炭水化物、核酸等のような巨大分子；細胞；ウイルス粒子等）に対する親和性を有し、かつ所望の標的物質と、不可逆共有結合のような強力な結合をこれらの物質が形成することを可能にする化学基を含有している、前記のようにＣＯＢＡＬＴ、共有結合抗体様トラッピング又はトラップと呼ばれ得る多様な物質の発明である。本発明は、（前記のような）標的種が選択され、次いで、合成化学的手法及び修飾によって、予め選択された標的種との選択的な共有結合を示す新規の物質（ＣＯＢＡＬＴ）が入手されるメカニズムを含む。ＣＯＢＡＬＴの使用には、診断的、分析的、治療的、及び産業的な適用が含まれる。
【００２５】
単一の仮説に限定されることは望まないが、ＣＯＢＡＬＴと標的物質との間の結合メカニズムは、以下のように起こり得る。初期の非共有結合性の複合体が、ＣＯＢＡＬＴと標的との間に迅速に形成されることが想像され；標的物質と異なる他の物質は、そのような複合体を形成しないか、又はＣＯＢＡＬＴ−標的物質複合体よりはるかに短い寿命を有する複合体（換言すると、それらの安定性ははるかに低いであろう）を形成すると予想され得る。複合体内の二成分、ＣＯＢＡＬＴ及び標的物質の配向は、二つの初期成分間の強力な（１個以上の）共有結合を有する新たな物質を生成させる化学反応が、迅速に起こり得るようなものである。ＣＯＢＡＬＴと標的物質以外の物質とによって形成された複合体は、たとえ幾らかの安定性を示したとしても、共有結合形成にとって必要な配向もしくは寿命を有していないか、又は反応速度が、ＣＯＢＡＬＴと所望の標的物質との間のものよりもはるかに低いと予想されよう。複合体という用語の使用は、ＣＯＢＡＬＴと所望の標的物質との間の複数個の複合体の可能性を排除するものではない。実際、本明細書に記載された適用のうちのいくつかの場合、多くの異なる複合体が形成され得るが、全体的な結果として、ＣＯＢＡＬＴは、その他の材料に比べて優先的な親和性を所望の標的物質に対して示し、所望の標的物質と優先的に化学反応すると予想される。
【００２６】
化学反応性ＣＯＢＡＬＴアプローチが、重要な治療的及びその他の適用を有し得る状況の例には、従来の非共有結合性結合剤と比較して増加した標的分子の結合が含まれる。不可逆化学反応は、最終的に、初期に結合した標的を全てトラッピングすることができるが、従来の非共有結合では、平衡定数に到達した後は、さらなる標的分子がトラッピングされ得ない。例示的な可能性のある適用には、低濃度の標的分析物のアッセイ検出、又はより低用量のより効果的な薬物を可能にするＣＯＢＡＬＴのより効果的な治療的作用が含まれる。
【００２７】
リガンドの可逆性の結合の後に、受容体とリガンドとの間の共有結合形成化学反応が起こる、化学反応性結合部位という概念の一つの利点を例示するため、分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）を用いた例が考慮され得る。分子インプリントポリマーという主題は、広範囲に検討されており（例えば、Ｇ．Ｗｕｌｆｆ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９５，３４，１８１２−１８３２；Ａ．Ｇ．Ｍａｙｙｅｓ  ａｎｄ  Ｋ．Ｍｏｓｂａｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，１６，３２１−３３２；Ｅ．Ｎ．Ｖｕｌｆｓｏｎ，Ｃ．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  Ｃｈｅｍ．Ｂｒｉｔ．１９９７，３３，２３−２６；Ｋ．Ｈａｕｐｔ  ａｎｄ  Ｋ．Ｍｏｓｂａｃｈ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８，１６，４６８−４７５；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｉｏｎｉｃ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７０３；Ｒ．Ａ．Ｂａｒｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍ．Ｍａｅｄａ編；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，１９９８）、この題目に関する多数の特許が発行されている［例えば、米国特許第４１２７７３０号（Ｗｕｌｆｆ，Ｇ．，Ｓａｒｈａｎ  Ａ．）；米国特許第５１１０８３３号（Ｍｏｓｂａｃｈ．Ｋ．）；米国特許第５６３０９７８号（Ｄｏｍｂ，Ａ．）；米国特許第５５８７２７３号（Ｙａｎ，Ｍ．ら）；米国特許第５８７２１９８号（Ｍｏｓｂａｃｈ，Ｋ．ら）］。これらの背景技術参照は、全て、あたかも完全に本明細書に記述されているかのごとく、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２８】
本例のため、ＭＩＰがテンプレート分子Ｘの存在下で合成されたものであり；ＭＩＰが、１０−５という（ＫＤとして与えられた）親和性でリガンドＸと結合する場合には、１０−５Ｍよりはるかに低いＸ濃度、例えば１０−７Ｍでは、検出可能な量のＸの結合が本質的に全く測定され得ないと仮定する；このＭＩＰに基づくセンサーは、そのような低レベルの分析物Ｘを検出しないと予想されよう。
【００２９】
複合体ＭＩＰ．Ｘを与えるＭＩＰによるＸの可逆性の（比較的弱い）結合の後に、ＸとＭＩＰとの間に共有結合形成反応が起こる場合には、不可逆的に形成されたＭＩＰ−Ｘの濃度が、複合体ＭＩＰ．Ｘの平衡濃度よりはるかに高い値にまで次第に上昇するため、このＭＩＰ（化学的に活性化されたＭＩＰ−ＣＯＢＡＬＴ）は、含まれている相対速度定数に依って、Ｘを検出することができるであろう。
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【００３０】
ＭＩＰの場合、系は、不可逆性酵素阻害剤及び抗体アフィニティー標識試薬と多少類似している。認めうる程度にＸと異なる物質は、たとえＭＩＰ腔に進入したとしても、反応にとって必要な配向を有していないであろうため（立体化学的又は「空間時間的」［Ｋｈａｎｊｉｎ  ＮＡ，Ｓｎｙｄｅｒ  ＪＰ，Ｍｅｎｇｅｒ  ＦＭ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１（５０）：１１８３１−１１８４６（１９９９）］要件が満たされない）、ＭＩＰ腔内で効率的に反応しない傾向を有するであろうことに注意されたい。「抗体模倣体」、化学反応性「受容体」、又はＣＯＢＡＬＴの化学反応性基の正確な性質は、ＭＩＰに基づくものであっても、ペプチドに基づくものであっても、トリアジンに基づくものであっても、シクロデキストリンに基づくものであっても、結合させるべき物質の必要条件及び性質に依存するであろう。提示された化学反応は例示的なものであり；その他の反応は、当業者にとって明白であり、共有結合が形成されるその他の反応に関する豊富な文献（これに制限はされない）より選択され得る。実施され得る化学反応の種類の様々な例示的な例は、アフィニティ標識、バイオコンジュゲート化学、並びに酵素活性部位及び受容体結合部位の標識反応に関する文献中に見い出され得る。
【００３１】
「増強された見かけの親和定数」という用語は、従来の非共有結合性結合物質より多くの標的物質を結合させるＣＯＢＡＬＴの能力を記載するために本明細書において使用される。親和定数又は結合定数は平衡系に限定され、不可逆性阻害剤の使用は平衡に到達することを技術的に可能にしないため、この定義は、古典的な平衡系からの一般化である。しかしながら、その定義は、特定の標的物質の改良された吸着（ｓｅｑｕｅｓｔｅｒｉｎｇ）の量的推定を行うことを可能にする。従って、従来のＭＩＰが２４時間後又は４８時間後に標的物質の所定の画分を結合させたことが決定される場合、この平衡系に関する平衡結合定数が決定されうる。化学反応性ＭＩＰ又はＣＯＢＡＬＴが、類似した時間が経過した後に、標的物質の増加した画分を結合させたことが決定された場合には、たとえＣＯＢＡＬＴが動的な系であり、「増強された見かけの親和性定数」が経時的に変動するとしても、この増加した画分が、「増強された見かけの親和性」と呼ばれ得る。
【００３２】
ＣＯＢＡＬＴには、実験室で合成された物質の多くの異なるクラスが含まれ、化学的に修飾されたモノクローナル抗体も含まれ得る。後者の場合には、適当なハプテンに対する抗体が誘発され、次いで、その抗体が、それをＣＯＢＡＬＴへ（例えば、アミンをイソチオシアネートへ；チロシンをｏ−キノンへ；チオールをクロロメチルチオエーテルへ、等）変換するために化学的に「活性化される」。抗体に基づくＣＯＢＡＬＴは、所望の標的物質と複合体化し、続いて共有結合的かつ不可逆的に結合するであろう。
【００３３】
ＣＯＢＡＬＴの作製に適している多くの物質には、（ｉ）文献中に報告されている従来の様式のうちの一つで調製され、次いで標的物質と特異的に結合し、次いで反応し、共有結合を形成する「活性化されたＭＩＰ」、即ちＣＯＢＡＬＴへと化学的に変換された分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）；（ｉｉ）ペプチドが特異的な標的物質と結合するのみならず、その物質と共有結合的に反応するよう、イソチオシアネート基のような反応性官能基を含有するよう修飾されたペプチド、例えば環状ペプチド；（ｉｉｉ）シクロデキストリンのような「プラットフォーム」分子のペプチド誘導体（ペプチド又はシクロデキストリンが、所望の標的物質と特異的に結合し、共有結合的に反応するよう化学的に活性化されている）；（ｉｖ）やはり、所定の標的物質に対する親和性を有し、それと化学的に反応するトリアジン誘導体のような非ペプチド物質；（ｖ）シクロデキストリンのような分子のトリアジン誘導体のような非ペプチド誘導体（トリアジン誘導体又はシクロデキストリンのいずれかが、所望の標的物質と特異的に結合し共有結合的に反応するよう化学的に活性化されている（又は、両方が活性化されている））が含まれるが、これらに制限はされない。標的物質は、いかなる材料のクラスにも制限されず、ステロイド、糖、脂質のような低分子；タンパク質、炭水化物、及び核酸のような巨大分子；細胞表面物質及び受容体；並びに生物医学的に重要なその他の分子を含むが、これらに制限はされない。本発明は、特に、薬物としてのＣＯＢＡＬＴの使用、並びに検出及び分離の適用のためのＣＯＢＡＬＴの使用に関する。
【００３４】
ＣＯＢＡＬＴの作製は、非制限的な例示的な例としてのみ与えられる以下の三つのアプローチ（これらに制限はされない）を含み得る。
ｉ．標的物質に対する選択性を有する化合物（例えばＭＩＰ）を作製し、次いで、標的分子が化合物と接触した場合に共有結合反応が起こるよう、化合物上の適当な特定の位置に化学反応性官能基を導入することにより、化合物を「活性化する」こと。又は、化学兵器の場合のように、標的物質が反応性官能基、例えばエステル、エポキシド、ジスルフィド等、又はフルオロホスフェートもしくはフルオロホスフォネートを有する場合、ＭＩＰ又はその他のＣＯＢＡＬＴは、場合により、標的と反応する適当な官能基が存在するよう調製されてもよい。
ｉｉ．標的と共有結合的に反応するよう、標的材料に対して選択的であることが既知の物質を化学的に修飾すること；この物質は、標的物質上の多数の異なる部位において反応してもよい。
ｉｉｉ．選択性及び化学反応性の両方のために設計された、関連しているか又は異なるＣＯＢＡＬＴのコンビナトリアルライブラリーを作製すること；次いで、これらは、標的物質を用いて最適な性能に関してスクリーニングされる。
【００３５】
さらに、免疫系によって産生された抗体における改良された結合の進化に似た様式で、ＣＯＢＡＬＴを、さらに「進化」させること、即ち、化学的に変化させ、所定の所望の標的材料に対する改良された結合性かつ反応性の物質を入手するためにさらに選択することが可能である。
【００３６】
前記の説明において、ＣＯＢＡＬＴは、標的物質との共有結合形成のための反応性基を１個有するものとして記載されたが、後に例示されるように、２個以上の活性化された官能基が各ＣＯＢＡＬＴ上に存在してもよい。
【００３７】
極めて多様な適当な官能基が、（ＭＩＰ、シクロデキストリン誘導体等のような）物質をＣＯＢＡＬＴへと変換するために取り込まれうる。以下に挙げられた例は、例示的なものであり、クラス、数、又は例を制限するためのものではない。
【表１】
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【００３８】
ＭＩＰの第一例の一つにおいてボロン酸が使用されたが、炭水化物、糖、糖脂質等のより緊密な結合は、２個以上のボロン酸誘導体を使用して達成され得る。同様に、ジオールとの結合のためのＭＩＰにおいてアセタール及びケタールが使用されたが、本発明の場合のような２個以上のアルデヒドの使用は、報告されていない。
【００３９】
従来、共有結合形成反応の報告例は多数存在しているが、これらの例は全て本発明とは異なる。化学的に活性化されたリガンドが、酵素阻害剤（いくつかの不可逆性阻害剤は、酵素活性部位残基と共有結合を形成する；「自殺」阻害剤；等）、並びに受容体及び抗体のための特異的標識剤として使用されている（後二者はしばしばアフィニティ標識アプローチと言われる）。これらの研究における目標は、常に、標識されたアミノ酸、結合部位の構造及び位相等に関する情報を得ることであったが、不可逆性酵素阻害剤のうちのいくつかは、重要な薬物（例えば、オーリスタット）である。
【００４０】
本発明は、本発明の重要かつ主要な態様において、標的物質上の任意の部位が、化学反応性増強の設計のための標的として利用可能であるという点で、上記の例とは区別され得る。これは、免疫系のアプローチに似ている：例えば酵素に対して誘発された抗体は、酵素の表面上の任意の点において結合することができ、特徴決定された場合、酵素活性部位（これに制限はされない）を含む、酵素上の所定の部位に特異的であることが見出される。従って、本発明の化学反応性の共有結合性の化合物も、演繹的なランダムな部位選択性を有する。従って、本発明は、上記のアプローチの全てにおいて必須の必要条件である、既知のもしくは明確なリガンド結合部位、又は任意のリガンド結合部位の利用可能性に全く依存しない。
【００４１】
ＣＯＢＡＬＴアプローチは、所望の結合性かつ共有結合形成性の反応（標的物質上の任意の部位において反応し得るもの）が起こる、イソチオシアネートのような化学反応性基を有する実現可能な構造が、設計又は発見されることを可能にする。本発明に係るそのような化合物の設計又は発見は、効果的なバインダーを発見する確率を改良するため、標的構造に関して入手可能な任意の知識を活用しうるが、本発明のアプローチは、主として、そして好ましくは、免疫系の抗体と同様に、多数の多様な結合構造候補の使用に依存した発見過程である。
【００４２】
さらに、本発明に関連した系（分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）、シクロデキストリン、ペプチド、トリアジン等に基づくＣＯＢＡＬＴ）は、以前には文献中に開示されていない。酵素との共有結合を形成するペプチド誘導体に関する参照が存在するが、これらは、前述の型の酵素阻害剤である。選択的結合のためのトリアジン誘導体が開発されているが、これらは、平衡、非共有結合性結合に基づいている［例えば、「Ｄｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｍｉｍｅｔｉｃ．」Ｒ−Ｘ  Ｌｉ，Ｖ．Ｄｏｗｄ，Ｄ．Ｊ．Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｓ．Ｊ．Ｂｕｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｃ．Ｒ．Ｌｏｗｅ（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１６，１９０−１９５］。
【００４３】
実施例１
コレステロール結合ＭＩＰ及びコレステロール結合ＭＩＰに基づくＣＯＢＡＬＴ
胆汁酸結合、及び胆汁酸結合ＭＩＰに基づくＣＯＢＡＬＴ
この実施例は、コレステロール及び胆汁酸の結合のためのＣＯＢＡＬＴの設計及び実施態様に関する。
【００４４】
身体からの効率的な特異的な排除がアテローム性動脈硬化症における重要な治療的進歩を表すコレステロール、及び腸管内菌叢に存在する細菌によって産生された有毒胆汁酸であるデオキシコール酸（ＤＣＡ）は、重要な適用である。図１は、特異的ＣＯＢＡＬＴの作製のためのアプローチの概略を示している。
【００４５】
図１に示されるように、ヒドロキシルを含有しているコレステロール標的及びＤＣＡ標的はＲ−ＯＨにより表される。標的アルコールＲＯＨのエステル誘導体Ｒ−Ｏ−ＣＯ−Ｒ’又はカルバメート誘導体Ｒ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−ＮＨ−Ｒ’［Ｒ’基は、スチレン、メタクリリル（ｍｅｔｈａｃｒｙｌｙｌ）等のような重合可能な官能基であるビニルを有する］が調製される。次いで、エステル又はカルバメートは、従来の方式［Ｇ．Ｗｕｌｆｆ  ａｎｄ  Ａ．Ｓａｒｈａｎ  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１１，３４１−（１９７２）；Ｇ．Ｗｕｌｆｆ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３４，１８１２−１８３２（１９９５）；Ｇ．Ｗｕｌｆｆ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇ．３６，１９６２−１９６４（１９９７）］で、大過剰の架橋剤により重合させられ、Ｒ−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−官能基の多くの「埋め込まれた」コピーを含有している高度に架橋されたポリマーを与える。次いで、ポリマーは、エステル結合又はカルバメート結合が本質的に全て加水分解されるよう化学的に（例えばＭｅＯＨ／ＫＯＨ／Ｈ２Ｏ溶液）処理され、Ｒ−ＯＨインプリント分子を放出し、カルボキシレート基（エステル誘導体の場合）又はアミノ基（カルバメート誘導体の場合）を含有している選択的な腔を作製する。典型的には、「テンプレート」基Ｒ−ＯＨのおよそ８０〜９５％が、このようにして除去される。
【００４６】
より具体的には、示されるように、図１の上部は、プリント又はテンプレート分子ＲＯＨの加水分解による除去の後に、ＲＯＨと相補的なカルボン酸含有腔を与えるために、ＲＯＨのエステル誘導体の重合を利用しており、その腔は、工程ｅの共有結合生成物を形成させるために酸塩化物へと活性化される。下部は、ＲＯＨの除去の後に、相補的なアミン含有腔を与えるために、ＲＯＨのカルバメート誘導体の重合を例示しており、その腔は、工程ｉの共有結合生成物を形成させるためにイソシアネート（又はイソチオシアネート、ここには例示されていない）へと活性化される。工程は全て、ＭＩＰ技術においてルーチンに使用されているものである：工程ａ、ＲＯＨのメタクリル酸エステルの合成（４−ビニルベンゼンイソシアネートからのカルバメートの合成は例示されていない）；工程ｂ及びｆ、エステル又はカルバメートが、ＡＩＢＮ及び熱（又は照射）のような開始剤を使用して、大過剰の架橋剤及びポロジェン（ｐｏｒｏｇｅｎ）（孔形成溶媒）により重合させられる；工程ｃ及びｇ、固体のポリマーが、破砕され、篩過され、全てのエステル結合及びカルバメート結合を加水分解しＲＯＨを除去するための試薬により処理される；工程ｄ、酸塩化物ＭＩＰに基づくＣＯＢＡＬＴが、ＳＯＣｌ２又はＣＯＣｌ２により処理することにより調製され得る；工程ｈ、イソシアネート（又はイソチオシアネート）ＭＩＰに基づくＣＯＢＡＬＴが、ホスゲンＣＯＣｌ２（又はチオホスゲン、ＣＳＣｌ２）との反応により調製され得る。
【００４７】
得られたＭＩＰは、従来の結合剤として直接使用されるか、又は特定の化学反応を使用した化学的修飾もしくは「活性化」により、ＣＯＢＡＬＴへと変換され得る。（エステル誘導体より派生した）カルボキシレートポリマーは、化学的に酸塩化物Ｃｌ−Ｃ（＝Ｏ）−ポリマーへと変換され、（カルバメート誘導体より派生した）アミノポリマーは、イソシアネートＯ＝Ｃ＝Ｎ−ポリマー又はイソチオシアネートＳ＝Ｃ＝Ｎ−ポリマーへと変換される。異なる反応性官能基は、様々な反応性及び配向及び標的分子からの距離を有するため、多くのＭＩＰに基づくＣＯＢＡＬＴのファミリーを調製し、最適な性能を有する材料を見い出すために試験することが可能である。
【００４８】
得られたＭＩＰに基づくＣＯＢＡＬＴに対して実施された実験は、Ｒ−ＯＨとＣＯＢＡＬＴとの見かけの平衡結合定数が、親ＭＩＰよりもはるかに高く；Ｒ−ＯＨの濃度を減少させ、インキュベーション時間を増加させた場合、この差が特に明瞭であることを示している。
【００４９】
共有結合型（ＣＯＢＡＬＴ）及び非共有結合型の２個のＭＩＰを、後者からＲ−ＯＨを解離させる条件の下で処理した場合、前者はＲ−ＯＨと結合したままである。
【００５０】
実施例２
ステロイドＭＩＰ
化学反応性分子インプリントポリマー（ＭＩＰ）を使用したＣＯＢＡＬＴアプローチを例示する。コレステリル４−ビニルフェニルカルバメートがテンプレートモノマーとして使用され；コレステリルメタクリレートは、疎水性結合及び認識を作製するために添加された機能性モノマーであった。加水分解によりポリマー（ＭＳ４０、ＭＳ４１）からコレステロールを切断すると、ＣＯ２が失われると共に、水素結合によってコレステロールと相互作用することができるアミノフェニル基を保持している非共有結合性（又は非反応性）の認識部位を有する従来のＭＩＰ（ＭＳ５０）が形成された。ホスゲン及びチオホスゲンそれぞれによるポリマーの化学的修飾によって、アミノ基を反応性のイソシアネート（ＭＳ７１）基及びイソチオシアネート（ＭＳ８０）基へとそれぞれ転換した（いずれも、コレステロールを共有結合的に結合させる）。
【００５１】
図２は、従来のコレステロール結合アミノ含有ＭＩＰ（ＭＳ５０）の調製の概略図を示す。別の実験において、コレステリルメタクリレートのポリマーが、加水分解に対して完全に抵抗性である（ＭＳ５０を得るために使用された比較的強烈な加水分解条件の下で、コレステロールを放出しない）ことが示され；従って、コレステリルメタクリレートを、親油性認識腔を得るための機能性モノマーとして使用した。
【００５２】
図３は、２個のＭＩＰ、非共有結合的に結合するもの、及び共有結合的に結合するもの（後者がＣＯＢＡＬＴである）の概略図を示す。イソシアネートＭＩＰ（ＭＳ７１）が例示されている；チオホスゲンを使用した類似の反応は、イソチオシアネートＭＩＰ（ＭＳ８０）を与えた。
【化１】
2004525973.tif 000004
【００５３】
ヒドロキノン約０．０１ｇを含有しているジクロロメタン（１０ｍｌ）中のコレステロール（１．０ｇ、２．６０ｍｍｏｌ）及びピリジン（０．２５ｍｌ、３．１２ｍｍｏｌ）の混合物へ、０℃で滴下にてメタクリロイルクロリド（０．３ｍｌ、３．１２ｍｍｏｌ）を添加した。その混合物を４時間ＲＴで撹拌し、分液漏斗へ移し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液（２×１０ｍｌ）により洗浄し、続いて塩水（２×１０ｍｌ）により洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで脱水し、溶媒を真空で蒸発させた。残さ（１．１５ｇ、９７％）を、約０．０５ｇのヒドロキノンを使用して、熱酢酸エチルより再結晶化させたところ、コレステリルメタクリレート（１）（１．０ｇ、８４％）の長い針状物質が得られた（融点９８−１００℃）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）０．６３（ｓ，３Ｈ，１８−ＣＨ３），０．８３（ｄ，６Ｈ，２７−ＣＨ３，Ｊ＝７．７Ｈｚ），０．８６（ｄ，３Ｈ，２１−ＣＨ３，Ｊ＝６．９Ｈｚ），１．０２（ｓ，３Ｈ，１９−ＣＨ３），０．８８−２．０５（ｂｒ，ステロイド核），１．８９（ｓ，３Ｈ，アリルＣＨ３），２．３８（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，Ｃ７−Ｈ２）４．６６（ｍ，１Ｈ，３α−Ｈ），５．４０（ｍ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ），５．４８（ｓ，１Ｈ，アリルＣＨ３に対しａｎｔｉの＝ＣＨ），６．３０（ｓ，１Ｈ，アリルＣＨ３に対しｓｙｎの＝ＣＨ）。
【化２】
2004525973.tif 000005
【００５４】
新鮮に蒸留された４−ビニルベンゾイルクロリド（１．２ｇ、７．２ｍｍｏｌ）をヒドロキノン０．１ｇを含有している乾燥アセトン（２５ｍｌ）に溶解させ、０℃へと冷却した。アジ化ナトリウム（４．６８ｇ、７２ｍｍｏｌ）の冷水溶液（２０ｍｌ）を、酸塩化物溶液へと徐々に添加した。反応混合物を２時間ＲＴで撹拌し、ジクロロメタン（３×２０ｍｌ）により抽出し、溶媒を蒸発させた。ひとつまみのヒドロキノンを添加することにより、酢酸エチルにより粗生成物を再結晶化させた（収量１．０７ｇ、８６％）（融点１６７〜１６９℃）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）５．４０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，ビニルＣ２−Ｈ，ｃｉｓ），５．８４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１９．５Ｈｚ，ビニルＣ２−Ｈ，ｔｒａｎｓ），６．６７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１及びＪ２＝１９．５及び１１．７  Ｈｚ，ビニルＣ１−Ｈ），７．４４（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，芳香環、ビニル基に対しオルト），８．００（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝９．７Ｈｚ，芳香環、アシルアジド基に対しオルト）。
【化３】
2004525973.tif 000006
【００５５】
８０℃の油浴で予熱されたヒドロキノン約０．０１ｇを含有しているベンゼン（ＣａＣｌ２で一夜乾燥）２５ｍｌ中のコレステロール（１．０ｇ、２．６０ｍｍｏｌ）の透明な溶液へ、固体４−ビニルベンゾイルアジド（０．４９５ｇ、２．８６ｍｍｏｌ）を、５回に分けて、スパチュラにより添加した。Ｎ２ガスの遅い放散が観察され、それは６時間後に静まった。透明な反応混合物をＲＴへと冷却し（この段階で固体が沈殿し始めた）、溶媒を蒸発させた（ロータリーエバポレーター）。粗固体を、ジクロロメタン５０ｍｌに溶解させ、５％重炭酸ナトリウム水溶液（３×５０ｍｌ）により洗浄した。溶媒を蒸発させ、ヒドロキノン約０．０１ｇを使用して、熱酢酸エチルより粗物質を再結晶化させた（収量１．３３ｇ、９２％）（融点１７８〜１８０℃）。
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）０．６３（ｓ，３Ｈ，１８−ＣＨ３），０．８３（ｄ，６Ｈ，２７−ＣＨ３，Ｊ＝７．８Ｈｚ），０．８６（ｄ，３Ｈ，２１−ＣＨ３，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．０２（ｓ，３Ｈ，１９−ＣＨ３），０．８０−２．０４（ｂｒ，ステロイド核），２．４０（ｍ，２Ｈ，Ｃ７−Ｈ２）４．６１（ｍ，１Ｈ，３α−Ｈ），５．１８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１１．７Ｈｚ，ビニルＣ２−Ｈ，ｃｉｓ），５．４０（ｍ，１Ｈ，Ｃ６−Ｈ），５．６４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１９．５Ｈｚ，ビニルＣ２−Ｈ，ｔｒａｎｓ），６．５８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），６．６３（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ１及びＪ２＝１９．５及び１１．７Ｈｚ，ビニルＣ１−Ｈ），７．３８（ｓ，４Ｈ，芳香環）。
【００５６】
塊状重合のための例示的な手法：
コレステリル（４−ビニル）フェニルカルバメート（０．１ｇ）、エチレングリコールジメタクリレート（ＥＧＤＭ）（０．７３６ｇ）、コレステリルメタクリレート（０．１７１ｇ）、ＥＶＢ（０．１３２ｇ）（これらの成分のモル比は１：２０：２：４である）、ポロジェン（ＥｔＯＨ／アセトニトリル、１：１ｖ／ｖ、３ｍｌ）、及び開始剤ＡＩＢＮ  ０．０１２ｇを含有している透明な溶液を、壁の厚いガラス重合チューブへ移した。チューブを、３回の凍結−脱気−解凍サイクルに供した後、炎で密封した。密封されたチューブを、３日間６０℃のオーブンに維持した。重合の後、チューブの首を破壊し、スパチュラを使用してポリマー塊を小片へと破壊し、破片を乳鉢で破砕した。６０ｍｌのＭｅＯＨを使用してポリマーをＳｏｈｘｌｅｔ抽出し、７０℃で真空乾燥させ、次いで計量した。ポリマー（ＭＳ４１、１．０ｇ）を、１Ｍ水酸化ナトリウムを含むメタノール（５０ｍｌ）に懸濁させ、２４時間、加熱還流させた。冷却した懸濁液を１Ｎ塩酸により中和し、焼結ガラス漏斗でろ過し、洗浄液が中性になるまで水で洗浄した後、メタノールで数回洗浄した。加水分解生成物及び全ての洗浄液の混合物を、ジクロロメタン（３×５０ｍｌ）により抽出し、無水硫酸ナトリウムで脱水し、予め計量されたフラスコで蒸発させた。得られたコレステロールの純度をＴＬＣにより確認し、その質量を使用して加水分解度を計算した。カルバメートの加水分解により除去されたコレステロールは、計算量の９７％を構成していた。
【００５７】
対照ポリマーを同様にして調製したが、カルバメートテンプレートは重合混合物より排除した。
【００５８】
実施例３
実施例１のコレステロール吸着剤（Ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔｓ）に関する試験
コレステロールの分析
Ｈｕａｎｇらによって開発された修飾された安定なリーベルマン−ブルヒアルト（Ｌｉｅｂｅｒｍａｎｎ−Ｂｕｃｈａｒｄ）試薬による呈色反応に基づき、コレステロールの分析を実施した。
コレステロール（ＦＷ：３８６．６７）
・リーベルマン−ブルヒアルト試薬の調製：氷酢酸（９０ｍｌ）を、よく撹拌された無水酢酸（１８０ｍｌ）へと徐々に添加した。
・濃硫酸（３０ｍｌ）をＲＴで注意深く上記の溶液へと添加し（これは溶液温度のわずかな上昇を引き起こす）、続いて無水硫酸ナトリウム６ｇを添加した。その溶液を５分間激しく撹拌し、透明な溶液をボトルへ移し、パラフィルムにより密閉した。ボトルを＜４℃の冷蔵庫で保管した。Ｓｏｍｍｅｒｓらによると、試薬は４℃で保管した場合には１ヶ月以上安定であり、彼らは、１日より長くＲＴ（室温）で試薬を保管しないことを推奨した。
・シクロヘキサン中のコレステロールのストック溶液の調製：標準的なフラスコ（２５ｍｌ）でコレステロール０．４８３３ｇをシクロヘキサンに溶解させ、５０ｍＭストック溶液を得た。
・コレステロールの標準溶液：上記のストック溶液より、０．２ｍｌ、０．４ｍｌ、０．６ｍｌ、０．８ｍｌ、１．０ｍｌ、１．２ｍｌ、１．４ｍｌ、及び１．６ｍｌをガラスシリンジ（１ｍｌ）を使用して取り出し、標準的なフラスコで１０ｍｌに希釈し、それぞれ１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、及び８ｍＭの濃度を有する溶液を得た。全ての溶液を二重に調製した。
・ＬＢ試薬によるコレステロールの発色：すりガラス栓（１４’）が取り付けられた１３個の三角フラスコ（１０ｍｌ）に、ガラスピペット（５ｍｌ）を使用してＬＢ試薬（２．０ｍｌ）を取った。ＲＴで、マイクロリットルシリンジを使用して、試薬を含有している１２個の三角フラスコへ、上記の標準溶液（１００μｌ）を添加した。溶液温度は不変である。試薬（４ｍｌ）を含有している１３番目のフラスコへはシクロヘキサン（２００μｌ）を添加し、それを参照とした。全てのフラスコを３６℃の水浴上で１５分間加熱した。５分後、溶液は青緑色へ変わった。水浴よりフラスコを取り除き、１５分かけてＲＴへと冷却した。６１８ｎｍでＵＶ−可視分光光度計を使用して、溶液のＯＤを測定した。
【００５９】
図４は、コレステロールに関する較正曲線を示す。
【００６０】
コレステロールのＭＳ５０との結合
１０ｍｌの標準的なフラスコでシクロヘキサン中のコレステロールのストック溶液を作成した。１ｍＭ、１．５ｍＭ、２ｍＭ、２．５ｍＭ、３ｍＭ、３．５ｍＭ、４ｍＭ、４．５ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭの濃度を、ＭＳ５０及びその対照ポリマーの両方について二重に研究した。１２個の三角フラスコのみを研究に使用したため、一度に三つの濃度のみを研究した（二重に三つの濃度のＭＳ５０及び対照ポリマーのため各６個のフラスコ）。別々にすりガラスジョイントが取り付けられた６個の三角フラスコで、ＭＳ５０及び対照ポリマーを各々計量した（２０ｍｇ）。ポリマーを含有している上記の１２個の三角フラスコに、上記の標準溶液（２ｍｌ）を添加した。パラフィルムでフラスコ栓を適所に維持し（これは水分の導入も防止した）、一夜、放置した。８〜１０時間の放置後、マイクロリットルシリンジを使用して上清から試料（１００μｌ）を取り、ＬＢ試薬（２ｍｌ）へと直接添加し、「コレステロールの分析」で言及されたようにして加熱へと進めた。得られた溶液を、６１８ｎｍでＵＶ−可視分光光度計により分析した。得られた濃度は遊離コレステロール濃度であり、初期溶液濃度からの差し引きにより、結合コレステロール濃度が得られた。対照ポリマーによる吸収（非特異的結合）を、ＭＳ５０のものから差し引く。この情報を使用して、スキャッチャードプロットを構築した。スキャッチャードプロットの構築には、ソフトウェア「Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ」を使用した。
【表２】
2004525973.tif 000007
【表３】
2004525973.tif 000008
【表４】
2004525973.tif 000009
【００６１】
図５及び６は、この実施例に関するスキャッチャードプロット及び結合等温プロットをそれぞれ示している。
【００６２】
図７は、ｃｒＭＩＰ−ＭＳ７１の調製に関する。
【００６３】
無水ＭｅＣＮ（５０ｍｌ）中のＭＳ５０（０．５ｇ〜０．１ｍｍｏｌのＮＨ２基）の懸濁液に、トリホスゲン４．９４７ｇ（１６．６６ｍｍｏｌ）を一度に添加した。得られた混合物を３０分間撹拌し、氷−塩混合物を使用して、０℃に冷却した。シリンジを使用して、１時間かけて徐々に、懸濁液へピリジン（４ｍｌ、５０ｍｍｏｌ）を添加した。内容物をこの温度で４時間撹拌した。ν＝２２６５ｃｍ−１（ヌジョール）で現れるＮＣＯの伸縮に従い、ＩＲ分光法により反応をモニタリングした。懸濁液をろ過し、ポリマーを無水アセトニトリル（２×１０ｍｌ）により洗浄し、３０分間８０℃のオーブンで乾燥させた。得られたポリマーＭＳ７１を、１時間、真空下でさらに乾燥させ、デシケーターで保管した。ろ過及び乾燥の過程で、２２６５ｃｍ−１におけるＮＣＯピーク％Ｔは、反応混合物から測定されたものと比較して５０％へと減少した。さらに、大気中に一夜放置すると、ＮＣＯピークは完全に消失した。
【００６４】
従来のＭＩＰ  ＭＳ５０と比較されたＣＯＢＡＬＴ  ＭＳ７１の結合研究
【表５】
2004525973.tif 000010
これらの二重の実験において、ＣＯＢＡＬＴが、これらの条件下で、結合コレステロール量を３０％越増加させたことが理解される。２個のポリマーをメタノール（廃棄された）により還流させ、次いで加水分解し、加水分解生成物をコレステロールに関して試験した場合、ＭＳ５０は検出可能なコレステロールを与えないが、ＭＳ７１は結合実験において取り込まれた量とほぼ同じ量を与え、このことは、後者ＣＯＢＡＬＴにおける安定な共有結合の形成と一致していた。
【００６５】
図８は、（最大のＮＣＯへの変換が達成された時点の）ＭＳ７１のＩＲスペクトルを示している。
【００６６】
同様にしてポリマーＭＳ５０をイソチオシアネートＭＩＰ、ＭＳ８０へと変換した。このポリマーは、予想通り、イソシアネートポリマーＭＳ７１よりはるかに安定であることが見い出された。大気に曝し４８時間放置した場合、２０８７ｃｍ−１における特徴的なＮＣＳ赤外ピークの減少により、約５０％のみが反応したことが示された。ＭＳ７１の場合と同様に、コレステロールにより処理した場合、「親」ＭＩＰが極少量のコレステロールしか結合させない濃度において、有意な結合を示すことが可能であった。０．００５Ｍの初期コレステロール濃度において、ＭＳ８０（全ての実験で２０ｍｇのポリマー試料を二重に使用した）は、ＭＳ５０より３９％多いコレステロールを結合させ；０．００３Ｍの初期コレステロール濃度では、ＭＳ８０はＭＳ５０より４８％多いコレステロールを結合させ；０．００１Ｍの初期コレステロール濃度では、ＭＳ８０はＭＳ５０より７６％多いコレステロールを結合させた。
【００６７】
実施例４
有毒有機リン化合物の結合のためのＭＩＰに基づくＣＯＢＡＬＴ
従った全体的なアプローチは、図９に概説されている。サリン、ソマン等、及びその他の化学戦毒素に使用されうるアプローチを例示するため、代表的な「ＯＰ（有機リン化合物）剤」としてＤＦＰを選択した。方法をさらに一般化するため、付加的な「ＯＰ剤」を後に記載する。簡単に説明すると、設計は、ＤＦＰに相補的な腔、及び適切に位置付けられた求核基（ＤＦＰと反応することができる活性ＯＨ基）を有するＭＩＰを作製することであった。工程には、（１）ＤＦＰ結合腔を提供する、酸素に連結されたジイソプロピルホスフェート基を含有している機能性モノマーを合成する工程（ＯＨが、後でＤＦＰとの反応のための求核基として作用する）；（２）孔を与える溶媒（ポロジェン）中の過剰（８０〜９０％）の架橋剤及び付加的なモノマーにより、機能性モノマー（５〜１５％）を重合させ、マクロレティキュラーポリマーを形成させ、分離する工程；（３）ジイソプロピルホスフェート基を除去するためポリマーを加水分解して、選択的な腔を提供し、酸素求核基を露出させる工程；（４）ＭＩＰによるＤＦＰ結合を推定する工程が含まれる。対照ポリマー（加水分解されていないポリマー、及び／又はジイソプロピルホスフェート基を含まない機能性モノマーより調製された非インプリントポリマー）を合成し、特徴決定し、比較のため使用した。
【００６８】
機能性モノマー
リン化合物の化学は、酸素α−求核基が、ＭＩＰの活性化工程におけるホスフェート基の加水分解（ＭＩＰ−ＢのＭＩＰ−Ｃへの加水分解；図９を参照のこと）を可能にするのに特に効果的であり、共有結合反応工程（ＭＩＰ−ＣからＭＩＰ−Ｄ、図９ｅ）におけるＤＦＰ及びその他の「ＯＰ剤」との良好な反応性を可能にするであろうということを示唆した。図１０は、調製されたＤＦＰ結合ＭＩＰのために使用された合成された機能性モノマーの代表的な構造を図示している。その他のフルオロホスフェート及びフルオロホスホネートのため、付加的な機能性モノマーを調製した。代表的な合成を以下に示す。各機能性モノマーを特徴決定し（１Ｈ及び３１Ｐ  ＮＭＲ、ＭＳ、ＩＲ、微量分析を含む）、後の工程のために熱及び加水分解に対する安定性に関して試験した。
【００６９】
重合
比較的均一な粒子を得、収量を最大限にするため、懸濁重合法（界面活性剤含有水に懸濁したトルエンに溶解した反応物の小滴を重合した）及び分散重合法（沈殿重合とも呼ばれる；溶媒（トルエン／メタノール）中の反応物の溶液を急速撹拌下で重合した）を使用した（後の粉砕及び篩過を必要とし、多量の損失をもたらす従来の塊状重合法も使用した）。熱開始重合法及び光化学的開始重合法も使用した。
【００７０】
ジビニルベンゼン／スチレン（ＤＶＢ／Ｓ）及びエチレングリコールジメタクリレート／モノメチルアクリレート（ＥＧＤＭＡ／ＭＭＡ）架橋剤／モノマー混合物を使用した。ジビニルベンゼン／スチレン／４−ビニルピリジン（ＤＶＢ／Ｓ／ＶＰ）及びその他の組み合わせの混合物も使用した。
【００７１】
ポリマーに取り込まれた機能性モノマーの割合（典型的には＞８０％）を示すため、リン含有物質に関して重合後の有機溶媒洗浄液を分析した（３１Ｐ−ＮＭＲ）。シェニガーフラスコを使用して、計量された試料を酸素中で完全に燃焼させた後、高感度ＩＣＰ法によってもリンに関してＭＩＰポリマーを分析した。１７８．２００ｎｍにおける高周波誘導結合プラズマ原子発光分析法（ＩＣＰ−ＡＥＳ）により、リン含有量を決定した。
【００７２】
全てのＭＩＰを、結合反応のために使用された溶媒における膨張に関して試験した。ジビニルベンゼンポリマーにおいて、得られた球状粒子のサイズは様々であった；いくつかの懸濁重合においては、約５０〜８５μ（ミクロン）の粒子が得られた。いくつかの分散重合においては、１．５〜５μ（ミクロン）の粒子が得られた。水、メタノール、及びＴＨＦは、一般に、認めうるほどにこれらのポリマーを膨張させなかったが、トルエン及び２−プロパノールは膨張させた。
【００７３】
ＭＩＰの加水分解（活性化）
ポリマー加水分解条件を変動させ、ＭＩＰのために最適化した。条件には、（１）ＫＯＨ水溶液／トルエン／２−プロパノール；（２）ＮＨ２ＯＨ−ＨＣｌ／トリエチルアミン／トルエン／２−プロパノール；（３）ＮＨ２ＯＨ−ＨＣｌ／トリエチルアミン／トルエン／２−プロパノール／ＤＢＵ；（４）ＮＨ２ＯＨ−ＨＣｌ／４０％ＫＯＨ水溶液／テトラブチルアンモニウムブロミド；（５）ＮＨ２ＯＨ／トルエン／２−プロパノール／水が含まれた。一般に、条件（４）を使用した。さらに、条件（４）の下での３の拡張的なインキュベーションは、オキシム基に対する化学的変化（例えば、アルデヒドへの加水分解）を示さなかった。
【００７４】
ＭＩＰの加水分解後の洗浄液の３１Ｐ−ＮＭＲ分析、及びポリマーのリン分析（ＩＣＰ−ＡＥＳ）を使用して、腔形成（活性化）を推定した。
【００７５】
ＯＰ剤のＭＩＰとの結合
アセチルコリンエステラーゼ及びブチリルコリンエステラーゼを使用して、ＤＦＰ及びその他のＯＰ剤の結合に関するアッセイを開発した。（共有結合反応のない場合でも）ｍＭ平衡結合定数の検出を可能にする条件の下で、較正を実施した。溶液（水性溶媒又は有機溶媒のいずれか）において反応を実施し、対照を使用して、酵素に対する溶媒の効果をアッセイした。
【００７６】
機能性モノマー３の調製：
４−ビニルベンズアルデヒドオキシムの調製：
ヘキサメチレンテトラミン（７０．８０ｇ、５０ｍｍｏｌ）、ヒドロキノン０．６ｇ、及び４−ビニルベンジルクロリド（３６．７ｍｌ、２５０ｍｍｏｌ）を、溶液が得られるまで、撹拌しながら氷酢酸（１００ｍｌ）と混合した。水（１００ｍｌ）を添加し、還流下で２時間混合物を煮沸した。次いで、濃ＨＣｌ（８５ｍｌ）を添加し、さらに１５分間混合物を煮沸した。室温まで冷却した後、Ｅｔ２Ｏ（３×１００ｍｌ）により混合物を抽出した。有機相を、１０％重炭酸ナトリウム（３×１００ｍｌ）及び水（１００ｍｌ）により洗浄し、乾燥させ、蒸発させ、４−ビニルベンズアルデヒド（２８．３０ｇ）を得た。それを、ヒドロキシルアミン（１６．４ｇ）の水溶液１５０ｍｌへと添加した。混合物を５℃へと冷却し、１０Ｍ  ＮａＯＨ（２４ｍｌ）を滴下にて添加した。撹拌を４８時間続行した。次いで、ジクロロメタン２×１００ｍｌにより混合物を抽出した。有機層を水により洗浄し、乾燥させ、蒸発させ、粗生成物（収率９８．４％）を得た。ヘキサンからの再結晶化及びシリカゲルクロマトグラフィー（石油エーテル／エーテル溶出液）の後に、純粋なオキシムが得られた。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）＝５．３４（ｄ，１Ｈ），５．８３（ｄ，１Ｈ），６．７３（ｄｄ，１Ｈ），７．３３−７．５５（ｍ，４Ｈ），８．１８（ｓ，１Ｈ），９．１４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）。
【００７７】
３の調製：
ナトリウム（１６０ｍｇ、７ｍｍｏｌ）を、オキシム（１ｇ、６．７５ｍｍｏｌ）の無水ジエチルエーテル溶液（１００ｍｌ）へと添加し、全てのナトリウムが反応するまで（〜６ｈ）、反応混合物を撹拌した。ジイソプロピルクロロホスフェート（ＤＣＰ）［Ｈ．ＭｃＣｏｍｂｉｅ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９４５，３８０］（１．３ｍｌ、６．７５ｍｍｏｌ）の無水エーテル溶液（５０ｍｌ）を滴下にて添加し、反応混合物を室温で一夜撹拌した。ろ過及び蒸発の後、残さをシリカゲルクロマトグラフィに供し、油状残さとしてモノマー３を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）＝１．２９（ｄ，６Ｈ），４．５７（ｑ，１Ｈ），５．３９（ｄ，１Ｈ），５．８３（ｄ，１Ｈ），６．６３（ｄｄ，１Ｈ），７．４４（ｄ，２Ｈ），７．５５（ｄ，２Ｈ），９．８０（ｓ，１Ｈ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）＝−２．３９。
【００７８】
機能性モノマー９の調製：
４−ビニルベンズアルデヒドオキシム及び市販の（Ａｌｄｒｉｃｈ）ジフェニルクロロホスフェートを使用して、３に関して記載されたようにして、反応を実施した；生成物は融点６８〜７２℃を有していた（合成スキームに関しては、図１１参照）。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）＝５．３７（ｄ，１Ｈ），５．８４（ｄ，１Ｈ），６．７２（ｄｄ，１Ｈ），７．２１−７．３６（ｍ，１０Ｈ），７．４４（ｄ，２Ｈ），７．６２（ｄ，２Ｈ），８．３３（ｓ，１Ｈ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）＝−１２．１７
【化４】
2004525973.tif 000011
【００７９】
モノマー１０の調製
トリイソプロピルホスファイト（１０ｍｌ、６０ｍｍｏｌ）及び臭化ベンジル（４．７６ｍｌ、６０ｍｍｏｌ）の混合物を９０℃で２時間加熱することにより、ベンジルイソプロピルクロロホスフェート（ＢＩＣＰ）を調製した。未反応の出発原料を留去し、残さ（８．７ｇ）をＣＣｌ４（５ｍｌ）に溶解させ、加熱還流させた。次いで、五塩化リン（７．０グラム）を１時間かけて少量ずつ添加し、さらに０．５時間、反応混合物を還流させた。蒸留（０．５ｍｍＨｇ）により、無色の液体として化合物ＢＩＣＰ（収率６５％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）＝１．２５（ｄ，３Ｈ），１．３１（ｄ，３Ｈ），３．４４（ｄ，２Ｈ），４．８３（ｍ，１Ｈ），７．２８（ｍ，５Ｈ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）＝３５．６８。
【００８０】
ＢＩＣＰ及び４−ビニルベンズアルデヒドオキシムを使用して、３及び９に関して記載されたようにして１０の合成を実施した。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）＝１．２７（ｄ，３Ｈ），１．３１（ｄ，３Ｈ），３．４０（ｄ，２Ｈ），５．３３（ｄ，１Ｈ），５．８３（ｄ，１Ｈ），６．７１（ｍ，１Ｈ），７．２５（ｍ，５Ｈ），７．４１（ｄ，２Ｈ），７．６２（ｄ，２Ｈ），８．２３（ｓ，１Ｈ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）＝２８．１０。
【００８１】
ジフェニルフルオロホスフェート（ＤＰＦＰ）及びベンジルイソプロピルフルオロホスホネート（ＢＩＦＰ）の調製
フッ化ナトリウム（４当量）を、１当量のクロロジフェニルホスフェート又はベンジルクロロイソプロピルホスホネート（ＢＩＣＰ）が溶解しているＣＣｌ４へと添加し、反応混合物を２４時間加熱還流させた。次いで、混合物をろ過し、さらに一部のＮａＦを濾液へと添加し、次いで、それをさらに２４時間加熱還流させ、３１Ｐ及び１９Ｆ  ＮＭＲによりモニタリングした。反応混合物をろ過し、蒸発させた。ＦＰ（Ｏ）（ＯｉＰｒ）ＣＨ２Ｐｈの場合には、生成物を蒸留した。
ＦＰ（Ｏ）（ＯＰｈ）２のＮＭＲデータ：３１Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）＝−２３．０４。１９Ｆ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）＝−８２．４（ｄ，ＪＰ−Ｆ＝１１６６Ｈｚ）
ＦＰ（Ｏ）（ＯｉＰｒ）ＣＨ２ＰｈのＮＭＲデータ：１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）＝１．８１（ｄ，３Ｈ），１．５２（ｄ，３Ｈ），３．２１（ｄ，２Ｈ），４．７８（ｍ，１Ｈ），７．２８（ｓ，５Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）＝２３．６３，２３．９９，３１．４２−３３．６４（ｄ），７３．７９，１２７．６１，１２７．６６，１２８．９４，１２９．７３，１２９．９８。３１Ｐ  ＮＭＲ  （ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）＝２７．１４（ｄ）。１９Ｆ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：δ（デルタ）＝−７０．７５（ｄ，ＪＰ−Ｆ＝１３３３Ｈｚ）。
【００８２】
溶液重合によるモノマー９を使用したポリマー［ＭＩＰ９２−４２］の調製
ジビニルベンゼン  ７．１ｇ
スチレン  ０．７ｇ
トルエン  ６．３ｇ
メタノール  ２３．５ｍｌ
モノマー９  ０．４０ｇ
開始剤２，２’−アゾビスイソブチロニトリル  ０．０８ｇ
メタノール２．７ｍｌに溶解させた開始剤を除き、全ての成分を、メカニカルスターラー、冷却器（ＣａＣｌ２チューブ）、及び滴下漏斗が取り付けられた三ッ口丸底１００ｍｌフラスコに投入した。撹拌された溶液を加熱還流させ、０．５時間後、開始剤溶液を添加した。さらに６時間の還流の後、反応混合物を冷却した。無色の固体のポリマービーズをろ過し、トルエン−メタノール（１：１）混合物（３００ｍｌ）により１回洗浄し、アセトン（各３００ｍｌ）により２回洗浄した。ポリマーを１８時間６０℃で真空乾燥させた。収量＝４．５ｇ、５５％。
【００８３】
ポリマー［ＭＩＰ９２−４２ＩＩＩ］の調製
ＭＩＰ９２−４２  １ｇを、トルエン５０ｍｌと共に０．５時間撹拌し；次いで、２−プロパノール５ｍｌを添加し、続いてＮａＯＨ水溶液（水１００ｍｌ中４０ｇ）１０ｍｌを添加した。激しく撹拌しながら、固体テトラブチルアンモニウムブロミド（クロリドを使用しても、同じ結果が得られた）２．５ｇを添加し、撹拌された反応物を１２時間７０℃に加温した。冷却された反応物を焼結ガラスフィルターでろ過し（濾液はリン含有量を決定するために使用された）、ポリマーを、水（５０ｍｌ）、０．１Ｎ  ＨＣｌ（５０ｍｌ）、１％Ｎａ２ＣＯ３溶液（５０ｍｌ）、６部の２−プロパノール（各５０ｍｌ）、クロロホルム（５０ｍｌ）、３部のトルエン（５０ｍｌ）により洗浄し、最後に６０℃で１２時間乾燥させた。
【００８４】
一例としてＭＩＰ９２−４２ＩＩＩを使用した代表的な結合実験
ＭＩＰ９２−４２ＩＩＩは、ジフェニルフルオロホスフェート（ＤＰＦＰ）を結合させるよう設計されており；加水分解されていないＭＩＰ９２−４２は対照ポリマーである。
【００８５】
ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈｅ）活性の阻害率（％）の測定により、実験の様々な段階で存在するＤＰＦＰの濃度を決定した。ＢＣｈｅ阻害率（％）をＤＰＦＰ濃度へと変換するため、新鮮なＤＰＦＰのイソプロピルアルコール溶液を使用して、較正曲線を構築した。ＢＣｈｅ活性は、比色試薬ＤＴＮＢの存在下で黄色を呈するブチリルチオコリンの酵素的加水分解からのチオコリンの産生に基づき、１分当たりのＡ４１２の変化の単位で測定された。
【００８６】
較正曲線を図１２に示す。
【００８７】
ポリマー９２−４２又は９２−４２ＩＩＩのいずれか１０ｍｇを含有している試料を、イソプロピルアルコール１ｍｌと混合し、振動振とう器上で室温で４４時間プレインキュベートした。次いで、５μＭ（マイクロモーラー）の最終濃度でＤＰＦＰを試料へと添加した。ＤＰＦＰ及びポリマーの混合物を振とう器に戻し、２４時間インキュベートした。ポリマー９２−４２を含有している試料は、テンプレートによって形成された特異的結合ポケット以外の位置で起こるバックグラウンド結合のための対照であった。さらに、イソプロピルアルコールのみ（ポリマーなし、ＤＰＦＰなし）を含有している対照、及び５μＭ（マイクロモーラー）のＤＰＦＰを含むイソプロピルアルコールのみ（ポリマーなし）を含有している対照も、実行した。これらの二つの対照は、インキュベーションの開始時（ゼロ時点）にも阻害率（％）に関してアッセイした。
【００８８】
２４時間後、ポリマーを沈降させるため、試料及び対照を１４０００×ｇで１分間遠心分離した。次いで、上清中に存在するＤＰＦＰの濃度を、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈｅ）活性の阻害率（％）の測定により決定した。
【００８９】
各試料の阻害率（％）、及び較正曲線からのその等価なＤＰＦＰ濃度を、以下の表１に与える。
【表６】
2004525973.tif 000012
【００９０】
少量のＤＰＦＰ（およそ０．５μＭ  ＤＰＦＰ）が、バックグラウンド加水分解により失われた。しかしながら、ポリマーを含有している試料は、１．５μＭへと有意に減少し、このことは、１０％というＤＰＦＰのバックグラウンド加水分解を考慮したとしても、ＤＰＦＰの６０％（３μＭ）がポリマーにより取り込まれたことを示しており、従って、ジフェニル化合物に対するインプリントポリマーの親和性が明白に証明された。
【００９１】
ＭＩＰ９２−４２ＩＩＩの選択性
ジフェニルホスフェートＤＰＦＰの代わりにジイソプロピルホスフェートコリンエステラーゼ阻害剤（ジイソプロピルクロロホスフェート、ＤＣＰ）を用いて、ポリマー９２−４２及び９２−４２ＩＩＩを使用して、上記の実験を繰り返した。
【００９２】
実験の様々な段階で存在するＤＣＰの濃度を、上記のＤＰＦＰの場合と同様に、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈｅ）活性の阻害率（％）の測定により決定した。
【００９３】
ＤＣＰに関する較正曲線を図１３に示す。
【００９４】
ポリマー９２−４２又は９２−４２ＩＩＩのいずれか１０ｍｇを含有している試料を、イソプロピルアルコール１ｍｌと混合し、振動振とう器上で室温で２４時間プレインキュベートした。次いで、５μＭの最終濃度でＤＣＰを試料へ添加した。ＤＣＰ及びポリマーの混合物を振とう器へと戻し、２４時間インキュベートした。ポリマー９２−４２を含有している試料は、テンプレートによって形成された特異的結合ポケット以外の位置で起こるバックグラウンド結合のための対照であった。さらに、イソプロピルアルコールのみを含有している対照、及び５μＭ  ＤＣＰを含むイソプロピルアルコールのみ（ポリマーなし）を含有している対照も、前記と同様に実行した。さらに、５μＭ  ＤＰＦＰのみを含有している対照、及び９２−４２ＩＩＩと共にＤＰＦＰを含有している対照を、比較のため実行した。
【００９５】
２４時間後、ポリマーを沈降させるため、試料及び対照を１４０００×ｇで１分間遠心分離した。次いで、上清中に存在するＤＰＦＰの濃度を、ブチリルコリンエステラーゼ（ＢＣｈｅ）活性の阻害率（％）の測定により決定した。
【００９６】
各試料の阻害率（％）、及び較正曲線からのその等価なＤＰＦＰ濃度を、以下の表２に与える。
【表７】
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【００９７】
バックグラウンド加水分解により、幾らかのＤＣＰ（およそ１．０μＭ）が失われた。ほぼ等しい量が、ポリマーに結合した。これは、ＤＣＰの初期濃度の２０％に相当する。対照的に、同量のポリマーにより、ほぼ全てのＤＰＦＰ（対照３）が取り込まれた。このＤＣＰ取り込みの欠如は、このＭＩＰのジフェニルアナログに対する特異性を明白に証明している。
【００９８】
実施例５
ＣＯＢＡＬＴの適用
本発明に係るＣＯＢＡＬＴ化合物の前記の例示的な適用に加え、その他の適用も可能である。これらの適用は、場合により、特定の標的分子との高度に特異的な結合の後、ＣＯＢＡＬＴ化合物と標的分子との間に不可逆共有結合が形成されることが望ましく、かつ可能である全ての適用を含み得る。先の記載は、以下に与えられる例示的な例証的な適用に従い使用されうるこれらのＣＯＢＡＬＴ化合物の設計及び作製のための方法を含んでいる。
【００９９】
胆汁酸吸着剤。コレスチラミンのような多数のポリマーが、胆汁酸吸着剤として使用されている。それらの作用は、ポリマー（典型的にはイオン交換樹脂型のポリマー）の中の強塩基性基の存在に基づいており、それらは、コレステロール低下及び胆汁関連疾患のため使用されている。これらの材料は、限定された効力を有しており、栄養素、薬物等のような他の必要な物質をも除去する（結合させる）ため、限定されている。
【０１００】
胆汁酸及び塩を結合させ、必要な栄養素、薬物、又はその他の物質を除去しない本発明に係る選択的ＣＯＢＡＬＴは、より有効であろう。重要なこととして、ＣＯＢＡＬＴは、デオキシコール酸のような、より疎水性の胆汁酸に対して選択的であるよう作製されうる。胆汁酸及び塩は、脂肪消化促進のような体内の重要な機能を果たしているが、研究者らは、デオキシコール酸（ＤＣＡ）、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）、及びリトコール酸（ＬＣＡ）のような、より疎水性（耐水性）の胆汁酸は、コレステロール及び脂肪のような脂質の血流中へのより高度の吸収を助長し、有毒であり、細胞に対する傷害を引き起こし、癌を促進することを見出した。最近の研究は、これらのより疎水性の胆汁酸が、高度に重要な病原であることを示している。
【０１０１】
不可逆結合を有する本発明のＣＯＢＡＬＴは、当分野において既知の化合物よりも特異的な結合により、より効率的な胆汁吸着剤の除去を提供する。
【０１０２】
環境的な検出、除去、及び保護
神経ガスであるサリン又はソマンのような軍隊又はテロリストによって兵器として使用される有毒化学物質を検出する必要が存在している。既存の生物学的な検出剤は、安定性を欠いているか、又は保管のための特別な条件を必要とする。これは、現地での適用を制限する。又は、コリンエステラーゼ酵素のような材料に基づく系は、特定の有機リン化合物化学兵器（例えば、ＵＳＡ  ＤＯＤ  ＣＤＢ０２−１０６  Ｒｅｑｕｅｓｔ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｐｏｓａｌ“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｆｉｅｌｄ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  Ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ”参照）に対する選択性を欠いている。同様に、化学兵器を除去するか、又は防御のため、例えば局所皮膚防御剤（Ｕ．Ｓ．Ａｒｍｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｆｅｎｓｅ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２００２  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｆｅｎｓｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ参照）として使用され得る化合物が必要とされている。
【０１０３】
水中の有機リン化合物殺虫剤を標的とするＭＩＰが開発されているが、それらは選択性を欠き、清浄化及び防御のために使用可能ではない（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＡＬら、Ａｎａｌｙｓｔ  １２６，７９８−８０２（２００１）参照）。本発明のＣＯＢＡＬＴは、これらの限界を克服する。
【０１０４】
実施例６
コンビナトリアルライブラリーより選択されたシクロデキストリンに基づくＣＯＢＡＬＴ
ＣＯＢＡＬＴ上の共有結合形成基がイソチオシアネートである、シクロデキストリンに基づくＣＯＢＡＬＴを得るためのアプローチの例示的な非排他的な例を、図１４に示す。ベータ−シクロデキストリンが例示されているが、アルファ−又はガンマ−シクロデキストリンに基づくコンビナトリアルライブラリーも使用され得る。シクロデキストリンに対する置換の程度は、広範囲に変動可能であり；図１４において、一つのコンビナトリアルライブラリー（Ｃｏｍｂ．Ｌｉｂ．Ａ）は、１個の可変置換基Ｒ１を有するよう例示されており、第二のコンビナトリアルライブラリー（Ｃｏｍｂ．Ｌｉｂ．Ｂ）は、２個の可変置換基Ｒ１及びＲ２を有するよう例示されている。各々は３個、４個、又はそれ以上の置換基を含有していてもよく、各置換基は多数の異なる基であってもよい。各場合において、最終ライブラリーは、トリチル保護構造として示されており；結合に関して試験する場合には、図１４の右上端に示されるように、トリチル基が除去される。そのようなＣＯＢＡＬＴは、低分子、ペプチド、及びタンパク質（これらの標的が、ヒドロキシル基又はアミノ基を含有している場合）との不可逆結合のために使用され得る。
【０１０５】
このアプローチの適用の一例において、少なくとも１０００個のメンバーを含有しているＣｏｍｂ．Ｌｉｂ．Ｂを調製した。各々異なるＲ１Ｉを含有している１０本の異なるチューブにおいて、１０個の異なるＲ１Ｉ物質１当量を、トリチル化モノ−４−イソシアナート−ベンジル−ベータ−シクロデキストリンと反応させることにより、調製を実施した。各チューブをさらに１０本の異なるチューブへ分割し、再び１０個の異なる置換されたヨウ化ベンジルの同じセットを使用して、各々を、１当量のＲ２Ｉと別々に反応させた。脱トリチル、及び１当量の活性化された蛍光性クマリンカルボン酸による１，０００本のチューブの処理の後、個々の物質（選択されたウェルのＴＬＣ分析及びＨＰＬＣに基づくと、完全には純粋でない材料）を、異なる濃度（１０マイクロＭ、１マイクロＭ、及び０．１マイクロＭ）で、ＢＳＡ、リゾチーム、及び精製されたマウスＩｇＧを含む様々なタンパク質の溶液へと適用し、様々なｐＨ緩衝液で、１時間、８時間、及び１５時間、室温でインキュベートした。
【０１０６】
チューブのいくつかには有意な差が存在し、蛍光に基づく結合の差は、最大およそ１００〜１０００倍であった。共有結合反応、即ちＣＯＢＡＬＴ活性が、蛍光性タンパク質溶液の透析後の蛍光の微小の損失〈＜１５％）により示された。
【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ヒドロキシル含有標的物質、ＲＯＨの選択的な共有結合のための「化学反応性」分子インプリントポリマー（ＭＩＰに基づくＣＯＢＡＬＴ）の例示的な調製を示す概略的なフローチャートである。
【図２】従来のコレステロール結合アミノ含有ＭＩＰ（ＭＳ５０）の調製の概略図を示す。
【図３】２個のＭＩＰ、即ち非共有結合的に結合するＭＩＰ、及び共有結合的に結合するＭＩＰ（ＣＯＢＡＬＴ）の概略図を示す。
【図４】コレステロールに関する較正曲線を示す。
【図５】実施例３に関するスキャッチャードプロットを示す。
【図６】実施例３に関する結合等温プロットを示す。
【図７】ｃｒＭＩＰ−ＭＳ７１の調製に関する。
【図８】ＭＳ７１のＩＲスペクトル（最大のＮＣＯへの変換が達成された時点）を示す。
【図９】機能性モノマーＡを、大過剰の架橋剤、ポロジェン等により重合させてＭＩＰ、Ｂ（ＭＩＰ−Ｂ）を作製し、それを加水分解してホスホネートを除去し、ＤＦＰと選択的に共有結合的に反応してＤ（ＭＩＰ−Ｄ）を形成する求核基（Ｘ）を含有している相補的な腔をＭＩＰ−Ｃに残す、有毒有機リン化合物の結合のためのＭＩＰに基づくＣＯＢＡＬＴを開発するための全体的なアプローチを記載する。
【図１０】調製されたＤＦＰ結合ＭＩＰのため使用された合成された機能性モノマーの代表的な構造を示す。
【図１１】４−ビニルベンズアルデヒドオキシムホスフェート及びホスホネート機能性モノマー３、９、及び１０の調製に使用された合成スキームを示す。
【図１２】ＢＣｈｅ阻害率（％）をＤＰＦＰ濃度へと変換するための較正曲線を示す。
【図１３】ＤＣＰ濃度に関する較正曲線を示す。
【図１４】標的物質との共有結合反応のためのイソチオシアネートを有するシクロデキストリンに基づくコンビナトリアルライブラリーを使用した、極めて多様なＣＯＢＡＬＴを調製するために採られたアプローチを例示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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2004525973.tif 000097
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