(57)【要約】ＥＴ−７４３は抗新生物活性を有する低分子量化合物であり、核内受容体ＳＸＲがＳＸＲ調節下応答エレメントからの遺伝子転写をトランス活性化する能力を阻害する。核内受容体ＳＸＲは、ｍｄｒ１遺伝子の転写を活性化し、その結果、細胞における多剤耐性を増大させる受容体として同定されている。ＳＸＲとｍｄｒ１遺伝子との相互作用およびＥＴ−７４３からは、ＳＸＲ活性化およびｍｄｒ１遺伝子転写の新規な阻害剤、従って、腫瘍細胞に対して単独でまたは別の抗新生物剤との同時投与によって抗新生物作用を発揮する新規な薬剤の同定に利用し得る、一連の生理学的なメカニズムがもたらされる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｄｒ１遺伝子転写のＳＸＲトランス活性化を阻害する能力について化合物を試験することを含む、抗新生物剤を同定するための化合物のスクリーニング方法。
【請求項２】
ｍｄｒ１遺伝子転写をトランス活性化するＳＸＲの能力を阻害することを含む、１または複数の細胞における多剤耐性を低減させる方法。
【請求項３】
１または複数の細胞をＳＸＲアンタゴニストと接触させることをさらに含み、前記アンタゴニストによってｍｄｒ１遺伝子転写のＳＸＲトランス活性化を阻害する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
接触をｉｎ ｖｉｖｏで行う、請求項３記載の方法。
【請求項５】
哺乳動物に有効量のＳＸＲアンタゴニストを投与することを含み、該ＳＸＲアンタゴニストによって腫瘍細胞におけるｍｄｒ１遺伝子の転写レベルを低下させる、前記哺乳動物における異常細胞増殖の治療または予防方法。
【請求項６】
ＳＸＲアンタゴニストによって、ＳＸＲコリプレッサーがＳＸＲから外れるのを防ぐ、請求項５記載の方法。
【請求項７】
ＳＸＲアンタゴニストによって、ＳＸＲリガンドがＳＸＲリガンド結合ドメインに結合するのを防ぐ、請求項５記載の方法。
【請求項８】
ＳＸＲアンタゴニストによってＳＸＲとＳＸＲコアクチベーターとの相互作用を阻害する、請求項５記載の方法。
【請求項９】
ＳＸＲアンタゴニストが腫瘍細胞に対して細胞傷害性である、請求項５記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物に抗新生物剤として有効な量の細胞傷害剤を投与し、ｍｄｒ１のＳＸＲ介在型トランス活性化を阻害することにより該細胞傷害剤のクリアランスまたは分解を阻害することを含む、哺乳動物における新生物障害の治療方法。
【請求項１１】
ＳＸＲ標的遺伝子の転写のＳＸＲによるトランス活性化を阻害する能力について化合物をスクリーニングする方法であって、ＳＸＲおよび該標的遺伝子を含むアッセイにおける１以上の化合物の存在により、該１以上の化合物の不在下における該標的遺伝子の転写と比較して、該標的遺伝子の転写が阻害されるか否かを決定することを含む、前記方法。
【請求項１２】
前記アッセイがＳＸＲリガンドを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記リガンドが薬物である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記標的遺伝子がｍｄｒ１である、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたは細胞中で行う、請求項１１記載の方法。
【請求項１６】
ａ）ＳＸＲリガンドを細胞へ添加し、
ｂ）該リガンドの添加によって増加した活性またはそれによって合成が増加した分子の量を測定し；
ｃ）１以上の化合物を工程（ａ）の細胞またはＳＸＲリガンドを添加した細胞へ添加し；
ｄ）工程（ｃ）の細胞について、工程（ｂ）と同様に活性または分子の量を測定し；そして
ｅ）該１以上の化合物によって、活性の増加または分子の合成の増加が阻害されたか否かを決定する；
ことを含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
前記分子がＰ−糖タンパク質である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記分子がレポーター遺伝子の遺伝子産物である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
ＳＸＲのリガンド結合ドメインとＳＸＲコアクチベーターとが機能的に会合することにより、レポーター遺伝子の発現が調節される、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ＳＸＲコアクチベーターが、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、ＧＲＩＰ、ＰＢＰ、ＳＸＲのコアクチベーターである擬似ペプチド、およびＳＸＲのコアクチベーターであるペプチド断片からなる群より選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
ＳＸＲのリガンド結合ドメインとＳＸＲコアクチベーターとが機能的に会合することにより、レポーター遺伝子の発現が増加する、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
ａ）ＳＸＲとＳＸＲ標的遺伝子を混合して混合物を形成し；
ｂ）リガンドを該混合物へ添加することによって増加した活性またはそれによって合成が増加した分子の量を測定し；
ｃ）１以上の該化合物を工程（ａ）の混合物へ添加し；
ｄ）工程（ｃ）の細胞について、工程（ｂ）と同様に活性または分子の量を測定し；そして
ｅ）該１以上の化合物によって、活性の増加または分子の合成の増加が阻害されたか否かを決定する；
ことを含む、請求項１１記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２３】
前記標的遺伝子がｍｄｒ１である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記分子がＰ−糖タンパク質である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記リガンドが薬物である、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
推定抗新生物剤について化合物をスクリーニングする方法であって、ＳＸＲおよびＳＸＲの標的遺伝子を含むアッセイにおける１以上の化合物の存在により、該１以上の化合物の不在下における該標的遺伝子の転写と比較して、該標的遺伝子の転写が阻害されるか否かを決定することを含む、前記方法。
【請求項２７】
前記アッセイがＳＸＲリガンドを含む、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記リガンドが薬物である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記標的遺伝子がｍｄｒ１である、請求項２６記載の方法。
【請求項３０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたは細胞中で行う、請求項２６記載の方法。
【請求項３１】
ａ）ＳＸＲリガンドを細胞へ添加し；
ｂ）該リガンドの添加によって増加した活性またはそれによって合成が増加した分子の量を測定し；
ｃ）１以上の化合物を工程（ａ）の細胞または核リガンドを添加した細胞へ添加し；
ｄ）工程（ｃ）の細胞について、工程（ｂ）と同様に活性または分子の量を測定し；
ｅ）該１以上の化合物によって、活性の増加または合成の増加が阻害されたか否かを決定する；
ことを含み、ここで上記活性の増加または上記分子の合成の増加を阻害する１または複数の化合物が、推定抗新生物剤である、請求項２６記載の方法。
【請求項３２】
前記分子がＰ−糖タンパク質である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記分子がレポーター遺伝子の遺伝子産物である、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
ＳＸＲのリガンド結合ドメインとＳＸＲコアクチベーターとが機能的に会合することにより、レポーター遺伝子の発現が調節される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ＳＸＲコアクチベーターが、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、ＧＲＩＰ、ＰＢＰ、ＳＸＲのコアクチベーターである擬似ペプチド、およびＳＸＲのコアクチベーターであるペプチド断片からなる群より選択される、請求項２４記載の方法。
【請求項３６】
ＳＸＲのリガンド結合ドメインとＳＸＲコアクチベーターとが機能的に会合することにより、レポーター遺伝子の発現が増加する、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
ａ）ＳＸＲとＳＸＲ標的遺伝子を混合して混合物を形成し；
ｂ）リガンドを該混合物へ添加することによって増加した活性またはそれによって合成が増加した分子の量を測定し；
ｃ）１以上の化合物を工程（ａ）の混合物へ添加し；
ｄ）工程（ｃ）の細胞について、工程（ｂ）と同様に活性または分子の量を測定し；そして
ｅ）該１以上の化合物によって、活性の増加または分子の合成の増加が阻害されたか否かを決定する；
ことを含む、請求項２６記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項３８】
前記標的遺伝子がｍｄｒ１である、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記分子がＰ−糖タンパク質である、請求項３７記載の方法。
【請求項４０】
前記リガンドが薬物である、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
推定抗新生物剤について化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）ＳＸＲリガンドを細胞へ添加し；
ｂ）該リガンドの添加によって低下した活性またはそれによって合成が低下した分子の量を測定し；
ｃ）１以上の化合物を工程（ａ）の細胞またはＳＸＲリガンドを添加した細胞へ添加し；
ｄ）工程（ｃ）の細胞について、工程（ｂ）と同様に活性または分子の量を測定し；
ｅ）該１以上の化合物によって、活性の低下または合成の低下が阻害されたか否かを決定する；
ことを含み、ここで上記活性の低下または上記分子の合成の低下を阻害する化合物が、推定抗新生物剤である、前記方法。
【請求項４２】
前記分子がレポーター遺伝子の遺伝子産物である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記分子がＰ−糖タンパク質である、請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
活性の前記増加または分子の合成の前記増加を阻害する前記化合物の１つを腫瘍細胞へ投与し、該化合物が腫瘍細胞に対して細胞傷害作用を示すか否かを決定することをさらに含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
活性の前記低下または分子の合成の前記低下を阻害する前記化合物の１つを腫瘍細胞へ投与し、該化合物が腫瘍細胞に対して細胞傷害作用を示すか否かを決定することをさらに含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４６】
細胞内での薬物の異化代謝を低下させる能力または細胞の薬物排出能を低下させる能力について推定候補化合物をスクリーニングする方法であって、ＳＸＲおよび標的遺伝子を含むアッセイにおける１以上の化合物の存在により、該１以上の化合物の不在下における該標的遺伝子の転写と比較して、該標的遺伝子の転写が阻害されるか否かを決定する工程を含み、上記標的遺伝子の転写を阻害する化合物が、薬物の異化代謝を低下させる、または、細胞の薬物排出能を低下させる候補である、前記方法。
【請求項４７】
前記アッセイがＳＸＲリガンドを含む、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記リガンドが前記薬物である、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
前記標的遺伝子がｍｄｒ１である、請求項４６記載の方法。
【請求項５０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏまたは細胞中で行う、請求項４６記載の方法。
【請求項５１】
ａ）ＳＸＲリガンドを細胞へ添加し；
ｂ）該リガンドの添加によって増加した活性またはそれによって合成が増加した分子の量を測定し；
ｃ）１以上の化合物を工程（ａ）の細胞またはＳＸＲリガンドを添加した細胞へ添加し；
ｄ）工程（ｃ）の細胞について、工程（ｂ）と同様に活性または分子の量を測定し；そして
ｅ）該１以上の化合物によって、活性の増加または分子の合成の増加が阻害されたか否かを決定する；
ことを含む、請求項４６記載の方法。
【請求項５２】
前記分子がＰ−糖タンパク質である、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記分子がレポーター遺伝子の遺伝子産物である、請求項５１記載の方法。
【請求項５４】
ＳＸＲのリガンド結合ドメインとＳＸＲコアクチベーターとが機能的に会合することにより、レポーター遺伝子の発現が調節される、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
ＳＸＲコアクチベーターが、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、ＧＲＩＰ、ＰＢＰ、ＳＸＲのコアクチベーターである擬似ペプチド、およびＳＸＲのコアクチベーターであるペプチド断片からなる群より選択される、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
ＳＸＲのリガンド結合ドメインとＳＸＲコアクチベーターとが機能的に会合することにより、レポーター遺伝子の発現が増加する、請求項５４記載の方法。
【請求項５７】
ａ）ＳＸＲとＳＸＲ標的遺伝子を混合して混合物を形成し；
ｂ）リガンドを該混合物へ添加することによって増加した活性またはそれによって合成が増加した分子の量を測定し；
ｃ）１以上の化合物を工程（ａ）の混合物へ添加し；
ｄ）工程（ｃ）の細胞について、工程（ｂ）と同様に活性または分子の量を測定し；そして
ｅ）該１以上の化合物によって、活性の増加または分子の合成の増加が阻害されたか否かを決定する；
ことを含む、請求項４６記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項５８】
前記標的遺伝子がｍｄｒ１である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
前記分子がＰ−糖タンパク質である、請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
前記リガンドが薬物である、請求項５７記載の方法。
【請求項６１】
薬物とＳＸＲの活性または発現のモジュレート剤とを同時投与することを含む、薬物化学療法。
【請求項６２】
薬物とＳＸＲの活性または発現のダウンレギュレート剤とを同時投与することを含む、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
薬物とＳＸＲの活性または発現のアップレギュレート剤とを同時投与することを含む、請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
薬物とＳＸＲ作用のモジュレート剤とを同時投与することを含む、薬物の有効性を増加させる方法。
【請求項６５】
前記モジュレート剤がＳＸＲアンタゴニストである、請求項６１記載の方法。
【請求項６６】
前記モジュレート剤がＳＸＲアゴニストである、請求項６１記載の方法。
【請求項６７】
患者に有効量のＳＸＲ阻害剤を投与することを含む、薬物治療を受けている患者において薬物代謝を阻害する方法。
【請求項６８】
治療用組成物の製造方法であって、以下の工程：
ａ）ＳＸＲ活性の阻害能またはＳＸＲの転写もしくは翻訳の阻害能について化合物をスクリーニングし；
ｂ）該化合物のいずれがＳＸＲ活性を阻害するのか、またはＳＸＲの転写もしくは翻訳を阻害するのか決定し；
ｃ）ＳＸＲ活性を阻害する、またはＳＸＲの転写もしくは翻訳を阻害すると決定された化合物を選択し；
ｄ）工程（ｃ）で選択した該化合物を治療上有効な量にて取得し；そして
ｅ）選択した化合物の治療上有効な量を１以上の製薬上許容し得る賦形剤と組み合わせて治療用組成物を形成する；
工程を含む、前記方法。
【請求項６９】
前記スクリーニングが請求項１１記載の工程を含む、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
前記スクリーニングが請求項２６記載の工程を含む、請求項６８記載の方法。
【請求項７１】
請求項６８記載の方法によって製造される治療用組成物。
【請求項７２】
ＳＸＲ活性またはＳＸＲ発現をモジュレートする請求項７１記載の治療用組成物の有効量を投与することにより、薬剤耐性を阻害する方法。
【請求項７３】
哺乳動物における病態の治療用に化合物を選択する方法であって、ここで
ａ）ＳＸＲのリガンド結合ドメインおよびＳＸＲ標的遺伝子を含む系を調製して、ＳＸＲの該リガンド結合ドメインと該標的遺伝子との相互作用によって検出可能なシグナルを発生させ；
ｂ）工程（ａ）における該系の検出可能なシグナルを測定し；
ｃ）化合物を工程（ｅ）の系へ添加し；
ｄ）工程（ｃ）の該系のシグナルを測定し；そして
ｅ）工程（ｄ）のシグナルが工程（ｂ）のシグナルよりも小さくなる化合物を選択する；
ことにより化合物を選択する、前記方法。
【請求項７４】
前記相互作用が直接的な相互作用である、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記相互作用が間接的な相互作用である、請求項７３記載の方法。
【請求項７６】
前記病態が癌である、請求項７３記載の方法。
【請求項７７】
前記標的遺伝子がｍｄｒ１である、請求項７３記載の方法。
【請求項７８】
前記検出可能なシグナルがｍｄｒ１ ＲＮＡである、請求項７３記載の方法。
【請求項７９】
前記検出可能なシグナルがＰ−糖タンパク質である、請求項７３記載の方法。
【請求項８０】
前記系が細胞を含む、請求項７３記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞が、前記標的遺伝子を含むベクターを含む、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
前記系が、生理学的な条件下にてＳＸＲの前記リガンド結合ドメインに結合するリガンドを含む、請求項７３記載の方法。
【請求項８３】
前記リガンドが薬物または薬物候補である、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
前記薬物または薬物候補が癌を治療するためのものである、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
前記系が、ツーハイブリッドアッセイの構成要素を含む、請求項７３記載の方法。
【請求項８６】
前記系が、ＳＸＲリガンド結合ドメインを活性化するペプチドに融合したＳＸＲリガンド結合ドメインをコードするベクターを含む、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
前記ペプチドがＶＰ１６である、請求項８５記載の方法。
【請求項８８】
前記系が、シグナル発生酵素をコードするベクターを含む、請求項８５記載の方法。
【請求項８９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる、請求項７３記載の方法。
【請求項９０】
前記系が、ＳＸＲのリガンド結合ドメインと前記標的遺伝子とを含む、請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
前記標的遺伝子がｍｄｒ１である、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
請求項７３記載の方法によって選択される、哺乳動物における病態を治療するための化合物。
【請求項９３】
請求項９２記載の化合物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６０／２２４，３５６号（２０００年８月１１日出願）に関し、該仮出願の出願日の利益を主張するものである。
【０００２】
発明の背景
本発明は、抗新生物活性について化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明はまた、ＳＸＲ核内受容体による標的遺伝子転写のトランス活性化を阻害する化合物、および、このような化合物の検出方法に関する。
【０００３】
発明の背景を説明するためあるいは実施に関する詳細の補足を提供するために本明細書中で利用する刊行物および他の資料は、引用により本明細書中に含まれるものとし、便宜上、添付の参考文献リストに別途分類しておく。
【０００４】
エクチナサイジン（Ｅｃｔｅｉｎａｓｃｉｄｉｎ）−７４３（ＥＴ−７４３、ＮＳＣ ６４８７６６）は、臨床での使用についてかなり有望である、新規の低分子量抗新生物薬である１。現在第２相試験が行われており、黒色腫、乳癌、非小細胞肺癌および卵巣癌等の各種腫瘍に対する臨床評価が計画されている２，３。特に注目すべきは、代替となる化学療法の選択肢が一般に存在しない肉腫に対して該薬物が有効である点である。ＥＴ−７４３は非常に強力な細胞傷害活性を有しており、１〜１００ｎＭの範囲のＩＣ５０値にて各種癌細胞系統およびヒト異種移植片の増殖を阻害する２，４。この範囲の細胞傷害活性は、いくつかの一般的な化学療法剤、例えば、タキソール、カンプトテシン、アドリアマイシン、マイトマイシン、シスプラチン、ブレオマイシンおよびエトポシド、よりも１０〜１０００倍強力である。ＥＴ−７４３の高い効力は、ＥＴ−７４３が特定の分子標的を介して作用することを意味している。
【０００５】
かなり有望であるにも拘わらず、ＥＴ−７４３がその細胞傷害応答を引き起こすメカニズムは今日まで確立されていない。ＥＴ−７４３は、様々な興味深い活性を促進すると報告されている。例えば、ＤＮＡの副溝への結合５、グアニンのＮ２位のアルキル化６およびＤＮＡ切断へのトポイソメラーゼＩ介在型架橋の促進４，７が挙げられる。ＥＴ−７４３はまた、ＮＦ−Ｙ転写因子によるＤＮＡ結合を阻害することが示された８，９。これらの現象は全てマイクロモル濃度にて引き起こされるのに対し、該薬物の細胞傷害作用は低ナノモルの範囲で明らかに現れるため、該現象のいずれもがＥＴ−７４３の細胞傷害作用に関係しているかは、依然として不明である。
【０００６】
化学療法に対する多剤耐性の原因となる遺伝子の１つは、Ｐ−糖タンパク質、ＰｇｐまたはＰ１７０と様々に呼ばれている（本明細書中では「Ｐ−糖タンパク質」と呼ぶ）タンパク質をコードするｍｄｒ１である。ある種の薬剤耐性および多剤耐性モジュレーターが機能する既知のメカニズムの１つは、細胞膜（例えば、ある種の薬剤耐性細胞、多剤耐性腫瘍細胞、胃腸管細胞および血液脳関門を形成する内皮細胞の細胞膜）に存在する内在性のＰ−糖タンパク質との相互作用によるものである。Ｐ−糖タンパク質は細胞の排出ポンプとして作用する。ある種の物質（例えば、各種疾患用の治療薬）は、細胞に作用する前にＰ−糖タンパク質によって細胞外へ排出されることが知られている。
【０００７】
ＥＴ−７４３は、ｍｄｒ１遺伝子の転写速度を低下させることが知られている１０。特に、１０〜５０ｎＭ濃度の該薬物が、Ｐ−糖タンパク質をコードする遺伝子（以下「ｍｄｒ１」とする）のトリコスタチン（ｔｒｉｃｈｏｓｔａｔｉｎ）誘導型転写を阻害することが知られている。ｍｄｒ１の転写のＥＴ−７４３による阻害に必要な濃度は、その細胞傷害作用に必要な濃度とほぼ同程度である。このことから、ＥＴ−７４３がｍｄｒ１転写を阻害するメカニズムが、その細胞傷害特性と関連している可能性が考えられる。さらに、Ｐ−糖タンパク質は両薬物に対する耐性およびアポトーシスの回避をもたらすことから１２，１３、Ｐ−糖タンパク質発現を特異的に調節する転写因子は、新規な抗新生物剤を合理的に設計する上で標的になり得ると考えられる。このように、ＥＴ−７４３等の細胞傷害性化合物は抗新生物剤としてかなり有望である一方、それらの最終的な有用性は、例えば、大量精製または大量合成が難しい等の要因で制限されてしまう可能性がある。
【０００８】
核内ホルモン受容体は、ヒトではリガンドモジュレート型転写因子の最大ファミリーを含む。これらの受容体は、ステロイド受容体および甲状腺受容体、ビタミンＤ並びにレチノイドの作用を仲介する。これらは細胞内受容体であり、細胞増殖や細胞分化、発生、およびホメオスタシスといった生理学的過程に関与する遺伝子の発現において重要な役割を果たす。これらの受容体が活性化されると、ホルモン応答エレメント（ＨＲＥ）と呼ばれる特異的なＤＮＡ配列に直接結合するか、または、ＤＮＡに結合する他のタンパク質に結合することでＤＮＡへ間接的に結合するため、該受容体は遺伝子の発現を調節できるようになる。核内受容体は、そのＤＮＡ結合特性に基づいて分類することができる。例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、アンドロゲン、プロゲスチンおよびミネラルコルチコイド受容体はホモ二量体として、逆方向反復リピートとして構成されるＨＲＥに結合する。第２のクラスの受容体は、例えば、レチノイン酸、甲状腺ホルモン、ビタミンＤ３、脂肪酸／ペルオキシソーム増殖因子およびエクジソンによって活性化される受容体等を含むが、通常のパートナーであるレチノイドＸ受容体（即ちＲＸＲ、９−ｃｉｓレチノイン酸受容体としても既知）とのヘテロニ量体としてＨＲＥに結合する。
【０００９】
「古典的」な核内受容体に対するホルモンの多くが前世紀から今世紀にかけて初めて記述されたものの、過去１０年間において、既知のホルモンを持たない、より多数の核内受容体タンパク質が同定されている。このようなタンパク質は「オーファン受容体」と呼ばれ、その存在は、遺伝子発現の調節に関与する新規のホルモンやシグナリング分子が未だ同定されずにいることを意味している。オーファン受容体は、新規の調節分子および新規の薬物療法を同定する最初の手掛かりを与えてくれるため、かなり有望である１４，１５。実際、このようなタンパク質は既に、アンドロスタン１６、プレグナン１７並びに代謝シグナル（例えば、脂肪酸１８、プロスタノイド１９、胆汁酸２０−２２およびコレステロール代謝産物２３−２５等）の新規なシグナリング経路を同定する上で強力なツールを提供してくれている。また、オーファン受容体が様々な非生体化合物１５（例えば、ペルオキシソーム増殖因子、アミノ安息香酸２６）および医薬製剤（例えば、チアゾリジンジオン系抗糖尿病薬）の分子標的であることが次第に明らかになってきている。
【００１０】
特に、オーファン受容体ＳＸＲ（ＰＸＲ、ＰＡＲ、ＰＲＲおよびＮＲ１Ｉ２としても既知）は、広範囲に及ぶ様々な薬物、例えば、リファンピシン、ＳＲ１２１８３、フェノバルビタール、クロトリマゾール、ＲＵ４８６、パクリタキセル、リトナビルおよびその他、と結合したり、これらをモジュレートすることが示された１１，１７，２６−３０，４４。これらの化合物に応答して、ＳＸＲはシトクロムＰ４５０ ３Ａ４（ｃｙｐ３Ａ４；全医薬製剤の約半数に代謝不活性化を引き起こす酵素）の転写を活性化する。ｃｙｐ３Ａ４はｍｄｒ１と同様、非生体物質の解毒経路において重要な遺伝子である。解毒における役割に合致して、ＣＹＰ３Ａ４とＰ−糖タンパク質は双方とも、薬物の代謝および排泄に関与する組織、例えば、肝臓および腸、において最も大量に発現される３１，３２。さらに、ＣＹＰ３Ａ４の基質の多くまたはモジュレーターの多くは、Ｐ−糖タンパク質の基質またはモジュレーターでもある３３。ＣＹＰ３Ａ４の効率的なインデューサー、例えば、リファンピシン、フェノバルビタール、およびクロトリマゾールも、ｍｄｒ１の転写を活性化する３４。基質／インデューサー特異性におけるこの有意な共通性は、ＳＸＲがｃｙｐ３Ａ４とｍｄｒ１の発現を調節することから、ｃｙｐ３Ａ４とｍｄｒ１とが共同して作用し、広範囲の化合物を解毒および不活性化することを示唆している。これらの知見より、ＳＸＲが非生体物質解毒系の重要なセンサーであるという示唆が導かれる。従ってＳＸＲは、自己誘導型の薬物代謝に関する既成の現象以外にも交叉反応を仲介しており、この交叉反応のため、同時投与された一方の薬物によって他方の薬物の排泄が促進される。このような作用は、各種の抗新生物剤、例えば、パクリタキセル（タキソール）、タモキシフェン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、イホスファミドおよびブスルファン等、がＣＹＰ３Ａ４の基質であるため、癌の化学療法において制限要因となるおそれがある。ＳＸＲのノーザンブロット分析からは、ＳＸＲが肝臓および小・大腸において大量に発現されることが判明した。最近の報告では、ＳＸＲが新生物乳房組織といったヒト腫瘍において変動的に発現されることが示唆されている３５。
【００１１】
ＳＸＲ等の核内受容体は従って、ステロイドおよび関連ホルモンの転写作用を仲介する。これらの受容体タンパク質では、標的遺伝子のシス作動性エレメントでＤＮＡに特異的に結合する保存されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、並びに特定のホルモンまたは他の因子による受容体の特異的活性化を可能にするリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を有する。リガンドがＬＢＤに結合し、コアクチベーターの動員とコリプレッサーの除去を促進する構造変化が受容体に起きると、核内受容体に対する標的遺伝子の転写活性化が生じる。この結果、標的遺伝子の転写をモジュレートし得る受容体複合体が生成する。アゴニスト結合後にコアクチベーターが動員されると、受容体は転写を活性化する。これに対し、受容体アンタゴニストが受容体に結合すると別の構造変化が受容体に生じ、標的遺伝子の転写機構との間に相互作用が起こらなくなるか、または、非生産的な相互作用が生じる。
【００１２】
ホルモンは通常小型かつ疎水性であって、細胞の細胞膜および細胞質中を拡散して核内受容体に結合し得ることが明らかにされている。ホルモンが受容体に結合すると、該受容体が結合するＨＲＥによって転写が調節される１または複数の遺伝子を活性化または抑制するように受容体はその構造を変化させる。あるいは、受容体を他のタンパク質に結合させてから遺伝子の転写を調節することにより、遺伝子を活性化または抑制することもある。このようなホルモンの例としては、ステロイドホルモン（例えば、テストステロン、β−エストラジオール、アルドステロン、コルチゾールやプロゲステロン）、甲状腺ホルモン（例えば、サイロキシン（Ｔ４）やトリヨードサイロキシン（Ｔ３））、およびビタミンＤ（脊椎動物において）、その他これらから誘導されるホルモンが挙げられる。ＥＴ−７４３等の低分子量疎水性化合物の転写調節能からは、ＥＴ−７４３がリガンド調節型転写因子を介して作用する可能性が考えられる。
【００１３】
薬物クリアランスのモジュレートにＳＸＲ核内受容体が関与することから、現在、ＳＸＲ遺伝子およびＳＸＲの調節下にある遺伝子の転写調節に薬理学的介入を提供しうる化合物、およびこのような化合物の同定方法がさらに求められている。このような化合物および方法は、ＳＸＲの調節下にある遺伝子の転写を改変することが有益となりうる患者にとって価値のあるものであり、また、ＳＸＲの調節下にある遺伝子の発現メカニズムをさらに説明する研究ツールとしても有用でありうる。
【００１４】
発明の要旨
本発明によれば、本発明者らは、ＥＴ−７４３が遺伝子転写のＳＸＲ活性化を阻害すること、さらに、ＳＸＲがｍｄｒ１遺伝子の転写を促進することを発見した。ＳＸＲがｍｄｒ１遺伝子の転写を促進し得ることから、ＳＸＲの活性化をも阻害するＥＴ−７４３等の細胞傷害薬（「ＳＸＲ透過（ＳＸＲ−ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ）」薬）を開発することは有用性を示している。従って、本発明は、ｍｄｒ１遺伝子のＳＸＲによるトランス活性化を阻害することを含む、Ｐ−糖タンパク質活性のモジュレート方法を提供する。
【００１５】
本発明の一態様は、化合物をＳＸＲ阻害能について試験することを含む、抗新生物剤を同定するための化合物のスクリーニング方法である。
本発明の第２の態様は、ｍｄｒ１遺伝子転写をトランス活性化するＳＸＲの能力を阻害することを含む、１または複数の細胞における多剤耐性を低減させる方法である。
【００１６】
本発明の第３の態様は、哺乳動物に有効量のＳＸＲアンタゴニストを投与し、該ＳＸＲアンタゴニストによって腫瘍細胞におけるｍｄｒ１遺伝子の転写レベルを低下させることを含む、哺乳動物における異常細胞増殖の治療または予防方法である。
【００１７】
本発明の別の態様は、哺乳動物に有効量の治療剤を投与し、ＳＸＲを阻害することにより該治療剤のクリアランスまたは分解を阻害することを含む、哺乳動物における障害の治療方法である。
【００１８】
本発明のさらなる態様は、ＳＸＲ標的遺伝子の転写のＳＸＲによるトランス活性化を阻害する能力について化合物をスクリーニングする方法であって、この方法は、ＳＸＲおよび該標的遺伝子を含むアッセイにおいて１以上の前記化合物を存在させることにより、該１以上の化合物の不在下における該標的遺伝子の転写と比較して、該標的遺伝子の転写が阻害されるか否かを決定することを含む。該標的遺伝子は、ＳＸＲに応答性の天然または合成の核酸を意味する。
【００１９】
本発明のさらに別の実施形態は、推定抗新生物剤について化合物をスクリーニングする方法であって、この方法は、ＳＸＲおよびＳＸＲの標的遺伝子を含むアッセイにおいて１以上の化合物を存在させることにより、該１以上の化合物の不在下における該標的遺伝子の転写と比較して、該標的遺伝子の転写が阻害されるか否かを決定することを含む。
【００２０】
本発明の別の実施形態は、推定治療剤について化合物をスクリーニングする方法であって、この方法は、
ａ）ＳＸＲリガンドを細胞へ添加し；
ｂ）該リガンドの添加によって低下した活性または合成が低下した分子の量を測定し；
ｃ）１以上の化合物を工程（ａ）の細胞またはＳＸＲリガンドを添加した細胞へ添加し；
ｄ）工程（ｃ）の細胞について、工程（ｂ）と同様に活性または分子の量を測定し；
ｅ）該１以上の化合物によって、活性の低下または合成の低下が阻害されたか否かを決定する；
ことを含み、活性の上記低下または分子の合成の上記低下を阻害する１または複数の化合物が、推定抗新生物剤である。
【００２１】
本発明にはまた、細胞内での薬物の異化代謝を低下させる能力または細胞の薬物排出能を低下させる能力について推定候補化合物をスクリーニングする方法も包含され、この方法は、ＳＸＲおよび標的遺伝子を含むアッセイにおいて１以上の化合物を存在させることにより、該１以上の化合物の不在下における該標的遺伝子の転写と比較して、該標的遺伝子の転写が阻害されるか否かを決定する工程を含み、上記標的遺伝子の転写を阻害する化合物が、薬物の異化代謝を低下させる、または、細胞の薬物排出能を低下させる候補である。
【００２２】
アゴニストに拮抗して作用し、それにより受容体活性化を阻害するアンタゴニストについてのスクリーニングすることに加えて、本発明の一態様は、逆アゴニストについてスクリーニングすることである。逆アゴニストは、アゴニストとは逆の作用を有し、活性を阻止しうる化合物である。このことは当業者には周知であり、Ｐｉｃａｒｄ４９に解説されている。
【００２３】
本発明のさらに別の態様は、薬物とＳＸＲの活性または発現のモジュレート剤とを同時投与することを含む治療方法である。
本発明の別の態様は、薬物とＳＸＲ作用のモジュレート剤とを同時投与することを含む、薬物の有効性を増加させる方法である。
【００２４】
本発明はまた、患者に有効量のＳＸＲ阻害剤を投与することを含む、薬物治療を受けている患者において薬物代謝および／または薬物排出を阻害する方法を提供する。
【００２５】
本発明は治療用組成物の製造方法にも関し、この方法は、
ａ）ＳＸＲ活性の阻害能について化合物をスクリーニングし；
ｂ）該化合物のいずれがＳＸＲ活性を阻害するのか決定し；
ｃ）ＳＸＲ活性を阻害すると決定された化合物を選択し；
ｄ）工程（ｃ）で選択した該化合物を治療上有効な量にて取得し；そして
ｅ）選択した化合物の治療上有効な量を１以上の製薬上許容し得る賦形剤と組み合わせて治療用組成物を形成する；
工程を含む。
【００２６】
本発明のさらなる態様としては、上記方法によって製造した治療用組成物、および、有効量の治療用組成物を投与することにより薬剤耐性を阻害する方法が挙げられる。
【００２７】
本発明のさらに別の態様は、哺乳動物における病態の治療用に化合物を選択する方法であり、
ａ）ＳＸＲのリガンド結合ドメインおよびＳＸＲ標的遺伝子を含む系を調製して、ＳＸＲの該リガンド結合ドメインと該標的遺伝子との相互作用によって検出可能なシグナルを発生させ；
ｂ）工程（ａ）における該系の検出可能なシグナルを測定し；
ｃ）化合物を工程（ｅ）の系へ添加し；
ｄ）工程（ｃ）の該系のシグナルを測定し；そして
ｅ）工程（ｄ）のシグナルが工程（ｂ）のシグナルよりも小さくなる化合物を選択する；
ことにより化合物を選択する。
【００２８】
本発明はまた、上記手順によって選択した化合物、および、選択した化合物を含む医薬組成物を包含する。
【００２９】
発明の詳細な説明
最初の核内受容体がクローニングされたのは１５年近く前であるため、数多くの生化学的、遺伝学的および構造的研究によって、これらのタンパク質がどのようにして転写を調節するのか明確かつ詳細に解明されている。核内ホルモン受容体間では、保存されたＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）およびリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）が存在している。リガンドの不在下では、ＳＸＲ等の受容体はレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）との真正ヘテロ二量体として、対応するＨＲＥに結合する。また、リガンドの不在下では、ＳＸＲを含む一部の受容体はコリプレッサー複合体と会合する３６。この複合体は、アセチル基をヒストンおよび他の基質から除去するヒストンデアセチラーゼを含有する。コリプレッサー複合体との会合により、ＤＮＡ転写機構が不活性化状態または抑制状態に維持される。リガンドがＬＢＤに結合してＳＸＲに構造変化が生じ、転写活性化ドメインが再配向されると、標的遺伝子の転写の活性化が生じる。これによりコリプレッサーが外れてコアクチベーター複合体が動員され、次いでクロマチンがアセチル化されて凝縮が緩み、続いて転写速度が加速される。
【００３０】
少なくとも２つのクラスの核内受容体コアクチベーターが同定されている。第１のクラスとしては、自身のヒストンアセチラーゼ活性によってクロマチン構造をモジュレートするＳＲＣ−１関連タンパク質（ＳＲＣ１、ＡＣＴＲおよびＧＲＩＰ）が挙げられる３７。第２のクラスとしては、基本的な転写機構の構成要素が含まれる大型の転写複合体の一部をなすＰＢＰ（ＤＲＩＰ ２０５およびＴＲＡＰ ２２０としても既知）が挙げられる３８，３９。核内受容体コアクチベーターの各クラスに入る他のタンパク質は同定されており、当業者には既知である。
【００３１】
ＳＸＲ活性化型転写を再現するのに標準的なモデル異種細胞系を利用すると、試験対象の過程を不明瞭にしてしまう可能性のある代謝事象の不存在下で活性をモニターすることが可能である。細胞が受容体、受容体遺伝子、応答エレメント、リガンド結合領域を含むハイブリッド、転写アクチベーター、コリプレッサー、コアクチベーター等を発現する適切なＤＮＡによって一過的にトランスフェクト可能である限り、いずれかの適切な異種細胞系を使用して、ＳＸＲ活性化の潜在的な阻害剤または既知の阻害剤の活性化を試験することができる。必要な遺伝子を１つ以上発現する細胞を使用してもよい。哺乳動物遺伝子の一過性発現に適しており、かつ、培養での維持に適した細胞系は当業者には周知であり、例えば、ＣＯＳまたはＣＶ−１細胞等が挙げられる。
【００３２】
本発明の実施には、特に明記しない限り、当業者の常識の範囲内の化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学および細胞培養の通常の技術４０−４３を利用する。本発明の詳細は、Ｓｙｎｏｌｄら１１による刊行物に開示されており、該刊行物はとりわけ、引用により全開示内容が本明細書中に含まれるものとする。
【００３３】
ＳＸＲのＥＴ−７４３による阻害を試験するため、ＣＶ−１細胞を、当該技術分野で公知の方法に従って、適切なレポーター構築物と共に該受容体の発現ベクターで一過的にトランスフェクトした。試験対象の受容体をＣＶ−１細胞で発現させた。適切なレポーター遺伝子構築物は生化学および分子生物学の分野の研究者には周知である。全トランスフェクションにはさらに、サイトメガロウイルスプロモーターを内部対照とする発現ベクター（ｐＣＭＶ−β−ｇａｌ）を含有した。このような研究での使用に適した構築物は、都合よくサイトメガロウイルス発現ベクター（ｐＣＭＶ）中にクローニングすることができる。例えば、ｐＣＭＶ−β−ｇａｌは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーの制御下で発現する大腸菌β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有している。当該技術分野で公知の他のベクターを本発明の方法に用いることもできる。
【００３４】
本明細書に記載の研究での使用に適した、以下に示す既述の完全長タンパク質をコードする遺伝子を、サイトメガロウイルス発現ベクター中にクローニングした。本出願における受託番号は全て、ＧｅｎＢａｎｋの受託番号とする。受容体断片を含有するＧＡＬ４融合物は、以下のタンパク質配列をｐＳＧ４２４４５由来の酵母ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１〜１４７）のＣ末端へ融合させることにより構築した：ＧＡＬ４−ＳＲＣ１（ヒトＳＲＣ−１、Ａｓｐ ６１７−Ａｓｐ ７６９、受託番号Ｕ５９３０２）、ＧＡＬ４−ＡＣＴＲ（ヒトＡＣＴＲ、Ａｌａ ６１６−Ｇｌｎ ７６８、受託番号ＡＦ０３６８９２）、ＧＡＬ４−ＧＲＩＰ（マウスＧＲＩＰ１、Ａｒｇ ６２５−Ｌｙｓ ７６５、受託番号Ｕ３９０６０）、ＧＡＬ４−ＰＢＰ（ヒトＰＢＰ、Ｖａｌ ５７４−Ｓｅｒ ６４９、受託番号ＡＦ２８３８１２）、ＧＡＬ４−ＳＭＲＴ（ヒトＳＭＲＴ、Ａｒｇ １１０９−Ｇｌｙ １３３０、受託番号Ｕ３７１４６）およびＧＡＬ４−ＮＣｏＲ（マウスＮＣｏＲ、Ａｒｇ ２０６５−Ｇｌｙ ２２８７、受託番号Ｕ３５３１２）。ＶＰ１６融合物には、７８アミノ酸ヘルペスウイルスＶＰ１６トランス活性化ドメイン（Ａｌａ ４１３−Ｇｌｙ ４９０、受託番号Ｘ０３１４１）を以下のタンパク質：ＶＰ−ＳＸＲ（完全長、ヒトＳＸＲ、受託番号ＡＦ０６１０５６）、のＮ末端へ融合させたものを含有させた１１，１６，２２，２４。
【００３５】
試験対象の受容体または受容体ドメインの活性化と比較するための対照遺伝子として使用するＣＭＶ−β−ｇａｌは、ｐＣＨ１１０由来の大腸菌β−ガラクトシダーゼコード配列（受託番号Ｕ０２４４５）を含有している。この遺伝子は手頃だったため本発明で使用したが、入手可能なそして活性化を測定するのに簡便なアッセイが存在するいずれかの非関連遺伝子を本発明の方法の際の対照として使用してもよい。
【００３６】
活性化アッセイ用のＣＶ−１細胞を、１０％樹脂炭ストリップ化（ｒｅｓｉｎ ｃｈａｒｃｏａｌ−ｓｔｒｉｐｐｅｄ）ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリンＧおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンスルフェートを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ−ＦＢＳ）中、３７℃、５％ＣＯ２にて増殖させた。トランスフェクション前日に、細胞を５０〜８０％コンフルエントとなるようにフェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳを用いて平板培養した。
【００３７】
リポフェクションにより細胞を一過的にトランスフェクトしたが、本発明の趣旨を逸脱しなければＤＮＡを細胞へトランスフェクトする他の方法を用いることもできる。ルシフェラーゼレポーター構築物（３００ｎｇ／１０５細胞）およびサイトメガロウイルス駆動型発現ベクター（２０〜５０ｎｇ／１０５細胞）を、内部対照であるＣＭＶ−β−ｇａｌ（５００ｎｇ／１０５細胞）と共に添加した。２時間後、リポソームを除去し、試験胆汁酸と他の化合物を含有するフェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳで細胞を約１６時間処理した。
【００３８】
ＳＸＲの阻害剤についての候補であれば、いずれの化合物も本方法で試験することができる。通常、複数の異なる濃度にて化合物を試験する。リガンドと接触させた後、細胞を回収し、ルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性（内部対照）または任意の所望のレポーター遺伝子の活性についてアッセイした。
【００３９】
レポーター遺伝子の活性は簡便には、内部対照に対して標準化することができ、データは未処理細胞に対する活性化倍率としてプロットできる。該アッセイ系に適合するものであれば、いずれの応答エレメントを使用してもよい。核内受容体が結合するＤＮＡ配列（ホルモン応答エレメントまたはＨＲＥ）に機能上相同なオリゴヌクレオチド配列は、本発明の方法での使用が考えられる。機能上相同な配列とは、アッセイ条件下で受容体、受容体へテロ二量体または所定のＤＮＡ結合ドメインに結合する配列である。機能上相同な配列は経験的に容易に決定される。応答エレメントは、当該技術分野で公知の方法により、該応答エレメントの核内受容体への結合を向上または低下させるように改変できる。
【００４０】
本発明者らは、オーファン核内受容体ＳＸＲが、ｍｄｒ１遺伝子の転写を活性化し得ることを見出した。このことより、本発明者らは、ｍｄｒ１転写に対するＥＴ−７４３の転写阻害作用がＳＸＲによって仲介されていると仮定した。実際に、ＥＴ−７４３は細胞傷害性に必要な濃度に匹敵する濃度（ＩＣ５０＝５ ｎＭ）にてＳＸＲを阻害した。これらのデータは、ＥＴ−７４３と、ナノモル濃度の該薬物に応答する分子標的であるＳＸＲとの間に関連があることを示している。さらに、ＥＴ−７４３をＳＸＲ活性のモジュレーターであるとすると、これらのデータからは、ＳＸＲが、低分子量抗新生物剤の同定を目的としたハイスループットスクリーニングの分子標的であることが示される。
【００４１】
ＥＴ−７４３はかなり有望であるものの、その最終的な有用性は、該化合物が海洋尾索類（Ｅｃｔｅｉｎａｓｃｉｄｉａ ｔｕｒｂｉｎａｔａ）に由来し、かつ、大量精製または大量合成が難しいという事実によって制限されてしまう可能性がある１，４６。このような欠点にも拘わらず、ＥＴ−７４３の分子標的、例えばＳＸＲ等を同定することにより、代替となる合成物または天然物ＳＸＲ阻害剤をスクリーニングするための、迅速かつ信頼性の高いハイスループットアプローチが提供される。最終的には、エストロゲン受容体（ＥＲ）発現について乳癌をスクリーニングすることで、ＥＲアンタゴニストであるタモキシフェンへの応答が予測される４７のとまさに同様に、ＳＸＲをＥＴ−７４３の標的として同定および確認することで、個々の腫瘍がＥＴ−７４３に応答する可能性を予測する臨床ツールを得ることができる。
【００４２】
一般的方法
一過性トランスフェクションアッセイ
ＣＶ−１細胞を１０％樹脂炭ストリップ化ウシ胎児血清、５０Ｕ／ｍｌペニシリンＧおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンスルフェートを添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ−ＦＢＳ）中、３７℃、５％ＣＯ２にて増殖させた。トランスフェクション前日に、細胞を５０〜８０％コンフルエントとなるようにフェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳを用いて平板培養した。既述の方法に従って４８、リポフェクションにより細胞を一過的にトランスフェクトした。適切なホルモン応答エレメントに連結したヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター（−１０５／＋５１）を含有するルシフェラーゼレポーター構築物（３００ｎｇ／１０５細胞）およびサイトメガロウイルス駆動型発現ベクター（２０〜５０ｎｇ／１０５細胞）を、内部対照であるＣＭＶ−β−ｇａｌと共に添加した。哺乳動物発現ベクターでは、サイトメガロウイルスプロモーター／エンハンサーを利用する。リポソームと２時間インキュベートした後、リポソームを除去し、適切な濃度のアゴニストまたはアンタゴニストを含有するフェノールレッド不含ＤＭＥＭ−ＦＢＳで細胞を約１６時間処理した。リガンドに曝露させた後、細胞を回収し、既知の方法に従ってルシフェラーゼおよび／またはβ−ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。
【００４３】
ヒトＬＳ１８０細胞を、１０％ウシ胎児血清、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、５０Ｕ／ｍｌペニシリンＧおよび５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンスルフェートを添加したイーグル最小必須培地中で維持した。処理前日に、ＬＳ１８０細胞を、１０％樹脂炭ストリップ化ウシ胎児血清を含有するフェノールレッド不含培地へ移し変え、所定の化合物でさらに２４時間処理した。ノーザンブロットを全ＲＮＡから調製し、以下のプローブを用いて分析した：ｍｄｒ１（受託番号ＮＭ ０００９２７、ヌクレオチド８４３−１１１１）、ｃｙｐ３Ａ４（受託番号Ｍ１８９０７、ヌクレオチド１５２１−２０５８）、および、対照としてＧＡＰＤＨ（受託番号ＮＭ ００２０４６、ヌクレオチド１０１−３３１）。
【００４４】
用語「機能的な会合」とは、２つ以上のタンパク質またはその断片の相互作用を意味し、天然の状態であってもよく、また、ハイブリッド分子の一部をなしていてもよく、ハイブリッド分子の一部をなす場合の相互作用は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏにてこのようなタンパク質または断片間で生じる会合を模倣するものである。相互作用は、２つの特異的なタンパク質どうしが直接接触する必要はなく、むしろ、間接的な相互作用であってよい（例えば、タンパク質が複合体の一部をなしていてもよい）。ツーハイブリッド転写アッセイでは、２つのタンパク質またはタンパク質断片は、一方の断片をＤＮＡ結合ドメインとのハイブリッドタンパク質として発現させ、他方を転写アクチベーターとのハイブリッドタンパク質として発現させると、機能的に会合する。この系では、２つのタンパク質断片が機能的に会合すると、ＤＮＡ結合ドメインによって認識されるＤＮＡ領域に転写アクチベーターが局在化し、続いてＤＮＡ結合ドメインに機能し得る形で連結しているレポーター遺伝子が発現される２２。
【００４５】
【実施例】
以下の実施例において本発明をさらに詳細に説明するが、これらの実施例は説明のためのものであって、本発明のどのような制限をも意図したものではない。当該技術分野で周知の常法または本明細書中で具体的に記述した他の方法を利用した。
【００４６】
実施例１
本実施例では、リガンドによって活性化されたＳＸＲがエクチナサイジン−７４３によって阻害されることを示す。ＥＴ−７４３がｍｄｒ１転写の強力な阻害剤であることは既に公知であった１１。従って本発明者らは、ＥＴ−７４３がＳＸＲ活性を抑制することによりｍｄｒ１を阻害するものと仮定した。図１Ａ〜１Ｄには、ＳＸＲおよびｍｄｒ１のリガンド誘導活性化のＥＴ−７４３阻害の結果を示す。５０ｎＭのＥＴ−７４３による阻害では、リガンド活性化ＳＸＲ転写が完全に抑制された（図１Ａ）。この作用は、ＥＴ−７４３が基本的なレポーター活性またはリガンド未結合状態のＳＸＲには作用しないという点で特異的であった。
【００４７】
この作用の特異性をさらに検討するため、本発明者らは、ＥＴ−７４３が、構成的なアンドロスタン受容体、ＣＡＲβ、によるトランス活性化を阻害し得るか否かを決定した。ＳＸＲおよびＣＡＲβは、そのＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインにおいて高い配列類似性を有する近縁の受容体であり、共通する応答エレメントおよびリガンドに結合することが示された４２。ＣＡＲβは強力な構成的活性を示したが、該活性は逆アゴニストであるアンドロスタノールによって抑制された（図１Ｂ）。これに対し、ＥＴ−７４３はＣＡＲβには作用しなかったことより、ＥＴ−７４３の阻害作用に対して特異性が存在することが明らかとなった。
【００４８】
本発明者らは次に、ＥＴ−７４３による阻害についてＩＣ５０値を求め、本薬物の細胞傷害作用について報告されているＩＣ５０値と比較した。野生型またはＧＡＬ−Ｌ−ＳＸＲのいずれかを用いた用量応答研究（図１Ｃ）からは、ＥＴ−７４３がリガンド活性化ＳＸＲを３ｎＭのＩＣ５０値で阻害したことが判明した。さらに、内在性ｍｄｒ１遺伝子のＳＸＲ介在型活性化を抑制するには、２０ｎＭのＥＴ−７４３で十分であった（図１Ｄ）。従って、ＳＸＲに対して観察されたＥＴ−７４３の作用は、本薬物の細胞傷害作用について報告されたＩＣ５０値２，４の範囲内に十分収まる。このように、ＥＴ−７４３に従来結びつけられた他の生化学的事象とは違って、ＳＸＲの阻害は、細胞の致死に十分なナノモル濃度のＥＴ−７４３に応答するのは分子標的だけであることを示している。
【００４９】
現在までの結果からは、ＥＴ−７４３が、ｍｄｒ１のトリコスタチン誘導型転写を阻害することが示された９。トリコスタチンはヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）酵素の阻害剤であり、該酵素は、リガンド未結合状態の核内受容体と相互作用するコリプレッサー複合体の一部をなすものである。哺乳動物ツーハイブリッドアッセイを用いて、本発明者らは、コリプレッサーＳＭＲＴがリガンド未結合状態のＳＸＲと相互作用し、かつ、ＳＸＲリガンドによってＳＭＲＴが外れることを見出した。従って、ＳＸＲリガンドとＨＤＡＣ阻害剤は、ＳＸＲ−関連性ＨＤＡＣ活性を失わせるか、または、これを阻害する。これらの観察から、ＥＴ−７４３がｍｄｒ１転写とＳＸＲ活性を阻害し得ることを説明する統一的なメカニズムが明らかである。
【００５０】
これらの結果より、ＳＸＲのリガンド誘導活性化がＥＴ−７４３によって阻害されることが示される。ＣＶ−１細胞をトランスフェクトし、リガンドの存在下（＋）または不在下（−）および５０ｎＭのＥＴ−７４３の存在下または不在下にて処理した（図１Ａ）。各処理に対し、レポーター遺伝子の活性を測定して活性化倍率をプロットした。図１ＢからはＥＴ−７４３がＣＡＲβに作用しないことが示される。ＣＶ−１細胞をＣＡＲβの発現ベクターでトランスフェクトしたものとしなかったものを、ＣＡＲβのアンタゴニストであるアンドロスタノール（５μＭ）またはＥＴ−７４３（５０ｎＭ）のいずれかで処理した。図１Ｃには、野生型およびＧＡＬ−Ｌ−ＳＸＲのＥＴ−７４３による阻害の用量応答を示す。細胞を野生型またはＧＡＬ−Ｌ−ＳＸＲのいずれか、および、対応するレポーターでトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞を培地または１０μＭのＳＲ１２８１３もしくはＳＲ１２８１３と所定濃度のＥＴ−７４３を添加した培地中に維持した。図１Ｄには、ＳＸＲリガンドＳＲ１２８１３＋／−２０ｎＭ ＥＴ−７４３で処理したＬＳ１８０細胞のノーザンブロット分析の結果を示す。図１Ｄから明らかなように、ＥＴ−７４３はｍｄｒ１遺伝子のＳＸＲ介在型活性化を阻害する。
【００５１】
実施例２
哺乳動物ツーハイブリッドアッセイを利用して、ＳＸＲの場合のコレギュレーターの動員に対するＥＴ−７４３類似体Ｐｔ６５０の作用を測定した。ＣＶ−１細胞を上記の通り、所定のハイブリッド発現ベクターおよび内部対照としてのβ−ガラクトシダーゼベクターでトランスフェクトした。レポーター活性を測定して内部β−ガラクトシダーゼ対照に対して標準化し、内部β−ガラクトシダーゼ活性の割合として記録する。ＣＶ−１細胞をＧＡＬ４レポーター構築物、および、ＳＸＲのリガンド結合ドメインに連結されたＶＰ１６トランス活性化ドメイン（ＶＰ−Ｌ−ＳＸＲ）を含有するＤＮＡ転写アクチベーターである第１ハイブリッドタンパク質をコードする発現ベクターで一過的にトランスフェクトした。また、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインを単独でコードする発現ベクター、あるいは、上述したような核内受容体コアクチベーターＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、ＧＲＩＰもしくはＰＢＰまたは核内受容体コリプレッサーＳＭＲＴもしくはＮＣｏＲの受容体相互作用ドメインに連結されたＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメインである第２ハイブリッドタンパク質をコードする発現ベクターでも細胞をトランスフェクトした。ＧＡＬ４レポーター構築物は、酵母ＧＡＬ４上流活性化配列を４コピー含んでおり、該配列には、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターおよびルシフェラーゼレポーター遺伝子を機能し得る形で連結させた（ＵＡＳＧｘ４−ＴＫ−ｌｕｃ）。
【００５２】
トランスフェクション後、細胞を対照培地または所定のＳＸＲアゴニストリガンドもしくはＰｔ６５０を含有する培地で処理した。Ｐｔ６５０は２０ｎＭの濃度で添加し、各ＳＸＲアゴニストリガンドは所定の濃度で添加した。本系では、核内受容体ＳＸＲアゴニストリガンドが第１ハイブリッドタンパク質の核内受容体リガンド結合ドメインと相互作用し、その結果、第１ハイブリッドの核内受容体リガンド結合ドメインに構造変化が生じ、かつ、該リガンド結合ドメインが第２ハイブリッドのコアクチベーターと会合すると、ルシフェラーゼレポーター発現が活性化される。本系では、ＧＡＬ４−コアクチベーターまたはハイブリッドと核内受容体リガンド結合ドメイン−ＶＰ転写アクチベーターハイブリッドとが会合することで、ＶＰ転写アクチベーターがＧＡＬ４ ＤＮＡ結合配列へ動員される。ＶＰ転写アクチベーターが動員されることにより、レポーター遺伝子構築物のＴＫプロモーターからルシフェラーゼ遺伝子が転写および発現される。
【００５３】
コリプレッサーの場合には、第１ハイブリッドタンパク質の核内受容体リガンド結合ドメインが第２ハイブリッドのコリプレッサーとアゴニストリガンドの不在下で相互作用すると、ルシフェラーゼレポーター発現が活性化される。ＳＸＲリガンドは、第１ハイブリッドの核内受容体リガンド結合ドメインの構造を変化させ、リガンド結合ドメインと第２ハイブリッドのコリプレッサーとの会合を阻害する。この結果、レポーター遺伝子構築物のＴＫプロモーターからのルシフェラーゼ遺伝子の転写活性化は起こらない。
【００５４】
本発明から逸脱することなく、本系において、レポーター遺伝子、プロモーターおよび転写アクチベーターを置換し得ることは、関連技術分野の当業者には容易に認められるであろう。核内受容体リガンド結合ドメインとコアクチベーターまたはコリプレッサーとの機能的な相互作用を検出し得るものであれば、いずれのレポーター遺伝子−プロモーター−上流アクチベーター構築物を利用してもよい。
【００５５】
実施例２の結果を表１に示す。ＥＴ−７４３類似体Ｐｔ６５０はコアクチベーターをアゴニスト結合ＳＸＲから外し、かつ、コリプレッサーがアゴニスト結合ＳＸＲから外れるのを戻すことが分かる。ＥＴ−７４３も同様に機能する。これらの結果から、本系を使用すれば、アゴニストによって活性化されたＳＸＲを、コリプレッサーを外してコアクチベーターを動員する能力も含めて、阻害することのできるＥＴ−７４３の機能上等価な化合物を見出すことが可能である。
【００５６】
【表１】
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【００５７】
【表２】
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【００５８】
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【００５９】
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【００６０】
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【００６１】
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【００６２】
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【図面の簡単な説明】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、ＳＸＲのリガンド誘導活性化およびｍｄｒ１発現のＥＴ−７４３による阻害を示す。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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