(57)【要約】本発明は、液内培養で増殖される、新規かつ別の、より高等な担子菌類キノコの菌株について述べる。具体的には、トレメラ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ）属の種の新規な菌株は、優れた収率の単細胞バイオマスかつ細胞外ヘテロ多糖体グルコノキシルオマナン、ナイアシン及び必須アミノ酸を与える。【特許請求の範囲】
【請求項１】
食用担子菌類キノコの単細胞バイオマスおよび細胞外多糖体の製造方法であって、栄養培地による液内培養で担子菌類の真菌を培養し、得られた食用担子菌類のバイオマスおよび細胞外多糖体を前記培養のブロスからアルコール沈殿によって単離すること、を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
担子菌類の真菌が、トレメラ・メセンテリカからなる群より選択されるトレメラ属の種である、請求項１に記載の食用担子菌類キノコのバイオマスおよび細胞外多糖体の製造方法。
【請求項３】
担子菌類の真菌が、血糖降下化合物、必須アミノ酸又はナイアシンを含む栄養物を産生する、請求項１に記載の食用担子菌類キノコのバイオマスおよび細胞外多糖体の製造方法。
【請求項４】
栄養培地が、以下の組成のものである、請求項１に記載の食用担子菌類キノコのバイオマスの製造方法。
2004514403.tif 000016
【請求項５】
栄養培地が、以下の組成のものである、請求項１に記載の食用担子菌類キノコのバイオマスおよび細胞外多糖の製造方法。
2004514403.tif 000017
【請求項６】
真菌が、トレメラ・メセンテリカ ＣＢＳ １０１９３９である、請求項１に記載の食用担子菌類キノコのバイオマスの製造方法。
【請求項７】
前記真菌が、トレメラ・ルシフォルミス、Ｔ． アウランティア、Ｔ．エンセファラ、及びＴ． メセンテリカからなる群より選択される、請求項１に記載の食用担子菌類キノコのバイオマスの製造方法。
【請求項８】
哺乳類のブドウ糖の血中濃度を下げるための組成物であって、乾燥担子菌類バイオマスの栄養補助処方を有することを特徴とする前記組成物。
【請求項９】
乾燥担子菌類バイオマスが、ブドウ糖−低減化合物、グルクロンオキシロマンナン、多糖類、繊維、タンパク質、必須アミノ酸、ビタミン又はナイアシンを含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
乾燥担子菌類バイオマスおよび細胞外多糖体が、トレメラ・メセンテリカ ＣＢ １０１９３９から産生される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
乾燥担子菌類バイオマスおよび細胞外多糖体が、トレメラ・ルシフォルミス、Ｔ． アウランティア、Ｔ．エンセファラ、及びＴ． メセンテリカからなる群より選択される真菌から産生される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１２】
乾燥担子菌類バイオマスおよび細胞外多糖体が、ブドウ糖の血中濃度を下げるための有効量で、経口投与用に許容性の製薬キャリヤーと共に使用される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１３】
乾燥担子菌類バイオマスおよび細胞外多糖体が、糖尿病を阻害するのに有効量で使用される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１４】
前記乾燥担子菌類バイオマスおよび細胞外多糖体が、ヒト免疫不全症を含む種々の病気を阻害するのに有効量で使用される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１５】
血糖降下のために患者を治療する方法であって、前記患者に、血清ブドウ糖の濃度を下げるのに有効量の、食用バイオマスの担子菌類かつ細胞外多糖体を含有するブドウ糖−低減化合物を含む組成物を投与する工程、を有することを特徴とする前記方法。
【請求項１６】
前記量が、ブドウ糖の血中濃度を約２０％〜５０％下げるのに有効である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
担子菌類のバイオマスがトレメラ属の種の真菌から産生される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
真菌の種が、トレメラ・ルシフォルミス、Ｔ． アウランティア、Ｔ．エンセファラ、及びＴ． メセンテリカからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
担子菌類バイオマスが、トレメラ・メセンテリカＣＢ １０１９３９から産生される、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は、生物学的に有効な栄養補助剤の優れた収量を生成するための、様々な高等担子菌類キノコの特定の培地を使用する培養法に関する。この栄養補助剤は、簡単な１工程法により単離され、かつ全般的に正常な生体機能を達成するため、及び特に高血糖症を制御するための食餌療法用サプリメントとして使用するために製剤される。更に詳細に述べると、本発明は、トレメラ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ）属に属する食用高等担子菌類キノコの液内培養（ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｃｕｌｔｕｒｅ）により得られた培養ブロスからの、医学的特性を有する多糖グルクロンオキシロマンナン、並びに必須アミノ酸及びビタミンに富んだバイオマス（ｂｉｏｍａｓｓ）の製造法に関する。
【０００２】
（１．発明の背景）
肉眼で見るのに十分な寸法の明確な子実体を有するキノコ及びマクロ真菌は、可食性が異なるおよそ１０，０００種を含む。およそ １００種が培養について試験されており、かつわずかに７〜８種が工業的規模で培養されている。１９９４年の栽培された食用キノコの世界中での製造は、約５００万トンと推定され、かつ１００億米ドルの価値があった。栽培された食用キノコのもっとも一般的な種は、Ａｇａｒｉｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｕｓ （Ｊ． Ｌｇｅ） Ｉｍｂａｃｈ、Ａ． ｂｉｔｏｒｑｕｉｓ （Ｑｕｅｌ．） Ｓａｃｃ．、Ｌｅｎｔｉｎｕｓ ｅｄｏｄｅｓ （Ｂｅｒｋ．） Ｓｔｒｉｎｇ．、Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ種、Ａｕｒｉｃｕｌａｒｉａ種、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ ｖｏｌｖａｃｅａ （Ｆｒ．） Ｓｉｎｇ．、Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ （Ｆｒ．） Ｓｉｎｇ、Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ Ｂｅｒｋ、Ｈｙｐｓｉｚｙｇｕｓ ｍａｒｍｏｒｅｕｓ （Ｐｅｃｋ） Ｂｉｇｅｌ．、Ｐｈｏｌｉｔａ ｎａｍｅｋｏ （Ｔ． Ｉｔｏ） Ｓ． Ｉｔｏ ｅｔ Ｉｍａｉ、Ｇｒｉｆｏｌａ ｆｒｏｎｄｏｓａ （Ｄｉｃｋｓ．： Ｆｒ．） Ｓ．Ｆ． Ｇｒａｙ、Ｈｅｒｉｃｉｕｍ ｅｒｉｎａｃｅｕｓ （Ｂｕｌｌ： Ｆｒ．） Ｐｅｒｓ．、Ｄｉｃｔｙｏｐｈｏｒａ ｉｎｄｕｓｉａｔａ （Ｖｅｎｔ．： Ｐｅｒｓ．） Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｓｔｒｏｐｈａｒｉａ ｒｕｇｏｓｏａｎｎｕｌａｔａ Ｆａｒｌ． ａｐｕｄ Ｍｕｒｒ．、Ｌｅｐｉｓｔａ ｎｕｄｄ （Ｂｕｌｌ．： Ｆｒ） Ｃｏｏｋｅ、Ａｇｒｏｃｙｂｅ ａｅｇｅｒｉｔａ （Ｂｒｉｇ．） Ｓｉｎｇ．を含む。
【０００３】
キノコ子実体の栽培は、例えば有害又は有益のいずれかであり得るような、キノコそれ自身及び他の微生物のような生物について論じられている。従って、キノコ栽培において使用される方法は、栽培される領域、入手可能な基質、環境条件及び遭遇した微生物の種に応じた変更を必要とする。
子実体生産のためのキノコ栽培は、最初の子実体が出現するまでに１月から数ヶ月を必要とする長期過程である。更に、これらの方法から得られる生成物の物理化学特性は不明でありかつ制御できないので、子実体からの多糖類の抽出工程は商業化可能であるとはみなされていないことがわかった（Ｏｔｓｕｋａらの米国特許第４，０５１，３１４号）。多糖生産体（ｐｒｏｄｕｃｅｒ）を液内培養することにより、限定された組成の環境的に純粋な培養培地を使用し、制御された条件下で、短期間に一定の組成の最終生成物を得ることが可能となる。
【０００４】
Ｔｒｅｍｅｌｌａ属のいくつかの種が、古代から民間療法薬として使用されている。これらは、Ｔ．フシフォルミス（Ｔ． ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｔ．メセンテリカ（Ｔ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）、Ｔ．アウランティア（Ｔ． ａｕｒａｎｔｉａ）及びＴ．シナバリナ（Ｔ． ｃｉｎｎａｂａｒｉｎａ）であり、これらは全て「健康増強、疾病抵抗性」として特徴付けられている（Ｙａｎｇ Ｑ．ら、Ｍｕｓｈｒｏｏｍ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１２： ６３１−６４３（１９８９））。黄金色の子実体を伴う最後の３種は、漢方薬において俗称「キンジ（Ｋｉｎｊｉ）」として知られており、かつ同等の医学的価値を有するとみなされている（Ｕｋａｉ Ｓ．ら、１９９５年、日本国特許公開第ＪＰ ７，２３８，０３１ Ａ号）。
【０００５】
Ｔｒｅｍｅｌｌａキノコは、いわゆるゼリーキノコ（ｊｅｌｌｙ ｍｕｓｈｒｏｏｍ）に属し、これはゼラチン状の子実体を形成する。ゼリーキノコは、Ｐｈｒａｇｍｏｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓという異なる分類群由来の一群の種であり、これは乾燥すると角質構造（ｈｏｒｎｙ ｔｅｘｔｕｒｅ）になることにより渇水時に長期生存が可能である。再度湿潤することができるならば、これらは水分を吸収し、かつゼラチン状となる。ゼリーキノコのこの特徴は、乾燥子実体の６０〜７０％を構成している特異的に水を吸収する多糖の存在に起因している。他の医療用キノコのβ−１−３−グルカン多糖とは異なり、ゼリーキノコの多糖は、グルコースに加え他の糖類からなり、従ってヘテロ多糖類に属する。Ｔｒｅｍｅｌｌａキノコ特有の性質は、他の医療用キノコにおいて薬学的活性のある多糖はそのバイオマスのごく一部分のみを構成しているのに対し、Ｔｒｅｍｅｌｌａキノコの薬学活性のある多糖類は、構造的子実体多糖のほとんどを構成していることである。例えば、シイタケキノコにおいては、新鮮なキノコ２００ｋｇからわずかに３１ｇのレンチナンが抽出された（Ｍｉｚｕｎｏ、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ、１：７−２７（１９９９）。
【０００６】
Ｔｒｅｍｅｌｌａ由来の主な薬学活性のある物質は、側鎖に主にキシロース及びグルクロン酸を伴う１，３−連結したα−Ｄ−マンノースの直線状骨格からなる、多糖グルクロンオキシロマンナン（ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｘｙｌｏｍａｎｎａｎ）である。Ｔｒｅｍｅｌｌａグルクロンオキシロマンナンの化学構造は、例え１つの種のものであっても異なる試料間で差があり、ある程度は多糖をベースにした同定法の種類に関連してのかもしれない。Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓのキシロース：グルクロン酸：マンノースの一般的割合は、１．０：２．７７：４．９であり；Ｔ． ａｕｒａｎｔｔａでは２：１：４であり；及びＴ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａでは７：１：５である（Ｆｒａｓｅｒ ＣＥら、Ｃａｎ Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５１： ２１９−２２４（１９７３））。グルコース及びフコース、キシロビオース及びフルクトースのような、いくつかの追加の糖類を、Ｔ． ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓの様々な試料において同定することができる。
【０００７】
Ｔｒｅｍｅｌｌａのいくつかの種は、低コレステロール血症活性を有することが示されているグルクロンオキシロマンナンを生成する。高血圧及び糖尿病を惹起する高コレステロール血症及び異常リポタンパク質血症は、虚血性の心臓病理学的及び脳血管の事象を決定する主要なリスク因子である。高コレステロール血症は、血中コレステロール比の２ｇ／ｌ以上の上昇と定義される。異常リポタンパク質血症は、多様なリポタンパク質レベルの障害に併発し、動脈壁に脂肪沈着を招く。ラットにおいて、高コレステロール血症食事（１．５％コレステロール、５％脂肪）中の５％乾燥粉末として摂取されたＴｒｅｍｅｌｌａ ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ子実体は、４週間のキノコ食事摂取の後、血清中総コレステロール濃度を１９％低下した。血清中低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）及びトリアシルグリセロールレベルにおいても同様の有意差が認められた（Ｃｈｅｕｎｇ． ＰＣＫ、Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｓ．、１６： １７２１−１７２５（１９９６））。
【０００８】
Ｔ． ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ子実体及び純粋な培養物の両方からの多糖の抗高脂血症作用は、これまでに説明されており（Ｊａｎｈｅ Ｓ．ら、Ｊ． Ｃｈｉｎａ Ｐｈａｒｍ． Ｕｎｉｖ．、２０：３４４−３４７（１９８９））、Ｔｒｅｍｅｌｌａ多糖が、アテローム性動脈硬化症の予防及び治療における食事療法用サプリメントとして有用であることが提唱されている（Ｒｙｏｎｇ ＬＨら、Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ． Ｒｅｓ．、１７：１０９１１１（１９８９））。加えて、Ｔｒｅｍｅｌｌａ多糖は、慢性肝炎症例において肝保護作用を有する（Ｘｉｏｎｇ ＨＺｒら、Ｃｈｉｎ． Ｊ． Ａｎｔｉｂｉｏｔ．、１０： ３６３−３６５（１９８５））。
【０００９】
トレメラ・アウランティア（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａ）は、正常マウス並びにストレプトゾシン−誘発型糖尿病及び遺伝的糖尿病の２種の糖尿病マウスモデルにおいて低血糖活性を有することがわかっている。糖尿病は、異なる２つの血液検体に基づく評価で絶食時血糖値の１．４ｇ／ｌ以上の上昇と定義される。インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤ）は、インスリン分泌の異常に対応し；心血管系合併症が、重大かつ持続性の高血糖に起因し、尿中のタンパク質の残留を生じる。Ｔｈｅｍｅｌｌａ ａｕｒａｎｔｉａ子実体多糖（ＴＡＰ）は、単に腹腔内投与のみでなはく、経口投与後にも（０．５ｇ／ｌ ＴＡＰ）、高血糖症に有効であることがわかった。Ｔ． ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ多糖について、アロキサン−又はストレプトゾシン−誘発型糖尿病マウスの予防又は治療における同様の作用が示された（Ｘｕｅ Ｗ．ら、Ｊ． Ｃｈｉｎａ Ｐｈａｒｍ． Ｕｎｉｖ．、２０； １８１−１８３（１９８９））。正常マウスにおける低血糖活性の機序が、少なくともインスリン分泌の増加、及びグルコース代謝の促進に関連していることが提唱されている（Ｋｉｈｏ， Ｔ．ら、Ｙａｋｕｇａｋｕ−Ｚａｓｓｈｉ、４，１１４：３０８−３１５（１９９４））。
【００１０】
Ｔ． ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ由来の酸性（ａｃｉｄ）ヘテログリカンは、サイトカイン−刺激活性を有することがわかった。分子量５５０〜４８ＫＤａの ４種の酸性ヘテログリカンが、その子実体から単離されている。それらの酸性ヘテログリカンのこれら及び他の断片も同じく、インターロイキン−６を分泌する単球を強く誘導し、このことは、その活性が、４種のヘテログリカン及びそれらの断片の（１→３）−マンナンの共通の構造により引き起されることを示唆している。つまり、分子量の変化は、ヘテログリカンの活性に明らかな影響を有さない（Ｇａｏ Ｑ．ら、Ｃａｒｂｏｎ Ｒｅｓ．、２８３：１３５−１４２（１９９６））。
【００１１】
天然に増殖したもしくは人工的に培養したＴｒｅｍｅｌｌａキノコの子実体は、様々な種類のＴｒｅｍｅｌｌａ健康維持栄養剤又は医療用食事、ドリンク剤又は飲料の開発について最近１０年間に広く使用されている（中国特許第１１２５０６５号；第１１０９３００号；第１１０２３０５号；第１０９９９４６号；第１０９１２６３号；第１０３２３６２号；第１０７２８２９号；第１０６６９６４号；第１０４４０３６号；第１２０４４７４号；第１１７８１２２；第１１１４８７１号；日本国特許第６１５３８７９号；第６３３９３５４号；第 ６００７５２７９号）。
【００１２】
これらのＴｒｅｍｅｌｌａ−による副生成物は、該キノコの菌糸体又は子実体のいずれかから精製され／部分的に限定された抽出物である「キノコ栄養補助剤（ｍｕｓｈｒｏｏｍ ｎｕｔｒｉｃｅｕｔｉｃａｌ）」として分類することができ、これはカプセル剤又は錠剤の形状で食餌療法用サプリメント又は機能性食品として消費され、かつこれは潜在的な治療用途を有する（Ｃｈａｎｇ ＳＴ、Ｉｎｔ． Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ、１： １−７（１９９９））。このように、栄養補助剤は、通常食の一部として消費される「栄養補給食品（ｎｕｔｒａｃｅｕｔｉｃａｌ）」とは異なり、健康をもたらす利点を提供するように何らかの方法で修飾／濃縮され得る。従って、栄養補助剤の濃縮された組成物は、キノコの適当な株を選択し及び／又は培地の培養条件を最適化することにより調製される。従って、ヒトが消費するための栄養補助剤としての承認のための規制要件は、栄養補給剤としてのものよりも一層厳格である。
【００１３】
しかし、医療用キノコの子実体由来の栄養補給剤の製品は、様々な栄養素の品質及び量が非常に多様であり、その結果高度の製品品質の再現性を保証するための標準プロトコールがないことはわかっている（Ｃｈａｎｇ ＳＴら、Ｉｎｔ． Ｊ． ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｍｕｓｈｒｏｏｍｓ、１：１３９−１４６（１９９９））。そのため、その中に存在する栄養素の種類及びレベルに関して比較的均質の栄養補助剤組成を有することが一般に望ましい。概して、異なるキノコ株の栽培において、純粋な培養物中の子実体及び菌糸体から抽出された多糖は、本質的に同一ではないが、しかし両方とも薬学的に活性があることはわかっている。Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ多糖のキシロース：グルクロン酸：マンノースの割合は、子実体由来のもの（１．０：２．７７：４．９）、及び異なるハプロイドの酵母様出芽株の純粋な培養物から得られたもの（１：０．８〜１．３：２．１〜３．５）について、わずかな差があることが認められる（Ｋａｋｕｔａ Ｍ．ら、Ａｇｉｃ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、４３：１６５９−１６６８（１９７９））。Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｆｕｃｉｆｏｒｍｓ多糖は、低コレステロール血症作用を有し、これは高コレステロール食に液内培養−由来の多糖を追加したラットにおいて試験した場合、子実体の多糖に特徴的であった。
【００１４】
あるいは、半固形培地上において、この基質から子実体が除去された後に、人工的に増殖している菌糸体から、Ｔｈｅｍｅｌｌａプロテオグリカンを作成する酸性法（ａｃｉｄｉｃ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）が開示されている（中国特許第１０７１０６０号）。Ｔｈｅｍｅｌｌａの純粋な培養物は、Ｔｈｅｍｅｌｌａ株が、主原料としてジャガイモで製造された液体培地に接種された場合に、発酵飲料の製造において使用された。発酵液は、濾過後、Ｔｒｅｍｅｌｌａ多糖飲料へと直接製造され、かつ更に粗Ｔｒｅｍｅｌｌａ多糖粉末を得るために、濃縮及び乾燥することができる（中国特許第１０６９８６６号；第１０５７９５４号）。Ｔｒｅｍｅｌｌａの栄養的及び医療的価値を完全に具体化しているこの栄養レベルの高い飲料は、ヒト免疫に対する作用を増強しかつ老化防止、抗腫瘍又は抗高脂血症作用を発揮するため提唱されている。
【００１５】
担子菌種のＣｏｒｉｏｌｕｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ純粋培養物の増殖率を増大する具体的方法が開発された（米国特許第４１５９２２５号）。これは、液体培地において粉砕又は剪断のような機械的処置を受けながら、この種の二核相（ｄｙｃａｒｉｏｔｉｃ）菌糸体が液内培養された場合に、この菌糸体は、固有の形態学的特徴であるクランプ連結（ｃｌａｍｐ ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）を喪失し、単核相菌糸体へと変化し、このようにして形成された単核相菌糸体は、安定であり、公知の二核相菌糸体と比べてその極めて高い増殖能という独自の特性を有することがわかっている。
【００１６】
Ｔｒｅｍｅｌｌａ種が属する一部のヘテロ担子菌種に特有の特徴は、それらの単核相（ハプロイド）株が、酵母様出芽細胞の形で増殖することができ、かつこれらの単核相株は、二核相菌糸体の粉砕によるのではなく、担子胞子プリント（ｐｒｉｎｔ）からのモノ担子菌（ｍｏｎｏｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｕｓ）培養物の出現によって得らることである。Ｔ−９ハプロイド株（ＦＥＲＭ Ｎｏ． ９４１９）を液内培養することにより得られた酵母様細胞を他の成分と配合しコレステロール上昇に阻害作用を有する食品及び飲料を製造する場合に、Ｔｒｅｒｍｅｌｌａ ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ食品及び飲料を製造するためにこの生物学的現象が使用された（日本国特許第１０２００７０号）。これまでは、Ｔｒｅｍｅｌｌａの単細胞培養物は、低血糖活性を有する化合物を製造するために使用されておらず、かつ特にＴｒｅｍｅｌｌａの単細胞培養は、いかなる目的にも使用されていない。
【００１７】
（２．発明の概要）
本発明は、Ｔｒｅｍｅｌｌａ属を含む食用担子菌類キノコの単細胞培養物の、限定された栄養培地を含む液内培養における栽培に関し、前記Ｔｒｅｍｅｌｌａ属担子菌類キノコにはＴｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ、Ｔ． ｆｕｃｉｆｏｒｍｉｓ、Ｔ． ａｕｒａｎｔｉａ、及びＴ． ｅｎｃｅｐｕａｌａが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００１８】
第一の態様において、本発明は、１種以上の低血糖活性を有する物質を生成する特徴を有する、１種以上の担子菌類キノコの液内培養物を栽培する方法を提供する。分子状グルコースを含む糖、窒素の有機又は無機給源、及び様々な塩を含有する本発明の栄養培地の使用は、Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａから選択された食用キノコのハプロイド酵母様出芽培養物の液内培養により、低血糖活性を有するグルクロンオキシロマンナンの生成を増強するために、特に適している。
【００１９】
第二の態様において、本発明は、低血糖化合物をキノコ細胞と共に濃縮し、その結果アルコール沈殿により発酵ブロスからの食用の単細胞バイオマス及び細胞外多糖の簡単な分離を可能にし、これにより更なる抽出、濃縮、精製又は複雑な分離工程を必要としないような方法を提供する。本発明の培養ブロスからの食用担子菌類の簡単な分離に、アルコール抽出後の乾燥が続く。
【００２０】
本発明において、経口消費又は摂取された場合にグルコースの血中レベルを低下するようなグルコース低下化合物である、グルクロンオキシロマンナンを含有する組成物が説明されている。従って本発明及び／又は本発明の治療法は、糖尿病のリスクが高い対象における上昇したグルコースにより引き起こされるリスクの低下に関する。
本発明は、例えばグルクロンオキシロマンナン、ビタミン、必須アミノ酸及び遊離のアミノ酸が豊富なタンパク質のような、健康の促進に概して有益である栄養補助剤成分を含む方法及び組成物を提供することができる。
更に本発明の他の目的及び利点は、一部は自明であり、かつ一部は本願明細書から明らかであろう。
【００２１】
（発明の詳細な記載）
本発明の目的は従来技術の諸欠点を解消することにあり、またｉ） 効果的かつ経済的に、グルコース−濃度低下化合物を製造する方法およびｉｉ） ダイエット用サプリメントとして食することができ、また有用である、栄養補助組成物を提供することにある。
本発明において使用するトレメラ菌株は、イスラエルにおいて、落葉樹上で採取した、天然に生育する子実体から得た。
担子胞子プリント（ｐｒｉｎｔ）は、徐々に減少する湿度条件下にある、保湿室内の滅菌したペトリ皿にある、新たな子実体から得た。これら担子胞子を、滅菌水中に移し、ペトリ皿内の麦芽寒天（プロナディサ（Ｐｒｏｎａｄｉｓａ）、ｐＨ ６．５）表面上に、胞子懸濁液を展開させた。個々の担子胞子から出現する主なコロニーを、無菌的に麦芽寒天斜面上に移した。標準的な「トレメラ属の形態学的および分子的研究（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｔｒｅｍｅｌｌａ）」， Ｃｈｅｅ−Ｊｅｎ Ｃｈ． １９９８年発行、Ｂｉｂｌ． Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａ， Ｂａｎｄ １７４中の、子実体に関する基準を利用し、また既知の種と比較することによって、採取した子実体を、トレメラメセンテリカ Ｒｅｔｚ： Ｆｒ．であるものと決定した。
特許手続きのための、微生物の寄託に関する国際的な承認に基づく、ブタペスト条約に従って、予備テストにおいて最良のポリサッカライド収率を示した、１菌株を、オランダ国セントラルビューローブールシメルカルチャーズ（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌ− ｃｕｌｔｕｒｅｓ）に寄託し、受託番号（Ａｃｃ． Ｎｏ．） ＣＢＳ １０１９３９を得た。
【００２２】
種：トレメラメセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ） Ｒｅｔｚ： Ｆｒ．；
受託番号： ＣＢＳ １０１９３９；
寄託日： １９９９年６月１４日。
トレメラメセンテリカは、極めて複雑なライフサイクルを持つ。他の担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）のキノコとは対照的に、単一の担子胞子が、菌糸および酵母−様の発芽細胞の両者によって、栄養培地上で発芽する（図１）。単担子胞子培養は、ハプロイドであり、即ち各細胞中にただ一つの核のみを含む（図５）。異なる担子胞子を由来とする、２種の許容性単核相細胞を接触させた場合、細胞質融合および核融合が起こり、二核相菌糸体が発生する（図４）。このニ核相菌糸体は、如何なる培養条件下においても、発芽細胞として成長することはできず、従って酵母−様の成長が、キノコ培養のハプロイド状態によって、遺伝的に決定される。このハプロイド培養は、より形成的である。というのは、栄養の不足した培地上でのまたは枯渇的な条件下では、酵母−様の細胞は、ハプロイド菌糸を生成し得る（図２）。他の微生物のような、単細胞の真菌培養は、菌糸体培養よりも、生物工学的工程にとって、より受け入れ易いものである。これは、特に担子菌類のニ核相性培養にとって重要であり、これは無菌菌糸体として成育し、また担子菌類接種源を調製するための特殊な手順が必要とされ、この手順はニ核相菌糸体のホモゲナイゼーションを含む。本発明の該ハプロイド酵母−様発芽培養は、生物工学的な考察ばかりか、菌糸体型よりも多量の多糖類を生産する生理的な属性によって規定されるように、最適の生育形態である（図３）。
【００２３】
多糖類を製造するために、Ｔ．メセンテリカＣＢＳ １０１９３９菌株の培養を、水性培地、例えば良好な生育およびバイオマス蓄積のために使用されている培地中で実施した。このような培地は、該生育中の培養物によって同化される、炭素源、窒素源および無機塩類を含む。Ｔ．メセンテリカは、リグノセルロース材料を利用でき、従ってペントース、ヘキソースおよび多糖類を包含する広範囲の炭水化物が、その生育にとって良好な炭素源である。グルコース、スクロースおよび澱粉、例えば穀粒、コーン粉末等が、単独でまたは炭素源との組み合わせとして利用できる主な成分である。この炭水化物の量は、通常該培地の約３〜５質量％の範囲内で変えることができ、かくして高収率でバイオマスが得られる。
通常有機物形状にある、最良の窒素源は、酵母水解物または抽出物、微生物学的なペプトン、コーンスティープリカー等を含む。単独または組み合わせた該窒素源は、該窒素源中に含まれるＮの含有率に依存して、０．５〜４質量％なる範囲内で使用されるが、純Ｎの含有率は、培地１Ｌにつき約１〜１．５ ｇ である。
【００２４】
該培地に配合できる無機塩類としては、カリウム、アンモニウムおよびマグネシウムのカチオンを含む塩である。生育にとってナトリウムは、全く必要とされない。有用なカチオンは、リン酸塩、硫酸塩および塩化物として得ることができる。主な微量元素Ｆｅ、Ｍｎ、ＺｎおよびＣｕは、任意の型の無機塩として利用することができる。
この醗酵は、２０〜２８℃にて行われる。回転式（ｏｒｂｉｔａｌ）インキュベータ内での生育にとって最適の温度は、２７℃であり、２８℃が最大であり、更なる温度の増加は有害であり、３０℃において、トレメラメセンテリカ細胞は、その成長を停止してしまう。液内培養によるこの醗酵は、種の発芽の１段階を含む。接種物調製の該第一段階で使用する、液状栄養培地は、炭素および窒素源、好ましくはグルコールまたはスクロース、およびペプトンまたは酵母抽出液の任意の適当な組み合わせであり得る。表面寒天培養物（チューブまたはペトリ皿）で接種された、種フラスコを、１００ ｍｌの無菌培地で満たし、該種フラスコを１００−１２０ ｒｐｍ にて４−６日、十分に生育するまで振とうする。該種フラスコを１ Ｌの無菌培地に移す。これ自体、１〜１０容の割合で、接種物として利用できる。
【００２５】
（実施例）
本発明は、その範囲において、以下の実施例に記載される態様によって何等限定されない。該実施例は、本発明の１局面を例示するものであり、また本発明の範囲は、酵母−様の発芽細胞として液内培養において成長する、担子菌類の任意の種および属を包含するものとする。目的および用途に依存して、調節し、もしくは改良できるものは、本発明の範囲内に含まれるものと理解すべきである。
【００２６】
実施例１
ｐＨ ６．８の麦芽寒天培地上の、トレメラメセンテリカＣＢＳ １０１９３９の６−８日齢の純粋培養物を含むチューブを、２５０ ｍｌの三角フラスコ中の培地Ａ １００ ｍＬを接種するために使用した。この寒天表面からの培養物を、無菌水で洗い流した。この培地Ａは、以下の組成（ｇ／ｌ）を有する。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
１２０℃での滅菌後３０分において、該培地ＡのｐＨは６．２〜６．５である。
これら接種したフラスコを、２００ ｒｐｍ、２７℃にて、冷蔵した回転式インキュベータ内でインキュベートした。６日間生育させた後、該種フラスコの全内容物を、２Ｌの三角フラスコ中の、１０００ ｍｌの培地Ｂに接種すべく移し、その醗酵を、該冷蔵した回転式インキュベータ内で２００ ｒｐｍ、２７℃にて行った。培地Ｂは、以下の組成を持つ：
【００２９】
【表２】
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2004514403.tif 000007
【００３０】
滅菌前に、該培地のｐＨを６．５に調節した。
培養を９０時間行った後、この培養ブロスを、４℃、５０００ ｒｐｍにて１０分間遠心分離処理した。このバイオマスを、１０５℃にて一定質量となるまで乾燥した後、その乾燥質量をグラム単位で測定した。多糖類の予想値は、培養上澄に対して２−３倍容の、沈殿用エタノールを使用して、遠心分離処理した該培養ブロスの上澄に基づいて、重量法により決定した。４℃にて２４時間後に、沈殿した粗製生体ポリマーを、濾過により分離し、一定質量となるまで乾燥した。
この醗酵培地Ｂ上で得られたバイオマスの収穫物は、３．４ ｇ／Ｌであり、また９０時間後の多糖類生産量は、５．８ ｇ／Ｌであった。
【００３１】
実施例２
ｐＨ ６．５の麦芽寒天培地上の、トレメラメセンテリカＣＢＳ １０１９３９の６−８日齢の純粋培養物を含むチューブを、２５０ ｍｌの三角フラスコ中の培地Ａ １００ ｍＬを接種するために使用した。この寒天表面から培養物を、無菌水で洗い流した。滅菌前に、該培地のｐＨを６．５に調節した。この培地Ａは、以下の組成（ｇ／ｌ）を有する。
【００３２】
【表３】
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【００３３】
このインキュベートしたフラスコを、冷蔵した回転式インキュベータ内で２００ ｒｐｍ、２７℃にてインキュベートした。６日間生育させた後、該種フラスコの内容物を、２Ｌの三角フラスコ中の、１０００ ｍｌの培地Ｂに接種すべく移し、その醗酵を、冷蔵した回転式インキュベータ内で２００ ｒｐｍ、２７℃にて行った。滅菌前に、該培地のｐＨを６．５に調節した。培地Ｂは、以下の組成を持つ：
【００３４】
【表４】
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【００３５】
培養の５日後に、２または３倍容のエチルアルコールを、培養ブロスに添加した。４℃にて２４時間後、該沈殿した粗生成物を、濾過により分離し、一定質量となるまで乾燥した。多糖類および単一細胞バイオマス両者からなる、この得られた生成物は１８．４ ｇ／Ｌであった。別途、実施例１記載の方法に従って測定した場合、多糖類の収率は、１３．９ ｇ／Ｌであり、またバイオマスの収率は７．７ ｇ／Ｌであった（多糖類の幾分かは、細胞と緊密に結合している）。
得られたバイオマスのアミノ酸分析は、必須アミノ酸が、全アミノ酸含有率の３１％を構成することを示した（表１）。このように、本発明の栄養補助組成物は、必須アミノ酸に富む、高品位のタンパク質を供給するための、有用な源である。
【００３６】
【表５】
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【００３７】
感受性の栄養要求性微生物の成長特性の評価に基づいて、微生物学的方法によって測定したＢ群のビタミン類の中で、Ｔ．メセンテリカバイオマスは、特にナイアシンに富む（表２）。かくして、本発明の栄養補助組成物は、ビタミンのサプリメントとして、特にナイアシンの天然源を供給するために、使用することができる。
【００３８】
【表６】
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【００３９】
栄養補助処方物およびその使用法
グルコース−濃度低下化合物を含む栄養補助組成物は、製造並びに保存条件下で安定でなければならず、また微生物、例えば真菌および細菌による汚染から保護されなければならず、これらは静菌剤、酸化防止剤、例えばビタミンＥおよびエトキシキン（これらは、フード＆ドラッグアドミニストレーション（Ｆｏｏｄ ＆ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって、一般的に安全に使用出来るものとして列挙されている）の使用による。
この処方物は、１回毎の毎日の用量として、または分割投与型の毎日の用量として投与でき、好ましくは食前、食中または食後に３回投与される。この処方物は、食品中で使用でき、あるいはこれを飾り付けし、包装するために使用できる。患者は、無期限で、血中グルコース濃度を調節するために、グルコース−低下化合物の摂取を維持することができる。投与濃度、頻度および期間を選択する上で考慮すべき条件は、主として該患者疾患の重篤度、該患者の血中グルコース濃度、有害な副作用および患者の予防的介入に対する要求並びにその治療上の有効性を含む。任意の特定の対象に対して、特定の投与養生は、個々の患者の要求、この栄養補助組成物を投与する、またはその投与を管理する人の専門的な判断に従って、時間をかけて調節すべきであり、またここに示された濃度範囲は、単なる例示であり、特許請求した本発明の組成物の、範囲またはその実施を制限するものではないことを、理解すべきである。他の濃度範囲および投与期間は、日常的な実験により決定できる。
【００４０】
糖尿病は、代謝、特にブドウ糖代謝の調節不全の病気、かつ長期の血管性及び神経性合併症である。糖尿病にはいくつかの臨床形態があり、その２つの主要形態はインシュリン依存性Ｉ型糖尿病（ＩＤＤＭ）と、非インスリン依存性ＩＩ型糖尿病（ＮＩＤＤＭ）である。ＩＤＤＭは珍しく、米国では２５０人に１人が発症し、毎年約１０，０００〜１５，０００人の新患者が報告されている。データはＩＤＤＭの発症率が欧州で増加していることを示唆しており、最も高い罹患率は北欧で見られ、例えば、１５０人に１人のフィンランド人が１５歳までにＩＤＤＭを発症する。ＬａＰｏｒｔｅ，Ｒ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｎ Ａｍｅｒｉｃａ，第２版，Ｍ．Ｈａｒｒｉｓ出版，国立保健研究所，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ． ＮＩＨ公開番号９５−１４９８，１９９５。
【００４１】
ＮＩＤＤＭは一般的であり、米国では全罹患率が６．６％である。ＮＩＤＤＭは、ほとんどの先進国の最高頻度の慢性病になってきており、次の１０年では１０％の罹患率が予想されている。毎年６００，０００人の新患者が報告されており、ＮＩＤＤＭ人口の半分が自分の異常に気づいていない。米国内のＮＩＤＤＭの罹患率の増加は、通常、ますます肥満かつすわって仕事をする老齢人口に起因している。６５歳を超える人のＮＩＤＤＭの罹患率は１８パーセントを超え、正常の体重の個体と比べ、体重指標が３０より高い肥満の人のＮＩＤＤＭに対するリスクは１０〜２０倍高い。ＩＤＤＭの遺伝的かつ免疫学的な標識は同定されているが、それらは十分でなく、ＩＤＤＭを定義し、又はＩＤＤＭとＮＩＤＤＭを区別するのに使用できるほど十分な感度でもない。Ｈａｒｒｉｓ，Ｍ．Ｉ．ら，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：５２３（１９８７）；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｐ．Ｈ．ら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ，ｅｄ Ａｌｂｅｒｔｉ，ＫＧＭＭら，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ Ｌｔｄ ＵＫ １９９２，ｐ１４８。
【００４２】
天然の血糖降下キノコ栄養補助剤は、一般的に経口摂取される。しかし、個々の物質がさらに該バイオマスから抽出されれば、その精製血圧降下物質を静脈内、腹腔内に、皮下に、筋肉内に、硬膜内に、経口的に、直腸内に、局所的に、又はエアロゾルによって投与することができる。
経口投与に好適な製剤形態としては、生理食塩水、水又はＰＥＧ４００のような希釈剤中に溶解された活性化合物の液体溶液；それぞれ固体、顆粒又はゼラチンとして所定量の活性物質を含有するカプセル又は錠剤；適切な媒体中の懸濁液；及びエマルジョンが挙げられる。
腸管外投与に好適な製剤形態としては、緩衝液、抗酸化剤及び保存剤を含有する水性及び非水性等張無菌液が挙げられる。製剤形態は単位用量でも多用量で製剤化されても良い。
服用量及び間隔を個々に調整して、抗糖尿病性及び他の有利な代謝効果を維持するのに十分な活性成分の血漿濃度を与えることができる。
【００４３】
あるいは、経口様式ではなく、局所的に、例えば該化合物を標的部位に、しばしばデポ又は徐放製剤形態で、直接注射することによって該化合物を投与することができる。
限定するものではないが、リポソーム及びエマルジョンを含む種々の薬理化合物用送達系を利用できる。本製薬組成物は、適切な固体若しくはゲル相キャリヤー又は賦形剤をも含むことができる。このようなキャリヤー又は賦形剤の例としては、限定するものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、種々の糖、スターチ、セルロース誘導体、ゼラチン、及びポリエチレングリコールのようなポリマーが挙げられる。
【００４４】
局所投与又は選択的摂取の場合、該栄養化合物の有効な局所濃度は、血漿濃度に関連しうる。
従って、本発明は、すべて以下の詳細な開示で例示されるように、数工程と、該工程の１つ以上の他工程のそれぞれについての関係、及びこのような工程及び方法を達成するのに適合される特性を具体化する製品を含み、かつ本発明の範囲は特許請求の範囲内に表される。
【００４５】
キノコ由来の多数の細胞性成分と二次代謝物が、免疫系に作用し、かつ種々の病気状態で使用されることがわかった。キノコは、強壮剤（ａｄａｐｔｏｇｅｎ）及び免疫賦活薬として使用されている。本明細書では、強壮剤（ａｄａｐｔｏｇｅｎ）は、植物由来の生体応答調節剤のカテゴリーに関する特定の基準に合ういずれの物質でもあり、免疫系の刺激によって宿主の生体応答を調節することができる。これら生体応答調節剤の主要成分は、（１→３）−β−Ｄ−グルカンである。β−Ｄ−グルカン、キノコから単離された多糖体は、リンパ球表面又は血清特異性タンパク質に結合し、マクロファージ、Ｔ−ヘルパー、天然キラー細胞及びエフェクター細胞を活性化する。これらは、抗体のみならずエフェクター細胞の活性化によって遊離されるインターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２）及びインターフェロン（ＩＮＦ−ｒ）の産生を高める。このように、抗癌多糖体の制癌効果は、宿主の免疫系の活性化から生じる。
【００４６】
水溶性β−Ｄ−グルカンに加え、キノコは、キシロース、マンノース、ガラクトース、及びウロン酸のヘテロ糖鎖、及びβ−Ｄ−グルカン−タンパク質複合体をも含有する。本発明の液中培養内で増殖して得られた、より高度な担子菌類の食用組成物は、細胞性かつ二次代謝物、多糖体、具体的には１，３−結合グルクロノキシルオマナンを含み、かつ免疫調節性及び制癌特性を示す。
より高等な担子菌類キノコは、グルカン、キチン、及び限定するものではないが、ペクチン性物質、ヘミセルロース又はポリウロニドを含むヘテロ多糖類に属する食物繊維を含有する。β−グルカン及びキチン物質は、主にキノコの食物繊維中に存在する。それらの制癌活性は、発癌物質のような危険物質との物理化学的相互作用に起因し、それによってそれらの腸内への吸収を妨げ、かつ排泄を促す。本発明の高等な担子菌類食用組成物は、β−グルカン、キチン及びヘテロ多糖類に属し、制癌活性を有する食物繊維を含む。
【００４７】
Ｔ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ液中菌糸体の効果は、Ｇ．Ｓ．Ｍａｈｄｉら，Ａｎｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ ３５：６５（１９９１）によって記載されているように、Ｓｐｒａｎｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ雄ラットのストレプトゾトシン誘発Ｉ型糖尿病モデルで研究することができる。血漿ブドウ糖濃度は、カゼインベースの食餌、又は対照群ではカゼインによっている供給食餌タンパク質に代えてＴ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａの食餌で養われたラットにストレプトゾトシンを１回投与した後７日で測定した。Ｔ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ食餌で養われたラットは、一般に、カゼイン飼育群よりもブドウ糖濃度をよく制御し、Ｔ． ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ中に存在する該栄養物の血糖降下の役割を示唆している。
【００４８】
本発明は、本発明の一局面の説明を意図した実施例に開示されるいずれの実施形態による範囲にも限定されものではなく、かつ機能的に等価ないずれの方法も本発明の範囲内である。実際、本明細書に示されかつ述べられた実施形態に加え、本発明の種々の変形が、前述の説明から当業者には明かだろう。このような変形は特許請求の範囲の範囲内であることが意図されている。
本明細書で引用されている種々の出版物は、参照によってその全体が本明細書に取り込まれるものとする。
【００４９】
前記説明から明らかにされることで、上述の目的が効率的に達成されることがわかり、かつ本発明の精神及び範囲から逸脱することなく上記方法の実施及び組成物に特定の変更を為しうるので、上記説明及び添付図面に示されるすべての事項は、例示として解釈され、意味を制限するものではない。
また、特許請求の範囲は、本明細書で述べた本発明の一般的及び特有の特徴のすべてを包含することを意図すること、及び本発明の範囲の言葉としてのすべての記載は、本発明内にあるとすべきことを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【図１】
菌糸または発芽細胞両者による、担持胞子の発芽を示す図である。対物レンズｘ１００、位相差顕微鏡。
【図２】
ハプイロイド菌株の細胞を示し、１個の細胞が、ハプロイド菌糸によって増殖している。対物レンズｘ１００、位相差顕微鏡。
【図３】
インディアン（Ｉｎｄｉａｎ）インキ中での、トレメラ・メセンテリカ（Ｔｒｅｍｅｌｌａ ｍｅｓｅｎｔｅｒｉｃａ）の調製を示す。細胞周辺の白色の領域は、多糖類粘液質外膜を示す。酵母−様の発芽細胞を取り巻く該多糖類マトリックスが、該菌糸のマトリックスよりも嵩高いことは明白である。対物レンズｘ１００。
【図４】
交差許容性ハプロイド菌株由来の、クランプ（ｃｌａｍｐｓ）をもつダ二核菌糸体を示す図である。ハプロイド細胞は、視野中に見ることができる。対物レンズＸ４０、位相差顕微鏡。
【図５】
液内培養されたトレメラメセンテリカＣＢＳ １０１９３９を示す図である。対物レンズｘ１００、位相差顕微鏡。
【国際公開パンフレット】
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2004514403.tif 000040
2004514403.tif 000041
2004514403.tif 000042
2004514403.tif 000043
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004514403.tif 000044
【国際調査報告】
2004514403.tif 000045
2004514403.tif 000046
2004514403.tif 000047