(57)【要約】本発明は、ネイティブなＥｒｂＢ４レセプターのアンタゴニストを使用することによって、平滑筋細胞の過剰な増殖および／または移動を制御するため、詳細には、狭窄を処置するための方法および手段に関する。本発明はさらに、平滑筋細胞の増殖および移動を阻害または増強し得るＥｒｂＢ４のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するための方法に関する。１つの実施形態において、平滑筋細胞は、膀胱平滑筋細胞であり、別の実施形態において、平滑筋細胞は、気道経路の平滑筋細胞である。
2004507559.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平滑筋細胞の過剰な増殖または移動を制御するための方法であって、該方法は、ネイティブなＥｒｂＢ４レセプターのアンタゴニストの有効量で該平滑筋細胞を処理する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記制御が、平滑筋細胞の過剰な増殖または移動の予防である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記制御が、平滑筋細胞の過剰な増殖または移動の阻害である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記阻害が完全な阻害である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記平滑筋細胞が幽門平滑筋細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記平滑筋細胞が膀胱平滑筋細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記平滑筋細胞が気道経路の平滑筋細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記平滑筋細胞の前記過剰な増殖または移動が、狭窄を生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記平滑筋細胞が血管平滑筋細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記血管平滑筋細胞がヒトのものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記血管平滑筋細胞が、ヒト大動脈平滑筋細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記平滑筋細胞の前記過剰な増殖または移動が血管狭窄を生じる、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記血管狭窄が、内皮細胞の過剰な増殖または移動によってさらに特徴付けられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記狭窄が再狭窄である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＥｒｂＢ４レセプターアンタゴニストが免疫付着因子である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫付着因子が、ネイティブなＥｒｂＢ４レセプターの細胞外ドメイン配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ネイティブなＥｒｂＢ４レセプターがヒトのものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ネイティブなヒトＥｒｂＢ４レセプター細胞外ドメイン配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域配列に融合される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫グロブリンがＩｇＧアイソタイプの免疫グロブリンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１アイソタイプ、ＩｇＧ２アイソタイプまたはＩｇＧ３アイソタイプの免疫グロブリンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫付着因子が、少なくとも１つのＩｇＧ免疫グロブリン軽鎖を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記アンタゴニストが抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体がネイティブなＥｒｂＢ４レセプターに対する中和抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体がグリコシル化されている、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
請求項２３に記載の方法であって、前記抗体が、ＨＥＲ４．１０Ｈ１．１Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２８）、ＨＥＲ４．１Ｃ６．Ａ１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２９）、ＨＥＲ４．３Ｂ９．２Ｃ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２６）、ＨＥＲ４．１Ａ６．５Ｂ３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２７）およびＨＥＲ４．８Ｂ１．２Ｈ２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体と本質的に同じエピトープを結合する、方法。
【請求項２７】
請求項２３に記載の方法であって、前記抗体が、ＨＥＲ４．１０Ｈ１．１Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２８）、ＨＥＲ４．１Ｃ６．Ａ１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２９）、ＨＥＲ４．３Ｂ９．２Ｃ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２６）、ＨＥＲ４．１Ａ６．５Ｂ３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２７）およびＨＥＲ４．８Ｂ１．２Ｈ２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基を有する、方法。
【請求項２８】
哺乳動物患者における狭窄を処置するための方法であって、該方法は、ネイティブな哺乳動物ＥｒｂＢ４レセプターのアンタゴニストの有効量を該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２９】
前記患者がヒトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記狭窄が血管狭窄である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記血管狭窄が再狭窄である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記アンタゴニストが免疫付着因子である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫付着因子が、ネイティブなＥｒｂＢ４レセプターの細胞外ドメイン配列を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞外ドメイン配列が、免疫グロブリン重鎖定常領域配列に融合される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記免疫グロブリンがＩｇＧアイソタイプの免疫グロブリンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アンタゴニストが抗体である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体がネイティブなヒトＥｒｂＢ４レセプターに対する中和抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載の方法であって、前記抗体が、ＨＥＲ４．１０Ｈ１．１Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２８）、ＨＥＲ４．１Ｃ６．Ａ１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２９）、ＨＥＲ４．３Ｂ９．２Ｃ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２６）、ＨＥＲ４．１Ａ６．５Ｂ３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２７）およびＨＥＲ４．８Ｂ１．２Ｈ２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体と本質的に同じエピトープを結合する、方法。
【請求項３９】
請求項３６に記載の方法であって、前記抗体が、ＨＥＲ４．１０Ｈ１．１Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２８）、ＨＥＲ４．１Ｃ６．Ａ１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２９）、ＨＥＲ４．３Ｂ９．２Ｃ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２６）、ＨＥＲ４．１Ａ６．５Ｂ３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２７）およびＨＥＲ４．８Ｂ１．２Ｈ２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基を有する、方法。
【請求項４０】
前記アゴニストが注射または注入として投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項４１】
前記処置が、前記狭窄に関連する高血圧をさらに低減する、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記処置が予防である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４３】
前記狭窄が幽門狭窄である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４４】
前記狭窄が膀胱壁の肥厚である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４５】
前記狭窄が閉塞性気道疾患の一部である、請求項２８に記載の方法。
【請求項４６】
哺乳動物患者における狭窄を処置するための方法であって、該方法は、ＥｒｂＢ４レセプターのアンタゴニストをコードする核酸を、該患者の細胞に導入する工程を包含する、方法。
【請求項４７】
前記患者がヒトである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記アンタゴニストが免疫付着因子である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記免疫付着因子が、免疫グロブリン重鎖定常領域配列に融合されたネイティブなヒトＥｒｂＢ４レセプターの細胞外ドメイン配列を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記アンタゴニストが抗体である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体がネイティブなＥｒｂＢ４レセプターに対する中和抗体である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
請求項５１に記載の方法であって、前記抗体が、ＨＥＲ４．１０Ｈ１．１Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２８）、ＨＥＲ４．１Ｃ６．Ａ１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２９）、ＨＥＲ４．３Ｂ９．２Ｃ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２６）、ＨＥＲ４．１Ａ６．５Ｂ３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２７）およびＨＥＲ４．８Ｂ１．２Ｈ２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体と本質的に同じエピトープを結合する、方法。
【請求項５４】
請求項５１に記載の方法であって、前記抗体が、ＨＥＲ４．１０Ｈ１．１Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２８）、ＨＥＲ４．１Ｃ６．Ａ１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２９）、ＨＥＲ４．３Ｂ９．２Ｃ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２６）、ＨＥＲ４．１Ａ６．５Ｂ３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２７）およびＨＥＲ４．８Ｂ１．２Ｈ２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基を有する、方法。
【請求項５５】
前記核酸がインビボで導入される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
前記核酸がエキソビボで導入される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
哺乳動物患者における血管狭窄に関連する高血圧を処置するための方法であって、ネイティブな哺乳動物ＥｒｂＢ４レセプターのアンタゴニストの有効量を、該患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項５８】
前記アンタゴニストが低分子である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
哺乳動物患者における狭窄の処置のための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと混合して、ネイティブな哺乳動物ＥｒｂＢ４レセプターのアンタゴニストの有効量を含む、薬学的組成物。
【請求項６０】
平滑筋細胞の増殖または移動を阻害または増強する分子を同定するための方法であって、該方法は、以下：
（ａ）ポリペプチドを候補分子と接触させる工程であって、該ポリペプチドは、ネイティブなＥｒｂＢ４レセプターの細胞外ドメインのアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ平滑筋細胞の過剰な増殖または移動を制御する能力を保持する、工程；および
（ｂ）該候補分子が、平滑筋細胞の過剰な増殖または移動を制御する該ポリペプチドの能力を阻害または増強するか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項６１】
前記ポリペプチドが、ネイティブなＥｒｂＢ４レセプターの細胞外ドメインを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記レセプターがヒトのものである、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ポリペプチドが免疫付着因子である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記分子が、平滑筋細胞の過剰な増殖または移動を制御する前記ポリペプチドの能力を増強する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記分子が、抗体および低分子からなる群より選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ＨＥＲ４．１０Ｈ１．１Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２８）、ＨＥＲ４．１Ｃ６．Ａ１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２９）、ＨＥＲ４．３Ｂ９．２Ｃ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２６）、ＨＥＲ４．１Ａ６．５Ｂ３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２７）およびＨＥＲ４．８Ｂ１．２Ｈ２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体と本質的に同じＥｒｂＢ４エピトープを結合する、抗体。
【請求項６７】
ＨＥＲ４．１０Ｈ１．１Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２８）、ＨＥＲ４．１Ｃ６．Ａ１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２９）、ＨＥＲ４．３Ｂ９．２Ｃ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２６）、ＨＥＲ４．１Ａ６．５Ｂ３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２７）およびＨＥＲ４．８Ｂ１．２Ｈ２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基を有する、抗体。
【請求項６８】
ＨＥＲ４．１０Ｈ１．１Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２８）、ＨＥＲ４．１Ｃ６．Ａ１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２９）、ＨＥＲ４．３Ｂ９．２Ｃ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２６）、ＨＥＲ４．１Ａ６．５Ｂ３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２７）およびＨＥＲ４．８Ｂ１．２Ｈ２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体からなる群より選択される、抗体。
【請求項６９】
抗ＥｒｂＢ４モノクローナル抗体４−１４４０、４−１４６０、４−１４７３、４−１４９２および４−１４６４からなる群より選択される抗体によって結合されるＥｒｂＢ４エピトープと本質的に同じＥｒｂＢ４エピトープを結合する、抗体。
【請求項７０】
抗ＥｒｂＢ４モノクローナル抗体４−１４４０、４−１４６０、４−１４７３、４−１４９２および４−１４６４からなる群より選択される抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基を有する、抗体。
【請求項７１】
高親和性でＥｒｂＢ４と結合する、抗体。
【請求項７２】
１００ｎＭ未満のＫｄでＥｒｂＢ４と結合する、請求抗７１に記載の抗体。
【請求項７３】
５０ｎＭ未満のＫｄでＥｒｂＢ４と結合する、請求抗７１に記載の抗体。
【請求項７４】
１０ｎＭ未満のＫｄでＥｒｂＢ４と結合する、請求抗７１に記載の抗体。
【請求項７５】
ヒト化抗体である、請求項７１に記載の抗体。
【請求項７６】
ヒト抗体である、請求項７１に記載の抗体。
【請求項７７】
抗体フラグメントである、請求項７１に記載の抗体。
【請求項７８】
ＥｒｂＢ４およびＥｒｂＢ３の両方に結合し得る、抗体。
【請求項７９】
高親和性でＥｒｂＢ４を結合する、請求項７８に記載の抗体。
【請求項８０】
高親和性でＥｒｂＢ４およびＥｒｂＢ３の両方を結合する請求項７８に記載の抗体。
【請求項８１】
ＥｒｂＢ４に結合し、かつ該ＥｒｂＢ４に結合するヒレグリンを減少させる、抗体。
【請求項８２】
高親和性でＥｒｂＢ４を結合する、請求項８１に記載の抗体。
【請求項８３】
ＥｒｂＢ４に結合し、かつ該ＥｒｂＢ４ヒレグリン誘導性チロシンリン酸化を減少させる、抗体。
【請求項８４】
高親和性でＥｒｂＢ４を結合する、請求項８３の抗体。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、ネイティブなＥｒｂＢ４レセプターのアンタゴニストを使用することによって、平滑筋細胞の過剰な増殖および／または移動を制御するための、詳細には、狭窄を処置するための方法および手段に関する。本発明はさらに、平滑筋細胞の増殖または移動を阻害または増強し得るＥｒｂＢ４のアゴニストおよびアンタゴニストの同定のための方法に関する。
【０００２】
（関連技術の説明）
（１．ＥｒｂＢレセプターチロシンキナーゼ）
細胞増殖および細胞分化を調節するシグナルの伝達は、種々の細胞タンパク質のリン酸化によって部分的に調節される。タンパク質チロシンキナーゼは、このプロセスを触媒する酵素である。レセプタータンパク質チロシンキナーゼは、細胞内基質のリガンド刺激チロシンリン酸化を介して細胞増殖を指向すると考えられている。
【０００３】
ＨＥＲ４／Ｅｒｂ４は、ＥｒｂＢファミリーに属するレセプタータンパク質チロシンキナーゼである。増加したＥｒｂＢ４発現は、胸部の腺癌を含む、上皮起源の特定の癌腫に密接に関連する（Ｐｌｏｗｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：１７４６−１７５０［１９９３］；Ｐｌｏｗｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３６６：４７３−４７５［１９９３］）。ＥｒｂＢ４発現を評価するヒト新生物状態（特に、乳癌）の検出のための診断方法が、ＥＰ特許出願番号５９９，２７４において記載される。
【０００４】
レセプターチロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーの他のメンバーとしては、以下が挙げられる：上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、およびＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）。ｅｒｂＢ１遺伝子は、ヒト悪性腫瘍に原因として関与している１７０ｋＤａの上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）をコードする。詳細には、この遺伝子の増加した発現は、乳房、膀胱、肺および胃のより侵略的な癌において観察されている（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ，Ｈ．およびＤｅａｎ，Ｃ．（１９９４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．４：２７７−２９６）。ＨＥＲ４は、ＨＥＲ２の非存在下で、ヒト乳癌細胞株における抗増殖応答および分化応答の媒介物として作用する（Ｓａｒｔｏｒら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２１：４２６５−７５（２００１））。
【０００５】
ｎｅｕ遺伝子（ｅｒｂＢ２およびＨＥＲ２とも呼ばれる）は、化学的に処置されたラットの神経芽細胞腫由来のトランスフォーミング遺伝子の産物として本来同定された１８５ｋＤａのレセプタータンパク質チロシンキナーゼをコードする。ヒトＨＥＲ２遺伝子の増幅および／または過剰発現は、乳癌および卵巣癌における不十分な予後と相関する（Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：１７７：１８２（１９８７）；Ｓｌａｍｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４４：７０７−７１２（１９８９）；および米国特許第４，９６８，６０３号）。ＨＥＲ２の過剰発現（頻繁であるが、遺伝子増幅に起因して均一でない）はまた、胃、子宮内膜、唾液腺、肺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓および膀胱の癌腫を含む、他の癌腫において観察されている。
【０００６】
さらなる関連遺伝子（ｅｒｂＢ３またはＨＥＲ３と呼ばれる）が記載されている。米国特許第５，１８３，８８４号；Ｋｒａｕｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：９１９３−９１９７（１９８９）；欧州特許出願番号４４４，９６１Ａ１；およびＫｒａｕｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：２９００−２９０４（１９９３）を参照のこと。Ｋｒａｕｓら（１９８９）は、顕著に上昇したレベルのｅｒｂＢ３　ｍＲＮＡが特定のヒト乳腺癌細胞株に存在することを発見し、このことは、ｅｒｂＢ１およびｅｒｂＢ２と同様に、ｅｒｂＢ３が、ヒト悪性腫瘍において役割を果たし得ることを示す。彼らはまた、キメラＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ３レセプターのＥｒｂＢ３触媒ドメインのＥＧＦ独立性活性化が、トランスフェクトされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞において増殖性応答を生じることを示した。さらに、これらの研究者らは、いくつかのヒト乳腺癌細胞株が、定常状態のＥｒｂＢ３チロシンリン酸化の有意な上昇を示すことを実証し、このことは、さらに、このレセプターがヒト悪性腫瘍において役割を果たし得ることを示す。癌におけるｅｒｂＢ３の役割は、他者によって探索されている。ｅｒｂＢ３は、乳癌（Ｌｅｍｏｉｎｅら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　６６：１１１６−１１２１（１９９２））、胃腸の癌（Ｐｏｌｌｅｒら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６８：２７５−２８０（１９９２）、Ｒａｊｋｕｍｅｒら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１７０：２７１−２７８（１９９３）、およびＳａｎｉｄａｓら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ　５４：９３５−９４０（１９９３））、ならびに膵臓癌（Ｌｅｍｏｉｎｅら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６８：２６９−２７３（１９９２）、およびＦｒｉｅｓｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１：１４１３−１４２０（１９９５））において過剰発現されることが見出されている。ＥｒｂＢ３は、内因性チロシンキナーゼ活性をほとんどまたは全く有さないという点で、ＥｒｂＢレセプターファミリーのなかで固有である（Ｇｕｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：８１３２−８１３６（１９９４）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２４７４７−５５（１９９４））。
【０００７】
ＥｒｂＢレセプターは一般に、細胞において種々の組み合わせで見出され、そしてヘテロダイマー形成は、種々のＥｒｂＢリガンドに対する細胞応答の多様性を増加させると考えられる（Ｅａｒｐら、Ｂｒｅａｓｔ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　３５：１１５−１３２（１９９５））。ＥＧＦＲは、以下の６つの異なるリガンドによって結合される：上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦ−　）、アンフィレグリン（ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ヘパリン結合性上皮増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン（ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ）およびエピレグリン（ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ）（Ｇｒｏｅｎｅｎら、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　１１：２３５−２５７（１９９４））。単一の遺伝子の選択的スプライシングから生じるヒレグリンタンパク質のファミリーは、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４についてのリガンドである。ヒレグリンファミリーは、αヒレグリン、βヒレグリンおよびγヒレグリン（Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２０５−１２１０（１９９２）；米国特許第５，６４１，８６９；ならびにＳｃｈａｅｆｅｒら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１５：１３８５−１３９４（１９９７））；ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）、グリア増殖因子（ＧＧＦ）；アセチルコリンレセプター誘導活性（ＡＲＩＡ）；ならびに感覚ニューロンおよび運動ニューロン由来因子（ＳＭＤＦ）を含む。概説について、Ｇｒｏｅｎｅｎら、Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒｓ　１１：２３５−２５７（１９９４）；Ｌｅｍｋｅ，Ｇ．Ｍｏｌｅｃ．＆　Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．７：２４７−２６２（１９９６）およびＬｅｅら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｖ．４７：５１−８５（１９９５）を参照のこと。近年、３つのさらなるＥｒｂＢリガンドが同定された；ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４のいずれかに結合することが報告されている（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　３８７　５０９−５１２（１９９７）およびＣａｒｒａｗａｙら、Ｎａｔｕｒｅ　３８７：５１２−５１６（１９９７））、ニューレグリン−２（ＮＲＧ−２）；ＥｒｂＢ４に結合するニューレグリン−３（Ｚｈａｎｇら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９４（１８）：９５６２−７（１９９７））；ならびにＥｒｂＢ４に結合するニューレグリン−４（Ｈａｒａｒｉら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１８：２６８１−２６８９（１９９９））。ＨＢ−ＥＧＦ、β−セルリンおよびエピレグリンもまたＥｒｂＢ４に結合する。
【０００８】
ＥＧＦおよびＴＧＦはＥｒｂＢ２に結合しないとはいえ、ＥＧＦは、ＥＧＦＲおよびＥｒｂＢ２を刺激してヘテロダイマーを形成し、これは、ＥＧＦＲを活性化し、そしてヘテロダイマーにおけるＥｒｂＢ２のトランスリン酸化をもたらす。ダイマー形成および／またはトランスリン酸化は、ＥｒｂＢ２チロシンキナーゼを活性化するようである。Ｅａｒｐら、前出を参照のこと。同様に、ＥｒｂＢ３がＥｒｂＢ２と同時発現された場合、活性なシグナル伝達複合体が形成され、そしてＥｒｂＢ２に対して指向された抗体はこの複合体を破壊し得る（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（２０）：１４６６１−１４６６５（１９９４））。さらに、ヒレグリン（ＨＲＧ）に対するＥｒｂＢ３の親和性は、ＥｒｂＢ２と同時に発現された場合、より高い親和性状態へと上昇する。ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ３タンパク質複合体に関して、Ｌｅｖｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１５：１３２９−１３４０（１９９５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９２：１４３１−１４３５（１９９５）；およびＬｅｗｉｓら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．，５６：１４５７−１４６５（１９９６）もまた参照のこと。ＥｒｂＢ４は、ＥｒｂＢ３と同様に、ＥｒｂＢ２と共に活性なシグナル伝達複合体を形成する（ＣａｒｒａｗａｙおよびＣａｎｔｌｅｙ，Ｃｅｌｌ　７８：５−８（１９９４））。
【０００９】
生理学的重要性に起因して、レセプターチロシンキナーゼのＥｒｂＢファミリーのメンバーは、しばしば、治療剤の開発のための標的化される。例えば、Ｈｕｄｚｉａｋら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．９（３）：１１６５−１１７２（１９８９）は、抗ＥｒｂＢ２抗体のパネルの生成を記載し、そのうちの１つ（４Ｄ５と呼ばれる）は、細胞増殖を５６％阻害した。マウス抗ＥｒｂＢ２抗体４Ｄ５の組換えヒト化バージョン（ｈｕＭＡｂ４Ｄ５−８、ｒｈｕＭＡｂ　ＨＥＲ２またはＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）；米国特許第５，８２１，３３７号）は、広範な先の抗癌治療を受けたＥｒｂＢ２過剰発現転移性乳癌を有する患者において、臨床的に活性である（Ｂａｓｅｌｇａら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１４：７３７−７４４（１９９６））。ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、腫瘍がＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２タンパク質を過剰発現する転移性乳癌を有する患者の処置のために、１９９８年９月２５日に食品医薬品局から販売許可を得た。ＨＥＲ２はまた、乳癌に加えて、他の癌においても過剰発現されるので、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）は、このような他の癌の処置においても同様に、大きい可能性を有する。
【００１０】
（２．平滑筋細胞増殖）
平滑筋細胞は、血管、胃腸管、気道経路（肺における気管および気管支）、尿路系（膀胱および尿管）などを含む、身体における多数の中空経路の非常に重要な構造的かつ機能的な成分である。平滑筋細胞は、これらの器官の正常な機能のために非常に重要に必要とされる弾性を担う。平滑筋細胞は、例えば、これらの器官によって運搬される体液の流れを調節するために、必要な場合、収縮および拡張によって種々の生理学的刺激に応答する。平滑筋細胞は、化学的刺激（例えば、増殖因子およびサイトカイン）だけでなく、物理的刺激（例えば、圧力および伸展）にも応答する。平滑筋細胞の過剰な増殖は、種々の障害において「狭窄」として公知の器官の壁の肥厚および器官の管腔の狭小化を生じる。
【００１１】
多数の増殖因子およびサイトカインが、平滑筋細胞の増殖に関与している。このような重要な分子の１つのカテゴリーは、ＥＧＦ関連リガンドである。例えば、種々のこのような器官由来の平滑筋細胞は、ＥＧＦレセプターを保有することが実証され、そしてこれらのいくつかは、ＨＢ−ＥＧＦのようなＥＧＦリガンドを合成および分泌さえし、従って、オートクラインループを設定する。種々のＥＧＦリガンドは、強力な分裂促進因子として作用し、そして平滑筋細胞の増殖を刺激し、しばしば、壁の肥厚および最終的な狭窄を生じる。例えば、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の過剰な増殖は、血管狭窄、血管形成または手術またはステント移植から生じる再狭窄、アテローム性動脈硬化症、移植アテローム性動脈硬化症、および高血圧の病状に関与する（ＣａｓｔｅｒｅｌｌａおよびＴｅｉｒｓｔｅｉｎ，Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｒｅｖ．７：２１９−２３１［１９９９］；Ａｎｄｒｅｓ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２：８１−８９［１９９８］；ならびにＲｏｓａｎｉｏら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２［補遺１］：１６４−１７０［１９９９］において論評される）。血管の肥厚は、血流に対する抵抗を増加させ、そして最終的に高血圧を生じる。さらに、組織への減少した血液供給はまた、壊死を引き起こし、そして炎症応答を誘導し、重篤な損傷を生じる。例えば、心筋梗塞は、酸素の欠乏および心筋組織の局所的死滅の結果として生じる。
【００１２】
乳児肥厚性幽門狭窄（ＩＨＰＳ）（これは、幽門管の機能的閉塞を引き起こす）はまた、幽門平滑筋細胞の肥厚および過形成を含む（ＯｕｅおよびＰｕｒｉ，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．４５：８５３−８５７［１９９９］）。さらに、ＥＧＦ、ＥＧＦレセプターおよびＨＢ−ＥＧＦは、幽門狭窄の病因に関与している（Ｓｈｉｍａら、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．４７：２０１−２０７［２０００］）。
【００１３】
同様に、下部尿路に影響する閉塞性症候群に応答して生じる膀胱壁肥厚は、膀胱平滑筋細胞の増殖を含む。ＨＢ−ＥＧＦの膜結合前駆形態は、膀胱平滑筋細胞において発現され、そしてＨＢ−ＥＧＦは、膀胱ＳＭＣ増殖についての強力な分裂促進因子である（Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１０２８−１０３６［１９９７］；Ｋａｅｆｅｒら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３：５８０−５８４［２０００］；Ｂｏｒｅｒら、Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１３３５−１３４５［１９９９］）。
【００１４】
閉塞性気道疾患は、平滑筋細胞増殖に関与する潜在的な病状を伴う疾患のなお別の群である。この群の１つの例は、気道炎症および気管支収縮において明らかな喘息である。ＥＧＦは、閉塞性気道疾患における気道ＳＭＣの病理学的増殖に関与する（Ｃｅｒｕｔｉｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７３：Ｌ１０−１５［１９９７］；Ｃｏｈｅｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８５−９０［１９９７］）。
【００１５】
本発明は、平滑筋細胞の過剰な移動および／または増殖を制御するための、特に、狭窄の処置のためのＥｒｂＢ４レセプターアンタゴニストの使用を開示する。
【００１６】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明は、ネイティブなＥｒｂＢ４レセプターのアンタゴニストの有効量で平滑筋細胞を処理することによって、平滑筋細胞の過剰な増殖または移動を制御するための方法に関する。この制御は、平滑筋細胞の過剰な増殖または移動の予防または阻害（完全な阻害を含む）である。１つの実施形態において、平滑筋細胞は、膀胱平滑筋細胞であり、別の実施形態において、平滑筋細胞は、気道経路の平滑筋細胞である。
【００１７】
血管平滑筋細胞のような平滑筋細胞の過剰な増殖または移動は、血管狭窄および再狭窄を含む、狭窄を生じ得る。１つの実施形態において、平滑筋細胞はヒトのものである。狭窄は、内皮細胞の過剰な増殖または移動によってさらに特徴付けられ得る。
【００１８】
１つの実施形態において、ＥｒｂＢ４レセプターアンタゴニストは、免疫付着因子である。別の実施形態において、ＥｒｂＢ４レセプターアンタゴニストは、抗体（例えば、ネイティブなＥｒｂＢ４レセプターに対する中和抗体）である。
【００１９】
別の局面において、本発明は、ヒトを含む、哺乳動物患者における狭窄を処置するための方法に関し、この方法は、ネイティブな哺乳動物ＥｒｂＢ４レセプターのアンタゴニストの有効量を患者に投与する工程を包含する。この処置は、狭窄の予防を含む。狭窄は、再狭窄を含む血管狭窄であり得る。アンタゴニストは、注射または注入として投与され得る。処置はまた、狭窄に関連する高血圧を低減するために使用され得る。狭窄は、再狭窄含む血管狭窄、幽門狭窄、膀胱壁の肥厚をまたは閉塞性気道疾患の一部であり得る。
【００２０】
１つの実施形態において、アンタゴニストは、免疫付着因子であり、これは、ネイティブなヒトＥｒｂＢ４レセプターの細胞外領域を含み得る。別の実施形態において、アンタゴニストは抗体（例えば、ネイティブなヒトＥｒｂＢ４レセプターに対する中和抗体）である。
【００２１】
さらなる局面において、本発明は、哺乳動物患者（例えば、ヒト）における狭窄を処置するための方法に関し、この方法は、ＥｒｂＢ４レセプターのアンタゴニストをコードする核酸を患者の細胞に導入する工程を包含する。この核酸は、インビボまたはエキソビボで導入され得、そしてレトロウイルスベクターのようなベクターまたは脂質ベースの送達系の補助で導入され得る。本発明の方法は、血管狭窄および再狭窄の処置（予防を含む）のために特に有用である。
【００２２】
アンタゴニストは、免疫付着因子であり得る。アンタゴニストはまた、抗体（例えば、ネイティブなヒトＥｒｂＢ４レセプターに対する中和抗体）であり得る。
【００２３】
別の局面において、本発明は、哺乳動物患者における血管狭窄に関連する高血圧を処置するための方法に関し、この方法は、ネイティブなＥｒｂＢ４レセプターのアンタゴニストの有効量を患者に投与する工程を包含する。このアンタゴニストは、低分子であり得る。
【００２４】
なおさらなる局面において、本発明は、哺乳動物患者における狭窄の処置のための薬学的組成物に関し、この組成物は、薬学的に受容可能なキャリアと混合して、ネイティブな哺乳動物ＥｒｂＢ４レセプターのアンタゴニストの有効量を含む。
【００２５】
全ての局面において、好ましいＥｒｂＢ４アンタゴニストは、免疫付着因子を含み、これは、好ましくは、免疫グロブリン定常領域配列に融合されたネイティブなヒトＥｒｂＢ４レセプター細胞外ドメイン配列を含む。この免疫グロブリン配列は、好ましくは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ３免疫グロブリンの重鎖定常領域の配列であり、そして免疫グロブリン重鎖定常領域を含む融合分子に共有結合された免疫グロブリン軽鎖配列をさらに含み得る。
【００２６】
別の好ましいクラスのＥｒｂＢ４アンタゴニストは、ネイティブなＥｒｂＢ４レセプターを特異的に結合する中和抗体を含む。この抗体は、好ましくは、ヒト抗体またはヒト化抗体である。１つの実施形態において、抗体は、ＨＥＲ４．１０Ｈ１．１Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２８）、ＨＥＲ４．１Ｃ６．Ａ１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２９）、ＨＥＲ４．３Ｂ９．２Ｃ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２６）、ＨＥＲ４．１Ａ６．５Ｂ３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２７）およびＨＥＲ４．８Ｂ１．２Ｈ２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体と本質的に同じエピトープを結合する。この抗体はまた、ＨＥＲ４．１０Ｈ１．１Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２８）、ＨＥＲ４．１Ｃ６．Ａ１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２９）、ＨＥＲ４．３Ｂ９．２Ｃ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２６）、ＨＥＲ４．１Ａ６．５Ｂ３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２７）およびＨＥＲ４．８Ｂ１．２Ｈ２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基を有し得る。
【００２７】
平滑筋細胞は、例えば、幽門もしくは膀胱の平滑筋細胞、または気道経路の平滑筋細胞であり得る。好ましくは、平滑筋細胞は、血管平滑筋細胞である。
【００２８】
なおさらなる局面において、本発明は、平滑筋細胞の増殖または移動を阻害または増強する分子を同定するための方法に関し、この方法は、以下：（ａ）ポリペプチドを候補分子と接触させる工程であって、該ポリペプチドは、ネイティブなＥｒｂＢ４レセプターの細胞外ドメインのアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ平滑筋細胞の過剰な増殖または移動を制御する能力を保持する、工程；および（ｂ）この候補分子が、平滑筋細胞の過剰な増殖または移動を制御するこのポリペプチドの能力を阻害または増強するか否かを決定する工程、を包含する。このポリペプチトは、ネイティブなＥｒｂＢ４レセプターの細胞外ドメインを含み得る。１つの実施形態において、このポリペプチドは、免疫付着因子である。特定の実施形態において、この分子は、平滑筋細胞の過剰な増殖または移動を制御するためのポリペプチドの能力を増強し、そしてこの分子は、抗体または低分子である。
【００２９】
なおさらなる局面において、本発明は、ＨＥＲ４．１０Ｈ１．１Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２８）、ＨＥＲ４．１Ｃ６．Ａ１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２９）、ＨＥＲ４．３Ｂ９．２Ｃ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２６）、ＨＥＲ４．１Ａ６．５Ｂ３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２７）およびＨＥＲ４．８Ｂ１．２Ｈ２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体のＥｒｂＢ４エピトープと本質的に同じＥｒｂＢ４エピトープに結合する抗体に関する。上記の方法に加え、そしてその開示の全体にわたり、これらの抗体は、乳癌を含む種々の癌の処置に有用であると考えられる。
【００３０】
なおさらなる局面において、本発明は、ＨＥＲ４．１０Ｈ１．１Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２８）、ＨＥＲ４．１Ｃ６．Ａ１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２９）、ＨＥＲ４．３Ｂ９．２Ｃ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２６）、ＨＥＲ４．１Ａ６．５Ｂ３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２７）およびＨＥＲ４．８Ｂ１．２Ｈ２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基を有する抗体に関する。
【００３１】
さらなる局面において、本発明は、ＨＥＲ４．１０Ｈ１．１Ａ１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２８）、ＨＥＲ４．１Ｃ６．Ａ１１（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２９）、ＨＥＲ４．３Ｂ９．２Ｃ９（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２６）、ＨＥＲ４．１Ａ６．５Ｂ３（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２７）およびＨＥＲ４．８Ｂ１．２Ｈ２（ＡＴＣＣ登録番号ＰＴＡ−２８２５）からなる群より選択されるハイブリドーマによって産生される抗体からなる群より選択される抗体に関する。
【００３２】
本発明はまた、抗ＥｒｂＢ４モノクローナル抗体４−１４４０、４−１４６０、４−１４７３、４−１４９２および４−１４６４からなる群より選択される抗体によって結合されるＥｒｂＢ４の本質的に同じエピトープに結合する抗体に関する。
【００３３】
さらに、本発明は、抗ＥｒｂＢ４モノクローナル抗体４−１４４０、４−１４６０、４−１４７３、４−１４９２および４−１４６４からなる群より選択される抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基を有する抗体に関する。
【００３４】
本発明はまた、高い親和性でＥｒｂＢ４に結合する抗体に関する。この抗体は、好ましくは１００ｎＭ未満のＫｄ、より好ましくは５０ｎＭ未満のＫｄ、なおより好ましくは２５ｎＭ未満のＫｄ、そして最も好ましくは１０ｎＭ未満のＫｄでＥｒｂＢ４に結合する。１つの実施形態において、この抗体は、ヒト抗体であり、別の実施形態において、この抗体はヒト化抗体である。なお別の実施形態において、この抗体は、抗体フラグメントである。
【００３５】
本発明はさらに、ＥｒｂＢ４およびＥｒｂＢ３の両方に結合し得る抗体に関する。１つの実施形態において、この抗体は、高い親和性でＥｒｂＢ４に結合し得、そして別の実施形態において、この抗体は、高い親和性でＥｒｂＢ４およびＥｒｂＢ４の両方にに結合する。
【００３６】
別の局面において、本発明は、ＥｒｂＢ４に結合し、かつＥｒｂＢ４に対するヒレグリン結合を減少させる抗体に関する。この抗体は、高い親和性でＥｒｂＢ４に結合し得る。
【００３７】
最後に、本発明は、ＥｒｂＢ４に結合し、かつＥｒｂＢ４のヒレグリン誘導チロシンリン酸化を減少させる抗体に関する。この抗体はまた、高い親和性でＥｒｂＢ４に結合し得る。
【００３８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
他に規定されない限り、本明細書中に使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．１９８９）を参照のこと。本発明の目的のために、以下の用語が以下に規定される。
【００３９】
他に示されない限り、本明細書中に使用される場合、用語「ＥｒｂＢ」は、哺乳動物ＥｒｂＢレセプター（すなわち、ＥｒｂＢ１レセプターまたは表皮増殖因子（ＥＧＦ）レセプター；ＥｒｂＢ２レセプターまたはＨＥＲ２レセプター；ＥｒｂＢ３レセプターまたはＨＥＲ３レセプター；ＥｒｂＢ４レセプターまたはＨＥＲ４レセプター；ならびに、将来同定されるであろうこのＩ型チロシンキナーゼファミリーの任意の他のメンバー）のうちの任意の１つ以上をいい、そして「ｅｒｂＢ」は、これらのレセプターをコードする哺乳動物ｅｒｂＢ遺伝子をいう。
【００４０】
用語「ＥｒｂＢ４」および「ＨＥＲ４」は、交換可能に使用され、そして、例えば、欧州特許出願（ＥＰ）第５９９，２７４号；Ｐｌｏｗｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：１７４６−１７５０（１９９３）；およびＰｌｏｗｍａｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６６：４７３−４７５（１９９３）に開示されるネイティブ配列のＥｒｂＢ４レセプターポリペプチド、ならびにそのアミノ酸配列改変体を含む機能的誘導体をいう。
【００４１】
「ネイティブ」または「ネイティブ配列」のＥｒｂＢ４レセプターまたはＨＥＲ４レセプターは、任意の哺乳動物（ヒトを含む）種における天然に存在するＥｒｂＢ４レセプターのアミノ酸配列を有する（その調製様式に関わらない）。従って、ネイティブまたはネイティブ配列のＥｒｂＢ４レセプターは、天然から単離され得るか、組換えＤＮＡ技術の技術によって産生され得るか、化学合成され得るか、またはこれらの方法もしくは類似の方法の任意の組合わせによって産生され得る。ネイティブのＥｒｂＢ４レセプターとしては、詳細には、当該分野において公知であるかまたは本明細書中の以後に認められる、ＥｒｂＢ４の天然に存在する対立遺伝子改変体、アイソフォーム、またはスプライス改変体のアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。ネイティブ配列のＥｒｂＢ４レセプターは、例えば、ＥＰ　５９９，２７４（前出）および２件のＰｌｏｗｍａｎらによる論文（前出）に開示される。Ｅｌｅｎｉｕｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６７６１−２６７６８（１９９７）は、マウス組織およびヒト組織の両方におけるＥｒｂＢ４の２つの選択的スプライシングされたアイソフォーム（これらは、細胞外膜近接（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ）（ＪＭ）領域中の選択的な２３（ＨＥＲ４　ＪＭ−ａ）アミノ酸または１３（ＨＥＲ４　ＪＭ−ｂ）アミノ酸のいずれかの挿入が異なる）の同定を報告する。Ｅｌｅｎｉｕｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ　１８：２６０７−２６１５（１９９９）は、細胞質ドメイン配列の欠失が、ＰＩ３−Ｋ細胞内シグナル伝達経路の活性化に必要とされる、ＥｒｂＢ４の別の天然に存在するアイソフォーム（ＥｒｂＢ４　ＣＹＴ−２として示される）の同定および特徴づけを報告する。ＨＥＲ４アイソフォームはまた、ＷＯ　９９／１９４８８に開示される。ＥｒｂＢ４をコードするヌクレオチド配列（配列番号１）は、図１に示され、そして対応する推定アミノ酸配列（配列番号２）が、図２に示される。
【００４２】
用語「ＥｒｂＢ４細胞外ドメイン」または「ＥｒｂＢ４　ＥＣＤ」は、シグナル配列と最初の推定膜貫通領域との間に位置するアミノ酸を含むＥｒｂＢ４の可溶性フラグメントをいう。１つの実施形態において、この「ＥｒｂＢ４　ＥＣＤ」は、図２に示されるヒトＥｒｂＢ４配列（配列番号２）のアミノ酸２６〜６４０（配列番号４）を含むポリペプチドである。
【００４３】
用語「哺乳動物」は、ヒト、家庭用動物および家畜用動物、ならびに動物園の動物、競技用動物、または愛玩動物（例えば、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）を含むがこれらに限定されない哺乳動物として分類される任意の動物をいうために本明細書中に使用される。好ましくは、本明細書中において哺乳動物はヒトである。
【００４４】
「機能的誘導体」は、対応するネイティブポリペプチドの定性的な生物学的活性を保持する限り、そのネイティブポリペプチドのアミノ酸配列改変体および共有結合誘導体を含む。アミノ酸配列改変体は、一般的に、ネイティブアミノ酸配列内のいずれかにおける１つ以上のアミノ酸の置換、欠失および／または挿入がネイティブ配列と異なる。欠失改変体としては、ネイティブポリペプチドのフラグメント、ならびにＮ末端短縮および／またはＣ末端短縮を有する改変体が挙げられる。通常、アミノ酸配列改変体は、ネイティブポリペプチドと少なくとも約７０％の相同性、好ましくは少なくとも約８０％の相同性、より好ましくは少なくとも約９０％の相同性を保有する。
【００４５】
「相同性」は、最大の相同性パーセントを達成するように配列を整列させ、そして必要である場合、ギャップを導入した後に、アミノ酸配列改変体中の同一である残基のパーセンテージとして規定される。整列のための方法およびコンピュータープログラムは、当該分野で周知である。１つのこのようなコンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．により作製された「Ａｌｉｇｎ　２」である（これは、Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ　Ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ　２０５５９に１９９１年１２月１０日にユーザードキュメンテーションと共に提出された）。
【００４６】
ＥｒｂＢ「アンタゴニスト」は、ＥｒｂＢエフェクター機能を妨害または干渉する分子であり、例えば、リガンドによるネイティブ配列のＥｒｂＢレセプターの結合および／もしくは活性化、ならびに／またはネイティブ配列のＥｒｂＢレセプターによって使用される下流の経路を妨害または干渉する分子である。このような分子は、例えば、チロシンリン酸化アッセイにおいてリガンドによるＥｒｂＢレセプター活性化を競合的に阻害するそれらの分子の能力に基づいて、スクリーニングされ得る。同様に、ネイティブ配列のＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）レセプターのアンタゴニストは、ＥｒｂＢ４エフェクター機能を妨害または干渉する分子であり、例えば、リガンドによるネイティブ配列のＥｒｂＢ４レセプターの結合および／もしくは活性化、ならびに／またはＥｒｂＢ４レセプターによって使用される下流の経路を妨害または干渉する分子である。このような分子は、例えば、チロシンリン酸化アッセイにおいてリガンドによるＥｒｂＢ４レセプター活性化を競合的に阻害するそれらの分子の能力に基づいて、スクリーニングされ得る。ＥｒｂＢ４アンタゴニストの例としては、可溶性ＥｒｂＢ４レセプター（例えば、ネイティブ配列のＥｒｂＢ４レセプターの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）および改変体ＥｒｂＢ４レセプターの細胞外ドメイン（ＥＣＤ））、ネイティブ配列のＥｒｂＢ４レセプターに対する中和抗体、ネイティブ配列のＥｒｂＢ４レセプターのリガンドに対する中和抗体（例えば、抗ＨＢ−ＥＧＦ抗体）、ＥｒｂＢ４−Ｉｇ免疫付着因子（キメラへテロ付着因子を含む）および低分子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
「ＥｒｂＢ４リガンド」は、ＥｒｂＢ４レセプターに結合し、そして／またはＥｒｂＢ４レセプターを活性化するポリペプチドを意味する。ＥｒｂＢ４リガンドとしては、βセルリン、エピレグリン（ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ＨＢ−ＥＧＦ、ＮＲＧ−２、ＮＲＧ−３およびヒレグリンが挙げられる。
【００４８】
本発明の方法において、用語「制御」およびその文法上の変形は、所望されない事象（例えば、平滑筋細胞および／または他の細胞型（例えば、内皮細胞）の過剰な増殖および／または移動のような生理学的状態）の予防、部分的阻害もしくは完全な阻害、減少、遅延または減速をいうために使用される。
【００４９】
用語「過剰な増殖および／または移動」は、処置されない場合に、所望されない生理学的状態または疾患（例えば、狭窄（血管狭窄、再狭窄、および幽門狭窄を含む）；膀胱壁肥厚、および閉塞性気道疾患など）の発生を生じるか、またはおそらくこれらを生じる、正常レベルを超えた増殖および／または移動を意味する。
【００５０】
「処置」は、治療的な処置および予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）手段または予防（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいう。処置が必要なものとしては、その障害を既に有するもの、ならびにその障害を有する傾向があるもの、またはその障害が予防されるべきもの挙げられる。本発明の目的に関して、有益な臨床結果または所望される臨床結果としては、検出可能であるか検出不可能であるかに関わらず、症状の緩和、疾患の程度の減少、安定した（すなわち、悪化しない）疾患状態、疾患の進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、ならびに寛解（部分的であるか、全体的であるかに関わらず）が挙げられるが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けなかった場合に予想される生存と比較して、生存を延長させることを意味し得る。処置が必要なものとしては、その状態または障害を既に有するもの、ならびにその状態または障害を有する傾向があるもの、またはその状態または障害が予防されるべきもの挙げられる。
【００５１】
用語「単離された」分子は、同定され、かつその分子の天然の供給源中でその分子が通常会合している少なくとも１つの夾雑分子と分離されている分子として、広範に規定される。好ましくは、単離された分子は、天然ではその分子が会合しているすべての成分と会合していない。
【００５２】
本明細書中に使用される場合、用語「免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）」は、タンパク質の結合ドメインを組合わせた抗体様分子（例えば、免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能を有する細胞表面レセプターの細胞外ドメイン（付着因子部分））をいう。用語「免疫付着因子」は、詳細には、ネイティブのＥｒｂＢ４レセプター配列または改変体のＥｒｂＢ４レセプター配列を含む。ＥｒｂＢ４−ＩｇＧ免疫付着因子の核酸配列を、図３に示す（配列番号３）。免疫付着因子は、ヒト抗体の多数の価値のある化学的特性および生物学的特性を保有し得る。免疫付着因子は、適切なヒト免疫グロブリンのヒンジおよび定常ドメイン（Ｆｃ）配列に連結された、所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築され得るので、目的の結合特異性は、完全にヒトの成分を用いて達成され得る。このような免疫付着因子は、患者に対して最小限に免疫原性であり、そして慢性的な使用または反復した使用に対して安全である。用語「単離された免疫付着因子」は、供給源から精製されるかまたは組換え方法もしくは合成方法によって調製され、かつ他のペプチドもしくはタンパク質を十分に含まない免疫付着因子をいう。
【００５３】
文献に報告されている免疫付着因子としては、以下が挙げられる：Ｔ細胞レセプターの融合物（Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８４：２９３６−２９４０（１９８７））；ＣＤ４（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３３７：５２５−５３１（１９８９）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３９：６８−７０（１９８９）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．ＵＳＡ　９：３４７−３５３（１９９０）；およびＢｙｒｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３４４：６６７−６７０（１９９０））；Ｌ−セレクチンもしくはホーミングレセプター（Ｗａｔｓｏｎら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１０：２２２１−２２２９（１９９０）；およびＷａｔｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３４９：１６４−１６７（１９９１））；ＣＤ４４（Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ　６１：１３０３−１３１３（１９９０））；ＣＤ２８およびＢ７（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０（１９９１））；ＣＴＬＡ−４（Ｌｉｓｌｅｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１−５６９（１９９１））；ＣＤ２２（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃら、Ｃｅｌｌ　６６：１１３３−１１４４（１９９１））；ＴＮＦレセプター（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８８：１０５３５−１０５３９（１９９１）；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：２８８３−２８８６（１９９１）；ならびにＰｅｐｐｅｌら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：１４８３−１４８９（１９９１））；ＮＰレセプター（Ｂｅｎｎｅｔｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：２３０６０−２３０６７（１９９１））；インターフェロンレセプター（Ｋｕｒｓｃｈｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９３５４−９３６０（１９９２））；４−１ＢＢ（Ｃｈａｌｕｐｎｙら、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８９：１０３６０−１０３６４（１９９２））、ならびにＩｇＥレセプター（ＲｉｄｇｗａｙおよびＧｏｒｍａｎ、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５、Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｎｏ．１４４８（１９９１））。
【００５４】
治療的使用のために記載されたホモマルチマー免疫付着因子の例としては、細胞表面ＣＤ４０へのＨＩＶの結合をブロックするためのＣＤ４−ＩｇＧ免疫付着因子が挙げられる。第１相臨床試験（ここで、ＣＤ４−ＩｇＧが妊娠女性に分娩の直前に投与された）得られたデータは、この免疫グロブリンが、ＨＩＶの母親−胎児転移の予防に有用であり得ることを示唆する（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：２１９−２２７（１９９３））。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する免疫付着因子もまた、開発された。ＴＮＦは、敗血症性ショックの主要な媒介因子であることが示された炎症誘発性サイトカインである。敗血症性ショックのマウスモデルに基づいて、ＴＮＦレセプター免疫付着因子は、敗血症性ショックを処置する際の臨床的使用のための候補として、見込みを示している（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．ら（１９９１）ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８８：１０５３５−１０５３９）。ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）（エタナーセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、ＩｇＧ　Ｆｃ領域に融合したＴＮＦレセプター配列を含む免疫付着因子）は、慢性関節リウマチの処置に対して、１９９８年１１月２日に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。慢性関節リウマチの処置におけるＥＮＢＲＥＬ（登録商標）の拡大された新規の用途は、近年、２０００年６月６日にＦＤＡによって承認された。ＴＮＦブロッカー（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）を含む）に関する最近の情報は、Ｌｏｖｅｌｌら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：７６３−１６９（２０００）、および付随の論説（ｐ８１０−８１１）；ならびにＷｅｉｎｂｌａｔｔら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４０：２５３−２５９（１９９９）；ＭａｉｎｉおよびＴａｙｌｏｒの総説、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５１：２０７−２２９（２０００）を参照のこと。免疫付着因子はまた、非治療的用途を有する。例えば、Ｌ−セレクチンレセプター免疫付着因子は、末梢リンパ節の高内皮性小静脈（ＨＥＶ）の組織学的染色のための試薬として使用された。この試薬はまた、Ｌ−セレクチンリガンドを単離および特徴付けるために使用された（Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、前出）。
【００５５】
免疫付着因子構造の２つのアームが異なる特異性を有する場合、その免疫付着因子は、二重特異的抗体に対する類似により「二重特異的免疫付着因子」と称される。Ｄｉｅｔｓｃｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　１６２：１２３（１９９３）は、接着分子であるＥ−セレクチンおよびＰ−セレクチンの細胞外ドメインを含むこのような二重特異的免疫付着因子を記載し、この各セレクチンは、天然では異なる細胞型において発現される。結合研究によって、このように形成された二重特異的免疫グロブリン融合タンパク質が、その二重特異的免疫グロブリン融合タンパク質が誘導された一重特異的免疫付着因子と比較して、骨髄性細胞株に対する増強された結合能力を有することが示された。
【００５６】
用語「ヘテロ付着因子」は、表現「キメラへテロマルチマー付着因子」と交換可能に使用され、そしてこの用語は各キメラ分子が生物学的に活性な部分（例えば、へテロマルチマー化レセプターモノマーの各々の細胞外ドメイン）をマルチマー化ドメインと結合しているキメラ分子（アミノ酸配列）の複合体をいう。「マルチマー化ドメイン」は、ヘテロマルチマー複合体内のキメラ分子の安定な相互作用を促進する。このマルチマー化ドメインは、免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、またはキメラへテロマルチマーのキメラ分子間の分子間ジスルフィド結合を形成する遊離のチオールを介して、相互作用し得る。このマルチマー化ドメインは、免疫グロブリン定常領域を含み得る。さらに、マルチマー化領域は、立体相互作用が安定な相互作用を促進するのみでなく、モノマー混合物由来のホモダイマーよりもヘテロダイマーの形成をさらに促進するようにも操作され得る。「突起」は、第１のポリペプチドの界面からの小さいアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置換することによって構築される。この突出に対して同一の大きさまたは同様の大きさである補償的な「空洞」が、必要に応じて、大きいアミノ酸側鎖をより小さいアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはスレオニン）と置換することによって、第２のポリペプチドの界面上に作製される。免疫グロブリン配列は、好ましくは、免疫グロブリン定常ドメインであるが、必ずしもそうである必要はない。本発明のキメラ中の免疫グロブリン部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４のサブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤまたはＩｇＭから獲得され得るが、好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ３から獲得され得る。
【００５７】
本明細書中に使用される場合、用語「エピトープタグ化」は、「タグポリペプチド」に融合されたキメラ付着因子全体を含むキメラポリペプチド、またはそのフラグメントをいう。タグポリペプチドは、抗体が作製され得るエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、なおもキメラへテロ付着因子の活性を妨害しないのに十分な短さである。タグポリペプチドは、好ましくは、そのタグポリペプチドに対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように十分に特徴的である。適切なタグポリペプチドは、一般的に、少なくとも６アミノ酸残基を有し、通常約８個〜５０個の間のアミノ酸残基（好ましくは約９個〜３０個の間の残基）を有する。本発明の実施形態は、エピトープタグに連結されるキメラへテロ付着因子を含み、このタグは、サンプル中のその付着因子を検出するためか、またはサンプルからその付着因子を回収するために使用される。
【００５８】
「単離された／高度に精製された／実質的に均質の免疫付着因子」、「単離された／高度に精製された／実質的に均質のヘテロ付着因子」、および「単離された／高度に精製された／実質的に均質のキメラへテロマルチマー付着因子」は、交換可能に使用され、そしてこの用語は、供給源から精製されるかまたは組換え方法もしくは合成方法によって調製された付着因子であって、かつ、クロマトグラフィー技術または他の精製技術（例えば、クマシーブルー染色または好ましくは銀染色を用いた非還元条件または還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による均質性の程度まで、他のペプチドまたはタンパク質を実質的に含まない付着因子を意味する。本明細書中において均質性は、約５％未満の他の供給源タンパク質の夾雑を意味する。本発明のＥｒｂＢ２／４−ＩｇＧキメラへテロ付着因子は、は、ホモダイマーと比較して十分に高い親和性で結合するので、ホモダイマーおよびヘテロダイマーの混合物の使用もまた、本発明の有用な実施形態と考えられる。用語「キメラへテロマルチマー付着因子」、「キメラへテロ付着因子」および「ＣＨＡ」は、本明細書中において交換可能に使用される。
【００５９】
用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、そして詳細には、ネイティブなＥｒｂＢ４レセプターを認識する抗体に及ぶ。「高い親和性」の結合を示す抗体は、約１００ｎＭ未満のＫｄ、好ましくは約５０未満、より好ましくは約２５未満、最も好ましくは約１０未満のＫｄを有する。
【００６０】
本明細書中に使用される場合、用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体をいい、すなわち、その集団を含む個々の抗体が、少量で存在し得る可能性のある天然に存在する変異体以外は、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して指向されている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を代表的に含む通常の（ポリクローナル）抗体調製物と比較して、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して指向される。
【００６１】
本明細書中においてモノクローナル抗体は、起源の種または免疫グロブリンのクラスもしくはサブクラスの指定ならびに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２、およびＦｖ）に関わらず（これらが所望の生物学的活性を示す限り）、抗キメラへテロ付着因子抗体の可変ドメイン（超可変ドメインを含む）を定常ドメインと連結することによって（例えば、「ヒト化」抗体）、または軽鎖を重鎖と連結することによって、またはある種由来の鎖を別の種由来の鎖と連結することによって、または融合物を異種タンパク質と連結することによって産生される、ハイブリッド抗体および組換え抗体を含む（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号およびＭａｇｅおよびＬａｍｏｙｉ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、７９−９７頁（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９８７）を参照のこと）。
【００６２】
従って、修飾成句「モノクローナル」は、実質的に均質の抗体集団から得られるような抗体の特徴を示し、そして修飾成句「モノクローナル」は、いなかるの特定の方法による抗体の産生を必要するものとしても解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ　３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技術を使用して作製されるファージライブラリーから単離され得る。
【００６３】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小の配列を含む、特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２または抗体の他の抗原結合部分配列）である。たいてい、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、そのヒト免疫グロブリンにおいて、レシピエント抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体（例えば、マウス、ラット、またはウサギ））のＣＤＲ由来の残基によって置換されている。いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）の残基は、対応する非ヒトＦＲ残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲ配列もしくはＦＲ配列のいずれにも見出されない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能を高め、そして最適化するようになされる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの可変ドメイン、代表的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、ＣＤＲの全領域またはＣＤＲの実質的に全体の領域は、非ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ領域に対応し、そしてＦＲの全残基またはＦＲの実質的に全体の残基は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の残基である。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的には、ヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ））の少なくとも一部を含む。
【００６４】
「筋細胞」は、骨格筋組織の細胞、心筋組織の細胞、平滑筋組織の細胞を含む。この用語は、より分化された筋細胞（例えば、筋芽細胞）を形成するように分化する細胞を含む。血管平滑筋細胞は、血管の中間の弾性膜（中膜）に存在する平滑筋細胞をいう。
【００６５】
用語「狭窄」は、身体中の中空の通路（例えば、管路または管）が狭くなることまたは狭窄をいう。用語「血管狭窄」は、血管の閉塞または血管が狭くなることをいう。血管狭窄は、しばしば、脂肪の沈着（アテローム性動脈硬化症の場合）または血管平滑筋細胞および内皮細胞の過剰な移動および増殖から生じる。動脈は、特に狭窄を受け易い。本明細書中に使用される場合、用語「狭窄」は、詳細には、最初の狭窄および再狭窄を含む。
【００６６】
用語「再狭窄」は、明らかに成功した最初の狭窄の処置後の、狭窄の再発をいう。例えば、血管狭窄の状況における「再狭窄」は、例えば、バルーン血管形成術による脂肪沈着の除去によって明らかな成功を伴なって処置された後の、血管狭窄の再発をいう。再狭窄の寄与因子のうちの１つは、内膜過形成である。「新内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ）過形成」および「新最内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａ）形成」と交換可能に使用される用語「内膜過形成」は、血管平滑筋および内皮細胞の過剰な増殖および移動の結果としての、血管の最も内部の層（最内膜）の肥厚化をいう。再狭窄の間に生じる多数の変化は、しばしば、総称して「血管壁リモデリング」と称される。
【００６７】
用語「バルーン血管形成術」および「経皮的経管的冠状動脈形成術」（ＰＴＣＡ）は、しばしば交換可能に使用され、そしてこの用語は、冠状動脈からのプラーク除去のための非外科的なカテーテルに基づく処置をいう。狭窄または再狭窄は、しばしば、血流に対する増大した抵抗の結果として、高血圧を導く。
【００６８】
用語「幽門狭窄」は、幽門（十二指腸へと開く胃の最も下の端にある通路）が狭まることをいう。
【００６９】
用語「高血圧」は、異常に高い血圧、すなわち、正常範囲の上限値を超えた血圧をいう。
【００７０】
「中和抗体」は、ＥｒｂＢレセプターのエフェクター機能をブロックし得るかまたはこの機能を有意に減少させ得る、本明細書中に規定されるような抗体分子を意味する。従って、「中和」抗ＥｒｂＢ４抗体は、ＥｒｂＢ４のエフェクター機能（例えば、リガンド結合および／または細胞応答の誘発）をブロックし得るかまたはこれらの機能を有意に減少させ得る。本発明の目的に関して、ＥｒｂＢ４に対するＥｒｂＢ４リガンド（ヒレグリン、ＨＲＧ）の結合を中和する抗ＥｒｂＢ４抗体の能力は、例えば、候補抗ＥｒｂＢ４抗体の存在下および非存在下において、検出可能に標識されたＨＲＧが、精製されたＥｒｂＢ４またはＥｒｂＢ４を発現する細胞株もしくはＥｒｂＢ４を発現するように改変された細胞株に対して結合することを測定することによって、モニターされ得る。このようなアッセイは、以下の実施例４に記載される。本発明のために、ＥｒｂＢ４による細胞応答の誘発を中和する抗ＥｒｂＢ４抗体の能力は、好ましくは、ヒレグリン（ＨＲＧ）によるＥｒｂＢ４のチロシンリン酸化の阻害をモニタリングすることによってか、または細胞増殖アッセイにおいて、試験される。代表的なアッセイは、以下の実施例４に開示される。「有意」な減少は、標的抗原（例えば、ＥｒｂＢ４）のエフェクター機能（例えば、リガンド（例えば、ＨＲＧ）結合および／または細胞応答の誘発）の、少なくとも約６０％の減少、または少なくとも約７０％の減少、好ましくは少なくとも約７５％の減少、より好ましくは少なくとも約８０％の減少、なおより好ましくは少なくとも約８５％の減少、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の減少、さらにより好ましくは少なくとも約９５％の減少、最も好ましくは少なくとも約９９％の減少を意味する。好ましくは、本明細書中に規定される「中和」抗体は、実施例４に記載のアッセイによって決定した場合に、ＨＲＧによるＥｒｂＢ４のチロシンリン酸化の、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％；なおより好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９９％を中和し得る。
【００７１】
「単離された」抗体は、同定され、かつその天然の環境の成分から分離および／または回収された抗体である。その天然の環境の夾雑成分は、その抗体についての診断的用途または治療的用途を妨害する物質であり、そしてこれらとしては、酵素、ホルモン、および他のタンパク質様または非タンパク質様の溶質が挙げられ得る。好ましい実施形態において、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定した場合に、９５重量％を超える抗体にまで、そして最も好ましくは、９９重量％を超えるまでに精製されるか、（２）スピニングカップ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ　ｃｕｐ）配列決定装置の使用により、少なくとも１５残基のＮ末端アミノ酸配列または内部アミノ酸配列を得るに十分な程度に精製されるか、または（３）クマシーブルー染色または好ましくは銀染色を使用する、還元条件下または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質なまでに精製される。単離された抗体は、組換え細胞内のインサイチュでのその抗体を含む。なぜなら、その抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在していないからである。しかし、通常には、単離された抗体は、少なくとも１回の精製工程によって調製される。
【００７２】
用語「エピトープ」は、タンパク質抗原上の（モノクローナルまたはポリクローナル）抗体に対する結合部位をいうために使用される。
【００７３】
特定のエピトープに対して結合する抗体は、「エピトープマッピング」によって同定され得る。タンパク質上のエピトープの位置をマッピングおよび特徴付けるための当該分野で公知の多数の方法が存在し、これらとしては、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，１９９９の第１１章に記載されるような、抗体−抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子フラグメント発現アッセイ、および合成ペプチドに基づくアッセイが挙げられる。競合アッセイは、以下に議論される。遺伝子フラグメント発現アッセイに従って、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームが、無作為にかまたは特定の遺伝子構築物のいずれかによって断片化され、そしてその発現されたタンパク質フラグメントと試験されるべき抗体との反応性が決定される。例えば、遺伝子フラグメントは、ＰＣＲによって生成され得、次いで、放射性アミノ酸の存在下でインビトロで転写され得、そしてタンパク質に翻訳され得る。次いで、放射性標識タンパク質フラグメントに対する抗体の結合が、免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定される。特定のエピトープがまた、ファージ粒子の表面上に提示されたランダムペプチド配列の大きなライブラリー（ファージライブラリー）を使用することによって同定され得る。あるいは、重複するペプチドフラグメントの規定されたライブラリーが、簡単な結合アッセイにおいて試験抗体に対する結合について試験され得る。後者の手法は、約５〜１５アミノ酸の線状エピトープを規定するのに適している。
【００７４】
抗体は、その抗体と参照抗体の２つが同一のエピトープまたは立体的に重複するエピトープを認識する場合、参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つの抗体が同一のエピトープまたは立体的に重複するエピトープに結合するか否かを決定するための、最も広範囲で使用され、かつ迅速な方法は、競合アッセイであり、この競合アッセイは、標識抗原または標識抗体のいずれかを用いて、全ての数の異なる形式で形成され得る。通常、抗原は、９６ウェルプレート上に固定化され、そして標識抗体の結合をブロックする非標識抗体の能力が、放射性標識または酵素標識を用いて測定される。
【００７５】
成句「ＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）レセプターを阻害する」とは、例えば、ＥｒｂＢ４レセプターに対するリガンドの結合をブロックすることによって、ＥｒｂＢ４レセプターの活性化を阻害または妨害するＥｒｂＢ４アンタゴニストの能力をいう。ＥｒｂＢ４レセプターの「活性化」は、チロシンリン酸化アッセイを用いて定量され得るレセプターのリン酸化、および結合リガンドによるシグナル伝達の誘導を構成する下流の事象をいう。「阻害」は、これらのアッセイのうちのいずれかが、少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％；なおより好ましくは少なくとも約８５％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも約９９％であることをいう。
【００７６】
表現「細胞の生存を低減させる」は、インビトロまたはインビボのいずれかでの、ＥｒｂＢ４アンタゴニストに対して曝露されていない未処理細胞と比較して、細胞の存在期間を低減させる作用をいう。表現「減少された細胞増殖」は、未処理細胞と比較して、インビトロまたはインビボにいずれかでＥｒｂＢ４アンタゴニストに対して曝露された集団中の細胞数の減少をいう。
【００７７】
ＥｒｂＢ４アンタゴニストに関連して使用される場合、「生物学的活性」は、関連するインビトロアッセイまたはインビボアッセイ（本明細書中の以下の実施例に記載されるＰＤＧＦ刺激された平滑筋細胞の増殖およびヒト大動脈平滑筋細胞移動アッセイ、動物モデルおよびヒト臨床試験を含む）において決定された場合に、基にある機構に関係なく、平滑筋細胞の過剰な増殖または移動を制御するＥｒｂＢ４アンタゴニストの能力をいう。従って、ＥｒｂＢ４アンタゴニストの生物学的活性としては、リガンド結合のンヒビターとしてか、もしくはネイティブＥｒｂＢ４レセプターの活性化のインヒビターとして機能すること、あるいは／またはその表面上にＥｒｂＢ４レセプターを発現する平滑筋細胞の増殖および／もしくは移動の阻害が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７８】
用語「疾患状態」は、細胞の機能系もしくは身体の機能系または器官の妨害、停止、または障害が生じている、細胞または哺乳動物全体の生理学的状態をいう。
【００７９】
用語「有効量」は、哺乳動物において疾患、障害または所望されない生理学的状態を処置（予防を含む）するのに有効な薬物の量をいう。本発明において、「有効量」のＥｒｂＢ４アンタゴニストは、平滑筋細胞の増殖を低下、減速または遅延させ得；平滑筋細胞の移動を低下、減速または遅延させ得；狭窄または再狭窄の発生を予防または阻害（すなわち、いくらか遅延させ、そして好ましくは停止させる）し得；そして／あるいは、狭窄または再狭窄と関連する症状の１つ以上をいくらか緩和し、特に、狭窄または再狭窄と関連する上昇した血圧の発生を予防または阻害（すなわち、いくらか減速させ、そして好ましくは停止させる）し得る。
【００８０】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係に配置される場合、「作動可能に連結している」。例えば、プレ配列または分泌リーダーについてのＤＮＡは、このＤＮＡがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、そのポリペプチドのＤＮＡに作動可能に連結されており；プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列の転写に影響を与える場合、そのコード配列に作動可能に連結されており；あるいは、リボソーム結合部位は、このリボソーム結合部位が翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般的に、「作動可能に連結された」とは、連続して連結されたＤＮＡ配列を意味し、そして分泌リーダの場合は、連続しかつ読み取りの相で連結されたＤＮＡ配列を意味する。しかし、エンハンサーは、連続的である必要はない。連結は、簡便な制限部位での連結によって達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドのアダプターまたはリンカーが、従来の実施に従って使用される。
【００８１】
「薬学的に受容可能な」キャリア、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度ではそれらに曝露された細胞または哺乳動物に対して非毒性である。しばしば、この薬学的に受容可能なキャリアは、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に受容可能なキャリアの例としては、以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸のような、緩衝液；アスコルビン酸を含む、抗酸化剤；低分子量（およそ１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）；モノサッカライド、ジサッカライド、および他の糖質（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトール、またはソルビトール）；塩を形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；および／あるいは非イオン性の界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰｌｕｒｏｎｉｃｓ）。
【００８２】
（Ｂ．本発明を実行するための方法）
本発明は、ネイティブＥｒｂＢ４レセプターのアンタゴニストによる狭窄症の処置に関する。本発明は、そのように限定されるわけではないが、好ましい実施形態において、そのアンタゴニストが、免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）またはキメラヘテロマルチマー接着因子である。免疫付着因子（ハイブリッド免疫グロブリンと呼ばれる）（その構造および調製を含む）は、例えば、ＷＯ　９１／０８２９８；および米国特許第５，４２８，１３０号および同第５，１１６，９６４号（これらの開示は、本明細書によって参考として明示的に援用される）に記載される。
【００８３】
（１．免疫付着因子またはキメラへテロマルチマー接着因子の生成）
以下の記載は、免疫付着因子核酸を含むベクターで形質転換またはトランスフェクションした細胞を培養することによる、免疫付着因子の生成に主に関する。当然、当該分野で周知である別の方法が、免疫付着因子を調製するために使用され得ることが、意図される。例えば、免疫付着因子配列またはその一部は、固相技術［例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｃｏ．，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ（１９６９）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１５４（１９６３）を参照のこと］を使用して、直接ペプチド合成により生成され得る。インビトロタンパク質合成は、手動技術を使用しても、または自動化によっても、実施され得る。自動合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を製造業者の指示を使用して用いて、達成され得る。免疫付着因子の種々の部分が、別個に化学合成され得、そして化学的方法または酵素的方法を使用して、全長免疫付着因子を生成するように組合され得る。
【００８４】
ネイティブ配列ＥｒｂＢ４レセプターをコードする核酸は、例えば、そのＥｒｂＢ４レセプターを発現することが既知の細胞（例えば、上記ＥＰ　５９９，２７４に記載される細胞、および上記Ｐｌｏｗｍａｎらの参考文献全体に記載される細胞）から単離され得るか、または合成され得る。
【００８５】
免疫グロブリンの軽鎖定常領域または重鎖定常領域をコードするＤＮＡは、公知であるか、またはｃＤＮＡライブラリーから容易に入手可能であるか、または合成される。例えば、Ａｄａｍｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９：２７１１〜２７１９（１９８０）；Ｇｏｕｇｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９：２７０２〜２７１０（１９８０）；Ｄｏｌｂｙら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ　７７：６０２７〜６０３１（１９８０）；Ｒｉｃｅら、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ　７９：７８６２〜７８６５（１９８２）；Ｆａｌｋｎｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　２９８：２８６〜２８８（１９８２）；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９〜２５６（１９８４）を参照のこと。
【００８６】
本発明の免疫付着因子またはキメラヘテロ接着因子は、好ましくは、宿主細胞における発現により生成され、そしてそれらから単離される。宿主細胞は、一般的には、本発明の核酸で形質転換される。好ましくは、この核酸は、発現ベクター中に組み込まれる。本明細書中のベクターをクローニングまたは発現するための適切な宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよび他の細菌）、酵母、および他の真核生物微生物、および高等真核細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞および哺乳動物細胞）である。これらの細胞はまた、生きている動物（例えば、ウシ、ヤギ、またはヒツジ）中に存在し得る。昆虫細胞もまた、使用され得る。クローニング方法および発現方法は、当該分野で周知である。
【００８７】
免疫付着因子（例えば、キメラＥｒｂＢ４−ＩｇＧ分子）の発現を得るために、１つ以上の発現ベクターが、形質転換またはトランスフェクションによって宿主細胞中に導入され、そして生じた組換え宿主細胞が、プロモーターを誘導するために適切に改変された従来の栄養培地中で培養され、組換え細胞を選択するか、またはＥｒｂＢ４−ＩｇＧ　ＤＮＡを増幅する。一般に、インビトロでの哺乳動物細胞培養の生産性を最大にする原理、プロトコル、および実際の技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９９１）に見出され得る。
【００８８】
（（ｉ）免疫付着因子をコードする核酸の構築）
本発明の免疫付着因子を調製する場合、好ましくは、天然のレセプターの細胞外ドメインをコードする核酸が、免疫グロブリンの定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸にＣ末端側で融合されるが、Ｎ末端融合物もまた可能である。代表的には、このような融合物においては、コードされるキメラポリペプチドは、免疫グロブリンの重鎖の定常領域の少なくとも機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを保持している。融合はまた、定常ドメインのＦｃ部分のＣ末端になされるか、または重鎖のＣＨ１もしくは軽鎖の対応する領域に、すぐＮ末端側でなされる。生じるＤＮＡ融合構築物は、適切な宿主細胞中で発現される。
【００８９】
所望の免疫付着因子を調製するために使用されるネイティブ配列細胞外ドメイン（例えば、ＥｒｂＢ４由来）のアミノ酸配列改変体および／または抗体配列をコードする核酸分子は、当該分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：天然の供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列改変体（例えば、ＥｒｂＢ４に関連した上記されたもの）の場合）、またはオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、およびネイティブ配列ＥｒｂＢ４の先に調製された改変体もしくは非改変体バージョンのカセット変異誘発による調製。
【００９０】
キメラヘテロ接着因子に含まれるネイティブ細胞外ドメインのアミノ酸配列改変体は、適切なヌクレオチド変化を、そのネイティブ細胞外ドメインＤＮＡ配列中に導入することによってか、または所望のキメラへテロ接着因子モノマーポリペプチドのインビトロ合成によって、調製される。そのような改変体は、例えば、免疫付着因子のアミノ酸配列またはキメラヘテロ接着因子のアミノ酸配列中の残基からの欠失、またはそのような残基の挿入もしくは置換を含む。
【００９１】
上記のようなネイティブ配列における変動は、表１に示される保存的変異および非保存的変異のための技術および指針のいずれかを使用して、なされ得る。
【００９２】
好ましい実施形態において、その核酸は、ＥｒｂＢ４レセプター細胞外ドメイン配列が抗体（特に、Ｆｃドメイン）のＣ末端部分のＮ末端に融合したキメラ分子（免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）のエフェクター機能を含む）をコードする。ＥｒｂＢ４レセプター細胞外ドメイン配列に重鎖定常領域全体を融合することが、可能である。しかし、より好ましくは、（ＩｇＧ　Ｆｃを化学的に定義する）パパイン切断部位（すなわち、重鎖の定常領域の最初の残基を１１４とした場合の残基２１６［Ｋｏｂｅｔら、前出］）または他の免疫グロブリンの同様の部位のすぐ上流のヒンジ領域で開始する配列が、その融合において使用される。特に好ましい実施形態においては、ＥｒｂＢ４レセプター細胞外ドメイン配列は、ＩｇＧ１重鎖、ＩｇＧ２重鎖、またはＩｇＧ３重鎖の、ヒンジ領域、およびＣＨ２、およびＣＨ３、またはＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインに、融合される。融合がなされる正確な部位は重要でなく、最適な部位は、慣用的実験によって決定され得る。
【００９３】
ヒト免疫付着因子のために、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン配列およびＩｇＧ３免疫グロブリン配列の使用が、好ましい。ＩｇＧ１を使用する主な利点は、ＩｇＧ１免疫付着因子が、固定されたプロテインＡにより効率的に精製され得ることである。対照的に、ＩｇＧ３の精製は、プロテインＧを必要とし、このプロテインＧは、かなり汎用性が低い媒体である。しかし、特定の免疫付着因子構築のためのＩｇ融合パートナーを選択する場合、免疫グロブリンの他の構造特性および機能特性が、考慮されるべきである。例えば、ＩｇＧ３ヒンジはもっと長くかつもっと可撓性であるので、このＩｇＧ３ヒンジは、ＩｇＧ１に融合した場合に適切に折り畳まないか機能しないかもしれないもっと大きな「接着因子」ドメインに、適合し得る。別の考慮事項は、結合価であり得る：ＩｇＧ免疫付着因子は二価ホモダイマーであるが、ＩｇＡおよびＩｇＭのようなＩｇサブタイプは、それぞれ、基本Ｉｇホモダイマー単位のダイマー構造またはペンタマー構造を生じ得る。
【００９４】
インビボ適用のために設計されるＥｒｂＢ４−Ｉｇ免疫付着因子について、Ｆｃ領域により特定される薬物動態特性およびエフェクター機能も、同様に重要である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４はすべてインビボ半減期２１日を有するが、その補体系を活性化する際のそれらの相対的能力は、異なる。Ｉｇ４は、補体を活性化せず、そしてＩｇＧ２は、補体活性化の際に、ＩｇＧ１よりも有意に弱い。さらに、ＩｇＧ１と異なり、ＩｇＧ２は、単核細胞または好中球上のＦｃレセプターに結合しない。ＩｇＧ３は補体活性化のために最適であるが、そのインビボ半減期は、他のＩｇＧアイソタイプの約３分の１である。
【００９５】
ヒト治療剤として使用されるように設計される免疫付着因子について別の重要な考慮事項は、特定のアイソタイプのアロタイプ改変体の数である。一般に、血清学的に規定されるアロタイプが少ないＩｇＧアイソタイプが、好ましい。例えば、ＩｇＧ１は、たった４つしか血清学的に規定されるアロタイプ部位を有さず、そのうち２つ（Ｇ１ｍ１およびＧ１ｍ２）はＦｃ領域中に位置し、そしてこれらの部位のうちの１つＧ１ｍ１は非免疫原性である。対照的に、ＩｇＧ３中には、血清学的に規定される１２個のアロタイプが存在し、そのすべてがＦｃ領域中に存在し、これらの部位のうちの３つだけ（Ｇ３ｍ５、Ｇ３ｍ１１、およびＧ３ｍ２１）が、非免疫原性である１つのアロタイプを有する。従って、ＩｇＧ３免疫付着因子の潜在的免疫原性は、ＩｇＧ１免疫付着因子の潜在的免疫原性よりも大きい。
【００９６】
ＥｒｂＢ４レセプター配列（例えば、細胞外ドメイン配列）をコードするｃＤＮＡおよび免疫付着因子のＩｇ部分をコードするｃＤＮＡが、選択された宿主細胞中での効率的発現を指向するプラスミドベクター中に、直列して挿入される。哺乳動物細胞における発現のために、ｐＲＫ５ベースのベクター［Ｓｃｈａｌｌら、Ｃｅｌｌ　６１、３６１〜３７０（１９９０）］およびＣＤＭ８ベースのベクター［Ｓｅｅｄ、Ｎａｔｕｒｅ　３２９、８４０（１９８９）］が、例えば、使用され得る。正確な接合部は、オリゴヌクレオチド指向性欠失変異誘発［ＺｏｌｌｅｒおよびＳｍｉｔｈ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１０、６４８７（１９８２）；Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３３７、５２５〜５３１（１９８９）］を使用して、指定された接合部コドン間の余分な配列を除去することによって、作製され得る。各半分が所望の接合部のいずれかの側の配列と相補的な、合成オリゴヌクレオチドが、使用され得、理想的には、これらは、３６マー〜４８マーである。あるいは、ＰＣＲ技術が、適切なベクターとインフレームでその分子の２つの部分を接合するために使用され得る。
【００９７】
免疫グロブリン軽鎖の存在は、本発明の免疫付着因子において必要ではないが、免疫グロブリン軽鎖が、ｔｒｋレセプター−免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合してか、またはｔｒｋレセプター細胞外ドメインに直接融合してのいずれかで、存在し得る。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、代表的には、ＥｒｂＢ４レセプター−免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと共発現される。分泌の際、そのハイブリッド重鎖および軽鎖は、２つにジスルフィド結合した免疫グロブリン重鎖−軽鎖対を含む免疫グロブリン様構造を提供するように、共有結合される。このような構造の調製に適切な方法は、例えば、１９８９年３月２８日発行の米国特許第４，８１６，５６７号に開示される。
【００９８】
本明細書中のキメラＥｒｂＢ４アンタゴニストの別の好ましい型は、異種ポリペプチド（例えば、マルチマー化ドメイン）に結合した、細胞外ドメイン（例えば、ＥｒｂＢ４モノマー由来）を含む、融合タンパク質である。このような配列は、組換えＤＮＡ技術を使用して、構築され得る。あるいは、この異種ポリペプチドは、当該分野で周知の技術（例えば、異種二官能性架橋剤の使用）により、細胞外ドメインポリペプチドに共有結合され得る。例示的カップリング剤としては、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）が、挙げられる。
【００９９】
１つの実施形態において、キメラヘテロ付着因子ポリペプチドは、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドと、キメラヘテロ付着因子のモノマーの融合物を含む。キメラヘテロ付着因子のこのようなエピトープタグ化形態が有用である。なぜなら、その存在は、タグポリペプチドに対する標識抗体を使用して検出され得るからである。また、エピトープｔａｇを提供すると、抗タグ抗体を使用するアフィニティ精製によって、キメラヘテロ付着因子を容易に精製し得る。タグポリペプチドおよびその各抗体は、当該分野で周知である。例としては、ｆｌｕ　ＨＡ　ｔａｇポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２１５９〜２１６５（１９８８））；ｃ−ｍｙｃタグおよびそれに対する８Ｆ９抗体、３Ｃ７抗体、６Ｅ１０抗体、Ｇ４抗体、Ｂ７抗体、および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　５（１２）：３６１０〜３６１６（１９８５））；および単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　３（６）：５４７〜５５３（１９９０））が、挙げられる。
【０１００】
キメラへテロマルチマーの共有結合改変の別の型は、そのヘテロマルチマーのモノマーポリペプチドを、種々の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマー）のうちの１つに結合することを包含する。キメラヘテロマルチマーはまた、例えば、コアセルベーション技術によってかまたは界面ポリマー化によって（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン微小カプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）微小カプセル）、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）中でか、またはマクロエマルジョン中で、調製された微小カプセル中に捕捉され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｌｏ，Ａ編（１９８０）に開示される。
【０１０１】
（（ｉｉ）宿主細胞の選択および形質転換）
宿主細胞は、免疫付着因子生成のための本明細書中に記載される発現ベクターまたはクローニングベクターで、トランスフェクトまたは形質転換され、そしてプロモーターを誘導するための適切なように改変された従来の栄養培地中で培養され、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅する。その培養条件（例えば、培地、温度、ｐＨなど）は、過度の実験を伴うことなく、当業者によって選択され得る。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコル、および実施技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ編（ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（上記）にて見出され得る。
【０１０２】
用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、本明細書中で互換可能に使用され、そしてＤＮＡを細胞中に導入するプロセスをいう。形質転換またはトランスフェクションの後、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム中に組み込み得るし、または染色体外エレメントとして存在し得る。真核生物細胞のトランスフェクションの方法および原核生物細胞の形質転換の方法は、当業者に公知であり、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介およびエレクトロポレーションがある。使用される宿主細胞に依存して、そのような細胞に適切な標準技術を使用して、形質転換が実施される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ（前出）に記載されるような、塩化カルシウムを使用するカルシウム処理、またはエレクトロポレーションが、原核生物に一般的に使用される。Ｓｈａｗら、Ｇｅｎｅ　２３：３１５（１９８３）およびＷＯ　８９／０５８５９（１９８９年６月２９日公開）に記載されるような、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによる感染が、特定の植物細胞の形質転換のために使用される。そのような細胞壁を有さない哺乳動物細胞について、Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２：４５６〜４５７（１９７８）のリン酸カルシウム沈殿法が、使用され得る。哺乳動物細胞宿主系トランスフェクションの一般的局面は、米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母中への形質転換は、代表的には、Ｖａｎ　Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３０：９４６（１９７７）およびＨｓｉａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）７６：３８２９（１９７９）の方法に従って、実行される。しかし、細胞中にＤＮＡを導入するための他の方法（例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、インタクトな細胞との細菌プロトプラスト融合、またはポリカチオン（例えば、ポリブレン、ポリオルニチン）もまた、使用され得る。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術について、Ｋｅｏｗｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１８５：５２７〜５３７（１９９０）およびＭａｎｓｏｕｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３６：３４８〜３５２（１９８８）を参照のこと。
【０１０３】
本明細書中のベクターにおいてＤＮＡをクローニングまたは発現するために適切な宿主細胞としては、原核生物細胞、酵母細胞、または高等真核生物細胞が、挙げられる。適切な原核生物としては、真正細菌（例えば、グラム陰性生物またはグラム陽性生物（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような、腸内細菌科））が挙げられるが、これらに限定されない。種々のＥ．ｃｏｌｉ株が、公に利用可能であり、そのような株は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２株ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ　３１，４４６）；Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ　３１，５３７）；Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ　２７，３２５）およびＥ．ｃｏｌｉ株Ｋ５　７７２（ＡＴＣＣ　５３，６３５）である。他の適切な原核生物宿主細胞としては、腸内細菌科（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ））、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｒｃｅｓｃａｎｓ）およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢａｃｉｌｌｕｓ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｕｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ　２６６，７１０号に開示される、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　４１Ｐ））、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが、挙げられる。これらの例は、限定ではなく、例示である。Ｗ３１１０株は、特に好ましい１つの宿主または特に好ましい１つの親宿主である。なぜなら、この株は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための一般的宿主株であるからである。好ましくは、その宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、Ｗ３１１０株は、宿主に対して内因性であるタンパク質をコードする遺伝子において遺伝子変異をもたらすように改変され得、そのような宿主の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株１Ａ２（これは、完全遺伝子型ｔｏｎＡを有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株９Ｅ４（これは、完全遺伝子型ｔｏｎＡ　ｐｔｒ３を有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ＡＴＣＣ　５５，２４４）（これは、完全遺伝子型ｔｏｎＡ　ｐｔｒ３　ｐｈｏＡ　Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９　ｄｅｇＰ　ｏｍｐＴ　ｋａｎｒを有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株３７Ｄ６（これは、完全遺伝子型ｔｏｎＡ　ｐｔｒ３　ｐｈｏＡ　Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９　ｄｅｇＰ　ｏｍｐＴ　ｒｂｓ７　ｉｌｖＧ　ｋａｎｒを有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０株４０Ｂ４（これは、非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を有する３７Ｄ６株である）；および１９９０年８月７日発行の米国特許第４，９４６，７８３号に開示される変異体ペリプラズムプロテアーゼを有するＥ．ｃｏｌｉ株が挙げられる。あるいは、インビトロクローニング方法（例えば、ＰＣＲおよびポリメラーゼ反応）が、適切である。
【０１０４】
原核生物に加えて、真核生物微生物（例えば、糸状真菌または酵母）が、免疫付着因子をコードするベクターのための適切なクローニング宿主または発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般的に使用される下等真核生物宿主微生物である。他としては、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ（ＢｅａｃｈおよびＮｕｒｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ　２９０：１４０［１９８１］；ＥＰ　１３９，３８３（１９８５年５月２日公開）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米国特許第４，９４３，５２９号；Ｆｌｅｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　９：９６８〜９７５（１９９１））（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｔｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５４（２）：７３７〜１７４２［１９８３］）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ　１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ　１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ　２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ　５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ　３６，９０６；Ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８：１３５（１９９０））、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ　４０２，２２６））；Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ　１８３，０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：２６５〜２７８［１９９８］）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ　２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７６：５２５９〜５２６３［１９７９］）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（１９９０年１０月３１日公開のＥＰ　３９４，５３８））；ならびに糸状真菌（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ（１９９１年１月１０日公開のＷＯ　９１／００３５７）；およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１２：２８４〜２８９［１９８３］；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ　２６：２０５〜２２１［１９８３］；Ｙｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８１：１４７０〜１４７４［１９８４］）およびＡ．ｎｉｇｅｒ（ＫｅｌｌｙおよびＨｙｎｅｓ、ＥＭＢＯ　Ｊ．４：４７５〜４７９［１９８５］）が、挙げられる。メチロトローフ酵母が、本明細書中で適切であり、そしてこのメチロトローフ酵母としては、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ属、Ｐｉｃｈｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ属、およびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ属からなる群より選択される、メタノール上で増殖可能な酵母が挙げられるが、これらに限定されない。この種類の酵母の例示である特定の種のリストが、Ｃ．Ａｎｔｈｏｎｙ、Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｓ　２６９（１９８２）に見出され得る。
【０１０５】
グリコシル化免疫付着因子の発現のために適切な宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ　Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　Ｓｆ９）、および植物細胞が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞株の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞およびＣＯＳ細胞が挙げられる。より特定の例としては、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系統（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ　１６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞、または懸濁培養中での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞）（Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトーリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３〜２５１（１９８０））；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ　７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ　Ｇ２、ＨＢ　８０６５）；およびマウス乳房腫瘍（ＭＭＴ　０６０５６２、ＡＴＣＣ　ＣＣＬ５１）が挙げられる。適切な宿主細胞の選択は、当業者に範囲内にある。
【０１０６】
一般に、ＥｒｂＢ４−Ｉｇ免疫付着因子の発現のための哺乳動物宿主細胞株の選択は、発現ベクターに主に依存する（下記を参照のこと）。別の考慮事項は、必要なタンパク質の量である。ミリグラム量が、一過性トランスフェクションからしばしば産生され得る。例えば、アデノウイルスＥＩＡ形質転換２９３ヒト胚腎細胞株が、効率的な免疫付着因子発現を可能にするようなリン酸カルシウム法の改変法によって、ｐＲＫ５ベースのベクターで一過性トランスフェクトされ得る。ＣＤＭ８ベースのベクターが、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ　６１、１３０３〜１３１３（１９９０）；Ｚｅｔｔｍｅｉｓｓｌら、ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．（ＵＳ）９、３４７〜３５３（１９９０））によりＣＯＳ細胞をトランスフェクトするために使用され得る。より多量のタンパク質が望まれる場合、宿主細胞株の安定なトランスフェクションの後に、免疫付着因子が発現され得る。例えば、ｐＲＫ５ベースのベクターが、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードしかつＧ４１８に対する耐性を付与するさらなるプラスミドの存在下で、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に導入され得る。Ｇ４１８に耐性であるクローンが、培養において選択され得、これらのクローンが、漸増レベルのＤＨＦＲインヒビターメトロレキサートの存在下で、増殖され、ＤＨＦＲ配列および免疫付着因子配列をコードする遺伝子コピーの数が同時に増幅されるクローンが、選択される。免疫付着因子が、Ｎ末端に疎水性リーダー配列を含む場合、その免疫付着因子は、トランスフェクトされた細胞によりプロセシングされそして分泌されるようである。より複雑な構造を有する免疫付着因子の発現は、特異的に適切な宿主細胞を必要とし得る。例えば、軽鎖またはＪ鎖のような構成成分が、特定の骨髄種細胞宿主またはハイブリドーマ細胞宿主によって提供され得る［Ｇａｓｃｏｉｇｎｅら、１９８７、前出；Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ，Ｖｉｒｏｌ．６７：３５６１〜３５６８（１９９３）］。
【０１０７】
（（ｉｉｉ）複製可能ベクターの選択および使用）
免疫付着因子をコードする核酸は、クローニング（ＤＮＡの増幅）用または発現用に、複製可能ベクター中に挿入され得る。種々のベクターが、公に利用可能である。そのベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態であり得る。適切な核酸配列が、種々の手順によりそのベクター中に挿入され得る。一般に、ＤＮＡは、当該分野で公知の技術を使用して、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位中に挿入される。ベクターの構成成分として、一般的には、１つ以上のシグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列が挙げられるが、これらに限定されない。これらの構成成分のうちの１つ以上を含む適切なベクターの構築は、当業者に公知な標準的連結技術を使用する。
【０１０８】
免疫付着因子は、直接的に組換え生成され得るだけでなく、異種ポリペプチド（これは、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端にある特定の切断部位を有する、シグナル配列または他のポリペプチドであり得る）との融合ポリペプチドとしても組換え生成され得る。一般に、このシグナル配列は、そのベクターの構成成分であり得るし、またはそのベクター中に挿入される免疫付着因子コードＤＮＡの一部でもあり得る。このシグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼリーダー、ペニシリナーゼリーダー、ｌｐｐリーダー、または耐熱性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される、原核生物シグナル配列であり得る。酵母の分泌のために、このシグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　α因子リーダーおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　α因子リーダー（後者は、米国特許第５，０１０，１８２号に記載される）を含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日公開のＥＰ　３６２，１７９）、または１９９０年１１月１５日公開のＷＯ　９０／１３６４６に記載されるシグナルであり得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列（例えば、同じ種または関連する種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列）ならびにウイルス分泌リーダーが、タンパク質の分泌を指向するために使用され得る。
【０１０９】
発現ベクターおよびクローニングベクターの両方が、選択された１つ以上の宿主細胞においてそのベクターを複製可能にする核酸配列を含む。そのような配列は、種々の細菌、酵母、およびウイルスに関して、周知である。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点が、ほとんどのグラム陰性細菌のために適切であり、２μプラスミド起点が、酵母のために適切であり、そして種々のウイルス起点（ＳＶ４０起点、ポリオーマ起点、アデノウイルス起点、またはＢＰＶ起点）が、哺乳動物細胞におけるクローニングベクターのために有用である。
【０１１０】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、選択遺伝子（選択マーカーとも呼ぶ）を含む。代表的選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン）に対する耐性を付与するタンパク質をコードするか、（ｂ）栄養要求性欠損を補うタンパク質をコードするか、または（ｃ）複合培地から利用可能でない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする（例えば、ＢａｃｉｌｌｕｓについてＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【０１１１】
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例は、免疫付着因子をコードする核酸を取り込むためにコンピテントな細胞を同定することを可能にする、選択マーカー（例えば、ＤＨＦＲまたはチミジンキナーゼ）である。野生型ＤＨＦＲが使用される場合に適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したＣＨＯ細胞であり、このような細胞は、Ｕｒｌａｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：４２１６（１９８０）により記載されるように調製されそして増殖される。酵母における使用のための適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子［Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、Ｎａｔｕｒｅ　２８２：３９（１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ　７：１４１（１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、Ｇｅｎｅ　１０：１５７（１９８０）］である。このｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母変異株（例えば、ＡＴＣＣ　Ｎｏ．４４０７６またはＰＥＰ４−１［Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　８５：１２（１９７７）］）についての選択マーカーを提供する。
【０１１２】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、ｍＲＮＡ合成を指向するように、免疫付着因子コード核酸配列に作動可能に連結されたプロモーターを通常含む。種々の可能な宿主細胞により認識されるプロモーターが、周知である。原核生物宿主と使用するために適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼプロモーター系およびラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　２７５：６１５（１９７８）；Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ　２８１：５４４（１９７９）］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．８：４０５７（１９８０）；Ｅｐ　３６，７７６］、およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター［ｄｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：２１〜２５（１９８３）］が挙げられる。細菌系における使用のためのプロモーターはまた、免疫付着因子をコードするＤＮＡに作動可能に連結された、シャイン−ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含む。
【０１１３】
酵母宿主との使用のために適切なプロモーター配列の例としては、３−ホスホグリセレートキナーゼのプロモーター［Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９８０）］、または他の解糖酵素［Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ．７：１４９（１９６８）；Ｈｏｌｌａｎｄ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１７：４９００（１９７８）］（例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼ）のプロモーターが、挙げられる。
【０１１４】
他の酵母プロモーター（増殖条件により制御される転写というさらなる利点を有する誘導性プロモーターである）は、アルコールデヒドロゲナーゼ２のプロモーター領域、イソシトクロムＣのプロモーター領域、酸性ホスファターゼのプロモーター領域、窒素代謝に関連する分解酵素のプロモーター領域、メタロチオネインのプロモーター領域、グリセルアルデヒド−３リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーター領域、ならびにマルトース利用を担う酵素のプロモーター領域、およびガラクトース利用を担う酵素のプロモーター領域である。酵母発現における使用に適切なベクターおよびプロモーターは、ＥＰ　７３，６５７にさらに記載される。
【０１１５】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの免疫付着因子の転写は、例えば、ウイルス（例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（１９８９年７月５日公開のＵＫ　２，２１１，５０４）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、レトロウイルス（例えば、鳥類肉腫ウイルス）、サイトメガロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびシミアンウイルス４０（ＳＶ４０））のゲノムから得られるプロモーターによってか、異種哺乳動物プロモーター（例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター）から得られたプロモーターによってか、または熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって、制御される。ただし、これは、このようなプロモーターが宿主細胞系と適合性である場合である。
【０１１６】
免疫付着因子をコードするＤＮＡの高等真核生物による転写は、そのベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって、増加され得る。エンハンサーは、ＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常約１０〜３００ｂｐであり、その転写を増加するようにプロモーターに対して作用する。哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、およびインスリン）由来の多くのエンハンサー配列が、現在公知である。しかし、代表的には、当業者は、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。例としては、複製起点の後期側上（１００〜２７０まで）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。このエンハンサーは、免疫付着因子コード配列の５’位または３’位にて、このベクター中に接続され得るが、好ましくは、そのプロモーターの５’側の部位に位置する。
【０１１７】
真核生物宿主細胞（酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞、動物細胞、ヒト細胞または他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターはまた、転写の終結に必要な配列、およびｍＲＮＡを安定にするために必要な配列を含む。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡもしくはｃＤＮＡの３’非翻訳領域から一般的に利用可能である。これらの領域は、免疫付着因子をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
【０１１８】
組換え脊椎動物細胞培養において免疫付着因子の合成に適合するために適切な、さらに他の方法、ベクター、および宿主細胞が、Ｇｅｔｈｉｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ　２９３：６２０〜６２５（１９８１）；Ｍａｎｔｅｉら、Ｎａｔｕｒｅ　２８１：４０〜４６（１９７９）；ＥＰ　１１７，０６０；およびＥＰ　１１７，０５８に記載されている。
【０１１９】
（（ｉｖ）免疫付着因子の精製）
免疫付着因子またはキメラヘテロ付着因子は、好ましくは、分泌ポリペプチドとして培養培地から回収されるが、これらはまた、宿主細胞溶解物から回収され得る。第１工程として、粒子状破片（宿主細胞または溶解フラグメントのいずれか）が、例えば、遠心分離または限外濾過によって除去され、必要に応じて、そのタンパク質は、市販のタンパク質濃縮フィルターを用いて濃縮され得、その後、以下から選択される１つ以上の精製手順によって、他の不純物からそのキメラヘテロ付着因子が分離され得る：免疫アフィニティーカラムによる分画；イオン交換カラムによる分画；硫酸アンモニウム沈殿またはエタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカによるクロマトグラフィー；ヘパリンセファロースによるクロマトグラフィー；カチオン交換樹脂によるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；およびゲル濾過。
【０１２０】
免疫付着因子を精製する特に有利な方法は、アフィニティークロマトグラフィーである。アフィニティーリガンドの選択は、そのキメラにおいて使用される免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡが、ヒトＩｇＧ１重鎖、ＩｇＧ２重鎖またはＩｇＧ４重鎖に基づく免疫付着因子を精製するために、使用され得る［Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１〜１３）１９８３）］。プロテインＧが、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトＩｇＧ３のために推奨される［Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ　Ｊ．５、１５６７１５７５（１９８６）］。アフィニティリガンドが結合するマトリックスは、最もしばしばアガロースであるが、他のマトリックスもまた、利用可能である。機械的に安定なマトリックス（例えば、制御された孔隙のガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼン）により、アガロースを用いて達成され得るよりも早い流速および短い処理回数が可能になる。プロテインＡアフィニティーカラムまたはプロテインＧアフィニティーカラムに免疫付着因子を結合するための条件は、Ｆｃドメインの特徴（すなわち、その種およびアイソタイプ）によりもっぱら影響される。一般に、適切なリガンドが選択される場合、効率的な結合が、非馴化培養流体から直接生じる。免疫付着因子の１つの識別的特徴は、ヒトＩｇＧ１分子について、プロテインＡに対する結合能力が、同じＦｃ型の抗体と比較していくらか減少していることである。結合した免疫付着因子は、酸性ｐＨ（３．０以上）でか、または穏やかにカオトロピックな塩を含む中性ｐＨ緩衝液中のいずれかで、効率的に溶出され得る。このアフィニティークロマトグラフィー工程は、９５％を超える純度である免疫付着因子調製物を生じ得る。
【０１２１】
当該分野で公知である他の方法が、免疫付着因子を精製するために、プロテインＡまたはプロテインＧによるアフィニティークロマトグラフィーに代えてか、またはこのアフィニティークロマトグラフィーに加えて、使用され得る。免疫付着因子は、親硫黄性（ｔｈｉｏｐｈｉｌｉｃ）ゲルクロマトグラフィー［ＨｕｔｃｈｅｎｓおよびＰｏｒａｔｈ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５９、２１７〜２２６（１９８６）］および固定金属キレートクロマトグラフィー［Ａｌ−ＭａｓｈｉｎｋｉおよびＭａｋａｉ、Ｊ．Ｄａｉｒｙ　Ｓｃｉ．７１、１７５６〜１７６３（１９８８）］中で抗体と同様に挙動する。しかし、抗体とは対照的に、イオン交換カラムにおけるそれらの免疫付着因子の挙動は、その等電点によってのみではなく、そのキメラ性質に起因して分子中に存在し得る電荷双極子によってもまた、影響される。
【０１２２】
エピトープタグ化免疫付着因子（例えば、ＥｒｂＢ４−ＩｇＧ）の調製により、その融合ポリペプチドを吸着するためにそのエピトープに対する抗体を含む免疫親和性カラムを使用する精製が、容易になる。免疫親和性カラム（例えば、ウサギポリクローナル抗ＥｒｂＢ４カラム）が、ＥｒｂＢ４−ＩｇＧをＥｒｂＢ４免疫エピトープに結合することによってそのＥｒｂＢ４−ＩｇＧを吸着するために使用され得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、ＥｒｂＢ４レセプター−免疫グロブリンキメラ（免疫付着因子）は、モノマーとしてかまたはヘテロマルチマーもしくはホモマルチマーとして、ＷＯ　９１／０８２９８に特に示されるように、特にダイマーまたはテトラマーとしてアセンブルされる。一般に、アセンブルされたこれらの免疫グロブリンは、既知の単位構造を有する。基本４鎖構造単位が、ＩｇＧ、ＩｇＤ、およびＩｇＥが存在する形態である。４単位構造が、そのより高分子量の免疫グロブリンにおいて反復され、ＩｇＭは、一般に、ジスルフィド結合によって保持された基本４単位のペンタマーとして存在する。ＩｇＡグロブリン、および時にはＩｇＧグロブリンは、血清中にマルチマー形態でも存在し得る。マルチマーの場合、各４単位は、同じであってもよいし、または異なってもよい。
【０１２４】
先に示したように、本発明の免疫付着因子は、二特異性にされ得、そして例えば、２つの異なるＥｒｂＢレセプター（少なくとも一方がＥｒＢ４である）由来の結合領域を含み得る。従って、本発明の免疫付着因子は、２つの別々のＥｒｂＢリガンドに対する結合特異性を有し得る。二重特異的分子について、それらの抗体様構造の一方のアームがキメラ抗体重鎖およびもう一方のアームがキメラ抗体重鎖−軽鎖対から構成される、トリマー分子が、精製の容易性に起因して有利である。１０個のテトラマーの混合物を生じる、二重特異的免疫付着因子の産生に従来使用される抗体産生クアドローマとは対照的に、トリマー免疫付着因子構造の３つの鎖をコードする核酸を用いてトランスフェクトした細胞は、３つの分子のみの混合物を産生し、そしてそれに応じて、これらの混合物からの所望の産物の精製が、より容易である。
【０１２５】
（（ｖ）免疫付着因子の特徴付け）
一般に、本発明のＥｒｂＢ４キメラヘテロマルチマーは、以下の特性の任意の１以上を有する：（ａ）ＨＢ−ＥＧＦのようなリガンドへの結合について、天然のヘテロマルチマーレセプターと競合する能力；（ｂ）ＥｒｂＢ２−ＩｇＧ／ＥｒｂＢ４−ＩｇＧ複合体を形成する能力；および（ｃ）天然のヘテロマルチマーレセプターの環境からリガンドを枯渇することによって、その天然のレセプターの活性化を阻害し、それによって、ＥｒｂＢ２レセプターおよびＥｒｂＢ４レセプターを発現する細胞の増殖を阻害する能力。
【０１２６】
特性（ａ）についてスクリーニングするために、キメラＥｒｂＢ４ヘテロマルチマー接着因子がリガンドに結合する能力は、インビトロで容易に決定され得る。例えば、これらのレセプターの免疫付着因子形態を生成し得、そしてＥｒｂＢ２／４−Ｉｇヘテロ免疫付着因子を固相上（例えば、ヤギ抗ヒト抗体をコートしたアッセイプレート上）に固定化し得る。次いで、その固定化された免疫付着因子に結合するリガンドの能力を決定し得る。より詳細については、以下の実施例に記載の１２５Ｉ−ＨＲＧ結合アッセイを参照のこと。
【０１２７】
特性（ｃ）に関して、ＭＣＦ７細胞を使用するチロシンリン酸化アッセイが、ＥｒｂＢ４レセプターの活性化についてスクリーニングする手段を提供する。本発明の代替的な実施形態において、ＷＯ９５／１４９３０に記載のＫＩＲＡ−ＥＬＩＳＡを使用して、ＨＥＲ４キメラヘテロ接着因子がＨＥＲ４レセプターの活性化を阻害する能力を定性的かつ定量的に測定し得る。
【０１２８】
本発明の免疫付着因子、キメラヘテロ接着因子（例えば、ＥｒｂＢ２／４−Ｉｇ）または他の分子がＥｒｂＢ２レセプターおよびＥｒｂＢ４レセプターを発現する細胞の増殖を阻害する能力は、標準的な手順によって細胞培養物中で容易に決定される。この実験に有用な細胞としては、ＡＴＣＣから入手可能なＭＣＦ７細胞およびＳＫ−ＢＲ−３細胞ならびにシュワン細胞が挙げられる（例えば、Ｌｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ　１６（６）：２０１２−２０１９（１９９６）を参照のこと）。これらの腫瘍細胞株を、細胞培養プレート中にプレートし、そのプレートに接着させ得る。潜在的なＥｒｂＢ４アンタゴニスト（例えば、ＥｒｂＢ４キメラヘテロ接着因子）の存在下および非存在下において、ＨＲＧリガンドを、添加する。単層を洗浄しそしてクリスタルバイオレットで染色／固定し、そして細胞増殖阻害を定量する。
【０１２９】
（２．抗体調製）
ＥｒｂＢ４アンタゴニストの別の好ましいクラスは、このレセプターに対する中和抗体を含む。
【０１３０】
（（ｉ）ポリクローナル抗体）
ポリクローナル抗体を調製する方法は、当該分野で公知である。ポリクローナル抗体は、例えば、免疫因子（および所望の場合にはアジュバント）の１回以上の注射によって、哺乳動物において惹起され得る。代表的には、免疫因子および／またはアジュバントは、複数回の皮下注射または腹腔内注射によって哺乳動物中に注射される。免疫因子を、免疫される哺乳動物において免疫原性であることが公知のタンパク質（例えば、血清アルブミン）またはダイズトリプシンインヒビターと結合体化することが、有用であり得る。使用され得るアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバントおよびＭＰＬ−ＴＤＭが挙げられる。
【０１３１】
（（ｉｉ）モノクローナル抗体）
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ方法を使用して作製され得るか、または組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６７号）によって作製され得る。
【０１３２】
ハイブリドーマ方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えば、ハムスターまたはマカクザル）を本明細書中上記のように免疫して、免疫に使用されたタンパク質に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得る、リンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫し得る。次いで、リンパ球を、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して骨髄腫細胞と融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。
【０１３３】
このように調製されたハイブリドーマ細胞を、適切な培養培地（好ましくは、融合されていない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１以上の物質を含む）に播種しそして増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠損している場合、ハイブリドーマのための培養培地は、代表的に、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨げる。
【０１３４】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの産生を支持し、そして培地（例えば、ＨＡＴ培地）に対して感受性である、骨髄腫細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫細胞株は、マウス骨髄腫細胞株（例えば、ＭＯＰ−２１マウス腫瘍およびＭＣ−１１マウス腫瘍に由来する骨髄腫細胞株（Ｓａｌｋ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　Ｃｅｌｌ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ　ＵＳＡから入手可能）、ならびにＳＰ−２細胞またはＸ６３−Ａｇ８−６５３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ　ＵＳＡより入手可能））である。ヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）；およびＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１−６３頁、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、［１９８７］）。
【０１３５】
ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降またはインビトロ結合アッセイ（例えば、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）または酵素連結イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ））によって決定する。
【０１３６】
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０７：２２０（１９８０）のスキャッチャード分析により決定され得る。
【０１３７】
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、これらの細胞を限界希釈手順によってサブクローン化し、そして標準的な方法により増殖させ得る（Ｇｏｄｉｎｇ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、５９−１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９８６））。この目的のための適切な培養培地としては、例えば、ＤＭＥＭ培地またはＲＰＭＩ−１６４０培地が挙げられる。さらに、これらのハイブリドーマ細胞を、動物の腹水腫瘍としてインビボで増殖させ得る。
【０１３８】
これらのサブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順（例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーなど）によって、培養培地、腹水または血清から適切に分離される。
【０１３９】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離されそして配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として働く。一旦単離されると、そのＤＮＡを、発現ベクター中に配置し得、次いで、その発現ベクターを、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはさもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞）にトランスフェクトし、その組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を獲得する。このＤＮＡはまた、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１、６８５１（１９８４）、または、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合連結することによって、改変され得る。この様式で、本明細書中の抗ＥｒｂＢ４レセプターモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」抗体または「ハイブリッド」抗体が、調製される。
【０１４０】
代表的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドを本発明の抗体の定常ドメインと置換して、またはこれらを本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインと置換して、ＥｒｂＢ４レセプターに対する特異性を有する１つの抗原結合部位および異なる抗原に対する特性を有する別の抗原結合部位を含む、キメラ二価抗体を作製する。
【０１４１】
キメラ抗体またはハイブリッド抗体はまた、合成タンパク質化学（架橋剤が関与する合成タンパク質化学を含む）において公知の方法を使用して、インビトロで調製され得る。例えば、イムノトキシンは、ジスルフィド交換反応を使用してかまたはチオエーテル結合の形成によって構築され得る。この目的のための適切な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０１４２】
抗体の組換え産生は、以下により詳細に記載される。
【０１４３】
（（ｉｉｉ）ヒト化抗体）
一般に、ヒト化抗体は、非ヒト供給源からその抗体に導入された、１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、「移入（ｉｍｐｏｒｔ）」残基と呼ばれ、これらは、代表的には、「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的には、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者ら［Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２１−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６（１９８８）］の方法に従って、げっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列で、そのヒト抗体の対応する配列を置換することによって行われ得る。
【０１４４】
従って、このような「ヒト化」抗体は、実質的にインタクトでないヒト可変ドメインが非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている、キメラ抗体である（Ｃａｂｉｌｌｙ、前出）。実際には、ヒト化抗体は、代表的には、いくつかのＣＤＲ残基および可能にはいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体中の相同部位由来の残基によって置換されている、ヒト抗体である。
【０１４５】
抗体は、抗原に対する高い特異性および他の好ましい生物学的特性を維持しながらヒト化されることが重要である。この目標を達成するために、好ましい方法に従って、ヒト化抗体は、親配列およびヒト化配列の３次元モデルを使用して、親配列および種々の概念上のヒト化産物の分析プロセスによって調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、一般的に利用可能であり、そして当業者によく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定３次元コンホメーション構造を例示および表示する、コンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の調査は、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基の潜在的な役割の分析（すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原を結合する能力に影響する残基の分析）を可能にする。このようにして、ＦＲ残基は、コンセンサスの移入配列から選択され得、そして組み合わせられ得、その結果、所望の抗体特性（例えば、標的抗原に対する増加した親和性）が達成される。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接かつほぼ実質的に関与する。さらなる詳細については、米国特許第５，８２１，３３７号を参照のこと。
【０１４６】
（（ｉｖ）ヒト抗体）
ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法によって作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫細胞株およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：３００１（１９８４）、およびＢｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、５１−６３頁（Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８７）によって記載されている。
【０１４７】
免疫に際して内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）を産生することが、現在可能である。例えば、キメラの生殖系列変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失が、内因性の抗体産生の完全な阻害を生じることが記載されている。このような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジに際してヒト抗体の産生を生じる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１−２５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ　３６２：２５５−２５８（１９９３）を参照のこと。
【０１４８】
Ｍｅｎｄｅｚら（Ｎａｔｕｒｅ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　１５：１４６−１５６［１９９７］）は、この技術をさらに改善し、そして「キセノマウス　ＩＩ（Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ　ＩＩ）」と名付けられたトランスジェニックマウス系統を生成した。このマウスは、抗原でチャレンジした場合、高い親和性完全ヒト抗体を生成する。これは、上記のような内因性ＪＨセグメントに欠失を有するマウスへの、メガベースのヒト重鎖および軽鎖の遺伝子座の生殖系列組み込みによって達成される。キセノマウスＩＩは、約６６個のＶＨ遺伝子、完全なＤＨ領域およびＪＨ領域、ならびに３つの異なる定常領域（μ、δおよびχ）を含む、１，０２０ｋｂのヒト重鎖遺伝子座を保有し、そしてまた、３２個のＶκ遺伝子、ＪκセグメントおよびＣκ遺伝子を含む、８００ｋｂのヒトκ遺伝子座を保有する。これらのマウスにおいて産生された抗体は、ヒトにおいて見られる抗体と全ての点（遺伝子の再編成、アセンブリおよびレパートリーを含む）において非常に類似する。ヒト抗体は、好ましくは、マウス遺伝子座における遺伝子再編成を妨げる内因性ＪＨセグメントの欠失に起因して、内因性の抗体以上に発現される。
【０１４９】
あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ　３４８、５５２−５５３［１９９０］）を使用して、免疫されていないドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ヒト抗体および抗体フラグメントをインビトロで産生し得る。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子を、糸状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３またはｆｄ）のメジャーコートタンパク質遺伝子またはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングし、そしてファージ粒子の表面上に機能的な抗体フラグメントとして提示する。その糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、その抗体の機能的特性に基づく選択は、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をも生じる。従って、そのファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、種々の形式で行われ得る；それらの概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｋｅｖｉｎ　Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ、Ｄａｖｉｄ　Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　３、５６４−５７１（１９９３）を参照のこと。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源が、ファージディスプレイのために使用され得る。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３５２、６２４−６２８（１９９１）は、免疫されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーからの、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。Ｍａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２、５８１−５９７（１９９１）またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ　Ｊ．１２、７２５−７３４（１９９３）によって記載される技術に本質的に従って、免疫されていないヒトドナー由来のＶ遺伝子のレパートリーが構築され得、そして抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体が単離され得る。天然の免疫応答において、抗体遺伝子は、高い割合で変異を蓄積する（体細胞性過剰変異）。導入された変化のいくつかは、高い親和性を付与し、そして高親和性表面の免疫グロブリンを提示するＢ細胞が、その後の抗原チャレンジの間に優先的に複製および分化される。この天然のプロセスは、「鎖シャッフリング」（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９−７８３［１９９２］）として公知の技術を使用することによって模倣され得る。この方法において、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖のＶ領域遺伝子を、免疫されていないドナーから得られたＶドメイン遺伝子の天然に存在する改変体（レパートリー）のレパートリーと連続的に置換することによって、改善され得る。この技術は、ｎＭ範囲の親和性を有する抗体および抗体フラグメントの産生を可能にする。非常に大きいファージ抗体レパートリー（「ｔｈｅ　ｍｏｔｈｅｒ−ｏｆ−ａｌｌ　ｌｉｂｒａｒｉｅｓ（全てのライブラリーの母）」としても公知）を作製するためのストラテジーは、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２１：２２６５−２２６６（１９９３）によって記載され、そしてこのような大きいファージライブラリーからの高親和性ヒト抗体の直接の単離が、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、ＥＭＢＯ　Ｊ．１３：３２４５−３２６０（１９９４）によって報告されている。遺伝子シャッフリングもまた、げっ歯類抗体からヒト抗体を誘導するために使用され得、このヒト抗体は、開始げっ歯類抗体と類似の親和性および特異性を有する。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれる、この方法に従って、ファージディスプレイ技術によって得られたげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖のＶドメイン遺伝子を、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置換し、げっ歯類−ヒトキメラを作製する。抗原に対する選択は、機能的な抗原結合部位を回復し得るヒト可変ドメインの単離を生じる（すなわち、エピトープが、パートナーの選択を支配（インプリント）する）。残りのげっ歯類Ｖドメインを置換するためにこのプロセスを繰り返す場合、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０６２１３（１９９３年４月１日公開）を参照のこと。ＣＤＲグラフティングによるげっ歯類抗体の従来のヒト化と異なり、この技術は、げっ歯類起源のフレームワーク残基もＣＤＲ残基も有さない、完全なヒト抗体を提供する。
【０１５０】
（（ｖ）二重特異的抗体）
二重特異的抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する、モノクローナル（好ましくは、ヒトまたはヒト化）抗体である。本発明の場合、この結合特異性の一方は、アンタゴニスト抗体を提供するためのＥｒｂＢ４レセプターに対するものであり、もう一方の結合特異性は、任意の他の抗原、そして好ましくは、別のレセプターまたはレセプターサブユニットに対するものである。
【０１５１】
二重特異的抗体を作製するための方法は、当該分野で公知である。従来では、二重特異的抗体の組換え産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、ここで、２つの重鎖が異なる特異性を有する（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、Ｎａｔｕｒｅ　３０５、５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリン重鎖および軽鎖のランダムな組み合わせに起因して、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０個の異なる抗体分子の可能性のある混合物を産生し、そのうちの１つのみしか、正確な二特異性構造を有さない。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程によって行われる、その正確な分子の精製は、むしろ煩わしく、そして産物の収率は、低い。類似の手順は、ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９３／０８８２９（１９９３年５月１３日公開）およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ　１０、３６５５−３６５９（１９９１）に開示される。
【０１５２】
異なるより好ましいアプローチに従って、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合される。融合体は、好ましくは、免疫グロブリン重鎖定常ドメインを用い、これは、少なくともヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域の一部を含む。軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましく、これは、これらの融合体の少なくとも一方に存在する。免疫グロブリン重鎖融合体、および所望の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡが、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物に同時トランスフェクトされる。このことは、その構築物において使用される等しくない比の３つのポリペプチド鎖が最適な収率を提供する実施形態では、その３つのポリペプチドフラグメントの変異の割合の調整において高い柔軟性を提供する。しかし、等しい比の少なくとも２つのポリペプチド鎖の発現が高い収率を生じるか、またはそれらの比が特に有意ではない場合、１つの発現ベクターに２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。このアプローチの好ましい実施形態において、二重特異的抗体は、一方のアームにおいて、第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、そして他方のアームにおいて、ハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性を提供する）から構成される。この非対称性構造は、所望でない免疫グロブリン鎖の組み合わせからの所望の二特異性化合物の分離を容易にすることが見出された。なぜなら、二重特異的分子の半分のみに存在する免疫グロブリン軽鎖の存在が、分離の容易な方法を提供するからである。
【０１５３】
二重特異的抗体の生成のさらなる詳細については、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１２１、２１０（１９８６）を参照のこと。
【０１５４】
（（ｖｉ）ヘテロ結合体抗体）
ヘテロ結合体抗体もまた、本発明の範囲内にある。ヘテロ結合体抗体は、２つの共有結合された抗体から構成される。このような抗体は、例えば、所望でない細胞へ免疫系の細胞を標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号）およびＨＩＶ感染の処置のために（ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ９１／００３６０およびＷＯ９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）推奨されている。ヘテロ結合体抗体は、任意の簡便な架橋方法を使用して作製され得る。適切な架橋剤は、当該分野で周知であり、そして米国特許第４，６７６，９８０号において多くの架橋技術と共に開示されている。
【０１５５】
（（ｖｉｉ）抗体フラグメント）
特定の実施形態において、ＥｒｂＢ４アンタゴニスト抗体（マウス抗体、ヒト抗体およびヒト化抗体、ならびに抗体改変体を含む）は、抗体フラグメントである。種々の技術が、抗体フラグメントの産生について開発されている。従来は、これらのフラグメントは、インタクトな抗体のタンパク質分解消化によって得られてきた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２４：１０７−１１７（１９９２）およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２９：８１（１９８５）を参照のこと）。しかし、現在、これらのフラグメントは、組換え宿主細胞によって直接産生され得る。例えば、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを、直接Ｅ．ｃｏｌｉから回収し得、そして化学的に結合してＦ（ａｂ’）２フラグメントを形成し得る（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０：１６３−１６７（１９９２））。別の実施形態において、Ｆ（ａｂ’）２は、ロイシンジッパーＧＣＮ４を使用して形成され、Ｆ（ａｂ’）２分子のアセンブリを促進する。別のアプローチに従って、Ｆｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントが、組換え宿主細胞培養物から直接単離され得る。抗体フラグメントの産生のための他の技術は、当業者に対して明らかである。
【０１５６】
（（ｖｉｉｉ）抗体のアミノ酸配列改変体）
ＥｒｂＢ４アンタゴニスト抗体のアミノ酸配列改変体は、適切なヌクレオチド変化をＥｒｂＢ４アンタゴニスト抗体ＤＮＡに導入することによるか、またはペプチド合成により調製される。このような改変としては、例えば、本明細書中に示される例のＥｒＢ４アンタゴニスト抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失、および／または挿入および／または置換が挙げられる。欠失、挿入および置換の任意の組み合わせが、最終構築物に達するようになされ、そこで、その最終構築物は、所望の特性を有する。アミノ酸変化はまた、ヒト化または改変体ＥｒｂＢ４アンタゴニスト抗体の翻訳後プロセシングを変更し得る（例えば、グリコシル化部位の数または位置の変化）。
【０１５７】
変異誘発についての好ましい位置である、ＥｒｂＢ４レセプター抗体の特定の残基または領域の同定のための有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれ、これは、ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍおよびＷｅｌｌｓ　Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５（１９８９）に記載される。ここで、標的残基の残基または群（例えば、荷電された残基（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓおよびｇｌｕ）が同定され、そして中性または負に荷電したアミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）によって置換され、ＥｒｂＢ４レセプター抗原とのそれらのアミノ酸との相互作用に影響を与える。次いで、置換に対して機能的感受性を示すこれらのアミノ酸位置が、その置換部位にかまたは置換部位に代えて、さらなる改変または他の改変を導入することによって、再度調整される。従って、アミノ酸配列バリエーションを導入するための部位は、予め決定されるが、その変異自体の性質は、予め決定される必要はない。例えば、所定の部位での変異の性能を分析するために、ａｌａスキャニングまたはランダム変異誘発が標的のコドンまたは領域において行われ、そして発現されたＥｒｂＢ４抗体改変体が、所望の活性についてスクリーニングされる。
【０１５８】
アミノ酸配列挿入としては、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシ末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有するＥｒｂＢ４アンタゴニスト抗体、またはエピトープタグに融合された抗体が挙げられる。ＥｒｂＢ４アンタゴニスト抗体分子の他の挿入改変体としては、酵素、または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドの、ＥｒｂＢ４アンタゴニスト抗体のＮ末端もしくはＣ末端への融合物が挙げられる。
【０１５９】
改変体の別の型は、アミノ酸置換改変体である。これらの改変体は、ＥｒｂＢ４アンタゴニスト抗体分子における少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、そしてその位置に異なる残基が挿入されている。置換変異誘発のために最も関心ある部位としては、超可変領域が挙げられるが、ＦＲ改変もまた企図される。保存的置換は、「好ましい置換」との見出しの表１に示される。このような置換が生物学的活性における変化を生じる場合、より実質的な変化（表１において「例示的置換」と称されるか、またはアミノ酸クラスに関して以下にさらに記載されるような）が導入され得、そしてその産物がスクリーニングされ得る。
【０１６０】
【表１】
2004507559.tif 000003
抗体の生物学的特性における実質的な改変は、（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造（例えば、シートまたはヘリックスコンホメーション）、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、あるいは（ｃ）側鎖の嵩高さの維持に対するそれらの効果において有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下のような群に分類される：
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
（５）鎖方向に影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および
（６）芳香族性：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１６１】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスのものに交換することを包含する。
【０１６２】
ＥｒｂＢ４アンタゴニスト抗体の適切なコンホメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基はまた、一般にセリンに置換されて、その分子の酸化に対する安定性を改善し得、そして異常な架橋を妨害し得る。逆に、システイン結合が、その抗体に付加されて、その安定性を改善し得る（特に、その抗体がＦｖフラグメントのような抗体フラグメントである場合）。
【０１６３】
特に好ましい型の置換改変体は、親の抗体（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１以上の超可変領域残基を置換することを包含する。一般に、さらなる開発のために選択された、これらの得られた改変体は、それらが生成される親抗体に比較して改善された生物学的特性を有する。このような置換改変体を生成するための簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する、親和性成熟である。手短には、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７個の部位）を変異させて、各部位に全ての可能なアミノ置換を生成する。このように生成された抗体改変体は、糸状ファージ粒子から一価の様式で、各粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物に対する融合物として提示される。次いで、ファージディスプレイされた改変体を、本明細書において開示されるような、それらの生物学的活性（例えば、アンタゴニスト活性）についてスクリーニングする。改変についての候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定し得る。あるいは、またはさらに、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析し、抗体とＥｒｂＢレセプターとの間の接触点を同定することも有利であり得る。このような接触残基および隣接する残基は、本明細書において説明される技術に従う置換のための候補である。一旦そのような改変体が生成されると、その改変体のパネルを本明細書において記載されるようなスクリーニングに供し、そして１以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択し得る。
【０１６４】
その抗体の別の型のアミノ酸改変体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変化させる。変化させることは、その抗体で見出される１以上の炭水化物部分を除去すること、および／または、その抗体に存在しない１以上のグリコシル化部位を付加すること、を意味する。
【０１６５】
抗体のグリコシル化は、代表的には、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合をいう。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生じる。Ｏ結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的には、セリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用され得る）への、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの１つの糖の結合をいう。
【０１６６】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が１以上の上記のトリペプチド配列を含むように（Ｎ結合型グリコシル化部位について）、そのアミノ酸配列を変化させることによって都合よく達成される。この変化はまた、元の抗体の配列への１以上のセリン残基またはトレオニン残基の付加または置換によって、なされ得る（Ｏ結合型グリコシル化部位について）。
【０１６７】
ＥｒｂＢ４アンタゴニスト抗体のアミノ酸配列改変体をコードする核酸分子は、当該分野で公知の種々の方法によって調製される。これらの方法としては、天然の供給源（天然に存在するアミノ酸配列改変体の場合）からの単離、あるいはＥｒｂＢ４アンタゴニスト抗体の先に調製された改変体または非改変体バージョンのオリゴヌクレオチド媒介（または部位特異的）変異誘発、ＰＣＲ変異誘発、およびカセット変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６８】
（ｉｘ）抗体の他の改変
本明細書中に開示されるＥｒｂＢ４アンタゴニスト抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。この抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：４０３０（１９８０）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号および同４，５４４，５４５号に記載されるような、当該分野において公知の方法によって調製される。増強された循環時間を有するリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示される。
【０１６９】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相蒸発（ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ）法によって生成され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを得るために、規定されたポアサイズのフィルターを通して押し出される。本発明の抗体のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されるようなリポソームに結合体化され得る。化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）は、必要に応じてこのリポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０１７０】
本発明の抗体はまた、プロドラッグを抗癌薬物に変換させるプロドラッグ活性化酵素（例えば、ペプチジル化学療法剤（ＷＯ８１／０１１４５を参照のこと））にこの抗体を結合体化することによってＡＤＥＰＴにおいて使用され得る。例えば、ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと。
【０１７１】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫結合体の酵素成分は、プロドラッグをより活性で細胞傷害性の形態に変換するような様式でプロドラッグに作用し得る任意の酵素を含む。
【０１７２】
本発明の方法において有用な酵素としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：リン含有プロドラッグを遊離薬物に変換するに有用なアルカリホスファターゼ；スルフェイト含有プロドラッグを遊離薬物に変換するに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬物５−フルオロウラシルに変換するに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するに有用な、プロテアーゼ（例えば、セラチアプロテアーゼ）、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよびカテプシン（例えば、カテプシンＢおよびＬ）；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化したプロドラッグを遊離薬物に変換するに有用な炭水化物切断酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ）；β−ラクタムで誘導体化されたプロドラッグを遊離薬物に変換するに有用なβ−ラクタマーゼ；ならびに、そのアミン窒素においてそれぞれフェノキシアセチル基またはフェニルアセチル基で誘導体化されたプロドラッグを遊離薬物に変換するに有用なペニシリンアミダーゼ（例えば、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼ）。あるいは、「アブザイム」として当該分野において公知である酵素活性を有する抗体をまた使用して、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換し得る（例えば、Ｍａｓｓｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ　３２８：４５７−４５８（１９８７）を参照のこと）。抗体−アブザイム結合体は、このアブザイムを腫瘍細胞集団に送達するために、本明細書中に記載のように調製され得る。
【０１７３】
本発明の酵素は、当該分野において周知の技術（例えば、上記の、ヘテロ二官能性架橋剤の使用）によってＥｒｂＢ４アンタゴニスト抗体に共有結合され得る。あるいは、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は、当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３１２：６０４−６０８（１９８４））を使用して構築され得る。
【０１７４】
本発明の特定の実施形態において、インタクトな抗体よりも抗体フラグメントを使用することが所望され得る。この場合、その血清半減期を増加させるために、抗体フラグメントを改変することが所望され得る。これは、例えば、サルベージレセプター結合エピトープをこの抗体フラグメントに組み込むことによって（例えば、抗体フラグメント中の適切な領域の変異によって、またはこのエピトープを、抗体フラグメントのいずれかの末端もしくはその間で融合されるペプチドタグに組み込むことによって（例えば、ＤＮＡ合成またはペプチド合成によって））達成され得る。１９９６年１０月１７日に公開されたＷＯ９６／３２４７８を参照のこと。
【０１７５】
サルベージレセプター結合エピトープは、一般に、ＦＣドメインの１つまたは２つのループ由来の任意の１以上のアミノ酸残基がその抗体フラグメントの類似した位置に移入される。さらにより好ましくは、ＦＣドメインの１つまたは２つのループ由来の３以上の残基が移入される。なおより好ましくは、このエピトープは、（例えば、ＩｇＧの）ＦＣ領域のＣＨ２ドメインから獲得され、そして抗体のＣＨ１領域、ＣＨ３領域もしくはＶＨ領域、または１より多くのこのような領域に移入される。あるいは、このエピトープは、ＦＣ領域のＣＨ２ドメインから獲得され、そして抗体フラグメントのＣＬ領域もしくはＶＬ領域、またはこれらの両方に移入される。
【０１７６】
ＥｒｂＢ４アンタゴニスト抗体の共有結合性改変はまた、本発明の範囲内に含まれる。これらは、適用可能な場合、抗体の化学合成または酵素的もしくは化学的な切断によってなされ得る。他の型の抗体の共有結合性改変は、選択された側鎖またはＮ末端残基もしくはＣ末端残基と反応し得る有機誘導剤を用いて抗体の標的化されたアミノ酸残基を反応させることによって、分子内に導入される。ポリペプチドの例示的共有結合性改変は、米国特許第５，５３４，６１５号（特に、本明細書中に参考として詳細に援用される）に記載される。好ましい型の抗体の共有結合性改変は、種々の非タンパク質ポリマーの１つ（例えば、米国特許第４，６４０，８３５号；同４，４９６，６８９号；同４，３０１，１４４号；同４，６７０，４１７号；同４，７９１，１９２号または同４，１７９，３３７号に記載される様式でのポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン）への抗体連結を含む。
【０１７７】
（３．可溶性ＥｒｂＢ４レセプターの調製）
可溶性ＥｒｂＢ４レセプター（例えば、ＥｒｂＢ４細胞外ドメイン）は、コード核酸を含むベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされた細胞を培養することによって調製され得る。もちろん、当該分野において周知である代替の方法がこのような可溶性レセプターを調製するために使用され得ることが意図される。例えば、可溶性レセプターの配列、またはその一部は、固相技術（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔら、前出；およびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、前出を参照のこと）を使用する直接ペプチド合成によって生成され得る。インビトロタンパク質合成は、手動技術を使用してかまたは自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を製造業者の手引書を用いて使用して達成され得る。可溶性レセプターの種々の部分は、別々に化学合成され得、そして、全長可溶性レセプターを生成するために化学法または酵素法を使用して連結され得る。
【０１７８】
可溶性ＥｒｂＢ４レセプターの組換え生成は、本質的に本明細書中上記のように、免疫付着因子（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）と組合わせて実施される。
【０１７９】
可溶性ＥｒｂＢ４レセプターの大規模生産のための最も簡便な方法は、ＥｒｂＢ４−Ｉｇ免疫付着因子からの切断によるものである。免疫付着因子と抗体との間の構造的類似性は、パパインのようなタンパク質分解酵素によって免疫付着因子を切断して「免疫付着」部分を含むＦｄ様フラグメントを生成することが可能であり得ることを示唆する。免疫付着因子の切断のためのより一般的な手法を提供するために、標的配列に高度に特異的であるタンパク質分解酵素が使用されるべきである。この目的に適したタンパク質分解酵素は、配列ＡＡＨＹＴＬを認識しかつ切断するサブチリシンＢＰＮの操作された変異体である。ＥｒｂＢ４−ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）免疫付着因子の支持ヒンジ領域へのこの標的配列の導入は、Ｆｃドメインとｔｒｋドメインとの間の高度に特異的な切断を容易にする。ＩｇＧ１免疫付着因子は、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製され、そしてこの酵素の固定化形態を用いて切断される。切断によって、２つの産物が生じる：Ｆｃ領域およびＥｒｂＢ４領域（これは、好ましくは、ＥｒｂＢ４細胞外ドメインである）。これらのフラグメントは、Ｆｃを保持しそして通過した画分中に精製されたＥｒｂＢ４フラグメントを得るためのプロテインＡカラムを通す第二の通過によって容易に分離され得る。同様の手法を使用して、下部のヒンジでの切断可能な配列を置換することによって、ダイマーＥｒｂＢ４部分を生成し得る。
【０１８０】
（４．治療組成物および治療方法）
ＥｒｂＢファミリーのレセプターおよび対応するリガンドのメンバーは、種々の器官における平滑筋細胞増殖に関与する。従って、ＥｒｂＢ４レセプターアンタゴニストは、哺乳動物（例えば、ヒト）における平滑筋細胞増殖を含む種々の「疾患または障害」の処置のために利用され得る。
【０１８１】
好ましい実施形態において、本発明は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の増殖を含みそして内膜の過形成（例えば、血管狭窄、血管形成術（ａｎｇｉｏｐｌａｓｙ）もしくは手術（ｓｕｒｇｅｒｙ）またはステント移植片により生じる再狭窄）、アテローム硬化症および高血圧を導く心疾患（ＣａｓｔｅｒｅｌｌａおよびＴｅｉｒｓｔｅｉｎ、Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｒｅｖ．７：２１９−２３１（１９９９）；Ａｎｄｒｅｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２：８１−８９（１９９８）；ならびにＲｏｓａｎｉｏら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２（ｓｕｐｐｌ　１）：１６４−１７０（１９９９）に総説される）の処置のためのＥｒｂＢ４レセプターアンタゴニストの使用に関する。種々の細胞および放出されたサイトカイン（これは、オートクライン様式、パラクリン様式またはジャクスタクリン様式で作用し、培地中での正常な位置から損傷した内膜へのＶＳＭＣの移動を生じる）の複雑な相互作用が存在する。移動したＶＳＭＣは、過剰に増殖し、そして内膜の肥厚を導き、これは、血管の狭窄または閉塞を生じる。損傷部での血小板の凝集および沈着によって、問題が重なり合う。多機能性セリンタンパク質分解酵素であるα−トロンビンは、血管損傷部で濃縮されそしてＶＳＭＣ増殖を刺激する。このレセプターの活性化に続いて、ＶＳＭＣは、種々のオートクライン増殖因子（ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦ−βを含む）を生成かつ分泌する（ＳｔｏｕｆｆｅｒおよびＲｕｎｇｅ、Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．２４：１４５−１５０（１９９８）に総説される）。
【０１８２】
ＥＧＦファミリーの種々のメンバーは、正常な増殖および血管の維持ならびに病的状態において重要な役割を担う。例えば、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢ−ＥＧＦ）は、強力なマイトジェンであり、そして繊維芽細胞およびＶＳＭＣ（内皮細胞ではない）についての走化性因子である（ＲａａｂおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ　１３３３：Ｆ１７９−１９９（１９９７）に総説される）。強力な脈管形成因子である血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管内皮細胞におけるＨＢ−ＥＧＦの発現を誘導する（Ａｒｋｏｎａｃら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３：４４００−４４０５（１９９８））。ＨＢ−ＥＧＦは、最終的には繊維芽細胞およびＶＳＭＣの移動および増殖を生じるシグナル伝達カスケードを開始するＨＥＲ１レセプターおよびＥｒｂＢ４レセプターに結合しかつ活性化する。ＨＢ−ＥＧＦはまた、ＶＳＭＣを刺激して、内皮細胞に対してマイトジェンの種々の因子を分泌する（Ａｂｒａｍｏｖｉｔｃｈら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ．４２５：４４１−４４７（１９９８））。さらに、これはまた、内皮細胞において走化性応答を誘導する。同様に、ＥＧＦレセプターを活性化する別のリガンドであるエピレグリン（ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ）は、アンギオテンシンＩＩ、エンドセリン−１およびトロンビンを用いて刺激されたＶＳＭＣによって分泌され、またＶＳＭＣの増殖についての強力なマイトジェンとして作用する（Ｔａｙｌｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９６：１６３３−１６３８（１９９９））。
【０１８３】
血管狭窄は、血流に対する増加した抵抗の結果として高血圧を生じる。さらに、組織に供給される血液の減少はまた、壊死を生じ、そして重篤な損傷を導く炎症性応答を誘導する。例えば、心筋梗塞は、酸素欠乏および心筋組織の局所的死亡の結果として生じる。経皮的透過性冠動脈血管形成術（ＰＴＣＡ）（単に、バルーン血管形成術という）は、閉塞性冠状動脈疾患についての非外科的カテーテルベースの処置である。この方法では、カテーテルは血管に導入され、そしてバルーンは、斑を機械的に除くためにこの斑の部位で膨らませられる。あるいは、ステントは、滑らかな血流を回復させるために移植される。しかし、新たな内膜の形成は、移植されたステント内でさえ生じる（ステント内（ｉｎ−ｓｔｅｎｔ）再狭窄として既知である）。例えば、ステントの配置は、初期の血栓沈着および急性の炎症、肉芽組織の発達、ならびに最終的には平滑筋細胞増殖および細胞外マトリクス合成を生じる（ＶｉｒｍａｎｉおよびＦａｒｂ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｌｉｐｉｄｏｌ．１０：４９９−５０６（１９９９）に総説される）。バイパス手術は、重篤な場合においてのみ罹患した血管を回避するために実施され、通常は、複数回の血管形成術が、血流を回復しそこなった後にのみ実施される。
【０１８４】
バルーン血管形成術が狭窄の処置のために広く使用されているが、その長期の成功は、再狭窄によって制限される。再狭窄は、ＰＴＣＡ後に血管開存性の維持における制限因子として持続し、３０〜５０％の患者に生じそして顕著な罹患率および健康管理の経費の原因となる。再狭窄の潜在的な機構は、血管の反動、消極的な血管再モデル化、血栓形成および新たな内膜の過形成からの影響の組み合わせから構成される。重要なことには、これらの事象は、相互連絡している。例えば、新たな過形成は、増殖因子によって刺激され、これは、局所の血栓および損傷した動脈セグメント自体によって放出され、そして急性の増殖性応答および炎症性応答を生じる他の増殖刺激タンパク質の発現を増強するように作用する。例えば、内皮損傷は、ＶＳＭＣにおけるＥＧＦ、ＥＧＦ様因子およびＥＧＦＲの発現を誘導し、これらは、内膜の肥厚および再狭窄を導く増殖を刺激するようにオートクライン様式で作用する。血管壁における細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の形成および蓄積は、バルーン血管形成述後に発達する再狭窄損傷の別の重要な構成要素である。
【０１８５】
再狭窄を防止する目的で多数の薬理学的試験が行われてきたが、そのほとんどが利点を示さなかった。種々の血管再生術装置、抗血小板薬物、抗血栓薬物および抗炎症薬物を使用する再狭窄予防における初期の臨床試験は、一様に陰性であった（ＣａｓｔｅｒｅｌｌａおよびＴｅｉｒｓｔｅｉｎ、Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｒｅｖ．７：２１９−２３１（１９９９）；Ａｎｄｒｅｓ、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．２：８１−８９（１９９８）；ならびにＲｏｓａｎｉｏら、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．８２（ｓｕｐｐｌ　１）：１６４−１７０（１９９９）に総説される）。近年のあらゆる進歩にもかかわらず、狭窄、またはバルーン血管形成術もしくはステント移植の後の再狭窄の予防のために十分な処置はなお存在しない。限定された成功がささいな無作為試験において達成されたが、狭窄、特に再狭窄は、主要な臨床問題である。本発明は、血管平滑筋細胞の増殖を制御することによる狭窄または再狭窄の処置のためのＥｒｂＢ４レセプターアンタゴニストを開示する。
【０１８６】
しかし、本発明の範囲は、血管平滑筋細胞の障害に限定されない。本発明の範囲は特に、任意の器官における平滑筋細胞の増殖から生じる任意の障害ならびにＥｒｂＢ４レセプターおよび／または対応するリガンドの活性な役割を含む任意の障害を含む。
【０１８７】
乳児肥厚性幽門狭窄（ＩＨＰＳ）は、最初に乳児を冒す比較的一般的な疾患である。潜在的な狭窄は、幽門管の機能的閉塞を生じる。従って、乳のない胃は、ひどく荒れている。ＩＨＰＳは、幽門平滑筋の塊の肥厚および過形成を含み、そして幽門狭窄を生じる（ＯｕｅおよびＰｕｒｉ、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．４５：８５３−８５７（１９９９））。さらに、ＥＧＦ、ＥＧＦレセプターおよびＨＢ−ＥＧＦの増加した発現は、コントロール組織と比較して、ＩＨＰＳ患者由来の幽門の環状かつ長軸方向の筋肉中のＳＭＣにおいて報告されている（Ｓｈｉｍａら、Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．４７：２０１−２０７（２０００））。本明細書中に開示されるＥｒｂＢ４アンタゴニストは、幽門平滑筋細胞の増殖の制御における使用を見出し得、従って、幽門狭窄の処置における使用を見出し得る。
【０１８８】
平滑筋細胞の収縮性の特性および種々の因子による平滑筋細胞の収縮の調節は、膀胱、尿管および尿道を含む尿収集系において重大な役割を担う。ＨＢ−ＥＧＦの膜結合前駆体形態は、膀胱平滑筋細胞および上皮細胞において発現される（Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：１０２８−１０３６（１９９７）；Ｋａｅｆｅｒら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１６３：５８０−５８４（２０００））。さらに、膜結合ＨＢ−ＥＧＦをレセプターとして利用することが公知であるジフテリア毒素を用いる膀胱ＳＭＣの処置は、これらの細胞の増殖を阻害した（Ｋａｅｆｅｒら、前記）。ＨＢ−ＥＧＦは、膀胱ＳＭＣ増殖のための強力なマイトジェンであり、そして、これらの細胞によって発現されるＥｒｂＢ１（ＨＥＲ１）レセプターに結合することによって作用し、従って、オートクライン増殖因子として作用する（Ｂｏｒｅｒら、Ｌａｂ　Ｉｎｖｅｓｔ．７９：１３３５−１３４５（１９９９））。この筆者らはまた、膀胱ＳＭＣ上にＥｒｂＢ４レセプターではないＥｒｂＢ２レセプターおよびＥｒｂＢ３レセプターの発現を実証した。これらの知見は、ＨＢ−ＥＧＦが下部尿路を冒す閉塞症候群に応じて生じる膀胱壁肥厚において役割を担う可能性を提起する。従って、本発明のＥｒｂＢ４アンタゴニスト、特にＥｒｂＢ４免疫付着因子は、膀胱平滑筋細胞の増殖を制御する際の有用性を証明し得、従って、尿閉塞症候群の予防または処置の際の有用性を証明し得る。
【０１８９】
閉塞性気道疾患は、平滑筋細胞増殖を含む潜在的病理学を有するさらに別の疾患群である。この群の１つの例は、喘息であり、これは、気道の炎症および気管支収縮において顕著である。ＥＧＦは、ヒト気道ＳＭＣの増殖を刺激することが示され、そして閉塞性気道疾患における気道ＳＭＣの病理学的増殖に関連する因子の１つであるようである（Ｃｅｒｕｔｉｓら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７３：Ｌ１０−１５（１９９７）；Ｃｏｈｅｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：８５−９０（１９９７））。従って、本発明のＥｒｂＢ４アンタゴニストは、閉塞性気道疾患の処置のために使用され得る。
【０１９０】
患者の細胞にインビボおよびエキソビボで核酸（必要に応じて、ベクターに含まれる）を導入するための２つの主要な手法が存在する。インビボ送達のために、核酸は、一般にはキメラなヘテロ付着因子が要求される部位で患者に直接注入される。エキソビボ処置のために、患者の細胞は取り出され、核酸はこれらの単離された細胞に導入され、そしてこの改変された細胞は直接にか、または例えば、患者内に移植される多孔性膜内にカプセル化されるかのいずれかで患者に投与される（例えば、米国特許第４，８９２，５３８号および同第５，２８３，１８７号を参照のこと）。
【０１９１】
生存細胞に核酸を導入するために利用可能な種々の技術が存在する。これらの技術は、培養細胞内にインビトロで移入されるか、または意図された宿主の細胞内にインビボで移入されるかに依存して変化する。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸移入に適切な技術としては、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などの使用が挙げられる。
【０１９２】
遺伝子のエキソビボ送達のために一般的に使用されるベクターは、レトロウイルスウイルスである。現在好ましいインビボ核酸移入技術としては、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、またはアデノ随伴ウイルス）を用いるトランスフェクション、および脂質ベース系（遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥおよびＤＣ−Ｃｈｏｌである）が挙げられる。いくつかの状況において、標的細胞を標的化する因子（例えば、細胞表面膜タンパク質または標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンドなど）とともに核酸供給源を提供することが所望される。リポソームが使用される場合、エンドサイトーシスに関連する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば、特定の細胞型を指向するカプシドタンパク質またはそのフラグメント、循環における内部移行を行うタンパク質に対する抗体、ならびに細胞内局在を標的化しかつ細胞内半減期を増強するタンパク質を標的化するために、ならびに／または取り込みを容易にするために使用され得る。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２：４４２９−４４３２（１９８７）、およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：３４１０−３４１４（１９９０）によって記載される。現在公知の遺伝子標識（ｍａｒｋｉｎｇ）プロトコルおよび遺伝子治療プロトコルの総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５６：８０８−８１３（１９９２）を参照のこと。また、ＷＯ９３／２５６７３およびその中に引用される参考文献を参照のこと。
【０１９３】
治療的処方物は、凍結乾燥した塊または水溶液の形態で、所望の程度の純度を有するＥｒｂＢ４アンタゴニストを、最適な生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤と混合することによる貯蔵のために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ．，Ａ．，Ｅｄ．，（１９８０））。薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、そしてこれらとしては以下が挙げられる：リン酸、クエン酸、および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む、モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール；ナトリウムのような塩形成対イオン；ならびに／あるいはＴｗｅｅｎ、プルロニクス（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤。
【０１９４】
インビボ投与のために使用される抗体または免疫付着因子は、滅菌されなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。この処方物は、通常は凍結乾燥形態または溶液で貯蔵される。
【０１９５】
治療組成物は、一般に滅菌アクセス口を有する容器（例えば、皮下注入針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたは瓶）内に置かれる。
【０１９６】
抗体、免疫付着因子またはキメラへテロ付着因子の投与経路（例えば、静脈、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内もしくは病巣内の経路、または下記のような徐放系の注射または注入）は、公知の方法に従う。ヘテロ付着因子または抗体は、注入または多孔性注射によって連続的に投与される。
【０１９７】
徐放性調製物の適切な例としては、マトリクスが造形品の形態（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）であるタンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスが挙げられる。徐放性マトリクスの例としては、以下が挙げられる：ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２）によって記載されるようなポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号、ＥＰ　５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７−５５６（１９８３））、非分解性エチレン−酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、前出）、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ルプロンディポット（Ｌｕｐｒｏｎ　Ｄｅｐｏｔ）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリド（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸からなる注入可能なミクロスフィア））、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）。
【０１９８】
徐放性ＥｒｂＢ４アンタゴニストとしてはまた、リポソームで包まれた薬物が挙げられる。ＥｒｂＢ４アンタゴニストを含むリポソームは、それ自体公知の方法によって調製される：Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ　５２，３２２；ＥＰ　３６，６７６；ＥＰ　８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号および同第４，５４４，５４５；ならびにＥＰ１０２，３２４。通常、リポソームは、小さい（約２００〜８００オングストローム）単層型であり、ここで、その脂質含量は、約３０モル％コレステロールより多く、選択された割合は、最適な治療のために調整される。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いる逆相エバポレーション法によって生成され得る。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを得るために規定されたポアサイズのフィルターを通して押し出される。化学療法剤（例えば、ドキソルビシン）は、必要に応じてリポソーム内に含まれる。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４（１９８９）を参照のこと。
【０１９９】
本発明のＥｒｂＢ４アンタゴニストを使用して、ＥｒｂＢ４リガンドを結合および分離するか、またはＥｒｂＢ４レセプターをブロックし、これにより細胞におけるＥｒｂＢ４活性化および細胞増殖を阻害し得る。本発明のＥｒｂＢ４アンタゴニストは、化学療法剤のような他の治療とともに患者に投与され得る。このような化学療法剤についての調製および投薬スケジュールは、製造業者の指示書に従ってかまたは当業者によって経験的に決定されたように使用され得る。このような化学療法剤についての調製および投薬スケジュールはまた、Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　Ｓｅｒｖｉｃｅ　Ｅｄ．，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９２）に記載される。化学療法剤は、アンタゴニスト投与前または後に行われ得るか、あるいは同時に与えられ得る。
【０２００】
治療的に使用されるべきアンタゴニストの有効量は、例えば、治療の目的、投与経路、および患者の状態に依存する。従って、最大治療効果を得るために必要とされる場合、投薬量を滴定し（ｔｉｔｅｒ）そして投与経路を改変することは、療法士にとって必要である。代表的な投薬量は、患者の体重あたり約１ｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲、好ましくは１０ｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり得る。代表的には、臨床医は、上記の障害の処置について所望の効果を達成する投薬量に届くまでアンタゴニストを投与する。
【０２０１】
（５．平滑筋細胞の増殖または移動を阻害または増強する分子を同定するための方法）
本発明は、平滑筋細胞の増殖を阻害または増強し得る分子を同定するためのスクリーニング方法を開示する。例えば、候補分子を、ＥｒｂＢ４レセプターの細胞外ドメインを含むポリペプチドとともにインキュベートし、続いて、平滑筋細胞の培養物に添加し、そして細胞の増殖に対する効果を決定する。ＥｒｂＢ４レセプターは、ネイティブなＥｒｂＢ４レセプター（例えば、ヒトＥｒｂＢ４レセプター）であってもネイティブなＥｒｂＢ４レセプターのアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドであってもよい。細胞増殖は、多くの方法でモニターおよび定量され得る。例えば、３Ｈ−チミジンのＤＮＡへの取り込みは、細胞増殖を示す細胞内ＤＮＡ合成をモニターするための十分確立された方法である。３Ｈ−チミジンのＤＮＡへの取り込みは、オートラジオグラフィーにおける銀粒子の数の顕微鏡的な計数、または生化学的に液体シンチレーション計数のいずれかによってモニターされる。同様に、５−ブロモ　２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の細胞ＤＮＡへの取り込みは、顕微鏡的または免疫学的のいずれかによってモニターされ得る。両方のアッセイは、ＤＮＡに取り込まれたＢｒｄＵを認識する高度に特異的なモノクローナル抗体を使用する。顕微鏡アッセイにおいて、細胞を、透過性にし、ＢｒｄＵ特異的モノクローナル抗体と反応させ、続いて、二次抗体で標識する。二次抗体は、蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッドなど）または酵素標識（アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼなど）のような付着した標識によって検出される。次いで、酵素反応の際に不溶性産物を生成する適切な基質を使用して、酵素標識二次抗体を示しかつ定量する。酵素アッセイは、適切な免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によってＢｒｄＵ特異的モノクローナル抗体の量をモニターする。ＢｒｄＵに対して特異的なモノクローナル抗体、ならびにこのような抗体を備えるＥＬＩＳＡキットは、多くの供給源（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍを含む）から市販されている。フローサイトメトリーをまた使用して、細胞増殖をモニターし得る。この方法において、細胞は、細胞あたりの核ＤＮＡ含量に基づいて分画される。核ＤＮＡ含量が細胞周期の相（Ｇ１期で２ｎ、Ｇ２＋Ｍ期で４ｎおよびＳ期で中間の値、ここで、ｎは、ハプロイド核ＤＮＡ含量の値）に依存して分裂する細胞の間で変動するので、細胞増殖は、この手法を用いてＳ期とＧ２＋Ｍ期とにおいて細胞の画分を見積もることによって迅速にモニターされ得る。
【０２０２】
平滑筋細胞のＥｒｂＢ４依存的増殖がＥｒｂＢ４レセプターを利用するリガンド媒介シグナル伝達経路を含むので、この経路における任意の工程は、モニターされ得、そして細胞増殖の基準として使用され得る。このような工程の１つは、ＥｒｂＢ４レセプターのリガンド誘導性チロシン自己リン酸化であり、ここで、ＷＯ９５／１４９３０に記載されるようなキナーゼレセプター活性化（ＫＩＲＡ）アッセイによってモニターされ得る。このＥＬＩＳＡ型アッセイは、ＥｒｂＢ４のようなレセプタータンパク質チロシンキナーゼのキナーゼドメインの自己リン酸化を測定することによって、キナーゼ活性化の定性的測定または定量的測定に適切である。このアッセイの第１段階は、平滑筋細胞の細胞膜に存在するＥｒｂＢ４レセプターのキナーゼドメインのリン酸化である。代表的には、第１固相（例えば、第１アッセイプレートのウェル）は、平滑筋細胞の実質的に均一な集団でコートされる。接着細胞であるので、平滑筋細胞は、第１固相に自然と接着する。キナーゼレセプターおよびｆｌａｇポリペプチドの融合物を含む「レセプター構築物」でトランスフェクトされた平滑筋細胞もまた、使用され得る。ｆｌａｇポリペプチドに特異的な抗体を、アッセイのＥＬＩＳＡ部分において使用して、ｆｌａｇポリペプチドを用いてレセプターを捕獲し得る。次いで、候補分子、およびネイティブなＥｒｂＢ４レセプターの細胞外ドメインを含むポリペプチドを、平滑筋細胞を含むウェルに添加し、続いて、ＫＩＲＡアッセイによってＥｒｂＢ４レセプターのチロシン自己リン酸化をモニターする。ＥｒｂＢ４レセプターの細胞外ドメインのアミノ酸配列と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドもまた、このアッセイにおいて使用され得る。暴露に続いて平滑筋細胞を、溶解緩衝液（この中に可溶化する界面活性剤を有する）を使用して可溶化し、穏やかに攪拌し、これにより、細胞融解物の濃縮または清澄化の必要なく、このアッセイのＥＬＩＳＡ部分に直接供され得る細胞融解物を放出する。
【０２０３】
次いで、調製した細胞溶解物は、アッセイの第２（ＥＬＩＳＡ）段階に供される。ＥＬＩＳＡ段階での第１工程のように、第２固相（通常、ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェル）は、捕獲因子（しばしば捕獲抗体）でコートされる。これは、ＥｒｂＢ４レセプターに、レセプター構築物の場合、ｆｌａｇポリペプチドに特異的に結合する。第２固相のコーティングは、この捕獲因子が第２固相に接着するように実施される。この捕獲因子は、一般にモノクローナル抗体であるが、ポリクローナルもまた使用され得る。次いで、得られた細胞溶解物は、接着する捕獲因子に暴露されるか、または接触させられる。その結果、レセプターまたはレセプター構築物は、第２固相に接着する（または捕獲される）。次いで、洗浄工程が、非結合の細胞溶解物を除いて捕獲したレセプターまたはレセプター構築物を残すように実施される。次いで、接着するかまたは捕獲されたレセプターまたはレセプター構築物は、チロシンキナーゼレセプター中のリン酸化したチロシン残基を同定する抗ホスホチロシン抗体に暴露されるかまたは接触させられる。好ましい実施形態において、抗ホスホチロシン抗体は、非放射性の着色試薬の変色を触媒する酵素に（直接的または間接的に）結合体化される。従って、レセプターのリン酸化は、次に起こるこの試薬の変色によって測定され得る。この酵素は、抗ホスホチロシン抗体に直接的に結合され得るか、または結合体化分子（例えば、ビオチン）が抗ホスホチロシン抗体に結合体化され得、続いてこの酵素は、結合体化した分子を介して抗ホスホチロシン抗体に結合され得る。最終的に、抗ホスホチロシン抗体の、捕獲されたレセプターまたはレセプター構築物への結合は、例えば、着色試薬の変色によって測定される。市販の抗ホスホチロシン抗体は、このアッセイに使用され得る。
【０２０４】
本発明はまた、平滑筋細胞の移動を阻害または増強し得る分子をスクリーニングする方法を提供する。この型の１つは、区画化された走化性細胞培養物チャンバー（例えば、Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ　Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから入手可能なＮｅｕｒｏｐｒｏｂｅ　ＣｈｅｍｏＴＸ走化性チャンバー）を利用する。この方法において、多孔性フィルターは、化学誘引物質（例えば、トロンビン）を含む下部チャンバー内の培地から上部チャンバー内の平滑筋細胞を分離する。平滑筋細胞は、候補分子、およびＥｒｂＢ４レセプターの細胞外ドメインを含むポリペプチドとともにインキュベートされる。インキュベート期間の終わりに、フィルターを染色し、そしてフィルターの底に移動した平滑筋細胞を、倒立顕微鏡を使用して計数する。
【０２０５】
化合物の従来のライブラリーまたはコンビナトリアルライブラリーは、スクリーニング目的に使用され得る。高スループットに適用される自動化手法は、このアッセイについて簡便に使用され得る。しかし、スクリーニングアッセイは、低分子のみに限定されず、抗体のような巨大分子でさえも、このスクリーニングに使用され得る。
【０２０６】
（実施例）
以下の実施例は、例示の目的で示され、そして限定の目的ではない。これらの実施例は、本発明の化合物、組成物および方法をどのように作製しそしてどのように使用するかについての完全な開示および記載を当業者に提供するように提供され、そして本発明者らが本発明としてみなすものの範囲を限定することを意図しない。使用した数（例えば、量、温度など）に関して精度を保障するように努力がなされたが、いくつかの実験的誤差および偏差は、考慮されるべきである。他で示されない限り、部は、重量部であり、温度は、摂氏であり、そして圧力は、大気圧またはほぼ大気圧である。本明細書中の引用全ての開示は、本明細書中に参考として明確に援用される。
【０２０７】
（実施例１：免疫付着因子およびキメラヘテロマルチマー免疫付着因子の構築、単離および生化学的特徴付け）
独特なＭｌｕＩ部位を、免疫グロブリンのヒンジドメインをコードする領域でヒトＩｇＧ重鎖を発現するプラスミド（ｐＤＲ、Ｊ．ＲｉｄｇｅｗａｙおよびＰ．Ｃａｒｔｅｒ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．から供与）中に操作した。ＭｌｕＩ部位もまた、これらのレセプターのＥＣＤ／ＴＭ連結部をコードする領域でＥｒｂＢ４発現プラスミドのセット中に操作した。全ての変異誘発を、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８２：４８８（１９８５））を使用して実施した。このＭｌｕＩ部位を利用して、適切なＥｒｂＢ４−ＩｇＧ融合構築物を作製した。ＥｒｂＢ４−ＩｇＧキメラの融合連結は：Ｇ６４０ＥｒｂＢ４−（ＴＲ）−ＤＫＴＨ２２４ＶＨ、ここで、ＥｒｂＢ４ポリペプチドのアミノ酸番号付けは、Ｐｌｏｗｍａｎら（Ｐｌｏｗｍａｎ，Ｇ．Ｄ．ら（１９９３ａ）ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　９０：１７４６−１７５０）に記載される。保存されたＴＲ配列は、このＭｌｕＩ部位に由来する。この融合構築物の調製において使用したＦｃ領域の配列は、Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．ら（Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．ら、（１９８２）ＮＡＲ　１０：４０７１−４０７９）に見出される。最終発現構築物は、ｐＲＫ型プラスミド骨格中であった。ここで、真核生物発現を、ＣＭＶプロモーター（Ｇｏｒｍａｎら、ＤＮＡ　Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．Ｔｅｃｈ．２：３−１０（１９９０））によって駆動する。
【０２０８】
インビトロ実験のためのタンパク質を得るために、接着ＨＥＫ−２９３細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５７３）を、標準リン酸カルシウム法（Ｇｏｒｍａｎ、前出、およびＨｕａｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１８：９３７−９４７（１９９０））を使用して、発現プラスミドを用いてトランスフェクトした。血清含有培地を、トランスフェクションの１５時間後に血清のない培地と置換し、そしてトランスフェクトした細胞を、５〜７日間インキュベートした。生じた馴化培地を回収し、そしてプロテインＡカラム（１ｍＬ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＨｉＴｒａｐ）を通した。精製したＩｇＧ融合物を、０．１Ｍクエン酸（ｐＨ４．２）を用いて１Ｍ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）を含むチューブ中に溶出した。溶出したタンパク質を、続いてＰＢＳに対して透析し、そしてＣｅｎｔｒｉ−ｐｒｅｐ−３０フィルター（Ａｍｉｃｏｎ）を使用して濃縮した。２５％の最終濃度までグリセロールを添加し、そしてこの物質を、−２０℃で貯蔵した。物質の濃度を、Ｆｃ−ＥＬＩＳＡを介して決定した。
【０２０９】
（１２５Ｉ−ＨＲＧ結合アッセイ）
ＨＲＧ　１（１７７−２４４）のＥＧＦ様ドメインを、以前に記載されたように（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１４６６１−１４６６５（１９９４））、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、精製し、そして放射性ヨウ素標識した。チャイニーズハムスター卵巣細胞において発現された全長ｒＨＲＧ　１を、ウェスタンブロット分析に使用した。結合アッセイを、Ｎｕｎｃブレイクアパートイムノモジュール（ｂｒｅａｋａｐａｒｔ　ｉｍｍｕｎｏ−ｍｏｄｕｌｅ）プレートにおいて実施した。プレートのウェルを、４℃で一晩、５０ｍＭカルボネート緩衝液（ｐＨ９．６）中の５ｇ／ｍｌヤギ抗ヒト抗体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）１００ｌでコーティングした。プレートを、２００ｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で２回リンスし、次いで、１００ｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳと共に３０分間室温にて短期間インキュベートした。緩衝液を除去し、そして各ウェルを、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中のＩｇＧ融合タンパク質１００ｌと共に、激しい側方（ｓｉｄｅ−ｔｏ−ｓｉｄｅ）回転下で１時間インキュベートした。プレートを、洗浄緩衝液で３回リンスし、そして種々の量の冷却競合物−ＨＲＧおよび１２５Ｉ−ＨＲＧ　１を添加し、そして激しい側方回転と共に２〜３時間室温にてインキュベートすることによって、競合的結合を実施した。ウェルを、洗浄緩衝液で迅速に３回リンスし、排出し、そして個々のウェルを、１００　Ｓｅｒｉｅｓ　Ｉｓｏ　Ｄａｔａ計数器を使用してカウントした。スキャッチャード分析を、改変されたリガンドプログラム（Ｍｕｎｓｏｎ，Ｐ．およびＲｏｂａｒｄ，Ｄ．（１９８０）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１０７：２２０−２３９）を使用して実施した。
【０２１０】
（３Ｈ−チミジン取り込みアッセイ）
トリチウム化チミジン取り込みアッセイを、９６ウェル様式で実施した。ＭＣＦ７細胞を、５０：５０のＦ１２／ＤＭＥＭ（高グルコース）０．１％胎仔ウシ血清（１００ｍｌ）中において１０，０００細胞／ウェルでプレーティングした。細胞を３時間静置させ、その後、ＥｒｂＢ４−ＩｇＧ融合タンパク質および／またはヒレグリンをこのウェルに添加し（２００ｍｌの最終容量）、そしてこのプレートを、３７℃の組織培養インキュベーター内において１５時間インキュベートした。トリチウム化チミジンを、このウェルに添加し（２０ｍｌの１／２０希釈トリチウム化チミジンストック：Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＴＲＡ　１２０　Ｂ３６３、１ｍＣｉ／ｍｌ）、そしてこのプレートをさらに３時間インキュベートした。次いで、トリチウム化物質を、Ｐａｃｋａｒｄ　Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ　１９６ハーベスターを使用して、ＧＦ／Ｃユニフィルター（ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ）（９６ウェル様式）上に収集した。フィルターを、Ｐａｃｋａｒｄ　Ｔｏｐｃｏｕｎｔ装置を使用して計数した。
【０２１１】
（実施例２：ヒト大動脈平滑筋細胞の増殖に対するＥｒｂＢ４−ＩｇＧ免疫付着因子（Ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｎ）の効果）
ヒト大動脈平滑筋細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を、９６ウェル組織培養プレートにおいて約５０％コンフルエント密度（５０００細胞／ウェル）で播種し、そしてＳＭ２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）中で一晩インキュベートした。翌日、この培地を、ＩＴＳ（１×）、２ｍＭ　Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸、２６．５ｍＭ　ＮａＨＣＯ３、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００Ｕ／ｍｌストレプトマイシンおよび０．１％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清を補充した、Ｍ１９９に交換した。この細胞を、さらに１６時間インキュベートした。次いで、この細胞を、Ｈｅｒ４−ＩｇＧ（４００ｎＭ）または緩衝液のいずれかで１時間処理し、次いで、ＰＤＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で４０時間処理した。コントロール細胞を未処理のままにして、細胞増殖の基底レベルを推定した。ＢｒｄＵ（ＰＢＳ中で調製された５−ブロモ２’−デオキシウリジンの１０μＭ溶液の１０μｌ／ウェル）のアリコートを添加し、そしてこの細胞を、さらに２時間インキュベートした。細胞増殖を、付着細胞についての製造業者の指示書に従ってＢｒｄＵ　ＥＬＩＳＡ（Ｃｅｌｌ　ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎキット，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ｍａｎｎｈｅｉｍ，カタログ番号１　６４７　２２９）を使用してＢｒｄＵ取り込みを定量することによってモニターした。
【０２１２】
図５に示されるように、ＰＤＧＦは、以前の報告（Ｒｏｓｓら、，Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ｂ　Ｂｉｏｌ　Ｓｃｉ．１２：１５５−１６９［１９９０］）と一致して、大動脈平滑筋細胞の増殖を刺激した。ＥｒｂＢ４−ＩｇＧ免疫付着因子での細胞の前処理は、ＰＤＧＦによって刺激される細胞増殖の程度を低下させた。ＥｒｂＢ４−ＩｇＧの代わりに緩衝液で処理されたコントロール細胞は、細胞増殖に対していかなる有意な影響をも示さなかった。これらのデータにより、平滑筋細胞の有糸分裂応答の少なくとも一部はＥｒｂＢ４レセプターの活性化によって媒介されること、およびＥｒｂＢ４免疫付着分子を用いて、ＥｒｂＢ４レセプターを活性化するリガンドを除去することにより、ＰＤＧＦへの応答における平滑筋細胞増殖が低下されることが示される。
【０２１３】
（実施例３：ヒト大動脈平滑筋細胞の移動に対するＥｒｂＢ４−ＩｇＧ免疫付着因子の効果）
ヒト大動脈平滑筋細胞をトリプシン処理し、そして１０％ＦＢＳを含むＤＭＥ中に５×１０５細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。細胞を、Ｈｅｒ４−ＩｇＧ（４００ｎＭ）または緩衝液と共に１５分間プレインキュベートした。ＣｈｅｍｏＴＸ走化性チャンバー（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ　Ｉｎｃ．，Ｃａｔ　１１６−８）の下部のウェルに、３００μｌの２Ｕ／ｍｌヒトトロンビンまたは緩衝液（ＰＢＳ）ネガティブコントロールの溶液を満たした。フィルターをチャンバーの頂部にマウントし、そして平滑筋細胞（緩衝液またはＥｒｂＢ４処理）を、５０μｌの容量の上部ウェルに添加した。このプレートおよびフィルターを、透明なプラスチックのフタで覆い、そして５％ＣＯ２を有する加湿空気中において３７℃で３時間インキュベートした。このインキュベーションの終了時に、フィルターを取り除き、そしてその上面をＱ−ｔｉｐで拭いて、残存するすべての細胞を取り除いた。このフィルターを、Ｄｉｆ−Ｑｕｉｃｋ染色溶液で染色し、そしてフィルターの下部に移動した細胞の数を、倒立位相差顕微鏡を用いて計数した。各群における６つのウェルおよび各ウェルにおける４０箇所の視野を計数した。
【０２１４】
図６に示されるように、トロンビンは、走化性刺激として作用し、そして大動脈平滑筋細胞の移動を誘導した。ＥｒｂＢ４−ＩｇＧ免疫付着因子は、トロンビンによって刺激される細胞の移動を阻害した。これらのデータにより、トロンビンが、平滑筋細胞の移動を刺激する能力の少なくとも一部分は、ＥｒｂＢ４レセプターに対するリガンドの放出によって媒介されること、およびＥｒｂＢ４免疫付着分子を用いて、これらのリガンドを除去することにより、トロンビンへの走化性応答が低下されることが示される。
【０２１５】
（実施例４：抗ＥｒｂＢ４モノクローナル抗体の産生および特徴付け）
（抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂの生成）
ＥｒｂＢ４の細胞外ドメインに特異的に結合する３４個のマウスモノクローナル抗体のパネルを、従来のハイブリドーマ技術を使用して作製した（表２）。総細胞性ＲＮＡを、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞から抽出し、そしてＲＴ　ＰＣＲにおけるテンプレートとして使用して、ヒトＥｒｂＢ４細胞外ドメイン（ＥＣＤ）コード配列を生成した。ＲＴ　ＰＣＲ反応に使用される特定のオリゴヌクレオチドを、ＥｒｂＢ４のＤＮＡ配列に基づいて合成した。ｇＤＥｒｂＢ４　ＥＣＤ融合タンパク質を、ヒトＥｒｂＢ４のアミノ酸２６〜６４０をコードする配列に対して単純ヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｄのアミノ酸１〜５２のコード配列を連結することによって構築した。ｇＤＥｒｂＢ４　ＥＣＤ　ｃＤＮＡを、サイトメガロウイルスに基づく発現ベクターｐＲＫ５に挿入した。この構築物を、標準的なリン酸カルシウム沈降プロトコールを使用して、ヒト胚腎臓２９３細胞中に一過的にトランスフェクトした。
【０２１６】
アフィニティカラムを、ＣＮＢＲセファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｐｐｓａｌａ　Ｓｗｅｄｅｎ）に抗ｇＤモノクローナル５Ｂ６を連結することによって調製した。ｇＤＥｒｂＢ４　ＥＣＤをトランスフェクトした２９３細胞からの上清を、ｙｍ３０メンブラン（Ａｍｉｃｏｎ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）上で２０〜４０倍濃縮し、そしてアフィニティ樹脂上にロードした。このカラムをＰＢＳで洗浄し、そしてレセプターを、１００ｍＭ酢酸／５００ｍＭ　ＮａＣｌ（ｐＨ２．４）で溶出した。ＥｒｂＢ４　ＥＣＤを、ＰＢＳ中に緩衝液交換し、そして濃縮した。タンパク質濃度を、ＯＤ２８０により決定した。
【０２１７】
Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０週間目、１週間目、２週間目および３週間目にその臀部フットパットにおいて、ＲＩＢＩ　ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳエマルジョン（ＲＩＢＩ　ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）中のＥｒｂＢ４　ＥＣＤ（約５ｇ）で免疫した。免疫したマウスを、ＥＬＩＳＡによって、抗体応答について試験した。最高力価を有するマウスは、４週間目の間、ＲＩＢＩ中のＥｒｂＢ４　ＥＣＤ（約５ｇ）を与えられた。３日後、膝窩および鼡径部節由来のリンパ球をマウスメラノーマ株Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と融合した。融合細胞を、９６ウェル組織培養プレート中において２００，０００細胞／ウェルの密度でプレーティングし、そしてＨＡＴ培地補充物（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用するハイブリドーマ選択を、融合の１日後に開始した。１０日目に開始して、下記のような放射性捕捉アッセイを使用して、ＥｒｂＢ４特異的抗体の存在について、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。安定して抗体を産生するクローンを、限外希釈によって得た。そして多量の特異的Ｍａｂを、腹水中で産生した。抗体を、プロテインＡ−セファロースカラム（Ｆｅｒｍｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）上で精製し、そして滅菌ＰＢＳ中において４℃で保存した。
【０２１８】
放射性捕捉アッセイにおいて、Ｍａｘｉｓｏｒｐブレイクアパートモジュール（ｂｒｅａｋａｐａｒｔ　ｍｏｄｕｌｅｓ）（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を、１００ｌの２ｇ／ｍｌヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で、４℃にて一晩コーティングした。このプレートを、ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ　２０（ＰＢＳＴ）で洗浄し、ＥＬＩＳＡ希釈液（ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０）でブロックし、そしてモノクローナル上清と共に２時間にわたり周囲温度でインキュベートした。このプレートを洗浄し、そして４０，０００カウント／ウェルの［１２５Ｉ］ＥｒｂＢ４　ＥＣＤと共にさらに１時間インキュベートした。洗浄後、この抗体に結合したＥｒｂＢ４の量を、Ｗａｌｌａｃ　１２７７　ＧａｍｍａＭａｓｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ　Ｉｎｃ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）においてウェルを計数することによって決定した。
【０２１９】
この方法によって産生された３４個の抗ＥｒｂＢ４モノクローナル抗体（表２）は、レセプターに対して高い親和性を有し、アイソタイプの多様性を示し、そしてこれらは、ＥｒｂＢ４　ＥＣＤにおける１８個の異なるエピトープに指向する。抗体のアイソタイプを、ＺｙｍｅｄからのＭｏｕｓｅ　ＭｏｎｏＡｂ　ＩＤ／ＳＰアイソタイピングキット（Ｓｏ．Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を製造業者の指示書に従って使用して決定した。
【０２２０】
（抗ＥｒｂＢ４抗体の特異性試験）
Ｍａｂの特異性を、固定されたＨＥＲ２、ＨＥＲ３およびＥｒｂＢ４の細胞外ドメイン（それぞれ、アミノ酸１〜６４５、１〜６１７および１〜６４０）に結合するその能力を測定するＥＬＩＳＡにおいて決定した。ＥＣＤを、１ｇ／ｍｌの濃度でＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、そしてビオチン化された抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂと共にインキュベートした。結合したＭａｂを、ストレプトアビジンペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）およびその基質ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して検出した。表２において見られ得るように、産生されたほぼすべての抗体が、ＥｒｂＢ４に対して高度に特異的であった（「特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」と表示された欄において、「４」により示される）。この抗体のうちの４つは、ＨＥＲ３に対して幾分かの結合を示した（「特異性（Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」と表示された欄において、「３」により示される）。
【０２２１】
（エピトープマッピングおよび特徴付け）
各モノクローナル抗体により結合されたＥｒｂＢ４エピトープを、競合結合分析（Ｆｅｎｄｌｙら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　５０：１５５０−１５５８（１９９０））により決定した。抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂを、ＥＬＩＳＡ希釈液中において２５ｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、そして５０ｌを、上記のようにしてｇＤＥｒｂＢ４　ＥＣＤでプレコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに添加した。このプレートを、室温で２時間インキュベートし、そしてＰＢＳＴで洗浄した。ビオチン化された抗ＥｒｂＢ４抗体の希釈物（１：１，０００〜１：１０，０００の範囲）を調製し、そして５０ｌを、アッセイプレートに添加した。室温での１時間のインキュベーション後、このプレートを洗浄し、そしてストレプトアビジンペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）の１：５０００希釈物５０ｌを添加した。このプレートを、ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ）を用いて顕色化した。抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂを、無関係のＭａｂコントロールとの比較において５０％以上、他の結合をブロックするその能力に基づいて、エピトープに分類した。関連のエピトープマッピングにより、１７個の異なるエピトープが同定された（表２においてＡ〜Ｑとして同定される）。
【０２２２】
９つの個々の抗体の活性を、さらに研究した。
【０２２３】
表２　抗ＥｒｂＢ４モノクローナルに関してまとめた表
【０２２４】
【表２】
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（結合親和性の決定）
抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂの相対的親和性を、Ｆｒｉｇｕｅｔら（Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ．７７（２）：３０５−１９（１９８５））に記載された方法に従って決定した。種々の濃度のＥｒｂＢ４　ＥＣＤ（１．１×１０−７Ｍ〜１．０８×１０−１０Ｍ）を、一定濃度の抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂ（２．０８×１０−１０Ｍ）と混合し、そして４℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、結合していないＭａｂを、ｇＤＥｒｂＢ４　ＥＣＤで予めコーティング（０．０５Ｍカルボネート緩衝液（ｐＨ９．６）中において１ｇ／ｍｌの濃度で１００ｌ／ウェル、４℃で１６時間）されたマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）に二連で１００ｌの反応混合物を添加することによってアッセイし、そして１時間室温でインキュベートした。ＰＢＳＴでの洗浄後、結合したＭａｂを、ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２ペルオキシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の１：５０００希釈物１００ｌ／ウェルを室温で１時間添加することによって検出した。このプレートを、ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド基質（ＯＰＤ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用して顕色化し、そしてプレートリーダーで読み取った。
【０２２５】
Ｍａｂはすべて高い結合親和性を示した。Ｋｄは、表３に提示されるように、０．４〜１２ｎｍの範囲である。
【０２２６】
（非還元イムノブロット）
抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂが、還元型ＥｒｂＢ４　ＥＣＤおよび非還元型ＥｒｂＢ４　ＥＣＤに結合する能力を、イムノブロット分析によって試験した。ＥｒｂＢ４　ＥＣＤを、ＢＭＥと共におよびＢＭＥを伴わずに、トリシン（ｔｒｉｃｉｎｅ）サンプル緩衝液に添加し、そして１０〜２０％　Ｎｏｖｅｘトリシンゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に適用した。このゲルを、１００Ｖで泳動し、そしてＰＶＤＦ，Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ　Ｐ，メンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上に０．５アンペアで６０分間エレクトロブロットした。このメンブランをＰＢＳＴで洗浄し、そしてＰＢＳ／０．５％　ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ　２０で一晩ブロックし、そして１ｇ／ｍｌのモノクローナル抗体と共に、周囲温度で１．５時間インキュベートした。このメンブランを洗浄し、そしてラット抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の１：１０，０００希釈物と共に、さらに１時間インキュベートした。このメンブランを徹底的に洗浄し、そしてＡｍｅｒｓｈａｍ　ＥＣＬ化学発光システム（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ　ｓｙｓｔｅｍ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＩＩ）を使用して現像した。
【０２２７】
Ｍａｂはいずれも、還元型ＥｒｂＢ４　ＥＣＤを認識し得なかった（データは示さず）。このことは、これらが立体エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ　ｅｐｉｔｏｐｅ）に指向されていることを示唆する。表３において陽性として同定されたＭａｂは、低濃度の非還元型ＥｒｂＢ４　ＥＣＤを認識し得たＭａｂである。Ｍａｂ　４−１４５９、４−１４６０、４−１４６１、４−１４６２、４−１４９２および４−１４９７は、高レベルの免疫反応性を示し、そして０．３ｎｇまで低いレベルで、非還元型ＥｒｂＢ４　ＥＣＤに結合し得た。
【０２２８】
（ＨＲＧ結合の阻害）
いかなるＥＧＦＲ様レセプターをも発現しないＫ５６２細胞株を使用して、抗ＥｒｂＢ４モノクローナル抗体をさらに特徴付けた。ＥｒｂＢ４でトランスフェクトされたＫ５６２細胞株（１Ｅ１０．１Ｈ４）を産生し、そして２ｍＭ　Ｌ−グルタミン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）および８００ｇ／ｍｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を有する、ＲＰＭＩ　１６４０中において培養した。アッセイの前に少なくとも２０時間、１Ｅ１０．１Ｈ４を、１０ｎｍホルボール−１２−ミリステート、１３−アセテート（ＰＭＡ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で刺激した。抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂを、この細胞株へのＨＲＧの結合をブロックするその能力について評価した。
【０２２９】
１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳおよび０．１％ＢＳＡ（結合緩衝液）を有する２００ｌのＲＰＭＩ　１６４０中に再懸濁された１．０×１０５のＫ５６２　ＥｒｂＢ４細胞を含む四連のサンプルを、１００ｎＭ抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂの存在下において、氷上にて一晩、１３２ｐＭ［１２５Ｉ］ＨＲＧ１（１７７−２４４）と共にインキュベートした。インキュベーション後、この細胞を、Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎろ過デバイス（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　ｄｅｖｉｃｅ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて収集し、そして２００ｌの氷冷結合緩衝液で２回洗浄した。細胞に関連したカウントを、γ計数器で測定した。結合％を、Ｍａｂを全く含まないコントロールサンプルに対して算出した。非特異的な結合を、５００ｎＭの未標識（ｃｏｌｄ）ＨＲＧ　１（１７７−２４４）の存在下でサンプルをインキュベートすることによって決定した。Ｍａｂが、９０％以上の結合をブロックした場合に、そのＭａｂをＨＲＧブロッキングについて陽性とみなした。表３に見られ得るように、試験された９つの抗ＥｒｂＢ４抗体のうちの６つは、このレベルで１２５Ｉ−ＨＲＧ結合を阻害し得た。Ｍａｂ４−１４６１は、結合を７％阻害した。そして１４５９は、全くＨＲＧブロッキングを示さなかった。抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂ　４−１４９７は結合を阻害せず、ＨＲＧの結合を２６％増強するようであった。
【０２３０】
（ヒト乳癌細胞株におけるＨＲＧ結合の阻害）
多数の抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂが、トランスフェクトされたＫ５６２細胞へのＨＲＧの結合をブロックし得たので、いくつかのヒト乳房癌腫細胞株へのＨＲＧ結合をブロックするその能力を試験した。細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、Ｔ４７ＤおよびＢＴ４７４（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を、１×１０５細胞／ウェルの密度で２４ウェル組織培養プレートにプレーティングし、そして一晩付着させた。抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂまたは抗ＨＥＲ２コントロールＭａｂ　２Ｃ４および４Ｄ５を、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳおよび０．１％ＢＳＡ（結合緩衝液）を有するＨａｍ’ｓ　Ｆ−１２およびＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ改変Ｅａｇｌｅ培地（１：１，ｖ／ｖ）中において１００ｎＭの濃度まで希釈し、そして三連でプレートに添加した。氷上での３０分間のインキュベーション後、１．５×１０５カウントの［１２５Ｉ］ＨＲＧ　１（１４４−２７７）を添加した。このプレートを、４時間氷上でインキュベートし、そして氷冷結合緩衝液で２回洗浄した。細胞を、８Ｍ尿素／３Ｍ酢酸で可溶化し、そして細胞に関連したカウントを、Ｗａｌｌａｃ　１２７７　ＧａｍｍａＭａｓｔｅｒで測定した。結合％を、上記のように算出した。非特異的な結合を、１００ｎＭの未標識（ｃｏｌｄ）ＨＲＧ　１（１４４−２７７）の存在下においてサンプルをインキュベートすることによって決定した。
【０２３１】
抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂはいずれも、試験された癌腫株への１２５Ｉ　ＨＲＧ結合の有意な阻害を引き起こさなかった。対照的に、抗ＨＥＲ２コントロールＭａｂ２Ｃ４および４Ｄ５は、それぞれ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞において８４％および２９％結合をブロックし、Ｔ４７Ｄ細胞において７０％および４８％結合をブロックし、そしてＢＴ４７４細胞において５７％および１２％結合をブロックした。未標識ＨＲＧコントロールは、１００ｎＭの濃度で、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞において９９％結合をブロックし、Ｔ４７Ｄ細胞において９８％結合をブロックし、そしてＢＴ４７４細胞において９６％結合をブロックした。このデータは、これらの細胞株においてＥｒｂＢ４レセプターが、ＨＲＧ応答を媒介するにおいて、さほど重要ではない役割を果たし得ることを示唆する。
【０２３２】
（チロシンリン酸化の阻害）
ヒレグリンは、ＥｒｂＢ４のチロシンリン酸化を誘導することが示された。従って、抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂが、Ｋ５６２　ＥｒｂＢ４細胞株において、ＨＲＧβ１（１７７−２４４）により刺激されるレセプターのリン酸化に影響を及ぼし得るか否かを決定することに関心がもたれた。
【０２３３】
ＥｒｂＢ４をトランスフェクトしたＫ５６２細胞株（１Ｅ１０．１Ｈ４）を、１×１０６細胞／ｍｌの密度まで、ＲＰＭＩ　１６４０組織培地中において増殖させた。次いで、この細胞を、ＰＭＡ（アッセイ緩衝液）を含まない無血清培地に交換し、そして３７℃で２〜６時間インキュベートした。この細胞を、アッセイ緩衝液で洗浄し、そして０．１％ＢＳＡを有するアッセイ緩衝液中において２．５×１０５細胞を含む二連のサンプルを、２５μｇの抗ＥｒｂＢ４　ＭａｂまたはコントロールＭａｂと共に室温において３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１セットのサンプルを、１５ｍＭのＨＲＧ　１（１７７−２４４）で、室温で８分間刺激した。上清を取り除き、そして細胞を、５０ｌ／ｍｌのメルカプトエタノールを含む１００ｌのＳＤＳサンプル緩衝液中において１００℃で５分間溶解した。各サンプルの３０ｌのアリコートを、４〜１２％ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ）中で電気泳動し、そしてＰＶＤＦメンブラン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にエレクトロブロットした。このメンブランを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＴｒｉｓ緩衝化生理食塩水中において、２％ＢＳＡで４℃で一晩ブロックし、そして組換え抗ホスホチロシンペルオキシダーゼモノクローナルＲＣ２０Ｈ（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）の１：１０００希釈物と共に、室温で４時間インキュベートした。結合した抗ホスホチロシンＡｂを、Ａｍｅｒｓｈａｍ　ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．）を用いて可視化し、そしてデンシトメトリーで定量した。
【０２３４】
試験した９つのモノクローナル抗体のうちの６つが、ＨＲＧに誘導されるチロシンリン酸化シグナルの生成を阻害した（表３）。残りの３つは阻害性ではなく、抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂはいずれも、ＥｒｂＢ４レセプターのリン酸化を阻害し得なかった。
【０２３５】
（免疫組織化学）
抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂは、診断試薬として有用であり得るので、標準的な免疫組織化学技術を使用して凍結細胞ペレットを染色するその能力を研究した。ＥｒｂＢ４をトランスフェクトしたＫ５６２細胞（１Ｅ１０．１Ｈ４）およびヒト乳癌株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、Ｔ４７ＤおよびＢＴ４７４（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）をペレットにし、そしてＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ　Ｉｎｃ．，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ）中で凍結した。凍結ペレットを、クリオスタット（ｃｒｙｏｓｔａｔ）において厚さ５ミクロンに切り出し、スライドにマウントし、冷却アセトン（４Ｃ）中において３〜５分間固定し、そして風乾した。内因性のペルオキシダーゼ活性を、グルコースオキシダーゼ方法の改変法を使用してクエンチした。このスライドをＰＢＳでリンスし、そして細胞を、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｂｉｏｔｉｎブロッキングキット（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｋｉｔ）（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用して、内因性のビオチン活性をブロックした。内因性の免疫グロブリン結合部位を、１０％正常ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ）でブロックした。次いで、この細胞を、１０ｇ／ｍｌの抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂと共にＲＴで１時間インキュベートし、次いで、ビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ）の１：２００希釈物と共に３０分間インキュベートした。このスライドを、ＡＢＣ　Ｅｌｉｔｅ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ）と共に３０分間インキュベートし、そして、ＤＡＢ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用して、ＥｒｂＢ４レセプターを可視化した。Ｍａｙｅｒのヘマトキシリン（Ｒｏｗｌｅｙ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｒｏｗｌｅｙ，ＭＡ）を使用して、細胞を対比染色した。
【０２３６】
多くの抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂが、ＥｒｂＢ４をトランスフェクトしたＫ５６２細胞を染色し得た。この染色は様々な強度であり、そしてほとんどまたは全くバックグラウンド染色は存在しなかった（表３）。数値は、無関係のコントロールと比較した染色強度を表す。Ｍａｂはいずれも、試験された凍結ヒト乳癌細胞を染色し得た（データは示さず）。
【０２３７】
表３　モノクローナル抗体の活性に関してまとめた表
【０２３８】
【表３】
2004507559.tif 000005
（ＦＡＣＳ分析）
抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂが、生存可能な細胞の表面上のＥｒｂＢ４に結合し得るか否かを決定するため、ＥｒｂＢ４をトランスフェクトしたＫ５６２細胞株および乳癌株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、Ｔ４７ＤおよびＢＴ−４７４を使用して、ＦＡＣＳ分析を実施した。付着細胞を、ＰＢＳ中の１０ｍＭ　ＥＤＴＡを使用して、組織培養フラスコから剥離し、１４００ｒｐｍで５分間遠心分離し、そして１％胎仔ウシ血清を有するＰＢＳ（ＦＡＣＳ希釈液）中に再懸濁した。この細胞を計数し、１０７細胞／ｍｌに調整し、そして０．１ｍｌの細胞を、１００ｌのＦＡＣＳ希釈液中の各Ｍａｂ１０ｇ／ｍｌと共に、４℃で３０分間インキュベートした。サンプルを洗浄し、０．１ｍｌの希釈液中に再懸濁し、そしてヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のＦＩＴＣ結合体化Ｆ（ａｂ’）２フラグメント１ｇと共に、４℃で３０分間インキュベートした。この細胞を洗浄し、０．５ｍｌのＦＡＣＳ希釈液中に再懸濁し、そしてＦＡＣＳｃａｎセルソーター（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｔ．Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を使用して分析した。データを、前方散乱光および側方散乱光、ならびにヨウ化プロピジウム蛍光によってゲート制御して、細片、重複（ｄｏｕｂｌｅｔ）、および死滅した細胞を排除した。
【０２３９】
すべてのＭａｂが、ＥｒｂＢ４でトランスフェクトされたＫ５６２細胞株上のＥｒｂＢ４レセプター（これは、約２×１０５レセプター／細胞で発現される）に結合した。ＥｒｂＢ４でトランスフェクトされたＫ５６２細胞で観察された細胞蛍光における２〜５０倍の増加が、アイソタイプコントロールと比較した場合に観察された。いくつかのより弱い結合は、インタクトな細胞上に配列したＥｒｂＢ４　ＥＣＤエピトープを反映し得る。対照的に、トランスフェクトされた細胞株において最高の蛍光強度を与えた、抗ＥｒｂＢ４抗体４−１４４０、４−１４６４および４−１４９２は、乳癌株ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、Ｔ４７ＤおよびＢＴ−４７４への最少の結合を示した。ポジティブコントロール抗ＨＥＲ２　Ｍａｂ　２−２Ｃ４は、ＨＥＲ２発現レベルと比例して、腫瘍株への結合を示した。これらの結果は、このアッセイの検出限界を下回る、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、Ｔ４７Ｄ細胞およびＢＴ−４７４細胞におけるＥｒｂＢ４発現レベルを示す。
【０２４０】
（ＥｒｂＢ４免疫付着因子へのヒレグリン結合の阻害）
図７は、示された濃度の抗ＥｒｂＢ４　Ｍａｂ４−１４４０、４−１４６０および４−１４６４を用いた、ブレイクアパートモジュールにおいて捕捉されたＥｒｂＢ４免疫付着因子への１２５Ｉ　ＨＲＧ結合の置換曲線を示す。Ｍａｘｉｓｏｒｐブレイクアパートモジュール（Ｎｕｎｃ）を、５０ｍＭのカルボネート緩衝液（ｐＨ９．６）中のヤギ抗ヒトＩｇ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）の１：２００希釈物１００ｌを用いて、４℃で一晩コーティングした。このプレートを、ＰＢＳＴで洗浄し、ＥＬＩＳＡ希釈液でブロックし、そして２００ｎｇ／ｍｌのＥｒｂＢ４免疫付着因子１００ｌと共に、周囲温度で２時間インキュベートした。このプレートを洗浄し、そして５０ｌの希釈Ｍａｂ（０．１〜１００ｎＭ最終）および１３２ｐＭの最終濃度を与えるように希釈された５０ｌの１２５Ｉ−ＨＲＧ　１（１７７−２４４）を、このプレートに添加した。周囲温度での１．５時間のインキュベーション後、このプレートを洗浄し、そしてレセプターに結合した１２５Ｉ−ＨＲＧの量を、Ｗａｌｌａｃ　１２７７　ＧａｍｍａＭａｓｔｅｒにおいてウェルを計数することによって決定した。
【０２４１】
図７は、Ｍａｂが、用量依存様式で免疫付着因子へのヒレグリン結合を阻害したことを示す。ここで、ＥＤ５０値は、０．７〜１．１ｎＭの範囲であった。これは、Ｍａｂが、高い程度のブロッキング能力を有することを示す。
【０２４２】
（材料の寄託）
以下のハイブリドーマを、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ．２０１１０−２２０９，ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した。
【０２４３】
【表４】
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この寄託されたハイブリドーマの各々は、表２において同定される抗ＥｒｂＢ４モノクローナル抗体の１つを産生する。ＨＥＲ４．１０Ｈ１．１Ａ１はｍＡｂ　４−１４６４を産生し、ＨＥＲ４．１Ｃ６．Ａ１１はｍＡｂ　４−１４４０を産生し、ＨＥＲ４．３Ｂ９．２Ｃ９はｍＡｂ　４−１４６０を産生し、ＨＥＲ４．１Ａ６．５Ｂ３はｍＡｂ　４−１４９２を産生し、そしてＨＥＲ４．８Ｂ１．２Ｈ２はｍＡｂ　４−１４７３を産生する。
【０２４４】
ＡＴＣＣでのハイブリドーマの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびそれに基づく規則（ブダペスト条約）の規定のもとでなされた。これは、寄託の日から３０年間にわたり寄託物の生存培養物の維持を保証する。この寄託物は、ブダペスト条約の規約のもとで、ＡＴＣＣにより利用可能となされ、そしてＧｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの間の同意を必要とし、これは関連する米国特許の発行または米国特許出願もしくは外国特許出願のいずれかの公開のいずれか早い方に際して、公へのこの寄託物の培養物の子孫の永続的かつ非制限的な利用可能性を保証し、そして、米国特許法第１２２条およびそれに準ずる長官の定める規定（米国特許法施行規則第１．１４条を含む（８８６　ＯＧ　６３８を特に参照））に従って、それに権利を与えられた米国特許商標局長官により指名されたものに対するこの子孫の利用可能性を保証する。
【０２４５】
本願の譲渡人は、寄託された材料の培養物が、適切な条件下で培養されて死滅するか、または損失するか、または破壊された場合に、通知に基づき、この材料を同一の別のもので速やかに交換することに同意した。寄託材料の利用可能性は、その特許法に従って任意の官庁の権限のもとで付与される権利に反して本発明を実施するための認可と解釈されるべきではない。
【０２４６】
前述に記載した明細書は、当業者が本発明を実施するのを可能にするに十分であると考えられる。本発明は、寄託された構築物により範囲を限定されるべきではない。なぜなら、寄託された実施形態は、本発明の特定の局面の一つの例示として意図され、そして機能的に等価な任意の構築物が本発明の範囲内である。本明細書中の材料の寄託は、本明細書中に含まれる書面による記載が、本発明の最良の態様を含む本発明の任意の局面の実施を可能にするに不十分であるという承認を構成するのではなく、また、特許請求の範囲を、それが表す特定の例示に限定するとして解釈されるべきでもない。実際に、本明細書中に示されそして記載されたものに加えて本発明の種々の改変物が、前述の記載から当業者に明らかであり、そして添付の特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、ヒトＥｒｂＢ４のヌクレオチド配列（配列番号１）を示す。
【図２】
図２は、ヒトＥｒｂＢ４の推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【図３】
図３は、ＥｒｂＢ４−ＩｇＧ免疫付着因子のヌクレオチド配列（配列番号３）を示す。
【図４】
図４は、図２に示されるＥｒｂＢ４アミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸２６〜６４０（配列番号４）を含むＥｒｂＢ４細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のアミノ酸配列を示す。
【図５】
図５は、ヒト大動脈平滑筋細胞のＰＤＧＦ刺激増殖に対する、ＥｒｂＢ４−ＩｇＧ免疫付着因子の効果を示す。
【図６】
図６は、ヒト大動脈平滑筋細胞のトロンビンに対する走化性応答に対する、ＥｒｂＢ４−ＩｇＧ免疫付着因子の効果を示す。
【図７】
図７は、抗ＨＥＲ４モノクローナル抗体による、ＨＥＲ４免疫付着因子へのヒレグリン結合の阻害を示す。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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