(57)【要約】本発明は有効量の薬剤を被験者に投与する段階を含む、被験者における状態を治療する方法であって、その薬剤がレチノイドシグナル伝達経路の1つまたは複数の成分を調整する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の薬剤を被験者へ投与する段階を含む、被験者の状態を治療する方法であって、該薬剤がレチノイドシグナル伝達経路の1つまたは複数の成分を調整する方法。
【請求項２】
状態が、運動ニューロン疾患、脳痴呆疾患、または変性運動疾患のような神経性の状態である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
レチノイドシグナル伝達経路の成分が、アルデヒドデヒドロゲナーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
アルデヒドデヒドロゲナーゼが、レチナールデヒドデヒドロゲナーゼ2(RALDH-2)である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
レチノイドシグナル伝達経路の成分が、レチノイド受容体である、請求項1または2記載の方法。
【請求項６】
レチノイド受容体が、レチノイン酸受容体αである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
有効量の薬剤を被験者へ投与する段階を含む、被験者の状態を治療する方法であって、該薬剤がレチノイドシグナル伝達経路の1つまたは複数の成分の発現を調整する方法。
【請求項８】
状態が、運動ニューロン疾患、脳痴呆疾患、または変性運動疾患のような神経性の状態である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
成分が、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である、請求項7または8記載の方法。
【請求項１０】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子が、レチナールデヒドデヒドロゲナーゼ2(raldh-2)である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
薬剤がraldh-2を含む、請求項1から10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
成分がレチノイド受容体をコードする遺伝子である、請求項7記載の方法。
【請求項１３】
レチノイド受容体遺伝子がレチノイン酸受容体αをコードする、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
薬剤がレチノイド受容体遺伝子を含む、請求項1〜10、12、または13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
成分がレチノイン酸応答遺伝子をコードする遺伝子である、請求項7記載の方法。
【請求項１６】
レチノイン酸応答遺伝子がIslet-1をコードする、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
薬剤がレチノイン酸応答遺伝子を含む、請求項1〜10、12、13、15、または16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
RALDH-2ポリペプチド、もしくはその断片、変種、もしくは誘導体、またはそれらをコードするポリヌクレオチド、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
神経性の状態を治療するための医薬品の生産における、RALDH-2ポリペプチド、もしくはその断片、変種、もしくは誘導体、またはそれらをコードするポリヌクレオチドの使用。
【請求項２０】
レチノイド受容体遺伝子、またはその断片、変種、もしくは誘導体を含む遺伝子療法ベクター。
【請求項２１】
レチノイド受容体遺伝子がレチノイン酸受容体αをコードする、請求項20記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項２２】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、またはその断片、変種、もしくは誘導体を含む、遺伝子療法ベクター。
【請求項２３】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子がRALDH-2をコードする、請求項22記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項２４】
レチノイン酸応答遺伝子、またはその断片、変種、もしくは誘導体を含む、遺伝子療法ベクター。
【請求項２５】
レチノイン酸応答遺伝子がIslet-1をコードする、請求項24記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項２６】
マウスまたはヒトのraldh-2遺伝子またはその断片、変種、もしくは誘導体を含む、遺伝子療法ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、被験者においてレチノイドシグナル伝達経路の1つまたは複数の化合物を調整することによって、被験者の状態を治療するための方法に関する。本発明はさらに、その方法に使用する核酸を含むベクターにも関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ビタミンA(レチノールまたは全トランスレチノール)およびプロビタミンA(βカロテン)は、代謝されてレチノイド誘導体になり、これらは視覚における光の吸収、または成長および発生のための遺伝子調節において機能する(Duester 2000)。
【０００３】
視覚に必要な代謝物は11-シス-レチナールで、これは網膜において光を吸収する色素として機能する(Wald、1951)。代謝物である全トランスレチノイン酸および9-シス-レチノイン酸は、遺伝子発現を直接に調節する核のレチノイド受容体のためのリガンドとして作用する。レチノイド受容体には2つのクラスがあり、レチノイン酸受容体(RAR)およびレチノイドX受容体(RXR)である(Kastnerら1994; NagpalおよびChandraratna 1998)。RARは全トランスレチノイン酸および9-シス-レチノイン酸によって活性化されるが、RXRは9-シス-レチノイン酸のみによって活性化される(Kastnerら1994; Kliewerら、1994)。
【０００４】
レチノイン酸は胎児のニューロンの誕生・生存および機能に重要であることが示されている(WuarinおよびSidell、1994; QuinnおよびDeBoni、1991)。さらに、様々な種類の胎児ニューロンに関する研究で、レチノイン酸は胎児ニューロンの数と長さの両方を刺激し得ることが示されている(Maden、1998; CorcoranおよびMaden、1999; Corcoranら、2000)。CNSの発生におけるRAの必要性は、広く研究されているが(Maden、2001総説)、成体のCNSにおけるレチノイドシグナル伝達の性質に関しては、ほとんど何も知られていない。
【０００５】
筋萎縮性側索硬化症(ALS)は進行性の致死性の神経変性疾患で、運動皮質、脳幹、および脊髄における運動ニューロンの損失により特徴づけられ、これによって衰弱と萎縮が起こる(DeliseおよびCarpenter、1984; Mulderら、1986)。ALSは散発性(全症例の90％の場合)および家族性(全症例の10％)のいずれでも起こる(JacksonおよびBryan、1998)。家族性ALSの20％では、銅亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ遺伝子(SOD1)に変異が見つかっている(Rosen、1993; Dengら、1993)。散発性の症例および残りの家族性の症例の80％に関与している遺伝子は、まだ同定されていない。現在のところ、この疾病を予防したり経過を逆行させる治療法はない。現在の治療法(リルゾールおよび抗酸化剤など)は、せいぜい生存をやや延長するにすぎない。
【０００６】
パーキンソン病は、運動、筋肉のコントロール、およびバランスに影響を与える、緩やかに進行する疾患である。パーキンソン病は致死性ではないが、寿命を低下させる。また生活の質を大きく低下させ、10〜20年で重度の不能状態になる場合がある。発症の平均年齢は55歳であるが、パーキンソン病の症例の約10％は40歳未満である。パーキンソン病は脳幹の一部、特に黒質と呼ばれる三日月型の細胞の塊で細胞が破壊されると起きる。黒質の神経細胞は、線条体に線維を送る。これらの細胞は必須の神経伝達物質であるドーパミンを放出する。線条体でドーパミンが減少することが、パーキンソン病の主な異常である。この減少により、運動および協調をコントロールする神経および筋肉が悪影響を受け、パーキンソン病に特徴的な主な症状が現れる。パーキンソン病の原因における、タンパク質αシヌクレイン、酵素複合体I、NMDA受容体、免疫因子、環境因子(毒素、感染、産業用化学物質など)、およびフリーラジカルの役割についても、現在、研究が行われている。遺伝子Parkinは、小児および青年期に発症するパーキンソン病の稀な型の原因である。
【０００７】
パーキンソン病の現在の薬物治療は、レボドーパ、抗コリン薬、アマンタジン、セレジリン、ドーパミン拮抗薬、カテコール-o-メチルトランスフェラーゼ阻害薬である。これらの治療法は、症状を軽減し、疾病の進行を遅らせるのにも有効である。しかし、時間が経つとこれらの薬剤の多くの副作用(ジスキネジアのような神経性、および精神障害)が疾患自体と同じほど苦痛になり、また薬剤の効果も最終的には失われる可能性がある。開発中の薬剤には、グルタミン酸の作用を阻害するもの(レマセミド、デキストロメトロファン、リルゾール、およびラモトリジンなど)、およびニコチン性アセチルコリン受容体拮抗薬がある。
【０００８】
アルツハイマー病は脳の緩やかな変性疾患であり、回復することはない。この疾患は皮質の全ての部分の神経細胞を攻撃し、それにより患者が感情を支配し、間違いおよびパターンを認識し、運動を協調し、記憶する能力を損なう。最終的には、患者は全ての記憶および精神的機能を失う。神経原線維濃縮体におけるタウタンパク質、βアミロイドタンパク質、アミロイド前駆体タンパク質、小胞体関連結合タンパク質ERAB、AMY117斑、前立腺アポトーシス応答-4(PAR-4)、神経伝達物質(アセチルコリン、セロトニン、およびノルエピネフリンなど)、炎症反応および環境因子(感染、金属、磁場、脳傷害、小児栄養不良、ビタミン欠損)のような、アルツハイマー病において役割を果たす因子に関する研究が行われている。遺伝的要素も、アルツハイマー病の発症に関与している。遅発型(65歳以上で発症)アルツハイマー病の研究では、アポリポプロテインE(ApoE)の遺伝子が注目されている。遅発型アルツハイマー病の他の遺伝因子には、βアミロイド前駆タンパク質、ユビキチンBをコードする遺伝子における変異が含まれている。プレセニリン-1およびプレセニリン-2における変異が、早発性(65歳未満で発症)アルツハイマー病の大部分の症例を説明することが研究で示された。
【０００９】
アルツハイマー病の治療のために、現在使用されているか開発中の薬剤の大部分は、進行を遅らせることを目的としている。治癒はない。薬には、コリン作動性の神経保護薬(タクリンおよびドネペジル)、抗炎症薬(非ステロイド抗炎症薬、コルチコステロイド、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、サリドマイド、およびテニダップ)、エストロゲン、抗酸化剤(ビタミンE、セレジリン、およびイチョウなど)、ニコチン、プロペントフィリン、ヒデルギン、パクリタキセル、およびCX516が含まれる。
【００１０】
本発明は先行技術に伴う問題を克服しようとするものである。
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明は、レチノイドシグナル伝達経路の欠損が神経疾患の根底にあるという、驚くべき所見に基づいている。
【００１２】
本発明の第1の局面では、被験者に有効量の薬剤を投与することを含む、被験者における状態を治療するための方法が提供され、この薬剤はレチノイドシグナル伝達経路の1つまたは複数の成分を調整するものである。
【００１３】
好ましくは、状態は運動ニューロン疾患、脳痴呆疾患、変性運動疾患、または中枢および/もしくは末梢神経系の任意の疾患である。
【００１４】
本明細書では、運動ニューロン疾患という用語は、筋萎縮性側索硬化症および他の同様な疾患を含む。脳痴呆疾患という用語は、アルツハイマー病および/または前頭側頭型痴呆および他の同様な疾患を含む。変性運動疾患という用語は、パーキンソン病、ハンチントン病、運動失調症、および他の同様な疾患を含む。
【００１５】
本明細書で使用される「被験者」という用語は、動物に関する。好ましくは動物は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００１６】
本明細書で使用される「薬剤」という用語は、ポリペプチドまたは他の高分子のような、1つまたは複数の分子である可能性がある。薬剤という用語は、例えば、レトロウイルスベクターもしくはウイルスベクターのようなベクター、または同様な物質でもあり得る。
【００１７】
本明細書で使用される「調整する」という用語は、レチノイドシグナル伝達経路の成分を、刺激する、上方制御する、下方制御する、阻害する、修飾する、変化させる、またはその他の方法で影響を与えることを意味する可能性がある。
【００１８】
本明細書で使用される「レチノイドシグナル伝達経路」という用語は、レチノイドシグナル伝達に関与する、シグナル伝達分子またはメッセンジャー分子、ポリペプチド、またはその断片を指す。この経路の成分は、全体の経路のサブセットであり、単一の分子種でさえありうる。そのような成分の例には、ビタミンA(レチノール)、プロビタミンA(βカロテン)、ビタミンAおよび/またはプロビタミンAもしくはその代謝物(例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、短鎖デヒドロゲナーゼ/リダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ)の代謝の触媒に関与する、1つもしくは複数の酵素、ビタミンAおよび/もしくはプロビタミンの代謝物(例えば、全トランスレチナール、もしくは9-シスレチナール)、レチノイドデヒドロゲナーゼの補助因子(例えばNADもしくはNADPH)、レチノイド受容体(例えば、レチノイン酸受容体α、もしくはレチノイドX受容体α)、レチノイン酸応答遺伝子(例えば、Islet-1、レチノイン酸受容体α2、レチノイン酸受容体β2、もしくはストロメライシン-1)もしくはレチノイン酸受容体の補助因子(例えば、受容体相互作用タンパク質140もしくは核受容体コリプレッサー)、またはレチノイドシグナル伝達に関与する任意の他の物質が含まれ得る。
【００１９】
本発明の1つの局面では、レチノイドシグナル伝達経路の成分は、アルデヒドデヒドロゲナーゼである。好ましくはアルデヒドデヒドロゲナーゼはレチナールデヒドデヒドロゲナーゼ2(RALDH-2)である。
【００２０】
本発明の別の局面では、レチノイドシグナル伝達経路の成分は、レチノイド受容体である。好ましくはレチノイド受容体はレチノイン酸受容体αである。
【００２１】
または、本発明の別の局面では、レチノイド経路の成分は、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびレチノイド受容体の両方である。
【００２２】
別の局面では、本発明は被験者に有効量の薬剤を投与することを含む、被験者における状態の治療方法を提供し、ここでこの薬剤はレチノイドシグナル伝達経路の1つまたは複数の成分の発現を調整する。
【００２３】
好ましくは、状態は上述および以下に詳細に記載される、神経性の状態である。
【００２４】
好ましくはレチノイドシグナル伝達経路の成分は、アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子である。好ましくはこのアルデヒドデヒドロゲナーゼは、レチナールデヒドデヒドロゲナーゼ2(raldh-2)である。
【００２５】
好ましくは薬剤はraldh-2を含む。
【００２６】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、その本来の意味を持ち、遺伝子全体、またはその断片、変種、もしくは誘導体を指す可能性がある。本発明で使用できる断片、変種、または誘導体は、ORF全体またはORFの一部を含む。
【００２７】
別の局面では、レチノイドシグナル伝達経路の成分は、レチノイド受容体をコードする遺伝子である。好ましくはレチノイド受容体遺伝子は、レチノイン酸受容体αをコードする。この局面では、薬剤は好ましくはレチノイド受容体遺伝子を含む。
【００２８】
別の局面では、レチノイドシグナル伝達経路の成分は、レチノイン酸応答遺伝子をコードする遺伝子である。好ましくは、レチノイン酸応答遺伝子は、Islet-1をコードする。この局面では、薬剤は好ましくはレチノイン酸応答遺伝子を含む。
【００２９】
別の局面では、本発明はRALDH-2ポリペプチドもしくはその断片、変種、もしくは誘導体、またはこれらをコードするポリヌクレオチド、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む、薬学的組成物を提供する。
【００３０】
別の局面では、本発明はRALDH-2ポリペプチドもしくはその断片、変種もしくは誘導体、またはこれらをコードするポリヌクレオチドの、神経性の状態の治療のための医薬品の製造における使用を提供する。
【００３１】
別の局面では、本発明はレチノイド受容体遺伝子またはその断片、変種、もしくは誘導体を含む、遺伝子療法ベクターを提供する。好ましくは、レチノイド受容体遺伝子はレチノイン酸受容体αをコードする。
【００３２】
遺伝子療法ベクターは、関心対象の遺伝子構築物を含む、レトロウイルスに基づくまたはウイルスに基づく粒子のような、任意の適当な送達手段を含み得る。これは以下にさらに詳しく説明される。
【００３３】
別の局面では、本発明はアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子またはその断片、変種、もしくは誘導体を含む遺伝子療法ベクターを提供する。好ましくは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子はraldh-2をコードする。
【００３４】
別の局面では、本発明はレチノイン酸応答遺伝子またはその断片、変種、もしくは誘導体を含む遺伝子療法ベクターを提供する。好ましくは、レチノイン酸応答遺伝子はIslet-1をコードする。
【００３５】
別の局面では、本発明はマウスまたはヒトのraldh-2遺伝子もしくはその断片、変種、もしくは誘導体を含む、遺伝子療法ベクターを提供する。
【００３６】
発明の詳細な説明
本明細書に記述されるアミノ酸配列およびヌクレオチド配列全体に加え、本発明はその任意の1つまたは複数の断片、変種、または誘導体の使用も含む。
【００３７】
ポリペプチドまたは核酸の断片は、理論的には、その親分子の1つの特性を保持しているかぎり、ほぼ任意のサイズでありうる。断片は親分子の切断型である可能性があり、例えば、N末端/5'端で切断されているか、またはC末端もしくは3'端で切断されているか、または両方の末端で切断されている可能性がある。断片はショットガンまたは超音波技術でも生産でき、これらにより一般的に、親分子の1つまたは両方の末端から切断された分子が生産されると予測される。好ましくは、断片は少なくとも3アミノ酸または9ヌクレオチドの長さを持つ。
【００３８】
誘導体は基準/親分子に基づくか、またはこれに由来する。誘導体は、親分子と比較して内部が欠失または切断されている分子であり得る。分子の誘導体は、その変異体も含み、これらはアミノ酸またはヌクレオチドの欠失、付加、または置換を含み得るが、この分子の少なくとも1つの特徴を保持している必要がある。この特徴は、親/基準分子の機能的または構造的特徴でありうる。親/基準分子の誘導体が保持する好ましい特徴は、相同性(すなわち、配列の同一性)である。したがって、保守的なアミノ酸またはヌクレオチド置換は、分子の性質を変えることなく、実質的に行なうことができ、N末端もしくはC末端、または核酸の対応する5'端もしくは3'端からの切断も可能である。さらに本発明に含まれる分子の断片も、欠失または置換させることができる。
【００３９】
置換は、以下を含む非天然アミノ酸によって行われる場合がある：α＊およびα-二置換＊アミノ酸、N-アルキルアミノ酸＊、乳酸＊、トリフロロチロシン＊、p-Cl-フェニルアラニン＊、p-Br-フェニルアラニン＊、p-I-フェニルアラニン＊のような天然アミノ酸のハロゲン化誘導体、L-アリル-グリシン＊、βアラニン、L-αアミノ酪酸＊、L-γアミノ酪酸＊、L-αアミノイソ酪酸＊、L-εアミノカプロン酸#、7-アミノヘプタン酸＊、L-メチオニンスルホン#＊、L-ノルロイシン＊、L-ノルバリン＊、p-ニトロ-L-フェニルアラニン＊、L-ヒドロキシプロリン#、L-チオプロリン＊、4-メチル-Phe＊、ペンタメチル-Phe＊のようなフェニルアラニン(Phe)のメチル誘導体、L-Phe(4-アミノ)#、Ｌ-Tyr(メチル)＊、L-Phe(4-イソプロピル)＊、L-Tic(1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボキシル酸)＊、L-ジアミノプロピオン酸#、およびL-Phe(4-ベンジル)＊。＊印は上記の説明(相同または非相同置換に関する)のために使用しており、誘導体の疎水性の性質を示すが、#は誘導体の親水性の性質を示すために使用しており、#＊は両親媒性の特性を示す。
【００４０】
変異型アミノ酸配列には、配列の任意の2つのアミノ酸残基の間に挿入できる適当なスペーサー基が含まれ、これには、グリシンまたはβアラニン残基のようなアミノ酸スペーサーに加えて、メチル、エチル、またはプロピル基のようなアルキル基が含まれる。別の変異型は、ペプトイド型の1つまたは複数のアミノ酸残基を含み、当業者には十分理解できるだろう。疑問を避けるために説明すると、「ペプトイド型」は、α炭素置換基が、α炭素ではなく残基の窒素原子上にある、変異型アミノ酸残基を指すために使用される。ペプトイド型のペプチドを調製する過程は、当技術分野で周知であり、例えば、Simon RJら、PNAS(1992) 89(20)、9367-9371およびHorwell DC、Trends Biotechnol.(1995) 13(4)、132-134がある。
【００４１】
「変種」という用語は、1つもしくは複数のアイソフォーム、もしくはドメインを組み替えた酵素、またはそれをコードする核酸も含む。より小さな分子に関しては、変種という用語は、親/基準分子の類似体、保護されたまたは脱保護された型、中間体、および/または塩を含むと理解される。
【００４２】
本発明で使用されるヌクレオチド配列は、合成または修飾ヌクレオチドを含みうる。当技術分野では、いくつかの異なる種類のオリゴヌクレオチドの修飾が知られている。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオネート骨格、ならびに/または分子の3'および/または5'端のアクリジンまたはポリリジン鎖の付加も含む。本発明の目的のためには、本明細書に記述されるヌクレオチド配列は、当技術分野で利用できる任意の方法によって改変できると理解される(例えば、「PCRプロトコール、方法と適用のガイド(PCR Protocols, A guide to methods and applications)」M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, T.J. White(編)、Academic Press、New York、1990参照)。
【００４３】
レチノイドシグナル伝達経路の断片、変種、変異体、および他の誘導体、またはそれらをコードする核酸は、好ましくはその分子と実質的な相同性を持つ。本明細書で使用される「相同性」という用語は、2つの物質が、当業者がその起源および/または機能が類似していると決定するのに十分な特性を共有していることを意味する。好ましくは、相同性は配列の同一性を指す。したがって、分子の誘導体は好ましくはその分子の配列と、実質的な配列の同一性を持つ。
【００４４】
相同性が配列の同一性を示すときの「実質的な相同性」は、75％を超える配列の同一性、最も好ましくは90％以上の配列の同一性を意味する。相同性の比較は、目で見て行うことができ、より一般的には、当技術分野で周知であり、Ausubelら、「Short Protocols in Molecular Biology」(1999)第4版、John Wiley & Sons, Inc.に記述されるBLAST比較技術を含む、容易に入手できる配列比較プログラムを用いて行える。これらの市販のコンピュータプログラムは、2つまたはそれ以上の配列間の相同性％を計算できる。
【００４５】
レチノイドシグナル伝達経路
本発明では、レチノイドシグナル伝達経路の成分は、以下に記述される任意の1つまたは複数の分子でありうる。
【００４６】
活性レチノイド型の代謝に寄与する3つの主要な酵素ファミリーが存在する(Duester、2000)。アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)はレチノールおよびレチナールの可逆的酸化/還元を触媒する。既知のアルコールデヒドロゲナーゼは、カッコ内に示す好ましい補助因子を伴い、ADH1(NAD)、ADH2(NAD)、ADH4(NAD)、ADH7(NAD)およびADH8(NADPH)を含む。短鎖デヒドロゲナーゼ/リダクターゼ(SDR)は、レチノールとレチナールの可逆的な酸化/還元を触媒する。既知の短鎖デヒドロゲナーゼ/リダクターゼは、適用可能な場合はカッコ内に示す好ましい補助因子を伴い、RoDH1(NADP)、RoDH2(NADPH)、RoDH3、RoDH4(NAD)、CRAD1(NAD)、CRAD2(NAD)、RDH5(NAD)およびretSDR1(NADPH)を含む。アルデヒドデヒドロゲナーゼは、主にレチナールのレチノイン酸への酸化を触媒する。既知のアルデヒドデヒドロゲナーゼは、カッコ内に示す好ましい補助因子を伴い、ALDH1(NAD)、ALDH6(NAD)、RALDH2(NAD)およびALDH-t(NAD)を含む。
【００４７】
RARおよびRXRは、プロモーター中に存在するレチノイン酸応答エレメントへ結合することによって遺伝子発現の上方制御するか、または他の転写因子のエンハンサー活性と拮抗することによって遺伝子発現の下方制御することのいずれかによって、遺伝子発現を調節するリガンド依存性転写因子である(NagpalおよびChandraratna、1998)。RARには3つのサブタイプ(α、β、およびγ)があり、別々の遺伝子にコードされている。それに加えて、各サブタイプには、異なるスプライシングおよび異なるプロモーターの使用による、複数のアイソフォームがある。RARαは2つの主なアイソフォーム(α1およびα2)、RARβは4つの主なアイソフォーム(β1、β2、β3、およびβ4)、RARγは2つの主なアイソフォーム(γ1およびγ2)を持つ。RXRには3つのサブタイプ(α、β、およびγ)があり、異なる遺伝子にコードされている。RXRは単一の遺伝子から種々のアイソフォームを生産すると考えられている。
【００４８】
RARおよびRXRは転写活性のあるRAR-RXRヘテロダイマーとして(Nagpalら、1992)またはRXRホモダイマーとして(Lehmannら、1992)、またはオーファン受容体を持つRXRヘテロダイマーとして(MangelsdorfおよびEvans、1995)、レチノイド応答遺伝子のプロモーター領域に結合することによって、遺伝子発現を上方制御する。レチノイド応答遺伝子のレチノイン酸応答エレメント(RARE)は、2つ(DR2)または5つ(DR5)の塩基対の直接の反復によって分けられた配列(コンセンサス)5'-RGKTCA-3'(RはGまたはA、KはGまたはT)の直接の反復を含む(Rossら、2000; Kastnerら、1995; NagpalおよびChandraratna、1998)。RXR応答エレメントは、1つ(DR1)の塩基対によって分けられた同一配列の直接の反復である(Kastnerら、1995; NagpalおよびChandraratna、1998)。RAREを含む遺伝子には、RARβ、RARα、RARγ、CRABPII、CRBPIおよびCRBPIIが含まれる。RXREを含む遺伝子には、CRABPII、CRBPII、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ、アシルCoAオキシダーゼ(ACO)、MHC I、Apo A1およびエノイル-CoAヒドラターゼ/3-ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼが含まれる。
【００４９】
レチノイドが誘導する遺伝子には、RAR受容体遺伝子(例えば、RARα2、RARβ2、およびRARγ2)、レチノイン酸の異化に関与するタンパク質をコードする遺伝子(例えば、細胞レチノイン酸結合タンパク質II、細胞レチノール結合タンパク質I、および細胞レチノール結合タンパク質II)、およびレチノイン酸合成に関与する遺伝子(例えば、ADH3)が含まれる。レチノイドが抑制する遺伝子には、細胞増殖に関与する遺伝子(例えば、Fos、myc、トランスフォーミング増殖因子β1、および上皮成長因子受容体)、異常な分化に関与する遺伝子(例えば、皮膚由来抗ロイコプロテイナーゼおよびトランスグルタミナーゼ)、ならびに炎症に関与する遺伝子(例えば、ストロメライシン-1、IL-2およびTNF-α)に関与する遺伝子が含まれる。
【００５０】
これらの受容体の転写活性を調整するレチノイン酸受容体の補助因子が存在することが、示唆されている。これらには、受容体相互作用タンパク質140(RIP140)および甲状腺受容体相互作用タンパク質1(TRIP1)のようなコアクチベーター、ならびに核受容体コリプレッサー(N-CoR)のようなコリプレッサー、ならびにレチノイドおよび甲状腺ホルモン受容体のサイレンシングメディエーター(SMRT)が含まれる(NagpalおよびChandraratna、1998)。これらも本明細書で定義されるレチノイドシグナル伝達経路の成分と考えられる。
【００５１】
神経疾患
神経性の状態、神経疾患、および神経障害という用語は、本明細書では同義または互換的に用いられ、運動ニューロン疾患、脳痴呆疾患、変性運動疾患、または中枢および/または末梢神経系の任意の疾患を指す。本発明の方法は神経性の状態の治療に有用である可能性があり、以下にその例が記述されている。
【００５２】
筋萎縮性側索硬化症および他の同様な疾患のような運動ニューロン疾患。アルツハイマー病および/または前頭側頭型痴呆および他の同様な疾患のような脳痴呆疾患。パーキンソン病、ハンチントン病、運動失調症、および他の同様な疾患のような変性運動疾患。
【００５３】
ベクターの構築
一般に、本発明に係る導入遺伝子は、RNAに転写され、選択的に翻訳されてポリペプチドを生産する発現されたヌクレオチド配列、およびベクターを含む。
【００５４】
ベクターは1つの環境から別の環境に物質を運搬することを可能にする、またはこれを容易にする道具である。例えば、組換えDNA技術で使用されるいくつかのベクターは、DNAセグメント(異種cDNAセグメントのような異種DNAセグメント等)のような物質を、標的細胞に移動させることを可能にする。選択的に、標的細胞中に入ると、ベクターは細胞中で異種DNAを維持するか、DNA複製のユニットとして作用する場合がある。組換えDNA技術で使用されるベクターの例には、プラスミド、染色体、人工染色体、またはウイルスが含まれる。
【００５５】
非ウイルス送達系には、DNAトランスフェクション法が含まれるが、これに限定されない。本明細書では、トランスフェクションには、非ウイルスベクターを用いて遺伝子を標的哺乳類細胞に送達する過程が含まれる。
【００５６】
典型的なトランスフェクション法には、エレクトロポレーション法、DNA遺伝子銃、脂質を介するトランスフェクション、コンパクト化されたDNAを介したトランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクション、陽イオン剤を介する、陽イオン表面両親媒性物質(cationic facial amphiphile；CFA)(Nature Biotechnology 1996 14; 556)、およびその組み合せが含まれる。
【００５７】
本明細書で使用される「プラスミド」は、異種DNAをその発現または複製のために細胞中に導入するために使用される、孤立性の要素を指す。そのような媒体の選択および使用は、当技術分野の範囲内である。多くのプラスミドベクターが利用でき、適当なベクターの選択は、ベクターの使用意図、すなわち、DNA増幅のためかDNA発現のためか、ベクター中に挿入されるDNAのサイズ、およびベクターで形質転換する宿主細胞に依存する。各ベクターには、それが適合する宿主細胞によって、種々の成分が含まれている。一般に、プラスミドベクターの成分には、以下のうちの1つまたは複数が含まれるがこれらに限定されない：複製開始点、1つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、転写終結配列、ポリアデニル化シグナル、イントロン配列、シグナル配列、ならびに転写および/または翻訳の調節に必要な任意の他の配列。
【００５８】
「プロモーター」という用語は、当技術分野の通常の意味で使用され、例えば、遺伝子発現のジャコブ・モノー説においてRNAポリメラーゼ結合および転写開始を可能にする配列である。
【００５９】
「エンハンサー」という用語は、必ずしも転写開始に直接関与しているとは限らないが、転写を増強する能力のあるDNA配列を指す。プロモーターに対するエンハンサーの位置は融通がきき、エンハンサーは方向に依存せずに作用する。エンハンサーは転写開始複合体と相互作用する可能性のある別の成分に結合し、転写を上方制御する。
【００６０】
プラスミドベクターは、一般に、1つまたは複数の選択された宿主細胞中でベクターを複製できるようにする核酸配列を含む。通常、クローニングベクターでは、この配列はベクターを宿主染色体DNAとは独立して複製できるようにする配列であり、複製開始点、または自律して複製する配列を含む。そのような配列は種々の哺乳類細胞、細菌、酵母、およびウイルスで周知である。プラスミドpBR322の複製開始点は、大部分のグラム陰性細菌に適しており、2μプラスミド複製開始点は酵母に適しており、種々のウイルス複製開始点(例えば、SV 40、ポリオーマ、アデノウイルス)は哺乳類細胞でのクローニングベクターに有用である。一般に、複製開始点の成分は、COS細胞のように、高レベルのDNA複製能を持つ哺乳類細胞中で使用されない限り、哺乳類の発現ベクターには不要である。
【００６１】
大部分の発現ベクターは、シャトルベクターであり、すなわち、少なくとも1つのクラスの生物体中で複製能があるが、発現のために別のクラスの生物体にトランスフェクトできる。例えば、あるベクターを大腸菌中にクローニングし、その後、同じベクターを、それが宿主細胞の染色体で独立して複製する能力がなくても、宿主生物の細胞にトランスフェクトできる。宿主ゲノムに挿入して、DNAを複製することもできる。DNAはPCRで増幅し、複製成分なしで宿主細胞に直接トランスフェクトすることもできる。
【００６２】
都合の良いことに、発現(およびクローニング)ベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含むことがある。この遺伝子は、選択培地中で増殖する形質転換宿主細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードしている。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は、培地中で生存しない。典型的には、選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、またはテトラサイクリンに対する耐性を与え、栄養要求性の欠失を補うか、または自然培地で得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【００６３】
例えば、以下のマーカーは、特にレトロウイルスベクターで首尾よく使用されてきた。それぞれG418およびヒグロマイシンに対する耐性を与える細菌のネオマイシンおよびヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子(Palmerら1987 Proc Natl Acad Sci 84: 1055-1059; Yangら1987 Mol Cell Biol 7:3923-2938)；メトトレキセートに対する耐性を与える変異マウスジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子(dhfr)(Millerら1985 Mol Cell Biol 5:431-437)；ミコフェノール酸、キサンチン、およびアミノプテリンを含む培地中で細胞が増殖できるようにする細菌のgpt遺伝子(Mannら1983 Cell 33:153-159)；ヒスチジンを含まないがヒスチジノールを含む培地中で細胞が増殖できるようにする細菌のhisD遺伝子(DanosおよびMulligan 1988 Proc Natl Acad Sci 85:6460-6464)；種々の薬剤への耐性を与える多剤耐性遺伝子(mdr)(Guildら1988 Proc Natl Acad Sci 85:1595-1599; Pastanら1988 Proc Natl Acad Sci 85:4486-4490)およびピューロマイシンまたはフレオマイシンに対する耐性を与える細菌の遺伝子(MorgenstenおよびLand 1990 Nucleic Acid Res 18:3587-3596)。
【００６４】
これらのマーカーは全て優性の選択マーカーであり、これらの遺伝子を発現する大部分の細胞を化学的に選択できるようにする。βガラクトシダーゼも、優性マーカーと考えられる；βガラクトシダーゼを発現する細胞は、蛍光活性化セルソーター(FACS)を用いて選択できる。実際、任意の細胞表面タンパク質は、すでにそのタンパク質を生産していない細胞のための選択可能マーカーを提供する。タンパク質を発現する細胞は、タンパク質に対する蛍光抗体およびセルソーターを用いて選択できる。ベクターに入れられてきた他の選択可能マーカーには、ヒポキサンチン、アメトプテリン、およびチミジンを含む培地中での細胞の増殖を可能にする、hprtおよびHSVチミジンキナーゼが含まれる。
【００６５】
ベクターの複製は大腸菌中で都合良くできるので、大腸菌の遺伝マーカーおよび大腸菌の複製開始点が含まれると有利である。これらは大腸菌複製開始点およびアンピシリンのような抗生物質に対する耐性を与える大腸菌の遺伝マーカーを含む、pBR322のような大腸菌プラスミド、Bluscriptcベクター、またはpUCプラスミド、例えば、pUC18またはpUC19から得られる。
【００６６】
哺乳類細胞の適当な選択可能マーカーは、ジヒドロ葉酸リダクターゼ(DHFR、メトトレキセート耐性)、チミジンキナーゼ、またはG418またはヒグロマイシンに対する耐性を与える遺伝子のような、導入遺伝子を含むベクターを取り込む能力のある細胞の同定を可能にするものである。哺乳類細胞形質転換体に、マーカーを取り込んで発現している形質転換体のみが、生存するように適応できる選択圧を与える。DHFRまたはグルタミンシンターゼ(GS)マーカーの場合には、圧が徐々に強くなるような条件下で形質転換体を培養し、選択遺伝子および連結した導入遺伝子DNAの両方の増幅(染色体の組込み部位で)を行なうように、選択圧をかけることができる。増幅は、増殖に重要なタンパク質の生産の需要がより大きな遺伝子と、それに強く結合した所望のタンパク質をコードしている可能性のある遺伝子が、組換え細胞の染色体内で縦に反復する過程である。通常、このようにDNAが増幅されると、合成される所望のタンパク質量が増える。
【００６７】
発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物体に認識され、導入遺伝子に機能的に連結したプロモーターを含む。そのようなプロモーターは、誘導性または構成的である可能性がある。プロモーターは、DNA供給源からプロモーターを取り出し、単離されたプロモーター配列をベクターに挿入することによって、導入遺伝子に機能的に連結できる。天然で導入遺伝子に通常結合している天然のプロモーター配列、および多くの異種プロモーターが、導入遺伝子の直接の増幅および/または発現に使用できる。「機能的に結合した」という用語は、記述された成分が、意図された様式で機能できるような関係にある位置のことを指す。コード配列に「機能的に連結した」制御配列は、コード配列の発現が、制御配列に適合する条件下で実行されるように連結している。
【００６８】
哺乳類宿主中のベクターからの導入遺伝子の転写は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、レトロウイルス、およびシミアンウイルス40(SV40)のようなウイルスのゲノムに由来するプロモーター、アクチンプロモーターのような異種哺乳類プロモーターまたは非常に強力なプロモーター、例えば、リボゾームタンパク質プロモーター、およびプロモーターが宿主細胞系に適合していれば導入遺伝子のコード配列に通常結合しているプロモーターにより、制御できる。
【００６９】
高等真核生物による導入遺伝子の転写は、ベクターにエンハンサー配列を挿入することにより増加できる。エンハンサーは比較的、方向および位置に依存しない。哺乳類遺伝子(例えば、エラスターゼおよびグロビン)に由来する多くのエンハンサーが知られている。しかし、通常は真核細胞ウイルスから得られるエンハンサーが用いられる。例えば、複製開始点の後側のSV40エンハンサー(bp 100〜270)、およびCMV初期プロモーターエンハンサーがある。エンハンサーはその5'または3'の位置で導入遺伝子にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5'側に位置する。
【００７０】
都合の良いことに、導入遺伝子をコードしている真核生物の発現ベクターは、遺伝子座制御領域(LCR)を含むことができる。LCRは宿主細胞のクロマチンに組み込まれた導入遺伝子の、組み込み部位に依存しない高レベルの発現を指揮する能力があり、これはベクターの染色体への組込みが起きた場合、遺伝子療法へ適用するために設計されたベクター中、またはトランスジェニック動物において、導入遺伝子が発現されるときに特に重要である。
【００７１】
ベクターは、宿主ゲノムの決められた遺伝子座に性格に組み込まれるように設計し、無作為な組込みの不都合な点を避けることができる。または、人工哺乳類染色体を用いて関心対象の遺伝子を送達し、組込みに関連する問題を避けることもできる。
【００７２】
真核生物の発現ベクターは、転写の終結およびmRNAの安定化に必要な配列も含む。そのような配列は、真核生物またはウイルスのDNAまたはcDNAの5'および3'非翻訳領域から、通常入手できる。これらの領域は、転写後プロセッシングの際にメッセンジャーRNAのポリアデニル化を指揮するヌクレオチドセグメントを含む可能性がある。
【００７３】
発現ベクターには、DNAの発現を行なう能力のある、プロモーター領域のような調節配列に機能的に連結した核酸を、発現する能力のある任意のベクターが含まれる。したがって、発現ベクターは、適当な宿主細胞に導入されると、クローニングされたDNAの発現をもたらすような、組換えDNAまたはRNA構築物を指す。適当な発現ベクターは、当技術分野で周知であり、真核細胞および/または原核細胞中で複製可能なベクター、およびエピソームであり続けるもの、または宿主細胞ゲノムに組み込まれるものが含まれる。例えば、導入遺伝子をコードする核酸は、哺乳類細胞中でcDNAを発現するために適当なベクター、例えば、pEVRF(Matthiasら、(1989) NAR 17、6418)のようなCMVエンハンサーに基づくベクターに挿入できる。
【００７４】
導入遺伝子のプロモーターおよびエンハンサーは、好ましくは、関心対象の遺伝子産物を産生するための条件下にある第1の標的細胞において、強い活性を持つか、強く誘導されることができる。プロモーターおよび/またはエンハンサーは、構成的に効率が良いか、その活性が組織または時間的に制限されてもよい。
【００７５】
他の好ましい成分には、標的導入遺伝子または複数の導入遺伝子の効率良い発現を可能にする物質が含まれる。
【００７６】
そのような成分の発現を調節するための1つの方法は、Yoshidaら(1997 Biochem Biophys Res Comm 230: 426)によってレトロウイルスのgal、polおよびVSV-Gタンパク質の生産について記述されたように、GossenおよびBujard(1992 Proc Natl Acad Sci 89: 5547)によって記述された、テトラサイクリンオン/オフ系を用いる。
【００７７】
本発明に係るベクターの構築は、通常のライゲーション技術を利用する。単離されたプラスミドまたはDNA断片を切断し、調製し、必要なプラスミドを生成するために望ましい形に再度ライゲーションする。必要ならば、構築したプラスミドにおいて正しい配列を確認するための分析を、既知の方法で行なう。発現ベクターの構築、インビトロ転写物の調製、DNAの宿主細胞への導入、ならびに発現および機能の評価のための分析の実行は、当技術分野で周知である。遺伝子の存在、増幅、および/または発現は、適当に標識したプローブを用いて、例えば、通常のサザンブロッティング、mRNAの転写を定量するためのノーザンブロッティング、ドットブロッティング(DNAまたはRNA分析)、またはインサイチューハイブリダイゼーションによって試料中で直接測定できる。
【００７８】
適当な技術は、文献に十分に記載されている。例えば、Sambrookら(1989)、「分子クローニング：実験マニュアル(Molecular Cloning: a laboratory manual)」；HamesおよびGlover(1985-1997) 「DNAクローニング：実用的アプローチ(DNA Cloning: a practical approach)」第I-IV巻(第2版)を参照されたい。免疫グロブリン遺伝子の操作方法は、McCaffertyら(1996)「抗体エンジニアリング：実用的アプローチ(Antibody Engineering: A Practical Approach)」。
【００７９】
当業者は、必要ならばこれらの方法をどのように修飾できるか容易に理解できるだろう。
【００８０】
ウイルスベクター系には、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【００８１】
本発明に係るウイルスベクターは、好ましくはレトロウイルスベクターである。「レトロウイルスベクター」という用語は、通常は、感染能力があるが、それ自身では複製能力のないレトロウイルス核酸を含む。したがって、複製欠損である。レトロウイルスベクターは、通常、標的細胞に送達するための、好ましくは非レトロウイルス起源の1つまたは複数の導入遺伝子を含む。レトロウイルスベクターは、機能的スプライス供与部位(FSDS)および機能的スプライス受容部位(FSAS)も含む可能性があり、したがって、FSDSがFSASの上流にあるときには、任意の介在配列がスプライシングされることができる。レトロウイルスベクターは、さらにU3領域に非レトロウイルス制御配列のような非レトロウイルス配列を含む可能性があり、これはレトロウイルスベクターが標的細胞中にプロウイルスとして組み込まれると、導入遺伝子の発現に影響を与える可能性がある。レトロウイルスベクターの含む要素は単一のレトロウイルスからである必要はない。したがって、本発明に従い、2つまたはそれ以上の異なるレトロウイルスまたは他の供給源から得られる要素を含むことができる。
【００８２】
「レトロウイルスプロベクター」という用語は、通常は上述のレトロウイルスベクターを含むが、機能的スプライス供与部位(FSDS)を生じることのできる第1の核酸配列(NS)、および機能的スプライス受容部位(FSAS)を生じることのできる第2のNSを含み、第1のNSは第2のNSの下流にあるので、第1のNSおよび第2のNSに伴うスプライシングは起きない。レトロウイルスプロベクターが逆転写されると、レトロウイルスベクターが形成される。
【００８３】
「レトロウイルスベクター粒子」という用語は、パッケージングされたレトロウイルスベクターを指し、これは好ましくは標的細胞に結合し入り込む能力を持つ。粒子の成分は、ベクターですでに記述されたように、野生型レトロウイルスを修飾したもので良い。例えば、粒子のタンパク質性コートのEnvタンパク質は、標的への特異性を変えるか、または他の所望の機能を持たせるために、遺伝的に組換えることができる。
【００８４】
本発明のこの局面のレトロウイルスベクターは、MMLV、MSV、またはMMTVのようなマウスオンコレトロウイルスから得られる可能性がある；またはHIV-1またはEIAVのようなレンチウイルスから得られる可能性がある；または別のレトロウイルスから得られる可能性がある。
【００８５】
本発明のレトロウイルスベクターは、レトロウイルスの天然のスプライス供与部位を、非機能的にするために修飾できる。
【００８６】
「修飾」という用語は、天然のスプライス供与のサイレンシングまたは除去を含む。スプライス供与部位を除去された、MLVに基づくベクターのようなベクターは、当技術分野で周知である。そのようなベクターの例はpBABEである(Morgensternら1990同上)。
【００８７】
導入遺伝子の構築
本発明では、導入遺伝子は任意の適当なヌクレオチド配列で良い。例えば、配列はDNAまたはRNAの可能性があり、合成により調製された、または組換えDNA技術を用いて調製された、または天然の供給源から単離された、またはその組み合せであり得る。配列は、センス配列またはアンチセンス配列であり得る。互いに直接もしくは間接的に、またはその組み合せで結合した、複数の配列があり得る。
【００８８】
適当な導入遺伝子コード配列には、レチノイン酸受容体、アルコールデヒドロゲナーゼ、短鎖デヒドロゲナーゼ/リダクターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、レチノイド応答遺伝子、およびそれらの誘導体(例えば結合したレポーター基)を含むがこれらに限定されない、治療および/または診断用の配列が含まれる。そのようなコード配列が含まれるときには、通常は適当なプロモーターに機能的に結合しており、プロモーターはリボザイムの発現を駆動するプロモーターまたは異なるプロモーターである場合がある。
【００８９】
導入遺伝子は融合タンパク質またはコード配列の一部をコードする可能性がある。
【００９０】
本発明に係る1つまたは複数の治療用遺伝子の送達は、単独で使用するか、他の治療法または治療の成分と組み合せて使用できる。
【００９１】
例えば、本発明の方法は、筋萎縮性側索硬化症のような運動ニューロン疾患のような神経疾患、アルツハイマー病および/または前頭側頭型痴呆のような脳痴呆疾患、パーキンソン病、ハンチントン病、および運動失調症のような変性運動疾患、および多発性硬化症、または他の神経性の状態の治療に有用である1つまたは複数の導入遺伝子の送達に使用できる。
【００９２】
細胞の形質転換
本発明で使用する細胞群は、例えば、上述の一般的な文献に記載されているような、細胞への核酸の導入に適した任意の適当な技術によって、形質転換できる。
【００９３】
本発明に係る細胞群は、好ましくは神経細胞を含む。
【００９４】
本発明に係る導入遺伝子を含むベクターは、任意の適当な手段で細胞群に導入できる。
【００９５】
薬学的組成物
本発明は治療に有効量の本発明の薬剤、および薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤(その組み合せを含む)を含む、薬学的組成物も提供する。
【００９６】
薬学的組成物は、医学および獣医学の分野でヒトまたは動物に使用でき、通常は任意の1つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤を含む。治療に使用するために許容される担体または希釈剤は、薬学で周知であり、例えば、「Reminton's Pharmaceutical Sciences」、Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro編、1985)に記述されている。薬学的担体、賦形剤、または希釈剤の選択は、意図する投与経路、および標準的な薬学的慣行にしたがって、行なえる。薬学的組成物は、担体、賦形剤、または希釈剤として、またはこれらに加えて、任意の適当な結合剤、潤滑剤、懸濁剤、被覆剤、可溶化剤を含む場合がある。
【００９７】
薬学的組成物には、保存剤、安定剤、着色料、および香料も含まれ得る。保存剤の例には、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、およびp-ヒドロキシ安息香酸エステルが含まれる。抗酸化剤および懸濁剤も使用される場合がある。
【００９８】
送達系によって、異なる組成物/配合の要件があり得る。例えば、本発明の薬学的組成物は、ミニポンプを用いてまたは経粘膜的に、例えば鼻噴霧、もしくは吸入用エアロゾル、もしくは摂取用溶液、または組成物が送達用の注入可能な形に配合されて非経口的に、例えば静脈内、筋肉内、もしくは皮下に投与されることができる。または、いくつかの経路から投与されるように製剤を設計することもできる。
【００９９】
消化管粘膜から経粘膜的に薬剤が投与される場合は、消化管を通過する際に安定である必要がある；例えば、タンパク質分解に耐性で、酸性pHで安定で、胆汁の界面活性作用に耐性である必要がある。
【０１００】
薬学的組成物は、吸入、座薬もしくは膣座薬、ローション、溶液、クリーム、軟膏もしくは散布剤の形で局所的に、皮膚パッチにより、でんぷんもしくはラクトースのような賦形剤を含む錠剤、単独もしくは賦形剤と混合したカプセルもしくは腔座薬の形で、または香料もしくは着色料を含むエリキシル剤、溶液、もしくは懸濁液の形で、または例えば静脈内、筋肉内、または皮下のような非経口的注射によって投与できる。非経口的投与の場合には、組成物は、例えば溶液を血液と等張にするために十分な塩または単糖のような他の物質を含む、無菌水性溶液の形であるのが最も良い。口腔内または舌下投与の場合は、組成物は通常の方法で配合できる錠剤またはロゼンジの形で投与できる。
【０１０１】
投与
「投与」という用語は、ウイルスまたは非ウイルス技術による送達を含む。ウイルス送達機構には、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス(AAV)ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。非ウイルス送達機構には、脂質を介するトランスフェクション、リポソーム、イムノリポソーム、リポフェクション、陽イオン表面両親媒性物質(CFA)およびその組み合せが含まれる。
【０１０２】
本発明の成分は、単独で投与することもできるが、一般的には、例えば、成分が意図する投与経路および標準的な薬学的慣行にしたがって、適当な薬学的賦形剤、希釈剤、または担体と混合される薬学的組成物として投与される。
【０１０３】
例えば、成分は錠剤、カプセル、腔座薬、エリキシル剤、溶液、または懸濁液の形で投与(例えば、経口または局所的に)でき、速効性、遅効性、変化した、持続性、パルス性、または制御した放出のため、香料または着色料を含む場合がある。
【０１０４】
薬剤が錠剤の場合には、錠剤は、微晶質セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基リン酸カルシウム、およびグリシンのような賦形剤、でんぷん(このましくはコーン、ポテト、またはタピオカのでんぷん)、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロース・ナトリウム、および特定の珪酸錯体(complex silicate)のような錠剤分解物質、ならびにポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ショ糖、ゼラチン、およびアカシアのような顆粒化結合剤を含む場合がある。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベーヘン酸グリセリン、およびタルクのような潤滑剤も含んでよい。
【０１０５】
ゼラチンカプセルの充填剤として、同様なタイプの固体組成物を利用できる。この点で好ましい賦形剤には、ラクトース、でんぷん、セルロース、乳糖、または高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性の懸濁液および/またはエリキシル剤には、種々の甘味料または香料、着色剤または色素、乳化剤および/または懸濁剤、ならびに水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリンのような希釈剤、ならびにその組み合せと混合することができる。
【０１０６】
投与(送達)経路には、経口(例えば、錠剤、カプセル、または摂取用溶液)、局所、粘膜(例えば、鼻噴霧または吸入用エアロゾル)、経鼻、非経口(例えば、注射剤)、消化管、脊髄内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、眼内、皮内、頭蓋内、気管内、膣内、脳室内、脳内、皮下、眼(硝子体内、または前房内(intracameral))、経皮、直腸、口腔、膣、硬膜外、舌下が1つまたは複数含まれるが、これらに限定されない。
【０１０７】
薬剤の全ての成分が同一の経路で投与される必要はないことを理解する必要がある。同様に、組成物が複数の有効成分を含む場合には、これらの成分は異なる経路で投与されても良い。
【０１０８】
本発明の薬剤が非経口的に投与される場合には、そのような投与の例には、静脈内、動脈内、腹腔内、クモ膜下、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内、もしくは皮下への成分の投与、および/または注入技術を用いた投与が1つまたは複数含まれる。
【０１０９】
非経口的投与の場合には、組成物は、例えば溶液を血液と等張にするために十分な塩またはグルコースのような他の物質を含む、無菌水性溶液の形であるのが最も良い。水性溶液は、必要ならば適当に緩衝する(好ましくはpH 3〜9)。無菌条件での適当な非経口製剤の調製は、当技術分野で周知の標準的な薬学的技術を用いて容易に行なえる。
【０１１０】
本発明の成分は、経鼻的または吸入によって投与でき、ドライパウダー吸入器またはエアロゾル噴霧の形で、加圧容器、ポンプ、スプレー、またはネブライザーから、適当な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、例えば1,1,1,2-テトラフルオロエタン(HFA 134A(商標))または1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン(HFA 227EA(商標))のようなヒドロフルオロアルカン、二酸化炭素、または他の適当なガスを用いて、都合良く送達できる。加圧エアロゾルの場合には、計量した量を送達するために、弁を提供することによって、投薬量は決定できる。加圧容器、ポンプ、スプレー、またはネブライザーは、例えばエタノールおよび噴射剤の混合物を溶媒として用い、さらにトリオレイン酸ソルビタンのような潤滑剤を含む、活性化合物の溶液または懸濁液を含む可能性がある。吸入器または散布器で使用するカプセルおよびカートリッジ(例えばゼラチン製)は、ラクトースまたはでんぷんのような適当な粉末ベースと、薬剤との粉末混合物を含むように調合できる。
【０１１１】
または、本発明の成分は、座薬または膣座薬の形で投与でき、ゲル、ヒドロゲル、ローション、溶液、クリーム、軟膏、または散布剤の形で局所的に投与もできる。本発明の成分は、例えば皮膚パッチを用いて、皮膚または経皮的に投与できる。肺または直腸の経路でも投与できる。眼の経路でも投与できる。眼科の使用には、等張でpH調節された無菌的生理食塩水中の微粉化懸濁液、または好ましくは等張でpH調節された無菌生理食塩水中の溶液として、選択的に塩化ベンジルアルコニウムのような保存剤と組み合せて調合できる。または、ワセリンのような軟膏中に配合できる。
【０１１２】
皮膚に局所的に適用する場合には、本発明の成分は、例えば、鉱物油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ろう、および水を、1つまたは複数含む混合物中に懸濁または溶解した有効成分を含む、適当な軟膏として調合できる。または、例えば、鉱物油、ソルビタンモノステアレート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、および水を、1つまたは複数含む混合物中に懸濁または溶解した適当なローションまたはクリームとして調合できる。
【０１１３】
用量レベル
通常、医師が個々の被験者に最も適した実際の用量を決定する。特定の患者のための特定の用量レベルおよび投与回数は様々であり、使用する特定の化合物の活性、代謝安定性、およびその化合物の作用の長さ、年齢、体重、健康状態、性別、食事、投与方法および時間、排出速度、薬剤の組み合せ、特定の状態の重症度、ならびに治療を受ける個体による。
【０１１４】
必要に応じて、化合物は0.01〜30 mg/kg体重、例えば0.1〜10 mg/kg体重、より好ましくは0.1〜1 mg/kg体重で投与できる。
【０１１５】
組成物が局所投与される場合には、典型的な用量は約1〜50 mg/cm2組織である。
【０１１６】
製剤
本発明の成分は、例えば1つまたは複数の適当な担体、希釈剤、または賦形剤と、当技術分野で周知の技術を用いて混合することによって、薬学的組成物へと配合することができる。
【０１１７】
本発明の薬剤は、薬学的に許容される塩として投与できる。通常は、薬学的に許容される塩は、所望の酸または塩基を適切に使用して調製できる。塩は溶液から沈殿し、濾過によって回収するか、または溶媒を蒸発させて回収できる。
【０１１８】
動物試験モデル
神経疾患の治療法または治療薬の設計および/または研究のために、インビボモデルが使用できる。モデルは神経疾患の発生または治療に関与する種々のパラメータに対する様々なツール/リード化合物の効果を探るために使用できる。
【０１１９】
別の態様では、本発明はCHATの生産を上昇させるためのRARαアゴニストの使用に関し、それによりアセチルコリン生産を上昇させる。アセチルコリンはアルツハイマー病で失われる神経伝達物質である。
【０１２０】
別の態様では、本発明はRARαを用いた遺伝子療法を介したコリン作動性ニューロンの修復に関する。
【０１２１】
別の態様では、本発明は成人の脳に移植するための、RARαでトランスフェクトされた幹細胞の使用に関する。
【０１２２】
脳卒中がβアミロイド沈着と関連することが知られている(例えば、Vidalら、Acta Neuropathologica、第100巻、第2000号、pp 1-12：「Senile dementia associated with amyloid beta protein angiopathy and tau perivascular pathology but not neuritic plaques in patients homozygous for the APOE epsilon 4 allele」)。本明細書では、そのような沈着に関与するレチノイドシグナル伝達に関する方法を開示する。したがって、別の態様では、本発明はβアミロイド沈着に関連する脳卒中の治療および/または予防における、RARαアゴニストの使用に関する。
【０１２３】
実施例
本発明は以下に記述される図に関して、実施例を用いて記述される。以下の実施例は説明のためのものであり、本発明の範囲を限定する意図はない。
【０１２４】
実施例1  ビタミンA除去は成体ラットにおいて運動ニューロンの変性を誘導する
本実施例は、食事のレチノイド欠乏により、レチノイン酸受容体α発現が下方制御されることを示し、運動ニューロン変性が存在することを示す。
【０１２５】
離乳したラット(ウィンスター)に正常な食事(対照)または市販のビタミンA除去食(Special Diet Services)を制約なしに与えた。レチノイド欠乏食を6ヶ月与えると、ラットは尾を持ったときの後ろ脚の反応および筋肉の萎縮によって、正常ラットから区別される(図1aおよびb)。これらの表現型は、レチノイド欠乏食を1年与えると、より重篤である(図1c)。
【０１２６】
ラットは4%パラホルムアルデヒド/0.5%グルタルアルデヒドの潅流によって屠殺し、インサイチューハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学用に組織を調製する。肝臓組織のHPLC測定では、ビタミンA除去食のラットでは、6ヶ月後にビタミンAが枯渇し、1年後にはビタミンAがほぼ欠損することを示す。
【０１２７】
インサイチューハイブリダイゼーションおよび免疫組織化学は、Corcoranら(2000)に記述されるように、マウスRARαプローブおよびNF200抗体(Sigmaより購入)を用いて実施する。全脊髄切片上の陽性運動ニューロンの数を計数する。レチノイド欠損ラットでは、腰髄の運動ニューロンは頚髄に存在する運動ニューロン(図2c)よりも空胞性の病変を多く持つ(図2d)。正常ラットでは、調べたいずれの脊髄のレベルでも空胞性の病変は観察されない(図2aおよびb)。NF200について染色した切片は、正常ラットの脊髄の同じ領域と比較して(図2aおよびb)、レチノイド欠損の腰髄および頚髄の運動ニューロンの細胞体に、この神経フィラメントが蓄積していることを示す(図2cおよびd)。レチノイド欠損腰髄には、軸索中の神経フィラメントの蓄積、いくらかの軸索膨張、および軸索の空胞化も見られる(図2d)。正常ラットの腰髄と比較して(図3a)、レチノイド欠損ラットの腰髄では、反応性正常細胞増加症も見られる(図3b)。インサイチューハイブリダイゼーションでは、頚髄と比較して(図4aおよびb)、レチノイド欠損ラットの腰髄では、運動ニューロンにおけるRARαの損失が見られる。
【０１２８】
実施例2  レチノイドシグナル伝達経路の成分は、運動ニューロン疾患患者のニューロンでは混乱している
本実施例は、運動ニューロン疾患の患者の運動ニューロンにおいて、レチノイドシグナル伝達経路の欠陥があることを示す。
【０１２９】
自発性運動ニューロン疾患の症例および年齢を合わせた対照から、死後の腰髄組織を入手する。組織を4% PFAで固定し、ろうに包埋し、10μM切片を切りだす。運動ニューロンの損失量は、運動ニューロンの総数を数えて評価する。患者では、年齢を合わせた対照と比較して、ニューロンの数が少ない。
【０１３０】
インサイチューハイブリダイゼーションは、Cororanら(2000)に記述されるようにして、ラットIslet-1、マウスRARα、およびマウスraldh-2プローブを用いて行なう。各全脊髄切片で、陽性運動ニューロンの数を計数する。
【０１３１】
インサイチューハイブリダイゼーションでは、非罹病患者と比較して罹病患者においてIslet-1運動ニューロンの数が低下しているが、Islet-1を発現する運動ニューロンの割合は、ほぼ同じであることを示す(図5、カラム1および2)。しかし、個々の運動ニューロンにおけるIslet-1の発現レベルは、正常な患者と比較して、運動ニューロン疾患の患者の方が低い(図6aおよびb)。RARα受容体の発現は、年齢を合わせた対照と比較して、運動ニューロン疾患患者では下方制御されている(図6cおよびd)。さらに、RARα受容体発現の欠如は、正常試料と比較して、運動ニューロン疾患患者での方が、より多くの運動ニューロンで見られる(図5、カラム3および4)。非罹病患者では、運動ニューロン疾患患者と比較して(図5、カラム6)、より多くの運動ニューロンが、raldh-2酵素を発現する(図5、カラム5)。罹病患者の残っている運動ニューロンでは、raldh-2の発現も、非罹病患者と比較して下方制御されている(図6eおよびf)。
【０１３２】
実施例3：成体神経系におけるレチノイドシグナル伝達の調整
要約
成体マウスおよびラット脳における、シグナル伝達分子レチノイン酸(RA)およびその変換分子(合成酵素、細胞質結合タンパク質、核受容体)の分布が示される。RARElacZトランスジェニックレポーターマウスを用いて、本発明者らは、海馬、脈絡叢、および小脳のプルキンエ細胞が活性RAシグナル伝達部位であることを発見した。HPLCにより、小脳は高レベルの全トランスRAを含むが、脳の他の部分は含まないことが分かった。小脳を取り囲む髄膜および脈絡叢は酵素RALDH2および結合タンパク質CRBP Iを発現するが、プルキンエ細胞は酵素RALDH3を発現する。プルキンエ細胞は、核受容体RARα、RXRα、RXRβ、およびRXRγも発現するが、RARβもRARγも発現しない。プルキンエ細胞が機能し生存するために、継続的にRAの供給が必要であることを示すために、本発明者らはラットの食事からビタミンAを最高1年間除去した。6ヶ月後には、核受容体の発現およびプルキンエ細胞数が低下した。1年後には、受容体の発現は完全に失われ、少なくとも1匹の実験動物は、よろめき歩行をして運動失調症の症状を示し、プルキンエ細胞の80％が失われていた。これらのデータは、本明細書に記述されるように、プルキンエ細胞の維持にはRAシグナル伝達が必要であることを示す。したがって、このシグナル伝達経路を調整すると、ヒトにおいて運動失調症に対する治療アプローチが提供されることが示された。
【０１３３】
背景
ビタミンAの生物活性のある代謝物であるレチノイン酸(RA)は、胚発生において重要なシグナル伝達物質であることが知られている。RAは、素早く拡散し胚細胞の領域全体に広がり、レチノイン酸受容体(RAR)およびレチノイドX受容体(RXR)として知られるリガンド活性化転写因子に結合することにより、核のレベルで重要な発生遺伝子のスイッチをオンまたはオフにできるため、そのような機能を持つ(1、2)。RARにはα、β、およびγの3つが、RXRにはα、β、およびγの3つがあり、これらはヘテロダイマーを形成し、レチノイン酸応答遺伝子のエンハンサー配列にあるレチノイン酸応答エレメント(RARE)に結合し得る。
【０１３４】
RA自身は、2つのクラスの酵素活性によって、ビタミンA(レチノール)から生産される。まず、レチノール/アルコールデヒドロゲナーゼがレチノールをレチナールデヒドに酸化し、次に、レチナールデヒドデヒドロゲナーゼがレチナールデヒドを全トランスRAおよび9-シスRAに酸化する(3)。全トランスRAは、さらにシトクロームP450の酵素CYP26の作用によって、4-オキソ-RA、4-OH-RAおよび18-OH-RAのような産物に代謝される(4、5)。
【０１３５】
胚におけるRAの役割は、RA自身の分布の決定、これらの酵素および受容体の発現ドメインの解析、RAの供給の上昇または低下、ならびに酵素および受容体の過剰発現またはノックアウトを含む様々な手法によって、研究されてきた。そのような研究によって、CNS(6)、肺(7)、体肢(8、9)、および腎臓(10)の発生においてRAが重要な役割を果たすことが同定された。例えば、CNSの発生では、RAは後脳の発生、神経冠の生存に非常に重要で、神経突起の生長に必要である(11、12)。
【０１３６】
成体では、1920年代に皮膚がレチノイドの欠乏下で大きく変化する部位であると同定されたが(13)、他の組織または器官におけるRAシグナル伝達について、またはそのようなシグナル伝達が起こるかどうかについてさえも、ほとんど知られていなかった。食事にビタミンAが欠乏すると、皮膚のほかにも、視覚、造血、および免疫系および精子形成が損なわれることが知られている。CNSの発生にはレチノイドが重要な役割を果たすにも関わらず、成体のCNSの機能および維持に対するレチノイドの必要性についてはほとんど知られていない。
【０１３７】
本明細書では、齧歯類の成体の脳におけるレチノイドの合成および活性部位、およびRA欠乏の結果が開示される。レチノイド活性の部位の同定のための1つの手法では、RARElacZ導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの使用が開示される。成体脳では、海馬、脈絡叢、および小脳のプルキンエ細胞の少なくとも3つのそのような領域が同定された。
【０１３８】
次に、3つの部分に分けられた脳において、HPLCによってレチノイドが検出されるかどうかが決定される。高レベルの全トランスRAは、小脳でのみ検出される。小脳のどの細胞が全トランスRAを合成および利用するかを探るために、本発明者らは酵素、結合タンパク質、および受容体の分布を調べ、RAのパラクリン/オートクリン機能についての重要な情報が得られた。
【０１３９】
RA欠損におけるこれらの活性部位の結果を開示する。これは、ラットの食事からビタミンAを除去して調べる。この実験の驚くべき結果は、小脳のプルキンエ細胞が消失し、とりわけ運動困難が生じることである。このように、食事にビタミンAが欠乏するか、レチノイドシグナル伝達タンパク質または合成酵素が機能しないと、プルキンエ細胞の機能の損失、不全、または阻害によって引き起こされることが知られている、特定の種類の運動失調症が起きる可能性がある。本発明の局面は、この驚くべき所見に基づいている。
【０１４０】
一般的方法
RARElacZトランスジェニック株の作製および使用は、発生学的研究での使用について、以前に記述されている(20)。本明細書では、成体脳を4%パラホルムアルデヒドで一晩固定し、PBSで洗い、全載または切片として、βガラクトシダーゼ染色した。
【０１４１】
HPLC分析には、200〜500 mgの肺を採取し、1 mlの安定化溶液(PBS中5 mg/mlアスコルビン酸、Na3EDTA、pH 7.3)でホモジナイズすることによって、ThallerおよびEichele(21)の方法にしたがって、レチノイドを組織から抽出する。ホモジネートを、抗酸化剤としてブチルヒドロキシトルエンを含む2倍量の1:8酢酸メチル/酢酸エチルで2回抽出し、窒素下で乾燥させる。抽出物を100μlのメタノールに再懸濁し、高速遠心して粒子状物質を除去し、分析のためにオートサンプラーバイアルに入れる。
【０１４２】
逆相HPLCは、フォトダイオードアレイ検知器および5μC18 LiChrocartカラム(Merck)を用い、同等のプレカラムを用いたBeckman System Gold Hardwareを用いて行なう。使用した移動相はAchkarら(22)のもので、レチノイン酸およびレチノールがよく分離される。流速は1.5 ml/分で、40%〜67%アセトニトリルのアセトニトリル/酢酸アンモニウム(15 mM、pH 6.5)の勾配で35分、その後100%アセトニトリルをさらに25分用いた。個々のレチノイドは、UV吸収スペクトルによって同定される。
【０１４３】
免疫組織化学は、4%パラホルムアルデヒド、2%トリクロロ酢酸、20%イソプロピルアルコールで固定されたろうに包埋された切片上で、CRBP I抗体(23)、CRABP I抗体(24)、RALDH2抗体(25)、およびカルビンジン抗体(Sigma)を用いて行なう。免疫反応性は、Vector Laboratoriesのキットを用いて、アビジン-ビオチン化ペルオキシダーゼ技術で可視化する。
【０１４４】
インサイチューハイブリダイゼーションは、適当なcDNAから合成されたRARおよびRXRプローブを用いて(27、28)、以前に記述されたプロトコール(26)にしたがって、ろうに包埋された切片上で行なう。CYP26プローブは、ニワトリから得る(29)。
【０１４５】
ビタミンA欠乏試験では、離乳した雌のウィスターラットを2群に分ける。1群には正常な食事を与え、他の群には市販のビタミンA除去食(Special Diet Services)を与える。実験開始後6ヶ月および12ヶ月に、対照および欠乏群から動物をとりだし、4％パラホルムアルデヒド、0.5%グルタルアルデヒドを潅流する。脳のろう包埋切片を調製し、上述のように免疫組織化学およびインサイチューハイブリダイゼーションに使用する。
【０１４６】
成体脳におけるレチノイド活性
成体脳のレチノイド活性部位が開示される。そのような部位の驚くべき同定によって、成体脳のこれらの領域に関与している疾患/状態に対する治療法の設計および開発が可能になる。特に本実施例は、脳性運動失調症の標的化に関する。
【０１４７】
RARElacZトランスジェニックマウス株(29)を用いて、成体脳にRA活性の活性部位があるかどうか決定する。lacZ遺伝子のために、RAREが活性化すると、組織は青く染色する。成体マウスの脳の矢状面切片で、3つの部分がRA活性を持つ(図7A)。1つは海馬(図7Aのh、および7Bでは高倍率)。2番目は脈絡叢(図7Aのc)で、図7Aの第4脳室中、および図7Cの側脳室中に高倍率で観察される。3番目は小脳(図7Aのp)で、高倍率ではプルキンエ細胞中であることが分かる(図7D)。
【０１４８】
成体マウスのウにおける内在性レチノイド
成体脳においてレチノイドを測定する試みはほとんど行われておらず、先行技術では、脳の個々の部分におけるレチノイドの測定はなかった。本明細書では、成体脳の異なる領域における数々のレチノイド種の同定および局在を開示する。これらの発見から、本発明は成体脳におけるレチノイドシグナル伝達の調整のためのエフェクターおよび/または標的の候補を提供する。
【０１４９】
上述のRARElacZレポーターの結果が、どのように内在性の生物活性のあるレチノイドと関連しているかを探るために、マウスの脳を3つの部分に分け、それぞれのレチノイドを調べた。3つの部分は、i) 大脳、ii) 脳幹、iii) 小脳である。レチノイドを300〜500 mgの組織から抽出し、逆相クロマトグラフィーで分離する。各実験は6〜10回繰り返す。
【０１５０】
全体として、これらの脳試料のレチノイド含量は、非常に一貫しており、肺、腎臓、肝臓などのような、分析した他の生体組織と比較して、少なくとも2つの独特の特徴を持つ。
【０１５１】
まず、全トランスレチノールのレベルが極度に低い：大脳 ＝ 9.2±2.3 pg/mg組織；脳幹 ＝ 13.5±4.1 pg/mg；小脳 ＝ 38.9±25.5 pg/mg。これは5156 pg/mgである肺と比較すると、約100〜500倍多い(30)。第2に、最初の8分間に溶出される、極性化合物の数が非常に多い(図8A〜C)。
【０１５２】
各試料にも特徴がある。大脳(図8A)の特徴は、
i) 4〜5分(ピーク1)にいくつかの珍しい極性化合物が溶出しており、これは、UV吸収に3つのピークがある点で、14-ヒドロキシ-4,14-レトロ-レチノール(14HRR)およびアンヒドロレチノールと類似しているが、ピーク自体は異なる極大点(319nm、333nm、349nm)を持つ。
ii) 16分(ピーク2)に非常に高レベルの化合物が溶出され、これは2つのピークのUV吸収スペクトル(極大点309nm、323nm)を持つ(図8Aのはめ込み)；全トランスレチノイン酸(ピーク3)が欠如している；UV極大点322(ピーク4)を持つ化合物が存在し、これは4-OH-レチノールの可能性がある(はめ込み、図8B)；非常に低レベルの全トランスレチノール(ピーク5)。脳幹(図8B)は、レトロレチノイドと類似した極性化合物(ピーク1)が存在しないこと以外は、非常に類似している。
【０１５３】
これに対して、小脳試料(図8C)の最も顕著な特徴は、全トランスレチノイン酸(ピーク3)のレベルが非常に高く、2つのピークの化合物(ピーク2)のレベルが低いことである。UVスペクトルによって、ピーク3が全トランスレチノイン酸(はめ込み、図8C)であることが確認され、その平均レベルは531±194 pg/mg組織であると決定される。
【０１５４】
このように、小脳におけるRARElacZ発現(図7D)は、HPLCで観察される高レベルの内在全トランスRAと相関している。
【０１５５】
酵素の発現
RA合成酵素およびRAシグナル伝達機構の成分(結合タンパク質、RAR、およびRXR)の分布が調べられる。本明細書に開示される発現パターンに基づき、本発明はレチノイドシグナル伝達の調整のための標的および/またはエフェクターを提供する。
【０１５６】
成体マウスの小脳におけるRALDH1、RALDH2、RALDH3、およびCYP26の分布を調べる。RALDHはレチナールデヒドから全トランスRAを生成し、CYP26は全トランスRAを4-オキソ-RA、4-OH-RA、18-OH-RAのようなより極性の高い化合物に代謝する。
【０１５７】
RALDH1 mRNAは小脳で発現されず、黒質細胞でのみ発現される。RALDH2タンパク質は小脳自体では発現されないが、小脳および脳の他の部分を取り囲む髄膜(図9A)で発現される。さらに小脳の下の第4脳室および側脳室の両方の脈絡叢中(図9B)、および脳全体の毛細血管の内膜において(図9A、矢印)発現される。
【０１５８】
理論に縛られることは望まないが、RAはこれらの供給源のいずれかから、小脳のニューロンに供給される可能性があるが、脈絡叢と髄膜とが、脳脊髄液(CSF)にRAを供給している可能性が非常に高い。
【０１５９】
RALDH3 mRNAは小脳自体のニューロン細胞中で発現される唯一のRA合成酵素であり、プルキンエ細胞で低レベルで発現する(図9C)。RAを分解する酵素であるCYP26 mRNAは、顆粒層で強く発現し、プルキンエ細胞で弱く発現する(図10C)。
【０１６０】
理論に縛られることは望まないが、RAが分子層または顆粒層のニューロンに必要ならば、髄膜および/または毛細血管から得られる可能性が高い。
【０１６１】
これに対して、プルキンエ細胞はRA合成のためのそれ自身の酵素を発現する。
【０１６２】
レチノイド結合タンパク質の発現
CRBP IおよびCRABP Iはそれぞれレチノールおよびレチノイン酸の代謝および隔離に関与する細胞質タンパク質である。本明細書では、これらのポリペプチドが小脳に存在する程度が開示される。これらの開示から、本発明は成体脳におけるレチノール/レチノイン酸シグナル伝達経路の調整のための標的/エフェクターを提供する。
【０１６３】
発現パターンは、CRBP IおよびCRABP I抗体を用いて解析される。
【０１６４】
CRBP IはRALDH2と同一の場所、すなわち小脳および脳の他の部分を取り囲む髄膜(図9D)、ならびに第4脳室および側脳室の脈絡叢(図9E)で発現される。CRABP Iは脈絡叢の比較的少数の細胞で発現される。
【０１６５】
理論に縛られることは望まないが、CRBP I(レチノールに結合し、レチノールデヒドロゲナーゼによるレチナールへの代謝に関与していると考えられる(31))とRALDH2(レチナールをRAに代謝する)の共存は、髄膜および/または脈絡叢がCSFのためのRAの供給源であると言う概念を強化する。この機構は、髄膜/脈絡叢→レチノール→(CRBP Iの作用)→レチナール→(RALDH2の作用)→レチノイン酸→CSFと要約できる可能性がある。この経路の1つまたは複数の時点で介入すると、本発明に係るCSF中のRAの調整が可能になる。
【０１６６】
RARおよびRXRの発現
脳の種々の領域におけるこれらの核転写因子の発現が開示される。これらの観察で、どの細胞がRAに応答するかの情報が得られる。そのような細胞は、例えば転写活性化によって応答する可能性がある。したがって本発明に従い、RAに対する、転写活性化を含む細胞応答の調整に影響を与えることのできる因子が提供される。
【０１６７】
小脳ではRARおよびRXRの発現が異なる。RARαはプルキンエ細胞および顆粒層で強く発現され(図9F)、脈絡叢で低レベルで発現される。RARβおよびRARγは小脳では発現されない(図9G)。RXRはそれぞれプルキンエ細胞で強く発現され(図9H、I)、顆粒層および脈絡叢で弱く発現される。RXR発現パターンの中での1つの差異は、RXRγはさらに分子層で発現されるが顆粒層では発現しないことである(図9I)。
【０１６８】
これらの発現パターンの要約図を図12に示す。
【０１６９】
理論に縛られることは望まないが、RAがプルキンエ層の細胞で活性で(図7D)、これらがRA合成酵素およびRA代謝酵素を発現し、さらにRA応答遺伝子の活性化のための受容体を強く発現するので、これらは小脳における鍵となるRA依存性細胞であり、したがってレチノイドシグナル伝達の調整の鍵となる標的となる。
【０１７０】
RA欠乏下における小脳の遺伝子発現および生存
本明細書ではレチノイドシグナル伝達の、プルキンエ細胞に対する効果が開示される。本実施例では、レチノイドシグナル伝達はRAの除去によって調整される。
【０１７１】
RAは離乳したラットにビタミンA除去食を1年間与えて除去された。この実験にマウスではなくラットが選ばれたのは、マウスの方がビタミンA結合になりにくいためである。ラットは栄養研究で選択される生物である。
【０１７２】
この実験の対照脳を用いて、本発明者らは成体マウスに関して上記実施例で得られた発現データが、成体ラット小脳のような他の成体哺乳類にも一般化できることを確認した。正常な食事を与えたラットを6ヶ月および1年後にサンプリングして、酵素、結合タンパク質、および受容体の発現を解析し、さらにプルキンエ細胞自体をカルビンジン抗体を用いて調べた。これらの遺伝子の発現は、マウス脳と同じで(RARαに関して図9Fおよび10Aを参照されたい)、発現は1年間にわたり、対照ラットでは変化しない。
【０１７３】
説明のため、2つの遺伝子発現パターンが示されている；プルキンエ細胞および顆粒層におけるRARα(図10A)ならびに顆粒層および弱いがプルキンエ細胞(図10C)におけるCYP26。生後6ヶ月の若い成体ラットおよび生後1年のラットにおけるカルビンジン染色は、プルキンエ細胞および樹状突起の染色パターン(図10E、F)も、計数したときのプルキンエ細胞の数(図11)にも、差を示さなかった。6ヶ月のラットは単位長さあたり平均16.3細胞(図11、カラム1)、1年のラットは単位長さあたり平均18.2細胞(図11、カラム2)持っていた。
【０１７４】
6ヶ月のRA欠乏後、顆粒層およびプルキンエ細胞においてRARαおよびCYP26の強い下方制御が見られる。細胞数は、単位長さあたり11.5細胞へと有意に(p＞0.0001)低下し(図11、カラム3)、樹状突起が減退しているという証拠もある。RAを1年欠乏させると、RARα(図10B)およびCYP26(図10D)の完全な下方制御がある。最も劇的には、この時点でサンプリングされた2匹の動物のうちの1匹では、切片中のプルキンエ細胞が大量に失われており(図10G、H)、細胞数は正常の20％に低下していた(図11、カラム4、単位長さあたり3.2細胞)。残ったプルキンエ細胞は、その全ての樹状突起を失っており、機能的ではないと考えられる(図10H)。このラットは、奇妙なよろめき歩行をする運動失調症の症状を示した。もう1匹の動物は、6ヶ月のRA欠乏動物と同等のプルキンエ細胞数を持ち、RARαおよびCYP26の完全な下方制御を示す。
【０１７５】
考察
RAおよびRAシグナルの伝達に関与する分子機構がどこに見られるかを探るための成体齧歯類の脳を用いた実験を通して、RAを維持のために必要とする神経細胞群が、上記に開示されるように決定される。
【０１７６】
RARElacZトランスジェニックレポーターマウスを用いて、RA活性を示す領域が成体脳に3つ観察される：海馬、脈絡叢、および小脳のプルキンエ細胞である。
【０１７７】
CRBPの役割は、レチノールデヒドロゲナーゼと相互作用し(31)、RALDH2からのRAの合成速度を上昇させることである(33)。髄膜は、これらの同じ2つのタンパク質を発現し(図9；(34))、したがってRAを合成している可能性が高い。成体の脈絡叢で生成する高レベルのRAは、脳脊髄液(CSF)に放出される可能性がある。
【０１７８】
発生時には、神経突起の生長と小脳自身の形態形成に必要なRAを、第4脳室の脈絡叢が生産することが示唆されている(32)。小脳の発生は、ヒト(35)およびラット新生児(Yamamotoら、1999)の両方において、過剰なRAの影響に感受性である。
【０１７９】
HPLCにより、本発明者らは、脳の他の部分ではRAが検出されないのに対して、小脳は高レベルの内在性全トランスRAを含むことを示す。このRAは、部分的には、小脳とともに除去されたはずの脈絡叢および髄膜に由来する可能性があるが、他に小脳でRAの内在性の供給源があるかどうかを決定するために、本発明者らはRAを合成する3つのRALDH酵素、すなわちRALDH1、2、および3、ならびにRAを分解する酵素であるCYP26の発現を調べる。
【０１８０】
RALDH1は、胚および若いマウスで報告されたように(17)、黒質のニューロンにのみ存在する。RALDH2は、上述のように、髄膜および毛細血管の内膜に存在する。前者の場所はCSFのためのRAを生産する可能性があるが、RAは他の栄養分と同様に、毛細血管から小脳のニューロンに提供される可能性もある。理論に縛られることは望まないが、これはRAが傍分泌の様式で小脳に作用すること、すなわち1つのタイプの細胞で生産され、別のタイプの細胞に作用することを示唆する。
【０１８１】
RALDH3発現を調べると、プルキンエ細胞自身がRA合成酵素を発現することが分かり、これはlacZレポーター切片が示すRA活性を担う可能性がある(上述を参照されたい)。さらに、RAを分解する酵素CYP26は、顆粒層で強く発現し、プルキンエ細胞で弱く発現する。別のCYPであるP450RAI-2も、ノーザンブロット分析で成人の小脳に発現されることが示されており(36)、これらの細胞は全トランスRAの分解に活性を持つ可能性がある。驚くべきことに、プルキンエ細胞は、細胞質結合タンパク質CRBP IもCRABP Iも発現していなかった。
【０１８２】
理論に縛られることは望まないが、プルキンエ細胞自身が、それが生産するRAを使う可能性がある。小脳におけるRARおよびRXRの発現が解析され、その発現を要約する模式図が図12に示されている。プルキンエ細胞は1つのRAR、すなわちRARαと、各RXRを発現する。したがって、RALDH3により生産されるRAが、プルキンエ細胞自身の遺伝子発現の維持を行なうために、その核で利用されている可能性がある。
【０１８３】
興味深いことに、RARおよびRXRに関連する別のレポーターである、オーファン受容体RORαも、成体マウス脳のプルキンエ細胞で特異的に発現される(38)。この遺伝子をノックアウトすると、プルキンエ細胞が劇的に減少した小さな小脳、振戦、および異常な身体平衡を示す(39)。これはstaggerer変異(40)と同じ表現型であり、RORαはこの変異マウスで異常である。本明細書に示すように、ラットの食事からビタミンAを除去すると、staggerer変異の表現型模写が得られる。理論に縛られることは望まないが、レチノイドがRORαのリガンドであり、リガンドが存在しないとRORαが活性化せず、プルキンエ細胞の機能が失われ、最終的に分解される可能性がある。したがって、本発明の1つの局面では、RORαがレチノイドシグナル伝達の調整のエフェクター候補の1つである。
【０１８４】
レチノイドシグナル伝達の別のエフェクター/調整物質は、本発明の開示によって同定される。例えば、髄芽腫細胞(41)およびニワトリ胚(42)の両方においてRAで調節されることが既知で、プルキンエ細胞によって発現される1つの遺伝子は、カルビンジンである。この分子は、食事からRAを除去したときの脳への影響を決定するためのマーカーとして使用される(上記を参照されたい)。したがって、カルビンジンは、本発明に係るレチノイドシグナル伝達のエフェクター/調整物質である可能性がある。
【０１８５】
RA除去食を6ヶ月行なった後、実験ラットはプルキンエ細胞および顆粒層におけるRARαおよびCYP26の下方制御、ならびにプルキンエ細胞数の有意な低下を示す。RA除去食を1年与えると、2匹の実験動物の少なくとも1匹は、明らかなよろめきをする運動能力の欠損を示し、プルキンエ細胞の80％が失われ、残りも樹状突起が観察されない。これらの結果は、レチノイドシグナル伝達経路がプルキンエ細胞の維持に継続して必要であり、神経疾患、特に神経変性疾患ではレチノイドシグナル伝達が損なわれることを意味する。したがって、本発明に係るレチノイドシグナル伝達の調整は、本明細書に記述される神経疾患に対抗するために、貴重な治療法となる。
【０１８６】
さらに、理論に縛られることは望まないが、プルキンエ細胞で発現されていることを示したレチノイド経路の分子(RALDH3、RARα、RXRα、RXRβ、RXRγ)の一つの変異が、ヒトの小脳性運動失調症の出現を引き起こしている可能性がある。この遺伝子またはその機能を置換することは、本発明に係る治療法の手段となる。ビタミンA欠乏の食事を6ヶ月摂ると、実験用ラットのRARαおよびCYP26の発現レベルが低下し、プルキンエ細胞数も低下する。ラットの加齢も、脳のRARおよびRXR mRNAの損失に関連しており、これはRAの投与によって逆行できる(43)。脳も、神経細胞の損失、樹状突起棘の減少、およびシナプスの可塑性の点で、特に加齢の影響を受ける。加齢の別の特徴は、栄養状態の損失である。上述のように、食事からのビタミンAの除去のように、レチノイドシグナル伝達を不利に調整することによって、加齢の神経的特徴(RARおよびRXR発現の低下、樹状突起棘の損失、神経細胞の損失)を早期に誘発することができる。したがって、栄養状態の損失、および特にビタミンA状態の損失は、神経の加齢を引き起こしている可能性がある。このように本発明にしたがって、レチノイドの供給を補うことなどにより、レチノイドシグナル伝達の調整をすることによって、加齢プロセスの速度を低下させることができる可能性がある。
【０１８７】
実施例4  レチノイドシグナル伝達の調整-アルツハイマー病および関連疾患への取り組み
アルツハイマー病の臨床的特徴を論じ、レチノイドシグナル伝達の関与が示される。
【０１８８】
ラットは、上記の実施例のように、レチノイド欠乏食で維持される。
【０１８９】
脳の切片を調製し、抗ウサギ抗βアミロイド1-40、Sigmaを用いてβアミロイドの発現を解析する。
【０１９０】
レチノイド欠乏食を6ヶ月与えても、レチノイド欠乏ラットと正常ラットの間には、検知される差は見られない。生後1年で、レチノイド欠乏ラットは、対照(図13A)と比較してβアミロイド量の上昇を示す(図13BおよびC)。少なくとも1例では、ニューロンのみならず血管にもアミロイドが観察される(図13B/C)。
【０１９１】
ラットでどのレチノイン酸受容体が欠損しているかが示される。生後6ヶ月で、レチノイド欠損ラットの脳のコリン作動性ニューロンにおいて、RARαの発現が低下しており、これは運動失調症および運動ニューロン疾患に関与するニューロンにおける発現の低下と類似している(上記実施例で考察した通り)。
【０１９２】
この発現の低下は、生後1年のレチノイド欠乏ラットで維持される。
【０１９３】
アセチルコリンに関与する酵素の1つであるコリンアセチルトランスフェラーゼ(CHAT)の発現が、抗ウサギCHAT抗体、Chemiconを使用して示される。この酵素の発現レベルは、対照と比較して、レチノイド欠乏ラットでは低下している。
【０１９４】
理論に縛られることは望まないが、RARαの損失が、βアミロイドの増加およびCHAT発現の損失を誘導する可能性がある。
【０１９５】
したがって、アルツハイマー病において、βアミロイドのさらなる生産を予防するためにRARαアゴニストを使用することが示される。
【０１９６】
実施例5  Raldh-2遺伝子療法ベクター
本実施例では、Raldh-2遺伝子の配列を含む遺伝子療法ベクターが構築される。
【０１９７】
raldh-2 ORFの5'のオリゴヌクレオチドプライマーおよびraldh-2 ORFの3'のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、PCRによりマウスcDNAが増幅される。得られたPCR産物は、raldh-2 ORF全体を含む。PCR産物を精製し、レトロウイルスベクタープラスミド構築物の、プロモーター/エンハンサーの下流のクローニング部位にライゲーションする。この構築物は、挿入物を確認するために配列決定する。
【０１９８】
その後構築物を用いて適当なレトロウイルスパッケージング細胞株を形質転換する。プラスミド構築物を含むレトロウイルス粒子を回収する。
【０１９９】
ニューロン細胞を、この組換えベクターで形質転換する。
【０２００】
実施例６
レチノイド欠乏ラットモデル(図14下パネル)において、正常ラット(図14上パネル)と比較すると、コリン作動性ニューロンを含む大脳皮質ニューロンにおいてRARα発現の損失があることをさらに示した。本発明に係るRARαの送達は、この欠失に対処する。
【０２０１】
レチノイド欠乏ラットでは、正常食を与えたラット(図15左パネル)と比較して、大脳皮質のコリン作動性ニューロンにコリンアセチルトランスフェラーゼ(CHAT)の損失がある(図15右パネル)。CHATは神経伝達物質であるアセチルコリンの生産に関与しており、これはアルツハイマー病の患者では失われる。ラットの神経変性疾患モデルでは、CHATはβアミロイド沈着に先行する。したがって、βアミロイド生産の調整は、上流の要素RARαおよびアセチルコリンを介して行われることが示される。RARαはアセチルコリンの生産を調節し、これはβアミロイドの生産を調節する可能性がある。さらに、RARαはアルツハイマー病に関与する他の神経伝達物質の生産を調節する可能性がある。このように、本発明に係るRARαの送達は、βアミロイド生産に関与する欠陥に対処することができる。
【０２０２】
ヒトでは、大脳皮質ニューロン(ラットの大脳皮質ニューロンとは異なる)が、レチノイン酸合成酵素Raldh-2を発現する。このRaldh-2酵素が、非罹病患者(図16の下パネル)と比較して、アルツハイマー病患者(図16上パネル)では劇的に下方制御されていることを示す。したがって、ヒトの大脳皮質ニューロンは、Raldh-2の発現によって合成できるという点で、追加のRA源を持つことが開示される。この追加のRA源は、髄膜によるRAの生産に加えて存在する。このように、Raldh-2酵素の発現の損失は、βアミロイド沈着を引き起こすことが開示される。本発明に係るRaldh-2の提供は、この欠陥に対処する。
【０２０３】
実施例7
HPLCで分析したヒトの運動ニューロン疾患患者の試料では、非罹病試料と比較して、新規のレチノイン酸の損失があることを示した(図17)。
【０２０４】
これらのレチノイン酸の同定は、運動ニューロン疾患の治療のためのレチノイドの設計にとって重要である。したがって、本発明は運動ニューロン疾患の治療のためのそのような候補レチノイン酸に関する。
【０２０５】
同様に、ヒトアルツハイマー病および正常の大脳皮質では、いくつかの新規のレチノイドがあることを開示する。特に、アルツハイマー病の脳では、非罹病脳と比較して、レチノイン酸の損失があることを示す(図18)。したがって、本発明に係るレチノイン酸の提供は、アルツハイマー病の問題に対処することが理解できる。
【０２０６】
参照
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実施例3の参照
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【図面の簡単な説明】
【０２０７】
【図１】成体ラットに対するレチノイド欠乏食の効果。A. 月齢6ヶ月の正常食のラット、B. 月齢6ヶ月のレチノイド欠乏食のラット、C. 生後1年のレチノイド欠乏食のラット。正常ラット(A)は尾を持つと後ろ脚を伸長するが、レチノイド欠乏食のラットは後ろ脚を収縮させる(BおよびC)。
【図２】頚髄(AおよびC)および腰髄(BおよびD)におけるNF200の発現。A. 月齢6ヶ月の正常食ラットの頚髄、B. 月齢6ヶ月の正常食ラットの腰髄、C. 月齢6ヶ月のレチノイド欠損ラットの頚髄、D.月齢6ヶ月のレチノイド欠損ラットの腰髄。
【図３】腰髄における反応性星状細胞増加症。星状細胞におけるGFAPの発現。A. 正常な腰髄、B. レチノイド欠損腰髄。
【図４】成体ラットの運動ニューロンにおけるRARαの発現。A. 月齢6ヶ月のレチノイド欠損ラットの腰髄、B. 6ヶ月の正常ラットの腰髄。
【図５】年齢を合わせた正常および運動ニューロン疾患患者における、Islet-1およびレチノイドシグナル伝達経路の成分を発現する腰髄中のモーターニューロンの割合のグラフ。カラム1. 正常腰髄におけるIslet-1陽性モーターニューロン、カラム2. 疾患腰髄におけるIslet-1陽性運動ニューロン、カラム3. 正常腰髄におけるRARα陽性運動ニューロン、カラム4. 疾患腰髄におけるRARα陽性運動ニューロン、カラム5. 正常腰髄におけるraldh-2陽性運動ニューロン、カラム6. 疾患腰髄におけるraldh-2陽性運動ニューロン。
【図６】年齢を合わせた正常(A、C、およびE)および自発性運動ニューロン疾患(B、D、およびF)の腰髄における、インサイチューハイブリダイゼーションによる、レチノイドシグナル伝達経路の成分およびIslet-1の発現。A、B. Islet-1の発現、C、D. RARα発現、E、F. raldh-2発現。年齢を合わせた正常者と比較して、患者において3つの転写物の各々が下方制御される。
【図７】RARElacZレポーターマウスの成体の脳におけるβガラクトシダーゼ活性。A.3つの強いレポーター活性を示す、脳の矢状断面の低倍率像。これらの3つの領域は、h＝海馬、c＝脈絡叢、p＝小脳のプルキンエ細胞である。これらは各々、B〜Dで高倍率で示されている。B.海馬におけるレポーター活性。C.側脳室の脈絡叢におけるレポーター活性。D.小脳におけるレポーター活性で、青い線はプルキンエ細胞を示す。
【図８】脳の3つの部分に存在するレチノイドのHPLCクロマトグラム。
【図９】成体マウスの小脳における酵素、結合タンパク質、および受容体の発現。A. 髄膜(三角印)および毛細血管内層(矢印)におけるRALDH2免疫反応性。B. 第4脳室の脈絡叢におけるRALDH2免疫反応性。C. プルキンエ細胞(三角印)のみでの発現を示すRALDH3インサイチューハイブリダイゼーション。D. 髄膜(三角印)におけるCRBP I免疫反応性。E. 第4脳室の脈絡叢におけるCRBP I免疫反応性。F. プルキンエ細胞(三角印)における強い発現、およびプルキンエ細胞の下の顆粒層における弱い発現を示すRARαインサイチューハイブリダイゼーション。G. 小脳での発現がないことを示すRARβインサイチューハイブリダイゼーション(三角印＝プルキンエ細胞)。H.プルキンエ細胞(三角印)における強い発現、およびプルキンエ細胞の下の顆粒層における弱い発現を示すRXRαインサイチューハイブリダイゼーション。I. プルキンエ細胞(三角印)における強い発現、およびプルキンエ細胞の上の分子層における弱い発現を示すRXRγインサイチューハイブリダイゼーション。ml ＝分子層、gl ＝顆粒層。
【図１０】正常およびビタミンA欠損ラット小脳における、受容体および酵素の発現パターン、ならびにプルキンエ細胞の変化。A. プルキンエ細胞(三角印)およびその下の顆粒層における発現を示す、生後1年のラットの小脳における、正常なRARα発現。B. ビタミンA欠損の生後1年のラットの小脳におけるRARαの発現で、この遺伝子が完全に下方制御されていることを示す。C. 対照の生後1年のラットの小脳におけるCYP26の正常な発現で、プルキンエ細胞(三角印)における弱い発現およびその下の顆粒層における強い発現を示す。D. ビタミンA欠損の生後1年のラットの小脳におけるCYP26の発現で、この遺伝子が完全に下方制御されていることを示す。EおよびF. 正常な生後1年のラット小脳のカルビンジン染色で、プルキンエ細胞およびその樹状突起を示す。GおよびH. ビタミンA欠損の生後1年のラット小脳のカルビンジン染色で、プルキンエ細胞数が大きく低下し、残った細胞は樹状突起を欠くことを示す。
【図１１】生後6ヶ月の正常およびビタミンA欠乏、ならびに生後1年の正常およびビタミンA欠乏の小脳におけるプルキンエ細胞数。1＝正常の6ヶ月のラット(n＝4)；2＝正常の1年のラット(n＝2)；3＝ビタミンA欠損の6ヶ月のラット(n＝2)；4＝ビタミンA欠損の1年のラット。生後6ヶ月のビタミンA欠損ラットでの数は、6ヶ月および1年の対照での数とは有意に異なっていた(p＞0.0001)。各脳での細胞計数は12回繰り返した。
【図１２】小脳を表す発現パターンの要約の図。赤＝RA。矢印は、髄膜および毛細血管からのRAの供給を表し、赤いプルキンエ細胞は、RALDH3およびRARElacZレポーターの存在のためにRAを含むように表されている(図7D)。
【図１３】生後1年の成体ラットの脳におけるBアミロイドの発現。A. 対照ラット-正常なラット脳。生後1年。アミロイド染色茶色。B. レチノイド欠損ラット- RA欠損ラット脳。生後1年。アミロイド染色茶色。レチノイド欠損ラット-RA欠損ラット脳。生後1年。アミロイド染色茶色。
【図１４】大脳皮質におけるRARαの発現。
【図１５】CHATの発現。
【図１６】コリン作動性ニューロンにおけるRALDH-2の発現。
【図１７】正常のヒト腰髄(AおよびB)およびヒト腰髄運動ニューロン疾患試料(CおよびD)におけるレチノイドのHPLC分析。矢印は正常なヒト腰髄に存在し、疾患試料には存在しないレチノイン酸を示す。
【図１８】ヒトアルツハイマー病(A)および非罹患大脳皮質(B)における、レチノイドのHPLC分析。両方の試料には新規のレチノイドがいくつか存在し、正常脳の試料と比較して、罹患試料ではレチノイン酸の損失が見られる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004521912.tif 000091
【国際調査報告】
2004521912.tif 000092
2004521912.tif 000093
2004521912.tif 000094
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