(57)【要約】本発明は、天然型のＣＹＰ１Ｂ１転写物の非翻訳領域（ＵＴＲ）に認められる配列を欠いた転写ユニットである、ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはその部分をコードする転写ユニットを含む核酸を提供する。本発明の核酸は翻訳抑制因子を欠いており、このため、ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはその部分の翻訳が増強される系を提供する。核酸を哺乳動物に投与する方法、および増殖性疾患または癌の治療における使用も開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子と結合するペプチドを含むＣＹＰ１Ｂ１またはその一部を含むポリペプチドをコードするコード配列を含む転写ユニットを含む核酸であって、転写ユニットがコード配列と機能的に結合した翻訳抑制因子を含んでいない核酸。
【請求項２】
ポリペプチドがＣＹＰ１Ｂ１の長さ８アミノ酸の区域を含む、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
ポリペプチドが配列番号：２２を含む、請求項２記載の核酸。
【請求項４】
ポリペプチドの長さが１００未満のアミノ酸である、請求項３記載の核酸。
【請求項５】
転写ユニットがＲＮＡ安定化配列を含む、請求項１記載の核酸。
【請求項６】
転写ユニットと機能的に結合した誘導性プロモーター配列を含む、請求項１記載の核酸。
【請求項７】
ポリペプチドがターゲティングシグナルを含む、請求項１記載の核酸。
【請求項８】
ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子と結合するペプチドを含むＣＹＰ１Ｂ１またはその一部を含むポリペプチドをコードするコード配列を含む転写ユニットを含む核酸であって、転写ユニットが配列番号：１８または配列番号：１９の１５０個の連続したヌクレオチドを含んでいない核酸。
【請求項９】
転写ユニットが配列番号：３〜９または配列番号：１５〜１７の少なくとも１つを含まない、請求項８記載の核酸。
【請求項１０】
転写ユニットが配列番号：３〜９および配列番号：１５〜１７をいずれも含まない、請求項９記載の核酸。
【請求項１１】
転写ユニットが配列番号：１８または配列番号：１９の５０個の連続したヌクレオチドを含まない、請求項８記載の核酸。
【請求項１２】
転写ユニットが配列番号：１８または配列番号：１９の２５個の連続したヌクレオチドを含まない、請求項８記載の核酸。
【請求項１３】
転写ユニットが配列番号：１８または配列番号：１９の１０個の連続したヌクレオチドを含まない、請求項８記載の核酸。
【請求項１４】
転写ユニットがＲＮＡ安定化配列を含む、請求項８記載の核酸。
【請求項１５】
誘導性プロモーター配列を含む、請求項８記載の核酸。
【請求項１６】
転写ユニットが、コード配列と機能的に結合した翻訳調節配列を含む、請求項８記載の核酸。
【請求項１７】
翻訳調節配列が鉄応答性配列である、請求項１６記載の核酸。
【請求項１８】
ポリペプチドがＣＹＰ１Ｂ１の長さ８アミノ酸の区域を含む、請求項８記載の核酸。
【請求項１９】
ポリペプチドが配列番号：２２を含む、請求項１８記載の核酸。
【請求項２０】
ポリペプチドの長さが１００未満のアミノ酸である、請求項１９記載の核酸。
【請求項２１】
ポリペプチドがターゲティングシグナルを含む、請求項８記載の核酸。
【請求項２２】
ＣＹＰ１Ｂ１の第１および第２の区域を含むハイブリッド型ポリペプチドをコードする転写ユニットを含む核酸であって、第１および第２の区域が連続しているか、またはスペーサーアミノ酸もしくはスペーサーペプチドによって分離されており、第１および第２の区域のそれぞれの長さが少なくとも８アミノ酸であり、第１および第２の区域がＣＹＰ１Ｂ１の非連続的な部分である、核酸。
【請求項２３】
ハイブリッド型ポリペプチドがＣＹＰ１Ｂ１の第３の区域をさらに含み、第３の区域の長さが少なくとも８アミノ酸であり、第１および第３の区域ならびに第２および第３の区域がＣＹＰ１Ｂ１の非連続的な部分である、請求項２２記載の核酸。
【請求項２４】
第１の区域が配列番号：２２の配列を含む、請求項２２記載の核酸。
【請求項２５】
ポリペプチドターゲティングシグナルを含む、請求項２２記載の核酸。
【請求項２６】
請求項１記載の核酸および免疫刺激物質を含む組成物。
【請求項２７】
免疫刺激物質が、長さ１８〜３０ヌクレオチドのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである、請求項２６記載の組成物。
【請求項２８】
免疫刺激物質がＩＬ−１２またはＩＦＮ−γである、請求項２６記載の組成物。
【請求項２９】
免疫刺激物質が脂質、核酸、糖質または細菌性ポリペプチドである、請求項２６記載の組成物。
【請求項３０】
請求項１記載の核酸および免疫刺激物質をコードする核酸を含む組成物。
【請求項３１】
免疫刺激物質がＩＬ−１２、ＩＦＮ−γまたは細菌性ポリペプチドである、請求項３０記載の組成物。
【請求項３２】
請求項１記載の核酸および薬学的に許容される担体を含む治療的組成物。
【請求項３３】
ポリマーマトリックスまたはシェルおよび請求項１記載の核酸を含む微粒子。
【請求項３４】
ポリマーマトリックスまたはシェルおよび請求項８記載の核酸を含む微粒子。
【請求項３５】
ポリマーマトリックスまたはシェルおよび請求項２２記載の核酸を含む微粒子。
【請求項３６】
請求項１記載の核酸を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における免疫応答の誘導方法。
【請求項３７】
哺乳動物が癌に罹患している、またはその危険性がある、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
核酸を皮下または筋肉内に投与する、請求項３６記載の方法。
【請求項３９】
免疫応答がＣＹＰ１Ｂ１に向けられる、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
免疫応答がＴ細胞応答である、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
免疫応答がＢ細胞応答である、請求項３９記載の方法。
【請求項４２】
請求項３３記載の微粒子を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における免疫応答の誘導方法。
【請求項４３】
以下の段階を含む、免疫応答を生じさせる方法：
哺乳動物の腫瘍内でのＣＹＰ１Ｂ１の発現を検出する段階；および
請求項１記載の核酸を哺乳動物に投与する段階を含み、投与によって哺乳動物における抗ＣＹＰ１Ｂ１免疫応答が誘発されるような方法。
【請求項４４】
以下の段階を含む、哺乳動物における腫瘍増殖または腫瘍活性を低下させる方法：
腫瘍を有する哺乳動物を同定する段階；
請求項１記載の核酸を哺乳動物に投与する段階；および
核酸の投与後の腫瘍のサイズまたは活性の低下を検出する段階。
【請求項４５】
核酸を投与する前に腫瘍内でのＣＹＰ１Ｂ１の発現を検出する段階をさらに含む、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
哺乳動物における免疫応答の誘導方法であって、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子と結合するＣＹＰ１Ｂ１またはその一部を含むポリペプチドをコードする核酸を哺乳動物に投与する段階を含み、該哺乳動物が第１の種に属し、ＣＹＰ１Ｂ１またはその一部が第２の種の天然のＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドの配列と同一であるような方法。
【請求項４７】
核酸を哺乳動物に投与する前に、該哺乳動物を腫瘍を有する同定する段階をさらに含む、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
核酸が請求項１記載の核酸である、請求項４６記載の方法。
【請求項４９】
核酸が請求項２２記載の核酸である、請求項４６記載の方法。
【請求項５０】
第１の種がヒトである、請求項４６記載の方法。
【請求項５１】
第２の種が齧歯動物である、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
齧歯動物がラットまたはマウスである、請求項５１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ＣＹＰ１Ｂ１核酸、および免疫応答を誘導するための使用方法に関する。
【０００２】
発明の背景
シトクロムＰ４５０は大規模な遺伝子ファミリーを構成する酵素であり、発癌物質の可能性がある多くの物質および複数の抗癌剤を含む、さまざまな生体異物の酸化的活性化および／または不活性化にかかわっている（ＧｕｅｎｇｅｒｉｃｈおよびＳｈｉｍａｄａ（１９９１）Ｃｈｅｍ． Ｒｅｓ． Ｔｏｘｉｃｏｌ． ４：９３１；ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＧｅｌｂｏｉｎ（１９９４）Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ． Ｒｅｖ． ２６：１６５；Ｋｉｖｉｓｔｏら（１９９５）Ｂｒ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ４０：５２３）。
【０００３】
ヒトＣＹＰ１遺伝子ファミリーは主なＰ４５０ファミリーの１つであり、２つのサブファミリーに分類される３つの独立した形態からなる。ＣＹＰ１Ｂ１は一方のサブファミリーに属し、長さは５４３アミノ酸である。これはＣＹＰ１Ａ２サブファミリーの２つのメンバーとは構造的に異なる（Ｔａｎｇら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：２８３２４）。
【０００４】
乳癌、食道癌および軟部組織肉腫を含むさまざまな種類の癌の研究により、ＣＹＰ１Ｂ１型のＰ４５０が腫瘍特異的に発現される可能性が示されている（Ｍｕｒｒａｙら（１９９１）Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ６３：１０２１；Ｍｕｒｒａｙら（１９９３）Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １７１：４９；Ｍｕｒｒａｙら（１９９４）Ｇｕｔ ３５：５９９を参照）。ＣＹＰ１Ｂ１の免疫組織化学的研究からは、複数の異なる種類の腫瘍で強い免疫反応性が認められている（膀胱、乳房、結腸、腎臓、肺、食道、卵巣、皮膚、胃、子宮、骨および結合組織、リンパ節、脳ならびに巣）（国際公開公報第９７／１２２４６号を参照、これは参照として本明細書に組み入れられる）。
【０００５】
発明の概要
本発明は、ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはその部分をコードし、翻訳抑制因子（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｅｌｅｍｅｎｔ）を欠いた転写ユニットを含む、核酸を構築しうるという発見に基づく。これらの因子は、天然型のＣＹＰ１Ｂ１転写物の非翻訳領域（ＵＴＲ）に位置してもコード配列中に位置してもよく、またはその両方でもよい。本発明の核酸は、ＣＹＰ１Ｂ１内因性翻訳抑制因子の一部または全体を欠いており、このため、ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはその部分の翻訳が増強される系を提供する。本発明の核酸が、コードされるタンパク質の免疫原性を強める変異、欠失、挿入または転位を含むことも可能である。本明細書に記載の核酸によってコードされるポリペプチドは、哺乳動物における免疫応答を誘発するのに有用である。
【０００６】
１つの局面において、本発明は、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子と結合するペプチドまたはＢ細胞エピトープであるペプチドを含むＣＹＰ１Ｂ１またはそれらの一部を含むポリペプチドをコードするコード配列を含む転写ユニットを含む核酸を特徴とする。転写ユニットは、コード配列と機能的に結合した翻訳抑制因子を含まない。
【０００７】
本明細書で用いる「転写ユニット」とは、翻訳開始シグナルを含み、その後に選択的にはイントロンならびに適切なスプライスドナー部位およびアクセプター部位を含むオープンリーディングフレームがあり、その後に終結コドンがある核酸のことを指し、ここで核酸は（１）ＲＮＡまたは（２）転写されてＲＮＡとなるヌクレオチド配列のいずれかである。「翻訳開始シグナル」とは、コザックコンセンサス配列の状況下にある開始コドンのことを指す。「翻訳抑制因子」とは、それが存在すると、転写物によってコードされるポリペプチドの翻訳レベルが、そのヌクレオチド配列を欠く転写物よりも少なくとも２５％低下する、転写物の非翻訳領域に位置するヌクレオチド配列のことを指す。翻訳抑制因子は、例えばリボソームの転写物との結合を妨げることにより、または転写物の半減期を短縮することにより、翻訳レベルを低下させることが可能である。
【０００８】
本明細書に記載の核酸によってコードされるポリペプチドは、長さが少なくとも８アミノ酸のＣＹＰ１Ｂ１区域を含む。１つの例では、ポリペプチドは配列ＦＬＤＰＲＰＬＴＶ（配列番号：２２）を含む。もう１つの例では、ポリペプチドは配列番号：３１〜３９のいずれかの配列を含む。もう１つの例では、ポリペプチドの長さは４００、３００、２００または１００未満のアミノ酸である。
【０００９】
本明細書で用いる「区域（ｓｅｇｍｅｎｔ）」とは、（ａ）ＣＹＰ１Ｂ１タンパク質の一部（すなわち全体に満たない断片）の配列に対応し、（ｂ）１つまたは複数のエピトープを含む、アミノ酸配列のことである。明確に言えば、「区域」は本明細書では、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドの一部のことを意味し、「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」という用語は天然のタンパク質の該当部分のことを意味する。「エピトープ」とは、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子の結合溝または抗体の抗原結合領域と結合するペプチドのことを指す。翻訳を促すために、本発明の上記または他の任意のコード配列の５’末端にメチオニンコドンを含めることができる。さらに、本明細書に記載の核酸によってコードされるポリペプチドが、以下にさらに詳細に説明する、ターゲティングシグナル（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）をコードすることも可能である。
【００１０】
本明細書に記載の転写ユニットは、ＲＮＡ安定化配列を含みうる。「ＲＮＡ安定化配列」とは、それが存在すると転写物の半減期がそのヌクレオチド配列を欠く転写物よりも長くなる、転写物の非翻訳領域（ＵＴＲ）（５’もしくは３’ ＵＴＲまたはその両方）に位置するヌクレオチド配列のことを指す。
【００１１】
本明細書に記載の核酸は、転写ユニットと機能的に結合した誘導性プロモーター配列を含みうる。「誘導性プロモーター配列」とは、作用物質（ａｇｅｎｔ）、例えば金属または他の何らかの非タンパク質性化合物がそのヌクレオチド配列と結合すると、そのヌクレオチド配列が機能的に結合した転写ユニットの転写の増強がもたらされるようなヌクレオチド配列のことを指す。誘導性プロモーター配列の一例はメタロチオネインプロモーターである。
【００１２】
本発明の核酸によってコードされるポリペプチドは、選択的にはターゲティングシグナルを含んでもよい。ターゲティングシグナルとは、それが結合したペプチドの細胞内輸送または分泌を指令するペプチドのことである。ターゲティングシグナルは、それがその部位で作用する限り、ハイブリッド型ポリペプチドのアミノ末端、例えばシグナル配列にあっても、カルボキシ末端にあっても、または内部にあってもよい。
【００１３】
ターゲティングシグナルは、例えばシグナル配列でありうる。それが結合したコードされるタンパク質を小胞体に向かわせる、および／またはコードされるタンパク質の分泌を引き起こす、任意のシグナル配列が適している。好ましいターゲティングシグナルの１つは、ＨＬＡ−ＤＲαのシグナルペプチド：
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である。本明細書に記載のポリペプチドと結合させることが可能なもう１つのシグナル配列は、以下の配列を有する：
2004534510.tif 000004
本明細書に記載のポリペプチドと結合させることが可能なもう１つのシグナル配列は、Ｅ１Ａシグナル配列である。
【００１４】
選択的には、ターゲティングシグナルを、シグナルペプチダーゼなどによるエピトープからのターゲティング配列の切断を促すために、ターゲティングシグナルと隣接区域との接合部にアミノ酸置換が導入されるように改変してもよい。
【００１５】
もう１つの局面において、本発明は、ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子と結合するペプチドを含むＣＹＰ１Ｂ１またはその一部を含むポリペプチドをコードするコード配列を含む転写ユニットを含む核酸であって、転写ユニットが配列番号：１８または配列番号：１９の１５０個の連続したヌクレオチドを含んでいない核酸を特徴とする。ＣＹＰ１Ｂ１またはその一部は、哺乳動物、例えばヒトの天然のＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドの配列に対応することが好ましい。
【００１６】
１つの例において、転写ユニットは配列番号：３〜９または１５〜１７のうち少なくとも１つを含まない。もう１つの例において、転写ユニットは配列番号：１８または配列番号：１９の５０、２５または１０個の連続したヌクレオチドを含まない。もう１つの例において、転写ユニットは配列番号：３〜９および１５〜１７をいずれも含まない。
【００１７】
転写ユニットは、コード配列と機能的に結合した翻訳調節配列を含みうる。「翻訳調節配列」とは、ある作用物質がそのヌクレオチド配列と結合すると、そのヌクレオチド配列が機能的に結合したコード配列によってコードされるポリペプチドの翻訳の増強がもたらされるようなヌクレオチド配列のことを指す。１つの例において、翻訳調節配列は鉄応答性配列である。
【００１８】
もう１つの局面において、本発明は、ＣＹＰ１Ｂ１の第１および第２の区域を含むハイブリッド型ポリペプチドをコードする転写ユニットを含む核酸を特徴とする。第１のおよび第２の区域は連続しているか、またはスペーサーアミノ酸もしくはスペーサーペプチドによって分離されている。第１のおよび第２の区域のそれぞれの長さが少なくとも８アミノ酸であり、ＣＹＰ１Ｂ１の非連続的な部分である。
【００１９】
「スペーサーアミノ酸」とは、本発明のポリペプチド中の２つの近接した区域（順に「Ａ」および「Ｂ」）の間に挿入される単一の残基であって、完全長ＣＹＰ１Ｂ１タンパク質においてＡのカルボキシ末端に隣接するアミノ酸と異なり、Ｂのアミノ末端に隣接するアミノ酸とも異なる残基のことを意味する。すなわち、スペーサーアミノ酸は、本発明のポリペプチド中に、ＣＹＰ１Ｂ１由来のＡの配列およびＣＹＰ１Ｂ１由来のＢの配列との不連続点を形成する。アミノ酸は通常、２０種の天然アミノ酸、例えばＡｌａ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＧｌｙなどのいずれかであるが、一般的には（１）ＣＹＰ１Ｂ１中でＡのカルボキシ末端に自然下で隣接するもの、および（２）ＣＹＰ１Ｂ１中でＢのアミノ末端に自然下で隣接するものを除く、任意のアミノ酸が可能である。
【００２０】
「スペーサー配列」とは、本発明のポリペプチド中の２つの近接した区域、例えば「Ａ」と「Ｂ」との間に挿入される２つ以上のアミノ酸の配列のことを意味する。スペーサーの配列は、ＡおよびＢの由来である完全長ＣＹＰ１Ｂ１タンパク質においてＡのカルボキシ末端およびＢのアミノ末端に隣接する配列とは異なる。すなわち、スペーサー配列は、本発明のポリペプチド中に、ＣＹＰ１Ｂ１由来のＡの配列およびＹ由来のＢの配列の双方との不連続点を形成する。
【００２１】
スペーサー配列の例には、Ａｌａ Ａｌａ、Ａｌａ Ｌｅｕ、Ｌｅｕ Ｌｅｕ、Ｌｅｕ Ａｌａ、Ｌｅｎ Ｉｌｅ、Ａｌａ Ａｌａ Ａｌａ、Ａｌａ Ｇｌｙ Ｌｅｕ、Ｐｈｅ Ｉｌｅ Ｉｌｅなどが含まれる。一般に、スペーサー配列は非極性アミノ酸を含むと考えられるが、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＨｉｓおよびＡｓｎなどの極性残基も存在することができ、特に３残基を上回るスペーサー配列ではそうであると考えられる。各スペーサー配列の全長および性質に関する唯一の外延は、ポリペプチドおよび／または核酸の合成、タンパク質分解プロセシングおよび操作の容易さに関する考慮によるものである。約４または５残基よりも長いスペーサー配列を用いることは一般に不必要であり、おそらくは望ましくないと思われるが、それらは例えば、６、８、１０、１５、２０、３０または５０残基であってもよいと考えられる。当然ながら、それらは５０残基よりもさらに長くてもよいと考えられる。
【００２２】
スペーサーアミノ酸およびスペーサー配列は、タンパク質の安定性を変化させるため、またはエピトープを放出するプロセシングを促すために有用である。スペーサーは通常、細胞内でのタンパク質分解プロセシングにより、所定の区域内のエピトープ間にある任意の配列とともにポリペプチドから除去される。このため、エピトープがＭＨＣ分子または（細胞からの分泌後に）抗体と結合する能力は損なわれない。時には、スペーサーアミノ酸またはスペーサー配列の一部が不完全なプロセシングのためにエピトープと結合したまま残ることも考えられる。これは一般に、ＭＨＣ分子との結合に対してほとんどまたは全く影響を及ぼさない。
【００２３】
本明細書に記載の核酸によってコードされるハイブリッド型ポリペプチドは、ＣＹＰ１Ｂ１の追加的な区域、例えば第３、第４、第５、第６の区域をさらに含みうる。これらの追加的な区域はそれぞれ長さが少なくとも８アミノ酸であり、ＣＹＰ１Ｂ１の非連続的な部分を構成している。
【００２４】
スペーサーは選択的には、ＣＹＰ１Ｂ１以外のタンパク質由来のＴ細胞および／またはＢ細胞エピトープを含むことができる。例えば、スペーサーは、破傷風トキソイドまたはＰＡＤＲＥ Ｔ細胞エピトープ（例えば、米国特許第５，６６２，９０７号を参照）をコードしうる。
【００２５】
本発明はまた、本明細書に記載の核酸およびアジュバントまたは免疫刺激物質を含む、組成物も特徴とする。アジュバントおよび「免疫刺激物質」とは、抗原特異的でない様式で免疫応答を誘発する物質、または樹状細胞などの専門化した抗原提示細胞の分化もしくは活性化を誘導する物質のことを指す。アジュバントの例には、ミョウバン、金、モノホスホリルリピドＡ、サポニン、油性乳剤、ＱＳ２１およびフロイントアジュバントが含まれる。免疫刺激物質の例には以下のものが含まれる：例えば長さ１８〜３０ヌクレオチドのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド；ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γなどのサイトカイン；Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＣＲ５などの細胞表面受容体；ならびに脂質、核酸、糖質および細菌性ポリペプチド。
【００２６】
本発明は、本明細書に記載の核酸およびＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γまたは細菌性ポリペプチドなどの免疫刺激物質をコードする核酸を含む組成物も含む。
【００２７】
本発明は、本明細書に記載の核酸および薬学的に許容される担体を含む治療的組成物も含む。本発明はまた、微粒子、例えば、ポリマーマトリックスまたはシェルおよび本明細書に記載の核酸を含むミクロスフェアも含む。本発明はまた、ポリマーネットワーク、例えばヒドロゲルおよび本明細書に記載の核酸も含む。
【００２８】
もう１つの局面において、本発明は、本明細書に記載の核酸を哺乳動物に投与することによる、哺乳動物における免疫応答の誘導方法を特徴とする。１つの例において、哺乳動物は癌に罹患している、またはその危険性がある。核酸は皮下、鼻腔内または筋肉内などのさまざまな経路によって投与することが可能である。核酸の注射後に注射部位で電気穿孔法を行ってもよい。本方法によって生じる免疫応答をＣＹＰ１Ｂ１に向かわせることが可能である。本方法はＴ細胞応答および／またはＢ細胞応答を引き起こしうる。
【００２９】
本発明は、本明細書に記載の微粒子またはポリマーネットワークを哺乳動物に投与することによる、哺乳動物における免疫応答の誘導方法も特徴とする。
【００３０】
本発明はまた、免疫応答を生じさせる方法であって、（１）哺乳動物の腫瘍または腫瘍内でのＣＹＰ１Ｂ１の発現を検出する段階；および（２）本明細書に記載の核酸を哺乳動物に投与する段階を含み、投与によって哺乳動物における抗ＣＹＰ１Ｂ１免疫応答が誘発される方法も特徴とする。
【００３１】
本発明はまた、哺乳動物における腫瘍増殖または腫瘍活性を低下させる方法も特徴とする。本方法は以下の段階を含む：（１）腫瘍を有する哺乳動物を同定する段階；（２）本明細書に記載の核酸を哺乳動物に投与する段階；および（３）核酸の投与後の腫瘍のサイズまたは活性の低下を検出する段階。本明細書で用いる「腫瘍活性」とは、腫瘍細胞の増殖を促進する、腫瘍細胞によって分泌される可溶性因子のことを指す。本方法はさらに、核酸を投与する前に腫瘍内でのＣＹＰ１Ｂ１の発現を検出する段階を含みうる。
【００３２】
本発明はまた、哺乳動物の再発までの期間、寿命または生活の質を増大させる方法も特徴とする。本方法は以下の段階を含む：（１）腫瘍を有する哺乳動物を同定する段階；（２）本明細書に記載の核酸を哺乳動物に投与する段階；および（３）核酸の投与後の哺乳動物の再発までの期間、寿命または生活の質の増大を評価する段階。再発までの期間、寿命または生活の質の増大は、例えば、化学療法の必要性の低下もしくは化学療法薬の投与期間の短縮、鎮痛薬の必要性の低下もしくは鎮痛薬の投与期間の短縮、または入院もしくは薬物療法の必要性もしくは期間の低下もしくは短縮によって評価することができる。
【００３３】
もう１つの局面において、本発明は、本明細書に記載の核酸を細胞に送達することによる、免疫応答の誘導方法を特徴とする。免疫応答の誘導はインビトロ、インビボまたはエクスビボのいずれで行ってもよい。例えば、抗ＣＹＰ１Ｂ１ Ｔ細胞を、例えば、ＣＹＰ１Ｂ１を発現する樹状細胞などの抗原提示細胞とのインキュベーションまたはＣＹＰ１Ｂ１タンパク質もしくはペプチドによるパルス刺激によって細胞培養下で作製し、その後に個体、例えば、癌に罹患した個体またはその危険性がある個体に再び導入することができる。
【００３４】
もう１つの局面において、本発明は、核酸を哺乳動物に投与することによる、哺乳動物における免疫応答の誘導方法を特徴とする。本方法において、哺乳動物は第１の種に属し、例えば哺乳動物はヒトであり、核酸はＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子または免疫グロブリン受容体と結合するＣＹＰ１Ｂ１またはその一部を含むポリペプチドをコードするが、ここでＣＹＰ１Ｂ１またはその一部は第２の種、例えばラットまたはマウスなどの齧歯動物の天然のＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドの配列と同一である。
【００３５】
本方法に従って投与される核酸は、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子または免疫グロブリン受容体と結合するＣＹＰ１Ｂ１またはその一部を含むポリペプチドをコードする任意の核酸でありうる。１つの例において、核酸は本発明の核酸である。核酸は裸の核酸として哺乳動物に送達することもでき、または微粒子などの送達媒体とともに送達することもできる。ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子と結合するＣＹＰ１Ｂ１またはその一部は、第１の種の天然のＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドの配列と同一でないことが好ましい。核酸を、選択的には、本明細書に記載の免疫刺激物質とともに投与することができる。
【００３６】
核酸を投与する哺乳動物は、細胞増殖性疾患、例えば癌を有する、またはその危険性があるものでよい。１つの例では、核酸を哺乳動物に投与する前に、哺乳動物を細胞増殖性疾患、例えば腫瘍を有するものとして同定する。
【００３７】
本発明の１つの利点は、本明細書に記載の核酸により、ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドが通常は産生されないまたは低レベルで産生される細胞において、ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはその一部の翻訳が可能になることである。
【００３８】
本明細書に記載の核酸構築物のいくつかのさらにもう１つの利点は、安定性が変化した、および／または酵素活性が変化、低下もしくは消失した、ポリペプチドの翻訳が可能になることである。ポリペプチドの安定性を変更することにより、そのプロセシングおよびその後の免疫系による認識を増強させることができる。ＣＹＰ１Ｂ１タンパク質の酵素活性を変更することにより、望ましくない生物活性が低下または消失する。
【００３９】
本発明の特定の構築物のさらにもう１つの利点は、ＣＹＰ１Ｂ１タンパク質の部分的または変化した配列のみを有する、ポリペプチド由来のＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ結合性エピトープの送達が可能になることである。すなわち、完全長ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドの発現に伴う有害な影響が避けられる。加えて、コードされるＣＹＰ１Ｂ１タンパク質のコード配列の変更により、抗原に対する自己寛容が遮断されると考えられる。
【００４０】
本発明の特定の構築物のさらにもう１つの利点は、本明細書に記載のポリペプチドの内部でのエピトープの組み合わせにより、少なくとも１つ、一般的には複数のＣＹＰ１Ｂ１エピトープが種々のＨＬＡアロタイプのそれぞれによって提示される可能性が高まることである。これにより、ポリペプチドをコードする単一の核酸を用いて、ＨＬＡ遺伝子座に多型のある個体の集団に免疫処置を行うことが可能になる。
【００４１】
別に定義する場合を除き、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者が一般に理解しているものと同じ意味を持つ。本発明の実施または検討のために本明細書に記載したものと同様または同等の方法および材料を用いることができるが、好ましい方法および材料は以下に説明するものである。本明細書で言及するすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、その全体が参照として本明細書に組み入れられる。対立が生じた場合には、定義を含め、本明細書が支配的であるものとする。さらに、材料、方法および実施例は例示的なものに過ぎず、限定を意図したものではない。
【００４２】
本発明のその他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになると考えられる。
【００４３】
詳細な説明
本発明は、天然型のＣＹＰ１Ｂ１転写物の非翻訳領域（ＵＴＲ）に認められる配列を欠いた転写ユニットである、ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはその部分をコードする転写ユニットを含む核酸を提供する。天然型のＣＹＰ１Ｂ１転写物は、少なくともある種の細胞環境で翻訳の部分的または全体的な抑制の一因となる翻訳抑制因子を含むと考えられている。本発明の核酸は翻訳抑制因子を欠いており、このため、ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはその部分の翻訳が増強される系を提供する。
【００４４】
本発明の核酸は、個体におけるＣＹＰ１Ｂ１特異的な免疫応答の誘発または増強のためのツールとして有用である。本核酸は天然のＣＹＰ１Ｂ１転写物に含まれる翻訳抑制因子を欠いているため、ＣＹＰ１Ｂ１タンパク質またはその一部の産生を可能とし、これによって免疫応答の発生を促進する。本発明の核酸は多数のＣＹＰ１Ｂ１エピトープをコードしうるため、多岐にわたるＭＨＣアロタイプを含む集団において免疫応答を誘発させるために有用である。本発明の核酸は、コードされるタンパク質の免疫原性を高めるのに役立つ変異、欠失、挿入または転位を含むこともできる。こうすることにより、改変されたＣＹＰ１Ｂ１配列を含むタンパク質が自己寛容を引き起こすのを妨げられると考えられる。加えて、本発明の核酸は、天然のＣＹＰ１Ｂ１転写物に含まれる翻訳抑制因子を欠くため、インビトロまたはインビボのいずれかでＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはその部分を生成させる目的にも有用である。
【００４５】
核酸
本発明の核酸は、（１）ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはその一部をコードするが（２）天然のＣＹＰ１Ｂ１転写物には対応しない、転写ユニットを含む。ヒトＣＹＰ１Ｂ１の核酸配列（配列番号：１）およびタンパク質配列（配列番号：２）を図１Ａ〜１Ｄに示す。本明細書ではこれらの配列を本発明の核酸を説明するための基準（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）として用いる。天然のヒトＣＹＰ１Ｂ１核酸の配列はジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）（商標）アクセッション番号Ｕ０３６８８、およびタング（Ｔａｎｇ）ら（１９９６）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２８３２４に記載されており、その内容は参照として組み入れられる。ラットおよびマウスなどの他の哺乳動物でオルソロガスなＣＹＰ１Ｂ１配列が同定されている（Ｗａｌｋｅｒら（１９９５）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ １６：１３１９；Ｓｈｅｎら（１９９４）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３：７６３；Ｓａｖａｓら（１９９４）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６９：１４９０５；これらは参照として本明細書に組み入れられる）。ヒト、ラットおよびマウスなどの改変型の真核生物ＣＹＰ１Ｂ１核酸も本発明に含まれる。
【００４６】
５’および／または３’ ＵＴＲに含まれ、翻訳抑制因子として作用する特定の配列を転写ユニットが欠いている点で、本発明の核酸は天然のＣＹＰ１Ｂ１核酸とは異なる。翻訳抑制因子の実体はさまざまな方法によって決定しうる。
【００４７】
ヌクレオチド配列が翻訳抑制因子を含むか否かを判定する第１の方法では、完全長ＲＮＡの配列を、例えばコンピュータプログラムにより、翻訳抑制にかかわるコンセンサス配列の存在に関して解析する。例えば、コンピュータ解析により、リプレッサー物質（例えばリプレッサータンパク質）が結合しうる配列を同定することができる。もう１つの例では、コンピュータ解析により、ＲＮＡ不安定化配列として作用する配列、例えば、それが存在することによって少なくともある種の細胞環境で転写物の半減期が短縮するヌクレオチド配列を同定することができる。もう１つの例では、コンピュータ解析により、転写物中に二次構造を形成すると思われる、翻訳抑制にかかわるコンセンサス配列を同定することができる。
【００４８】
配列番号：１の配列に対応するＣＹＰ１Ｂ１ ＲＮＡ転写物のＵＴＲの解析により、二次構造と推定される領域が同定された。この解析は、ズーカー（Ｚｕｋｅｒ）およびターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）によるｍｆｏｌｄプログラムのバージョン３．０を用いて行った（Ｚｕｋｅｒら（１９９９）、「ＲＮＡの二次構造の予測のためのアルゴリズムおよび熱力学：実践的ガイド（Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ ｆｏｒ ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ）」、「ＲＮＡの生化学およびバイオテクノロジー（ＲＮＡ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」中、１１〜４３、Ｊ． Ｂａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ ＆ Ｂ．Ｆ．Ｃ． Ｃｌａｒｋ編、ＮＡＴＯ ＡＳＩシリーズ、Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｍａｔｈｅｗｓら（１９９９）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８８：９１１〜９４０）。ｍｆｏｌｄは自由エネルギーの最小化に基づくＲＮＡ二次構造の予測のためのズーカー（Ｚｕｋｅｒ）アルゴリズムを具体化したものである。本解析におけるフォールディング温度は３７℃に固定される。
【００４９】
ＣＹＰ１Ｂ１ ＲＮＡ転写物中の二次構造と予想される領域を表１に示す。これらの領域は翻訳リプレッサーと推定されるものを構成しており、このため、本発明の核酸はこれらの配列、配列番号：３〜１７のうち１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個）を欠くことが可能である。
【００５０】
【表１】ＣＹＰ１Ｂ１転写物の非翻訳領域の二次構造解析
2004534510.tif 000005
【００５１】
ヌクレオチド配列が翻訳抑制因子を含むか否かを判定する第２の方法では、改変されたＣＹＰ１Ｂ１転写物によって産生されるタンパク質の量を野生型ＣＹＰ１Ｂ１転写物と比較する実験的な評価により、翻訳抑制因子を同定することができる。例えば、配列番号：１の配列のＵＴＲ欠失変異体を構築し、変異体および配列番号：１の配列のそれぞれを別の細胞集団で発現させて、変異体および野生型のそれぞれから産生されたＣＹＰ１Ｂ１タンパク質の量を比較する。改変された転写物の方が野生型ＣＹＰ１Ｂ１よりもタンパク質産生を増強させるならば、それには１つまたは複数の翻訳抑制因子があると考えられる。例えば、本発明の核酸は、配列番号：１８の５’ ＵＴＲ配列（配列番号：１のヌクレオチド１〜３６２）を欠くものでもよい。もう１つの例において、核酸は配列番号：１９の３’ ＵＴＲ配列（配列番号：１のヌクレオチド２０１１〜５１２８）を欠くものでよい。もう１つの例において、核酸は配列番号：１８および配列番号：１９の両方を欠くものでよい。配列番号：１８および／または配列番号：１９の両方を欠いた核酸に加えて、本発明は、配列番号：１８および／または配列番号：１９のうち特定の数の連続したヌクレオチド、例えば少なくとも４００、３００、２００、１５０、１００、５０、２５または１０個を欠いた核酸も含む。この解析は上記のコンピュータ解析とともに行うことができる。
【００５２】
本発明の核酸が、コードされるＣＹＰ１Ｂ１タンパク質またはその変種の免疫原性を高めるのに役立つ変異、欠失、挿入または転位を含む点で、天然のＣＹＰ１Ｂ１核酸と異なってもよい。タンパク質の免疫原性を評価する方法は当技術分野で周知であり、これには、核酸による免疫処置を動物に行い、その後にリンパ節、脾臓、血液または血清を採取してＴ細胞応答またはＢ細胞応答に関して分析することが含まれる。標準的なアッセイは本明細書に説明されており、これにはＣｒ５１アッセイ、エリスポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）アッセイ、テトラマーアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＣＹＰ１Ｂ１に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を測定するためのＦＡＣＳによる細胞内サイトカイン染色分析、ヘルパーＴ応答を測定するためのエリスポット（Ｅｌｉｓｐｏｔ）アッセイおよびＴ細胞増殖試験、ならびにＢ細胞応答を測定するためのＥＬＩＳＡおよびウエスタン分析が含まれる。
【００５３】
配列番号：１などのＣＹＰ１Ｂ１核酸に対する改変は、当業者に周知の方法によって行うことができる。特定の５’および／または３’ ＵＴＲ配列の除去は、適切なプライマー対を用いたテンプレートのＰＣＲ増幅および増幅産物の発現ベクター中へのサブクローニングによって行える。例えば、配列番号：１８および配列番号：１９を欠く核酸は、配列番号：１の核酸をテンプレートとし、配列番号：１の３６３〜３８２の領域に対応するプライマー（プライマー１）および配列番号：１の１９９１〜２０１０の領域に対応するプライマー（プライマー２）を用いるＰＣＲ増幅によって構築可能である。
【００５４】
図２Ａ〜２Ｃは、ＣＹＰ１Ｂ１をコードする核酸の３つの例を示している。これらの図は配列番号：１のヌクレオチド位置を参照している。図２Ａは配列番号：１の完全長ＣＹＰ１Ｂ１核酸である。図２Ｂは配列番号：１の切断型であり、５’ＵＴＲおよび３’ ＵＴＲの一部を欠いたものである。図２Ｃは、図２ＡのＣＹＰ１Ｂ１核酸に存在する５’ ＵＴＲのすべて、さらには３’ ＵＴＲ配列のすべてを欠いたものである。
【００５５】
ポリペプチドをコードする核酸の発現を促進するために、核酸に調節因子を含めることができる。これらの因子には、ヒトまたは他の哺乳動物の細胞における発現を増強させるための配列、例えばプロモーターおよび／またはエンハンサーが含まれる。例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、ＣＭＶ、ＲＳＶもしくはＬＴＲなどのウイルスプロモーター、筋特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーター、ＡＰＣ特異的プロモーターなどの細胞特異的プロモーター、または誘導性プロモーターを、選択的にはコード配列の５’末端に存在させる。誘導性プロモーターの例には、メタロチオネインプロモーター（例えば、Ｔｅｓｔａら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５４：４５０８を参照）およびテトラサイクリン応答性プロモーター（例えば、Ｇｉａｖａｚｚｉら（２００１）６１：３０９を参照）が含まれる。
【００５６】
本核酸に、ＲＮＡ安定化配列、例えば、コード配列の５’側および／または３’側に置かれたアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）β−グロビン遺伝子由来のＲＮＡ安定化配列；イントロン（これはコード配列の内部または隣接した任意の位置に配置しうる）；ポリ（Ａ）付加部位；複製起点；ならびに原核および／または真核宿主における構築物の複製および選択を可能にする選択マーカー（例えばカナマイシン耐性遺伝子）または栄養要求性マーカーをコードする１つまたは複数の遺伝子、を含めることもできる。
【００５７】
本核酸に、天然のＣＹＰ１Ｂ１転写物に由来するものでない翻訳調節配列を含めることもできる。翻訳調節配列は当技術分野で知られている（例えば、ＡｚｉｚおよびＭｕｎｒｏ（１９８７）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４：８４７８を参照）。翻訳調節配列を本明細書に記載の転写ユニットに付加することにより、タンパク質発現の翻訳調節が可能になる。例えば、コードされるタンパク質の翻訳に鉄応答性イベントを付与する目的で、フェリチンｍＲＮＡの５’ ＵＴＲの最初の６７ヌクレオチド（ＡｚｉｚおよびＭｕｎｒｏ、前記）を本明細書に記載の転写ユニットと連結することができる。
【００５８】
本核酸に、他の転写シグナルおよび翻訳シグナル、例えばコザック配列、さらにはＦＬＡＧ、ｍｙｃ、ＨＡまたはＨｉｓタグなどの抗体決定基をコードする配列などを、選択的にはコード配列の５’または３’末端であって終止コドンの前に存在するように、含めてもよい。
【００５９】
ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドをコードする核酸は、哺乳動物の抗原提示細胞（ＡＰＣ）における発現を可能にする任意のベクター中に含めることができる。核酸を発現ベクター、すなわち内部でコード配列が発現制御配列と機能的に結合しているベクター中にクローニングしてもよい。本発明に有用なベクターには、線状の核酸断片または環状のＤＮＡ、プラスミドベクター、ウイルスベクター、真菌ベクターおよび細菌ベクターが含まれる。「プラスミド」とは、自律性で自己複製能のある染色体外の環状ＤＮＡのことである。好ましいウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、ＳＶ４０ウイルス、アルファウイルスまたはヘルペスウイルスに由来するものである。適したベクターの例には、一連のｐｃＤＮＡ哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がある。
【００６０】
核酸は単一のポリペプチドをコードすることもでき、二重プロモーターベクターのように、それぞれが異なるプロモーターの制御下にある複数のポリペプチドをコードすることもできる。二重プロモーターベクターにより、所定のベクターから産生されるエピトープの数を減らさずに、２つの短いポリペプチドを単一の長いものの代わりに用いることが可能となる。また、第１のポリペプチドの配列およびおそらくはプロセシングを変化させずに、新たなＣＹＰ１Ｂ１配列を追加することも可能となる。２つの関係のないタンパク質、例えばＣＹＰ１Ｂ１および免疫刺激物質をコードすることも可能である。または、核酸は、２つのコード配列の間、例えば本明細書に記載の２つのポリペプチドをコードする核酸配列の間の位置にＩＲＥＳ配列を含む。ＩＲＥＳ配列はリボソームを下流の翻訳単位の開始コドンに結合させ、単一のポリシストロン性ｍＲＮＡからの第２のタンパク質の翻訳を引き起こす。２つ以上のポリペプチドをコードする発現ベクターは、選択的には、１つの分泌性ポリペプチドおよび１つの非分泌性ポリペプチドをコードすることが可能である。このようなベクターは、Ｔ細胞応答およびＢ細胞応答の両方を誘導するために用いることができる。また、２つの関係のないタンパク質、例えばＣＹＰ１Ｂ１および免疫刺激物質をコードさせるためにこれを用いることもできる。
【００６１】
ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチド
本発明の核酸は、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子または免疫グロブリン受容体と結合する少なくとも１つのペプチドエピトープを含むＣＹＰ１Ｂ１またはその一部を含むポリペプチドをコードする。本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドのアミノ末端に、翻訳を促すためのメチオニン残基をコードすることができる。本ポリペプチドは、ＣＹＰ１Ｂ１の複数のエピトープ、さらにはそれぞれが１つまたは複数のエピトープを含むＣＹＰ１Ｂ１の複数の区域を含みうる。ＣＹＰ１Ｂ１のＭＨＣ結合エピトープは当業者に周知の方法によって同定可能である。ＭＨＣクラスＩ結合ペプチドは一般に長さが８〜１０アミノ酸残基であり、一方、ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドは一般に長さが１２〜３０アミノ酸残基である。
【００６２】
特定のＭＨＣアレルと結合するエピトープは、ＣＹＰ１Ｂ１由来の一連の重複性ペプチド断片をまず合成し、ＭＨＣアレルと結合することが知られた放射標識ペプチドを用いる当技術分野で知られた結合試験によりペプチドを試験することによって同定可能である。被験ペプチドが、例えば、放射標識した被験ペプチドとの競合による評価で、ＭＨＣアレルと特異的に結合すること（すなわち、エピトープであること）が示されれば、そのエピトープを別のエピトープ（重複性または隣接性）と組み合わせて何らかの区域を作製または規定することができる。上記の方法および関連した方法の例は、米国特許第６，０３７，１３５号、国際公開公報第９９／４５９５４号および国際公開公報第０４４７７５Ａ２号に記載されており、これらは参照として本明細書に組み入れられる。
【００６３】
または、放射標識したβ２−ミクログロブリンおよび被験ペプチドの存在下での可溶性ＭＨＣクラスＩ分子のリフォールディングによってエピトープを同定することもできる。完全な複合体はリフォールディングし、正しいサイズの受容体を生じると考えられる。β２−ミクログロブリンは、被験ペプチドの結合親和性と直接相関する測定可能な速度で複合体から解離する（Ｇａｒｂｏｃｚｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：３４２９；Ｐａｒｋｅｒら（１９９２）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：５４５１；およびＰａｒｋｅｒら（１９９２）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９：１８９６）。この種のデータの解析により、ＨＬＡ−Ａ２受容体に関して所定の被験ペプチドの解離時間を予測するアルゴリズムが得られている（Ｐａｒｋｅｒら（１９９４）Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５２：１６３）。迅速な解離は低い親和性と、緩徐な解離は高い親和性と相関づけられている。このアルゴリズムは敷衍され、ＨＬＡ−Ａアロタイプ、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ２４に関するエピトープの結合親和性の予測に利用できるようになっている。このアルゴリズムはウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｂｉｍａｓ．ｄｃｒｔ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｍｏｌｂｉｏ／ｈｌａ＿ｂｉｎｄ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）で見ることができる。エピトープが有効な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答を生じさせるには、それが抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣ分子と結合し、その結果生じた受容体−リガンド複合体がＣＴＬ上に発現されたＴ細胞受容体によって認識される必要がある。
【００６４】
または、米国特許第５，８２７，５１６号および米国特許出願第０９／３７２，３８０号（これらは参照として本明細書に組み入れられる）などに記載された技法を用いてＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ結合ペプチドを同定することにより、エピトープを同定することもできる。
【００６５】
上記のＭＨＣ分子とインビトロで結合するエピトープを、インビトロ免疫感作アッセイで、ヒトＴ細胞応答を誘発する有効性に関して評価すること（またはＴ細胞応答を生じさせるために用いること）ができる（例えば、Ｓｃｈｕｌｔｚｅら（１９９７）Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １００：２７５７を参照）。この種のアッセイは以前に、ヒトおよびマウスのＴ細胞応答性エピトープを同定するために用いられている（Ａｌｅｘａｎｄｅｒら（１９９６）Ａｍｅｒ． Ｊ． Ｏｂｓｔｅｔ． ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏｌ、１７５：１５８６；Ｔａｒｐｅｙら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８１：２２２）。これらのアッセイは、免疫療法のために多数の特異的ＣＴＬを作製する目的にも用いられる（Ｔｓａｉら（１９９８）Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８：６５）。信頼性を確保するためには、被験ペプチドによるパルス刺激を行った樹状細胞（ＤＣ）の存在下で１回目のＴ細胞刺激を行うことが望ましい。さらに、刺激時にＩＬ−１０を含めることにより、細胞の培養中に起こることが時にある非特異的な反応が抑制されるとかもしれない。続いて、Ｔ細胞の活性化を、λ−ＩＦＮ分泌を測定するＥＬＩＳＡアッセイを用いて、ＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＴＮＦα、ＩＦＮ−γもしくはＩＬ−２などのサイトカインを測定するエリスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）により、またはλ−ＩＦＮなどのサイトカインを含むＣＤ８＋、ＣＤ１６−細胞の増加を三色分析によって判定するＦＡＣＳを用いることによって検討する。または、Ｔ細胞の活性化を、５１Ｃｒ放出ＣＴＬアッセイまたはテトラマーアッセイを用いて測定することもできる（例えば、Ｍｏｌｌｄｒｅｍら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ６：１０１８を参照）。
【００６６】
所定のアロタイプを有するすべての個体が特定のエピトープに反応するとは限らない可能性がある。例えば、ＨＬＡ−Ａ２アロタイプを有する細胞を持つある個体は所定のエピトープに反応するが、同じような第２の個体は反応しないことが考えられる。この問題を克服するためには、２体のドナー、さらにより好ましくは３体のドナーからのＴ細胞に関してそれぞれのＨＬＡアロタイプを検討し、それがＴ細胞エピトープであることを確認するとよい。さらに一般的なアレル（すなわち、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ３）の場合は、最大で４体のドナーを検討することが好ましい。
【００６７】
各エピトープの検討は、まず１体のドナーからの細胞を用いて行う。第１のドナーの細胞を用いてエピトープがＴ細胞応答を誘発しなければ、第２のドナー、さらには第３ドナーからの細胞を用いてさらに検討する。２回または３回の試行を行ってもエピトープがＴ細胞応答性を示さなければ、選択的には、これをポリペプチドに含めるものとしては選択しない。
【００６８】
抗原のインビトロ提示を行う方法を変更することにより、分析を強化することもできる。ＤＣによるＴ細胞の初回刺激は通常、インビトロ免疫処置の一部である。免疫感作を増強するために、十分な抗原提示およびＴ細胞刺激が確実に行われるように、例えば、前もって作製した後に凍結しておいたＣＤを用いて、各刺激時にＤＣを加えることができる。または、ＡＰＣの細胞表面ＣＤ４０受容体に対する抗体結合によって抗原提示細胞（ＡＰＣ）を活性化することにより、Ｔ細胞刺激を増強させることもできる。
【００６９】
または、エピトープを、ＨＬＡ分子に対する結合親和性のみに基づいて構築物中に含めるために選択すること、または、本明細書ならびにシッツ（Ｃｈｉｃｚ）ら（１９９３）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８：２７および米国特許第５，８２７，５１６号における記載のように、自然にプロセシングされたペプチドの分析に基づいて同定することも可能である。
【００７０】
Ｂ細胞エピトープは、哺乳動物における免疫応答を誘導する能力に基づいて選択することができる。例えば、ＣＹＰ１Ｂ１ペプチドをフロイントアジュバントと混合してマウスに注射する。免疫処置動物から血清を採取し、ＣＹＰ１Ｂ１に対する応答性に関してウエスタンブロットによる試験を行う（市販されている、Ｇｅｎｔｅｓｔ、Ｗｏｂｕｒｎ ＭＡ）。
【００７１】
本発明の核酸によってコードされるポリペプチドは、必ずしも配列番号：２の完全長ＣＹＰ１Ｂ１タンパク質を含む必要はない。例えば、本発明の核酸によってコードされるポリペプチドは、天然のＣＹＰ１Ｂ１の生物活性を欠くことができる（例えば、Ｈｅｉｄｅｌら（２０００）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ６０：３４５４）。ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはその一部をコードする核酸が、機能喪失型変異（例えば挿入、欠失、フレームシフト変異または一塩基変異）を有するコード配列を含むこともできる（Ｂａｉｌｅｙら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５８：５０３８）。ＣＹＰ１Ｂ１コード配列中のフレームシフト変異の例は、ストイロフ（Ｓｔｏｉｌｏｖ）ら（１９９７）Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． ６：６４１およびサーファラージ（Ｓａｒｆａｒａｚｉ）ら（１９９７）Ｈｕｍ． Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． ６：１６６７に記載されている。もう１つの例において、ポリペプチドは、ヒンジ領域（例えば、配列番号：２のアミノ酸約３８〜６１）または配列番号：２のアミノ酸約４００〜５４０の間に位置するＣＹＰ１Ｂ１のヘム結合部分の保存的コア配列の全体もしくは一部を欠くことができる（Ｓｔｏｉｌｏｖら（１９９８）Ａｍ． Ｊ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔ． ６２：５７３）。もう１つの例において、ポリペプチドは、ＣＹＰ１Ｂ１の酸化還元ドメインの全体もしくは一部を欠くことができ、または活性部位領域（Ｌｅｗｉｓら（１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ １３９：５３）もしくはタンパク質のフォールディングもしくは安定性のために必要な領域に変異を有することができる。もう１つの例において、ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸約１８〜３７の間に位置するＣＹＰ１Ｂ１膜貫通領域の全体または一部を欠くことができる。
【００７２】
図３は、ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチド（配列番号：２）ならびにその断片および変種を示している。図３に示した種々のポリペプチドは、ＣＹＰ１Ｂ１をコードする本明細書に記載の核酸、例えば、５’ ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲの全体または一部を欠く核酸によってコードされうる。ポリペプチドの中には配列番号：２２のペプチドを含むものもある。図３に示したＣＹＰ１Ｂ１断片および変種を以下に説明する。
【００７３】
配列番号：３１
本ポリペプチドは、ＣＹＰ１Ｂ１のヒンジ領域内に４アミノ酸（配列番号：２の残基５１〜５４）の欠失を含む。本ポリペプチドは、野生型タンパク質と比較して、残基５７（ＷからＣに）、６１（ＧからＥに）、３６５（ＧからＷに）、３７９（ＰからＬに）および３８７（ＥからＫに）にアミノ酸の変化を含む。変化した残基には下線を付した。配列番号：３１のアミノ酸配列を以下に列挙する：
2004534510.tif 000006
【００７４】
配列番号：３２
本ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸１〜６０の欠失を含む。欠失はＣＹＰ１Ｂ１のＥＲドメイン、膜貫通ドメインおよびヒンジ領域を包含する。メチオニン（下線を付した）は配列番号：３２のポリペプチドのアミノ末端に位置する。本ポリペプチドは、野生型タンパク質と比較して、残基３６５（ＧからＷに）、３７９（ＰからＬに）および３８７（ＥからＫに）にアミノ酸の変化を含む。変化した残基には同じく下線を付した。この配列はＦ１Ｒ１と命名された。配列番号：３２のアミノ酸配列を以下に列挙する：
2004534510.tif 000007
【００７５】
配列番号：３３
本ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸１〜６０および４６２〜５４３の欠失を含む。欠失はＣＹＰ１Ｂ１のＥＲドメイン、膜貫通ドメインおよびヒンジ領域を包含する。メチオニン（下線を付した）は配列番号：３３のポリペプチドのアミノ末端に位置する。本ポリペプチドは、野生型タンパク質と比較して、残基３６５（ＧからＷに）、３７９（ＰからＬに）および３８７（ＥからＫに）にアミノ酸の変化を含む。変化した残基には同じく下線を付した。この配列はＦ１Ｒ２と命名された。配列番号：３３のアミノ酸配列を以下に列挙する：
2004534510.tif 000008
【００７６】
配列番号：３４
本ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸１〜１７１の欠失を含む。欠失はＣＹＰ１Ｂ１のＥＲドメイン、膜貫通ドメインおよびヒンジ領域を包含する。メチオニン（下線を付した）は配列番号：３４のポリペプチドのアミノ末端に位置する。本ポリペプチドは、野生型タンパク質と比較して、残基３６５（ＧからＷに）、３７９（ＰからＬに）および３８７（ＥからＫに）にアミノ酸の変化を含む。変化した残基には同じく下線を付した。この配列はＦ２Ｒ１と命名された。配列番号：３４のアミノ酸配列を以下に列挙する：
2004534510.tif 000009
【００７７】
配列番号：３５
本ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸１〜１７１および４６２〜５４３の欠失を含む。欠失はＣＹＰ１Ｂ１のＥＲドメイン、膜貫通ドメインおよびヒンジ領域を包含する。メチオニン（下線を付した）は配列番号：３５のポリペプチドのアミノ末端に位置する。本ポリペプチドは、野生型タンパク質と比較して、残基３６５（ＧからＷに）、３７９（ＰからＬに）および３８７（ＥからＫに）にアミノ酸の変化を含む。変化した残基には同じく下線を付した。この配列はＦ２Ｒ２と命名された。配列番号：３５のアミノ酸配列を以下に列挙する：
2004534510.tif 000010
【００７８】
配列番号：３６
本ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸１〜２９２の欠失を含む。欠失はＣＹＰ１Ｂ１のＥＲドメイン、膜貫通ドメインおよびヒンジ領域を包含する。本ポリペプチドは、野生型タンパク質と比較して、残基３６５（ＧからＷに）、３７９（ＰからＬに）および３８７（ＥからＫに）にアミノ酸の変化を含む。変化した残基には下線を付した。この配列はＦ３Ｒ１と命名された。配列番号：３６のアミノ酸配列を以下に列挙する：
2004534510.tif 000011
【００７９】
配列番号：３７
本ポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸１〜２９２および４６２〜５４３の欠失を含む。欠失はＣＹＰ１Ｂ１のＥＲドメイン、膜貫通ドメインおよびヒンジ領域を包含する。本ポリペプチドは、野生型タンパク質と比較して、残基３６５（ＧからＷに）、３７９（ＰからＬに）および３８７（ＥからＫに）にアミノ酸の変化を含む。変化した残基には下線を付した。この配列はＦ３Ｒ２と命名された。配列番号：３７のアミノ酸配列を以下に列挙する：
2004534510.tif 000012
【００８０】
挿入、欠失、フレームシフト変異または一塩基変異をＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチド配列に導入し、野生型タンパク質と比較して安定性および／または生物活性が変化したポリペプチドを得ることができる。ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドの安定性を変化させることにより、細胞機構によるそのプロセシングに影響を及ぼすことができる。例えば、安定性の低下したＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドはより多くのプロセシングを受け、それによってＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子によって提示されるＣＹＰ１Ｂ１ペプチドが増加すると考えられる。ＣＹＰ１Ｂ１の生物活性を変化（例えば、低下または消失）させることにより、酵素活性などの不要な活性を低下または消失させることができる。
【００８１】
以下のものは、野生型ＣＹＰ１Ｂ１タンパク質と比較して、３つ（配列番号：３８）および５つ（配列番号：３９）のアミノ酸残基に変化を含むＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドの例である。
【００８２】
配列番号：３８
本ポリペプチドは、野生型タンパク質と比較して、残基５７（ＷからＣに）、６１（ＧからＥに）および３６５（ＧからＷに）にアミノ酸の変化を含む。変化した残基には下線を付した。配列番号：３８のアミノ酸配列を以下に列挙する：
2004534510.tif 000013
【００８３】
配列番号：３９
本ポリペプチドは、野生型タンパク質と比較して、残基５７（ＷからＣに）、６１（ＧからＥに）、３６５（ＧからＷに）、３７９（ＰからＬに）および３８７（ＥからＫに）にアミノ酸の変化を含む。変化した残基には下線を付した。配列番号：３９のアミノ酸配列を以下に列挙する：
2004534510.tif 000014
【００８４】
上記のように、本明細書に記載の核酸によってコードされるポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子または免疫グロブリン受容体と結合するＣＹＰ１Ｂ１またはその一部を含む。ポリペプチドは、配列番号：２に存在する連続したアミノ酸の配列に対応する２５、５０、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００個またはそれ以上のアミノ酸を含みうる。加えて、ポリペプチドの長さは３００、２００、１５０、１００または５０未満のアミノ酸でありうる。例えば、ポリペプチドは配列番号：２０（配列番号：２のアミノ酸１〜２７２）または配列番号：２１（配列番号：２のアミノ酸２７３〜５４４）を含みうる。
【００８５】
本明細書に記載の任意のＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはその断片は、野生型ＣＹＰ１Ｂ１タンパク質または改変型ＣＹＰ１Ｂ１配列と同一な配列の全体または一部を含みうる。例えば、本明細書に記載したそれらの任意のものの構造を有するポリペプチド（例えば、図３に示したポリペプチド）を、配列番号：３８および／または配列番号：３９のポリペプチド中に含まれるアミノ酸変化のうち任意の１つまたは複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）を含むように作製することができる。
【００８６】
本明細書に記載の核酸によってコードされるポリペプチドは、配列番号：２のアミノ酸残基１９０〜１９８に対応するアミノ酸配列ＦＬＤＰＲＰＬＴＶ（配列番号：２２）を含みうる。配列番号：２２のペプチドは、ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドの自然にプロセシングされたエピトープである。加えて、ポリペプチドは、配列番号：２３（配列番号：２のアミノ酸残基１８５〜２０５）の配列に由来する少なくとも８アミノ酸を含むことができる。配列番号：２２または配列番号：２３を含むポリペプチドの長さは３００、２００、１５０、１００または５０アミノ酸でありうる。
【００８７】
さらに、本発明の核酸が、ポリペプチドを希望する細胞内区画に向かわせるターゲティングシグナルであって、そのポリペプチドと結合したターゲティングシグナルをコードする１つまたは複数の配列を含んでもよい。ターゲティングシグナル（この用語は輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）シグナルまたはターゲティング配列と互換的に用いられる）は、タンパク質を分泌の標的とすること、またはポリペプチドを小胞体（ＥＲ）、ゴルジ体、核、リソソーム、クラスＩＩペプチドローディング区画もしくはエンドソームに向かわせることができ、これには、シグナルペプチド（翻訳時にタンパク質をＥＲに向かわせるアミノ末端配列）、ＫＤＥＬ（配列番号：２４）などのＥＲ保持ペプチド、ＫＦＥＲＱ（配列番号：２５）、ＱＲＥＦＫ（配列番号：２６）などのリソソームターゲティングペプチド、ならびにＱに隣接して一方の側にＫ、Ｒ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、ＶおよびＬから選択される４残基が並んだ他のペンタペプチドが含まれる。ポリペプチドの分泌を導くターゲティングシグナル（例えば、配列番号：４０）も含まれる。また、ポリペプチドの膜への挿入を導くターゲティングシグナル（例えば、膜貫通配列）も含まれる。膜挿入配列を含むポリペプチドを細胞質尾部を有するように構築することもでき、有しないように構築することもできる。
【００８８】
ＥＲターゲティング配列の一例は、ＨＬＡ−ＤＲαリーダー配列、
2004534510.tif 000015
である。ターゲティング配列がこの特定した２５残基配列の一部分（例えば、少なくとも１０アミノ酸残基）のみを含んでも、その部分がポリペプチドのＥＲへのターゲティングを生じるのに十分であるならばよい。ターゲティング配列のもう１つの例はＥ１Ａ配列である。
【００８９】
核移行配列には、チャイスキー（Ｃｈｅｉｓｋｙ）ら（１９８９）Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ９：２４８７；ロビンス（Ｒｏｂｂｉｎｓ）（１９９１）Ｃｅｌｌ ６４：６１５；およびディングウォール（Ｄｉｎｇｗａｌｌ）ら（１９９１）ＴＩＢＳ １６：４７８に記載されたような、ヌクレオプラスミン様およびＳＶ４０様の核ターゲティングシグナルが含まれる。いくつかの核移行配列は、
2004534510.tif 000016
を含む。
【００９０】
場合によっては、シグナルペプチダーゼまたは他のタンパク分解物質による切断を促進するために、ターゲティングシグナルのアミノ酸配列を改変することが望ましい。シグナルペプチダーゼの認識配列はフォン・ハイーヌ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ）（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １４：４６８３に記載されている。フォン・ハイーヌ（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ）の−３、−１ルールを用いると、ターゲティングシグナルが存在する際にシグナルペプチダーゼによる切断が成功する確率を高める配列を選択することができる。
【００９１】
場合によっては、ポリペプチドの安定性を変化させることにより、ポリペプチド配列を野生型ＣＹＰ１Ｂ１配列から改変することが望ましい。ポリペプチドの安定性を低下させる１つの方法は、プロテアソームに対するそのターゲティング性を高めることによる。例えば、ユビキチン配列を含むターゲティングシグナルを本明細書に記載のポリペプチドと結合し、ポリペプチドを分解のために細胞プロテアソームに向かわせることができる（例えば、Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ（１９９５）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ７：２１５〜２２３；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら（１９９７）Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：８４９７〜８５０３）。ポリペプチドの安定性を低下させる別の方法では、ポリペプチドが、タンパク質安定性に寄与するＣＹＰ１Ｂ１配列の全体または一部、例えば、ヒンジ領域（配列番号：２のアミノ酸約３８〜６１）の全体または一部を欠くことができる。１つの例において、ポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸５１〜５４の間に位置するＰＰＧＰ領域を欠く（例えば、配列番号：３１のポリペプチドを参照）。
【００９２】
または、ポリペプチドがターゲティングシグナルを欠くこともでき、こうするとポリペプチドは細胞質に位置すると考えられる。
【００９３】
ひとたび細胞内で発現されると、コードされたペプチドはプロセシングされ、複数のＭＨＣクラスＩ結合エピトープのいずれか１つとなる。ＭＨＣ分子はペプチドと結合するとＴ細胞応答を活性化することができる。ＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドもコードされたペプチドから生じうる。これらのペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞によって提示されるとヘルパーＴ細胞またはＣＴＬを活性化すると考えられる。他の受容体も、コードされたペプチドまたはプロセシングされたその断片と結合し、ＮＫまたはＢ細胞などの免疫細胞を活性化しうる。これらの細胞は、本発明のペプチドに反応して誘発されたサイトカインによっても活性化されうる。１つの例では、配列番号：４０などの分泌シグナルをポリペプチドに付加し、ポリペプチドの分泌およびＢ細胞などの免疫細胞の活性化をもたらす。
【００９４】
ＣＹＰ１Ｂ１の複数の区域を含むポリペプチドにおいて、ポリエピトープ性ポリペプチド内部の区域の順序は、それらの区域が天然のＣＹＰ１Ｂ１タンパク質中に存在する順序に対応しうるが、天然のタンパク質中で個々の区域の間にあるアミノ酸配列のいくつか（すなわち、少なくとも１つの残基）が欠失してもよい。または、区域の順序が天然のタンパク質のものと異なってもよい。このプロセスによって作製されるタンパク質は分子進化（例えば、米国特許第６，１３２，９７０号を参照）、エクソンシャッフリングまたはドメインシャッフリングのアプローチによってデザインされたものでもよい。
【００９５】
ポリペプチドがプロセシングされ、エピトープがＭＨＣによって提示されたか否かを明らかにするためには、ポリエピトープ性ポリペプチドコード配列を含む組換えワクシニアウイルスに感染させた自己脾細胞、ＰＢＬまたはＥＢＶ形質転換細胞を用いてインビトロＴ細胞刺激アッセイを行うとよい。これらの標的細胞は、脾細胞またはＰＢＬを、３〜１０プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞の多重感染度（ｍｏｉ）の組換えワクシニアとともに３７℃で２時間インキュベートすることによって作製する。感染後に細胞をペレット化し、洗浄した上でインビトロ刺激アッセイにおける標的として用いる。異なるＭＨＣアロタイプを有する１つまたは複数の個体、例えばマウスまたはヒト由来（またはＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドもしくは核酸構築物による免疫処置を行った１つもしくは複数の個体由来）の刺激したＴ細胞を標的細胞とともにインキュベートし、標的細胞がＴ細胞を刺激する能力を、例えばλ−インターフェロンの発現または分泌によって測定する。
【００９６】
または、ポリエピトープ性ポリペプチドからのエピトーププロセシングを、ヒト細胞から精製したプロテアソームを用いて検討することもできる（Ｔｈｅｏｂａｌｄら（１９９８）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １８８：１０１７；Ｋｉｓｓｅｌｅｖら（１９９９）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２８９：３３６３；およびＮｕｓｓｂａｕｍら（１９９８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：１２４０４）。
【００９７】
Ｔ細胞アッセイのほかに、例えばトランスジェニックマウスを用いるアッセイを用いて、インビボで送達した場合の構築物の機能（例えば、エピトープが正しくプロセシングされて提示されること）を確認することもできる。ＨＬＡ−Ａ２拘束性の提示を測定するためには、哺乳動物発現ベクター（例えば、プラスミド）中にあるポリエピトープ構築物を微粒子内に封入し、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスに筋肉内または皮下注射などの経路によって導入する。または、微粒子送達媒体を用いずに、構築物を例えば、組換えウイルスもしくは細菌ベクター、例えばワクシニアウイルス中にある形で、または裸のＤＮＡとして投与してもよい。その後にインビトロでＴ細胞応答を評価する（Ｈｅｄｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ． ４：３６５〜６８、１９９８）。標的細胞としては、被験Ａ２エピトープによるパルス刺激を加えたＴ２Ａ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２をコードするＤＮＡをトランスフェクトしたＴ２細胞）またはＥＬ４．Ａ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２をコードするＤＮＡをトランスフェクトしたＥＬ４細胞）、および本発明の核酸を導入したＴ２Ａ２細胞が可能である。ペプチドを用いない、または無関係なペプチドによるパルス刺激を加えたＥＬ４．Ａ２細胞またはＴ２Ａ２細胞を用いる試験を平行して行う。このようにして、本発明の核酸の投与後にインビボでプロセシングされて提示されるＨＬＡ−Ａ２エピトープが同定される。陽性の結果が得られれば、ポリエピトープ性ポリペプチドのプロセシングが予想通りに起こったことが示唆される。
【００９８】
または、ハンケ（Ｈａｎｋｅ）ら（１９９８）Ｖａｃｃｉｎｅ １６：４２６の方法に従って、または米国特許出願第６０／１５４，６６５号および米国特許出願第６０／１６９，８４６号（これらは参照として本明細書に組み入れられる）に記載されたように、ポリエピトープ性ポリペプチドを作製してもよい。
【００９９】
免疫刺激物質
組成物は、本明細書に記載の核酸のほかに、アジュバントもしくは免疫刺激物質、または免疫刺激物質をコードする核酸を含むことが可能である。有用なアジュバントおよび免疫刺激物質の例には以下のものが含まれる：ＩＳＣＯＭＳ、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、ミョウバン、金、フロイントアジュバント、サイトカイン、例えばＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γなど；Ｂ７−１、Ｂ７−２またはＣＣＲ５などの細胞表面受容体；リポ多糖（ＬＰＳ）；モノホスホリルリピドＡ；ＱＳ２１；例えば長さ１８〜３０ヌクレオチドのＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド；および細菌毒素などの細菌性ポリペプチド。樹状細胞などの専門化した抗原提示細胞の分化または活性化を刺激する化合物は、免疫刺激物質として有用である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドの例は米国特許第６，２３９，１１６号に記載されている。選択的には、本明細書に記載のポリペプチドおよび免疫刺激物質をコードする核酸を、単一のベクター、例えば本明細書に記載の二プロモーターベクターまたはＩＲＥＳベクター中に含めることができる。または、本発明の核酸が、免疫刺激物質とインフレームに融合したＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはその一部をコードすることもできる。この種の融合タンパク質の作製方法は当技術分野で周知であり、例えば国際公開公報第９５／０５８４９号に記載されている。
【０１００】
方法
本発明の核酸を、リンパ増殖性疾患もしくは癌などのさまざまな種類の細胞増殖性疾患を有することが判明している個体、さまざまな種類の癌を有する疑いのある個体、またはさまざまな種類の癌に罹患しやすい個体（例えば、癌の易罹病性に関する遺伝子的および／または遺伝的な徴候、例えばＢＲＣＡ１遺伝子の変異を有する個体）において免疫原として用いることができる。他の適した個体には、癌に関連した疾患の症状を呈している、またはそれを発症する可能性が高い例が含まれる。核酸は、種々の細胞増殖性疾患または癌、例えば膀胱、乳房、結腸、結合組織、肺、食道、皮膚、リンパ節、脳、卵巣、胃、子宮、精巣および前立腺の癌に関連した疾患を予防または治療するために予防的または治療的に用いることができる。１つの例では、核酸をワクチンとして用いる。
【０１０１】
ペプチドをコードする核酸は、さまざまな種類の増殖性疾患もしくは癌またはこれらの増殖性疾患もしくは癌に関連した疾患を治療するために、単独で投与することもでき、または当技術分野で知られた他の治療法、例えば化学療法、放射線療法および外科手術と組み合わせて投与することもできる。さらに、本発明の核酸を、免疫応答を増強するためにデザインされた他の治療と組み合わせて、例えば、当技術分野で周知のように、アジュバント、ビタミン、免疫刺激物質またはサイトカイン（またはサイトカインをコードする核酸）との同時投与によって、投与することもできる。核酸および免疫刺激物質を含む組成物については本明細書で説明している。
【０１０２】
本発明の核酸を、種々の癌またはこれらの癌に関連した疾患の予防または治療のための医薬品の製造に用いることもできる。
【０１０３】
ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはその部分をコードする核酸は、急速に増殖している細胞集団または腫瘍、例えば、ＣＹＰ１Ｂ１タンパク質を発現し、ＣＹＰ１Ｂ１ペプチドをＭＨＣ分子と関連づけて提示する腫瘍、またはＣＹＰ１Ｂ１タンパク質を細胞表面に発現する腫瘍に対する癌罹患動物（ｐａｔｉｅｎｔ）の免疫応答を誘発するための免疫療法に用いることができる。天然型のＣＹＰ１Ｂ１転写物は翻訳の部分的または全体的な抑制の一因となる翻訳抑制因子を含むと考えられるため、個体の免疫系はＣＹＰ１Ｂ１に対してナイーブまたは寛容であると思われる。他の細胞におけるＣＹＰ１Ｂ１タンパク質の発現は免疫学的自己寛容をもたらすと思われ、このため、自己寛容を妨げる機構によって本発明の核酸の有効性が高まると思われる。例えば、本発明の核酸は翻訳抑制因子を少なくとも１つ欠いており、このため、ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはその部分の翻訳が増強された系を提供し、それによって個体の免疫系に抗ＣＹＰ１Ｂ１免疫応答を生じさせる能力がある。本明細書に記載のポリペプチドを個体の１つの細胞、例えば非悪性ＡＰＣなどの非悪性細胞に産生させて、個体の別の細胞、例えば癌細胞に対する体液性および／または細胞免疫応答を生じさせることが可能である。
【０１０４】
高レベルの発癌物質に曝露された個体、例えば喫煙者の中には、ＣＹＰ１Ｂ１を高レベルに発現し、このためこのタンパク質に対する寛容を示す例があると思われる。本明細書に記載の方法によって抗ＣＹＰ１Ｂ１免疫応答を生じさせることにより、このような個体におけるこの寛容を遮断し、それによってＣＹＰ１Ｂ１発現細胞、例えば癌細胞に対する免疫応答が生じると考えられる。
【０１０５】
本明細書に記載の核酸構築物をエクスビボ治療に用いることもできる。例えば、樹状細胞、末梢血単核細胞または骨髄細胞などの細胞を個体または適切なドナーから採取し、核酸組成物または本明細書に記載の核酸によってコードされるポリペプチドによりエクスビボで活性化した上で、個体に戻すことができる。さらに、筋芽細胞などの細胞に本明細書に記載の核酸発現ベクターをトランスフェクトした上で個体に投与することもできる。このため、ＣＹＰ１Ｂ１を発現する筋芽細胞は、抗ＣＹＰ１Ｂ１免疫応答を生じさせるためのＣＹＰ１Ｂ１のインビボでの源として働く。
【０１０６】
抗ＣＹＰ１Ｂ１免疫応答を生じさせるための本明細書に記載の方法は、抗ＣＹＰ１Ｂ１免疫応答の発生に付随する、テロメラーゼ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）またはｐ５３などの１つまたは複数の追加的な癌関連抗原に対する免疫応答を生じさせることも含みうる。このような免疫応答は、第１のポリペプチドが本明細書に記載のＣＹＰ１Ｂ１含有ポリペプチドであって第２のものが癌関連抗原の全体または一部を含むポリペプチドである、２つのポリペプチドをコードする核酸の投与を含む、さまざまな方法によって活性化することができる。
【０１０７】
いくつかの態様では、構築物によってコードされるポリペプチドは、間接的なアプローチを介して、免疫応答を増強するため、または自己寛容を遮断するために用いることができる。核酸およびそれらによってコードされるポリペプチドは、局所的または全身的な炎症反応をもたらすと考えられる免疫刺激物質を含みうる。ペプチドエピトープをタンパク質に挿入し、結果として生じるタンパク質を免疫原性にする一例は、国際公開公報第９５／０５８４９号に記載があり、これは参照として本明細書に組み入れられる。
【０１０８】
核酸およびコードされるポリペプチドの効果は、初回刺激（例えば、プラスミド、ウイルスベクターまたは細菌ベクターまたはポリペプチド）の後に、免疫応答の増強を助けるために同じ物質による追加刺激を行うことによって増強させることが可能である（例えば、国際公開公報第９８／５６９１９号を参照）。
【０１０９】
核酸または本発明の核酸によってコードされるポリペプチドは、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍の発達を観測するために用いることができる（表２）。マウスに本発明の核酸を含む５０μｇ〜１００μｇのプラスミドによる免疫処置を１〜３回、３週間間隔で行う。プラスミドは微粒子もしくは他の送達媒体中にある形で送達することができ、または裸のＤＮＡとして送達してもよい。その後に腫瘍細胞をマウスに移植する。免疫処置後の何らかの時点（個々の腫瘍によって異なる）で、腫瘍の増殖または活性を初期の増殖または活性と比べて評価することにより、腫瘍の発達を観測する。腫瘍の増殖が緩徐化もしくは抑制されたこと、または活性が低下したことを判定する。ＣＹＰ１Ｂ１をコードする核酸による免疫処置の前に腫瘍を投与することにより、核酸製剤の治療効果を示すための実験を行うこともできる。
【０１１０】
【図２】腫瘍／株の組み合わせ
2004534510.tif 000017
【０１１１】
本発明は、第１の種に属する哺乳動物における免疫応答を誘発する方法であって、哺乳動物、例えばヒトまたはマウスに対して、ＭＨＣクラスＩもしくはクラスＩＩ分子または免疫グロブリン受容体と結合するＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはその一部を含むポリペプチドをコードする核酸を投与することによる方法も含む。これらの方法において、ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドまたはそのＭＨＣ結合部分もしくは免疫グロブリン結合部分は、第２の種、例えばマウスまたはラットなどの齧歯動物の天然のＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチドの配列と同一である。本方法に用いる核酸は、選択的には、本発明の核酸、例えば天然型のＣＹＰ１Ｂ１転写物の非翻訳領域（ＵＴＲ）に認められる配列を欠いた核酸、または変異、欠失、挿入もしくは転位を有するＣＹＰ１Ｂ１をコードする核酸でありうる。核酸は裸の状態で、または本明細書に記載の任意の送達媒体を介して、例えば微粒子またはポリマー性ヒドロゲルマトリックス中にある形で、投与することができる。上記の第１の種に対する核酸の送達が、第１の種におけるヘテロクリティック免疫応答、例えば、第１の種によって内因性に産生されるＣＹＰ１Ｂ１配列に向けられた免疫応答の発生を引き起こしてもよい。このため、本方法は第１の種におけるＴ細胞寛容を遮断し、ＣＹＰ１Ｂ１ Ｔ細胞応答を誘導するために用いうると考えられる。これらの方法において、哺乳動物は癌などの細胞増殖性疾患を有する、またはそれを発症する危険性のあるものでよい。
【０１１２】
核酸の送達
本発明の組成物を、さまざまな癌に対する免疫応答を誘発させることを意図したペプチドを発現する核酸を適切な細胞内に送達するために用いてもよい。遺伝子送達の利点の一つは、抗原性ペプチドが、免疫原性ペプチドが結合するＭＨＣ分子との相互作用が動態的に有利である標的細胞自体の内部で産生されるという点である。これは、抗原性ペプチドをＭＨＣ分子に特異的に指向させない標準的なワクチンプロトコールとは対照的である。または、ポリペプチドを分泌させて、Ｂ細胞などの免疫細胞の活性化をもたらすことも可能である。
【０１１３】
本発明の核酸は、標準的な方法、例えばドネリー（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ）ら、Ｊ． Ｉｍｍ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １７６：１４５、１９９４、およびビチエロ（Ｖｉｔｉｅｌｌｏ）ら、Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９５：３４１、１９９５に記載された方法を用いて投与することができる。本発明の核酸は、当技術分野で知られた任意の様式で、例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、皮内、腹腔内、鼻腔内、膣内、直腸内もしくは皮下に対象に注射することができ、またはそれらを例えば溶液もしくは微粒子を含む粉末の吸入によって消化管、粘膜もしくは気道に導入することができる。または、本発明の組成物を皮膚に適用してもよく、インビトロまたはインビボで細胞または組織への電気穿孔を行ってもよい。または、本発明の組成物を、細胞または組織への導入をもたらす超音波によって投与してもよい。さらに、本発明の組成物を遺伝子銃によって投与してもよい。本発明のポリペプチド、類似体または核酸の持続的で連続的な放出を、例えば浸透ポンプを用いることによって得ることもできる。投与は局所的（例えば、筋肉内、または腫瘍もしくは他の感染部位に対して）または全身的のいずれも可能である。
【０１１４】
核酸は、生理食塩液、脂質、リポソーム、微粒子もしくはナノスフェアなどの薬学的に許容される担体中にある形で、ヒドロゲルとして、コロイド懸濁液として、または粉末として輸送することができる。それらは裸のままでもよく、または送達媒体および／またはトランスフェクション促進物質と会合もしくは複合体を形成させた上で、脂質、リポソーム、ミクロスフェア、微粒子、マイクロカプセル、金、ナノ粒子、ポリマー、濃縮剤、多糖類、ポリアミノ酸、デンドリマー、サポニン、吸着増強物質、またはストレプトリシンＯもしくは脂肪酸などの膜透過化物質といった、当技術分野で知られた送達システムを用いて送達することができる。ヒドロゲルネットワークの例は、２００１年２月２０日に提出された米国特許出願第６０／２７０，２５６号に記載されている。
【０１１５】
核酸は、核酸の核への移動を促す核移行シグナルを含みうる。例えば、核酸は、転写因子などのＤＮＡ結合タンパク質が結合するヌクレオチド配列を含むことが可能である。もう１つの例において、ペプチドを主体とする核移行シグナルを本発明の核酸とともに提供し、それによって核酸の核への移動を促すこともできる。有用なシグナルの例には、ｈｎＲＮＡ配列およびＳＶ４０核移行シグナルが含まれる。核移行ペプチド配列は、例えば、核酸と混合すること、核酸と結合させること、またはリポソームもしくは微粒子などの送達媒体中に組み入れることが可能である。
【０１１６】
その他の標準的な送達方法、例えば微粒子銃による導入またはエクスビボ治療を用いることもできる。エクスビボ治療では、例えば抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞、末梢血単核球または骨髄細胞を罹患動物または適当なドナーから採取し、免疫原性組成物によってエクスビボで活性化した上で、哺乳動物に戻すことができる。
【０１１７】
米国特許第５，７８３，５６７号および２０００年６月２日に提出された米国特許出願第６０／２０８，８３０号に記載されたものを含む微粒子を、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはポリペプチドなどの高分子を細胞に送達するための媒体として用いることができる。このため、それらは本明細書に記載の核酸を、選択的には免疫刺激物質とともに、個体の細胞に送達するために有用と思われる。微粒子は、ポリマーマトリックス中に抱埋された高分子、またはポリマーのシェル内に封入された高分子を含む。微粒子は、例えば封入されたＤＮＡを非分解状態に維持することにより、高分子の完全性を維持するように作用する。微粒子を、高分子のパルス送達のために、および特定の部位またはマクロファージ、単球もしくは樹状細胞などの特定の細胞もしくは細胞集団に送達するために用いることもできる。
【０１１８】
ポリマーマトリックスは、乳酸グリコール酸共重合体、デンプン、ゼラチンまたはキチンなどの生分解性コポリマーでありうる。微粒子を特に、対象の食細胞へのＤＮＡ分子の送達を最大にするために用いることができる。または、微粒子を組織に注射または移植し、そこで沈着物を形成させることもできる。沈着物が分解するにつれて、核酸が経時的に徐々に放出されて、遊離ＤＮＡとして近傍の細胞（ＡＰＣを含む）に取り込まれる。
【０１１９】
微粒子は、マチオヴィッツ（Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ）ら（国際公開公報第９５／２４９２９号）ならびに米国特許第５，８１７，３４３号および第５，９２２，２５３号による記載のようにして製剤化することができ、これらは参照として本明細書に組み入れられる。
【０１２０】
本発明の核酸は、当技術分野で周知の技法を用いて、脂質、デンドリマーまたはリポソームを介して対象に投与することができる。例えば、免疫原性ポリペプチドまたは免疫原性ペプチドをコードする核酸を有するリポソームは、インビボでＣＴＬ反応を誘発することが知られている（Ｒｅｄｄｙら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：１５８５、１９９２；Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４８：３３３６〜３３４１、１９９２；Ｆｒｉｅｓら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：３５８、１９９２；Ｎａｂｅｌら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８９：５１５７、１９９２）。
【０１２１】
本発明の核酸は、コレステロールおよびクイルＡ（サポニン）を混合した際にまたはサポニン単独で自然に形成される大きさが３０〜４０ｎｍの陰性荷電ケージ様構造である、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）を用いて投与することができる。本発明の核酸をＩＳＣＯＭＳととともに投与することもでき、または個別に投与することもできる。
【０１２２】
トキソプラズマ症およびエプスタイン−バーウイルス誘発腫瘍を含むさまざまな感染症の実験モデルで、ＩＳＣＯＭＳを抗原の送達媒体として用いて、防御免疫が誘発されている（Ｍｏｗａｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １２：３８３〜３８５、１９９１）。精製した完全なＨＩＶ−１−ＩＩＩＢ ｇｐ １６０エンベロープ糖タンパク質またはインフルエンザ血球凝集素のいずれかを抗原として、ＩＳＣＯＭＳ中に封入された抗原の用量が１Ｆｇ程度の少なさでもクラスＩ媒介性ＣＴＬ反応が生じることが明らかになっている（Ｔａｋａｈａｓｈｉら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ ３４４：８７３）。
【０１２３】
体重１ｋｇ当たり１回の投与につきＤＮＡ約１μｇ〜２００μｇの用量を投与することが予想される。罹患動物が成人である場合、ワクチンレジメンは例えば、微粒子または他の送達媒体中にある形で送達する場合は１０μｇ〜１０００μｇのＤＮＡの筋肉内、静脈内、経口もしくは皮下投与、または裸のＤＮＡの場合は約１μｇ〜１８μｇの筋肉内もしくは皮内への１回〜１２回の反復投与を含むことができる。当然ながら、医学分野において周知のように、所定の罹患動物（ｐａｔｉｅｎｔ）に対する用量は罹患動物の体格、体表面積、年齢、性別、全般的健康状態；投与の時間および経路；投与する特定の化合物；ならびに同時投与するその他の薬剤を含む、多くの要因に依存する。至適用量の決定は、当業者の薬理学者の能力の範囲内に十分に含まれる。
【０１２４】
核酸に対する免疫系の応答の測定
本明細書に記載の核酸が免疫応答を誘発する能力は、免疫応答を測定するための当技術分野で周知の方法を用いてアッセイすることができる。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞の生成は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、細胞内サイトカインの発現の測定により、またはＭＨＣテトラマーの使用により、示すことができる。ＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴなどの標準的なアッセイを用いて、Ｔ細胞活性化に起因するサイトカインプロファイルを測定することもできる。３Ｈ−チミジン取り込みおよび当技術分野で知られた他のアッセイなどのアッセイを用いて、Ｔ細胞増殖を測定することもできる。Ｔ細胞応答性の評価にはＤＴＨ反応の測定を用いることができる。Ｂ細胞応答はＥＬＩＳＡなどの当技術分野で知られたアッセイを用いて測定可能である。
【０１２５】
その他の方法、例えばデジタル画像化ならびに細胞診、コルポスコピーおよび組織学的な評価を用いて、さまざまな種類の増殖性疾患または癌に対する免疫原性ペプチドおよび免疫原ペプチドをコードする核酸の効果を評価することもできる。
【０１２６】
以下は本発明の実施に関する実施例である。これらはいかなる形でも本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【０１２７】
実施例
実施例１  ヒトＣＹＰ１Ｂ１ ｃＤＮＡ構築物の作製
ヒトＣＹＰ１Ｂ１（配列番号：２）およびＣＹＰ１Ｂ１−ｄｅｌｔａ ３（配列番号：３８）をコードするｃＤＮＡのそれぞれを、２つの異なるプラスミド発現ベクター、ｐＣＤＮＡ−３およびｐ３Ｋ中にクローニングした。これらのＣＹＰ１Ｂ１核酸構築物は５４３アミノ酸のタンパク質をコードするｃＤＮＡを含むが、ＣＹＰ１Ｂ１のすべての非翻訳領域を欠く。ＣＹＰ１Ｂ１−ｄｅｌｔａ ３構築物は、配列番号：２の野生型ＣＹＰ１Ｂ１と比較して、アミノ酸位置５７、６１および３６５（アミノ酸５７：ＴｒｐがＣｙｓに変化；アミノ酸６１：ＧｌｙがＧｌｕに変化；アミノ酸３６５：ＧｌｙがＴｒｐに変化；配列番号：３８を参照）に３つの置換を含む。発現ベクターｐｃＤＮＡ３−ＣＹＰＨｕ１Ｂ１、ｐ３ｋ−ＣＹＰＨｕ１Ｂ１、ｐｃＤＮＡ３−ＣＹＰＨｕ１Ｂ１−ｄｅｌｔａ ３（ｐｃＤＮＡｈｕｌＢ１ｄ３）、ｐ３Ｋ−ＣＹＰＨｕ１Ｂ１−ｄｅｌｔａ ３（ｐ３ｋｈｕ１Ｂ１ｄ３）および対照ベクターｐｃＤＮＡ３およびｐ３Ｋを、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カラムを製造者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）の指示に従って用いて、形質転換大腸菌から精製した。各構築物の配列を決定し、求める変化が導入されたことを確認した。
【０１２８】
このほかのＣＹＰ１Ｂ１構築物は以下の通りに作製した。ＰＣＲを用いてｐｃＤＮＡ３Ｈｕ１Ｂ１ｄ５の骨格に欠失を導入した。ｐｃＤＮＡ３Ｈｕ１Ｂ１ｄ５は、５つのアミノ酸：Ｗ５７Ｃ、Ｇ６１Ｅ、Ｇ３６５Ｗ、Ｐ３７９ＬおよびＥ３８７Ｋが置換されたヒトＣＹＰ１Ｂ１タンパク質をコードする。上流プライマーには、制限部位および以後のコード配列に対してインフレームとなったＡＴＧコドンを含めた。下流プライマーには、適切なＣＹＰ１Ｂ１コード配列に続いて、終止コドンおよびクローニング用の制限部位を含めた。ｐｃＤＮＡ３Ｈｕ１Ｂ１−ｄｅｌｔａＰＰＧＰは、アミノ酸５１〜５４（ＰＰＧＰ）が欠失している点を除いてＣＹＰ１Ｂ１タンパク質の全体を含む。ｐｃＤＮＡ３Ｈｕ１Ｂ１−Ｆ１Ｒ１にコードされるタンパク質はＣＹＰ１Ｂ１の最初の６０アミノ酸の欠失を含み、ｐｃＤＮＡ３Ｈｕ１Ｂ１−Ｆ１Ｒ２タンパク質は同じＮ末端欠失に加えてＣＹＰ１Ｂ１タンパク質の最後の８２アミノ酸の欠失を含む。ｐｃＤＮＡ３Ｈｕ１Ｂ１−Ｆ２Ｒ１タンパク質はＣＹＰ１Ｂ１の最初の１７１アミノ酸の欠失を含み、ｐｃＤＮＡ３Ｈｕ１Ｂ１−Ｆ２Ｒ２にコードされるタンパク質は同じＮ末端欠失に加えてＣＹＰ１Ｂ１の最後の８２アミノ酸の欠失を含む。ｐｃＤＮＡ３Ｈｕ１Ｂ１−Ｆ３Ｒ１タンパク質はＣＹＰ１Ｂ１の最初の２９２アミノ酸の欠失を含み、ｐｃＤＮＡ３Ｈｕ１Ｂ１−Ｆ３Ｒ２は同じＮ末端欠失に加えてＣＹＰ１Ｂ１タンパク質の８２アミノ酸の欠失を含む（図３）。二重ＰＥＰ−Ｐａｄｒｅタンパク質を図３に配列番号：４１として示している。
【０１２９】
ＨＬＡ−Ａ２／ＫｂトランスジェニックＣ５７Ｂｌ／６マウス系統はハイブリッド型ＭＨＣクラスＩ分子を産生する。このハイブリッド分子において、ペプチド結合ドメイン（α１およびα２）はヒトクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ＊０２０１に由来し、Ｔ細胞上のＣＤ８補助受容体と相互作用するドメイン（α３）はマウスクラスＩ分子Ｋｂに由来する。この結果生じるマウスは、ＨＬＡ−Ａ２拘束性エピトープを含む免疫原に反応する能力があり、ヒト標的細胞発現ＨＬＡ−Ａ２を発現するヒト標的細胞を認識するマウス細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を生成する能力がある（Ｖｉｔｉｅｌｌｏら、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７３：１００７、１９９１）。
【０１３０】
以下の実施例に述べる実験により、以下のことが示された：１）ＣＹＰ１Ｂ１をコードするプラスミドが発現される；２）ＣＹＰ１Ｂ１タンパク質が翻訳される；３）コードされるタンパク質がインビボでプロセシングされ、ペプチドがクラスＩ受容体上に提示される；４）Ｔ細胞レパートリーはクラスＩｌペプチド複合体を認識しうる細胞を含む。
【０１３１】
実施例２  野生型ＣＹＰ１Ｂ１をコードするＤＮＡ発現ベクターによるマウスの免疫処置によりインビボでＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおけるＴ細胞免疫が誘発される
ヒトのクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ２．１を発現する６週齡〜８週齡の雌性トランスジェニックマウスの少なくとも３匹の群に対して、ｐｃＤＮＡ３−ＣＹＰＨｕ１Ｂ１またはｐｃＤＮＡ３プラスミドベクターによる免疫処置を行った。それぞれの前頸骨筋に１００μｇのプラスミドＤＮＡを注射した。追加免疫処置は初回免疫処置の１４日後に行った。２回目の免疫処置の１２日後に脾細胞を採取した。
【０１３２】
２〜３匹のマウスから１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地中に脾臓の単細胞懸濁液を調製した。４℃の０．８３％ＮＨ４Ｃｌ中で細胞を１０分間インキュベートすることによって赤血球を溶解させた。洗浄後に細胞をＣＤ８＋ Ｔ細胞濃縮カラムで製造者のプロトコールに従って分離した（マウスＴ細胞ＣＤ８サブセットカラムキット、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞に対して特異的な個々のヒトＣＹＰ１Ｂ１エピトープの検出には、マウスインターフェロン−γ（ＩＦＮ−ｇ）酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを用いた（マウスＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳｐｏｔ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。簡潔に述べると、１×１０５個の精製脾細胞を、１０μモルの合成ＨＬＡ−Ａ２． １結合ペプチドＦＬＤＰＲＰＬＴＶ（配列番号：２２）による前パルス刺激を加えるかまたはヒトＣＹＰ１Ｂ１発現ワクシニアベクターを１４時間感染させた同じ数の同系ＥＬ−４Ａ２／Ｋｂ標的細胞とともに、インビトロでインキュベートした。２４時間共培養した後に、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイを製造者の指示に従って行うことにより（マウスＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳｐｏｔ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔ細胞活性を測定した。ＣＹＰ１Ｂ１応答性Ｔ細胞の頻度を表すスポットを、自動ＥＬＩＳｐｏｔ読み取りシステムを用いて算定した（図４）。
【０１３３】
実施例３ ＣＹＰ１Ｂ１変種ｃＤＮＡ構築物はインビボでＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおけるＴ細胞免疫を誘発する
ヒトのクラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ２．１を発現する６〜８週齡の雌性トランスジェニックマウスの少なくとも３匹の群に対して、ｐ３Ｋ−ＣＹＰＨｕ１Ｂ１−ｄｅｌｔａ ３またはｐ３Ｋプラスミドベクターによる免疫処置を行った。それぞれの前頸骨筋に１００μｇのプラスミドＤＮＡを注射した。追加免疫処置は初回免疫処置の１４日後に行った。２回目の免疫処置の１２日後に脾細胞を採取した。
【０１３４】
２〜３匹のマウスから１０％ウシ胎仔血清および抗生物質を加えたＲＰＭＩ−１６４０培地中に脾臓の単細胞懸濁液を調製した。４℃の０．８３％ＮＨ４Ｃｌ中で細胞を１０分間インキュベートすることによって赤血球を溶解させた。洗浄後に細胞をＣＤ８＋ Ｔ細胞濃縮カラムで製造者のプロトコールに従って分離した（マウスＴ細胞ＣＤ８サブセットカラムキット、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。ＣＤ８＋ Ｔ細胞に対して特異的な個々のヒトＣＹＰ１Ｂ１エピトープの検出には、マウスインターフェロン−γ（ＩＦＮ−ｇ）酵素結合イムノスポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイを用いた（マウスＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳｐｏｔ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。簡潔に述べると、１×１０５個の精製脾細胞を、１０μモルの合成ＨＬＡ−Ａ２． １結合ペプチドＦＬＤＰＲＰＬＴＶ（配列番号：２２）による前パルス刺激を加えるかまたはヒト１Ｂ１発現ワクシニアベクターを１４時間感染させた同じ数の同系ＥＬ−４Ａ２／Ｋｂ標的細胞とともに、インビトロでインキュベートした。２４時間共培養した後に、ＥＬＩｓｐｏｔアッセイを製造者の指示に従って行うことにより（マウスＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳｐｏｔ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｔ細胞活性を測定した。ＣＹＰ１Ｂ１応答性Ｔ細胞の頻度を表すスポットを、自動ＥＬＩＳｐｏｔ読み取りシステムを用いて算定した（図５）。
【０１３５】
実施例４  ウエスタンブロット分析による抗ＣＹＰ１Ｂ１抗体の検出
ＣＹＰ１Ｂ１をコードする核酸による免疫処置を行った動物の血清を、以下の通りに、抗ＣＹＰ１Ｂ１抗体の存在に関して検査することができる。３０ｕｇのミクロソームタンパク質を含むヒトＣＹＰ１Ｂ１ミクロソーム（Ｇｅｎｔｅｓｔ、Ｗｏｂｕｒｎ ＭＡ）をＳＤＳサンプルバッファー（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＭＡ）中で煮沸し、１０％Ｔｒｉｓ−ＨＣｌアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｃｈｉｃａｇｏ、Ｉｌｌ）上で電気泳動により分離する。このゲルのエレクトロブロッティングをニトロセルロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に対して行う。非特異的なタンパク質結合部位は、ニトロセルロース膜を５％脱脂乳とともにＴＢＳＴ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ［ｐＨ ８］、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で室温で６０分間インキュベートすることによってブロックする。ニトロセルロースフィルターを、種々の希釈度の免疫マウス被験血清（例えば、ＣＹＰ１Ｂ１ペプチドまたは核酸による免疫処置を行ったマウスからのもの）、またはマウス抗ヒトＣＹＰ１Ｂ１ ４４３〜４５７ペプチド５Ｄ３ｍＡｂハイブリドーマ培養上清をＴＢＳＴ−５％脱脂乳で１：４０〜１：３０００に希釈したものとともにインキュベートする。次に膜を、ヤギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）をＴＢＳＴ ５％脱脂乳で１：２０００に希釈したものとともにインキュベートする。各抗体とのインキュベーション後に膜をＴＢＳＴ中で１０分間ずつ５回洗浄する。特異的タンパク質バンドの存在を示すために膜をＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で現像する。
【０１３６】
実施例５ ＣＹＰ１Ｂ１核酸構築物の電気穿孔
ｐ３ｋｈｕ１Ｂ１ｄ３ ＤＮＡによる単回の免疫処置後にＡ２／Ｋｂトランスジェニックマウスで誘導されたＴ細胞応答に対する電気穿孔の効果を検討した。マウスにはｐ３ｋｈｕ１Ｂ１ｄ３またはｐ３Ｋ対照ベクターを注射するか無処置とした。その後に治療群を電気穿孔を行うものとそれ以上の処置を行わないものに分けた。電気穿孔により、ＣＹＰ１９０ペプチドによるパルス刺激を加えた場合も天然のＣＹＰ１Ｂ１タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルスを感染させた場合も、ＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ細胞に対するＴ細胞応答性の頻度は有意に増加した。
【０１３７】
図６は、ＨＬＡ−Ａ２／ＫｂトランスジェニックマウスにおけるＴ細胞応答性が電気穿孔によって増強されることを示している。対をなすマウスの群に対してｐ３ｋＨｕ１Ｂ１ｄ３ＤＮＡ、ｐ３Ｋ対照ＤＮＡによる単回の免疫処置を行った上で、一方の群には電気穿孔を行い（＋＋）、他方には処置を行わなかった。直接的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイによるＣＤ８＋ Ｔ濃縮脾細胞の検査を、ヒトペプチドＣＹＰ１９０によるパルス刺激を加えた（ＣＹＰ１９０）または処置を行わない（無処置）ＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ細胞に対して行った。抗原特異的Ｔ細胞の頻度はスポット形成細胞／ＣＤ８＋ Ｔ細胞１０ｅ６個として報告する。
【０１３８】
６〜８週齡のＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂトランスジェニック雌性マウスを用いた。注射用のプラスミドＤＮＡは、エンドトキシン非含有プラスミド精製キットを製造者の指示に従って用いて作製した（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）。２５μｌを各肢の前頸骨筋に注射して計１００μｇのＤＮＡを投与した。電気穿孔は麻酔したマウスに対してその直後に、ＢＴＸニードルアレイ（Ｍｏｄｅｌ ５３２）をＤＮＡ注射部位の範囲に筋肉内挿入し、ＥｌｅｃｔｏＳｑｕａｒｅＰｏｒａｔｏｒ Ｍｏｄｅｌ Ｔ８２０（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ）によりパルス（１００Ｖ、パルス長２０ｍｓｅｃ×８回）を与えることによって行った。マウスに対する免疫処置は１回（１群当たりマウス２匹）とし、１２日後にアッセイした。ＣＹＰ１Ｂ１に対するマウスＣＤ８＋ Ｔ細胞の応答は、市販のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイキットを製造者の推奨に従って用いるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって分析した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。エフェクター細胞としては、プール脾細胞をＣＤ８＋ Ｔ細胞（マウスＴ細胞ＣＤ８サブセットカラムキット；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に関して濃縮した上で１×１０５個／ウェルで２つずつプレーティングした。１０ｕｇ／ｍｌペプチドによるパルス刺激を加えるかプレーティングの前に組換えワクシニアウイルスもしくは野生型ワクシニア（ＭＯＩ、１０）に１６〜１８時間感染させた１×１０５個のＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ細胞／ウェルによってＴ細胞を刺激した。プレートを２４時間インキュベートし、現像した上で自動画像解析により解析した（Ｚｅｉｌｎｅｔ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）。抗原特異的Ｔ細胞の頻度はスポット形成細胞（ＳＦＣ）／ＣＤ８＋ Ｔ細胞１×１０６個として報告する。マウス胸腺腫細胞株ＥＬ４はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、ｐＳＶ２ｎｅｏベクター中に挿入したＨＬＡ−Ａ２／ＫＢＭＤ ｃＤＮＡをトランスフェクトした。ヒトＣＹＰ１Ｂ１ペプチドＣＹＰ１９０（ＦＬＤＰＲＰＬＴＶ；配列番号：２２）は、ハーバード大学医学部バイオポリマー研究所（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。
【０１３９】
実施例６ ＣＹＰ１Ｂ１核酸構築物を含むヒドロゲルおよび微粒子
種々の送達系によるＣＹＰ１Ｂ１ｄ３ＤＮＡの送達により、ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスにおいて特異的免疫応答を誘発することができる。ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスを用いて、ヒドロゲル中にある形で送達されたＤＮＡがインビボで免疫応答を生じさせうるか否かを評価した。変異型ＣＹＰ１Ｂ１ ｃＤＮＡ（ｐｃＤＮＡ３Ｈｕ１Ｂ１ｄ３）をコードするＤＮＡ構築物を含む２％ポリマーネットワーク、ヒドロゲル配合物または微粒子の３回の投与により、ＨＬＡ−Ａ２拘束性ＣＹＰ１９０ペプチドによるパルス刺激を加えるか完全長の天然ＣＹＰ１Ｂ１タンパク質をコードする組換えワクシニアウイルスを感染させたＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ細胞に対する特異的応答性を有する脾臓ＣＤ８＋ Ｔ細胞が高頻度に誘発された。無処置のまま、または野生型ワクシニアウイルスを感染させたＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ細胞に対する有意な応答性は観察されなかった。配合ベクター（ｐｃＤＮＡ ３）ＤＮＡによる免疫処置を行ったマウスでは応答は誘発されなかった。
【０１４０】
図７は、ＣＹ１Ｂ１ ＤＮＡ／ヒドロゲル配合物の免疫処置による、Ａ２／ＫｂトランスジェニックマウスにおけるＣＹＰ１Ｂ１特異的Ｔ細胞応答の誘導を示している。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスに対して、ＰＬＧ微粒子内または２％ポリマーネットワークヒドロゲル中にある状態で送達されるｐｃＤＮＡ３ＤＮＡまたはｐｃＤＮＡ３Ｈｕ１Ｂ１ｄ３による免疫処置を３回行った。直接的なＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイによるＣＤ８＋ Ｔ濃縮脾細胞の検査を、ヒトペプチドＣＹＰ１９０によるパルス刺激を加える（ＣＹＰ１９０）かＣＹＰ１Ｂ１をコードするワクシニアウイルスを感染させた（ｖａｃＨｕ１Ｂ１）ＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ細胞に対して行った。処置を行わない（無処置）、ならびに野生型ワクシニアを感染させたＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ細胞（Ｖａｃ ｗｔ）を対照として含めた。抗原特異的Ｔ細胞の頻度はスポット形成細胞／ＣＤ８＋ Ｔ細胞１×１０６個として報告する。
【０１４１】
マウス６〜８週齡の雌性マウスをすべての実験に用いた。注射用のプラスミドＤＮＡは、エンドトキシン非含有プラスミド精製キットを製造者の指示に従って用いて作製した（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）。２５μｌを各肢の前頸骨筋に注射して計１００μｇのＤＮＡを投与した。プラスミドＤＮＡは微粒子内に封入するか本明細書に記載のポリマーネットワークヒドロゲル中に配合して免疫処置に用いた。マウスに対する免疫処置は２週間の間隔をおいて３回行い（各群当たりマウス２匹）、最後の免疫処置から１２日後にアッセイした。微粒子は３箇所の筋肉：脛骨筋、腓腹筋（ヒラメ筋）および大腿筋に、すなわちマウス１匹当たり６つの部位に投与した。ポリマーネットワークヒドロゲルは１００ｕｇ ＤＮＡ／１００ｕｌとして１つの脛骨筋当たり５０ｕｌを注入した。ＣＹＰ１Ｂ１に対するマウスＣＤ８＋ Ｔ細胞の応答は、市販のＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイキットを製造者の推奨に従って用いるＩＦＮ−γ ＥＬＩＳＰＯＴによって分析した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。エフェクター細胞として、プール脾細胞をＣＤ８＋ Ｔ細胞（マウスＴ細胞ＣＤ８サブセットカラムキット；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に関して濃縮した上で１×１０５個／ウェルで２つずつプレーティングした。１０ｕｇ／ｍｌペプチドによるパルス刺激を加えるかプレーティングの前に組換えワクシニアウイルスもしくは野生型ワクシニア（ＭＯＩ、１０）に１６〜１８時間感染させた１×１０５個のＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ細胞／ウェルによってＴ細胞を刺激した。プレートを２４時間インキュベートし、現像した上で自動画像解析により解析した（Ｚｅｉｌｎｅｔ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）。抗原特異的Ｔ細胞の頻度はスポット形成細胞（ＳＦＣ）／ＣＤ８＋ Ｔ細胞１×１０６個として報告する。
【０１４２】
実施例７ ＣＹＰ１Ｂ１核酸構築物を含む微粒子
ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスを用いて、ＰＬＧ微粒子内に封入したＤＮＡがインビボで免疫応答を生じさせうるか否かを評価した。変異型ＣＹＰ１Ｂ１ ｃＤＮＡ（ｐ３ｋｈｕ１Ｂ１ｄ３；ＺＹＣ３００）をコードするＤＮＡ構築物を含む微粒子の２回の投与により、完全長の天然ｈｕＣＹＰ１Ｂ１ ｃＤＮＡをコードする組換えワクシニアウイルスを感染させたＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ細胞に対する特異的応答性を有するＴ細胞が誘発された。野生型ワクシニアウイルスを感染させたＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ細胞に対する有意な応答性は観察されなかった。免疫処置を行わなかったマウスおよびベクター対照による免疫処置を行ったマウスは、いずれの刺激物質に対してもＩＦＮ−γ応答を示さなかった。
【０１４３】
有効な抗腫瘍免疫の誘導には、自己抗原に対するエフェクターＴ細胞レパートリーの増大が伴う。このトランスジェニックマウスモデルにおけるＣＹＰ１Ｂ１の治療的腫瘍抗原としての有効性を示唆するデータは、内因性のマウスクラスＩ ＭＨＣと関連づけられたマウスＣＹＰ１Ｂ１自己決定基に対するＴ細胞応答が免疫処置後に誘発されることを示すものと考えられる。マウスおよびヒトのＣＹＰ１Ｂ１にはアミノ酸レベルでかなりの配列相同性がある。以前に記載されたペプチド結合アルゴリズムを用いて、Ｈ−Ｋｂ結合性ＣＹＰ１Ｂ１ペプチドと予想されるものがマウス特異的自己応答の誘導を検討するための反応物として同定された。このＣＹＰ１Ｂ１残基７７〜８４（ＬＡＲＲＹＧＤＶ；配列番号：４２）はヒトおよびマウスのオルソログの間で共通である。このペプチドをヒトＣＹＰ １９０ ＨＬＡ−Ａ２エピトープとともに含め、ヒトＣＹＰ１Ｂ１ ＤＮＡを含む微粒子による免疫処置を行ったマウスにおいて応答が検出されうるかを検討した。示した通り、このペプチドに対する明らかな応答を検出できた。
【０１４４】
図８は、ＣＹＰ１Ｂ１をコードする封入ＤＮＡによるマウスの免疫処置により、トランスジェニックマウスにおけるＣＹＰ１Ｂ１特異的な免疫応答が誘発されることを示している。ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスに対して、免疫処置を行わない（左のバー）か、またはｐ３ｋｈｕ１Ｂ１ｄ３（右のバー）もしくはｐ３ｋ対照（中央のバー）を含む微粒子による免疫処置を２回行った。直接ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより、ＣＤ８＋濃縮脾細胞をＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ腫瘍細胞に対する免疫応答に関して検査した。標的細胞にはＨＬＡ−Ａ２ペプチドＣＹＰ１９０、ペプチドＣＹＰ７７によるパルス刺激を加えるか、またはＣＹＰ１Ｂ１−ワクシニア（ＶａｃＨｕｌＢ１）もしくはワクシニア野生型対照（Ｖａｃ Ｗｔ）を感染させた。
【０１４５】
ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｂトランスジェニックマウスに対しては、上記の通りに、ＰＬＧ微粒子内に封入したエンドトキシン非含有プラスミドを計１００μｇのＤＮＡとして各肢の前頸骨筋に投与する免疫処置を行った。マウスに対する免疫処置は２週間の間隔で行い、最後の免疫処置から１２日後にアッセイした。ＣＹＰ１Ｂ１に対するマウスＣＤ８＋ Ｔ細胞の応答はＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって分析した。エフェクター脾細胞をＣＤ８＋ Ｔ−細胞に関して濃縮し、１×１０５細胞／ウェルで２つずつプレーティングした。１０μｇ／ｍｌペプチドによるパルス刺激を加えるかプレーティングの前に組換えワクシニアウイルスもしくは野生型ワクシニア（ＭＯＩ、１０）に１６〜１８時間感染させた１×１０５個のＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ細胞／ウェルによってＴ細胞を刺激した。抗原特異的Ｔ細胞の頻度はスポット形成細胞／ＣＤ８＋ Ｔ細胞１×１０６個として報告する。ペプチドＣＹＰ７７（ＬＡＲＲＹＧＤＶ；配列番号：４２）はヒトおよびマウスのＣＹＰ１Ｂ１ ＤＮＡ配列で共通しており、これはマルチプルペプチドシステムズ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。
【０１４６】
実施例８ ＣＹＰ１Ｂ１核酸構築物を注射したマウスにおけるＭＨＣクラスＩＩ応答
ｐｃＤＮＡ３−Ｈｕ１Ｂ１がプロセシングおよび提示がなされるタンパク質をコードするか否か、ならびに近交系マウスの多くの系統でＭＨＣクラスＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発しうるか否かを評価するための実験を行った。クラスＩＩ ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ＣＹＰ１Ｂ１タンパク質に由来する合成ペプチドを用いるエクスビボＩＦＮ−ｇ Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイによって検出した。
【０１４７】
３種類のマウス系統（Ｃ３Ｈ、Ｃ５７／Ｂｌ６およびＢａｌｂ／ｃ）に対して１００μｇのｐｃＤＮＡ３−Ｈｕ１Ｂ１を注射した（筋肉内）。第１４日にマウスに対して同じ用量のｐｃＤＮＡ３−Ｈｕ１Ｂ１の追加投与（筋肉内）を行った。第２７日に脾臓を摘出し、ＣＤ４＋Ｔ細胞が濃縮された脾細胞をペプチドによるパルス刺激を加えた同系ＡＰＣに対して検討するＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。さらに、陰性対照とするために未感作マウスから単離したＣＤ４＋Ｔ細胞のスクリーニングも行った。ＣＤ４＋Ｔ細胞のすべてを、一連の合成ＣＹＰ１Ｂ１ ３０量体ペプチド（配列については表３参照）、ＰＨＡ（陽性アッセイ対照）およびＨＢＶ−２（陰性アッセイ対照）に対してスクリーニングした。
【０１４８】
【表３】合成ＣＹＰ１Ｂ１ペプチド
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【０１４９】
検討した３つのマウス系統のそれぞれで応答を誘発したＣＹＰ１Ｂ１ペプチドに関する上記のアッセイの結果を表４に示す。報告値はすべて、ＩＦＮ−ｇスポット形成細胞（ＳＦＣ）／ＣＤ４＋Ｔ細胞１，０００，０００個を表している。
【０１５０】
【表４】Ｃ３Ｈ、Ｃ５７／Ｂｌ６およびＢａｌｂ／ｃマウスにおけるＭＨＣクラスＩＩ応答
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【０１５１】
実施例９ ＣＹＰ１Ｂの欠失型構築物による免疫処置
ＣＹＰ１Ｂ１の改変によって有効な免疫原が得られるか否かを検討するために、Ｎ末端およびＣ末端の部分を段階的に欠失させた一連のＣＹＰ１Ｂ１ ｃＤＮＡを組換え法によって作製した。構築物はｐ３ｋｈｕ１Ｂ１ｄ５骨格にクローニングしたため、この構築物にある５つの点変異を含む。発現を確認するために、構築物を２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトし、２日後にトランスフェクト細胞から可溶化物を作製した。可溶化物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、移行させたゲルに対してウエスタン分析を行った。ブロットをＣＹＰ１Ｂ１に対して特異的なモノクローナル抗体によりプローブ検索し、化学発光により検出を増強した（ＥＣＬ ｋｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）。この実験によるデータから、欠失型構築物から変異型ＣＹＰ１Ｂ１タンパク質が発現されることが示された。
【０１５２】
これらの構築物がＣＹＰ１Ｂ１特異的Ｔ細胞を誘導したか否かを明らかにするために、ＨＬＡ−Ａ２／Ｋｄトランスジェニックマウスに対して、切断型ＣＹＰ１Ｂ１ ｃＤＮＡをコードするＤＮＡ構築物による免疫処置を行った。図９は、切断型ＣＹＰ１Ｂ１ ＤＮＡの免疫処置によってＣＹＰ１Ｂ１特異的Ｔ細胞が誘導されたことを示している。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスには免疫処置を行わないか、または変異型および／もしくは切断型のＣＹＰ１Ｂ１タンパク質をコードするｃＤＮＡ構築物による免疫処置を行った。免疫処置マウスから得たＣＤ８＋ Ｔ濃縮脾細胞の検査を、直接ＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより、ヒトペプチドＣＹＰ１９０（ＣＹＰ１９０）もしくはマウスペプチドＣＹＰ３７３（ｍＣＹＰ３７３）によるパルス刺激を加えるか、野生型ワクシニア（Ｖａｃ ｗｔ）もしくはＣＹＰ１Ｂ１をコードするワクシニアウイルス （ＶａｃＨｕ１Ｂ１）を感染させたＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ細胞に対して行った。処置を行わない（無処置）、ならびに野生型ワクシニアを感染させたＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ細胞（Ｖａｃ ｗｔ）を対照として含めた。抗原特異的Ｔ細胞の頻度はスポット形成細胞（ＳＦＣ）／ＣＤ８＋ Ｔ細胞１×１０６個として報告する。指定の構築物をコードするＤＮＡによりマウスの免疫処置を行った。
【０１５３】
マウス６〜８週齡の雌性マウスをすべての実験に用いた。注射用のプラスミドＤＮＡは、エンドトキシン非含有プラスミド精製キットを製造者の指示に従って用いて作製した（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）。２５μｌを各肢の前頸骨筋に注射して計１００μｇのＤＮＡを投与した。マウスに対する免疫処置は第０日および第１４日に行い（各群当たりマウス２匹）、最後の免疫処置から１２日後にアッセイした。ＣＹＰ１Ｂ１に対するマウスＣＤ８＋ Ｔ細胞の応答は、アッセイキットを製造者の推奨に従って用いるＩＦＮ−ｇ ＥＬＩＳＰＯＴによって分析した（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）。エフェクター細胞として、プール脾細胞をＣＤ８＋ Ｔ細胞（マウスＴ細胞ＣＤ８サブセットカラムキット；Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）に関して濃縮した上で１×１０５個／ウェルで２つずつプレーティングした。１０ｕｇ／ｍｌペプチドによるパルス刺激を加えるかプレーティングの前に組換えワクシニアウイルスもしくは野生型ワクシニア（ＭＯＩ、１０）に１６〜１８時間感染させた１×１０５個のＥＬ４−Ａ２／Ｋｂ細胞／ウェルによってＴ細胞を刺激した。プレートを２４時間インキュベートし、現像した上で自動画像解析により解析した（Ｚｅｉｌｎｅｔ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ， Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ）。抗原特異的Ｔ細胞の頻度はスポット形成細胞（ＳＦＣ）／ＣＤ８１細胞１×１０６個として報告する。マウスペプチドＣＹＰ３７３（ＳＤＱＱＱＰＮＬＰＹＶ；配列番号：５６）はマルチプルペプチドシステムズ（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ）社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。
【０１５４】
その他の態様
本発明をその詳細な説明とともに述べてきたが、前記の説明は例示を意図したものであり、添付する特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。
その他の面、利点および修正は、以下の特許請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ〜図１Ｄ】ＣＹＰ１Ｂ１をコードする核酸（配列番号：１）およびポリペプチド（配列番号：２）の配列を示している。
【図２Ａ〜図２Ｃ】オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および種々の量の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むＣＹＰ１Ｂ１ ｃＤＮＡ構築物の概略図である。
【図３】ＣＹＰ１Ｂ１ポリペプチド（配列番号：２）ならびにいくつかのＣＹＰ１Ｂ１切断型および欠失型変異体の概略図である。
【図４】ＣＹＰ１Ｂ１発現ベクターによる免疫処置を行ったマウスにおけるＣＹＰ１Ｂ１応答性Ｔ細胞の生成を示している。
【図５】ＣＹＰ１Ｂ１変種発現ベクターによる免疫処置を行ったマウスにおけるＣＹＰ１Ｂ１応答性Ｔ細胞の生成を示している。
【図６】ＣＹＰ１Ｂ１発現ベクターによる免疫処置に続いて電気穿孔法を行ったマウスにおけるＣＹＰ１Ｂ１応答性Ｔ細胞の生成を示している。
【図７】ポリマーネットワーク中に含まれるＣＹＰ１Ｂ１発現ベクターによる免疫処置を行ったマウスにおけるＣＹＰ１Ｂ１応答性Ｔ細胞の生成を示している。
【図８】微粒子内に含まれるＣＹＰ１Ｂ１発現ベクターによる免疫処置を行ったマウスにおけるＣＹＰ１Ｂ１応答性Ｔ細胞の生成を示している。
【図９】ＣＹＰ１Ｂ１発現ベクターによる免疫処置を行ったマウスにおけるＣＹＰ１Ｂ１応答性ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔ細胞の生成を示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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2004534510.tif 000106
【国際調査報告】
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2004534510.tif 000108
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