(57)【要約】生物学的試料中のエリスロポエチン及びエリスロポエチン受容体の同時測定のための方法及びキットが記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプル中のエリスロポエチン（Ｅｐｏ）およびＥｐｏ受容体ＥｐｏＲを同時に測定する方法であって、
（ａ）第一および第二抗体は、機能性抗体断片であって、Ｅｐｏに特異的な結合親和性を有する第一抗体、およびＥｐｏＲに特異的な結合親和性を有する第二抗体を、その異なる離れた領域に有する固体の基質を与える工程；
（ｂ）該固体基質を、該生物学的サンプル中のＥｐｏおよびＥｐｏＲが該第一および第二抗体に結合される条件下で、該生物学的サンプルに接触させる工程；及び
（ｃ）該固体基質上のＥｐｏおよびＥｐｏＲの存否または量を検出する工程
を含む方法。
【請求項２】
該機能性抗体断片が、Ｆａｂ断片である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
該第一および第二抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
該ＥｐｏおよびＥｐｏＲの存否または量の検出が、工程（ｂ）の該固体基質の、第三の抗体および第四の抗体への接触を含み、ここで、第三抗体は、Ｅｐｏに特異的な結合親和性を有し、第四抗体はＥｐｏＲに特異的な結合親和性を有し、該第三および第四抗体は、検出できるように標識されている、請求項１記載の方法。
【請求項５】
該第三および第四抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
該ＥｐｏおよびＥｐｏＲの存否または量の検出が、
（ｄ）工程（ｂ）の該固体基質を、第三の抗体および第四の抗体に接触させる工程であって、ここで該第三の抗体はＥｐｏに特異的な結合親和性を有し、該第四の抗体はＥｐｏＲに特異的な結合親和性を有する工程；及び
（ｅ）工程（ｄ）の該固体基質を、該第三および第四抗体に特異的な結合親和性を有する、第五の標識された抗体に接触させる工程
を含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
該第三および第四抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該第五の標識された抗体が、酵素、基質または蛍光部分で標識される、請求項６記載の方法。
【請求項９】
生物学的サンプル中のＥｐｏおよびＥｐｏＲを検出するためのキットであって、
（ａ）第一抗体および第二抗体を、その異なる別個の領域に有する固体の基質であって、ここで、該第一抗体は、Ｅｐｏに特異的な結合親和性を有し、該第二抗体はＥｐｏＲに特異的な結合親和性を有し、ここで、該第一および第二抗体は、機能性抗体断片である、気質；
（ｂ）第三の抗体が封入された第一の容器であって、ここで第三の抗体はＥｐｏに特異的な結合親和性を有する、第一の容器と；
（ｃ）第四の抗体が封入された第二の容器であって、ここで該第四の抗体は、ＥｐｏＲに特異的な結合親和性を有する、容器と
を含むキット。
【請求項１０】
該キットが、対照抗原が封入された第三の容器をさらに含む、請求項９記載のキット。
【請求項１１】
該キットが、該固体基質を該生物学的サンプルに、該生物学的サンプル中のいかなるＥｐｏおよびＥｐｏＲも該第一および第二抗体に結合される条件下で接触させ、かつＥｐｏおよびＥｐｏＲが結合した該固体基質を、該第三および第四抗体に接触させることによって、ＥｐｏおよびＥｐｏＲを同時に検出できることを示す、標識またはパッケージ挿入物をさらに含む、請求項９記載のキット。
【請求項１２】
該第一および第二抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項９記載のキット。
【請求項１３】
該第一および第二抗体が、機能性抗体断片である、請求項９記載のキット。
【請求項１４】
該第三および第四抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項９記載のキット。
【請求項１５】
該固体基質が、微量滴定プレートである、請求項９記載のキット。
【請求項１６】
ヒト血液前駆細胞上のＥｐｏＲの存否または量を検出する方法であって、
（ａ）ヒト血液前駆細胞を含有する生物学的サンプルを、ＥｐｏＲに特異的な結合親和性を有する抗体に接触させて、該接触が、抗体が該生物学的サンプル中のヒト血液前駆細胞上のＥｐｏＲに結合される条件下で生じる工程、及び
（ｂ）抗体が結合した該ヒト血液前駆細胞を同定することによって、ＥｐｏＲの存否または量を検出する工程
を含む方法。
【請求項１７】
該生物学的サンプルが、血液または骨髄細胞である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該機能性抗体断片が、Ｆａｂ断片である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
該ヒト血液前駆細胞が、巨核球、赤血球系前駆細胞および骨髄球系前駆細胞を含む、請求項１６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）およびＥｐｏ受容体を同時に測定するためのアッセイに関する。特に、ＥｐｏおよびＥｐｏＲ、ならびに関連する核酸を同時に検出するための、免疫アッセイおよびＰＣＲ依拠アッセイを記載する。
【０００２】
（発明の背景）
エリスロポエチン（Ｅｐｏ）は、哺乳動物の腎臓および肝臓で生成される、分子量が３４キロダルトン（ｋＤａ）の糖タンパク質ホルモンである。Ｅｐｏは、赤血球前駆細胞の増殖および分化を誘導する、赤血球形成の枢要な成分である。Ｅｐｏ活性は、グロビンおよび炭酸デヒドラターゼを包含する、数多くの赤血球系特異遺伝子の活性化にも関連する〔Ｂｏｎｄｕｒａｎｔ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ５：６７５−６９４ （１９８５）；Ｋｏｕｒｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １２６：２５９−２６５ （１９８６）〕。エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）は、造血／サイトカイン／成長因子受容体ファミリーの一員であり、このファミリーは、その他いくつかの成長因子受容体、たとえばインターロイキン（ＩＬ）−３、−４および−６受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体、ならびにプロラクチンおよび成長ホルモン受容体も包含する〔Ｂａｚａｎ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：６９３４−６９３８ （１９９０）〕。サイトカイン受容体ファミリーの成員は、貫膜領域のすぐ外側に位置する、４個の共通システイン残基、およびトリプトファン−セリンＸ−トリプトファン−セリンのモチーフを有する。この共通配列は、タンパク質−タンパク質相互作用に関与すると考えられる〔Ｃｈｉｂａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， １８４：４８５−４９０ （１９９２）〕。
【０００３】
ＥｐｏＲｃＤＮＡは、最近、マウス肝〔Ｔｏｊｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ．， １４８：４４３−４４８ （１９８７）〕、およびヒト胎児肝〔Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７６：３１−３５ （１９９０）；Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７６：２４−３０ （１９９０）〕から単離されている。ヒトｃＤＮＡは、ＭＷが〜５５ｋＤａで、約５０８のアミノ酸を有するポリペプチドをコードしている。ヒトＥｐｏＲのゲノムクローンは、単離かつ配列決定されている〔Ｐｅｎｎｙ ＆ Ｆｏｒｇｅｔ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １１：９７４−９８０ （１９９１）；Ｎｏｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７８：２５４８−２５５６ （１９９１）〕。コーディング配列の分析から、シグナルペプチド中の約２４のアミノ酸残基、細胞外ドメイン内の約２２６のアミノ酸、膜にまたがるドメイン内の約２３のアミノ酸、および細胞質ドメイン内の約２３５のアミノ酸が予測される〔Ｄ’Ａｎｄｒｅａ ＆ Ｚｏｎ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓ． ８６：６８１−６８７ （１９９０）；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７６：３１−３５ （１９９０）；およびＰｅｎｎｙ ＆ Ｆｏｒｇｅｔ， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １１：９７４−９８０ （１９９１）〕。ヒト成熟ＥｐｏＲタンパク質は、約４８４のアミノ酸を有する。ヒトの赤血球系前駆細胞は、すべて、Ｅｐｏ受容体を含むことが示されている。Ｅｐｏの結合は、赤血球系前駆細胞が成熟するにつれて低下すると思われ、遂にはＥｐｏ受容体が網赤血球上に検出できなくなる〔Ｓａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓ． ８０：３５７−３６６ （１９８７）；Ｓａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ． １３７：３３７ （１９８８）〕。Ｅｐｏは、赤血球系前駆細胞の細胞生存率を維持し、それらが有糸分裂および分化へと進むことを可能にする。Ｅｐｏを生じる二つの主な赤血球系前駆細胞は、バースト形成単位赤血球系（ＢＦＵ−Ｅ）およびコロニー形成単位赤血球系（ＣＦＵ−Ｅ）である。Ｅｐｏ受容体の数は、正常なＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＥでのＥｐｏに対する応答と非常に良く相関する。Ｅｐｏ受容体数は、ヒトおよびマウスの細胞では、ＣＦＵ−Ｅ期にピーク受容体数に達した後に減少すると思われる〔Ｓａｗａｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓ． ８０：３５７−３６６ （１９８７）；およびＬａｎｄｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７３：１４７６−１４８６ （１９８９）〕。Ｅｐｏ除去後のＥｐｏ受容体の回復は、タンパク質合成に依存すると思われ、Ｅｐｏが除去されたときの、分解によるＥｐｏ受容体のダウンレギュレーション、およびその後の新規合成による、受容体のアップレギュレーションが示唆される〔Ｓａｗｙｅｒ ＆ Ｈａｎｋｉｎｓ， Ｂｌｏｏｄ ７２：１３２ （１９８８）；およびＫｏｍａｔｓｕ ＆ Ｆｕｊｉｔａ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．， ５３：１１５６−１１６１ （１９９３）〕。巨核球および赤血球系前駆細胞でのＥｐｏ受容体の研究から、赤血球生成と血小板新生との調節の間には、両細胞型による細胞分裂の刺激がＥｐｏ受容体数によって制御されるという点で、関連性があることが示唆される〔Ｂｅｒｒ��ｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７２：９７０−９７７ （１９８８）；およびＫｏｍａｔｓｕ ＆ Ｆｕｊｉｔａ、前掲〕。Ｅｐｏ受容体は、クローニングされているが、Ｅｐｏ受容体とのＥｐｏのＥｐｏ受容体との結合に関与する正確な機序、およびその後の赤血球生成過程との関係は、不明である。
【０００４】
Ｅｐｏ受容体（ＥｐｏＲ）の特徴付けは、天然の入手源から得られるＥｐｏＲの量が極めて少量であるため、困難であった。そのため、Ｅｐｏとその受容体との、赤血球生成を刺激する相互作用の機序は、依然として不明である〔Ｄ’Ａｎｄｒｅａ ＆ Ｚｏｎ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓ． ８６：６８１−６８７ （１９９０）〕。最近、この機序は、白血病誘発における成長因子およびその受容体の役割を理解するのに多大な関心が払われており；変化した造血成長因子およびその受容体は、腫瘍形成および白血病誘発に寄与し得る〔Ｄｕｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：１４９３−１４９６ （１９８９）；およびＬｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ５７：５３４−５３８ （１９８６）〕。
【０００５】
特定の細胞型のＥｐｏ応答性と、Ｅｐｏに対するその細胞型の親和性との間の相関に関するいくつかの研究では、一致しない結果が報告されている。これらの研究は、対応するプラスミドベクターからの未変性でないいくつかのアミノ酸配列を有する、組換えＥｐｏおよびＥｐｏＲを用いている〔Ｂｅｒｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ ７２：９７０−９７７ （１９８８）；およびＨａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６７：１５２０５−１５２０９ （１９９２）〕。これらの組換えＥｐｏおよびＥｐｏＲ分子の三次構造の変化および／またはその他の特徴が、未変性タンパク質の特徴を変えた可能性がある。したがって、外来の（たとえばベクター）アミノ酸配列を含まない、Ｅｐｏ受容体の実質的に純粋な断片を得ることは、有意な進歩であると思われる。そのような断片が、機能的活性を保持するか否かは予測できないにしても、精製された細胞外ドメイン断片は、Ｅｐｏ受容体の細胞外ドメインにＥｐｏが結合することから、特に役立つと思われる。
【０００６】
（発明の要約）
本発明は、ＥｐｏまたはＥｐｏＲタンパク質、および関連する抗体を検出するための、いくつかの鋭敏かつ簡単な方法の開発に基づく。本明細書に記載された方法および試薬は、ＥｐｏおよびＥｐｏＲ関連の臨床的問題はもとより、他の血液学上の成長因子関連の臨床的問題における鑑別診断に役立つ手段を代表する。純粋なヒトＥｐｏ−ｂｐ（Ｅｐｏ結合タンパク質、すなわちＥｐｏＲの細胞外ドメイン）、およびそれに対する抗体の精製は、本方法が治療および診断の用途に向けて開発されることを可能にする、基準点である。Ｅｐｏ−Ｒの視覚化は、今や、ヒトサンプルでのｉｎ ｖｉｔｒｏ、および動物研究でのｉｎ ｖｉｖｏの双方で可能である。ＥｐｏまたはＥｐｏＲ、およびそれに対する抗体の測定は、血球前駆細胞でのＥｐｏ／ＥｐｏＲ相互作用における構造的および機能的関連性を理解するのを助けると思われる。
【０００７】
本明細書に記載されたアッセイ方法は、ヒトの血液および組織サンプル中のナノ濃度のＥｐｏおよびＥｐｏＲ可溶性タンパク質を検出することができる。鋭敏な検出は、血球産生におけるＥｐｏ／ＥｐｏＲ相互作用、および血球酸性における関連する疾病のより充分な理解を許す。そのため、本方法は、血液学的な悪性、およびいくつかの全身性心血管疾患を制御するための治療方法を確立することを可能にする。
【０００８】
一態様では、本発明は、生物学的サンプル中のＥｐｏおよびＥｐｏＲの同時測定の方法を特徴とする。この方法は、（ａ）Ｅｐｏに特異的な結合親和性を有する第一抗体、およびＥｐｏＲに特異的な結合親和性を有する第二抗体（該第一および第二抗体は、機能性抗体断片（たとえばＦａｂ断片）である）を、その異なる別個の領域に有する固体の基質を与える工程と；（ｂ）該固体基質を、生物学的サンプル中のＥｐｏおよびＥｐｏＲが第一および第二抗体に結合される条件下で、該生物学的サンプルに接触させる工程とを包含する。ＥｐｏおよびＥｐｏＲの存否または量は、固体基質上で検出される。第一および第二抗体は、ポリクローナル抗体であってもよい。
【０００９】
ＥｐｏおよびＥｐｏＲの存否または量の検出は、上記の工程（ｂ）の固体基質を、Ｅｐｏに特異的な結合親和性を有する第三の抗体、およびＥｐｏＲに特異的な結合親和性を有する第四の抗体（該第三および第四抗体は、検出できるように標識されている）に接触させる工程を含んでもよい。該第三および第四抗体は、ポリクローナル抗体であってもよい。
【００１０】
ＥｐｏおよびＥｐｏＲの存否または量を検出する工程は、（ｄ）上記の工程（ｂ）の固体基質を、Ｅｐｏに特異的な結合親和性を有する第三の抗体、およびＥｐｏＲに特異的な結合親和性を有する第四の抗体に接触させる工程と；（ｅ）工程（ｄ）の固体基質を、第三および第四抗体に特異的な結合親和性を有する、第五の標識された抗体に接触させる工程とを含んでいてもよい。第三および第四抗体は、ポリクローナル抗体であってもよい。第五の標識された抗体は、酵素、基質または蛍光部分で標識されていてもよい。
【００１１】
本発明は、生物学的サンプル中のＥｐｏおよびＥｐｏＲを検出するためのキットも特徴とする。該キットは、（ａ）Ｅｐｏに特異的な結合親和性を有する第一抗体、およびＥｐｏＲに特異的な結合親和性を有する第二抗体（該第一および第二抗体は、機能性抗体断片である）を、その異なる離れた領域に有する固体の基質（たとえば微量滴定プレート）と；（ｂ）Ｅｐｏに特異的な結合親和性を有する第三の抗体が封入された第一の容器と；（ｃ）ＥｐｏＲに特異的な結合親和性を有する第四の抗体が封入された第二の容器とを含む。該キットは、さらに、対照抗原が封入された第三の容器を含んでもよい。該キットは、該固体基質を該生物学的サンプルに、該生物学的サンプル中のいかなるＥｐｏおよびＥｐｏＲも該第一および第二抗体に結合される条件下で接触させ、かつＥｐｏおよびＥｐｏＲが結合した該固体基質を、該第三および第四抗体に接触させることによって、ＥｐｏおよびＥｐｏＲを同時に検出できることを示す、標識またはパッケージ挿入断片も含んでいてよい。第一および第二抗体は、ポリクローナル抗体であることができ、かつ機能性抗体断片であってもよい。第三および第四抗体も、ポリクローナル抗体であってもよい。
【００１２】
本発明は、ヒト血液前駆細胞上のＥｐｏＲの存否または量を検出する方法も特徴とする。この方法は、血液または骨髄のような、ヒト血液前駆細胞を含有する生物学的サンプルを、ＥｐｏＲに特異的な結合親和性を有する抗体に接触させて、該接触が、抗体が該生物学的サンプル中のヒト血液前駆細胞上のＥｐｏＲに結合される条件下で生じる工程と、抗体が結合した該ヒト血液前駆細胞を特定することによって、ＥｐｏＲの存否または量を検出する工程とを含む。ヒト血液前駆細胞は、巨核球、赤血球系および骨髄球系前駆細胞を含んでいてもよい。
【００１３】
本発明の一つまたはそれ以上の実施態様の詳細は、添付の図面、および以下の記載中に説明される。本発明のその他の特徴、目的および利点は、記載および図面ならびにクレームから明らかになると思われる。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
ヒトの組換えＥｐｏ、およびヒトの完全長Ｅｐｏの受容体ｃＤＮＡクローンが入手できるにも拘わらず、ＥｐｏおよびＥｐｏＲの相互作用、または赤血球系前駆細胞の増殖および分化に関与するシグナル変換の機序について知られていることは、僅かであるに過ぎない。
【００１５】
プラスミド発現ベクターは、そのベクターに挿入された、クローニングされたコーディング配列からのタンパク質の発現を可能にする。発現ベクターは、一般に、選別できるマーカーと、宿主細胞内でのベクターの選別および維持のための複製起点、ならびに挿入された遺伝子に融合するのに適したポリペプチドの、高レベルの発現を誘導するための誘導できる調節要素とを有する。好都合な制限部位を、タンパク質分解による切断部位配列の下流でベクターに組み込むのが好ましい。ＥｐｏＲコーディング配列断片に融合するのに好適なポリペプチドは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼであって、トロンビンタンパク質分解切断部位をカルボキシル末端に有する。
【００１６】
本明細書に開示された発明のための発現ベクターは、ＥｐｏＲ細胞外ドメインを、融合タンパク質の一部として発現し、これが、その後切断されて、精製ＥｐｏＲ細胞外ドメインを生じることができる。ＥｐｏＲ細胞外ドメインのコーディング配列は、この配列を、発現ベクター内の適切な読み枠に挿入するのに適したいかなる方式でも加工してよい。たとえば、一対のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを、第一のプライマーが細胞外ドメインの５′末端のコーディング配列に相当し、第二のプライマーが細胞外ドメインの３′末端のコーディング配列に相補的であるように合成してよい。このプライマーは、好ましくは、該プライマーの、望みの標的配列の末端に相当する部分を挟む好都合な制限酵素部位を有する。このプライマーを用いて、ヒトの完全長ＥｐｏＲｃＤＮＡの鋳型からＥｐｏＲ細胞外ドメインを増幅する。そうして、得られたＰＣＲ産物を、発現ベクターにクローニングする。各末端に、同じ制限部位ではなく、異なる制限部位を有するＰＣＲプライマーを合成するのが、好ましい。ＰＣＲ産物の各末端での異なる制限部位の存在は、ヒトＥｐｏＲコーディング配列断片のセンス配向での挿入を容易にする。
【００１７】
ヒトエリスロポエチン受容体細胞外ドメインを融合タンパク質の一部として有する、融合タンパク質の高レベルの発現は、宿主細胞培養体に組換えプラスミド発現ベクターからの発現を誘導することによって達成される。以後、融合タンパク質を、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈと呼び、精製ヒトエリスロポエチン受容体細胞外ドメインを、Ｅｐｏ−ｂｐ（Ｅｐｏ結合タンパク質）と呼ぶ。細胞タンパク質抽出物は、発現している大腸菌培養物から、適切ないかなる方式にても調製するのが好ましい。ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈは、抽出物から、望みのとおりに精製されてよい。たとえば、抽出物を、この融合タンパク質のＥｐｏ−ｂｐコーディング配列の上流の部分で結合する能力を有するカラム越しに通してよい。該融合タンパク質は、カラムに結合するが、抽出物中のその他のタンパク質は、カラム基質への融合タンパク質の結合を可能にする緩衝液とともに、カラム洗液中に溶出する。次いで、緩衝液条件を変えることによって、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈを高純度で溶出させることができる。
【００１８】
Ｅｐｏ−ｂｐの精製は、精製ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈを、適切な切断法を用いて切断することによって達成してよい。たとえば、上流ポリペプチドとＥｐｏ−ｂｐとの間の切断部位は、臭化シアンに感受性であるか、またはこれに代えて、部位特異性プロテアーゼ切断に感受性であってもよい。好適実施態様では、トロンビンタンパク質分解切断部位は、上流ポリペプチドに組み込まれるが、この上流ポリペプチドコーディング配列のカルボキシル末端に位置する、好都合な制限クローニング部位に対する５′は除く。
【００１９】
切断されたＥｐｏ−ｂｐポリペプチドのセグメントは、サイズ排除クロマトグラフィー、等電点電気泳動またはアフィニティークロマトグラフィーのような精製手法によって、上流ポリペプチドセグメントから分離してよい。さらに、望みであれば、２種類以上の精製手法を用いて、適切な程度の精製を達成してもよい。好適な精製手法は、アフィニティークロマトグラフィーである。たとえば、プロテアーゼ処理融合タンパク質混合物は、アガロースビーズをＥｐｏとカップリングさせたカラムに掛けてよい。切断されたＥｐｏ−ｂｐセグメントは、Ｅｐｏ−アガロースに結合するが、上流ポリペプチドセグメントは、カラムを通過する。次いで、液相のｐＨを低下させることによって、Ｅｐｏ−ｂｐを溶出させる。
【００２０】
本発明の一実施態様では、ヒトＥｐｏＲ（ｈＥｐｏＲ）の第２５〜２５０アミノ酸のコーディング配列を、ｐＧＥＸ−２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｍｅｃｈａｎｉｃｓｂｕｒｇ， ＰＡ）にクローニングする。ｐＧＥＸ−２Ｔは、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のコーディング配列に機能的に結合された、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターを有する。ＧＳＴコーディング配列の３′末端は、トロンビンタンパク質分解切断部位を正しい読み枠内に有するばかりでなく、ＧＳＴに共有結合でカップリングさせようとするコーディング配列を挿入するのに好都合なクローニング部位も有する。
【００２１】
ｈＥｐｏＲの第２５〜２５０アミノ酸を有するＰＣＲ産物を、適切なＤＮＡ鋳型、たとえばヒト完全長ＥｐｏＲｃＤＮＡから作成する。細胞外ドメインコーディング配列の５′末端とともにＢａｍＨ１部位を有する、ＰＣＲプライマーを合成し、細胞外ドメインコーディング配列の３′末端に相補的な配列とともにＥｃｏＲ１部位を有するＰＣＲプライマーを合成する。ｐＧＥＸ−２Ｔ内のＢａｍＨ１部位は、ＧＳＴコーディング配列に関連するＥｃｏＲ１部位に対して５′に位置させる。このＰＣＲ産物を、ｐＧＥＸ−２Ｔにクローニングし、期待される大きさのプラスミドを有する、形質転換した大腸菌コロニーを、特定する。
【００２２】
アミノ末端のＧＳＴセグメント、およびカルボキシル末端のＥｐｏＲ細胞外ドメインセグメントを有する融合タンパク質を、ＩＰＴＧで転写を誘導することによって、形質転換した大腸菌で発現させる。ＩＰＴＧは、融合タンパク質コーディング配列の上流に位置するｌａｃプロモーターを抑制する。ある量の融合タンパク質を蓄積するのに充分な時間発現させた後、いかなる適切な方式によって細胞を溶解させ、未精製抽出物を調製する。この未精製抽出物の混合物は、融合タンパク質をその他の多くの細胞性タンパク質に加えて有する。この融合タンパク質、すなわちＥｐｏＲｅｘ−ｔｈは、抽出物から望みのとおりに精製してよい。
【００２３】
好適実施態様では、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈを、グルタチオン（ＧＳＨ）とカップリングさせたアガロースビーズを有するカラム越しに通す。ＧＳＨは、ＧＳＴの基質であり、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈのＧＳＴセグメントは、この固定化したＧＳＨに高い親和性で結合することになる。こうして、融合タンパク質は、カラムに結合するようになるが、抽出物中のその他の実質的にすべてのタンパク質は、結合しないことになる。洗浄した後、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈは、還元されたＧＳＨを液相に加えることによって、カラムから溶出させてよい。
【００２４】
本発明の一実施態様では、精製ヒトエリスロポエチン受容体細胞外ドメインのポリペプチドは、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈをトロンビンで消化することによって調製してよい。次いで、得られたＧＳＴおよびＥｐｏ−ｂｐの消化混合物を、Ｅｐｏアフィニティーカラムに掛けてよい。Ｅｐｏ−ｂｐは、そのリガンドであるＥｐｏに結合するが、ＧＳＴは、カラムを通過する。Ｅｐｏ−ｂｐは、適切な溶離緩衝液、たとえば０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０を用いることによって、精製形態で溶出させてよい。
【００２５】
（抗体）
ヒトエリスロポエチン受容体細胞外ドメインに対する抗体は、そのようなポリペプチドの精製調製品を、動物の免疫系に提示することによって形成することができる。たとえば、精製されたＥｐｏ−ｂｐを、ラット、マウス、ウサギ、ヤギまたはヒツジのような動物に、皮下、筋内または腹腔内注射してよい。望みであれば、間隔をおいてブースター注射を行うことができる。Ｅｐｏ−ｂｐに対する循環中の抗体は、注射された動物の免疫系が形成し、これらの抗体は、血液、好ましくは血清から捕集することができる。抗Ｅｐｏ−ｂｐ血清は、様々なアッセイ形式、たとえばウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡアッセイなどでＥｐｏ−ｂｐを検出するのに用いることができる。検出しようとするＥｐｏ−ｂｐは、たとえば、Ｅｐｏ−ｂｐの精製調製品、細菌もしくは真核細胞抽出物、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養からの真核細胞、血清サンプル、または個体から採取された組織もしくは細胞生検からさえ調製してよい。抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体は、健全なヒトＥｐｏＲはもとよりＥｐｏ−ｂｐの細胞外ドメインも認識すると期待される。Ｅｐｏ−ｂｐに対して誘導されたモノクローナル抗体は、当技術に公知の方法によって調整することができる〔Ｄ’Ａｎｄｒｅａ ｅｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ， ７５：８７４−８８０ （１９９０）；米国特許第４，５５８，００５号明細書；およびＨａｒｌｏｗ ＆ Ｌｉｓｓ， Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｌａｂ Ｍａｎｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， １９８８〕。
【００２６】
たとえば、本明細書に記載されたとおり、抗Ｅｐｏ−ｂｐおよび抗Ｅｐｏ抗体は、Ｅｐｏ−ｂｐまたは合成Ｅｐｏを、３ヶ月にわたって３〜４週ごとにヒツジに接種し、次いで、血清を捕集して、抗体を精製するすることによって、ヒツジに発生させた。このポリクローナル抗体を、Ｆａｂ画分についてさらに精製し、これをフルオレセイン標識した。
【００２７】
Ｅｐｏ−ｂｐに対して誘導した抗体は、好ましくは、ＥｐｏＲ細胞外ドメインに特異的な結合親和性を有する。たとえば、精製Ｅｐｏ−ｂｐを注射した動物からの血清は、精製Ｅｐｏ−ｂｐ１０μｇをポリアクリルアミドゲル中で電気泳動させ、抗Ｅｐｏ−ｂｐ血清の１：２，０００希釈に接触させたとき、ウエスタンブロット分析でＥｐｏ−ｂｐと検出できる結合を与えなければならない。
【００２８】
ＥｐｏまたはＥｐｏＲに特異的な結合親和性を有する抗体断片は、公知の手法によって生成することができる。たとえば、そのような断片は、抗体分子のペプシン消化によって生成することができるＦ（ａｂ′）２断片、およびＦ（ａｂ′）２断片のジスルフィド結合を還元することによって生成することができる、Ｆａｂ断片を包含するが、これらに限定されない。一般に、精製された免疫グロブリンは、固定化されたパパインを含む管に加え、攪拌しつつ、約３７℃で温置することができる。パパインは、塩酸システインを含有するリン酸消化緩衝液中に存在する。可溶化されたＦａｂ断片は、セパレーター管を用いて回収し、プロテインＡクロマトグラフィーによって精製することができる。
【００２９】
注目すべきことに、アッセイに用いられる抗体のセット（捕捉および検出抗体）は、抗体の同じであるか、または異なる調製品に由来することができる。たとえば、捕捉および検出抗体を、ともに、ヒツジから精製することができるか、または捕捉抗体は、ヒツジから精製するが、検出抗体は、ヤギから精製することができる（またはその逆）。
【００３０】
（ＥｐｏおよびＥｐｏＲ、ならびにその部分を測定する方法）
ＥｐｏおよびＥｐｏＲは、クローニングされ、多くの研究が実施されているものの、Ｅｐｏ関連の臨床的問題とＥｐｏＲ関連のそれとを区別するのに利用できる方法は、皆無である。代表的になされている予測は、臨床的症状と標準的な血液試験とで推定される推測に基づく。したがって、ＥｐｏおよびＥｐｏＲを検出するための信頼できる試験方法が必要である。本方法は、異なる疾病状態における関連するタンパク質および抗体の迅速かつ鋭敏な検出のために臨床の現場で用いるのに適する。本発明の方法は、ＥｐｏおよびＥｐｏＲの存否または量を検出するのに用いることができる。
【００３１】
本明細書に記載のとおり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法を、Ｅｐｏ−ｂｐを包含するＥｐｏおよびＥｐｏＲの検出に用いることができる。ＰＣＲとは、標的核酸を増幅する手順または手法を意味する。代表的には、問題の領域の末端またはその先からの配列情報を用いて、増幅しようとする鋳型の反対側の鎖と同一の配列である、オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。ＰＣＲは、全ゲノムＤＮＡまたは全細胞性ＲＮＡからの配列を包含する、ＤＮＡおよびＲＮＡからの特定の配列を増幅するのに用いることができる。プライマーは、代表的には１４〜４０ヌクレオチドの長さであるが、１０〜数百ヌクレオチドの長さにわたることができる。一般的なＰＣＲの手法は、たとえば、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｅｄ． Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ， Ｃ． ＆ Ｄｖｅｋｓｌｅｒ， Ｇ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９９５に記載されている。
【００３２】
ＰＣＲに基づく方法では、標識された基質および抗体を用いて、リガンド結合部位を検出し、Ｅｐｏ／ＥｐｏＲｍＲＮＡ産生を測定することができる。反応に用いられるプライマーは、ＥｐｏおよびＥｐｏＲをコードしている配列に基づいて、公知であり、上に記載された標準的手法を用いて、化学的に合成することができる。いくつかの実施態様では、ビオチニル化されたプライマーを用いることができる。たとえば、ビオチニル化され、ジゴキシゲニンを含むＰＣＲ産物を生成するために、ジゴキシゲニン標識化ヌクレオチドおよびビオチニル化プライマーを用いて、標準的な条件下で、ＰＣＲ反応を実施することができる。このＰＣＲ産物は、ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆した微量滴定プレートのような、基質上に固定化することができる。固定化は、代表的には、用意された基質の存在下で、適切な量の時間にわたって、たとえば約３７℃で３０分間、ＰＣＲ産物を温置することによって実施する。産物は、抗ジゴキシゲニン抗体、またはその断片の添加によって検出する。抗ジゴキシゲニン抗体は、セイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼのような酵素と包合させて、産物の容易な検出を促進することができる。一般に、ジアミノベンジジンのようなペルオキシダーゼ基質、またはリン酸４−メチルウンベリフェリル（ＭＵＰ）もしくはリン酸ｐ−ニトロフェニル二ナトリウム（ＮＰＰ）のようなホスファターゼ基質を、反応させたサンプルに加え、発色を視覚的にか、あるいはＮＰＰを基質として用いたときは、４０５ｎｍでの分光光度法によってか、またはＭＵＰを基質に用いたときは、３６５ｎｍ励起フィルターもしくは４５０ｎｍ発光フィルターを用いる分光蛍光法によって追跡する。ＰＣＲ産物の化学発光検出も、ルミノールのような化学発光性基質を用いて実施することができる。
【００３３】
Ｅｐｏ−ｂｐを包含するＥｐｏおよびＥｐｏＲを測定するもう一つの方法は、免疫蛍光標識法である。この方法は、捕捉抗Ｅｐｏ−ｂｐ断片または抗Ｅｐｏ断片を、基板（たとえば微量滴定プレート）の異なる別個の領域に被覆することを包含する。代表的には、抗体断片を基板とともに室温で約２時間温置することによって、抗体断片を基板に被覆する。血清／血漿、血液および骨髄細胞を包含する、均一化された組織または細胞のような生物学的サンプルを、被覆された基板に加え、適切な量の時間にわたって温置する。たとえば、サンプルを、約２４〜約３７℃の温度で約２０〜３０分間温置することができる。次いで、蛍光標識されたデテクター抗体（すなわち、標識された抗Ｅｐｏおよび抗ＥｐｏＲ抗体）を加え、材料を、適切な量の時間（たとえば３７℃で１０〜３０分）にわたって温置する。サンプルは、アルブミン添加または無添加２０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）のような適切な緩衝液中で洗浄することができる。陽性のサンプルは、蛍光顕微鏡下での観察、またはマイクロプレート蛍光光度計を用いる４０５ｎｍでの吸光の決定によって特定することができる。
【００３４】
免疫蛍光標識法は、抗ＥｐｏＲ抗体および抗ＥｐｏＲ抗体を検出するのに用いることもできる。抗体を検出するには、基板の異なる離れた領域を、上に記載したのと同じ方法を用いて、ＥｐｏおよびＥｐｏＲ（抗原）で被覆する。陽性サンプルは、ＥｐｏおよびＥｐｏＲを検出するのと同じ方式で特定する。
【００３５】
適切な蛍光標識は、たとえば、フルオレセイン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ）、テキサスレッド（登録商標：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｅｕｇｅｎ， ＯＲ）、５−（および６−）カルボキシ−Ｘ−ローダミン、リサミンローダミンＢ、５−（および６−）カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン−５−イソシアナート（ＦＩＴＣ）、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、テトラメチルローダミン−５−（および−６−）イソチオシアナート、５−（および６−）カルボキシテトラメチルローダミン、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、６−〔フルオレセイン−５−（および６−）カルボキシアミド〕ヘキサン酸、Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−３−インダセンプロピオン酸、エオシン−５−イソチオシアナート、エリスロシン−５−イソチオシアナート、フィコエリトリン（Ｂ−、Ｒ−またはシアニン−）、アロフィコシアニン、オレゴングリーン（登録商標）およびカスケード（登録商標）ブルーアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｅｕｇｅｎ， ＯＲ）を包含する。
【００３６】
Ｅｐｏ−ｂｐを包含するＥｐｏおよびＥｐｏＲを測定するさらに一つの方法は、酵素免疫アッセイである。この方法は、磁気分離、すなわち組織分類、細胞選別、細胞下細胞小器官分画およびＤＮＡ分離に極めて効率的かつ特異的である手法の利用を包含する。この方法の感度は、市場で利用できる、ＥＬＩＳＡ法を包含するその他の方法と比較したとき、１，０００倍高められることが期待される。ＥｐｏおよびＥｐｏＲもしくはＥｐｏ−ｂｐ、または抗Ｅｐｏ抗体および抗ＥｐｏＲ抗体は、この方法で検出することができる。一般に、捕捉ビーズ、たとえばアガロースビーズは、抗Ｅｐｏもしくは抗ＥｐｏＲ抗体を検出するために、ＥｐｏもしくはＥｐｏＲ、またはその部分でか、あるいはＥｐｏまたはＥｐｏＲを検出するために、抗Ｅｐｏもしくは抗ＥｐｏＲ抗体でかのいずれかで被覆することができる。生物学的サンプルを、捕捉ビーズに塗布し、適切な温度。および適切な時間長、たとえば室温で約２５分間温置する。そうして、酵素と包合させた、種特異的な二次抗体を加える。温置およびｄ洗浄の後、酵素基質を加え、発色させる。ビーズを、ペレット化し、上に記載したとおりに色を検出する。
【００３７】
これらの方法の無数の変化形を実施することができる。たとえば、酵素に包合させたストレプトアビジンまたはアビジンの添加および発色によって、陽性のサンプルが検出できるように、デテクター抗体をビオチニル化することができる。セイヨウワサビペルオキシダーゼを包合させた分子も、ルミノールの酸化を触媒することになり、化学ルミネセンスを通じて、光を検出することができる。発光は、化学的な増強剤を含ませることによって増強することができる。
【００３８】
本明細書に開示された、ＥｐｏＲの精製細胞外ドメインは、得られることになるそのような純粋なヒトＥｐｏ受容体断片（すなわち、非ヒトまたは非Ｅｐｏ受容体アミノ酸配列を含まない）の最初のものである。本明細書に開示された実験は、そのような断片が、ヒトＥｐｏに特異的に結合できる能力を保持していることを立証する。本明細書に開示されたタンパク質および抗体は、Ｅｐｏ−Ｅｐｏ受容体相互作用の機序を理解するのに役立つ。本発明の精製Ｅｐｏ−ｂｐは、Ｅｐｏ受容体の構造を調べ、赤血球系前駆細胞における分化および増殖機構の調節に関与する因子を特定するのにも役立つ。その上、本明細書に開示された発明は、ＥｐｏおよびＥｐｏ受容体を特定かつ定量することはもとより、造血系の悪性、および一定の心血管系疾患を理解することにも役立つ。加えて、本明細書に記載された大きな発見は、ヒト始原血液細胞は、すべて、Ｅｐｏ受容体を有することが示され、Ｅｐｏに結合できることである。
【００３９】
本発明は、下記の例示的実施態様を参照して、さらに理解されると思われるが、これらは、純粋に例としてのものであり、クレームに記載された限りでの本発明の真の対象範囲を限定するとして解釈してはならない。
【００４０】
例１材料及び方法
グルタチオン（ＧＳＨ）−アガロース、ｐＧＥＸ−２Ｔ発現ベクター及びセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｇ−５０は、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ； Ｍｅｃｈａｎｉｃｓｂｕｒｇ， ＰＡ）から購入した。ＰＣＲ試薬は、パーキン−エルマー・シータス（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ； Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ）から購入し、アフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ）１５は、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ； Ｒｉｃｈｍｏｎｄ， ＣＡ）から購入した。バクテリオファージＴ４ＤＮＡリガーゼ、制限酵素及びイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）は、ＢＲＬギブコ（ＢＲＬ Ｇｉｂｃｏ； Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）から購入した。Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩは、Ｂｉｏ １０１ （Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ） から購入した。ニトロセルロースは、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｃｏ． （Ｋｅｅｎｅ， ＮＨ） から購入した。化学蛍光（Ｃｈｅｍｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ： ＥＣＬ）試薬及び１２５Ｉ−Ｅｐｏは、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ； Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）から購入し、標識されていないＥｐｏは、Ｃｈｕｇａｉ−Ｕｐｊｏｈｎ （Ｒｏｓｅｍｏｎｔ， ＩＬ） から贈与を受けた。フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）、トロンビン、トリプシン及びトリトンＸ−１００は、シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ； Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から購入した。ビオチン化ウサギ抗ヒツジ抗体及びアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼは、ピアス社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｏ．； Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）から購入した。全長ヒトエリスロポイエチン受容体（ＥｐｏＲ）ｃＤＮＡ調製物であるＬＡＰ３７は、エール（Ｙａｌｅ）大学（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ， ＣＴ）の Ｂｅｒｎａｒｄ Ｇ． Ｆｏｒｇｅｔ博士から提供を受けた。その他の全ての試薬は試薬等級のものを使用した。
【００４１】
例２ＥｐｏＲ  ｃＤＮＡ組換えベクターの構築
組換えプラスミド発現ベクターｐＪＹＬ２６を、ヒトＥｐｏ受容体の細胞外ドメインコーディング配列を含有するＰＣＲ産物及びプラスミドベクターｐＧＥＸ−２Ｔから構築した。このプラスミドの構築を下記に説明する。
【００４２】
ＰＣＲ増幅は、全長ヒトＥｐｏＲ  ｃＤＮＡであるＬＡＰ３７を鋳型として使用して行った。５′−センスプライマーとしては、５′−ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＣＣＣＣＣＧＣＣＴＡＡＣ−３′を使用した。このプライマーは、５′末端にＢａｍＨＩリンカー配列を有しており、その後に全長ヒトＥｐｏＲタンパク質のアミノ酸第２５乃至第２９をコードする配列が存在する。３′−アンチセンスプライマーとしては、５′−ＴＧＡＡＴＴＣＧＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＣＴ−３′を使用した。このプライマーは、ＥｃｏＲＩリンカーを有しており、その後に全長ＥｐｏＲのアミノ酸第２２６乃至第２２２をコードする配列に相補的な配列が存在する。パーキンエルマー−シータスＰＣＲキットを使用し、ＬＡＰ３７  ｃＤＮＡ  ０．１μｇ、各プライマー  ２０ｐＭ、ｄＮＴＰ混合物（ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＡＴＰ）１．２５ｍＭ、Ｔａｑポリメラーゼ  ０．５μｌ 及びＰＣＲキットに供給された１０×緩衝液を用いてＰＣＲを行った。プログラミングが可能なＰＴＣ−１００サーマルコントローラー（Ｍ．Ｊ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ， Ｉｎｃ． Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ， ＭＡ）を使用して、９４℃で１分間変性させ、５５℃で１分間アニーリングさせた後、７２℃で１．５分間伸長させるサイクルを２５回反復して増幅させた。
【００４３】
ＰＣＲ産物（〜６００ｂｐ）及びｐＧＥＸ−２Ｔ（〜４．９ｋｂ）の大きさを、１％ Ｓｅａｋｅｍ 及び２％ Ｎｕｓｉｅｖｅアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ， Ｒｏｃｋｌａｎｄ， ＭＥ）のゲル上で、１×ＴＡ緩衝液（５０×ＴＡは、１Ｌ 中にトリス塩基２４２ｇ及び酢酸５７．１ｍｌを含有する）中でＨａｅ ＩＩスタンダードを用いて移動させ、確認した。ＰＣＲ産物及びｐＧＥＸ−２Ｔの両方を、製造者の指示（Ｂｉｏ １０１， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）のとおりにＧｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩ方法によってゲルスライスから精製した。ＰＣＲ産物及びｐＧＥＸ−２Ｔの濃度を、ＯＤ２６０での吸光度により概算した。その後、両ＤＮＡを、連結する前に３７℃で４時間ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化した。消化産物を、１％ Ｓｅａｋｅｍ 及び２％ Ｎｕｓｉｅｖｅアガロースゲル上で分析した。ＰＣＲ産物及びｐＧＥＸ−２Ｔ断片の両方をゲルから切り出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ ＩＩ方法によって再び精製した。
【００４４】
連結は、ＰＣＲ産物及びｐＧＥＸ−２Ｔをそれぞれ１μｇ／μｌ で含有する混合物で行った。混合物を、４５℃で５分間インキュベートし、０℃に冷却させた。その後、１０×バクテリオファージＴ４ＤＮＡ緩衝液  １μｌ、１０×バクテリオファージＤＮＡリガーゼ  １μｌ、１０ｍＭＡＴＰを加えて総量を１０μｌとした。次に、混合物全体を１６℃の循環水槽内で一晩インキュベートした。生成された連結物は、サイズスタンダード、ｐＧＥＸ−２Ｔ、ＰＣＲ産物、及び連結産物（ＰＣＲ産物＋ｐＧＥＸ−２Ｔ）を含むレーンを用いて、１％アガロースゲル上、１×ＴＡ緩衝液中を１００ボルトで移動させる電気泳動によって確認した。連結産物は、〜５．５ｋｂであることが確認された。その後、連結混合物のアリコートを用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換させた（連結混合物２０μｇ／ＪＭ１０９  ２００μｌ）。形質転換のためには、大腸菌混合物を静かに反転させて混合した後、氷浴中で３０分間インキュベートし、４２℃で正確に９０秒間インキュベートした。その後、混合物を氷浴中で１乃至２分間冷却させ、ＬＢ培地（１Ｌ 中に、バクトトリプトン  １０ｇ、バクトイースト  ５ｇ、ＮａＣｌ  １０ｇ含有、ｐＨ７．５、オートクレーブしたもの）５００μｌを添加した。３７℃で４５分間インキュベートした後、ＬＢ混合物を、ＬＢ／Ａｍｐ寒天ペトリプレート上に、５０、７５、１２５、１５０及び３００ｍｌの量で展開した。寒天ペトリプレートは、１Ｌ のＬＢ培地当たり１５ｇの寒天（オートクレーブしたもの）及び１００μｇ／Ｌ のアンピシリンを含有する、２０乃至３０ｍｌのＬＢ／Ａｍｐ培地で製造した。対照ＬＢ／Ａｍｐプレートは、完全な（インタクトな）ｐＧＥＸ−２Ｔ、消化されたｐＧＥＸ−２Ｔ及びＰＣＲ産物のみで作成した。プレートは、ベンチ上で数時間おいて液体を吸収させた後、逆にして３７℃で２４時間培養した。成長したコロニーを、格子を付したプレートに植え、これを再び３７℃で２４時間培養する一方、全てのコロニーの別のセットをＬＢ／Ａｍｐ培地各５ｍｌ中で一晩生育させた。
【００４５】
各コロニーからミニプレップ（ｍｉｎｉｐｒｅｐ）法でＤＮＡを抽出した。各コロニーをＬＢ／Ａｍｐ培地（５０μｇ／ｍｌ  Ａｍｐ貯蔵液の２μｌ／ｍｌ）５ｍｌと共に緩く栓をした１５ｍｌプラスチック試験管に入れ、激しく振とうしながら３７℃インキュベーター中で一晩培養した。次の日、各培養物の１．５ｍｌを、４℃、１４，０００×ｇで３分間マイクロ遠心分離してペレットにし、ＳＴＥＴ  ９３μｌ 及びリゾチーム貯蔵液１７μｌ（ＳＴＥＴ：５％スクロース＋５％トリトンＸ−１００＋５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０＋５０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、４℃保存；リゾチーム貯蔵液：５ｍｇ／ｍｌ、冷凍庫に保存）中に再懸濁させた。その後、再懸濁された混合物を室温で１０分間インキュベートし、２分間沸騰させた後、４℃、１４，０００×ｇで１５分間マイクロ遠心分離した。ペレットを滅菌した楊枝で除去し、ＲＮＡｓｅ（１００ｍｇ／ｍｌ）２μｌを上清に加え、３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、氷冷イソプロパノール１１０μｌを加えて、混合物を４回反転させた後、４℃、１４，０００×ｇで１５分間ペレットにした。次いで、ペレット（ＤＮＡ）を〜１ｍｌの７０％エタノールで洗浄し、残存するＳＴＥＴ及びその他の不純物を除去し、ペレットを再び４℃、１４，０００×ｇで１５分間遠心分離した。ペレットを１乃至２時間空気中で乾燥させた後、滅菌したｄＨ２Ｏ  ２５μｌ中に再懸濁させた。
【００４６】
抽出されたＤＮＡを、ＴＡ緩衝液中の０．８％アガロースゲル上で、色素フロント線がゲルの長さの４／５程移動するまで１００ボルトで泳動し、確認した。ゲルを、室温で１５分間、静かに振とうしながらエチジウムブロマイド（０．５μｇ／ｍｌ）で染色し、ｄＨ２Ｏで１５分間脱色した。ＤＮＡバンドは、ＵＶ光下で調べた。予測された大きさのＤＮＡを有する培養物を、ＥｃｏＲＩ及び／又はＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩで消化した後、ＴＡ緩衝液中の１％アガロースゲルで調べた。ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ消化は、試料混合物を、ＤＮＡ２μｇ当たりＥｃｏＲＩ又はＢａｍＨＩ  １μｇの比率で制限酵素と混合し、試料容量１０μｌ当たり制限酵素キットに包含されている１０×反応緩衝液１μｌを用いて、３７℃の水槽で２時間インキュベートすることによって行った。ＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲＩ＋ＢａｍＨＩで消化したＤＮＡサイズを１％アガロースゲルで調ベた後、約〜５．５ｋｂの大きさのプラスミドを有する１つのコロニーを選択した。このコロニー内のプラスミドを、ｐＪＹＬ２６と命名した。ｐＪＹＬ２６のダイヤグラムを、図１の上段に示す。
【００４７】
例３ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈ融合タンパク質の精製
本実施例は、２つのセグメントを有する融合タンパク質の製造及び精製を教示している。第一のセグメントは、カルボキシ末端にトロンビン切断部位を有するポリペプチドＧＳＴである。第二のセグメントは、このトロンビン切断部位で第一のセグメントに融合されている、ヒトＥｐｏ受容体の細胞外ドメインである。ＧＳＴ及びＥｐｏ−ｂｐを含有する融合タンパク質ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈは、ＧＳＨ−アガロース親和性クロマトグラフィーによって精製する。
【００４８】
組換えベクターｐＪＹＬ２６を含む形質転換された大腸菌を、アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地４００ｍｌ中で激しく振とうしながら３７℃で一晩生育させた。次の日、培養物を新しいＬＢ／Ａｍｐ培地４Ｌ で希釈し、更に９０分間培養した後、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭとなるように添加した。ＩＰＴＧで誘導した４時間後に、細胞を、４℃、３，０００×ｇで１５分間遠心分離してペレットにし、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール（βＭＥ）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ及び１ｍＭ  ＤＦＰを含む溶解緩衝液１６０ｍｌ中に再懸濁させた。次いで、固体リゾチーム１６０ｍｇを添加した。６０ｃｃ注射器を使用して、溶解された細胞懸濁液を、１８、２１及び２３ゲージの針を３度通過させてホモジナイズし、氷上で３０分間インキュベートした。ドライアイス／メタノール凍結及び３７℃での解凍過程を３回反復し、弱く超音波処理した後、トリトンＸ−１００を１％となるように添加した。上清を、４℃、１５×ｋｇで１５分間遠心分離して回収した。
【００４９】
ＧＳＨ−アガロースカラムは、膨潤させたＧＳＨ−アガロースビーズを１０倍のベッド容量のリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ：１６ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、４ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、３Ｍ ＮａＣｌの塩過剰）で３回洗浄して、保存剤及び溶出性デキストランをアガロースゲルから除去することによって調製した。その後、カラムを５倍のベッド容量の等張ＰＢＳで平衡化した。ＩＰＴＧで誘導された抽出物をカラムに適用し、カラムを５倍のベッド容量のＰＢＳで２回洗浄して、ＧＳＨ−アガロースに親和性を持っていない全てのタンパク質を溶出させた。その後、５０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に５ｍＭ  還元型ＧＳＨを含有する５倍のベッド容量の溶出緩衝液を加えることにより、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈを溶出させた。１．０ｍｌの画分を回収し、各画分のＡ２８０を測定した。Ａ２８０データを図２ａに示す。後に、画分１８乃至２３がＥｐｏＲｅｘ−ｔｈタンパク質を含有することが示された。これらの画分を合わせた。４Ｌの細胞培養物から、平均２ｍｇのＥｐｏＲｅｘ−ｔｈが抽出された。
【００５０】
例４Ｅｐｏ−ｂｐの精製
図１の下段に図式化したように、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈは、トロンビン特異的タンパク分解的切断部位を含有している。トロンビンは、図１に示すように、配列−ＣＴＧ  ＧＴＴ  ＣＣＧ  ＣＧＴ  ＧＧＡ  ＴＣＣ−にコードされるアミノ酸配列Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｐｒｏ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒで特異的に切断する。参照：Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ， Ｇｅｎｅ ６７： ３１−４０ （１９８８）。ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈをトロンビンと共にインキュベートしてＥｐｏ−ｂｐセグメントからＧＳＴセグメントを切断し、下記のようにＥｐｏ−アガロース親和性を利用して２つのセグメントを精製した。
【００５１】
最も効果的なトロンビン切断を見出すため、様々の濃度のトロンビンを試した。精製したＥｐｏＲｅｘ−ｔｈを、室温又は３７℃で、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で１時間、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈ  ６０μｇ当たり０．０１２５、０．１２５、０．６又は２．４μｇのトロンビンを用いてインキュベートした。その結果を、ポリアクリルアミドゲル（１２．５％）電気泳動で分析した。クマシーブルーで染色した後、融合タンパク質ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈ（５５ｋＤａ）、Ｅｐｏ−ｂｐ（２９ｋＤａ）及びＧＳＴ（２６ｋＤａ）に相当するバンドが見られた。ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈの完全消化のために、０．６μｇの濃度を選択した。結果を図３に示す。
【００５２】
トロンビンで切断するため、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈ  ６０μｇを、トロンビン０．６μｇと共に室温で１時間インキュベートした。混合物を、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）又はＰＢＳ中のエリスロポイエチン−アガロースカラムに適用した。Ｅｐｏ−ｂｐを０．１Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させた。０．５ｍｌの画分を、予め２Ｍ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）０．５ｍｌを含有している試験管に回収した。Ｅｐｏ−ｂｐピークの画分１４乃至１９を合わせた後、以後の実験のため、ＴＢＳ又はＰＢＳ中で４℃で一晩透析した。４Ｌ の細胞培養調製物から出発して、およそ２００μｇのＥｐｏ−ｂｐが抽出された。
【００５３】
Ｅｐｏ−アガロースビーズを使用してＥｐｏ−アガロースカラムを準備した。Ｅｐｏ−アガロースビーズは、０．１Ｍ ３−（Ｎ−モルフォリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）中でＥｐｏ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を４℃で一晩透析することによって調製した。Ｅｐｏは、透析したＥｐｏ溶液１ｍｌ及び洗浄したアフィゲル（Ａｆｆｉｇｅｌ）１５  ２ｍｌを混合し、回転振盪器上で室温で２時間インキュベートすることによって、アフィゲル１５ビーズに結合させた。上清を、２，０００×ｇで３０秒間マイクロ遠心分離した後に除去した。充填されたＥｐｏ−アガロースビーズは、４℃でＴＢＳ又はＰＢＳで３回洗浄し、使用するまで保存した。目的とするタンパク質画分を回収した後、Ｅｐｏ−アガロースビーズは、ＴＢＳ又はＰＢＳで十分に洗浄し、再使用するまで４℃に保存することができる。
【００５４】
例５Ｅｐｏ−ｂｐに対する抗体の製造
本実施例は、精製されたＥｐｏ−ｂｐに対する抗体の製造を教示している。精製されたＥｐｏ−ｂｐを、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動し、Ｅｐｏ−ｂｐタンパク質バンドをＰＢＳ中で再懸濁させ、ヒツジに注射した。抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体を含有するヒツジ血清は、その血清を１：２，０００で希釈した場合、精製されたヒトＥｐｏ−ｂｐを検出することが示された。
【００５５】
上記のとおり精製されたＥｐｏ−ｂｐ（０．５ｍｇ）を、２×処理（レムリ：Ｌａｅｍｍｌｉ）緩衝液と混合し、１０分間沸騰させた。混合物を１２．５％ＳＤＳゲルに適用し、２００ボルトで３乃至４時間電気泳動した。ゲルを０．１２５％クマシーブルーで一晩染色し、ｄＨ２Ｏで１乃至２時間脱色した後、カミソリでゲルからＥｐｏ−ｂｐバンドを切り出した。
【００５６】
Ｅｐｏ−ｂｐゲルスライスをＰＢＳ緩衝液１０乃至１５ｍｌ中に再懸濁させ、ゲルが小片に粉砕されてＰＢＳとの懸濁混合物を形成するまで、反復して注射器を通過させた。この懸濁液を成体のヒツジに皮下注射した。Ｅｐｏ−ｂｐは、動物体重２５ｋｇ当たりＥｐｏ−ｂｐ  ０．５ｍｇ以上の比率で注射した。初回の注射後３週毎に１回ずつ、初回注射と同じ用量で２回の追加免疫注射を行った。２回目の追加免疫注射後、血液を採取して抗体を回収することができる。動物による抗体の産生を維持するために、毎月注射することができる。注射部位は動物の各部位を巡回させる。参照：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｈａｐｔｅｒ １８， １９８９。
【００５７】
注射した動物から採血するため、採血部位の毛を７０％アルコールで消毒した。耳動脈又は他の接近可能な動脈を探して毛を剃った。少量のキシレンを、耳の端の、採血部位でない所に塗布した。血液を翼状針（バタフライ）で徐々に抜いて、ヘパリンを入れていないガラス試験管に受けた。血液を室温で１時間インキュベートして凝固させ、パスツールピペットで試験管壁から血餅をはずして、試験管を４℃で一晩インキュベートした。凝固した血液混合物を、ディッシュに注いで、血餅を除去した。凝固していない残りの部分を、ガラス試験管に戻し、３００ｒｐｍ で１０分間遠心分離した。Ｅｐｏ−ｂｐの精製について上述したのと同じ手順を用いて、上清（血清）を、Ｅｐｏ−ｂｐ親和性カラムに適用し、カラムに結合した抗体を、０．１Ｍ グリシン緩衝液（ｐＨ３．０）で溶出させた。溶出液を、ＰＢＳ中で４℃で一晩透析し、５００μｌずつのアリコートに分けて−７０℃で保存した。Ｅｐｏ−ｂｐ親和性カラムは、下記の例６に記載されているＥｐｏ−ｂｐアフィゲルビーズと同じ方法で、Ｅｐｏ−ｂｐ及びアフィゲル１５アガロースビーズから調製した。
【００５８】
この例で使用した溶液は、次のように調製する：  溶解緩衝液ＩＩ：５０ｍＭ  ＮａＰＯ４（０．５Ｍ  二塩基性ＰＯ４７．７４ｍｌ＋０．５Ｍ  一塩基性ＰＯ４  ２．２６ｍｌ）＋１０ｍＭ  β−メルカプトエタノール＋１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８。
ＰＢＳ緩衝液：０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋１６ｍＭ二塩基性ＰＯ４＋６ｍＭ  一塩基性ＰＯ４、ｐＨ７．４。
ＴＢＳ緩衝液：１Ｌにつき、２Ｍ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１２．５ｍｌ＋５Ｍ  ＮａＣｌ  ２７．５ｍｌ。
２×処理（レムリ）緩衝液：０．１２５Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８＋４％ＳＤＳ＋２０％グリセロール＋１０％β−メルカプトエタノール。
【００５９】
ヒツジ抗Ｅｐｏ−ｂｐ血清を、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， ２ｎｄ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９に記載されているウェスタンブロッティング法及びＥＣＬ製造者（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏ．， Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）によって提供されているウェスタンブロッティングプロトコールによって、精製されたＥｐｏ−ｂｐに対する結合について分析した。トロンビンで切断した後、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈとＥｐｏ−ｂｐとをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動により分離した。その後、ゲルをニトロセルロース（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｃｏ．， Ｋｅｅｎｅ， ＮＨ）上にブロッティングした。ブロット液（Ｂｌｏｔｔｏ：１Ｌ 中に脱脂粉乳８０ｇ、５Ｍ ＮａＣｌ  ３０ｍｌ、２Ｍ トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５  １０ｍｌ及び０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）中のニトロセルロースに、ヒツジ抗Ｅｐｏ−ｂｐ血清を１：２，０００の希釈倍率で加え、静かに撹拌しながら室温で１時間インキュベートした。一次抗体を洗浄した後、第二の試薬であるビオチン化されたウサギ抗免疫グロブリン抗ヒツジ抗体（１：１０，０００希釈）をブロット液中のニトロセルロースに加え、更に１時間室温で振とうしながらインキュベートした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ−アビジン（１：１０，０００希釈）を加え、混合物を室温で４５分インキュベートした。洗浄したニトロセルロースを、素早く化学蛍光（ＥＣＬ）試薬に浸した後、濡れた状態のブロットを直ちにＫＯＤＡＫ Ｘ線フィルムに露出させた。図４は、各レーンに下記のタンパク質が適用されたウェスタンブロットの写真を示す：レーン１、分子量スタンダード；レーン２、トロンビンで消化したＥｐｏＲｅｘ−ｔｈ；レーン３、ＧＳＴ；レーン４、精製されたＥｐｏ−ｂｐ。図４のレーン４から分かるように、精製されたＥｐｏ−ｂｐは、１：２，０００で希釈された抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体によって検出された。精製されたＥｐｏ−ｂｐの見掛け分子量は、約２９ｋＤａ であった。
【００６０】
例６Ｅｐｏ−ｂｐに対するＥｐｏの結合
本例は、Ｅｐｏ−ｂｐに対するＥｐｏのリガンド結合及び結合に対するＥｐｏ濃度の効果を教示している。
【００６１】
Ｅｐｏ−ｂｐビーズは、ＰＢＳ中の洗浄されたアフィゲル１５アガロースビーズに、６０μｇ／ｍｌのＥｐｏ−ｂｐを添加し、タンパク質の最終濃度がＥｐｏ−ｂｐビーズ１ｍｌ当たりおよそ３０μｇとなるようにして調製した。混合物を回転プラットホーム上で室温で２時間インキュベートした。氷冷ＰＢＳ緩衝液で３回洗浄した後、ペレットをＰＢＳ緩衝液１ｍｌ中に再懸濁させた。結合アッセイのため、最終懸濁液３０μｌ（Ｅｐｏ−ｂｐ約１．０μｇ）を種々の濃度の１２５Ｉ−Ｅｐｏと混合し、５分ごとにピペットで再懸濁させながら室温で１時間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、氷冷ＰＢＳ緩衝液１ｍｌを加えて、反応していない１２５Ｉ−Ｅｐｏを洗浄し、更に２回洗浄をくり返した。反応させたビーズを、ガンマー計数器で計数した。トリプシン消化抽出物（下記参照）からの、完全なＥｐｏ−ｂｐより小さいタンパク質も、同じ方法で適用して、リガンド結合に関する効果をテストした。非特異的結合は、標識されたＥｐｏを添加する前に混合物を１時間２００倍過剰量の標識されていないＥｐｏと予めインキュベートする以外には、同じ方法で測定した。
【００６２】
Ｅｐｏに対するＥｐｏ−ｂｐの結合を図５に示す。図５の各点は、２乃至４回の試料の平均値である。データは平均値±ＳＥＭとして示してある。ｐ数値が０．０５未満の場合、有意であるものとした。結果を、２−テイルドステューデントｔ−テスト（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔ−ｔｅｓｔ）で分析した。Ｅｐｏ−ｂｐに対するＥｐｏの特異的結合活性は、Ｅｐｏ濃度が増加するに従って急激に増加し、１２５Ｉ−Ｅｐｏの濃度を８ｎＭから１２ｎＭに増加させると結合は３倍に増加した。Ｅｐｏ結合の見掛けの飽和状態は、１２ｎＭで起こった。これは、１２５Ｉ−Ｅｐｏの反応させていない上清においても確認された。Ｅｐｏ−ｂｐに対する１２５Ｉ−Ｅｐｏの結合は、１２５Ｉ−Ｅｐｏが８ｎＭ以上である濃度条件で、標識されていないＥｐｏの存在下で有為に抑制された（両比較でｐ＜０．０００１）。非特異的結合は、予想よりも多少高かった。ウェスタンブロット及び結合アッセイで示されたＥｐｏ−ｂｐに対するＥｐｏ結合の特異性及び感度により、過剰量の標識されていないＥｐｏが１２５Ｉ−Ｅｐｏの結合を完全に排除しうることは、予期されていた。
【００６３】
リガンド結合に関与するＥｐｏ−ｂｐの最小限の配列を見出すため、トリプシン消化実験を行った。Ｅｐｏ受容体タンパク質にはいくつかのアルギニン及びリジン部位が存在し、これらはトリプシン消化の特異的部位となることもできる。Ｅｐｏ−ｂｐのトリプシン消化は、総量２００μｌのＰＢＳ、ｐＨ６．７中で、Ｅｐｏ−ｂｐ  ５μｇ当たり１０、２０、３０、５０、１００μｇ及び２ｍｇのトリプシンを用いて、３７℃で３乃至６時間行った。反応は、等量の２Ｎ 酢酸を加えるか、あるいは沸騰させることによって停止した。図６から分かるように、Ｅｐｏ−ｂｐは、２０μｇ以上のトリプシンが存在する場合、効果的に切断された。トリプシンは、２ｍｇのトリプシンを含有するレーンで２３．２ｋＤａのタンパク質バンドとして視認可能である。トリプシンによって消化されたＥｐｏ−ｂｐは、２０ｋＤａのタンパク質として視認可能である。図６において、レーン１は標準分子量マーカーを含み；レーン２は対照であり；レーン３乃至８は、それぞれ１０、２０、３０、５０、１００μｇ及び２ｍｇのトリプシン濃度で３７℃で３時間消化したものを示し；レーン９乃至１４は、同じトリプシン濃度で３７℃で６時間インキュベートしたものを示す。
【００６４】
切断されていないＥｐｏ−ｂｐはおよそ３０ｋＤａであるので、ファルマシア  セファデックスＧ−５０（ＭＷ≦３０，０００）を使用したゲル濾過クロマトグラフィーを適用して、分子量≦３０，０００のタンパク質成分を総混合物から分離した。粉末状のセファデックスＧ−５０を水和させ、等張ＰＢＳで数回洗浄して保存剤を除去した。トリプシンで消化したＥｐｏＲｅｘ−ｔｈを、ゲルカラムの上部にＰＢＳ中総量２ｍｌで適用した。カラムを、スイングローター（ｓｗｉｎｇｉｎｇ−ｂｕｃｋｅｔ ｒｏｔｏｒ）内で２，０００×ｇで室温で４分間遠心分離した。注射器底より回収された最初の溶出液（〜０．２ｍｌ）を、蓋を取ったマイクロ遠心チューブに回収した。この溶出液は、Ｅｐｏ−ｂｐより大きいサイズのタンパク質を含有している。更にＰＢＳ緩衝液０．２ｍｌをカラムに加えて、１０分間遠心分離することによって、二番目の溶出液を新しい蓋を取ったマイクロ遠心チューブに回収した。この工程を２回反復した。二番目の溶出液をＥｐｏ−アガロースカラムに適用し、ピークの画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びウェスタンブロッティングで調べた。図６に示すように、トリプシンで消化したＥｐｏ−ｂｐの最終産物は、およそ２０ｋＤａ であった。抗体は、切断されたＥｐｏ−ｂｐを認識しなかった。したがって、ウェスタンブロッティングによって確認されたように、トリプシン消化によってＥｐｏ−ｂｐから３０個のアミノ酸が除去されると、Ｅｐｏ−ｂｐに対する抗体による認識も完全に排除された。
【００６５】
例７
前駆細胞におけるＥｐｏＲの検出：
ＰＣＲ試薬は、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ（Ｎｅｗａｌｋ， ＣＴ）から、またＡｆｆｉｇｅｌ（登録商標）１５は、ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）から購入した。イソプロピルチオ−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）は、ＢＲＬ Ｇｉｂｃｏ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）から購入した。ニトロセルロースは、Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ Ｃｏ．（Ｋｅｅｎｅ， ＮＨ）から購入した。化学ルミネセンス（ＥＣＬ）試薬は、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ， ＩＬ）から購入した。２，７−ジクロロフルオレセイン、フェニルメチルスルホニル＝フロリド（ＰＭＳＦ）、ジイソプロピルフルオロホスファート（＊ＤＦＰ）、トロンビン、トリトンＸ−１００、ビオチン−アミドカプロイル−ヒドラジド、アルカリ性ホスファターゼ結合体、およびリン酸ｐ−ニトロフェニル二ナトリウムは、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）から購入した。ビオチニル化ウサギ抗ヒツジ抗体、アビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼ、およびＩｇＧ精製キットは、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）から購入した。ジゴキシゲニン（標識化核酸用）、ストレプトアビジンおよびウサギ抗ジゴキシゲニンＦａｂ／アルカリ性ホスファターゼ結合体は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍｅｎｈｅｉｍ Ｃｏｒｐ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）から購入し、微量滴定プレートは、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｃｏｓｔａｒ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ）から購入した。ヒツジ抗Ｅｐｏおよび抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体は、例５に上記したとおりに、調製した。オリゴヌクレオチドは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ， Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ， ＭＮの微化学施設によって合成した。他の化学物質は、すべて、試薬等級のものである。
【００６６】
動物：５週齢の雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットを、対照またはＥｐｏ投与群に割り振って、明（Ｌ）周期を０４：００時〜１８：００時とし、５匹の下位群を、それぞれ、Ｌオンの０、４、８、１２、１６および２０時間後に形成した。ラットは、標準的なラット飼料、および自由に到達できる飲料水で飼育した。４週後、週３回のＥｐｏ（５０Ｕ／体重ｋｇ）または生理食塩水注射の４週間の課程の完了直前直後に４時間ごとに体重を測定した。血圧測定のためには、ラットの大腿動脈に挿管した。
【００６７】
統計方法：結果は、スチューデントの両側ｔ検定、および線形最小二乗律動測定法によって解析した。データは、平均±標準誤差として表した。０．０５未満のｐ値を、有意であると見なした。
【００６８】
結果：５０単位／ｋｇのＥｐｏを週３回ずつ４週間投与したラットは、すべて、脾臓腫大を示したが（１２０匹）、生理食塩水投与のラットで脾臓腫大を示したのは、皆無であった。注目すべきことに、この研究に用いた濃度は、臨床的設定に一般的に用いられる用量範囲内（５０〜１５０単位／ｋｇ）に属した。図７Ａ〜７Ｃは、Ｅｐｏ投与脾臓を示すが、図７Ｄは、対照脾臓である。血圧は、Ｅｐｏ投与により全体的に上昇した。対照対Ｅｐｏ投与の基線値は、８９対８６ｍｍＨｇであったのに対し、投与後の値は、１１６対１３５ｍｍＨｇであった（ｐ＜０．０００１）。血液上昇、ヘマトクリット増加および脾臓肥大の与えられた値で、変化は、早朝の方が悪化した（午前８：００時の値は、三者すべてについて最悪）。表１は、観察の要約を示す。
【００６９】
受容体を、下記の方法で標識した。骨髄細胞を、ＰＢＳで３回洗浄し、対照およびサンプルについて丸底マイクロプレートのウェルごとに１〜３ｘ１０３個の細胞を分与した。上清を除去し、精製されたＦａｂ分画フルオレセイン包合抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体１００μｌを加えた。混合物を氷上に３０分間放置し、次いで、細胞を、ＰＢＳ中１％のＦＣＳおよび０．０１％のＮａＮ３を含有する緩衝液４００μｌを各サンプルに加えることによって、３回洗浄し、２００Ｇで２分間遠心分離した。細胞を、総量５０μｌ以下のＰＢＳ中にボルテックス攪拌器上で再懸濁させ、倒立蛍光顕微鏡下で分析した。図８Ａ〜８Ｆは、フルオレセイン標識した対照骨髄細胞、またはしなかったそれの顕微鏡写真である。図９Ａ〜９Ｆは、フルオレセイン標識した骨髄前駆細胞、またはしなかったそれの顕微鏡写真である。受容体の結合部位は、蛍光標識化の手法を用いて、視覚化してある。注目すべきことに、結合部位は、巨核球（Ｍ）、赤芽球（＊、▲）、および、正赤芽球（⇒）の間ばかりでなく、骨髄芽球（△）の間にも位置している。図１０は、図９のと同じプレパラートを含むが、異なる視野が示されている。これは、細胞間の細胞受容体を示し、受容体が位置する細胞型を特定する最初の刊行物である。
【００７０】
【表１】
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【００７１】
例８：
ＥｐｏもしくはＥｐｏＲ、およびそれらの部分を検出するための免疫蛍光標識化の方法
Ｅｐｏ／Ｅｐｏ−ｂｐ、およびそれらの抗体の蛍光標識化を、製造者の使用説明書に従って実施した。フルオレセイン標識したＦａｂ抗体画分も、製造者のプロトコルに記載されたとおりに精製した。Ｆｃ画分も、その他の用途のために精製かつ保管することができる。これらの材料を用いて、血漿、血清、巨核球、ＲＢＣおよびＷＢＣ前駆細胞、または均一化脾臓もしくは腎臓サンプルを包含する、血液および／または組織サンプル中のＥｐｏおよびＥｐｏＲを検出した。別途指定されない限り、０．９％ＮａＣｌ中に１６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、４ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、および２．７ｍＭのＫＣｌを含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いた。アッセイの結果は、１時間未満で用意することができた。
【００７２】
Ａ．血清／血漿／均一化組織サンプル
９６穴マイクロプレートを、１μｇ／ウェルの精製された、Ｅｐｏ検出のための抗Ｅｐｏ抗体、またはＥｐｏ−ｂｐもしくはＥｐｏＲ検出のための抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体で予備被覆する。抗Ｅｐｏおよび抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体を、９６穴マイクロプレートの異なる別個の領域に予備被覆して、ＥｐｏおよびＥｐｏＲの同時検出を容易にする。
【００７３】
１）１：１０希釈サンプル（血清／血漿／均一化組織）２００μｌを、捕捉Ｅｐｏ／抗体またはＥｐｏ−ｂｐ／抗体に加える。混合物を、３７℃で２時間温置し、次いで、プレートを流しの上で一回軽い動きで裏返すことによって、上清を除去する。
【００７４】
２）１μｇ／ｍｌの、それぞれ、Ｅｐｏ検出のためのＦａｂ分画フルオレセイン標識化抗Ｅｐｏ抗体、またはＥｐｏ−ｂｐもしくはＥｐｏＲ検出のためのＦａｂ分画フルオレセイン標識化抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体、および抗Ｅｐｏまたは抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体検出のためのフルオレセイン標識化ＥｐｏもしくはＥｐｏ−ｂｐを加える。混合物を３７℃で１５分間温置し、４００μｌ／ウェルの、ＰＢＳ中１％のＦＣＳおよび０．０１％のＮａＮ３を含有する緩衝液で３回洗浄する。
【００７５】
３）ＰＢＳ緩衝液５０μｌを加え、倒立蛍光顕微鏡下で分析するか、および／またはマイクロプレート蛍光光度計を用いて、４９０ｎｍでの吸光度を測定する。
【００７６】
Ｂ．前駆細胞サンプル
１）ＰＢＳ中の洗浄した血液または骨髄細胞を、対照およびサンプルプレート用の丸底マイクロプレートに１〜３ｘ１０３細胞／ウェルで分与し、微量滴定プレートローターを取り付けた遠心分離機を用いて、２００Ｇで２分間遠心分離して、ペレットを形成する。
【００７７】
ａ．上清を除去し、Ｆａｂ分画したフルオレセイン包合させた抗体１００μｌを加え、プレートをボルテックス攪拌器上で充分に混合する。混合物を氷上で３０分間放置し、次いで、ＰＢＳ中１％のＦＣＳおよび０．０１％のＮａＮ３を含有する緩衝液４００μｌを、各ウェルに加えることによって、細胞を３回洗浄し、２００Ｇで２分間遠心分離する。
【００７８】
ｂ．プレート内の細胞を、ボルテックス攪拌器上でＰＢＳに再懸濁させて、総量を５０μｌとし、倒立蛍光顕微鏡下で分析するか、および／またはマイクロプレート蛍光光度計を用いて、４９０ｎｍでの吸光度を測定する。
【００７９】
フルオレセイン標識化細胞は、直ちに分析するか、または２〜３時間まで氷上に保つことができる。図９および１０は、骨髄前駆細胞のフルオレセイン標識化受容体部位を示し、受容体が視覚化されている。
【００８０】
例９
検出のＰＣＲの方法：
比色分析に基質および抗体を用いて、リガンド結合部位を検出し、Ｅｐｏ／ＥｐｏＲ−ｍＲＮＡ産生を測定することになる。酵素免疫アッセイを発展させるための迅速な標識化には、Ｅｐｏ／ＥｐｏＲ−ＤＮＡｄによるＰＣＲ生成したプローブの非放射性標識化を、ハイブリダイゼーションの際に適用して、ベクターと配列との間のクロスハイブリダイゼーションを反映する非特異的バックグラウンド反応を軽減することができる。ジゴキシゲニン特異性アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）包合体で改質したＤＩＧのＥＬＩＳＡ型検出のために、このＰＣＲ産物を、非放射性ハイブリダイゼーションプローブとして用いることができ、非標識化標的核酸をハイブリダイズさせて、ＤＩＧ標識化ハイブリダイゼーション複合体を調製する。抗原−抗体−ＡＰ複合体は、基質の５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル＝ホスファート（ＢＣＩＰ）を、沈澱したイノキシル基を検出するニトロブルーテトラゾリウム＝クロリド（ＮＢＴ）と併用して、定位される。
【００８１】
ｍＲＮＡ抽出：
Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ． （Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ， ＣＡ）の全ＲＮＡキットを、等重量の各器官、または等しい細胞数（製造者の説明に従って、血液サンプル２ｍｌを用いて溶菌するか、または組織１ｇを用いてホモジナイズして、ＲＮＡを抽出した）とともに用いて、全ＲＮＡを抽出した。結合条件を調整するようサンプルを調製し、ＲＮｅａｓｙ Ｋｉｔに掛け、ＰＢＳで３回洗浄して、全ＲＮＡを溶離させた。ｍＲＮＡは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＣｅｔｕｓのＰＣＲキットを、ＥｐｏまたはＥｐｏＲプライマー、および上記の抽出されたサンプルからの全ＲＮＡとともに用いて、精製することになる。ｍＲＮＡは、臭化エチジウムで染色したアガロースゲル上で確認した。ｍＲＮＡバンドを、読み／定量し、写真に記録した。
【００８２】
原液
ＢＣＩＰ：１０％ジメチルホルムアミド、５０ｍｇ／ｍｌ；
ＮＢＴ：７０％ジメチルホルムアミド、５０ｍｇ／ｍｌ、暗所で４℃で貯蔵；
アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）：ニトロブルーテトラゾリウム＝クロリド（５０％ジメチルホルムアミド中５０ｍｇ／ｍｌとして２０μｌ）、および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル＝ホスファートｐ−トルイジンブルー塩（５０％ジメチルホルムアミド中５０ｍｇ／ｍｌとして１００μｌ）を、１００ｍＭのトリスＣｌ、ｐＨ９．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２３０ｍｌに溶解し、室温で貯蔵；
【００８３】
ＢＣＩＰ／ＮＢＴ調製：
使用直前に、ＮＢＴ原液３３μｌを、ＡＰ緩衝液５ｍｌに加え、充分に混合する。次いで、ＢＣＩＰ原液１６．５μｌを加え、充分に混合する。基質混合物は、３０分以内に用いなければならない。
【００８４】
光学的検出のためには、光学的基質のＢＣＩＰ／ＮＢＴを加えて、青色の生成物を得、４０５ｎｍで吸光度を測定する。
【００８５】
手順：
１）対照鋳型、１対のＥｐｏおよびＥｐｏＲＰＣＲプライマー、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、およびジゴキシゲニン標識化ｄＵＴＰ／ｄＮＴＰを包含する、ＰＣＲキットが供給されている。試験を実施するときはサンプルＤＮＡが必要である。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは、他から別個に購入することもできる。
【００８６】
２）２５周期のＰＣＲを実施して、Ｄｉｇ−ＤＮＡ、ビオチニル化ＤＮＡ、またはＤｉｇ−ビオチニル化ＤＮＡ断片を１００μｌの総量で得る。ＰＣＲ産物は、たとえば、１％アガロースゲル中での電気泳動、および臭化エチジウム染色によって、確認する。
【００８７】
３）９６穴ＥＩＡマイクロプレートを、アビジン−ビオチン複合体法でのビオチニル化ＤＮＡ検出のためには、１ウェルあたり１００μｌのストレプトアビジンでか、またはビオチニル化またはＤｉｇ標識化検出のいずれかのためには、精製Ｅｐｏ／ＥｐｏＲ抗体で被覆する。
【００８８】
４）ＰＣＲ産物の量を、ＴＢＳ中２００μｌに増加させる。ＰＣＲ産物ほぼ１００μｌを９６穴ＥＩＡマイクロプレートに重複して加えて、固定化する。３７℃で３０分間温置して、ＰＣＲ産物を結合させ、次いで、プレートを流しの上で一回軽い動きで裏返すことによって、上清を除去する。
【００８９】
５）１００μｌ／ウェルのアルカリ性ホスファターゼ包合ウサギポリクローナルヒツジ抗ジゴキシゲニンＦａｂ（１μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で３０分間温置し、次いでＴＢＳ４００μｌ中で３回洗浄する。
【００９０】
６）基質溶液１００μｌを加える。発色のためには、１０体積％のジエタノールアミン−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．５中のホスファターゼ基質、リン酸ｐ−ニトロフェニル二ナトリウム（１ｍｇ／ｍｌ）を加えることになる。室温で３０分間温置して、酵素反応を実施し、次いで、０．０１％ＮａＮ３を含有する停止液１００μｌを加え、ＴＢＳ４００μｌで３回洗浄する（発色中は、振盪しないこと）。
【００９１】
７）発色を視覚的に記録し、ＥＬＩＳＡリーダーによって４０５ｎｍでの吸光度を決定する。
【００９２】
ジゴキシゲニンを組み込んだＤＮＡ断片は、抗ジゴキシゲニン抗体が認識する。
【００９３】
例１０
酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）の方法：
ビーズ法
ＥｐｏおよびＥｐｏ−ｂｐアガロースビーズを、０．１Ｍの３（ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）中で４℃で終夜透析したＥｐｏおよびＥｐｏ−ｂｐ（０．５ｍｇ／ｍｌ）を用いて調製し、透析ＥｐｏおよびＥｐｏ−ｂｐの溶液１ｍｌ、および洗浄したＡｆｆｉｇｅｌ １５のビーズを混合することによって、Ａｆｆｉｇｅｌ １５ビーズに結合する。混合物を、回転振盪機にて室温で２時間温置した。２，０００Ｇで３０分間微量遠心分離した後、上清を除去し、次の工程に応じてＰＢＳまたはＴＢＳ中で洗浄した。
【００９４】
１）Ａｆｆｉｇｅｌ １５ビーズを、Ｅｐｏ検出のための２μｇ／ウェルの抗Ｅｐｏ抗体、およびその逆、またはＥｐｏ−ｂｐ検出のための抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体、およびその逆で被覆する。
【００９５】
２）ＴＢＳ中で１：１０に希釈したサンプル血清／血漿／均一化組織２００μｌを、それぞれ、捕捉Ｅｐｏ／抗体またはＥｐｏ−ｂｐ／抗体に加え、次いで、静かに揺動しつつ、室温で２５分間温置し、ＴＢＳで３回洗浄し、２００Ｇで４℃で２分間して、上清を除去する。
【００９６】
３）１μｇ／ｍｌのウサギ抗ヒツジ免疫グロブリン／アルカリ性ホスファターゼ包合体を、指標として加え、静かに揺動しつつ、室温で２５分間温置し、ＴＢＳで３回洗浄する。
【００９７】
４）発色のために、１０体積％のジエタノールアミン−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ９．５中のホスファターゼ基質、リン酸ｐ−ニトロフェニル二ナトリウム（１ｍｇ／ｍｌ）を加え、室温で３０分間温置し、４０５ｎｍでの吸光度を測定する。
【００９８】
例１１
アビジン−ビオチン複合体法：
製造者の使用説明書に従って、Ｅｐｏ、Ｅｐｏ−ｂｐ、およびそれらの抗体を、ビオチン−アミドカプロイル＝ヒドロアジドでビオチニル化した。クロマトグラフィーからの各生成物２．５ｍｇを、ＰＢＳ緩衝液中で終夜透析してから、ビオチニル化した。透析された生成物を、それぞれ、ビオチン−アミドカプロイル＝ヒドロアジド４０ｍｇ、およびＮａＣＮＢＨ３（Ｓｉｇｍａ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）５ｍｇを加えることによってビオチニル化し、３７℃で２時間温置した。ＰＢＳ緩衝液中での徹底的な透析によって、残留試薬を生成物から分離した。検出は、血漿または血清前駆細胞、および均一化脾臓もしくは腎臓サンプルを包含する、血液および／または組織サンプル中での、抗Ｅｐｏ抗体検出のためのＥｐｏ、Ｅｐｏのための抗Ｅｐｏ抗体、抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体のためのＥｐｏ−ｂｐ、およびＥｐｏ−ｂｐのための抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体を包含する。
【００９９】
１）９６穴マイクロプレートを、１ウェルあたりＰＢＳ中２０μｇ／ｍｌの精製された、Ｅｐｏ検出のための抗Ｅｐｏ抗体、もしくはその逆、またはＥｐｏ−ｂｐ検出のための抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体、もしくはその逆で予備被覆する。
【０１００】
２）１：１０希釈サンプル血清／血漿／均一化組織２００μｌを加え、３７℃で３０分間温置し、次いで上清を除去する。
【０１０１】
３）１ウェルあたりＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌのビオチニル化した、Ｅｐｏ検出のための抗Ｅｐｏ抗体、もしくはその逆、またはＥｐｏ−ｂｐ検出のための抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体、もしくはその逆１００μｌ（を加える）。混合物を、３７℃で２０分間温置し、次いでＰＢＳ４００μｌで３回洗浄する。
【０１０２】
４）１ウェルあたりＰＢＳ緩衝液中１００μｌのストレプトアビジン（２μｇ／ｍｌ）を加え、３７℃で２０分間温置し、次いで、１％ＦＣＳおよび０．０１％ＮａＮ３を含有するＰＢＳで３回洗浄する。上清を、プレートを流しの上で一回軽い動きで裏返すことによって除去する。
【０１０３】
５）プレート内の混合物を、ボルテックス攪拌器によって、緩衝液に再懸濁させて、１００μｌの総量とし、ＢｉｏＲａｄのマイクロプレートリーダー、または同等のいずれかのマイクロプレートリーダーを用いて、４０５ｎｍでの吸光度を測定する。アッセイの結果は、１時間未満で用意することができる。
【０１０４】
一次抗体は、標的タンパク質を定位するが、それは、種特異性二次抗体を用いて、セイヨウワサビ過酸化物（ＨＲＰ）と包合させることによって検出される。ＨＲＰ包合ストレプトアビジン複合体は、定型的プロトコルにも変更せずに用いることができる。ＨＲＰ包合分子（たとえば抗体、ストレプトアビジンまたはプロテインＡ）は、ルミノールの酸化を触媒し、発光は、化学ルミネセンスを介して検出されるが、それは、ルミノールのＨＲＰで触媒される酸化に化学的な増強剤を含ませることによって与えられる、持続的な発光によって増強される。ＥＣＬは、ルミノール単独での酸化より約１，０００倍も多くの光を与える。
【０１０５】
例１２
ＥｐｏおよびＥｐｏＲの検出のためのＥＩＡ：
血液サンプルは、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ研究所、Ｔｗｉｎ Ｃｉｔｉｅｓ病院および血液銀行での志願者はもとより、横浜および東京の日本の病院からも得た。抗体およびＥｐｏ−ｂｐは、すべて、上記のとおり調製した。ＥＩＡは、下記のとおり実施した：
【０１０６】
１）ＥＩＡマイクロプレートを、２μｇ／ウェルの、Ｅｐｏ検出のための抗Ｅｐｏ抗体、またはＥｐｏ−ｂｐ検出のための抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体で被覆した。抗体検出のために、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中２００μｌの１：１０希釈血清または血漿でプレートを被覆し、室温で３０分間温置するか、または４℃で終夜貯蔵した。
【０１０７】
２）ウェルを２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴ（ＰＢＳ中０．０５％のトゥイーン２０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．， ＭＯ））で３回洗浄した。
【０１０８】
３）ＰＢＳＴ中１％のＢＳＡ２００μｌを各ウェルに加え、室温で３０分間温置することによって、非特異的結合部位を遮断した。
【０１０９】
４）ウェルを、２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄した。
【０１１０】
５）ストレプトアビジン（ＰＢＳＴ２００μｌ中２μｇ／ウェル）標識した抗体（Ｅｐｏ検出のためのＦａｂ抗Ｅｐｏ抗体、抗ＥｐｏのためのＥｐｏ、Ｅｐｏ−ｂｐ検出のためのＦａｂ抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体、または抗Ｅｐｏ−ｂｐのためのＥｐｏ−ｂｐ）をウェルに加え、サンプルを室温で３０分間温置した。
【０１１１】
６）ウェルを２００μｌ／ウェルのＰＢＳＴで３回洗浄した。
【０１１２】
７）各ウェルに、リン酸−クエン酸緩衝液、ｐＨ６中の二塩酸ｏ−フェニレンジアミン（ｏＰＤ）（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃｏ．， ＭＯ）１６０μｌを加え、室温で３０分間温置した。
【０１１３】
８）５ＮのＮａＯＨ４０μｌを加えることによって、反応を停止し、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。
【０１１４】
リン酸−クエン酸緩衝液中のｏＰＤは、下記のとおり調製した。１００ｍｌのためには、０．５Ｍクエン酸塩４．８６ｍｌ、０．５ＭのＮａ２ＨＰＯ４１０．２８ｍｌ、ｏＰＤ原液（１０ｍｇ／ｍｌ）２ｍｌ、およびｄＨ２Ｏを１００ｍｌまで、ｐＨ６．０。使用直前に、３％Ｈ２Ｏ２４００μｌを加えた。
【０１１５】
ＥＩＡの結果を、図１１に示すが、各測定の光学的密度（ＯＤ）は、８〜１４例の個々の（二重にとった）サンプルの平均±ＳＥとして提示されている。図１１に提示されたＯＤ測定は、各サンプルのＯＤからブランｋのＯＤ値を減算することによって算出した。図１１に示されるとおり、血清および血漿中のＥｐｏおよびＥｐｏ−ｂｐのＯＤは、互いに類似している（ＯＤ４０５：血清Ｅｐｏ、血清Ｅｐｏ−ｂｐ、血漿Ｅｐｏおよび血漿Ｅｐｏ−ｂｐについて、それぞれ、０．３０８±０．０２６、０．２８９±０．０２２、０．２８９±０．０２８および０．２９９±０．０１５）。抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体レベルの血漿レベルは、他の３カテゴリーのそれより有意に低かった：血清抗Ｅｐｏ、血清抗Ｅｐｏ−ｂｐ、血漿抗Ｅｐｏおよび血漿抗Ｅｐｏ−ｂｐについて、それぞれ、０．０５８±０．００８；０．０５２±０．００６；０．０５４±０．０１３；および０．３１±０．００４（ｐ＜０．０２５）。血清中のＥｐｏまたはＥｐｏ−ｂｐ、および血漿中のＥｐｏに対する抗体は、類似するように思われた。ＥｐｏおよびＥｐｏ−ｂｐ値を、同じプレートに対照として調製された既知のＥｐｏ濃度を用いて、ｍＵ／ｍｌに変換した。血清中には、２５．４±２．１７ｍＵ／ｍｌのＥｐｏ、および２４．２±１．８４ｍＵ／ｍｌのＥｐｏ−ｂｐが存在した。血漿には、２４．２±２．３５ｍＵ／ｍｌのＥｐｏ、および２５．０±１．２６ｍＵ／ｍｌのＥｐｏ−ｂｐが存在した。
【０１１６】
このアッセイは、ＥｐｏおよびＥｐｏ−ｂｐを測定するための簡単な方法であり、放射線免疫アッセイによるＥｐｏおよびＥｐｏ−ｂｐの測定（１７．７±６．３ｍＵ／ｍｌ）よりも、単位数の面で鋭敏なアッセイ、およびはるかに少ない標準誤差を与える。さらに、調製に用いられる材料は、慣用の方法に用いられる材料、たとえば放射能その他の毒性を有する化学物質に比して、環境的に穏やかである。
【０１１７】
上記の詳細な説明は本発明に対する理解を増進させるためだけのものであり、当業者には、添付した請求の範囲の精神と領域から逸脱することなしに改変が明らかであるので、上記の詳細な説明から不必要な制限が加えられるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ｐＪＹＬ２６、すなわち、発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔに挿入されたヒトエリスロポエチン受容体ｃＤＮＡの、約６７８ｂｐの５′コーディング配列を有するプラスミドの模式的表現を示す図である。
【図２Ａ】
大腸菌の細胞抽出物のグルタチオンアフィニティーカラムでの精製から捕集された、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈを発現する画分の、２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）を示すグラフ（Ａ）、およびトロンビン処理されたＥｐｏＲｅｘ−ｔｈのエリスロポエチンアフィニティークロマトグラフィーの結果として捕集された、Ｅｐｏ−ｂｐを含有する画分のＡ２８０を示すグラフ（Ｂ）である。
【図２Ｂ】
大腸菌の細胞抽出物のグルタチオンアフィニティーカラムでの精製から捕集された、ＥｐｏＲｅｘ−ｔｈを発現する画分の、２８０ｎｍでの吸光度（Ａ２８０）を示すグラフ（Ａ）、およびトロンビン処理されたＥｐｏＲｅｘ−ｔｈのエリスロポエチンアフィニティークロマトグラフィーの結果として捕集された、Ｅｐｏ−ｂｐを含有する画分のＡ２８０を示すグラフ（Ｂ）である。
【図３】
クーマシーブルー染色されたポリアクリルアミドゲルの、トロンビンによるＥｐｏＲｅｘ−ｔｈの切断を示す写真である。
【図４】
Ｅｐｏ−ｂｐとのヒツジ抗Ｅｐｏ−ｂｐ抗体の結合を示すウエスタンブロット分析を示す写真である。
【図５】
非標識化Ｅｐｏの存在および不在下での、Ｅｐｏ−ｂｐとの様々な濃度のヒト１２５Ｉ−Ｅｐｏの結合を示すグラフである。
【図６】
クーマシーブルー染色されたポリアクリルアミドゲルの、Ｅｐｏ−ｂｐのトリプシン消化後に観察されたポリペプチドバンドを示す写真である。
【図７Ａ】
Ｅｐｏを投与したラットから単離された脾臓の写真（Ａ〜Ｃ）、および対照ラットからのそれの写真（Ｄ）である。
【図７Ｂ】
Ｅｐｏを投与したラットから単離された脾臓の写真（Ａ〜Ｃ）、および対照ラットからのそれの写真（Ｄ）である。
【図７Ｃ】
Ｅｐｏを投与したラットから単離された脾臓の写真（Ａ〜Ｃ）、および対照ラットからのそれの写真（Ｄ）である。
【図７Ｄ】
Ｅｐｏを投与したラットから単離された脾臓の写真（Ａ〜Ｃ）、および対照ラットからのそれの写真（Ｄ）である。
【図８Ａ】
フルオレセイン標識した対照骨髄細胞、またはしなかったそれの顕微鏡写真である。８Ａ〜８Ｃは、倍率１００ｘでの対照細胞（ＡおよびＣ）または４００ｘでのそれ（Ｂ）である。８Ｄ〜８Ｆは、正の対照としての免疫前血清投与細胞（１，０００ｘ）である。８Ｃおよび８Ｆは、フルオレセイン標識されたヒツジの血清投与細胞である。免疫前血清投与サンプル（Ｆ）は、対照細胞（Ｃ）で示されたのと同じいかなる受容体結合活性も示さなかったことが注目される。
【図８Ｂ】
フルオレセイン標識した対照骨髄細胞、またはしなかったそれの顕微鏡写真である。８Ａ〜８Ｃは、倍率１００ｘでの対照細胞（ＡおよびＣ）または４００ｘでのそれ（Ｂ）である。８Ｄ〜８Ｆは、正の対照としての免疫前血清投与細胞（１，０００ｘ）である。８Ｃおよび８Ｆは、フルオレセイン標識されたヒツジの血清投与細胞である。免疫前血清投与サンプル（Ｆ）は、対照細胞（Ｃ）で示されたのと同じいかなる受容体結合活性も示さなかったことが注目される。
【図８Ｃ】
フルオレセイン標識した対照骨髄細胞、またはしなかったそれの顕微鏡写真である。８Ａ〜８Ｃは、倍率１００ｘでの対照細胞（ＡおよびＣ）または４００ｘでのそれ（Ｂ）である。８Ｄ〜８Ｆは、正の対照としての免疫前血清投与細胞（１，０００ｘ）である。８Ｃおよび８Ｆは、フルオレセイン標識されたヒツジの血清投与細胞である。免疫前血清投与サンプル（Ｆ）は、対照細胞（Ｃ）で示されたのと同じいかなる受容体結合活性も示さなかったことが注目される。
【図８Ｄ】
フルオレセイン標識した対照骨髄細胞、またはしなかったそれの顕微鏡写真である。８Ａ〜８Ｃは、倍率１００ｘでの対照細胞（ＡおよびＣ）または４００ｘでのそれ（Ｂ）である。８Ｄ〜８Ｆは、正の対照としての免疫前血清投与細胞（１，０００ｘ）である。８Ｃおよび８Ｆは、フルオレセイン標識されたヒツジの血清投与細胞である。免疫前血清投与サンプル（Ｆ）は、対照細胞（Ｃ）で示されたのと同じいかなる受容体結合活性も示さなかったことが注目される。
【図８Ｅ】
フルオレセイン標識した対照骨髄細胞、またはしなかったそれの顕微鏡写真である。８Ａ〜８Ｃは、倍率１００ｘでの対照細胞（ＡおよびＣ）または４００ｘでのそれ（Ｂ）である。８Ｄ〜８Ｆは、正の対照としての免疫前血清投与細胞（１，０００ｘ）である。８Ｃおよび８Ｆは、フルオレセイン標識されたヒツジの血清投与細胞である。免疫前血清投与サンプル（Ｆ）は、対照細胞（Ｃ）で示されたのと同じいかなる受容体結合活性も示さなかったことが注目される。
【図８Ｆ】
フルオレセイン標識した対照骨髄細胞、またはしなかったそれの顕微鏡写真である。８Ａ〜８Ｃは、倍率１００ｘでの対照細胞（ＡおよびＣ）または４００ｘでのそれ（Ｂ）である。８Ｄ〜８Ｆは、正の対照としての免疫前血清投与細胞（１，０００ｘ）である。８Ｃおよび８Ｆは、フルオレセイン標識されたヒツジの血清投与細胞である。免疫前血清投与サンプル（Ｆ）は、対照細胞（Ｃ）で示されたのと同じいかなる受容体結合活性も示さなかったことが注目される。
【図９Ａ】
骨髄前駆細胞のフルオレセイン標識化受容体部位の顕微鏡写真である（９Ａ〜９Ｆ）。Ｍ：巨核球、＊：好塩基性赤芽球、▲：多染性赤芽球、△：骨髄芽球、⇒：正赤芽球（倍率：ＡおよびＢ：４００ｘ、Ｃ〜Ｆ：１，０００ｘ）。
【図９Ｂ】
骨髄前駆細胞のフルオレセイン標識化受容体部位の顕微鏡写真である（９Ａ〜９Ｆ）。Ｍ：巨核球、＊：好塩基性赤芽球、▲：多染性赤芽球、△：骨髄芽球、⇒：正赤芽球（倍率：ＡおよびＢ：４００ｘ、Ｃ〜Ｆ：１，０００ｘ）。
【図９Ｃ】
骨髄前駆細胞のフルオレセイン標識化受容体部位の顕微鏡写真である（９Ａ〜９Ｆ）。Ｍ：巨核球、＊：好塩基性赤芽球、▲：多染性赤芽球、△：骨髄芽球、⇒：正赤芽球（倍率：ＡおよびＢ：４００ｘ、Ｃ〜Ｆ：１，０００ｘ）。
【図９Ｄ】
骨髄前駆細胞のフルオレセイン標識化受容体部位の顕微鏡写真である（９Ａ〜９Ｆ）。Ｍ：巨核球、＊：好塩基性赤芽球、▲：多染性赤芽球、△：骨髄芽球、⇒：正赤芽球（倍率：ＡおよびＢ：４００ｘ、Ｃ〜Ｆ：１，０００ｘ）。
【図９Ｅ】
骨髄前駆細胞のフルオレセイン標識化受容体部位の顕微鏡写真である（９Ａ〜９Ｆ）。Ｍ：巨核球、＊：好塩基性赤芽球、▲：多染性赤芽球、△：骨髄芽球、⇒：正赤芽球（倍率：ＡおよびＢ：４００ｘ、Ｃ〜Ｆ：１，０００ｘ）。
【図９Ｆ】
骨髄前駆細胞のフルオレセイン標識化受容体部位の顕微鏡写真である（９Ａ〜９Ｆ）。Ｍ：巨核球、＊：好塩基性赤芽球、▲：多染性赤芽球、△：骨髄芽球、⇒：正赤芽球（倍率：ＡおよびＢ：４００ｘ、Ｃ〜Ｆ：１，０００ｘ）。
【図１０Ａ】
図９のと同じ細胞プレパラートの異なる部位設定による顕微鏡写真である。Ｍ：巨核球、＊：好塩基性赤芽球、▲：多染性赤芽球、⇒：正赤芽球（倍率：１，０００ｘ）。
【図１０Ｂ】
図９のと同じ細胞プレパラートの異なる部位設定による顕微鏡写真である。Ｍ：巨核球、＊：好塩基性赤芽球、▲：多染性赤芽球、⇒：正赤芽球（倍率：１，０００ｘ）。
【図１０Ｃ】
図９のと同じ細胞プレパラートの異なる部位設定による顕微鏡写真である。Ｍ：巨核球、＊：好塩基性赤芽球、▲：多染性赤芽球、⇒：正赤芽球（倍率：１，０００ｘ）。
【図１０Ｄ】
図９のと同じ細胞プレパラートの異なる部位設定による顕微鏡写真である。Ｍ：巨核球、＊：好塩基性赤芽球、▲：多染性赤芽球、⇒：正赤芽球（倍率：１，０００ｘ）。
【図１１】
血清または血漿サンプル中のＥｐｏおよびＥｐｏ−ｂｐの光学密度（４０５ｎｍ）のグラフである。誤差の棒は、標準誤差（ＳＥ）を表す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図１１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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