(57)【要約】本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳しくは非毒性の選択的かつ強力なc-kit阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、骨粗鬆症のような骨喪失を治療する方法に関する。好ましくは、この阻害剤は、IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
チロシンキナーゼ阻害剤を、そのような治療を必要とする哺乳類に投与する段階を含む、骨喪失を治療する方法。
【請求項２】
チロシンキナーゼ阻害剤が、IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、請求項1記載の方法。
【請求項３】
c-kit阻害剤を、そのような治療を必要とする哺乳類に投与する段階を含む、骨喪失を治療する方法。
【請求項４】
c-kit阻害剤が非毒性の選択的および強力なc-kit阻害剤である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
阻害剤が、インドリノン、ピリミジン誘導体、ピロロピリミジン誘導体、キナゾリン誘導体、キノキサリン誘導体、ピラゾール誘導体、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体およびピリジル-キノロン誘導体、スチリル化合物、スチリル置換ピリジル化合物、セレオインドール、セレニド、三環式ポリヒドロキシル化合物、ならびにベンジルホスホン酸化合物からなる群より選択される、請求項4記載の方法。
【請求項６】
阻害剤が以下からなる群より選択される、請求項4記載の方法：
‐ピリミジン誘導体、より詳しくはN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体、
‐インドリノン誘導体、より詳しくはピロール置換インドリノン、
‐単環式、二環式アリール、およびヘテロアリール化合物、ならびに
‐キナゾリン誘導体。
【請求項７】
c-kit阻害剤が、以下の式IIの化合物から選択される、請求項3から6のいずれか一項に記載の方法：
2004530722.tif 000009
式中、R1、R2およびR3は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキル、または環状もしくは複素環基、特にピリジル基から独立して選択され；
R4、R5、およびR6は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキル、特にメチル基から独立して選択され；
ならびにR7は、少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、アミノ基のように少なくとも一つの塩基性部位を有する。
【請求項８】
c-kit阻害剤が、4-(4-メチルピペラジン-1-イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3-イル)ピリミジン-2-イルアミノ)フェニル]ベンズアミドである、請求項3から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
c-kit阻害剤がIL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、請求項3から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
c-kit阻害剤が活性化c-kitの阻害剤である、請求項3から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
活性化c-kit阻害剤がSCF活性化c-kitを阻害することができる、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
阻害剤が構成的に活性化された変異体c-kitを阻害することができる、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
以下を含むスクリーニング法によって得ることができる、選択的で強力かつ非毒性の活性化c-kit阻害剤である化合物を、そのような治療を必要とする哺乳類に投与する段階を含む、骨喪失を治療する方法：
a）（i）活性化c-kit、および（ii）試験する少なくとも一つの化合物を、成分（i）と成分（ii）とが複合体を形成することができる条件下で接触させる段階、
b）活性化c-kitを阻害する化合物を選択する段階、
c）IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、段階b）において同定された化合物のサブセットを試験して選択する段階。
【請求項１４】
スクリーニング法が、SCF活性化野生型c-kitを同様に阻害することができる変異体活性化c-kitの阻害剤である、段階b）において同定された化合物のサブセットを試験して選択することからなる段階をさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
活性化c-kitが、段階a）のSCF活性化野生型c-kitである、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
推定の阻害剤が、段階a）において10 μMより高い濃度で試験される、請求項13から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
IL-3が、好ましくはIL-3依存的細胞の培養培地に0.5 ng/mlから10 ng/ml、好ましくは1 ng/mlから5 ng/mlの濃度で存在する、請求項13から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
IL-3依存的細胞が、肥満細胞、トランスフェクトした肥満細胞、BaF3およびIC-2からなる群より選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
成分（ii）が活性化c-kitを阻害する程度がインビトロまたはインビボで測定される、請求項13から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
1μM未満の濃度で野生型c-kitを阻害することができる化合物を、試験して選択することからなる段階をさらに含む、請求項13から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
試験がインビトロまたはインビボで行われる、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
変異体活性化c-kitおよび／または野生型c-kitの阻害が免疫沈降およびウェスタンブロットのような標準的な生化学的技術を用いて測定される、請求項13から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
c-kitリン酸化の量が測定される、請求項13から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
同定および選択された化合物が、強力、選択的で非毒性の野生型c-kit阻害剤である、請求項13から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
以下を含むスクリーニング法によって得ることができるc-kit阻害剤を、そのような治療を必要とする哺乳類に投与する段階を含む、骨喪失を治療する方法：
a）永続的に活性化されたc-kitである変異体c-kit（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおける変異）を発現する細胞を用いて、細胞死の程度を測定することにより、それぞれがIC50＜10 μMを有する、活性化c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを同定するために、複数の被験化合物について増殖アッセイを行う段階、
b）c-kitを特異的に標的にする候補化合物のサブセットを同定するために、IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞である、野生型c-kitを発現する細胞を用いて、段階（a）において同定された候補化合物のサブセットについて増殖アッセイを行う段階、
c）c-kitを発現する細胞を用いて、段階b）において同定された化合物のサブセットについて増殖アッセイを行い、細胞死の程度を測定することにより、それぞれがIC50＜10 μMを有する、好ましくはIC50＜1 μMを有する、野生型c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを選択する段階。
【請求項２６】
細胞死の程度が3Hチミジンの取り込み、トリパンブルー排除法、またはヨウ化プロピジウムによるフローサイトメトリーによって測定される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
ヒトにおける骨喪失を予防および／または治療するための、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、およびグルココルチコイド誘発骨粗鬆症を含む骨粗鬆症、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨形成異常、骨硬化症、オステオペニア、骨軟化症、骨線維形成不全、ならびにページェット病のような骨喪失を予防および／または治療するための、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
骨喪失を治療する薬剤を製造するためのc-kit阻害剤の使用。
【請求項３０】
閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、およびグルココルチコイド誘発骨粗鬆症を含む骨粗鬆症、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨形成異常、骨硬化症、オステオペニア、骨軟化症、骨線維形成不全、ならびにページェット病のような骨喪失を治療するための、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳しくはc-kit阻害剤を含む、経口投与に適した組成物。
【請求項３１】
閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、およびグルココルチコイド誘発骨粗鬆症を含む骨粗鬆症、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨形成異常、骨硬化症、オステオペニア、骨軟化症、骨線維形成不全、ならびにページェット病のような骨喪失を治療するための、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳しくはc-kit阻害剤を含む、局所、鼻腔内、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、鞘内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、腸内、舌下、または直腸投与に適した組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤、より詳しくは非毒性の選択的かつ強力なc-kit阻害剤を、そのような治療を必要とするヒトに投与する段階を含む、骨粗鬆症のような骨喪失を治療する方法に関する。好ましくは、この阻害剤は、IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない。
【背景技術】
【０００２】
骨は、コラーゲン骨格と、骨格を強化する無機質であるリン酸カルシウムとでその大部分が構成される生きた増殖組織である。コラーゲンとカルシウムはいずれも骨を機械的応力に耐えるようにする。一生のあいだ、骨はより大きく、より重く、そしてより密度が濃くなり、だいたい30歳でその最大値に達する。その後、骨吸収と増殖のバランスが傾き始め、閉経後最初の数年に急速な骨喪失が認められ、これは閉経後数年持続する。吸収と増殖のバランスが、突然にそして有意に骨喪失に都合がよいように向かうと、骨粗鬆症を発症する。この疾患に関する総説は、Raiszら、2000；「Epidermiology and pathogenesis of osteoporosis」、Clin Cornerstone 2(6)：1〜10に認められうる。
【０００３】
骨粗鬆症は、アメリカ人約3000万人に関係し、その80％が女性である。さらに、50歳を超えると女性2人に1人および男性8人に1人がその一生のあいだに骨粗鬆症関連骨折を有する。骨粗鬆症は、アメリカだけでも年間に150万件の骨折に関与しており、骨粗鬆症に関係する費用は毎年約140億ドルである。
【０００４】
骨粗鬆症を治療または予防する現在の方法には、エストロゲン、カルシトニン、アレンドロネート、ラロキシフェン、およびリセドロネートの投与が含まれる。エストロゲン補充療法は、骨喪失を減少させて、骨密度を増加させることが示されているが、これは女性の子宮内膜の癌を発症するリスクを増加させうる。ラロキシフェンは、骨喪失を予防するように思われる選択的エストロゲン受容体調節剤であるが、顔面潮紅および静脈血栓症のような副作用が認められている。アレンドロネートは、ビスホスホネートと呼ばれる薬剤のクラスに属し、骨喪失を減少させ、骨密度を増加させるが、腹痛または骨格筋痛、悪心、胸焼け、食道の刺激も同様に認められている。カルシトニンは、カルシウム調節および骨代謝に関係する天然に存在する非性ホルモンである。閉経後少なくとも5年を過ぎた女性では、カルシトニンは、骨喪失を遅らせて、骨折に関連した疼痛を軽減する。しかし、注射可能なカルシトニンは、アレルギー反応、ならびに顔面および手の潮紅、頻尿、悪心、および発疹を含む不快な副作用を引き起こす可能性がある。男性の場合骨喪失のために用いられる治療には、カルシウムおよびビタミンDによるビタミンおよび無機質の補充が含まれるが、これは進行疾患を治療する場合には有効性が限られている。
【０００５】
したがって、上記の知見に関して長期間より有効であり、特に反復投与した場合に十分に認容される骨喪失のもう一つの治療が必要である。
【０００６】
本発明に関連して、本発明者らは、副甲状腺ホルモン分泌、特定のサイトカイン、および他の骨吸収メディエータが、骨吸収を刺激しうることを発見した。血清カルシウムレベルが低ければ、副甲状腺ホルモン分泌を促進して、エストロゲンの欠乏は、サイトカインの産生および活性の上昇に関連する。肥満細胞の異常な増殖も同様にサイトカイン、ヘパリン、および骨吸収に関する他のメディエータを放出する可能性がある。特に興味深いのは、肥満細胞の増殖は、異常な骨のリモデリング障害において報告されている。例えば、全身性肥満細胞疾患による重度の骨粗鬆症が、Lehmann Tら、Br. J. Rheumatol. 1996、9月；35(9)：898〜900によって認められている。実際に、肥満細胞症の症例の中には、骨粗鬆症の症状を示す人がありうる。Johansson C.ら、Age Ageing、1月；25(1)：1〜7およびDelsignore JLら、1996、Iowa Orthop. J. 16：126〜34。
【０００７】
閉経後骨粗鬆症の無処置女性の腸骨稜の非脱石灰化切片における肥満細胞数の定量を、正常な女性および正常な男性の値に対する知見と対比させた。骨髄肥満細胞数の平均値は、正常な女性では男性より大きい。正常な女性と比較して、骨粗鬆症の女性は、骨髄における肥満細胞の数がより大きかった。したがって、これらの知見は、肥満細胞数の増加と閉経後骨粗鬆症との関連を確認する。
【０００８】
例えば、c-kitまたはc-kitシグナル伝達の阻害を通しての、活性化の遮断と肥満細胞の生存とをねらいとした治療戦略は、このように有用となる可能性があり、疾患の発症を減少させるために役立ちうるであろう。
【０００９】
肥満細胞（MC）は、CD34、c-kit、およびCD13抗原を発現する造血幹細胞の特定のサブセットに由来する組織要素である（Kirshenbaumら、Blood 94：2333〜2342、1999、およびIshizukaら、Curr. Opin. Immunol. 5：937〜43、1993）。未成熟なMC前駆細胞は、血流の中を循環して組織において分化する。これらの分化および増殖プロセスは、サイトカインの影響下にあり、最も重要なサイトカインの一つは、Kitリガンド（KL）、スチール因子（SL）、または肥満細胞増殖因子（MCGF）とも呼ばれる幹細胞因子（SCF）である。SCF受容体は、III型受容体チロシンキナーゼサブファミリーに属する癌原遺伝子であるc-kitによってコードされる（BoissanおよびArock、J. Leukoc Biol. 67：135〜48、2000）。この受容体はまた、他の造血細胞または非造血細胞上で発現される。SCFによってc-kit受容体がライゲーションされると、その二量体形成を誘導し、その後トランスリン酸化が起こり、様々な細胞質内物質が動員および活性化される。これらの活性化物質は、細胞の増殖および活性化に関与する多数の細胞内シグナル伝達経路を誘導する（BoissanおよびArock、2000）。肥満細胞は、組織での位置および構造が不均一であるのみならず、機能的および組織化学的レベルにおいても不均一であるという特徴を有する（AldenborgおよびEnerback、Histochem. J. 26：587〜96、1994；Braddingら、J. Immunol. 155：297〜307、1995；Iraniら、J. Immunol. 147：247〜53、1991；Millerら、Curr. Opin. Immunol. 1：637〜42、1989；ならびにWelleら、J. Leukoc Biol. 61：233〜45、1997）。
【００１０】
本発明に関連して、肥満細胞が、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、およびグルココルチコイド誘発骨粗鬆症を含む骨粗鬆症、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨形成異常、骨硬化症、オステオペニア、骨軟化症、骨線維形成不全、ならびにページェット病のような骨喪失の病因において重要な役割を有することが提唱され、それらにおいて肥満細胞は、本明細書において三つの群に分類される非常に多様なメディエータを産生する：
‐予め形成された顆粒関連メディエータ（ヒスタミン、プロテオグリカン、および中性プロテアーゼ）、
‐脂質由来メディエータ（プロスタグランジン、トロンボキサン、およびロイコトリエン）、
‐ならびに様々なサイトカイン（IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、TNF-α、GM-CSF、MIP-1a、MIP-1b、MIP-2、およびIFN-γ）。
【００１１】
次に、活性化肥満細胞によってメディエータ（TNF-α、ヒスタミン、ロイコトリエン、プロスタグランジン等）が遊離されると、局所炎症および骨における細胞のアポトーシスの活性化を誘導しうる。さらに、肥満細胞はT細胞およびマクロファージを活性化し、これらはさらにこの炎症および破壊プロセスに寄与する。
【００１２】
したがって、本発明は、肥満細胞の増殖、生存、および活性化を阻害するためにc-kit特異的キナーゼを用いることを提案する。これらの障害の病因において何らかの役割を有する肥満細胞を破壊する段階からなる、骨喪失を治療する新しい経路が提供される。チロシンキナーゼ、より詳しくはc-kit阻害剤は、この目標に到達するために特に適していることが判明した。
【発明の開示】
【００１３】
説明
本発明は、チロシンキナーゼ阻害剤を、そのような治療を必要とする哺乳類に投与する段階を含む、骨喪失を治療する方法に関する。
【００１４】
チロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物（国際公開公報第92/20642号）、ビニレン-アザインドール誘導体（国際公開公報第94/14808号）、および1-シクロプロピル-4-ピリジル-キノロン（米国特許第5,330,992号）、スチリル化合物（米国特許第5,217,999号）、スチリル置換ピリジル化合物（米国特許第5,302,606号）、セレオインドール（seleoindole）およびセレニド（国際公開公報第94/03427号）、三環式ポリヒドロキシル化合物（国際公開公報第92/21660号）、ならびにベンジルホスホン酸化合物（国際公開公報第91/15495号）、ピリミジン誘導体（米国特許第5,521,184号および国際公開公報第99/03854号）、インドリノン誘導体およびピロール置換インドリノン（米国特許第5,792,783号、欧州特許第934 931号、米国特許第5,834,504号、米国特許第5,883,116号、米国特許第5,883,113号、米国特許第5,886,020号、国際公開公報第96/40116号、および国際公開公報第00/38519号）、ならびにビス単環式、二環式アリールおよびヘテロアリール化合物（欧州特許第584 222号、米国特許第5,656,643号、および国際公開公報第92/20642号）、キナゾリン誘導体（欧州特許第602 851号、欧州特許第520 722号、米国特許第3,772,295号、および米国特許第4,343,940号）、ならびにアリールおよびヘテロアリールキナゾリン（米国特許第5,721,237号、米国特許第5,714,493号、米国特許第5,710,158号、および国際公開公報第95/15758号）から選択される。
【００１５】
好ましくは、このチロシンキナーゼ阻害剤は、IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない。
【００１６】
もう一つの態様において、本発明は、c-kit阻害剤をそのような治療を必要とする哺乳類に投与する段階を含む、骨喪失を治療する方法に向けられる。好ましくは、c-kit阻害剤は非毒性の選択的かつ強力なc-kit阻害剤である。そのような阻害剤は、インドリノン、ピリミジン誘導体、ピロロピリミジン誘導体、キナゾリン誘導体、キノキサリン誘導体、ピラゾール誘導体、ビス単環式、二環式、または複素環式アリール化合物、ビニレン-アザインドール誘導体およびピリジル-キノロン誘導体、スチリル化合物、スチリル置換ピリジル化合物、セレオインドール、セレニド、三環式ポリヒドロキシル化合物、ならびにベンジルホスホン酸化合物からなる群より選択することができる。
【００１７】
好ましい化合物の中でも、N-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体（米国特許第5,521,184号および国際公開公報第99/03854号）のようなピリミジン誘導体、インドリノン誘導体およびピロール置換インドリノン（米国特許第5,792,783号、欧州特許第934 931号、米国特許第5,834,504号、米国特許第5,883,116号、米国特許第5,883,113号、米国特許第5,886,020号、国際公開公報第96/40116号、および国際公開公報第00/38519号）、ならびにビス単環式、二環式アリールおよびヘテロアリール化合物（欧州特許第584 222号、米国特許第5,656,643号、および国際公開公報第92/20642号）、キナゾリン誘導体（欧州特許第602 851号、欧州特許第520 722号、米国特許第3,772,295号、および米国特許第4,343,940号）、4-アミノ置換キナゾリン（米国特許第3,470,182号）、4-チエニル-2-(1H)-キナゾロン、6,7-ジアルコキシキナゾリン（米国特許第3,800,039号）、アリールおよびヘテロアリールキナゾリン（米国特許第5,721,237号、米国特許第5,714,493号、米国特許第5,710,158号、および国際公開公報第95/15758号）、4-アニリノキナゾリン化合物（米国特許第4,464,375号）、および4-チエニル-2-(1H)-キナゾロン（米国特許第3,551,427号）に注目することは興味深い。
【００１８】
そのため、好ましくは本発明は、非毒性の強力かつ選択的なc-kit阻害剤を投与する段階を含む、骨喪失を治療する方法に関する。そのような阻害剤は、ピリミジン誘導体、より詳細には式IのN-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体から選択されうる：
2004530722.tif 000002
式中、R1、R2、R3、R13〜R17基は、本明細書の説明に組み入れられる、欧州特許第564 409 B1号に記載される意味を有する。
【００１９】
好ましくは、N-フェニル-2-ピリミジン-アミン誘導体は、式IIに対応する化合物から選択される：
2004530722.tif 000003
式中、R1、R2、およびR3は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキルまたは環状もしくは複素環基、特にピリジル基から独立して選択され；
R4、R5、およびR6は、H、F、Cl、Br、I、C1〜C5アルキル、特にメチル基から独立して選択され；
かつR7は、少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、アミノ基のように少なくとも一つの塩基性部位を有する。
【００２０】
好ましくはR7は以下の基である：
2004530722.tif 000004
これらの化合物において、以下のように定義されることが好ましい：
R1は、複素環基、特にピリジル基であり、
R2およびR3はHであり、
R4はC1-C3アルキル、特にメチル基であり、
R5およびR6はHであり、
かつR7は、少なくとも一つの置換基を有するフェニル基であり、アミノ基、例えば以下の基：
2004530722.tif 000005
のように、少なくとも一つの塩基性部位を有する。
【００２１】
したがって好ましい態様において、本発明は、以下の式に対応するCGP57148B：4-(4-メチルピペラジン-1-イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3-イル)ピリジン-2-イルアミノ)フェニル]ベンズアミドとして当技術分野で公知である化合物の有効量を投与する段階を含む、自己免疫疾患を治療する方法に関する：
2004530722.tif 000006
【００２２】
本化合物の調製は、欧州特許第564 409号の実施例21に記載され、特に有用であるβ型は国際公開公報第99/03854号に記載されている。
【００２３】
または、c-kit阻害剤は以下から選択することができる：
‐インドリノン誘導体、より詳細にはピロール置換インドリノン；
‐単環式、二環式アリールおよびヘテロアリール化合物、キナゾリン誘導体；ならびに
‐2-フェニル-キナキソリン誘導体、例えば2-フェニル-6,7-ジメトキシキナキソリンのようなキナキソリン。
【００２４】
好ましい局面において、本発明は、c-kit阻害剤がIL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、上記の方法を意図する。
【００２５】
「骨喪失」という表現は、本明細書において、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、およびグルココルチコイド誘発骨粗鬆症を含む骨粗鬆症、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨形成異常、骨硬化症、オステオペニア、骨軟化症、骨線維形成不全、ならびにページェット病から選択される疾患を意味する。
【００２６】
さらなる態様において、上記のc-kit阻害剤は、活性化c-kitの阻害剤である。本発明の枠組みにおいて、「活性化c-kit」という表現は、点突然変異、欠失、挿入から選択される少なくとも一つの変異を含む、構成的に活性化された変異体c-kitを意味するが、天然のc-kit配列（配列番号：1）の改変および変化型も意味する。そのような変異、欠失、挿入、改変および変化は、トランスホスホリラーゼドメイン、膜近傍ドメイン、ならびにc-kit活性を直接または間接的に担う任意のドメインにおいて起こりうる。「活性化c-kit」という表現はまた、本明細書においてSCF活性化c-kitを意味する。c-kitを活性化するために好ましい、選択的なSCF濃度は、5×10-7M〜5×10-6Mを含み、好ましくは2×10-6M付近である。好ましい態様において、段階a）の活性化変異体c-kitは、Y823に対して近位に、より詳細にはc-kitの自己リン酸化に関係する配列番号：1のアミノ酸800位〜850位に、少なくとも一つの変異、特にD816V、D816Y、D816F、およびD820G変異体を有する。もう一つの好ましい態様において、段階a）の活性化変異体c-kitは、c-kitの膜近傍ドメインに欠失を有する。そのような欠失は、例えば、c-kit d(573-579)と呼ばれるコドン573と579の間にある。c-kitの膜近傍ドメインに近位の点突然変異V559Gもまた重要である。
【００２７】
この点において、本発明は、以下を含むスクリーニング法によって得ることができる活性化c-kitの、選択的で強力な非毒性の阻害剤である化合物を、そのような治療を必要とする哺乳類に投与する段階を含む、骨喪失を治療する方法を意図する：
a）（i）活性化c-kitと（ii）試験する少なくとも一つの化合物とを、（i）と（ii）の成分が複合体を形成することができる条件下で接触させる段階、
b）活性化c-kitを阻害する化合物を選択する段階、
c）IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない、段階b）で同定された化合物のサブセットを試験して選択する段階。
【００２８】
本スクリーニング法はさらに、SCF活性化野生型c-kitを阻害することもできる、活性化変異体c-kitの阻害剤（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおいて）である段階b）において同定された化合物のサブセットを試験して選択する段階からなる段階を含みうる。または、段階a）において活性化c-kitは、SCF活性化野生型c-kitである。
【００２９】
本発明を実施するための最良の様式は、段階a）において10μMを超える濃度で推定の阻害剤を試験する段階からなる。適切な濃度は、例えば10、15、20、25、30、35、または40μMである。
【００３０】
段階c）において、IL-3は、好ましくはIL-3依存的細胞の培養培地において、0.5 ng/ml〜10 ng/mlの濃度で、好ましくは1 ng/ml〜5 ng/mlの濃度で存在する。
【００３１】
IL-3依存的細胞の例には以下が含まれるが、これらに限定されない：
増殖および生存に関して、c-kitを本来発現してそれに依存している細胞株。そのような細胞において、以下の技法を用いてヒト肥満細胞株を確立することができる：正常なヒト肥満細胞を、c-kitシグナルペプチドとTAG配列とを含む変異体c-kitをコードする配列を含むレトロウイルスベクターに感染させることができ、それによって変異体c-kitおよび造血細胞において発現された野生型c-kitを、抗体によって区別することができる。
【００３２】
この技術は、細胞の死を誘導せず、遺伝子移入が安定であり満足できる収率（約20％）を生じることから都合がよい。純粋な正常ヒト肥満細胞は、ヒト臍帯静脈から得られた血液に由来する前駆細胞を培養することによって、日常的に得ることができる。この点において、他の血液成分から単核球を分離するために、臍帯静脈からのヘパリン処置（heparinated）血をフィコール勾配上で遠心する。次に、免疫磁気選択系MACS（Miltenyi biotech）を用いて、上記の単離細胞からCD34+前駆細胞を精製する。次に、CD34+細胞をMCCM培地（L-グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、5×10-5Mβ-メルカプトエタノール、20％仔ウシ胎児血清、1％ウシ血清アルブミン、および100 ng/ml組換え型ヒトSCFを添加したα-MEM）において、105個/mlの細胞濃度で5％CO2大気中、37℃で培養する。培地を5〜7日ごとに交換する。培養物中に存在する肥満細胞の割合（％）は、メイ・グリュンワルド・ギムザ染色またはトルイジンブルー染色を用いて毎週評価する。抗トリプターゼ抗体も同様に、培養物における肥満細胞を検出するために用いることができる。培養10週間後、肥満細胞の純粋な細胞集団（＞98％）が得られる。
【００３３】
標準的な技法を用いて、上記のように確立された細胞株をトランスフェクトするために、c-kitを発現するベクターを調製することが可能である。ヒトc-kitのcDNAは、Yardenら（1987）EMBO J. 6（11）、3341〜3351に記載されている。c-kitのコード部分（3000 bp）は、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、PCRによって増幅することができ、かつクローニングすることができる：
2004530722.tif 000007
【００３４】
NotIおよびXhoIによって消化したPCR産物を、T4リガーゼを用いてpFlag-CMVベクター（SIGMA）に挿入して、ベクターをNotIおよびXhoIによって消化して、CIP（Biolabs）を用いて脱リン酸化する。pFlag-CMV-c-kitを用いて細菌クローンXL1-blueを形質転換する。クローンの形質転換は、以下のプライマーを用いて確認する：
2004530722.tif 000008
適切なカセットを用いて、当技術分野において日常的で一般的な技法によって部位特異的変異誘発を行う。
【００３５】
ベクターMigr-1（ABC）は、成熟肥満細胞をトランスフェクトするために用いられるレトロウイルスベクターを構築するための基礎として用いることができる。このベクターは、IRESの3'末端でGFPをコードする配列を含むことから都合がよい。これらの特徴によって、蛍光血球計算器による直接分析を用いてレトロウイルスに感染した細胞を選択することができる。先に述べたように、c-kit cDNAのN末端配列は、異種のc-kitを内因性のc-kitと区別するために有用であるFlag配列を導入するために、改変することができる。
【００３６】
用いることができる他のIL-3依存的細胞株には以下が含まれるが、これらに限定されない：
‐c-kitの野生型または変異型（膜近傍および触媒部位において）を発現するBaf3マウス細胞は、Kitayamaら（1996）、Blood 88：995〜1004、およびTsujimuraら（1999）、Blood 93：1319〜1329に記述される。
‐c-kitWTまたはc-kitD814Yのいずれかを発現するIC-2マウス細胞は、Piaoら（1996）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：14665〜14669に示される。
【００３７】
IL-3非依存的細胞株は以下の通りである：
‐HMC-1、肥満細胞白血病患者に由来する因子非依存的細胞株は、構成的キナーゼ活性を有する膜近傍変異体c-kitポリペプチドを発現する（Furitsu Tら、J. Clin. Invest. 1993、92：1736〜1744；Butterfieldら、「Establishment of immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia.」、Leuk Res. 1988、12：345〜355、およびNagataら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1995、92：10560〜10564）。
‐P815細胞株（814位でc-kit変異を本来発現する肥満細胞腫）は、Tsujimuraら（1994）、Blood、83：2619〜2626に記述されている。
【００３８】
成分（ii）が活性化c-kitを阻害する程度は、インビトロまたはインビボで測定することができる。インビボで測定する場合、Y823に対して近位に、より詳細にはc-kit自己リン酸化に関係する配列番号：1のアミノ酸800位〜850位の間に、少なくとも一つの変異を有する活性化変異体c-kit、特にD816V、D816Y、D816F、およびD820G変異体を発現する細胞株が好ましい。活性化変異体c-kitを発現する細胞株の例は先に述べた通りである。
【００３９】
もう一つの好ましい態様において、方法はさらに、1μM未満の濃度で野生型c-kitを阻害することができる化合物を、試験して選択することからなる段階を含む。これは、インビトロまたはインビボで測定することができる。
【００４０】
インビボ試験は、チロシンキナーゼ阻害剤が、骨粗鬆症のトランスジェニックマウスモデルにおける骨粗鬆症の症状を軽減できるか否かを測定する段階を含んでもよい。例えば、内因性のSPARC発現を欠損するトランスジェニックマウスは、この点において有用となりうる（米国特許第6,239,326号）。
【００４１】
したがって、上記の方法に従って同定および選択された化合物は、強力で選択的な非毒性の野生型c-kit阻害剤である。
【００４２】
または、上記のスクリーニング法はインビトロで実施することができる。この点において、免疫沈降およびウェスタンブロットのような標準的な生化学技術を用いて、活性化変異体c-kitおよび／または野生型c-kitの阻害を測定することができる。好ましくは、c-kitリン酸化の量を測定する。
【００４３】
なおさらなる態様において、本発明はスクリーニングが以下を含む、先に記載した骨喪失を治療する方法を意図する：
a）それぞれがIC50＜10μMを有する、活性化c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することによって同定するために、永続的な活性化c-kitである変異体c-kit（例えば、トランスホスホリラーゼドメインにおいて）を発現する細胞を用いて、複数の被験化合物によって増殖アッセイを行う段階、
b）特にc-kitを標的とする候補化合物のサブセットを同定するために、IL-3の存在下で培養されたIL-3依存的細胞である、野生型c-kitを発現する細胞を用いて、段階a）において同定された候補化合物のサブセットによって増殖アッセイを行う段階、
c）c-kitを発現する細胞を用いて、段階b）において同定された化合物のサブセットによって増殖アッセイを行い、それぞれがIC50＜10μM、好ましくはIC50＜1μMを有する、野生型c-kitを標的とする候補化合物のサブセットを、細胞死の程度を測定することによって選択する段階。
【００４４】
本明細書において、細胞死の程度は、3Hチミジンの取り込み、トリパンブルー排除法、またはヨウ化プロピジウムによるフローサイトメトリーによって測定することができる。これらは、当技術分野において日常的に実施される一般的な技術である。
【００４５】
本発明に従う方法には、ヒトにおいて骨喪失を予防および／または治療する段階が含まれる。
【００４６】
したがって、本発明は、閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、およびグルココルチコイド誘発骨粗鬆症を含む骨粗鬆症、嚢胞性線維性骨炎、腎性骨形成異常、骨硬化症、オステオペニア、骨軟化症、骨線維形成不全、ならびにページェット病のような骨喪失を治療する薬剤を製造するために、上記の化合物を用いる段階を含む。
【００４７】
本発明において利用される薬学的組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、鞘内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、または直腸手段を含むがこれらに限定されない任意の数の経路によって投与してもよい。
【００４８】
活性成分の他に、これらの薬学的組成物は、薬学的に用いることができる調製物への活性化合物の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含んでもよい。製剤および投与のための技術に関するさらなる詳細は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」の最新版（マック出版社、イーストン、ペンシルバニア州）において見いだされるであろう。
【００４９】
経口投与のための薬学的組成物は、経口投与のために適した用量で当技術分野で周知の薬学的に許容される担体を用いて調製することができる。そのような担体によって、薬学的組成物は、患者が摂取するための錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等として調製することができる。
【００５０】
本発明において用いるために適した薬学的組成物には、c-kit阻害剤が意図する目的を達成するために有効量で含まれる組成物が含まれる。有効量の決定は、十分に当業者の能力範囲内である。治療的有効量は、症状または病態を改善する活性成分の量を意味する。治療的有効量および毒性は、細胞培養または実験動物において標準的な薬学的技法、例えばED50（集団の50％において治療的に有効である用量）およびLD50（集団の50％に対して致死的である用量）によって決定してもよい。毒性対治療効果の用量比が治療指数であり、これはLD50/ED50比として表記することができる。大きい治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。上記のように、本発明に従うチロシンキナーゼ阻害剤およびより詳しくはc-kit阻害剤は、IL-3の存在下で培養したIL-3依存的細胞の死を促進することができない。
【００５１】
本発明はまた、先に定義されたチロシンキナーゼ阻害剤と、骨喪失を治療するために個別に、同時に、または併用して用いられる、エストロゲン、カルシトニン、アレンドロネート、ラロキシフェン、リセドロネート、ビタミンCおよびカルシウムから選択される少なくとも一つの化合物とを含む産物にも関する。
【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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