(57)【要約】コラーゲン（ＣＯＬ）等のタンパク質およびヒアルロン酸（ＨＡ）等の多糖類を、種々のＣＯＬ／ＨＡ比率で有する二層性マトリックスを開示する。各層は多孔性構造を有する。これらの材料は組織再生、とりわけ整形外科的インプラントおよび薬物デリバリーに用いる場合に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織再生のための生分解性多層マトリックスであって、２層を含んでなり、その各層は、タンパク質及び多糖類より成る群から選択される架橋ポリマー成分を含む、前記マトリックス。
【請求項２】
前記ポリマー成分が、コラーゲン、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、キチン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸及びアルギン酸塩より成る群から選択される、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項３】
前記各層のタンパク質及び／又は多糖類が、共有結合で架橋されている、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項４】
前記タンパク質が、コラーゲン、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニンより成る群から選択される、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項５】
前記多糖類が、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、キトサン、キチン及びアルギン酸塩より成る群から選択されるメンバーである、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項６】
前記層が、化学的な架橋を介して互いに接着している、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項７】
前記層が、互いに、機械的に付着している、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項８】
前記層が、化学的組成において互いに異なる、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項９】
前記層が、物理的密度において互いに異なる、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項１０】
前記層が、構造的多孔性において互いに異なる、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項１１】
１つの層がヒアルロン酸塩を含み、もう１つの層がコラーゲンを含む、請求項８に記載のマトリックス。
【請求項１２】
１つの層がヒアルロン酸塩を含み、もう１つの層がコラーゲンを含む、請求項９に記載のマトリックス。
【請求項１３】
１つの層がヒアルロン酸塩を含み、もう１つの層がコラーゲンを含む、請求項１０に記載のマトリックス。
【請求項１４】
前記タンパク質及び／又は多糖類が、ジビニルスルホンで架橋されている、請求項３に記載のマトリックス。
【請求項１５】
前記タンパク質及び／又は多糖類が、ビアルデヒド、トリアルデヒド又はポリアルデヒドで架橋されている、請求項３に記載のマトリックス。
【請求項１６】
前記ポリアルデヒドが、アルデヒド基を担持する酸化された多糖類誘導体を含む、請求項１５に記載のマトリックス。
【請求項１７】
前記層が、互いに、ジビニルスルホンを用いた処理で化学的に架橋されている、請求項６に記載のマトリックス。
【請求項１８】
前記層が、互いに、熱脱水により化学的に架橋されている、請求項６に記載のマトリックス。
【請求項１９】
成長因子、ｃＤＮＡ、遺伝子構築物、ホルモン、又は他の生物学的活性物質を含む、請求項１に記載のマトリックス。
【請求項２０】
前記層の各々が、成長因子、ｃＤＮＡ、遺伝子構築物、ホルモン、又は他の生物学的活性物質を含む、請求項１９に記載のマトリックス。
【請求項２１】
インビボで組織を修復及び生成する方法であって、請求項１に記載のマトリックスを、組織再生が望まれる部位に適用する工程を含む、前記方法。
【請求項２２】
前記マトリックスを、骨成長が望まれる部位に適用する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記マトリックスを、軟骨成長が望まれる部位に適用する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記マトリックスを、関節修復が望まれる部位に適用する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
組織再生のために生分解性多層マトリックスを調製する方法であって、ある多糖類又はタンパク質に架橋された他の多糖類又はタンパク質を含む架橋された第一のポリマー層を、ある多糖類又はタンパク質に架橋された他の多糖類又はタンパク質を含む架橋された第二のポリマー層に適用する工程を含み、前記多糖類又はタンパク質が、コラーゲン、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、キチン、キトサン、ヘパラン、ヘパラン硫酸及びアルギン酸塩より成る群から独立して選択される、前記方法。
【請求項２６】
前記第一のポリマー層が、互いに架橋された２つの多糖類又はタンパク質を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第一のポリマー層が、コラーゲンに架橋されたコラーゲンを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第一のポリマー層が、互いに架橋された２つの異なる多糖類又はタンパク質を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記第一のポリマー層が、コラーゲンに架橋されたヒアルロン酸塩を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第一のポリマー層が、ジビニルスルホンを用いた化学的架橋により、前記第二のポリマー層に適用される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記マトリックスの中へ、成長因子、ｃＤＮＡ、遺伝子構築物、ホルモン、又は他の生物学的活性物質の少なくとも１つを組み込む工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記成長因子、ｃＤＮＡ、遺伝子構築物、ホルモン、又は他の生物学的活性物質が、マトリックス作製後に組み込まれる、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記成長因子、ｃＤＮＡ、遺伝子構築物、ホルモン、又は他の生物学的活性物質が、マトリックス作製中に装填される、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は組織再生のための生分解性マトリックスに向けられる。
【０００２】
多糖類、例えばヒアルロン酸（ＨＡ）を含むグリコサミノグリカンは、広範な種類の生体材料に使用されている。ヒアルロン酸（ＨＡ）は天然発生多糖類であり、眼科および整形外科で扱うマトリックスに用いられている。天然ＨＡ分子のその物理学的特性および短い滞留時間のため、ＨＡ単独の臨床適応は限定されている。ホルムアルデヒド架橋ＨＡであるヒランは、関節炎を患う関節の粘性補充に用いられている（Ｔａｋｉｇａｍｉら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｐｏｌｙｍｅｒｓ　２２：１５３−１６０（１９９３））。
【０００３】
Ｂｅｒｇら（１９９６年４月４日発行、米国特許第５５１０４１８号）は、注射用処方または固体移植片として用いられる合成親水性ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に化学的に結合したグリコサミノグリカン、例えばＨＡ、コンドロイチン硫酸、ケラタン硫酸、キチンおよびヘパリンを開示している。Ｋｉｍａｔａら（１９９５年１１月７日発行、米国特許第５４６４９４２号）は、リン脂質に連結したグリコサミノグリカンおよび転移インヒビターとしてのその使用を開示している。Ｓａｋｕｒａｉら、１９９４年５月１０日発行、米国特許第５３１０８８１号は、グリコサミノグリカン修飾タンパク質を開示している。Ｂａｌａｚｓら、１９９２年７月７日発行、米国特許第５１２８３２６号は、ジビニルスルホンと架橋したヒアルロナンを開示している。
【０００４】
（発明の概要）
本発明は組織再生のための生分解性マトリックス、マトリックスの製造方法、およびマトリックスの使用方法を提供する。
【０００５】
本発明の生分解性マトリックスは２層から成り、各層は、組成、密度、および多孔性が異なる、架橋されたポリマー成分を含み、ポリマー成分の各々は、コラーゲン、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、キチン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸およびアルギン酸塩より成る群から選択されるメンバーの誘導体である。
【０００６】
２層は、機械的付着または化学的架橋により接着している。
【０００７】
架橋化剤、例えばジビニルスルホンまたはジアルデヒドと、ポリマー成分を反応させることにより層を形成して生分解性マトリックスを製造する。次いでスラリーでよい第二の層を適用し、第一の層上に機械的に付着及びゲル化させるか、または架橋化剤により第一の層上に化学的に結合させることができる。第二の層もまた架橋されたポリマー成分を含んでなる。
【０００８】
また、本発明は、組織再生が望まれる部位にマトリックスを適用することにより組織を再生するためのマトリックスの使用方法をも提供する。
【０００９】
（好ましい実施形態の説明）
マトリックスは、その組成、密度および多孔性が異なる少なくとも２つの多孔性ポリマー層を含み、そのため成長している組織環境内で異なる特性を有する。２つのポリマー層を別個に調製し、次いで化学的架橋または機械的固着のいずれかにより組み合わせる。層は組成、密度、多孔性および架橋結合の性質のうちの少なくとも１つの特性が異なるが、これらの特性の１つまたは２つは双方の層で同一であってもよい。
【００１０】
本発明ではポリマー成分の各々はコラーゲン、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、キチン、キトサン、ヘパリン、ヘパリン硫酸およびアルギン酸塩より成る群から選択される。好ましい実施形態では、ポリマー成分は、コラーゲン、アルブミン、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンより成る群から選択されるタンパク質である。別の好ましい実施形態では、ポリマー成分は、ヒアルロン酸、デキストラン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、キトサン、キチンおよびアルギン酸塩より成る群から選択される多糖類である。好ましい実施形態では、ポリマー成分は、ヒアルロン酸およびコラーゲンより成る群から選択される。本明細書で用いる「ポリマー成分」なる用語は、多糖類またはタンパク質およびその塩、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等の塩である。ポリマー成分の出発物質の好ましい形態には、ヒトでの使用が認められているものが含まれる。ヒアルロン酸の出発物質は、細菌発酵により、またはオンドリの鶏冠からの単離により誘導できるか、または市販の供給源から得ることができる。
【００１１】
各層は、同一のまたは異なるポリマー成分を含む。１つの好ましい実施形態では、双方の層のポリマー成分はコラーゲンである。別の好ましい実施形態では、１つの層はＨＡを含み、別の層はコラーゲンを含んでなる。典型的には、多糖類は、約１０００から１０００００００ダルトンの平均分子量を有する。
【００１２】
本発明のマトリックスを、スポンジ様形態などのいくつかの物理学的形態で処方できる。
【００１３】
また、薬物、成長因子、ポリペプチド、タンパク質、ｃＤＮＡ、遺伝子構築物およびその他の生物活性治療薬は、マトリックスに含まれてよく、ゲル化前に作用物質を２つの誘導体のうちの１つと混合するか、または形成後のスポンジ内へ分散させるかにより、スポンジ内に捕らえられる。
【００１４】
作用物質をマトリックスに共有結合させることもできる。
【００１５】
マトリックスを、移植可能な処方に望ましいスポンジ様材料に処方することができる。本発明のマトリックスを凍結乾燥または望ましい形状の型の中で空気乾燥することによりいずれかの形状に形成することができる。
【００１６】
成長因子および／または治療薬は、マトリックスに含まれてよく、ヒト、微生物および植物などの種々の動物に由来するタンパク質、並びに化学合成および遺伝子操作技術を用いて製造されたものを含むことができる。かかる作用物質には、非限定例としては、生物学的に活性な物質、例えば成長因子（ｂＦＧＦ、ａＦＧＦ、ＥＧＦ（表皮性成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来の成長因子）、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）、ＴＧＦ−βスーパーファミリー（ＢＭＰ＝ｓ、ＧＤＦ−５、ＡＤＭＰ−１およびｄｐｐ）などのＴＧＦ−β１から３等）；サイトカイン（インターフェロン・アルファ、ベータおよびガンマなどの種々のインターフェロン、およびインターロイキン−２および−３等）；ホルモン（インスリン、成長ホルモン放出因子およびカルシトニン等）；非ペプチドホルモン；抗生物質；抗癌剤および化学物質（成長因子または成長因子レセプターの化学的擬似物質等）、並びに遺伝子およびＤＮＡ構築物（ｃＤＮＡ構築物およびゲノム構築物を含む）がある。好ましい実施形態では、作用物質には、（タンパク質様物質またはそうでなければ）骨、靭帯、軟骨または骨または関節に関連するその他の組織の成長の誘導または伝導に役割を果たすことが見出されている因子、例えばＢＭＰおよびｂＦＧＦ、が含まれる。本発明は、また、マトリックス内にカプセル化された自己由来または同種異型細胞の使用をも包含する。自己由来細胞は供与体において天然に発生するものか、または望ましいタンパク質生成物をコードする核酸を含有するように組換えにより修飾されている細胞でよい。
【００１７】
技術分野の当業者により理解されるように、担体内に固定またはカプセル化される作用物質の量は意図する標的に依存して変化するが、通常ピコグラムからグラムの量の範囲である。
【００１８】
意図される適用に依存して移植または直接適用により本発明のマトリックスを投与することができる。
【００１９】
２つのポリマー層の各々は、例えばコラーゲンおよびヒアルロン酸（ＣＯＬおよびＨＡ）を架橋させることにより、それぞれ合成できる。典型的な架橋化剤にはジビニルスルホン（ＤＶＳ）およびポリアルデヒド（例えば、ビアルデヒドまたはトリアルデヒド等）がある。層の１つが多糖類を含んでなる場合、それは、糖環を開裂し、過ヨウ素酸ナトリウムと反応させて遊離のアルデヒド末端基を有する多糖類誘導体を生成するよう、架橋のために調製され得る。２つのＣＯＬ／ＨＡポリマー層をＤＶＳと化学的に組み合わせるために、これらはその表面に結合した活性な水素原子およびスルホン官能基を双方共に担持すべきである。これはＣＯＬ／ＨＡの架橋リンカーに対する比率を調節するかまたはゲル化時間を変化させるかのいずれかにより達成できる。
【００２０】
また別に、層を熱脱水により連結させることができる。層を機械的に結合させるために、１つの層は第二の層の成分が浸透できるほど十分に大きな孔を有するべきであり、そこでゲル化することができる。従って第二の層の物質の溶液の粘性およびゲル化能力の双方の調節が重要である。粘性が低く、ゲル化時間が長い第二の層物質のスラリーは、第一の層全体に浸透することができる。これらのパラメーターを調節して、スラリーを第一の層に十分浸透させ、強力な機械的結合を形成させ、そこでそれをゲル化する。
【００２１】
１つの実施形態では、多糖類またはタンパク質を別の多糖類またはタンパク質と架橋することにより第一のポリマー層を調製する。２つの多糖類またはタンパク質は同一または互いに異なってよい。例えば、コラーゲンをコラーゲンに架橋できるか、またはヒアルロン酸塩をコラーゲンに架橋することができる。種々のＣＯＬ／ＨＡ比率を用いることができる。ＨＡに対するコラーゲンの典型的な比率は２：８から９：１である。
【００２２】
次いで第一のポリマー層を機械的および／または化学的に第二のポリマー層に適用することができる。典型的な化学的適用はＤＶＳまたはポリアルデヒド連結剤で架橋することにより達成できる。
【００２３】
図面は、二層性マトリックスを形成する方法の具体例を図式的に示す。コラーゲン（ＣＯＬ）およびヒアルロン酸塩（ＨＡ）を別々にＤＶＳで架橋し、架橋したＣＯＬ層１０ａおよび架橋したＨＡ層１０ｂを別個に形成する。層１０ａは、コラーゲンのペプチド鎖上のヒドロキシおよびアミノ基を介して架橋している。層１０ｂは、多糖類のヒドロキシ基を介して架橋している。次いで層１０ａおよび１０ｂを互いにＤＶＳで架橋し、二層性生成物１１を形成する。
【００２４】
マトリックスの作製中、層の架橋または機械的適用の間に生物学的活性物質を組み込むことができる。また別に、活性物質を含有する溶液にマトリックスを浸漬することにより、マトリックスを作製した後に生物学的物質を組み込むことができる。
【００２５】
技術分野の当業者に既知のインビトロおよびインビボの双方の試験により組織再生の効率を示すことができる。本発明では、好ましい治療薬は、骨、靭帯、柔組織、軟骨または骨若しくは関節に関連するその他の組織の成長の誘導または伝導に役割を果たすことが見出されている因子である。前記した治療薬を含み得るマトリックスを、望ましい組織再生（例えば、骨成長、軟骨成長または関節修復）の部位に適用する。
【００２６】
軟骨誘導、軟骨伝導、骨誘導または骨伝導の評価のためのインビトロおよびインビボアッセイは技術分野の当業者に既知である。インビトロ試験に関しては、ＷｏｎｇおよびＣｈｏｎの方法（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　７２：３１６７−３１７１（１９７５））による一連のコラゲナーゼ消化により収穫した初代ラット胎児頭蓋冠細胞またはＴｈｙｂｅｒｇおよびＭｏｓｋａｌｅｗｓｋｉの方法（Ｃｅｌｌ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｒｅｓ．２０４：７７−９４（１９７９））による初代ラット骨端軟骨、またはＢｌｅｉｎ−Ｓｅｌｌａ　Ｏ．らの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４３：１６９−１７５（１９９５））により収穫されたウサギ関節軟骨細胞を望ましい作用物質を含有する担体に播種し、通常の条件下で１から４週間培養する。次いで培養物を処理し、組織化学的に評価する。
【００２７】
初代ラット骨髄および間質細胞並びにラットまたはウサギの初代軟骨細胞の付着、遊走、増殖および分化をサポートすることの成功により、本発明のマトリックスの軟骨伝導または軟骨誘導能力が決定される。骨髄および骨髄間質細胞は全層性欠損の軟骨下骨髄に見出される軟骨前駆細胞の供給源である。骨髄は２から３週齢の近交系ルイスラットの長骨から収穫でき、担体に直接加えるか、または標準的な条件下で２週間培養できる。これらの培養物から成長した付着性間質細胞集団を継代し、用時まで凍結する。６代まで継代した細胞を培養または担体への播種に用いて軟骨伝導または軟骨誘導能力に関して試験する。
【００２８】
レチノイン酸処置軟骨細胞はあまり成熟していない軟骨細胞に相当し、これを使用してマトリックスが軟骨生成の後期段階をサポートする能力を試験する。初代軟骨細胞のレチノイン酸処置は担体での培養または細胞の播種の前に実施する（Ｄｉｅｔｚ，Ｕ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．５２（１）：５７−６８（１９９３））。
【００２９】
細胞数およびミトコンドリア活性に基づく生存性を測定できるＭＴＳアッセイを用いて細胞付着および増殖をモニター観察する。付着分析および１から２週間の増殖評価のために、血清の存在下または不在下、治療薬を含有する担体上で間質細胞または軟骨細胞を６から１８時間培養する。
【００３０】
細胞遊走試験に関しては、マトリックスを多孔性トランスウェル膜培養インサート（コーニング）にコーティングまたは備えつける。間質細胞はトランスウェルの上部チャンバーの担体の上面に播種し、化学誘因物質（成長因子、ＰＤＧＦ）は下部チャンバーに設置する。１２から１８時間の培養の後、担体を通ってトランスウェル膜の下部側に遊走した細胞をＭＴＳアッセイにより定量する。マトリックスルを上部チャンバーから除去し、組織化学的に処理して浸潤の程度を評価する。
【００３１】
軟骨生成および骨生成に適切な分化マーカーの分析はタンパク質および転写レベルの双方で評価される。分析できる特異的マーカーには：１）ＩＩ型コラーゲンおよびＩＩＡおよびＩＩＢイソ型；２）アグレカン・プロテオグリカン；３）ＩＸ、ＸおよびＸＩ型コラーゲン；４）Ｉ型コラーゲン；５）軟骨マトリックスタンパク質（ＣＭＰ）；６）Ｃａｒｔ−１転写因子；７）フィブロネクチン（ＥＤＡ、ＥＤＢイソ型）；８）デコリン・プロテオグリカン；９）リンクタンパク質；１０）ＮＧ−２プロテオグリカン；１１）ビグリカン・プロテオグリカン；１２）アルカリ性ホスファターゼなどがある。ノーザン／ＰＣＲ分析、ウェスタンブロッティングにより、または代謝性細胞標識により分化を測定できる。
【００３２】
ノーザン／ＰＣＲ分析に関しては、標準的な手順により間質細胞または軟骨細胞からＲＮＡを単離する。時間経過試験を用いて、細胞型に依存して１から６週間にわたる最適培養期間を決定できる。特異的ｃＤＮＡまたはＰＣＲ増幅プローブを用いてノーザンゲルおよびハイブリダイゼーション技術により単離したＲＮＡを分析する。オートラジオグラフのデンシトメトリー走査およびハウスキーピング遺伝子シグナル（Ｇ３ＰＤＨ）への正規化によりノーザン分析を定量化する。分析すべき遺伝子の公開されたｃＤＮＡ配列から作製したプライマーを用いる定量ＰＣＲ分析でノーザン分析を補うことができる。
【００３３】
ウェスタンブロッティングに関しては、標準的な技術により骨生成または軟骨生成物質を含有するマトリックスで培養された細胞から可溶化タンパク質ライゼートを単離する（Ｓｐｉｒｏ　Ｒ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１５：１４６３−１４７３（１９９１））。細胞を溶解した後、マトリックスを強力な変性剤（８Ｍ　尿素、ＧｎＨＣＬ）中で抽出して結合したまたは組み込まれたタンパク質を除去および試験する。特異的ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いてウェスタンブロッティング技術によりタンパク質サンプルを分析する。
【００３４】
代謝性細胞標識に関しては、標準的な技術により、マトリックスで培養した細胞を３５ＳＯ４、３５Ｓ−メチオニンまたは３Ｈ／１４Ｃ標識アミノ酸で代謝的に放射性標識する（Ｓｐｉｒｏら、前出）。可溶化した細胞およびマトリックス結合タンパク質を目的のタンパク質に特異的な抗体で定量的に免疫沈澱させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析する（Ｓｐｉｒｏら、前出）。オートラジオグラフのデンシトメトリー走査により結果の定量化を実施し、細胞等価物またはハウスキーピングタンパク質、例えばアクチンのいずれかにシグナルを正規化する。
【００３５】
加えて、本発明のマトリックスのインビボでの軟骨生成分化をサポートする能力を近交系ラット柔組織移植モデルで試験できる。前記したラット骨髄または間質細胞を高密度で担体に播種し、１０％のＦＢＳ血清および抗生物質を含有するＭＥＭ培地中一晩培養し、次いでミリポア分散チャンバーに移し、８週齢受体の腹膜内または皮下に移植する。３週後にチャンバーを収穫し、軟骨形成に関して組織学的に評価する。
【００３６】
非近交系ラットの移植モデルを用いてマトリックスがインビボで軟骨表現型を維持する能力を評価する。肋骨肋軟骨軟骨細胞を高密度で担体に播種し、１％のラット血清および抗生物質を含有するハムズＦ−１２中一晩培養する。次いで８週齢雄スプラーグ・ダウレイラットの鈍的解剖により作製した後脛骨筋嚢に播種した担体を移植する。１４および２８日に外植片を取り、アグレカンおよびＩＩ型コラーゲンの染色に基づき、適合性、軟骨成長および分化した表現型の維持に関して組織学的に評価する。
【００３７】
インビボ試験に関しては、６週齢雄スプラーグ・ダウレイラットの頭頂骨に作製した５ｍｍ×３ｍｍの欠損に移植することにより、ラット頭蓋欠損モデルにおける骨性治癒をサポートする能力に関してマトリックスを評価することができる。ラジオグラフィーおよび組織学的分析により２８日に欠損を評価する。
【００３８】
軟骨修復のためのインビボモデルはウサギの全層性関節軟骨欠損である（Ａｍｉｅｌら、Ｊ．Ｂｏｎｅ　Ｊｏｉｎｔ　Ｓｕｒｇ．６７Ａ：９１１（１９８５））。成熟雄ニュージーランド白色ウサギの内側大腿関節丘の中央に直径約３．７ｍｍおよび深さ５ｍｍの寸法の欠損を作製する。次いで欠損をマトリックスで充填するかまたはコントロールとして充填しないままにする。６および１２週に、次いで６か月および１年後に欠損を形態学的および組織学的に評価する。
【００３９】
以下の実施例は説明の目的で提供するものであって、本発明をいかなるようにも限定することを意図するものではない。
【００４０】
実施例１
１つの層はＣＯＬ含量７０％、もう１つの層はＨＡ含量１００％のＣＯＬ／ＨＡ二層性マトリックスの調製。この実施例は、ＨＡ／ＤＶＳ層を、ＨＡグラジエントを有するＣＯＬと架橋する方法を説明する。
【００４１】
ＣＯＬ／ＨＡ懸濁液（ＣＯＬ　５６０ｍｇ、プレップＦファイバー；ＨＡ　２４０ｍｇ；０．２Ｎ　ＮａＯＨ）２０ｍｌにＤＶＳを２４０ｍｇ加えた。混合物を即座にヘビーデューティーブレンダーで低速で２×５秒間混和し、望ましい型に注いだ。約２０分後、ＣＯＬ／ＨＡスラリーがゲル化し始めたとき、４００ｍｇのＨＡおよびＤＶＳを含有するＨＡ／ＤＶＳビスコース１０ｍｌをＣＯＬ／ＨＡスラリーの上部に加えた。ＨＡ／ＤＶＳが混合後すぐにゲル化するので、適用の４から５分前までには激しく攪拌してビスコースを調製しなければならない。内容物の入った型を作業台上に室温で１時間放置し、完全にゲル化させ、次いで１０％のイソプロピルアルコール溶液中に１時間放置した。このように形成したマトリックスを多量の脱イオン水で数回交換しながら４８時間洗浄し、続いて凍結乾燥した。
【００４２】
実施例２
１つの層はＣＯＬ含量１００％、もう１つの層はＨＡ含量１００％のＣＯＬ／ＨＡ二層性マトリックスの調製。この実施例はＨＡ／ＤＶＳ層をＣＯＬ／グルタルアルデヒド層に架橋する方法を説明する。
【００４３】
施設内用に採用した正規の手順により、予め作製したＣＯＬスポンジを３０％　イソプロピルアルコール中のグルタルアルデヒドと架橋することによりＣＯＬマトリックスを調製した。マトリックスを０．２ＮのＮａＯＨに５分間浸漬し、適当な型に入れた。ＨＡ／ＤＶＳビスコースを実施例１に記載するとおり調製し、ＣＯＬマトリックスの上部に注いだ。作業台上に室温で１時間放置した後、マトリックスを１０％のイソピロピルアルコールに１時間漬け、次いで多量の脱イオンＨ２Ｏに数回交換しながら４８時間漬け、続いて凍結乾燥した。
【００４４】
実施例３
１つの層はＣＯＬ含量１００％、もう１つの層はＨＡ含量１００％のＣＯＬ／ＨＡ二層性マトリックスの調製。この実施例はＨＡ／ＤＶＳ層をＣＯＬ／ＤＶＳ層に架橋する方法を説明する。
【００４５】
ＣＯＬファイバー（４％、０．２Ｎ　ＮａＯＨ）をＤＶＳと共にヘビーデューティーブレンダーで低速で２×５秒間混和することによりＣＯＬマトリックスを調製した。このように形成したＣＯＬ／ＤＶＳスラリーを適当な型に注ぎ、作業台上に室温で３０分間放置した。ＨＡ／ＤＶＳビスコースを実施例１に記載するように調製し、ＣＯＬ／ＤＶＳゲルの上部に注いだ。作業台上に室温でさらに１時間放置した後、マトリックスを凍結乾燥した。乾燥したマトリックスを１０％　イソプロピルアルコールに１時間漬け、次いで多量の脱イオン水に数回交換しながら４８時間漬け、続いて凍結乾燥した。
【００４６】
実施例４
２つの層で異なる架橋密度を有するＨＡ／ＤＶＳ二層性マトリックスの調製。この実施例は、架橋の程度を調節することにより、１つの層では高い多孔性を有し、他方では低い多孔性を有するＨＡ／ＤＶＳ二層性ゲルを調製する方法を説明する。
【００４７】
０．２ＮのＮａＯＨ１０ｍｌ中で、ＨＡ４００ｍｇをＤＶＳ４００μｌと混合し、完全に混合し、望ましい型に注ぎ、次いで２分間室温にした。この瞬間に、ＨＡ／ＤＶＳビスコースの１０ｍｌ（８％　架橋リンカーおよび４％　ＨＡ）を予め成型したＨＡゲルの上部に注いだ。二層性ゲルを室温でさらに１時間インキュベートし、完全にゲル化させた。ゲルを洗浄し、前記したように凍結乾燥した。
【００４８】
実施例５
２つの層で異なる質量密度を有するＣＯＬ／ＨＡ二層性マトリックスの調製。この実施例はその質量密度を調節することにより、１つの層で高い多孔性を有し、他方では低い多孔性を有するＨＡ／ＤＶＳ二層性ゲルを調製する方法を説明する。
【００４９】
ＣＯＬ／ＨＡスラリー［ｄ、７０ｍｇ／ｍｌ；９：１（ＣＯＬ／ＨＡ）；０．２Ｎ　ＮａＯＨ］をＤＶＳ（７５ｍｇ／ｍｌ）と激しく混和することにより混合し、望ましい型に注いだ。即座に、低密度のＣＯＬ／ＨＡスラリー［ｄ、３５ｍｇ／ｍｌ；９：１（ＣＯＬ／ＨＡ）；０．２ＮのＮａＯＨ］の別の部分をＤＶＳ（３５ｍｇ／ｍｌ）と混合し、最初のＣＯＬ／ＨＡゲルの上部に注いだ。次いでマトリックスを室温でさらに１時間インキュベートし、続いて凍結乾燥した。乾燥したマトリックスを多量の脱イオン水で洗浄し、再度凍結乾燥した。
【００５０】
実施例６
架橋したＨＡをコアに有し、１００％のＣＯＬを外側の層に有するＣＯＬ／ＨＡマトリックスの調製。この実施例は、酸ＣＯＬ溶液を用いてＨＡネットワークをＣＯＬゲル中にはめ込む方法を説明する。
【００５１】
予めＰＢＳで膨潤させた直径８ｍｍのＨＡ／ＤＶＳマトリックスを、１２ウェル組織培養プレートのウェルの中央に置いた。ＣＯＬ溶液１．６０ｍｌ（コラーゲン・コーポレーション、３ｍｇ／ｍｌ、０．０１２Ｍ　ＨＣｌ）１０ＸのＰＢＳ０．２０ｍｌと０．１０ＮのＮａＯＨ０．２０ｍｌを、４ｍｌのポリプロピレン丸底試験管に加え、５分間攪拌し、次いで水浴中３７℃でインキュベートした。時間経過と共にＣＯＬ溶液の粘性が増大し、最終的には試験管を水平から双方に６０度の角度で置いた場合、壁面に沿って流れるのが困難になった。ビスコースを注意深くウェルに注ぎ、プレートを３７℃でさらに４０分間インキュベートした。コアＨＡマトリックスとウェルの壁面の間の空間にＣＯＬゲルは充填して形成された。この手順ではＣＯＬビスコースのＨＡ／ＤＶＳ層への浸透はその粘性に依存する。従って、ＣＯＬビスコースは、コアにわずかしか浸透しないで、末端でのみゲル化して、物理学的に強固な架橋を作製するように容易に設計され得る。一方で、２つの層の完全性は維持されたままである。
【００５２】
実施例７
ＣＯＬゲルをコアに有し、ＨＡ／ＤＶＳを外側の層に有するＣＯＬ／ＨＡマトリックスの調製。この実施例は、酸ＣＯＬ溶液を用いてＨＡ／ＤＶＳの内側にＣＯＬゲルを得る方法を説明する。
【００５３】
８×４ｍｍ（ｒ×ｄ）の大きさのＨＡ／ＤＶＳマトリックスディスクの中央に孔（ｒ、４ｍｍ）を開け、ＰＢＳで膨潤させ、組織培養プレートに置いた。前記したように調製したＣＯＬビスコースを注意深く孔に注いだ。プレートをさらに４０分間インキュベーションし続けた。
【００５４】
実施例８
ＣＯＬ／ＨＡ二層性マトリックスの同定。
【００５５】
合成ＣＯＬ／ＨＡ二層性マトリックスを安定性および構造的外観に関して同定した。
【００５６】
安定性実験に関しては、このように調製したマトリックスを１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＰＢＳに漬け、４℃で保存して酵素による分解を防御した。２か月後、試験したマトリックスの全てについて、２つの層の崩壊は観察されず、これはこのように形成された二層性マトリックスの安定性を示している。
【００５７】
前記で説明したように調製したマトリックスを０．０１％のトルイジンブルーで染色し、次いでエオシンで染色した。青色および紫色の２色は各々ＨＡ領域およびＣＯＬ領域で示され、これは２つの別個の層を有するマトリックスの形成を示している。
【００５８】
実施例９
ＦＲＣ細胞を播種したＣＯＬ／ＨＡ二層性マトリックスの培養。この実施例は、２つの別個の層におけるＣＯＬ／ＨＡ比率が、細胞付着および分化に及ぼす影響を説明している。
【００５９】
ラット胎児頭蓋冠（ＦＲＣ）細胞を、実施例６に記載したように調製したＣＯＬ／ＨＡ二層性マトリックスに、ＨＡ／ＣＯＬゲルあたり１．５×１０６セルの密度で播種した。２μｇのＧＤＦ−５を含有するＤＭＥＭ２．５ｍｌを各ウェルに加え、通常の条件下で培養した。２４時間後、培地をピペットで取り出し、マトリックスをＰＢＳで洗浄し、１０％のホルマリンで固定し、クリスタルバイオレットで染色し、次いで顕微鏡観察により試験した。ＣＯＬ領域に付着した細胞が広がり、ＨＡ領域に付着した細胞は丸いままだった。
【００６０】
実施例１０
ＦＲＣ細胞で予め播種したＣＯＬ／ＨＡ二層性マトリックスの培養。これは２つの層の組成の差異が細胞分化に及ぼす影響を説明している。実施例３に記載したとおりに調製したマトリックスを使用した。１つの二層性マトリックスをＦＧＦに浸漬し（＋ＧＦ）、第二の二層性マトリックスをＦＧＦを用いないでインプラントした（−ＧＦ）。マトリックスを８×６×４ｍｍ（Ｌ、Ｗ、Ｈ）の大きさの直方体に切断し、エタノールで滅菌し、４×１０５セル／標本の密度でＦＲＣ細胞を装填し、ＤＭＥＭ中３７℃で４週間培養した。培地は隔日に交換した。４週後、マトリックスを培地から除去し、ＰＢＳで洗浄し、組織学により細胞形態学に関して試験し、ＤＮＡの定量により細胞数を計数し、ｐ−ニトロフェノールと反応させることによりアルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰ）活性のレベルを測定し、ジメチルメチレンブルーアッセイにより硫酸グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に関して測定した。ＨＡ層の細胞は丸く、凝集し、軟骨細胞様形態であったが、ＣＯＬ層で成長した細胞は平らで広がっていた。生化学的分析により、ＣＯＬ層の細胞は、ＨＡ層の細胞に比較して、高レベルのＡＬＰおよび低レベルのＧＡＧを発現した（表１）。これらの結果から、二層性マトリックスの区別された領域内の細胞の分化は、特定の組成変化により決定され得ると示される。
【表１】
サンプル　　　　　　細胞増殖＊　　 ＡＬＰ＊＊　　　　硫酸ＧＡＧ
ＣＯＬ層（＋ＧＦ）　６．８８　　　６１．８　　０．４５±０．０３
ＣＯＬ層（−ＧＦ）　６．４２　　　１０３　　　−０．０２±０．０６
ＨＡ層（＋ＧＦ）　　５．５３　　　７　　　　　２．５３±０．０８
ＨＡ層（−ＧＦ）　　４．５８　　　１３　　　　０．９±０．１
＊細胞増殖、各サンプル中における、１日目のＤＮＡ量に対する２８日目のＤＮＡ量の割合
＊＊ＡＬＰ、アルカリ性ホスファターゼ活性、μモル／ｇＤＮＡ／分
＊＊＊５倍に希釈された脱染色溶液の５９５ｎｍでのＯ．Ｄ．
【図面の簡単な説明】
【図１】
本発明による二層性マトリックスの実施形態の合成についての概要的フローチャートである。
【図１】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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