(57)【要約】アミノ酸１１３または１１４の一方または双方が変異されている、麻疹ウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内に少なくとも１個の変異を有する改変モルビリウイルスを記載する。かかる改変モルビリウイルスは、遺伝子発現の低下した抑制を示す。カルボキシ末端領域を含み、ゲノムの他の領域内の追加の変異または欠失が含まれてもよい。
2004513616.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内の変異がアミノ酸１１３および１１４の変異よりなる群より選ばれる、モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内に少なくとも１個の変異を有する、モルビリウイルス属の、単離され、組換え産生され、非セグメント化された、負センスの一本鎖ＲＮＡウイルス。
【請求項２】
ウイルスが、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルス、小型反芻動物病ウイルス、イルカモルビリウイルスおよびアザラシジステンパーウイルスよりなる群より選ばれる、請求項１記載のモルビリウイルス。
【請求項３】
変異がアミノ酸１１３にある、請求項１記載のモルビリウイルス。
【請求項４】
アミノ酸１１３における変異がチロシンからアラニンへである、請求項３記載のモルビリウイルス。
【請求項５】
変異がアミノ酸１１４にある、請求項１記載のモルビリウイルス。
【請求項６】
アミノ酸１１４における変異がアスパラギン酸からアラニンへである、請求項５記載のモルビリウイルス。
【請求項７】
アミノ酸１１３および１１４の双方に変異が存在する、請求項１記載のモルビリウイルス。
【請求項８】
アミノ酸１１３における変異がチロシンからアラニンへであり、そしてアミノ酸１１４における変異がアスパラギン酸からアラニンへである、請求項７記載のモルビリウイルス。
【請求項９】
ウイルスが麻疹ウイルスである、請求項２記載のモルビリウイルス。
【請求項１０】
麻疹ウイルスＶタンパク質のアミノ酸２３１−２９９に相当するカルボキシ−末端（Ｃ−末端）領域の少なくとも一部分における変異またはその欠失をさらに含んでなる、請求項３記載の麻疹ウイルス。
【請求項１１】
Ｃ−末端領域における変異が、アミノ酸２３３および２３４のそれぞれにある、請求項１０記載の麻疹ウイルス。
【請求項１２】
アミノ酸２３３および２３４のそれぞれにおける変異がアルギニンからアラニンへである、請求項１１記載の麻疹ウイルス。
【請求項１３】
アミノ酸２３３および２３４のそれぞれにおける変異がアルギニンからアスパラギン酸へである、請求項１１記載の麻疹ウイルス。
【請求項１４】
欠失が、アミノ酸２３２から２９９まで、２７９から２９９まで、２６７から２９９まで、２５０から２９９まで、２４３から２９９までおよび２３６から２９９までよりなる群より選ばれる、請求項１０記載の麻疹ウイルス。
【請求項１５】
欠失がアミノ酸２３２から２９９までである、請求項１４記載の麻疹ウイルス。
【請求項１６】
欠失がＣ−末端領域より上流に延び、そしてアミノ酸２２９から２９９までである、請求項１５記載の麻疹ウイルス。
【請求項１７】
さらに
（ａ）ヌクレオチド２６（Ａ→Ｔ）、ヌクレオチド４２（Ａ→ＴまたはＡ→Ｃ）およびヌクレオチド９６（Ｇ→Ａ）よりなる群より選ばれる３’ゲノムプロモーター領域内の少なくとも１個の弱毒化変異であって、これらのヌクレオチドは正鎖、アンチゲノム性、メッセージセンス中に提示され、そして
（ｂ）残基３３１（イソロイシン→トレオニン）、１４０９（アラニン→トレオニン）、１６２４（トレオニン→アラニン）、１６４９（アルギニン→メチオニン）、１７１７（アスパラギン酸→アラニン）、１９３６（ヒスチジン→チロシン）、２０７４（グルタミン→アルギニン）および２１１４（アルギニン→リシン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化よりなる群より選ばれるＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内の少なくとも１個の弱毒化変異、を含んでなる、請求項３記載の麻疹ウイルス。
【請求項１８】
さらに
（ａ）Ｎ遺伝子に対して、残基１２９（グルタミン→リシン）、１４８（グルタミン酸→グリシン）および４７９（セリン→トレオニン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化、
（ｂ）Ｐ遺伝子に対して、残基２２５（グルタミン酸→グリシン）、２７５（システイン→チロシン）および４３９（ロイシン→プロリン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化、
（ｃ）Ｃ遺伝子に対して、残基７３（アラニン→バリン）、１０４（メチオニン→トレオニン）および１３４（セリン→チロシン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化、および
（ｄ）Ｆ遺伝子−末端シグナルに対して、ヌクレオチド７２４３（Ｔ→Ｃ）における変化であって、これらのヌクレオチドは、正鎖、アンチゲノム性、メッセージセンス中に提示される
よりなる群より選ばれる、少なくとも１個の弱毒化変異を含んでなる、請求項３記載の麻疹ウイルス。
【請求項１９】
さらに
（ａ）ヌクレオチド２６（Ａ→Ｔ）、ヌクレオチド４２（Ａ→ＴまたはＡ→Ｃ）およびヌクレオチド９６（Ｇ→Ａ）よりなる群より選ばれる３’ゲノムプロモーター領域内の少なくとも１個の弱毒化変異であって、これらのヌクレオチドは正鎖、アンチゲノム性、メッセージセンス中に提示され、そして
（ｂ）残基３３１（イソロイシン→トレオニン）、１４０９（アラニン→トレオニン）、１６２４（トレオニン→アラニン）、１６４９（アルギニン→メチオニン）、１７１７（アスパラギン酸→アラニン）、１９３６（ヒスチジン→チロシン）、２０７４（グルタミン→アルギニン）および２１１４（アルギニン→リシン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化よりなる群より選ばれるＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内の少なくとも１個の弱毒化変異、を含んでなる、請求項１０記載の麻疹ウイルス。
【請求項２０】
（ａ）Ｎ遺伝子に対して、残基１２９（グルタミン→リシン）、１４８（グルタミン酸→グリシン）および４７９（セリン→トレオニン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化、
（ｂ）Ｐ遺伝子に対して、残基２２５（グルタミン酸→グリシン）、２７５（システイン→チロシン）および４３９（ロイシン→プロリン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化、
（ｃ）Ｃ遺伝子に対して、残基７３（アラニン→バリン）、１０４（メチオニン→トレオニン）および１３４（セリン→チロシン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化、および
（ｄ）Ｆ遺伝子−末端シグナルに対して、ヌクレオチド７２４３（Ｔ→Ｃ）における変化であって、ここでこれらのヌクレオチドは、正鎖、アンチゲノム性、メッセージセンス中に提示される
よりなる群より選ばれる、少なくとも１個の弱毒化変異をさらに含んでなる、請求項１０記載の麻疹ウイルス。
【請求項２１】
ウイルスがイヌジステンパーウイルスである、請求項２記載のモルビリウイルス。
【請求項２２】
イヌジステンパーウイルスＶタンパク質のアミノ酸２３１−２９９に相当するＣ−末端領域の少なくとも一部分における変異またはその欠失をさらに含んでなる、請求項２１記載のイヌジステンパーウイルス。
【請求項２３】
ウイルスが牛疫ウイルスである、請求項２記載のモルビリウイルス。
【請求項２４】
牛疫ウイルスＶタンパク質のアミノ酸２３１−２９９に相当するＣ−末端領域の少なくとも一部分における変異またはその欠失をさらに含んでなる、請求項２３記載の牛疫ウイルス。
【請求項２５】
ウイルスがイルカモルビリウイルスである、請求項２記載のモルビリウイルス。
【請求項２６】
牛疫ウイルスＶタンパク質のアミノ酸２３１−３０３に相当するＣ−末端領域の少なくとも一部分における変異またはその欠失をさらに含んでなる、請求項２２５３記載のイルカモルビリウイルス。
【請求項２７】
モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内の変異がアミノ酸１１３および１１４の変異よりなる群より選ばれる、モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内に少なくとも１個の変異を有する、モルビリウイルス属の、単離され、組換え産生され、非セグメント化された、負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスを、希釈剤またはキャリヤーと一緒に含んでなる、免疫原性組成物。
【請求項２８】
請求項２７記載の免疫原性組成物を個体に投与することを含んでなる、モルビリウイルス属の非セグメント化、負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスに対する防御を誘導するように個体を免疫化するための方法。
【請求項２９】
さらにアジュバントを含んでなる、請求項２７記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
請求項２９記載の免疫原性組成物を個体に投与することを含んでなる、モルビリウイルス属の非セグメント化、負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスに対する防御を誘導するように個体を免疫化するための方法。
【請求項３１】
モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内の変異が、アミノ酸１１３および１１４の変異よりなる群より選ばれる、モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内に少なくとも１個の変異を挿入することを含んでなるモルビリウイルス属のＶタンパク質により起きる抑制を低減するための方法。
【請求項３２】
モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内の変異が、アミノ酸１１３および１１４の変異よりなる群より選ばれる、モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内に少なくとも１個の変異を挿入することにより改変されたモルビリウイルスＶタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列。
【請求項３３】
Ｖタンパク質をコードする単離された核酸分子の部分が、モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内に少なくとも１個の変異を挿入するように改変され、該モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内の変異がアミノ酸１１３および１１４の変異によりなる群より選ばれる、モルビリウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子を含んでなる転写ベクターを、キャプシド化、転写および複製のために必要なトランス作用性タンパク質Ｎ、ＰおよびＬをコードする少なくとも１個の単離された核酸分子を含んでなる少なくとも１個の発現ベクターと一緒に含んでなり、これにより発現した場合に感染性モルビリウイルスが産生される組成物。
【請求項３４】
請求項３３記載の少なくとも２種のベクターを用いて宿主細胞を形質転換、感染またはトランスフェクションし、そして感染性モルビリウイルスを産生するように、これらのベクターの共発現を許容する条件下で宿主細胞を培養することを含んでなる、感染性モルビリウイルスを産生するための方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、Ｖタンパク質により正常では起こされる抑制（ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）を低減する１個またはそれ以上の変異および／または欠失を有する、モルビリウイルス属の、単離され、組換え産生された、負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスに関する。
【０００２】
［発明の背景］
エンベロープを有する負センスの一本鎖ＲＮＡウイルスは、特有に構成されそして発現される。負センスの一本鎖ウイルスのゲノムＲＮＡは、ヌクレオキャプシドの範囲内で２種の鋳型機能に役立つ：メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の合成のための鋳型としておよびアンチゲノム（＋）鎖の合成のための鋳型として。ウイルス複製は、ｍＲＮＡの合成の後に起こりそしてウイルスタンパク質の連続的合成を必要とする。新たに合成されたアンチゲノム（＋）鎖は、（−）鎖ゲノムＲＮＡのさらなるコピーを生成するための鋳型として役立つ。
【０００３】
ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ複合体は、ゲノムの３’末端、特にはプロモーター領域におけるシス−作用性シグナルと連動することにより転写および複製を起動しそして達成する。次いで、ウイルスゲノムは、その３’末端からその５’末端まで一方向にゲノム鋳型から転写される。
【０００４】
ウイルス分類に関する国際委員会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｅｅ ｏｎ ｔｈｅ Ｔａｘｏｎｏｍｙｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ） により１９９３年に改訂された再分類に基づき、モノネガウイルスと呼ばれる目が確定された。この目は、負の極性（負センス）の一本鎖、非セグメント化（ｎｏｎｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）ＲＮＡゲノムを有する、エンベロープを有するウイルスの３科を含む。これらの科は、パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ） 、ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ） およびフィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ） である。パラミクソウイルス科はさらに２種の亜科、すなわちパラミクソウイルス亜科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｎａｅ） およびニューモウイルス亜科（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ） に分類されている。パラミクソウイルス亜科は、３種の属、すなわちレスピロウイルス（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）属（以前のパラミクソウイルス属）、ルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ） 属およびモルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ） 属を含む。ニューモウイルス亜科はニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ） 属を含む。新しい分類は、形態学的基準、ウイスルゲノムの構成、生物学的活性そして遺伝子および遺伝子産物の配列関連性に基づく。モルビリウイルスの現在の分類学的分類は、下記である。
【０００５】
モノネガウイルス目
パラミクソウイスル科
パラミクソウイルス亜科
モルビリウイルス属
麻疹ウイルス
イルカモルビリウイルス
イヌジステンパーウイルス
小型反芻動物病ウイルス（Ｐｅｓｔｅ−ｄｅｓ−ｐｅｔｉｔｓ−ｒｕｍｉｎａｎｔｓ ｖｉｒｕｓ）
アザラシジステンパーウイルス
牛疫ウイルス
これらのウイルスの多くに対して、いかなる種類のワクチンも入手できない。従って、このようなヒトおよび動物の病原体に対するワクチンを開発する必要がある。このようなワクチンは、レシピエント内に防御性免疫応答を誘導しなければならない。このような好都合の応答の定性および定量的特徴は、一般にその後いくらかの有意の期間の間同一または高度に関連するウイルスによる再感染から防御される天然ウイルス感染の生存者内で見られるもの、から推論される。
【０００６】
種々の方法がこのようなワクチンの開発のための探究の際に考慮でき、これらには下記の使用が含まれる：（１）精製された個別のウイルスタンパク質ワクチン（サブユニットワクチン）、（２）不活性化された全ウイルス製剤、および（３）生の弱毒化ウイルス。
【０００７】
サブユニットワクチンは、純粋で、限定可能で、および組換えＤＮＡ発現法を含む種々の手段により大量に比較的容易に産生される、という望ましい特徴を有する。今日まで、Ｂ型肝炎表面抗原の顕著な例を除き、ウイルスサブユニットワクチンは、特に未経験のレシピエントにおいて、一般に誘導された短命および／または不十分な免疫のみを誘導してきた。
【０００８】
ポリオ（ＩＰＶ）およびＡ型肝炎のホルマリン不活性化全ウイルス製剤は、安全かつ有効なことが証明されている。対照的に、同様に不活性化された全ウイルス、例えば呼吸器合胞体ウイルスおよび麻疹ウイルスワクチンを用いる免疫化は、その後天然または「野生型」ウイルスに直面する場合に、ワクチン被接種者が悪化または異常な疾患に罹患しやすくなる不利な免疫応答および／または応答プロフィールを誘導した。
【０００９】
適切に弱毒化された野生型ウイルスの生の誘導体は、ワクチン候補として明確な利益を与える。生で複製する薬剤として、それらはレシピエント内で感染を開始し、その間にウイルス遺伝子産物を発現し、処理し、およびワクチン被接種者特有のＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩ分子に関連して提示し、体液性および細胞媒介免疫応答、ならびに天然の感染症の生存者の防御的免疫プロフィールとパラレルなサイトカインおよびケモカインパターンを誘導する。
【００１０】
この好ましい免疫応答パターンは、典型的には主として体液的免疫監視アーム（ａｒｍ） に制限される不活性化またはサブユニットワクチンにより誘導される限定的な応答とは対照的である。さらに、一部のホルマリン不活性化全ウイルスワクチン、例えば１９６０年代に開発された麻疹および呼吸器合胞体ウイルスワクチンにより誘導される免疫応答プロフィールは、持続性防御を与えられないだけでなく、実際に、ワクチン被接種者がその後野生型ウイルスに対抗する場合に、異常で悪化し、さらに致死的でさえある疾病素質に導かれた。
【００１１】
生で弱毒化されたウイルスは、ワクチン候補として高度に望ましい特性を有するけれども、それらは開発が困難なことが知られている。困難性の最大の点は、レシピエントを感染しそして適当な豊富さで所望の免疫応答プロフィールを誘導するために十分な複製能力を保持しながら、その疾患発生能力（すなわち毒性）を失った野生型ウイルスの誘導体を単離する必要性にある。
【００１２】
歴史的には、毒性と弱毒化との間のこの微妙な均衡は、種々の生育条件（例えば温度）の下で、種々の宿主組織または細胞を介する野生型ウイルス単離物の連続継代により達成されている。この過程はウイルス変種（変異体）の生育に有利と考えられ、その一部は弱毒化の有利な特徴を有する。場合により、化学的変異誘導によってもさらなる弱毒化が達成される。
【００１３】
この繁殖／継代スキームは、典型的には温度感受性、低温適応性および／またはそれらの宿主範囲を改変されたウイルス誘導体の出現に導き、その１種またはすべては野生型、疾患原因ウイルスからの変化、すなわち弱毒化と関連することもある変化である。
【００１４】
麻疹および流行性耳下腺炎（パラミクソウイルスである）の予防のため、およびポリオおよび風疹（正鎖ＲＮＡウイルスである）に対する防御のためのものを含む数種の生ウイルスワクチンがこの方法により生成されそして世界中で現在の小児の免疫感染養生法の主力を提供している。
【００１５】
しかしながら、弱毒化生ウイルスワクチン候補を生成するためのこの手段は、長たらしく、そして最善でも予測不可能であり、所望の弱毒化特性を有するこれらのランダムに発生するゲノム変異体の選択的な自然所産に主として依存する。得られるウイルスは、生体外で所望の表現型を有し、そして動物モデルで弱毒化されているように見えることもある。しかし、これらがワクチン候補として意図されるヒトまたは動物宿主内においてこれらはあまりにもしばしば過少または過剰弱毒化のいずれかのままである。
【００１６】
使用されている現在のワクチンに関してさえ、さらに有効なワクチンへの要求がなお存在する。例えば、現在の麻疹ワクチンは、適度に良好な防御を提供する。しかし、最近の麻疹の流行は、現在のワクチンの効力の不足を示唆する。母体の免疫化にもかかわらず、高率の急性麻疹感染が１歳以下の小児で発生しており、野生型麻疹感染の後に発生する抗体レベルと同等の抗麻疹抗体レベルを誘導するためのワクチンの能力がないことを反映する（文献１、２、３）。その結果、ワクチン免疫化された母親は、新生児を生涯の最初の数カ月を越えて防御するため十分な経胎盤由来の受動的抗体をそれらの幼児に提供する能力が低い。
【００１７】
あらかじめ免疫化された青年および若い成人における急性麻疹感染は、別の問題を指摘する。これらの二次ワクチンの失敗は、豊富で持続性の双方である抗ウイルス防御を誘導しかつ維持するための現在のワクチンの能力の限界を示す（４、５、６）。最近さらに別の潜在的な問題が明らかになった。過去１５年間に単離された野生型麻疹の赤血球凝集素タンパク質は、ワクチン株からの距離が次第に増大していることを示している（７）。この「抗原ドリフト」は、ワクチン株が最適な防御を与えるために必要な理想的な抗原レパートリーを含んでいないのではないかとの合理的な懸念を高める。従って、改良されたワクチンに対する要求がある。
【００１８】
合理的なワクチン設計は、これらのワクチンのさらに良い理解により、特にウイルスにコードされた毒性の決定因子ならびに弱毒化に関係するこれらのゲノム変化の同定により援助されるであろう。
【００１９】
ヒトの罹患率および致死率の主要な原因としてのその重要性のために、麻疹ウイルスは非常に広範に研究されている。麻疹ウイルスは、それぞれ明確な生物学的機能を有する２個の区画、すなわちリポタンパク質膜およびリボ核タンパク質粒子コアから成る大型で比較的球形のエンベロープを有する粒子である（８）。ビリオンエンベロープは、３種のウイルス特異性タンパク質により変化を受ける宿主細胞誘導原形質膜であり：すなわち赤血球凝集素（Ｈ；約８０キロドルトン（ｋＤ））および融合（Ｆ１，２ ；約６０ｋＤ）糖タンパク質は、ビリオン表面に突出しそしてウイルス粒子に宿主細胞付着性および侵入能力を与える（９）。Ｈおよび／またはＦに対する抗体は、これらが感染を開始するためのウイルスの能力を無効にするので、防御性と考えられる（１０、１１、１２）。マトリックス（Ｍ；約３７ｋＤ）タンパク質は、膜の内面を覆う両親媒性タンパク質であり、これはビリオン形態形成を調整し、従ってウイルス再産生を完了される（１３）。ビリオンコアは１５，８９４ヌクレオチド長さのゲノムＲＮＡを含み、その上には、約６０ｋＤヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質の約２６００分子と親密に会合することにより鋳型活性が与えられる（１４、１５、１６）。この約１ミクロン長さのラセン状リボ核タンパク質粒子と緩く会合しているのは、ポリメラーゼ補助因子（Ｐ；約７０ｋＤ）と協力するウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（Ｌ；約２４０ｋＤ）の酵素レベルであり、そして多分さらに別のウイルス−特異性ならびに宿主コードされたタンパク質は、麻疹ウイルスゲノム配列を転写および複製する（１７）。
【００２０】
麻疹ウイルスの６種のビリオン構造タンパク質は、下記：３’−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−Ｈ−Ｌ−５’のように配列した６個の連続、非重複遺伝子によりコードされる。これまで確定されていない機能の２種の別の麻疹ウイルス遺伝子も同定されている。Ｃ（約２０ｋＤ）およびＶ（約４５ｋＤ）として知られるこれらの２種の非構造タンパク質は、両方共にＰ遺伝子によりコードされる。Ｃタンパク質は、Ｐ　ｍＲＮＡ内の第二読み取り枠によりコードされる。Ｖタンパク質は、Ｐのアミノ末端配列およびＰタンパク質中には欠いているジンクフィンガー類似でシステインに富むカルボキシ末端ドメインを有するハイブリッドタンパク質をコードする共転写的に編集されたＰ遺伝子−由来のｍＲＮＡによりコードされる（９）。
【００２１】
すべてのモルビリウイルスはＶタンパク質を産生し（１８）、これには麻疹ウイルス、牛疫ウイルス、イヌジステンパーウイルスおよびアザラシジステンパーウイルスが含まれる（１９）。麻疹ウイルスＶタンパク質は、Ｐ遺伝子によりコードされる非構造タンパク質である（８）。大部分のパラミクソウイルスと同様に、麻疹ウイルスはＶタンパク質、Ｐタンパク質、およびＣタンパク質を含むＰ遺伝子からの多重タンパク質をコードする（９）。ＰおよびＶタンパク質の翻訳は、最初の２３０アミノ酸が一致するポリペプチドをもたらす同じメチオニンコドンで開始する。ＲＮＡエディティングは、より短く独自のＶタンパク質Ｃ−末端の翻訳をもたらすフレームシフトを起こす一部のＰ遺伝子ｍＲＮＡ内に起きるので、Ｖタンパク質のカルボキシ末端（Ｃ−末端）はＰタンパク質とは異なる（１８）。Ｃタンパク質アミノ酸配列は、これが下流の翻訳開始コドンで開始する異なる読み取り枠より完全に翻訳されるので、これはＶおよびＰタンパク質とは無関係である（２０）。
【００２２】
麻疹ウイルスのＰおよびＶ　ｍＲＮＡは同一の開始コドンを共有しそしてＰおよびＶタンパク質の最初の２３０アミノ酸が一致する。Ｖ　ｍＲＮＡは、ヌクレオチド２４９６から２４９８までの配列”ＧＧＧ”を拡張して第四の”Ｇ”残基を含むようになる”Ｇ”残基挿入を含む。余分の非−鋳型指示”Ｇ”残基がヌクレオチド２４９５と２４９９の間に挿入される場合に、エディティングが転写の間に起き、読み取り枠中にシフトを起こし、これによりＰタンパク質のカルボキシ末端２７６アミノ酸はＶタンパク質の６８アミノ酸のシステインに富むカルボキシ末端で置換される。
【００２３】
Ｖタンパク質の機能は十分には解明されていないが、しかしすべてのモルビリウイルス類はＶタンパク質をコードする。これは、Ｖタンパク質を合成するための能力を保存してモルビリウイルスに有利となる有利な機能をＶタンパク質が果たすことを示す。Ｖタンパク質発現は培養される細胞内のウイルス複製のために本質的ではないことが知られているが（１９、２１〜２５）、しかし動物モデル系においてＶタンパク質の発現は、感染の重症度に影響するように見える。例えば、センダイウイルス（非−モルビリウイルス　パラミクソウイルス）は、マウスモデル系において肺炎を通常は起こさないがしかし、Ｖタンパク質発現を欠いた組換えウイルスを用いて感染させると毒性が低い（２２、２６）。組換えヒトパラインフルエンザウイルス　タイプ３（別の非−モルビリウイルス
パラミクソウイルス）も、Ｄタンパク質発現での欠失がＶタンパク質オープンリーディングフレームでの欠失と組み合わされた場合に、ネズミおよびサルにおいて弱毒化表現型を示す（２３）。
【００２４】
同様に、麻疹ウイルスのために使用される動物モデル系を用いる研究からの結果も、病原性におけるＶタンパク質の役割を示唆する。組換え麻疹ウイルスによるコットンラット（ｃｏｔｔｏｎ ｒａｔ）肺の感染は、感染ウイルスがＶタンパク質発現を欠く場合にはさらに少ない子孫ウイルスを生成した（２７）。また、ＳＣＩＤマウス内に移植された組織中でのヒト胸腺細胞生存は、感染ウイルスがＶタンパク質を発現しない場合には麻疹ウイルスを用いる感染がさらに困難であった（２８）。最後に、麻疹ウイルスを頭蓋内接種されたＣＤ４６トランスジェニックマウスは、ウイルスがＶタンパク質を発現しない場合には高率の生存率を有していた（２９）。麻疹ウイルスＶタンパク質が病原性に関係するという結論は、病原性がさらに低い変種またはワクチン株内でＶタンパク質コード領域変異を発見した配列解析によっても支持される（３０、３１）。総合すれば、これらの結果は、Ｖタンパク質が麻疹ウイルスおよび数種の他のパラミクソウイルスの毒性を決定する際に重要な役を演じるという仮説を支持する。
【００２５】
Ｖタンパク質が感染の過程に影響できることは明らかと見られるが、この現象の背後にある機構は未知である。多数の研究からの結果は、潜在的な機能をＶタンパク質に帰属させ始めている。例えば、Ｖタンパク質とＰタンパク質とに共通するアミノ酸配列がウイルスヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質との相互作用を媒介することが示された（２７、３２−３９）。Ｖタンパク質とＮタンパク質との間のこの相互作用は、Ｎタンパク質の細胞分布に影響すると考えられ（２７、４０、４１）そしてある種の追加的な未同定の機能を有するらしい。一部のＶタンパク質も細胞タンパク質と相互作用することが見いだされ（４２、４３）、そしてサルウイルス５（ＳＶ５）の場合に、細胞タンパク質との相互作用は感染の間のインターフェロンシグナル伝達経路の阻害の原因となることが可能である（４４）。Ｖタンパク質を含むタンパク質−タンパク質相互作用に加えて、数件の研究は、ウイルス遺伝子発現および複製を調節する制御機構にＶタンパク質を関連させた。一過性発現系内のセンダイウイルスＶタンパク質発現は、欠陥干渉（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ）（ＤＩ）粒子複製を阻害し（４５）そして生体外転写反応におけるＤＩ粒子複製も同様に阻害する（３５）。Ｖタンパク質を抑制と関連させるこれらの観察と一致して、Ｖタンパク質発現を欠く数種のウイルスは、感染の間に高いレベルのゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびウイルスタンパク質を産生することが観察された（２１、２６、２７）。
【００２６】
以上に記載した性質に加えて、すべてのウイルスＶタンパク質はシステインに富むＣ−末端を含む。パラミクソウイルスＶタンパク質は、高度のアミノ酸類似性を共有はしないが、しかしこれらはすべて７個の位置が一致するシステイン残基を含む（４６）。この際立った特徴は、Ｖタンパク質が実際はジンクフィンガータンパク質であるのではないか（４７）または少なくとも亜鉛に配位した二次構造のある種の形を形成するのではないかとの見解に導き（４８、４９、５０）、そして実際に、数種のＶタンパク質は亜鉛を結合することが見いだされた（５１、５２、５３）。Ｖタンパク質が亜鉛配位構造を形成する可能性は、これらの構造の形式が核酸相互作用またはタンパク質−タンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインをしばしば形成するためにかなりの興味を引く（４８、４９、１０）。独自のＣ末端領域を欠く末端切除Ｖタンパク質を発現する組換えセンダイウイルスも病原性が低く、病原性におけるＶタンパク質の役割がこの領域を必要とすることを示唆することも注目に値する（２４）。
【００２７】
ウイルス−特異性タンパク質をコードする配列に加えて、麻疹ウイルスゲノムは、関連ウイルスの転写および複製経路を指示するものに類似する明確な非−タンパク質コード領域を含む（９、５４）。これらの調節シグナルは麻疹ウイルスゲノムの３’および５’末端に、そしてそれぞれのシストロン間境界にわたる短い内部領域内に存在する。前者は、ゲノム転写、ゲノムおよびアンチゲノムキャプシド化、および複製を指示する推定プロモーターおよび／または調節配列要素をコードする。後者は、シグナル転写終止およびそれぞれのモノシストロン性ウイルスｍＲＮＡのポリアデニル化および次いで次の遺伝子の転写の再開始をコードする。一般に、麻疹ウイルスポリメラーゼ複合体は、これらシグナルに対して、他の非−セグメント化負鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼより高く反応するように見える（９、５４、５５、５６）。転写は、麻疹ウイルスゲノムの３’末端またはその近くで開始しそして次いで５’方向に進行してモノシストロン性ｍＲＮＡを産生する（１６、５４、５７）。
【００２８】
麻疹ウイルスは、その末端調節ドメインをリーダーおよびトレーラーコード配列の範囲を越えて延ばしているように見える（５４）。麻疹の場合に、これらの領域は１０７　３’ゲノムヌクレオチド（「３’ゲノムプロモーター領域」、「延長プロモーター」とも呼ばれ、これはリーダー領域をコードする５２　ヌクレオチド、次いで３個の遺伝子間ヌクレオチド、そしてＮ　ｍＲＮＡの５’非翻訳領域をコードする５２ヌクレオチドを含んでなる）および１０９　５’末端ヌクレオチド（Ｌ　ｍＲＮＡの３’非翻訳領域をコードする６９個、遺伝子間の３ヌクレオチドおよびトレーラーをコードする３７ヌクレオチド）を包含する。これらの３’末端内で、ゲノムおよびアンチゲノム双方の約１００ヌクレオチドは、共有ヌクレオチド配列の２個の短い領域である：すなわちゲノムおよびアンチゲノムの絶対的３’末端の１６個のヌクレオチドの中の１４個が一致する。これらの末端内部で、絶対配列一致の１２ヌクレオチドの追加の領域が位置決定された。麻疹ウイルスゲノムの転写が開始する筈でありそしてアンチゲノムの複製が開始する筈である部位およびその近傍にあるこれらの位置は、これらの短い独自配列ドメインが延長プロモーター領域を包含することを示唆する。
【００２９】
これらの区分された配列要素は、転写開始の別の部位、すなわちＮ遺伝子開始部位での転写開始を命令する内部ドメイン、およびアンチゲノム産生を指示する３’内部ドメインを示すであろう（５４、５８、５９）。転写および複製のシス−作用性決定因子としてのこれらの調節の役割に加えて、これらの３’延長ゲノムおよびアンチゲノムプロモーター領域は、それぞれアンチゲノムおよびゲノムＲＮＡの新生５’末端をコードする。これらの新生ＲＮＡ内に、ヌクレオキャプシド鋳型形成のためおよびその結果としての転写および複製の増幅のために必要な別の重要な調節要素である、Ｎタンパク質核形成のためのこれまで同定されていないシグナルが存在する。
【００３０】
すべてのモルビリウイルス類で、複製、転写およびキャプシド化を含む必須のなウイルス機能のために必要なシス作用性シグナルが、非コーディングゲノム末端内に含まれる。機能性のために絶対的なトランス作用性要素は、Ｎ、ＰおよびＬ遺伝子内に含まれる。追加のトランス作用性因子、例えばＶおよびＣタンパク質は、機能性を調節するようである。これらのいずれかの領域内の変異は、ウイルス転写／複製効率の低下を含む重要な機能の改変をもたらすようである。
【００３１】
Ｖタンパク質発現と病原性との間の明瞭な関連、およびワクチン弱毒化への継続する興味は（３０、６０）、麻疹ウイルスＶタンパク質機能をさらに詳細に研究する必要性に導いた。特に、Ｖタンパク質抑制活性、Ｖタンパク質とＮタンパク質との相互作用、およびＲＮＡを結合するＶタンパク質の能力を含む種々のＶタンパク質特性を研究するために一過性発現系を用いる必要がある。
【００３２】
［発明の要約］
従って、モルビリウイルスのＶタンパク質による遺伝子発現の抑制の原因であるモルビリウイルスのゲノムの領域を同定することが本発明の目的である。遺伝子発現の抑制が低減されるモルビリウイルスのＶタンパク質の変異種を生成することが本発明の別の目的である。１種またはそれ以上のかかる変異を含む組換え産生モルビリウイルスを生成することが本発明のさらなる別の目的である。かかる組換え産生モルビリウイルスを含むワクチンまたは免疫原性組成物を処方することが本発明のさらなる別の目的である。本発明の一つの態様において、Ｖタンパク質は麻疹ウイルス由来である。
【００３３】
以下に考察するような本発明のこれらおよびその他の目的は、モルビリウイルスに対して、アミノ酸１１３（チロシン）および１１４（アスパラギン酸）の１個または双方が変異された、これらのモルビリウイルスのＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４（保存領域２；図２参照）に相当する領域を改変することにより達成される。本発明の一つの態様では、これらのアミノ酸はアラニンに変異される。
【００３４】
Ｖタンパク質のさらなる改変は、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルスおよびイルカモルビリウイルスのＶタンパク質のアミノ酸２３１−２９９に、および牛疫ウイルスのアミノ酸２３１−３０３に相当するモルビリウイルスＶタンパク質のカルボキシ末端（Ｃ−末端）領域の少なくとも一部分を変異または欠失することにより行ってもよい。
【００３５】
これらの改変は、ミニレプリコン系内のＶタンパク質による遺伝子発現の抑制を低下する効果を有する。結果は、当該技術分野では既知でありそして以下に記載する「レスキュー」系の使用により全長感染性モルビリウイルスの回収に容易に拡張される。
【００３６】
一過性アッセイにおけるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子発現を有する麻疹ウイルスミニレプリコンは、Ｖタンパク質により強力に抑制された。抑制活性は、アミノ酸１１２−１３４の間のタンパク質のアミノ末端の第三の領域内のアミノ酸置換により、ならびにＶタンパク質のシステインに富むＣ−末端領域（アミノ酸２３１−２９９）の少なくとも一部分の変異または欠失により低下された。
【００３７】
麻疹ウイルスの場合に、上記の変異は、下記
（１）ヌクレオチド２６（Ａ→Ｔ）、ヌクレオチド４２（Ａ→ＴまたはＡ→Ｃ）およびヌクレオチド９６（Ｇ→Ａ）よりなる群より選ばれる３’ゲノムプロモーター領域内の少なくとも１個の弱毒化変異であって、これらのヌクレオチドは正鎖、アンチゲノム性、メッセージセンス中に提示され、
（２）残基３３１（イソロイシン→トレオニン）、１４０９（アラニン→トレオニン）、１６２４（トレオニン→アラニン）、１６４９（アルギニン→メチオニン）、１７１７（アスパラギン酸→アラニン）、１９３６（ヒスチジン→チロシン）、２０７４（グルタミン→アルギニン）および２１１４（アルギニン→リシン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化よりなる群より選ばれるＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内の少なくとも１個の弱毒化変異、
（３）Ｎ遺伝子に対して、残基１２９（グルタミン→リシン）、１４８（グルタミン酸→グリシン）および４７９（セリン→トレオニン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化よりなる群より選ばれる少なくとも１個の弱毒化変異、
（４）Ｐ遺伝子に対して、残基２２５（グルタミン酸→グリシン）、２７５（システイン→チロシン）および４３９（ロイシン→プロリン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化よりなる群より選ばれる少なくとも１個の弱毒化変異、
（５）Ｃ遺伝子に対して、残基７３（アラニン→バリン）、１０４（メチオニン→トレオニン）および１３４（セリン→チロシン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化よりなる群より選ばれる少なくとも１個の弱毒化変異、および
（６）Ｆ遺伝子−末端シグナル（シス作用性転写終止シグナル）に対して、ヌクレオチド７２４３（Ｔ→Ｃ）における変化であって、これらのヌクレオチドは、正鎖、アンチゲノム性、すなわちメッセージ（コーディング）センス中に提示される
ような、弱毒化性である変異とさらに組み合わされてもよい。
【００３８】
本発明の別の態様では、これらの変異モルビリウイルスは、それぞれのウイルスの野生型に対して防御的免疫反応を発現するワクチンまたは免疫原性組成物を調製するために使用される。
【００３９】
本発明のさらなる態様では、モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内の変異が、アミノ酸１１３および１１４の変異よりなる群より選ばれる、モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内に少なくとも１個の変異を挿入することを含んでなるモルビリウイルスのＶタンパク質により起きる抑制を低減するための方法が記載される。
【００４０】
本発明のさらに別の態様では、モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内の変異が、アミノ酸１１３および１１４の変異よりなる群より選ばれる、モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内に少なくとも１個の変異を挿入することにより改変されたモルビリウイルスＶタンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列が記載されている。
【００４１】
本発明のさらなる別の態様では、Ｖタンパク質をコードする単離された核酸分子の部分が、モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内の変異がアミノ酸１１３および１１４の変異によりなる群より選ばれる、モルビリウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内に少なくとも１個の変異を挿入するように改変された、モルビリウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子を含んでなる転写ベクターを、キャプシド化、転写および複製のために必要なトランス作用性タンパク質Ｎ、ＰおよびＬをコードする少なくとも１個の単離された核酸分子を含んでなる少なくとも１個の発現ベクターと一緒に含んでなり、これにより宿主細胞がこれらのベクターを用いて形質転換、感染またはトランスフェクションされそして所望のモルビリウイルスを産生するようにこれらのベクターの共発現を許容する条件下で培養される組成物を提供する。次いで、それぞれのウイルスの野生型形に対して防御性免疫応答を誘導するワクチンまたは免疫原性組成物を調製するためにそれぞれのウイルスを使用する。
【００４２】
［発明の詳細な記述］
麻疹ウイルスを用いて例示するけれども、本発明はイヌジステンパーウイルスおよび牛疫ウイルスを含みこれらに限定はされない他のモルビリウイルス類にも適用できる。
【００４３】
麻疹ウイルス弱毒化と遺伝子発現および複製の制御に関係する機構との間の潜在的な関連の考慮（３０、６０）は、Ｖタンパク質の分析に導いた。タンパク質発現はウイルス病原性（２２、２３、２６−２９）にそして遺伝子発現および複製の制御（２１、２６、２７、３５、４５）にも関連しているる。目標は、麻疹ウイルス遺伝子発現に対するＶタンパク質の効果をさらに解析することであった。
【００４４】
変異Ｖタンパク質発現ベクターを構築する前に、種々の異なるモルビリウイルス類からのＶタンパク質の間のアミノ酸類似性を検討した（図２）。高いアミノ酸一致性の領域は重要な機能性ドメインを含み、そしてこれらの保存領域（ＣＲ）の１つまたはそれ以上はミニレプリコン抑制に関与するようである。エドモンストン（Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ） 野生型麻疹ウイルス、牛疫ウイルス、イルカモルビリウイルス、およびイヌジステンパーウイルスからのＶタンパク質の整列は、Ｃ−末端がモルビリウイルス類の間で同様の間隔を有する７個のシステイン残基を含むという初期の観察（４６）を確認することに加えて、ＣＲ１〜６と呼ばれる顕著な配列一致の数個の保存された領域を明らかにした（図２に示す）。数個のＣＲは、変異Ｖタンパク質ベクターを生成する間に標的とされた。
【００４５】
高レベルの一致を含む領域を同定することに加えて、潜在的な機能性モチーフを探すためにコンピューター分析を使用し、そして潜在的な麻疹ウイルスＶタンパク質機能性ドメインの可能な位置に関する追加的な鍵に関して文献を検討した。これらの分析の結果を図２中の整列上で説明する。数件の研究は、Ｎタンパク質との相互作用に影響するＶおよびＰタンパク質の領域を位置決定した。ＣＲ１内に位置するＶおよびＰタンパク質のアミノ最末端（Ｎ−末端）は、ツーハイブリッドアッセイにおいてＮタンパク質（３４（図２）との相互作用を媒介する配列を含む。Ｖ−Ｎタンパク質−タンパク質相互作用に関与する別の配列は、ＣＲ４を包含するアミノ酸２０４−２３０の間に位置決定された（２７、６４）。麻疹ウイルスＶタンパク質亜鉛結合ドメイン（５１）はＣ−末端内にありそしてＣＲ５およびＣＲ６中に見いだされる少なくとも数個のシステイン残基を必要とするらしい。システインに富むドメインのＮ−末端において、ＣＲ５の部分である塩基性アミノ酸（２２９−２３４）を含む良く保存された領域がある。麻疹ウイルスＶタンパク質中の同じ領域の近く（アミノ酸２２５）は、エドモンストンワクチン株内に見いだされるアミノ酸置換である（野生型のグルタミン酸からグリシンへ（３０））。最後に、麻疹ウイルスＶタンパク質中で、ロイシンジッパーモチーフの記憶であるロイシン反復（アミノ酸９３−１０７）がある（６５、６６）。多数のこれらのドメインおよびモチーフは、ミニレプリコン系およびＶタンパク質変異体発現ベクターを用いるさらなる研究のための魅力的な候補であった。
【００４６】
Ｖタンパク質発現ベクターを調製することに加えて（図１Ａ）、エドモンストン野生型Ｎ、ＰおよびＬタンパク質を含む３種の塩基性複製装置成分のためにＴ７発現プラスミドを調製した。ＰおよびＶタンパク質ベクター内の下流翻訳開始コドンからのＣタンパク質発現によるいかなる潜在的な混乱も避けるために、Ｃタンパク質オープンリーディングフレームをＣタンパク質の翻訳を回避するように改変した。Ｃタンパク質ＡＴＧコドンをＡＣＧに変換しそしてＣタンパク質オープンリーディングフレーム内の第二コドンを終止コドンに変換した（ＴＣＡからＴＡＡへ）。これらの改変は、ＰおよびＶタンパク質に関してはサイレントであった。
【００４７】
Ｖタンパク質が麻疹ウイルスｍＲＮＡ転写およびゲノム複製を調節する際に関与するであろうとの指摘（２１、２６、２７、３５、４５）は、ミニレプリコン系がＶタンパク質発現に応答するかどうかをテストするための実験を示唆した。ミニレプリコン系は、野生型Ｖタンパク質機能に影響するＶ遺伝子変異が評価でき、そして組換え野生型ウイルスを用いるウイルス弱毒化のさらなる遺伝子研究にこれらの知見を潜在的に適用されるようにエドモンストン野生型成分を用いて組み立てられた。エドモンストン野生型麻疹ウイルス−ミニレプリコン（図１Ｂ、ｐＭＶｗｔ１０７−ＣＡＴ）は、ｐＭＶ１０７−ＣＡＴ中のワクチンリーダー配列をエドモンストン野生型リーダー配列に変換してｐ１０７ＭＶ−ＣＡＴミニレプリコン（６３）から誘導された（６０）。
【００４８】
野生型成分が検出可能なミニレプリコン発現を作動させることが可能であることを決定するために、ＨＥｐ２細胞をミニレプリコンＤＮＡおよびＮ、ＰおよびＬタンパク質発現ベクターを用いてトランスフェクションし、共にＭＶＡ／Ｔ７を用いて感染して（６２）Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼを得た。トランスフェクションの４８時間後に細胞を採取しそして細胞抽出液をＣＡＴ活性に関して分析した。エドモンストン野生型ミニレプリコン系は、Ｌポリメラーゼタンパク質発現ベクターを除くすべてのＤＮＡを用いてトランスフェクションされた負対照中に産生された背景レベルより高いＣＡＴ活性を直ちに発生した（図１Ｃ、レーン１および２、そしてデータは記載せず）。これは、一過性発現アッセイの間に産生されたＣＡＴ活性が特異性でありそして不変の麻疹ウイルス複製装置に依存することを示した。
【００４９】
次いで、Ｖタンパク質の発現が一過性発現アッセイにおいてミニレプリコン発現に対して検出可能な効果を有するかどうかを決定するためにミニレプリコン系を使用した。Ｖタンパク質発現ベクターの増加量を用いてミニレプリコンアッセイトランスフェクションを行った。挿入を欠く発現ベクターの適当な量を含ませてトランスフェクションされたＤＮＡの全量を一定に保った。Ｖタンパク質発現ベクターの量を０から４００ｎｇまで増加した効果を図１Ｃに示す。レーン１の正対照は、Ｖタンパク質発現が存在しない場合に得られるＣＡＴ活性の量を示した（図１Ｃ、レーン１）。レーン２は、Ｌタンパク質発現ベクターが除外された場合にＣＡＴ活性が検出不能であることを示す負対照である。レーン３〜７は、Ｖタンパク質発現ベクターの増加量の負効果を示す。ＣＡＴ活性の抑制は、Ｖタンパク質発現ベクター最少の量でも明瞭であり（レーン３および４）そしてさらに高い量では著しく強く、Ｖタンパク質発現プラスミド４００ｎｇをトランスフェクションされた場合に検出可能なミニレプリコン発現を事実的に排除した（レーン７）。レーン３〜７で使用されたＶタンパク質発現ベクターの２倍増加は、相対ＣＡＴ活性において観察された低下とも良く相関した。これらの結果は、Ｖタンパク質機能の一つの局面がミニレプリコンアッセイを用いて観察できることを明確に示す。このミニレプリコンアッセイにおけるＶタンパク質発現の容易に検出可能なこの負効果は、Ｖタンパク質変異体のミニレプリコン抑制表現型をさらに検討するために好都合なフォーマットを提供した。
【００５０】
Ｖタンパク質変異体の分析を開始するために、Ｖタンパク質のアミノ酸末端にエピトープタグを含むようにＶタンパク質発現ベクター（図１Ａ）を改変した（ｐＭＶ−ｈａＶ−ｗｔ、図３）。これはトランスフェクションされた細胞からの溶解物中のタンパク質のウエスタンブロット検出を容易としそして変異Ｖタンパク質の安定性および定常状態レベルの相対比較を可能とするために行われた。野生型Ｖタンパク質発現ベクターのイニシエーターメチオニンコドンをインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグを用いて置換した（６７）。この改変されたＶタンパク質ベクター（ｐＭＶ−ｈａＶ−ｗｔ）は、Ｃタンパク質の発現を避ける塩基置換も保持した。ミニレプリコン実験におけるｐＭＶ−ｈａＶ−ｗｔの試験は、Ｎ−末端ＨＡタグの存在が、ミニレプリコン活性を抑制するＶタンパク質の能力に検出可能な効果を持たないことを明らかにした（図４、レーン１〜４、そしてデータは記載せず）。
【００５１】
ｐＭＶ−ｈａＶ−ｗｔ内に導入した変異の最初のシリーズは、図２に示した配列モリーフの一部分に向けられた。これらの変異の一つは、システイン残基を含む独自のＶタンパク質Ｃ−末端を欠く末端切除Ｖタンパク質をもたらした（アミノ酸２３１−２９９が欠失）（図３、ｐＭＶ−ｈａＶ−１）。プラスミドｐＭＶ−ｈａＶ−２は、野生型Ｖコーディング配列をエドモンストンワクチン配列に変換した（アミノ酸２２５、グルタミン酸をグリシンへ）。残りの６個の変異（ｐＭＶ−ｈａＶ番号３−８）は、一部のＣＲに向けられたアミノ酸置換であった。最初に、タンパク質構造を大きくは改変しないでＶタンパク質内の特定のドメインの機能を改変するための試みとして、アミノ酸置換を導入した。チャージツーアラニン（ｃｈａｒｇｅ−ｔｏ−ａｌａｎｉｎｅ） 法により示唆された戦略を用いて（６８、６９、７０）、荷電または極性アミノ酸残基を規定する２個の連続したアミノ酸コドンを最初に標的とし、そしてこれらをアラニンをコードするコドンに変換する変異を導入した。
【００５２】
本発明は野生型残基ではなくてアラニンを有する変異体により例示されているけれども、野生型残基の他の非保存性変異も本発明の範囲内である。例えば、アスパラギン酸は酸性（負荷電）分子である。従って、非保存性変異は、酸性分子でもあるグルタミン酸以外のアミノ酸に対して行われるものである。適当な別のアミノ酸は、塩基性（正荷電）分子であるアミノ酸のリシン、ヒスチジンおよびアルギニンを含む。適当な別のアミノ酸には、非極性官能基を有するアミノ酸、例えばアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリン、および非荷電極性官能基を有するアミノ酸、例えばアスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニンおよびチロシンをさらに含む。
【００５３】
同様に、チロシンは非荷電極性分子である。従って、非保存性変異は、非荷電極性分子でもあるアスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリンおよびトレオニン以外のアミノ酸に置換が行われているものである。適当な別のアミノ酸は、塩基性（正荷電）分子であるアミノ酸のリシン、ヒスチジンおよびアルギニンを含む。適当な別のアミノ酸は、さらに、非極性官能基を有するアミノ酸、例えばアラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファンおよびバリン、および酸性（負荷電）官能基を有するアミノ酸、例えばアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。
【００５４】
ミニレプリコンアッセイにおける変異Ｖタンパク質ベクター１〜８の分析を図４Ａに示す。結果は、２種のベクター（ｐＭＶ−ｈａＶ−１およびｐＭＶ−ｈａＶ−５）がミニレプリコン活性を抑制する低い能力を有することを示した。一つの変異体（ｈａＶ−１）は、Ｖタンパク質の独自のＣ−末端（アミノ酸２３１−２９９）を欠く欠失変異体であった。第二の変異体（ｈａＶ−５）は、アミノ酸１１３および１１４で置換変異を含んでいた（ＣＲ２内に位置する。図２参照）。これは、この機能がＣＲ２およびＣ−末端により独立して部分的に媒介されるであろうことを示唆した。Ｃ−末端切除変異体と同様に、ＣＲ２変異体も残留抑制活性を保持した。
【００５５】
図４Ａのレーン１および２は、対照試料を含んでいた。レーン１で分析したトランスフェクションはＬタンパク質発現ベクターを欠きそして背景ＣＡＴ活性の低いレベルを表した。レーン２の正対照は、Ｖタンパク質が存在しない場合に観察された最高活性を示した。ＨＡタグを含む野生型Ｖタンパク質ベクター（ｐＭＶ−ｈａＶ−ｗｔ）の２００および４００ｎｇにより媒介された抑制をレーン３および４に示す。上記のように、Ｎ−末端ＨＡタグは、ミニレプリコンを抑制するＶタンパク質の能力に対してほとんど効果を持たず、そして本実験で、ｈａＶ−ｗｔベクターの２００および４００ｎｇはミニレプリコン活性をそれぞれ約７および１６倍抑制した。大部分の変異体は、ｈａＶ−ｗｔベクターとほぼ同様の効果でＣＡＴ活性を抑制し、Ｖタンパク質ベクター２００ｎｇをトランスフェクションした場合に、対照活性（レーン２）の２０％またはそれ未満にＣＡＴ活性を低下させた（レーン３、７、９、１１、１５、１７、１９）。２種のＶタンパク質ベクター（ｐＭＶ−ｈａＶ−１、レーン５および６、ｐＭＶ−ｈａＶ−５、レーン１３および１４）は、本実験および反復した実験においてミニレプリコン活性の抑制に著しく効果が低かった。プラスミドｐＭＶ−ｈａＶ−１はシステインに富むＶタンパク質Ｃ−末端を欠き、一方ｐＭＶ−ｈａＶ−５はＣＲ２内に二重のアラニン置換（アミノ酸１１３−１１４）を含んでいた。
【００５６】
抑制に影響を与える両方のドメインは、興味ある特徴を有する。Ｃ−末端は亜鉛結合ドメインを含みそしてＲＮＡ結合ドメインも含む（図５）。荷電残基の小さいクラスターが提案されたアルファらせんの一つの面（残基１１４Ｄ、１１８Ｅ、１２１Ｋ、１２５Ｄ）に沿って位置しているであろうとコンピューターモデルが予測するので、ＣＲ２の一次アミノ酸配列は注目される。従って、ＣＲ２は一部の転写因子内に観察された配列に類似する両親媒性アルファらせんである可能性がある（７１）。
【００５７】
ＣＲ２と関連する抑制活性も、このアミノ酸配列がＶおよびＰタンパク質の双方中に存在するので興味がある。ポリメラーゼサブユニットおよびヌクレオキャプシド構築因子としてＰタンパク質により演じられる本質的な役割（７２）は、抑制におけるＶタンパク質の非本質的な役割と著しく異なる。しかし、これら２種のタンパク質はアミノ酸配列のかなりの部分を共有している。ＣＲ２はＶおよびＰの範囲内で異なって機能するタンパク質−タンパク質相互作用の部位であるらしい。理論により制約はされないが、Ｖタンパク質の独特のＣ−末端がＣＲ２を暴露する三次構造をＶタンパク質に与え、他方ではＰタンパク質内でこのドメインが隔離されている間にサプレッサードメインとして機能することをこれに許容する。
【００５８】
変異体ｈａＶ−１またはｈａＶ−５により起こされる抑制の低下が少ないタンパク質発現と単純に相関するかどうかを決定するために、抗−ＨＡ抗体を用いてウエスタンブロットを行って、トランスフェクションされた細胞内のＶタンパク質の相対的存在量を推定した（図４Ｂ）。この実験のための細胞は、細胞がＮ、ＰおよびＬタンパク質ならびにＶタンパク質を含むように、ミニレプリコン実験の間に行ったものと正確に同様に行ってトランスフェクションされた。タグを付したタンパク質は、２種の負対照を除いてすべてのトランスフェクション細胞抽出液中に検出できた。レーン１内で抽出液を分析するために使用する細胞にはＶタンパク質をトランスフェクションせず、そしてレーン２内では、エピトープタグを含まないＶタンパク質をコードするベクターを用いて細胞をトランスフェクションした。レーン３で検出されたタンパク質は、ＨＡタグを付した野生型Ｖタンパク質であった。レーン４内のタンパク質はＣ−末端を欠く末端切除変異体でありそしてその移動度は著しく改変された。残りのタンパク質は、アミノ酸置換を含む変異体（上記のもの）であった（図４Ｂ、レーン５〜１１）。これらのタンパク質の数種は、この１２％ポリアクリルアミドゲル中で小さいがしかし認められるほどの移動度変化を有していた（例えばレーン１０および１１）。しかし、これらのタンパク質内で荷電および極性残基がアラニンに置換されたので、これは意外ではない。すべてのタンパク質の相対存在度はかなり類似すると判定されたが、しかしｈａＶ−１（レーン４）はこの実験では低くそしてこれは反復実験でも再現可能であったことは除く。これは、ｈａＶ−１の低い抑制活性が、より低いタンパク質レベルよりもたらされたようであり、一方、ｈａＶ−５の低い抑制活性が不安定なタンパク質により起こされないことを示唆する。
【００５９】
ｈａＶ−１が不安定であったという理由によってのみこれが低い抑制であった可能性をさらに検討するために、Ｖタンパク質ベクターの増加量を用いてミニレプリコンアッセイを行ってｈａＶ−１タンパク質の細胞内の量の補足を助けた（図４Ｃ）。このミニレプリコン実験は、Ｖタンパク質ベクターの最大量を４００ｎｇから１μｇに増やした点を除き、上記と同様に行った。ＤＮＡの質量は、ベクター骨格ＤＮＡ（挿入を欠く）の適当量を含むことによりすべてのトランスフェクションにおいて一定に保った。図４Ｃ、レーン１は、タンパク質ベクターを付加しないで行った正対照であった。レーン２および３は、１００（レーン２）および４００（レーン３）ｎｇを加えた野生型ｈａ−Ｖベクターの効果を示し、これらはこの実験で活性をそれぞれ５８％および２６％に低下した。ｈａＶ−１の増加量の添加は、ＭＶ−ＣＡＴの活性に対してほとんど効果がなくそしてさらに高い抑制のレベルを有するｈａＶ−１ベクターの増加質量を相関するための明確な傾向は観察されなかった。これは、ｈａＶ−１の低下した抑制活性が、単に低下した細胞内タンパク質レベルの低下によるのではなく、むしろＣ−末端の欠失の効果であったことを示唆する。
【００６０】
ＳＶ５　Ｖタンパク質のＮ−末端内の第三の塩基性アミノ酸の高い含有量を含む領域は、ＲＮＡ結合を媒介する（７３）。相同領域は麻疹ウイルスＶタンパク質内では明らかではないが（７３）、しかし、麻疹ウイルスＶタンパク質がＣ−末端内のジンクフィンガー類似配列を介してＲＮＡ結合もする可能性を検討した（図５）。
【００６１】
Ｖタンパク質のＲＮＡ結合活性を評価するために、数種の細胞ＲＮＡ結合タンパク質の研究に使用して成功した（７４〜７７）ポリリボヌクレオチドホモポリマー結合アッセイを使用した（図５Ａ）。多数のＲＮＡ結合タンパク質がポリリボヌクレオチドホモポリマーへの特性的親和性を示した。例えば、細胞ｈｎＲＮＰ　Ｕタンパク質はポリ（Ｇ）およびポリ（Ｕ）に比較的高い親和性で結合するが、しかしポリ（Ａ）およびポリ（Ｃ）にはあったとしてもほとんど結合しない（７５）。この概念は、トランスフェクションされた細胞抽出液内のＶタンパク質がホモポリマーレジン上に捕捉できたかどうかを決定するために使用された。ミニレプリコントランスフェクションに使用したすべての発現ベクター（Ｎ、Ｐ、Ｌ、Ｖおよびミニレプリコン）を用いて細胞をトランスフェクションし、次いでＭＶＡ／Ｔ７を用いて感染した。細胞質性細胞溶解物を４８時間後に調製しそして４種のポリリボヌクレオチドホモポリマーの一つと連結したアガロースビーズを用いて３０〜６０分間、４℃でインキュベーションした。ビーズを遠心分離により集め、次いで再懸濁しそして細胞溶解緩衝液を用いて３回洗浄した。結合タンパク質は、ＳＤＳ−ゲル添加緩衝液中で煮沸してビーズから溶離させた。
【００６２】
最初に、アッセイをテストするために、トランスフェクションされたプラスミドから発現した既知のＲＮＡ結合タンパク質を捕捉する能力を試験した。このために、Ｎタンパク質に特異性のモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロットにより、４種の異なるレジンから溶離したタンパク質を分析した（図５Ｂ）。Ｎタンパク質は、ポリ（Ｇ）およびポリ（Ｕ）に結合した試料中で直ちに検出された（レーン２および４）。ポリ（Ｇ）に結合したＮタンパク質の量が、一般にこの実験および数回の反復実験ではさらに多かった。ポリ（Ａ）またはポリ（Ｃ）を用いるとＮタンパク質はほとんどまたは全く捕捉されなかった。
【００６３】
ホモポリマーレジンと相互作用するｈａＶの能力を分析するために、上記のようにしてこの実験を反復した（図５Ｂ、レーン５〜８）。抗−ＨＡ抗体を用いるウエスタンブロットの分析は、Ｎタンパク質の分析後に得られた結果と類似した結果を明らかにした（図５Ｂ、レーン１〜４）。ポリ（Ｇ）およびポリ（Ｕ）レジンは両方共にｈａＶに対する親和性を示した（レーン６および８）。Ｖタンパク質はポリ（Ｇ）に最もよく結合しそしてポリ（Ｕ）にはさらに弱く、一方ポリ（Ａ）またはポリ（Ｃ）にはほとんど結合しなかった。一部の実験では、非常に弱いバンドが見られ、これはポリ（Ａ）との低い親和性相互作用を示す。しかし、通常、この相互作用は検出できない。
【００６４】
Ｖタンパク質がポリ（Ｇ）およびポリ（Ｕ）に容易に結合しそしてポリ（Ａ）およびポリ（Ｃ）には良くないという事実は、アッセイが単にポリアニオンレジンへの親和性を測定するだけではないことを示し、そしてＶタンパク質が２種のポリヌクレオチドへの優先性を示すことも示した。Ｖタンパク質およびＮタンパク質の双方はポリ（Ｇ）およびポリ（Ｕ）を優先する（図５）。これは多数の細胞ＲＮＡ結合タンパク質により示された特徴である（７４、７６、７７）。
【００６５】
ｈａＶタンパク質の結合プロフィールがＮタンパク質と著しく類似するという事実は、Ｖタンパク質がＮタンパク質との相互作用を介してポリ（Ｇ）およびポリ（Ｕ）レジン上に間接的に捕捉され、ＲＮＡとの直接相互作用ではない可能性を高くする。この可能性を検討するために、ｈａＶタンパク質発現ベクターのみを用いて細胞をトランスフェクションしそして細胞抽出液を調製しそして上記と同様に処理した。ウエスタンブロットによる分析は、ｈａＶタンパク質（図５Ｂ、レーン９〜１２）がこの場合にもポリ（Ｇ）およびポリ（Ｕ）に結合することを再び示した。これは、Ｖタンパク質とホモポリマーレジンとの相互作用が他のウイルスタンパク質を必要としないことを示した。実際に、他のウイルスタンパク質が存在しないと、さらに大量のＶタンパク質がポリ（Ｇ）およびポリ（Ｕ）に通常は結合する（レーン６と１０および８と１２を比較すること）。これは、他のウイルスタンパク質の１種がＶタンパク質とポリリボヌクレオチドとの間の相互作用にわずかに干渉するらしいことを示唆した。
【００６６】
ｈａＶのポリ（Ｇ）への結合に影響する条件の限定された分析も行った（図５Ｂ、レーン１３〜１６）。結合反応への１０ｍＭ　ＥＧＴＡまたはＥＤＴＡ（レーン１４および１５）の添加は、ポリ（Ｇ）に結合するＶタンパク質の量を低下した。結合反応への酵母ＲＮＡコンペティターの添加（２５μｇ／ｍｌ）（レーン１６）は、結合にほとんど影響しなかった。しかし、細胞質抽出液は細胞ＲＮＡの相当の量をすでに含んでおりそして酵母ＲＮＡの添加はほとんど影響しないらしいので、これは特に意外ではない。非特異性ＲＮＡ（酵母ＲＮＡ）の添加はレジンに結合するＶタンパク質の量を低下させないように見えるので、これらの結果は、ポリ（Ｇ）へのＶタンパク質の結合が二価陽イオンにより刺激されそして比較的特異性相互作用であることを示唆する。
【００６７】
ＲＮＡ結合がミニレプリコン活性を抑制する能力と相関できるかどうかを決定するために、次に、ｈａＶタンパク質変異体のＲＮＡ結合活性を分析するために、ポリ（Ｇ）結合アッセイを使用した。ｈａＶタンパク質変異体（図３）は、他のいかなるウイルスタンパク質がなくても細胞内に発現された。粗細胞質抽出液を調製しそして上記のようにしてポリ（Ｇ）レジンに結合し、そして結合タンパク質をウエスタンブロッティングにより分析した（図６）。既に示したように、ｈａＶはポリ（Ｇ）により捕捉されそしてウエスタンブロット上で抗−ＨＡ抗体により検出され（レーン２）、一方ＨＡ−タグがなくてＶタンパク質を含む試料は（レーン１）背景シグナルを生成しなかった。変異タンパク質の分析は、大部分のＶタンパク質に対するポリ（Ｇ）結合活性の同様のレベルを明らかにした（レーン４〜１３）。例外は変異体ｈａＶ−１である。この変異タンパク質の非常に低いレベルがポリ（Ｇ）に結合した。これは、このタンパク質が結合に関して欠陥であることを明瞭に示した（レーン３）。低いけれども検出可能なｈａＶ−１による結合のレベルは、ＲＮＡ結合が本質的に低下されたが、しかし完全に排除されてはいないことを示した。これらの結果は、大部分の変異体が、野生型ｈａＶとほぼ同等のＲＮＡ結合活性を保持することを証明した。ミニレプリコン抑制に対して欠陥性であった２種の変異体の一方（ｈａＶ−５）は、ポリ（Ｇ）ならびに野生型ｈａＶを結合し、一方他の変異体（ｈａＶ−１）は、著しく低いポリ（Ｇ）結合活性を示した。これは、ミニレプリコン抑制とＶタンパク質の独自のＣ−末端により媒介される結合活性との間に相関があるらしいことを示唆する。一方、これは、Ｖタンパク質ＲＮＡ結合活性が、麻疹ウイルス遺伝子発現および複製において調節的な役割を演じるらしいことを示唆した。
【００６８】
Ｖタンパク質と関連するＲＮＡ結合活性とミニレプリコン抑制との間の潜在的な関係は、Ｃ−末端のシステインに富む領域を欠くＶタンパク質変異体がＲＮＡとほとんど結合せずそして効力が低いミニレプリコン抑制因子でもあることを示す結果から誘導できた。
【００６９】
別の実験において、ミニレプリコン抑制は、Ｎタンパク質を結合するＶタンパク質の能力と相関しないことが示された。Ｖ−Ｎタンパク質複合体の形成は、Ｖタンパク質媒介ミニレプリコン抑制のために必ずしも必要ではなかった。Ｖタンパク質変異体ｈａＶ−９およびｈａＶ−１１（図３）は、Ｎタンパク質と相互作用しないが、しかし完全な抑制活性を保持した（データは記載しない）。
【００７０】
Ｖタンパク質変異体の分析は、高親和性ＲＮＡ結合のためにＣ−末端が必要であることを示唆した。亜鉛結合ドメインを含むこの領域の欠失（５１）は、ポリ（Ｇ）レジン上の捕捉できたタンパク質の量を大幅に低下したが、しかしすべての結合を完全には排除しなかった。これは、Ｖタンパク質内に第二の弱いＲＮＡ結合ドメインが存在することを示唆するらしい。下記により制約はされないが、魅力的な可能性は、Ｃ−末端内のジンクフィンガー類似ドメインが核酸結合ドメインの一つの重要な成分を形成し、そしてＶタンパク質中の第二のドメインがＣ−末端と協同して、より高い親和性結合部位を創成することである。
【００７１】
ＲＮＡ結合のこれらの研究は、Ｖタンパク質が、粗細胞抽出液中に存在するいかなる追加的ウイルスタンパク質がなくてもＲＮＡと相互作用できたことも示した。これは、Ｖタンパク質がＲＮＡに直接結合することを示唆する。Ｖタンパク質が、他方ではＲＮＡへの結合の原因となる細胞タンパク質と相互作用する可能性が残るので、この結論は最終的ではない。このモデルが真であるとすると、データは、細胞因子との相互作用の原因となるタンパク質−タンパク質相互作用をＣ−末端が媒介するらしいことを示す。精製した組換えＶタンパク質は、Ｖタンパク質が直接ＲＮＡに結合するかどうかをさらに検討するために重要である。
【００７２】
変異ｈａＶ−５タンパク質はミニレプリコン抑制に対して欠陥であるけれども（図４）、これはＲＮＡ（図６）および野生型タンパク質に結合した。従って、ＣＲ２に関連するミニレプリコン抑制活性は、分析した他の２種の活性（ＲＮＡ結合およびＮタンパク質との相互作用）と直接には相関しなかった。抑制モチーフとしてＣＲ２を有効に機能させるためには、Ｖタンパク質のＣ−末端内に不変のＲＮＡ結合ドメインを必要とするらしい。Ｖタンパク質はある種のＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写因子と類似するらしくそしてこれはモジュール状構造を有する（７８）。
【００７３】
ＣＲ２が抑制に直接関与する可能性をさらに完全にテストするために、このドメイン（アミノ酸１１２−１３４）を欠失させてｈａＶ−２３を生成した（図７、配列番号９）。意外にも、この欠失は抑制活性に大きくは影響しなかった（図８）。ＣＲ２が抑制に影響することなく欠失できるという事実は、ＣＲ２が抑制において積極的に関与するドメインを含んでいないことを論証する。その代わりに、ｈａＶ−５中に見いだされたアミノ酸１１３と１１４との置換により起きた欠陥（図７おび８）が、優性の負効果を生成するように考えられる（以前のウエスタンブロット分析は、抑制の欠陥はｈａＶ−５不安定性によっては起きないことを示した）。
【００７４】
理論により限定はされないが、ｈａＶ−５中のＹＤからＡＡへの置換は、抑制活性を部分的に遮断するＶタンパク質の三次構造内に微妙な改変を生成した。あるいは、Ｖタンパク質と他のウイルスタンパク質または細胞タンパク質との間の相互作用があるかも知れない。二重のアラニン置換は、抑制活性を阻害するかまたは不活性タンパク質複合体中のＶタンパク質を隔離するタンパク質−タンパク質相互作用に有利らしい。
【００７５】
弱い抑制表現型が二重のアラニン置換により創成される優性の負効果により起きるという概念を、ｈａＶ−５内に見いだされる置換に非常に類似してはいるがしかし区別される追加のアミノ酸置換を作ってさらにテストした（図７）。ｈａＶ−５内の当初のＹＤからＡＡへの置換は、ＣＲ２のアミノ境界に位置するＶＹＤＨよりなる良く保存されたモチーフ内で操作された（図２）。このモチーフは、麻疹ウイルス、イヌジステンパーウイルス、牛疫ウイルスおよびイルカモルビリウイルスからのＶタンパク質配列中で一致していた。変異体ｈａＶ−２４（配列番号１０）内で、ＶＹＤＨ配列をＶＹＡＡに変換し、そして変異体ｈａＶ−２５（配列番号１１）中では、ＶＹＤＨをＶＡＡＡに変換した。これらの変異体の双方ならびに野生型ｈａＶタンパク質発現が、ＭＶミニレプリコン遺伝子発現を抑制した（図８）。これはｈａＶ−５の欠陥がＶＹＤＨからＶＡＡＨへの置換に著しく特徴的であることを意味する。
【００７６】
Ｃ−末端ジンクフィンガー類似ドメインが抑制に役割を演じるという可能性をＣ−末端内のシステイン残基の対内にアミノ酸置換を導入してさらに検討した（図９）。システイン残基１および２（アミノ酸２５１および２５５）をアラニンに変換して変異体ｈａＶ−１２（配列番号１４）を生成した。同様に、Ｃ−末端システイン残基４および５（アミノ酸２６９および２７２）をアラニンに置換して変異体ｈａＶ−１３（配列番号１５）を生成した。システイン残基を対で変異させて、これがＣ−末端内のジンクフィンガー類似構造を有意に改変しそして抑制活性に容易に検出できる改変を産生することを期待した。
【００７７】
意外にも、これらの変異体のＣＡＴ発現研究（図１０）は、これらがシステイン置換により軽くしか影響されないことを明らかにした。ｈａＶ−１２およびｈａＶ−１３の双方が野生型ｈａＶタンパク質抑制活性の大きい部分を保持した（野生型の約６５％）。この結果は、いくぶん意外であった。亜鉛−配位システイン残基の置換は抑制を無効とすると予想されていた。多分、７個のシステイン残基中の２個のみの置換が推定されるジンクフィンガー核酸結合構造を完全には破壊しなかったのであろう。あるいは、推定されるジンクフィンガーモチーフが、予め予想されたほどには重要な役割を演じていない可能性がある。従って、変異体の２種の追加のシリーズを調製して抑制におけるＣ−末端の役割をさらに試験した。
【００７８】
一組の変異において、Ｃ−末端から初めて少しずつ増加する欠失を作った（ｈａＶ−１４〜ｈａＶ−１９、配列番号１６〜２１）。最少の欠失（ｈａＶ−１４）は、Ｃ−末端からアミノ酸２１個を取り去り、一方最大の欠失（ｈａＶ−１９）はアミノ酸残基７１個を取り去った。ｈａＶ−１とほぼ同様ではあるけれども、しかし変異体ｈａＶ−１９を構築した（図９、配列番号１３）が、それはｈａＶ−１９中での欠失は、アミノ酸２２９−２３４の間に位置する小さい塩基性モチーフの部分である数個の追加のアミノ酸を取り去り、そしてｈａＶ−１９の表現型はｈａＶ−１により示される変異体表現型の確認とみなすことができたからである。
【００７９】
ミニレプリコンアッセイにおけるＣ−末端変異体の分析は、大きい欠失変異体（ｈａＶ−１およびｈａＶ−１９）が同様に挙動することを明らかにした。これらはミニレプリコン遺伝子発現が、野生型ｈａＶにより誘導される５〜８倍抑制の代わりにただの約２倍またはそれ以下の抑制であった（図１０）。興味あることには、大きい欠失により示される低下した抑制活性がさらに小さい末端切除変異体よってもすべて再現されたことである。最少のＣ−末端欠失（ｈａＶ−１４）でも、約２倍のみ抑制するＶタンパク質をもたらした。この結果は、Ｃ−末端の最末端が完全な状態であることが完全な抑制活性のために本質的であることを意味する。
【００８０】
Ｃ−末端欠失変異の効果を分析することに加えて、独自のＶタンパク質Ｃ−末端の開始部分にある塩基性モチーフ（ＫＫＧＨＲＲ、アミノ酸２２９−２３７、配列番号１２）が抑制に何らかの役割を演じる可能性を検討するために、数種の追加の変異体を生成させた。２個のアルギニン残基のアラニンへ（ｈａＶ−２０、配列番号２２）またはアスパラギン酸へ（ｈａＶ−２１、配列番号２３）の変換はＣ−末端欠失変異体のものと同様の効果を有していた。２種の置換変異体は、平均して１．５〜３倍のみでミニレプリコン発現を抑制し、一方、野生型Ｖタンパク質抑制は通常５〜８倍の範囲であった（図１０）。これらの結果は、塩基性モチーフの混乱も正常なＶタンパク質抑制機能を破壊することを意味する。
【００８１】
この結果は、塩基性モチーフを欠失し、一方Ｃ−末端の残部は不変に保ってさらに検討した（図９、ｈａＶ−２２、配列番号２４）。意外にも、一回の予備実験が、塩基性モチーフの欠失が抑制活性に対して認められるほどの効果を有していないことを示した。ｈａＶ−２２はＣＡＴ活性を約９倍抑制した（図１０）。総合すると、これらの結果は、塩基性モチーフ内のアミノ酸置換がタンパク質三次構造内に好ましくない変化を起こすことにより、多分、抑制活性に対して支配的な負効果を生じることを示唆する。反対に、塩基性モチーフの欠失は、ミニレプリコン遺伝子発現を抑制するＶタンパク質の能力をほとんど変化させなかった。
【００８２】
麻疹ウイルスＶタンパク質ミニレプリコン抑制の機構は未知である。結果は、機構がＮタンパク質との相互作用を必要としないが、しかしＲＮＡとの相互作用は関与することを示唆する。ＲＮＡ結合は、ミニレプリコンアッセイにおいて多数の異なる機構を介してＣＡＴ活性の低下をもたらすことができた。例えば、Ｖタンパク質がウイルスｍＲＮＡを結合すると、ＲＮＡ結合活性は翻訳を抑制できた。Ｖタンパク質は、これが初期のウイルスＲＮＡに結合しそしてＲＮＡとＮタンパク質との会合を妨害する場合に、キャプシド化の速度にも影響できた。反対に、これはヌクレオキャプシド構築をいくらか刺激でき、これによりｍＲＮＡの損失を伴ってゲノム長さのＲＮＡを過剰産生するようにミニレプリコン系を強制した。Ｖタンパク質も、プロモーターにおいてまたはその近傍で結合しそして転写を抑制する転写因子に類似すると予見できた。Ｖタンパク質が転写因子に類似する場合には、これはゲノム合成とｍＲＮＡ合成とを均衡させるスイッチの調節因子であろう。
【００８３】
Ｖタンパク質機能の詳細な解析は、免疫原性組成物内に使用するための候補モルビリウイルス株内に弱毒性変異を導入するための基礎を提供する。公開された研究は、Ｖタンパク質発現の排除が弱毒化ウイルス複製をもたらすことを示した（１９、２２、２３、２６〜２９）。弱毒化の種々の程度は、Ｖタンパク質の特異性ドメインへのアミノ酸置換を目的として導入され、むしろこれにより発現を排除する。例えば、Ｖタンパク質抑制機能の部分的欠損は、独自のＣ−末端内の１個またはそれ以上のシステイン残基の変異により達成される。ＰおよびＶに共通の領域内の置換、例えばＣＲ２内のアラニン置換は、これらがＰタンパク質に大きい影響を及ぼさないでＶタンパク質機能に影響を有する場合には適当である。これらの変異は、当該技術分野で記載される「レスキュー」のための逆遺伝系を用いて評価される（１９、７９、８０、８１）。
【００８４】
裸のゲノムＲＮＡは転写および複製のための鋳型としては役立てないので、本発明の変異を含む感染性モルビリウイルスを生成するためには逆遺伝系を使用しなければならない。むしろ、これらのゲノム配列は、これらがヌクレオキャプシド構造内へＮタンパク質により完全にキャプシド化される場合にのみ認められる。これは、ゲノムおよびアンチゲノム性末端プロモーター配列が転写または複製経路を開始するために認識される範囲においてのみである。
【００８５】
負センス、一本鎖ＲＮＡウイルスゲノムの転写および複製は、リボ核タンパク質コア（ヌクレオキャプシド）に対して作用する多量体（Ｍｕｌｔｉｍｅｒ）性タンパク質の酵素活性を介して達成される。すべてのモルビリウイルスは、３種のウイルスタンパク質、Ｎ、ＰおよびＬをこれらの経路を進行させるために必要とする。
【００８６】
本明細書中に記載の変異は、部位−指定変異発現を用いてモルビリウイルス株内に導入される。本明細書中に定義した１種またはそれ以上の変異がモルビリウイルス株内に導入される。変異の種々の組み合わせの累積効果が評価できる。
【００８７】
本発明は、ミニレプリコン系を用いて例示される。モルビリウイルスのＶタンパク質のＣＲ２およびＣ−末端（ならびに麻疹ウイルスのプロモーター領域およびＬタンパク質、Ｎ、Ｐおよび／またはＣタンパク質および／またはＦ遺伝子末端シグナル）への変異をコードするヌクレオチド配列内の変化は、当該技術分野では既知の技術を用いて全長ウイルス内に容易に挿入できる。変異は、標準組換えＤＮＡ法によりウイルスゲノムのＤＮＡコピー内に導入される。これは、野生型または改変されたウイルスゲノム背景であってもよく、これにより新しいウイルスを生成する。これらの変異を含む感染性クローンまたは粒子はｃＤＮＡレスキュー系を用いて生成され、これは種々の負センスＲＮＡウイルスに適用され、これにはセンダイウイルス（８２）、麻疹ウイルス（８３、８８）、呼吸器合胞体ウイルス（８４）、ＰＩＶ−３（８５）、狂犬病（８６）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）（８７）、および牛疫ウイルス（８９）が含まれ、これらの引用文献は引用することによって本明細書中に編入される。
【００８８】
簡単にいえば、すべてのモルビリウイルスレスキュー系は以下のように要約できる：各々は、適当なＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばＴ７　ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）および繁殖可能な細菌プラスミド内に挿入された自己切断リボザイム配列（例えばＤ型肝炎リボザイム）の間に位置する全ウイルスゲノムのクローニングされたＤＮＡ相当体を必要とする。この転写ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ）が正確に、またはほぼ正確に５’および３’末端を有するウイルスアンチゲノム（またはゲノム）の一本鎖ＲＮＡコピーを忠実に転写できる容易に操作できるＤＮＡ鋳型を提供する。ウイルスゲノムＤＮＡコピーおよび近接するプロモーターおよびリボザイム配列の方向は、アンチゲノムまたはゲノムＲＮＡ相当体が転写されるかどうかを決定する。また、新規のウイルス継代のレスキューのために必要なことは、裸の一本鎖ウイルスアンチゲノムまたはゲノムＲＮＡ転写体を機能性ヌクレオキャプシド鋳型内にキャプシド化するために必要なウイルス特異性、トランス作用性タンパク質：すなわちウイルスヌクレオキャプシド（Ｎ）タンパク質、ポリメラーゼ−随伴リンタンパク質（Ｐ）およびポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質である。これらのタンパク質は、このヌクレオキャプシド鋳型を転写および複製するためにエンゲージしなければならない活性ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含んでなる。
【００８９】
典型的には、これらのウイルストランス作用性タンパク質は、所要のトランス作用性タンパク質の一部またはすべてが、これらのウイルス特異性遺伝子および遺伝子産物を安定な形質転換体として含みそして発現するための操作された哺乳動物細胞内に産生されてもよいけれども、所要のタンパク質をコードする１種またはそれ以上のプラスミド発現ベクターから生成される。
【００９０】
レスキューのための（必ずしも排他的ではないけれども）典型的な環境は、ウイルスゲノム性ｃＤＮＡ含有転写ベクターからアンチゲノム（またはゲノム）性一本鎖ＲＮＡの転写を作動させるためにＴ７ポリメラーゼが存在する適当な哺乳動物細胞内部環境を含む。共転写的またはその直後に、このウイルスアンチゲノム（またはゲノム）ＲＮＡ転写産物は、ヌクレオキャプシドタンパク質により機能性鋳型内にキャプシド化されそして所要のウイルス特異性トランス作用性タンパク質をコードする共トランスフェクションされた発現プラスミドから共に産生された所要のポリメラーゼ成分によりエンゲージされる。これらの出来事および過程は、ウイルスｍＲＮＡの所要の転写、新しいゲノムの複製および増幅および、これらにより、新規のウイルス継代の産生、すなわちレスキューに導く。
【００９１】
非モルビリウイルスの狂犬病、ＶＳＶおよびセンダイのレスキューのために、Ｔ７ポリメラーゼを組換えワクシニアウイルスＶＴＦ７−３により提供する。しかし、この系は、レスキューされたウイルスが、物理的もしくは生化学的手段によりまたはポックスウイルスにとって良い宿主ではない細胞もしくは組織内での反復された継代操作（ｐａｓｓａｇｉｎｇ） によりワクシニアウイルスから分離されることを必要とする。麻疹ウイルスｃＤＮＡレスキューのために（そして推測的に他のモルビリウイルスのために）、この要件は、Ｔ７ポリメラーゼ、ならびにウイルスＮおよびＰタンパク質を発現する細胞系統を創成することにより避けられる。レスキューは、ゲノム発現ベクターおよびＬ遺伝子発現ベクターをヘルパー細胞系統内にトランスフェクションして達成される。哺乳動物内でＴ７　ＲＮＡポリメラーゼを発現するが感染性継代をほとんどまたは全く産生しないワクシニアウイルス、ＭＶＡ−Ｔ７の宿主域変異体の利点は、麻疹ウイルスおよびその他のモルビリウイルスをレスキューするために開発される。必要なキャプシド化タンパク質の共発現の後、合成全長アンチゲノムウイルスＲＮＡをウイルスポリメラーゼタンパク質によりキャプシド化、複製および転写しそして複製されたゲノムを感染性ビリオン内にパッケージする。かかるアンチゲノムに加えて、現在ではゲノム類似体がセンダイおよびＰＩＶ−３でレスキューに成功した（８５、９０）。
【００９２】
従って、レスキュー系は、モルビリウイルスのゲノムまたはアンチゲノムをコードする単離された核酸分子を含んでなる転写ベクターを含んでなる組成物を提供する。核酸分子は、麻疹ウイルスＶタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内に少なくとも１個の変異（および、場合により、本明細書中に記載の他の変異）を、キャプシド化、転写および複製に必要なトランス作用性タンパク質（例えばモルビリウイルスのＮ、ＰおよびＬ）をコードする少なくとも１個の単離された核酸分子を含んでなる少なくとも１種の発現ベクターと一緒に含む。次いで、上記の少なくとも２種の発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換、感染またはトランスフェクションする。宿主細胞は、感染性改変ウイルスを産生するようにこれらのベクターの共発現を許容する条件下で培養される。
【００９３】
次いで、レスキューされた感染性ウイルスをその所望の表現型（Ｖタンパク質による低下した抑制、温度感受性、低温適応性、プラーク形態、および転写および複製弱毒化）に関して最初は生態外の手段で試験する。麻疹ウイルスのＮ、ＰまたはＣ遺伝子またはＦ遺伝子末端シグナル内の変異も、所要のトランス作用性キャプシド化およびポリメラーゼ活性が野生型またはワクチンヘルパーウイルスにより提供されるミニレプリコン形質転換を用い、または遺伝子特異性弱毒化変異を包含するＮ、Ｐおよび種々のＬ遺伝子を発現するプラスミドにより試験される。
【００９４】
レスキューされたウイルスの弱毒化表現型が存在する場合には、適当な動物モデル用いて負荷試験を行う。ヒト以外の霊長類は、ヒト疾患の病因論のための好ましい動物モデルを提供する。これらの霊長類は、最初に弱毒化、組換え生成ウイルスを用いて免疫化され、次いでウイルスの野生型を負荷される。サルは、接種の鼻腔内、気管内または皮下経路を含みこれらの限定はされない種々の経路により感染される（９１）。実験的に感染されたアカゲザルおよびカニクイザルも、麻疹に対するワクチン誘導防御の研究のための動物モデルとして役立つ（９２）。
【００９５】
防御は、疾患徴候および症状、生存率、ウイルス開放性および抗体力価などの基準により測定される。所要の基準に合致する場合には、組換え産生ウイルスは人体内試験の実行可能な候補ワクチンまたは免疫原性組成物と考えられる。「レスキュー」されたウイルスは、変異を組み込むウイルスの継代および後続の世代として、「組換え産生された」と考えられる。
【００９６】
「レスキュー」されたウイルスが、ワクチンとして使用するための最適レベルに対して不十分に弱毒化または過剰に弱毒化されている場合でも、これはかかる最適株を開発するために価値がある情報である。
【００９７】
最適には、点変異を含むコドンは、点変異のみを有するコドンによりコードされるアミノ酸を変化することなく、コドン内に第二または第二および第三の変異を導入することにより安定化されてもよい。安定化変異を含む感染性ウイルスクローンも、上記のｃＤＮＡ「レスキュー」系を用いて産生される。
【００９８】
以前に、引用することによって本明細書中に編入される国際特許出願公開番号ＷＯ９８／１３５０１号（９３）中に、３’ゲノムプロモーター領域内に少なくとも１個の弱毒性変異を有しそしてＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内に少なくとも１個の弱毒化変異を有するモノネガウイルス目（例えば麻疹ウイルス）の組換え産生、弱毒化、非セグメント化、負センス、一本鎖ＲＮＡウイルスの生成および単離を開示した。
【００９９】
具体的には、これらの変異は、
（１）ヌクレオチド２６（Ａ→Ｔ）、ヌクレオチド４２（Ａ→ＴまたはＡ→Ｃ）およびヌクレオチド９６（Ｇ→Ａ）よりなる群より選ばれる３’ゲノムプロモーター領域内の少なくとも１個の弱毒化変異であって、これらのヌクレオチドは正鎖、アンチゲノム性、メッセージセンス中に提示され、そして
（２）残基３３１（イソロイシン→トレオニン）、１４０９（アラニン→トレオニン）、１６２４（トレオニン→アラニン）、１６４９（アルギニン→メチオニン）、１７１７（アスパラギン酸→アラニン）、１９３６（ヒスチジン→チロシン）、２０７４（グルタミン→アルギニン）および２１１４（アルギニン→リシン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化よりなる群より選ばれるＲＮＡポリメラーゼ遺伝子内の少なくとも１個の弱毒化変異、を含んでなる。
【０１００】
さらに引用することにより本明細書中に編入される国際特許出願公開番号ＷＯ９９／４９０１７号（９４）中に、Ｎ、ＰもしくはＣ遺伝子内またはＦ遺伝子−末端シグナル内に少なくとも１個の弱毒化変異を有する組換え産生、弱毒化した麻疹ウイルスの生成および単離を開示した。
【０１０１】
具体的には、これらの変異は、
（１）Ｎ遺伝子に対して、残基１２９（グルタミン→リシン）、１４８（グルタミン酸→グリシン）および４７９（セリン→トレオニン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化よりなる群より選ばれる少なくとも１個の弱毒化変異、
（２）Ｐ遺伝子に対して、残基２２５（グルタミン酸→グリシン）、２７５（システイン→チロシン）および４３９（ロイシン→プロリン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化よりなる群より選ばれる少なくとも１個の弱毒化変異、
（３）Ｃ遺伝子に対して、残基７３（アラニン→バリン）、１０４（メチオニン→トレオニン）および１３４（セリン→チロシン）よりなる群より選ばれるアミノ酸に変化を生成するヌクレオチド変化よりなる群より選ばれる少なくとも１個の弱毒化変異、および
（４）Ｆ遺伝子−末端シグナル（シス作用性転写終止シグナル）に対して、ヌクレオチド７２４３（Ｔ→Ｃ）における変化であって、これらのヌクレオチドは、正鎖、アンチゲノム性、すなわちメッセージ（コーディング）センス中に提示されるもの
を含んでなる。
【０１０２】
変異のこれらの組のいずれかまたは双方からの弱毒化変異の個々または組み合わせは、Ｖタンパク質のアミノ酸１１２−１３４に相当する領域内に少なくとも１個の変異を有するものを特異的に含む本発明のモルビリウイルス内に、ならびにアミノ酸１１２−１３４内のかかる変異およびアミノ酸２３１で開始するＣ−末端領域の少なくとも一部分内の変異またはその欠失の双方を有するものへ組み込むことができる。
【０１０３】
本発明のウイルスは、ワクチンまたは免疫原性組成物を処方するために使用される。これを行うために、ウイルスを適当な濃度に調整しそしていずれかの適当なアジュバント、希釈剤またはキャリヤーを用いて処方する。生理学的に受容できる媒体をキャリヤーおよび／または希釈剤として使用してもよい。これらには、以下に限定はされないが、水、適当な等張性媒体、グリセロール、エタノールおよびその他の慣用の溶剤、リン酸緩衝生理食塩水などが含まれる。適当なアジュバントには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＭＰＬＴＭ（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ；ＲＩＢＩ ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．， Ｈａｍｉｌｔｏｎ， ＭＴ 、現在はＣｏｒｉｘａ）、合成脂質Ａ類似物、例えば５２９（Ｃｏｒｉｘａ）、スチムロン（Ｓｔｉｍｕｌｏｎ）ＴＭＱＳ−２１（Ａｑｕｉｌａ Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ， ＭＡ） およびＩＬ−１２（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ） が含まれ、これらに限定はされない。
【０１０４】
本発明の一つの態様では、モルビリウイルスを含む処方は、ワクチンまたは免疫原性組成物として使用することを意図する。ウイルスは、凍結防止添加剤または安定剤、例えばタンパク質（例えばアルブミン、ゼラチン）、糖類（例えばスクロース、ラクトース、ソルビトール）、アミノ酸（例えばグルタミン酸ナトリウム）、生理食塩水、またはその他の防御性薬剤と混合してもよい。この混合物を液状に保つか、または次いで輸送および貯蔵のために乾燥または凍結乾燥しそして投与の直前に水と混合する。
【０１０５】
本発明のモルビリウイルスを含んでなる処方は、ウイルスの野生型相当物による感染に対する防御を誘導するためにヒトまたはその他の脊椎動物を免疫化するために有用である。従って、本発明は、上記のようにして生成したウイルスの種類を組み込んだワクチンまたは免疫原性組成物の処方の有効な免疫化量を患者に投与することによる、モルビリウイルスによる感染に対する防御を誘導するために患者を免疫化する方法をさらに提供する。
【０１０６】
投与の適当な回数でワクチンまたは免疫原性組成物の十分な量を免疫応答を誘導するために患者に投与する。当該技術分野の熟練者は、かかる量および投与を容易に決定できる。投与は、あらゆる慣用の有効な形、例えば経鼻、非経口、経口、または局所経由により、いかなる粘膜面、例えば鼻内、口腔、眼、肺、膣または直腸表面に、例えばエーロゾル噴射によって行ってもよい。投与の好ましい手段は鼻内投与である。
【０１０７】
本明細書中に引用したすべての特許および刊行物は、引用することにより本明細書に編入される。
【０１０８】
本発明をさらに良く理解するために、下記の実施例を記載する。実施例は例示の目的のみでありそして本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
【０１０９】
実施例
実施例１
細胞およびウイルス
ＨＥｐ２細胞を１０％ウシ胎児血清を補足したダルベッコ変法イーグル媒体（ＤＭＥＭ）内で培養した。チキン胚繊維芽細胞（ＣＥＦ；ＳＰＡＦＡＳ， Ｉｎｃ ）を同じ媒体内で維持した。ファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ（ＭＶＡ／Ｔ７；６２）を発現するワクシニアウイルスの弱毒化株をＣＥＦ中で培養した。プラーグアッセイもＣＥＦ上で行った。
【０１１０】
実施例２
組換えＤＮＡ
麻疹ウイルスＮ、ＰおよびＬタンパク質発現クローン（図１Ａ）をそれぞれ感染細胞全ＲＮＡから遺伝子特異性プライマーを用いる逆転写およびＰＣＲ増幅（ＲＴ／ＰＣＲ）により、次いで適当なＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ依存性発現ベクター内にクローニングして調製した（６１）。ベロ（ｖｅｒｏ）細胞を麻疹ウイルスのエドモンストン野生型株を用いて感染し、そして細胞の約７０％またはそれ以上が細胞改変効果を示した場合に、ＲＮＡをガウニジウム（ｇａｕｎｉｄｉｕｍ） −フェノール抽出法により調製した（９５）。ＲＴ／ＰＣＲは、単管タイタン（ｏｎｅ−ｔｕｂｅ Ｔｉｔａｎ）増幅キット（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ） 内に含まれたトリ筋芽球症（ａｖｉａｎ ｍｙｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ）ウイルスＲＴおよびＰｗｏポリメラーゼを用いて行った。ＲＴ段階は、３０〜６０分間、４７℃、次いでＰＣＲ増幅の３０〜３５サイクルで行った。増幅したＤＮＡフラグメントを、ベクターのＮｃｏＩ部位内に位置した翻訳開始コドンを有するＴ７発現プラスミド（図１（６１、８３））内にクローニングした。クローニングしたＤＮＡをサイクル−シーケンシング（９６）により確認しそしてヌクレオチド置換エラーを、モルフ（Ｍｏｒｐｈ） キットを用いるオリゴヌクレオチド変異誘導（５ｐｒｉｍｅ−３ｐｒｉｍｅ， Ｉｎｃ）により、または以前に記載したような新規増幅ＤＮＡフラグメントを用いるサブフラグメントの置換（９６）により修正した。
【０１１１】
Ｖタンパク質コード領域に近接するプラスミドを用いるエドモンストン野生型全長ｃＤＮＡクローンからのＰＣＲ増幅により最初のＶタンパク質発現クローンを調製した。増幅したＤＮＡをＴ７発現ベクター内にクローニングしそしてＶ遺伝子フレームシフトを生成するために必要な追加のＧヌクレオチド残基をオリゴヌクレオチド−指示変異誘導によりエディティング部位に加えた（１８）。野生型および変異Ｖタンパク質発現ベクターも、アミノ酸末端のインフルエンザウイルス赤血球凝集素エピトープタグ（ＨＡ−タグ；（６７））を用いて調製した。開始コドンを含みそしてＨＡ−エピトープタグ（ＣＣ　ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＴＡＴ　ＣＣＴ　ＴＡＴ　ＧＡＣ　ＧＴＧ　ＣＣＴ　ＧＡＣ　ＴＡＴ　ＧＣＣ）（配列番号５）を含む配列を含むようにＴ７ベクタープラスミドを改変し、次いでポリリンカー（プラスミドｐＴ７／ＨＡ）により改変した。Ｖタンパク質コード領域をアミノ末端でＨＡタグを用いてクローニングした。これは、Ｖタンパク質イニシエーターメチオニンコドンを置換することに役立ち、ｐＭＶ−ｈａＶ−ｗｔと呼ばれるプラスミドの産生をもたらした。Ｖタンパク質変異体は、オリゴヌクレオチド指示または欠失変異誘導によりｐＭＶ−ｈａＶ−ｗｔ骨格内に調製した。
【０１１２】
ＰおよびＶコード領域の５’末端を増幅するように設計されたプライマー（ＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＣＡＣＧＣＣＡＣＧＴＡＡＡＡＡＡＣＧＧＡＣ）（配列番号６）は、下流Ｃタンパク質オープンリーディングフレームを破壊する２個の塩基変化（下線付）を含んでいた。これらの変化は、ＰおよびＶオープンリーディングフレームに関してサイレントであった。同様のヌクレオチド変化がｐＴ７ＭＶ−ｈａＶ構築物にも引き継がれた。
【０１１３】
すべてのタンパク質発現構築物に対して、ｃＤＮＡ挿入物は内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）の３’をクローニングしてＴ７　ＲＮＡポリメラーゼ転写物の翻訳を助けた。５０アデノシン残基の部分は３’末端に位置し、次いでＴ７　ＲＮＡポリメラーゼターミネーターが位置する。ＰおよびＶ発現ベクターの双方は、下流Ｃタンパク質オープンリーディングフレームからの翻訳開始を妨害するために設計された塩基置換を含んでいた。
【０１１４】
麻疹ウイルスミニレプリコン（ｐＭＶｗｔ１０７−ＣＡＴ、図１Ｂ）はｐＭＶ１０７−ＣＡＴの誘導体であった（６３）。プラスミドｐＭＶ１０７−ＣＡＴは麻疹ウイルスのワクチン株内に見いだされたリーダー配列を含み（６０）そしてオリゴヌクレオチド−指示変異誘導を用いてプラスミドｐＭＶ１０７ｗｔ−ＣＡＴ（これは野生型リーダーを含んでいた）に変換された。
【０１１５】
実施例３
一過性発現実験
一過性ミニレプリコン発現の分析は、種々の量のウイルスタンパク質発現ベクター（図１Ｂ）およびＣＡＴレポーター遺伝子を含む麻疹ウイルスミニレプリコン（図１Ｂ）を用いて、本質的に以前の記載（９６）のようにして行われた。麻疹ウイルスミニレプリコンは、ＣＡＴレポーター遺伝子および麻疹ウイルスのエドモンストン野生型株からの麻疹リーダー配列を含むｐＭＶ１０７−ＣＡＴの誘導体であった（６３）（６０）。細胞が約７０〜９０％集密となると、６ウエルプレート内のＨＥｐ２細胞をトランスフェクションに使用した。トランスフェクション混合物は、無血清ＯｐｔｉＭＥＭ２００μｌ中のミニレプリコンＤＮＡ（５０〜２００ｎｇ　ｐＭＶｗｔ１０７−ＣＡＴ）および発現プラスミド（４００ｎｇ　ｐＭＶｗｔ−Ｎ、３００ｎｇ　ｐＭＶｗｔ−Ｐ〔Ｃ− 〕、１００ｎｇ　ｐＭＶｗｔ−Ｌ）を組み合わせて調製した。Ｖタンパク質発現プラスミドは、図１Ｃに記入したように、２５〜４００ｎｇの範囲の量に従ってこの混合物中に含まれた。リポフェクターセ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｃｅ） （１２〜１５μｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ） をＤＮＡ−媒体混合物に加えそして２０〜３０分間、室温でインキュベーションした。細胞あたりに約２ｐｆｕを用いてトランスフェクションされる細胞のそれぞれのウエルを感染させるために十分なＭＶＡ／Ｔ７を含む無血清ＯｐｔｉＭＥＭ０．８ｍｌを提供するために十分な量の別のＭＶＡ／Ｔ７混合物を調製した。トランスフェクションを開始する前に、ＤＮＡ−媒体−リポフェクターセトランスフェクション混合物をＭＶＡ／Ｔ７−媒体混合物８００μｌと混合しそしてピペットを使用しておだやかに混合した。次いで、培養媒体を細胞単層から除去しそして一緒にした１トランスフェクション混合物を細胞に加えた。
【０１１６】
一晩インキュベーションした後に、１０％ＦＢＡを補足したＤＭＥＭを用いてトランスフェクション混合物および媒体を置換しそして細胞をさらに一日インキュベーションした。トランスフェクションの開始から約４８時間後に、細胞を採取しそして以前に記載したように（９６）ＣＡＴ活性の分析のために抽出液を調製した。ＣＡＴの発現を図１Ｃに示す。一部の実験では、粗細胞抽出液中のタンパク質をウエスタンブロッティングにより分析してタンパク質発現を測定した（９７）。トランスフェクションされた細胞を０．２％ＮＰ４０を補足したＴＮ緩衝液（５０ｍＭトリス〔ｐＨ７．４〕、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ）を用いて溶解した。細胞抽出液を遠心分離により清澄化して核を除きそして等量のレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ） 試料緩衝液（６２．５ｍＭトリス〔ｐＨ６．８〕、２５％グリセロール、２％ＳＤＳ、０．０１％ブロモフェノールブルー）を細胞質抽出液に加えた。約２．５％のβ−メルカプトエタノールを含むように試料を調整し次いで煮沸した。ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびエレクトロブロッティングを標準プロトコールを用いて行った（９７）。マウスモノクロナール抗体１２ＣＡ５（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ） またはラットモノクロナール抗体３Ｆ１０（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ） のいずれかを用いてエピトープタグしたＶタンパク質を検出した。検出は、ペルオキシダーゼ−結合二次抗体（Ｓｉｇｍａ） および化学蛍光試薬（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙまたはＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）を用いて行った。
【０１１７】
実施例４
変異麻疹ウイルスＶタンパク質によるミニレプリコン発現の抑制
実施例３に記載の一過性ミニレプリコン発現ＣＡＴアッセイを麻疹ウイルスＶタンパク質変異体ｈａＶ−１〜ｈａＶ−８の種々の量を用いて反復し、これらの変異体は、野生型配列（ｈａＶ−ｗｔ）と下記の点で異なっていた（図３参照）：
ｈａＶ−１：アミノ酸２３１−２９９の欠失
ｈａＶ−２：アミノ酸２２５のグルタミン酸のグリシンへの変異
ｈａＶ−３：アミノ酸２２９および２３０のリシンのアラニンへの変異
ｈａＶ−４：アミノ酸２０４および２０９のリシンおよびトレオニンのアラニンへの変異
ｈａＶ−５：アミノ酸１１３および１１４のチロシンおよびアスパラギン酸のアラニンへの変異
ｈａＶ−６：アミノ酸１００および１０１のロイシンおよびグルタミンのアラニンへの変異
ｈａＶ−７：アミノ酸１４および１５のグルタミン酸およびシステインのアラニンへの変異
ｈａＶ−８：アミノ酸３および４のグルタミン酸のアラニンへの変異。
【０１１８】
それぞれのＶプラスミド（野生型またはｈａＶ−１〜ｈａＶ−８タンパク質をコードする）のそれぞれ２００または４００ｎｇを使用しそしてＶタンパク質発現ベクターを用いないで行ったトランスフェクション（レーン２）から得られた活性の百分率として相対ＣＡＴ活性を測定した。結果を図４Ａに示す。低い百分率は、ＣＡＴ発現の抑制の高い程度と相関する。Ｖタンパク質の発現は、抗−ＨＡ抗体を用いて分析したウエスタンブロットにより測定された（図４Ｂ）。
【０１１９】
ｈａＶ−１をコードするＶプラスミド増加量（１００ｎｇ〜１μｇ）を用いてＣＡＴアッセイを反復しそして相対活性を図４Ｃに示す。
【０１２０】
実施例５
ＲＮＡ結合アッセイ
ＲＮＡ結合アッセイ（７４、７６、７７）を行って、ポリリボヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ） とのアガロースレジンカップルを用いて麻疹ウイルスＶタンパク質のＲＮＡへの結合を評価した。０．５％ＮＰ４０、５％グリセロール、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２ 、１ｍＭ　ＺｎＣｌ２ およびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ） を補足したＴＮ緩衝液を用いて上記のようにしてトランスフェクションされた細胞を溶解した。ポリリボヌクレオチドを含むアガロースレジン（ビーズの沈降した体積で約２５〜５０μｌ）を清澄化した細胞溶解物に加えそして３０〜６０分間、４℃で揺動ながらインキュベーションした。インキュベーションの後、レジンを３回洗浄して未結合タンパク質を除去した。２．５％β−メルカプトフェノールを補足したレムリ緩衝液中で煮沸してタンパク質をレジンから溶離した。操作を図５Ａの手順図に要約した。ポリヌクレオチドレジンにより捕捉されたタンパク質を上記のようにウエスタンブロッティングにより分析した。アッセイは、最初に野生型Ｖタンパク質、次いでｈａＶ−１〜ｈａＶ−１１を用いて行った。変異体ｈａＶ−１〜ｈａＶ−８は以上に記載したものである。変異体ｈａＶ−９〜ｈａＶ−１１は、野生型配列（ｈａＶ−ｗｔ）と下記の相違を有する（図３参照）：
ｈａＶ−９：アミノ酸１−２０の欠失
ｈａＶ−１０：アミノ酸２０８−２３０の欠失
ｈａＶ−１１：アミノ酸１−２０および２０８−２３０の欠失。
結果を図５Ｂ（野生型）および６（変異体）に示す。
【０１２１】
実施例６
追加のＣＲ２変異麻疹ウイルスＶタンパク質によるミニレプリコン発現の抑制
実施例３および４に記載の一過性ミニレプリコン発現ＣＡＴアッセイを、麻疹ウイルスＶタンパク質ＣＲ２変異体ｈａＶ−５およびｈａＶ−２３〜ｈａＶ−２５を用いて反復し、これらの変異体はＣＲ２（アミノ酸１００−１４０、図７参照）中で野生型配列（ｈａＶ）（配列番号７）から下記の相違を有する：
ｈａＶ−５：アミノ酸１１３および１１４のチロシンおよびアスパラギン酸のアラニンへの変異（配列番号８）
ｈａＶ−２３：アミノ酸１１２〜１３４の欠失（配列番号９）
ｈａＶ−２４：アミノ酸１１４および１１５のアスパラギン酸およびヒスチジンのアラニンへの変異（配列番号１０）
ｈａＶ−２５：アミノ酸１１３〜１５５のチロシン、アスパラギン酸およびヒスチジンの変異（配列番号１１）
それぞれのＶプラスミド（野生型、ｈａＶ−５またはｈａＶ−２３〜ｈａＶ−２５Ｖタンパク質をコードする）の４００ｎｇを使用し、いかなるＶタンパク質発現ベクターも含まないで行ったトランスフェクションから得られた活性（バー１）の百分率として相対ＣＡＴ活性を測定した。結果を図８に示す。低い百分率は、ＣＡＴ発現の抑制の高い程度に相関する。
【０１２２】
実施例７
追加のＣ−末端変異麻疹ウイルスＶタンパク質によるミニレプリコン発現の抑制
実施例３および４に記載の一過性ミニレプリコン発現ＣＡＴアッセイを、麻疹ウイルスＶタンパク質変異体ｈａＶ−１およびｈａＶ−１２〜ｈａＶ−２２を用いて反復し、これらの変異体はＣ−末端配列（アミノ酸２２０−２９９、図９参照）中で野生型配列（ｈａＶ）（配列番号７）から下記の相違を有する：
ｈａＶ−１：アミノ酸２３２〜２９９の欠失（配列番号１３）
ｈａＶ−１２：アミノ酸２５１および２５５のシステインのアラニンへの変異（配列番号１４）
ｈａＶ−１３：アミノ酸２６９および２７２のシステインのアラニンへの変異（配列番号１５）
ｈａＶ−１４：アミノ酸２７９〜２９９の欠失（配列番号１６）
ｈａＶ−１５：アミノ酸２６７〜２９９の欠失（配列番号１７）
ｈａＶ−１６：アミノ酸２５０〜２９９の欠失（配列番号１８）
ｈａＶ−１７：アミノ酸２４３〜２９９の欠失（配列番号１９）
ｈａＶ−１８：アミノ酸２３６〜２９９の欠失（配列番号２０）
ｈａＶ−１９：アミノ酸２２９〜２９９の欠失（配列番号２１）
ｈａＶ−２０：アミノ酸２３３および２３４のアルギニンのアラニンへの変異（配列番号２２）
ｈａＶ−２１：アミノ酸２３３および２３４のアルギニンのアスパラギン酸への変異（配列番号２３）
ｈａＶ−２２：アミノ酸２２９〜２３７の欠失（配列番号２４）
それぞれのＶプラスミド（野生型、ｈａＶ−１またはｈａＶ−１２〜ｈａＶ−２２Ｖタンパク質をコードする）の４００ｎｇを使用し、いかなるＶタンパク質発現ベクターも含まないで行ったトランスフェクションから得られた活性（バー１）の百分率として相対ＣＡＴ活性を測定した。結果を図１０に示す。低い百分率は、ＣＡＴ発現の抑制の高い程度に相関する。
【０１２３】
【表１】
2004513616.tif 000003
【０１２４】
【表２】
2004513616.tif 000004
【０１２５】
【表３】
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【０１２６】
【表４】
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【０１２７】
【表５】
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【０１２８】
【表６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】
Ａは、トランスフェクションに使用した４種のプラスミド発現ベクターを示す。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ依存性発現ベクター（６１）は、ＭＶＡ／Ｔ７を用いて感染した細胞内でエドモンストン野生型Ｎ、Ｐ、Ｌ、またはＶ遺伝子の発現を指示するために調製し（６２）、Ｂは、ｐＭＶ１０７−ＣＡＴから誘導されたミニレプリコンを示す（６３）。ｐＭＶ１０７−ＣＡＴ中のエドモンストン麻疹ウイルスワクチンリーダー配列を野生型配列に変換した（６０）。Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによるミニレプリコンプラスミドＤＮＡの転写は、トランスフェクションされた細胞中に負センスＲＮＡミニレプリコンコピーを生成し、Ｃは、一過性発現アッセイにおけるミニレプリコン活性に対するＶタンパク質発現の効果を証明するＣＡＴアッセイを示す。レーン１は、ミニレプリコン発現を作動するために必要なすべてのプラスミドベクター（Ｎ、ＰおよびＬ）を用いてトランスフェクションされた細胞から得られた正対照であった。レーン２は、Ｌポリメラーゼベクターを除くすべてのプラスミドを用いて細胞がトランスフェクションされたことを除いて、レーン１と同様であった。レーン３〜７では、Ｖタンパク質発現ベクターの増加量をトランスフェクション中に包含させた。トランスフェクションされたＤＮＡの全質量は、挿入がないベクターＤＮＡの適当な量を包含させて一定に保った。相対ＣＡＴ活性は、レーン１の１００％活性に基づいて算出した。
【図２】
４種の異なるモルビリウイルスからのＶタンパク質のアミノ酸配列の比較を示す。エドモンストン野生型麻疹ウイルスＶタンパク質アミノ酸配列（ジーンバンク受託番号（Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）ＡＦ２６６２８８）（配列番号１）をイヌジステンパーウイルス（ＡＦ０１４９６３）（配列番号４）、牛疫ウイルス（Ｚ３０６９７）（配列番号２）、およびイルカモルビリウイルス（Ｚ４７７５８）（配列番号３）と比較した。一致性の高いレベルを含む領域は、斜線のあるバーを用いて上部に示しそして保存領域と呼んだ（ＣＲ１〜ＣＲ６）。別の注目すべき配列は、黒バーの下線を付した。これらは、Ｎタンパク質とのＶ（およびＰ）タンパク質相互作用に含まれる領域（３４）、Ｖ−Ｎタンパク質複合体の細胞局在内に含まれる領域（２７、６４）、および亜鉛結合ドメインを含むシステインに富む領域（５１）を含む。重要な他の領域は、２２９−２３４の間の塩基性領域、位置２２５における麻疹ウイルスワクチンアミノ酸置換（グルタミン酸からグリシンへ）（３０）および位置９３−１０７の間のロイシンジッパーのロイシン反復領域残存（６５、６６）を含む。ＶおよびＰタンパク質に共通の領域はアミノ酸１−２３０の間でありそして独自のＶタンパク質配列（太文字のアミノ酸）は２３１−２９９の間である。整列した配列の上部に沿って図中に記載したアミノ酸位置は、麻疹ウイルスＶタンパク質のものに相当する。
【図３】
変異麻疹ウイルスＶタンパク質発現ベクターのマップを示す。これらの研究に使用したエピトープ−タグを付したＶタンパク質発現ベクターを図示する。変異Ｖタンパク質ベクターは、Ｖタンパク質イニシエーターメチオニンの代わりにインフルエンザウイルスＨＡタグを有するＶタンパク質を発現するベクタープラスミド骨格中に生成された（６７）。配列の重要部分を図の上部のＶタンパク質マップに示しそして上記の図２の記載と関連してさらに補完して示す。野生型（ｈａＶ−ｗｔ）および変異タンパク質（ｈａＶ１〜１１）をＶタンパク質マップの下に示す。ＨＡタグはアミノ末端において斜線枠として示しそして残りのＶタンパク質配列を中空の枠で示す。アミノ酸置換はアミノ酸位置およびアミノ酸変化と共に黒色点で示す。欠失または末端切除変異体は中断さらたＶタンパク質マップで示す。
【図４】
Ａは、Ｖタンパク質変異体（ｈａＶ−１〜ｈａＶ−８、図３の説明参照）の活性をテストする一過性発現実験の結果を示すＣＡＴアッセイの形での変異麻疹ウイルスＶタンパク質によるミニレプリコン抑制を示す。Ｖタンパク質ベクターの量（２００または４００ｎｇ）および変異体の名称をＣＡＴアッセイの下に図４Ａ中に示す。相対活性は、いかなるＶタンパク質発現ベクターも用いないで行ったトランスフェクションから誘導されたレーン２に対する百分率として算出する。レーン１は、Ｌタンパク質を用いないでで行った負対照であり、Ｂは、一過性発現実験でのＶタンパク質発現を測定するために行ったウエスタンブロットを示す。レーン１および２は、Ｖタンパク質ベクターの非存在でトランスフェクション（レーン１）またはタグがないＶタンパク質を発現するＶタンパク質ベクターを用いてトランスフェクションした細胞から誘導された負対照である。ウエスタンブロットは抗−ＨＡ抗体を用いてプローブし、Ｃは、発現ベクターの増加量（１００ｎｇ〜１μｇ）を用いるｈａＶ−１によるミニレプリコン抑制の分析を示す。
【図５】
麻疹ウイルスタンパク質と関連するＲＮＡ結合活性を示す。ＮＰ４０溶解によりトランスフェクションされた細胞から調製した粗細胞性抽出液をポリリボヌクレオチドホモポリマーに連結したアガロースビーズを用いてＲＮＡ結合活性に関して分析した。操作を説明する手順図を図５Ａに示す。図５Ｂは、ポリリボヌクレオチドレジン上に捕捉されたタンパク質を試験するために使用したウエスタンブロットを示す。ミニレプリコン実験に使用したと同様の条件を用いて細胞をトランスフェクションした（レーン１〜８）が、一部のトランスフェクションにおいて細胞をｈａＶ発現ベクターのみを用いてトランスフェクションしたこと（レーン９〜１２）を除く。レーン１〜４は、４種の異なるポリヌクレオチドレジンに結合するＮタンパク質の分析を示す。レーン５〜１２は、ｈａＶタンパク質への結合フラクションの分析を示す。同様に、レーン９〜１６は、ＥＧＴＡ（ＥＧ）、ＥＤＴＡ（ＥＤ）、または酵母ＲＮＡ（ＲＮＡ）の存在下でポリ（Ｇ）に結合したＶタンパク質の分析を示す。
【図６】
変異麻疹ウイルスＶタンパク質によるＲＮＡ結合を示す。図５に記載のポリリボヌクレオチドホモポリマー結合アッセイを変異麻疹ウイルスＶタンパク質の分析のために使用した（ｈａＶ　１〜１１、レーン３〜１３、図３の説明参照）。この実験において、Ｖ発現ベクターのみを用いて細胞をトランスフェクションした。レーン１で試験した細胞抽出液は、エピトープタグを含まないＶタンパク質を含む負対照であった。すべての変異タンパク質を試験するためにポリ（Ｇ）を使用した。
【図７】
ｈａＶと呼ばれる野生型麻疹ウイルスＶタンパク質のＣＲ２（アミノ酸１００−１４０）内のアミノ酸配列（配列番号７）と、ｈａＶ−５と呼ばれるアミノ酸１１３のチロシンおよびアミノ酸１１４のアスパラギン酸がアラニンで置換された変異体（配列番号８）、ｈａＶ−２３と呼ばれるアミノ酸１１２−１３４が欠失した変異体（配列番号９）、ｈａＶ−２４と呼ばれるアミノ酸１１４のアスパラギン酸およびアミノ酸１１５のヒスチジンがアラニンで置換されている変異体（配列番号１０）、およびｈａＶ−２５と呼ばれるアミノ酸１１３のチロシン、アミノ酸１１４のアスパラギン酸およびアミノ酸１１５のヒスチジンがアラニンで置換された変異体（配列番号１１）との比較を示す。
【図８】
ＣＡＴアッセイにおける図７に記載のＣＲ２変異の効果を示し、これは一過性発現アッセイにおけるミニレプリコン活性に対するＶタンパク質発現の効果を証明する。バー１は、ミニレプリコン発現を作動するためにに必要なすべてのプラスミドベクター（Ｎ、ＰおよびＬ）を用いてトランスフェクションされた細胞から得た正対照であった。バー２は、ｈａＶをコードする発現ベクターも用いて細胞をトランスフェクションされたことを除いてバー１と同様であった。バー３〜６では、指定のＣＲ２変異体をコードする発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクションした。相対ＣＡＴ活性は、バー１の１００％活性に基づいて算出した。
【図９】
ｈａＶと呼ばれる野生型麻疹ウイルスＶタンパク質のＣ−末端（アミノ酸２２０−２９９）中のアミノ酸配列（配列番号１２）と、ｈａＶ−１と呼ばれるアミノ酸２３２〜２９９が欠失した変異体（配列番号１３）、ｈａＶ−１２と呼ばれるアミノ酸２５１および２５５のシステインがアラニンで置換された変異体（配列番号１４）、ｈａＶ−１３と呼ばれるアミノ酸２６９および２７２のシステインがアラニンで置換された変異体（配列番号１５）、ｈａＶ−１４と呼ばれるアミノ酸２７９〜２９９が欠失した変異体（配列番号１６）、ｈａＶ−１５と呼ばれるアミノ酸２６７〜２９９が欠失した変異体（配列番号１７）、ｈａＶ−１６と呼ばれるアミノ酸２５０〜２９９が欠失した変異体（配列番号１８）、ｈａＶ−１７と呼ばれるアミノ酸２４３〜２９９が欠失した変異体（配列番号１９）、ｈａＶ−１８と呼ばれるアミノ酸２３６〜２９９が欠失した変異体（配列番号２０）、ｈａＶ−１９と呼ばれるアミノ酸２２９〜２９９が欠失した変異体（配列番号２１）、ｈａＶ−２０と呼ばれるアミノ酸２３３および２３４のアルギニンがアラニンで置換された変異体（配列番号２２）、ｈａＶ−２１と呼ばれるアミノ酸２３３および２３４のアルギニンがアスパラギン酸で置換された変異体（配列番号２３）、およびｈａＶ−２２と呼ばれるアミノ酸２２９〜２３７が欠失した変異体（配列番号２４）との比較を示す。
【図１０】
一過性発現アッセイでのミニレプリコン活性に対するＶタンパク質発現の効果を証明するＣＡＴアッセイにおける図９に記載のＣ−末端変異体の効果を示す。バー１は、ミニレプリコン発現を作動するために必要なすべてのプラスミドベクター（Ｎ、ＰおよびＬ）を用いてトランスフェクションされた細胞から得た正対照であった。バー２は、ｈａＶをコードする発現ベクターも用いて細胞をトランスフェクションしたことを除いて、バー１と同様であった。バー３〜１４では、指定のＣ−末端変異をコードする発現ベクターを用いて細胞をトランスフェクションした。相対ＣＡＴ活性は、バー１の１００％活性に基づいて算出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際公開パンフレット】
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【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
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【国際調査報告】
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