(57)【要約】本発明により、メイタンシノイドと細胞結合剤（ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）との細胞傷害性コンジュゲートを製造するワンステップ法を開示する。反応性部分をもつジスルフィドリンカーを有してなるメイタンシノイドを、細胞結合剤の事前の修飾を行うことなく、抗体のような細胞結合剤に連結させる。このコンジュゲートは、標的細胞に特異的に送達される細胞傷害性の治療剤として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個以上のメイタンシノイド分子と細胞結合剤とを含む細胞傷害性コンジュゲートを製造する方法であって、反応性エステルを含有する１個以上のメイタンシノイド分子を細胞結合剤と反応させる単一のステップから本質的になる、上記方法。
【請求項２】
１個以上のメイタンシノイド分子と細胞結合剤とを含む細胞傷害性コンジュゲートを製造する方法であって、反応性エステルを含有する１個以上のメイタンシノイド分子を細胞結合剤と反応させる単一のステップから本質的になり、該細胞結合剤が、１個以上のメイタンシノイド分子とのコンジュゲーションに使用するための反応性基をもたせる事前の修飾が施されていない細胞結合剤である、上記方法。
【請求項３】
前記コンジュゲートを単離する第２のステップをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記反応性エステルが連結部分を介して前記１個以上のメイタンシノイド分子に連結されている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記連結部分が、ジスルフィド結合、酸に不安定な結合、光に不安定な結合、ペプチダーゼに不安定な結合またはエステラーゼに不安定な結合である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記連結部分がジスルフィド結合である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記反応性エステルが、ジスルフィドで連結された反応性エステルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記反応性エステルが、Ｎ−スクシンイミジルエステル、Ｎ−スルホスクシンイミジルエステル、Ｎ−フタルイミジルエステル、Ｎ−スルホフタルイミジルエステル、２−ニトロフェニルエステル、４−ニトロフェニルエステル、２，４−ジニトロフェニルエステル、３−スルホニル−４−ニトロフェニルエステルまたは３−カルボキシ−４−ニトロフェニルエステルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記反応性エステルがＮ−スクシンイミジルエステルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応性エステルがＮ−スルホスクシンイミジルエステルである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞結合剤が、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、抗体フラグメント、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、ビタミンおよび栄養素輸送分子からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞結合剤がモノクロナール抗体である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞結合剤が抗体フラグメントである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１４】
反応性エステルをもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドを製造する方法であって、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（カルボキシアルキルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシンをヒドロキシ化合物と反応させて反応性エステルをもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドを生成させることを含む、上記方法。
【請求項１５】
前記Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（カルボキシアルキルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシンがＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシン（６）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記反応のメイタンシノイドエステル生成物を単離するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記ヒドロキシ化合物が、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホフタルイミド、２−ニトロフェノール、４−ニトロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、３−スルホニル−４−ニトロフェノール、および３−カルボキシ−４−ニトロフェノールからなる群より選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒドロキシ化合物がＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記ヒドロキシ化合物がＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヒドロキシ化合物がＮ−ヒドロキシスクシンイミドであり、かつ反応性エステルをもつジスルフィド部分を有してなる前記メイタンシノイドがＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシンのＮ−スクシンイミジルエステル（２）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒドロキシ化合物がＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドであり、かつ反応性エステルをもつジスルフィド部分を有してなる前記メイタンシノイドがＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシンのＮ−スルホスクシンイミジルエステル（３ａ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
反応性エステルをもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドを製造する方法であって、チオール含有メイタンシノイドを、反応性ジスルフィドを含有する反応性カルボン酸エステルと反応させることを含む、上記方法。
【請求項２３】
反応性エステルをもつジスルフィド部分を有してなる前記メイタンシノイドを単離するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
反応性ジスルフィドを含有する前記反応性カルボン酸エステルが４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタン酸Ｎ−スクシンイミジル（７）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
反応性エステルをもつジスルフィド部分を有してなる前記メイタンシノイドがＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシンのＮ−スクシンイミジルエステル（２）である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
反応性エステルをもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドを製造する方法であって、チオール含有メイタンシノイドを、反応性ジスルフィドを含有する水溶性反応性カルボン酸エステルと反応させることを含む、上記方法。
【請求項２７】
反応性エステルをもつジスルフィド部分を有してなる前記メイタンシノイドを単離するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
反応性ジスルフィドを含有する前記水溶性反応性カルボン酸エステルが４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタン酸スルホスクシンイミジル（８）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
反応性エステルをもつジスルフィド部分を有してなる前記メイタンシノイドがＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシンのＮ−スルホスクシンイミジルエステル（３）である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシン（６）を製造する方法であって、チオール含有メイタンシノイドを４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタン酸（５）と反応させることを含む、上記方法。
【請求項３１】
前記Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシン（６）を単離するステップをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシン（６）を製造する方法であって、
（ａ） Ｎ−メチル−Ｎ−（３−メルカプトプロパノイル）−Ｌ−アラニンと４−メルカプトペンタン酸トリメチルシリルエチル（９）とを組み合わせて混合ジスルフィド化合物を形成するステップと、
（ｂ） メイタンシノールをステップ（ａ）の生成物にカップリングさせてメイタンシノイドエステル１０を生成させるステップと、
（ｃ） 該メイタンシノイドエステル１０を脱保護するステップと
を含む、上記方法。
【請求項３３】
前記Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシン（６）を単離するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
反応性エステルをもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドであって、次式１１：
ＤＭ１−Ｓ−ＣＲ１Ｒ２−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２−Ｘ （１１）
〔式中、
ＤＭ１は、
【化１】
2004520450.tif 000003
であり、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、線状高級アルキルまたは分枝状高級アルキルであり、
ｎは１〜５であり、かつ
Ｘは、活性エステルの一部分であり、Ｎ−スクシンイミジル、Ｎ−スルホスクシンイミジル、Ｎ−フタルイミジル、Ｎ−スルホフタルイミジル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、３−スルホニル−４−ニトロフェニルまたは３−カルボキシ−４−ニトロフェニルの形をとることができる。〕
で構成されている、上記メイタンシノイド。
【請求項３５】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＣＨ３であり、ｎが２であり、かつＸがＮ−スクシンイミジルである、請求項３４に記載の反応性メイタンシノイド誘導体。
【請求項３６】
Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＣＨ３であり、ｎが２であり、かつＸがＮ−スルホスクシンイミジルである、請求項３４に記載の反応性メイタンシノイド誘導体。
【請求項３７】
次式：
【化２】
2004520450.tif 000004
で構成されている、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシン（６）。
【請求項３８】
次式：
【化３】
2004520450.tif 000005
で構成されている、メイタンシノイドエステル（１０）。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、メイタンシノイドと細胞結合剤（ｃｅｌｌ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｇｅｎｔ）とを含む細胞傷害性コンジュゲートを調製するための改良された方法に関する。このコンジュゲートは、特定の細胞集団に標的化されて送達されるので、治療目的に使用される。本発明はまた、反応性基をもつジスルフィド部分を有し細胞傷害性コンジュゲートの調製に使用しうるメイタンシノイドを調製する方法に関する。本発明はさらに、新規なメイタンシノイドに関する。
【０００２】
（発明の背景）
モノクロナール抗体−薬物コンジュゲートを用いる腫瘍細胞への特異的ターゲッティングの試みに関して多くの報告がなされている（Ｓｅｌａ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ １８９−２１６ （Ｃ． Ｖｏｇｅｌ， ｅｄ． １９８７）； Ｇｈｏｓｅ ｅｔ ａｌ， ｉｎ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｒｕｇｓ １−２２ （Ｅ． Ｇｏｌｄｂｅｒｇ， ｅｄ． １９８３）； Ｄｉｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ， ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ １−２３ （Ｊ． Ｒｏｄｗｅｌｌ， ｅｄ． １９８８）； Ｐｉｅｔｅｒｓｚ ｅｔ ａｌ， ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ２５−５３ （Ｊ． Ｒｏｄｗｅｌｌ， ｅｄ． １９８８）； Ｂｕｍｏｌ ｅｔ ａｌ， ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ ５５−７９ （Ｊ． Ｒｏｄｗｅｌｌ， ｅｄ． １９８８）。メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、およびクロラムブシルのような細胞傷害性薬物が、さまざまなマウスモノクロナール抗体にコンジュゲートされた。場合により、薬物分子は、血清アルブミン（Ｇａｒｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４６：２４０７−２４１２ （１９８６）； Ｏｈｋａｗａ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２３：８１−８６ （１９８６）； Ｅｎｄｏ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４７：１０７６−１０８０ （１９８０））、デキストラン（Ｈｕｒｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２：２５−３５ （１９８０）； Ｍａｎａｂｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ３４：２８９−２９１ （１９８５）； Ｄｉｌｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４６：４８８６−４８９１ （１９８６）； Ｓｈｏｖａｌ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ８５： ８２７６−８２８０ （１９８８））、またはポリグルタミン酸（Ｔｓｕｋａｄａ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃ． Ｉｎｓｔ． ７３：７２１−７２９ （１９８４）； Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２７：１６０２−１６０７ （１９８４）； Ｔｓｕｋａｄａ ｅｔ ａｌ． Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ５２：１１１−１１６ （１９８５））のような介在担体分子を介して抗体分子に連結された。
【０００３】
そのような免疫コンジュゲートを調製するために広範にわたる一連のリンカー技術が利用され、開裂性リンカーおよび非開裂性リンカーの両方が研究されてきた。しかしながら、ほとんどの場合、標的部位でコンジュゲートから薬物分子を非修飾形態で放出させることができたときに薬物の十分な細胞傷害能を観測することができるにすぎない。
【０００４】
抗体−薬物コンジュゲートを調製するために利用されてきた開裂性リンカーの１つは、受容体媒介エンドサイトーシス中に見られるエンドソームおよびリソソームのようなさまざまな細胞内区画の酸性環境を利用する酸に不安定なリンカーであり、シス−アコニット酸をベースにしたものである。ＳｈｅｎおよびＲｙｓｅｒは、ダウノルビシンと巨大分子担体とのコンジュゲートを調製するためにこの方法を導入した（Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． １０２：１０４８−１０５４ （１９８１））。ＹａｎｇおよびＲｅｉｓｆｅｌｄは、ダウノルビシンを抗黒色腫抗体にコンジュゲートするために同一の技法を使用した（Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃ． Ｉｎｓｔ． ８０：１１５４−１１５９ （１９８８））。最近、Ｄｉｌｌｍａｎらも、ダウノルビシンと抗Ｔ細胞抗体とのコンジュゲートを調製するために同じように酸に不安定なリンカーを使用した（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：６０９７−６１０２ （１９８８））。
【０００５】
Ｔｒｏｕｅｔらにより探究された別の手法では、ペプチドスペーサーアームを介してダウノルビシンを抗体に連結させることが必要であった（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ７９：６２６−６２９ （１９８２））。これは、リソソームペプチダーゼの作用によりそのようなコンジュゲートから遊離薬物を放出させることができることを前提条件として行われた。
【０００６】
しかしながら、抗体−薬物コンジュゲートはコンジュゲートされていない遊離薬物と同一の細胞傷害能を示すことはほとんどないことがｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性試験により明らかにされている。このことから、薬物分子を抗体から放出させる機構が非常に非効率的であることが示唆された。免疫毒素の分野において、モノクロナール抗体と触媒活性タンパク質毒素とをジスルフィド架橋することにより形成されたコンジュゲートは、他のリンカーを含有するコンジュゲートよりも細胞傷害性が大きいことが示された。Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：１２０３５−１２０４１ （１９８５）； Ｌａｍｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎｓ １７５−２０９ （Ａ． Ｆｒａｎｋｅｌ， ｅｄ． １９８８）； Ｇｈｅｔｉｅ ｅｔ ａｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ４８：２６１０−２６１７ （１９８８）を参照されたい。これは、抗体分子と毒素との間のジスルフィド結合の効率的開裂に寄与するグルタチオンの細胞内濃度が高いことに起因するものであった。それにもかかわらず、薬物と巨大分子とのコンジュゲートを調製するためにジスルフィド架橋を使用する報告例はごく少数にすぎない。Ｓｈｅｎらは、メトトレキセートからメルカプトエチルアミド誘導体への変換それに続くジスルフィド結合を介するポリ−Ｄ−リシンとのコンジュゲーションについて記載した（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：１０９０５−１０９０８ （１９８５））。このほか、トリスルフィド含有毒性薬物カリケアマイシンと抗体とのコンジュゲートの調製について記載した報告もある（Ｍｅｎｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ． Ｆｏｕｒｔｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ａｂｓｔｒａｃｔ ８１ （１９８９））。トリスルフィド含有毒性薬物カリケアマイシンと抗体とのコンジュゲートの調製について記載した報告は他にもある（Ｈｉｎｍａｎ ｅｔ ａｌ， ５３ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ３３３６−３３４２ （１９９３））。
【０００７】
ジスルフィドで連結された抗体−薬物コンジュゲートが少ない理由の１つは、ジスルフィド架橋を介して薬物を抗体に連結させるために容易に使用することのできる硫黄原子含有部分をもつ細胞傷害性薬物が入手できないことにある。さらに、既存の薬物の化学修飾をその細胞傷害能を低減させることなく行うのは困難である。
【０００８】
既存の抗体−薬物コンジュゲートの他の大きな欠点は、標的化された抗原の数が限られているため、またメトトレキセート、ダウノルビシンおよびビンクリスチンのような癌増殖抑制剤（ｃａｎｃｅｒｏｓｔａｔｉｃ ｄｒｕｇ）の細胞傷害性が比較的緩和であるため、標的部位に十分な濃度の薬物を送達することができない点である。有意な細胞傷害性を達成するために、多数の薬物分子を抗体に直接または担体高分子を介して連結させることが必要になる。しかしながら、そのような高度に修飾された抗体は、しばしば、標的抗原に対する結合性の低下および血流からの急速なｉｎ ｖｉｖｏクリアランスを呈する。
【０００９】
メイタンシノイドは細胞傷害性の高い薬物である。メイタンシンは、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ ｓｅｒｒａｔａからＫｕｐｃｈａｎらにより最初に単離され、メトトレキセート、ダウノルビシンおよびビンクリスチンのような従来の癌化学療法剤の１００〜１０００倍の細胞傷害性であることが示された（米国特許第３，８９６，１１１号）。続いて、微生物の中にもメイタンシノールおよびメイタンシノールのＣ−３エステルのようなメイタンシノイドを産生するものがあることが見いだされた（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成されたメイタンシノールのＣ−３エステルおよびメイタンシノールの類似体も報告されている（Ｋｕｐｃｈａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． ２１：３１−３７ （１９７８）； Ｈｉｇａｓｈｉｄｅ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ２７０：７２１−７２２ （１９７７）； Ｋａｗａｉ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ３２：３４４１−３４５１ （１９８４）。Ｃ−３エステルの調製に用いられてきたメイタンシノール類似体としては、たとえば、芳香環上（たとえば、デクロロ）またはＣ−９、Ｃ−１４（たとえば、ヒドロキシル化メチル基）、Ｃ−１５、Ｃ−１８、Ｃ−２０およびＣ−４，５位で修飾されたメイタンシノールが挙げられる。
【００１０】
天然に存在するＣ−３エステルおよび合成のＣ−３エステルは、つぎの２つのグループに分類することができる。
（ａ） 単純なカルボン酸とのＣ−３エステル（米国特許第４，２４８，８７０号； 同第４，２６５，８１４号； 同第４，３０８，２６８号； 同第４，３０８，２６９号； 同第４，３０９，４２８号； 同第４，３１７，８２１号； 同第４，３２２，３４８号；および同第４，３３１，５９８号）、および
（ｂ） Ｎ−メチル−Ｌ−アラニンの誘導体とのＣ−３エステル（米国特許第４，１３７，２３０号； 同第４，２６０，６０８号； 同第５，２０８，０２０号； およびＣｈｅｍ． Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． １２：３４４１ （１９８４））。
【００１１】
グループ（ｂ）のエステルはグループ（ａ）のエステルよりも細胞傷害性がかなり高いことが判明した。
【００１２】
メイタンシンは有糸分裂阻害剤である。ｉｎ ｖｉｖｏでＬ１２１０細胞をメイタンシンで処理すると細胞の６７％が有糸分裂状態で集積されるとの報告がなされている。未処理の対照細胞は３．２〜５．８％の範囲の分裂指数を示すことが報告された（Ｓｉｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ． ４３ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９７５， Ｂｉｂｌ． Ｈａｅｍａｔ． ４９５−５００ （１９７６））。メイタンシンは微小管タンパク質チューブリンの重合を阻害して微小管の形成を妨害し、これにより有糸分裂を阻害することが、ウニの卵およびクラムの卵を用いた実験から示唆されている（Ｒｅｍｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １８９：１００２−１００５ （１９７５））。
【００１３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて、Ｐ３８８、Ｌ１２１０、およびＬＹ５１７８マウス白血病細胞懸濁液は、１０−３〜１０−１μｇ／μｌの用量のメイタンシンにより阻害され、最も感受性が高いのはＰ３８８系統であるがことが見いだされている。メイタンシンはまた、ヒト鼻咽腔癌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖の活性阻害剤であることが示され、１０−７ｍｇ／ｍｌ程度の低濃度でヒト急性リンパ芽球性白血病系ＣＥＭが阻害されるとの報告がなされた（Ｗｏｌｐｅｒｔ−ＤｅＦｉｌｌｉｐｐｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ２４：１７３５−１７３８ （１９７５））。
【００１４】
ｉｎ ｖｉｖｏにおいても、メイタンシンは活性であることが示された。Ｐ３８８リンパ性白血病系での腫瘍増殖は５０〜１００倍の用量範囲にわたり阻害されることが示され、高い治療指数であることが示唆された。同様に、Ｌ１２１０マウス白血病系、ヒトルイス肺癌系およびヒトＢ−１６黒色癌系でも、有意な阻害活性を示す可能性がある（Ｋｕｐｃｈａｎ， Ｐｅｄ． Ｐｒｏｃ． ３３：２２８８−２２９５ （１９７４））。
【００１５】
メイタンシノイドと細胞結合剤（抗体など）とをコンジュゲートさせる現在の方法は、２つの反応ステップを必要とする。最初に、抗体などの細胞結合剤をピリジルジチオプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）のような架橋試薬で修飾して抗体中にジチオピリジル基を導入する（Ｃａｒｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． １７３：７２３−７３７ （１９７８）； 米国特許第５，２０８，０２０号）。第２のステップで、チオール基を有するＤＭ１のような反応性メイタンシノイドを修飾された抗体に添加することにより、修飾された抗体中のチオピリジル基を置換してジスルフィドで連結された細胞傷害性メイタンシノイド／抗体コンジュゲートを生成させる（米国特許第５，２０８，０２０号）。
【００１６】
メイタンシノイドと抗体とをコンジュゲートさせる現在の方法には、抗体を２つの反応ステップに付すという欠点があり、したがって、ＳＰＤＰやメイタンシノイドのようなコンジュゲートされていない小さい有機分子からタンパク質を分離するためにゲル濾過を行う２回のタンパク質精製ステップが必要になる。このため、この方法では費用と時間がかかるうえに生成物収率が低くなる。
【００１７】
したがって、反応ステップ数が低減され、それに伴って時間と費用が削減され、しかも収率が増大された、メイタンシノイドと細胞結合剤とをコンジュゲートさせる方法が非常に必要とされている。
【００１８】
（発明の概要）
本発明の１実施形態では、メイタンシノイドと細胞結合剤との細胞傷害性コンジュゲートを製造するワンステップ法を開示する。反応性基をもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドを、細胞結合剤の事前の修飾を行うことなく、抗体のような細胞結合剤に連結させる。このコンジュゲーション法を用いると、感受性の高い抗体蛋白質分子に対する反応時間および処理時間が最小限に抑えられるとともに、タンパク質精製ステップも最小限に抑えられるので、全収率が改良される。このコンジュゲートは、標的細胞に特異的に送達される細胞傷害性の治療剤として有用である。
【００１９】
第２の実施形態では、本発明により、反応性基をもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドを合成する新規な方法を開示する。メイタンシノイドは、低ｐＨ（ｐＨ５以下）または高ｐＨ（ｐＨ８以上）の水性条件に感受性がありかつ水溶液への溶解性が低い有機分子である。本発明で開示されている新規な方法は、有機溶媒中または水性溶媒と有機溶媒との混合物中でメイタンシノイドから反応性基をもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドに変換することにより、これらの問題を克服する。得られた反応性メイタンシノイド誘導体は、水溶液への溶解性がより良好であり、温和な条件下（ｐＨ６〜８）、水性緩衝液中、単一反応ステップで細胞結合剤にコンジュゲートさせることができる。このほかの利点は、この方法で生じたすべてのメイタンシノイド中間体を、コンジュゲートさせる前に十分に分析することができる点である。反応性基をもつジスルフィド部分を有してなる以下に示す化合物２および３ａのような好適なメイタンシノイドの合成については以下で説明する。
【００２０】
本発明の第３の実施形態では、反応性基をもつジスルフィド部分を有してなる化合物２および３ａのようなメイタンシノイドの製造に使用しうる化合物６および１０のような他のメイタンシノイド誘導体の製造方法を開示する。
【００２１】
第４の実施形態では、いくつかの新しいメイタンシノイド、すなわち、化合物２、３ａ、６および１０を提示する。それらの用途としては、新規な細胞傷害性コンジュゲートの製造が挙げられる。
【００２２】
（図面の簡単な説明）
（後述の「図面の簡単な説明」の項を参照されたい）
【００２３】
（発明の詳細な説明）
本発明により、メイタンシノイドと細胞結合剤とを含む細胞傷害性コンジュゲートを合成するワンステップ法を開示する。また本発明により、反応性基をもつジスルフィド部分を有してなる化合物２および３ａのような新規なメイタンシノイドを合成する方法を開示する。このほか、本発明により、化合物６および１０のような新規なメイタンシノイド誘導体を合成する方法を提示する。さらに本発明により、反応性基をもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドの製造に有用である化合物６および１０のような新規なメイタンシノイド誘導体を提示する。さらにまた本発明により、反応性基をもつジスルフィド部分を有してなる化合物２および３ａのような新規なメイタンシノイドを提示する。このメイタンシノイドは、新規な細胞傷害性コンジュゲートを合成するのに有用である。
【００２４】
当業界では、既存の薬物をその細胞傷害能を低下させることなく修飾することはきわめて難しいとみられている。開示された本発明では、適切な細胞結合剤への連結を可能にする反応性化学部分を有するメイタンシノイド分子、特に、ジスルフィド部分と反応性基とを含有するメイタンシノイド分子を修飾する方法を教示することにより、この問題を克服する。その結果、反応性基をもつジスルフィド部分を有してなる開示された新規なメイタンシノイドは、天然に存在するメイタンシノイドの細胞傷害能を保持し、場合により増強することさえある。
【００２５】
細胞傷害性メイタンシノイド−細胞結合剤コンジュゲートを用いると、望ましくない細胞だけが標的化された形でメイタンシノイド誘導体の細胞傷害作用を最大限に発揮させることができるので、非標的健常細胞への損傷に起因した副作用が防止される。したがって、本発明により、死滅または溶解させるべき疾患細胞または異常細胞、たとえば、腫瘍細胞（特に、充実性腫瘍細胞）、ウイルス感染細胞、微生物感染細胞、寄生生物感染細胞、自己免疫細胞（自己抗体を産生する細胞）、活性化細胞（移植片拒絶もしくは移植片対宿主疾患に関与する細胞）、または任意の他のタイプの疾患細胞または異常細胞を最小の副作用で除去するのに有用な作用剤およびその新規な製造方法を提供する。
【００２６】
したがって、本発明により、メイタンシノイドと細胞結合剤とを含む細胞傷害性コンジュゲートを製造するワンステップ法を教示する。さらに本発明により、メイタンシノイド誘導体と、結合形もしくは放出形または両方の状態のいずれかで高い細胞傷害性を保持しつつ細胞結合剤への化学的連結を可能にする反応性基をもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドと、を合成する方法を教示する。最後に、本発明により、反応性基をもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドの製造に有用なメイタンシノイド誘導体と、新規な細胞傷害性コンジュゲートの合成に有用な反応性基をもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドと、を開示する。
【００２７】
本発明に係る細胞傷害性コンジュゲートは、細胞結合剤に連結された１つ以上のメイタンシノイドを含む。メイタンシノイドを細胞結合剤に連結させるために、最初にメイタンシノイドを修飾しなければならない。
【００２８】
細胞結合剤に連結させることのできる反応性メイタンシノイド誘導体を製造するために本発明で使用することのできるメイタンシノイドは、当技術分野で周知であり、公知の方法に従って天然源から単離するかまたは公知の方法に従って合成により調製することができる。
【００２９】
好適なメイタンシノイドとしては、たとえば、メイタンシノールおよびメイタンシノール類似体が挙げられる。好適なメイタンシノール類似体としては、たとえば、修飾された芳香環を有する類似体および他の位置で修飾された類似体が挙げられる。
【００３０】
修飾された芳香環を有するメイタンシノールの好適な類似体の具体例としては、以下のものが挙げられる。
（１） Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，２５６，７４６号）（アンサマイトシンＰ２のＬＡＨ還元により調製される）、
（２） Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４，３６１，６５０号および同第４，３０７，０１６号）（ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓもしくはＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓを用いて脱メチル化によりまたはＬＡＨを用いて脱塩素化により調製される）、
（３） Ｃ−２０−デメトキシ、Ｃ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４，２９４，７５７号）（塩化アシルを用いてアシル化により調製される）。
【００３１】
他の位置で修飾されたメイタンシノールの好適な類似体の具体例としては、以下のものが挙げられる。
（１） Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）（メイタンシノールとＨ２ＳまたはＰ２Ｓ５との反応により調製される）、
（２） Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）、
（３） Ｃ−１４−ヒドロキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）（Ｎｏｃａｒｄｉａから調製される）、
（４） Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓによるメイタンシノールの変換により調製される）、
（５） Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および同第４，３１５，９２９号）（Ｔｒｅｗｉａ ｎｕｄｉｆｌｏｒａから単離される）、
（６） Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号および同第４，３２２，３４８号）（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓによるメイタンシノールの脱メチル化により調製される）、
（７） ４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）（メイタンシノールの三塩化チタン／ＬＡＨ還元により調製される）。
【００３２】
メイタンシノイドを細胞結合剤に連結させるために、メイタンシノイドには連結部分が含まれる。連結部分は、特定の部位における十分に活性なメイタンシノイドの放出を可能にする化学結合を含有する。好適な化学結合は当技術分野で周知であり、たとえば、ジスルフィド結合、酸に不安定な結合、光に不安定な結合、ペプチダーゼに不安定な結合およびエステラーゼに不安定な結合が挙げられる。好ましいのはジスルフィド結合である。
【００３３】
本発明にしたがって、連結部分には反応性化学基が含まれる。好ましい実施形態では、ジスルフィド結合連結部分を介して反応性化学基をメイタンシノイドに共有結合させることができる。
【００３４】
特に好ましい反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。
【００３５】
反応性化学基を含有する連結部分を含んでなる特に好ましいメイタンシノイドは、連結部分がジスルフィド結合を含有しかつ化学反応性基がＮ−スクシンイミジルエステルまたはＮ−スルホスクシンイミジルエステルを含むメイタンシノールＣ−３エステルおよびその類似体である。
【００３６】
連結部分を化学的に連結させる位置としてメイタンシノイド上の多くの位置を利用することができる。たとえば、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ−１４位、ヒドロキシで修飾されたＣ−１５位、およびヒドロキシ基を有するＣ−２０位は、すべて有用であると予想される。しかしながら、Ｃ−３位が好ましく、メイタンシノールのＣ−３位は特に好ましい。
【００３７】
連結部分を有するメイタンシノールエステルの合成についてジスルフィド結合を含有する連結部分に関して以下で説明するが、当業者であれば、他のメイタンシノイドを使用することができるのと同様に、他の化学結合（先に記載したとおり）を有する連結部分を本発明で使用することもできることが理解されよう。他の化学結合の具体例としては、酸に不安定な結合、光に不安定な結合、ペプチダーゼに不安定な結合およびエステラーゼに不安定な結合が挙げられる。本明細書に組み入れられる米国特許第５，２０８，０２０号の開示には、そのような結合をもつメイタンシノイドの製造法が教示されている。
【００３８】
メイタンシノイド誘導体および反応性基をもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドの合成については、図１〜４を参照することにより記述することができる。ここでは、ジスルフィド含有メイタンシノイドエステルが調製される。
【００３９】
本発明の方法では、ほとんどの場合、正式にはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシンと命名されるチオール含有メイタンシノイド（ＤＭ１）が出発試薬として利用される。ＤＭ１は以下の構造式（１）で表される。
【化４】
2004520450.tif 000002
【００４０】
細胞傷害性コンジュゲートの製造法
本発明の代表的な細胞傷害性コンジュゲートは、抗体／メイタンシノイド、抗体フラグメント／メイタンシノイド、表皮増殖因子（ＥＧＦ）／メイタンシノイド、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）／メイタンシノイド、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）／メイタンシノイド、エストロゲン／メイタンシノイド、エストロゲン類似体／メイタンシノイド、アンドロゲン／メイタンシノイドおよびアンドロゲン類似体／メイタンシノイドである。
【００４１】
反応性基含有メイタンシノイドを細胞結合剤と反応させることにより細胞傷害性コンジュゲートを製造する。このコンジュゲートは、ＨＰＬＣによりまたはゲル濾過により精製しうる。
【００４２】
スキーム１：
より具体的には、反応性基をもつジスルフィド部分を有してなるモル過剰のメイタンシノイドと共に水性緩衝液に抗体を加えた溶液をインキュベートすることが可能である。過剰のアミン（たとえば、エタノールアミン、タウリンなど）を添加することにより、反応混合物の反応を停止させることができる。次に、メイタンシノイド−抗体コンジュゲートをゲル濾過により精製することが可能である。
【００４３】
抗体１分子あたりの結合されたメイタンシノイド分子の数は、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度の比を分光光度法で測定することにより決定することができる。この方法により、抗体１分子あたり平均で１〜１０個のメイタンシノイド分子を連結させることができる。
【００４４】
本発明に係る細胞結合剤とメイタンシノイド薬物とのコンジュゲートが種々の望ましくない細胞系の増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏで抑制する能力に関して評価することができる。これらの化合物の細胞傷害性を評価するために、たとえば、ヒト類表皮癌系Ａ−４３１、ヒト小細胞肺癌細胞系ＳＷ２、ヒト乳房腫瘍系ＳＫＢＲ３およびＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫系Ｎａｍａｌｗａのような細胞系を容易に使用することができる。評価対象の細胞を化合物に２４時間暴露し、公知の方法により直接アッセイで細胞の生存率を測定することができる。次に、アッセイの結果からＩＣ５０値を計算することができる。
【００４５】
反応性基をもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドの製造法
本発明に開示されている、反応性基をもつジスルフィド部分を有してなる新規なメイタンシノイドは、式１１
ＤＭ１−Ｓ−Ｓ−ＣＲ１Ｒ２−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２−Ｘ （１１）
〔式中、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５、線状または分枝状の高級アルキルであり、
ｎは１〜５であり、かつ
Ｘは、活性エステルの一部分であり、Ｎ−スクシンイミジル、Ｎ−スルホスクシンイミジル、Ｎ−フタルイミジル、Ｎ−スルホフタルイミジル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、３−スルホニル−４−ニトロフェニル、または３−カルボキシ−４−ニトロフェニルの形をとることができる。〕
で表される化合物である。
【００４６】
線状アルキルとしては、たとえば、プロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられる。
【００４７】
分枝状アルキルとしては、たとえば、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソペンチルおよび１−エチル−プロピルが挙げられる。
【００４８】
式１１の好ましい実施形態としては、反応性ＣＯ２−Ｘエステル〔式中、Ｘは、Ｎ−スクシンイミジルまたはＮ−スルホスクシンイミジルである。〕をもつジスルフィド部分を有してなる上記メイタンシノイドが挙げられる。式１１のより好ましい実施形態としては、反応性基をもつジスルフィド部分を有してなる上記メイタンシノイドのうち、Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＣＨ３であり、ｎが２であり、かつＣＯ２−Ｘが活性Ｎ−スクシンイミジルエステル（化合物２）であるかまたはＣＯ２−Ｘが活性Ｎ−スルホスクシンイミジルエステル（化合物３ａ）であるメイタンシノイドが挙げられる。
【００４９】
反応性基をもつジスルフィド部分を有してなる新規なメイタンシノイドは、以下の新たに開示された方法により調製することが可能である。
【００５０】
スキーム２ａ：   無水有機溶媒中、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド．ＨＣｌ（ＥＤＣ．ＨＣｌ）の存在下、周囲温度で、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシン（化合物６）をＮ−ヒドロキシスクシンイミドと約１〜１２時間反応させることにより、反応性Ｎ−スクシンイミジルエステルをもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイド（化合物２）を調製することが可能である。反応の終了は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）または高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のような標準的な化学的方法によりモニターすることが可能である。反応の終了後、反応性Ｎ−スクシンイミジルエステルをもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイド誘導体（化合物２）を、シリカゲルクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣを用いて精製することが可能である。ＥＤＣ．ＨＣｌ以外の縮合剤、たとえば、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を反応に使用することも可能である。
【００５１】
スキーム２ｂ：  反応性Ｎ−スクシンイミジルエステルをもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイド（化合物２）を別の方法により調製することも可能である。４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＰ）（化合物７）のメタノール溶液をＤＭ１のメタノール溶液で処理する。酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３〜５）を添加し、アルゴン雰囲気下、室温で反応混合物を攪拌する。Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８カラムを用いてＨＰＬＣにより反応の進行をモニターすることが可能である。ＨＰＬＣにより生成物２を精製することが可能である。
【００５２】
スキーム３ａ：  無水有機溶媒（たとえば、塩化メチレン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル）中、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド．ＨＣｌ（ＥＤＣ．ＨＣｌ）（酸（６）よりも１〜２倍モル過剰）の存在下で、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシン（化合物６）をＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（酸（６）よりも１〜２倍モル過剰）と反応させることにより、反応性Ｎ−スルホスクシンイミジルエステルをもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイド（化合物３ａ）を調製することが可能である。反応の終了は、ＴＬＣまたはＨＰＬＣのような標準的な化学的方法を用いてモニターすることが可能である。反応の終了後、シリカゲルクロマトグラフィーにより、もしくはＨＰＬＣにより、または大量の酢酸エチルを添加して沈殿させることにより（Ｓｔａｒｏｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， １９８２， ２１：３９５０−３９５５に記載されているＮ−スルホスクシンイミジルエステルの一般的な調製方法に類似した方法）、反応性のＮ−スルホスクシンイミジルエステル（化合物３ａ）をもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイド誘導体を精製することが可能である。ＥＤＣ．ＨＣｌ以外の縮合剤を反応に使用することも可能である。
【００５３】
スキーム３ｂ：  反応性Ｎ−スルホスクシンイミジルエステルをもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイド（化合物３ａ）を別の方法により調製することも可能である。４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタン酸Ｎ−スルホスクシンイミジル（スルホ−ＳＰＰ）（化合物８）のメタノール溶液をＤＭ１のメタノール溶液で処理する。酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３〜５）を添加し、アルゴン雰囲気下、室温で反応混合物を攪拌する。ＨＰＬＣにより反応の進行をモニターすることが可能である。ＨＰＬＣにより生成物３ａを精製することが可能である。
【００５４】
メイタンシノイド誘導体の製造法
スキーム４ａおよび４ｂには、ＤＭ１（１）からメイタンシノイド誘導体を製造する新規な方法が開示されている。このメイタンシノイド誘導体６は、正式にはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシンと命名され、次式で表される。
ＤＭ１−Ｓ−Ｓ−ＣＲ１Ｒ２−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ （６）
Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＣＨ３、ｎ＝２
【００５５】
いくつかの細胞傷害性メイタンシノイド−細胞結合剤コンジュゲートを調製する際、メイタンシノイド誘導体６を直接使用することが可能である。好ましくは、先にスキーム２ａおよび３ａに記載した新規な方法を用いて反応性基をもつジスルフィド部分を有してなる新規なメイタンシノイドを製造する際、メイタンシノイド誘導体６を使用する。
【００５６】
スキーム４ａ：   ＤＭ１と４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタン酸（化合物５）との間のジスルフィド交換によりメイタンシノイド誘導体６を合成することが可能である。４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタン酸のメタノール溶液をＤＭ１のメタノール溶液で処理する。リン酸カリウム緩衝液を添加し、アルゴン雰囲気下、室温で反応混合物を攪拌する。ＨＰＬＣにより反応の進行をモニターすることが可能である。ＨＰＬＣにより生成物６を精製することが可能である。精製された生成物をＨＰＬＣにより再び分析することが可能である。化合物６のナトリウム塩の高分解能質量分析により、生成物の同定を行うことが可能である。
【００５７】
スキーム４ｂ：  メイタンシノールをＮ−メチル−Ｎ−（３−メルカプトプロパノイル）−Ｌ−アラニンと４−メルカプトペンタン酸トリメチルシリルエチルとの混合ジスルフィド（化合物９）とカップリングさせてメイタンシノイドエステル（化合物１０）を生成させ、次に、これを脱保護して化合物６を得る別の方法により、メイタンシノイド誘導体６を調製することも可能である。
【００５８】
細胞結合剤の調製法
治療剤としての本発明の化合物の有効性は、適切な細胞結合剤の注意深い選択に依存する。細胞結合剤は、現在知られているかまたは知られるようになる任意の種類の細胞結合剤であってよく、ペプチドおよび非ペプチドを包含する。一般的には、これらは、抗体（特に、モノクロナール抗体）、リンホカイン、ホルモン、増殖因子、ビタミン、栄養素輸送分子（たとえば、トランスフェリン）、または他の任意の細胞結合分子もしくは物質でありうる。
【００５９】
使用することのできる細胞結合剤のより具体的な例としては、以下のものが挙げられる。
ポリクロナール抗体；
モノクロナール抗体；
抗体のフラグメント、たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｖ（Ｐａｒｈａｍ， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３１：２８９５−２９０２ （１９８３）； Ｓｐｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １１３：４７０−４７８ （１９７４）； Ｎｉｓｏｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ８９：２３０−２４４ （１９６０））；
インターフェロン（たとえば、α、β、γ）；
リンホカイン、たとえば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６；
ホルモン、たとえば、インスリン、ＴＲＨ（甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン）、ＭＳＨ（メラニン細胞刺激ホルモン）、アンドロゲンやエストロゲンのようなステロイドホルモン；
増殖因子およびコロニー刺激因子、たとえば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｕｒｇｅｓｓ， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ５：１５５−１５８ （１９８４））；
トランスフェリン（Ｏ’Ｋｅｅｆｅ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：９３２−９３７ （１９８５））；ならびに
ビタミン、たとえば、葉酸塩。
【００６０】
モノクロナール抗体技術により、特異的モノクロナール抗体の形できわめて特異的な細胞結合剤を製造することが可能である。当技術分野で特に知られているのは、対象の抗原、たとえば、インタクトな標的細胞、標的細胞から単離された抗原、全ウイルス、弱毒化全ウイルス、およびウイルスコートタンパク質のようなウイルスタンパク質で、マウス、ラット、ハムスターまたは他の任意の哺乳動物を免疫することにより産生されるモノクロナール抗体を作製する技術である。感作されたヒト細胞を使用することもできる。モノクロナール抗体を作製する他の方法は、ｓｃＦｖ（１本鎖可変領域）、特にヒトｓｃＦｖのファージライブラリーを使用する方法である（たとえば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓらの米国特許第５，８８５，７９３号および同第５，９６９，１０８号； ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙらのＷＯ ９２／０１０４７； ＬｉｍｉｎｇらのＷＯ ９９／０６５８７を参照されたい）。このほか、ヒト化抗体が使用可能であるのと同様に、米国特許第５，６３９，６４１号に開示されている表面変更（ｒｅｓｕｒｆａｃｅ）された抗体を使用することも可能である。
【００６１】
適切な細胞結合剤の選択は、標的化の対象となる特定の細胞集団に応じて選択すべき問題であるが、一般的には、適切な抗体を入手できるのであれば、ヒトモノクロナール抗体が好ましい。
【００６２】
たとえば、モノクロナール抗体Ｊ５は、共通急性リンパ芽球性白血病抗原（ＣＡＬＬＡ）に特異的なマウスＩｇＧ２ａ抗体であり（Ｒｉｔｚ ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒｅ ２８３：５８３−５８５ （１９８０））、標的細胞が急性リンパ芽球性白血病のようにＣＡＬＬＡを発現する場合に使用することができる。同様に、モノクロナール抗体抗Ｂ４は、Ｂ細胞上のＣＤ１９抗原に結合するマウスＩｇＧ１であり（Ｎａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３１：２４４−２５０ （１９８３））、標的細胞が非Ｈｏｄｇｋｉｎリンパ腫または慢性リンパ芽球性白血病のようにこの抗原を発現するＢ細胞または疾患細胞である場合に使用することができる。
【００６３】
さらに、急性骨髄性白血病の疾患細胞に対する細胞結合剤として、骨髄性細胞に結合するＧＭ−ＣＳＦを使用することが可能である。移植片拒絶の予防、移植片対宿主疾患の治療および予防、ならびに急性Ｔ細胞白血病の治療のために、活性化されたＴ細胞に結合するＩＬ−２を使用することができる。黒色腫の治療のために、メラニン細胞に結合するＭＳＨを使用することができる。
【００６４】
エストロゲン（もしくはエストロゲン類似体）またはアンドロゲン（もしくはアンドロゲン類似体）を細胞結合剤として用いることにより、それぞれ、乳房および精巣の癌をうまく標的化することができる。
【００６５】
（実施例）
次に、実施例を参照することにより本発明について具体的に説明するが、これらの実施例に限定されるものではない。特に記載のない限り、パーセント、比、部などはすべて重量基準である。以下に記載の実施例は、Ｒ１がＨであり、Ｒ２がＣＨ３であり、かつｎが２である分子である。Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立してＨ、ＣＨ３、Ｃ２Ｈ５または高級アルキルでありかつｎが１〜５である他の分子についても、類似の合成を行うことができる。
【００６６】
実施例１ａ
メイタンシノイド２を用いる細胞傷害性コンジュゲートの調製
２０％の最終ＤＭＡ濃度を与えるジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に加えられた６倍モル過剰のメイタンシノイド２と共に、ｐＨ６．５の水性緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩）にｈｕＮ９０１抗体（２．５ｍｇ／ｍＬ）を加えた溶液をインキュベートした。周囲温度で反応を１３時間進行させた。反応混合物を２つの部分に分けた。一方の部分は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲル濾過カラムに通して精製し、第２の部分は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００ゲル濾過カラムに通して精製した。いずれの場合においても、モノメリック（ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ）コンジュゲートを含有する画分をプールした。２８０および２５２ｎＭにおける抗体成分およびＤＭ１成分の既知の吸光係数（ｈｕＮ９０１の吸光係数：ε２８０ｎｍ＝２１７，５６０ Ｍ−１ｃｍ−１およびε２５２ｎｍ＝８０，０６２ Ｍ−１ｃｍ−１；ＤＭ１の吸光係数ε２８０ｎｍ＝５，７００ Ｍ−１ｃｍ−１およびε２５２ｎＭ＝２６，７９０ Ｍ−１ｃｍ−１）を用いて分光光度法によりコンジュゲートの濃度を決定した。
【００６７】
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５クロマトグラフィーによる精製では、抗体１分子あたり平均で２．０８個の連結されたＤＭ１分子を含有するコンジュゲートが得られた（出発抗体を基準にした収率＝６０％）。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００クロマトグラフィーによる精製では、抗体１分子あたり平均で１．６１個の連結されたＤＭ１分子を含有するコンジュゲートが得られた（出発抗体を基準にした収率＝６４％）。
【００６８】
実施例１ｂ
メイタンシノイド３ａを用いる細胞傷害性コンジュゲートの調製
２０％の最終ＤＭＡ濃度を与えるジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）に加えられた１２倍モル過剰のメイタンシノイド３ａと共に、ｐＨ６．５の水性緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、５０ｍＭ塩化ナトリウム、２ｍＭエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩）にｈｕＮ９０１抗体（２．５ｍｇ／ｍＬ）を加えた溶液をインキュベートした。周囲温度で反応を１１時間進行させた。反応混合物を２つの部分に分けた。一方の部分は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲル濾過カラムに通して精製し、第２の部分は、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００ゲル濾過カラムに通して精製した。いずれの場合においても、モノメリックコンジュゲートを含有する画分をプールした。２８０および２５２ｎＭにおける抗体成分およびＤＭ１成分の既知の吸光係数（ｈｕＮ９０１の吸光係数：ε２８０ｎｍ＝２１７，５６０ Ｍ−１ｃｍ−１およびε２５２ｎｍ＝８００６２ Ｍ−１ｃｍ−１；ＤＭ１の吸光係数ε２８０ｎｍ＝５７００ Ｍ−１ｃｍ−１およびε２５２ｎＭ＝２６７９０ Ｍ−１ｃｍ−１）を用いて分光光度法によりコンジュゲートの濃度を決定した。
【００６９】
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５クロマトグラフィーによる精製では、抗体１分子あたり平均で４．８９個の連結されたＤＭ１分子を含有するコンジュゲートが得られた（出発抗体を基準にした収率＝５９％）。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００クロマトグラフィーによる精製では、抗体１分子あたり平均で４．１６個の連結されたＤＭ１分子を含有するコンジュゲートが得られた（出発抗体を基準にした収率＝５８％）。
【００７０】
実施例２ａ
反応性Ｎ−スクシンイミジルエステルをもつメイタンシノイド誘導体（２）の合成
すべての反応をアルゴン雰囲気下で行った。試薬はすべて、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙから購入したものであった。Ｂｒｕｋｅｒ ４００ ＭＨｚ装置により核磁気共鳴（１Ｈ ＮＭＲ）スペクトルを取得し、Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ Ｅｓｑｕｉｒｅ ３０００装置によりエレクトロスプレーイオン化を用いて質量スペクトルを取得した。
【００７１】
チオール含有メイタンシノイド（Ｌ−ＤＭ１、化合物１）の合成については、既に記載されている（米国特許第５，２０８，０２０号）。
【００７２】
４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタン酸（ＰＰＡ、化合物５）の調製：  １Ｌ二口フラスコに、攪拌子、添加漏斗および温度計を配置した。１５０ｇの１，３−ジブロモブタン（０．７４モル）および７００ｍＬのジメチルスルホキシドをフラスコに仕込んだ。シアン化ナトリウム（３７．５ｇ、０．７６モル）を脱イオン水（７９ｍＬ）に加えた溶液を、反応温度が６５℃を超えない速度で滴下した。添加が終了した後、反応液を一晩攪拌した。７００ｍＬの脱イオン水で混合物を希釈し、酢酸エチル：ヘキサンの１：１溶液（２×１．４Ｌ）で抽出した。有機層を合わせて、７００ｍＬの脱イオン水および７００ｍＬの飽和塩化ナトリウム水溶液で逐次的に洗浄した。減圧下（約１５トル）で溶媒を蒸発させた。残渣を２１０ｍＬの試薬等級エタノールに溶解させ、１Ｌフラスコに移した。次に、脱イオン水（２１０ｍＬ）およびチオ尿素（６６．４ｇ、０．８７モル）をフラスコに添加した。フラスコに還流冷却器を取り付け、攪拌しながら油浴中で加熱して穏やかに還流させた。４時間後、油浴を取り除き、フラスコを室温まで冷却させた。１０Ｍ水酸化ナトリウム溶液（５００ｍＬ）を添加し、混合物を攪拌しながら油浴中で一晩加熱して穏やかに還流させた。油浴を取り除き、フラスコを室温まで冷却させた。溶液を分液漏斗に移し、５００ｍＬずつに分けた酢酸エチルで２回洗浄した。水性層を２Ｌフラスコに移し、氷／水浴中で冷却させた。酢酸エチル（１Ｌ）を添加し、水性層を調べて約ｐＨ２になるまで、濃ＨＣｌを添加しながら内容物を迅速に攪拌した。酢酸エチル層を分離し、水性層を酢酸エチル（２×１Ｌ）で抽出した。有機層を合わせ、室温でロータリーエバポレーションにより濃縮して４−メルカプトペンタン酸を得た。さらなる精製を行うことなく、これを次のステップで使用した。
【００７３】
攪拌子の入った２Ｌフラスコに、２−２’−ジチオジピリジン（３００ｇ、１．３６モル）、試薬等級エタノール（１Ｌ）および氷酢酸（４２ｍＬ）を仕込んだ。粗製４−メルカプトペンタン酸を酢酸エチル（４００ｍＬ）に加えた溶液を１５分間かけて滴下し、アルゴン下で反応液をさらに２時間攪拌した。ロータリーエバポレーションにより溶媒を除去し、最小量の酢酸エチルに残渣を溶解させ、シリカゲルカラム（６．２５×２７ｃｍ）を用いてカラムクロマトグラフィーにより精製した。未反応の２，２’−ジチオピリジン（Ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２）がすべて除去されるまで、４：１ヘキサン：酢酸エチルでカラムから溶出させた。次に、２％の酢酸を含有する４：１ヘキサン：酢酸エチルでカラムから溶出させた。ＴＬＣにより溶出をモニターし、画分を合わせた。次に、減圧下でロータリーエバポレーションにより溶媒を除去し、純粋な４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタン酸（ＰＰＡ、化合物５）を白色固体（４０ｇ、全収率２３％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣｌ３） δ１．３９ （ｄ， ３Ｈ）， ２．０ （ｔ， ２Ｈ）， ２．５６ （ｔ， ２Ｈ）， ２．８−３．３ （ｍ， １Ｈ）， ６．８−７．２ （ｍ， １Ｈ）， ７．６−７．８ （ｍ， ２Ｈ）， ８．４−８．６ （ｍ， １Ｈ）， １１．６８ （ｓ， １Ｈ）。
【００７４】
Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシン（Ｌ−ＤＭ１−ＴＰＡ、化合物６）の調製：  ４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタン酸（化合物５、２４ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）およびＬ−ＤＭ１（化合物１、３０ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）をガラス容器中で蒸留された（ｇｌａｓｓ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ）メタノール（５ｍＬ）に加えた溶液を激しく攪拌し、３ｍＬの水性緩衝液（２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．６）を滴下した。反応液を一晩放置し、そしてＶｙｄａｃ Ｃ−１８、１０×２５０ｍｍカラム、３０℃、流速４．７５ｍＬ／分を用いてｐＨ７．２の４０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液中でアセトニトリルの直線濃度勾配（３０分かけて１５％から８５％へ）を加えながらＨＰＬＣにより生成物を精製した。Ｌ−ＤＭ１−ＴＰＡ（６）は、１２分の保持時間で溶出した。生成物をアンモニウム塩として回収し、１５ｍＬの酢酸エチルに溶解させた。４ｍＬの１Ｍ ＨＣｌそれに続いて３ｍＬの飽和塩化ナトリウム溶液で逐次的に溶液を洗浄した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を脱水し、真空下で溶媒を除去し、１５ｍｇ（収率３７％）の生成物６を得た。高分解能質量分析により生成物の同定を行った。ナトリウム化分子イオンに対する計算値＝８９２．２８９１、実測値＝８９２．２９５５。Ｈ１ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ６．８４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１ Ｈｚ）， ６．７６ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝７，１ Ｈｚ）， ６．５９ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝１４， １１ Ｈｚ）， ６．３２−６．６４ （ｍ， ２Ｈ）， ５．６−５．７ （ｍ， １Ｈ）， ５．１３−５．２３ （ｍ， １Ｈ）， ４．８３ （ｄｔ， １Ｈ， Ｊ＝９，３ Ｈｚ）， ４．３１ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝１２，１ Ｈｚ）， ３．９９ （ｓ， ３Ｈ）， ３．６３ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝１３，１ Ｈｚ）， ３．４９ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝９ Ｈｚ）， ３．３６ （ｓ， ３Ｈ）， ３．２２ （ｄ， ３Ｈ， Ｊ＝１ Ｈｚ）， ３．１２ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝１２，１ Ｈｚ）， ２．７５−２．９１ （ｍ， ５Ｈ） ２．５４−２．７２（ｍ， ４Ｈ）， ２．３４−２．５２ （ｍ， ２Ｈ）， ２．２０ （ｄｄ， ３Ｈ， Ｊ＝１３，１ Ｈｚ）， １．７−１．９ （ｍ， ４Ｈ）， １．６６ （ｓ， ３Ｈ）， １．４２−１．５ （ｍ， ２Ｈ）， １．３７ （ｄｄ， ３Ｈ， Ｊ＝９，１ Ｈｚ）， １．２−１．３ （ｍ， ７Ｈ）， ０．８１ （ｓ， ３Ｈ）。
【００７５】
Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシンのＮ−スクシンイミジルエステル（Ｌ−ＤＭ１−ＴＰＡスクシンイミジルエステル、化合物２）の調製：  Ｌ−ＤＭ１−ＴＰＡ（６）（１０ｍｇ、０．０１１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１．５ｍＬ）に加えた溶液を、激しく攪拌しながら、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）および１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド．ＨＣｌ（２１ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）で処理した。反応を２時間進行させ、その後、溶媒の約半分を真空下で除去した。（塩化メチレン：メタノール９５：５）の移動相を用いて残存溶液を分取薄層クロマトグラフィー（厚さ２０００ミクロンの２枚のシリカプレート）にかけた。所望の生成物（２）のバンドをプレートから掻取って２０ｍＬの（塩化メチレン：メタノール８０：２０）と共に攪拌し、そして焼結ガラス漏斗に通して真空濾過した。真空下で濾液を濃縮し、（８ｍｇ、０．００８３ｍｍｏｌ、収率７５％）の生成物を得た。質量スペクトル分析により、Ｍ＋＋Ｎａ ９８９．４に一致する基準ピークイオンが確認された。９８９．４イオンのフラグメント化により、化合物２の構造に一致する娘イオンが生成された。Ｈ１ ＮＭＲ （４００ ＭＨｚ， ＣＤＣｌ３） δ６．９６ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１．８ Ｈｚ）， ６．８１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１．８ Ｈｚ）， ６．４８ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝１５，１１ Ｈｚ）， ６．２７ （ｓ， １Ｈ）， ６．１４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１１ Ｈｚ）， ５．５３ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝１５， ９．３ Ｈｚ）， ５．４１ （ｑ， １Ｈ， Ｊ＝６．９ Ｈｚ）， ４．３６ （ｄｄ， １Ｈ， Ｊ＝１２，１ Ｈｚ）， ３．９９ （ｓ， ３Ｈ）， ３．６６ （ｓ， １Ｈ）， ３．５４ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝９．３ Ｈｚ）， ３．４−３．５４ （ｍ， ５Ｈ）， ３．３６ （ｓ， ３Ｈ）， ３．３５ （ｓ， ３Ｈ）， ３．２１ （ｓ，３Ｈ）， ３．１２ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝１２．７ Ｈｚ）， ２．８８ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝５．４ Ｈｚ）， ２．７ （ｓ， ４Ｈ）， ２．５−２．６５ （ｍ， ５Ｈ）， ２．１ （ｄ， １Ｈ， Ｊ＝９．４ Ｈｚ）， １．６９ （ｓ， ３Ｈ）， １．４５−１．５５ （ｍ， ２Ｈ）， １．１−１．３ （ｍ， １０Ｈ）， ０．８３ （ｓ， ３Ｈ）。
【００７６】
実施例２ｂ
反応性Ｎ−スクシンイミジルエステルをもつメイタンシノイド誘導体（２）を合成する別の方法
４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタン酸（ＳＰＰ、化合物７）のＮ−スクシンイミジルエステルの調製：  ４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタン酸（５、３０ｇ、１２３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５２５ｍＬ）に加えた溶液を、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１４．３ｇ、１２４ｍｍｏｌ）および１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド．ＨＣｌ（３１．８ｇ、１６５ｍｍｏｌ）で処理した。室温で内容物を２時間攪拌し、その後、７５０ｍＬの酢酸エチルを添加した。０．５％の酢酸水溶液（３５０ｍＬ）で溶液を３回洗浄し、さらに１５０ｍＬの飽和塩化ナトリウム水溶液で１回洗浄した。無水硫酸ナトリウムを用いて有機層を脱水し、濾過し、そしてロータリーエバポレーションにより真空下で溶媒を除去した。残渣を最小量の酢酸エチルに溶解させ、１：１ヘキサン：酢酸エチルを用いてスラリー充填された６．２５×２０ｃｍシリカカラムに供給した。１：１ヘキサン：酢酸エチルでカラムから溶出させた。生成物を含有する画分を合わせ、ロータリーエバポレーションにより溶媒を除去した。得られた油状物（３１ｇ）を加温した最小量の試薬等級エタノールに溶解させ、磁気攪拌しながら３５０ｍＬのエチルエーテルを添加し続いて１００ｍＬのヘキサンを添加した。得られた沈殿物を真空濾過により回収し、３０℃の真空オーブン中で１２時間乾燥させることにより、１８．７ｇのＳＰＰ（７）を白色固体（１８．７ｇ、収率４５％）として得た。１Ｈ ＮＭＲ （ＣＤＣＬ３） δ１．３９ （ｄ， ３ Ｈ）， ２．０ （ｔ， ３Ｈ）， ２．５６−３．４ （ｍ， ７ Ｈ）， ６．８−７．２ （ｍ， １ Ｈ）， ７．６−７．８ （ｍ， ２Ｈ）， ８．４−８．６ （ｄ， １Ｈ）。元素分析：計算値： ％Ｃ ４９．４； ％Ｈ ４．７０； ％Ｎ ８．２０； ％Ｓ １８．８０、実測値： ％Ｃ ４９．３ ％Ｈ ４．６８， ％Ｎ ８．１８， ％Ｓ １８．９４。
【００７７】
Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシンのＮ−スクシンイミジルエステル（Ｌ−ＤＭ１−ＴＰＡスクシンイミジルエステル、化合物２）の調製：  ４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタン酸のＮ−スクシンイミジルエステル（ＳＰＰ、化合物７、３ｍｇ、１５μｍｏｌ）をメタノール（１５ｍｌ）に加えた溶液を、ジメチルアセトアミド（０．１ｍｌ）中のＤＭ１（化合物１、０．５８ｍｇ、０．８μｍｏｌ）と反応させた。リン酸カリウム緩衝液（０．５ｍｌの０．２Ｍ溶液、ｐＨ６、２ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加し、アルゴン雰囲気下、室温で、反応混合物を攪拌した。先に述べたように、反応の進行をシリカゲルＴＬＣによりモニターし、生成物を分取シリカゲルＴＬＣにより精製した。
【００７８】
実施例３ａ
反応性Ｎ−スルホスクシンイミジルエステルをもつメイタンシノイド誘導体（３ａ）の合成
Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシンのＮ−スルホスクシンイミジルエステル（Ｌ−ＤＭ１−ＴＰＡスルホスクシンイミジルエステル、化合物３ａ）の調製：  Ｌ−ＤＭ１−ＴＰＡ（化合物６、２ｍｇ ０．００２ｍｍｏｌ）をジメチルアセトアミド（０．２５ｍＬ）に溶解させ、これにＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドナトリウム塩（１．０ｍｇ、０．００４６ｍｍｏｌ）およびジシクロヘキシルカルボジイミド（１．０ｍｇ、０．００４８ｍｍｏｌ）を添加した。３時間後、０．５ｍＬのジイソプロピルアルコールを添加し、得られた沈殿物を濾過により除去した。濾液のＨＰＬＣ分析（Ｖｙｄａｃ Ｃ−１８カラム、１０×２５０ Ｃ１８カラム、３０℃、流速４．７５ｍＬ／分、５０ｍＭギ酸トリエチルアンモニウムｐＨ３．８緩衝液を用いて、メタノールの直線濃度勾配（３０分かけて３０％から９０％へ）を加えた）を行ったところ、２つの主要なピークが得られた。一方は２２分溶出の未反応Ｌ−ＤＭ１−ＴＰＡに対するピークであり、他方は１９分溶出のＬ−ＤＭ１−ＴＰＡスルホスクシンイミジルエステルに対するピークである。１９分で溶出する化合物を単離して質量分析により調べたところ、３ａの二ナトリウム化分子イオン（Ｍ＋＋２Ｎａ）、ｍ／ｅ １０９１．４に一致する予想されたピークを有する化合物であることが判明した。１０９１．４イオンのさらなるフラグメント化により、予測可能な娘イオン、ｍ／ｅ １０７３．４（Ｍ＋＋２Ｎａ−Ｈ２Ｏ）、８７４．４（Ｍ＋＋２Ｎａ−ナトリウム化Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）が生成された。
【００７９】
Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−［３−（３−カルボキシ−１−メチル−プロピルジチオ）−１−オキソプロピル］−メイタンシン（Ｌ−ＤＭ１−ＴＰＡ、化合物６）および４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタン酸（ＰＰＡ、化合物５）の調製については、先の実施例２ａに記載した。
【００８０】
実施例３ｂ
反応性Ｎ−スルホスクシンイミジルエステルをもつメイタンシノイド誘導体（３ａ）を合成する別の方法
ＤＭ１（１）をｓｕｌｆｏＳＰＰ（４−（２−ピリジルジチオ）−ペンタン酸のＮ−スルホスクシンイミジルエステル、化合物８）のナトリウム塩と反応させることにより、メイタンシノイド３ａを直接調製することもできる。ｓｕｌｆｏＳＰＰのナトリウム塩（８ａ）は、ＳＰＰ（７）に対して記載した方法により、ＥＤＣ．ＨＣｌの存在下でＰＰＡ（５）をＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミドのナトリウム塩とカップリングさせることにより調製することができる（先の実施例２ａを参照されたい）。ジメチルアセトアミドおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するｐＨ６のリン酸カリウム緩衝液中、周囲温度で、ＤＭ１を２０倍モル過剰の８ａと反応させると、メイタンシノイド３ａが得られ、実施例３ａに記載されているように、これをＨＰＬＣにより精製することができる。
【００８１】
実施例４
メイタンシノイド誘導体（６）を合成する別の方法
図５に概略が示されるように、メイタンシノールからメイタンシノイド６を直接調製することもできる。化合物９は、ＰＰＡ（５）の（２−トリメチルシリル）エチルエステルとＮ−メチル−Ｎ−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−Ｌ−アラニンとのジスルフィド交換により調製される。シリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィーにより生成物を精製することができる。既に記載されているように（米国特許第５，２０８，０２０号）、ジクロロメタン中、ＤＣＣ（７．２当量）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）または塩化亜鉛（１当量）の存在下で、メイタンシノールを６当量の化合物９でエステル化すると、メイタンシノイド１０が得られ、シリカゲルクロマトグラフィーまたはＨＰＬＣのような標準的な化学的手段により、これを精製することができる。テトラヒドロフラン中、室温で、化合物１０を５当量のテトラブチルアンモニウムフルオリドで３０分間処理すると、（トリメチルシリル）エチル保護基の開裂が起こり、化合物６が生成される。実施例２ａに記載されているように、これをＨＰＬＣにより精製することができる。
【００８２】
実施例５
ｉｎ ｖｉｔｒｏ効力に関するｈｕＮ９０１−ＤＭ１コンジュゲートの評価
この新しいワンステップ法により調製されたｈｕＮ９０１−ＤＭ１コンジュゲートの抗原発現細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞傷害性を、次のように評価した。ｈｕＮ９０１（ＮＣＡＭ／ＣＤ５６）に対する抗原を構成的に発現するＡ４３１細胞のクローンをこのアッセイで使用した。１０％ウシ胎仔血清およびペニシリン＋ストレプトマイシンを添加した２ｍｌのＤＭＥＭ培地中、２×１０３細胞／ウェルの密度で、６ウェル組織培養処理プレートに細胞をプレーティングした。プレーティング時にｈｕＮ９０１−ＤＭ１コンジュゲートまたは対照ｈｕＮ９０１抗体をウェルに添加し、組織培養インキュベーター中、３７℃、６％ ＣＯ２で、培養物を５〜７日間インキュベートし、２５細胞／コロニー以上のコロニーを形成させた。次に、ＰＢＳでプレートを洗浄してから、ＰＢＳ中の１０％ホルムアルデヒド／０．２％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレットを用いて３０分間かけて室温で固定／染色した。ウェルを水で３回すすぎ、空気乾燥させ、そして解剖用低倍率顕微鏡下でコロニーを数えた。薬物処理されたウェル中のコロニー数／未処理のウェル中のコロニー数として生存率を計算した。
【００８３】
メイタンシノイド２を用いてワンステップ法により調製され、続いてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５またはＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００クロマトグラフィーにより精製されたｈｕＮ９０１−ＤＭ１コンジュゲートは、抗原陽性細胞を死滅させる効力が高く、ＩＣ５０値は１×１０−１０Ｍであったことが、結果（図１）により示される。これとは対照的に、コンジュゲートされていないｈｕＮ９０１抗体は非傷害性であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】
化合物２を用いて本発明の方法により調製し続いてＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００ （●）またはＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ （○）クロマトグラフィーのいずれかで精製したｈｕＮ９０１−メイタンシノイドコンジュゲートおよびコンジュゲートされていないｈｕＮ９０１抗体（▲）が抗原陽性細胞を死滅させる能力をアッセイした実験の結果を示す。
【図２】
反応性基をもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドの合成経路を示す。
【図３】
反応性基をもつジスルフィド部分を有してなるメイタンシノイドの別の合成経路を示す。
【図４】
細胞傷害性コンジュゲートの合成経路を示す。
【図５】
Ｌ−ＤＭ１−ＴＰＡ（化合物６）を製造する別の経路を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際公開パンフレット】
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【国際調査報告】
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