(57)【要約】本発明は、キメラレポーター構築物、レポーター構築物を含有する組換え細胞、および組換え細胞を利用して、Ｇタンパク質共役型受容体ファミリーの細胞表面受容体などの細胞表面受容体と相互作用する物質を検出するためのアッセイを提供する。レポーター構築物および組換え細胞は、ハイスループットスクリーニングアッセイに特に適しており、物質と細胞表面受容体との間の相互作用の検出は、ＦＡＣＳまたは光度測定法によって視覚的に実施されることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの転写調節エレメントに、機能できるように連結されたキメラレポーター遺伝子を含むレポーター構築物であって、前記キメラレポーター遺伝子が、インフレームで融合された異なる２つの遺伝子由来のコーディング配列を含み、前記コーディング配列のそれぞれが、該コーディング配列が発現される細胞を溶解もしくは破壊するかまたは該細胞の生存度を減少させる必要を伴わずに検出することができる遺伝子産物を産生する、上記レポーター構築物。
【請求項２】
前記キメラレポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子由来のコーディング配列および発光するタンパク質をコードする遺伝子由来のコーディング配列を含む、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項３】
前記キメラレポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、重金属耐性遺伝子由来のコーディング配列、またはこれらの遺伝子のうち２つの遺伝子に由来するコーディング配列を含む、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項４】
前記キメラレポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、細菌ルシフェラーゼ遺伝子、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ遺伝子、フォチヌス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ）ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子由来のコーディング配列、またはこれらの遺伝子のうち２つの遺伝子に由来するコーディング配列を含む、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項５】
前記構築物が、プラスミド、ウイルス、ウイルス核酸、コスミド、ファージミド、または人工染色体である、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項６】
前記キメラレポーター遺伝子が、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子由来およびフォチヌス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ）ルシフェラーゼをコードする遺伝子由来の配列を含む、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの転写調節エレメントが、セカンドメッセンジャー応答エレメントを含む、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項８】
前記少なくとも１つの転写調節エレメントが、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、ＴＰＡ応答エレメント（ＴＲＥ；ＡＰ−１）、ＮＦＡＴ応答エレメント、またはこれら３つのエレメントの混合である、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項９】
前記少なくとも１つの転写調節エレメントが、細胞表面受容体のリガンドへの結合の結果として、直接的または最終的に発生し得る細胞内シグナルに応答性を有する、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの転写調節エレメントが、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）またはホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＴＰＡ）に応答性を有する、請求項９に記載のレポーター構築物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの転写調節エレメントが、最小プロモーターに融合した複数のＴＲＥモチーフを含む、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項１２】
ａ）少なくとも１つの転写調節エレメントに、機能できるように連結されたキメラレポーター遺伝子を含むレポーター構築物であって、前記キメラレポーター遺伝子が、インフレームで融合された異なる２つの遺伝子由来のコーディング配列を含み、前記コーディング配列のそれぞれが、該コーディング配列が発現される細胞を溶解もしくは破壊するかまたは該細胞の生存度を減少させる必要を伴わずに検出することができる遺伝子産物を産生する、レポーター構築物と、
ｂ）細胞表面受容体またはイオンチャネルと、
を含む組換え細胞であって、
前記細胞表面受容体またはイオンチャネルと該受容体またはチャネルに特異的に相互作用する物質との相互作用が、レポーター遺伝子の発現レベルを変化させる、組換え細胞。
【請求項１３】
前記細胞が哺乳類細胞または昆虫細胞である、請求項１２に記載の組換え細胞。
【請求項１４】
前記細胞がヘプタヘリックス受容体である細胞表面受容体を含む、請求項１２に記載の組換え細胞。
【請求項１５】
前記細胞がキットの構成要素として存在する、請求項１２に記載の組換え細胞。
【請求項１６】
細胞表面受容体タンパク質またはイオンチャネルに特異的に相互作用する物質の検出方法であって、
ａ）ｉ）少なくとも１つの転写調節エレメントに、機能できるように連結されたキメラレポーター遺伝子を含むレポーター構築物であって、前記キメラレポーター遺伝子が、インフレームで融合された異なる２つの遺伝子由来のコーディング配列を含み、前記コーディング配列のそれぞれが、該コーディング配列が発現される細胞を溶解もしくは破壊するかまたは該細胞の生存度を減少させる必要を伴わずに検出することができる遺伝子産物を産生する、レポーター構築物と、
ｉｉ）細胞表面受容体またはイオンチャネルであって、前記細胞表面受容体またはイオンチャネルが組換え細胞の表面で発現される、細胞表面受容体またはイオンチャネルと、を含む組換え細胞であって、
前記細胞表面受容体またはイオンチャネルと物質との特異的相互作用が、該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させる、組換え細胞を準備する工程と、
ｂ）前記細胞表面受容体またはイオンチャネルに特異的に相互作用することが可能であると推測される少なくとも１つの物質を含有するサンプルに、該組換え細胞を暴露させる工程と、
ｃ）前記キメラレポーター遺伝子の発現が変化させられているかどうかを決定する工程と、を含む方法であって、
レポーター遺伝子発現の変化が、サンプル中の物質と細胞表面受容体またはイオンチャネルとの相互作用、即ち、前記細胞表面受容体またはイオンチャネルに特異的に相互作用する物質のサンプル中における存否を示す、検定方法。
【請求項１７】
前記細胞表面受容体がヘプタヘリックス受容体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子発現の変化が、遺伝子発現の増加である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記キメラレポーター遺伝子が、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子由来およびフォチヌス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ）ルシフェラーゼをコードする遺伝子由来の配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
組換え細胞を準備する工程が、ＥＧＦＰによるシグナルの検出によるクローン選択を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
シグナルを検出するために蛍光標示式セルソーター（ＦＡＣＳ）または蛍光顕微鏡が使用される、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
関連出願の表示
本出願は、２０００年９月７日に出願された米国仮出願番号６０／２３０，７０５号（該仮出願の開示内容全体は本明細書に参考として援用される）に依存し、該仮出願の利益を要求する。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、組換え核酸技術の分野に関連する。本発明は、さらに薬物探索の分野に関する。より詳細には、本発明は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、チロシンキナーゼ型受容体、およびイオンチャネルなどの細胞表面受容体と相互作用する物質を検出するための組換え核酸、組換え細胞、キット、およびアッセイに関する。組換え核酸、組換え細胞、キット、およびアッセイは、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）によく適している。
【０００３】
当該分野の状態に関する説明
細胞表面受容体と相互作用する物質を検出するためのさまざまなアッセイが当該分野において知られている。一般に、これらのアッセイは、目的の受容体を発現する組換え細胞に依存し、ある物質と該受容体との相互作用をレポーター遺伝子のアップまたはダウンレギュレーションに関連づける。これらのアッセイの多くの目的は、薬学的に活性のある物質を同定することである。そのような薬学的に活性のある物質は、疾患状態もしくは異常に関連しうる所定のシグナル経路において、望ましくない過剰または過少発現を抑えるための薬物として使用することができる。
【０００４】
例えば、米国特許第５，４０１，６２９号（Ｈａｒｐｏｌｄら）は、イオンチャネルおよび／または細胞表面受容体に対するアゴニストもしくはアンタゴニスト活性を有する化合物をアッセイするための組換え細胞およびアッセイ系を開示している。該‘６２９号特許は、レポーター遺伝子構築物によって形質転換された、細胞表面上に受容体を有する組換え細胞を開示している。構築物は、１）受容体が該受容体のアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する化合物と相互作用する場合に生じる細胞内状態に応答する転写調節エレメント、および２）検出可能な遺伝子産物をコードし、かつ機能できるように転写調節エレメントに結合されているレポーター遺伝子を含む。転写調節エレメントは、カルシウム、ｃＡＭＰ、またはＮＧＦに応答性を有する。アッセイされる受容体は、アドレナリン性受容体、およびムスカリン性受容体などのＧタンパク質共役型受容体である。レポーターは、ＣＡＴ、ホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼである。細胞系（ｃｅｌｌ　ｌｉｎｅ）は、トランスフェクション可能で、目的の特異的受容体のバックグラウンドレベルが低いかまたは全く認められない状態のものでなければならない。受容体は、カラム５の４２行目〜カラム６の１２行目に列挙されている。実施例では、組換え哺乳類細胞およびアッセイが開示されている。しかし、該‘６２９号特許のアッセイは、高い発現レベルを有する細胞を同定し入手するために時間および手間が掛かるクローン選択方法に依存する。さらに、該アッセイは、アッセイの感度を減少させるバックグラウンドシグナルのレベルが高い。
【０００５】
米国特許第５，４３６，１２８号（Ｈａｒｐｏｌｄら）は、細胞表面局在受容体およびイオンチャネルの特異的なアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する物質を検出し、同定する方法、ならびに本方法に有用な組換え細胞について開示している。該‘１２８号特許の組換え細胞は、特異的イオンチャネルまたは細胞表面受容体を発現するように遺伝子操作され、また、受容体またはイオンチャネルに由来するシグナルによって制御される調節領域に結合したレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物を含有する。組換え細胞は、内因性の細胞表面タンパク質を発現することができるか、または細胞表面タンパク質をコードする異種ＤＮＡを発現することができる。細胞表面受容体は、ムスカリン性受容体などのＧタンパク質共役型受容体である。調節領域は、ｃ−ｆｏｓ遺伝子、ＶＩＰ遺伝子、ソマトスタチン遺伝子、プロエンケファリン遺伝子、カルボキシキナーゼ遺伝子、および神経成長因子−１遺伝子、ならびにｃＡＭＰ応答配列および細胞内カルシウムイオン濃度に応答性を有するエレメントを含む。レポーター遺伝子は、ＣＡＴ、ホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアルカリホスファターゼである。実施例は、組換え哺乳類細胞系およびアッセイを開示している。しかし、該‘６２９号特許のアッセイと同様に、該‘１２８号特許のアッセイは、時間が掛かるクローン選択方法を必要とし、アッセイは、バックグラウンドシグナルのレベルが高い。
【０００６】
米国特許第５，８５４，００４号（Ｃｚｅｒｎｉｌｏｆｓｋｙら）は、受容体依存性シグナル伝達経路に対する変調効果を有する物質をスクリーニングするためのプロセス、およびそのようなプロセスにおいて有用な組換え細胞を開示している。アッセイは、Ｇタンパク質共役型受容体を発現する組換え細胞を使用する。該組換え細胞は、受容体の活性に関与する分子の細胞内濃度の変化に応答する調節配列に連結されたレポーターをコードする組換えＤＮＡを含有する。調節分子は、イノシトール−１，４，５−三リン酸、ジアシルグリセロール、ｃＡＭＰ、またはカルシウムである。調節エレメントは、ＴＲＥまたはＣＲＥ調節エレメントである。哺乳類細胞が有用であることが開示されている。レポーター遺伝子は、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ＣＡＴ、およびルシフェラーゼである。受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体である。しかし、該‘６２９および‘１２８号特許と同様に、該‘００４号特許のクローン選択方法は、時間および手間が掛かり、高いバックグラウンド対シグナル比を生じる。
【０００７】
Ｈｉｍｍｌｅｒら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１３（１−４）：７９−９４，　１９９３）は、受容体に作用する薬物の生物学的活性を測定する細胞スクリーニングシステムを開示している。該システムは、受容体をｃＡＭＰシグナル伝達経路にカップリングさせ、複数のｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）に機能できるように連結されたレポーター遺伝子の転写が活性化されることに依存する。ヒトドーパミンＤ１受容体およびＣＲＥ制御下のルシフェラーゼを発現する安定組換え細胞系は、アポモルフィンの刺激によりルシフェラーゼ誘導を示した。
【０００８】
さらに、Ｗｅｙｅｒら（Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｃｈａｎｎｅｌｓ，　１：１９３−２００，　１９９３）は、ホスホリパーゼＣシステムを介して、レポーター遺伝子の発現とＧタンパク質共役型受容体の活性化とを関連付けることによってＧタンパク質共役型受容体の活性を変調する物質を検出する細胞アッセイシステムを開示している。ＩＣＡＭ−１遺伝子調節領域の制御下にルシフェラーゼ遺伝子を含有する組換え細胞が開示されている。これらの組換え細胞は、ヒトニューロキニン２受容体またはヒトセロトニン２受容体をコードする構築物をさらに含有することができる。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、分子と組換え細胞によってコードされる受容体との相互作用によって制御される。
【０００９】
アデニル酸シクラーゼにカップリングする受容体（Ｃｈｅｎ，　Ｗ．ら、Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　２２：３４９−５４，　１９９５）およびＣａ＋を動員することによって作用する受容体（Ｗｅｙｅｒら、上掲；Ｓｔｒａｔｏｗａ，　Ｃ．ら、Ｊ．　Ｒｅｃｅｐｔ．　Ｓｉｇｎａｌ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ．　Ｒｅｓ．，　１５：６１７−３０，　１９９５；Ｓｉｓｔａ，　Ｐ．ら、Ｍｏｌ．　Ｃｅｌｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．，　１４１：１２９−３４，　１９９４；Ｓｃｈａｄｌｏｗ，　Ｖ．ら、Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｅｌｌ，　３：９４１−５１，　１９９５）に関するいくつかのレポーターシステムに関する記述がある。しかし、それらの中に、多様な環境における化合物の効率的な大量スクリーニングについて十分に最適化されているものはない。
【００１０】
さらに最近では、細胞表面受容体と物質との相互作用の結果としてのシグナル伝達経路の活性の変化を検出するためのシステムは、二重レポーター（ｄｕａｌ　ｒｅｐｏｒｔｅｒ）構築物を含んでいる。例えば、Ｓｔａｂｌｅｓら（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　＆　Ｓｉｇｎａｌ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　１９（１−４）：３９５−４１０，　１９９９）は、それぞれ異なるＧタンパク質共役型受容体に応答する２つの異なるルシフェラーゼレポーターを同時に使用して、各受容体と相互作用する物質を検出することについて開示している。このアッセイでは、ヒトバソプレッシンＶ２受容体を発現し、ｃＡＭＰ応答エレメントに機能できるように結合されたホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有する組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が、ヒトβ２−アドレナリン受容体を発現し、ｃＡＭＰ応答エレメントに操作可能に結合したレニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子を含有する組換え細胞ＣＨＯ細胞と共培養された。ホタルルシフェラーゼとレニラルシフェラーゼの活性は異なる基質および反応条件に依存するため、一方の活性化は、例えば組換え細胞が組換え受容体と相互作用する物質と接触する結果として、他方の活性化から区別することができる。こうして、該アッセイは、一つの培養によって、試料中に一または複数の特異的なＧタンパク質共役型受容体を活性化する物質が含まれるかどうかについての情報を提供することができる。しかし、上記で考察されたアッセイと同様に、Ｓｔａｂｌｅｓらのアッセイも、アッセイに最も有用である細胞を同定するために、時間の掛かるクローン選択方法を利用している。
【００１１】
真核細胞の膜受容体のうち、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のスーパーファミリー、即ちヘプタヘリックス受容体が最も広範に分布している（例えば、Ｗａｔｓｏｎ，　Ｓ．およびＡｒｋｉｎｓｔａｌｌ，　Ｓ．，　Ｔｈｅ　Ｇ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｌｉｎｋｅｄ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｆａｃｔｓ　Ｂｏｏｋ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｌｏｎｄｏｎ，　１９９４）。それらは、異なる多くの化学分類由来の非常に多様な物質からシグナルを受け取り、様々な細胞内、組織、および器官応答を生じる。Ｇタンパク質共役型受容体と相互作用する多様な物質のうち、走化性物質は広範な群を形成する。この群は、微生物による攻撃の間免疫細胞の移動を調節する。さらに、Ｇタンパク質共役型ケモカイン受容体のいくつかは、ＨＩＶ−１ウイルスがＣＤ４陽性細胞に融合し続いて感染するために必要であるので、最近非常に注目されている（Ｗｅｉｓｓ，　Ｒ．Ａ．およびＣｌａｐｈａｍ，　Ｐ．Ｒ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　３８１：６４７−６４８，　１９９６；Ｈｉｌｌ，　Ｃ．Ｍ．およびＬｉｔｔｍａｎ，　Ｄ．Ｒ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　３８２：　６６８−６６９，　１９９６；Ｆａｕｃｉ，　Ａ．Ｓ．，　Ｎａｔｕｒｅ，　３８４：５２９−５３３，　１９９６）。他のＧタンパク質共役型受容体としては、ムスカリン性アセチルコリン受容体、アドレナリン性受容体、セロトニン受容体、およびオプシン受容体、ならびに他の神経伝達物質受容体およびホルモン受容体が含まれる。
【００１２】
現在、臨床で使用されている薬学的薬物の７０％以上は、Ｇタンパク質共役型受容体のスーパーファミリーのメンバーを標的としている。それらが仲介する多数の生理学的作用のため、薬物試験の大部分は、この種類の膜受容体上で行われる。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）の出現により、ＧＰＣＲに対して特異的に設計された効率的な細胞ベースのレポーターシステムが必要になっている。
【００１３】
組換えＧタンパク質共役型受容体アッセイが知られ、それらの多くはハイスループットスクリーニングに適用可能である一方、当該分野においてより高感度で、手間および時間が掛からない改良されたアッセイが必要とされている。
【００１４】
発明の概要
本発明は、ハイスループットスクリーニングに用いることができる、迅速で、信頼性が高く、比較的安価なレポーターシステムを提供することによって、当該分野における難点に取り組んでいる。本発明は、選択された細胞表面受容体と相互作用する物質を検出するのに使用することができる、遺伝子操作されたレポーターシステムを提供する。従って、本発明は、Ｃａ２＋の移動と、マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰＫ）カスケードを介したシグナルとによって作用するＧＰＣＲによく適した新規の最適化された細胞ベースのレポーターシステムを提供する。
【００１５】
本発明のシステムは、リガンドの細胞表面受容体への結合、またはリガンドと組換え細胞表面上のイオンチャネルとの相互作用の最終的な結果として、キメラレポーター遺伝子の発現の活性化、もしくはサイレンサーモチーフによる該発現の抑制が生じるように、キメラレポーター遺伝子が、セカンドメッセンジャー応答性エレメントなどの少なくとも１つの転写調節エレメントに機能できるように連結されているレポーター構築物を含有する組換え細胞を使用する。レポーター構築物は、新規のキメラレポーター遺伝子の発現を制御する。キメラレポーター遺伝子は、２つの個別の遺伝子のコーディング配列を含み、それらのそれぞれは検出可能な遺伝子産物を産生する。実施態様では、それらの遺伝子の一方は、内因性の活性を有する（即ち、基質分子または活性化分子の添加を必要としない）遺伝子産物をコードし、他方の遺伝子は、きわめて低いレベルで検出することができる活性を有し、また高いシグナル対ノイズ比を提供するタンパク質をコードする。ある実施態様では、キメラレポーター遺伝子は、強化緑色蛍光タンパク質（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ：　ＥＧＦＰ）などの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする配列、またはＧＦＰの一部をコードする配列であって蛍光を発するのに十分な配列を含む。ある実施態様では、キメラレポーター遺伝子はまた、フォチヌス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ）ルシフェラーゼ、またはルシフェラーゼの一部をコードする配列であって発光するのに十分な配列を含む。本発明のレポーター構築物によって、ＧＦＰによるシグナルを検出してクローン選択を行うことが可能となる。シグナルを検出するために蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）または蛍光顕微鏡を使用することができ、迅速な単一細胞解析および選別が可能である。同時に、ルシフェラーゼによって、感度および信頼性の高いレポーターシグナルが達成される。ＧＦＰ固有の蛍光があるため、レポーター遺伝子を発現する細胞を検出するために基質分子を予め充填する必要がない。従って、細胞の取り扱いは極めて簡単で、アッセイを強健にする。さらに、クローン選択後の細胞の生存率は非常に高い。
【００１６】
従って、本発明は、本発明のレポーター構築物を含有する組換え細胞を提供する。組換え細胞は、レポーター構築物を含有することに加えて、少なくとも１つの外来性受容体、とりわけＧタンパク質共役型受容体、他の膜受容体、またはイオンチャネルタンパク質を発現することができる。即ち、組換え細胞は、Ｇタンパク質共役型受容体を自然に発現することができるか、またはＧタンパク質共役型受容体をコードする非相同的核酸を含有することができる。本発明の組換え細胞が細胞表面上に存在するＧタンパク質共役型受容体と相互作用する物質に暴露される場合、該細胞は高レベルでレポーター遺伝子を発現するが、細胞表面上に存在するＧタンパク質共役型受容体と相互作用する物質が存在しない場合、レポーター遺伝子を検出可能なレベルで発現しない。
【００１７】
本発明はまた、組換え細胞を作製する方法を提供する。該方法は、形質転換、トランスフェクション、その他本発明のレポーター構築物を組換え細胞を作製するのに適切な宿主細胞に導入することを含むことができる。該方法は、Ｇタンパク質共役型受容体などの細胞表面受容体を発現する異種核酸を、宿主細胞に形質転換し、トランスフェクションし、またはそうでなければ導入することをさらに含むことができる。該方法は、宿主細胞のゲノムに組み込まれた遺伝子由来の目的の異種タンパク質を発現する、安定した組換え細胞を準備することを含むことができる。該方法はまた、例えば、ＦＡＣＳまたはレポーター活性の目視での観察（蛍光、色などの変化による）によって、迅速なクローン選択を行うための手順を含むことができる。該方法はまた、プラスミドなどのゲノム外エレメントとして組換え体に存在する、少なくとも１つの異種遺伝子を発現させる一過的に形質転換された組換え細胞の調製を含むことができる。組換え細胞は細胞系であることができ、哺乳類細胞、昆虫細胞、または他の適切な細胞であることができる。
【００１８】
従って、本発明は、レポーター構築物を提供する。レポーター構築物は、少なくとも１つの応答エレメントに操作可能に連結されたキメラレポーター遺伝子を含む。レポーター構築物は、選択された宿主細胞におけるキメラレポーター遺伝子の高レベルかつ緊縮な発現について、および選択された細胞表面受容体について、実施者によって最適化される。例えば、レポーター構築物上に存在する応答エレメントの数および間隔配置を最適化して、エレメントが応答性となるのに十分な量の分子が存在する場合にのみ高レベルの発現を提供することができる。この方法では、レポーター構築物は、バックグラウンドシグナルを最小にするのに役立ち、システム全体の信頼性および感度を援助することができる。実施態様では、本発明のシステムを使用して、標的Ｇタンパク質受容体と相互作用する物質を検出する。実施態様では、最小のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに融合した複数のＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート）応答性エレメント（ＴＲＥ）から成る合成エンハンサーを使用する。レポーター構築物はベクター（例えば、プラスミド）上に存在することができるが、必ずしもそうである必要はない。
【００１９】
さらに、本発明は、本発明のレポーター構築物を作製する方法を提供する。該方法は、核酸の作製や改変に有用であることが当業者に公知である分子遺伝学的技術を含む。該方法は、本発明のレポーター構築物を提供し、本発明のアッセイにおいてレポーター遺伝子の指定された発現を最適化するために使用される。
【００２０】
本発明は、細胞表面受容体と相互作用する物質を検出するためのアッセイをさらに提供する。アッセイは、本発明の組換え細胞を、少なくとも１つの物質を含有するサンプルに暴露すること、およびサンプルが組換えレポーター遺伝子の発現を活性化するかどうかを決定すること、それによってサンプル内の少なくとも１つの物質が細胞表面受容体と相互作用したかどうかを示すことを含むことができる。該方法は、細胞表面受容体と相互作用する物質を精製すること、単離すること、および／または同定することをさらに含むことができる。
【００２１】
従って、本発明は、本発明のアッセイを実施するためのキットを提供する。キットは、すべての細胞、構築物、試薬、および目的の細胞表面受容体へのある物質の結合を検出するのに必要な供給物を含むことができるが、必ずしもこれらを含まない。キットは、例えば、Ｇタンパク質共役型受容体活性化代謝経路の活性を変調する薬物を同定するために使用することができる。
【００２２】
図面を参照することにより、本発明は、より詳細に説明されるであろう。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞表面受容体またはイオンチャネルと相互作用する物質を検出するためのレポーターシステムを提供する。レポーターシステムは、目的の細胞表面受容体またはイオンチャネルを発現する組換え細胞、および細胞表面受容体もしくはイオンチャネルともう１つの分子（例えば、リガンド）との相互作用の結果として産生されるか、またはそうでなければ利用可能となる少なくとも１つの分子に発現を調節されるレポーター遺伝子とを利用する。本発明のレポーターシステムは、迅速で、信頼性が高くかつ使用が簡単である。レポーターシステムはまた、最良な応答性を有する受容体特異的レポーター細胞系の迅速かつ効率的な確立のためのクローン選択方法を提供する。本発明のレポーター構築物は、多様な細胞タイプにおいて、多様な細胞表面受容体およびイオンチャネルと共に機能し、この点で当該分野において公知である構築物よりも有利である。いくつかの細胞系は、それらを受容不能にする内因性受容体またはイオンチャネルを発現するため、多様な細胞タイプにおいて機能する構築物の能力は有利である。内因性受容体またはチャネルは、組換え試験受容体またはチャネルと共有するリガンドと相互作用することによって干渉することもあるし、あるいは複合的リガンド混合物を使用する場合、内因性受容体またはチャネルは、標的受容体もしくはチャネルと協力して応答することもある。以下に記載のように、他で示さない限り、「受容体」は、一般に受容体およびイオンチャネルの両方を示すものとして使用され、「イオンチャネル」を含めて解釈するとイオンチャネルの機能または一般的アプリケーションと一致しない場合にのみ、受容体に限定して解釈すべきである。
【００２４】
本発明の第１の局面では、レポーター構築物を含む核酸が提供される。核酸は、本発明のキメラ遺伝子をコードし、標的細胞において発現され得る任意の核酸であることができる。従って、本発明の核酸は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、二本鎖もしくは一本鎖、直鎖もしくは閉環、鎖状、および／またはスーパーコイルであることができる。
【００２５】
実施態様では、本発明の核酸は、当業者に公知である構築物およびエレメントを含む。例えば、核酸は、発現ベクターまたはシャトルベクターであることができる。その例として、プラスミド；ファージおよびファージ核酸を含むウイルスならびにウイルス核酸；コスミド；ファージミド；ならびに細菌人工染色体（ＢＡＣ）および酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む人工染色体が挙げられるが、これらに限定されない。核酸は裸の核酸として提供することもできるし、または核酸を宿主細胞に導いて送達することを助ける他の分子との複合体、もしくは混合物の一部として提供することができる。例えば、核酸は、核酸の宿主細胞への取り込みを増加させるリポソーム、細胞もしくは組織特異的抗体、または細胞もしくは組織特異的リガンドを含む組成物中に用意することができる。
【００２６】
本発明のレポーター構築物は、少なくとも１つの転写調節エレメントに操作可能に連結されたキメラレポーター遺伝子を含む。転写調節エレメントは、少なくとも１つのタンパク質もしくはタンパク質複合体が結合することができるプロモーターまたはエンハンサーの部分を構成する。従って、実施態様では、キメラレポーター遺伝子は、プロモーターおよび／または少なくとも１つのエンハンサー配列に、機能できるように連結されている。プロモーターまたはエンハンサー、従って、転写調節エレメントは、それがコーディング配列の転写の調節に参加する場合、コーディング配列に操作可能に連結されている。様々な転写調節エレメントが当業者に公知であり、そのすべてが本発明に適用可能である。転写調節エレメントの例としては、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）およびＴＰＡ応答エレメント（ＴＲＥ；ＡＰ−１）、または表面受容体の刺激時に遺伝子転写に関与する他の任意の転写調節エレメントが挙げられるが、これらに限定されない。他の転写調節エレメントについては、米国特許第５，４０１，６２９号および同第５，４３５，１２８号（Ｈａｒｐｏｌｄら）ならびに米国特許第５，８５４，００４号（Ｃｚｅｒｎｉｌｏｆｓｋｙら）に開示されており、それらの全体が参考として本明細書に援用されている。
【００２７】
実施態様において、転写調節エレメントは、細胞表面受容体がリガンドに結合する結果として、直接的にまたは最終的に発生し得る細胞内シグナルに応答性を有する。例えば、転写調節エレメントは、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）またはホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＴＰＡ）に応答性であることができる。
【００２８】
レポーター構築物はすくなくとも１つのキメラレポーター遺伝子を含み、ここで、その発現は少なくとも１つの転写調節エレメントによって制御されている。発現は、細胞内シグナル伝達分子に応答して、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされ得る。好ましくは、細胞内シグナル伝達分子が存在しない場合、キメラレポーター遺伝子の発現はほとんど検出されないかまたはまったく検出されない。実施態様では、複数の転写調節エレメントが一つのキメラレポーター遺伝子に操作可能に連結されている。これらの実施態様では、レポーター構築物は、選択された宿主細胞において、キメラレポーター遺伝子が高レベルかつ緊縮に発現するように最適化されている。例えば、構築物上に存在する転写調節エレメントの数および間隔配置は、エレメントが応答する分子が十分量存在する場合にのみ、高レベル発現を提供するように最適化されている。一つの調節エレメントの複数のコピー、１より多いタイプの調節エレメント、またはこれら２つの組み合わせを含むことによって、本発明のレポーター構築物は、バックグラウンドシグナルを最小にし、システム全体の信頼性および感度を援助するように最適化することができる。転写調節エレメントの例には、ＡＰ−１、ＣＲＥ、およびＮＦＡＴがある。
【００２９】
最小プロモーターは、それ自体必ずしも必要ではないが、転写を指令する能力をなお有するプロモーターの最も小さなフラグメントを構成する。上記の２つの成分（即ち、少なくとも１つの転写調節エレメントおよび最小プロモーター）は、本明細書において「レポーター調節エレメント」と規定される。実施態様では、１より多いタイプのレポーター調節エレメントが、単一のキメラレポーター遺伝子に操作可能に連結されている。
【００３０】
本発明のレポーター構築物は、少なくとも１つのキメラレポーター遺伝子（本明細書ではレポーター融合遺伝子ともいう）を含む。キメラレポーター遺伝子は、少なくとも２つのタンパク質、またはその機能的部分（即ち、フラグメント）のコーディング配列を含む。適切なレポーター遺伝子は、それらが発現される細胞を溶解もしくは破壊するかまたは該細胞の生存率を減少させる必要を伴わずに、発現産物をモニターすることができるレポーター遺伝子である。「機能部分」は、それが発現される細胞を溶解もしくは破壊するか、または該細胞の生存率を減少させる必要を伴わずに、モニターすることができる活性を有するタンパク質あるいはポリペプチドをコードするのに十分量のコーディング配列である。好適な実施態様では、フラグメントの活性は、該フラグメントが起因する全長タンパク質の活性と同じ活性である。レポーター構築物から発現されるレポータータンパク質は容易に検出することができるため、タンパク質の機能的部分の同定は、過度または過剰な実験を必要とせず、直接的事項である。
【００３１】
適切なレポーター遺伝子は当該分野において公知であり、ルシフェラーゼ、抗生物質耐性、重金属耐性、および他の遺伝子であって、発光、蛍光、試薬の色の変化を生じる化学反応、または遺伝子が導入されている細胞におけるいくつかの検出可能な表現型の変化によって、検出することができる上記遺伝子を含む。レポーター遺伝子の例としては、ホタルルシフェラーゼ、細菌ルシフェラーゼ、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ、フォチヌス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ）ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
レポーター構築物において、キメラレポーター遺伝子を作製するために使用されるレポーター遺伝子の選択は、当業者の好みに基づくことができる。当業者に周知でありかつ広範に実施されている標準的な分子生物学技術を使用して、キメラレポーター遺伝子を作製することができる。例えば、制限エンドヌクレアーゼ切断および再連結を使用して、２つのレポーター遺伝子のコーディング領域を融合し、キメラレポーター遺伝子を作製することができる。必要であれば、制限エンドヌクレアーゼ切断部位のオリゴ特異的操作を使用して、レポーター遺伝子の所望の点での切断を確実にし、例えば、キメラレポーター遺伝子の適切なリーディングフレームを維持することができる。
【００３３】
本発明のレポーター構築物は選択マーカーをさらに含み、それらには抗生物質耐性および重金属耐性遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。選択マーカーは当業者に周知であり、従って、ここで詳細に列挙する必要はない。選択マーカーは、本発明のアッセイに使用するための大量の構築物を調製するのに有用であり得て、また例えば、本発明の組換え細胞、および該組換え細胞の純粋培養の維持のための選択マーカーとして使用することができる。さらに、本発明のレポーター構築物は、宿主での構築物の複製および維持を増強するために複製開始点を含むことができる。
【００３４】
本発明のレポーター構築物によって、本発明を実施する者は、レポーター調節エレメントを介した活性化（または抑制）に応じて所望のレベルのレポーター遺伝子を発現する組換え細胞を作製することができる。例えば、レポーター構築物によって、実施者は、選択された受容体および／またはシグナル伝達経路に連結されることが公知である分子など、予め選択された細胞内シグナル伝達分子によって誘導して、キメラレポーター遺伝子の発現のレベルを最大にすることができる。本発明の実施態様では、ヘプタヘリックス受容体に基づくレポーター細胞系の構築において、最適化されたレポーター構築物が使用される。これらの実施態様では、プロモーターは、最小プロモーターに融合された複数のＴＲＥモチーフを含む。実施態様では、レポーター構築物はｐＧＬ３−ＡＰ１ｘ１　ＦＯＳである。実施態様では、レポーター構築物はｐＧＬ３．ＡＰ１ｘ９　ＦＯＳである。実施態様では、レポーター構築物はｐＧＬ３−ＡＰ１ｘ１　ＣＭＶである。実施態様では、構築物は、レポーター構築物ｐＧＬ３．ＡＰ１ｘ９　ＣＭＶにおけるような９つのＴＲＥモチーフを含む。実施態様では、レポーター構築物はｐｃＦＵＳＩＩである。さらに他の実施態様では、レポーター構築物はｐｃＦＵＳ３である。例示的レポーター構築物については、以下の実施例、および図においてより詳細に記載されている。
【００３５】
もう１つの局面では、本発明は、本発明のレポーター構築物を作製する方法を提供する。該方法は、核酸の作製や改変に有用であることが当業者に公知である分子遺伝学的技術を含む。該方法は、本発明のレポーター構築物を提供し、本発明のアッセイにおいてレポーター遺伝子の支配された発現を最適にするために使用される。一般に、ベクターなどの一般に利用可能な核酸分子には少なくとも１つのレポーター遺伝子、および少なくとも１つの転写調節エレメントを挿入し、シグナル伝達分子（例えば、転写因子）が転写調節エレメントに結合した結果、検出可能なレポータータンパク質の産生が増強または抑制されるように改変される。単一の転写調節エレメントの複数コピーを、単一なレポーター遺伝子に、機能できるように連結させることができる。さらに、複数の種類のレポーター調節エレメントを、単一なレポーター遺伝子に、機能できるように連結させることができる。さらに、異なる数および種類の調節エレメントの混合物を、単一なレポーター遺伝子に機能できるように連結させることができる。レポーター調節エレメントの選択、および各エレメントのコピー数は、宿主細胞において最高レベルのレポーター遺伝子の発現を提供するように最適化すべきである。加えて、発現が所望されない条件下では、発現のレベルは検出のレベルに近いか、またはそれ未満であることが好ましい。該レポーター構築物は、様々な細胞タイプに最適であるが、全シグナルおよびシグナル対ノイズバックグラウンド比は、本発明の構築物を含有する個々の細胞タイプで異なり得る。シグナル対ノイズ比は、利用されているシグナル伝達経路において必要な成分をコードする１つ以上の組換え遺伝子を細胞に導入することによって、改良することができる。選択された細胞に対しレポーター調節エレメントの数を最適化することは、当業者が迅速に達成することができる日常的、直接的事項である。
【００３６】
もう１つの局面では、本発明は組換え細胞を提供する。本発明の組換え細胞は、本発明のレポーター構築物を含有する。組換え細胞は、レポーター構築物上に存在する少なくとも１つのレポーター遺伝子を発現することができる。レポーター遺伝子の発現は、細胞表面受容体とリガンドの相互作用に最終的に応答する少なくとも１つの転写調節エレメントによって調節される。レポーター遺伝子の発現は、細胞表面受容体とリガンドとの間の相互作用に応答して、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされ得る。実施態様では、レポーター遺伝子の発現は、細胞表面受容体とリガントの相互作用に応答してアップレギュレートされる。リガンドは、薬物、プロドラッグ、およびウイルスを含むが、これらに限定されない細胞表面受容体と相互作用する任意の物質または微生物であることができる。物質、またはリガンドは有機的でもよいし無機的でもよい。
【００３７】
実施態様では、細胞表面受容体と相互作用する物質（例えば、リガンド）に細胞が暴露される場合、本発明の組換え細胞は高いレベルでレポーター遺伝子を発現するが、細胞表面受容体と相互作用する物質が存在しない場合、認識可能なレベルでは該遺伝子を発現しない。これらの実施態様では、細胞表面受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体、チロシンキナーゼタイプ受容体、またはイオンチャネル受容体であることができるが、これらに限定されない。
【００３８】
従って、レポーター構築物を含有することに加えて、組換え細胞は少なくとも１つの細胞表面受容体を発現する。細胞表面受容体は、内因性遺伝子（即ち、分子生物学的技術を使用して細胞に導入されたのではない遺伝子）から、または組換えにより（即ち、分子生物学的技術による遺伝子を宿主細胞に導入した結果として）発現させることができる。実施態様では、宿主細胞のゲノムに天然に存在する遺伝子の発現は、分子生物学技術により遺伝子のコピーをさらに導入し、組換え細胞を生じることによって増大することができる。従って、細胞表面受容体遺伝子は、１、２、または複数コピーで組換え細胞中に存在することができ、ゲノム上（即ち、宿主の染色体内）、染色体外、またはその両方に存在することができる。実施態様では、細胞表面受容体は、レポーター遺伝子構築物上に存在する遺伝子から発現される。実施態様では、細胞表面受容体は、レポーター遺伝子構築物とは別の構築物上に存在する遺伝子から発現される。実施態様では、細胞表面受容体の発現は調節を受けない（即ち、該受容体は構成的に発現される）が、一方、他の実施態様では、細胞表面受容体の発現は調節を受ける。
【００３９】
実施態様では、細胞表面受容体はＧタンパク質共役型受容体である。実施態様では、細胞表面受容体はイオンチャネル受容体である。実施態様では、細胞表面受容体はチロシンキナーゼタイプ受容体である。好ましくは、受容体、または発現される受容体の大部分は、細胞表面に局在化される。Ｇタンパク質共役型受容体の例としては、ロイコトリエンＢ４受容体（ＢＬＴＲ）、ケモカイン受容体ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４、アルファ１ｂアドレナリン受容体、ならびにＣ５ａ受容体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
特に非内因性細胞表面受容体が発現される実施態様では、シグナル伝達経路の１つ以上のメンバーは不在であるかまたは十分に機能しないため、組換え細胞は、細胞表面受容体から産生されるシグナルを転写調節エレメントに天然には伝達しない。これらの実施態様では、不在であるかまたは十分に機能しない経路メンバーは、組換え「ヘルパー」タンパク質として細胞に供給することができる。組換えヘルパータンパク質は、レポーター構築物または別の発現ベクターから発現させることができる。さらに、それらは、宿主細胞ゲノムに組み込まれているベクターからも発現させることができる。
【００４１】
さらなる局面では、本発明は組換え細胞を作製する方法を提供する。該方法は、本発明のレポーター構築物を形質転換、トランスフェクション、またはそうでなければ適切な宿主細胞に導入することを含むことができる。核酸、ウイルスなどを真核細胞に形質転換、トランスフェクト、またはそうでなければ導入するための技術は、当業者に公知である。レポーター構築物、他のベクター（他の遺伝子を共発現させるために使用する場合）、または宿主細胞の容認できない変化を生じない限り、任意の適切な技術を使用することができる。容認できない変化には、核酸および細胞を、意図する目的に不適合にする変化が含まれる。
【００４２】
実施態様では、該方法は、Ｇタンパク質共役型受容体などの細胞表面受容体をコードする異種核酸を宿主細胞に形質転換、トランスフェクト、またはそうでなければ導入することをさらに含む。細胞表面受容体をコードする異種核酸の導入は、レポーター構築物の宿主細胞への導入前、同時、または好ましくは後に、達成することができる。実施態様では、細胞表面受容体をコードする遺伝子は、レポーター構築物上に存在する。他の実施態様では、細胞表面受容体をコードする遺伝子は別の核酸構築物上に存在する。
【００４３】
該方法は、宿主細胞のゲノムに組み込まれている遺伝子から目的の異種タンパク質を発現する、安定組換え細胞を調製することを含むことができる。あるいは、該方法は、宿主細胞のゲノムに組み込まれていない遺伝子から（例えば、エプスタイン・バーウイルスベクター上に存在する遺伝子から）目的の異種タンパク質を発現する安定組換え細胞を調製することを含むことができる。該方法はまた、プラスミドなどのゲノム外エレメントとして、組換え体内に存在する少なくとも１つの異種遺伝子を発現する、一過的に形質転換された組換え細胞を調製することを含むことができる。本発明は、最良な発現組換えクローンの迅速な選択のための方法を提供する。安定的および一過的に形質転換された細胞を調製するための技術は、当業者に公知である。一般に、システムを構築する細胞は単一の祖先形質転換体の後代である。本明細書で規定される組換え発現システムは、発現させようとするＤＮＡ配列または合成遺伝子に連結された調節エレメントの誘導時に、異種タンパク質を発現する。
【００４４】
組換え細胞は細胞系であることができ、哺乳類または非哺乳類であり得る。実施態様では、哺乳類の細胞表面受容体は、昆虫細胞において組換え発現される。一般に、多くの哺乳類転写調節エレメントは、昆虫（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）卵巣（Ｓｆ９、Ｓｆ２１）細胞）および他の非哺乳類（例えば、酵母、線虫）細胞などの他の真核細胞においても活性を有するため、そのような細胞においても、哺乳類レポーター構築物および組換え細胞受容体を使用することが可能である。例えば、とりわけ細胞内カルシウムレベルに応答性を有する哺乳類細胞由来のＡＰ−１エレメントは、カルシウムを動員する場所に受容体システムが存在するならば、昆虫細胞においても機能することができる。
【００４５】
本発明のさらなる局面は、細胞表面受容体と相互作用する物質を検出するためのアッセイである。概略的に、本発明のアッセイの原理を図８に示す。一般に、アッセイは、本発明の組換え細胞（細胞の培養物を含む）をサンプルに暴露させることと、レポーター構築物上に存在するレポーター遺伝子の発現が変化するかどうかを決定することとを含む。変化（即ち、アップまたはダウンレギュレーション）は、サンプルが、組換え細胞の表面に存在する受容体と相互作用することができる少なくとも１つの物質を含有することを示す。レポーター遺伝子発現の変化は、当業者に広く知られておりかつ入手可能である試薬、プロトコル、および装置を使用して、容易に解析される。例えば、多くの業者が、ルシフェラーゼ、ＣＡＴ、β−ガラクトシダーゼ、およびアルカリホスファターゼ由来のシグナルの発現および検出のためのシステムを販売している。市販されていない他のシステムも当業者に知られており、本発明に従って使用することができる。
【００４６】
アッセイは、任意の適切な量の培養培地中の細胞をそのままで（ｉｎｔａｃｔ）または溶解して実施することができる。好適な実施態様では、アッセイは、９６穴または３８４穴プレートなどのマイクロタイタープレートにおいて実施される。これらの実施態様では、マイクロタイタープレートのいくつかまたはすべてのウェルが、本発明の組換え細胞の培養物を含有する。それぞれの培養物は、同じまたは異なる物質を含有するサンプルに暴露される。従って、選択された細胞表面受容体と相互作用する能力について複数の物質をアッセイするために、同じマイクロタイタープレートを使用することができる。さらに、活性の有無を検証するために、単一のマイクロタイタープレートにおける複数のウェルを使用して、サンプルを複数回アッセイすることができる。すべての場合において、シグナルは、組換え試験受容体を有さない対照細胞において得られるシグナルと相対比較される。
【００４７】
本発明のアッセイは、選択された細胞表面受容体と相互作用する大量の物質、または物質の混合物をスクリーニングするために使用することができるハイスループットアッセイであることができる。例えば、本発明の実施態様では、Ｇタンパク質共役型受容体のスーパーファミリーの細胞表面受容体を発現する組換え細胞が、ある物質と相互作用すると、受容体にシグナルを発生させ、続いてレポーター構築物上のレポーター遺伝子を活性化する。レポーター遺伝子産物の発現のレベルは、適切な技術（蛍光、発光、色の変化）によってモニターされる。
【００４８】
実施態様では、細胞表面受容体と相互作用する物質をアッセイする方法は、細胞表面受容体と相互作用する物質を精製、単離、および／または同定することをさらに含む。これらの実施態様では、当業者に公知の技術を使用して、物質を精製および／または単離することができる。そのような技術としては、沈殿、ろ過（サイズ排除クロマトグラフィーを含む）、液体クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、遠心分離、アフィニティークロマトグラフィー、および溶媒抽出が挙げられるが、これらに限定される必要はない。
【００４９】
本発明のレポーターシステムは、組換え細胞のクローン選択を含むことができる。従って、実施態様では、本発明に係る細胞の作製方法は細胞のクローン選択を含む。従って、実施態様では、本発明のアッセイは、細胞表面受容体の活性に影響を及ぼす分子のスクリーニングに先立ち、効率的に発現する細胞を得るためのクローン選択をすることを含む。クローン選択は、当業者に公知である任意の技術を使用して行うことができる。例えば、該アッセイは、低電力手術用顕微鏡のＵＶ光による照射（活性化）中に、蛍光標示式セルソーター（ＦＡＣＳ）を使用して行うことができる。従って、本発明のアッセイは、当該分野における公知のアッセイに必要とされた多くの時間および労力を回避する。本発明のシステムにより、他のアッセイに必要な時間の何分の一かで、良好に応答する細胞を同定することが可能である。その結果、本発明のアッセイのシグナル対ノイズ比は他のアッセイよりも高くなる。
【００５０】
クローン選択は、レポーター細胞系の構築および本発明のアッセイの実施において有利に使用することができる。しばしば、最終細胞系の感度は、実質的に増加し得る。本発明の構築物におけるキメラレポーター遺伝子の存在はまた、ＦＡＣＳによる、または蛍光顕微鏡によるコロニーの目視下での同定によるコロニー選択を可能にする。従って、実施態様では、フォチヌス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ）ルシフェラーゼにインフレーム（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）で融合したＥＧＦＰを含む、キメラレポーター遺伝子を有する構築物が提供される。
【００５１】
本発明のもう１つの局面では、キットが提供される。実施態様では、本発明のアッセイを実施するために（即ち、特定の細胞表面受容体と相互作用する物質を含有するサンプルを同定するか、またはそのような物質を検出するために）、該キットを使用する。キットは、細胞、構築物、試薬、および目的の細胞表面受容体に対するある物質の結合を検出するのに必要な供給物を含むが、必ずしもこれらに限定されない。例えば、Ｇタンパク質共役型受容体活性化代謝経路の活性を変調する薬物を同定するために、キットを使用することができる。また、例えば、イオンチャネルと相互作用するタンパク質または小さな分子を検出するために、該キットを使用することができる。
【００５２】
実施例
本発明の実施態様の例を参考にして、本発明をさらに説明する。以下の実施例は、本発明の特定の実施例をさらに十分に例示することを意味し、本発明の範囲を制限するものと解釈すべきではない。
【００５３】
実施例１：レポータープラスミドの構築
本発明のレポータープラスミドの構築を図１に概略的に示す。特に、プラスミドｐＧＬ３ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を本発明のレポーター構築物の骨格として使用した。本発明で使用するプライマーおよびオリゴヌクレオチドを表１に示す。表中、コンセンサスＴＲＥモチーフを太字で示し、制限エンドヌクレアーゼ部位に下線を付している。
【００５４】
【表１】
2004508042.tif 000002
【００５５】
プライマーＰ１およびＰ２により、最小ＣＭＶプロモーターを増幅する一方、プライマーＰ３およびＰ４ならびにテンプレートとしてｐｃ−ＦＯＳ（ＡＴＣＣ４１０４２）を使用し、ＰＣＲによってｃ−ｆｏｓプロモーターを増幅した。上流プライマー配列はそれぞれ１つのＴＲＥを含有した。このＴＲＥを、転写開始点に対し−５４位（最小ｃ−ｆｏｓプロモーター）および−５１位（最小ＣＭＶプロモーター）に挿入した。ＰＣＲフラグメントを、それぞれＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ（最小ＣＭＶプロモーター）、およびＳａｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ（最小ｃ−ｆｏｓプロモーター）で消化した。フラグメントを適切に消化したベクターに挿入した。これにより、それぞれプラスミドｐＧＬ３−ＡＰｘ１　ＦＯＳおよびｐＧＬ３−ＡＰｘ１　ＣＭＶが生じた。プラスミドをＳａｃＩで線状化し、８ｘＴＲＥボックス（オリゴヌクレオチドＯ５〜Ｏ８に対応する）を挿入した。これにより、プラスミドｐＧＬ３−ＡＰｘ９　ＦＯＳおよびｐＧＬ３−ＡＰｘ９　ＣＭＶを生じた。８ｘＴＲＥボックスをベクターに挿入することによって、ベクターのＳａｃＩ部位が破壊され、オリゴヌクレオチドＯ５およびＯ６と共に新たなＳａｃＩ部位が導入された。５ｘＴＲＥ構築物を得るために、４ｘＴＲＥを含有するＳａｃＩフラグメントを切り出し、プラスミドを再連結した（図１）。プライマーおよびオリゴヌクレオチドは本発明者らが設計し、Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬにおいて注文合成した。
【００５６】
実施例２：キメラレポーター遺伝子の構築
プライマーＰ５およびＰ６を用いるＰＣＲ反応において、プラスミドｐＥＧＦＰ−１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をテンプレートとして使用し、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を増幅した。ＮｃｏＩおよびＢｓｐＨＩで該産物を切断し、ルシフェラーゼ遺伝子の前方のｐＧＬ３−ＡＰｘ９　ＣＭＶのＮｃｏＩ部位に挿入し、プラスミドｐＦＵＳＩＩを得た。それによりＥＧＦＰの末端の終止コドンが除去され、ＥＧＦＰとホタルルシフェラーゼとの間の融合タンパク質を生じた。プラスミドｐＦＵＳＩＩをＢａｍＨＩおよびＫｐｎＩで消化し、完全なレポーター構築物を含有するフラグメントを、ＢｇｌＩＩ／ＫｐｎＩ部位間でｐｃＤＮＡ３プラスミドの骨格に連結し、それによってｐｃＤＮＡ３のＣＭＶプロモーターを置き換えた。得られたプラスミドｐｃＦＵＳＩＩはレポーター構築物およびネオマイシン耐性カセットを含有する（図２；配列番号１１）。
【００５７】
実施例３：レポータープラスミドの構築
３つの原型受容体をレポーターシステムにおいて試験した。すべての受容体ＯＲＦを、標準的な技術によりｐＩＲＥＳｐｕｒｏベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）に挿入した。アルファアドレナリン性受容体、Ｒα１ｂ　ｃＤＮＡはＲｏｂｅｒｔ　Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ博士より無償で提供されたものであり（Ｌｏｍａｓｎｅｙら、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２６６：６３６５−６３６９，　１９９１を参照のこと）、ケモカイン受容体であるＣＣＲ５は、本発明者らがＰＣＲによってヒト単球よりクローン化して配列決定し、ヒトロイコトリエンＢ４受容体であるＢＬＴＲをコードするｃＤＮＡは、本発明者らの研究室において早期にクローン化されていた（Ｏｗｍａｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　３７：１８７−１９４，　１９９６；Ｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，　２４０：１６２−１６６，　１９９７）。
【００５８】
実施例４：レポーター細胞系の選択
細胞培養
１０％ウシ胎仔血清、０．５％ストレプトマイシンおよびペニシリンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中において、３７℃および７％ＣＯ２でＧｌｕｔａｍａｘ　Ｉと共に、ＨｅＬａ細胞およびＣＨＯ細胞を増殖させた。
【００５９】
トランスフェクション
ＨｅＬａおよびＣＨＯ細胞に、本質的に当該分野に公知の方法（Ｒｏｌｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：５４０，　１９９４を参照のこと）の記載通りに、エレクトロポレーション法を用いた。簡単に説明すると、ＥｌｅｃｔｒｏＳｑｕａｒｅＰｏｒａｔｏｒ　Ｔ８２０（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ；　ＢＴＸ）を使用することにより、５×１０６個の細胞を、ギャップ４ｍｍのキュベット内のエレクトロポレーション緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液、２５０ｍＭショ糖、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．２）中で、１５０Ｖで３ミリ秒間ずつ１５回、電気パルスを与えた。電気パルスの前に、細胞を６〜１０マイクログラムのプラスミドと混合し、氷上で１０分間インキュベートした。エレクトロポレーション後、細胞を１０分間３７℃に保った。一過性発現後の刺激実験では、１つのトランスフェクション由来の細胞を２４穴プレートの６つのウェルに分配した。
【００６０】
１５ｃｍ径のディッシュ中で増殖させた細胞を、９マイクログラムの線状化されたプラスミドと共にエレクトロポレートし、安定ＨｅＬａ細胞系を確立した。２日後、培地に、それぞれ１μｇ／ｍｌのＧ４１８または１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを補充した。培地は、２週間の間、１日おきに取り換えた。
【００６１】
目視選択手順
約２週間後、プレートあたり５０〜２００個のコロニーが増殖した。ＨＦレポーター細胞系の選択のために、培地に１００ｎＭ　ＰＭＡを約１６時間補充した。適切な蛍光フィルターを有するＯｌｙｍｐｕｓ倒立顕微鏡を使用し、ＵＶ光下でコロニーを確認した。緑色のコロニーをピペットで拾い出し、増殖させ、レポーター細胞系として試験した。異なる受容体を、エレクトロポレーションにより安定にトランスフェクトし、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）耐性クローンを選択した。コロニーを拾い出し、増殖させ、適切なアゴニストによる受容体刺激後にレポーター遺伝子を活性化する能力について分析した。この手順により、ＨＦ１ｐＢＬＴＲ細胞、ＨＦ１ｐＲα１ｂ細胞、およびＨＦ１ｐＣＣＲ５細胞を生じた。
【００６２】
ＦＡＣＳ選択手順
Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製ＦＡＣＳ　Ｖａｎｔａｇｅ機器を使用した。ＨＦ１細胞およびＨＦ１ｐＢＬＴＲ細胞を、６穴プレート内で増殖させた。ＦＡＣＳの１６時間前に、細胞を、それぞれ３×１０−４Ｍ　ＡＴＰまたは２×１０−８Ｍ　ＬＴＢ４で刺激した。細胞をトリプシン処理し、マグネシウムおよびカルシウムを含まない１０ｍｌ　ＰＢＳで３回洗浄し、ＦＡＣＳの１時間前に、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中に１ｍｌあたり５００，０００細胞で懸濁した。次いで、ＨＦ１細胞から、次の２つのプール、即ち母集団の２０％にあたる１００，０００個の細胞群、および最良の応答性を有する細胞の５％にあたる４０，０００個の細胞群をそれぞれ選別した。ＨＦ１ｐＢＬＴＲ細胞（最良の細胞の１０％を示す１００，０００個の細胞）を選別した。最良の応答性細胞は、最も多くのＥＧＦＰを含有する細胞と規定される。これらのプールを増殖させ、母細胞系と並行して２週間培養し、次いで、記載のような連結刺激実験に使用した。
【００６３】
実施例５：ルシフェラーゼアッセイおよび刺激実験
ルシフェラーゼアッセイ
多様なプロモーター構築物で一過性トランスフェクションした細胞を、トランスフェクションの２４時間後に、２４穴プレート中で１００ｎＭ　ＰＭＡによって１０時間刺激した。次いで、培地を取り出し、ＰＢＳで１回細胞を洗浄し、１ウェルあたり１００マイクロリットルのレポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。分析まで通常１晩、−２０℃でプレートを保存した。製造者の指示に従い、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｂｉｏｔｈｅｍａ，　Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ルシフェラーゼアッセイを実施した。一過性トランスフェクションした細胞を、Ｔｕｒｎｅｒ　ＴＤ−２０ｅ照度計で分析した。安定にトランスフェクションされたクローンのルシフェラーゼアッセイを、９６穴プレート形式のＢＭＧ　Ｌｕｍｉｓｔａｒ照度計を用いて行った。組織培養クオリティー用の白色の透明底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）を使用した。１ウェルあたり９０μｌ培地中で約１０，０００〜２０，０００個の細胞を増殖させた。３日後、１０μｌ　ＰＢＳにリガンドを添加し、さらに１６時間インキュベートした。培地を除去し、細胞溶解緩衝液を添加した。さらなる解析までプレートを−７０℃で保存した。すべての実験は、４回反復で２〜４回実施した。
【００６４】
９６穴プレートリーダーにおける蛍光分析
透明底を有する黒色プレート（Ｃｏｓｔａｒ）においてＢＭＧ　Ｆｌｕｏｓｔａｒ蛍光計で蛍光測定を実施した。上記のように培養および刺激した細胞を１００μｌ　ＰＢＳ中でアッセイした。蛍光測定後、ＰＢＳを除去し、上記のようにルシフェラーゼ活性を決定した。
【００６５】
阻害剤
上記のように、ＨＦ１、ＨＦ１ｐＢＬＴＲ、およびＨＦ１ｐＲα１ｂ細胞を９６穴プレート中で増殖させた。それぞれのアゴニストによる刺激の３０分前に、それぞれの阻害剤を１μＭの濃度で細胞に添加した。１６時間後にルシフェラーゼアッセイを実施した。
【００６６】
計算
すべての計算は、ＧｒａｐｈＰａｄプリズムコンピュータプログラムで実施した。
【００６７】
実施例６：昆虫細胞系における最適化のためのｐｃＦＵＳＩＩの改変
ネオマイシン耐性遺伝子のＳＶ４０プロモーターを、プラスミドｐＩＥ１−３（Ｎｏｖａｇｅｎ）由来のバキュロウイルスＩＥ−１プロモーターで置き換えることによって、プラスミドｐｃＦＵＳＩＩを昆虫細胞で使用するために改変した。これは、ｐｃＦＵＳＩＩをＥｃｏＲＩ／ＡｆｌＩＩで消化し、ＡｆｌＩＩ部位を平滑化することによって行った。次いで、ＩＥ１プロモーターを含有するｐＩＥ１−３由来のＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩフラグメントをこの部位に連結し、このようにして、プラスミドｐｃＦＵＳＩＩ−ＩＥを得た（配列番号１２）。
【００６８】
実施例７：Ｇタンパク質キメラ構築物
すべてのネイティブな昆虫Ｇタンパク質が、哺乳類受容体からシグナルを有効に伝達する能力を有するとは限らないため、昆虫細胞に基づくいくつかのレポーターシステムにはＧタンパク質発現ユニットも含有させた。このユニットは、哺乳類ＧαまたはキメラＧαサブユニットのいずれかの転写を制御する構成的（即ち、調節を受けない）プロモーターから成る。次いで、この発現単位は基本レポーターの構築（図２）に挿入される。キメラＧタンパク質は昆虫Ｇαサブユニット（ｄＧαｑ３）の遺伝子を基本とし、最後の５個のアミノ酸が、ヒトＧαｉ２またはＧα１６サブユニットのいずれかの最後の５個のアミノ酸で、置き換えられている。これは、表２に記載のプライマーとテンプレートとしてｄＧｑ−３の遺伝子（Ｔａｌｌｕｒｉ　Ｓ．ら、ＰＮＡＳ，　９２：１１４７５−１１４７９，　１９９５）とを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって達成した。
【００６９】
【表２】
2004508042.tif 000003
【００７０】
Ｐｗｏポリメラーゼ、および２ｍＭ　ＭｇＳＯ４と共にテンプレートを１０サイクル増幅した（９５℃で２０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分）。産物をＢｇｌＩＩ／ＮｏｔＩで消化し、続いて、ｐＩＥ１−３に連結した。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、平滑化した。ＩＥ１プロモーターおよびキメラＧタンパク質を含有する発現カセットを精製し、ｐｃＦＵＳＩＩ−ＩＥレポーターベクターの充填（ｆｉｌｌｅｄ−ｉｎ）ＢｓｍＩ部位に連結した。
【００７１】
実施例８：レポーター構築物の阻害
選択された阻害剤によって本発明のレポーター構築物が阻害される能力を試験した。図７はこれらの実験の結果を示す。グラフは、本発明のレポーター細胞系、つまり組換え受容体を発現しないＨＦ１、アルファアドレナリン性試験受容体を発現するＨＦ１ｐＲα１ｂレポーター細胞、およびロイコトリエンＢ４試験受容体を発現するＨＦ１ｐＢＬＴＲレポーター細胞を示す。それぞれの細胞を、以下に記載するように、ａ）アゴニストのみ（対照）、ｂ）ＵＯ１２６、ｃ）ＤＨＢＰ、またはｄ）ＧＦ１０９２０３Ｘに暴露した。
【００７２】
まず、ＨＦ１細胞をＡＴＰ（図３に例示した最大濃度で）で刺激して内因性ＡＴＰ受容体を活性化し、次いで、組換え受容体（ＨＦ１ｐＢＬＴＲおよびＨＦ１ｐＲａ１ｂ）を発現する細胞をそれらの応答性アゴニスト（それぞれ図４Ａおよび４Ｂに例示した最大濃度で）で刺激した。他のシグナル伝達経路を阻害するために、アゴニスト刺激を開始する３０分前に、それぞれ１μＭの濃度の化合物（右側に示されている）でレポーター細胞を処理した。アゴニストのみで処理した細胞（対照）のルシフェラーゼ活性を１００％とした。４回反復して実施した実験の典型的な組を示す。誤差バーは±ＳＥＭを示す。スチューデントｔ検定により統計的有意性解析を実施した。
【００７３】
結果は、本発明のレポーター構築物の発現を阻害するために、多様な化合物を使用することができることを示す。この結果はさらに、本発明のシステムは、本発明のレポーター構築物およびレポーター細胞が発生するシグナルのレベルにポジティブな影響を及ぼす化合物または分子を同定するために使用することができるだけではなく、該システムは、シグナルのレベルにネガティブな影響を及ぼす化合物または分子を同定するためにも使用することができることを示す。さらに、この結果は、化合物をシステムに添加して、レポーター構築物および細胞が発生するシグナルの強度を調節することができることを示している。即ち、本発明を実施する当業者が選択した量の阻害化合物または分子を、本発明のアッセイに添加して、所望のレベルのシグナルがアッセイによって産生されるようにシグナルの強度を調整することができる。
【００７４】
実施例９：昆虫細胞系に基づくレポーターシステム
昆虫細胞におけるレポーター構築物ｐｃＦＵＳＩＩの試験
カルシウムの動員時に、レポーター構築物ｐｃＦＵＳＩＩが昆虫細胞において活性化されるかどうかを試験するために、構築物を一過的にＳ２細胞にトランスフェクションした。次いで、トランスフェクトされた細胞を、カルシウム放出に影響を及ぼす薬物で処理した。タプシガーギン（５００ｎＭ）またはスタウロスポリン（５００ｎＭ）で処理するとレポーター遺伝子の活性化が５〜１０倍増加することが見出された（図９）。先に行った哺乳類レポーターシステムでの経験を考慮すると、これらの結果は、ｐｃＦＵＳＩＩ構築物が、昆虫細胞のレポーターベクターとして使用することができることを示している。
【００７５】
昆虫細胞系のレポーターシステムにおけるエクオリンの試験
昆虫細胞における、このレポーターシステムの有用性を試験するために、ｐＩＥ１−エクオリン発現プラスミドを、ラットα１ｂおよびＣＣＲ５受容体の発現ベクターと共に、Ｓｆ９細胞に共感染させた。ラットα１ｂ受容体は、昆虫細胞の内因性Ｇタンパク質を使用して、Ｓｆ９細胞でカルシウムを動員できることが見出された。一方、ＣＣＲ５は、ヒトＧα１６サブユニットの遺伝子を発現する発現ベクターと共感染した場合にのみ、カルシウムを動員することができた。従って、本発明は、ヒト細胞表面受容体に連結したキメラレポーター構築物だけではなく、異種ヒトシグナル伝達経路をも含む組換え細胞を提供するので、様々な細胞表面受容体を使用する様々な細胞においてシステムを使用することができる。
【００７６】
実施例１０：異なるタイプの調節エレメントの混合物を含有するプロモーターの構築
プラスミドｐｃＦＵＳ２−６ｘＳＴＡＴ／ＮＦκＢの構築は、オリゴヌクレオチドＯ９（５’ＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＡＴＴＣＣＣＧＧＡＴＣＣ３’；配列番号１６）およびＯ１０（５’ＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＡＡ３’；配列番号１７）の各２コピーを、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＦＵＳ２ベクターに連結することによって達成された。６ｘＳＴＡＴ／ＮＦκＢカセットを含有するＫｐｎＩ／ＸｈｏＩ断片を切り出して、ＸｈｏＩ制限化ｐＧＬ３基本プラスミド（ＰＲＯＭＥＧＡ）に連結し、ｐＧＬ３−１２ｘＳＴＡＴ／ＮＦκＢを得た。ｐｃＦＵＳ２−６ｘＳＴＡＴ／ＮＦκＢのＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩプロモーター断片を、ｐＧＬ３−９ｘＡＰ−１ＦＯＳのＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩプロモーター断片で置き換えることによって、レポータープラスミドｐｃＦＵＳ３を構築した。６ｘＳＴＡＴ／ＮＦκＢおよび９ｘＡＰ−１カセットを含有するＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを含有するｐｃＦＵＳ３のプロモーターの配列を、配列番号１８として本明細書に開示する。
【００７７】
実施例１１：ｐｃＦＵＳ３をトランスフェクションした哺乳類レポーター細胞系の特徴付け
当該分野において公知の標準的な技術によって、レポーターベクターｐｃＦＵＳ３をＨｅＬａ細胞に安定にエレクトロポレーションした。（実施例４および５に記載の通り）３２０個の安定した細胞クローンを目視選択法によってスクリーニングし、ＰＭＡまたはＡＴＰ刺激後、ルシフェラーゼアッセイ法で２０個のクローンを２回再確認した。５個のクローンは、実施したすべての試験でＨＦ１細胞よりも優れていた。目的に最も適した細胞クローンをＨＦＦ１１と命名し、さらなる研究の例示的クローンとして使用した。
【００７８】
ＨＦＦ１１細胞において内因的に発現された受容体を、当該分野において公知のそれぞれのリガンドで刺激した。内因的に発現された受容体ＣＸＣＲ４をＳＤＦ−１で刺激するか、または内因的に発現されたＡＴＰ受容体をＡＴＰで刺激することによって得られた結果は、ＨＦ１細胞に対してシグナル対ノイズ比が２〜３倍上昇したことを示した。
【００７９】
ＨＦＦ１１細胞を使用して、ヒトＣＣＲ５またはＣ５ａのヒト受容体（Ｃ５ａＲ）を安定して発現する細胞系を確立した。最大限のアゴニスト刺激後、ルシフェラーゼ活性が、ＣＣＲ５をトランスフェクトした細胞では約８０倍、Ｃ５ａ　Ｃ末端ペプチド（ＢＡＣＨＥＭ　Ｈ−３４６２）で刺激したＣ５ａＲをトランスフェクトした細胞では約３０倍上昇した。
【００８０】
実施例１２：レポーター構築物で一過的にトランスフェクトした哺乳類細胞の特徴付け
原型レポータープラスミド（ｐｃＦＵＳ２；ｐｃＦＵＳ２−６ｘＳＴＡＴ／ＮＦκＢ；ｐｃＦＵＳ３およびｐＧＬ３−１２ｘＳＴＡＴ／ＮＦκＢ）を使用し、エレクトロポレーションによってＨｅＬａ細胞に一過的にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞は、１００ｎＭ　ＰＭＡまたは１００ｎＭ　ＰＭＡと１０−６Ｍタプシガーギンとで刺激されるか、対照として処理された。１０時間のインキュベーション後、細胞を溶解し、アッセイした。増幅値を表３に示す。
【００８１】
【表３】
2004508042.tif 000004
【００８２】
本発明は、好適な実施態様を参考にして上記において詳細に説明してきた。しかし、当業者であれば、本発明の範囲および趣旨を逸脱することなく、本発明の実施において様々な改変および変更を加えることができることが理解できるであろう。本明細書において引用されたすべての参考文献は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【００８３】
【配列表】
【表４】
2004508042.tif 000005
【表５】
2004508042.tif 000006
【表６】
2004508042.tif 000007
【表７】
2004508042.tif 000008
【表８】
2004508042.tif 000009
【表９】
2004508042.tif 000010
【表１０】
2004508042.tif 000011
【表１１】
2004508042.tif 000012
【表１２】
2004508042.tif 000013
【表１３】
2004508042.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【図１】プロモーター領域内に様々な数のＡＰ−１（ＴＲＥ）モチーフを含むことによる、本発明のレポーター構築物の構築を概略的に示す図である。
【図１Ａ】最小ＣＭＶまたは最小ｃ−ｆｏｓプロモーターのいずれかのすぐ前方にＰＣＲを使用して、第１のＴＲＥを直接挿入した。
【図１Ｂ】第１のＴＲＥの前方にオリゴヌクレオチドＯ５〜Ｏ８を挿入することによって、９ｘＴＲＥ構築物をクローン化した。
【図１Ｃ】９ｘＴＲＥ構築物をＳａｃＩで消化し、４ＴＲＥを除去して、５ｘＴＲＥを作製した。
【図２】本発明のレポーター構築物の概略図である。プラスミドｐｃＦＵＳＩＩを使用して、安定なＨｅＬａレポーター細胞系、ＨＦ１を確立した。構築物は、９ｘＴＲＥ　ＣＭＶ最小プロモーターによって駆動され、ＨｅＬａ宿主細胞の刺激後のＥＧＦＰの検出を可能にするのに十分高いシグナルを確実にする、ＥＧＦＰ−ホタルルシフェラーゼキメラレポーター遺伝子を含有する。ｐｃＤＮＡ３ベクターの骨格はまた、ネオマイシン耐性カセットを含有する。名称ｐＡは、ポリＡテイルを表す。ＥＧＦＰは、強化緑色蛍光タンパク質を表す。
【図３】２つの宿主細胞系におけるルシフェラーゼ活性の誘導において、最小ｃ−ｆｏｓプロモーターまたは最小ＣＭＶプロモーターと組み合わせたＴＲＥの数の影響を示す図である。
【図３Ａ】ＨｅＬａ細胞。
【図３Ｂ】ＣＨＯ細胞。
一過性発現のためにエレクトロポレートされた細胞を１００ｎＭ　ＰＭＡで１０時間刺激した。刺激および非刺激細胞間の相対的発光単位（ＲＬＵ）の比として増幅を算出した。結果を、３〜４回の独立したトランスフェクション実験（それぞれの実験を３回反復した）の平均値＋ＳＥＭとして表現する。ｎ．ｄ．は「測定せず」を意味する。
【図４】ＦＡＣＳ分析の結果を示す図である。ＨＦ１ｐＢＬＴＲ細胞を２×１０−８ＭロイコトリエンＢ４で刺激し、次いで、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ＦＡＣＳ　Ｖａｎｔａｇｅで選別した。最も高いＥＧＦＰレベルを発現した１０％の細胞を通門させ、増殖させた。
【図４Ａ】非刺激細胞。
【図４Ｂ】刺激細胞。矢印は、通門させ、増殖させた１０％部分の細胞を示す。
【図５】本発明のレポーター細胞系、ＨＦ１を確立するために使用したＨｅＬａ細胞内に存在する内因性ＡＴＰ受容体の応答を例示した図である。
【図５Ａ】様々な濃度のＡＴＰによる１６時間の刺激後の濃度−応答曲線。算出されたＥＣ５０値は１．０７×１０−４Ｍである。４回反復して実施した典型的な実験の平均値を示す。誤差バーは±ＳＥＭを示す。
【図５Ｂ】標的細胞上に存在する内因性ＡＴＰ受容体によって仲介される応答を誘導し、そして伝達するために、示された時点において１０−４Ｍ　ＡＴＰによる刺激後に９６穴形式で増殖させた本発明のＨＦ１レポーター細胞のＴＲＥ介在性応答の時間経過。４回反復して実施した１つの典型的な実験の平均値を示す。誤差バーは±ＳＥＭを示す。
【図６】本発明のレポーター細胞を、３つの広く異なるケミカルメディエーターのファミリーを代表するリガンドで活性化された３種類の受容体で試験したモデル実験を示す図である。
【図６Ａ】モノアミン（エピネフリン）がリガンドであった。
【図６Ｂ】脂質メディエーター（ＬＴＢ４）がリガンドであった。
【図６Ｃ】（配列ＲＡＮＴＥＳを有する）ペプチドがリガンドであった。
アルファアドレナリン受容体Ｒα１ｂ（Ａ中）、ロイコトリエンＢ４受容体ＢＬＴＲ（Ｂ中）、およびケモカイン受容体ＣＣＲ５（Ｃ中）を発現するレポーター細胞の刺激に関する濃度−応答曲線を示す。それぞれの受容体は、本発明のＨＦ１レポーター細胞において安定して発現され、それぞれのアゴニストによる刺激を受けた。これらの実験において５０％有効濃度（ＥＣ５０）を生じるアゴニスト濃度の値は、ＢＬＴＲと相互作用するロイコトリエンＢ４では、４．４×１０−８Ｍ；Ｒα１ｂと相互作用するエピネフリンでは、１．１７×１０−７Ｍ；およびＣＣＲ５と相互作用するＲＡＮＴＥＳでは、１．１１×１０−７Ｍであった。４回反復して実施した典型的な実験の平均値を示す。誤差バー（小さ過ぎてほとんど見えない）はＳＥＭを示す。
【図７】本発明のレポーター構築物の発現のレベルが阻害剤によって変化し得るかどうかを試験するように設計された実験の結果を示す図である。アゴニスト刺激を開始する各３０分前に、レポーター細胞を１μＭの濃度の多様な化合物（右側に示された）で処理した。４回反復して実施した典型的な組の実験を示す。誤差バーは±ＳＥＭを示す。スチューデントｔ検定により統計的有意性解析を実施した。
【図８】本発明によるアッセイを概略的かつ全体的に示す図である。
【図９】カルシウム放出に影響を及ぼす様々な薬物で処理した場合のＳ２昆虫細胞におけるｐｃＦＵＳＩＩのレポーター構築物発現の結果を示す図である。
【図１Ａ】
2004508042.tif 000015
【図１Ｂ】
2004508042.tif 000016
【図１Ｃ】
2004508042.tif 000017
【図２】
2004508042.tif 000018
【図３Ａ】
2004508042.tif 000019
【図３Ｂ】
2004508042.tif 000020
【図４Ａ】
2004508042.tif 000021
【図４Ｂ】
2004508042.tif 000022
【図５Ａ】
2004508042.tif 000023
【図５Ｂ】
2004508042.tif 000024
【図６Ａ】
2004508042.tif 000025
【図６Ｂ】
2004508042.tif 000026
【図６Ｃ】
2004508042.tif 000027
【図７】
2004508042.tif 000028
【図８】
2004508042.tif 000029
【図９】
2004508042.tif 000030
【国際公開パンフレット】
2004508042.tif 000031
2004508042.tif 000032
2004508042.tif 000033
2004508042.tif 000034
2004508042.tif 000035
2004508042.tif 000036
2004508042.tif 000037
2004508042.tif 000038
2004508042.tif 000039
2004508042.tif 000040
2004508042.tif 000041
2004508042.tif 000042
2004508042.tif 000043
2004508042.tif 000044
2004508042.tif 000045
2004508042.tif 000046
2004508042.tif 000047
2004508042.tif 000048
2004508042.tif 000049
2004508042.tif 000050
2004508042.tif 000051
2004508042.tif 000052
2004508042.tif 000053
2004508042.tif 000054
2004508042.tif 000055
2004508042.tif 000056
2004508042.tif 000057
2004508042.tif 000058
2004508042.tif 000059
2004508042.tif 000060
2004508042.tif 000061
2004508042.tif 000062
2004508042.tif 000063
2004508042.tif 000064
2004508042.tif 000065
2004508042.tif 000066
2004508042.tif 000067
2004508042.tif 000068
2004508042.tif 000069
2004508042.tif 000070
2004508042.tif 000071
2004508042.tif 000072
2004508042.tif 000073
2004508042.tif 000074
2004508042.tif 000075
2004508042.tif 000076
2004508042.tif 000077
2004508042.tif 000078
2004508042.tif 000079
2004508042.tif 000080
2004508042.tif 000081
2004508042.tif 000082
2004508042.tif 000083
2004508042.tif 000084
2004508042.tif 000085
2004508042.tif 000086
2004508042.tif 000087
2004508042.tif 000088
2004508042.tif 000089
2004508042.tif 000090
2004508042.tif 000091
2004508042.tif 000092
2004508042.tif 000093
2004508042.tif 000094
2004508042.tif 000095
2004508042.tif 000096
【国際公開パンフレット（コレクトバージョン）】
2004508042.tif 000097
【手続補正書】
【提出日】平成15年2月25日(2003.2.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの転写調節エレメントに、機能できるように連結されたキメラレポーター遺伝子を含むレポーター構築物であって、前記キメラレポーター遺伝子が、インフレームで融合された異なる２つの遺伝子由来の前記コーディング配列を含み、コーディング配列のそれぞれが、該コーディング配列が発現される細胞を溶解もしくは破壊する必要を伴わずに検出することができる遺伝子産物を産生し、
前記少なくとも１つの転写調節エレメントの少なくとも１つが、細胞表面受容体とリガンドとの結合の結果発生し得るシグナルに応答性を有する、レポーター構築物。
【請求項２】
前記キメラレポーター遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子由来のコーディング配列および発光するタンパク質をコードする遺伝子由来のコーディング配列を含む、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項３】
前記キメラレポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、重金属耐性遺伝子由来のコーディング配列、またはこれらの遺伝子のうち２つの遺伝子に由来するコーディング配列を含む、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項４】
前記キメラレポーター遺伝子が、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、細菌ルシフェラーゼ遺伝子、レニラ（Ｒｅｎｉｌｌａ）ルシフェラーゼ遺伝子、フォチヌス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ）ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、アルカリホスファターゼ遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子由来のコーディング配列、またはこれらの遺伝子のうち２つの遺伝子に由来するコーディング配列を含む、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項５】
前記構築物が、プラスミド、ウイルス、ウイルス核酸、コスミド、ファージミド、または人工染色体である、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項６】
前記キメラレポーター遺伝子が、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子由来およびフォチヌス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ）ルシフェラーゼをコードする遺伝子由来の配列を含む、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの転写調節エレメントが、セカンドメッセンジャー応答エレメントを含む、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項８】
前記少なくとも１つの転写調節エレメントが、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、ＴＰＡ応答エレメント（ＴＲＥ；ＡＰ−１）、ＮＦＡＴ応答エレメント、またはこれら３つのエレメントの混合である、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項９】
前記少なくとも１つの転写調節エレメントが、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）またはホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＴＰＡ）に応答性を有する、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの転写調節エレメントが、最小プロモーターに融合した複数のＴＲＥモチーフを含む、請求項１に記載のレポーター構築物。
【請求項１１】
ａ）少なくとも１つの転写調節エレメントに、機能できるように連結されたキメラレポーター遺伝子を含むレポーター構築物であって、前記キメラレポーター遺伝子が、インフレームで融合された異なる２つの遺伝子由来のコーディング配列を含み、前記コーディング配列のそれぞれが、該コーディング配列が発現される細胞を溶解もしくは破壊するかまたは該細胞の生存度を減少させる必要を伴わずに検出することができる遺伝子産物を産生する、レポーター構築物と、
ｂ）細胞表面受容体またはイオンチャネルと、
を含む組換え細胞であって、
前記細胞表面受容体またはイオンチャネルと該受容体またはチャネルに特異的に相互作用する物質との相互作用が、レポーター遺伝子の発現レベルを変化させる、組換え細胞。
【請求項１２】
前記細胞が哺乳類細胞または昆虫細胞である、請求項１１に記載の組換え細胞。
【請求項１３】
前記細胞がヘプタヘリックス受容体である細胞表面受容体を含む、請求項１１に記載の組換え細胞。
【請求項１４】
前記細胞がキットの構成要素として存在する、請求項１１に記載の組換え細胞。
【請求項１５】
細胞表面受容体タンパク質またはイオンチャネルに特異的に相互作用する物質の検出方法であって、
ａ）ｉ）少なくとも１つの転写調節エレメントに、機能できるように連結されたキメラレポーター遺伝子を含むレポーター構築物であって、前記キメラレポーター遺伝子が、インフレームで融合された異なる２つの遺伝子由来の前記コーディング配列を含み、コーディング配列のそれぞれが、該コーディング配列が発現される細胞を溶解もしくは破壊するかまたは該細胞の生存度を減少させる必要を伴わずに検出することができる遺伝子産物を産生する、レポーター構築物と、
ｉｉ）細胞表面受容体またはイオンチャネルであって、前記細胞表面受容体またはイオンチャネルが組換え細胞の表面で発現される、細胞表面受容体またはイオンチャネルと、を含む組換え細胞であって、
前記細胞表面受容体またはイオンチャネルと物質との特異的相互作用が、該レポーター遺伝子の発現レベルを変化させる、組換え細胞を準備する工程と、
ｂ）前記細胞表面受容体またはイオンチャネルに特異的に相互作用することが可能であると推測される少なくとも１つの物質を含有するサンプルに、該組換え細胞を暴露させる工程と、
ｃ）前記キメラレポーター遺伝子の発現が変化させられているかどうかを決定する工程と、を含む方法であって、
レポーター遺伝子発現の変化が、サンプル中の物質と細胞表面受容体またはイオンチャネルとの相互作用、即ち、前記細胞表面受容体またはイオンチャネルに特異的に相互作用する物質のサンプル中における存否を示す、検定方法。
【請求項１６】
前記細胞表面受容体がヘプタヘリックス受容体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
遺伝子発現の変化が、遺伝子発現の増加である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記キメラレポーター遺伝子が、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）をコードする遺伝子由来およびフォチヌス（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ）ルシフェラーゼをコードする遺伝子由来の配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
組換え細胞を準備する工程が、ＥＧＦＰによるシグナルの検出によるクローン選択を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
シグナルを検出するために蛍光標示式セルソーター（ＦＡＣＳ）または蛍光顕微鏡が使用される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
該シグナルが、細胞表面タンパク質とリガンドとの結合により直接的に発生する、請求項１に記載のレポーター構築物。
【国際調査報告】
2004508042.tif 000098
2004508042.tif 000099
2004508042.tif 000100
2004508042.tif 000101
2004508042.tif 000102
2004508042.tif 000103
2004508042.tif 000104